(57)【要約】  本発明は、生成物を選択および回収する方法に関し、該方法は、  ‐キャリア流体（１０）に含まれる複数の液滴（４）を含むエマルジョン（６）を提供するステップであって、各液滴が内部流体（８）を含む、提供するステップと、  ‐前記エマルジョン（６）のいくつかの液滴（４）について少なくとも１つの物理的パラメータを測定するステップと、  ‐前記測定するステップの間に得られた測定値に基づいて、前記エマルジョンの前記液滴（４）の少なくともいくつかをある分類に分類するステップと、  ‐前記液滴（４）の前記分類に基づいて分類された液滴（４）の少なくともいくつかをタグ付けするステップと、  ‐前記液滴または前記液滴（４）の一部のタグを使用して前記液滴（４）または前記（４）の一部を選択的に回収するステップとを含む。
2019519200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生成物を選択および回収する方法であって、
キャリア流体（１０）に含まれる複数の液滴（４）を含むエマルジョン（６）を提供するステップであって、各液滴が内部流体（８）を含む、提供するステップと、
前記エマルジョン（６）のいくつかの液滴（４）について少なくとも１つの物理的パラメータを測定するステップと、
前記測定するステップの間に得られた測定値に基づいて、前記エマルジョンの前記液滴（４）の少なくともいくつかをある分類に分類するステップと、
前記液滴（４）の前記分類に基づいて分類された液滴（４）の少なくともいくつかをタグ付けするステップと、
前記液滴または前記液滴（４）の一部のタグを使用して前記液滴（４）または前記液滴（４）の一部を選択的に回収するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記分類するステップの間に複数の液滴（４）を同時に分類し、前記回収するステップが、分類された液滴（４）の各々にタグ付けするステップの後に前記液滴（４）を選別するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記測定するステップが、好ましくは各液滴（４）内の速度論的反応の監視のために、同一の液滴上で異なる連続モーメントで繰り返される少なくとも１つのパラメータを測定するステップ、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
複数の液滴の各液滴について、前記測定するステップが、同一の液滴上でいくつかの異なるパラメータを測定するステップを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
各液滴（４）の前記内部流体（８）がシグナル試薬（１６）を含み、前記タグ付けするステップが、前記液滴（４）の前記分類に応じて、前記シグナル試薬（１６）を光学活性化するステップを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記分類するステップの間に複数の液滴（４）を複数の分類に分類し、前記タグ付けするステップが、ある分類からの液滴（４）の各々を予め設定された照射条件で照射するステップからなり、前記シグナル試薬（１６）が、活性化後に光シグナル、有利には蛍光を放出することができ、前記回収するステップの間に、放出された光シグナルのレベルに基づいて前記液滴（４）を選別し、前記シグナル試薬（１６）によって放出される前記光シグナルのレベルが前記活性化の間の照射条件に依存する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
各液滴（４）の前記内部流体（８）がシグナル試薬（１６）を含み、前記タグ付けするステップが、前記液滴の前記分類に応じて、前記シグナル試薬（１６）を熱活性化するステップを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記エマルジョン（６）を二次元チャンバ（２２）内に提供し、前記測定するステップおよび前記タグ付けするステップの間に、前記エマルジョン（６）が単一層の液滴（４）の形態で前記二次元チャンバ（２２）内に維持される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
分類された液滴（４）が細胞を含み、前記タグ付けするステップが前記細胞をマークするステップを含み、前記選択的に回収するステップがエマルジョンブレイクに続いてサイトメトリによって選別するステップを含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
生成物を選択および回収するシステム（１）であって、
キャリア流体（１０）に含まれる複数の液滴（４）を含むエマルジョン（６）を受け入れることができる支持体（２０）であって、各液滴が内部流体（８）を含む、支持体と、
前記支持体（２０）に受け入れられた前記エマルジョン（６）のいくつかの液滴（４）の少なくとも１つの物理的パラメータを測定する装置（２４）と、
測定ステップの間に得られた測定値に基づいて、前記エマルジョン（６）の少なくとも１つの液滴（４）の分類を決定することができる分類ユニット（２６）と、
前記液滴（４）の分類決定に基づいて前記液滴（４）または前記液滴（４）の一部をタグ付けすることができるタグ付け装置（２８）と、
前記タグ付けに基づく前記液滴（４）または前記液滴（４）の一部の回収装置（３０）と、を備えるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生成物の選択および回収のための方法に関する。この方法は、例えば、エマルジョンのある液滴に含まれる特定の生成物を回収することを意図する。例えば、生成物は、液滴中で起こった化学反応または生物学的反応から生じ得る。
【背景技術】
【０００２】
フローサイトメトリシステムを使用して、細胞を選別する前に、液体または気体の流れによって駆動された分離された粒子、特に細胞を特徴付けることが知られている。しかしながら、このようなシステムでは、粒子の流れを選別する必要があり、回収前に簡単な測定を行うことが可能になるだけである。これらのシステムは、特に、膜または細胞内マーカーを有する細胞を選別するために使用される。しかし、これらのシステムは、分泌する分子に基づいて細胞を選別することができない。さらに、これらのシステムは、いくつかの測定を連続的に行うことができない。従って、これらのシステムは、速度論的反応を監視することによって生成物を特徴付けるのに適していない。従って、複雑な表現型に基づいて細胞を選択する場合のように、複数のパラメータに基づいて粒子または液滴を選択するためにこのようなシステムを使用することは不可能である。
【０００３】
文献ＷＯ２０１０／００７３０７Ａ２には、チャンバ内のエマルジョンを読み取る方法が記載されており、液滴の内容に関する豊富な情報を得ることが可能である。測定の後、特定の特性を有する特定の液滴は、特定の液滴を吸引するマイクロピペットを使用して取り出すことによって個々に回収することができる。
【０００４】
しかしながら、エマルジョンの異なる点に散在する特定の液滴の回収は面倒であり、自動化するのが困難である。さらに、マイクロピペットを使用してエマルジョンの液滴を吸引することは、エマルジョンを含むチャンバの上部壁を除去することを必要とする。このステップは、液滴の蒸発および汚染のリスクを生じ、回収される生成物の劣化をもたらし得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１０／００７３０７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の１つの目的は、既存の方法よりも信頼性が高く高速である、対象の液滴の内容の正確な特徴付けおよび効率的な回収を可能にする、生成物を選択および回収する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、生成物を選択および回収する方法に関し、該方法は、
‐キャリア流体に含まれる複数の液滴を含むエマルジョンを提供するステップであって、各液滴が内部流体を含む、提供するステップと、
‐前記エマルジョンのいくつかの液滴について少なくとも１つの物理的パラメータを測定するステップと、
‐前記測定するステップの間に得られた測定値に基づいて、前記エマルジョンの前記液滴の少なくともいくつかをある分類に分類するステップと、
‐前記液滴の前記分類に基づいて分類された液滴の少なくともいくつかをタグ付けするステップと、
‐前記液滴または前記液滴の一部のタグを使用して前記液滴または前記の一部を選択的に回収するステップと、を含む。
【０００８】
本発明による方法は、以下の特徴の１つまたは複数を単独でまたは技術的に可能な任意の組み合わせに従って含み得る。
‐複数の液滴は、分類するステップの間に同時に分類され、回収するステップは、分類された液滴の各々をタグ付けした後に液滴を選別するステップを含む。
‐測定するステップは、同一の液滴上で異なる連続モーメントで繰り返される少なくとも１つのパラメータを測定するステップ、好ましくは各滴内の速度論的反応を監視するステップを含む。
‐複数の液滴の各液滴について、測定するステップは、同一の液滴上でいくつかの異なるパラメータを測定するステップを含む。
‐各液滴の内部流体はシグナル試薬を含み、タグ付けするステップは、液滴の分類に応じてシグナル試薬を光学活性化するステップを含む。
‐分類するステップの間に複数の液滴が複数の分類に分類され、タグ付けするステップは、ある分類からの液滴の各々を予め設定された照射条件で照射するステップからなり、シグナル試薬は、回収するステップの間に、放出された光シグナルのレベルに基づいて液滴が選別され、シグナル試薬によって放出される光シグナルのレベルは、活性化の間の照射条件に依存する。
‐各液滴の内部流体はシグナル試薬を含み、タグ付けするステップは、液滴の分類に応じてシグナル試薬を熱活性化するステップを含む。
‐エマルジョンは二次元チャンバ内に提供され、測定するステップおよびタグ付けするステップの間に、エマルジョンは単一層の形態で二次元チャンバ内に維持される。
‐分類された液滴は細胞を含み、タグ付けするステップは細胞にマーキングするステップを含み、選択的に回収するステップは、エマルジョンブレイクを含み、続いてサイトメトリによる選別を含む。
‐エマルジョンの各液滴は、液滴に特有の要素と反応することができる試験試薬を含む。
【０００９】
本発明はまた、生成物を選択および回収するシステムに関し、該システムは、
‐キャリア流体に含まれる複数の液滴を含むエマルジョンを受け入れることができる支持体であって、各液滴が内部流体を含む、支持体と、
‐前記支持体に受け入れられた前記エマルジョンのいくつかの液滴の少なくとも１つの物理的パラメータを測定する装置と、
‐測定ステップの間に得られた測定値に基づいて、前記エマルジョンの少なくとも１つの液滴の分類を決定することができる分類ユニットと、
前記液滴の分類決定に基づいて前記液滴または前記液滴の一部をタグ付けすることができるタグ付け装置と、
前記タグ付けに基づく前記液滴または前記液滴の一部の回収装置と、を備える。
【００１０】
本発明は、単に例として提供され、添付の図面を参照した以下の説明を読むことにより、より深く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】生成物を選択および回収するためのシステムの概略図である。
【図２】液滴回収システムに注入する前のエマルジョンの概略図である。
【図３】生成物の選択および回収のためのシステムの第１の例示的な応用を示す。
【図４】生成物の選択および回収のためのシステムの第１の例示的な応用を示す。
【図５】生成物の選択および回収のためのシステムの第２の例示的な応用を示す。
【図６】生成物の選択および回収のためのシステムの第３の例示的な応用を示す。
【図７】生成物の選択および回収のためのシステムの第４の例示的な応用を示す。
【図８】生成物の選択および回収のためのシステムの第５の例示的な応用を示す。
【図９】生成物の選択および回収のためのシステムの第５の例示的な応用を示す。
【図１０】生成物の選択および回収のためのシステムの第６の例示的な応用を示す。
【図１１】生成物の選択および回収のためのシステムの第６の例示的な応用を示す。
【図１２】生成物の選択および回収のためのシステムの第７の例示的な応用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下の説明において、用語「上流」および「下流」、ならびに用語「入口」および「出口」は、システムの流体の通常の循環方向に関して使用される。用語「長手方向」は、チップ内の循環導管の方向に対して定義される。「横断面」は、長手方向に垂直な平面を指す。要素の「直径」とは、横断面内の考慮される要素の最大の横方向の広がりを指す。
【００１３】
他の記載において、用語「細胞」は、真核細胞または原核細胞を意味する。細胞は、例えば、細菌、酵母、藻類、真菌、哺乳動物細胞などである。
【００１４】
図１には、生成物を選択および回収するためのシステム１が示されている。図２を参照すると、液滴を回収するためのシステム１は、エマルジョン６の液滴４を分析し、ある液滴４に含まれる生成物を選択的に回収する。
【００１５】
液滴４のエマルジョン６が図２に示されている。エマルジョン６は、キャリア流体１０中に分散された内部流体８の複数の液滴４から構成されている。各液滴４は、内部流体８で満たされた閉区画を構成し、そこで例えば化学的または生物学的反応が生じ、生成物の形成または改変を明らかにする結果となり得る。
【００１６】
エマルジョン６は実質的に安定であり、このことは、エマルジョン６の固定体積について、エマルジョン６の固定体積が−８０℃から８０℃、１ｂａｒで４８時間の間維持されたときに、液滴４の数および体積が５％未満変化することを意味する。エマルジョン６は濃縮される。これは、エマルジョン６中の液滴４の体積分率が５％から９９．９％の間、有利には５０％から８０％の間、特に７４％に等しいことを意味する。エマルジョン６の液滴４は、好ましくは実質的に単分散であり、多分散性が５％未満であることを意味する。液滴４は、例えば、１ｐＬから２μＬの間に含まれる体積を有する。有利には、液滴４の体積は、特に細胞分析用途では、２０ｐＬから５０ｐＬの間に含まれる。
【００１７】
従って、液滴の直径は、一般に３２マイクロメートルから４６マイクロメートルの間に含まれる。
【００１８】
エマルジョン６の少なくともいくつかの液滴４は、エマルジョン６の他の液滴４とは異なる。従って、各液滴４は、互いに異なり得る内部流体８を含む。有利には、全ての液滴４の内部流体８は、少なくとも１つの同一の共通ベース１２を含む。
【００１９】
各液滴４の内部流体８は、液滴４に特有の要素１４および共通ベース１２で構成されている。特定要素１４と共通ベース１２との比率および／または特定要素１４の性質は、液滴毎に変化する。
【００２０】
例えば、共通ベース１２は、リン酸緩衝食塩水または培養培地などの細胞の生存に適した緩衝液を含む。有利には、液滴４の体積の１０％超が共通ベース１２から構成される。
【００２１】
有利には、各液滴４の共通ベース１２は、シグナル試薬１６を含む。シグナル試薬１６は、各液滴４内に同一の割合で存在する。シグナル試薬１６は、後述するように、タグ付け装置２８によって活性化することができる。
【００２２】
例えば、シグナル試薬１６は、活性化された後にのみ蛍光シグナルを放射することができる。有利には、シグナル試薬１６によって放射される蛍光シグナルの強度は、活性化の条件に依存する。
【００２３】
例えば、シグナル試薬１６は、「フルオレセインビス−（５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル）エーテル、ジカリウム塩（ＣＭＮＢ−ケージドフルオレセイン）」の名称でＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社によって販売されているＣＭＮＢ−ケージドフルオレセイン（５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル）を含む。この化合物は無色であり、光分解前には非蛍光性である。ケージを形成する基は、フルオレセインの放出を可能にするように、３５５ｎｍでの紫外線（ＵＶ）フラッシュ下で溶解することができる。フルオレセインは、タグ付けに用いることができる高度に蛍光性の分子である。
【００２４】
液滴４の特定要素１４は、例えば、互いに反応することができる化学的もしくは生物学的試薬、または反応の生成物である。例えば、液滴４の特定要素１４は、細胞、および細胞によって分泌される要素、例えばタンパク質である。
【００２５】
例えば、ある液滴４の特定要素１４は、既知の励起および放射長を有する蛍光生成物であるが、その割合は未知である。
【００２６】
図３および図４に示す第１の例では、同一の蛍光性の特定要素１４、スルホローダミンの濃度は、以下で説明するように、液滴４毎に変化する。
【００２７】
各液滴４の内部流体８は、キャリア流体１０と混和しない。混和しないとは、２つの流体間の分配係数が１０−３未満であることを意味する。液滴４はエマルジョン６内で明確に画定され、エマルジョン６中の２つの隣接する液滴４間の交換は、キャリア流体１０に可溶性またはわずかに可溶性である、すなわち、分配係数が１０−３以上である化合物であり、隣接する液滴４間で組成が異なる場合に限定される。例えば、内部流体８は水相であり、キャリア流体１０は有機相、特に油相である。キャリア流体１０は、例えば、フッ化油を形成するＦＣ−４０またはＨＦＥ−７５００などのヒドロフルオロエーテルを含む。
【００２８】
さらに有利には、キャリア流体１０は界面活性剤を含む。界面活性剤は、エマルジョン６を安定化させることができる。界面活性剤は、例えば、ポリエチレングリコールとペルフルオロポリエーテルのブロックコポリマー（ＰＥＧ−ＰＦＰＥ）、Ｒａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓによって得られたＫｒｙｔｏｘ−Ｄｉ−ＰＥＧまたはＢｉｏＲａｄによって得られた界面活性剤を有するＱＸ２００液滴生成油である。例えば、キャリア流体１０中の界面活性剤濃度は、２％から５％の間である。
【００２９】
図１に示すように、システム１は、エマルジョン６を受け入れるためのチャンバ２２を画定する支持体２０を備える。システム１は、支持体２０に受け入れられたエマルジョン６のいくつかの液滴４の少なくとも１つの物理的パラメータを測定するための装置２４と、分類ユニット２６と、タグ付け装置２８と、回収装置３０とをさらに備える。
【００３０】
エマルジョン６は、例えば、調製装置によって調製される。エマルジョンは、エマルジョンを注入するための注入モジュール３２によってシステム１のチャンバ内に配置される前に貯蔵される。例えば、注入モジュール３２は、シリンジポンプ、圧電装置または圧力式フローコントローラを含む。
【００３１】
例えば、支持体２０はチップである。チップ２０は、この例では、長手方向軸Ｘおよび長手方向軸Ｘに垂直な横方向の軸Ｙに沿って延びる矩形のブロックである。さらに、チップは、長手方向軸Ｘおよび横軸Ｙに垂直な高さ軸Ｚに沿った厚さを有する。チップ２０は、入口導管３４と、チャンバ２２と、出口導管３６とを備える。入口導管３４は、エマルジョンを注入するための注入モジュール３２と流体連通するように上流に配置することができる。出口導管３６は、図１に示すように、回収装置３０と流体連通して下流に配置することができる。
【００３２】
チャンバ２２は、測定およびタグ付けステップの間に、キャリア流体１０中の複数の液滴４を保管するためのものである。チャンバ２２は、有利には、エマルジョン６を装填するステップの後に液滴４をチャンバ内に分配するために、研究されるエマルジョン６の寸法に適合した寸法を有する。液滴４は、有利には、長手方向軸Ｘおよび横軸Ｙを含むチップの平面に沿った２次元層内に分配される。液滴４は、別の液滴４に重ならない。
【００３３】
例えば、液滴４は、チャンバ２２内で球形であり、軸Ｚに沿ったチャンバ２２の高さは、液滴４の直径に実質的に等しい。あるいは、チャンバ２２の高さは、エマルジョン６の液滴４の直径より小さく、液滴４は、チャンバ２２内で軸Ｚに沿って平坦化されたパックの形状になっている。
【００３４】
チャンバ２２は、測定領域３８を有する。測定領域３８は、同時に１０００滴から１０００００００滴の間のエマルジョン、特に１０５滴を包含することができる。さらに、測定領域３８の寸法は、測定装置２４およびタグ付け装置２８によって完全に掃引することができるように適している。
【００３５】
チップ２０は、少なくとも測定領域３８において透明であり、測定装置２４による測定領域３８に存在する液滴４の物理的パラメータの測定を可能にする。
【００３６】
有利には、チップ２０は、透明材料、例えばガラス、またはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）などの透明プラスチックから作製される。チップ２０の材料は、有利にはキャリア流体１０に対して不透過性である。
【００３７】
連続的または同時に、測定装置２４は、支持体２０に受け入れられたエマルジョン６のいくつかの液滴４の少なくとも１つの物理的パラメータを測定することができる。有利には、測定領域３８に存在する全ての液滴４に対してパラメータを測定することができる。
【００３８】
測定装置２４は、特に、液滴４の光学測定を可能にする。
【００３９】
例えば、測定装置２４は、測定領域３８の液滴４から来る光を検出することができるセンサ４０と、光源４２とを備える。
【００４０】
例えば、センサ４０は、測定領域３８の画像を形成することができるＣＣＤカメラである。得られた画像解像度は、例えば、形態学的基準を用いて液滴４に存在する細胞種を識別することを可能にする。
【００４１】
光源は、例えば、隣接する液滴４を照射することなく１つの液滴４を選択的に照射することができる。
【００４２】
代替的または追加的に、光源４２は、測定ゾーン３８全体を照射することができる。
【００４３】
例えば、光源４２は、測定領域３８の液滴４を照射するように構成された白色光源である。代替的にまたは追加的に、光源４２は、測定領域３８にわたって放射線を放出するように構成された励起レーザまたは蛍光ランプを含む。
【００４４】
有利には、測定装置２４のセンサ４０および光源４２は、各液滴のスケールでいくつかの蛍光チャネルでの測定を可能にする。例えば、測定装置２４に、ＧＦＰフィルタアセンブリ（励起４６５〜４９５ｎｍ、二色性５０５ｎｍ、発光５１５〜５５５ｎｍ）、ＴＲＩＴＣフィルタ（励起５３０〜５６０ｎｍ、二色性５７０ｎｍ、発光５９０〜６５０ｎｍ）およびＣｙ５フィルタ（励起６００〜６５０ｎｍ、二色性６６５ｎｍ、発光６７０〜７２５ｎｍ）の組み合わせが使用された。各蛍光チャネルは、異なる特性を測定するために使用することができる。
【００４５】
測定装置２４は、例えば、国際公開第２０１０／００７３０７号に記載されているような２次元走査装置である。
【００４６】
さらに、測定装置２４は、得られた測定値を分類ユニット２６に伝達することができる。
【００４７】
分類ユニット２６は、測定装置２４から信号を受信して処理し、液滴４の特性を記録することができる。例えば、分類ユニット２６は、メモリおよびマイクロプロセッサを含む。分類ユニット２６は、測定ステップの間に得られた測定値に基づいてエマルジョン６の少なくとも１つの液滴４の分類を決定することができる。
【００４８】
分類基準は、例えば、メモリに記録される。代替的または追加的に、メモリは、例えば、いくつかの液滴４内の速度論的反応の監視のために、測定装置２４によって異なる時点で行われる連続的な測定を記録することができる。マイクロプロセッサは、測定値から計算を実行し、計算結果を分類基準のパラメータと比較することができる。
【００４９】
有利には、分類ユニット２６は、ユーザが測定ステップ中に得られた結果を回収し、測定ステップ中に得られた結果またはこれらの希望に基づいて分類基準を調整することができるようにマン・マシンインターフェースを含む。
【００５０】
タグ付け装置２８は、液滴４の分類決定に基づいて液滴４または液滴４の一部をタグ付けすることができる。
【００５１】
例えば、タグ付け装置２８は、シグナル試薬１６を活性化するために予め設定されたパラメータで液滴４を照射することができるレーザを含む。
【００５２】
一例では、タグ付け装置２８および測定装置２４に２つの別個の光源が使用される。
【００５３】
１つの代替例では、測定装置２４およびタグ付け装置２８の両方に同一の光源４２が使用される。例えば、測定ステップの間、有意な読み取り流量を有するために、光源４２は測定領域３８全体を照射する。しかしながら、タグ付けステップの間、光源４２は、２つの隣接する液滴４をタグ付けしないように、液滴４を選択的に照射する。
【００５４】
代替的に、タグ付け装置２８は、シグナル試薬１６を活性化するように予め設定されたパラメータで液滴４を特に加熱することができる供給源を含む。
【００５５】
代替的に、タグ付け装置２８は、加熱によってシグナル試薬１６を活性化するため、または細胞もしくはリソソームの選択的溶解を行うために、予め設定されたパラメータで、１つの液滴内に電場を特に発生させることができる電極回路を含む。
【００５６】
注入モジュール３２は、例えば、エマルジョン６をチャンバ２０の出口導管を通って流出させて、エマルジョン６が回収装置３０に注入されるようにすることができる。
【００５７】
回収装置３０は、タグ付けに基づいて液滴４または液滴の一部を回収することができる。例えば、回収装置３０は、液滴４全体を回収することを可能にする。代替的に、回収装置３０は、液滴４の細胞を回収することを可能にする。例えば、回収装置３０は、フローサイトメータまたは選別装置を含む。例えば、使用される選別装置には、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｖｏｌ  ８、８７０−８９１において２０１３年に発表された論文「Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｄｒｏｐｌｅｔ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ」に記載されているものがある。
【００５８】
有利には、回収装置３０は、活性化されたシグナル試薬１６に対応する細胞を測定し、前記シグナルに基づいて選別を行うことができる。
【００５９】
次に、生成物を選択および回収するための第１の方法を説明する。前述の選択および回収システム１は、前記方法を実施するために提供される。
【００６０】
エマルジョン６を注入するためのモジュール３２に、前述のエマルジョン６が提供される。エマルジョン６を注入するための注入装置を使用して、液滴４のエマルジョン６がチャンバ２２に注入される。代替的に、システム１は、エマルジョン６をチャンバ２２に直接提供する。
【００６１】
有利には、チャンバ２２において、液滴４は、コンパクトな配置、特に少なくとも測定領域３８において軸Ｚを横切る平面に沿って互い違いに並んだ列に従って配置される。
【００６２】
測定ステップの間に、測定領域３８に存在するエマルジョン６のいくつかの液滴４に対して物理的パラメータが測定される。
【００６３】
測定ステップは、液滴４の循環がない状態でチャンバ２２内で行われる。各液滴の空間的位置６は、これらのパラメータと同時に分類装置２６のメモリに記録される。
【００６４】
測定ステップの間に、所与の励起波長および所与の発光波長についての液滴４の蛍光シグナルが、測定装置２４によって測定される。
【００６５】
例えば、前記波長は、所望の生成物の波長に対応する。
【００６６】
測定ステップに続いて、分類装置２６は、得られた測定値に基づいて液滴４の分類を決定する。
【００６７】
例えば、この分類ステップの間に、結果が分析され、互いに、および分類基準と比較される。分類装置２６は、少なくとも１つの液滴４が属する分類を決定する。
【００６８】
分類の間に、例えば、所望の生成物の蛍光チャネルにおいて、特定の閾値を上回る強度を有する液滴４の全てが同一の分類に割り当てられる。閾値は、例えば、エマルジョン６の全ての液滴４の平均強度に対して決定される。
【００６９】
分類は有利には自動化される。代替的に、分類は、マン・マシンインターフェースを使用してオペレータによって行われる。
【００７０】
次いで、液滴４は、その分類に基づいてタグ付け装置２８を用いてタグ付けされる。
【００７１】
有利には、液滴４は、測定およびタグ付けステップに必要な時間の間、チャンバ２２内で動かないように維持される。
【００７２】
タグ付けは、例えば、シグナル試薬１６を光学的に活性化するために液滴４を照射するステップを含む。照射は、例えば、タグ付け装置２８のレーザによって行われる。
【００７３】
タグ付けステップの後、回収ステップが実行される。回収ステップは、液滴４またはその内容物を回収装置３０に移送するステップを含む。例えば、エマルジョン６は、注入モジュール３２を使用して回収装置に注入される。
【００７４】
タグ付けの後、分類され、次いでタグ付けされた液滴４は、それらのマーキングに基づいて、他の液滴と区別され得る。したがって、例えば回収の間または回収装置３０への移送の間に液滴４の空間分布が変更されたとしても、それらの分類を決定することが可能である。
【００７５】
移送後、有利には回収装置３０によって測定ステップが実行され、シグナル試薬１６からの検出閾値を上回る信号を有する液滴４の全てが同一の管に集められる。活性化されたシグナル試薬１６からのシグナルは、回収ステップの間に特にこれらの液滴４を回収することを可能にする。液滴４は、それらのタグ付けに基づいて選別される。
【００７６】
したがって、このようなシステムは、エマルジョン６を少なくとも２つの液滴の群に分離することを可能にし、液滴４の群の回収を可能にする。
【００７７】
測定およびタグ付けステップの間に測定領域３８に液滴４を保持することにより、タグ付けされた液滴４の精密かつ正確な特性を得ることが可能になる。さらに、測定ステップはフローサイトメトリシステムよりも長くなり得る。測定は、例えば繰り返すことができる。したがって、分類ステップを実行する前に、いくつかの測定値を１つの液滴４ごとに統合することができる。これにより、ノイズの可能性のある単一の測定値に基づいて液滴４を選択することが回避される。従って、分類された液滴４は、その回収前により良好に特徴付けされる。
【００７８】
さらに、回収は、測定シグナルではなくタグ付けシグナルに基づく。タグ付け前に分類基準を正確に調節することによって、他の液滴４に近い特徴が測定された液滴４の分類を効果的に分離することが可能である。
【００７９】
第１の方法の第１の実施例を図３および図４を参照して説明する。この例では、エマルジョン６は、異なる濃度のスルホローダミンを含む液滴を含む３つのエマルジョンから形成される。各エマルジョンの各液滴４は、同一の比率のシグナル試薬１６をさらに含み、試薬はＣＭＮＢ−ケージドフルオレセインである。
【００８０】
タグ付けのために使用されるシグナル試薬１６の濃度は、例えば、１ｎＭから１００μＭの間に含まれ、有利には２μＭと同等である。
【００８１】
測定ステップの間、スルホローダミンに対応する蛍光シグナルは、測定領域３８のいくつかの液滴４について記録される。図３は、スルホローダミンに対応する蛍光チャネルにおいて観察された測定領域３８の一部を示す。この図では、低強度６０、中強度６２または高強度６４の蛍光シグナルを有する３種類の液滴４をそれぞれ区別することが可能である。この例における各タイプの液滴６０，６２，６４は、異なるスルホローダミン濃度を有するエマルジョンに由来する。液滴４の最高強度を有する液滴６４は、最高濃度のスルホローダミンを含む。
【００８２】
分類の間、エマルジョンの全ての液滴４の中強度が計算される。強度閾値は、例えばこの中間値の１．５倍として計算される。所望の生成物の蛍光チャネルにおいてこの閾値を上回る強度を有する液滴４の全てが第１の分類に割り当てられる。第１の分類に分類されたこれらの液滴４は、図３の高強度を有する液滴６４に対応する。
【００８３】
タグ付けステップの間、第１の分類に属する液滴６４は、５秒間の持続時間を有する３５５ｎｍのＵＶフラッシュによって選択的に照射される。これらのフラッシュにより、ＣＭＮＢケージが切断され、フルオレセインが放出される。こうして、これらの液滴４のシグナル試薬１６が活性化される。
【００８４】
図４は、フルオレセインに対応する蛍光チャネルにおいて観察される、タグ付けステップ後の図３と同一の測定領域３８の部分を示す。図３において高強度を有する液滴６４のみがタグ付けステップの間にマークされた。したがって、それらは、フルオレセインチャネルにおいて有意な強度を有する。分類されていない他の液滴６０，６２はＵＶフラッシュによって照射されておらず、それらのシグナル試薬１６は活性化されておらず、従ってそれらはフルオレセインの蛍光チャネルにおいて蛍光性ではないため、コントラストが大きい。この図は、分類された液滴６４がタグ付けされているが、他のものはタグ付けされていないことを示している。
【００８５】
回収ステップの間、液滴４は、回収装置３０によってフルオレセインに対応するチャネルの蛍光シグナルに基づいて選別される。したがって、スルホローダミン濃度が高い液滴６４は、高コントラストのタグ付け信号に基づいてエマルジョンの他の液滴６０，６２から分離される。したがって、それらは迅速かつ効率的に回収することができる。
【００８６】
次に、生成物を選択および回収するための第２の方法を説明する。この方法は、分類ステップの間に、複数の液滴４が分類ステップの間に複数の分類に分類されるという点で第１の方法とは異なる。
【００８７】
タグ付けステップの間、ある分類の各液滴４は、予め設定された照射条件で照射され、シグナル試薬１６によって放射される蛍光シグナルのレベルは、活性化の間の照射条件に依存する。次に、液滴４は、回収ステップの間に蛍光レベルに基づいて選別される。
【００８８】
第２の例では、第２の方法が実施される。第２の例は、分類ステップまでは第１の例と同一である。分類ステップの間に、２つの閾値が決定される。第１の強度閾値は平均値の１．５倍として計算され、第２の閾値は平均値の０．５倍として計算される。第１の閾値を超える強度を有する全ての液滴が第１の分類に割り当てられ、第２の閾値未満の強度を有する全ての液滴が第２の分類に割り当てられる。
【００８９】
図５のグラフに示すように、液滴４に送られるＵＶフラッシュの数を変更することによって、同量のＣＭＮＢ−ケージドフルオレセインからいくつかの蛍光レベルに達することができる。従って、これにより、液滴４の分類に基づいてタグ付けシグナルを変更することが可能となる。従って、第１の分類の液滴６４は、１回のフラッシュで照射される。第２の分類の液滴６０は、４回のフラッシュで照射される。
【００９０】
タグ付けステップの後、第２の分類の液滴６０は、フルオレセインチャネルにおいて高い強度を有し、液滴６４は、フルオレセインチャネルにおいて、より低いが検出しやすい強度を有する。分類されていない液滴６２は、フルオレセインチャネルにおいて蛍光性ではない。
【００９１】
回収ステップの間に、高いスルホローダミン濃度を含む液滴６４がこうして分離される。同様に、低いスルホローダミン濃度を含む液滴６０は、高いコントラストを有するタグ付けシグナルに基づいて分離される。したがって、各カテゴリを効果的に回収することができる。
【００９２】
次に、生成物を選択および回収する第３の方法を説明する。この方法は、第１の方法および第２の方法と異なり、各液滴４の共通ベース１２が１つまたは複数の試験試薬をさらに含む。
【００９３】
試験試薬は、液滴４中の物理的パラメータを測定することを可能にする。各試験試薬は、エマルジョン６の各液滴４中に同一の割合で存在する。
【００９４】
例えば、試験試薬は、液滴においてＥＬＩＳＡ試験を実施するために必要な試薬であるか、または免疫学的試験の試薬である。
【００９５】
有利には、少なくとも１つの試験試薬または試験反応の生成物が蛍光性である。測定は、異なる試薬または蛍光生成物に対応する異なる蛍光チャネルで測定装置２４によって行われる。
【００９６】
シグナル試薬１６は、試薬または試験生成物の蛍光チャネルと交差しないように選択するのが有利である。
【００９７】
測定ステップの間に、液滴の特定の要素１４の有効性が試験され、試験によって測定される。
【００９８】
有利には、測定ステップは、試験の特性パラメータを測定するステップを含み、異なる連続モーメントで繰り返す。測定を繰り返すことにより、液滴４内の試験反応の速度論的監視を行うことが可能になる。
【００９９】
図６に示す第３の例では、測定領域３８は１０ｍｍの長さおよび８ｍｍの幅を有し、４０，０００滴を含む。異なる点はそれぞれ液滴に対応し、異なるグレーレベルは試験試薬に対応する励起チャネルの異なる蛍光強度に対応する。測定ステップの時間は、実行された試験に依存する。図６の例では、４０，０００滴に対する４つの異なる蛍光チャネルの測定が約１０分間続く。
【０１００】
測定が完了すると、結果に基づいて液滴の分類を行うことが可能である。したがって、分類は、いくつかの測定されたパラメータに関係する。したがって、液滴４は、試験の結果に基づいて分類することができる。例えば、液滴４は、液滴４内で起こる反応の収率および前記反応の速度に基づいて分類される。
【０１０１】
例えば、抗原との親和性試験において良好な結果を有する液滴４が、分類ステップの間に同定される。それらは、試験の結果に関連付けられた分類に分類される。
【０１０２】
これらの液滴をタグ付けすることで、一般的な選別機を使用して他のものから簡単に分離することが可能となる。こうして、液滴は、そのカテゴリに対応するタグ付けシグナルで容易に回収することができる。
【０１０３】
この方法では、単一のパラメータで行われるため、液滴を簡単に回収することができるが、選択は複雑であり、いくつかのパラメータに基づく。回収は簡単であるため、回収された液滴は、他の方法を用いて下流で分析することができる。例えば、液滴が細胞を含む場合、配列決定を行うかまたは培養に戻すことができる。
【０１０４】
次に、図７を参照して、第３の方法の実施を示す第４の実施例を説明する。この例では、破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質の抗原に対して反応する抗体を産生する細胞を同定および分離することを目的とする。
【０１０５】
４０ｐＬの液滴を含み、ゼロまたは１つの抗体産生細胞を含むエマルジョン６が形成される。各液滴は、産生された抗体、特にＴＴ試験試薬の表現型の特徴付けを可能にする試薬を含む。さらに、各液滴４は、ケージドフルオレセインなどの光活性化マーカーを含む。
【０１０６】
液滴４は、測定ゾーン３８の各液滴４が照射されて別々に観察することができるようにするのに適した二次元アレイに従ってチャンバ２２内に配置される。
【０１０７】
測定ステップの間、抗体の数における親和性が測定される。図７は、各液滴４について、抗体の測定された親和性に基づく抗体分泌率を示す。このグラフでは、各点は液滴４に対応する。このようなグラフは、例えば、分類装置２６に表示され、ユーザが分類基準を選択できるようにする。
【０１０８】
この例では、測定領域３８には１５，０００滴が存在し、１２，０００滴が細胞を含む。これらの１２，０００滴のうち、２００滴のみが検出可能な量でＴＴに対して作用する抗体を有し、そのうち２１滴が高親和性を有する。これらの２１滴は、回収される第１の分類に配置される。有利には、低親和性の抗体を含む他の液滴は、比較のために使用される第２の分類に分類される。さらに、抗体を産生していない細胞を含むいくつかの液滴および細胞を含まないいくつかの液滴は、細胞を特徴付けることを可能にする他の実験においてブランクまたはネガティブコントロールとして後に使用される第３の分類および第４の分類に分類される。
【０１０９】
分類された液滴の照射は、前記液滴中の光活性マーカーを特に活性化することを可能にし、隣接する液滴４は照射されない。タグ付けステップの間、選択された液滴４は、その分類に対応するパラメータで１つずつ照射される。
【０１１０】
回収ステップの間に、ほとんどの抗体または最良の抗体を含む液滴４をチューブ内に選択的に回収し、分泌された前記抗体を有する細胞を培養に戻すことができる。代替的に、回収後、細胞を溶解し、それらのＤＮＡまたはＲＮＡを増幅し、公知の技術を用いて配列決定する。
【０１１１】
このシステムは、これらの細胞が、他の分類の多数の細胞に関連するノイズに紛れないようにすることが可能である。
【０１１２】
次に、生成物を選択および回収する第４の方法について説明する。シグナル試薬１６は、活性化される細胞マーカーを含む。分類された液滴は細胞を含む。細胞マーカーは、活性化されると、それ自体を付着させ、分類された液滴中に存在する細胞の膜をマークすることができる。例えば、膜に固定された活性化細胞マーカーは蛍光性である。
【０１１３】
タグ付けステップは細胞をマークするステップを含み、選択的回収ステップはエマルジョンブレークに続いてサイトメトリによる選別を含む。
【０１１４】
例えば、細胞のマークは、膜、細胞内、または細胞オルガネラ、例えばリソソームである。
【０１１５】
このようなシグナルは、回復ステップの間にタグ付け細胞を特に回収することを可能にする。この回収ステップの間、エマルジョン６は、液滴４の内部相８が融合して連続相を形成するように破壊される。連続相が回収される。連続相のサイトメトリによる選別、例えば蛍光による細胞選別機での選別は、マークされた細胞を分離することを可能にする。連続相の細胞は、タグ付けステップの間に行われたマークに基づいて選別される。
【０１１６】
そのような方法は、多くの細胞についてその表現型の複雑な測定の後に細胞の特異的な回収を可能にする。
【０１１７】
次に、第４の方法の実施を説明する第５の実施例について説明する。この例では、エマルジョンを破壊することによって回収される前に、タグ付けステップの間に細胞に直接タグ付けすることを目的とする。
【０１１８】
例えば、液滴への導入の前に、細胞は、タンパク質および特定の脂質中に存在するアミン基などの、接触可能な膜の要素と反応する非蛍光試薬でマークされる。最も好ましい試薬は、光によって活性化され、このプロセスでは蛍光性になる。試薬は、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社によって市販されているＣＭＮＤ−ケージドカルボキシフルオレセイン、ＳＥ（５−カルボキシフルオレセイン−ビス−（５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル）エーテル、β−アラニン−カルボキサミド、スクシンイミジルエステル）である。ＵＶ光を用いた活性化は、液滴および細胞の回収後に選別可能な蛍光細胞を生じる。
【０１１９】
代替的に、細胞は、スルホ−ＳＢＥＤ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−２−（６−［ビオチンアミド］−２−（ｐ−アジド−ベンズアミド）−エキソアノアミド）エチル−１，３’−ジチオプロリオネート、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ３３０３３）で実験前にマークされる。この錯体は、３つの反応基、すなわち第１級アミン基と反応することができるスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと、光活性化基（アジド−ベンズアミド基）と、ビオチン分子とを含む。このマーカーは実験前に全ての細胞に加えられる。それはタンパク質または膜脂質中に存在する細胞膜のアミン基と反応する。
【０１２０】
４０ｐＬの液滴を含み、ゼロまたは１つのスルホＳＢＥＤで官能化されたこれらの細胞を含むエマルジョン６が形成される。液滴は、前と同様にチャンバ２２内に配置される。
【０１２１】
測定ステップおよび分類ステップの後、選択された液滴の細胞はＵＶ光によって照射される。
【０１２２】
ＵＶ光はアジドベンズアミド基を活性化し、細胞膜と反応して２つの化学基によって細胞表面に結合した分子を形成する。タグ付けの後、液滴は回収され、エマルジョンが破壊される。
【０１２３】
遠心分離ステップにより細胞を精製することができる。全ての細胞を回収することにより、細胞を操作しやすくなり、目的の細胞の損失を少なくすることができる。
【０１２４】
最後に、細胞を、２５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤を含む溶液中でインキュベートするように設置する。これにより、ジスルフィド基をビオチンに結合するヒドロキシスクシンイミジル鎖を切断することが可能になる。このようにして、タグ付けステップの間に紫外線によって活性化されていない全ての細胞からビオチンが除去される。タグ付けされた細胞では、ジスルフィド基の結合も切断されるが、活性化されたアジドベンズアミドはビオチンを細胞膜に保持する。
【０１２５】
その結果、タグ付けステップの間に照射された細胞のみが、その膜上にビオチン分子を有する。
【０１２６】
ビオチンは次に、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社によって市販されているストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ５５５などの蛍光ストレプトアビジンでマークすることができる。したがって、マークされた細胞は、残りの細胞集団に対して高い蛍光性を示す。細胞は次にＦＡＣＳによって回収することができる。
【０１２７】
代替的に、ビオチン化細胞は、ストレプトアビジンを用いて官能化磁気ビーズに結合される。次に、細胞を溶液から磁気的に除去することによって細胞が精製される。
【０１２８】
代替的に、エマルジョンを形成する前に、細胞は、フルオレセイン基またはアジド、ビオチン、ＮＴＡなどの特定の化学基を有する別の活性化可能な膜マーカーで官能化される。
【０１２９】
１つの代替案では、シグナル試薬１６は、例えばメッセンジャーＲＮＡマーキングのような、活性化されるＤＮＡまたはＲＮＡのマーキングを可能にするプライマまたは試薬を含む。さらに、細胞は、例えば、それぞれの液滴４中で溶解される。
【０１３０】
活性化されると、このシグナル試薬１６は、例えば蛍光シグナルを用いて、選択された液滴４中に存在するＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡをマークすることができる。
【０１３１】
代替的に、目的のＤＮＡまたはＲＮＡは、アジド、アルキン、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）などのキレート剤、または磁性粒子などの化学基によってマークされる。このようなマーキングにより、回収ステップの間にタグ付けされたＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡを特に回収することが可能となる。この回収ステップの間、エマルジョンは、液滴の内部相が単一の連続相を形成するように破壊される。
【０１３２】
マークされたＤＮＡまたはＲＮＡは、使用されるシグナル試薬１６のための適切な精製方法を用いて精製される。例えば、それらは、ＮＴＡの場合にはニッケル樹脂精製によって、アジドまたはアルキンのクリックケミストリによって回収される。
このような技術は、例えば、対象のｍＲＮＡの配列決定を容易にする。
【０１３３】
１つの代替案では、液滴４はシグナル試薬１６を含まない。タグ付けステップは、分類された液滴４の細胞のレーザー溶解を行うステップからなる。回収ステップの間、エマルジョン６は破壊され、生成物は遠心分離によって精製される。溶解されていない細胞および残屑は除去される。これにより、選択された細胞の細胞質の特異的な回収が可能になる。
【０１３４】
１つの代替案は、マークされていない液滴の細胞の全てを溶解することからなる。回収ステップの間、エマルジョン６が破壊され、溶解した細胞および残屑が除去される。これにより、選択された細胞の特異的な回収が可能になる。
【０１３５】
１つの代替案では、シグナル試薬１６の活性化は、密度を増加させる。タグ付けステップの間に、分類された液滴４の密度が増加する。回収ステップの間、エマルジョンは、密度による分離を可能にする装置、例えばデカントフラスコ内に破壊されることなく注入される。これにより、分類された液滴４の回収が可能になる。
【０１３６】
１つの代替案では、シグナル試薬１６は、局所加熱条件下で活性化することができる。局所加熱は、細胞またはリポソームの溶解に使用される。考慮されるリポソームは分子を放出し、有利には放出後に液滴または細胞をマークすることを可能にする。この放出された分子は、細胞もしくは液滴を蛍光マーキングすることができ、または細胞の性質を変化させることができる。
【０１３７】
タグ付けステップは、液滴４の分類に応じてシグナル試薬１６を熱活性化するステップを含む。タグ付けステップの間、選択された液滴は、タグ付け装置を使用して局所的に加熱される。
【０１３８】
次に、第５の方法について説明する。この方法は、図８および図９に示す第５の実施例において実施される。
【０１３９】
この方法は、液滴が主軸に沿った細長い物体を画定する少なくとも１つの粒子塊を含み、少なくともいくつかの液滴が塊に付着することができる少なくとも１つの標的要素を含み、測定ステップが、塊上の標的要素の結合の特徴的な物理的パラメータを測定することを含む点で前述の方法とは異なる。
【０１４０】
支持体２０は、図８に示すように、粒子が細長い塊７２を形成するように磁場Ｂを形成することができる供給装置７０を備える。
【０１４１】
粒子は超常磁性粒子である。粒子は、磁場が印加されたときに細長い塊７２をカラムの形態で形成することができる。塊上の標的要素の結合の特徴的な物理的パラメータの測定は、液滴内に位置する複数の点で局所的に行われ、測定ステップは、好ましくは、液滴内で測定された値の積分を決定することを含む。測定ステップの間、粒子は組織化されて細長い塊７２をカラム状に形成する。このシステムは、速度論的監視のためにより良いコントラストで蛍光測定を得ることを可能にする。
【０１４２】
第５の実施例は、測定ステップの間に、液滴中の単離された固有の一次細胞によって生成されたモノクローナル抗体の、所定の抗原に対する分泌速度および親和性を同時に測定する可能性を示す。液滴４の選択を可能にする固有の要素１４は、一次細胞によって分泌されるモノクローナル抗体である。この分泌は速度論的に測定される。
【０１４３】
この例では、液滴は４０ピコリットルの体積を有する。この例では、分析および分類される細胞は、マウスの脾臓から予め抽出されたＢリンパ球であり、標準的な手順（Ｐａｎ  ＢキットＩＩ＃１３０−１０４−４４３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて精製される。
【０１４４】
試験試薬は、抗原、定量化実体（ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｅｎｔｉｔｙ）、および塊７２を形成することができ、捕獲実体（ｃａｐｔｕｒｅ  ｅｎｔｉｔｙ）を有する粒子を含む。抗原は、所望の抗体と複合体を形成することができる。定量化実体は、抗体と複合体を形成することもできる。
【０１４５】
抗原は蛍光抗原であり、より具体的には、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社によって提供される標準キットのマーキング手順のために、予めＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８フルオロフォアで官能化された破傷風トキソイドタンパク質、「ＴＴ−ＡＦ４８８」である。各液滴は、２５ｎＭのＴＴ−ＡＦ４８８を含む。液滴のカラムを形成するために使用される磁性粒子は、捕獲実体、ここでは「ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ａｎｔｉ−ＬＣ−ｋａｐｐａ（Ｍｕｒｉｎｅ）コンジュゲート」（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＃７１０３１５２５００）で飽和状態にマークされる。これらの粒子は、、捕獲実体で飽和状態にマークされたストレプトアビジン磁性粒子（Ａｄｅｍｔｅｃｈ＃０４３３）である。この例では、使用される定量化実体は、Ｒａｂｂｉｔ  Ｆａｂ  ２ａｎｔｉ−ＦＣｍｏｕｓｅ  ＡＦ６４７、ＪａｃｋｓｏｎＩＲ＃３１５−６０６−１４６である。各液滴は、７５ｎＭのこの定量化実体を含む。
【０１４６】
定量化実体の蛍光シグナルに対する抗原の蛍光シグナルの比は、抗体の解離定数と相関する。解離定数Ｋｄは、ビーズカラムに固定された抗体に関する蛍光抗原濃度測定およびビーズカラムに捕捉された抗体濃度の同時測定から評価される。
【０１４７】
図９は、時間（分）の関数として、単一細胞の規模における液滴の分散シグナルに対する磁気ビーズの線の再局在化シグナルの比の推移を示すグラフである。「再局在化シグナル」は、塊付近の蛍光シグナルを指し、「分散シグナル」は、残りの液滴の蛍光シグナルを指す。
【０１４８】
さらに、滴定曲線によって、測定された信号をモノクローナル抗体の濃度と相関させることが可能である。この濃度を図９に示す。滴定曲線は、例えば、ＴＴ７と呼ばれる既知の量の抗ＴＴ抗体を含むエマルジョンから測定装置２４で行われる。滴定曲線を生成するために使用されたＴＴ７は、２０１３年にＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ：３１、第１６６から１６９頁に掲載されたＢｒａｎｄｏｎ  Ｊ  ＤｅＫｏｓｋｙらによる「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｉｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ」と題する論文に記載された配列からの組換えタンパク質発現によって得られた。
【０１４９】
本発明による生成物の選択および回収の方法は、既存の方法よりも信頼性が高く高速であり、対象の液滴の内容の正確な特徴付けおよび効率的な回収を可能にする。
【０１５０】
この方法の１つの利点は、回収の前に速度論的測定を行うことが可能であることである。これは、刺激に対する生物学的応答を監視することを可能にし、異なるパラメータを計算することを可能にする。さらに、いくつかの測定を行うことができるため、試験の間に擬陽性と陽性をよりよく区別することができる。
【０１５１】
このシステム１は、単一細胞レベルで細胞系を研究するのに有用である。さらに、このシステムは、複雑な表現型に基づく選択を可能にする。例えば、細胞と細菌との間の相互作用を、測定ステップの間に観察することができる。これは、細菌に対するそれらの挙動に基づいて、異なる群の細胞を分類および回収することを可能にする。同様に、同じ液滴内に存在する異なる細胞間の相互作用を測定ステップの間に観察することができる。
【０１５２】
システム１は、液滴による細胞分泌物を特徴付けることを可能にする。分析された細胞分泌物は、抗体、サイトカインおよびホルモン分泌物であり得る。液滴が細胞を含む場合、液滴中の分泌物はその細胞に対応する。結果として、分泌物のパラメータを測定し、前記分泌物をもたらした液滴全体または細胞を回収することができることが非常に有利である。このようなシステムは、一方では、特に、対象抗原と分泌抗体の結合係数、親和性、および特異性の決定を通してその表現型の機能的特徴付けを可能にし、他方では細胞の回収を可能にし、抗体産生細胞のインビボ研究を行うことを可能にする。例えば、回収は、選択された細胞の遺伝子型の研究を可能にする。それらの表現型に基づいて細胞を選択することで、表現型が対象でない細胞の配列決定を回避することができ、対象の遺伝子配列をより容易に見つけ出すことが可能となる。実際に、相関関係がより容易に作られ、測定ノイズは低減される。
【０１５３】
図１０から１１は、生成物を選択および回収するためのシステムの第６の例示的応用を示す。この第６の実施例は、第１の実施例と同様である。
【０１５４】
図１０は、本発明による方法を用いた選択の前に異なる濃度のスルホローダミンを含む液滴から形成されたエマルジョン６を示す。
【０１５５】
この実施例では、２００ｎＭの濃度のスルホローダミンを含む液滴のみが、ケージドフルオレセインを放出することによってタグ付けされる。タグ付けされた液滴のみが次に回収される。
【０１５６】
図１１は、回収された液滴の画像を示す。これらの液滴は実質的に同一の強度を有する。
【０１５７】
図１２を参照して、第７の実施例について説明する。図１２は、ケージドカルボキシフルオレセイン−ＮＨＳを用いてマークされた細胞を示す。この実験では、選択基準はスルホローダミンの低濃度レベルである。２００ｎＭの濃度のスルホローダミンを含む液滴のみがタグ付けされる。選択された液滴は、細胞を紫外線に曝露することによってタグ付けされる。
【０１５８】
次に、第８の実施例について説明する。この例は、ビオチンによる細胞のタグ付けを説明する。
【０１５９】
この第８の実施例では、１ミリリットル当たり１０ＭＩＯ細胞の溶液を５０μＭのスルホ−ＳＢＥＤと共に氷上で１５分間インキュベートする。細胞を遠心分離により回収し、すすぎ、緩衝液中で再懸濁する。
【０１６０】
細胞は２つのバッチに分離される。第１のバッチは紫外線に１０秒間曝露される。第２のバッチは紫外線に曝露されない。
【０１６１】
次に、５ｍＭのＤＴＴ、還元剤が各バッチに添加され、溶液は４℃で３０分間インキュベートされる。
【０１６２】
細胞が紫外線に曝露されていない第２のバッチでは、シグナル試薬が切断される。
【０１６３】
反対に、ＵＶ光を受けた第１のバッチでは、シグナル試薬は官能基によって細胞に結合する。
【０１６４】
次に、細胞は２回すすがれ、３００ｍＭのストレプトアビジン−アレクサ５５５が細胞に添加される。
【０１６５】
ストレプトアビジン−アレクサ５５５は、紫外線に曝露された細胞のみに結合してマークすることが観察される。
【０１６６】
次に、第９の実施例について説明する。この実施例は、蛍光によってマークされた細胞のサイトメトリ分析を説明する。この実験では、細胞株由来の細胞を１ミリリットルあたり１０細胞の濃度で取り出す。１つは２００ｍＭのケージドフルオレセイン−ＮＨＳの溶液１００μＬを加える。次に、細胞は氷上で３０分間インキュベートされ、次いで、液滴にカプセル化される。細胞のパーセンテージ１１．３４％がＵＶ光に曝露され、エマルジョンがチャンバから取り出され、破壊され、次いで細胞が精製される。ＵＶ光に曝露された細胞のみがタグ付けされる。
【０１６７】
細胞残屑と細胞を区別するために、細胞は細胞生存マーカー、赤カルセインと共にインキュベートされる。
【０１６８】
サイトメータ分析では、陽性細胞の９．４３％が生存してタグ付けされていると測定する。
【０１６９】
別の例では、ＩｇＧを分泌する細胞は、ＩｇＧ分泌を検出した後にタグ付けされる。
【符号の説明】
【０１７０】
４  液滴
６  エマルジョン
８  内部流体
１０  キャリア流体
１２  共通ベース
１４  液滴特有の要素
１６  シグナル試薬
２０  支持体
２２  チャンバ
２４  測定装置
２６  分類ユニット
２８  タグ付け装置
３０  回収装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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