(57)【要約】  哺乳動物において免疫応答を誘発する所望のポリペプチドをコードする核酸配列と、抗体をコードする核酸配列、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせとの組み合わせを含む組成物が、本明細書に開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）抗原をコードする第１の核酸配列と、
ｂ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントをコードする第２の核酸配列と
を含む、組成物。
【請求項２】
前記抗体が、重鎖ポリペプチドまたはそのフラグメント、及び軽鎖ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記重鎖ポリペプチドまたはそのフラグメントが、第３の核酸配列でコードされ、前記軽鎖ポリペプチドまたはそのフラグメントが、第４の核酸配列でコードされている、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第２の核酸配列が、前記第３の核酸配列及び前記第４の核酸配列を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記第２の核酸配列が、前記第３の核酸配列及び第４の核酸配列を単一転写物として発現するプロモーターを更に含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記第２の核酸配列が、プロテアーゼ切断部位をコードする第５の核酸配列を更に含み、前記第５の核酸配列が、前記第３の核酸配列と前記第４の核酸配列の間に位置する、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
対象のプロテアーゼが、前記プロテアーゼ切断部位を認識及び切断する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記重鎖ポリペプチドが、可変重領域及び定常重領域１を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記重鎖ポリペプチドが、可変重領域、定常重領域１、ヒンジ領域、定常重量域２及び定常重量域３を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記軽鎖ポリペプチドが、可変軽領域及び定常軽領域を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第２の核酸配列がコザック配列を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第４の核酸配列が免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＩｇシグナルペプチドにはＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドが含まれる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗体が前記抗原に対して特異的である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗原が外来性抗原である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記外来性抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原及び寄生虫抗原からなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ウイルス抗原が、ＨＩＶ抗原、チクングニア抗原、デング抗原、肝炎抗原、ＨＰＶ抗原、ＲＳＶ抗原、インフルエンザ抗原及びエボラ抗原からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ウイルス抗原がチクングニア抗原である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第１の核酸配列が、配列番号８１〜８８に記載されているアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗原をコードする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第１の核酸配列が、配列番号８９〜９６に記載されている核酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第２の核酸配列が、配列番号５９または６１に記載されているアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第２の核酸配列が、配列番号５８または６０に記載されている核酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗原が自己抗原である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物を、個体に、前記個体において免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む、免疫応答を誘導する方法。
【請求項２６】
前記免疫応答が持続性である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫応答が全身性である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を個体に投与することを含む、疾患または障害が診断されている個体の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月２１日出願の米国特許仮出願第６２／３１１，３１６号、２０１６年９月１９日出願の米国特許仮出願第６２／３９６，７４８号、２０１６年９月１９日出願の米国特許仮出願第６２／３９６，７５０号、２０１６年１１月３日出願の米国特許仮出願第６２／４１７，０９３号、２０１６年５月４日出願の米国特許仮出願第６２／３３２，３８１号、２０１６年８月１７日出願の米国特許仮出願第６２／３７６，１６２号、２０１６年１２月２日出願の米国特許仮出願第６２／４２９，４５４号及び２０１６年１２月２日出願の米国特許仮出願第６２／４２９，４７３号の優先権を主張し、これらは、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ＤＮＡワクチンと、１つ以上の合成抗体をインビボで生成する組み換え核酸配列及びその機能性フラグメントを含む組成物との組み合わせに関する。本発明の組成物は、免疫応答を誘導するため、ならびに抗原に対して個体を予防的及び／または治療的に免疫化するための改善された方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
免疫グロブリン分子は、それぞれ軽（Ｌ）及び重（Ｈ）鎖の２つの種類を含み、これらはシステイン残基の間でジスルフィド結合（Ｓ−Ｓと示されている）により共有結合的に連結されている。重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインが、抗体分子の結合部位に寄与する。重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）、ならびに（可撓性）ヒンジ領域から構成される。軽鎖も定常ドメイン（ＣＬ）を有する。重及び軽鎖の可変領域は、４つのフレームワーク領域（ＦＲ：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）、ならびに３つの相補性決定領域（ＣＤＲ：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）から構成される。したがって、これらは非常に複雑な遺伝子系であり、インビボで組み立てることが困難である。
【０００４】
標的モノクローナル抗体（ｍＡＢ）は、過去２５年間における最も重要な医学的な治療上の進歩の１つを表している。この種類の免疫に基づいた療法は、多数の自己免疫性疾患、がん治療、ならびに感染性疾患に対して、現在日常的に使用されている。悪性腫瘍では、現在使用されている免疫グロブリン（Ｉｇ）に基づいた療法の多くが、腫瘍に対して向けられる細胞傷害性化学療法レジメンと組み合わされている。この組み合わせ手法は、全体的な生存率を大幅に改善している。多数のｍＡｂ調合剤が、特定のがんに対して使用が認可されており、非ホジキンリンパ腫を治療するためにＣＤ２０を標的とするキメラｍＡｂであるＲｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、ならびにＣＴＬＡ−４を遮断し、黒色腫及び他の悪性腫瘍の治療に使用されているヒトｍＡｂであるイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）が含まれる。加えて、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）は別の重要なヒト化ｍＡｂであり、ＶＥＧＦ及び腫瘍新血管新生を標的にし、結腸直腸癌の治療に使用されている。悪性腫瘍の治療において恐らく最も高い注目を集めているｍＡｂは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを標的とするヒト化調合剤であるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）であり、患者のサブセットにおいて乳癌に対して顕著な効力を有することが実証されている。更に、多数のｍＡｂが、自己免疫性及び特定の血液障害の治療に使用される。
【０００５】
がん治療に加えて、ポリクローナルＩｇの受動移入は、ジフテリア、Ａ型及びＢ型肝炎、狂犬病、破傷風、水痘、ならびに呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）を含む多数の感染性疾患に対する防御効力を媒介する。事実、いくつかのポリクローナルＩｇ調合剤は、防御Ｉｇが能動的ワクチン接種により生成されるのに十分な時間がない状況下で疾患流行域に旅行する個人に、特定の感染性病原体に対する一時的な防御を提供する。更に、免疫機能不全の小児において、ＲＳＶ感染を標的にするｍＡｂであるパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ）は、ＲＳＶに対する臨床的防御が実証されている。
【０００６】
市場に存在する現在利用可能な治療抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。これらの抗体には、抗体定常領域（Ｆｃ）に結合した２つのＮ連結二分枝複合型オリゴ糖を有する糖タンパク質が含まれ、ここで大部分のオリゴ糖はコアフコシル化されている。これは、Ｆｃと白血球受容体（ＦｃγＲ）または補体との相互作用を介して、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のエフェクター機能を発揮する。治療抗体のインビボ効力における（インビトロと比べた）低減現象があり、したがって、大用量の、時には数百ミリグラムの毎週用量の治療抗体が必要となる。これは、主に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＦｃγＲＩＩＩａへの結合における血清ＩｇＧと治療抗体との競合に起因する。内在性ヒト血清ＩｇＧは、治療抗体により誘導されるＡＤＣＣを阻害する。したがって、ヒトにおいて非フコシル化治療抗体の効力が増強され得る。非フコシル化治療抗体は、フコシル化ヒト血清ＩｇＧよりかなり高い結合親和性をＦｃγＲＩＩＩａに対して有し、これは、ヒト血漿ＩｇＧによる干渉を克服する好ましい特性である。
【０００７】
抗体に基づいた治療には、危険性がないわけではない。１つのそのような危険性は抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）であり、これは、非中和抗ウイルスタンパク質が宿主細胞へのウイルス侵入を促進し、細胞に感染性の増加をもたらすときに生じる。いくつかの細胞は、ウイルスが侵入するために使用する通常の受容体を表面に有さない。抗ウイルスタンパク質（すなわち、抗体）は、これらの細胞のうちのいくつかが形質膜に有する抗体Ｆｃ受容体に結合する。ウイルスは、抗体のもう一方の末端にある抗原結合部位に結合する。このウイルスは、この機構を使用してヒトマクロファージに感染し、通常は軽度のウイルス感染を、命を脅かすものにする可能性がある。最も広く知られているＡＤＥの例は、デングウイルス（ＤＥＮＶ）による感染状況において生じる。ＤＥＮＶの１つの血清型に以前に感染した人が、何か月または何年か後に異なる血清型に感染する場合に観察される。そのような場合、疾患の臨床経過はより重篤であり、これらの人々は、ＡＤＥが生じていない人々と比較して高いウイルス血症を有する。このことは、一次（最初の）感染がほぼ軽症の疾患（ＤＦ）を小児に引き起こし、一方、二次感染（後日の再感染）が、小児及び成人の両方におけるより重症の疾患（ＤＨＦ及び／またはＤＳＳ）を伴う可能性が高いという観察を説明している。４つの抗原的に異なるＤＥＮＶの血清型（ＤＥＮＶ−１〜ＤＥＮＶ−４）がある。ＤＥＮＶによる感染は、中和同型免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の産生を誘導し、感染血清型に対して終生免疫をもたらす。ＤＥＮＶによる感染は、他の３つの血清型に対してある程度の交差防御免疫も生じる。中和異型抗体の誘導に加えて、ＤＥＮＶによる感染は、ウイルスを部分的にしか中和しない、または全く中和しない異型抗体も誘導し得る。そのような交差反応性であるが非中和性の抗体の産生が、より重篤な二次感染の理由であり得る。いったん白血球の内部に入ると、ウイルスの複製は検出されず、最終的に非常に高いウイルス力価を生成し、重篤な疾患を引き起こす。
【０００８】
ｍＡｂ療法の臨床的影響は印象的である。しかし、この治療手法の使用及び普及を制限する問題が依然として存在する。これらのうちのいくつかには、これらの複合生物製剤の高い製造価格が含まれ、より広範な人々における、特に大きな影響を与え得る開発途上世界における使用を制限し得る。更に、効力を獲得及び維持するためにｍＡｂを繰り返し投与する頻度要件は、ロジスティックス及び患者の服薬遵守に関して妨げになり得る。血清ＩｇＧとの競合に起因する治療抗体の低インビボ効力を低減または排除する、新たな抗体が必要である。デング、ＨＩＶ、ＲＳＶなどのようなウイルスにおける抗体依存性感染増強を排除することができる、新たな抗体が必要である。治療的または予防的であることが実証でき得るいくつかの機能を行う二重特異性抗体、二機能性抗体及び抗体カクテルが必要である。本明細書に記載されている合成抗体を、ＤＮＡに基づいたワクチンを含むワクチンによる免疫化を介した宿主系の免疫刺激と共に利用することができる併用療法も、必要である。加えて、これらの抗体製剤の長期安定性は、たびたび短く、最適ではない。したがって、安全で費用有効的に対象に送達することができる合成抗体分子の必要性が、当該技術において依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘発する組成物と、抗体、そのフラグメント、その変異体、またはその組み合わせをコードする核酸配列を含む組成物との組み合わせを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の１つの態様は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘発するポリペプチドを発現することができる、核酸構築物を提供する。核酸構築物は、コードヌクレオチド配列及びコードヌクレオチド配列に作動可能に連結しているプロモーターから構成される。コードヌクレオチド配列はポリペプチドを発現し、ポリペプチドはコンセンサス抗原を含む。プロモーターは、哺乳動物においてポリペプチドの発現を調節する。
【００１１】
本発明の別の態様は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を生成することができる、ＤＮＡプラスミドワクチンを提供する。ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳動物においてコンセンサス抗原を発現することができるＤＮＡプラスミド及び薬学的に許容される賦形剤から構成される。ＤＮＡプラスミドは、コンセンサス抗原をコードするコード配列に作動可能に連結しているプロモーターから構成される。
【００１２】
本発明の別の態様は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、ＤＮＡプラスミドワクチンを、哺乳動物の組織に送達することであり、ＤＮＡプラスミドワクチンが、哺乳動物において免疫応答を誘発するために、哺乳動物の細胞にコンセンサス抗原を発現することができるＤＮＡプラスミドを含む、送達することと、組織の細胞を電気穿孔して、ＤＮＡプラスミドが細胞に侵入することを可能にすることを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明は、対象において合成抗体を生成する方法に向けられている。本方法は、抗体をコードする組み換え核酸配列またはそのフラグメントを含む組成物を対象に投与することを含むことができる。組み換え核酸配列は、合成抗体を生成するために対象において発現され得る。
【００１４】
生成された合成抗体は、脱フコシル化されていてもよい。生成された合成抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２領域にロイシンからアラニンへの２個の突然変異を含んでいてもよい。
【００１５】
抗体は、重鎖ポリペプチドまたはそのフラグメント及び軽鎖ポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことができる。重鎖ポリペプチドまたはそのフラグメントを、第１の核酸配列でコードすることができ、軽鎖ポリペプチドまたはそのフラグメントを、第２の核酸配列でコードすることができる。組み換え核酸配列は、第１の核酸配列及び第２の核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、対象において第１の核酸配列及び第２の核酸配列を単一転写物として発現するプロモーターを、更に含むことができる。プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得る。
【００１６】
組み換え核酸配列は、プロテアーゼ切断部位をコードする第３の核酸配列を更に含むことができる。第３の核酸配列は、第１の核酸配列と第２の核酸配列の間に位置することができる。対象のプロテアーゼは、プロテアーゼ切断部位を認識し、切断することができる。
【００１７】
組み換え核酸配列は、抗体ポリペプチド配列を生成するために対象において発現され得る。抗体ポリペプチド配列は、重鎖ポリペプチドまたはそのフラグメント、プロテアーゼ切断部位及び軽鎖ポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことができる。対象により産生されるプロテアーゼは、抗体ポリペプチド配列のプロテアーゼ切断部位を認識し、切断することができ、それによって、切断重鎖ポリペプチド及び切断軽鎖ポリペプチドが生成される。合成抗体は、切断重鎖ポリペプチド及び切断軽鎖ポリペプチドにより生成され得る。
【００１８】
組み換え核酸配列は、第１の核酸配列を第１の転写物として発現する第１のプロモーター及び第２の核酸配列を第２の転写物として発現する第２のプロモーターを含むことができる。第１の転写物は第１のポリペプチドに翻訳され、第２の転写物は第２のポリペプチドに翻訳され得る。合成抗体は、第１及び第２のポリペプチドにより生成され得る。第１のプロモーター及び第２のプロモーターは、同じものであり得る。プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得る。
【００１９】
重鎖ポリペプチドは、可変重領域及び定常重領域１を含むことができる。重鎖ポリペプチドは、可変重領域、定常重領域１、ヒンジ領域、定常重量域２及び定常重量域３を含むことができる。軽鎖ポリペプチドは、可変軽領域及び定常軽領域を含むことができる。
【００２０】
組み換え核酸配列は、コザック配列を更に含むことができる。組み換え核酸配列は、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドを更に含むことができる。Ｉｇシグナルペプチドには、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドが含まれ得る。
【００２１】
組み換え核酸配列は、配列番号１、２、５、４１、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１及び８０のアミノ酸配列の少なくとも１つをコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号３、４、６、７、４０、４２、４４、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６３及び７９の核酸配列のうちの少なくとも１つを含むことができる。
【００２２】
また本発明は、対象において合成抗体を生成する方法に向けられている。本方法は、重鎖ポリペプチドをコードする第１の組み換え核酸配列またはそのフラグメントと、軽鎖ポリペプチドをコードする第２の組み換え核酸配列またはそのフラグメントとを含む組成物を対象に投与することを含むことができる。第１の組み換え核酸配列は、第１のポリペプチドを生成するために対象において発現され、第２の組み換え核酸は、第２ポリペプチドを生成するために対象において発現され得る。合成抗体は、第１及び第２のポリペプチドにより生成され得る。
【００２３】
第１の組み換え核酸配列は、対象において第１のポリペプチドを発現する第１のプロモーターを更に含むことができる。第２の組み換え核酸配列は、対象において第２のポリペプチドを発現する第２のプロモーターを更に含むことができる。第１のプロモーター及び第２のプロモーターは、同じものであり得る。プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得る。
【００２４】
重鎖ポリペプチドは、可変重領域及び定常重領域１を含むことができる。重鎖ポリペプチドは、可変重領域、定常重領域１、ヒンジ領域、定常重量域２及び定常重量域３を含むことができる。軽鎖ポリペプチドは、可変軽領域及び定常軽領域を含むことができる。
【００２５】
第１の組み換え核酸配列及び第２の組み換え核酸配列は、コザック配列を更に含むことができる。第１の組み換え核酸配列及び第２の組み換え核酸配列は、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドを更に含むことができる。Ｉｇシグナルペプチドには、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドが含まれ得る。
【００２６】
本発明は、対象において疾患を予防または治療する方法に更に向けられている。本方法は、上記の方法のうちの１つに従って対象において合成抗体を生成することを含むことができる。合成抗体は、外来抗原に対して特異的であり得る。外来抗原は、ウイルス由来であり得る。ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、またはデングウイルスであり得る。
【００２７】
ウイルスは、ＨＩＶであり得る。組み換え核酸配列は、配列番号１、２、５、４６、４７、４８、４９、５１、５３、５５及び５７のアミノ酸配列の少なくとも１つをコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号３、４、６、７、５０、５２、５５、５６、６２及び６３の核酸配列の少なくとも１つを含むことができる。
【００２８】
ウイルスは、ＣＨＩＫＶであり得る。組み換え核酸配列は、配列番号５９及び６１のアミノ酸配列の少なくとも１つをコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号５８、６０、９７、９８、９９及び１００の核酸配列の少なくとも１つを含むことができる。
【００２９】
ウイルスは、ジカであり得る。組み換え核酸配列は、配列番号１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２１、１２２、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、または１３３のアミノ酸配列の少なくとも１つをコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号１２４，１２６、１２８、１３０、または１３２の核酸配列の少なくとも１つを含むことができる。
【００３０】
ウイルスは、デングウイルスであり得る。組み換え核酸配列は、少なくとも１つの配列番号４５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、少なくとも１つの配列番号４４の核酸配列を含む。
【００３１】
合成抗体は、自己抗原に対して特異的であり得る。自己抗原は、Ｈｅｒ２であり得る。組み換え核酸配列は、配列番号４１及び４３のアミノ酸配列の少なくとも１つをコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号４０及び４２の核酸配列の少なくとも１つを含むことができる。
【００３２】
合成抗体は、自己抗原に対して特異的であり得る。自己抗原は、ＰＳＭＡであり得る。組み換え核酸配列は、少なくとも１つの配列番号８０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、少なくとも１つの配列番号７９の核酸配列を含むことができる。
【００３３】
本発明は、上に記載された方法のいずれか１つにより産生された産物にも向けられている。産物は、機能性抗体を発現することができる単一ＤＮＡプラスミドであり得る。産物は、インビボで組み合わされて機能性抗体を形成する機能性抗体の構成成分を発現することができる、２つ以上の別個のＤＮＡプラスミドから構成され得る。
【００３４】
本発明は、病原体に感染した対象を治療する方法であって、病原体に特異的な合成抗体をコードするヌクレオチド配列を投与することを含む方法にも向けられている。本方法は、病原体の抗原を投与して、対象に免疫応答を生成することを更に含むことができる。
【００３５】
本発明は、がんの対象を治療する方法であって、がんマーカーをコードするヌクレオチド配列を投与して、ＡＤＣＣを誘導することを含む方法にも向けられている。
【００３６】
本発明は、配列番号７９に記載されている核酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有する核酸配列を含む合成抗体をコードする、核酸分子にも向けられている。
【００３７】
本発明は、配列番号７９に記載されている核酸配列を含む合成抗体をコードする核酸分子にも向けられている。
【００３８】
本発明は、配列番号８０に記載されているアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列を含む合成抗体をコードする、核酸分子にも向けられている。
【００３９】
本発明は、配列番号８０に記載されているアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含む合成抗体をコードする、核酸分子にも向けられている。
【００４０】
上に記載された核酸分子のうちのいずれか１つは、発現ベクターを含んでもよい。
【００４１】
本発明は、上に記載された核酸分子の１つ以上を含む組成物にも向けられている。組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＡからＤを含み、ＣＶＭ１−免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）及びＣＶＭ−１−Ｆａｂ  ｄＭＡｂプラスミドの設計及び発現を描写する。Ａは、ＣＶＭ１−Ｆａｂのインビトロ発現を描写する。ＣＶＭ１−Ｆａｂ、ＣＶＭ１−可変重鎖（ＶＨ）及びＣＶＭ１−可変軽鎖（ＶＬ）構築物を２９３Ｔ細胞に形質移入し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）による結合を介してインビトロ発現を決定した。試料を形質移入の０、２４及び４８時間後に分析した。空骨格（ｅｍｐｔｙ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）ｐＶａｘ１プラスミドで形質移入した細胞が陰性対照として機能した。Ｂは、ＣＶＭ１−ＩｇＧのインビトロ発現を描写する。ＣＶＭ１−ＩｇＧを２９３Ｔ細胞に形質移入し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）による結合を介してインビトロ発現を決定した。試料を形質移入の０、２４及び４８時間後に分析した。空骨格ｐＶａｘ１プラスミドで形質移入した細胞が陰性対照として機能した。Ｃは、ＣＶＭ１−ＩｇＧ及びＣＶＭ１−Ｆａｂのインビボ発現を描写する。５〜６週齢のマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｊ）が、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、ＣＶＭ１−ＶＨ、ＣＶＭ１−ＶＬ、またはＣＶＭ１−Ｆａｂプラスミドの単回１００μｇの筋肉内注射を受け、続いて電気穿孔を受けた（１群あたり５頭のマウス）。ｐＶａｘ１ベクターの注射を陰性対照として使用した。血清ＩｇＧレベルを、筋肉内注射を受けたマウスにおいて様々な時点で測定した。Ｄは、ＣＶＭ１−ＩｇＧが投与されたマウスの血清が、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）に結合したことを実証する実験結果を描写する。ＥＬＩＳＡプレートを、組み換えＣＨＩＫＶエンベロープまたはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）（サブタイプＢ、ＭＮ）エンベロープタンパク質で被覆し、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、ＣＶＭ１−Ｆａｂ、またはｐＶａｘ１の単回注射を与えたマウスから１５日目に得た血清を試験した。
【図２】ＡからＤを含み、ＣＶＭ１−免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の結合分析及び中和活性を描写する。Ａは、ＣＶＭ１−ＩｇＧ投与マウスにより生成されたＩｇＧが、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）に結合できたことを実証する免疫蛍光アッセイを描写する。ＣＨＩＫＶ感染ベロ細胞を感染の２４時間後に固定し、免疫蛍光アッセイにより評価して、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ抗原発現（緑色）を検出した。細胞核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。ｐＶａｘ１が注射された対照マウスの血清を陰性対照として使用した。Ｂは、ＣＶＭ１−ＩｇＧ注射マウスの血清（１５日目）の、標的タンパク質への結合親和性を描写する。結合は、ＣＨＩＫＶ感染細胞または偽感染細胞の細胞溶解産物を使用して、ウエスタンブロットにより検査した。タンパク質移入膜を、装填対照として、β−アクチンに対する抗体で再検索した。ここに提示されている画像は、元の画像からトリミングされたものであり、いくつかのゲルの代表例である。Ｃは、プラスミド注射マウスの血清のＣＨＩＫＶ感染細胞への結合の蛍光活性化細胞選別分析を描写する。ｘ軸は、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖを補完したレンチウイルスＧＦＰ偽ウイルスを使用した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）染色を示す。ｙ軸は、ＣＶＭ１−ＩｇＧを注射した１５日後のマウスに産生されたヒトＩｇＧによる感染細胞の染色を示す。対照抗ＣＨＩＫＶ抗体（Ｅｎｖ抗体）による染色、ならびに抗体なし及びｐＶａｘ１による染色も示されている。二重陽性細胞の存在及び数は、ＣＨＩＫＶ感染細胞に結合する血清の存在及びレベルを示す。Ｄは、電気穿孔を介してＣＶＭ１−ＩｇＧが注射されたマウスの血清が、複数のＣＨＩＫＶ株（すなわち、Ｒｏｓｓ、ＬＲ２００６−ＯＰＹ１、ＩＮＤ−６３−ＷＢ１、ＰＣ−０８、ＤＲＤＥ−０６及びＳＬ−ＣＨ１）に対する中和活性を有することを描写している。中和抗体力価がプロットされており、５０％阻害濃度（ＩＣ５０値、括弧内）をＰｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエアで計算した。同様の結果が、それぞれの実験において１群あたり少なくとも１０頭のマウスを用いた２つの独立した実験において観察された。
【図３】ＡからＤを含み、ＣＶＭ１−Ｆａｂ及びＣＶＭ１−免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）により付与されたインビボ免疫防御の特徴決定を描写する。Ａは、１００μｇのｐＶａｘ１（陰性対照）、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、ＣＶＭ１−可変重鎖及びＣＶＭ１−可変軽鎖が０日目に注射され、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）が２日目に負荷されたＢＡＬＢ／ｃマウスを描写する。マウスを毎日モニターし、生存率をウイルス負荷後の２０日間にわたって記録した。Ｂは、１００μｇのｐＶａｘ１（陰性対照）、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、ＣＶＭ１−可変重鎖及びＣＶＭ１−可変軽鎖が０日目に注射され、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）が３０日目に負荷されたＢＡＬＢ／ｃマウスを描写する。マウスを毎日モニターし、生存率をウイルス負荷後の２０日間にわたって記録した。Ｃは、異なる経路のＣＨＩＫＶ負荷からのマウスの防御を描写する。２群のマウスに、１００μｇのＣＶＭ１−ＩｇＧを筋肉内経路で注射し、続いて２日目にウイルス負荷を皮下接種により行った。マウスを毎日モニターし、生存率をウイルス負荷後の２０日間にわたって記録した。黒色矢印はプラスミド注射を示し、赤色矢印はウイルス負荷の時点を示す。各群は１０頭のマウスからなり、結果は、２つの独立した実験の代表例であった。Ｄは、異なる経路のＣＨＩＫＶ負荷からのマウスの防御を描写する。２群のマウスに、１００μｇのＣＶＭ１−ＩｇＧを筋肉内経路で注射し、続いて２日目にウイルス負荷を鼻腔内接種により行った。マウスを毎日モニターし、生存率をウイルス負荷後の２０日間にわたって記録した。黒色矢印はプラスミド注射を示し、赤色矢印はウイルス負荷の時点を示す。各群は１０頭のマウスからなり、結果は、２つの独立した実験の代表例であった。
【図４】ＡからＤを含み、ＣＶＭ１−免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）とチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）ＤＮＡワクチンとの比較及び組み合わせ試験を描写する。Ａは、１００μｇのＣＶＭ１−ＩｇＧ、１００μｇのｐＶａｘ１（陰性対照）、または２５μｇのＣＨＩＫＶーＥｎｖ  ＤＮＡが０日目に注射され、ＣＨＩＫＶ  Ｄｅｌ−０３（ＪＮ５７８２４７、１×１０７プラーク形成単位の総体積２５μＬ）が２日目に負荷されたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率分析を描写する。マウスを負荷後２０日間にわたってモニターし、生存率を記録した。Ｂは、１００μｇのＣＶＭ１−ＩｇＧの単回注射が０日目に投与された、または２５μｇのＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡの免疫化が０日目、１４日目及び１８日目に３回投与され、次に同じ条件下で同じＣＨＩＫＶ分離株で３５日目に負荷されたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率分析を描写する。マウスを負荷後２０日間にわたってモニターし、生存率を記録した。Ｃは、ＣＶＭ１−ＩｇＧの１００μｇの単回注射が０日目に投与され、ＣＨＩＫＶーＥｎｖ  ＤＮＡ（２５μｇ）の免疫化が０日目、１４日目及び２８日目に３回投与された、２０群のＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率分析を描写する。次に半数のマウスを２日目に、残りの半数を３５日目に、同じ条件下で、上に記載されたものと同じＣＨＩＫＶ分離株負荷によって負荷した。黒色矢印はプラスミド注射を示し、赤色矢印はウイルス負荷の時点を示す。マウスを負荷後２０日間にわたってモニターし、生存率を記録した。Ｄは、マウスにおける２回目の免疫化の１間後の単回ＣＶＭ１−ＩｇＧ（ヒト抗ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ）注射及びＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ免疫化（マウス抗ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ）による、抗ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ抗体の持続的及び全身的な誘導を実証する実験結果を描写する。
【図５】ＡからＣを含み、ＣＶＭ１−免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）及び／またはチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）ＤＮＡがワクチン投与されたウイルス負荷マウスにおける病理的な足蹠腫脹及び体重変化の特徴決定を描写する。Ａは、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ、ＣＶＭ１−ＩｇＧ＋ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ、またはｐＶａｘ１（対照）を受けたマウスにおけるＣＨＩＫＶ負荷の１週間後のウイルス力価を描写する。各データ点は、１０頭のマウスのウイルス力価の平均を表す。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。Ｂは、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ、ＣＶＭ１−ＩｇＧ＋ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ、またはｐＶａｘ１を受けたマウスにおける、ＣＨＩＫＶ分離株による皮下接種後の毎日の平均体重増加（±標準偏差［ＳＤ］）を描写する。マウスを接種後の特定の日に計量した。結果は、平均体重（±ＳＤ）を表す。Ｃは、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ、ＣＶＭ１−ＩｇＧ＋ＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ、またはｐＶａｘ１を受けたマウスにおいて特定の日にカリパスの使用により定量化された、後ろ足の腫脹を描写する。データは平均値（±ＳＤ）である。
【図６】Ａ及びＢを含み、ウイルス負荷ＣＶＭ１−ＩｇＧ及び／またはＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチン接種マウスにおける細胞免疫分析を描写する。Ａは、ＣＶＭ１−ＩｇＧ＋ＣＨＩＫＶーＥｎｖが注射され、次に同じ条件下でＣＨＩＫＶ分離株が３５日目に負荷されたマウスで測定された、抗ＣＨＩＫＶヒトＩｇＧレベルの濃度を描写する。抗ＣＨＩＫＶヒトＩｇＧレベルの濃度は、注射後の指示された時点で測定された。Ｂは、ＣＨＩＫＶ特異的ペプチドで刺激された後にＣＶＭ１−ＩｇＧ＋ＣＨＩＫＶーＥｎｖが注射されたマウスの脾細胞におけるＴ細胞応答を描写する。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを、３５日目に試料において実施した。示されたデータは、少なくとも２つの別々の実験の代表例である。
【図７】ＣＨＩＫＶ感染マウスの血清炎症促進性サイトカインのレベルの特徴決定を描写する。サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６）のレベルを、特定のＥＬＩＳＡアッセイにより負荷１週間後のマウスにおいて測定した。ＣＨＩＫＶ  ＩｇＧ及びＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖが注射されたマウスは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６レベルで類似した有意により低い血清レベルを有した。データは、マウス（ｎ＝１群につき１０頭）あたり３つのウエルの平均を表す。
【図８】抗ジカウイルスＥｎｖ抗体の持続的及び全身的な誘導を実証する実験結果を描写する。抗ＺＩＫＶ抗体応答は、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ＋ＺＶ−ＤＭＡｂ免疫化によって誘導される。Ａ１２９マウス（ｎ＝４）を２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドにより２週間間隔で３回、またはＺＩＫＶ−ＤＭＡｂにより１回、筋肉内において免疫化した。組み換えＺＩＫＶ−エンベロープへの結合を、示された異なる時点での動物の血清により分析した。単回のＺＶ−ＩｇＧ（ヒト抗ＺＩＫＶ）注射及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化（マウス抗ＺＩＫＶエンベロープ）に続く抗ＺＩＫＶ  Ｅｎｖ抗体の持続的及び全身的な誘導である。示されているデータは、少なくとも２つの別々の実験の代表例であり、平均ＯＤ４５０値は±ＳＤで示されている。
【図９】ＺＩＫＶ−Ｅタンパク質の構造を描写する。
【図１０】ジカｄＭＡｂの開発及び特徴決定のワークフローを描写する。
【図１１】ＺＩＫＶ−Ｅｎｖ特異的モノクローナル抗体の結合ＥＬＩＳＡを描写する。
【図１２】ＺＶ  Ｅｎｖ及びＺＶ  ｍＡｂのウエスタンブロットを描写する。２μｇのｒＺＶエンベロープタンパク質を装填し、１：２５０の希釈をＺＶモノクローナル抗体に使用した。
【図１３】ジカｍＡｂのＶＨ及びＶＬの整列を描写する。
【図１４】ジカｍＡｂのＶＨ及びＶＬの整列及び識別、ならびにＲＭＳＤ基質を描写する。
【図１５】ｍＡｂモデルの重ね合わせを描写する。
【図１６】ＣＤＲ領域モデルの比較を描写する。
【図１７】ｍＡｂの１Ｃ２Ａ６、８Ｄ１０Ｆ４及び８Ａ９Ｆ９のＶＨ及びＶＬの整列を描写する。
【図１８】１Ｃ２Ａ６Ｆｖのモデルを描写する。
【図１９】８Ｄ１０Ｆ４、１Ｃ２Ａ６、８Ａ９Ｆ９、３Ｆ１２Ｅ９及び１Ｄ４Ｇ７のＦｖの生物物理的特徴の概要を描写する。
【図２０】ＡからＥを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサスＤＮＡワクチンの構築を実証する実験結果を描写する。Ａは、ｐＶａｘ１哺乳類発現ベクターへのクローニングを示すＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンの概略図を描写する。コンセンサス設計戦略をＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス配列に採用した。ｐｒＭＥ構築物のコドン最適化合成遺伝子は、合成ＩｇＥリーダー配列を含んだ。最適化遺伝子構築物を、ＣＭＶプロモーターの制御下で修飾ｐＶａｘ１ベクターのＢａｍＨ１及びＸｈｏ１部位に挿入した。Ｂは、ワクチン標的と、潜在的に関連するエピトープ領域との重複を実証する、ＺＩＫＶ−Ｅタンパク質のモデル構築を描写する。ワクチン設計の目的により行ったいくつかの変更が、ドメインＩＩ及びＩＩＩに位置している（中央左の差し込み図の点線の範囲内に位置する）。これらの領域におけるワクチン特異的残基の変化は、Ｅ（エンベロープ）タンパク質二量体のリボン主鎖図の紫色ＣＰＫフォーマットで示されている（各鎖は、それぞれ薄緑色及び深緑色である）。確定されたＥＤＥに対応する領域は青緑色で示され、融合ループは青色で示されている。ワクチンＥタンパク質の残基Ｉｌｅ１５６（Ｔ１５６Ｉ）は、１５０ループの表面に露出するようにモデルで作られており、いくつかの他のＺＩＫＶ株、ならびに多数のデングウイルス株のＮ連結グリコシル化モチーフＮＸＳ／Ｔの一部である。Ｃは、ウエスタンブロット分析を使用した、２９３Ｔ細胞におけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現分析を描写する。２９３Ｔ細胞にＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドを形質移入し、細胞溶解産物及び上澄みを、パン−フラビウイルス免疫化血清によってワクチン構築物の発現について分析した。タンパク質分子量マーカー（ｋＤａ）、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ形質移入細胞の細胞溶解産物及び上澄み、ならびにｒＺＩＫＶ−Ｅ陽性対照を、示されたように装填した。Ｄは、ウエスタンブロット分析を使用した、２９３Ｔ細胞におけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現分析を描写する。２９３Ｔ細胞にＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドを形質移入し、細胞溶解産物及び上澄みを、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化血清によってワクチン構築物の発現について分析した。タンパク質分子量マーカー（ｋＤａ）、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ形質移入細胞の細胞溶解産物及び上澄み、ならびにｒＺＩＫＶ−Ｅ陽性対照を、示されたように装填した。Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質発現の免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）分析を描写する。細胞に５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドを形質移入した。形質移入した２４時間後に、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化マウスの血清（１：１００）を添加し、続いて検出のために二次抗体の抗マウスＩｇＧ−ＡＦ４８８抗体を添加することによって、免疫蛍光標識化を実施した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ及びｐＶａｘ１免疫化マウスの血清による染色が示されている。ＤＡＰＩパネルは、細胞核の対照染色を示す。オーバーレイパネルは、抗マウスＩｇＧ−ＡＦ４８８とＤＡＰＩの染色パターンの組み合わせである。ＤＡＰＩは４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであり、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥはジカウイ��スの前駆体の膜及びエンベロープである。
【図２１】ＡからＤを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチン接種後のマウスにおける細胞免疫応答の特徴決定を実証する実験結果を描写する。Ａは、この試験に使用されたワクチン免疫化及び免疫分析の時系列を描写する。Ｂは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化に応答した脾細胞におけるＩＦＮ−γ分泌を測定するＥＬＩＳｐｏｔ分析を描写する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）を、２５μｇのｐＶａｘ１またはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンにより３回、筋肉内で免疫化し、続いて電気穿孔した。細胞免疫応答の誘導を示すＩＦＮ−γ生成を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより測定した。３回目の免疫化の１週間後に採取した脾細胞を、ｐｒＭ及びエンベロープタンパク質の全体にわたる６つのペプチドプールのうちの１つの存在下でインキュベートした。結果を積み上げ棒グラフで示す。データは、百万個の脾細胞あたりのＳＦＵ（スポット形成単位）の平均数を表し、値はそれぞれの平均応答±平均値の標準誤差を表す。Ｃは、３回目の免疫化の１週間後に基質ペプチドプール１で刺激することによって決定された、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的ＩＦＮ−γ応答のエピトープ組成を描写する。値は、各群の平均応答±平均値の標準誤差を表す。この実験を、独立して少なくとも３回実施して、類似した結果を得た。Ｄは、Ｔ細胞応答のフローサイトメトリー分析を描写する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥによる免疫化は、ＺＩＫＶペプチドで刺激されたとき、多数のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌細胞を誘導する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンによる最後の免疫化の１週間後に、脾細胞を、プールしたＺＩＫＶペプチド（５μＭ）またはＲ１０単独の存在下で培養した。ＺＩＫＶペプチド特異的ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌細胞の頻度を、フローサイトメトリーにより測定した。単機能ゲートを、陰性対照（非刺激）試料に基づいて設定し、試料全体にわたって一定に配置した。全ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答率（％）が示されている。これらのデータは、２つの独立した免疫化実験の代表例である。ＩＮＦはインターフェロンであり、ＴＮＦは腫瘍壊死因子であり、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥはジカウイルスの前駆体の膜及びエンベロープである。
【図２２】ＡからＥを含み、抗ＺＩＫＶ抗体応答がＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種により誘導されることを実証する実験結果を描写する。Ａは、免疫化マウスにおける結合抗体産生を測定する（ＯＤ４５０値により測定する）ＥＬＩＳＡ分析を描写する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４）を２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドまたはｐＶａｘ１により２週間間隔で３回、筋肉内において免疫化した。ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合を、免疫化後の異なる時点（２１、３５及び５０日目）での動物の血清により様々な希釈で分析した。示されたデータは、少なくとも３つの別々の実験の代表例である。Ｂは、エンドポイント結合力価分析を描写する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫原に応答して産生された抗ＺＩＫＶエンドポイント力価の差を、それぞれ追加免疫した後の免疫化動物の血清によって分析した。Ｃは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化により誘導されたｒＺＩＫＶ−Ｅ特異的抗体のウエスタンブロット分析を描写する。ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質を、１２．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動させ、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化マウス（３５日目）のプールした血清によりウエスタンブロットで分析した。ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合は、矢先で示されている。Ｄは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化により誘導されたＺＩＫＶ特異的抗体の免疫蛍光分析を描写する。ＺＩＫＶ−ＭＲ７６６に感染した、または偽感染したベロ細胞を、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化マウス（３５日目）のプールした血清で染色し、続いて検出のために抗マウスＡＦ４８８二次抗体で染色した。Ｅは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化により誘導された中和抗体のプラーク低減中和（ＰＲＮＴ）アッセイ分析を描写する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化マウスの血清試料を、ＺＩＫＶ感染力をインビトロで中和する能力について試験した。ＰＲＮＴ５０を、投与ウイルスの５０％を阻害することができる血清希釈係数と定義した。括弧内の値は、ＰＲＮＴ５０を示す。対照ＺＩＫＶ−Ｃａｐ（ＺＩＫＶカプシドタンパク質を発現するＤＮＡワクチン）及びｐＶａｘ１血清を陰性対照として使用した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥはジカウイルスの前駆体の膜及びエンベロープである。
【図２３】ＡからＥを含み、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種後のＺＩＫＶ特異的細胞免疫応答の誘導を実証する実験結果を描写する。Ａは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化に応答した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ−γ分泌を測定するＥＬＩＳｐｏｔ分析を描写する。アカゲザルを、２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドにより０週目に皮内で免疫化し、２つの部位にそれぞれ１ｍｇを４回投与し、免疫化の直後に皮内電気穿孔を行った。ＰＢＭＣを免疫化前及び６週目に単離し、「材料及び方法」のセクションに記載されているように、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用して、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥペプチドによる刺激に応答したＩＦＮ−γ分泌細胞を検出した。全ｐｒＭＥタンパク質を包含する６つのペプチドプールにおいて百万ＰＢＭＣ毎に得た、ＩＦＮ−γ産生細胞の数が示されている。値は、各群（ｎ＝５）の平均応答±平均値の標準誤差を表す。図２３Ｂは、ＤＮＡワクチン接種後のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的抗体応答の検出を描写する。抗ＺＩＫＶ  ＩｇＧ抗体を、免疫化前及び６週目にＥＬＩＳＡにより測定した。Ｃは、１回目及び２回目の免疫化後に示されている抗ＺＩＫＶエンベロープ抗体のエンドポイントＥＬＩＳＡ力価を描写する。Ｄは、組み換えエンベロープタンパク質への結合を実証する、６週目のＲＭ免疫血清を使用するウエスタンブロット分析を描写する。Ｅは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥにより免疫化されたＲＭの血清のＰＲＮＴ活性を描写する。個別のサルの免疫化前の血清及び６週目の免疫血清を、ＺＩＫＶ感染力をインビトロで中和する能力についてプラーク低減中和（ＰＲＮＴ）アッセイにより検査した。ＰＲＮＴ５０を、投与ウイルスの５０％を阻害することができる血清希釈係数と定義した。計算（ＰＲＮＴ５０）値が、それぞれのサルについて提示されている。ＩＦＮはインターフェロンであり、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥはジカウイルスの前駆体の膜及びエンベロープである。
【図２４】ＡからＦを含み、ＺＩＫＶ感染後のＩ型インターフェロンα，β受容体を欠いている免疫化マウスの生存率データを実証する実験結果を描写する。ＡはＺＩＫＶ感染後のＩＦＮＡＲ−／−マウスの生存率を描写する。マウスを２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンにより２週間間隔で２回免疫化し、ＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを、２回目の免疫化の１週間後に、１×１０６プラーク形成単位で負荷した。ＢはＺＩＫＶ感染後のＩＦＮＡＲ−／−マウスの生存率を描写する。マウスを２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンにより２週間間隔で２回免疫化し、ＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを、２回目の免疫化の１週間後に、２×１０６プラーク形成単位で負荷した。Ｃは、１×１０６プラーク形成単位で免疫化された動物の体重変化を描写する。Ｄは、２×１０６プラーク形成単位で免疫化された動物の体重変化を描写する。Ｅは、１×１０６プラーク形成単位で免疫化された動物の臨床スコアを描写する。Ｆは、２×１０６プラーク形成単位で免疫化された動物の臨床スコアを描写する。臨床スコアの指定は以下のとおりである。１：疾患なし、２：運動性の減少、３：丸まった姿勢及び運動性の減少、４：後肢の指背歩行（部分的な麻痺）、５：一方の後肢の麻痺、ならびに６：両方の後肢の麻痺。データは、実験毎に１群あたり１０頭を用いた２つの独立した実験の結果を反映している。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥはジカウイルスの前駆体の膜及びエンベロープである。
【図２５】ＡからＤを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンの単回免疫化が、Ｉ型インターフェロンα，β受容体を欠いているマウスにおいてＺＩＫＶ負荷に対して防御を提供したことを実証する実験結果を描写する。マウスを１回免疫化し、２×１０６プラーク形成単位のＺＩＫＶ−ＰＲ２０９を単回免疫化の２週間後に負荷した。生存率曲線は、実験毎に１群あたり１０頭のマウスを描写している。Ａは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンがマウスの脳においてＺＩＫＡ誘導神経性異常を防除することを実証している。Ｂは、負荷の７〜８日後に収集され、組織学のためにＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）で染色された、ｐＶａｘ１及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種群の脳切片を描写する。代表的なものであり、非防御ｐＶａｘ１対照動物から採取した切片は、病理を示している。（ｉ）大脳皮質の神経網内に核断片（差し込み図は、核断片を強調するために高い拡大率及び矢印を示している）、（ｉｉ）皮質内血管の血管周囲への細胞浸潤、リンパ球浸潤及び細胞の変性、（ｉｉｉ）大脳皮質内の血管周囲への細胞浸潤、細胞の変性及び核断片、ならびに（ｉｖ）海馬内のニューロンの変性（矢印）。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種マウスの正常組織の例は、正常範囲内であると思われた（ｖ及びｖｉ）。Ｃは、ワクチン接種及び感染後の指定された日時におけるウイルス負荷後のマウスからの血漿試料におけるＺＩＫＶ  ＲＮＡのレベルを描写する。結果は、血漿１ミリリットルあたりのゲノム等価物として示されている。Ｄは、感染後の２８日目に分析された脳組織におけるＺＩＫＶ  ＲＮＡのレベルを描写する。結果は、組織１グラムあたりのゲノム等価物として示されている。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥはジカウイルスの前駆体の膜及びエンベロープである。
【図２６】Ａ及びＢを含み、ＺＩＫＶ負荷後の抗ＺＩＫＶ免疫血清の受動移入に対する、Ｉ型インターフェロンα，β受容体を欠いているマウスの防御を実証する実験結果を描写する。抗ＺＩＫＡウイルスＩｇＧに滴定した、プールしたＮＨＰ抗ＺＩＫＶ免疫血清を、ＺＩＫＡウイルス（マウス１頭あたり１０６プラーク形成単位）を皮下負荷した１日後に、マウスに腹腔内投与した（１５０μｌ／マウス）。対照として、正常なサル血清及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を、対照として同齢のマウスに投与した（１５０μｌ／マウス）。Ａは、感染及び処置経過にわたるマウスの体重変化を描写する。各ポイントは、それぞれのマウスの負荷前（０日目）の体重に対する計算された率（％）の平均及び標準誤差を表す。Ｂは、ＮＨＰ免疫血清の投与後のマウスの生存率を描写する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥはジカウイルスの前駆体の膜及びエンベロープである。
【図２７】ＡからＤを含み、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６またはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥブラジルワクチンの免疫応答の特徴決定を実証する実験結果を描写する。Ａは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥブラジルＤＮＡワクチンのいずれかによるワクチン接種後の細胞及び抗体応答を測定する、ＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡ分析を描写する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）を２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６により筋肉内で３回免疫化し、続いてインビボ電気穿孔（ＥＰ）を行った。細胞免疫応答の誘導を示すＩＦＮ−γ生成を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔにより測定した。３回目の免疫化の１週間後に採取した脾細胞を、ｐｒＭ及びＥタンパク質の全体にわたる６つのペプチドプールのうちの１つの存在下でインキュベートした。結果を積み上げ棒グラフで示す。データは、百万個の脾細胞あたりのＳＦＵ（スポット形成単位）の平均数を表し、値はそれぞれの平均応答±平均値の標準誤差を表す。Ｂは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥブラジルＤＮＡワクチンのいずれかによるワクチン接種後の細胞及び抗体応答を測定する、ＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡ分析を描写する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）を２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥブラジルにより筋肉内で３回免疫化し、続いてインビボＥＰを行った。細胞免疫応答の誘導を示すＩＦＮ−γ生成を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔにより測定した。３回目の免疫化の１週間後に採取した脾細胞を、ｐｒＭ及びＥタンパク質の全体にわたる６つのペプチドプールのうちの１つの存在下でインキュベートした。結果を積み上げ棒グラフで示す。データは、百万個の脾細胞あたりのＳＦＵ（スポット形成単位）の平均数を表し、値はそれぞれの平均応答±平均値の標準誤差を表す。Ｃは、免疫化Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける結合抗体産生を測定するＥＬＩＳＡ分析を描写する。ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合を、免疫化後の３５日目のマウスの血清により様々な希釈で分析した。Ｄは、免疫化Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける結合抗体産生を測定するＥＬＩＳＡ分析を描写する。ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合を、免疫化後の３５日目のマウスの血清により様々な希釈で分析した。
【図２８】ＡからＤを含み、ＺＩＫＶ−エンベロープタンパク質の発現、精製及び特徴決定を実証する実験結果を描写する。Ａは、ｒＺＩＫＶ−Ｅ発現用のクローニングプラスミドを描写する。Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析による組み換えＺＩＫＶ−Ｅ（ｒＺＩＫＶ−Ｅ）タンパク質の特徴決定を描写する。レーン１はＢＳＡ対照であり、レーン２は、ｐＥＴ−２８ａベクタープラスミドで形質転換され、ニッケル金属親和性樹脂カラムで精製され、ＩＰＴＧ誘導後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の溶解産物である。レーン３は、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロットにより分析された、３７組み換えＺＶ−Ｅ精製タンパク質である。レーンＭは、タンパク質分子量マーカーである。Ｃは、抗原性について評価された精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質を描写する。ＥＬＩＳＡプレートをｒＺＩＫＶ−Ｅで被覆し、次に、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンまたは陽性対照として汎フラビウイルス抗体で免疫化されたマウスの免疫血清の様々な希釈と共にインキュベートした。実験例に記載されているように、ペルオキシダーゼ複合抗マウス抗体、続くテトラメチルベンジジン基質の添加によって、結合したＩｇＧを検出した。Ｄは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化マウスの免疫血清を用いた、精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質のウエスタンブロット検出を描写する。記載されているように、様々な濃度の精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに装填した。免疫血清の１：１００及びヤギ抗マウスの１：１５，０００の希釈を、室温で１時間使用した。洗浄した後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ赤外線画像装置で画像化した。Ｏｄｙｓｓｅｙのタンパク質分子量標準を使用した。矢印は、ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質の位置を示す。
【図２９】ＡからＣを含み、ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥの免疫応答の特徴決定を示す実験結果を描写する。ＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡ分析は、ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥへの細胞及び抗体応答を測定する。マウス（ｎ＝４／群）を２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥにより筋肉内で３回免疫化し、続いてインビボＥＰを行った。Ａは、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔにより測定された、細胞免疫応答の誘導を示すＩＦＮ−γ生成を描写する。Ｂは、免疫化ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおける結合抗体産生を測定するＥＬＩＳＡ分析を描写する。ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合を、免疫化後の様々な時点でのマウスの血清により分析した。Ｃは、免疫化ＩＦＮＡＲ−／−マウスに産生された抗ＺＩＫＶ抗体のエンドポイント力価分析を描写する。
【図３０】ＡからＤを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥに対して免疫化されたカニクイザルの免疫血清の中和活性を実証する実験結果を描写する。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧ細胞を偽感染させた、またはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンで免疫化した（６週目）、プールしたＮＨＰ血清の存在下で０．０１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでＭＲ７６６に感染させた。ジカウイルスの感染力を、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種ＮＨＰの血清を使用して、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により感染の４日後に分析した。Ａは、ベロ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧにおけるＺＩＫＶウイルスＭＲ７６６及びＰＲ２０９による感染の阻害を実証する、２０×対物で撮った染色組織試料片の写真を描写する。Ｂは、ベロ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧにおけるＺＩＫＶウイルスＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧによる感染の阻害を実証する、２０×対物で撮った染色組織試料片の写真を描写する。Ｃは、ベロ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧにおけるＺＩＫＶウイルスＭＲ７６６及びＰＲ２０９による感染の阻害を実証する、感染した（ＧＦＰ陽性細胞）の百分率を示す棒グラフを描写する。Ｄは、ベロ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧにおけるＺＩＫＶウイルスＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧによる感染の阻害を実証する、感染した（ＧＦＰ陽性細胞）の百分率を示す棒グラフを描写する。
【図３１】ＡからＥを含み、ＺＩＫＶがＩＦＮＡＲ−／−マウスに対して毒性であることを実証する実験結果を描写する。これらのデータは、ＺＩＫＶがＩＦＮＡＲ−／−において毒性であり、罹患及び死亡をもたらすことを裏づける。Ａは、１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスが頭蓋内に接種されたＩＦＮＡＲ−／−マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を描写する。Ｂは、１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスが静脈内に接種されたＩＦＮＡＲ−／−マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を描写する。Ｃは、１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスが腹腔内に接種されたＩＦＮＡＲ−／−マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を描写する。Ｄは、１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスが皮下に接種されたＩＦＮＡＲ−／−マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を描写する。Ｅは、全ての経路による感染経過にわたるマウスの体重変化を描写する。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
１つの実施形態において、本発明は、１つ以上の抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、１つ以上の抗体またはそのフラグメントをコードする１つ以上のヌクレオチド配列とを含む組成物を提供する。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物において所望の標的に対する免疫応答を誘発する組成物と、抗体をコードする組み換え核酸配列、そのフラグメント、その変異体、またはその組み合わせを含む組成物との組み合わせを提供する。
【００４５】
１つの実施形態において抗体をコードする組み換え核酸配列は、重鎖及び軽鎖をコードする配列を含む。特に、組み換え核酸配列から発現される重鎖及び軽鎖ポリペプチドを、合成抗体に組み立てることができる。重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドは、合成抗体が抗原に結合できること、本明細書に記載されているように組み立てられていない抗体と比較して、より多くの免疫原性があること及び抗原に対して免疫応答を誘発または誘導できることを組み立てがもたらすように、互いに相互作用し得る。
【００４６】
加えて、これらの合成抗体は、抗原誘発免疫応答により産生された抗体と比べて、対象においてより急速に生成される。合成抗体は、有効に結合して一連の抗原を中和することができる。合成抗体は、また、疾患に対して有効に防御すること及び／または生存率を促進することができる。
【００４７】
本発明の別の態様は、哺乳動物において所望の標的（例えば、抗原）に対する免疫応答を生成することができる、ＤＮＡプラスミドワクチンを提供する。ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳動物においてコンセンサス抗原を発現することができるＤＮＡプラスミド及び薬学的に許容される賦形剤から構成される。ＤＮＡプラスミドは、コンセンサス抗原をコードするコード配列に作動可能に連結しているプロモーターから構成される。
【００４８】
１．定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含め、本文書が優先される。好ましい方法及び材料が下に記載されているが、本明細書に記載されているものに類似した、または同等である方法及び材料を、本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示されている材料、方法及び例は、例示的なものにすぎず、制限することを意図していない。
【００４９】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「することができる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」及びその変形は、本明細書において使用されるとき、追加の作用または構造物の可能性を除外しない非限定的な移行句、用語、または語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」には、特に文脈により明確に指示されない限り、複数対象が含まれる。本開示は、明確に記述されていても、いなくても、本明細書に提示されている実施形態または要素「を含む」、「からなる」及び「から実質的になる」他の実施形態も企図する。
【００５０】
「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの部類の抗体、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含むそのフラグメントもしくは誘導体、ならびに単鎖抗体及びその誘導体を意味し得る。抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を示す、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製された抗体、またはこれらの混合物であり得る。
【００５１】
「抗体フラグメント」または「抗体のフラグメント」は、本明細書において交換可能に使用され、抗原結合部位または可変領域を含む無傷の抗体の部分を指す。その部分には、無傷の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）が含まれない。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１つの軽鎖可変ドメインのみを含有する単鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有する単鎖ポリペプチド、１つの重鎖可変領域のみを含有する単鎖ポリペプチド及び重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する単鎖ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
「抗原」は、宿主に免疫応答を生成する能力を有するタンパク質を指す。抗原は、抗体に認識され、結合され得る。抗原は、体内または外部環境由来であり得る。
【００５３】
「コード配列」または「コード核酸」は、本明細書において使用されるとき、本明細書に記載されている抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を指すことを意味し得る。コード配列には、プロモーターを含む調節要素に作動可能に連結している開始及び終止シグナル、ならびに核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞に発現を指示することができるポリアデニル化シグナルが更に含まれ得る。コード配列には、シグナルペプチドをコードする配列が更に含まれ得る。
【００５４】
「補体」または「相補的」は、本明細書において使用されるとき、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体のワトソン・クリック（例えば、Ａ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を意味し得る核酸を意味し得る。
【００５５】
「定電流」は、本明細書において使用されるとき、組織、または当該組織を確定する細胞が、この同じ組織に送達される電気パルスの持続時間にわたって受けている、または経験している電流と定義される。電気パルスは、本明細書に記載されている電気穿孔装置により送達される。本明細書において提供される電気穿孔装置が好ましくは瞬時のフィードバックを有するフィードバック要素を有するので、この電流は、電気パルスの寿命にわたってこの同じ組織において一定のアンペアを維持する。フィードバック要素は、パルスの持続時間の全体を通して組織（または細胞）の抵抗を測定すること、ならびにこの同じ組織において電流が電気パルスの全体を通して（マイクロ秒のオーダーで）及びパルス間で一定のままであるように、電気穿孔装置に電気エネルギー出力を変更させる（例えば、電圧を増加させる）ことができる。いくつかの実施形態において、フィードバック要素はコントローラを含む。
【００５６】
「電流フィードバック」または「フィードバック」は、本明細書において使用されるとき、交換可能に使用されてもよく、提供される電気穿孔装置の能動的応答を意味し得、これには、電極間の組織中の電流を測定すること及び電流を一定レベルに維持するため、電気穿孔（ＥＰ）装置により送達されるエネルギー出力をそれに応じて変更することが含まれる。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気処置の開始前に使用者によって事前設定される。フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔構成要素、例えば、コントローラによって達成することができ、それは、この電気回路が電極間の組織中の電流を連続的にモニターすること及びモニターした電流（または組織内の電流）を事前設定電流と比較して、連続的にエネルギー出力の調整を行って、モニターした電流を事前設定レベルに維持することができるからである。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるので、瞬時であり得る。
【００５７】
「分散電流」は本明細書において使用されるとき、本明細書に記載されている電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流パターンを意味し得、このパターンは、電気穿孔されている組織に任意の区域における電気穿孔関連熱ストレスの発生を最小限にする、好ましくは排除する。
【００５８】
「電気穿孔」、「電気透過処理」、または「電気運動増強」（「ＥＰ」）は、本明細書において交換可能に使用されるとき、生体膜に微視的経路（孔）を誘導する膜貫通電界パルスの使用を指すことができ、微視的経路（孔）の存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン及び水などの生体分子が細胞膜の一方の側面から他方へ通過することを可能にする。
【００５９】
「内在性抗体」は、本明細書において使用されるとき、液性免疫応答を誘導する有効用量の抗原が投与される対象に生成される抗体を指すことができる。
【００６０】
「フィードバック機構」は、本明細書において使用されるとき、ソフトウエアまたはハードウエア（またはファームウエア）により実施されるプロセスを指すことができ、このプロセスは、所望の組織のインピーダンスを受け（エネルギーパルスの送達前、間及び／または後）、事前設定値と、好ましくは電流と比較し、事前設定値を達成するために、送達されたエネルギーパルスを調整する。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施され得る。
【００６１】
「フラグメント」は、機能している、すなわち、所望の標的に結合し、全長抗体と同じ意図された効果を有することができる抗体のポリペプチドフラグメントを意味し得る。抗体のフラグメントは、それぞれの場合にシグナルペプチド及び／または１位にメチオニンを有している、または有していないＮ及び／またはＣ末端に、少なくとも１個のアミノ酸が欠損している以外は、完全長に１００％同一であり得る。フラグメントは、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、特定の完全長抗体の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。フラグメントは、抗体に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一であるポリペプチドのフラグメントを含んでもよく、同一率を計算したときに含まれていないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドを追加的に含んでもよい。フラグメントは、Ｎ末端メチオニン及び／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＧまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを更に含むことができる。Ｎ末端メチオニン及び／またはシグナルペプチドは、抗体のフラグメントに連結され得る。
【００６２】
抗体をコードする核酸配列のフラグメントは、それぞれの場合にシグナルペプチドをコードする配列及び／または１位にメチオニンを有している、または有していない５’及び／または３’末端に、少なくとも１個のヌクレオチドが欠損している以外は、完全長に１００％同一であり得る。フラグメントは、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、特定の完全長コード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。フラグメントは、抗体に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一であるポリペプチドをコードするフラグメントを含んでよく、同一率を計算したときに含まれていないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列を場合により追加的に含んでもよい。フラグメントは、Ｎ末端メチオニン及び／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列を更に含むことができる。Ｎ末端メチオニン及び／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の抗体のフラグメントに連結され得る。
【００６３】
「遺伝子構築物」は、本明細書において使用されるとき、抗体などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列には、プロモーターを含む調節要素に作動可能に連結している開始及び終止シグナル、ならびに核酸が投与される個体の細胞に発現を指示することができるポリアデニル化シグナルが含まれる。本明細書において使用されるとき、「発現可能形態」という用語は、個体の細胞に存在するときにコード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結している必要な調節要素を含有する遺伝子構築物を指す。
【００６４】
「同一」または「同一性」は、本明細書に使用されるとき、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、配列が特定の領域にわたって、示された率（％）で同じ残基を有することを意味し得る。百分率は、２つの配列を最適に整列すること、２つの配列を特定した領域にわたって比較すること、両方の配列に生じた同一残基の位置の数を決定して、マッチした位置の数を生じること、マッチした位置の数を、特定の領域における位置の総数で割ること及び結果に１００を掛けて、配列同一性の率を生じることによって、計算することができる。２つの配列が異なる長さのものである場合、または整列が１つ以上の付着端を生成し、特定された領域の比較がシグナル配列のみを含む場合、単一配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡ及びＲＮＡが比較される場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は等価であるとみなされ得る。同一性は、手作業により、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピューター配列アルゴリズムを使用して実施され得る。
【００６５】
「インピーダンス」は、本明細書において使用されるとき、フィードバック機構を考察するきに使用され得、オームの法則に従って電流値に変換することができ、事前設定電流との比較を可能にする。
【００６６】
「免疫応答」は、本明細書において使用されるとき、１つ以上の核酸及び／またはペプチドの導入に応答した宿主の、例えば哺乳動物の免疫系の活性化を意味し得る。免疫応答は、細胞性もしくは液性応答、または両方の形態であり得る。
【００６７】
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書において使用されるとき、一緒に共有結合的に連結している少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖の描写は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体を、所定の核酸と同じ目的に使用することができる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸及びその補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で標的配列とハイブリッド形成し得るプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。
【００６８】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得る、または二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部を含有し得る。核酸は、ゲノムとｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有してもよい。核酸は、化学合成法により、または組み換え方法により得ることができる。
【００６９】
「作動可能に連結」は、本明細書において使用されるとき、遺伝子の発現が、空間的に接続しているプロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との距離は、そのプロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子においてプロモーターの制御下にある遺伝子との距離にほぼ同じであり得る。当該技術において知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能の損失を伴うことなく適応され得る。
【００７０】
「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、本明細書において使用されるとき、アミノ酸の連結配列を意味することができ、天然、合成、もしくは修飾、または天然と合成の組み合わせであり得る。
【００７１】
「プロモーター」は、本明細書において使用されるとき、細胞において核酸の発現を付与する、活性化する、または増強することができる合成又は天然由来分子を意味し得る。プロモーターは、１つ以上の特異的転写調節配列を含んで、発現を更に増強すること、ならびに／またはこの空間的発現及び／もしくは時間的発現を変更することができる。プロモーターは、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含むこともでき、これらは転写の出発部位から数千塩基対までに位置することができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫及び動物を含む源に由来するものであり得る。プロモーターは、遺伝子構成要素の発現を、恒常的に、または発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発生段階に関して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して差次的に調節することができる。プロモーターの代表例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター及びＣＭＶ  ＩＥプロモーターが含まれる。
【００７２】
「シグナルペプチド」及び「リーダー配列」は、本明細書において交換可能に使用され、本明細書に記載されているタンパク質のアミノ末端に連結され得るアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的にはタンパク質の局在化を指示する。本明細書において使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、好ましくは、タンパク質が産生される細胞からタンパク質の分泌を促進する。シグナルペプチド／リーダー配列は、多くの場合、細胞からの分泌時に、多くの場合に成熟タンパク質と呼ばれるタンパク質の残部から切断される。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端に連結される。
【００７３】
「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、本明細書において使用されるとき、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）と、例えば、核酸の複雑な混合物中において、ハイブリッド形成する条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下で異なっている。ストリンジェントな条件は、確定されたイオン強度、ｐＨで特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリッド形成する（確定されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下の）温度であり得る（標的配列が過剰量で存在するので、Ｔｍではプローブの５０％が平衡状態で占有されている）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度などの約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、約１０〜５０個のヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、約５０個のヌクレオチドを超える）では少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリッド形成では、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリッド形成の少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリッド形成条件には、以下が含まれる。５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳで４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで６５℃でのインキュベーション、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳによる６５℃での洗浄。
【００７４】
「対象」及び「患者」は、本明細書において交換可能使用されるとき、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ及びマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザルなどのサル、チンパンジーなど）、ならびにヒト）が含まれるが、これらに限定されない任意の脊椎動物を指す。いくつかの実施形態において対象はヒトまたは非ヒトであり得る。対象または患者は、他の形態の治療を受けていることがある。
【００７５】
「実質的に相補的」は、本明細書において使用されるとき、第１の配列が、第２の配列の補体に対して、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の範囲にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性であること、あるいは２つの配列がストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成することを意味し得る。
【００７６】
「実質的に同一」は、本明細書において使用されるとき、第１及び第２の配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００，１０００、１１００個、またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の範囲にわたって、または第１の配列が第２の配列の補体に対して実質的に相補的である場合は核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味し得る。
【００７７】
「合成抗体」は、本明細書において使用されるとき、本明細書に記載されている組み換え核酸配列によりコードされ、対象に生成される抗体を指す。
【００７８】
「治療」または「治療する」は、本明細書において使用されるとき、疾患を予防、抑制、抑圧、または完全に排除する手段によって、疾患から対象を防御することを意味し得る。疾患の予防は、本発明のワクチンを、疾患の発症前に対象に投与することを伴う。疾患の抑制は、本発明のワクチンを、疾患が誘導された後であるが、臨床的発現の前に対象に投与することを伴う。疾患の抑圧は、本発明のワクチンを、疾患の臨床的発現後に対象に投与することを伴う。
【００７９】
「変異体」は、核酸に関して本明細書に使用されるとき、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部もしくはフラグメント、（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列もしくはその一部の補体、（ｉｉｉ）基準核酸またはその補体に実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で基準核酸、その補体、もしくは実質的に同一の配列とハイブリッド形成する核酸を意味し得る。
【００８０】
「変異体」は、ペプチドまたはポリペプチドに関して、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物学的活性を保持している。変異体は、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているアミノ酸配列を有する基準タンパク質と実質的に同一である、アミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似した特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）の異なるアミノ酸に置き換えることは、典型的にはわずかな変更を伴うことが当該技術において認識されている。このわずかな変更は、当該技術において理解されているアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって、部分的に確認することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、疎水性及び電荷を考慮することに基づいている。類似した疎水性親水性指標のアミノ酸を置換して、依然としてタンパク質機能を保持できることが、当該技術において知られている。１つの態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにすることもできる。ペプチドの文脈において、アミノ酸の親水性を考慮することは、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にし、これは、抗原性及び免疫原性と十分に相関することが報告されている有用な手段である。米国特許第４，５５４，１０１号が参照により本明細書に完全に組み込まれる。類似した親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができ、当該技術において理解されている。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸によって実施することができる。アミノ酸の疎水性指標及び親水性値は、両方ともアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。観察と一致するように、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ及び他の特性によって明らかなように、アミノ酸の特にアミノ酸の側鎖の相対的類似性によって左右されることが理解される。
【００８１】
変異体は、完全遺伝子配列またはそのフラグメントの全長にわたって実質的に同一である核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列またはそのフラグメントの全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。変異体は、アミノ酸配列またはそのフラグメントの全長にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはそのフラグメントの全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
【００８２】
「ベクター」は、本明細書において使用されるとき、複製起点を含有する核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【００８３】
本明細書における数値範囲の列挙では、それぞれの介在数値は、同じ程度の精度であることが明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲では、数値７及び８が６及び９に加えて考慮され、６．０〜７．０の範囲では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明確に企図される。
【００８４】
２．組成物
１つの態様において、本発明は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘発する組成物と、抗体をコードする核酸配列、そのフラグメント、その変異体、またはその組み合わせを含む組成物との組み合わせを提供する。組成物を、それを必要とする対象に投与して、合成抗体のインビボ発現及び形成を促進することができる。
【００８５】
１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘発する第１の組成物と、抗体、そのフラグメント、その変異体、またはその組み合わせをコードする核酸配列を含む第２の組成物との組み合わせに関する。１つの実施形態において、第１の組成物は、１つ以上の抗原をコードする核酸を含む。１つの実施形態において、第１の組成物はＤＮＡワクチンを含む。
【００８６】
本発明は、抗体、そのフラグメント、その変異体、またはその組み合わせをコードする組み換え核酸配列を含む組成物に関する。組成物は、それを必要とする対象に投与されたとき、対象に合成抗体の生成をもたらすことができる。合成抗体は、対象に存在する標的分子（すなわち、抗原）に結合することができる。そのような結合は、抗原を中和し、別の分子による、例えば、タンパク質または核酸による抗原の認識を遮断し、抗原に対して免疫応答を誘発または誘導することができる。
【００８７】
合成抗体は、組成物が投与された対象において、疾患を治療、予防及び／または防御することができる。合成抗体は、抗原に結合することによって、組成物が投与された対象において、疾患を治療、予防及び／または防御することができる。合成抗体は、組成物が投与された対象において、疾患に対する生存率を促進することができる。合成抗体は、組成物が投与された対象において、疾患に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の生存率を提供することができる。他の実施形態において、合成抗体は、組成物が投与された対象において、疾患に対して少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％の生存率を提供することができる。
【００８８】
組成物は、組成物を対象に投与した少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、または６０時間以内に、対象において合成抗体の生成をもたらすことができる。組成物は、組成物を対象に投与した少なくとも約１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間以内に、対象において合成抗体の生成をもたらすことができる。組成物は、組成物を対象に投与した約１時間から約６日間、約１時間から約５日間、約１時間から約４日間、約１時間から約３日間、約１時間から約２日間、約１時間から約１日、約１時間から約７２時間、約１時間から約６０時間、約１時間から約４８時間、約１時間から約３６時間、約１時間から約２４時間、約１時間から約１２時間、または約１時間から約６時間以内に、対象において合成抗体の生成をもたらすことができる。
【００８９】
組成物は、それを必要とする対象に投与されるとき、抗原を投与して液性免疫応答が誘導される対象における内在性抗体の生成より素早く、合成抗体の生成を対象においてもたらすことができる。組成物は、抗原を投与して液性免疫応答が誘導された対象における内在性抗体の生成の、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日前に、合成抗体の生成をもたらすことができる。
【００９０】
本発明の組成物は、組成物が疾病または死亡を引き起こさないように安全であること、疾病に対して防御的であること、ならびに投与の容易さ、ほんのわずかな副作用、生物学的安定性及び低い用量単価を提供することなど、有効な組成物に必要な特徴を有することができる。
【００９１】
本発明の別の態様は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を生成することができる、ＤＮＡプラスミドワクチンを提供する。ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳動物においてコンセンサス抗原を発現することができるＤＮＡプラスミド及び薬学的に許容される賦形剤から構成される。ＤＮＡプラスミドは、コンセンサス抗原をコードするコード配列に作動可能に連結しているプロモーターから構成される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本明細書のＤＮＡ配列では、５’末端からＩｇＥリーダー配列を除去することができ、本明細書のタンパク質配列では、Ｎ末端からＩｇＥリーダー配列を除去することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡプラスミドは、コード配列のＮ末端からＩｇＥリーダー配列を除いた抗原をコードするコード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡプラスミドは、コード配列のＮ末端に結合し、かつプロモーターに作動可能に連結しているＩｇＥリーダー配列を更に含む。
【００９４】
ＤＮＡプラスミドは、コード配列のＣ末端に結合したポリアデニル化配列を更に含むことができる。好ましくは、ＤＮＡプラスミドは、最適化されたコドンである。
【００９５】
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤はアジュバントである。好ましくは、アジュバントは、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、形質移入促進剤である。好ましくは、形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質であり、より好ましくはポリ−Ｌ−グルタミン酸塩である。好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩は、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度である。好ましくは、ＤＮＡプラスミドワクチンは、１ｍｇ／ｍｌ以上の総ＤＮＡプラスミド濃度を有する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡプラスミドは、複数の特有のＤＮＡプラスミドを含み、複数の特有のＤＮＡプラスミドは、それぞれ、コンセンサス抗原を含むポリペプチドをコードする。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態において、ＤＮＡプラスミドワクチンは、アジュバントを更に含むことができる。いくつかの実施形態において、アジュバントは、アルファインターフェロン、ガンマインターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ａｔｔｒａｃｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＣＴＡＣＫ）、胸腺上皮発現ケモカイン（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｈｙｍｕｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ｍｕｃｏｓａｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６からなる群から選択され、シグナル配列が欠失しているＩＬ−１５が含まれ、場合によりＩｇＥからのシグナルペプチドが含まれる。有用なアジュバントであり得る他の遺伝子には、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１−アルファ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びこれらの機能性フラグメントをコードするものが含まれる。いくつかの好ましい実施形態において、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、またはＭＥＣから選択される。
【００９８】
いくつかの実施形態において、哺乳動物においてコンセンサス抗原に対して免疫応答を誘発する方法には、粘膜免疫応答を誘発する方法が含まれる。そのような方法は、１つ以上のＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質及びこれらの機能性フラグメントまたはその発現可能なコード配列を、上に記載されたコンセンサス抗原を含むＤＮＡプラスミドと組み合わせて、哺乳動物に投与することを含む。１つ以上のＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質及びこれらの機能性フラグメントを、本明細書において提供されるＤＮＡプラスミドワクチンの投与の前に、投与と同時に、または投与の後に、投与することができる。いくつかの実施形態では、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ及びこれらの機能性フラグメントからなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする単離核酸分子が、哺乳動物に投与される。
【００９９】
３．ＤＮＡワクチン
上に記載されたように、組成物には、１つ以上の抗原を含む、ワクチンのような免疫原組成物が含まれ得る。ワクチンを使用して任意の数の抗原に対して防御することができ、それによって、抗原に基づく病理に対して治療、予防及び／または防御することができる。ワクチンは、ワクチンが投与された対象に免疫応答を著しく誘導することができ、それによって、抗原による感染を防御し、治療することができる。
【０１００】
ワクチンは、ＤＮＡワクチン、ペプチドワクチン、またはＤＮＡとペプチドの組み合わせワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、抗原をコードする核酸配列を含むことができる。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、そのフラグメント、またはこれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ペプチド結合により抗原に連結しているリンカー、リーダー、またはタグ配列をコードする追加の配列を含むことができる。ペプチドワクチンは、抗原性ペプチド、抗原性タンパク質、その変異体、そのフラグメント、またはこれらの組み合わせを含むことができる。ＤＮＡとペプチドの組み合わせワクチンは、抗原及び抗原性ペプチドまたはタンパク質をコードする上に記載された核酸配列を含むことができ、抗原性ペプチドまたはタンパク質及びコードされた抗原は、同じアミノ酸配列を有する。
【０１０１】
ワクチンは、ワクチンが投与された対象に液性免疫応答を誘導することができる。誘導された液性免疫応答は、抗原に対して特異的であり得る。誘導された液性免疫応答は、抗原に対して反応性であり得る。液性免疫応答は、ワクチンが投与された対象において、約１．５倍から約１６倍、約２倍から約１２倍、または約３倍から約１０倍で誘導され得る。液性免疫応答は、ワクチンが投与された対象において、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍で誘導され得る。
【０１０２】
ワクチンにより誘導される液性免疫応答には、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、ワクチンが投与された対象に伴う中和抗体のレベルが増加することが含まれ得る。中和抗体は、抗原に対して特異的であり得る。中和抗体は、抗原に対して反応性であり得る。中和抗体は、ワクチンが投与された対象において、感染及び関連する病理に対して防御及び／または治療を提供することができる。
【０１０３】
ワクチンにより誘導される液性免疫応答には、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、ワクチンが投与された対象に伴うＩｇＧ抗体のレベルが増加することが含まれ得る。これらのＩｇＧ抗体は、抗原に対して特異的であり得る。これらのＩｇＧ抗体は、抗原に対して反応性であり得る。好ましくは、液性応答は、抗原の２つ以上の株に対して交差反応性である。ワクチンが投与された対象に伴うＩｇＧ抗体のレベルは、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、約１．５倍から約１６倍、約２倍から約１２倍、または約３倍から約１０倍に増加され得る。ワクチンが投与された対象に伴うＩｇＧ抗体のレベルは、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍に増加され得る。
【０１０４】
ワクチンは、ワクチンが投与された対象に細胞性免疫応答を誘導することができる。誘導された細胞性免疫応答は、抗原に対して特異的であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、抗原に対して反応性であり得る。好ましくは、細胞性応答は、抗原の２つ以上の株に対して交差反応性である。誘導された細胞性免疫応答には、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘発が含まれ得る。誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、抗原に対して反応性であり得る。誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、多機能性であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘発を含むことができ、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの組み合わせを産生する。
【０１０５】
誘導される細胞性免疫応答には、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、ワクチンが投与された対象に伴うＣＤ８＋Ｔ細胞応答が増加することが含まれ得る。ワクチンが投与された対象に伴うＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、約２倍から約３０倍、約３倍から約２５倍、または約４倍から約２０倍に増加され得る。ワクチンが投与された対象に伴うＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１６．０倍、少なくとも約１７．０倍、少なくとも約１８．０倍、少なくとも約１９．０倍、少なくとも約２０．０倍、少なくとも約２１．０倍、少なくとも約２２．０倍、少なくとも約２３．０倍、少なくとも約２４．０倍、少なくとも約２５．０倍、少なくとも約２６．０倍、少なくとも約２７．０倍、少なくとも約２８．０倍、少なくとも約２９．０倍、または少なくとも約３０．０倍に増加され得る。
【０１０６】
誘導された細胞性免疫応答には、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の増加が含まれ得る。ワクチンが投与された対象に伴うＣＤ３＋ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の頻度は、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍に増加され得る。
【０１０７】
誘導された細胞性免疫応答には、ＴＮＦ−αを産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の増加が含まれ得る。ワクチンが投与された対象に伴うＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＮＦ−α＋Ｔ細胞の頻度は、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、または１４倍に増加され得る。
【０１０８】
誘導された細胞性免疫応答には、ＩＬ−２を産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の増加が含まれ得る。ワクチンが投与された対象に伴うＣＤ３＋ＣＤ８＋ＩＬ−２＋Ｔ細胞の頻度は、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、少なくとも約０．５倍、１．０倍、１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、または５．０倍に増加され得る。
【０１０９】
誘導された細胞性免疫応答には、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの両方を産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の増加が含まれ得る。ワクチンが投与された対象に伴うＣＤ３＋ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋Ｔ細胞の頻度は、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、少なくとも約２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、または１８０倍に増加され得る。
【０１１０】
ワクチンにより誘導された細胞性免疫応答には、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘発が含まれ得る。誘発されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、所望の抗原に対して反応性であり得る。誘発されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、多機能性であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘発を含むことができ、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、またはＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの組み合わせを産生する。
【０１１１】
誘導された細胞性免疫応答には、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加が含まれ得る。ワクチンが投与された対象に伴うＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の頻度は、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍に増加され得る。
【０１１２】
誘導された細胞性免疫応答には、ＴＮＦ−αを産生するＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加が含まれ得る。ワクチンが投与された対象に伴うＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＮＦ−α＋Ｔ細胞の頻度は、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、または２２倍に増加され得る。
【０１１３】
誘導された細胞性免疫応答には、ＩＬ−２を産生するＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加が含まれ得る。ワクチンが投与された対象に伴うＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＬ−２＋Ｔ細胞の頻度は、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、または６０倍に増加され得る。
【０１１４】
誘導された細胞性免疫応答には、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの両方を産生するＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加が含まれ得る。ワクチンが投与された対象に伴うＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋Ｔ細胞の頻度は、ワクチンが投与されなかった対象と比較して、少なくとも約２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１３．５倍、１４．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０．０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、または３５倍に増加され得る。
【０１１５】
本発明のワクチンは、ワクチンそれ自体が疾病または死亡を引き起こさないように安全であることなど、有効な組成物に必要な特徴を有することができ、ウイルスまたは細菌などの生病原体に曝露されたときにもたらされる疾病に対して防御的であり、中和抗体を誘導して、細胞の発生を予防し、細胞内病原体に対して防御的Ｔ細胞を誘導し、投与の容易さ、ほんのわずかな副作用、生物学的安定性及び低い用量単価を提供する。
【０１１６】
ワクチンは、筋肉または皮膚などの異なる組織に投与されたとき、免疫応答を更に誘導することができる。ワクチンは、電気穿孔もしくは注射により、または皮下もしくは筋肉内を介して投与されたとき、免疫応答を更に誘導することができる。
【０１１７】
ａ．ワクチン構築物及びプラスミド
ワクチンは、１つ以上の抗原をコードする核酸構築物またはプラスミドを含むことができる。核酸構築物またはプラスミドは、１つ以上の異種核酸配列を含む、または含有することができる。抗原をコードする核酸配列を含むことができる遺伝子構築物が、本明細書において提供される。遺伝子構築物は、機能性染色体外分子として細胞内に存在することができる。遺伝子構築物は、セントロメア、テロメア、またはプラスミドもしくはコスミドを含む線状ミニ染色体であり得る。遺伝子構築物は、１つ以上の異種核酸配列を含む、または含有することができる。
【０１１８】
遺伝子構築物は、抗原を任意の順番で発現するプラスミドの形態であり得る。
【０１１９】
遺伝子構築物は、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス及び組み換えワクシニアを含む、組み換えウイルスベクターのゲノムの一部でもあり得る。遺伝子構築物は、細胞の中で生存する弱毒化生微生物または組み換え微生物ベクター中の遺伝子材料の一部であり得る。
【０１２０】
遺伝子構築物は、核酸のコード配列の遺伝子発現のために、調節エレメントを含むことができる。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、停止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。
【０１２１】
核酸配列は、ベクターになり得る遺伝子構築物を構成することができる。ベクターは、哺乳動物に免疫応答を誘発するのに有効な量で、哺乳動物の細胞中に抗原を発現することができる。ベクターは組み換えであり得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含むことができる。ベクターはプラスミドであり得る。ベクターは、抗原をコードする核酸を細胞に形質移入するのに有用な可能性があり、形質転換された宿主細胞は、抗原の発現が生じる条件下で培養され、維持される。
【０１２２】
コード配列は、安定性及び高レベルの発現のために最適化され得る。いくつかの場合において、コドンは、細胞内結合に起因して形成されるＲＮＡなどの二次構造形成を低減するために選択される。
【０１２３】
ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含むことができ、１つ以上のがん抗原コード配列（複数可）の上流にあり得る開始コドン及び抗原のコード配列（複数可）の下流にあり得る停止コドンを、更に含むことができる。開始及び終止コドンは、抗原のコード配列（複数可）のフレーム内にあり得る。ベクターは、抗原のコード配列（複数可）に作動可能に連結しているプロモーターを含むこともできる。抗原のコード配列（複数可）に作動可能に連結しているプロモーターは、サイウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどの、ヒト遺伝子からのプロモーターでもあり得る。プロモーターは、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの、天然または合成の組織特異的プロモーターでもあり得る。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第２００４／０１７５７２７号に記載されており、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
ベクターは、抗原のコード配列（複数可）の下流にあり得るポリアデニル化シグナルを含むこともできる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロブリンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
【０１２５】
ベクターは、抗原の上流にエンハンサーを含むこともできる。エンハンサーは、ＤＮＡ発現のために必要であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号及びＷＯ９４／０１６７３７に記載されており、これらの内容は、それぞれ参照により完全に組み込まれる。
【０１２６】
ベクターを染色体外に維持するため及びベクターの多数のコピーを細胞内に産生するため、ベクターは哺乳類複製起点を含むこともできる。ベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４である可能性があり、エプスタイン・バーウイルス複製起点及び核内抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含むことができ、組み込まれることなく多数のエピソーム複製コピーを産生することができる。ベクターは、ｐＶａｘ１、または本明細書に記載されている変異プラスミドなど、変化を有するｐＶａｘ１変異体であり得る。変異ｐＶａｘ１プラスミドは、主鎖ベクタープラスミドｐＶａｘ１の２９９８塩基対変異体である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）。ＣＭＶプロモーターは、塩基１３７〜７２４に位置している。Ｔ７プロモーター／プライミング部位は、塩基６６４〜６８３にある。多重クローニング部位は、塩基６９６〜８１１にある。ウシＧＨポリアデニル化シグナルは、塩基８２９〜１０５３にある。カナマイシン耐性遺伝子は、塩基１２２６〜２０２０にある。ｐＵＣ起点は、塩基２３２０〜２９９３にある。
【０１２７】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＶａｘ１の配列に基づいて、以下の突然変異が、本明細書に記載されているプラスミド１〜６の主鎖に使用されたｐＶａｘ１の配列に見出された。
ＣＭＶプロモーターにＣ＞Ｇ２４１、
ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐｏｌｙＡ）の下流にＣ＞Ｔ１９４２主鎖、
カナマイシン遺伝子の下流にＡ＞−２８７６主鎖、
ｐＵＣ複製起点（Ｏｒｉ）の多コピー数突然変異にＣ＞Ｔ３２７７（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８５を参照）、
ＲＮＡＳｅＨ部位の上流にあるｐＵＣ  Ｏｒｉの最末端にＧ＞Ｃ３７５３。
【０１２８】
塩基対２、３及び４は、ＣＭＶプロモーターの上流で、主鎖においてＡＣＴからＣＴＧに変更されている。
【０１２９】
ベクターの主鎖は、ｐＡＶ０２４２であり得る。ベクターは、複製欠陥アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターであり得る。
【０１３０】
ベクターは調節配列を含むこともでき、これは、ベクターが投与される哺乳類またはヒト細胞における遺伝子発現にとって好適であり得る。本明細書に開示されている１つ以上のがん抗原配列はコドンを含むことができ、これは、宿主細胞におけるコード配列のより効率的な転写を可能にすることができる。
【０１３１】
ベクターは、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であることができ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生に使用することができる。またベクターは、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であることができ、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生に使用することができる。またベクターは、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイル発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であることができ、昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用することができる。またベクターは、ｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であることができ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞におけるタンパク質産生に使用することができる。ベクターは、日常的な技術によりタンパク質を産生する発現ベクターまたは系であることができ、参照により完全に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）に含まれる、容易に入手可能な出発材料であることができる。
【０１３２】
４．ＤＮＡコード抗体
上に記載されたように、組成物は、組み換え核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、抗体、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードすることができる。抗体は、下により詳細に記載される。
【０１３３】
組み換え核酸配列は、異種核酸配列であり得る。組み換え核酸配列は、少なくとも１つの異種核酸配列または１つ以上の異種核酸配列を含むことができる。
【０１３４】
組み換え核酸配列は、最適化された核酸配列であり得る。そのような最適化は、抗体の免疫原性を増加または変更することができる。最適化は、転写及び／または翻訳を改善することもできる。最適化には、以下のうちの１つ以上が含まれ得る。転写を増加する低ＧＣ含量のリーダー配列、ｍＲＮＡ安定及びコドン最適化、翻訳を増加するためのコザック配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）の付加、シグナルペプチドをコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列の付加、ならびにシス作用性配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）を可能にする程度の排除。
【０１３５】
ａ．組み換え核酸配列構築物
組み換え核酸配列は、１つ以上の組み換え核酸配列構築物を含むことができる。組み換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素を含むことができ、下により詳細に記載される。
【０１３６】
組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列構築物は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列を含むこともできる。組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含むことができ、それぞれのリーダー配列は、シグナルペプチドをコードする。組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーター、１つ以上のイントロン、１つ以上の転写終止領域、１つ以上の開始コドン、１つ以上の終止もしくは停止コドン及び／または１つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカーまたはタグ配列を含むこともできる。タグ配列は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグをコードすることができる。
【０１３７】
（１）重鎖ポリペプチド
組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域及び／または少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含むことができる。少なくとも１つの常重鎖領域には、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）及び定常重鎖領域３（ＣＨ３）、ならびに／またはヒンジ領域が含まれ得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域及びＣＨ１領域を含むことができる。他の実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含むことができる。
【０１３９】
重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）のセットを含むことができる。ＣＤＲセットは、ＶＨ領域の３つの超可変領域を含有することができる。重鎖ポリペプチドのＮ末端から進めると、これらのＣＤＲは、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」及び「ＣＤＲ３」と示される。重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与することができる。
【０１４０】
（２）軽ポリペプチド
組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域及び／または定常軽鎖（ＣＬ）領域を含むことができる。
【０１４１】
軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）のセットを含むことができる。ＣＤＲセットは、ＶＬ領域の３つの超可変領域を含有することができる。軽鎖ポリペプチドのＮ末端から進めると、これらのＣＤＲは、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」及び「ＣＤＲ３」と示される。軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与することができる。
【０１４２】
（３）プロテアーゼ切断部位
組み換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列を含むことができる。プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼにより認識され得る。プロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼ、例えば、フリン、エラスターゼ、ＨｔｒＡ、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、チロシン及びペプシンであり得るが、これらに限定されない。プロテアーゼはフリンであり得る。他の実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または内部ペプチド結合を切断する（すなわち、Ｎ末端もしくはＣ末端ペプチド結合を切断しない）任意のプロテアーゼであり得る。
【０１４３】
プロテアーゼ切断部位は、切断の効率を促進または増加する１つ以上のアミノ酸配列を含むことができる。１つ以上のアミノ酸配列は、別個のポリペプチドを形成または生成する効率を促進または増加することができる。１つ以上のアミノ酸配列は、２Ａペプチド配列を含むことができる。
【０１４４】
（４）リンカー配列
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカー配列を含むことができる。リンカー配列は、本明細書に記載されている１つ以上の構成要素を空間的に分離または連結することができる。他の実施形態において、リンカー配列は、２つ以上のポリペプチドを空間的に分離または連結するアミノ酸配列をコードすることができる。
【０１４５】
（５）プロモーター
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含むことができる。１つ以上のプロモーターは、遺伝子発現を推進し、遺伝子発現を調節することができる任意のプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介した転写に必要なシス作用性配列エレメントである。遺伝子発現を指示するために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、天然の設定における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離で、組み換え核酸配列構築物の転写開始部位置から位置し得る。しかし、この距離の変動は、プロモーター機能の損失を伴うことなく適応され得る。
【０１４６】
プロモーターは、重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列に作動可能に連結し得る。プロモーターは、原核細胞における発現に有効であることが示されたプロモーターであり得る。コード配列に作動可能に連結しているプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、サイウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモーター、例えば、ＳＶ４０前期プロモーター及びＳＶ４０後期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）、またはヒトメタロチオネインなどの、ヒト遺伝子からのプロモーターでもあり得る。
【０１４７】
プロモーターは、恒常的プロモーター、または誘導性プロモーターであることができ、これは宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝露されたときにのみ転写を開始する。多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織もしくは臓器、または発生段階に特異的でもあり得る。プロモーターは、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの、天然または合成の組織特異的プロモーターでもあり得る。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第２００４／０１７５７２７号に記載されており、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
プロモーターは、エンハンサーを伴い得る。エンハンサーは、コード配列の上流に位置することができる。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号及びＷＯ９４／０１６７３７に記載されており、これらの内容は、それぞれ参照により完全に組み込まれる。
【０１４９】
（６）イントロン
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のイントロンを含むことができる。それぞれのイントロンは、機能性スプライス供与及び受容部位を含むことができる。イントロンは、スプライシングのエンハンサーを含むことができる。イントロンは、効率的なスプライシングに必要な１つ以上のシグナルを含むことができる。
【０１５０】
（７）転写終止領域
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上の転写終止領域を含むことができる。転写終止領域は、コード配列の下流にあって、効率的な終止を提供することができる。転写終止領域は、上に記載されたプロモーターと同じ遺伝子から得ることができる、または１つ以上の異なる遺伝子から得ることができる。
【０１５１】
（８）開始コドン
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上の開始コドンを含むことができる。開始コドンは、コード配列の上流に位置することができる。開始コドンは、コード配列のフレーム内にあり得る。開始コドンは、効率的な翻訳開始に必要な１つ以上のシグナルと関連することができ、例えば、リボソーム結合部位であるが、これに限定されない。
【０１５２】
（９）終止コドン
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上の終止または停止コドンを含むことができる。終止コドンは、コード配列の下流にあり得る。終止コドンは、コード配列のフレーム内にあり得る。終止コドンは、効率的な翻訳終止に必要な１つ以上のシグナルと関連することができる。
【０１５３】
（１０）ポリアデニル化シグナル
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、転写物の効率的なポリアデニル化に必要な１つ以上のシグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、コード配列の下流に位置することができる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロブリンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
【０１５４】
（１１）リーダー配列
組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含むことができる。リーダー配列は、シグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチド、例えば、ＩｇＧシグナルペプチド及びＩｇＥシグナルペプチドであり得るが、これらに限定されない。
【０１５５】
ｂ．組み換え核酸配列構築物の配置
上に記載されたように、組み換え核酸配列は、１つ以上の組み換え核酸配列構築物を含むことができ、それぞれの組み換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素を含むことができる。１つ以上の構成要素は、上に詳細に記載されている。１つ以上の構成要素は、組み換え核酸配列構築物に含まれるとき、互いに任意の順番で配置され得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の構成要素は、下に記載されているように組み換え核酸配列構築物に配置され得る。
【０１５６】
（１）配置１
１つの配置において、第１の組み換え核酸構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸酸配列を含むことができ、第２の組み換え核酸構築物は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸酸配列を含むことができる。
【０１５７】
第１の組み換え核酸配列構築物は、ベクターに配置され得る。第２の組み換え核酸配列構築物は、第２または別のベクターに配置され得る。組み換え核酸配列構築物のベクターにおける配置は、下により詳細に記載される。
【０１５８】
第１の組み換え核酸配列構築物は、プロモーター、イントロン、転写終止領域、開始コドン、終止コドン及び／またはポリアデニル化シグナルを含むこともできる。第１の組み換え核酸配列構築物は、リーダー配列を更に含むことができ、リーダー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または、５’）に位置する。したがって、リーダー配列によりコードされるシグナルペプチドは、ペプチド結合により重鎖ポリペプチドに連結され得る。
【０１５９】
第２の組み換え核酸配列構築物は、プロモーター、開始コドン、終止コドン及び／またはポリアデニル化シグナルを含むこともできる。第２の組み換え核酸配列構築物は、リーダー配列を更に含むことができ、リーダー配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または、５’）に位置する。したがって、リーダー配列によりコードされるシグナルペプチドは、ペプチド結合により軽鎖ポリペプチドに連結され得る。
【０１６０】
このように、配置１の１つの例は、ＶＨ及びＣＨ１を含む重鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター（したがって、第１の組み換え核酸配列構築物）、ならびにＶＬ及びＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター（したがって、第２の組み換え核酸配列構築物）を含むことができる。配置１の第２の例は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３を含む重鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター（したがって、第１の組み換え核酸配列構築物）、ならびにＶＬ及びＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター（したがって、第２の組み換え核酸配列構築物）を含むことができる。
【０１６１】
（２）配置２
第２の配置において、組み換え核酸構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列及び軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むことができる。重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または、５’）に位置することができる。あるいは、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または、５’）に位置することができる。
【０１６２】
組み換え核酸配列構築物は、下により詳細に記載されるベクターに配置され得る。
【０１６３】
組み換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位及び／またはリンカー配列をコードする異種核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列構築物に含まれる場合、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の間に位置することができる。したがって、プロテアーゼ切断部位は、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドが、発現時に別個のポリペプチドに分離することを可能にする。他の実施形態において、リンカー配列が組み換え核酸配列構築物に含まれる場合、リンカー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の間に位置することができる。
【０１６４】
組み換え核酸配列構築物は、プロモーター、イントロン、転写終止領域、開始コドン、終止コドン及び／またはポリアデニル化シグナルを含むこともできる。組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含むことができる。組み換え核酸配列構築物は、１つのプロモーターが、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸酸配列と関連することができ、第２のプロモーターが、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸酸配列と関連することができるように、２つのプロモーターを含むことができる。なお他の実施形態において、組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列及び軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と関連する１つのプロモーターを含むことができる。
【０１６５】
組み換え核酸配列構築物は、２つのリーダー配列を更に含むことができ、第１のリーダー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または、５’）に位置し、第２のリーダー配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または、５’）に位置する。したがって、第１のリーダー配列によりコードされる第１のシグナルペプチドは、ペプチド結合により重鎖ポリペプチドに連結され、第２のリーダー配列によりコードされる第２のシグナルペプチドは、ペプチド結合により軽鎖ポリペプチドに連結され得る。
【０１６６】
このように、配置２の１つの例は、ＶＨ及びＣＨ１を含む重鎖ポリペプチド、ならびにＶＬ及びＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードするベクター（したがって、組み換え核酸配列構築物）を含むことができ、リンカー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の間に位置する。
【０１６７】
配置２の第２の例は、ＶＨ及びＣＨ１を含む重鎖ポリペプチド、ならびにＶＬ及びＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードするベクター（したがって、組み換え核酸配列構築物）を含むことができ、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の間に位置する。
【０１６８】
配置２の第３の例は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３を含む重鎖ポリペプチド、ならびにＶＬ及びＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードするベクター（したがって、組み換え核酸配列構築物）を含むことができ、リンカー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の間に位置する。
【０１６９】
配置２の第４の例は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３を含む重鎖ポリペプチド、ならびにＶＬ及びＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードするベクター（したがって、組み換え核酸配列構築物）を含むことができ、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の間に位置する。
【０１７０】
ｃ．組み換え核酸配列構築物からの発現
上に記載されたように、組み換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素のうち、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列及び／または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むことができる。したがって、組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドの発現を促進することができる。
【０１７１】
上に記載された配置１が利用される場合、第１の組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドの発現を促進することができ、第２の組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチドの発現を促進することができる。上に記載された配置２が利用される場合、組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの発現を促進することができる。
【０１７２】
発現すると、例えば、限定されないが、細胞、生物、または哺乳動物において、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドは、合成抗体に組み立てられ得る。特に、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドは、組み立てが、抗原に結合することができる合成抗体をもたらすように、互いに相互作用し得る。他の実施形態において、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドは、組み立てが、本明細書に記載されたように組み立てられていない抗体と比較して、より多くの免疫原性がある合成抗体をもたらすように、互いに相互作用し得る。なお他の実施形態において、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドは、組み立てが、抗原に対して免疫応答を誘発または誘導することができる合成抗体をもたらすように、互いに相互作用し得る。
【０１７３】
ｄ．ベクター
上に記載された組み換え核酸配列構築物は、１つ以上のベクターに配置され得る。１つ以上のベクターは、複製起点を含有することができる。１つ以上のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。１つ以上のベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【０１７４】
１つ以上のベクターは、異種発現構築物であることができ、一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用されるプラスミドである。発現ベクターが細胞内部に入ると、組み換え核酸配列構築物によりコードされた重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドが、細胞転写及び翻訳機構であるリボソーム複合体によって産生される。１つ以上のベクターは、大量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、したがってタンパク質を発現することができる。
【０１７５】
（１）発現ベクター
１つ以上のベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であり得る。環状プラスミド及び線状核酸は、特定のヌクレオチド配列の発現を適切な対象の細胞において指示することができる。組み換え核酸配列構築物を含む１つ以上のベクターは、キメラであってもよく、これは、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。
【０１７６】
（２）プラスミド
１つ以上のベクターはプラスミドであり得る。プラスミドは、細胞に組み換え核酸配列構築物を形質移入するのに有用であり得る。プラスミドは、組み換え核酸配列構築物を対象に導入するのに有用であり得る。プラスミドは調節配列を含むこともでき、このことは、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現にとって好適であり得る。
【０１７７】
プラスミドを染色体外に維持するため及びプラスミドの多数のコピーを細胞内に産生するため、プラスミドは哺乳類複製起点を含むこともできる。プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であってもよく、エプスタイン・バーウイルス複製起点及び核内抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含むことができ、組み込まれることなく多数のエピソーム複製コピーを産生することができる。プラスミドの骨格は、ｐＡＶ０２４２であり得る。プラスミドは、複製欠陥アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであり得る。
【０１７８】
プラスミドは、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生に使用され得る。またベクターは、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよく、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生に使用され得る。またプラスミドは、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイル発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよく、昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。またプラスミドは、ｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよく、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。
【０１７９】
（３）環状及び線状ベクター
１つ以上のベクターは環状プラスミドであってもよく、細胞ゲノムへの組み込みによって標的細胞を形質転換することができる、または染色体外に存在してもよい（例えば、複製起点を有する自己複製プラスミド）。ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはＰｒｏｖａｘ、または組み換え核酸配列構築物によりコードされている重鎖ポリペプチド及び／もしくは軽鎖ポリペプチドを発現することができる任意の他の発現ベクターであり得る。
【０１８０】
電気穿孔により対象に効率的に送達され、組み換え核酸配列構築物によりコードされている重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドを発現することができる、線状核酸または線状発現カセット（「ＬＥＣ」）も、本明細書において提供される。ＬＥＣは、任意のリン酸主鎖を欠いている任意の線状ＤＮＡであり得る。ＬＥＣは、任意の抗生物質耐性遺伝子及び／またはリン酸主鎖を含有しなくてもよい。ＬＥＣは、所望の遺伝子発現に無関係の他の核酸配列を含有しなくてもよい。
【０１８１】
ＬＥＣは、線状化され得る任意のプラスミドから誘導されてもよい。プラスミドは、組み換え核酸配列構築物によりコードされている重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドを発現することができる。プラスミドは、ｐＮＰ（プエルトリコ／３４）またはｐＭ２（ニューカレドニア／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはＰｒｏｖａｘ、または組み換え核酸配列構築物によりコードされている重鎖ポリペプチド及び／もしくは軽鎖ポリペプチドを発現することができる任意の他の発現ベクターであり得る。
【０１８２】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰ及びｐｃｒＭ２は、ｐＮＰ（プエルトリコ／３４）及びｐＭ２（ニューカレドニア／９９）からそれぞれ誘導され得る。
【０１８３】
（４）ベクターの調製方法
組み換え核酸配列構築物が配置される１つ以上のベクターの調製方法が、本明細書において提供される。最終サブクローニングステップの後、ベクターを使用して、大規模発酵タンク内の細胞培養物に、当該技術に既知の方法の使用により接種することができる。
【０１８４】
他の実施形態では、最終サブクローニングステップの後、ベクターを１つ以上の電気穿孔（ＥＰ）装置により使用することができる。ＥＰ装置は、下により詳細に記載される。
【０１８５】
１つ以上のベクターは、既知の装置及び技術の組み合わせを使用して配合または製造され得るが、好ましくは、２００８年１２月４日公開のＷＯ２００８／１４８０１０に記載されているプラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの例において、本明細書に記載されているＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で配合され得る。製造技術には、米国特許出願第６０／９３９，７９２号の記載されているものに加えて、２００７年７月３日に発行された使用許諾特許の米国特許第７，２３８，５２２号に記載されているものを含む、当業者に一般的に知られている様々な装置及びプロトコールも含まれる、または組み入れられる。上に参照された出願、ならびに米国特許出願第６０／９３９，７９２号及び米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８６】
５．抗体
上に記載されたように、組み換え核酸配列は、抗体、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードすることができる。抗体は、抗原に結合または反応することができ、下により詳細に記載される。
【０１８７】
抗体は、重鎖及び軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）のセットを、重鎖と軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）のセットの間にそれぞれ介在して含んでもよく、ＣＤＲに支持を提供し、ＣＤＲの相互の相対的な空間的関係性を定義する。ＣＤＲセットは、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含有してもよい。重鎖または軽鎖のＮ末端から進めると、これらの領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」及び「ＣＤＲ３」と示される。したがって抗原結合部位は、重及び軽鎖Ｖ領域のそれぞれのＣＤＲセットから構成される、６つのＣＤＲを含むことができる。
【０１８８】
タンパク質分解酵素のパパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかのフラグメントを生じ、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）フラグメント）は、それぞれ、無傷の抗原結合部位を含む共有結合性ヘテロ二量体を含む。酵素のペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２フラグメントが含まれる、いくつかのフラグメントを提供することができる。したがって、抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２であり得る。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含むことができる。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域及びＣＨ１領域を含むことができる。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域及びＣＬ領域を含むことができる。
【０１８９】
抗体は免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含むことができる。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びCＨ３領域を含むことができる。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域及びＣＬ領域を含むことができる。
【０１９０】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、キメラ抗体、単鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種からの相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域の１つ以上を有する所望の抗原に結合する、非ヒト種からの抗体であり得る。
【０１９１】
抗体は、二重特異性抗体であることができ、下により詳細に記載される。抗体は、二機能性抗体であることができ、これも下により詳細に記載される。
【０１９２】
上に記載されたように、抗体は、組成物が対象に投与されたときに、対象において生成され得る。抗体は、対象内において半減期を有し得る。いくつかの実施形態において、抗体を修飾して、対象内の半減期を延長または短縮することができる。そのような修飾は、下により詳細に記載される。
【０１９３】
抗体は脱フコシル化することができ、下により詳細に記載される。
【０１９４】
抗体を修飾して、抗原に関連する疾患の抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を低減または防止することができ、下により詳細に記載される。
【０１９５】
ａ．二重特異性抗体
組み換え核酸配列は、二重特異性抗体、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードすることができる。二重特異性抗体は、２つの抗原と結合または反応することができ、例えば、その抗原のうちの２つが下により詳細に記載される。二重特異性抗体は、本明細書に記載されている抗体のうちの２つのフラグメントから構成され得、それによって、二重特異性抗体が、２つの所望の標的分子と結合または反応することを可能にし、これには、下により詳細に記載される抗原、受容体のリガンドを含むリガンド、受容体のリガンド結合部位を含む受容体、リガンド受容体複合体及びがんマーカーを含むマーカーが含まれ得る。
【０１９６】
ｂ．二機能性抗体
組み換え核酸配列は、二機能性抗体、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードすることができる。二機能性抗体は、下に記載される抗原と結合または反応することができる。二機能性抗体を修飾して、抗原の認識及び抗原との結合を超える追加の機能性を抗体に付与することもできる。そのような修飾には、Ｈ因子またはそのフラグメントへのカップリングが含まれ得るが、これに限定されない。Ｈ因子は、補体活性化の可溶性調節因子であり、したがって、補体媒介性溶解（ＣＭＬ）を介した免疫応答に寄与することができる。
【０１９７】
ｃ．抗体半減期の延長
上に記載されたように、抗体を修飾して、対象内の半減期を延長または短縮することができる。修飾は、対象の血清中の抗体の半減期を延長または短縮することができる。
【０１９８】
修飾は、抗体の定常領域に存在し得る。修飾は、１つ以上のアミノ酸置換を含有しない抗体の半減期と比較して抗体の半減期を延長する、抗体の定常領域における１つ以上のアミノ酸置換であり得る。修飾は、１つ以上のアミノ酸置換を含有しない抗体の半減期と比較して抗体の半減期を延長する、抗体のＣＨ２ドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換であり得る。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、定常領域における１つ以上のアミノ酸置換には、定常領域のメチオニン残基をチロシン残基に置き換えること、定常領域のセリン残基をトレオニン残基に置き換えること、定常領域のトレオニン残基をグルタミン酸残基に置き換えること、またはこれらの任意の組み合わせが含まれてもよく、それによって抗体の半減期が延長される。
【０２００】
他の実施形態において、定常領域における１つ以上のアミノ酸置換には、ＣＨ２ドメインのメチオニン残基をチロシン残基に置き換えること、ＣＨ２ドメインのセリン残基をトレオニン残基に置き換えること、ＣＨ２ドメインのトレオニン残基をグルタミン酸残基に置き換えること、またはこれらの任意の組み合わせが含まれてもよく、それによって抗体の半減期が延長される。
【０２０１】
ｄ．脱フコシル化
組み換え核酸配列は、フコシル化されていない抗体（すなわち、脱フコシル化抗体もしくは非フコシル化抗体）、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせをコードすることができる。フコシル化には、糖のフコースを分子に付加すること、例えば、フコースをＮーグルカン、Ｏ−グルカン及び糖脂質に結合することが含まれる。したがって、脱フコシル化抗体では、フコースは定常領域の炭水化物鎖に結合していない。次に、このフコシル化の欠如は、フコシル化された抗体と比較して、抗体によるＦｃγＲＩＩＩａ結合及び抗体指向性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉc）（ＡＤＣＣ）活性を改善することができる。したがって、いくつかの実施形態において、非フコシル化抗体は、フコシル化抗体と比較して、増加したＡＤＣＣ活性を示すことができる。
【０２０２】
抗体は、抗体のフコシル化を防止または阻害するように修飾され得る。いくつかの実施形態において、そのように修飾された抗体は、非修飾抗体と比較して、増加したＡＤＣＣ活性を示すことができる。修飾は、重鎖、軽鎖、またはこれらの組み合わせにおけるものであり得る。修飾は、重鎖における１つ以上のアミノ酸置換、軽鎖における１つ以上のアミノ酸置換、またはこれらの組み合わせであり得る。
【０２０３】
ｅ．ＡＤＥ応答の低減
抗体を修飾して、抗原に関連する疾患の抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を低減または予防することができるが、依然として抗原を中和することができる。例えば、抗体を修飾して、下により詳細に記載されるＤＥＮＶに関連する疾患のＡＤＥを低減または予防することができるが、依然としてＤＥＮＶを中和することができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、抗体を修飾して、抗体がＦｃγＲ１ａに結合することを低減または防止する１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。１つ以上のアミノ酸置換は、抗体の定常領域にあり得る。１つ以上のアミノ酸置換には、抗体の定常領域においてロイシン残基をアラニン残基に置き換えることが含まれてもよく、すなわち、本明細書においてＬＡ、ＬＡ突然変異、またはＬＡ置換としても知られている。１つ以上のアミノ酸置換には、抗体の定常領域において２つのロイシン残基をアラニン残基にそれぞれ置き換えることが含まれてもよく、本明細書においてＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ突然変異、またはＬＡＬＡ置換としても知られている。ＬＡＬＡ置換の存在は、抗体がＦｃγＲ１ａに結合することを防止または遮断することができ、したがって、修飾抗体は、抗原に関連する疾患のＡＤＥを増強または引き起こすことはないが、依然として抗原を中和する。
【０２０５】
６．抗原
ＤＮＡプラスミドワクチンは、抗原、またはそのフラグメントもしくは変異体をコードする。合成抗体は、抗原、またはそのフラグメントもしくは変異体に向けられる。抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、またはこれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、そのフラグメント、またはこれらの組み合わせであり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、その変異体、そのフラグメント、またはこれらの組み合わせであり得る。
【０２０６】
抗原は、いくつもの生物、例えば、ウイルス、寄生虫、細菌、真菌、または哺乳動物からのものであり得る。抗原は、自己免疫疾患、アレルギー、または喘息に関連し得る。他の実施形態において、抗原は、がん、ヘルペス、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連し得る。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、抗原は外来性である。いくつかの実施形態において、抗原は自己抗原である。
【０２０８】
ａ．外来性抗原
いくつかの実施形態において、抗原は外来性である。外来性抗原は、体内に導入されると、免疫応答を刺激することができる任意の非自己物質である（すなわち、対象の外部に由来する）。
【０２０９】
（１）ウイルス抗原
外来性抗原は、ウイルス抗原、またはそのフラグメント、またはその変異体であり得る。ウイルス抗原は、以下の科のうちの１つのウイルスからのものであり得る：Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、またはＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅ。ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）及びＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、天然痘ウイルス（大天然痘及び小天然痘）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱ウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、毛様細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス（出血熱）、狂犬病ウイルス、エボラ熱ウイルス、マールブルグウイルス、はしかウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペス１型（口腔ヘルペス）、単純ヘルペス２型（性器ヘルペス）、帯状疱疹（水痘帯状疱疹、別名水疱瘡）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えば、ヒトＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、ラッサウイルス、アレナウイルス、または発がん性ウイルスからのものであり得る。
【０２１０】
（ａ）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原
ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原からのものであり得る。いくつかの実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＡエンベロープタンパク質、サブタイプＢエンベロープタンパク質、サブタイプＣエンベロープタンパク質、サブタイプＤエンベロープタンパク質、サブタイプＢ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖタンパク質、ＧａｇサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、もしくはＤタンパク質、ＭＰｏｌタンパク質、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇの核酸もしくはアミノ酸配列、またはこれらの任意の組み合せであり得る。
【０２１１】
ＨＩＶに特異的な合成抗体は、配列番号３の核酸配列でコードされている配列番号４８のアミノ酸配列及び配列番号４の核酸配列でコードされている配列番号４９のアミノ酸配列を含むＦａｂフラグメントを、含むことができる。合成抗体は、配列番号６の核酸配列でコードされている配列番号４６のアミノ酸配列及び配列番号７の核酸配列でコードされている配列番号４７のアミノ酸配列を含むことができる。Ｆａｂフラグメントは、配列番号５０の核酸でコードされている配列番号５１のアミノ酸配列を含む。Ｆａｂは、配列番号５２の核酸でコードされている配列番号５３のアミノ酸配列を含むことができる。
【０２１２】
ＨＩＶに特異的な合成抗体は、配列番号５のアミノ酸を含むＩｇを含むことができる。Ｉｇは、配列番号６２の核酸でコードされている配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる。Ｉｇは、配列番号６３の核酸でコードされている配列番号２のアミノ酸配列を含むことができる。Ｉｇは、配列番号５４の核酸配列でコードされている配列番号５５のアミノ酸配列及び配列番号５６の核酸配列でコードされている配列番号５７のアミノ酸配列を含むことができる。
【０２１３】
ＨＩＶ抗原をコードするＤＮＡワクチンには、サブタイプＡエンベロープタンパク質、サブタイプＢエンベロープタンパク質、サブタイプＣエンベロープタンパク質、サブタイプＤエンベロープタンパク質、サブタイプＢ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖタンパク質、ＧａｇサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、もしくはＤタンパク質、ＭＰｏｌタンパク質、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇの核酸もしくはアミノ酸配列、またはこれらの任意の組み合せをコードするワクチンが含まれ得る。ＨＩＶ抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許第８，１６８，７６９号及びＷＯ２０１５／０７３２９１に記載されているものが含まれ、これらの内容は、それぞれ参照により完全に組み込まれる。
【０２１４】
（ｂ）チクングニアウイルス
ウイルス抗原は、チクングニアウイルスからのものであり得る。チクングニアウイルスは、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科のアルファウイルス属に属する。チクングニアウイルスは、感染したＡｅｄｅｓ属などの蚊に刺されることによってヒトに伝染する。
【０２１５】
ＣＨＩＫＶに特異的な合成抗体は、配列番号５８の核酸配列でコードされている配列番号５９のアミノ酸配列及び配列番号６０の核酸配列でコードされている配列番号６１のアミノ酸配列を含むＦａｂフラグメントを、含むことができる。ＣＨＩＫＶに特異的な合成抗体は、配列番号９７〜１００のうちの１つによってコードされているＩｇを含むことができる。
【０２１６】
ＤＮＡワクチンは、ＣＨＩＫＶ抗原をコードすることができる。ＣＨＩＫＶ抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許第８，８５２，６０９号に記載されているものが含まれ、その内容は参照により完全に組み込まれる。ＣＨＩＫＶ抗原をコードするＤＮＡワクチンは、配列番号８１〜８８のうちの１つを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。ＣＨＩＫＶ抗原をコードするＤＮＡワクチンは、配列番号８９〜９６の配列を含む核酸配列を含むことができる。例えば、１つの実施形態において、ＤＮＡワクチンはＣＨＩＫＶ  Ｅ１コンセンサスタンパク質をコードする。１つの実施形態において、ＣＨＩＫＶ  Ｅ１コンセンサスタンパク質は、配列番号８１または８４のうちの一方のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、ＣＨＩＫＶ  Ｅ１コンセンサスタンパク質をコードするＤＮＡワクチンは、配列番号８９または９２の核酸配列を含む。１つの実施形態において、ＤＮＡワクチンはＣＨＩＫＶ  Ｅ２コンセンサスタンパク質をコードする。１つの実施形態において、ＣＨＩＫＶ  E2コンセンサスタンパク質は、配列番号８２または８５のうちの一方のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、ＣＨＩＫＶ  Ｅ２コンセンサスタンパク質をコードするＤＮＡワクチンは、配列番号９０または９３の核酸配列を含む。１つの実施形態において、ＤＮＡワクチンはＣＨＩＫＶカプシドコンセンサスタンパク質をコードする。１つの実施形態において、ＣＨＩＫＶカプシドコンセンサスタンパク質は、配列番号８３または８６のうちの一方のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、ＣＨＩＫＶカプシドコンセンサスタンパク質をコードするＤＮＡワクチンは、配列番号９１または９４の核酸配列を含む。１つの実施形態において、ＤＮＡワクチンはＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖコンセンサスタンパク質をコードする。１つの実施形態において、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖコンセンサスタンパク質は、配列番号８７または８８のうちの一方のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖコンセンサスタンパク質をコードするＤＮＡワクチンは、配列番号９５または９６の核酸配列を含む。
【０２１７】
（ｃ）デングウイルス
ウイルス抗原は、デングウイルスからのものであり得る。デングウイルス抗原は、ウイルス粒子を形成する３つのタンパク質またはポリペプチド（Ｃ、ｐｒＭ及びＥ）のうちの１つであり得る。デングウイルス抗原は、ウイルスの複製に関与する７つの他のタンパク質またはポリペプチド（ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５）のうちの１つであり得る。デングウイルスは、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３及びＤＥＮＶ−４が含まれる、ウイルスの５つの株または血清型のうちの１つであり得る。抗原は、複数のデングウイルス抗原の任意の組み合わせであり得る。
【０２１８】
デングウイルスに特異的な合成抗体は、配列番号４４の核酸配列でコードされている配列番号４５のアミノ酸配列を含むＩｇを含むことができる。
【０２１９】
ＤＮＡワクチンは、デングウイルス抗原をコードすることができる。デングウイルス抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許第８，８３５，６２０号及びＷＯ２０１４／１４４７８６に記載されているものが含まれ、これらの内容は、それぞれ参照により完全に組み込まれる。
【０２２０】
（ｄ）肝炎抗原
ウイルス抗原には、肝炎ウイルス抗原（すなわち、肝炎抗原）、またはそのフラグメント、またはその変異体が含まれ得る。肝炎抗原は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）及び／またはＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）の１つ以上からの抗原または免疫原であり得る。
【０２２１】
肝炎抗原は、ＨＡＶからの抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＡＶカプシドタンパク質、ＨＡＶ非構造タンパク質、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせであり得る。
【０２２２】
肝炎抗原は、ＨＣＶからの抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＣＶヌクレオカプシドタンパク質（すなわち、コアタンパク質）、ＨＣＶエンベロープタンパク質（例えば、Ｅ１及びＥ２）、ＨＣＶ非構造タンパク質（例えば、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂ）、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせであり得る。
【０２２３】
肝炎抗原は、ＨＤＶからの抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＤＶデルタ抗原、そのフラグメント、またはその変異体であり得る。
【０２２４】
肝炎抗原は、ＨＥＶからの抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＥＶカプシドタンパク質、そのフラグメント、またはその変異体であり得る。
【０２２５】
肝炎抗原は、ＨＢＶからの抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面タンパク質、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｘ遺伝子でコードされているＨＢＶタンパク質、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせであり得る。肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ａ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈ表面タンパク質、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせであり得る。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ、またはＨＢＶ遺伝子型Ｈからの抗原であり得る。
【０２２７】
ＤＮＡワクチンは、肝炎抗原をコードすることができる。肝炎抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許第８，８２９，１７４号、同第８，９２１，５３６号、同第９，４０３，８７９号、同第９，２３８，６７９号に記載されているものが含まれ、これらの内容は、それぞれ参照により完全に組み込まれる。
【０２２８】
（ｅ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原
ウイルス抗原には、ＨＰＶからの抗原が含まれ得る。ＨＰＶ抗原は、子宮頸癌、直腸癌及び／または他のがんを引き起こす１６、１８，３１，３３、３５、４５、５２及び５８型のＨＰＶからのものであり得る。ＨＰＶ抗原は、６及び１１型のＨＰＶからのものであり、性器疣贅を引き起こし得、頭頸部癌を引き起こすことが知られている。
【０２２９】
ＨＰＶ抗原は、それぞれのＨＰＶ型からのＨＰＶのＥ６またはＥ７ドメインのものであり得る。例えば、１６型のＨＰＶ（ＨＰＶ１６）では、ＨＰＶ１６抗原には、ＨＰＶ１６のＥ６抗原、ＨＰＶ１６のＥ７抗原、これらのフラグメント、変異体、または組み合わせが含まれ得る。同様に、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ６のＥ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ１１のＥ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ１８のＥ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ３１のＥ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ３３のＥ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ５２のＥ６及び／もしくはＥ７、またはＨＰＶ５８のＥ６及び／もしくはＥ７、これらのフラグメント、変異体、または組み合わせであり得る。
【０２３０】
ＤＮＡワクチンは、ＨＰＶ抗原をコードすることができる。ＨＰＶ抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、２００８年１月３１日公開のＷＯ２００８／０１４５２１、米国特許出願公開第２０１６／００３８５８４号、米国特許第８，３８９，７０６号及び同第９，０５０，２８７号に記載されているものが含まれ、これらの内容は、それぞれ参照により完全に組み込まれる。
【０２３１】
（ｆ）ＲＳＶ抗原
ウイルス抗原には、ＲＳＶ抗原が含まれ得る。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ縮合タンパク質（本明細書において、「ＲＳＶ  Ｆ」、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質」及び「Ｆタンパク質」とも呼ばれる）、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。ヒトＲＳＶ縮合タンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢの間で保存され得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９４．１）からのＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ａ２株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＢ５９８５８．１）、またはそのフラグメントもしくは変異体からのＲＳＶ  Ｆタンパク質であり得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体の単量体、二量体、または三量体であり得る。
【０２３２】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、融合前形態または融合後形態であり得る。融合後形態のＲＳＶ  Ｆは、免疫化された動物において高い力価の中和抗体を誘発し、動物をＲＳＶ負荷から防御する。
【０２３３】
ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ結合糖タンパク質（本明細書において、「ＲＳＶ  Ｇ」、「ＲＳＶ  Ｇタンパク質」及び「Ｇタンパク質」とも呼ばれる）、またはそのフラグメントもしくは変異体でありも得る。ヒトＲＳＶ  Ｇタンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢの間で異なっている。抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９３）からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５６０１、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１０６８、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５５９８、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１１２３、またはそのフラグメントもしくは変異体からのＲＳＶ  Ｇタンパク質であり得る。
【０２３４】
他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ非構造タンパク質１（「ＮＳ１タンパク質」）、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８７．１）からのＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。ヒトＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ非構造タンパク質２（「ＮＳ２タンパク質」）、またはそのフラグメントもしくは変異体でもあり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８８．１）からのＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。更にＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶヌクレオカプシド（「Ｎ」）タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８９．１）からのＲＳＶ  Ｎタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶリンタンパク質（「Ｐ」タンパク質）、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９０．１）からのＲＳＶ  Ｐタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。またＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ基質タンパク質（「Ｍ」タンパク質）、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９１．１）からのＲＳＶ  Ｍタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。
【０２３５】
なお他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ低分子疎水性（「ＳＨ」）タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９２．１）からのＲＳＶ  ＳＨタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。またＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ基質タンパク質２−１（「Ｍ２−１」タンパク質）、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９５．１）からのＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。更にＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ基質タンパク質２−２（「Ｍ２−２」タンパク質）、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９７．１）からのＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。ヒトＲＳＶ抗原は、ＲＳＶポリメラーゼＬ（「Ｌ」）タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９６．１）からのＲＳＶ  Ｌタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。
【０２３６】
更なる実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＬタンパク質の最適化されたアミノ酸配列を有することができる。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶゲノムでコードされているタンパク質のいずれかなどの、ヒトＲＳＶタンパク質または組み換え抗原であり得る。
【０２３７】
他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのヒトＲＳＶゲノム、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｎタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｐタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  ＳＨタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｌタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５６０１からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１０６８からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５５９８からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１１２３からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはそのフラグメント、またはその変異体であり得るが、これらに限定されない。
【０２３８】
ＤＮＡワクチンは、ＲＳＶ抗原をコードすることができる。ＲＳＶ抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許出願公開第２０１５／００７９１２１号に記載されているものが含まれ、その内容は参照により組み込まれる。
【０２３９】
（ｇ）インフルエンザ抗体
ウイルス抗原には、インフルエンザウイルスからの抗原が含まれ得る。インフルエンザ抗原は、１つ以上のインフルエンザ血清型に対して免疫応答を哺乳動物において誘発することができるものである。抗原には、全長翻訳産物ＨＡ０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、その変異体、そのフラグメント、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。インフルエンザ赤血球凝集素抗原は、Ａ型インフルエンザの血清型Ｈ１、Ａ型インフルエンザの血清型Ｈ１の多数の株からの異なるセットから誘導されるハイブリッド配列である血清型Ｈ２の多数の株から誘導され得る、またはＢ型インフルエンザの多数の株から誘導され得る。インフルエンザ赤血球凝集素抗原は、Ｂ型インフルエンザからのものであり得る。
【０２４０】
インフルエンザ抗原は、免疫応答を誘導することができる特定のインフルエンザ免疫原に対して有効であり得る、少なくとも１つの抗原性エピトープを含有することもできる。抗原は、無傷のインフルエンザウイルスに存在する免疫原性部位及びエピトープの全レパートリーを提供することができる。抗原は、血清型Ｈ１または血清型Ｈ２の複数のＡ型インフルエンザウイルス株など、１つの血清型の複数のＡ型インフルエンザウイルス株の赤血球凝集素抗原配列から誘導され得る。抗原は、２つの異なる赤血球凝集素抗原配列またはその一部の組み合わせから誘導される、ハイブリッド赤血球凝集素抗原配列であり得る。２つの異なる赤血球凝集素抗原配列は、それぞれ、血清型Ｈ１の複数のＡ型インフルエンザウイルス株など、１つの血清型の複数のＡ型インフルエンザウイルス株の異なるセットから誘導され得る。抗原は、複数のＢ型インフルエンザウイルス株の赤血球凝集素抗原配列から誘導される赤血球凝集素抗原配列であり得る。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、またはＢＨＡ抗原であり得る。
【０２４２】
インフルエンザ抗原に特異的な合成抗体は、配列番号１５５〜１６１のうちの１つのアミノ酸配列を含むＩｇを含むことができる。インフルエンザ抗原に特異的な合成抗体は、配列番号１６２〜１７０のうちの１つの核酸配列を含む核酸分子によりコードされ得る。
【０２４３】
ＤＮＡワクチンは、インフルエンザ抗原をコードすることができる。インフルエンザ抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、２００８年１月３１日公開のＷＯ２００８／０１４５２１、米国特許第９，５９２，２８５号、同第８，２９８，８２０号、米国特許出願公開第２０１６／００２２８０６号、同第２０１６／０１７５４２７号に記載されているものが含まれ、これらの内容は、それぞれ参照により完全に組み込まれる。
【０２４４】
（ｈ）エボラウイルス
ウイルス抗原は、エボラウイルスからのものであり得る。エボラウイルス疾患（ＥＶＤ）またはエボラ出血熱（ＥＨＦ）には、ブンディブギョ（Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ）ウイルス（ＢＤＢＶ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、スーダンウイルス（ＳＵＤＶ）及びタイフォレスト（Ｔａｉ  Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス（ＴＡＦＶ、コートジボワールエボラウイルス（アイボリーコースト（Ｉｖｏｒｙ  Ｃｏａｓｔ）エボラウイルス、ＣＩＥＢＯＶ）とも呼ばれる）を含む４つの既知のエボラウイルスのいずれかが含まれる。
【０２４５】
エボラウイルス抗原に特異的な合成抗体。エボラウイルスに特異的な合成抗体は、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、または配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＩｇを含むことができる。エボラウイルスに特異的な合成抗体は、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、または配列番号１４８のアミノ酸配列を含む核酸分子よりコードされ得る。
【０２４６】
ＤＮＡワクチンは、エボラ抗原をコードすることができる。エボラ抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許出願公開第２０１５／０３３５７２６号に記載されているものが含まれ、その内容は参照により組み込まれる。
【０２４７】
（ｉ）ジカウイルス
ウイルス抗原は、ジカウイルスからのものであり得る。ジカ疾患は、ジカウイルスによる感染によって引き起こされ、蚊に刺されることによって、またはヒトの間の性行為感染によって、ヒトに伝染し得る。ジカ抗原には、ジカウイルスエンベロープタンパク質、ジカウイルスＮＳ１タンパク質、またはジカウイルスカプシドタンパク質が含まれ得る。
【０２４８】
ジカ抗原に特異的な合成抗体は。ジカウイルスに特異的な合成抗体は、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号  １０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２１、または配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＩｇを含むことができる。
【０２４９】
ＤＮＡワクチンは、ジカ抗原をコードすることができる。ジカ抗原をコードするＤＮＡワクチンは、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１及び配列番号１３３のうちの１つを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。ジカ抗原をコードするＤＮＡワクチンは、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０及び配列番号１３２のうちの１つを含む核酸配列を含むことができる。
【０２５０】
（ｊ）マールブルグウイルス
ウイルス抗原は、マールブルグウイルスからのものであり得る。マールブルグウイルス免疫原を使用して、複数のマールブルグウイルスサブタイプまたは血清型に対して広範囲の免疫を誘導することができる。抗原は、マールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質から得ることができる。
【０２５１】
ＤＮＡワクチンは、マールブルグ抗原をコードすることができる。マールブルグ抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許第９，５９７，３８８号に記載されているものが含まれ、その内容は参照により完全に組み込まれる。マールブルグウイルス抗原をコードするＤＮＡワクチンは、配列番号１５０、配列番号１５２及び配列番号１５４のうちの１つを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。マールブルグウイルス抗原をコードするＤＮＡワクチンは、配列番号１４９、配列番号１５１及び配列番号１５３のうちの１つを含む核酸配列を含むことができる。
【０２５２】
（２）細菌抗原
外来性抗原は、細菌抗原、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。細菌は、以下の門のいずれか１つからのものであり得る：Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ及びＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ。
【０２５３】
細菌は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌であり得る。細菌は、好気性菌または嫌気性菌であり得る。細菌は、独立栄養菌または従属栄養菌であり得る。細菌は、中温菌、好中球、極限環境微生物、好酸球、好アルカリ菌（ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｅ）、好熱菌、好冷菌、好塩菌、または高浸透圧親和性菌であり得る。
【０２５４】
細菌は、炭疽菌、抗生物質耐性菌、病原菌、食中毒菌、感染菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌、または破傷風菌であり得る。細菌は、マイコバクテリア、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅであり得る。細菌は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであり得る。
【０２５５】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許出願公開第２０１４／０３４１９３６号に記載されているものが含まれ、その内容は参照により組み込まれる。
【０２５６】
ＭＲＳＡ抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許出願公開第２０１４／０３４１９４４号に記載されているものが含まれ、その内容は参照により組み込まれる。
【０２５７】
（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原
細菌抗原は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原（すなわち、ＴＢ抗原もしくはＴＢ免疫原）、またはそのフラグメント、またはその変異体であり得る。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＡｇ８５ファミリーからのものであり、例えば、Ａｇ８５Ａ及びＡｇ８５Ｂであり得る。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＥｓｘファミリーからのものであり、例えば、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＤ、ＥｓｘＥ、ＥｓｘＦ、ＥｓｘＨ、ＥｓｘＯ、ＥｓｘＱ、ＥｓｘＲ、ＥｓｘＳ、ＥｓｘＴ、ＥｓｘＵ、ＥｓｘＶ及びＥｓｘＷであり得る。
【０２５８】
ＤＮＡワクチンは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原をコードすることができる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許出願公開第２０１６／００２２７９６号に記載されているものが含まれ、その内容は参照により組み込まれる。
【０２５９】
（３）寄生虫抗原
外来性抗原は、寄生虫抗原、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。寄生虫は、原生動物、蠕虫、または外部寄生虫であり得る。蠕虫（すなわち、虫）は、扁虫.（例えば、吸虫及び条虫）、鉤頭虫、または円形虫（例えば、蟯虫）であり得る。外部寄生虫は、シラミ、ノミ、マダニ及びコダニであり得る。
【０２６０】
寄生虫は、以下の疾患のいずれか１つを引き起こす任意の寄生虫であり得る：アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、ベイリスアスカリス症（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉａｓｉｓ）、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ症（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ）、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮症、腸蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症及び鞭虫症。
【０２６１】
寄生虫は、アカントアメーバ、アニサキス、Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、ウマバエ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ、トコジラミ、Ｃｅｓｔｏｄａ（条虫）、恙虫、Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ  ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、鉤虫、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｌｉｎｇｕａｔｕｌａ  ｓｅｒｒａｔａ、肝吸虫、Ｌｏａ  ｌｏａ、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ−肺吸虫、Ｐｉｎｗｏｒｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、コダニ、条虫、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、鞭虫、またはＷｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉであり得る。
【０２６２】
（ａ）マラリア抗原
外来性抗原は、マラリア抗原（すなわち、ＰＦ抗原もしくはＰＦ免疫原）、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。抗原は、マラリアを引き起こす寄生虫からのものであり得る。マラリア発症寄生虫は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍであり得る。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原には、スポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原が含まれ得る。
【０２６３】
いくつかの実施形態において、マラリア抗原は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ免疫原のＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ及びＡｍａ１のうちの１つであり得る。免疫原は、全長タンパク質または全長タンパク質の免疫原フラグメントであり得る。
【０２６４】
他の実施形態において、マラリア抗原はＴＲＡＰであることができ、これはＳＳＰ２とも呼ばれる。なお他の実施形態において、マラリア抗原はＣｅｌＴＯＳであることができ、これはＡｇ２とも呼ばれ、高度に保存されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ抗原である。更なる実施形態において、マラリア抗原はＡｍａ１であることができ、これは高度に保存されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＣＳ抗原であり得る。
【０２６５】
他の実施形態において、マラリア抗原は、本明細書に記載されている２つ以上のＰＦタンパク質の組み合わせを含む融合タンパク質であり得る。例えば、融合タンパク質は、互いに直接隣接している、またはスペーサーにより、もしくはその間の１個以上のアミノ酸により連結されている２つ以上のＣＳ免疫原、ＣｏｎＬＳＡ１免疫原、ＣＯＮＴＲＡＰ免疫原、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原及びＣｏｎＡｍａ１免疫原を含むことができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、２つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は３つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は４つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は５つのＰＦ免疫原を含む。２つのＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ及びＬＳＡ１、ＣＳ及びＴＲＡＰ、ＣＳ及びＣｅｌＴＯＳ、ＣＳ及びＡｍａ１、ＬＳＡ１及びＴＲＡＰ、ＬＳＡ１及びＣｅｌＴＯＳ、ＬＳＡ１及びＡｍａ１、ＴＲＡＰ及びＣｅｌＴＯＳ、ＴＲＡＰ及びＡｍａ１、またはＣｅｌＴＯＳ及びＡｍａ１を含むことができる。３つのＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１及びＴＲＡＰ；ＣＳ、ＬＳＡ１及びＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１及びＡｍａ１；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ及びＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ及びＡｍａ１；またはＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ及びＡｍａ１を含むことができる。４つのＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ及びＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ及びＡｍａ１；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ及びＡｍａ１；ＣＳ、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ及びＡｍａ１；またはＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ及びＡｍａ１を含むことができる。５つのＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ及びＡｍａ１を含むことができる。
【０２６６】
ＤＮＡワクチンは、マラリア抗原をコードすることができる。マラリア抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許出願公開第２０１３／０２７３１１２号に記載されているものが含まれ、その内容は参照により組み込まれる。
【０２６７】
（４）真菌抗原
外来性抗原は、真菌抗原、またはそのフラグメントもしくは変異体であり得る。真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ、ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ、またはＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍであり得る。
【０２６８】
ｂ．自己抗原
いくつかの実施形態において、抗原は自己抗原である。自己抗原は、免疫応答を刺激することができる、対象の自己身体の構成物であり得る。いくつかの実施形態において、自己抗原は、対象が疾患状態、例えば、自己免疫疾患にない限り、免疫応答を誘発しない。
【０２６９】
自己抗原には、サイトカイン、ＨＩＶ及びデングを含む上に列挙されたものなどのウイルスに対する抗体、がんの進行及び進展に影響を与える抗原、ならびに細胞表面受容体または膜貫通タンパク質が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０２７０】
（１）ＷＴ−１
自己抗原は、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子１（ＷＴ１）、そのフラグメント、その変異体、またはこれらの組み合わせであり得る。ＷＴ１は、Ｎ末端にプロリン／グルタミン豊富ＤＮＡ結合ドメイン及びＣ末端に４つのジンクフィンガーモチーフを含有する転写因子である。ＷＴ１は、泌尿生殖器系の正常な発生に役割を果たし、多数の因子と、例えば、既知の腫瘍抑制因子であるｐ５３及び細胞傷害性薬物による治療後に多数の部位でＷＴ１を切断するセリンプロテアーゼであるＨｔｒＡ２と相互作用する。ＷＴ１の突然変異は、腫瘍もしくはがん形成、例えば、ウィルムス腫瘍または腫瘍発現ＷＴ１をもたらす可能性がある。
【０２７１】
ＤＮＡワクチンは、ＷＴ−１抗原をコードすることができる。ＷＴ−１抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許出願公開第２０１５／０３２８２９８号及び同第２０１６／００３０５３６号に記載されているものが含まれ、これらの内容は、それぞれ参照により組み込まれる。
【０２７２】
（２）ＥＧＦＲ
自己抗原には、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）またはそのフラグメントもしくは変異体が含まれ得る。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１及びＨＥＲ１とも呼ばれる）は、細胞外タンパク質リガンドの上皮増殖因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーのための細胞表面受容体である。ＥＧＦＲは、受容体のＥｒｂＢファミリーのメンバーであり、４つの緊密に関連している受容体チロシンキナーゼであるＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）及びＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）が含まれる。ＥＧＦＲ発現または活性に影響を与える突然変異は、がんをもたらす可能性がある。
【０２７３】
抗原にはＥｒｂＢ−２抗原が含まれ得る。ＥｒｂＢ−２（ヒト上皮増殖因子受容体２）は、Ｎｅｕ、ＨＥＲ２、ＣＤ３４０（分化３４０のクラスター）、またはｐ１８５としても知られており、ＥＲＢＢ２遺伝子によりコードされる。この遺伝子の増幅または過剰発現は、特定の侵襲型乳癌の発生及び進行に役割を果たすことが示されている。乳癌を有する女性のおよそ２５〜３０％において、遺伝子変異がＥＲＢＢ２遺伝子に発生しており、腫瘍細胞の表面に増量したＨＥＲ２の産生をもたらす。このＨＥＲ２の過剰発現は、急速な細胞分化を促進し、したがって、ＨＥＲ２が腫瘍細胞をマークする。
【０２７４】
ＨＥＲ２に特異的な合成抗体は、配列番号４０の核酸配列でコードされている配列番号４１のアミノ酸配列、及び配列番号４２の核酸配列でコードされている配列番号４３のアミノ酸配列を含むＦａｂフラグメントを、含むことができる。
【０２７５】
（３）コカイン
自己抗原は、コカイン受容体抗原であり得る。コカイン受容体には、ドーパミン輸送体が含まれる。
【０２７６】
（４）ＰＤ−１
自己抗原には、プログラム死１（ＰＤ−１）が含まれ得る。プログラム死１（ＰＤ−１）、ならびにそのリガンドのＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、Ｔ細胞の活性化、寛容性及び免疫病理の均衡を調節する阻害シグナルを送達する。ＰＤ−１は、細胞外ＩｇＶドメイン、その後に膜貫通領域及び細胞内尾部を含む、２８８アミノ酸細胞表面タンパク質分子である。
【０２７７】
ＤＮＡワクチンは、ＰＤ−１抗原をコードすることができる。ＰＤ−１抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許出願公開第２０１７／０００７６９３号に記載されているものが含まれ、その内容は参照により組み込まれる。
【０２７８】
（５）４−１ＢＢ
自己抗原には、４−１ＢＢリガンドが含まれ得る。４−１ＢＢリガンドは、ＴＮＦスーパーファミリーに属する２型膜貫通糖タンパク質である。４−１ＢＢリガンドは、活性化されたＴリンパ球に発現し得る。４−１ＢＢは、活性化誘導Ｔ細胞共刺激分子である。４−１ＢＢによるシグナル伝達は、生存遺伝子を上方制御し、細胞分化を増強し、サイトカイン産生を誘導し、Ｔ細胞の活性化誘導細胞死を防止する。
【０２７９】
（６）ＣＴＬＡ４
自己抗原には、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）が含まれてもよく、ＣＤ１５２（分化１５２のクラスター）としても知られている。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞の表面に見出されるタンパク質受容体であり、抗原に対して細胞免疫攻撃をもたらす。抗原は、細胞外Ｖドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部、またはこれらの組み合わせなどの、ＣＴＬＡ−４のフラグメントであり得る。
【０２８０】
（７）ＩＬ−６
自己抗原には、インターロイキン６（ＩＬ−６）が含まれ得る。ＩＬ−６は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、抑うつ症、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、多発性骨髄腫、がん、ベーチェット病及び関節リウマチが含まれるが、これらに限定されない多くの疾患において、炎症及び自己免疫過程を刺激する。
【０２８１】
（８）ＭＣＰ−１
自己抗原には、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）が含まれ得る。ＭＣＰ−１は、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）または低分子誘導サイトカインＡ２とも呼ばれる。ＭＣＰ−１は、ＣＣケモカインファミリーに属するサイトカインである。ＭＣＰ−１は、単球、記憶Ｔ細胞及び樹状細胞を、組織損傷または感染のいずれかによって生した炎症部位へ動員する。
【０２８２】
（９）アミロイドベータ
自己抗原には、アミロイドベータ（Ａβ）またはそのフラグメントもしくは変異体が含まれ得る。Ａβ抗原は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドを含むことができ、ＸとＹの両方を含むヒト配列Ａβタンパク質のアミノ酸Ｙに対するアミノ酸位置Ｘからのアミノ酸配列、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩ（配列番号１７１）（アミノ酸位置１〜４７に相当、ヒト問い合わせ配列）のアミノ酸位置Ｙに対するアミノ酸位置Ｘからのアミノ酸配列またはその変異体を含むことができる。Ａβ抗原は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ポリペプチドのＡβポリペプチドを含むことができ、ここでＸは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２であり、Ｙは、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、または１５であり得る。Ａβポリペプチドは、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個、少なくとも４５個、または少なくとも４６個のアミノ酸であるフラグメントを含むことができる。
【０２８３】
（１０）ＩＰ−１０
自己抗原には、インターフェロン（ＩＦＮ）ガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）が含まれ得る。ＩＰ−１０は、低分子誘導サイトカインＢ１０またはＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）としても知られている。ＣＸＣＬ１０は、単球、内皮細胞及び線維芽細胞などのいくつかの種類の細胞により、ＩＦＮ−γに応答して分泌される。
【０２８４】
（１１）ＰＳＭＡ
自己抗原には、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）が含まれ得る。ＰＳＭＡは、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミン酸ペプチダーゼＩ（ＮＡＡＬＡダーゼＩ）、ＮＡＡＧペプチダーゼ、または葉酸ヒドロラーゼ（ＦＯＬＨ）としても知られている。ＰＭＳＡは、前立腺癌細胞により高度に発現される膜内在性タンパク質である。
【０２８５】
いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡに対して向けられている抗体（抗ＰＳＭＡ抗体）をコードする組み換え核酸配列は、組み換え核酸配列構築物を配列２で含む組み換え核酸配列であり得る。
【０２８６】
なお他の実施形態において、組み換え核酸配列によりコードされている抗ＰＳＭＡ抗体は、本明細書に記載されているように修飾され得る。１つのそのような修飾は脱フコシル化抗体であり、実施例において実証されているように、市販の抗体と比較して増加したＡＤＣＣ活性を示した。修飾は、重鎖、軽鎖、またはこれらの組み合わせにおけるものであり得る。修飾は、重鎖における１つ以上のアミノ酸置換、軽鎖における１つ以上のアミノ酸置換、またはこれらの組み合わせであり得る。
【０２８７】
ＰＳＭＡに特異的であり、フコシル化されないように修飾されている抗体は、配列番号７９により記載されている核酸配列によりコードされ得る。配列番号７９は、配列番号８０により記載されているアミノ酸をコードする。
【０２８８】
ＤＮＡワクチンは、ＰＳＭＡ抗原をコードすることができる。ＰＳＭＡ抗原をコードするＤＮＡワクチンの例には、米国特許出願公開第２０１３／０３０２３６１号に記載されているものが含まれ、その内容は参照により組み込まれる。
【０２８９】
ｃ．他の抗原
いくつかの実施形態において、抗原は、外来性抗原及び／または自己抗原以外の抗原である。
【０２９０】
（ａ）ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１
他の抗原は、ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１であり得る。ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１は、ＨＩＶの中和ＣＤ４結合部位抗体である。ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１は、ｇｐ１２０ループＤ、ＣＤ４結合ループ及びＨＩＶ−１のＶ５領域内に含まれるＨＩＶ−１の一部に接触する。
【０２９１】
（ｂ）ＨＩＶ−１  ＰＧ９
他の抗原は、ＨＩＶ−１  ＰＧ９であり得る。ＨＩＶ−１  ＰＧ９は、ＨＩＶ（ＨＩＶ−１）エンベロープ（Ｅｎｖ）糖タンパク質（ｇｐ）三量体に優先的に結合し、ウイルスを広範囲に中和する、グリカン依存性ヒト抗体の拡大するファミリーの創始メンバーである。
【０２９２】
（ｃ）ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０
他の抗原は、ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０であり得る。ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０は、中和抗ＨＩＶ抗体である。ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０は、ｇｐ４１外部ドメインのＣ末端に位置する、ＨＩＶ−１の膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）にマップされた線状エピトープに向けられている。
【０２９３】
（ｄ）ＤＶ−ＳＦ１
他の抗原は、ＤＶ−ＳＦ１であり得る。ＤＶ−ＳＦ１は、４つのデングウイルス血清型のエンベロープタンパク質と結合する中和抗体である。
【０２９４】
（ｅ）ＤＶ−ＳＦ２
他の抗原は、ＤＶ−ＳＦ２であり得る。ＤＶ−ＳＦ２は、デングウイルスのエピトープと結合する中和抗体である。ＤＶ−ＳＦ２は、ＤＥＮＶ４血清型に特異的であり得る。
【０２９５】
（ｆ）ＤＶ−ＳＦ３
他の抗原は、ＤＶ−ＳＦ３であり得る。ＤＶ−ＳＦ３は、デングウイルスエンベロープタンパク質のＥＤＩＩＩ  Ａ鎖と結合する中和抗体である。
【０２９６】
７．組成物の賦形剤及び他の構成要素
組成物は、薬学的に許容される賦形剤を更に含むことができる。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤などの機能性分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、形質移入促進剤であり得、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類縁体、ムラミルペプチド、キノン類縁体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知の形質移入促進剤が含まれ得る。
【０２９７】
形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオンであり、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩（ＬＧＳ）が含まれ、または脂質である。形質移入促進剤はポリ−Ｌ−グルタミン酸塩であり、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩は、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で組成物に存在し得る。形質移入促進剤には、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類縁体、ムラミルペプチド、キノン類縁体、ならびにスクアレン及びスクアレンなどの小胞も含まれてもよく、またヒアルロン酸を、組成物と一緒に投与するために使用してもよい。組成物は、脂質、レシチンリポソームもしくはＤＮＡリポソーム混合物（ＷO９３２４６４０を参照すること）のような当該技術に既知の他のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子などの形質移入促進剤、あるいは他の既知の形質移入促進剤を含むこともできる。形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオンであり、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩（ＬＧＳ）が含まれ、または脂質である。ワクチン中の形質移入促進剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０２９８】
組成物は、遺伝子促進剤を更に含むことができる。
【０２９９】
組成物は、ＤＮＡを、約１ナノグラムから１００ミリグラム、約１マイクログラムから約１０ミリグラム、好ましくは約０．１マイクログラムから約１０ミリグラム、より好ましくは約１ミリグラムから約２ミリグラムの量で含むことができる。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、約５ナノグラムから約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、約１０ナノグラムから約８００マイクログラムのＤＮＡを含有することができる。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有することができる。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有することができる。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラムから１００ミリグラム、約１マイクログラムから約１０ミリグラム、約０．１マイクログラムから約１０ミリグラム、約１ミリグラムから約２ミリグラム、約５ナノグラムから約１０００マイクログラム、約１０ナノグラムから約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有することができる。
【０３００】
組成物は、使用される投与様式に従って配合され得る。注射用薬学的組成物は、滅菌、発熱物質無含有及び微粒子無含有であり得る。等張性配合物または溶液を使用することができる。等張性添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースが含まれ得る。組成物は、血管収縮剤を含むことができる。等張性溶液にはリン酸緩衝食塩水が含まれ得る。組成物は、ゼラチン及びアルブミンを含む安定剤を更に含むことができる。安定剤は、配合物が長時間にわたって室温または周囲温度で安定であることを可能にし、ＬＧＳ、またはポリカチオンもしくはポリアニオンが含まれる。
【０３０１】
８．合成抗体の生成方法
本発明は、合成抗体を生成する方法にも関する。本方法は、下により詳細に記載される送達方法を使用して、組成物を、それを必要とする対象に投与することを含むことができる。このようにして、合成抗体は、組成物が対象に投与されたときに、対象またはインビボにおいて生成される。
【０３０２】
本方法は、組成物を１つ以上の細胞に導入することを含むこともでき、したがって合成抗体は、１つ以上の細胞において生成または産生され得る。本方法は、組成物を１つ以上の組織、例えば、限定されることなく、皮膚及び筋肉に導入することを更に含むこともでき、したがって合成抗体は、１つ以上の組織において生成または産生され得る。
【０３０３】
９．抗体の確認または選別方法
本発明は、上に記載された抗原と反応性である、または結合する、上に記載された抗体の確認または選別方法に更に関する。抗体の確認または選別方法は、抗体を確認または選別するために、当該技術に既知の方法によって抗原を使用することができる。そのような方法には、ライブラリー（例えば、ファージ提示）からの抗体の選択、ならびに動物の免疫化、続く抗体の単離及び／または精製が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０３０４】
１０．組成物の送達方法
本発明は、組成物を、それを必要とする対象に送達する方法にも関する。送達方法には、組成物を対象に投与することが含まれ得る。投与には、インビボ電気穿孔を伴う及び伴わないＤＮＡ注射、リポソーム媒介送達、ならびにナノ粒子促進送達が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０３０５】
組成物の送達を受ける哺乳動物は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、バイソン、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット及びニワトリであり得る。
【０３０６】
組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸内、径粘膜、局所、吸入、頬側投与、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内及び関節内、またはこれらの組み合わせを含む異なる経路によって投与され得る。獣医用途では、組成物は、正常な獣医診療に従って適切に許容される製剤として投与され得る。獣医は、特定の動物に最も適した投与レジメン及び投与経路を容易に決定することができる。組成物は、伝統的なシリンジ、無針注射装置、「微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｇｏｎｅ  ｇｕｎｓ）」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与され得る。
【０３０７】
ａ．電気穿孔
電気穿孔を介した組成物の投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成するのに有効なエネルギーパルスを、哺乳類の所望の組織に送達するように構成され得る電気穿孔装置の使用によって達成することができ、好ましくは、エネルギーパルスは、使用者により入力される事前設定電流に類似した定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素及び電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含むことができる。電気穿孔構成要素には、コントローラ、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、現状報告要素、通信ポート、メモリ要素、電源及び電源スイッチを含む、電気穿孔装置の様々な要素の１つ以上が含まれ得る、または組み込まれ得る。電気穿孔は、インビボ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ  ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎ電気穿孔（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）を、プラスミドによる細胞への形質移入を促進するために使用して達成され得る。
【０３０８】
電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つの要素として機能することができ、他の要素は、電気穿孔構成要素と通信する別の要素（または構成要素）である。電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つを超える要素として機能することができ、これらは、電気穿孔構成要素から離れている電気穿孔装置の他の要素と依然として通信することができる。１つの電気機械または機械装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素は、それらの要素は１つの装置として、または互いに通信する別々の要素にとして機能することができるので、限定されなくてもよい。電気穿孔構成要素は、所望の組織に定電流を生成するエネルギーパルスを送達することができ、フィードバック機構を含む。電極アセンブリには、空間的に配置された複数の電極を有する電極アレイが含まれてもよく、電極アセンブリは、電気穿孔構成要素からエネルギーパルスを受け、電極を通してエネルギーパルスを所望の組織に送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーパルスを送達する際に中性であり、所望の組織におけるインピーダンスを測定し、インピーダンスを電気穿孔構成要素に通信する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受け取ることができ、電気穿孔構成要素から送達されたエネルギーパルスを調整して、定電流を維持することが可能である。
【０３０９】
複数の電極が、エネルギーパルスを分散パターンで送達することができる。複数の電極は、電極をプログラムシーケンスで制御することによって、エネルギーパルスを分散パターンで送達することができ、プログラムシーケンスは、使用者により電気穿孔構成要素に入力される。プログラムシーケンスは、順番に送達される複数のパルスから構成されてもよく、複数のパルスのそれぞれのパルスは、少なくとも２つの作動電極により送達され、一方は、インピーダンスを測定する中性電極であり、複数のパルスの後に続くパルスは、少なくとも２つの作動電極のうちの異なる方により送達され、一方は、インピーダンスを測定する中性電極である。
【０３１０】
フィードバック機構は、ハードウエアまたはソフトウエアにより実施され得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施され得る。フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓ毎に発生するが、好ましくはリアルタイムフィードバックまたは瞬時（すなわち、応答時間を決定する利用可能な技術により決定される実質的な瞬時）である。中性電極は、所望の組織におけるインピーダンスを測定することができ、インピーダンスをフィードバック機構に通信し、フィードバック機構は、インピーダンスに応答し、エネルギーパルスを調整して、定電流を事前設定電流に類似した値に維持する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達の際に定電流を連続的及び瞬時に維持することができる。
【０３１１】
本発明の組成物の送達を促進することができる電気穿孔装置及び電気穿孔方法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．により提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されたものが含まれ、これらの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。組成物の送達に使用され得る他の電気穿孔装置及び電気穿孔方法には、２００６年１０月１７日出願の米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号及び２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号の利益を米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて主張する、２００７年１０月１７日出願の同時係属及び共有米国特許出願第１１／８７４０７２号において提供されたものが含まれ、これらは全て、全体が本明細書に組み込まれる。
【０３１２】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号は、電極システム及びそれらの、身体または植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するための使用を記載する。モジュール式電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電性連結を提供する電気コネクタ及び電源から構成され得る。操作者は、支持構造に装填されている複数の針電極を掴み、身体または植物の選択された組織の中に確実に挿入することができる。次に生体分子が、選択された組織の中に皮下針を介して送達される。プログラム定電流パルスコントローラが作動され、定電流電気パルスが複数の針電極に適用される。適用された定電流電気パルスは、生体分子が複数の電極の間の細胞の中に導入されることを促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全ての内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３１３】
Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物の選択された組織の中への生体分子の導入を有効に促進するために使用され得る電気穿孔装置を記載している。電気穿孔装置には、操作がソフトウエアまたはファームウエアにより特定されている動電装置（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ）（「ＥＫＤ装置」）が含まれる。ＥＫＤ装置は、使用者の制御及びパルスパラメータの入力に基づいて、アレイにおける電極の間に一連のプログラム定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの記憶及び取得を可能にする。電気穿孔装置は、針電極のアレイを有する交換可能なディスク、注射針の中心注入チャンネル及び取り外し可能なガイドディスクも含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全ての内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３１４】
米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されている電極アレイ及び方法を、筋肉などの組織のみならず、他の組織または臓器への深部貫入のために適合させることができる。電極アレイの配置のため、注射針（選択された生体分子を送達する）も標的臓器の中に完全に挿入され、注射は、電極により予め輪郭が描かれた区域内の標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されている電極は、好ましくは、長さが２０ｍｍ、ゲージが２１である。
【０３１５】
加えて、電気穿孔装置及びその使用を組み込むいくつかの実施形態において、以下の特許に記載されている電気穿孔装置が企図される：１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号及び２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日発行の米国特許第６，９３９，８６２号。更に、様々な装置のいずれかを使用するＤＮＡの送達に関する、２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号及びＤＮＡの注入方法を描写する、２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号に提供されている主題を網羅する特許が、本明細書において企図される。上記の特許は、その全体が参照により組み込まれる。
【０３１６】
１１．治療方法
対象に合成抗体を生成することによって、それを必要とする対象において疾患を治療、防御及び／または予防する方法も、本明細書において提供される。本方法には組成物を対象に投与することが含まれ得る。対象への組成物の投与は、上に記載された送達方法を使用して実行することができる。
【０３１７】
対象において合成抗体が生成されると、合成抗体は、抗原に結合または抗原と反応することができる。そのような結合は、抗原を中和し、別の分子による、例えば、タンパク質または核酸による抗原の認識を遮断し、抗原に対して免疫応答を誘発または誘導し、それによって、対象において抗原に関連する疾患を治療、防御及び／または予防することができる。
【０３１８】
ワクチン送達またはワクチン接種の方法が、治療または予防免疫応答を誘導するために提供され得る。ワクチン接種の方法は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を生成することができる。ワクチンは、哺乳動物の免疫系の活性を調節する及び免疫応答を増強するために、個体に送達され得る。ワクチンの送達は、核酸分子としてのコンセンサス抗原の形質移入であってもよく、細胞内に発現し、細胞表面に送達され、これを免疫系が認識し、細胞、体液性、または細胞及び体液性応答を誘導する。ワクチンの送達は、上に考察されたようにワクチンを哺乳動物に送達することによって、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導または誘発するために使用され得る。
【０３１９】
組成物の用量は、１μｇ〜１０ｍｇの活性成分／ｋｇ体重／時間であり、２０μｇ〜１０ｍｇの活性成分／ｋｇ体重／時間であり得る。組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日毎に投与され得る。有効な治療のための組成物の投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回であり得る。
【０３２０】
組成物は、抗原をコードするＤＮＡワクチンを１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上含むことができる。組成物は、ＤＮＡコード合成抗体またはそのフラグメントを１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上含むことができる。
【０３２１】
ＤＮＡワクチン及びＤＭＡｂは、同じ時点または異なる時点で投与され得る。１つの実施形態において、ＤＮＡワクチン及びＤＭＡｂは、同時に投与される。１つの実施形態において、ＤＮＡワクチンはＤＭＡｂの前に投与される。１つの実施形態において、ＤＭＡｂはＤＮＡワクチンの前に投与される。
【０３２２】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡワクチンは、ＤＭＡｂが投与された１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、または１４日以上後に投与される。ある特定の実施形態において、ＤＮＡワクチンは、ＤＭＡｂが投与された１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上、９週間以上、または１０週間以上後に投与される。ある特定の実施形態において、ＤＮＡワクチンは、ＤＭＡｂが投与された１か月以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、５か月以上、６か月以上、７か月以上、８か月以上、９か月以上、１０か月以上、１１か月以上、または１２か月以上後に投与される。
【０３２３】
ある特定の実施形態において、ＤＭＡｂは、ＤＮＡワクチンが投与された１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、または１４日以上後に投与される。ある特定の実施形態において、ＤＭＡｂは、ＤＮＡワクチンが投与された１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上、９週間以上、または１０週間以上後に投与される。ある特定の実施形態において、ＤＭＡｂは、ＤＮＡワクチンが投与された１か月以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、５か月以上、６か月以上、７か月以上、８か月以上、９か月以上、１０か月以上、１１か月以上、または１２か月以上後に投与される。
【０３２４】
ある特定の実施形態において、ＤＭＡｂ及びＤＮＡワクチンは、１回投与される。ある特定の実施形態において、ＤＭＡｂ及び／またはＤＮＡワクチンは、１回を超えて投与される。ある特定の実施形態において、ＤＭＡｂ及びＤＮＡワクチンの投与は、持続的及び全身的な免疫応答を提供する。
【０３２５】
１２．抗体と組み合わせた使用
本発明は、合成抗体と治療抗生物質剤の組み合わせを投与することによって、それを必要とする対象において疾患を治療、防御及び／または予防する方法も提供する。
【０３２６】
合成抗体及び抗生物質剤は、合成抗体と治療抗生物質剤の組み合わせが両方とも対象に存在するような任意の適切な方法の使用によって投与され得る。１つの実施形態において、本方法は、上に詳細に記載された方法のいずれかによる、本発明の合成抗体を含む第１の組成物の投与及び合成抗体の投与の１日未満、２日未満、３日未満、４日未満、５日未満、６日未満、７日未満、８日未満、９日未満、または１０日未満後に、抗生物質剤を含む第２の組成物の投与を含むことができる。１つの実施形態において、本方法は、上に詳細に記載された方法のいずれかによる、本発明の合成抗体を含む第１の組成物の投与及び合成抗体の投与の１日を超えた、２日を超えた、３日を超えた、４日を超えた、５日を超えた、６日を超えた、７日を超えた、８日を超えた、９日を超えた、または１０日を超えた後に、抗生物質剤を含む第２の組成物の投与を含むことができる。１つの実施形態において、本方法は、抗生物質剤を含む第１の組成物の投与及び抗生物質剤の投与の１日未満、２日未満、３日未満、４日未満、５日未満、６日未満、７日未満、８日未満、９日未満、または１０日未満後に、上に詳細に記載された方法のいずれかによる、本発明の合成抗体を含む第２の組成物の投与を含むことができる。１つの実施形態において、本方法は、抗生物質剤を含む第１の組成物の投与及び抗生物質剤の投与の１日を超えた、２日を超えた、３日を超えた、４日を超えた、５日を超えた、６日を超えた、７日を超えた、８日を超えた、９日を超えた、または１０日を超えた後に、上に詳細に記載された方法のいずれかによる、本発明の合成抗体を含む第２の組成物の投与を含むことができる。１つの実施形態において、本方法は、同時発生的な、上に詳細に記載された方法のいずれかによる、本発明の合成抗体を含む第１の組成物の投与及び抗生物質剤を含む第２の組成物の投与を含むことができる。１つの実施形態において、本方法は、同時発生的な、上に詳細に記載された方法のいずれかによる、本発明の合成抗体を含む第１の組成物の投与及び抗生物質剤を含む第２の組成物の投与を含むことができる。１つの実施形態において、本方法は、本発明の合成抗体及び抗生物質剤を含む単一組成物の投与を含むことができる。
【０３２７】
本発明の合成抗体と組み合わせて使用することができる抗生物質の非限定例には、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、アミカシン、トブラマイシン）、キノロン（例えば、シプロフロキサシン、レボフロキサシン）、セファロスポリン（例えば、セフタジジム、セフェピム、セフォペラゾン、セフピロム、セフトビプロール）、抗緑膿菌性ペニシリン：カルボキシペニシリン（例えば、カルベニシリン及びチカルシリン）及びウレイドペニシリン（例えば、メズロシリン、アズロシリン及びピペラシリン）、カルバペネム（例えば、メロペネム、イミペネム、ドリペネム）、ポリミキシン（例えば、ポリミキシンＢ及びコリスチン）、ならびにモノバクタム（例えば、アズトレオナム）が含まれる。
【０３２８】
本発明は、以下の非限定例によって例示されている多数の態様を有する。
【実施例】
【０３２９】
１３．実施例
本発明は、以下の実施例によって更に例示される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示のためだけに提示されていることが理解されるべきである。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更及び修正を様々な用途及び条件に適合するよう行うことができる。したがって、本明細書に示され記載されているものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の記載から当業者には明白である。そのような修正も、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０３３０】
実施例１
チクングニアウイルスに対するＤＮＡコード抗体予防法及びＤＮＡワクチン接種により誘発された急速で長期間の免疫
ワクチン接種は、免疫の生成前に誘導期を示すことが知られており、したがって、免疫応答が効果を表す前に感染する時間のすき間がある。ワクチン及び自然免疫応答の利益を、ＤＮＡ合成抗体またはｄＭａｂを使用した有効な免疫の急速な生成と共に利用する特定の新規手法が、以下に提供される。
【０３３１】
生物学的に活性な抗チクングニアウイルスエンベロープｍＡｂ（ｄＭＡｂと称する）をコードする合成プラスミドの電気穿孔媒介送達を伴う、抗体に基づいた予防法／療法を、新規受動免疫に基づいた戦略により設計し、抗ウイルス効力について、ならびに従来の能動ワクチン接種に固有の欠点を克服する能力について評価した。ＣＨＩＫＶ−ｄＭＡｂの１回の筋肉内注射は、ＣＨＩＫＶ−ＤＮＡワクチンの能動ワクチン接種より急速に抗体をインビボで産生した。このｄＭＡｂは、多様なＣＨＩＫＶ臨床分離株を中和し、マウスをウイルス負荷から防御した。両方の組み合わせは、急速であるばかりでなく長寿命の防御をもたらす。
【０３３２】
本明細書に提示されている結果は、ＤＮＡに基づいたｄＭＡｂ戦略が、新興ウイルス感染に対して急速な防御を誘導し、これをＤＮＡワクチン接種と組み合わせることができ、この新興感染症に対して特有の短期間及び長期間の両方の防御を提供することを実証している。これらの試験は、病原体治療及び制御戦略についての示唆を有する。
【０３３３】
方法
ＣＨＩＫＶ特異的ｄＭＡｂの構築及び発現
確立された抗Ｅｎｖ特異的ＣＨＩＫＶ中和ヒトｍＡｂの遺伝子配列情報を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのデータベースから得た（Ｗａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８６：３２５８−６４）。発現確認試験に使用されるヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞及びベロ細胞を、以前に記載されたように維持した（Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  ５：ｅ９２８）。ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ｄＭＡｂ調合剤の可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）鎖セグメントを、いくつかの修飾を有して合成オリゴヌクレオチドの使用によって生成し、全長免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、「ＣＶＭ１−ＩｇＧ」と称する）またはＦａｂフラグメント（「ＣＶＭ１−Ｆａｂ」と称する）のいずれかに構築した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ９：２２５３−６２）。ＣＶＭ１−ＩｇＧのクローニングでは、Ｐ２Ａ自己プロセシングペプチド配列とカップリングしたフリン切断部位により分離されている重及び軽鎖遺伝子を含有する、単一オープンリーディングフレームを組み立てた。この導入遺伝子を、ｐＶａｘ１発現ベクターにクローン化した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ９：２２５３−６２）。ＣＶＭ１−ＦａｂのＶＨ及びＶＬ鎖を別々のｐＶａｘ１ベクターにクローン化した。組織培養物の形質移入では、１００μｇのｐＶａｘ１  ＤＮＡ、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、またはＣＶＭ１−Ｆａｂ（ＶＨ及びＶＬ構築物それぞれ１００μｇ）を使用した。本試験に使用するＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖに基づいたＤＮＡワクチンを、以前に記載されたように開発及び特徴決定した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：５１２８−３４、Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  ５：ｅ９２８）。
【０３３４】
ＣＨＩＫＶ−ｄＭＡｂ  ＩｇＧの定量化及び結合アッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイを、ＣＭＶ１−ＩｇＧまたはｐＶａｘ１が投与されたマウスから二重に収集及び測定した血清により実施して、発現動態及び標的抗原結合を定量化した。これらの測定及び分析を、以前に記載されたように実施した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。
【０３３５】
ｄＭＡｂ生成ＩｇＧのウエスタンブロット及び免疫蛍光分析
ＩｇＧ発現のウエスタンブロット分析では、ＣＨＩＫＶ（ウイルス分離株ＰＣ０８）感染細胞を、感染の２日後に溶解し、以前に公開された方法により評価した（Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  ５：ｅ９２８、Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。免疫蛍光分析では、チャンバースライド（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ，Ｐｅｎｆｉｅｌｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）にベロ細胞（１×１０４）を接種し、ウイルス分離株ＣＨＩＫＶ  ＰＣ０８により感染効率１で２時間感染させた。免疫蛍光分析を以前に記載されたように実施し（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）、スライドを共焦点顕微鏡法（ＬＳＭ７１０；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）により目視評価した。得られた画像をＺｅｎソフトウエア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）の使用により半定量的に分析した。
【０３３６】
ｄＭＡｂ  ＤＮＡプラスミド投与及びインビボ分析
ＣＶＭ１−Ｆａｂ及びＣＶＭ１−ＩｇＧの発現動態及び機能性を、１００μｇの対照ｐＶａｘ１、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、または１００μｇの、ＣＶＭ１−Ｆａｂの各プラスミド鎖の筋肉内注射後のＢ６．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において評価した。ＤＮＡワクチンを含む試験では、２５μｇのＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖプラスミドを、２週間間隔で３回注射した。全ての注射の直後に、ＣＨＩＫＶ  ｄＭＡｂ  ＤＮＡプラスミドを電気穿孔により送達した（Ｆｌｉｎｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５：１２６１６、Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２、Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  ｉｏｌ  １１４３：１２３−３０）。
【０３３７】
ＣＨＩＫＶ負荷試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、ＣＭＶ−Ｆａｂ（ＶＨ及びＶＬ）、または対照ｐＶａｘ１プラスミドの単回（１００μｇ）電気穿孔増強筋肉内注射を受けた。ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチンは、上に記載されたように送達された。ＤＮＡ送達の２日または３５日後、マウスに、１０７プラーク形成単位（２５μＬ）のウイルス分離株ＣＨＩＫＶ  Ｄｅｌ−０３（ＪＮ５７８２４７）（Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃａｎ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５７：１０７３−７）を、皮下（各後足の背面）または鼻腔内のいずれかに負荷した（Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  ５：ｅ９２８）。マウスの足の腫脹（高さ×幅）を、感染後毎日、１４日間まで測定した。加えて、動物を生存、ならびに感染の徴候（すなわち、体重変化及び嗜眠）について毎日（感染後２０日間まで）モニターした。体重の３０％超を失った動物を安楽死させ、血清試料を、サイトカイン定量化及び他の免疫分析のために収集した。血液試料を感染の７〜１４日後に尾部から収集し、ウイルス血症レベルをプラークアッセイにより測定した。
【０３３８】
中和抗体の分析
ＣＶＭ１−ＩｇＧが投与されたマウスの抗ＣＨＩＫＶ中和抗体力価を、以下のＣＨＩＫＶ分離離株に感染したベロ細胞の使用により、以前に記載された方法（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：５０３０−９、Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  ５：ｅ９２８）によって決定した：ＬＲ２００６−ＯＰＹ１（インド洋大流行（Ｉｎｄｉａｎ  Ｏｃｅａｎ  Ｏｕｔｂｒｅａｋ））、ＩＮＤ−６３ＷＢ１及びＳＬ−ＣＨ１（アジアクレード（Ａｓｉａｎ−ｃｌａｄｅ））、Ｒｏｓｓ（ＥＣＳＡクレード）、ならびにＰＣ０８及びＤＲＤＥ−０６（ＥＣＳＡクレード）。中和力価は、ベロ細胞単層における細胞変性効果の１００％低減を媒介する最高希釈の逆数として計算した。データを生成し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウエアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の使用により統計分析を実施した。Ｓ字形用量応答を当てはめた非線形回帰を使用して、感染の抗体媒介５０％阻害（ＩＣ５０）レベルを決定した。ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ偽型産生及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を、以前に記載されたように実施した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ８４２３４）。
【０３３９】
サイトカイン定量化分析
血清を、ＣＶＭ１−Ｆａｂ、ＣＶＭ１−ＩｇＧ及びＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ注射マウスから、ならびにＣＨＩＫＶ負荷マウス（負荷の１週間後）から収集した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６の血清サイトカインレベルは、ＥＬＩＳＡキットを製造会社の使用説明書（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って使用することにより測定した。
【０３４０】
統計分析
スチューデントｔ検定またはノンパラメトリックスピアマン相関係数検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア（Ｐｒｉｓｍ  Ｉｎｃ．）の使用によって実施した。対照と実験群の変数の相関関係を、スピアマンの順位相関係数検定の使用によって統計的に評価し、全ての試験において、ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【０３４１】
結果
抗ＣＨＩＫＶ  ｄＭＡｂの設計及び発現の確認
ＣＨＩＫＶによる宿主細胞へのウイルス侵入は、Ｅｎｖにより媒介され、それに対して大部分の中和抗体が生成される（Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  ５：ｅ９２８、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００４３５）。したがって、Ｅ１とＥ２の両方のＥｎｖタンパク質を認識する中和抗ＣＨＩＫＶ  ｍＡｂの軽及び重免疫グロブリン鎖を発現する、ＤＮＡプラスミド（ｄＭＡｂ）を設計した（Ｗａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８６：３２５８−６４、Ｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９：ｅ１００３３１２）。全長抗ＣＨＩＫＶ  ｄＭＡｂのＶＬ及びＶＨ免疫グロブリン鎖のコード配列に相補的なＤＮＡを発現増加のために最適化し、以前に記載された方法（Ｆｌｉｎｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５：１２６１６、Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ９：２２５３−６２）を使用して、ｐＶａｘ１ベクターにクローン化した。抗ＣＨＩＫＶ−Ｆａｂを発現する構築物には、ＶＨ及びＶＬ遺伝子を別々にクローン化した。抗Ｅｎｖ特異的ＣＨＩＫＶ中和ｍＡｂから構築された最適化合成プラスミドを、ＩｇＧ及びＦａｂ抗体では、それぞれＣＶＭ１−ＩｇＧまたはＣＶＭ１−Ｆａｂと称した。ヒト２９３Ｔ細胞に、ＣＶＭ１−ＩｇＧプラスミドまたはＣＶＭ１−Ｆａｂ（ＶＬ、ＶＨ、もしくは組み合わせ）プラスミドのいずれかを形質移入して、インビトロ発現を確証した。図１Ａ及び１Ｂに示されているように、抗ＣＨＩＫＶ抗体レベルは、結合抗原として使用した組み換えＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖを用いて、ＥＬＩＳＡにより測定した。これらのデータは、ＣＶＭ１−Ｆａｂ及びＣＶＭ１−ＩｇＧが筋肉内に抗体を発現し、インビトロにおいて正確に組み立てられ、生物学的に機能していると思われることを示している。
【０３４２】
ＣＶＭ１−ＩｇＧ及びＣＶＭ１−Ｆａｂのインビボ発現及び定量化
インビトロ発現を確認した後、ＣＶＭ１−ＦａｂまたはＣＶＭ１−ＩｇＧが抗ＣＨＩＫＶ抗体をインビボで産生する能力を測定した。５〜６週齢のＢ６．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｊマウスに、１００μｇのＣＶＭ１−ＩｇＧ（ＣＶＭ１−ＩｇＧは１つのプラスミドである）、それぞれ１００μｇのＣＶＭ１  ＶＨ及びＶＬ（ＣＶＭ１−Ｆａｂは２つのプラスミドからなる）、または対照ベクターを単回筋肉内の電気穿孔媒介注射により投与した。血清を、指定された時点で収集し、標的抗原結合を、ＥＬＩＳＡを使用してＩｇＧ定量化によって測定した。ＣＶＭ１−Ｆａｂから生成されたｍＡｂは、ＣＶＭ１−ＩｇＧのものより急速に（すなわち、注射後３日以内に）現れたが、両方の構築物は、１５日目までには類似したｍＡｂレベルを生成した（平均血清レベル［±標準偏差］、ＣＶＭ１−Ｆａｂでは１５８７．２３±７３．２３ｎｇ／ｍＬ、ＣＶＭ１−ＩｇＧでは１３４１．２９±８２．０７ｎｇ／ｍＬ、図１Ｃ）。マウスに、ＣＶＭ１−ＩｇＧまたはＣＶＭ１−Ｆａｂのいずれかを投与し、血清抗体レベルを結合ＥＬＩＳＡにより評価した。ＣＶＭ１−ＩｇＧとＣＶＭ１−Ｆａｂの両方を注射した１５日後に収集された血清は、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖタンパク質に結合したが、無関係の対照抗原であるヒト免疫不全ウイルス１型Ｅｖｎには結合しなかった（図１Ｄ）。これらのデータは、ＣＶＭ１−ＩｇＧまたはＣＶＭ１−Ｆａｂ構築物からインビボ産生された抗ＣＨＩＫＶ抗体が、従来のように産生された抗原特異的抗体に類似した生物学的特徴を有することを示している。
【０３４３】
ＣＶＭ１−ＩｇＧ注射マウスからの血清におけるインビボ特異性及び広範囲な中和活性
抗ＣＨＩＫＶ  ｄＭＡｂ生成ｍＡｂを、結合特異性及び抗ＣＨＩＫＶ中和活性について試験した。ＣＶＭ１−ＩｇＧを注射したマウスからの血清を、固定したＣＨＩＫＶ  ＰＣ０８感染ベロ細胞に対して、免疫蛍光アッセイにより試験した。結果は、ＣＨＩＫＶ感染細胞への血清抗体の結合を示した（図２Ａ）。標的タンパク質へのＣＶＭ１−ＩｇＧ注射マウスの血清の結合を確認するため、ウエスタンブロット分析により検査した。ＣＨＩＫＶ感染細胞からの総細胞溶解産物におけるＣＨＩＫＶ  Ｅ２タンパク質（５０ｋＤａ）発現の検出は、ＣＶＭ１−ＩｇＧ発現の特異性を示している（図２Ｂ）。インビボ産生ＣＶＭ１−ＩｇＧ抗体の特異性は、緑色蛍光タンパク質コードＣＨＩＫＶに感染した細胞に対するＦＡＣＳ分析によって更に実証された（図２Ｃ）。更に、免疫組織化学分析及びＦＡＣＳ分析により実証されたＣＶＭ１−Ｆａｂ結合は、生成された全長ＣＶＭ１−ＩｇＧのものに類似していた（データ示されず）。まとめると、これらの知見は、ＣＶＭ１−ＩｇＧプラスミドから生成された抗体の強い特異性を示している。
【０３４４】
更に、ＣＶＭ１−ＩｇＧを受けたマウスからの血清中の抗ＣＨＩＫＶ中和活性を、６つの多様なＣＨＩＫＶ株において測定した：ＬＲ２００６−ＯＰＹ１（インド洋大流行）、ＩＮＤ−６３ＷＢ１（アジアクレード）、Ｒｏｓｓ（ＥＣＳＡクレード）、ＰＣ０８（ＥＣＳＡクレード）、ＳＬ−ＣＨ１（アジアクレード）及びＤＲＤＥ−０６（ＥＣＳＡクレード）（Ｓｚｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ７９：１３３−６）。ＩＣ５０値をそれぞれのウイルス分離株において決定した。ＣＶＭ１−ＩｇＧ注射マウスからの血清は、６つのＣＨＩＫＶ株を全て有効に中和し、単回注射がマウスにおいてヒト抗ＣＨＩＫＶ  ＩｇＧのレベルの有意な中和を生じ得ることを実証している（図２Ｄ）。類似した結果が、ＣＶＭ１−Ｆａｂ注射マウスからの血清を使用して観察された（データ示されず）。これらのデータは、ＣＶＭ１−ＩｇＧ構築物によりインビボで産生された抗体が、関連する生物学的活性（すなわち、ＣＨＩＫＶに対する結合及び中和活性）を有することを示している。
【０３４５】
ＣＶＭ１−ＩｇＧ注射は致死的なＣＨＩＫＶ負荷からマウスを防御する
以前の研究は、ウイルスに対する初期免疫が感染を制御する主要な要因であることを実証した（Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １２：７６５−７１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：１２９−３４、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  Ｖｉｒｕｓ  １８：８６−９５）。ＣＶＭ１−ＩｇＧまたはＣＶＭ１−Ｆａｂから生成された抗体がＣＨＩＫＶへの初期曝露に対して防御を提供するかを決定するため、１０頭のマウス群が、ｐＶａｘ１、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、またはＣＶＭ１−Ｆａｂの単回投与を０日目に受けた。続いて各群には、２日目にウイルスを皮下負荷して、自然ＣＨＩＫＶ感染を模倣した（図３Ａ）。続いて動物の生存率及び体重変化を２０日間にわたって記録した。ｐＶａｘ１対照プラスミドを注射したマウスは、全て、ウイルスを負荷した１週間以内に死亡した。逆に、ｐＶａｘ１プラスミドを受けたマウスの０％の生存率と比較して、ＣＶＭ１−ＩｇＧまたはＣＶＭ１−Ｆａｂのいずれかを投与したマウスにおいて、１００％の生存率が観察され（Ｐ＝．００３３）、ＣＶＭ１−ＩｇＧ及びＣＶＭ１−Ｆａｂプラスミドが、送達後の２日間以内に防御免疫を付与したことを実証している。
【０３４６】
免疫防御の寿命を次に評価した。マウス（ｎ＝１０）の第２の群に、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、ＣＶＭ１−Ｆａｂ、またはｐＶａｘ１の０日目の単回注射の３０日後に、ＣＨＩＫＶを負荷した（図３Ｂ）。マウスを、次の２０日間にわたって生存についてモニターした。ＣＶＭ１−ＦａｂまたはＣＶＭ１−ＩｇＧを注射したマウスは、ｐＶａｘ１注射マウスの生存なしと比較して、それぞれ７０％及び９０％の生存率を示し（Ｐ＝．０１２０）、ＣＶＭ１−ＩｇＧが、より永続性のある免疫防御を提供することを示した（図３Ｂ）。
【０３４７】
粘膜面における感染に対して防御するＣＶＭ１−ＩｇＧプラスミドの能力を評価するため、感染の６〜１０日以内の四肢筋力低下、足蹠腫脹、嗜眠及び高い死亡率などの目に見えるＣＨＩＫＶ病理発生を生じることが以前に実証されている皮下対鼻腔内ウイルス負荷に対する、ＣＶＭ１−ＩｇＧの防御効力を評価した（Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  ５：ｅ９２８、Ｃｏｕｄｅｒｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ４：ｅ２９）。簡略化のため、試験をＣＶＭ１−ＩｇＧ構築物に集中した。２０頭のマウス群がｐＶａｘ１またはＣＶＭ１−ＩｇＧの単回投与を受け、半分（すなわち、１０頭）には、注射の２日後に皮下または鼻腔内経路を介してＣＨＩＫＶが負荷された。ＣＶＭ１−ＩｇＧで防御されたマウスは、ｐＶａｘ１注射マウスと比較して、それが皮下ウイルス負荷（Ｐ＝．００２４、図３Ｃ）及び鼻腔内ウイルス負荷（Ｐ＝．００７３、図３Ｄ）の両方から防御し、全身感染及び粘膜感染に対して防御できることを実証した。
【０３４８】
ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ発現ＤＮＡワクチン（ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ）と比較したＣＶＭ１−ＩｇＧ投与の防御効力を比較する効力研究を、次に実施した。新規コンセンサスに基づいたＤＮＡワクチンが、本発明者の研究所において開発され、マウスにおけるＣＨＩＫＶ負荷に対して、防御を提供することができた。またＤＮＡワクチンは、カニクイザルにおいて適度な細胞免疫応答と、強力な中和抗体応答の両方を誘導した［１１，１２］。マウス群に、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ、またはｐＶａｘ１の単回注射を投与し、続いて、注射の２日後にウイルスを負荷した。ＣＨＩＫＶ  ＥｎｖまたはｐＶａｘ１の単回免疫化を受けたマウスは、ウイルス負荷の６日以内に死亡し、一方、ＣＶＭ１−ＩｇＧの単回免疫化は、１００％の防御を提供した（図４Ａ）。ＣＶＭ１−ＩｇＧは、明らかに、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチンより急速に防御免疫を付与した（Ｐ＝．００２６）。
【０３４９】
ＣＨＩＫＶ−ＩｇＧ投与及びＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチン接種により付与されたインビボ防御免疫の比較
次に、長期ＣＨＩＫＶ負荷防御試験を、０日目にＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチンをワクチン接種した後またはＣＶＭ１−ＩｇＧを投与した後の３５日目に実施した。ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチンの多重追加免疫送達は、１００％の防御を付与し（図４Ｂ）、一方、８０％の生存率が、ＣＶＭ１−ＩｇＧを投与したマウスにおいて観察された（Ｐ＝．０００７）。誘導された抗体応答の動態は、ＣＶＭ１−ＩｇＧの単回注射の２日以内に測定可能であり、１５日目にはピークレベルであり（およそ、１４００ｎｇ／ｍＬ）、検出可能なｍＡｂレベルは、注射後少なくとも４５日間にわたって維持された（図６Ａ）。発現は続いているが、これらのレベルは、ピークレベルと比較すると減少しており、実験において注目された部分的な防御を支持している（図４Ｂ）。
【０３５０】
ＣＶＭ１−ＩｇＧとＣＨＩＫＶ−Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチンの共送達（ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ）は全身体液性免疫、細胞媒介免疫及びインビボにおける防御を提供する
抗体送達とワクチン接種手法との組み合わせにおける１つの潜在的な問題は、抗体が多くの伝統的なワクチンを中和する可能性があり（Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  ５：ｅ９２８、Ｆｌｉｎｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５：１２６１６、Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２、Ｌａｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３：ｅ２５１７）、したがって不適合なプラットフォームであることである。ＣＨＩＫＶ負荷の文脈において、マウスの生存率に対するＣＶＭ１−ＩｇＧとＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖの共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の効果も評価した。この実験において、２０頭のマウスに、ＣＶＭ１−ＩｇＧの単回用量及びＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡの３用量を０日目に上に記載されたように投与した。続いて、動物の半分にはＣＨＩＫＶを２日目に、他の半分には３５日目に負荷した。これらの群の生存を時間の関数として追跡した。予想外なことではなく、両方の負荷群は、１００％の長期生存を有した（図４Ｃ）。特に、２日目のＣＨＩＫＶ負荷実験の結果は、感染に対して防御を媒介するＣＶＭ１−ＩｇＧ試薬の有用性を示し、生存率は、対照（ｐＶａｘ１）動物において、負荷の４日後までにおよそ３０％減少している。図４Ｄは、ＣＶＭ１−ＩｇＧ及びＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチンを受けたマウスに生成された抗ＣＨＩＫＶ  ＩｇＧの経時的なレベルを示し、抗ＣＨＩＫＶヒトＩｇＧは、ＣＶＭ１−ＩｇＧプラスミドにより生成された抗体を表し、抗ＣＨＩＫＶマウスＩｇＧは、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖワクチンにより誘導された抗体を表す。ヒトＩｇＧとマウスＩｇＧの両方が検出され、異なる発現動態を示した。初期ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチン接種の３日後までには、マウスの抗Ｅｎｖ抗体レベルは、本質的に０に近づいた（マウス抗ＣＨＩＫＶ  ＩｇＧ）。逆に、単回ＣＶＭ１−ＩｇＧ注射の３日後には、ヒト抗Ｅｎｖ抗体レベルは顕著であった（ヒト抗ＣＨＩＫＶ  ＩｇＧ）。これらのデータは、ＣＨＩＫＶ負荷の感染及び死亡に対して急速な防御を媒介する、ＣＶＭ１−ＩｇＧの重要性を強調している。
【０３５１】
更に、ＣＶＭ１−ＩｇＧ、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ、またはＣＶＭ１−ＩｇＧ＋ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖが注射された動物において誘導されたＴ細胞応答を、ＩＦＮ−γレベルを測定する定量的酵素連結免疫スポットアッセイ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ａｓｓａｙ）により評価した（図６Ｂ）。ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖは、ＣＶＭ１−ＩｇＧとの共送達にかかわりなく、強いＴ細胞応答を誘発し、これらの手法には干渉がないことを示している。逆に、ＣＶＭ１−ＩｇＧのみが投与された動物は、予想されたように、Ｔ細胞応答を発生しなかった。これらの知見は、ＣＶＭ１−ＩｇＧとＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチンの両方を、相互干渉を起こすことなく同時に投与することができ、全身体液性及び細胞免疫を介した即時及び長続きする防御を提供することを実証している。
【０３５２】
ＣＶＭ１−ＩｇＧ投与はＣＨＩＫＶウイルス量及び炎症促進性サイトカインレベルを低減する
以前の研究は、ウイルス量及び炎症促進性サイトカインレベルを含むＣＨＩＫＶ関連疾患の重篤度と相関関係にある分子を確認した（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ４２６１、Ｃｈａａｉｔａｎｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４：２６５−７１）。したがって、これらの疾患関連マーカーをウイルス負荷の初期及び後期の時点で抑制する、ＣＶＭ１−ＩｇＧの能力を評価した。ＣＶＭ１−ＩｇＧ、ＣＶＭ１−Ｆａｂ、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ、またはＣＶＭ１−ＩｇＧ＋ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチンにより免疫化されたマウスは、ｍＡｂを生成し、ウイルス量を著しく低減した（図５Ａ）。ウイルス量の低減に加えて、これらのマウスは、対照（ｐＶａｘ１）免疫化マウスと比較して足蹠腫脹を示さず、２０日間の実験期間にわたって一貫して体重を増加した（図５Ｂ及び５Ｃ）。また、ＣＶＭ１−ＩｇＧ生成ｍＡｂ及びＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチンは、ウイルス負荷の１０日後に、ｐＶａｘ１と比較して、ＣＨＩＫＶ媒介炎症促進性サイトカイン（すなわち、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−β）の著しくに低減したレベルを示した（図７）。これらの知見は、ＣＶＭ１−ＩｇＧの単回注射が、ＣＨＩＫＶ関連病理を防御ワクチン接種により誘導されるものに匹敵する程度に抑制することを示唆している（Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  ５：ｅ９２８）。
【０３５３】
生物学的機能性ｍＡｂのインビボ急速産生のための最適化ＤＮＡプラスミドの電気穿孔媒介送達
結果は、ＣＶＭ１  ＩｇＧの単回用量を注射したマウスが、投与の２日後にウイルス負荷から完全に防御されたこと、一方、ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖ  ＤＮＡワクチンの単回ワクチン接種後では、おそらく防御免疫を備えるのに十分な時間がないために、感染から生き残ったマウスがいなかったことを実証している。しかし、免疫化レジメンに続く後の時点での負荷では、完全な防御がＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖによって観察された。類似した防御レベルが、ＣＶＭ１−ＩｇＧの単回用量を投与したマウスにおいて発生したが、防御は、経時的に８０％に衰えた。注目すべきことに、ＣＶＭ１−ＩｇＧとＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖの共送達は、急速で持続的な体液性及び細胞免疫を生じ、組み合わせ手法が相乗的で有益な効果を提供することを実証した。重要なことに、ＣＶＭ１−ＩｇＧとＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖの共送達は、短期間または長期間の防御免疫応答の発生に関して拮抗的ではなかった。
【０３５４】
実施例２−ジカウイルスに対するＤＮＡコード抗体予防法及びＤＮＡワクチン接種により誘発された急速で長期間の免疫
ワクチン接種は、免疫の生成前に誘導期を示すことが知られており、したがって、免疫応答が効果を表す前に感染する時間のすき間がある。ワクチン及び自然免疫応答の利益を、ＤＮＡ合成抗体またはｄＭＡｂを使用した有効な免疫の急速な生成と共に利用する特定の新規手法が、以下に提供される。
【０３５５】
生物学的に活性な抗ジカウイルスエンベロープｍＡｂ（ｄＭＡｂと称する）をコードする合成プラスミドの電気穿孔媒介送達を伴う、抗体に基づいた予防法／療法が、新規受動免疫に基づいた戦略により設計され、抗ウイルス効力について、ならびに従来の能動ワクチン接種に固有の欠点を克服する能力について評価される。ＺＩＫＶ−ｄＭＡｂの１回の筋肉内注射は、ＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンの能動ワクチン接種より急速に抗体をインビボで産生する。このｄＭＡｂは、多様なＺＩＫＶ臨床分離株を中和し、マウスをウイルス負荷から防御した。両方の組み合わせは、急速であるばかりでなく長寿命の防御をもたらす。
【０３５６】
ＤＮＡに基づいたｄＭＡｂ戦略は、新興ウイルス感染に対して急速な防御を誘導し、これをＤＮＡワクチン接種と組み合わせることができ、この新興感染症に対して特有の短期間及び長期間の両方の防御を提供する。これらの試験は、病原体治療及び制御戦略についての示唆を有する。
【０３５７】
ｄＭＡｂ  ＩｇＧの定量化及び結合アッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイを、ＺＩＫＶ−ｄＭＡｂが投与された対象からの血清により実施して、発現動態及び標的抗原結合を定量化する。
【０３５８】
ｄＭＡｂ生成ＩｇＧの分析
ＺＩＫＶ感染細胞のＩｇＧ発現をウエスタンブロットにより分析する。免疫蛍光分析では、ＺＩＫＶ感染細胞を共焦点顕微鏡法により目視評価し、定量的または半定量的に分析する。
【０３５９】
ｄＭＡｂ  ＤＮＡプラスミド投与及びインビボ分析
発現動態及び機能性を、対照またはＺＩＫＶ−ｄＭＡｂを注射した後の対象において評価した。ＤＮＡワクチンを含む研究では、ＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンプラスミドが投与される。
【０３６０】
負荷試験
対象は、ＺＩＫＶ−ｄＭＡｂまたは対照プラスミドの電気穿孔増強注射を受ける。ＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンは、上に記載されたように送達された。ＤＮＡが送達された後、対象には、ＺＩＫＶを負荷する。動物を生存及び感染の徴候についてモニターする。血清試料を、サイトカイン定量化及び他の免疫分析のために収集する。血液試料を感染後に収集し、ウイルス血症レベルを測定する。
【０３６１】
中和抗体の分析
ＺＩＫＶ−ｄＭＡｂが投与された対象の抗ＺＩＫＶ中和抗体力価を決定する。中和力価は、細胞における細胞変性効果の１００％低減を媒介する最高希釈の逆数として計算され得る。
【０３６２】
サイトカイン定量化分析
血清が、ＺＩＫＶ−ｄＭＡｂ及びＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチン注射対象から、ならびにＺＩＫＶ負荷対象から収集される。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６血清サイトカインレベルが測定される。
【０３６３】
抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂの設計及び発現の確認
抗ＺＩＫＶ中和ｍＡｂから構築された最適化合成プラスミドを、ＩｇＧ及びＦａｂ抗体のために設計した。細胞に、ＺＩＫＶ−ＩｇＧプラスミドまたはＺＩＫＶ−Ｆａｂ（ＶＬ、ＶＨ、もしくは組み合わせ）プラスミドのいずれかを形質移入して、インビトロ発現を確証する。ＺＩＫＶ−Ｆａｂ及びＺＩＫＶ−ＩｇＧは筋肉内に抗体を発現し、インビトロにおいて正確に組み立てられ、生物学的に機能していると思われた。
【０３６４】
抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂのインビボ発現及び定量化
インビトロ発現を確認した後、ＺＩＫＶ−ＦａｂまたはＺＩＫＶ−ＩｇＧが抗ＺＩＫＶ抗体をインビボで産生する能力を測定する。構築物は両方ともｍＡｂを生成する。対象に、ＺＩＫＶ−ＩｇＧまたはＺＩＫＶ−Ｆａｂのいずれかを投与し、血清抗体レベルを結合ＥＬＩＳＡにより評価する。ＺＩＫＶ−ＩｇＧ及びＺＩＫＶ−Ｆａｂの両方が注射された後に収集した血清は、ＺＩＫＶタンパク質に結合するが、無関係の対照抗原には結合しない。これらのデータは、ＺＩＫＶ−ＩｇＧまたはＺＩＫＶ−Ｆａｂ構築物からインビボ産生された抗ＺＩＫＶ抗体が、従来のように産生された抗原特異的抗体に類似した生物学的特徴を有することを示している。
【０３６５】
抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ注射対象からの血清におけるインビボ特異性及び広範囲な中和活性
抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ生成ｍＡｂが結合特異性及び抗ＺＩＫＶ中和活性について試験される。血清抗体はＺＩＫＶ感染細胞に結合する。抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂプラスミドから生成された抗体には強い特異性がある。
【０３６６】
更に、抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂを受けた対象の血清における抗ＺＩＫＶ中和活性を、ＺＩＫＶ株に対して測定する。抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ注射対象の血清は、ＺＩＫＶ分離株を有効に中和し、単回注射がヒト抗ＺＩＫＶ  ＩｇＧの顕著な中和レベルを生じ得ることを実証している。このように、抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ構築物によりインビボで産生された抗体は、関連する生物学的活性（すなわち、ＺＩＫＶに対する結合及び中和活性）を有する。
【０３６７】
抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ注射は致死的なＺＩＫＶ負荷からマウスを防御する
抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂから生成された抗体がＺＩＫＶへの初期曝露に対して防御を提供するかを決定するため、１０頭の対象群が、対照または抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂを０日目に受ける。続いて各群には、ウイルスを皮下負荷して、自然ＺＩＫＶ感染を模倣する。続いて対象の生存及び体重変化を記録する。抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂプラスミドは、防御免疫を付与する。
【０３６８】
免疫防御の寿命を次に評価する。第２群の対象には、０日目に抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂまたは対照プラスミドを注射した後、ＺＩＫＶが負荷される。対象を生存についてモニターする。抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂは、より永続性のある免疫防御を提供する。
【０３６９】
抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂは、対照注射対象と比較して、皮下ウイルス負荷及び鼻腔内ウイルス負荷の両方から対象を防御し、抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂが全身感染及び粘膜感染を防御し得ることを実証している。
【０３７０】
ＺＩＫＶ  ＤＮＡワクチン（ＺＩＫＶ−ＤＮＡ）と比較した抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ投与の防御効力を比較する効力試験を、次に実施する。新規コンセンサスに基づいたＤＮＡワクチンが、本発明者の研究所において開発され、ＺＩＫＶ負荷に対して防御を提供することができる。またＤＮＡワクチンは、測定可能な細胞免疫応答と、強力な中和抗体応答の両方を誘導した。対象群に、抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ、ＺＩＫＶ−ＤＮＡ、またはｐＶａｘ１の単回注射を投与し、続いてウイルスを負荷する。抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂは、ＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンより急速に防御免疫を付与する。
【０３７１】
抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ投与及びＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチン接種により付与されるインビボ防御免疫の比較
次に、長期ＺＩＫＶ負荷防御試験を、０日目にＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンをワクチン接種した後または抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂを投与した後に実施した。ＺＩＫＶ−ＤＮＡは、抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂより長い防御免疫を付与する。
【０３７２】
抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ及びＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンの共送達は全身体液性免疫、細胞媒介免疫及びインビボ防御を生じる
抗体送達をワクチン接種手法と組み合わせる１つの潜在的な問題は、抗体が多くの伝統的なワクチンを中和する可能性があり、したがって不適合なプラットフォームであることである。ＺＩＫＶ負荷の文脈において、対象の生存に対する抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂとＺＩＫＶ−ＤＮＡの共投与の効果を評価する。対象には、抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ及びＺＩＫＶ−ＤＮＡが０日目に投与される。続いて、一部の動物にはＺＩＫＶが２日目に、他には３５日目に負荷される。これらの群の生存を時間の関数として追跡する。抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂは感染に対する防御を媒介し、生存率は、対照（ｐＶａｘ１）動物では負荷の４日後におよそ３０％減少している。抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ及びＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンにより誘導されたＩｇＧは、両方とも検出される。抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂは、ＺＩＫＶ負荷による感染及び死亡に対して急速な防御を媒介する。
【０３７３】
更に、抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ、ＺＩＫＶ−ＤＮＡ、または抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂ＋ＺＩＫＶ−ＤＮＡが注射された対象に誘導されたＴ細胞応答を評価する。ＺＩＫＶ−ＤＮＡは、抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂとの共送達にかかわりなく、強いＴ細胞応答を誘発し、これらの手法には干渉がないことを示している。逆に、抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂのみが投与された動物は、Ｔ細胞応答を発生していない。抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂとＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンの両方を、相互干渉を起こすことなく同時に投与することができ、全身体液性及び細胞免疫を介した即時及び長続きする防御が提供される（図８）。
【０３７４】
生物学的機能性ｍＡｂのインビボ急速産生のための最適化ＤＮＡプラスミドの電気穿孔媒介送達
抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂが投与された対象は、投与の直ぐ後のウイルス負荷から完全に防御され、一方、ＺＩＫＶ−ＤＮＡワクチンの単回免疫化の後では、おそらく防御免疫を備えるのに十分な時間がないために、対象は感染から生き残っていない。しかし、免疫化レジメンに続く後の時点での負荷では、ＺＩＫＶ−ＤＮＡは完全な防御を提供している。類似した防御レベルが、抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂの単回用量を投与した対象において発生したが、防御は、経時的に衰えた。注目すべきことに、抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂとＺＩＫＶ−ＤＮＡの共送達は、急速で持続的な体液性及び細胞免疫を生じ、組み合わせ手法が相加的または相乗的な効果を有し得ることを示唆している。重要なことに、抗ＺＩＫＶ  ｄＭＡｂとＺＩＫＶ−ＤＮＡの共送達は、短期間または長期間の防御免疫応答の発生に関して拮抗的ではない。
【０３７５】
実施例３−エボラウイルスに対するＤＮＡコード抗体予防法及びＤＮＡワクチン接種により誘発された急速で長期間の免疫
ワクチン接種は、免疫の生成前に誘導期を示すことが知られており、したがって、免疫応答が効果を表す前に感染する時間のすき間がある。ワクチン及び自然免疫応答の利益を、ＤＮＡ合成抗体またはｄＭａｂを使用した有効な免疫の急速な生成と共に利用する特定の新規手法が、以下に提供される。
【０３７６】
生物学的に活性な抗エボラウイルスエンベロープｍＡｂ（ｄＭＡｂと称する）をコードする合成プラスミドの電気穿孔媒介送達を伴う、抗体に基づいた予防法／療法が、新規受動免疫に基づいた戦略により設計され、抗ウイルス効力について、ならびに従来の能動ワクチン接種に固有の欠点を克服する能力について評価される。ＥＢＯＶ−ｄＭＡｂの１回の筋肉内注射は、ＥＢＯＶ−ＤＮＡワクチンの能動ワクチン接種より急速に抗体をインビボで産生する。このｄＭＡｂは、多様なＥＢＯＶ臨床分離株を中和し、マウスをウイルス負荷から防御した。両方の組み合わせは、急速であるばかりでなく長寿命の防御をもたらす。
【０３７７】
ＤＮＡに基づいたｄＭＡｂ戦略は、新興ウイルス感染に対して急速な防御を誘導し、これをＤＮＡワクチン接種と組み合わせることができ、この新興感染症に対して特有の短期間及び長期間の両方の防御を提供する。これらの試験は、病原体治療及び制御戦略についての示唆を有する。
【０３７８】
ｄＭＡｂ  ＩｇＧの定量化及び結合アッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイを、ＥＢＯＶ−ｄＭＡｂが投与された対象からの血清により実施して、発現動態及び標的抗原結合を定量化する。
【０３７９】
ｄＭＡｂ生成ＩｇＧの分析
ＥＢＯＶ感染細胞のＩｇＧ発現をウエスタンブロットにより分析する。免疫蛍光分析では、ＥＢＯＶ感染細胞を共焦点顕微鏡法により目視評価し、定量的または半定量的に分析する。
【０３８０】
ｄＭＡｂ  ＤＮＡプラスミド投与及びインビボ分析
発現動態及び機能性を、対照またはＥＢＯＶ−ｄＭＡｂを注射した後の対象において評価した。ＤＮＡワクチンを含む研究では、ＥＢＯＶ−ＤＮＡワクチンプラスミドが投与される。
【０３８１】
負荷試験
対象は、ＥＢＯＶ−ｄＭＡｂまたは対照プラスミドの電気穿孔増強注射を受ける。ＥＢＯＶ−ＤＮＡワクチンは、上に記載されたように送達された。ＤＮＡが送達された後、対象には、ＥＢＯＶを負荷する。動物を生存及び感染の徴候についてモニターする。血清試料を、サイトカイン定量化及び他の免疫分析のために収集する。血液試料を感染後に収集し、ウイルス血症レベルを測定する。
【０３８２】
中和抗体の分析
ＥＢＯＶ−ｄＭＡｂが投与された対象の抗ＥＢＯＶ中和抗体力価を決定する。中和力価は、細胞における細胞変性効果の最高希釈媒介１００％低減の逆数として計算され得る。
【０３８３】
サイトカイン定量化分析
血清は、ＥＢＯＶ−ｄＭＡｂ及びＥＢＯＶ−ＤＮＡワクチン注射対象から、ならびにＥＢＯＶ負荷対象から収集される。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６血清サイトカインレベルが測定される。
【０３８４】
抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂの設計及び発現の確認
抗ＥＢＯＶ中和ｍＡｂから構築された最適化合成プラスミドを、ＩｇＧ及びＦａｂ抗体のために設計した。細胞に、ＥＢＯＶ−ＩｇＧプラスミドまたはＥＢＯＶ−Ｆａｂ（ＶＬ、ＶＨ、もしくは組み合わせ）プラスミドのいずれかを形質移入して、インビトロ発現を確証する。ＥＢＯＶ−Ｆａｂ及びＥＢＯＶ−ＩｇＧは筋肉内に抗体を発現し、インビトロにおいて正確に組み立てられ、生物学的に機能していると思われた。
【０３８５】
抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂのインビボ発現及び定量化
インビトロ発現を確認した後、ＥＢＯＶ−ＦａｂまたはＥＢＯＶ−ＩｇＧが抗ＥＢＯＶ抗体をインビボで産生する能力を測定する。構築物は両方ともｍＡｂを生成する。対象に、ＥＢＯＶ−ＩｇＧまたはＥＢＯＶ−Ｆａｂのいずれかを投与し、血清抗体レベルを結合ＥＬＩＳＡにより評価する。ＥＢＯＶ−ＩｇＧ及びＥＢＯＶ−Ｆａｂの両方が注射された後に収集した血清は、ＥＢＯＶタンパク質に結合するが、無関係の対照抗原には結合しない。これらのデータは、ＥＢＯＶ−ＩｇＧまたはＥＢＯＶ−Ｆａｂ構築物からインビボ産生された抗ＥＢＯＶ抗体が、従来のように産生された抗原特異的抗体に類似した生物学的特徴を有することを示している。
【０３８６】
抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂ注射対象からの血清におけるインビボ特異性及び広範囲な中和活性
抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂ生成ｍＡｂが結合特異性及び抗ＥＢＯＶ中和活性について試験される。血清抗体はＥＢＯＶ感染細胞に結合する。抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂプラスミドから生成された抗体には強い特異性がある。
【０３８７】
更に、抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂを受けた対象の血清における抗ＥＢＯＶ中和活性を、ＥＢＯＶ株に対して測定する。抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂ注射対象の血清は、ＥＢＯＶ分離株を有効に中和し、単回注射がヒト抗ＥＢＯＶ  ＩｇＧの顕著な中和レベルを生じ得ることを実証している。このように、抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂ構築物によりインビボで産生された抗体は、関連する生物学的活性（すなわち、ＥＢＯＶに対する結合及び中和活性）を有する。
【０３８８】
抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂ注射は致死的なＥＢＯＶ負荷からマウスを防御する
抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂから生成された抗体がＥＢＯＶへの初期曝露に対して防御を提供するかを決定するため、１０頭の対象群が、対照または抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂを０日目に受ける。続いて各群には、ウイルスを皮下負荷して、自然ＥＢＯＶ感染を模倣する。続いて対象の生存及び体重変化を記録する。抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂプラスミドは、防御免疫を付与する。
【０３８９】
免疫防御の寿命を次に評価する。第２群の対象には、０日目に抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂまたは対照プラスミドを注射した後、ＥＢＯＶが負荷される。対象を生存についてモニターする。抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂは、より永続性のある免疫防御を提供する。
【０３９０】
抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂは、対照注射対象と比較して、皮下ウイルス負荷及び鼻腔内ウイルス負荷の両方から対象を防御し、抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂが全身感染及び粘膜感染を防御し得ることを実証している。
【０３９１】
ＥＢＯＶ  ＤＮＡワクチン（ＥＢＯＶ−ＤＮＡ）に対する抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂ投与の防御効力を比較する効力試験を、次に実施する。新規コンセンサスに基づいたＤＮＡワクチンが、本発明者の研究所において開発され、ＥＢＯＶ負荷に対して防御を提供することができる。またＤＮＡワクチンは、測定可能な細胞免疫応答と、強力な中和抗体応答の両方を誘導した。対象群に、抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂ、ＥＢＯＶ−ＤＮＡ、またはｐＶａｘ１の単回注射を投与し、続いてウイルスを負荷する。抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂは、ＥＢＯＶ−ＤＮＡワクチンより急速に防御免疫を付与する。
【０３９２】
抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂ投与及びＥＢＯＶ−ＤＮＡワクチン接種により付与されたインビボ防御免疫の比較
次に、長期ＥＢＯＶ負荷防御試験を、０日目にＥＢＯＶ−ＤＮＡワクチンをワクチン接種した後または抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂを投与した後に実施した。ＥＢＯＶ−ＤＮＡは、抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂより長い防御免疫を付与する。
【０３９３】
抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂとＥＢＯＶ−ＤＮＡワクチンの共送達は全身体液性免疫、細胞媒介免疫及びインビボ防御を生じる
抗体送達をワクチン接種手法と組み合わせる１つの潜在的な問題は、抗体が多くの伝統的なワクチンを中和する可能性があり、したがって不適合なプラットフォームであることである。ＥＢＯＶ負荷の文脈において、対象の生存に対する抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂとＥＢＯＶ−ＤＮＡの共投与の効果を評価する。対象には、抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂ及びＥＢＯＶ−ＤＮＡが０日目に投与される。続いて、一部の動物にはＥＢＯＶが２日目に、他には３５日目に負荷される。これらの群の生存を時間の関数として追跡する。抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂは感染に対する防御を媒介し、生存率は、対照（ｐＶａｘ１）動物では負荷の４日後におよそ３０％減少している。抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂ及びＥＢＯＶ−ＤＮＡワクチンにより誘導されたＩｇＧは、両方とも検出される。抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂは、ＥＢＯＶ負荷による感染及び死亡に対して急速な防御を媒介する。
【０３９４】
更に、抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂ、ＥＢＯＶ−ＤＮＡ、または抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂ＋ＥＢＯＶ−ＤＮＡが注射された対象に誘導されたＴ細胞応答を評価する。ＥＢＯＶ−ＤＮＡは、抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂとの共送達にかかわりなく、強いＴ細胞応答を誘発し、これらの手法には干渉がないことを示している。逆に、抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂのみが投与された動物は、Ｔ細胞応答を発生していない。抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂとＥＢＯＶ−ＤＮＡワクチンの両方を、相互干渉を起こすことなく同時に投与することができ、全身体液性及び細胞免疫を介した即時及び長続きする防御が提供される。
【０３９５】
生物学的機能性ｍＡｂのインビボ急速産生のための最適化ＤＮＡプラスミドの電気穿孔媒介送達
抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂが投与された対象は、投与の直ぐ後のウイルス負荷から完全に防御され、一方、ＥＢＯＶ−ＤＮＡワクチンの単回免疫化の後では、おそらく防御免疫を備えるのに十分な時間がないために、対象は感染から生き残っていない。しかし、免疫化レジメンに続く後の時点での負荷では、ＥＢＯＶ−ＤＮＡは完全な防御を提供している。類似した防御レベルが、抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂの単回用量を投与した対象において発生したが、防御は、経時的に衰えた。注目すべきことに、抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂとＥＢＯＶ−ＤＮＡの共送達は、急速で持続的な体液性及び細胞免疫を生じ、組み合わせ手法が相加的または相乗的な効果を有し得ることを示唆している。重要なことに、抗ＥＢＯＶ  ｄＭＡｂとＥＢＯＶ−ＤＮＡの共送達は、短期間または長期間の防御免疫応答の発生に関して拮抗的ではない。
【０３９６】
実施例４−マールブルグウイルスに対するＤＮＡコード抗体予防法及びＤＮＡワクチン接種により誘発された急速で長期間の免疫
ワクチン接種は、免疫の生成前に誘導期を示すことが知られており、したがって、免疫応答が効果を表す前に感染する時間のすき間がある。ワクチン及び自然免疫応答の利益を、ＤＮＡ合成抗体またはｄＭＡｂを使用した有効な免疫の急速な生成と共に利用する特定の新規手法が、以下に提供される。
【０３９７】
生物学的に活性な抗マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）ｍＡｂ（ｄＭＡｂと称する）をコードする合成プラスミドの電気穿孔媒介送達を伴う、抗体に基づいた予防法／療法が、新規受動免疫に基づいた戦略により設計され、抗ウイルス効力について、ならびに従来の能動ワクチン接種に固有の欠点を克服する能力について評価される。ＭＡＲＶ−ｄＭＡｂの１回の筋肉内注射は、ＭＡＲＶ−ＤＮＡワクチンの能動ワクチン接種より急速に抗体をインビボで産生する。このｄＭＡｂは、多様なＭＡＲＶ臨床分離株を中和し、マウスをウイルス負荷から防御した。両方の組み合わせは、急速であるばかりでなく長寿命の防御をもたらす。
【０３９８】
ＤＮＡに基づいたｄＭＡｂ戦略は、新興ウイルス感染に対して急速な防御を誘導し、これをＤＮＡワクチン接種と組み合わせることができ、この新興感染症に対して特有の短期間及び長期間の両方の防御を提供する。これらの試験は、病原体治療及び制御戦略についての示唆を有する。
【０３９９】
ｄＭＡｂ  ＩｇＧの定量化及び結合アッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイを、ＭＡＲＶ−ｄＭＡｂが投与された対象からの血清により実施して、発現動態及び標的抗原結合を定量化する。
【０４００】
ｄＭＡｂ生成ＩｇＧの分析
ＭＡＲＶ感染細胞のＩｇＧ発現をウエスタンブロットにより分析する。免疫蛍光分析では、ＭＡＲＶ感染細胞を共焦点顕微鏡法により目視評価し、定量的または半定量的に分析する。
【０４０１】
ｄＭＡｂ  ＤＮＡプラスミド投与及びインビボ分析
発現動態及び機能性を、対照またはＭＡＲＶ−ｄＭＡｂを注射した後の対象において評価した。ＤＮＡワクチンを含む研究では、ＭＡＲＶ−ＤＮＡワクチンプラスミドが投与される。
【０４０２】
負荷試験
対象は、ＭＡＲＶ−ｄＭＡｂまたは対照プラスミドの電気穿孔増強注射を受ける。ＭＡＲＶ−ＤＮＡワクチンは、上に記載されたように送達された。ＤＮＡが送達された後、対象には、ＭＡＲＶを負荷する。動物を生存及び感染の徴候についてモニターする。血清試料を、サイトカイン定量化及び他の免疫分析のために収集する。血液試料を感染後に収集し、ウイルス血症レベルを測定する。
【０４０３】
中和抗体の分析
ＭＡＲＶ−ｄＭＡｂが投与された対象の抗ＭＡＲＶ中和抗体力価を決定する。中和力価は、細胞における細胞変性効果の１００％低減を媒介する最高希釈の逆数として計算され得る。
【０４０４】
サイトカイン定量化分析
血清は、ＭＡＲＶ−ｄＭＡｂ及びＭＡＲＶ−ＤＮＡワクチン注射対象から、ならびにＭＡＲＶ負荷対象から収集される。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６血清サイトカインレベルが測定される。
【０４０５】
抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂの設計及び発現の確認
抗ＭＡＲＶ中和ｍＡｂから構築された最適化合成プラスミドを、ＩｇＧ及びＦａｂ抗体のために設計した。細胞に、ＭＡＲＶ−ＩｇＧプラスミドまたはＭＡＲＶ−Ｆａｂ（ＶＬ、ＶＨ、もしくは組み合わせ）プラスミドのいずれかを形質移入して、インビトロ発現を確証する。ＭＡＲＶ−Ｆａｂ及びＭＡＲＶ−ＩｇＧは筋肉内に抗体を発現し、インビトロにおいて正確に組み立てられ、生物学的に機能していると思われた。
【０４０６】
抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂのインビボ発現及び定量化
インビトロ発現を確認した後、ＭＡＲＶ−ＦａｂまたはＭＡＲＶ−ＩｇＧが抗ＭＡＲＶ抗体をインビボで産生する能力を測定する。構築物は両方ともｍＡｂを生成する。対象に、ＭＡＲＶ−ＩｇＧまたはＭＡＲＶ−Ｆａｂのいずれかを投与し、血清抗体レベルを結合ＥＬＩＳＡにより評価する。ＭＡＲＶ−ＩｇＧ及びＭＡＲＶ−Ｆａｂの両方が注射された後に収集した血清は、ＭＡＲＶタンパク質に結合するが、無関係の対照抗原には結合しない。これらのデータは、ＭＡＲＶ−ＩｇＧまたはＭＡＲＶ−Ｆａｂ構築物からインビボ産生された抗ＭＡＲＶ抗体が、従来のように産生された抗原特異的抗体に類似した生物学的特徴を有することを示している。
【０４０７】
抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂ注射対象からの血清におけるインビボ特異性及び広範囲な中和活性
抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂ生成ｍＡｂが結合特異性及び抗ＭＡＲＶ中和活性について試験される。血清抗体はＭＡＲＶ感染細胞に結合する。抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂプラスミドから生成された抗体には強い特異性がある。
【０４０８】
更に、抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂを受けた対象の血清における抗ＭＡＲＶ中和活性を、ＭＡＲＶ株に対して測定する。抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂ注射対象の血清は、ＭＡＲＶ分離株を有効に中和し、単回注射がヒト抗ＭＡＲＶ  ＩｇＧの顕著な中和レベルを生じ得ることを実証している。このように、抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂ構築物によりインビボで産生された抗体は、関連する生物学的活性（すなわち、ＭＡＲＶに対する結合及び中和活性）を有する。
【０４０９】
抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂ注射は致死的なＭＡＲＶ負荷からマウスを防御する
抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂから生成された抗体がＭＡＲＶへの初期曝露に対して防御を提供するかを決定するため、１０頭の対象群が、対照または抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂを０日目に受ける。続いて各群には、ウイルスを皮下負荷して、自然ＭＡＲＶ感染を模倣する。続いて対象の生存及び体重変化を記録する。抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂプラスミドは、防御免疫を付与する。
【０４１０】
免疫防御の寿命を次に評価する。第２群の対象には、０日目に抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂまたは対照プラスミドを注射した後、ＭＡＲＶを負荷した。対象を生存についてモニターする。抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂは、より永続性のある免疫防御を提供する。
【０４１１】
抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂは、対照注射対象と比較して、皮下ウイルス負荷及び鼻腔内ウイルス負荷の両方から対象を防御し、抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂが全身感染及び粘膜感染を防御し得ることを実証している。
【０４１２】
ＭＡＲＶ  ＤＮＡワクチン（ＭＡＲＶ−ＤＮＡ）に対する抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂ投与の防御効力を比較する効力試験を、次に実施する。新規コンセンサスに基づいたＤＮＡワクチンが、本発明者の研究所において開発され、ＭＡＲＶ負荷に対して防御を提供することができる。またＤＮＡワクチンは、測定可能な細胞免疫応答と、強力な中和抗体応答の両方を誘導した。対象群に、抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂ、ＭＡＲＶ−ＤＮＡ、またはｐＶａｘ１の単回注射を投与し、続いてウイルスを負荷する。抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂは、ＭＡＲＶ−ＤＮＡワクチンより急速に防御免疫を付与する。
【０４１３】
抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂ投与及びＭＡＲＶ−ＤＮＡワクチン接種により付与されたインビボ防御免疫の比較
次に、長期ＭＡＲＶ負荷防御試験を、０日目にＭＡＲＶ−ＤＮＡワクチンをワクチン接種した後または抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂを投与した後に実施した。ＭＡＲＶ−ＤＮＡは、抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂより長い防御免疫を付与する。
【０４１４】
抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂとＭＡＲＶ−ＤＮＡワクチンの共送達は全身体液性免疫、細胞媒介免疫及びインビボ防御を生じる
抗体送達をワクチン接種手法と組み合わせる１つの潜在的な問題は、抗体が多くの伝統的なワクチンを中和する可能性があり、したがって不適合なプラットフォームであることである。ＭＡＲＶ負荷の文脈において、対象の生存に対する抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂとＭＡＲＶ−ＤＮＡの共投与の効果を評価する。対象には、抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂ及びＭＡＲＶ−ＤＮＡが０日目に投与される。続いて、一部の動物にはＭＡＲＶが２日目に、他には３５日目に負荷される。これらの群の生存を時間の関数として追跡する。抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂは感染に対する防御を媒介し、生存率は、対照（ｐＶａｘ１）動物では負荷の４日後におよそ３０％減少している。抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂ及びＭＡＲＶ−ＤＮＡワクチンにより誘導されたＩｇＧは、両方とも検出される。抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂは、ＭＡＲＶ負荷による感染及び死亡に対して急速な防御を媒介する。
【０４１５】
更に、抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂ、ＭＡＲＶ−ＤＮＡ、または抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂ＋ＭＡＲＶ−ＤＮＡが注射された対象に誘導されたＴ細胞応答を評価する。ＭＡＲＶ−ＤＮＡは、抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂとの共送達にかかわりなく、強いＴ細胞応答を誘発し、これらの手法には干渉がないことを示している。逆に、抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂのみが投与された動物は、Ｔ細胞応答を発生していない。抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂとＭＡＲＶ−ＤＮＡワクチンの両方を、相互干渉を起こすことなく同時に投与することができ、全身体液性及び細胞免疫を介した即時及び長続きする防御が提供される。
【０４１６】
生物学的機能性ｍＡｂのインビボ急速産生のための最適化ＤＮＡプラスミドの電気穿孔媒介送達
抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂが投与された対象は、投与の直ぐ後のウイルス負荷から完全に防御され、一方、ＭＡＲＶ−ＤＮＡワクチンの単回免疫化の後では、おそらく防御免疫を備えるのに十分な時間がないために、対象は感染から生き残っていない。しかし、免疫化レジメンに続く後の時点での負荷では、ＭＡＲＶ−ＤＮＡは完全な防御を提供している。類似した防御レベルが、抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂの単回用量を投与した対象において発生したが、防御は、経時的に衰えた。注目すべきことに、抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂとＭＡＲＶ−ＤＮＡの共送達は、急速で持続的な体液性及び細胞免疫を生じ、組み合わせ手法が相加的または相乗的な効果を有し得ることを示唆している。重要なことに、抗ＭＡＲＶ  ｄＭＡｂとＭＡＲＶ−ＤＮＡの共送達は、短期間または長期間の防御免疫応答の発生に関して拮抗的ではない。
【０４１７】
実施例５−インフルエンザに対するＤＮＡコード抗体予防法及びＤＮＡワクチン接種により誘発された急速で長期間の免疫
ワクチン接種は、免疫の生成前に誘導期を示すことが知られており、したがって、免疫応答が効果を表す前に感染する時間のすき間がある。ワクチン及び自然免疫応答の利益を、ＤＮＡ合成抗体またはｄＭＡｂを使用した有効な免疫の急速な生成と共に利用する特定の新規手法が、以下に提供される。
【０４１８】
生物学的に活性な抗インフルエンザウイルス（Ｆｌｕ）ｍＡｂ（ｄＭＡｂと称する）をコードする合成プラスミドの電気穿孔媒介送達を伴う、抗体に基づいた予防法／療法が、新規受動免疫に基づいた戦略により設計され、抗ウイルス効力について、ならびに従来の能動ワクチン接種に固有の欠点を克服する能力について評価される。Ｆｌｕ−ｄＭＡｂの１回の筋肉内注射は、Ｆｌｕ−ＤＮＡワクチンの能動ワクチン接種より急速に抗体をインビボで産生する。このｄＭＡｂは、多様なＦｌｕ臨床分離株を中和し、マウスをウイルス負荷から防御した。両方の組み合わせは、急速であるばかりでなく長寿命の防御をもたらす。
【０４１９】
ＤＮＡに基づいたｄＭＡｂ戦略は、新興ウイルス感染に対して急速な防御を誘導し、これをＤＮＡワクチン接種と組み合わせることができ、この新興感染症に対して特有の短期間及び長期間の両方の防御を提供する。これらの試験は、病原体治療及び制御戦略についての示唆を有する。
【０４２０】
ｄＭＡｂ  ＩｇＧの定量化及び結合アッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイを、Ｆｌｕ−ｄＭＡｂが投与された対象からの血清により実施して、発現動態及び標的抗原結合を定量化する。
【０４２１】
ｄＭＡｂ生成ＩｇＧの分析
Ｆｌｕ感染細胞のＩｇＧ発現をウエスタンブロットにより分析する。免疫蛍光分析では、Ｆｌｕ感染細胞を共焦点顕微鏡法により目視評価し、定量的または半定量的に分析する。
【０４２２】
ｄＭＡｂ  ＤＮＡプラスミド投与及びインビボ分析
発現動態及び機能性を、対照またはＦｌｕ−ｄＭＡｂを注射した後の対象において評価した。ＤＮＡワクチンを含む研究では、Ｆｌｕ−ＤＮＡワクチンプラスミドが投与される。
【０４２３】
負荷試験
対象は、Ｆｌｕ−ｄＭＡｂまたは対照プラスミドの電気穿孔増強注射を受ける。Ｆｌｕ−ＤＮＡワクチンは、上に記載されたように送達された。ＤＮＡが送達された後、対象にはＦｌｕを負荷する。動物を生存及び感染の徴候についてモニターする。血清試料を、サイトカイン定量化及び他の免疫分析のために収集する。血液試料を感染後に収集し、ウイルス血症レベルを測定する。
【０４２４】
中和抗体の分析
Ｆｌｕ−ｄＭＡｂが投与された対象の抗Flu中和抗体力価を決定する。中和力価は、細胞における細胞変性効果の１００％低減を媒介する最高希釈の逆数として計算され得る。
【０４２５】
サイトカイン定量化分析
血清は、Ｆｌｕ−ｄＭＡｂ及びＦｌｕ−ＤＮＡワクチン注射対象から、ならびにＦｌｕ負荷対象から収集される。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６血清サイトカインレベルが測定される。
【０４２６】
抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂの設計及び発現の確認
抗Ｆｌｕ中和ｍＡｂから構築された最適化合成プラスミドを、ＩｇＧ及びＦａｂ抗体のために設計した。細胞に、Ｆｌｕ−ＩｇＧプラスミドまたはＦｌｕ−Ｆａｂ（ＶＬ、ＶＨ、もしくは組み合わせ）プラスミドのいずれかを形質移入して、インビトロ発現を確証する。Ｆｌｕ−Ｆａｂ及びＦｌｕ−ＩｇＧは筋肉内に抗体を発現し、インビトロにおいて正確に組み立てられ、生物学的に機能していると思われた。
【０４２７】
抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂのインビボ発現及び定量化
インビトロ発現を確認した後、Ｆｌｕ−ＦａｂまたはＦｌｕ−ＩｇＧが抗Ｆｌｕ抗体をインビボで産生する能力を測定する。構築物は両方ともｍＡｂを生成する。対象に、Ｆｌｕ−ＩｇＧまたはＦｌｕ−Ｆａｂのいずれかを投与し、血清抗体レベルを結合ＥＬＩＳＡにより評価する。Ｆｌｕ−ＩｇＧ及びＦｌｕ−Ｆａｂの両方が注射された後に収集した血清は、Ｆｌｕタンパク質に結合するが、無関係の対照抗原には結合しない。これらのデータは、Ｆｌｕ−ＩｇＧまたはＦｌｕ−Ｆａｂ構築物からインビボ産生された抗Ｆｌｕ抗体が、従来のように産生された抗原特異的抗体に類似した生物学的特徴を有することを示している。
【０４２８】
抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂ注射対象からの血清におけるインビボ特異性及び広範囲な中和活性
抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂ生成ｍＡｂが結合特異性及び抗Ｆｌｕ中和活性について試験される。血清抗体はＦｌｕ感染細胞に結合する。抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂプラスミドから生成された抗体には強い特異性がある。
【０４２９】
更に、抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂを受けた対象の血清における抗Ｆｌｕ中和活性を、Ｆｌｕ株に対して測定する。抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂ注射対象の血清は、Ｆｌｕ分離株を有効に中和し、単回注射がヒト抗Ｆｌｕ  ＩｇＧの顕著な中和レベルを生じ得ることを実証している。このように、抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂ構築物によりインビボで産生された抗体は、関連する生物学的活性（すなわち、Ｆｌｕに対する結合及び中和活性）を有する。
【０４３０】
抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂ注射は致死的なＦｌｕ負荷からマウスを防御する
抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂから生成された抗体がＦｌｕへの初期曝露に対して防御を提供するかを決定するため、１０頭の対象群が、対照または抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂを０日目に受ける。続いて各群には、ウイルスを皮下負荷して、自然Ｆｌｕ感染を模倣する。続いて対象の生存及び体重変化を記録する。抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂプラスミドは、防御免疫を付与する。
【０４３１】
免疫防御の寿命を次に評価する。第２群の対象には、０日目に抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂまたは対照プラスミドを注射した後、Ｆｌｕを負荷した。対象を生存についてモニターする。抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂは、より永続性のある免疫防御を提供する。
【０４３２】
抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂは、対照注射対象と比較して、皮下ウイルス負荷及び鼻腔内ウイルス負荷の両方から対象を防御し、抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂが全身感染及び粘膜感染を防御し得ることを実証している。
【０４３３】
Ｆｌｕ  ＤＮＡワクチン（Ｆｌｕ−ＤＮＡ）に対する抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂ投与の防御効力を比較する効力試験を、次に実施する。新規コンセンサスに基づいたＤＮＡワクチンが、本発明者の研究所において開発され、Ｆｌｕ負荷に対して防御を提供することができる。またＤＮＡワクチンは、測定可能な細胞免疫応答と、強力な中和抗体応答の両方を誘導した。対象群に、抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂ、Ｆｌｕ−ＤＮＡ、またはｐＶａｘ１の単回注射を投与し、続いてウイルスを負荷する。抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂは、Ｆｌｕ−ＤＮＡワクチンより急速に防御免疫を付与する。
【０４３４】
抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂ投与及びＦｌｕ−ＤＮＡワクチン接種により付与されたインビボ防御免疫の比較
次に、長期Ｆｌｕ負荷防御試験を、０日目にＦｌｕ−ＤＮＡワクチンをワクチン接種した後または抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂを投与した後に実施した。Ｆｌｕ−ＤＮＡは、抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂより長い防御免疫を付与する。
【０４３５】
抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂとＦｌｕ−ＤＮＡワクチンの共送達は全身体液性免疫、細胞媒介免疫及びインビボ防御を生じる
抗体送達をワクチン接種手法と組み合わせる１つの潜在的な問題は、抗体が多くの伝統的なワクチンを中和する可能性があり、したがって不適合なプラットフォームであることである。Ｆｌｕ負荷の文脈において、対象の生存に対する抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂとＦｌｕ−ＤＮＡの共投与の効果を評価する。対象には、抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂ及びＦｌｕ−ＤＮＡが０日目に投与される。続いて、一部の動物にはＦｌｕが２日目に、他には３５日目に負荷される。これらの群の生存を時間の関数として追跡する。抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂは感染に対する防御を媒介し、生存率は、対照（ｐＶａｘ１）動物では負荷の４日後におよそ３０％減少している。抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂ及びＦｌｕ−ＤＮＡワクチンにより誘導されたＩｇＧは、両方とも検出される。抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂは、Ｆｌｕ負荷による感染及び死亡に対して急速な防御を媒介する。
【０４３６】
更に、抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂ、Ｆｌｕ−ＤＮＡ、または抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂ＋Ｆｌｕ−ＤＮＡが注射された対象に誘導されたＴ細胞応答を評価する。Ｆｌｕ−ＤＮＡは、抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂとの共送達にかかわりなく、強いＴ細胞応答を誘発し、これらの手法には干渉がないことを示している。逆に、抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂのみが投与された動物は、Ｔ細胞応答を発生していない。抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂとＦｌｕ−ＤＮＡワクチンの両方を、相互干渉を起こすことなく同時に投与することができ、全身体液性及び細胞免疫を介した即時及び長続きする防御が提供される。
【０４３７】
生物学的機能性ｍＡｂのインビボ急速産生のための最適化ＤＮＡプラスミドの電気穿孔媒介送達
抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂが投与された対象は、投与の直ぐ後のウイルス負荷から完全に防御され、一方、Ｆｌｕ−ＤＮＡワクチンの単回免疫化の後では、おそらく防御免疫を備えるのに十分な時間がないために、対象は感染から生き残っていない。しかし、免疫化レジメンに続く後の時点での負荷では、Ｆｌｕ−ＤＮＡは完全な防御を提供している。類似した防御レベルが、抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂの単回用量を投与した対象において発生したが、防御は、経時的に衰えた。注目すべきことに、抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂとＦｌｕ−ＤＮＡの共送達は、急速で持続的な体液性及び細胞免疫を生じ、組み合わせ手法が相加的または相乗的な効果を有し得ることを示唆している。重要なことに、抗Ｆｌｕ  ｄＭＡｂとＦｌｕ−ＤＮＡの共送達は、短期間または長期間の防御免疫応答の発生に関して拮抗的ではない。
【０４３８】
実施例５−機能性抗ジカ「ＤＮＡモノクローナル抗体」（ＤＭＡｂ）
本明細書に提示されている試験は、プラスミドＤＮＡの筋肉内電気穿孔を介した機能性抗ジカ「ＤＮＡモノクローナル抗体」（ＤＭＡｂ）の生成を実証する。抗ジカモノクローナル抗体のコドン最適化可変領域ＤＮＡ配列を、ヒトＩｇＧ１定量ドメインに合成した。プラスミドＤＮＡコード抗体を、Ｃ３Ｈマウスに送達した。この試験は、現存する生物学的療法の代替案としてＤＭＡｂを支持するものである。
【０４３９】
ＺＩＫＶ−Ｅｎｖ（ＺＩＫＶ−Ｅ）タンパク質は、融合ループを有する５０５アミノ酸タンパク質である（図９）。ＺＩＫＶ−Ｅタンパク質に対する抗体が、重鎖及び軽鎖を発現するＤＮＡモノクローナル抗体（ｄＭＡｂ）を介して、インビボで発現される（図１０）。ＺＩＫＶ−Ｅｎｖ特異的モノクローナル抗体の１Ｃ２Ａ６、１Ｄ４Ｇ７、２Ｂ７Ｄ７、３Ｆ１２Ｅ９、４Ｄ６Ｅ８、５Ｅ６Ｄ９、６Ｆ９Ｄ１、９Ｄ１０Ｆ４、８Ａ９Ｆ９及び９Ｆ７Ｅ１は、それぞれ、インビトロでＺＩＫＶ−Ｅｎｖと結合する（図１１及び図１２）。モノクローナル抗体は、ＶＨ及びＶＬ鎖の両方において様々な程度の配列相同性を示す（図１３〜１５）。１Ｄ４Ｇ７の大きなＶＨ  ＣＤＲ３を明確に見ることができ、他のＣＤＲ及びフレームワーク領域における他のいくつかの異なる折りたたみも同様である。３Ｆ１２Ｅ９の配列多様性にもかかわらず、全体的な配列及び立体配置は、１Ｄ４Ｇ７よりも、１Ｃ２Ａ６、８Ｄ１０Ｆ４及び８Ａ９Ｆ９に一層近い（図１５）。１Ｄ４Ｇ７は、大きなＣＤＲ３ループに起因してＶＨとＶＬドメインの間に間隙を欠いている。配列類似性は構造的類似性につながり、それによって全体的なＣＤＲ立体配置及び分子形状は、前に示されたクラスター形成に従って保存される（図１６）。１Ｃ２Ａ６は、表面に露出したＣＤＲから遠位に遊離ＣＹＳ残基を有する。別の潜在的に関連する差が、ＶＨ  ＦＲ２領域に生じている。この残基は、ＣＤＲ立体配置に直接関与していないが、局所的な残基の詰め込みに影響を与える。２つの変化が、ＩＭＧＴ確定ＣＤＲ領域内に生じている。ＶＬの変化（Ｆ、Ｆ、Ｓ）は、ＶＬ−ＶＨ界面に直接影響を与えている（図１７）。遊離ＣＹＳは、分子表面に、高度に修飾できる化学基を露出させて残す（図１８）。開発可能性指数は１Ｄ４Ｇ７が最高であり、多数の非極性残基を含有する長いＣＤＲ３ループに起因する可能性が非常に高い。しかし過去の経験に基づいて、このこと自体が問題であるとは思われない（図１９）。高い類似度に基づいて、１Ｃ２Ａ６、８Ｄ１０Ｆ４及び８Ａ９Ｆ９は、同じ基本様式で同じエピトープと結合する可能性が高い。３つの配列における小さな差には、１Ｃ２Ａ６に露出した遊離ＣＹＳ残基及び８Ｄ１０Ｆ４のＶＨ−ＶＬ界面において予測されるパイ相互作用の数の減少が含まれる。３Ｆ１２Ｅ９は、ＣＤＲ領域において１Ｃ２Ａ６、８Ｄ１０Ｆ４及び８Ａ９Ｆ９に類似性を有するが、いくつかの重要な差も有する。ｍＡｂ  １Ｄ４Ｇ７は、上に記述された他のｍＡｂと異なる様式により結合する、または完全に異なるエピトープと結合する可能性が高い。
【０４４０】
実施例６−受動抗体移入及びｐｒＭＥｎｖ  ＤＮＡワクチンによる能動免疫化を介したＺＩＫＶ感染及び病理発生に対するインビボ防御
この試験では、ＺＩＫＶのプレメンブレン＋エンベロープタンパク質（ｐｒｅ−ｍｅｍｂｒａｎｅ＋ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ｐｒＭＥｎｖ）を標的にする新規の合成ＤＮＡワクチンを生成し、インビボ効力を評価した。プラスミド構築物の初期のインビトロ発生及び評価試験に続いて、マウス及び非ヒト霊長類を、電気穿孔媒介増強ＤＮＡ送達によって、このｐｒＭＥｎｖ  ＤＮＡに基づいた免疫原で免疫化した。ワクチン接種した動物は、抗原特異的細胞及び体液性免疫及び中和活性を生成することが見出された。インターフェロン（ＩＦＮ）−α／βの受容体を欠いている（ＩＦＮＡＲ−／−と称する）マウスでは、このＤＮＡワクチンによる免疫化は、インビボウイルス負荷の後、脳組織におけるウイルス病理の予防に加えて、感染関連体重減少または死亡に対して１００％の防御を誘導した。加えて、非ヒト霊長類抗ＺＩＫＶ免疫血清の受動移入は、続くウイルス負荷に対してＩＦＮＡＲ−／−マウスを防御した。発病マウスモデルにおけるこのＺＩＫＶワクチンの最初の試験は、ＺＩＫＶ感染においてｐｒＭＥを標的にする免疫応答の重要性を支持し、このワクチン手法の追加的な研究が、ヒトにおけるＺＩＫＶの制御にとって重要であり得ることを示唆している。
【０４４１】
細胞、ウイルス及び動物
ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＲＬ−Ｎ２６８、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）及びベロＣＣＬ−８１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ならびに１％のペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（ダルベッコー修飾イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ−Ｑ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に維持し、コンフルエンスの時点で継代させた。ＺＩＫＶウイルス株ＭＲ７６６（Ｄｒ．Ｓｕｓａｎ  Ｗｅｉｓｓからの寛大な贈り物）及びＰＲ２０９（Ｂｉｏｑｕａｌ，ＭＤ）を、ベロ細胞において増幅させ、貯蔵物を標準的なプラークアッセイによってベロ細胞に滴定した。５〜６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）及びＩＦＮＡＲ-／-（ＭＭＲＲＣ貯蔵所−Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスを収容し、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｗｉｓｔａｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｇｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ  ＩＡＣＵＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の指針に従って、温度制御光周期施設において治療／ワクチン接種した。
【０４４２】
ＲＭを収容し、Ｂｉｏｑｕａｌ，ＭＤ，ＵＳＡにおいて治療／ワクチン接種した。この試験を、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＩＨ，ｔｈｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ及びＵ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅに記載されている推奨に厳密に従って行った。全ての動物の免疫化治療は、Ｂｉｏｑｕａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。Ｂｉｏｑｕａｌは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅにより公認されている。全ての手順は、獣医師の監督下において、訓練を受けた人員によってケタミン麻酔をかけて実施され、動物の福祉を保護するため及び苦痛を最小限にするために「Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ」の推奨に従って全ての努力が成された。動物を、社会的やり取りが可能なように個別の霊長類ケージに隣接し、湿度、温度及び光（１２時間の明／１２時間の暗サイクル）の制御条件下で収容した。食餌及び水は自由に入手可能であった。動物を１日２回モニターし、市販のサル用固形飼料、菓子（ｔｒｅａｔｓ）及び果物を、訓練を受けた人員によって１日２回与えた。
【０４４３】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンの構築
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドＤＮＡ構築物は、膜（ｐｒＭ）＋エンベロープ（Ｅ）の全長前駆体をコードし、カプシドタンパク質が合成された。コンセンサス戦略を使用し、コンセンサス配列を、現在のＺＩＫＶ  ｐｒＭＥタンパク質配列の整列によって決定した。ワクチン挿入物を、ヒトにおける発現を増強するために遺伝子最適化（すなわち、コドン及びＲＮＡ最適化）し、ＩｇＥリーダー配列を付加して、発現を促進させた。構築物は、市販（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＮＪ，ＵＳＡ）の合成物であり、以前に記載されたように、サイトメガロウイルス前初期プロモーターの制御下で修飾ｐＶａｘ１発現ベクターにサブクローン化した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。最終構築物をＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンと呼び、対照プラスミド骨格はｐＶａｘ１である。加えて、ＭＲ７６６（ＤＱ８５９０５９．１）及び２０１６ブラジル（ＡＭＡ１２０８４．１）大流行株のｐｒＭ及びＥ遺伝子をコードする多数の他の適合ＤＮＡ構築物も、更なる評価のために設計した。ＤＮＡ構築物の大規模増幅をＩｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡ）において実施し、精製プラスミドＤＮＡを免疫化のために水中で配合した。ＤＮＡ挿入物のサイズをアガロースゲル電気泳動によって確認した。系統発生分析を、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウエア（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）を使用してＣｌｕｓｔａｌＷの多重整列によって実施した。
【０４４４】
ＤＮＡ免疫化及び電気穿孔媒介送達増強
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）及びＩＦＮＡＲ-／-マウス（５〜６週齢）を、総体積が２０〜３０μｌの水中の２５μｇのＤＮＡをインビボ電気穿孔送達により前脛骨筋に送達することによって免疫化した。インビボ電気穿孔を、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ適応型定電流電気穿孔装置（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）により、ＤＮＡ注射の直後に同じ部位に送達した。三叉ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ低侵襲装置を、筋肉の中に約２ｍｍ挿入した。方形波パルスが、２６ゲージソリッドステンレス鋼電極から構成される三角形３電極アレイから送達され、０．１アンプの２つの定電流パルスが、１秒遅れの間隔で５２μｓ／パルスにより送達された。電気穿孔の使用に関する更なるプロトコールは、以前に詳細に記載されている（Ｆｌｉｎｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５：１２６１６）。マウスを２週間間隔で３回免疫化し、最終の免疫化の１週間後に殺処分した。血液を、細胞及び体液性免疫応答の分析のため、それぞれの免疫化の後に収集した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。カニクイザル免疫原性試験：５頭のカニクイザルを、２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンにより５週間間隔で２回、２つの部位で皮内免疫化した。マウス免疫化において記載されたものと同じ装置を使用して、電気穿孔を直後に送達した。
【０４４５】
ウエスタンブロット分析
インビトロ発現試験では、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ試薬を製造会社（Ａｇｉｌｅｎｔ）のプロトコールに従って使用して、形質移入を実施した。簡潔には、細胞を３５ｍｍ皿に５０％集密に増殖させ、１μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンを形質移入した。細胞を形質移入の２日後に収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で溶解した。ウエスタンブロットを使用して、採取した細胞溶解産物におけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質の発現、ならびに、抗フラビウイルス、またはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種マウスの免疫血清のいずれかの使用によるマウス及びＲＭの血清の免疫特異性について、以前に記載されたように確証した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。簡潔には、３〜１２％のＢｉｓ−ＴｒｉｓＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、５μｇまたは１μｇのＺＩＫＶエンベロープ組み換えタンパク質（ｒＺＩＫＶ−Ｅ）、形質移入細胞溶解産物または上澄み及びＯｄｙｓｓｅｙタンパク質Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ（製品番号９２８−４００００）を装填した。ゲルを、ＭＯＰＳ緩衝液により２００Ｖで５０分間作動させた。タンパク質を、ｉＢｌｏｔ  ２  Ｇｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用によってニトロセルロース膜に移入した。膜を、ＰＢＳ  Ｏｄｙｓｓｅｙ遮断緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により室温で１時間遮断した。ワクチン発現を検出するため、抗フラビウイルス群抗原（ＭＡＢ１０２１６−クローンＤ１−４Ｇ２−４−１５）抗体を、１：５００に希釈し、マウス及びＲＭの免疫血清を、０．２％のＴｗｅｅｎ  ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を有するＯｄｙｓｓｅｙ遮断緩衝液で１：５０に希釈し、膜と共に４℃で一晩インキュベートした。膜をＰＢＳＴで洗浄し、次に適切な二次抗体（ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＣＷ、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をマウス血清及びフラビウイルス抗体と共に、ならびにヤギ抗ヒトＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＲＭ血清と共に、マウス血清では１：１５，０００の希釈と共に、室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ赤外線画像装置（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で画像化した。
【０４４６】
免疫蛍光アッセイ
免疫蛍光アッセイでは、細胞をカバースリップにおいて増殖させ、５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンを形質移入した。形質移入の２日後、細胞を４％パラホルムアルデヒドに１５分間固定した。次に非特異的結合を、ＰＢＳに希釈した正常なヤギ血清により室温で１時間遮断した。次にスライドをＰＢＳで５分間洗浄し、続いて免疫化マウス又はＲＭの血清の１：１００の希釈と共に４℃で一晩インキュベートした。スライドを上に記載されたように洗浄し、適切な二次抗体（マウス血清ではヤギ抗マウスＩｇＧＡＦ４８８及びＲＭ血清ではヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＦ４８８、Ｓｉｇｍａ）の１：２００希釈と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、ＤＡＰＩを有するＦｌｏｕｒｏｓｈｉｅｌｄ封入培地（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）（Ａｂｃａｍ）を添加して、全ての細胞の核を染色した。その後、カバースリップを載せ、スライドを顕微鏡で観察した（ＥＶＯＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。加えて、ベロ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ又はＵ８７−ＭＢ細胞を４チャンバー組織培養処理ガラススライドにおいて増殖させ、ＲＭ免疫血清（１：２００）とプレインキュベートした／しなかったＺＩＫＶ−ＭＲ７６６またはＰＲ２０９を０．０１のＭＯＩで感染させ、パンフラビウイルス抗体を記載されたように使用して、ＺＩＫＶ感染の４日後に染色した（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｊ  Ｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ９４：１３６２−９）。
【０４４７】
病理組織学分析
病理組織学のため、ホルマリン固定パラフィン包埋脳組織を厚さ５μｍの矢状切片に切断して、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に載せ、３７℃で一晩ベーキングした。キシレンを２回交換して、切片を脱パラフィン処理し、１００％、９０％、次に７０％のエタノールに浸漬して再水和した。切片では、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）を使用して、核構造を２分間染色し、続いて１％の酸アルコール（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）により分化させ、Ｓｃｏｔｔ水道水で２分間処理した。続いて切片では、エオシン（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）を使用して、細胞質構造を２分間対比染色した。スライドを７０％、９０％及び１００％のエタノールで再水和し、キシレンで清浄にし、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して取り付けた。
【０４４８】
脾細胞及びＰＢＭＣ単離
脾細胞の単一細胞懸濁液を、全てのマウスから調製した。簡潔には、マウスの脾臓を、１０％ＦＢＳ（Ｒ１０）が補充された５ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０に個別に収集し、次に、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ  ８０パドルブレンダー（Ａ．Ｊ．Ｓｅｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）により高速で３０秒間処理した。処理された脾臓試料を４５ｍｍのナイロンフィルターで濾過し、次に１，５００ｇにより４℃で１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、５ｍｌのＡＣＫ（アンモニウム−塩化物−カリウム）溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に室温で５分間再懸濁し、次にＰＢＳを加えて、反応を停止させた。試料を再び１，５００ｇにより４℃で１０分間遠心分離した。細胞ペレットをＲ１０に再懸濁し、次に、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ及びフローサイトメトリー分析に使用する前に４５ｍｍのナイロンフィルターに通した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。ＲＭでは、血液（各時点で２０ｍｌ）をＥＤＴＡ管に収集し、Ａｃｃｕｓｐｉｎ管を用いる標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ手順（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して、ＰＢＭＣを単離した。５ミリリットルの血液も、血清を単離する各時点において血清管に収集した。
【０４４９】
フローサイトメトリー及び細胞内サイトカイン染色アッセイ
脾細胞を９６ウエルプレート（２×１０６／ウエル）に加え、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ブレフェルジンＡ及びモネンシン、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプールペプチドにより３７℃／５％ＣＯ２で５時間刺激した。細胞刺激カクテル（＋タンパク質輸送阻害剤のＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）、イオノマイシン、ブレフェルジンＡ及びモネンシン；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を陽性対照として使用し、Ｒ１０培地を陰性対照として使用した。次に全ての細胞では、製造会社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の使用説明書に記載されたとおりに、表面及び細胞内タンパク質を染色した。簡潔には、細胞を、フルオロクロム結合抗体による表面染色の前に、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％アジ化ナトリウム及び１％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）で洗浄した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、製造会社のプロトコールに従ってＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｔｙｏｐｅｒｍ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して固定及び透過処理し、続いて細胞内染色を行った。以下の抗体を表面染色に使用した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ１９（Ｖ４５０；クローン１Ｄ３；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（ＦＩＴＣ；クローンＲＭ４−５；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８（ＡＰＣ−Ｃｙ７；クローン５３−６．７；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４４（ＢＶ７１１；クローンＩＭ７；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。細胞内染色では、以下の抗体を使用した。ＩＦＮ−γ（ＡＰＣ；クローンＸＭＧ１．２；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＴＮＦ−α（ＰＥ；クローンＭＰ６−ＸＴ２２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５；クローン１４５−２Ｃ１１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩＬ−２（ＰｅＣｙ７；クローンＪＥＳ６−ＳＨ４；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。全てのデータを、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の使用により収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）の使用により分析した。
【０４５０】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
簡潔には、９６ウエルＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、抗マウスＩＦＮ−γ捕捉Ａｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡで２時間遮断した。免疫化マウスからの２００、０００個の脾細胞を各ウエルに加え、培地のみ（陰性対照）、培地＋ＰＭＡ／イオノマイシ（陽性対照）、または９個のアミノ酸による１５ｍｅｒの重複からなり、ＺＩＫＶ  ｐｒＭＥタンパク質の長さに及ぶペプチドプール（１μｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を伴う培地の存在下、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。２４時間後、細胞を洗浄し、次にビオチン化抗マウスＩＦＮ−γＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に４℃で一晩インキュベートした。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、洗浄した後に各ウエルに加え、次に室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドイルホスフェートｐ−トルイジン塩及びニトロブルー塩化テトラゾリウム（発色試薬（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  ｃｏｌｏｕｒ  ｒｅａｇｅｎ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えた。最後に、プレートを蒸留水ですすぎ、室温で乾燥し、ＳＦＵを自動ＥＬＩＳｐｏｔ読み取り機（ＣＴＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）により定量化し、未加工値を脾細胞百万個あたりのＳＦＵに正規化した。ＲＭ試料では、サル用ＥＬＩＳＰＯＴＰＲＯＩＦＮ−γキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を製造会社により記載されたように使用し、２００，０００個のＰＢＭＣをペプチドプールで刺激し、プレートを洗浄し、スポットを現像し、以前に記載されたように計数した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。
【０４５１】
体液性免疫応答：抗体結合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを使用して、マウス及びＲＭ血清の力価を以前に記載されたように決定した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。簡潔には、１μｇの精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質を使用して、９６ウエルマイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）を４℃で一晩被覆した。ＰＢＳ中の１０％ＦＢＳで少なくとも１時間遮断した後、プレートを０．０５％ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中のＴｗｅｅｎ  ２０）で４回洗浄した。免疫化マウス及びＲＭからの血清試料を１％ＦＢＳにより段階希釈し、プレートに加え、次に室温で１時間インキュベートした。プレートを再び０．０５％ＰＢＳＴで４回洗浄し、次に、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と共に、マウス血清では１：３５，０００希釈と共に室温で１時間インキュベートした。ＲＭ血清では、抗サルＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１：５，０００の希釈により室温で１時間使用した。結合した酵素は、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）基質溶液を製造会社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の使用説明書に従って加えることによって検出した。反応を、１５分後に１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させた。４５０ｎｍでの光学濃度を、Ｓｙｎｅｒｇｙプレート読み取り機により読み取った。全てのマウス及びＲＭ血清試料を二重にアッセイした。終点力価を、以前に記載された方法（Ｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１：３５−４１）を使用して決定した。
【０４５２】
中和（ＰＲＮＴ５０）アッセイ
ＭＲ７６６及びベロ細胞が関わるＰＲＮＴは、以前に記載されていた（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９３：１６５８−６５）。簡潔には、熱不活性化マウスまたはＲＭ血清を、無血清ＤＭＥＭにより段階希釈し（１：１０〜１：１２８０）、等量のＺＩＫＶ−ＭＲ７６６（１００ＰＦＵ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。混合物をベロ細胞の集密層に加え、３７℃で放置し、２時間かけて吸着させた。２×ＤＭＥＭ培地：ソフトアガー（１：１）オーバーレイを細胞に被せ、プレートを３７℃で５日間インキュベートした。寒天オーバーレイを取り除き、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１×ＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレット溶液で染色し、１×ＰＢＳで洗浄し、プレートを放置して乾燥させた。２４ウエルプレートで行ったアッセイにおけるプラークを自動Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ読み取り機（ＣＴＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）により走査し、試料ウエルの中、ならびに陰性対照（ＤＭＥＭのみ）及び陽性対照（１００ＰＦＵ  ＭＲ７６６ＺＩＫＶウイルスのみ）ウエル中のプラークを、ＥＬＩＳｐｏｔ読み取り機に備わった自動ソフトウエアを使用して計数した。プラーク低減率を以下のように計算した。低減％＝１００×｛１−（各希釈におけるプラークの平均数／陽性対照ウエルにおけるプラークの平均数）｝。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して、それぞれ個別の血清希釈の対数変換に対するプラーク低減％の非線形回帰分析を実施し、ワクチン接種後のピーク応答での実際の５０％ＰＲＮＴ力価の線形補間を促進した。５０％中和での中央値及び四分位数間範囲を、それぞれの中和標的全体において及びワクチン処理群において計算し、幾何平均抗体価も計算した。力価は、プラーク数の５０％低減をもたらす最高希釈の逆数を表す。
【０４５３】
ＩＦＮＡＲ-／-マウスにおけるＺＩＫＶ負荷試験
ＺＩＫＶ負荷試験では、ＩＦＮＡＲ-／-マウス（ｎ＝１０／群）をＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンまたはｐＶａｘ１により１回または２回免疫化した。マウスに、１５日目（単一免疫化群）または第２の免疫化（２回免疫化群）の１週間後の２１日目に、１×１０６ＰＦＵまたは２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスのいずれかを負荷した。また、ＩＦＮＡＲ-／-マウスの追加の群（ｎ＝１０／群）を１回免疫化し、１５日目に２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９を負荷した。負荷後に、動物を計量し、体温を皮下に位置する温度チップによって毎日測定した。加えて、疾患の臨床徴候（運動性の減少、丸まった姿勢、後肢の指背歩行（部分的な麻痺）、一方の後肢の麻痺、または両方の後肢の麻痺）について１日に２回観察し、ウイルス量を決定するために採血した。福祉に基づいた殺処分の基準は、２０％の体重減または一方もしくは両方の後肢の麻痺から構成された。
【０４５４】
ＺＩＫＶ量を測定するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ
処置したマウスからの脳をＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に４℃で１週間浸漬し、次に−８０で貯蔵した。次に脳組織を計量し、ステンレス鋼ビーズを有するＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を３０サイクル／秒で６分間使用して、２ｍｌのクライオバイアル中の６００μｌのＲＬＴ緩衝液において均質化した。ウイルスＲＮＡも、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）により血液から単離した。ＺＩＫＶ特異的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを、対象動物におけるウイルスＲＮＡの検出に利用した。ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｖｉｒｕｓ  １−Ｓｔｅｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、プライマーＺＩＫＶ８３５及びＺＩＫＶ９１１ｃ、ならびにプローブＺＩＫＶ８６０ＦＡＭを使用して逆転写及び増幅した。標準曲線を、それぞれのプレートについて並行して生成し、ウイルスゲノムコピー数の定量化に使用した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）ソフトウエアバージョン２．３を使用して、サイクル閾（Ｃｔ）値を計算し、以前に記載されたように（Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １４：１２３２−９）、複製の少なくとも１つにおけるＣｔ値≦３８を陽性と考慮した。前出血（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）は、このアッセイでは陰性であった。
【０４５５】
統計分析
抗体力価における増加倍数の差を、マン・ホイットニー分析の使用により比較した。統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ，  Ｐｒｉｓｍ  ４（Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。全ての分析物において、Ｐ＜０．０５が有意であるとみなされた。ｌｏｇ１０変換を終点結合ＥＬＩＳＡ力価及び全ウイルスＰＲＮＴ５０力価に適用した。
【０４５６】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサスＤＮＡワクチンの構築
ＺＩＫＶ  ｐｒＭ（前駆体の膜）及びＥｎｖ（エンベロープ）遺伝子（ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ）のコンセンサス配列を、ヒトに感染を引き起こした１９５２年から２０１５年の間に単離された様々なＺＩＫＶから、ｐｒＭおよびＥｎｖ配列を使用して生成した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス配列を、高い効率の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダーペプチド配列の付加を含む、追加的な修飾及び最適化を行ってインビボ発現を改善した後のｐＶａｘ１ベクターに、クローン化した（図２０Ａ）。ＺＩＫＶエンベロープ配列の最適化整列を、相同性モデル及びＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５による可視化を使用して実施した。基準モデルには、ＰＤＢ  ５ＪＨＭ及びＰＤＢ  ５ＩＺ７が含まれた。ｐｒＭＥ抗原の特定の領域に対応して整列させた残基を、可視化の目的のためにモデルにおいて標識した（図２０Ｂ）。最適化コンセンサスワクチン選択肢は、この研究で分析された多数のＺＩＫＶ株と比べて、一般に保存的または半保存的である。ＥＤＥ特異的中和抗体の構造研究は、これらの認識決定基がエンベロープ二量体インターフェースの血清型インバリアント部位に見出され得ることを明らかにしており、融合ループの露出主鎖、ならびに２つの保護グリカン鎖（Ｎ６７及びＮ１５３連結グリカン）が含まれる（Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  ５２０：１０９−１３）。これらの２つのグリコシル化部位は、他のフラビウイルスにおいてあまり高度に保存されていない。更に、ＺＩＫＶは、Ｎ６７連結グルコシル化部位を有さず、Ｎ１５４連結グリコシル化部位（デングにおけるＮ１５３連結グリコシル化部位と同等である）は、単離されたＺＩＫＶ株にいくつかにおいて不在である。したがって、コンセンサス設計の一部として、構築物を、このグリコシル化部位を省くように設計した。この部位にグリコシル化を欠いていることは、ＺＩＫＶエンベロープタンパク質へのＥＤＥ１型の広範囲の中和抗体（ｂｎＡｂ）の結合を改善することに相関している（Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  ５２０：１０９−１３）。
【０４５７】
構築に続いて、プラスミドからのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質の発現を、ウエスタンブロット分析及び間接的免疫蛍光分析によって確認した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥにより一時的に形質移入された細胞から調製されたタンパク質抽出物を、パンフラビウイルス抗体（図２０Ｃ）及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化マウスからの収集した血清（図２０Ｄ）を使用して、ウエスタンブロットにより発現について分析した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ発現を、抗ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的抗体による形質移入の４８時間後にＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドが形質移入された２９３Ｔ細胞を染色することによって、ＩＦＡにより更に検出した（図２０Ｅ）。
【０４５８】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖ  ＤＮＡワクチンは抗原特異的Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに誘導する
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖプラスミドワクチンが細胞免疫応答を誘導する能力を評価した。４頭の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス群に、対照プラスミド主鎖（ｐＶａｘ１）またはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドワクチンのいずれかの筋肉内（ｉ．ｍ．）注射、続く送達部位の電気穿孔により２週間間隔で３回免疫化した（図２１Ａ）。動物を３回目の注射の１週間後に殺処分し、それぞれの動物から採取された大量の脾細胞を、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥが包含されるペプチドプールにエキソビボ曝露された後にインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を分泌する能力についてＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより評価した。アッセイ結果は、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化マウスからの脾細胞が複数のＺＩＫＶ−Ｅペプチドプールによる刺激の後に細胞免疫応答を生じたことを示している（図２１Ｂ）。最も強い細胞応答（複数可）を誘発したＺＩＫＶ−Ｅｎｖの領域（複数可）を、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質の全体に及ぶ１５ｍｅｒ（１１個のアミノ酸による重複）からなる２２個のペプチドプールの使用によって、マトリックス形式のＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより評価した。いくつかのプールは、上昇したＴ細胞応答を示し、ペプチドプール１５は、最高値のスポット形成単位（ＳＦＵ）を示した（図２１Ｃ）。このマトリックスマッピング分析は、優位なｐｒＭＥエピトープ「ＩＲＣＩＧＶＳＮＲＤＦＶＥＧＭ（配列番号１７）」（アミノ酸１６７〜１８１）を明らかにした。このペプチドは、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅツールを利用した分析によってＨ２−Ｄｂ制限エピトープを含有することが確認され、このことは、このハロタイプにおいて、抗原が有効に処理されたことを支持している。
【０４５９】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンの細胞免疫原性についての更なる評価は、最終免疫化の１週間後に収集されたＣＤ８＋Ｔ細胞の多機能性の決定を伴った。結果は、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチン接種が二機能性ワクチン特異的Ｔ細胞発現ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）及びＩＦＮ−γの割合を増加させたことを示している。重要なことに、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチン接種は、Ｔ細胞機能を拡大する強い能力を示した（図２１Ｄ）。
【０４６０】
加えて、比較免疫研究を、最近確認されたブラジルＺＩＫＶ株または元のＭＲ７６６  ＺＩＫＶ株のいずれかのｐｒＭＥｎｖ配列をコードする最適化プラスミドによって実施した。いずれかのプラスミドで免疫化されたマウスにおける細胞応答の誘導を、３回目のワクチン接種の１週間後、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖペプチドプールで脾細胞を刺激した後にＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ分析によって測定した。結果は、コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチン構築物により誘導されたＴ細胞応答が、２つの非コンセンサスプラスミドワクチンのいずれかにより生成されたものより一貫して高かったことを例示している（図２７Ａ及び２７Ｂ）。ブラジルまたはＭＲ７６６  ｐｒＭＥワクチンのいずれかにより誘導された細胞応答の詳細なマッピング分析は、両方のワクチンが、コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖプラスミドでは図２１Ｂ及び図２１Ｃに確認されるように、優位なＥｎｖ特異的ＣＴＬエピトープに対して顕著な細胞応答を誘導したことを明らかにした（データ示されず）。コンセンサス免疫原は、これらにＴ細胞アッセイにおいて同じ用量でより堅牢な応答を一貫して誘導し、追加のアッセイで更に評価した。
【０４６１】
ＺＩＫＶ組み換えエンベロープタンパク質の生成
これらの試験の開始時には、特定の抗ＺＩＫＶ免疫応答を評価する市販の試薬は入手可能ではなかった。したがって、必要に迫られて、組み換えＺＩＫＶエンベロープタンパク質（ｒＺＩＫＶ−Ｅ）を生成して、この試験において実施されるアッセイを支援した。この試薬を生成するため、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンコンセンサス抗原に基づいたコンセンサＺＩＫＶエンベロープ配列を、ｐＥｔ３０ａ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクターにクローン化した（図２８Ａ）。ｒＺＩＫＶ−Ｅ抗原をＥ．ｃｏｌｉ培養物で産生し、ニッケルカラムクロマトグラフィーを使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析し、ｒＺＩＫＶ−Ｅ形質移入細胞からの予想されたサイズの過剰発現したタンパク質を溶解産物の中に示し、抗Ｈｉｓタグ抗体を使用するウエスタン分析によって検出することができた（図２８Ｂ）。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンで免疫化されたマウスの血清はｒＺＩＫＶ−Ｅｎｖに結合し、これをＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ、図２８Ｃ）における捕捉抗原として使用した。複数のフラビウイルスのエンベロープタンパク質と反応する市販の抗体（指定された汎フラビウイルス）も、ｒＺＩＫＶ−Ｅに結合した。ウエスタン分析は、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖ免疫化マウスの免疫血清がｒＺＩＫＶ−Ｅを特異的に認識したことを実証した（図２８Ｄ）。これらのデータは、生成されたｒＺＩＫＶ−ＥがＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチン接種マウスの免疫血清と特異的に反応したことを示し、故に、この組み換えタンパク質を更なる免疫原性試験に使用した。
【０４６２】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンによるＣ５７ＢＬ／６マウスにおける機能性体液性応答の誘導
コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンが体液性免疫応答をマウスに誘導する能力を評価した。４頭のＣ５７ＢＬ／６マウス群を、２５μｇの空（ｅｍｐｔｙ）対照ｐＶａｘ１またはコンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンプラスミドのいずれかにより気穿孔媒介送達を介して、２週間間隔で３回筋肉内（ｉ．ｍ．）において免疫化した。血清を、それぞれの免疫化マウスから得て、ＺＩＫＶ特異的ＩｇＧ応答について、捕捉抗原として固定ｒＺＩＫＶ−Ｅを使用してＥＬＩＳＡにより試験した。抗ＺＩＫＶ特異的ＩｇＧの顕著な増加が、２１日目に観察され、血清ＩｇＧレベルの更なる押し上げが３５日目に認められた（図２２Ａ）。ワクチン接種した動物の６０日目の血清は、上昇されたＺＩＫＶ特異的抗体応答が最終追加免疫の後に長期間にわたって維持されたことを示している。最も重要なことに、ワクチン接種したマウスの血清は、終点力価が示しているように、非常に高いレベルのｒＺＩＫＶ−Ｅ特異的抗体を含有した（図２２Ｂ）。ワクチン誘導抗体の特異性についての追加の評価を、ＺＩＫＶ  ｐｒＭＥｎｖプラスミド接種マウスのプールした血清を、ウエスタン分析によりｒＺＩＫＶ−Ｅ（エンベロープ）を検出する能力について（図２２Ｃ）及び免疫蛍光アッセイによりＺＩＫＶ（ＭＲ７６６株）感染細胞を染色する能力について（図２２Ｄ）選別することによって実施した。これら両方の分析結果は、ワクチン誘導体液性応答の特異性を確認した。
【０４６３】
更に、ＺＩＫＶ特異的結合抗体応答も、上に記載されたブラジル株及びＭＲ７６６株のｐｒＭＥｎｖ配列をコードするプラスミドで免疫化されたマウスにおいて評価した。ｐＶａｘ１免疫化マウス及び両方の非コンセンサスワクチン免疫化マウスからの３５日目（３回目の免疫化の１週間後）の血清を、ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合についてＥＬＩＳＡにより分析した。この分析は、ＭＲ７６６及びブラジルワクチンプラスミドが両方とも顕著な抗体結合を誘導したこと、ならびにコンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンによる免疫化が、ｒＺＩＫＶ−Ｅに対して有効な体液性応答を生成することを示している（図２７Ｃ及び図２７Ｄ）。
【０４６４】
プラーク低減中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイを、対照ｐＶａｘ１プラスミド、コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖプラスミドワクチン、またはコンセンサスＺＩＫＶ−Ｃ（カプシド）プラスミドワクチンのいずれかにより免疫化（３×）されたマウスから３５日目にプールした血清において実施した。使用されたＰＲＮＴアッセイは、デングウイルス、ウエストナイルウイルス及び他のフラビウイルスについて以前に記載された技術（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：４０４０−７）を適合させた方法であった。図２２Ｅに示されているように、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種は、４５６±５の抗ＺＩＫＶ逆数ＰＲＮＴ５０希釈力価（対照ＺＩＫＶ感染の５０％が阻害される血清希釈の逆数）を有する著しい中和応答を生じたが、ＺＩＫＶ−Ｃａｐ  ＤＮＡワクチンがワクチン接種されたマウスは、ｐＶａｘ１対照プラスミドワクチン接種動物（力価＝１５±２）を僅かに超えるだけの力価（３３±６）を示した。
【０４６５】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンによる免疫化後のＩ型インターフェロン受容体を欠いている（ＩＦＮＡＲ-／-）マウスにおけるＺＩＫＶに対する免疫応答及び防御
ＺＩＫＶ誘導疾患及び免疫の機構は、不十分に定義されており、ＺＩＫＶ感染に対する免疫応答の防御対仮定的病原性の性質は、依然として不明のままである（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｊ  Ｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ９４：１３６２−９）。マウスの大部分の系統は、ＺＩＫＶ感染に対して抵抗性があるが、ＩＦＮ−α／β受容体を欠いている（ＩＦＮＡＲ-／-）マウスは、感染及び疾患にかかりやすいことが見出されており、大部分が負荷の６〜７日後に冒されている（Ｌａｚｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １９：７２０−３０）。コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドワクチンが細胞及び体液性免疫応答をこのマウス系統に誘導する能力を調査した。５〜６週齢の雌ＩＦＮＡＲ-／-マウス（ｎ＝４）を、対照ｐＶａｘ１プラスミドまたはＺＩＫＶ  ｐｒＭＥワクチンプラスミドワクチンのいずれかにより、電気穿孔媒介送達を用いて、２週間間隔で３回ｉ．ｍ．において免疫化した。血清を免疫化マウスから０、１４、２１及び３５日目に収集し、脾細胞を最終免疫化（３５日目）の１週間後にマウスから採取した。ワクチン免疫化マウスの脾細胞は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて１０６細胞あたりのＳＦＵベルにより示されているように、明確な細胞免疫応答を生じた（図２９Ａ）。ｒＺＩＫＶ−Ｅを捕捉抗原として使用したＥＬＩＳＡ分析の結果は、１４日目までには検出可能な抗ＺＩＫＶ血清ＩｇＧを示し（約１：１，０００の力価）、これらのレベルは、続く結合抗体によるワクチン接種により押し上げられて、力価は少なくとも１：１００，０００に到達している（図２９Ｂ及び２９Ｃ）。比較として、免疫後３５日目の試料のＰＲＮＴ５０力価は、１：６０であった。結果は、コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンで免疫化されたＩＦＮＡＲ-／-マウスが、抗ＺＩＫＶ細胞及び体液性免疫応答を生成できることを示し、この病原体負荷に対する推定ワクチン効果のモデルによる更なる研究を支持している。
【０４６６】
非ヒト霊長類においてＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖ  ＤＮＡワクチンより誘発されるＺＩＫＶ特的機能性細胞及び体液性応答
ＮＨＰを、低電圧皮内形式において強力な免疫応答を示す最近の研究に基づいて、皮内電気穿孔の使用による皮内免疫化によって免疫化した（Ｈｕｔｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｈｕｍ  ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２３：９４３−５０、Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １：ｅ１１）。カニクイザル（ＲＭ、ｎ＝５／群）に、２．０ｍｇのワクチンプラスミドを電気穿孔により皮内に投与し、それぞれの動物には、４週間置いて２回ワクチン接種した。血清及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、０日目（免疫化前）及び６週目（２回目の免疫化の２週間後）に収集した。免疫化前及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖペプチドプールでエキソビボ刺激された６週目のＰＢＭＣのＥＬＩＳｐｏｔ分析は、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖ免疫化がＲＭにおいて堅牢な抗ＺＩＫＶ  Ｔ細胞応答を誘導したことを示した（図２３Ａ）。
【０４６７】
ワクチン接種したＲＭの血清における特異的抗ＺＩＫＶ抗体応答をＥＬＩＳＡにより評価した。６週目に、ｒＺＩＫＶ−Ｅｎｖ特異的結合抗体が、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖがワクチン接種された動物において検出可能であった（図２３Ｂ）。終点力価を、２週目（１回目の免疫化後）及び６週目（２回の免疫化後、図２３Ｃ）に、それぞれの動物において決定した。ＥＬＩＳＡの結果は、個別にワクチン接種した動物からＲＭ血清を使用したウエスタンブロット分析により確認した（図２３Ｄ）。６週目にＲＭにおいて生成された抗体の中和活性を、ＰＲＮＴ５０アッセイにより評価した。ワクチン接種された全てのサルは、抗ＺＩＫＶ逆数ＰＲＮＴ５０希釈力価が１６１〜１３８０の範囲（平均５０１±２２４平均標準誤差、図２３Ｅ）である顕著な中和活性を有した。ＰＲＮＴ力価は、ＥＬＩＳＡ力価と直接相関しなかった（データ示されず）。
【０４６８】
ベロ細胞、神経芽細胞腫（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）、または神経前駆細胞（Ｕ−８７ＭＧ）細胞のＺＩＫＶ感染をインビトロで遮断するＮＨＰワクチン免疫血清の能力を、ＩＦＡにより検査した。ＺＩＫＶ  Ｑ２株（ＭＲ７６６またはＰＲ２０９）を、血清またはＮＨＰ免疫血清の希釈物においてプレインキュベートし、それぞれの種類の細胞の単層に添加した。感染の４日後、ＺＩＫＶ陽性細胞をフラビウイルス抗体に使用によりＩＦＡで確認し（図３０Ａ、３０Ｃ）、ＺＩＶＫ陽性細胞を定量化した（図３０Ｂ、３０Ｄ）。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種ＲＭの血清は、ＺＩＫＶ感染をそれぞれの種類の細胞において阻害した。
【０４６９】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化後のＩＦＮＡＲ-／-マウスにおけるＺＩＫＶ感染及び疾患に対する防御
探索研究において、５〜６週齢のＩＦＮＡＲ（-／-）マウス（ｎ＝１０）に、１×１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＺＩＫＶ−ＰＲ２０９分離株を、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、または静脈内（ｉ．ｖ．）経路により投与して負荷した。負荷した後、全ての動物を、体重の日常的な測定、ならびに後肢脱力及び麻痺などの瀕死状態の他の徴候の検査を含む、感染の臨床徴候についてモニターした。接種の最初の４日間には、マウスの一般的な外観に変化は観察されなかった。しかし、４日目の後、各群のマウスは、全体的な活動の低下、運動性の減少、多くの場合に後肢脱力を伴う丸まった姿勢、水摂取の減少及び明確な体重減を示した。動物は、ウイルス負荷の経路にかかわりなく、６日目から８日目の間に感染に冒された（図３１Ａ〜３５Ｅ）。これらのデータに基づいて、このモデルにおいてＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ媒介防御を評価する後の試験は、負荷にｓ．ｃ．経路を使用した。
【０４７０】
次にＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンの防御効力を、このＩＦＮＡＲ-／-マウスモデルにおいて評価した。マウス（ｎ＝１０）の２群を、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンの電気穿孔媒介送達を介してｉ．ｍ．経路で免疫化した（２５μｇのワクチン）。また、１０頭のマウスの２群を、対照ｐＶａｘ１ベクターの電気穿孔媒介送達を介してｉ．ｍ．経路で免疫化した。免疫化を２週間置いて２回実施し、全ての動物に、２１日目（２回目の免疫化の１週間後）に負荷した。対照とワクチン接種マウスの一方のセットは、ｓ．ｃ．経路により１×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９を受け、他方のセットには、ｓ．ｃ．経路により２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９が負荷された。負荷の３週間後、全てのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種動物は、１００％生存し、一方、僅か３０％の単回用量または１０％の２回用量負荷対照が生存した（図２４Ａ及び２４Ｂ）。全ての負荷において、ワクチン接種動物は疾患の徴候がなく、体重減の証拠がないことが含まれた（図２４Ｃ及び２４Ｄ）。ＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスによる対照マウスの感染は、動性の減少、丸まった姿勢、後肢の指背歩行及び／または一方もしくは両方の後肢の麻痺を伴って、体重の顕著な減少を生じた（図２４Ｅ及び２４Ｆ）。
【０４７１】
ＩＦＮＡＲ-／-マウスをＺＩＫＶ負荷から防御するＺＩＫＶ  ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンの単回免疫化の潜在的な能力を、評価した。１０頭のマウス群を、対照プラスミドまたはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンのいずれかにより、電気穿孔でｉ．ｍ．において１回免疫化し、２週間後に、倍総用量の２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９の投与を負荷した。負荷の３週間後、１００％のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種動物が生存し、一方、僅か１０％の対照動物が生存した（図２５Ａ）。全体的な組織病理学的変化を決定するため、脳組織を厚さ５μｍの矢状切片に切断して、核構造を染色し、エオシンを使用して細胞質構造を対比染色した（図２５Ｂ）。組織学及びウイルス量の分析のために、マウスを負荷の７または８日後に殺処分した。ＺＩＫＶ感染は、マウスに重篤な脳病理を生じた。非ワクチン接種対照（ｐＶａｘ１）マウスの脳切片は、好中球内の核フラグメント（図２５Ｂ）、皮質内血管の血管周囲への細胞浸潤、リンパ球浸潤及大脳皮質細胞の変性（図２５Ｂ）、ならびに海馬内のニューロンの変性（図２５Ｂ）を示した。しかし対照的に、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種動物は、脳組織に正常な組織病理を表し（図２５Ｂ）、合成ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンによる免疫化で誘導された防御抗体が、ウイルス誘導疾患を脳において制限し得ることを支持している。この観察は、脳を防御するワクチン接種の可能性をこのモデルにおいて実証している。ＺＩＫＶ負荷後のワクチン接種マウスにおける体重減及び運動機能障害の寛解に一致して、顕著に低下したウイルス量が、高（２×１０６ＰＦＵ）用量負荷群のウイルス負荷ｐＶａｘ１ワクチン接種動物と比較して、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種動物の血液（図２５Ｃ）及び脳（図２５Ｄ）において認められた。まとめると、これらのデータは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチン媒介免疫応答がマウスをＺＩＫＶ負荷から防御し得ることを例示している。
【０４７２】
抗ＺＩＫＶ免疫血清の受動移入はマウスをＺＩＫＶ感染から防御する
次に、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチン接種ＲＭの免疫血清の移入が、ＺＩＫＶ媒介病理発生をＩＦＮＡＲ-／-マウスにおいて防御するかを試験した。このため、６週齢のＲＭからの１５０μｇ当量のＩｇＧ（ＰＲＮＴ５０約１／１６０）を、ＺＩＫＶウイルス負荷の１日後に、ＩＦＮＡＲ-／-マウスに養子移入した。２群の対照マウスが含まれ、一方の群は、ＲＭから免疫前血清を受け、他方の群は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を受けた。ＰＢＳまたは対照血清を受けたマウスは、感染の過程で最初の体重の１５〜２５％を減少し、感染の６〜８日後に全て死亡した。ＲＭのワクチン免疫血清を感染にわかりやすいマウスに移入したとき、動物は３及び４日目に体重を減少したが、その後５日目から回復し始め、最終的に８０％が感染負荷から生存し（図２６Ａ）、ウイルス負荷後のＺＩＫＶ換算の臨床症状に対して防御を付与するＮＨＰ血清の能力を実証している（図２６Ｂ）。ＺＩＫＶの負荷に対する防御について免疫血清移入の効力を評価するために実施された反復実験では、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫血清受容動物のうち、生存率は、８０〜１００％の範囲であった。これらの試験は、抗ＺＩＫＶワクチン免疫血清が、獲得適応抗ＺＩＫＶ免疫応答の不在下でＺＩＫＶ感染に対して有意な防御を付与する能力を有したことを示している。
【０４７３】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス構築物によるワクチン接種
ヒトにおける最近のＺＩＫＶの蔓延及び関連する病理発生には、深刻な懸念が生じている。現在、この進行感染病原体に対して認可ワクチンまたは治療薬は存在していない。ごく最近、一連の実験的ＺＩＫＶワクチンが、非病原性動物感染モデルにおいて負荷のウイルス量を低下したことが示されている（Ｌａｒｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｎａｔｕｒｅ  ５３６：４７４−８、Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３：１１９２−３２）。これらのデータは期待の持てるものである。これに関連して、ＺＩＫＶを標的にする追加的な新規ワクチン手法を、追加のモデルにおいて検査することが重要である。ここで、新規コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭ及びＥ抗原を発現するように設計された合成ＤＮＡワクチンを、マウス及び非ヒト霊長類における電気穿孔増強免疫化後に免疫原性について評価した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチン接種は、マウス及びＮＨＰの両方において、免疫原性であること、ならびに抗原特異的Ｔ細胞、結合及び中和抗体を生成することが観察された。特有なことに、ＮＨＰには、皮内経路により電気穿孔を介してＺＩＫＶ−ｐｒＭＥが免疫化され、これには、最近記載されているように、ｉ．ｍ．電気穿孔より低い電圧及び小さい形質移入域が使用される（Ｔｒｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｌａｎｃｅｔ  ３８６：２０７８−８８）。そのような手法の更なる研究は、臨床状況において利益をもたらし得る。
【０４７４】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス構築物は、推定グリコシル化部位を除去する潜在的なＮＸＳ／Ｔモチーフの設計変化を含む。この部位にグリコシル化を欠失することは、ＺＩＫＶ−Ｅタンパク質へのＥＤＥ１型のｂｎＡｂ（広範囲の中和抗体）の結合を改善することに相関している（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，  ＳｃｉＴｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥにより誘導された抗体応答は、開発された類似のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥブラジルワクチンにより誘発されたものと同様堅牢であると思われ、いくつかの場合では、規模の点でより優れていると思われる。これらの構築物は、配列が元のＺＩＫＶ−ＭＲ７６６分離株または最近広まっているブラジルのＺＩＫＶ株と、それぞれ適合していた。支持的ではあるが、誘導免疫応答に対する、そのような組み込み設計変化の効果について、更なる研究がより多くの洞察を提供するであろう。
【０４７５】
ＺＩＫＶの病原性負荷モデルはほとんどないので、Ｃ５７ＢＬ／６及びＩＦＮＡＲ-／-マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンの免疫応答の推定防御性を比較した。両系統のマウスは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥにより免疫化されたとき、堅牢な体液性免疫応答で応答した。Ｔ細胞応答も誘導されたが、ＩＦＮＡＲ-／-動物において誘導されたものと比較して、野生型Ｃ５７ＢＬ／６においてより堅牢であると思われ、マウスにおけるノックアウト表現型によると予測されたように、先天性に起因する適応免疫の移行における部分的な欠陥を支持している。しかし、抗原特異的免疫の誘導に基づいて、モデルは、感染及び病理発生の両方に対するワクチンの影響を評価するために有用であった。ＩＦＮＡＲ-／-マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥによる単回ワクチン接種は、このモデルにおいて疾患及び死亡に対して防御的であり、神経病因の防御が含まれた。Ｅｎｖ抗原に対して向けられたフラビウイルス中和抗体は、疾患に対する防御において主要な役割を有すると考えられ、この考えは、動物モデルにおける受動抗体移入実験により直接的に及び蚊媒介ウイルス感染にかかりやすい地理的地域における前向き研究の疫学データにより間接的に支持されている（Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  １３０：６９−８０、Ｒｏａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｌａｎｃｅｔ  ３８７：８４３、Ｓａｍａｒａｓｅｋｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｌａｎｃｅｔ  ３８７：５２１−４）。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンによる、ならびに免疫化ＮＨＰからの血清移入によるＩＦＮＡＲ-／-マウスの免疫化は、このネズミモデルにおいて防御的であったが、血清移入マウスではなくＩＦＮＡＲ-／-ワクチン接種マウスは、病理発生の制御の指標である体重減の改善された制御を示した。追加の研究が必要であるが、この結果は、このモデルにおける防御の局面におけるＴ細胞応答の役割を示唆している可能性がある。加えて、負荷から回復した対照ＩＦＮＡＲ-／-マウスは、少なくとも数週間にわたってウイルス陽性のままであることがＰＣＲにより観察され、ワクチン接種の追加的な利益を示唆している。この研究は、罹患しやすい宿主における疾患の予防に影響を与えるワクチン接種、この場合、この合成ＤＮＡワクチン接種の可能性を支持している。
【０４７６】
前述の詳細な記載及び添付の実施例は、単に例示的であり、本発明の範囲に対する制限として受け止めるべきではなく、それは添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ定義されることが、理解される。
【０４７７】
開示されている実施形態に対する様々な変更及び修正が当業者に明らかとなるであろう。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、配合物、または使用方法が含まれるが、これらに限定されない、このような変更及び修正を、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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