(57)【要約】  本発明は、第一の態様において、生体高分子複合体の精製のための方法に関する。典型的に、クロマトグラフィーステップは適用されない。つまり、本発明は、生体高分子複合体の精製のための方法に関する。さらに、本発明は、記載された通りの精製に続き、水溶性ポリマーを含有するリザーバー溶液中での結晶化のステップを含む、生体高分子複合体の結晶化のための方法に関する。さらに、本発明による方法によって取得可能な、精製された生体高分子複合体ならびに結晶化された生体高分子複合体が提供される。最後に、個体の２０Ｓプロテアソームを阻害するための候補化合物の適合性を判定するための方法が提供される。前記方法は、癌、自己免疫疾患、筋ジストロフィー、肺気腫、または癌もしくはＡＩＤＳに伴うカヘキシーを治療、改善または予防するための、個体中の２０Ｓプロテアソームの適切な阻害剤を同定する個別化医療において、特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された生体高分子複合体を得るための、
ａ）生体高分子複合体を含有する粗試料を用意するステップ、
ｂ）２５，０００から３５，０００×ｇでの細胞残屑の分離のための第１の遠心分離ステップを行うステップ、
ｃ）０％から２５％（ｗ／ｖ）の量のオスモライト、およびシステインのチオール−アルキル化を可能にする化合物を、第１の遠心分離ステップから得られた上清に補うステップ、
ｄ）５０，０００から１５０，０００×ｇ、例えば、８０，０００から１２０，０００×ｇでの遠心分離による、第２の遠心分離ステップを行うステップ、
ｅ）沈殿のために、第２の遠心分離ステップから得られた上清を、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートで処理するステップ、
ｆ）前記ポリマー、例えば、ポリアルキレングリコールを含有しないバッファー中での再懸濁後に、ポリマーをベースとする沈殿物、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿物を有するオスモライトを使用して、密度勾配遠心分離を行うステップ、
ｇ）ステップｅ）およびｆ）を１回または複数回、任意に繰り返すステップ、
ｈ）生体高分子複合体の水溶性ポリマーをベースとする沈殿、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿による、濃縮のステップ
を含む、生体高分子複合体の精製のための方法。
【請求項２】
ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール、特に、ポリエチレングリコール４００から２０，０００、例えば、４００から６０００である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の遠心分離ステップが、Ｓ３０画分を得る遠心分離である、および／または第２の遠心分離ステップが、Ｓ１００画分を得る遠心分離である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
オスモライト勾配が、１０から４０％（ｗ／ｖ）スクロースのスクロースをベースとする勾配である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第２の遠心分離ステップの後で、上清が、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコールアミン、もしくはポリカルボキシレート、特に、ポリエチレングリコールでの示差沈殿をうけ、前記示差沈殿が、より低い濃度の水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートでの第１の沈殿ステップを含み、それにより生体高分子複合体が上清中に維持され、生体高分子複合体を沈殿させるための、より高い濃度の水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートでのさらなる沈殿ステップを有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体高分子複合体が、プロテアソーム、例えば、２０Ｓプロテアソームまたは２６Ｓプロテアソーム、脂肪酸シンターゼ、例えば、酵母脂肪酸シンターゼである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
粗試料が、細胞の低張性溶解によって得られる、または凍結粉砕によって得られるサイトゾル抽出物である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生体高分子複合体が、免疫プロテアソームであり、方法が、免疫プロテアソームの発現を誘導するのに十分な時間、サイトカイン、特にＩＦＮγを有する細胞を培養するステップを含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレート、特にポリエチレングリコールを含有する、リザーバー溶液中での結晶化のステップをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の生体高分子複合体の精製のための方法を含む、生体高分子複合体の結晶化のための方法。
【請求項１０】
タンパク質濃度が、結晶化のために少なくとも５ｍｇ／ｍｌである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
結晶化のステップが、最初は、１５℃を超える温度で、その後は、８℃以下の温度である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
結晶の安定化および脱水が、８℃以下の温度で実行される、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な、精製された生体高分子複合体。
【請求項１４】
少なくとも２つの異種または相同タンパク質サブユニットから構成される、または核酸分子とタンパク質との組合せである、請求項１３に記載の精製された生体高分子複合体。
【請求項１５】
回折分析によって決定して、３Å以下、例えば、２．２Å以下の分解能を有する、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な、結晶化された生体高分子複合体。
【請求項１６】
個体の２０Ｓプロテアソームを阻害するための候補化合物の適合性を判定するための方法であって、
請求項９から１２のいずれか一項に記載の候補化合物を含有する、前記個体の２０Ｓプロテアソームの結晶化のための方法のステップ、または請求項１５に記載の候補化合物を含有する、結晶化された２０Ｓプロテアソームを用意するステップ、
−  ２．２Å以下の分解能での回折分析によって、２０Ｓプロテアソームの結晶構造を決定するステップ、
−  前記分析に基づいて、個体の２０Ｓプロテアソームの阻害剤としての候補化合物の適合性を判定するステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
個体が、２０Ｓプロテアソームの第１の阻害剤、例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ジヒドロエポネマイシン（Dihydroeponomycin）、エポノマイシン（Eponomycin）、マリゾミブ、イキサゾミブ、デランゾミブ、ＯＮＸ−９１２またはＯＮＸ−０９１４に応答しない個体である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第一の態様において、生体高分子複合体の精製のための方法に関する。典型的に、それによって、クロマトグラフィーステップは適用されない。つまり、本発明は、精製された生体高分子複合体を得るための、ａ）生体高分子複合体を含有する粗試料を用意するステップ、ｂ）２５，０００から３５，０００×ｇでの細胞残屑の分離のための第１の遠心分離ステップを行うステップ、ｃ）０％から２５％（ｗ／ｖ）の量のオスモライト、およびシステインをチオール−アルキル化を可能にする化合物を、第１の遠心分離ステップから得られた上清に補うステップ、ｄ）５０，０００から１５０，０００×ｇ、例えば、８０，０００から１２０，０００×ｇでの遠心分離による、第２の遠心分離ステップを行うステップ、ｅ）沈殿のために、第２の遠心分離ステップから得られた上清を、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートで処理するステップ、ｆ）前記ポリマー、例えば、ポリアルキレングリコールを含有しないバッファー中での再懸濁後に、ポリマーをベースとする沈殿物、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿物を有するオスモライトを使用して、密度勾配遠心分離を行うステップ、ｇ）ステップｅ）およびｆ）を１回または複数回、任意に繰り返すステップ、ｈ）生体高分子複合体の水溶性ポリマーをベースとする沈殿、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿による、濃縮のステップを含む、方法に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、記載された通りの精製に続き、水溶性ポリマーを含有するリザーバー溶液中での結晶化のステップを含む、生体高分子複合体の結晶化のための方法に関する。さらに、本発明による方法によって取得可能な、精製された生体高分子複合体ならびに結晶化された生体高分子複合体が提供される。最後に、個体の免疫プロテアソームを含む２０Ｓプロテアソームを阻害するための候補化合物の適合性を判定するための方法が提供される。前記方法は、癌、自己免疫疾患、筋ジストロフィー、肺気腫、または癌もしくはＡＩＤＳに伴うカヘキシーを治療、改善または予防するための、個体中の免疫プロテアソームを含む２０Ｓプロテアソームの適切な阻害剤を同定する個別化医療において、特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
多くの生化学のニーズについて、さらに分析するために、分子の混合物から特定の分子を分離できることが望ましい。これは、例えば、細胞抽出物からのタンパク質もしくはその他の生体分子の精製、汚染物質からの合成化学物質の精製、または化学混合物、特に、生体高分子複合体の分離を含む。高分子複合体、例えば生体高分子複合体は、超分子集合体または同一の部分である。例えば、生体高分子複合体は、同一のまたは異なる生体分子、種類が異なってさえいる生体分子の集合体である。かかる生体分子としては、タンパク質、核酸、脂質および糖が挙げられる。典型的に、生体高分子複合体は、自然環境、例えば、生命体の中に存在する特定の条件下で形成される。前記生体高分子複合体は、生命体の生存にとって極めて重要であり、様々な生化学経路において主要な機能を有する。これらの生体高分子複合体が作業課題をどのように行うかという機構的理解の鍵は、これらの生体高分子複合体の三次元構造に関する知識である。しかし、生体高分子複合体の構造、特に、前記生体高分子複合体の機能を研究する際の１つの主要な障害は、生体高分子複合体の組成上の複雑さ、およびしばしば、特に自然環境から単離される場合のその組成上の複雑さに基づく前記構造の相対的不安定性である。つまり、高分子集合体における構造決定および正確な形成は、組換えで発現されるまたは合成で生成されるときの精製の間に実現することは困難である。特に、生体高分子複合体を単離および精製する場合、目標は、機能状態にあり構造が安定している、精製された生体高分子複合体を提供することである。生物科学における進行中の研究により、高分子が、一般に、孤立して作用せず、その代わり、組織化されて超分子集合体になることが、明らかにされている。生体高分子複合体または分子機械と呼ばれる、これらのモジュールは、細胞恒常性を維持するのに必須の生化学反応を実施する活性種である。以下、生体高分子複合体または一般的に複合体と称される、分子機械または生体高分子複合体は、タンパク質のみから構成されるクラス、タンパク質および核酸からなるクラス、ならびに内在性膜複合体の３つの主要なクラスに分類できる。
【０００４】
つまり、三次元構造を決定して、細胞内のそれぞれの作用様式への機構的洞察を得ることを可能にするためには、生体高分子複合体を安定させ、完全に機能させることが必要である。
【０００５】
プロテオミクスの成長する化学は、特定の時期に特定の細胞によって産生されるタンパク質の全体である細胞のプロテオーム内で、生体高分子複合体を形成する、分子および相互作用する分子のより大きい集合体の同定を必要とする。したがって、タンパク質の分析をする一般的方法が必要とされ、その方法によって、機構的活性を研究するために、精製は、高純度で豊富な生体高分子複合体を提供させるべきである。
【０００６】
細胞活性および疾患における治療標的化の機構的理解のために、生体高分子複合体のより高い分解能構造の説明が、最も重要である。
今日、タンパク質およびより大きい複合体を精製させる、様々な方法およびツールが提供される。これらの方法のほとんどが、好適なカラムを使用して精製させるクロマトグラフィーステップに基づく。しかし、カラムまたはクロマトグラフィーに基づく精製は、多くの時間と労力を要し、費用がかかる。その上、これらの種類の精製方法は、したがって、所望の機能性生体高分子複合体を単純で迅速に精製させる適切な方法とならない。適切な分離または精製方法としては、いくつかの異なる方法、例えば、沈殿および透析技術、クロマトグラフィー法ならびに電荷／質量の比によって支配される移動度による分子の分離を使用するゲル電気泳動が挙げられる。電気泳動は、広く使用され、多孔質母材、例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル中で通常実施される。しばしば、分子は、移動度に関連する一次元目の電場および、その後、一次元目の分離のために使用された電場とは方向が異なる電場への適用によって分離され、そのようにして、二次元ゲル電気泳動を作り出す。しかし、ゲル電気泳動は、機能性高分子の精製のための最適な方法ではない。つまり、ネイティブ電気泳動は可能であるが、典型的に、電気泳動は、変性条件を提供する必要がある。しかし、クロマトグラフィー単離と同様に、電気泳動は、多孔質母材に起因して、サイズにかかわらず、正味電荷に基づく。
【０００７】
現在、最適な方法は、クロマトグラフィー単離および精製である。しかし、典型的に、この種類の精製手順は、例えば結晶化によって、さらなる分析にとって適切でない高分子をもたらす。
【０００８】
Ｈｗａｎｇ  Ｋ  Ｙら、Ｍｏｌ．Ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ．１９９４、４、２７３〜２７５は、ラットの肝臓からの２０Ｓプロテアソームの結晶化を記載している。ＵＳ２００６／０２８１１１８Ａ１は、プロテアソームの迅速精製のための方法および組成物ならびにその成分の使用方法を記載している。Ｅｖｔｅｅｖａ  Ｉ．Ｎ．ら、Ｃｉｔｏｌｏｇｉｃａ  Ｎａｕｋａ、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、Ｒｕｓｓｌａｎｄ、２０１３、５５（１２）、８９３〜９００は、ラットの肝臓から単離された２６Ｓプロテアソームの精製および濃縮のための方法の比較分析に関する。ＪＰ  Ｈ０５  ２９２９６４Ａは、安定状態のヒト２６Ｓプロテアソームを精製するための生成方法およびヒト２６Ｓプロテアソームそれ自体を記載している。
【０００９】
参考文献に記載された方法は、ゲル濾過またはその他のカラムおよびクロマトグラフィーをベースとする方法に基づく精製を、典型的に含有する。
ＷＯ２０１３／０３４１６０において、したがって、生体高分子複合体の集合、均一性および／または熱力学的安定性の判定に基づき、前記複合体を分析するための方法が提供される。しかし、そこに記載された方法を実施するには、したがって、精製された高分子複合体を提供することが必要である。
【００１０】
それ故に、生体高分子複合体を迅速で単純に精製させ、それによって、これらの複合体が、活性および機能性を維持する方法が、現在も引き続き必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第一の態様において、本発明は、精製された生体高分子複合体を得るための、
ａ）生体高分子複合体を含有する粗試料を用意するステップ、
ｂ）２５，０００から３５，０００×ｇでの細胞残屑の分離のための第１の遠心分離ステップを行うステップ、
ｃ）０％から２５％（ｗ／ｖ）の量のオスモライト、ならびにシステインをチオール−アルキル化および／または還元させる化合物を含有する、第１の遠心分離ステップから得られた上清を補うステップ、
ｄ）５０，０００から１５０，０００×ｇ、例えば、８０，０００から１２０，０００×ｇでの遠心分離による、第２の遠心分離ステップを行うステップ、
ｅ）沈殿のために、第２の遠心分離ステップから得られた上清を、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートで処理するステップ、
ｆ）前記ポリマー、例えば、ポリアルキレングリコールを含有しないバッファー中での再懸濁後に、ポリマーをベースとする沈殿物、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿物を有するオスモライトを使用して、密度勾配遠心分離を行うステップ、
ｇ）ステップｅ）およびｆ）を１回または複数回、任意に繰り返すステップ、
ｈ）生体高分子複合体の水溶性ポリマーをベースとする沈殿、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿による、濃縮のステップ
を含む、生体高分子複合体の精製のための方法を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコールアミン、もしくはポリカルボキシレート、特にポリエチレングリコールを含有する、リザーバー溶液中での結晶化のステップをさらに含む、本発明による方法による生体高分子複合体の精製のための方法を含む、生体高分子複合体の結晶化のための方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明による方法によって取得可能な、精製された生体高分子複合体を提供する。これらの精製された生体高分子複合体は、その他の機構決定または機能分析のための使用に加えて、前記複合体のさらなる結晶化にとって適切である。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明による方法によって取得可能な、結晶化された生体高分子複合体に関する。
最後に、本発明は、個体の免疫プロテアソームを含む２０Ｓプロテアソームを阻害するための候補化合物の適合性を判定するための方法であって、
−  本発明による候補化合物を含有する、前記個体の免疫プロテアソームを含む２０Ｓプロテアソームの結晶化のための方法のステップ、または本発明による候補化合物を含有する、結晶化された２０Ｓプロテアソームを用意するステップ、
−  ２．２Å以下の分解能での回折分析によって、免疫プロテアソームを含む２０Ｓプロテアソームの結晶構造を決定するステップ、
−  前記分析に基づいて、個体の免疫プロテアソームを含む２０Ｓプロテアソームの阻害剤としての候補化合物の適合性を判定するステップ
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】生体高分子複合体の精製のための本発明によって実施されたステップのフローチャートである。
【図２】２０Ｓプロテアソームの精製のための本発明によって実施されたステップのフローチャートである。
【図３】精製されたタンパク質ならびに本発明による方法において得られた、様々な画分および中間画分におけるその精製を示す、ＳＤＳｐａｇｅの図である。Ｓ３０（第２列）およびＳ１００（第３列）の抽出物のアリコート、再懸濁されたＰＥＧカット（第４列）、１および２のスクロース勾配（第５および第６列）のプールならびに最終の精製されたタンパク質調製物（第７列）ならびに分子量マーカー（第１列）を表す。
【図４】本発明による方法によって得られた、ヒト２０Ｓプロテアソーム結晶の回転写真を示す図である。振動法によって測定された、安定化および脱水されたヒト２０Ｓプロテアソーム結晶の典型的な回折パターンを示す。この特定の結晶の回折限界は、１．８Åである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、第一の態様において、精製された生体高分子複合体を得るための、
ａ）生体高分子複合体を含有する粗試料を用意するステップ、
ｂ）２５，０００から３５，０００×ｇでの細胞残屑の分離のための第１の遠心分離ステップを行うステップ、
ｃ）０％から２５％（ｗ／ｖ）の量のオスモライト、およびシステインのチオール−アルキル化を可能にする化合物を、第１の遠心分離ステップから得られた上清に補うステップ、
ｄ）５０，０００から１５０，０００×ｇ、例えば、８０，０００から１２０，０００×ｇでの遠心分離による、第２の遠心分離ステップを行うステップ、
ｅ）沈殿のために、第２の遠心分離ステップから得られた上清を、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートで処理するステップ、
ｆ）前記ポリマー、例えば、ポリアルキレングリコールを含有しないバッファー中での再懸濁後に、ポリマーをベースとする沈殿物、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿物を有するオスモライトを使用して、密度勾配遠心分離を行うステップ、
ｇ）ステップｅ）およびｆ）を１回または複数回、任意に繰り返すステップ、
ｈ）生体高分子複合体の水溶性ポリマーをベースとする沈殿、例えば、ポリアルキレングリコールをベースとする沈殿による、濃縮のステップ
を含む、生体高分子複合体の精製のための方法に関する。
【００１７】
留意すべきは、上記ステップのいくつかは、異なる順番であってもよいことである。例えば、ステップｃ）は、ステップｂ）の前などに行われてよい。
本明細書で使用するとき、用語「高分子複合体」および特に用語「生体高分子複合体」は、本発明にしたがってサブユニットから作られた、任意の集合体を意味する。サブユニットは通常、高分子複合体の最小単位であり、高分子複合体の特徴的構造または特性の原因となる。サブユニットは、例えば、タンパク質モノマー、ＤＮＡ−またはＲＮＡ−高分子である。述べた通り、高分子複合体は、異なるまたは同一の部分またはサブユニットの超分子集合体である。複合体は、少なくとも５００ｋＤａ以上の大きさの高分子複合体を形成する、少なくとも２つの同一のまたは異なるサブユニットから、通常なる。多くの同一のサブユニットが結合して、高分子複合体を形成する場合、ホモオリゴマー高分子複合体と称される。ホモオリゴマー複合体のための一般的な例は、未変性分子量８５０ｋＤａを有するシャペロニンＧｒｏＥＬである。高分子複合体が複数の非同一のサブユニットによって形成される場合、ヘテロオリゴマー高分子複合体と称される。ヘテロオリゴマー複合体のための一般的な例は、未変性分子量７５０ｋＤａを有する、真核生物の２０Ｓプロテアソームである。かかる高分子複合体の構造的複雑さは、球状から細長い繊維状構造体までにわたり得る。高分子複合体のための大きさの上限は、現在、未知であり、核膜孔複合体およびいつくかのウイルスなどの構造体は、大きさが１００ＭＤａを超えることが知られている。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「オスモライト」は、浸透に影響を与える化合物を指す。例としては、これらに限定されるわけではないが、グリセロール、スクロース、糖全般、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡＯ）およびエチレングリコールが挙げられる。
【００１９】
用語「正味電荷ゼロのポリマー」は、数百ダルトンのサイズ範囲内の反復する化学単位の連続した共有結合によって集積される、ポリマーを指す。正味電荷ゼロの定義は、理想的には電子電荷を含有しない（正、負のいずれもない）反復単位の特性によって満たされる。電子電荷は、存在する場合、均衡がとれた様式で表れるはずである、つまり、２の値の正電荷は、２の値の負電荷によって相殺されるはずである。相殺された電子電荷を有するかかる分子は、双性イオンの、種または化学物質と称される。
【００２０】
用語「結晶」は、空間で反復する様式の、任意の所与の単一の分子または分子種の超分子集合体を指す。これによって、分子または分子種は、原子が共有結合および／または非共有結合によって連結される、任意の化学的部分と定義できる。非共有結合の例としては、これらに限定されるわけではないが、水素結合、静電気相互作用およびファンデルワールス接触が挙げられる。結晶中の１つの分子と別の分子の関係は、ブラベー格子に基づく、厳密な対称の法則によって説明できる。
【００２１】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または用語「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」もしくは「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、互換的に、本明細書において使用され、前記用語は、態様「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を含む。
【００２２】
用語「非イオン性ポリマー」は、数百ダルトンのサイズ範囲内の反復する化学単位の連続した共有結合によって集積される分子を指す。化学単位が電子電荷を含有しない場合、結果として生じるポリマーは、非イオン性ポリマーと称される。
【００２３】
本発明による方法は、生体高分子複合体の精製を可能にする、単純で迅速な手順を提供することを目的とする。複合体は、高均一性を有して提供され、したがって、再現性のある結晶化を可能にする。さらに、スクリーニングのために、再現性のある様式で、十分豊富に、生体高分子複合体の迅速な結晶化を可能にする化学条件が提供される。
【００２４】
方法は、化合物ライブラリーで浸漬実験させるのに十分な大きさである結晶を提供することを目的とし、したがって、前記生体高分子複合体の適切なリガンドの同定をする。これは、個別化された薬物が前記個体を治療するために決定される、個人的医療における適用にとって、特に適切である。さらに、これは、第一選択の薬物が、個体に有効ではない場合、特に適切である。
【００２５】
これらのリガンドまたは相互作用物質は、活性化剤、阻害剤およびアロステリックエフェクターを含む、生体高分子複合体と相互作用する、特に、生体高分子複合体の機能性を変化させる化合物を含む。
【００２６】
その上、本発明による精製のための方法は、その後の結晶化にとって適切な、精製された生体高分子化合物を提供し、したがって、結晶に高い安定化および凍結保護をもたらすことが可能であり、それ故に、２．２Å未満の分解能範囲、例えば、１．８から２．２Åの範囲内の回折データ収集を可能にする。
【００２７】
本発明による方法は、本発明の実施形態において、前記方法が生体高分子複合体のクロマトグラフィーのない精製を許容する、様々なステップを含む。
典型的に、生体高分子複合体は、粗試料、例えば、細胞培養から得られた細胞または生体高分子複合体を発現する細胞の培養から得られた上清の中に存在する。
【００２８】
粗試料は、例えば、哺乳動物の組織／細胞の場合、低張性溶解によって、または酵母および真菌の場合、凍結粉砕、機械的破砕および／もしくは高圧破断によって得られた細胞からのサイトゾル抽出物、ならびに原核生物発現系から、典型的になる。
【００２９】
実施形態において、細胞培養は、予め決定された成分、例えばサイトカインの存在下で、実施される。例えば、生体高分子複合体が免疫プロテアソームである場合、細胞の培養は、免疫プロテアソームの発現を誘導するのに十分な時間、サイトカイン、特に、インターフェロンガンマで行われる。例えば、細胞培養は、４８から９６時間の範囲の時間である。当業者は、所望の生体高分子複合体の発現を誘導するための適切な培養条件を熟知している。
【００３０】
粗試料は、細胞残屑の分離のための第一の遠心分離ステップに供する。細胞残屑をペレット状にするための前記分離ステップは、したがって、２５，０００から３５，０００×ｇで行われ、抽出物および上清を得る。例えば、３０，０００×ｇでの遠心分離の場合、Ｓ３０抽出物が得られる。当業者は、したがって、用語Ｓ３０を熟知している。
【００３１】
次のステップとして、第一の遠心分離ステップの後に得られた上清は、システインをチオール−アルキル化および／または還元させる化合物で処理される。つまり、本発明者らは、この時点でのシステインのチオール−アルキル化および／または還元が、生体高分子複合体を精製する精製方法を改良させることを認識した。つまり、この時点でシステインのチオール−アルキル化および／または還元をもたらすことが、得られた生体高分子複合体の安定性および純度にとって有益である。
【００３２】
留意すべきは、システインをチオール−アルキル化および／または還元させる化合物が、この特定のステップの前または後で、本発明において使用されるバッファー系中に存在してよいことである。
【００３３】
システインのチオール−アルキル化（Ｓ−アルキル化）を可能にする化合物の好ましい実施形態としては、ヨードアセトアミド、ヨードアセテート、およびＮ−エチルマレイミド、ならびにジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの化合物が挙げられる。
【００３４】
Ｓ−アルキル化および／またはチオールシステイン還元化合物は、最終溶液中に、１から１００ｍＭ、例えば、２から５０ｍＭ、例えば、５から３０ｍＭの量で、存在する。例えば、２つの異なるＳ−アルキル化化合物が、存在してよい。実施形態において、ヨードアセトアミドを、最終濃度１０ｍＭでＮ−エチルマレイミドと組み合わせて、最終濃度合計１０ｍＭで加える。
【００３５】
さらに、オスモライトを、第１の遠心分離ステップから得られた前記サイトゾル抽出物に加えてよい。前記オスモライトは、存在しなくてよい、または０．５から２５％（ｗ／ｖ）の量で存在してよい。実施形態において、１０から２５％（ｗ／ｖ）、例えば、１５から２０％（ｗ／ｖ）のオスモライトを加える。例えば、オスモライトは、糖、例えば二糖である。好ましいオスモライトとしては、スクロース、グリセロール、ＴＭＡＯ、エチレングリコール、プロピレングリコール、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトースが挙げられる。実施形態において、スクロース粉末を、１５から２５％（ｗ／ｖ）の量で、上清および精製バッファーの溶液に加える。
【００３６】
さらに、プロテアーゼ阻害剤を加えてよい。例えば、公知のプロテアーゼ阻害剤、すなわちトリプシン阻害剤である、ベンズアミジンクロリド（benzamidine chloride）を、１ｍＭから１００ｍＭ、例えば、５ｍＭから２０ｍＭ、特に１０ｍＭの量で加えてよい。
【００３７】
その上、オスモライトならびにプロテアーゼ阻害剤、Ｓ−アルキル化および／またはシステイン還元化合物は、したがって、先行のステップまたは後続のステップにおいて存在するバッファー系中に存在してよい。当業者は、これらの成分がどこで必要とされるかを、容易に決定できる。
【００３８】
その上、前記バッファーは、非イオン性洗浄剤、例えば、オクチルグルコースネオペンチルグリコール（ＯＧＮＧ）、またはネオペンチルグリコール群のその他のメンバーを含むその他の適切な洗浄剤を、さらに含有してよい。
【００３９】
本発明の実施形態において、オスモライトが存在し、オスモライトはスクロースである。
本発明のステップｃ）による、言及された化合物での上清の処理は、好ましくは室温で行われるが、１０分から１時間、例えば３０分などの十分な時間、最初のステップにおいて、４℃から２５℃の間の範囲内で実行してよい。いくつかの実施形態において、インキュベーションを、十分な時間、例えば、５０分から２時間、振とうさせながら、最初の温度より高い温度、例えば、２５℃から３７℃の間で、継続する。
【００４０】
その後、第２の遠心分離ステップが、行われる。前記第２の遠心分離ステップは、５０，０００から１５０，０００×ｇでの遠心分離によって行われる。例えば、遠心分離は、８０，０００から１２０，０００×ｇの範囲で、実行される。実施形態において、遠心分離ステップは、Ｓ１００抽出物をもたらす。
【００４１】
第２の遠心分離ステップは、十分な時間行われ、抽出物を得る。例えば、遠心分離は、４℃で、少なくとも１時間、例えば２時間、行われる。当業者は、前記遠心分離ステップを行うための適切な条件を熟知している。
【００４２】
遠心分離の後で、さらに濾過ステップを含んで、得られた細胞質抽出物を清澄化してよい。濾過ステップは、粗試料および生体高分子複合体に応じて、先行または後続のステップにおいてもまた、行われてよい。
【００４３】
次に、第２の遠心分離ステップから得られた上清は、水溶性ポリマーで処理される。適切な水溶性ポリマーとしては、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマーが挙げられる。実施形態において、好ましいポリマーとしては、ポリアルキレングリコール、ポリアミンまたはポリカルボキシレートが挙げられる。沈殿にとって適切なポリマーとなるその他の構造体としては、様々なポリマーの沈殿剤が挙げられる。（ａ）Ｍ型Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ。Ｒ１＝ＥＯについて−ＨまたはＰＯについて−ＣＨ３。ＰＯ／ＥＯモル比は、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  Ｍ２００５について２９／６、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  Ｍ２０７０について１０／３１およびＪｅｆｆａｍｉｎｅ  Ｍ６００について９／１である。（ｂ）ペンタエリトリトールエトキシレート。（ｃ）ペンタエリトリトールプロポキシレート。（ｄ）ポリビニルピロリドン。（ｅ）ポリプロピレングリコール。（ｆ）ポリビニルアルコール。（ｇ）ポリアクリレート。（ｈ）セルロースをベースとするポリマー。Ｒ１＝−Ｈ、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ３（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、−Ｈまたは−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ（カルボキシメチルセルロース）。（ｉ）ポリ（エチレンイミン）。（ｊ）ジ［ポリ（エチレングリコール）］アジペート。（ｋ）Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  ＥＤ２００３。（ｌ）Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  Ｄ２０００。（ｍ）Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  ＳＤ２００１。（ｎ）Ｔ型Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ。（ｏ）ポリアクリルアミド。（ｐ）グリセロールエトキシレート。（ｑ）アクリル酸／マレイン酸コポリマー。（ｒ）ビニルピロリドン／ビニルイミダゾールコポリマー。これらの様々なポリマー沈殿剤を、下記のスキーム１にもまた示す。
【００４４】
【化１】
2019527815.tif 000002
【００４５】
スキーム1
添え字ｘ、ｙ、ｚおよびｗのそれぞれは、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０から、独立して選択される。
【００４６】
実施形態において、上清は、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコールで、処理される。適切なポリアルキレングリコールポリマーとしては、ポリエチレングリコール、特に、ポリエチレングリコール４００から２０，０００、例えば、４００から６０００が挙げられる。ＰＥＧポリマーに関して、数字は、したがって、ＰＥＧポリマーの平均分子量を示す。
【００４７】
上清を、前記ポリマーで、例えば、４℃での撹拌下、２０％（ｗ／ｖ）の濃度でＰＥＧ４００を使用して、沈殿させ、その後インキュベートする。インキュベーション時間は、約１０から３０分であってよい。つまり、ポリマーを、適切な濃度、典型的に、５％から３０％（ｗ／ｖ）、例えば、１５％から２５％（ｗ／ｖ）の範囲内で、抽出物へ加える。加えるポリマーの量は、使用するポリマー次第である。当業者は、したがって、適切な濃度を選択することを熟知している。ポリマーの添加および撹拌は、十分な時間、例えば、１０から３０分、例えば２０分間、１５℃未満、例えば１０℃未満、例えば、０℃から１０℃の範囲内の温度で行われる。
【００４８】
沈殿の後で、沈殿物が、さらなる遠心分離ステップによって得られてよい。沈殿物を、沈殿のために使用されたポリマーを含有しないバッファー、例えば、ポリアルキレングリコールを含有しないバッファー中で、再懸濁する。次に、前記再懸濁された材料は、密度勾配遠心分離に供する。例えば、４℃で、３０分間、３０，００００×ｇでの遠心分離の後の沈殿物の再懸濁が、サッカライド、例えば、スクロース、非イオン性ポリマー、例えば、ラウリルマルトースネオペンチルグリコール（ＬＭＮＧ）、還元剤、したがってタンパク質のジスルフィド結合を還元する、例えばジチオトレイトールを含有するが、ＰＥＧを含有しない、精製バッファー中で実行される。
【００４９】
沈殿の後で再懸濁された材料での、第１の密度勾配遠心分離ともまた名付けられる、密度勾配遠心分離が、オスモライトをベースとする勾配に再懸濁された材料を負荷することによって実施され、オスモライトをベースとする勾配は、例えば、糖勾配、例えば、スクロースをベースとする勾配である。勾配は、１０から４０％（ｗ／ｖ）の勾配であり得る。例えば、オスモライト勾配は、１０から４０％（ｗ／ｖ）スクロースのスクロースをベースとする勾配である。当業者は、したがって、適切な勾配を選択して、所望の生体高分子複合体を分離させることになる。典型的に、勾配は、所望の生体高分子複合体が勾配の中央でまたは３分割の２つ目で存在するように選択される。勾配は、適切な条件下、つまり、例えば２７０，０００×ｇで、例えば４℃で、十分な時間行われる。典型的に、勾配は、線形勾配であるが、指数関数的凸または指数関数的凹の勾配が可能である。
【００５０】
勾配は、公知の方法によって集められ、生体高分子複合体を含有する画分を、水溶性ポリマー、典型的に、前に使用したのと同じ水溶性ポリマーによって沈殿させる。
必要な場合、したがって、沈殿再懸濁および密度勾配遠心分離を、繰り返して、精製された生体高分子複合体に到達する。最後の密度勾配遠心分離の後で、生体高分子複合体は、精製された生体高分子複合体を得るために、水溶性ポリマーをベースとする沈殿によって濃縮される。
【００５１】
実施形態において、第１の遠心分離ステップは、Ｓ３０画分を得るための遠心分離である、および／または第２の遠心分離ステップは、Ｓ１００画分を得る遠心分離である。
さらに、任意に濾過をうけてもよい、第２の遠心分離ステップの後で得られた上清は、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレート、特に、ポリエチレングリコールでの示差沈殿に供し、この示差沈殿は、生体高分子複合体が上清中に維持される、より低い濃度の水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートでの第１の沈殿ステップを含み、生体高分子複合体を沈殿させるための、より高い濃度の水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレートでのさらなる沈殿ステップを有する。
【００５２】
示差沈殿は、より少ない密度勾配遠心分離および沈殿ステップで、所望の生体高分子複合体を分離させる。
精製ならびに密度勾配の画分は、ＳＤＳ−ｐａｇｅ分析によって制御されてよい。当業者は、したがって、精製を制御する適切な方法を熟知している。
【００５３】
実施形態において、精製される生体高分子複合体は、それぞれの免疫プロテアソームを含むプロテアソーム、例えば、２０Ｓプロテアソームまたは２６Ｓプロテアソームである。２０Ｓプロテアソームまたは２６Ｓプロテアソームの精製の場合、ＰＥＧ４００が最適なポリマーとして使用され、密度勾配がスクロース１０から３０％（ｗ／ｖ）のスクロースをベースとする線形密度勾配である、沈殿および密度勾配遠心分離のステップが、少なくとも１回繰り返される。
【００５４】
別の実施形態において、生体高分子複合体は、脂肪酸シンターゼ、例えば、酵母脂肪酸シンターゼである。ここで、沈殿および密度勾配のステップは、少なくとも２回、例えば３回、繰り返される。その上、密度勾配は、スクロース１０から４５％（ｗ／ｖ）のスクロースをベースとする線形密度勾配である。その上、Ｓ−アルキル化および／またはシステイン還元剤は、ＤＴＴである。第２の遠心分離ステップの後で得られた上清は、したがって、沈殿物またはペレットを得るために、例えば、第１の沈殿ステップにおける２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４００を有するＰＥＧ４００を使用し、その後、３０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４００で得られた上清を沈殿させる、示差沈殿に供する。
【００５５】
実施例において実証された通り、これらの複合体が、複合体のさらなる結晶化を可能にする高純度を有する、本発明による方法によって精製された生体高分子複合体を得ることが可能である。
【００５６】
さらなる態様において、本発明は、生体高分子複合体の結晶化のための方法に関する。本発明による結晶化のための方法は、本明細書に記載された通り、生体高分子複合体の精製のための方法を含む。精製の後で、精製された複合体を、水溶性ポリマー、特に、非イオン性ポリマーまたは正味電荷ゼロのポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、もしくはポリカルボキシレート、特に、ポリエチレングリコールを含有するリザーバー溶液中に、再懸濁する。結晶化バッファーとしてもまた知られるリザーバーバッファーは典型的に、０．１Ｍの量でトリス、ＨＥＰＥＳまたはＢｉｓＴｒｉｓバッファー系を含有するバッファーである。その上、２０Ｓプロテアソームの場合、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ３３５０は、５から３０％（ｗ／ｖ）の範囲内、例えば、１０から２０％（ｗ／ｖ）、例えば１０％（ｗ／ｖ）である。ＦＡＳの場合、ポリエチレングリコール、例えばＰＥＧ３３５０は、５から２０％（ｗ／ｖ）の範囲内、例えば、１４％（ｗ／ｖ）である。
【００５７】
適切な条件は、例えば、Ｃｈａｒｉ  Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１５、１２、８５９〜８６５またはＷＯ２０１３／０３４１６０に記載された、ＰｒｏｔｅｏＰｌｅｘ法を使用して決定されてよい。結晶化は、２Å未満の前記結晶の再現性のある分解能をさらに許容して、結晶を安定化および脱水することによって、継続されてよい。結晶化方法は、少なくとも５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する生体高分子複合体で行われてよい。その上、結晶化のステップは、最初は、１５℃を超える温度で、その後は、８℃以下の温度で行われてよい。つまり、最初のステップにおいて、制御された安定化が、適切な結晶安定化バッファー、例えば、より多量のポリマーを有する、上に記載されたＢｉｓＴｒｉｓバッファーを使用して行われる一方で、結晶のより低い温度での脱水は、結晶安定化バッファーと同様であるが、より多量のポリマーおよび、その上、アルコール、例えば、ＭＰＤ、２−メチル−２，４−ペンタンジオールまたはグリセロールを含有してよい、結晶脱水バッファーで行われる。
【００５８】
上述のバッファー、すなわち、結晶化バッファー、結晶安定化バッファーおよび結晶脱水バッファーは、さらに、塩化マグネシウム、ＭｇＣｌ２を含有してよい。したがって、例えば、２０Ｓプロテアソームの場合、塩化マグネシウムは、バッファー中に０．２Ｍの量で存在する。ＦＡＳの場合、結晶脱水バッファーは、０．２〜５Ｍの範囲内で塩化マグネシウム、ヨウ化カリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウムまたは塩化カリウムのいずれかを含有する。
【００５９】
塩化マグネシウムまたはその他の塩の存在または非存在は、生体高分子複合体次第であり得る。述べた通り、したがって、ＷＯ２０１３／０３４１６０に記載された方法を使用することにより、適切な条件の同定が可能になり得る。本発明による結晶化方法の実施形態において、結晶は、さらに、生体高分子複合体と相互作用する、またはこれらの複合体と相互作用すると考えられる化合物で浸漬される。したがって、例えば、結晶は、活性化剤、阻害剤、または相互作用する、例えば生体高分子複合体に結合する、その他の種類のリガンドで、浸漬される。例えば、プロテアソーム結晶中へ包含されるプロテアソーム阻害剤の場合、プロテアソーム結晶は、前記阻害剤を含有するバッファー系、例えば、上述の結晶脱水バッファー系で、インキュベートされ、十分な量、例えば、１から１０ｍＭの量で、上述のプロテアソーム阻害剤をさらに含有する。
【００６０】
十分な時間、例えば少なくとも５時間、例えば少なくとも１０時間のインキュベーションの後で、結晶は、その後、集められてよく、分析の準備ができる。
つまり、本発明による生体高分子複合体の結晶化のための方法は、任意に、相互作用する化合物で浸漬された多数の結晶を提供させる。したがって、化合物ライブラリーでの浸漬実験および、最終的に、最も適切な相互作用物質、例えば、活性化剤または阻害剤または化合物に影響を与えるその他の生体高分子複合体の決定を可能にする。例えば、免疫プロテアソームを含む、２０Ｓプロテアソームまたは２６Ｓプロテアソームの場合、化合物ライブラリーは、プロテアソーム複合体を阻害するための候補化合物から構成されてよい。個別化医療の場合、免疫プロテアソームを含む２０Ｓプロテアソームまたは任意のその他の生体高分子複合体は、本発明による方法によって結晶化されてよく、その後、候補化合物は、結晶と共にインキュベートされ、したがって、結晶と相互作用させ、それによって前記複合体の相互作用物質として前記候補化合物の適合性を判定する。例えば、２０Ｓプロテアソームの阻害剤の場合、個体を治療するための最も適切な阻害剤が、決定される。さらに、この方法は、個体が第一選択の阻害剤、例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ジヒドロエポノマイシン（Dihydroeponomicin）、エポノマイシン（Eponomicin）、マリゾミブ、イキサゾミブ、デランゾミブ、ＯＮＸ−９１２（オプロゾミブ）またはＯＮＸ−０９１４に耐性がある場合、２０Ｓプロテアソームの阻害剤として活性のある化合物を同定するのに適切である。
【００６１】
つまり、本発明の別の実施形態において、個体の免疫プロテアソームを含む２０Ｓプロテアソームを阻害するための候補化合物の適合性を判定するための方法が提供される。前記方法は、本発明による候補化合物を含有する、前記個体の２０Ｓプロテアソームの結晶化のための方法に記載されたステップ、または代替として、本発明による候補化合物を含有する、結晶化された２０Ｓプロテアソームを用意するステップを含む。典型的に、候補化合物は、上述の通り、結晶中に浸漬することによって、結晶中に導入される。
【００６２】
例えば浸漬によって、２０Ｓプロテアソームにより例証された、結晶化された生体高分子複合体中への候補化合物の組み込みの後で、２０Ｓプロテアソームの結晶構造が決定される。例えば、結晶構造は、２．２Å以下の分解能での回折分析によって決定される。候補化合物を有する生体高分子複合体の結晶構造に基づいて、前記候補化合物の適合性が判定される。例えば、候補化合物が、２．２Å以下での回折分析に基づいて、個体の２０Ｓプロテアソームのための阻害剤として適切であるかどうかが判定される。
【００６３】
本発明による方法は、前記個体を治療するための活性薬物としての適切な化合物を決定するため、つまり、個別化医療を適用するために、特に有用である。例えば、個体が、２０Ｓプロテアソームの第１の阻害剤、例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ジヒドロエポノマイシン、エポノマイシンまたはＯＮＸ−０９１４に応答しない個体の場合。
【００６４】
例えば、免疫プロテアソームを含む２０Ｓプロテアソームの阻害剤の形態での候補化合物は、癌、自己免疫疾患、筋ジストロフィー、肺気腫、または癌もしくはＡＩＤＳに伴うカヘキシーを治療、改善または予防する方法に使用されてよい。癌は、リンパ系腫瘍から選択される、好ましくは、再発性および軟治性ＭＭを含む多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫、例えば、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含むＢ細胞リンパ腫、ならびにワンデンストレームマクログロブリン血症から選択される癌、または関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群もしくは強皮症から選択される自己免疫疾患であってよい。
【００６５】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明による方法によって得られる、精製された生体高分子複合体に関する。本発明による方法で取得可能な、これらの精製された生体高分子複合体は、高い均一性を有する特徴があり、したがって、さらなる結晶化にとって特に適切である。その上、精製方法は、したがって、これらの生体高分子複合体の再現性がある十分な精製をさせる方法となる。得られた複合体は、高純度で豊富に得られる。
【００６６】
実証された通り、精製によって、前に記載されなかった高分解能、つまり、２．２Å以下の分解能、例えば、１．８から２．２Åの分解能範囲内での回折分析をさせて、生体高分子複合体の結晶を提供させる。
【００６７】
実施形態において、精製された生体高分子複合体は、少なくとも２つの異種または相同タンパク質サブユニットから構成される、または核酸分子とタンパク質との組合せである。精製された生体高分子複合体としては、免疫プロテアソームを含むプロテアソーム、例えば、２０Ｓプロテアソームまたは２６Ｓプロテアソーム、ならびにシャペロニン複合体、例えば、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＬ−ＥＳ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ６０−１０、ならびに４０Ｓ−、６０Ｓ−および８０Ｓ−リボソーム、真核生物の脂肪酸シンターゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を含む。
【００６８】
さらに、本発明は、本明細書に記載された結晶化方法によって取得可能な、結晶化された生体高分子複合体に関する。これらの結晶化された生体高分子複合体は、２．２Å以下の分解能での回折分析を許容する。例えば、免疫プロテアソームを含む２０Ｓプロテアソームの場合、１．８から２．２Åの範囲内での分解能を許容することが、初めて可能になった。
【００６９】
この分解能に基づいて、前記化合物を結晶中に浸漬し、その後、２．２Å以下の高分解能での回折分析により分析することによって、生体高分子複合体、例えば、２０Ｓプロテアソームの適切な相互作用物質を同定することが可能である。つまり、したがって、これらの化合物が、生体高分子複合体の活性部位に存在するかどうか、または化合物が、これらの複合体の活性に影響を与えるその他の部位と共に存在するかどうかを、同定することが可能である。方法および精製された生体高分子複合体、ならびに結晶化された生体高分子複合体の適合性は、２０Ｓプロテアソームによって例証される。しかし、さらなるデータが、シャペロニン複合体、例えば、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＬ−ＥＳ、真核生物のＨｓｐ６０、真核生物のＨｓｐ６０−１０、４０Ｓ−、６０Ｓ−および８０Ｓ−リボソーム、ならびに真核生物の脂肪酸シンターゼについて得られる。
【００７０】
図１は、上述の通り、生体高分子複合体の精製のための方法によるステップのフローチャートである。
下に示された実施例は、本発明を、さらに限定することなく、説明する。
【実施例】
【００７１】
材料および方法：
材料
標準化学物質を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）から得た。プロテアソーム阻害剤であるオプロゾミブ、エポキソマイシンおよびジヒドロエポネマイシンを、ＡｐｅｘＢｉｏ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）から購入し、ＭＬＮ９７０８およびボルテゾミブを、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）から、Ｚ−ＬＬＹ−ケトアルデヒドを、Ｂａｃｈｅｍ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、スイス）から得、１００ｍＭ濃度で、ＤＭＳＯ中で再懸濁した。洗浄剤を、Ａｎａｔｒａｃｅ（Ｍａｕｍｅｅ、ＵＳＡ）から、結晶化プレートを、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ、ＵＳＡ）から、Ｌｉｔｈｏｌｏｏｐｓを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（Ｓｕｆｆｏｌｋ、ＵＫ）およびＪｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊｅｎａ、ドイツ）から得た。
表Ｓ１：タンパク質精製、結晶化、結晶安定化、結晶脱水のためのバッファーおよび酵素アッセイ
精製バッファー：ＢｉｓＴｒｉｓ０．０５Ｍ  ｐＨ６．５、ＫＣｌ  ０．０５Ｍ、ＭｇＣｌ２  ０．０１Ｍ、βグリセロリン酸０．０１Ｍ
結晶化バッファー：ＢｉｓＴｒｉｓ０．１Ｍ  ｐＨ６．５、ＭｇＣｌ２  ０．２Ｍ、ＰＥＧ３３５０  １０％（ｗ／ｖ）
結晶安定化バッファー：ＢｉｓＴｒｉｓ０．１Ｍ  ｐＨ６．５、ＭｇＣｌ２  ０．２Ｍ、ＰＥＧ３３５０  ２０％（ｗ／ｖ）
結晶脱水バッファー：ＢｉｓＴｒｉｓ０．１Ｍ  ｐＨ６．５、ＭｇＣｌ２  ０．２Ｍ、ＰＥＧ３３５０  ２５％（ｗ／ｖ）、ＭＰＤ２０％（ｖ／ｖ）
【００７２】
方法
図２で表されたヒト２０Ｓプロテアソームの精製
Ｓ３０ＨｅＬａ細胞質抽出物を、わずかに変更を加えたＤｉｇｎａｍら、（２０）にしたがって、低張性溶解により調製した。低張性溶解および遠心分離により核を収集した後で、上清（粗細胞質抽出物）を、４℃で３０分間３０，０００×ｇで遠心分離し、液体窒素中、４０ｍｌアリコートで急速冷凍し、さらに使用するまで、−８０℃で貯蔵した。Ｓ３０ＨｅＬａ細胞質抽出物を、３７℃での水浴で解凍し、１０×ストックから１×濃度まで精製バッファーを補って、続いて、スクロース粉末を２０％（ｗ／ｖ）まで、オクチルグルコースネオペンチルグリコール（ＯＧＮＧ、水中１０％（ｗ／ｖ）のストック溶液から）０．１％（ｗ／ｖ）まで、ヨードアセトアミドを１０ｍＭまで、Ｎ−エチルマレイミドを１０ｍＭまで、およびベンズアミジンクロリドを１０ｍＭまで加えた。抽出物を、３０分間マグネチックスターラーで室温にてインキュベートし、続いて、１時間１４０ｒｐｍで振とうさせて、３０℃でインキュベートした。処理された抽出物を、４℃で２時間１００，０００×ｇで遠心分離した。遠心分離の後で、上清を、チーズクロスおよびミラクロスのそれぞれ３層を通し濾過して、Ｓ１００ＨｅＬａ細胞質抽出物を得た。
【００７３】
清澄化された抽出物は、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ、数字は、ＰＥＧポリマーの平均分子量を示す）で示差沈殿に供する。ＰＥＧ４００を、４℃で撹拌下、２０％（ｖ／ｖ）の濃度までＳ１００ＨｅＬａ細胞質抽出物に加え、２０分間インキュベートする。沈殿させたタンパク質を、４℃で３０分間３０，０００×ｇで遠心分離することによって除去する。次に、上清を、上述の通り、ＰＥＧ４００の濃度を３０％（ｖ／ｖ）まで上昇させることによって、沈殿させる。このステップの沈殿物は、ヒト２０Ｓプロテアソームを含有し、４℃で３０分間３０，０００×ｇでの遠心分離によって回収され、１８℃で、オービタルシェーカー中、スクロース２％（ｗ／ｖ）、ＤＴＴ１０ｍＭおよびラウリルマルトースネオペンチルグリコール（ＬＭＮＧ）０．０１％（ｗ／ｖ）を含有する精製バッファー中で再懸濁される。再懸濁された材料を、ＤＴＴ５ｍＭを含有する精製バッファー中の１０〜３０％（ｗ／ｖ）のスクロース勾配に負荷し、４℃で１６時間２７０，０００×ｇで遠心分離する。勾配を、Ａｋｔａ  Ｐｒｉｍｅ（Ｇ  Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって４００μｌの画分中で集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、２０Ｓプロテアソームを含有する画分を同定した。選択された画分を、プールし、ＰＥＧ４００を４０％（ｖ／ｖ）加えることにより沈殿させた。遠心分離（３０，０００×ｇ、２０分）の後で、上清を除去し、沈殿物を、スクロース５％（ｗ／ｖ）、ＤＴＴ１０ｍＭおよびＬＭＮＧ０．０１％（ｗ／ｖ）を含有する精製バッファー中で再懸濁した。再懸濁された材料を、ＤＴＴ５ｍＭを含有する精製バッファー中の１０〜４０％（ｗ／ｖ）の線形スクロース勾配に負荷し、４℃で２０時間２８４，０００×ｇで遠心分離する。２０Ｓプロテアソームを含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、さらにもう一度、同定し、沈殿させ、４０％のＰＥＧ４００を加えることによって濃縮し、スクロース５％（ｗ／ｖ）、ＤＴＴ５ｍＭおよびＬＭＮＧ０．０１％を含有する精製バッファー中で再懸濁し、最終的に精製されたタンパク質調製物を１３ｍｇ／ｍｌで産生する。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用するＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）によって決定した。この手順は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でのＳ１００ＨｅＬａ細胞質抽出物３００ｍｌから始まって、精製されたヒト２０Ｓプロテアソーム２０ｍｇを、再現性よく産生する。精製手順の全体を、結晶グレードのタンパク質を産生する４８時間以内に終了させる。精製は、様々な精製ステップからの画分のＳＤＳｐａｇｅを示す図３に明示される。
【００７４】
ヒト２０Ｓプロテアソームの結晶化
ヒト２０Ｓプロテアソームを、結晶化バッファーの５００μｌリザーバーの上のＣｈｒｙｓｃｈｅｍシッティングドロップ蒸気拡散プレート（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ、ＵＳＡ）において、タンパク質０．５μｌ＋結晶化バッファー０．５μｌを混合することによって、タンパク質濃度７．５ｍｇ／ｍｌで結晶化する。これらの条件下、ヒト２０Ｓプロテアソームは、単位細胞定数、ａ＝１１４Å、ｂ＝２０２Å、ｃ＝３０２Å、α＝β＝γ＝９０°を有する空間群Ｐ２１２１２１において結晶化する。上記の精製手順は、したがって、５０００超の結晶化装置において典型的に実施するのに適切である。現在同定された結晶化条件のさらなる利点としては、それぞれの結晶化装置が典型的に、１０〜１５の結晶を産生することが挙げられ、結晶は、１５０×１５０×２００μｍ３の大きさである。結晶のフルサイズまでの結晶化は、インキュベーション２０時間以内で達成される（図１参照）。それ故に、約５００００個の結晶を、抽出物調製７２時間以内に作製でき、その結晶の全ては、分解能２Å未満まで典型的に回折する。
【００７５】
結晶安定化および脱水
上記の手順によって得られたヒト２０Ｓプロテアソーム結晶は、制御された様式で安定化および脱水される必要があり、分解能２Å未満まで再現性よく回折する。本発明者らは、再現性のある手順を確立するために多大な努力を払って、これを達成した。３つのステップが関与する。１）最初に１８℃で成長させたヒト２０Ｓ結晶を含有する結晶化トレイを、スタイロフォームの箱の中へ入れ、４℃まで移行させる。典型的に、トレイを、８時間インキュベートする。２）結晶を、４℃で、安定化し、脱水する。最初に、シールを除去し、リザーバー溶液１μｌを加える。次に、結晶安定化バッファー２μｌを、結晶化ドロップに加える。同時に、リザーバー溶液を、結晶脱水バッファーに交換する。次に、ドロップを、再密封し、４℃で８時間超の蒸気拡散によって、新しいリザーバー溶液に対して平衡化させる。３）プロテアソーム阻害剤を、ドロップに結晶脱水バッファー４μｌを加えることにより、結晶中へ浸漬し、バッファーは、５ｍＭの最適なプロテアソーム阻害剤をさらに含有する（最終濃度、２．５ｍＭ）。次に、ドロップを、再密封し、１２時間超で平衡化させる。結晶安定化、脱水およびリガンド浸漬の手順の全体は、したがって、３０時間以内で終了する。
【００７６】
ヒト２０Ｓ免疫プロテアソームの精製
ヒト２０Ｓプロテアソームの精製に関する上記の方法と同様に、免疫プロテアソームは、当技術分野で記載されている通り、提供された粗試料を、７２時間、２００Ｕ／μｌインターフェロンガンマで培養された細胞培養から得る、同じアプローチにしたがって精製する。
【００７７】
免疫プロテアソームの結晶化を、上記の通り実行した。２．２Å未満の分解能を得ることが可能であった。
酵母脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）の精製
手短に言えば、酵母Ｆａｓの精製は、以下の通り行われる。
１）粉砕された酵母細胞（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはＣ．テルモフィルム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））７７０ｇを、３０分３７℃で、スターラーにより解凍した。
２）以下を加える。
・１×標準バッファー（ＳＢ）（アセテート）（１６８ｍｌ×２）
・ＰＭＳＦ（溶液）５ｍＭ
・ベンズアミジン１０ｍＭ
・ベータグリセロリン酸１０ｍＭ
・ＤＴＴ２０ｍＭ
・スクロース２０％（ｗ／ｖ）
３）ＲＴで３０分間、インキュベートする。
４）３０分間３００００ｇで、遠心分離し、ミラクロスおよびチーズクロス（それぞれ３層）を使用して、上清を濾過する。
５）上清にＯＧＮＧ（溶液）０．２％を加え、１時間３０℃で、インキュベートする。
６）３７ｋｒｐｍ、１時間、遠心分離する（Ｔｉ４５Ｂｅｃｋｍａｎｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
７）ミラクロスおよびチーズクロスの３層を使用して、上清を濾過する。
８）１８℃で３０分間、１×ＳＢ（アセテート）中に、２０％のＰＥＧ４００で沈殿させ、２５分間２７，５００ｇで、遠心分離する。
９）ペレットを廃棄し、１８℃で３０分間、１×ＳＢ（アセテート）中に、３０％のＰＥＧ４００で、上清を沈殿させ、２５分間２７，５００ｇで、遠心分離する。
１０）ペレットを保持し、上清を廃棄する。
１１）再懸濁バッファー（スクロース２％、１×ＳＢアセテートバッファー、ＤＴＴ１０ｍＭ、ベータ−ガラクトシダーゼ１０ｍＭ、ＬＭＮＧ（ラウロイルマルトシドネオペンチルグリコール（Lauroylmaltosideneopentylglycol））０．０１％）中で、ペレットを再懸濁する。
１２）ＳＷ３０、１０〜４５％の勾配を有する６バイアルに再懸濁されたペレットを負荷し、１６時間３０，０００ｒｐｍで稼働させる（勾配は、スクロース、１×ＳＢアセテートバッファー、ＤＴＴ１０ｍＭおよびベータグリセロリン酸１０ｍＭを含有する）。
１３）ＦＡＳ画分）を、プールし、濾過し、１８℃、１時間でＳＢアセテートバッファー中に４０％のＰＥＧ４００を使用して、沈殿させた。ＦＡＳ画分を、１時間２７，５００ｇで遠心分離した。
１４）ペレットを、再懸濁バッファー（スクロース２％、１×ＳＢアセテートバッファー、ＤＴＴ１０ｍＭ、ベータ−ガラクトシダーゼ１０ｍＭ、ＬＭＮＧ０．０１％）中で再懸濁した。
１５）再懸濁されたペレットを、１２バイアルのＳｗ４０、１０〜４５％の勾配に負荷した、そして１６時間２５０００ｒｐｍで稼働させる。
１６）ＦＡＳ画分を、プールし、濾過し、１８℃、１時間で、ＳＢアセテートバッファー中に４０％のＰＥＧ４００を使用して、沈殿させた。ＦＡＳ画分を、２５分間２７，５００ｇで、遠心分離した。
１７）ペレットを、約４．２ｍｌの体積の再懸濁バッファー（スクロース２％、１×ＳＢアセテートバッファー、ＤＴＴ１０ｍＭ、ＬＭＮＧ０．０１％）中で再懸濁した。
１８）再懸濁されたペレットを、１２×Ｓｗ４０、１０〜４５％の勾配に負荷した、そして１６時間２２０００ｒｐｍで稼働させる。
１９）ＦＡＳ画分を、プールし、１８℃、１時間で、ＳＢアセテートバッファー中に４０％のＰＥＧ４００を使用して、沈殿させた。ＦＡＳ画分を、２５分間２７，５００ｇで、遠心分離した。
２０）ペレットを、再懸濁バッファー（スクロース２０％、１×ＳＢアセテートバッファー、ＤＴＴ１０ｍＭ、ＬＭＮＧ０．０１％）中で再懸濁した。最終濃度は、１．１ｍｌに対して１５ｍｇ／ｍｌであった。
【００７８】
細胞２６０ｇから出発して、収量は、酵母脂肪酸シンターゼ約１６ｍｇである。ＦＡＳを、本明細書に記載された方法にしたがって結晶化し、屈折は、４Å未満の範囲、特に２．８Åで可能である。その上、電子顕微鏡観察を、分解能３Å未満で行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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