(57)【要約】  本発明は、医薬組成物を提供する。具体的に、第１の成分と第２の成分を含み、第１の成分は、ファルネソイドＸ受容体アゴニスト及び前駆体、活性代謝物、立体異性体、薬剤学的に許容される塩、エステル系及び溶媒和物から選択される少なくとも一つであり、第２の成分は、ＮＰＣ１Ｌ１受容体阻害剤及び前駆体、活性代謝物、立体異性体、薬剤学的に許容される塩、エステル系及び溶媒和物から選択される少なくとも一つである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物であって、
ファルネソイドＸ受容体アゴニスト及び前駆体、活性代謝物、立体異性体、薬剤学的に許容される塩、エステル系及び溶媒和物から選択される少なくとも一つである第１の成分と、
ＮＰＣ１Ｌ１受容体阻害剤及び前駆体、活性代謝物、立体異性体、薬剤学的に許容される塩、エステル系及び溶媒和物から選択される少なくとも一つである第２の成分と、を含む、
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記ファルネソイドＸ受容体アゴニストは、コール酸、リトコール酸、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、ＧＷ４０６４、ＷＡＹ−３６２４５０、ＰＸ−１０２及びＰＸ２０３５０から選択される少なくとも一つである、
ことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＮＰＣ１Ｌ１受容体阻害剤は、コレステロール吸収阻害剤化合物である、
ことを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＮＰＣ１Ｌ１受容体阻害剤は、Ｈｙｚｅｔｉｍｉｂｅ、エゼチミブである、
ことを特徴とする請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物が
１〜１００重量部の前記第１の成分、及び
１〜１００重量部の前記第２の成分、を含む、
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物が
２．５〜５０重量部の前記第１の成分、及び
５〜５０重量部の前記第２の成分、を含む、
ことを特徴とする請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
医薬製剤であって、
請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物を活性成分とする、
ことを特徴とする医薬製剤。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物が医薬の製造における用途であって、
前記医薬が総コレステロール及び/またはトリアシルグリセロール、低密度リポタンパク質コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール、及び/またはアラニンアミノ基転移酵素及び/またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素、アルカリホスファターゼのレベル、肝指数を低下することに用いられる、
ことを特徴とする用途。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物が医薬の製造における用途であって、
前記医薬がＮＡＦＬＤ、糖尿病または心血管疾患を予防及び/または治療することに用いられる、
ことを特徴とする用途。
【請求項１０】
前記医薬が肝炎、肝線維症、肝硬変、肝癌を予防及び/または治療することに用いられる、
ことを特徴とする請求項９に記載の医薬組成物が医薬の製造における用途。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物が医薬の製造における用途であって、
前記医薬がＮＡＳＨを予防及び/または治療することに用いられる、
ことを特徴とする用途。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物が医薬の製造における用途であって、
前記医薬が高脂血症性脂肪肝を予防及び/または治療することに用いられる、
ことを特徴とする用途。
【請求項１３】
前記医薬組成物の投与手段が、経口投与、または混合物の形式で投与、または異なった時間に順次投与することである、
ことを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記載の用途。
【請求項１４】
前記医薬組成物の投与量は、１〜１０００ｍｇ/日である、
ことを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬分野に関し、特に、本発明は、医薬組成物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪肝（Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ）は、通常なびまん性肝疾患の一種であり、多種類の起因による肝臓脂肪代謝異常の代謝性疾患である。主に、肝細胞に摂取された脂肪の増加、かつ脂肪酸化の減少のため、肝細胞に蓄積された脂肪が多すぎる病態である。脂肪肝の病因が比較的に複雑で、例えばアルコール依存、肥満、糖尿病、脂質代謝異常などが挙げられる。特に、高脂血症と深く関連している。脂肪肝の発症メカニズムが今まで完全に判明されていない。一般的には、肝細胞によるトリアシルグリセロールの合成と、低密度リポタンパク質の分泌とのバランスを取れないことは、脂肪肝を形成する主要な起因であると考えている。脂肪肝を形成する病因の相違に応じて、通常に、アルコール性脂肪性肝疾患（ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＦＬＤ）と非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ, ＮＡＦＬＤ）が分けられている。ＮＡＦＬＤは、多大の脂肪がトリアシルグリセロール（脂肪変性）としての形式で肝臓に堆積することを意味する。その発症メカニズムは、インスリン抵抗性（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＩＲ）とメタボリックシンドローム（ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｓｙｎｄｒｏmｅ、ＭＳ）と関連している。ＮＡＦＬＤ が非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎ-ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ、ＮＡＦＬ）から非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ-ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＮＡＳＨ）に進行し、肝硬変に発展し、更に肝細胞癌となることがある。ＮＡＦＬＤは、欧米先進国における最も一般的な疾患であり、先進国の２０〜３０％の人口が非アルコール性脂肪性肝疾患を患い、２０３０年に５０％まで上昇することが予想されている。中国にも同様な状況に陥り、富裕の地域において、既に最も一般的な疾患になった。脂肪肝による肝疾患の発症の勢いも大きくなる。人間ドックを行ったヒトにおいて、４０〜４９歳の男性の脂肪肝の発症率が一番高いであり、２８％まで達する。且つ、脂肪肝が検出されても、病院に行き、更に詳しい検査を受ける人が少ないと懸念されている。中国の脂肪肝の発症率が総人口の１０％を占め、ウイルス性肝炎に次ぐ肝疾患になった。肝線維症の発生率が２５％まで至り、かつ約１．５％〜８．０％の患者が肝硬変や更に肝細胞癌に発展することができる。ＮＡＦＬＤ がＮＡＳＨに発展した場合、肝硬変、肝不全と肝細胞癌の発生リスクが大幅に大きくなる。ある報道によると、現在、ＮＡＦＬＤが２０％〜４０％の成人に影響を及ぼした。その中で、約３０％のＮＡＦＬＤがＮＡＳＨに発展し、またＮＡＳＨ患者の肝硬変発症率が１５％〜２５％であり、その患者の約３０％〜４０％が肝疾患による死亡になる。そのため、脂肪性肝疾患が既に現在の肝疾患分野の新たな挑戦になった。
【０００３】
しかしながら、ＮＡＦＬＤを治療する医薬品が承認されていなく、現在、ＮＡＦＬＤを治療する主な医薬は、インシュリン増感剤（ビグアニド系医薬、例えばメトホルミンであり、チアゾリジンジオン系化合物、例えばロシグリタゾン、ピオグリタゾン）、脂質降下薬（スタチン系、フィブラート系）、利胆薬（ウルソデオキシコール酸）、肝臓保護薬（ビタミンＥ、シリマリン、アセチルシステイン）及び漢方薬（カシュウ (何首烏)、丹参、タクシャ（沢瀉）、センキュウ、ケツメイシ、サンザシなど）を含む。種類が多く、作用メカニズムが単一であり、効能がほぼ同じ、全体的に高い薬効を持たず、かつ副作用があり、患者の耐容性が低下するため、更なる改善が求められている。現在、ＮＡＦＬＤを有効に治療する手段が知られなく、複数の新薬がまだ臨床試験中である。インシュリン増感剤（例えば、チアゾリジンジオン系医薬）が、肝臓炎症と脂肪含有量を改善することに対して一定の効果を有することが承認されているが、ＮＡＳＨによる肝線維化への進行を阻害できない。
【０００４】
従って、脂肪肝疾患を治療する医薬を更に開発することが求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の技術課題の一つを一定の程度で解決し、または有用の商用利用可能な選択を提供することである。そのため、本発明の一つの課題は、非アルコール性脂肪性肝疾患と非アルコール性脂肪性肝炎を有効に治療・予防する医薬組成物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の側面によれば、本発明は、医薬組成物を提供するものである。本発明の具体的な実施例によれば、前記医薬組成物は、第１の成分と第２の成分を含む。前記第１の成分は、ファルネソイドＸ受容体アゴニスト及び前駆体、活性代謝物、立体異性体、薬剤学的に許容される塩、エステル系及び溶媒和物から選択される少なくとも一つである。第２の成分は、ＮＰＣ１Ｌ１受容体阻害剤及び前駆体、活性代謝物、立体異性体、薬剤学的に許容される塩、エステル系及び溶媒和物から選択される少なくとも一つである。
【０００７】
そのため、本発明は、前記医薬組成物は、総コレステロール及び/またはトリアシルグリセロール、低密度リポタンパク質コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール、及び/またはアラニンアミノ基転移酵素及び/またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素、アルカリホスファターゼのレベル及び肝指数を低下する効果を有するため、ＮＡＦＬＤ、糖尿病または心血管疾患の予防及び/または治療、及び肝炎、肝線維症、肝硬変、肝癌などの予防及び/または治療に対して優れた効果を有する。特に、非アルコール性脂肪性肝疾患と非アルコール性脂肪性肝炎の予防・治療に対して優れた効果を有する。
【０００８】
本発明の具体的な実施例によれば、前記ファルネソイドＸ受容体アゴニストは、コール酸（ＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、オベチコール酸（ＯＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ＧＷ４０６４、ＷＡＹ−３６２４５０、ＰＸ−１０２とＰＸ２０３５０から選択される少なくとも一つである。
【０００９】
本発明の具体的な実施例によれば、前記ＮＰＣ１Ｌ１受容体阻害剤は、コレステロール吸収阻害剤化合物である。コール酸（ＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、オベチコール酸（ＯＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ＧＷ４０６４、ＷＡＹ−３６２４５０、ＰＸ−１０２とＰＸ２０３５０から選択される少なくとも一つである物質と、コレステロール吸収阻害剤化合物と併用して得られた組成物が、非アルコール性脂肪性肝疾患と非アルコール性脂肪性肝炎の予防・治療に対して優れた効果を有する。
【００１０】
本発明の具体的な実施例によれば、前記ファルネソイドＸ受容体アゴニストは、オベチコール酸であることが好ましい。本発明の具体的な実施例によれば、ＮＰＣ１Ｌ１受容体阻害剤は、Ｈｙｚｅｔｉｍｉｂｅ、エゼチミブ（Ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ）であることが好ましい。本発明の具体的な実施例によれば、前記エゼチミブの活性代謝物は、エゼチミブグルクロニド（Ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）である。オベチコール酸と、Ｈｙｚｅｔｉｍｉｂｅ及び/またはエゼチミブを併用して得られた前記医薬組成物が、非アルコール性脂肪性肝疾患と非アルコール性脂肪性肝炎を予防・治療する作用を更に向上させる。
【００１１】
本発明の具体的な実施例によれば、前記医薬組成物に含まれるＮＰＣ１Ｌ１受容体阻害剤は、代表的な医薬であるエゼチミブを選択することが好ましい。エゼチミブは、選択的なコレステロール吸収阻害剤であり、腸粘膜の刷子縁に作用し、腸粘膜のＮｉｅｍａｎｎ-Ｐｉｃｋ Ｃ１-Ｌｉｋｅ １ (ＮＰＣ１Ｌ１) 輸送タンパク質と特異的に結合し、小腸における外因性コレステロールと関連するフィトステロール系の吸収を選択的に阻害するため、肝臓に蓄えられたコレステロールを減少させ、血漿における総コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロールを低下させるとともに、高密度リポタンパク質コレステロールのレベルを向上させるが、他の栄養物質に対して、例えばビタミン、脂肪、タンパク質と糖などの吸収阻害作用が顕著ではなく、主に、飲食による高脂血症を対象として作用を奏する。スタチン系医薬と異なり、肝臓の内因性コレステロールを阻害する作用を奏しない。技術発展の現状において、エゼチミブに対する研究は、依然としてスタチン系医薬の併用薬とすることにより、糖尿病及びメタボリックシンドロームによる高コレステロール血症患者のＬＤＬ−Ｃのレベルを低下させることや、脂質を低下させることによりアテローム性動脈硬化による心血管系イベントの発生などを低下させることを着目している。
【００１２】
従来の研究に基づいて、エゼチミブのターゲットサイトであるＮＰＣ１Ｌ１は、小腸の絨毛と陰窩に分布しているだけではなく、霊長目動物または人類の肝臓にも発現と分布している。従って、エゼチミブも肝臓上ＮＰＣ１Ｌ１受容タンパクに作用し、肝胆から低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）と、脂質を含有するカイロミクロンまたは極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）とを除去することを促進して、脂肪肝を改善する作用がある。エゼチミブがＬＤＬ−Ｃの低下に対する優れた効果に基づいて、ＮＡＦＬＤに対する治療の希望として提案するが、今まで明確な結論が出ていない。
【００１３】
本発明の具体的な実施例によれば、前記医薬組成物に選ばれたエゼチミブは、安全性が非常に高い医薬である。エゼチミブが経口を介して迅速に吸収され、腸と肝臓においてもっと活性のある産物になるように糖化され、腸肝循環を介して、ＮＰＣ１Ｌ１に往復的に作用する。14Ｃで標識されたエゼチミブ医薬代謝実験から観察すると、エゼチミブが、ほとんど主な医薬代謝酵素であるシトクロムP４５０により代謝されていないため、他の医薬と相互作用していない。
【００１４】
発明者が検討したところ、エゼチミブとオベチコール酸と併用する場合、オベチコール酸が非アルコール性脂肪性肝疾患病と非アルコール性脂肪性肝炎の改善作用を大幅に向上させるとともに、オベチコール酸のみを利用することによるＬＤＬの向上などの副作用を低下することができるため、前記二つの医薬を併用する場合、オベチコール酸が、非アルコール性脂肪性肝疾患病と非アルコール性脂肪性肝炎の治療における欠陥を補うことに優れています。また、エゼチミブとオベチコール酸と併用する場合、医薬の間の相互作用が発生しないため、前記医薬組成物が良好な安全性を有する。
【００１５】
本発明の具体的な実施例によれば、発明者が以下の知見に基づいて、オベチコール酸とエゼチミブと併用して前記医薬組成物を完成した。
【００１６】
まず、オベチコール酸は、半合成ケノデオキシコール酸であり、肝臓、腸と腎臓などのビリルビン代謝に参加する細胞において大量に発現され、その天然リガンドは、胆汁酸である。プラセボ対照と対比すると、オベチコール酸治療組の患者の総コレステロールと低密度リポタンパク質のレベルが更に高いが、高密度リポタンパク質が低下する。一部の患者が脂質介入を受け、前もって投与を停止する。治療によるコレステロールの向上及びインスリン抵抗性、または、動脈硬化症のリスクを増加させるため、心血管系イベントをもたらすので、長期な安全性に対して懸念され、更に深く検討する必要がある。
【００１７】
この副作用を減少するため、現在の当業者が、一般的に、スタチン系医薬と併用することを想到することがある。現在の技術発展に基づいて、スタチン系医薬は、広く利用されている脂質降下医薬として、その医薬自体が広く研究されている。心血管疾患の患者が現在、スタチン系医薬によるコレステロールを低下する作用から利益を得、かつ生体外または生体内の研究に基づいて、スタチン系医薬も脂質降下を除いて、独立的な抗炎作用を有する。免疫の調節、抗酸化、抗血せん及び抗菌などの作用を示すものである。炎症及び酸化還元メカニズムと、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨの発症メカニズムと深く関連しているため、各国のガイドラインにも、脂質異常症のあるＮＡＦＬＤ及ＮＡＳＨを治療することについて、スタチン系医薬を利用することが推薦されている。
【００１８】
現在、スタチン系医薬がＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨを治療する効果性及び安全性に対する研究が多い。スタチン系医薬が転移酵素を低下させ、肝脂肪変性の程度を軽減することができるが、肝線維症の改善に対して効果がない。ＮＡＦＬＤをＮＡＳＨに発展することを遅延できることが示唆されている。即ち、スタチンがＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ及び脂質異常症（高ＬＤＬ−Ｃ血症）を治療することに対して効果がある。しがしながら、これらの臨床試験のサンプル数が少なく、追跡調査時間が長くない問題があり、同時に大部分の実験が組織学的検査を行わない。一方、スタチン系医薬は、多大の安全リスク、例えば重度の副作用である筋疾患が存在する、筋疾患の発生率と厳しさが、いずれもスタチンの用量と正の相関がある。主に、筋肉痛または筋力低下が生じるとともに、ＣＫ（クレアチンキナーゼ）が正常基準の１０倍以上に上がり、発熱と全身倦怠感が生じることがある。筋疾患が早期に発見されず、そのまま医薬の投与を続ける場合、横紋筋融解症と急性腎不全に罹るおそれがある。同時に、スタチン系医薬により患者の血糖異常、肝酵素異常、記憶と認識障害などをもたらす。また、最も重要なことは、スタチン系医薬が、競合阻害により内因性コレステロールから律速酵素（ＨＭＧ-ＣＯＡ還元酵素）、細胞内のメバロン酸経路を阻害し、細胞内のコレステロール合成を減少させるため、細胞膜表面（主に、肝細胞）の低密度リポタンパク質受体数と活性の増加を刺激するようにフィードバックすることにより、血清コレステロールの除去を増加し、血清コレステロールのレベルを低下させるが、外因性コレステロールに対する顕著な効果がない。しかしながら、脂肪肝患者の血コレステロールの大部分が、飲食摂取による外因性コレステロールに属し、かつスタチン系医薬と他の医薬を併用する場合、例えばフィブラート系、ナイアシン系、シクロスポリン、ＨＩＶタンパク質阻害剤と併用する場合、常に有害反応が生じる。そのため、発明者が、一般的な併用手段としてのスタチン系医薬を併用することは、適当な選択ではないと考えている。
【００１９】
そのため、発明者が、鋭意研究を重ねて、ファルネソイドＸ受容体アゴニストと、コレステロール吸収阻害剤とを併用する場合、相乗効果を有し、特に、オベチコール酸とエゼチミブとを併用する場合、ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨの治療に対する予想できない効果を有し、特に、当該組成物がオベチコール酸のみを利用することによるＬＤＬ向上の副作用を低下することができることを見出す。よって、当該組成物を非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎と高脂血症性脂肪肝を治療する医薬として更に開発することが期待されている。
【００２０】
本発明の具体的な実施例によれば、前記実施例の医薬組成物に、１〜１００重量部の前記第１の成分、及び１〜１００重量部の前記第２の成分を含む。前記の配合により、両者の相乗効果を更に向上させ、ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨの治療効果を更に向上させることができる。
【００２１】
本発明の具体的な実施例によれば、前記実施例の医薬組成物に、２．５〜５０重量部の前記第１の成分、及び５〜５０重量部の前記第２の成分を含むことが好ましい。前記配合により、両者の相乗効果を更に向上させ、ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨの治療効果を更に向上させることができる。
【００２２】
本発明の第２の側面によれば、本発明は、医薬製剤を提供する。当該医薬製剤が、活性成分としての前記医薬組成物を含む。これにより、活性成分の薬理作用を発揮し、前記医薬組成物が備える効能を有する。具体的に、前記製剤が総コレステロール及び/またはトリアシルグリセロール、低密度リポタンパク質コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール、及び/またはアラニンアミノ基転移酵素及び/またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素、アルカリホスファターゼのレベル、肝指数を低下する効能を有し、更にＮＡＦＬＤ、糖尿病または心血管疾患の予防及び/または治療、及び肝炎、肝線維症、肝硬変、肝癌の予防及び/または治療などに対して顕著な効果を有する。特に、非アルコール性脂肪性肝疾患と非アルコール性脂肪性肝炎の予防・治療に対して優れた効果を有する。
【００２３】
本発明の具体的な実施例によれば、前記医薬製剤は、活性成分である前記医薬組成物は、薬剤学的に許容されるベクターを含む。本発明の実施例によれば、前記薬剤学的に許容されるベクターは、薬剤学的に許容される溶剤、推進剤、可溶化剤、助溶剤、乳化剤、着色剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、潤滑剤、湿潤剤、浸透圧調整剤、安定剤、流動化剤、矯味剤、防腐剤、懸濁化剤、コーティング材料、芳香剤、粘着防止剤、整合剤、浸透促進剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、可塑剤、表面活性剤、発泡剤、消泡剤、増粘剤、インクルージョン剤、保湿剤、吸収剤、希釈剤、凝集剤と分散剤、濾過助剤、放出遅延剤、高分子骨格材料と成膜材料から選択される少なくとも一つである。これにより、前記医薬組成物が製剤に形成され、臨床用の医薬製剤に適用するような形式を呈する。
【００２４】
本発明の具体的な実施例によれば、前記医薬製剤は、経口投与に適合した任意の剤型でも良い。経口投与である場合、活性成分としての本発明の医薬組成物の医薬剤型は、錠剤、舌下錠、発泡錠、コーティング錠、糖衣錠、分散錠、腸溶錠、顆粒剤、ゼラチンカプセル、腸溶カプセル、徐放性カプセル、放出制御カプセル、経口液状製剤を含むが、これらに限定されるものではない。錠剤またはカプセルを選択することが好ましい。
【００２５】
本発明の具体的な実施例によれば、前記医薬製剤における活性成分である医薬組成物の第１の成分の含有量は、１ｍｇ〜１００ｍｇであり、好ましくは、２．５ｍｇ〜５０ｍｇであり、第２の成分の含有量は、１ｍｇ〜１００ｍｇであり、好ましくは、５ｍｇ〜５０ｍｇである。
【００２６】
本発明の具体的な実施例によれば、前記医薬製剤における活性成分である医薬組成物における第１の成分の含有量は、１ｍｇであり、第２の成分の含有量は、１ｍｇである。
【００２７】
本発明の第３の側面によれば、本発明は、前記医薬組成物が医薬の製造における用途を提供する。前記医薬は、総コレステロール及び/またはトリアシルグリセロール、低密度リポタンパク質コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール、及び/またはアラニンアミノ基転移酵素及び/またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素、アルカリホスファターゼのレベル、肝指数を低下することに用いられている。
【００２８】
本発明の第４の側面によれば、本発明は、前記医薬組成物が医薬の製造における用途を提供する。前記医薬が、ＮＡＦＬＤ、糖尿病または心血管疾患を予防及び/または治療することに用いられている。
【００２９】
本発明の具体的な実施例によれば、前記医薬が、肝炎、肝線維症、肝硬変、肝癌を予防及び/または治療することに用いられている。
【００３０】
本発明の第６の側面によれば、本発明は、前記医薬組成物が医薬の製造における用途を提供する。前記医薬が、高脂血症性脂肪肝を予防及び/または治療することに用いられている。
【００３１】
本発明の具体的な実施例によれば、医薬組成物が医薬の製造における用途において、医薬組成物の投与手段が、経口投与、または混合物の形式で投与、または同時投与または異なった時間に順次投与することである。
【００３２】
本発明の具体的な実施例によれば、医薬組成物が医薬の製造における用途において、医薬組成物の投与量は、１〜１０００ｍｇ/日である。
【００３３】
本発明の付加的な特徴及びメリットは、以下の説明において一部が述べられ、一部が以下の説明においてさらに明瞭になり、又は本発明の実践を介して把握できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
図面は、本発明を更に理解するための明細書の一部として、下記具体的な実施形態を参照しながら、本発明を説明するようなことであるが、これに限定されるものではない。
【図１】本発明の実施例４によれば、投与４週後、ＮＡＦＬＤゴールデンハムスター肝組織形態への影響を示すグラフである
【図２】本発明の実施例４によれば、投与４週後、ＮＡＦＬＤゴールデンハムスター肝組織色への影響を示すグラフである
【図３】ゴールデンハムスターＮＡＳＨモデルにおけるオベチコール酸とエゼチミブ投与実験の肝病理切片図である
【図４】ゴールデンハムスターＮＡＳＨモデルにおけるオベチコール酸とエゼチミブが、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡを低下する実験結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。以下の実施形態は、例示的なものであり、本発明を解釈するのみに用いられ、本発明を限定するものと理解されてはならない。実施例に具体的な技術または条件が記載されていない場合、本分野の文献に記載の技術、条件または製品の取扱書に従って実行する。本発明に利用した製剤や機器の生産者が記載されていない場合、いずれも一般的な市販品に属する。
【００３６】
実施例１  オベチコール酸の調製
１．３ｋｇ３α-ヒドロキシ-６-エチリデン-７-ケト-５β-コラン酸、１３．０ｋｇ精製水、０．６５ｋｇ ５０％水酸化ナトリウム水溶液と０．１３ｋｇ １０％パラジウム炭素を反応槽に入れる。反応混合物が反応完了まで１〜３大気圧で水素化されている。窒素置換後、反応液を濾過して触媒を回収し、母液を収集して反応槽に入れ、９５〜１００℃まで昇温し、反応完了まで撹拌する。１１．５ｋｇ酢酸ブチルを入れ、撹拌しながら約５．２ｋｇクエン酸水溶液をｐＨ４〜５まで調節する。次に、０．５時間撹拌した後に、静置して分層し、有機相を分離して水洗いされ活性炭を入れ、５５℃ほど約０．５時間処理され、活性炭を濾過して、固体が大量に析出されるまでろ液が減圧濃縮され、濾過して、０．６ｋｇ酢酸ブチルで濾過ケークを洗浄した後に、６０℃以下、減圧で真空乾燥され、１．２ｋｇ ３α-ヒドロキシ-６α-エチル-７-ケト-５β-コラン酸を得る。
【００３７】
１．１５ｋｇ３α-ヒドロキシ-６α-エチル-７-ケト-５β-コラン酸、９．２ｋｇ精製水、１．１ｋｇ ５０％水酸化ナトリウム水溶液を反応槽に入れる。混合物を８０℃ほど昇温させ、全部溶解まで撹拌する。５％水酸化ナトリウム水溶液に溶解した水素化ホウ素ナトリウム（０．１０４ｋｇ）溶液を反応槽に入れ、そして９５〜１０５℃まで昇温させ、反応完了まで撹拌する。反応液が５５℃ほどに冷却され、８．１ｋｇ酢酸ブチルと８．６ｋｇ５０％のクエン酸水溶液を入れ、ｐＨ４〜５まで調節し、静置して分層し、有機相を分離して水洗いされた後に、減圧濃縮され、濾過して析出した固体を収集して、酢酸ブチルで再結晶された後に、真空干燥され、０．７５ｋｇオベチコール酸の粗生成物を得る。粗生成物を、６．０ｋｇ精製水と０．１７ｋｇ ５０％水酸化ナトリウム水溶液に入れ、攪拌しながら溶解した後、濾過膜を介して濾過され、ろ液を希塩酸システム（１６．７ｋｇ精製水と０．２５ｋｇ ３７％濃塩酸により調製された）に入れ、前記希塩酸システムの温度が４０℃以上に制御される。４０〜４５℃で約１時間撹拌する。反応液を２０℃ほどまで冷却し、濾過して、精製水で濾過ケークをｐＨが６．０〜７．０まで洗浄して、５０℃ほどで真空干燥され、０．７ｋｇオベチコール酸を得る。
【００３８】
実施例２  エゼチミブの調製
窒素雰囲気で、(４Ｓ)-３-[(５Ｓ)-５-(４-フルオロフェニル)-５-ヒドロキシ-１-オキソペンチル]-４-フェニル基-２-オキサゾリジノン（２．０ｋｇ）、４-[[(４-フルオロフェニル)イミン]メチル]-フェノール（２．４ｋｇ）、ジクロロメタン（１５．０ｋｇ）を５０Ｌ反応槽に入れ、-５℃以下に保持され、ＤＩＰＥＡ（３．８ｋｇ）を入れ、撹拌しながらクロロトリメチルシラン（２．３ｋｇ）を滴下し、滴下完了後、反応完了まで撹拌して、主原料を得ることをシステムＡと呼ぶ。
【００３９】
四塩化炭素（１．２６ｋｇ）を、ジクロロメタン（４．５ｋｇ）を有する１００Ｌ反応槽を入れ、-１５℃ほどに冷却し、チタンテトライソプロポキシド（０．６８ｋｇ）を入れ、２０分撹拌した後に、-３０℃まで冷却し、前記ＴＭＳにより保護された主原料システムＡを滴下し、-２０℃を超えないように制御され、滴下完了後、約３時間激しく撹拌して、反応完了した。
【００４０】
温度が０℃以下に制御され、イソプロパノール（１６．０ｋｇ）を滴下し、更にジクロロメタン（３４．５ｋｇ）を入れ、０．５時間撹拌して、飽和酒石酸水溶液（３５．０ｋｇ）を入れ、室温まで自然昇温され、その後反応完了まで３時間撹拌して、水相と有機相を得る。ジクロロメタンで水相を抽出して、有機相と合併して精製水（２４．０ｋｇ）で洗浄され、更に有機相に２０％亜硫酸水素ナトリウム水溶液（３５．０ｋｇ）を入れ、約３時間撹拌して、析出された固体を濾過・収集して、かつ精製水で洗浄する。ろ液を反応槽に入れ、水相を分離して有機相を取得し、精製水（１６．０ｋｇ）でその有機相を洗浄した後に、留分を無くすように減圧濃縮され、更にジクロロメタン（５．６ｋｇ）を入れ、精製水（４．０ｋｇ）と撹拌して、析出された固体を濾過して、前記固体と合併して、乾燥して、１．８２ｋｇ (Ｓ)-３-((Ｓ)-５-(４-フルオロフェニル)-５-(トリメチルシロキシ)ペンタノイル)-４-フェニル基-２-オキサゾリジノンを得る。
【００４１】
(Ｓ)-３-((Ｓ)-５-(４-フルオロフェニル)-５-(トリメチルシロキシ)ペンタノイル)-４-フェニル基-２-オキサゾリジノン（１．８２ｋｇ）、ジクロロメタン（１０．５ｋｇ）、ＢＳＡ（ビス(トリメチルシリル)アセトアミド）（２．５５ｋｇ）を１００Ｌの反応槽に入れ、還流まで加熱し、反応完了まで撹拌する。その後、室温まで冷却して、メチルｔ-ブチルエーテル（４．９ｋｇ）を入れ、１時間撹拌して、更にＴＢＡＦ・３Ｈ2Ｏ（テトラブチルアンモニウムフルオリド三水和物）（３６．４g）を入れ、反応完了まで撹拌して、留分を無くすように減圧濃縮され、濃縮液にアセトン（３．８ｋｇ）を入れ、０〜１０℃で２ｍｏｌ／Ｌの硫酸溶液（２．０ｋｇ）を滴下して、室温で反応完了まで撹拌する。ジクロロメタン（９．０ｋｇ）、精製水（４．０ｋｇ）を入れ、撹拌して、析出された固体を濾過・収集する。母液を反応槽に再投入し、水相が分離され、有機相に精製水（１０ｋｇ）を入れ、０〜１０℃で撹拌して、析出された固体を濾過・収集して、前記固体と合併して、更にジクロロメタン（５ｋｇ）と精製水（５ｋｇ）を入れ、スラリー化まで撹拌して、０〜５℃まで冷却・濾過して、濾過ケークを４５〜５５℃、減圧で真空乾燥され、得られた固体を無水エタノール（１４ｋｇ）に入れ、溶解した後に、濾過して、ろ液が約半分の体積まで４５〜５５℃、減圧濃縮され、精製水（６．６ｋｇ）を入れた後、０〜５℃まで冷却して晶析され、約１時間撹拌した後、固体を濾過・収集して、約５０℃、減圧で真空乾燥され、エゼチミブ７７０gを得る。
【００４２】
実施例３  エゼチミブのグルクロニドの調製
-２５℃で０．０９１ｍｌ三フッ化ホウ素ジエチルエーテルを３．３３g 3,4,6−トリ-Ｏ-アセチル-α-Ｄ−グルコピラノース1,2-(オルト酢酸メチル)と４．２４g ３-Ｏ-アセチルエゼチミブのジクロロメタン溶液に入れる。-２０℃で２時間反応して、１０℃まで昇温させ、反応完了まで反応した後、飽和塩化アンモニウム水溶液によりクエンチされ、酢酸エチルで抽出して、有機相が分離され、それぞれ飽和塩化アンモニウム水溶液、水と塩化ナトリウム水溶液で洗浄され、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで濃縮・精製され、５．３９gの中間生成物を得る。
【００４３】
５．０８gの前記中間生成物を１２７ｍｌメタノールと１２７ｍｌトリエチルアミンに溶解して、室温でゆっくり４４５ｍｌ水を入れる。得られた澄み反応液を反応完了まで一晩撹拌する。メタノールとトリエチルアミンを除去するように濃縮し、残された溶液を１Ｍ塩酸で酸性化された後、酢酸エチルで抽出する。抽出された有機相を合併して、それぞれ１Ｍ塩酸、水と塩化ナトリウム水溶液で洗浄され、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで濃縮・精製され、また乾燥して２．６gエゼチミブグルクロニドを得る。
【００４４】
実施例４  オベチコール酸とエゼチミブの併用、それぞれの単独投与による高脂肪食誘発のＮＡＦＬＤへの影響
１、装置
Ｓｙｓｍｅｘ ＣＨＥＸ−１８０ 生化学自動分析装置、
Ｂｅｃｋｍａｎ ２２Ｒ  遠心機、
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＣＰ１２４Ｓ 電子秤、
ＫＵＤＯＳ ＳＫ７２００Ｈ 超音波洗浄機。
【００４５】
２、試薬
下記のアッセイキットは、いずれも上海科華生物工程有限会社の市販品である。
ＴＣアッセイキット（ロット番号 ２０１５０９１２）、ＴＧアッセイキット（ロット番号 ２０１５１０１２）、ＬＤＬ−Ｃアッセイキット（ロット番号２０１５１１２２）、ＨＤＬ−Ｃアッセイキット（ロット番号 ２０１５０３２２）、ＡＬＰアッセイキット（ロット番号 ２０１５１１１２）、ＧＬＵアッセイキット（ロット番号 ２０１５０８２２）アッセイキット。
ＡＬＴ（ロット番号 ＺＧ５００５）とＡＳＴ（ロット番号ＺＧ５００４）アッセイキットは、シスメックス株式会社の市販品であり、
オベチコール酸、エゼチミブ医薬は、いずれも１０％ Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ ＨＳ １５（ＢＡＳＦ、ロット番号 ２１４６６２８８Ｋ０）により所望濃度を調製する。
【００４６】
３、動物
雄ＳＰＦ級のゴールデンハムスター７８匹、ＢＷ（体重）７０〜９０ｇ（Ｂｅｉｊｉｎg Ｖｉｔａl Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａl Ｔｅｃｈｎｏlｏgｙ ＣＯ., Ｌｔｄから購入する。証明書番号ＳＣＸＫ（ＪＩＮＧ）２０１２-０００１）。
【００４７】
４、ＮＡＦＬＤモデル化のゴールデンハムスターを調製する
１０匹ゴールデンハムスターは、正常組として通常飼料を与え、他の６８匹ゴールデンハムスターは、購入日から高脂食を与え（０．３％コレステロール、１２．５％パーム油、８７．２％通常飼料）、水飲みが自由で、光照射周期１０時間/１４時間、３週間飼育後、１４時間絶食させ、水飲みが自由で、翌日に眼窩静脈から０．８ｍＬ採血して、ヘパリンナトリウムで抗凝固を行い、５０００ｒ・ｍｉｎ-1で１０ｍｉｎ遠心し、３００μＬの上澄み液を測定用カップに入れ、自動生化学分析装置により血漿におけるＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−ＣとＡＬＴの含有量を検出し、かつ検出結果に基づいてゴールデンハムスターをグループ分ける。
【００４８】
５、グループ分けと投与
通常飼料を与える１０匹における６匹のゴールデンハムスターを正常組とする。高脂食を与える他の６８匹における３０匹が無作為に３組（各組１０匹ずづ）に分けられ、それぞれモデル組、オベチコール酸組（１ ｍｇ/ｋｇ）、オベチコール酸（１ ｍｇ/ｋｇ）+ エゼチミブ組（１ ｍｇ/ｋｇ）とする。初投与の時間は、午後４時であり、各組動物の投与量は、いずれも１０ｍＬ・ｋｇ-1であり、モデル組に、同体積の１０％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒを投与する。正常組を除いて、投与期間において他の３組に継続的に高脂食を与え、投与２週後、全てのゴールデンハムスターを一晩絶食させるが、断水させない。翌日の午前、エチルエーテルで動物を麻酔した後、眼窩静脈から０．８ｍＬ採血して、ヘパリンナトリウムで抗凝固を行い、５０００ｒ・ｍｉｎ-1で１０ｍｉｎ遠心し、３００μＬの血漿を収集して、自動生化学分析装置により血漿におけるＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−ＣとＡＬＴのレベルを検出する。投与４週後、各ゴールデンハムスターの血漿を収集して、血漿におけるＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＡＬＴ、ＡＳＴとＡＬＰのレベルを検出する。採血完了後、エチルエーテルで前記ゴールデンハムスターを深く麻酔し、動物の質量を測り、腹部の正中に開腹を行いことにより、肝臓の大きさ、色、テクスチャを観察し、写真を撮る。その後、肝臓を取り出し、生理食塩水で洗浄され、ろ紙により吸い尽くされた後、肝指数を算出するために質量を測る。その後、肝の左葉を迅速に切り出して、１０％中性緩衝ホルマリンに置き、固定され、パラフィン切片（ＨＥ染色）を製造した後、肝組織の病理学的な変化を観察する。
【００４９】
６、統計学的な処理
【数１】
2019509348.tif 000002
によりデータ結果を示し、ｔ検定により組同士の対比を行う。
【００５０】
７、実験結果
投与２週後、各組のゴールデンハムスターの血漿におけるＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＡＬＴ、ＡＳＴとＡＬＰのレベルの結果を表１に示す。正常組と対比すると、モデル組血漿におけるＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＡＬＴ、ＡＳＴとＡＬＰのレベルがいずれも有意に高い（Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１）、モデル組と対比すると、オベチコール酸のみを利用する組が、ゴールデンハムスター血漿におけるＡＳＴのレベルを有意に低下するが（Ｐ＜０．０５）、ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＡＬＴとＡＬＰに対する影響は、有意差がなく（Ｐ＞０．０５）、モデル組と対比すると、オベチコール酸とエゼチミブの併用組が、血漿におけるＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＡＬＴ、ＡＳＴのレベルを有意に低下するが（Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１）、血漿におけるＡＬＰのレベルがほとんど変化しない（Ｐ＞０．０５）。
【００５１】
投与４週後、各組のゴールデンハムスターの血漿におけるＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＡＬＴ、ＡＳＴとＡＬＰのレベル及び肝指数の結果を表２に示す。正常組と対比すると、モデル組の血漿におけるＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＡＬＴ、ＡＳＴのレベルと肝指数がいずれも有意に高いが（Ｐ＜０．０１）、ＡＬＰは有意差がなく（Ｐ＞０．０５）、モデル組と対比すると、オベチコール酸のみを利用する組が、ゴールデンハムスター血漿におけるＴＣ、ＬＤＬ−Ｃ、ＡＬＴ、ＡＳＴのレベルを有意に低下するが（Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１）、相対的に高い数値を持ち、かつＴＧ、ＨＤＬ−Ｃ、ＡＬＰ、肝指数への影響の有意差がなく（Ｐ＞０．０５）、モデル組と対比すると、オベチコール酸とエゼチミブの併用組が肝指数（Ｐ＜０．０１）及び血漿におけるＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰのレベルを有意に低下する（Ｐ＜０．０１）。
【００５２】
投与４週後、各組ゴールデンハムスター肝組織サンプルを図１と図２に示す。図１は、投与４週後、ＮＡＦＬＤゴールデンハムスター肝組織形態への影響を示す。Ａ−１、２、３は、正常組を示し、Ｂ−１、２、３は、モデル組を示し、Ｃ−１、２、３は、オベチコール酸組を示し、Ｄ−１、２、３は、オベチコール酸+エゼチミブ組を示し、１、２、３は、各組における任意に選ばれたゴールデンハムスターを示す。図２は、投与４週後、ＮＡＦＬＤゴールデンハムスター肝組織色への影響を示す。Ａは、正常組を示し、Ｂは、モデル組を示し、Ｃは、オベチコール酸組を示し、Ｄは、オベチコール酸+エゼチミブ組を示す。肝臓を全体的に観察すると、正常組の肝臓は、鮮紅色を呈し、エッジが鋭く、表面が平滑で、テクスチャが柔軟である。モデル組のゴールデンハムスターの肝臓体積がより大きく、全体がフルサイズであり、外膜が張り、表面が粗く、樺色またはクリーム色がかった黄色を呈し、白色に近く、エッジが緩く、油っぽいタッチ感があり、テクスチャが崩れやすい。オベチコール酸のみを利用する組の肝組織が、モデル組とほぼ同じであるが、オベチコール酸とエゼチミブの併用組のゴールデンハムスター肝臓が、モデル組より赤く、弾力があり、正常組に近い肝外見を呈する。
【００５３】
上記の説明により、オベチコール酸のみを利用する場合、ゴールデンハムスターＮＡＦＬＤへの治療効果が顕著ではないが、オベチコール酸とエゼチミブとの併用が、所望の効果を示す。
【００５４】
【表１】
2019509348.tif 000003
【００５５】
【表２】
2019509348.tif 000004
【００５６】
以上により、ファルネソイドＸ受容体アゴニストオベチコール酸とコレステロール吸収阻害剤エゼチミブとの併用は、ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨに対する予想できない治療効果を持っている。特に、当該組成物が、オベチコール酸のみを利用することによるＬＤＬ向上の副作用を減少することができる。そのため、当該医薬組成物は、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎と高脂血症性脂肪肝の治療薬として更に研究することが期待されている。目前、オベチコール酸とエゼチミブとの組み合わせは勿論、オベチコール酸の医薬組成物により治療を行う報道も見つからない。本発明者は、動物モデルにより、両者の相乗効果を見出し、かつ相互作用による干渉がないため、安全性が高い。そのため、オベチコール酸とエゼチミブとの併用は、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎と高脂血症性脂肪肝などの疾患を治療することに寄与を示す。
【００５７】
実施例５ オベチコール酸とエゼチミブの併用投与、及びそれぞれ単独投与がＮＡＳＨへの影響
エゼチミブ組（０．３ ｍｇ/ｋｇ）の増加、かつオベチコール酸組の投与用量は、５ ｍｇ/ｋｇに変更し、オベチコール酸+エゼチミブ組におけるオベチコール酸の投与用量は、５ ｍｇ/ｋｇに変更、エゼチミブの投与用量は、０．３ ｍｇ/ｋｇに変更することを除いて、他の実験条件は、実施例４を参照する。具体的に、Ａは、正常組を示し、Ｂは、モデル組を示し、Ｃは、オベチコール酸組を示し、Ｄは、オベチコール酸+エゼチミブ組を示し、Ｅは、エゼチミブ組を示す。
【００５８】
実験後のゴールデンハムスター肝組織サンプルを切片する。図３のように示す。
【００５９】
結果により、ゴールデンハムスターＮＡＳＨモデルにおいて、
１）オベチコール酸が、血漿における肝酵素をわずかに低下するが、トリアシルグリセロール、コレステロール、ＬＤＬをわずかに向上させる。しかしながら、肝の病理切片から見ると、オベチコール酸が肝細胞脂肪含有量を大幅に低下することができ、肝脂肪帯を大幅に減少させるが、炎症細胞の浸潤と集合を減少できなく、肝線維症への進行を阻害できない。
２）エゼチミブが血漿におけるトリアシルグリセロール、コレステロール、ＬＤＬと肝酵素を低下させ、ＡＬＰにわずかな低下作用を奏するが、肝の病理切片から見ると、炎症細胞の浸潤と集合を改善するしかできないが、肝の脂肪含有量を低下できないことや、肝臓から脂肪を除去することができない。
３）オベチコール酸とエゼチミブとの併用は、血漿におけるトリアシルグリセロール、コレステロールとＬＤＬを大幅に低下し、ＡＬＰをわずかに低下することができる。肝の病理切片から見ると、肝細胞における脂肪含有量を低下し、脂肪帯を大幅に減少させるだけではなく、炎症細胞の浸潤と集合を大幅に減少させることができる。そのため、ＮＡＳＨ患者にオベチコール酸を利用する時に、コレステロールとＬＤＬ向上による心血管リスクを改善するだけではなく、オベチコール酸のみを利用することによる肝酵素の低下や肝炎症細胞浸潤の減少が顕著ではない効果を改善して、肝線維症への進行を阻害する。
【００６０】
実施例６ オベチコール酸とエゼチミブの併用投与、及びそれぞれ単独投与がＨＢＶ  ＤＮＡコビー数への影響
１．実験材料
ＨｅｐＧ２肝癌細胞が、武漢大学の中国典型培養物保蔵センター（ＨｅｐＧ２の保蔵センター番号は、ＧＤＣ０２４）により提供されている。
ウシ胎児血清は、アメリカＧｉｂｃｏ会社の市販品である。
ＤＭＥＭ培地は、アメリカＧｉｂｃｏ公司の市販品である。
Ｌｉｐｏ２０００トランスフェクション試薬は、アメリカＬｉｆｅ会社の市販品である。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＰＣＲ蛍光定量アッセイキットは、上海科華生物工程有限会社の市販品である。
【００６１】
２． 細胞培養条件
ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地に、体積分率５％ＣＯ2、３７℃、飽和湿度で培養する。
【００６２】
３． 実験グループ分け
陰性対照組は、ＨｅｐＧ２細胞、医薬と同体積のジメチルスルホキシド （ＤＭＳＯ）および同体積の１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を使用した。
オベチコール酸のみ投与組は、ＨｅｐＧ２細胞、オベチコール酸の濃度が、それぞれ２μｍｏＬ/Ｌ、１０μｍｏＬ/Ｌであるオベチコール酸溶液（ＤＭＳＯにより調製される）および同体積の１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を使用した。
オベチコール酸とエゼチミブ併用医薬組は、ＨｅｐＧ２細胞、濃度が異なるオベチコール酸とエゼチミブの溶液（２μｍｏＬ/Ｌオベチコール酸+２μｍｏＬ/Ｌエゼチミブ、２μｍｏＬ/Ｌオベチコール酸+１０μｍｏＬ/Ｌエゼチミブ、１０μｍｏＬ/Ｌオベチコール酸+２μｍｏＬ/Ｌエゼチミブであり、いずれもジメチルスルホキシド （ＤＭＳＯ）により調製される）および同体積の１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を使用した。
【００６３】
４．実験方法
対数増殖期であるＨｅｐＧ２細胞を４×１０5個/ウェルの密度で２４ウェルプレートに接種し、各ウェルに０．５ｍｌずつを添加して、５％ＣＯ2、３７℃、飽和湿度で６時間培養する。細胞接着及び生長性がよい。その後、ウェルプレートにおける各ウェルの培地を、新たな培地に取り替える。各ウェルにおける細胞に０．８μg ＨＢＶ全遺伝子プラスミド（pＢＬＵｅ-ＨＢＶ１．３）を導入する：０．８μg プラスミドと２μＬ Ｌｉｐｏ２０００ トランスフェクション試薬を１００μＬ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ無血清培地に入れ、均一に混合し、２０ｍｉｎ静置し、その混合液を培養された細胞に入れる。１２時間培養後、培地を廃棄して、その後、前記グループ分けに従って、培養液または医薬溶液をそれぞれ対応のウェルに入れ、各対応のウェルが３つのウェルに設置され、更に、５％ ＣＯ2、３７℃、飽和湿度で４８時間培養する。細胞を収集し、ＨＢＶ  ＤＮＡ（複製中間体、閉環状ＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ）を抽出して、蛍光定量ＰＣＲ検出を行う。
【００６４】
５． 実験結果
結果により、図４（ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドであり、ＯＣＡは、オベチコール酸であり、ＥＢＭは、エゼチミブである）に示すように、オベチコール酸とエゼチミブとの併用は、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡを明確に低下するため、Ｂ型肝炎によるＮＡＳＨ患者に対してより良い治療効果を与えるおそれがある。
【００６５】
本願の明細書の説明において、「一つの実施例」、「いくつかの実施例」、「例示」、「具体的な例示」または「いくつかの例示」などの用語は、該当実施例または例示を結合しながら説明した具体的な特徴、構成、材料または特性が本願の少なくとも一つの実施例または例示に含まれることを意味する。本明細書において、前記用語の概要な表現は、同一の実施例または例示を対象とする必要がない。かつ、説明した具体的な特徴、構成、材料または特性が任意の一つまたは複数の実施例または例示に適当な手段で結合されることができる。また、互いに矛盾しない場合、当業者が本明細書に記載の異なる実施例または例示及び異なる実施例または例示における特徴を結合することや組み合わせることができる。
【００６６】
本発明の実施例は、上記内容に開示・説明されているが、上記実施例は、例示として挙げられ、それに限定されるものではない、当業者が本発明の範囲で、様々な変化、修正、取り替え及び変形を行うことができる。
【図１】
2019509348.tif 000005
【図２】
2019509348.tif 000006
【図３】
2019509348.tif 000007
【図４】
2019509348.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月21日(2018.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物であって、
ファルネソイドＸ受容体アゴニスト及び前駆体、活性代謝物、立体異性体、薬剤学的に許容される塩、エステル系及び溶媒和物から選択される少なくとも一つである第１の成分と、
ＮＰＣ１Ｌ１受容体阻害剤及び前駆体、活性代謝物、立体異性体、薬剤学的に許容される塩、エステル系及び溶媒和物から選択される少なくとも一つである第２の成分と、を含む、
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記ファルネソイドＸ受容体アゴニストは、コール酸、リトコール酸、オベチコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、ＧＷ４０６４、ＷＡＹ−３６２４５０、ＰＸ−１０２及びＰＸ２０３５０から選択される少なくとも一つである、
ことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＮＰＣ１Ｌ１受容体阻害剤は、コレステロール吸収阻害剤化合物である、
ことを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＮＰＣ１Ｌ１受容体阻害剤は、Ｈｙｚｅｔｉｍｉｂｅ、エゼチミブである、
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物が
１〜１００重量部の前記第１の成分、及び
１〜１００重量部の前記第２の成分、を含む、
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物が
２．５〜５０重量部の前記第１の成分、及び
５〜５０重量部の前記第２の成分、を含む、
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
医薬製剤であって、
請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物を活性成分とする、
ことを特徴とする医薬製剤。
【請求項８】
総コレステロール及び/またはトリアシルグリセロール、低密度リポタンパク質コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール、及び/またはアラニンアミノ基転移酵素及び/またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素、アルカリホスファターゼのレベル、肝指数を低下することに用いられる請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＮＡＦＬＤ、糖尿病または心血管疾患を予防及び/または治療することに用いられる請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
肝炎、肝線維症、肝硬変、肝癌を予防及び/または治療することに用いられる請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＮＡＳＨを予防及び/または治療することに用いられる請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
高脂血症性脂肪肝を予防及び/または治療することに用いられる請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬組成物の投与手段が、経口投与、または混合物の形式で投与、または異なった時間に順次投与することである、
ことを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記医薬組成物の投与量は、１〜１０００ｍｇ/日である、
ことを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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