(57)【要約】  微小流体環境において１つ以上の磁石を使用して、部分、細胞、または他のそのような構成単位の集団を浮上させるためのシステムおよび方法が提供される。これらのシステムおよび方法は、例えば、構成単位の異種集団を互いに分離または選別し、構成単位の浮上中に多数構成単位集合体を集合させ、リアルタイムでポイントオブケアで試料を評価するために使用することができる。これらのシステムおよび方法はまた、スマートフォンなどの画像化装置がシステム内で操作されると構成単位をリアルタイムで取り込むことを可能にするフレームを利用してもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分の変動が磁化率および／または固有の密度の差に基づく、前記部分の異種集団を分離するための浮上装置であって、磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含み、前記磁場は、前記部分の異種集団を含有する試料を受容するためのマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと相互作用する大きさにされている、装置
を含む磁気浮上ベースの診断システムであって、
前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルは、その中に前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルの部分が形成される複数の層によって画定され、前記複数の層の少なくとも１つは、前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルへの入口チャネルを提供し、少なくとも２つの複数の層は前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルから別個の出口を提供する、磁気浮上ベースの診断システム。
【請求項２】
前記複数の層は、少なくとも２つの層を含み、前記少なくとも２つの層のそれぞれは、その中に形成された各々の入口および各々の出口を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記各層の各々が、レーザ加工材料から形成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記複数の層のうちの少なくとも２つの層の間に薄膜が配置されて、上部および下部の出口を確立する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記少なくとも１つの入口および前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに、前記部分の異種集団および常磁性培地を含む試料を流すステップと、
前記部分の異種集団を含む前記試料に磁場を加えて、前記部分の異種集団の個々のメンバーと前記常磁性培地との間の磁化率および固有の密度の少なくとも１つの差に基づいて前記異種集団を分離するステップと、
その後前記試料の第１の部分を上部出口から、前記試料の第２の部分を下部出口から流し出し、それにより前記部分の異種集団の第２の群から前記部分の異種集団の第１の群を分離するステップと
を含む、請求項１に記載のシステムを用いて選別する方法。
【請求項６】
前記複数の層は、上層、中間層、および下層を含む少なくとも３つの層を含み、前記３つの層のそれぞれが、その中に形成された各々の入口および各々の出口を含み、前記少なくとも１つの入口および前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに前記試料を流すステップが、前記部分の異種集団および常磁性培地を含む前記試料を前記下部入口に、前記常磁性培地を前記上部および中央入口に導入するステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、常磁性培地と混合された血液試料であり、前記血液試料が循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または循環腫瘍クラスター／栓子（ＣＴＭ）を含み、前記ＣＴＣ／ＣＴＭが分離され、前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内の前記磁場に曝された後前記上部チャネルに流れる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
温度および架橋の少なくとも１つの助けにより、分離した部分の集団を安定化させるステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
生物学的または非生物学的部分の集団を分離するための装置を含むシステムを用いて選別する方法であって、前記装置が磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含み、前記磁場は、部分の集団を含有する試料の受容のためにマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと相互作用する大きさにされており、
前記部分の集団および常磁性培地を含む試料を入口から前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに出口に向けて流すステップと、
前記試料が前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内にある間に、前記少なくとも１つの磁石を用いて前記試料に磁場を加えるステップであって、前記磁場を加えることは、前記部分の集団のメンバーのうちの少なくとも一部、ただし全部ではないメンバーが、前記出口に向かって流れることを阻止し、それによって、前記部分の集団を分離するステップと
を含む方法。
【請求項１０】
前記部分の集団のメンバーの少なくとも一部、ただし全部ではないメンバーを阻止するステップが、高い磁気誘導のために前記磁場の磁気の縁部で生じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記部分の集団が、前記血球が前記少なくとも１つの磁石によって生成された前記磁場を通過して移動することが阻止されるが、血漿は、前記少なくとも１つの磁石により生成される前記磁場を経て前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルを通って前記出口に至るよう流れることが可能である血液試料を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
温度および架橋の少なくとも１つの助けにより、分離した部分の集団を安定化させるステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含む浮上装置を含む磁気浮上ベースの診断システムを使用する磁気シグネチャに基づいて多部分集合体を集合させる方法であって、前記少なくとも１つの磁石が部分の集団を含有する試料の受容のためにマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと近接し、
前記部分の集団および常磁性培地を含む試料を前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内に導入するステップ、および
前記試料が前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内にある間に、前記少なくとも１つの磁石を用いて前記試料に磁場を加えるステップであって、ここで前記磁場を加えることが、前記部分の集団の少なくとも一部を浮上させて、前記部分の集団が凝集して多部分集合体を形成する互いの空間的関係で前記部分の集団を配置するステップ、
を含む方法。
【請求項１４】
前記多部分集合体を形成する前記部分の集団の前記凝集が、前記磁場によって誘導された前記浮上によって確立された前記空間的関係に前記部分の集団が実質的に留まっている間に、自然発生的に持続時間にわたり生じる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記磁場が永久磁石によって生成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記磁場が電流によって誘導されるコイルによって生成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記システムが、高スループットの多部分集合体を可能にする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記部分が細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記部分がポリマーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記多部分集合体を形成する前記部分の集団の前記凝集は、温度および架橋の少なくとも１つの助けにより起こり、安定化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
画像化装置と共に使用するための磁気浮上ベースの診断システムであって、
細胞の異種集団を分離するための浮上装置であって、前記細胞の変動が磁化率の差に基づいており、磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含み、前記少なくとも１つの磁石が細胞の異種集団を含有する試料の受容のためにマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと近接している、浮上装置と、
光源と、
前記浮上装置と前記光源とを支持するフレームであって、画像化装置を支持するようさらに構成され、前記光源を前記浮上装置を介して前記画像化装置に光を透過してリアルタイムで細胞の異種集団の少なくとも一部を観察する位置で支持するフレームと
を含む、磁気浮上ベースの診断システム。
【請求項２２】
レンズをさらに備え、前記フレームが前記レンズを支持し、前記光源は、前記レンズを介して前記画像化装置に光をさらに透過させるように配置される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記画像化装置は、スマートフォン、ＣＭＯＳカメラ、およびＣＣＤカメラのうちの１つである、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記画像化装置によって収集されたデータは、ブルートゥース（登録商標）、ＷｉＦｉ、およびセルラネットワークのうちの少なくとも１つを介して送信される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記フレームによって支持される中立密度フィルタをさらに備え、前記中立密度フィルタは、前記光源と前記浮上装置との間に配置される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２６】
前記画像化装置がカメラを含み、前記フレームが、ある位置で前記画像化装置を受容して、前記カメラが前記レンズを介して伝送される画像を受容するように位置決めされる、前記フレームによって支持される画像化装置をさらに備える、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２７】
前記画像化装置が、細胞の異種集団の前記分離をリアルタイムで観察するように構成されている、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記フレームは、携帯性のために前記フレームのサイズを縮小する圧縮位置と、前記フレームが拡張される拡張位置とを有する、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２９】
前記フレームが前記拡張位置にあるとき、前記フレームは、その上面の凹部内で前記画像化装置を受容するように構成される、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記画像化装置がコンパクトであり、スマートフォン様の保護ケースカバーの中に挿入され、それによって前記画像化装置を画像化経路に連結し、前記フレーム内に前記スマートフォンの位置を確立する、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記画像化装置が前記フレームに収容されると、前記画像化装置の前記カメラが前記レンズに面し、前記画像化装置のディスプレイが、前記細胞の異種集団を含む前記試料の観察のために視認可能なままである、請求項２１に記載のシステム。
【請求項３２】
前記システムが、浮上された対象の数を計数し定量化するようにさらに構成される、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記画像化装置が、前記画像化装置を用いて白色の視野と蛍光タイプ両方の画像化を行うことができる、請求項２１に記載のシステム。
【請求項３４】
磁気浮上ベースの診断システムにおける細胞の異種集団を観察するための方法であって、
浮上装置のマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに前記細胞の集団の試料を配置するステップと、
画像化装置をフレームに配置するステップと、
前記浮上装置内の前記細胞の集団を分離するステップと、
前記浮上装置内の前記細胞の集団を分離している間、前記細胞の集団の前記分離の画像を収集するために前記画像化装置を使用するステップと
を含む方法。
【請求項３５】
前記細胞の集団の前記分離の画像の前記収集がリアルタイムで行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料が血液である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料が、唾液、尿、血漿、血清、および便を含む体液；皮膚、肛門、鼻および膣のスワブまたはドアの取手からの環境的なスワブを含むスワブ；および涙液、肺からのラバッシュ液、乳房からの間質組織液を含む近位の流体から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞の集団の前記収集された画像から得た前記細胞の集団の少なくともいくつかを計数することと、定量化することの少なくとも１つをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
部分の変動が磁化率および／または固有の密度の差に基づく、前記部分の異種集団を分離するための浮上装置であって、磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含み、前記磁場が、前記部分の異種集団を含有する試料を受容するためのマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと相互作用する大きさにされている、装置と、
前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルの前記入口および／または出口にある、前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルの高さおよび／または幅にわたるそれぞれの所定の位置で流体を前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに導入またはそこから退かせる少なくとも１つの針と
を含む、磁気浮上ベースのシステム。
【請求項４０】
前記入口または前記出口に複数の針を備え、前記複数の針のそれぞれが、異なる空間位置で前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと連通している、請求項３９に記載の磁気浮上ベースのシステム。
【請求項４１】
前記入口における第１の注射針が、前記出口における第２の吸引針と異なる高さにある、請求項３９に記載の磁気浮上ベースのシステム。
【請求項４２】
生殖医療に使用する個々の胚および卵母細胞の性質を評価する方法であって、
浮上装置のマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに１つまたは複数の胚または卵母細胞を含む試料を配置するステップ、
前記浮上装置に胚または卵母細胞を含む前記試料を浮上させるステップ、および
密度および浮上プロファイルの１つまたは複数に関して前記胚または卵母細胞の前記性質を格付けするステップ
を含む方法。
【請求項４３】
前記密度および浮上プロファイルの１つまたは複数に関する前記胚または卵母細胞の前記性質を前記格付けに基づいて、前記胚または卵母細胞の１つまたは複数の胚または卵母細胞を選択するステップ、および体外受精処置において前記１つまたは複数の胚または卵母細胞を使用するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
液滴シーケンシングのための磁気浮上システムにおいて、液滴中に封入される複数の部分を浮上させる方法であって、
複数の液滴において前記複数の部分を封入し、前記複数の液滴を試料中に懸濁させるステップと、
前記複数の液滴を含有する前記試料を前記磁気浮上システムのマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに配置するステップと、
前記磁気浮上システムにおいて前記複数の液滴を浮上させるステップと
を含む方法。
【請求項４５】
前記試料が、前記複数の部分のいずれも封入しない複数の液滴をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年１０月２日に出願された「Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｏｉｅｔｉｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｌｅｖｉｔａｔｉｏｎ」と題する米国特許出願第６２／２３６，６９２号の利益を主張し、その内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［連邦支援の研究または開発の陳述］
本発明は、米国国立科学財団によって授与された１１５０７３３の契約、および米国国立衛生研究所により授与されたＥＢ０１５７７６およびＨＧ０００２０５の契約の下、政府の支援によってなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、微小流体環境において１つまたは複数の磁石を使用して、部分、細胞、または他のそのような構成単位の集団を浮上させるためのシステムおよび方法に関する。これらのシステムおよび方法は、構成単位の異種集団を互いに分離または選別し、構成単位の浮上中に複数の構成単位の集合体を集合させるために使用できる。これらのシステムおよび方法はまた、スマートフォンなどの画像化装置がシステム内で操作されると構成単位をリアルタイムで取り込むことを可能にするフレームを利用してもよい。
【背景技術】
【０００４】
磁気浮上は、個々の巨視的対象の密度および磁化率の分析のため、および食品を分離して牛乳、チーズ、およびピーナッツバターの脂肪含量を判定し、それらの固有の密度に基づいて様々な粒子を比較し、物体の自己集合を誘導し、法医学関連の証拠を特性評価するのに有効な手段として、従来使用されてきた。これらの初期の磁気浮上ベースの実験は、顕微鏡に適合しないか、顕微鏡に合わせた大規模なセットアップを利用して行っていた。
【０００５】
生理学的および病理学的な多種多様な細胞のプロセスは、細胞内常磁性反応種、例えば活性酸素種（ＲＯＳ）または活性窒素種（ＲＮＳ）の形成または消光による細胞の体積質量密度または磁気シグネチャ（magnetic signature）の一時的または永続的変化を伴う。これらの事象は、細胞周期段階、分化、細胞死（アポトーシス／ネクローシス）、悪性疾患、疾患状態、活性化、食作用、インビボおよびエクスビボの細胞老化、ウイルス感染、および薬物に対する特異的および非特異的応答を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
臨床および家庭の環境を含む生活の場で健康情報を共有するための、携帯式で、堅牢で、安価で使いやすい疾患の診断および予後のモニタリングプラットフォームに対する新たな必要性が存在している。本明細書では、異なる構成単位（例えば、白血球または赤血球または他の部分）が磁気勾配で浮上され、磁気勾配におけるその固有の密度のために分離される、磁気浮上ベースの診断システムが提供される。さらに、対応する分析用の使いやすいスマートフォン統合浮上システムが開示されている。携帯式イメージング磁気浮上（ｉ−ＬＥＶ）システムを使用して、例えば、白血球および赤血球を同定することができ、任意の標識を使用せずに細胞数を定量することができることが示される。さらに、ｉ−ＬＥＶで浮上した細胞やその他の部分は、単一構成単位分解能（例えば、単一細胞）で区別することができ、診断とモニタリング、ならびに臨床および研究での応用が可能になる。とりわけ、これによって、家庭という環境や臨床的な環境を含む様々な環境で、スマートフォンを使用して疾患の診断とモニタリングをすることが、可能になる。
【０００７】
このような開示のシステムには、多くの潜在的な用途がある。このようなシステムは、例えば、全血から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を無標識、高スループットで単離するための微小流体プラットフォームとしても使用することができる。プラットフォームは、磁気浮上の原理を利用して、マイクロチャネル内を流れる間にそれらの密度プロファイルに基づいて細胞を分離する。血球よりも低い固有の密度を通常有する癌細胞は、マイクロチャネル内でより高いレベルで浮上することができ、それにおいては３つの異なる常磁性流体が上から下に流れる（上流および中流：担体緩衝液、底流：癌細胞を含む試料血液）。次いで、それら浮上した癌細胞を試料の血流から抽出し、上部に流れる担体緩衝液内に収集する。したがって、このプラットフォームにより、例えば、癌患者の血液からの希少なＣＴＣの高スループットの単離が可能になり、ＣＴＣ由来のバイオマーカーおよび分子標的の臨床研究が容易になる。
【０００８】
したがって、開示のシステムは、全血から血漿を分離する際の使用、およびまた、いくつかの例として全血からＣＴＣを単離するための使用ために、特に適用可能であり得る。
【０００９】
さらに、システムによって提供される分離および選別には、他の様々な用途がある。例えば、三次元細胞培養技術を可能にするために、磁気シグネチャに基づいた多細胞集合体のための方法を喚起する。それは、微小重力の可能性のある地上ベースのシミュレーションとして、細胞の磁気浮上のためにさらに使用できる。さらに、これらのツールは、磁気／密度特性および画像化／分子プロファイリングに基づいた選別、回収、および特性評価のための方法で使用することができる。
【００１０】
本発明の一態様によれば、磁気浮上ベースの診断システムが提供される。磁気浮上ベースの診断システムは、部分の変動が磁化率および固有の密度の１つまたは複数の差に基づく部分の異種集団を分離するための浮上装置を含む。この装置は、磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含み、磁場は、部分の異種集団を含有する試料を受容するために、マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと相互作用するような大きさにされる。マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルは、その中にマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルの部分が形成される複数の層によって画定され、複数の層の少なくとも１つは、マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルへの入口チャネルを提供し、複数の層の少なくとも２つはマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルからの別個の出口を提供する。
【００１１】
いくつかの形態では、複数の層は、少なくとも２つの層を含むことができ、層のそれぞれは、その中に形成された各々の入口および各々の出口を含む。
【００１２】
いくつかの形態では、各層の各々は、レーザ加工材料から形成され得る。
【００１３】
いくつかの形態では、複数の層のうちの少なくとも２つの層の間に薄膜が配置されて、上部および下部の出口を確立することができる。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、このシステムを選別方法に使用してもよい。この方法は、部分の異種集団および常磁性培地を含む試料を入口およびマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに流すことを含む。部分の異種集団を含む試料に磁場を加えて、部分の異種集団の個々のメンバーと常磁性培地との間の磁化率および固有の密度の少なくとも１つの差に基づいて異種集団を分離する。その後、試料の第１の部分を上部出口から流し出し、試料の第２の部分を下部出口から流し出し、それにより部分の異種集団の第２の群から部分の異種集団の第１の群を分離する。
【００１５】
この方法のいくつかの形態では、複数の層は、上層、中間層、および下層を含む少なくとも３つの層を含むことができ、３つの層のそれぞれが、その中に形成された各々の入口および各々の出口を含んでよい。この形態では、入口およびマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに試料を流すステップが、部分の異種集団および常磁性培地を含む試料を下部入口に、常磁性培地を上部および中央入口に導入することを含んでよいことが企図される。必要に応じて、多くの層、入口、および／または出口をシステムに追加できることが企図される。上記の形態は３つ以上の層を識別するが、３つの層は、提供され得る層の１つの例示的な数に過ぎず、同様に、３つより多いまたは少ない出口を有し得る。
【００１６】
いくつかの形態では、試料は、常磁性培地と混合された血液試料であってもよい。血液試料は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または循環腫瘍クラスター／栓子（ＣＴＭ）を含むことができ、ＣＴＣ／ＣＴＭは、マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内の磁場に曝された後に、分離されて上部チャネルに流れ得る。
【００１７】
いくつかの形態では、この方法は、温度および架橋の少なくとも１つの助けにより、分離した部分の集団を安定化させるステップをさらに含み得る。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、生物学的または非生物学的部分の集団を分離するための装置を含むシステムを用いて選別する方法であって、装置が磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含み、それは、部分の集団を含有する試料の受容のためにマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと相互作用する大きさにされている。この方法では、部分の集団および常磁性培地を含む試料を、入口からマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに、出口に向けて流す。試料がマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内にある間に、磁石を用いて試料に磁場を加える。磁場を加えることは、部分の集団のメンバーのうちの少なくとも一部、ただし全部ではないメンバーが、出口に向かって流れることを阻止し、それによって、部分の集団を分離する。
【００１９】
この方法のいくつかの形態では、部分の集団のメンバーの少なくとも一部、ただし全部ではないメンバーを阻止するステップが、高い磁気誘導のために磁場の磁気の縁部で生じる可能性がある。
【００２０】
いくつかの形態では、部分の集団は、血球は１つまたは複数の磁石によって生成された磁場を通過して移動するのが阻止されるが、血漿は磁石により生成される磁場を経てマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルを通って出口に至るよう流れることが可能である血液試料を含み得る。
【００２１】
いくつかの形態では、方法は温度および架橋の少なくとも１つの助けにより、分離した部分の集団を安定化させるステップをさらに含み得る。
【００２２】
本発明のさらに別の態様によれば、方法は、磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含む浮上装置であって、磁石が部分の集団を含有する試料の受容のためにマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと近接している、装置を含む磁気浮上ベースの診断システムを使用する磁気シグネチャに基づいて、多部分集合体を集合させるステップを提供する。部分の集団および常磁性培地を含む試料をマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内に導入する。試料がマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内にある間に、１つまたは複数の磁石を用いて試料に磁場を加え、その結果、磁場を加えることは、部分の集団の少なくとも一部を浮上させて、部分の集団が凝集して多部分集合体を形成する、互いに空間的関係にある部分の集団を配置する。
【００２３】
この方法のいくつかの形態では、多部分集合体を形成する部分の集団の凝集が、磁場によって誘導された浮上によって確立された空間的関係に部分の集団が実質的に残っている間に、持続時間にわたって自然発生的に生じ得る。
【００２４】
いくつかの形態では、磁場は永久磁石によって生成されてもよい。他の形態では、磁場は、電流によって誘導されるコイルによって生成されてもよい。さらに別の形態の磁場生成も使用できる。
【００２５】
部分は、複数の異なる種類の構成単位または材料であり得る。この方法のいくつかの形態では、部分は細胞であってもよい。この方法の他の形態では、部分はポリマーであってもよい。
【００２６】
この方法のいくつかの形態では、多部分集合体を形成する部分の集団の凝集は、温度および架橋の少なくとも１つの助けにより起こり得て、安定化し得る。
【００２７】
本発明のさらに別の態様によれば、画像化装置と共に使用するための磁気浮上ベースの診断システムが提供される。このシステムは、細胞の異種集団を分離するための浮上装置を含み、これにおいて細胞の変動は磁化率の差に基づいている。この装置は、磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含み、磁石が細胞の異種集団を含有する試料の受容のためにマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと近接している。システムはさらに、光源と、レンズ（システムのいくつかの形態におけるもの、ただしレンズは省略することができる）およびフレームを含む。フレームは、浮上装置と光源と、さらにシステムの一部として存在している場合、レンズも支持する。このフレームは、画像化装置を支持するようにさらに構成されている。フレームは、浮上装置を介して光を透過する位置で光源を、また存在している場合は、リアルタイムで細胞の異種集団の少なくとも一部を観察するために、画像化装置に対してレンズを支持する。
【００２８】
いくつかの形態では、画像化装置は、スマートフォン、ＣＭＯＳカメラ、およびＣＣＤカメラのうちの１つであってよい。画像化装置によって収集されたデータは、特に操作場所が遠隔の治療地点である場合に、ブルートゥース（登録商標）、Ｗｉｆｉ、および電話のネットワークのうちの少なくとも１つを介して送信してもよい。
【００２９】
いくつかの形態では、システムは、フレームによって支持される中立密度フィルタをさらに含み得、中立密度フィルタは、光源と浮上装置との間に配置される。
【００３０】
いくつかの形態では、システムは、フレームによって支持される画像化装置をさらに含むことができ、その画像化装置はカメラを含む。この形態では、フレームは、フレームが、ある位置で画像化装置を受容して、カメラがレンズを介して伝送される画像を受け取るように位置決めされることができる。画像化装置は、細胞の異種集団の分離をリアルタイムで観察するように構成されてもよい。
【００３１】
いくつかの形態では、フレームは、携帯性のためにフレームのサイズを縮小する圧縮位置と、フレームが拡張される拡張位置とを有することができる。フレームが拡張位置にあるとき、フレームはその上面の凹部内で画像化装置を受容するように構成され得る。
【００３２】
画像化装置がフレームに収容されると、画像化装置のカメラがレンズに面し、画像化装置のディスプレイが、細胞の異種集団を含む試料の観察のために視認可能なままであり得る。
【００３３】
本発明のさらに別の態様によれば、磁気浮上ベースのシステムにおいて細胞の異種集団を観察するための方法が提供される。細胞集団の試料は、浮上装置のマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに受け入れられるか、または配置される。画像化装置は、フレーム内に配置される。浮上装置内で細胞の集団は分離される。浮上装置内で細胞の集団が分離されている間に、細胞の集団の分離の画像を収集するために画像化装置を使用する。
【００３４】
この方法のいくつかの形態では、細胞の集団の分離の画像の収集がリアルタイムで行われ得る。
【００３５】
この方法のいくつかの形態では、試料は血液であってもよい。この方法の他の形態では、試料は、唾液、尿、血漿、血清、および便を含む体液；皮膚、肛門、鼻および膣のスワブまたはドアの取手から得た環境的なスワブを含むスワブ；および涙液、肺から得たラバッシュ液（lavash fluid）、乳房から得た間質組織液を含む近位の流体であってよい。当然のことながら、この試料の列挙は例示的なものであり、限定的ではないことが理解されよう。
【００３６】
いくつかの形態では、方法は、細胞の集団の収集された画像から得た細胞の集団の少なくともいくつかを計数するステップ、および／または定量化するステップをさらに含み得る。
【００３７】
本発明のさらに別の態様によれば、磁気浮上ベースのシステムは、部分の変動が磁化率および／または固有の密度の差に基づく、部分の異種集団を分離するための浮上装置を含む。この装置は、磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含み、磁場が、部分の異種集団を含有する試料を受容するためのマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと相互作用する大きさにされている。システムはさらに、マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルの入口および／または出口にある、マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルの高さおよび／または幅にわたるそれぞれの所定の位置で流体をマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに導入またはそこから退かせる少なくとも１つの針を含む。
【００３８】
いくつかの形態では、入口または出口の１つまたは両方に複数の針を備えることができ、複数の針のそれぞれが、異なる空間位置でマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと流体連通することができる。
【００３９】
いくつかの形態では、選別を促進するために、入口における第１の注射針が、出口における第２の吸引針と異なる高さにあってもよい。前述したように、それらの間にある試料中の部分の磁気分離が存在し得る。
【００４０】
別の態様によれば、生殖医療に使用する個々の胚および卵母細胞の性質を評価する方法が開示される。この方法は、浮上装置のマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに１つまたは複数の胚または卵母細胞を含む試料を置くステップ、および浮上装置に胚または卵母細胞を含む試料を浮上させるステップを含む。密度および浮上プロファイルの１つまたは複数で、胚または卵母細胞の性質を格付けする。
【００４１】
いくつかの形態では、本方法は、密度および浮上プロファイルの１つまたは複数における胚または卵母細胞の性質の格付けに基づき、胚または卵母細胞の１つまたは複数を選択するステップ、および選択された１つまたは複数の胚または卵母細胞を体外受精処置で使用するステップをさらに含み得る。
【００４２】
別の態様によれば、磁気浮上システムにおいて、液滴中に封入される複数の部分を浮上させる方法が開示される。この方法は、複数の部分を複数の液滴に封入し、複数の液滴を試料中に懸濁させるステップと、複数の液滴を含有する試料を磁気浮上システムのマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに配置するステップと、磁気浮上システムにおいて複数の液滴を浮上させるステップとを含む。
【００４３】
この方法のいくつかの形態では、試料は、複数の部分のいずれも封入しない複数の液滴をさらに含むことができる。
【００４４】
本発明のこれらおよび他の利点は、詳細な説明および図面から明らかになるであろう。以下は、本発明の好ましい実施形態の説明に過ぎない。本発明の全範囲を評価するためには、特許請求の範囲を検討すべきである。好ましい実施形態は、特許請求の範囲内の唯一の実施形態であることを意図しているものではないためである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】細胞の定量化および迅速な試料の調製のためのｉ−ＬＥＶプラットフォームを示す。図１Ａは、浮上装置に見出せる、磁石、キャピラリーチャネルおよびミラーの配置を示す。図１Ｂは、（Ｉ）患者から得たマイクロキャピラリーに装填または収集された少量（３０μＬ）の血液試料、（ＩＩ）キャピラリーの力を用いてマイクロキャピラリーチャネルに充填された血液試料、（ＩＩＩ）Ｃｒｉｔｏｓｅａｌ（商標）を用いたマイクロキャピラリーチャンネルの封止、および（ＩＶ）同極が互いに対向する２つの永久ネオジム磁石の間に導入されたキャピラリーチャネルを示す。図１Ｃは、スマートフォン、レンズ、浮上装置、光源、および周囲のフレームにより支持されるフィルタを含むｉ−ＬＥＶセットアップを示す。
【図２】ｉ−ＬＥＶプラットフォーム内の赤血球および白血球の分離を示す。図２Ａは、ｉ−ＬＥＶによって撮影されたＷＢＣおよびＲＢＣの分離画像を示す。図２Ｂは、異なる高さで浮上したＲＢＣおよびＷＢＣが、明視野を用いた従来の顕微鏡検査によって画像化されることを示す。図２Ｃは、ＣＤ４５標識ＷＢＣの蛍光画像を示す。図２Ｄは、ＷＢＣおよびＲＢＣの分離を確認するための明視野およびＣＤ４５画像の重複を示す。図２Ｅは、生きているＲＢＣが浮上しているのに対し、死んでいるＷＢＣがキャピラリーの底に凝集する、ｉ−ＬＥＶによるＲＢＣおよびＷＢＣの生死アッセイイメージングを示す。図２Ｆは明視野を示し、図２ＧはＤＡＰＩ標識を示し、図２Ｈは蛍光顕微鏡を用いたＷＢＣの重複画像を示す。
【図３】異なる希釈および時点での赤血球および白血球の幅を示す。図３Ａは、浮上細胞バンドの幅の経時変化を示す、異なる時点におけるＲＢＣバンド幅の画像を含む。図３Ｂは、３０分間にわたりｉ−ＬＥＶによって分析される２つの異なる濃度（９０および４５０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）におけるＲＢＣの幅をプロットしている。図３Ｃは、２５０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬから０．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬまで変化する異なるＲＢＣ濃度での、浮上した赤血球の画像を含み、図３Ｄは、これらのＲＢＣ濃度のそれぞれについての血液バンドの幅をプロットし、グラフは５０〜２５０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲の細胞濃度内で線形である。図３Ｅは、異なる濃度で浮上したＷＢＣの画像を含み、図３Ｆは、ＷＢＣ濃度に対する血液バンドの幅をプロットしている。
【図４】単一細胞検出および密度の測定を示す。図４Ａは、１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度のＲＢＣの画像であり、図４Ｂは、画像アルゴリズムを用いた単一血球の検出を示す。図４Ｃは、様々な密度（１．０２５ｇ  ｍＬ−１、１．０３１ｇ  ｍＬ−１、１．０４４ｇ  ｍＬ−１、および１．０６４ｇ  ｍＬ−１）の直径１０〜１００μｍのビーズが、３０ｍＭのＧｄ＋において明確な浮上高さを有することが示されている。図４Ｄは、１．０６４ｇ  ｍＬ−１の密度のビーズが、異なるＧｄ＋の濃度（１０ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭ）で異なる浮上の高さを有することを示す。図４Ｅは、粒子の密度を測定するための標準的な関数を提示する、線形当てはめ曲線を示す。
【図５】異なるＧｄ＋の濃度におけるＲＢＣおよびＷＢＣ分離を示す。図５Ａ〜５Ｃは、異なるＧｄ＋の濃度（３０、６０および９０ｍＭ）におけるＷＢＣおよびＲＢＣ分離の蛍光顕微鏡画像であり、対して図５Ｄ〜５Ｆは、ｉ−ＬＥＶシステムを用いて画像化された同プロセスである。両方のイメージングプラットフォームは、Ｇｄ＋の濃度の上昇が浮上の高さを増加させるのに対し、分離分解能は低下することを示している。
【図６】携帯電話ベースの浮上システムを用いた、ＲＢＣに対するクロロキンの効果のモニタリングを示す。
【図７】浮上装置を用いた薬物の効果のモニタリング、具体的には、赤血球に対するマラリア薬物（クロロキン）の効果を示す図である。図７Ａは、７５ｍｇ／ｍＬのクロロキンが添加された経時的な赤血球の浮上を示す。図７Ｂは、クロロキン濃度１．２５、２．５、５および７．５ｍｇ／ｍＬの浮上の高さおよび画像分析を示す。図７Ｃは、各濃度の影響を示すより詳細なグラフを示す、図７Ｂを拡大したグラフである。図７Ｄは、較正実験のために毎回密度ビーズが添加された図７Ｂおよび７Ｃのデータセットを生成するために分析された実際の画像である。
【図８】クロロキンに対する種々の血液試料の示差的応答を示す。
【図９】メカノバイオロジー研究を実施するための浮上システムの使用を示す。
【図１０】胚の分化を研究し、胚の健康にアクセスするための浮上システムの使用を示す。
【図１１】３つの異なる適用および３つの異なる電話機に対するｉ−ＬＥＶフレーム構成要素の設計を示す。下の３列は、様々な用途（すなわち、基本的なイメージング対蛍光イメージング対高度な蛍光イメージング）のｉ−ＬＥＶの異なる高さに対するものである。一番上の行は、３つの異なるスマートフォンとベースのアダプタ部分を示している。
【図１２】多くの機能をより携帯式かつコンパクトに組み合わせた新しいｉ−ＬＥＶ設計を示す。
【図１３】携帯電話ベースの画像化のためのｉ−ＬＥＶの別の更新された設計を示す。
【図１４】ｉ−ＬＥＶをどのように実施し、医療システムに貢献できるかを示す図である。血球計数は、様々な設定（すなわち、自宅または職場、または旅行中または休暇中）で、統合されたモバイルアプリケーションを用いて行うことができる。モバイルのアプリケーションは、測定値を医療提供者に報告する。医療提供者は結果を分析し、オンラインシステムを通じてフィードバックを提供する。
【図１５】高スループット磁気浮上セル（または他の部分）の選別のためのプラットフォームの設計および原理を示す。
【図１６】異なる密度のビーズが選別される高スループット磁気浮上選別装置の実験結果を示す。
【図１７】癌細胞が血液試料から選別される高スループット磁気浮上選別装置の実験結果を示す。
【図１８】別の高スループット磁気浮上選別装置を示す。
【図１９】高スループット磁気浮上選別装置を用いた血漿血液分析の結果を示す図である。
【図２０】血漿分離の効率を確立するための蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を示す。
【図２１】全血からのＲＢＣおよびＷＢＣの分離を示す。
【図２２】磁石が血漿から細胞を分離する抗ヘルムホルツ型の構成において、一対の磁石を用いて血液中の血漿から細胞を分離する模式図を示す。
【図２３】高磁気誘導の誘導される細胞ブロッキングベースの血漿分離装置である。
【図２４】図２３の装置を用いて、５０ｍＭのＧａ３＋（図２４Ａ）および１００ｍＭのＧａ３＋（図２４Ｂ）において血液試料から効率的な血漿分離をするための常磁性培地Ｇａ３＋濃度の最適化を示す詳細図である。
【図２５】図２５Ａにて、図２３の装置の入口への血液試料の装填を、図２５Ｂにて、出口から出る血漿を示す。
【図２６】スフェロイド（spheroid）集合体の方法を示す。
【図２７】磁気シグネチャに基づく多細胞３Ｄ集合体の別の方法を示す。
【図２８】磁気浮上に基づいた細胞の選別、回収および特性評価の方法を示す。
【図２９】凝集時間研究の画像を提示する。
【図３０】細胞生存率に与えるガドリニウム濃度および浮上の効果を示す一連の画像を提示する。
【図３１】種々のタイプのスフェロイドの経時的な融合を示す。
【図３２】ＮＩＨ  ３Ｔ３スフェロイドの成長研究および免疫染色を示す。
【図３３】スフェロイドの高スループットの集合を促進するための例示的な磁気浮上システムを示す。
【図３４】慢性疾患の存在を同定するために一対の患者血液試料のプロファイルに適用された浮上プラットフォームの使用を示す。
【図３５】慢性疲労症候群の患者における、経時的なＲＢＣの連続モニタリングを示す。
【図３６】慢性疲労症候群の患者における、経時的なＷＢＣの連続モニタリングを示す。
【図３７】浮上装置を用いた代謝産物、化学物質の効果のスクリーニングおよびモニタリングを示す
【図３８】細菌細胞の磁気浮上を示す。
【図３９】検証すべき表面から拭き取った試料に関して磁気浮上を用いて得られた細菌細胞バンドの画像を提供する。
【図４０】高い常磁性条件下で５分以内に細菌細胞を表面から迅速に検出できることを示す。
【図４１】磁気浮上システムにおける胞子の浮上および検出を示す。
【図４２】浮上システム内で栄養細菌細胞（vegetative bacterial cell）を浮上させ検出できることを示す。
【図４３】卵母細胞の浮上プロファイルを示す。
【図４４】非感染およびＨＩＶ感染血液ＣＤ４  Ｔ細胞が磁気浮上ベースのプラットフォームにおいて著しく異なる浮上プロファイルを有することを示す。
【図４５】抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ２ビーズと抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ２抗体による刺激は、ＨＩＶ感染血液ＣＤ４  Ｔ細胞の浮上プロファイルを変化させることを示す。
【図４６】チャネルの末端に針を含む、微小流体の高スループット磁気浮上装置の設計を示す。
【図４７】微小流体磁気浮上システム内での細胞の操作および収集を示す。
【図４８】１５０ｍＭの常磁性溶液（すなわち、ガドリニウム）を用いたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中の液滴の浮上を示す。
【図４９】１５０ｍＭ常磁性溶液（すなわち、ガドリニウム）を含むウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中の液滴の浮上を示す。
【図５０】１５０ｍＭの常磁性溶液（すなわち、ガドリニウム）を含むウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中の液滴の浮上を示しており、その中で液滴は異なる生物学的部分を封入する。
【図５１】癌研究における化学的で無標識の磁気浮上チップの特性評価を示す。
【図５２】腎臓癌（腎細胞癌）患者から得た血液試料の磁気浮上プロファイリングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下に、例えば細胞のような生物学的部分および非生物学的部分を分離および選別するための様々な例示的構造が提供される。以下の各サブセクションで、「ｉ−ＬＥＶ」装置の構成を含む様々な態様を記載している。この装置は部分の集団を含む試料のポイントオブケア（ＰＯＣ）の画像化および分析を提供するための画像化装置（スマートフォンなど）を組み込むことができる携帯式浮上システムである。次いで、部分選別およびブロッキング技術のその後の説明をさらに記載する。最後に、３Ｄの自己集合システムの構築においてこうした浮上システムを使用することについて説明する。
【００４７】
以下は、単なる例として提供され、概念を説明するか、実験データを介して概念実証（proof-of-concept）を提供する。当業者であれば、これらの実施例は限定的ではなく、特許請求の範囲内に入る用途および構造の一部を例示するのに役立つのみであることを理解するであろう。
【００４８】
［磁気浮上（ｉ−ＬＥＶ）と携帯電話イメージングの統合］
血液または他のタイプの試料を画像化および分析するための携帯式のセットアップを提供するために、任意の場所で容易に組み立てることができる構成要素を提供する磁気浮上ベースの診断システムが本明細書に開示される。
【００４９】
これは携帯式で堅牢で安価で使いやすい、疾患の診断と予後をモニタリングするプラットフォームで、臨床現場や家庭の設定を含めた生活の場で健康情報を共有する。近年のデジタル医療技術の進歩により、早期診断、薬物治療、および個人化医療が改善された。高解像度カメラと高いデータ処理能力を備えたスマートフォンは、診断装置と統合すると、興味深い生物医学的応用が可能になる。さらに、これらの装置は、精密医学のために、特に鎌状赤血球貧血、サラセミアおよび慢性疲労症候群などの希少な疾患に罹患している患者を診断し継続的にモニタリングするために、携帯式で、迅速で、無標識で、使いやすく、手頃な価格の生物医学装置が特に必要とされる、供給源の限られた設定において、公衆衛生に貢献する計り知れない可能性を有する。
【００５０】
ここでは、異なる細胞種（例えば、白血球および赤血球）または部分の型が磁気勾配で浮上し、それらの固有の密度のために分離される磁気浮上ベースの診断システムが提示される。さらに、使いやすいスマートフォン統合の浮上システムを導入し、細胞分析や部分分析を行う。この携帯式イメージング磁気浮上システム（本明細書でｉ−ＬＥＶという名称で呼んでいるものの例）を使用して、白血球および赤血球を同定することができ、いずれの標識をも使用せずに細胞数を定量化できることが示されている。さらに、ｉ−ＬＥＶで浮上した細胞は、単細胞の分解能で区別することができ、潜在的に診断とモニタリングを可能にするだけでなく、臨床や研究の応用も可能にする。
【００５１】
ｉ−ＬＥＶでは、指を穿刺して血液試料を収集することができ、血液はシステムのキャピラリー内で浮上する。その後、システム内で受信されたスマートフォンは、画像を取り込んで血液を分析することができる。セットアップには、様々なアプリケーションに対応するためのいくつかの構成要素が含まれている。
【００５２】
迅速な診断ツールは、臨床および獣医学、ならびに食品の安全性など、複数の分野で使用されている。ポイントオブケア（ＰＯＣ）装置により、安価で、迅速で、携帯式で、無標識で、アクセスしやすく、使いやすい診断ソリューションが可能になる。さらに、コンプライアンスおよび疾患の進行をモニタするためにＰＯＣ装置を適用することができる。しかし、大部分のシステムは、広範な試料の調製および標識ステップが必要となり、その使用を制限する。精密医学は、遺伝子データに基づいて患者のプロフィールに対する治療を調整する。より効率的な薬物の開発と早期診断の改善を達成するために、研究機関や製薬会社によって細胞分析と分子分析がますます行われている。この点で、高解像度カメラ、高速コンピューティングパワー、グラフィックプロセッサ、データストレージ、および接続キャパシティを備えたスマートフォンは、遠隔医療およびＰＯＣ診断を含む様々な医療のプラットフォームに使用されている。
【００５３】
一例として、赤血球（ＲＢＣ）および白血球（ＷＢＣ）の計数は、病理検査室で評価される診断パラメータである。現在、血球の計数および分類には、血球計数、コールター計数法またはフローサイトメトリー法が最も広く用いられている方法である。表１において、ｉ−ＬＥＶ装置を、これらの確立された方法と比較している。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
コールター計数法およびフローサイトメトリー法が複雑かつ高価であるのに対し、血球計数は、安価であるが、労働集約的であり、時間がかかり、ＰＯＣ試験には実用的ではない。最近開発された方法は、感度が高く堅牢な技術を適用することによって当分野を進歩させてきた。しかし、安価で正確な血球計数器はＰＯＣ治療にはまだ欠いている。
【００５６】
近年、磁気浮上原理は、細胞および細胞事象をモニタし、生物学的に特性評価するために使用されてきた。以前の研究で、浮上用プラットフォームを用いて、サブミクロンレベルまで様々なサイズの異なる細胞型を特有の高さに整列させることができることが示されている。ここでは、例えば、標識を使用せずに血球を同定および定量する、スマートフォンベースの磁気浮上システムが開示されている。このシステムは、高磁場での血液バンドの幅を分析することにより、全血試料中のＲＢＣおよびＷＢＣ数を評価する。以前は、標識なしで血球を分離することは、臨床診断において重要な難題を提起していた。開示のシステムを使用して、ＲＢＣおよびＷＢＣは、その独自の密度シグネチャのために分離することができる。ｉ−ＬＥＶ装置は、血球計数のための使いやすくアクセスしやすいＰＯＣソリューションで、疾患の進行や薬物の有効性を家庭内でモニタするのに使用できる。
【実施例】
【００５７】
［実施例１］
［ｉ−ＬＥＶの構築と設計］
磁気浮上ベースの診断システムの実験的セットアップは、以下の通り、図１Ｃに示すような１つの形態のｉ−ＬＥＶシステムを構築し、使用するためのものである。図１Ｃに示すように、１６０ｍｍ、１００ｍｍ、２０５ｍｍの寸法を有するｉ−ＬＥＶシステムを組み立てるために、レーザカッター（ＶＬＳ  ２．３０  Ｖｅｒｓａ  Ｌａｓｅｒ）で切断した厚さ３ｍｍのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）片を使用した。３ｍｍのステップの付いたねじは、様々な用途での挿入部品に対応するように設計されている。ｉ−ＬＥＶシステムの最上層は、図１１の最上段で見てとれるように、異なるブランドのスマートフォンと互換性のあるいくつかの異なるバージョンを有する。広範囲の光学系と光源を必要としない簡単な実験のために、セットアップの高さを半分にすることができる。フルサイズのｉ−ＬＥＶシステムは、広帯域ＬＥＤ、ならびに励起および発光フィルタを挿入することにより、蛍光イメージング用ハードウェアに対応できる。マイクロキャピラリーチャネル（断面１ｍｍ×１ｍｍ、長さ５０ｍｍ、壁厚０．２ｍｍ）、Ｎ５２グレードネオジム磁石（ＮｄＦｅＢ）（長さ５０ｍｍ、幅２ｍｍ、高さ５ｍｍ）、およびサイドミラーを、図１Ｂに示すような磁気浮上装置を構築するために使用する。
【００５８】
図１Ｃに最もよく見られるように、浮上装置は、レンズアダプタを含むことができるスマートフォンの３ｃｍ下に置く。自動焦点機能を備えた電話では、試料を上下に動かす必要なく焦点面を調整できる。各別個の測定の前に、血漿を１００Ｗ、０．５Ｔｏｒｒで３分間処理した後に、マイクロキャピラリーチャネルを磁石の間に配置する。磁石が直接入射光を遮断するので、２つのミラーを４５°に配置して、浮上チャネルを通るように光を通過させた。チャネルの照明は、スマートフォンのカメラと位置合わせする。
【００５９】
試料の測定が行われた。ＲＢＣ、ＷＢＣおよびポリエチレンビーズを、様々な濃度の常磁性培地（３０ｍＭ、６０ｍＭおよび９０ｍＭのＧｄ＋）を含むＰＢＳ中で添加した。試料３０μＬをマイクロキャピラリーにピペットで入れ、チャネルをＣｒｉｔｏｓｅａｌ（商標）で密封した。試料はシステム内で試料自体の平衡高さに達するまで３０分間浮上させた。図３Ａおよび図３Ｂに示すように、較正測定を実施して安定化時間を定量化した。細胞およびビーズの幅および高さを画像化し、ｉｍａｇｅＪを用いて分析した。
【００６０】
赤血球（ＲＢＣ）の浮上は、以下の通りであった。健康なドナーから得た血液試料を、スタンフォード大学の血液センターから受け取った。全血を、３０ｍＭのＧｄ＋を含むＰＢＳ中で様々な比率で希釈した。濃度を結果に記載した。血液安定化時間を測定するために、４５０および９０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度の血液を用いた。血液バンドの幅および細胞の濃度を相関させるために、２５０〜０．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの様々な濃度の血液を使用した。
【００６１】
白血球（ＷＢＣ）の浮上は、以下の通りであった。全血をＲＢＣ溶解緩衝液と１：１０の比で混合した。ＲＢＣをインキュベーションの５分後に溶解し、血液試料を１，５００ｒｐｍで３分間懸濁させた。得られたＷＢＣペレットをＰＢＳに再懸濁した。１〜５×１０６ＷＢＣ／ｍＬの漸増濃度を用いて、ＷＢＣ浮上バンドの幅を細胞の濃度と相関させた。
【００６２】
生きている白血球で実験を行った。ＷＢＣを抗ＣＤ４５抗体結合ＦＩＴＣ（１：２０  ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で３０分間標識した。次いで、ＷＢＣをＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。このプロセスの終わりに、生きているＷＢＣおよびｌｘ  ＲＢＣを３０ｍＭのＧｄ＋を含むＰＢＳ中で１，５００ｒｐｍで３分間懸濁させた（５０：５０）。細胞を３０分間浮上させ、画像化した。
【００６３】
死んでいる白血球で実験を行った。ＲＢＣ溶解後、凍結保護剤を含まないＰＢＳ中で、ＷＢＣを−８０℃で一晩凍結させて、ＷＢＣを死滅させた。一晩インキュベートした後、死んでいるＷＢＣ細胞を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）（１：１，０００  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１５分間室温で染色した。染色後、死んでいるＷＢＣをＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。最後に、死んでいるＷＢＣおよび１．０００ｘＲＢＣを混合し、３０ｍＭのＧｄ＋を含むＰＢＳ中で１，５００ｒｐｍで３分間懸濁させた（５０：５０）。細胞を３０分間浮上させ、画像化した。
【００６４】
画像解析を行った。ＩｍａｇｅＪを使用して、ＲＢＷの段階的な画像分析を行った。簡単に言えば、スマートフォンで撮影した画像をＩｍａｇｅＪにアップロードした。その後、浮上した血液バンドを切り取り、バックグラウンドを差し引いた。画像は１６ビットに変換され、閾値は「Ｄｅｆａｕｌｔ−ＢＷ」設定に調整された。面積、重心、および境界の矩形を測定した。測定された面積を境界の矩形で割り、血液バンドの高さの平均を得た。画像分析の各ステップについては、補足情報でさらに詳しく説明している。
【００６５】
図１に示されている携帯式磁気浮上ベースのイメージングプラットフォームは、ｉ．システムの構成要素を据え付けるためのいくつかのねじを備えたフロントパネル、ｉｉ．スマートフォンの真後ろに配置され、カメラに画像をフォーカスするレンズ、ｉｉｉ．浮上した血球のバンド幅を画像化するために、レンズの真下に配置された、キャピラリーを有する浮上装置、およびｉｖ．画像を改良するための単純なＬＥＤ光源やＮＤフィルタなどの追加の構成要素を含む、いくつかの構成要素を有する。フロントパネルには、外光を遮るスライドインドアがある。セットアップは、レーザカッターで準備したポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）構成要素を使用して設計された。浮上装置は、磁石、ミラー、チャネルでできている。２つの永久磁石（長さ５０ｍｍ、幅２ｍｍ、高さ５ｍｍ）が、同極が向き合う向きに設定されている。キャピラリーチャネル（長さ５０ｍｍ、断面１ｍｍ×１ｍｍ、壁厚０．２ｍｍ）を磁石の間に挿入することができる。浮上チャネルを照らし、観察するために、サイドミラーが使用される。浮力と磁力が等しい位置では、常磁性媒質（この例ではガダビスト）に添加された試料が媒体内で浮上する。試料の浮上した高さは、式１に基づいて計算する。
【００６６】
【数１】
2019502896.tif 000004
【００６７】
式の第１部分は粒子に加えられる磁力を表し、第２部分は浮力を表す。磁気誘導、重力加速度、細胞と培地の体積密度の差、および自由空間の透過性を、それぞれＢ、ｇ、ρおよびμｏで表している。試料は、質量と体積とは無関係に、主に密度に基づいて独自の高さで浮上する。異なる試料の種を分離するｉ−ＬＥＶシステムの可能性を実証するために、ＲＢＣおよびＷＢＣを５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの等しい濃度で混合し、図２Ａに示すようにそれらの異なる浮上特性に従って分離した。また、図２Ｂ〜図２Ｄに示すように、異なる高さで浮上した細胞のタイプを確認するために、同じ試料を、通常の顕微鏡法を用いて画像化した。ＣＤ４５で標識されたＷＢＣの重複した画像、およびＲＢＣとＷＢＣの混合した試料の明視野画像は、図２Ａ〜図２Ｄに示すようにｉ−ＬＥＶの結果を明確に立証した。さらに、ＷＢＣおよびＲＢＣを用いて生死アッセイを行った。最初に、ＷＢＣを染色し、一晩冷凍した。次いで、これらの死細胞を等濃度でＲＢＣ試料に添加した。ｉ−ＬＥＶシステムは、チャネルの中央に浮上したＲＢＣのみを示し、一方、図２Ｅに示すように、死んでいるＷＢＣは下部に集まった。結果を確認するために、死んでいるＷＢＣをＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡でそれらを視覚化した。図２Ｆに見られるＷＢＣと図２Ｇに見られるＤＡＰＩ染色されたＷＢＣの重複した明視野画像は、図２Ｆ〜２Ｈに示されるように生死アッセイの結果を確認した。
【００６８】
次に、図５に示すように、ＲＢＣおよびＷＢＣ混合物を浮上させ、２つの他のガドリニウム（Ｇｄ＋）濃度を利用して分離して、細胞分離実験に最適なＧｄ＋の濃度を同定した。Ｇｄ＋の濃度が増加するにつれ（例えば、６０および９０ｍＭから）、浮上の高さが上昇し、バンドを互いに区別することが困難になった。この結果は、キャピラリー壁から適切な距離に細胞を保つ間、この濃度が最適な浮上を可能にするので、この例示的実験における理想的なＧｄ＋の濃度は約３０ｍＭであることを示している。この状態では、結果として生じるバンドは区別しやすい。
【００６９】
次いで、ｉ−ＬＥＶを用いて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に添加されたＲＢＣを定量した。平衡時間を評価するために、最初に異なる時点で較正測定を実施した。最終濃度４５０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬでＰＢＳに添加した全血試料を３０分間浮上させた。浮上の間３分毎に試料を画像化し、図３Ａに示すように約１５分後に細胞が独自の浮上の高さで平衡化したことを実証した。異なる濃度で安定化時間を検証するために、９０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの血液を用いた実験を行った。安定化曲線の指数関数的な時定数は、４５０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬでは５．８分、９０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬでは３．３分であった。図３Ｂにさらに示すように、血球濃度対時間曲線は、曲線に対する平衡時間が再び１５分間であったことを示す。血球の濃度が高いほど平衡化に時間がかかった。異なる濃度での血液バンド幅の変化を評価するために、さらなる検証実験を行った。２５０、１２５、６３、５０、２５および０．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で、ｉ−ＬＥＶシステムで、ＲＢＣを画像化した。血球計数器を用いて各試料を定量し、算出された血球数を確認した。細胞の濃度を評価するために、血液の総面積を照射領域の幅で割ることによって、チャネルにわたる浮上した血液バンドの幅を測定した。より高い濃度（５０〜２５０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、濃度に対する血液の幅の曲線は直線的であり、１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬあたり０．６マイクロメーターの傾きを有していた。しかし、細胞の濃度が減少するにつれて（例えば、０．８〜２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、図３Ｄに見られるように、曲線は直線性を失った。５０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを超える血球の濃度について、浮上中の血液バンドの幅が細胞の濃度と相関することが認められた。また、ＷＢＣを１〜５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲の様々な濃度で画像化し、図３Ｅ〜３Ｆに示すように血液バンドの幅に対して濃度をプロットした。ＷＢＣ濃度はまた、線形の様式で血液バンドの幅と相関した。
【００７０】
ｉ−ＬＥＶプラットフォームを使用して、いかなる標識をも使用せずに単一細胞を検出した。ＲＢＣ濃度を１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下に希釈した後、照射領域の個々の細胞を、図４Ａ〜図４Ｂに示す単純な画像処理ツールを用いて定量した。最後に、ポリエチレンビーズをキャピラリー内で浮上させてプラットフォームの浮上分解能を確認し、異なる試料および細胞の密度を計算できる可能性を示した。１．０２５ｇ  ｍｌ−１、１．０３１ｇ  ｍｌ−１、１．０４４ｇ  ｍｌ−１または１．０６４ｇ  ｍｌ−１の密度を有する直径１０〜１００μｍの様々なサイズを有するビーズは、図４Ｃに示すように３０ｍＭのＧｄ＋において明確な浮上の高さを示した。図４Ｄに示すように、１．０６４ｇ  ｍＬ−１の密度を有するビーズは、異なるＧｄ＋の濃度（１０ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭ）で異なる浮上の高さを有することも認められた。
【００７１】
以前の研究は、異なる磁気浮上システムのためのいくつかの関連する生物学的応用を導入した。ここでは、磁気浮上とスマートフォン装置を組み合わせた新規のプラットフォームを表すｉ−ＬＥＶを提示する。ｉ−ＬＥＶシステムは、血球数を確実に分析し、個々の細胞を検出することもできる。それはスマートフォンの可用性を活用して医療ニーズに対応し、未処理の全血からＲＢＣとＷＢＣを計数する、迅速で携帯式で、使いやすく、手頃な価格のプラットフォームである。現在の技術水準では、血液処理は臨床的な処置であり、訓練された専門家だけでなく、広範な材料および装置を必要とする。したがって、血液処理はＰＯＣ設定には現在実装できない。しかし、開示のシステムは、家庭に由来する血液分析を実現し、疾患の診断およびモニタリングを容易にすることができる。
【００７２】
セットアップは、図１Ｃに見られるように、蛍光ＬＥＤ、レンズ、励起フィルタおよび発光フィルタを挿入するためのいくつかのスロットを有するので、ｉ−ＬＥＶ装置は、蛍光イメージングを行うこともできる。現在のプラットフォームは静的であるが、動的な流動実験を可能にし、キャピラリー内で分離された特定の細胞型に与える薬物のリアルタイムの効果をモニタするよう拡張することができる。このシステムのさらなる応用は、特に供給源が制約された環境において、例えば循環する血球または鎌状赤血球疾患をモニタするための高度な検査を含むことができる。スマートフォンに統合された浮上システムは、スマートフォンが世界中で広く使用されているため、大規模な集団に簡単な血液検査を提供することができる。全世界で約５０億人が携帯電話を使用していると推定されている。この点で、ｉ−ＬＥＶなどのスマートフォン統合医療技術は、特に財政源および物流源が限られた開発途上国で、医療サービスにおいて重要な役割を果たす可能性がある。
【００７３】
ｉ−ＬＥＶ試験の結果は、アプリを使用して分析および評価することができ、図１４に概略的に示すように、統合されたクラウドプラットフォームを介して、医療提供者に転送することもできる。このプラットフォームが携帯式で、手頃な価格で、シンプルであることは、家庭環境や生物学的または臨床検査室での血球計数の使いやすい設定をもたらす。
【００７４】
このタイプの磁気浮上ベースの診断システムは、様々な異なるタイプの用途に使用することができる。一例として、いくつかの疾患の診断およびモニタリングのため血球計数を行うことができる。別の例として、白血球および赤血球は、鎌状赤血球貧血、サラセミアおよび慢性疲労症候群のような疾患に利用するために分離できる。さらに、この技術は、疾患の診断とモニタリングのためＰＯＣアプローチを使用して、医学的に関連性の高い問題にさらに対処するために適用することができる。例えば、ウイルスに感染した細胞は浮上特性が異なり、やはり開発途上国に特に妥当なｉ−ＬＥＶシステムのもう１つの有望な用途を代表していることが以前から示されている。
【００７５】
この装置はスマートフォンの機能を利用しており、家庭の環境や、様々な供給源の制限された環境で、携帯式であり、迅速で、無標識で、使いやすく、手頃な価格の血球計数や分析を可能にする。スマートフォン浮上装置の機能と連続的な試料のフローを組み合わせることで、供給源が制約された設定で対象の細胞を高スループットで単離できる。
【００７６】
ｉ−ＬＥＶの携帯電話ベース磁気浮上システムバージョンが、（１）薬物、代謝物、化学物質の影響をモニタすること、（２）異なる条件下の細胞のメカノバイオロジーを研究すること、および（３）胚および卵母細胞の分化を研究し、胚／卵母細胞の健康へ近づくことを含む様々な応用へ拡大できるという概念実証を示す、いくつかの追加の実施例をこれから提示する。
【００７７】
［実施例２］
［浮上装置を用いた薬物の影響のモニタリング］
ここで図７を参照するが、浮上装置を用いて薬物の効果をモニタした。浮上システムを、赤血球に与えるクロロキンと呼ばれるマラリア薬の効果を検討するために、具体的に使用した。図７Ａでは、７５ｍｇ／ｍＬのクロロキンを赤血球に添加し、その浮上をｉ−ＬＥＶ装置でモニタした。暴露する時間が長くなるにつれ、クロロキンを血液試料に添加すると赤血球の浮上した高さが低下することが分かる。図７Ｂ〜７Ｄに示すように、異なる濃度のクロロキンが全血に与える影響も画像化した。このことから、２．５および５ｍｇ／ｍＬが類似していながら、１．５および７．５ｍｇ／ｍＬが類似の効果を有することが分かる。図７Ｂおよび７Ｃ（図７Ｃは図７Ｂのグラフの一部を拡大したもの）において、１．２５、２．５、５および７．５ｍｇ／ｍＬという濃度のクロロキンを血液に加え、これらの画像の浮上した高さを分析した。図７Ｄは、図７Ｂおよび図７Ｃのプロットを生成するために分析された実際の画像を示す。図７Ｄでは、較正実験のために、毎回一定の密度のビーズを添加した。
【００７８】
ここで図８を参照すると、７．５ｍｇ／ｍＬおよび７５ｍｇ／ｍＬのクロロキンの投与に対し異なる血液試料（すなわち、異なる血液試料「試料−１」、「試料−２」および「試料−３」）の応答が示されており、後者は非常に高濃度の薬物である。見てとれるように、血液試料は、特に高投与量の処置の後、キャピラリーチャネル内の非常に低い高さで水平になる。したがって、磁気浮上システムは、異なる血液型に対する薬物の効果を迅速に見る方法を提供する。
【００７９】
さらに、図６は、携帯電話ベースの浮上システム（ｉ−ＬＥＶ）を用いた、ＲＢＣに対するクロロキンの効果のモニタリングを示す。ｉ−ＬＥＶでは、クロロキンの濃度を上げると面積が小さくなった。画像は６０分経時的に撮影された。図６Ａに示すように、クロロキン濃度１．２５ｍｇ／ｍＬおよび５ｍｇ／ｍＬを使用し、最初２４分を示している。次に、図６Ｂは、面積の分析を示すグラフである。血液の面積は、研究室で開発されたｉｍａｇｅＪスクリプトを使用して測定した。面積は細胞の生存率を示す。細胞が経時的にアポトーシスを起こすにつれて、面積は小さくなる。図６Ｃを見ると、同じスクリプトを使用して浮上の高さが測定される。高さは細胞の密度と直接相関する。薬物濃度が高いほど、５０分以内の血液の密度が高くなる。
【００８０】
［実施例３］
［浮上システムを用いたメカノバイオロジー研究］
図９は、メカノバイオロジー研究における浮上システムの使用を示す。図９Ａにおいて、乳癌細胞を異なるコラーゲンゲルに入れた。コラーゲン濃度の２０％および４０％をこの研究で使用した。この場合、オーバーレイされた画像は詳細を伝えることができない。しかし、図９Ｂ（および図９Ｃに提供された図９Ｂのズームされた詳細）では、濃度のプロットがより詳細を提示し、サドルの差異を把握することを可能にする。したがって、ｉ−ＬＥＶ装置は、老化および幹細胞の分化を含む細胞力学研究に使用することができる。
【００８１】
［実施例４］
［胚分化研究および胚の健康の評価］
ここで図１０を参照すると、浮上システムが、胚の分化を研究し、胚の健康に近づくために使用されていることが示されている。胚の混合する集団を、異なる日に浮上した。各胚の密度は経時的に減少した。したがって、このシステムは、異なる高さで浮上している健康な胚をモニタし、理解するために適用することができる。
【００８２】
［実施例５］
［ｉ−ＬＥＶの設計の更新］
図１３は、携帯電話ベースのイメージングのためのｉ−ＬＥＶ装置のさらに別の更新された設計を示す。図１３において、設計は、ミラーなしで示され、図１、図１１、および図１２に見られる以前のバージョンよりもコンパクトである。磁気浮上ベースの診断システムは、多くの物理的形態を取得することができることが理解されよう。
【００８３】
［高スループットの磁気浮上細胞分離］
高スループットの磁気浮上細胞選別のためのプラットフォームの設計および原理は、図１５Ａおよび図１５Ｂに概略的に示されている。プラットフォームは上から下（上部／中間部／下部）に構成された３組の注入口と排出口に接続されたマイクロチャネルを含み、単一のネオジム磁石がマイクロチャネルの下部基板の下に置かれる。微小流体装置は、３つの異なるポリカーボネート層を組み立てることによって製造され、その各々は、レーザ機械加工によって形成されたマイクロチャネル切断を組み込んで、両面に接着剤を用いて形成される。チップの組み立て後、チュービング（Ｔｙｇｏｎ（登録商標）マイクロボアチューブ、０．０１０）を入口ポートと出口ポートに接続し、続いて２つのＰＭＭＡホルダーを使用して磁石を配置する。常磁性ガドリニウム（Ｇｄ＋）で添加された血液試料を、一定の流速でシリンジポンプを用いて下部注入口を通してプラットフォームに連続的に導入し、Ｇｄ＋を含む緩衝液を上部注入口および中間部注入口に別々に注入する。
【００８４】
磁気の効果がなければ、粒子は、微小流体流の層流特性のために、拡散によってのみ３つの異なる流体流の間を移動することができる。磁場をマイクロチャネル全体に加えると、細胞または他の部分と周囲の常磁性培地との間の磁化率の差により、細胞がより高い磁場強度の部位（すなわち、磁石の近く）からより低い部位（すなわち、磁石から離れた所）に移動する。例えば、癌細胞は血球よりも固有の密度が低く、大きさが大きいため、ＣＴＣは他の血球よりも速く浮上し、結果的にＣＴＣを上部の流体流に移動させ、その後の下流分析のために別々に収集することができる。
【００８５】
［実施例６］
［試験ビーズの密度分離］
分離のためのシステムを検証するために、ここで図１６に移ると、異なる密度（緑色＝１．０３１ｇ／ｍｌ（上段）および赤色＝１．０８９ｇ／ｍｌ（下段））を有する２種類のビーズ間の分離について、プラットフォームを検証した。試料混合物は、図１６Ａでは処理および収集前が示され、図１６Ｂでは、磁気浮上ベースの細胞イメージングセットアップでの処理後が上部／中間部／下部出口において示される。大部分の緑色ビーズは上部の液体流から収集されたが、ほとんどの赤色ビーズは下部収集物で認められ、プラットフォームが密度により粒子を分離できることを実証した。
【００８６】
［実施例７］
［乳癌細胞の密度分離］
より実用的な適用を検証するために、次に図１７に移ると、２０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度の乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を添加した１０倍希釈血液試料を用いてプラットフォームを検証した。図１７Ａは、処理および収集前の試料を示し、図１７Ｂは、処理後の上部／中間部／下部出口からの収集物をそれぞれ磁気浮上ベースの細胞イメージングセットアップに導入したものを示す。ほとんどの癌細胞は、処理後に他の血球が枯渇した上部の流体流から集められ、抗体または追加の標識を使用せずに血液から癌細胞を単離したことを実証した。
【００８７】
［実施例８］
［代替の２つの磁石の設計］
１つの代替の設計では、第１の微小流体プラットフォームは、１つの入口および２つの出口に接続された薄膜によって出口近くで２つ（すなわち、上部チャネルおよび下部チャネル）に分割された長い直線チャネルを組み込むことができる。この装置は、磁気浮上の原理を利用して、常磁性培地中のそれらの固有の密度に基づいて細胞を分離する。装置製造のために、ポリカーボネートシートをレーザカッターを用いて最初に切断し、両面接着テープを用いて組み立てた。作製された微小流体チップは、それぞれ２００μｍおよび７００μｍの高さの下部チャネルおよび上部チャネルを備えている。第１の微小流体設計は、出口近くの薄膜によって２つ（上部および下部チャネル）に分割され、それぞれ出口に各々接続された長い直線チャネルを組み込んでいる。２つの永久磁石ＮｄＦｅＢが、チャネルの上部と下部にそれぞれ配置され、同極が互いに向き合っている。磁気浮上ベースの高スループット血球選別装置用のそのような設計は、例えば一対の磁石を含み、図１８に見出すことができる。
【００８８】
［実施例９］
［血漿血液分析］
ここで図１９に移ると、図１８に示すような装置における血漿血液分析が示されている。ここで図１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃを参照すると、５、１０、２０ｕＬ／分の流速で血球の選別が認められ、血球は上部チャネルで回収されなかった。一方、３０および５０ｕＬ／分のようなより高速の流速では、血球はまた上部チャネルで回収されたので、血球選別は見出されなかった。より高速の流速での持続時間が不十分であるため、血球は浮上せず、細胞が両方のチャネル上を流れる均質な層に分離されている。したがって、試験が実施された例示的なシステムでは、２０μＬ／分が血球選別のための最適な流速として選択される。図１９Ｄにおいて、上部チャネルから収集され、遠心分離によって分離された血漿と比較する血漿の総タンパク質の分析をし、上部チャネルを形成する血漿のタンパク質の濃度が、従来の遠心分離法で見られるように、回復することが見出された。最適化された条件下で、開発された高スループットのＭａｇＬｅｖベースの装置（すなわち、前述の選別装置）は、血球を効率的に選別すると結論づけられる。
【００８９】
［実施例１０］
［蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析］
ここで図２０を参照すると、Ｍａｇｌｅｖベースの高スループット血球選別装置の血漿分離効率を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によって評価した。最初に、Ｍａｇｌｅｖ装置によって分離された全血および血球を、ＣＤ４５  Ａｌｅｘａ４８８およびＣＤ３６  ＦＩＴＣ抗体で染色し、ＦＡＣＳ分析に供した。図２０Ａに示すように、全血中にＲＢＣおよびＷＢＣの両方が認められ、図２０Ｂに示すように、Ｍａｇｌｅｖ装置の下部チャネルから血球が分離されたのに対して、図２０Ｃに示すように、装置の上部チャネルでは、血球は認められなかった。得られた結果は、最適化された条件下で、開発されたＭａｇｌｅｖ装置が全血から血球および血漿を分離することができるということにさらに適合する。
【００９０】
［実施例１１］
［全血からの赤血球および白血球の分離］
ここで図２１に移ると、希少な細胞の密度がＷＢＣと相対的に同等であるかそれより高いことから、開発されたＭａｇｌｅｖ装置を用いて、ＲＢＣおよびＷＢＣを全血から分離して、全血から希少な細胞を単離できるということを示している。血球を分離するために、図２１Ａに示すように、下部チャネルの高さを１００μｍに減少させ、下部チャネルと上部チャネルとの間に仕切りを組み立てた。浮上すると、すべてのＲＢＣは、下部チャネルを通って流れ、１００μｍ未満の高さに浮上し、図２１Ｂに示すように、それらは上部チャネルには見られなかった。図２１Ｃはまた、約７０％のＷＢＣが上部チャネルから収集されたことを示しており、これは、ＷＢＣの大部分が、上部チャネルを通って流れる１００μｍ以上の高さで浮上しているためである可能性がある。得られた結果は、開発された高スループットのＭａｇＬｅｖ装置が、全血および腫瘍からＣＴＣおよび胎児赤血球などの希少な細胞を単離することができることを証明した。
【００９１】
［実施例１２］
［血液中の癌細胞の選別］
細胞型の混合物がチャネルに沿って流れるとき、２つの永久磁石によって生成される磁場勾配により、個々の細胞型は、細胞の密度によって決定されるチャネル内の独特な垂直位置に分離される。例えば、癌細胞は、それらの大きな固有の密度差のために、複合的な混合物（すなわち、血液）から容易に分離することができる。開示の微小流体設計では、典型的には血球の上を浮上するＣＴＣ／ＣＴＭを、上部チャネルから収集することができる。最初に、血漿分離のためのプラットフォームを検証した。このプラットフォームでは、３０ｍＭのＧｄ３＋を含む全血試料を２０μＬ／分の一定の流速でチャネルに流す。磁場の下では、細胞は高磁気誘導から低磁気誘導に移動し、密度シグネチャに従ってチャネルの特定の高さで浮上する。高密度のために、血球ＲＢＣおよびＷＢＣは分流器の下方に流され、下部出口で収集され、一方、血漿は上部チャネル出口から上方に流れ、収集された。同様に、下部チャネルの高さを１００μｍに減少させることによって、ＷＢＣを分離して上部チャネルから回収した。これは、同様にこの装置がＣＴＣを全血試料から分離することができる可能性を示している。
【００９２】
［実施例１３］
［磁場を用いた細胞分離／ブロッキング］
ここで図２２に移ると、このプラットフォームの第３の設計および原理が概略図に示されている。現在のＭａｇｌｅｖベースの血漿分離は、高濃度の磁性媒体での高磁場誘導細胞ブロッキングの原理を用いる。血液試料がチャネルに流入している間、常磁性媒質中で高い磁気誘導を生成する磁石の縁の高磁場のために、細胞は低誘導部位に移動し、入口チャンバに積み重なる。微小流体チャネルは、高さ１ｍｍ、長さ５０ｍｍおよび幅４ｍｍという特徴で、１つの入口および出口に接続された長い直線チャネルであってもよい。提示された微小流体血漿分離装置は、単純な微細加工を用いて製造される。それは、ポリカーボネートシートを用い、所望のチャネル特徴についてレーザカッターで切断し、両面接着テープを用いて組み立てるものである。２つの永久ネオジム磁石が、同極が互いに向き合うように、チャネルの上部と下部に配置される。血漿分離実験のために、常磁性媒質ガドリニウム（Ｇｄ３＋）添加血液試料を一定流速のシリンジポンプを用いて注入口に流入させる。磁気の縁部の近くの高い磁気誘導のために、細胞はブロックされ、入口チャンバに戻って積み重なり、血漿のみチャネル内に入ることになり、出口で収集される。
【００９３】
図２３では、高磁気誘導の誘導された細胞ブロッキングベースの血漿分離装置を、側面図（図２３Ａ）および上面図（図２３Ｂ）に示す。図２４および２５は、血液試料からの効率的な血漿分離のための常磁性培地Ｇｄ３＋濃度の最適化を示す。図２５Ａは、細胞ブロッキングベースの血漿分離装置（すなわち、ＭａｇＬｅｖ）に充填された血液を示し、図２４は、ブロッキングを示す詳細な図面であり、図２５Ｂは、出口での血漿の収集を示す（下記の実験によれば一定の流速、２０μＬ／分で流れる１００ｍＭのＧｄ３＋添加ＰＢＳ１０倍希釈血液試料から）。
【００９４】
この実験では、５０ｍＭのＧｄ３＋（図２３Ａ）および１００ｍＭのＧｄ３＋（図２３Ｂ）添加ＰＢＳ１０倍希釈全血を、図２２の装置により一定速度、２０μＬ／分で流した。図２４に示すように、磁気反発力は、Ｇａ３＋の濃度が増加するにつれて増加し、低濃度の５０ｍＭのＧｄ３＋と比較して効果的に細胞をブロックする高い磁気誘導を生成する。
【００９５】
［磁気シグネチャと微小重力のシミュレーションに基づく多細胞３Ｄ集合体］
磁気浮上を利用して、形状の制御された多細胞の３Ｄの細胞の集合体を、迅速に作製することができる。この方法は、インビボ細胞−細胞および細胞−ＥＣＭの相互作用および組織を模倣することができる細胞培養条件を提供することによって、従来の２Ｄ組織培養を超える可能性がある。他の方法と比較して、本明細書に記載される磁気浮上方法は、人工の足場または磁気浮上粒子（浮上用）を必要としない。組み立てられた細胞凝集物は、組織工学、疾患モデリング、薬物スクリーニングおよび細胞／組織生物学研究に使用することができる。
【００９６】
とりわけ、このシステムは、高価で複雑な研究装置を使用することなく、微小重力が空間用途の細胞生物学にどのように影響するかを研究する研究を可能にする可能性がある。それは、微小重力条件下での細胞のゲノム解析、転写型解析、およびプロテオーム解析を可能にし得る。
【００９７】
とりわけ、この方法は、磁気／密度特性、および画像化／分子プロファイリングの両方を利用した選別、回収および特性評価を可能にする。装置内で磁気的に分離された細胞は、磁場の非存在下ではあるが、磁気／密度選別を失うことなく、ライブおよび非ライブイメージング方法（例えば、透過光、蛍光顕微鏡、免疫染色）の両方で除去および特性評価することができる。さらに、対象の細胞は、イメージング方法に応じて、浮上装置からの分析（例えば、ゲノム解析、転写型解析、およびプロテオーム解析）またはさらなる培養のために、選択的に回収することができる。この方法は、細胞／組織生物学の研究に広く使用することができる。この方法は、細胞とは異なる対象物にも適用可能であることも想定されている。
【００９８】
［実施例１４］
［スフェロイド集合方法］
図２６は、スフェロイド集合体の方法を示す。図２６Ａおよび図２６Ｂを参照すると、磁気誘導（Ｂ）および重力（ｇ）のおかげで細胞が浮上し、磁力（Ｆｍａｇ）および浮力（Ｆｂ）が互いに平衡する平衡面に集束される。培地の磁気感受性（χｍ）は、細胞の磁化率（χｃ）よりも大きい。図２６Ａおよび図２６Ｂの０日目の画像と２日目の画像との間で比較して図示しているように、浮上中に、細胞は経時的に安定的な球状凝集物に自己集合する。図２６Ｃは、種々の細胞型ＮＩＨ−３Ｔ３、ＧＦＰヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ−ＨＵＶＥＣ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の画像を提示する。細胞の濃度は細胞培地で５０ｍＭのＧｄ＋で５０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。白いスケールバーは１００μｍである。
【００９９】
［実施例１５］
［磁気シグネチャに基づく多細胞３Ｄ集合体の第２の例］
図２７は、磁気シグネチャに基づく多細胞３Ｄ集合体の別の方法を示す。Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ  ＩＩポリスチレンマイクロキャリアを図２７Ａに示すように５０ｍＭのガドリニウム濃度で浮上させた。図２７Ｂは、１０分後のポリスチレンマイクロキャリアと３Ｔ３  ＮＩＨ細胞との共浮上の画像を示し、図２７Ｃは、３日後のそれを示す。図２７Ｄに示すように、２５０〜３００μｍのポリマーストランドを１００ｍＭのガドリニウム濃度で浮上装置に挿入した。図２７Ｅの画像は、１０分後のポリマーストランドおよびＧＦＰ−ＨＵＶＥＣ細胞の共浮上を示し、図２７Ｆの画像は、７５ｍＭのガドリニウム濃度での１日後のそれを示す。これらの画像すべてにおいて、スケールバーは２００μｍである。
【０１００】
［実施例１６］
［磁気浮上に基づく細胞の選別、回収および特性評価のための方法］
ここで図２８を参照すると、磁気浮上に基づく細胞の選別、回収および特性評価の方法が示されている。この方法の図解が図２８Ａに示されている。細胞（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３）は、アガロースゲル中で浮上し、次いで、図２８Ｂに示されるように、穏やかな流れの窒素ガスのキャピラリーから固化／十字形のゲルが除去される。除去後、対象の細胞を、図２８Ｃに示すように、切断、打ち抜き、およびレーザキャプチャーマイクロダイセクションにより単離することができる。ゲルはまた、固定され、免疫染色され得る。結果は、図２８Ｄに示すように、マウスの小脳からの浮上神経細胞画分を含むアガロース切片の免疫染色を示した。図２８Ｅに示すように、ゲル切片を融解または分解して分析すべき細胞試料に放出することができる。
【０１０１】
［実施例１７］
［スフェロイドの凝集時間研究］
図２９を参照して、凝集時間研究の画像を提示する。３Ｔ３細胞を集め、抽出し、２、４および８時間で画像化した。磁気浮上（ＬＥＶ）と垂下（ＨＤ）を比較した。８時間後、磁気浮上装置に安定的な細胞凝集物が形成された。これらの画像の白いスケールバーは２００μｍである。
【０１０２】
［実施例１８］
［細胞生存率に対するＧｄ濃度および浮上の効果］
ここで図３０を参照すると、細胞生存率に対するＧｄの濃度および浮上の効果が示されている。３Ｔ３細胞を、磁気浮上（ＬＥＶ）および垂下（ＨＤ）の間に、異なる濃度のＧｄ＋（０、２５、５０、１００ｍＭ）に４８時間暴露した。次いで、生存／死亡アッセイ（カルセイン／エチジウムホモダイマー−１）を用いてスフェロイド生存率を評価した。得られた結果は、凝集体中の細胞の大部分が生存していることを示している。白いスケールバーは１００μｍである。
【０１０３】
［実施例１９］
［スフェロイドの融合］
ここで図３１を参照すると、ＤＩＯ染色（緑色）およびＤＩＩ染色３Ｔ３（赤色）スフェロイドの融合が図３１Ａに示され、ＨＵＶＥＣ−ＧＦＰ（緑色）およびＤＩＩ染色３Ｔ３（赤色）スフェロイドの融合が図３１Ｂに示されている。スフェロイドは、磁気浮上（４８時間、５０ｍＭのＧｄ）によって予め作製され、次いで、１つの浮上装置内に一緒に挿入された。スフェロイドの相互作用を３日間モニタした。図３１Ｃにおいて、ＨＵＶＥＣ−ＧＦＰ（緑色）およびＤＩＩ染色３Ｔ３（赤色）細胞は一緒に誘導されて多細胞スフェロイドを形成する。明視野および蛍光画像が提示される。
【０１０４】
得られた結果は、浮上システムが、制御された幾何形状および細胞構成を有する多細胞スフェロイドを迅速に組み立てることができることを示す。白いスケールバーは２００ｍｍである。
【０１０５】
［実施例２０］
［３Ｔ３スフェロイドの機能試験］
ここで図３２に移ると、磁気浮上（ＬＥＶ）法および垂下（ＨＤ）法（４８時間、５０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、５０ｍＭのＧｄ＋）を用いて３Ｔ３スフェロイドを集合させた。次いで、スフェロイドを非接着性９６ウェルプレートに入れ、フィブリンゲル（２０ｍｇ／ｍｌ）内に包埋し、図３２Ａに示すように５日間培養した。毎日、スフェロイドの明視野画像を収集した。図３２Ａにおいて、スケールバーは、０〜２日目は２００μｍであり、３〜５日目は５００μｍである。図３２Ｂは、浮上後に免疫染色するスフェロイドを示し、図３２Ｃは、フィブリンゲルにおける５日後を示す。核（ＤＡＰＩ、青色）、細胞増殖（ｋｉ６７、マゼンタ）、コラーゲンＩ（赤色）分泌およびアクチンフィラメント（緑色）（色はグレースケールで描いている）。得られた結果は、組み立てられたスフェロイドが機能的であることを示す。白いスケールバーは２００μｍである。
【０１０６】
［実施例２１］
［集合体用の微小流体磁気浮上システム］
ここで図３３Ａを参照すると、スフェロイド集合体のための微小流体磁気浮上システムの概略図が提示される。提案されたシステムでは、磁気浮上中に、細胞が微小流体装置の壁の間で区画化される。したがって、複数のスフェロイド（各区画に１つ）を高スループットの様式で得ることができる。図３３Ｂは、屈曲部で形成された１つのそのようなスフェロイドを示す。１５０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞の濃度を使用した（４８時間、６０ｍＭのＧｄ＋）。図３３Ｂにおいて、スケールバーは２００ｍｍである。
【０１０７】
［これらの磁気浮上システムおよびツールの多様な追加の応用］
本明細書で説明される様々なツール、方法、およびシステムは、広範囲の応用で適用できることが企図される。これらの応用のいくつかは、本開示で提供されるツール、方法、およびシステムの様々な有用性のうちのいくつかを示すために提供される。
【０１０８】
［実施例２２］
［磁気浮上による標的細胞（すなわち、細菌、酵母、ウイルス、病原体、循環腫瘍細胞、循環上皮細胞など）の同定およびエンリッチのための磁気ビーズ戦略］
磁気マイクロ／ナノ粒子は、種特異的抗体とコンジュゲートすることができる。分子標的への抗体の結合は、標的細胞（すなわち、感染を引き起こす細菌細胞）の磁気シグネチャを変化させる。磁性粒子を有する特定のタイプの病原体を捕捉した後、その磁気シグネチャが増加して標的細胞／分子／病原体をマイクロチャネルの底に向かって沈降させる。次いで、捕捉された細胞／分子を洗い流し、さらなる分析（すなわち、抗生物質感受性分析）のためにエンリッチすることができる。
【０１０９】
［実施例２３］
［臨床試料からの高スループット細菌細胞単離および抗生物質感受性試験］
細菌細胞は、赤血球および白血球に比べて著しく密度が高い。高スループット微小流体浮上システムへの試料注入後、細菌および血球は、それらの密度シグネチャに従って浮上され、均質な層に分離される。密度が高いため、細菌細胞は異なる高さで浮上し、別の（すなわち下部）出口で収集され、赤血球および白血球は異なる高さで浮上し、他の出口から収集される。高スループット微小流体プラットフォームはまた、単離された病原体を再度利用し、同じ試料に対して反復して抗生物質感受性試験を繰り返す独自の能力を可能にする。現在の臨床アッセイでは、単離された細菌細胞の数が約１０〜１００ｃｅｌｌｓ／ｍｌであることを考慮すると、細菌を培養して増殖させる必要がある。微小流体浮上プラットフォームでは、細菌細胞を１つの抗生物質で検証し、浮上プロファイルの急激な変化を調べる。細菌集団が治療に耐性のある場合、細菌細胞をチャネルから流出させ、チャンバをＰＢＳで洗浄して残りの抗生物質溶液を除去し、同じ細菌集団を別の抗生物質候補で検証する。したがって、この能力は、非常に数の少ない病原体を将来の抗生物質感受性試験のために培養する必要性を大幅に排除する。
【０１１０】
［実施例２４］
［慢性疾患に罹患している患者の血球をプロファイルするために用いられる浮上プラットフォーム］
図３４を参照すると、浮上プラットフォームは、慢性疾患に罹患している患者の血球をプロファイルするために適用することができる。例えば、重篤に病んでいる慢性疲労症候群（ＣＦＳ）患者から得た血球（すなわち、赤血球（ＲＢＣ）および白血球（ＷＢＣ））の浮上プロファイルは、健常者のコントロールから得たＷＢＣのプロファイルとは大きく異なる。
【０１１１】
［実施例２５］
［慢性疾患に罹患している患者から得た赤血球の連続モニタおよび浮上プロファイリング］
図３５および３６は、それぞれ、慢性疾患（すなわち、慢性疲労症候群）に罹患している患者由来の赤血球および白血球の連続的なモニタリングおよび浮上プロファイリングを示す。このような継続的なモニタリングは、根本的な原因または時間経過に伴う血液プロファイルの変化を特定するのに役立つ可能性がある。
【０１１２】
［実施例２６］
［浮上装置を用いた代謝産物、化学物質の効果のスクリーニングおよびモニタリング］
図３７は、浮上装置を用いた代謝産物、化学物質の効果のスクリーニングおよびモニタリングを示す。図３７Ａは、慢性疾患（すなわち、慢性疲労症候群、癌、感染症）に罹患している患者から単離された白血球へのＡＴＰ添加の効果を研究するために使用される浮上システムを示す。図３７Ｂは、細胞生存率を示しており、生きている白血球および死んでいる白血球の数を、単一細胞の分解能でリアルタイムでそれらの浮上プロファイルに従ってモニタ、検出および計数することができる。
【０１１３】
［実施例２７］
［抗菌用途］
さらに、この磁気浮上システムは、土壌からの細菌細胞の検出、表面からの細菌細胞の携帯式で迅速な検出（すなわち、スワップ試料（swap sample））、医療機器表面の微生物または病院の管理システムの微生物のサーベイランス、栄養細菌細胞からの胞子の検出および分離などの多くの抗菌用途に適用することができるが、これらに限定されない。
【０１１４】
［実施例２８］
［細菌細胞の浮上］
図３８を参照すると、細菌細胞は、異なる生物学的培地および土壌（すなわち、ウシ胎児血清）中で浮上され、検出され得る。大腸菌（Ｄｈ５α）の一晩での培養物をＦＢＳで希釈し、１００ｍＭのＧｄ＋溶液中で浮上させた。細菌細胞は、１時間の浮上後に固有の浮上帯を形成した。
【０１１５】
［実施例２９］
［表面からの細菌細胞の迅速な検出］
図３９および図４０は、細菌細胞が表面から迅速に検出され得ることを示す。１００μｌの液体大腸菌（Ｄｈ５α）培養物をガラスのスライド上に注ぎ、その後表面をコットンスワップで洗浄した。次いで、コットンスワップをＰＢＳ中でボルテックスし、３０μｌのスワップ試料を２００ｍＭのＧｄ＋溶液中で浮上させた。細菌細胞は３０分以内に固有の浮上帯を形成した。したがって、携帯式の浮上システムを用いて表面から細菌を迅速に検出することができる。
【０１１６】
ここで図４０に移ると、細菌細胞は、高い常磁性条件下で５分以内に表面から迅速に検出され得ることが示される。１００μｌの液体大腸菌（Ｄｈ５α）培養物をガラスのスライド上に注ぎ、その後表面をコットンスワップにて洗浄した。次いで、コットンスワップをＰＢＳ中でボルテックスし、３０μｌのスワップ試料を９００ｍＭのＧｄ＋溶液中で浮上させた。細菌細胞は５分以内に固有の浮上帯を形成した。したがって、携帯式の浮上システムを用いて表面から細菌を迅速に検出することができる。
【０１１７】
［実施例３０］
［他のタイプの部分および細胞の浮上］
適切な浮上構成の条件下で、開示のシステム内で他のタイプの細胞を浮上させることができる。さらなるいくつかの例として、図４１は、磁気浮上システムにおける胞子の浮上および検出を示す（粗い点線の帯域を参照）。同様に、図４２は、栄養細菌細胞が浮上システム内で浮上され検出され得ることを示す。
【０１１８】
［実施例３１］
［磁気浮上を用いた卵母細胞の性質予測］
卵母細胞の性質は、体外受精（ＩＶＦ）のような生殖研究に応用すべく、浮上および密度プロファイルに従って予測することができる。
【０１１９】
ここで図４３を参照すると、様々な卵母細胞の浮上プロファイルが示されている。マウスから単離した卵母細胞を、異なる常磁性溶液（１０ｍＭ、１５ｍＭおよび３０ｍＭのＧｄ＋）で浮上させた。異なる段階での卵母細胞の密度は、それらの浮上プロファイルからモニタおよび計算することができる。
【０１２０】
［実施例３２］
［非感染対ＨＩＶ感染ＣＤ４  Ｔ細胞の浮上プロファイル］
磁気浮上装置はまた、ＨＩＶ非感染対感染ＣＤ４  Ｔ細胞の浮上プロファイルを研究するために使用された。１００，０００のＨＩＶ非感染および感染血液ＣＤ４  Ｔ細胞を、それぞれ３０ｍＭの常磁性溶液を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で浮上させた。試料を２０分間浮上させ、浮上プロファイルを比較した。図４４Ａおよび４４Ｂに示されるように、非感染およびＨＩＶ感染血液ＣＤ４  Ｔ細胞は、磁気浮上ベースのプラットフォームにおいて顕著に異なる浮上プロファイルを有する。
【０１２１】
比較目的のために、感染細胞に対する刺激の効果を図４５に示す。抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ２ビーズおよび抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ２抗体で刺激した１００，０００のＨＩＶ感染ＣＤ４  Ｔ細胞を、３０ｍＭの常磁性溶液を含むＰＢＳ溶液中で浮上させ、図４５Ａに各々示している（そして図４５Ｂに定量化されている）。ＨＩＶ感染血液ＣＤ４  Ｔ細胞をコントロールとして使用した。試料を２０分間浮上させ、浮上プロファイルを比較した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ２ビーズおよび抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ２抗体による刺激は、ＨＩＶ感染血液ＣＤ４  Ｔ細胞の浮上プロファイルを変化させることが示された。
【０１２２】
［実施例３３］
［微小流体高スループット磁気浮上プラットフォームの追加の設計（すなわち、針および吸引の追加）］
ここで図４６に移ると、マイクロキャピラリーチャネル、入口、マイクロキャピラリーチャネルの端部の２つ以上の針、つまりａ）チャネルの上部の１つ以上の針、ｂ）チャネルの底および収集出口にある１つ以上の針を含む微小流体浮上プラットフォーム（μＭａｇＬｅｖ）の画像が示されている。さらに、これらの針は、チャネルの３次元空間領域またはその外側のいずれの場所にも配置することができる。試料（すなわち、ビーズ、癌細胞、血液など）を注入口で混合し、次いで、様々な負圧および流速を使用して、それらの密度に従って試料を退かせることができる。低密度または低磁化率の試料は、下部の針を備えた微小流体ポンプによって退かせ、下部出口管に集めることができる。より高密度またはより高磁化率の試料は、下部の針で退かせ、下部出口管に集めることができる。磁気プラットフォームの他の設計パラメータ（例えば、磁石強度、磁石の幾何学的配置、寸法）は、したがって、迅速な処理、およびより良好な選別を可能にするようにさらに修正することができる。
【０１２３】
図４６Ａでは、２つの針がマイクロキャピラリーチャネルの末端にある。次に、図４６Ｂにおいて、流動中にビーズおよび細胞を同時に流し、選別し、退かせ、負圧によって収集することができることが示されている。図４６Ｃには、微小流体磁気浮上システムのプロトタイプの写真が示されている。
【０１２４】
ここで図４７に移ると、微小流体磁気浮上システム内の細胞の操作および収集が示されている。図４７Ａでは、より低密度またはより低磁化率の試料は、上部の針を有する微小流体ポンプによって退かせ、上部排出管にて収集できる。さらに、上部の針の吸引を下の針の吸引よりも高く維持することによって、試料を上部の収集針に退かせることができる（吸引上部の針＞吸引下部の針）。浮上した試料がどこから収集されるかを判定するために、複数の吸引口における流速を比較的に操作することができる。図４７Ｂでは、より高密度の試料を下部の針で退かせ、下部の収集針に接続された出口管に集めることができる。さらに、上部の針の吸引を下部の針の吸引よりも低く維持することによって、試料を下部の収集針に退かせることができる（吸引上部の針＜吸引下部の針）。
【０１２５】
［実施例３４］
［液滴選別および液滴シーケンシングの結果］
液滴は磁気浮上システム内で浮上し、分析および診断のための様々な異なる方法を提供することができる。液滴は、常磁性溶液を用いて、異なる溶液および界面活性剤（すなわち、ウシ胎児血清、血漿、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを含む胎仔ウシ血清、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを含む血漿）中に懸濁させることができる。生物学的部分（すなわち、細胞、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ウイルス、細菌など）を封入する液滴を選別し、分離することができる。異なるタイプの細胞を封入する液滴は、浮上プロファイルが異なる場合があり、したがって、ゲノム解析、転写型解析、プロテオーム解析、および代謝解析のためのさらなる特性評価のために選別して収集される。生細胞と死細胞を含む液滴は、浮上プロファイルが異なることがある。これは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑの応用で、死細胞と生細胞を含む液滴を分離するために使用できる。次に、生細胞のみを封入する液滴を、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑに使用することができる。この機能により、液滴シーケンシング（Droplet-Sequencing）のコストと処理時間が大幅に短縮される。
【０１２６】
最初に図４８を見ると、１５０ｍＭの常磁性溶液（すなわち、ガドリニウム）を含むウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中に液滴を浮上させる。図４９では、１５０ｍＭの常磁性溶液（すなわち、ガドリニウム）を含むウシ胎仔血清（ＦＢＳ）＋ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で液滴を浮上させている。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液は、液滴を分散させるのに役立つ。図５０では、１５０ｍＭの常磁性溶液（すなわち、ガドリニウム）を含むウシ胎仔血清（ＦＢＳ）＋ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で液滴を浮上させている。異なる生物学的部分を封入する液滴を浮上させ、選別し、分離することができる。空の液滴対、蛍光標識されたウイルス粒子を含有する液滴を、浮上させて画像化することができる。蛍光対非蛍光液滴は、浮上システム内で選別することができる。
【０１２７】
［実施例３５］
［癌研究用のデータの収集］
図５１は、化学的および無標識の磁気浮上チップを特性評価する。浮上チップは、同じ装置内の循環腫瘍細胞および循環腫瘍クラスターを同時に分離することができる。図５１Ａに示すように、カルセイン標識単一細胞（ＣＴＣ）および癌細胞の凝集体（ＣＴＭ）の存在を検証するために使用できる手順が示される。腎癌細胞の単一細胞（ＣＴＣ）および腎癌細胞のクラスター（ＣＴＭ）は、同時に分離および選別することができ、ＷＢＣを用いた添加実験において、同じ装置内で、いかなる標識をも使用せずに検出することができる。次に、図５１Ｂには、磁気的な青写真を介した血液からの癌細胞の分離効率が示されている。異なる濃度の添加された癌細胞（１００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）における効率を分析し、異なる癌細胞型（すなわち、肺癌、乳癌および腎臓癌）について比較した。分離効率は、添加された癌細胞の総数に対する血球バンドの上方に浮上した癌細胞の比率として定義される。（Ｎ＝３の独立した実験、データは平均±平均標準誤差（ＳＥＭ）として表される）。
【０１２８】
腎臓癌患者から得た血液試料をＦＢＳ中で１：２０の比率で希釈し、次いで磁気浮上装置の３０ｍＭのＧｄ＋溶液中で浮上させた。浮上の２０分後、右端の画像である図５１Ａに示されるＲＢＣおよびＷＢＣからなるバンドの上方に、ＣＴＣおよびＣＴＣのクラスター（青色の円、すなわち、右の３つの円）が浮上した。これらの推定上のＣＴＣは、マイクロキャピラリーチャネルの上部で浮上しているので、密度が非常に軽いことが認められた。
【０１２９】
図５２は、腎臓癌（腎細胞癌）患者から得た血液試料の磁気浮上プロファイリングを示す。血液試料をＦＢＳ中で１：２０の比率で希釈し、次いで３０ｍＭのＧｄ＋溶液中で浮上させた。ＣＴＣのクラスター（両方のパネルの円で囲まれた領域）は、赤血球および白血球からなるバンドの上方に浮上した。
【０１３０】
本発明を１つまたは複数の好ましい実施形態に関して説明したが、明示的に述べられた以外の多くの等価物、代替物、変形物および改変が可能であり、本発明の範囲内であることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月1日(2018.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分の変動が磁化率および／または固有の密度の差に基づく、前記部分の異種集団を分離するための浮上装置であって、磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含み、前記磁場は、前記部分の異種集団を含有する試料を受容するためのマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと相互作用する大きさにされている、装置
を含む磁気浮上ベースの診断システムであって、
前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルは、その中に前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルの部分が形成される複数の層によって画定され、前記複数の層の少なくとも１つは、前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルへの入口チャネルを提供し、少なくとも２つの複数の層は前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルから別個の出口を提供する、磁気浮上ベースの診断システム。
【請求項２】
前記複数の層は、少なくとも２つの層を含み、前記少なくとも２つの層のそれぞれは、その中に形成された各々の入口および各々の出口を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記各層の各々が、レーザ加工材料から形成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記複数の層のうちの少なくとも２つの層の間に薄膜が配置されて、上部および下部の出口を確立する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記少なくとも１つの入口および前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに、前記部分の異種集団および常磁性培地を含む試料を流すステップと、
前記部分の異種集団を含む前記試料に磁場を加えて、前記部分の異種集団の個々のメンバーと前記常磁性培地との間の磁化率および固有の密度の少なくとも１つの差に基づいて前記異種集団を分離するステップと、
その後前記試料の第１の部分を上部出口から、前記試料の第２の部分を下部出口から流し出し、それにより前記部分の異種集団の第２の群から前記部分の異種集団の第１の群を分離するステップと
を含む、請求項１に記載のシステムを用いて選別する方法。
【請求項６】
前記複数の層は、上層、中間層、および下層を含む少なくとも３つの層を含み、前記３つの層のそれぞれが、その中に形成された各々の入口および各々の出口を含み、前記少なくとも１つの入口および前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに前記試料を流すステップが、前記部分の異種集団および常磁性培地を含む前記試料を前記下部入口に、前記常磁性培地を前記上部および中央入口に導入するステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、常磁性培地と混合された血液試料であり、前記血液試料が循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または循環腫瘍クラスター／栓子（ＣＴＭ）を含み、前記ＣＴＣ／ＣＴＭが分離され、前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内の前記磁場に曝された後前記上部チャネルに流れる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
温度および架橋の少なくとも１つの助けにより、分離した部分の集団を安定化させるステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
生物学的または非生物学的部分の集団を分離するための装置を含むシステムを用いて選別する方法であって、前記装置が磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含み、前記磁場は、部分の集団を含有する試料の受容のためにマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと相互作用する大きさにされており、
前記部分の集団および常磁性培地を含む試料を入口から前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに出口に向けて流すステップと、
前記試料が前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内にある間に、前記少なくとも１つの磁石を用いて前記試料に磁場を加えるステップであって、前記磁場を加えることは、前記部分の集団のメンバーのうちの少なくとも一部、ただし全部ではないメンバーが、前記出口に向かって流れることを阻止し、それによって、前記部分の集団を分離するステップと
を含む方法。
【請求項１０】
前記部分の集団のメンバーの少なくとも一部、ただし全部ではないメンバーを阻止するステップが、高い磁気誘導のために前記磁場の磁気の縁部で生じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記部分の集団が、前記血球が前記少なくとも１つの磁石によって生成された前記磁場を通過して移動することが阻止されるが、血漿は、前記少なくとも１つの磁石により生成される前記磁場を経て前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルを通って前記出口に至るよう流れることが可能である血液試料を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
温度および架橋の少なくとも１つの助けにより、分離した部分の集団を安定化させるステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含む浮上装置を含む磁気浮上ベースの診断システムを使用する磁気シグネチャに基づいて多部分集合体を集合させる方法であって、前記少なくとも１つの磁石が部分の集団を含有する試料の受容のためにマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと近接し、
前記部分の集団および常磁性培地を含む試料を前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内に導入するステップ、および
前記試料が前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内にある間に、前記少なくとも１つの磁石を用いて前記試料に磁場を加えるステップであって、ここで前記磁場を加えることが、前記部分の集団の少なくとも一部を浮上させて、前記部分の集団が凝集して多部分集合体を形成する互いの空間的関係で前記部分の集団を配置するステップ、
を含む方法。
【請求項１４】
前記多部分集合体を形成する前記部分の集団の前記凝集が、前記磁場によって誘導された前記浮上によって確立された前記空間的関係に前記部分の集団が実質的に留まっている間に、自然発生的に持続時間にわたり生じる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記磁場が永久磁石によって生成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記磁場が電流によって誘導されるコイルによって生成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記システムが、高スループットの多部分集合体を可能にする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記部分が細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記部分がポリマーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記多部分集合体を形成する前記部分の集団の前記凝集は、温度および架橋の少なくとも１つの助けにより起こり、安定化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
画像化装置と共に使用するための磁気浮上ベースの診断システムであって、
細胞の異種集団を分離するための浮上装置であって、前記細胞の変動が磁化率の差に基づいており、磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含み、前記少なくとも１つの磁石が細胞の異種集団を含有する試料の受容のためにマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと近接している、浮上装置と、
光源と、
前記浮上装置と前記光源とを支持するフレームであって、画像化装置を支持するようさらに構成され、前記光源を前記浮上装置を介して前記画像化装置に光を透過してリアルタイムで細胞の異種集団の少なくとも一部を観察する位置で支持するフレームと
を含む、磁気浮上ベースの診断システム。
【請求項２２】
レンズをさらに備え、前記フレームが前記レンズを支持し、前記光源は、前記レンズを介して前記画像化装置に光をさらに透過させるように配置される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記画像化装置は、スマートフォン、ＣＭＯＳカメラ、およびＣＣＤカメラのうちの１つである、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記画像化装置によって収集されたデータは、ブルートゥース（登録商標）、ＷｉＦｉ、およびセルラネットワークのうちの少なくとも１つを介して送信される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記フレームによって支持される中立密度フィルタをさらに備え、前記中立密度フィルタは、前記光源と前記浮上装置との間に配置される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２６】
前記画像化装置がカメラを含み、前記フレームが、ある位置で前記画像化装置を受容して、前記カメラが前記レンズを介して伝送される画像を受容するように位置決めされる、前記フレームによって支持される画像化装置をさらに備える、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２７】
前記画像化装置が、細胞の異種集団の前記分離をリアルタイムで観察するように構成されている、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記フレームは、携帯性のために前記フレームのサイズを縮小する圧縮位置と、前記フレームが拡張される拡張位置とを有する、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２９】
前記フレームが前記拡張位置にあるとき、前記フレームは、その上面の凹部内で前記画像化装置を受容するように構成される、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記画像化装置がコンパクトであり、スマートフォン様の保護ケースカバーの中に挿入され、それによって前記画像化装置を画像化経路に連結し、前記フレーム内に前記スマートフォンの位置を確立する、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記画像化装置が前記フレームに収容されると、前記画像化装置の前記カメラが前記レンズに面し、前記画像化装置のディスプレイが、前記細胞の異種集団を含む前記試料の観察のために視認可能なままである、請求項２１に記載のシステム。
【請求項３２】
前記システムが、浮上された対象の数を計数し定量化するようにさらに構成される、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記画像化装置が、前記画像化装置を用いて白色の視野と蛍光タイプ両方の画像化を行うことができる、請求項２１に記載のシステム。
【請求項３４】
磁気浮上ベースの診断システムにおける細胞の異種集団を観察するための方法であって、
浮上装置のマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに前記細胞の集団の試料を配置するステップと、
画像化装置をフレームに配置するステップと、
前記浮上装置内の前記細胞の集団を分離するステップと、
前記浮上装置内の前記細胞の集団を分離している間、前記細胞の集団の前記分離の画像を収集するために前記画像化装置を使用するステップと
を含む方法。
【請求項３５】
前記細胞の集団の前記分離の画像の前記収集がリアルタイムで行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料が血液である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料が、唾液、尿、血漿、血清、および便を含む体液；皮膚、肛門、鼻および膣のスワブまたはドアの取手からの環境的なスワブを含むスワブ；および涙液、肺からのラバッシュ液、乳房からの間質組織液を含む近位の流体から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞の集団の前記収集された画像から得た前記細胞の集団の少なくともいくつかを計数することと、定量化することの少なくとも１つをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
部分の変動が磁化率および／または固有の密度の差に基づく、前記部分の異種集団を分離するための浮上装置であって、磁場を生成する少なくとも１つの磁石を含み、前記磁場が、前記部分の異種集団を含有する試料を受容するためのマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと相互作用する大きさにされている、装置と、
前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルの前記入口および／または出口にある、前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルの高さおよび／または幅にわたるそれぞれの所定の位置で流体を前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに導入またはそこから退かせる少なくとも１つの針と
を含む、磁気浮上ベースのシステム。
【請求項４０】
前記入口または前記出口に複数の針を備え、前記複数の針のそれぞれが、異なる空間位置で前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルと連通している、請求項３９に記載の磁気浮上ベースのシステム。
【請求項４１】
前記入口における第１の注射針が、前記出口における第２の吸引針と異なる高さにある、請求項３９に記載の磁気浮上ベースのシステム。
【請求項４２】
生殖医療に使用する個々の胚および卵母細胞の性質を評価する方法であって、
浮上装置のマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに１つまたは複数の胚または卵母細胞を含む試料を配置するステップ、
前記浮上装置に胚または卵母細胞を含む前記試料を浮上させるステップ、および
密度および浮上プロファイルの１つまたは複数に関して前記胚または卵母細胞の前記性質を格付けするステップ
を含む方法。
【請求項４３】
前記密度および浮上プロファイルの１つまたは複数に関する前記胚または卵母細胞の前記性質を前記格付けに基づいて、前記胚または卵母細胞の１つまたは複数の胚または卵母細胞を選択するステップ、および体外受精処置において前記１つまたは複数の胚または卵母細胞を使用するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
液滴シーケンシングのための磁気浮上システムにおいて、液滴中に封入される複数の部分を浮上させる方法であって、
複数の液滴において前記複数の部分を封入し、前記複数の液滴を試料中に懸濁させるステップと、
前記複数の液滴を含有する前記試料を前記磁気浮上システムのマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに配置するステップと、
前記磁気浮上システムにおいて前記複数の液滴を浮上させるステップと
を含む方法。
【請求項４５】
前記試料が、前記複数の部分のいずれも封入しない複数の液滴をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
細胞の異種集団を分離する方法であって、
単一の磁石に結合されたマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルを含むシステムを得るステップ、
前記細胞の異種集団を前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに提供するステップ、および
磁化率および密度の差に基づいて、前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内の前記細胞の異種集団を浮上させるステップ
を含む方法。
【請求項４７】
細胞の異種集団を分離して収集する方法であって、
２つ以上の出口を含むマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルを得るステップ、
常磁性培地中の前記細胞の異種集団を前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル中に配置するステップ、
磁化率および密度の差に基づいて、前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内の前記細胞の異種集団を分離するステップ、および
前記分離された細胞を含む流体を前記２つ以上の出口から可変速度を用いて退かせるステップ
を含む方法。
【請求項４８】
胎児細胞を血液試料から分離する方法であって、
磁場に曝されたマイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルに血液試料および常磁性培地を配置するステップ、
それらの磁化率および密度に基づいて前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネル内の細胞を浮上させるステップ、および
前記マイクロキャピラリーまたは微小流体チャネルの浮上高さ閾値を用いて前記胎児細胞を単離するステップ
を含む方法。
【国際調査報告】
2019502896.tif 000057
2019502896.tif 000058
2019502896.tif 000059