(57)【要約】  本明細書において、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物および／またはＧＬＳ１阻害組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、対象における肺血管疾患を治療するための組成物および方法が、提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における肺血管疾患を治療する方法であって、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物および／またはＧＬＳ１阻害組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物が前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物が、ベルテポルフィン、その塩、プロドラッグ、または誘導体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記肺血管疾患が肺高血圧症である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記肺血管疾患が肺動脈高血圧症である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＬＳ１阻害組成物が前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＬＳ１阻害組成物が、ＣＢ−９６８、その塩、プロドラッグ、または誘導体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記肺血管疾患が肺高血圧症である、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記肺血管疾患が肺動脈高血圧症である、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物および前記ＧＬＳ１阻害組成物の両方が前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物が、ベルテポルフィン、その塩、プロドラッグ、または誘導体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧＬＳ１阻害組成物が、ＣＢ−９６８、その塩、プロドラッグ、または誘導体である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記肺血管疾患が肺高血圧症である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記肺血管疾患が肺動脈高血圧症である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
対象における肺血管硬化を低減する方法であって、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物および／またはＧＬＳ１阻害組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物が前記対象に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物が、ベルテポルフィン、その塩、プロドラッグ、または誘導体である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＧＬＳ１阻害組成物が前記対象に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＬＳ１阻害組成物が、ＣＢ−９６８、その塩、プロドラッグ、または誘導体である、請求項１５または１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物および前記ＧＬＳ１阻害組成物の両方が前記対象に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物が、ベルテポルフィン、その塩、プロドラッグ、または誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＧＬＳ１阻害組成物が、ＣＢ−９６８、その塩、プロドラッグ、または誘導体である、請求項２０または２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／３４１，８４８号明細書の優先権の利益を主張するものであり、この開示は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
政府出資の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により付与された助成金番号ＨＬ１２４０２１の下で米国政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
肺高血圧症（ＰＨ）およびその特に重症のサブタイプ、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）は、増殖促進性の細胞表現型および有害な肺血管リモデリングを特徴とする、あまり理解されていない血管疾患である。血管細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の変化は、ＰＨの分子的駆動因子として認識が増大している。コラーゲンおよびエラスチン産生の調節異常（Mecham RP, et al., Science. 1987;237(4813):423-6)は、末期および初期疾患のいずれにおいても（Bertero T, et al., Cell Reports. 2015;13(5):1016-32）ならびに近位および遠位血管のいずれにおいても（Lammers S, et al., Compr Physiol. 2012;2(1):295-319）観察されている。血管ＥＣＭの薬理学的ターゲティングは、ＰＨを改善し得るが（Cowan K, et al.,  Nature Medicine. 2000;6(6):698-702; Nave AH, et al. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2014;34(7):1446-58）、ＥＣＭメカノトランスダクション（すなわち、細胞が外部機械力を感知し、これに適合できるようになるプロセス）を脈管構造に関連付けるプロセスは、まさに明らかになりつつある。海馬シグナル伝達経路に固有の２つの関連共転写因子、ＹＡＰ（Ｙｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）およびＴＡＺ（またはＷＷＴＲ１）は、硬いＥＣＭによって機械的に活性化され、多臓器にわたる細胞の増殖および生存の中心的調節因子として機能し、ゆえに組織の成長および発達を調節している（Dupont S, et al. Nature. 2011;474(7350):179-83; Pan D. Dev Cell. 2010;19(4):491-505）。最近、肺血管の硬化が疾患初期にＹＡＰ／ＴＡＺを活性化し、これによりｍｉＲ−１３０／３０１ファミリーを誘導して、ＰＨにおけるさらなるＥＣＭリモデリングをインビボで増大させることがわかった（Bertero T, et al., Cell Reports. 2015;13(5):1016-32）。ＥＣＭ硬化は、ＰＨにおいて細胞増殖を駆動することもわかったが、これらの機能的関連はかなり重要であるものの、その分子機構は依然として不明なままである。
【０００４】
これとは別に、ミトコンドリアの酸化的リン酸化から解糖へのエネルギー生産の慢性的シフトである好気的解糖が、ＰＨにおける肺動脈内皮および平滑筋増殖ならびに遊走の病原性駆動因子として記載されている（Cottrill KA, and Chan SY. European J. of Clin. Invest. 2013;43(8):855-65により概説されているように）。この代謝シフトに関連したＰＨの先行機構研究は、歴史的に低酸素疾患モデルに依存してきた（Paulin R, and Michelakis ED. Circ. Res. 2014;115(1):148-64; Zhao L, et al. Nature. 2015;524(7565):356-60）。それにもかかわらず、数例を挙げると素因的遺伝子変異、先天性心臓疾患、強皮症、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染などの特発性または続発性状態に関連したＰＨサブタイプの数多くの形態は、明らかな低酸素傷害の非存在下の重度の代謝調節異常も特徴とする。ＰＨにおいて明白な低酸素ストレスとは無関係に機能する代謝機能不全の分子的調節因子に関して、データがようやく明らかになりつつある（Diebold I, et al. Cell Metabolism. 2015;21(4):596-608）。
【０００５】
この観点を踏まえると、増加する証拠は、グルコース消費および好気的解糖に関連したプロセスを含む、ＰＨを超えた状況でのＹＡＰ／ＴＡＺ活性と細胞代謝との重要なつながりを示唆している（Wang W, et al. Nat Cell Biol. 2015;17(4):490-9; Mo JS, et al. Nat Cell Biol. 2015;17(4):500-10; Enzo E, et al. EMBO J. 2015;34(10):1349-70）。しかし、解糖の増加だけでは、そのような増殖細胞の代謝要求全てを満たすには不十分である。トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路も、グルタミンなどのアミノ酸の酸化を介して主要なエネルギー生産源としての役割を果たしている（Le A, et al. Cell metabolism. 2012;15(1):110-21）。ＴＣＡ回路の機能の継続には、炭素中間体の補給を必要とする。この補給、またはアナプレロティック反応は、２つの主な経路、グルタミノリシス（酵素グルタミナーゼ［ＧＬＳ］を介したグルタミンの脱アミド化）およびＡＴＰ依存性ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）を介したピルビン酸のオキサロ酢酸へのカルボキシル化により達成される。詳細には、ＧＬＳ活性を介したグルタミノリシスは、特に急速に増殖している細胞において、細胞エネルギー、炭素、および窒素の動員を可能にすることによりアナプレロティック反応に寄与し（Lunt SY, and Vander Heiden MG. Annu Rev Cell Dev Biol. 2011;27(441-64)）、細胞増殖および生存能を維持するために酸化的リン酸化から解糖へ代謝を切り換えた形質転換細胞における重要なプロセスとして機能を果たす（Zhao Y, et al. Cell Death Dis. 2013;4(e532)）。増殖の直接誘導のためにアスパラギン酸生産を支持するグルタミノリシス（および／またはピルビン酸カルボキシル化）の特定の能力が、悪性腫瘍細胞において最近報告されている（Sullivan LB, et al. Cell. 2015;162(3):552-63; Birsoy K, et al. Cell. 2015;162(3):540-51）。ＰＨでは、不全右室心筋細胞におけるグルタミノリシスの調節異常が観察されている（Piao L, et al. Journal ofmolecural medicine. 2013;91(10):1185-97）。それにもかかわらず、特に肺血管の硬化により駆動される、またはＹＡＰ／ＴＡＺ活性化の関連でのグルタミン代謝の病因的重要性は定義されていない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＥＣＭ硬化により誘導される代謝スイッチが、ＹＡＰ／ＴＡＺの機械的活性化により調整されることを実証する図である（Ａ〜Ｃ）。Ａ）免疫ブロット分析は、ＰＡＥＣにおいて２つの独立したｓｉＲＮＡ配列によるＹＡＰおよびＴＡＺのノックダウンを確認した。Ｂ〜Ｅ）ＰＡＥＣは、軟らかいまたは硬いマトリックスで培養した。細胞内乳酸は硬いマトリックスで増加したが、そのような増加はＹＡＰ／ＴＡＺのｓｉＲＮＡノックダウンにより鈍化した（Ｂ）。硬いマトリックスでは、ＹＡＰ／ＴＡＺノックダウンは、アナプレロティックおよび解糖活性を反映する特異的代謝産物変化（Ｂ）、ならびに乳酸／ピルビン酸比（Ｃ）も鈍化させた。データは平均±ＳＥＭとして表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。スケールバー、２０μｍ（類似の結果がＰＡＳＭＣで見出された、データは示されていない）。
【図２】ＹＡＰ／ＴＡＺが、重要な代謝酵素の転写を制御することを示す図である（Ａ〜Ｈ）。Ａ）配列分析は、ＧＬＳ１、ＬＤＨＡ、およびＰＣのプロモーター領域のＴＥＡＤ結合部位（Ａ〜Ｄとして標識されている）の存在を予測した。Ｂ）ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲは、ＧＬＳ１、ＬＤＨＡ、およびＰＣプロモーター領域のＴＥＡＤ／ＹＡＰ結合部位の存在を確認した。既知のＹＡＰ標的、ＣＴＧＦを陽性対照として使用した。結果は、抗ＹＡＰまたは抗ＩｇＧ対照による免疫沈降前の総インプットＤＮＡのパーセントとして表す。Ｃ〜Ｅ）免疫ブロッティング（Ｄ）および濃度測定（Ｅ）を伴うＲＴ−ｑＰＣＲ（Ｃ）は、硬いマトリックス中のＰＡＥＣにおけるＧＬＳ１、ＬＤＨＡ、およびＰＣ発現の増加が、ＹＡＰ／ＴＡＺノックダウンにより鈍化されることを明らかにした。Ｆ〜Ｈ）ＲＴ−ｑＰＣＲ（Ｆ）および免疫ブロッティング／濃度測定（Ｇ〜Ｈ）は、ＹＡＰ（ｐＹＡＰ）が、軟らかいマトリックス中のＰＡＥＣにおけるＧＬＳ１、ＬＤＨＡ、およびＰＣ発現を増加させることを明らかにした。全てのパネルで、対照群（軟らかいマトリックスで培養されたｓｉＮＣ、ｐＹＡＰ）の平均発現に倍数変化１を割り当て、これと関連試料を比較した。データは平均±ＳＥＭとして表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。スケールバー、２０μｍ（類似の結果がＰＡＳＭＣ（末梢動脈平滑筋細胞）で見出された、データは示されていない）。
【図３】ＧＬＳの薬理学的または遺伝子的阻害が、硬いマトリックスにおけるグルタミノリシスの上方制御を鈍化させることを実証する図である（Ａ〜Ｇ）。Ａ〜Ｃ）ＰＡＥＣにおいて、ターゲットＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、ＧＬＳ（ＢＰＴＥＳまたはＤＯＮ）の薬理学的阻害が、硬いマトリックスにおける代謝産物発現の変化を鈍化させることを明らかにした。具体的には、硬いマトリックス対照（ｓｉ-ＮＣ硬）と比べて、ＧＬＳ１阻害はグルタミン、ピルビン酸、およびコハク酸を増加させ、グルタミン酸およびアスパラギン酸を減少させ（Ａ）、乳酸（Ｂ）および乳酸／ピルビン酸比（Ｃ）を低下させた。Ｄ）免疫ブロット分析は、２つの独立したｓｉＲＮＡ配列によるＧＬＳ１のノックダウンを確認した。Ｅ〜Ｇ）ＰＡＥＣにおいて、ＧＬＳ１ノックダウンは、硬いマトリックスにおける代謝産物発現の変化を鈍化させ、グルタミン、ピルビン酸、およびコハク酸を増加させ、グルタミン酸およびアスパラギン酸を減少させ（Ｅ）、乳酸／ピルビン酸比を低下させた（Ｆ〜Ｇ）。全てのパネルで、対照群（軟らかいマトリックス）の平均発現に倍数変化１を割り当て、これと関連試料を比較した。データは平均±ＳＤとして表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図４】モノクロタリン曝露ラットにおけるメカノトランスダクションの操作は、グルタミノリシス低下肺血管増殖に影響を与え、ＰＡＨを予防することを実証する図である（Ａ〜Ｉ）。Ａ〜Ｂ）モノクロタリン曝露後、ラットを、毎日ＢＡＰＮもしくはビヒクル（Ａ）またはビヒクルもしくはベルテポルフィンの毎日腹腔内注射（Ｂ）のどちらかで治療した。Ｃ）ＢＡＰＮおよびベルテポルフィンのいずれも、モノクロタリン曝露ラットの肺のＬＯＸ活性を低下させた。Ｄ）原子間力顕微鏡法は、ＢＡＰＮおよびベルテポルフィン治療ラットにおける肺細動脈（＜１００ｍｍ）硬化を減少させることを明らかにした。黒い線は中央値を表す；記号は個々のＰＡ測定値を表す。Ｅ〜Ｆ）ＰＡＨ  ＣＤ３１＋細胞のＲＴ−ｑＰＣＲは、ＢＡＰＮおよびベルテポルフィン治療ラットにおける２つのＹＡＰ／ＴＡＺ標的遺伝子、ＣＴＧＦおよびＣＹＲ６１の減少、ならびにＧＬＳ発現（Ｅ）および活性（Ｆ）の低下を明らかにした。Ｇ）ヘマトキシリン／エオシン着色および同時免疫蛍光顕微鏡法（co-immunofluorescence microscopy）は、ビヒクルラットと比べたＢＡＰＮおよびベルテポルフィン治療ラットにおける血管厚および筋肉化の減少ならびにＹＡＰ１＋細胞の減少、ＧＬＳ１血管強度の低下、ならびにＣＤ３１／ＰＣＮＡおよびα−ＳＭＡ／ＰＣＮＡ二重陽性細胞の減少を明らかにした。Ｈ〜Ｉ）ベルテポルフィンおよびより低程度でＢＡＰＮは、ＲＶＳＰにより定量化したＰＡＨ重症度を改善した（Ｉ）。全てのパネルで、対照群の平均発現に倍数変化１を割り当て、これと関連試料を比較した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。スケールバー、５０μｍ。
【図５】モノクロタリン曝露ラットにおけるＧＬＳの薬理学的阻害が、グルタミノリシスおよび関連する肺血管細胞増殖を減少させたことを示す図である（Ａ〜Ｈ）。モノクロタリン疾患誘導後、ラットを、実験プロトコールの模式図に記載されたビヒクル、ＧＬＳａｓの２つの薬理学的阻害剤、Ｃ９６８またはＣＢ８３９の毎日腹腔内注射で治療した（Ａ〜Ｂ）。Ｃ〜Ｄ）Ｃ９６８（Ｃ）またはＣＢ８３９（Ｄ）のどちらかは、モノクロタリン曝露ラットの肺におけるＧＬＳ活性を低下させた。Ｅ〜Ｈ）同時免疫蛍光顕微鏡法は、疾患肺細動脈におけるＫｉ６７／ＰＣＮＡ陽性増殖細胞を明らかにした（ビヒクル）。Ｃ９６８またはＣＢ８３９のどちらかは、α−ＳＭＡ＋内側（Ｇ〜Ｈ）およびＣＤ３１／ｖＷＦ＋内皮（Ｅ〜Ｆ）区画中のＫｉ６７／ＰＣＮＡ陽性細胞の数を減少させた。全てのパネルで、対照群の平均発現に倍数変化１を割り当て、これと関連試料を比較した。データは平均±ＳＥＭとして表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。スケールバー、５０μｍ。
【図６】モノクロタリン曝露ラットにおけるＧＬＳの薬理学的阻害が、ＰＡＨ症状発現を改善したことを示す図である（Ａ〜Ｈ）。予防実験（Ｃ９６８）または反転試験のいずれでも、モノクロタリン注射後、グルタミノリシスの阻害は、血管リモデリングにより定量化したＰＡＨ重症度（Ａ〜Ｂ）、細動脈筋肉化（Ｃ〜Ｄ）、ＲＶＳＰ（Ｅ〜Ｇ）、および右室肥大（フルトン指数、ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ）（Ｈ）を改善した。全てのパネルで、対照群の平均発現に倍数変化１を割り当て、これと関連試料を比較した。データは平均±ＳＥＭとして表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。スケールバー、５０μｍ。
【図７】ＧＬＳ１の遺伝子的または薬理学的阻害が、ＰＡＥＣ増殖を制御するが、アポトーシスは制御しないことを示す図である（Ａ〜Ｃ）。Ａ〜Ｃ）ＰＡＥＣを軟らかい（１ｋＰａ）または硬い（５０ｋＰａ）マトリックスにプレーティングし、示された治療に曝露させた。アポトーシス（Ａ〜Ｃ）および増殖（Ｂ〜Ｃ）をプレーティング４８時間後に定量化した。Ａ）酵素アッセイは、軟らかいマトリックスおよび、程度は比較的低いが硬いマトリックスにおける血清枯渇２４時間後のカスパーゼ３／７活性の増加を明らかにした。対照治療（ビヒクル対照；ｓｉＲＮＡスクランブル対照、ｓｉＮＣ）と比較して、ＧＬＳ１の薬理学的阻害剤（ＢＰＴＥＳ、Ｃ９６８）の存在下、または２つの独立したｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＧＬＳ１＿１、ｓｉＧＬＳ１＿２）によるＧＬＳ１ノックダウン後、有意な変化は観察されなかった。Ｂ〜Ｃ）免疫蛍光顕微鏡法（Ｂ）および定量化（Ｃ）により明らかにされたように、増殖はマトリックス硬化により増加した（ＰＣＮＡ＋染色に反映された）が、薬理学的ＧＬＳ１阻害により減少した。アポトーシス（切断カスパーゼ３染色、ＣＣ−３＋に反映された）は、軟および硬条件のいずれにおいても血清飢餓により増加したが、ＧＬＳ１阻害による影響を受けなかった。全てのパネルで、対照群（軟らかいマトリックス）の平均発現に倍数変化１を割り当て、これと関連試料を比較した。データは平均±ＳＤとして表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図８】細動脈周囲の線維性コラーゲンの増加が、ＰＡＨの複数の形態に罹患しているヒト患者におけるＧＬＳ、グルタミノリシス、およびアスパラギン酸生産の増加と相関していることを示す図である（Ａ〜Ｅ）。Ａ〜Ｂ）同時免疫蛍光顕微鏡法および定量化は、細動脈周囲の線維性コラーゲン沈着の増加が、ヒトＰＡＨ（ｎ＝６）においてＬＤＨＡ（Ａ）およびＰＣ（Ｂ）発現の増加を伴うことを明らかにした。そのような染色は、疾患肺細動脈におけるＹＡＰ１／ＬＤＨＡ（Ａ）およびＹＡＰ１／ＰＣ（Ｂ）二重陽性細胞の増加をさらに実証した。Ｃ）これらの変化は、内側（α−ＳＭＡ＋）および内皮（ｖＷＦ＋）区画の両方で増殖肺血管細胞（Ｋｉ６７＋）の増加、ならびに血管アポトーシス細胞（ＣＣ−３＋）の有意な低減を伴った。Ｄ〜Ｅ）類似の変化が網状病変で観察された。
【図９】疾患促進細胞外マトリックス（pro-diseased extracellular matrix）を構築するために、グルタミノリシスが活性化ＰＡＡＦの代謝要求を維持することを実証する図である（Ａ〜Ｌ）。Ａ〜Ｃ）ＢＰＴＥＳ、Ｃ９６８またはＣＢ８３９のいずれかによるＧＬＳ１の薬理学的阻害は、グルタミノリシス（Ａ）、解糖（Ｂ）、およびアスパラギン酸生産（Ｃ）の減少に反映される、硬いマトリックス上で培養したＰＡＡＦの代謝活性化を鈍化させた。Ｄ〜Ｅ）ＢＰＴＥＳ、Ｃ９６８またはＣＢ８３９のいずれかによるＧＬＳ１の薬理学的阻害は、炎症促進性サイトカイン（ＥＤＮ１、ＩＬ６またはＴＧＦ−ｂ）により刺激すると、ＰＡＡＦ依存性ＥＣＭリモデリングを減少させた。Ｆ）ＲＴ−ｑＰＣＲは、Ｃ９６８またはＣＢ８３９のどちらかによるＧＬＳ１の阻害が、ＴＧＦ−ｂ誘導ＥＣＭ関連遺伝子発現および線維芽細胞活性化マーカー（ａ−ＳＭＡ）を減少させることを明らかにした。Ｇ〜Ｈ）ピクロシリウスレッド染色による線維性コラーゲン可視化（Ｇ）および定量化（Ｈ）は、ＧＬＳ１阻害剤の存在下の活性化ＰＡＡＦ（ＴＧＦ−ｂ）によるＥＣＭリモデリングの減少を確認した。Ｉ〜Ｍ）ＰＡＡＦは示された治療で培養した。細胞を除去し、肺動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）を、ＰＡＡＦにより合成したマトリックス上で培養した。ＰＣＮＡ染色（Ｉ）および定量化は、対照（ＴＧＦ−ｂ）と比べて、ＴＧＦ−ｂ＋ＧＬＳ１阻害剤で治療したＰＡＡＦによりリモデリングされたマトリックス上の増殖細胞（ＰＣＮＡ＋）の減少を明らかにした。同じ条件で、ＲＴ−ｑＰＣＲは、対照（ＴＧＦ−ｂ）と比べて、ＴＧＦ−ｂ＋ＧＬＳ１阻害剤で治療したＰＡＡＦにより合成したマトリックス上で培養したＰＡＥＣによる炎症促進性サイトカイン遺伝子発現（Ｊ〜Ｌ）の減少を明らかにした。データは、３通りで行った少なくとも３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして表す（＊Ｐ＜０．０５、§Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．００１）。対試料は両側Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定により比較し、一方、一元配置ＡＮＯＶＡおよび事後テューキー検定は群比較に使用した。
【図１０】ＥＣＭリモデリングまたはＧＬＳ１の薬理学的阻害が、ＥＣＭ硬化とグルタミノリシスの間のフィードバックループを明らかにすることを示す図である（Ａ〜Ｆ）。Ａ〜Ｄ）モノクロタリン曝露後、ラットを、毎日ＢＡＰＮ（ｎ＝８）対ビヒクル（Ａ〜Ｂ；ｎ＝７）または別個のベルテポルフィンの毎日ｉ．ｐ．注射（ｎ＝６）対別個のビヒクル（Ｃ〜Ｄ；ｎ＝６）で治療した。ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価した場合、ＢＡＰＮおよびベルテポルフィンのいずれも、モノクロタリン曝露ラットの肺におけるＧＬＳ１発現を減少させた。Ｅ〜Ｆ）モノクロタリン曝露後、ラットを毎日ＣＢ８３９（ｎ＝８）対ビヒクル（Ｅ〜Ｆ；ｎ＝７）で治療した。原子間力顕微鏡法（Ｆ）は、ＣＢ８３９治療ラットにおける肺細動脈（直径＜１００μｍ）硬化の減少を明らかにした。横線は中央値を表す；記号は個々の肺動脈測定値を表す。全てのパネルで、対照群の平均発現に倍数変化１を割り当て、これと関連試料を比較した。対試料は両側Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定により比較し、一方、一元配置ＡＮＯＶＡおよび事後テューキー検定を群比較に使用した（＊Ｐ＜０．０５、＃Ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書において、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物および／またはＧＬＳ１阻害組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、対象における肺血管疾患を治療するための組成物および方法が、提供される。いくつかの実施形態において、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物は、ベルテポルフィン、その塩、プロドラッグ、または誘導体である。他のまたはさらなる実施形態において、ＧＬＳ１阻害組成物は、ＣＢ−８３９、その塩、プロドラッグ、または誘導体である。本出願全体を通して使用される用語は、当業者にとって通常のおよび典型的な意味で解釈されるべきである。しかし、本出願者は、以下の用語が以下に定義する特定の定義を与えられることを望む。
【０００８】
定義
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が特に明確に指示しない限り複数の言及を含む。例えば、用語「細胞（a cell）」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【０００９】
用語「投与すること」は、経口、局所、静脈内、皮膚、皮下、経皮（transcutaneous）、経皮（transdermal）、筋肉内、関節内（intra-joint）、非経口、細動脈内、皮内、脳室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻内、直腸、膣である投与、吸入または埋め込みリザーバーによる投与を指す。用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内（intra-articular）、滑液嚢内、胸骨内、莢膜内、肝内、病巣内、および頭蓋内注射または注入手法を含む。一実施形態において、投与は静脈内である。
【００１０】
範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして本明細書において表され得る。そのような範囲が表される場合、別の態様は、一方の特定の値からおよび／または他方の特定の値までを含む。同様に、値が、先行する「約」を用いて近似値として表される場合、特定の値は別の態様を形成することが理解されよう。各々の範囲の端点は、他方の端点と関連していても、および他方の端点とは無関係でも重要であることがさらに理解されよう。本明細書に開示された、いくつかの値があること、および各値は、該値自体に加えて、その特定の値の「約」としても本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示されるならば、「約１０」もまた開示される。ある値が開示されるとき、該値「以下」、「該値以上」、および値間の考えられる範囲もまた、当業者によって適切に理解されるように開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示されるならば、「１０以下」および「１０以上」もまた開示される。本出願全体を通して、データはいくつかの異なる形式で提供され、このデータは、端点および始点、およびデータ点の任意の組合せに対する範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点「１５」が開示されるならば、１０から１５の間だけでなく、１０および１５を超える、１０および１５以上、１０および１５未満、１０および１５以下、ならびに１０および１５と同等も開示されると見なされることが理解される。２つの特定のユニット間の各ユニットもまた開示されることも理解される。例えば、１０および１５が開示されるならば、１１、１２、１３、および１４もまた開示される。
【００１１】
用語「ＣＢ−８３９」は、本明細書において、以下に示すような、ならびに／または米国特許第８，６０４，０１６号明細書および／もしくは米国特許第８，８６５，７１８号明細書に記載された化学構造を有する化学組成物を指す。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
「組成物」は、活性剤（例えば、ベルテポルフィンおよび／またはＣＢ−８３９組成物）および不活性（例えば、検出可能な薬剤または標識）またはアジュバントなどの活性な別の化合物または組成物の組合せを含むことが意図される。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「含む」は、組成物および方法は列挙された要素を含むが、他の要素を排除しないことを意味することが意図される。組成物および方法を定義するのに使用される場合、「から本質的になる」は、該組合せにとって任意の本質的な重要性を持つ他の要素を排除することを意味するものとする。ゆえに、本明細書に定義された要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量の混入物、ならびに例えば、リン酸緩衝食塩水、保存料などの薬学的に許容される担体を排除しない。「からなる」は、他の成分の微量を超える要素および本発明の組成物を投与するための実質的な方法ステップを排除することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００１５】
「対照」は、比較目的で実験において使用される代替の対象または試料である。対照は、「陽性」または「陰性」であり得る。
【００１６】
用語「疾患」は、感染、炎症、環境要因、または遺伝的欠損などのさまざまな原因から生じ、徴候、症状、または両方の同定可能な群を特徴とする対象の一部、臓器、または全身の異常状態を指す。いくつかの実施形態において、疾患は癌である。
【００１７】
「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１つまたは複数の投与、適用または投与量で投与することができる。
【００１８】
用語「ＧＬＳ１阻害組成物」は、本明細書において、対象または血管細胞に投与されると、（部分的または完全に）ＧＬＳ１を減少または不活性化させる任意の組成物を指す。いくつかの実施形態において、用語「ＧＬＳ１阻害組成物」は、本明細書において、対象または血管細胞に投与され、ＧＬＳ１を減少または不活性化させる場合、肺高血圧症、肺動脈高血圧症および／または血管硬化も治療する任意の組成物を指す。ＧＬＳ１阻害組成物の非限定的な例は、本明細書に記載されたＣＢ−８３９、Ｃ−９６８、ＤＯＮおよびＢＰＴＥＳである。
【００１９】
用語「ＧＬＳ１」は、本明細書において、グルタミナーゼおよびヒトにおけるＫ−グルタミナーゼとしても知られるＧＬＳ１ポリペプチドを指し、ＧＬＳ遺伝子によりコードされる。用語「ＧＬＳ１ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドをコードするＧＬＳ１を指し、その全体またはその断片にＧＬＳ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＧＬＳ１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、次のような１つまたは複数の公表されているデータベースにおいて同定されるものである：ＨＧＮＣ：４３３１；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：２７４４；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１５４１９；ＯＭＩＭ：１３８２８０；およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ９４９２５。いくつかの実施形態において、ＧＬＳ１ポリヌクレオチドは、配列番号３の配列（ＫＧＡアイソフォームとして知られる）を含むＧＬＳ１ポリペプチド、または配列番号３と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、または配列番号３の一部分を含むポリペプチドをコードする。配列番号３のＧＬＳ１ポリペプチドは、成熟ＴＡＺの未成熟型またはプロセシング前型を表してもよく、したがって、本明細書に含まれるのは、配列番号３のＧＬＳポリペプチドの成熟部分またはプロセシング部分である。いくつかの例において、ＧＬＳ１ポリペプチドは、その配列が配列番号３とは次のように異なるＧＡＣアイソフォームである：５５１〜６６９：ＶＫＳＶＩＮＬＬＦＡ・・・ＴＶＨＫＮＬＤＧＬＬ→ＨＳＦＧＰＬＤＹＥＳ・・・ＹＲＭＥＳＬＧＥＫＳ。
【００２０】
治療目的のための「哺乳動物」は、ヒト、飼育動物および家畜、ヒト以外の霊長類、ならびに例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの動物園動物、競技用動物、または愛玩動物を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。
【００２１】
「医薬組成物」は、活性剤と、組成物をインビボでまたはエクスビボでの診断的または治療的使用に適したものにする不活性または活性な薬学的に許容される担体との組合せを含むことが意図される。
【００２２】
用語「薬学的に許容される担体」は、一般に安全および無毒な医薬組成物を調製する上で有用である担体または賦形剤を意味し、獣医学的および／またはヒトの薬学的用途に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、リン酸緩衝食塩水溶液、水、および油／水または水／油エマルジョンなどのエマルジョン、およびさまざまなタイプの湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれをも包含する。本明細書で使用される場合、用語「担体」は、医薬製剤における使用のための、および以下にさらに記載される任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、または当技術分野で周知の他の材料を包含する。医薬組成物はまた、保存料も含むことができる。「薬学的に許容される担体」は本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つまたは１つを超えるそのような担体のいずれをも含む。
【００２３】
用語「薬学的有効量」、「治療有効量」、または「治療有効用量」は、研究者、獣医、医師または他の臨床家により探求されている組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物および／またはＧＬＳ１阻害組成物などの組成物の量を指す。いくつかの実施形態において、所望の応答は、肺高血圧症、肺動脈高血圧症および／または肺血管硬化などの血管疾患の治療である。そのような治療は、右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）、右室肥大（フルトン指数、ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ）、血管リモデリング、および細動脈筋肉化の１つまたは複数を決定して定量化することができる。
【００２４】
いくつかの例において、所望の生物学的または医学的応答は、組成物の複数の投与量を数日、数週、または数年間にわたって対象に投与した後に達成される。用語「薬学的有効量」、「治療有効量」、または「治療有効用量」は、投与されたとき、治療下の疾患の１つもしくは複数の症状の出現を予防する、またはある程度軽減するのに十分な、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物および／またはＧＬＳ１阻害組成物などの組成物のその量を含む。治療有効量は、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物および／またはＧＬＳ１阻害組成物などの組成物、疾患およびその重症度、投与経路、投与時期、排せつ速度、薬物の組合せ、治療医の判断、剤形、ならびに治療される対象の年齢、体重、全般的健康、性別および／または食生活に応じて異なる。本方法との関連において、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物および／またはＧＬＳ１阻害組成物の薬学的または治療有効量もしくは用量は、肺高血圧症、肺動脈高血圧症および／または肺血管硬化を治療するのに十分な量を含む。
【００２５】
用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、およびその文法的変形は、本明細書で使用される場合、疾患および／または１つもしくは複数のその付随症状の発症または再発を部分的または完全に遅延または防止する、あるいは対象が疾患に罹患または再罹患するのを部分的または完全に阻止する、あるいは疾患または１つもしくは複数のその付随症状に罹患または再罹患する対象のリスクを部分的または完全に低減する方法を指す。
【００２６】
用語「肺血管疾患」は、肺血管高血圧を指すのに本明細書で使用され、肺高血圧症（ＰＨ）および肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）のいずれをも含む。肺血管疾患は、肺血管硬化に起因し得、および／または肺血管硬化を含む。
【００２７】
「塩」とは、本明細書に定義されているように水溶性もしくは油溶性または分散性であり、治療的に許容される、本明細書に開示された化合物の両イオン性形態を意味する。塩は、化合物の最終単離および精製中に調製されてもよく、または遊離塩基の形態の適切な化合物を適切な酸と反応させて別個に調製されてもよい。適切な塩のリストは、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000, p. 704；および"Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use," P. Heinrich Stahl and Camille G. Wermuth, Eds., Wiley-VCH, Weinheim, 2002に見出される。塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、およびカルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、Ｌ−アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ベシル酸塩）、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸、ジグルコン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、ゲンチジン酸塩、グルタル酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、馬尿酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、ＤＬ−マンデル酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ホスホン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ピログルタミン酸塩、コハク酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、Ｌ−酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、パラトルエンスルホン酸塩（ｐ−トシレート）、およびウンデカン酸塩が挙げられる。同様に、本明細書に開示された化合物中の塩基性基は、メチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化物、臭化物、ならびにヨウ化物；ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミル硫酸塩；デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリルの塩化物、臭化物ならびにヨウ化物；ならびにベンジルおよびフェネチルの臭化物で四級化することができる。治療的に許容される付加塩を形成するのに用いることができる酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにシュウ酸、マレイン酸、コハク酸、およびクエン酸などの有機酸が挙げられる。塩は、化合物と、アルカリ金属イオンまたはアルカリ土類イオンとの配位により形成することもできる。それゆえに、本明細書に開示された化合物のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩などが形成され得る。
【００２９】
塩基性付加塩は、金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、もしくは重炭酸塩などの適切な塩基、またはアンモニアもしくは有機第１級アミン、第2級、もしくは第3級アミンとカルボキシ基を反応させて、化合物の最終単離および精製中に調製されてもよい。治療上許容される塩のカチオンとしては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン、およびＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどの非毒性第４級アミンカチオンが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機 アミンとしては、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、およびピペラジンが挙げられる。
【００３０】
「プロドラッグ」とは、生理的条件下で治療的に活性な化合物に変換される化合物を意味する。プロドラッグは、不活性の（または著しく低い活性の）形態で投与される。投与されると、プロドラッグは体内で（インビボで）活性化合物に代謝される。本明細書に開示されたある特定の化合物は、Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism: Chemistry, Biochemistry, and Enzymology（Testa, Bernard and Mayer, Joachim M. Wiley-VHCA, Zurich, Switzerland 2003）に記載されているようにプロドラッグとしても存在することができる。本明細書に記載された化合物のプロドラッグは、生理的条件下で容易に化学変化を受けて化合物をもたらす、化合物の構造的に修飾された形態である。さらに、プロドラッグは、エクスビボ環境で化学的または生化学的方法により化合物に変換されてもよい。例えば、プロドラッグは、適切な酵素または化学試薬と共に経皮パッチリザーバーに入れられる場合、化合物にゆっくり変換され得る。プロドラッグは、いくつかの状況において、その化合物または親薬物より投与することが容易であり得るため、しばしば有用である。プロドラッグは、例えば、経口投与により生体利用可能となり得るのに対し、親薬物はそうではない。プロドラッグは、親薬物よりも医薬組成物における改善された可溶性を有することもできる。プロドラッグの加水分解的切断または酸化活性化に依存するものなど、多種多様なプロドラッグ誘導体が当技術分野で知られている。限定するものではないが、プロドラッグの例は、エステル（「プロドラッグ」）として投与されるが、次いで活性実体であるカルボン酸に代謝的に加水分解される化合物である。さらなる例としては、化合物のペプチジル誘導体が挙げられる。
【００３１】
適切なプロドラッグを選択および調製するための方法は、例えば、以下に提供されている：T. Higuchi and V. Stella, “Prodrugs as Novel Delivery Systems,” Vol. 14, ACS Symposium Series, 1975；H. Bundgaard, Design of Prodrugs, Elsevier, 1985；およびBioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987。活性化合物のプロドラッグは、従来のエステルであってもよい。プロドラッグとして利用されているいくつかの一般的なエステルは、フェニルエステル、脂肪族（Ｃ７〜Ｃ８またはＣ８〜Ｃ２４）エステル、コレステロールエステル、アシルオキシメチルエステル、カルバミン酸エステル、およびアミノ酸エステルである。好ましくは、本明細書に開示された化合物のプロドラッグは薬学的に許容される。
【００３２】
用語「対象」は、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含むが、これらに限定されない哺乳動物などの動物を含むように本明細書では定義される。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容される置換基を含むことが企図される。広範な態様において、許容される置換基としては、有機化合物の非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式およびヘテロ環式、ならびに芳香族および非芳香族置換基が挙げられる。例示的置換基としては、例えば、以下に記載されたものが挙げられる。許容される置換基は、１つまたは複数であってもよく（例えば、「二置換された」、「三置換された」などと呼ばれる）、適切な有機化合物に関して同じであってもまたは異なっていてもよい。本開示の目的のために、窒素および酸素などのヘテロ原子は、水素置換基、および／またはヘテロ原子の原子価を満たす本明細書に記載された有機化合物の任意の許容される置換基を有してもよい。本開示は、有機化合物の許容される置換基によりいかなる形でも限定されることを企図しない。同様に、用語「置換」または「〜で置換された」は、そのような置換が、置換原子および置換基の許容原子価と一致しており、ならびに置換が安定な化合物、例えば、転位、環化、脱離などによる変換を自発的に受けない化合物をもたらすという暗黙の条件を含む。同様に、本明細書で使用される場合「置換」または「〜で置換された」は、１つの置換基が別の置換基に融合される立体配置を包含すると意味される。例えば、アリール基で置換されたアリール基（またはその逆）は、１つのアリール基が単一のシグマ結合を介して第２のアリール基に結合されること、および同様に、２つのアリール基が融合される、例えば、一方のアリール基の２つの炭素が他方のアリール基の２つの炭素と共有されることを意味し得る。
【００３４】
用語「治療する」、「治療すること」、「治療」およびそれらの文法的変形は、本明細書で使用される場合、疾患の１つもしくは複数の付随症状の強度を部分的もしくは完全に遅延、軽減、緩和もしくは低減すること、ならびに／または疾患の１つもしくは複数の原因を軽減、緩和もしくは妨害することを含む。本発明による治療は、予防的、防止的、対症的、または救済的に適用され得る。防止的治療は、発症前（例えば、疾患の明らかな徴候前）、初期発症中（例えば、疾患の最初の徴候および症状時）、または疾患の発生の確立後に対象に投与される。防止的投与は、感染症状の症状発現前に数日から数年にわたって生じ得る。いくつかの例において、用語「治療する」、「治療すること」、「治療」およびそれらの文法的変形は、対象の治療前と比較して、または一般もしくは試験集団におけるそのような症状の発生と比較して、肺高血圧症、肺動脈高血圧症および／または血管硬化を部分的または完全に低減することを含む。低減は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％以上であってもよい。
【００３５】
用語「ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物」は、本明細書において、対象または血管細胞に投与されると、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの成分を減少または不活性化させる任意の組成物を指す。いくつかの実施形態において、用語「ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害組成物」は、本明細書において、対象または血管細胞に投与され、ＹＡＰおよび／またはＴＡｚを減少または不活性化させる場合、肺高血圧症、肺動脈高血圧症および／または血管硬化の低減をもたらす任意の組成物を指す。
【００３６】
用語「ＴＡＺ」は、本明細書において、ＷＷＴＲ１またはＷＷ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １としても知られるポリペプチドを指す。用語「ＴＡＺポリヌクレオチド」は、ＴＡＺ／ＷＷＴＲ１コードポリヌクレオチドを指し、その全体またはその断片にＴＡＺ／ＷＷＴＲ１遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＴＡＺ／ＷＷＴＲ１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、１つまたは複数の公表されているデータベースにおいて次のように同定されるものである：ＨＧＮＣ：２４０４２；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：２５９３７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８４０８；ＯＭＩＭ：６０７３９２；およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＧＺＶ５。いくつかの実施形態において、ＴＡＺポリヌクレオチドは、配列番号１の配列、または配列番号１と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、あるいは配列番号１の一部分を含むポリペプチドを含むＴＡＺポリペプチドをコードする。配列番号１のＴＡＺポリペプチドは、成熟ＴＡＺの未成熟型またはプロセシング前型を表してもよく、したがって、本明細書に含まれるのは、配列番号１中のＴＡＺポリペプチドの成熟部分またはプロセシング部分である。
【００３７】
用語「ＹＡＰ」は、本明細書において、ＹＡＰ１、Ｙｅｓ関連タンパク質１（Ｙｅｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、またはＹａｐ６５としても知られるＹＡＰポリペプチドを指し、ヒトにおいては、ＹＡＰ１遺伝子によりコードされる。用語「ＹＡＰポリヌクレオチド」は、ＹＡＰコードポリヌクレオチドを指し、その全体またはその断片にＹＡＰ１遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＹＡＰポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、１つまたは複数の公表されているデータベースにおいて次のように同定されるものである：ＨＧＮＣ：１６２６２；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：１０４１３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３７６９３；ＯＭＩＭ：６０６６０８；およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４６９３７。いくつかの実施形態において、ＹＡＰポリヌクレオチドは、配列番号２の配列、または配列番号２と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、もしくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、あるいは配列番号２の一部分を含むポリペプチドを含むＹＡＰポリペプチドをコードする。配列番号２のＹＡＰポリペプチドは、成熟ＹＡＰの未成熟型またはプロセシング前型を表してもよく、したがって、本明細書に含まれるのは、配列番号２中のＹＡＰポリペプチドの成熟部分またはプロセシング部分である。
【００３８】
用語「ベルテポルフィン」は、本明細書において、以下に示すような、ならびに／または米国特許第５，７０７，６０８号明細書、米国特許第５，７９８，３４５号明細書、および／もしくは米国特許第５，７５６，５４１号明細書に記載された化学構造を有する、化学名３−［（２３Ｓ，２４Ｒ）−１４−エテニル−５−（３−メトキシ−３−オキソプロピル）−２２，２３−ビス（メトキシカルボニル）−４，１０，１５，２４−テトラメチル−２５，２６，２７，２８−テトラアザヘキサシクロ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］オクタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１−ドデカエン−９−イル］プロパン酸を有する化学組成物を指す。
【００３９】
【化２】
2019519533.tif 000004
【００４０】
化合物および組成物
本明細書において、肺高血圧症を治療し、肺動脈高血圧症を治療し、血管硬化を低減し、ならびに／またはＹＡＰ／ＴＡＺおよび／もしくはＧＬＳ１媒介経路を阻害するための化合物が開示される。肺高血圧症を治療し、肺動脈高血圧症を治療し、血管硬化を低減し、ならびに／またはＹＡＰ／ＴＡＺおよび／もしくはＧＬＳ１媒介経路を阻害するための化合物は、ベルテポルフィン、ＣＢ−８３９、またはそれらのプロドラッグ、誘導体、塩、溶媒和物、もしくはそれらの組合せであってもよい。本明細書に記載れた化合物の１つまたは複数を含有する医薬組成物は、薬学的に許容される担体を用いて調製することができる。「薬学的に許容される」担体は、妥当なベネフィット／リスク比に見合った、過度の有害な副作用（毒性、刺激、およびアレルギー応答など）がなく、ヒトおよび／または動物との使用に適したものである。担体は、活性成分以外の医薬組成物中に存在する全ての成分である。担体としては、希釈剤、結合剤、滑沢剤、崩壊薬、ｐＨ調節剤、保存料、抗酸化剤、可溶化促進剤、安定剤、界面活性剤、およびコーティング組成物が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００４１】
希釈剤は、「充填剤」とも呼ばれており、典型的には、錠剤の圧縮またはビーズ剤および顆粒剤の形成のための実用的なサイズが提供されるように、固体剤形の嵩を増すのに必要である。適切な希釈剤としては、リン酸二カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、加水分解デンプン、α化デンプン、二酸化シリコーン、酸化チタン、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、および粉末糖が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
結合剤は、固体投与製剤に粘着性質を与え、ゆえに錠剤またはビーズ剤もしくは顆粒が、該剤形の形成後に元の形を保つことを確保するために使用される。適切な結合剤材料としては、デンプン、α化デンプン、ゼラチン、糖（スクロース、グルコース、デキストロース、ラクトース、およびソルビトールを含む）、ポリエチレングリコール、ワックス、アカシア、トラガカントなどの天然および合成ゴム、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロースを含むセルロース、およびビーガム（veegum）、ならびにアクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマー、メタクリル酸メチルコポリマー、メタクリル酸アミノアルキルコポリマー、ポリアクリル酸／ポリメタクリル酸、およびポリビニルピロリドンなどの合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
滑沢剤は、錠剤の製造を促進するのに使用される。適切な滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセロール、ポリエチレングリコール、タルク、および鉱油が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
崩壊剤は、投与後の剤形の崩壊または「分解」を促進するのに使用され、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルデンプンナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、α化デンプン、粘土、セルロース、アルギニン、ゴム、または架橋ＰＶＰ（ＧＡＦ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ製のＰｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ  ＸＬ）などの架橋ポリマーが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４５】
安定剤は、例として酸化反応を含み得る薬物分解反応を阻害または遅延させるのに使用される。
【００４６】
界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、両性または非イオン性表面活性剤であってもよい。適切なアニオン性界面活性剤には、カルボン酸イオン、スルホン酸イオン、および硫酸イオンを含有するものが挙げられ得るが、これらに限定されない。アニオン性界面活性剤の例としては、長鎖アルキルスルホン酸およびアルキルアリールスルホン酸のナトリウム、カリウム、アンモニウム（ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなど）、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム（ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなど）、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム（ビス−（２−エチルチオキシル）−スルホコハク酸ナトリウムなど）、ならびにアルキル硫酸塩（ラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられる。カチオン性界面活性剤には、第４級アンモニウム化合物（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウムなど）、ポリオキシエチレンおよびココナッツアミンが挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤の例としては、モノステアリン酸エチレングリコール、ミリスチン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、オレイン酸ポリグリセリル−４、ソルビタンアシレート、スクロースアシレート、ラウリン酸ＰＥＧ−１５０、モノラウリン酸ＰＥＧ−４００、モノラウリン酸ポリオキシエチレン、ポリソルベート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ＰＥＧ−１０００セチルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリプロピレングリコールブチルエーテル、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（商標）４０１、ステアロイルモノイソプロパノールアミド、およびポリオキシエチレン水添タロウアミドが挙げられる。両性界面活性剤の例としては、Ｎ−ドデシル−β−アラニンナトリウム、Ｎ−ラウリル−β−イミノジプロピオン酸ナトリウム、ミリストアンホアセテート（myristoamphoacetate）、ラウリルベタインおよびラウリルスルホベタインが挙げられる。
【００４７】
コーティング組成物には、可塑剤、顔料、着色剤、安定化剤、および滑剤が挙げられ得る。適切なコーティング材料の例としては、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネートなどのセルロースポリマー；ポリビニルアセテートフタレート、アクリル酸ポリマーおよびコポリマー、ならびに商品名ＥＵＤＲＡＧＩＴ（商標）（Ｒｏｔｈ  Ｐｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔｅｒｓｔａｄｔ、ドイツ）で市販されているメタクリル樹脂、ゼイン、セラック、および多糖が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書に開示された化合物および組成物は、不活性希釈剤などの薬学的に許容される担体、または経口送達用の吸収可能な可食担体と場合により組み合わせて、静脈内または経口投与など全身投与することができる。該組成物は、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、または患者の食事の食べ物と共に直接取り込まれてもよい。経口治療投与には、活性化合物は、１つまたは複数の賦形剤と組み合わされてもよく、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤、エアロゾルスプレー剤等の形態で使用されてもよい。
【００４９】
錠剤、トローチ剤、丸薬、カプセル剤などは、以下のものを含有することもできる：ガムトラガカント、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびスクロース、フルクトース、ラクトースもしくはアスパルテームなどの甘味剤、またはペパーミント、冬緑油、もしくはサクランボ香味料などの香味剤が添加されてもよい。単位剤形がカプセルである場合、上記のタイプの材料に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含有してもよい。さまざまな他の材料が、コーティング剤として、またはさもなければ固体単位剤形の物理的形態を変更するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、セラック、または糖などでコーティングされてもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、保存料としてメチルおよびプロピルパラベン、サクランボまたはオレンジフレーバーなどの色素および香味料を含有してもよい。当然ながら、任意の単位剤形を調製する上で使用される任意の材料は、薬学的に許容され、用いられる量において実質的に無毒であるべきである。さらに、活性化合物は、持続放出調製物およびデバイスに組み込まれてもよい。
【００５０】
本明細書に開示された化合物および組成物、それに加えてそれらの薬学的に許容される塩、水和物、プロドラッグ、または誘導体などは、注入または注射により静脈内、筋肉内、または腹腔内に投与することができる。活性剤またはその塩の溶液は、場合により非毒性界面活性剤と混合して、水中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製することもできる。貯蔵および使用の通常の条件下、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存料を含有することができる。
【００５１】
注射または注入に適した医薬剤形には、場合によりリポソームにカプセル化された、滅菌した注射もしくは注入可能な溶液または分散液の即時調製に適合された、活性成分を含む滅菌水溶液もしくは分散液または滅菌粉末が挙げられ得る。最終的な剤形は、製造および貯蔵の条件下で滅菌、流体および安定であるべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または液体分散媒であってもよい。適当な流動性は、例えば、リポソームの形成、分散液の場合は必要とされる粒径の維持、または界面活性剤の使用により維持され得る。場合により、微生物作用の予防が、さまざまな他の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらされ得る。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、緩衝液、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの包含によりもたらされ得る。
【００５２】
滅菌注射可能溶液は、必要量の本明細書に開示された化合物および／または薬剤を、上記に列挙されたさまざまな他の成分と共に適切な溶媒に組み込み、必要に応じて、その後に濾過滅菌することにより調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、以前に滅菌濾過された溶液中に存在する活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥法である。
【００５３】
薬学的に許容される塩、水和物、プロドラッグ、それらのまたは誘導体を含む、本明細書に開示された化合物および組成物は、放出制御製剤で投与されてもよい。そのような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を与え得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Ed. (2005, Lippincott, Williams & Wilins, Baltimore, Md. 21201) pages 889-964および“Pharmaceutical dosage form tablets”, eds. Liberman et al. (New York, Marcel Dekker, Inc., 1989)を参照。これらの参考文献は、錠剤およびカプセル剤、ならびに錠剤、カプセル剤、および顆粒剤の遅延放出剤形を調製するための担体、材料、装置およびプロセスに関する情報を提供している。
【００５４】
放出制御組成物は、該組成物の投与後、全身への短期または長期放出のために作製され得る。該組成物は、液体形態、乾燥粉末（例えば、凍結乾燥）形態で、またはポリマーデバイス（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）として調製されてもよい。マトリックスは、活性剤が固体ポリマーマトリックスまたはマイクロカプセル内で分散されるミクロスフェアなどの微粒子の形態であってもよく、微粒子においてコアはポリマーシェルとは異なる材料であり、本来は液体または固体であり得る活性剤がコア中に分散または懸濁される。あるいは、ポリマーは、ナノメートルから４センチメートルの範囲の薄いスラブもしくはフィルム、破砕もしくは他の標準的な手法により製造される粉末、またはさらにはヒドロゲルなどのゲルとして成型されてもよい。
【００５５】
非生分解性または生分解性マトリックスのどちらかが、開示された化合物の送達に使用されてもよいが、生分解性マトリックスが好ましい。これらは、天然または合成ポリマーであってもよい。ポリマーは、放出が望まれる期間に基づき選択される。いくつかの場合では線形放出が最も有用であり得るが、他の場合ではパルス放出または「バルク放出」がより有効な結果をもたらし得る。ポリマーは、ヒドロゲルの形態（典型的には水の約９０重量％まで吸収）であってもよく、場合により多価イオンまたはポリマーと架橋されてもよい。
【００５６】
マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出、および当業者に公知他の方法により形成することができる。生体侵食性ミクロスフェアは、例えば、Mathiowitz and Langer, J Controlled Release, 1987, 5:13-22; Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 1987, 6:275-283;およびMathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci, 1988, 35:755-774に記載されているような、薬物送達用のミクロスフェアを作製するために開発された方法のいずれかを用いて調製することができる。
【００５７】
本明細書に開示された化合物および組成物、それに加えてそれらの薬学的に許容される塩、水和物、プロドラッグ、または誘導体などは、拡散または浸出機構（例えば、フィルムまたはゴム）のどちらかによる放出を可能にする不活性マトリックスに組み込まれてもよい。遅延崩壊マトリックス（slowly disintegrating matrix）も該製剤に組み込むことができる。放出制御の別の形態は、浸透圧効果により、水が単一の小さな開口部を通って侵入し、薬物を押し出せるようにする半透膜に薬物が封入されるものである。経口製剤に関して、放出の位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸、または回腸）、または大腸であってもよい。好ましくは、放出は、活性剤（または誘導体）の保護により、または腸などに胃環境を超えて活性剤を放出することにより、胃環境の悪影響を回避する。完全な胃耐性を確保するために、腸溶コーティング（すなわち、少なくともｐＨ５．０まで不透過性である）は不可欠である。これらのコーティングは、混合フィルムとして、またはＢａｎｎｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃａｐｓから入手可能なものなどのカプセル剤として使用することができる。
【００５８】
方法
同様に、本明細書においては、血管疾患、肺高血圧症、および／もしくは肺動脈高血圧症を治療し、血管硬化を低減し、ならびに／またはそのような治療を必要としている対象のＹＡＰ／ＴＡＺおよび／もしくはＧＬＳ１媒介経路を阻害する方法が、提供される。方法は、本明細書に記載れた１つもしくは複数の化合物または組成物の治療有効量を対象に投与することを含み得る。いくつかの例において、方法は、ベルテポルフィンまたはベルテポルフィンを含む医薬組成物の治療有効量を、対象に投与することを含む。いくつかの例において、方法は、ベルテポルフィン、その塩、プロドラッグ、もしくは誘導体、またはそれらの組合せの治療有効量を対象に投与することを含み得る。他のまたはさらなる例において、方法は、ＣＢ−８３９またはＣＢ−８３９を含む医薬組成物の治療有効量を、対象に投与することを含む。いくつかの例において、方法は、ＣＢ−８３９の治療有効量を投与することを含み得る。したがって、本明細書に含まれるのは、ベルテポルフィンおよびＣＢ−８３９の治療有効量を投与する方法であり、この治療有効性は、両方の組成物の投与に起因し得る。
【００５９】
これらの方法は、ＹＡＰ／ＴＡＺ機械的活性化と、好気的解糖の状況で増殖に対する細胞のエネルギーニーズを調整するのに必要とされるグルタミノリシス酵素（glutaminolytic enzyme）ＧＬＳ１との重大なつながりがあることを実証する、本明細書に提供された新規結果を反映している。そのような分子的洞察は、血管コンプライアンスに対する単なる血行動態作用の試験を超えて、むしろ血管リモデリングおよびＰＨ発生の特異的代謝原因として、血管硬化のパラダイムを前進させるものである。これらの結果は、ＹＡＰ／ＴＡＺを介した共通の調節ヒエラルキーを通じて一体につながったグルタミン代謝および好気的解糖の両方を明らかにすることにより、直接的低酸素傷害を超えてＰＨ自体における代謝軸の調節異常の基本的理解も変えるものである。最終的に、細胞外環境がどのように肺血管機能障害を指示するかの中枢機構としてグルタミノリシスを置くことにより、これらの結果は、ＹＡＰ１−ＧＬＳ１軸を標的とする新規な治療法を開発するための、またはそれどころか、ＰＨの既に承認されている薬物療法において再利用するための基盤を形成する。
【００６０】
最近の研究は、ＰＨにおける血管硬化が、ＰＨの初期のおよび強力な発病トリガーとなるという概念を前進させている。それにもかかわらず、血管増殖との関連を超えて、そのような機械的刺激により影響を受ける下流の分子経路の詳細な特徴付けは欠落している。あるいは、以前の研究は、ＰＨにおける著明なミトコンドリア機能障害および代謝機能障害を実証しているが、そのような代謝イベントの複雑な開始トリガーは、特に低酸素傷害の直接の結果を超えるものは、とらえどころがない。今日まで、そのような代謝表現型は一つには低酸素症により引き起こされ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼのピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）媒介阻害を介した解糖スイッチをもたらすことが知られている。より最近のデータは、非コードＲＮＡ、骨形成タンパク質受容体２型（ＢＭＰＲ２）の機能喪失、およびサーチュイン３欠損を、ＰＨにおける全体的なミトコンドリア機能障害と関連付けている。ここで、機械的活性化プロセスとしての、および好気的解糖により同時調節されるグルタミノリシスの同定は、ＰＨにおいて代謝再プログラミングでみられる調節ヒエラルキーの理解を前進させる。硬化と代謝との間のそのような接点は、マトリックスリモデリングに関連して腫瘍において提案された関連する再プログラミングイベントと類似する点がある。代謝調節異常との直接的な因果関係により、これはまた、単に末期の特徴というよりむしろ、この疾患の開始発病トリガーとしての血管硬化のパラダイムも強化する。 
【００６１】
血管硬化をグルタミノリシスおよび増殖と関連付ける機能的つながりの解明は、ＰＨの開始および進行中、多数の血管細胞タイプの間での細胞増殖、遊走、およびアポトーシス間の相互作用に対する基本的な洞察も提供する。他の生物学的関連において記載されているように、硬いマトリックスおよびＹＡＰ／ＴＡＺ活性化に応答したグルタミノリシスおよびアナプレロティック反応の増加は、特にＰＡＳＭＣにおける過剰増殖状態を持続する重要な代謝ニーズに応えるものであり、ゆえにＰＨの病的血管リモデリングを引き起こす。ＰＡＳＭＣを超えて、ＹＡＰ／ＴＡＺ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３０／３０１フィードバックループが最近記載された。これによりマトリックス硬化は増大され、隣接する硬化マトリックスに接するナイーブ線維芽細胞の機械的活性化により、肺脈管構造およびおそらくさらには肺実質を通じて広がる。ＹＡＰ／ＴＡＺ活性化をグルタミノリシスと関与させる現在の知見を踏まえて、線維芽細胞におけるグルタミノリシスおよびアナプレロティック反応は、マトリックス硬化およびリモデリングの制御と本質的に関連している可能性がある。
【００６２】
一方で、硬化およびグルタミノリシスの役割は、ＰＨにおけるＰＡＥＣの依然として不完全に記載されている機能障害を制御する上で、より複雑とある可能性がる。今日まで、ＰＨ発病の引き金を引くことにおいてＰＡＥＣアポトーシスは、口火を切る初期の役割を果たすと考えられている。最初のＥＣアポトーシスは、次いで疾患進行に不可欠な過剰増殖性および病原性ＰＡＥＣの別個の集団を生じさせる。ＰＡＥＣアポトーシスおよび増殖のそのような時空間的均衡は、もともとＶｏｅｌｋｅｌとその共同研究者によって記載され、それ以来他の人によって記載された。該知見は、ＰＡＥＣアポトーシスのこの動力学モデルと一致しており、傷害およびアポトーシスの開始の波は、そのすぐ後にＹＡＰ／ＴＡＺ−ＧＬＳ１活性化およびグルタミノリシスが続き、ゆえにその後、ＰＡＥＣの増殖を促進することを示している。特に、このモデルは、他の人によって報告されているように、特によりゆっくり進行するＰＨの状況で、ＰＨ開始後のより後の時点でさえＰＡＥＣアポトーシスの継続を除外するものではない。しかし、これらのアポトーシスイベントは、明白な血管硬化およびグルタミノリシスがさらにより顕著である場合、増殖性成分（ＰＨのより重度のモデルにおいてより多く見られることを本発明者らが見出している成分）以外の細胞で起きていなければならない。そのような増殖は、アポトーシスおよび増殖の均衡がＰＡＥＣ集団でより顕著であったＰＨのより初期段階（ラットにおけるモノクロタリン注射後のＤ３〜Ｄ７によって代表される、データは示されていない）のＰＡＥＣ代謝回転の増加を反映している可能性がある。しかし、ＹＡＰ１およびＧＬＳ１上方制御が持続していた重度のＰＨのより後の段階で、アポトーシスよりＰＡＥＣ増殖が優位であることは明らかであった。この知見は、ＹＡＰ上方制御およびグルタミノリシスプロセスがＰＡＥＣ様細胞の明らかな異常増殖を伴う、ＰＡＨにおけるヒト網状病変の観察と相関している（データは示されていない）。内皮層が明らかに異常増殖されていない状況においてさえ、過剰増殖性抗アポトーシスＰＡＥＣが、内皮間葉移行−−今やＰＨ発病に直接関係しているプロセスであり、さらなる増殖により、内皮細胞が（単に内膜というよりむしろ）内側層の過形成に注ぎ込まれるようになる−−のために再プログラミングされる可能性はある。最後に、ＰＡＥＣにおける増殖能の増大と相関して、これらの知見は、マトリックス硬化およびＹＡＰ−ＧＬＳ１軸により促進された遊走促進性表現型（pro-migratory phenotype）も明らかにした（データは示されていない）。増殖および遊走の障害は、ヒト網状病変で観察されており、ＰＨにおける過剰増殖性ＰＡＥＣのより最近の研究は、付随する遊走性表現型を記載している。そのような遊走の障害は、ＰＨにおける異常な血管新生に寄与している可能性がある。異常な血管新生は、いくつかの場合では肺細動脈の血管新生促進性および病原性リモデリングに関連し、他の場合では血管新生不全、したがって肺血管樹全体の剪定に関連している。その結果、本明細書に記載された結果は、正確なタイミングで段階特異的な様式で多数の肺血管細胞表現型に影響を与える血管硬化、ＹＡＰ／ＴＡＺ−ＧＬＳ１軸���およびグルタミノリシスをＰＨ発病の中心点に置く。
【００６３】
グルタミノリシスの中心的媒介因子としてのＹＡＰ／ＴＡＺの機械的活性化も、一般に、海馬シグナル伝達による代謝の複雑な制御の理解を前進させる。特に、データは、少なくともマトリックス硬化に対する内因性応答の状態では、ＹＡＰおよびＴＡＺが単独でなく両方一緒に、ＧＬＳ１、ＬＤＨＡ、およびＰＣ発現に必要であることを示した（図２Ｃ〜Ｅ）。それにもかかわらず、ＹＡＰ１単独の過剰発現は、これらの下流遺伝子を増加させることができるため（図２Ｆ〜Ｈ）、ＹＡＰ１はこの表現型関して十分であり、グルタミノリシスを調節する上でいくつかの冗長な機能を保持している可能性があることが結論される。しかし、この冗長性は、マトリックス硬化中にＴＡＺも上方制御される場合は明らかではなく、ゆえにＴＡＺと一緒のＹＡＰの活性は、硬条件下でグルタミノリシス誘導を可能にする優先的な協調関係を表すことを示唆している。さらに、以前の研究は、細胞エネルギー状態を、ＡＭＰキナーゼ活性化または好気的解糖を介したＹＡＰ／ＴＡＺの転写活性の直接的促進のどちらかによるＹＡＰ活性の強力な調節因子として意味付けた。メバロン酸代謝もＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅを活性化し得、これが今度はＹＡＰ／ＴＡＺを脱リン酸化する。特に、ＹＡＰ活性とグルタミン合成酵素（ＧＳ）との間のつながりは、ＧＳ発現が優位を占め得る肝臓において具体的に報告されている。それにもかかわらず、肺脈管構造などの他の組織区画では、これらの知見は、ＹＡＰ／ＴＡＺが代謝シグナルに応答するという概念と補完的に、これらの因子を解糖経路およびグルタミノリシス経路を再プログラミングし、細胞増殖と調整する機械的センサーとしてより直接的に定義している。ＹＡＰ／ＴＡＺと上流および下流代謝合図との間のこの相互関係は、この経路に固有の調節可能なフィードバック駆動特性を示唆するものであり、ＥＣＭリモデリング、ＰＨサブタイプ、重症度、または経時段階の負荷に応じた代謝プログラムの個別化「チューニング」に部分的に関与し得る。さらに、ＹＡＰ／ＴＡＺに影響を与える既知の環境合図の拡大するレパートリーを考えると、海馬シグナル伝達の代謝作用は、血管硬化またはＰＨ単独よりさらに広範囲の影響にまで及んでいる可能性がある。確かに、臓器発生および腫瘍発生の観点から、増殖能を効率的なエネルギー生産と均衡させる一次機構としての、グルタミノリシスおよび解糖における海馬シグナル伝達の主要な調節的役割を推測したくなる。
【００６４】
ＰＨ疾病表現型（pathophenotype）の重要な媒介因子としてのグルタミノリシスの同定は、この疾患において好気的解糖を超えた本質的な調節代謝チェックポイントに注意を移している。結節制御ポイント（nodal control point）としてのＧＬＳ１の同定は、一般にグルタミノリシスおよびアナプレロティック反応を、ＰＨおよび癌の病因の全般的な類似性の根底にある重要な分子的決定因子として際立たせる。これらの知見は、グルタミントランスポーターなどのグルタミン処理の他の側面が関与している可能性があることも示唆し得る。さらに、ＧＬＳ１を超えて、２つのさらなる酵素−ＬＤＨＡおよびピルビン酸カルボキシラーゼ−が、解糖およびアナプレロティック反応の硬化媒介変化における関連チェックポイントとしてここで同定された（図１）。これは、今後の特徴付けを待つＰＨの代謝ランドスケープにわたるさらにより幅広いレベルの制御を示すものである。
【００６５】
ＹＡＰ／ＴＡＺ−ＧＬＳ軸とＨＩＶ−ＰＡＨとの機構的つながりも、ＰＨのこの不可解な形態の病因に対する必要とされる洞察に寄与する。ＨＩＶ感染個体ではＰＡＨの有病率の増加が存在するが、ＨＩＶ−ＰＡＨの分子的病因についてはほとんど知られていない。ＨＩＶまたはＳＩＶ感染に続発するＰＡＨの霊長類およびヒトモデルにおいてＹＡＰ／ＴＡＺおよびＧＬＳの作用を確立することにより、これらの知見は、組織病理学的関連を超えて、ＰＡＨのこのサブタイプで活性な分子および細胞疾病表現型が他のＰＡＨ形態と重複しており、同様の標的化治療法による治療に適する可能性があるという長く待ち望まれた証拠を提供する。
【００６６】
最後に、ＰＨにおけるグルタミノリシスの機械的活性化の同定は、ＰＨの新規な臨床管理戦略を策定する土台づくりをする。これまで、ジクロロ酢酸によるＰＤＫの薬理学的阻害は、ＰＨに関する臨床研究下の最も卓越した代謝標的化戦略であった。本明細書に記載れた結果は、マトリックスリモデリングおよびグルタミノリシスに関連した一連の機能的につながりのある標的が、さらなるＰＨの治療法の開発に有望であると示すことを実証する。モノクロタリン曝露ラットにおけるＢＡＰＮによるＰＨの血行動態指数および組織学的指数の改善（図４）は、ＰＨ発病におけるコラーゲン架橋およびＥＣＭリモデリングの重要性を強化し、慢性低酸素ＰＨにおいてＬｏｘ（リシルオキシダーゼ）を阻害する先行研究と一致する。しかし、特異的Ｌｏｘ阻害剤単独の治療的使用は、冗長または補完的な機能を示し得るいくつかの他のリシルオキシダーゼの重要性が潜在的に原因となって、わずかな有効性（すなわち、右室リモデリングの改善、図４）に悩まされる可能性がある。それにもかかわらず、下流のＹＡＰ１−ＧＬＳ１代謝軸の標的化と併用される場合、相加的またはおそらく相乗的治療効果が、肺血管増殖およびリモデリングを阻害する上で出現し得る。ＹＡＰ１阻害剤ベルテポルフィン単独を使用する場合、肺脈管構造の海馬シグナル伝達を変化させる代謝さえを超える多数の有益な効果の出現、および重度のげっ歯類ＰＨの強固な改善（図４）を考えると、これはＹＡＰ１で特に顕著である可能性がある。
【００６７】
記載された化合物または組成物は、臨床反応に応じて必要な場合に調整され得る適切な投与量で最初に投与することができる。例えば動物テストで決定された予備用量、ヒト投与のための投与量の比例増減は、当技術分野で認められた慣例に従って行われる。例えば、マウスにおける、および他の動物、ヒトに対する有効投与量の推定方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第４，９３８，９４９号明細書、Freireich et al., Cancer Chemother Reports, 1966, 50(4):219-244を参照。毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための）により決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。いくつかの例において、大きな治療指数を示す組成物が使用される。
【００６８】
治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初は推定することができる。用量は、細胞培養アッセイまたは動物モデルで決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する治療化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルで開発することができる。血漿中レベルは、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＨＰＬＣにより測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、適切なバイオアッセイによりモニターすることができる。投与量の例は、約０．１×ＩＣ５０、約０．５×ＩＣ５０、約１×ＩＣ５０、約５×ＩＣ５０、１０×ＩＣ５０、約５０×ＩＣ５０、および約１００×ＩＣ５０である。
【００６９】
本明細書に記載れた化合物の治療有効量の例は、化合物および症状の重症度に応じて約１μｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇである。適切な治療有効用量は治療医により選択することができ、いくつかの例において約１μｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、または約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲である。さらに、動物におけるある特定の具体的な投与量が実施例に示される。
【００７０】
ベルテポルフィンに関して、有効量は約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ）の範囲であってもよい。有効用量はまた、当業者により認識されているように、投与経路、賦形剤使用、および他の治療剤の使用を含む他の治療的処置との併用の可能性に依存して異なる。いくつかの例において、ベルテポルフィン、その塩、プロドラッグ、もしくは誘導体、またはそれらの組合せの治療有効量は、１日あたり約１０〜２５ｍｇ／ｋｇである。
【００７１】
Ｃ−９６８およびＣＢ８３９に関して、有効量は約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ）の範囲であってもよい。有効用量はまた、当業者により認識されているように、投与経路、賦形剤使用、および他の治療剤の使用を含む他の治療的処置との併用の可能性に依存して異なる。いくつかの例において、Ｃ−９６８またはＣＢ８３９、それらの塩、プロドラッグ、もしくは誘導体、またはそれらの組合せの治療有効量は、１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇである。
【００７２】
投与量は、医師により決定することができ、必要に応じて、観察された治療効果に適合するように調整することができる。組成物は、投与後、循環レベルを最大長時間最大化するためにボーラス投与として与えられてもよい。連続注入も、ボーラス投与後に使用することができる。いくつかの例において、化合物または組成物は、２、３、４、または６等用量の個別投与で投与されてもよい。例えば、１日あたり約２５ｍｇ／ｋｇが２、３、４、または６等用量の個別投与で投与されてもよい。別の例において、１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇが２、３、４、または６等用量の個別投与で投与されてもよい。
【００７３】
本明細書に記載れた化合物または組成物は、短期および長期使用に適している。「短期使用」は、本明細書で使用される場合、開示された化合物または組成物の約２０回投与以下の患者への投与を指し得る。したがって、用語「長期使用」は、本明細書で使用される場合、開示された化合物または組成物の約２０回投与を超える患者への投与を指し得る。
【００７４】
記載された化合物および組成物は、痛覚、炎症性、機能性、もしくは神経障害性疼痛の治療で使用される鎮痛剤、または抗炎症剤などの、単独または１つもしくは複数のさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。１つまたは複数のさらなる治療剤は、それだけで投与される場合、治療効果を生んでもまたは生まなくでもよいが、開示された化合物または組成物のいずれかと投与される場合、そのような効果（例えば、疼痛低減）をもたらす。
【００７５】
本明細書に記載れた１つまたは複数のさらなる治療剤ならびに化合物および組成物は、同時投与を含む任意の順番で、および最大数日離して時間的に間をあけた順番で投与することができる。本明細書に記載れた１つまたは複数のさらなる薬剤ならびに化合物および組成物の投与は、同じまたは異なる経路によってもよい。いくつかの例において、１つまたは複数のさらなる薬剤は、本明細書に記載れた化合物および組成物と組み合わされてもよい。
【００７６】
上記は本発明の好ましい実施形態に関すること、および数多くの変更が本発明の範囲から逸脱することなくその中でなされ得ることも理解されるべきである。本発明は、その範囲に制限を課していると決して解釈されるべきではない以下の例によってさらに例示される。それどころか、さまざまな他の実施形態、変更形態、およびそれらの同等物の手段があり得、本明細書の記載を読んだ後、本発明の趣旨および／または添付特許請求の範囲から逸脱することなく、当業者にこれらを示唆し得ることが明白に理解されるべきである。本明細書で参照される全ての特許、特許出願、および刊行物は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【実施例】
【００７７】
[実施例１]
実験手順
細胞培養および試薬
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭで培養した。初代ヒト肺動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）をＥＧＭ−２細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ）で増殖させ、実験は３〜６継代で行った。初代ヒト肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）をＳｍＧＭ−２細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ）で培養し、実験は３〜９継代で行った。ＧＬＳ１（２、３）：ＢＰＴＥＳ（ビス−２−（５−フェニルアセトアミド−１，３，４−チアジアゾール−２−イル）エチルスルフィド）、ＤＯＮ（６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン）、およびＣ９６８（グルタミナーゼ阻害剤、化合物９６８、５−（３−ブロモ−４−（ジメチルアミノ）フェニル）−２，２−ジメチル−２，３，５，６−テトラヒドロベンゾ［ａ］フェナントリジン−４（１Ｈ）−オン）の阻害剤はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、それぞれ１０μＭ、５μＭおよび１０μＭの濃度で使用した。グルタミン酸はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、２ｍＭの濃度で使用した。アスパラギン酸はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、１０ｍＭの濃度で使用した。
【００７８】
オリゴヌクレオチドおよびトランスフェクション
ＹＡＰとしてのＯｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｐｌｕｓ  ｓｉＲＮＡ（Ｊ−０１２２００−０７およびＪ−０１２２００−０５）、ＴＡＺ（ＷＷＴＲ１；Ｊ−０１６０８３−０５およびＪ−０１６０８３−０６）、ＧＬＳ（Ｊ−００４５４８−０９、ｓｉ−ＧＬＳ＿１；Ｊ−００４５４８−１０、ｓｉ−ＧＬＳ＿２）、およびスクランブル対照Ｄ−００１８１０−０１およびＤ−００１８１０−０２）は、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。ｓｉＲＮＡ実験は、ｓｉＹＡＰ＿１／ＴＡＺ＿１またはｓｉＹＡＰ＿２／ＴＡＺ＿２のどちらかで得られた結果を代表する。ＰＡＥＣ、およびＰＡＳＭＣをコラーゲンコーティングプラスチック（５０μｇ／ｍＬ）にプレーティングし、製造元の指示書に従って、ｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、２４時間後に７０〜８０％コンフルエンスでトランスフェクトした。トランスフェクション８時間後、細胞をトリプシン処理し、ヒドロゲルに再プレーティングした。
【００７９】
プラスミド
ＹＡＰ１コード配列を購入し（Ａｄｄｇｅｎｅ；プラスミド＃１８８８１）、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を用いてｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にサブクローニングした。ＧＦＰを発現するレンチウイルス親ベクターを対照として使用した。ＰＡＥＣ、およびＰＡＳＭＣにおけるこれらの構築物の安定発現は、レンチウイルス導入により達成した。全てのクローン化プラスミドをＤＮＡ配列決定により確認した。
【００８０】
レンチウイルス作製
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造元の指示書に従って、パッケージングプラスミド（ｐＰＡＣＫ、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と一緒にレンチウイルスプラスミドでＬｉｐｏｆｅｃｔアミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクトした。ウイルスを回収し、滅菌濾過し（０．４５μｍ）、遺伝子導入のためのＰＡＥＣ、およびＰＡＳＭＣのその後の感染に利用した（２４〜４８時間インキュベーション）。
【００８１】
メッセンジャーＲＮＡ抽出
細胞を１ｍｌのＱｉａＺｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）中でホモジナイズした。全ＲＮＡ含量を、製造元の指示書に従ってｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。全ＲＮＡ濃度は、ＮＤ−１０００マイクロ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて決定した。
【００８２】
メッセンジャーＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲ
メッセンジャーＲＮＡを、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて逆転写してｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡ  は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  デバイスを用いて蛍光標識Ｔａｑｍａｎプライマーセットにより増幅させた。２つのＧＬＳ１アイソフォーム、ＫＧＡおよびＧＡＣの相対発現量を特異的に決定するために、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ０１０１４０１９＿ｍ１およびＨｓ０１０２２１６６＿ｍ１をそれぞれ使用した。ＲＮＡ種の倍数変化を式（２−ΔΔＣｔ）を用いて算出し、ＲＰＬＰ０発現に対して正規化した。
【００８３】
ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ
ＰＡＥＣをプラスチック上で４８時間培養した。細胞は２ｍＭグルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）と４５分間、次いで１％パラホルムアルデヒドに室温で１５分間、二重架橋した。固定化細胞を、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、２．５％グリセロールを含有し、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補充した１０ｍｌの溶解緩衝液１［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＩＧＥＰＡＬ  ６３０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）］に氷上で１０分間溶解し、その後緩衝液２［プロテアーゼ阻害剤を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８）および２００ｍＭ  ＮａＣｌ］中、室温で１５分間インキュベートした。クロマチンを振幅３０％で１０分間（１分の１０サイクル）超音波処理した。試料を遠心分離し（２×１４，０００ｇ、各５分間）、可溶性クロマチンを新鮮なチューブに移した。超音波処理後の架橋ＤＮＡを、５μｇの抗ＹＡＰ１抗体（ｓｃ−１５４０７Ｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または非免疫ウサギＩｇＧ（ａｂ２７４７２、Ａｂｃａｍ）で一晩、４℃で沈殿させた。クロマチン／抗体複合体をＰｕｒｅＰｒｏｔｅｏｍｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でプルダウンし、低塩および高塩緩衝液で洗浄した。架橋反転（６５℃、４時間）およびプロテイナーゼＫ処理後、クロマチンをフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製した。沈殿したＤＮＡを、予測したＴＥＡＤ結合部位または非関連ゲノム領域（対照）用に生成したプライマーを用いてｑＰＣＲにより分析した。
【００８４】
マイクロアレイ
ＰＡＥＣをｓｉＲＮＡ対照（ｓｉ−ＮＣ）またはＧＬＳ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＧＬＳ＿１）でトランスフェクトし、軟らかいヒドロゲル（１ｋＰａ）または硬いヒドロゲル（５０ｋＰａ）で培養した。トランスフェクション４８時間後、細胞を溶解し、ＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（ＨｕＧｅｎｅ  ２．０  ＳＴ）でのハイブリダイゼーションのために製造元の指示書に従って抽出    した、簡単には、全ＲＮＡを、ＰＡＥＣ細胞からｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造元の指示書に従って抽出した。全ＲＮＡ濃度は、ＮＤ−１０００マイクロ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて決定した。ビオチン化ｃＤＮＡは、ＷＴ  Ｐｌｕｓ増幅キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて１００ｎｇの全ＲＮＡから調製した。断片化後、５．５μｇのｃＤＮＡをＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ２．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイズした。ＧｅｎｅＣｈｉｐｓを洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０で染色し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇを用いてスキャンした。生データをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＣｏｎｓｏｌｅでＲＭＡを用いて正規化し、対数形質転換シグナル強度として表した。
【００８５】
経路濃縮分析
一元配置ＡＮＯＶＡ検定を遺伝子ごとに使用して、軟らかいおよび硬いマトリックスバックグラウンドの両方でｓｉ−ＧＬＳ１処理とビヒクル処理ＰＡＥＣとの間の差次的発現をテストした。差次的に発現された遺伝子は、０．０５のｐ値カットオフおよび１．５の倍数変化カットオフに基づき選択した。差次的に発現された遺伝子の経路濃縮は、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ  ２．８．１環境でＲｅａｃｔｏｍｅ  ＦＩ分析ツールを用いて行った（４）。経路ごとのヒートマップを、ＴＭ４  ＭｕｌｔｉＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｖｉｅｗｅｒを用いて生成した（５）。
【００８６】
免疫ブロッティングおよび抗体
細胞をＬａｅｍｍｅｌｉ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）に溶解した。タンパク質溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａｄ）に移した。膜をＴＮ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中５％無脂肪乳、またはＴＮ緩衝液中５％ＢＳＡで遮断し、一次および次いで二次抗体の存在下でインキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎを含有するＴＮ緩衝液で洗浄後、免疫反応性バンドをＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で可視化した。ＹＡＰ１（＃４９１２；１／１０００）およびＹＡＰ／ＴＡＺ（＃８４１８；１／１０００）の一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから入手した。ＧＬＳ１（ａｂ１５６８７６；１／１０００）、ＰＣ（ａｂ１１５５７９；１／１０００）、ＬＤＨＡ（ａｂ４７０１０；１／１０００）の一次抗体は、Ａｂｃａｍから入手した。チューブリンの一次抗体（Ｔ４０２６；１／５０００）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ＴＡＺの一次抗体（ｓｃ−４８８０５）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。ＨＲＰに結合した適切な二次抗体（抗ウサギ、抗マウス、および抗ヤギ）を使用した（Ｄａｋｏ）。
【００８７】
免疫蛍光
さまざまな示された処理の後、培養細胞をＰＢＳ／ＰＦＡ  ４％で１０分間固定し、ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ  １００×０．１％で１０分間透過処理した。細胞を次いで抗ＰＣＮＡ（＃４９１２；１／１００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗Ｋｉ６７（ａｂ１５５８０；１／２００；Ａｂｃａｍ）、および／または抗切断カスパーゼ−３（１／２００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と室温で２時間インキュベートした。Ａｌｅｘａ−５９４および／またはＡｌｅｘａ−４８８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合した二次抗体を１／５００で使用した。核をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）と対比染色した。
【００８８】
細胞計数アッセイ
示された規定の前処理またはトランスフェクションプロトコール後、ＰＡＥＣまたはＰＡＳＭＣを、１ウェルあたり３０  ０００細胞で６ウェルプレートに３通りにプレーティングした。細胞を接着させるために一晩インキュベーションした後、６ウェルを計数して処理時点の最初の計数を決定した（グルタミン酸、アスパラギン酸、ＢＰＴＥＳ、ＤＯＮ、またはＣ９６８）。２日、４日、または６日後、ウェルの内容物をトリプシン処理し、計数し、増殖率を算出した。
【００８９】
ＢｒｄＵ増殖アッセイ
指数関数的に増殖する細胞を、示されたマトリックスに４８時間プレーティングした。増殖アッセイのために、５−ブロモ−２−ウリジン（ＢｒｄＵ）を細胞培養培地に１時間添加し、ＤＮＡに組み込まれたＢｒｄＵを、検出キット（ＢｒｄＵ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＃６８１３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて明らかにした。
【００９０】
スクラッチアッセイ
集密なＰＡＥＣにピペット先端を用いて傷をつけ、その後創傷床閉鎖（wound bed closure）を１０時間にわたって連続的に行った。明視野像を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により管理されたＣｏｏｌＳＮＡＰＨＱ  ＣＣＤ  Ｃａｍｅｒａで１０６位相差対物レンズにより１時間ごとに撮影した。創傷床領域を、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij/）を用いて定量化した。
【００９１】
ミトコンドリア電位測定
以前に記載されているように（６）、細胞を２ｎＭ  ＴＭＲＭ（テトラメチルローダミンメチルエステル、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびへキスト（０．１μｇ／ｍｌ）で３０分間、３７℃で染色した。１ウェルあたり５〜８枚のランダム画像を、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００落射蛍光顕微鏡を用いて記録した。画像ごとの平均細胞蛍光強度をＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて決定した。
【００９２】
カスパーゼ３／７アッセイ
カスパーゼ３／７活性は、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造元の指示書に従って定量化した。簡単には、細胞を異なる硬さのヒドロゲルにプレーティングし、記載されているように処理した。プレーティングの２４時間後、細胞を血清の存在下または非存在下で２４時間培養した。細胞を次いで溶解し、１０μｇの全タンパク質をカスパーゼ基質と１時間インキュベートし、発光をプレートリーダー（ＳｙｎｅｒｇｙＨＴＸマルチモードリーダー、Ｂｉｏｔｅｋ）により定量化した。
【００９３】
動物
モノクロタリン治療ラット：本発明者らが以前に記載したように（７、８）、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１０〜１４週齢）に６０ｍｇ／ｋｇモノクロタリンを０時点で注射し；曝露後０〜４週時点で右心カテーテル検査を行い、その後肺組織を、以下に記載するように（セクション：組織回収）、ＲＮＡ抽出またはパラフィン包埋のために回収した。
【００９４】
サル免疫不全ウイルス感染アカゲザル：以前に記載されているように（９）、アカゲザル（ＲＭ）、６〜１０歳は、国立霊長類センターまたはピッツバーグ大学の実験動物研究部門により承認された供給業者から入手した。マカクにＳＩＶ  ΔＢ６７０（Ｍ．Ｍｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂ、ピッツバーグ大学の贈与）を静脈内接種した。血漿ウイルス量および末梢血ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、定量ＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリーにより決定した。肺動脈カテーテル検査を感染前に行い、感染の６カ月および１０〜１２カ月後に繰り返した。さらに、肺組織を剖検中に得、サルの正体を盲検化された獣医病理学者により肺動脈が調べられた。
【００９５】
血漿からの代謝産物抽出
以前に公開されたプロトコール（１０）に従って、代謝産物を、内部標準（ＩＳＴＤ）を添加した８０μＬ低温メタノール１００％を添加して２０μＬの血漿から抽出した。
【００９６】
ラット肺血管内皮細胞の単離
以前に報告されているように（８、１１）、ラットからの肺葉組織をはさみでさいの目に切り、２００μＬのコラゲナーゼＤ溶液（Ｓｉｇｍａ）を添加し、４．８ｍＬ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中、２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＤの最終濃度にした。自動回転で３７℃、３０分間インキュベーションした後、２０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ、８０Ｕ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ  Ｉの最終濃度）を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。溶液を、７０μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により２回濾過して単一の細胞懸濁液を得た。２ラウンドのＰＢＳ洗浄、細胞ペレット化、および再懸濁後、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を使用して赤血球を除去した。残った細胞を、マウス抗ラット−ＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ  ５５５０２５）と４℃で３０分インキュベートした。細胞を２回ＰＢＳ洗浄し、製造元のプロトコールに従って抗マウスＩｇＧ１マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と１５分インキュベートした。単一ＣＤ３１陽性細胞を、次いでａｕｔｏＭＡＣＳ  Ｐｒｏ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒを用いて製造元の指示書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）により回収した。ＣＤ３１陽性細胞の純度（＞９５％）を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ３１（ａｂ３３８５８、Ａｂｃａｍ）による細胞標識後に、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるフローサイトメトリー分析により確かめた。
【００９７】
ラット肺の組織回収
直接右室穿刺による生理学的測定後、肺血管を１ｃｃの生理食塩水で優しく流して、心肺組織を回収する前に血液細胞の大部分を除去した。心臓を除去し、その後右室（ＲＶ）および左室＋中隔（ＬＶ＋Ｓ）を切開および秤量した。臓器を次いで組織プレパラート用に回収し、またはその後のＲＮＡおよび／もしくはタンパク質のホモジナイズあるいは抽出のために液体Ｎ２に急速冷凍した。肺組織を特異的にさらに処理するために、切除前に、肺にＰＢＳを右室カニューレ挿管により一定低圧（約１０ｍｍＨｇ）で流し、その後約２０ｃｍ  Ｈ２Ｏの圧力で１０％中性緩衝液ホルマリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて左肺の気管膨張を行なった。切除、および２５℃、１０％中性緩衝ホルマリン中で１６時間固定後、肺組織を、５μｍ切片にスライスする前にエタノール−キシレン脱水シリーズによりパラフィン包埋した（Ｈｙｅｒｃｅｎｔｅｒ  ＸＰ  ＳｙｓｔｅｍおよびＥｍｂｅｄｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓｈａｎｄｏｎ）。
【００９８】
ＧＬＳ１活性アッセイ
製造元の指示書に従って（Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｃｏｈｅｓｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、急速冷凍ラット肺組織（０．１ｇ／試料）を氷上の１ｍＬのアッセイ緩衝液中でホモジナイズし、８０００ｇで４℃、１０分間遠心分離した。タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより決定した。総タンパク質（１００μｇ）に対して正規化した試料を、キット試薬と３７℃で１時間インキュベートし、吸光度を４２０ｎｍで測定した。
【００９９】
肺切片の免疫組織化学および免疫蛍光
肺切片（５μｍ）を脱パラフィンし、高温抗原回復を行い、その後ＴＢＳ／ＢＳＡ  ５％、１０％ロバ血清で遮断し、免疫組織化学については一次抗体およびビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）、または免疫蛍光についてはＡｌｅｘａ  ４８８、５６８および６４７コンジュゲート二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に曝露させた。ＹＡＰ１に対する一次抗体（＃４９１２；１／２００またはｓｃ１０１１９９；１／５０）は、それぞれＣｅｌｌ  ＳｉｇｎａｌｉｎｇおよびＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。ＧＬＳ１に対する一次抗体（ａｂ１５６８７６；１／１００）、ＰＣ（ａｂ１１５５７９；１／１００）、ＬＤＨＡ（ａｂ４７０１０；１／２００）、およびα−ＳＭＡ（ａｂ３２５７５；１／１０００）は、Ａｂｃａｍから購入した。ＣＤ３１に対する一次抗体（ｓｃ−１５０６；１／１００）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ＰＣＮＡに対する一次抗体（１３−３９００、１／１００）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ほとんどの場合、発色はストレプトアビジン−ビオチン化アルカリホスファターゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）と、それに続くＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄアルカリホスファターゼ基質溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を添加して達成した。レバミゾールを添加して内因性アルカリホスファターゼ活性（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を遮断した。写真を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｂ×５１顕微鏡またはＺＥＩＳＳ  ＬＳＭ  Ｅｘｃｉｔｅｒ共焦点顕微鏡を用いて得た。所与の組織切片（＞１０血管／切片）に存在する、気管支気道とは関係ない肺小血管（直径＜１００□ｍ）を分析（Ｎ＞５匹／群）のために選択した。染色の強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて定量化した。肺細動脈筋肉化の程度を、以前に記載されているように（１２）、全末梢肺細動脈に対する完全および部分的に筋肉化した末梢（直径＜１００μｍ）肺細動脈の割合の算出により、α−ＳＭＡについて染色したパラフィン包埋肺切片で評価した。全ての測定は条件を盲検化して行った。
【０１００】
原子間力顕微鏡法
ラット肺を、体重ｇ単位で０．０２５ｇのＯＣＴで膨張させ、液体窒素蒸気で凍結し、−８０℃で貯蔵した。ラット肺スライス（１０μｍ厚）をガラススライドから切り取り、試料を含有するガラス断片を５０ｍｍ皿（Ｗｉｌｌｃｏのガラス底培養皿）の底に接着させた。測定前にまず試料をすすぎ、その後４ｍｌのＰＢＳで１回被覆した。試料の機械的特性を、位相差により目的とする領域を正確に示すことができる光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００Ｂ）と連結したＢｉｏＳｃｏｐｅ  Ｃａｔａｌｙｓｔ原子力顕微鏡（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて試験した。各試料に対して、５本から最大９本の血管（直径＜１００μｍ）を、ちょうど同じ数の離散点で３５〜８０の力−距離曲線から集める「自動露出（Point and Shoot）」法を用いて分析した。微小押込み実験を、ホウケイ酸ガラス球状チップ（直径５μｍ）を備えたプローブおよび名目ばね定数０．０６Ｎ／ｍを有するカンチレバー（Ｎｏｖａｓｃａｎ）を用いてＰＢＳで行った。押込みは、相対トリガーモードでおよびトリガー閾値を２ｎＮに設定して、２μｍ／秒の速度を用いて実施した。見かけのヤング率を、力曲線をＨｅｒｔｚの球圧子押込みモデルにフィットさせ、およびポワソン比０．４を用いて、ＮａｎｏＳｃｏｐｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １．５０ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて算出した。大きな押込みを避けるために、力曲線全体のそれぞれ５％および２５％の最小および最大Ｆｏｒｃｅ  Ｆｉｔ  Ｂｏｕｎｄａｒｙを該フィットに対して考慮した。
【０１０１】
ピクロシリウスレッド染色および定量化
ピクロシリウスレッド染色は、０．１％ピクロシリウスレッド（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄ８０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した５μｍパラフィン切片の使用により達成し、ワイゲルトヘマトキシリンで対比染色して線維性コラーゲンを明らかにした。切片を、次いで互いに平行および直角に配向された分析器および偏光子を用いて連続的に撮像した。顕微鏡条件（ランプ輝度、コンデンサ開口部、対物レンズ、ズーム、曝露時間、およびゲインパラメーター）は、全ての試料のイメージングを通じて維持した。最小閾値は、線維構造を表す直角に配向された偏光子を通過する（すなわち、黒いバックグラウンドからの残留光を除外する）光のみを含めた、各実験の適切な対照切片に設定した。閾値は、各実験内の全条件にわたって全ての画像について維持した。閾値光により覆われた移動領域の面積を算出し、１条件につき少なくとも１０切片／血管をまとめて平均化した（ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェア）。標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
【０１０２】
代謝産物抽出は、若干変更して基本的に記載されているように行った（３５）。簡単には、代謝産物は、−８０℃で予冷した８０％水性メタノールを用いてドライアイス上で培養細胞およびＣＤ３１＋細胞から抽出した。２０，０００×ｇで４℃、１０分間の遠心分離によりプレクリアした血漿から代謝産物を抽出した。上清を、−８０℃で予冷した４つの容積の１００％メタノールを用いて４時間、−８０℃で抽出した。代謝産物抽出中に内部標準、［１３Ｃ４］−２−オキソグルタレート（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。細胞および血漿抽出物の両方からの不溶性材料は、２０，０００×ｇで４℃、１５分間の遠心分離により除去した。以前に記載されているように（３６）、上清は標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。代謝産物を、ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ固定相（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ×３．５ｍｍ；Ｍｅｒｃｋ）を用いて分離した。ＭＳパラメーターはグルタミン標準溶液を用いて最適化した。モニターした質量移行は、８７＞８７（ピルビン酸）、１１５＞７３＋９９（コハク酸）、１３２＞８８（アスパラギン酸）、１４５＞１０１（２ＯＧ）、１４５＞１２７（グルタミン）、１４６＞１２８（グルタミン酸）、および１４９＞１０５（［１３Ｃ４］−２ＯＧ）であった。質量移行および保持時間ウィンドウは、そのままのおよびマトリックススパイク標準の分析により確かめた。ピーク面積をＸｃａｌｉｂｕｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）により定量化し、手作業で見直した。
【０１０３】
細胞外フラックス分析
ＰＡＥＣ（３０，０００細胞／ウェル）またはＰＡＳＭＣ（５０，０００細胞／ウェル）を、２０μＬの軟らかいまたは硬いゲル（「補足」に記載された）でプレコーティングしたＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２４ウェルプレートにプレーティングした。付着させるために一晩インキュベーション後、細胞をアッセイ培地（フェノールレッドなしのＤＭＥＭまたは０．５％透析ＦＢＳおよび０．１ｍｇ／ｍＬウリジン、ｐＨ７．４を含有するピルビン酸；Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより製造）で２回洗浄し、５００μＬの新鮮アッセイ培地でインキュベートした。酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ、解糖の代理マーカー）をＸＦ２４またはＸＦｅ２４  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。ミトコンドリアおよび解糖ストレスアッセイを製造元のプロトコールに従って行った。ＯＣＲおよびＥＣＡＲを、アッセイ終了後に測定した細胞計数に対して正規化した測定した。
【０１０４】
ＰＨラットにおけるＹＡＰ１の阻害
ＰＨを誘導するために、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１０〜１４週齢）に６０ｍｇ／ｋｇモノクロタリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注射した。２日後、ラットは、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に可溶化した２５ｍｇ／ｋｇのベルテポルフィン（Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｌｔｄ）で毎日腹腔内注射を受けた。モノクロタリン注射後２１日目に最後の注射をした２日後、右心カテーテル検査を行い、その後、本発明者らが記載したように（２）、ＲＮＡもしくはタンパク質抽出、パラフィン包埋、またはＯＣＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）による凍結保存のために、肺組織およびＣＤ３１＋細胞を回収した。
【０１０５】
ＰＨラットにおけるＧＬＳ１の阻害
ＰＨを誘導するために、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１０〜１４週齢）に６０ｍｇ／ｋｇモノクロタリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注射した。２日後、Ｃ９６８（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の連続腹腔内注射を毎日与え、モノクロタリン注射後の７日後、ＣＢ８３９（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の連続腹腔内注射を毎日与えた。モノクロタリン注射後２１日目に最後の注射をした２日後、右心カテーテル検査を行い、その後、本発明者らが記載したように（２）、ＲＮＡもしくはタンパク質抽出、パラフィン包埋、またはＯＣＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）による凍結保存のために、肺組織およびＣＤ３１＋細胞を回収した。
【０１０６】
ヒト対象
インフォームドコンセントは全ての試験手順に対して得た。ホルマリン固定パラフィン包埋肺試料に関して、ヒトＰＨ標本を未使用または廃棄された外科試料（表２）から回収した。そのいくつかを、本発明者らは以前に記載しており（３７）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｂａｎｋからの非疾患ヒト肺標本が記載されている（３８）。図８Ｅ〜Ｇに記載された血漿回収および分析に関して、臨床的に重大な呼吸困難を有し、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ボストン、ＭＡ、ＵＳＡで右心カテーテル検査を受けている個人を選択した（表３、その何人かを（２６）に記載した）。平均肺動脈圧の上昇＞２５ｍｍＨｇ（ｍＰＡＰ）により定義された臨床ＰＨの存在または非存在により、対象を層別化した。肺動脈コンプライアンスの測定に関して、４２人のＨＩＶ感染個体のコホートが、ＨＩＶ感染者における肺疾患の進行中の研究の一環としてピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ＰＡ、ＵＳＡで肺動脈カテーテル検査を受けた。ＰＡＨ（ｍＰＡＰ＞２５ｍｍＨｇ）の診断は、１１人の個体で行った（表４）。これらの侵襲血行動態測定に基づき、肺動脈コンプライアンスを１回拍出量／脈圧により算出した。最後に、循環代謝産物（表５）について末梢血漿を分析したヒト対象において、文書に記録されたＰＡＨあり（侵襲肺動脈カテーテル検査（ｍＰＡＰ＞２５ｍｍＨｇ）により評価）、またはＰＡＨなし（侵襲肺動脈カテーテル検査（ｍＰＡＰ＜２５ｍｍＨｇまたは肺動脈収縮期圧＜４０ｍｍＨｇの非侵襲的心エコー推計）で評価）のどちらかのＨＩＶ感染個体の別のコホートを、カリフォルニア大学、サンフランシスコ校、サンフランシスコ、ＣＡ、ＵＳＡで補充した。
【０１０７】
ヒト血漿試料採取
主肺動脈から対象由来の血液を採取するために、臨床適応右心カテーテル処置を、以前に記載されているように（３７）蛍光透視ガイド下で右内頸静脈アプローチによる標準的なプロトコールにより行った。カテーテルを、蛍光透視および血行動態波形により確かめた主肺動脈に配置した。次いで、血液を遠位カテーテルポートから引き出し、Ｋ＋−ＥＤＴＡ抗凝固薬を含む標準的なバキュテナーチューブに採取した。血漿を血液の標準的な遠心分離後に抽出し、その後−８０℃で貯蔵した。本発明者らが以前に記載したように（４０）、静脈末梢血をＨＩＶ陽性対象から採取するために、静脈血を標準的な抗凝固薬（ＥＤＴＡ）処置バキュテナーチューブに採取した。細胞要素を、血液採集後、血液試料ごとに２０００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化した。上清血漿を次いで等分し、−８０℃で直ちに凍結した。
【０１０８】
統計
細胞培養実験は、反復ごとに少なくとも３回および少なくとも３通りに行った。各群の動物の数を算出して、パワー８０％および標準偏差１０％で実験群と対照群との間の平均の少なくとも２０％差を測定した。この試験に固有の患者試料の数は、主に臨床的利用可能性により決定した。げっ歯類およびヒト組織の両方のインサイチュ発現／組織学的分析、ならびにマウスおよびラットの肺血管血行動態は、盲検様式で行った。培養細胞を用いたインビトロ実験の数値定量化または転写／ｍｉＲＮＡ発現のインサイチュ定量化は、平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。げっ歯類またはヒト試薬を用いた生理学的実験の数値定量化は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。免疫ブロット画像は、少なくとも３回反復された実験を代表している。顕微鏡写真は、各関連コホートの実験を代表している。データ分布の正規性はシャピロウィルク検定により決定した。対試料を、正規分布データについては両側Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定により比較し、非正規分布データについてはマンホイットニーＵノンパラメトリック検定を使用した。群間の比較には、一元配置ＡＮＯＶＡおよび事後テューキー検定を行った。０．０５未満のＰ値を有意と見なした。
【０１０９】
[実施例２]
機械的刺激は肺血管内皮および平滑筋細胞における代謝再プログラミングを調節する
ＥＣＭ硬化により伝えられた機械的／物理的合図が、血管細胞代謝を調節するかどうかを決定するために、軟らかいまたは硬いマトリックス上での培養により肺血管細胞タイプの代謝スクリーニングを行った。細胞外フラックス分析により、酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（解糖の代理マーカー）を肺動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）で評価した。細胞外酸性化速度定量化に反映されるように、ＥＣＭ硬化は、解糖予備能を同時に低下させながら、オリゴマイシンＡ誘導細胞外酸性化速度と基礎細胞外酸性化速度との間の差として算出した基礎解糖を増加させた（データは示されていない）。ゆえに、硬いマトリックス上の細胞は、軟らかいマトリックス上の細胞と比べて最大速度により近い解糖フラックスを示した。あるいは、ＥＣＭ硬化の増大は、基礎ＯＣＲ、ＡＴＰ依存性ＯＣＲ（基礎ＯＣＲとオリゴマイシンＡ阻害ＯＣＲとの間の差）、および最大ＯＣＲ（カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン、ＦＣＣＰを介する誘導に反映された）を有意に低下させ、ゆえにミトコンドリアの酸化的リン酸化の減少を反映した。これらの代謝変化に対応して、硬いマトリックスは、全体のミトコンドリア電位を低下させた（データは示されていない）。類似の結果が肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）について観察された（データは示されていない）。まとめると、硬条件は、機械的刺激として作用して解糖を増加させ、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を減少させる。
【０１１０】
これらの同じ機械的条件下の解糖の活性、アナプレロティック反応、およびＴＣＡ回路を決定するために、候補細胞内アミノ酸および代謝産物を、ＰＡＥＣで液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定した。硬条件での解糖の増加および酸化的リン酸化の減少と一致して、乳酸／ピルビン酸比の増大が観察された。さらに酸化的リン酸化の減少と一致して、硬いマトリックスはコハク酸レベルを低下させ、乳酸生産を増加させた（データは示されていない）。重要なことには、ＥＣＭ硬化は、解糖の加速に付随する推定アナプレロティックプロセスと一致するグルタミン酸およびアスパラギン酸の強固な増加を伴う細胞内グルタミンも減少させた。解糖（ＬＤＨＡ）およびアナプレロティック反応（ＧＬＳ１およびＰＣ）の両方に関与する、ＰＡＥＣ中の３つの重要な酵素−乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）、両方のＧＬＳ１アイソフォーム（ＫＧＡおよびＧＡＣ）、およびＰＣのレベルは、硬いマトリックスで上昇した（データは示されていない）。上記のように、類似の結果がＰＡＳＭＣについて得られた（データは示されていない）。ゆえに、硬いマトリックスへの曝露は、解糖および酸化的リン酸化を変えるだけでなく、アミノ酸のアナプレロティック補給も制御する。
【０１１１】
[実施例３]
ＥＣＭ硬化はＹＡＰ／ＴＡＺに依存して代謝を制御する。
ＹＡＰおよびＴＡＺは肺血管細胞の機械センサーとして作用するという先行知見を考慮して、ＹＡＰ／ＴＡＺが代謝再プログラミング時のＥＣＭ硬化の結果を調節する上で重要かどうかを決定した。硬いマトリックス中のＰＡＥＣでは、ＹＡＰ／ＴＡＺノックダウン（図２Ａ）は乳酸／ピルビン酸比を低下させた（図２Ｂ）。これは、解糖に対するその制御を反映するものである。ＹＡＰ／ＴＡＺノックダウンは、グルタミン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸生産に対する硬いＥＣＭのアナプレロティック作用も鈍化させた（図２Ｃ）。それに応じて、ミトコンドリアの膜電位も、硬いマトリックスにおけるＹＡＰ／ＴＡＺノックダウン中に持続された（データは示されていない）。逆に、軟らかいマトリックスで増殖させたＰＡＥＣでは、ＹＡＰの安定発現（ｐＹＡＰ）は乳酸／ピルビン酸比を増大させ、グルタミンを減少させ、グルタミン酸およびアスパラギン酸を増加させ、その結果、ミトコンドリアの膜電位を低下させた（データは示されていない）。特に、ＰＡＥＣの硬いＥＣＭにより機械的に制御された解糖およびグルタミノリシスの同じ経路は、ＰＡＳＭＣのＹＡＰ／ＴＡＺにより活性化された（データは示されていない）。
【０１１２】
ＹＡＰ／ＴＡＺ複合体のいくつかの推定結合部位（ＴＥＡＤ部位）を、解糖およびグルタミノリシスに関与する重要な代謝酵素−ＬＤＨＡ、ＧＬＳ１、およびＰＣのプロモーター領域の配列分析により明らかにした（図２Ａ）。ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲは、各遺伝子の少なくとも１つの部位におけるＹＡＰの直接結合を実証した（図２Ｂ）。それに応じて、ＰＡＥＣ（図２Ｃ〜Ｅ）およびＰＡＳＭＣ（データは示されていない）におけるＹＡＰ／ＴＡＺのｓｉＲＮＡノックダウンは、標的遺伝子発現を減少させたが、軟らかいマトリックス中のＰＡＥＣにおける強制ＹＡＰ発現は、そのレベルを増大させた（図２Ｆ〜Ｈ）。まとめると、ＹＡＰ／ＴＡＺは、ＥＣＭ硬化により開始される機械誘発性解糖およびグルタミノリシス代謝再プログラミングイベントに不可欠である。
【０１１３】
[実施例４]
ＧＬＳ１発現およびグルタミノリシスの増加は硬環境での解糖および細胞増殖の持続に重要である
ＧＬＳ１が硬化誘導およびＹＡＰ／ＴＡＺ依存性グルタミノリシスに重要かどうかを決定するために、ＰＡＥＣを軟らかいまたは硬いマトリックス中で培養し、ＧＬＳ１の２つのアイソフォーム（ＫＧＡおよびＧＡＣ）、ＢＰＴＥＳ（ビス−２−（５−フェニルアセトアミド−１，３，４−チアジアゾール−２−イル）エチルスルフィド）、ＤＯＮ（６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン）、またはＣＢ−９６８（グルタミナーゼ阻害剤、化合物９６８、Ｃ−９６８）の（図３Ａ〜Ｃ）またはｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＧＬＳ；図３Ｄ〜Ｇ）の既知の阻害剤に曝露させた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量化した場合、ＰＡＥＣにおけるＧＬＳの阻害は、グルタミン消費、グルタミン酸生産、およびアスパラギン酸生産の硬化誘導プロセスを鈍化させた（図３ＡおよびＥ）。ＧＬＳ１阻害は、乳酸／ピルビン酸比の低下により示された硬いマトリックス中の解糖も低下させた（図３Ｂ〜Ｃ、図３Ｆ〜Ｇ）。代謝活性の類似の変化は、ＰＡＳＭＣでＧＬＳ１を阻害したときに観察された（データは示されていない）。
【０１１４】
ＧＬＳ１により調節される下流の分子プロセスを同定するために、硬いマトリックス細胞でｓｉ−ＧＬＳに曝露したＰＡＥＣの発現アレイ分析および経路濃縮は、特に増殖能を制御する細胞周期遺伝子および細胞遊走を制御する細胞外マトリックス組織化に関与する因子を下方制御する、多数の経路の系統的再プログラミングを明らかにした（表１）。細胞計数、ＢｒｄＵパルス、カスパーゼ３／７活性、およびＰＣＮＡ／切断カスパーゼ−３二重染色により評価した場合、ＧＬＳ１阻害は、軟らかいマトリックスでのアポトーシスおよび増殖にほとんど影響を与えなかったが、ＰＡＥＣでは硬いマトリックスでの増殖を鈍化させた（データは示されていない）。さらに、マトリックス組織化に影響を与えるトランスクリプトームの結果に対応して、ｓｉＲＮＡまたは薬理学的手段により達成されたＧＬＳ阻害は、細胞遊走を阻害した（データは示されていない）。類似の効果がＰＡＳＭＣで観察された（データは示されていない）。
【０１１５】
グルタミン酸およびアスパラギン酸のアナプレロティック生産が、増殖を持続するＧＬＳ１作用の中心となるかどうかを調べるために、ＧＬＳ１またはＹＡＰ／ＴＡＺを欠く細胞でグルタミン酸またはアスパラギン酸補充を行った。これらの結果および以前の観察と一致して、ＧＬＳ１またはＹＡＰ／ＴＡＺのｓｉＲＮＡノックダウンは、細胞計数および増殖マーカー、ＰＣＮＡの定量により評価したＰＡＥＣまたはＰＡＳＭＣのどちらかにおける増殖を減少させた（データは示されていない）。重要なことには、ＧＬＳ１またはＹＡＰ／ＴＡＺが減少した細胞では、細胞増殖がグルタミン酸によって少なくとも部分的に回復し、アスパラギン酸補充によってより完全に回復した（データは示されていない）。さらに、アスパラギン酸補充は、同様に、硬いマトリックスにおけるＧＬＳ１欠損ＰＡＥＣの細胞遊走の低減を反転させた（データは示されていない）。まとめると、これらの結果は、ＧＬＳ１ならびにグルタミノリシスによるグルタミン酸およびアスパラギン酸生産のその制御が、硬いマトリックス曝露に特異的な代謝再プログラミング、ならびに結果としての血管細胞増殖および遊走に不可欠であることを実証している。
【０１１６】
[実施例５]
ＹＡＰ／ＴＡＺ−ＧＬＳ１軸は、ＰＨのげっ歯類およびヒト例における血管硬化に曝露したＰＡＥＣおよびＰＡＳＭＣの解糖およびグルタミノリシスをインビボで活性化する
炎症性ＰＡＨ（モノクロタリン誘導）のラットモデルにおいて、肺動脈硬化は、疾患肺細動脈におけるＡＰ／ＴＡＺ発現の増加を伴う早期病理学的イベントとして最近記載された。この同じモノクロタリンラットモデルにおいて、グルタミノリシスが活性化され、肺動脈硬化、ＹＡＰ１活性化、およびＰＡＨと相関しているかどうかを決定した。以前に報告されているように、ピクロシリウスレッド染色は、原子間力顕微鏡法により実証された、モノクロタリン曝露ラットに由来し肺細動脈硬化の増加と相関する、疾患肺細動脈中の線維性コラーゲン沈着の増加を実証した（データは示されていない）。これらの変化は、ＰＡＨの血行動態症状発現を伴った。これらのラットから、ビヒクルまたはモノクロタリンに曝露した３週間後の肺由来のＣＤ３１＋内皮細胞を単離し、代謝産物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量化した（データは示されていない）。硬いマトリックスで増殖させた培養ＰＡＥＣにおけるアナプレロティック反応の観察と一致して、ＰＡＨ  ＣＤ３１＋細胞中のグルタミンは減少し、アスパラギン酸は増加した。特に、これらの細胞ではグルタミン酸濃度の有意な変化は観察されなかった。これは、インビボでの肺細胞のグルタミン酸代謝回転の上昇を示唆している可能性がある。ＴＣＡ回路活性の低下を示すコハク酸の減少も観察され、乳酸／ピルビン酸比の解糖的増大が存在した（データは示されていない）。そのような代謝産物変化と一致して、ＣＤ３１＋細胞中のＧＬＳ１発現の有意な増加が観察された（データは示されていない）。免疫ブロッティングも、モノクロタリンラット肺由来のＣＤ３１＋およびＣＤ３１−細胞の両方におけるタンパク質レベルでのＧＬＳ１、ＬＤＨＡ、およびＰＣ発現の対応する増加を実証した（データは示されていない）。インサイチュでは、共焦点免疫蛍光顕微鏡法が、疾患肺細動脈のＣＤ３１＋（内皮）およびα−ＳＭＡ＋（平滑筋）区画の両方でＧＬＳ１、ＰＣ、およびＬＤＨＡ染色の増加を明らかにした（データは示されていない）。
【０１１７】
特に、ＧＬＳ１、ＬＤＨＡ、およびＰＣ全ての上方制御は、ＹＡＰ１核局在化の増加および結果として得られた、疾患肺細動脈中のＰＣＮＡ＋／Ｋｉ６７＋増殖細胞の上方制御と相関した（データは示されていない）。疾患進行中のこれらのイベントの正確な動力学決定するために、インサイチュ共焦点免疫蛍光顕微鏡法を、ラットのモノクロタリン誘導ＰＨのさまざまな段階で行った。ＰＨにおける内皮アポトーシスの先行理論と一致して、切断カスパーゼ−３インサイチュ染色およびカスパーゼ３／７活性（モノクロタリン注射後０〜３日目）に反映された、内皮アポトーシスの初期ではあるが一時的な誘導が見出された（データは示されていない）。次いで、血管ＧＬＳ１発現の増加と相関するその後のアポトーシスの減少と、平滑筋および内皮細胞増殖の増加がこれに続いた。まとめると、およびインビトロでの知見と一致して、これらの結果は、血管傷害後および内皮アポトーシスの初期の波の直後、肺血管硬化およびグルタミノリシスの発生が、インビボで疾患内皮および平滑筋細胞の増殖の増加と同じ動力学をたどることを実証している。
【０１１８】
グルタミノリシス再プログラミングは、肺血管細胞増殖を持続するためのヒトＰＡＨの活性プロセスであるかどうかがさらに疑問視された。特発性および遺伝性病因ならびに強皮症に及ぶ原因に由来するヒトＰＡＨ患者（ｎ＝１３）のコホートを試験し（表２）、外傷または無関係な原因で死亡した非ＰＡＨ対象（ｎ＝６）と比較した（２）。ＰＡＨ症例における細動脈周囲のコラーゲンリモデリングの増加と一致して、ＧＬＳ１、ＰＣ、およびＬＤＨＡの同時の上方制御がＣＤ３１＋（内皮）およびα−ＳＭＡ＋（平滑筋）細胞の両方で観察された（データは示されていない）。ＰＡＨラットと同様に、ＧＬＳ１はＹＡＰ１核局在化と同時に増加し、ＹＡＰ１核局在化はＰＣＮＡ＋／Ｋｉ６７＋増殖血管細胞の増加と相関した（データは示されていない）。類似の観察が、網状病変−活発な増殖および静止状態のアポトーシスが一貫して観察される後期血管病変でなされた（データは示されていない）。重要なことには、これらの代謝酵素の変化は、ＰＨ個体（平均肺動脈圧［ｍＰＡＰ］≧２５ｍｍＨｇ、表３の患者人口統計情報）の主肺動脈に由来する試料でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより評価した、循環血漿中の代謝産物プロフィールと相関した。特に肺動脈圧が高い（平均肺圧＞４５ｍｍＨｇ）対象では、解糖の増加を反映して乳酸／ピルビン酸比は上昇したが、グルタミン／グルタミン酸比は低下し、アスパラギン酸は増加した。これは、非ＰＨ個体（ｍＰＡＰ＜２５ｍｍＨｇ、データは示されていない）と比較して、グルタミノリシスおよびアナプレロティック反応の上方制御を示すものである。まとめると、これらの結果は、げっ歯類およびヒト疾患例の両方にわたってインビボでＰＡＨにおけるグルタミノリシス代謝スイッチおよび血管増殖を誘導するように、血管硬化がＹＡＰ／ＴＡＺを活性化するという考えを支持している。
【０１１９】
[実施例６]
ＹＡＰ／ＴＡＺ−ＧＬＳ１軸は、ＳＩＶ−ＰＡＨを有する霊長類およびＨＩＶ誘導ＰＡＨを有する者において解糖およびグルタミノリシスを誘導する
ＰＡＨのげっ歯類モデルはヒトにおける疾患の全ての側面を再現するわけではないため、この同じ分子軸がより関連のあるモデル生物において活発であるかどうかを、直接低酸素刺激を使用することなく決定した。以前に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）誘導ＰＡＨの非ヒト霊長類モデルが、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に感染したアカゲザルで記載された。重要なことには、そのようなモデルは、ＰＡＨの血行動態および組織学的な症状発現を再現する。そのようなモデルは、ＰＡＨ発症感染マカクの５０〜６０％で不完全な浸透度も示し、ゆえに、ヒトにおけるＨＩＶ感染を伴うＰＡＨの不完全な浸透度と一致する。重要なことには、モノクロタリン曝露ラットと同様に、ＰＡＨの血行動態および組織学的な症状発現が確認されたＳＩＶ感染マカクのコホートにおいて、ピクロシリウスレッド染色は、非ＰＡＨ、ＳＩＶ感染動物と比較して細動脈周囲の線維性コラーゲンの増加を実証した（データは示されていない）。ＳＩＶ−ＰＡＨマカクの疾患肺細動脈は、ＹＡＰ１核局在化の増加、増殖ＰＣＮＡ＋／Ｋｉ６７＋細胞、および非アポトーシス、切断カスパーゼ−３陰性細胞と一致する、ＧＬＳ１、ＰＣ、およびＬＤＨＡの増加も提示した（データは示されていない）。
【０１２０】
最後に、ＳＩＶ−ＰＡＨマカクにおけるこれらの知見に起因して、ＨＩＶ−ＰＡＨに罹患しているヒトは、肺血管硬化の増加の徴候、ならびに結果として生じる血管解糖およびグルタミノリシスの変化も提示し得るかどうかを決定した。肺動脈カテーテル検査を受けたＨＩＶ感染個体４２人のコホートを試験し、１１個体でＰＡＨの診断に至った（表４）。ＨＩＶ−ＰＡＨ対象の侵襲的血行動態データの分析は、ＨＩＶ感染、非ＰＡＨ個体と比較して、肺動脈硬化の増加と一致する肺動脈コンプライアンスの有意な低下を明らかにした。重要なことには、ＰＡＨを有するおよびＰＡＨがないＨＩＶ感染者の別個のコホートからの末梢静脈血漿代謝産物を定量化することにより（表４）、解糖活性の増加を示す乳酸／ピルビン酸比の増大が観察されたが、グルタミン／グルタミン酸比の低下およびアスパラギン酸の増加は、ＨＩＶ−ＰＡＨにおけるグルタミノリシスおよびアナプレロティック反応の上方制御と一致した（データは示されていない）。その結果、げっ歯類およびヒトＰＡＨの他の例における分子的知見を映し出し、ＨＩＶ−ＰＡＨにおけるＹＡＰ／ＴＡＺ−ＧＬＳ１活性化のこれらの観察は、肺血管硬化と代謝調節異常との間の緊密に関連したつながりと相関する。
【０１２１】
[実施例７]
肺血管硬化およびＹＡＰ／ＴＡＺ依存性メカノトランスダクションの調節は、グルタミノリシスおよびＰＨの症状発現をインビボで調節する。
細動脈周囲のＥＣＭリモデリングおよびＹＡＰ／ＴＡＺが、インビボで血管細胞代謝を調節するかどうかを明確に確立するために、ＹＡＰ／ＴＡＺ依存性メカノトランスダクションの変化が、モノクロタリンラットモデルにおけるグルタミノリシスおよびＰＨ発症を直接制御するかどうかを決定した。最初に、コラーゲン架橋およびその結果として生じるマトリックス硬化に関与する酵素、Ｌｏｘの既知の薬理学的阻害剤（β−アミノプロピオニトリル、ＢＡＰＮ）を用いて、ＥＣＭ硬化の阻害が、モノクロタリン曝露ラットで観察された代謝変化および下流のＰＨの症状発現を予防できるかどうかを決定した（図４Ａ）。ＢＡＰＮ治療は、左室心機能に対する有害な作用なしに（データは示されていない）、原子間力顕微鏡法により評価した、肺Ｌｏｘ活性および結果として生じる細動脈周囲のＥＣＭ硬化を実際に減少させた（図４Ｃ〜Ｅ）。インビトロでの結果と一致して、ＢＡＰＮによるＥＣＭ硬化の低減は、ＹＡＰ１依存性遺伝子発現の減少（図４Ｅ）、および直接酵素活性測定および結果として生じる代謝産物発現の変化に反映された、下流のＧＬＳ活性の低下（図４Ｆ−Ｇ）をもたらした。そのような代謝作用は、インサイチュ細動脈染色に反映された血管内皮および平滑筋増殖をさらに減少させ（図４Ｇ）、血管リモデリングおよび筋肉化（図４Ｇ）、ならびに右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）（図４Ｈ）により測定したＰＨの血行動態的および組織学的な症状発現を改善した。
【０１２２】
平行して、第２に、ＹＡＰ１の既知の薬理学的阻害剤（ベルテポルフィン）を使用して、ＹＡＰ１活性が、疾患のこの同じラットモデルにおいて血管グルタミノリシスの活性化およびＰＨにも不可欠であるかどうかをインタロゲートした（図４Ｂ）。予想通り、ベルテポルフィンは、左室心機能または全身血圧に対する有害な作用なしに（データは示されていない）、ＹＡＰ１依存性遺伝子発現を減少させた（図４Ｅ）。その結果、ＢＡＰＮと同じように、ただしはるかにより強固な程度で、ベルテポルフィンは、下流の代謝（ＧＬＳ１発現および活性、図４Ｆ〜Ｇ）、増殖徴候（図４Ｇ）、および血管リモデリング／筋肉化の低減を含むＰＨの末期的な症状発現、ＲＶＳＰ、および右室リモデリング（フルトン指数）（図４Ｇ〜Ｉ）を改善した。その結果、これらのデータは、肺血管グルタミノリシスおよびアナプレロティック反応、増殖、およびＰＨを誘導するために、ＥＣＭ硬化はＹＡＰ／ＴＡＺ特異的メカノトランスダクションに依存するというインビボでの原因となる証拠を提供している。
【０１２３】
[実施例８]
グルタミノリシスのＧＬＳ１依存性阻害はインビボで肺血管細胞増殖を減少させ、ＰＨを改善する
最後に、グルタミノリシス自体が、ＰＨにおける肺血管増殖の促進に不可欠であるかどうかを調べるために、ＧＬＳ１の２つの別個の薬理学的阻害剤（Ｃ９６８およびＣＢ−８３９）を、疾患予防（図５Ａ）または疾患逆転（図５Ｂ）投与プロトコールのどちらかを用いてモノクロタリン曝露ラットに投与した。ＰＨを誘導するために、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１０〜１４週齢）に６０ｍｇ／ｋｇモノクロタリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注射した。２日後、Ｃ９６８またはＣＢ−８３９（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の連続腹腔内注射を毎日与え、モノクロタリン注射後の７日後、Ｃ９６８またはＣＢ−８３９（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の連続腹腔内注射を毎日与えた。モノクロタリン注射後２１日目に最後の注射をした２日後、右心カテーテル検査を行い、その後、以前に記載したように（Bertero T, et al. Cell Reports. 2015;13(5):1016-32）、ＲＮＡもしくはタンパク質抽出、パラフィン包埋、またはＯＣＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）による凍結保存のために、肺組織およびＣＤ３１＋細胞を回収した。
【０１２４】
両方の場合において、Ｃ９６８およびＣＢ−８３９治療は、左室機能または全身血圧に対する有害な作用なしに（データは示されていない）、対照と比較したラット肺全体のＧＬＳ１活性を低下させた（図５Ｃ〜Ｄ）。それに応じて、Ｃ９６８およびＣＢ−８３９はいずれも、対照ＰＨラットと比較して、ＣＤ３１＋／ｖＷＦ＋（内皮）およびα−ＳＭＡ＋（平滑筋）肺細動脈細胞中の増殖マーカー（ＰＣＮＡ＋／Ｋｉ６７＋）の存在を減少させた（図５Ｅ〜Ｈ）。その結果、Ｃ９６８およびＣＢ−８３９はいずれも、肺細動脈リモデリング（図６Ａ〜Ｂ）および筋肉化（図６Ｃ〜Ｄ）、右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）（図６Ｅ、図６Ｇ）、および右室リモデリング（図６Ｆ、図６Ｈ）を有意に減少させた。まとめると、これらの結果は、ＧＬＳ１およびＥＣＭ硬化に依存したプロセスであるグルタミノリシスを、ＰＨにおける肺血管増殖の持続に必要な重要な代謝媒介因子として直接意味付けるものである。
【０１２５】
【表１−１】
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【０１２６】
【表１−２】
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【０１２７】
【表１−３】
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【０１２８】
【表１−４】
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【０１２９】
【表２】
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【０１３０】
【表３】
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【０１３１】
【表４】
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【０１３２】
【表５】
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配列
【０１３３】
配列番号１
【化３】
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【０１３４】
配列番号２
【化４】
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【０１３５】
配列番号３
【化５】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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