(57)【要約】  本発明は、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全症が挙げられるが、これらに限定されない、多くの状態の治療、予防、または緩和のための養子免疫エフェクター細胞療法のための改善された組成物を提供する。より具体的には、本発明は、改善されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞組成物、ならびにその作製方法および使用方法に関する。特定の実施形態において企図される免疫エフェクター細胞は、１つ以上のＴ細胞受容体遺伝子座におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および正確な破壊または修飾を含み、ＴＣＲ発現およびシグナル伝達の破壊をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の改変されたＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）対立遺伝子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞であって、前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が、標的抗原に結合したとき、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、増加した量の炎症性サイトカインを分泌する、ＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２】
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される標的抗原に結合する細胞外ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項３】
前記ＣＡＲは、前記Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインを含む、請求項１または請求項２に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項４】
前記ＣＡＲが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択されるポリペプチドから単離された１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項５】
前記ＣＡＲが、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項６】
前記ＣＡＲが、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＰＤ１のヒンジ領域、およびＣＤ１５２のヒンジ領域からなる群から選択されるヒンジ領域ポリペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項７】
前記ＣＡＲが、１つ以上のリンカーポリペプチドを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項８】
前記ＣＡＲが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３領域を含むスペーサー領域ポリペプチドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項９】
前記ＣＡＲが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、およびヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドからなる群から選択されるシグナルペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１０】
前記１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子が、非機能性であるか、または実質的に減少した機能を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１１】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が、前記ＣＡＲをコードする核酸を含む１つ以上のプロウイルス組み込み体を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１２】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が、前記ＣＡＲをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、相同組換え修復によって前記１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子に挿入されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１３】
前記１つ以上の炎症性サイトカインが、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＩＰ−１αからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１４】
ＣＡＲ  Ｔ細胞であって、
ａ）１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子と、
ｂ）標的抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸と、を含み、
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が、前記標的抗原を発現する標的細胞と接触したとき、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、増加した量の１つ以上の炎症性サイトカインを分泌する、ＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１５】
ＣＡＲ  Ｔ細胞であって、
ａ）１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子と、
ｂ）標的抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸を含む１つ以上のプロウイルス組み込み体と、を含み、
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が、標的抗原に結合したとき、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、増加した量の１つ以上の炎症性サイトカインを分泌する、ＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１６】
１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞であって、標的抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸を含むドナー修復テンプレートが、相同組換え修復によって前記１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子に挿入され、前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が、標的抗原に結合したとき、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、増加した量の１つ以上の炎症性サイトカインを分泌する、ＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１７】
前記核酸が、前記ＣＡＲをコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１８】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、短いＥＦ１αプロモーター、長いＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ  ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される、請求項１７に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１９】
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２０】
前記ＣＡＲが、膜貫通ドメインおよび１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２１】
前記ＣＡＲが、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２２】
前記ＣＡＲが、シグナルペプチド、１つ以上のリンカーペプチド、および１つ以上のヒンジペプチド、ならびに任意に、１つ以上のスペーサーペプチドをさらに含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２３】
前記ＣＡＲが、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２４】
前記ＣＡＲが、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２５】
前記ＣＡＲが、抗ＣＳＰＧ４  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２６】
前記ＣＡＲが、抗ＲＯＲ１  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２７】
前記ＣＡＲが、抗ＰＳＣＡ  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２８】
前記ＣＡＲが、抗ＴＡＧ７２  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２９】
前記１つ以上の炎症性サイトカインが、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＩＰ−１αからなる群から選択される、請求項１４〜２８のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞を含む、組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞と、生理学的に許容される賦形剤と、を含む、組成物。
【請求項３２】
ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する方法であって、
ａ）ＴＣＲα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断を操作することであって、前記切断が、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）によって修復され、それによって、改変されたＴＣＲα対立遺伝子を生成する、操作することと、
ｂ）ＣＡＲをコードするウイルスベクターを前記Ｔ細胞に形質導入することと、を含み、
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が、標的抗原に結合したとき、改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、増加した量の１つ以上の炎症性サイトカインを分泌する、方法。
【請求項３３】
前記改変されたＴＣＲα対立遺伝子が、非機能性であるか、または実質的に減少した機能を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する方法であって、
ａ）ＴＣＲα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断を操作することと、
ｂ）前記Ｔ細胞に、ＣＡＲをコードする核酸に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含むドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターを形質導入することと、を含み、
前記ドナー修復テンプレートが、前記二本鎖切断（ＤＳＢ）の前記部位で相同組換え修復によって前記ＴＣＲα対立遺伝子に組み込まれ、
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が、標的抗原に結合したとき、改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、増加した量の１つ以上の炎症性サイトカインを分泌する、方法。
【請求項３７】
前記ドナー修復テンプレートが、前記ＤＳＢの５´のＴＣＲα配列に相同な５´相同アームと、前記ＤＳＢの３´のＴＣＲα配列に相同な３´相同アームとを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２からの１つ以上のＩＴＲを有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記レンチウイルスが、インテグラーゼ欠損レンチウイルスである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記二本鎖切断が、操作されたヌクレアーゼで生成される、請求項３２〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記メガヌクレアーゼが、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥから操作される、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記操作されたヌクレアーゼが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび操作されたメガヌクレアーゼを含むメガＴＡＬである、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記二本鎖切断が、操作されたエンドヌクレアーゼおよび末端プロセシング酵素によって生じる、請求項３２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよび前記末端プロセシング酵素をコードするｍＲＮＡが、前記Ｔ細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ウイルス自己切断ペプチド、および末端プロセシング酵素が、前記Ｔ細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ＩＲＥＳ要素、および末端プロセシング酵素が、前記Ｔ細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片に融合された前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが、前記Ｔ細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記末端プロセシング酵素が、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記末端プロセシング酵素が、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つ以上の炎症性サイトカインが、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＩＰ−１αからなる群から選択される、請求項３２〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞、または請求項３０もしくは請求項３１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５６】
腫瘍を排除するために前記対象に投与される改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞の治療上有効量が、前記腫瘍を排除するために前記対象に投与される改変されたＴＣＲαを欠いているＣＡＲ  Ｔ細胞の治療上有効量より少ない、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記がんが、固形がんである、請求項５５または請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記がんが、液性がんである、請求項５５または請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記液性がんが、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、ならびに髄外性形質細胞腫からなる群から選択される血液学的悪性腫瘍である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記血液学的悪性腫瘍が、多発性骨髄腫である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記血液学的悪性腫瘍が、ＣＬＬである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
治療を必要とする対象におけるＢ細胞関連状態を治療する方法であって、前記対象に、治療上有効量の請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞、または前記対象に、治療上有効量の請求項３０もしくは請求項３１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項６３】
前記Ｂ細胞関連状態が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、不確定な悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節性障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、および急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞関連アミロイドーシス、または意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｂ細胞関連状態が、Ｂ細胞悪性腫瘍である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｂ細胞関連状態が、形質細胞悪性腫瘍である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記Ｂ細胞関連状態が、自己免疫疾患である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を増大させる方法であって、ＴＣＲα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成する操作されたヌクレアーゼを導入して、前記ＴＣＲα対立遺伝子を改変させることによって、前記ＣＡＲ  Ｔ細胞表面上のＴＣＲαシグナル伝達成分の利用能を低減させることを含む、方法。
【請求項６８】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が、前記ＣＡＲをコードする１つ以上のプロウイルス組み込み体を含み、前記ＤＳＢが、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）によって修復される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が、前記ＤＳＢで相同組換え修復により前記ＴＣＲα対立遺伝子に組み込まれるＣＡＲをコードする核酸に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記メガヌクレアーゼが、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥから操作される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記操作されたヌクレアーゼが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび操作されたメガヌクレアーゼを含むメガＴＡＬである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記二本鎖切断が、操作されたエンドヌクレアーゼおよび末端プロセシング酵素によって生じる、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、および前記末端プロセシング酵素をコードするｍＲＮＡが、前記Ｔ細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ウイルス自己切断ペプチド、および末端プロセシング酵素が、前記Ｔ細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ＩＲＥＳ要素、および末端プロセシング酵素が、前記Ｔ細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片に融合された前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが、前記Ｔ細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
前記末端プロセシング酵素が、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記末端プロセシング酵素が、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
標的抗原に結合した前記ＣＡＲ  Ｔ細胞が、改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して増加した量の、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＩＰ−１αからなる群から選択される１つ以上の炎症性サイトカインを分泌する、請求項６７〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１６年４月１４日出願の米国仮出願第６２／３２２，５４７号、２０１６年４月７日出願の米国仮出願第６２／３１９，７０３号の利益を主張するものであり、これらの出願の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称はＢＬＢＤ＿０６７＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは６１ＫＢであり、２０１７年４月７日に作成され、本明細書の出願と同時に、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、養子細胞療法のための改善された免疫エフェクター細胞組成物に関する。より具体的には、本発明は、改善されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞組成物、ならびにその作製方法および使用方法に関する。
【０００４】
関連技術の説明
がんの世界的負担は、１９７５〜２０００年に２倍になった。がんは、世界中で罹患率および死亡率の２番目に多い原因であり、２０１２年には、約１４１０万の新しい症例および８２０万のがん関連死亡を伴う。最も一般的ながんは、乳癌、肺、および気管支癌、前立腺癌、結腸および直腸癌、膀胱癌、皮膚の黒色腫、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、腎臓および腎盂癌、子宮内膜癌、白血病、および膵臓癌である。新たながん症例の数は、今後２０年以内に、２２００万まで上昇すると予想される。
【０００５】
Ｔ細胞の単離、改変、拡張、および再注入に基づいた養子細胞免疫療法戦略は、初期段階臨床治験において検討および試験されている。特に、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）に基づいた戦略は、それらの選択的認識および強力なエフェクター機構によるがん免疫療法のための最適なエフェクター細胞に急速になる。
【０００６】
しかしながら、現在の治療は、成功の混合した速度を示し、小人数の患者のみが長期寛解を形成し、ＣＡＲ  Ｔ細胞系免疫療法にとっていまだに実現されていない可能性を示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、概して、一部分において、改善された免疫エフェクター細胞組成物、およびそれを製造する方法に関する。特定の実施形態において企図される免疫エフェクター細胞は、１つ以上のＴ細胞受容体遺伝子座におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および正確な破壊または修飾を含み、ＴＣＲ発現およびシグナル伝達の破壊をもたらす。驚くべきことには、本発明者らは、１つ以上の改変されたＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）対立遺伝子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞が、増加した量の細胞傷害性サイトカインを分泌し、改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いているＣＡＲ  Ｔ細胞よりも治療上有効であることを発見している。
【０００８】
様々な実施形態において、１つ以上の改変されたＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）対立遺伝子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞が、提供され、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的抗原に結合したとき、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、増加した量の炎症性サイトカインを分泌する。
【０００９】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される標的抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
【００１０】
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインを含む。
【００１１】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択されるポリペプチドから単離された１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【００１２】
さらなる実施形態において、ＣＡＲは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＰＤ１のヒンジ領域、およびＣＤ１５２のヒンジ領域からなる群から選択されるヒンジ領域ポリペプチドを含む。
【００１４】
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上のリンカーポリペプチドを含む。
【００１５】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３領域を含むスペーサー領域ポリペプチドを含む。
【００１６】
さらなる実施形態において、ＣＡＲは、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、およびヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドからなる群から選択されるシグナルペプチドを含む。
【００１７】
特定の実施形態において、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子は、非機能性であるか、または実質的に減少した機能を有する。
【００１８】
さらなる実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸を含む１つ以上のプロウイルス組み込み体を含む。
【００１９】
ある特定の実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、相同組換え修復によって１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子に挿入されている。
【００２０】
さらなる実施形態において、１つ以上の炎症性サイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＩＰ−１αからなる群から選択される。
【００２１】
様々な実施形態において、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子、および標的抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸を含むＣＡＲ  Ｔ細胞が、提供され、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的抗原を発現する標的細胞と接触するときに、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、増加した量の１つ以上の炎症性サイトカインを分泌する。
【００２２】
様々な実施形態において、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子、および標的抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸を含む１つ以上のプロウイルス組み込み体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞が、提供され、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的抗原に結合したとき、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、増加した量の１つ以上の炎症性サイトカインを分泌する。
【００２３】
様々な実施形態において、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞が、提供され、標的抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸を含むドナー修復テンプレートが、相同組換え修復によって１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子に挿入され、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的抗原に結合したとき、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、増加した量の１つ以上の炎症性サイトカインを分泌する。
【００２４】
ある特定の実施形態において、核酸は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、短いＥＦ１αプロモーター、長いＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される。
【００２６】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【００２８】
さらなる実施形態において、ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００２９】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、シグナルペプチド、１つ以上のリンカーペプチド、および１つ以上のヒンジペプチド、ならびに任意に、１つ以上のスペーサーペプチドをさらに含む。
【００３０】
さらなる実施形態において、ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００３１】
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗ＣＳＰＧ４ｓｃＦｖ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００３３】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、抗ＲＯＲ１ｓｃＦｖ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００３４】
さらなる実施形態において、ＣＡＲは、抗ＰＳＣＡ  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００３５】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、抗ＴＡＧ７２ｓｃＦｖ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００３６】
さらなる実施形態において、１つ以上の炎症性サイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＩＰ−１αからなる群から選択される。
【００３７】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるＣＡＲ  Ｔ細胞を含む、組成物が、提供される。
【００３８】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるＣＡＲ  Ｔ細胞、および生理学的に許容される賦形剤を含む、組成物が、提供される。
【００３９】
様々な実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する方法が、提供され、本方法は、ＴＣＲα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断を操作することであって、切断は、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）によって修復され、それによって改変されたＴＣＲα対立遺伝子を生成する、操作することと、ＣＡＲをコードするウイルスベクターをＴ細胞に形質導入することと、を含み、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的抗原に結合したとき、改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、増加した量の１つ以上の炎症性サイトカインを分泌する。
【００４０】
ある特定の実施形態において、改変されたＴＣＲα対立遺伝子は、非機能性であるか、または実質的に減少した機能を有する。
【００４１】
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。
【００４２】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００４３】
様々な実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する方法が、提供され、本方法は、ＴＣＲα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断を操作することと、ＣＡＲをコードする核酸に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含むドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターをＴ細胞に形質導入することと、を含み、ドナー修復テンプレートは、二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位で相同組換え修復によってＴＣＲα対立遺伝子に組み込まれ、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的抗原に結合したとき、改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、増加した量の１つ以上の炎症性サイトカインを分泌する。
【００４４】
ある特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢのＴＣＲα配列５´に相同な５´相同アーム、およびＤＳＢのＴＣＲα配列３´に相同な３´相同アームを含む。
【００４５】
さらなる実施形態において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである。
【００４６】
特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２からの１つ以上のＩＴＲを有する。
【００４７】
特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する。
【００４８】
さらなる実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
【００４９】
いくつかの実施形態において、レンチウイルスは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスである。
【００５０】
特定の実施形態において、二本鎖切断は、操作されたヌクレアーゼで生成される。
【００５１】
ある特定の実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される。
【００５２】
ある特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥから操作される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび操作されたメガヌクレアーゼを含むメガＴＡＬである。
【００５４】
さらなる実施形態において、二本鎖切断は、操作されたエンドヌクレアーゼおよび末端プロセシング酵素によって生じる。
【００５５】
特定の実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、および末端プロセシング酵素をコードするｍＲＮＡは、Ｔ細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
【００５６】
さらなる実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ウイルス自己切断ペプチド、および末端プロセシング酵素は、Ｔ細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
【００５７】
特定の実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ＩＲＥＳ要素、および末端プロセシング酵素は、Ｔ細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
【００５８】
さらなる実施形態において、末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片に融合された操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、Ｔ細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
【００５９】
ある特定の実施形態において、末端プロセシング酵素は、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す。
【００６０】
特定の実施形態において、末端プロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、１つ以上の炎症性サイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＩＰ−１αからなる群から選択される。
【００６２】
様々な実施形態において、対象におけるがんを治療する方法が、提供され、本方法は、対象に、ＣＡＲ  Ｔ細胞または本明細書において企図される組成物を投与することを含む。
【００６３】
さらなる実施形態において、腫瘍を排除するために対象に投与される改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞の治療上有効量は、腫瘍を排除するために対象に投与される改変されたＴＣＲαを欠いているＣＡＲ  Ｔ細胞の治療上有効量より少ない。
【００６４】
さらなる実施形態において、がんは、固形がんである。
【００６５】
ある特定の実施形態において、がんは、液性がんである。
【００６６】
特定の実施形態において、液性がんは、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫からなる群から選択される血液学的悪性腫瘍である。
【００６７】
さらなる実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、多発性骨髄腫である。
【００６８】
ある特定の実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、ＣＬＬである。
【００６９】
様々な実施形態において、治療を必要とする対象におけるＢ細胞関連状態を治療する方法が、提供され、本方法は、対象に、治療上有効量のＣＡＲ  Ｔ細胞または対象に、治療上有効量の本明細書において企図される組成物を投与することを含む。
【００７０】
特定の実施形態において、Ｂ細胞関連状態は、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、不確定な悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節性障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、および急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞関連アミロイドーシス、または意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症である。
【００７１】
ある特定の実施形態において、Ｂ細胞関連状態は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。
【００７２】
特定の実施形態において、Ｂ細胞関連状態は、形質細胞悪性腫瘍である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、Ｂ細胞関連状態は、自己免疫疾患である。
【００７４】
様々な実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を増大させる方法が、提供され、本方法は、ＴＣＲα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成する操作されたヌクレアーゼを導入して、ＴＣＲα対立遺伝子を改変させることによって、ＣＡＲ  Ｔ細胞表面上のＴＣＲαシグナル伝達成分の利用能を低減させることを含む。
【００７５】
さらなる実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする１つ以上のプロウイルス組み込み体を含み、ＤＳＢは、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）によって修復される。
【００７６】
さらなる実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＤＳＢで相同組換え修復によってＴＣＲα対立遺伝子に組み込まれるＣＡＲをコードする核酸に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される。
【００７８】
特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥから操作される。
【００７９】
さらなる実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび操作されたメガヌクレアーゼを含むメガＴＡＬである。
【００８０】
ある特定の実施形態において、二本鎖切断は、操作されたエンドヌクレアーゼおよび末端プロセシング酵素によって生じる。
【００８１】
特定の実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、および末端プロセシング酵素をコードするｍＲＮＡは、Ｔ細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ウイルス自己切断ペプチド、および末端プロセシング酵素は、Ｔ細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
【００８３】
ある特定の実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ＩＲＥＳ要素、および末端プロセシング酵素は、Ｔ細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
【００８４】
特定の実施形態において、末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片に融合された操作されたエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、Ｔ細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。さらなる実施形態において、末端プロセシング酵素は、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す。
【００８５】
さらなる実施形態において、末端プロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００８６】
特定の実施形態において、標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞は、改変されたＴＣＲα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して増加した量の、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＩＰ−１αからなる群から選択される１つ以上の炎症性サイトカインを分泌する。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】標準培養プロセスを用いて培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＥＰなし）、電気穿孔したが、ｍＲＮＡを受けない細胞（ＥＰのみ）、ならびに大規模および小規模の両方で、ＴＣＲα遺伝子（ＴＣＲα  ＫＯ）を標的化するメガＴＡＬをコードするｍＲＮＡで電気穿孔した細胞における２つの代表的なドナーに対して１０日目のＶＣＮを示す。
【図２】標準培養プロセスを用いて培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＥＰなし）、電気穿孔したが、ｍＲＮＡを受けない細胞（ＥＰのみ）、ならびに大規模および小規模の両方で、ＴＣＲα遺伝子（ＴＣＲα  ＫＯ）を標的化するメガＴＡＬをコードするｍＲＮＡで電気穿孔した細胞における１０日間にわたる代表的な増殖曲線を示す。
【図３】抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現およびＴＣＲα破壊における２人のドナーに対する代表的なＦＡＣＳプロットを示す。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現は、ＰＥフルオロフォアに対して共役されたＢＣＭＡ抗原を有する細胞を染色することによって決定された。ＴＣＲα破壊は、抗ＣＤ３染色によって決定された。
【図４】図３に示されるＦＡＣＳデータのグラフ表示を示す。
【図５Ａ−１】標準培養プロセスを用いて培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＥＰなし）、電気穿孔したが、ｍＲＮＡを受けない細胞（ＥＰのみ）、ならびにＢＣＭＡ陽性およびＢＣＭＡ陰性細胞株の存在下で培養されたＴＣＲα遺伝子（ＴＣＲα  ＫＯ）を標的化するメガＴＡＬをコードするｍＲＮＡで電気穿孔した細胞における抗原依存性ＩＦＮγ放出のための代表的なデータを示す。
【図５Ａ−２】標準培養プロセスを用いて培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＥＰなし）、電気穿孔したが、ｍＲＮＡを受けない細胞（ＥＰのみ）、ならびにＢＣＭＡ陽性およびＢＣＭＡ陰性細胞株の存在下で培養されたＴＣＲα遺伝子（ＴＣＲα  ＫＯ）を標的化するメガＴＡＬをコードするｍＲＮＡで電気穿孔した細胞における抗原依存性ＩＦＮγ放出のための代表的なデータを示す。
【図５Ｂ−１】標準培養プロセスを用いて培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＥＰなし）、ならびにＢＣＭＡ陽性およびＢＣＭＡ陰性細胞株の存在下で培養されたＴＣＲα遺伝子（ＴＣＲα  ＫＯ）＋／−Ｔｒｅｘ２を標的化するメガＴＡＬをコードするｍＲＮＡで電気穿孔した細胞におけるＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＩＰ−１αの抗原依存性放出のための代表的なデータを示す。
【図５Ｂ−２】標準培養プロセスを用いて培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＥＰなし）、ならびにＢＣＭＡ陽性およびＢＣＭＡ陰性細胞株の存在下で培養されたＴＣＲα遺伝子（ＴＣＲα  ＫＯ）＋／−Ｔｒｅｘ２を標的化するメガＴＡＬをコードするｍＲＮＡで電気穿孔した細胞におけるＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＩＰ−１αの抗原依存性放出のための代表的なデータを示す。
【図６Ａ】標準培養プロセスを用いて製造された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＥＰなし）、ＥＰのみ、およびＤａｕｄｉ異種移植モデルにおけるＴＣＲα  ＫＯの最長２７日の処理のインビボ有効性を示す。
【図６Ｂ】標準培養プロセスを用いて製造された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＥＰなし）、ＥＰのみ、およびＤａｕｄｉ異種移植モデルにおけるＴＣＲα  ＫＯの最長４３日の処理のインビボ有効性を示す。
【図７】抗ＣＤ１９ＣＡＲが相同組換え修復（ＨＲ−Ｔ細胞）を用いてＴＣＲα遺伝子に挿入されている抗ＣＤ１９ＣＡＲ（ＬＶ−Ｔ細胞）およびＴ細胞をコードするレンチウイルスで形質導入したＴ細胞中の抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現の代表的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図８】（図８Ａ）Ｅ：Ｔ比を１：１でＮａｌｍ−６細胞を発現するＣＤ１９を用いた共培養アッセイにおいて、抗ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＬＶ−Ｔ細胞）、および２人のドナーから調製された抗ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＬＶ−Ｔ細胞）のインビトロ細胞傷害性を示す。    （図８Ｂ）１：１のＥ：Ｔ比でＮａｌｍ−６細胞を発現するＣＤ１９で共培養してから２４時間後に、非形質導入対照Ｔ細胞および抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＬＶ−Ｔ細胞）、ならびに２人のドナーから調製された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＬＶ−Ｔ細胞）に対する抗原依存性ＩＦＮγ放出に対する代表的なデータを示す。
【図９】抗ＣＤ１９  ＣＡＲが相同組換え修復を用いてＴＣＲα遺伝子に挿入されている抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ細胞をコードするレンチウイルスで形質導入したＴ細胞中の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現の代表的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図１０Ａ】Ｅ：Ｔ比を１：１でＮａｌｍ−６細胞を発現するＣＤ１９を用いた共培養アッセイにおいて、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＬＶ−Ｔ細胞）および２人のドナーから調製された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＬＶ−Ｔ細胞）のインビトロ細胞傷害性を示す。
【図１０Ｂ】Ｅ：Ｔ比を１：１でＮａｌｍ−６細胞を発現するＣＤ１９で共培養してから２４時間後に、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＬＶ−Ｔ細胞）、および２人のドナーから調製された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＬＶ−Ｔ細胞）に対する抗原依存性ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＴＮＦα放出に対する代表的なデータを示す。
【図１１Ａ】Ｎａｌｍ−６細胞を発現するＣＤ１９の存在下で２４時間培養されたレンチウイルス形質導入（ＬＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞）または相同組換えＨＲ−ＣＡＲ  Ｔ細胞）によって産生された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞のためのＴ細胞枯渇マーカーの発現を示す。
【図１１Ｂ】Ｎａｌｍ−６細胞を発現するＣＤ１９の存在下で７２時間培養されたレンチウイルス形質導入（ＬＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞）または相同組換えＨＲ−ＣＡＲ  Ｔ細胞）によって産生された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞のためのＴ細胞枯渇マーカーの発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、Ｉ−ＯｎｕＩのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号２は、配列番号１によってコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号３および４は、ゲノム編集のためのＴＣＲα標的部位の例示的な例を示す。
配列番号５〜７は、操作されたＩ−ＯｎｕＩバリアントのポリペプチド配列を示す。
配列番号８は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲのポリペプチド配列を示す。
配列番号９は、プラスミド、ｐＢＷ１０２１のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０は、ＴＣＲα  Ｉ−ＯｎｕＩのメガＴＡＬ標的部位を示す。
配列番号１１は、ＴＣＲα  Ｉ−ＯｎｕＩのメガＴＡＬの例示的な例のポリペプチド配列を示す。
配列番号１２は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの例示的な例のポリペプチド配列を示す。
配列番号１３は、プラスミド、ｐＢＷ４００のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４〜２４は、様々なリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５〜４９は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。
【００８９】
Ａ．概要
本発明は、概して、一部分において、改善された免疫エフェクター細胞組成物、およびそれを製造する方法に関する。特定の実施形態において企図される免疫エフェクター細胞は、１つ以上のＴ細胞受容体遺伝子座におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および正確な破壊または修飾を含み、ＴＣＲ発現およびシグナル伝達の破壊をもたらす。驚くべきことには、本発明者らは、本明細書において企図される方法によって製造される１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞が、増大した治療有効性、例えば、炎症性サイトカイン、例えば、腫瘍細胞に対してＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解活性を増大させる、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、および細胞毒素を含む他の分子、例えば、パーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢの抗原依存性分泌の増加に染まっていることが発見している。
【００９０】
様々な実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子の１つ以上の対立遺伝子の改変を含む。特定の実施形態において、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子の改変は、ＴＣＲα対立遺伝子（複数可）の発現を除去するか、または実質的に除去し、ＴＣＲα対立遺伝子（複数可）の発現を低下するか、および／またはＴＣＲα対立遺伝子（複数可）の１つ以上の機能を損なう、実質的に損なう、もしくは除去するか、またはＴＣＲα対立遺伝子（複数可）が機能しない。特定の実施形態において、ＴＣＲα機能としては、細胞表面へのＣＤ３の動員、抗原のＭＨＣ依存性認識および結合、ＴＣＲαβシグナル伝達の活性化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
様々な実施形態において、ＤＮＡ切断が、細胞のＴＣＲα遺伝子において生じ、切断されたゲノム配列の末端のＮＨＥＪは、正常なＴＣＲの発現、機能喪失型もしくは機能獲得型ＴＣＲの発現を有する細胞、または好ましくは機能的なＴＣＲの発現を欠いている、例えば、細胞表面にＣＤ３を動員する能力を欠いている細胞をもたらし、ＴＣＲαβシグナル伝達を活性化し、ＭＨＣ−抗原複合体を認識し、結合し得る。１つの好ましい実施形態において、修復は、操作されたエンドヌクレアーゼおよび末端プロセシング酵素、例えば、３´−５´エキソヌクレアーゼ（Ｔｒｅｘ２）またはその生物学的に活性な断片を用いることによってＮＨＥＪおよび機能喪失型に偏っている。
【００９２】
様々な他の実施形態において、切断されたＴＣＲαゲノム配列の修復のためのドナーテンプレートが、提供され、ＴＣＲα対立遺伝子が、ＤＮＡ切断部位における相同組換えによってテンプレートの配列で修復される。好ましい実施形態において、修復テンプレートは、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００９３】
したがって、本明細書において企図される方法および組成物は、既存の養子細胞療法と比較して量子改善を表す。
【００９４】
別段の指示が具体的にない限り、特定の実施形態の実践には、当該技術分野の技能の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来法が用いられ、これらの多くは、例証の目的で以下に記載される。このような技法は文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００８年７月更新）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの学術誌中の研究論文を参照されたい。
【００９５】
Ｂ．定義
別様に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。特定の実施形態の実践および試験には、本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が使用され得るが、好ましい実施形態の組成物、方法、および材料を本明細書に記載する。本開示において、以下の用語は、以下の定義の通りである。
【００９６】
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という冠詞は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の１つ、または１つより多く（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上）を指すように使用される。例として、「あるエレメント（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
【００９７】
代替物（例えば、「または（ｏｒ）」）の使用は、代替物のうちの１つ、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するよう理解されるものとする。
【００９８】
「および／または」という用語は、代替物のうちの１つまたは両方のいずれかを意味するよう理解されるものとする。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％ほど異なる分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、基準の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さについて±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の範囲の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
【０１００】
一実施形態において、例えば、１〜５、約１〜５、または約１〜約５の範囲は、範囲によって包含される各数値を指す。例えば、非例示的かつ単に例示的な実施形態において、「１〜５」の範囲は、１、２、３、４、５、もしくは１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０、または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０の語句と同等である。
【０１０１】
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉は、記載されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の一群の包含を暗示するが、いかなる他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の一群の除外を暗示するものではないと理解される。「からなる」とは、「からなる」という表現に続くもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という表現は、列記される要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、句の後に列記される任意の要素を含み、列記された要素の開示において指定された活性または作用に干渉しない、または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。よって、「から本質的になる」という句は、列記される要素が必要であるか、または必須であるが、列記された要素の活性または作用に物質的に影響を及ぼす他の要素が存在しないことを示す。
【０１０２】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「付加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して様々な箇所での前述の句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態に対して言及されない。更に、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において、任意の好適な様式で組み合わされてよい。一実施形態の特徴の積極的な記載が特定の実施形態における特徴を除外する根拠とならないことも理解する。
【０１０３】
「免疫エフェクター細胞」とは、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺滅活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。特定の実施形態において企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞である。
【０１０４】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野において認識されており、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むよう意図される。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであってもよい。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＮＫＴ細胞である。特定の実施形態で使用するのに好適な他の例示的なＴ細胞集団は、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞を含む。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現するように改変される。
【０１０５】
「強力なＴ細胞」および「若いＴ細胞」は、特定の実施形態において互換的に使用され、Ｔ細胞が増殖および分化の同時減少が可能であるＴ細胞表現型を指す。特定の実施形態において、若いＴ細胞は、「ナイーブＴ細胞」の表現型を有する。特定の実施形態において、若いＴ細胞は、生物学的マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの１つ以上または全てを含む。一実施形態において、若いＴ細胞は、生物学的マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの１つ以上または全てを含む。一実施形態において、若いＴ細胞は、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、およびＬＡＧ３の発現を欠いている。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞の対称または非対称分裂のいずれかにおける細胞分裂の増加を指す。特定の実施形態において、「増殖」は、Ｔ細胞の対称または非対称分裂を指す。「増殖の増加」は、処理されていない試料中の細胞と比較して、処理された試料中の細胞の数が増加している場合に起こる。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、細胞の効力もしくは増殖を減少させるまたは細胞をより発生的に制限された状態へと移動させる方法を指す。特定の実施形態において、分化したＴ細胞は、免疫エフェクター細胞機能を獲得する。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞製造」または「Ｔ細胞を製造する方法または同等の用語は、Ｔ細胞の治療用組成物を産生するプロセスを指し、この製造方法は、次のステップ：採取、刺激、活性化、ゲノム編集、および拡張のうちの１つ以上または全てを含むことができる。
【０１０９】
「エクスビボ」という用語は、一般に、生物体の外側で行われる行為、例えば、天然の条件の変更が最小であることが好ましい、生物体の外側の人工的な環境において生組織内または生組織上で行われる実験または測定などを指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物体から取得し、通常は滅菌条件下で、一般には数時間または最大約２４時間であるが、状況に応じて最大４８または７２時間を含む時間にわたって実験装置内で培養または調節した生細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態において、そのような組織または細胞を収集し、凍結させ、エクスビボにおける処理のために後で解凍することができる。生細胞または組織を使用して数日よりも長く続く組織培養実験または手順は、一般には「インビトロ」と見なされるが、ある特定の実施形態において、この用語は、エクスビボと互換的に使用することができる。
【０１１０】
「インビボ」という用語は、一般に、生物体の内側で行われる行為、例えば、細胞の自己再生および細胞の増殖または増大などを指す。一実施形態において、「インビボにおける増大」という用語は、細胞集団の数をインビボにおいて増加させる能力を指す。一実施形態において、細胞は、インビボで操作または改変される。
【０１１１】
「刺激」という用語は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル変換が挙げられるが、これらに限定されない、シグナル変換事象が媒介される、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドの結合によって誘導される一次応答を指す。
【０１１２】
「刺激分子」は、同族刺激性リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を指す。
【０１１３】
「刺激性リガンド」は、本明細書で使用される場合、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在する場合、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（本明細書において、「刺激分子」と称される）と特異的に結合し、それにより、これらに限定されないが、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含めた、Ｔ細胞による一次応答を媒介することができるリガンドを意味する。刺激性リガンドとしては、ＣＤ３リガンド、例えば、抗ＣＤ３抗体ならびにＣＤ２リガンド、例えば、抗ＣＤ２抗体およびペプチド、例えば、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。特定の実施形態において、活性化は、誘導性サイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能にも関連し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、増殖しているＴ細胞を指す。ＴＣＲ単独を通じて生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、１つ以上の二次または共刺激シグナルも必要である。したがって、Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を通じた一次刺激シグナルおよび１つ以上の二次共刺激シグナルを含む。共刺激は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を通じた、またはＣＤ２を通じた刺激などの一次活性化シグナルを受けたＴ細胞による増殖および／またはサイトカイン産生によって証明することができる。
【０１１５】
「共刺激シグナル」とは、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わさって、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、および／または特定の分子（例えばＣＤ２８）の上方制御もしくは下方制御を導くシグナルを指す。
【０１１６】
「共刺激リガンド」は、共刺激分子に結合する分子を指す。共刺激リガンドは、可溶性であり得るか、または表面上に提示され得る。「共刺激分子」は、共刺激リガンド（例えば、抗ＣＤ２８抗体）と特異的に結合するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。
【０１１７】
「自家性」とは、本明細書で使用される場合、ドナーおよびレシピエントは、同じ対象である細胞を指す。
【０１１８】
「同種」とは、本明細書で使用される場合、ドナーおよびレシピエント種は、同じであるが、細胞は遺伝的に異なる細胞を指す。
【０１１９】
「同系」とは、本明細書で使用される場合、ドナーおよびレシピエント種は、同じであるが、ドナーおよびレシピエントは、異なる個人であり、ドナー細胞およびレシピエント細胞は、遺伝的に同一である細胞を指す。
【０１２０】
「異種」は、本明細書で使用される場合、ドナーおよびレシピエント種が異なる種の細胞を指す。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「個体」および「対象」という用語は、多くの場合、互換的に使用され、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療薬、および本明細書において他の箇所に企図される方法を用いて治療され得る、がん、または他の免疫障害の症状を示す任意の動物を指す。好適な対象（例えば、患者）は、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、農場動物、および家畜動物、またはペット（ネコまたはイヌ）を含む。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な対象には、がんまたは他の免疫障害を有するか、それと診断されたことがあるか、またはそのリスクがあるか、もしくはそれを有しているヒト患者が含まれる。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、本明細書において他の箇所に開示される組成物および方法を用いて治療され得るがんまたは他の免疫障害と診断されたことのある対象を指す。
【０１２３】
本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」には、疾患または病態の症状もしくは病理に対する、あらゆる有益な作用または望ましい効果を含み、治療される疾患または状態、例えば、がん、自己免疫疾患、免疫障害などのうちの１つ以上の測定可能なマーカーの最小の低減さえも含み得る。治療は、任意に、疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを伴ってもよい。「治療」は、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な根絶、あるいは治癒を必ずしも示さない。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」および「予防される（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」などの同様の用語は、疾患もしくは状態、例えば、がん、自己免疫疾患、免疫障害などの発生または再発の可能性を予防、阻害、または低減するための手法を示す。疾患もしくは状態の開始または再発を遅延する、あるいは疾患もしくは状態の症状の発生または再発を遅延することも指す。本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および類似する用語も、疾患もしくは状態の開始または再発前の疾患もしくは状態の強度、作用、症状、および／または負荷を減少させることも含む。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「の少なくとも１つの症状を寛解させる」という語句は、対象が治療を受けている疾患または状態、例えば、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全のうちの１つ以上の症状を減少させることを指す。特定の実施形態において、治療される疾患または状態はがんであり、寛解される１つ以上の症状としては、脱力感、疲労、息切れ、易挫傷性および易出血性、頻繁な感染症、リンパ節腫大、腹部の膨張または（腹部器官の肥大による）痛み、骨痛または関節痛、骨折、計画外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続的微熱、および（腎機能不全による）排尿減少が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益なもしくは所望の予防または治療結果を達成するのに十分な、ゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞の「有効な量」または「有効量」を指す。
【０１２７】
「予防有効量」は、所望の予防的結果を達成するのに有効なゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞の量を指す。必ずしもそうではないが、典型的には、予防的用量は疾患の発生前または初期段階で対象に使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少ない。
【０１２８】
ゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞の「治療上有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発するゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞の能力などの要因によって異なり得る。治療上有効量は、治療的に有益な作用がウイルスまたは形質導入された治療用細胞の任意の毒性または有害な作用を上回るものでもある。「治療上有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を治療するのに有効な量を含む。治療量が示される場合、投与される特定の実施形態において企図される組成物の正確な量は、医師が、本明細書を考慮して、ならびに患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態における個々の差を考慮して、決定することができる。
【０１２９】
「免疫障害」は、免疫系からの応答を排除する疾患を指す。特定の実施形態において、「免疫障害」という用語は、がん、自己免疫疾患、または免疫不全を指す。一実施形態において、免疫障害は、感染性疾患を包含する。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、一般に、異常な細胞が制御されずに分裂し、近くの組織に浸潤し得る、疾患または状態のクラスに関する。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「悪性」という用語は、腫瘍細胞の群が、制御されていない成長（すなわち、正常な限界を超えた分裂）、浸潤（すなわち、近接組織への侵入およびその破壊）、ならびに転移（すなわち、リンパ液または血液を介した、体内の他の場所への拡散）のうちの１つ以上を示すがんを指す。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「転移する」という用語は、身体の１つの部分から別の部分へとがんが拡散することを指す。拡散した細胞により形成された腫瘍は「転移性腫瘍」または「転移」と呼ばれる。転移性腫瘍は、元々（原発）の腫瘍の細胞と同様の細胞を含む。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「良性」または「非悪性」という用語は、大きく成長し得るが、身体の他の部分に拡散しない腫瘍を指す。良性腫瘍は、自己限定的であり、通常は浸潤または転移しない。
【０１３４】
「がん細胞」は、がん性腫瘍または組織の個々の細胞を指す。「腫瘍」または「腫瘍細胞」とは、概して、良性、前悪性、または悪性であり得る細胞の異常増殖により形成された腫脹または病変を指す。ほとんどのがんは腫瘍を形成するが、いくつか、例えば白血病は、必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成するがんに関しては、がん（細胞）および腫瘍（細胞）という用語は互換的に使用される。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。
【０１３５】
「自己免疫疾患」とは、体が、自身の組織のいくつかの成分に対する免疫原性（すなわち、免疫系）応答を生じる疾患を指す。言い換えれば、免疫系は、体内のある組織または系を「自己」と認識する能力を失い、あたかもそれを外来であるかのように標的とし、攻撃する。自己免疫疾患は、主に１つの器官が影響を受けるもの（例えば、溶血性貧血および抗免疫甲状腺炎）と、自己免疫疾患プロセスが多くの組織を通じて拡散するもの（例えば、全身性エリテマトーデスに分類することができる。例えば、多発性硬化症は、脳および脊髄の神経線維を囲む鞘を攻撃するＴ細胞によって引き起こされると考えられている。これにより、協調喪失、衰弱、および霧視が生じる。自己免疫疾患は、当該技術分野で既知であり、例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ループス、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などが挙げられる。
【０１３６】
「免疫不全」とは、疾患によってまたは化学物質の投与によって免疫系が損なわれた患者の状態を意味する。この状態により、当該系が、外来物質に対する防御に必要な血液細胞の数および型が欠損したものになる。免疫不全状態または疾患は、当該技術分野で既知であり、それらとしては、例えば、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）、選択的ＩｇＡ欠損症、分類不能型免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫性疾患、高ＩｇＭ症候群、および糖尿病が挙げられる。
【０１３７】
「感染性疾患」とは、人から人へまたは生物体から生物体へ伝染する可能性があり、微生物またはウイルス性因子によって引き起こされる疾患（例えば、風邪）を指す。感染性疾患は、当該技術分野で既知であり、それらとしては、例えば、肝炎、性行為感染症（例えば、クラミジア、淋病）、結核、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、およびインフルエンザが挙げられる。
【０１３８】
「増強する」もしくは「促進する」、または「増加する」もしくは「増幅する」もしくは「強化する」とは、概して、本明細書において企図される組成物、例えば、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞が、同じまたは実質的に同じＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞によって引き起こされる応答と比較して、より大きな応答（すなわち、生理学的応答）をもたらすか、誘発するか、または引き起こす能力を指すが、ＴＣＲα対立遺伝子は、改変されていない（対照組成物）。測定可能な応答は、炎症性サイトカイン放出の増加、例えば、とりわけ、当該技術分野で理解および本明細書における説明から明らかである他の測定可能な応答の中でもとりわけ、ＩＦＮγ、細胞溶解活性の増加、またはＣＡＲ発現の増加を含み得る。「増加した」または「増強された」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によりもたらされる応答の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（その間および１を超える全ての整数ならびに小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の増加を含み得る。
【０１３９】
「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低減する（ｌｏｗｅｒ）」または「減る（ｌｅｓｓｅｎ）」または「低下する（ｒｅｄｕｃｅ）」または「軽減する（ａｂａｔｅ）」または「除去する（ａｂｌａｔｅ）」または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「抑制する（ｄａｍｐｅｎ）」とは、一般に、本明細書において企図される組成物の、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより小さな応答（すなわち、生理学的応答）をもたらすか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。測定可能な応答は、内因性ＴＣＲ発現または機能の減少を含み得る。「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」量とは、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によって生じる応答（参照応答）の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（その間および１を超える全ての整数ならびに小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の減少を含み得る。
【０１４０】
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化しない」、または「実質的に変化しない」、または「実質的に減少しない」とは、概して、本明細書において企図される組成物が、細胞において、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系列における応答と比較した場合に実質的に同様もしくは比較可能な生理学的応答（すなわち、下流作用）をもたらすか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。比較可能な応答は、参照応答と大幅に異ならないか、または測定可能な差がないものである。
【０１４１】
本明細書で使用される「特異的結合親和性」、または「特異的に結合する」、または「特異的に結合している」、または「特異的結合」、または「特異的に標的化する」という用語は、バックグラウンド結合よりも高い結合親和性である分子から別のものに結合することを説明する。結合ドメインは、例えば、約１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡結合定数）を有する標的分子に結合するまたはそれと関連する場合、標的分子に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態において、結合ドメインは、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１以上のＫａを有する標的物に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、またはそれ以上のＫａを有する結合ドメインを指す。
【０１４２】
あるいは、親和性は、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ、またはそれ以下）の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義され得る。特定の実施形態において企図される結合ドメインポリペプチドの親和性は、従来の技術を使用して、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって、または結合会合（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、もしくは標識リガンドを使用した置換アッセイによって、あるいは、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能であるＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００などの表面プラズモン共鳴デバイス、またはそれぞれＣｏｒｎｉｎｇおよびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから入手可能なＥＰＩＣシステムもしくはＥｎＳｐｉｒｅなどの光学バイオセンサ技術を使用して、容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０、および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、またはその均等物も参照されたい）。
【０１４３】
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合より約２倍高いか、バックグラウンド結合より約５倍高いか、バックグラウンド結合より約１０倍高いか、バックグラウンド結合より約２０倍高いか、バックグラウンド結合より約５０倍高いか、バックグラウンド結合より約１００倍高いか、またはバックグラウンド結合より約１０００倍以上高い。
【０１４４】
「抗原（Ａｇ）」とは、動物において抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することのできる化合物、組成物、または物質、例えば、脂質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ペプチド、または核酸を指し、動物に注射または吸収される組成物（例えば、腫瘍特異的タンパク質を含むものなど）を含む。抗原は、開示される抗原などの異種抗原により誘発されたものを含む、特定の体液性または細胞性免疫の産物と反応する。「標的抗原」または「標的抗原または対象」は、本明細書において企図される操作された抗原受容体の結合ドメインが結合するように設計される、抗原である。一実施形態において、抗原は、クラスＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体である。
【０１４５】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、結合剤が結合する抗原の領域を指す。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、ある断片に通常隣接する配列から取り除かれたＤＮＡ断片を指す。「単離されたポリヌクレオチド」は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、または実際に存在せず、人の手によって作製された他のポリヌクレオチドも指す。
【０１４７】
本明細書で使用される、「単離されたタンパク質」、「単離されたペプチド」、または「単離されたポリペプチド」などは、細胞環境から、および細胞の他の成分との会合から、ペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロでの合成、単離、および／または精製を指し、すなわち、それは、インビボの物質と著しく会合していない。
【０１４８】
「単離された細胞」とは、天然に存在しない細胞、例えば、インビボの組織または器官から得られた、および細胞外マトリックスが実質的に含まない、実際に存在しないＴ細胞、改変されたＴ細胞、操作されたＴ細胞などを指す。
【０１４９】
「組換え」とは、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナー捕捉を含むが、これらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間の遺伝子情報の交換プロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を介して細胞において二本鎖切断の修復中に起こるそのような交換の特殊の形態を指す。このプロセスには、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を受けた分子）を修復するためのテンプレートとして「ドナー」分子を用い、かつそれは、ドナーから標的への遺伝情報の移動をもたらすために、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」として、様々な名称で公知である。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、そのような移動は、切断された標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または、標的の一部になる遺伝情報の再合成にドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、および／または関連のプロセスを含み得る。そのような特殊なＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような、標的分子の配列の変更をもたらす場合が多い。
【０１５０】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が挙げられるが、これらに限定されない、種々の方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方とも可能である。二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために用いられる。
【０１５１】
「標的部位」または「標的配列」は、結合および／または切断が存在するのに十分な条件という条件で、結合分子が結合するおよび／または切断するであろう核酸の一部を定義する染色体または染色体外核酸配列である。
【０１５２】
「外因性」分子は、１つ以上の遺伝子的、生化学的、または他の方法によって、通常細胞に存在しないが、細胞に導入される分子である。例示的な外因性分子としては、有機小分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞への外因性分子の導入のための方法は、当業者に既知であり、脂質媒介移動（すなわち、中性および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、生体高分子ナノ粒子、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介移動、およびウイルスベクター媒介移動を含むが、これらに限定されない。
【０１５３】
「内因性」分子は、通常、特定の環境条件下の特定の発達段階で、特定の細胞に存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、他の細胞小器官、または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、内因性ＴＣＲを含むことができる。
【０１５４】
「遺伝子」とは、このような調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接するかどうかに関わらず、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を指す。遺伝子としては、プロモーター配列、ターミネータ、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製開始点、マトリックス付着部位、および遺伝子座制御領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳により産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスにより修飾されたＲＮＡ、および例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化により修飾されたタンパク質も含む。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「ゲノム編集」という用語は、遺伝子の発現を回復、補正、および／または修正する、細胞のゲノムにおける標的部位で遺伝子材料の置換、欠失、および／または導入を指す。特定の実施形態において企図されるゲノム編集は、任意に、ドナー修復テンプレートの存在下で、細胞のゲノムにおける標的部位でＤＮＡ病変を生成するために、１つ以上の操作されたヌクレアーゼを細胞に導入することを含む。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、細胞内の全遺伝子材料にＤＮＡまたはＲＮＡの形態における追加の遺伝子材料の染色体または染色体外の添加を指す。遺伝子改変は、細胞のゲノムにおける特定の部位に標的化され得るか、または非標的化され得る。一実施形態において、遺伝子改変は、部位特異的である。一実施形態において、遺伝子改変は、部位特異的ではない。
【０１５８】
Ｃ．ゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞
特定の実施形態において企図される方法によって製造されるゲノム編集された細胞は、改善されたＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を含む。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含む。驚くべきことには、本発明者らは、本明細書において企図される方法によって製造される１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞が、増大した治療有効性、例えば、炎症性サイトカイン、例えば、腫瘍細胞に対してＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解活性を増大させる、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、および細胞毒素を含む他の分子、例えば、パーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢの抗原依存性分泌の増加に染まっていることが発見している。いずれの特定の理論によって拘束されるものではないが、増大したＣＡＲ  Ｔ細胞有効性が、一部分において、ＣＡＲのためのアクセサリーシグナル伝達成分を解放するＴＣＲ  αβ受容体発現の低下、サイトカイン分泌の増加、および持続性シグナル伝達の低減によるものであることが企図される。
【０１５９】
様々な実施形態において、ゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、本明細書において企図される遺伝子編集する組成物および方法によって改変された１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子を含む。
【０１６０】
一実施形態において、ゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子、およびＣＡＲをコードする核酸を含む。
【０１６１】
一実施形態において、ゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子、およびＣＡＲをコードする核酸を含む１つ以上のプロウイルス組み込み体を含む。一実施形態において、プロウイルス組み込み体は、レトロウイルスまたはレンチウイルス系プロウイルス組み込み体である。
【０１６２】
一実施形態において、ゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含み、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子は、相同組換え修復によって、ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー修復テンプレートを１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子に挿入することによって改変されている。
【０１６３】
特定の実施形態において、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する方法は、Ｔ細胞の集団を活性化し、Ｔ細胞の集団を刺激して、増殖することと、操作されたヌクレアーゼをＴ細胞の集団に導入して、ＴＣＲα対立遺伝子で二本鎖切断を生じることと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を、Ｔ細胞に導入することと、を含む。
【０１６４】
ある特定の実施形態において、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する方法は、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して、増殖することと、ＣＡＲをコードするウイルスベクターをＴ細胞に形質導入することと、を含む。操作されたヌクレアーゼの発現は、ＮＨＥＪによって優先的に修復されるＴＣＲα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断を形成する。一実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼは、３´末端プロセシング酵素、例えば、Ｔｒｅｘ２などの３´−５´エキソヌクレアーゼを有する細胞に導入されて、ＮＨＥＪによって二本鎖切断を修復するために偏向を増加させる。一実施形態において、Ｔ細胞は、レトロウイルスベクター、例えば、ＣＡＲをコードする、ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターで形質導入する。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する方法は、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して、増殖することと、ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターをＴ細胞に形質導入することと、を含み、操作されたヌクレアーゼの発現は、ＴＣＲα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断を形成し、ドナー修復テンプレートは、二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位で相同組換え修復（ＨＤＲ）によってＴＣＲα対立遺伝子に組み込まれる。一実施形態において、ドナーテンプレートは、ＣＡＲをコードする核酸に作動可能に連結されたＲＮＡｐｏｌ  ＩＩプロモーターをさらに含む。
【０１６６】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、自家性／自律性（「自己」）であっても、非自家性（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であってもよい。本明細書で使用される場合、「自家」は、同じ対象からの細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同種」は、比較する際に細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同系」は、比較する際に細胞と遺伝的に同一である異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「異種」は、比較する際に細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、哺乳類対象から得られる。より好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、霊長類対象から得られる。最も好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、ヒト対象から得られる。
【０１６７】
Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含むが、これらに限定されない、いくつかの供給源から得ることができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、当業者に既知の任意の数の技術、例えば沈降、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などを使用して、対象から収集された血液単位から得ることができる。
【０１６８】
他の実施形態において、単離または精製されたＴ細胞集団が、使用される。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣの単離後、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球との両方が、活性化、増幅、および／または遺伝子改変の前または後に、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、およびエフェクターＴ細胞の亜集団に分別され得る。
【０１６９】
マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７、およびＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定のサブ集団は、正または負の選択技法により更に単離され得る。一実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、またはＣＤ３８もしくはＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定のサブ集団は、正または負の選択技法により更に単離され得る。様々な実施形態において、製造されたＴ細胞組成物は、マーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、およびＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しない、または実質的に発現しない。
【０１７０】
一実施形態において、単離または精製されたＴ細胞集団は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、マーカーのうちの１つ以上発現する。
【０１７１】
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、ゲノム編集する前に、個体から単離され、まず、活性化し、刺激して、インビトロで増殖する。
【０１７２】
Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を達成するために、Ｔ細胞は、多くの場合、１つ以上の刺激、活性化、および／または拡大させる。Ｔ細胞は、一般的に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、および同第６，８６７，０４１号（それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法を使用して、活性化および増幅させ得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞を、活性化し、Ｔ細胞へのゲノム編集組成物の導入前に、約１日〜約４日間、約１〜約３日間、約１〜約２日間、約２〜約３日間、約２〜約４日間、約３〜約４日間、または約１日間、約２日間、約３日間、または約４日間増幅させる。
【０１７３】
特定の実施形態において、Ｔ細胞は、活性化し、Ｔ細胞へのゲノム編集組成物の導入前に、約６時間、約１２時間、約１８時間、または約２４時間増幅させる。
【０１７４】
一実施形態において、Ｔ細胞は、ゲノム編集組成物がＴ細胞に導入されると同時に活性化する。
【０１７５】
一実施形態において、共刺激リガンドが、Ｔ細胞上の同族の共刺激分子に特異的に結合する抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）で提示され、それにより、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によりもたらされる一次シグナルに加えて、所望のＴ細胞応答を媒介するシグナルが提供される。好適な共刺激リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、リンフォトキシンベータ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合する作動薬または抗体、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
特定の実施形態において、共刺激リガンドは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０１７７】
好適な共刺激リガンドは、標的抗原をさらに含み、これは、可溶形態で提供されても、またはゲノム編集されたＴ細胞で発現する操作された抗原受容体に結合するＡＰＣもしくはａＡＰＣで発現してもよい。
【０１７８】
様々な実施形態において、ゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞を生成する方法は、Ｔ細胞を含む細胞の集団を活性化させること、およびＴ細胞の集団を増幅させることを含む。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって、一次刺激シグナルを提供すること、およびアクセサリー分子、例えばＣＤ２８によって二次共刺激シグナルを提供することによって達成され得る。
【０１７９】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、好適なＣＤ３結合剤、例えばＣＤ３リガンドまたは抗ＣＤ３モノクローナル抗体とＴ細胞を接触させることによって刺激され得る。ＣＤ３抗体の例示的な例としては、ＯＫＴ３、Ｇ１９−４、ＢＣ３、および６４．１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８０】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって提供される一次刺激シグナルに加えて、Ｔ細胞応答の誘導は、第２の共刺激シグナルを必要とする。特定の実施形態において、ＣＤ２８結合剤は、共刺激シグナルを提供するために使用され得る。ＣＤ２８結合剤の例示的な例としては、天然のＣＤ２８リガンド、例えば、ＣＤ２８の天然リガンド（例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）などのタンパク質のＢ７ファミリーのメンバー；ＣＤ２８を架橋することができる抗ＣＤ２８モノクローナル抗体またはその断片、例えば、モノクローナル抗体９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８、ＫＯＬＴ−２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、およびＥＸ５．３Ｄ１０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
一実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって刺激を提供する分子、および共刺激分子は、同じ表面に結合する。
【０１８２】
ある特定の実施形態において、刺激シグナルおよび共刺激シグナルを提供する結合剤は、細胞の表面上に局在化される。これは、細胞表面上でのその発現に好適な形態における結合剤をコードする核酸を細胞にトランスフェクトもしくは形質導入することによって、あるいは結合剤を細胞表面に結合させることによって達成することができる。
【０１８３】
別の実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって刺激を提供する分子、および共刺激分子は、抗原提示細胞で提示される。
【０１８４】
一実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって刺激を提供する分子、および共刺激分子は、別々の表面上に提供される。
【０１８５】
ある特定の実施形態において、刺激シグナルおよび共刺激シグナルを提供する結合剤のうちの１つは、可溶性であり（溶液で提供され）、他の薬剤（複数可）は、１つ以上の表面上に提供される。
【０１８６】
特定の実施形態において、刺激シグナルおよび共刺激シグナルを提供する結合剤は、両方とも可溶形態で提供される（溶液で提供される）。
【０１８７】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞を作製するための方法は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でＴ細胞を活性化させることを含む。
【０１８８】
一実施形態において、本明細書において企図される方法によって活性化されたＴ細胞の増幅は、Ｔ細胞を含む細胞の集団を、数時間（約３時間）から約７日間〜約２８日間、またはそれらの間の任意の時間単位の整数値にわたって培養することをさらに含む。別の実施形態において、Ｔ細胞組成物は、１４日間培養され得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、約２１日間培養される。別の実施形態において、Ｔ細胞組成物は、約２〜３日間培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上になり得るように、数サイクルの刺激／活性化／増幅が望ましい場合もある。
【０１８９】
特定の実施形態において、Ｔ細胞培養に適切な条件としては、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉａ  １６４０もしくはＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ））、ならびに、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−α、または当業者に既知の細胞の増殖に好適な任意の他の添加剤を含むが、これらに限定されない、増殖および生存能に必要な１つ以上の要素が挙げられる。
【０１９０】
細胞培養培地のさらなる例証となる例としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、血清不含であるか、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）または定義されたホルモン一式、ならびに／またはＴ細胞の増殖および増幅に十分な量のサイトカイン（複数可）が補充された、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５、およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験用培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖の支持に必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）に維持される。
【０１９２】
特定の実施形態において、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、および／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培養培地において、概してビーズまたは他の表面に結合した抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体などの刺激剤および共刺激剤と接触させられる。
【０１９３】
他の実施形態において、種々の共刺激分子およびサイトカインの安定した発現および分泌を指向するようにＫ５６２、Ｕ９３７、７２１．２２１、Ｔ２、およびＣ１Ｒ細胞を操作することにより作製された人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）。特定の実施形態において、Ｋ３２またはＵ３２  ａＡＰＣは、ＡＡＰＣ細胞表面上に１つ以上の抗体ベースの刺激分子の表示を指向するために使用される。Ｔ細胞集団は、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、および／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６を含むが、これらに限定されない、様々な共刺激分子を発現するａＡＰＣにより増幅され得る。最後に、ａＡＰＣは、遺伝子改変Ｔ細胞を増幅し、ＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２８発現を維持するために、効率的なプラットホームを提供する。ＷＯ０３／０５７１７１およびＵＳ２００３／０１４７８６９に提供されるａＡＰＣは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９４】
様々な実施形態において、改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を生成する方法は、本明細書において企図される１つ以上の操作されたヌクレアーゼをＴ細胞の集団に導入して、ＴＣＲα対立遺伝子で二本鎖切断を生じることを含む。
【０１９５】
一実施形態において、本明細書において企図される１つ以上のヌクレアーゼは、活性化および刺激前に、Ｔ細胞に導入される。
【０１９６】
別の実施形態において、本明細書において企図される１つ以上のヌクレアーゼは、Ｔ細胞が刺激されるのとほぼ同時にＴ細胞に導入される。
【０１９７】
好ましい実施形態において、本明細書において企図される１つ以上のヌクレアーゼは、Ｔ細胞の活性化および刺激後、例えば、約１、２、３、または４日後に、Ｔ細胞に導入される。特定の実施形態において、Ｔ細胞に導入されたヌクレアーゼとしては、エンドヌクレアーゼ、例えば、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ならびに任意に、末端プロセシングヌクレアーゼまたはその生物学的に活性な断片、例えば、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が挙げられるが、これらに限定されない。エンドヌクレアーゼおよび末端プロセシングヌクレアーゼは、融合タンパク質として発現され得、ポリシストロニックｍＲＮＡから発現され得るか、または独立して、１つ以上のｍＲＮＡまたは発現カセットから発現され得る。
【０１９８】
特定の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、ベクターを用いてＴ細胞に導入される。他の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、好ましくは、ｍＲＮＡとしてＴ細胞に導入される。ヌクレアーゼは、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、熱ショック、電気穿孔、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介移動などに導入され得る。
【０１９９】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集された方法は、ＮＨＥＪを介して優先的に修復される標的部位でＤＳＢを形成するために、本明細書において企図される１つ以上の操作されたヌクレアーゼを、活性化および刺激されたＴ細胞の集団に導入することと、続いて、Ｔ細胞の集団に、ＣＡＲをコードするベクターを形質導入することと、を含む。
【０２００】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集された方法は、標的部位でＤＳＢを形成するために、本明細書において企図される１つ以上の操作されたヌクレアーゼを、活性化および刺激されたＴ細胞の集団に導入することと、続いて、１つ以上のドナー修復テンプレートを、相同組換えによってＤＳＢ部位で細胞のゲノムに組み込まれるであろうＴ細胞の集団に導入することと、を含む。
【０２０１】
特定の実施形態において、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のドナーテンプレートは、Ｔ細胞の集団に導入される。ドナーテンプレートは、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、熱ショック、電気穿孔、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移動などに導入され得る。
【０２０２】
好ましい実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ電気穿孔によってＴ細胞に導入され、１つ以上のドナー修復テンプレートは、ウイルス形質導入によってＴ細胞に導入される。
【０２０３】
別の好ましい実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ電気穿孔によってＴ細胞に導入され、１つ以上のドナー修復テンプレートは、ＡＡＶ形質導入によってＴ細胞に導入される。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からのＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のうちのいずれか１つからの血清型を含み得る。好ましい実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からのＩＴＲ、およびＡＡＶ６からの血清型を含み得る。
【０２０４】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、１つ以上の相同アームを含む。本明細書で使用される場合、「相同アーム」という用語は、標的部位でヌクレアーゼによって導入されるＤＮＡ切断に隣接するＤＮＡ配列と同一する、またはほぼ同一であるドナーテンプレート中の核酸配列を指す。一実施形態において、ドナーテンプレートは、ＤＮＡ切断部位の５´のＤＮＡ配列と同一する、またはほぼ同一である核酸を含む５´相同アームを含む。一実施形態において、ドナーテンプレートは、ＤＮＡ部位の３´のＤＮＡ配列と同一する、またはほぼ同一である核酸を含む３´相同アームを含む。好ましい実施形態において、ドナーテンプレートは、５´相同アームと３´相同アームとを含む。
【０２０５】
特定の実施形態において企図される相同アームの好適な長さの例示的な例は、独立して、選択され得、相同アームの全ての介在長さを含む、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約２６００ｂｐ、約２７００ｂｐ、約２８００ｂｐ、約２９００ｂｐ、または約３０００ｂｐ、もしくはそれ以上の相同アームが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０２０６】
好適な相同アームの長さのさらなる例示的な例としては、相同アームの全ての介在長さを含む、約１００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約１５００ｂｐ、または約１０００ｂｐ〜約１５００ｂｐが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
特定の実施形態において、５´および３´相同アームの長さは、独立して、約５００ｂｐ〜約１５００ｂｐから切断される。一実施形態において、５´相同アームは、約１５００ｂｐであり、３´相同アームは、約１０００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは、約６００ｂｐであり、３´相同アームは、約６００ｂｐである。
【０２０８】
ドナー修復テンプレートは、本明細書において他の箇所に企図される、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどを１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含み得る。
【０２０９】
様々な実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５´相同アーム、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＣＡＲ、および３´相同アームを含む。
【０２１０】
別の好ましい実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ電気穿孔によってＴ細胞に導入され、１つ以上のドナー修復テンプレートは、レンチウイルス形質導入によってＴ細胞に導入される。レンチウイルスベクター骨格は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来し得る。レンチウイルスベクターは、組み込みコンピテントまたはインテグリーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）であり得る。一実施形態において、ＨＩＶ系ベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列要素）を含むＩＤＬＶベクターが、好ましい。
【０２１１】
１つ以上のドナー修復テンプレートは、１つ以上の操作されたヌクレアーゼが細胞に導入される前、それと同時に、またはその後に送達され得る。ある特定の実施形態において、１つ以上のドナー修復テンプレートは、１つ以上の操作されたヌクレアーゼと同時に送達される。他の実施形態において、１つ以上のドナー修復テンプレートは、１つ以上の操作されたヌクレアーゼの前に、例えば、１つ以上の操作されたヌクレアーゼの約１分〜約３０分、約１分〜約６０分、約１分〜約９０分、約１時間〜約２４時間前に、または１つ以上の操作されたヌクレアーゼの２４時間以上前が挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上のドナー修復テンプレートの数秒〜数時間前に送達される。ある特定の実施形態において、１つ以上のドナー修復テンプレートは、ヌクレアーゼの後、好ましくは、約１、２、３、４、５、６、７、もしくは８時間以内に、より好ましくは、約１、２、３、もしくは４時間以内に、またより好ましくは、約４時間以内に送達される。
【０２１２】
１つ以上のドナー修復テンプレートは、１つ以上の操作されたヌクレアーゼと同じ送達システムを用いて送達され得る。非限定的な例として、同時に送達したとき、ドナー修復テンプレートおよび操作されたヌクレアーゼは、同じベクター、例えば、ＩＤＬＶレンチウイルスベクターまたはＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）によってコードされ得る。特定の好ましい実施形態において、操作されたヌクレアーゼ（複数可）は、ｍＲＮＡ電気穿孔によって送達され、ドナー修復テンプレートは、ＡＡＶベクターによる形質導入によって送達される。
【０２１３】
特定の実施形態において、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を用いてＣＡＲ  Ｔ細胞を生成する方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、および／もしくはＩＬ−１５などの適切なサイトカイン、ならびに／またはＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤を含む細胞培地中で、細胞を、刺激剤および共刺激剤、例えば、可溶性抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、またはビーズもしくは他の表面に結合した抗体と接触させることを含む。
【０２１４】
本明細書で使用される場合、「ＰＩ３Ｋ阻害剤」という用語は、ＰＩ３Ｋに結合し、その少なくとも１つの活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または有機小分子を指す。ＰＩ３Ｋタンパク質は、クラス１のＰＩ３Ｋ、クラス２のＰＩ３Ｋ、およびクラス３のＰＩ３Ｋの３つのクラスに分けることができる。クラス１のＰＩ３Ｋは、４つのｐ１１０触媒サブ単位（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γ）のうちの１つ、ならびに調節サブ単位の２つのファミリーのうちの１つからなるヘテロ二量体として存在する。特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤を標的化する。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤の１つ以上のアイソフォームに選択性（すなわち、ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γ、またはｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γのうちの１つ以上に対する選択性）を示すであろう。別の態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はアイソフォーム選択性を提示せず、「汎ＰＩ３Ｋ阻害剤」とみなされるであろう。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ触媒ドメインとの結合に関してＡＴＰと競合するであろう。
【０２１５】
特定の実施形態で使用するのに好適なＰＩ３Ｋ阻害剤の例示的な例としては、ＢＫＭ１２０（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ１４７（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、（汎ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、およびＰＸ−８６６（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤；ｐ１１０α、ｐ１１０β、およびｐ１１０γアイソフォーム、Ｏｎｃｏｔｈｙｒｅｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１６】
選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤の他の例示的な例としては、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＺＳＴＫ４７４、およびＩＰＩ−１４５が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１７】
汎ＰＩ３Ｋ阻害剤のさらに例示的な例としては、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＳＫ１０５９６１５、ＴＧ１００７１３、およびＧＤＣ−０９４１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１８】
好ましい実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＺＳＴＫ４７４である。
【０２１９】
Ｄ．ヌクレアーゼ
特定の実施形態において企図される免疫エフェクター細胞組成物は、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子を標的化する操作されたヌクレアーゼで達成されたゲノム編集によって生成される。
【０２２０】
様々な実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子において標的ＤＮＡ配列を結合し、切断するように設計される、操作されたヌクレアーゼを用いて編集される。特定の実施形態において企図される操作されたヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドテンプレート、例えば、ドナー修復テンプレートの不在下で、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）によって修復され、続いて、ＣＡＲをコードするウイルスで形質導入され得るか、または相同組換え修復（ＨＤＲ）、すなわち、ＣＡＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で相同組換えによって修復され得る、標的ポリヌクレオチド配列中の二本鎖切断を導入するために使用することができる。ある特定の実施形態において企図される操作されたヌクレアーゼはまた、ドナー修復テンプレートの存在下で、細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）機構または相同組換えを用いて修復され得る一本鎖ＤＮＡ切断を生じさせる、ニッカーゼとして操作され得る。ＮＨＥＪは、遺伝子機能を妨害する小挿入および欠失の形成を頻繁にもたらす変異性プロセスである。相同組換えは、修復のためのテンプレートとして相同ＤＮＡを必要とし、標的部位を隣接する領域に相同性を持っている配列によっていずれかの側上に隣接された、標的部位で所望の配列を含有するドナーＤＮＡの導入によって特定された無限の様々な修正をもたらすように活用され得る。
【０２２１】
「操作されたヌクレアーゼ」とは、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼを指し、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断標的配列に隣接したＤＮＡ結合標的配列に結合するように設計および／または改変されている。操作されたヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼまたは事前に操作されたヌクレアーゼから設計および／または改変され得る。特定の実施形態において企図される操作されたヌクレアーゼは、１つ以上のさらなる機能ドメイン、例えば、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。特定の実施形態において、操作されたＨＥは、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素を有するＴ細胞に導入される。ＨＥおよび３´プロセシング酵素は、別々に、例えば、異なるベクターまたは別々のｍＲＮＡで、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
【０２２２】
標的配列に結合および切断するように操作され得るヌクレアーゼの例示的な例としては、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、メガＴＡＬ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、およびクラスタ化調節的スペース間短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓヌクレアーゼシステムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるヌクレアーゼは、１つ以上の異種ＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガＴＡＬ）を含む（Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。他の実施形態において、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位（例えば、同族体結合部位とは異なる部位に結合するように操作されているメガヌクレアーゼ）に結合するように改変され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、それらの同族体結合部位とは異なる標的部位に結合するように設計されている（Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、標的部位（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）にヌクレアーゼを標的化するように核酸配列を必要とする。
【０２２４】
様々な実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、ＴＣＲα遺伝子座における一本鎖ニックまたは二本鎖切断（ＤＳＢ）に結合し、導入するように操作されている。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」および「メガヌクレアーゼ」は、同義に使用され、１２〜４５個の塩基対切断部位を認識し、一般に、配列および構造モチーフに基づいた５つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓ  ｂｏｘ、およびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫに分類される、天然に存在するヌクレアーゼまたは操作されたメガヌクレアーゼを指す。
【０２２５】
操作されたＨＥは、実際に存在せず、組換えＤＮＡ技術またはランダム変異誘発によって得ることができる。操作されたＨＥは、天然に存在するＨＥまたは事前に操作されたＨＥにおいて、１つ以上のアミノ酸改変を行う、例えば、１つ以上のアミノ酸を変異、置換、添加、または欠失することによって得られ得る。特定の実施形態において、操作されたＨＥは、ＤＮＡ認識界面への１つ以上のアミノ酸改変を含む。
【０２２６】
「ＤＮＡ認識界面」とは、核酸標的塩基と相互作用するＨＥアミノ酸残基、ならびに隣接するような残基を指す。各ＨＥにおいて、ＤＮＡ認識界面は、側鎖−側鎖接触および側鎖−ＤＮＡ接触の広範なネットワークを含み、その大部分は、必然的に特定の核酸標的配列を認識するのに特有である。それ故に、特定の核酸配列に対応するＤＮＡ認識界面のアミノ酸配列は、著しく変化し、任意の天然または操作されたＨＥの特徴である。非限定的な例として、特定の実施形態において企図される操作されたＨＥは、天然ＨＥ（または事前に操作されたＨＥ）のＤＮＡ認識界面中に局在する１つ以上のアミノ酸残基を変異させた、ＨＥバリアントのライブラリーを構築することによって得られ得る。ライブラリーは、切断アッセイを用いて、各予想ＴＣＲα遺伝子座標的部位に対する標的切断活性についてスクリーニングされ得る（例えば、Ｊａｒｊｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（２０）：６８７１−６８８０を参照されたい）。
【０２２７】
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）は、メガヌクレアーゼの最も良く研究されたファミリーであり、主に、古細菌ならびに緑藻類および菌類におけるオルガネラＤＮＡにおいてコードされ、最高全体のＤＮＡ認識特異性を示す。ＬＨＥは、１タンパク質鎖当たり１つまたは２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ触媒モチーフを含み、それぞれ、ホモ二量体または一本鎖モノマーとして機能する。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質の構造研究は、高度に保存されたコア構造を特定し（Ｓｔｏｄｄａｒｄ  ２００５）、αββαββα折り畳みによって特徴とし、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフがこの折り畳みの第１のらせんに属する。ＬＨＥの高度に効率的かつ特定の切断は、新規の高度に特異的なエンドヌクレアーゼを得るためにタンパク質の骨組みを表す。しかしながら、非天然または非標準的な標的部位に結合および切断するために操作されたＬＨＥは、適切なＬＨＥ骨組みの選択、標的遺伝子座の検査、推定上の標的部位の選択、およびＬＨＥの広範囲な改変を、標的部位における塩基対位置の最大３分の２で、そのＤＮＡ接触点および切断特異性を改変するために必要とする。
【０２２８】
操作されたＬＨＥが設計され得るＬＨＥの例示的な例としては、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２９】
一実施形態において、操作されたＬＨＥは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択される。
【０２３０】
一実施形態において、操作されたＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩである。例えば、配列番号１および２を参照されたい。
【０２３１】
一実施形態において、ヒトＴＣＲα遺伝子を標的化する操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、天然Ｉ−ＯｎｕＩから生成された。好ましい実施形態において、ヒトＴＣＲα遺伝子を標的化する操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、事前に操作されたＩ−ＯｎｕＩから生成された。一実施形態において、操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、配列番号３に記載されるヒトＴＣＲα遺伝子標的部位に対して生成された。一実施形態において、操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、配列番号４に記載されるヒトＴＣＲα遺伝子標的部位に対して生成された。
【０２３２】
特定の実施形態において、操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、ＤＮＡ認識界面への１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩのＤＮＡ認識界面（Ｔａｅｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１  Ａｕｇ  ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）、または配列番号５、６、もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩの操作されたバリアント、またはそのさらに操作されたバリアントと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。
【０２３３】
一実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩのＤＮＡ認識界面（Ｔａｅｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１  Ａｕｇ  ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）、または配列番号５、６、もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩの操作されたバリアント、またはそのさらに操作されたバリアントと少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％，より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を含む。
【０２３４】
特定の実施形態において、操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、ＤＮＡ認識界面において、特に、Ｉ−ＯｎｕＩの位置２４〜５０、６８〜８２、１８０〜２０３、および２２３〜２４０から位置しているサブドメイン（配列番号２）、または配列番号５、６、もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩの操作されたバリアント、またはそのさらに操作されたバリアントにおいて１つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。
【０２３５】
一実施形態において、操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩ配列全体内に他の場所に位置しているさらなる位置で１つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。置換および／または改変され得る残基としては、核酸標的に接触するか、または直接もしくは水分子を介して核酸骨格もしくはヌクレオチド塩基と相互作用するアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。１つの非限定的な例において、本明細書において企図される操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩの位置：１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６  ７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置（配列番号２）、または配列番号５、６、もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩの操作されたバリアント、またはそのさらに操作されたバリアントにおいて１つ以上の置換および／または改変、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２５を含む。
【０２３６】
特定の実施形態において、本明細書において企図される操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｌ２６Ｉ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｅ、Ｖ３７Ｎ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ，Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｔ、Ｎ７５Ｒ、Ｓ７８Ｍ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｙ、Ｆ１８２Ｇ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１９０Ｇ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｙ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｓ、Ｋ２２５Ｗ、およびＤ２３６Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換および／または改変を含む。
【０２３７】
一実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、配列番号５、６、もしくは７に記載のアミノ酸配列、またはそのさらに操作されたバリアントを有する。
【０２３８】
様々な例示的な実施形態は、ＴＣＲα遺伝子座の標的領域に結合し、切断するメガＴＡＬヌクレアーゼを企図する。「メガＴＡＬ」とは、操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび操作されたメガヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼを指し、ならびに任意に、１つ以上のリンカーおよび／またはさらなる機能ドメイン、例えば、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、メガＴＡＬは、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素を有するＴ細胞に導入され得る。メガＴＡＬおよび３´プロセシング酵素は、別々に、例えば、異なるベクターまたは別々のｍＲＮＡで、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
【０２３９】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」は、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥエフェクターまたはＴＡＬエフェクター）のＤＮＡ結合部分である（例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、初めから、または天然に存在するＴＡＬＥ、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｇａｒｄｎｅｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｌｆａｌｆａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅからのＡｖｒＢｓ３、ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍからのｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７で操作される。ＤＮＡ結合ドメインを誘発および設計するためのＴＡＬＥタンパク質の例示的な例は、米国特許第９，０１７，９６７号およびその中に言及される参照文献において開示され、これらのすべてが、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４０】
特定の実施形態において、メガＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのその対応する標的ＤＮＡ配列への結合に関与する１つ以上の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長である。各ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位は、典型的には、反復の１２位および／または１３位で反復可変二残基（ＲＶＤ）を作製する１または２つのＤＮＡ結合残基を含む。１２位および１３位でＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧは、Ｔに結合し、ＮＩはＡに結合し、ＮＮは、ＧまたはＡに結合し、ＮＧは、Ｔに結合するように、これらのＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ認識のための天然（正準）コードが決定されている。ある特定の実施形態において、非正準（非定型）ＲＶＤが、企図される。
【０２４１】
特定の実施形態において企図される特定のメガＴＡＬで用いるのに好適な非正準ＲＶＤの例示的な例としては、グアニン（Ｇ）の認識のためのＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、ＳＳ、ＮＮ、ＳＮ、ＫＮ；アデニン（Ａ）の認識のためのＮＩ、ＫＩ、ＲＩ、ＨＩ、ＳＩ；チミン（Ｔ）の認識のためのＮＧ、ＨＧ、ＫＧ、ＲＧ；シトシン（Ｃ）の認識のためのＲＤ、ＳＤ、ＨＤ、ＮＤ、ＫＤ、ＹＧ；ＡまたはＧの認識のためのＮＶ、ＨＮ；およびＡまたはＴまたはＧまたはＣの認識のためのＨ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、Ｓ＊が挙げられるが、これらに限定されず、式中、（＊）は、１３位でアミノ酸が不在することを意味する。特定の実施形態において企図される特定のメガＴＡＬで用いるのに好適なＲＶＤのさらなる例示的な例は、米国特許第８，６１４，０９２号に開示されるものをさらに含み、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４２】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、３〜３０反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、メガＴＡＬは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、５〜１３反復単位、より好ましくは７〜１２反復単位、より好ましくは９〜１１反復単位、およびより好ましくは９、１０、または１１反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０２４３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、３〜３０反復単位、および一連のＴＡＬＥ反復単位のＣ末端で位置している２０アミノ酸を含むさらなる単一の切断型ＴＡＬＥ反復単位、すなわち、さらなるＣ末端半ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む（本明細書において他の箇所に開示されるＣキャップのアミノ酸−２０〜−１、以下に参照）。それ故に、特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、３．５〜３０．５反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、メガＴＡＬは、３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、５．５〜１３．５の反復単位、より好ましくは、７．５〜１２．５の反復単位、より好ましくは、９．５〜１１．５の反復単位、およびより好ましくは９．５、１０．５、または１１．５の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０２４４】
特定の実施形態において、メガＴＡＬは、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチド、１つ以上のＴＡＬＥ繰り返しドメイン／単位、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチド、および操作されたメガヌクレアーゼを含む。
【０２４５】
本明細書で使用される場合、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドという用語は、天然に存在するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＮＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位が、ＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さからのものであり得る。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対して少なくとも１２０〜少なくとも１４０もしくはそれ以上のアミノ酸のＮ末端を含む（０は、ほとんどのＮ末端反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤ  ポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対して少なくとも約１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または少なくとも１４０のアミノ酸のＮ末端を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくとも約アミノ酸＋１〜＋１２２から少なくとも約＋１〜＋１３７のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、ほとんどのＮ末端反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対して少なくとも約１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７のアミノ酸のＮ末端を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸＋１〜＋１２１のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、ほとんどのＮ末端反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤ  ポリペプチドは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対して少なくとも約１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７のアミノ酸のＮ末端を含む。
【０２４６】
本明細書で使用される場合、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドという用語は、天然に存在するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＣＴＤは、存在する場合、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位が、ＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さからのものであり得る。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復への少なくとも２０〜少なくとも８５またはそれ以上のアミノ酸のＣ末端を含む（初めの２０のアミノ酸は、最後のＣ末端完全反復単位に対して半反復単位のＣ末端である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対して少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または少なくとも８５のアミノ酸のＣ末端を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質のうちの少なくとも約−２０〜−１のアミノ酸のＣＴＤポリペプチドを含む（−２０は、最後のＣ末端完全反復単位に対してアミノ酸１の半反復単位のＣ末端である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対して少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１のアミノ酸のＣ末端を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質のうちの少なくとも約−２０〜−１のアミノ酸のＣＴＤポリペプチドを含む（−２０は、最後のＣ末端完全反復単位に対してアミノ酸１の半反復単位のＣ末端である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対して少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１のアミノ酸のＣ末端を含む。
【０２４７】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、標的配列に結合するように操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、標的配列に結合し、切断するように操作されたメガヌクレアーゼ、ならびに任意に、任意に、本明細書において他の箇所に企図される１つ以上のリンカーポリペプチドで互いに結合される、ＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドを含む、融合ポリペプチドを含む。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含むメガＴＡＬ、ならびに任意に、ＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドが、操作されたメガヌクレアーゼにさらに融合されるリンカーポリペプチドに融合されることが企図される。それ故に、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインによって結合した標的配列から離れて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド以内であるＤＮＡ標的配列に結合する。このように、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、ゲノム編集の特異性および効率を増加させる。
【０２４８】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合反復単位、ならびにＩ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩ、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩからなる群から選択される操作されたＬＨＥを含む。
【０２４９】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合反復単位のＮＴＤ、ＣＴＤ、ならびにＩ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、または好ましくは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩ、またはより好ましくは、Ｉ−ＯｎｕＩからなる群から選択される操作されたＬＨＥを含む。
【０２５０】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、約９．５〜約１１．５のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合反復単位のＮＴＤ、ならびにＩ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、または好ましくは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩ、またはより好ましくは、Ｉ−ＯｎｕＩからなる群から選択される操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥを含む。
【０２５１】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、約１２２アミノ酸〜１３７アミノ酸、約９．５、約１０．５、または約１１．５の結合反復単位のＮＴＤ、約２０アミノ酸〜約８５アミノ酸のＣＴＤ、ならびにＩ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、または好ましくは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩ、またはより好ましくは、Ｉ−ＯｎｕＩからなる群から選択される操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥを含む。
【０２５２】
特定の実施形態において、ＴＣＲα遺伝子座の標的領域に結合し、切断するＴＡＬＥＮが、企図される。「ＴＡＬＥＮ」とは、本明細書において他の箇所に企図される操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメイン（またはそのエンドヌクレアーゼ半ドメイン）を含む操作されたヌクレアーゼを指し、ならびに任意に、１つ以上のリンカーおよび／またはさらなる機能ドメイン、例えば、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素を有するＴ細胞に導入され得る。ＴＡＬＥＮおよび３´プロセシング酵素は、別々に、例えば、異なるベクターまたは別々のｍＲＮＡで、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
【０２５３】
一実施形態において、標的二本鎖切断は、２つのＴＡＬＥＮを用いて達成され、それぞれ、触媒活性の切断ドメインを再構成するために使用され得るエンドヌクレアーゼ半ドメインを含む。別の実施形態において、標的二本鎖切断は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび２つのエンドヌクレアーゼ半ドメインを含む単一のポリペプチドを用いて達成される。
【０２５４】
特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥＮは、ＮＴＤ、約３〜３０の反復単位、例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインを含む。
【０２５５】
特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥＮは、ＮＴＤ、約３．５〜３０．５の反復単位、例えば、約３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、ＣＴＤ、およびエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインを含む。
【０２５６】
特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥＮは、本明細書において他の箇所に開示される約１２１アミノ酸〜約１３７アミノ酸のＮＴＤ、約９．５〜約１１．５の反復単位（すなわち、約９．５、約１０．５、または約１１．５の反復単位）を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、約２０アミノ酸〜約８５アミノ酸のＣＴＤ、およびエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインを含む。
【０２５７】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、一種制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多数の種において存在し、（認識部位で）ＤＮＡとの配列特異的結合、ならびに結合部位またはその近くでＤＮＡの切断を可能にする。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合およびエンドヌクレアーゼドメインを有する。一実施形態において、ＴＡＬＥＮは、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からのエンドヌクレアーゼドメイン（またはエンドヌクレアーゼ半ドメイン）、および本明細書において他の箇所に企図される１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０２５８】
特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥＮで用いるのに好適なＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼドメインの例示的な例は、「ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｕｂｌｉｓｔ？Ｓ」で開示される少なくとも１６３３のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。
【０２５９】
特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥＮで用いるのに好適なＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼドメインのさらなる例示的な例は、Ａａｒ  Ｉ、Ａｃｅ  ＩＩＩ、Ａｃｉ  Ｉ、Ａｌｏ  Ｉ、Ａｌｗ２６  Ｉ、Ｂａｅ  Ｉ、Ｂｂｒ７  Ｉ、Ｂｂｖ  Ｉ、Ｂｂｖ  ＩＩ、ＢｂｖＣ  Ｉ、Ｂｃｃ  Ｉ、Ｂｃｅ８３  Ｉ、ＢｃｅＡ  Ｉ、Ｂｃｅｆ  Ｉ、Ｂｃｇ  Ｉ、ＢｃｉＶ  Ｉ、Ｂｆｉ  Ｉ、Ｂｉｎ  Ｉ、Ｂｍｇ  Ｉ、Ｂｐｕ１０  Ｉ、ＢｓａＸ  Ｉ、Ｂｓｂ  Ｉ、ＢｓｃＡ  Ｉ、ＢｓｃＧ  Ｉ、ＢｓｅＲ  Ｉ、ＢｓｅＹ  Ｉ、Ｂｓｉ  Ｉ、Ｂｓｍ  Ｉ、ＢｓｍＡ  Ｉ、ＢｓｍＦ  Ｉ、Ｂｓｐ２４  Ｉ、ＢｓｐＧ  Ｉ、ＢｓｐＭ  Ｉ、ＢｓｐＮＣ  Ｉ、Ｂｓｒ  Ｉ、ＢｓｒＢ  Ｉ、ＢｓｒＤ  Ｉ、ＢｓｔＦ５  Ｉ、Ｂｔｒ  Ｉ、Ｂｔｓ  Ｉ、Ｃｄｉ  Ｉ、ＣｊｅＰ  Ｉ、Ｄｒｄ  ＩＩ、ＥａｒＩ、Ｅｃｉ  Ｉ、Ｅｃｏ３１  Ｉ、Ｅｃｏ５７  Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｍ  Ｉ、Ｅｓｐ３  Ｉ、Ｆａｕ  Ｉ、Ｆｉｎ  Ｉ、Ｆｏｋ  Ｉ、Ｇｄｉ  ＩＩ、Ｇｓｕ  Ｉ、Ｈｇａ  Ｉ、Ｈｉｎ４  ＩＩ、Ｈｐｈ  Ｉ、Ｋｓｐ６３２  Ｉ、Ｍｂｏ  ＩＩ、Ｍｌｙ  Ｉ、Ｍｍｅ  Ｉ、Ｍｎｌ  Ｉ、Ｐｆｌ１１０８、Ｉ  Ｐｌｅ  Ｉ、Ｐｐｉ  Ｉ  Ｐｓｒ  Ｉ、ＲｌｅＡ  Ｉ、Ｓａｐ  Ｉ、ＳｆａＮ  Ｉ、Ｓｉｍ  Ｉ、ＳｓｐＤ５  Ｉ、Ｓｔｈ１３２  Ｉ、Ｓｔｓ  Ｉ、ＴｓｐＤＴ  Ｉ、ＴｓｐＧＷ  Ｉ、Ｔｔｈ１１１  ＩＩ、ＵｂａＰ  Ｉ、Ｂｓａ  Ｉ、およびＢｓｍＢ  Ｉからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼのものを含む。
【０２６０】
一実施形態において、本明細書において企図されるＴＡＬＥＮは、Ｆｏｋ  ＩのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。
【０２６１】
一実施形態において、本明細書において企図されるＴＡＬＥＮは、切断特異性を増強するために少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからのＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼ半ドメインを含み、任意に、エンドヌクレアーゼ半ドメインは、ホモ二量体化を最小限にするかまたは防止する１つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。
【０２６２】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態で用いるのに好適な切断半ドメインの例示的な例は、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００８０１３１９６２号、同第２００９０３１１７８７号、同第２００９０３０５３４６号、同第２０１１００１４６１６号、および同第２０１１０２０１０５５号を含み、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６３】
特定の実施形態において、ＴＣＲα遺伝子座の標的領域に結合し、切断する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が、企図される。「ＺＦＮ」は、１つ以上の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメイン（またはそのエンドヌクレアーゼ半ドメイン）を含む操作されたヌクレアーゼを指し、ならびに任意に、１つ以上のリンカーおよび／またはさらなる機能ドメイン、例えば、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。
【０２６４】
特定の実施形態において、ＺＦＮは、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素を有するＴ細胞に導入され得る。ＺＦＮおよび３´プロセシング酵素は、別々に、例えば、異なるベクターまたは別々のｍＲＮＡで、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
【０２６５】
一実施形態において、標的二本鎖切断は、２つのＺＦＮを用いて達成され、それぞれ、触媒活性の切断ドメインを再構成するために使用され得るエンドヌクレアーゼ半ドメインを含む。別の実施形態において、１つ以上の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび２つのエンドヌクレアーゼ半ドメインを含む単一のポリペプチドを用いて達成される。
【０２６６】
一実施形態において、ＺＮＦは、本明細書において他の箇所に企図されるＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン、および本明細書において他の箇所に企図されるエンドヌクレアーゼドメイン（またはエンドヌクレアーゼ半ドメイン）を含む。
【０２６７】
一実施形態において、ＺＮＦは、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン、および本明細書において他の箇所に企図されるメガヌクレアーゼを含む。
【０２６８】
特定の実施形態において、ＺＦＮは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つもしくはそれ以上の亜鉛フィンガーモチーフおよびエンドヌクレアーゼドメイン（またはエンドヌクレアーゼ半ドメイン）を有する亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む。典型的には、単一の亜鉛フィンガーモチーフは、約３０アミノ酸長である。亜鉛フィンガーモチーフは、正準Ｃ２Ｈ２亜鉛フィンガーならびに非正準亜鉛フィンガー、例えば、Ｃ３Ｈ亜鉛フィンガーおよびＣ４亜鉛フィンガーなどの両方を含む。
【０２６９】
亜鉛フィンガー結合ドメインは、任意のＤＮＡ配列に結合するように操作され得る。所与の３ｂｐのＤＮＡ標的配列に対する候補亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインが特定されており、対応する複合ＤＮＡ標的配列を標的化されるマルチフィンガーペプチド中に複数のドメインを連結するためのモジュール組み立て戦略が、考案されている。当該技術分野で既知の他の好適な方法はまた、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸を設計および構築するために使用することができ、例えば、ファージディスプレイ、ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリー、コンピュータ／合理的設計、親和性選択、ＰＣＲ、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからのクローニング、合成的構築などである（例えば、米国特許第５，７８６，５３８号、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９２：３４４−３４８（１９９５）、Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：５６８９−５６９５（１９９４）、Ｒｅｂａｒ＆Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１−６７３（１９９４）、Ｃｈｏｏ＆Ｋｌｕｇ，ＰＮＡＳ  ９１：１１１６３−１１１６７（１９９４）、Ｃｈｏｏ＆Ｋｌｕｇ，ＰＮＡＳ  ９１：１１１６８−１１１７２（１９９４）、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ８９：７３４５−７３４９（１９９２）、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：９３−９６（１９９５）、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９２：９７５２−９７５６（１９９５）、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：５５２５−５５３０（１９９７）、Ｇｒｉｅｓｍａｎ＆Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６５７−６６１（１９９７）、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９１：１１−９９−１１１０３（１９９４）を参照されたい）。
【０２７０】
個々の亜鉛フィンガーモチーフは、３つまたは４つのヌクレオチド配列に結合する。亜鉛フィンガー結合ドメインが操作されて、結合する配列（例えば、標的配列）の長さは、操作された亜鉛フィンガー結合ドメインにおける多くの亜鉛フィンガーモチーフを決定するであろう。例えば、亜鉛フィンガーモチーフが重複するサブ部位に結合しないＺＦＮについては、６ヌクレオチドの標的配列が、２フィンガー結合ドメインによって結合され、９ヌクレオチドの標的配列が、３フィンガー結合ドメインなどによって結合される。特定の実施形態において、標的部位における個々の亜鉛フィンガーモチーフのためのＤＮＡ結合部位は、連続している必要はないが、マルチフィンガー結合ドメイン中の亜鉛フィンガーモチーフ間のリンカー配列の長さおよび性質に応じて、１つまたはいくつかのヌクレオチドによって分離され得る。
【０２７１】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるＺＮＦは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つもしくはそれ以上の亜鉛フィンガーモチーフを含む亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ならびに少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および本明細書において他の箇所に企図される１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインからのエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインを含む。
【０２７２】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるＺＮＦは、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つもしくはそれ以上の亜鉛フィンガーモチーフを含む亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ならびに、Ａａｒ  Ｉ、Ａｃｅ  ＩＩＩ、Ａｃｉ  Ｉ、Ａｌｏ  Ｉ、Ａｌｗ２６  Ｉ、Ｂａｅ  Ｉ、Ｂｂｒ７  Ｉ、Ｂｂｖ  Ｉ、Ｂｂｖ  ＩＩ、ＢｂｖＣ  Ｉ、Ｂｃｃ  Ｉ、Ｂｃｅ８３  Ｉ、ＢｃｅＡ  Ｉ、Ｂｃｅｆ  Ｉ、Ｂｃｇ  Ｉ、ＢｃｉＶ  Ｉ、Ｂｆｉ  Ｉ、Ｂｉｎ  Ｉ、Ｂｍｇ  Ｉ、Ｂｐｕ１０  Ｉ、ＢｓａＸ  Ｉ、Ｂｓｂ  Ｉ、ＢｓｃＡ  Ｉ、ＢｓｃＧ  Ｉ、ＢｓｅＲ  Ｉ、ＢｓｅＹ  Ｉ、Ｂｓｉ  Ｉ、Ｂｓｍ  Ｉ、ＢｓｍＡ  Ｉ、ＢｓｍＦ  Ｉ、Ｂｓｐ２４  Ｉ、ＢｓｐＧ  Ｉ、ＢｓｐＭ  Ｉ、ＢｓｐＮＣ  Ｉ、Ｂｓｒ  Ｉ、ＢｓｒＢ  Ｉ、ＢｓｒＤ  Ｉ、ＢｓｔＦ５  Ｉ、Ｂｔｒ  Ｉ、Ｂｔｓ  Ｉ、Ｃｄｉ  Ｉ、ＣｊｅＰ  Ｉ、Ｄｒｄ  ＩＩ、ＥａｒＩ、Ｅｃｉ  Ｉ、Ｅｃｏ３１  Ｉ、Ｅｃｏ５７  Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｍ  Ｉ、Ｅｓｐ３  Ｉ、Ｆａｕ  Ｉ、Ｆｉｎ  Ｉ、Ｆｏｋ  Ｉ、Ｇｄｉ  ＩＩ、Ｇｓｕ  Ｉ、Ｈｇａ  Ｉ、Ｈｉｎ４  ＩＩ、Ｈｐｈ  Ｉ、Ｋｓｐ６３２  Ｉ、Ｍｂｏ  ＩＩ、Ｍｌｙ  Ｉ、Ｍｍｅ  Ｉ、Ｍｎｌ  Ｉ、Ｐｆｌ１１０８、Ｉ  Ｐｌｅ  Ｉ、Ｐｐｉ  Ｉ  Ｐｓｒ  Ｉ、ＲｌｅＡ  Ｉ、Ｓａｐ  Ｉ、ＳｆａＮ  Ｉ、Ｓｉｍ  Ｉ、ＳｓｐＤ５  Ｉ、Ｓｔｈ１３２  Ｉ、Ｓｔｓ  Ｉ、ＴｓｐＤＴ  Ｉ、ＴｓｐＧＷ  Ｉ、Ｔｔｈ１１１  ＩＩ、ＵｂａＰ  Ｉ、Ｂｓａ  Ｉ、およびＢｓｍＢ  Ｉからなる群から選択される少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からのエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインを含む。
【０２７３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるＺＮＦは、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つもしくはそれ以上の亜鉛フィンガーモチーフを含む亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ならびにＦｏｋ  ＩのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからのエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインを含む。
【０２７４】
一実施形態において、本明細書において企図されるＺＦＮは、切断特異性を増強するために少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼ半ドメインを含み、任意に、エンドヌクレアーゼ半ドメインは、ホモ二量体化を最小限にするかまたは防止する１つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。
【０２７５】
様々な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ（クラスタ化調節的スペース間短パリンドローム反復）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼシステムは、１つ以上のＴＣＲα遺伝子座における一本鎖ニックまたは二本鎖切断（ＤＳＢ）に結合し、導入するように操作される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、哺乳動物のゲノム操作のために使用することができる細菌システムに基づいた最近操作されたヌクレアーゼシステムである。例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−８２３、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ１５２：１１７３−１１８３、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），ｅＬｉｆｅ２：ｅ００４７１、Ｄａｖｉｄ  Ｓｅｇａｌ（２０１３）ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００５６３、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８（１１）：２２８１−２３０８、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  １６３（３）：７５９−７７１を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７６】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼ、ならびにＣａｓヌクレアーゼを標的部位に動員する１つ以上のＲＮＡ、例えば、トランス活性化ｃＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、または単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、本明細書において「単一のガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と称される１つのポリヌクレオチド配列に操作され得る。
【０２７７】
一実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼもしくはニッカーゼもしくは触媒的に死滅したＣａｓとして操作され、ＴＣＲα遺伝子座内に位置しているプロトスペーサー標的配列の部位特異的なＤＮＡ認識および部位特異的な切断のためのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡで標的複合体を形成する。プロトスペーサーモチーフは、Ｃａｓ／ＲＮＡ複合体を動員する役割を果たす、短プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する。Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓポリペプチドに特異的なＰＡＭモチーフを認識する。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、特定のＣａｓポリペプチドに特異的な特定の３´ＰＡＭ配列によって隣接された二本鎖ポリヌクレオチド配列のいずれかまたは両方の鎖を標的化し、切断するために使用することができる。ＰＡＭは、バイオインフォマティクスを用いてまたは実験的なアプローチを用いて特定され得る。Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０（１１）：１１１６−１１２１であり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７８】
一実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ以上の異種ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインまたは亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥまたは亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインへのＣａｓヌクレアーゼの融合は、ＤＮＡ切断効率および特異性を増加させる。特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、任意に、１つ以上のリンカーおよび／またはさらなる機能ドメイン、例えば、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素を有するＴ細胞に導入され得る。Ｃａｓヌクレアーゼおよび３´プロセシング酵素は、別々に、例えば、異なるベクターまたは別々のｍＲＮＡで、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
【０２７９】
様々な実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。
【０２８０】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態で用いるのに好適なＣａｓ９ポリペプチドの例示的な例としては、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｏｗｎｅｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｕｂｆｌａｖａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ、およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａが挙げられるが、これらに限定されない、細菌種から得られ得る。
【０２８１】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態で用いるのに好適なＣｐｆ１ポリペプチドの例示的な例は、とりわけ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｓｐｐ．が挙げられるが、これらに限定されない、細菌種から得られ得る。
【０２８２】
Ｃａｓ９オルトログの保存領域には、中央ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよび分割ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅ  Ｈドメインが含まれる。Ｃｐｆ１ドメインは、ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅ  Ｈドメインを有するが、認識できるＨＮＨドメインを有しない。ＨＮＨおよびＲｕｖＣ様ドメインは、それぞれ、二本鎖ＤＮＡ標的配列の１つの鎖を切断するのに関与する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼポリペプチドのＨＮＨドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＲｕｖＣ様ドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を切断する。Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１のそれぞれのＲｕｖＣ様ドメインが、標的部位の相補的または非相補的鎖を切断する二量体として作用すると予測される。特定の実施形態において、バリアントドメインのヌクレアーゼ活性を減少または排除するＨＮＨまたはＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインにおける１つ以上のアミノ酸付加、欠失、変異、または置換を含む、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアント（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）が、企図される。
【０２８３】
ドメインにおけるヌクレアーゼ活性を減少または排除するＣａｓ９  ＨＮＨ変異の例示的な例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｄ１０Ａ）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ（Ｄ９Ａ）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｄ１３Ａ）、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｄ１６Ａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８４】
ドメインにおけるヌクレアーゼ活性を減少または排除するＣａｓ９  ＲｕｖＣ様ドメインの例示的な例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、またはＮ８６３Ａ）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ（Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、またはＮ６２２Ａ）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｄ８７８Ａ、Ｈ８７９Ａ、またはＮ９０２Ａ）、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｄ５８７Ａ、Ｈ５８８Ａ、またはＮ６１１Ａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８５】
Ｅ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
特定の実施形態において、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むＴ細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作される。
【０２８６】
一実施形態において、Ｔ細胞は、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子におけるＤＳＢを導入することによって、続いて、ＣＡＲをコードするベクターをＴ細胞に形質導入することによって操作される。
【０２８７】
一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子におけるＤＳＢを導入することによって操作される。特定の実施形態において、ＣＡＲは、単一のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢで挿入される。
【０２８８】
一実施形態において、本明細書において企図される操作されたＴ細胞は、ＴＣＲα対立遺伝子で挿入されないＣＡＲを含む。
【０２８９】
様々な実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を再指向させるＣＡＲを発現する。ＣＡＲは、特定の抗腫瘍細胞免疫活性を呈するキメラタンパク質を生成するために、標的抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体ベースの特異性をＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせる分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源からの異なるタンパク質またはＤＮＡの一部で構成されることを説明する。
【０２９０】
様々な実施形態において、ＣＡＲは、特定の標的抗原に結合する細胞外ドメイン（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される）、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲの主な特性は、免疫エフェクター細胞の特異性を再指向させ、それにより、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を利用して、主要組織適合性（ＭＨＣ）依存様式で標的抗原発現細胞の細胞死を媒介することのできる分子の増殖、サイトカイン産生、食作用、または産生を誘発するそれらの能力である。
【０２９１】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍細胞上に発現する、標的ポリペプチド、例えば、標的抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」は、同義に使用され、目的とする標的抗原に特異的に結合する能力を有するＣＡＲを提供する。結合ドメインは、生物学的分子（例えば、細胞表面受容体もしくは腫瘍タンパク質、脂質、多糖、または他の細胞表面標的分子、またはその成分）に特異的に認識および結合する能力を有する、任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを含み得る。結合ドメインは、目的とする生物学的分子のために任意の天然に存在する、合成、半合成、または組換え産生された結合パートナーを含む。
【０２９２】
特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０２９３】
「抗体」は、免疫細胞により認識されるものなど、抗原決定基を含有するペプチド、脂質、多糖、または核酸など、標的抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合剤を指す。抗体は、抗原結合断片、例えば、ラクダＩｇ（ラクダ科抗体もしくはそのＶＨＨ断片）、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、またはその他の抗体断片を含む。本用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ結合抗体（二重特異性抗体など）、およびそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
【０２９４】
ある好ましい実施形態において、結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【０２９５】
別の好ましい実施形態において、結合ドメインは、ラクダ科抗体である。
【０２９６】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリーからなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含み、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１を含む。
【０２９７】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
【０２９８】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外結合ドメイン、例えば、抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、抗原は、クラスＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体である。
【０２９９】
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、様々なドメイン間のリンカー残基を含む。「可変領域リンカー配列」は、得られるポリペプチドが、同じ軽鎖および重鎖の可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対して特異的結合親和性を保持するように、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に接続し、２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性のあるスペーサー機能を提供するアミノ酸配列である。特定の実施形態において、リンカーは、１つ以上の重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメインを分離する。特定の実施形態において、ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つもしくはそれ以上のリンカーを含む。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約１〜約２５個のアミノ酸、約５〜約２０個のアミノ酸、もしくは約１０〜約２０個のアミノ酸、または任意の介在長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個またはそれ以上のアミノ酸長である。
【０３００】
特定の実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインには、１つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、および活性化が可能となるように抗原結合ドメインをエフェクター細胞の表面から離して移動させる領域を指す（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換えの起源のいずれに由来してもよい。ある特定の実施形態において、スペーサードメインは、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３を含むがこれらに限定されない、免疫グロブリンの一部である。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【０３０１】
一実施形態において、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【０３０２】
一実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインは、１つ以上の「ヒンジドメイン」に連結し、これは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、および活性化が可能となるように、抗原結合ドメインをエフェクター細胞の表面から離して位置付ける機能を果たす。ＣＡＲは一般に、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間に１つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然に生じる免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【０３０３】
本明細書に記載のＣＡＲで用いるのに好適な例示的なヒンジドメインとしては、ＣＤ８αおよびＣＤ４などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これは、これらの分子の野生型ヒンジ領域であってもよいし、変更されていてもよい。別の実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【０３０４】
一実施形態において、ヒンジは、ＰＤ−１ヒンジまたはＣＤ１５２ヒンジである。
【０３０５】
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分と細胞内シグナル伝達ドメインとを融合させ、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の形質膜に固着させる、ＣＡＲの一部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。
【０３０６】
例示的なＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファまたはベータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１に由来し得る（すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域（複数可）を含む。
【０３０７】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態において、本明細書において企図されるＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメイン、およびＣＡＲのＴＭドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを連結する、好ましくは長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の間のアミノ酸の短いオリゴ−またはポリペプチドリンカーを含む。グリシン−セリンリンカーは、特に好適なリンカーを提供する。
【０３０８】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、標的抗原に対する効果的なＣＡＲ結合のメッセージを、免疫エフェクター細胞の内部に形質導入して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、およびＣＡＲ結合標的細胞に対する細胞傷害因子の放出を含む細胞傷害活性、または細胞外ＣＡＲドメインに対する抗原結合により誘発される他の細胞応答を誘発することに関与する、ＣＡＲの部分を指す。
【０３０９】
したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に特殊機能を行わせる、タンパク質の一部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用され得るが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切り詰められた部分が使用される程度において、このような切り詰められた部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、ドメイン全体の代わりに使用され得る。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切り詰められた部分を含むことを意味する。
【０３１０】
ＴＣＲによって生成されたシグナル単独ではＴ細胞の完全な活性化に不十分であり、二次的または共刺激性のシグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン、すなわち、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存性一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、抗原依存様式で作用して二次的または共刺激性のシグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されると言うことができる。好ましい実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０３１１】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激方法または阻害方法のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激様式で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られる、シグナル伝達モチーフを含有し得る。
【０３１２】
特定の実施形態において企図されるＣＡＲで用いるのに好適な一次シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭの例示的な例としては、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特定の好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインおよび１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に、任意の順序でタンデムに連結していてよい。
【０３１３】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および増幅を増強するために、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。
【０３１４】
特定の実施形態において企図されるＣＡＲで用いるのに好適なそのような共刺激分子の例示的な例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインからなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０３１５】
様々な実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメイン；ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメイン；ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択されるポリペプチドから単離される１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインを含む。
【０３１６】
Ｆ．ポリペプチド
ＣＡＲ、ガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、およびＣａｓヌクレアーゼ、融合ポリペプチド、およびポリペプチドを発現するベクターが挙げられるが、これらに限定されない、様々なポリペプチドが、本明細書において企図される。
【０３１７】
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として同義に使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、様々な周知の組換えおよび／または合成技法のいずれかを使用して調製され得る。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えば、それらは、全長タンパク質配列、全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含み得、かつ、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然に存在するおよび天然に存在しない両方の、当該技術分野で既知の他の修飾を含み得る。
【０３１８】
本明細書で使用される「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、細胞環境から、また細胞の他の成分との会合から、ペプチドもしくはポリペプチド分子をインビトロで単離および／または精製することを指す（すなわち、それは、インビボの物質と著しく会合していない）。
【０３１９】
特定の実施形態において企図されるポリペプチドの例示的な例としては、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、治療ポリペプチド、および融合ポリペプチド、およびそのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２０】
ポリペプチドバリアントには、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な断片」または「最小限の生物学的に活性な断片」とは、天然に存在するポリペプチド活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％保持するポリペプチド断片を指す。ポリペプチド断片は、ポリペプチドを指し、これは、天然に存在するもしくは組換え産生されたポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／もしくは内部欠失、または置換を有する、単量体または多量体であり得る。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約１７００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態において、断片が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００またはそれ以上のアミノ酸長である。
【０３２１】
ポリペプチド断片の例示的な例としては、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、抗体断片、細胞外リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、多量体化ドメインが挙げられる。
【０３２２】
ポリペプチドには、「ポリペプチドバリアント」が挙げられる。ポリペプチドバリアントは、１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入において天然に存在するポリペプチドと異なり得る。そのようなバリアントは、天然に存在し得るか、または、例えば、上記のポリペプチド配列のうちの１つ以上を改変することによって合成的に生成され得る。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチドに、１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入によって、ポリペプチドの生物学的特性を改善させることが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、典型的にはバリアントが参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する場合、本明細書において企図される参照配列のいずれかに対して少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３２３】
上記のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、短縮化、および挿入を含む、様々な方法で変更され得る。このような操作方法は、当該技術分野で一般に既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける突然変異により調製され得る。突然変異誘発およびヌクレオチド配列の変更方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、およびこれらの文献中に引用される参考文献を参照されたい。目的とするタンパク質の生物活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができる。
【０３２４】
ある特定の実施形態において、バリアントは、１つ以上の保存的置換を含むであろう。「保存置換」とは、ペプチド化学分野における当業者がポリペプチドの二次構造および疎水性親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｎａｔｕｒｅ）が実質的に変化しないことを予想するように、アミノ酸が類似する性質を有する別のアミノ酸に置換されるものである。改変が、特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において行われつつ、望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体のポリペプチドをコードする機能分子も得ることができる。同等の、またはさらには改善されたバリアントポリペプチドを作り出すために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが所望される場合、当業者は、例として、例えば表１によるコードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変化させることができる。
【表１−１】
2019510503.tif 000002
【表１−２】
2019510503.tif 000003
【０３２５】
生物学的活性を消失することなく置換、挿入、または欠失させることのできるアミノ酸残基がどれかを決定する指針は、当該技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ、またはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアなどを使用して見出すことができる。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したまたは非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を伴う。天然に生じるアミノ酸は、一般に、酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電の極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸の４つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は、本技術分野における当業者に既知であり、一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく作製され得る。当業者は、全般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が実質的に生物学的活性を変更しないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。
【０３２６】
ポリペプチドバリアントは、グリコシル化形態、他の分子との凝集接合体、および無関係の化学部分との共有結合接合体（例えば、ＰＥＧ化分子）をさらに含む。共有結合バリアントは、当該技術分野で既知であるように、アミノ酸鎖内またはＮ末端もしくはＣ末端の残基に見出される基に官能基を連結することによって調製することができる。バリアントには、対立遺伝子バリアント、種バリアント、およびムテインも含まれる。タンパク質の機能活性に影響を及ぼさない領域の短縮化または欠失もバリアントである。
【０３２７】
一実施形態において、２つ以上のポリペプチドの発現が所望される場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書において他の箇所に開示されるように、およびＩＲＥＳ配列によって分離され得る。
【０３２８】
特定の実施形態において企図されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、融合ポリペプチド、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質とは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。
【０３２９】
別の実施形態において、２つ以上のポリペプチドが、本明細書において他の箇所に開示されるように、１つ以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現し得る。
【０３３０】
一実施形態において、本明細書において企図される融合タンパク質は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のヌクレアーゼ、ならびに１つ以上のリンカーおよび／または自己切断型ポリペプチドを含む。
【０３３１】
一実施形態において、本明細書において企図される融合タンパク質は、１つ以上の細胞外ドメイン、細胞外リガンド結合ドメイン、または抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびまたは１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに任意に、１つ以上の多量体化ドメインを含む。
【０３３２】
特定の実施形態において企図される融合タンパク質である、ポリペプチドの例示的な例としては、少なくともおよそを有するポリペプチドが含まれ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、ＣＡＲ、および他のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３３】
融合ポリペプチドは、典型的には、Ｃ末端とＮ末端で連結しているが、それらは、Ｃ末端とＣ末端、Ｎ末端とＮ末端、またはＮ末端とＣ末端で連結していてもよい。特定の実施形態において、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の活性が保存される限り、保存的に改変されたバリアント、多形性バリアント、対立遺伝子、変異体、サブ配列、および種間相同体も含み得る。融合ポリペプチドは、化学合成方法もしくは２つの部分間の化学連結により産生され得るか、または他の標準的な技法を使用して一般的に調製され得る。融合ポリペプチドを含む連結されたＤＮＡ配列は、本明細書において他の箇所に開示されているように、好適な転写または翻訳の制御エレメントに作動可能に連結される。
【０３３４】
融合ポリペプチドは、任意に、ポリペプチド内で１つ以上のポリペプチドまたはドメインを連結させるために使用することができるリンカーを含み得る。ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドが、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮できるように、その適切な二次および三次構造の折り畳みを確実にするのに十分な距離によって任意の２つ以上のポリペプチド構成成分を分離するために用いられ得る。そのようなペプチドリンカー配列は、当該技術分野で標準的な技術を用いて融合ポリペプチドに組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、要因：（１）それらが可撓性伸長立体配座を取ることができること、（２）それらが第１および第２のポリペプチド上の機能性エピトープと相互作用できる二次構造を取れないこと、および（３）ポリペプチド機能性エピトープと反応するかもしれない疎水性または荷電残基の欠失、に基づいて選択され得る。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒ残基を含有する。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の中性に近いアミノ酸もまた、このリンカー配列中で使用され得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６，１９８５、Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２，１９８６、米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているものを含む。リンカー配列は、特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能ドメインを分離し、立体干渉を防止するために使用することができる不要なＮ末端アミノ酸領域を含有するときには、必要とされない。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性アミノ酸配列である。リンカーポリペプチドは、１〜２００アミノ酸の長さ、１〜１００アミノ酸の長さ、または１〜５０アミノ酸の長さであり得、その間の全ての整数値を含む。
【０３３５】
例示的なリンカーとしては、次のアミノ酸配列：グリシンポリマー（Ｇ）ｎ；グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５である）；グリシン−アラニンポリマー；アラニン−セリンポリマー；ＧＧＧ（配列番号１４）；ＤＧＧＧＳ（配列番号１５）；ＴＧＥＫＰ（配列番号１６）（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号１７）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、上記参照）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１８）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６．）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号１９）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２０）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号２１）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号２２）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号２３）；ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号２４）が挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、柔軟なリンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラムを使用して（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）、またはファージディスプレイ法により、合理的に設計され得る。
【０３３６】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドドメインの各々の間または内因性オープンリーディングフレームとドナー修復テンプレートによってコードされるポリペプチドとの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含んでもよい。加えて、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルとしては、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位）、および自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が挙げられる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照されたい）。
【０３３７】
好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断型ペプチドは当業者に既知である（例えば、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２、Ｓｃｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位は、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルスＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、因子Ｘａ、およびエンテロキナーゼを含むが、これらに限定されない。その高い切断厳密性により、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号２５）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号２６）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２７）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断はＱとＧとの間またはＱとＳとの間で生じる）が一実施形態において好ましい。
【０３３８】
ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａもしくは２Ａ様の部位、配列、またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。特定の実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
【０３３９】
一実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ−１）２Ａペプチド、Ｔｈｅｉｌｏｖｉｒｕｓ２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。
【０３４０】
２Ａ部位の例示的な例を、表２に提供する。
【表２】
2019510503.tif 000004
【０３４１】
Ｇ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドとしては、プレ−メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、合成ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４２】
ポリヌクレオチドとは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００もしくはそれ以上のヌクレオチドの長さ、ならびに全ての中間の長さのヌクレオチドの多量体型を指す。この文脈において、「中間の長さ」が、引用された値の間の任意の長さ、例えば、６、７、８、９など、１０１、１０２，、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などを意味することは、容易に理解されるであろう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列のいずれかに対して少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０３４３】
様々な例示的な実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドとしては、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、ＣＡＲ、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに発現ベクター、ウイルスベクター、および運搬プラスミドを含むポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４４】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または下文に定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって、参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語は、１つ以上のヌクレオチドが付加もしくは欠失されたか、または異なるヌクレオチドで修飾されているか、または置き換えられたポリヌクレオチドを含む。この点において、変異、付加、欠失、および置換を含むある特定の変更は、参照ポリヌクレオチドに対して行われ得、それにより変更されたポリヌクレオチドは参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは十分に理解されている。
【０３４５】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で標的核酸配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズすることは、ヌクレオチド配列が互いに少なくとも６０％同一性が、ハイブリダイズされたままであるハイブリダイゼーションプロトコルを説明する。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨの特定の配列に対して熱溶解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）であり、標的配列に相補的なプローブの５０％は、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする。標的配列は、一般に、過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有されている。
【０３４６】
本明細書で使用される「配列同一性」または例えば「に対して５０％同一の配列」を含む記述は、配列が比較枠にわたってヌクレオチド単位基準またはアミノ酸単位基準で同一である程度を指す。よって、「配列同一性の割合」は、比較枠にわたって２つの最適にアライメントされた配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列で生じる位置数を決定して対応位置数を得ること、比較枠の総位置数（すなわち、枠のサイズ）で対応位置数を除すること、およびその結果を１００で乗じて配列同一性の割合を得ることにより計算され得る。典型的には、ポリペプチドバリアントが参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する、本明細書に記載される参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
【０３４７】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語は、「参照配列」、「比較枠」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的な同一性」を含む。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも１２だが、頻繁に１５〜１８、多くの場合、少なくとも２５の単量体単位である。２つのポリヌクレオチドは、各々、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）および（２）２つのポリヌクレオチド間で多様である配列を含み得るため、２つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、「比較枠」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所的な領域を特定および比較することにより行われる。「比較枠」は、２つの配列が最適にアライメントされた後に、ある配列が同じ数の隣接位置の参照配列と比較される、少なくとも６つの隣接位置、一般的には約５０〜約１００、より一般的には約１００〜約１５０の概念的セグメントを指す。比較枠は、２つの配列の最適なアライメントの参照配列（付加または欠失を含まない）と比較したとき、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較枠をアライメントするための配列の最適なアライメントは、コンピュータ化されたアルゴリズムの実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）により、または調査および選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良のアライメント（すなわち、比較枠にわたって最高率の相同性をもたらす）により実施され得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されるＢＬＡＳＴファミリーのプログラムも参照することができる。配列分析の詳細な説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５のユニット１９．３に見出すことができる。
【０３４８】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、ある断片に通常隣接する配列から取り除かれたＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態において、「単離されたポリヌクレオチド」は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または実際に存在せず、人の手によって作製された他のポリヌクレオチドも指す。
【０３４９】
ポリヌクレオチドの配向を説明する用語は、５´（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３´（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）を含む。ポリヌクレオチド配列は、５´から３´配向または３´から５´配向で注釈が付けられ得る。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについては、５´から３´の鎖は、その配列がプレメッセンジャー（ｐｒｅｍＲＮＡ）の配列と同一であるため［ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりにＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除く］、「センス」鎖、「プラス」鎖、または「コード」鎖と呼ばれる。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写された鎖である相補３´から５´鎖は、「テンプレート」鎖、「アンチセンス」鎖、「マイナス」鎖、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「逆配向」という用語は、３´から５´配向で書かれた５´から３´配列、または５´から３´配向で書かれた３´から５´配列を指す。
【０３５０】
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関係が表されるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５´Ａ  Ｇ  Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  ３´の相補鎖は、３´Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｇ  Ｔ  Ａ  Ｃ  ５´である。後者の配列は、左側に５´端、そして右側に３´端の５´Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  Ａ  Ｃ  Ｔ  ３´の逆相補として書かれることが多い。その逆相補体と等しい配列は、パリンドローム配列と言われる。相補性は「部分的」であり、核酸の塩基のうちのいくつかのみが塩基対合規則に従い一致する。または、核酸間で「完全な」もしくは「全」相補性が存在し得る。
【０３５１】
本明細書で使用される「核酸カセット」という用語は、１つ以上のＲＮＡを発現することのできるベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的となる１つ以上のポリヌクレオチド（複数可）を含有する。別の実施形態において、核酸カセットは、目的となる１つ以上のポリヌクレオチド（複数可）に作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列を含有する。ベクターは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個もしくはそれ以上の核酸カセットを含み得る。このカセットは、単一単位として、他のポリヌクレオチド配列、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターから除去されるか、またはそれに挿入され得る。
【０３５２】
ポリヌクレオチドは、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。本明細書で使用される場合、「目的となるポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは本明細書において企図される阻害性ポリヌクレオチドの転写のためのテンプレートとして機能するポリヌクレオチドを指す。
【０３５３】
さらに、本明細書において企図されるように、遺伝コードの縮重の結果として、ポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードし得る多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者には理解されよう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の未変性遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。とはいえ、コドン利用の差により異なるポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび／または霊長類のコドン選択のために最適化されるポリヌクレオチドは、特定の実施形態において特に企図される。一実施形態において、特定の単立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つ以上の変異の結果として変更されている内在性ポリヌクレオチド配列である。
【０３５４】
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ＣＡＲをコードするドナー修復テンプレートを含む。
【０３５５】
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、または別の阻害性ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない、阻害性ポリヌクレオチドを含む。
【０３５６】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」または「短い干渉ＲＮＡ」という用語は、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、またはエピジェネティックＲＮＡｉのプロセスを媒介する短いポリヌクレオチド配列を指す（Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９、Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１３，１３９−１４１、およびＳｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６）。
【０３５７】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」という用語は、２０〜２２ヌクレオチド、典型的には、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる、約７０ヌクレオチドホールドバックＲＮＡ前駆体構造から切り取られた、小さい非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと標的との間の相補性の程度により、２つの方法のうちの１つでそれらの標的を負に調節する。
【０３５８】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」または「短いヘアピンＲＮＡ」という用語は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖によって形成される二本鎖構造を指す。
【０３５９】
本明細書で使用される場合、「リボザイム」という用語は、標的ｍＲＮＡの部位特異的切断が可能な触媒的に活性なＲＮＡ分子を指す。
【０３６０】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、阻害性ＲＮＡを含み、本明細書において他の箇所に記載されるように、例えば、強力な構成的ｐｏｌ  ＩＩＩ、例えば、ヒトまたはマウスＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトおよびマウスＨ１  ＲＮＡプロモーター、またはヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター、または強力な構成的ｐｏｌ  ＩＩプロモーターなどの１つ以上の調節配列を含む。
【０３６１】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書において他の箇所に開示されるか、または当該技術分野で既知の、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされてもよく、その結果、それらの全体的な長さが大幅に変動してもよい。したがって、ほぼ全ての長さのポリヌクレオチド断片を採用することができ、合計の長さは、好ましくは、調製の容易さおよび意図される組換えＤＮＡプロトコルの使用により制限されることが特定の実施形態において企図される。
【０３６２】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知であり、利用可能である十分に確立された種々の技術のいずれを使用して、調製、操作、発現、および／または送達され得る。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切なベクターに挿入され得る。
【０３６３】
ベクターの例示的な例としては、プラスミド、自己複製配列、および転位因子、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６４】
ベクターのさらなる例示的な例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１誘導人工染色体（ＰＡＣ）など、バクテリオファージ、例えば、ラムダファージまたはＭ１３ファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６５】
ベクターとして有用なウイルスの例示的な例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６６】
発現ベクターの例示的な例としては、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介性遺伝子移入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列が、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のために、このような発現ベクターに連結され得る。
【０３６７】
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外に維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込むことなしに、および宿主細胞の分裂により徐々に失われることなく複製することができるベクターを指し、該ベクターは染色体外またはエピソームで複製することも意味する。ベクターは、アルファ、ベータ、もしくはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、または酵母からのＤＮＡ複製起源、または「ｏｒｉ」をコードする配列を保有するように操作される。典型的には、宿主細胞は、複製を活性化するウイルス複製トランス活性化因子タンパク質を含む。アルファヘルペスウイルスは、比較的短い生殖周期、可変宿主範囲を有し、感染細胞を効率的に破壊し、主に感覚神経節において潜伏感染を確立する。アルファヘルペスウイルスの例示的な例としては、ＨＳＶ  １、ＨＳＶ  ２、およびＶＺＶが挙げられる。ベータヘルペスウイルスは、長い生殖周期および制限された宿主範囲を有する。感染細胞は、多くの場合、増大する。潜在性は、血液、腎臓、分泌腺、および他の組織の白血球に維持され得る。ベータヘルペスウイルスの例示的な例としては、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６、およびＨＨＶ−７が挙げられる。ガンマ−ヘルペスウイルスは、Ｔリンパ球またはＢリンパ球のいずれかに対して特異的であり、潜在性は、多くの場合、リンパ組織において示されている。ガンマヘルペスウイルスの例示的な例としては、ＥＢＶおよびＨＨＶ−８が挙げられる。
【０３６８】
発現ベクター内に存在する「発現制御配列」、「制御エレメント」、または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う、ベクター複製起点の非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳領域である。このようなエレメントは、それらの強度および特異性が異なり得る。用いられるベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む任意の数の好適な転写および翻訳エレメントを使用することができる。
【０３６９】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルスベクターを含むが、これらに限定されず、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの外因性、内因性、もしくは異種の制御配列を含む。「内因性」制御配列は、ゲノム内の所与の遺伝子と自然に連結しているものである。「外因性制御配列」は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターにより指向されるように、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技法）により遺伝子と並立に配置されるものである。「異種制御配列」は、遺伝子操作されている細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。
【０３７０】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始および転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ豊富領域、および／またはＮが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域の、転写の開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列を含む。
【０３７１】
「エンハンサー」という用語は、転写を増強することができ、いくつかの事例では別の制御配列に対するそれらの配向に関係なく機能することができる配列を含むＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／もしくは他のエンハンサー要素と協同的または追加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーターおよびエンハンサー両方の機能を提供することができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
【０３７２】
「作動可能に連結される」という用語は、説明されている成分がそれらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある並立を指す。一実施形態において、本用語は、発現制御配列が第２の配列に対応する核酸の転写を指向する、核酸発現制御配列（プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的となるポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指す。
【０３７３】
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結された配列の転写を構成的もしくは連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、それぞれ、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在性」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサー、または限定された様々な細胞および組織型における発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、もしくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであり得る。
【０３７４】
特定の実施形態で使用するのに好適な例証となる遍在性発現制御配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核細胞翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータメンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ  ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８−５５（１９９５））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７５】
特定の実施形態において、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、系統特異的、または組織特異的な発現を達成するために（例えば、細胞型、細胞系統、もしくは組織のサブセットのみまたは発達の特定の段階の間ポリペプチドをコードする特定の核酸を発現するために）、細胞、細胞型、細胞系統、または組織特異的発現制御配列を使用することが望ましくあり得る。
【０３７６】
本明細書で使用される場合、「条件付き発現」は、誘導性発現、抑制性発現、特定の生理学的状態、生物学的状態、または疾患状態を有する細胞または組織における発現などを含むが、これらに限定されない、あらゆる種類の条件付き発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を除外することを意図しない。ある特定の実施形態は、目的となるポリヌクレオチドの条件付き発現を提供し、例えば、ポリヌクレオチドを発現させる、または目的となるポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現を増加もしくは減少させる処理または条件に、細胞、組織、生物などを供することによって、発現が制御される。
【０３７７】
誘導性プロモーター／系の例示的な例としては、グルココルチコイドもしくはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター（対応するホルモンでの処理によって誘導可能）、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（様々な重金属での処理によって誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節可能な系（Ｓｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クミン酸誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７８】
条件付き発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。ある特定の実施形態によると、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼにより媒介される組換えのための少なくとも１つ（典型的には２つ）の部位（複数可）を含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であり得る１つ以上の組換え部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）を伴う組換え反応に関与する、切除性（ｅｘｃｉｓｉｖｅ）もしくは組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）のタンパク質、酵素、補助因子、または関連するタンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７（１９９３）を参照されたい）、またはそれらの変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含む融合タンパク質）、断片、およびバリアントを含む。特定の実施形態で使用するのに好適なリコンビナーゼの例示的な例としては、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７９】
ポリヌクレオチドは、多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかに対して１つ以上の組換え部位を含み得る。部位特異的リコンビナーゼのための標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みに必要とされる任意の部位（複数可）に加えてであることを理解されたい。本明細書で使用される場合、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識および結合する特定の核酸配列を指す。
【０３８０】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの組換え部位の１つはｌｏｘＰであり、これは、８塩基対コア配列に隣接する２つの１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として機能する）を含む３４塩基対配列である（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。他の例示的なｌｏｘＰ部位は、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｂｅｔｈｋｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）を含むが、これらに限定されない。
【０３８１】
ＦＬＰリコンビナーゼの好適な認識部位としては、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、Ｆ４、Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８２】
認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ−ｃ３１により認識される、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列である。φＣ３１  ＳＳＲは、異型部位ａｔｔＢ（長さが３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さが３９ｂｐ）との間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。それぞれ、細菌およびファージゲノム上のファージインテグラーゼの結合部位に名前が由来するａｔｔＢおよびａｔｔＰは両方とも、φＣ３１ホモ二量体により結合される可能性がある不完全な逆方向反復を含入する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。産生部位であるａｔｔＬおよびａｔｔＲは、φＣ３１媒介組換えを進めるために（Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、効果的に不活性であり、反応を不可逆にする。挿入を触媒するために、ａｔｔＢ保有ＤＮＡが、ａｔｔＰ部位をゲノムａｔｔＢ部位に挿入するよりも容易にゲノムａｔｔＰ部位内に容易に挿入されることが分かった（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。よって、典型的な戦略は、相同組換えにより、ａｔｔＰ保有「ドッキング部位」を、定義された座位に位置付け、次に、挿入のためにこれをａｔｔＢ保有入来配列と組み合わせる。
【０３８３】
一実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、一対のリコンビナーゼ認識部位によって隣接される修復テンプレートポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、修復テンプレートポリヌクレオチドは、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、またはａｔｔ部位によって隣接される。
【０３８４】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、１つ以上のポリペプチドをコードする目的となる１つ以上のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１つ以上のＩＲＥＳ配列または自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離され得る。
【０３８５】
本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質コード領域）のＡＴＧなどの開始コドンへの直接的な内部リボソーム侵入を促進し、それによって遺伝子のキャップ非依存性翻訳をもたらすエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３）およびＪａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ  １（１０）：９８５−１０００を参照されたい。当業者によって一般に用いられるＩＲＥＳの例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されるものを含む。当該技術分野で既知の「ＩＲＥＳ」のさらなる例としては、ピコルナウイルスから得られるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、ならびにウイルスまたは細胞ｍＲＮＡ源から得られるＩＲＥＳ、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ、ならびに酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されている脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈｅｌｏｍｙｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６（３）：１６０２−９）およびＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８（１１）：６１７８−９０）が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳはまた、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ種のウイルスゲノム、ならびにＨＣＶ、Ｆｒｉｅｎｄマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）、およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）においても報告されている。
【０３８６】
一実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドに使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳである。
【０３８７】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスコザック配列を含む。本明細書で使用される場合、「コザック配列」という用語は、リボソームの小さいサブ単位へのｍＲＮＡの初期結合を大幅に容易にし、翻訳を増加させる、短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号５０）であり、式中、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２、およびＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。
【０３８８】
効率的な終止および異種核酸転写物のポリアデニル化を指向するエレメントは、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見られる。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される場合、「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写の終止およびポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’端へのポリＡ尾部の付加により、ｍＲＮＡの安定性を促進し、よって、転写効率の増加に寄与し得る。ポリＡ尾部を欠く転写物は不安定であり、迅速に分解されるため、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。ベクターにおいて使用され得るポリＡシグナルの例示的な例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野で既知の別の好適な異種もしくは内因性ポリＡ配列が挙げられる。
【０３８９】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを保有する細胞は、直接的な毒性および／または未制御の増殖のリスクを低減させるために、誘導性自殺遺伝子を含む自殺遺伝子を用いる。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドを保有する宿主または細胞に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ−９もしくはカスパーゼ−８、またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−９は、二量体化の特定の化学誘導物資（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。
【０３９０】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書において企図される遺伝子改変された細胞に、インビボで負の選択を受けやすくさせる遺伝子セグメントを含む。「負の選択」とは、個々のインビボ条件の変化の結果として排除され得る注入された細胞を指す。負の選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対して感受性を付与する遺伝子の挿入により生じ得る。負の選択可能な遺伝子は当該技術分野で既知であり、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ）遺伝子、細胞性ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞性アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、および細菌性シトシンデアミナーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０３９１】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、インビトロでの負の選択可能な表現型の細胞の選択を可能にする正のマーカーを更に含むポリヌクレオチドを含む。正の選択可能なマーカーは、宿主細胞に導入されると、その遺伝子を有する細胞の正の選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。この種類の遺伝子は当該技術分野で既知であり、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０３９２】
一実施形態において、正の選択可能なマーカーおよび負の選択可能エレメントは、負の選択可能エレメントの損失が正の選択可能なマーカーの損失も必然的に伴うように連結されている。特定の実施形態において、正の選択可能なマーカーおよび負の選択可能なマーカーは、一方の損失が他方の損失に義務的につながるように融合されている。上述される所望の正負両方の選択の特徴を付与するポリペプチドを発現産物としてもたらす融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでの正の選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、およびインビボでの負の選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドをもたらす。優性の正の選択可能なマーカーと負の選択可能なマーカーとの融合に由来する二機能性選択可能な融合遺伝子の使用を説明する、Ｓ．Ｄ．ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴ  ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の刊行物も参照されたい。
【０３９３】
好ましい正の選択可能なマーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましい負の選択可能なマーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ、ＶＺＶ  ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来する。特定の実施形態において企図される例示的な二機能性選択可能融合遺伝子としては、正の選択可能なマーカーは、ｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、負の選択可能なマーカーは、シトシンデアミナーゼもしくはＴＫ遺伝子、または選択可能マーカーに由来する。
【０３９４】
特定の実施形態において、１つ以上のメガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、ＣＡＲ、治療ポリペプチド、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルス方法およびウイルス方法の両方によって、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に導入され得る。特定の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートの送達は、同じ方法もしくは異なる方法によって、および／または同じベクターもしくは異なるベクターによって提供され得る。
【０３９５】
「ベクター」という用語は、本明細書において、別の核酸分子を移入または輸送することのできる核酸分子を指すように使用される。移入された核酸は概して、ベクター核酸分子に連結、例えば、挿入される。ベクターは、細胞における自律複製を指向する配列を含んでもよいし、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書において企図される１つ以上のポリヌクレオチドをＴ細胞に送達するために使用される。
【０３９６】
非ウイルスベクターの例示的な例としては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９７】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法としては、電気穿孔、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオン、または脂質：核酸抱合体、裸ＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥデキストラン介在転移、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９８】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態で用いるのに好適なポリヌクレオチド送達システムの例示的な例としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．によって提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識のために好適なカチオン性および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０−１８７、およびＢａｌａｚｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１−１２を参照されたい。抗体標的バクテリア由来の生命体ではない（ｎｏｎ−ｌｉｖｉｎｇ）ナノ細胞ベースの送達もまた、特定の実施形態において企図される。
【０３９９】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、個々の患者に、典型的には、以下に記載されるように、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用による投与によってインビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、個々の患者から外植される細胞（例えば、動員末梢血、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検など）または万能ドナー造血幹細胞などのエクスビボで細胞に送達され、続いて、細胞の患者に再移植され得る。
【０４００】
一実施形態において、操作されたヌクレアーゼおよび／またはドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターは、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与される。あるいは、裸ＤＮＡが、投与され得る。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない、血液または組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常使用される経路のうちのいずれかによるものである。かかる核酸を投与する好適な方法が利用可能であり、当業者に周知であり、１つを超える経路が、特定の組成物を投与するために使用することができるが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりもより即時かつより効果的な反応を提供することができる。
【０４０１】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態で用いるのに好適なウイルスベクターシステムの例示的な例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペス、アデノウイルス、遺伝子導入のためのワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０２】
様々な実施形態において、操作されたヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）で細胞を形質導入ことによって、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に導入される。
【０４０３】
ＡＡＶは、主なエピソームである小規模（約２６ｎｍ）の複製欠損である。非エンベロープウイルス。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、典型的には、最小で、トランス遺伝子およびその調節配列、ならびに５´および３´ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）からなる。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０から単離されるカプシド配列を含む。
【０４０４】
いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列が、１つのＡＡＶ血清型から単離され、カプシド配列が、異なるＡＡＶ血清型から単離される、キメラｒＡＡＶが使用される。例えば、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来するカプシド配列を有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と称される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からのＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のうちのいずれか１つからのカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列と、ＡＡＶ６に由来するカプシド配列とを含む。
【０４０５】
いくつかの実施形態において、操作および選択方法は、目的となる細胞を形質導入する可能性が高いＡＡＶカプシドに適用され得る。
【０４０６】
ｒＡＡＶベクターの構築、その生成、および精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号、同第９，１６９，４９２号、同第９，０１２，２２４号、同第８，８８９，６４１号、同第８，８０９，０５８号、および同第８，７８４，７９９号に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０４０７】
様々な実施形態において、ＣＡＲ、操作されたヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、またはドナー修復テンプレートは、細胞を、レトロウイルス、例えば、１つ以上のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスで形質導入することによって、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に導入される。
【０４０８】
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状二本鎖ＤＮＡのコピーに逆転写し、その後そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態において使用するのに好適な例示的なレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、ならびにレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０９】
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または族）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作動性配列要素）が好ましい。
【０４１０】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、１つ以上のＬＴＲ、ならびにアクセサリーエレメント：ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、輸出エレメント、ポリ（Ａ）配列のうちの１つ以上または全てを含み、任意に、本明細書において他の箇所に論じられるように、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、絶縁体エレメント、選択可能なメーカー、および細胞自殺遺伝子を含み得る。
【０４１１】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、組み込みまたは非組み込みまたは組み込み欠損レンチウイルスであり得る。本明細書で使用される場合、「組み込み欠損レンチウイルス」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノム内に組み込む能力を欠くインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組み込み能力のないウイルスベクターは、特許出願ＷＯ２００６／０１０８３４に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４１２】
インテグラーゼ活性を減少させるのに好適なＨＩＶ−１遺伝子における例示的な変異としては、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、およびＫ２６４Ｈが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１３】
「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、それらの天然の配列関係において、直接反復であり、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域を含有するレトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指す。
【０４１４】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、レトロウイルス、例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のセントラルポリプリントラクトおよび中央終止配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）が配列に含まれる核酸を指す。好適なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。
【０４１５】
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスＲＮＡをウイルスカプシドまたは粒子内に挿入するために必要なレトロウイルスゲノム内に位置するプサイ（Ψ）配列を指し、例えば、Ｃｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。
【０４１６】
「輸出エレメント」という用語は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ輸出エレメントの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ  ５８：４２３を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１７】
特定の実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および任意に、転写終止シグナルをベクター内に組み込むことにより増加する。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）、および同類のもの（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）など、種々の転写後調節エレメントが、タンパク質における異種核酸の発現を増加させることができる。
【０４１８】
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲを改変する結果としていくつかの安全性の強化をもたらす。「自己不活性化型」（ＳＩＮ）ベクターとは、Ｕ３領域として知られている右（３´）ＬＴＲエンハンサープロモーター領域が１回目のウイルス複製以降のウイルス転写を防止するように（例えば欠失または置換によって）改変されている、複製欠損ベクターを指す。５´ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターに置き換えてウイルス粒子の産生中のウイルスゲノムの転写を推進することによって、さらなる安全性の強化がもたらされる。使用され得る異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。
【０４１９】
本明細書で使用される「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が好ましい特性を保有する別のウイルスのもので置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）が通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞に標的指向するため、ＨＩＶがより広範囲の細胞を感染させることを可能にする、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイピングされ得る。
【０４２０】
ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、既知の方法に従って生成される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
【０４２１】
本明細書において企図されるある特定の具体的な実施形態によると、ウイルスベクター骨格配列の大部分または全てが、レンチウイルス、例えばＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび／もしくはレンチウイルス配列の多くの異なる供給源を使用することまたは組み合わせることができ、ある特定のレンチウイルス配列における多くの置換および変更が、移入ベクターが本明細書に記載される機能を行う能力を損なうことなく適用され得ることを理解されたい。さらに、種々のレンチウイルスベクターが当該技術分野で既知であり、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、および１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照されたく、それらの多くが、本明細書において企図されるウイルスベクターまたは移入プラスミドを産生するように適合され得る。
【０４２２】
様々な実施形態において、ＣＡＲ、操作されたヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、またはドナー修復テンプレートは、免疫エフェクター細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで形質導入することによって、免疫エフェクター細胞に導入される。
【０４２３】
アデノウイルス系ベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現が得られている。このベクターは、相対的に簡単な系で大量に産生され得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、トランス遺伝子を、Ａｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子に置き換え、その後、複製欠損ベクターが、トランスで欠失遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞中で増殖されるように、操作される。Ａｄベクターは、非分裂中の分化細胞、例えば肝臓、腎臓、および筋肉中に見出されるものを含む多数の型の組織をインビボで形質導入し得る。従来のＡｄベクターは、大きな輸送能力を有する。
【０４２４】
複製欠損である現行のアデノウイルスベクターの生成および伝播は、Ａｄ５  ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎臓細胞から形質転換された２９３と指定された特有のヘルパー細胞株を利用し得、Ｅ１タンパク質を構造的に発現する（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域がアデノウイルスゲノムに不必要である（Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，１９７８）ため、２９３細胞の支援を受ける現行のアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域、Ｄ３領域のいずれか、または両方の領域に外来ＤＮＡを保持する（Ｇｒａｈａｍ  ＆  Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子の発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ  ＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２、Ｇｒａｈａｍ  ＆  Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）で使用されている。組み換えアデノウイルスを異なる組織に投与する研究には、気管点滴注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ  ＆  Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳への定位接種（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）が含まれる。臨床試験中のＡｄベクターの使用の一例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化に対するポリヌクレオチド療法を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。
【０４２５】
様々な実施形態において、ＣＡＲ、操作されたヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、またはドナー修復テンプレートは、免疫エフェクター細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペス、例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２で形質導入することによって、免疫エフェクター細胞に導入される。
【０４２６】
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである直鎖二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有する包まれた二十面体カプシドからなる。一実施形態において、ＨＳＶ系ウイルスベクターは、１つ以上の必須または非必須ＨＳＶ遺伝子に欠けている。一実施形態において、ＨＳＶ系ウイルスベクターは、複製欠損である。最も複製欠損であるＨＳＶベクターは、複製を妨げるために、１つ以上の最初期、初期、または後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含む。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子を欠損し得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期のＤＮＡ発現、および２５ｋｂまでの外因性ＤＮＡインサートを収容するその大型ウイルスＤＮＡゲノムをもたらすことができる、潜伏段階へ入る能力である。ＨＳＶ系ベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、および同第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願ＷＯ９１／０２７８８、ＷＯ９６／０４３９４、ＷＯ９８／１５６３７、およびＷＯ９９／０６５８３に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０４２７】
Ｈ．組成物および製剤
特定の実施形態において企図される組成物は、本明細書において企図されるように、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、および免疫エフェクター細胞組成物を含み得る。組成物は、薬学的組成物を含むが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独で、または１つ以上の他の治療様式と組み合わせてのいずれかで、細胞または動物に投与するための、薬学的に許容される、または生理学的に許容される溶液に製剤化された組成物を指す。また、所望される場合、組成物が、例えばサイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法薬、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の様々な薬学的活性剤といった他の薬剤と組み合わせて投与されてもよいことは理解されよう。本組成物に同様に含まれ得る他の構成成分に実質的に制限はないが、但し、追加の薬剤が、本組成物が意図される療法を送達する能力に悪影響を及ぼさないものとする。
【０４２８】
「薬学的に許容される」という表現は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに好適な、妥当な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
【０４２９】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」としては、ヒトまたは飼育動物に使用するのに許容可能なものとして米国食品医薬品局によって承認されている任意のアジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な薬学的に許容される担体としては、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；ココアバター、ワックス、動物脂および植物脂、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；落花生油、綿実油、紅花油、胡麻油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質除去水；等張食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液、ならびに薬学的製剤において採用される任意の他の適合性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３０】
特定の実施形態において、組成物は、本明細書において企図される方法によって製造される、ある量のゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上の改変されたおよび／または非機能性ＴＣＲα対立遺伝子を含み、１つ以上のＣＡＲを発現する、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。
【０４３１】
特定の実施形態において企図される方法によって製造されるＣＡＲ  Ｔ細胞を含む薬学的組成物が、約１０２〜約１０１０個の細胞／ｋｇ体重、約１０５〜約１０９個の細胞／ｋｇ体重、約１０５〜約１０８個の細胞／ｋｇ体重、約１０５〜約１０７個の細胞／ｋｇ体重、約１０７〜約１０９個の細胞／ｋｇ体重、または約１０７〜約１０８個の細胞／ｋｇ体重の投与量（これらの範囲内の全ての整数値を含む）で投与され得ると概説することができる。細胞数は、その中に含まれる細胞の型のように、組成物が意図される最終用途に依存する。本明細書に提供される使用において、細胞は一般に、１リットル以下の容量であり、５００ｍＬ以下、更には２５０ｍＬまたは１００ｍＬ以下であり得る。したがって、所望の細胞の密度は、典型的には、約１０６個の細胞／ｍＬ超であり、概して約１０７個の細胞／ｍＬ超、概して約１０８個の細胞／ｍＬ以上である。臨床的に関連する免疫細胞数は、累積的に約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２個の細胞と等しいかまたはそれを超える複数回の注入に分配され得る。
【０４３２】
いくつかの実施形態において、特に、注入された細胞の全てが特定の標的抗原に再指向されるため、１０６／キログラム（患者当たり１０６−１０１１）の範囲内の低い細胞数が投与され得る。ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞は、これらの範囲内の投薬量で複数回投与され得る。細胞は、療法を受ける患者に対して同種、同系、異種、または自家であり得る。所望される場合、治療は、免疫応答の誘導を増強するために、注入されたＴ細胞の生着および機能を増強するために、本明細書に記載されるマイトジェン（例えばＰＨＡ）またはリンホカイン、サイトカイン、および／もしくはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１８、およびＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与を含んでもよい。
【０４３３】
概して、本明細書に記載されるように活性化および増幅された細胞を含む組成物は、免疫不全の個体において生じる疾患の治療および防止に用いられ得る。具体的には、本明細書において企図される方法によって製造される改変されたＴ細胞を含む組成物は、がんの治療に使用される。特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、単独で、あるいは担体、希釈剤、賦形剤、および／またはＩＬ−２、ＩＬ−７、および／もしくはＩＬ−１５、または他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の構成成分と組み合わせて薬学的組成物としてのいずれかで投与され得る。特定の実施形態において、本明細書において企図される薬学的組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤と組み合わせた、ある量の１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。
【０４３４】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞を含む薬学的組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を更に含み得る。特定の実施形態において企図される組成物は、好ましくは、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内、または筋肉内投与用に製剤化される。
【０４３５】
液体薬学的組成物は、それらが溶液であるか、懸濁液であるか、または他の同様の形態であるかにかかわらず、注射用水、食塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張食塩水などの無菌希釈剤、溶媒もしくは懸濁媒として機能し得る合成モノグリセリドもしくはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；アセテート、シトレート、またはホスフェートなどの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調整するための薬剤のうちの１つ以上を含み得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックで作製された多用量バイアルに封入され得る。注射可能な薬学的組成物は、好ましくは減菌である。
【０４３６】
一実施形態において、ゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地において製剤化される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は、血清不含培地である。
【０４３７】
血清不含培地は、簡素かつより明確に定義された組成、低い程度の混入物、感染因子源の可能性の排除、およびコストの低下を含め、血清含有培地に比べていくつかの利点を有する。様々な実施形態において、血清不含培地は動物質不含であり、任意選択によりタンパク質不含であってもよい。任意選択により、培地は生物薬剤学的に許容される組換えタンパク質を含んでもよい。「動物質不含」培地とは、成分が非動物源に由来する培地を指す。動物質不含培地では、組換えタンパク質が天然の動物タンパク質に取って代わり、栄養素は合成源、植物源、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質不含」培地は、タンパク質を実質的に含まないものと定義される。
【０４３８】
特定の組成物に使用される血清不含培地の例証となる例としては、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＸ−ＶＩＶＯ１０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３９】
好ましい一実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含む溶液において製剤化される。
【０４４０】
別の好ましい実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物は、凍結保存培地を含む溶液において製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地を使用して、解凍後の高い細胞生存成績を維持することができる。特定の組成物に使用される凍結保存培地の例示的な例としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４１】
より好ましい実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ対ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０を５０：５０で含む溶液において製剤化される。
【０４４２】
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、単独で、または１つ以上の治療薬と組み合わせて、有効量の増幅されたゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞組成物を含む。したがって、ＣＡＲ  Ｔ細胞組成物は、単独で投与されても、または他の公知のがん治療、例えば放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学的療法などと組み合わせて投与されてもよい。本組成物は、抗生物質と組み合わせても投与され得る。このような治療薬は、特定の癌など、本明細書に記載される特定の疾患状態の標準的な治療として、当該技術分野において認められていてよい。特定の実施形態において企図される例示的な治療剤としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、治療用抗体、または他の活性剤および補助剤が挙げられる。
【０４４３】
ある特定の実施形態において、本明細書において企図されるＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と併せて投与されてもよい。化学療法剤の例示的な例としては、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミンを含むエチレンイミンならびにメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシロマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン���ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン薬など；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン薬；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。
【０４４４】
種々の他の治療剤が、本明細書において企図される組成物と併せて使用され得る。一実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物は、抗炎症剤と共に投与される。抗炎症剤または薬物は、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）（アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬物、シクロホスファミド、およびミコフェノレートを含む）を含むが、これらに限定されない。
【０４４５】
他の例示的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）およびＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）などのＣｏｘ−２阻害剤、ならびにシアリレート（ｓｉａｌｙｌａｔｅ）からなる群から選択される。例示的な鎮痛薬は、アセトアミノフェン、オキシコドン、プロポルキシフェン（ｐｒｏｐｏｒｘｙｐｈｅｎｅ）塩酸塩のトラマドールからなる群から選択される。例示的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンからなる群から選択される。例示的な生体応答修飾物質としては、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）に対して指向される分子、ＴＮＦ拮抗薬（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、およびインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））などのサイトカイン阻害剤、ケモカイン阻害剤、ならびに接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的応答修飾物質は、モノクローナル抗体ならびに分子の組換え形態を含む。例示的なＤＭＡＲＤとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシリラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金（経口（オーラノフィン）および筋肉内）、およびミノサイクリンが挙げられる。
【０４４６】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたＴ細胞との組み合わせに好適な治療用抗体の例示的な例としては、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュシジツマブ、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファリエツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、ティガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、、ＣＣ４９、および３Ｅ８が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４７】
ある特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、サイトカインと併せて投与される。本明細書で使用される場合、「サイトカイン」とは、細胞間の介在物質として別の細胞に作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質の一般的な用語を意味する。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、ケモカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−アルファ、ベータ、および−ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される場合、サイトカインという用語は、天然源または組換え細胞培養物からのタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【０４４８】
Ｉ．標的細胞
特定の実施形態において、標的細胞、例えば、腫瘍またはがん細胞に再指向されたゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞が、細胞上に標的抗原に結合する結合ドメインを有することが企図される。
【０４４９】
一実施形態において、標的細胞は、他の正常な（所望の）細胞の表面上には実質的に見出されない抗原、例えば標的抗原を発現する。
【０４５０】
一実施形態において、標的細胞は、骨の細胞（ｂｏｎｅ  ｃｅｌｌ）、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、筋芽細胞、筋細胞、平滑筋細胞、膀胱細胞、骨髄細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、グリア細胞、アストロサイト細胞、ニューロン、色素細胞、上皮細胞、皮膚細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、乳房細胞、結腸細胞、食道細胞、胃腸管細胞、胃細胞、結腸細胞、頭部細胞、頸部細胞、歯肉細胞、舌細胞、腎細胞、肝細胞、肺細胞、鼻咽頭細胞、卵巣細胞、濾胞細胞、子宮頸部細胞、膣細胞、子宮細胞、膵細胞、膵実質細胞、膵管細胞、膵島細胞、前立腺細胞、陰茎細胞、生殖腺細胞、睾丸細胞、造血細胞、リンパ球系細胞、または骨髄系細胞である。
【０４５１】
一実施形態において、標的細胞は、固形がん細胞である。
【０４５２】
特定の実施形態において企図される組成物および方法によって標的化され得る細胞の例示的な例としては、次の固形がん：副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管細胞癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維組織腫（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｈｉｓｔｉｏｓａｒｃｏｍａ）、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部癌、血管芽腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼球内黒色腫、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、メルケル細胞癌、正中管癌（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、口癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口頭癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂腎および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃の癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５３】
一実施形態において、標的細胞は、液性がんまたは血液癌細胞である。
【０４５４】
多発性骨髄腫の例示的な例としては、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５５】
特定の実施形態において企図される組成物および方法によって標的化され得る細胞の例示的な例としては、次の白血病：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、ならびに真性赤血球増加症のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５６】
特定の実施形態において企図される組成物および方法によって標的化され得る細胞の例示的な例としては、次のリンパ腫：ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、ならびにＢ細胞非ホジキンリンパ腫：バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫；およびＴ細胞非ホジキンリンパ腫：菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、および前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫を含むがそれに限定されない非ホジキンリンパ腫のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５７】
特定の実施形態において企図される組成物および方法によって標的化され得る細胞の例示的な例としては、次の多発性骨髄腫：顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５８】
別の特定の実施形態において、標的細胞は、がん患者の細胞などのがん細胞である。
【０４５９】
一実施形態において、標的細胞は、細胞、例えば、ＣＭＶ、ＨＰＶ、およびＥＢＶが挙げられるが、これらに限定されない、ウイルスによって感染されるがん細胞である。
【０４６０】
一実施形態において、標的抗原は、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１のエピトープである。
【０４６１】
Ｊ．治療方法
本明細書において企図される組成物および方法によって製造されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全症が挙げられるが、これらに限定されない、様々な状態の治療で用いるための改善された養子細胞療法を提供する。特定の実施形態において、一次Ｔ細胞の特異性は、本明細書において企図されるＣＡＲで一次Ｔ細胞を遺伝子改変することにより、腫瘍またはがん細胞に再指向される。一実施形態において、ゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、それを必要とするレシピエントに注入される。注入された細胞は、受容者の腫瘍細胞を殺滅することができる。
【０４６２】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、固形腫瘍またはがんの治療で使用される。
【０４６３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管細胞癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維組織腫（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｈｉｓｔｉｏｓａｒｃｏｍａ）、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部癌、血管芽腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼球内黒色腫、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、メルケル細胞癌、正中管癌（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、口癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口頭癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂腎および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃の癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍のものが挙げられるが、これらに限定されない、固形腫瘍またはがんの治療で使用される。
【０４６４】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない、固形腫瘍またはがんの治療で使用される。
【０４６５】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、膵臓、膀胱、および肺が挙げられるが、これらに限定されない、様々ながんの治療で使用される。
【０４６６】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、液性がんまたは血液癌の治療で使用される。
【０４６７】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療で使用される。
【０４６８】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、以下の白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性，前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、ならびに髄外性形質細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない、液性がんの治療において使用される。
【０４６９】
特定の実施形態において、治療上有効量の、本明細書において企図されるゲノム編集されたＴ細胞またはそれを含む組成物を、それを必要とする患者に、単独でまたは１つ以上の治療剤と組み合わせて投与することを含む方法が、提供される。ある特定の実施形態において、これらの細胞は、がんを発症するリスクがある患者の治療で使用される。したがって、特定の実施形態は、治療上有効量の本明細書において企図されるゲノム編集されたＴ細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんの少なくとも１つの症状の治療または予防または寛解を含む。
【０４７０】
一実施形態において、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法は、有効量、例えば、治療上有効量の本明細書において企図されるゲノム編集されたＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物を投与することを含む。適切な投薬量は臨床試験によって決定され得るが、投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定される。
【０４７１】
一実施形態において、対象に投与される組成物中のＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０５個の細胞、少なくとも０．５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも０．５×１０７個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも０．５×１０８個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも０．５×１０９個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも２×１０９個の細胞、少なくとも３×１０９個の細胞、少なくとも４×１０９個の細胞、少なくとも５×１０９個の細胞、または少なくとも１×１０１０個の細胞である。
【０４７２】
特定の実施形態において、約１×１０７個のＴ細胞〜約１×１０９個のＴ細胞、約２×１０７個のＴ細胞〜約０．９×１０９個のＴ細胞、約３×１０７個のＴ細胞〜約０．８×１０９個のＴ細胞、約４×１０７個のＴ細胞〜約０．７×１０９個のＴ細胞、約５×１０７個のＴ細胞〜約０．６×１０９個のＴ細胞、または約５×１０７個のＴ細胞〜約０．５×１０９個のＴ細胞が対象に投与される。
【０４７３】
一実施形態において、対象に投与される組成物中のＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０４個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０４個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０４個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０４個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０５個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０６個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０６個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０７個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０７個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０８個の細胞／ｋｇ体重、または少なくとも１×１０９個の細胞／ｋｇ体重である。
【０４７４】
特定の実施形態において、約１×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約１×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、約２×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．９×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、約３×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．８×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、約４×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．７×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、約５×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．６×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、または約５×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．５×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重が対象に投与される。
【０４７５】
所望の療法をもたらすために、特定の実施形態において企図される組成物の複数回投与が必要とされる場合があることは、当業者であれば認識するであろう。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、１０年、またはそれ以上にわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回もしくはそれ以上投与され得る。
【０４７６】
ある特定の実施形態において、活性化されたＴ細胞を対象に投与し、次いで再採血し（またはアフェレーシスを行い）、そこからＴ細胞を活性化させ、これらの活性化および増幅したＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間毎に複数回行われ得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃもしくはそれ以上の採血から活性化される。理論に束縛されるものではないが、この複数回採血／複数回再注入プロトコルの使用は、ある特定のＴ細胞集団を選出することに役立ち得る。
【０４７７】
特定の実施形態において企図される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、留置、または移植を含む、任意の簡便な様式で行われ得る。好ましい実施形態において、組成物は、非経口投与される。本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口投与される」という語句は、腸内および局所投与以外、通常、注射による投与モードを指し、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、ならびに胸骨内注射および注入を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書において企図される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位への直接注射により対象に投与される。
【０４７８】
一実施形態において、それを必要とする対象は、対象のがんに対する細胞免疫応答を増加させるために有効量の組成物を投与される。免疫応答は、感染細胞、調節性Ｔ細胞、およびヘルパーＴ細胞応答を死滅させることができる細胞傷害性Ｔ細胞により媒介される細胞免疫応答を含み得る。Ｂ細胞を活性化することができるヘルパーＴ細胞によって主に媒介され、よって抗体産生につながる体液性免疫応答も誘発され得る。組成物により誘導される免疫応答の種類を分析するには種々の技術を使用することができ、これらは、当該技術分野において、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．に詳しく記載されている。
【０４７９】
一実施形態において、がんと診断された対象を治療する方法は、対象から免疫エフェクター細胞を取り出すことと、前記免疫エフェクター細胞のゲノムを編集し、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞の集団を生成することと、ＣＡＲをコードする核酸を細胞に導入することと、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞の集団を同じ対象に投与することと、を含む。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
【０４８０】
特定の実施形態において企図される細胞組成物を投与するための方法は、エクスビボのゲノム編集された免疫エフェクター細胞の再導入、または対象に導入されると成熟免疫エフェクター細胞に分化する免疫エフェクター細胞のゲノム編集された前駆細胞の再導入をもたらすのに有効な任意の方法を含む。１つの方法は、末梢血Ｔ細胞をゲノム編集することと、ＣＡＲをコードする核酸をエクスビボで細胞に形質導入することと、形質導入細胞を対象に戻すことと、を含む。
【０４８１】
本明細書に引用される公開文献、特許出願、および交付済み特許は全て、個々の公開文献、特許出願、または交付済み特許それぞれが参照により組み込まれるよう明確かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４８２】
前述の実施形態は、理解を明確にするために図示および例によりいくらか詳細に記載されているが、本明細書において企図される教示の観点から、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更および改変がそれに対して行われ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、限定ではなく、単なる例示として提供されるものである。当業者であれば、変更または改変しても本質的に同様の結果を得ることができる必須ではない種々のパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０４８３】
実施例１
破壊されたＴＣＲα  対立遺伝子を有する抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞
培養方法
凍結保存された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を用いて２人の異なる健常なドナーから単離し、解凍し、抗体を刺激する抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  Ｔ細胞を有する培地に入れた。抗体刺激から２４時間後、細胞を、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む第二世代のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレンチウイルスを用いて１０のＭＯＩで形質導入した。抗体刺激から７２時間後、１００×１０６個の形質導入した細胞（大規模）または５×１０６個の形質導入した細胞（小規模）を、ＴＣＲα遺伝子座を標的とするメガＴＡＬをコードする５０μｇ／ｍＬのインビトロ転写ｍＲＮＡを有するＭａｘｃｙｔｅ電気穿孔デバイスを使用して電気穿孔した。電気穿孔直後の培養液中に細胞を戻して、３０℃で２４時間インキュベートし、３７℃のインキュベーターに戻し、ＩＬ−２を含有する新鮮な培地で合計１０日間培養した。１０日目に、細胞を、今後の分析のために凍結保存した。
【０４８４】
ベクターコピー数分析
組み込まれたレンチウイルス粒子の数をｑ−ＰＣＲによって決定し、ベクターコピー数（ＶＣＮ）として提示した。ＶＣＮを、市販のｇＤＮＡ単離キットを用いて細胞からゲノムＤＮＡを単離することと、組み込まれたプロウイルスのＰｓｉ／Ｇａｇ領域のためのｔａｑＭａｎプローブで定量的ＰＣＲアッセイを行うことと、プラスミドベースの陽性対照で生成された標準曲線を用いて、Ｐｓｉ／Ｇａｇシグナルを、内因性ＲＮＡｓｅＰコピー数と比較することによって決定した。ＶＣＮは、標準培養プロセスを用いて培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＥＰなし）、電気穿孔したが、ｍＲＮＡを受けない細胞（ＥＰのみ）、およびＴＣＲα遺伝子を標的化するメガＴＡＬをコードするｍＲＮＡで電気穿孔した細胞（ＴＣＲα  ＫＯ）における各ドナーに対して同様であった。図１。
【０４８５】
細胞増殖
生存細胞計数は、細胞の増殖における電気穿孔プロトコルの影響を決定することを除いては、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ計数デバイスおよびトリパンブルーを用いた１０日間の培養プロセス中、両ドナーに対して行われた。単独で電気穿孔を行った細胞（ＥＰのみ）またはＴＣＲα  メガＴＡＬ  ｍＲＮＡで電気穿孔を行った細胞（ＴＣＲα  ＫＯ）、および３０℃で一晩インキュベートした細胞は、標準プロセスを用いて培養した細胞と比較して遅延増殖を示したが、ＰＢＭＣ培養開始後の５日〜１０日間同様の成長速度を再開した。図２。
【０４８６】
抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現およびＴＣＲα標的有効性（ＣＤ３陰性細胞）
抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現、およびフローサイトメトリー分析を介してＴＣＲα破壊の有効性は、１０日目に決定された。ＣＡＲ発現は、ＰＥフルオロフォアに対して共役されたＢＣＭＡ抗原を有する細胞を染色することによって決定された。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現は、電気穿孔群および非電気穿孔群の中で同様であった。図３、最右の象限。メガＴＡＬ媒介ＴＣＲα破壊は、ＣＤ３表面染色によって決定された。検出可能なＣＤ３発現は、細胞表面へのＴＣＲα鎖輸送を必要とし、ＴＣＲα破壊の遺伝子分析とよく相関していることがこれまでに示されている。データは、ＣＤ３が、大規模でメガＴＡＬ  ｍＲＮＡで電気穿孔された約５０％のＴ細胞、小規模で約６０％の細胞の表面から除去されることを示す。図３、最下の象限。ＴＣＲα破壊は、ＣＡＲ陽性細胞とＣＡＲ陰性細胞との間で同様であった。図３、左隅の象限（ＣＡＲ陰性）を右隅の象限（ＣＡＲ陽性）と比較する。図４は、図３に示されるＦＡＣＳデータのグラフ表示を示す。
【０４８７】
抗原依存性細胞傷害性放出
ＢＣＭＡ陽性細胞株およびＢＣＭＡ陰性細胞株に対して破壊されたＴＣＲα対立遺伝子（ＴＣＲα  ＫＯ）を有する抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の生物学的活性を、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）放出アッセイを用いて評価した。５×１０４個のＴ細胞は、上述のように、標準プロセス（ＥＰなし）、ＥＰのみ、およびＴＣＲα  ＫＯを用いて増幅し、ＢＣＭＡ陽性細胞株およびＢＣＭＡ陰性細胞株を１：１の比で、３７℃で２４時間共培養した。培養培地上清を収集し、標準発光アッセイを、異なる細胞型から相対的サイトカイン生成を評価するために行った。ＴＣＲα  ＫＯ細胞は、抗原依存性様式において、より高いレベルの主な免疫刺激サイトカインＩＦＮγを分泌した。図５Ａ。
【０４８８】
ＢＣＭＡ陽性細胞株およびＢＣＭＡ陰性細胞株に対して破壊されたＴＣＲα対立遺伝子（ＴＣＲα  ＫＯ＋／−Ｔｒｅｘ２）を有する抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の生物学的活性を、サイトカイン放出アッセイを用いて評価した。５×１０４個のＴ細胞は、標準プロセス（ＥＰなし）、ＴＣＲα  ＫＯ、またはＴｒｅｘ２で生成したＴＣＲα  ＫＯを用いて増幅した。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｔ細胞、またはＢＣＭＡ陽性細胞株およびＢＣＭＡ陰性細胞株を１：１の比で、３７℃で２４時間共培養した。培養培地上清を収集し、標準発光アッセイを、異なる細胞型から相対的ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＩＰ−１α生成を評価するために行った。全ての抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原依存性様式においてサイトカインを生成した。図５Ｂ。
【０４８９】
ＴＣＲα  ＫＯ細胞のインビボ有効性
上述の標準プロセス（ＥＰなし）、ＥＰのみ、およびＴＣＲα  ＫＯの処理を用いて製造された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｄａｕｄｉ腫瘍異種移植片モデルを使用してインビボ有効性について試験した。ルシフェラーゼを構成的に発現する２×１０６個のＤａｕｄｉ細胞を、ＮＳＧマウスに注射し、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ撮像装置によって評価されるように、ルシフェラーゼシグナルが、約１×１０７ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ（腫瘍細胞注射後の約１１日）に達するまで、移植し、成長させた。この時、マウスを、１０×１０６、５×１０６、または２．５×１０６個の抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（１群当たりｎ＝５）で注射した。腫瘍の成長に続いて、ルシフェラーゼのＸｅｎｏｇｅｎ造影を介して週２回マウスを連続造影した。２７日で、全ての用量にわたってＴＣＲα  ＫＯ細胞は、標準プロセスを用いて培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、およびｍＲＮＡを用いずに電気穿孔したものをしのいだ。図６Ａ。
【０４９０】
ＴＣＲα  ＫＯ細胞は、継続して、４３日で他の抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞をしのぐ。図６Ｂ。
【０４９１】
実施例２
ＴＣＲα破壊は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞からサイトカイン放出を増強する
抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするレンチウイルスで形質導入したＴ細胞における抗原依存性サイトカイン生成は、ＴＣＲα遺伝子座に組み込まれた抗ＣＤ１９  ＣＡＲを含有するゲノム編集されたＴ細胞における抗原依存性サイトカイン生成と比較した。
【０４９２】
レンチウイルス抗ＣＤ１９  ＣＡＲ
ヒトＰＢＭＣ（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（５０ｎｇ／ｍＬ）で０日目に活性化した。２４時間のインキュベーション後、１×１０６個の細胞を、抗ＣＤ１９  ＣＡＲレンチウイルス（ＬＶ−Ｔ細胞；ｐＢＢ１４６、配列番号８）で形質導入した。レンチウイルスベクターは、ＣＤ８α由来のシグナルペプチド、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターを含むＣＡＲ発現カセットを含有した。レンチウイルスを、確立されたプロトコルを用いて調製した。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
【０４９３】
ＴＣＲα遺伝子座に組み込まれた抗ＣＤ１９  ＣＡＲ
抗ＣＤ１９  ＣＡＲを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドを、設計し、構築し、検証した（ｐＢＷ１０２１、配列番号９）。ドナー修復テンプレートは、ＣＤ８α由来のシグナルペプチド、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターを含むＣＡＲ発現カセットを含有した。ドナー修復テンプレートの５´および３´相同領域は、それぞれ、約６５０ｂｐであった。
【０４９４】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を、複製、カプシド、およびアデノウイルスヘルパーエレメントに必要性をもたらす１つ以上のプラスミドでＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を一時的に同時遺伝子導入することによって調製した。ｒＡＡＶは、イオジキサノール系勾配における超遠心分離を使用して同時遺伝子導入したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞培地から精製した。
【０４９５】
ヒトＰＢＭＣ（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（５０ｎｇ／ｍＬ）で０日目に活性化した。活性化後の３日目に、細胞を、緩衝液のみ（ＵＴＤ対照）またはＴＣＲαを標的化するメガＴＡＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（配列番号１１）で電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、３０℃で１時間インキュベートし、抗ＣＤ１９  ＣＡＲドナー修復テンプレートをコードするｒＡＡＶで形質導入して、ＴＣＲα遺伝子座で相同組換え（ＨＲ−Ｔ細胞）を推進した。ゲノム編集された細胞を、３０℃で２４時間インキュベートし、次いで、回収し、ＩＬ−２を含有する培地で、３７℃で５日間培養した。
【０４９６】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現およびＴＣＲα標的有効性（ＣＤ３陰性細胞）
活性化後の１０日目に、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ３および抗ＣＤ１９  ＣＡＲ表面発現を検出するために、フローサイトメトリーによって分析した。レンチウイルス形質導入は、７２％のＣＤ３＋抗ＣＤ１９−ＣＡＲ＋Ｔ細胞を生成したが、２８〜４０％のＨＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ３−抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋であった。図７。
【０４９７】
抗原依存性細胞傷害性
ＬＶ−ＴおよびＨＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性可能性を、エフェクター対標的物（Ｅ：Ｔ）の比を１：１で２４時間、Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋のＮａｌｍ−６（ＧＦＰ）とＫ５６２（ＢＦＰ）標的細胞の混合物を５０：５０で同時インキュベートすることによって分析した。Ｔ細胞の共培養後、Ｎａｌｍ−６対Ｋ５６２に比は、Ｔ細胞傷害性の直接読み出しである。ＣＤ１９の特異的細胞傷害性の同様のレベルは、ＬＶ−ＴおよびＨＲ−Ｔ細胞の両方の共培養において観察された。図８Ａ。
【０４９８】
抗原依存性細胞傷害性放出
抗原依存性サイトカイン放出を、ＬＶ−Ｔ細胞またはＨＲ−Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋Ｎａｌｍ−６細胞と、Ｅ：Ｔ比を１：１で２４時間共培養することによって分析した。培養上清を収集し、ＩＦＮγ放出をサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。ＨＲ−Ｔ細胞は、ＬＶ−Ｔ細胞と比較して、増加した量のＩＦＮγを放出した。図８Ｂ。
【０４９９】
実施例３
ＴＣＲα破壊は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞からサイトカイン放出を増強する
抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするレンチウイルスで形質導入したＴ細胞における抗原依存性サイトカイン生成は、ＴＣＲα遺伝子座に組み込まれた抗ＣＤ１９  ＣＡＲを含有するゲノム編集されたＴ細胞における抗原依存性サイトカイン生成と比較した。
【０５００】
レンチウイルス抗ＣＤ１９  ＣＡＲ
ヒトＰＢＭＣ（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（５０ｎｇ／ｍＬ）で０日目に活性化した。２４時間のインキュベーション後、１×１０６個の細胞を、抗ＣＤ１９  ＣＡＲレンチウイルス（ＬＶ−Ｔ細胞；ｐＢＢ１４６、配列番号８）で形質導入した。レンチウイルスベクターは、ＣＤ８α由来のシグナルペプチド、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターを含むＣＡＲ発現カセットを含有した。レンチウイルスを、確立されたプロトコルを用いて調製した。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
【０５０１】
ＴＣＲα遺伝子座に組み込まれた抗ＣＤ１９  ＣＡＲ
抗ＣＤ１９  ＣＡＲを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドを、設計し、構築し、検証した（ｐＢＷ４００、配列番号１３）。ドナー修復テンプレートは、ＣＤ８α由来のシグナルペプチド、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、およびウッドチャック転写後調節領域（ＷＰＲＥ）を含むＣＡＲに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターを含むＣＡＲ発現カセットを含有した。ドナー修復テンプレートの５´および３´相同領域は、それぞれ、約６５０ｂｐであった。
【０５０２】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を、複製、カプシド、およびアデノウイルスヘルパーエレメントに必要性をもたらす１つ以上のプラスミドでＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を一時的に同時遺伝子導入することによって調製した。ｒＡＡＶは、イオジキサノール系勾配における超遠心分離を使用して同時遺伝子導入したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞培地から精製した。
【０５０３】
ヒトＰＢＭＣ（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、可溶性抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（５０ｎｇ／ｍＬ）で０日目に活性化した。活性化後の３日目に、細胞を、緩衝液のみ（ＵＴＤ対照）またはＴＣＲαを標的化するメガＴＡＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（配列番号１１）で電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、３０℃で１時間インキュベートし、抗ＣＤ１９  ＣＡＲドナー修復テンプレートをコードするｒＡＡＶで形質導入して、ＴＣＲα遺伝子座で相同組換え（ＨＲ−Ｔ細胞）を推進した。ゲノム編集された細胞を、３０℃で２４時間インキュベートし、次いで、回収し、ＩＬ−２を含有する培地で、３７℃で５日間培養した。
【０５０４】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現およびＴＣＲα標的有効性（ＣＤ３陰性細胞）
活性化後の１０日目に、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ３および抗ＣＤ１９  ＣＡＲ表面発現を検出するために、フローサイトメトリーによって分析した。レンチウイルス形質導入は、８５％のＣＤ３＋抗ＣＤ１９−ＣＡＲ＋Ｔ細胞を生成したが、４９％のＨＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ３−抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋であった。図９。
【０５０５】
抗原依存性細胞傷害性
ＬＶ−ＴおよびＨＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性可能性を、エフェクター対標的物（Ｅ：Ｔ）の比を１：１で２４時間、Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋のＮａｌｍ−６（ＧＦＰ）とＫ５６２（ＢＦＰ）標的細胞の混合物を５０：５０で同時インキュベートすることによって分析した。Ｔ細胞の共培養後、Ｎａｌｍ−６対Ｋ５６２に比は、Ｔ細胞傷害性の直接読み出しである。ＣＤ１９の特異的細胞傷害性の同様のレベルは、ＬＶ−ＴおよびＨＲ−Ｔ細胞の両方の共培養において観察された。図１０Ａ。
【０５０６】
抗原依存性細胞傷害性放出
抗原依存性サイトカイン放出を、ＬＶ−Ｔ細胞またはＨＲ−Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋Ｎａｌｍ−６細胞と、Ｅ：Ｔ比を１：１で２４時間共培養することによって分析した。培養上清を収集し、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＴＮＦα放出をサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。ＨＲ−Ｔ細胞は、ＬＶ−Ｔ細胞と比較して、増加した量のサイトカインを放出した。図１０Ｂ。
【０５０７】
実施例４
ＴＣＲα遺伝子座への抗ＣＤ１９  ＣＡＲトランス遺伝子の相同組換えは、Ｔ細胞枯渇マーカーの低減された発現と関連している
抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするレンチウイルスで形質導入したＴ細胞におけるＴ細胞枯渇は、ＴＣＲα遺伝子座に組み込まれた抗ＣＤ１９  ＣＡＲを含有するゲノム編集されたＴ細胞におけるＴ細胞枯渇と比較した。
【０５０８】
プロモーターを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド、抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするトランス遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを、設計し、構築し、検証した。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を、複製、カプシド、およびアデノウイルスヘルパーエレメントに必要性をもたらす１つ以上のプラスミドでＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を一時的に同時遺伝子導入することによって調製した。ｒＡＡＶは、イオジキサノール系勾配における超遠心分離を使用して同時遺伝子導入したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞培地から精製した。
【０５０９】
レンチウイルスベクターは、ＣＤ８α由来のシグナルペプチド、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターを含むＣＡＲ発現カセットを含有した。レンチウイルスを、確立されたプロトコルを用いて調製した。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
【０５１０】
一次ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、ＣＤ３およびＣＤ２８で活性化した。活性化した一次ヒトＴ細胞を、インビトロで転写されたメガＴＡＬ  ｍＲＮＡで電気穿孔し、抗ＣＤ１９  ＣＡＲトランス遺伝子（ＨＲ−ＣＡＲ  Ｔ細胞）をコードするｒＡＡＶ標的化ベクターで形質導入したか、または活性化した一次ヒトＴ細胞を、抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするレンチウイルスで形質導入した（ＬＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞）。
【０５１１】
ＬＶ−ＴおよびＨＲ−Ｔ細胞を、エフェクター（Ｅ）細胞対標的（Ｔ）細胞の比を１：１で、ＣＤ１９を発現するＮａｌｍ−６細胞で共培養した。Ｔ細胞枯渇マーカー発現（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、およびＴｉｍ−３）を、２４時間および７２時間の共培養で測定した。２４時間で、ＨＲ−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＬＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較してＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の上方調節の低減を示した。図１１Ａ。７２時間で、ＨＲ−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＬＶ−ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較してＰＤ−１およびＴｉｍ−３の上方調節の低減を示した。図１１Ｂ。
【０５１２】
概して、続く特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、可能性のある全ての実施形態を、かかる特許請求の範囲が権利を有する同等物の全範囲と共に含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示により制限されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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