(57)【要約】本発明は、血小板由来増殖因子C (PDGF-C)のエピトープと特異的に相互作用し、かつ該エピトープに対する測定可能な結合親和性を示す単離された抗体に一部関する。そのような抗体は、細胞機能に対するその作用を研究するために、特定の態様においてはPDGF-Cシグナル伝達経路に関連する疾患または状態の処置および/または予防のために、細胞内のまたは細胞から分泌されたPDGF-Cの活性の調節に用いられうる。2019527545.tif 000038
2019527545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板由来増殖因子C (PDGF-C)のエピトープと特異的に相互作用し、かつ該エピトープに対する測定可能な親和性を示す、単離された抗体またはその断片。
【請求項２】
PDGF-Cの活性部分(SEQ ID NO: 2)を含むポリペプチドまたはそれと実質的に相同なポリペプチドと特異的に相互作用し、かつ該ポリペプチドに対する測定可能な親和性を示す、単離された抗体またはその断片。
【請求項３】
前記ポリペプチドがSEQ ID NO: 3を含むか、またはそれと実質的に相同である、請求項2に記載の単離された抗体。
【請求項４】
それぞれ、6B3の軽鎖相補性決定領域(CDR) (SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; およびSEQ ID NO: 18)である、またはそれらと実質的に相同である、軽鎖CDR
を有する、請求項2に記載の単離された抗体。
【請求項５】
それぞれ、11F5の軽鎖CDR (SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; およびSEQ ID NO: 21)である、またはそれらと実質的に相同である、軽鎖CDR
を有する、請求項2に記載の単離された抗体。
【請求項６】
それぞれ、12F5の軽鎖CDR (SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; およびSEQ ID NO: 24)である、またはそれらと実質的に相同である、軽鎖CDR
を有する、請求項2に記載の単離された抗体。
【請求項７】
それぞれ、6B3の重鎖CDR (SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; およびSEQ ID NO: 36)である、またはそれらと実質的に相同である、重鎖CDR
を有する、請求項2に記載の単離された抗体。
【請求項８】
それぞれ、11F5の重鎖CDR (SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; およびSEQ ID NO: 39)である、またはそれらと実質的に相同である、重鎖CDR
を有する、請求項2に記載の単離された抗体。
【請求項９】
それぞれ、12F5の重鎖CDR (SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; およびSEQ ID NO: 42)である、またはそれらと実質的に相同である、重鎖CDR
を有する、請求項2に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
それぞれ、ch6B3の重鎖CDR (SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 47; およびSEQ ID NO: 48)である、またはそれらと実質的に相同である、重鎖CDR
を有する、請求項2に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
それぞれ、hu6B3の重鎖CDR (SEQ ID NO: 49〜51)である、またはそれらと実質的に相同である、重鎖CDR
を有する、請求項2に記載の単離された抗体。
【請求項１２】
前記抗体の重鎖および軽鎖が、SEQ ID NO: 4および10、SEQ ID NO: 5および11、SEQ ID NO: 6および12、SEQ ID NO: 7および13、SEQ ID NO: 8および14、またはSEQ ID NO: 9および15の各配列を含む、請求項2に記載の単離された抗体。
【請求項１３】
モノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはヒトモノクローナル抗体である、請求項2に記載の単離された抗体。
【請求項１４】
細胞を請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分の有効量と接触させる段階を含む、細胞における血小板由来増殖因子C (PDGF-C)の活性を調節する方法。
【請求項１５】
前記細胞が、PDGF-Cを発現する腫瘍細胞、腫瘍上皮細胞、または腫瘍間質細胞である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍細胞が、頭、首、目、口、のど、食道、気管支、喉頭、咽頭、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、膀胱、子宮、子宮頸部、乳房、卵巣、精巣または他の生殖器官、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、および脳または中枢神経系のがんからなる群より選択されるがん細胞型から形成される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍細胞が、膀胱TCC、乳房IDC、乳房ILC、結腸直腸腺がん、多形性膠芽腫、神経膠肉腫、肝細胞がん、肺腺がん、肺SqCC、転移性黒色腫、中皮腫、卵巣腺がん、膵臓腺がん、前立腺腺がん、腎細胞がん、および子宮腺がんからなる群より選択されるがん細胞型から形成される、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物に請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分の有効量を投与する段階を含む、哺乳動物における細胞のPDGF-C媒介性自己分泌および/または傍分泌シグナル伝達を調節する方法。
【請求項１９】
前記細胞が、PDGF-CまたはPDGF-CCを分泌する腫瘍細胞である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞が、頭、首、目、口、のど、食道、気管支、喉頭、咽頭、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、膀胱、子宮、子宮頸部、乳房、卵巣、精巣または他の生殖器官、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、および脳または中枢神経系のがんからなる群より選択されるがん細胞型から形成される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍細胞が、膀胱TCC、乳房IDC、乳房ILC、結腸直腸腺がん、多形性膠芽腫、神経膠肉腫、肝細胞がん、肺腺がん、肺SqCC、転移性黒色腫、中皮腫、卵巣腺がん、膵臓腺がん、前立腺腺がん、腎細胞がん、および子宮腺がんからなる群より選択されるがん細胞型から形成される、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物に請求項1〜13に記載の抗体またはその抗原結合部分の有効量を投与する段階を含む、哺乳動物における血管新生を阻害する方法。
【請求項２３】
哺乳動物に請求項1〜13に記載の抗体またはその抗原結合部分の有効量を投与する段階を含む、哺乳動物における腫瘍増殖を低減させる方法。
【請求項２４】
(i) 請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分、および(ii) 薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
【請求項２５】
6B3、11F5、12F5、および19C7からなる群より選択される抗体を分泌するハイブリドーマ。
【請求項２６】
血小板由来増殖因子C (PDGF-C)以外の血小板由来増殖因子に対して最小の親和性を示しながらPDGF-Cペプチドのエピトープにインビトロで特異的に結合することができる抗体またはその断片; および
該抗体またはその断片に直接的または間接的に結合する試薬
を含む、血小板由来増殖因子C (PDGF-C)以外の血小板由来増殖因子に対して最小の親和性を示しながらPDGF-Cペプチドを検出するためのキット。
【請求項２７】
前記抗体が請求項1〜13に記載の抗体である、請求項26に記載のキット。
【請求項２８】
前記抗体が、6B3、11F5、12F5、19C7、ch63B、およびhu6B3からなる群より選択されるモノクローナル抗体である、請求項26に記載のキット。
【請求項２９】
6B3、11F5、12F5、ch6B3、hu6B3からなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変重鎖断片をコードする単離された核酸分子であって、該可変重鎖断片が、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、それらの断片、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記単離された核酸分子。
【請求項３０】
6B3、11F5、12F5、ch6B3、およびhu6B3からなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変重鎖CDRをコードする単離された核酸分子。
【請求項３１】
6B3の重鎖CDRがSEQ ID NO: 34〜36のアミノ酸配列を含む、請求項30に記載の単離された核酸分子。
【請求項３２】
SEQ ID NO: 82〜84の核酸配列を含む、請求項30に記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
11F5の重鎖CDRがSEQ ID NO: 37〜39のアミノ酸配列を含む、請求項30に記載の単離された核酸分子。
【請求項３４】
SEQ ID NO: 85〜87の核酸配列を含む、請求項30に記載の単離された核酸分子。
【請求項３５】
12F5の重鎖CDRがSEQ ID NO: 40〜42のアミノ酸配列を含む、請求項30に記載の単離された核酸分子。
【請求項３６】
SEQ ID NO: 88〜90の核酸配列を含む、請求項30に記載の単離された核酸分子。
【請求項３７】
抗体の可変重鎖CDRをコードする単離された核酸分子であって、該重鎖CDRが、SEQ ID NO: 46〜48またはSEQ ID NO: 49〜51のアミノ酸配列を含む、前記単離された核酸分子。
【請求項３８】
SEQ ID NO: 94〜96またはSEQ ID NO: 97〜99の核酸配列を含む、請求項37に記載の単離された核酸分子。
【請求項３９】
組換え宿主細胞における抗体ch6B3の可変重鎖断片、抗体hu6B3の可変重鎖断片、または6B3、11F5、および12F5からなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変重鎖断片の発現のための発現ベクターであって、請求項29〜38のいずれか一項に記載の核酸分子を含む該発現ベクター。
【請求項４０】
抗体ch6B3の可変重鎖断片または6B3、11F5、および12F5からなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変重鎖断片を発現する宿主細胞であって、請求項39に記載の発現ベクターを含有する該宿主細胞。
【請求項４１】
6B3、11F5、12F5、およびch63Bからなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変軽鎖断片をコードする単離された核酸分子であって、該可変軽鎖断片が、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記単離された核酸分子。
【請求項４２】
6B3、11F5、12F5、およびch63Bからなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変軽鎖CDRをコードする単離された核酸分子。
【請求項４３】
6B3の軽鎖CDRがSEQ ID NO: 16〜18のアミノ酸配列を含む、請求項42に記載の単離された核酸分子。
【請求項４４】
SEQ ID NO: 64〜66の核酸配列を含む、請求項42に記載の単離された核酸分子。
【請求項４５】
11F5の軽鎖CDRがSEQ ID NO: 19〜21のアミノ酸配列を含む、請求項42に記載の単離された核酸分子。
【請求項４６】
SEQ ID NO: 67〜69の核酸配列を含む、請求項42に記載の単離された核酸分子。
【請求項４７】
12F5の軽鎖CDRがSEQ ID NO: 22〜24のアミノ酸配列を含む、請求項42に記載の単離された核酸分子。
【請求項４８】
SEQ ID NO: 70〜72の核酸配列を含む、請求項42に記載の単離された核酸分子。
【請求項４９】
抗体の可変軽鎖CDRをコードする単離された核酸分子であって、SEQ ID NO: 76〜78または79〜81の核酸配列を含む該単離された核酸分子。
【請求項５０】
組換え宿主細胞における抗体ch6B3の可変軽鎖断片、抗体hu6B3の可変軽鎖断片、または6B3、11F5、および12F5からなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変軽鎖断片の発現のための発現ベクターであって、請求項42〜49のいずれか一項に記載の核酸分子を含有する該発現ベクター。
【請求項５１】
抗体ch6B3の可変軽鎖断片、抗体hu6B3の可変軽鎖断片、または6B3、11F5、および12F5からなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変軽鎖断片を発現する宿主細胞であって、請求項50に記載の発現ベクターを含有する該宿主細胞。
【請求項５２】
動物に請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分の有効量を投与する段階を含む、その必要がある高等脊椎動物における血液脳関門の透過性を調節するための方法。
【請求項５３】
その必要がある対象に請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分の有効量を投与する段階を含む、脳血管の疾患または状態を処置するための方法。
【請求項５４】
前記疾患または状態が、浮腫腹水症(edema ascites)、水胸症、心膜水腫、脳浮腫(cerebral/brain edema)、水頭症、緑内障、急性肺水腫、網膜症、黄斑症、脳卒中、虚血性網膜症、アルツハイマー病、多発性硬化症、外傷、炎症、およびCNSの腫瘍からなる群より選択されるものである、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
網膜症が糖尿病性網膜症である、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
黄斑症が滲出型加齢黄斑変性症(AMD)である、請求項54に記載の方法。
【請求項５７】
異種血小板由来増殖因子C (PDGF-C)タンパク質をコードする異種PDGF-C遺伝子がゲノムに含まれている、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５８】
異種PDGF-Cタンパク質がヒトPDGF-Cタンパク質(SEQ ID NO: 1)と少なくとも75%同一である、請求項57に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５９】
マウス、ラット、またはウサギである、請求項57に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６０】
マウスである、請求項59に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６１】
異種PDGF-Cタンパク質がヒト化マウスPDGF-Cタンパク質である、請求項60に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６２】
ヒト化マウスPDGF-Cタンパク質が、マウスPDGF-Cタンパク質に対するK242T、K246R、R299S、K318R、N342S、およびA343T変異のうちの1つまたは複数を含む、請求項61に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６３】
ヒト化マウスPDGF-Cタンパク質がSEQ ID NO: 103の配列を含む、請求項62に記載のトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年7月1日付で出願された米国仮特許出願第62/357,536号に対する優先権を主張する。本出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、血小板由来増殖因子C (PDGF-C)およびその二量体形態PDGF-CCのエピトープと特異的に相互作用し、かつ該エピトープに対する測定可能な結合親和性を示す単離された抗体に一部関する。そのような抗体は、細胞機能に対するPDGF-CCの作用を研究するために、特定の態様においてはPDGF-C発現に関連する疾患または状態の処置および/または予防のために、細胞内のまたは細胞から分泌されたPDGF-CCの活性の調節に用いられうる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血小板由来増殖因子(PDGF)は、正常な組織増殖および維持にとって重要であり、悪性腫瘍、アテローム性動脈硬化症および線維症のようないくつかの病理学的状態にも関与している。PDGFシグナル伝達は、2つの構造的に関連したチロシンキナーゼ受容体PDGFR-αおよびPDGFR-βを通じて媒介される。PDGFファミリーは、4本のポリペプチド鎖: 古典的なPDGF-AおよびPDGF-B鎖ならびについ最近になって発見されたPDGF-CおよびPDGF-D鎖を伴うジスルフィド結合した二量体からなる。これらの鎖の各々の顕著な特徴は、それら全てがVEGF/PDGF相同ドメイン(VHD)を含むことである。PDGF-CおよびPDGF-D鎖は、それらが各々、2ドメイン構造を形成するVHDから上流のCUBドメインも有するという点でさらに異なる。
【０００４】
PDGF-Cは潜在的二量体PDGF-CCとして細胞から分泌され、PDGF-CCがその同族受容体(PDGFR)に結合し活性化する前に、CUBドメインの、調節されたタンパク質分解除去が必要とされることが知られている。活性化されたPDGF-CCは、PDGF-AAと同様に、PDGFR-αホモ二量体を通じてシグナル伝達すると考えられているが、PDGF-CCもPDGF-DDも同様に、PDGFRα/βヘテロ二量体複合体を同様に活性化できるという考えがいくつかある。
【０００５】
多くの悪性がん腫の形態学的特徴である血管新生におけるPDGF-CCの関与は、マウス胚、マウス角膜、および虚血性心臓組織を含む多数のモデルにおいて実証されている。その役割の詳細はまだ研究されているが、PDGF-CCは、VEGF上方制御、PDGF受容体の活性化によって、および/または間質に及ぼす直接的な作用を通して血管新生を誘導すると考えられている。それゆえ、自己分泌および傍分泌PDGF媒介性シグナル伝達は、腫瘍およびその周辺組織の脈管化を通して腫瘍細胞増殖および浸潤の加速につながるかまたはそれに寄与すると考えられている。
【０００６】
最近の研究は、そのような作用がPDGF-CCの活性を阻害することによって無効にされうることを示した。具体的には、PDGF-CC活性の阻害は血管新生の低減につながり、それが特定の悪性腫瘍の進行を遅らせることが示されている。場合によっては、それはさらに腫瘍細胞増殖の低減をもたらした(Crawford Y., et al. Cancer Cell 15:21-34, 2009（非特許文献1）)。したがって、PDGF-CCは、PDGF誘導性血管新生を研究するための魅力的な標的になる。PDGF-CCはまた、悪性がん腫、特にPDGF-Cを発現するもの、またはそうでなければ、脈管化および腫瘍増殖のためにPDGF-CC依存的経路を用いるものを処置するための潜在的な治療剤および/または潜在的な化学療法剤の魅力的な標的になる。
【０００７】
最近の研究はまた、PDGF-CCシグナル伝達が血液脳関門、脳血管および脊髄の血管において見られる特殊な血管壁ならびに眼の網膜の完全性を制御することを示している。血液脳関門の独特の性質は、イオンおよび他のほとんどの小分子を含むほとんどの血液成分について、通常の条件下では血液脳関門を不透過性にする。この理由は、中枢神経系(CNS)を封鎖して血液中の有毒物質および/または感染性物質が入らないようにするためであること、ならびに正常な神経活動は血液の性質と適合しないということにある。脳卒中、外傷、多発性硬化症(MS)のような炎症状態、感染症、原発性および続発性がん、手術、心停止または出産合併症に続く脳への正常な酸素および栄養素供給の欠如、アルツハイマー病を含むCNSの神経変性疾患を含むが、これらに限定されない、脳および他のCNS部分のいくつかのタイプの病的状態において、血液脳関門の完全性が損なわれるようになり、その結果CNSの実質への体液および他の血液成分の溢出を引き起こす。これは組織の腫脹および炎症をもたらし、正常な灌流の喪失ならびに脳、脊髄および網膜に対する損傷の増加につながる。したがって、PDGF-CCは、上記のように損なわれた血液脳関門を伴う状態の処置のための潜在的治療剤の魅力的な標的となる。血液脳関門の完全性を制御する上でのPDGF-CCの潜在的な役割は、Su et al. Activation of PDGF-CC by plasminogen activator impairs blood brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine, 14;731-737, 2008（非特許文献2）によって、およびEriksson et al. 「Methods and compositions for modulation of blood-neural barrier」, 国際出願PCT/US2007/066804（特許文献1）によって以前に認識されており、そのどちらも参照として本明細書に組み入れられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】PCT/US2007/066804
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Crawford Y., et al. Cancer Cell 15:21-34, 2009
【非特許文献２】Su et al. Activation of PDGF-CC by plasminogen activator impairs blood brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine, 14;731-737, 2008
【発明の概要】
【００１０】
特定の局面において、本発明は、血小板由来増殖因子C (PDGF-C)の二量体形態PDGF-CCを含むPDGF-Cのエピトープと特異的に相互作用する、および/または該エピトープに対する測定可能な親和性を示す、単離された抗体またはその断片に関する。さらなる局面において、そのような抗体またはその断片は、タンパク質PDGF-Cの活性部分(SEQ ID NO: 2)内のポリペプチドまたはそれと実質的に相同なポリペプチドと特異的に相互作用する、および/または該ポリペプチドに対する測定可能な親和性を示す。さらなる局面において、抗体またはその断片は、SEQ ID NO: 3のエピトープと、またはSEQ ID NO: 3内の配列もしくはそれと実質的に相同なポリペプチドと特異的に相互作用する、および/またはそれに対する測定可能な親和性を示す。
【００１１】
本発明の抗体(まとめて抗PDGF-C抗体と称し、または抗PDGF-CC抗体と称する)は、PDGF-CおよびPDGF-CCの両方と特異的に相互作用し、かつ/または両方に対する測定可能な親和性を示し、モノクローナル抗体(mAb) 6B3、11F5、19C7および12F5の、キメラ抗体ch6B3のまたはヒト化抗体hu6B3の、完全抗体、断片または実質的に相同な断片を含みうる。断片は、6B3、ch6B3、hu6B3、11F5、12F5および19C7の可変軽鎖および重鎖配列またはCDR領域の1つまたは一部分を含みうるか、あるいはそのような配列と実質的に相同でありうる。6B3、ch6B3、hu6B3、11F5、12F5および19C7の各々の軽鎖および重鎖CDRは、以下の通りである:
6B3
ペプチド - 軽鎖 - SEQ ID NO: 16 (CDR1)、SEQ ID NO: 17 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 18 (CDR3); 重鎖 - SEQ ID NO: 34 (CDR1)、SEQ ID NO: 35 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 36 (CDR3);
核酸 - 軽鎖 - SEQ ID NO: 64 (CDR1)、SEQ ID NO: 65 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 66 (CDR3); 重鎖 - SEQ ID NO: 82 (CDR1)、SEQ ID NO: 83 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 84 (CDR3);
ch6B3
ペプチド - 軽鎖 - SEQ ID NO: 28 (CDR1)、SEQ ID NO: 29 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 30 (CDR3); 重鎖 - SEQ ID NO: 46 (CDR1)、SEQ ID NO: 47 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 48 (CDR3);
核酸 - 軽鎖 - SEQ ID NO: 76 (CDR1)、SEQ ID NO: 77 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 78 (CDR3); 重鎖 - SEQ ID NO: 94 (CDR1)、SEQ ID NO: 95 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 96 (CDR3);
11F5
ペプチド - 軽鎖 - SEQ ID NO: 19 (CDR1)、SEQ ID NO: 20 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 21 (CDR3); 重鎖 - SEQ ID NO: 37 (CDR1)、SEQ ID NO: 38 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 39 (CDR3);
核酸 - 軽鎖 - SEQ ID NO: 67 (CDR1)、SEQ ID NO: 68 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 99 (CDR3); 重鎖 - SEQ ID NO: 85 (CDR1)、SEQ ID NO: 86 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 87 (CDR3);
12F5
ペプチド - 軽鎖 - SEQ ID NO: 22 (CDR1)、SEQ ID NO: 23 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 24 (CDR3); 重鎖 - SEQ ID NO: 40 (CDR1)、SEQ ID NO: 41 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 42 (CDR3);
核酸 - 軽鎖 - SEQ ID NO: 70 (CDR1)、SEQ ID NO: 71 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 72 (CDR3); 重鎖 - SEQ ID NO: 88 (CDR1)、SEQ ID NO: 89 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 90 (CDR3)。
19C7
ペプチド - 軽鎖 - SEQ ID NO: 25 (CDR1)、SEQ ID NO: 26 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 27 (CDR3); 重鎖 - SEQ ID NO: 43 (CDR1)、SEQ ID NO: 44 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 45 (CDR3);
核酸 - 軽鎖 - SEQ ID NO: 73 (CDR1)、SEQ ID NO: 74 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 75 (CDR3); 重鎖 - SEQ ID NO: 91 (CDR1)、SEQ ID NO: 92 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 93 (CDR3)。
hu6B3
ペプチド - 軽鎖 - SEQ ID NO: 31 (CDR1)、SEQ ID NO: 32 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 33 (CDR3); 重鎖 - SEQ ID NO: 49 (CDR1)、SEQ ID NO: 50 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 51 (CDR3);
核酸 - 軽鎖 - SEQ ID NO: 79 (CDR1)、SEQ ID NO: 80 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 81 (CDR3); 重鎖 - SEQ ID NO: 97 (CDR1)、SEQ ID NO: 98 (CDR2)、およびSEQ ID NO: 99 (CDR3)。
【００１２】
この目的のために、および特定の局面において、本発明の抗PDGF-C抗体または抗PDGF-C抗体の部分は、1つまたは複数の上述の配列、断片、またはその相同体を含む単離された核酸分子中にコードされる。核酸分子は、モノクローナル抗体6B3、11F5、19C7、および12F5の、キメラ抗体ch6B3のまたはヒト化抗体hu6B3の、可変重鎖および/もしくは軽鎖ならびに/またはCDRを、その断片を含め、コードしうる。そのような核酸配列は、発現ベクターにクローニングされ、組換え宿主細胞に挿入されうる。この目的のために、本発明は各々の単離された核酸、そのような単離された核酸をコードする組換え発現ベクター、およびそのようなベクターを発現する宿主細胞を含む。
【００１３】
上述の配列の1つまたは複数を組み入れた本発明の抗PDGF-C抗体は、その実質的に相同な変種を含めて、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒトモノクローナル抗体、または本明細書において定義される他の変種として提供されうる。
【００１４】
本発明はまた、本発明の抗PDGF-C抗体の1つまたは組み合わせを単独でまたは薬学的組成物中で用いる処置方法に関する。処置方法の1つの態様は、少なくとも1つの本発明の抗PDGF-C抗体の有効量を哺乳動物に投与することによって、PDGF-CC発現がん腫のような細胞における血小板由来増殖因子CC (PDGF-CC)の活性を調節することを含む。さらなる態様において、本発明の処置方法は、細胞からのPDGF-CC媒介性自己分泌または傍分泌シグナル伝達の調節を含む。例えば、PDGF-CC発現がん腫で、PDGF-CC自己分泌または傍分泌シグナル伝達は、脈管化、間質支持、または細胞内もしくは細胞周辺での他の腫瘍作用に関連しており、これは細胞生存性および/または腫瘍増殖をもたらす。本発明の1つまたは複数の抗PDGF-C抗体の投与は、そのようなシグナル伝達を阻害または阻止し、そのような作用の減少を引き起こすために用いられうる。この目的のために、本発明の処置方法はまた、少なくとも1つの本発明の抗PDGF-C抗体の有効量を哺乳動物に投与することによって、血管新生、間質支持、細胞生存性、腫瘍サイズなどを低減させる方法を含む。
【００１５】
さらに別の態様において、処置方法は、少なくとも1つの本発明の抗PDGF-C抗体の有効量を哺乳動物に投与することによって、血液脳関門における血小板由来増殖因子CC (PDGF-CC)の活性を調節する段階を含む。さらなる態様において、本発明の処置方法は、CNSのいくつかの病的状態におけるPDGF-CC媒介性血液脳関門開放の調節を含む。本発明の1つまたは複数の抗PDGF-C抗体の投与は、そのようなシグナル伝達を阻害または阻止し、そのような作用の減少を引き起こすために用いられうる。この目的のために、本発明の処置方法はまた、少なくとも1つの本発明の抗PDGF-C抗体の有効量を哺乳動物に投与することによって、CNS病態などによる血液脳関門の開放を低減させる方法を含む。
【００１６】
さらに、本発明は、PDGF-CC発現細胞の存在を患者もしくは対象の体液中で診断するための、またはそうでなければ、PDGF-CC活性の標的阻害を示す代替治療用物質を同定するための診断アッセイ、薬物スクリーニングアッセイなどを含む。本発明の抗PDGF-C抗体はまた、PDGF-CC発現細胞におけるPDGF-CCの活性を研究するための分子ツールとしても用いられうる。
【００１７】
そのような態様に関連して、本発明はまた、(1) PDGF-C以外の血小板由来増殖因子に対して最小の親和性を示しながら血小板由来増殖因子C (PDGF-C)ペプチドのエピトープにインビトロで特異的に結合することができる抗体またはその断片; および(2) 該抗体またはその断片に直接的または間接的に結合する試薬を含む、PDGF-C以外の血小板由来増殖因子に対して最小の親和性を示しながら血小板由来増殖因子C (PDGF-C)ペプチドを検出するためのキットを含む。
【００１８】
本発明はまた、その必要がある高等脊椎動物における血液脳関門の透過性を調節するための方法を提供する。本方法は、上記の抗体またはその抗原結合部分の有効量を動物に投与する段階を含む。脳血管の疾患または状態を処置するための方法も提供される。この方法は、上記の抗体またはその抗原結合部分の有効量を、それを必要とする対象に投与する段階を含む。疾患または状態の例としては、浮腫腹水症(edema ascites)、水胸症、心膜水腫、脳浮腫(cerebral/brain edema)、水頭症、緑内障、急性肺水腫、網膜症、黄斑症、脳卒中、虚血性網膜症、アルツハイマー病、多発性硬化症、外傷、炎症、およびCNSの腫瘍が挙げられる。1つの例において、網膜症は糖尿病性網膜症である。別の例において、黄斑症は滲出型加齢黄斑変性症(AMD)である。
【００１９】
別の局面において、本発明は、異種血小板由来増殖因子C (PDGF-C)タンパク質をコードする異種PDGF-C遺伝子がゲノムに含まれている、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。異種PDGF-Cタンパク質は、ヒトPDGF-Cタンパク質(SEQ ID NO: 1)と少なくとも75% (例えば、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、および100%)同一であることができる。トランスジェニック動物は、マウス、ラット、またはウサギであることができる。1つの例において、動物はマウスである。その場合、異種PDGF-Cタンパク質はヒト化マウスPDGF-Cタンパク質であることができる。ヒト化マウスPDGF-Cタンパク質は、マウスPDGF-Cタンパク質(SEQ ID NO: 104)と少なくとも75% (例えば、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、および100%)同一でありうるタンパク質であることができる。それはマウスPDGF-Cタンパク質に対する以下の変異のうちの1つまたは複数を含むことができる: K242T、K246R、R299S、K318R、N342S、およびA343T。例えば、ヒト化マウスPDGF-Cタンパク質は、SEQ ID NO: 103の配列を含むことができる。
【００２０】
当業者は、前述が本発明を必ずしも限定するものではないこと、ならびに本発明のさらなる態様および利点が本明細書において提供される開示に基づいて容易に利用可能であることを容易に認識するであろう。
【００２１】
本発明の理解に役立つように、以下の非限定的な定義が提供される。
【００２２】
本明細書において用いられる「相同性」という用語は、2つの組成物間の共有構造の存在をいうことができる。タンパク質の文脈における「相同性」という用語は、2つまたはそれ以上のアミノ酸および/またはペプチド配列の間の重複の量(例えば、百分率で表される)をいうことができる。核酸の文脈において、この用語は、2つまたはそれ以上の核酸配列間の重複の量(例えば、百分率で表される)をいうことができる。本明細書において用いられる場合、2つの配列間のパーセント(%)相同性は、2つの配列間のパーセント同一性に等しい。2つの配列間のパーセント同一性は、2つの配列の最適アライメントのために導入される必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一な位置の数の関数である(すなわち、%相同性 ＝ 同一な位置の数/位置の総数×100)。2つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の判定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。そのような相同性は、局所的アライメントツールおよび/またはアルゴリズムを介して当技術分野においてよく表されており、ペアワイズアライメント、多重配列アライメント法、構造的アライメント法、および／または系統発生分析法を含みうる。
【００２３】
例えば、2つのアミノ酸配列のパーセント同一性または2つの核酸のパーセント同一性は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993にあるように修正された、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを用いて判定することができる。そのようなアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)に組み入れられている。BLASTヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、NBLASTプログラム、スコア＝100、ワード長-12を用いて実施することができる。BLASTタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いて実施することができる。2つの配列間にギャップが存在する場合、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記述されているようにGapped BLASTを利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータを用いることができる。
【００２４】
本明細書において用いられる場合、「実質的に相同な」とは、大部分ではあるが完全には相同ではなく、相同である配列としての活性の大部分または全部を保持する配列を意味する。具体的には、「実質的に相同」とは、ある配列が参照配列に対して少なくとも70%同一である、好ましくは少なくとも75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同性であることを意味する。
【００２５】
本明細書において用いられる場合、異種ポリペプチド、核酸、または遺伝子は、外来種に由来するもの、または同じ種に由来する場合はその元の形態から実質的に改変されているものである。2つの融合ドメインまたは配列は、それらが天然に存在するタンパク質または核酸において互いに隣接していない場合、互いに異種である。
【００２６】
導入遺伝子は、それが導入される細胞もしくは対象に対して部分的もしくは全体的に異種であるか、またはそれが導入される細胞もしくは対象の内因性遺伝子と同種であるが、ゲノムを改変するような方法で対象のゲノムに挿入される(例えば、それは天然の遺伝子のものとは異なる位置に挿入される、またはその挿入はノックアウトをもたらす)ように意図される核酸配列(例えば、1つまたは複数の対象ポリペプチドをコードする)に対するものである。導入遺伝子は、1つまたは複数の機能的に連結された転写調節配列(例えば、エンハンサー配列)および関心対象の核酸の最適な発現に必要でありうるイントロンのような、他の任意の核酸を含むことができる。トランスジェニック細胞は、導入遺伝子を含む細胞である。トランスジェニック動物は、動物の細胞の1つもしくは複数、または全てが導入遺伝子を含む任意の動物である。当技術分野において公知の意図的な遺伝子操作により前駆細胞に導入することによって導入遺伝子を細胞に導入することができる。導入遺伝子は、染色体内に組み込まれてもよく、または染色体外で複製するDNAであってもよい。
【００２７】
本明細書において用いられる場合、「エピトープ」という用語は、B細胞および/もしくはT細胞が応答する抗原上の部位、またはそれに対して抗体が産生されるおよび/もしくは抗体が結合する分子上の部位をいう。例えば、エピトープは、そのエピトープを規定する抗体によって認識することができる。エピトープは、「線状エピトープ」(一次アミノ酸一次配列がエピトープを含む場合; 典型的には少なくとも3個の連続アミノ酸残基、より一般的には、ユニークな配列中の少なくとも5個、最大で約8個から約10個までのアミノ酸)または「立体配座エピトープ」(一次連続アミノ酸配列がエピトープの唯一の規定成分ではないエピトープ)のいずれかであることができる。立体配座エピトープは、この立体配座エピトープがペプチドまたはタンパク質の三次元構造を認識するので、線状エピトープと比べて増加したアミノ酸数を含みうる。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成すると、立体配座エピトープを形成する特定のアミノ酸および/またはポリペプチド主鎖が並置されるようになり、抗体がエピトープを認識することが可能になる。エピトープの立体配座を判定する方法には、例えば、X線結晶学、二次元核磁気共鳴分光法および部位特異的スピン標識および電子常磁性共鳴分光法が含まれるが、これらに限定されることはない。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)を参照されたく、この開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００２８】
本明細書において用いられる場合、「単離された」という用語は、それが当技術分野内で用いられる通り、すなわち抗体/特異的結合メンバー、核酸分子などが見出される状態である。抗体/特異的結合メンバーおよび核酸分子は、それらがその天然の環境、またはそのような調製が組換えDNA技術(インビトロで実践される)またはインビボによるものである場合にはそれらが調製される環境(例えば細胞培養)において見出される他のポリペプチドまたは核酸のようなそれらが天然に関連する物質を、含まないまたは実質的に含まないであろう。「単離された」は、その初期環境からの取り出し後に本発明の同定され特徴付けられた成分を含有する任意の形態を網羅する。確かに限定するものではないが、例として、薬学的製剤、希釈剤を有する製剤、インビトロまたはインビボのいずれかで修飾(例えば、抗体グリコシル化)され、その環境から取り出されている抗体/特異的結合メンバー、核酸分子およびその部分を有する製剤が挙げられる。
【００２９】
「対象」または「患者」という用語は、脊索動物門(Phylum Chordata)の任意のメンバーを含むよう意図され、非限定的に、ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーならびに他の類人猿およびサル種のような、ヒト以外の霊長類を含む）; ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜; イヌおよびネコのような飼育哺乳動物; マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物; ニワトリ、シチメンチョウのような家禽、野鳥および狩猟鳥、ならびに他のキジ類の鳥であるアヒル、ガチョウなどを含む、鳥類が挙げられる。
【００３０】
疾患を「処置する」または疾患の「処置」という用語は、疾患の徴候または症状を緩和するための努力の一環として、1つまたは複数の薬物を対象(ヒトまたはその他)に投与することを含みうる、プロトコルを実行することをいう。緩和は、疾患の徴候または症状が出現する前に、およびその出現後に起こりうる。したがって、「処置する」または「処置」は、疾患を「予防すること」または疾患の「予防」を含む。加えて、「処置する」または「処置」は、徴候または症状の完全な緩和を必要とせず、治癒を必要とせず、具体的には対象に限界的なプラスの効果しかないプロトコルを含む。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、本明細書において提供される、抗体の「有効量」または「薬学的有効量」という用語は、所望の生物学的結果を提供するために無毒であるが十分な活性成分の量をいう。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、当業者により慣用の実験方法を用いて判定されうる。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語は、材料が、いずれの望ましくない生物学的作用も引き起こすことなくまたはそれが含有される組成物(例えば、「薬学的に許容される組成物」)のいかなる成分とも有害な方法で相互作用することなく、製剤化された生物剤とともに薬物送達デバイスにおいて個体に投与されうることを意味する。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、互換的に用いられうる「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に著しい刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体、希釈剤および賦形剤をいう。アジュバントはこれらの語句に含まれる。
【００３４】
本明細書において用いられる場合、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に添加される不活性な物質をいう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
（図１）組換えヒトPDGF-DDタンパク質(上パネル)、PDGF-CCタンパク質(中パネル)、およびヒスチジンポリペプチド(下パネル)に対するPDGF-CCモノクローナル抗体結合活性のハイブリドーマ上清を例示する。
（図２）6B3、11F5、12F5、および19C7と同定された4種のmAbの結合特異性を例示する。図2A: 抗体がヒトPDGF-CCとのみ反応することを例示する。図2B: 6B3ではなく12F5がマウスPDGF-Cコアタンパク質を認識し、両抗体ともRhPCcを認識することを例示する。
（図３）CDRに下線を引いた、抗体6B3、11F5、12F5、および19C7の完全可変軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO: 4〜7)のアライメントを提供する。
（図４）CDRに下線を引いた、6B3、11F5、12F5、および19C7の完全可変重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO: 10〜13)のアライメントを提供する。
（図５）マウス抗体(mu6B3)と比較しての、ch6B3の完全可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列のアライメントを提供する。
（図６）さまざまな濃度(44.6〜267.6 μM)の
2019527545.tif 000003
の存在下での、固定化された組換えPDGF-CCコアタンパク質への6B3抗体(333nM)の結合について観察された最大Biacore応答のバイオセンサー分析を例示する。PDGF-CCへの6B3結合の減少はペプチド3のみの存在下でのみ観察され、特異的阻害を示唆していた。
（図７）固定化PDGFCペプチド
2019527545.tif 000004
への抗体6B3 (濃度範囲20.8 nM〜667 nM)の結合(図7A)ならびに固定化PDGF-Cペプチドエピトープ
2019527545.tif 000005
および1アミノ酸だけPDGF-Cペプチドと異なった対応するPDGF-Dペプチド
2019527545.tif 000006
への抗体6B3 (1.334 μM)の結合(図7B)についてのバイオセンサー分析からのセンサーグラムを例示する。チオール固定化を用いてセンサーチップ上の規定の配向のためにペプチドをC末端システインで合成した。
（図８）強調表示された6B3エピトープ配列および表示されたPDGF-Dに対する相同性を有するPDGF-Cアミノ酸配列の231〜345位の残基(SEQ ID NO: 2)を例示する。
（図９）PDGF-DDではなくPDGF-CCへの、抗体6B3、11F5、12F5、および19C7の結合の特異性についてのバイオセンサー分析の図解を提供する。
（図１０）1:1ラングミュア(Langmuir)結合モデルに適合させた、マウス6B3 (10A)およびキメラ6B3 (10B)についての代表的な結合曲線を例示する。
（図１１）PDGF-CC活性の阻害を例示する。図11A: SDS-PAGEゲルおよび免疫ブロッティング分析を提供し、PAE-PDGFRαリン酸化の阻害を示している。図11B: SDS-PAGEゲルおよび免疫ブロッティング分析を提供し、PDGF-CC誘導性PAE-PDGFRαリン酸化の阻害を示している。PB: PDGFRαのPDGF-BB活性化に対する陽性対照; 対照: 全長PDGF-Cの陰性対照。RhPC: 組換えヒトPDGF-CCコアドメイン。
（図１２）図12AおよびBは、6B3がPDGF-CC誘導性PAEα細胞増殖を投与量依存的に阻害することを実証する。
（図１３）200倍に拡大した、正常ヒト組織における免疫組織化学的6B3染色パターンを例示する。
（図１４）200倍に拡大した、ヒト腫瘍組織における免疫組織化学的6B3染色パターンを例示する。
（図１５）抗PDGF-C 12F5または6B3 300 μgにより週3回3週間(15A)ならびに300 μgおよび1 mg用量の6B3療法により週3回さらに長い4週の期間(15B)処置したマウスにおける結腸がん腫異種移植片の結果を例示する。
（図１６）Colo205異種移植片切片のポドカリキシン(Podocalyxin)染色による血管の免疫組織化学分析を例示しており、ここでパネルAは血管数の変化を実証し、パネルBは単位面積当たりの血管数の変化を実証し、パネルCは血管外周の変化を実証し、パネルDは細胞増殖の変化を実証する。
（図１７）図17A〜Bは、抗PDGF-CC処置が血管新生の減少を介して同所性腫瘍増殖を減少させたことを例示する。
（図１８）図18Aおよび18Bは、抗PDGF-C抗体によるPDGF-CC媒介性血液脳関門開放の調節を実証する結果を示す。図18A: PDGF-CCの髄腔内注射および抗PDGF-C抗体6B3または対照抗体BM4の腹腔内注射後のマウス脳におけるエバンスブルーの溢出(extravasion)を例示する写真のセットである。図18B: 同じ結果を示す図表である。
（図１９）マウスおよびヒトPDGF-CCの増殖因子ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 108および109)の比較を提供する。赤い矢印は、部分的にヒト化されたPDGF-CCマウス系統を作製するために変更されたアミノ酸を示す。
（図２０）部分的にヒト化されたマウスPDGF-Cタンパク質のアミノ酸配列(1〜345位の残基, SEQ ID NO: 103)を例示する。増殖因子ドメイン(229〜345位のアミノ酸残基)中の6つのアミノ酸置換には下線が引かれている。アミノ酸置換は、242Kから242T、246Kから246R、299Rから299S、318Kから318R、342Nから342S、および343Aから343Tである。
（図２１）脳卒中のヒト化マウスモデルの作製のためのターゲティングベクターを例示する。
（図２２）PDGF-CCマウスゲノム遺伝子座、脳卒中のヒト化マウスモデルの作製のためのターゲティングベクター、相同組換え後の標的PDGF-CC対立遺伝子、およびFlp組換え後のヒト化PGCF-CC対立遺伝子を例示する。
（図２３）1回拍出量(図23A)および出血スコア(図23B)に及ぼすMCAO前の6B3処置(予防的処置)の効果を例示する。
（図２４）1回拍出量(図24A)および出血スコア(図24B)に及ぼすMCAO後の6B3処置(治療的処置)の効果を例示する。
（図２５）CDRに下線を引いた、マウス抗体(mu6B3)と比較しての、hu6B3の完全可変軽鎖タンパク質配列のアライメントを提供する。
（図２６Ａ）CDRに下線を引いた、マウス抗体(mu6B3, SEQ ID NO: 15)と比較しての、hu6B3HCRの完全可変重鎖タンパク質配列(SEQ ID NO: 14)のアライメントを提供する。hu6B3「R」バージョンは、PDGF-CCに対して優れた結合特性を実証し、ヒト化抗体の最終配列として選択された。
（図２６Ｂ）CDRに下線を引いた、マウス抗体(mu6B3, SEQ ID NO: 15)と比較しての、hu6B3HCGの完全可変重鎖タンパク質配列(SEQ ID NO: 110)のアライメントを提供する。
（図２７）ELISA分析(図27A)およびウエスタンブロッティング(図27B)により、マウス6B3抗PDGF-CC抗体の特異性および機能が、キメラ化およびヒト化の後で保持されていることを例示する。図27A: PDGF-CCに対する親マウス抗PDGF-CCモノクローナル抗体6B3の特異性は、キメラ6B3 (ch6B3)ならびにヒト化抗体hu6B3 Gおよびhu6B3 R形態により保持される。対照抗PDGF-DD抗体12C2のみが、密接に関連したPDGFファミリーメンバーPDGF-DDに結合する。図27B: 細胞と精製抗体(5 μg/ml)との事前のインキュベーション有りまたは無しで50 ng/mlのPDGF-CCコアタンパク質でPAE細胞を刺激した。活性化受容体を抗ホスホチロシン抗体PY99で検出した。結果は、ヒト化6B3 GおよびR変種が親マウスmAb 6B3と同程度に効果的にPDGF-Cを中和することを実証している。対照12C2ではなく、抗PDGF-CCモノクローナル抗体12F5も中和を行っていた。
（図２８）固定化されたPDGF-CCと漸増濃度のhu6B3抗体変種A)重鎖G30RおよびB)重鎖R30との間の相互作用についてのバイオセンサー分析からのセンサーグラムを例示する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
発明の詳細な説明
PDGF-Cは、本明細書において多くの既存のがん腫の分子的特徴であることが実証され、血管新生および腫瘍増殖のための誘導経路に、ならびにCNSの血液脳関門の生理学的性質を制御する因子として、関連付けられている。PDGF-C発現はまた、アテローム性動脈硬化症および線維症のような他の疾患状態にも関連している。したがって、それは、PDGF-C発現細胞の研究、またあるいは、関連する細胞型がPDGF-C発現/分泌を示す疾患または状態と診断された患者を処置する方法のための実行可能な標的となる。特定の局面において、本発明は、血小板由来増殖因子C (PDGF-C)の1つまたは複数のエピトープと特異的に相互作用し、かつ該エピトープに対する測定可能な親和性を示す、単離された抗体、本明細書において「抗PDGF-C抗体」に関する。そのような抗体は、細胞機能に及ぼすその作用を研究するために細胞内のまたは細胞から分泌されたPDGF-CCの活性の調節のために、および特定の態様においてはPDGF-C発現の増加またはPDGF-CC活性の増加に関連する疾患または状態の処置のために用いられうる。特定の態様において、抗PDGF-C抗体は、腫瘍細胞の増殖および転移を処置もしくは予防するために、および/または血管新生および腫瘍増殖を阻止するために対象に投与され、ならびにCNS損傷もしくはCNS疾患を処置するために対象に投与されうる。
【００３７】
ある局面において、それは、以下のアミノ酸配列を有するヒト型のタンパク質をいう:
2019527545.tif 000007
【００３８】
しかしながら、本発明はこの形態に限定されず、本明細書において論じられるまたはそうでなければ当技術分野において知られているPDGF-CおよびPDGF-CCの特性を標的細胞において示す、天然または合成の任意の変種を含みうる。
【００３９】
抗PDGF-C抗体の標的エピトープは、それに対して本発明の1つまたは複数の抗体が測定可能な親和性で結合するPDGF-Cの任意の1つまたは複数のペプチド配列を含む。そのような配列は、タンパク質の活性領域または非活性領域を含むことができ、本明細書において定義されるように、線状エピトープおよび/または立体配座エピトープのいずれかを含む。特定の局面において、それらは、抗体の結合が宿主細胞におけるPDGF-CC活性の測定可能な低減をもたらす1つまたは複数の領域を含む。この目的のために、特定の局面において、エピトープは、抗体の結合が活性部位遮断、立体障害、アロステリック阻害などのようなタンパク質活性を変更するタンパク質の位置にある。そのような結合部位は、SEQ ID NO: 2として提供される、全長配列の231〜345位の残基 (上記の下線)の位置に提供されるPDGF-CCコア活性ドメイン内の1つまたは複数のエピトープを含みうるが、これらに限定されることはない。別の態様において、エピトープは、アミノ酸配列
2019527545.tif 000008
(またはその中のアミノ酸配列)を含む。本発明のエピトープは、SEQ ID NO: 1〜3内の正確な配列に限定されず、少なくとも70%の相同性、80%の相同性、90%の相同性または99%の相同性を有する任意の配列を含みうる。
【００４０】
本発明の抗PDGF-C抗体は、本明細書において同定された1つまたは複数の抗原結合ドメインを含んだ2本の同一の重鎖および2本の軽鎖を含む。軽鎖は、1つの可変ドメイン(VL)および1つの定常ドメイン(CL)を含む。重鎖はまた、1つの可変ドメイン(VH)および、抗体のクラスまたはアイソタイプに応じて、3つまたは4つの定常ドメイン(CH1、CH2、CH3およびCH4)を含む。アイソタイプにはIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMが含まれるが、これらに限定されることはなく、IgAおよびIgGはサブクラスまたはサブタイプにさらに細分される。特定の非限定的な発明において、本発明のアイソタイプはIgGであり、これはそのサブタイプ(例えばIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4)の1つまたは組み合わせを含む。
【００４１】
用途に応じて、特定のアイソタイプまたはアイソタイプ誘導体が、本発明によって企図される抗体に選択的に用いられうる。
【００４２】
本発明のいくつかの態様において、抗体は、顕著な補体依存性細胞傷害(CDC)および/またはエフェクター媒介性殺傷を抗体依存性細胞傷害(ADCC)によりもたらすアイソタイプを有する。そのようなエフェクター機能には、補体の第1成分(C1)、Fcγ受容体I (FcγRI、CD64としても知られる))、FcγRII (CD32としても知られる)またはFcγRIIIa/b (CD16としても知られる)の活性化が含まれるが、これらに限定されることはない。IgGアイソフォームの場合、エフェクター機能のレベルは、IgG3≧IgG1≧IgG2≧IgG4の順に減少する。それゆえ、顕著なエフェクター機能および/または補体を活性化する能力を有するIgG3およびIgG1のようなアイソタイプは、腫瘍細胞増殖、生存性または転移の処置または予防、および血管新生の阻止のような、企図される抗体の腫瘍学用途に特に有用である。
【００４３】
本発明の別の態様において、抗体は、比較的不活性であると考えられるアイソタイプ、例えばエフェクター機能の低減を示すまたはエフェクター機能を示さないアイソタイプを有する。そのようなアイソタイプの非限定的な例としては、IgG2、IgG4、またはそれらのエフェクター機能を低下させるために変異されている他のアイソタイプが挙げられる。例えば、ヒトIgG1およびIgG2の233〜236位の残基ならびにIgG4の327、330および331位の残基の置換は、CDCおよびADCCを顕著に減少させることが実証されている(Armour KL, Clark MR, Hadley AG, Williamson LM. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24およびShields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae J, Briggs J, Xie D, Lai J, Stadlen A, Li B, Fox JA, Presta LG. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604を参照のこと)。低減したエフェクター機能を有するアイソタイプは、CNSの損なわれたBBBに関連する障害または状態を処置するために投与される抗体に特に有用である。
【００４４】
対合した重鎖定常ドメインは一般に、抗体のFc領域を規定すると理解されている。その配列に基づいて、それは抗体に上記の1つまたは複数のアイソタイプを提供する。Fc領域は、Fc受容体結合、補体媒介性細胞傷害および抗体依存性細胞傷害の活性化と関連している。この目的のために、それは免疫学的反応性の惹起に少なくとも部分的に関与している。
【００４５】
抗体のVLおよびVHドメインは一般に、「Fv」領域として定義され、抗原結合部位を構成する。一本鎖Fv (scFv)は、1つのポリペプチド鎖上にVLドメインおよびVHドメインを含んだタンパク質を含み、ここで一方のドメインのN末端と他方のドメインのC末端とが、柔軟なリンカーによって連結されている。「Fab」領域は、VL-CL (すなわち、軽鎖)およびVH-CH (「Fd」とも表される)を含む抗体の部分をいう。
【００４６】
抗体のFv領域の各VLおよびVHドメイン内に存在するのは、8つのフレームワーク領域(FR)および6つの全相補性決定領域(CDR)である。4つのFRおよび3つのCDRが各VL鎖およびVH鎖において見出される。4つのFR領域(FR1、FR2、FR3、およびFR4)は比較的保存されているが、CDR領域(CDR1、CDR2、およびCDR3)は、標的エピトープ配列の認識および結合に主に関与する抗体の超可変部分に相当する。典型的には、FRおよびCDR領域は、以下のように抗体のNH2末端からCOOH末端へと配置される: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
【００４７】
特定の局面において、本発明の抗PDGF-C抗体は、本明細書において定義される単離されたモノクローナル抗体6B3、11F5、12F5、および19C7、ならびにそのような抗体を産生するハイブリドーマを含む。本発明の抗体はまた、モノクローナル抗体6B3、11F5、12F5、および19C7の変種、すなわち抗体6B3、11F5、12F5、および19C7からのペプチド配列の1つまたは組み合わせを有する抗体を含む。そのような変種の2つの非限定的な例は、6B3 mAbと実質的に相同なCDR配列を有するキメラ抗体ch6B3およびヒト化抗体hu6B3である。
【００４８】
以下の表1および2は、それぞれ、抗体6B3、11F5、12F5、19C7、ch6B3およびhu6B3の可変軽鎖および可変重鎖のアミノ酸配列を提供する。
【００４９】
（表１）可変軽鎖配列
2019527545.tif 000009
【００５０】
（表２）可変重鎖配列
2019527545.tif 000010
【００５１】
以下の表3および4は、それぞれ、抗体6B3、11F5、12F5、19C7、ch6B3およびhu6B3の可変軽鎖CDRおよび可変重鎖CDRのアミノ酸配列を提供する。
【００５２】
（表３）可変軽鎖CDR配列
2019527545.tif 000011
【００５３】
（表４）可変重鎖CDR配列
2019527545.tif 000012
【００５４】
本発明の抗PDGF-C抗体は、本明細書において同定された1つまたは複数のエピトープを含むPDGF-Cタンパク質に対して測定可能な結合親和性を示すように、前述の可変軽鎖、可変重鎖、および/またはCDRペプチド配列を正確に含んでいてもよく、あるいは前述の配列の1つと十分に相同であってもまたは実質的に同じであってもよい。実質的に同じアミノ酸配列または十分に相同とは、参照により内容が本明細書に組み入れられるPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988)にしたがってFASTA検索法により判定された場合に、比較されたアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の相同性または同一性を有する配列として本明細書において定義される。本発明の抗PDGF-C抗体は、標的抗原またはエピトープに対して測定可能な親和性で結合する、天然に存在する抗体、(Fab’)2のような二価断片、Fabのような一価断片、一本鎖抗体、一本鎖Fv (scFv)、単一ドメイン抗体、多価一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディなどとして提供されうる。
【００５５】
6B3、11F5、12F5、19C7またはch6B3もしくはhu6B3抗体のVHおよび/もしくはVL領域ならびに/またはCDRを含みうる上記のアミノ酸配列(またはその断片)をコードする単離された核酸分子も本発明に含まれる。6B3、11F5、12F5、19C7、ch6B3およびhu6B3の可変軽鎖および重鎖DNA配列は、表5および6において以下の通りであり、各々のCDR領域に下線が引かれている。
【００５６】
（表５）可変軽鎖DNA配列
2019527545.tif 000013
【００５７】
（表６）可変重鎖DNA配列
2019527545.tif 000014
【００５８】
6B3、11F5、12F5、19C7、ch6B3およびhu6B3の可変軽鎖および重鎖CDR配列のDNA配列は、表7および8において以下の通りである。
【００５９】
（表７）可変軽鎖CDR配列
2019527545.tif 000015
【００６０】
（表８）可変重鎖CDR配列
2019527545.tif 000016
【００６１】
単離された核酸分子(ポリヌクレオチド)は、6B3、11F5、12F5、19C7、ch6B3、hu6B3の生物学的に関連する部分、または6B3、11F5、12F5、19C7、ch6B3、hu6B3の親和性成熟型もしくは他の変異型、または本明細書において論じられる他の抗PDGF-C抗体をコードする。この目的のために、単離された核酸分子は、前述のDNA配列の1つもしくは複数、前述の配列の1つもしくは複数の断片、または前述の1つもしくは複数と少なくとも70%相同、80%相同、90%相同もしくは99%相同である核酸配列を含みうる。
【００６２】
変種抗体も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本出願において列挙されている配列の変種も本発明の範囲内に含まれる。改善された親和性を有する抗体配列のさらなる変種は、当技術分野において公知の方法を用いて得ることができ、それらは本発明の範囲内に含まれる。例えば、さらに改善された親和性を有する抗体を得るためにアミノ酸置換を用いることができる。あるいは、ヌクレオチド配列のコドン最適化を用いて、抗体産生のための発現系における翻訳効率を改善することができる。
【００６３】
特定の態様において、本発明の抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびにCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでこれらのCDR配列の1つまたは複数は、本明細書において記述される好ましい抗体に基づく特定のアミノ酸配列、またはその保存的改変を含み、かつここで抗体はPDGF-Cおよび/またはPDGF-CCへの結合の所望の機能的特性を保持している。
【００６４】
本発明において開示されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の保存的改変または機能的等価体は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のポリペプチド誘導体、例えば、1つもしくは複数の点突然変異、挿入、欠失、切断を有するタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせをいう。それは、親ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質(本発明に開示されるものなど)の活性を実質的に保持している。一般に、保存的改変または機能的等価体は、親(例えば、本明細書において開示される配列の1つ)と少なくとも70% (例えば、70%〜100%の任意の数、例えば70%、80%、85%、90%、95%、および99%を含む)同一である。
【００６５】
本明細書において用いられる場合、「保存的改変」という用語は、アミノ酸配列を含んだ抗体の結合特性に顕著には影響を与えないまたはそれを変化させないアミノ酸改変をいう。そのような保存的改変はアミノ酸置換、付加および欠失を含む。部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発のような、当技術分野において公知の標準的な技法により、本発明の抗体に改変を導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、
塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、
酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、
非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、
非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、
β分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および
芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)
が含まれる。
【００６６】
したがって、本発明の抗体のCDR領域内の1つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、改変された抗体を、本明細書において記述される機能アッセイを用いて、保持された機能について試験することができる。
【００６７】
抗体の他の改変が本明細書において企図される。例えば、抗体は、種々の非タンパク質性重合体の1つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体に連結することができる。抗体はまた、例えば、コアセルベーション技法によってまたは界面重合(例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）によって、コロイド状薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中で、またはマクロエマルジョン中で調製されたマイクロカプセル中に封入することができる。そのような技法は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。
【００６８】
本発明の核酸は他の核酸を実質的に含まなくてもよい。ほとんどのクローニング目的の場合、DNAが好ましいが、非限定的には、核酸である。前述のDNA分子の1つまたは組み合わせを発現ベクターにサブクローニングし、続いて選択の宿主細胞にトランスフェクションしてもよく、ここで組換え宿主細胞は本発明の6B3、11F5、12F5、19C7、ch6B3、hu6B3もしくは抗PDGF-C抗体の関連部分、またはその親和性成熟型の相当なレベルの供給源を提供する。そのような手順はscFvの作製のような、種々の用途のために、または例えばIgG抗体のヒトCHおよびCL領域をコードする哺乳動物発現ベクター系においてこれらのVHおよびVL鎖を共発現させるために用いられうる。遺伝暗号の縮重は、2つを除く全てのアミノ酸について、複数のコドンが特定のアミノ酸をコードするというようなものである。これによって本発明の抗体をコードする合成DNAの構築が可能になり、ここで合成DNAのヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるヌクレオチド配列と顕著に異なるが、それでもなおそのような抗体をコードする。そのような合成DNAは本発明の範囲内にあることが意図される。特定の宿主細胞または生物においてそのような合成DNAを発現させることが望まれる場合、そのような合成DNAのコドン使用頻度はその特定の宿主のコドン使用頻度を反映するように調節することができ、かくして本発明の抗体のさらに高い発現レベルをもたらすことができる。言い換えれば、特定のアミノ酸をコードするさまざまなコドンにおけるこの重複性は本発明の範囲内である。それゆえ、本発明はまた、以下に示されるように、同一アミノ酸の最終的な翻訳をコードする代替コドンを含むRNAをコードするDNA配列を対象にする: A＝Ala＝アラニン: コドンGCA、GCC、GCG、GCU; C＝Cys＝システイン: コドンUGC、UGU; D＝Asp＝アスパラギン酸: コドンGAC、GAU E＝Glu＝グルタミン酸: コドンGAA、GAG; F＝Phe＝フェニルアラニン: コドンUUC、UUU; G＝Gly＝グリシン: コドンGGA、GGC、GGG、GGU; H＝His＝ヒスチジン: コドンCAC、CAU; I＝Ile＝イソロイシン: コドンAUA、AUC; AUU; K＝Lys-リジン: コドンAAA、AAG; L＝Leu＝ロイシン: コドンUUA、UUG、CUA、CUC、CUG、CUU; M＝Met＝メチオニン: コドンAUG; N＝Asp＝アスパラギン: コドンGAU、GAC; P＝Pro＝プロリン: コドンCCA、CCC、CCG、CCU; Q＝Gln＝グルタミン: コドンCAA、CAG; R＝Arg＝アルギニン: コドンAGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGU; S＝Ser＝セリン: コドンAGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCU; T＝Thr＝トレオニン: コドンACA、ACC、ACG、ACU; V＝Val＝バリン: コドンGUA、GUC、GUG、GUU; W＝Trp＝トリプトファン: コドンUGG; Y＝Tyr＝チロシン: コドンUAC、UAU。次いで、そのような組換え発現ベクターは、代替の抗体形態の作製に適した細胞株に安定的にまたは一過性にトランスフェクションされうる。
【００６９】
本発明は、同一の抗体またはその部分を発現する異なるDNA分子(例えば、同一のscFvまたはIgGのVHおよび/もしくはVL部分をコードする別の核酸分子)をもたらしうるコドン重複性の存在に注目する。本明細書の目的のために、1つまたは複数の置換コドンを有する配列は、縮重変異と定義されよう。配列変異の他の原因はRNA編集を通して起こりうる。そのようなRNA編集は、読み取り枠の変化が、発現されるタンパク質における改変されたアミノ酸残基をもたらさない、別の形態のコドン重複性をもたらしうる。発現された抗体の最終的な物理的性質を改善するDNA配列または翻訳された抗体のいずれかにおける変異も本発明の範囲内に含まれる。この目的のために、本発明は、(i) 6B3、11F5、12F5、19C7、ch6B3またはhu6B3を含むがこれらに限定されない、抗PDGF-C抗体の親和性成熟型、ならびに/あるいは(ii) 部位特異的変異を導入するのに知られた公知の親和性成熟方法論および組換えDNA技法を通じて作製されるCDR1、CDR2および/またはCDR3領域における1つまたは複数の変異を含むがこれらに限定されない、6B3、11F5、12F5、19C7、ch6B3、またはhu6B3を含むがこれらに限定されない、抗PDGF-C抗体の変異型に関する。そのような単離または精製された核酸分子は、抗PDGF-C抗体のVHおよび/またはVL部分に当たるであろう。これらの核酸は他の核酸を実質的に含まず、前述にしたがってクローニングされうる。
【００７０】
本発明はまた、抗PDGF-C抗体のそれぞれの重鎖および/または軽鎖領域(またはその断片)をコードする核酸分子を含む、原核生物および真核生物の両方の、組換えベクターおよび組換え宿主に関する。これらの核酸分子は、全体的にまたは部分的に、天然には連結されていない他のDNA分子(すなわち、組換えヒト抗体の作製に用いられる免疫グロブリン遺伝子を包含するDNA分子)と連結されて、それぞれのヒト組換え抗体をコードする「組換えDNA分子」を形成することができる。これらのベクターはDNAまたはRNAから構成されうる。ほとんどのクローニング目的の場合、DNAベクターが好ましい。典型的なベクターには、プラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、および他の形態のエピソームDNAまたは組み込まれたDNAが含まれる。特定の遺伝子移入、組換えヒト抗体の作製または他の使用に適したベクターを判定することは当業者の管理権限内にある。関心対象の核酸分子を発現ベクターにサブクローニングし、そのベクターを含む宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションを行う方法、およびそれぞれの発現ベクターを宿主細胞に導入する段階と、適切な条件下で宿主細胞を培養する段階とを含む実質的に純粋なタンパク質を作製する方法は、周知である。そのようにして産生された抗体(IgG組換えヒト抗体のような)は、慣用の方法で宿主細胞から収集されうる。適当なプロモーターおよび他の適切な転写調節エレメントを含んだ任意のベクターを含む、任意の既知の発現ベクターが、本発明のこの部分を実践するために利用されうる。得られた発現構築体を原核生物または真核生物の宿主細胞に移入して、組換えタンパク質を産生する。発現ベクターは、適切な宿主におけるクローン化DNAの転写およびそれらのrnRNAの翻訳に必要とされるDNA配列として本明細書において定義される。そのようなベクターは、細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞のような種々の宿主において真核生物DNAを発現させるために用いることができる。特別に設計されたベクターは細菌−酵母または細菌−動物細胞のような宿主間のDNAの往復を可能にする。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性、および活性プロモーターを含むべきである。プロモーターは、RNAポリメラーゼをDNAに結合させてRNA合成を開始させるDNA配列として定義される。強力なプロモーターは、rnRNAを高頻度で開始させるものである。そのような操作のための技法は、Sambrook, et al. (1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)において記述されているのを見出すことができ、当業者には周知であり、利用可能である。発現ベクターは、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスを含みうるが、これらに限定されることはない。適当でありうる市販の哺乳動物発現ベクターには、pcDNA3.neo (Invitrogen)、pcDNA3.1 (Invitrogen)、pCI-neo (Promega)、pLITMUS28、pLITMUS29、pLITMUS38 and pLITMUS39 (New England Bioloabs)、pcDNAI、pcDNAIanp (Invitrogen)、pcDNA3 (Invitrogen)、pMClneo (Stratagene)、pXT1 (Stratagene)、pSG5 (Stratagene)、EBO pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110)、pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224)、pRSVgpt (ATCC 37199)、pRSVneo (ATCC 37198)、pSV2-dhfr (ATCC 37146)、pUCTag (ATCC 37460)、およびlZD35 (ATCC 37565)が含まれるが、これらに限定されることはない。また、pCR2.1 (Invitrogen)、pET1 la (Novagen)、lambda gtl 1 (Invitrogen)、およびpKK223-3 (Pharmacia)を含むが、これらに限定されない、種々の細菌発現ベクターが利用可能である。さらに、pYES2 (Invitrogen)およびPichie発現ベクター(Invitrogen)を含むが、これらに限定されない、種々の真菌細胞発現ベクターが用いられうる。また、pBlueBacIIIおよびpBlueBacHis2 (Invitrogen)、ならびにpAcG2T (Pharmingen)を含むが、これらに限定されない、種々の昆虫細胞発現ベクターが用いられうる。
【００７１】
組換え宿主細胞は、大腸菌(E. coli)のような細菌、酵母のような真菌細胞、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞株を含むが、これらに限定されない、哺乳動物細胞; ならびに昆虫細胞を含むが、これらに限定されない、原核生物または真核生物でありうる。適当でありうる哺乳動物種には、L細胞L-M(TK-) (ATCC CCL1.3)、L細胞L-M (ATCC CCL 1.2)、Saos-2 (ATCC HTB-85)、293 (ATCC CRL1573)、Raji (ATCC CCL 86)、CV-1 (ATCC CCL 70)、COS-l (ATCC CRL1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、CHO-K1 (ATCC CCL 61)、3T3 (ATCC CCL 92)、NIH/3T3 (ATCC CRL 1658)、HeLa (ATCC CCL 2)、C127I (ATCC CRL 1616)、BS-C-l (ATCC CCL 26)、MRC-5 (ATCC CCL171)およびCPAE (ATCC CCL 209)が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００７２】
本発明の抗体はまた、ポリクローナル抗体、代替モノクローナル抗体、キメラ抗体、および/またはヒト化抗体を含むが、これらに限定されない、前述の変種を形成するように適合または特異的に操作されうる。本発明の単離抗体または変種抗体は、単一可変ドメイン(sVD)およびsVDを含む抗原結合タンパク質を含みうる。sVD結合部位は、抗原特異的Fv領域(VHおよびVLドメインの両方を含む)から得ることができる。多くの場合、Fv領域の結合親和性および特異性は、主に可変ドメインのうちの1つによってもたらされることが示されうる。あるいは、scFvは直接得ることができる。sVDの直接供給源には、VHドメインのみを含有する抗体を天然に発現する哺乳動物(例えば、ラクダ科動物)が含まれる。さらに、ファージディスプレイライブラリは、単一の可変ドメインのみを発現するように構築することができる。例えば、ヒトドメイン抗体ファージディスプレイライブラリは、Domantis (Cambridge, UK)から市販されている。
【００７３】
ch6B3のようなキメラ抗体は一般に、1つの抗体の可変ドメインおよび異なる抗体の定常ドメインを含みうる。典型的には、抗体に対する宿主免疫応答を最小限に抑えるために、および抗体エフェクター機能を保持することによって抗体標的に対する宿主応答を増強するために、キメラ抗体の定常ドメインは、キメラ抗体が投与される種と同じ種から取得される。
【００７４】
hu6B3のようなヒト化抗体は、可変ドメインが、ヒトフレームワーク領域に移植されている非ヒト起源の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含むように構築されたキメラタンパク質の形態である。この目的のために、および特定の態様において、それは、当技術分野において周知である組換えDNA技術および非ヒトトランスジェニックのさまざまな手段によって作製されうる。そのような方法論は、1つまたは以下の起源から抗体を作製するために利用される: (i) コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離されたscFvもしくは代替抗体; (ii) 宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞に安定的もしくは一過的にトランスフェクションされたそれぞれの発現ベクターから作製された部分的もしくは完全な抗体(例えば、PDGF-CCに対する特異性を示す所定の抗体形態の発現を促進するように、それぞれのCHおよびCLヌクレオチド配列とともに発現ベクターにVHおよびVL鎖をコードするヌクレオチド配列をサブクローニングする); ならびに/または(iii) ヒト免疫グロブリン遺伝子を含んだ非ヒトトランスジェニック動物から、もしくは関心対象のヒト組換え抗体を作製するためにヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列への組換え「混合および適合」に依存する他の任意の既知の方法論によって、単離された抗体。
【００７５】
ヒト化構築体は、例えば、非ヒト供給源由来の抗原結合ドメインがヒトにおける処置に用いられることが望まれる場合、有害な免疫原性の特徴の排除に有益である。可変ドメインは高度の構造的相同性を有し、CDRおよびFRに対応する可変ドメイン内のアミノ酸残基の容易な同定を可能にする。
【００７６】
特に、キメラ型および/またはヒト化型に限定するのではなく、そのような変種抗体に対する親和性を保存または増強するための方法が開発されている。1つの方法は、CDR領域の立体配座に影響を与える外来フレームワーク残基をレシピエント可変ドメインに含めることである。第2の方法は、外来可変領域に最も近い相同性を有するヒト可変ドメイン上に外来CDRを移植することである。所望のCDR配列を含む重複プライマーを用いて個々のFR配列を最初に増幅し、その後の増幅反応において得られた遺伝子セグメントを連結することによって、CDRは異なるフレームワーク領域上に最も容易に移植される。異なる可変ドメイン上へのCDRの移植は、アミノ酸配列中のCDRに隣接しているかまたはCDRの立体配座に影響を与える折り畳み可変ドメイン構造中のCDRに対してパックされているアミノ酸残基の置換をさらに含むことができる。それゆえ、本発明のヒト化可変ドメインは、1つまたは複数の非ヒトCDRを含むヒトドメイン、ならびに結合特性を保存または増強するために追加の置換または置き換えがなされているそのようなドメインを含む。
【００７７】
本発明の抗体はまた、抗体が免疫系に対して自己のように見えるようにするために表面に露出した残基を置換することによって免疫原性が低くされている可変ドメインを利用してもよい。抗体は、親和性を失うことなくこのプロセスによって改変されてきた。抗原結合部位付近のアミノ酸残基の内部パッキングは変化しないままであるので、親和性は保存される。免疫原性を低減させる目的での本発明による表面露出残基の置換は、結合特性に影響を与えるCDR残基または隣接残基の置換を意味しない。
【００７８】
前述の態様のいずれにおいても、抗体に組み込まれた可変領域、CDR、および定常領域は、親和性および/または特異性を改変するために、インビトロまたはインビボでの変異およびスクリーニング手順に供することができる。したがって、本発明の結合ドメインは、直接変異、親和性成熟方法、または鎖シャッフリングによりCDRおよび/またはFR領域を変異させることによって結合特性が改善されたものを含む。単一ドメイン抗体の結合の一次決定基であるアミノ酸残基は、Kabat定義のCDR内にありうるが、他の残基も含みうることが理解される。sVDの場合、抗原結合に重要な残基はまた、そうでなければVH-VLヘテロ二量体の界面に位置するであろうアミノ酸も潜在的に含むことができる。典型的には、ファージディスプレイを用いてそのような変異体をスクリーニングし、所望の結合特性を有するものを同定する(例えば、Yang et al., J. Mol. Biol., 254: 392-403 (1995)を参照のこと)。変異は種々の方法で作製することができる。1つの方法は、他の点では同一の配列の集団において、全20種のアミノ酸またはそのサブセットが特定の位置に見られるように個々の残基または残基の組み合わせを無作為化することである。あるいは、変異性PCR法により、ある範囲のCDR残基にわたって変異が誘発されうる(例えば、Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)を参照のこと)。例えば、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、大腸菌の突然変異誘発遺伝子株中で増殖されうる(例えば、Low et al., J. Mol. Biol., 250: 359-368 (1996)を参照のこと)。これらの突然変異誘発方法は、当業者に公知の多くの方法の例示である。
【００７９】
特定の態様を参照して本発明を記述してきたが、本発明の範囲から逸脱することなくさまざまな変更が加えられ、それらの要素と等価物が置換されうることが当業者には理解されよう。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、本発明の教示に対する特定の状況または材料に適合するように多くの修正が加えられうる。それゆえ、本発明は開示された特定の態様に限定されるのではなく、本発明は添付の特許請求の範囲または後に追加される任意の特許請求の範囲に含まれる全ての態様を含むことが意図される。
【００８０】
前述に加えて、本発明の抗PDGF-C抗体は、単独でまたは多様な使用のための組成物内で用いられうる。特定の局面において、本発明の抗体および抗体を含んだ組成物は、PDGF-C発現細胞型と診断された患者の処置、PDGF-C発現細胞またはがん腫の診断、細胞内のPDGF-C発現の検出、代替のPDGF-C結合化合物のスクリーニングおよび選択などに用いられうる。以下はそのような使用について詳述しているが、本発明の抗PDGF-C抗体の使用に対する限定と見なされるべきではない。この目的のために、当業者は、本発明の抗体が当技術分野において他に知られている任意の使用で提供されうることを容易に理解するであろう。
【００８１】
処置方法および薬学的製剤
特定の局面において、本発明の抗PDGF-C抗体は、PDGF-CCに結合してその活性を阻害することにより、対象における血管新生を阻止するため、または対象における固形腫瘍のサイズを低減させるため対象に投与されうる。例えば、本発明の抗PDGF-C抗体は、細胞内のPDGF-CC媒介性活性を低減させるために、または細胞/腫瘍の自己分泌および/もしくは傍分泌シグナル伝達を低減させるために、または血液脳関門におけるPDGF-CCシグナル伝達を低減させるために投与することができる。例えば、多くの腫瘍細胞は、脈管化、間質支持、または腫瘍細胞生存性および/もしくは腫瘍増殖に最終的に寄与する他の腫瘍作用を達成するためにPDGF-CC自己分泌および/または傍分泌シグナル伝達を用いる。本発明の抗PDGF-C抗体は、PDGF-CC媒介性シグナル伝達を低減、阻害、または阻止するためにPDGF-C発現がん腫を有する患者に投与され、最終的には、脈管化、間質支持などの低減ならびに腫瘍サイズおよび/または細胞生存性の低減をもたらしうる。
【００８２】
PDGF-C発現細胞型の非限定的な例としては、頭、首、目、口、のど、食道、気管支、喉頭、咽頭、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、膀胱、子宮、子宮頸部、乳房、卵巣、精巣または他の生殖器官、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、および脳または中枢神経系のがんが挙げられる。特定の非限定的な局面において、そのような細胞型には、膀胱移行上皮がん(TCC)、乳房浸潤性腺管がん(IDC)、乳房浸潤性小葉がん(ILC)、結腸直腸腺がん、多形性膠芽腫、神経膠肉腫、肝細胞がん、肺腺がん、肺扁平上皮がん(SqCC)、転移性黒色腫、中皮腫、卵巣腺がん、膵臓腺がん、前立腺腺がん、腎細胞がん、子宮腺がんなどが含まれる。しかしながら、本発明の抗体の使用は、がん細胞型の処置に必ずしも限定されず、そのような抗体はまた、細胞内のまたは細胞から分泌されたPDGF-CCの活性を阻害することにより、任意のPDGF-CC関連疾患病態および/または状態を処置するために投与されうる。そのような状態の非限定的な例としては、中枢神経系(CNS)の血液脳関門(BBB) (脳、脊髄および眼の網膜)の完全性の調節、アテローム性動脈硬化症および線維症が挙げられる。
【００８３】
他の局面において、本発明の抗PDGF-C抗体は、損なわれたBBBに関連する障害または状態を処置するために対象に投与されうる。したがって、本発明の方法および組成物は、脳浮腫、脳卒中、虚血性網膜症、糖尿病性網膜症、アルツハイマー病、多発性硬化症、およびCNSの腫瘍のようなCNS疾患を処置するために用いることができる。本発明の方法は、脳浮腫、肺塞栓症、心血管疾患、頭部外傷、感染症、神経学的疾患、または浮腫が重大な臨床上の問題である他の疾患を処置するのに特に適している。特に好ましい態様において、本発明は脳浮腫の処置に用いられる。本発明の方法はまた、浮腫腹水症、水胸水症、水膜症、脳浮腫、水頭症、緑内障、または急性肺水腫のような、局所性または限局性浮腫、ならびに全身浮腫または水症のような、広汎性または全身性浮腫を処置するために用いられうる。
【００８４】
本発明の抗PDGF-CC処置から恩恵を受けうる脳浮腫(cerebral edema)または脳浮腫(brain edema)はさらに、発展途上国の多くの子供を死に至らしめる脳マラリア感染による虚血性脳浮腫(Penet et al., Imaging experimental cerebral malaria in vivo: significant role of ischemic brain edema. J. Neurosci. 2005; 25:7352-8を参照のこと); 急性肝不全における脳浮腫(Vaquero et al., Brain edema in acute liver failure. A window to the pathogenesis of hepatic encephalopathy. Ann. Hepatol. 2003 2:12-22を参照のこと); 多くの面で脳外傷に似ている、脳外科手術から生じた浮腫; 頭蓋内腫瘍によって引き起こされる浮腫(Papadopoulos et al., Molecular mechanisms of brain tumor edema. Neuroscience. 2004; 129:1011-20を参照のこと); および高所脳浮腫(Hackett and Roach. High altitude cerebral edema. High. Alt. Med. Biol. 2004 5:136-46を参照のこと)を含みうるが、これらに限定されることはない。
【００８５】
好ましくは、抗PDGF-C抗体または抗体を含む薬学的組成物は、例えば脳浮腫の場合には脳脊髄液(CSF)への直接注射によって、または血管内投与あるいはBBBに成功裏に到達することが実証されている鼻腔内送達を介して浮腫部位に送達される。
【００８６】
好ましい態様において、投与は静脈内、くも膜下腔内または経鼻投与(鼻腔内)を介する。特に、脳浮腫の処置のためまたは虚血性脳卒中の併用療法において、血液脳関門の領域における血管床への送達に好ましい投与様式は、髄腔内または鼻腔内投与である。本明細書において用いられる場合、「髄腔内投与」という用語は、例えば、Lazorthes et al., Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192、およびOmaya et al., Cancer Drug Delivery, 1: 169-179)に記述されているように、穿頭もしくは脳槽内を通じて大槽への側方脳室注入または腰椎穿刺を通じて腰部領域へなどを含む技法により、薬学的製剤中のPDGF-C抗体を対象の脳脊髄液に直接送達することを含む。「腰部領域」という用語は、3番目と4番目の腰部(下背部)椎の間の領域を含むことが意図される。「大槽」という用語は、頭蓋骨が終わり、脊髄が頭の後ろから始まる領域を含むことが意図される。「脳室」という用語は、脊髄の中心管と連続している脳内の空洞を意味する。上記の部位のいずれかへのPDGF-C抗体の投与は、抗体の直接注射によって、または注入ポンプの使用によって達成することができる。例えば、米国特許第8765671号および同第8147828号を参照されたく、これらの内容は参照により組み入れられる。
【００８７】
損なわれたBBBに関連する障害または状態を処置する場合、本明細書において開示されるPDGF-C抗体は、参照により内容が組み入れられる米国特許第8765671号および同第8147828号に記述された方法で、tPAのような、他の治療用物質と組み合わせて用いることができる。
【００８８】
「処置」という用語は、治療的および予防的手段の両方をいう。処置を必要とする者には、疾患または障害に既に罹患している者、ならびに疾患または障害を予防しようとしている者が含まれる。処置されるべき対象は、疾患または障害を有すると診断された可能性があるか、あるいは疾患にかかりやすい素因を持つまたは疾患にかかりやすい可能性がある。
【００８９】
抗PDGF-C抗体の投与は、単独でまたは既存の治療レジメンとの組み合わせでありうる。例えば、がん腫の場合、追加の治療レジメンは、その他の点で当技術分野において公知の1つまたは複数の化学療法剤を含むことができる。当業者は、これらのレジメンの各々について標準的な投与量および日程計画を容易に判定することができる。
【００９０】
前述の処置レジメンの1つまたは複数と併せて、有効量の1つまたは複数の本発明の抗PDGF-C抗体またはその親和性成熟型を含む薬学的組成物が、PDGF-CC活性を阻害することにより予防的または治療的処置を提供するために投与されうる。本発明の抗体に基づく薬学的組成物は、当技術分野において公知の任意の数の戦略によって製剤化されうる(例えば、McGoff and Scher, 2000, Solution Formulation of Proteins/Peptides: In McNally, E.J., ed. Protein Formulation and Delivery. New York, NY: Marcel Dekker; pp. 139-158; Akers and Defilippis, 2000, Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Philadelphia, PA: Talyor and Francis; pp. 145-177; Akers, et al., 2002, Pharm. Biotechnol. 14:47-127を参照のこと)。患者への投与に適した薬学的に許容される組成物は、許容される温度範囲内での貯蔵中に最大の安定性を促進しながらも生物学的活性をともに保持する製剤中に抗体の有効量を含有するであろう。薬学的組成物はまた、所望の製剤に応じて、薬学的に許容される希釈剤、薬学的に許容される担体および/もしくは薬学的に許容される賦形剤、または動物もしくはヒト投与用の薬学的組成物を製剤化するために通常用いられる任意のそのような媒体を含むことができる。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、およびハンクス液などである。本発明の薬学的組成物または製剤において有用な賦形剤の量は、それを必要とする対象に送達されるときに抗体を均一に分散させることができるように抗体を組成物全体に均一に分布させるのに役立つ量である。それは、高すぎる濃度から起こりうる任意の有害な副作用を同時に最小限に抑えながら、所望の有益な緩和的または治癒的結果をもたらす濃度に抗体を希釈するのに役立ちうる。それは保存的効果も持ちうる。したがって、高い生理学的活性を有する抗体の場合、より多くの賦形剤が利用されるであろう。他方、より低い生理学的活性を示す任意の活性成分の場合、より少ない量の賦形剤が利用されるであろう。一般に、組成物中の賦形剤の量は、全組成物の約50重量(w)%〜99.9重量%であろう。抗体が特に低い生理学的活性を示す場合、賦形剤の量は1重量%程度に少なくてもよい。他方、特に高い生理学的活性を有する抗体の場合、賦形剤の量は、約98.0重量%〜約99.9重量%でありうる。さらに、抗体(antibody or antibodies)は、「化学的誘導体」(通常は基本分子の一部ではない追加の化学的部分を含む分子)の形態で投与されうる。そのような部分は、生物剤の溶解度、半減期、吸収などを改善しうる。あるいは、これらの部分は抗体の望ましくない副作用を軽減しうる。
【００９１】
薬学的組成物はまた、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および共重合体(ラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロースなどのような)、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、ならびに脂質凝集体(油滴またはリポソームのような)などの大型のゆっくり代謝される高分子も含むことができる。さらに、これらの担体は免疫刺激剤(すなわち、アジュバント)として機能することができる。非経口投与の場合、本発明の薬剤は、生理的に許容される希釈剤中の物質の溶液または懸濁液の注射用投与量として、水油、生理食塩水、グリセロール、またはエタノールのような無菌の液体でありうる薬学的担体とともに投与することができる。さらに、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、pH緩衝物質などのような補助物質を組成物中に存在させることができる。薬学的組成物の他の成分は、石油、動物由来、植物由来、または合成由来のもの、例えば、落花生油、大豆油、および鉱油である。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールは、特に注射用溶液にとって、好ましい液体担体である。
【００９２】
抗体製剤は液体形態または固体形態でありうる。固体製剤は一般に凍結乾燥され、単回または複数回投薬のいずれかのために投与前に溶液にされる。製剤は、熱変性を避けるために極端な温度またはpHに曝露されるべきではない。したがって、本発明の抗体組成物を生物学的に関連のあるpH範囲内で製剤化することが不可欠である。貯蔵中に適切なpH範囲を維持するために緩衝化された溶液が、特に製剤化から投与までの間、より長期間貯蔵された液体製剤について示される。今日まで、液体および固体製剤はどちらも、長期間安定性を保持するために、より低い温度(通常2〜8℃)での貯蔵を必要としている。製剤化された抗体組成物、特に液体製剤は、有効濃度(通常1% w/v未満)のベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン、および/またはプロピルパラベンを含むがこれらに限定されない、貯蔵中のタンパク質分解を阻止または最小化するための静菌薬を含みうる。静菌薬は患者によっては禁忌でありうる。それゆえ、凍結乾燥された製剤が、そのような成分を含有するか含有しないかのいずれかの溶液中で再構成されうる。抗凍結剤としての糖類(ソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびズルシトールのようなポリヒドロキシ炭化水素ならびに/またはスクロース、ラクトース、マルトースもしくはトレハロースのような二糖類を含むが、必ずしもこれらに限定されない)および、場合によっては、関連する塩(NaCl、KClまたはLiClを含むがこれらに限定されない)を含むがこれらに限定されない、追加の成分が緩衝化液体または固体抗体製剤に添加されうる。そのような抗体製剤、特に長期貯蔵を予定している液体製剤は、非経口注射にも製剤を有用にしながら、2〜8℃またはそれ以上の温度で長期安定性を促進するために有用な範囲の総オスモル濃度に依存するであろう。有効な範囲の総オスモル濃度(溶液中の分子の総数)は、約200 mOs/L〜約800 mOs/Lである。溶液の総オスモル濃度が適切な範囲内に維持されるようにするために、スクロースまたはソルビトールのような、抗凍結剤の量が製剤中の塩の量に依存することは明らかであろう。それゆえ、無塩製剤は、約5%〜約25%のスクロースを含有しうるが、スクロースの好ましい範囲は約7%〜約15%であり、無塩製剤中の特に好ましいスクロース濃度は10%〜12%である。あるいは、無塩のソルビトールに基づく製剤は、ソルビトールを約3%〜約12%の範囲内、好ましくは約4%〜7%の範囲内で含有することができ、特に好ましい範囲は無塩製剤中に約5%〜約6%のソルビトールである。無塩製剤は、もちろん、有効なオスモル濃度レベルを維持するために、各抗凍結剤の範囲の増加を正当化するであろう。これらの製剤はまた、二価カチオン(MgCl2、CaCl2およびMnCl2を含むが、必ずしもこれらに限定されない); 非32イオン性界面活性剤(ポリソルベート-80 (Tween 80(登録商標))、ポリソルベート-60 (Tween 60(登録商標))、ポリソルベート-40 (Tween 40(登録商標))およびポリソルベート-20 (Tween 20(登録商標))を含むが、必ずしもこれらに限定されない、Brij 58(登録商標)、Brij 35(登録商標)を含むがこれらに限定されない、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ならびにTriton X-100(登録商標)、Triton X 114(登録商標)、NP40(登録商標)、Span 85およびPluronic系列の非イオン性界面活性剤(例え���、Pluronic 121)のような他のものを含有しうる。静菌剤の推定包含を含めて、そのような成分の任意の組み合わせは、本発明の抗体含有製剤を満たすのに有用でありうる。
【００９３】
さまざまな他の担体、希釈剤、賦形剤などの多数の例が当技術分野において公知であり、本明細書において引用されている参考文献、ならびにRemington's Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990)に開示されており、それらの内容は参照により本明細書に組み入れられる。簡潔には、適当な担体、賦形剤、および他の薬剤を組み入れて薬学的組成物を製剤化し、移動、送達、耐性などの改善を提供してもよいことが理解されよう。生物剤および/または追加の活性成分を担体に組み入れる方法は、当業者に公知であり、生物剤の性質および本発明を実践している人によって選択される担体の性質に依存する。イオン結合、ゲルカプセル封入または担体内への物理的捕捉、イオントフォレーシスおよび生物剤の溶液中への担体の浸漬は、開示された処置方法の実践に用いられる薬学的組成物の製剤化において企図される適当な例である。あるいは、担体は生物剤のための希釈剤にすぎない場合がある。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、無水吸収基剤、水中油型または油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス(種々の分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲル、およびカルボワックスを含有する半固体混合物を含みうる。本発明の化合物を利用する投与レジメンは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態; 処置される状態の重症度; 投与経路; 患者の腎臓、肝臓および心血管機能; ならびに利用されるその特定の生物剤を含む種々の要因にしたがって選択される。通常の技能を有する内科医または獣医は、状態の進行を阻止するか、状態の進行に対抗するか、または状態の進行を停止させるために必要とされる薬物の有効量を容易に判定かつ処方することができる。毒性なしで有効性をもたらす範囲内の薬物濃度を達成するうえでの最適精度には、標的部位への薬物の利用可能性の動態に基づくレジメンが必要とされる。これには薬物の分布、平衡、および排除に関する考慮事項が含まれる。製剤中の活性成分が製剤によって不活性化されず、製剤が生理学的に適合性であるという条件で、前述の製剤のいずれも本発明による処置および治療において適切でありうる。
【００９４】
本発明の薬学的組成物は、PDGF-CC活性を阻害すること、すなわち腫瘍サイズの低減、血管新生の減少などによって治療的処置を供与するのに十分な量で、当技術分野において利用可能な任意の様式、戦略および/または組み合わせで宿主に投与されうる。これらの組成物は、当技術分野において公知の種々の経路、特に、静脈内(IV)、筋肉内(IM); または皮下(SC)投与のような非経口経路を含むがこれらに決して限定されない非経口経路によって個体に提供されうるが、IV投与が治療用抗体投与の技術分野内での基準である。これらの組成物は、別々のまたは複数の用量(すなわち、処置レジメンを通して製剤の無菌状態を維持することにより時間をずらして抗体を投与すること)として投与されうる。本発明の化合物を利用する投与レジメンは、患者(ヒト患者のような)のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態; 処置される状態の重症度; 投与経路; 患者の腎臓、肝臓および心血管機能; ならびに利用されるその特定の抗体を含む種々の要因にしたがって選択される。通常の技能を有する内科医または獣医は、抗体の有効治療量を容易に判定かつ処方することができる。毒性なしで有効性をもたらす範囲内の抗体濃度を達成するうえでの最適精度には、標的部位への薬物の利用可能性の動態に基づくレジメンが必要とされる。これには薬物の分布、平衡、および排除に関する考慮事項が含まれる。本明細書において記述される抗体は、適切な投与量で単独で用いられうる。あるいは、他の薬剤の同時投与または逐次投与が望ましいこともある。本発明の抗体のための治療的投薬レジメンを代替の予防的または治療的レジメンの施行とともに提示することが可能であろう。有効な投与レジメンは、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物療法、および処置が予防的であるか治療的であるかを含む多くの異なる要因に依って変化するであろう。抗PDGF-C抗体の投与の場合、投与量は、宿主体重の約0. 0001〜100 mg/kg、より通常には0.01〜5 mg/kgの範囲である。
【００９５】
本発明の抗PDGF-C抗体組成物の送達および投与レジメンに関する別の局面は、非注射用および注射用デバイスを含みうる非経口経路を介した薬物送達に関する。典型的には、注射用組成物は液体溶液または懸濁液として調製される; 注射の前に液体媒体に溶解または懸濁するのに適した固体形態も調製することができる。調製物はまた、上記のように、アジュバント効果の増強のためのポリラクチド、ポリグリコリド、または共重合体のようなリポソームまたは微粒子の中に乳化またはカプセル化することができる(Langer, 1990, Science 249: 1527-1523; およびHanes, 1997, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119を参照のこと)。本発明の薬剤は、活性成分の持続放出またはパルス放出を可能にするような方法で製剤化できる蓄積注射またはインプラント調製物の形態で投与することができる。
【００９６】
PDGF-C/PDGF-CC検出/診断アッセイ
本明細書において記述される抗PDGF-C抗体は、組織サンプル中のPDGF-CおよびPDGF-CC型の存在を判定するためのおよび/またはPDGF-C発現がん腫、CNS組織、血液、血清、血漿および脳脊髄液のような、PDGF-C発現細胞型の存在を診断するためのいくつかの異なる免疫アッセイにおける基礎試薬として用いられうる。一般的に言えば、抗体は、定性的であれ定量的であれ、あらゆるタイプの免疫アッセイにおいて利用することができる。これには、二部位サンドイッチアッセイおよび非競合型の単一部位サンドイッチアッセイの両方、ならびに従来の競合結合アッセイが含まれる。検出の容易さ、およびその定量的性質のための、関心対象の1つの態様は、サンドイッチまたは二重抗体アッセイであり、それらのうちにはいくつかの変化形が存在し、その全てが本発明のこの部分により包含されることが意図される。例えば、典型的なフォワードサンドイッチアッセイでは、非標識抗体(例えば一次抗PDGF-C抗体)を固体基材、例えば、マイクロタイタープレートウェル上に固定化し、試験しようとするサンプルを結合分子と接触させる。抗体-抗原二成分複合体の形成を可能とするのに十分な時間の、適当なインキュベーション時間の後、検出可能なシグナルを誘導できるレポーター分子で標識された二次抗体(例えば、一次とは異なる標的エピトープを有する二次PDGF-C抗体)を次いで添加し、インキュベーションを継続し、異なる部位での抗原との結合、および抗体-抗原標識抗体の三成分複合体の形成に十分な時間を与える。任意の未反応物質を洗い流し、抗原の存在をシグナルの観察によって判定し、それを、既知量の抗原を含有する対照サンプルとの比較により定量することができる。フォワードサンドイッチアッセイの変化形には、サンプルと抗体の両方を結合抗体に同時に添加する同時アッセイ、または標識抗体と試験したいサンプルを最初に組み合わせ、インキュベートし、未標識の表面結合抗体に添加するリバースサンドイッチアッセイが含まれる。これらの技法は当業者に周知であり、わずかの変化の可能性が容易に明らかであろう。本明細書において用いられる場合、「サンドイッチアッセイ」は、基本的な二部位技法に関する全ての変化形を包含することが意図される。
【００９７】
本発明のサンドイッチアッセイの場合、その二量体の性質を考えると、PDGF-CCタンパク質に対して異なるまたは同じ結合特異性を有する2つの抗体を用いてアッセイを実施することができる。したがって、いくつかの可能な組み合わせが可能である。より具体的な例として、典型的なフォワードサンドイッチアッセイにおいて、一次抗体は固体支持体に共有結合または受動的に結合している。固体表面は通常、ガラスまたは重合体であり、最も一般的に使用される重合体はセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスクもしくはマイクロプレート、または免疫アッセイを実施するのに適した他の任意の表面の形態でありうる。結合プロセスは当技術分野において周知である。結合後、固相-抗体複合体を試験サンプルの調製において洗浄する。次いで試験すべき体液のアリコートを固相複合体に添加し、存在する任意のPDGF-CCタンパク質を抗体に結合させるのに十分な時間25℃でインキュベートする。次いで、二次抗体を固相複合体に添加し、二次抗体を一次抗体-抗原固相複合体に結合させるのに十分なさらなる時間にわたって25℃でインキュベートする。二次抗体はレポーター分子に連結されており、その可視シグナルはサンプル中の任意の抗原への二次抗体の結合を示すために用いられる。本明細書において用いられる「レポーター分子」とは、その化学的性質により、抗原結合抗体の検出を可能にする分析的に検出可能なシグナルを提供する分子を意味する。サンプル中の抗原量の判定を可能とするためには、検出は少なくとも比較的定量可能でなければならず、これは絶対的に計算されてもよく、または既知の正常レベルの抗原を含有する標準(または標準の系列)と比較して行われてもよい。
【００９８】
このタイプのアッセイにおいて最も一般的に使用されるレポーター分子は酵素または蛍光色素分子のいずれかである。酵素免疫アッセイの場合、酵素は、多くの場合グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩によって、二次抗体にコンジュゲートされる。しかしながら、容易に認識されるように、多種多様の異なるコンジュゲーション技法が存在し、それらは当業者に周知である。一般的に使用される酵素には、とりわけ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。特定の酵素とともに用いられる基質は、一般に、対応する酵素による加水分解の際の検出可能な色変化の生成のために選択される。例えば、p-ニトロフェニルホスフェートはアルカリホスファターゼコンジュゲートとともに用いるのに適しており; ペルオキシダーゼコンジュゲートの場合、1,2-フェニレンジアミンまたはトルイジンが一般的に使用される。上記の発色基質よりもむしろ蛍光生成物を生じる蛍光基質を利用することも可能である。全ての場合において、酵素標識抗体を一次抗体-PDGF-CCタンパク質複合体に添加し、複合体に結合させ、次いで過剰の試薬を洗い流す。次いで、適切な基質を含有する溶液を、抗体-抗原-標識抗体の三成分複合体に添加する。基質は二次抗体に連結された酵素と反応し、定性的可視シグナルを与え、それは、通常は分光学的にさらに定量されて、血清サンプル中に存在する抗原の量の評価を与えうる。
【００９９】
さらに、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく抗体に化学的に結合されうる。特定の波長の光での照射によって活性化されると、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子内に励起状態を誘発し、続いて特徴的なより長い波長の光の放出を行う。発光は、光学顕微鏡または別の適当な検出デバイスを用いて視覚的に検出可能な特徴的な色として現れる。酵素免疫アッセイ(EIA)と同様に、蛍光標識抗体を一次抗体-PDGF-Cタンパク質複合体に結合させる。未結合試薬を洗浄した後、残りの三成分複合体を次に適切な波長の光に曝露し、観察された蛍光が抗原の存在を示す。免疫蛍光法およびEIA法は両方とも当技術分野において非常によく確立されており、本方法に特に好ましい。しかしながら、放射性同位元素、化学発光分子または生物発光分子のような、他のレポーター分子もまた利用されうる。必要とされる用途に合うように手順を変える方法は当業者には容易に明らかであろう。
【０１００】
別の態様において、試験されるサンプルは、それが共有結合的または非共有結合的のいずれかで固体基材に接着されている単一部位免疫アッセイにおいて用いられうる。本発明の非標識抗PDGF-C抗体を、固体基材に結合したサンプルと接触させる。抗体-抗原二成分複合体の形成を可能とするのに十分な時間の、適当なインキュベーション時間の後、検出可能なシグナルを誘導することができるレポーター分子で標識された二次抗体を次いで添加し、インキュベーションを継続し、抗原-抗体-標識抗体の三成分複合体の形成に十分な時間を与える。単一部位免疫アッセイの場合、二次抗体は、PDGF-C/PDGF-CCに特異的な抗体に結合することができる一般的な抗体(すなわち、免疫グロブリンに対する異種(zenogeneic)抗体、特にレポーター分子に連結された抗(IgMおよびIgG))でありうる。
【０１０１】
キット
本発明は、上記のアッセイを実施するためのキットおよび診断システムを包含する。その目的のために、本明細書において開示される方法のための反応成分の1つまたは複数は、標的分子の濃縮および検出で用いるためのキットの形態で供給することができる。そのようなキットでは、適切な量の1つまたは複数の反応成分が1つもしくは複数の容器中で提供されるか、または基材上に保持される(例えば、静電相互作用、共有結合、または非共有結合によって)。
【０１０２】
1つの態様において、キットは、標的特異的抗体(例えば、抗PDGF-C/PDGF-CC抗体)、および標的への標的特異的抗体の結合を検出するための1つまたは複数の試薬を含みうる。試薬は、例えば、蛍光タグ、酵素タグ、または他の検出可能なタグを含みうる。試薬はまた、二次もしくは三次抗体または酵素反応のための試薬を含んでもよく、ここで酵素反応は、可視化されうる生成物を生成する。1つの態様において、本発明は、適当な容器内の標識形態または非標識形態の本発明の1つまたは複数の標的特異的抗体、間接アッセイのためのインキュベーション用試薬、およびそのようなアッセイにおける検出のための基質または誘導体化剤を、標識の性質に依って含む診断キットを提供する。対照試薬および使用説明書を含めてもよい。キットはまた、以下の成分の1つまたは複数を含みうる: 支持体、停止試薬、修飾試薬または消化試薬、オスモライト、検出タグを検出するための装置、および緩衝液(1×または濃縮形態での)。
【０１０３】
組織サンプルまたは宿主における標的の存在の検出のための、標識された標的特異的抗体のような、標的特異的抗体とともに用いるための診断キットもまた供給されうる。そのような診断キットにおいて、および本明細書の他の箇所に記述されている治療的使用のためのキットにおいて、標的特異的抗体は、典型的には単独でまたは標的細胞もしくはペプチドに特異的なさらなる抗体とともに、容器中に凍結乾燥形態で提供されうる。典型的には、薬学的に許容される担体(例えば、不活性希釈剤)および/またはその成分、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、または炭酸緩衝液、安定剤、保存剤、殺生物剤、不活性タンパク質、例えば血清アルブミンなども(典型的には混合のために別々の容器中に)含まれ、さらなる試薬も含まれる(同様に典型的には別々の容器中に)。特定のキットでは、典型的には別の容器中に存在する、標的特異的抗体に結合することができる二次抗体も含まれる。二次抗体は、典型的には標識とコンジュゲートされ、本発明の標的特異的抗体と同様の様式で製剤化される。上記および本明細書の他の箇所に記述の方法を用い、標的特異的抗体を使って処置を必要とする患者のサブセットを定義し、そのような細胞および関連組織を特徴付けることができる。
【０１０４】
キットまたはシステムは、少なくとも1アッセイに十分な量で、本明細書において記述される成分の任意の組み合わせを含むことができ、成分の使用のための有形の形式で記録された説明書をさらに含むことができる。いくつかの用途において、1つまたは複数の反応成分は、予め測定された使い捨ての量で、個々の、典型的には使い捨ての、チューブまたは同等の容器中にて提供されうる。そのような配置では、標的抗原の存在について試験したいサンプルを個々のチューブに添加し、増幅を直接実施することができる。キット中に供給される成分の量は任意の適切な量であることができ、製品が向けられる目標市場に依存しうる。適切な量を判定するための一般的な指針は、例えば、Joseph Sambrook and David W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; およびFrederick M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2003において見い出されうる。
【０１０５】
成分が供給される容器は、供給された形態を保持することができる任意の従来の容器、例えば、微量遠心管、アンプル、ボトル、もしくは流体デバイス、カートリッジ、ラテラルフローのような、一体型試験デバイス、または他の類似のデバイスであることができる。いくつかの態様において、キットは、本明細書において記述される方法のいずれかにおいて成分を使用するための説明書をさらに含むことができる。そのようなキットおよびシステムのための典型的な包装材料は、反応成分または検出プローブを種々の構成のいずれかで(例えば、バイアル、マイクロタイタープレートウェル、マイクロアレイ中などで)保持する固体マトリックス(例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微粒子など)を含む。
【０１０６】
システムは、キット成分を含むことに加えて、アッセイを実施するための器具類、例えば、標識分子からのシグナルを検出するためのルミノメーターをさらに含みうる。本発明のキットまたはシステムの使用を詳述した書面による指示またはビデオに録画された実演のような指示は、キットまたはシステムとともに任意で提供されてもよい。任意で、本発明のキットまたはシステムは、データの生成、分析および/または記憶を促進するための、ならびにデータベースへのアクセスを容易にするためのソフトウェアをさらに含んでもよい。ソフトウェアは、データの収集、記憶、および/または分析において使用できる論理命令、命令セット、または適当なコンピュータプログラムを含む。提供されるソフトウェアを用いて、データの比較および関係分析が可能である。
【０１０７】
薬物スクリーニングアッセイ
さらなる態様において、本発明の抗PDGF抗体は、細胞内でPDGF-CC活性の阻害剤として作用しうる化合物をスクリーニングし選択する方法において用いられうる。そのような方法論は、PDGF-CC活性を調節する化合物を選択するために、さまざまな抗体/ペプチド/試験化合物相互作用アッセイにおいて抗PDGF-C親和性を有する抗体を利用することを含む。化合物は、非タンパク質性有機もしくは無機分子、ペプチド(例えば、潜在的予防用もしくは治療用ペプチドワクチンとして)、タンパク質、DNA (一本鎖もしくは二本鎖)またはRNA (siRNAもしくはshRNAのような)でありうる。本明細書の開示および教示を再検討すると、PDGF-Cのエピトープへの結合について本発明の抗PDGF-C抗体と効果的に競合する任意のそのようなペプチドまたは小分子が、PDGF-C発現または過剰発現によって特徴付けられる疾患状態、特にPDGF-C発現がん腫の予防的または治療的処置に関連する可能性のあるリード化合物に当たることが明らかになるであろう。この目的のために、相互作用アッセイは、PDGF-Cエピトープを占有しまたはPDGF-Cエピトープと相互作用し、抗体に取って代わる化合物を同定するためのハイスループットスクリーニングの目的のために利用されうる。
【０１０８】
ELISAアッセイ、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロット分析、分離もしくは洗浄段階を必要としない検出可能な生物学的相互作用に依る任意のホモジニアスアッセイ(例えば、PerkinElmerのAlphaScreenを参照のこと)、および/またはSPRに基づく技術(例えば、BIACoreを参照のこと)を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知のさまざまな抗体/抗原に基づくアッセイが上記にしたがって用いられうる。抗PDGF-C抗体の使用を通じて同定される化合物および/またはペプチドワクチン候補は、種々のアッセイによって検出されうる。アッセイは、既知の抗体/抗原複合体を形成する能力に変化があるかどうかを判定するための単純な「はい/いいえ」アッセイでありうるか、またはELISAに基づくアッセイ、ホモジニアスアッセイ、もしくはSPRに基づくアッセイのようなアッセイを利用することによって本質的に定量的とされうる。この目的のために、本発明は、利用される既知の方法論にかかわらず、試験化合物が本発明の抗PDGF-C抗体と競合する能力を測定する、任意のそのようなアッセイに関する。
【０１０９】
以下は、前述の発明を裏付ける実施例である。これらは本発明に対する限定と解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１０】
実施例1. ヒトPDGF-CCに対するモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体をヒトPDGF-CC活性コアドメインタンパク質に対して作製した。免疫化プロトコルにおいて利用された精製PDGF-CCコアドメイン断片(RhPC)は、末端ヒスチジンタグを有するPDGF-CCタンパク質(SEQ ID NO: 1)の230〜345位の残基(SEQ ID NO: 2)からなっていた。それは既述(Li X, et al. Nat Cell Biol. 2000 May 2(5):302-309、その内容は参照により本明細書に組み入れられる)のようにバキュロウイルス感染昆虫Sf9細胞から産生かつ精製された。PDGF-Cのコアドメインは、PDGF-D (PDGF-Cが最も相同性を共有するヒトタンパク質)中の相同領域と53%の同一性を有する。PDGF-CCに特異的な抗体を作製するのに十分な非同一領域がある。
【０１１１】
市販の組換え精製ヒトPDGF-AA、PDGF-BBおよびPDGF-DDを購入した。活性PDGF-CCに対する対照ポリクローナル遮断抗体は、既述(Li X, et al. Nat Cell Biol. 2000 May 2(5):302-309)のようにウサギ615から単離された親和性精製ウサギIgGであった。
【０１１２】
COS-1細胞は最初にDMEM培地中で維持された。両方の培地に10% FCS、2 mMグルタミン、100 U/mlペニシリンおよび100 mg/mlストレプトマイシンを補充した。細胞を加湿5% CO2雰囲気中37℃で培養した。馴化無血清培地および沈殿タンパク質をトリクロロ酢酸で収集した。増殖因子PDGF-DDまたはPDGF-CCおよびペンタHis-ペプチドをトリクロロ酢酸(TCA)沈殿し、タンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離した。
【０１１３】
マウスPDGF-CCタンパク質を産生するために、COS-1細胞に、発現ベクターpCDNA3.1 (Invitrogen)中に構築されたマウスPDGF-Cコアプラスミドをトランスフェクションした。リポフェクトアミンプラス試薬(Invitrogen)を用いたトランスフェクションを製造元の指示にしたがって行った。トランスフェクションされた細胞を無血清培地中で培養した。トランスフェクションの24時間後に、培養上清(COSmPCcoremedia)を収集し、サンプル30 μlをヒトPDGF-Cコアタンパク質(RhPcc 0.1 μg)とともにSDS-PAGEに負荷し、タンパク質をSDS-PAGEによって分離した。次いで、標準的な手段を用いてタンパク質を単離した。
【０１１４】
標準的な手順によるマウスの免疫および脾臓融合に続いて、16ハイブリドーマの上清を最初にELISAおよびウエスタン分析によりPDGF-CC結合特異性について評価した。市販のPDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-DDおよび組換えPDGF-CCを用いてこれを探索するために、高感度ELISAアッセイを利用した。具体的には、1 μg/mlの濃度で100 mM NaHCO3中に希釈された精製組換えヒトPDGFリガンド、PDGF-AA、BB、CCおよびDDの抗原固定を+4℃で終夜行った。その後、全てのインキュベーションを室温で1.5〜2時間行い、洗浄をPBSで行った。三つ組で、ハイブリドーマ上清をPBS/1%ウシ血清アルブミン(BSA)中1:2の希釈度で適用し、または精製モノクローナル抗体(mAb)を添加した(3% BSA中1.5 μg/ml)。ウサギポリクローナルIgG精製抗体を陽性対照(4 μg/ml)として用いた。結合を抗マウス(または対照の抗ウサギ)アルカリホスファターゼ結合二次抗体で検出し、ELISA用アルカリホスファターゼイエロー(pNPP)液体基質システム(Sigma‐Aldrich)とのインキュベーションによって可視化した。吸光度を405 nmで読み取った。
【０１１５】
予想される反応性パターンおよびPDGFR-αリン酸化の阻止を示す、新たに作製されたモノクローナル抗体を選択した。PDGF-CCへのハイブリドーマ上清の特異的結合を示す免疫ブロッティング分析の結果を図1に示す。PDGF-CのコアドメインとPDGF-D (PDGF-Cが最も相同性を共有するヒトタンパク質)中の相同領域との間に53%のアミノ酸同一性がある。どのクローンもPDGF-DDまたはポリヒスチジン(his6)に対して強い陽性免疫反応性を示さなかった。抗体6B3、11F5、12F5および19C7の精製サンプルを用いた代表的なELISA分析を図2Aに示す。抗体6B3、11F5、12F5および19C7は、ヒトPDGF-CCに特異的に結合したが、PDGF-DDまたはPDGF-AAには結合しなかった。さらなる免疫ブロッティング分析により、精製抗体12F5はマウスPDGF-CCおよびヒトPDGF-CCへの結合を示すが、6B3はそうではないことが観察された(図2B)。抗体6B3は、ヒトPDGF-CCに対してのみ結合を示した。
【０１１６】
実施例2. 抗体のアミノ酸配列
6B3、19C7、11F5および12F5に対する可変重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、標準的な手順によって判定した。完全な可変軽鎖および可変重鎖配列がそれぞれ図3および4に提示されている。興味深いことに、19C7および6B3の配列は同一であった。抗体は全てカッパ軽鎖を有するアイソタイプIgG2aであると判定された。6B3、11F5および12F5抗体の相補性決定領域(CDR)およびアイソタイプは、上記の表3および4に提示されており、CDRは図3および4中の下線を引いた配列である。
【０１１７】
実施例3. キメラ抗PDGF-CC抗体6B3 (ch6B3)の作製
マウスモノクローナル抗体11F5、12F5、19C7および6B3のcDNA配列を、標準的な実験室技法を用いて判定した。インビトロおよびインビボの特性に基づき、以下では、6B3をマウス-ヒトキメラ抗体の作製のためのおよびヒト化のための候補として選択した。
【０１１８】
重鎖(HC)および軽鎖(LC)クローン6B3 PDGF CC抗体のマウス可変領域をGeneArtによって合成し、それぞれpEE6.4およびpEE14.4グルタミンシンテターゼ(GS)発現ベクター(Lonza Biologics)中のヒトIgG1重鎖および軽鎖カッパ定常領域の上流にクローニングした。
【０１１９】
DNA配列検証の後に、pEE6.4ch6B3HCおよびpEE14.4ch6B3LCベクターをNotI/SalI制限酵素で消化し、pEE6.4ch6B3HC由来のHCカセットをpEE14.4ch6B3LCプラスミドにクローニングして二重遺伝子ベクターpDGVch6B3最終構築体を作製した。一過性(Freestyle 293)細胞および安定(CHO)細胞の両方においてGSシステムを用いた発現を実施し、ELISAおよびBiacoreならびにPDGF-CC中和活性を用いて評価したch6B3抗体産物のPDGF-CC結合を、マウスモノクローナル抗体について下記のようにインビトロで評価した。
【０１２０】
キメラ(ch)およびマウス(mu) 6B3抗体の配列アライメントを図5に提示する。ch6B3の相補性決定領域(CDR)およびアイソタイプは上記の表3および4に提示されており、CDRは図5中の下線を引いた配列である。
【０１２１】
実施例4. PDGF-C上の6B3結合エピトープの同定
PDGF-CCコア抗原上に位置する6B3抗体可変ドメイン結合エピトープは、抗体Fvドメインの3D構造およびPDGF-CCコアドメイン二量体のモデルから既述(Zhang W., et. al. J Comput Aided Mol Des. 27(6):539-50, 2013)の方法を用いて計算的に予測された。
【０１２２】
PDGF-CCコアタンパク質上の6B3抗体結合エピトープの一部を形成する4つの推定ペプチドを同定し、次いで6B3結合エピトープの精緻化を目的としたバイオセンサー分析のために合成した(表9)。
【０１２３】
（表９）
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【０１２４】
潜在的ペプチドエピトープの非存在下および存在下での、固定化PDGF-CCコアドメインへの6B3抗体の結合:
カルボキシメチルデキストラン被覆センサーチップ(Xantec CMD)を用いBIAcore 2000バイオセンサーにてバイオセンサー分析を行った。標準的なアミンカップリング化学(0.05M NHS/0.2M EDC)を用いて、チップをチャネル2上PDGF-CCコア抗原(60 μg/mL)で誘導体化した。チャネル1をエタノールアミンで誘導体化し、屈折率効果の補正のためのブランク対照チャネルとして用いた。
【０１２５】
6B3抗体のサンプル(333 nM)を個々のPDGF-Cペプチド: ペプチド1 (142 μM)、ペプチド2 116 μM、ペプチド3 (89 μM)およびペプチド4 (179 μM)の非存在下または存在下において固定化PDGFCコア抗原上にHBS緩衝液(10 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% Tween-20)中で注入した(10 μL/分で30 μL)。注入段階の後、チップ表面上にHBS緩衝液を360秒間流すことによって解離をモニターした。結合した抗体を溶出し、チップ表面を10 mMグリシンpH 2.0 30 μlの注入によりサンプル間で再生した。
【０１２６】
6B3結合動態の変化がペプチド3
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の存在下において観察された。さらなるバイオセンサー分析により、PDGF-CCへの6B3結合のこの阻害がペプチド3濃度依存的であり、特異的阻害を示すことが確認された。過剰濃度(最大267 μM)のペプチド1、2または4では、6B3 (333 nM)結合阻害は観察されなかった(図6)。
【０１２７】
固定化PDGFCペプチド3
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への6B3抗体の結合
チオール化学を用いて、ペプチド3をカルボキシメチルデキストラン被覆センサーチップのチャネル4上に固定化した。手短に言えば、標準的なアミンカップリング化学(0.05M NHS/0.2M EDC)、続いて1 Mホウ酸PH 8.2中80 mMの(2-(2-ピリジニルジチオ)エタンアミン(PDEA)を用いてチップをチャネル4上で活性化した。ペプチド3 (10 mM酢酸ナトリウムpH 4.5中100 nM)をそのC末端システインを介してPDEAにコンジュゲートさせた。次いでチップを、10 mM酢酸ナトリウムpH 4.0および1 MエタノールアミンpH 8.2中40 mMのL-システインを用いてブロッキングした。ブランクの誘導体化チャネルを対照チャネルとして用いた。
【０１２８】
抗体6B3のサンプル(20.8 nM〜667 nM)を、固定化ペプチド3上にHBS緩衝液中で注入した(10 μL/分で30 μL)。特異的結合がブランクチャネルと比較して観察され、次いで、より小さい重複ペプチド配列でさらに調べられた(データは示されていない)。
【０１２９】
抗体6B3が結合した特異的PDGFCペプチド配列の判定:
PDGFCコアドメイン内の
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の推定上のエピトープ領域を包含する3つの重複する10アミノ酸ペプチドを合成して、6B3エピトープをさらに精緻化した。これらのペプチドは
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であった。ペプチドは、チオール固定化を用いたセンサーチップ上での規定の配向のためにC末端システインで合成された。
【０１３０】
固定化ペプチド上にHBS緩衝液中で6B3抗体のサンプル(1.334 μM)を注入した(10 μL/分で30 μL)。結果は図7Aに示されており、6B3が
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ペプチドに結合すること、および図7Bに示されるように重複ペプチド
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に対して、または代替ペプチド
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に対して結合は観察されなかったので、SVSIR配列が6B3結合に不可欠であることを示す。
【０１３１】
したがって、相同性モデリングによる推定上の6B3エピトープの予測およびその後のバイオセンサー分析による判定により、PDGFCコアドメイン配列内の特異的6B3エピトープは配列
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内の256SVSIR260であると判定された。
【０１３２】
抗体6B3エピトープのPDGFC特異性:
本発明者らの以前のウエスタンブロットおよび細胞に基づく分析によって、6B3がPDGF-Dポリペプチドに結合しないものと判定されたので、さらなるバイオセンサー結合分析により、PDGF-Cペプチドエピトープ
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および1アミノ酸だけ異なる対応するPDGF-Dペプチド
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への6B3の結合を調べた。ペプチドは、チオール固定化を用いたセンサーチップ上での規定の配向のためにC末端システインで合成された。
【０１３３】
抗体6B3のサンプル(667 nM)を、固定化された
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ペプチド上にHBS緩衝液中で注入した(10 μL/分で30 μL)。
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への特異的結合が、
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と比較しておよびブランク対照チャネルと比較して観察された(図7B)。
【０１３４】
PDGF-C配列SVSIRは、対応するPDGF-D配列とはアミノ酸1個(セリン)だけ異なる(図8)。
【０１３５】
実施例5. ヒトPDGF-CC特異性についてのバイオセンサー確認
A. 親和性の推定
バイオセンサー分析は、NTAセンサーチップを用いBIAcore 2000バイオセンサーにて行った。簡潔には、NTAセンサーチップにNi 2+を負荷し使用して、ヒスチジンタグ付きPDGF-CCリガンドを固定化した。見かけの親和性(KD)を判定するために、PDGF-CC抗体をさまざまな濃度でチップ上を通過させた。チップをEGTAで再生した。さらなる分析の前に、チップをHBS (EDTAを含有しない)で洗浄することにより再平衡化した。BIAevaluationソフトウェアを用い、1:1のラングミュア結合分析モデルを使って、各セットの抗体実験について見かけの会合(ka)および解離(kd)速度定数を推定した。
【０１３６】
330 nMの濃度の抗PDGF-CC mAb (6B3、12F5、19C7および11F5)を固定化PDGF-CCおよびPDGF-DD (R&D)上に注入した。図9に示される結果は、密接に関連したPDGF-DD配列と比べてPDGF-CCへの結合の特異性を実証し、これらの観察結果はELISA分析と一致した(図2A)。キメラ6B3構築体はまた、6B3マウス抗体と比較して、低いナノモルの見かけの結合親和性を実証し、見かけの結合親和性の喪失を実証しなかった。マウスおよびキメラ6B3の代表的な結合曲線を図10に示す。これらの曲線を1:1のラングミュア結合モデルに適合させた。
【０１３７】
調べた各抗体について用量依存的結合が観察された。見かけのオン速度(ka)、オフ速度(kd)および解離定数を表10に報告する。各抗体について計算された解離定数は低いナノモル範囲にあり、5つの抗体全てがPDGF-CCリガンドに対して高い親和性を有することを示した。予想通り、6B3および19C7は極めて同等な見かけの結合親和性を実証した。
【０１３８】
（表１０）バイオセンサー分析 − 1/1ラングミュア分析を用いて判定された抗PDGF-CC抗体の見かけの結合パラメータ
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【０１３９】
B. 結合の特異性
固定化PDGF-CCを用い4つの抗PDGF-CC候補mAbのパネルについて競合結合分析を同様に行った。標準的な条件を用い一級アミン基(NHS/EDC化学)を介してCM5センサーチップにPDGF-CC抗原を共有結合させた。抗PDGF-CC mAb (6B3、12F5、19C7および11F5)ならびに対照抗PDGF-DD mAbを固定化抗原上に注入した。別々のエピトープに対して作製されたモノクローナル抗体は、互いに独立して結合するが、密接に関連したエピトープに対して作製された抗体は互いの結合を妨害する。全ての利用可能な結合部位が占有される表面飽和まで、一次抗体の注入(100 μl/mLで50 μL)によりペアワイズ結合研究を行った。次いで、注入(100 μl/mLで50 μL)後にPDGF-CCへの二次抗体の結合を評価した。
【０１４０】
10 mMグリシンpH 2.1を用いてセンサーチップ表面から結合物質を取り出すことにより、各分析サイクルを終了させた。同じ抗体の相互重複を逆の順序で分析することによってマッピングを行った。PDGF-CCへの結合の性質およびPDGF-CC内のジスルフィド結合の関与の可能性をさらに調べるために、非還元および還元/アルキル化抗原を用いてモノクローナル抗体結合を行った。還元およびアルキル化は、ジチオスレイトール(50 mMで200 μL)およびヨードアセトアミド(200 μLで30 mM)の連続注入により固定化PDGF-CC上で行った。
【０１４１】
固定化PDGF-CCリガンドへの結合について交差競合するmAbの有効性を以下の表にまとめた(表11)。カラーコードは以下を含む: 白色, 結合抗体(異なるエピトープ); 黒色: 競合抗体(類似エピトープ); 灰色, 結合を妨げる抗体。
【０１４２】
（表１１）バイオセンサー分析 − 固定化PDGF-CC結合についての抗体交差競合
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【０１４３】
予想通り、各抗体はそれ自体と競合し、同一の可変ドメインmAb 6B3および19C7も結合について競合した。MAb 12F5および11F5は、6B3および19C7に対して、ならびに互いに対して異なるエピトープを有する。結合のいくらかの干渉が、6B3および19C7との11F5について観察され、エピトープの重複または立体障害を示唆していた。Biacoreデータから判定された4つの抗体についてのエピトープ群を以下に図式的に提示する。
Biacoreデータから判定されたエピトープ群。
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【０１４４】
PDGF-CC抗原が還元およびアルキル化された場合に結合反応性の明らかな変化は観察されず、全てのエピトープがジスルフィド非依存性であるように思われるものと示唆された。
【０１４５】
実施例6. PDGF-リガンドは受容体活性化および細胞増殖を誘導した
PDGF受容体α(PDGFR-α)を過剰発現するブタ大動脈内皮細胞(PAE)を利用して、PDGF-CC誘導性PDGFR-α活性化の活性を中和するためのmAbを特徴付けた。細胞を60 ng/mlの活性化組換えヒトPDGF-リガンドのみで、または精製mAb (5 μg/ml)とプレインキュベーションされたPDGF-リガンドで氷上にて1時間刺激した。PDGFR-αのPDGF-BB活性化についての陽性対照および全長PDGF-CCの陰性対照(対照)または未刺激細胞をアッセイに含めた。その後、細胞を冷PBS中で洗浄し、穏やかに遠心分離し、溶解緩衝液(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5%デオキシコール酸, 200 μMオルトバナジウム酸塩および完全プロテアーゼ阻害剤)中で溶解した。次いで、放出されたタンパク質を、ホスホチロシンPY99を認識するマウスモノクローナル抗体およびC末端PDGFRを検出するウサギポリクローナル抗体を用いた免疫ブロッティングによって分析し、CEDを負荷対照として用いた。
【０１４６】
ヒトPDGF-CCのコアドメインは、PDGF-BBと同様に、PDGFR-αのチロシンリン酸化を効率的に誘導した(図11A)。未刺激細胞からのPDGFR-αまたは全長PDGF-CCで刺激した細胞からのPDGFR-αは、バックグラウンドレベルの活性化のみを示した。その後のPDGFR-αに対する抗体によるフィルタのプロービングにより、等量のPDGFR-αが全てのレーンに存在することが確認された(データは示されていない)。抗体6B3、11F5、19C7および12F5は、PAE細胞においてPDGF-CC誘導性のPDGFR-αリン酸化を遮断したが、PDGF-BB誘導性のPDGFR-αリン酸化を遮断しなかったことが観察された。したがって、これらの抗体はヒトPDGF-CCに対する中和モノクローナル抗体である。インビトロ分析はまた、マウス-ヒトキメラ抗体6B3がPDGF-CC誘導性のPDGFR-α活性化の阻害において親マウスmAb 6B3と同程度に有効な中和抗体であることを実証した(図11B)。抗PDGF-CC mAb 12F5も中和性であったが、12C2または9A5はそうでなかった。
【０１４７】
PDGFR-αを過剰発現するPAE (ブタ大動脈内皮細胞)を同様に利用して、PDGF-CC誘導性のPDGFR-α活性化による増殖を阻害する能力についてこれらの抗体の例として6B3を評価した。PAE-α細胞を6ウェルプレートに播種し(細胞2×105個/ウェル)、無血清培地中で終夜飢餓状態にした。次いで、細胞をヒトPDGF-CCコアドメインタンパク質(RhPCC) (図12A)で、または6B3 (0〜6 μg/ml)および50 ng/ml RhPCC (図12B)で24時間処理した。細胞数を24時間後に細胞計数器で判定した。
【０１４８】
図12は、6B3がPDGF-CC誘導性のPAEα細胞増殖を用量依存的に阻害することを実証する。3 μg/mlの6B3の存在下では、50 ng/mlのPDGF-CCコアドメインによって誘導されたPAEα細胞増殖の最大阻害が観察された(図12B)。
【０１４９】
実施例7. 免疫組織化学 − 組織スクリーニング
A. 材料および方法
6B3、11F5、12F5および19C7ならびに他のクローン反応性の免疫組織化学的分析を、最初に乳がん組織について探った。これらの抗体の例としてのクローン6B3のさらなる免疫組織化学的特徴付けを、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト正常組織および腫瘍のパネルにて行った。
【０１５０】
ヒト組織は、Victorian Cancer Biobank and Austin Hospital Tissue Bank (Melbourne, Australia)によって提供された。パラフィン包埋切片を脱パラフィンした後に、室温で10分間3%過酸化水素での内因性ペルオキシダーゼ活性のクエンチングを行った。抗原回復は、10 mmol/Lクエン酸pH 6.0中で30分間煮沸することによった。使用した抗体および希釈物は、6B3 (1.5 μg/ml)、アイソタイプ対照mIgG1 (Southern Biotechnologies; 1.5 μg/ml)、CD34 (0.5 μg/mL; Dako)であった。Dako-Envision+ 抗マウスHRP結合二次抗体、続いてDAB色素原を用いて抗体結合を検出した。
【０１５１】
陽性対照サンプルは、ヒト肺がん細胞株A549 (ATCC)および既知の陽性扁平上皮細胞肺がん組織からなった。アッセイ対照は、一次抗体をアイソタイプ対照と置き換えること、または一次抗体を省くことを含んでいた。
【０１５２】
抗体とインキュベートされた組織にシグナルが存在し、アイソタイプ対照とインキュベートされた切片および/または一次抗体の非存在下においてインキュベートされた切片にシグナルが存在しなかった場合、試験組織を陽性と報告した。
【０１５３】
陽性対照組織による染色の特異性のさらなる分析は、PDGF-CCリガンドまたは関連する増殖因子VEGF-Bとの競合を含んだ。マウス6B3抗体(1.5 μg/ml)を、A549細胞またはヒト胎盤組織の切片への混合物の適用1時間前に6.7倍過剰のPDGF-CC His6抗原(10 μg/ml)または過剰のVEGF-B抗原(10 μg/ml)とともにインキュベートした。染色の検出は、標準的な6B3免疫組織化学プロトコルにしたがって行った。
【０１５４】
スライドを、Aperio ScanScope XT機器(Aperio Technologies, Inc, Vista, CA)を用いてデジタル化し、ImageScopeソフトウェア(Aperio Technologies, Inc, Vista, CA)を用いて観察した。
【０１５５】
抗体とインキュベートされた組織にシグナルが存在し、アイソタイプ対照とインキュベートされた切片または一次抗体なしでインキュベートされた切片にシグナルがないまたは最小であった場合、試験組織を陽性と報告した。
【０１５６】
抗体CD34を隣接切片に適用して、血管の同定および染色頻度を補助した。
【０１５７】
6B3染色を3つのパラメータによって報告した:
1) 陽性染色の強度: -または陰性または -ve陰性; ＋, 弱い染色; ＋＋, 中程度の染色; ＋＋＋, 強い染色; および＋ve, 強度が記録されていない陽性染色
2) 範囲として提供された、陽性細胞染色の割合:
陰性,
＜5%
6〜25%
26〜50%
51〜75%
＞75%
3) 陽性組織の頻度、すなわち評価された組織の総数(分母)と比較した陽性組織(分子)。
【０１５８】
染色の強度および陽性に染色された細胞の割合に基づいて、各個々の組織サンプルについて修正H-スコアを判定した。このスコアは陽性細胞の割合(範囲0〜5 [陰性 ＝ 0; ＜5% ＝ 1; 6〜25% ＝ 2; 26〜50% ＝ 3; 51〜75% ＝ 4; ＞75% ＝ 5])に染色の強度(陰性 ＝ 0; + ＝ 1; ++ ＝ 2; +++ ＝ 3)を乗じることによって判定された。修正H-スコアを用い、正常および腫瘍標本における6B3反応性の間の統計的有意性を判定するために、各組織型についてｔ検定を実施し使用した。0.05未満のP値が有意であった。
【０１５９】
B. 結果
正常組織および腫瘍組織の免疫組織化学染色の結果を、それぞれ表12および13に示す。アイソタイプおよび陰性対照には染色がなかったことから、6B3抗体による染色が特異的であることが示唆された。正常組織および腫瘍組織の染色パターンの代表的な画像を、それぞれ図13および14に提示する。
【０１６０】
i. 正常組織
ノザンブロット分析は、ヒトの心臓、肝臓、腎臓、膵臓および卵巣におけるPDGF-C転写産物の豊富な発現、他のほとんどの組織におけるもっと少ないレベルのmRNA転写産物を以前に明らかにした。この以前のmRNA分析と一致して、PDGF-CCタンパク質の広範な発現が、ヒトの心臓、肝臓、腎臓、膵臓、子宮、卵巣および前立腺において観察された。
【０１６１】
正常組織では、6B3の染色パターンは主に上皮細胞の細胞質において観察され、注目されるところでは間質細胞の細胞質において観察され、例外は卵巣であり、膜パターンも見られる。内皮細胞の染色も観察された(図13)。血管および間質の染色の頻度は、間質および血管の染色が同様の頻度の陽性染色を示した腸、卵巣、子宮および胎盤を除いて、正常組織の上皮成分の染色頻度よりも少ない傾向があった。
【０１６２】
副腎皮質細胞は弱から中程度の細胞質染色を示した。組織中心部においては髄質がサンプリングされていないため、副腎の皮質免疫組織化学染色のみを報告することができた。脳では、広範囲の弱から中程度の神経細胞およびグリア細胞の染色が観察された。乳房組織における染色の主なパターンは筋上皮細胞に対するものであったが、導管細胞もまた陽性に染色された。脂肪は弱い陽性を示した(データは示されていない)。腎臓において、尿細管の上皮細胞の広範な染色および糸球体における壁細胞の染色があった。高い腎臓PDGF-CC mRNAレベルおよびボーマン嚢の壁上皮細胞、管状上皮細胞(Henleのループ、遠位細管、集合管)、および動脈内皮細胞の染色もまた、ポリクローナル抗体を用いて以前に記述されている。大腸では、腺および上皮は一般に弱から中程度の染色強度を示したが、固有層は増加した染色強度を示した。潜在的増殖因子についての高レベルのmRNAがヒト心臓について以前に報告されたが、活性なPDGF-CCは通常存在しないことを示唆する、弱染色の心筋および低頻度の陽性染色血管が観察された。以前のmRNA分析と一致して、中程度から強い染色強度が肝臓肝細胞について観察されたが、胆管は、ほとんど陽性であるが、より弱い強度を有した。腺房が中程度から強い強度の広範な染色パターンを示した正常膵臓において同様のパターンが観察されたが、管は弱く、より少ない頻度で染色された。
【０１６３】
ii. 腫瘍組織
PDGF-CCタンパク質の免疫染色は、腫瘍細胞の細胞質および膜において観察され、多くの場合、強い核周囲染色パターンを示した。6B3の発現は血管の内皮細胞においても見られ、評価可能であれば、試験した腫瘍の間質成分の細胞質においても見られた。
【０１６４】
腫瘍細胞染色は研究した全ての腫瘍組織に広く行き渡っており、一般に75%超の腫瘍細胞が中程度から強い強度の染色を表したが、膠芽腫、浸潤性小葉がんおよび前立腺腺がんは例外であり、ここではより不均一な染色パターンが見られた(図14)。さらに、異なる腫瘍分化段階にわたって染色の頻度も強度も差がなかった。
【０１６５】
iii. 腫瘍組織と正常組織の比較
一般に、正常組織実質は、それぞれの腫瘍細胞染色強度と比較した場合、染色強度の顕著な減少を示した。これに対する例外は、正常な肝細胞と原発性肝腫瘍細胞との間の強度の差が明白ではない肝臓組織、および正常な腺上皮と子宮腫瘍細胞との間の染色強度の差が明白ではない子宮組織であった。
【０１６６】
さらに、腫瘍組織と比較した場合、陽性に染色された細胞の頻度は、正常組織についてより低かった。これに対する例外はやはり肝臓および子宮組織であり、さらに、腎臓、卵巣および脳であり、ここでは明らかな違いは明らかではなかった。
【０１６７】
まとめると、結果から、いくつかの例外を除き、正常組織において、その各腫瘍組織と比べて低いPDGF-CC発現が示された。
【０１６８】
正常染色パターンと腫瘍6B3染色パターンとの間の見かけの違いを調べるために、修正H-スコアシステムを利用して、陽性細胞染色の割合が離散数ではなく範囲として報告される結果の統計分析を可能にした。
【０１６９】
修正H-スコアの分析に基づいて、腫瘍細胞におけるPDGF-CCの6B3染色は、膀胱(P＝0.039)、脳神経膠肉腫(P＜0.001)、乳房浸潤性管がん(P＝0.006)、腸(P＜0.001)、腎臓(P＝0.008)、膵臓(P＜0.001)および前立腺(P＝0.001)のその各正常上皮組織と比べて有意に増加した。しかし、脳神経膠芽腫(P＝0.26)、および乳房浸潤性小葉がん(P＝0.87)の腫瘍細胞染色とその各正常上皮との間に有意差はなく、どちらも非常に不均一な染色パターンを示し、またPDGF-C染色もその各正常上皮組織において強く陽性であった肝細胞がん腫(P＝0.26)および子宮腺がん腫(P＝0.59)については示さなかった。
【０１７０】
浸潤性小葉がんはIDCよりも成長が遅く攻撃的ではない傾向があり、ILCを有する患者は、IDCを有する患者よりも良好な予後を有する傾向がある。それほど攻撃的ではない腫瘍ではPDGF-C発現が減少する可能性があるという推論は脳および神経膠芽腫、つまり非常に攻撃的な脳腫瘍では明らかではなかった。この仮説を探究するためには、関連する臨床情報とともに、より多数の腫瘍を用いたさらなる分析が行われる必要があるだろう。
【０１７１】
PDGF-Cトランスジェニックマウスモデルにおいて、PDGF-Cの過剰発現が肝線維症、脂肪症および肝細胞がんを引き起こすことが以前に実証された。現行の免疫組織化学的研究において用いられている正常な肝臓のほとんどは線維症または脂肪症を示した。これらの条件は、「正常な」肝臓において観察されたPDGF-CCの高発現および肝細胞がんにおけるPDGF-CC発現レベルとのいかなる統計的差異の欠如も説明しうる。
【０１７２】
間質の染色の比較は、間質がないために調べた多くの種類の組織において評価することができなかった(表12および13)。正常乳房組織における間質染色と比較して、浸潤性乳管(P＝0.039)および小葉がん腫瘍(P＝0.006)の両方において有意に高い間質染色があった。正常前立腺組織と腫瘍前立腺組織の間質成分の間に見られた染色に統計的に有意な差はなかった(P＝0.08)。正常子宮における間質細胞染色と比較して、子宮腫瘍間質細胞の染色の有意な減少(P＝0.011)が観察された。
【０１７３】
膀胱、脳、乳房、腸、腎臓、膵臓および前立腺について、正常組織と各腫瘍組織の血管染色の間に非常に有意な差(P＜0.0001)が観察された。PDGF-Cは、腫瘍血管新生に関与するとされており、正常血管と比較して腫瘍血管において観察されたより高い染色はこれを支持するであろう。正常肝臓と腫瘍肝臓(P＝0.39)または子宮(P＝0.20)の血管染色との間に観察された染色パターンに統計的に有意な差はなかった。
【０１７４】
結論として、6B3抗体によって検出されたPDGF-CCは、ある範囲のヒト正常組織および腫瘍組織にわたって広く発現されていた。腫瘍組織における6B3染色のパターンは、血管の内皮細胞、腫瘍細胞の細胞質および膜、ならびに評価可能な場合は間質細胞の細胞質において観察された。全体として、正常組織と比較して腫瘍組織における有意に増加したレベルの6B3染色が観察された。
【０１７５】
（表１２）正常ヒト組織パネル上の抗体6B3のPDGF-CC免疫反応性
2019527545.tif 000034
【０１７６】
（表１３）ヒト腫瘍組織パネル上の抗体6B3のPDGF-CC免疫反応性
2019527545.tif 000035
【０１７７】
実施例8. インビボ療法研究
A. 結腸がん異種移植片
結腸腫瘍におけるPDGF-CC発現のインビボ作用を調べるために、いくつかの細胞株を細胞表面および細胞内蛍光活性化細胞選別(FACS)分析によってスクリーニングした。ヒト結腸直腸がん細胞株Colo205は、6B3および12F5抗体を用いたPDGF-CCの細胞内発現、ならびに細胞表面PDGFRα発現を実証し、インビボ腫瘍異種移植片治療研究で用いるために選択された。
【０１７８】
Animal Research Centre, WA, Australiaで飼育されたnu/nu対立遺伝子についてホモ接合性である、6〜7週齢の雌性胸腺欠損BALB/cヌードマウスにおいてインビボ調査を行った。マウスをオートクレーブ処理したマイクロアイソレータケージ内で維持し、個々に通気されたケージシステム(Techniplast IVC System, Italy)を用いて陽圧封じ込めラックに収容した。異種移植片を樹立するために、マウスの左側腹部に2×106個のHT-29またはColo 205大腸がん細胞を皮下接種した。これらの細胞株をFACS分析によって評価し、PDGF-Rα細胞表面発現および細胞内PDGF-CC発現について陽性であることを確認した(データは示されていない)。
【０１７９】
腫瘍が50〜100 mm3の平均体積に達したら、12F5、6B3、または対照としてのPBSでの処置を0日目に開始した。マウス10匹の群に、PBS媒体対照、または抗体100 μg、300 μgもしくは1.0 mgの用量で計9用量の腹腔内(i.p.)注射を週3回、3週間または4週間行った。式(長さ×幅2)/2を用いて腫瘍体積を判定したが、ここで長さは最長軸であり、幅は長さに対して直角に測定したものである。腫瘍体積が1000 mm3に達したときに、マウスを倫理的理由で安楽死させた。データは各処置について平均腫瘍体積±SEとして表された。
【０１８０】
動物(n ＝ 1または2)を0日目におよび治療開始後1、2、3または4週の時点で各群から殺処置した。腫瘍異種移植片をマウスから外科的に取り出し、二等分して急速冷凍するか、または増殖、細胞構造、血管構造および数の形態評価および薬力学的評価のために終夜10% (v/v)ホルマリン中で固定した。
【０１８１】
週3回3週間、抗PDGF-C 12F5または6B3 300 μgで処置したマウスにおける結腸がん異種移植片の結果を図15Aに示す。両抗体は、21日目および24日目の時点で2週間の治療後に腫瘍増殖を有意に阻害した(P＝0.04; 対応のあるt検定)。倫理的腫瘍量の懸念からPBS対照群を25日目の時点で処分し、さらなる有効性評価を妨げた。同じCOLO205結腸がん異種移植モデルを用いた2回目の実験では、300 μgおよび1 mg用量の6B3療法を4週間の長期間にわたって週3回投与した。結果を図15Bに示す。用量応答は明らかではなかったが、やはり2週間および3週間の抗PDGF-CC療法の後、PBS対照と6B3 1 mgとの間に有意差が観察された(P＜0.02 Day 17, 24日目)。
【０１８２】
B. Colo205異種移植薬力学評価 − 組織標本、組織学、および免疫染色
パラフィン包埋後、4 μmのColo205異種移植片(Xenograft)切片を切断し載せた。切片を60℃のオーブン中で脱パラフィンし、続いてキシレンおよびエタノール中での洗浄を行った。組織過酸化活性を蒸留水中3% (v/v)の過酸化水素中での室温で20分間のインキュベーションによりクエンチした。抗原を「回復させる」ために100℃の沸騰水浴を用い30分間10%クエン酸緩衝液, pH 6.0 (Labvision)を用いて切片を処理した。冷却後、非特異的結合を、Maxitageタンパク質ブロッキング剤(Thermo Fisher)を用いて室温で30分間ブロッキングした。続いてスライドをスライドラック(Thermo Shandon)に移し、以下のように適切な一次抗体を用いて発色させた。
【０１８３】
Ki-67染色による細胞増殖
切片を1/100ウサギ抗ヒトKi-67 (Thermo Scientific, RM-9106)とともに室温で2時間インキュベートし、PBSで洗浄し、抗ウサギIgG-HRP (Dako, K4003)とともに30分間インキュベートした。染色は、20分間AECでの発色およびマイヤーのヘマトキシリン染色後に可視化された。
【０１８４】
ポドカリキシン染色による血管評価
切片をヤギ抗ヒトポドカリキシン(R&D, AF1556)抗体1 μgとともに室温で2時間インキュベートした。PBSでの洗浄後、切片をビオチン化抗ヤギ二次抗体とともにインキュベートし、Vectastain ABCキット(Vector Laboratories)を製造元の指示にしたがって用い可視化した。
【０１８５】
全ての画像は、Aperio ImageScopeスライドスキャンおよび分析システムを用いて捕捉された。腫瘍サンプル内の血管数および密度、ならびに血管周囲を判定するために画像分析を行った。
【０１８６】
結果
Colo205異種移植片切片のポドカリキシン染色による血管の免疫組織化学的同定を行ったが、血管数、周囲長および血管面積についての分析結果が図16 (A)〜(C)に提示されている。分析により、異種移植片内の血管の数およびサイズが3週間および4週間の6B3抗PDGF-CC処置後に有意に減少し、血管のパターンもPBS対照異種移植片と比較して処置群において変化したことが実証された。これらの結果もやはり、抗PDGF-CC療法の抗血管新生活性を示唆している。
【０１８７】
Ki-67マーカーを用いて細胞増殖を評価した。Aperio ImageScope核染色アルゴリズムを用いて陽性細胞を計数した。Ki67染色によって評価される細胞増殖速度の有意差は、PBS対照異種移植片と6B3処置異種移植片との間で明らかであり(図16D)、増殖の有意な減少が6B3 1 mgの抗PDGF-CC処置3週間後に観察された。この観察結果は、観察された遅発性腫瘍増殖と一致し(図15)、細胞増殖阻害のインビトロでの観察結果と一致している(図12)。
【０１８８】
C. MDA-MB-231乳がん異種移植片
10% FBS、100単位/mlのペニシリン、100 μg/mlのストレプトマイシン、および2 mMグルタミンを補充したDMEM中で通常の条件にてヒト乳房腫瘍細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435およびMCF-7を培養した。製造元の指示(SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit, Invitrogen)にしたがってRNA (1.25 μg)を逆転写した。製造元の指示にしたがい、KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix (2×) Universal (KAPA Biosystems)を用いてRotor-Gene Q (Qiagen) Real-Time PCRサーマルサイクラー中で、計40サイクル、リアルタイム定量PCRを行った。PDGF-C (カタログ番号: QT00088935 QuantiTect Primer Assay, Qiagen)、B2M (カタログ番号:QT00026551 QuantiTect Primer Assay, Qiagen, 参照遺伝子)。
【０１８９】
さらなる分析のため、MDA-MB-231細胞を選択したが、これは一般に認められた乳がんモデルであり、また高いPDGF-C mRNAレベルを示す。同所性腫瘍モデルを作製するために、2×106個のMDA-MB-231細胞を雌性6〜8週齢CB17/Icr-Prkdc scid/Crlマウス(Charles River)の第4乳腺へ同所性に注射した。最長直径が3 mmを超えて測定されると定義した、明らかに触診可能に腫瘍がなった後、6B3 Igおよびアイソタイプ適合対照Igを週2回腹腔内投与した(300 μg/マウス/用量)。処置を7回続けた。腫瘍サイズを週2回測定し、腫瘍体積を幅2×長さ×π/6として算出した。実験の終わりに、マウスを2.5%アベルチン(Sigma-Aldrich)で安楽死させ、PBS 10 ml続いて2% PFA 10 mlで心臓灌流し、その後腫瘍を取り出し、前述のように切片化のために処理した。ヤギ抗マウスポドカリキシン(1:100) (R&D Systems)を用いて血管染色を行った。血管の密度は、10個の均等に分布した視野内の血管構造の数/40×視野として手動で計数した。
【０１９０】
MDA-MB-231細胞の同所性注射後の腫瘍体積の有意な低減が、6回目の処置後に対照Ig処置動物と比較して6B3処置マウスにおいて観察された。全体として、6B3 Igによる処置は、6回目の処置または3週間後に約30%の腫瘍サイズの有意な低減を引き起こし(図17A)、これは結腸がん異種移植片モデルによる観察と一致する。特に、6B3はヒトPDGF-CCを中和するだけであり、腫瘍細胞と隣接する間質との間の傍分泌シグナル伝達の機能的重要性を実証している。腫瘍からの切片の染色は、おそらくはマウス線維芽細胞に浸潤している、腫瘍間質細胞上にのみPDGFRαが見出されることを明らかにした(データは示されていない)。6B3 Igで処置した腫瘍からの切片では、PDGFRα発現間質細胞は小さく、伸張していなかったが、対照Igで処置した腫瘍では、これらの細胞はより細長く、線維芽細胞の典型的なパターンを視覚化した(データは示されていない)。
【０１９１】
6B3および対照Ig処置腫瘍においてポドカリキシンを用い微小血管密度を測定することで、腫瘍におけるPDGF-CCシグナル伝達の阻害が微小血管密度をおよそ30%だけ低減させることが明らかにされた(p＜0.05) (図17B)。これらの結果は、この乳がんマウスモデルにおけるPDGF-CCシグナル伝達の制限が、有意な方法で、おそらく腫瘍血管の数を減らすことによって腫瘍の増殖を低減させることを明らかにした。
【０１９２】
実施例9. 抗PDGF-C抗体6B3によるPDGF-CC媒介性血液脳関門開放の調節
抗PDGF-Cモノクローナル抗体6B3が脳内の血液脳関門のPDGF-CC媒介性開放を標的とする能力を実証するために、総容量500 μlにPBS中でともに別々に希釈された抗PDGF-Cモノクローナル抗体6B3または対照抗体BM4 400 μgをC57Bl/6マウスに腹腔内注射した。3〜4時間後、注射されたマウスは、続いてイソフルランにより麻酔され、定位固定フレームにマウントされた。頭蓋骨を露出させるための皮膚手術に続いて、ブレグマから中外側(ML) 0および前後方向(AP) -2の位置で2 mmの穴を頭蓋骨に開けた。PBS 3 μlに希釈された高精製PDGF-CCコアドメインタンパク質1,5 μgを、微量注入ロボット(Neurostar)を用いてブレグマからML 0; AP -2および背腹(DV) 2.6の位置で第3脳室に1 μl/分の速度で注入した(PDGF-CC ICV)。PBS 3 μlの注入を対照(PBS ICV)として役立てた。創傷を創傷クリップで閉じた。これらの手順の後に、ろ過したエバンスブルー溶液100 μlを各マウスの尾静脈に注射し、2時間循環させた後、PBSで徹底的に灌流した。図中に示された時点は、PDGF-CC ICV注射(3時間、3,5時間および4時間)後の時間をいう。解剖した脳を写真撮影し、血管外遊出したエバンスブルーが脳内に残っている青色色素として見られた(図18A)。血管外遊出したエバンスブルーの定量化のため、脳を別々にホモジナイズし、半球当たり500 μlのN,N-ジメチルホルムアミド中に抽出した。サンプルの有機N,N-ジメチルホルムアミド相中に存在するエバンスブルー色素を、参照として本明細書に組み入れられるYepes M, Sandkvist M, Moore EG, Bugge TH, Strickland DK, Lawrence DA Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein. J Clin Invest. 112:1533-40, 2003に記述されているように光度計を用いて定量化した(図18B)。簡潔には、エバンスブルーレベルを式: (A620nm - ((A500nm + A740nm)/2)) / mg湿重量から判定した。結果から、マウスを抗PDGF-C抗体(PDGF-CC ICV + 6B3)で処置した場合、PDGF-CCが媒介する血液脳関門の開放およびエバンスブルーの血管外遊出が対照抗体BM4 (PDGF-CC ICV + BM4)と比較して有意に低減されたことが示される。結果から、抗PDGF-C抗体6B3の全身投与が、PDGF-CCによって誘発された血液脳関門の開放時に、血液脳関門開放を効率的に閉鎖することが示された。結果からまた、抗PDGF-C抗体6B3を用いた血液脳関門の閉鎖に及ぼす最大の効果を達成するためには、およびエバンスブルーの血管外遊出を阻止するためには、血液脳関門を開放させるためのPDGF-CCを介したシグナル伝達の少なくとも4時間前にi.p.注射が必要とされたので、抗体は好ましくは、静脈内に投与されなければならないことが示された。単離された脳からの血管外遊出エバンスブルーの定量化により、抗体投与時のエバンスブルー血管外遊出の有意な低減につながる抗PDGF-C抗体6B3によるPDGF-CC誘導性の血液脳関開放の閉鎖が実証された。エバンスブルー血管外遊出の定量化は、PDGF-CC ICV前に抗PDGF-C抗体6B3および対照抗体BM4の注射3〜4,5時間後に注射された脳を用いて測定された。
【０１９３】
実施例10. 実験的脳卒中の間の6B3 (抗PDGFC)の治療的使用
A. 材料および方法
動物、HFDおよび抗体処置
雄性または雌性C57BL/6NTac-Pdgfc tm3633(K242T, K246R, R299S, K318R, N342S, A343T)Arteマウス(PDGF-CChumと称する)に離乳(生後3週間)から16週間(生後19週間) 60%高脂肪食(HFD, Research Diets)を給餌した。PDGFChumマウスを、抗PDGFC (6B3)で予防的または治療的に処置した。マウスに6B3またはアイソタイプ適合対照抗体(BM4) 400 μgを腹腔内注射した。
【０１９４】
虚血性脳卒中のマウスモデル
PDGFChumマウスを3%イソフルランで麻酔し、マスクを着けて維持した。次にマウスを解剖顕微鏡(Nikon SMZ-2T)下にしっかりと置いた。左中大脳動脈(MCA)を以前に記述されたように曝露し(Nagai et al., J. Thromb. Haemost. 3, 1379-1384 (2005)を参照のこと)、レーザードップラーフロープローブ(N型(18ゲージ), Transonic Systems)を、MCAの分岐部から1.5 mm後側中央に位置する大脳皮質の表面に配置した。プローブを流量計(TransonicモデルBLF21)に接続し、相対的組織灌流ユニット(TPU)データを連続データ取得プログラム(Windaq, DATAQ Instruments)で記録した。ローズベンガル(Rose Bengal) (Fisher Scientific)をPBS中で10 mg/mlに希釈し、次いで最終用量50 mg/kgで尾静脈に注射した。3.5 mWの緑色光レーザー(540 nm, Melles Griot)を注射の開始時に6 cmの距離からMCAに向け、大脳皮質のTPUを記録した。TPUが閉塞前レベルの30%未満に低下したとき、完全閉塞が達成された。
【０１９５】
一回拍出量および出血スコアの評価
TTCによる一回拍出量の評価は、本質的に記述されているように行った(Li et al., Neurology 54, 689-696 (2000)を参照のこと)。簡潔には、動物を3%イソフルランで麻酔し、断頭術によって安楽死させた。次に脳を取り出し、マトリックス(Harvard Apparatus)中で厚さ2 mmの冠状切片に切断し、PBS中4%の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)によりRTで30分間染色した。健常組織は赤レンガ色に変色したが、梗塞組織はTTCに対して反応を示さなかった。Zeiss Lumar実体顕微鏡に取り付けられたAxio Cam Mrc5 (Zeiss)カラーカメラを用いて各脳の4つの中央切片の画像を記録し、捕捉した画像を画像解析システム(NIH Image J)で解析し下記式で半球病変体積%を算出した。
V%脳卒中＝ Σ(病変領域) / Σ(同側半球領域)＊100。
出血スコアを評価するために、次いでヘムスコアリングシステムを用いることにより4つの中央切片の画像を定量化した: 0＝出血なし、1＝1〜3個の点状出血、2＝4〜6個の点状出血、3＝6個超の点状出血、4＝広範囲の出血。各脳の8つの画像からのスコアを合計し、平均スコア/群を算出した。
【０１９６】
B. 結果
活性PDGF-CCタンパク質の脳室内注射はBBB開放を誘導するのに十分であり(Su et al., Nat Med 14(7), 731-737 (2008)を参照のこと)、その阻害は急性および進行性の両方の実験的神経病理モデルにおいてBBB機能不全を最小にすることが示されている(Su et al., Nat Med 14(7), 731-737 (2008)、Abrams et al., PLoS One 7(6), e38760 (2012)、Adzemovic et al., PLoS One 8(2), e56586 (2013)、Fredriksson et al., Ann Clin Transl Neurol 2(7), 722-738 (2015)、Lewandowski et al., Acta Neuropathol 131(3), 453-464 (2016)、Su et al., Front Cell Neurosci 9, 385 (2015)を参照のこと)ので、本発明者らは、実験的脳卒中の間の血小板由来増殖因子(PDGF)-CCシグナル伝達経路を妨害することを目的とした。PDGF-CCの遮断が中大脳動脈閉塞(MCAO)を改善しうるかどうかを分析するために、脳卒中の動物モデル、すなわちヒト化マウスモデルを作製した。ヒト化マウス系統は、マウスPDGF-CCアミノ酸配列の代わりにヒトPDGF-CCアミノ酸配列をコードするゲノムDNAを部分的に含み(図19)、抗ヒトPDGFCモノクローナル抗体(6B3)を用いてインビボでのPDGF-CCシグナル伝達の中和を可能にした。
【０１９７】
マウスPDFG-CCをヒトPDGF-CCで置き換えるためのターゲティング戦略は、NCBI転写産物NM_019971_2に基づいた(図20)。エクソン1は翻訳開始コドンを含んでいた。K242T、K246RおよびR299S変異をエクソン5に導入した。K318R、N342SおよびA343T変異をエクソン6に導入した。これらの変異はヒトアミノ酸配列に対応する。マウスゲノム断片(C57BL/6J RPCIB-731 BACライブラリから得た)および選択した特徴(図21のベクターマップに示されるように、組換え部位および選択マーカーのような)をターゲティングベクター中で組み立てた。必要ならば、さらなる断片をqPCRによって増幅し、サブクローニングした。確認された最終のターゲティングベクター配列を図21に示す。陽性選択マーカーをFRT (ネオマイシン耐性 - NeoR)およびF3 (ピューロマイシン耐性- PuroR)部位に隣接させ、それぞれイントロン4およびイントロン5に挿入した。ターゲティングベクターは、C57BL/6J RPCIB-731 BACライブラリ由来のBACクローンを用いて作製し、TaconicArtemis C57BL/6N Tac ES細胞株にトランスフェクションした。相同組換えクローンは、二重陽性(NeoRおよびPuroR)ならびに陰性(チミジンキナーゼ - Tk)選択を用いて単離した。構成的ヒト化対立遺伝子は、選択マーカーのインビトロFlp媒介除去後に得られた。この対立遺伝子は、変異Pdgfc K242T、K246R、R299S、K318R、N342S、A343Tタンパク質を発現した。残りの組換え部位はゲノムの非保存領域に位置していた(図22)。以下に示すのは、野生型マウスPDGF-Cタンパク質配列および変異型であり、ここで242Kから242T、246Kから246R、299Rから299S、318Kから318R、342Nから342S、および343Aから343Tへの変異に下線が引かれている。
オリジナルの野生型マウスPDGF-Cタンパク質配列(SEQ ID NO: 104)
2019527545.tif 000036
ヒト化PDGF-Cタンパク質配列(SEQ ID NO: 103)
2019527545.tif 000037
【０１９８】
MCAO前の6B3処置(予防的処置)
MCAOの誘発前に6B3でPDGF-CCを遮断すると、一回拍出量および出血スコアが有意に低減するかどうかを試験するために、PDGF-CChumに16週間HFDを与え、その後MCAOを誘発した。MCAO誘発の24時間前に、マウスを6B3 (n＝12)またはBM4 (n＝14)のいずれかで処置した。MCAOの72時間後にマウスを殺処理し、TTC法を用いて一回拍出量を測定した。6B3処置マウスは18.35 % +/- 2.2%の一回拍出量を有し、BM4処置マウスは29.21 +/-1.72% (平均 +/- SEM)であった。対応のないｔ検定を用いたｐ値は0.0006であった。橙色と赤色のドットは、これらのマウスをその一般的健康状態の悪化のため、それぞれMCAOの24時間後または48時間後に殺処理しなければならなかったことを示している(図23A)。6B3処置PDGF-CChumは5.17 +/- 0.73の出血スコアを有し、BM4処置マウスは7.93 +/-1.04 (平均 +/- SEM)であった。対応のないt検定を用いたp値は0.045であった。橙色と赤色のドットは、これらのマウスをその一般的健康状態の悪化のため、それぞれMCAOの24時間後または48時間後に殺処理しなければならなかったことを示している(図23B)。
【０１９９】
要約すれば、MCAOの誘発前にPDGF-CCを6B3で遮断すると、一回拍出量および出血スコアが有意に低減された。
【０２００】
MCAO後の6B3処置(治療的処置)
MCAO後に6B3でPDGF-CCを遮断(治療的処置)すると、一回拍出量および出血スコアが有意に低減するかどうかを試験するために、PDGF-CChumに16週間HFDを与え、MCAOを誘発した。MCAO誘発の1時間後に、マウスを6B3 (n＝13)またはBM4 (n＝13)のいずれかで処置した。MCAOの72時間後にマウスを殺処理し、TTC法を用いて一回拍出量を測定した。6B3処置マウスは16.05% +/- 1.55%の一回拍出量を有し、BM4処置マウスは27.32 +/-2.78% (平均 +/- SEM)であった。対応のないｔ検定を用いたｐ値は0.0017であった。赤紫色のドットは、これらのマウスをその一般的健康状態の悪化のため、MCAOの24時間後に殺処理しなければならなかったことを示している(図24A)。6B3処置マウスは12 +/- 0.83の出血スコアを有し、BM4処置マウスは9.69 +/-0.84 (平均 +/- SEM)であった。対応のないｔ検定を用いたｐ値は0.062であった。赤紫色のドットは、これらのマウスをその一般的健康状態の悪化のため、MCAOの24時間後に殺処理しなければならなかったことを示している(図24B)。
【０２０１】
要約すれば、MCAOの誘発後にPDGF-CCを6B3で遮断すると、一回拍出量が有意に低減されたが、出血スコアを有意には変化させなかった。
【０２０２】
実施例11. ヒト化抗PDGF-CC抗体6B3 (hu6B3)の作製
リガンド結合特性を維持しながら、6B3抗体可変ドメインの免疫原性を最小限に抑えるために、ヒト化プロセスを行った。第一世代構築体は、6B3のヒト可変軽鎖ドメインの2つの変種および6B3のヒト化可変重鎖ドメインの3つの変種を含んでいた。これらは、選択された生殖系列配列に最も近い利用可能な結晶構造を有する相同性モデリング分析に基づいて作製された。
【０２０３】
以下の基準に基づいて可変領域アミノ酸を評価した:
・CDRにはない
・埋没残基は変更されなかった
・ヒトのコンセンサスとヒトの生殖細胞系の両方が同じ残基を有する場合に変更がなされた
・VL/VH界面の外側
・Chothia, Tomlinson, Padlanによって同定された外側の保存残基
【０２０４】
発現系はLONZA Biologicsによって提供されるように、pEE 14.4およびpEE6.4重鎖および軽鎖発現ベクターを用いるLONZA GS発現系に基づいた。合成され、配列確認されたヒト化可変軽鎖および重鎖ドメインを、マウス可変ドメインを置換する、以前に調製されたpEE14.4ch6B3LCおよびpEE6.4ch6B3HCキメラIgG1κ構築体にクローニングした。二重遺伝子ベクターを構築し、続いてヒト化重鎖候補と組み合わせたキメラ軽鎖、ならびにキメラ重鎖と組み合わせたヒト化軽鎖候補の一過性トランスフェクションを行った。ハイブリッド構築体に加えて、完全にヒト化されたバージョンを組み合わせ、同様に分析した。6つの変種hu-ch6B3産物およびhu6B3LC + HC産物によるPDGF-CCへの結合をELISAおよびバイオセンサー分析によって評価し、親マウス6B3抗体と比較して低い結合活性が全ての産物において観察された。
【０２０５】
次に、以下の追加の基準に基づいて可変領域アミノ酸を評価した後に、第二世代ヒト化構築体を作製した:
・埋没残基はヒト生殖細胞系アミノ酸に変更された
・マウスから一般的なヒト生殖細胞系コンセンサス配列への保守的変更
・マウスアミノ酸に対する非保存的変更および復帰突然変異は、アミノ酸構造、側鎖相互作用および電荷に基づく抗原結合への寄与にしたがって考慮された。
【０２０６】
重鎖残基グリシンG30を、縮重プライマーによってハイブリドーマから増幅された一般的に存在する最初のmu6B3可変配列にしたがってアルギニン(R30)に改変した。hu6B3VLおよびhu6B3VHは、CHO細胞において安定した遺伝子発現を達成するためにコドン最適化配列を用いて全長ヒトIgG1κおよびIgG4κコンテキストへ操作された。6B3抗PDGF-C抗体のヒト化は、VL中の11個のアミノ酸の変異(図25)ならびにVH鎖中の18個のアミノ酸の変異(図26Aおよび26B)を含んだ。最終的なhu6B3抗体は、ELISAにより組換えPDGF-CCへの強い結合およびバイオセンサー分析により高い見かけの親和性を実証した。PDGF-CCに対する特異性および中和活性はインビトロで確認された(図27)。固定化PDGF-CCへの2.6 nM〜333 nMの濃度範囲にわたるhu6B3 R30およびR30G変種の見かけの結合特性をバイオセンサー分析によって分析した。両方の構築体がナノモルの見かけの結合親和性を示したが、hu6B3「R」バージョンはPDGF-CCに対して優れた結合特性を実証し(図28)、IgG1κヒト化抗体hu6B3の最終配列として選択された。
【０２０７】
前述の例および好ましい態様の記述は、特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものとしてではなく、例示するものとして解釈されるべきである。容易に理解されるように、特許請求の範囲において記載される本発明から逸脱することなく、上記の特徴の多数の変形および組み合わせを利用することができる。そのような変形は本発明の範囲からの逸脱と見なされるものではなく、そのような変形は全て以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。本明細書において引用された全ての参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。
【図１】
2019527545.tif 000039
【図２】
2019527545.tif 000040
【図３】
2019527545.tif 000041
【図４】
2019527545.tif 000042
【図５】
2019527545.tif 000043
【図６】
2019527545.tif 000044
【図７】
2019527545.tif 000045
【図８】
2019527545.tif 000046
【図９】
2019527545.tif 000047
【図１０】
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【図１１】
2019527545.tif 000049
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
2019527545.tif 000065
【図２７】
2019527545.tif 000066
【図２８】
2019527545.tif 000067
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月23日(2019.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本明細書において用いられる場合、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に添加される不活性な物質をいう。
[本発明1001]
血小板由来増殖因子C (PDGF-C)のエピトープと特異的に相互作用し、かつ該エピトープに対する測定可能な親和性を示す、単離された抗体またはその断片。
[本発明1002]
PDGF-Cの活性部分(SEQ ID NO: 2)を含むポリペプチドまたはそれと実質的に相同なポリペプチドと特異的に相互作用し、かつ該ポリペプチドに対する測定可能な親和性を示す、単離された抗体またはその断片。
[本発明1003]
前記ポリペプチドがSEQ ID NO: 3を含むか、またはそれと実質的に相同である、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1004]
それぞれ、6B3の軽鎖相補性決定領域(CDR) (SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; およびSEQ ID NO: 18)である、またはそれらと実質的に相同である、軽鎖CDR
を有する、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1005]
それぞれ、11F5の軽鎖CDR (SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; およびSEQ ID NO: 21)である、またはそれらと実質的に相同である、軽鎖CDR
を有する、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1006]
それぞれ、12F5の軽鎖CDR (SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; およびSEQ ID NO: 24)である、またはそれらと実質的に相同である、軽鎖CDR
を有する、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1007]
それぞれ、6B3の重鎖CDR (SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; およびSEQ ID NO: 36)である、またはそれらと実質的に相同である、重鎖CDR
を有する、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1008]
それぞれ、11F5の重鎖CDR (SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; およびSEQ ID NO: 39)である、またはそれらと実質的に相同である、重鎖CDR
を有する、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1009]
それぞれ、12F5の重鎖CDR (SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; およびSEQ ID NO: 42)である、またはそれらと実質的に相同である、重鎖CDR
を有する、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1010]
それぞれ、ch6B3の重鎖CDR (SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 47; およびSEQ ID NO: 48)である、またはそれらと実質的に相同である、重鎖CDR
を有する、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1011]
それぞれ、hu6B3の重鎖CDR (SEQ ID NO: 49〜51)である、またはそれらと実質的に相同である、重鎖CDR
を有する、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1012]
前記抗体の重鎖および軽鎖が、SEQ ID NO: 4および10、SEQ ID NO: 5および11、SEQ ID NO: 6および12、SEQ ID NO: 7および13、SEQ ID NO: 8および14、またはSEQ ID NO: 9および15の各配列を含む、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1013]
モノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはヒトモノクローナル抗体である、本発明1002の単離された抗体。
[本発明1014]
細胞を本発明1001〜1013のいずれかの抗体またはその抗原結合部分の有効量と接触させる段階を含む、細胞における血小板由来増殖因子C (PDGF-C)の活性を調節する方法。
[本発明1015]
前記細胞が、PDGF-Cを発現する腫瘍細胞、腫瘍上皮細胞、または腫瘍間質細胞である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記腫瘍細胞が、頭、首、目、口、のど、食道、気管支、喉頭、咽頭、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、膀胱、子宮、子宮頸部、乳房、卵巣、精巣または他の生殖器官、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、および脳または中枢神経系のがんからなる群より選択されるがん細胞型から形成される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記腫瘍細胞が、膀胱TCC、乳房IDC、乳房ILC、結腸直腸腺がん、多形性膠芽腫、神経膠肉腫、肝細胞がん、肺腺がん、肺SqCC、転移性黒色腫、中皮腫、卵巣腺がん、膵臓腺がん、前立腺腺がん、腎細胞がん、および子宮腺がんからなる群より選択されるがん細胞型から形成される、本発明1015の方法。
[本発明1018]
哺乳動物に本発明1001〜1013のいずれかの抗体またはその抗原結合部分の有効量を投与する段階を含む、哺乳動物における細胞のPDGF-C媒介性自己分泌および/または傍分泌シグナル伝達を調節する方法。
[本発明1019]
前記細胞が、PDGF-CまたはPDGF-CCを分泌する腫瘍細胞である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記腫瘍細胞が、頭、首、目、口、のど、食道、気管支、喉頭、咽頭、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、膀胱、子宮、子宮頸部、乳房、卵巣、精巣または他の生殖器官、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、および脳または中枢神経系のがんからなる群より選択されるがん細胞型から形成される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記腫瘍細胞が、膀胱TCC、乳房IDC、乳房ILC、結腸直腸腺がん、多形性膠芽腫、神経膠肉腫、肝細胞がん、肺腺がん、肺SqCC、転移性黒色腫、中皮腫、卵巣腺がん、膵臓腺がん、前立腺腺がん、腎細胞がん、および子宮腺がんからなる群より選択されるがん細胞型から形成される、本発明1019の方法。
[本発明1022]
哺乳動物に本発明1001〜1013の抗体またはその抗原結合部分の有効量を投与する段階を含む、哺乳動物における血管新生を阻害する方法。
[本発明1023]
哺乳動物に本発明1001〜1013の抗体またはその抗原結合部分の有効量を投与する段階を含む、哺乳動物における腫瘍増殖を低減させる方法。
[本発明1024]
(i) 本発明1001〜1013のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、および(ii) 薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
[本発明1025]
6B3、11F5、12F5、および19C7からなる群より選択される抗体を分泌するハイブリドーマ。
[本発明1026]
血小板由来増殖因子C (PDGF-C)以外の血小板由来増殖因子に対して最小の親和性を示しながらPDGF-Cペプチドのエピトープにインビトロで特異的に結合することができる抗体またはその断片; および
該抗体またはその断片に直接的または間接的に結合する試薬
を含む、血小板由来増殖因子C (PDGF-C)以外の血小板由来増殖因子に対して最小の親和性を示しながらPDGF-Cペプチドを検出するためのキット。
[本発明1027]
前記抗体が本発明1001〜1013の抗体である、本発明1026のキット。
[本発明1028]
前記抗体が、6B3、11F5、12F5、19C7、ch63B、およびhu6B3からなる群より選択されるモノクローナル抗体である、本発明1026のキット。
[本発明1029]
6B3、11F5、12F5、ch6B3、hu6B3からなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変重鎖断片をコードする単離された核酸分子であって、該可変重鎖断片が、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、それらの断片、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記単離された核酸分子。
[本発明1030]
6B3、11F5、12F5、ch6B3、およびhu6B3からなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変重鎖CDRをコードする単離された核酸分子。
[本発明1031]
6B3の重鎖CDRがSEQ ID NO: 34〜36のアミノ酸配列を含む、本発明1030の単離された核酸分子。
[本発明1032]
SEQ ID NO: 82〜84の核酸配列を含む、本発明1030の単離された核酸分子。
[本発明1033]
11F5の重鎖CDRがSEQ ID NO: 37〜39のアミノ酸配列を含む、本発明1030の単離された核酸分子。
[本発明1034]
SEQ ID NO: 85〜87の核酸配列を含む、本発明1030の単離された核酸分子。
[本発明1035]
12F5の重鎖CDRがSEQ ID NO: 40〜42のアミノ酸配列を含む、本発明1030の単離された核酸分子。
[本発明1036]
SEQ ID NO: 88〜90の核酸配列を含む、本発明1030の単離された核酸分子。
[本発明1037]
抗体の可変重鎖CDRをコードする単離された核酸分子であって、該重鎖CDRが、SEQ ID NO: 46〜48またはSEQ ID NO: 49〜51のアミノ酸配列を含む、前記単離された核酸分子。
[本発明1038]
SEQ ID NO: 94〜96またはSEQ ID NO: 97〜99の核酸配列を含む、本発明1037の単離された核酸分子。
[本発明1039]
組換え宿主細胞における抗体ch6B3の可変重鎖断片、抗体hu6B3の可変重鎖断片、または6B3、11F5、および12F5からなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変重鎖断片の発現のための発現ベクターであって、本発明1029〜1038のいずれかの核酸分子を含む該発現ベクター。
[本発明1040]
抗体ch6B3の可変重鎖断片または6B3、11F5、および12F5からなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変重鎖断片を発現する宿主細胞であって、本発明1039の発現ベクターを含有する該宿主細胞。
[本発明1041]
6B3、11F5、12F5、およびch63Bからなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変軽鎖断片をコードする単離された核酸分子であって、該可変軽鎖断片が、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記単離された核酸分子。
[本発明1042]
6B3、11F5、12F5、およびch63Bからなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変軽鎖CDRをコードする単離された核酸分子。
[本発明1043]
6B3の軽鎖CDRがSEQ ID NO: 16〜18のアミノ酸配列を含む、本発明1042の単離された核酸分子。
[本発明1044]
SEQ ID NO: 64〜66の核酸配列を含む、本発明1042の単離された核酸分子。
[本発明1045]
11F5の軽鎖CDRがSEQ ID NO: 19〜21のアミノ酸配列を含む、本発明1042の単離された核酸分子。
[本発明1046]
SEQ ID NO: 67〜69の核酸配列を含む、本発明1042の単離された核酸分子。
[本発明1047]
12F5の軽鎖CDRがSEQ ID NO: 22〜24のアミノ酸配列を含む、本発明1042の単離された核酸分子。
[本発明1048]
SEQ ID NO: 70〜72の核酸配列を含む、本発明1042の単離された核酸分子。
[本発明1049]
抗体の可変軽鎖CDRをコードする単離された核酸分子であって、SEQ ID NO: 76〜78または79〜81の核酸配列を含む該単離された核酸分子。
[本発明1050]
組換え宿主細胞における抗体ch6B3の可変軽鎖断片、抗体hu6B3の可変軽鎖断片、または6B3、11F5、および12F5からなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変軽鎖断片の発現のための発現ベクターであって、本発明1042〜1049のいずれかの核酸分子を含有する該発現ベクター。
[本発明1051]
抗体ch6B3の可変軽鎖断片、抗体hu6B3の可変軽鎖断片、または6B3、11F5、および12F5からなる群より選択されるモノクローナル抗体の可変軽鎖断片を発現する宿主細胞であって、本発明1050の発現ベクターを含有する該宿主細胞。
[本発明1052]
動物に本発明1001〜1013のいずれかの抗体またはその抗原結合部分の有効量を投与する段階を含む、その必要がある高等脊椎動物における血液脳関門の透過性を調節するための方法。
[本発明1053]
その必要がある対象に本発明1001〜1013のいずれかの抗体またはその抗原結合部分の有効量を投与する段階を含む、脳血管の疾患または状態を処置するための方法。
[本発明1054]
前記疾患または状態が、浮腫腹水症(edema ascites)、水胸症、心膜水腫、脳浮腫(cerebral/brain edema)、水頭症、緑内障、急性肺水腫、網膜症、黄斑症、脳卒中、虚血性網膜症、アルツハイマー病、多発性硬化症、外傷、炎症、およびCNSの腫瘍からなる群より選択されるものである、本発明1053の方法。
[本発明1055]
網膜症が糖尿病性網膜症である、本発明1054の方法。
[本発明1056]
黄斑症が滲出型加齢黄斑変性症(AMD)である、本発明1054の方法。
[本発明1057]
異種血小板由来増殖因子C (PDGF-C)タンパク質をコードする異種PDGF-C遺伝子がゲノムに含まれている、非ヒトトランスジェニック動物。
[本発明1058]
異種PDGF-Cタンパク質がヒトPDGF-Cタンパク質(SEQ ID NO: 1)と少なくとも75%同一である、本発明1057のトランスジェニック動物。
[本発明1059]
マウス、ラット、またはウサギである、本発明1057のトランスジェニック動物。
[本発明1060]
マウスである、本発明1059のトランスジェニック動物。
[本発明1061]
異種PDGF-Cタンパク質がヒト化マウスPDGF-Cタンパク質である、本発明1060のトランスジェニック動物。
[本発明1062]
ヒト化マウスPDGF-Cタンパク質が、マウスPDGF-Cタンパク質に対するK242T、K246R、R299S、K318R、N342S、およびA343T変異のうちの1つまたは複数を含む、本発明1061のトランスジェニック動物。
[本発明1063]
ヒト化マウスPDGF-Cタンパク質がSEQ ID NO: 103の配列を含む、本発明1062のトランスジェニック動物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
（図１）組換えヒトPDGF-DDタンパク質(上パネル)、PDGF-CCタンパク質(中パネル)、およびヒスチジンポリペプチド(下パネル)に対するPDGF-CCモノクローナル抗体結合活性のハイブリドーマ上清を例示する。
（図２）6B3、11F5、12F5、および19C7と同定された4種のmAbの結合特異性を例示する。図2A: 抗体がヒトPDGF-CCとのみ反応することを例示する。図2B: 6B3ではなく12F5がマウスPDGF-Cコアタンパク質を認識し、両抗体ともRhPCcを認識することを例示する。
（図３）CDRに下線を引いた、抗体6B3、11F5、12F5、および19C7の完全可変軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO: 4〜7)のアライメントを提供する。
（図４）CDRに下線を引いた、6B3、11F5、12F5、および19C7の完全可変重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO: 10〜13)のアライメントを提供する。
（図５）マウス抗体(mu6B3)と比較しての、ch6B3の完全可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列のアライメントを提供する。
（図６）さまざまな濃度(44.6〜267.6 μM)の
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の存在下での、固定化された組換えPDGF-CCコアタンパク質への6B3抗体(333nM)の結合について観察された最大Biacore応答のバイオセンサー分析を例示する。PDGF-CCへの6B3結合の減少はペプチド3のみの存在下でのみ観察され、特異的阻害を示唆していた。
（図７）固定化PDGFCペプチド
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への抗体6B3 (濃度範囲20.8 nM〜667 nM)の結合(図7A)ならびに固定化PDGF-Cペプチドエピトープ
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および1アミノ酸だけPDGF-Cペプチドと異なった対応するPDGF-Dペプチド
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への抗体6B3 (1.334 μM)の結合(図7B)についてのバイオセンサー分析からのセンサーグラムを例示する。チオール固定化を用いてセンサーチップ上の規定の配向のためにペプチドをC末端システインで合成した。
（図８）強調表示された6B3エピトープ配列および表示されたPDGF-Dに対する相同性を有するPDGF-Cアミノ酸配列の231〜345位の残基(SEQ ID NO: 2)を例示する。
（図９）PDGF-DDではなくPDGF-CCへの、抗体6B3、11F5、12F5、および19C7の結合の特異性についてのバイオセンサー分析の図解を提供する。
（図１０）1:1ラングミュア(Langmuir)結合モデルに適合させた、マウス6B3 (10A)およびキメラ6B3 (10B)についての代表的な結合曲線を例示する。
（図１１）PDGF-CC活性の阻害を例示する。図11A: SDS-PAGEゲルおよび免疫ブロッティング分析を提供し、PAE-PDGFRαリン酸化の阻害を示している。図11B: SDS-PAGEゲルおよび免疫ブロッティング分析を提供し、PDGF-CC誘導性PAE-PDGFRαリン酸化の阻害を示している。PB: PDGFRαのPDGF-BB活性化に対する陽性対照; 対照: 全長PDGF-Cの陰性対照。RhPC: 組換えヒトPDGF-CCコアドメイン。
（図１２）図12AおよびBは、6B3がPDGF-CC誘導性PAEα細胞増殖を投与量依存的に阻害することを実証する。
（図１３）200倍に拡大した、正常ヒト組織における免疫組織化学的6B3染色パターンを例示する。
（図１４）200倍に拡大した、ヒト腫瘍組織における免疫組織化学的6B3染色パターンを例示する。
（図１５）抗PDGF-C 12F5または6B3 300 μgにより週3回3週間(15A)ならびに300 μgおよび1 mg用量の6B3療法により週3回さらに長い4週の期間(15B)処置したマウスにおける結腸がん腫異種移植片の結果を例示する。
（図１６）Colo205異種移植片切片のポドカリキシン(Podocalyxin)染色による血管の免疫組織化学分析を例示しており、ここでパネルAは血管数の変化を実証し、パネルBは単位面積当たりの血管数の変化を実証し、パネルCは血管外周の変化を実証し、パネルDは細胞増殖の変化を実証する。
（図１７）図17A〜Bは、抗PDGF-CC処置が血管新生の減少を介して同所性腫瘍増殖を減少させたことを例示する。
（図１８）図18Aおよび18Bは、抗PDGF-C抗体によるPDGF-CC媒介性血液脳関門開放の調節を実証する結果を示す。図18A: PDGF-CCの髄腔内注射および抗PDGF-C抗体6B3または対照抗体BM4の腹腔内注射後のマウス脳におけるエバンスブルーの溢出(extravasion)を例示する写真のセットである。図18B: 同じ結果を示す図表である。
（図１９）マウスおよびヒトPDGF-CCの増殖因子ドメインのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 109および110)の比較を提供する。赤い矢印は、部分的にヒト化されたPDGF-CCマウス系統を作製するために変更されたアミノ酸を示す。
（図２０）部分的にヒト化されたマウスPDGF-Cタンパク質のアミノ酸配列(1〜345位の残基, SEQ ID NO: 103)を例示する。増殖因子ドメイン(229〜345位のアミノ酸残基)中の6つのアミノ酸置換には下線が引かれている。アミノ酸置換は、242Kから242T、246Kから246R、299Rから299S、318Kから318R、342Nから342S、および343Aから343Tである。
（図２１）脳卒中のヒト化マウスモデルの作製のためのターゲティングベクターを例示する。
（図２２）PDGF-CCマウスゲノム遺伝子座、脳卒中のヒト化マウスモデルの作製のためのターゲティングベクター、相同組換え後の標的PDGF-CC対立遺伝子、およびFlp組換え後のヒト化PGCF-CC対立遺伝子を例示する。
（図２３）1回拍出量(図23A)および出血スコア(図23B)に及ぼすMCAO前の6B3処置(予防的処置)の効果を例示する。
（図２４）1回拍出量(図24A)および出血スコア(図24B)に及ぼすMCAO後の6B3処置(治療的処置)の効果を例示する。
（図２５）CDRに下線を引いた、マウス抗体(mu6B3)と比較しての、hu6B3の完全可変軽鎖タンパク質配列のアライメントを提供する。
（図２６Ａ）CDRに下線を引いた、マウス抗体(mu6B3, SEQ ID NO: 10)と比較しての、hu6B3HCRの完全可変重鎖タンパク質配列(SEQ ID NO: 15)のアライメントを提供する。hu6B3「R」バージョンは、PDGF-CCに対して優れた結合特性を実証し、ヒト化抗体の最終配列として選択された。
（図２６Ｂ）CDRに下線を引いた、マウス抗体(mu6B3, SEQ ID NO: 10)と比較しての、hu6B3HCGの完全可変重鎖タンパク質配列(SEQ ID NO: 111)のアライメントを提供する。
（図２７）ELISA分析(図27A)およびウエスタンブロッティング(図27B)により、マウス6B3抗PDGF-CC抗体の特異性および機能が、キメラ化およびヒト化の後で保持されていることを例示する。図27A: PDGF-CCに対する親マウス抗PDGF-CCモノクローナル抗体6B3の特異性は、キメラ6B3 (ch6B3)ならびにヒト化抗体hu6B3 Gおよびhu6B3 R形態により保持される。対照抗PDGF-DD抗体12C2のみが、密接に関連したPDGFファミリーメンバーPDGF-DDに結合する。図27B: 細胞と精製抗体(5 μg/ml)との事前のインキュベーション有りまたは無しで50 ng/mlのPDGF-CCコアタンパク質でPAE細胞を刺激した。活性化受容体を抗ホスホチロシン抗体PY99で検出した。結果は、ヒト化6B3 GおよびR変種が親マウスmAb 6B3と同程度に効果的にPDGF-Cを中和することを実証している。対照12C2ではなく、抗PDGF-CCモノクローナル抗体12F5も中和を行っていた。
（図２８）固定化されたPDGF-CCと漸増濃度のhu6B3抗体変種A)重鎖G30RおよびB)重鎖R30との間の相互作用についてのバイオセンサー分析からのセンサーグラムを例示する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
抗体6B3が結合した特異的PDGFCペプチド配列の判定:
PDGFCコアドメイン内の
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の推定上のエピトープ領域を包含する3つの重複する10アミノ酸ペプチドを合成して、6B3エピトープをさらに精緻化した。これらのペプチドは
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であった。ペプチドは、チオール固定化を用いたセンサーチップ上での規定の配向のためにC末端システインで合成された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
固定化ペプチド上にHBS緩衝液中で6B3抗体のサンプル(1.334 μM)を注入した(10 μL/分で30 μL)。結果は図7Aに示されており、6B3が
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ペプチドに結合すること、および図7Bに示されるように重複ペプチド
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に対して、または代替ペプチド
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に対して結合は観察されなかったので、SVSIR（SEQ ID NO: 112）配列が6B3結合に不可欠であることを示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
PDGF-C配列SVSIR（SEQ ID NO: 112）は、対応するPDGF-D配列とはアミノ酸1個(セリン)だけ異なる(図8)。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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