(57)【要約】本開示は、ヒトインターロイキン−１２（ＩＬ１２）、その機能的断片、およびＩＬ１２を含む融合タンパク質をコードする連結したヌクレオシドのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドに関する。一部の実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列最適化されている。特定の実施形態では、本開示は、ヒトＩＬ１２のポリペプチド配列をコードするヌクレオチドを含む、配列最適化されたポリヌクレオチド、またはこれらの配列最適化されたポリヌクレオチドとの高い配列同一性を有する配列を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍のサイズの低減または腫瘍の成長の阻害をそれを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、インターロイキン１２  ｐ４０サブユニット（「ＩＬ１２Ｂ」）ポリペプチドおよびインターロイキン１２  ｐ３５サブユニット（「ＩＬ１２Ａ」）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を含む、方法。
【請求項２】
前記対象に、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物、またはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、またはこれらの組合せを阻害する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、抗体を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合性断片、ＰＤ−１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合性断片、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片、およびこれらの組合せである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＣＴＬＡ−４抗体が、トレメリムマブまたはイピリムマブである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記抗ＰＤ−１抗体が、ニボルマブまたはペンブロリズマブである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物を投与するステップが、前記対象におけるＴ細胞を活性化する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｔ細胞の活性化をそれを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞の活性化が、Ｔ細胞増殖を誘導することを含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞の活性化が、前記腫瘍へのＴ細胞の浸潤を誘導すること、または腫瘍浸潤Ｔ細胞の数を増大させることを含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞の活性化が、メモリーＴ細胞応答を誘導することを含む、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記活性化されたＴ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはその両方を含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することが、前記腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比を増大させる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比を増大させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法。
【請求項１７】
前記エフェクター対サプレッサーＴ細胞比が、ＣＤ８＋Ｔ細胞：制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の比である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ８＋：Ｔｒｅｇ比が、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、または少なくとも１５０である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物を投与することが、前記対象における活性化ＮＫ細胞の数をさらに増大させる、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増大させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法。
【請求項２１】
活性化ＮＫ細胞の数が、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増大する、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記増大した活性化ＮＫ細胞が、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、または少なくとも約１４日間維持される、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物を投与することが、前記対象の前記腫瘍における交差提示樹状細胞を増大させる、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
交差提示樹状細胞を増大させることを必要とする対象の腫瘍においてそれを行う方法であって、前記対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法。
【請求項２５】
前記交差提示樹状細胞が、ＣＤ１０３＋細胞である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物を投与することが、前記対象における遠位腫瘍のサイズを低減するか、または遠位腫瘍の成長を阻害する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドおよび前記ＩＬ１２Ａポリペプチドが、直接またはリンカーをコードする核酸によって融合されている、請求項１または２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドが、前記ＩＬ１２Ａポリペプチドまたは前記リンカーの５’末端に位置する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＩＬ１２Ａポリペプチドが、前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドまたは前記リンカーの５’末端に位置する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸２３〜３２８に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、ＩＬ１２Ｂ活性を有する、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩＬ１２Ａポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸３３６〜５３２に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、ＩＬ１２Ａ活性を有する、請求項２７から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記シグナルペプチドが、ＩＬ１２Ｂシグナルペプチドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記シグナルペプチドが、配列番号４８のアミノ酸１〜２２に少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が、リンカーを介してＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む、請求項２７から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、ＩＬ１２Ｂシグナルペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、リンカー、およびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む、請求項２７から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記リンカーが、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを含む、請求項２７から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（ＧｎＳ）ｍを含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（ＧｎＳ）ｍを含み、ここで、ｎは６であり、ｍは１である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＩＬ１２ポリペプチドが、配列番号４８に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号５〜４４、２３６、および２３７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１から４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２３６または２３７に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１から４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含むＯＲＦを含む、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、節ＸＩに列挙されているもののうちのいずれかおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、５−メチルシトシン、５−メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＯＲＦ中の前記ヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、請求項４３から４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＯＲＦにおける前記化学的に修飾されたヌクレオシドが、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ＯＲＦ中のウリジンヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、請求項１から４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＯＲＦ中のアデノシンヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、請求項１から４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＯＲＦ中のシチジンヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、請求項１から４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＯＲＦ中のグアノシンヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、請求項１から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１２２結合部位である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１２２−３ｐまたはｍｉＲ−１２２−５ｐ結合部位である、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ａａｃｇｃｃａｕｕａ  ｕｃａｃａｃｕａａａ  ｕａ（配列番号５１）に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ−１２２に結合する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｕｇｇａｇｕｇｕｇａ  ｃａａｕｇｇｕｇｕｕ  ｕｇ（配列番号５３）に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ−１２２に結合する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｃａａａｃａｃｃａｕ  ｕｇｕｃａｃａｃｕｃ  ｃａ（配列番号５４）に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ−１２２に結合する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリヌクレオチドが、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項４３から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記５’ＵＴＲが、表３に列挙される配列に少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポリヌクレオチドが、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項４３から５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記３’ＵＴＲが、表４Ａまたは４Ｂに列挙される配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリヌクレオチドが、３’ＵＴＲ内にｍｉＲＮＡ結合部位を含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリヌクレオチドが、前記ｍｉＲＮＡ結合部位に融合されたヌクレオチドスペーサー配列を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ヌクレオチドスペーサー配列が、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリヌクレオチドが、５’末端キャップ構造を含む、請求項４３から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記５’末端キャップ構造が、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ポリヌクレオチドが、３’ポリＡ尾部を含む、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のｍｉＲＮＡ結合部位を含む、請求項１から６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ポリヌクレオチドが、コドン最適化ＯＲＦを含む、請求項１から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ポリヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写された（ＩＶＴ）ポリヌクレオチドである、請求項１から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ポリヌクレオチドが、環状である、請求項１から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ポリヌクレオチドが、送達剤とともに製剤化されている、請求項１から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記送達剤が、リピドイド、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記送達剤が、脂質ナノ粒子である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記脂質ナノ粒子が、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質、アミノアルコール脂質、ＫＬ２２、およびこれらの組合せからなる群から選択される脂質を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記送達剤が、式（Ｉ）を有する化合物、
【化２０】
2019516710.tif 000145
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜２０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、および−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択され、
ただし、Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２ではない、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるとき、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない、請求項７０から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記化合物が、式（ＩＡ）の化合物、
【化２１】
2019516710.tif 000146
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、および９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、１、２、３、４、または５であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、およびＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ｍが、５、７、または９である、請求項７５から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記化合物が、式（ＩＩ）の化合物、
【化２２】
2019516710.tif 000147
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、およびＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記化合物が、化合物１から化合物１４７、ならびにそれらの塩および立体異性体から選択される、請求項７５から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記化合物が、式（ＩＩａ）の化合物、
【化２３】
2019516710.tif 000148
またはその塩もしくは立体異性体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
前記化合物が、式（ＩＩｂ）の化合物、
【化２４】
2019516710.tif 000149
またはその塩もしくは立体異性体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
前記化合物が、式（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）の化合物、
【化２５】
2019516710.tif 000150
またはその塩もしくは立体異性体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８４】
Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱおよび−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択され、ここで、Ｑ、Ｒ、およびｎは、請求項７５または７６において上記に定義される通りである、請求項７６に記載の方法。
【請求項８５】
前記化合物が、式（ＩＩｄ）の化合物、
【化２６】
2019516710.tif 000151
またはその塩もしくは立体異性体であり、
式中、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ５〜１４アルキルおよびＣ５〜１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、および４から選択され、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ５、Ｒ６、およびｍは、請求項７５または７６に定義される通りである、請求項７６に記載の方法。
【請求項８６】
Ｒ２が、Ｃ８アルキルである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
Ｒ３が、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ８アルキル、またはＣ９アルキルである、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項８８】
ｍが、５、７、または９である、請求項８５から８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
各Ｒ５が、Ｈである、請求項８５から８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
各Ｒ６が、Ｈである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記送達剤が、式（Ｉ）を有する化合物、
【化２７】
2019516710.tif 000152
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲおよび−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−（Ｓ）Ｓ−、−（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３〜６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ３〜６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択され、
ただし、Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２ではない、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるとき、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない、請求項７２から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記送達剤が、式（ＩＡ）の化合物、
【化２８】
2019516710.tif 000153
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、および９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、もしくは−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
ＭおよびＭ’は、独立して、−（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、およびＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９３】
ｍが、５、７、または９である、請求項９１または９２に記載の組成物。
【請求項９４】
前記化合物が、式（ＩＩ）の化合物、
【化２９】
2019516710.tif 000154
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、もしくは−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
ＭおよびＭ’は、独立して、−（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、およびＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される、請求項９２または９３に記載の組成物。
【請求項９５】
Ｍ１が、Ｍ’である、請求項９２から９４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９６】
ＭおよびＭ’が、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−である、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
ｌが、１、３、または５である、請求項９２から９６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９８】
前記化合物が、化合物１から化合物２３２、それらの塩および立体異性体、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９９】
前記送達剤が、リン脂質をさらに含む、請求項７２から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記リン脂質が、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  ジエーテルＰＣ）、
１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、
１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６：０  ＰＥ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、
スフィンゴミエリン、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記リン脂質が、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：０−１６：０  ＰＣ、ＭＰＰＣ）、
１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：０−１８：０  ＰＣ、ＭＳＰＣ）、
１−パルミトイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−０２：０  ＰＣ）、
１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１４：０  ＰＣ、ＰＭＰＣ）、
１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１８：０  ＰＣ、ＰＳＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１８：１  ＰＣ、ＰＯＰＣ）、
１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１８：２  ＰＣ、ＰＬＰＣ）、
１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−２０：４  ＰＣ）、
１−パルミトイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：０−２２：６  ＰＣ）、
１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−１４：０  ＰＣ、ＳＭＰＣ）、
１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−１６：０  ＰＣ、ＳＰＰＣ）、
１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−１８：１  ＰＣ、ＳＯＰＣ）、
１−ステアロイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−１８：２  ＰＣ）、
１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−２０：４  ＰＣ）、
１−ステアロイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−２２：６  ＰＣ）、
１−オレオイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１４：０  ＰＣ、ＯＭＰＣ）、
１−オレオイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１６：０  ＰＣ、ＯＰＰＣ）、
１−オレオイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１８：０  ＰＣ、ＯＳＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０−１８：１  ＰＥ、ＰＯＰＥ）、
１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０−１８：２  ＰＥ）、
１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０−２０：４  ＰＥ）、
１−パルミトイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０−２２：６  ＰＥ）、
１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０−１８：１  ＰＥ）、
１−ステアロイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０−１８：２  ＰＥ）、
１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０−２０：４  ＰＥ）、
１−ステアロイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０−２２：６  ＰＥ）、
１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記送達剤が、構造脂質をさらに含む、請求項７２から１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記送達剤が、ＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項７２から１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記送達剤が、
３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、
Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、
１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、
１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、
２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、
ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、
２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、
１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、
２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、
（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および
（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群から選択されるイオン化可能脂質をさらに含む、請求項７２から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記送達剤が、第四級アミン化合物をさらに含む、請求項７２から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第四級アミン化合物が、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、
Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、
１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、
Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、
Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、
Ｎ−（１，２−ジオレオイルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、
Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＬｅＰＣ）、
１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、
１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、
１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＴＡＰ）、
１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＳｅＰＣ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＰｅＰＣ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭｅＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯｅＰＣ）、
１，２−ジ−（９Ｚ−テトラデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１４：１  ＥＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１６：０−１８：１  ＥＰＣ）、
およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記組成物が、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために製剤化されている、請求項１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記組成物が、筋肉内、皮下、腫瘍内、または皮内送達のために製剤化されている、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記組成物が、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、頭蓋内、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸内、鼻内、頬内、膣内、または埋込み型リザーバーを介して投与される、請求項１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記投与が、がんを処置する、請求項１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記がんが、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳のがん、乳がん、小児がん、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭がんおよび下咽頭がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口咽頭のがん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟部組織における肉腫、基底および扁平細胞皮膚がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウイルムス腫瘍、がんの処置によって引き起こされる続発性がん、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記組成物が、ポンプを備えるデバイス、パッチ、薬物リザーバー、短ニードルデバイス、単一ニードルデバイス、多ニードルデバイス、マイクロニードルデバイス、ジェット式注射デバイス、弾道的粉末／粒子送達デバイス、カテーテル、ルーメン、凍結プローブ、カニューレ、マイクロカニューレ、または熱、ＲＦエネルギー、電流を利用するデバイス、あるいはこれらの任意の組合せによって投与される、請求項１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記有効量が、約０．１０ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇである、請求項１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記対象が、ヒトである、請求項１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
ヒトＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子であって、前記ポリヌクレオチドが、ヒトＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたヒトＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、脂質ナノ粒子。
【請求項１１８】
前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドが、ペプチドリンカーによって、前記ＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されている、請求項１１７に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１１９】
前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドが、前記ＩＬ１２Ａポリペプチドまたは前記ペプチドリンカーの５’末端に位置する、請求項１１７または１１８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２０】
前記ＩＬ１２Ａポリペプチドが、前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドまたは前記ペプチドリンカーの５’末端に位置する、請求項１１７または１１８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２１】
前記ペプチドリンカーが、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを含む、請求項１１７から１２０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２２】
前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（ＧｎＳ）ｍを含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０である、請求項１２１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２３】
前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（ＧｎＳ）ｍを含み、ここで、ｎは６であり、ｍは１である、請求項１２２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２４】
前記ＯＲＦが、シグナルペプチドをコードする、請求項１１７から１２３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２５】
前記シグナルペプチドが、ヒトＩＬ１２Ｂシグナルペプチドである、請求項１２４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２６】
前記ヒトＩＬ１２Ｂポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸２３〜３２８に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１１７から１２５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２７】
前記ヒトＩＬ１２Ａポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸３３６〜５３２に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１１７から１２６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２８】
前記ヒトＩＬ１２Ｂシグナルペプチドが、配列番号４８のアミノ酸１〜２２に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１１７から１２７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２９】
前記ヒトＩＬ１２ポリペプチドが、配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３０】
前記ポリヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む、請求項１１７から１２９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３１】
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１２２結合部位である、請求項１３０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３２】
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１２２−３ｐまたはｍｉＲ−１２２−５ｐ結合部位である、請求項１３１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３３】
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、配列番号５４に記載される配列を含むｍｉＲ−１２２−５ｐ結合部位である、請求項１３２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３４】
前記ポリヌクレオチドが、３’ＵＴＲを含む、請求項１１７から１３３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３５】
前記３’ＵＴＲが、配列番号２４０に記載される配列を含む、請求項１３４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３６】
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、前記３’ＵＴＲに位置する、請求項１３４または１３５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３７】
前記ポリヌクレオチドが、５’ＵＴＲを含む、請求項１３６に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３８】
前記５’ＵＴＲが、配列番号３９に記載される配列を含む、請求項１３７に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３９】
前記ポリヌクレオチドが、５’末端キャップ構造を含む、請求項１１７から１３８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４０】
前記５’末端キャップ構造が、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはこれらの類似体である、請求項１３９に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４１】
前記ポリヌクレオチドが、３’ポリＡ尾部を含む、請求項１１７から１４０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６に記載される配列を含む、請求項１１７に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２３６または２３７に記載される配列を含む、請求項１１７に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４４】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含むＯＲＦを含む、請求項１１７から１４３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４５】
前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、５−メチルシトシン、５−メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４６】
前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、Ｎ１−メチルシュードウリジンである、請求項１４５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４７】
前記脂質ナノ粒子が、約２０〜６０％のイオン化可能アミノ脂質：５〜２５％のリン脂質：２５〜５５％のステロール；および０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、請求項１１７から１４６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４８】
前記脂質ナノ粒子が、約５０％のイオン化可能アミノ脂質：１０％のリン脂質：３８．５％のコレステロール；および１．５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、請求項１１７から１４７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４９】
前記イオン化可能アミノ脂質が、化合物１８である、請求項１４８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１５０】
個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のための医薬の製造における、請求項１１７から１４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子の使用であって、前記医薬が、前記脂質ナノ粒子および任意選択の薬学的に許容される担体を含み、前記処置が、前記医薬を、チェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて投与することを含む、使用。
【請求項１５１】
請求項１１７から１５０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を含む医薬と、任意選択の薬学的に許容される担体と、前記医薬を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて投与することに関する指示を含む添付文書とを含む、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のためのキット。
【請求項１５２】
個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のために第１の医薬および第２の医薬を投与することに関する指示を含む添付文書をさらに含む、請求項１５１に記載のキット。
【請求項１５３】
個体におけるがんの処置またはその進行の遅延に使用するための、請求項１１７から１４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、任意選択の薬学的に許容される担体とを含む組成物であって、前記処置が、前記脂質ナノ粒子を第２の組成物と組み合わせて投与することを含み、前記第２の組成物が、チェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項１５４】
請求項１１７から１４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１５５】
前記脂質ナノ粒子が、腫瘍内投与のために製剤化されている、請求項１５４に記載の医薬組成物。
【請求項１５６】
請求項１５４または１５５に記載の医薬組成物を含む容器と、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のための前記医薬組成物の投与に関する指示を含む添付文書とを含む、キット。
【請求項１５７】
前記添付文書が、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のために、前記医薬組成物を、チェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて投与することに関する指示をさらに含む、請求項１５６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３３８，４８３号、および２０１７年１月７日に出願された第６２／４４３，６９３号に対する優先権の利益を主張し、そのそれぞれの全体が、本明細書に参考として援用される。
【０００２】
電子的に提出された配列表の参照
本出願とともに出願された、電子的に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表（名称：３５２９＿０３５ＰＣ０２＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：３９０，２３１バイト、および作成日：２０１７年５月１６日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン−１２（ＩＬ１２）は、自然免疫および獲得免疫において重要な役割を果たす炎症促進性サイトカインである。Ｇａｔｅｌｙ，  ＭＫら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻：４９５〜５２１頁（１９９８年）。ＩＬ１２は、主として、ｐ３５およびｐ４０というジスルフィド結合された２つのサブユニットからなる、７０ｋＤａのヘテロダイマータンパク質として機能する。ＩＬ１２  ｐ４０ホモダイマーが存在するが、ＩＬ１２受容体に結合するアンタゴニストとして機能する以外には、生物学的応答を媒介するとは考えられていない。（同書）。ＩＬ１２  ｐ４０サブユニット（ＮＭ＿００２１８７；Ｐ２９４６０；ＩＬ１２Ｂ、ナチュラルキラー細胞刺激因子２、細胞傷害性リンパ球成熟因子２とも称される）の前駆体形態は、３２８アミノ酸長であるが、その成熟形態は、３０６アミノ酸長である。ＩＬ１２  ｐ３５サブユニット（ＮＭ＿０００８８２；Ｐ２９４５９；ＩＬ１２Ａ、ナチュラルキラー細胞刺激因子１、細胞傷害性リンパ球成熟因子１とも称される）の前駆体形態は、２１９アミノ酸長であり、成熟形態は、１９７アミノ酸長である。（同書）。ＩＬ１２  ｐ３５およびｐ４０サブユニットの遺伝子は、異なる染色体に存在し、互いに独立して制御されている。Ｇａｔｅｌｙ，  ＭＫら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻：４９５〜５２１頁（１９９８年）。多数の異なる免疫細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、およびＢ細胞）は、抗原刺激時にＩＬ１２を産生する。活性なＩＬ１２ヘテロダイマーは、タンパク質合成後に形成される。（同書）。
【０００４】
ＩＬ１２タンパク質は、ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の両方を活性化するその能力に起因して、１９９４年以来、有望な抗がん治療薬として研究されている。Ｎａｓｔａｌａ，  Ｃ．  Ｌ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５３巻、１６９７〜１７０６頁（１９９４年）を参照されたい。しかしながら、高い期待にもかかわらず、早期臨床研究では、満足のいく結果が得られなかった。Ｌａｓｅｋ  Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、６３巻、４１９〜４３５号、４２４頁（２０１４年）。ＩＬ１２の反復投与は、ほとんどの患者において、獲得応答をもたらし、ＩＬ１２により誘導されるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の血中レベルを次第に減少させた。（同書）。さらに、ＩＬ１２に誘導される抗がん活性は、大部分がＩＦＮγの二次分泌によって媒介されることが認識されていたが、ＩＬ１２によるＩＦＮ−γと他のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）またはケモカイン（ＩＰ−１０もしくはＭＩＧ）との同時誘導は、重度の毒性を引き起こした。（同書）。
【０００５】
負のフィードバックおよび毒性に加えて、臨床環境におけるＩＬ１２療法のわずかな有効性は、ヒトにおける強力な免疫抑制環境によって引き起こされる可能性がある。（同書）。ＩＦＮ−γの毒性を最低限に抑え、ＩＬ１２の有効性を改善させるために、科学者たちは、様々なアプローチ、例えば、様々な用量および時間のプロトコールをＩＬ１２療法に試した。Ｓａｃｃｏ，  Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９０巻、４４７３〜４４７９頁（１９９７年）；Ｌｅｏｎａｒｄ，  Ｊ．  Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９０巻、２５４１〜２５４８頁（１９９７年）；Ｃｏｕｇｈｌｉｎ，  Ｃ．  Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７巻、２４６０〜２４６７頁（１９９７年）；Ａｓｓｅｌｉｎ−Ｐａｔｕｒｅｌ，  Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ、９１巻、１１３〜１２２頁（２００１年）；およびＳａｕｄｅｍｏｎｔ，  Ａ．ら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１６巻、１６３７〜１６４４頁（２００２年）を参照されたい。それにもかかわらず、これらのアプローチは、患者の生存に有意な影響を及ぼさなかった。Ｋａｎｇ，  Ｗ．  Ｋ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１２巻、６７１〜６８４頁（２００１年）。
現在のところ、いくつかのＩＬ１２臨床試験が、進行中である。これらの複数の臨床試験は、１９９６年のＩＬ１２の初めてのヒト臨床試験から、２０年近くも進行中であるが、ＦＤＡに承認されたＩＬ１２製品は、依然として利用可能ではない。したがって、当技術分野において、ＩＬ１２を使用して腫瘍を処置するための改善された治療的アプローチに対する必要性が存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇａｔｅｌｙ，  ＭＫら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻：４９５〜５２１頁（１９９８年）
【非特許文献２】Ｎａｓｔａｌａ，  Ｃ．  Ｌ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５３巻、１６９７〜１７０６頁（１９９４年
【非特許文献３】Ｌａｓｅｋ  Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、６３巻、４１９〜４３５号、４２４頁（２０１４年）
【非特許文献４】Ｓａｃｃｏ，  Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９０巻、４４７３〜４４７９頁（１９９７年）
【非特許文献５】Ｌｅｏｎａｒｄ，  Ｊ．  Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９０巻、２５４１〜２５４８頁（１９９７年）
【非特許文献６】Ｃｏｕｇｈｌｉｎ，  Ｃ．  Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７巻、２４６０〜２４６７頁（１９９７年）
【非特許文献７】Ａｓｓｅｌｉｎ−Ｐａｔｕｒｅｌ，  Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ、９１巻、１１３〜１２２頁（２００１年）
【非特許文献８】Ｓａｕｄｅｍｏｎｔ，  Ａ．ら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１６巻、１６３７〜１６４４頁（２００２年）
【非特許文献９】Ｋａｎｇ，  Ｗ．  Ｋ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１２巻、６７１〜６８４頁（２００１年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、がんの処置のためのｍＲＮＡ治療薬を提供する。本開示のｍＲＮＡ治療薬は、特に、この技術が、免疫調節性ポリペプチド（例えば、免疫腫瘍学（「ＩＯ」）において有用な免疫刺激性ポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２など）をコードするｍＲＮＡの細胞内送達、続いて標的細胞内、例えば、腫瘍中の標的細胞内における機能的タンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ合成を提供するため、がんの処置に極めて好適である。本開示は、（１）望ましくない免疫活性化（例えば、外来核酸のｉｎ  ｖｉｖｏ導入と関連する自然免疫応答）を最低限に抑え、（２）ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳効率を最適化するように修飾されたヌクレオチドを有する、治療用ｍＲＮＡを特徴とする。本開示の例示的な態様は、タンパク質の発現を増強するために、自然免疫応答を低減するヌクレオチド修飾と配列最適化との組合せを、特に、免疫調節性ポリペプチド（例えば、免疫刺激性ポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２）をコードする治療用ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に有する、治療用ｍＲＮＡを特徴とする。
【０００８】
他の態様では、本開示のｍＲＮＡ治療薬技術は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系を介した、免疫調節性（例えば、免疫刺激性）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの送達を特徴とする。例示的な実施形態では、本開示のｍＲＮＡ治療薬技術は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系を介した、免疫調節性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの腫瘍への送達を特徴とする。本開示はまた、免疫調節性（例えば、免疫刺激性）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡと組み合わせて、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与した場合に、改善された特性、例えば、細胞内取り込み、細胞内輸送、および／またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出を有する、新規なイオン化可能脂質に基づくＬＮＰを特徴とする。本開示のＬＮＰ製剤はまた、ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与と関連する免疫原性の低減も示す。
【０００９】
本開示のある特定の態様は、腫瘍のサイズの低減または腫瘍の成長の阻害をそれを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、インターロイキン１２  ｐ４０サブユニット（「ＩＬ１２Ｂ」）ポリペプチドおよびインターロイキン１２  ｐ３５サブユニット（「ＩＬ１２Ａ」）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、方法は、対象に、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物、またはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、またはこれらの組合せを阻害する。一部の実施形態では、組成物を投与することは、対象におけるＴ細胞を活性化する。
【００１０】
本開示の別の態様は、Ｔ細胞の活性化をそれを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞増殖を誘導することを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、腫瘍へのＴ細胞の浸潤を誘導すること、または腫瘍浸潤Ｔ細胞の数を増大させることを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、メモリーＴ細胞応答を誘導することを含む。一部の実施形態では、活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはその両方を含む。ある特定の実施形態では、組成物を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比を増大させる。一部の実施形態では、組成物を投与することは、対象における活性化ＮＫ細胞の数をさらに増大させる。一部の実施形態では、組成物を投与することは、対象の腫瘍における交差提示樹状細胞を増大させる。一部の実施形態では、組成物を投与することは、対象における遠位腫瘍のサイズを低減するか、または遠位腫瘍の成長を阻害する。
【００１１】
本開示の別の態様は、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比を増大させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、エフェクター対サプレッサーＴ細胞比は、ＣＤ８＋Ｔ細胞：制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の比である。
【００１２】
本開示の別の態様は、活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増大させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法を対象とする。
【００１３】
本開示の別の態様は、交差提示樹状細胞を増大させることを必要とする対象の腫瘍においてそれを行う方法であって、対象に、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、交差提示樹状細胞は、ＣＤ１０３＋細胞である。
【００１４】
本開示の他の態様は、ヒトＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を対象とし、ポリヌクレオチドは、ヒトＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたヒトＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２Ａポリペプチドは、直接またはリンカーをコードする核酸によって融合されている。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸２３〜３２８に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、ＩＬ１２Ｂ活性を有する。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸３３６〜５３２に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、ＩＬ１２Ａ活性を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＩＬ１２Ｂシグナルペプチドである。
【００１６】
一部の実施形態では、組成物は、リンカーを介してＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む法。一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ１２Ｂシグナルペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、リンカー、およびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドが、配列番号４８に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリヌクレオチドは、配列番号５〜４４、２３６、および２３７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２３６または２３７に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含むＯＲＦを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、５−メチルシトシン、５−メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＯＲＦにおける化学的に修飾されたヌクレオシドは、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００１９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２２結合部位である。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２２−３ｐまたはｍｉＲ−１２２−５ｐ結合部位である。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ａａｃｇｃｃａｕｕａ  ｕｃａｃａｃｕａａａ  ｕａ（配列番号５１）に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ−１２２に結合する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｕｇｇａｇｕｇｕｇａ  ｃａａｕｇｇｕｇｕｕ  ｕｇ（配列番号５３）に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ−１２２に結合する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｃａａａｃａｃｃａｕ  ｕｇｕｃａｃａｃｕｃ  ｃａ（配列番号５４）に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ−１２２に結合する。
【００２０】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。ある特定の実施形態では、５’ＵＴＲは、表３に列挙される配列に少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。ある特定の実施形態では、３’ＵＴＲは、表４Ａまたは４Ｂに列挙される配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’ＵＴＲ内にｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位に融合されたヌクレオチドスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’末端キャップ構造を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’ポリＡ尾部を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化ＯＲＦを含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写された（ＩＶＴ）ポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、環状である。
【００２１】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、送達剤とともに製剤化されている。一部の実施形態では、送達剤は、リピドイド、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、送達剤は、脂質ナノ粒子である。一部の実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物、
【化１】
2019516710.tif 000002
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、Ｒ１は、Ｃ５〜２０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、および−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択され、ただし、Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２ではない、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるとき、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない。
【００２２】
一部の実施形態では、化合物は、式（ＩＡ）の化合物、
【化２】
2019516710.tif 000003
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、ｍは、５、６、７、８、および９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、１、２、３、４、または５であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、およびＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される。
【００２３】
一部の実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）の化合物、
【化３】
2019516710.tif 000004
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、およびＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される。
【００２４】
一部の実施形態では、化合物は、化合物１から化合物１４７、ならびにそれらの塩および立体異性体から選択される。一部の実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物、
【化４】
2019516710.tif 000005
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、Ｒ１は、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲおよび−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、Ｒ８は、Ｃ３〜６炭素環および複素環からなる群から選択され、Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ３〜６炭素環および複素環からなる群から選択され、各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択され、ただし、Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２ではない、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるとき、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない。
【００２５】
一部の実施形態では、送達剤は、リン脂質をさらに含む。一部の実施形態では、リン脂質は、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  ジエーテルＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６：０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、およびこれらの混合物からなる群から選択される。一部の実施形態では、リン脂質は、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：０−１６：０  ＰＣ、ＭＰＰＣ）、１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：０−１８：０  ＰＣ、ＭＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−０２：０  ＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１４：０  ＰＣ、ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１８：０  ＰＣ、ＰＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１８：１  ＰＣ、ＰＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１８：２  ＰＣ、ＰＬＰＣ）、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−２０：４  ＰＣ）、１−パルミトイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：０−２２：６  ＰＣ）、１−ステアロイル−２−ミリストイル��ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−１４：０  ＰＣ、ＳＭＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−１６：０  ＰＣ、ＳＰＰＣ）、１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−１８：１  ＰＣ、ＳＯＰＣ）、１−ステアロイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−１８：２  ＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−２０：４  ＰＣ）、１−ステアロイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−２２：６  ＰＣ）、１−オレオイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１４：０  ＰＣ、ＯＭＰＣ）、１−オレオイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１６：０  ＰＣ、ＯＰＰＣ）、１−オレオイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１８：０  ＰＣ、ＯＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０−１８：１  ＰＥ、ＰＯＰＥ）、１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０−１８：２  ＰＥ）、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０−２０：４  ＰＥ）、１−パルミトイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０−２２：６  ＰＥ）、１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０−１８：１  ＰＥ）、１−ステアロイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０−１８：２  ＰＥ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０−２０：４  ＰＥ）、１−ステアロイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０−２２：６  ＰＥ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００２６】
一部の実施形態では、送達剤は、構造脂質をさらに含む。一部の実施形態では、送達剤は、ＰＥＧ脂質をさらに含む。一部の実施形態では、送達剤は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群から選択されるイオン化可能脂質をさらに含む。
【００２７】
一部の実施形態では、送達剤は、第四級アミン化合物をさらに含む。ある特定の実施形態では、第四級アミン化合物は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−（１，２−ジオレオイルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、
【００２８】
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＬｅＰＣ）、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＳｅＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＰｅＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭｅＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯｅＰＣ）、１，２−ジ−（９Ｚ−テトラデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１４：１  ＥＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１６：０−１８：１  ＥＰＣ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００２９】
ある特定の実施形態では、組成物が、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために製剤化されている。一部の態様では、組成物は、筋肉内、皮下、腫瘍内、または皮内送達のために製剤化されている。
【００３０】
ある特定の態様では、投与は、がんを処置する。一部の実施形態では、がんは、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳のがん、乳がん、小児がん、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭がんおよび下咽頭がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口咽頭のがん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟部組織における肉腫、基底および扁平細胞皮膚がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウイルムス腫瘍、がんの処置によって引き起こされる続発性がん、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００３１】
ある特定の態様では、組成物は、ポンプを備えるデバイス、パッチ、薬物リザーバー、短ニードルデバイス、単一ニードルデバイス、多ニードルデバイス、マイクロニードルデバイス、ジェット式注射デバイス、弾道的粉末／粒子送達デバイス、カテーテル、ルーメン、凍結プローブ、カニューレ、マイクロカニューレ、または熱、ＲＦエネルギー、電流を利用するデバイス、あるいはこれらの任意の組合せによって投与される。一部の態様では、有効量は、約０．１０ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、（１）野生型ＩＬ１２Ｂアミノ酸配列、（２）ｗｔＩＬ１２Ｂをコードする野生型核酸、（３）野生型ＩＬ１２Ａアミノ酸配列、（４）ｗｔＩＬ１２Ａをコードする野生型核酸、（５）野生型ＩＬ１２Ｂシグナルペプチドアミノ酸配列、および（６）ｗｔＩＬ１２Ｂシグナルペプチドをコードする野生型核酸を示す。
【００３３】
【図２】図２Ａは、対応するＩＬ１２組換えタンパク質と比較した、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２  ｍＲＮＡの静脈内投与後に観察されたＩＬ１２血漿レベルに関する、より高いＡＵＣおよびＣｍａｘを示すグラフである。図２Ｂは、ＩＬ１２組換えタンパク質と比較した、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２  ｍＲＮＡの静脈内投与後に観察されたＩＦＮγ血漿レベルに関する、より高いＡＵＣおよびＣｍａｘを示すグラフである。
【００３４】
【図３】図３は、第１群（ＰＢＳ）、第２群（ＩＬ１２タンパク質）、第７群および第８群（それぞれ、対照ＮＳＴ−ＦＩＸ、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．０５ｍｇ／ｋｇ）と比較した、０．１ｍｇ／ｋｇ（第４群）および０．０５ｍｇ／ｋｇ（第５群）の用量（逆三角形を含む線で示される）での、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２  ｍＲＮＡの単回静脈内（ＩＶ）用量のロバストな有効性を示すグラフである。
【００３５】
【図４ＡＢ】図４Ａ〜図４Ｆは、０．１ｍｇ／ｋｇ（第４群）（図４Ｆ）および０．０５ｍｇ／ｋｇ（第５群）（図４Ｅ）の用量の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２  ｍＲＮＡ、ＰＢＳ（１群）（図４Ａ）、ＩＬ１２タンパク質（第２群）（図４Ｄ）、対照ＮＳＴ−ＦＩＸ、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．０５ｍｇ／ｋｇ（それぞれ、第７群および第８群）（それぞれ、図４Ｃおよび図４Ｂ）の、単回静脈内（ＩＶ）用量の投与後に見られた平均腫瘍体積および完全奏功（ＣＲ）数を示すグラフである。完全奏功（ＣＲ）は、図４Ｅおよび図４Ｆにのみ示される。図４Ｅは、６／８のＣＲが第５群において見られた（０．０５ｍｇ／ｋｇの用量の、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２  ｍＲＮＡ）。図４Ｆは、５／９のＣＲが第４群において見られた（０．１ｍｇ／ｋｇの用量の、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２  ｍＲＮＡ）。ＩＬ１２  ｍＲＮＡ群を除いて、他の全ての群において、ＣＲは観察されなかった。
【図４ＣＤ】同上
【図４ＥＦ】同上
【００３６】
【図５】図５は、１μｇ（約０．０５ｍｇ／ｋｇ）のＩＬ１２タンパク質（第２群）、０．１ｍｇ／ｋｇ（第７群）もしくは０．０５ｍｇ／ｋｇ（第８群）のＮＳＴ−ＦＩＸ、またはＰＢＳ（第１群）の単回ＩＶ用量と比較した、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量（第５群）および０．１ｍｇ／ｋｇの用量（第４群）の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２  ｍＲＮＡの単回静脈内（ＩＶ）用量からの腫瘍埋込み後４７日目での生存利益を示すグラフである。
【００３７】
【図６】図６Ａ〜図６Ｂは、腺癌（ＭＣ３８）腫瘍を担持するマウスに投与された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２  ｍＲＮＡの単回腫瘍内用量（４μｇ）のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を示すグラフである。図６Ａは、埋込み後１０日目に開始して、２４日目までの、平均腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。第１群（丸）は、埋込み後１０日目に４μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ  ＬＮＰを投与されたマウス（ｎ＝７）を表す；第２群（四角）は、４μｇの非翻訳因子ＩＸをコードする対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ−ＦＩＸ  ＬＮＰ）を投与されたマウス（ｎ＝７）を表し、第３群（三角）は、ＰＢＳを投与されたマウスの別の対照群（ｎ＝７）を表す。図６Ｂは、埋込み後１０日目に開始して、４７日目までの、各群のマウスの個々の腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。４μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ（丸）を投与された７匹の動物のうちの３匹（４４％）において、完全奏功（ＣＲ）が達成された。
【００３８】
【図７ＡＢ】図７Ａ〜図７Ｂは、Ａ２０  Ｂ細胞リンパ腫腫瘍を担持するマウスに投与されたＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２  ｍＲＮＡの腫瘍内用量（５μｇ）のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を示すグラフである。図７Ａは、５μｇの非翻訳対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ）を投与されたマウス（ｎ＝１２）の個々の腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。図７Ｂは、５μｇのＩＬ１２（ｍｉＲｌｅｓｓ）ｍＲＮＡを投与されたマウス（ｎ＝１２）の個々の腫瘍体積を示す。ＩＬ１２  ｍＲＮＡを受けた１２匹の動物のうちの５匹において、完全奏功（ＣＲ）が達成された。
【００３９】
【図７Ｃ】図７Ｃは、Ｂ細胞リンパ腫腫瘍モデル（Ａ２０）中のｍｉＲ１２２結合部位を含有するＩＬ１２  ｍＲＮＡ（５μｇ）の同等のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を示すグラフである（図７Ｃ）。両方のＩＬ１２  ｍＲＮＡ（ｍｉＲ１２２結合部位を含む、および含まない（すなわち、ｍｉＲｌｅｓｓ））を、ＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化した。ＩＬ１２  ｍＲＮＡを、Ａ２０  Ｂ細胞リンパ腫腫瘍を担持するマウスに投与した。ＩＬ１２  ｍｉＲ１２２群の１２匹のマウスのうちの６匹において、完全奏功（ＣＲ）が達成された（図７Ｃ）。
【００４０】
【図８ＡＢ】図８Ａ〜図８Ｂは、Ａ２０  Ｂ細胞リンパ腫腫瘍を担持するマウスに投与されたＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の０．５μｇのＩＬ−１２  ｍＲＮＡの単回用量のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を示すグラフである。ＩＬ１２  ｍｉＲｌｅｓｓ（０．５μｇ）群（図８Ａ）の１２匹のマウスのうちの４匹において、およびＩＬ１２  ｍｉＲ１２２（０．５μｇ）群（図８Ｂ）の１２匹のマウスのうちの３匹において、完全奏功（ＣＲ）が達成された。
【００４１】
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡの複数用量を、Ａ２０腫瘍を担持するマウスに投与することによる、Ｂ細胞リンパ腫腫瘍モデル（Ａ２０）中でのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性の増強を示すグラフである。０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２の週用量を７日間で６回投与された１２匹のマウスのうちの５匹において、完全奏功（ＣＲ）が達成された。
【００４２】
【図８Ｄ】図８Ｄは、Ａ２０  Ｂ細胞リンパ腫腫瘍を担持するマウスに投与された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（すなわち、化合物１８）の腫瘍内週用量のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性が、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性と類似することを示すグラフである。図１４は、化合物１８に基づくＬＮＰ中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡを７日間で６回投与された１２匹のマウスに関する個々の腫瘍体積を示す。また、１２匹の動物のうちの５匹において、完全奏功（ＣＲ）が達成された。
【００４３】
【図８ＥＦ】図８Ｅ〜図８Ｆは、ＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の０．５μｇの非翻訳陰性対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ）（図８Ｅ）および化合物１８に基づくＬＮＰ中の０．５μｇの非翻訳陰性対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ）（図８Ｆ）の週用量（７日間で６回）を投与されたＡ２０腫瘍を担持するマウスにおける腫瘍増殖を示すグラフである。
【００４４】
【図９ＡＢ】図９Ａ〜図９Ｂは、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中の示された用量のＩＬ１２  ｍＲＮＡの、Ａ２０腫瘍を担持するマウスへの腫瘍内投与後、６時間および２４時間での血漿（図９Ａ）および腫瘍（図９Ｂ）中のＩＬ１２の用量依存的レベルを示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）５μｇのＮＳＴ、（ｖ）０．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉ）２．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉ）５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉｉ）０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、および（ｘ）５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２を投与した。
【００４５】
【図９ＣＤ】図９Ｃ〜図９Ｄは、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中のＩＬ１２  ｍＲＮＡと比較した、化合物１８に基づくＬＮＰ中のＩＬ１２  ｍＲＮＡの示された用量の投与後の血漿および腫瘍中のＩＬ１２レベルの上昇を示すグラフである。図９Ｃは、６時間および２４時間での血漿ＩＬ１２レベルを示す；図９Ｄは、６時間および２４時間での腫瘍ＩＬ１２レベルを示す。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｖ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｖｉ）化合物１８中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｖｉｉ）化合物１８中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｖｉｉｉ）５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）化合物１８中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、および（ｘ）化合物１８中の２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２を投与した。
【００４６】
【図９ＥＦ】図９Ｅ〜図９Ｆは、ＩＬ１２  ｍＲＮＡの、Ａ２０腫瘍を担持するマウスへの投与後の血漿（図９Ｅ）および腫瘍（図９Ｆ）中、６時間および２４時間でのＩＦＮγレベルの増大を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）ＭＣ３中の５μｇのＮＳＴ、（ｖ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｘ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｘｉ）化合物１８中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉ）化合物１８中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉｉ）化合物１８中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、および（ｘｉｖ）化合物１８中の２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２を投与した。
【００４７】
【図９ＧＨ】図９Ｇ〜図９Ｈは、ＩＬ１２  ｍＲＮＡの、Ａ２０腫瘍を担持するマウスへの投与後の血漿（図９Ｇ）および腫瘍（図９Ｈ）中、６時間および２４時間でのＩＰ１０レベルの増大を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）ＭＣ３中の５μｇのＮＳＴ、（ｖ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｘ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｘｉ）化合物１８中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉ）化合物１８中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉｉ）化合物１８中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、および（ｘｉｖ）化合物１８中の２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２を投与した。
【００４８】
【図９ＩＪ】図９Ｉ〜図９Ｊは、ＩＬ１２  ｍＲＮＡの投与後の血漿（図９Ｉ）および腫瘍（図９Ｊ）中、６時間および２４時間でのＩＬ６レベルの低下を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）ＭＣ３中の５μｇのＮＳＴ、（ｖ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｘ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｘｉ）化合物１８中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉ）化合物１８中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉｉ）化合物１８中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、および（ｘｉｖ）化合物１８中の２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２を投与した。
【００４９】
【図９ＫＬ】図９Ｋ〜図９Ｌは、ＩＬ１２  ｍＲＮＡの投与後の血漿（図９Ｋ）および腫瘍（図９Ｌ）中、６時間および２４時間でのＧ−ＣＳＦレベルの低下を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）ＭＣ３中の５μｇのＮＳＴ、（ｖ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｘ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｘｉ）化合物１８中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉ）化合物１８中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉｉ）化合物１８中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、および（ｘｉｖ）化合物１８中の２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２を投与した。
【００５０】
【図９ＭＮ】図９Ｍ〜図９Ｎは、ＩＬ１２  ｍＲＮＡの投与後の血漿（図９Ｍ）および腫瘍（図９Ｎ）中、６時間および２４時間でのＧＲＯαレベルの低下を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）ＭＣ３中の５μｇのＮＳＴ、（ｖ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｘ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｘｉ）化合物１８中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉ）化合物１８中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉｉ）化合物１８中の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、および（ｘｉｖ）化合物１８中の２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２を投与した。
【００５１】
【図１０ＡＢ】図１０Ａ〜図１０Ｂは、陰性対照ｍＲＮＡ（図１０Ａ）と比較した、ＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２  ｍＲＮＡ（図１０Ｂ）による処置後のＡ２０腫瘍を用いる疾患誘導後３５日目までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。
【００５２】
【図１０ＣＤ】図１０Ｃ〜図１０Ｄは、陰性対照ｍＲＮＡ（図１０Ｃ）と比較した、ＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２  ｍＲＮＡ（図１０Ｄ）による処置後のＡ２０腫瘍を用いる疾患誘導後３５日目までのマウスの体重測定値を示すグラフである。
【００５３】
【図１１Ａ】図１１Ａは、マウスにおけるルシフェラーゼにより可能になったＭＣ３８結腸がん細胞株を用いる疾患誘導後２２日目での腫瘍量の代用としての生物発光（ＢＬ）を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、処置なし、２μｇのｍＩＬ１２＿ｍｉＲｌｅｓｓ、２μｇのｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２、２μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２、４μｇのｍＩＬ１２＿ｍｉＲｌｅｓｓ、４μｇのｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２、４μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２、および１μｇのｒｍ  ＩＬ１２を投与した。
【００５４】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＮＳＴ−ＯＸ４０Ｌ陰性対照と比較した、ＩＬ１２  ｍＲＮＡを担持するＬＮＰで処置したマウスの生存率を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。このグラフは、Ａ２０腫瘍の埋込み後１５０日目までの生存を示す。
【００５５】
【図１２ＡＢ】図１２Ａは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１２Ｂは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１２Ｃは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１２Ｄは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。
【図１２ＣＤ】図１２Ａは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１２Ｂは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１２Ｃは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１２Ｄは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。
【００５６】
【図１３ＡＢ】図１３Ａは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１３Ｂは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１３Ｃは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１３Ｄは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。
【図１３ＣＤ】図１３Ａは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１３Ｂは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１３Ｃは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１３Ｄは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。
【００５７】
【図１４ＡＢ】図１４Ａは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１４Ｂは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１４Ｃは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１４Ｄは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。
【図１４ＣＤ】図１４Ａは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１４Ｂは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１４Ｃは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１４Ｄは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。
【００５８】
【図１５ＡＢ】図１５Ａは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１５Ｂは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１５Ｃは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１５Ｄは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。「Ｇ／Ｃ含量（％）」と標識された列は、％Ｇ／ＣＴＬに対応する。
【図１５ＣＤ】図１５Ａは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１５Ｂは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１５Ｃは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１５Ｄは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。「Ｇ／Ｃ含量（％）」と標識された列は、％Ｇ／ＣＴＬに対応する。
【００５９】
【図１６】図１６Ａは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するコドン位置１、２、３のＧ／Ｃ組成の偏り間の比較を示す。図１６Ｂは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するコドン位置１、２、３のＧ／Ｃ組成の偏り間の比較を示す。図１６Ｃは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するコドン位置１、２、３のＧ／Ｃ組成の偏り間の比較を示す。図１６Ｄは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１〜ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するコドン位置１、２、３のＧ／Ｃ組成の偏り間の比較を示す。
【００６０】
【図１７Ａ】図１７Ａは、示された用量のＩＬ１２  ｍＲＮＡの、腫瘍を担持するマウスへの腫瘍内投与後２４時間での血漿中のＩＬ１２の用量依存的レベルを示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）処置なし、（ｉｉ）５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）０．０５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｉｖ）０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｖ）５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｖｉ）５μｇのＮＳＴ、（ｖｉｉ）０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２（４用量）、（ｖｉｉｉ）２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２（４用量）、および（ｉｘ）５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２（４用量）を投与した。
【００６１】
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＩＬ１２  ｍＲＮＡの、腫瘍を担持するマウスへの腫瘍内投与後２４時間での血漿中のＩＦＮγレベルの増大を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）処置なし、（ｉｉ）５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）０．０５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｉｖ）０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｖ）５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｖｉ）５μｇのＮＳＴ、（ｖｉｉ）０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２（４用量）、（ｖｉｉｉ）２．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２（４用量）、および（ｉｘ）５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２（４用量）を投与した。
【００６２】
【図１８Ａ】図１８Ａ〜図１８Ｂは、ＩＬ１２  ｍＲＮＡの、ＭＣ３８腫瘍を担持するマウスへの腹腔内投与後、２００時間の経過にわたる血漿中のＩＬ１２（図１８Ａ）および血漿中のＩＦＮγ（図１８Ｂ）のレベルの増大を示すグラフである。マウスに、（ｉ）処置なし、（ｉｉ）２μｇのＩＬ１２  ｍｉＲｌｅｓｓ、（ｉｉｉ）２μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｉｖ）４μｇのＩＬ１２  ｍｉＲｌｅｓｓ、（ｖ）４μｇのｍｉＲ１２２、（ｖｉ）１μｇのＩＬ１２タンパク質、（ｖｉｉ）２μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２、または（ｖｉｉｉ）４μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２を投与した。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜図１８Ｂは、ＩＬ１２  ｍＲＮＡの、ＭＣ３８腫瘍を担持するマウスへの腹腔内投与後、２００時間の経過にわたる血漿中のＩＬ１２（図１８Ａ）および血漿中のＩＦＮγ（図１８Ｂ）のレベルの増大を示すグラフである。マウスに、（ｉ）処置なし、（ｉｉ）２μｇのＩＬ１２  ｍｉＲｌｅｓｓ、（ｉｉｉ）２μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２、（ｉｖ）４μｇのＩＬ１２  ｍｉＲｌｅｓｓ、（ｖ）４μｇのｍｉＲ１２２、（ｖｉ）１μｇのＩＬ１２タンパク質、（ｖｉｉ）２μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２、または（ｖｉｉｉ）４μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２を投与した。
【００６３】
【図１９ＡＢ】図１９Ａ〜図１９Ｂは、陰性対照ｍＲＮＡ（図１９Ａ）と比較した、化合物１８に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の０．５μｇのＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２  ｍＲＮＡ（図１９Ｂ）を用いる処置後の、Ａ２０腫瘍を用いた疾患融合後９０日目までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。
【００６４】
【図１９ＣＤ】図１９Ｃ〜図１９Ｄは、ナイーブマウス（図１９Ｃ）またはＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２  ｍＲＮＡで予め処置され、再チャレンジした完全奏功マウス（図１９Ｄ）におけるＡ２０腫瘍を用いた疾患誘導後６０日目までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。
【００６５】
【図２０】図２０Ａ〜図２０Ｄは、ＭＣ３８−Ｓ腫瘍を担持するマウスへのＩＬ１２  ｍＲＮＡの単回腫瘍内投与後、８０日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、０．０５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２０Ａ）、０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２０Ｂ）、５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２０Ｃ）、またはＮＳＴ（図２０Ｄ）を投与した。
【００６６】
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｆは、ＭＣ３８−Ｓ腫瘍を担持するマウスへのＩＬ１２  ｍＲＮＡの単回用量または複数回用量の後、８０日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、単回用量の０．０５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２１Ａ）、単回用量の０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２１Ｂ）、単回用量の５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２１Ｃ）、２回用量の０．０５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２１Ｄ）、２回用量の０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２１Ｅ）、２回用量の５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２１Ｆ）を投与した。
【００６７】
【図２２】図２２は、ＮＳＴ−ＦＩＸ陰性対照と比較した、ＩＬ１２  ｍＲＮＡを担持するＬＮＰで処置したマウスの生存率を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。グラフは、ＭＣ３８−Ｓ腫瘍の埋込み後８０日目までの生存を示す。
【００６８】
【図２３−１】図２３Ａ〜図２３Ｄは、ＭＣ３８−Ｒ腫瘍を担持するマウスへのＩＬ１２  ｍＲＮＡの単回用量の後７５日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、０．０５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２３Ａ）、０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２３Ｂ）、５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２３Ｃ）、またはＮＳＴ（図２３Ｄ）を投与した。
【００６９】
【図２３−２】図２３Ｅ〜図２３Ｊは、ＭＣ３８−Ｒ腫瘍を担持するマウスへのＩＬ１２  ｍＲＮＡの単回用量または複数回用量の後７５日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、単回用量の０．０５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２３Ｅ）、単回用量の０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２３Ｆ）、単回用量の５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２３Ｇ）、複数回用量の０．０５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２３Ｈ）、複数回用量の０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２３Ｉ）、または複数回用量の５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２３Ｊ）を投与した。
【００７０】
【図２４】図２４は、ＮＳＴ−ＯＸ４０Ｌ陰性対照と比較した、ＩＬ１２  ｍＲＮＡを担持するＬＮＰで処置したマウスの生存率を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。グラフは、ＭＣ３８−Ｒ腫瘍の埋込み後、８０日目までの生存を示す。
【００７１】
【図２５】図２５は、２８日の経過にわたるＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇を示すグラフである。
【００７２】
【図２６ＡＢ】図２６Ａ〜図２６Ｅは、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇およびＭＣ３８−Ｒ腫瘍を担持するマウスへの単回用量のＩＬ１２  ｍＲＮＡのその後の投与後、９０日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇のための抗体対照、次いで、０．５μｇの陰性対照ｍＲＮＡ（図２６Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇のための抗体対照、次いで、０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２６Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇抗体クローン２４．３、次いで、０．５μｇの陰性対照ｍＲＮＡ（図２６Ｃ）、またはＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇抗体クローン２４．３、次いで、０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図２６Ｄ）を投与した。図２６Ｅは、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇後にＩＬ１２  ｍＲＮＡで処置したマウスと比較した、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇なしにＩＬ１２  ｍＲＮＡで処置したマウスの生存率を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。グラフは、ＭＣ３８−Ｒ腫瘍の埋込み後、９０日目までの生存を示す。
【図２６ＣＤ】同上
【図２６Ｅ】同上
【００７３】
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｂは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる腫瘍内用量のＩＬ１２  ｍＲＮＡの後、２４時間または７２時間のＭＣ３８−Ｒ（図２７Ａ）およびＢ１６Ｆ１０−ＡＰ３（図２７Ｂ）腫瘍中でのＰＤＬ１発現について染色陽性のＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞のパーセントを示すグラフである。統計的有意性は、星印で示される。
【００７４】
【図２８】図２８Ａ〜図２８Ｂは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる用量のＩＬ１２  ｍＲＮＡの後、７日間のＭＣ３８−Ｒ（図２８Ａ）およびＢ１６Ｆ１０−ＡＰ３（図２８Ｂ）腫瘍中での免疫浸潤物（ＣＤ４５＋細胞）（左パネル）および腫瘍１ｍｇあたり（右パネル）の割合としての腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞を示すグラフである。統計的有意性は、星印で示される。
【００７５】
【図２９】図２９Ａ〜図２９Ｂは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる用量のＩＬ１２  ｍＲＮＡの後、７日間のＭＣ３８−Ｒ（図２９Ａ）およびＢ１６Ｆ１０−ＡＰ３（図２９Ｂ）腫瘍中でのＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞に対する比を示すグラフである。統計的有意性は、星印で示される。
【００７６】
【図３０】図３０Ａ〜図３０Ｂは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる用量のＩＬ１２  ｍＲＮＡの後、２４時間のＭＣ３８−Ｒ（図３０Ａ）およびＢ１６Ｆ１０−ＡＰ３（図３０Ｂ）腫瘍中での初期活性化マーカーＣＤ６９について染色陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示すグラフである。統計的有意性は、星印で示される。
【００７７】
【図３１】図３１Ａ〜図３１Ｂは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる用量のＩＬ１２  ｍＲＮＡの後、２４時間または７２時間のＭＣ３８−Ｒ（図３１Ａ）およびＢ１６Ｆ１０−ＡＰ３（図３１Ｂ）腫瘍中での初期活性化マーカーＣＤ６９について染色陽性のＮＫ細胞のパーセントを示すグラフである。統計的有意性は、星印で示される。
【００７８】
【図３２】図３２Ａ〜図３２Ｂは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる用量のＩＬ１２  ｍＲＮＡの後、７日間のＭＣ３８−Ｒ（図３２Ａ）およびＢ１６Ｆ１０−ＡＰ３（図３２Ｂ）腫瘍１ｍｇあたりのＣＤ１０３＋古典的樹状細胞の数を示すグラフである。図３２Ｃは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる用量のＩＬ１２  ｍＲＮＡの後、２４時間、７２時間、または７日間のＢ１６Ｆ１０−ＡＰ３腫瘍の腫瘍流入領域リンパ節（ＬＮ）中のＣＤ８６について染色陽性のＣＤ８＋古典的樹状細胞のパーセントを示すグラフである。統計的有意性は、星印で示される。
【００７９】
【図３３ＡＢ】図３３Ａ〜図３３Ｂは、ＭＣ３８−Ｒ腫瘍を担持するマウスへの抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与後、５５日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、抗体対照（図３３Ａ）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン８０）（図３３Ｂ）を投与した。図３３Ｃ〜図３３Ｇは、ＩＬ１２  ｍＲＮＡのみ、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせたＩＬ１２  ｍＲＮＡの投与後、９０日までのＭＣ３８−Ｒ腫瘍を担持するマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、（ｉ）単剤療法としての単回ｉＴｕ用量の０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図３３Ｃ）、（ｉｉ）単剤療法としての単回ｉＴｕ用量の５．０μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２（図３３Ｄ）、（ｉｉｉ）複数回腹腔内用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた単回ｉＴｕ用量の０．５μｇのＩＬ１２  ｍｉＲ１２２（図３３Ｅ）、（ｉｖ）複数回腹腔内用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた単回ｉＴｕ用量の５．０μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図３３Ｆ）；または（ｖ）複数回腹腔内用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（図３３Ｇ）を投与した。
【図３３ＣＤ】同上
【図３３ＥＦ】同上
【図３３Ｇ】同上
【００８０】
【図３４】図３４Ａ〜図３４Ｃは、７５日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。ＭＣ３８−Ｒ腫瘍を担持するマウスを、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみ（図３４Ａ）、０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡのみ（図３４Ｂ）、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡの両方（図３４Ｃ）で、埋込み１０日後に処置した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、６回用量にわたって投与した。垂直の破線は、投与日を示す。
【００８１】
【図３５ＡＢ】図３５Ａ〜図３５Ｄは、７０日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０−ＡＰ３腫瘍を担持するマウスを、陰性対照（図３５Ａ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみ（図３５Ｂ）、単回用量の０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡのみ（図３５Ｃ）、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡの両方（図３５Ｄ）で、埋込みの１０日後に処置した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、６回用量にわたって投与した。垂直の破線は、投与日を示す。
【図３５ＣＤ】図３５Ａ〜図３５Ｄは、７０日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０−ＡＰ３腫瘍を担持するマウスを、陰性対照（図３５Ａ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみ（図３５Ｂ）、単回用量の０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡのみ（図３５Ｃ）、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡの両方（図３５Ｄ）で、埋込みの１０日後に処置した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、６回用量にわたって投与した。垂直の破線は、投与日を示す。
【００８２】
【図３６ＡＢＣ】図３６Ａは、腫瘍細胞を両側に埋め込まれたマウスの図面である。図３６Ｂ〜図３６Ｇは、陰性対照（ＮＳＴ  ｍＲＮＡ＋アイソタイプ抗体対照）（図３６Ｂ〜図３６Ｃ）、０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図３６Ｄ〜図３６Ｅ）、または５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図３６Ｆ〜図３６Ｇ）による処置後の、処置された腫瘍（図３６Ｂ、図３６Ｄ、および図３６Ｆ）ならびに遠位腫瘍（図３６Ｃ、図３６Ｅ、および図３６Ｇ）における６０日目までのＭＣ３８−Ｓが両側に埋め込まれたマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。垂直の破線は、投与日を示す。
【図３６ＤＥ】図３６Ａは、腫瘍細胞を両側に埋め込まれたマウスの図面である。図３６Ｂ〜図３６Ｇは、陰性対照（ＮＳＴ  ｍＲＮＡ＋アイソタイプ抗体対照）（図３６Ｂ〜図３６Ｃ）、０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図３６Ｄ〜図３６Ｅ）、または５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図３６Ｆ〜図３６Ｇ）による処置後の、処置された腫瘍（図３６Ｂ、図３６Ｄ、および図３６Ｆ）ならびに遠位腫瘍（図３６Ｃ、図３６Ｅ、および図３６Ｇ）における６０日目までのＭＣ３８−Ｓが両側に埋め込まれたマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。垂直の破線は、投与日を示す。
【図３６ＦＧ】図３６Ａは、腫瘍細胞を両側に埋め込まれたマウスの図面である。図３６Ｂ〜図３６Ｇは、陰性対照（ＮＳＴ  ｍＲＮＡ＋アイソタイプ抗体対照）（図３６Ｂ〜図３６Ｃ）、０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図３６Ｄ〜図３６Ｅ）、または５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図３６Ｆ〜図３６Ｇ）による処置後の、処置された腫瘍（図３６Ｂ、図３６Ｄ、および図３６Ｆ）ならびに遠位腫瘍（図３６Ｃ、図３６Ｅ、および図３６Ｇ）における６０日目までのＭＣ３８−Ｓが両側に埋め込まれたマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。垂直の破線は、投与日を示す。
【００８３】
【図３７ＡＢ】図３７Ａ〜図３７Ｆは、アイソタイプ対照抗体（図３７Ａ、図３７Ｃ、もしくは図３７Ｅ）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（図３７Ｂ、図３７Ｄ、もしくは図３７Ｆ）と組み合わせた、活性ｍＲＮＡなし（ＮＳＴ  ｍＲＮＡ）（図３７Ａ〜図３７Ｂ）、０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図３７Ｃ〜図３７Ｄ）、または５μｇのＩＬ１２のｍＲＮＡ（図３７Ｅ〜図３７Ｆ）による処置後、６０日までのＭＣ３８−Ｓが両側に埋め込まれたマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。垂直の破線は、投与日を示す。
【図３７ＣＤ】図３７Ａ〜図３７Ｆは、アイソタイプ対照抗体（図３７Ａ、図３７Ｃ、もしくは図３７Ｅ）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（図３７Ｂ、図３７Ｄ、もしくは図３７Ｆ）と組み合わせた、活性ｍＲＮＡなし（ＮＳＴ  ｍＲＮＡ）（図３７Ａ〜図３７Ｂ）、０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図３７Ｃ〜図３７Ｄ）、または５μｇのＩＬ１２のｍＲＮＡ（図３７Ｅ〜図３７Ｆ）による処置後、６０日までのＭＣ３８−Ｓが両側に埋め込まれたマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。垂直の破線は、投与日を示す。
【図３７ＥＦ】図３７Ａ〜図３７Ｆは、アイソタイプ対照抗体（図３７Ａ、図３７Ｃ、もしくは図３７Ｅ）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（図３７Ｂ、図３７Ｄ、もしくは図３７Ｆ）と組み合わせた、活性ｍＲＮＡなし（ＮＳＴ  ｍＲＮＡ）（図３７Ａ〜図３７Ｂ）、０．５μｇのＩＬ１２  ｍＲＮＡ（図３７Ｃ〜図３７Ｄ）、または５μｇのＩＬ１２のｍＲＮＡ（図３７Ｅ〜図３７Ｆ）による処置後、６０日までのＭＣ３８−Ｓが両側に埋め込まれたマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。垂直の破線は、投与日を示す。
【００８４】
【図３８】図３８は、野生型およびコドン最適化ＩＬ−１２  ｍＲＮＡ構築物による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＩＬ−１２発現を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
本開示は、免疫応答を刺激する物質（例えば、ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡ）、すなわち、免疫療法による疾患の予防または処置を含む、がんを処置するための新規なアプローチを提供する。
【００８６】
一態様では、本開示は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドを使用して、がんを処置する方法に関する。本明細書に開示されるＩＬ１２ポリペプチドは、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、またはＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂの両方を含む。別の態様では、本開示は、ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡならびに抗がん剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を特徴とする組合せアプローチを使用してがんを処置する方法を提供する。いかなる理論によっても束縛されるものではないが、抗がん免疫応答のプライミングは、例えば、Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞の刺激時に、ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡを、例えば腫瘍内に投与することによって、可能であると考えられる。したがって、ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡの腫瘍内注射により、例えば、腫瘍環境内において免疫系に第１の刺激シグナルを提供すると考えられる。ＩＬ１２はまた、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の産生を刺激し得る。本明細書に開示されるように、ＩＬ１２はまた、直接的またはＩＦＮ−γを通じて間接的に、腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現を増大させ得、これにより、局所的腫瘍免疫が損なわれ得る。したがって、一部の態様では、本開示は、腫瘍を処置する方法であって、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、ＰＤ−Ｌ１とその受容体、すなわち、ＰＤ−１との間の相互作用を遮断する抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて投与するステップを含む、方法を提供する。他の態様では、本開示は、腫瘍を処置する方法であって、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせて投与するステップを含む、方法を含む。さらなる態様では、本開示は、腫瘍を処置する方法であって、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせて投与するステップを含む、方法を提供する。本開示の一部の態様はまた、追加の薬剤、例えば、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、またはＯＸ４０ＬをコードするｍＲＮＡを含む。他の態様では、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ポリヌクレオチドの形態で投与され得る。同様に、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ポリヌクレオチドの形態で投与され得る。例示的な態様は、脂質ナノ粒子−（ＬＮＰ−）封入型ｍＲＮＡを用いた処置を特徴とする。例示的な態様は、カチオン性脂質に基づくＬＮＰにおけるｍＲＮＡの腫瘍内投与を特徴とする。
１．がんを処置する方法
【００８７】
本開示のある特定の態様は、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズ、質量、および／もしくは体積を低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を予防する方法であって、本明細書に開示されるＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ、またはポリヌクレオチドを含むベクターもしくは宿主細胞、またはポリヌクレオチドによってコードされるＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２Ａポリペプチドを投与することを含む、方法を対象とする。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードし、ここで、ポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。一部の実施形態では、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズ（質量および／もしくは体積を含む）を低減するか、または腫瘍の成長を阻害する方法は、対象に、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、有効量の組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
【００８８】
一部の実施形態では、方法は、第２の薬剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、当該分野において公知または本明細書に記載される任意のチェックポイント阻害剤である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体である。一部の実施形態では、第２の薬剤は、ＯＸ４０ＬをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドまたは本明細書に開示の任意の他の薬剤から選択される。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤を含む組成物は、１つより多くのチェックポイント阻害剤を含む。１つの特定の実施形態では、本方法は、（ｉ）本明細書に開示されるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ならびに（ｉｉ）抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せを投与することを含む。
【００８９】
一部の実施形態では、本方法は、対象における腫瘍のサイズを、投与前の腫瘍のサイズと比較して、低減する。ある特定の実施形態では、腫瘍のサイズは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは約１００％だけ低減される。ある特定の実施形態では、対象は、部分奏功を呈する。ある特定の実施形態では、対象は、完全奏功を呈する。
【００９０】
一部の実施形態では、本開示の方法は、それを必要とする対象において、腫瘍の成長を、阻害、停止、または遅延させる。ある特定の実施形態では、腫瘍成長は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月間、少なくとも約２か月間、少なくとも約３か月間、少なくとも約４か月間、少なくとも約５か月間、少なくとも約６か月間、少なくとも約９か月間、少なくとも約１２か月間、少なくとも約１５か月間、少なくとも約１８か月間、少なくとも約２４か月間、または少なくとも約３６か月間阻害、停止または遅延される。他の実施形態では、腫瘍の成長は、無期限に阻害される。
【００９１】
他の実施形態では、本開示は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、単独でまたはこのポリヌクレオチドを本明細書に開示される任意の薬剤と組み合わせて投与することによって、抗腫瘍効果を促進する（例えば、Ｔ細胞増殖を誘導する、腫瘍へのＴ細胞の浸潤を誘導する、メモリーＴ細胞応答を誘導する、ＮＫ細胞の数を増大させるなど）方法を提供する。
【００９２】
他の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象においてＴ細胞を活性化する、それを必要とする対象においてＴ細胞増殖を誘導する、それを必要とする対象の腫瘍へのＴ細胞の浸潤を誘導する、および／またはそれを必要とする対象においてメモリーＴ細胞応答を誘導する方法であって、対象に、本明細書に開示される組成物、例えば、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、単独であるいは第２の薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤ポリペプチド、またはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチド、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、または本明細書に開示される任意の他の薬剤を含む組成物と組み合わせて投与するステップを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の、単独でまたは第２の薬剤と組み合わせた腫瘍内投与は、他の投与経路と比較して、抗腫瘍効果（例えば、腫瘍へのＴ細胞の浸潤）の有効性を増大させ得る。
【００９３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドを、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することにより、対象においてＴ細胞が活性化される。Ｔ細胞の活性化は、当技術分野において公知の任意の手段で特徴付けることができる。一部の実施形態では、活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４を発現する。一部の実施形態では、活性化されたＴ細胞は、ＣＤ８を発現する。ある特定の実施形態では、活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４およびＣＤ８を発現する。ある特定の実施形態では、活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含む。
【００９４】
一実施形態では、対象における活性化されたＴ細胞は、対象における腫瘍のサイズを低減するか、または腫瘍の成長を阻害する。Ｔ細胞の活性化は、当技術分野における適用、例えば、Ｔ細胞増殖を測定すること；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくは酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）によってサイトカイン産生を測定すること；またはフローサイトメトリーなどの技法によるＴ細胞活性化と関連する細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１５４、およびＣＤ１３４）の検出を使用して、測定することができる。
【００９５】
一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞増殖を誘導することを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞増殖は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＩＬ１２の投与前のＴ細胞増殖のレベルと比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍だけ増大する。
【００９６】
一実施形態では、対象におけるＴ細胞増殖は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、対象におけるＴ細胞増殖は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。Ｔ細胞増殖は、当技術分野における適用、例えば、細胞計数、生存性染色、光学密度アッセイ、またはフローサイトメトリーなどの技法によるＴ細胞活性化と関連する細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１５４、およびＣＤ１３４）の検出を使用して、測定することができる。
【００９７】
一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、腫瘍のＴ細胞の浸潤の誘導を含む。一部の実施形態では、腫瘍におけるＴ細胞浸潤は、レベルポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＩＬ１２の投与前の腫瘍のＴ細胞浸潤のレベルと比較して少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍だけ増大する。
【００９８】
一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、腫瘍浸潤Ｔ細胞の数を増大させることを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍における腫瘍浸潤Ｔ細胞の数は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＩＬ１２の投与前の腫瘍における腫瘍浸潤Ｔ細胞の数と比較して少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍だけ増大する。
【００９９】
一実施形態では、対象の腫瘍へのＴ細胞の浸潤は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、対象の腫瘍へのＴ細胞の浸潤は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。腫瘍へのＴ細胞の浸潤は、当技術分野における適用、例えば、組織切片化および細胞マーカーの染色、腫瘍部位における局所的サイトカイン産生の測定、またはフローサイトメトリーなどの技法によるＴ細胞表面マーカーの検出を使用して、測定することができる。
【０１００】
一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、それを必要とする対象において、メモリーＴ細胞応答を誘導することを含む。ある特定の実施形態では、メモリーＴ細胞応答は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＩＬ１２の投与前のメモリーＴ細胞応答と比較して少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍だけ増大する。
【０１０１】
一実施形態では、対象におけるメモリーＴ細胞応答は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、対象におけるメモリーＴ細胞応答は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。メモリーＴ細胞応答は、当技術分野における適用、例えば、メモリーＴ細胞と関連するＴ細胞マーカーの測定、メモリー免疫応答と関連する局所的サイトカイン産生の測定、またはフローサイトメトリーなどの技法によるメモリーＴ細胞表面マーカーの検出を使用して、測定することができる。
【０１０２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドを、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比を増大させる。ある特定の実施形態では、エフェクター対サプレッサーＴ細胞比は、対象における（ｉ）ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、もしくはＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の、（ｉｉ）Ｔｒｅｇ細胞に対する比によって特徴付けられる。ある特定の実施形態では、エフェクター対サプレッサーＴ細胞比の増大は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増大と相関する。一部の実施形態では、エフェクター対サプレッサーＴ細胞比の増大は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増大と相関する。一部の実施形態では、エフェクター対サプレッサーＴ細胞比の増大は、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増大と相関する。一部の実施形態では、エフェクター対サプレッサーＴ細胞比の増大は、Ｔｒｅｇ細胞の数の減少と相関する。
【０１０３】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＩＬ１２（単独で、または抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて）の投与後のエフェクター対サプレッサーＴ細胞比、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ細胞比は、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約２．５：１、少なくとも約３：１、少なくとも約３．５：１、少なくとも約３．５：１、少なくとも約４：１、少なくとも約４．５：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１５：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約２５：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約３５：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約４５：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約６０：１、少なくとも約７０：１、少なくとも約８０：１、少なくとも約９０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約１１０：１、少なくとも約１２０：１、少なくとも約１３０：１、少なくとも約１４０：１、少なくとも約１５０：１、少なくとも約２００：１、少なくとも約２５０：１、または少なくとも約５００：１である。
【０１０４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＩＬ１２（単独で、または抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて）の投与後のエフェクター対サプレッサーＴ細胞比、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ細胞比は、少なくとも約１．５、少なくとも約２、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、または少なくとも約５００である。
【０１０５】
一実施形態では、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比の増大は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比の増大は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比は、当技術分野における適用を使用して、例えば、ＩＨＣおよび／またはフローサイトメトリーを含む当技術分野において公知の任意の方法を使用してＣＤ８＋、ＣＤ４＋、またはＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の、Ｔｒｅｇ細胞に対する比を測定することによって、測定することができる。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、本方法による活性化Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ６２＋（Ｌ−セレクチン＋）細胞、ＣＤ６９＋細胞、ＣＤ４０Ｌ＋細胞、ＣＤ１３７＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ７１＋細胞、ＣＤ２６＋細胞、ＣＤ２７＋細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ３０＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１５４＋細胞、ＣＤ１３４＋細胞、ＣＸＣＲ３＋細胞、ＣＣＲ４＋細胞、ＣＣＲ６＋細胞、ＣＣＲ７＋細胞、ＣＸＣＲ５＋細胞、Ｃｒｔｈ２＋細胞、ガンマデルタＴ細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、本方法による活性化Ｔ細胞は、Ｔｈ１細胞である。他の実施形態では、本方法によって活性化されたＴ細胞は、Ｔｈ２細胞である。他の実施形態では、本開示によって活性化されるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。
【０１０７】
一部の実施形態では、本方法による浸潤Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ６２＋（Ｌ−セレクチン＋）細胞、ＣＤ６９＋細胞、ＣＤ４０Ｌ＋細胞、ＣＤ１３７＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ７１＋細胞、ＣＤ２６＋細胞、ＣＤ２７＋細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ３０＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１５４＋細胞、ＣＤ１３４＋細胞、ＣＸＣＲ３＋細胞、ＣＣＲ４＋細胞、ＣＣＲ６＋細胞、ＣＣＲ７＋細胞、ＣＸＣＲ５＋細胞、Ｃｒｔｈ２＋細胞、ガンマデルタＴ細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、本方法による浸潤Ｔ細胞は、Ｔｈ１細胞である。他の実施形態では、本方法による浸潤Ｔ細胞は、Ｔｈ２細胞である。他の実施形態では、本開示による浸潤Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。
【０１０８】
一部の実施形態では、本方法によって誘導されるメモリーＴ細胞は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ６２＋（Ｌ−セレクチン＋）細胞、ＣＤ６９＋細胞、ＣＤ４０Ｌ＋細胞、ＣＤ１３７＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ７１＋細胞、ＣＤ２６＋細胞、ＣＤ２７＋細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ３０＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１５４＋細胞、ＣＤ１３４＋細胞、ＣＸＣＲ３＋細胞、ＣＣＲ４＋細胞、ＣＣＲ６＋細胞、ＣＣＲ７＋細胞、ＣＸＣＲ５＋細胞、Ｃｒｔｈ２＋細胞、ガンマデルタＴ細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、本方法によるメモリーＴ細胞は、Ｔｈ１細胞である。他の実施形態では、本方法によるメモリーＴ細胞は、Ｔｈ２細胞である。他の実施形態では、本開示によるメモリーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本開示は、腫瘍に対する獲得免疫応答、自然免疫応答、または獲得免疫応答および自然免疫応答の両方を誘導する方法であって、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、単独であるいは第２の薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、ならびに／または本明細書に開示される任意の他の薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法を含む。
【０１１０】
本開示は、さらに、それを必要とする対象において、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増大させる方法であって、ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを、単独であるいは第２の薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、ならびに／または本明細書に開示される任意の他の薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。一態様では、対象におけるＮＫ細胞の数の増大は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、対象におけるＮＫ細胞の数の増大は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。対象におけるＮＫ細胞の数の増大は、当技術分野における適用、例えば、ＮＫ細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３３５／ＮＫｐ４６；ＣＤ３３６／ＮＫｐ４４；ＣＤ３３７／ＮＰｐ３０）または細胞内ＮＫ細胞マーカー（例えば、パーフォリン、グランザイム、グラニュライシン）の検出を使用して、測定することができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、対象における活性化ＮＫ細胞の数を、投与前の活性化ＮＫ細胞の数と比較して、増大させる。一部の実施形態では、活性化ＮＫ細胞の数は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍だけ増大する。一部の実施形態では、活性化ＮＫ細胞の増大は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、または少なくとも約２８日間維持される。
【０１１２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、対象の腫瘍における交差提示樹状細胞の数を、投与前の腫瘍における交差提示樹状細胞の数と比較して、増大させる。一部の実施形態では、腫瘍中の交差提示樹状細胞の数は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍だけ増大する。一部の実施形態では、腫瘍中の交差提示樹状細胞の増大は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、または少なくとも約２８日間維持される。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、本開示はまた、腫瘍を有する対象におけるＩＦＮγ発現を増大させる方法であって、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、単独であるいは第２の薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、ならびに／または本明細書に開示される任意の他の薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法を対象とする。
【０１１４】
他の実施形態には、腫瘍を有する対象におけるＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５／１５Ｒ、ＩＬ−２７、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、またはこれらの任意の組合せの発現を増大させる方法であって、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、単独でまたは本明細書に開示される別の薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法も含まれる。さらに他の実施形態では、本開示の方法には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８、ＩＬ−３、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、またはこれらの任意の組合せの発現を誘導する方法が含まれ得る。
【０１１５】
ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドは、直接的または間接的にのいずれかで、腫瘍に投与するのに好適な医薬組成物として製剤化され得る。「腫瘍」という用語は、本明細書において広義に使用され、生理学的機能を有さず、通常は急速な無制御な細胞増殖により生じる、組織のあらゆる異常な新成長を指す。本明細書において使用されるとき、「腫瘍」という用語は、良性腫瘍および悪性腫瘍の両方に関する。
【０１１６】
本開示のある特定の態様は、単回投与用量の、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、単独でまたは本明細書に開示される任意の薬剤と組み合わせて腫瘍内投与する方法を提供する。そのような実施形態では、ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡは、１回のみ投与され得、一方で、他の薬剤は、その通常の投薬スケジュールに従って、定期的に投与され得る。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡの投与の前に投与される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、例えば、本明細書に開示される化合物１８において、製剤化される。いかなる理論によっても束縛されるものではないが、一部の態様では、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドおよび／または本明細書に開示される脂質ナノ粒子製剤の腫瘍内送達は、抗腫瘍有効性を誘発し、腫瘍を処置するための投薬に十分な単回用量の投与を可能にする。ＩＬ−１２によって誘導されるＩＦＮγの潜在的毒性を考慮すると、本開示のポリヌクレオチドのこの単回投薬レジメンは、処置を必要とする対象にとって有益であり得る。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、本方法は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの単回用量を、第２の薬剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせて投与することを含み、この第２の薬剤は、その通常の（例えば、承認されている）スケジュールに従って同様に単回投与で提供されてもよく、または複数回投与で提供されてもよい。他の実施形態では、方法は、任意選択で、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの２回以下の投与、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの３回以下の投与、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの４回以下の投与、またはＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの５回以下の投与を含む。
【０１１８】
他の実施形態では、本方法は、アブスコパル効果、例えば、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡによる、腫瘍の局所的な処置、例えば、腫瘍内送達が、処置された腫瘍の退縮だけでなく、局所的な処置の範囲外の腫瘍（「遠位腫瘍」）の退縮も引き起こす、腫瘍の処置をもたらし得る。
【０１１９】
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、遠位腫瘍のサイズを低減する。ある特定の実施形態では、投与は、第１の腫瘍に対して腫瘍内であり、この投与は、第２の遠位腫瘍のサイズを低減する。一部の実施形態では、遠位腫瘍のサイズは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％だけ低減される。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、遠位腫瘍の成長を阻害する。ある特定の実施形態では、投与は、第１の腫瘍に対して腫瘍内であり、この投与は、第２の遠位腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、遠位腫瘍の成長は、少なくとも約７日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２か月間、少なくとも約３か月間、少なくとも約４か月間、少なくとも約５か月間、少なくとも約６か月間、少なくとも約７か月間、少なくとも約８か月間、少なくとも約９か月間、少なくとも約１０か月間、少なくとも約１１か月間、少なくとも約１２か月間、少なくとも約１８か月間、少なくとも約２４か月間、少なくとも約３０か月間、少なくとも約３６か月間、少なくとも約４年間、または少なくとも約５年間阻害される。
【０１２１】
本明細書に開示される腫瘍内投与のための医薬組成物を使用した、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの腫瘍への送達により、
（ｉ）腫瘍におけるポリヌクレオチドの保持が増大され得る、
（ｉｉ）腫瘍における発現されるポリペプチドのレベルが、腫瘍周囲の組織における発現されるポリペプチドのレベルと比較して、増大され得る、
（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドまたは発現される産物の標的外組織（例えば、腫瘍周囲組織、もしくは遠位位置、例えば、肝臓組織）への漏出が減少され得る、または
（ｉｖ）これらの任意の組合せが起こり得、
ここで、ある特性に関して観察される増大または減少とは、対応する参照組成物（例えば、式（Ｉ）の化合物が存在しないか、または別のイオン化可能アミノ脂質、例えば、ＭＣ３によって置換されている、組成物）と比べたものである。
【０１２２】
一実施形態では、漏出の減少は、非腫瘍組織、例えば、腫瘍周囲組織、または別の組織もしくは器官、例えば、肝臓組織におけるポリペプチドの発現に対する、腫瘍におけるポリペプチドの発現の比の減少として定量化することができる。
【０１２３】
ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの腫瘍への送達は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドを含む、例えば、ナノ粒子形態の、本明細書に開示される医薬組成物を、対象に投与することを含み、ここで、医薬組成物の投与は、腫瘍を組成物と接触させることを含む。
【０１２４】
ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである事例では、腫瘍内の細胞を、医薬組成物と接触させると、翻訳可能なｍＲＮＡが、細胞内で翻訳されて、目的のポリペプチドが産生され得る。しかしながら、実質的に翻訳可能ではないｍＲＮＡもまた、腫瘍に送達され得る。実質的に翻訳可能ではないｍＲＮＡは、ワクチンとして有用であり得る、および／または細胞の翻訳成分を封鎖して、細胞における他の種の発現を低減することができる。
【０１２５】
本明細書に開示される医薬組成物により、特異的送達を増大させることができる。本明細書において使用されるとき、「特異的送達」という用語は、本明細書に開示される医薬組成物（例えば、ナノ粒子形態）による、目的の標的組織（例えば、腫瘍）への、標的外組織（例えば、哺乳動物の肝臓）へと比較してより多くの（例えば、少なくとも１．５倍多い、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い）、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの送達を意味する。
【０１２６】
特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルは、例えば、
（ｉ）組織の重量に対する、組織内の、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドから発現されるタンパク質の量、
（ｉｉ）組織の重量に対する、組織内のポリヌクレオチドの量、または
（ｉｉｉ）組織内の総タンパク質の量に対する、組織内の、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドから発現されるタンパク質の量
を比較することによって測定することができる。
【０１２７】
腫瘍または腫瘍内の特定のクラスの細胞への特異的な送達は、医薬組成物を対象に投与したときに、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、標的到達地（例えば、標的組織）に、他の標的外到達地と比べて高い比率で送達されることを示す。
【０１２８】
本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む医薬組成物（例えば、ナノ粒子形態）を腫瘍に投与する場合に、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを腫瘍内に送達するための方法を提供する。腫瘍内投与は、
（ｉ）腫瘍におけるＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの保持の増大、
（ｉｉ）腫瘍における発現されるポリペプチドのレベルの、腫瘍周囲組織における発現されるポリペプチドのレベルと比較した、増大、
（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドまたは発現される産物の標的外組織（例えば、腫瘍周囲組織、または遠位位置、例えば、肝臓組織への）への漏出の減少、ならびに
（ｉｖ）これらの任意の組合せ
からなる群から選択される１つまたは複数の特性を示し得、
ここで、ある特性に関して観察される増大または減少とは、対応する参照組成物（例えば、式（Ｉ）の化合物が存在しないか、または別のイオン化可能アミノ脂質、例えば、ＭＣ３によって置換されている、組成物）と比べたものである。
【０１２９】
一実施形態では、漏出の減少は、非腫瘍組織、例えば、腫瘍周囲組織、または別の組織もしくは器官、例えば、肝臓組織におけるポリペプチドの発現に対する、腫瘍におけるポリペプチドの発現の比の減少として定量化することができる。
【０１３０】
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物を使用することにより結果として生じる送達における別の特性は、他の脂質成分を使用して同じ治療剤または治療剤をコードするポリヌクレオチドを送達した場合に観察される免疫応答に対する、免疫応答の低減である。
【０１３１】
したがって、本開示は、対象の腫瘍組織における治療剤（例えば、医薬組成物の一部として投与されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは投与の結果として発現されるポリペプチド）の保持を増大させる方法であって、本明細書に開示される医薬組成物を、腫瘍組織に腫瘍内投与するステップを含み、腫瘍組織における治療剤の保持が、対応する参照組成物（例えば、ＭＣ３）を投与した後の腫瘍組織における治療剤の保持と比較して増大する、方法を提供する。
【０１３２】
対象の腫瘍組織におけるポリヌクレオチドの保持を増大させる方法であって、本明細書に開示される医薬組成物を、腫瘍組織に腫瘍内投与するステップを含み、腫瘍組織におけるポリヌクレオチドの保持が、対応する参照組成物（例えば、ＭＣ３）を投与した後の腫瘍組織におけるポリヌクレオチドの保持と比較して増大する方法もまた、提供される。
【０１３３】
対象の腫瘍組織における発現されるポリペプチドの保持を増大させる方法であって、本明細書に開示される医薬組成物を、腫瘍組織に投与するステップを含み、医薬組成物が、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、腫瘍組織における発現されるポリペプチドの保持が、対応する参照組成物（例えば、ＭＣ３）を投与した後の腫瘍組織におけるポリペプチドの保持と比較して増大する、方法もまた、提供される。
【０１３４】
本開示はまた、それを必要とする対象に腫瘍内投与されるポリヌクレオチドの発現漏出を減少させる方法であって、前記ポリヌクレオチドを、本明細書に開示される医薬組成物として腫瘍組織に腫瘍内投与するステップを含み、非腫瘍組織におけるポリペプチドの発現レベルが、対応する参照組成物（例えば、ＭＣ３）を投与した後の非腫瘍組織におけるポリペプチドの発現レベルと比較して減少する、方法を提供する。
【０１３５】
それを必要とする対象に腫瘍内投与される治療剤（例えば、医薬組成物の一部として投与されるポリペプチド）の発現漏出を減少させる方法であって、治療剤を、本明細書に開示される医薬組成物として腫瘍組織に腫瘍内投与するステップを含み、非腫瘍組織における治療剤の量が、対応する参照組成物（例えば、ＭＣ３）を投与した後の非腫瘍組織における治療薬の量と比較して減少する、方法もまた、提供される。
【０１３６】
対象の腫瘍における発現されるポリペプチドの発現漏出を減少させる方法であって、腫瘍組織に、本明細書に開示される医薬組成物を投与するステップを含み、医薬組成物が、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、非腫瘍組織における発現されるポリペプチドの量が、対応する参照組成物（例えば、ＭＣ３）を投与した後の非腫瘍組織における発現されるポリペプチドの量と比較して減少する、方法もまた、提供される。
【０１３７】
一部の実施形態では、非腫瘍組織は、腫瘍周囲組織である。他の実施形態では、非腫瘍組織は、肝臓組織である。
【０１３８】
本開示はまた、医薬組成物、例えば、当技術分野において公知の脂質を含む医薬組成物の腫瘍内投与によって引き起こされる免疫応答を、そのような組成物中の１つまたはすべての脂質を式（Ｉ）の化合物で置き換えることによって、低減または予防するための方法を提供する。例えば、ＭＣ３（または当技術分野において公知の他の脂質）を含む医薬組成物におけるＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与によって引き起こされる免疫応答は、ＭＣ３を、式（Ｉ）の化合物、例えば、化合物１８で置き換えることによって、予防（回避）または緩和することができる。
【０１３９】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本明細書に開示される医薬組成物において投与した後に観察される免疫応答は、治療剤、またはＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、もしくはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または別の生理学的緩衝溶液（例えば、リンガー溶液、タイロード溶液、ハンクス平衡塩類溶液など）において投与した場合に観察される免疫応答と比較して、上昇しない。
【０１４０】
一部の実施形態では、治療剤、またはＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、もしくはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本明細書に開示される医薬組成物において投与した後に観察される免疫応答は、ＰＢＳまたは別の生理学的緩衝溶液を単独で投与した場合に観察される免疫応答と比較して、上昇しない。
【０１４１】
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物を対象に腫瘍内投与した場合に、免疫応答は観察されない。
【０１４２】
したがって、本開示はまた、それを必要とする対象に、治療剤、またはＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、もしくはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達する方法であって、対象に、本明細書に開示される医薬組成物を腫瘍内投与するステップを含み、医薬組成物の投与によって引き起こされる免疫応答が、
（ｉ）ＰＢＳ単独または別の生理学的緩衝溶液（例えば、リンガー溶液、タイロード溶液、ハンクス平衡塩類溶液など）、
（ｉｉ）ＰＢＳまたは別の生理学的緩衝溶液における、治療剤、またはＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、もしくはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは
（ｉｉｉ）対応する参照組成物、すなわち、式（Ｉ）の化合物が、別のイオン化可能アミノ脂質、例えば、ＭＣ３で置換された、同じ医薬組成物
の腫瘍内投与によって引き起こされる免疫応答と比較して、上昇しない方法を提供する。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、投与により、がんが処置される。
【０１４４】
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、腫瘍内、腸内、胃腸内、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（硬膜上）、脳内（大脳内に）、側脳室内（脳室内に）、皮膚上（皮膚の上への適用）、皮内（皮膚そのものに）、皮下（皮膚の下に）、鼻内投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈の中に）、腹腔内（腹膜に）、動脈内（動脈の中に）、筋肉内（筋肉の中に）、心臓内（心臓の中に）、骨内注入（骨髄の中に）、髄腔内（脊柱管に）、腹腔内（腹膜への注入もしくは注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通じて）、空洞内注射（陰茎の基底部に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分配のための無傷な皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、吹送（吸飲）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上）、または点耳を含むがこれらに限定されない、利用可能な任意の経路で投与され得る。他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、非経口（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、腫瘍内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、および頭蓋内への注射もしくは注入技法を含む）、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸内、鼻内、頬内、膣内、または埋込み型リザーバーを介して、投与される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、組成物、またはポリペプチドは、皮下、静脈内、腹腔内、腫瘍内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、皮内、病巣内、頭蓋内、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸内、鼻内、頬内、膣内、または埋込み型リザーバーを介して、投与される。１つの特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、腫瘍内投与される。
【０１４５】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポンプを備えるデバイス、パッチ、薬物リザーバー、短ニードルデバイス、単一ニードルデバイス、多ニードルデバイス、マイクロニードルデバイス、ジェット式注射デバイス、弾道的粉末／粒子送達デバイス、カテーテル、ルーメン、凍結プローブ、カニューレ、マイクロカニューレ、または熱、ＲＦエネルギー、電流を利用するデバイス、またはこれらの任意の組合せによって送達される。
【０１４６】
本開示の他の態様は、ポリヌクレオチドを含有する細胞の、哺乳動物対象への移植に関する。細胞の、哺乳動物対象への投与は、当業者には公知であり、これには、局所的埋込み（例えば、局所もしくは皮下投与）、器官送達または全身注射（例えば、静脈内注射もしくは吸入）、および薬学的に許容される担体における細胞の製剤化が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、約０．１０μｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの量で投与される。
【０１４８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、対象の細胞におけるＩＬ１２の発現をもたらす。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、対象におけるＩＬ１２活性の増大をもたらす。例えば、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびにＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または製剤を対象に投与する方法において使用され、ここで、この方法は、対象の少なくとも一部の細胞においてＩＬ１２活性の増大をもたらす。
【０１４９】
一部の実施形態では、対象に対するＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、およびＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物又は製剤の投与は、正常対象において予測される活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％またはそれより大きなレベルまでの細胞対象におけるＩＬ１２活性の増大をもたらす。
【０１５０】
本開示の他の実施形態はまた、それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、対象に、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびにＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを、１つまたは複数の抗がん剤とともに投与するステップ（例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に）を含む、方法を提供する。
【０１５１】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびにＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズを低減するか、または腫瘍の成長を阻害するために使用することができる。
【０１５２】
一部の実施形態では、腫瘍は、疾患、障害、および／または状態と関連している。特定の実施形態では、疾患、障害、および／または状態は、がんである。したがって、一態様では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびにＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の投与により、がんが処置される。
【０１５３】
「がん」は、身体における異常な細胞の無制御な成長により特徴付けられる様々な疾患の広範な群を指す。制御されない細胞の分裂および成長は、近傍の組織に侵入し、またリンパ系または血流を通じて身体の遠位部分に転移し得る、悪性腫瘍の形成をもたらす。「がん」または「がん組織」は、様々なステージの腫瘍を含み得る。ある特定の実施形態では、がんまたは腫瘍は、ステージ０であり、その場合、例えば、がんまたは腫瘍は、発達の非常に初期にあり、転移はしていない。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、ステージＩであり、その場合、例えば、がんまたは腫瘍は、比較的サイズが小さく、近傍の組織に拡がっておらず、転移していない。他の実施形態では、がんまたは腫瘍は、ステージＩＩまたはステージＩＩＩであり、その場合、例えば、がんまたは腫瘍は、ステージ０またはステージＩよりも大きく、成長して近傍の組織に入っているが、リンパ節への可能性を除き転移はしていない。他の実施形態では、がんまたは腫瘍は、ステージＩＶであり、その場合、例えば、がんまたは腫瘍は、転移している。ステージＩＶはまた、進行性がんまたは転移性がんとも称され得る。
【０１５４】
一部の態様では、がんは、これらに限定されないが、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳のがん、乳がん、小児がん、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭がんおよび下咽頭がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口咽頭のがん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟部組織における肉腫、基底および扁平細胞皮膚がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウイルムス腫瘍、がんの処置によって引き起こされる続発性がん、ならびにこれらの任意の組合せを含み得る。
【０１５５】
一部の態様では、腫瘍は、固形腫瘍である。「固形腫瘍」としては、肉腫、黒色腫、癌腫、または他の固形腫瘍がんが挙げられるが、これらに限定されない。「肉腫」は、胚結合組織のような物質からできた腫瘍を指し、通常、線維性物質または均質な物質に包埋された緊密に詰まった細胞から構成される。肉腫としては、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバメシー肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、包巣状軟部肉腫（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｓｏｆｔ  ｐａｒｔ  ｓａｒｃｏｍａ）、エナメル上皮肉腫、ブドウ状横紋筋肉腫、緑色肉腫（ｃｈｌｏｒｏｍａ  ｓａｒｃｏｍａ）、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉細胞腫肉腫、傍骨性骨肉腫、網状赤血球肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、または末梢血管拡張性肉腫（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｌｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
「黒色腫」という用語は、皮膚または他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を指す。黒色腫としては、例えば、末端性黒子性黒色腫（ａｃｒａ−ｌｅｎｔｉｇｉｎｏｕｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディングパッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子性黒色腫、悪性黒色腫、転移性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、および表在拡大型黒色腫が挙げられる。
【０１５７】
「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤し、転移を生じる傾向にある上皮細胞からできた、悪性の新成長を指す。例示的な癌腫としては、例えば、腺房癌、小葉癌、腺嚢癌、腺様嚢胞癌、腺腫様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質の癌腫、肺胞上皮癌、肺胞上皮細胞癌、基底細胞癌（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌、基底扁平上皮細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、脳状癌（ｃｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管細胞癌、絨毛膜癌、膠様癌、面疱癌、体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱状癌、円柱細胞癌、管癌、緻密性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｄｕｒｕｍ）、胎児性癌、脳様癌、類表皮癌、咽頭扁桃上皮癌、外方増殖性癌、潰瘍癌、線維性癌、ゼラチン性癌、ゼラチン状癌、巨細胞癌（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血様癌（ｈｅｍａｔｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子状癌、副腎様癌（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、幼児型胎児性癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロンペッカー癌（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチツキー細胞癌（Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ−ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫性癌、リンパ上皮癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌、軟性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｌｌｅ）、粘液性癌（ｍｕｃｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘表皮癌、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液癌（ｍｕｃｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様癌、上咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、髄質様癌、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、硬癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌（ｓｏｌａｎｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、球状細胞癌、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、紐状癌（ｓｔｒｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、毛細血管拡張性癌、毛細血管拡張様癌、移行細胞癌、結節癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌（ｔｕｂｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌、または絨毛癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｖｉｆｌｏｓｕｍ）が挙げられる。
【０１５８】
処置することができるさらなるがんは、例えば、白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳がん、卵巣がん、肺がん、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃がん、結腸がん、悪性膵臓インスリノーマ（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｓｕｌａｎｏｍａ）、悪性カルチノイド、膀胱がん、前悪性皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、乳頭様甲状腺がん、神経芽細胞腫、神経内分泌がん、食道がん、泌尿生殖器管がん、悪性高カルシウム血症、子宮頸がん、子宮内膜がん、副腎皮質がん、前立腺がん、ミュラー管がん、卵巣がん、腹膜がん、卵管がん、または子宮漿液性乳頭状癌（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）が挙げられる。
２．組合せ療法
【０１５９】
本開示は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするＯＲＦ（例えば、ｍＲＮＡ）を含むポリヌクレオチド、または組合せ療法としての、すなわち、任意の他の抗がん剤との組合せでのその使用をさらに含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードし、ポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦ、または組合せ療法としての、すなわち、任意の他の抗がん剤との組合せでのその使用を含む。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、本開示は、１つもしくは複数の抗がん剤と組み合わせた、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、もしくはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド、または対象への１つもしくは複数の抗がん剤と組み合わせたポリヌクレオチドの使用を対象とする。一実施形態では、組合せ療法は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドと、１つまたは複数の標準的な治療法との組合せであり得る。別の実施形態では、本開示の方法は、２つの追加の抗がん剤、３つの追加の薬剤、４つの追加の薬剤などを含む。追加の抗がん剤は、タンパク質、例えば、抗体、またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗がん剤は、ｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の抗がん剤は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡである。他の実施形態では、１つまたは複数の抗がん剤は、腫瘍抗原でも腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡでもない。他の実施形態では、１つまたは複数の抗がん剤は、タンパク質、例えば、抗体である。
【０１６１】
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗がん剤は、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって承認された薬剤である。他の実施形態では、１つまたは複数の抗がん剤は、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって予備承認された（ｐｒｅ−ａｐｐｒｏｖｅｄ）薬剤である。
【０１６２】
当業者であれば、本開示の代替的な実施形態には、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質として、ＩＬ１２と、任意の他の薬剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはＯＸ４０Ｌとの組合せ療法が含まれることも認識するであろう。例えば、本開示は、（ｉ）ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）と抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むタンパク質、（ｉｉｉ）ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）と抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む第２のタンパク質、または（ｉｖ）ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）とＯＸ４０Ｌを含む第２のタンパク質の組合せ療法を包含する。他の実施形態では、ＩＬ１２はまた、タンパク質として投与することもできる。
【０１６３】
他の実施形態では、追加の薬剤は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡと一緒に製剤化されてもよく、または別個に製剤化されてもよい。さらに、別個に製剤化される場合であっても、追加の薬剤は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドと同時または逐次的に投与することができる。一実施形態では、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドは、第２の薬剤の前に投与される。別の実施形態では、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドは、第２の薬剤の後に投与される。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、追加の薬剤、例えば、本明細書に開示される任意の抗体またはＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドもまた、腫瘍内投与される。他の実施形態では、第２の薬剤、例えば、本明細書に開示される任意の抗体またはＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドは、異なる経路を介して、例えば、静脈内、皮下、腹腔内などで投与される。
【０１６５】
一部の態様では、本方法または組成物の対象は、１つまたは複数の標準的な治癒療法による処置を受けている。別の態様では、本方法または組成物の対象は、１つまたは複数の標準的な治癒療法または抗がん療法に対して応答性ではなかった。一態様では、対象は、これまでに、ＩＬ１２タンパク質またはＩＬ１２  ＤＮＡ遺伝子療法により処置されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、抗ＰＤ−１アンタゴニストまたは抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニストで処置される。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＰＤ−１に結合するモノクローナル抗体で、および／または本開示のポリヌクレオチドの前に、ＣＴＬＡ−４に結合するモノクローナル抗体で処置されている。別の態様では、対象は、本方法または組成物のポリヌクレオチドの前に、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体療法で処置されている。
【０１６６】
近年、治療目的での免疫チェックポイント阻害剤の導入は、がんの処置に革命を起こした。チェックポイント阻害剤と、他の共刺激または阻害性分子との組合せを特徴とする治療法に、関心が持たれている。
【０１６７】
Ｔ細胞の制御、すなわち、活性化または阻害は、共刺激シグナルまたは共阻害性シグナルによって媒介される。この相互作用は、リガンド／受容体の相互作用を介して発生する。Ｔ細胞は、ＯＸ４０などの活性化受容体およびプログラム死受容体１（ＰＤ−１）または細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）などの阻害性受容体（すなわち、免疫チェックポイント）の両方を無数に保有している（Ｍｅｌｌｍａｎら、２０１１年、Ｎａｔｕｒｅ．、４８０巻、４８０〜４８９頁）。この免疫チェックポイントの活性化は、Ｔ細胞の脱活性化をもたらし、腫瘍細胞によりこれらの経路が奪われることは、腫瘍細胞の免疫脱出の成功に寄与する。
【０１６８】
一部の実施形態では、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズを低減するか、または腫瘍の成長を阻害する方法は、対象に、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、有効量の組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
【０１６９】
一部の実施形態では、方法は、第２の薬剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、当該分野において公知または本明細書に記載される任意のチェックポイント阻害剤である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体である。一部の実施形態では、第２の薬剤は、ＯＸ４０ＬをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、本明細書に開示の任意の他の薬剤、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤を含む組成物は、１つより多くのチェックポイント阻害剤を含む。１つの特定の実施形態では、本方法は、（ｉ）本明細書に開示されるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ならびに（ｉｉ）抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せを投与することを含む。
【０１７０】
一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗体の抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその抗原結合断片であるＰＤ−１に特異的に結合する抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合断片であるＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合断片であるまたはそれらの組合せである。一実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片である。他の実施形態では、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体は、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合断片である。他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体は、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合断片である。
【０１７１】
プログラム死受容体１／プログラム死リガンド１（ＰＤ−１／ＰＤＬ−１）とＰＤＬ−２との間の相互作用を標的とするペンブロリズマブまたはニボルマブなどの免疫チェックポイント阻害剤は、近年、様々な悪性腫瘍の処置に関して承認されており、現在、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）を含むがんに関して臨床試験で調査が行われている。これらの試験から得られるデータは、これらの患者集団において、好ましい安全性および毒性プロファイルを伴った、実質的な活性を示す。
【０１７２】
例えば、チェックポイント阻害剤は、黒色腫の処置に関して、臨床試験で試験されている。特に、フェーズＩＩＩの臨床試験では、それぞれ、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１免疫チェックポイントを標的とするイピリムマブおよびペンブロリズマブなどの治療法が、黒色腫を有する患者の３年生存率を、約７０％に引き上げ、全生存率（５年を上回る）を約３０％に引き上げたことが明らかとなっている。
【０１７３】
同様に、チェックポイント阻害剤は、頭頸部がんの処置に関して、臨床試験で試験されている。前臨床研究では、ＨＮＳＣＣ腫瘍の４５〜８０％が、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）を発現することが示されている（Ｚａｎｄｂｅｒｇら、（２０１４年）、Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．、５０巻、６２７〜６３２頁）。現在のところ、ＨＮＳＣＣにおいて単剤療法としてまたは組合せレジメンで免疫チェックポイント阻害剤の有効性および安全性を評価する臨床試験が、数十存在している。例えば、ＰＤ  １、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ−４阻害剤による臨床試験が、ＨＮＳＣＣにおいて試験されている。ＰＤ−１抗体ペンブロリズマブが、転移性／再発性（Ｒ／Ｍ）ＨＮＳＣＣ患者において有効であり得るというデータが、フェーズ１ｂ、Ｋｅｙｎｏｔｅ−０１２フェーズＩ／ＩＩ試験で得られている（Ｃｈｅｎｇ．  ＡＳＣＯ、２０１５年、口頭発表）。より最近では、無作為化ＣｈｅｃｋＭａｔｅ−１４１フェーズＩＩＩ臨床試験のデータが、提示された（Ｇｉｌｌｉｓｏｎ．  ＡＡＣＲ、２０１６年、口頭発表）。この研究では、白金−不応性Ｒ／Ｍ  ＨＮＳＣＣ患者において２週間ごとに提供されるモノクローナルＰＤ−１抗体ニボルマブの有効性が調査された。この研究は、この研究のニボルマブアームの優位性に起因して、早期に終了した。
【０１７４】
一態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＰＤ−１アンタゴニストで以前に処置されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＰＤ−１に結合するモノクローナル抗体で処置されている。別の態様では、対象は、本方法または組成物のポリヌクレオチドの前に、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体療法で処置されている。他の態様では、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体療法は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、またはこれらの任意の組合せを含む。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＰＤ−Ｌ１に結合するモノクローナル抗体で処置されている。別の態様では、対象は、本方法または組成物のポリヌクレオチドの前に、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体で処置されている。他の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体療法は、デュルバルマブ、アベルマブ、ＭＥＤＩ４７３、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ（ａｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、またはこれらの任意の組合せを含む。
【０１７５】
一部の態様では、対象は、本開示の組成物での処置の前に、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストで処置されている。別の態様では、対象は、本開示の組成物の前に、ＣＴＬＡ−４に結合するモノクローナル抗体で以前に処置されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体で処置されている。他の態様では、抗ＣＴＬＡ−４抗体療法は、イピリムマブまたはトレメリムマブを含む。
【０１７６】
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法および／またはその対象における免疫療法の方法であって、対象に、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体と組み合わせて投与するステップ（例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に）を含み、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、デュルバルマブ、アベルマブ、ＭＥＤＩ４７３、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ、またはこれらの任意の組合せを含む、方法を対象とする。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、本開示に有用な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブとも称される；ＵＳ２０１４／０３４１９１７を参照されたい）またはＢＭＳ−９３６５５９（以前の１２Ａ４またはＭＤＸ−１１０５）（例えば、米国特許第７，９４３，７４３号、ＷＯ２０１３／１７３２２３を参照されたい）である。他の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）としても公知である）である。他の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ、ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）、およびＲＧ７４４６としても公知である）（例えば、Ｈｅｒｂｓｔら、（２０１３年）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３１（付録）：３０００．要約；米国特許第８，２１７，１４９号）、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブとも称される；Ｋｈｌｅｉｆ（２０１３年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ２０１３、２０１３年９月２７日〜１０月１日、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓである。
【０１７８】
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法および／またはその対象における免疫療法の方法であって、対象に、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、例えば、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体と組み合わせて、投与するステップ（例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に）を含む、方法を対象とする。
【０１７９】
一実施形態では、本開示に有用な抗ＰＤ−１抗体（またはその抗原結合性部分）は、ペンブロリズマブである。ペンブロリズマブ（「ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）」、ランブロリズマブ、およびＭＫ−３４７５としても公知である）は、ヒト細胞表面受容体ＰＤ−１（プログラム死−１またはプログラム細胞死−１）を対象とするヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体である。ペンブロリズマブは、例えば、米国特許第８，９００，５８７号に記載されており、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ？ｃｄｒｉｄ＝６９５７８９（最終アクセス：２０１４年１２月１４日）も参照されたい。ペンブロリズマブは、再発性または不応性黒色腫および進行性ＮＳＣＬＣの処置に関して、ＦＤＡによって承認されている。
【０１８０】
別の実施形態では、本開示に有用な抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブである。ニボルマブ（「ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）」としても公知であり、以前は５Ｃ４、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、またはＯＮＯ−４５３８と表記されていた）は、ＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）との相互作用を選択的に予防し、それによって抗腫瘍Ｔ細胞機能の下方制御を遮断する、完全ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤抗体である（米国特許第８，００８，４４９号、Ｗａｎｇら、２０１４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．、２巻（９号）、８４６〜５６頁）。ニボルマブは、腎細胞癌（腎臓腺癌、または副腎腫）、黒色腫、および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む様々な進行性固形腫瘍において、活性を示している（Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１２ａ；Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１４年；Ｄｒａｋｅら、２０１３年；ＷＯ２０１３／１７３２２３。
【０１８１】
他の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＭＥＤＩ０６８０（以前のＡＭＰ−５１４）であり、これは、ＰＤ−１受容体に対するモノクローナル抗体である。ＭＥＤＩ０６８０は、例えば、米国特許第８，６０９，０８９号Ｂ２またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ？ｃｄｒｉｄ＝７５６０４７（最終アクセス、２０１４年１２月１４日）に記載されている。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＢＧＢ−Ａ３１７であり、これは、ヒト化モノクローナル抗体である。ＢＧＢ−Ａ３１７は、米国公開第２０１５／００７９１０９号に記載されている。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、ＡＭＰ−２２４であり、これは、Ｂ７−ＤＣ  Ｆｃ融合タンパク質である。ＡＭＰ−２２４は、米国公開第２０１３／００１７１９９号またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ／ｃａｎｃｅｒ−ｄｒｕｇ？ｃｄｒｉｄ＝７００５９５（最終アクセス２０１５年７月８日）において考察されている。
【０１８４】
他の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法および／またはその対象における免疫療法の方法であって、対象に、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、例えば、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体と一緒に投与するステップ（例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に）を含み、例えば、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、またはこれらの任意の組合せを含む、方法を含む。
【０１８５】
他の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法および／またはその対象における免疫療法の方法であって、対象に、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、例えば、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体と組み合わせて投与するステップ（例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に）を含み、例えば、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体は、イピリムマブもしくはトレメリムマブ、またはこれらの任意の組合せを含む、方法を対象とする。
【０１８６】
例示的な臨床抗ＣＴＬＡ−４抗体は、米国特許第６，９８４，７２０号に開示されているヒトｍＡｂ  １０Ｄ１（現在では、イピリムマブとして公知であり、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）として販売されている）である。本方法に有用な別の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６としても公知である）である。トレメリムマブは、ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗ＣＴＬＡ−４抗体である。トレメリムマブは、ＷＯ２０１２／１２２４４４、米国公開第２０１２／２６３６７７号、または国際公開第２００７／１１３６４８号Ａ２に記載されている。
【０１８７】
一実施形態では、ＩＬ１２をコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、第１のｍＲＮＡ）およびＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、第２のｍＲＮＡ）は、組み合わせて投与される。別の実施形態では、ＩＬ１２をコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、第１のｍＲＮＡ）およびＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、第２のｍＲＮＡ）は、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分、ＰＤ−１受容体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分、またはＰＤ−Ｌ１受容体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分と組み合わせて、投与される。
【０１８８】
一実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、第１のｍＲＮＡ）およびＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、第２のｍＲＮＡ）は、ＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１受容体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分、またはそれをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、投与される。
【０１８９】
別の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、第１のｍＲＮＡ）およびＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、第２のｍＲＮＡ）は、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分またはそれをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、投与される。
【０１９０】
さらに別の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、第１のｍＲＮＡ）およびＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、第２のｍＲＮＡ）は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分およびＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分（またはそれらのポリヌクレオチド）と組み合わせて、投与される。
【０１９１】
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、（ｉ）ＩＬ１２をコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、第１のｍＲＮＡ）、および（ｉｉ）ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分をコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、第２のｍＲＮＡ）を、単一の製剤に含む。
【０１９２】
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドおよびＯＸ４０Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、単一の製剤に含む。
【０１９３】
ヒトＯＸ４０Ｌは、Ｔａｎａｋａらによって、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に感染したヒトリンパ球の表面上において、初めて特定された（Ｔａｎａｋａら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（１９８５年）、３６巻（５号）、５４９〜５５頁）。ＯＸ４０Ｌは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）のリガンドである。ＯＸ４０Ｌは、ＣＤ２５２（分化クラスター２５２）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー４、ｔａｘ転写により活性化される糖タンパク質１、ＴＸＧＰ１、またはｇｐ３４とも表記されていた。ヒトＯＸ４０Ｌは、１８３アミノ酸長であり、アミノ酸１〜２３の細胞質ドメイン、アミノ酸２４〜５０の膜貫通ドメイン、およびアミノ酸５１〜１８３の細胞外ドメインという３つのドメインを含有する。
【０１９４】
一部の実施形態では、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドと組み合わせられ得るＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物のＯＸ４０ＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、哺乳動物のＯＸ４０Ｌポリペプチドは、マウスＯＸ４０Ｌポリペプチドである。一部の実施形態では、哺乳動物のＯＸ４０Ｌポリペプチドは、ヒトＯＸ４０Ｌポリペプチドである。一部の実施形態では、ＯＸ４０Ｌポリペプチドは、表１に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１９５】
一部の実施形態では、本開示の各ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、すなわち、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよびＯＸ４０ＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、哺乳動物のＩＬ１２ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＯＸ４０ＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、哺乳動物のＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、マウスＩＬ１２ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＯＸ４０ＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、マウスＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ヒトＩＬ１２ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＯＸ４０ＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ヒトＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする。
【０１９６】
一部の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドは、表４に示されるヒトアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＯＸ４０Ｌポリペプチドは、表１に示されるヒトアミノ酸配列を含む。
【０１９７】
一部の実施形態では、ＯＸ４０Ｌポリペプチドは、表１に列挙されるアミノ酸配列または表１に列挙されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列はＯＸ４０受容体に結合することができる。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるＯＸ４０Ｌポリペプチドは、１つまたは複数の保存的置換を有する、表１に列挙されるアミノ酸配列を含み、ここで、この保存的置換は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドのその受容体への結合活性に有意に影響を及ぼさない、すなわち、ＯＸ４０Ｌポリペプチドは、置換後にＯＸ４０受容体に結合する。
【０１９９】
他の実施形態では、ＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、ｍＲＮＡ）は、表１に列挙される核酸配列に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である配列を含む。当業者であれば、配列が、本出願において、ＤＮＡの形態（チミジンを含有する）で記述されている場合、対応するＲＮＡ配列は、チミジンの代わりにウリジンを含有することを理解する。
【０２００】
一部の実施形態では、本方法および組成物に有用なポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＯＸ４０Ｌの細胞質ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＯＸ４０Ｌの膜貫通ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインおよびＯＸ４０Ｌの膜貫通をコードするオープンリーディングフレームを含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインおよびＯＸ４０Ｌの細胞質ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン、ＯＸ４０Ｌの膜貫通、およびＯＸ４０Ｌの細胞質ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。
【０２０１】
表１は、例えば、ＯＸ４０Ｌの前駆体および成熟配列、ならびにＯＸ４０Ｌ配列を含む構築物を提示する。さらに、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドを含み、３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲなどの構成要素をさらに含む、構築物は、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドと考えられるであろう。当業者であれば、表１に開示される天然のシグナル配列およびプロペプチド配列（前駆体では存在しており、対応する成熟形態では不在である、配列）ならびに表１に開示される非天然のシグナルペプチドに加えて、その他のシグナル配列が使用され得ることを理解するであろう。したがって、表１によるＯＸ４０Ｌポリペプチドまたはポリヌクレオチドへの言及は、当技術分野において公知の代替的なシグナルペプチド（またはコーディング配列）がＯＸ４０Ｌポリペプチド（またはポリヌクレオチド）に結合されているバリアントを包含する。本出願全体を通じて、表１に開示される配列への言及は、本出願が出願された時点で当技術分野において公知のそれらの配列のオルソログおよび機能的バリアント（例えば、多形体バリアント）ならびにアイソフォームにも同等に適用可能であり、それらを包含することも、理解されたい。
【表１−１】
2019516710.tif 000006
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
2019516710.tif 000011
【表１−７】
2019516710.tif 000012
【表１−８】
2019516710.tif 000013
【表１−９】
2019516710.tif 000014
３．インターロイキン−１２（ＩＬ１２）
【０２０２】
ＩＬ１２（ＩＬ−１２とも示される）は、多面的サイトカインであり、その作用により、自然免疫と獲得免疫との間の相互接続が形成される。ＩＬ１２は、主として、ｐ３５およびｐ４０というジスルフィド結合された２つのサブユニットからなる、７０ｋＤａのヘテロダイマータンパク質として機能する。ＩＬ１２  ｐ４０サブユニット（ＮＭ＿００２１８７；Ｐ２９４６０；ＩＬ１２Ｂ、ナチュラルキラー細胞刺激因子２、細胞傷害性リンパ球成熟因子２とも称される）の前駆体形態は、３２８アミノ酸長であるが、その成熟形態は、３０６アミノ酸長である。ＩＬ１２  ｐ３５サブユニット（ＮＭ＿０００８８２；Ｐ２９４５９；ＩＬ１２Ａ、ナチュラルキラー細胞刺激因子１、細胞傷害性リンパ球成熟因子１とも称される）の前駆体形態は、２１９アミノ酸長であり、成熟形態は、１９７アミノ酸長である。（同書）。ＩＬ１２  ｐ３５およびｐ４０サブユニットの遺伝子は、異なる染色体に存在し、互いに独立して制御されている。Ｇａｔｅｌｙ，  ＭＫら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻：４９５〜５２１頁（１９９８年）。多数の異なる免疫細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、およびＢ細胞）は、抗原刺激時にＩＬ１２を産生する。活性なＩＬ１２ヘテロダイマーは、タンパク質合成後に形成される。（同書）。
【０２０３】
ＩＬ１２は、４つのアルファヘリックスのバンドルから構成される。これは、２つの別個の遺伝子であるＩＬ１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ１２Ｂ（ｐ４０）によってコードされるヘテロダイマーサイトカインである。活性なヘテロダイマー（「ｐ７０」と称される）およびｐ４０のホモダイマーが、タンパク質合成後に形成される。
【０２０４】
したがって、一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２ポリペプチドは、直接またはリンカーによって融合されたＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａを含む、単一のポリペプチド鎖を含む。他の実施形態では、本開示のＩＬ１２ポリペプチドは、ＩＬ１２Ｂを含む第１のポリペプチドおよびＩＬ１２Ａを含む第２のポリペプチドという２つのポリペプチドを含む。ある特定の態様では、本開示は、ＩＬ１２ＡポリペプチドおよびＩＬ１２Ｂポリペプチドを提供し、ＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂポリペプチドは、同じ鎖にあるか、または異なる鎖にある。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２ＡまたはＩＬ１２Ｂポリペプチドは、野生型ＩＬ１２ＡまたはＩＬ１２Ｂ配列に対する置換、ならびに挿入および／または付加、欠失および／または共有結合修飾を含有する、バリアント、ペプチド、またはポリペプチドである。一部の実施形態では、配列タグ（エピトープタグ、例えば、Ｖ５タグなど）またはアミノ酸が、例えば、局在化のために、本開示のポリヌクレオチドによってコードされる配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）付加されてもよい。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドのカルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域に位置するアミノ酸残基を、任意選択で、欠失させて、断片を得てもよい。
【０２０５】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）によってコードされるＩＬ１２Ａおよび／またはＩＬ１２Ｂポリペプチドは、ＩＬ１２Ａおよび／またはＩＬ１２Ｂ配列の置換バリアントを含み、このバリアントは、１つ、２つ、３つ、またはそれより多くの置換を含み得る。一部の実施形態では、置換バリアントは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含み得る。他の実施形態では、バリアントは、挿入バリアントである。他の実施形態では、バリアントは、欠失バリアントである。
【０２０６】
他の実施形態では、ＩＬ１２Ａおよび／またはＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂポリペプチドを融合するリンカーを含む。リンカーの非限定的な例は、本明細書の他の箇所に開示されている。
【０２０７】
本開示の一部の態様は、ヒトＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む脂質ナノ粒子であって、ポリヌクレオチドが、ヒトＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたヒトＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、脂質ナノ粒子を対象とする。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、ペプチドリンカーによって、ＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、ＩＬ１２Ａポリペプチドまたはペプチドリンカーの５’末端に位置する。他の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチドは、ＩＬ１２Ｂポリペプチドまたはペプチドリンカーの５’末端に位置する。
【０２０８】
当業者には理解されるように、ＩＬ１２タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、バリアント、および相同タンパク質（オルソログ）もまた、本開示のＩＬ１２ポリペプチドの範囲内にあると考えられる。本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの非限定的な例は、図１〜２に示されている。例えば、表２は、配列番号における相関するアミノ酸の番号付け、配列番号におけるヌクレオチド番号付け、ならびに５’ＵＴＲ、ＩＬ１２Ｂシグナルペプチド、成熟ＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂペプチド、ならびにリンカーを示す。
【表２】
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４．ポリヌクレオチドおよびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
【０２０９】
ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数のＩＬ１２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ、例えば、ｍＲＮＡ）を含む、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を提供する。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＩＬ−１２ポリペプチドをコードし、ここで、ポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする単一のＯＲＦを含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、直接またはリンカーによって融合されたＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２Ａポリペプチドを含む単一のＩＬ１２ポリペプチド鎖をコードし、ここで、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、
（ｉ）全長ＩＬ１２Ｂポリペプチド（例えば、野生型ＩＬ１２Ｂと同じかまたは本質的に同じ長さを有する）、
（ｉｉ）全長ＩＬ１２Ｂポリペプチドの機能的断片（例えば、ＩＬ１２Ｂ野生型よりも短いが、ＩＬ１２Ｂ酵素活性を依然として保持している、短縮型（例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列）、
（ｉｉｉ）そのバリアント（例えば、１つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている全長または短縮型ＩＬ１２Ｂタンパク質、例えば、野生型ＩＬ１２Ｂポリペプチドに対してポリペプチドのＩＬ１２Ｂ活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント（例えば、Ｖ３３Ｉ、Ｖ２９８Ｆ、または当技術分野において公知の任意の他の天然もしくは人工バリアント））、ならびに
（ｉｖ）（ｉ）全長ＩＬ１２Ｂ野生型、その機能的断片、またはバリアント、および（ｉｉ）異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される、ならびに／または
ＩＬ１２Ａポリペプチドは、
（ｖ）全長ＩＬ１２Ａポリペプチド（例えば、野生型ＩＬ１２Ａと同じかまたは本質的に同じ長さを有する）、
（ｖｉ）全長ＩＬ１２Ａポリペプチドの機能的断片（例えば、ＩＬ１２Ａ野生型よりも短いが、ＩＬ１２Ａ酵素活性を依然として保持している、短縮型（例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列）、
（ｖｉｉ）そのバリアント（例えば、１つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている全長または短縮型ＩＬ１２Ａタンパク質、例えば、ｗｔＩＬ１２Ａポリペプチドに対してポリペプチドのＩＬ１２Ａ活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント（例えば、当技術分野において公知の天然または人工バリアント））、ならびに
（ｖｉｉｉ）（ｉ）全長ＩＬ１２Ａ野生型、その機能的断片、またはバリアント、および（ｉｉ）異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される。
【０２１０】
他の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂポリペプチドを含む第１の鎖およびＩＬ１２Ａポリペプチドを含む第２の鎖という２つのポリペプチド鎖をコードし、ここで、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、
（ｉ）シグナルペプチドを有するかまたは有さない成熟ＩＬ１２Ｂポリペプチド（例えば、野生型ＩＬ１２Ｂと同じかまたは実質的に同じ長さを有する）、
（ｉｉ）成熟ＩＬ１２Ｂポリペプチドのいずれかの機能的断片（例えば、ＩＬ１２Ｂ野生型よりも短いが、依然としてＩＬ１２Ｂ酵素活性を保持する、短縮型（例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列）、
（ｉｉｉ）そのバリアント（例えば、１つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている、全長、成熟、または短縮型ＩＬ１２Ｂタンパク質、例えば、野生型ＩＬ１２Ｂポリペプチドに対して、ポリペプチドのＩＬ１２Ｂ活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント（例えば、Ｖ３３Ｉ、Ｖ２９８Ｆ、または当技術分野において公知の任意の他の天然もしくは人工バリアント））、ならびに
（ｉｖ）（ｉ）シグナルペプチドを有するかもしくは有さない、成熟ＩＬ１２Ｂ野生型、その機能的断片、もしくはバリアント、および（ｉｉ）異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される、ならびに／または
ＩＬ１２Ａは、
（ｖ）シグナルペプチドを有するかまたは有さない成熟ＩＬ１２Ａポリペプチド（例えば、野生型ＩＬ１２Ａと同じかまたは実質的に同じ長さを有する）、
（ｖｉ）野生型ＩＬ１２Ａポリペプチドのいずれかの機能的断片（例えば、ＩＬ１２Ａ野生型よりも短いが、依然としてＩＬ１２Ａ酵素活性を保持する、短縮型（例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列）、
（ｖｉｉ）そのバリアント（例えば、１つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている全長、成熟、または短縮型ＩＬ１２Ａタンパク質、例えば、参照アイソフォームに対して、ポリペプチドのＩＬ１２Ａ活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント（例えば、当技術分野において公知の天然または人工バリアント））、ならびに
（ｖｉｉｉ）（ｉ）シグナルペプチドを有するかもしくは有さない、成熟ＩＬ１２Ａ野生型、その機能的断片、もしくはバリアント、および（ｉｉ）異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、哺乳動物のＩＬ１２ポリペプチド、例えば、ヒトＩＬ１２ポリペプチド、機能的断片またはそのバリアントをコードする。
【０２１２】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、細胞に導入されたとき、これらの細胞においてＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａタンパク質発現レベルおよび／または検出可能なＩＬ１２酵素活性レベルを、本開示のポリヌクレオチドの投与前の細胞におけるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａタンパク質発現レベルおよび／または検出可能なＩＬ１２酵素活性レベルと比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも１００％だけ増大させる。ＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２Ａタンパク質の発現レベルならびに／またはＩＬ１２酵素活性は、当技術分野において公知の方法に従って測定することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に導入される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に導入される。
【０２１３】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ（図１を参照）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【０２１４】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、コドン最適化核酸配列を含み、コドン最適化核酸配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は野生型ＩＬ１２Ａおよび／またはＩＬ１２Ｂ配列に由来する。
【０２１５】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａの全長配列（すなわち、開始メチオニンおよびシグナルペプチドを含む）を有するＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａをコードするヌクレオチド配列を含む。成熟ヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａでは、開始メチオニンおよび／またはシグナルペプチドを、除去して、それぞれ、配列番号１および配列番号３のアミノ酸残基を含む「成熟ＩＬ１２Ｂ」および／または「成熟ＩＬ１２Ａ」を得ることができる。それぞれ、配列番号１は、配列番号４８のアミノ酸２３〜３２８に対応し、配列番号３は、配列番号４８のアミノ酸３３６〜５３２に対応する。ヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａの全配列を対象とする本開示の教示は、開始メチオニンおよび／またはシグナルペプチドを欠くヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａの成熟形態にも適用可能である。したがって、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａの成熟配列を有するＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａをコードするヌクレオチド配列を含む本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化されている。
【０２１６】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ配列において少なくとも１の点変異、少なくとも２の点変異、少なくとも３変異、少なくとも４変異、少なくとも５変異、少なくとも６変異、少なくとも７変異、少なくとも８変異、少なくとも９変異、または少なくとも１０変異を含み、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ酵素活性を保持するＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ（すなわち、１または複数の変異がない以外は同じ）のＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも１００％であるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ活性を有する。一部の実施形態では、変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化されている。
【０２１７】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ酵素活性を変化させない変異を有するＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。そのような変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドは、機能的に中立と称され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の機能的に中立な点変異を含む変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
【０２１８】
一部の実施形態では、変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａより高いＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ酵素活性を有する。一部の実施形態では、変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ（すなわち、１または複数の変異がない以外は同じＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ）の活性より少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも１００％高いＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ活性を有する。
【０２１９】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、機能的ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、例えば、１つもしくは複数の断片は、野生型ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドのポリペプチド部分配列に対応し、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ酵素活性を保持する。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ断片は、対応する全長ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡのＩＬ１２活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも１００％であるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ活性を有する。一部の実施形態では、機能的ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ断片をコードするＯＲＦを含む本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化されている。
【０２２０】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、対応する全長ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａよりも高いＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ酵素活性を有するＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。したがって、一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ断片は、対応する全長ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡのＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ活性より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％高いＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ活性を有する。
【０２２１】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａより少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％短いＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【０２２２】
他の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、これは、
（ｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００７、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１０、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１８またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１９のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００８のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１３、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１７のヌクレオチド６７〜９８４あるいはｈＩＬ１２ＡＢ＿００４のヌクレオチド７０〜９８７に対する少なくとも約８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００９のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００５のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３８のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３２、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３６のヌクレオチドヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｘ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２７、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２９、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３９、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３５、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３７のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２８、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３３のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１５のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；または
（ｘｉｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００６のヌクレオチド６７〜９８４に対する１００％の配列同一性
を有する。
【０２２３】
他の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、これは、
（ｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１０のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１９のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１３のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００７またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１４のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿００８のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００５のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００９のヌクレオチド１００６〜１５９６あるいはｈＩＬ１２ＡＢ＿００４のヌクレオチド１００９〜１５８９に対する少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿１７のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｘ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２９またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２７のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３９またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２５、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３５のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３７、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２２のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２６、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３８のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１１、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２８のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；または
（ｘｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００３のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する約１００％の配列同一性
を有する。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａをコードする単一のＯＲＦを含み、ＯＲＦは、
（ｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００７、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１０、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１８またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１９のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００８のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１３、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１７のヌクレオチド６７〜９８４あるいはｈＩＬ１２ＡＢ＿００４のヌクレオチド７０〜９８７に対する少なくとも約８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００９のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００５のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３８のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３２、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３６のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｘ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２７、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２９、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３９、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３５、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３７のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２８、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３３のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１５のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；または
（ｘｉｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００６のヌクレオチド６７〜９８４に対する約１００％の配列同一性；
を有する配列、ならびに
（ｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１０のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１９のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１３のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００７またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１４のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿００８のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００５のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００９のヌクレオチド１００６〜１５９６あるいはｈＩＬ１２ＡＢ＿００４のヌクレオチド１００９〜１５９９に対する少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿１７のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｘ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２９またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２７のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３９またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２５、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３５のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３７、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２２のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２６、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３８のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１１、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２８のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；または
（ｘｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００３のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する約１００％の配列同一性
を有する配列を含む。
【０２２５】
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂをコードする第１のＯＲＦおよびＩＬ１２Ａをコードする第２のＯＲＦを含み、第１のＯＲＦは、
（ｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００７、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１０、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１８またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１９のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００８のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１３、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１７のヌクレオチド６７〜９８４あるいはｈＩＬ１２ＡＢ＿００４のヌクレオチド７０〜９８７に対する少なくとも約８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００９のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００５のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３８のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３２、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３６のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｘ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２７、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２９、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３９、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３５、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３７のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２８、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３３のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１５のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０のヌクレオチド６７〜９８４に対する少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；または
（ｘｉｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００６のヌクレオチド６７〜９８４に対する約１００％の配列同一性
を有する配列を含み、かつ／または
第２のＯＲＦは、
（ｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１０のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１９のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１３のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００７またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１４のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿００８のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００５のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００９のヌクレオチド１００６〜１５９６あるいはｈＩＬ１２ＡＢ＿００４のヌクレオチド１００９〜１５９９に対する少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿１７のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｘ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２９またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２７のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３９またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２５、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３５のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３７、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２２のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉｉ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２６、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３８のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１１、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２８のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する少なくとも約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；または
（ｘｖ）  ｈＩＬ１２ＡＢ＿００３のヌクレオチド１００６〜１５９６に対する約１００％配列の配列同一性
を有する配列を含む。
【０２２６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ｈＩＬ１２ＡＢ＿００２（配列番号６）またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００２（配列番号６）として示される配列に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一であるヌクレオチド配列を含むＯＲＦを含む。
【０２２７】
一実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列（例えば、第１のＯＲＦ）およびＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列（例えば、第２のＯＲＦ）は、直接的に、またはリンカーによって融合されている。他の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列（例えば、第１のＯＲＦ）およびＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列（例えば、第２のＯＲＦ）は、互いに融合されていない。
【０２２８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂ−ＩＬ１２Ａ融合ポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号５〜４４からなる群から選択される配列に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する。表４を参照のこと。
【０２２９】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂ−ＩＬ１２Ａ融合ポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号５〜４４からなる群から選択される配列に７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、７０％〜９５％、８０％〜９５％、７０％〜８５％、７５％〜９０％、８０％〜９５％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、もしくは９５％〜１００％の配列同一性を有する。表４を参照のこと。
【０２３０】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、約９００〜約１００，０００ヌクレオチド（例えば、９００〜１，０００、９００〜１，１００、９００〜１，２００、９００〜１，３００、９００〜１，４００、９００〜１，５００、１，０００〜１，１００、１，０００〜１，１００、１，０００〜１，２００、１，０００〜１，３００、１，０００〜１，４００、１，０００〜１，５００、１，０８３〜１，２００、１，０８３〜１，４００、１，０８３〜１，６００、１，０８３〜１，８００、１，０８３〜２，０００、１，０８３〜３，０００、１，０８３〜５，０００、１，０８３〜７，０００、１，０８３〜１０，０００、１，０８３〜２５，０００、１，０８３〜５０，０００、１，０８３〜７０，０００、または１，０８３〜１００，０００）を含む。
【０２３１】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂ−ＩＬ１２Ａ融合ポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）の長さは、少なくとも５００ヌクレオチド長（例えば、少なくとも、もしくは約５００、６００、７００、８０、９００、１，０００、１，０５０、１，０８３、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００より大きい、または１００，０００を含め、これまでのヌクレオチド）である。
【０２３２】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ノンコーディングである少なくとも１つの核酸配列、例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含むＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【０２３３】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂおよび／または、一本鎖または二本鎖であるＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【０２３４】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるか、またはこれとして機能する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードし、翻訳されて、コードされたＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで産生することができる、ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【０２３５】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、送達剤、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜１４７のうちのいずれか、または化合物１〜２３２のうちのいずれかとともに、製剤化される。
【０２３６】
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）はまた、コードされるポリペプチドの、治療上関連する部位への輸送を促進する、追加の特徴をコードするヌクレオチド配列を含む。タンパク質輸送を補助する１つのそのような特徴は、シグナル配列または標的化配列である。これらのシグナル配列によってコードされるペプチドは、標的化ペプチド、輸送ペプチド、およびシグナルペプチドを含め、様々な名称で公知である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、本明細書に記載されるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードする、ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【０２３７】
一部の実施形態では、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、それぞれ、約９〜２００ヌクレオチド長（３〜７０アミノ酸）であり、任意選択で、それぞれ、コーディング領域またはポリペプチドの５’（またはＮ末端）に組み込まれた、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加により、１つまたは複数の標的化経路を通じた、コードされるポリペプチドの所望される部位、例えば、小胞体またはミトコンドリアへの輸送がもたらされる。一部のシグナルペプチドは、タンパク質が所望される部位に輸送された後に、例えば、シグナルペプチダーゼによって、タンパク質から切断される。
【０２３８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、天然のシグナルペプチドをコードする５’核酸配列をさらに含む。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、天然のシグナルペプチドをコードする核酸配列を欠く。
【０２３９】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このヌクレオチド配列は、異種シグナルペプチドをコードする５’核酸配列をさらに含む。
【０２４０】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のＯＲＦの５’末端に位置するシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。
【０２４１】
一部の実施形態では、第１のＯＲＦは、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。
【０２４２】
一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＩＬ１２Ｂシグナルペプチドである。
【０２４３】
一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号４８のアミノ酸１〜２２に少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
【０２４４】
提供されるＲＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、対応するＤＮＡ配列（例えば、ウラシルからチミンへの変換）を理解するであろう。同様に、提供されるＤＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、対応するＲＮＡ配列（例えば、チミンからウラシルへの変換）を理解するであろう。
５．キメラタンパク質
【０２４５】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、１つまたは複数の目的のポリペプチドをコードする１つより多くの核酸配列（例えば、１つより多くのＯＲＦ）を含み得る。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする単一のＯＲＦを含む。しかしながら、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、１つより多くのヌクレオチド配列、例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド（第１の目的のポリペプチド）、その機能的断片、もしくはバリアントをコードする第１のヌクレオチド配列、ＩＬ１２Ａポリペプチド（第２の目的のポリペプチド）、その機能的断片、もしくはバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列、および第３の目的のポリペプチド（例えば、ＩＬ１２に対して異種のポリペプチド）を発現する第３のヌクレオチド配列を含んでもよい。一実施形態では、第３の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、ＩＬ１２Ｂポリペプチドに融合され得る。別の実施形態では、第３の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、ＩＬ１２Ａポリペプチドに融合され得る。他の実施形態では、第３の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２Ａポリペプチドの両方に融合され得る。さらなる実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、３つより多くのヌクレオチド配列、例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド（第１の目的のポリペプチド）、その機能的断片、またはバリアントをコードする第１のヌクレオチド配列、ＩＬ１２Ａポリペプチド（第２の目的のポリペプチド）、その機能的断片、またはバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列、第３の目的のポリペプチドを発現する第３のヌクレオチド配列、および第４の目的のポリペプチドを発現する第４のヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態では、第３の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、ＩＬ１２Ａポリペプチドに融合され、第４の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、ＩＬ１２Ｂポリペプチドに融合される。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多い目的のポリペプチドは、遺伝子融合され得る、すなわち、２つまたはそれよりも多いポリペプチドは、同じヌクレオチド配列によってコードされ得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多い目的のポリペプチドの間に、リンカー（例えば、Ｇ４Ｓペプチドリンカーまたは当技術分野において公知の別のリンカー）をコードする核酸配列を含み得る。
【０２４６】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、それぞれが目的のポリペプチドを発現する、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多いヌクレオチド配列を含み得る。
【０２４７】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードする第１の核酸配列（例えば、第１のＯＲＦ）、ならびに第２の目的のポリペプチドをコードする第２の核酸配列（例えば、第２のＯＲＦ）を含み得る。
６．リンカー
【０２４８】
一態様では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａは、直接またはリンカーによって、融合され得る。他の実施形態では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａは、直接またはリンカーによって、異種ポリペプチドに融合され得る。ＩＬ１２ＢをＩＬ１２Ａに、またはＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２Ａを異種ポリペプチドに、融合するのに好適なリンカーは、ポリペプチド（もしくはペプチド）部分または非ポリペプチド部分であり得る。
【０２４９】
本開示の一部の態様は、ヒトＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を対象とし、ここで、ポリヌクレオチドは、ヒトＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたヒトＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、ペプチドリンカーによってＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、ＩＬ１２Ａポリペプチドまたはペプチドリンカーの５’末端に位置する。他の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチドは、ＩＬ１２Ｂポリペプチドまたはペプチドリンカーの５’末端に位置する。
【０２５０】
一部の実施形態では、リンカーは、１アミノ酸〜約２００アミノ酸を含むペプチドリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、または少なくとも４０アミノ酸を含む。
【０２５１】
一部の実施形態では、リンカーはＧＳ（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）リンカーであり得、例えば、（ＧｎＳ）ｍを含み、ここで、ｎは１〜２０の整数であり、ｍは１〜２０の整数である。一部の実施形態では、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーは、（ＧｎＳ）ｍ（配列番号２０３）を含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０である。一部の実施形態では、ＧＳリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｏ（配列番号２０４）を含み得、ここで、ｏは、１〜５の整数である。一部の実施形態では、ＧＳリンカーは、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号２０５）、ＧＧＳＧＧＧＧＧ（配列番号２０６）、またはＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号２０７）を含み得る。ある特定の実施形態では、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーは、（ＧｎＳ）ｍを含み、ここで、ｎは６であり、ｍは１である。
【０２５２】
一部の実施形態では、本開示に好適なリンカーはＧｌｙ豊富なリンカーであり得、例えば、（Ｇｌｙ）ｐ（配列番号２０８）を含み、ここで、ｐは、１〜４０の整数である。一部の実施形態では、Ｇｌｙ豊富なリンカーは、ＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧまたはＧＧＧＧＧＧＧＧを含み得る。
【０２５３】
一部の実施形態では、本開示に好適なリンカーは、（ＥＡＡＡＫ）ｑ（配列番号２０９）を含み得、ここで、ｑは、１〜５の整数である。一実施形態では、本開示に好適なリンカーは、（ＥＡＡＡＫ）３を含み得る。
【０２５４】
さらなる例示的なリンカーとして、これらに限定されないが、ＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１０）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号２１１）、ＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧ（配列番号２１２）、ＧＧＳＧＧＨＭＧＳＧＧ（配列番号２１３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２１４）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２１５）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号２１６）、ＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧ（配列番号２１７）、ＡＡＧＡＡＴＡＡ（配列番号２１８）、ＧＧＳＳＧ（配列番号２１９）、ＧＳＧＧＧＴＧＧＧＳＧ（配列番号２２０）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＧＳＧ（配列番号２２１）、ＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２２２）、およびＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２２３）が挙げられる。
【０２５５】
リンカーをコードするヌクレオチドは、本開示のヌクレオチド配列を融合するように構築され得る。提供されるＲＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、対応するＤＮＡ配列（例えば、ウラシルからチミンへの変換）を理解するであろう。同様に、提供されるＤＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、対応するＲＮＡ配列（例えば、チミンからウラシルへの変換）を理解するであろう。
７．ＩＬ１２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列最適化
【０２５６】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、別の目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡ、リンカーをコードするヌクレオチド配列、またはこれらの任意の組合せを含む。
【０２５７】
ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする、配列最適化されたヌクレオチド配列、例えば、コドン最適化されたｍＲＮＡ配列は、参照配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする野生型ヌクレオチド配列）に対して、少なくとも１つの同義核酸塩基置換を含む、配列である。
【０２５８】
配列最適化されたヌクレオチド配列は、参照配列とは、配列が部分的または完全に異なり得る。例えば、ＴＣＴコドンによって一様にコードされるポリセリンをコードする参照配列は、ＡＧＣコドンによって一様にコードされるであろうポリセリンをコードする配列が得られるように、その核酸塩基の１００％が置換される（それぞれのコドンに関して、１位のＴがＡによって置き換えられ、２位のＣがＧによって置き換えられ、３位のＴがＣによって置き換えられる）ことによって、配列最適化され得る。参照ポリセリン核酸配列と配列最適化されたポリセリン核酸配列との間のグローバルペアワイズアライメントから得られる配列同一性の百分率は、０％であろう。しかしながら、両方の配列から得られるタンパク質産物は、１００％同一である。
【０２５９】
一部の配列最適化（コドン最適化と称されることもある）方法は、当技術分野において公知であり（以下により詳細に考察され）、１つまたは複数の所望される結果を達成するのに有用であり得る。これらの結果としては、例えば、適正なフォールディングを確保するために、ある特定の組織標的および／もしくは宿主生物におけるコドン頻度を一致させること；ｍＲＮＡの安定性を増大させるかもしくは二次構造を低減するようにＧ／Ｃ含量をバイアスすること；遺伝子の構築もしくは発現を損傷し得るタンデム反復コドンもしくは塩基の回数を最小限に抑えること；転写および翻訳調節領域をカスタマイズすること；タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去すること；コードされるタンパク質に翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加すること；タンパク質ドメインを付加、除去、もしくはその順序を入れ替えること；制限部位を挿入もしくは欠失すること；リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾すること；タンパク質の様々なドメインが適正にフォールディングするのを可能にするように、翻訳速度を調整すること；ならびに／またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは排除することを挙げることができる。配列最適化のツール、アルゴリズム、およびサービスは、当技術分野において公知であり、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）によるサービス、および／または専売的方法が挙げられる。
【０２６０】
各アミノ酸のコドンの選択肢を、表３に示す。
【表３】
2019516710.tif 000016
【０２６１】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、ここで、配列最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントは、改善された特性（例えば、配列最適化されていない参照ヌクレオチド配列によってコードされるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントと比較して）、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与した後の発現有効性に関連する改善された特性を有する。そのような特性としては、核酸の安定性（例えば、ｍＲＮＡ安定性）の改善、標的組織における翻訳有効性の増大、発現される短縮型タンパク質の数の低減、発現されるタンパク質のフォールディングの改善またはミスフォールディングの予防、発現される産物の毒性の低減、発現される産物によって引き起こされる細胞死の低減、タンパク質凝集の増大および／または減少が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６２】
一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列は、ヒト対象における発現のためにコドン最適化されており、当技術分野における１つまたは複数の問題を回避する構造的および／または化学的特徴、例えば、構造的および機能的完全性を保持しながら核酸に基づく治療薬の製剤化および送達を最適化すること、発現の閾値を克服すること、発現率を改善すること、半減期および／またはタンパク質濃度、タンパク質局在化を最適化すること、ならびに免疫応答などの有害な生体応答および／または分解経路を回避することに有用な特徴を有する。
【０２６３】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、追加の目的のポリペプチド、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、マイクロＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、リンカーをコードする核酸配列、またはこれらの任意の組合せ）を含み、このヌクレオチド配列は、
（ｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）における少なくとも１のコドンを、ウリジン修飾配列を生成するために、ウリジン含量を増大もしくは減少させるように、代替的なコドンで置換すること、
（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）における少なくとも１のコドンを、同義コドンセットにおいてより高いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換すること、
（ｉｉｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）における少なくとも１のコドンを、Ｇ／Ｃ含量を増大させるように代替的なコドンで置換すること、または
（ｉｖ）これらの組合せ
を含む方法によって、配列最適化されている。
【０２６４】
一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）は、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも１つの改善された特性を有する。
【０２６５】
一部の実施形態では、配列最適化方法は、多重パラメーターのものであり、本明細書に開示される１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれよりも多くの方法ならびに／または当技術分野において公知の他の最適化方法を含む。
【０２６６】
本開示の一部の実施形態において有益であると考えることができる特徴は、ポリヌクレオチドによってまたはその領域内にコードされ得、そのような領域は、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする領域の上流（５’）、下流（３’）、またはその中にあり得る。これらの領域は、タンパク質コーディング領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列最適化の前および／または後に、ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。そのような特徴の例としては、非翻訳領域（ＵＴＲ）、マイクロＲＮＡ配列、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ポリ−Ａ尾部、および検出可能なタグが挙げられるがこれらに限定されず、ＸｂａＩ認識を有し得る多重クローニング部位が含まれ得る。
【０２６７】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および／またはｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含み、これらは、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、これらは、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および／またはｍｉＲＮＡ結合部位の任意の部分は、すべて対象外の場合も含め、配列最適化され得、独立して、配列最適化の前および／または後に、１つまたは複数の異なる構造的または化学的修飾を含有し得る。
【０２６８】
一部の実施形態では、最適化の後に、ポリヌクレオチドは、再構築され、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体などであるがこれらに限定されない、ベクターに形質転換される。例えば、最適化されたポリヌクレオチドは、再構築され、化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ｍａｉｚｅ、ショウジョウバエなどに形質転換され得、ここで、高コピー数のプラスミド様または染色体構造体が、本明細書に記載される方法によって生じる。
８．ＩＬ１２ポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列
【０２６９】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする、配列最適化されたヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、ここで、ＯＲＦは、配列最適化されている。
【０２７０】
ヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａをコードする例示的な配列最適化されたヌクレオチド配列を、表４Ａ〜４Ｄに示す。一部の実施形態では、表４Ａ〜４Ｄの配列最適化されたＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ配列、それらの断片、ならびにバリアントは、本明細書に開示される方法を実施するために使用される。一部の実施形態では、表４Ａ〜４Ｄの配列最適化されたＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ配列、それらの断片、ならびにバリアントは、図１に開示される野生型配列と組み合わされるか、またはその代替物である。提供されるＲＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、対応するＤＮＡ配列（例えば、ウラシルからチミンへの変換）を理解するであろう。同様に、提供されるＤＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、対応するＲＮＡ配列（例えば、チミンからウラシルへの変換）を理解するであろう。
【表４Ａ−１】
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【表４Ａ−２】
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【表４Ａ−３】
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【表４Ａ−４】
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【表４Ａ−５】
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【表４Ａ−６】
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【表４Ａ−７】
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【表４Ａ−８】
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【表４Ａ−９】
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【表４Ａ−１０】
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【表４Ａ−１１】
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【表４Ａ−１２】
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【表４Ａ−１３】
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【表４Ａ−１４】
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【表４Ｂ−１】
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【表４Ｂ−２】
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【表４Ｂ−３】
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【表４Ｂ−４】
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【表４Ｂ−５】
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【表４Ｂ−６】
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【表４Ｂ−７】
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【表４Ｂ−８】
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【表４Ｂ−９】
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【表４Ｂ−１０】
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【表４Ｂ−１１】
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【表４Ｂ−１２】
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【表４Ｂ−１３】
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【表４Ｂ−１４】
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【表４Ｂ−１５】
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【表４Ｃ−１】
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【表４Ｃ−２】
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【表４Ｃ−３】
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【表４Ｃ−４】
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【表４Ｃ−５】
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【表４Ｃ−６】
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【表４Ｃ−７】
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【表４Ｃ−８】
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【表４Ｃ−９】
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【表４Ｃ−１０】
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【表４Ｃ−１１】
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【表４Ｃ−１２】
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【表４Ｃ−１３】
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【表４Ｃ−１４】
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【表４Ｃ−１５】
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【表４Ｃ−１６】
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【表４Ｄ】
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【０２７１】
本明細書に開示される配列最適化されたヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列および他の公知の配列最適化されたヌクレオチド配列とは異なり、例えば、これらの配列最適化された核酸は、固有の組成特徴を有する。
【０２７２】
一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする）におけるウラシルまたはチミン核酸塩基の百分率は、参照野生型ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン核酸塩基の百分率に対して、修飾（例えば、低減）されている。そのような配列は、ウラシル修飾またはチミン修飾配列と称される。ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン含量の百分率は、配列中のウラシルまたはチミンの数を、ヌクレオチドの総数で除し、１００を乗じることによって、決定することができる。一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列は、参照野生型配列におけるウラシルまたはチミン含量よりも低いウラシルまたはチミン含量を有する。一部の実施形態では、本開示の配列最適化されたヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン含量は、参照野生型配列におけるウラシルまたはチミン含量よりも多く、参照野生型配列と比較した場合に、依然として、有益な効果、例えば、発現の増大および／またはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答の低減を維持する。
【０２７３】
一部の実施形態では、本開示の最適化された配列は、配列中に固有の範囲のウラシルまたはチミン（ＤＮＡの場合）を含有する。最適化された配列のウラシルまたはチミン含量は、様々な方式、例えば、理論上の最小値に対する最適化された配列のウラシルまたはチミンの含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）、野生型に対する含量（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）、および総ヌクレオチド含量に対する含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）で表すことができる。ＤＮＡについては、チミンはウラシルの代わりに存在することが認識されており、Ｕが出現するところをＴで置き換えるであろう。したがって、例えば、ＲＮＡに関する％ＵＴＭ、％ＵＷＴ、または％ＵＴＬに関連するすべての開示は、ＤＮＡに関する％ＴＴＭ、％ＴＷＴ、または％ＴＴＬに同等に適用可能である。
【０２７４】
ウラシルまたはチミンの理論上の最小値に対するウラシルまたはチミン含量は、配列最適化されたヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミンの数を、仮説上の配列におけるすべてのコドンが可能な最低のウラシルまたはチミン含量を有する同義コドンで置き換えられた仮説上のヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミンの総数で除し、１００を乗じることによって決定される、パラメーターを指す。このパラメーターは、本明細書において、％ＵＴＭまたは％ＴＴＭと略される。
【０２７５】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、１９６％未満、１９５％未満、１９０％未満、１８５％未満、１８０％未満、１７５％未満、１７０％未満、１６５％未満、１６０％未満、１５５％未満、１５０％未満、１４５％未満、１４０％未満、１３９％未満、１３８％未満、１３７％未満、１３６％未満、１３５％未満、１３４％未満、１３３％未満、１３２％未満、１３１％未満、１３０％未満、１２９％未満、１２８％未満、１２７％未満、１２６％未満、１２５％未満、１２４％未満、１２３％未満、１２２％未満、１２１％未満、１２０％未満、１１９％未満、１１８％未満、１１７％未満、１１６％未満、または１１５％未満である。
【０２７６】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、１９６％未満かつ１００％を上回る、１０１％を上回る、１０２％を上回る、１０３％を上回る、１０４％を上回る、１０５％を上回る、１０６％を上回る、１０７％を上回る、１０８％を上回る、１０９％を上回る、１１０％を上回る、１１１％を上回る、１１２％を上回る、１１３％を上回る、１１４％を上回る、１１５％を上回る、１１６％を上回る、１１７％を上回る、１１８％を上回る、１１９％を上回る、１２０％を上回る、１２１％を上回る、１２２％を上回る、１２３％を上回る、１２４％を上回る、１２５％を上回る、１２６％を上回る、１２７％を上回る、１２８％を上回る、１２９％を上回る、または１３０％を上回る、１３５％を上回る、１３０％を上回る、１３１％を上回る、または１３２％を上回る。
【０２７７】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、１３２％〜１５０％、１３３％〜１５０％、１３４％〜１５０％、１３５％〜１５０％、１３６％〜１５０％、１３７％〜１５０％、１３８％〜１５０％、１３９％〜１５０％、１４０％〜１５０％、１３２％〜１５１％、１３２％〜１５２％、１３２％〜１５３％、１３２％〜１５４％、１３２％〜１５５％、１３２％〜１５６％、１３２％〜１５７％、１３２％〜１５８％、１３２％〜１５９％、１３２％〜１６０％、１３３％〜１５１％、１３４％〜１５２％、１３５％〜１５３％、１３６％〜１５４％、１３７％〜１５５％、１３８％〜１５６％、１３８％〜１５７％、１３９％〜１５８％、１４０％〜１５９％、もしくは１４１％〜１６０％である。
【０２７８】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、約１３３％〜約１５２％、例えば、１３２．３２％〜１５０．５１％である。
【０２７９】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、１９８％未満、１９５％未満、１９０％未満、１８５％未満、１８０％未満、１７５％未満、１７０％未満、１６５％未満、１６０％未満、１５５％未満、１５０％未満、１４５％未満、１４０％未満、１３９％未満、１３８％未満、１３７％未満、１３６％未満、１３５％未満、１３４％未満、１３３％未満、１３２％未満、１３１％未満、１３０％未満、１２９％未満、１２８％未満、１２７％未満、１２６％未満、１２５％未満、１２４％未満、１２３％未満、１２２％未満、１２１％未満、１２０％未満、１１９％未満、１１８％未満、１１７％未満、１１６％未満、または１１５％未満である。
【０２８０】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、１９８％未満かつ１００％を上回る、１０１％を上回る、１０２％を上回る、１０３％を上回る、１０４％を上回る、１０５％を上回る、１０６％を上回る、１０７％を上回る、１０８％を上回る、１０９％を上回る、１１０％を上回る、１１１％を上回る、１１２％を上回る、１１３％を上回る、１１４％を上回る、１１５％を上回る、１１６％を上回る、１１７％を上回る、１１８％を上回る、１１９％を上回る、１２０％を上回る、１２１％を上回る、１２２％を上回る、１２３％を上回る、１２４％を上回る、または１２５％を上回る。
【０２８１】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、１２５％〜１４３％、１２６％〜１４３％、１２７％〜１４３％、１２８％〜１４３％、１２９％〜１４３％、１３０％〜１４３％、１３１％〜１３２％、１３３％〜１３４％、１３５％〜１４３％、１２５％〜１４４％、１２５％〜１４５％、１２５％〜１４６％、１２５％〜１４７％、１２５％〜１４８％、１２５％〜１４９％、１２５％〜１５０％、１２５％〜１５１％、１２５％〜１５２％、１２５％〜１５３％、１２５％〜１５４％、１２５％〜１５５％、１２６％〜１４４％、１２７％〜１４５％、１２８％〜１４６％、１２９％〜１４７％、１３０％〜１４８％、１３１％〜１４９％、１３２％〜１５０％、もしくは１３３％〜１５１％である。
【０２８２】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、約１２４％〜約１４５％、例えば、１２５％〜１４４．４２％である。
【０２８３】
本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾配列はまた、対応する野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミン含量に対する、そのウラシルまたはチミン含量にしたがって記載され得る（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）。
【０２８４】
「野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミン含量に対するウラシルまたはチミン含量」という語句は、配列最適化された核酸におけるウラシルまたはチミンの数を、対応する野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミンの総数で除し、１００を乗じることによって決定されるパラメーターを指す。このパラメーターは、本明細書において、％ＵＷＴまたは％ＴＷＴと略される。
【０２８５】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、５０％を上回る、５５％を上回る、６０％を上回る、６５％を上回る、７０％を上回る、７５％を上回る、８０％を上回る、８５％を上回る、９０％を上回る、または９５％を上回る。
【０２８６】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、５５％〜８８％、５６％〜８７％、５７％〜８６％、５８％〜８５％、５９％〜８４％、６０％〜８３％、６１％〜８２％、６２％〜８１％、６３％〜８０％、６４％〜７９％、６５％〜７８％、もしくは６５％〜７７％である。
【０２８７】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、６６％〜７８％、６６％〜７７％、６７％〜７７％、６７％〜７６％、もしくは６５％〜７７％である。
【０２８８】
特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約６６％〜約７７％、例えば、６７％〜７６％である。
【０２８９】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、５０％を上回る、５５％を上回る、６０％を上回る、６５％を上回る、７０％を上回る、７５％を上回る、８０％を上回る、８５％を上回る、９０％を上回る、または９５％を上回る。
【０２９０】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、５０％〜８５％、５１％〜８４％、５２％〜８３％、５３％〜８２％、５４％〜８１％、５５％〜８０％、５６％〜７９％、５７％〜７８％、５８％〜７７％、５９％〜７６％、６０％〜７５％、６１％〜７４％、もしくは６２％〜７３％である。
【０２９１】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、６１％〜７４％、６１％〜７３％、６１％〜７２％、６１％〜７３％、６２％〜７３％、６２％〜７２％、６２％〜７４％、もしくは６３％〜７２％である。
【０２９２】
特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約６２％〜約７３％、例えば、６３％〜７２％である。
【０２９３】
総ヌクレオチド含量に対する野生型ＩＬ１２Ｂのウラシルまたはチミン含量（％）は、約２１％である。一部の実施形態では、総ヌクレオチド含量に対するＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量（％）（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、２１％未満である。一部の実施形態では、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、または１０％未満である。一部の実施形態では、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％以上である。
【０２９４】
一部の実施形態では、総ヌクレオチド含量に対する本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、１０％〜２０％、１１％〜２０％、１１．５％〜１９．５％、１２％〜１９％、１２％〜１８％、１３％〜１８％、１３％〜１７％、１３％〜１６％、１３％〜１６％、１４％〜１６％、１４％〜１７％、もしくは１３％〜１７％である。
【０２９５】
特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル−またはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、約１３％〜約１７％、例えば、１４％〜１６％である。
【０２９６】
総ヌクレオチド含量に対する野生型ＩＬ１２Ａのウラシルまたはチミン含量（％）は、約２６％である。一部の実施形態では、総ヌクレオチド含量に対するＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量（％）（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、２５％未満である。一部の実施形態では、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、２５％未満、２４％未満、２３％未満、２２％未満、２１％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、または１０％未満である。一部の実施形態では、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％以上である。
【０２９７】
一部の実施形態では、総ヌクレオチド含量に対する本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、１０％〜２５％、１１％〜２５％、１２％〜２５％、１３％〜２５％、１４％〜２５％、１５％〜２５％、１６％〜２５％、１０％〜２４％、１０％〜２３％、１１％〜２２％、１１％〜２１％、１１％〜２０％、１１％〜１９％、１１％〜１８％、１２％〜２４％、１２％〜２３％、１３％〜２２％、１４％〜２１％、１３％〜２０％、１５％〜１９％、１５％〜２０％、１６％〜１９％、１６％〜１８％、もしくは１３％〜１７％である。
【０２９８】
特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、約１５％〜約１９％、例えば、１６％〜１８％である。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、対応する野生型核酸配列に対して、低減された数の連続したウラシルを有する。例えば、２つの連続したロイシンは、配列ＣＵＵＵＵＧによってコードされ得、これは、４ウラシルのクラスターを含む。そのような部分配列は、例えば、ＣＵＧＣＵＣで置換され得、これにより、ウラシルクラスターが除去される。
【０２９９】
フェニルアラニンは、ＵＵＣまたはＵＵＵによってコードされ得る。したがって、ＵＵＵによってコードされるフェニルアラニンが、ＵＵＣによって置き換えられた場合であっても、同義コドンは、依然として、ウラシルペア（ＵＵ）を含有する。したがって、配列中のフェニルアラニンの数は、コードされるポリペプチドにおけるフェニルアラニンの数を変化させずには排除することができないウラシルペア（ＵＵ）の最小の数を確立する。
【０３００】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列に対して、低減された数のウラシルトリプレット（ＵＵＵ）を有する。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、４、３、２、１のウラシルトリプレット（ＵＵＵ）を含有するか、または全く含有しない。
【０３０１】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列におけるウラシルペア（ＵＵ）の数に対して、低減された数のウラシルペア（ＵＵ）を有する。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列におけるウラシルペア（ＵＵ）の可能な最小の数に対応する数のウラシルペア（ＵＵ）を有する。
【０３０２】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、野生型核酸配列中のウラシルペア（ＵＵ）の数より少なく、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３のウラシルペア（ＵＵ）を有する。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、７〜１３、８〜１４、９〜１５、１０〜１６、１１〜７、１２〜１８のウラシルペア（ＵＵ）を有する。
【０３０３】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、野生型核酸配列中のウラシルペア（ＵＵ）の数より少なく、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のウラシルペア（ＵＵ）を有する。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、７〜１３、８〜１４、９〜１５、１０〜１６、１１〜７、１２〜１８のウラシルペア（ＵＵ）を有する。
【０３０４】
「野生型核酸配列におけるウラシルペア（ＵＵ）に対するウラシルペア（ＵＵ）」という語句は、配列最適化されたヌクレオチド配列におけるウラシルペア（ＵＵ）の数を、対応する野生型ヌクレオチド配列におけるウラシルペア（ＵＵ）の総数で除し、１００を乗じることによって決定されるパラメーターを指す。このパラメーターは、本明細書において、％ＵＵｗｔと略される。
【０３０５】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２ＡまたはＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２０％未満の％ＵＵｗｔを有する。
【０３０６】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、２４％〜５９％の％ＵＵｗｔを有する。特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、２９％〜５５％の％ＵＵｗｔを有する。
【０３０７】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、１４％〜５７％の％ＵＵｗｔを有する。特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、１９％〜５２％の％ＵＵｗｔを有する。
【０３０８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列中の核酸塩基（例えば、ウラシル）のうちの少なくとも９５％は、修飾された核酸塩基である。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列中のウラシルのうちの少なくとも９５％は、５−メトキシウラシルである。一部の実施形態では、ウラシル修飾された配列を含むポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、ウラシル修飾された配列を含むポリヌクレオチドは、送達剤、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜１４７のいずれかまたは化合物１〜２３２のいずれかとともに製剤化される。
【０３０９】
一部の実施形態では、％ＧＴＭＸと略される「ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上の最大グアニン含量に対する、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａをコードする配列最適化ＯＲＦのグアニン含量」は、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％である。一部の実施形態では、％ＧＴＭＸは、約７０％〜約８０％、約７１％〜約７９％、約７１％〜約７８％、もしくは約７１％〜約７７％である。
【０３１０】
一部の実施形態では、％ＣＴＭＸと略される「ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上の最大シトシン含量に対するＯＲＦのシトシン含量」は、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％である。一部の実施形態では、％ＣＴＭＸは、約６０％〜約８０％、約６２％〜約８０％、約６３％〜約７９％、もしくは約６８％〜約７６％である。
【０３１１】
一部の実施形態では、％Ｇ／ＣＴＭＸと略される「ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中の理論上の最大Ｇ／Ｃ含量に対するＯＲＦ中のグアニンおよびシトシン含量（Ｇ／Ｃ）」は、少なくとも約８１％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％である。％Ｇ／ＣＴＭＸは、約８０％〜約１００％、約８５％〜約９９％、約９０％〜約９７％、もしくは約９１％〜約９６％である。
【０３１２】
一部の実施形態では、％Ｇ／ＣＷＴと略される「対応する野生型ＯＲＦ中のＧ／Ｃ含量に対するＯＲＦ中のＧ／Ｃ含量」は、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０４％、少なくとも１０５％、少なくとも１０６％、少なくとも１０７％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、もしくは少なくとも１２０％である。
【０３１３】
一部の実施形態では、ＯＲＦ中の３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量は、対応する野生型ＯＲＦ中の３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量より少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、もしくは少なくとも３０％高い。
【０３１４】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、ここで、ＯＲＦは、配列最適化されており、％ＵＴＬ、％ＵＷＴ、％ＵＴＭ、％ＧＴＬ、％ＧＷＴ、％ＧＴＭＸ、％ＣＴＬ、％ＣＷＴ、％ＣＴＭＸ、％Ｇ／ＣＴＬ、％Ｇ／ＣＷＴ、または％Ｇ／ＣＴＭＸのそれぞれは、単独またはそれらの組合せで、（ｉ）パラメーターの最大値（ＭＡＸ）に、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０標準偏差（ＳＴＤ  ＤＥＶ）を加えたものに対応する最大値から、（ｉｉ）パラメーターの最小値（ＭＩＮ）から、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０標準偏差（ＳＴＤ  ＤＥＶ）を差し引いたものに対応する最小値の範囲にある。
９．配列最適化の方法
【０３１５】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列、例えば、ＯＲＦを含む、ポリヌクレオチド）は、配列最適化される。配列最適化されたヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列は、本明細書において「核酸」とも称される）は、参照配列（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする野生型配列）に対して、少なくとも１つのコドン修飾を含む。したがって、配列最適化された核酸において、少なくとも１のコドンが、参照配列（例えば、野生型配列）における対応するコドンとは異なる。
【０３１６】
一般に、配列最適化された核酸は、参照配列におけるコドンを同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）で置換することを含む少なくとも１つのステップによって生成される。そのような置換は、例えば、コドン置換マップ（すなわち、コドン最適化配列におけるそれぞれのアミノ酸をコードするであろうコドンを提供する表）を適用することによって、または規則のセット（例えば、グリシンが、中性アミノ酸の次にある場合、グリシンは、ある特定のコドンによってコードされるが、極性アミノ酸の次にある場合は、別のコドンによってコードされる）を適用することによって、実行され得る。コドン置換（すなわち、「コドン最適化」）に加えて、本明細書に開示される配列最適化方法は、有害なモチーフの除去（脱安定化モチーフ置換）など、厳密にはコドン最適化を対象とはしない追加の最適化ステップを含む。これらの配列最適化された核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含む組成物および製剤は、機能的に活性なＩＬ１２のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を促進するために、それを必要とする対象に投与され得る。
【０３１７】
細胞培養物における大型分子の組換え発現は、多くの制限（例えば、乏しいタンパク質発現レベル、短縮された発現産物をもたらす分割された翻訳、タンパク質のミスフォールディングなど）を伴う困難な作業であり得る。これらの制限は、機能的に活性なＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）またはそれを含む組成物もしくは製剤を、がんを患う患者に投与し、それによって、がんを処置するためのＩＬ１２ポリペプチドの合成および送達が内因的に生じるようにすることによって、低減または回避することができる。
【０３１８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系（例えば、細胞培養物）からｉｎ  ｖｉｖｏ発現へ変更するには、治療剤をコードする核酸配列の再設計が必要である。必ずしもコードされるアミノ酸配列の変化を伴うことなく、異なるコドンを選択することによって、天然に存在する遺伝子配列を再設計することにより、多くの場合、タンパク質の発現レベルに劇的な増大をもたらすことが可能である（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、２００４年、Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２２巻、３４６〜５３頁）。コドン適合性指標（ＣＡＩ）、ｍＲＮＡ二次構造、ｃｉｓ制御配列、ＧＣ含量などの変数、および多数の他の類似の変数は、タンパク質発現レベルといくらか相関することが示されている（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓら、２００６年、「Ｊｏｕｒｎａｌ／ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７巻、２８５頁）。しかしながら、遺伝子コードの縮重に起因して、すべてが同じ治療剤をコードする、多数の異なる核酸配列が存在する。それぞれのアミノ酸は、最大で６の同義コドンによってコードされ、これらのコドン間の選択肢が、遺伝子発現に影響を及ぼす。加えて、コドン使用頻度（すなわち、異なる生物が、ポリペプチド配列を発現するためにコドンを使用する頻度）は、生物間で異なる（例えば、ヒトまたはヒト化治療用抗体の組換え産生は、ハムスター細胞培養物において頻繁に生じる）。
【０３１９】
一部の実施形態では、参照核酸配列は、コドンマップを適用することによって配列最適化することができる。当業者であれば、以下に開示されるコドンマップにおけるＴ塩基はＤＮＡに存在し、一方で、Ｔ塩基は、対応するＲＮＡではＵ塩基によって置き換えられるであろうことを理解するであろう。例えば、ＤＮＡ形態の本明細書に開示される配列最適化された核酸、例えば、ベクターまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ）鋳型は、そのＴ塩基が、その対応する転写ｍＲＮＡでは、Ｕ塩基として転写されるであろう。この点に関して、配列最適化されたＤＮＡ配列（Ｔを含む）およびそれらの対応するＲＮＡ配列（Ｕを含む）のいずれも、本開示の配列最適化された核酸と考えられる。当業者であれば、１つまたは複数の塩基を、非天然の塩基で置き換えることによって、同等のコドンマップを生成することができることも、理解するであろう。したがって、例えば、ＴＴＣコドン（ＤＮＡマップ）は、ＵＵＣコドン（ＲＮＡマップ）に対応し、これは、ΨΨＣコドン（Ｕがシュードウリジンで置き換えられているＲＮＡマップ）に対応し得る。
【０３２０】
一実施形態では、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、またはＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂの両方をコードする参照配列は、ある特定のアミノ酸をコードするすべてのコドンを、コドンマップに提供される代替的なコドンのうちの１つだけで置き換えることによって、最適化することができる。例えば、最適化された配列におけるすべてのバリンは、ＧＴＧまたはＧＴＣまたはＧＴＴによってコードされるであろう。
【０３２１】
本開示の配列最適化されたポリヌクレオチドは、１つもしくは複数のコドン最適化方法、またはそれらの組合せを使用して、生成することができる。核酸配列を配列最適化するために使用することができる配列最適化方法は、本明細書に詳細に記載されている。この方法の一覧は、包括的でも制限的でもない。
【０３２２】
以下において考察される配列最適化方法のそれぞれについて記載される設計の原理および規則は、多数の異なる方式で組み合わせることができ、例えば、参照核酸配列の一部の領域に関する高Ｇ／Ｃ含量配列最適化、または他の領域に関するウリジン含量配列最適化、ならびに配列全体で二次構造を最小限に抑えるためまたは有害なモチーフを排除するための標的化ヌクレオチド変異がある。
【０３２３】
配列最適化方法の可能な組合せの選択は、例えば、合成ポリヌクレオチドを産生するために使用される特定の化学的性質に依存し得る。そのような選択肢はまた、配列最適化された核酸、例えば、ＩＬ１２を含む完全配列、機能的断片、または融合タンパク質などによってコードされるタンパク質の特徴にも依存し得る。一部の実施形態では、そのような選択肢は、配列最適化された核酸（例えば、治療用合成ｍＲＮＡ）によって標的とされる特定の組織または細胞に依存し得る。
【０３２４】
最適化方法の適用および分析により得られる配列最適化方法または設計規則を組み合わせる機構は、単純なものも複雑なものもある。例えば、組合せは、次のものであり得る：
（ｉ）逐次的：それぞれの配列最適化方法および設計規則のセットを、全体の配列の異なる部分配列に適用し、例えば、コドン１〜３０位のウリジンを低減させ、次いで、配列の残りに関して高頻度のコドンを選択する；
（ｉｉ）階層的：複数の配列最適化方法または設計規則のセットを、階層的な決定論的様式で組み合わせる。例えば、最もＧＣの豊富なコドンを使用し、それらのコドンの最も高い頻度のものを選択することによって、（共通の）つながりを破壊する。
（ｉｉｉ）多因子／多重パラメーター：機械学習または他のモデリング技法を使用して、複数の重複する要件および矛盾する可能性のある要件を最も良好に満たす単一の配列を設計する。このアプローチは、コンピュータを使用して、いくつかの数学的技法、例えば、遺伝子アルゴリズムを適用することを必要とするであろう。
【０３２５】
最終的に、これらのアプローチのそれぞれにより、特定の規則のセットを得ることができ、これは、多くの場合に、単一のコドン表、すなわち、標的タンパク質（すなわち、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチド）におけるそれぞれのアミノ酸のコドンの分類された一覧に要約され得、特定の規則または規則のセットが、それぞれのアミノ酸位について特定のコドンをどのように選択するかを示す。
ａ．ウリジン含量最適化
【０３２６】
核酸配列における局所的に高い濃度のウリジンの存在は、特に、修飾されたウリジン類似体を合成ｍＲＮＡの産生に使用した場合に、翻訳に対して有害な影響、例えば、翻訳の遅延または早すぎる翻訳の終止を有する場合がある。例えば、高ウリジン含量はまた、ＴＬＲ活性化に起因して、合成ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を低減させ得る。
【０３２７】
したがって、核酸配列は、少なくとも１つのウリジン含量最適化ステップを含む方法を使用して、配列最適化され得る。そのようなステップは、例えば、参照核酸における少なくとも１のコドンを、代替的なコドンで置換して、ウリジン修飾配列を生成することを含み、ここで、ウリジン修飾配列は、以下の特性のうちの少なくとも１つを有する：
（ｉ）全体的なウリジン含量の増大もしくは減少、
（ｉｉ）局所的ウリジン含量の増大もしくは減少（すなわち、特定の部分配列に限定されたウリジン含量の変化）、
（ｉｉｉ）全体的なウリジン含量を変化させない、ウリジン分布の変更、
（ｉｖ）ウリジンクラスタリング（例えば、クラスター数、クラスターの位置、もしくはクラスター間の距離）の変化、または
（ｖ）これらの組合せ。
【０３２８】
一部の実施形態では、配列最適化プロセスは、全体的なウリジン含量を最適化すること、すなわち、配列最適化された核酸におけるウリジン核酸塩基の百分率を、参照核酸配列におけるウリジン核酸塩基の百分率に対して、最適化することを含む。例えば、参照配列では、核酸塩基の３０％がウリジンであり得、配列最適化された核酸では、核酸塩基の１０％がウリジンであり得る。
【０３２９】
他の実施形態では、配列最適化プロセスは、参照核酸配列の特定の領域における局所的なウリジン含量を低減すること、すなわち、配列最適化された核酸の部分配列におけるウリジン核酸塩基の百分率を、参照核酸配列の対応する部分配列におけるウリジン核酸塩基の百分率に対して、低減することを含む。例えば、参照核酸配列は、局所的なウリジン含量が３０％の５’末端領域（例えば、３０コドン）を有し得、配列最適化された核酸配列では、同じ領域におけるウリジン含量が、１０％まで低減され得る。
【０３３０】
特定の実施形態では、コドンは、参照核酸配列において、例えば、タンパク質翻訳に有害な影響を有し得るウリジンクラスターの数、サイズ、位置、または分布を低減または修飾するように、置き換えられ得る。一般則としては、参照核酸配列のウリジン含量を低減することが望ましいとはいえ、ある特定の実施形態では、参照核酸配列の一部の部分配列のウリジン含量、および特に局所的なウリジン含量を、増大させてもよい。
【０３３１】
翻訳に対する悪影響を回避するためのウリジン含量の低減は、他の設計目標を達成するために、本明細書に開示される他の最適化方法と組み合わせて行うことができる。例えば、ウリジン含量最適化は、ランプ設計と組み合わせてもよいが、これは、ほとんどのアミノ酸について最も稀なコドンを使用することにより、一部の例外はあるが、Ｕ含量を低減することになるためである。
【０３３２】
一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列と比較した場合に、より低いＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を誘導するように設計される。いくつかのＴＬＲは、核酸を認識し、応答する。頻繁なウイルス構成物質である二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、ＴＬＲ３を活性化することが示されている。Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ、４１３巻、７３２〜７３８頁およびＷａｎｇら、（２００４年）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、１０巻、１３６６〜１３７３頁を参照されたい。一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡは、ＴＬＲ７を活性化する。Ｄｉｅｂｏｌｄら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３巻、１５２９〜１５３１頁を参照されたい。ＲＮＡオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するＲＮＡは、ヒトＴＬＲ８のリガンドである。Ｈｅｉｌら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３巻、１５２６〜１５２９頁を参照されたい。細菌およびウイルスＤＮＡの特徴である非メチル化ＣｐＧモチーフを含有するＤＮＡは、ＴＬＲ９を活性化する。Ｈｅｍｍｉら、（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ、４０８巻、７４０〜７４５頁を参照されたい。
【０３３３】
本明細書において使用されるとき、「ＴＬＲ応答」という用語は、ＴＬＲ７受容体による一本鎖ＲＮＡの認識と定義され、一部の実施形態では、受容体による一本鎖ＲＮＡの認識によって引き起こされるＲＮＡの分解および／または生理学的応答を包含する。ＲＮＡのＴＬＲ７への結合を判定および定量化するための方法は、当技術分野において公知である。同様に、ＲＮＡが、ＴＬＲ７に媒介される生理学的応答（例えば、サイトカイン分泌）を誘発したかどうかを判定するための方法も、当技術分野において周知である。一部の実施形態では、ＴＬＲ応答は、ＴＬＲ７の代わりに、ＴＬＲ３、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９によって媒介されてもよい。
【０３３４】
ＴＬＲ７に媒介される応答の抑制は、ヌクレオシド修飾を介して達成することができる。ＲＮＡは、本質的に、１００を上回る異なるヌクレオシド修飾を受ける（ｍｏｄｓ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕにおいて利用可能なＲＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅを参照されたい）。ヒトｒＲＮＡは、例えば、細菌ｒＲＮＡよりも１０倍多いシュードウリジン（Ψ）および２５倍多い２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシドを有する。細菌ｍＲＮＡは、ヌクレオシド修飾を含有しないが、一方で、哺乳動物ｍＲＮＡは、Ｎ７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）に加えて、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン、および多数の２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシドなどの修飾されたヌクレオシドを有する。
【０３３５】
ＲＮＡの２つの決定的な特徴であるウラシルおよびリボースは、ＴＬＲ７刺激に必要かつ十分であり、短い一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）は、いくつかのウリジンを近傍に含有する限り、配列独立様式で、ＴＬＲ７アゴニストとして作用する。Ｄｉｅｂｏｌｄら、（２００６年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３６巻、３２５６〜３２６７頁を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書に開示される最適化方法のうちの１つまたは複数は、ウリジン含量を（局所的および／もしくは局所的に）低減すること、ならびに／またはＴＬＲ７に媒介される応答を低減もしくは抑制するように、ウリジンクラスタリングを低減もしくは修飾することを含む。
【０３３６】
一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列によって引き起こされるＴＬＲ応答（例えば、ＴＬＲ７によって媒介される応答）は、参照核酸配列によって引き起こされるＴＬＲ応答より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％低い。
【０３３７】
一部の実施形態では、参照核酸配列によって引き起こされるＴＬＲ応答は、ウリジン修飾された配列によって引き起こされるＴＬＲ応答より少なくとも約１倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍高い。
【０３３８】
一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量（平均の全体的なウリジン含量）（絶対的もしくは相対的）は、参照核酸配列のウリジン含量（絶対的もしくは相対的）より高い。したがって、一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列は、参照核酸配列より少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％多くのウリジンを含む。
【０３３９】
他の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量（平均の全体的なウリジン含量）（絶対的もしくは相対的）は、参照核酸配列のウリジン含量（絶対的もしくは相対的）より低い。したがって、一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列は、参照核酸配列より少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％少ないウリジンを含む。
【０３４０】
一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量（平均の全体的なウリジン含量）（絶対的もしくは相対的）は、ウリジン修飾された配列中の総核酸塩基のうちの５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満である。一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量は、約１０％〜約２０％である。一部の特定の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量は、約１２％〜約１６％である。
【０３４１】
一部の実施形態では、参照核酸配列のウリジン含量は、スライドウインドウを使用して測定することができる。一部の実施形態では、スライドウインドウの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０核酸塩基である。一部の実施形態では、スライドウインドウは、４０を上回る核酸塩基長である。一部の実施形態では、スライドウインドウは、２０核酸塩基長である。スライドウインドウで測定されるウリジン含量に基づいて、参照核酸配列および配列最適化された核酸の長さ全体のウリジン含量を表すヒストグラムを生成することが可能である。
【０３４２】
一部の実施形態では、参照核酸配列は、ある特定の百分率の値よりも高いかまたは低い、ヒストグラム内のピークを低減または排除するように修飾することができる。一部の実施形態では、参照核酸配列は、スライドウインドウ表示における６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、または３０％ウリジンよりも高いピークを排除するように修飾することができる。別の実施形態では、参照核酸配列は、２０核酸塩基のスライドウインドウを使用して測定した場合に、配列最適化された核酸に、３０％ウリジンを上回るピークがないように、修飾され得る。一部の実施形態では、参照核酸配列は、２０核酸塩基のスライドウインドウを使用して測定した場合に、配列最適化された核酸配列における所定の数を上回るかまたは下回るピークが、ある特定の閾値よりも上または下に存在しないように、修飾され得る。例えば、一部の実施形態では、参照核酸配列は、配列最適化された核酸において、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％ウリジンよりも高くにピークが存在しないか、またはそこに１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０より多くのピークが存在しないように、修飾され得る。別の実施形態では、配列最適化された核酸は、３０％またはそれよりも高いウリジン含量に、０個のピーク〜２個のピークを含有する。
【０３４３】
一部の実施形態では、参照核酸配列は、連続したウリジンの発生を低減するように配列最適化され得る。例えば、２つの連続したロイシンは、配列ＣＵＵＵＵＧによってコードされ得、これは、４ウリジンのクラスターを含む。そのような部分配列は、ＣＵＧＣＵＣで置換され得、これにより、ウリジンクラスターが有効に除去されるであろう。したがって、参照核酸配列は、ウリジンペア（ＵＵ）、ウリジントリプレット（ＵＵＵ）、またはウリジンクアドロップレット（ＵＵＵＵ）を低減または排除することによって、配列最適化され得る。より高次のＵの組合せは、より低次の組合せを組み合わせたものとは考えない。したがって、例えば、ＵＵＵＵは、２つの連続したＵペアではなく、厳密にクアドロップレットと考えられるか、またはＵＵＵＵＵＵは、３つの連続したＵペアでも２つの連続したＵトリプレットでもなく、セクツプレットと考えられる、などである。
【０３４４】
一部の実施形態では、すべてのウリジンペア（ＵＵ）および／またはウリジントリプレット（ＵＵＵ）および／またはウリジンクアドロップレット（ＵＵＵＵ）が、参照核酸配列から除去され得る。他の実施形態では、ウリジンペア（ＵＵ）および／またはウリジントリプレット（ＵＵＵ）および／またはウリジンクアドロップレット（ＵＵＵＵ）は、ある特定の閾値よりも下に低減され得、例えば、配列最適化された核酸における発生は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０を上回らない。特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満のウリジンペアを含有する。別の特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、ウリジンペアおよび／またはトリプレットを含有しない。
【０３４５】
フェニルアラニンコドン、すなわち、ＵＵＣまたはＵＵＵは、ウリジンペアまたはトリプルを含み、したがって、ウリジン含量を低減する配列最適化は、最大でも、フェニルアラニンのＵトリプレットをフェニルアラニンのＵペアに低減することができる。一部の実施形態では、ウリジンペア（ＵＵ）および／またはウリジントリプレット（ＵＵＵ）の発生は、非フェニルアラニンＵペアまたはトリプレットのみを指す。したがって、一部の実施形態では、非フェニルアラニンウリジンペア（ＵＵ）および／またはウリジントリプレット（ＵＵＵ）は、ある特定の閾値よりも下に低減され得、配列最適化された核酸における発生は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０を上回らない。特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満の非フェニルアラニンウリジンペアおよび／またはトリプレットを含有する。別の特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、非フェニルアラニンウリジンペアおよび／またはトリプレットを含有しない。
【０３４６】
一部の実施形態では、配列最適化された核酸におけるウリジンの組合せ（例えば、ペア、トリプレット、クアドロップレット）の低減は、参照核酸配列に存在するウリジンの組合せに対する低減の百分率として表すことができる。
【０３４７】
一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジンペアの総数のうちの約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくは６５％を含有し得る。一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジントリプレットの総数のうちの約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくは６５％を含有し得る。一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジンクアドルプレットの総数のうちの約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくは６５％を含有し得る。
【０３４８】
一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在する非フェニルアラニンウリジンペアの総数のうちの約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくは６５％を含有し得る。一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在する非フェニルアラニンウリジントリプレットの総数のうちの約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくは６５％を含有し得る。
【０３４９】
一部の実施形態では、配列最適化された配列におけるウリジン含量は、この配列における理論上の最小ウリジン含量に対して表すことができる。「理論上の最小ウリジン含量」という用語は、配列中のすべてのコドンを、ウリジン含量が最も低い同義コドンで置き換えた後の、配列の長さに対する百分率としての核酸配列のうちのウリジン含量と定義される。一部の実施形態では、配列最適化された核酸のウリジン含量は、参照配列（例えば、野生型配列）の理論上の最小ウリジン含量と同一である。一部の態様では、配列最適化核酸のウリジン含量は、参照配列（例えば、野生型配列）の理論上の最小ウリジン含量の約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約１９５％または約２００％である。
【０３５０】
一部の実施形態では、配列最適化された核酸のウリジン含量は、参照配列（例えば、野生型配列）の理論上の最小ウリジン含量と同一である。
【０３５１】
参照核酸配列（例えば、野生型配列）は、ウリジンクラスターを含み得、これは、それらの数、サイズ、位置、分布、またはこれらの組合せに起因して、翻訳に対して負の影響を有する。本明細書において使用されるとき、「ウリジンクラスター」という用語は、ある特定の閾値を上回るウリジン含量（通常、百分率として記載される）を含有する、参照核酸配列または配列最適化された核酸配列における部分配列を指す。したがって、ある特定の実施形態では、部分配列が、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％より大きなウリジン含量を含む場合、そのような部分配列は、ウリジンクラスターと考えられる。
【０３５２】
ウリジンクラスターの負の影響は、例えば、ＴＬＲ７応答を誘起することであり得る。したがって、本明細書に開示される核酸配列最適化方法の一部の実施形態では、クラスターの数、クラスターのサイズ、クラスターの位置（例えば、核酸配列の５’および／もしくは３’末端の近傍）、クラスター間の距離、またはウリジンクラスターの分布（例えば、核酸配列に沿ったクラスターのある特定のパターン、発現される産物における二次構造エレメントに対するクラスターの分布、もしくはｍＲＮＡの二次構造に対するクラスターの分布）を低減することが望ましい。
【０３５３】
一部の実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも１つのウリジンクラスターを含み、このウリジンクラスターは、参照核酸配列の部分配列であり、この部分配列中の総ウリジン核酸塩基の百分率は所定の閾値を上回る。一部の実施形態では、部分配列の長さは、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００核酸塩基である。一部の実施形態では、部分配列は、１００核酸塩基より長い。一部の実施形態では、閾値は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％ウリジン含量である。一部の実施形態では、閾値は、２５％を上回る。
【０３５４】
例えば、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ、およびＲを含むアミノ酸配列は、核酸配列ＧＣＵ、ＧＡＵ、ＧＧＵ、ＡＧＵ、ＣＧＵによってコードされ得る。そのような配列は、いずれのウリジンペア、トリプレット、またはクアドロップレットも含有しないが、核酸塩基のうちの３分の１は、ウリジンである。そのようなウリジンクラスターは、代替的なコドンを使用することによって、例えば、ウリジンを含有しないＧＣＣ、ＧＡＣ、ＧＧＣ、ＡＧＣ、およびＣＧＣを使用することによって、除去され得る。
【０３５５】
他の実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも１つのウリジンクラスターを含み、ここで、前記ウリジンクラスターは、参照核酸配列の部分配列であり、スライドウインドウを使用して測定される前記部分配列のウリジン核酸塩基の百分率は、所定の閾値を上回る。一部の実施形態では、スライドウインドウの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０核酸塩基である。一部の実施形態では、スライドウインドウは、４０核酸塩基長を上回る。一部の実施形態では、閾値は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％のウリジン含量である。一部の実施形態では、閾値は、２５％を上回る。
【０３５６】
一部の実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも２つのウリジンクラスターを含む。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも少ないウリジンリッチクラスターを含有する。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも多くのウリジンリッチクラスターを含有する。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列における対応するウリジンリッチクラスターよりも短い長さのウリジンリッチクラスターを含有する。他の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列における対応するウリジンリッチクラスターよりも長い長さのウリジンリッチクラスターを含有する。
【０３５７】
Ｋａｒｉｋｏら、（２００５年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２３巻、１６５〜１７５頁、Ｋｏｒｍａｎｎら、（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９巻、１５４〜１５７頁、またはＳａｈｉｎら、（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｜  ＡＯＰ、２０１４年９月１９日オンライン刊行、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ４２７８を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｂ．グアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量
【０３５８】
参照核酸配列は、参照核酸配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対的または相対的）を変化させることを含む方法を使用して、配列最適化することができる。そのような最適化は、参照核酸配列の全体的なＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）を変化させる（例えば、増大もしくは減少させる）こと、参照核酸配列におけるＧ／Ｃ含量に局所的な変化を導入する（例えば、参照核酸配列中の選択された領域もしくは部分配列におけるＧ／Ｃを増大もしくは減少させる）こと、参照核酸配列におけるＧ／Ｃクラスターの頻度、サイズ、および分布を変化させること、またはこれらの組合せを含み得る。
【０３５９】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）と比較したＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）の全体的な増大を含む。一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）の全体的な増大は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）に対して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％である。
【０３６０】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量に対するＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）の全体的な減少を含む。一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量絶対的もしくは相対的）の全体的な減少は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）に対して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％である。
【０３６１】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列中の対応する部分配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）と比較した部分配列（すなわち、Ｇ／Ｃ修飾された部分配列）中のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対的もしくは相対的）の局所的な増大を含む。一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）の局所的な増大は、参照核酸配列中の対応する部分配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）に対して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％である。
【０３６２】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列中の対応する部分配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）に対する部分配列（すなわち、Ｇ／Ｃ修飾された部分配列）中のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対的もしくは相対的）の局所的な減少を含む。一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）の局所的な減少は、参照核酸配列中の対応する部分配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）に対して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％である。
【０３６３】
一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００核酸塩基長である部分配列において増大または低減される。
【０３６４】
一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）は、少なくとも約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００核酸塩基長である部分配列において増大または低減される。
【０３６５】
一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）は、少なくとも約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、または１００００核酸塩基長である部分配列において増大または低減される。
【０３６６】
本明細書に記載されるＧおよびＣ含量（絶対的または相対的）の増大または減少は、低Ｇ／Ｃ含量を有する同義コドンを、高Ｇ／Ｃ含量を有する同義コドンで置き換えること、またはその逆によって、行うことができる。例えば、Ｌは、６の同義コドンを有するが、そのうちの２つは、２つのＧ／Ｃを有し（ＣＵＣ、ＣＵＧ）、３つは、単一のＧ／Ｃを有し（ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＡ）、１つは、Ｇ／Ｃを有さない（ＵＵＡ）。そのため、参照核酸が、ある特定の位置にＣＵＣコドンを有した場合、その位置におけるＧ／Ｃ含量は、ＣＵＣを、単一のＧ／Ｃを有するコドンまたはＧ／Ｃを有さないコドンのうちのいずれかで置き換えることによって、低減され得る。
【０３６７】
米国公開第ＵＳ２０１４０２２８５５８、同第ＵＳ２００５００３２７３０  Ａ１、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、（２０１２年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、８３巻、３７〜４６頁を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｃ．コドン頻度−コドン使用頻度バイアス
【０３６８】
当技術分野において公知の多数のコドン最適化方法は、参照核酸配列におけるコドンの、より高い頻度を有するコドンとの置換に基づく。したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、非コドン最適化配列における使用の頻度に対して、配列最適化された核酸における他の同義コドンと比べた１つまたは複数のコドンの使用の頻度の修飾の使用を含む方法を使用して最適化された配列であり得る。
【０３６９】
本明細書において使用されるとき、「コドン頻度」という用語は、コドン使用頻度バイアス、すなわち、ＤＮＡ／ＲＮＡをコードする際の同義コドンの発生頻度における差異を指す。一般に、コドンの選好性は、翻訳最適化のために、変異バイアスと天然の選択との間のバランスを反映することが、認識されている。最適なコドンは、より早い翻訳速度および高い正確性を達成するのに役立つ。これらの因子の結果として、翻訳選択は、高度に発現される遺伝子においてはより強力であることが予測される。バイオインフォマティクスおよび計算生物学の分野において、多数の統計学的方法が、コドン使用頻度バイアスを分析するために提案され、使用されている。例えば、ＣｏｍｅｒｏｎおよびＡｇｕａｄｅ（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．、４７巻、２６８〜７４頁を参照されたい。「最適なコドンの頻度」（Ｆｏｐ）（Ｉｋｅｍｕｒａ（１９８１年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１５１巻（３号）、３８９〜４０９頁）、相対的コドン適合（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｃｏｄｏｎ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）（ＦｏｘおよびＥｒｉｌ（２０１０年）ＤＮＡ  Ｒｅｓ．、１７巻（３号）、１８５〜９６頁）、または「コドン適合指標」（ＣＡＩ）（ＳｈａｒｐおよびＬｉ（１９８７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５巻（３号）、１２８１〜９５頁）などの方法は、遺伝子発現レベルを予測するために使用され、一方で、「コドンの有効数」（Ｎｃ）および情報理論によるシャノンエントロピーなどの方法は、コドン使用頻度の均等性を測定するために使用される。多変量の統計学的方法、例えば、対応分析および主成分分析は、遺伝子間のコドン使用頻度の変動性を分析するために広く使用される（Ｓｕｚｕｋｉら、（２００８年）ＤＮＡ  Ｒｅｓ．、１５巻（６号）、３５７〜６５頁、Ｓａｎｄｈｕら、Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｂｉｏｌ．、２００８年、８巻（２号）、１８７〜９２頁）。
【０３７０】
本明細書に開示されるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、野生型核酸配列、変異体核酸配列、キメラ核酸配列など、例えば、ｍＲＮＡであり得る）は、参照核酸配列における少なくとも１のコドンを、同義コドンセット内のより高いまたは低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換することを含む方法を使用して、コドン最適化することができ、ここで、結果として得られる配列最適化された核酸は、参照核酸配列と比べて、少なくとも１つの最適化された特性を有する。
【０３７１】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列中のコドンのうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは１００％は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より高いコドン頻度を有する。
【０３７２】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列における少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換され、参照核酸配列における少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換される。
【０３７３】
一部の実施形態では、ＩＬ１２をコードする参照核酸配列中のコドンのうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約７５％は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より高いコドン頻度を有する。
【０３７４】
一部の実施形態では、より高いコドン頻度を有する少なくとも１の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。他の実施形態では、より高いコドン頻度を有するすべての代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。
【０３７５】
一部の実施形態では、より低いコドン頻度を有する少なくとも１の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も低いコドン頻度を有する。一部の実施形態では、より高いコドン頻度を有するすべての代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。
【０３７６】
一部の特定の実施形態では、少なくとも１の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて２番目に高い、３番目に高い、４番目に高い、５番目に高い、または６番目に高い頻度を有する。一部の特定の実施形態では、少なくとも１の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて２番目に低い、３番目に低い、４番目に低い、５番目に低い、または６番目に低い頻度を有する。
【０３７７】
コドン頻度に基づく最適化は、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列に対して、上述のように全体的に適用されてもよく、または局所的に適用されてもよい。一部の実施形態では、局所的に適用される場合、参照核酸配列の領域は、コドン頻度に基づいて、ある特定の部分配列におけるコドンのすべてまたはある特定の百分率を、それらのそれぞれの同義コドンセットにおけるより高いまたは低い頻度を有するコドンで置換することで、修飾され得る。したがって、一部の実施形態では、参照核酸配列の部分配列中のコドンのうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは１００％は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より高いコドン頻度を有する。
【０３７８】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列における少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換され、参照核酸配列の部分配列における少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換される。
【０３７９】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列中のコドンのうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約７５％は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より高いコドン頻度を有する。
【０３８０】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列において置換される、より高いコドン頻度を有する少なくとも１の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。他の実施形態では、参照核酸配列の部分配列において置換される、より低いコドン頻度を有するすべての代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も低いコドン頻度を有する。
【０３８１】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列において置換される、より低いコドン頻度を有する少なくとも１の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も低いコドン頻度を有する。一部の実施形態では、参照核酸配列の部分配列において置換される、より高いコドン頻度を有するすべての代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。
【０３８２】
特定の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化された核酸は、特定の位置、例えば、配列最適化された核酸の５’末端もしくは３’末端において、またはそれらの領域から所定の距離（例えば、配列最適化された核酸の５’末端または３’末端から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００コドン）内で、参照核酸配列の対応する部分配列における全体的なコドン頻度よりも高いかまたは低い全体的なコドン頻度を有する部分配列を含み得る。
【０３８３】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化された核酸は、全体的なコドン頻度が、参照核酸配列の対応する部分配列における全体的なコドン頻度よりも高いかまたは低い１つより多くの部分配列を含み得る。当業者であれば、全体的により高いかまたは低い全体的なコドン頻度を有する部分配列が、全体的なコドン頻度がより高いまたは低いか、部分配列の長さ、部分配列間の距離、部分配列の位置などに応じて、無数のパターンで組織化され得ることを理解するであろう。
【０３８４】
米国特許第ＵＳ５０８２７６７号、同第ＵＳ８１２６６５３号、同第ＵＳ７５６１９７３号、同第ＵＳ８４０１７９８号、米国公開第ＵＳ２００８００４６１９２号、同第ＵＳ２００８００７６１６１号、国際公開第ＷＯ２００００１８７７８号、Ｗｅｌｃｈら、（２００９年）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、４巻（９号）、ｅ７００２頁、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、（２０１２年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、８３巻、３７〜４６頁、Ｃｈｕｎｇら、（２０１２年）ＢＭＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻、１３４号を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｄ．脱安定化モチーフ置換
【０３８５】
配列最適化に影響を及ぼすことができる様々なモチーフが存在し、それらは、様々な非排他的カテゴリー、例えば、以下のものに含まれる：
（ｉ）一次配列に基づくモチーフ：単純なヌクレオチドの配列によって定義されるモチーフ。
（ｉｉ）構造的モチーフ：ある特定の二次構造を形成する傾向にあるヌクレオチドの配列によってコードされるモチーフ。
（ｉｉｉ）局所的モチーフ：１つの連続した部分配列でコードされるモチーフ。
（ｉｖ）分布型モチーフ：２つまたはそれよりも多い分離した部分配列でコードされるモチーフ。
（ｖ）利益モチーフ：ヌクレオチドの構造または機能を改善するモチーフ。
（ｖｉ）不利益モチーフ：ヌクレオチドの構造または機能に対する有害な作用を有するモチーフ。
【０３８６】
不利益モチーフのカテゴリーに適合する多数のモチーフが存在する。一部の例としては、例えば、比較的短い正確な配列である傾向にある制限酵素モチーフ、例えば、Ｘｂａ１の制限部位モチーフ（ＴＣＴＡＧＡ（配列番号２２４））、ＥｃｏＲＩの制限部位モチーフ（ＧＡＡＴＴＣ（配列番号２２５））、ＥｃｏＲＩＩの制限部位モチーフ（ＣＣＷＧＧ（配列番号２２６）、ここで、Ｗは、ＩＵＰＡＣ不確定コードに従ってＡもしくはＴを意味する）、もしくはＨｉｎｄＩＩＩの制限部位モチーフ（ＡＡＧＣＴＴ（配列番号２２７））；長く、正確な配列ではなくコンセンサス配列に基づく傾向にある、酵素部位、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにおけるもの（ＧｎｎｎｎＷｎＣＲｎＣＴＣｎＣｎｎＷｎＤ（配列番号２２８）、ここで、ｎは、任意のヌクレオチドを意味し、Ｒは、ＡもしくはＧを意味し、Ｗは、ＡもしくはＴを意味し、Ｄは、ＡもしくはＧもしくはＴを意味するが、Ｃではない）；構造的モチーフ、例えば、ＧＧＧＧ（配列番号２２９）リピート（Ｋｉｍら、（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ、３５１巻（６３２４号）、３３１〜２頁）；または他のモチーフ、例えば、ＣＵＧトリプレットリピート（Ｑｕｅｒｉｄｏら、（２０１４年）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１２４巻、１７０３〜１７１４頁）が挙げられる。
【０３８７】
したがって、本明細書に開示されるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、参照核酸配列における少なくとも１つの脱安定化モチーフを置換すること、およびそのような不利益モチーフを除去するか、またはそれを利益モチーフで置き換えることを含む方法を使用して、配列最適化され得る。
【０３８８】
一部の実施形態では、最適化プロセスは、参照核酸配列における利益モチーフおよび／または不利益モチーフを特定することを含み、ここで、そのようなモチーフは、例えば、最適化プロセスの前または最中に、参照核酸配列において安定性の消失を引き起こし得る特定の部分配列である。例えば、最適化中の特定の塩基の置換により、制限酵素によって認識される部分配列（モチーフ）が生成され得る。したがって、最適化プロセスの最中、不利益モチーフの出現を、配列最適化された配列と、不利益となることが公知のモチーフのライブラリーとの比較によって、モニタリングすることができる。次いで、不利益モチーフの特定を、事後フィルターとして、すなわち、参照核酸配列に導入され得る可能性を有するある特定の修飾が、実際に実施されるべきかどうかを決定するために、使用することができる。
【０３８９】
一部の実施形態では、不利益モチーフの特定は、本明細書に開示される配列最適化方法の適用の前に使用することができる、すなわち、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列におけるモチーフの特定、ならびにそれらの代替的な核酸配列との置換えは、事前処理ステップとして、例えば、ウリジン低減の前に、使用することができる。
【０３９０】
他の実施形態では、不利益モチーフの特定およびそれらの除去は、本明細書に開示される配列最適化方法のうちの２つまたはそれよりも多くを含む多重パラメーターの核酸最適化方法に組み込まれる、追加の配列最適化技法として使用される。この様式で使用される場合、最適化プロセス中に特定された不利益モチーフは、例えば、本来の設計原理（例えば、低いＵ、高い頻度など）に可能な限りの近似性を保つために、可能な限り低い数の核酸塩基を置換することによって、除去されるであろう。
【０３９１】
例えば、米国公開第ＵＳ２０１４０２２８５５８号、同第ＵＳ２００５００３２７３０号、または同第ＵＳ２０１４０２２８５５８号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｅ．限定的コドンセット最適化
【０３９２】
一部の特定の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の配列最適化は、限定的コドンセット、例えば、本来の数よりも少ないコドンを使用して２０の天然のアミノ酸、２０の天然のアミノ酸のサブセット、または例えば非天然のアミノ酸を含む拡大されたアミノ酸のセットをコードするコドンセットを使用して、行われ得る。
【０３９３】
遺伝子コードは、すべての生物で高度に類似しており、単純な６４エントリーの表で表すことができ、これにより、タンパク質翻訳に関与する２０の標準的なアミノ酸に加え、開始および終止コドンがコードされるであろう。遺伝子コードは、縮重している、すなわち、一般に、１より多くのコドンにより、それぞれのアミノ酸が指定される。例えば、アミノ酸ロイシンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、またはＣＵＧコドンによって指定され、一方で、アミノ酸セリンは、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＣＣ、ＵＣＵ、ＡＧＵ、またはＡＧＣコドンによって指定される（第１、第２、または第３の位置における違い）。天然の遺伝子コードは、天然に存在するアミノ酸をコードする６２のコドンを含む。したがって、本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、２０のアミノ酸をコードするための６２よりも少ないコドンを含む最適化されたコドンセット（遺伝子コード）は、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、または２０のコドンを含み得る。
【０３９４】
一部の実施形態では、限定的コドンセットは、２０未満のコドンを含む。例えば、タンパク質が２０種類未満のアミノ酸を含む場合、そのようなタンパク質は、２０未満のコドンを含むコドンセットにコードされ得る。したがって、一部の実施形態では、最適化コドンセットは、参照核酸配列にコードされるタンパク質中に存在するアミノ酸の異なる種類と同じ数のコドンを含む。一部の実施形態では、最適化コドンセットは、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２またはさらに１のコドンを含む。
【０３９５】
一部の実施形態では、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸、すなわち、天然では１より多くのコドンによってコードされるアミノ酸は、天然に存在する同義コドンの数よりも少ないコドンでコードされる。例えば、一部の実施形態では、Ａｌａは配列最適化核酸中で３、２または１のコドンにコードされ得る；Ｃｙｓは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ａｓｐは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ｇｌｕは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ｐｈｅは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ｇｌｙは配列最適化核酸中で３のコドン、２のコドンまたは１のコドンにコードされ得る；Ｈｉｓは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ｉｌｅは配列最適化核酸中で２のコドンまたは１のコドンにコードされ得る；Ｌｙｓは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ｌｅｕは配列最適化核酸中で５のコドン、４のコドン、３のコドン、２のコドンまたは１のコドンにコードされ得る；Ａｓｎは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ｐｒｏは配列最適化核酸中で３のコドン、２のコドン、または１のコドンにコードされ得る；Ｇｌｎは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ａｒｇは配列最適化核酸中で５のコドン、４のコドン、３のコドン、２のコドン、または１のコドンにコードされ得る；Ｓｅｒは配列最適化核酸中で５のコドン、４のコドン、３のコドン、２のコドン、または１のコドンにコードされ得る；Ｔｈｒは配列最適化核酸中で３のコドン、２のコドン、または１のコドンにコードされ得る；Ｖａｌは配列最適化核酸中で３のコドン、２のコドン、または１のコドンにコードされ得る；かつＴｙｒは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る。
【０３９６】
一部の実施形態では、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸、すなわち、天然では１より多くのコドンによってコードされるアミノ酸は、限定的コドンセットにおける単一のコドンによってコードされる。
【０３９７】
一部の特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、ＤＮＡであり、限定的コドンセットは、２０のコドンからなり、ここで、それぞれのコドンは、２０のアミノ酸のうちの１つをコードする。一部の実施形態では、配列最適化核酸はＤＮＡであり、限定的コドンセットは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、およびＧＣＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＡＡＴまたはＡＣＣから選択される少なくとも１のコドン；ＧＡＴまたはＧＡＣから選択される少なくとも１のコドン；ＴＧＴまたはＴＧＣから選択される少なくとも１のコドン；ＣＡＡまたはＣＡＧから選択される少なくとも１のコドン；ＧＡＡまたはＧＡＧから選択される少なくとも１のコドン；ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、およびＧＧＧからなる群から選択されるＣＡＴまたはＣＡＣから選択される少なくとも１のコドン；少なくとも１のコドン；ＡＴＴ、ＡＴＣ、およびＡＴＡからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、およびＣＴＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＡＡＡまたはＡＡＧから選択される少なくとも１のコドン；ＡＴＧコドン；ＴＴＴまたはＴＴＣから選択される少なくとも１のコドン；ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、およびＣＣＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、およびＡＧＣからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、およびＡＣＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＴＧＧコドン；ＴＡＴまたはＴＡＣから選択される少なくとも１のコドン；ならびにＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、およびＧＴＧからなる群から選択される少なくとも１のコドンを含む。
【０３９８】
他の実施形態では、配列最適化核酸はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり、限定的コドンセットは２０コドンからなり、各コドンは、２０のアミノ酸のうちの１つをコードする。一部の実施形態では、配列最適化核酸はＲＮＡであり、限定的コドンセットは、ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、およびＧＣＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＡＡＵまたはＡＣＣから選択される少なくとも１のコドン；ＧＡＵまたはＧＡＣから選択される少なくとも１のコドン；ＵＧＵまたはＵＧＣから選択される少なくとも１のコドン；ＣＡＡまたはＣＡＧから選択される少なくとも１のコドン；ＧＡＡまたはＧＡＧから選択される少なくとも１のコドン；ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、およびＧＧＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＣＡＵまたはＣＡＣから選択される少なくとも１のコドン；ＡＵＵ、ＡＵＣ、およびＡＵＡからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、およびＣＵＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＡＡＡまたはＡＡＧから選択される少なくとも１のコドン；ＡＵＧコドン；ＵＵＵまたはＵＵＣから選択される少なくとも１のコドン；ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、およびＣＣＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵ、およびＡＧＣからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、およびＡＣＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＵＧＧコドン；ＵＡＵまたはＵＡＣから選択される少なくとも１のコドン；および、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、およびＧＵＧからなる群から選択される少なくとも１のコドンを含む。
【０３９９】
一部の特定の実施形態では、限定的コドンセットは、ある特定の組織または細胞への投与後の配列最適化された核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ）のｉｎ  ｖｉｖｏ発現に関して最適化されている。
【０４００】
一部の実施形態では、最適化されたコドンセット（例えば、２０のアミノ酸をコードする２０コドンのセット）は、少なくとも以下の特性のうちの１つを満たす。
（ｉ）最適化されたコドンセットは、元のもしくは天然のコドンセットよりも高い平均Ｇ／Ｃ含量を有する、または
（ｉｉ）最適化されたコドンセットは、元のもしくは天然のコドンセットよりも低い平均Ｕ含量を有する、または
（ｉｉｉ）最適化されたコドンセットは、最も高い頻度を有するコドンから構成されている、または
（ｉｖ）最適化されたコドンセットは、最も低い頻度を有するコドンから構成されている、または
（ｖ）これらの組合せ。
【０４０１】
一部の特定の実施形態では、最適化されたコドンセットにおける少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおいて２番目に高い、３番目に高い、４番目に高い、５番目に高い、または６番目に高い頻度を有する。一部の特定の実施形態では、最適化されたコドンにおける少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおいて２番目に低い、３番目に低い、４番目に低い、５番目に低い、または６番目に低い頻度を有する。
【０４０２】
本明細書において使用されるとき、「天然のコドンセット」という用語は、参照核酸配列をコードするために源生物によって天然に使用される、コドンセットを指す。本明細書において使用されるとき、「元のコドンセット」という用語は、配列最適化の開始前に、参照核酸配列をコードするために使用されるコドンセット、または配列最適化が反復的または再帰的に適用される場合には、新しい最適化反復の開始時に参照核酸配列の最適化されたバリアントをコードするために使用されるコドンセットを指す。
【０４０３】
一部の実施形態では、コドンセット中のコドンのうち５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、最高の頻度を有するものである。他の実施形態では、コドンセット中のコドンのうち５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、最低の頻度を有するものである。
【０４０４】
一部の実施形態では、コドンセット中のコドンのうち５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、最高のウリジン含量を有するものである。一部の実施形態では、コドンセット中のコドンのうち５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、最低のウリジン含量を有するものである。
【０４０５】
一部の実施形態では、コドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）は、元のコドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％高い。一部の実施形態では、コドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）は、元のコドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低い。
【０４０６】
一部の実施形態では、コドンセットのウラシル含量（絶対的もしくは相対的）は、元のコドンセットの平均ウラシル含量（絶対的もしくは相対的）より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％高い。一部の実施形態では、コドンセットのウラシル含量（絶対的もしくは相対的）は、元のコドンセットの平均ウラシル含量（絶対的もしくは相対的）より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低い。
【０４０７】
米国出願公開第２０１１／００８２０５５号および国際公開第ＷＯ２００００１８７７８号もまた参照されたく、これらのいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
１０．配列最適化された核酸の特徴付け
【０４０８】
本開示の一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする、本明細書に開示される配列最適化された核酸（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を試験して、少なくとも１つの核酸配列特性（例えば、ヌクレアーゼに曝露した場合の安定性）または発現特性が、配列最適化されていない核酸に対して、改善されているかどうかを判定することができる。
【０４０９】
本明細書において使用されるとき、「発現特性」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、それを必要とする対象に投与した後の合成ｍＲＮＡの翻訳有効性）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系において試験した合成ｍＲＮＡの翻訳有効性）のいずれかでの、核酸配列の特性を指す。発現特性としては、投与後にＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡによって産生されるタンパク質の量、ならびに産生される可溶性またはその他の機能的タンパク質の量が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に開示される配列最適化された核酸は、本明細書に開示されるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化された核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）によってコードされるタンパク質を発現する細胞の生存性によって、評価することができる。
【０４１０】
特定の実施形態では、最適化されていない参照核酸配列に対して、コドン置換を含有する、本明細書に開示される複数の配列最適化された核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、機能性に関して特徴付けて、目的の特性、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系での、または標的組織もしくは細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏでの発現特性を測定することができる。
ａ．核酸配列の本質的な特性の最適化
【０４１１】
本開示の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの所望される特性は、核酸配列の本質的な特性である。例えば、ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性に関して配列最適化され得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、特定の標的組織または細胞における発現に関して配列最適化され得る。一部の実施形態では、核酸配列は、エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによるその分解を予防することによって、その血漿半減期を増大させるように、配列最適化される。
【０４１２】
他の実施形態では、核酸配列は、溶液中での加水分解に対するその耐性を増大させるように、例えば、配列最適化された核酸または配列最適化された核酸を含む医薬組成物を水溶性条件下において最小限の分解で保管することができる時間を延長するように、配列最適化される。
【０４１３】
他の実施形態では、配列最適化された核酸は、乾燥状態での保管条件における加水分解に対するその耐性を増大させるように、例えば、配列最適化された核酸を凍結乾燥後に最小限の分解で保管することができる時間を延長するように、最適化され得る。
ｂ．タンパク質発現に関して最適化された核酸配列
【０４１４】
本開示の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの所望される特性は、本明細書に開示される配列最適化された配列によってコードされるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドの発現レベルである。タンパク質の発現レベルは、１つまたは複数の発現系を使用して、測定することができる。一部の実施形態では、発現は、細胞培養系、例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞において、測定することができる。一部の実施形態では、発現は、生細胞の抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球ライセートから調製されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系、または精製された個々の成分のアセンブリによって調製されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を使用して、測定することができる。他の実施形態では、タンパク質発現は、例えば、マウス、ウサギ、サルなど、ｉｎ  ｖｉｖｏ系において測定される。
【０４１５】
一部の実施形態では、溶液形態におけるタンパク質発現が、望ましい場合がある。したがって、一部の実施形態では、参照配列は、溶液形態におけるタンパク質発現のレベルが最適化された、配列最適化された核酸配列が得られるように、配列最適化され得る。タンパク質発現のレベルおよび他の特性、例えば、可溶性、凝集のレベル、および短縮産物の存在（すなわち、タンパク質分解、加水分解、または欠損した翻訳に起因する断片）は、当技術分野において公知の方法に従って、例えば、電気泳動（例えば、天然もしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥ）またはクロマトグラフィー方法（例えば、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーなど）を使用して、測定することができる。
ｃ．標的組織または標的細胞の生存性の最適化
【０４１６】
一部の実施形態では、核酸配列によってコードされる異種治療用タンパク質の発現は、標的組織または細胞において有害な作用を有し、タンパク質収率を低減させ得るか、または発現される産物の品質を低減し得る（例えば、タンパク質断片の存在もしくは封入体における発現されたタンパク質の沈降に起因する）、または毒性を引き起こし得る。
【０４１７】
したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列、例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする核酸配列の配列最適化を使用して、配列最適化された核酸によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存性を増大させることができる。
【０４１８】
異種タンパク質発現はまた、自家または異種移植のために核酸配列がトランスフェクトされた細胞にとって、有害であり得る。したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列の配列最適化を使用して、配列最適化された核酸配列によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存性を増大させることができる。細胞または組織の生存性、毒性、および他の生理学的反応における変化は、当技術分野において公知の方法に従って測定することができる。
ｄ．免疫および／または炎症性応答の低減
【０４１９】
一部の事例では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチド、またはその機能的断片をコードする配列最適化された核酸の投与は、免疫応答を誘発し得、この免疫応答は、（ｉ）治療剤（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）、または（ｉｉ）そのような治療剤の発現産物（例えば、ｍＲＮＡによってコードされるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂ融合ポリペプチド）、または（ｉｖ）これらの組合せによって引き起こされ得る。したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）の配列最適化を使用して、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする核酸の投与によって、またはそのような核酸によってコードされるＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂ融合体の発現産物によって、誘発される、免疫応答または炎症応答を減少することができる。
【０４２０】
一部の態様では、炎症応答は、当技術分野において公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、１つまたは複数の炎症性サイトカインのレベルの増大を検出することによって、測定することができる。「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症応答の際に上昇されるサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＧＲＯαとしても公知のＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ））リガンド１、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ−誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、または顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が挙げられる。炎症性サイトカインという用語には、当技術分野において公知の炎症応答と関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１３（Ｉｌ−１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）なども含まれる。
１１．ＩＬ１２ポリペプチドをコードする修飾されたヌクレオチド配列
【０４２１】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／ＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むウラシル修飾配列であり、ここで、ｍＲＮＡは、化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。
【０４２２】
本開示のある特定の態様では、５−メトキシウラシル塩基が、ポリヌクレオチド中にあるように、リボース糖に結合した場合、結果として得られる修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、５−メトキシウリジンと称される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは約１００％が５−メトキシウラシルである。一実施形態では、ポリヌクレオチドのウラシルは、少なくとも９５％が５−メトキシウラシルである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドのウラシルは、１００％が５−メトキシウラシルである。
【０４２３】
ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも９５％が５−メトキシウラシルである実施形態では、全体的なウラシル含量は、免疫応答をほとんど〜全く誘導せずに好適なタンパク質発現レベルを提供するように調整され得る。一部の実施形態では、ＯＲＦのウラシル含量（％ＵＴＭ）は、約１０５％〜約１４５％、約１０５％〜約１４０％、約１１０％〜約１４０％、約１１０％〜約１４５％、約１１５％〜約１３５％、約１０５％〜約１３５％、約１１０％〜約１３５％、約１１５％〜約１４５％、もしくは約１１５％〜約１４０％である。他の実施形態では、ＯＲＦのウラシル含量は、約１１７％〜約１３４％または１１８％〜１３２％の％ＵＴＭである。一部の実施形態では、％ＵＴＭは、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、もしくは約１５０％である。この文脈では、「ウラシル」という用語は、５−メトキシウラシルおよび／または天然に存在するウラシルを指し得る。
【０４２４】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含量の約５０％、約４０％、約３０％、もしくは約２０％未満である。一部の実施形態では、ＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含量の約１５％〜約２５％である。他の実施形態では、ＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含量の約２０％〜約３０％である。一実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中のウラシル含量は、オープンリーディングフレーム中の総核酸塩基含量の約２０％未満である。この文脈において、「ウラシル」という用語は、５−メトキシウラシルおよび／または天然に存在するウラシルを指し得る。
【０４２５】
さらなる実施形態では、５−メトキシウラシルおよび調整されたウラシル含量を有するＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、増大したシトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対的または相対的）を有する。一部の実施形態では、ＯＲＦのＣ、Ｇ、またはＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）の全体的な増大は、野生型ＯＲＦのＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）に対して少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％である。一部の実施形態では、ＯＲＦ中のＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量は、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列の理論上の最大Ｇ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量（％ＧＴＭＸ；％ＣＴＭＸ、または％Ｇ／ＣＴＭＸ）の約１００％未満、約９０％未満、約８５％未満、または約８０％未満である。他の実施形態では、ＯＲＦ中のＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量は、％ＧＴＭＸ、％ＣＴＭＸ、または％Ｇ／ＣＴＭＸの約７０％〜約８０％、約７１％〜約７９％、約７１％〜約７８％、もしくは約７１％〜約７７％である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧおよび／またはＣ含量の増大（絶対的または相対的）は、低Ｇ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量を有する同義コドンを、高Ｇ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量を有する同義コドンで置き換えることによって、行うことができる。他の実施形態では、Ｇおよび／またはＣ含量の増大（絶対的または相対的）は、Ｕで終わるコドンを、ＧまたはＣで終わる同義コドンで置き換えることによって、行われる。
【０４２６】
さらなる実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、５−メトキシウラシルを含み、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも、少ないウラシルペア（ＵＵ）および／またはウラシルトリプレット（ＵＵＵ）および／またはウラシルクアドロップレット（ＵＵＵＵ）を含有する調整されたウラシル含量を有する。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ウラシルペアおよび／またはウラシルトリプレットおよび／またはウラシルクアドロップレットを含有しない。一部の実施形態では、ウラシルペアおよび／またはウラシルトリプレットおよび／またはウラシルクアドロップレットは、ある特定の閾値よりも下に低減され、例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおける発生は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０を上回らない。特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満の非フェニルアラニンウラシルペアおよび／またはトリプレットを含有する。別の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、非フェニルアラニンウラシルペアおよび／またはトリプレットを含有しない。
【０４２７】
さらなる実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、５−メトキシウラシルを含み、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも少ないウラシルリッチクラスターを含有する、調整されたウラシル含量を有する。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列における対応するウラシルリッチクラスターよりも短い長さのウラシルリッチクラスターを含有する。
【０４２８】
さらなる実施形態では、代替的なより低頻度のコドンが利用される。ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする、５−メトキシウラシル含有ｍＲＮＡのＯＲＦ中のコドンのうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは１００％は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドン同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より低いコドン頻度を有する。ＯＲＦはまた、上述のように、調整されたウラシル含量を有する。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおける少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換される。
【０４２９】
一部の実施形態では、ウラシル含量が調整された、５−メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦは、哺乳動物細胞に投与した場合に、対応する野生型ｍＲＮＡからのＩＬ１２の発現レベルよりも高いＩＬ１２の発現レベルを呈する。他の実施形態では、哺乳動物細胞に投与した場合のＩＬ１２の発現レベルは、少なくとも９５％の５−メトキシウラシルを含有し、理論上の最小値の約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、または約２００％のウラシル含量を有する対応するｍＲＮＡと比べて、増大する。さらに他の実施形態では、哺乳動物細胞に投与した場合のＩＬ１２の発現レベルは、対応するｍＲＮＡと比べて増大し、ここで、ウラシルの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％が、１−メチルシュードウラシルまたはシュードウラシルである。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。他の実施形態では、哺乳動物細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＢＪ線維芽細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、ＩＬ１２は、ｍＲＮＡがｉｎ  ｖｉｖｏで哺乳動物細胞に投与される場合に発現される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、マウス、ウサギ、ラット、サル、またはヒトに投与される。一実施形態では、マウスは、ヌルマウスである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１５ｍｇ／ｋｇの量で、マウスに投与される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内または筋肉内投与される。他の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドは、ｍＲＮＡが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞に投与される場合に発現される。一部の実施形態では、発現は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１５００倍、または少なくとも約３０００倍だけ増大する。他の実施形態では、発現は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、６０％、約７０％、約８０％、約９０％、もしくは約１００％だけ増大する。
【０４３０】
一部の実施形態では、ウラシル含量が調整された、５−メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦは、安定性の増大を呈する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、同じ条件下における対応する野生型ｍＲＮＡの安定性と比べて、細胞における安定性の増大を呈する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する耐性、熱安定性、および／または二次構造の安定化の増大を含む、安定性の増大を呈する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡが呈する安定性の増大は、ｍＲＮＡの半減期（例えば、血漿、細胞、または組織試料における）を判定すること、ならびに／またはｍＲＮＡによる経時的なタンパク質発現（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）の曲線下面積（ＡＵＣ）を判定することによって、測定される。ｍＲＮＡは、半減期および／またはＡＵＣが、同じ条件下における対応する野生型ｍＲＮＡの半減期および／またはＡＵＣを上回る場合、安定性の増大を有するとして特定される。
【０４３１】
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、同じ条件下における対応する野生型ｍＲＮＡによって誘導される免疫応答と比べて、検出可能により低い免疫応答（例えば、自然または獲得）を誘導する。他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、同じ条件下におけるＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするが、５−メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡによって誘導される免疫応答と比べて、または同じ条件下におけるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードし、５−メトキシウラシルを含むが、調整されたウラシル含量を有さないｍＲＮＡによって誘導される免疫応答と比べて、検出可能により低い免疫応答（例えば、自然または獲得）を誘導する。自然免疫応答は、増大した炎症促進性サイトカインの発現、細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５など）の活性化、細胞死、および／またはタンパク質翻訳の終止もしくは低減によって示すことができる。一部の実施形態では、自然免疫応答の低減は、１型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−τ、ＩＦＮ−ω、およびＩＦＮ−ζ）の発現もしくは活性レベルまたはインターフェロンにより制御される遺伝子、例えば、ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）の発現、ならびに／または本開示のｍＲＮＡの細胞への１回もしくは複数回の投与の後の細胞死の減少によって、測定することができる。
【０４３２】
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡに応答した哺乳動物細胞による１型インターフェロンの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡ、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするが、５−メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードし、５−メトキシウラシルを含むが、調整されたウラシル含量を有さないｍＲＮＡと比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％を上回って、低減される。一部の実施形態では、インターフェロンは、ＩＦＮ−βである。一部の実施形態では、哺乳動物細胞への本開示のｍＲＮＡの投与によって引き起こされる細胞死の頻度は、対応する野生型ｍＲＮＡ、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするが、５−メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードし、５−メトキシウラシルを含むが、調整されたウラシル含量を有さないｍＲＮＡで観察される細胞死の頻度よりも、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％を上回って、低い。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＢＪ線維芽細胞である。他の実施形態では、哺乳動物細胞は、脾細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、マウスまたはラットのものである。他の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒトのものである。一実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入された哺乳動物細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
【０４３３】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡであり、ここで、ｍＲＮＡにおけるウラシルは、少なくとも約９５％が５−メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦにおける理論上の最小ウラシル含量の約１１５％〜約１３５％であり、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦにおけるウラシル含量は、そのＯＲＦにおける総核酸塩基含量の約３０％未満である。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦは、ＯＲＦのＧ／Ｃ含量（絶対的または相対的）が、対応する野生型ＯＲＦと比較して、少なくとも約４０％増大するようにさらに修飾される。さらに他の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦは、２０を下回る非フェニルアラニンウラシルペアおよび／またはトリプレットを含有する。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおける少なくとも１のコドンは、さらに、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡにおけるウラシルが、少なくとも約９５％が５−メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量が、対応する野生型ＯＲＦにおける理論上の最小ウラシル含量の約１１５％〜約１３５％である、ＯＲＦを含むｍＲＮＡによってコードされるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡによるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドの発現と比較した場合に、少なくとも約１０倍増大する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、オープンＯＲＦを含み、ここで、ｍＲＮＡにおけるウラシルは、少なくとも約９５％が５−メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦの理論上の最小ウラシル含量の約１１５％〜約１３５％であり、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入された哺乳動物細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
１２．ポリヌクレオチドを修飾するための方法
【０４３４】
本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド）を含む、修飾されたポリヌクレオチドを含む。修飾されたポリヌクレオチドは、化学的に修飾され得るおよび／または構造的に修飾され得る。本開示のポリヌクレオチドが、化学的および／または構造的に修飾された場合、ポリヌクレオチドは、「修飾されたポリヌクレオチド」と称され得る。
【０４３５】
本開示は、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書において「核酸塩基」とも称される）と組み合わせて含有する、化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾されたヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾されたまたは非天然のヌクレオシドを含むように、任意の有用な方法、例えば、化学的、酵素的、または組換えなどによって、合成することができる。ポリヌクレオチドは、連結したヌクレオシドの１つまたは複数の領域を含み得る。そのような領域は、変動する骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含むであろう。
【０４３６】
本明細書に開示される修飾されたポリヌクレオチドは、様々な異なる修飾を含み得る。一部の実施形態では、修飾されたポリヌクレオチドは、１つ、２つ、またはそれよりも多くの（任意選択で、異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有する。一部の実施形態では、細胞に導入された修飾されたポリヌクレオチドは、未修飾のポリヌクレオチドと比較して、１つまたは複数の望ましい特性、例えば、改善されたタンパク質発現、低減された免疫原性、または細胞における低減された分解を呈し得る。
ａ．構造的修飾
【０４３７】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、構造的に修飾される。本明細書において使用されるとき、「構造的」修飾は、ヌクレオチド自体に対する有意な化学的修飾を伴うことなく、２つまたはそれよりも多い連結したヌクレオシドが、ポリヌクレオチドにおいて、挿入、欠失、重複、逆転、または無作為化されているものである。化学結合は、構造的修飾を実行するために、必要に応じて破壊および再形成されることになるため、構造的修飾は、化学的性質に関するものであり、したがって、化学的修飾である。しかしながら、構造的修飾は、異なる配列のヌクレオチドをもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ（配列番号２３０）」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に化学的に修飾され得る。同じポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ（配列番号２３０）」から、「ＡＴＣＣＣＧ（配列番号２３１）」に構造的に修飾され得る。この場合、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、ポリヌクレオチドに対する構造的修飾をもたらす。
ｂ．化学的修飾
【０４３８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、化学的に修飾される。本明細書においてポリヌクレオチドを参照して使用されるとき、「化学的修飾」または適宜「化学的に修飾される」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）、またはシチジン（Ｃ）リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに対する、その核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組合せを含むがそれらに限定されない、それらの位置、パターン、パーセント、または集団のうちの１つまたは複数における、修飾を指す。通常、本明細書において、これらの用語は、天然に存在する５’末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すことは意図されない。
【０４３９】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、同じヌクレオシド型のすべてもしくは一部の一様な化学修飾、または同じヌクレオシド型のすべてもしくは一部における同じ出発修飾の下方滴定によって得られる修飾の集団、またはすべてのウリジンが、ウリジン類似体、例えば、５−メトキシウリジンによって置き換えられる場合など、無作為な組込みを有するが同じヌクレオシド型のすべてもしくは一部のある測定パーセントの化学的修飾を有し得る。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体を通じて同じヌクレオシド型の２つ、３つ、または４つの一様な化学的修飾を有し得る（例えば、すべてのウリジンおよび／またはすべてのシチジンなどが、同じ様式で修飾される）。
【０４４０】
修飾されたヌクレオチド塩基の対合は、標準的なアデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、またはグアノシン−シトシンの塩基対だけでなく、非標準的もしくは修飾された塩基を含むヌクレオチド間および／または修飾されたヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合ドナーおよび水素結合アクセプターの配置は、非標準的な塩基と標準的な塩基との間、または２つの相補的な非標準的な塩基構造の間の水素結合を許容する。そのような非標準的な塩基対合の１つの例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組合せが、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
【０４４１】
当業者であれば、別途示される場合を除き、本出願に記載されるポリヌクレオチド配列は、代表的なＤＮＡ配列において「Ｔ」が指定されるが、配列がＲＮＡを表す場合には、「Ｔ」は、「Ｕ」に置き換えられるであろうことを理解するであろう。
【０４４２】
本開示の組成物において有用なポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−イソペンテニルアデノシン；Ｎ６−メチルアデノシン；Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；１，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン；１−メチルアデノシン；２’−Ｏ−メチルアデノシン；２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）；２−メチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２’−Ｏ−メチルアデノシン；２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）；イソペンテニルアデノシン；Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン；Ｎ６−アセチルアデノシン；Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；２−メチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン；７−デアザ−アデノシン；Ｎ１−メチル−アデノシン；Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン；Ｎ６−ｃｉｓ−ヒドロキシ−イソペンテニル−アデノシン；α−チオ−アデノシン；２（アミノ）アデニン；２（アミノプロピル）アデニン；２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン；２−（アルキル）アデニン；２−（アミノアルキル）アデニン；２−（アミノプロピル）アデニン；２−（ハロ）アデニン；２−（ハロ）アデニン；２−（プロピル）アデニン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＡＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドアデノシンＴＰ；６（アルキル）アデニン；６（メチル）アデニン；６−（アルキル）アデニン；６−（メチル）アデニン；７（デアザ）アデニン；８（アルケニル）アデニン；８（アルキニル）アデニン；８（アミノ）アデニン；８（チオアルキル）アデニン；８−（アルケニル）アデニン；８−（アルキル）アデニン；８−（アルキニル）アデニン；８−（アミノ）アデニン；８−（ハロ）アデニン；８−（ヒドロキシル）アデニン；８−（チオアルキル）アデニン；８−（チオール）アデニン；８−アジド−アデノシン；アザアデニン；デアザアデニン；Ｎ６（メチル）アデニン；Ｎ６−（イソペンチル）アデニン；７−デアザ−８−アザ−アデノシン；７−メチルアデニン；１−デアザアデノシンＴＰ；２’フルオロ−Ｎ６−Ｂｚ−デオキシアデノシンＴＰ；２’−ＯＭｅ−２−アミノ−ＡＴＰ；２’Ｏ−メチル−Ｎ６−Ｂｚ−デオキシアデノシンＴＰ；２’−ａ−エチニルアデノシンＴＰ；２−アミノアデニン；２−アミノアデノシンＴＰ；２−アミノ−ＡＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２−���ジドアデノシンＴＰ；２’−ｂ−エチニルアデノシンＴＰ；２−ブロモアデノシンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２−クロロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシアデノシンＴＰ；２−フルオロアデノシンＴＰ；２−ヨードアデノシンＴＰ；２−メルカプトアデノシンＴＰ；２−メトキシ−アデニン；２−メチルチオ−アデニン；２−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−ブロモアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−クロロアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−フルオロアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−ヨードアデノシンＴＰ；３−デアザアデノシンＴＰ；４’−アジドアデノシンＴＰ；４’−炭素環式アデノシンＴＰ；４’−エチニルアデノシンＴＰ；５’−ホモ−アデノシンＴＰ；８−アザ−ＡＴＰ；８−ブロモ−アデノシンＴＰ；８−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；９−デアザアデノシンＴＰ；２−アミノプリン；７−デアザ−２，６−ジアミノプリン；７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン；７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン；２，６−ジアミノプリン；７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン；２−チオシチジン；３−メチルシチジン；５−ホルミルシチジン；５−ヒドロキシメチルシチジン；５−メチルシチジン；Ｎ４−アセチルシチジン；２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルシチジン；５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン；リシジン；Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン；Ｎ４−メチルシチジン；Ｎ４，Ｎ４−ジメチル−２’−ＯＭｅ−シチジンＴＰ；４−メチルシチジン；５−アザ−シチジン；シュード−イソ−シチジン；ピロロ−シチジン；α−チオ−シチジン；２−（チオ）シトシン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＣＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＣＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドシチジンＴＰ；３（デアザ）５（アザ）シトシン；３（メチル）シトシン；３−（アルキル）シトシン；３−（デアザ）５（アザ）シトシン；３−（メチル）シチジン；４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５（ハロ）シトシン；５（メチル）シトシン；５（プロピニル）シトシン；５（トリフルオロメチル）シトシン；５−（アルキル）シトシン；５−（アルキニル）シトシン；５−（ハロ）シトシン；５−（プロピニル）シトシン；５−（トリフルオロメチル）シトシン；５−ブロモ−シチジン；５−ヨード−シチジン；５−プロピニルシトシン；６−（アゾ）シトシン；６−ア��−シチジン；アザシトシン；デアザシトシン；Ｎ４（アセチル）シトシン；１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン；１−メチル−シュードイソシチジン；２−メトキシ−５−メチル−シチジン；２−メトキシ−シチジン；２−チオ−５−メチル−シチジン；４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン；４−メトキシ−シュードイソシチジン；４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン；４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン；４−チオ−シュードイソシチジン；５−アザ−ゼブラリン；５−メチル−ゼブラリン；ピロロ−シュードイソシチジン；ゼブラリン；（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）シチジンＴＰ；２，２’−アンヒドロ−シチジンＴＰ塩酸塩；２’フルオロ−Ｎ４−Ｂｚ−シチジンＴＰ；２’フルオロ−Ｎ４−アセチル−シチジンＴＰ；２’−Ｏ−メチル−Ｎ４−アセチル−シチジンＴＰ；２’Ｏ−メチル−Ｎ４−Ｂｚ−シチジンＴＰ；２’−ａ−エチニルシチジンＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’−ｂ−エチニルシチジンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシシチジンＴＰ；２’−Ｏ−メチル−５−（１−プロピニル）シチジンＴＰ；３’−エチニルシチジンＴＰ；４’−アジドシチジンＴＰ；４’−炭素環式シチジンＴＰ；４’−エチニルシチジンＴＰ；５−（１−プロピニル）アラ−シチジンＴＰ；５−（２−クロロ−フェニル）−２−チオシチジンＴＰ；５−（４−アミノ−フェニル）−２−チオシチジンＴＰ；５−アミノアリル−ＣＴＰ；５−シアノシチジンＴＰ；５−エチニルアラ−シチジンＴＰ；５−エチニルシチジンＴＰ；５’−ホモ−シチジンＴＰ；５−メトキシシチジンＴＰ；５−トリフルオロメチル−シチジンＴＰ；Ｎ４−アミノ−シチジンＴＰ；Ｎ４−ベンゾイル−シチジンＴＰ；シュードイソシチジン；７−メチルグアノシン；Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；Ｎ２−メチルグアノシン；ワイオシン；１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；１−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）；７−アミノメチル−７−デアザグアノシン；７−シアノ−７−デアザグアノシン；アルカエオシン；メチルワイオシン；Ｎ２，７−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン；Ｎ２，７，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン；６−チオ−グアノシン；７−デアザ−グアノシン；８−オキソ−グアノシン��Ｎ１−メチル−グアノシン；α−チオ−グアノシン；２（プロピル）グアニン；２−（アルキル）グアニン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＧＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＧＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドグアノシンＴＰ；６（メチル）グアニン；６−（アルキル）グアニン；６−（メチル）グアニン；６−メチル−グアノシン；７（アルキル）グアニン；７（デアザ）グアニン；７（メチル）グアニン；７−（アルキル）グアニン；７−（デアザ）グアニン；７−（メチル）グアニン；８（アルキル）グアニン；８（アルキニル）グアニン；８（ハロ）グアニン；８（チオアルキル）グアニン；８−（アルケニル）グアニン；８−（アルキル）グアニン；８−（アルキニル）グアニン；８−（アミノ）グアニン；８−（ハロ）グアニン；８−（ヒドロキシル）グアニン；８−（チオアルキル）グアニン；８−（チオール）グアニン；アザグアニン；デアザグアニン；Ｎ（メチル）グアニン；Ｎ−（メチル）グアニン；１−メチル−６−チオ−グアノシン；６−メトキシ−グアノシン；６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン；６−チオ−７−デアザ−グアノシン；６−チオ−７−メチル−グアノシン；７−デアザ−８−アザ−グアノシン；７−メチル−８−オキソ−グアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン；Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン；１−Ｍｅ−ＧＴＰ；２’フルオロ−Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ；２’Ｏ−メチル−Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ；２’−ａ−エチニルグアノシンＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’−ｂ−エチニルグアノシンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオログアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロログアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオログアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシグアノシンＴＰ；４
’−アジドグアノシンＴＰ；４’−炭素環式グアノシンＴＰ；４’−エチニルグアノシンＴＰ；５’−ホモ−グアノシンＴＰ；８−ブロモ−グアノシンＴＰ；９−デアザグアノシンＴＰ；Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ；１−メチルイノシン；イノシン；１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン；２’−Ｏ−メチルイノシン；７−メチルイノシン；２’−Ｏ−メチルイノシン；エポキシクエオシン；ガラクトシル−クエオシン；マンノシルクエオシン；クエオシン；アリアミノ−チミジン；アザチミジン；デアザチミジン；デオキシ−チミジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２−チオウリジン；３−メチルウリジン；５−カルボキシメチルウリジン；５−ヒドロキシウリジン；５−メチルウリジン；５−タウリノメチル−２−チオウリジン；５−タウリノメチルウリジン；ジヒドロウリジン；シュードウリジン；（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；１−メチル−３−（３−アミノ−５−カルボキシプロピル）シュードウリジン；１−メチルシュードウリジン；１−メチル−シュードウリジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；３−メチル−シュード−ウリジンＴＰ；４−チオウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；５，６−ジヒドロ−ウリジン；５−アミノメチル−２−チオウリジン；５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−カルバモイルメチルウリジン；５−カルボキシヒドロキシメチルウリジン；５−カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル；５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルバモイルメチルウリジンＴＰ；５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン；５−メトキシカルボニルメチルウリジン；５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン；５−メチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン；５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチルウリジン；５−メチルジヒドロウリジン；５−オキシ酢酸−ウリジンＴＰ；５−オキシ酢酸−メチルエステル−ウリジンＴＰ；Ｎ１−メチル−シュード−ウリジン；ウリジン５−オキシ酢酸；ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）−ウリジンＴＰ；５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）−２−チオウリジンＴＰ；５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンＴＰ；５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）ウリジンＴＰ；５−プロピニルウラシル；α−チオ−ウリジン；１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２（チオ）−シュードウラシル；１（アミ���アルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）−シュードウラシル；１置換２（チオ）−シュードウラシル；１置換２，４−（ジチオ）シュードウラシル；１置換４（チオ）シュードウラシル；１置換シュードウラシル；１−（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２−（チオ）−シュードウラシル；１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュード−ＵＴＰ；１−メチル−シュード−ＵＴＰ；２（チオ）シュードウラシル；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２−（チオ）ウラシル；２，４−（ジチオ）シュードウラシル；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルオロ−グアノシン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＵＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＵＴＰ；２’−アジド−デオキシウリジンＴＰ；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドウリジンＴＰ；２−メチルシュードウリジン；３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル；４（チオ）シュードウラシル；４−（チオ）シュードウラシル；４−（チオ）ウラシル；４−チオウラシル；５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル；５（２−アミノプロピル）ウラシル；５（アミノアルキル）ウラシル；５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル；５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル；５（メチル）２（チオ）ウラシル；５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチル）４（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル；５（プロピニル）ウラシル；５（トリフルオロメチル）ウラシル；５−（２−アミノプロピル）ウラシル；５−（アルキル）−２−（チオ）シュードウラシル；５−（アルキル）−２，４（ジチオ）シュードウラシル；５−（アルキル）−４（チオ）シュードウラシル；５−（アルキル）シュードウラシル；５−（アルキル）ウラシル；５−（アルキニル）ウラシル；５−（アリルアミノ）ウラシル；５−（シアノアルキル）ウラシル；５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル；５−（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５−（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５−（ハロ）ウラシル；５−（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル；５−（メトキシ）ウラシル；５−（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル；５−（メトキシカルボニ���−メチル）ウラシル；５−（メチル）２（チオ）ウラシル；５−（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５−（メチル）４（チオ）ウラシル；５−（メチル）−２−（チオ）シュードウラシル；５−（メチル）−２，４（ジチオ）シュードウラシル；５−（メチル）−４（チオ）シュードウラシル；５−（メチル）シュードウラシル；５−（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル；５−（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル；５−（メチルアミノメチル）−４−（チオ）ウラシル；５−（プロピニル）ウラシル；５−（トリフルオロメチル）ウラシル；５−アミノアリル−ウリジン；５−ブロモ−ウリジン；５−ヨード−ウリジン；５−ウラシル；６（アゾ）ウラシル；６−（アゾ）ウラシル；６−アザ−ウリジン；アリアミノ−ウラシル；アザウラシル；デアザウラシル；Ｎ３（メチル）ウラシル；シュード−ＵＴＰ−１−２−エタン酸；シュードウラシル；４−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−カルボキシメチル−シュードウリジン；１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン；１−プロピニル−ウリジン；１−タウリノメチル−１−メチル−ウリジン；１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン；１−タウリノメチル−シュードウリジン；２−メトキシ−４−チオ−シュードウリジン；２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン；２−チオ−１−メチル−シュードウリジン；２−チオ−５−アザ−ウリジン；２−チオ−ジヒドロシュードウリジン；２−チオ−ジヒドロウリジン；２−チオ−シュードウリジン；４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン；４−メトキシ−シュードウリジン；４−チオ−１−メチル−シュードウリジン；４−チオ−シュードウリジン；５−アザ−ウリジン；ジヒドロシュードウリジン；（±）１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｒ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｓ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）アラ−ウリジンＴＰ；（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）ウリジンＴＰ；（Ｚ）−５−（２−ブロモ−ビニル）アラ−ウリジンＴＰ；（Ｚ）−５−（２−ブロモ−ビニル）ウリジンＴＰ；１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−シュード−ＵＴＰ；１−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）シュードウリジンＴＰ；１−（２，２−ジエトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１−（２，４，６−トリメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（２，４，６−トリメチル−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（２，４，６−トリメチル−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（２−アミノ−２−カルボキシエチル）シュード−ＵＴＰ；１−（２−アミノ−エチル）シュード−ＵＴＰ；１−（２−ヒドロキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１−（２−メトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１−（３，４−ビス−トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（３，４−ジメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュード−ＵＴＰ；１−（３−アミノ−プロピル）シュード−ＵＴＰ；１−（３−シクロプロピル−プロパ−２−イニル）シュード��リジンＴＰ；１−（４−アミノ−４−カルボキシブチル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アミノ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アミノ−ブチル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アミノ−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アジドベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−ブロモベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−クロロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−フルオロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−ヨードベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メタンスルホニルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メトキシ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−メトキシ−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−メチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メチル−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−ニトロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−ニトロ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１（４−ニトロ−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−チオメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−トリフルオロメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（５−アミノ−ペンチル）シュード−ＵＴＰ；１−（６−アミノ−ヘキシル）シュード−ＵＴＰ；１，６−ジメチル−シュード−ＵＴＰ；１−［３−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオニル］シュードウリジンＴＰ；１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−プロピオニル｝シュードウリジンＴＰ；１−アセチルシュードウリジンＴＰ；１−アルキル−６−（１−プロピニル）−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−（２−プロピニル）−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−アリル−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−エチニル−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−ホモアリル−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−ビニル−シュード−ＵＴＰ；１−アリルシュードウリジンＴＰ；１−アミノメチル−シュード−ＵＴＰ；１−ベンゾイルシュードウリジンＴＰ；１−ベンジルオキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−ベンジル−シュード−ＵＴＰ；１−ビオチニル−ＰＥＧ２−シュードウリジンＴＰ；１−ビオチニルシュードウリジンＴＰ；１−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−シアノメチルシュードウ
リジンＴＰ；１−シクロブチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロブチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘプチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘプチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘキシルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘキシル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロオクチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロオクチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロペンチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロペンチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロプロピルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロプロピル−シュード−ＵＴＰ；１−エチル−シュード−ＵＴＰ；１−ヘキシル−シュード−ＵＴＰ；１−ホモアリルシュードウリジンＴＰ；１−ヒドロキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−Ｍｅ−２−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−Ｍｅ−４−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−Ｍｅ−アルファ−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−メタンスルホニルメチルシュードウリジンＴＰ；１−メトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−メチル−６−（２，２，２−トリフルオロエチル）シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−（４−モルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−（４−チオモルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−（置換フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−アミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−アジド−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ブロモ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−クロロ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−シアノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ジメチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−エトキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−エチルカルボキシレート−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−エチル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−フルオロ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ホルミル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ヒドロキシアミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ヒドロキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ヨード−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−メトキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−メチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−フェニル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−トリフルオロメトキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ；１−モルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１−ペンチル−シュード−ＵＴＰ；１−フェニル−シュード−ＵＴＰ；１−ピバロイルシュードウリジンＴＰ；１−プロパルギルシュードウリジンＴＰ；１−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−プロピニル−シュードウリジン；１−ｐ−トリル−シュード−ＵＴＰ；１−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−チオメトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−チオモルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１−トリフルオロアセチルシュードウリジンＴＰ；１−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ；１−ビニルシュードウリジンＴＰ；２，２’−アンヒドロ−ウリジンＴＰ；２’−ブロモ−デオキシウリジンＴＰ；２’−Ｆ−５−メチル−２’−デオキシ−ＵＴＰ；２’−ＯＭｅ−５−Ｍｅ−ＵＴＰ；２’−ＯＭｅ−シュード−ＵＴＰ；２’−ａ−エチニルウリジンＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’−ｂ−エチニルウリジンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシウリジンＴＰ；２−メトキシ−４−チオ−ウリジン；２−メトキシウリジン；２’−Ｏ−メチル−５−（１−プロピニル）ウリジンＴＰ；３−アルキル−シュード−ＵＴＰ；４’−アジドウリジンＴＰ；４’−炭素環式ウリジンＴＰ；４’−エチニルウリジンＴＰ；５−（１−プロピニル）アラ−ウリジンＴＰ；５−（２−フラニル）ウリジンＴＰ；５−シアノウリジンＴＰ；５−ジメチルアミノウリジンＴＰ；５’−ホモ−ウリジンＴＰ；５−ヨード−２’−フルオロ−デオキシウリジンＴＰ；５−フェニルエチニルウリジンＴＰ；５−トリジュウテロメチル−６−ジュウテロウリジンＴＰ；５−トリフルオロメチル−ウリジンＴＰ；５−ビニルアラウリジンＴＰ；６−（２，２，２−トリフルオロエチル）−シュード−ＵＴＰ；６−（４−モルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；６−（４−チオモルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；６−（置換−フェニル）−シュード−ＵＴＰ；６−アミノ−シュード−ＵＴＰ；６−アジド−シュード−ＵＴＰ；６−ブロモ−シュード−ＵＴＰ；６−ブチル−シュード−ＵＴＰ；６−クロロ−シュード−ＵＴＰ；６−シアノ−シュード−ＵＴＰ；６−ジメチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；６−エトキシ−シュード−ＵＴＰ；６−エチルカルボキシレート−シュード−ＵＴＰ；６−エチル−シュード−ＵＴＰ；６−フルオロ−シュード−ＵＴＰ；６−ホルミル−シュード−ＵＴＰ；６−ヒドロキシアミノ−シュード−ＵＴＰ；６−ヒドロキシ−シュード−ＵＴＰ；６−ヨード−シュード−ＵＴＰ；６−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ；６−メトキシ−シュード−ＵＴＰ；６−メチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；６−メチル−シュード−ＵＴＰ；６−フェニル−シュード−ＵＴＰ；６−フェニル−シュード−ＵＴＰ；６−プロピル−シュード−ＵＴＰ；６−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ；６−トリフルオロメトキシ−シュード−ＵＴＰ；６−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ；アルファ−チオ−シュード−ＵＴＰ；シュードウリジン１−（４−メチルベンゼンスルホン酸）ＴＰ；シュードウリジン１−（４−メチル安息香酸）ＴＰ；シュードウリジンＴＰ１−［３−（２−エトキシ）］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−（２−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−｛２（２−エトキシ）−エトキシ｝−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−メチルホスホン酸；シュードウリジンＴＰ１−メチルホスホン酸ジエチルエステル；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−３−プロピオン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−４−ブタン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−５−ペンタン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−６−ヘキサン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−７−ヘプタン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−メチル−ｐ−安息香酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−ｐ−安息香酸；ワイブトシン；ヒドロキシワイブトシン；イソワイオシン；ペルオキシワイブトシン；不十分修飾ヒドロキシワイブトシン；４−デメチルワイオシン；２，６−（ジアミノ）プリン；１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル：１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル；１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン；２（アミノ）プリン；２，４，５−（トリメチル）フェニル；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルオロ−シチジン；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルオロ−アデニン；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルオロ−ウリジン；２’−アミノ−２’−デオキシリボース；２−アミノ−６−クロロ−プリン；２−アザ−イノシニル；２’−アジド−２’−デオキシリボース；２’フルオロ−２’−デオキシリボース；２’−フルオロ修飾塩基；２’−Ｏ−メチル−リボース；２−オキソ−７−アミノピリドピリミジン−３−イル；２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル；２−ピリジノン；３ニトロピロール；３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル；３−（メチル）イソカルボスチリリル；４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンゾイミダゾール；４−（メチル）ベンゾイミダゾール；４−（メチル）インドリル；４，６−（ジメチル）インドリル；５ニトロインドール；５置換ピリミジン；５−（メチル）イソカルボスチリリル；５−ニトロインドール；６−（アザ）ピリミジン；６−（アゾ）チミン；６−（メチル）−７−（アザ）インドリル；６−クロロ−プリン；６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；７−（アザ）インドリル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）フェノキサジン−１−イル（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｌ−ｙｌ）；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；７−（プロピニル）イソカルボスチリリル；７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル；７−デアザ−イノシニル；７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル；７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；９−（メチル）−イミジゾピリジニル；アミノインドリル；アントラセニル；ビス−オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；ジフルオロトリル；ヒポキサンチン；イミジゾピリジニル；イノシニル；イソカルボスチリリル；イソグアニシン；Ｎ２−置換プリン；Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン；Ｎ６−置換プリン；Ｎ−アルキル化誘導体；ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）；ニトロベンゾイミダゾリル；ニトロイミダゾリル；ニトロインダゾリル；ニトロピラゾリル；ヌブラリン；Ｏ６−置換プリン；Ｏ−アルキル化誘導体；オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；オキソホルマイシンＴＰ；パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；ペンタセニル；フェナントラセニル；フェニル；プロピニル−７−（アザ）インドリル；ピレニル；ピリドピリミジン−３−
イル；ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル；ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；ピロロピリミジニル；ピロロピリジニル；スチルベンジル；置換１，２，４−トリアゾール；テトラセニル；ツベルシジン；キサンチン；キサントシン−５’−ＴＰ；２−チオ−ゼブラリン；５−アザ−２−チオ−ゼブラリン；７−デアザ−２−アミノ−プリン；ピリジン−４−オンリボヌクレオシド；２−アミノ−リボシド−ＴＰ；ホルマイシンＡ  ＴＰ；ホルマイシンＢ  ＴＰ；ピロロシンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−アデノシンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−シチジンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−ウリジンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−グアノシンＴＰ；５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジンＴＰ；およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）アデノシンＴＰ
【０４４３】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾された核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の組合せを含む。
【０４４４】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、α−チオ−グアノシン、α−チオ−アデノシン、５−シアノウリジン、４’−チオウリジン  ７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、および２，６−ジアミノプリン、（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、２，８−ジメチルアデノシン、２−ゲラニルチオウリジン、２−リシジン、２−セレノウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）−５，６−ジヒドロウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン、３−メチルシュードウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンメチルエステル、５−アミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−アミノメチル−２−セレノウリジン、５−アミノメチルウリジン、５−カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５−カルバモイルメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−シアノメチルウリジン、５−ヒドロキシシチジン、５−メチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、７−アミノカルボキシプロピル−デメチルワイオシン、７−アミノカルボキシプロピルワイオシン、７−アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、８−メチルアデノシン、Ｎ４，Ｎ４−ジメチルシチジン、Ｎ６−ホルミルアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環状Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル−クエオシン、メチル化不十分修飾ヒドロキシワイブトシン、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチルシチジン、ゲラニル化５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、ゲラニル化５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、Ｑ塩基、ｐｒｅＱ０塩基、ｐｒｅＱ１塩基、およびこれらの２つまたはそれよりも多くの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、５−メチルシトシン、５−メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾された核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の組合せを含む。１つの特定の実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、Ｎ１−メチルシュードウリジンである。
（ｉ）塩基修飾
【０４４５】
ある特定の実施形態では、化学的修飾は、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）の核酸塩基におけるものである。
【０４４６】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基を含む。
【０４４７】
一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、２−チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’−チオウラシル、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウラシル、２−チオ−１−メチル−シュードウラシル、２−チオ−５−アザ−ウラシル、２−チオ−ジヒドロシュードウラシル、２−チオ−ジヒドロウラシル、２−チオ−シュードウラシル、４−メトキシ−２−チオ−シュードウラシル、４−メトキシ−シュードウラシル、４−チオ−１−メチル−シュードウラシル、４−チオ−シュードウラシル、５−アザ−ウラシル、ジヒドロシュードウラシル、５−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、１−メチル−シュードウラシル（ｍ１ψ）、５−メトキシ−ウラシル（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シトシン（ｍ５Ｃ）、α−チオ−グアニン、α−チオ−アデニン、５−シアノウラシル、４’−チオウラシル、７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデニン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデニン（ｍ６Ａ）、および２，６−ジアミノプリン、（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアニン、７−シアノ−７−デアザ−グアニン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアニン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアニン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアニン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアニン、７−メチル−８−オキソ−グアニン、およびこれらの２つまたはそれよりも多くの組合せからなる群から選択される。
【０４４８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド中の核酸塩基は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
【０４４９】
一部の実施形態では、化学的に修飾された核酸塩基は、ウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【０４５０】
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
【０４５１】
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のアデニンは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
【０４５２】
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のシトシンは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
【０４５３】
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のグアニンは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
【０４５４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、修飾された核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の組合せを含む。
【０４５５】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）における修飾された核酸塩基は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオ−グアノシン、およびα−チオ−アデノシンからなる群から選択される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、前述の修飾された核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の組合せを含む。
【０４５６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、シュードウリジン（ψ）および５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）および５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、２−チオウリジンおよび５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）および５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
【０４５７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾に関しては、一様に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体を通じて修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で一様に修飾され得、これは、ｍＲＮＡ配列におけるすべてのシトシン残基が、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、配列に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について、上記に記載されるもののうちのいずれかなど、修飾された残基との置換えによって、一様に修飾され得る。
【０４５８】
一部の実施形態では、オープンリーディングフレームにおける化学的に修飾されるヌクレオシドは、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【０４５９】
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたシトシンである。修飾されたシトシンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジンが挙げられる。
【０４６０】
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたウリジンである。修飾されたウリジンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、５−シアノウリジンまたは４’−チオウリジンが挙げられる。
【０４６１】
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたアデニンである。修飾されたアデニンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデニン（ｍ６Ａ）、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。
【０４６２】
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたグアニンである。修飾されたグアニンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシンが挙げられる。
【０４６３】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）における核酸塩基が修飾されたヌクレオチドは、５−メトキシウリジンである。
【０４６４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、修飾された核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の組合せを含む。
【０４６５】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド）におけるある種類の核酸塩基（例えば、ウラシル）のうちの少なくとも９５％が、修飾された核酸塩基である。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド）におけるウラシルのうちの少なくとも９５％が、５−メトキシウラシルである。
【０４６６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、５−メトキシウリジン（５ｍｏ５Ｕ）および５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
【０４６７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾に関しては、一様に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体を通じて修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、５−メトキシウリジンで一様に修飾され得、これは、ｍＲＮＡ配列における実質的にすべてのウリジン残基が、５−メトキシウリジンで置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、配列に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について、上記に記載されるもののうちのいずれかなど、修飾された残基との置換えによって、一様に修飾され得る。
【０４６８】
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたシトシンである。
【０４６９】
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたウラシルである。修飾されたウラシルを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドは、５−メトキシウラシルを含む。
【０４７０】
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたアデニンである。
【０４７１】
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたグアニンである。
【０４７２】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中の核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの組合せは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
【０４７３】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のウリジンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
【０４７４】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のアデノシンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
【０４７５】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のシチジンヌクレオシドは、少なくとも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
【０４７６】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のグアノシンヌクレオシドは、少なくとも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
【０４７７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に開示されるサブユニットおよび異種ポリペプチドリンカーを含め、ヌクレオシドの間に任意の有用なリンカーを含み得る。本開示の組成物において有用なそのようなリンカーとしては、骨格修飾を含め、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：３’−アルキレンホスホネート、３’−アミノホスホロアミデート、アルケン含有骨格、アミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、キラルホスホネート、キラルホスホロチオエート、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレン（メチルイミノ）、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、モルホリノ結合、−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−、ヘテロ原子ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、ホスフィネート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ＰＮＡ、シロキサン骨格、スルファメート骨格、スルフィドスルホキシドおよびスルホン骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにチオノホスホロアミデート。
（ｉｉ）糖修飾
【０４７８】
ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み込むことができる修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、構成ブロック分子）は、リボ核酸の糖に修飾され得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）が、修飾され得るか、またはいくつかの異なる置換基で置き換えられ得る。２’位における例示的な置換基としては、Ｈ、ハロ、任意に置換されるＣ１〜６アルキル；任意に置換されるＣ１〜６アルコキシ；任意に置換されるＣ６〜１０アリールオキシ；任意に置換されるＣ３〜８シクロアルキル；任意に置換されるＣ３〜８シクロアルコキシ；任意に置換されるＣ６〜１０アリールオキシ；任意に置換されるＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；任意に置換されるＣ１〜１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載される任意のもの）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、ここで、Ｒは、Ｈまたは任意に置換されるアルキルであり、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数である；２’−ヒドロキシルが、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって同じリボース糖の４’−炭素に結合されている、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）、ここで、例示的な架橋は、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋を含む；本明細書に定義されるアミノアルキル；本明細書に定義されるアミノアルコキシ；本明細書に定義されるアミノ；ならびに本明細書に定義されるアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７９】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である、糖基リボースを含む。例示的で非限定的な修飾されたヌクレオチドとしては、リボースにおける酸素の置換え（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはアルキレン、例えば、メチレンまたはエチレンでの）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置き換えるため）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタン４員環を形成するため）；リボースの環拡大（例えば、ホスホロアミデート骨格も有する、例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびモルホリノのための、追加の炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成するため）；多環式形態（例えば、トリシクロ；および「アンロックド」形態、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ、リボースが、ホスホジエステル結合に結合したグリコール単位によって置き換えられる）、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースが、α−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置き換えられる）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ、２−アミノ−エチル−グリシン結合が、リボースおよびホスホジエステル骨格を置き換える）が挙げられる。糖基はまた、リボースにおける対応する炭素のものとは逆の立体化学構造を有する、１つまたは複数の炭素を含有し得る。したがって、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アラビノースを糖として含有するヌクレオチドを含み得る。そのような糖修飾は、国際特許公開第ＷＯ２０１３０５２５２３号および同第ＷＯ２０１４０９３９２４号に教示されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（ｉｉｉ）修飾の組合せ
【０４８０】
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／あるいはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチド、またはそれらの機能的断片、もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、糖、核酸塩基、および／またはヌクレオシド間結合に対する修飾の組合せを含み得る。これらの組合せは、本明細書に記載される任意の１つまたは複数の修飾を含み得る。
【０４８１】
修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドの組合せの例は、以下の表５に提供される。修飾されたヌクレオチドの組合せを使用して、本開示のポリヌクレオチドを形成することができる。別途示されない限り、修飾されたヌクレオチドは、本開示のポリヌクレオチドの天然のヌクレオチドを、完全に置換してもよい。非限定的な例として、天然のヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載される修飾されたヌクレオシドで置換され得る。別の非限定的な例では、天然のヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示される修飾されたヌクレオシドのうちの少なくとも１つで、部分的に（例えば、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．９％）置換され得るかまたは置き換えられ得る。塩基／糖またはリンカーの任意の組合せが、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得、そのような修飾は、国際特許公開第ＷＯ２０１３０５２５２３号および同第ＷＯ２０１４０９３９２４号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１１５２７２号および同第ＵＳ２０１５０３０７５４２号に教示されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【表５−１】
2019516710.tif 000063
【表５−２】
2019516710.tif 000064
【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
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１３．非翻訳領域（ＵＴＲ）
【０４８２】
非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳されない、開始コドンの前（５’ＵＴＲ）および終止コドンの後（３’ＵＴＲ）のポリヌクレオチドの核酸区画である。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、本開示のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、さらに、ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはこれらの組合せ）を含む。
【０４８３】
ＵＴＲは、ポリヌクレオチドのコーディング領域に相同であっても異種であってもよい。一部の実施形態では、ＵＴＲは、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするＯＲＦに相同である。一部の実施形態では、ＵＴＲは、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするＯＲＦに対して異種である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くの５’ＵＴＲまたはその機能的断片を含み、これらのそれぞれは、同じかまたは異なるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くの３’ＵＴＲまたはその機能的断片を含み、これらのそれぞれは、同じかまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
【０４８４】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはこれらの任意の組合せは、配列最適化される。
【０４８５】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはこれらの任意の組合せは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。
【０４８６】
ＵＴＲは、制御上の役割、例えば、増大または減少した安定性、局在化、および／または翻訳効率を提供する、特徴を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織、または生物に投与することができ、１つまたは複数の制御上の特徴は、日常的な方法を使用して測定することができる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの機能的断片は、それぞれ、全長５’または３’ＵＴＲの１つまたは複数の制御上の特徴を含む。
【０４８７】
天然の５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす特徴を有する。それらは、リボソームが、多数の遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に公知である、コザック配列のようなものを特徴としている。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号２３２）を有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）であり、これには、別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することも公知である。
【０４８８】
特定の標的器官の豊富に発現される遺伝子において典型的に見出される特徴を操作することによって、ポリヌクレオチドの安定性およびタンパク質産生を増強することができる。例えば、肝臓に発現されるｍＲＮＡ、例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子の５’ＵＴＲの導入により、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を増強することができる。同様に、その組織における発現を改善するために他の組織特異的ｍＲＮＡに由来する５’ＵＴＲを使用することが、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ハーキュリン）、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、ミエロイド細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、ならびに肺上皮細胞（例えば、ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）に可能である。
【０４８９】
一部の実施形態では、ＵＴＲは、タンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有している転写産物のファミリーから選択される。例えば、コードされるポリペプチドは、特定の細胞、組織において、または発達中の何らかの時点で、発現される、タンパク質のファミリーに属し得る（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する）。遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに由来するＵＴＲを、同じかまたは異なるタンパク質のファミリーの任意の他のＵＴＲと交換して、新しいポリヌクレオチドを作製することができる。
【０４９０】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、異種であり得る。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、３’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。
【０４９１】
共同所有の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（公開第ＷＯ／２０１４／１６４２５３号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、本開示のポリヌクレオチドにおいて、ＯＲＦに隣接する領域として利用することができる例示的なＵＴＲの一覧を提供する。
【０４９２】
本出願の例示的なＵＴＲとしては、グロビン、例えば、α−またはβ−グロビン（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン）；強力なコザック翻訳開始シグナル；ＣＹＢＡ（例えば、ヒトシトクロムｂ−２４５  αポリペプチド）；アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）；ＨＳＤ１７Ｂ４（水酸化ステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ）；ウイルス（例えば、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄化萎縮ウイルス）；熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）；翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）；グルコース輸送体（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））；アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）；ＧＡＰＤＨ；チューブリン；ヒストン；クエン酸回路酵素；トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）を欠くＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ）；リボソームタンパク質大型３２（Ｌ３２）；リボソームタンパク質（例えば、ヒトまたはマウスリボソームタンパク質、例えば、ｒｐｓ９など）；ＡＴＰシンターゼ（例えば、ＡＴＰ５Ａ１またはミトコンドリアＨ＋−ＡＴＰシンターゼのβサブユニット）；成長ホルモンｅ（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））；伸長因子（例えば、伸長因子１  α１（ＥＥＦ１Ａ１））；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）；筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）；β−Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲンアルファ２（Ｃｏｌ１Ａ２）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲンアルファ２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲンアルファ１（Ｃｏｌ６Ａ１））；リボフォリン（例えば、リボフォリンＩ（ＲＰＮＩ））；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）；カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）；カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）；プロコラーゲン−リジン、２−オキソグルタレート５−ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；ならびにヌクレオバインディン（例えば、Ｎｕｃｂ１）の核酸配列に由来する１つまたは複数の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４９３】
他の例示的な５’および３’ＵＴＲとしては、Ｋａｒｉｋｏら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、２００８年、１６巻（１１号）、１８３３〜１８４０頁；Ｋａｒｉｋｏら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、２０１２年、２０巻（５号）、９４８〜９５３頁；Ｋａｒｉｋｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０１１年、３９巻（２１号）：ｅ１４２頁；Ｓｔｒｏｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９７年、４巻、６２４〜６２７頁；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２０１５年、２９０巻（９号）、５６６１〜５６７２頁；Ｙｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００７年、２５巻（１０号）、１７０１〜１７１１頁；Ｃａｆｒｉら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、２０１５年、２３巻（８号）、１３９１〜１４００頁；Ａｎｄｒｉｅｓら、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．、２０１２年、９巻（８号）、２１３６〜２１４５頁；Ｃｒｏｗｌｅｙら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２０１５年６月３０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１５．６８；Ｒａｍｕｎａｓら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、２０１５年、２９巻（５号）、１９３０〜１９３９頁；Ｗａｎｇら、Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２０１５年、１５巻（４号）、４２８〜４３５頁；Ｈｏｌｔｋａｍｐら、Ｂｌｏｏｄ、２００６年、１０８巻（１３号）、４００９〜４０１７頁；Ｋｏｒｍａｎｎら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１１年、２９巻（２号）、１５４〜１５７頁；Ｐｏｌｅｇａｎｏｖら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎ．  Ｔｈｅｒ．、２０１５年、２６巻（１１号）、７５１〜７６６頁；Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、２０１０年、７巻（５号）、６１８〜６３０頁；ＭａｎｄａｌおよびＲｏｓｓｉ、Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．、２０１３年、８巻（３号）、５６８〜５８２頁；ＨｏｌｃｉｋおよびＬｉｅｂｈａｂｅｒ、ＰＮＡＳ、１９９７年、９４巻（６号）、２４１０〜２４１４頁；Ｆｅｒｉｚｉら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．、２０１５年、１５巻（１７号）、３５６１〜３５７１頁；Ｔｈｅｓｓら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、２０１５年、２３巻（９号）、１４５６〜１４６４頁；Ｂｏｒｏｓら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１５年、１０巻（６号）、ｅ０１３１１４１頁；Ｂｏｒｏｓら、Ｊ．  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．  Ｂ．、２０１３年、１２９巻、９３〜９９頁；Ａｎｄｒｉｅｓら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１５年、２１７巻、３３７〜３４４頁；Ｚｉｎｃｋｇｒａｆら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００３年、２１巻（１５号）、１６４０〜９頁；Ｇａｒｎｅａｕら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００８年、８２巻（２号）、８８０〜８９２頁；ＨｏｌｄｅｎおよびＨａｒｒｉｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４年、３２９巻（１号）、１１９〜１３３頁；Ｃｈｉｕら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００５年、７９巻（１３号）、８３０３〜８３１５頁；Ｗａｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９７年、１６巻（１３号）、４１０７〜４１１６頁；Ａｌ−Ｚｏｇｈａｉｂｉら、Ｇｅｎｅ、２００７年、３９１巻（１〜２号）、１３０〜９頁；Ｖｉｖｉｎｕｓら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００１年、２６８巻（７号）、１９０８〜１９１７頁；ＧａｎおよびＲｈｏａｄｓ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９９６年、２７１���（２号）、６２３〜６２６頁；Ｂｏａｄｏら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、１９９６年、６７巻（４号）、１３３５〜１３４３頁；ＫｎｉｒｓｃｈおよびＣｌｅｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２０００年、２７２巻（１号）、１６４〜１６８頁；Ｃｈｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８年、３７巻（４６号）、１６２９８〜１６３０６頁；ＩｚｑｕｉｅｒｄｏおよびＣｕｅｖｚａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、２０００年、３４６巻、３部：８４９〜８５５頁；Ｄｗｙｅｒら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、１９９６年、６６巻（２号）、４４９〜４５８頁；Ｂｌａｃｋら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９９７年、１７巻（５号）、２７５６〜２７６３頁；ＩｚｑｕｉｅｒｄｏおよびＣｕｅｖｚａ、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９９７年、１７巻（９号）、５２５５〜５２６８頁；ＵＳ８２７８０３６、ＵＳ８７４８０８９、ＵＳ８８３５１０８、ＵＳ９０１２２１９、ＵＳ２０１０／０１２９８７７、ＵＳ２０１１／００６５１０３、ＵＳ２０１１／００８６９０４、ＵＳ２０１２／０１９５９３６、ＵＳ２０１４／０２０６７５、ＵＳ２０１３／０１９５９６７、ＵＳ２０１４／０２９４９０、ＵＳ２０１４／０２０６７５３、ＷＯ２００７／０３６３６６、ＷＯ２０１１／０１５３４７、ＷＯ２０１２／０７２０９６、ＷＯ２０１３／１４３５５５、ＷＯ２０１４／０７１９６３号、ＷＯ２０１３／１８５０６７、ＷＯ２０１３／１８２６２３、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＷＯ２０１３／１８５０６９、ＷＯ２０１４／１４４１９６、ＷＯ２０１４／１５２６５９、２０１４／１５２６７３、ＷＯ２０１４／１５２９４０、ＷＯ２０１４／１５２７７４、ＷＯ２０１４／１５３０５２、ＷＯ２０１４／１５２９６６、ＷＯ２０１４／１５２５１３、ＷＯ２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５／０６２７３８、ならびにＷＯ２０１５／０２４６６７に記載されるものが挙げられるがこれらに限定されず、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４９４】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、β−グロビン５’ＵＴＲ；強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する５’ＵＴＲ；シトクロムｂ−２４５  αポリペプチド（ＣＹＢＡ）５’ＵＴＲ；水酸化ステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）５’ＵＴＲ；タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ；ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）５’ＵＴＲ；非構造的タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム；デング熱ウイルス（ＤＥＮ）５’ＵＴＲ；熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）５’ＵＴＲ；ｅＩＦ４Ｇ  ５’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１  ５’ＵＴＲ；これらの機能的断片およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【０４９５】
一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、β−グロビン３’ＵＴＲ；ＣＹＢＡ  ３’ＵＴＲ；アルブミン３’ＵＴＲ；成長ホルモン（ＧＨ）３’ＵＴＲ；ＶＥＥＶ  ３’ＵＴＲ；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）３’ＵＴＲ；α−グロビン３’ＵＴＲ；ＤＥＮ  ３’ＵＴＲ；ＰＡＶオオムギ黄化萎縮ウイルス（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）３’ＵＴＲ；伸長因子１  α１（ＥＥＦ１Ａ１）３’ＵＴＲ；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）３’ＵＴＲ；ミトコンドリアＨ（＋）−ＡＴＰシンターゼのβサブユニット（β−ｍＲＮＡ）３’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１  ３’ＵＴＲ；ＭＥＦ２Ａ  ３’ＵＴＲ；β−Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ  ３’ＵＴＲ；これらの機能的断片およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０４９６】
他の例示的なＵＴＲとしては、ＷＯ２０１４／１６４２５３に開示されているＵＴＲのうちの１つまたは複数（ＵＴＲの任意の組合せを含む）が挙げられるがこれらに限定されず、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国仮出願第６１／７７５，５０９号の表２１および米国仮出願第６１／８２９，３７２号の表２２には、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの開始部位および終了部位の一覧が示されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。表２１では、それぞれの５’ＵＴＲ（５’−ＵＴＲ−００５から５’−ＵＴＲ  ６８５１１）は、その天然または野生型（相同）転写産物と比べた、その開始部位および終了部位により特定される（ＥＮＳＴ、ＥＮＳＥＭＢＬデータベースにおいて使用される識別子）。
【０４９７】
任意の遺伝子またはｍＲＮＡに由来する野生型ＵＴＲが、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。一部の実施形態では、ＵＴＲは、例えば、ＯＲＦに対するＵＴＲの配向もしくは位置を変更することによって、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって、野生型または天然のＵＴＲに対して変化させて、バリアントＵＴＲを産生することができる。一部の実施形態では、５’または３’ＵＴＲのバリアント、例えば、野生型ＵＴＲの変異体、または１つもしくは複数のヌクレオチドがＵＴＲの末端に付加されたかもしくはそこから除去されたバリアントが、利用され得る。
【０４９８】
加えて、１つまたは複数の合成ＵＴＲを、１つまたは複数の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用してもよい。例えば、ＭａｎｄａｌおよびＲｏｓｓｉ、Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．、２０１３年、８巻（３号）、５６８〜８２頁（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ならびにｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／Ｄｅｒｒｉｃｋ＿Ｒｏｓｓｉ／（最終アクセス２０１６年４月１６日）で入手可能な配列を参照されたい。ＵＴＲまたはその部分は、それらが選択された転写産物と同じ配向で配置されてもよく、または配向もしくは位置を変化させてもよい。したがって、５’および／または３’ＵＴＲは、逆転されるか、短くされるか、延長されるか、または１つもしくは複数の他の５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲと組み合わされてもよい。
【０４９９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば、二重、三重、または四重の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。例えば、二重ＵＴＲは、直列または実質的に直列のいずれかで、同じＵＴＲの２つのコピーを含む。例えば、二重ベータ−グロビン３’ＵＴＲを、使用することができる（ＵＳ２０１０／０１２９８７７を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５００】
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のＵＴＲのいずれかから選択される５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、
【表Ａ−１】
2019516710.tif 000074
【表Ａ−２】
2019516710.tif 000075
【表Ａ−３】
2019516710.tif 000076
【表Ａ−４】
2019516710.tif 000077
を含む。
【０５０１】
一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、
【表Ｂ−１】
2019516710.tif 000078
【表Ｂ−２】
2019516710.tif 000079
【表Ｂ−３】
2019516710.tif 000080
【表Ｂ−４】
2019516710.tif 000081
【表Ｂ−５】
2019516710.tif 000082
【表Ｂ−６】
2019516710.tif 000083
【表Ｂ−７】
2019516710.tif 000084
【表Ｂ−８】
2019516710.tif 000085
【表Ｂ−９】
2019516710.tif 000086
【表Ｂ−１０】
2019516710.tif 000087
を含む。
【０５０２】
ある特定の実施形態では、本開示の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ配列は、本明細書に開示の５’ＵＴＲ配列のいずれかを含む５’ＵＴＲ配列および／または本明細書に開示の３’ＵＴＲ配列のいずれかを含む３’ＵＴＲ配列、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される配列に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０５０３】
ある特定の実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、３’ＵＴＲの機能を破壊することなく、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位、またはその中の任意の他の異種ヌクレオチド配列を含む。ｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ配列のいくつかの例を、表６に列挙する。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２３８〜２４０からなる群から選択される配列に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２３８に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２３９に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２４０に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【表６】
2019516710.tif 000088
【０５０４】
本開示のポリヌクレオチドは、特徴の組合せを含み得る。例えば、ＯＲＦには、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲおよび／またはポリ−Ａ尾部の鋳型付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲが、隣接していてもよい。５’ＵＴＲは、同じおよび／または異なるＵＴＲに由来する第１のポリヌクレオチド断片および第２のポリヌクレオチド断片を含み得る（例えば、ＵＳ２０１０／０２９３６２５を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５０５】
パターン型ＵＴＲを有することもまた、本開示の範囲内である。本明細書において使用されるとき、「パターン型ＵＴＲ」には、反復または交互のパターン、例えば、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、または１回、２回、もしくは３回を上回って反復されるこれらのバリアントが含まれる。これらのパターンにおいて、それぞれの文字Ａ、Ｂ、またはＣは、異なるＵＴＲ核酸配列を表す。
【０５０６】
他の非ＵＴＲ配列を、本開示のポリヌクレオチド内の領域または部分領域として使用してもよい。例えば、イントロンまたはイントロン配列の部分が、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。イントロン配列の組込みにより、タンパク質の産生ならびにポリヌクレオチドの発現レベルを増大させることができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりまたはそれに加えて、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、Ｙａｋｕｂｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１０年、３９４巻（１号）、１８９〜１９３頁を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、それぞれ、非構造的タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレームを含む、ＲＶゲノムＲＮＡの５’および／または３’末端と関連する５’および／または３’配列、またはその欠失誘導体を含む（例えば、Ｐｏｇｕｅら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６７巻（１２号）、７１０６〜７１１７頁を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ウイルスキャプシド配列はまた、翻訳エンハンサー、例えば、キャプシド配列の５’部分として使用され得る（例えば、Ｓｊｏｂｅｒｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＮＹ）、１９９４年、１２巻（１１号）、１１２７〜１１３１頁ならびにＦｒｏｌｏｖおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．１９９６年、７０巻（２号）、１１８２〜１１９０頁に記載されるセムリキ森林ウイルスおよびシンドビスウイルスキャプシドＲＮＡ、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＯＲＦおよびウイルスキャプシド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成５’ＵＴＲを、非合成３’ＵＴＲと組み合わせて含む。
【０５０７】
一部の実施形態では、ＵＴＲはまた、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、１つの翻訳エンハンサーエレメント、または複数の翻訳エンハンサーエレメント（集合的に、「ＴＥＥ」、これは、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増大させる核酸配列を指す）を含み得る。非限定的な例として、ＴＥＥとしては、ＵＳ２００９／０２２６４７０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるもの、および当技術分野において公知のその他のものが挙げられる。非限定的な例として、ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置してもよい。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＴＥＥを含む。
【０５０８】
一態様では、ＴＥＥは、核酸の翻訳活性、例えば、限定されないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳を促進し得る、ＵＴＲ内の保存されたエレメントである。これらの配列の保存は、ヒトを含め、１４種にわたって示されている。例えば、Ｐａｎｅｋら、「Ａｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  １８Ｓ  ｒＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｔｏ  ｍＲＮＡ  ５’ＵＴＲｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ５４８を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５０９】
１つの非限定的な例では、ＴＥＥは、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５’リーダーにおけるＴＥＥ配列を含む。Ｃｈａｐｐｅｌｌら、ＰＮＡＳ、２００４年、１０１巻、９５９０〜９５９４頁を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５１０】
他の非限定的な例において、ＴＥＥは、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、およびＷＯ２００９／０７５８８６の配列番号１〜３５；ＷＯ２０１２／００９６４４の配列番号１〜５および７〜６４５；ならびにＷＯ１９９９／０２４５９５、ＵＳ６３１０１９７、およびＵＳ６８４９４０５の配列番号１の配列のうちの１つもしくは複数を有するＴＥＥを含み、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５１１】
一部の実施形態では、ＴＥＥは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＨＣＶ−ＩＲＥＳ、またはＩＲＥＳ要素であり、例えば、これらに限定されないが、ＵＳ７４６８２７５、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ２００７／０２５００８、およびＷＯ２００１／０５５３６９に記載されるもの；このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＩＲＥＳ要素として、Ｃｈａｐｐｅｌｌら、ＰＮＡＳ  ２００４  １０１：９５９０−９５９４、Ｚｈｏｕら、ＰＮＡＳ  ２００５  １０２：６２７３−６２７８、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１１／０１２４１００、およびＷＯ２００７／０２５００８によって記載されるようなＧｔｘ配列（例えば、Ｇｔｘ９−ｎｔ、Ｇｔｘ８−ｎｔ、Ｇｔｘ７−ｎｔ）が挙げられ得るが、これらに限定されず、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５１２】
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」または「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列」とは、本明細書において提供されるおよび／または当技術分野において公知のＴＥＥ（例えば、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＵＳ２００９／００９３０４９、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００１／０５５３７１、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、およびＥＰ２６１０３４０Ａ１を参照のこと、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）またはそれらのバリアント、ホモログ、もしくは機能的誘導体のうちの１つまたは複数を含むポリヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＴＥＥの１つまたは複数のコピーを含む。翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおけるＴＥＥは、１つまたは複数の配列セグメント中に編成され得る。配列セグメントは、本明細書において提供されるＴＥＥのうちの１つまたは複数を保有してよく、それぞれのＴＥＥは、１つまたは複数のコピーで存在している。複数の配列セグメントが、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドに存在する場合、それらは、同種であっても異種であってもよい。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおける複数の配列セグメントは、本明細書において提供される同一または異なる種類のＴＥＥ、同一または異なる数のそれぞれのＴＥＥのコピー、ならびに／またはそれぞれの配列セグメント内で同一もしくは異なる編成のＴＥＥを保有し得る。一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。
【０５１３】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２００１／０５５３７１、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、ＥＰ２６１０３４０Ａ１、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２００９／００９３０４９、またはＵＳ２０１３／０１７７５８１に開示される少なくとも１つのＴＥＥまたはその部分を含み、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５１４】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、ＥＰ２６１０３４０Ａ１、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、Ｃｈａｐｐｅｌｌら、ＰＮＡＳ  ２００４  １０１：９５９０−９５９４、Ｚｈｏｕら、ＰＮＡＳ  ２００５  １０２：６２７３−６２７８、ならびにＷｅｌｌｅｎｓｉｅｋら、「Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３、ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２の補遺の表１および補遺の表２に開示されるＴＥＥに少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるＴＥＥを含み、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５１５】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、ＥＰ２６１０３４０Ａ１、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、Ｃｈａｐｐｅｌｌら、ＰＮＡＳ  ２００４  １０１：９５９０−９５９４、Ｚｈｏｕら、ＰＮＡＳ  ２００５  １０２：６２７３−６２７８、ならびにＷｅｌｌｅｎｓｉｅｋら、「Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３、ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２の補遺の表１および補遺の表２に開示されるＴＥＥ配列の５〜３０ヌクレオチド断片、５〜２５ヌクレオチド断片、５〜２０ヌクレオチド断片、５〜１５ヌクレオチド断片、または５〜１０ヌクレオチド断片（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの断片）から選択されるＴＥＥを含む。
【０５１６】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／００９３０４９、およびＷＯ２００１／０５５３７１のいずれかに記載されている転写制御エレメントであるＴＥＥを含み、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。転写制御エレメントは、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／００９３０４９、およびＷＯ２００１／０５５３７１に記載されている方法などであるがこれらに限定されない、当技術分野において公知の方法によって特定することができる。
【０５１７】
一部の実施形態では、本明細書に記載される少なくとも１つのＴＥＥを含む５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、モノシストロニック配列、例えば、限定されないが、ベクター系または核酸ベクターに組み込まれ得る。非限定的な例として、ベクター系および核酸ベクターとして、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２００９／００９３０４９、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ２００７／０２５００８、およびＷＯ２００１／０５５３７１に記載されるものが挙げられ得る。
【０５１８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、本明細書に記載のＴＥＥまたはその部分を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ中のＴＥＥは、５’ＵＴＲに位置するＴＥＥと同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【０５１９】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または６０より多くのＴＥＥ配列を含み得る。一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、１〜６０、１〜５５、１〜５０、１〜４５、１〜４０、１〜３５、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つのＴＥＥ配列を含み得る。本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同じまたは異なるＴＥＥ配列であり得る。本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲにおける異なるＴＥＥ配列の組合せには、異なるＴＥＥ配列のうちのいずれかの１より多くのコピーが組み込まれた組合せが含まれ得る。ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、または１回、２回、３回、もしくは３回を上回って反復されるこれらのバリアントなどのパターンであり得る。これらのパターンにおいて、それぞれの文字Ａ、Ｂ、またはＣは、異なるＴＥＥヌクレオチド配列を表す。
【０５２０】
一部の実施形態では、ＴＥＥは、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ２００７／０２５００８、ＷＯ２０１２／００９６４４に記載される方法によって特定することができ、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５２１】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を分離するためのスペーサーを含む。非限定的な例としては、スペーサーは、１５ヌクレオチドのスペーサーおよび／または当技術分野において公知のその他のスペーサーであり得る。他の非限定な例として、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲにおいて、それぞれ、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、または１０回より多く反復されるＴＥＥ配列−スペーサーモジュールを含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回反復されるＴＥＥ配列−スペーサーモジュールを含む。
【０５２２】
一部の実施形態では、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーは、本開示のポリヌクレオチドの翻訳を制御することができる、当技術分野において公知の他の配列、例えば、本明細書に記載されるｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位およびｍｉＲシード）を含み得る。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を分離するために使用されるそれぞれのスペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の構成要素（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
【０５２３】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ｍｉＲおよび／またはＴＥＥ配列を含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドへのｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の組込みにより、ステムループ領域の形状を変化させることができ、これにより、翻訳を増大および／または減少させることができる。例えば、Ｋｅｄｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０年、１２巻（１０号）、１０１４〜２０頁を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
１４．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
【０５２４】
センサー配列としては、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列および／もしくはモチーフ、内因性核酸結合分子の擬受容体として作用するように操作された人工的結合部位、ならびにこれらの組合せが挙げられる。センサー配列の非限定的な例は、米国公開第２０１４／０２００２６１号に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５２５】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本開示のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、センサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、センサー配列は、ｍｉＲＮＡ結合部位である。
【０５２６】
ｍｉＲＮＡは、１９〜２５ヌクレオチドの長さの非コーディングＲＮＡであり、ポリヌクレオチドに結合し、遺伝子発現を、安定性を低減させることまたはポリヌクレオチドの翻訳を阻害することのいずれかによって、下方制御する。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位の領域内の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８または２〜７位を含み得る。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ結合部位におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ  １位に対向するアデノシン（Ａ）が隣接している。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ結合部位におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ  １位に対向するアデノシン（Ａ）が隣接している。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，  Ｆａｒｈ  ＫＫ，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，  Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，  Ｌｉｍ  ＬＰ，  Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ；  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．、２００７年７月６日、２７巻（１号）、９１〜１０５頁を参照されたい。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングを行って、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡの存在または不在を判定することができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、またはマイクロＲＮＡシードを含む。そのような配列は、米国公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号および米国公開第ＵＳ２００５／００５９００５号において教示されているものなど、任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５２７】
本明細書において使用されるとき、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡと相互作用または会合または結合するのに十分な、ｍｉＲＮＡのすべてまたは領域に対する相補性を有する、ポリヌクレオチド内、例えば、ＤＮＡ内、または５’ＵＴＲおよび／もしくは３’ＵＴＲを含めたＲＮＡ転写産物内の配列を指す。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、本開示のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。例示的な実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【０５２８】
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、ｍｉＲＮＡに媒介されるポリヌクレオチドの制御、例えば、ｍｉＲＮＡに媒介されるポリヌクレオチドの転写抑制または分解を促進するのに十分な程度の相補性を指す。本開示の例示的な態様では、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、ｍｉＲＮＡに媒介されるポリヌクレオチドの分解、例えば、ｍｉＲＮＡに先導されるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に媒介されるｍＲＮＡの切断を促進するのに十分な程度の相補性を指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９〜２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、１９〜２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部分にのみ、例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列の全長の１、２、３、または４ヌクレオチド未満の一部分にのみ、相補的であってもよい。所望される制御が、ｍＲＮＡ分解である場合には、十分または完全な相補性（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡの長さのすべてまたは有意な部分にわたる、十分な相補性または完全な相補性）が、好ましい。
【０５２９】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有するが、１つ、２つ、または３つのヌクレオチド置換、末端付加、および／または短縮を除く。
【０５３０】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方において、対応するｍｉＲＮＡよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチド短い。さらに他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方において、対応するマイクロＲＮＡよりも２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、依然として、ｍｉＲＮＡ結合部位のうちの１つもしくは複数を組み込むｍＲＮＡを分解すること、またはｍＲＮＡの翻訳を予防することが可能である。
【０５３１】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ダイサーを含有する活性なＲＩＳＣの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位がＲＩＳＣ内の対応するｍｉＲＮＡに結合することにより、ｍｉＲＮＡ結合部位を含有するｍＲＮＡが分解されるか、またはｍＲＮＡが翻訳されるのが予防される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを切断するように、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドに不安定性を誘導するように、不完全な相補性を有する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制するように、不完全な相補性を有する。
【０５３２】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡとは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のミスマッチを有する。
【０５３３】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、それぞれ、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続したヌクレオチドに対して相補的な、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続したヌクレオチドを有する。
【０５３４】
本開示のポリヌクレオチドに１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を操作することにより、ポリヌクレオチドは、分解の標的となるか翻訳が低減され得るが、ただし、問題のｍｉＲＮＡが利用可能であることを条件とする。これにより、ポリヌクレオチドを送達したときの標的外作用が低減され得る。例えば、本開示のポリヌクレオチドが、組織または細胞に送達することを意図していなかったにもかかわらずそこに到達してしまった場合でも、ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位をポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに操作しておけば、組織または細胞において豊富なｍｉＲＮＡにより、目的の遺伝子の発現を阻害することが可能である。
【０５３５】
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特定の組織におけるタンパク質発現を増大させるために、それらが天然に存在しているポリヌクレオチド配列から除去してもよい。例えば、特定のｍｉＲＮＡの結合部位を、ポリヌクレオチドから除去して、そのｍｉＲＮＡを含有する組織または細胞におけるタンパク質発現を改善することができる。
【０５３６】
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を、正常細胞および／またはがん性細胞などであるがこれらに限定されない特定の細胞に指向するために、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を、正常細胞および／またはがん性細胞などであるがこれらに限定されない特定の細胞に指向するために、５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲに、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多いｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
【０５３７】
複数の組織における発現の制御は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去を通じて達成することができる。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するかまたは挿入するかの決定は、疾患におけるｍｉＲＮＡ発現パターンおよび／またはそれらのプロファイリングに基づいて行うことができる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、ならびにそれらの発現パターンおよび生物学における役割の特定が、報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒら、Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、２０１０年、１１巻、９４３〜９４９頁；ＡｎａｎｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２０１１年、１８巻、１７１〜１７６頁；ＣｏｎｔｒｅｒａｓおよびＲａｏ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２０１２年、２６巻、４０４〜４１３頁（２０１１年１２月２０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ、２００９年、１３６巻、２１５〜２３３頁；Ｌａｎｄｇｒａｆら、Ｃｅｌｌ、２００７年、１２９巻、１４０１〜１４１４頁；ＧｅｎｔｎｅｒおよびＮａｌｄｉｎｉ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．、２０１２年、８０巻、３９３〜４０３頁およびその中のすべての参考文献；これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５３８】
ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ結合部位は、米国公開第２０１４／０２００２６１号、同第２００５／０２６１２１８号、および同第２００５／００５９００５号に記載されている非限定的な例を含め、任意の公知の配列に対応し得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５３９】
ｍｉＲＮＡが、ｍＲＮＡを制御し、それによってタンパク質の発現を制御することが公知である組織の例としては、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、ミエロイド細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、および肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０５４０】
一部のマイクロＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−１２２は、正常組織において豊富であるが、がんまたは腫瘍組織においてははるかに低いレベルで存在する。したがって、マイクロＲＮＡ標的配列（すなわち、マイクロＲＮＡ結合部位）を、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、３’ＵＴＲなどの領域または他の領域）に操作することにより、正常組織（マイクロＲＮＡが豊富である）における分解または翻訳の低減のために有効に分子を標的とし、同時に、がんまたは腫瘍組織（マイクロＲＮＡがはるかに低いレベルで存在する）における高いレベルの翻訳を提供することができる。これにより、本開示の方法および組成物に、腫瘍標的化アプローチが提供される。
【０５４１】
本開示に有用であり得るｍｉＲＮＡ結合部位のさらなる例として、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが挙げられ、これには、これらに限定されないが、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｈｓａ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−１−−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２−−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７９、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４７ａ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ｂ、ｍｉＲ−１５５−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２−３ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１９７−３ｐ、ｍｉＲ−１９７−５ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ，ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ，ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−２９０９、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ，、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３３１−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７７−３ｐ、ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−５４２、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｊ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、およびｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられる。さらに、新規のｍｉＲＮＡは、マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびマイクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）分析（例えば、Ｊｉｍａ  ＤＤら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０、１１６：ｅ１１８−ｅ１２７；Ｖａｚ  Ｃら、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１０、１１，２８８、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）によって免疫細胞において特定することができる。
【０５４２】
肝臓において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１２２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２２８−５ｐ、ｍｉＲ−１２４９、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１３０３、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−５８１、ｍｉＲ−９３９−３ｐ、およびｍｉＲ−９３９−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の肝臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。肝臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０５４３】
肺において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３８１−３ｐ、およびｍｉＲ−３８１−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の肺特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて肺におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。肺特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０５４４】
心臓において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１８６−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７４４−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、およびｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の心臓特異的マイクロＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて心臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。心臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０５４５】
神経系において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−１２７１−３ｐ、ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ，ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３６６６、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｍｉＲ−４５４−５ｐ、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−５１０、ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５７１、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−９２２、ｍｉＲ−９−３ｐ、およびｍｉＲ−９−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。神経系において富化されるｍｉＲＮＡとして、これらに限定されないが、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−３２０ｅ、ｍｉＲ−３２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−９２２を含むニューロンにおいて特異的に発現されるもの、ならびにこれらに限定されないが、ｍｉＲ−１２５０、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０６５−３ｐ、ｍｉＲ−３０６５−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、およびｍｉＲ−６５７を含むグリア細胞において特異的に発現されるものがさらに上げられる。任意のＣＮＳ特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて神経系におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。神経系特異的ｍｉＲＮＡ結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０５４６】
膵臓において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１０５−３ｐ、ｍｉＲ−１０５−５ｐ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１９５−３ｐ、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、およびｍｉＲ−９４４が挙げられるが、これらに限定されない。任意の膵臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて膵臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０５４７】
腎臓において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、およびｍｉＲ−５６２が挙げられるが、これらに限定されない。任意の腎臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。腎臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０５４８】
筋肉において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２８６、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、およびｍｉＲ−２５−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の筋肉特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて筋肉におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。筋肉特異的ｍｉＲＮＡ結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
【０５４９】
ｍｉＲＮＡは、また、異なる種類の細胞、例えば、これらに限定されないが、内皮細胞、上皮細胞、および脂肪細胞において、差示的に発現される。
【０５５０】
内皮細胞において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｍｉＲ−１０１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２３６−３ｐ、ｍｉＲ−１２３６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、およびｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。多数の新規なｍｉＲＮＡが、ディープシークエンシング分析から内皮細胞において発見されている（例えば、Ｖｏｅｌｌｅｎｋｌｅ  Ｃら、ＲＮＡ、２０１２、１８、４７２−４８４、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）。任意の内皮細胞特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて内皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。
【０５５１】
上皮細胞において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、呼吸線毛上皮細胞において特異的なｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−８０２およびｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ、肺上皮細胞において特異的なｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１２６、腎臓上皮細胞において特異的なｍｉＲ−３８２−３ｐ、ｍｉＲ−３８２−５ｐ、および角膜上皮細胞において特異的なｍｉＲ−７６２が挙げられるが、これらに限定されない。任意の上皮細胞特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて上皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。
【０５５２】
加えて、広範なｍｉＲＮＡ群が、胚性幹細胞において豊富であり、幹細胞の自己再生ならびに神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成細胞、および筋肉細胞などの様々な細胞系統の発生および／または分化を調節している（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ＫＴら、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２０１３、１３（５）、７５７−７６４；Ｖｉｄｉｇａｌ  ＪＡおよびＶｅｎｔｕｒａ  Ａ、Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．２０１２、２２（５−６）、４２８−４３６；Ｇｏｆｆ  ＬＡら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２００９、４：ｅ７１９２；Ｍｏｒｉｎ  ＲＤら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８、６１０−６２１；Ｙｏｏ  ＪＫら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１２、２１（１１）、２０４９−２０５７、これらのそれぞれは、その全体が参考として本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞において豊富なｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ７ｄ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１３８−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−２−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１５４−３ｐ、ｍｉＲ−１５４−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｅ、ｍｉＲ−３６７−３ｐ、ｍｉＲ−３６７−５ｐ、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−５４８ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｋ、ｍｉＲ−５４８ｌ、ｍｉＲ−５４８ｍ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５４８ｏ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｏ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−７６６−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ，ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−９４１，ｍｉＲ−９６−３ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐおよびｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。多くの予測される新規なｍｉＲＮＡは、ヒト胚性幹細胞においてディープシークエンシングによって発見されている（例えば、Ｍｏｒｉｎ  ＲＤら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８、６１０−６２１；Ｇｏｆｆ  ＬＡら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２００９、４：ｅ７１９２；Ｂａｒ  Ｍら、Ｓｔｅｍ細胞、２００８、２６、２４９６−２５０５、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）。
【０５５３】
一実施形態では、胚性幹細胞の発生および／もしくは分化を調節するため、変性状態（例えば、変性疾患）における幹細胞の老化を阻害するため、または疾患状態における幹細胞（例えば、がん幹細胞）の老化およびアポトーシスを刺激するために、胚性幹細胞に特異的なｍｉＲＮＡの結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに含まれてもよく、またはそこから除去されてもよい。
【０５５４】
多くのｍｉＲＮＡ発現に関する研究は、様々ながん細胞／組織および他の疾患におけるｍｉＲＮＡの差次的発現をプロファイリングするために行われている。一部のｍｉＲＮＡは、ある特定のがん細胞において異常に過剰発現され、その他のものは、過少発現される。例えば、ｍｉＲＮＡは、がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）；がん幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４）；膵臓がんおよび疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）；喘息および炎症（ＵＳ８４１５０９６）；前立腺がん（ＵＳ２０１３／００５３２６４号）；肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）；肺がん細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）；皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）；結腸直腸がん細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）；がん陽性リンパ節（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）；上咽頭癌（ＥＰ２１１２２３５）；慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）；甲状腺がん（ＷＯ２０１３／０６６６７８）；卵巣がん細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）；乳がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病およびリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４号、同第ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において、差次的に発現される。
【０５５５】
非限定的な例として、ある特定のがんおよび／または腫瘍細胞において過剰発現されるｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲから除去され、がん細胞において過剰発現されるｍｉＲＮＡによって抑制されていた発現を回復させ、それによって、対応する生物学的機能、例えば、転写の刺激および／または抑制、細胞周期停止、アポトーシス、ならびに細胞死を緩和することができる。ｍｉＲＮＡの発現が上方制御されていない正常な細胞および組織は、影響を受けない。
【０５５６】
ｍｉＲＮＡはまた、血管新生など、複雑な生物学的プロセスを制御し得る（例えば、ｍｉＲ−１３２）（ＡｎａｎｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２０１１年、１８巻、１７１〜１７６頁）。本開示のポリヌクレオチドでは、そのようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位は、生物学的に関連する細胞型または関連する生物学的プロセスに合わせてポリヌクレオチドの発現を調整するために、除去または導入され得る。この文脈において、本開示のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドと定義される。
【０５５７】
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）に対して完全に相補的であり、それによって、ｍｉＲＮＡ結合部位に融合したｍＲＮＡを分解する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡに対して完全に相補的ではない。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、対応するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）と同じ長さである。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、５’末端、３’末端、またはその両方において、対応するマイクロＲＮＡ（例えば、２２ヌクレオチドを有するｍｉＲ−１２２）よりも１ヌクレオチド短い。さらに他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、５’末端、３’末端、または両方において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）より２ヌクレオチド短い。なお他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、５’末端、３’末端、または両方において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）より３ヌクレオチド短い。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、５’末端、３’末端、または両方において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）より４ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、５’末端、３’末端、または両方において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）より５ヌクレオチド短い。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、５’末端、３’末端、または両方において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）より６ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、５’末端または３’末端において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）より７ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、５’末端または３’末端において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）より８ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、５’末端または３’末端において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）より９ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、５’末端または３’末端において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）より１０ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、５’末端または３’末端において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）より１１ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、５’末端または３’末端において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）より１２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、依然として、ｍｉＲＮＡ結合部位のうちの１つもしくは複数を組み込むｍＲＮＡを分解すること、またはｍＲＮＡの翻訳を予防することが可能である。
【０５５８】
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）を含むＲＩＳＣ複合体が、マイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを切断するように、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）に対する十分な相補性を有する。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）を含むＲＩＳＣ複合体が、マイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドに不安定性を誘導するように、不完全な相補性を有する。別の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）を含むＲＩＳＣ複合体が、マイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制するように、不完全な相補性を有する。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、対応するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）から１個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから２個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから３個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから４個のミスマッチを有する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから５個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから６個のミスマッチを有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから７個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから８個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから９個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１０個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１１個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１２個のミスマッチを有する。
【０５５９】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、対応するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）の少なくとも約１０の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１０の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１１の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１１の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１２の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１２の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１３の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１３の連続したヌクレオチド、または対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１４の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１４の連続したヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１５の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１６の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１６の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１７の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１７の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１８の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１８の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１９の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１９の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約２０の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約２０の連続したヌクレオチド、または対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約２１の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約２１の連続したヌクレオチドを有する。
【０５６０】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＢとＩＬ１２Ａとの融合ポリペプチド、ならびに少なくとも１のｍｉＲ−１２２結合部位、少なくとも２のｍｉＲ−１２２結合部位、少なくとも３のｍｉＲ−１２２結合部位、少なくとも４のｍｉＲ−１２２結合部位、または少なくとも５のｍｉＲ−１２２結合部位をコードするｍＲＮＡを含む。一態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２２に結合するか、またはｍｉＲ−１２２に相補的である。別の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２２−３ｐまたはｍｉＲ−１２２−５ｐに結合する。特定の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号５２または５４に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ−１２２に結合する。特定の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号５２または５４に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ここで、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２２に結合する。別の特定の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号５４に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ここで、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２２に結合する。これらの配列を、以下の表７に示す。
【表７】
2019516710.tif 000089
【０５６１】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）は、ポリヌクレオチドの任意の位置（例えば、３’ＵＴＲ）において、本開示のポリヌクレオチドに挿入される。ポリヌクレオチドにおける挿入部位は、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が、対応するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）の不在下において、機能的ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドの翻訳を妨害しない限り、ポリヌクレオチドのいずれの場所であってもよく、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１２２）の存在下においては、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入およびｍｉＲＮＡ結合部位の対応するｍｉＲＮＡへの結合は、ポリヌクレオチドを分解することまたはポリヌクレオチドの翻訳を予防することが可能である。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに挿入される。
【０５６２】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＢとＩＬ１２Ａ融合とのポリペプチドをコードするｍＲＮＡの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド内の下流に挿入される。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチド、例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＢとＩＬ１２Ａとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド内の下流に挿入される。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチド、例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＢとＩＬ１２Ａとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの終止コドンから約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド〜約６５ヌクレオチド内の下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本明細書に開示されるＩＬ１２ポリペプチドをコードする核酸配列中の終止コドンの下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本明細書に開示される膜ドメインをコードする核酸配列中の終止コドンの下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本明細書に開示される異種ポリペプチドをコードする核酸配列中の終止コドンの下流に挿入される。
【０５６３】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドの任意の位置（例えば、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ）において、本開示のポリヌクレオチドに挿入される。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ポリヌクレオチドにおける挿入部位は、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が、対応するｍｉＲＮＡの不在下において、機能的ポリペプチドの翻訳を妨害しない限り、ポリヌクレオチドのいずれの場所であってもよく、ｍｉＲＮＡの存在下においては、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入およびｍｉＲＮＡ結合部位の対応するｍｉＲＮＡへの結合は、ポリヌクレオチドを分解することまたはポリヌクレオチドの翻訳を予防することが可能である。
【０５６４】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本開示のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド内の下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド内の下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド〜約６５ヌクレオチド内の下流に挿入される。
【０５６５】
ｍｉＲＮＡ遺伝子制御は、周囲配列の種、配列の種類（例えば、異種、相同、外因性、内因性、もしくは人工的）、周囲配列における制御エレメント、ならびに／または周囲配列における構造エレメントなどであるがこれらに限定されない、ｍｉＲＮＡの周囲の配列によって、影響を受け得る。ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲによって影響を受け得る。非限定的な例として、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列型のヒト３’ＵＴＲと比較して、目的のポリペプチドの発現に対するｍｉＲＮＡ配列の制御効果を増大させ得る。
【０５６６】
一実施形態では、５’ＵＴＲの他の制御エレメントおよび／または構造エレメントは、ｍｉＲＮＡに媒介される遺伝子制御に影響を及ぼし得る。制御エレメントおよび／または構造エレメントの１つの例は、５’ＵＴＲにおける構造化ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）であり、これは、タンパク質の翻訳を開始するための翻訳伸長因子の結合に必要である。ＥＩＦ４Ａ２が、５’−ＵＴＲにおけるこの二次構造化エレメントに結合することが、ｍｉＲＮＡに媒介される遺伝子発現には必要である（Ｍｅｉｊｅｒ  ＨＡら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、３４０巻、８２〜８５頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本開示のポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに媒介される遺伝子制御を増強するために、構造化５’ＵＴＲをさらに含み得る。
【０５６７】
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作され得る。この文脈において、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれよりも多いｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作されてもよい。例えば、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、２、または１のｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作されてもよい。一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、同じであってもよく、または異なるｍｉＲＮＡ部位であってもよい。本開示のポリヌクレオチドに組み込まれる異なるｍｉＲＮＡ結合部位の組合せには、異なるｍｉＲＮＡ部位のうちのいずれかの１つより多くのコピーが組み込まれる組合せが含まれ得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内で同じ組織を標的としてもよく、または異なる組織を標的としてもよい。非限定的な例として、組織特異的、細胞型特異的、または疾患特異的なｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに導入することを通じて、特定の細胞型（例えば、肝細胞、ミエロイド細胞、内皮細胞、がん細胞など）における発現の程度を低減させることができる。
【０５６８】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの５’末端付近、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端とのほぼ中間、ならびに／または３’ＵＴＲの３’末端付近に、操作され得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近および３’ＵＴＲの５’末端と３’末端とのほぼ中間に、操作され得る。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの３’末端付近および３’ＵＴＲの５’末端と３’末端とのほぼ中間に、操作され得る。さらに別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近および３’ＵＴＲの３’末端付近に、操作され得る。
【０５６９】
別の実施形態では、３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、および／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に相補的であり得る。
【０５７０】
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、対象の異なる組織または異なる細胞型において発現される１つより多くのｍｉＲＮＡ部位を含むように操作され得る。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、対象の肝臓および腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御するために、ｍｉＲ−１９２およびｍｉＲ−１２２を含むように操作され得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、同じ組織に対する１つより多くのｍｉＲＮＡ部位を含むように操作されてもよい。
【０５７１】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと関連する治療域および／または差次的発現を、ｍｉＲＮＡ結合部位により変化させることができる。例えば、死のシグナルを提供するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、がん細胞のｍｉＲＮＡシグネチャーによって、がん細胞においてより高度に発現するように設計することができる。がん細胞が、特定のｍｉＲＮＡをより低いレベルで発現する場合には、そのｍｉＲＮＡ（または複数のｍｉＲＮＡ）の結合部位をコードするポリヌクレオチドを、より高度に発現させることになる。したがって、死のシグナルを提供するポリペプチドは、がん細胞において、細胞死を誘発または誘導する。同じｍｉＲＮＡをより高度な発現で保有する近傍の非がん細胞は、コードされる死のシグナルによって受ける影響は低いであろうが、これは、ポリヌクレオチドが、３’ＵＴＲにおいてコードされる結合部位または「センサー」へのｍｉＲＮＡの結合の作用に起因して、より低いレベルで発現されるためである。逆に、細胞生存または細胞保護のシグナルを、がんを含有する組織および非がん性細胞に送達することもでき、その場合、ｍｉＲＮＡは、がん細胞においてより高い発現を有し、その結果、がん細胞に対しては生存シグナルがより低くなり、正常な細胞に対しては生存シグナルがより高くなる。本明細書に記載されるｍｉＲＮＡ結合部位の使用に基づいて、異なるシグナルを有する複数のポリヌクレオチドを設計し、投与することができる。
【０５７２】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの発現は、少なくとも１つのセンサー配列をポリヌクレオチドに組み込み、投与のためにポリヌクレオチドを製剤化することによって、調節することができる。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込み、ポリヌクレオチドを、本明細書に記載される脂質のうちのいずれかを含め、カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子に製剤化することによって、組織または細胞を標的とすることができる。
【０５７３】
本開示のポリヌクレオチドは、異なる組織、細胞型、または生物学的条件におけるｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞型、または生物学的条件における発現をより標的化するように操作することができる。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入を通じて、本開示のポリヌクレオチドは、組織もしくは細胞において、または生物学的条件の文脈で、タンパク質発現が最適となるように設計することができる。
【０５７４】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、公知のｍｉＲＮＡシード配列に１００％の同一性を有するか、またはｍｉＲＮＡシード配列に１００％よりも低い同一性を有するかのいずれかである、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むように設計することができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、公知のｍｉＲＮＡシード配列に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｍｉＮＲＡ結合部位を組み込むように設計され得る。ｍｉＲＮＡシード配列は、ｍｉＲＮＡ結合親和性を減少させ、したがってポリヌクレオチドの下方調節の低減をもたらすように、部分的に変異していてもよい。本質的には、ｍｉＲＮＡ結合部位とｍｉＲＮＡシードとの間のマッチまたはミスマッチの程度は、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力をより細かく調整するためのレオスタットとして作用し得る。加えて、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域における変異もまた、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力に影響を及ぼし得る。
【０５７５】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、ステムループのループに組み込まれ得る。
【０５７６】
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡシード配列は、ステムループのループに組み込まれ得、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ステムループの５’または３’ステムに組み込まれ得る。
【０５７７】
一実施形態では、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）は、ステムループのステムの５’末端に組み込まれ得、ｍｉＲＮＡシードは、ステムループのステムに組み込まれ得る。別の実施形態では、ＴＥＥは、ステムループのステムの５’末端に組み込まれ得、ｍｉＲＮＡシードは、ステムループのステムに組み込まれ得、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ステムの３’末端またはステムループの後の配列に組み込まれ得る。ｍｉＲＮＡシードおよびｍｉＲＮＡ結合部位は、同じおよび／または異なるｍｉＲＮＡ配列に対するものであり得る。
【０５７８】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列および／またはＴＥＥ配列の組込みは、ステムループ領域の形状を変化させ、これにより、翻訳が増大および／または減少し得る。（例えば、Ｋｅｄｄｅら、「Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３’ＵＴＲ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．」Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．、２０１０年を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５７９】
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’−ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ配列は、１９もしくは２２ヌクレオチド配列および／またはシードなしのｍｉＲＮＡ配列であり得るが、これらに限定されない。
【０５８０】
一実施形態では、５’ＵＴＲにおけるｍｉＲＮＡ配列を使用して、本明細書に記載される本開示のポリヌクレオチドを安定させることができる。
【０５８１】
別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲにおけるｍｉＲＮＡ配列を使用して、翻訳開始の部位、例えば、限定されないが、開始コドンのアクセス性を減少させることができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａｔｓｕｄａら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．、２０１０年、１１巻（５号）：ｅ１５０５７頁を参照されたく、これは、第１の開始コドン（ＡＵＧ）へのアクセス性を減少させるために、開始コドンの周辺（ＡＵＧコドンのＡを＋１として、−４から＋３７）にアンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドおよびエクソン−ジャンクション複合体（ＥＪＣ）を使用していた。Ｍａｔｓｕｄａは、ＬＮＡまたはＥＪＣを用いて開始コドンの周辺の配列を変化させることによって、ポリヌクレオチドの効率、長さ、および構造安定性が影響を受けることを示した。本開示のポリヌクレオチドは、翻訳開始の部位へのアクセス性を減少させるために、翻訳開始の部位の付近に、Ｍａｔｓｕｄａらによって記載されているＬＮＡまたはＥＪＣ配列ではなく、ｍｉＲＮＡ配列を含み得る。翻訳開始の部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前、後、またはその内部であってもよい。非限定的な例として、翻訳開始の部位は、シード配列または結合部位などのｍｉＲＮＡ配列内に位置し得る。別の非限定的な例として、翻訳開始の部位は、例えば、シード配列またはｍｉｒ−１２２結合部位などのｍｉＲ−１２２配列内に位置してもよい。
【０５８２】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞におけるコードされるポリペプチドの発現を弱めるために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、肝臓における目的のコードされるポリペプチドの発現を弱めるために、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位を含み得る。別の非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−３ｐシード配列、シードを有さないｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐシード配列、シードを有さないｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４６結合部位、ｍｉＲ−１４６シード配列、および／またはシード配列を有さないｍｉＲ−１４６結合部位を含み得る。
【０５８３】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、免疫細胞においてｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解して、治療薬送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑制するために、３’ＵＴＲに少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドを、抗原提示細胞においてより不安定になるようにすることができる。これらのｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、ｍｉｒ−１２２−５ｐまたはｍｉｒ−１２２−３ｐが挙げられる。
【０５８４】
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用し得るポリヌクレオチドの領域に、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
【０５８５】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、（ｉ）ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、ならびに（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）を含む。
【０５８６】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列、ならびに本明細書に開示されるｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列における１種類の核酸塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％が、修飾された核酸塩基である。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列におけるウラシルの少なくとも９５％が、５−メトキシウリジンである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびにｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドは、送達剤、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜１４７のうちのいずれか、または化合物１〜２３２のうちのいずれかとともに製剤化される。
１５．３’ＵＴＲおよびＡＵリッチエレメント
【０５８７】
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド）は、３’ＵＴＲをさらに含む。
【０５８８】
３’−ＵＴＲは、翻訳終止コドンのすぐ後にあり、転写後に遺伝子発現に影響を及ぼす制御性領域を含有することが多い、ｍＲＮＡの区画である。３’−ＵＴＲ内の制御性領域は、ｍＲＮＡのポリアデニル化、転写効率、局在化、および安定性に影響を及ぼし得る。一実施形態では、本開示に有用な３’−ＵＴＲは、制御性タンパク質またはマイクロＲＮＡの結合部位を含む。一部の実施形態では、３’−ＵＴＲは、サイレンサー領域を有し、この領域は、リプレッサータンパク質に結合し、ｍＲＮＡの発現を阻害する。他の実施形態では、３’−ＵＴＲは、ＡＵリッチエレメントを含む。タンパク質は、ＡＲＥに結合して、局在化様式で転写産物の安定性もしくは崩壊速度に影響を及ぼすか、または翻訳開始に影響を及ぼす。他の実施形態では、３’−ＵＴＲは、ポリ（Ａ）尾部と呼ばれる数百のアデニン残基のｍＲＮＡ転写産物の末端への付加を誘導する、配列ＡＡＵＡＡＡを含む。
【０５８９】
天然または野生型の３’ＵＴＲは、そこに埋め込まれたアデノシンおよびウリジンのストレッチを有することが公知である。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高い代謝回転率を有する遺伝子において、特に顕著である。それらの配列特徴および機能特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分類することができる（Ｃｈｅｎら、１９９５年）：クラスＩのＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフの複数の分散されたコピーを含有する。Ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏＤは、クラスＩのＡＲＥを含有する。クラスＩＩのＡＲＥは、２つまたはそれよりも多い重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを有する。この種類のＡＲＥを含有する分子としては、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａが挙げられる。クラスＩＩＩのＡＲＥは、あまりはっきりと定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ−Ｊｕｎおよびミオゲニンが、このクラスの２つの十分に研究されている例である。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを脱安定化することが公知であるが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、最も注目すべきことにはＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増大させることが実証されている。ＨｕＲは、３つすべてのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を、核酸分子の３’ＵＴＲに操作することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＨｕＲの結合、したがってメッセージの安定化につながるであろう。
【０５９０】
３’ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を使用して、本開示のポリヌクレオチドの安定性を調節することができる。特定のポリヌクレオチドを操作する場合、ＡＲＥの１つまたは複数のコピーを導入して、本開示のポリヌクレオチドの安定性を低くし、それによって、結果として得られるタンパク質の翻訳を削減し、産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを特定し、除去または変異させて、細胞内の安定性を増大させ、それによって、結果として得られるタンパク質の翻訳および産生を増大させることができる。トランスフェクション実験を、関連する細胞株において行うことができ、本開示のポリヌクレオチドを使用して、タンパク質産生を、トランスフェクション後の様々な時点においてアッセイすることができる。例えば、細胞に、異なるＡＲＥ操作分子をトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡキットを関連するタンパク質に使用することによって、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、および７日後に、産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
【０５９１】
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドに有用な３’ＵＴＲは、本出願において示されているものから選択される３’ＵＴＲを含む。
【０５９２】
ある特定の実施形態では、本開示に有用な３’ＵＴＲ配列は、本明細書に列挙される３’ＵＴＲ配列およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される配列に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なヌクレオチド配列を含む。
１６．５’キャップを有する領域
【０５９３】
本開示はまた、５’キャップならびに本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。
【０５９４】
天然のｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を増大させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合するが、このＣＢＰは、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合により成熟な環状ｍＲＮＡ種を形成することを通じて、細胞におけるｍＲＮＡの安定性および翻訳の適合性を担う。キャップは、さらに、ｍＲＮＡスプライシングの間、５’近位のイントロンの除去を補助する。
【０５９５】
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端がキャッピングされ、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドとの間で５’−ｐｐｐ−５’−三リン酸結合を生成し得る。この５’−グアニル酸キャップは、次に、メチル化されて、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を生成してもよい。ｍＲＮＡの５’末端の末端および／または末端前の転写ヌクレオチドのリボース糖もまた、任意選択で、２’−Ｏ−メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を通じた５’キャップ除去は、分解のために、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を標的としてもよい。
【０５９６】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ部分を組み込む。
【０５９７】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ除去を予防し、したがって、ｍＲＮＡ半減期を増大させる、非加水分解性キャップ構造を含む。キャップ構造の加水分解は、５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、修飾されたヌクレオチドを、このキャッピング反応の際に使用してもよい。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手したワクシニアキャッピング酵素を、製造業者の指示に従ってα−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに使用して、５’−ｐｐｐ−５’キャップにホスホロチオエート結合を作製してもよい。α−メチル−ホスホネートおよびセレノ−ホスフェートヌクレオチドなど、追加の修飾されたグアノシンヌクレオチドを使用してもよい。
【０５９８】
追加の修飾としては、糖環の２’−ヒドロキシル基におけるポリヌクレオチドの５’末端および／または５’末端前のヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化（上述）が挙げられるが、これに限定されない。複数の異なる５’キャップ構造を使用して、ｍＲＮＡ分子としての機能を果たすポリヌクレオチドなどの核酸分子の５’キャップを生成してもよい。本明細書において、合成キャップ類似体、化学的キャップ、化学的キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも称される、キャップ類似体は、キャップ機能は保持しているが、それらの化学構造が、天然の（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）５’キャップとは異なる。キャップ類似体は、化学的（すなわち、非酵素的）または酵素的に合成され得る、および／または本開示のポリヌクレオチドに連結され得る。
【０５９９】
例えば、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’−三リン酸基によって連結された２つのグアニンを含有し、ここで、一方のグアニンは、Ｎ７メチル基ならびに３’−Ｏ−メチル基を含有する（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ、これは、３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇとも表記することができる））。他方の未修飾のグアニンの３’−Ｏ原子は、キャッピングされたポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドに連結されるようになる。Ｎ７−および３’−Ｏ−メチル化グアニンは、キャッピングされたポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
【０６００】
別の例示的なキャップは、ｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡに類似であるが、グアノシンに２’−Ｏ−メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
【０６０１】
一部の実施形態では、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップ類似体は、異なるリン酸位置において、ボラノリン酸基またはホスホロセレノエート基で修飾されてもよく、例えば、米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号に記載されるジヌクレオチドキャップ類似体があり、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６０２】
別の実施形態では、キャップは、キャップ類似体であり、当技術分野において公知および／または本明細書に記載されるキャップ類似体のＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態である。キャップ類似体のＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態の非限定的な例としては、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧおよびＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−ｍ３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、Ｋｏｒｅら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１３年、２１巻、４５７０〜４５７４頁に記載されている様々なキャップ類似体およびキャップ類似体を合成する方法を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、本開示のキャップ類似体は、４−クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
【０６０３】
キャップ類似体は、ポリヌクレオチドまたはその領域の同時のキャッピングを可能にするが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応においては、転写産物の最大２０％が、キャッピングされないまま残り得る。これは、キャップ類似体と内因性の細胞転写機構によって産生される核酸の内因性５’キャップ構造との構造上の相違と同様に、翻訳の適合性の低減および細胞安定性の低減をもたらし得る。
【０６０４】
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）はまた、より真正な５’キャップ構造を生成するために、酵素を使用して、製造後に（ＩＶＴまたは化学合成に関係なく）キャッピングすることもできる。本明細書において使用されるとき、「より真正な」という語句は、構造的または機能的に、内因性または野生型の特徴を厳密に反映または模倣した特徴を指す。すなわち、「より真正な」特徴は、従来技術の合成の特徴もしくは類似体などと比較して、内因性、野生型、天然、もしくは生理学的な細胞機能および／もしくは構造をより良好に表しているか、または１つもしくは複数の点に関して、対応する内因性、野生型、天然、もしくは生理学的な特徴よりも性能が優れている。本開示のより真正な５’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当技術分野において公知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然、もしくは生理学的な５’キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の結合の増強、半減期の増大、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性の低減、および／または５’キャップ除去の低減を有するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間にカノニカル５’−５’−三リン酸結合を作製することができ、ここで、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含有し、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルを含有する。そのような構造は、キャップ１構造と称される。このキャップは、例えば、当技術分野において公知の他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳の適合性および細胞の安定性、ならびに細胞の炎症促進性サイトカインの活性化の低減をもたらす。キャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、および７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０５】
非限定的な例として、キメラポリヌクレオチドを製造後にキャッピングすることが、より効率的であり得るが、これは、キメラポリヌクレオチドのほぼ１００％を、キャッピングすることができるためである。これは、キャップ類似体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応の過程で、キメラポリヌクレオチドに連結させた場合の約８０％とは対照的である。
【０６０６】
本開示によると、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本開示によると、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体としては、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０７】
ある特定の実施形態では、５’末端キャップ構造は、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体である。
１７．ポリ−Ａ尾部
【０６０８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ポリ−Ａ尾部をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリ−Ａ尾部の末端基は、安定化のために組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリ−Ａ尾部は、デス−３’ヒドロキシル尾部を含む。
【０６０９】
ＲＮＡプロセシングの間に、長いアデニンヌクレオチドの鎖（ポリ−Ａ尾部）が、安定性を増大させるために、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ分子に付加され得る。転写の直後に、転写産物の３’末端が切断されて、３’ヒドロキシルが遊離し得る。次いで、ポリ−Ａポリメラーゼが、アデニンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と称されるこのプロセスにより、例えば、およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０残基の長さを含め、およそ８０〜およそ２５０残基の長さであり得る、ポリ−Ａ尾部が付加される。
【０６１０】
ポリＡ尾部はまた、構築物が核外に輸送された後に付加されてもよい。
【０６１１】
本開示によると、ポリＡ尾部の末端基は、安定化のために組み込まれ得る。本開示のポリヌクレオチドは、デス−３’ヒドロキシル尾部を含み得る。これらはまた、Ｊｕｎｊｉｅ  Ｌｉらによって教示される構造的部分または２’−Ｏメチル修飾を含み得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５巻、１５０１〜１５０７頁、２００５年８月２３日、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０６１２】
本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含む、代替的なポリＡ尾部構造を有する転写産物をコードするように設計されてもよい。Ｎｏｒｂｕｒｙによると、「末端ウリジル化もまた、ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡにおいて検出されている。これらのｍＲＮＡの代謝回転は、染色体ＤＮＡ複製の完了または阻害後の可能性として毒性であるヒストン蓄積の予防に重要であると考えられる。これらのｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）尾部の欠如によって区別され、その機能は、安定したステム−ループ構造およびその同族ステム−ループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が代わりに担う；後者は、ポリアデニル化ｍＲＮＡのＰＡＢＰのものと同じ機能を行う」（Ｎｏｒｂｕｒｙ、「Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ：  ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｉｌ  ｗａｇｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｇ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；  ＡＯＰ、２０１３年８月２９日オンライン刊行、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６１３】
ユニークなポリＡ尾部の長さは、本開示のポリヌクレオチドにある特定の利点を提供する。一般に、ポリＡ尾部の長さは、存在する場合、３０ヌクレオチド長より長い。他の実施形態では、ポリＡ尾部は、３５ヌクレオチド長より長い（例えば、少なくともまたは約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００ヌクレオチドより長い）。
【０６１４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその領域は、約３０〜約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、および２，５００〜３，０００）を含む。
【０６１５】
一部の実施形態では、ポリ−Ａ尾部は、全体的なポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの特定の領域の長さに対して、設計される。この設計は、コーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づき得るか、またはポリヌクレオチドから発現される最終的な産物の長さに基づき得る。
【０６１６】
この文脈において、ポリ−Ａ尾部は、ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長くてもよい。ポリ−Ａ尾部はまた、それが属するポリヌクレオチドの画分として設計してもよい。この文脈において、ポリ−Ａ尾部は、構築物の全長、構築物の領域、または構築物の全長からポリ−Ａ尾部を差し引いたものの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％、またはそれよりも長くてもよい。さらに、ポリ−Ａ結合タンパク質のためのポリヌクレオチドの結合部位の操作およびコンジュゲーションにより、発現を増強してもよい。
【０６１７】
加えて、ポリ−Ａ尾部の３’末端において修飾されたヌクレオチドを使用して、複数の異なるポリヌクレオチドを、ＰＡＢＰ（ポリ−Ａ結合タンパク質）を介して３’末端を通じて一緒に連結してもよい。トランスフェクション実験を、関連する細胞株において行うことができ、タンパク質産生を、ＥＬＩＳＡによって、トランスフェクションの１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、および７日後にアッセイすることができる。
【０６１８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ポリＡ−Ｇカルテット領域を含むように設計される。Ｇカルテットは、４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイであり、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方においてＧリッチ配列によって形成することができる。この実施形態では、Ｇカルテットは、ポリ−Ａ尾部の末端に組み込まれる。結果として得られるポリヌクレオチドを、様々な時点において、安定性、タンパク質産生、および半減期を含む他のパラメーターについてアッセイする。ポリＡ−Ｇカルテットが、１２０ヌクレオチドのポリ−Ａ尾部を単独で使用した場合に確認されるタンパク質産生の少なくとも７５％に相当する、ｍＲＮＡからのタンパク質産生をもたらすことが見出されている。
１８．開始コドン領域
【０６１９】
本開示はまた、開始コドン領域ならびに本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含む、ポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似であるか、または同様の機能を果たす領域を有し得る。
【０６２０】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドンで開始され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧなどであるがこれらに限定されない代替的な開始コドンで開始され得る（Ｔｏｕｒｉｏｌら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、９５巻、（２００３年）、１６９〜１７８頁およびＭａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１０年、５巻、１１頁を参照されたく、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０６２１】
非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンＡＣＧで開始される。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧで開始される。さらに別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧで開始される。
【０６２２】
翻訳を開始するコドン、例えば、限定されないが、開始コドンまたは代替的な開始コドンに隣接するヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ、および／または構造に影響を及ぼすことが公知である。（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１０年、５巻、１１頁を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかのマスキングを使用して、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さ、および／または構造を変化させることができる。
【０６２３】
一部の実施形態では、マスキングされた開始コドンまたは代替的な開始コドンにおける翻訳開始の確率を低減するようにコドンをマスキングまたは遮蔽するために、マスキング剤が、開始コドンまたは代替的な開始コドンの付近で使用され得る。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチドおよびエクソン−ジャンクション複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、マスキング剤ＬＮＡポリヌクレオチドおよびＥＪＣについて記載しているＭａｔｓｕｄａおよびＭａｕｒｏ（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１０年、５巻、１１号）を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０６２４】
別の実施形態では、翻訳が、代替的な開始コドンで開始される可能性を増大させるために、マスキング剤を使用して、ポリヌクレオチドの開始コドンをマスキングすることができる。一部の実施形態では、翻訳が、マスキングした開始コドンまたは代替的な開始コドンの下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで開始される機会を増大させるために、マスキング剤を使用して、第１の開始コドンまたは代替的な開始コドンをマスキングしてもよい。
【０６２５】
一部の実施形態では、開始コドンまたは代替的な開始コドンは、ｍｉＲ結合部位の完璧な相補体内に位置し得る。ｍｉＲ結合部位の完璧な相補体は、マスキング剤と同様に、ポリヌクレオチドの翻訳、長さ、および／または構造の調節を補助し得る。非限定的な例として、開始コドンまたは代替的な開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完璧な相補体の中央に位置し得る。開始コドンまたは代替的な開始コドンは、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、第４のヌクレオチド、第５のヌクレオチド、第６のヌクレオチド、第７のヌクレオチド、第８のヌクレオチド、第９のヌクレオチド、第１０のヌクレオチド、第１１のヌクレオチド、第１２のヌクレオチド、第１３のヌクレオチド、第１４のヌクレオチド、第１５のヌクレオチド、第１６のヌクレオチド、第１７のヌクレオチド、第１８のヌクレオチド、第１９のヌクレオチド、第２０のヌクレオチド、または第２１のヌクレオチドの後に位置し得る。
【０６２６】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳を、開始コドンではないコドンで開始させるために、ポリヌクレオチドの開始コドンは、ポリヌクレオチド配列から除去され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンの次のコドンまたは下流の開始コドンもしくは代替的な開始コドンで開始され得る。非限定的な実施例では、翻訳を、下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで開始させるために、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧが、ポリヌクレオチド配列の最初の３つのヌクレオチドとして、除去される。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ、および／またはポリヌクレオチドの構造を調節するためまたはその調節を試みるために、下流の開始コドンおよび／または代替的な開始コドンのための少なくとも１つのマスキング剤を、さらに含んでもよい。
１９．終止コドン領域
【０６２７】
本開示はまた、終止コドン領域ならびに本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含む、ポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に、少なくとも２の終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＤＮＡの場合にはＴＧＡ、ＴＡＡ、およびＴＡＧから、またはＲＮＡの場合にはＵＧＡ、ＵＡＡ、およびＵＡＧから選択され得る。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合の終止コドンＴＧＡまたはＲＮＡの場合の終止コドンＵＧＡ、および１の追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、３の連続した終止コドン、４の終止コドン、またはそれよりも多い終止コドンを含む。
２０．挿入および置換
【０６２８】
本開示はまた、挿入および／または置換をさらに含む、本開示のポリヌクレオチドも含む。
【０６２９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、同じ塩基のヌクレオシドの少なくとも１つの領域および／またはストリングの挿入によって置き換えられ得る。ヌクレオチドの領域および／またはストリングは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８ヌクレオチドを含み得るがこれらに限定されず、ヌクレオチドは、天然および／または非天然であり得る。非限定的な例として、ヌクレオチドの群は、５〜８のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのうちのいずれかのストリング、および／またはそれらの組合せを含み得る。
【０６３０】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのうちのいずれか、および／またはそれらの組合せなどであるがこれらに限定されない、２つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも２つの領域および／またはストリングの挿入によって置き換えられ得る。例えば、５’ＵＴＲは、５〜８のアデニン塩基を挿入し、続いて、５〜８のシトシン塩基を挿入することによって、置き換えることができる。別の例では、５’ＵＴＲは、５〜８のシトシン塩基を挿入し、続いて、５〜８のアデニン塩基を挿入することによって、置き換えることができる。
【０６３１】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流に、少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。非限定的な例として、少なくとも１つの置換および／または挿入は、転写開始部位のすぐ下流の領域において（例えば、＋１から＋６であるがこれらに限定されない）少なくとも１つの核酸を置換することによって、転写開始部位の下流で生じ得る。転写開始部位のすぐ下流におけるヌクレオチドの領域に対する変更は、開始速度に影響を及ぼし得、見かけのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）反応定数値を増大させ得、初期転写を硬化する転写複合体からの短い転写産物の解離を増大させ得る（Ｂｒｉｅｂａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２年）４１巻、５１４４〜５１４９頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。少なくとも１つのヌクレオシドの修飾、置換、および／または挿入は、配列のサイレント変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列における変異を引き起こし得る。
【０６３２】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位の下流に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３のグアニン塩基の置換を含み得る。
【０６３３】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位のすぐ下流の領域に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６のグアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例としては、その領域のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４のアデニンヌクレオチドによって置換され得る（配列番号２３３）。別の非限定的な例では、その領域のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４のシトシン塩基によって置換され得る（配列番号２３４）。別の非限定的な例では、その領域のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４のチミンおよび／または本明細書に記載されるヌクレオチドのうちのいずれかによって置換され得る（配列番号２３５）。
【０６３４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、開始コドンの上流に、少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。明確さの目的で、当業者であれば、開始コドンは、タンパク質コーディング領域の最初のコドンであり、一方で、転写開始部位は、転写が開始される部位であることを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つの置換および／または挿入を含み得るが、これらに限定されない。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流にある１つ、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの位置で、挿入または置換され得る。挿入および／または置換されるヌクレオチドは、同じ塩基（例えば、すべてのＡもしくはすべてのＣもしくはすべてのＴもしくはすべてのＧ）、２つの異なる塩基（例えば、ＡおよびＣ、ＡおよびＴ、もしくはＣおよびＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、およびＴ、もしくはＡ、Ｃ、およびＴ）、または少なくとも４つの異なる塩基であり得る。
【０６３５】
非限定的な例として、ポリヌクレオチドにおけるコード領域の上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載されるヌクレオチドのうちのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例では、ポリヌクレオチドにおけるグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流かつ開始コドンの前の領域に、１つのグアニン塩基が残るように設計され得る（Ｅｓｖｅｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ、（２０１１年）、４７２巻（７３４４号）、４９９〜５０３頁を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、少なくとも５のヌクレオチドが、転写開始部位の下流であるが、開始コドンの上流である１つの位置に挿入され得、この少なくとも５のヌクレオチドは、同じ塩基の種類であり得る。
２１．ＩＬ１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド
【０６３６】
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端に、
（ｉ）上記に提供される５’キャップ、
（ｉｉ）５’ＵＴＲ、例えば、上記に提供される配列、
（ｉｉｉ）ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、本明細書に開示されるＩＬ１２をコードする配列最適化された核酸配列、
（ｉｖ）少なくとも１つの終止コドン、
（ｖ）３’ＵＴＲ、例えば、上記に提供される配列、および
（ｖｉ）上記に提供されるポリ−Ａ尾部
を含む。
【０６３７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【０６３８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、野生型ＩＬ１２（例えば、アイソフォーム１、２、３、または４）のタンパク質配列に、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
２２．ポリヌクレオチドを作製する方法
【０６３９】
本開示はまた、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド）またはその相補体を作製するための方法を提供する。
【０６４０】
一部の態様では、本明細書に開示され、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を使用して、構築することができる。他の態様では、本明細書に開示され、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用して、化学合成によって構築することができる。
【０６４１】
他の態様では、本明細書に開示され、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、宿主細胞を使用することによって、作製される。ある特定の態様では、本明細書に開示され、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞発現、または当技術分野において公知の任意の他の方法の１つまたは複数の組合せによって、作製される。他の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞である。
【０６４２】
天然に存在するヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオシド、またはこれらの組合せは、候補ヌクレオチド配列に存在する天然に存在するヌクレオシドを完全または部分的に置き換えることができ、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込むことができる。結果として得られるポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、次いで、タンパク質を産生するおよび／または治療的転帰をもたらすそれらの能力について、試験してもよい。
ａ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／酵素的合成
【０６４３】
本明細書に開示される本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）系を使用して、転写され得る。この系は、典型的に、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、およびポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、天然および非天然の（修飾された）ＮＴＰを含め、本明細書に記載されるものから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、および変異体ポリメラーゼ、例えば、限定されないが、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを組み込むことができるポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。米国公開第ＵＳ２０１３０２５９９２３号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６４４】
任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントを、本開示のポリヌクレオチドの合成に使用することができる。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸の挿入または欠失によって修飾され得る。非限定的な例として、ＲＮＡポリメラーゼは、未修飾のＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’−修飾ヌクレオチド三リン酸を組み込む能力の増大を呈するように修飾され得る（国際公開第ＷＯ２００８０７８１８０号および米国特許第８，１０１，３８５号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０６４５】
バリアントは、ＲＮＡポリメラーゼを進化させること、ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸および／もしくは核酸配列を最適化させること、ならびに／または当技術分野において公知の他の方法を使用することによって、得ることができる。非限定的な例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのバリアントは、Ｅｓｖｅｌｔら（Ｎａｔｕｒｅ、４７２巻、４９９〜５０３頁（２０１１年）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって設定された連続した指向型進化系を使用して、進化させることができ、ここで、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、９３位のリシンとスレオニンとの置換（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１ＮまたはＬ８６４Ｆなどあるがこれらに限定されない、少なくとも１つの変異をコードし得る。別の非限定的な例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのバリアントは、米国公開第２０１００１２００２４号および同第２００７０１１７１１２号に記載されるように、少なくとも１つの変異をコードし得、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＲＮＡポリメラーゼのバリアントとしては、置換バリアント、保存的アミノ酸置換、挿入バリアント、欠失バリアント、および／または共有結合誘導体を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０６４６】
一態様では、ポリヌクレオチドは、野生型またはバリアントのＲＮＡポリメラーゼによって認識されるように設計され得る。これを行う際、ポリヌクレオチドは、野生型または親キメラポリヌクレオチドに由来する配列変化の部位または領域を含有するように修飾され得る。
【０６４７】
ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応は、ポリメラーゼを利用する酵素的方法によって行うことができる。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドまたは核酸鎖において、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成を触媒する。現在公知のＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列比較および結晶構造分析に基づいて、様々なファミリーに分類され得る。ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）またはＡポリメラーゼのファミリーは、Ｅ．ｃｏｌｉのクレノウ断片、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７  ＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼを含め、これらのファミリーの中でも、最も研究されている。別の大きなファミリーは、ＤＮＡポリメラーゼα（ｐｏｌ  α）またはＢポリメラーゼファミリーであり、すべての真核生物複製ＤＮＡポリメラーゼならびにファージＴ４およびＲＢ６９由来のポリメラーゼを含む。類似の触媒機構を用いるが、これらのポリメラーゼファミリーは、基質特異性、基質類似体組込み効率、プライマー伸長の程度および速度、ＤＮＡ合成の様式、エクソヌクレアーゼ活性、ならびに阻害剤に対する感度が異なる。
【０６４８】
ＤＮＡポリメラーゼはまた、反応温度、ｐＨ、ならびに鋳型およびプライマーの濃度など、それらが必要とする最適な反応条件に基づいて、選択される。しばしば、所望されるＤＮＡ断片のサイズおよび合成効率を達成するために、１つより多くのＤＮＡポリメラーゼの組合せが、用いられる。例えば、Ｃｈｅｎｇらは、ｐＨを増大させ、グリセロールおよびジメチルスルホキシドを添加し、変性時間を減少させ、伸長時間を増大させ、クローニングされたインサートおよびヒトゲノムＤＮＡから長い標的を有効に増幅するために、３’から５’のエクソヌクレアーゼ活性を有する二次熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。（Ｃｈｅｎｇら、ＰＮＡＳ、９１巻、５６９５〜５６９９頁（１９９４年）、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。バクテリオファージＴ３、Ｔ７、およびＳＰ６に由来するＲＮＡポリメラーゼは、生物化学研究および生物物理学研究のためのＲＮＡを調製するために、広く使用されている。ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素、およびポリ−Ａポリメラーゼは、同時係属中の国際公開第ＷＯ２０１４０２８４２９号に開示されており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６４９】
一態様では、本開示のポリヌクレオチドの合成において使用することができるＲＮＡポリメラーゼは、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼである。（Ｚｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１１９３を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼは、近年、Ｚｈｕらによって、海洋性シアノファージＳｙｎ５から特徴付けられ、ここでは、プロモーター配列も特定された（Ｚｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｚｈｕらは、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して、より広い範囲の温度および塩分濃度において、ＲＮＡ合成を触媒したことを見出した。加えて、プロモーターにおける開始ヌクレオチドの要件が、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼでは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して低いストリンジェンシーであることが見出され、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成に有望となった。
【０６５０】
一態様では、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼを、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの合成に使用することができる。非限定的な例として、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼは、正確な３’末端を必要とするポリヌクレオチドの合成において使用することができる。
【０６５１】
一態様では、Ｓｙｎ５プロモーターは、ポリヌクレオチドの合成において使用することができる。非限定的な例として、Ｓｙｎ５プロモーターは、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年）によって記載されている５’−ＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧ−３’（配列番号４７）であり得る。
【０６５２】
一態様では、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載されるおよび／または当技術分野において公知である、少なくとも１つの化学的修飾を含むポリヌクレオチドの合成において使用することができる（例えば、Ｚｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年に記載されているシュード−ＵＴＰおよび５Ｍｅ−ＣＴＰの組込みを参照されたい）。
【０６５３】
一態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年）によって記載されている修正および改善された精製手順を使用して精製されたＳｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成することができる。
【０６５４】
遺伝子操作における様々なツールは、鋳型として作用する標的遺伝子の酵素的増幅に基づいている。目的の個々の遺伝子または特定の領域の配列の研究のため、ならびに他の研究上の必要性のために、ポリヌクレオチドまたは核酸の少量の試料から、標的遺伝子の複数のコピーを生成する必要がある。そのような方法は、本開示のポリヌクレオチドの製造において適用することができる。
【０６５５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標的遺伝子の高速増幅、ならびにゲノムマッピングおよびシーケンシングにおいて、広範な用途を有する。ＤＮＡの合成のための重要な構成要素は、鋳型としての標的ＤＮＡ分子、標的ＤＮＡ鎖の末端に相補的なプライマー、構成ブロックとしてのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、およびＤＮＡポリメラーゼを含む。ＰＣＲが、変性、アニーリング、および伸長のステップを進む際、新しく産生されたＤＮＡ分子は、次の複製サークルの鋳型として作用することができ、標的ＤＮＡの指数関数的増幅が達成される。ＰＣＲは、変性およびアニーリングのための加熱および冷却のサイクルを必要とする。基本的なＰＣＲの変化形としては、非対称ＰＣＲ（Ｉｎｎｉｓら、ＰＮＡＳ、８５巻、９４３６〜９４４０頁（１９８８年））、インバースＰＣＲ（Ｏｃｈｍａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２０巻（３号）、６２１〜６２３頁（１９８８年））、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｆｒｅｅｍａｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２６巻（１号）、１１２〜２２頁、１２４〜５頁（１９９９年）、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、などである）が挙げられる。ＲＴ−ＰＣＲでは、一本鎖ＲＮＡが、所望される標的であり、逆転写酵素によって、まず二本鎖のＤＮＡに変換される。
【０６５６】
様々な等温ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸増幅技法が、ＰＣＲの代替法または補足法として開発されている。例えば、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）は、制限酵素がニックを形成する能力に基づく（Ｗａｌｋｅｒら、ＰＮＡＳ、８９巻、３９２〜３９６頁（１９９２年）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。制限酵素認識配列が、アニーリングされたプライマー配列に挿入される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰによって伸長されて、二本鎖が形成される。二本鎖のうちの一方の鎖のみが、制限酵素によって切断される。それぞれの一本鎖が、次いで、後続の合成のための鋳型として利用可能となる。ＳＤＡは、ＰＣＲの複雑な温度管理サイクルを必要としない。
【０６５７】
転写媒介増幅（ＴＭＡ）とも呼ばれる核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）もまた、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ  Ｈ、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの組合せを利用する等温増幅法である。（Ｃｏｍｐｔｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ、３５０巻、９１〜９２頁（１９９１年））、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。標的ＲＮＡが、鋳型として使用され、逆転写酵素が、その相補的なＤＮＡ鎖を合成する。ＲＮＡｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ鋳型を加水分解し、ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ標的に相補的な第１のＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖を合成するための空間を作り、ＤＮＡ二本鎖が形成される。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、このＤＮＡ二本鎖の相補的なＲＮＡ鎖を連続して生成する。これらのＲＮＡ鎖が、新しいＤＮＡ合成サイクルの鋳型として作用し、結果として、標的遺伝子の増幅が生じる。
【０６５８】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、一本鎖の環状ポリヌクレオチドを増幅し、多数回の等温酵素合成を伴い、ここで、Ф２９  ＤＮＡポリメラーゼが、ポリヌクレオチド環を連続して何周もすることによって、プライマーを伸長し、その配列を何度も複製する。したがって、環状鋳型の線形コピーが達成される。次いで、プライマーが、この線形コピーにアニーリングされ得、その相補的な鎖が合成され得る。Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９巻、２２５〜２３２頁（１９９８年）を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一本鎖の環状ＤＮＡもまた、ＲＮＡポリメラーゼの存在下において、ＲＮＡ合成の鋳型としての機能を果たし得る。（Ｄａｕｂｅｎｄｉｅｋら、ＪＡＣＳ、１１７巻、７８１８〜７８１９頁（１９９５年）、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。インバース高速ｃＤＮＡ末端増幅（ＲＡＣＥ）ＲＣＡは、Ｐｏｌｉｄｏｒｏｓらによって説明されている。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が、ｃＤＮＡに逆転写された後、ＲＮＡｓｅ  Ｈ処置によって、ｃＤＮＡが分離される。次いで、ｃＤＮＡが、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅによって環状化され、環状ＤＮＡとなる。結果として得られる環状ＤＮＡの増幅は、ＲＣＡによって達成される。（Ｐｏｌｉｄｏｒｏｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４１巻、３５〜４２頁（２００６年）、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０６５９】
前述の方法のいずれも、本開示のポリヌクレオチドの１つまたは複数の領域を製造するのに利用することができる。
【０６６０】
リガーゼによるポリヌクレオチドまたは核酸のアセンブリも、広く使用される。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を通じて、ポリヌクレオチド鎖の５’末端および３’末端の分子間ライゲーションを促進する。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、２つの隣接するポリヌクレオチドプローブが、ハイブリダイズして標的遺伝子の１本の鎖となり、リガーゼによって互いに結合されるという原理に基づく、有望な診断技法である。標的遺伝子が存在していないか、または標的遺伝子に単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）などのミスマッチが存在する場合、プローブはライゲーションできない。（Ｗｉｅｄｍａｎｎら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、３巻（４号）、ｓ５１〜ｓ６４頁（１９９４年）、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＬＣＲを、様々な増幅技法と組み合わせて、検出の感度を増大させるか、またはポリヌクレオチドおよび核酸の合成において使用する場合には産物の量を増大させることができる。
【０６６１】
核酸のライブラリー調製キットは、現在、複数が市販されている。これらは、少量の核酸試料を、下流適用のためにインデックスされたライブラリーに変換するための酵素および緩衝液を含む。例えば、ＤＮＡ断片を、末端調製、ライゲーション、サイズ選択、クリーンアップ、ＰＣＲ増幅、および最終クリーンアップのために、ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）によるＮＥＢＮＥＸＴ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（商標）ＤＮＡライブラリー調製キットに入れてもよい。
【０６６２】
増幅技法の改善のために、継続的な開発が続いている。例えば、Ａｓａｄａらの米国特許第８，３６７，３２８号は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の効率性を増大させるために、反応エンハンサーを利用することを教示しており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。反応エンハンサーは、酸性物質または酸性物質のカチオン性複合体を含む。Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉらの米国特許第７，３８４，７３９号は、酵素的ＤＮＡ合成を促進するカルボン酸イオン供給物質について教示しており、ここで、カルボン酸イオン供給物質は、シュウ酸、マロン酸、シュウ酸のエステル、マロン酸のエステル、マロン酸の塩、およびマレイン酸のエステルから選択され、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｓｏｂｅｋらの米国特許第７，３７８，２６２号は、ＤＮＡ増幅の忠実性を増大させるための酵素組成物を開示しており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この組成物は、３’エクソヌクレアーゼ活性を有するがポリメラーゼ活性を有さない１つの酵素、およびポリメラーゼである別の酵素を含む。これらの酵素のいずれも、熱安定性であり、低温では不活性となるように可逆的に修飾される。
【０６６３】
Ｇｅｔｔｓらの米国特許第７，５５０，２６４号は、ｃＤＮＡ分子の３’末端にオリゴデオキシヌクレオチド尾部を結合させ、ＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ転写を開始することによって行われる、複数回のセンスＲＮＡ分子の合成について教示しており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｒｏｈａｙｅｍの米国特許公開第２０１３／０１８３７１８号は、一本鎖ＤＮＡ鋳型に対してＲＮＡポリメラーゼ活性を示す、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）によるＲＮＡ合成について教示しており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非標準的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、Ｂｅｎｎｅｒの米国特許第６，６１７，１０６号に開示されているように、非標準的なヌクレオチドを含む鋳型を、鋳型のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドの混合物と接触させることによる、酵素的重合を用いて合成することができ、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｂ．化学的合成
【０６６４】
標準的な方法を適用して、目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、例えば、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を合成することができる。例えば、特定の単離されたポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含有する単一のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーを、合成することができる。他の態様では、所望されるポリペプチドの部分をコードする複数の小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、それらをライゲーションしてもよい。一部の態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、典型的に、相補的アセンブリのための５’または３’オーバーハングを含有する。
【０６６５】
本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、当技術分野において公知の化学的合成方法および可能な核酸塩基置換を使用して、化学的に合成することができる。例えば、国際公開第ＷＯ２０１４０９３９２４号、同第ＷＯ２０１３０５２５２３号、同第ＷＯ２０１３０３９８５７号、同第ＷＯ２０１２１３５８０５号、同第ＷＯ２０１３１５１６７１号、米国公開第ＵＳ２０１３０１１５２７２号、または米国特許第ＵＳ８９９９３８０号もしくは同第ＵＳ８７１０２００号を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｃ．ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの精製
【０６６６】
本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製には、ポリヌクレオチドのクリーンアップ、品質保証、および品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、当技術分野において公知の方法、例えば、限定されないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、ポリ−Ｔビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴ−Ｔ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ．、Ｖｅｄｂａｅｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、またはＨＰＬＣに基づく精製方法、例えば、限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって、行うことができる。
【０６６７】
「精製ポリヌクレオチド」など、ポリヌクレオチドに関連して使用される場合、「精製された」という用語は、少なくとも１つの混入物質から分離されたものを指す。本明細書において使用されるとき、「混入物質」は、別の物質を、不適合、不純、または低品質にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、それが本来見出されるものとは異なる形態もしくは環境、または処置もしくは精製方法に供される前に存在していたものとは異なる形態もしくは環境で、存在する。
【０６６８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、不純物を除去し、これにより、望ましくない免疫応答を低減または除去すること、例えば、サイトカイン活性を低減することができる。
【０６６９】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して、投与の前に精製される。
【０６７０】
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して精製された本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、異なる精製方法によって精製された同じ本開示のポリヌクレオチドにより得られる発現レベルと比較して、コードされるＩＬ１２タンパク質の発現の増大を提示する。
【０６７１】
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））により精製されたポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の点変異のうちの１つまたは複数を含む、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０６７２】
一部の実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞に導入されたとき、これらの細胞においてＩＬ１２タンパク質発現レベルを、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞に導入される前、または非ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞に導入された後の細胞におけるＩＬ１２タンパク質の発現レベルに対して、例えば、１０〜１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％だけ増大させる。
【０６７３】
一部の実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞に導入されたとき、これらの細胞において機能的ＩＬ１２タンパク質発現レベルを、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞に導入される前、または非ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞に導入された後の細胞におけるＩＬ１２タンパク質の機能的発現レベルに対して、例えば、１０〜１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％だけ増大させる。
【０６７４】
一部の実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞に導入されたとき、これらの細胞において検出可能なＩＬ１２活性を、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞に導入される前、または非ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞に導入された後の細胞における機能的ＩＬ１２の活性レベルに対して、例えば、１０〜１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％だけ増大させる。
【０６７５】
一部の実施形態では、精製ポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約８５％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９６％の純度、少なくとも約９７％の純度、少なくとも約９８％の純度、少なくとも約９９％の純度、または約１００％の純度である。
【０６７６】
品質保証および／または品質管理チェックは、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光、または分析的ＨＰＬＣなどであるがこれらに限定されない方法を使用して、行うことができる。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素ＰＣＲを含むがこれに限定されない方法によって、シーケンシングされ得る。
ｄ．ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの発現の定量化
【０６７７】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、それらの発現産物、ならびに分解産物および代謝産物は、当技術分野において公知の方法によって定量化することができる。
【０６７８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、エクソソームにおいて、または１つもしくは複数の体液に由来する場合に、定量化することができる。本明細書において使用されるとき、「体液」には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または射精前液、汗、排泄物、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、粥状液、乳糜液、胆汁、間質液、経血、膿汁、皮脂、嘔吐物、腟分泌物、粘膜分泌物、大便水、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸飲液、胞胚腔液、ならびに臍帯血が含まれる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から採取してもよい。
【０６７９】
エクソソーム定量化方法では、２ｍＬ以下の試料を対象から得、エクソソームを、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心法、差次的遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはこれらの組合せによって、単離する。分析において、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、不在、短縮、または変化であり得る。レベルを、１つもしくは複数の臨床表現型、またはヒト疾患バイオマーカーに関するアッセイと、相関させることが有利である。
【０６８０】
アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組合せを使用して行うことができ、一方で、エクソソームは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）方法などの免疫組織化学法を使用して単離することができる。エクソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心法、差次的遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはこれらの組合せによって単離してもよい。
【０６８１】
これらの方法は、試験者に、残っているポリヌクレオチドまたは送達されたポリヌクレオチドのレベルを、リアルタイムでモニタリングする能力をもたらす。本開示のポリヌクレオチドは、構造的または化学的修飾に起因して内因性の形態とは異なるため、これが可能である。
【０６８２】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、紫外線可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などであるがこれに限定されない方法を使用して、定量化することができる。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）である。定量化されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが、適正なサイズであり得るかを判定し、ポリヌクレオチドの分解が生じていないことを調べるために、分析してもよい。ポリヌクレオチドの分解は、限定されないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣに基づく精製方法、例えば、限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法によって、調べることができる。
２３．医薬組成物および製剤
【０６８３】
本開示は、上述のポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む、医薬組成物および製剤を提供する。一部の実施形態では、組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
【０６８４】
一部の実施形態では、組成物または製剤は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする、本明細書に開示される配列最適化された核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有し得る。一部の実施形態では、組成物または製剤は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化された核酸配列に対して有意な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
【０６８５】
医薬組成物または製剤は、任意選択で、１つまたは複数の追加の活性な物質、例えば、治療的および／または予防的に活性な物質を含んでもよい。本開示の医薬組成物または製剤は、滅菌および／または発熱物質不含であり得る。医薬剤の製剤化および／または製造における一般的な検討項目は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。一部の実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的で、「活性成分」という語句は、概して、本明細書に記載されるように送達されるポリヌクレオチドを指す。
【０６８６】
本明細書に記載される製剤および医薬組成物は、薬理学の分野において公知であるかまたは今後開発される、任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つもしくは複数の他の補助成分と会合させ、次いで、必要に応じておよび／または望ましい場合には、生成物を所望される単回または複数回投薬単位に分割、成形、および／またはパッケージングするステップを含む。
【０６８７】
本開示による医薬組成物または製剤は、バルクで、単回の単位用量として、および／または複数の単回単位用量として、調製、パッケージング、および／または販売され得る。本明細書において使用されるとき、「単位用量」とは、所定の量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。活性成分の量は、一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および／またはそのような投薬量の便宜的な割合、例えば、そのような投薬量の半分または３分の１などに等しい。
【０６８８】
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対的な量は、処置を受ける対象の同一性、サイズ、および／または状態に応じて、さらには組成物を投与しようとする経路に応じて、変動し得る。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（重量／重量）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば、０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、または少なくとも８０％（重量／重量）の活性成分を含み得る。
【０６８９】
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および製剤は、少なくとも１つの本開示のポリヌクレオチドを含有し得る。非限定的な例として、組成物または製剤は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの本開示のポリヌクレオチドを含有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物または製剤は、１つより多くの種類のポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、組成物または製剤は、線形形態および環状形態のポリヌクレオチドを含み得る。別の実施形態では、組成物または製剤は、環状ポリヌクレオチドおよびＩＶＴポリヌクレオチドを含み得る。さらに別の実施形態では、組成物または製剤は、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド、および環状ポリヌクレオチドを含み得る。
【０６９０】
本明細書において提供される医薬組成物および製剤の説明は、主として、ヒトへの投与に好適な医薬組成物および製剤を対象としているが、当業者であれば、そのような組成物が、一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に好適であることを理解するであろう。組成物を様々な動物への投与に好適なものにするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物または製剤の修正形が、十分に理解され、通常の技能の獣医学薬理学者であれば、必要だとしても単に通常の実験によって、そのような修正形を設計および／または実行することができる。医薬組成物または製剤の投与が企図される対象としては、ヒトおよび／もしくは他の霊長類；商業関連の哺乳動物、例えば、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラットを含む、哺乳動物；ならびに／または商業関連の鳥類、例えば、家禽、ニワトリ、カモ、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウを含む鳥類が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６９１】
本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む、医薬製剤を提供する。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、（１）安定性を増大させるため、（２）細胞のトランスフェクションを増大させるため、（３）持続放出もしくは遅延放出を可能にするため（例えば、ポリヌクレオチドのデポー製剤から）、（４）生体分布を変化させるため（例えば、ポリヌクレオチドの標的を特定の組織もしくは細胞型とするため）、（５）ｉｎ  ｖｉｖｏでコードされるタンパク質の翻訳を増大させるため、ならびに／または（６）ｉｎ  ｖｉｖｏでコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させるために、１つまたは複数の賦形剤を使用して、製剤化してもよい。一部の実施形態では、医薬製剤は、送達剤（例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜１４７のうちのいずれかまたは化合物１〜２３２のうちのいずれか）をさらに含む。
【０６９２】
薬学的に許容される賦形剤としては、本明細書において使用されるとき、所望される特定の剤形に好適な、ありとあらゆる溶媒、分散媒、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁補助剤、希釈剤、造粒剤および／もしくは分散剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤、結合剤、滑沢剤もしくは油、着色剤、甘味剤もしくは香味剤、安定剤、酸化防止剤、抗微生物剤もしくは抗真菌剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝液、キレート剤、凍結保護剤（ｃｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、ならびに／または増量剤が挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製するための技法は、当技術分野において公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６年を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【０６９３】
例示的な希釈剤としては、炭酸カルシウムもしくは炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトールなど、および／またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６９４】
例示的な造粒剤および／または分散剤としては、デンプン、アルファ化デンプン、または微晶質デンプン、アルギン酸、グアーガム、寒天、ポリ（ビニル−ピロリドン）、（ピロビドン）、架橋型ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、架橋型カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウムなど、および／またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６９５】
例示的な界面活性剤および／または乳化剤としては、天然の乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、グリセリルモノオレエート、ポリオキシエチレンエステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ  ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８など、ならびに／またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６９６】
例示的な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、モラセス、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、天然および合成のガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム）、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６９７】
酸化は、ｍＲＮＡ、特に、液体ｍＲＮＡ製剤の、潜在的な分解経路である。酸化を予防するために、酸化防止剤を製剤に添加してもよい。例示的な酸化防止剤としては、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ベンジルアルコール、ブチルヒドロキシアニソール、ｍ−クレゾール、メチオニン、ブチルヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはカリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウムなど、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６９８】
例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、エデト酸三ナトリウムなど、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６９９】
例示的な抗微生物剤または抗真菌剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウムまたはナトリウム、ソルビン酸カリウムまたはナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸など、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７００】
例示的な保存剤としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ−カロテン、クエン酸、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）など、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０１】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド溶液のｐＨは、安定性を改善するために、ｐＨ５〜ｐＨ８に維持される。ｐＨを調節するための例示的な緩衝液としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン（もしくはヒスチジン−ＨＣｌ）、リンゴ酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなど、および／またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０２】
例示的な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、モルト、水添植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムまたはマグネシウムなど、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０３】
本明細書に記載される医薬組成物または製剤は、凍結する際に本明細書に記載されるポリヌクレオチドを安定化するための凍結保護剤（ｃｙｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含有し得る。例示的な凍結保護剤としては、マンニトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロースなど、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０４】
本明細書に記載される医薬組成物または製剤は、「薬学的に洗練された」固形物をもたらし、長期（例えば、３６ヶ月間）の保管期間の間、凍結乾燥されたポリヌクレオチドを安定させるために、凍結乾燥ポリヌクレオチド製剤中に増量剤を含有してもよい。本開示の例示的な増量剤としては、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース、ラフィノース、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０５】
一部の実施形態では、医薬組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。本開示の送達剤としては、リポソーム、脂質ナノ粒子、リピドイド、ポリマー、リポプレックス、微細小胞、エクソソーム、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、コンジュゲート、およびこれらの組合せを挙げることができるが、これらに限定されない。
２４．送達剤
ａ．脂質化合物
【０７０６】
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。具体的には、本出願は、
（ａ）ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびに
（ｂ）送達剤を含む、医薬組成物を提供する。
【０７０７】
一部の実施形態では、本開示の送達剤は、２０１６年９月１６日に出願され、国際公開第ＷＯ２０１７／０４９２４５号として公開された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２号に開示されている任意の１つまたは複数の化合物を含み、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０７０８】
一部の実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物、
【化５】
2019516710.tif 000090
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ，および−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３〜６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ３−６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択される。
【０７０９】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜２０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２および−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものを含み、ここで、アルキルおよびアルケニル基は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。
【０７１０】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが、１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）ｎが、１もしくは２であるとき、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではないものを含む。
【０７１１】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲならびにＮ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロシクロアルキルであって、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノおよびＣ１〜３アルキルから選択される１つもしくは複数の置換基で置換されているヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３〜６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ３−６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０７１２】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜２０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびにＮ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロシクロアルキルであって、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノおよびＣ１〜３アルキルから選択される１つもしくは複数の置換基で置換されているヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０７１３】
なお別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５〜１４員複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、および−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２，から選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、Ｑが５〜１４員複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が、ｎが１または２である−（ＣＨ２）ｎＱであるか、または（ｉｉ）Ｒ４が、ｎが１である−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が−ＣＨＱＲおよび−ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑは５〜１４員ヘテロアリールまたは８〜１４員ヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３〜６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ３−６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０７１４】
なお別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜２０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５〜１４員複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、Ｑが５〜１４員複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が、ｎが１または２である−（ＣＨ２）ｎＱであるか、または（ｉｉ）Ｒ４が、ｎが１である−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が−ＣＨＱＲおよび−ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑは５〜１４員ヘテロアリールまたは８〜１４員ヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０７１５】
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、および−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３〜６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ３−６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０７１６】
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜２０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０７１７】
なお別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ２〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、各ｎは、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ１〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０７１８】
なお別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜２０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ２〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、各ｎは、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ１〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０７１９】
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、および−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、各ｎは、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ１〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０７２０】
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜２０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、および−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、各ｎは、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ１〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０７２１】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）のもの、
【化６】
2019516710.tif 000091
を含み、式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、および９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、およびＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される。
【０７２２】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）のもの、またはその塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、ｍは、５、６、７、８、および９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり
Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、およびＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される。
【０７２３】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）のもの、
【化７】
2019516710.tif 000092
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、およびＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される。
【０７２４】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）のもの、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、およびＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される。
【０７２５】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）のもの、
【化８】
2019516710.tif 000093
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述の通りである。
【０７２６】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）のもの、
【化９】
2019516710.tif 000094
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述の通りである。
【０７２７】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）のもの、
【化１０】
2019516710.tif 000095
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述の通りである。
【０７２８】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｅ）のもの、
【化１１】
2019516710.tif 000096
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述の通りである。
【０７２９】
一部の実施形態では、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｅ）の化合物は、Ｒ４を含み、これは、−（ＣＨ２）ｎＱおよび−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択され、ここで、Ｑ、Ｒ、およびｎは、上記に定義される通りである。
【０７３０】
一部の実施形態では、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択され、ここで、Ｒは上記に定義される通りである。一部の態様では、ｎは、１または２である。一部の実施形態では、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。
【０７３１】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）のもの、
【化１２】
2019516710.tif 000097
またはその塩であり、式中、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ５〜１４アルキルおよびＣ５〜１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、および４から選択され、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ５、Ｒ６、およびｍは、上記に定義される通りである。
【０７３２】
式（ＩＩｄ）の化合物の一部の態様では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物の一部の態様では、Ｒ３は、Ｃ５〜Ｃ９アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物の一部の態様では、ｍは、５、７、または９である。式（ＩＩｄ）の化合物の一部の態様では、各Ｒ５は、Ｈである。式（ＩＩｄ）の化合物の一部の態様では、各Ｒ６は、Ｈである。
【０７３３】
別の態様では、本出願は、（１）式（Ｉ）を有する化合物、（２）任意選択で、補助脂質（例えば、リン脂質）、（３）任意選択で、構造脂質（例えば、ステロール）、（４）任意選択で、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ脂質）、および（５）任意選択で、第四級アミン化合物を含む、脂質組成物（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））を提供する。例示的な実施形態では、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、その中に封入されたポリヌクレオチドを、さらに含む。
【０７３４】
本明細書において使用されるとき、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、１個または複数の炭素原子（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれよりも多い炭素原子）を含む、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。
【０７３５】
「Ｃ１〜１４アルキル」という表記法は、１〜１４個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。アルキル基は、任意選択で置換され得る。
【０７３６】
本明細書において使用されるとき、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、２個またはそれよりも多い炭素原子（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれよりも多い炭素原子）および少なくとも１つの二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。
【０７３７】
「Ｃ２〜１４アルケニル」という表記法は、２〜１４個の炭素原子および少なくとも１つの二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルケニル基は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多い二重結合を含み得る。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つまたは複数の二重結合を含み得る。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であり得る。アルケニル基は、任意選択で置換され得る。
【０７３８】
本明細書において使用されるとき、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の１つまたは複数の環を含む、単環系または多環系を意味する。環は、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５員環であり得る。
【０７３９】
「Ｃ３〜６炭素環」という表記法は、３〜６個の炭素原子を有する単一の環を含む、炭素環を意味する。炭素環は、１つまたは複数の二重結合を含み得、芳香族であり得る（例えば、アリール基）。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、および１，２−ジヒドロナフチル基が挙げられる。炭素環は、任意選択で置換され得る。
【０７４０】
本明細書において使用されるとき、「複素環」または「複素環式基」という用語は、１つまたは複数の環を含む、単環系または多環系を意味し、少なくとも１つの環が少なくとも１つのヘテロ原子を含む。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素、または硫黄原子であり得る。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２員環であり得る。複素環は、１つまたは複数の二重結合を含み得、芳香族であり得る（例えば、ヘテロアリール基）。複素環の例としては、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、およびイソキノリル基が挙げられる。複素環は、任意選択で置換され得る。
【０７４１】
本明細書において使用されるとき、「生体分解性基」は、対象における脂質のより迅速な代謝を促進し得る基である。生体分解性基は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基であり得るが、これらに限定されない。
【０７４２】
本明細書において使用されるとき、「アリール基」とは、１つまたは複数の芳香環を含む、炭素環式基である。例示的なアリール基としては、フェニルおよびナフチル基が挙げられる
【０７４３】
本明細書において使用されるとき、「ヘテロアリール基」とは、１つまたは複数の芳香環を含む、複素環式基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、およびチアゾリルが挙げられる。アリールおよびヘテロアリール基のいずれも、任意選択で置換され得る。例えば、ＭおよびＭ’は、任意選択で置換されるフェニル、オキサゾール、およびチアゾールからなる非限定的な群から選択することができる。本明細書の式において、ＭおよびＭ’は、独立して、上述の生体分解性基の一覧から選択され得る。
【０７４４】
アルキル、アルケニル、およびシクリル（例えば、カルボシクリルおよびヘテロシクリル）基は、別途指定されない限り、任意選択で置換され得る。任意選択の置換基は、ハロゲン原子（例えば、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物基）、カルボン酸（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、−ＯＨ）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、代替的にはＣ＝Ｏと表される）、ハロゲン化アシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、Ｘは、臭化物、フッ化物、塩化物、およびヨウ化物から選択されるハロゲン化物）、カーボネート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、−ＯＲ）、アセタール（例えば、−Ｃ（ＯＲ）２Ｒ”“、ここで、各ＯＲは、同じであっても異なってもよいアルコキシ基であり、Ｒ”“は、アルキルまたはアルケニル基である）、ホスフェート（例えば、Ｐ（Ｏ）４３−）、チオール（例えば、−ＳＨ）、スルホキシド（例えば、−Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、−Ｃ（Ｓ）Ｈ）、スルフェート（例えば、Ｓ（Ｏ）４２−）、スルホニル（例えば、−Ｓ（Ｏ）２−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、または−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、−Ｎ３）、ニトロ（例えば、−ＮＯ２）、シアノ（例えば、−ＣＮ）、イソシアノ（例えば、−ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、−ＮＲ２、−ＮＲＨ、または−ＮＨ２）、カルバモイル（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、または−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、およびシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。
【０７４５】
前述のもののいずれにおいても、Ｒは、本明細書において定義される通り、アルキルまたはアルケニル基である。一部の実施形態では、置換基自体が、例えば、本明細書において定義される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの置換基でさらに置換されてもよい。例えば、Ｃ１〜６アルキル基は、本明細書に記載される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの置換基でさらに置換されてもよい。
【０７４６】
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、および（ＩＩｅ）のうちのいずれか１つの化合物は、適宜、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含む。
【０７４７】
一部の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、および−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５〜１４員芳香族または非芳香族の複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、および−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択される。
【０７４８】
他の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、および−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個もしくは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびにＮ、Ｏ、およびＳから選択される１個もしくは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロシクロアルキルであって、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、およびＣ１〜３アルキルから選択される１つもしくは複数の置換基で置換されているヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは、独立に、１、２、３、４、および５から選択される。
【０７４９】
他の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、および−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個もしくは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立に、１、２、３、４、および５から選択され、Ｑが５〜１４員複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が、ｎが１または２である−（ＣＨ２）ｎＱであるか、または（ｉｉ）Ｒ４が、ｎが１である−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が−ＣＨＱＲおよび−ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑは、５〜１４員ヘテロアリールまたは８〜１４員ヘテロシクロアルキルのいずれかである。
【０７５０】
他の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、および−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個もしくは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立に、１、２、３、４、および５から選択される。
【０７５１】
別の実施形態では、Ｒ４は、非置換Ｃ１〜４アルキル、例えば、非置換メチルである。
【０７５２】
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、ここで、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、および５から選択される。
【０７５３】
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、ここで、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、および−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、および５から選択される。
【０７５４】
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、ここで、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ２〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、および５から選択される。
【０７５５】
ある特定の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｃ２〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成する。
【０７５６】
一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５〜２０アルキルおよびＣ５〜２０アルケニルからなる群から選択される。
【０７５７】
他の実施形態では、Ｒ１は、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択される。
【０７５８】
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、−Ｒ＊ＹＲ”および−ＹＲ”から選択される。一部の実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。一部の実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ８アルキルまたはＣ８アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３〜１２アルキルである。例えば、Ｒ”は、Ｃ３アルキルであり得る。例えば、Ｒ”は、Ｃ４〜８アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８アルキル）であり得る。
【０７５９】
一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５〜２０アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ６アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ８アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ９アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルキルである。
【０７６０】
一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５〜２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルケニルである。一部の実施形態では、Ｒ１は、リノレイルである。
【０７６１】
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、分岐鎖である（例えば、デカン−２−イル、ウンデカン−３−イル、ドデカン−４−イル、トリデカン−５−イル、テトラデカン−６−イル、２−メチルウンデカン−３−イル、２−メチルデカン−２−イル、３−メチルウンデカン−３−イル、４−メチルドデカン−４−イル、またはヘプタデカ−９−イル）。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、
【化１３】
2019516710.tif 000098
である。
【０７６２】
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、非置換Ｃ５〜２０アルキルまたはＣ５〜２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換Ｃ５〜２０アルキルまたはＣ５〜２０アルケニル（例えば、１−シクロプロピルノニルなど、Ｃ３〜６炭素環で置換されたもの）である。
【０７６３】
他の実施形態では、Ｒ１は、−Ｒ”Ｍ’Ｒ’である。
【０７６４】
一部の実施形態では、Ｒ’は、−Ｒ＊ＹＲ”および−ＹＲ”から選択される。一部の実施形態では、Ｙは、Ｃ３〜８シクロアルキルである。一部の実施形態では、Ｙは、Ｃ６〜１０アリールである。一部の実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。一部の実施形態では、Ｙは、シクロヘキシル基である。ある特定の実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ１アルキルである。
【０７６５】
一部の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３〜１２アルキルおよびＣ３〜１２アルケニルからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙに隣接するＲ”は、Ｃ１アルキルである。一部の実施形態では、Ｙに隣接するＲ”は、Ｃ４〜９アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８またはＣ９アルキル）である。
【０７６６】
一部の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ４アルキルおよびＣ４アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ５アルキルおよびＣ５アルケニルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ６アルキルおよびＣ６アルケニルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ７アルキルおよびＣ７アルケニルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ９アルキルおよびＣ９アルケニルから選択される。
【０７６７】
他の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１１アルキルおよびＣ１１アルケニルから選択される。他の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１３アルケニル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１７アルケニル、Ｃ１８アルキル、およびＣ１８アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、分岐鎖である（例えば、デカン−２−イル、ウンデカン−３−イル、ドデカン−４−イル、トリデカン−５−イル、テトラデカン−６−イル、２−メチルウンデカン−３−イル、２−メチルデカン−２−イル、３−メチルウンデカン−３−イル、４−メチルドデカン−４−イル、またはヘプタデカ−９−イル）。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、
【化１４】
2019516710.tif 000099
である。
【０７６８】
ある特定の実施形態では、Ｒ’は、非置換Ｃ１〜１８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換Ｃ１〜１８アルキル（例えば、１−シクロプロピルノニルなど、Ｃ３〜６炭素環で置換されたＣ１〜１５アルキル）である。
【０７６９】
一部の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、またはＣ８アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１３アルキル、またはＣ１４アルキルである。
【０７７０】
一部の実施形態では、Ｍ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。一部の実施形態では、Ｍ’は、−ＯＣ（Ｏ）−である。
【０７７１】
他の実施形態では、Ｍ’は、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍ’は、フェニル、オキサゾール、およびチアゾールからなる群から選択され得る。
【０７７２】
一部の実施形態では、Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。一部の実施形態では、Ｍは、−ＯＣ（Ｏ）−である。一部の実施形態では、Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−である。一部の実施形態では、Ｍは、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−である。
【０７７３】
他の実施形態では、Ｍは、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍは、フェニル、オキサゾール、およびチアゾールからなる群から選択され得る。
【０７７４】
一部の実施形態では、Ｍは、Ｍ’と同じである。他の実施形態では、Ｍは、Ｍ’とは異なる。
【０７７５】
一部の実施形態では、各Ｒ５は、Ｈである。ある特定のそのような実施形態では、各Ｒ６も、Ｈである。
【０７７６】
一部の実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、またはｉ−プロピル）である。
【０７７７】
一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ５〜１４アルキルまたはＣ５〜１４アルケニルである。
【０７７８】
一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は同じである。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ２アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ３アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ６アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ７アルキルである。
【０７７９】
他の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は異なる。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１〜７（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７アルキル）またはＣ９アルキルである。
【０７８０】
一部の実施形態では、Ｒ７およびＲ３は、Ｈである。
【０７８１】
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
【０７８２】
一部の実施形態では、ｍは、５、７、または９である。
【０７８３】
一部の実施形態では、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱおよび−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。
【０７８４】
一部の実施形態では、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、炭素環、および複素環からなる群から選択される。
【０７８５】
ある特定の実施形態では、Ｑは、−ＯＨである。
【０７８６】
ある特定の実施形態では、Ｑは、置換または非置換５〜１０員ヘテロアリールであり、例えば、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、プリン、２−アミノ−１，９−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−オン−９−イル（もしくはグアニン−９−イル）、アデニン−９−イル、シトシン−１−イル、またはウラシル−１−イルである。ある特定の実施形態では、Ｑは、例えばオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、およびＣ１〜３アルキルから選択される１つまたは複数の置換基で置換された、置換５〜１４員ヘテロシクロアルキルである。例えば、Ｑは、４−メチルピペラジニル、４−（４−メトキシベンジル）ピペラジニル、またはイソインドリン−２−イル−１，３−ジオンである。
【０７８７】
ある特定の実施形態では、Ｑは、非置換または置換Ｃ６〜１０アリール（フェニルなど）またはＣ３〜６シクロアルキルである。
【０７８８】
一部の実施形態では、ｎは、１である。他の実施形態では、ｎは、２である。さらなる実施形態では、ｎは、３である。ある特定の実施形態では、ｎは、４である。例えば、Ｒ４は、−（ＣＨ２）２ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、−（ＣＨ２）３ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、−（ＣＨ２）４ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、ベンジルであり得る。例えば、Ｒ４は、４−メトキシベンジルであり得る。
【０７８９】
一部の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環である。一部の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３〜６シクロアルキルである。例えば、Ｒ４は、例えば、ＯＨ、ハロ、Ｃ１〜６アルキルなどで任意選択で置換されたシクロヘキシルであり得る。例えば、Ｒ４は、２−ヒドロキシシクロヘキシルであり得る。
【０７９０】
一部の実施形態では、Ｒは、Ｈである。
【０７９１】
一部の実施形態では、Ｒは、非置換Ｃ１〜３アルキルまたは非置換Ｃ２〜３アルケニルである。例えば、Ｒ４は、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３であり得る。
【０７９２】
一部の実施形態では、Ｒは、置換Ｃ１〜３アルキル、例えば、ＣＨ２ＯＨである。例えば、Ｒ４は、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨであり得る。
【０７９３】
一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５〜１４員芳香族または非芳香族複素環を形成する。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、芳香族または非芳香族のいずれかである、任意選択で置換されるＣ３〜２０炭素環（例えば、Ｃ３〜１８炭素環、Ｃ３〜１５炭素環、Ｃ３〜１２炭素環、またはＣ３〜１０炭素環）を形成する。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ３〜６炭素環を形成する。他の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ６炭素環、例えば、シクロヘキシルまたはフェニル基を形成する。ある特定の実施形態では、複素環またはＣ３〜６炭素環は、１つまたは複数のアルキル基で置換される（例えば、同じ環原子または隣接もしくは非隣接の環原子において）。例えば、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、１つまたは複数のＣ５アルキル置換を有するシクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得る。ある特定の実施形態では、Ｒ２およびＲ３によって形成された複素環またはＣ３〜６炭素環は、炭素環式基で置換される。例えば、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、シクロヘキシルで置換されたシクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得る。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ７〜１５炭素環、例えば、シクロヘプチル、シクロペンタデカニル、またはナフチル基を形成する。
【０７９４】
一部の実施形態では、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱおよび−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。一部の実施形態では、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、およびプリンからなる群から選択される。
【０７９５】
一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ３〜６炭素環、例えば、フェニル基を形成する。ある特定の実施形態では、複素環またはＣ３〜６炭素環は、１つまたは複数のアルキル基で置換される（例えば、同じ環原子または隣接もしくは非隣接の環原子において）。例えば、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、１つまたは複数のＣ５アルキル置換を有するフェニル基を形成し得る。
【０７９６】
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物、式（Ｉ）の化合物は、
【化１５−１】
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【化１５−２】
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【化１５−３】
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【化１５−４】
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【化１５−５】
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【化１５−６】
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【化１５−７】
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【化１５−８】
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【化１５−９】
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【化１５−１０】
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【化１５−１１】
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【化１５−１２】
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【化１５−１３】
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【化１５−１４】
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【化１５−１５】
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【化１５−１６】
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【化１５−１７】
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【化１５−１８】
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【化１５−１９】
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【化１５−２０】
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【化１５−２１】
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【化１５−２２】
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【化１５−２３】
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【化１５−２４】
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【化１５−２５】
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【化１５−２６】
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【化１５−２７】
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【化１５−２８】
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【化１５−２９】
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【化１５−３０】
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【化１５−３１】
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【化１５−３２】
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【化１５−３３】
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【化１５−３４】
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およびそれらの塩または立体異性体からなる群から選択される。
【０７９７】
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物１〜化合物１４７、またはそれらの塩もしくは立体異性体からなる群から選択される。
【０７９８】
本明細書に開示される脂質化合物のアミン部分は、ある特定の条件下において、プロトン化され得る。例えば、式（Ｉ）による脂質の中心アミン部分は、典型的に、アミノ部分のｐＫａよりも低いｐＨではプロトン化され（すなわち、正に荷電する）、ｐＫａよりも高いｐＨでは実質的に荷電されない。そのような脂質は、イオン化可能アミノ脂質と称され得る。
【０７９９】
１つの特定の実施形態では、イオン化可能アミノ脂質は、化合物１８である。
【０８００】
一部の実施形態では、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中、約１モル％〜９９モル％の範囲である。
【０８０１】
一実施形態では、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９モル％である。
【０８０２】
一実施形態では、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中、約３０モル％〜約７０モル％、約３５モル％〜約６５モル％、約４０モル％〜約６０モル％、および約４５モル％〜約５５モル％の範囲である。
【０８０３】
１つの特定の実施形態では、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中、約５０モル％である。
【０８０４】
本明細書に開示されるイオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物に加えて、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、追加の成分、例えば、リン脂質、構造脂質、第四級アミン化合物、ＰＥＧ脂質、およびこれらの任意の組合せを含み得る。
【０８０５】
他の態様では、脂質ナノ粒子は、約２０〜６０％のイオン化可能アミノ脂質：５〜２５％のリン脂質：２５〜５５％のステロール；および０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約２０〜６０％の化合物１８：５〜２５％のリン脂質：２５〜５５％のコレステロール；および０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約５０％のイオン化可能アミノ脂質：約１０％のリン脂質：約３８．５％のコレステロール；および約１．５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約５０％の化合物１８：約１０％のリン脂質：約３８．５％のコレステロール；および約１．５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約４９．８３％のイオン化可能アミノ脂質：約９．８３％のリン脂質：約３０．３３％のコレステロール；および約２．０％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約４９．８３％の化合物１８：約９．８３％のリン脂質：約３０．３３％のコレステロール；および約２．０％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。
ｂ．脂質組成物中の追加の成分
（ｉ）リン脂質
【０８０６】
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数のリン脂質、例えば、１つまたは複数の飽和または（ポリ）不飽和リン脂質またはそれらの組合せを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分および１つまたは複数の脂肪酸部分を含む。例えば、リン脂質は、式（ＶＩＩ）による脂質であり得、
【化１６】
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Ｒｐは、リン脂質部分を表し、Ｒ１およびＲ２は、同じであっても異なってもよい、不飽和ありまたはなしの脂肪酸部分を表す。
【０８０７】
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２−リゾホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
【０８０８】
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノール酸、エルカ酸、フィタン酸（ｐｈｙｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサンエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
【０８０９】
特定のリン脂質は、膜への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つまたは複数の負に荷電したリン脂質と相互作用し得る。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つまたは複数の要素（例えば、治療剤）が、膜を通過することを可能にし得、例えば、１つまたは複数の要素の標的組織（例えば、腫瘍組織）への送達を可能にし得る。
【０８１０】
分岐化、酸化、環化、およびアルキンを含む修飾および置換を有する天然の種を含む、非天然のリン脂質の種もまた、企図される。例えば、リン脂質は、１つまたは複数のアルキン（例えば、１つまたは複数の二重結合が三重結合で置き換えられたアルケニル基）で官能化され得るかまたはそれに架橋し得る。適切な反応条件下において、アルキン基は、アジドに曝露されると、銅に触媒される環状付加を受け得る。そのような反応は、膜透過もしくは細胞認識を促進するためにナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化すること、またはナノ粒子組成物を、有用な成分、例えば、標的化もしくは画像化部分（例えば、色素）にコンジュゲートすることに有用であり得る。
【０８１１】
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質はまた、リンスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリンも含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される腫瘍内送達のための医薬組成物は、１つより多くのリン脂質を含んでもよい。１つより多くのリン脂質が使用される場合、そのようなリン脂質は、同じリン脂質クラス（例えば、ＭＳＰＣおよびＤＳＰＣ）、または異なるクラス（例えば、ＭＳＰＣおよびＭＳＰＥ）に属し得る。
【０８１２】
リン脂質は、対称型または非対称型のものであり得る。本明細書において使用されるとき、「対称リン脂質」という用語には、一致する脂肪酸部分を有するグリセロリン脂質、ならび変動する脂肪酸部分およびスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖が、同等の数の炭素原子を含む、スフィンゴ脂質が含まれる。本明細書において使用されるとき、「非対称リン脂質」という用語には、リゾ脂質、異なる脂肪酸部分（例えば、異なる数の炭素原子および／または不飽和（例えば、二重結合）を有する脂肪酸部分）を有するグリセロリン脂質、ならびに変動する脂肪酸部分およびスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖が、類似しない数の炭素原子を含む（例えば、変動する脂肪酸部分が、炭化水素鎖よりも少なくとも２個多い炭素原子を含むか、炭化水素鎖よりも少なくとも２個少ない炭素原子を含む）、スフィンゴ脂質が含まれる。
【０８１３】
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、少なくとも１つの対称リン脂質を含む。対称リン脂質は、
１，２−ジプロピオニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０３：０  ＰＣ）、
１，２−ジブチリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０４：０  ＰＣ）、
１，２−ジペンタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０５：０  ＰＣ）、
１，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０６：０  ＰＣ）、
１，２−ジヘプタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０７：０  ＰＣ）、
１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０８：０  ＰＣ）、
１，２−ジノナノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０９：０  ＰＣ）、
１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１０：０  ＰＣ）、
１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１１：０  ＰＣ、ＤＵＰＣ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１２：０  ＰＣ）、
１，２−ジトリデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１３：０  ＰＣ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：０  ＰＣ、ＤＭＰＣ）、
１，２−ジペンタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１５：０  ＰＣ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０  ＰＣ、ＤＰＰＣ）、
１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（４ＭＥ  １６：０  ＰＣ）、
１，２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１７：０  ＰＣ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  ＰＣ、ＤＳＰＣ）、
１，２−ジノナデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１９：０  ＰＣ）、
１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２０：０  ＰＣ）、
１，２−ジヘンアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２１：０  ＰＣ）、
１，２−ジベヘノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２２：０  ＰＣ）、
１，２−ジトリコサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２３：０  ＰＣ）、
１，２−ジリグノセロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２４：０  ＰＣ）、
１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：１（Δ９−Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２−ジミリステライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：１（Δ９−Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）、
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：１（Δ９−Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２−ジパルミテライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：１（Δ９−Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）、
１，２−ジペトロセレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１（Δ６−Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１（Δ９−Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＯＰＣ）、
１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１（Δ９−Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）、
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：２（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＬＰＣ）、
１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：３（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＬｎＰＣ）、
１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２０：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２０：４（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＡＰＣ）、
１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２２：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２２：６（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＨＡＰＣ）、
１，２−ジネルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２４：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（０６：０  ＰＥ）、
１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（０８：０  ＰＥ）、
１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１０：０  ＰＥ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１２：０  ＰＥ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１４：０  ＰＥ）、
１，２−ジペンタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１５：０  ＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０  ＰＥ）、
１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（４ＭＥ  １６：０  ＰＥ）、
１，２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１７：０  ＰＥ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０  ＰＥ、ＤＳＰＥ）、
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：１  ＰＥ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：１（Δ９−Ｃｉｓ）ＰＥ、ＤＯＰＥ）、
１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：１（Δ９−Ｔｒａｎｓ）ＰＥ）、
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：２  ＰＥ、ＤＬＰＥ）、
１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：３  ＰＥ、ＤＬｎＰＥ）、
１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（２０：４  ＰＥ、ＤＡＰＥ）、
１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（２２：６  ＰＥ、ＤＨＡＰＥ）、
１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  ジエーテルＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
【０８１４】
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０  Ｄｉｅｔｈｅｒ  ＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ  １６：０  ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ，ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択される少なくとも１つの対称リン脂質を含む。
【０８１５】
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、少なくとも１つの非対称リン脂質を含む。非対称リン脂質は、
１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：０−１６：０  ＰＣ、ＭＰＰＣ）、
１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：０−１８：０  ＰＣ、ＭＳＰＣ）、
１−パルミトイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−０２：０  ＰＣ）、
１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１４：０  ＰＣ、ＰＭＰＣ）、
１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１８：０  ＰＣ、ＰＳＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１８：１  ＰＣ、ＰＯＰＣ）、
１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１８：２  ＰＣ、ＰＬＰＣ）、
１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−２０：４  ＰＣ）、
１−パルミトイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：０−２２：６  ＰＣ）、
１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−１４：０  ＰＣ、ＳＭＰＣ）、
１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−１６：０  ＰＣ、ＳＰＰＣ）、
１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−１８：１  ＰＣ、ＳＯＰＣ）、
１−ステアロイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−１８：２  ＰＣ）、
１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−２０：４  ＰＣ）、
１−ステアロイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０−２２：６  ＰＣ）、
１−オレオイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１４：０  ＰＣ、ＯＭＰＣ）、
１−オレオイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１６：０  ＰＣ、ＯＰＰＣ）、
１−オレオイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１８：０  ＰＣ、ＯＳＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０−１８：１  ＰＥ、ＰＯＰＥ）、
１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０−１８：２  ＰＥ）、
１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０−２０：４  ＰＥ）、
１−パルミトイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０−２２：６  ＰＥ）、
１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０−１８：１  ＰＥ）、
１−ステアロイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０−１８：２  ＰＥ）、
１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０−２０：４  ＰＥ）、
１−ステアロイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０−２２：６  ＰＥ）、
１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
【０８１６】
脂質組成物において有用な非対称脂質はまた、リゾ脂質であってもよい。リゾ脂質は、
１−ヘキサノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０６：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−ヘプタノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０７：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−オクタノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０８：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−ノナノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０９：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−デカノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１０：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−ウンデカノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１１：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−ラウロイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１２：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−トリデカノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１３：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１４：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−ペンタデカノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１５：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−ヘプタデカノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１７：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−ステアロイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−ノナデカノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１９：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−アラキドイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２０：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−ベヘノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２２：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−リグノセロイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２４：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−ヘキサコサノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（２６：０  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１４：０  Ｌｙｓｏ  ＰＥ）、
１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１６：０  Ｌｙｓｏ  ＰＥ）、
１−ステアロイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：０  Ｌｙｓｏ  ＰＥ）、
１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（１８：１  Ｌｙｓｏ  ＰＥ）、
１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
【０８１７】
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、ＭＰＰＣ、ＭＳＰＣ、ＰＭＰＣ、ＰＳＰＣ、ＳＭＰＣ、ＳＰＰＣ、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの非対称リン脂質を含む。一部の実施形態では、非対称リン脂質は、１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＳＰＣ）である。特定の実施形態では、非対称リン脂質は、２０１７年４月１３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／２７４９２号に開示されている１つまたは複数のリン脂質であり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０８１８】
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、１つもしくは複数の対称リン脂質、１つもしくは複数の非対称リン脂質、またはこれらの組合せを含有し得る。複数のリン脂質が存在する場合、それらは、等モル比または非等モル比で存在し得る。
【０８１９】
一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、脂質組成物中、約１モル％〜約２０モル％、約５モル％〜約２０モル％、約１０モル％〜約２０モル％、約１５モル％〜約２０モル％、約１モル％〜約１５モル％、約５モル％〜約１５モル％、約１０モル％〜約１５モル％、約５モル％〜約１０モル％の範囲の総量のリン脂質（例えば、ＭＳＰＣ）を含む。一実施形態では、リン脂質の量は、脂質組成物中、約８モル％〜約１５モル％である。一実施形態では、リン脂質（例えば、ＭＳＰＣ）の量は、脂質組成物中、約１０モル％である。
【０８２０】
一部の態様では、特定のリン脂質（例えば、ＭＳＰＣ）の量は、脂質組成物中、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０モル％である。
（ｉｉ）第四級アミン化合物
【０８２１】
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）を含み得る。「第四級アミン化合物」という用語は、１つまたは複数の第四級アミン基（例えば、トリアルキルアミノ基）を有し、永続的に正の電荷を有し、塩の形態で存在する、化合物を含んで使用される。例えば、１つまたは複数の第四級アミン基は、脂質またはポリマー（例えば、ＰＥＧ）で存在し得る。一部の実施形態では、第四級アミン化合物は、（１）第四級アミン基、ならびに（２）（ｉ）直鎖もしくは分岐鎖で飽和もしくは不飽和の炭化水素鎖、および（ｉｉ）任意選択で、第四級アミン基と炭化水素鎖との間にエーテル、エステル、カルボニル、もしくはケタール結合を含む、少なくとも１つの疎水性尾部基を含む。一部の実施形態では、第四級アミン基は、トリメチルアンモニウム基であり得る。一部の実施形態では、第四級アミン化合物は、２つの同一な炭化水素鎖を含む。一部の実施形態では、第四級アミン化合物は、２つの異なる炭化水素鎖を含む。
【０８２２】
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、少なくとも１つの第四級アミン化合物を含む。第四級アミン化合物は、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、
Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、
１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、
Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、
Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、
Ｎ−（１，２−ジオレオイルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、
Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＬｅＰＣ）、
１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、
１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、
１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＴＡＰ）、
１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＳｅＰＣ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＰｅＰＣ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭｅＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯｅＰＣ）、
１，２−ジ−（９Ｚ−テトラデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１４：１  ＥＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１６：０−１８：１  ＥＰＣ）、
およびこれらの任意の組合せからなる非限定群から選択され得る。
【０８２３】
一実施形態では、第四級アミン化合物は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）である。
【０８２４】
第四級アミン化合物は、ＵＳ２０１３／０２４５１０７  Ａ１、ＵＳ２０１４／０３６３４９３  Ａ１、ＵＳ８，１５８，６０１、ＷＯ２０１５／１２３２６４  Ａ１、およびＷＯ２０１５／１４８２４７  Ａ１に記載されているものなど、当技術分野において公知であり、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０８２５】
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物中の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、約０．０１モル％〜約２０モル％の範囲である。
【０８２６】
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、約０．５モル％〜約２０モル％、約０．５モル％〜約１５モル％、約０．５モル％〜約１０モル％、約１モル％〜約２０モル％、約１モル％〜約１５モル％、約１モル％〜約１０モル％、約２モル％〜約２０モル％、約２モル％〜約１５モル％、約２モル％〜約１０モル％、約３モル％〜約２０モル％、約３モル％〜約１５モル％、約３モル％〜約１０モル％、約４モル％〜約２０モル％、約４モル％〜約１５モル％、約４モル％〜約１０モル％、約５モル％〜約２０モル％、約５モル％〜約１５モル％、約５モル％〜約１０モル％、約６モル％〜約２０モル％、約６モル％〜約１５モル％、約６モル％〜約１０モル％、約７モル％〜約２０モル％、約７モル％〜約１５モル％、約７モル％〜約１０モル％、約８モル％〜約２０モル％、約８モル％〜約１５モル％、約８モル％〜約１０モル％、約９モル％〜約２０モル％、約９モル％〜約１５モル％、約９モル％〜約１０モル％の範囲である。
【０８２７】
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、約５モル％〜約１０モル％の範囲である。
【０８２８】
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、約５モル％である。一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、約１０モル％である。
【０８２９】
一部の実施形態では、第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、本明細書に開示の脂質組成物中の少なくとも約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５または２０モル％である。
【０８３０】
一部の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、式（Ｉ）の化合物を含む。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）対第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡ）のモル濃度比は、約１００：１〜約２．５：１である。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）対第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）のモル濃度比は、約９０：１、約８０：１、約７０：１、約６０：１、約５０：１、約４０：１、約３０：１、約２０：１、約１５：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、または約２．５：１である。一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）対第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）のモル濃度比は、約１０：１である。
【０８３１】
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、２０１７年４月１３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２号に開示されている脂質組成物を含み、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０８３２】
一部の態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、第四級アミン化合物を含まない。一部の態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、ＤＯＴＡＰを含まない。
（ｉｉｉ）構造脂質
【０８３３】
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数の構造脂質を含み得る。本明細書において使用されるとき、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、また、ステロール部分を含有する脂質を指す。一部の実施形態では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される。一部の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。
【０８３４】
一実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物中の構造脂質（例えば、ステロール、例えば、コレステロール）の量は、約２０モル％〜約６０モル％、約２５モル％〜約５５モル％、約３０モル％〜約５０モル％、もしくは約３５モル％〜約４５モル％の範囲である。
【０８３５】
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、ステロール、例えば、コレステロール）の量は、約２５モル％〜約３０モル％、約３０モル％〜約３５モル％、もしくは約３５モル％〜約４０モル％の範囲である。
【０８３６】
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、ステロール、例えば、コレステロール）の量は、約２３．５モル％、約２８．５モル％、約３３．５モル％、もしくは約３８．５モル％である。
【０８３７】
一部の実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、ステロール、例えば、コレステロール）の量は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０モル％である。
【０８３８】
一部の態様では、開示される腫瘍内送達のための医薬組成物の脂質組成物成分は、コレステロールを含まない。
（ｉｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質
【０８３９】
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
【０８４０】
本明細書において使用されるとき、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、およびＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。そのような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
【０８４１】
一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質としては、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、ＰＥＧ−ジパルメトレイル（ＰＥＧ−ｄｉｐａｌｍｅｔｏｌｅｙｌ）、ＰＥＧ−ジオレイル、ＰＥＧ−ジステアリル、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ−１，２−ジミリスチルオキシルプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８４２】
一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【０８４３】
一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質の脂質部分には、約Ｃ１４〜約Ｃ２２、好ましくは、約Ｃ１４〜約Ｃ１６の長さを有するものが含まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。
【０８４４】
一実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ−ＤＳＧおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥが挙げられる。
【０８４５】
ＰＥＧ脂質は、米国特許第８１５８６０１号および国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４号Ａ２に記載されているものなど、当技術分野において公知であり、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０８４６】
一実施形態では、医薬組成物の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約０．１モル％〜約５モル％、約０．５モル％〜約５モル％、約１モル％〜約５モル％、約１．５モル％〜約５モル％、約２モル％〜約５モル％モル％、約０．１モル％〜約４モル％、約０．５モル％〜約４モル％、約１モル％〜約４モル％、約１．５モル％〜約４モル％、約２モル％〜約４モル％、約０．１モル％〜約３モル％、約０．５モル％〜約３モル％、約１モル％〜約３モル％、約１．５モル％〜約３モル％、約２モル％〜約３モル％、約０．１モル％〜約２モル％、約０．５モル％〜約２モル％、約１モル％〜約２モル％、約１．５モル％〜約２モル％、約０．１モル％〜約１．５モル％、約０．５モル％〜約１．５モル％、もしくは約１モル％〜約１．５モル％の範囲である。
【０８４７】
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約１．５モル％である。
【０８４８】
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５モル％である。
【０８４９】
一部の態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
【０８５０】
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物、および非対称リン脂質を含む。一部の実施形態では、脂質組成物は、化合物１８およびＭＳＰＣを含む。
【０８５１】
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物、および第四級アミン化合物を含む。一部の実施形態では、脂質組成物は、化合物１８およびＤＯＴＡＰを含む。
【０８５２】
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物、非対称リン脂質、および第四級アミン化合物を含む。一部の実施形態では、脂質組成物は、化合物１８、ＭＳＰＣ、およびＤＯＴＡＰを含む。
【０８５３】
一実施形態では、脂質組成物は、約５０モル％の式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）、約１０モル％のＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ、約３３．５モル％のコレステロール、約１．５モル％のＰＥＧ−ＤＭＧ、および約５モル％のＤＯＴＡＰを含む。一実施形態では、脂質組成物は、約５０モル％の式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）、約１０モル％のＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ、約２８．５モル％のコレステロール、約１．５モル％のＰＥＧ−ＤＭＧ、および約１０モル％のＤＯＴＡＰを含む。
【０８５４】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２０〜６０％のイオン化可能アミノ脂質：５〜２５％のリン脂質：２５〜５５％のステロール；および０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約２０〜６０％の化合物１８：５〜２５％のリン脂質：２５〜５５％のコレステロール；および０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約５０％のイオン化可能アミノ脂質：約１０％のリン脂質：約３８．５％のコレステロール；および約１．５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約５０％の化合物１８：約１０％のリン脂質：約３８．５％のコレステロール；および約１．５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約４９．８３％のイオン化可能アミノ脂質：約９．８３％のリン脂質：約３０．３３％のコレステロール；および約２．０％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約４９．８３％の化合物１８：約９．８３％のリン脂質：約３０．３３％のコレステロール；および約２．０％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。
【０８５５】
脂質ナノ粒子の構成成分は、所望の転帰に基づいてポリヌクレオチドの最適な送達のために適合させることができる。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、４０〜６０モル％のイオン化可能アミノ脂質（例えば、式（Ｉ）の化合物）、８〜１６モル％のリン脂質、３０〜４５モル％のコレステロール、１〜５モル％のＰＥＧ脂質、および任意選択で１〜１５モル％の第四級アミン化合物を含み得る。
【０８５６】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５〜６５モル％のイオン化可能アミノ脂質（例えば、式（Ｉ）の化合物）、５〜１０モル％のリン脂質、２５〜４０モル％のコレステロール、０．５〜５モル％のＰＥＧ脂質、および任意選択で１〜１５モル％の第四級アミン化合物を含み得る。
【０８５７】
核酸脂質粒子の非限定的な例は、米国特許公開第２０１４０１２１２６３号に開示されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（ｖ）他のイオン化可能アミノ脂質
【０８５８】
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、式（Ｉ）にしたがう脂質に加えて、１つまたは複数のイオン化可能脂質を含み得る。本明細書において使用されるとき、「イオン化可能脂質」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、１つまたは複数の荷電した部分を含む脂質を指し得る。一部の実施形態では、イオン化可能脂質は、正に荷電していてもよいし、負に荷電していてもよい。イオン化可能脂質は、正に荷電してもよく、その場合、「カチオン性脂質」と称され得る。例えば、イオン化可能分子は、アミン基を含み得、イオン化可能アミノ脂質と称され得る。
【０８５９】
イオン化可能脂質は、
３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、
Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、
１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、
１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、
２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、
ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、
２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、
１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、
（１３Ｚ，１６５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニドコサ−１３−１６−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）、
２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、
（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および
（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる非限定群から選択され得る。これらに加え、イオン化可能アミノ脂質は、環状アミン基を含む脂質であってもよい。
【０８６０】
イオン化可能脂質はまた、国際公開第ＷＯ２０１５／１９９９５２号Ａ１に開示されている化合物であってもよく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、イオン化可能アミノ脂質としては、
【化１７−１】
2019516710.tif 000135
【化１７−２】
2019516710.tif 000136
およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
（ｖｉ）他の脂質組成物成分
【０８６１】
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、上述のものに加えて、１つまたは複数の成分を含み得る。例えば、脂質組成物は、１つまたは複数の透過性増強分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤（例えば、界面活性剤）、または他の成分を含み得る。例えば、透過性増強分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載されている分子であってもよい。炭水化物は、単糖類（例えば、グルコース）ならびに多糖類（例えば、グリコーゲン、ならびにその誘導体および類似体）を含み得る。脂質組成物は、ｐＨ７のクエン酸もしくはリン酸などであるがこれらに限定されない緩衝液、塩、および／または糖を含み得る。塩および／または糖は、等張性のために、本明細書に記載される製剤に含まれ得る。
【０８６２】
ポリマーは、本明細書に開示される医薬組成物（例えば、脂質ナノ粒子の形態の医薬組成物）を封入または部分的に封入するために、含まれ得るおよび／または使用され得る。ポリマーは、生体分解性および／または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。
【０８６３】
脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比の範囲は、約１０：１〜約６０：１（重量／重量）であり得る。
【０８６４】
一部の実施形態では、脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１または６０：１（重量／重量）であり得る。一部の実施形態では、脂質組成物対治療剤をコードするポリヌクレオチドの重量／重量比は、約２０：１または約１５：１である。
【０８６５】
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、１より多くのポリペプチドを含有し得る。例えば、本明細書に開示される医薬組成物は、２つまたはそれよりも多くのポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。
【０８６６】
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１または７０：１、あるいはこれらの比の範囲もしくはいずれか、例えば、これらに限定されないが、５：１〜約１０：１、約５：１〜約１５：１、約５：１〜約２０：１、約５：１〜約２５：１、約５：１〜約３０：１、約５：１〜約３５：１、約５：１〜約４０：１、約５：１〜約４５：１、約５：１〜約５０：１、約５：１〜約５５：１、約５：１〜約６０：１、約５：１〜約７０：１、約１０：１〜約１５：１、約１０：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１０：１〜約３０：１、約１０：１〜約３５：１、約１０：１〜約４０：１、約１０：１〜約４５：１、約１０：１〜約５０：１、約１０：１〜約５５：１、約１０：１〜約６０：１、約１０：１〜約７０：１、約１５：１〜約２０：１、約１５：１〜約２５：１，約１５：１〜約３０：１、約１５：１〜約３５：１、約１５：１〜約４０：１、約１５：１〜約４５：１、約１５：１〜約５０：１、約１５：１〜約５５：１、約１５：１〜約６０：１または約１５：１〜約７０：１の脂質：ポリヌクレオチド重量比のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含み得る。
【０８６７】
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、およそ０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、例えば、これらに限定されないが、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌまたは２．０ｍｇ／ｍｌより大きな濃度のポリヌクレオチドを含み得る。
【０８６８】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよび脂質ナノ粒子を含む製剤は、０．１５ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含み得る。一部の実施形態では、製剤は、１０ｍＭのクエン酸緩衝液をさらに含んでもよく、製剤は、追加で、１０％重量／重量までのスクロース（例えば、少なくとも１％重量／重量、少なくとも２％重量／重量／、少なくとも３％重量／重量、少なくとも４％重量／重量、少なくとも５％重量／重量、少なくとも６％重量／重量、少なくとも７％重量／重量、少なくとも８％重量／重量、少なくとも９％重量／重量または１０％重量／重量）を含んでもよい。
（ｖｉｉ）ナノ粒子組成物
【０８６９】
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される。したがって、本開示はまた、（ｉ）本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物などの送達剤を含む脂質組成物、ならびに（ｉｉ）ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ナノ粒子組成物も提供する。そのようなナノ粒子組成物において、本明細書に開示される脂質組成物は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封入し得る。
【０８７０】
ナノ粒子組成物は、典型的に、マイクロメートル単位またはそれよりも小さいサイズであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、およびリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、５００ｎｍまたはそれよりも小さい直径を有する脂質二重層を有するリポソームであり得る。
【０８７１】
ナノ粒子組成物には、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、およびリポプレックスが含まれる。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つまたは複数の脂質二重層を含む、小胞である。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水溶性コンパートメントで分離された、２つまたはそれよりも多い同心二重層を含む。脂質二重層は、互いに官能化および／または架橋され得る。脂質二重層は、１つまたは複数のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含み得る。
【０８７２】
本開示のナノ粒子組成物は、式（Ｉ）による少なくとも１つの化合物を含む。例えば、ナノ粒子組成物は、化合物１〜１４７のうちの１つもしくは複数、または化合物１〜３４２のうちの１つもしくは複数を含み得る。ナノ粒子組成物はまた、様々な他の成分も含み得る。例えば、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）による脂質に加えて、１つまたは複数の他の脂質、例えば、（ｉ）少なくとも１つのリン脂質、（ｉｉ）少なくとも１つの第四級アミン化合物、（ｉｉｉ）少なくとも１つの構造脂質、（ｉｖ）少なくとも１つのＰＥＧ脂質、または（ｖ）これらの任意の組合せを含んでもよい。
【０８７３】
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）およびリン脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ）を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）、リン脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ）、および第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）および第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）を含む。
【０８７４】
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）からなるか、または本質的にそれからなる、脂質組成物を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）およびリン脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ）からなるか、または本質的にそれからなる、脂質組成物を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）、リン脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ）、および第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）からなるか、または本質的にそれからなる、脂質組成物を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）および第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）からなるか、または本質的にそれからなる、脂質組成物を含む。
【０８７５】
一実施形態では、ナノ粒子組成物は、（１）約５０モル％の式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）；約１０モル％のＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ；約３３．５モル％のコレステロール；約１．５モル％のＰＥＧ−ＤＭＧ（例えば、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）；約５モル％のＤＯＴＡＰを含む脂質組成物；および（２）ポリヌクレオチドを含む。
【０８７６】
一実施形態では、ナノ粒子組成物は、（１）約５０モル％の式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）；約１０モル％のＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ；約２８．５モル％のコレステロール；約１．５モル％のＰＥＧ−ＤＭＧ（例えば、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）；約１０モル％のＤＯＴＡＰを含む脂質組成物；および（２）ポリヌクレオチドを含む。
【０８７７】
一実施形態では、ナノ粒子組成物は、（１）約５０モル％の式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）；約１０モル％のＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ；約２３．５モル％のコレステロール；約１．５モル％のＰＥＧ−ＤＭＧ（例えば、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）；約１５モル％のＤＯＴＡＰを含む脂質組成物；および（２）ポリヌクレオチドを含む。
【０８７８】
ナノ粒子組成物は、様々な方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡法（例えば、透過電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡）を使用して、ナノ粒子組成物の形態学およびサイズ分布を試験することができる。動的光散乱法または電位差測定（例えば、電位差滴定）を使用して、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱法はまた、粒子サイズを判定するためにも利用することができる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）などの機器もまた、ナノ粒子組成物の複数の特徴、例えば、粒子サイズ、多分散性指標、およびゼータ電位を測定するために使用され得る。
【０８７９】
本明細書において一般に定義されるように、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性の特性を有する小分子を指す。脂質は、天然に存在しても合成であってもよい。脂質のクラスの例としては、脂肪、ワックス、ステロール含有代謝産物、ビタミン類、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、およびポリケチド、ならびにプレノール脂質が挙げられるが、これらに限定されない。一部の事例では、一部の脂質の両親媒性の特性により、水性媒体中で、リポソーム、小胞、または膜の形成がもたらされる。
【０８８０】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン化可能脂質を含み得る。本明細書において使用されるとき、「イオン化可能脂質」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、１つまたは複数の荷電した部分を含む脂質を指し得る。一部の実施形態では、イオン化可能脂質は、正に荷電している場合も負に荷電している場合もある。イオン化可能脂質は、正に荷電してもよく、その場合には、「カチオン性脂質」と称され得る。例えば、イオン化可能分子は、アミン基を含み得、イオン化可能アミノ脂質と称され得る。本明細書において使用されるとき、「荷電した部分」は、正式な電子電荷、例えば、一価（＋１または−１）、二価（＋２または−２）、三価（＋３または−３）などを有する化学的部分である。荷電した部分は、アニオン性（すなわち、負に荷電している）またはカチオン性（すなわち、正に荷電している）であり得る。正に荷電した部分の例としては、アミン基（例えば、第一級、第二級、および／または第三級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、ならびにイミジゾリウム（ｉｍｉｄｉｚｏｌｉｕｍ）基が挙げられる。特定の実施形態では、荷電した部分は、アミン基を含む。負に荷電した基またはその前駆体の例としては、カルボキシレート基、スルホネート基、スルフェート基、ホスホネート基、ホスフェート基、ヒドロキシル基などが挙げられる。荷電した部分の電荷は、変動し得、一部の事例では、環境条件、例えば、ｐＨの変化により、その部分の電荷が変化し得る、かつ／またはその部分が荷電するかもしくは非荷電になることをもたらし得る。一般に、分子の電荷密度は、所望に応じて選択され得る。
【０８８１】
「荷電した」または「荷電した部分」という用語は、分子上の「部分的な負の電荷」または「部分的な正の電荷」を指すものではないことを理解されたい。「部分的な負の電荷」および「部分的な正の電荷」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味が与えられる。「部分的な負の電荷」は、官能基が、極性を生じる結合を含み、電子密度が結合の１つの原子に引き寄せられ、その原子に部分的な負の電荷をもたらす場合に、生じ得る。当業者であれば、一般に、このようにして極性が生じる結合を認識するであろう。
【０８８２】
一部の実施形態では、イオン化可能脂質は、イオン化可能アミノ脂質であり、これは、当技術分野において、「イオン化可能カチオン性脂質」と称される場合がある。一実施形態では、イオン化可能アミノ脂質は、リンカー構造体を介して接続された正に荷電した親水性の頭部および疎水性の尾部を有し得る。
【０８８３】
ナノ粒子のサイズは、炎症などであるがこれに限定されない生物学的反応に対抗するのに役立ち得るか、またはポリヌクレオチドの生物学的効果を増大させ得る。
【０８８４】
本明細書において使用されるとき、ナノ粒子組成物の文脈における「サイズ」または「平均サイズ」とは、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
【０８８５】
一実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＢとＩＬ１２Ａとの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、約１０〜約１００ｎｍ、例えば、これらに限定されないが、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍおよび／または約９０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子中に製剤化される。
【０８８６】
一実施形態では、ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍの直径を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、１００ｎｍより大きい、１５０ｎｍより大きい、２００ｎｍより大きい、２５０ｎｍより大きい、３００ｎｍより大きい、３５０ｎｍより大きい、４００ｎｍより大きい、４５０ｎｍより大きい、５００ｎｍより大きい、５５０ｎｍより大きい、６００ｎｍより大きい、６５０ｎｍより大きい、７００ｎｍより大きい、７５０ｎｍより大きい、８００ｎｍより大きい、８５０ｎｍより大きい、９００ｎｍより大きい、９５０ｎｍより大きいまたは１０００ｎｍより大きい直径を有する。
【０８８７】
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、１μｍまたはそれ未満（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、またはそれ未満）である。
【０８８８】
ナノ粒子組成物は、比較的に均質であり得る。多分散性指標を使用して、ナノ粒子組成物の均質性、例えば、ナノ粒子組成物の粒子サイズ分布を示すことができる。低い多分散性指標（例えば、０．３未満）は、通常、狭い粒子サイズ分布を示す。ナノ粒子組成物は、約０〜約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５の多分散指数を有し得る。一部の実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物の多分散指数は、約０．１０〜約０．２０であり得る。
【０８８９】
ナノ粒子組成物のゼータ電位を使用して、組成物の界面動電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を示し得る。正であっても負であっても比較的低い電荷を有するナノ粒子組成物が、一般的に、望ましいが、これは、より高度に荷電した種は、望ましくなく、細胞、組織、および体内の他の要素と、相互作用し得るためである。一部の実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物のゼータ電位は、約−１０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約１０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約−５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ〜約＋１０ｍＶであり得る。
【０８９０】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約１０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約１０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約２０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約３０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約４０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約６０ｍＶ、および約４０ｍＶ〜約５０ｍＶであり得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１５ｍＶ〜約４５ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、および約２５ｍＶ〜約３５ｍＶであり得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ、約２０ｍＶ、約３０ｍＶ、約４０ｍＶ、約５０ｍＶ、約６０ｍＶ、約７０ｍＶ、約８０ｍＶ、約９０ｍＶ、および約１００ｍＶであり得る。
【０８９１】
ポリヌクレオチドの「封入効率」という用語は、提供された最初の量に対して、調製後にナノ粒子組成物に封入されるかまたはそれ以外の方法で会合される、ポリヌクレオチドの量を示す。本明細書において使用されるとき、「封入」は、完全、実質的、または部分的な封止、閉じ込め、包囲、または内包を指し得る。
【０８９２】
封入効率は、高いことが望ましい（例えば、１００％に近い）。封入効率は、例えば、ナノ粒子組成物を含有する溶液中のポリヌクレオチドの量を、１つまたは複数の有機溶媒または界面活性剤でナノ粒子組成物を破壊する前と後で、比較することによって、測定することができる。
【０８９３】
蛍光を使用して、溶液中の遊離ポリヌクレオチドの量を測定してもよい。本明細書に記載のナノ粒子組成物について、ポリヌクレオチドの封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。ある特定の実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。
【０８９４】
本明細書に開示される医薬組成物中に存在するポリヌクレオチドの量は、複数の要因、例えば、ポリヌクレオチドのサイズ、所望される標的および／もしくは用途、またはナノ粒子組成物の他の特性、ならびにポリヌクレオチドの特性に依存し得る。
【０８９５】
例えば、ナノ粒子組成物において有用なｍＲＮＡの量は、ｍＲＮＡのサイズ（長さ、または分子量として表される）、配列、および他の特徴に依存し得る。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの相対的な量はまた、変動し得る。
【０８９６】
本開示の脂質ナノ粒子組成物中に存在する脂質組成物およびポリヌクレオチドの相対的な量は、有効性および耐容性を考慮して最適化することができる。ｍＲＮＡをポリヌクレオチドとして含む組成物については、Ｎ：Ｐ比が、有用な測定法としての機能を果たし得る。
【０８９７】
ナノ粒子組成物のＮ：Ｐ比は、発現および耐容性の両方を調節するため、低いＮ：Ｐ比および強い発現を有するナノ粒子組成物が、望ましい。Ｎ：Ｐ比は、ナノ粒子組成物中の脂質対ＲＮＡの比に応じて変動する。
【０８９８】
一般に、低いＮ：Ｐ比が、好ましい。１つまたは複数のＲＮＡ、脂質、およびそれらの量は、約２：１〜約３０：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１のＮ：Ｐ比を提供するように選択され得る。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１〜約８：１であり得る。他の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５：１〜約８：１である。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、５：１〜６：１である。１つの特定の態様では、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１である。
【０８９９】
ナノ粒子組成物を提供することに加えて、本開示はまた、ポリヌクレオチドを封入することを含む、脂質ナノ粒子を産生する方法も提供する。そのような方法は、本明細書に開示される医薬組成物のうちのいずれかを使用し、当技術分野において公知の脂質ナノ粒子の産生方法に従って、脂質ナノ粒子を産生することを含む。例えば、Ｗａｎｇら、（２０１５年）「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．、８７巻、６８〜８０頁；Ｓｉｌｖａら、（２０１５年）「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．  Ｐａｒｔ  Ｉ：  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻、９４０〜９５４頁；Ｎａｓｅｒｉら、（２０１５年）「Ｓｏｌｉｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ａｄｖ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．、５巻、３０５〜１３頁；Ｓｉｌｖａら、（２０１５年）「Ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」、Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻、２９１〜３０２頁、およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい。
２５．他の送達剤
ａ．リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
【０９００】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、またはこれらの任意の組合せを含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、１つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化され得る。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して、ポリヌクレオチドによって誘導されるタンパク質の産生の有効性を改善することができるが、これは、これらの製剤が、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増大させ得る、かつ／またはコードされるタンパク質の翻訳を増大させ得るためである。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子はまた、ポリヌクレオチドの安定性を増大させるためにも使用することができる。
【０９０１】
リポソームは、主として、脂質二重層から構成され得、医薬製剤の投与のための送達用ビヒクルとして使用することができる、人工的に調製された小胞である。リポソームは、様々なサイズのものであり得る。多ラメラ小胞（ＭＬＶ）は、直径が数百ナノメートルであり得、狭い水溶性コンパートメントで分離された同心二重層系列を含有し得る。小単細胞小胞（ＳＵＶ）は、直径が５０ｎｍよりも小さくあり得、大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は、直径が５０〜５００ｎｍであり得る。リポソーム設計は、限定されないが、非健常組織へのリポソームの結合を改善するため、またはエンドサイトーシスなどであるがこれに限定されない事象を活性化するために、オプソニンまたはリガンドを含み得る。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低いかまたは高いｐＨ値を含有してもよい。
【０９０２】
リポソームの形態は、封止される医薬製剤およびリポソーム成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、封止される物質の有効濃度およびその潜在的な毒性、小胞の適用および／もしくは送達中に付随する任意の追加のプロセス、意図される適用に最適な小胞のサイズ、多分散性、および保管寿命、ならびに安全かつ効率的なリポソーム生成物のバッチごとの再現性および拡張生成性などに依存し得る。
【０９０３】
非限定的な例として、合成膜小胞などのリポソームは、米国公開第ＵＳ２０１３０１７７６３８号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３７号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３６号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３５号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３４号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３３号、同第ＵＳ２０１３０１８３３７５号、同第ＵＳ２０１３０１８３３７３号、および同第ＵＳ２０１３０１８３３７２号に記載されている方法、装置、およびデバイスによって調製することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、例えば、国際公開第ＷＯ２０１２０３１０４６号、同第ＷＯ２０１２０３１０４３号、同第ＷＯ２０１２０３０９０１号、同第ＷＯ２０１２００６３７８号、および同第ＷＯ２０１３０８６５２６号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１８９３５１号、同第ＵＳ２０１３０１９５９６９号、および同第ＵＳ２０１３０２０２６８４号に記載されているように、リポソームに封入され得る、および／またはこれは、水溶性コアに格納され得、このコアが、次いで、リポソームに封入されてもよい。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９０４】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、カチオン性の水中油型エマルジョンにおいて製剤化されてもよく、ここで、エマルジョン粒子は、油性のコアおよびカチオン性脂質を含み、これらが、ポリヌクレオチドと相互作用し、分子をエマルジョン粒子に係留することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、親水相が分散された連続した疎水相を含む、油中水型エマルジョンにおいて製剤化され得る。例示的なエマルジョンは、国際公開第ＷＯ２０１２００６３８０号および同第ＷＯ２０１０８７７９１号に記載されている方法によって作製することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９０５】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、脂質−ポリカチオン複合体において製剤化され得る。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、例えば、米国公開第ＵＳ２０１２０１７８７０２号に記載されている方法によって達成することができる。非限定的な例として、ポリカチオンは、ポリリシン、ポリオルニチン、および／またはポリアルギニン、ならびに国際公開第ＷＯ２０１２０１３３２６号または米国公開第ＵＳ２０１３０１４２８１８号に記載されているカチオン性ペプチドなどであるが、これらに限定されない、カチオン性ペプチドまたはポリペプチドを含み得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９０６】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１３１２３５２３号、同第ＷＯ２０１２１７０９３０号、同第ＷＯ２０１１１２７２５５号、および同第ＷＯ２００８１０３２７６号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１７１６４６号に記載されているものなどの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）において製剤化されてもよく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９０７】
脂質ナノ粒子製剤は、典型的に、１つまたは複数の脂質を含む。一部の実施形態では、脂質は、イオン化可能脂質（例えば、イオン化可能アミノ脂質である）。一部の実施形態では、脂質は、カチオン性脂質である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、リン脂質、構造脂質、第四級アミン化合物、および粒子の凝集を低減することができる分子、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む、他の成分をさらに含む。
【０９０８】
カチオン性脂質およびイオン化可能脂質としては、例えば、国際公開第ＷＯ２０１５１９９９５２号、同第ＷＯ２０１５１３０５８４号、同第ＷＯ２０１５０１１６３３号、および同第ＷＯ２０１２０４０１８４号、同第ＷＯ２０１３１２６８０３号、同第ＷＯ２０１１１５３１２０号、同第ＷＯ２０１１１４９７３３号、同第ＷＯ２０１１０９０９６５号、同第ＷＯ２０１１０４３９１３号、同第ＷＯ２０１１０２２４６０号、同第ＷＯ２０１２０６１２５９号、同第ＷＯ２０１２０５４３６５号、同第ＷＯ２０１２０４４６３８号、同第ＷＯ２０１００８０７２４号、同第ＷＯ２０１０２１８６５号、同第ＷＯ２００８１０３２７６号、および同第ＷＯ２０１３０８６３７３号、米国特許第７，８９３，３０２号、同第７，４０４，９６９号、同第８，２８３，３３３号、および同第８，４６６，１２２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１０２２４４４７号、同第ＵＳ２０１２０２９５８３２号、同第ＵＳ２０１５０３１５１１２号、同第ＵＳ２０１０００３６１１５号、同第ＵＳ２０１２０２０２８７１号、同第ＵＳ２０１３００６４８９４号、同第ＵＳ２０１３０１２９７８５号、同第ＵＳ２０１３０１５０６２５号、同第ＵＳ２０１３０１７８５４１号、同第ＵＳ２０１３０１２３３３８号、および同第ＵＳ２０１３０２２５８３６号に記載されているものを挙げることができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、脂質組成物中のカチオン性脂質およびイオン化可能脂質の量は、約０．０１モル％〜約９９モル％の範囲である。
【０９０９】
例示的なイオン化可能脂質としては、本明細書に開示される化合物１〜１４７のうちのいずれか１つ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ４−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＫＬ１０、ＫＬ２２、ＫＬ２５、オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ、オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）、およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的なイオン化可能脂質としては、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル（ｄｉｍｅｍｙｌ）ヘキサコサ−１７，２０−ジエン−９−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ５Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−８−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３，１６−ジエン−５−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−１０−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル（ｄｉｍｅｉｈｙｌ）オクタコサ−１９，２２−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０−アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７−エン−９−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７−アミン、Ν，Ν−ジメチルヘプタコサン−１０−アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−ノニルイコサ−１１，１４−ジエン−１−イル］ピロリジン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−２０−エン−１０−アミン、（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−（ｅｐ��ａｃｏｓ）−１５−エン−１０−アミン、（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１４−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１７−エン−１０−アミン、（２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリトリアコンタ−２４−エン−１０−アミン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０−エン−１０−アミン、（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２−エン−１０−アミン、（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６−エン−８−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］エプタデカン−８−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘニコサン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロ（ｃｙｃＩｏ）プロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン−８−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ウンデシル（ｕｎｄｅｃｙＩ）シクロプロピル］テトラデカン−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛７−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン−１−アミン、１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヘプチルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデカン−９−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン−６−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカン−８−アミン、Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）−Ν，Ν−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクタ−５−エン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン；（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ、１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（９Ｚ）−ヘキサデカ−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈ（１−メチル（ｍｅｔｏｙｌ）オクチル）オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−｛［８−（２−オクチル（ｏｃｌｙｌ）シクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、および（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２−トリエン−１０−アミン、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。
【０９１０】
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、およびホスファチジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質はまた、リンスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリンも含む。一部の実施形態では、リン脂質は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ジエーテルＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ  １６：０  ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ、ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、およびこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、リン脂質は、ＭＰＰＣ、ＭＳＰＣ、ＰＭＰＣ、ＰＳＰＣ、ＳＭＰＣ、ＳＰＰＣ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、およびこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、脂質組成物中のリン脂質（例えば、ＤＳＰＣおよび／またはＭＳＰＣ）の量は、約１モル％〜約２０モル％の範囲である。
【０９１１】
構造脂質は、ステロールおよびステロール部分を含有する脂質を含む。一部の実施形態では、構造脂質としては、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、およびこれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。一部の実施形態では、脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロール）の量は、約２０モル％〜約６０モル％の範囲である。
【０９１２】
本明細書に記載される第四級アミン化合物としては、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−（１，２−ジオレオイルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＬｅＰＣ）、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＳｅＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＰｅＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭｅＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯｅＰＣ）、１，２−ジ−（９Ｚ−テトラデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１４：１  ＥＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（１６：０−１８：１  ＥＰＣ）、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、脂質組成物中の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、約０．０１モル％〜約２０モル％の範囲である。
【０９１３】
ＰＥＧ修飾脂質としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、およびＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。そのような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ  ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、ＰＥＧ−ジパルメトレイル、ＰＥＧ−ジオレイル、ＰＥＧ−ジステアリル、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ−１，２−ジミリスチルオキシルプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一部の実施形態では、脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約０．１モル％〜約５モル％の範囲である。
【０９１４】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、透過性増強分子をさらに含み得る。非限定的な透過性増強分子は、米国公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９１５】
ＬＮＰ製剤は、ホスフェートコンジュゲートをさらに含有し得る。ホスフェートコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏ循環時間を増大させ得る、かつ／またはナノ粒子の標的化送達を増大させ得る。ホスフェートコンジュゲートは、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０３３４３８号または米国公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号に記載されている方法によって作製することができる。ＬＮＰ製剤はまた、例えば、米国公開第ＵＳ２０１３００５９３６０号、同第ＵＳ２０１３０１９６９４８号、および同第ＵＳ２０１３００７２７０９号に記載されているポリマーコンジュゲート（例えば、水溶性コンジュゲート）も含有し得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９１６】
ＬＮＰ製剤は、対象における本開示のナノ粒子の送達を増強するために、コンジュゲートを含み得る。さらに、コンジュゲートは、対象におけるファゴサイトーシスによるナノ粒子のクリアランスを阻害し得る。一部の実施形態では、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計された「自己」ペプチド（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、３３９巻、９７１〜９７５頁によって説明されている「自己」粒子、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）であってもよい。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらによって示されているように、自己ペプチドは、マクロファージに媒介されるナノ粒子のクリアランスを遅延させ、これにより、ナノ粒子の送達が増強された。
【０９１７】
ＬＮＰ製剤は、炭水化物担体を含み得る。非限定的な例として、炭水化物担体としては、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型の材料、フィトグリコーゲンコハク酸オクテニル、フィトグリコーゲンベータ−デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンベータ−デキストリンを挙げることができるが、これらに限定されない（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１０９１２１号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０９１８】
ＬＮＰ製剤は、粒子の送達を改善するために、界面活性剤またはポリマーでコーティングされ得る。一部の実施形態では、ＬＮＰは、米国公開第ＵＳ２０１３０１８３２４４号に記載されているように、ＰＥＧコーティングおよび／または中性表面電荷を有するコーティングなどであるがこれらに限定されない、親水性コーティングでコーティングされ得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９１９】
ＬＮＰ製剤は、米国特許第８，２４１，６７０号または国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に記載されているように、脂質ナノ粒子が粘膜壁を貫入することができるように、粒子の表面特性を変化させるように操作してもよく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９２０】
粘液を貫入するように操作されたＬＮＰは、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）および／またはポリマー−ビタミンコンジュゲートおよび／またはトリ−ブロックコポリマーを含み得る。ポリマー材料としては、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０９２１】
粘液を貫入するように操作されたＬＮＰはまた、表面改質剤、例えば、限定されないが、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、例として、ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロミドなど）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、およびポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルソリン、チモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）、ならびにｒｈＤＮａｓｅを含む様々なＤＮａｓｅを含み得る。
【０９２２】
一部の実施形態では、粘液貫入性ＬＮＰは、粘膜貫入を増強するコーティングを含む、低浸透圧製剤であり得る。製剤は、それが送達される上皮に対して、低浸透圧であり得る。低浸透圧製剤の非限定的な例は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に見出すことができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９２３】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、限定することなく、ＡＴＵＰＬＥＸＴＭ系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系、ならびにＳｉｌｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）からの他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）からのＳＴＥＭＦＥＣＴＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、および核酸のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）もしくはプロタミンに基づく標的化および非標的化送達など、リポプレックスとして製剤化される（Ａｌｅｋｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００８年、６８巻、９７８８〜９７９８頁；Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、２０１２年、５０巻、７６〜７８頁；Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００６年、１３巻、１２２２〜１２３４頁；Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００６年、１３巻、１３６０〜１３７０頁；Ｇｕｔｂｉｅｒら、Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、２０１０年、２３巻、３３４〜３４４頁；Ｋａｕｆｍａｎｎら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ、２０１０年、８０巻、２８６〜２９３頁、Ｗｅｉｄｅら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００９年、３２巻、４９８〜５０７頁；Ｗｅｉｄｅら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００８年、３１巻、１８０〜１８８頁；Ｐａｓｃｏｌｏ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、４巻、１２８５〜１２９４頁；Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋら、２０１１年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３４巻、１〜１５頁；Ｓｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００５年、２３巻、７０９〜７１７頁；Ｐｅｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２００７年、６巻、１０４号、４０９５〜４１００頁；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２００８年、１９巻、１２５〜１３２頁、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０９２４】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）として製剤化され、これは、１０〜１０００ｎｍの平均直径を有する球形であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤および／または乳化剤で安定化することができる、固体脂質コアマトリックスを有する。例示的なＳＬＮは、国際公開第ＷＯ２０１３１０５１０１号に記載されるものであり得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９２５】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、調節放出および／または標的化送達のために製剤化され得る。本明細書において使用されるとき、「調節放出」は、治療的転帰を実現する特定の放出パターンに適合する、医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、調節放出および／または標的化送達のために、本明細書に記載されるおよび／または当技術分野において公知の送達剤に封入され得る。本明細書において使用されるとき、「封入する」という用語は、封止、包囲、または内包することを意味する。これは、本開示の化合物の製剤化に関連するため、封入は、実質的か、完全か、または部分的であってもよい。「実質的に封入される」という用語は、本開示の医薬組成物または化合物のうちの少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９％よりも多く、または９９．９９９％よりも多くが、送達剤内に封止、包囲、または内包され得ることを意味する。「部分的封入」は、本開示の医薬組成物または化合物のうちの１０よりも少ない、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ未満が、送達剤内に封止、包囲、または内包され得ることを意味する。
【０９２６】
有利なことに、封入は、蛍光および／または電子顕微鏡写真を使用して、本開示の医薬組成物または化合物の脱出または活性を測定することによって、判定することができる。例えば、本開示の医薬組成物または化合物のうちの少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％よりも多くが、送達剤に封入される。
【０９２７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの調節放出製剤は、少なくとも１つの調節放出コーティング（例えば、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＳ（登録商標）、およびエチルセルロース水性分散液などのセルロース誘導体（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）およびＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標）））を含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの調節放出製剤は、米国公開第ＵＳ２０１３０１３０３４８号に記載されているポリマー系、または米国特許第８，４０４，２２２号に記載されているＰＥＧおよび／もしくはＰＥＧ関連ポリマー誘導体を含み得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。
【０９２８】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、治療用ナノ粒子に封入され得、本明細書において、「治療用ナノ粒子ポリヌクレオチド」と称され得る。治療用ナノ粒子は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号、同第ＷＯ２０１０００５７２１号、同第ＷＯ２０１０００５７２３号、および同第ＷＯ２０１２０５４９２３号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号、同第ＵＳ２０１０００６８２８５号、同第ＵＳ２０１１０２７４７５９号、同第ＵＳ２０１０００６８２８６号、同第ＵＳ２０１２０２８８５４１号、同第ＵＳ２０１２０１４０７９０号、同第ＵＳ２０１３０１２３３５１号、および同第ＵＳ２０１３０２３０５６７号、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号、および同第８，３１８，２１１号に記載されている方法によって製剤化することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９２９】
一部の実施形態では、治療用ナノ粒子ポリヌクレオチドは、持続放出用に製剤化され得る。本明細書において使用されるとき、「持続放出」は、特定の期間にわたる放出速度に適合する、医薬組成物または化合物を指す。期間としては、数時間、数日間、数週間、数ヶ月、および数年間が挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの持続放出ナノ粒子は、国際公開第ＷＯ２０１００７５０７２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号、同第ＵＳ２０１１０２１７３７７号、同第ＵＳ２０１２０２０１８５９号、および同第ＵＳ２０１３０１５０２９５号に開示されているように製剤化することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９３０】
一部の実施形態では、治療用ナノ粒子ポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２００８１２１９４９号、同第ＷＯ２０１０００５７２６号、同第ＷＯ２０１０００５７２５号、同第ＷＯ２０１１０８４５２１号、および同第ＷＯ２０１１０８４５１８号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１０００６９４２６号、同第ＵＳ２０１２０００４２９３号、および同第ＵＳ２０１００１０４６５５号に記載されているもののように、標的特異的となるように製剤化することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９３１】
ＬＮＰは、マイクロ流体ミキサーまたはマイクロミキサーを使用して、調製することができる。例示的なマイクロ流体ミキサーとしては、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ  ｂｅｉ  Ｗｉｌｄｏｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）によって製造されているものを含むがこれに限定されないスリット型インターデジタルマイクロミキサー、および／またはジグザグヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）を挙げることができるが、これらに限定されない（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖｅｔら、「Ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔ  ｓｉｚｅ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  ａｑｕｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｃｏｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｍｉｘｉｎｇ」、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２８巻、３６３３〜４０頁（２０１２年）；Ｂｅｌｌｉｖｅａｕら、「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ  ｌｉｍｉｔ−ｓｉｚｅ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．、１巻、ｅ３７（２０１２年）；Ｃｈｅｎら、「Ｒａｐｉｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｉＲＮＡ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ」、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１３４巻（１６号）、６９４８〜５１頁（２０１２年）を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例示的なマイクロミキサーとしては、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ  Ｍａｉｎｚ  ＧｍｂＨ、Ｍａｉｎｚ  ＧｅｒｍａｎｙからのＳｌｉｔ  Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｍｉｘｅｒ（ＳＩＭＭ−Ｖ２）またはＳｔａｎｄａｒｄ  Ｓｌｉｔ  Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｍｉｘｅｒ（ＳＳＩＭＭ）またはＣａｔｅｒｐｉｌｌａｒ（ＣＰＭＭ）またはＩｍｐｉｎｇｉｎｇ−ｊｅｔ（ＩＪＭＭ）が挙げられる。一部の実施形態では、ＳＨＭを使用してＬＮＰを作製する方法は、少なくとも２つの入力ストリームを混合することをさらに含み、ここで、混合は、マイクロ構造に誘導されるカオス的移流（ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈａｏｔｉｃ  ａｄｖｅｃｔｉｏｎ）（ＭＩＣＡ）によって生じる。この方法によると、流体ストリームは、交互の流れを引き起こし、流体が互いにフォールディングされる、ヘリンボーンパターンに存在するチャネルを通って流れる。この方法はまた、表面の配向が、流体サイクリング中に変化する、流体混合のための表面を含み得る。ＳＨＭを使用してＬＮＰを生成する方法には、米国公開第ＵＳ２００４０２６２２２３号および同第ＵＳ２０１２０２７６２０９号に開示されているものが含まれ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９３２】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、マイクロ流体技術を使用して、脂質ナノ粒子において製剤化され得る（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｍ．、「Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、４４２巻、３６８〜３７３頁（２００６年）およびＡｂｒａｈａｍら、「Ｃｈａｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５巻、６４７〜６５１頁（２００２年）を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）またはＤｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ、ＵＫ）からのものなどであるがこれらに限定されない、マイクロミキサーチップを使用して、脂質ナノ粒子において製剤化され得る。マイクロミキサーチップは、分割および再混合の機構を用いて、２つまたはそれよりも多い流体ストリームの高速混合に使用することができる。
【０９３３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、例えば、これらに限定されないが、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍおよび／または約９０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。
【０９３４】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍの直径を有し得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍより大きい、１５０ｎｍより大きい、２００ｎｍより大きい、２５０ｎｍより大きい、３００ｎｍより大きい、３５０ｎｍより大きい、４００ｎｍより大きい、４５０ｎｍより大きい、５００ｎｍより大きい、５５０ｎｍより大きい、６００ｎｍより大きい、６５０ｎｍより大きい、７００ｎｍより大きい、７５０ｎｍより大きい、８００ｎｍより大きい、８５０ｎｍより大きい、９００ｎｍより大きい、９５０ｎｍより大きいまたは１０００ｎｍより大きい直径を有し得る。
【０９３５】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、より小さなＬＮＰを使用して送達することができる。そのような粒子は、０．１μｍ未満から最大１００ｎｍ、例えば、これらに限定されないが、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、または９７５ｕｍ未満の直径を含み得る。
【０９３６】
本明細書に記載されるナノ粒子およびマイクロ粒子は、マクロファージおよび／または免疫応答を調節するように、幾何形状を操作することができる。幾何形状を操作した粒子は、肺送達などであるがこれに限定されない、標的化送達のための本明細書に記載されるポリヌクレオチドを組み込むように、様々な形状、サイズ、および／または表面電荷を有し得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０８２１１１号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。幾何形状を操作した粒子の他の物理的特徴としては、穿孔、傾斜アーム、非対称性および表面の粗さ、細胞および組織との相互作用を変化させ得る電荷を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０９３７】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるナノ粒子は、米国公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載されるものなどであるがこれに限定されない、ステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子であり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ステルスまたは標的特異的ステルスナノ粒子は、２つまたはそれよりも多いポリマーを含み得るポリマーマトリックス、例えば、限定されないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、またはこれらの組合せを含み得る。
ｂ．リピドイド
【０９３８】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リピドイドを含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、リピドイドとともに製剤化され得る。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子を、調製することができ、それによって、局所的および／または全身的な投与経路を介したリピドイド製剤の注射後に、コードされるタンパク質の産生によって判断した場合に、ポリヌクレオチドの有効な送達を達成することができる。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含むがこれらに限定されない、様々な手段で投与され得る。
【０９３９】
リピドイドの合成は、文献に記載されている（Ｍａｈｏｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．、２０１０年、２１巻、１４４８〜１４５４頁；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．、２０１０年、２６７巻、９〜２１頁；Ａｋｉｎｃら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００８年、２６巻、５６１〜５６９頁；Ｌｏｖｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２０１０年、１０７巻、１８６４〜１８６９頁；Ｓｉｅｇｗａｒｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２０１１年、１０８巻、１２９９６〜３００１頁を参照されたく、これらのすべては、その全体が本明細書に組み込まれる）。
【０９４０】
ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ；９８Ｎ１２−５としても公知である、Ｍｕｒｕｇａｉａｈら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０１巻、６１頁（２０１０年）を参照されたい）、Ｃ１２−２００（誘導体およびバリアントを含む）、ならびにＭＤ１を含むがこれらに限定されない、異なるリピドイドを用いた製剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性に関して試験することができる。リピドイド「９８Ｎ１２−５」は、Ａｋｉｎｃら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、２００９年、１７巻、８７２〜８７９頁によって開示されている。リピドイド「Ｃ１２−２００」は、Ｌｏｖｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２０１０年、１０７巻、１８６４〜１８６９頁ならびにＬｉｕおよびＨｕａｎｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．、２０１０年、６６９〜６７０頁によって開示されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９４１】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、アミノアルコールリピドイドにおいて製剤化され得る。アミノアルコールリピドイドは、米国特許第８，４５０，２９８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法によって調製することができる。
【０９４２】
リピドイド製剤は、ポリヌクレオチドに加えて、３つもしくは４つ、またはそれよりも多くの成分を含む、粒子を含み得る。リピドイドおよびリピドイドを含むポリヌクレオチド製剤は、国際公開第ＷＯ２０１５０５１２１４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ｃ．ヒアルロニダーゼ
【０９４３】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、ならびに注射（例えば、筋肉内または皮下注射）のためのヒアルロニダーゼ。ヒアルロニダーゼは、間質壁の構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それによって、組織透過性を増大させる（Ｆｒｏｓｔ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．、（２００７年）４巻、４２７〜４４０頁）。あるいは、ヒアルロニダーゼを使用して、筋肉内、腫瘍内、または皮下に投与されるポリヌクレオチドに曝露される細胞の数を増大させることができる。
ｄ．ナノ粒子模倣体
【０９４４】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ナノ粒子模倣体に封入されるおよび／または吸収される。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、および細胞などであるがこれらに限定されない送達機能を有する生物または粒子を模倣し得る。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ウイルスの送達機能を模倣し得る非ビリオン（ｎｏｎ−ｖｉｒｏｎ）粒子に封入され得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２００６３７６号ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１７１２４１号および同第ＵＳ２０１３０１９５９６８号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ｅ．ナノチューブ
【０９４５】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ロゼットナノチューブ、リンカーを伴うツイン塩基を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブ、および／または単層カーボンナノチューブなどであるがこれらに限定されない、少なくとも１つのナノチューブに付着またはそうでなければ結合した（例えば、静電力、イオン、共有結合、および／または他の力を通じて）、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドを含むナノチューブおよびナノチューブ製剤は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１４１５２２１１号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｆ．自己アセンブル型ナノ粒子または自己アセンブル型巨大分子
【０９４６】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達のための自己アセンブル型ナノ粒子または両親媒性巨大分子（ＡＭ）での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ＡＭは、アルキル化糖骨格がポリ（エチレングリコール）に共有結合した、生体適合性の両親媒性ポリマーを含む。水溶液中において、ＡＭは、自己アセンブルしてミセルを形成する。核酸自己アセンブル型ナノ粒子は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７号に記載され、ＡＭおよびＡＭを形成する方法は、米国公開第ＵＳ２０１３０２１７７５３号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｇ．無機ナノ粒子、半導電性ナノ粒子および金属ナノ粒子
【０９４７】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、無機ナノ粒子、または半導電性材料もしくは金属材料を含む水分散性ナノ粒子での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。無機ナノ粒子は、限定されないが、水膨張性であるクレイ物質を含み得る。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子または親水性ナノ粒子であり得る。非限定的な例として、無機、半導電性、および金属ナノ粒子は、例えば、米国特許第５，５８５，１０８号および同第８，２５７，７４５号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１２０２２８５６５号、同第ＵＳ２０１２０２６５００１号、および同第ＵＳ２０１２０２８３５０３号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｈ．外科用シーラント：ゲルおよびヒドロゲル
【０９４８】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、外科用シーラントでの本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ゲルおよびヒドロゲルなどの外科用シーラントは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｉ．懸濁液製剤
【０９４９】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、懸濁液での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、懸濁液は、ポリヌクレオチド、水非混和性油デポー、界面活性剤および／もしくは共界面活性剤、ならびに／または共溶媒を含む。懸濁液は、まず、ポリヌクレオチドの水溶液、および１つまたは複数の界面活性剤を含む油系相を調製し、次いで、２つの相（水相および油系相）を混合することによって、形成することができる。
【０９５０】
懸濁液製剤のための例示的な油としては、ゴマ油およびミグリオール（飽和ココナッツ油およびパーム核油由来のカプリル酸およびカプリン脂肪酸のエステル、ならびにグリセリンまたはプロピレングリコールを含む）、トウモロコシ油、ダイズ油、ピーナツ油、ビーズワックス、ならびに／またはパームシード油が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な界面活性剤としては、クレモホール、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール、ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ、Ｃａｐｍｕｌ（登録商標）、ｌａｂｒａｓｏｌ、ミリスチン酸イソプロピル、および／またはＳｐａｎ  ８０が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、懸濁液は、エタノール、グリセロール、および／またはプロピレングリコールを含むがこれらに限定されない共溶媒を含み得る。
【０９５１】
一部の実施形態では、懸濁液は、水非混和性デポーからの拡散による周囲環境へのポリヌクレオチドの放出を調節し、続いて、周囲環境（例えば、水性環境）への再可溶化をもたらし得る。
【０９５２】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、注射するとエマルジョンが自発的に形成され（例えば、水相に送達されたときに）、それにより、油相から水相へのポリヌクレオチドの放出のための高い表面積対体積の比がもたらされ得るように、製剤化され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ナノエマルジョンにおいて製剤化され、これは、液体疎水性コアが、脂質または界面活性剤の層で包囲またはコーティングされたものを含み得る。例示的なナノエマルジョンおよびそれらの調製は、例えば、米国特許第８，４９６，９４５号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｊ．カチオンおよびアニオン
【０９５３】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、ならびにカチオンまたはアニオン、例えば、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、およびこれらの組合せを含む。例示的な製剤は、例えば、米国特許第６，２６５，３８９号および同第６，５５５，５２５号に記載されているように、金属カチオンと複合体を形成したポリマーおよびポリヌクレオチドを含み得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、カチオン性ナノ粒子は、二価および一価カチオンの組合せを含有し得る。カチオン性ナノ粒子またはカチオン性ナノ粒子を含む１つもしくは複数のデポーにおけるポリヌクレオチドの送達は、長時間作用するデポーとして作用することおよび／またはヌクレアーゼによる分解の速度を低減することによって、ポリヌクレオチドのバイオアベイラビリティを改善することができる。
ｋ．成形ナノ粒子およびマイクロ粒子
【０９５４】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、様々なサイズ、形状、および化学的性質の成形ナノ粒子での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。例えば、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子は、ＬＩＱＵＩＤＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ）によるＰＲＩＮＴ（登録商標）技術を使用して、作製することができる（例えば、国際公開第ＷＯ２００７０２４３２３号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０９５５】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、マイクロ粒子において製剤化される。マイクロ粒子は、ポリヌクレオチドのコア、ならびにポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、およびポリ無水物を含むがこれらに限定されない生体適合性および／または生体分解性ポリマーの外皮を含有し得る。マイクロ粒子は、ポリヌクレオチドを吸着するための吸着表面を有し得る。マイクロ粒子は、少なくとも１ミクロン〜少なくとも１００ミクロン（例えば、少なくとも１ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも５０ミクロン、少なくとも７５ミクロン、少なくとも９５ミクロン、および少なくとも１００ミクロン）の直径を有し得る。一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、マイクロ粒子およびポリヌクレオチドを含むマイクロエマルジョンである。例示的なマイクロ粒子、マイクロエマルジョン、およびそれらの調製物は、例えば、米国特許第８，４６０，７０９号、同第８，３０９，１３９号、および同第８，２０６，７４９号、米国公開第ＵＳ２０１３０１２９８３０号、同第ＵＳ２０１３１９５９２３号、および同第ＵＳ２０１３０１９５８９８号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１３０７５０６８号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｌ．ナノジャケットおよびナノリポソーム
【０９５６】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｎａｎｏ（Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）によるナノジャケットおよびナノリポソームでの本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ナノジャケットは、カルシウム、リン酸を含む体内で天然に見出される材料から作製され、少量のケイ酸もさらに含み得る。ナノジャケットは、５〜５０ｎｍの範囲のサイズを有し得る。
【０９５７】
ナノリポソームは、体内に天然に存在する脂質などであるがこれに限定されない脂質から作製される。ナノリポソームは、６０〜８０ｎｍの範囲のサイズを有し得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、セラミドナノリポソームなどであるがこれに限定されない、ナノリポソームにおいて製剤化される。
ｍ．細胞またはミニ細胞
【０９５８】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞にトランスフェクトされ、続いて対象に移植される、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。本明細書に開示されるポリヌクレオチドの細胞に基づく製剤を使用して、細胞へのトランスフェクション（例えば、細胞担体において）を確実にする、ポリヌクレオチドの生体分布を変化させる（例えば、細胞担体の標的を特定の組織もしくは細胞型に定めることによって）、および／またはコードされるタンパク質の翻訳を増大させることができる。
【０９５９】
例示的な細胞としては、赤血球、ウイロソーム、およびエレクトロポレーション細胞が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｇｏｄｆｒｉｎら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．、２０１２年、１２巻、１２７〜１３３頁；Ｆａｎｇら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．、２０１２年、１２巻、３８５〜３８９頁；Ｈｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２０１１年、１０８巻、１０９８０〜１０９８５頁；Ｌｕｎｄら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．、２０１０年、２７巻、４００〜４２０頁；Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅら、Ｊ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２００７年、１７巻、３９〜４７頁；Ｃｕｓｉ、Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ．、２００６年、２巻、１〜７頁；ｄｅ  Ｊｏｎｇｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２００６年、１３巻、４００〜４１１頁を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０９６０】
ウイルス媒介および非ウイルス媒介技法を含む様々な方法が、当技術分野において公知であり、核酸の細胞への導入に好適である。典型的な非ウイルス媒介技法の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介移入、マイクロインジェクション、マイクロ発射媒介移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介移入（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびその他）、または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【０９６１】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１１０８５２３１号および同第ＷＯ２０１３１１６６５６号、ならびに米国公開第２０１１０１７１２４８号に記載されている方法によって合成される、合成ウイルス様粒子（ＶＬＰ）において送達することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９６２】
ソノポレーション、すなわち細胞超音波処理の技法は、細胞の原形質膜の透過性を修飾するために、音（例えば、超音波周波数）を使用することである。ソノポレーション法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで核酸を送達することが公知である（ＹｏｏｎおよびＰａｒｋ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．、２０１０年、７巻、３２１〜３３０頁；ＰｏｓｔｅｍａおよびＧｉｌｊａ、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７年、８巻、３５５〜３６１頁；ＮｅｗｍａｎおよびＢｅｔｔｉｎｇｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２００７年、１４巻、４６５〜４７５頁；米国公開第ＵＳ２０１００１９６９８３号および同第ＵＳ２０１００００９４２４号、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０９６３】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションによって送達され得る。エレクトロポレーション技法は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび臨床で核酸を送達することが公知である（Ａｎｄｒｅら、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２０１０年、１０巻、２６７〜２８０頁；Ｃｈｉａｒｅｌｌａら、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２０１０年、１０巻、２８１〜２８６頁；Ｈｏｊｍａｎ、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２０１０年、１０巻、１２８〜１３８頁、すべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。エレクトロポレーションデバイスは、これらに限定されないが、ＢＴＸ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）（例えば、ＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｓｙｓｔｅｍ）およびＩｎｏｖｉｏ（Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ、ＰＡ）（例えば、Ｉｎｏｖｉｏ  ＳＰ−５Ｐ筋肉内送達デバイスまたはＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）３０００皮内送達デバイス）を含め、世界中で多くの企業によって販売されている。
【０９６４】
一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞、微生物細胞、藻類細胞、および真菌細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞は、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ハムスター、またはウシの細胞などであるがこれらに限定されない、哺乳動物細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、ＨｅＬａ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＫＥＫ  ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、Ｃａｃｏ、Ｃａｃｏ−２、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＧ４４、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ−Ｓ、Ｈｕｖｅｃ、ＣＶ−１、Ｈｕｈ−７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＩＭＲ−９０、ＭＣＦ−７、Ｕ−２０Ｓ、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＳＦ９、ＳＦ２１、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含むがこれらに限定されない、樹立細胞株に由来し得る。
【０９６５】
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ細胞、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞、Ｃａｎｄｉｄａ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ細胞などであるがこれらに限定されない、真菌細胞である。
【０９６６】
ある特定の実施形態では、細胞は、大腸菌細胞、枯草菌細胞、またはＢＬ２１細胞などであるがこれらに限定されない、細菌細胞である。本開示の方法によってトランスフェクトされる初代細胞および二次細胞は、様々な組織から得ることができ、培養物中に維持することができるすべての細胞型を含むがこれらに限定されない。初代細胞および二次細胞としては、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、乳腺上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、膠細胞、神経細胞、血液の形成要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞、およびこれらの体細胞型の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。初代細胞はまた、同じ種のドナーから、または別の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）から得ることもできる。
【０９６７】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、細菌性ミニ細胞での本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む。非限定的な例として、細菌性ミニ細胞は、国際公開第ＷＯ２０１３０８８２５０号または米国公開第ＵＳ２０１３０１７７４９９号に記載されているものであり得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｎ．半固体組成物
【０９６８】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、半固体またはペースト様組成物を形成するために、疎水性マトリックスでの本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。非限定的な例として、半固体またはペースト様組成物は、国際公開第ＷＯ２０１３０７６０４号に記載されている方法によって作製することができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｏ．エクソソーム
【０９６９】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、少なくとも１つのポリヌクレオチドをロードし、細胞、組織、および／または生物に送達することができる、エクソソームでの本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。非限定的な例として、ポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１３０８４０００号に記載されているように、エクソソームにロードすることができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｐ．絹に基づく送達
【０９７０】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、絹に基づく送達のために製剤化された、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。絹に基づく送達系は、絹フィブロイン溶液を、本明細書に記載されるポリヌクレオチドと接触させることによって、形成することができる。非限定的な例として、持続放出型絹に基づく送達系およびそのような系を作製する方法は、米国公開第ＵＳ２０１３０１７７６１１号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｑ．アミノ酸脂質
【０９７１】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、アミノ酸脂質を用いた製剤である、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基および１つまたは複数の親油性尾部を含む、親油性化合物である。アミノ酸脂質およびアミノ酸脂質を作製する方法の非限定的な例は、米国特許第８，５０１，８２４号に記載されている。アミノ酸脂質製剤は、ポリヌクレオチドに結合しそれを放出する、アミノ酸脂質を含む放出可能な形態で、ポリヌクレオチドを送達することができる。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの放出は、例えば、米国特許第７，０９８，０３２号、同第６，８９７，１９６号、同第６，４２６，０８６号、同第７，１３８，３８２号、同第５，５６３，２５０号、および同第５，５０５，９３１号に記載されるように、酸不安定性リンカーによってもたらされ得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｒ．微細小胞
【０９７２】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、微細小胞製剤での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。例示的な微細小胞としては、米国公開第ＵＳ２０１３０２０９５４４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。一部の実施形態では、微細小胞は、国際公開第ＷＯ２０１３１１９６０２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているＡＲＲＤＣ１媒介型微細小胞（ＡＲＭＭ）である。
ｓ．多価電解質間複合体
【０９７３】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、多価電解質間複合体での、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。多価電解質間複合体は、電荷動的ポリマーが、１つまたは複数のアニオン性分子と複合体を形成すると、形成される。電荷動的ポリマーおよび多価電解質間複合体の非限定的な例、ならびに多価電解質間複合体を作製する方法は、米国特許第８，５２４，３６８号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｔ．結晶質ポリマー系
【０９７４】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、結晶質ポリマー系での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。結晶質ポリマー系は、結晶質部分および／または結晶質部分を含む末端単位を有するポリマーである。例示的なポリマーは、米国特許第８，５２４，２５９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ｕ．ポリマー、生体分解性ナノ粒子、およびコア−シェルナノ粒子
【０９７５】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、ならびに天然および／または合成のポリマーを含む。ポリマーとしては、ポリエチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ−リシン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトされたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生体分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分岐鎖ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾されたポロキサマー、弾性生体分解性ポリマー、生体分解性コポリマー、生体分解性ポリエステルコポリマー、生体分解性ポリエステルコポリマー、多重ブロックコポリマー、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生体分解性架橋型カチオン性多重ブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０９７６】
例示的なポリマーとしては、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＲｏｃｈｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＤＹＮＡＭＩＣ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）製剤、ＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、例えば、限定されないが、ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）からのシクロデキストリン、デンドリマー、ならびにポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）、およびｐＨ応答性コ−ブロックポリマー、例えば、ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）が挙げられる。
【０９７７】
ポリマー製剤により、ポリヌクレオチドの持続または遅延放出（例えば、筋肉内または皮下注射後の）が可能となる。ポリヌクレオチドの放出プロファイルの変化により、例えば、長期間にわたって、コードされるタンパク質の翻訳をもたらすことができる。また、ポリマー製剤を使用して、ポリヌクレオチドの安定性を増大させることもできる。持続放出製剤としては、ＰＬＧＡマイクロスフェア、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、外科用シーラント、例えば、フィブリノーゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｅｌｉａ、ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）、ＰＥＧ系シーラント、ならびにＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０９７８】
非限定的な例として、修飾されたｍＲＮＡは、調整可能な放出速度（例えば、数日間および数週間）を有するＰＬＧＡマイクロスフェアを調製し、封入プロセスの間、修飾されたｍＲＮＡの完全性を維持しながら、修飾されたｍＲＮＡをＰＬＧＡマイクロスフェアに封入することによって、ＰＬＧＡマイクロスフェアにおいて製剤化することができる。ＥＶＡｃは、前臨床の持続放出型インプラント適用において広く使用されている非生体分解性の生体適合性ポリマーである（例えば、延長放出製品、緑内障のためのピロカルピン眼内インサートであるＯｃｕｓｅｒｔまたは持続放出プロゲステロン子宮内避妊器具であるｐｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ；経皮送達系、Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ、およびＳｅｌｅｇｉｌｉｎｅ；カテーテル）。ポロキサマーＦ−４０７  ＮＦは、５℃よりも低い温度では低粘度であり、１５℃よりも高い温度では固形ゲルを形成する、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの親水性の非イオン性界面活性剤トリブロックコポリマーである。
【０９７９】
非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、米国特許第６，１７７，２７４号に記載されているように、ＰＬＬがグラフトされたＰＥＧのポリマー化合物とともに、製剤化されてもよい。別の非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（例えば、米国公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号、ならびに米国特許第８，２３６，３３０号および同第８，２４６，９６８号を参照されたい）、またはＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡブロックコポリマー（例えば、米国特許第６，００４，５７３号を参照されたい）などのブロックコポリマーとともに製剤化されてもよい。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９８０】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（アミン−ｃｏ−エステル）、またはこれらの組合せなどであるがこれらに限定されない、少なくとも１つのアミン含有ポリマーとともに製剤化されてもよい。例示的なポリアミンポリマーおよび送達剤としてのそれらの使用は、例えば、米国特許第８，４６０，６９６号、同第８，２３６，２８０号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９８１】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第６，６９６，０３８号、同第６，５１７，８６９号、同第６，２６７，９８７号、同第６，２１７，９１２号、同第６，６５２，８８６号、同第８，０５７，８２１号、および同第８，４４４，９９２号、米国公開第ＵＳ２００３００７３６１９号、同第ＵＳ２００４０１４２４７４号、同第ＵＳ２０１００００４３１５号、同第ＵＳ２０１２００９１４５号、および同第ＵＳ２０１３０１９５９２０号、ならびに国際公開第ＷＯ２００６０６３２４９号および同第ＷＯ２０１３０８６３２２号に記載されているように、生体分解性カチオン性リポポリマー、生体分解性ポリマー、または生体分解性コポリマー、生体分解性ポリエステルコポリマー、生体分解性ポリエステルポリマー、線形生体分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生体分解性架橋型カチオン性多重ブロックコポリマー、またはこれらの組合せにおいて、製剤化されてもよく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９８２】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０１８４４５３号に記載されているように、少なくとも１つのシクロデキストリンポリマーにおいて、またはそれとともに、製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１３１０６０７２号、同第ＷＯ２０１３１０６０７３号、および同第ＷＯ２０１３１０６０８６号に記載されているように、少なくとも１つの架橋型カチオン結合ポリマーにおいて、またはそれとともに、製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０２３１２８７号に記載されているように、少なくともＰＥＧ化アルブミンポリマーにおいて、またはそれとともに、製剤化され得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９８３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ポリマー、脂質、および／または他の生体分解性薬剤、例えば、限定されないが、リン酸カルシウムの組合せを使用して、ナノ粒子として製剤化され得る。成分は、送達用のナノ粒子の微調整を可能にするために、コア−シェル、ハイブリッド、および／または積層（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ）構造で、組み合わせてもよい（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．、２００６年、５巻、７９１〜７９６頁；Ｆｕｌｌｅｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．、２００８年、２９巻、１５２６〜１５３２頁；ＤｅＫｏｋｅｒら、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．、２０１１年、６３巻、７４８〜７６１頁；Ｅｎｄｒｅｓら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．、２０１１年、３２巻、７７２１〜７７３１頁；Ｓｕら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．、２０１１年６月６日、８巻（３号）、７７４〜８７頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、ナノ粒子は、複数のポリマー、例えば、限定されないが、親水性−疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、および／または親水性ポリマー（国際公開第ＷＯ２０１２０２２５１２９号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含み得る。
【０９８４】
コア−シェルナノ粒子の使用は、さらに、カチオン性架橋型ナノゲルコアおよび様々なシェルを合成するための高スループットのアプローチに焦点を当てている（Ｓｉｅｇｗａｒｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２０１１年、１０８巻、１２９９６〜１３００１頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達、および内部移行は、ナノ粒子のコア成分およびシェル成分の両方における化学組成を変化させることによって、正確に調節することができる。例えば、コア−シェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合した後、ｓｉＲＮＡをマウスの肝細胞に効率的に送達することができる。
【０９８５】
一部の実施形態では、中間のＰＬＧＡ層および外側のＰＥＧを含有する中性脂質層を含む、中空脂質コアを、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの送達に使用することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのコア、およびコアにあるポリヌクレオチドを保護するために使用されるポリマーシェルを含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載されるポリマーのいずれかであってよく、当技術分野において公知であり、ポリマーシェアルを使用して、コアにあるポリヌクレオチドを保護することができる。
【０９８６】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドとともに使用するためのコア−シェルナノ粒子は、米国特許第８，３１３，７７７号または国際公開第ＷＯ２０１３１２４８６７号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｖ．ペプチドおよびタンパク質
【０９８７】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増大させるため、および／またはポリヌクレオチドの生体分布を変化させるため（例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とすることによって）、および／またはコードされるタンパク質の翻訳を増大させるために、ペプチドおよび／またはタンパク質を用いて製剤化された、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１１０６３６号および同第ＷＯ２０１３１２３２９８号）。一部の実施形態では、ペプチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０１２９７２６号、同第ＵＳ２０１３０１３７６４４号、および同第ＵＳ２０１３０１６４２１９号に記載されているものであり得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｗ．コンジュゲート
【０９８８】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、担体もしくは標的化基に共有結合しているか、または一緒になって融合タンパク質を産生する２つのコード領域（例えば、標的化基および治療用タンパク質もしくはペプチドを有する）をコンジュゲートとして含む、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。コンジュゲートは、ナノ粒子を、組織もしくは生物におけるニューロンに選択的に指向させるか、または血液脳関門を越えるのを補助する、ペプチドであり得る。
【０９８９】
コンジュゲートは、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）；または脂質を含む。リガンドはまた、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸（ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌｌｉｃ  ａｃｉｄ））、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣体ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
【０９９０】
一部の実施形態では、コンジュゲートは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの担体としての機能を果たし得る。コンジュゲートは、カチオン性ポリマー、例えば、限定されないが、ポリ（エチレングリコール）にグラフトされ得るポリアミン、ポリリシン、ポリアルキレンイミン、およびポリエチレンイミンを含み得る。例示的なコンジュゲートおよびそれらの調製物は、米国特許第６，５８６，５２４号および米国公開第ＵＳ２０１３０２１１２４９号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９９１】
コンジュゲートはまた、標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、指定された細胞型、例えば、腎臓細胞に結合する抗体を含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであり得る。
【０９９２】
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに対して特定の親和性を有する分子、または抗体、例えば、がん細胞、内皮細胞、または骨細胞などの指定された細胞型に結合する抗体であり得る。標的化基はまた、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。これらはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フルクトース、またはアプタマーを含み得る。リガンドは、例えば、リポポリ多糖、またはｐ３８  ＭＡＰキナーゼの活性化因子であり得る。
【０９９３】
標的化基は、特定の受容体を標的とすることができる任意のリガンドであり得る。例としては、限定することなく、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アパタマー（ａｐａｔａｍｅｒ）、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、およびＨＤＬリガンドが挙げられる。特定の実施形態では、標的化基は、アプタマーである。アプタマーは、未修飾であってもよく、または本明細書に開示される修飾のうちの任意の組合せを有してもよい。非限定的な例として、標的化基は、例えば、米国公開第ＵＳ２０１３０２１６６１０１２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、血液−中枢神経系関門を越えた標的化送達のための、グルタチオン受容体（ＧＲ）結合性コンジュゲートであり得る。
【０９９４】
一部の実施形態では、コンジュゲートは、相乗的生体分子−ポリマーコンジュゲートであってもよく、これは、より優れた治療的有効性を提供するための長時間作用型連続放出系を含む。相乗的生体分子−ポリマーコンジュゲートは、米国公開第ＵＳ２０１３０１９５７９９号に記載されているものであり得る。一部の実施形態では、コンジュゲートは、国際特許公開第ＷＯ２０１２０４０５２４号に記載されているアプタマーコンジュゲートであってもよい。一部の実施形態では、コンジュゲートは、米国特許第８，５０７，６５３号に記載されているアミン含有ポリマーコンジュゲートであってもよい。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）にコンジュゲートされ得る。
【０９９５】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、シグナル配列または標的化配列も含み得る、細胞貫入性ポリペプチドに共有結合でコンジュゲートされる。コンジュゲートは、増大した安定性および／または増大した細胞トランスフェクション、および／または変化した生体分布（例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とする）を有するように、設計され得る。
【０９９６】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、送達を増強する薬剤にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、薬剤は、モノマーまたはポリマー、例えば、国際公開第ＷＯ２０１１０６２９６５号に記載されている、標的化モノマーまたは標的化ブロックを有するポリマーであり得る。一部の実施形態では、薬剤は、例えば、米国特許第６，８３５，３９３号および同第７，３７４，７７８号に記載されているように、ポリヌクレオチドに共有結合された輸送剤であってもよい。一部の実施形態では、薬剤は、米国特許第７，７３７，１０８号および同第８，００３，１２９号に記載されているものなど、膜壁輸送増強剤であってもよい。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｘ．小器官
【０９９７】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、長期間持続する治療製剤において目的のコードされるポリペプチドを発現することができる小器官での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。例示的な小器官および製剤は、国際公開第ＷＯ２０１４１５２２１１号に記載されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ｙ．シュードビリオン
【０９９８】
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、シュードビリオン（例えば、Ａｕｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡによって開発されたシュードビリオン）において本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。
【０９９９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを送達するために使用されるシュードビリオンは、ウイルス、例えば、限定されないが、例として、米国公開第ＵＳ２０１３００１２４５０号、同第ＵＳ２０１３００１２５６６号、同第ＵＳ２１０３００１２４２６号、および同第ＵＳ２０１２０２０７８４０号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１３００９７１７号に記載されているヘルペスおよびパピローマウイルスに由来し得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【１０００】
シュードビリオンは、米国公開第ＵＳ２０１２００１５８９９号および同第ＵＳ２０１３０１７７５８７号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１００４７８３９号、同第ＷＯ２０１３１１６６５６号、同第ＷＯ２０１３１０６５２５号、および同第ＷＯ２０１３１２２２６２号に記載されている方法によって調製される、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり得る。一態様では、ＶＬＰは、バクテリオファージＭＳ、Ｑβ、Ｒ１７、ｆｒ、ＧＡ、Ｓｐ、ＭＩ、Ｉ、ＭＸＩ、ＮＬ９５、ＡＰ２０５、ｆ２、ＰＰ７、ならびに植物ウイルスであるカブクリンクルウイルス（ＴＣＶ）、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）、インゲンマメ南部モザイクウイルス（ＳＢＭＶ）、ならびにソラマメモットルウイルス、ブロムモザイクウイルス、カシア黄輪点ウイルス（Ｃａｓｓｉａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｂｌｏｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）、ササゲクロロティックモットルウイルス（ＣＣＭＶ）、メランドリウム黄斑点ウイルス（Ｍｅｌａｎｄｒｉｕｍ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｅｃｋ  ｖｉｒｕｓ）、およびスプリングビューティ潜在ウイルス（ｓｐｒｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ  ｌａｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ）を含むｇｅｎｕｓ  Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓのメンバーであり得る。別の態様では、ＶＬＰは、米国公開第ＵＳ２０１３０１７７５８７号および米国特許第８，５０６，９６７号に記載されているように、インフルエンザウイルスに由来し得る。一態様では、ＶＬＰは、国際公開第ＷＯ２０１３１１６６５６号に記載されているものなど、粒子の脂質膜または外側に係留した、Ｂ７−１および／またはＢ７−２分子を含み得る。一態様では、ＶＬＰは、国際公開第ＷＯ２０１２０４９３６６号に記載されているＶＬＰなど、ノロウイルス、ロタウイルス、組換えＶＰ６タンパク質、または二重層ＶＰ２／ＶＰ６に由来し得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【１００１】
一部の実施形態では、シュードビリオンは、国際公開第ＷＯ２０１０１２０２６６号および米国公開第ＵＳ２０１２０１７１２９０号に記載されているヒトパピローマウイルス様粒子であり得る。一部の実施形態では、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、自己アセンブル型粒子であってもよい。一態様では、シュードビリオンは、米国公開第ＵＳ２０１３０１１６４０８号および同第ＵＳ２０１３０１１５２４７号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１３１１９８７７号に記載されている、ビリオン由来のナノ粒子であり得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【１００２】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドの製剤およびそれを製剤化するための方法の非限定的な例はまた、国際公開第ＷＯ２０１３０９０６４８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に提供されている。
２６．使用のための組成物および製剤
【１００３】
本開示のある特定の態様は、上記に開示されているポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む、組成物または製剤を対象とする。
【１００４】
一部の実施形態では、組成物または製剤は、
（ｉ）ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）であって、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含み（例えば、ウラシルのうちの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、５−メトキシウラシルである）、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２−３ｐまたはｍｉＲ−１２２−５ｐ結合部位）をさらに含む、ポリヌクレオチド、ならびに
（ｉｉ）式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜１４７のうちのいずれか（例えば、化合物１８、２５、２６、もしくは４８）、または化合物１〜２３２のうちのいずれかを含む、送達剤
を含む。
【１００５】
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上の最小ウラシルまたはチミン含量に対する、ＯＲＦのウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）は、約１００％〜約１５０％である。
【１００６】
一部の実施形態では、上述のポリヌクレオチド、組成物、または製剤は、ＩＬ１２関連疾患、障害、または状態、例えば、がんを処置および／または予防するために使用される。
２７．投与の形態
【１００７】
上述の本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物、および製剤は、治療的に有効な転帰をもたらす任意の経路によって投与され得る。これらとしては、腸内（腸に）、胃腸内、硬膜外（硬膜に）、経口（口から）、経皮、硬膜上、脳内（大脳に）、側脳室内（脳室内に）、皮膚上（皮膚の上への適用）、皮内（皮膚そのものに）、皮下（皮膚の下に）、鼻内投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈の中に）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈の中に）、筋肉内（筋肉の中に）、心臓内（心臓の中に）、骨内注入（骨髄の中に）、髄腔内（脊柱管に）、腹腔内（腹膜への注入もしくは注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通じて）、空洞内注射（病理学的腔に）、腔内（陰茎の基底部に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分配のための無傷な皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、経膣、吹送（吸飲）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上）、点耳、耳介（耳にもしくは耳への）、頬内（頬への）、結膜、皮膚、歯科的（１つまたは複数の歯に）、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨内部）、尾内（馬尾内部）、脳槽内（小脳延髄槽大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ  ｍａｇｎａ  ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｍｅｄｕｌａｒｉｓ）内部）、角膜内（角膜内部）、歯冠内、冠内（冠動脈内）、陰茎海綿体内（陰茎の陰核海綿体の膨張性空隙内）、椎間板内（椎間板内部）、導管内（腺導管内部）、十二指腸内（十二指腸内部）、硬膜内（硬膜内部もしくはその下に）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内部）、歯肉内（歯肉内部）、回腸内（小腸遠位部分内部）、病巣内（局在化した病変部の内部もしくはそこへの直接的な導入）、管腔内（管腔内部）、リンパ管内（リンパ内部）、髄内（骨髄腔内部）、髄膜内（髄膜内部）、眼内（眼内部）、卵巣内（卵巣内部）、心膜内（心膜内部）、胸膜内（胸膜内部）、前立腺内（前立腺腺内部）、肺内（肺もしくはその気管支内部）、副鼻腔内（鼻洞または眼窩周囲洞内部）、脊髄内（脊柱内部）、滑液嚢内（関節の滑液腔内部）、腱内（腱内部）、精巣内（精巣内部）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルにおける脳脊髄液内部）、胸郭内（胸郭内部）、小管内（器官の細管内部）、腫瘍内（腫瘍内部）、鼓室内（中耳内部）、血管内（１つまたは複数の血管内部）、脳室内（脳室内部）、イオン注入（可溶性塩イオンが身体の組織に移動する電流を用いて）、灌注（開放創傷部もしくは体腔を浸漬するかもしくは洗い流すため）、喉頭（喉頭に直接的に）、鼻腔胃（鼻を通じて胃内に）、閉塞的包帯技法（後で領域を閉鎖する包帯剤によって被覆する局所投与経路）、眼部（外眼部に）、中咽頭（口および咽頭に直接的に）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所的もしくは全身的な効果のための経口もしくは経鼻吸入により気道内部へ）、眼球後（脳橋背後もしくは眼球背後）、心筋内（心筋に入る）、軟部組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤性（胎盤を通じてもしくはそれを越えて）、経気管（気管壁を通じて）、経鼓膜（鼓室を越えてまたはそれを通じて）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、��骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシス、または脊髄が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、組成物は、血液脳関門、血管関門、または他の上皮関門を越えることを可能にする様式で、投与され得る。特定の実施形態では、ある投与経路のための製剤は、少なくとも１つの不活性成分を含み得る。
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本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチド、またはその機能的断片、もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）臣膀ꏨꞁ듧麃臣膀臩閁苣鞾苣芀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣ꢁ臣膀胣뢣臣趀臣꾁胣袃菣뎃苣閃苣꾂苣ꞃ菣銂뿤늀臣讂雨ꒉ臣鞁臣膀菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣膀臩馁苣鎁臣銂賦馁胣设臣낁胣내菨ꮁ胩钁臣貂苣鶃菣貃苣것苣膃菣꾁胣꺿ꏩ銂郥覜臣ꪁ臣뒠郥貁臣讂胣뢣臣鶃菣貃苣것苣膃菣꾁胣鎽諦鎡裥躇臣誁臣ꚁ藥ꖟ臣芁苣膀鳦躘듧뢛臣風볨閁苣ꚁ臣讂諦躸뗧꾷苣뾽铧鞁臣膀듧麃臣膀臩馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 겜雩몤臣鶃菣貃苣것苣膃菣袼뻤袁臣膀볯겼볯銼볯鶃菣骃菣膃菣膀볯겼볯銼볯鶃菣骃菣膃菣膀臣覂臣ꮁ볯뺁臣꾁볯겼볯銼볯誁苣뎁볯겼볯銼볯꺁黨袐菣ꪃ菣鞃菣覃胣뺁臣꾁臣꺁ꧦ붃髧궖觧膀苣鞁臣꾁菣ꪃ苣뎃菣銂苣벃菣馁苣貃苣것苣膃菣超裥銂郥肂胣鶃菣貃苣것苣膃菣覼臣膀鳦躘듧뢛臣風볨閁苣讂雦閳苣뾽铧鞁臣膀ꏨꒉ賥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀ꏨꒉ臣膀뿤뺣臣貂臣蒁臣节苣辁胣誁苣뎁볯뺁臣꾁鳦꺿ꏩꞁ臣ꎁ臣节苣蒁胣鶃菣貃苣것苣膃菣銂郥覜臣鞾苣芀ꏨꒉ臣膀駩骮臣貂臣蒁臣膀듧麃단ꖅ觥膀雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣薋뷤膀胩钁觥膀铧鎽뗦龣胦뺁臣꾁铧鎽臩袐胦鶃菣麃菣膀뫦銪胣誁苣뎁賦骶铦몇胩钁菣鶃菣銂臣覂臣ꮐ臣鞾苣芀ꏨꒉ賥閁苣龁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀뷥肊ꇨ蚈蟩ꮁ臣蒁臣겅鿧ꞁ臣誂胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣閊룤貵럨銂뷤ꢔ臣ꚁ胣내菨ꮁ胩钁臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†뗧邈觧꾁臣龁胣뒛軦蒚郥뢵苣鞁臣꾁뗦겼胣ꮂ菣벃菣ꮃ苣讻臣ꚁ胣늂菣膀닧ꮜ胣龻蛨膀苣ꪃ菣ꂃ胣늂菣膀菣벃苣ꞃ菣膀臣袂臣込臣龁臣뒻룤겖臣袂臣ꚁ胣蒵裦ꦉ苣뎂菣蚃苣뎃苣뺁臣꾁郥뢵臣鮁臣誹뛧邝雦节臣辁臣龔뷤蚈꟨Ꞁ鷦首臣ꦁ臣ꦉ돨銂뷤ꢔ臣ꚁ胣誁苣뎁臣꺁믤銂郥肂臣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣膀臣辁臣讁臣讉껦꺁臣ꆁ臣蒁臣貂臣ꞁ胣ꢙ껥뺁臣꾁뗧钹臣뒛軦蒚臣膀臩馁苣龁苣ꮁ胣붣觥隌臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†鳦讖ꓧ꾁胣麝뗧ꎏ臣袂臣ꢳ냥ꮁ苣讂諦躸臣붥臩ꪁ뷥讅臣꺁胣겜雩몤臣鶃菣貃苣것苣膃菣袼뻤袁臣膀볯겼볯銼볯鶃菣骃菣膃菣膀볯겼볯銼볯鶃菣骃菣膃菣膀臣覂臣ꮁ볯뺁臣꾁볯겼볯銼볯誁苣뎁볯겼볯銼볯꺁黨袐菣ꪃ菣鞃菣覃胣뺁臣꾁臣꺁ꧦ붃髧궖觧节臣辁臣邃菣ꊂ菣袃苣뎂菣覃臣讂菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣ꮐ苣鶃菣貃苣것苣膃菣覼臣膀臩銂賥ꮐ臣讂胣麝뗧ꎏ諦躸臣龁苣꺁뛦鎽觥ꊽ臣鞁臣꾁胣겖귥蒚臣놨껥閁苣讂苣麃菣뢂菣뎃胣麃苣꾂菣ꢂ菣ꮃ苣ꞃ菣膀뫦늶胣뢇뿦늶胣랂菣莃菣膀臣袂臣込臣龁臣ꢂ菣궂苣ꮃ臣馌臣覂苣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁胣뮴胦邈裥ꮁ諥袁臣膀뛦鎽觥ꊽ臣膀뷥肊ꇨ蚈蟩ꮁ臣蒁臣莺臣뾽铧閁苣ꚁ臣讂룤뮴胦貸蟩ꒉ胣设臣낁胣设臣鞁臣膀냦뺁臣꾁믤꺁뫦銪胣꾏뫦隌觥誁苣뎁매隌觥膀뻤袁臣膀苣膃菣ꊂ菣뎂菣ꮃ胣ꒂ苣鞃菣钃菣ꊂ菣뎂菣ꮃ胣궂藩ꢂ菣ꮃ胣ꊅ藩ꢂ菣ꮃ胣馃菣뢂菣ꊂ菣뎂菣ꮃ胣覮臦馦藩馃菣뢂菣膀菣궃菣것菣낂菣뎂菣ꮃ胣醼볯鎼裢隃菣것菣낂菣뎂菣ꮃ胣뢂菣膃菣鮃菣ꂃ苣龃菣膀닦袼뻥ꮁ胣뾶껥릲胣붐諨龔닦膀菣Ꚃ菣궃苣랂铧膀菨붊닦膀苣ꪃ菣隃닦膀臣뺁臣릲胣誁苣뎁苣麃닦覼胣낂菣뮂菣벃菣膀菣袃菣銃菣궃菣ꮃ菣ꪃ菣ꊂ菣뎂菣ꮃ胣鶃菣ꢂ菣것菣낂菣뎂菣ꮃ胣誁苣뎁苣ꮃ菣뾂菣꺁蓨ꪂ藩ꢂ苣蚃菣膀臣覂臣ꮁ臣貂苣꺁럦袐觧銂郥뾁뻥讂胣趸듦Ꞁ룥袇觥꺁믤ꮁ胣貵迥蒵裦ꦉ臣膀맦꒽觥膀매隌觥誁苣뎁蟦膿賥ꒉ胣颔釥ꒉ胣馦釥ꒉ胣ꪁ苣뎁臣込臣龁臣뎊ꛩꒉ臣ꦁ臣ꊂ苣ꖃ菣뎃菣銂郥뾁뻥讂胣芁苣릉껥꺁껥붖뷥讅臣꾁胣麝뗧ꎏ諦躸臣龁苣ꮁ胣蒵裦ꦉ臣膀迥뚺賥ꒉ胣设臣낁胣ꎼ볯ꖼ볯꾼볯ꢼ볯늼볯뮙賩蚕꣦覼胣ꊂ菣뎂菣ꮃ胣릲胣覤胦릲胣낂菣뎂菣ꮃ胣鶃菣붂菣馃菣袃胣랂苣궃菣궂苣袃菣뎃胣鶃菣麃菣膀臣袂臣込臣龁臣鎁苣覂臣蒵郥鮁臣랷郥閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†鷩貵迥閊룤꺁臣膂臣뮌雨蒵裦ꦉ臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣꺁룤뮴胦邈裥銂郥뾁뻥讂胣뾽铧閁苣讂룤뮴胦邈裥꺁臣骁苣讁臣膀볯뎼†볯辽뷯蒽†뷯躽뷯₄꒼뷯閽뷯₇ꆼ뷯趽뷯躽뷯鎽뷯銽뷯钽뷯辽뷯袼볯꒼볯覼臣趪迥閁苣ꚁ臣ꚁ苣袂臣膀臣貂苣趪迥閁苣ꚁ臣ꪁ臣ꚁ苣袂臣芀鷩貵迥閊룤꺁臣膂臣뮌雨蒵裦ꦉ臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣趸듦Ꞁ裦蚈臣릾뫥蒚臣꾁臣蒁룤Ꞧ臣꾁胣ꦡ藩膀菣뎃菣袃菣ꮃ胣銪듧膀藩뢅菣袃菣Ꚃ菣膀ꇥ隌菣袃菣Ꚃ菣膀臣袂臣뒰藩隌菣袃菣Ꚃ菣貁郥뺁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†돦蒰铧뾪ꏨꦉ胣设臣낁胣薻迨ꢳ냥ꢔ냦Ꞁ蟦膿뛦뺁臣꾁닦ꪳ蟦膿뛦꾁胣붥臩ꪁ裥ꎕ觥膀맦꒽觥膀臣袂臣込臣龁臣뢇뿦隌觥銂뷤ꢔ臣ꚁ胣겅鿧꺁諦鎡臣袂臣ꚁꏨꒉ賥閁苣鞾苣芀믦貏돦蒰铧뾪ꏨꦉ臣膀鷩銯胦꺁鷩貵迥ꞁ꣨릮臣貂苣貸蟩ꒉ臣袂臣込臣龁臣뚺ꫥ궸臣薻迨ꢳ냥ꢔ뫦늶胣뢇뿦늶胣誁苣뎁볯뺁臣꾁苣麃菣뢂菣뎃胣设臣낁胣醼볯鎼裢隃苣뎃苣ꪂ菣ꮃ룤꺁뫦늶臣芁苣鞾苣芀꣨릮臣貂苣鎃菣꾂菣誁苣뎁뫦銪臣궸臣节胣뒰胣ꪃ菣겂菣뚺뛦膀볯躼볯躼볯躼胣誁苣뎁귧떼ꇥ隌菣袃菣Ꚃ菣뚺뛦銂铧蒁苣鎁臣貁臣趁苣芀믦貏臣몛껥릲臣膀뻥ꖝ髧ꮁ胣뚺ꫥ뺁臣꾁蟦膿ꫥ鎽臣鞁臣ꢔ臣覂苣讂胣鎁臣꺛髧ꞁ胣袐裦꺁菣躃苣ꪃ苣ꪃ菣뺁臣꾁苣낂菣뮂菣覃苣ꮐ苣膀믤辄臣ꆄ裥肿臣몛껥릲臣ꢔ臣覂苣鞾苣芀蓨ꪂ藩膀뻤袁臣膀苣것苣뎃藩꾁胣ꢳ냥ꢔ臣뾪ꏨꦉ臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣薻迨붣觥꾁臣龁胣肱触蒚뫩钅觥膀뿤颭觥膀臣袂臣ꦷꇨꒉ臣ꦁ臣ꊂ苣ꖃ菣뎃菣节郥뾁뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†돦蒰铧붣觥꾁胣设臣낁胣내迨鶿賦閃苣ꮃ苣벃苣骀臣龁뿦躁臣袂臣ꚁ믦貏臣ꚁ苣袂臣膀臣袂臣込臣龁臣뾽铧趉臣薻迨뒰苣鞁臣꾁믤꺁믦貏돦蒰铧銪뷤궸臣뚺꟨节臣辁臣蚈闦閁臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂믦貏鯥鎽뗧邈觧꺁뷥讅臣薻迨ꒉ苣蒵臣벾苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀믦貏臣ꚁ苣袂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꢳ냥ꢔꏨꒉ臣膀뗧钹胣ꢙ껥膀臣袂臣込臣龁臣뺯뇨꺁ꃩ龟臣꺁鯧ꖎ髧ꪁ돦蒰臣龁苣꺁苣꺁臣芁苣鞾苣芀鷩邙껥蒚臣设臣鞁臣膀뗧钹胣ꢙ껥膀臣袂臣込臣龁臣뺯뇨ꮁ胣骙ꇨꞀꃩ龟臣꺁뿥训蛥ꢳ냥ꮁ苣ꎁ臣붣觥銂鯧ꖎ髧ꮁ돦蒰臣ꚁ苣袂臣芀볯设臣낁胣몼뷯躽뷯覽苣膀볯膽뷯閽뷯薽†볯覽뷯钽뷯莽뷯躽뷯貽뷯螽뷯膀볯邼볯鎼맥銂迥ꞅ臣貂臣辁胣鎁臣薆껥꾁胣芏藧ꮁ苣誂臣꺁藥鎽臣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂볯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 뮴胦邈裥꺁諥鲞苣뚻闩閁臣讂臣膂臣膀髧许臣龁臣训苨薆돦蒰臣覂臣뮴胦邈裥꺁郥躏苣薁믥閁臣讂臣ꢁ臣鮜臣鞁臣뒠郥貁ꓥ蒁胣鎁苣꾁胣뒰뫦Ꞁ臣躽臣邵駦ꪳ臣龁臣麝駦ꪳ鷦首臣늶뷤뢇뿦늶臣뾽铧ꮁ苣ꎁ臣钁裦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀臣꺁臣膂胣겖觧꺁郥躏臣龀뫥꾁胣鶁臣뚺꟨龀뫥ꮁ뻤颭臣膀뫦ꎧ胩ꚺ臣膀뗧뚙臣떂苣몂臣袂臣邵駦ꪳ臣ꊽ藦ꮁ뻤颭臣鞾苣芀臣讂臣꾁胣麝뗧ꎏ臣閊룤閁苣讂雨ꦉ뷥讅臣뢐迥꺁臩뚻臣膀雨ꦉ苣膀닦Ꞁ菣銃苣ꮃ臣뚺꟨뺁臣꾁蟦膿臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ臩邈臣貂苣芀돦蒰铧螃菣벃뷥讅臣膀菣ꪃ菣꾂菣覃裢鶃菣낂菣뎂菣覃臣ꦁ臣龔뷤蚈꟨Ꞁ菣ꪃ菣벃臣膀雨ꦉ臣麃苣꾂菣ꮂ菣뮂菣麃菣ꪃ苣릂苣ꊽ裦馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀뷤붣臣貂苣芀雨ꦉ꿥鶃菣麃菣꺁꿦膀臣袂臣ꢔ臣覂苣讂藥鎽髧ꪁ菣ꪃ菣벃臣Ꞁ돨ꮁ뿥颁臣膀雨ꦉ铦몇臣龀뫥銂ꫨ肯臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣隻臣龔뷤蚈꟨Ꞁ菣ꪃ菣벃臣设臣鞁臣꾁胣鶃菣袼苣ꮃ菣ꢂ苣蚃菣覼臣袂臣鶃菣袼蓧뒰觧覼臣馌臣覂苣讂胣螃菣벃돦蒰ꏨꒉ臣膀雨ꦉ苣膀뫨鎽뗧钹臣ꦁ郥Ꞁ臣芁苣ꪃ菣붂菣ꂃ臣龁臣麃苣꾂菣ꢂ菣ꮃ苣ꞃ菣ꮁ냥ꊭ臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁꫨ붣臣貂苣芀戼㹲 銼볯躼苣莃菣誁苣뎁菣邃苣릂戼㹲 膽볯궂菣袃㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 겜雩몤臣膀鳦讖ꓧ꺁觧놨ꯨ花臣貂苣貃苣것苣膃菣銂菩袐觨辁胣誁苣뎁볯뺁臣꾁諥螎髧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣颧胣ꪁ苣莃菣銂迦鮾臣讂胣뢅黥蒚臣꾁胣궂菣袃臣膀뷤ꢔ胨貁꿥ꆱ臣螤闦꺁蟥꺽苣龮雦馁苣膀臣袂臣込臣龁臣螤闦꺁껥鎨苣龮雦馁苣꺁苣꾏菨ꮁ臣讂臣膂臣膍裥ꪁ蟩誁苣뎁볯뺁臣꾁闦꺁裦蚈苣ꮐ苣ꞁ臣趂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 肸藦颧臣꾁胣겜雩몤臣膀鳦讖ꓧ꺁裥邭볯鶃菣貃苣것苣膃菣覼苣ꮐ苣궂菣袃苣邏뻤馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 趉꣨궂菣袃臣膀뿧뎨迥붃ꃩ龟苣ꮐ苣견볯꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃苣ꮐ苣뾂菣醃苣ꪳ铧龔臣龁苣꺁苣꺁臣芁臣ꚁ苣袂臣芀苣莃菣꾁胣붣觥蒵裦ꦉ苣ꊽ裦馁苣龁苣꺁菣莃苣벃苣뎃苣誁苣뎁賦몤臣覂臣ꮁ볯뺁臣꾁胩钁觥銂臣覂臣ꮐ苣ꞁ苣袂臣芀胩钁觥꾁胣龔郧龣ꇥ뒰胣ꦷꇨ隌뫦늶胣ꪃ菣覃苣覃臣龁臣겜飦내鯦ꮁ雩몤臣貂苣뮻蓦꺁胩钁觥銂郥鎂臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯邼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†룤ꢃ臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀럧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