(57)【要約】  葉緑体におけるトランス遺伝子発現を改良する方法が、そのように作製された改良トランス遺伝子、及び疾患の治療へのその使用方法と共に開示される。具体的には、本方法は、目的のタンパク質をコードする核酸の天然の配列を分析すること、及び前記配列中のコドンを高等植物の葉緑体のｐｓｂＡ遺伝子で優先的に使用されるコドンに置き換えることを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉緑体における目的のタンパク質をコードするトランス遺伝子の翻訳を増加させる方法であって、
ａ）前記目的のタンパク質をコードする核酸の天然配列を分析すること、及び前記配列中のコドンを高等植物の葉緑体のｐｓｂＡ遺伝子で優先的に使用されるコドンに置き換えること、及び任意選択でリボソームプロファイリングを実施すること、及び翻訳中にリボソームストールを引き起こす任意のコドンを除去すること；
ｂ）合成のコドン最適化配列を作製すること、及び前記配列を葉緑体形質転換ベクターにクローニングすることであって、前記合成配列が、前記葉緑体での発現に好適な５’及び３’調節エレメントに作動可能に連結されていること；
ｃ）前記治療用タンパク質が発現する条件下で標的植物を前記ベクターで形質転換することであって、前記コドンの置換により、天然配列を用いて観察される発現レベルと比べて少なくとも２倍のタンパク質発現の増加が生じること
を含む方法。
【請求項２】
前記目的のタンパク質を単離することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物から葉を採取して凍結乾燥することを更に含み、前記凍結乾燥葉が前記目的のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
リボソームストールを低減するため前記配列中のコドンを改変することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
図４Ａに示される核酸によってコードされる合成ＶＰ１タンパク質。
【請求項６】
図２Ｅに示される核酸によってコードされる合成第ＶＩＩＩ因子ＨＣ−ＬＣタンパク質。
【請求項７】
図１７Ｆに示される核酸によってコードされる合成インスリン成長因子様１タンパク質。
【請求項８】
図１８Ａに示される核酸によってコードされる合成ムタナーゼ酵素。
【請求項９】
ポリオウイルスに対して以前免疫されたことがある対象に全身及び粘膜免疫を生じさせる方法であって、請求項４に記載の合成ＶＰ１タンパク質を含む凍結乾燥植物細胞をアジュバントの存在下で前記対象に経口的に投与することを含み、前記投与が前記対象における抗ＶＰ１−ＩｇＧ１力価及び抗ＶＰ−１−ＩｇＡ力価の産生を引き起こし、それにより前記ポリオウイルスに対する免疫がブーストされる、方法。
【請求項１０】
前記投与が１〜４回実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の凝固因子の投与を含む、それを必要としている対象の血液凝固障害を治療する方法であって、前記投与が前記対象の前記血液凝固障害の症状を軽減する、方法。
【請求項１２】
それを必要としている対象に請求項７に記載のムタナーゼを経口投与することを含む、う蝕の形成を阻害する方法であって、前記ムタナーゼが前記対象のプラーク形成を阻害する、方法。
【請求項１３】
前記ムタナーゼが抗菌ペプチドとの融合物として投与され、及びチューインガムとして製剤化される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項５〜８のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするプラスチド形質転換ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターで形質転換された植物。
【請求項１６】
食用である請求項１５に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／３１０，７８８号明細書に対する優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、助成金番号第Ｒ０１  ＨＬ１０７９０４号、第Ｒ０１  ＨＬ１０９４４２号、第Ｒ０１  ＥＹ  ０２４５６４号、及び国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、助成金番号第ＩＯＳ−１３３９１３０号からの連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ゲノミクス法、プロテオミクス法及びリボソームプロファイリング法を用いたコドン最適化による葉緑体におけるトランス遺伝子発現の改良に関する。そのように改良されたトランス遺伝子及びその使用方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００４】
本明細書全体を通じて、本発明が関係する技術分野の水準を説明するため幾つかの刊行物及び特許文献を引用する。それらの引用の各々は、それらが完全に示されたものとして参照により本明細書に援用される。
【０００５】
葉緑体内のヒト治療用タンパク質の臨床移行における大きな制約は、その低い発現レベルである。原核生物遺伝子、又はより短いヒト遺伝子は、葉緑体で高発現する（全葉タンパク質の最大７０％）。例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）及びバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の天然の原核生物遺伝子は、葉緑体内で全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）のそれぞれ最大２９．４％及び４５．３％発現した（Ｄｅ  Ｃｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｒｕｈｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。小さいヒト遺伝子は、インスリン様成長因子１（約７．８ｋＤａ、Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、プロインスリン（約１２ｋＤａ、Ｒｕｈｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、及びインターフェロン−α２ｂ（約２１．５ｋＤａ、Ａｒｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を含め、葉緑体内で極めて高レベルで発現した。しかしながら、大型のヒトタンパク質の発現は大きな課題を示す。
【０００６】
同様に、ウイルスワクチン抗原の発現は全く予測不能であり、発現レベルは高いか、中程度か、又は極端に低いかである。例えば、ロタウイルスのＶＰ６抗原は、Ｎ末端領域におけるタンパク質分解に対するその感受性に起因して、タバコ葉緑体内での蓄積が極めて低レベルであった（Ｂｉｒｃｈ−Ｍａｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｉｎｋａ  Ｂｏｒｃｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ヒトパピローマウイルス１６型Ｌ１抗原の発現レベルは０．１％〜１．５％まで様々であり、ＬＴＢと融合した場合にはタバコ葉緑体内に最大２％蓄積したが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合した場合には極端に低かった（Ｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｗａｈｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ；Ｗａｈｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ｂ；Ｈａｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。更に、タバコにおいては、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に対する葉緑体由来の抗原の不安定性が報告されている。葉緑体由来のｐ２４タンパク質は、天然ｐ２４  ｃＤＮＡを発現させたとき最も若い葉に約２．５％蓄積したに過ぎず、成葉では検出不能であった（ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。高用量のワクチン抗原が高レベルの免疫を刺激して、病原体に対するより高い防御性を付与することは周知であり、従って葉緑体内でのより高レベルの発現が大きな要件である（Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌｌ，２０１５）。
【０００７】
かかる課題は、最適な調節配列（プロモーター、５’及び３’ＵＴＲ）、特に種特異的内因性エレメントの使用によって対処されている（Ｒｕｈｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。単純にヒト遺伝子の各コドンの３番目の位置を修飾することによってＡＴ含量を増加させる大ざっぱな試みが行われている（Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。幾つかの同義コドンの翻訳効率に関する挿入遺伝子のインビトロアッセイは、必ずしもプラスチドｍＲＮＡにおけるコドン使用と相関するわけではないが（Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｓｕｇｉｕｒａ，２００７）、かかるインビボ研究がないため、これまでのコドン最適化研究で用いられている（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｊａｂｅｅｎ  ａｔ  ａｌ．，２０１０）。従って、数百の葉緑体ゲノムのシーケンシングにより集積した広範な知識を利用して高発現葉緑体遺伝子のコドン使用及び頻度を理解しようとする体系的な研究が行われたことはない。別の大きな課題は、多量体構造体の凝集又は形成に起因して唯一の信頼性の高い方法（ＥＬＩＳＡ）を用いることができないため、不溶性タンパク質を定量化する信頼性の高い方法がないことである。並列反応モニタリング（ＰＲＭ）による質量分析法によるターゲットプロテオーム定量化が、その特異度及び感度に基づき相対的及び絶対的タンパク質定量化の強力なツールとなっている（Ｄｏｍｏｎ  ａｎｄ  Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，２０１０；Ｇａｌｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。加えて、ＰＲＭは高い特異度及び多重化特性を提供するため、ｎａｎｏＬＣ保持時間及びプレカーサーイオンｍ／ｚに基づき（Ｇａｌｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ペプチドの複数のフラグメントイオンを特異的にモニタすることが可能であるが、この概念は植物タンパク質薬物では一度も試験されたことがない。
【０００８】
弱毒生ウイルス及び死滅ウイルスの発現に関連した欠点には、ビルレンスへの復帰可能性、免疫原性レベルの低さ、種間の抗原変異性、及び野生型株への遺伝物質の移入可能性が含まれる（Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。２００６年に初めて確認されたナイジェリアでの２型ワクチン由来ポリオ（ＶＤＶＰ２）のアウトブレイクはアフリカでエンデミックとなり、今日まで存続している（Ｆａｍｕｌａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ナイジェリア北部では、２００５年以降、２型循環型ワクチン由来ポリオウイルス（ｃＶＤＰＶ２）に関連するこの大規模な灰白髄炎のアウトブレイクが発生している；４０３症例の各々からの分離株のＰ１／カプシド領域配列の系統発生解析によれば、２００５〜２０１１年にこのアウトブレイクが２３の独立したＶＤＰＶ２の出現となり、そのうち少なくとも７個が循環型系統群を樹立したことが報告された（Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。世界中でポリオ・サーベイランス・プログラム（ＰＳＰ）を通じて急性弛緩性麻痺（ＡＦＰ）症例に関連する非ポリオエンテロウイルス（ＮＰＥＶ）が高頻度で報告されている（Ｌａｘｍｉｖａｎｄａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。野生ポリオ症例は多くの国で集中的な経口ポリオワクチン接種プログラムにより根絶されているが、世界中で非ポリオＡＦＰ症例の報告が増えつつある。現在認識されているＥＶ種は、３つのＰＶ血清型を含むポリオウイルス（ＰＶ）と、ヒトエンテロウイルス（ＨＥＶ）Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤとに分けられている（Ｄｈｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。それらのゲノムの系統発生解析に基づけば、ＰＶとＨＥＶ−Ｃ種の血清型とは近縁関係にある（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。更に、ＨＥＶ種Ｃの循環頻度の高さが、ワクチン由来ポリオウイルス（ＶＤＰＶ）アウトブレイクの報告につながっている（Ｒａｋｏｔｏ−Ａｎｄｒｉａｎａｒｉｖｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。２００５〜２０１１年の間に、ナイジェリアで非ポリオエンテロウイルスＣ（ＮＰＥＶ−Ｃ）起源の非構造領域（ＮＳＲ）に起源を有する２３の循環型ワクチン由来ポリオウイルス（ｃＶＤＰＶ）系統が確認された。従って、セービン経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）と在来のＮＰＥＶ−Ｃとの間での組換えが、ナイジェリアでアウトブレイク時に分離された組換えｃＶＤＰＶ系統の幾つかをもたらした（Ａｄｅｎｉｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ｃＶＤＰＶは、概してＯＰＶとＨＥＶ−Ｃとの間の相同組換えによって生じるもので、全世界で灰白髄炎のアウトブレイクを数多く引き起こしたため、健康への重大な脅威となった（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ワクチン接種率が低い地域では、ＯＰＶとＨＥＶ−Ｃの組換えに起因して強毒性のｃＶＤＰＶが野生型ＰＶに置き換わるリスクがある。地球規模のＰＶ根絶に向け、全世界でＯＰＶワクチン接種を中止して、新たなアウトブレイクにつながり得るワクチン由来ポリオウイルス株の数を最小限に抑えることが提案されている（Ｋｏｕｉａｖｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０００９】
植物由来サブユニットワクチンは耐熱性であり、動物病原体による汚染がない。それらはまた、複数の感染症を防御するため複数の抗原及び経粘膜担体（ｃａｒｒｉｒｅ）を含むように操作することもできる（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。経口送達後に回腸の絨毛間で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するインタクトな植物細胞に関する最近の報告により、消化器系にあるタンパク質薬物が胃内の酸及び酵素から保護されることについての直接的なエビデンスが提供された；経粘膜担体ＣＴＢと融合したＧＦＰは、植物細胞から腸管腔内に放出されると、上皮細胞によってＧＭ１受容体介在性送達を通じて吸収された（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。かかる機構的及び概念的進歩は、発酵、精製、低温貯蔵及び輸送などの複雑な生産システムのコスト削減により、ワクチン送達に革命をもたらし得る（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５及びＫｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３。核ゲノムで発現させるジャガイモ由来のＨＢｓＡｇが一昔前に前臨床試験及びヒト臨床試験で試験されたが（Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｔｈａｎａｖａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、後期段階に進む上での進捗は遅れている。２つの大きな課題は、核ゲノムによる抗原の発現レベルの低さ、及びアジュバントによる抗原プライミング注射なしにはトレランスが誘導される可能性があることである（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｒｙｂｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明においては、葉緑体における目的のタンパク質をコードするトランス遺伝子の翻訳を増加させる方法が提供される。例示的方法は、前記目的のタンパク質をコードする核酸の天然配列を分析すること、及び前記配列中のコドンを、１００を超える植物種にわたる葉緑体のｐｓｂＡ遺伝子で優先的に使用されるコドンに置き換えること、及び任意選択でリボソームプロファイリングを実施すること、及び翻訳中にリボソームストールを引き起こす任意のコドンを除去することを含む。次に合成のコドン最適化配列が作製されて葉緑体形質転換ベクターにクローニングされ、前記合成配列は、前記葉緑体での発現に好適な５’及び３’調節エレメントに作動可能に連結されている。次に標的植物が、前記治療用タンパク質が発現する条件下でこのベクターによって形質転換され、ここで前記コドンの置換により、天然配列を用いて観察される発現レベルと比べて少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、２０倍又は４０倍のタンパク質発現の増加が生じる。本方法は、任意選択で、前記目的のタンパク質を単離することを伴い得る。好ましい実施形態において、本方法は、前記植物から葉を採取して凍結乾燥することを更に含み、ここで凍結乾燥葉は目的のタンパク質を含む。
【００１１】
特に好ましい実施形態において、ポリオ治療用のワクチンに有利に使用し得る合成ＶＰ１タンパク質タンパク質が提供される。従って、ポリオウイルスに対して以前免疫されたことがある対象に全身及び粘膜免疫を生じさせる方法であって、前記対象にアジュバントの存在下で上記に記載される凍結乾燥植物細胞を経口投与することを含み、前記投与が前記対象における抗ＶＰ１−ＩｇＧ１力価及び抗ＶＰ−１−ＩｇＡ力価の産生を引き起こし、それにより前記ポリオウイルスに対する免疫がブーストされる方法が提供される。
【００１２】
別の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子重鎖及び軽鎖がコドン最適化されている。そのように作製された第ＶＩＩＩ因子は、血液凝固障害の治療方法に有利に使用し得る。従って、本発明はまた、本明細書に開示されるとおり効率的に発現するよう最適化された凝固因子を用いた血液凝固障害の治療方法も提供する。本明細書ではＦＶＩＩＩが例示されるが、本明細書に提供される指針を用いてＦＩＸ、ＦＸ、及びＦＶＩＩなどの他の凝固因子も容易に最適化することができる。
【００１３】
本発明の方法はまた、合成インスリン成長因子（ＩＧＦ−１）の作製にも有利に使用し得る。本明細書に記載される合成ＩＧＦ−１を使用したＩＧＦ−１欠損の治療方法もまた本発明の範囲内にある。
【００１４】
更に別の実施形態において、合成ムタナーゼ酵素が提供される。合成ムタナーゼ酵素を使用したう蝕の治療方法もまた開示される。
【００１５】
本発明の別の態様において、ポリオウイルスに対して以前免疫されたことがある対象に全身及び粘膜免疫を生じさせる方法であって、前記対象にアジュバントの存在下で上記に記載される凍結乾燥植物細胞を経口投与することを含み、前記投与が前記対象における抗ＶＰ１−ＩｇＧ１力価及び抗ＶＰ−１−ＩｇＡ力価の産生を引き起こし、それにより前記ポリオウイルスに対する免疫がブーストされる方法。
【００１６】
また、本明細書に記載される合成タンパク質をコードするプラスチド形質転換ベクターも本発明の範囲内にある。かかるベクターを含む植物もまた、本発明の態様を形成する。好ましい実施形態において、植物は食用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】植物葉緑体における異種遺伝子の発現に最適化されたコドンのアルゴリズム開発。コドン最適化アルゴリズムの開発手順。ＮＣＢＩから収集し、コドン優先度に関して分析した１３３の植物種からのｐｓｂＡ遺伝子の配列データ。Ｊａｖａプログラミング言語を用いてコドン最適化器を開発し、図示するコドン優先度表が生成された。コドン優先度は、各アミノ酸のパーセンテージ使用率によって示す。
【図２−１】レタス葉緑体形質転換ベクターへのコドン最適化合成ＦＶＩＩＩ単鎖、重鎖及び軽鎖遺伝子の構築、並びに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びホモプラスミック系統におけるその発現のＰＣＲによる確認。（図２Ａ）ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ単鎖、重鎖及び軽鎖発現カセットを含むベクターコンストラクトの概略図。Ｐｒｒｎ、ｒＲＮＡオペロンプロモーター；ａａｄＡ、アミノグリコシド３’−アデニリルトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｙｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子；ＰｐｓｂＡ、ｐｓｂＡ遺伝子のプロモーター及び５’−ＵＴＲ；ＣＴＢ、コレラ非毒性Ｂサブユニットのコード配列；ＦＶＩＩＩ  ＳＣC、コドン最適化ＦＶＩＩＩ重鎖（Ｂドメインからの１４アミノ酸を含むＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の融合形態；ＴｐｓｂＡ、ｐｓｂＡ遺伝子の３’−ＵＴＲ；ｔｒｎＩ、イソロイシル−ｔＲＮＡ；ｔｒｎＡ、アラニル−ｔＲＮＡ。ｐＵＣ−ＬＳＬＦをＢａｍＨＩで消化することによりサザンブロットプローブ（ＳＢ−Ｐ）を作成し、トランスプラストミック植物からのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩによって消化した。
【図２−２】レタス葉緑体形質転換ベクターへのコドン最適化合成ＦＶＩＩＩ単鎖、重鎖及び軽鎖遺伝子の構築、並びに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びホモプラスミック系統におけるその発現のＰＣＲによる確認。（図２Ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＨＣ、ＬＣ及びＳＣの天然配列又はコドン最適化配列の発現に関するウエスタンブロットアッセイ。ＦＶＩＩＩ  ＨＣ、ＬＣ及びＳＣの天然配列又はコドン最適化配列を含む葉緑体発現ベクターで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から全タンパク質を抽出した。タンパク質を指示のとおりロードし、抗ＣＴＢ抗体（１対１０，０００）でプローブした。形質転換及び非形質転換（ＵＴ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を補足したテリフィックブロス（ＴＢ）培地中において３７℃で一晩インキュベートした。矢印は、対応するサイズが予想されたタンパク質を示す（ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＨＣ、１００ｋＤａ；ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＬＣ、９２ｋＤａ及びＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＳＣ、１７９ｋＤａ）（図２Ｃ）ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＬＣ及びＳＣ発現カセットの組込みに関するＰＣＲ分析。Ａに指示するとおりの特異的な一組のプライマーを使用してＤＮＡ断片を増幅し、１％アガロースゲル上で分離させた。ＵＴ、非形質転換野生型ｇＤＮＡ；Ｓ１〜Ｓ３、３つの独立したＦＶＩＩＩ  ＳＣトランスプラストミック系統；Ｌ１〜Ｌ８、８つの独立したＦＶＩＩＩ  ＬＣトランスプラストミック系統（ｌｉｎｇｅ）。（図２Ｄ）ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＳＣCのサザンブロット分析。全レタスゲノムＤＮＡ（３μｇ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．８％アガロースゲル上で分離し、Ｎｙｔｒａｎ膜にブロットした。ＵＴ、非形質転換野生型植物；１〜４、４つの独立した２ラウンド目のトランスプラストミック系統。
【図２−３】レタス葉緑体形質転換ベクターへのコドン最適化合成ＦＶＩＩＩ単鎖、重鎖及び軽鎖遺伝子の構築、並びに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びホモプラスミック系統におけるその発現のＰＣＲによる確認。（図２Ｅ）配列コドン最適化ＦＶＩＩＩ単鎖。ＨＣ、Ａ１及びＡ２ドメインを含むＦＶＩＩＩ重鎖（配列番号１）；ＬＣ、Ａ３、Ｃ１及びＣ２ドメインを含むＦＶＩＩＩ軽鎖。配列番号２）ＣＴＢ：コレラ非毒性Ｂサブユニットの天然配列（配列番号３）。
【図３】サザンブロットを用いたホモプラスミック系統の確認及びホモプラスミックトランスプラストミック植物系統で発現したタンパク質の定量化。（図３Ａ及び図３Ｂ）ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＬＣC及びＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＳＣCのサザンブロット分析。全レタスゲノムＤＮＡ（３μｇ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．８％アガロースゲル上で分離し、Ｎｙｔｒａｎ膜にブロットした。ＵＴ、非形質転換野生型植物；Ｌ１〜Ｌ８及びＳ１〜Ｓ４、それぞれＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＬＣC及びＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＳＣCの８つ及び４つの独立した２ラウンド目のトランスプラストミック系統。（図３Ｃ）ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＨＣC、ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＬＣC及びＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＳＣCを発現する凍結乾燥したトランスプラストミックレタス葉から抽出した全葉タンパク質（５００μｌ抽出緩衝液中１０ｍｇ）の４マイクログラムを指示されるとおりロードし、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させた。抗ＣＴＢ抗体（１対１００００）を使用してＣＴＢ融合ＦＶＩＩＩタンパク質をプローブした。ＵＴ、非形質転換野生型（ＵＴ）；Ｃｏ、コドン最適化配列。定量化のためＣＴＢ標準を指示されるとおりロードし、計算した定量化結果（μｇ／ｍｇ）を各バッチの下に示した。ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＨＣC及びＬＣCを発現するトランスプラストミックレタス植物はペンシルベニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）の温室で生育して採取し、ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＳＣCレタス植物はＦｒａｕｎｈｏｆｅｒ  ｃＧＭＰ施設の水耕培養システムで発芽させて生育し、及び葉は毎月採取した。
【図４−１】天然及びコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１を発現するトランスプラストミックタバコ及びレタス系統の作出及び特徴付け並びにＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＨＣ及びＶＰ１遺伝子の発現のウエスタンブロットによる定量化。（図４Ａ）ＣＴＢ−ＶＰ１発現カセットを含むタバコ及びレタス葉緑体形質転換ベクター。Ｐｒｒｎ、ｒＲＮＡオペロンプロモーター；ａａｄＡ、アミノグリコシド３’−アデニリルトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｙｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子；ＰｐｓｂＡ、ｐｓｂＡ遺伝子のプロモーター及び５’−ＵＴＲ；ＣＴＢ、非毒性コレラＢサブユニットのコード配列；ＶＰ１、ポリオウイルスＶＰ１遺伝子のコード配列（配列番号４）；ＴｐｓｂＡ、ｐｓｂＡ遺伝子の３’−ＵＴＲ；ｔｒｎＩ、イソロイシル−ｔＲＮＡ；ｔｒｎＡ、アラニル−ｔＲＮＡ。
【図４−２】天然及びコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１を発現するトランスプラストミックタバコ及びレタス系統の作出及び特徴付け並びにＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＨＣ及びＶＰ１遺伝子の発現のウエスタンブロットによる定量化。レタス（図４Ｂ）又はタバコ（図４Ｃ）から抽出した全葉タンパク質を指示濃度でロードし、グラジエント（４％〜２０％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。図４Ｄ．野生型（ＷＴ）、天然ＣＴＢ−ＶＰ１（Ｎ）及びコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１（ＣＯ）タバコ植物から抽出した全タンパク質を抗ＣＮＴＢ抗体でプローブした。定量化の標準としてＣＮＴＢをロードした。
【図５】ノーザンブロットによるトランス遺伝子転写物の定量化。２００ｂｐのｐｓｂＡ  ５’ＵＴＲ（ＦＶＩＩＩについて）又はｐｓｂＡ  ３’ＵＴＲ（ＶＰ１について）調節配列でプローブしたＣＮＴＢ−Ｆ８  ＨＣ（図５Ａ）及びＣＮＴＢ−ＶＰ１（図５Ｂ）遺伝子のノーザンブロット。下段及び上段の転写物が内因性ｐｓｂＡ遺伝子及びＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ遺伝子を表す。ローディングが等しいことを評価するため、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色したゲルを含める。ＵＴ、非形質転換野生型；Ｎ、天然配列；ＣＯ、コドン最適化配列。
【図６Ａ】Ｎ末端からＣ末端へのタンパク質配列におけるＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ及びＣＮＴＢ−ＶＰ１タンパク質のＰＲＭ質量分光分析。Ｅｘｅ−ｙは、コドン最適化遺伝子又は天然遺伝子のＣＴＢ−Ｆ８  ＨＣからのペプチドのペプチドモル濃度計測値（カラム上のｆｍｏｌ）を表す。図６Ａ．ＣＮＴＢ：ペプチド１、ＩＦＳＹＴＥＳＬＡＧＫ（配列番号５）；ペプチド２、ＩＡＹＬＴＥＡＫ（配列番号６）；ペプチド３、ＬＣＶＷＮＮＫ（配列番号７）。
【図６Ｂ】Ｎ末端からＣ末端へのタンパク質配列におけるＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ及びＣＮＴＢ−ＶＰ１タンパク質のＰＲＭ質量分光分析。Ｅｘｅ−ｙは、コドン最適化遺伝子又は天然遺伝子のＣＴＢ−Ｆ８  ＨＣからのペプチドのペプチドモル濃度計測値（カラム上のｆｍｏｌ）を表す。図６Ｂ．ＦＶＩＩＩペプチド：ペプチド４、ＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲ（配列番号８）；ペプチド５、ＷＴＶＴＶＥＤＧＰＴＫ（配列番号９）；ペプチド６、ＹＹＳＳＦＶＮＭＥＲ（配列番号１０）。
【図６Ｃ】Ｎ末端からＣ末端へのタンパク質配列におけるＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ及びＣＮＴＢ−ＶＰ１タンパク質のＰＲＭ質量分光分析。Ｅｘｅ−ｙは、コドン最適化遺伝子又は天然遺伝子のＣＴＢ−Ｆ８  ＨＣからのペプチドのペプチドモル濃度計測値（カラム上のｆｍｏｌ）を表す。図６Ｃ．ＣＮＴＢ：ペプチド１、ＩＦＳＹＴＥＳＬＡＧＫ（配列番号１）；ペプチド３、ＬＣＶＷＮＮＫ（配列番号３）；ペプチド２、ＩＡＹＬＴＥＡＫ（配列番号５）。各試料における４つのテクニカルレプリケートの中央値を表す。
【図７】ＰＲＭ質量分光分析及びコドン最適化後に観察される変化倍数。報告される変化倍数の増加は、それぞれ６つ及び３つのペプチド、ＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ（図７Ａ）及びＣＮＴＢ−ＶＰ１（図７Ｂ）による結果の中央値を表す。Ｅｘｅ−ｙは、コドン最適化又は天然植物抽出物からのペプチドの変化倍数の増加（カラム上のｆｍｏｌ計測値に基づく）を表す。ＣＮＴＢ：ペプチド１、ＩＦＳＹＴＥＳＬＡＧＫ（配列番号５）；ペプチド２、ＩＡＹＬＴＥＡＫ（配列番号６）；ペプチド３、ＬＣＶＷＮＮＫ（配列番号７）。ＦＶＩＩＩ：ペプチド４、ＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲ（配列番号８）；ペプチド５、ＷＴＶＴＶＥＤＧＰＴＫ（配列番号９）；ペプチド６、ＹＹＳＳＦＶＮＭＥＲ（配列番号１０）。
【図８Ａ】天然及びコドン最適化ＶＰ１又はＦ８  ＨＣを発現するトランスプラストミック植物のリボソームプロファイリングデータ。統合ゲノムビューワ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ：ＩＧＶ）で天然（Ｎ）トランス遺伝子、コドン最適化（ＣＯ）トランス遺伝子並びに内因性ｐｓｂＡ及びｒｂｃＬ遺伝子のリードカバレッジを表示する。図８Ａ．天然及びコドン最適化ＶＰ１トランス遺伝子を発現するタバコ葉のデータ。天然系統のデータ中の連続したアラニンコドンの各対にアスタリスクを付す。３つの連続したアラニンコドンに＋記号を付す。天然ＶＰ１を発現する植物における多くの強力なリボソームポーズ部位が、対を成すアラニンコドンにマッピングされ、一方、これはコドン最適化系統では観察されない。コドン最適化系統における連続したセリンコドンの各対に三角を付す。主要なリボソームストールは、コドン最適化ＶＰ１遺伝子では５つの密接したセリンコドンを有する領域にマッピングされる。
【図８Ｂ】天然及びコドン最適化ＶＰ１又はＦ８  ＨＣを発現するトランスプラストミック植物のリボソームプロファイリングデータ。統合ゲノムビューワ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ：ＩＧＶ）で天然（Ｎ）トランス遺伝子、コドン最適化（ＣＯ）トランス遺伝子並びに内因性ｐｓｂＡ及びｒｂｃＬ遺伝子のリードカバレッジを表示する。図８Ｂ．天然及びコドン最適化Ｆ８  ＨＣトランス遺伝子を発現するレタス植物のデータ。天然ＦＢ  ＨＣ遺伝子における主要なリボソームストールが、天然ｐｓｂＡ遺伝子では使用されないコドンであるＣＴＣロイシンコドンの隣接する対にマッピングされる。リボソームフットプリントカバレッジはコドン最適化トランス遺伝子ではるかに一様性が高い。
【図８Ｃ】天然及びコドン最適化ＶＰ１又はＦ８  ＨＣを発現するトランスプラストミック植物のリボソームプロファイリングデータ。統合ゲノムビューワ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ：ＩＧＶ）で天然（Ｎ）トランス遺伝子、コドン最適化（ＣＯ）トランス遺伝子並びに内因性ｐｓｂＡ及びｒｂｃＬ遺伝子のリードカバレッジを表示する。図８Ｃ．絶対及び相対リボソームフットプリントカウント。
【図９Ａ】天然及びコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１を発現するトランスプラストミックタバコ及びレタス系統の作出及び特徴付け。図９Ａ．天然及びコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１トランスプラストミックタバコ系統のサザンブロット分析。ＡｆｌＩＩＩで消化した野生型（ＷＴ）及び形質転換（系統１、２、３及び４）ゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩで消化したＤＩＧ標識フランキング配列でプローブした。
【図９Ｂ】天然及びコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１を発現するトランスプラストミックタバコ及びレタス系統の作出及び特徴付け。図９Ｂ．ＣＴＢ−ＶＰ１発現カセットを含むタバコ及びレタス葉緑体形質転換ベクター。Ｐｒｒｎ、ｒＲＮＡオペロンプロモーター；ａａｄＡ、アミノグリコシド３’−アデニリルトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｙｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子；ＰｐｓｂＡ、ｐｓｂＡ遺伝子のプロモーター及び５’−ＵＴＲ；ＣＴＢ、非毒性コレラＢサブユニットのコード配列；ＶＰ１、ポリオウイルスＶＰ１遺伝子のコード配列；ＴｐｓｂＡ、ｐｓｂＡ遺伝子の３’−ＵＴＲ；ｔｒｎＩ、イソロイシル−ｔＲＮＡ；ｔｒｎＡ、アラニル−ｔＲＮＡ；
【図９Ｃ】天然及びコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１を発現するトランスプラストミックタバコ及びレタス系統の作出及び特徴付け。図９Ｃ．葉緑体へのトランス遺伝子の部位特異的組込みを確認するサザンブロット分析。
【図９Ｄ】天然及びコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１を発現するトランスプラストミックタバコ及びレタス系統の作出及び特徴付け。図９Ｄ．２つの独立したレタストランスプラストミック系統及び野生型（ＷＴ）対照におけるＣＴＢ−ＶＰ１のウエスタンブロット分析。
【図１０】トランスプラストミック系統で産生されたＣＴＢ−ＶＰ１の安定性。試験した全ての凍結乾燥試料において周囲温度で４及び８ヵ月間の貯蔵後にＣＴＢ−ＶＰ１融合タンパク質のインタクトな単量体バンドが観察され、いかなる検出可能なＣＴＢ−ＶＰ１の分解もなかった。ＧＭ１結合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、葉緑体で発現したＣＴＢ−ＶＰ１の五量体構造の形成を評価したところ、タバコからの天然の及びコドン最適化した新鮮及び凍結乾燥ＣＴＢ−ＶＰ１の両方がＣＴＢ（陽性対照）と同等の吸光度を示し、一方、野生型植物又はＢＳＡ（陰性対照）からはシグナルは検出されなかった。
【図１１−１】経口又は皮下ワクチン接種後の血清ＶＰ１−ＩｇＧ１及びＶＰ１−ＩｇＡ抗体力価の評価。ＩＰＶでプライミングし、且つサポニン及び／又はスクアレンをアジュバントとしたＩＰＶ又は植物製天然若しくはコドン最適化ＶＰ１のいずれかでブーストしたマウスの抗体反応。プレートを精製ＶＰ１タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングし、血清試料（ブーストの２又は４週間後）、続いてＨＲＰコンジュゲートラット抗マウスＩｇＧ１（１：１０００）（ＢＤ）又はＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＡ（１：５０００）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ）でプローブした。（図１２Ａ〜図１２Ｆ）種々の時点におけるＶＰ１−ＩｇＧ１抗体力価：（図１２Ａ〜図１２Ｄ）週１回のブーストと０、２９、４３及び５７日目の血清試料採取；（図１２Ｅ、図１２Ｆ）月１回のブーストと８７及び１１７日目の試料採取；（図１２Ｇ〜図１２Ｊ）種々の時点におけるＶＰ１−ＩｇＡ抗体力価：（図１２Ｇ〜図１２Ｉ）週１回のブーストと０、２９及び４３日目の血清試料採取；（図１２Ｊ）月１回のブーストと１１７日目の血清試料採取。群１：未処置；群２：ＩＰＶでプライミング及びブースト；群５：ＩＰＶプライミング、アジュバント（サポニン／スクアレン）有りで天然ＶＰ１タンパク質でブースト；群８：ＩＰＶプライミング、アジュバント（サポニン／スクアレン）有りでコドン最適化ＶＰ１タンパク質でブースト；群９：サポニン及びスクアレンの両方をアジュバントとしてコドン最適化ＶＰ１でブースト、但しＩＰＶプライミング無し。スチューデントｔ検定による統計的分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６）。＊＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１を示す。
【図１１−２】経口又は皮下ワクチン接種後の血清ＶＰ１−ＩｇＧ１及びＶＰ１−ＩｇＡ抗体力価の評価。ＩＰＶでプライミングし、且つサポニン及び／又はスクアレンをアジュバントとしたＩＰＶ又は植物製天然若しくはコドン最適化ＶＰ１のいずれかでブーストしたマウスの抗体反応。プレートを精製ＶＰ１タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングし、血清試料（ブーストの２又は４週間後）、続いてＨＲＰコンジュゲートラット抗マウスＩｇＧ１（１：１０００）（ＢＤ）又はＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＡ（１：５０００）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ）でプローブした。（図１２Ａ〜図１２Ｆ）種々の時点におけるＶＰ１−ＩｇＧ１抗体力価：（図１２Ａ〜図１２Ｄ）週１回のブーストと０、２９、４３及び５７日目の血清試料採取；（図１２Ｅ、図１２Ｆ）月１回のブーストと８７及び１１７日目の試料採取；（図１２Ｇ〜図１２Ｊ）種々の時点におけるＶＰ１−ＩｇＡ抗体力価：（図１２Ｇ〜図１２Ｉ）週１回のブーストと０、２９及び４３日目の血清試料採取；（図１２Ｊ）月１回のブーストと１１７日目の血清試料採取。群１：未処置；群２：ＩＰＶでプライミング及びブースト；群５：ＩＰＶプライミング、アジュバント（サポニン／スクアレン）有りで天然ＶＰ１タンパク質でブースト；群８：ＩＰＶプライミング、アジュバント（サポニン／スクアレン）有りでコドン最適化ＶＰ１タンパク質でブースト；群９：サポニン及びスクアレンの両方をアジュバントとしてコドン最適化ＶＰ１でブースト、但しＩＰＶプライミング無し。スチューデントｔ検定による統計的分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６）。＊＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１を示す。
【図１１−３】経口又は皮下ワクチン接種後の血清ＶＰ１−ＩｇＧ１及びＶＰ１−ＩｇＡ抗体力価の評価。ＩＰＶでプライミングし、且つサポニン及び／又はスクアレンをアジュバントとしたＩＰＶ又は植物製天然若しくはコドン最適化ＶＰ１のいずれかでブーストしたマウスの抗体反応。プレートを精製ＶＰ１タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングし、血清試料（ブーストの２又は４週間後）、続いてＨＲＰコンジュゲートラット抗マウスＩｇＧ１（１：１０００）（ＢＤ）又はＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＡ（１：５０００）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ）でプローブした。（図１２Ａ〜図１２Ｆ）種々の時点におけるＶＰ１−ＩｇＧ１抗体力価：（図１２Ａ〜図１２Ｄ）週１回のブーストと０、２９、４３及び５７日目の血清試料採取；（図１２Ｅ、図１２Ｆ）月１回のブーストと８７及び１１７日目の試料採取；（図１２Ｇ〜図１２Ｊ）種々の時点におけるＶＰ１−ＩｇＡ抗体力価：（図１２Ｇ〜図１２Ｉ）週１回のブーストと０、２９及び４３日目の血清試料採取；（図１２Ｊ）月１回のブーストと１１７日目の血清試料採取。群１：未処置；群２：ＩＰＶでプライミング及びブースト；群５：ＩＰＶプライミング、アジュバント（サポニン／スクアレン）有りで天然ＶＰ１タンパク質でブースト；群８：ＩＰＶプライミング、アジュバント（サポニン／スクアレン）有りでコドン最適化ＶＰ１タンパク質でブースト；群９：サポニン及びスクアレンの両方をアジュバントとしてコドン最適化ＶＰ１でブースト、但しＩＰＶプライミング無し。スチューデントｔ検定による統計的分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６）。＊＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１を示す。
【図１１−４】経口又は皮下ワクチン接種後の血清ＶＰ１−ＩｇＧ１及びＶＰ１−ＩｇＡ抗体力価の評価。ＩＰＶでプライミングし、且つサポニン及び／又はスクアレンをアジュバントとしたＩＰＶ又は植物製天然若しくはコドン最適化ＶＰ１のいずれかでブーストしたマウスの抗体反応。プレートを精製ＶＰ１タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングし、血清試料（ブーストの２又は４週間後）、続いてＨＲＰコンジュゲートラット抗マウスＩｇＧ１（１：１０００）（ＢＤ）又はＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＡ（１：５０００）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ）でプローブした。（図１２Ａ〜図１２Ｆ）種々の時点におけるＶＰ１−ＩｇＧ１抗体力価：（図１２Ａ〜図１２Ｄ）週１回のブーストと０、２９、４３及び５７日目の血清試料採取；（図１２Ｅ、図１２Ｆ）月１回のブーストと８７及び１１７日目の試料採取；（図１２Ｇ〜図１２Ｊ）種々の時点におけるＶＰ１−ＩｇＡ抗体力価：（図１２Ｇ〜図１２Ｉ）週１回のブーストと０、２９及び４３日目の血清試料採取；（図１２Ｊ）月１回のブーストと１１７日目の血清試料採取。群１：未処置；群２：ＩＰＶでプライミング及びブースト；群５：ＩＰＶプライミング、アジュバント（サポニン／スクアレン）有りで天然ＶＰ１タンパク質でブースト；群８：ＩＰＶプライミング、アジュバント（サポニン／スクアレン）有りでコドン最適化ＶＰ１タンパク質でブースト；群９：サポニン及びスクアレンの両方をアジュバントとしてコドン最適化ＶＰ１でブースト、但しＩＰＶプライミング無し。スチューデントｔ検定による統計的分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６）。＊＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１を示す。
【図１２−１】ポリオウイルスセービン１、２及び３株に対するポリオウイルス中和力価の決定。サポニン単独（群３及び６）、スクアレン単独（群４及び７）又は両方（群５、８及び９）をアジュバントとして天然又はコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１抗原で経口的にブーストしたマウス（ｎ＝１０／群）のウイルス中和抗体力価；ＩＰＶでプライミング及びブーストしたマウス（群２）；及び未処置マウス。各マウスの個々の力価をプロットした。バーは中和力価平均値±ＳＥＭを表す。ウイルス中和が検出されなかった時点における力価の逆数の血清希釈度を２．５のｌｏｇ2（力価）として記録した。３つ全てのセービン株、（図１２Ａ）セービン１、（図１２Ｂ）セービン２、及び（図１２Ｃ）セービン３に対するポリオウイルス中和抗体  グラフにはスチューデントｔ検定を用いた＊＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１を示す（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６）。
【図１２−２】ポリオウイルスセービン１、２及び３株に対するポリオウイルス中和力価の決定。サポニン単独（群３及び６）、スクアレン単独（群４及び７）又は両方（群５、８及び９）をアジュバントとして天然又はコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１抗原で経口的にブーストしたマウス（ｎ＝１０／群）のウイルス中和抗体力価；ＩＰＶでプライミング及びブーストしたマウス（群２）；及び未処置マウス。各マウスの個々の力価をプロットした。バーは中和力価平均値±ＳＥＭを表す。ウイルス中和が検出されなかった時点における力価の逆数の血清希釈度を２．５のｌｏｇ2（力価）として記録した。３つ全てのセービン株、（図１２Ａ）セービン１、（図１２Ｂ）セービン２、及び（図１２Ｃ）セービン３に対するポリオウイルス中和抗体  グラフにはスチューデントｔ検定を用いた＊＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１を示す（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６）。
【図１３−１】皮下ＩＰＶ又は経口ＶＰ１ブースティング後のセービン１、２及び３中和力価の血清陽性率。血清有病マウス（中和抗体ｌｏｇ2（力価）≧３）の数と、１日目及び３０日目に天然又はコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１でブーストするか（群３〜９）、又はＩＰＶプライム／ブースト（群２）の各群のマウスの総数により決定されるとおりのポリオウイルス中和抗体の血清陽性率。セービン株１、２及び３（図１３Ａ〜図１３Ｃ）及び３つ全てのセービン型（図１３Ｄ）に対する中和力価の血清陽性率を示す。図１３Ｅ．血清陽性率の結果（％）。＊＊、Ｐ＜０．０５、＊＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊、Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定を用いてグラフに指示するとおり（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６）。
【図１３−２】皮下ＩＰＶ又は経口ＶＰ１ブースティング後のセービン１、２及び３中和力価の血清陽性率。血清有病マウス（中和抗体ｌｏｇ2（力価）≧３）の数と、１日目及び３０日目に天然又はコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１でブーストするか（群３〜９）、又はＩＰＶプライム／ブースト（群２）の各群のマウスの総数により決定されるとおりのポリオウイルス中和抗体の血清陽性率。セービン株１、２及び３（図１３Ａ〜図１３Ｃ）及び３つ全てのセービン型（図１３Ｄ）に対する中和力価の血清陽性率を示す。図１３Ｅ．血清陽性率の結果（％）。＊＊、Ｐ＜０．０５、＊＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊、Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定を用いてグラフに指示するとおり（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６）。
【図１４】タバコ葉緑体形質転換ベクター（ｐＬＤ−ｕｔｒ）への天然ＣＴＢと融合したコドン最適化合成ＩＧＦ−１の構築及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるその発現の確認。（図１４Ａ）ＣＴＢ−ＩＧＦ−１発現カセットを含む葉緑体形質転換ベクターマップの概略図。Ｐｒｒｎ、ｒＲＮＡオペロンプロモーター；ａａｄＡ、アミノグリコシド３’−アデニリルトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｙｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子；ＰｐｓｂＡ、ｐｓｂＡ遺伝子のプロモーター及び５’−ＵＴＲ；ＣＴＢ、天然コレラ非毒性Ｂサブユニットのコード配列；ＩＧＦ−１（ＣN）、コドン最適化ヒトインスリン様成長因子１（Ｅａペプチドの３５アミノ酸を含む１０５アミノ酸）；ＴｐｓｂＡ、ｐｓｂＡ遺伝子の３’−ＵＴＲ；ｔｒｎＩ、イソロイシル−ｔＲＮＡ；ｔｒｎＡ、アラニル−ｔＲＮＡ。（図１４Ｂ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＩＧＦ−１のコドン最適化配列の発現に関するイムノブロットアッセイ。ＩＧＦ−１の２つのコドン最適化配列（ＣO、コドン最適化した古い方；ＣN、コドン最適化した新しい方）を含む葉緑体発現ベクターで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から全タンパク質を抽出した。指示されるとおりタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、抗ＣＴＢ抗体（１対１０，０００）でプローブした。２つの合成配列（ＣO及びＣN）間の発現の倍数差をＩｍａｇｅ  Ｊを用いて計算した。形質転換及び非形質転換（ＵＴ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を補足したルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地中において３７℃で一晩インキュベートした。矢印はサイズが予想されたタンパク質を示す（ＣＴＢ−ＩＧＦ−１、２４．３ｋＤａ）（図１４Ｃ）ＣＴＢ−ＩＧＦ−１トランスプラストミック系統のサザンブロット分析。トランスプラストミック植物からのゲノムＤＮＡをＡｆｌＩＩＩで消化し、ｐＵＣ−ｃｔｖのＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ消化によって作成した後のサザンブロットプローブ（ＳＢ−Ｐ）領域の０．８１ｋｂをプローブとして使用した。
【図１５】トランスプラストミック系統（ｔｒｎａｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ  ｌｉｎｅ）におけるＣＴＢ−ＩＧＦ−１の定量化及び機能分析。抗ＣＴＢ（図１５Ａ）及び抗ＩＧＦ−１（図１５Ｂ）に対する凍結乾燥ＣＴＢ−ＩＧＦ−１トランスプラストミック系統のウエスタンブロット分析。レーン１、２ｎｇ；２、４ｎｇ；３、８ｎｇのコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）；１−１、２ｎｇ；２−１、４ｎｇ；３−１、８ｎｇのヒトインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）；４、０．１ｕｇ；５、０．２ｕｇ；６、０．４ｕｇのＣＴＢ−ＩＧＦ−１凍結乾燥葉ホモジネート。約２４．３ｋＤａのＣＴＢ−ＩＧＦ−１タンパク質を矢印で示す。（図１５Ｃ）新鮮及び凍結乾燥ＣＴＢ−ＩＧＦ−１からの全葉タンパク質のイムノブロット評価。等量の新鮮葉及び凍結乾燥葉を同じ容積の抽出緩衝液中に抽出し、次にそれらを段階希釈液にロードした。矢印はＣＴＢ−ＩＧＦ−１の予想サイズを示す。（図１５Ｄ）ＧＭ１受容体に対するＣＴＢ−ＩＧＦ−１五量体形態のＥＬＩＳＡアッセイ。ＢＳＡ及びＧＭ１を陰性対照として使用した。
【図１６】植物由来ＩＧＦ−１の活性アッセイ。（図１６Ａ）ＣＴＢ−ＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１受容体のリン酸化に関する細胞ベースのアッセイ。Ｐ−ＩＧＦＲはリン酸化したＩＧＦ−１受容体を示し、及びＧＡＰＤＨ／Ａｋｔを対照として使用した。上図は用量に依存的なリン酸化であり、下図は時間に依存的なリン酸化を示す。（図１６Ｂ）強制経口投与後の時間に依存的なマウス（ｎ＝３）血清中の循環Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１量。（図１６Ｃ）強制経口投与後の時間に依存的な血中グルコース量。植物ＧＦＰを同量の植物由来ＣＴＢ−ＩＧＦ−１における対照として利用した。（図１６Ｄ）植物由来ＣＴＢ−ＩＧＦ−１を強制経口投与した後に血清及び筋組織で検出されたＩＧＦ−１。植物ＧＦＰを強制経口投与対照として使用し、及びＧＡＰＤＨが筋組織における陽性対照であった。
【図１７−１】精製ＣＴＢ−ＩＧＦ−１によるヒト及び／又はマウス細胞の増殖アッセイ（図１７Ａ）タバコトランスプラストミック系統からのＣＴＢ−ＩＧＦ−１の精製。Ｃ、精製後のＣＴＢ−ＩＧＦ−１のクーマシーブルー（ｃｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染色；Ｗ、ＣＴＢ抗体に対するウエスタンブロットアッセイ。矢印は約２４．３ｋＤａのＣＴＢ−ＩＧＦ−１を示す。（図１７Ｂ）植物からのＩＧＦ−１ペプチド及び精製ＣＴＢ−ＩＧＦ−１の濃度系列とのＨＯＫ（ヒト口腔ケラチノサイト）のインキュベーション後４８時間。２，５００個のＨＯＫ細胞を播種してから１８時間後、それをＩＧＦ−１及び精製ＣＴＢ−ＩＧＦ−１と共に４８時間インキュベートした。生細胞の密度をＭＴＴアッセイ（ｅｓｓａｙ）によって吸光度５７０で計測した。ＩＧＦ−１ペプチドを陽性対照として利用した。（図１７Ｃ）ＣＴＢ−ＩＧＦ−１用量依存的なＧＭＳＣ（ヒト歯肉由来間葉系間質細胞）の相対吸光度。４０００個のＧＭＳＣ細胞を播種し、ＣＴＢ−ＩＧＦ−１及び対照としてのＩＧＦ−１と共に２４時間インキュベートした後に生細胞を計測した。（図１７Ｄ）ＩＧＦ−１及びＣＴＢ−ＩＧＦ−１と共に４８時間インキュベートした後、生存ＳＣＣ（ヒト頭頸部扁平上皮癌細胞）の吸光度を計測した。インキュベーションには３０００個のＳＣＣを播種した。（図１７Ｅ）２４時間インキュベートした後のＭＣ３ＴＣ（マウス骨芽細胞）のＣＴＢ−ＩＧＦ−１用量依存的相対吸光度。４０００個のＭＣ３ＴＣを播種した。（図１７Ｂ〜図１７Ｅ）これは、各々が、３回繰り返して行った２つのバイオロジカルリピートから得られたデータの代表である。（図１７Ｆ）天然及びコドン最適化（Ｎａｔ及びＣｏ）ＩＧＦ−１遺伝子の配列アラインメント。最適化コドンには黄色を付す。Ｎａｔ：天然配列；Ｃｏ：コドン最適化配列。グリコシル化を回避するため、Ｌｓｙ68（ＡＡＧ）、Ａｒｇ74（ＣＧＴ）及びＡｒｇ77（ＣＧＣ）をＧｌｙ68（ＧＧＴ）、Ａｌａ74（ＧＣＡ）及びＡｌａ77（ＧＣＴ）に変えた（これらには赤色を付す）。
【図１７−２】精製ＣＴＢ−ＩＧＦ−１によるヒト及び／又はマウス細胞の増殖アッセイ（図１７Ａ）タバコトランスプラストミック系統からのＣＴＢ−ＩＧＦ−１の精製。Ｃ、精製後のＣＴＢ−ＩＧＦ−１のクーマシーブルー（ｃｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染色；Ｗ、ＣＴＢ抗体に対するウエスタンブロットアッセイ。矢印は約２４．３ｋＤａのＣＴＢ−ＩＧＦ−１を示す。（図１７Ｂ）植物からのＩＧＦ−１ペプチド及び精製ＣＴＢ−ＩＧＦ−１の濃度系列とのＨＯＫ（ヒト口腔ケラチノサイト）のインキュベーション後４８時間。２，５００個のＨＯＫ細胞を播種してから１８時間後、それをＩＧＦ−１及び精製ＣＴＢ−ＩＧＦ−１と共に４８時間インキュベートした。生細胞の密度をＭＴＴアッセイ（ｅｓｓａｙ）によって吸光度５７０で計測した。ＩＧＦ−１ペプチドを陽性対照として利用した。（図１７Ｃ）ＣＴＢ−ＩＧＦ−１用量依存的なＧＭＳＣ（ヒト歯肉由来間葉系間質細胞）の相対吸光度。４０００個のＧＭＳＣ細胞を播種し、ＣＴＢ−ＩＧＦ−１及び対照としてのＩＧＦ−１と共に２４時間インキュベートした後に生細胞を計測した。（図１７Ｄ）ＩＧＦ−１及びＣＴＢ−ＩＧＦ−１と共に４８時間インキュベートした後、生存ＳＣＣ（ヒト頭頸部扁平上皮癌細胞）の吸光度を計測した。インキュベーションには３０００個のＳＣＣを播種した。（図１７Ｅ）２４時間インキュベートした後のＭＣ３ＴＣ（マウス骨芽細胞）のＣＴＢ−ＩＧＦ−１用量依存的相対吸光度。４０００個のＭＣ３ＴＣを播種した。（図１７Ｂ〜図１７Ｅ）これは、各々が、３回繰り返して行った２つのバイオロジカルリピートから得られたデータの代表である。（図１７Ｆ）天然及びコドン最適化（Ｎａｔ及びＣｏ）ＩＧＦ−１遺伝子の配列アラインメント。最適化コドンには黄色を付す。Ｎａｔ：天然配列；Ｃｏ：コドン最適化配列。グリコシル化を回避するため、Ｌｓｙ68（ＡＡＧ）、Ａｒｇ74（ＣＧＴ）及びＡｒｇ77（ＣＧＣ）をＧｌｙ68（ＧＧＴ）、Ａｌａ74（ＧＣＡ）及びＡｌａ77（ＧＣＴ）に変えた（これらには赤色を付す）。
【図１８Ａ】葉緑体形質転換ベクターへのパエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株ＲＭ１のコドン最適化ムタナーゼ配列の構築。５’末端にプロテグリンを付加し、及び３’末端にＨｉｓタグを付加した。図１８Ａ：最適化ムタナーゼコード配列を提供するベクター構築。
【図１８Ｂ】葉緑体形質転換ベクターへのパエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株ＲＭ１のコドン最適化ムタナーゼ配列の構築。５’末端にプロテグリンを付加し、及び３’末端にＨｉｓタグを付加した。図１８Ｂ：ｐｓｂＡ遺伝子のコドン頻度に基づきムタナーゼ遺伝子をコドン最適化した。この表は天然及びコドン最適化ムタナーゼ配列のコドン頻度を示す。
【図１８Ｃ】葉緑体形質転換ベクターへのパエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株ＲＭ１のコドン最適化ムタナーゼ配列の構築。５’末端にプロテグリンを付加し、及び３’末端にＨｉｓタグを付加した。図１８Ｃ．制限消化によるｐＬＳ−ＭＦベクター中のムタナーゼ遺伝子の確認。レーン１：ＤＮＡマーカー；レーン２：Ｎｄｅ  Ｉ及びＢｇｌ  ＩＩで消化したｐＬＳ−ＭＦムタナーゼ；レーン３：Ｓａｌ  Ｉ及びＰｓｈＡ  ＩＩで消化したｐＬＳ−ＭＦムタナーゼ；レーン４：未消化プラスミド。
【図１８Ｄ】葉緑体形質転換ベクターへのパエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株ＲＭ１のコドン最適化ムタナーゼ配列の構築。５’末端にプロテグリンを付加し、及び３’末端にＨｉｓタグを付加した。図１８Ｄ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えタンパク質の発現を検出するウエスタンブロット分析：抗Ｈｉｓ抗体でプローブしたウエスタンブロット。ムタナーゼ遺伝子をｐＬＤ及びｐＬＳ−ＭＦベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させた。タンパク質を更に精製し、その発現をウエスタンブロットによって確認した。
【図１８Ｅ】葉緑体形質転換ベクターへのパエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株ＲＭ１のコドン最適化ムタナーゼ配列の構築。５’末端にプロテグリンを付加し、及び３’末端にＨｉｓタグを付加した。図１８Ｅ．ムタナーゼ（ｍｕｔａｎｓｅ）アッセイの結果を示す。
【図１８Ｆ】葉緑体形質転換ベクターへのパエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株ＲＭ１のコドン最適化ムタナーゼ配列の構築。５’末端にプロテグリンを付加し、及び３’末端にＨｉｓタグを付加した。図１８Ｆ．ムタナーゼを発現するトランスプラストミック植物を作出するための植物形質転換方法の概略。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明では、葉緑体ゲノム配列を利用した異種遺伝子発現、リボソームプロファイリング及び質量分析法又は並列反応モニタリング（ＰＲＭ）によるターゲットプロテオーム定量化を用いることにより、葉緑体における目的の異種タンパク質の翻訳を増加させる方法を開発した。１３３の植物種のｐｓｂＡ遺伝子に基づくコドン最適化により、同一のｐｓｂＡ調節配列によってドライブされる対応する天然遺伝子と比較したとき、ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）及びポリオウイルスカプシドタンパク質１（ＶＰ１）の重鎖の翻訳効率が増加した。Ｎ末端又はＣ末端からのペプチドを使用したＰＲＭ分析では、ＦＶＩＩＩ又はＶＰ１コドン最適化遺伝子の５〜７倍又は２２〜２８倍の増加が示された。同じバッチの材料のウエスタンブロット分析では、より低い定量或いはより高い定量のいずれも示され、何らかの限界が浮き彫りとなった。ＰＲＭは、植物細胞におけるバイオ医薬品の定量に関してここで初めてバリデートされ、不溶性又は多量体タンパク質に特に有用である。原核生物起源であるにも関わらず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と葉緑体との間ではコドン使用が異なる。ノーザンブロットにより、コドン最適化タンパク質合成の増加が、転写物の存在量又は安定性に対する任意の影響というよりむしろ、翻訳レベルでの増加であることが確認された。リボソームフットプリントはＦＶＩＩＩコドン最適化後にＶＰ１翻訳に比例して増加することなく、又は減少さえしたが、律速段階の診断に有用である。天然遺伝子のＣＴＣロイシンコドンにおける主要なリボソームポーズがコドン最適化時に除去された。コドン最適化ＶＰ１遺伝子においてはセリンコドンのクラスターにリボソームストールが観察された。ＣＴＣロイシンクラスターを除去する合成配列が、かかる配列を更に最適化する。
【００１９】
ＷＨＯの戦略的諮問専門家グループ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｔｓ）は、２０１６年、全世界に向けてＯＰＶ２を完全に使用中止し、少なくとも１回のＩＰＶ接種に置き換えることを勧告した。しかしながら、高いコスト、ＩＰＶの限られた供給、持続的なｃＶＤＰＶ伝播及び後のブースティングの必要性については依然として解決されていない。低コストでコールドチェーンが不要の植物製ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）サブユニットワクチンを単回のＩＰＶプライミング後の経口ブースターとして使用する戦略は、この危急の必要性に応える新規解決法である。植物細胞にバイオカプセル化したＶＰ１の経口ブースティングは、３つ全てのポリオウイルスセービン血清型に対して高いＶＰ１−ＩｇＧ１、ＩｇＡ及び中和抗体力価（約３．１７〜１０．１７ｌｏｇ2力価）をもたらした。ＶＰ１を発現する凍結乾燥植物細胞を有効性の損失なしに周囲温度で無期限に貯蔵可能であることにより、現在全てのワクチンに必要なコールドチェーンが廃止される。これらの知見は、植物製ブースターワクチンがＯＰＶに取って代わること、又は年少期に受けた免疫の免疫力が弱まっている高齢者集団で免疫力をブーストすることについてのエビデンスを提供する。
【００２０】
定義：
前述の概要及び以下の詳細な説明は、いずれも例示的及び説明的なものに過ぎず、本教示の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。本願においては、特に具体的に明記されない限り、単数形の使用が複数形を含む。例えば、「少なくとも１つ」は、２つ以上が存在し得ることを意味する。また、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「〜を含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、及び「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、又はこれらの語幹を持つ単語の変化形、例えば限定はされないが、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含んだ（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）」、及び「〜を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定を意図するものでなく、「以下の要素を含むが、他の要素を除外しない」ことを意味する。
【００２１】
用語「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、又は「〜から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、本明細書で使用されるとき、他の要素がその組み合わせにいかなる本質的な重要性を及ぼすことも除外する。「又は」の使用は、特に明記しない限り、「及び／又は」を意味する。用語「及び／又は」は、その前及び後にある用語をまとめて考慮しても、又は別々に考慮してもよいことを意味する。例示として、但し限定でなく、「Ｘ及び／又はＹ」は「Ｘ」又は「Ｙ」又は「Ｘ及びＹ」を意味することができる。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、薬剤、薬物、又はペプチドを対象に「投与すること」又は「投与」という用語には、化合物をその意図される機能が発揮されるように対象に導入又は送達する任意の経路が含まれる。投与すること又は投与は、経口的、鼻腔内、非経口的（静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、直腸内、又は局所的なものを含め、任意の好適な経路によって行うことができる。投与すること又は投与には、自己投与及び他者による投与が含まれる。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、用語「疾患」、「障害」、又は「合併症」は、対象の正常状態からの任意の逸脱を指す。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、用語「有効量」「有効な量」などは、所望の結果を実現するのに必要な投与量で及び期間にわたって有効な量を意味する。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、用語「阻害する」又は「治療する」は、疾患状態の臨床症状を悪化させない又は発症させないこと、例えば、疾患状態に曝露されている又はそれに罹り易い可能性があるものの、疾患状態の症状はまだ現れていない又はそれを示していない対象において、疾患の発生を阻害することを意味する。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＴＢ」はコレラ毒素Ｂサブユニットを指す。コレラ毒素は、１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットとを含むタンパク質複合体である。Ｂサブユニットは非毒性であり、それによってタンパク質がガングリオシドの五糖鎖を介して細胞表面に結合することが可能となるため、タンパク質複合体にとって重要である。
【００２７】
「レプリコン」は、概してそれ自体の制御下での複製能を有する任意の遺伝要素、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ又はウイルスである。レプリコンはＲＮＡ又はＤＮＡのいずれであってもよく、且つ一本鎖又は二本鎖であってもよい。
【００２８】
「ベクター」は、そこに別の遺伝子配列又はエレメント（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）が付加され、付加された配列又はエレメントの複製をもたらす任意の媒体である。
【００２９】
「発現オペロン」は、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧ又はＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写及び翻訳制御配列を有し得る核酸セグメントであって、宿主細胞又は生物におけるポリペプチドコード配列の発現を促進するものを指す。
【００３０】
用語「プロモーター領域」は、遺伝子の５’調節領域（例えば、５’ＵＴＲ配列（例えば、ｐｓｂＡ配列、プロモーター（例えば、形質転換する植物にとって内因性のユニバーサルＰｒｎｎプロモーター又はｐｓｂＡプロモーター及び任意選択のエンハンサーエレメントを指す。
【００３１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用されるとき、本発明の配列、プライマー及びプローブを指し、２つ以上の、好ましくは３つより多いリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、種々の要因、並びにそのオリゴヌクレオチドの詳細な適用及び使用に依存することになる。
【００３２】
語句「特異的にハイブリダイズする」は、当該技術分野において一般に用いられる所定の条件下でかかるハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な（時に「実質的に相補的」と称される）配列の２つの一本鎖核酸分子間の会合を指す。詳細には、この用語は、本発明の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを指し、非相補配列の一本鎖核酸とのそのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの実質的な除外を指す。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、用語「レポーター」、「レポーターシステム」、「レポーター遺伝子」、又は「レポーター遺伝子産物」は、例えば生物学的アッセイ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイによるか、又は熱量測定、蛍光発生、化学発光若しくは他の方法によって容易に計測可能なレポーターシグナルを発現時に生成する産物をコードする遺伝子が核酸に含まれる作動可能な遺伝的システムを意味するものとする。核酸はＲＮＡ又はＤＮＡ、線状又は環状、一本鎖又は二本鎖、アンチセンス又はセンス極性のいずれであってもよく、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御エレメントに作動可能に連結される。必要な制御エレメントは、レポーターシステムの性質及びレポーター遺伝子の形態がＤＮＡか、それともＲＮＡかによって異なり得るが、限定はされないが、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグナルなどのようなエレメントが含まれ得る。
【００３４】
用語「形質転換する」、「トランスフェクトする」、「形質導入する」は、細胞又は宿主生物に核酸を導入する任意の方法又は手段を指すものとし、同じ意味を伝えて同義的に使用され得る。かかる方法としては、限定はされないが、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、ＰＥＧ融合などが挙げられる。
【００３５】
用語「選択可能なマーカー遺伝子」は、発現時に形質転換細胞又は植物に抗生物質耐性などの選択可能な表現型を付与する遺伝子を指す。プラスチド形質転換ベクターにおいて有用な選択可能なマーカーとしては、限定なしに、スペクチノマイシン耐性、グリホセート耐性、ＢＡＤＨ耐性、及びカナマイシン耐性をコードするものが挙げられる。
【００３６】
用語「作動可能に連結された」は、コード配列の発現に必要な調節配列がＤＮＡ分子においてコード配列に対してそのコード配列の発現を生じさせるように適切な位置に置かれていることを意味する。この同じ定義が、時に発現ベクターにおける転写単位及び他の転写制御エレメント（例えばエンハンサー）の配置に適用されることもある。
【００３７】
用語「ＤＮＡコンストラクト」は、植物の形質転換及び子孫トランスジェニック植物の作成に使用される遺伝子配列を指す。これらのコンストラクトは、ウイルスベクター又はプラスミドベクターで植物に投与し得る。しかしながら、本発明での使用に最も好ましいのは、プラスチド形質転換ベクターである。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔ−ＤＮＡ介在性形質転換及び微粒子銃方法を用いた形質転換などの他の送達方法もまた、本発明の範囲内にあることが企図される。形質転換用ＤＮＡは、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，ｅｄｓ．Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５に示されるものなどの標準的なプロトコルに従い調製し得る。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、用語「葉緑体」には、植物細胞及び光合成を行う他の真核生物に見られる細胞小器官又はプラスチドが含まれる。葉緑体は光エネルギーを捕捉して自由エネルギーをＡＴＰの形態で確保し、光合成と呼ばれる複雑な一組のプロセスを経てＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する。葉緑体はクロロフィルを含有する。葉緑体ではトランス遺伝子のコピー数及び発現レベルが高い。各葉緑体が最大１００個のゲノムを含有し得る一方、各植物細胞が最大１００個の葉緑体を含有し得る。従って、各植物細胞が１０００００個もの葉緑体ゲノムを含有することができ、これが葉緑体ゲノムによって発現されるタンパク質の高い発現レベルをもたらす。更に、葉緑体ゲノムは核ゲノムＤＮＡと異なり花粉によって伝達されないため、葉緑体は母性遺伝を通じた遺伝子の封じ込めを提供する。葉緑体はポリシストロニックＲＮＡを転写する能力を有し、ジスルフィド結合、多量体のアセンブリ及び脂質修飾などの翻訳後修飾を行う能力を含め、真核生物タンパク質の正しいプロセシングを実施することができる。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「組成物」、「医薬組成物」又は「治療剤」は全て、本明細書に記載されるとおりのコンストラクトを含むミエリン塩基性タンパク質を含む組成物を含む。任意選択で、「組成物」、「医薬組成物」又は「治療剤」は、薬学的に許容可能な希釈剤又は担体を更に含む。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、遺伝子又はポリヌクレオチドの文脈で用語「発現」とは、遺伝子又はポリヌクレオチドのＲＮＡへの転写を含む。この用語はまた、必ずしもというわけではないが、続くＲＮＡのポリペプチド鎖への翻訳及びそのタンパク質へのアセンブリも含み得る。
【００４１】
植物レムナントには、目的のタンパク質が発現した植物に由来する１つ以上の分子（限定はされないが、タンパク質及びその断片、ミネラル類、ヌクレオチド及びその断片、植物構造成分等）が含まれ得る。従って、全植物材料（例えば、植物の葉、茎、果実等の全体又は一部分）又は粗植物抽出物に関する組成物であれば、並びに１つ以上の検出可能な植物レムナントを有する精製された目的のタンパク質を含む組成物も、高濃度の植物レムナントを必ず含有し得る。具体的な実施形態において、植物レムナントはルビスコである。
【００４２】
別の実施形態において、本発明は、植物葉緑体で産生される治療用融合タンパク質の投与によって疾患を治療又は予防するための投与可能な組成物に関する。本組成物は、植物が発現する融合タンパク質の治療有効量及び植物レムナントを含む。
【００４３】
本明細書に教示される特定の実施形態において発現するタンパク質は、種々の方法で対象、ヒト又は動物に投与することによりインビボで使用され得る。医薬組成物は経口的又は非経口的に、即ち、皮下、筋肉内又は静脈内に投与されてもよく、しかし経口投与が好ましい。
【００４４】
本発明の実施形態によって作製される経口組成物は、プラスチド由来の治療用融合タンパク質を産生するトランスジェニック植物を用いて製造された食品材料の摂取により投与することができる。植物の可食部、又はその一部分が、食事成分として使用される。治療用組成物は、所望の投与様式に適切な固体又は液体媒体、希釈剤及び添加剤を用いて古典的な方法で製剤化することができる。経口的には、組成物は、少なくとも１つの媒体、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチン等を含む錠剤、カプセル、顆粒、散剤、チュアブルガムなどの形態で投与することができる。調製物はまたエマルション化されてもよい。活性免疫原性又は治療用成分は、多くの場合に、薬学的に許容可能な、且つ活性成分と適合性のある賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びこれらの組み合わせである。加えて、必要であれば、組成物は湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又はアジュバントなどの少量の補助物質を含有してもよい。好ましい実施形態では、医薬品を作り出すトランスジェニック植物の食用植物、ジュース、穀粒、葉、塊茎、茎、種子、根又は他の植物部位がヒト又は動物によって摂取され、ひいては疾患を治療する又は疾患に対して免疫する極めて安価な手段がもたらされる。
【００４５】
具体的な実施形態において、治療用融合タンパク質の発現能を有する葉緑体を含む植物材料（例えばレタス、トマト、ニンジン、低ニコチンタバコ材料等）は、ホモジナイズされ、カプセル化される。具体的な一実施形態において、レタス材料の抽出物がカプセル化される。代替的実施形態において、レタス材料はカプセル化前に粉末化される。
【００４６】
代替的実施形態において、投与の便宜上、組成物はトランスジェニック植物のジュースで提供され得る。前記目的のため、形質転換する植物は、好ましくは、とりわけトマト、ニンジン及びリンゴ（これらは通常はジュースの形態で摂取される）からなる食用植物から選択される。
【００４７】
別の実施形態によれば、本発明は、本明細書に開示されるとおりの治療用融合タンパク質又はペプチドを発現する異種遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換葉緑体ゲノムに関する。
【００４８】
本明細書におけるタンパク質配列の参照は、既知の完全長アミノ酸配列並びにかかるアミノ酸配列から選択される少なくとも１２、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０又は２６５連続アミノ酸、又はその生物学的に活性な変異体に関する。典型的には、ポリペプチド配列は既知のヒトバージョンの配列に関する。
【００４９】
同一性パーセントのばらつきは、例えば、アミノ酸置換、挿入、又は欠失に起因し得る。アミノ酸置換は、１対１のアミノ酸の置き換えと定義される。アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸が同様の構造的及び／又は化学的特性を有するとき、本質的に保存的である。保存的な置き換えの例は、ロイシンのイソロイシン又はバリンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、又はスレオニンのセリンによる置換である。
【００５０】
アミノ酸挿入又は欠失は、アミノ酸配列への変化又はアミノ酸配列内での変化である。それらは典型的には約１〜５アミノ酸の範囲内に収まる。ポリペプチドの生物学的又は免疫学的活性を消失させることなく、どのアミノ酸残基を置換し、挿入し、又は欠失させ得るかを決定する際の指針は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアなど、当該技術分野において周知のコンピュータプログラムを用いて見付け出すことができる。アミノ酸変化が生物学的に活性な治療用融合ポリペプチドをもたらすかどうかは、例えば以下の具体的な実施例に記載されるとおりの、天然の活性に関するアッセイによって容易に判定することができる。
【００５１】
本明細書における遺伝子配列への言及は、一本鎖又は二本鎖核酸配列を指し、及び目的のポリペプチドのコード配列又はそのコード配列の相補体を含む。ポリペプチドをコードする縮重核酸配列、並びにｃＤＮＡと少なくとも約５０、５５、６０、６５、６０、好ましくは約７５、９０、９６、又は９８％同一である相同ヌクレオチド配列は、本明細書の教示においてポリヌクレオチドとして使用され得る。２つのポリヌクレオチドの配列間のパーセント配列同一性は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを利用するＡＬＩＧＮなどのコンピュータプログラムを用いて、ギャップ開始ペナルティ−１２及びギャップ伸長ペナルティ−２でアフィンギャップ検索を用いて決定される。生物学的に活性なポリペプチドをコードする核酸配列の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体、及び変異体もまた、有用なポリヌクレオチドである。
【００５２】
上記に記載した核酸配列の変異体及び相同体もまた、有用な核酸配列である。典型的には、相同ポリヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知のとおり、ストリンジェントな条件下で候補ポリヌクレオチドが既知のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより同定し得る。例えば、以下の洗浄条件：２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温２回、各３０分；次に２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃１回、３０分；次に２×ＳＳＣ、室温２回、各１０分を用いると、高々約２５〜３０％の塩基対ミスマッチを含む相同配列を同定することができる。より好ましくは、相同核酸鎖は１５〜２５％の塩基対ミスマッチ、更により好ましくは５〜１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００５３】
本明細書において言及されるポリヌクレオチドの種相同体もまた、好適なプローブ又はプライマーを作製してｃＤＮＡ発現ライブラリをスクリーニングすることにより同定し得る。相同性が１％低下する毎に二本鎖ＤＮＡのＴｍが１〜１．５℃ずつ低下することは周知である（Ｂｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１，１２３（１９７３）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件に従い目的のポリヌクレオチド又はその相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた、有用なポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は周知であり、当該技術分野において理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２nd  ｅｄ．，１９８９の９．５０〜９．５１頁に開示されている。
【００５４】
典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、試験下のハイブリッドのＴm計算値を約１２〜２０℃下回る温度及び塩濃度の組み合わせが選択されなければならない。目的のポリヌクレオチド又はその相補体と、それらのヌクレオチド配列のうちの１つと少なくとも約５０、好ましくは約７５、９０、９６、又は９８％同一のポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴmは、例えば、Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４８，１３９０（１９６２）の式：
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）、
［式中、ｌ＝塩基対単位でのハイブリッドの長さ］
を用いて計算することができる。
【００５５】
ストリンジェントな洗浄条件としては、例えば、４×ＳＳＣで６５℃、又は５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣで４２℃、又は０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃が挙げられる。高度にストリンジェントな洗浄条件としては、例えば、０．２×ＳＳＣで６５℃が挙げられる。本発明の実施を容易にするため、以下の材料及び方法を提供する。
【００５６】
コドン最適化
葉緑体における異種遺伝子の発現を最大化するため、１３３の種子植物種にわたるｐｓｂＡ遺伝子のコドン優先度に基づき葉緑体コドン最適化プログラムを開発した。配列は全て、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＧｅｎｏｍｅｓＧｒｏｕｐ．ｃｇｉ？ｔａｘｉｄ＝２７５９＆ｏｐｔ＝ｐｌａｓｔｉｄ）からダウンロードした。１３３個のｐｓｂＡ遺伝子からの合計４６，５００個のコドンを分析することにより、各アミノ酸について同義コドン間での使用優先度を決定した。ＪＡＶＡを用いて最適化アルゴリズム（クロロプラスト・オプティマイザー（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）ｖ２．１）を作製し、レアコドンから葉緑体で高頻度に使用されるコドンへの変更を促進した。
【００５７】
トランスプラストミック系統の作出
ｐＡＡＶ−ＴＴＲ−ｈＦ８−ミニプラスミド（Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）をＰＣＲ鋳型として使用して、ＦＶＩＩＩ重鎖（ＨＣ）の天然配列を増幅した。コドン・オプティマイザー（Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）ｖ２．１を使用して得たコドン最適化ＨＣ配列がＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって合成された。本発明者らはまた、ＦＶＩＩＩ軽鎖（ＬＣ）、ＩＦＧ−１及びムタナーゼも最適化した。セービン１（Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎ  Ｃｈｕｍａｋｏｖ博士、ＦＤＡより供与いただいた）の天然ＶＰ１遺伝子（９０６ｂｐ）をＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。コドン最適化ＶＰ１配列もまたＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成された。増幅した合成の遺伝子配列をそれぞれラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）及びプティ・ハバナ（Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ）の葉緑体形質転換ベクターｐＬＳＬＦ及びｐＬＤ−ｕｔｒにクローニングした。以前記載のとおり（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、配列が確認されたプラスミドをボンバードメントに使用してトランスプラストミック植物を作出した。サザンブロット分析を用いたトランスプラストミック系統の確認を以前記載のとおり行い（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、但しプローブ標識及び検出については、ＤＩＧ  ｈｉｇｈ  ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識及び検出スターターキットＩＩ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１５８５６２４９１０）を使用した。
【００５８】
翻訳の評価
天然配列とコドン最適化配列との間でタンパク質発現レベルを比較するため、抗ＣＮＴＢ抗体を用いてイムノブロット及びデンシトメトリーアッセイを実施した。１×ＰＢＳ及び５ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を超音波処理することにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から全タンパク質を抽出した。全植物タンパク質については、粉末化した凍結乾燥植物細胞を抽出緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭトリス−Ｃｌ  ｐＨ８．０、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＳＤＳ、１４ｍＭ  β−ＭＥ、４００ｍＭスクロース、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、及びプロテイナーゼ阻害薬カクテル）中に５００μＬ当たり１０ｍｇの比率で懸濁し、氷上で１時間インキュベートして再水和させた。懸濁細胞をボルテックス（約３０秒）後に超音波処理した（パルスオン５秒及びパルスオフ１０秒、ソニケーター３０００、Ｍｉｓｏｎｉｘ）。ブラッドフォードアッセイの後、等量のホモジナイズしたタンパク質を既知量のＣＮＴＢタンパク質標準と共にＳＤＳ−ポリアクリルアミドにロードし、分離した。ＣＮＴＢ融合タンパク質を検出するため、抗ＣＮＴＢポリクローナル抗体（ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を１×ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に１：１０，０００希釈し、次に、１×ＰＢＳＴ中に１：４，０００希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４０３０−０５）で膜をプローブした。化学発光シグナルをＸ線フィルム上に現像し、これを使用してＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ＩＪ  １．４６ｒ；ＮＩＨ）で定量分析を行った。
【００５９】
転写物の評価
組織培養室内の寒天培地で生育した植物の葉からｅａｓｙ−ＢＬＵＥ（商標）全ＲＮＡ抽出キット（ｉＮｔＲＯＮ、カタログ番号１７０６１）を使用して全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡゲルブロットについては、等量の全ＲＮＡ（４μｇ）を０．８％アガロースゲル（１．８５％ホルムアルデヒド及び１×ＭＯＰＳ含有）上で分離し、ナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ  ＳＰＣ；Ｗｈａｔｍａｎ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）にブロットした。ノーザンブロットについては、葉緑体形質転換プラスミドのｐｓｂＡ  ５’又は３’ＵＴＲ領域からのＰＣＲ増幅産物をプローブとして使用した。上記に記載したとおりＤＩＧ標識及び検出キットを使用して膜上のハイブリダイゼーションシグナルを検出した。
【００６０】
凍結乾燥
確認されたホモプラスミック系統を温度及び光が制御された温室に移した。完全に成長したトランスプラストミック植物の成葉を採取し、凍結乾燥まで−８０℃で貯蔵した。−植物葉材料をフリーズドライするため、３日間にわたりチャンバ温度を−４０℃から２５℃に上昇させながら、凍結して砕いた小さい葉片を４００ｍＴｏｒｒ真空下で昇華させた（Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３５ＸＬ、ＶｉｒＴｉｓ  ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。コーヒーグラインダー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｂｅａｃｈ）を最高速度で使用して、脱水した葉を粉末化し、タバコは３回、各１０秒間粉砕し、及びレタスは３回、５秒間粉砕した。粉末化した葉をシリカゲルと共に室温で気密・無水条件下に容器内に貯蔵した。
【００６１】
凍結したＣＴＢ−ＶＰ１タバコ葉を凍結乾燥器（Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３５ＸＬ、ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｔｏｎｅ  Ｒｉｄｇｅ、ＮＹ）のドライアイス上に移し、４００ｍＴｏｒｒ真空下、−４０℃、−３０℃、−２０℃、−１５℃、−１０℃、−５℃及び２５℃で合計７２時間凍結乾燥した。凍結乾燥葉材料をコーヒーグラインダー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｂｅａｃｈ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐｉｎｅｓ，ＮＣ，ＵＳＡ）において最高速度で３回粉砕した（パルスオン１０秒及びオフ３０秒）。この細粉をシリカゲルと共に無水環境に室温で貯蔵した。
【００６２】
質量分光分析のためのタンパク質抽出及び試料調製
１０ｍｇの凍結乾燥葉粉末から、１ｍＬ抽出緩衝液（２％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭ  ＴＥＡＢ）を加えることによって全タンパク質を抽出した。凍結乾燥葉粉末を時々ボルテックスしながら室温で３０分間インキュベートすることにより、植物細胞を再水和させた。次にホモジネートを７０℃で１時間インキュベートし、続いて常時回転させながら室温で一晩インキュベーションした。１４，０００ｒｐｍ（約２０，８００ｒｃｆ）で遠心することにより細胞壁／細胞膜デブリをペレット化した。この手順はデュプリケートで実施した。
【００６３】
以前記載のとおり（Ｌｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、全てのタンパク質抽出物（１００μｌ）を１０ｋＤａのフィルタカットオフの遠心装置（Ｖｉｖａｃｏｎ）において０．５％デオキシコール酸ナトリウムの存在下に１０μｇトリプシン／Ｌｙｓ−Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で酵素消化した。消化後、デオキシコール酸ナトリウムを１％（最終濃度）トリフルオロ酢酸による酸沈殿によって除去した。脱塩前に試料に安定同位体標準（ＳＩＳ）ペプチド（＞９７％純度、Ｃ末端Ｌｙｓ及びＡｒｇをＬｙｓ  Ｕ−１３Ｃ６；Ｕ−１５Ｎ２及びＡｒｇ  Ｕ−１３Ｃ６；Ｕ−１５Ｎ４としたもの、ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をスパイクした。ＭＳ分析前に試料をＯｌｉｇｏＲ３  ｓｔａｇｅ−ｔｉｐ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で脱塩した。初期タンパク質抽出物（１０μｌ）をＯｌｉｇｏＲ３  ｓｔａｇｅ  ｔｉｐカラムで脱塩した。次に脱塩した材料を高速真空装置で乾燥させて、６μＬの水中０．１％ギ酸に懸濁した。２μｌの脱塩材料をカラムに注入することにより、ＭＳ分析をデュプリケートで実施した。
【００６４】
ＰＲＭ質量分光分析及びデータ分析
３３．３μｇの凍結乾燥葉粉末から抽出及び消化した全タンパク質の量に対応する、３４ｆｍｏｌの各ＳＩＳペプチドをスパイクインした２μＬのペプチドをカラムに注入することにより、液体クロマトグラフィーと組み合わせたターゲット質量分光分析を実施した。Ｅａｓｙ−ｎＬＣ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して自作の３０ｃｍ×７５μｍ内寸Ｃ１８カラム（１．９μｍ粒径、ＲｅｐｒｏＳｉｌ、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ  ＨＰＬＣ  ＧｍｂＨ）でペプチドを分離した。移動相は、両方ともにＨＰＬＣグレード（Ｆｌｕｋａ）の、０．１％ギ酸（Ａ）及び９０％アセトニトリル及び０．１％ギ酸（Ｂ）の水溶液からなった。４％溶媒Ｂの水溶液でカラムにペプチドを２５０ｎＬ／分でロードした。４−７−２７−３６−６５−８０％Ｂについて非直線グラジエントをそれぞれ２−５０−１０−１０−５分間適用することによりペプチドを溶出させた。
【００６５】
ｎａｎｏｓｐｒａｙ  Ｆｌｅｘ（商標）イオン源を備えたＱｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で並列反応モニタリング（ＰＲＭ）モードを用いてＭＳ分析を実施した（Ｇａｌｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。２ｍ／ｚウィンドウでインクルージョンリストから標的を分離、分解能３５，０００（ｍ／ｚ２００で）、目標ＡＧＣ値１×１０6、及び最大充填時間１２０ｍｓ。正規化衝突エネルギーは２９に設定した。等しいｎａｎｏＬＣクロマトグラフィー下におけるＳＩＳペプチドの分析により、保持時間スケジュールを決定した。標的プレカーサーイオン及び保持時間スケジュールの一覧は補足情報に報告する。Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェアを用いてＰＲＭデータ分析を実施した（ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００６６】
リボソームプロファイリング
植物の上から２番目及び３番目の葉をリボソームプロファイリング用に採取した。レタス植物は約２ヵ月齢であった。タバコ植物は、天然及びコドン最適化ＶＰ１コンストラクトについてそれぞれ２．５又は２ヵ月齢であった。葉は正午に採取し、液体窒素で急速凍結した。Ｚｏｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）に記載されるとおり、但しミクロコッカスヌクレアーゼの代わりにリボヌクレアーゼＩを用いて、リボソームフットプリントを調製した。ＮＥＸＴｆｌｅｘ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡシーケンシングキットｖ２（ＢＩＯＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、５１３２−０３）でリボソームフットプリントをシーケンシングライブラリに変換した。パイロット実験で観察された大量のｒＲＮＡ夾雑物に対応するビオチン化オリゴヌクレオチドを用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成後にサブトラクティブハイブリダイゼーションによってｒＲＮＡ夾雑物を除去した。試料をオレゴン大学ゲノミクスコア施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でシーケンシングした。配列リードをｃｕｔａｄａｐｔによって処理してアダプター配列を除去し、デフォルトパラメータのｂｏｗｔｉｅ２でリードを改変葉緑体ゲノム配列とアライメントした。
【００６７】
トランスプラストミック植物の葉緑体ベクター構築及び再生
フォワードプライマー５’−ｇｇｇＣＣＣｇｇｇＣＣＣＣｇｇＣｇＴＡＡＡＣｇＣＴＣＴｇＴＴｇｇｇＴＴＡｇｇＴＣＡｇＡＴｇ−３’及びリバースプライマー５’−ＣｇＡＴＣＴＡｇＡＴＣＡＡＴＡＴｇＴｇｇＴＣＡｇＡＴＣ−３’を使用してセービン１型ポリオウイルス（Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎ  Ｃｈｕｍａｋｏｖ博士、ＦＤＡより供与いただいた）の天然ＶＰ１遺伝子（９０６ｂｐ）を増幅した。ＰＣＲ増幅断片及びコドン最適化ＶＰ１遺伝子（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡによって合成された）をタバコ及びレタス葉緑体形質転換ベクターにクローニングした。葉緑体形質転換ベクターの微粒子銃送達並びにトランスプラストミックタバコ（ニコチアナ・タバカム品種プティ・ハバナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ））及びレタス（ラクツカ・サティバ品種シンプソン・エリート（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｖ．Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｅｌｉｔｅ））系統の再生を以前記載のとおり実施した（Ｒｕｈｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００６８】
トランスプラストミックタバコ及びレタス系統の特徴付け
葉緑体ゲノムへのトランス遺伝子カセットの組込みを確認するため、タバコ及びレタスについてそれぞれプライマー対３Ｐ／３Ｍ及び５Ｐ／２Ｍ又は１６Ｓ−Ｆｗ／３Ｍ及び５Ｐ／２Ｍを使用してＰＣＲを実施した（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｋａｎａｇａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。以前記載のとおりサザンブロット分析を実施してトランス遺伝子の組込み及びホモプラスミーを確認した（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００６９】
葉緑体由来タンパク質のイムノブロット分析及び精製
既発表の方法（Ｄａｖｏｏｄｉ−Ｓｅｍｉｒｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）に従いＣＴＢ−ＶＰ１融合タンパク質のイムノブロット分析及び定量化を実施した。ＣＴＢ−ＶＰ１融合タンパク質を検出するため、ブロットを１：１０，０００ウサギ抗ＣＴＢポリクローナル抗体（ＧｅｎｅＷａｙ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）又は１：１，０００ウサギ抗ＶＰ１ポリクローナル抗体（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｌ．Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、ＵＳＡ）、続いて二次抗体として１：４，０００ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）と共にインキュベートした。ＣＴＢ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）及び組換えセービン１  ＶＰ１（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｌ．Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、ＵＳＡ）を陽性対照として使用した。葉緑体由来ＣＴＢ−ＶＰ１融合タンパク質を精製するため、Ｈｉｓ６０  Ｎｉ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造者の指示に従い使用した。溶出した画分を滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回透析し、アリコートに分け、−２０℃で保存した。精製した葉緑体由来ＣＴＢ−ＶＰ１を免疫グロブリン測定に使用した。
【００７０】
コレラ毒素Ｂ−ＧＭ１ガングリオシド受容体結合アッセイ
タバコ葉緑体由来ＣＴＢ−ＶＰ１が五量体を形成してＧＭ１ガングリオシド受容体に結合する能力を試験するため、記載されるとおりＣＴＢ−ＧＭ１結合アッセイを実施した（Ｄａｖｏｏｄｉ−Ｓｅｍｉｒｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００７１】
マウス及び免疫スケジュール
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から６〜７週齢の雌ＣＤ−１マウスを購入し、マイクロアイソレーターケージで飼育した。実験はペンシルベニア大学動物実験委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の指針に従い行った。マウスを１群当たり１０匹のマウスの９群に無作為に分けた。群１は対照群とし、マウスは処置を受けなかった。群２〜８のマウスは全て、３種類のポリオウイルス（１型（マホーニー）、２型（ＭＥＦ−１）、及び３型（ソウケット）（ＩＰＯＬ、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ＳＡ））の１００μｌのＩＰＶ懸濁液で皮下的に（ｓ．ｃ．）プライミングした。群２のマウスはプライミングの３０日後に同じＩＰＶでｓ．ｃ．ブーストした。群３〜９のマウスは凍結乾燥した植物材料で経口的にブーストした：群３〜８のマウスは、プライミングの１週間後から開始して８週連続で週１回ブーストした。群３〜５のマウスは、凍結乾燥した天然ＣＴＢ−ＶＰ１発現葉で経口的にブーストした；各マウスは、２００μｌのＰＢＳ＋種々のアジュバント：サポニン（群３）、スクアレン（群４）又は両方（群５）中２０ｍｇの材料でブーストした。群６〜９のマウスは、凍結乾燥したコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１発現葉で経口的にブーストした；各マウスは、２００μｌのＰＢＳ＋種々のアジュバント：サポニン（群６）、スクアレン（群７）又は両方（群８及び９）中２０ｍｇの材料でブーストした。プライミングの１日前及びブースティングの７日後に血液を採取した。血清試料は５６℃で３０分間熱失活させて補体活性を破壊した。
【００７２】
バイオカプセル化植物製ＣＴＢ−ＶＰ１タンパク質のワクチン製剤の調製
ワクチン製剤化は、概して以前記載のとおり39、40、但し変更を加えて実施した。簡潔に言えば、ダブルエマルション法を用いてワクチン製剤を調製した。スクアレンをアジュバントとするＶＰ１抗原を調製するため、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０を２０ｍｇの凍結乾燥ＶＰ１抗原と混合することにより水相中の一次エマルションを作製した。油相はスクアレン（８０％ｖ／ｖ）とＳｐａｎ−８０（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４７８０）（２０％ｖ／ｖ）との組み合わせであった。エマルションは、一次油性エマルションを水相と混合し、マウス当たり総容積２００μｌとなるようにＰＢＳで調整した後、５，０００ｒｐｍで５分間ホモジナイズすることにより作製した。
【００７３】
サポニンをアジュバントとするＶＰ１抗原を調製するため、２０ｍｇの凍結乾燥した天然又はコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１植物材料をマウス当たり２ｍｇサポニンと混合し、ＰＢＳを加えて最終容積を２００μｌにした。両方のアジュバントを用いるＶＰ１抗原を調製するため、２０ｍｇの凍結乾燥した天然又はコドン最適化ＶＰ１を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０含有のＰＢＳ中２ｍｇのサポニンと混合することにより一次エマルションを作製した。次に、一次エマルションを次にスクアレン（８０％ｖ／ｖ）及びＳｐａｎ−８０（２０％ｖ／ｖ）含有のスクアレンエマルションと穏やかに混合した。
【００７４】
ＥＬＩＳＡによる抗体反応の決定
ＶＰ１特異的ＩｇＧ１及びＩｇＡ力価の血清レベルを含めた免疫応答をダイレクトＥＬＩＳＡ及びインビトロポリオウイルスセービン１、２及び３中和アッセイによってアッセイした（これらは疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：ＣＤＣ）によって実施された）。簡潔に言えば、抗体反応アッセイのため、１０μｇ／ｍｌ精製ＣＴＢ−ＶＰ１タンパク質を使用して９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩コーティングした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有のＰＢＳ中１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  ７９０６）でブロックした。１：４００希釈から開始して、個々の熱失活血清試料の２倍希釈物を４℃で一晩インキュベートした。二次抗体は、ブロッキング緩衝液で希釈したＨＲＰコンジュゲートラット抗マウスＩｇＧ１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５９６２６、１：１，０００）及びＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ、Ａ１３８Ｎ、１：５，０００）であり、３７℃で１時間インキュベートし、続いてＴＭＢ基質（ＥＳ００１、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＣＡ）によって室温で１０分間発色させた。１００μｌの２Ｎ硫酸を各ウェルに加えることにより反応を停止させて、４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーを用いて吸光度を測定した。抗体力価は、カットオフを上回る最も高い希釈度の逆数として定義し、カットオフはバックグラウンド平均値の３倍であった41。血清試料は全てトリプリケートで試験した。結果は個々の抗体力価±ＳＥＭとして示す。
【００７５】
ポリオウイルスセービン１、２、３中和アッセイ
サポニン及び／又はスクアレンをアジュバントとした天然又はコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１タンパク質による、又は群２についてはプライミング及びブースティングの両方ともにＩＰＶによる１０回目の経口ブースト後、以前記載のとおり21、42のＣＤＣでの後の中和アッセイのため血清試料を採取し、−８０℃で保存した。簡潔に言えば、血清試料は、セービン株１型、２型、及び３型に対する抗体の変法マイクロ中和アッセイを用いてトリプリケートで試験した。対照群及び実験群からの血清試料を無作為盲検的に試験した。ウイルス中和が検出されなかった時点における力価の逆数の血清希釈度を２．５のｌｏｇ2（力価）、又は陰性として記録した；≧３のｌｏｇ2力価を防御的と見なした。各マウスの個々の力価をプロットし、バーは中和力価平均値±ＳＥＭを表す。
【００７６】
統計的分析
全てのデータは個々のマウスについて報告し、各群の平均値±ＳＥＭを提示する。群間の抗体力価の統計的に有意な差に関する分析はスチューデントｔ検定を用いて実施し（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６）及びＰ値＜０．０５を有意と見なした。
【００７７】
本発明の特定の実施形態を例示するため、以下の実施例を提供する。これらの実施例はいかなる形であれ本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００７８】
実施例Ｉ
ゲノミクス、プロテオミクス及びリボソームプロファイリングツールを用いた天然及びコドン最適化ヒト又はウイルス遺伝子の比較分析は葉緑体におけるトランス遺伝子発現の理解を高める
ヒト／ウイルストランス遺伝子のコドン最適化
葉緑体によるコドン使用の違いは、多くの場合に翻訳の低下と関連付けられる。治療的に関連性のあるタンパク質の発現を増加させるため、先行研究が例えばＦＶＩＩＩについて＜０．００５％及びＶＰ１について約０．１％の極めて低い発現レベルを明らかにしたことに伴い、ヒトの血液凝固第ＶＩＩＩ因子重鎖（ＦＶＩＩＩ  ＨＣ及びＦＶＩＩＩ  ＬＣ）、及びＩＧＦ−１、ポリオウイルスのウイルスカプシドタンパク質１（ＶＰ１）及び細菌のムタナーゼの天然配列を分析した。ｐｓｂＡ遺伝子は葉緑体において最も高発現の遺伝子であるため、１３３の植物種のｐｓｂＡ遺伝子で使用されるコドンの分析に基づき、アルゴリズムを用いて翻訳を増加させるためのコドン最適化ソフトウェアを開発した（図１）。ｐｓｂＡ遺伝子の翻訳効率はｒｂｃＬ遺伝子より２００倍超高いため、この遺伝子を最適化に選択した（Ｅｉｂｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。更に、葉緑体で発現する１４０個のトランス遺伝子のうち７５％超がｐｓｂＡ調節配列を使用する。図１に示されるとおりのその使用頻度に従い各アミノ酸の同義コドンを順位付けした。従って、異種遺伝子のレアコドンのほとんどが、コドン最適化プログラムによってｐｓｂＡ遺伝子で使用されるコドンに従い変更された。コドン最適化プログラムの開発においては、本発明者らはまた、各アミノ酸について最も高い優先度のコドンのみを使用する合成遺伝子の発現についても調べた。
【００７９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における天然及び合成遺伝子の翻訳の評価
本研究では、新規に開発した葉緑体コドン最適化器を用いてＦＶＩＩＩ  ＨＣ（２２６２ｂｐ）、ＦＶＩＩＩ  ＬＣ及びＦＶＩＩＩＳＣc（コドン最適化ＦＶＩＩＩ重鎖（Ｂドメインからの１４アミノ酸を含むＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）との融合形態（図２Ａ及び図２Ｅ）及びＶＰ１（図４Ａ）（９０６）の天然配列をコドン最適化し、合成した。コドン最適化後、ＦＶＩＩＩ  ＨＣのＡＴ含量が５６％から６２％へとやや増加し、７５４アミノ酸中３８３個のコドンが最適化された。セービン１のＶＰ１配列については、９０６ｂｐ長の天然配列をコドン最適化し、これによりＡＴ含量が５１．９８％から５９．０３％へとやや増加し、３０２アミノ酸中１８７個のコドンが最適化された。合成遺伝子カセットを葉緑体形質転換ベクター、レタスについてはｐＬＳＬＦ又はタバコについてはｐＬＤ−ｕｔｒに挿入した（図２Ａ及び図４Ａ）。腸上皮細胞に存在するモノシアロテトラヘキソシルガングリオシド受容体（ＧＭ１）を介した融合タンパク質の効率的な粘膜送達に使用されるコレラ非毒性Ｂサブユニット（ＣＮＴＢ）に天然及び合成遺伝子を融合した。２つのタンパク質の融合によって立体障害が引き起こされる可能性を排除し、及びインターナリゼーション後に繋留されたタンパク質の循環中への放出を促進するため、ＣＮＴＢと融合タンパク質との間にヒンジ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）及びフューリン切断部位（Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）のヌクレオチド配列を操作した。コドン最適化の特異的評価のため、これらの融合遺伝子は同一のｐｓｂＡプロモーター、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ下に置いた（図２Ａ及び図４Ａ）。形質転換体の選択のため、アミノグリコシド−３”−アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子（ａａｄＡ）をリボソームＲＮＡプロモーター（Ｐｒｒｎ）によってドライブして、形質転換細胞にスペクチノマイシン耐性を付与した。内因性葉緑体ゲノム配列と同一であるイソロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔｒｎＩ）及びアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔｒｎＡ）遺伝子の配列が発現カセットに隣接し、効率的な二重相同組換え及びフランキング配列を有するイントロンの最適なプロセシングにつながった。
【００８０】
コドン最適化ＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＨＣ及びＣＮＴＢ−ＶＰ１を発現するトランスプラストミック植物を作出する前に、まず合成遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換してその発現を評価した。原核生物起源であるため、葉緑体は類似した転写／翻訳機構を有する。図２Ｂに見られるとおり、天然ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現レベルは、レタス及びタバコの両方の葉緑体形質転換ベクターにクローニングした合成ＦＶＩＩＩ遺伝子よりも約１１倍低かった。対照的に、ほぼ極めて優先度の高いコドンのみで構成された合成ＦＶＩＩＩ遺伝子は、ウエスタンブロットで検出不能でさえあった。ＣＮＴＢ−ＶＰ１について、コドン最適化配列の発現は天然配列より３倍高かった。また、極めて優先度の高いコドンのみで構成された合成ＶＰ１遺伝子は天然配列より２倍低い発現を示した。
【００８１】
レタス及びタバコ葉緑体における天然及びコドン最適化遺伝子の翻訳効率
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における合成配列の発現の向上を確認した後、合成ＦＶＩＩＩ  ＨＣ及びＶＰ１配列を含む形質転換ベクターを使用して、コドン最適化ＨＣ及びＶＰ１を発現するトランスプラストミックレタス及びタバコ植物を作出した。ホモプラスミーを確認するため、天然及びコドン最適化ＦＶＩＩＩ  ＨＣを発現する４つの独立したレタス及びタバコ系統、及び天然及びコドン最適化ＶＰ１を発現する系統でサザンブロット分析を実施した。ＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＨＣ天然及びコドン最適化配列を発現するレタス植物については、葉緑体ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、フランキング領域にわたる消化標識プローブでプローブした（図２Ｄ）。ＣＮＴＢ−ＨＶＩＩＩ  ＨＣ（コドン最適化）を発現するタバコ植物については、ＡｆｌＩＩＩを用いてゲノムＤＮＡを消化した。選択された全ての系統が、予想された個別的なハイブリダイゼーション断片を示し、形質転換されなかった断片はなかった（図３Ａ）。図４Ａに示すコンストラクトによってコードされるＣＮＴＢ−ＶＰ１を発現するタバコ植物の場合、４つの独立したトランスプラストミック系統から抽出した全ゲノムＤＮＡをＡｆｌＩＩＩによって消化し、フランキング配列でプローブすると、２つの個別的なハイブリダイゼーション断片が示され、形質転換されなかった４．４ｋｂ断片はなかった。従って、これらのデータから、全てのトランスプラストミック系統のホモプラスミーが確認され、従ってトランス遺伝子コピー数でなく、その発現レベルが翻訳効率に直接関係するはずである。
【００８２】
イムノブロット及びデンシトメトリーアッセイを用いてコドン最適化又は天然遺伝子配列の発現レベルを定量化した（図４Ｃ及び図４Ｄ）。約１００．７〜約５９６．６ｕｇ／ｇＤＷのコドン最適化遺伝子のＦＶＩＩＩ  ＨＣの濃度は、約２０．０〜５７．２μｇ／ｇＤＷであった天然ＦＶＩＩＩ  ＨＣ遺伝子を発現するレタス植物と比べて１．７６〜２９．８倍高かった。パーセンテージ全葉タンパク質率（％ＴＬＰ）は、コドン最適化ヒト遺伝子配列（０．０５８〜約０．３８％）で天然ヒト遺伝子配列（０．０１５〜約０．０２６％）よりも約２．２３〜約２５．３３倍高かった。かかる発現レベルのばらつきは、葉の年齢及び発生段階の違いに起因する。本研究でＰＲＭ質量分析法に使用したバッチは、それぞれコドン最適化配列と天然配列との間で乾燥重量基準で５．０２倍の増加（１００．７対２０．０μｇ／ｇＤＷ）又は全葉タンパク質基準で３．９８倍の増加（０．０７４対０．０１６％ＴＬＰ）を示した。タバコ植物の場合、コドン最適化植物における濃度は約８４７．７〜１２６６．０μｇ／ｇＤＷであり、約３６．６〜約８５．５μｇ／ｇＤＷであった天然遺伝子と比べて約９．９２〜３４．６倍高い、又はＴＬＰ基準で約４．０〜約１３．９倍高いＦＶＩＩＩタンパク質が発現した。ＣＮＴＢ−ＶＰ１を発現するタバコ植物については、ＰＲＭ質量分析法に使用したバッチはそれぞれコドン最適化配列と天然配列との間でＤＷ基準で４８倍の高さ（２，６００対５４μｇ／ｇＤＷ）及びＴＬＰ基準で４６倍の高さ（４．６％対０．１％）を示した（図４Ｄ）。これらのデータから、本発明者らの新規に開発したコドン最適化プログラムから得られたコドン最適化配列が、トランス遺伝子の翻訳をコード配列に基づき様々なレベルに大幅に改善した。
【００８３】
コドン最適化が転写物の安定性に及ぼす影響を調べるため、プローブ、ｐｓｂＡ  ５’又は３’ＵＴＲ配列でノーザンブロットを実施した（図５Ａ〜図５Ｂ）。抽出した全ＲＮＡを連続的にロードし、ＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＨＣ及びＣＮＴＢ−ＶＰ１のコドン最適化及び天然配列の検出されたｍＲＮＡレベルをデンシトメトリーを用いて内因性ｐｓｂＡ転写物に対して正規化し、次に正規化後の割合を比較した。ノーザンブロットから、コドン最適化ＣＮＴＢ−Ｆ  ＶＩＩＩ及び−ＶＰ１蓄積の増加がＲＮＡ転写物の存在量又は安定性というよりむしろ、翻訳レベルでの増加であることが示された。
【００８４】
ＰＲＭ分析による絶対定量化
コドン最適化及び天然遺伝子配列の発現レベルもまたＰＲＭ質量分析法を用いて定量化した（図６Ａ〜図６Ｃ）。ＣＮＴＢ及びＦＶＩＩＩ  ＨＣ配列のＰＲＭ分析に最適なプロテオタイプのペプチドを選択するため、本発明者らは初めに、ＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＨＣを発現するレタス植物のトリプシン消化物の標準ＭＳ／ＭＳ分析を実施した（データは示さず）。この実験から、本発明者らはＣＮＴＢからの３つのペプチド（ペプチド１、ＩＦＳＹＴＥＳＬＡＧＫ（配列番号５）；ペプチド２、ＩＡＹＬＴＥＡＫ（配列番号６）；ペプチド３、ＬＣＶＷＮＮＫ（配列番号７）及び３つのＦＶＩＩＩ  ＨＣトリプシンペプチド（ペプチド４、ＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲ（配列番号８）；ペプチド５、ＷＴＶＴＶＥＤＧＰＴＫ（配列番号９）；ペプチド６、ＹＹＳＳＦＶＮＭＥＲ（配列番号１０）を選択した。これらの３つのＣＮＴＢトリプシンペプチド及び３つのＦＶＩＩＩ  ＨＣトリプシンペプチドのＰＲＭ測定の結果として、コドン最適化植物のＦＶＩＩＩ  ＨＣタンパク質の含量を計算した（図６Ａ〜図６Ｂ）。コドン最適化レタス植物のＦＶＩＩＩ  ＨＣタンパク質の含量（Ｔｃｏｎｔｅｎｔ）は、天然配列を発現するレタス植物と比べて５．６倍高かった（図７Ａ）。ＣＴＢから選択されたペプチドは、天然コンストラクトとコドン最適化コンストラクトとの間で４．９（ＩＡＹＬＴＥＡＫ）（配列番号６）〜５．２（ＩＦＳＹＴＥＳＬＡＧＫ）（配列番号５））〜６．６（ＬＣＶＷＮＮＫ）（配列番号７）の範囲の変化倍数を示した。ＦＶＩＩＩ  ＨＣから選択されたペプチドは、５．５（ＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲ）（配列番号８）〜５．７（ＹＹＳＳＦＶＮＭＥＲ）（配列番号１０）〜７．１（ＷＴＶＴＶＥＤＧＰＴＫ）（配列番号９）（図７Ａ）の範囲を示した。これらの結果は表１に報告する。定量化範囲の直線性もまた決定した（データは示さず）。これらの６つのペプチド全てについて、本発明者らは０．９８を超えるＲ2値を観察した。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
３つのＣＮＴＢトリプシンペプチドのＰＲＭ測定の結果として、コドン最適化植物のＶＰ１タンパク質の含量を計算した（図６Ｃ）。コドン最適化植物のＶＰ１タンパク質の含量は、天然配列ＶＰ１を発現するタバコ植物と比べて２５．９倍高いと計算された。増加倍数は２２．５（ＬＣＶＷＮＮＫ）（配列番号７）〜２６．０（ＩＡＹＬＴＥＡＫ）（配列番号６）〜２８．０（ＩＦＳＹＴＥＳＬＡＧＫ）（配列番号５）（図７Ｂ）の範囲である。定量化範囲の直線性もまた、２２０ａｔｏｍｏｌ〜１７０ｆｍｏｌ（注入１回当たりのカラム上に相当する値）を包含するダイナミックレンジで一定量の植物消化物（４種類の植物材料全ての１：１：１：１混合物）においてＳＩＳペプチドをスパイクすることにより調べた。
【００８７】
絶対定量化は、既知量のカウンターパートＳＩＳペプチドを試料にスパイクすることにより実現し得る。各々についてカウンターパートＳＩＳペプチド（３４ｆｍｏｌ）をタンパク質消化物（３３．３μｇの凍結乾燥葉粉末から抽出されたタンパク質に相当する量）と混合してカラムに注入した。各々、ＳＩＳ及び内因性ペプチドの曲線下面積（ＡＵＣ）の比を計算することにより、本発明者らは、内因性ペプチドモル濃度を推定し、カラム上のフェムトモルとして表した（図６Ａ〜図６Ｃ）。コドン最適化及び天然配列についてのカラム上のフェムトモル（ｆｅｎｔｏｍｏｌｅ）の計算した全ての比の平均値（それぞれ６及び３つのペプチド、ＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＨＣ及びＣＮＴＢ−ＶＰ１）をコドン最適化コンストラクトにおけるタンパク質発現の増加倍数として報告する。図６Ａ〜図６Ｃに、試料調製及びＰＲＭ分析の高い再現性が示される。ペプチド測定値は全て、４つのテクニカルレプリケート、２つの試料調製レプリケート（葉粉末〜抽出〜タンパク質消化）及び２つのＭＳテクニカルレプリケートの結果であった。ペプチド当たりの４つの測定値間の変動係数（％）は、１６％及び２２％であった２例を除き、いずれにおいても０．５％〜１０％の範囲であった。
【００８８】
リボソームプロファイリング研究
リボソームプロファイリングは、ディープシーケンシングを用いて「リボソームフットプリント」−外因性ヌクレアーゼの攻撃からリボソームによって保護されるｍＲＮＡ断片をマッピングする。この方法は、インビボでリボソームによって占有されるｍＲＮＡセグメントのゲノムワイドな高分解能の定量的スナップショットを提供する（Ｉｎｇｏｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。全体的なリボソームフットプリントカバレッジが、翻訳アウトプットの推定を提供することができ、及びリボソームが減速又は失速する位置は、リボソーム占有率が特に高い領域を特徴とする。
【００８９】
コドン最適化が如何にリボソームの挙動に影響を及ぼすかを調べるため、本発明者らは、天然及びコドン最適化ＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＨＣ及びＣＮＴＢ−ＶＰ１トランス遺伝子を発現する植物からリボソームプロファイリングを行った。図８Ａ〜図８Ｃは、各トランス遺伝子における位置の関数としてのリボソームフットプリントの存在量を示す；内因性葉緑体ｐｓｂＡ及びｒｂｃＬ遺伝子におけるフットプリントカバレッジが、最適化コンストラクトと天然コンストラクトとの間でトランス遺伝子データを正規化する手段として示される。リボソームフットプリントカバレッジは、天然ＶＰ１試料と比べてコドン最適化ＶＰ１試料ではるかに高かった（図８Ａ）。しかしながら、この増加の大きさは、データをどのように正規化するかに応じて異なる（図８Ｃ）：増加は、全葉緑体リボソームフットプリント、ｐｓｂＡリボソームフットプリント、又はｒｂｃＬリボソームフットプリントに対して正規化したとき、それぞれ５倍、１６倍、又は１．５倍である。これらの数値は、定量的質量分析データから推測されるＶＰ１タンパク質存在量の２２〜２８倍の増加と比べてかなり低い。リボソームプロファイルのトポグラフィーは概してバイオロジカルレプリケート間で高度に再現性がある（例えば図８ＢのｒｂｃＬ及びｐｓｂＡを参照）。これとの関連において、内因性ｐｓｂＡ及びｒｂｃＬ遺伝子のピーク及びバレーが天然及び最適化タバコＶＰ１系統で非常に異なることは注目に値する。これらの内因性遺伝子、特に天然ＶＰ１系統に観察された高いピーク（リボソームポーズと推定される）の多くは、対を成すアラニンコドン（図８Ａ中のアスタリスク）にマッピングされる。アラニンコドンにおけるリボソーム挙動の大域的違いが天然及びコドン最適化系統の差次的トランス遺伝子発現に寄与し得る可能性がある。
【００９０】
ＦＶＩＩＩ系統におけるリボソームフットプリント数はコドン最適化系統において約２分の１に低下した一方、タンパク質蓄積は５〜７倍増加した。しかしながら、主要なリボソームポーズは天然トランス遺伝子の３’末端近傍と、続いてリボソーム占有率が極めて低い領域に観察することができる（図８Ｂの括弧で括った領域を参照）。このリボソームポーズは、天然ｐｓｂＡ遺伝子では決して使用されないコドンであるＣＴＣロイシンコドンの対にマッピングされる（図１を参照）。これらの結果は、これらのロイシンコドンにおけるリボソームのストールが下流配列の翻訳及びタンパク質全体のアウトプットを制限する一方で、上流配列にリボソームの蓄積もまた引き起こすことを強く示唆している。従って、この場合、全体的なリボソーム占有率は翻訳アウトプットを反映しない。コドン最適化変異体においてそれらのロイシンコドンが修飾されると、このリボソームストールが消失し、トランス遺伝子にわたってはるかに均等なリボソーム分布がもたらされた（図８Ｂ、右）。リボソームフットプリントカバレッジはコドン最適化トランス遺伝子ではるかに一様性が高い（図８Ｃ）。
【００９１】
考察
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と葉緑体とのコドン使用は同様でない
コドン最適化ＦＶＩＩＩ  ＨＣ、ＬＣ及びＳＣ配列は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現レベルを７〜１０倍向上させた。ホモプラスミック系統（全ての葉緑体ゲノムの形質転換）をサザンブロットによって確認した。コドン最適化ＣＴＢ−ＦＶＩＩＩ重鎖（１００ｋＤａ）、軽鎖（９２ｋＤａ）及び単鎖（１７９ｋＤａ）の最も高いレベルの発現レベルは、凍結乾燥植物細胞でそれぞれ２４４０、１６０及び２３０μｇ／ｇであった。単鎖レタスでは、発現レベルは２６日齢から４８日齢で１５０μｇ／ｇから２３０μｇ／ｇに増加した。合成遺伝子の翻訳効率について、葉緑体は原核生物起源であるため、初めに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系で試験した。しかしながら、合成ＶＰ１遺伝子の発現は、天然遺伝子よりも僅か３倍高いことを示したに過ぎなかった。合成ＶＰ１の翻訳レベルがＦＶＩＩＩ  ＨＣよりも低いのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と葉緑体との間でまれにしか使用されないコドンに違いがあるためであり得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、６つのアルギニンコドンのうち４つ（ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ及びＣＧＡ）のコドンの優先度が低い。また、グリシンのＧＧＡ、イソロイシンのＡＵＡ、ロイシンのＣＵＡ、及びプロリンのＣＣＣ（Ｋａｎｅ，１９９５）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で最も優先度が低いコドンである。通常、少数のレアコドンが翻訳に重大な障害を引き起こすことはない。しかしながら、多数のレアコドンがクラスター化すると、翻訳に影響する。アルギニンコドンＡＧＧ／ＡＧＡについては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質発現に対するその有害効果が広く研究されてきた。ＡＧＧコドンのタンデムリピートの程度が異なる試験タンパク質を使用した研究では、ＡＧＧクラスターの数が２から５になると、翻訳は大幅に低下した（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。天然ＶＰ１についてはレアコドンのクラスター化の問題はないが、ＦＶＩＩＩ  ＨＣの天然配列は３つのクラスター化部位を有し、そこにアルギニン又はグリシンのレアコドンが連続的に、例えばコドン３及び４（ＡＧＡ−ＡＧＡ）、コドン４８９及び４９９（ＡＧＧ−ＡＧＡ）、及びコドン５６２及び５６３（ＡＧＡ−ＧＧＡ）に置かれていることが分かった。従って天然ＦＶＩＩＩ  ＨＣ配列からコドン最適化によってまれなＡｒｇコドンの多重リピートを除去すれば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における合成ＨＣの翻訳が増加し得る。対照的に、ＶＰ１の天然配列はかかるレアコドンのタンデムリピートを有しないため、ＦＶＩＩＩ  ＨＣ天然配列と比べて発現効率への影響は小さかった。これらのデータを踏まえると、食用レタスを使用したＦＶＩＩＩ  ＳＣ凝固因子の作製及び経口送達が、費用対効果の高い安全な方法で、コンプライアンスが向上した患者に有益となるであろうことは明らかである。ｃＧＭＰ施設における治療用植物葉の大規模な／臨床グレードの生産は、大型動物モデル、非ヒト霊長類における植物製凝固因子の評価を強化し、及び毒性研究を促進するであろう。
【００９２】
コドン最適化により葉緑体における翻訳が大幅に亢進する
葉緑体における天然ＶＰ１とコドン最適化ＶＰ１との間の２２．５〜２８．０倍（ＰＲＭによる）及び４６〜４８倍（ＷＢによる）の増加はかなり顕著である。コドン最適化器Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒは葉緑体における異種遺伝子の発現を最適化するように設計したため、葉緑体における天然配列と合成配列との間での発現レベルの向上は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現と比べてはるかに大きいことが予想される。例えば、ロイシンのＣＵＡは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではまれにしか使用されないが、同じコドンが葉緑体では最も選好して使用される。コドン最適化プログラムは６つのロイシンコドンのうちＣＵＡの割合をＶＰ１の天然配列の２７．８％からコドン最適化配列の３８．９％に増加させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現と対照的に、天然配列及びコドン最適化配列を発現するＶＰ１植物間のタンパク質レベルの倍数差は、ＦＶＩＩＩ  ＨＣを発現する植物における天然配列とコドン最適化配列との間のその倍数差と比べて大きかった。ＦＶＩＩＩの分子量（７５４アミノ酸）がＶＰ１（３０２アミノ酸）よりも高いため、葉緑体においてより多くのｔＲＮＡ及びアミノ酸が必要であることを所与とすれば、得られたタンパク質合成は効率が低いことになる。葉緑体は外来性タンパク質を合成及び蓄積する能力が極めて高いことを考えると、窒素供給及びアミノ酸プールが組換えタンパク質の蓄積にとって大きな関心事であり得る。既報告に見られるとおり（Ｂａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、タンパク質合成資源の制限に起因した常在タンパク質、特にルビスコ（通常は主要な葉アミノ酸貯蔵タンパク質として機能する）の減少に伴い、トランスプラストミック植物の全アミノ酸含量が大きい影響を受けた。
【００９３】
ｐｓｂＡにおけるコドン使用（本発明者らのプログラム）は、優先的なＡｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ及びＰｈｅコドンが、インビトロ研究（Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｓｕｇｉｕｒａ，２００７）に基づく７９個のタバコ葉緑体ｍＲＮＡに関する既報告のものと異なる。優先的コドンは、恐らくは優先的コドンを認識する対応するｔＲＮＡの濃度がより高いことに起因して非優先的コドンよりも速く解読され、これによりタンパク質合成の伸長速度が加速する（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。高等植物葉緑体ゲノムは、保存された一組の３０個のｔＲＮＡをコードする。この一組が、葉緑体における翻訳機構を支持するのに十分であると考えられる（Ｌｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。コドン最適化ＶＰ１のリボソームプロファイリングデータでは、推定上のリボソームストール部位に相当する２つの主ピークのデータが異常に高濃度のセリンコドンと相関した（図８Ａ）。コドン７１、７３、７５、７６及び７９に５つのセリンコドンがクラスター化した。コドン１７８、１７９及び１８２に３つの他のセリンコドンが見付かった。各クラスター内の２つの隣接するセリン（コドン７５及び７６（ＵＣＵ−ＡＧＵ）、及びコドン１７８及び１７９（ＵＣＣ−ＵＣＵ））（図８Ａの三角形の印を参照）は、高レベルのリボソームストールを示す。従って、これらのコドンを、異なるが同様であるアミノ酸のコドンに置き換えることにより、コドン最適化ＶＰ１トランス遺伝子の発現の更なる増加を達成し得る。
【００９４】
先行研究では、異種遺伝子の発現レベルを向上させるためのコドン修飾は、コドンの３番目のヌクレオチドを変更することによるＡＴ含量の増加に焦点が置かれた。ＩＧＦ−１の場合（Ｄａｎｉｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、コドンの３番目の位置によって変更されたＩＧＦ−１の合成配列が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）システムで天然配列と比べて発現の劇的な増加倍数を示したが、葉緑体では発現レベルの増加は観察されなかったことから、ＡＴ含量の増加は翻訳の亢進における主要な寄与因子でないことが示唆される。この研究に見られるとおり、コドン最適化ＶＰ１のＡＴ含量は僅かに増加したが、最適化ＣＴＢ−ＶＰ１のタンパク質レベルは葉緑体での発現時に天然配列と比べて最大２２．５６〜２８．０倍（ＰＲＭによる）及び４６〜４８倍（ＷＢによる）に劇的に増加した。従って、翻訳効率の調節においては、幾つかの他の要因が重要な役割を果たす。ＣＮＴＢ−ＶＰ１のリボソームプロファイリング研究で観察されるとおり、特定のコドンの利用可能性及び密度が翻訳に重大な影響を与え得る。同様に、ＦＶＩＩＩ  ＨＣ、リボソームフットプリントの結果は、リボソームポーズが、ｐｓｂＡ遺伝子ではほぼ使用されないＣＴＣロイシンコドンにマッピングされることを示した。このコドンはまた、レタスｒｂｃＬ遺伝子（２．４４％）においてもまれにしか使用されず、タバコｒｂｃＬについては、このコドンは全く使用されない。天然ＦＶＩＩＩ  ＨＣはＣＴＣコドンを１５．２８％もの高さで使用するが、ｐｓｂＡコドン使用に従いＣＴＣコドンはコドン最適化配列から除かれた。天然ＦＶＩＩＩ  ＨＣ及びｐｓｂＡ遺伝子のコドン頻度のより詳細な分析により、レアコドンに関する更なる洞察が明らかになる；ＧｌｙのＧＧＧはｐｓｂＡでは２．３％使用されるが、ＨＣ天然では１１．６３％である；ＬｅｕのＣＴＧはｐｓｂＡでは３．７％であるが、ＨＣ天然では２６．３９％である；ＰｒｏのＣＣＣは１．９％対１１．９％である；ＡｒｇのＣＧＧは０．５％対１０．８１％である；ＶａｌのＣＴＧは１．７％対２５．４９％である。そのため、ＣＴＣコドンと同様に、天然ヒト遺伝子における上記に記載した幾つかの他のレアコドンが、葉緑体における翻訳効率を低下させたはずである。
【００９５】
不溶性多量体タンパク質の定量化の新規解決法
大きな課題は、多量体構造体の凝集又は形成に起因して唯一の信頼性の高い方法（ＥＬＩＳＡ）を用いることができないため、不溶性タンパク質を定量化する信頼性の高い方法がないことである。しかしながら、タンパク質薬物の正確な用量の送達は、その臨床使用に向けた基本的な要件である。従って、この研究で本発明者らは、コドン最適化配列及び天然配列を担持する植物におけるＣＮＴＢ−ＦＶＩＩＩ  ＨＣ及びＣＮＴＢ−ＶＰ１の絶対定量化のため並列反応モニタリング（ＰＲＭ）分析を行った。ＰＲＭ分析は、その高い感度、特異度、及び複合的タンパク質マトリックス内の特異的タンパク質標的の正確な定量化により、例えば血漿中のバイオマーカーの発見など、定量的プロテオミクス研究において広く利用されている（Ｇａｌｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。これらの性質は、タンパク質マトリックス供給源（例えばタバコ又はレタスからの植物抽出物）又は複雑さとは無関係の、特異的タンパク質標的の定量化にＰＲＭを用いることの利点を明らかに示している。更に、少数のタンパク質用のＰＲＭアッセイの開発を比較的短期間及び低コストで実現することができる（ＭＳ機器は考慮に入れない）。ペプチド主体の定量化方法論はまた、タンパク質抽出方法のロバスト性及び多用途性ももたらすため、目的タンパク質を天然のコンホメーションに保つことは必須ではない。しかしながらこれは、消化に使用される酵素の酵素切断部位へのアクセスにより本質的にバイアスを受ける。このバイアスを解消するため、本発明者らは強力な変性条件（即ち２％ＳＤＳ）及びタンパク質分解酵素の活性に有利な緩衝液（即ちデオキシコール酸ナトリウム系緩衝液）（Ｌｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を使用している。ＦＶＩＩＩ  ＨＣ（図６及び図７）については、天然配列と比べたコドン最適化配列の増加倍数の値に有意なばらつきはなく、それは定量化に選択したペプチドによって決まった。ＣＮＴＢ領域（融合タンパク質のＮ末端）から選択された３つのペプチドは、増加倍数の範囲が４．９〜６．４であったことを示したが、この範囲はＦＶＩＩＩ領域（融合タンパク質のＣ末端）から選択されたペプチドについては５．３〜７．１であった。従ってＰＲＭ分析から得られた定量化結果は、融合タンパク質の選択領域（Ｎ末端か、それともＣ末端か）又は構成タンパク質（ＣＮＴＢか、それともＦＶＩＩＩ  ＨＣか）とは無関係に一貫している。また、ＣＮＴＢＶＰ１の同じ３つのＣＮＴＢペプチドは、増加倍数が２２．５〜２８．０の範囲で一貫していることを示した。ＰＲＭ分析は、異なるサイズのタンパク質の移動度及びトランスファー並びに抗体プローブの飽和度によりもたらされるばらつきを排除したため、ウエスタンブロットより優れている。総じて、ＰＲＭワークフローは第一にＣＮＴＢ及びＦＶＩＩＩ  ＨＣ配列からのプロテオタイプペプチドの選択；及びカウンターパートＳＩＳペプチドの合成からなった。６つのペプチドが選択され、これらのペプチドの二重及び／又は三重荷電状態の質量電荷比（ｍ／ｚ）及びウィンドウ±５分としたクロマトグラフィーで観察された保持時間（ＲＴ）に基づき、Ｑｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計でのＰＲＭ分析のスケジュールが組まれた。プレカーサーイオンの選択を目標とするこの二重の方法が、Ｑｅｘａｃｔｉｖｅ  ＭＳの高分解能に加え、アッセイの高い特異度に寄与する。取得後のＰＲＭデータ分析もまた、アッセイに高い特異度を付与する。次に、マトリックスからの明らかな夾雑物の寄与がない、５つの最も高強度のフラグメントイオンが、ペプチドの定量化に選択される。最後に、使用するバイオインフォマティクスツール、即ちＳｋｙｌｉｎｅ（ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）によるフラグメントイオンのアサインの信頼性が、カウンターパートＳＩＳペプチドの各々で生成された参照ＭＳ／ＭＳスペクトル及びＲＴプロファイルの比較によって実現する。ＰＲＭの高い感度、特異度、多用途性及びロバスト性は、植物における翻訳システムを特徴付ける新たな機会を提供する。
【００９６】
結論
葉緑体における有益なバイオ医薬品の合成に関する我々の理解を促進するため、葉緑体ゲノム配列、リボソームプロファイリング及びターゲット質量分析法（ＭＳ）を利用して異種遺伝子発現を分析した。質量分析法によるターゲットプロテオーム定量化により、コドンを最適化すると翻訳効率がコード配列基準で５〜５０倍増加することが示され、この手法が植物細胞におけるタンパク質薬物投与量の定量化に初めてバリデートされた。多量体構造体の凝集又は形成に起因して不溶性タンパク質を定量化する信頼性の高い方法がないことが、大きな課題である。本研究に使用したバイオ医薬品は両方ともＣＮＴＢ融合タンパク質であり、腸上皮ＧＭ１受容体へのその結合の要件である五量体を形成するものである。かかる多量体構造体のため、投与量の定量化に関して一般的に用いられるＥＬＩＳＡは排除された。しかしながら、タンパク質薬物の正確な用量の送達は、その臨床使用に向けた基本的な要件であり、本研究ではこの重要な目標が達成された。実際、本研究で作成された植物バイオマスは、疾病管理センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）によってバリデートされたポリオブースターワクチンの開発につながっており、アウトブレイク地域で重篤なポリオを引き起こす現行の経口ポリオワクチンを中止するよう求める世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の２０１６年４月の要求事項に適合する時機の良い発明である。
【００９７】
コドン最適化タンパク質の蓄積のかかる増加は、転写物の存在量又は安定性に対する任意の影響というよりむしろ、翻訳レベルでの増加である。コドン最適化プログラムはタバコ及びレタスの両方で葉緑体におけるトランス遺伝子発現を増加させ、種特異性がない。先行のインビトロ研究と対照的に、新規にシーケンシングした多量の葉緑体ゲノムを用いた異種遺伝子発現の初の徹底的インビボ研究が新規コドン最適化プログラムの開発を促進し、このプログラムは臨床応用に重要な２つのタンパク質を使用して試験された。プロファイリング研究を用いて得られたリボソームフットプリントは、ＶＰ１翻訳に比例して増加することはなく、又はＦＶＩＩＩコドン最適化後に減少さえしたが、これは翻訳における律速段階の診断に有効なツールである。コドン最適化後には、葉緑体でまれにしか使用されないコドンであるＣＴＣロイシンコドンにおける主要なリボソームポーズが天然遺伝子から除かれた。コドン最適化遺伝子における他のコドンクラスターで観察されるリボソームストールが、かかるストールを引き起こすコドンを除くことによる更なる最適化の機会を提供する。
【００９８】
参考文献
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Ｌｅｅ  ＳＢ，Ｌｉ  Ｂ，Ｊｉｎ  Ｓ，Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ（２０１１）「ウイルス及び細菌感染を制御するための葉緑体における抗菌ペプチドレトロサイクリン−１０１及びプロテグリン−１の発現及び特徴付け（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｒｅｔｒｏｃｙｃｌｉｎ−１０１  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ−１  ｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ  ９：１００−１１５
Ｌｅｎｚｉ  Ｐ，Ｓｃｏｔｔｉ  Ｎ，Ａｌａｇｎａ  Ｆ，Ｔｏｒｎｅｓｅｌｌｏ  ＭＬ，Ｐｏｍｐａ  Ａ，Ｖｉｔａｌｅ  Ａ，Ｄｅ  Ｓｔｒａｄｉｓ  Ａ，Ｍｏｎｔｉ  Ｌ，Ｇｒｉｌｌｏ  Ｓ，Ｂｕｏｎａｇｕｒｏ  ＦＭ，Ｍａｌｉｇａ  Ｐ，Ｃａｒｄｉ  Ｔ（２００８）「葉緑体で発現したヒトパピローマウイルス１６型Ｌ１カプシドタンパク質の翻訳融合はトランスプラストミックタバコにおける抗原蓄積を亢進させる（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  Ｌ１  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ）」．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１７：１０９１−１１０２．
Ｌｅｏｎ  ＩＲ，Ｓｃｈｗａｅｍｍｌｅ  Ｖ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＯＮ，Ｓｐｒｅｎｇｅｒ  ＲＲ（２０１３）「溶液中消化効率の定量的評価が偏りのないタンパク質分析に最適なプロトコルを特定する（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １２：２９９２−３００５
Ｌｕｎｇ  Ｂ，Ｚｅｍａｎｎ  Ａ，Ｍａｄｅｊ  ＭＪ，Ｓｃｈｕｅｌｋｅ  Ｍ，Ｔｅｃｈｒｉｔｚ  Ｓ，Ｒｕｆ  Ｓ，Ｂｏｃｋ  Ｒ，Ｈｕｅｔｔｅｎｈｏｆｅｒ  Ａ（２００６）「ミトコンドリア及び葉緑体からの小さい非コードＲＮＡの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ）」．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：３８４２−３８５２
ＭｃＣａｂｅ  ＭＳ，Ｋｌａａｓ  Ｍ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒａｂａｄｅ  Ｎ，Ｐｏａｇｅ  Ｍ，Ｂａｄｉｌｌｏ−Ｃｏｒｏｎａ  ＪＡ，Ｚｈｏｕ  Ｆ，Ｋａｒｃｈｅｒ  Ｄ，Ｂｏｃｋ  Ｒ，Ｇｒａｙ  ＪＣ，Ｄｉｘ  ＰＪ（２００８）「ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）ｐ２４抗原の産生のための高バイオマスタバコ品種メリーランド・マンモスのプラスチド形質転換（Ｐｌａｓｔｉｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｂｉｏｍａｓｓ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｖａｒｉｅｔｙ  Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｍａｍｍｏｔｈ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １（ＨＩＶ−１）ｐ２４  ａｎｔｉｇｅｎ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ  ６：９１４−９２９
ＭａｃＬｅａｎ  Ｂ，Ｔｏｍａｚｅｌａ  ＤＭ，Ｓｈｕｌｍａｎ  Ｎ，Ｃｈａｍｂｅｒｓ  Ｍ，Ｆｉｎｎｅｙ  ＧＬ，Ｆｒｅｗｅｎ  Ｂ，Ｋｅｒｎ  Ｒ，Ｔａｂｂ  ＤＬ，Ｌｉｅｂｌｅｒ  ＤＣ，ＭａｃＣｏｓｓ  ＭＪ（２０１０）「スカイライン：ターゲットプロテオミクス実験を作成及び分析するためのオープンソース文書エディタ（Ｓｋｙｌｉｎｅ：ａｎ  ｏｐｅｎ  ｓｏｕｒｃｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ  ｅｄｉｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃｒｅａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）」．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６：９６６−９６８
Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｍ（２００７）「タバコ葉緑体において同義コドンの翻訳効率が必ずしもコドン使用と相関するわけではない（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ｃｏｄｏｎｓ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ａｌｗａｙｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４９：１２８−１３４
Ｑｕｅｓａｄａ−Ｖａｒｇａｓ  Ｔ，Ｒｕｉｚ  ＯＮ，Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ（２００５）「トランスジェニック葉緑体における異種多重遺伝子オペロンの特徴付け：転写、プロセシング、及び翻訳（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ｏｐｅｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８：１７４６−１７６２
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＡＨ，Ｇｏｌｄｍａｎ  Ｅ，Ｄｕｎｎ  ＪＪ，Ｓｔｕｄｉｅｒ  ＦＷ，Ｚｕｂａｙ  Ｇ（１９９３）「汎用コドン試験システムで実証した、連続ＡＧＧコドンが大腸菌における翻訳に及ぼす効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ  ＡＧＧ  ｃｏｄｏｎｓ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｃｏｄｏｎ  ｔｅｓｔ  ｓｙｓｔｅｍ）」．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７５：７１６−７２２
Ｒｕｈｌｍａｎ  Ｔ，Ｖｅｒｍａ  Ｄ，Ｓａｍｓｏｎ  Ｎ，Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ（２０１０）「トランス遺伝子組込み及び発現における異種葉緑体配列エレメントの役割（Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １５２：２０８８−２１０４
Ｓｈｅｎｏｙ  Ｖ，Ｋｗｏｎ  ＫＣ，Ｒａｔｈｉｎａｓａｂａｐａｔｈｙ  Ａ，Ｌｉｎ  Ｓ，Ｊｉｎ  Ｇ，Ｓｏｎｇ  Ｃ，Ｓｈｉｌ  Ｐ，Ｎａｉｒ  Ａ，Ｑｉ  Ｙ，Ｌｉ  Ｑ，Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｊ，Ｋａｔｏｖｉｃｈ  ＭＪ，Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ，Ｒａｉｚａｄａ  ＭＫ（２０１４）「植物細胞にバイオカプセル化したアンジオテンシン変換酵素２及びアンジオテンシン−（１−７）の経口送達は肺高血圧症を軽減する（Ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ２  ａｎｄ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−（１−７）ｂｉｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）」．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ６４：１２４８−１２５９
Ｓｈｅｒｍａｎ  Ａ，Ｓｕ  Ｊ，Ｌｉｎ  Ｓ，Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｈｅｒｚｏｇ  ＲＷ，Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ（２０１４）「植物細胞にバイオカプセル化した抗原の経口送達による血友病ＡマウスモデルにおけるＦＶＩＩＩに対する阻害因子形成の抑制（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＦＶＩＩＩ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  ｂｙ  ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｉｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｂｌｏｏｄ  １２４：１６５９−１６６８
Ｓｈｉｌ  ＰＫ，Ｋｗｏｎ  ＫＣ，Ｚｈｕ  Ｐ，Ｖｅｒｍａ  Ａ，Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ，Ｌｉ  Ｑ（２０１４）「植物細胞にバイオカプセル化したＡＣＥ２／Ａｎｇ−（１−７）の経口送達は実験的ぶどう膜炎及び自己免疫性ぶどう膜網膜炎を防ぐ（Ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＡＣＥ２／Ａｎｇ−（１−７）ｂｉｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｕｖｅｉｔｉｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）」．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２２：２０６９−２０８２
Ｖｅｒｍａ  Ｄ，Ｍｏｇｈｉｍｉ  Ｂ，ＬｏＤｕｃａ  ＰＡ，Ｓｉｎｇｈ  ＨＤ，Ｈｏｆｆｍａｎ  ＢＥ，Ｈｅｒｚｏｇ  ＲＷ，Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ（２０１０）「バイオカプセル化凝固第ＩＸ因子の経口送達は血友病Ｂマウスの阻害因子形成及び致死的アナフィラキシーを防ぐ（Ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆａｔａｌ  ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ  ｍｉｃｅ）」．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：７１０１−７１０６
Ｖｅｒｍａ  Ｄ，Ｓａｍｓｏｎ  ＮＰ，Ｋｏｙａ  Ｖ，Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ（２００８）「葉緑体における外来性遺伝子の発現プロトコル（Ａ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ）」．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ３：７３９−７５８
Ｗａｈｅｅｄ  ＭＴ，Ｔｈｏｅｎｅｓ  Ｎ，Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｍ，Ｈａｓｓａｎ  ＳＷ，Ｇｏｔｔｓｃｈａｍｅｌ  Ｊ，Ｌｏｅｓｓｌ  Ｅ，Ｋａｕｌ  ＨＰ，Ｌｏｅｓｓｌ  ＡＧ（２０１１ａ）「アジュバントとしてのＬＴＢと融合したヒトパピローマウイルス１６型Ｌ１抗原を含む二重五量体ワクチン候補のプラスチド発現：トランスプラストミック植物は多面的表現型を示す（Ｐｌａｓｔｉｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｐｅｎｔａｍｅｒｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−１６  Ｌ１  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｕｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ＬＴＢ  ａｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ：ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｓｈｏｗ  ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ  ９：６５１−６６０
Ｗａｈｅｅｄ  ＭＴ，Ｔｈｏｅｎｅｓ  Ｎ，Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｍ，Ｈａｓｓａｎ  ＳＷ，Ｒａｚａｖｉ  ＮＭ，Ｌｏｅｓｓｌ  Ｅ，Ｋａｕｌ  ＨＰ，Ｌｏｅｓｓｌ  ＡＧ（２０１１ｂ）「タバコにおけるカプソメアのアセンブリにつながる修飾ヒトパピローマウイルスＬ１タンパク質のトランスプラストミック発現：費用対効果の高い第２世代ワクチンに向けた一歩（Ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｌ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃａｐｓｏｍｅｒｅｓ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ：ａ  ｓｔｅｐ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ２０：２７１−２８２
Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｓｕ  Ｊ，Ｓｈｅｒｍａｎ  Ａ，Ｒｏｇｅｒｓ  ＧＬ，Ｌｉａｏ  Ｇ，Ｈｏｆｆｍａｎ  ＢＥ，Ｌｅｏｎｇ  ＫＷ，Ｔｅｒｈｏｒｓｔ  Ｃ，Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ，Ｈｅｒｚｏｇ  ＲＷ（２０１５）「血友病療法に対する植物ベースの経口トレランスはＬＡＰ＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含めた複合的免疫調節応答を用いる（Ｐｌａｎｔ−ｂａｓｅｄ  ｏｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｅｍｐｌｏｙｓ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ＬＡＰ＋ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｂｌｏｏｄ  １２５：２４１８−２４２７
Ｙｅ  ＧＮ，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ  ＰＴＪ，Ｂｒｏｙｌｅｓ  Ｄ，Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ  Ｄ，Ｘｕ  ＣＷ，Ｎｅｈｒａ  Ｎ，Ｓｔａｕｂ  ＪＭ（２００１）「プラスチドが発現する５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子がタバコにおける高レベルのグリホセート耐性を提供する（Ｐｌａｓｔｉｄ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ５−ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ２５：２６１−２７０
Ｙｕ  ＣＨ，Ｄａｎｇ  Ｙ，Ｚｈｏｕ  Ｚ，Ｗｕ  Ｃ，Ｚｈａｏ  Ｆ，Ｓａｃｈｓ  ＭＳ，Ｌｉｕ  Ｙ（２０１５）「コドン使用は局所翻訳伸長速度に影響を与えて共翻訳タンパク質フォールディングを調節する（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ）」．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５９：７４４−７５４
Ｚｏｓｃｈｋｅ  Ｒ，Ｂａｒｋａｎ  Ａ（２０１５）「トウモロコシにおけるチラコイド結合リボソームのゲノムワイド分析は、チラコイド膜への共翻訳ターゲティングの原理を明らかにする（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｙｌａｋｏｉｄ−ｂｏｕｎｄ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｍａｉｚｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）」．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１２：Ｅ１６７８−８７
Ｚｏｓｃｈｋｅ  Ｒ，Ｗａｔｋｉｎｓ  ＫＰ，Ｂａｒｋａｎ  Ａ（２０１３）「高速リボソームプロファイリング方法はインビボでの葉緑体リボソーム挙動を解明する（Ａ  ｒａｐｉｄ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｅｌｕｃｉｄａｔｅｓ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２５：２２６５−２２７５
Ｂｕｒｎｓ，Ｃ．Ｃ．，Ｄｉｏｐ，Ｏ．Ｍ．，Ｓｕｔｔｅｒ，Ｒ．Ｗ．＆  Ｋｅｗ，Ｏ．Ｍ．「ワクチン由来ポリオウイルス（Ｖａｃｃｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓｅｓ）」．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２１０（Ｓｕｐｐｌ．１），Ｓ２８３−Ｓ２９３（２０１４）．
Ｆａｍｕｌａｒｅ，Ｍ．＆  Ｈｕ，Ｈ．「エピデミック及びエンデミック疾患の系統地理学的データから伝染ネットワークを抽出する：シエラレオネにおけるエボラウイルス、２００９年Ｈ１Ｎ１パンデミックインフルエンザ及びナイジェリアにおけるポリオ（Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈｙｌｏｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  ｄａｔａ  ｆｏｒ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｅｎｄｅｍｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｓｉｅｒｒａ  Ｌｅｏｎｅ，２００９  Ｈ１Ｎ１  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｎｄ  ｐｏｌｉｏ  ｉｎ  Ｎｉｇｅｒｉａ）」．Ｉｎｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ７，１３０−１３８（２０１５）．
Ｂｕｒｎｓ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．「ナイジェリア北部における大規模アウトブレイクの間の２型ワクチン由来ポリオウイルスの多重独立発生（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２  ｖａｃｃｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｉｎ  ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｎｉｇｅｒｉａ）」．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７，４９０７−４９２２（２０１３）．
Ｌａｘｍｉｖａｎｄａｎａ，Ｒ．，Ｙｅｒｇｏｌｋａｒ，Ｐ．，Ｇｏｐａｌｋｒｉｓｈｎａ，Ｖ．＆  Ｃｈｉｔａｍｂａｒ，Ｓ．Ｄ．「インド南西部における急性弛緩性麻痺に関連する非ポリオエンテロウイルス感染症の特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｐｏｌｉｏ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｆｌａｃｃｉｄ  ｐａｒａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｓｏｕｔｈ−Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｉｎｄｉａ）」．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ６１６５０（２０１３）．
Ｄｈｏｌｅ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「インドの急性弛緩性麻痺小児における非ポリオエンテロウイルス：ポリオ根絶前の重要な評価（Ｎｏｎ−ｐｏｌｉｏ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｆｌａｃｃｉｄ  ｐａｒａｌｙｓｉｓ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ：ｖｉｔａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｂｅｆｏｒｅ  ｐｏｌｉｏ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ）」．Ｊ．Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｃｈｉｌｄ．Ｈｅａｌｔｈ  ４５，４０９−４１３（２００９）．
Ｂｒｏｗｎ，Ｂ．，Ｍ．Ｓ．Ｏｂｅｒｓｔｅ，Ｋ．Ｍａｈｅｒ，＆  Ｍ．Ａ．Ｐａｌｌａｎｓｃｈ．「完全ゲノム配列決定はポリオウイルスとヒトエンテロウイルス種Ｃのメンバーとが非カプシドコード領域において近縁関係にあることを示す（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｈｏｗｓ  ｔｈａｔ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｃ  ａｒｅ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｎｃａｐｓｉｄ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７，８９７３−８９８４（２００３）．
Ｒａｋｏｔｏ−Ａｎｄｒｉａｎａｒｉｖｅｌｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．「マダガスカルにおける高頻度のヒトエンテロウイルス種Ｃ循環（Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｃ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｄａｇａｓｃａｒ）」．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３，２４２−２４９（２００５）．
Ａｄｅｎｉｊｉ，Ｊ．Ａ．＆  Ｆａｌｅｙｅ，Ｔ．Ｏ．「ナイジェリアで循環するエンテロウイルスＣ株及び組換え循環ワクチン由来ポリオウイルスの発生に対するその寄与（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  Ｃ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｎｉｇｅｒｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓｅｓ）」．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１６０，６７５−６８３（２０１５）．
Ｊｉａｎｇ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．「ＣクラスターコクサッキーＡ型ウイルスからの多様なポリオウイルス出現のエビデンス及び世界的ポリオウイルス根絶に向けた意味（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃ−ｃｌｕｓｔｅｒ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｌｏｂａｌ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ）」．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４，９４５７−９４６２（２００７）．
Ｋｏｕｉａｖｓｋａｉａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．「皮内不活化ポリオウイルスワクチン：前臨床用量設定試験（Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ：ａ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｏｓｅ−ｆｉｎｄｉｎｇ  ｓｔｕｄｙ）」．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２１１，１４４７−１４５０（２０１５）．
Ｐａｒｋｅｒ，Ｅ．Ｐ．，Ｍｏｌｏｄｅｃｋｙ，Ｎ．Ａ．，Ｐｏｎｓ−Ｓａｌｏｒｔ，Ｍ．，Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｋ．Ｍ．＆  Ｇｒａｓｓｌｙ，Ｎ．Ｃ．「不活化ポリオウイルスワクチンが粘膜免疫に及ぼす影響：ポリオ根絶最終段階に向けた意味（Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｏｎ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｏｌｉｏ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｇａｍｅ）」．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １４，１１１３−１１２３（２０１５）．
Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．＆  Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｈ．「ヒト感染症に対する植物製経口ワクチン−まだ辿り着かないの？（Ｐｌａｎｔ−ｍａｄｅ  ｏｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ−Ａｒｅ  ｗｅ  ｔｈｅｒｅ  ｙｅｔ？）」  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１３，１０５６−１０７０（２０１５）．
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Ｊｉｎ，Ｓ．＆  Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｈ．「改変葉緑体ゲノムはスマート化したばかり（Ｔｈｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｊｕｓｔ  ｇｏｔ  ｓｍａｒｔｅｒ）」．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．２０，６２２−６４０（２０１５）．
Ｋｗｏｎ，Ｋ．Ｃ．，Ｖｅｒｍａ，Ｄ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｎ．Ｄ．，Ｈｅｒｚｏｇ，Ｒ．＆  Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ．「植物細胞にバイオカプセル化したヒトバイオ医薬品、自己抗原及びワクチン抗原の経口送達（Ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｉｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ）」．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６５，７８２−７９９（２０１３）．
Ｋｏｎｇ．，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．「トランスジェニック植物で発現するＢ型肝炎表面抗原による経口免疫化（Ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ）」．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８，１１５３９−１１５４４（２００１）．
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Ｒｙｂｉｃｋｉ，Ｅ．Ｐ．「ウイルスに対する植物ベースのワクチン（Ｐｌａｎｔ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ）」．Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．１１，２０５−２２４（２０１４）．
Ｒｕｈｌｍａｎ，Ｔ．，Ａｈａｎｇａｒｉ，Ｒ．Ｄｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｓａｍｓａｍ，Ｍ．＆  Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ．「レタス及びタバコ葉緑体におけるコレラ毒素Ｂプロインスリン融合タンパク質の発現−経口投与は非肥満糖尿病マウスの膵島炎の発症を防ぐ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ−ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｌｅｔｔｕｃｅ  ａｎｄ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ−ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．５，４９５−５１０（２００７）．
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Ｋａｎａｇａｒａｊ，Ａ．Ｐ．，Ｖｅｒｍａ，Ｄ．＆  Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ．「レタス葉緑体におけるデング３型プレ膜及びエンベロープポリタンパク質の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ−３  ｐｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｌｅｔｔｕｃｅ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７６，３２３−３３３（２０１１）．
Ｄｏｍｉｎｇｏｓ，Ｍ．ｄｅ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．「経口及び非経口の両方のワクチン接種用の新規油ベースの抗原送達製剤（Ａ  ｎｅｗ  ｏｉｌ−ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  ｏｒａｌ  ａｎｄ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」．Ｏｐｅｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｊ．２，５２−６０（２００８）．
Ｌｅｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．．「アジュバントサポニンを伴う植物小胞体で発現する赤血球凝集素Ｈ５の経口免疫化はマウスを高病原性鳥インフルエンザＡウイルス感染から防御する（Ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ  Ｈ５  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｗｉｔｈ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓａｐｏｎｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１３，６２−７２（２０１５）．
Ｆｒｅｙ，Ａ．，Ｄｉ  Ｃａｎｚｉｏ  ＆  Ｊ．，Ｚｕｒａｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．「イムノアッセイのための統計的に定義付けられたエンドポイント力価決定方法（Ａ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｔｉｔｅｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）」．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２１，３５−４１（１９９８）．
Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｊ．，Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ｌ．Ｖ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．＆  Ａｇｇｅｒ，Ｅ．Ｍ．「アジュバントＣＡＦ０１に製剤化した不活化ポリオウイルスによる誘導用量節約（Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｄｏｓｅ  ｓｐａｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ＣＡＦ０１）」．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ１００８７９（２０１４）．
【００９９】
実施例ＩＩ
種々のポリオウイルス血清型に対する免疫を付与するコールドチェーン及びウイルス不要の植物製ブースターワクチン
植物形質転換ベクターの構築
セービン１コード配列（ＣＤＳ）に由来する２つのＶＰ１タンパク質をタバコ及びレタス葉緑体で発現させた。図４Ａを参照のこと。第１の配列は、経粘膜担体ＣＴＢと融合した天然９０６ｂｐ  ＶＰ１配列（５１．９８％ＡＴ）を包含した。第２の配列は、実施例Ｉに記載されるとおりタバコ及びレタス葉緑体における発現にコドン最適化した。タンパク質中の３０２アミノ酸のうち１８７個のコドンについて、コドン使用頻度が葉緑体ｐｓｂＡ遺伝子（最も高度に翻訳される葉緑体遺伝子）のものに類似するよう変更することにより最適化した。レアコドンを葉緑体におけるトランス遺伝子発現に最適なコドンに置き換え、最適化したＶＰ１遺伝子のＡＴ含量が５１．９８％から５９．０３％に増加した。両方のＣＴＢ−ＶＰ１融合遺伝子とも、ＧＰＧＰ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）（配列番号１３）ヒンジ領域と共に構築して融合したＶＰ１の立体障害を最小限に抑え、並びにフューリン切断部位、ＲＲＫＲＳＶ（Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ）（配列番号１４）と共に構築した（図１０Ａ）。融合遺伝子はｐｓｂＡプロモーター及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）によってドライブして発現を増加させ、及びｐｓｂＡ  ３’−ＵＴＲによって転写物を安定化させた。
【０１００】
タバコ及びレタスプラストームへの外来性遺伝子の組込み
微粒子銃パーティクルボンバードメントによってＣＴＢ−ＶＰ１トランスプラストミック系統を作成した。スペクチノマイシン含有培地で選択した後、タバコについて３Ｐ／３Ｍ及び５Ｐ／２Ｍ又はレタスについて１６Ｓ−Ｆｗ／３Ｍ及び５Ｐ／２ＭのプライマーセットによるＰＣＲ分析によって推定トランスプラストミック系統を確認した（データは示さず）。ＣＴＢ−ＶＰ１遺伝子のターゲット組込み及びホモプラスミーをｔｒｎＩ及びｔｒｎＡフランキング配列でプローブしたサザンブロットによって更に確かめた（図９Ｂ）。全ての独立したトランスプラストミックタバコ系統が、ＡｆｌＩＩＩ消化した全ＤＮＡブロットにおいて野生型からの４．４ｋｂ断片を除き、正しいサイズの個別的なハイブリダイゼーション断片を示した（図９Ａ）。トランスプラストミックレタス系統は１２．２ｋｂの予想サイズのハイブリダイズ断片を示したが、非形質転換野生型植物からの９．１ｋｂ断片もまた示し、ヘテロプラスミーが示唆された。しかしながら、２ラウンドの選択後、トランスプラストミックレタス系統１はほぼホモプラスミーに達した（図９Ｃ及び図９Ｄ）。従ってサザンブロット分析により、葉緑体ゲノムへのトランス遺伝子の部位特異的な安定組込み及びトランス遺伝子ホモプラスミーが確認された。図９Ｄに示されるとおり、レタス由来のＣＴＢ−ＶＰ１は４４ｋＤａの正しい分子質量で検出された。
【０１０１】
凍結乾燥タバコ葉におけるフォールディング、安定性及びＣＴＢ−ＶＰ１五量体アセンブリ
トランスプラストミック植物におけるＣＴＢ−ＶＰ１蓄積をウエスタンブロット分析によって定量化した。天然及びコドン最適化植物のバンドにおけるＣＴＢ−ＶＰ１タンパク質の強度を既知量のＣＴＢ標準と比較した。ウエスタンブロット分析から、天然ＶＰ１遺伝子産物と比較したときコドン最適化ＶＰ１配列がＣＴＢ−ＶＰ１の蓄積を有意に増加させたことが示された。天然及びコドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１は全葉タンパク質のそれぞれ最大０．１％及び４〜５％に達した（ターゲットＭＳ又はウエスタンブロットを用いた定量化に基づけば最大１００倍の増加、データは示さず）。図９Ｄに示すとおり、４４ｋＤａの正しい分子質量を有する単量体ＣＴＢ−ＶＰ１融合タンパク質が抗ＣＴＢ又はＶＰ１抗体で検出された。ＣＴＢ−ＶＰ１抗原は、凍結葉試料と比較したとき凍結乾燥細胞中で約２０倍増加した。試験した全ての凍結乾燥試料において周囲温度で４及び８ヵ月間の貯蔵後にＣＴＢ−ＶＰ１融合タンパク質のインタクトな単量体バンドが観察され、いかなるＣＴＢ−ＶＰ１の検出可能な分解もなかった。ＧＭ１結合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、葉緑体で発現したＣＴＢ−ＶＰ１の五量体構造の形成を評価した。図１０に示すとおり、タバコからの天然の及びコドン最適化した新鮮及び凍結乾燥ＣＴＢ−ＶＰ１の両方がＣＴＢ（陽性対照）と同等の吸光度を示し、一方、野生型植物又はＢＳＡ（陰性対照）からはシグナルは検出されなかった。これは、新鮮葉緑体及び凍結乾燥葉緑体の両方で発現するＣＴＢ−ＶＰ１融合タンパク質が、タンパク質薬物送達の要件であるＧＭ１ガングリオシド受容体に結合し得る正しい五量体構造を形成したことを示している。凍結乾燥し、及び８ヵ月間周囲温度で長期間保存した後にも、ＶＰ１の安定性、ＧＭ１ガングリオシド受容体への結合の有効性、正しいフォールディング及び五量体アセンブリが維持された。
【０１０２】
ＶＰ１に対する動物ワクチン接種及び抗体反応
植物由来サブユニットワクチンは耐熱性であり、動物病原体による汚染がない。こうしたワクチンはまた、複数の感染症を防御するため、複数の抗原及び経粘膜担体（ｃａｒｒｉｒｅ）を含むように操作することもできる。かかる機構的及び概念的進歩は、発酵、精製、低温貯蔵及び輸送などの複雑な生産システムのコスト削減により、ワクチン送達に革命をもたらし得る。植物ベースのワクチン生産の２つの大きな課題としては、核ゲノムによる抗原の発現レベルの低さ、及びアジュバントによる抗原プライミング注射なしにはトレランスが誘導される可能性があることが挙げられる。
【０１０３】
ワクチン有効性の低さ、不安定性及び神経毒性への復帰、循環ワクチン由来ポリオウイルスの排出、並びに不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）のコストの高さ及び不適切な粘膜免疫を含めた現行のＯＰＶの不適切な点に対処するため、本研究では植物細胞にバイオカプセル化したポリオウイルス抗原を使用して低コストブースターワクチンを開発した。経口ブースターにＯＰＶ反復ワクチン接種よりむしろ植物製ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）サブユニットワクチンを使用する戦略は、全世界的ＰＶ根絶という目標を達成するための新規手法である。本研究では、本発明者らは、植物製アジュバント（サポニン及びスクアレン）と併せた葉緑体由来ＶＰ１による経口ブースティングが強力な免疫応答を誘導して、それが種々のＰＶ血清型に対する防御免疫を付与することのエビデンスを提供する。
【０１０４】
前出の例では、本発明者らは凍結乾燥ＣＴＢ−ＶＰ１タンパク質について記載している。本例では、このタンパク質を植物由来のアジュバント（サポニン及び／又はスクアレン）と共に製剤化しており、これらのアジュバントは特異的抗体免疫原性を誘導して種々のポリオウイルス血清型を中和するものである。マウスを「方法」の節及び以下の表に記載するとおり群に分けた。
【０１０５】
【表２】
2019509064.tif 000003
【０１０６】
植物形質転換ベクターの構築
セービン１コード配列（ＣＤＳ）に由来する２つのＶＰ１タンパク質をタバコ葉緑体で発現させた。第１の配列は、経粘膜担体ＣＴＢと融合した天然９０６ｂｐ  ＶＰ１配列（５１．９８％ＡＴ）を包含した。第２の配列は、タバコ及びレタス葉緑体における発現にコドン最適化した。タンパク質中の３０２アミノ酸のうち１８７個のコドンについて、コドン使用頻度が葉緑体ｐｓｂＡ遺伝子（最も高度に翻訳される葉緑体遺伝子）のものに類似するよう変更することにより最適化した。レアコドンを葉緑体におけるトランス遺伝子発現に最適なコドンに置き換え、最適化したＶＰ１遺伝子のＡＴ含量が５１．９８％から５９．０３％に増加した。両方のＣＴＢ−ＶＰ１融合遺伝子とも、ＧＰＧＰ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ヒンジ領域と共に構築して融合したＶＰ１の立体障害を最小限に抑え、並びにフューリン切断部位、ＲＲＫＲＳＶ（Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ）と共に構築した（図４Ａ及び図９Ｂ）。融合遺伝子はｐｓｂＡプロモーター及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）によってドライブして発現を増加させ、及びｐｓｂＡ  ３’−ＵＴＲによって転写物を安定化させた。
【０１０７】
ＶＰ１に対する動物ワクチン接種及び抗体反応
上述のとおり、マウスを上記の表に示される群に分けた。免疫化の１日前、全ての群のマウスを採血した。本発明者らは、アジュバントと共にＩＰＶ又はＣＴＢ−ＶＰ１でブーストした後２９、４３、５７、８７及び１１７日目に種々の時点のＶＰ１特異的ＩｇＧ１及びＩｇＡ抗体の血清力価を決定した。試験した全ての時点で、全身及び粘膜免疫応答をＥＬＩＳＡによって定量化した。ＶＰ１−ＩｇＧ１力価は初めの１ヵ月で最も高いレベルに達し、同じレベルに留まった。更なるブースティングによってはＶＰ１−ＩｇＧ１レベルは増加しなかった（図１１を参照）。コドン最適化ＣＴＢ−ＶＰ１＋両方のアジュバントでブーストしたマウスもまた、ＩＰＶでブーストしたもの（群９、図１１Ｂ〜図１１Ｆを参照）よりも高い抗ＶＰ１  ＩｇＧ１抗体力価を有した。同様に、ＶＰ１−ＩｇＡ力価も経口ブースティング後に初めの１ヵ月で増加し、後続のブースティングがもたらしたＩｇＡ力価の増加は僅かであった（図１１Ｇ〜図１１Ｊ）。際立って対照的に、ＩＰＶブースティングによってはＩｇＡ力価は増加せず、全身ワクチン送達の限界が確認された。これらの結果は、ＣＴＢ−ＶＰ１を発現する植物細胞による経口ブースティングが粘膜免疫応答及び全身免疫応答の両方を誘導し得る一方、ＩＰＶプライム／ブーストはより低いレベルのＩｇＧ１及び無視できる程のＩｇＡ力価を生じさせたことを示している。
【０１０８】
更に、コドン最適化ＶＰ１によるワクチン接種が特異的抗ＶＰ１  ＩｇＧ１及びＩｇＡの有意に高い血清力価を誘導したことから、凍結乾燥コドン最適化材料における抗原の高発現が有効な免疫化に決定的に重要であることが示される。更に、２つのアジュバントと組み合わせた天然又はコドン最適化のいずれのＶＰ１抗原によるブースティングも（群５、８及び９）、いずれか一方のアジュバントを併せるよりも強力なＩｇＧ１及びＩｇＡ免疫応答を誘導したことから、植物由来のアジュバントが粘膜経路（ｒｏｔｅ）による抗原の送達並びに強力な粘膜及び全身免疫応答の発生を亢進させることが示唆される。
【０１０９】
プライミング及びブースティング後の全てのセービン１、２及び３株に対するポリオウイルス中和力価
抗ＶＰ１  ＩｇＧ１及びＩｇＡ抗体がポリオウイルスを中和することができるかどうかを決定するため、３つ全てのセービン血清型についてウイルス中和力価を測定した。全ての実験群及び未処置群からの血液試料をＣＤＣにおいて二重盲検式にトリプリケート試料で試験した。血清試料は、抗体がｌｏｇ2力価≧２．５で存在する場合に血清反応陽性と見なした。個々の中和力価をプロットした。バーは各群の中和力価平均値±ＳＥＭを表す。結果は、ＩＰＶプライミング後に、全ての実験群−天然（群３〜５）又はコドン最適化ＶＰ１抗原＋いずれか一方又は両方のアジュバント（群６〜９）による経口ブースティング、並びに同じＩＰＶのみによるプライミング及びブースティング（群２）が３つ全てのセービン株血清型に対して有意に高い中和力価を誘導したことを示している。結果は、コドン最適化ＶＰ１＋サポニン及びスクアレンによる経口ブースティング（群８）が最も多いセービン１、セービン２及びセービン３中和抗体を生じ、プライミング及びブーストの両方をＩＰＶで行ったマウス群（群２）と同様であったことを示している（図１２）。異なるセービンウイルス血清型間で中和有効性に有意な統計学的差はなかったが、ＩＰＶプライム／ブースト（Ｐ＜０．０１）及び植物細胞を用いた経口ブースティング（Ｐ＜０．００１）でセービン３が最も高い中和力価を有した。しかしながら、ＩＰＶプライミングなしにコドン最適化ＶＰ１で経口的にブーストしたのみのマウスの血清中には、中和抗体は検出されなかった。
【０１１０】
ポリオウイルス中和抗体の血清陽性率を決定するため、各セービン株について、血清有病（中和抗体ｌｏｇ2（力価）≧３）のマウスの数を各群のマウス総数と比較した。ＩＰＶでブーストしたマウス（群２）、又はコドン最適化ＶＰ１抗原＋サポニン及びスクアレンアジュバントで経口的にブーストしたマウス（群８）は、ポリオウイルスセービン１、２及び３中和抗体について高い血清陽性率を示した（図１３−Ｄ）。血清陽性率は、ＩＰＶプライム／ブースト対ＶＰ１による経口ブースティングについて７０〜９０％の間で様々であったが、同様のＰ値（＜０．００１）で統計学的差はなかった。これらの結果は、サポニン及びスクアレンの両方をアジュバントとしたコドン最適化ＶＰ１抗原が、セービン１、２及び３株の全てに対して最も高い血清陽性率（図１３）及びウイルス中和力価（図１３）（ｌｏｇ2力価約３．１７〜１０．１７）を有することを示している。この結果は、ＯＰＶブースティングによって引き起こされると考えられる野生型ポリオウイルス又はｃＶＤＰＶの再燃に苦慮する国々において、植物細胞にバイオカプセル化したサブユニットワクチンを灰白髄炎に対する費用対効果の高いブースターワクチンとして使用し得ることを実証している。
【０１１１】
考察
ＶＤＰＶ２のアウトブレイク後、血清型２型ＯＰＶの使用中止リスクを軽減するため少なくとも１回のＩＰＶ接種をルーチンの免疫スケジュールに取り入れることを支援して、２０１３年に幾つかの重要な地球規模の政策及び手順が採られた。ＷＨＯの戦略的諮問専門家グループ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｔｓ：ＳＡＧＥ）はルーチンの免疫プログラムからのＯＰＶ２の使用中止を全ての国に勧告し、これは２０１５年のＯＰＶを使用する全ての国における少なくとも１回のＩＰＶ接種の導入、及び２０１６年の全世界的なＯＰＶ２の使用中止によって促進された（世界ポリオ根絶構想（ｇｌｏｂａｌ  ｐｏｌｉｏ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ：ＧＰＥＩ）、２０１５年）。これらの現状での優先事項を達成するためには、許認可及びルーチン免疫への二価ＯＰＶの利用し易さの向上、並びにＯＰＶを使用する全ての国への少なくとも１回のＩＰＶ接種の確かな実現を含め、必要な活動に重点が置かれなければならない。しかしながら、ＩＰＶの全世界的な導入及び来たる三価ＯＰＶ（ｔＯＰＶ）から二価ＯＰＶ（ｂＯＰＶ）への切り替えの準備には、ＩＰＶ供給の逼迫、持続的ｃＶＤＰＶ伝播及び封じ込め要件に適合するための課題を含め、複数のリスクがなおも残っている（ＧＰＥＩポリオ根絶最終段階の中期レビュー（Ｐｏｌｉｏ  Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ＆  Ｅｎｄｇａｍｅ  Ｍｉｄｔｅｒｍ  Ｒｅｖｉｅｗ）、２０１５年）。最も重要なことには、ＩＰＶ以外に利用可能なブースター技術はなく、多くの発展途上国はその費用を負担できない。更に、ＯＰＶワクチン接種のルーチンでの使用は、世界ＰＶ根絶上は中止すべきであり、全世界でＯＰＶの代わりにＩＰＶを導入することが求められている。同時に、ＶＤＰＶの出現及び将来起こる野生型ＰＶのアウトブレイクに対して高いレベルの集団免疫を維持する必要がある。しかしながら、ＩＰＶワクチン接種１回当たりの現在の費用は発展途上国にとって高過ぎる。
【０１１２】
葉緑体におけるＶＰ１の発現及び植物細胞へのバイオカプセル化は、経口送達時に抗原を消化器系から保護することができ、片利共生微生物による腸内での免疫系へのその放出を促進する22、23。ＣＴＢ抗原融合物は、ＧＭ１腸上皮受容体を介した免疫系への経粘膜送達を促進する24。更に、ＣＴＢ融合ワクチン抗原はプライミング及び経口ブースター後に抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの産生を刺激して、毒素／病原体攻撃からの防御をもたらす22。コールドチェーンを必要としない、経口投与し易い感染症に対する生ワクチンの生産が、特に低温貯蔵及び輸送の利用が限られている地域において重要なニーズである22。先行研究では、バイオ医薬品又は抗原タンパク質を凍結乾燥植物材料中において室温で数ヵ月間又は更には２年間、いかなる検出可能な分解もなく貯蔵できることが実証されている25〜27。ＶＰ１は、周囲温度で数ヵ月間貯蔵したとき、凍結乾燥植物細胞中で極めて安定している。
【０１１３】
数回の経口ブーストが適切に高レベルの全身及び粘膜免疫を生じさせた後、抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡが有意に誘導された。ＶＰ１−ＩｇＧ１及びＶＰ１−ＩｇＡの両方の力価とも、経口ブースティング後の最初の１ヵ月で最も高いレベルに達し、更なる回数のブースターによってもそれ以上増加しなかった。ここでは後期段階の血清採取からの中和データを提供するが、セービン血清型１型の中和に関して評価した以前のバッチも、ＶＰ１を発現する植物細胞でブーストした群において同様の結果を示した（データは示さず）。本研究では、経口送達前に植物細胞をＰＢＳに懸濁したが、小児への送達については、液糖を含有する好適な製剤が必要となり得る。ＩＰＶは全身性抗体を誘導して麻痺性疾患を防ぐのに極めて有効であるが、ポリオウイルスの再感染及び環境中への排出を防ぐために必要な粘膜免疫の誘導においては効率が下がる。本発明者らの結果から、ＩＰＶでｓ．ｃ．プライミング／ブーストしたマウスにおいてＩｇＡ力価が最小限であることが確認されたが、これはＩＰＶの不十分な粘膜免疫を説明している。ＩＰＶでｓ．ｃ．プライミングしてバイオカプセル化ＶＰ１で経口的にブーストしたマウスは強力な抗原特異的血清ＩｇＧ１（＞１２，８００力価）及びＩｇＡ（＞８００力価）応答を誘発し、アジュバントと併せたＶＰ１抗原の経口送達が全身免疫応答及び粘膜免疫応答の両方を生じさせたことが確認された。ウイルスによる免疫化と異なり、サブユニットワクチンは主としてＩｇＧ１アイソタイプ抗体を伴うＴｈ２応答を誘導する28〜30。サブユニットワクチンによる経口ブースティングは、高いＩｇＧ１／ＩｇＡ力価によって示されるとおり、粘膜免疫応答及び全身免疫応答の両方を誘発する。
【０１１４】
本研究では、本発明者らは葉緑体で発現する天然及びコドン最適化ＶＰ１抗原の両方を評価した。ＶＰ１タンパク質レベルは、コドン最適化ＶＰ１を発現する植物においてはるかに高かった。本発明者らのインビボ研究はまた、コドン最適化ＶＰ１によるワクチン接種が天然ＶＰ１と比べてはるかに高いＩｇＧ１及びＩｇＡ抗体反応を誘導したことも示しており（図１１Ａ〜図１１Ｊ）、ワクチン製剤として経口的に送達される抗原タンパク質が高量であるほど、経口免疫化に一層有効であることが示唆される。ブースト間の間隔がより長かったにも関わらず抗体力価は増加したことから、サブユニットワクチンによるブースティングが強力な記憶免疫応答を生じさせ得ることが示唆される。
【０１１５】
１：８希釈（３ｌｏｇ2（力価））の閾値を上回る力価の中和抗体レベルが、国のあらゆる規制当局により、ＩＰＶ含有ワクチンに関する許可申請の精査時に防御と良好な相関があるとして認められている21、31。予想どおり、全てのセービン株について、ＩＰＶによるプライミング及びブースティングによって誘導されたウイルス中和力価は高かった。本発明者らの研究では、ＩＰＶによるプライミング及びアジュバント（サポニン及びスクアレン）と併せたバイオカプセル化ＶＰ１による経口ブースティングが、全てのセービン１、２、３株に対して最も高い血清陽性及びウイルス中和力価を示した（３．１７〜１０．１７の範囲のｌｏｇ2力価）。ＶＰ１＋２つのアジュバントによるブーストのみで、プライミングしなかったマウス（群９）は、最も強力なＶＰ１特異抗体（ＩｇＧ１及びＩｇＡ）産生を示したが、ＩＰＶでプライミングしたマウスと比較したとき、この群では中和ウイルス力価は観察されなかった。従って、サブユニットワクチン接種による経口ブースティング単独は、抗原に対する良好な中和抗体反応を誘導するには不十分であるように見える。ＥＬＩＳＡによるこれらの高い抗ＶＰ１抗体は、感染細胞の表面上に発現するウイルスタンパク質に結合するのみで、遊離ウイルス粒子には有意と言える程には結合せず、従ってそれらはウイルスを中和して細胞をウイルス感染から防御することができない可能性もある32。ウイルス感染の細胞間伝播を阻止するには、高濃度の中和抗体が必要である33〜35。これらの結果は、病原体に対して十分な免疫を誘導するには経口プライミングが不可欠であることを実証している。
【０１１６】
本研究はポリオブースターワクチンに焦点を当てているが、平均余命が増加していることに伴い、免疫をブーストする必要性は高まっている。高齢者集団で感染症に対する免疫が失われることについての懸念は増大しつつある。例えば、帯状疱疹は、加齢によって免疫系が弱まったときに潜伏性水痘ウイルスが再活性化すると起こり、これが新規のウイルス感染に起因して観察されることはめったにない。従って、高齢者集団で幾つもの感染症に対する免疫を亢進させるため、低コストの経口ブースターワクチンがあれば、この目的に適うことができるであろう。
【０１１７】
結論として、現在、いかなる感染症に対しても、ウイルス不要及びコールドチェーン不要のワクチンは利用可能でない。従って、トランスプラストミック技術を用いたワクチンの生産及び経口送達は、低コストのコールドチェーン不要及びウイルス不要のブースターワクチンの開発を促進するであろう。ここで本発明者らは、全世界的ＰＶ根絶及びエンデミック地域におけるポリオアウトブレイクの予防に向けたＯＰＶワクチン反復接種を回避する代替戦略としてのバイオカプセル化ポリオ抗原を使用した低コストのブースターワクチンを示す。
【０１１８】
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２５．Ｌａｋｓｈｍｉ，Ｐ．Ｓ．，Ｖｅｒｍａ，Ｄ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，Ｌｌｏｙｄ，Ｂ．＆  Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｈ．「カプセル状の低コスト結核ワクチン抗原：葉緑体における発現、バイオカプセル化、インビトロでの安定性及び機能評価（Ｌｏｗ  ｃｏｓｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｃａｐｓｕｌｅｓ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ，ｂｉｏ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）」．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ５４７０８（２０１３）．
２６．Ｓｈｉｌ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．「植物細胞にバイオカプセル化したＡＣＥ２／Ａｎｇ−（１−７）の経口送達は実験的ぶどう膜炎及び自己免疫性ぶどう膜網膜炎を防ぐ（Ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＡＣＥ２／Ａｎｇ−（１−７）ｂｉｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｕｖｅｉｔｉｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）」．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２，２０６９−２０８２（２０１４）．
２７．Ｓｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．「血友病Ｂにおける経口トレランス誘導のためのレタス細胞にバイオカプセル化した凝固第ＩＸ因子の低コスト工業生産（Ｌｏｗ  ｃｏｓｔ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｂｉｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｌｅｔｔｕｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ）」．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ７０，８４−９３（２０１５）．
２８．Ｂｕｃｈｍａｎ，Ｇ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．「タンパク質ベースの天然痘ワクチンは非ヒト霊長類を致死性サル痘ウイルス攻撃から防御する（Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｍａｌｌｐｏｘ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌｅｔｈａｌ  ｍｏｎｋｅｙｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）」．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８，６６２７−６６３６（２０１０）．
２９．Ｆｏｇｇ，Ｃ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．「組換えタンパク質に対するアジュバント亢進性の抗体反応はオルトポックスウイルス攻撃に対するマウス及びサルの防御と相関する（Ａｄｊｕｖａｎｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｔｏ  ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ）」．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５，２７８７−２７９９（２００７）．
３０．Ｆｏｇｇ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．「細胞内及び細胞外ビリオンの複数の組換え外膜タンパク質によるワクチン接種によって誘導されるワクシニアウイルスに対する防御免疫（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｉｒｉｏｎｓ）」．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８，１０２３０−１０２３７（２００４）．
３１．Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ．「ワクチン接種によって誘導される防御の相関関係（Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」．Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５５−１０６５（２０１０）．
３２．Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．「抗体、ウイルス及びワクチン（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，７０６−７１３（２００２）．
３３．Ｂｕｒｉｏｎｉ，Ｒ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｓａｎｎａ，Ｐ．Ｐ．，Ｂｌｏｏｍ，Ｆ．Ｅ．＆  Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．「糖タンパク質Ｄに対する組換えヒトＦａｂはインビトロで単純ヘルペスウイルス１型及び２型の感染性を中和し、及び細胞間伝播を予防する（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  ｔｏ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓｅｓ  １  ａｎｄ  ２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）」．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，３５５−３５９（１９９４）．
３４．Ｈｏｏｋｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｕｒｎｓ，Ｗ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｇｅｉｓ，Ｓ．＆  Ｎｏｔｋｉｎｓ，Ａ．Ｌ．「中和抗体の存在下におけるウイルスの拡散：泡沫状ウイルス感染における持続機構（Ｖｉｒａｌ  ｓｐｒｅａｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｉｎ  ｆｏａｍｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１４，１１７２−１１７８（１９７６）．
３５．Ｐａｎｔａｌｅｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．「抗Ｖ３抗体が無細胞及び細胞間ヒト免疫不全ウイルス伝播に及ぼす効果（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ｖ３  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）」．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，２２６−２３１（１９９５）．
３６．Ｒｕｈｌｍａｎ，Ｔ．，Ａｈａｎｇａｒｉ，Ｒ．Ｄｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｓａｍｓａｍ，Ｍ．＆  Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ．「レタス及びタバコ葉緑体におけるコレラ毒素Ｂプロインスリン融合タンパク質の発現−経口投与は非肥満糖尿病マウスの膵島炎の発症を防ぐ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ−ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｌｅｔｔｕｃｅ  ａｎｄ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ−ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．５，４９５−５１０（２００７）．
３７．Ｖｅｒｍａ，Ｄ．，Ｓａｍｓｏｎ，Ｎ．Ｐ．，Ｋｏｙａ，Ｖ．＆  Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｈ．「葉緑体における外来性遺伝子の発現プロトコル（Ａ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ）」．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．３，７３９−７５８（２００８）．
３８．Ｋａｎａｇａｒａｊ，Ａ．Ｐ．，Ｖｅｒｍａ，Ｄ．＆  Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｈ．「レタス葉緑体におけるデング３型プレ膜及びエンベロープポリタンパク質の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ−３  ｐｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｌｅｔｔｕｃｅ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７６，３２３−３３３（２０１１）．
３９．Ｄｏｍｉｎｇｏｓ，Ｍ．ｄｅ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．「経口及び非経口の両方のワクチン接種用の新規油ベースの抗原送達製剤（Ａ  ｎｅｗ  ｏｉｌ−ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  ｏｒａｌ  ａｎｄ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」．Ｏｐｅｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｊ．２，５２−６０（２００８）．
４０．Ｌｅｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．「アジュバントサポニンを伴う植物小胞体で発現する赤血球凝集素Ｈ５の経口免疫化はマウスを高病原性鳥インフルエンザＡウイルス感染から防御する（Ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ  Ｈ５  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｗｉｔｈ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓａｐｏｎｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１３，６２−７２（２０１５）．
４１．Ｆｒｅｙ，Ａ．，Ｄｉ  Ｃａｎｚｉｏ  ＆  Ｊ．，Ｚｕｒａｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．「イムノアッセイのための統計的に定義付けられたエンドポイント力価決定方法（Ａ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｔｉｔｅｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）」．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２１，３５−４１（１９９８）．
４２．Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｊ．，Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ｌ．Ｖ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．＆  Ａｇｇｅｒ，Ｅ．Ｍ．「アジュバントＣＡＦ０１に製剤化した不活化ポリオウイルスによる誘導用量節約（Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｄｏｓｅ  ｓｐａｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ＣＡＦ０１）」．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ１００８７９（２０１４）．
【０１１９】
実施例ＩＩＩ
植物葉緑体にバイオカプセル化したコドン最適化インスリン様成長因子１の経口送達
ヒトインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）は、傷害後の筋芽細胞／線維形成、分化及び再生における骨格筋の成長及び発達において重要な役割を果たす。ＥペプチドがＩＧＦ−１の有効性を高めるため、葉緑体でＰｒｏ−ＩＧＦ−１を発現させてコストを削減し、経口送達を促進することが望ましい。
【０１２０】
実施例Ｉに記載した、１３３の植物種からの最も高発現の葉緑体遺伝子に基づき開発したソフトウェアを用いて、Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１Ｅ（１０５ａａ）をコドン最適化した（図１７Ｆを参照）。合成ｐｒｏ−ＩＧＦ−１Ｅを天然配列コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）に融合し、図１４Ａに示されるとおり葉緑体ベクターに挿入した。ＩＧＦ−１のコドン最適化配列の発現に関するイムノブロットアッセイを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で実施した。ＩＧＦ−１の２つのコドン最適化配列（ＣO、コドン最適化した古い方；ＣN、コドン最適化した新しい方）を含む葉緑体発現ベクターで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から全タンパク質を抽出した。図１４Ｂの矢印は、予想タンパク質サイズを示す（ＣＴＢ−ＩＧＦ−１、２４．３ｋＤａ）。ＣＴＢ−ＩＧＦ−１トランスプラストミック系統のサザンブロット分析を図１４Ｃに示す。図１５Ａ〜図１５Ｄは、トランスプラストミック細胞系統におけるコドン最適化ＩＧＦ−１の定量化及び機能分析を示す。
【０１２１】
植物由来ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦＲ）のリン酸化をインビトロで調べた。結果は図１６Ａに示す。図１６Ｂ〜図１６Ｄは、ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の強制経口投与後のマウスで測定したときの循環系中の遊離Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１を示す。ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１はまた、４つのヒト／マウス経口細胞系統の増殖アッセイによっても評価した。図１７Ａ〜図１７Ｅを参照。
【０１２２】
１０５ａａのうち７３個のコドンが修飾された結果、コドン最適化ＩＧＦ−１遺伝子のＡＴ含量は５７％となった。グリコシル化を回避するため、Ｌｓｙ６８、Ａｒｇ７４及びＡｒｇ７７をＧｌｙ６８、Ａｌａ７４及びＡｌａ７７に変えた。図１７Ｆを参照。調べた系統は、サザンブロットでホモプラスミー（全ての葉緑体ゲノムへの組込み）を示し、及びＣＴＢ−ＩＧＦ１の高レベルの発現を示した。凍結乾燥植物細胞のＧＭ１  ＥＬＩＳＡから、五量体形態のＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１の維持及びジスルフィド結合を含むフォールディングが確認された。葉緑体由来ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１はＰ６細胞のＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦＲ）を用量依存的且つ時間依存的にリン酸化した。
【０１２３】
凍結乾燥植物細胞の経口送達後８時間の時点で血中のＰｒｏ−ＩＧＦ−１は３倍に増加し、これは最長２４時間まで維持された（図１８Ｃ）；ｐｒｏ−ＩＧＦ−１は筋組織において２倍高かった（図１６Ｄ）。植物細胞からの精製ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１は、ヒト口腔ケラチノサイト、歯肉由来間葉系間質細胞、頭頸部扁平上皮癌細胞、及びマウス骨芽細胞の増殖を用量依存的に（１．４〜３．９倍高く）刺激した。
【０１２４】
結論
強制経口投与後の植物由来ＣＴＢ−Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１によるＩＧＦＲのリン酸化並びに循環系及び筋組織におけるＰｒｏ−ＩＧＦ−１の維持から、植物細胞にバイオカプセル化した機能性ＩＧＦ１の低コスト生産及び送達にこのシステムが適合することが確認される。凍結乾燥植物細胞は、ＩＧＦ−１の有効性の低下なしに周囲温度で無期限に貯蔵することができる。
【０１２５】
臨床的意義
葉緑体におけるＥペプチドと併せたＰｒｏ−ＩＧＦ−１の発現は、筋肉障害を含めた、ＩＧＦ−１欠損によって引き起こされる障害を治療するための有効、効率的且つ廉価な経口薬物送達概念を提供する。この手法は、反復的長期薬物送達への患者コンプライアンスを高めることに加え、医療費の高騰に対処するための技術的な進歩をもたらす。
【０１２６】
実施例ＩＶ
レタスで作製されるう蝕治療用の廉価なバイオ医薬品
う蝕は、世界中に蔓延しているバイオフィルム関連口腔疾患である。抗菌薬はエキソポリサッカライド（ＥＰＳ）マトリックスに浸透しないため、最小限の有効性しかない。従って、本例では、本発明者らは、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）と融合したＥＰＳ分解酵素デキストラナーゼ及びムタナーゼを発現させる。植物葉緑体における組換え酵素生産は、非常に高価な発酵、精製、低温貯蔵／輸送及び侵襲的外科的送達をなくして周囲温度での貯蔵を促進するため、１０００〜３，１００倍安価である。本例の主な目標は、ＡＭＰ及び酵素を発現する凍結乾燥植物細胞が含浸されたチューインガムを開発することである。従って、レポーター遺伝子ＧＦＰを発現する凍結乾燥植物細胞で作られたチューインガムで、薬物放出が最大限となるように咀嚼シミュレータを使用して咀嚼速度及び時間を最適化する初期研究を実施した。
【０１２７】
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）のデキストラナーゼ遺伝子及びパエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）のムタナーゼ遺伝子をＰＧ１と融合するか、又はＰＧ１無しかのいずれかとし、葉緑体ベクターにクローニングし、その機能を初めに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で評価した。図１８Ａを参照。天然に存在する酵素と最適化バージョンとのコドン使用の違いを図１８Ｂに示す。上記に記載し、及び図１８Ｃに示すとおり、最適化した遺伝子をレタス発現ベクターにクローニングした。ウエスタンブロッティングによりロバストなタンパク質発現が確認された。図１８Ｄを参照。咀嚼シミュレータを使用して、人工唾液中のＧＦＰを定量化することによりガム錠の放出動態を研究した。
【０１２８】
新規コドン最適化アルゴリズムは、ｐｓｂＡコドン階層に基づきムタナーゼ遺伝子における（１２６１個中）５８６個のレアコドンを優先的コドンに置き換えた。コドン最適化ムタナーゼ遺伝子（ＡＭＰ融合有り又は無し）をタバコ及びレタス葉緑体ベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、これは市販の酵素と同様に完全に機能性であった。図１８Ｅを参照。天然デキストラナーゼ遺伝子をタバコ葉緑体ベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるデキストラナーゼ活性を試験した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって産生された組換えデキストラナーゼは寒天プレート上のブルーデキストランを分解し、デキストラン加水分解が確認される。トランスプラストミック系統の作出及び特徴付けの手順を図１８Ｆに示す。
【０１２９】
ガム錠中のＧＦＰがガム調製中に有意に分解されることはなかった。最大限のタンパク質放出に必要な咀嚼速度、時間は、咀嚼シミュレータを使用して現在最適化しているところである。従って、ＡＭＰと融合したＥＰＳ分解酵素の産生は、好ましくはガム錠として投与される、有望なう蝕治療を提供するはずである。
【０１３０】
本発明の好ましい実施形態の幾つかを上記に説明し、具体的に例示したが、本発明をかかる実施形態に限定することは意図されない。それらの実施形態に対しては、以下の特許請求の範囲に記載されるとおりの本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく様々な改良を行うことができる。
【図１】
2019509064.tif 000004
【図２−１】
2019509064.tif 000005
【図２−２】
2019509064.tif 000006
【図２−３】
2019509064.tif 000007
【図３】
2019509064.tif 000008
【図４−１】
2019509064.tif 000009
【図４−２】
2019509064.tif 000010
【図５】
2019509064.tif 000011
【図６Ａ】
2019509064.tif 000012
【図６Ｂ】
2019509064.tif 000013
【図６Ｃ】
2019509064.tif 000014
【図７】
2019509064.tif 000015
【図８Ａ】
2019509064.tif 000016
【図８Ｂ】
2019509064.tif 000017
【図８Ｃ】
2019509064.tif 000018
【図９Ａ】
2019509064.tif 000019
【図９Ｂ】
2019509064.tif 000020
【図９Ｃ】
2019509064.tif 000021
【図９Ｄ】
2019509064.tif 000022
【図１０】
2019509064.tif 000023
【図１１−１】
2019509064.tif 000024
【図１１−２】
2019509064.tif 000025
【図１１−３】
2019509064.tif 000026
【図１１−４】
2019509064.tif 000027
【図１２−１】
2019509064.tif 000028
【図１２−２】
2019509064.tif 000029
【図１３−１】
2019509064.tif 000030
【図１３−２】
2019509064.tif 000031
【図１４】
2019509064.tif 000032
【図１５】
2019509064.tif 000033
【図１６】
2019509064.tif 000034
【図１７−１】
2019509064.tif 000035
【図１７−２】
2019509064.tif 000036
【図１８Ａ】
2019509064.tif 000037
【図１８Ｂ】
2019509064.tif 000038
【図１８Ｃ】
2019509064.tif 000039
【図１８Ｄ】
2019509064.tif 000040
【図１８Ｅ】
2019509064.tif 000041
【図１８Ｆ】
2019509064.tif 000042
【配列表】
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【国際調査報告】
2019509064.tif 000043
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