(57)【要約】  分析中の生体試料を含む基板上に分配される流体（１０５）の補給量（２７９）を概算するシステムであって、流体（１０５）は基板とカバーガラス（１３０）との間の空間に閉じ込められており、前記システムは、    ａ．画像取得記憶システムであって、      ｉ．基板およびカバーガラス（１３０）上に配置されたカメラ（３３０）および      ｉｉ．２つの光源を備え、第１の光源（１１０）は、第１の光源（１１０）から発せられる第１の光（１１１）が、カメラ（３３０）の視野（ＦＯＶ）内にあるように位置決めされ、第２の光（１２０）源は、第２の光（１２１）源から発せられる第２の光（１２１）が、カメラ（３３０）の視野（ＦＯＶ）外にあるように位置決めされ、それにより暗視野撮像用に構成された撮像配置を作成する、    画像取得記憶システムと、    ｂ．画像取得記憶システムに動作可能に結合されたプロセッサ（２２０）と、    ｃ．プロセッサ（２００）に動作可能に結合されたメモリ（２１０）であって、プロセッサ（２００）によって実行されるとき、プロセッサ（２００）に、      ｉ．撮影画像（３４２）を生成するためにカメラ（３３０）を用いて、生体試料を保持する基板上に分配される流体（１０５）の画像を撮影することと、      ｉｉ．基板上に分配され、基板とカバーガラス（１３０）との間の空間に閉じ込められた流体（１０５）の流体境界（３４１）を識別するために撮影画像（３４２）を分析することと、      ｉｉｉ．基板上に分配された流体（１０５）の流体体積（１０９）を流体境界（１０７）から決定される流体（１０５）幅を用いて計算することと、      ｉｖ．計算流体体積および所定の流体体積に基づいて流体（１０５）の補給量（２７９）を計算することとを、    含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するように構成される、メモリ（２１０）とを、備えるシステム。
2019519757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析中の生体試料を保持する基板上に分配されることになる流体の補給(replenishment)量の概算(estimating)方法であって、
ａ．撮影画像を生成するために撮像システムを用いて、前記生体試料を保持する前記基板上に分配される前記流体の画像を撮影するステップであって、前記流体が前記基板とカバーガラスとの間の空間に閉じ込められているステップと、
ｂ．前記基板上に分配され、前記基板と前記カバーガラスとの間の前記空間に閉じ込められた前記流体の流体境界(boundaries)を識別するために前記撮影画像を分析するステップと、
ｃ．前記基板上に分配された前記流体の流体体積を前記流体境界から決定される流体幅を用いて計算するステップと、
ｄ．前記計算流体体積および所定の流体体積に基づいて前記流体の前記補給量を計算するステップとを、
含む方法。
【請求項２】
前記撮影画像内にエラーまたは異常があるか否かを判断するためにフレームチェックを実行するステップであって、前記フレームチェックが前記撮影画像内にエラーまたは異常を検出する場合、前記撮影画像が前記フレームチェックを通過するまで、またはフレームチェックのエラー反復最大回数に到達するまで、画像を繰り返し撮影するステップをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基板上に分配された前記流体の流体位置を決定するステップと、前記流体位置を所定の位置と比較するステップとを、さらに含み、前記カバーガラスが、前記基板を横断して前記流体を動かす可動カバーガラスであり、流体位置が前記所定の位置の外側にある場合、前記流体が可動カバーガラスによって前記所定の位置へ移動されるまで、画像の撮影を繰り返し、前記流体位置が前記所定の位置内に入った場合、前記流体体積を計算する、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記撮像システムが、前記カバーガラス上に配置されたカメラと、少なくとも２つの光源とを含み、第１の光源は、前記第１の光源から発せられる第１の光が、前記カメラの視野（ＦＯＶ）内にあるように位置決めされ、第２の光源は、前記第２の光源から発せられる第２の光が、前記カメラの前記視野外にあるように位置決めされ、暗視野撮像用に構成された撮像配置を提供する、
請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
暗視野撮像が、前記撮影画像を分析するとき、前記流体境界を識別するために使用される、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記撮影画像を分析するステップが、前記流体境界を識別するために、前景検出を前記撮影画像に適用するステップを含む、
請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記流体が透明な流体であり、流体動作に基づいた前景(foreground)検出が、前記流体境界を識別するために使用される、
請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記流体が着色された流体であり、色しきい値検出が、前記流体境界を識別するために使用される、
請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記撮影画像を分析するステップが、ノイズを前記撮影画像のバックグラウンドから除去するステップをさらに含む、
請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記カメラと前記カバーガラスとの間の距離が、約３８．１ｃｍ（１５インチ）から約５０．８ｃｍ（２０インチ）の間である、
請求項４から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記流体体積を計算するステップが、前記計算流体体積を提供するために前記流体幅を検量線(calibration curve)と比較するステップを含み、前記検量線は、対応する流体幅に対する既知の流体体積をプロットすることによって準備される、
請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記検量線が、一次の検量線である、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記流体体積を計算するステップが、さらに
ａ．前記撮影画像内の気泡を識別するために円形(circle)検出を実行することによって、前記基板と前記カバーガラスとの間の前記空間に閉じ込められた前記分配された流体内の気泡を検出するステップと、
ｂ．気泡の数および各気泡の気泡体積を計算すること、および補正計算体積を提供するために、前記流体幅を使用して決定された前記計算体積から総気泡体積を減じることによって気泡体積を補償するステップと、
ｃ．前記補給量を計算するために、前記補正された計算体積を使用するステップとを、含む、
請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記フレームチェックを実行するステップが、前記撮影画像内の暗画素に対する明画素の比を計算するステップを含み、前記撮影画像内で暗画素に対する明画素の前記比が約５０％よりも大きいとき、前記画像が、前記フレームチェックを失敗し、前記撮影画像内で暗画素に対する明画素の前記比が約５０％よりも小さいとき、前記画像は、前記フレームチェックを通過する、
請求項２から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記フレームチェックを実行するステップが、体積差を得るために、前記計算流体体積を前記所定の流体体積または少なくとも１つの事前に計算された体積と比較するステップを含み、前記体積差と前記所定の流体体積または前記事前に計算された体積との比の絶対値が、前記流体の所定の蒸発速度を使用して計算された差よりも大きいとき、前記画像が、前記フレームチェックを失敗する、
請求項２から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記フレームチェックを実行するステップが、フレームチェックエラー反復最大回数に到達した場合にユーザに通知するステップをさらに含む、
請求項２から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記フレームチェックエラー反復最大回数が、約５回の反復である、
請求項２から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記補給量だけ前記流体体積を補給するステップをさらに含む、
請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記流体位置を決定するステップが、前記可動カバーガラスの位置を決定するステップを含み、前記可動カバーガラスの前記位置が、前記流体位置と関連性を示し、前記可動カバーガラスの前記位置が、所定領域の外側にある場合、前記流体位置は、前記所定位置の外側にある、
請求項３から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記可動カバーガラスが、流体を転がすカバーガラス(fluid rolling cover)を含み、前記所定の領域は、前記流体を転がすカバーガラスの位置に対する前記流体位置の動作の遅れを補償するために、前記流体を転がすカバーガラスの中心線からオフセットしている、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記流体位置を決定するステップが、前記流体を転がすカバーガラスが、前記基板を横断して前記流体を動かそうとするとき、前記流体を転がすカバーガラスの前記中心線に対する前記流体の動作の方向を決定するステップをさらに含む、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
分析中の生体試料を含む基板上に分配される流体の補給量を概算するシステムであって、前記流体が、前記基板とカバーガラスとの間の空間に閉じ込められており、前記システムが、
ａ．画像取得記憶システムであって、
ｉ．前記基板および前記カバーガラス上に配置されたカメラと、
ｉｉ．少なくとも２つの光源であって、第１の光源が、前記第１の光源から発せられる第１の光が、前記カメラの視野（ＦＯＶ）内にあるように位置決めされ、第２の光源が、前記第２の光源から発せられる第２の光が、前記カメラの前記視野外にあるように位置決めされ、それにより暗視野撮像用に構成された撮像配置を作成する、光源とを含む、
画像取得記憶システムと、
ｂ．前記画像取得記憶システムに動作可能に結合されたプロセッサと、
ｃ．前記プロセッサに動作可能に結合されたメモリであって、前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサに、
ｉ．撮影画像を生成するために前記カメラを用いて、前記生体試料を保持する前記基板上に分配される前記流体の画像を撮影することと、
ｉｉ．前記基板上に分配され、前記基板と前記カバーガラスとの間の前記空間に閉じ込められた前記流体の流体境界を識別するために前記撮影画像を分析することと、
ｉｉｉ．前記基板上に分配された前記流体の流体体積を前記流体境界から決定される流体幅を用いて計算することと、
ｉｖ．前記計算流体体積および所定の流体体積に基づいて前記流体の前記補給量を計算することとを、
含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するように構成される、メモリとを、
備える、システム。
【請求項２３】
前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサに前記撮影画像内にエラーまたは異常があるか否かを判断するためにフレームチェックを実行することを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成され、前記フレームチェックが前記撮影画像内にエラーまたは異常を検出する場合、前記撮影画像が前記フレームチェックを通過するまで、またはフレームチェックのエラー反復最大回数に到達するまで、画像を繰り返し撮影する、
請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサに、前記基板上に分配される前記流体の流体位置を決定することと、前記流体位置を所定の位置と比較することとを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成され、前記カバーガラスが、前記基板を横断して前記流体を移動させる可動カバーガラスであり、前記流体位置が前記所定の位置の外側にあるとき、前記流体は、前記可動カバーガラスによって前記所定の位置へ移動され、前記流体位置が前記所定の位置内に入った場合、前記流体体積を計算する、
請求項２２または２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記流体境界を識別するために暗視野撮像を適用する、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される、
請求項２２から２４のいずれかに記載のシステム。
【請求項２６】
前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記流体境界を識別するために前景検出を前記撮影画像に適用する、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される、
請求項２２から２４のいずれかに記載のシステム。
【請求項２７】
前記流体が、透明な流体であり、前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記流体境界を識別するために動作に基づいた前景検出を適用する、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される、
請求項２２から２６のいずれかに記載のシステム。
【請求項２８】
前記流体が、着色された流体であり、前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記流体境界を識別するために色しきい値検出を適用する、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される、
請求項２２から２６のいずれかに記載のシステム。
【請求項２９】
前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記撮影画像のバックグラウンドからノイズを除去する、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される、
請求項２２から２８のいずれかに記載のシステム。
【請求項３０】
前記カメラと前記カバーガラスとの間の距離が、約３８．１ｃｍ（１５インチ）から約５０．８ｃｍ（２０インチ）の間である、
請求項２２から２９のいずれかに記載のシステム。
【請求項３１】
前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサに、前記計算流体体積を提供するために前記流体幅を検量線と比較することを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成され、前記検量線は、対応する流体幅に対する既知の流体体積をプロットすることによって準備される、
請求項２２から３０のいずれかに記載のシステム。
【請求項３２】
前記検量線が、一次の検量線である、
請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサに、
ａ．前記撮影画像内の気泡を識別するために円形検出を実行することによって、前記基板と前記カバーガラスとの間の前記空間に閉じ込められた前記分配された流体内の気泡を検出することと、
ｂ．気泡の数および各気泡の気泡体積を計算すること、および補正計算体積を提供するために、前記流体幅を使用して決定された前記計算体積から総気泡体積を減じることによって気泡体積を補償することと、
ｃ．前記補給量を計算するために、前記補正された計算体積を使用することとを、
含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される、
請求項２２から３２のいずれかに記載のシステム。
【請求項３４】
前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサに前記撮影画像内の暗画素に対する明画素の比を計算することを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成され、前記撮影画像内で暗画素に対する明画素の前記比が約５０％よりも大きいとき、前記画像は、前記フレームチェックを失敗し、前記撮影画像内で暗画素に対する明画素の前記比が約５０％よりも小さいとき、前記画像は、前記フレームチェックを通過する、
請求項２２から３３のいずれかに記載のシステム。
【請求項３５】
前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサに体積差を得るために、前記計算流体体積を前記所定の流体体積または少なくとも１つの事前に計算された体積と比較することを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成され、前記体積差と前記所定の流体体積または前記事前に計算された体積との比の絶対値が、前記流体の所定の蒸発速度を使用して計算された差よりも大きいとき、前記画像は、前記フレームチェックを失敗する、
請求項２２から３４のいずれかに記載のシステム。
【請求項３６】
前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサに、フレームチェックエラー反復最大回数に到達した場合に、ユーザに通知することを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される、
請求項２２から３５のいずれかに記載のシステム。
【請求項３７】
前記フレームチェックエラー反復最大回数が、約５回の反復である、
請求項２３から３６のいずれかに記載のシステム。
【請求項３８】
補給ディスペンサをさらに含み、前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記ディスペンサに、前記補給量だけ前記流体体積を補給させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される、
請求項２２から３７のいずれかに記載のシステム。
【請求項３９】
前記メモリが、前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサに、前記可動カバーガラスの位置を決定することを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成され、前記可動カバーガラスの前記位置が、前記流体位置と関連性を示し、前記可動カバーガラスの前記位置が、所定領域の外側にある場合、前記流体位置は、前記所定位置の外側にある、
請求項２４から３８のいずれかに記載のシステム。
【請求項４０】
前記可動カバーガラスが、流体を転がすカバーガラスを含み、前記所定の領域は、前記流体を転がすカバーガラスの位置に対する前記流体位置の動作の遅れを補償するために、前記流体を転がすカバーガラスの中心線からオフセットしている、
請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
前記流体位置を決定することが、前記流体を転がすカバーガラスが、前記基板を横断して前記流体を動かそうとするとき、前記流体を転がすカバーガラスの前記中心線に対する前記流体の動作の方向を決定することをさらに含む、
請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
前記プロセッサの制御下の補給ディスペンサをさらに含み、前記メモリは、前記プロセッサによって実行されるとき、前記補給ディスペンサに前記流体補給量を前記カバーガラスと前記基板との間の前記空間に送達させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される、
請求項２２から４１のいずれかに記載のシステム。
【請求項４３】
請求項２２から４１のいずれかに記載の装置に請求項４から２１のいずれかに記載の方法を実行させる命令を含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項４４】
請求項１から２１のいずれかに記載の方法を実行させる命令を記憶してあるコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
[0001]本開示は、内容が本明細書に参照により組み込まれる、２０１６年４月２７日に提出された米国仮特許出願第６２／３２８，２５４号の利益を主張するものである。
【０００２】
[0002]本発明は、試薬量検知用のシステムおよび方法に関し、詳細には、組織染色処理中のスライドガラス上の試薬量検知用のシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]生物学的検定法は、生体標本に関連付けられた１つまたは複数の特性、たとえば、その分子含有量または細胞構造などを、測定または観察するために実行され得る解析手順である。たとえば、組織切片および細胞試料などの細胞標本は、それらが基板上に支持されている間、１つまたは複数の流体を標本に塗布することによって、顕微鏡分析のために準備され得る。顕微鏡スライドガラスが支持する細胞標本は、多くの場合、着色するために１つまたは複数の染料または他の試薬で処理され、他の透明なまたは不可視の細胞および細胞の成分と対比される。免疫組織化学的（ＩＨＣ）および原位置ハイブリッド形成法（ＩＳＨ）染色法は、標本内部のタンパク質および核酸それぞれの存在、位置、および分布を明瞭化するために、細胞標本の処理に使用され得る。
【０００４】
[0004]分析およびプラットフォーム構築および商業的分析試験は、再現性および精度が、現在は病理学者の評価によって安定化されるため、時間および資源の点から費用がかかり得る。スライドガラスに基づく分析の成功は、一定のＩＳＨ分析に１２時間以上かかり得る分析の完了後にようやく、病理学者によって、さらに時間を要する多標的プロトコルを用いて評価される。組織染色処理での任意の混乱または不整合は、その後にようやく発見され、多くの場合、正確な原因には広範な追加分析が必要となる。全体的に、そのような処理は、浪費される高価な組織試料、および増加する開発時間とその付随するコストに関して、問題を生み出す。
【０００５】
[0005]試薬流体の蒸発は、試薬濃度の変化を生じさせ得るメカニズムの１つである。たとえば、試薬からの溶媒の蒸発は、特に試薬流体の体積の縁部において、試薬成分の濃度の増加をもたらし得る。同様に、分析中の生体試料による試薬成分の取り込みも、１つまたは複数の試薬成分の局在的な枯渇の原因となり得る。この取り込みは、たとえば組織試料全体で不均一であり得るので、濃度勾配が発生し得て、１つまたは複数のそのような勾配に沿った染色度合いの差を生じさせ得る。さらに、濃度が増加するにつれて、通常、取り込みおよび他の相互作用ならびに反応が加速するので、蒸発は、こう配および不均一な染色の原因となり得る。全体的に、時間的および空間的な試薬濃度の変化は、組織試料全体の不均一な染色という結果をもたらし得る。蒸発の場合、組織が部分的にまたは全体的に乾燥し、組織試料が使用不能になることもあり得る。原因に関係なく、濃度変化または組織損傷を判定するために、病理学者の分析を待たねばならないことは、多大な浪費時間と、高価および／または希少な試料のさらなる消費とに、つながることになる。
【０００６】
[0006]商業的分析を商業的計器で実行した後、分析の成功は、病理学者によって評価されることになる。トラブルシューティング指針および彼ら自身の知識を用いることで、病理学者は、試験所へ分析を実行するフィードバックを提供し、新しい試料を要求することができる。再び、このことは、相当な遅延につながるが、この場合、遅延は、患者が、彼らの生活の質に非常に密接に影響を与え得る結果を受け取るのに要する時間に影響する。
【０００７】
[0007]処理中の蒸発を軽減するための現在の解決策は、局所的な湿度および温度に依存する概算蒸発速度に基づいた流体の補給に頼っている。湿度および温度は、分析処理時間中に変動し得るので、そのような試薬の概算補給速度は、正確でない可能性がある。さらに、補給速度は、スライドガラス毎に決定されないし、リアルタイムでも決定されない。したがって、流体体積を検知し、かつリアルタイムで正確な液体補給を提供する、方法およびシステムが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願発明の一実施例は、例えば、リアルタイム体積制御するためのシステムおよび方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
[0008]本明細書で開示されるのは、流体体積を検知し、かつリアルタイムで液体補給を提供する、方法、コンピュータプログラム製品、およびシステムであり、その結果、分析結果を損ねかねない処理条件が、未然に回避される。さらに、開示される方法、プログラム製品、およびシステムは、病理学者が処理過失発生を判定する、試料試験の完了を待たなくてもよいように、支援し得る。
【００１０】
[0009]一態様によれば、分析中の生体試料を保持する基板上に分配されることになる、流体補給量の概算方法が開示される。本方法は、撮影画像を生成するために撮像システムを用いて、（顕微鏡のスライドガラス上に載せられた組織または細胞学試料などの）生体試料を保持する基板上に分配される流体の画像を撮影することを含む。特に、流体は、向かい合わされる表面が、分析ステップが実行される（毛管現象空間のような）小体積空間を形成するように基板から一定の間隔を置かれた薄膜染色システムのように、基板とカバーガラスとの間に閉じ込められ得る。撮影画像は、基板上に分配され、基板とカバーガラスとの間の空間に閉じ込められた流体の流体境界を識別するために（たとえば画像分析方法によって）分析される。識別される流体境界は、次に基板上に分配された流体体積を計算するために使用され得る、流体幅を提供する。たとえば、決定された幅は、既知の体積に対応する流体幅を測定し、一次（線形）関数などの関数との関係にフィッティングすることによって作成された検量線と比較されてもよい。別法として、基板とカバーガラスとの間の空間の幾何学的寸法が、観察された幅と共に、体積の計算に用いられてもよい。流体体積の計算方法に関係なく、この計算流体体積は、追加流体が追加されるべきか否か判定し、たとえば蒸発、または逃散ならびに漏洩などの他の任意の過程による、流体損失を補給するために、どれだけの量が追加されるべきか決定するために使用され得る。流体の補給量は、所定の体積と計算流体体積とを比較することによって、計算されてもよく、計算流体体積と所定の体積との差分が、補給量を提供する。具体的な実施形態では、方法は、補給量だけ流体体積を補給するステップをさらに含む。この方法では、任意の流体損失は、置換され得て、それにより分析中、十分な試薬などの流体と、生体試料との接触の保証を支援する。生体試料と接触する適切な流体量の維持は、結果として、計画通りの分析進行の補償を支援し、全ての分析プロセスが完了してはじめて（乾燥組織などの）問題が発見されるとすると、他に発生するかもしれない分析結果を提供することで、遅延を回避し得る。
【００１１】
[0010]別の態様では、分析中の生体試料を含む基板上に、詳細には流体が基板とカバーガラスとの間の空間に閉じ込められたところに、分配される流体補給量を概算するシステムが開示される。全体システムは、基板およびカバーガラス上に配置されたカメラと、少なくとも２つの光源とをそれ自体が含む、画像取得記憶システムを含む。第１の光源は、第１の光源から発せられる第１の光が、カメラの視野（ＦＯＶ）内にあるように位置決めされ、第２の光源は、第２の光源から発せられる第２の光が、カメラの視野外にあるように位置決めされる。撮像配置は、それにより暗視野撮像を支援するように構成される。画像分析システムは、画像取得記憶システムに動作可能に結合されたプロセッサと、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに一定の動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するように構成されたプロセッサに動作可能に結合されたメモリとをさらに含む。動作は、撮影画像を生成するためにカメラを使用して、生体試料を保持する基板上に分配される流体の画像を撮影することと、基板上に分配され、基板とカバーガラスとの間の空間に閉じ込められた流体の流体境界を識別するために撮影画像を解析することと、流体境界から決定された流体幅を使用して、基板上に分配された流体の流体体積を計算することと、計算流体体積および所定の流体体積に基づいて流体の補給量を計算することとを含む。ある実施形態では、流体体積を所定の体積に復帰させるために、たとえば自動的に、プロセッサの制御下で、メモリが補給ディスペンサを制御する命令をさらに記憶して、補給量は、システムの補給ディスペンサを使用して追加される。
【００１２】
[0011]具体的な実施形態では、流体境界の縁部を照明する暗視野撮像の使用、および／または動作中の流体境界を検出する前景動作検出の使用、および／または着色された流体の検出を支援する色しきい値の使用、の全てが合同して、流体幅の検出を確実に支援し、最小限の誤差で（たとえば約１．５％未満の誤差で）リアルタイムに多種多様な流体の計算流体体積を提供する。そのうえ、開示された方法およびシステムは堅牢であり、システム内の分析は、ディスペンサの動作などの他のシステムの動作、組織の色の変化、および機器の振動によって影響されない。
【００１３】
[0012]他の態様では、開示されたシステムに開示された方法を実行させる命令と、開示された方法を実行する命令を記憶する（非一時的な）コンピュータ可読媒体と、を含むコンピュータプログラム製品が提供される。
【００１４】
[0013]追加の実施形態および態様が、添付図面に関連して提供される以下の詳細な説明の考察から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】[0014]開示された実施形態による例示的なカメラおよび照明の配置の側面図である。
【図２】[0015]開示された実施形態によるリアルタイム補給システム（ＲＴＲＳ）のブロック図である。
【図３】[0016]図３Ａは、動作ベースの色しきい値処理の前景検出を使用した流体縁部検出の例を示す図である。図３Ｂは、動作ベースの色しきい値処理の前景検出を使用した流体縁部検出の例を示す図である。図３Ｃは、動作ベースの色しきい値処理の前景検出を使用した流体縁部検出の例を示す図である。図３Ｄは、動作ベースの色しきい値処理の前景検出を使用した流体縁部検出の例を示す図である。図３Ｅは、動作ベースの色しきい値処理の前景検出を使用した流体縁部検出の例を示す図である。図３Ｆは、動作ベースの色しきい値処理の前景検出を使用した流体縁部検出の例を示す図である。
【図４】[0017]図４Ａは、体積計算に使用されるべきでない画像フレームタイプの例を示す図である。図４Ｂは、体積計算に使用されるべきでない画像フレームタイプの例を示す図である。
【図５】[0018]開示された実施形態による前景検出の例示的な処理を示す図である。
【図６】[0019]図６Ａは、変化するＡＲＣおよび流体位置を示す図である。図６Ｂは、変化するＡＲＣおよび流体位置を示す図である。図６Ｃは、変化するＡＲＣおよび流体位置を示す図である。図６Ｄは、変化するＡＲＣおよび流体位置を示す図である。
【図７】[0020]図７Ａは、ＡＲＣ位置対流体位置を示す図である。図７Ｂは、ＡＲＣ位置対流体位置を示す図である。図７Ｃは、ＡＲＣ位置対流体位置を示す図である。図７Ｄは、ＡＲＣ位置対流体位置を示す図である。
【図８】[0021]ＲＴＲＳ境界部の動作１２０秒後の例示的なスクリーンショットである。
【図９】[0022]ＲＴＲＳ境界部の流体の気泡補償を用いた例示的なスクリーンショットである。
【図１０】[0023]例示の実施例による、計算体積と既知の体積との間の密な対応を示す図である。
【図１１】[0024]図１１Ａは、明視野および暗視野画像内での変化する組織の色および振動を用いた縁部検出の非限定的な例を示す図である。図１１Ｂは、明視野および暗視野画像内での変化する組織の色および振動を用いた縁部検出の非限定的な例を示す図である。図１１Ｃは、明視野および暗視野画像内での変化する組織の色および振動を用いた縁部検出の非限定的な例を示す図である。図１１Ｄは、明視野および暗視野画像内での変化する組織の色および振動を用いた縁部検出の非限定的な例を示す図である。
【図１２】[0025]多様な試薬の測定体積の非限定的な例を示す図である。
【図１３】[0026]図１３Ａは、暗視野および明視野の撮像配置を示す図である。 [0027]図１３Ｂは、対象物の縁部を強調した暗視野撮像の非限定的な例を示す図である。
【図１４】[0028]図１４Ａは、明視野撮像と暗視野撮像との比較を示す図である。図１４Ｂは、明視野撮像と暗視野撮像との比較を示す図である。図１４Ｃは、明視野撮像と暗視野撮像との比較を示す図である。図１４Ｄは、明視野撮像と暗視野撮像との比較を示す図である。図１４Ｅは、明視野撮像と暗視野撮像との比較を示す図である。図１４Ｆは、明視野撮像と暗視野撮像との比較を示す図である。
【図１５】[0029]図１５Ａは、縁部検出に使用された組織試料の画像フレームの例を示す図である。図１５Ｂは、縁部検出に使用された組織試料の画像フレームの例を示す図である。
【図１６】[0030]図１５Ａの縁部検出を示す図である。
【図１７】[0031]図１５Ｂの縁部検出を示す図である。
【図１８】[0032]図１８Ａは、ライン状にパターン化されたヒータ上で、ヘマトキシリンで染色された組織を示す図である。図１８Ｂは、ライン状にパターン化されたヒータ上で、ヘマトキシリンで染色された組織を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[0033]本明細書で説明する特徴または特徴の組合せは、任意のそのような組合せに含まれる特徴が相互に矛盾しないという条件のもと、文脈、本明細書、およびある当業者の知識から明らかになるように、本開示の範囲内に含まれる。付加的な利点および態様は、以下の詳細な明細書および請求項を考慮することで明らかになるであろう。
【００１７】
[0034]一態様では、分析中の生体試料を保持する基板上に分配されることになる流体の補給量の概算方法が開示される。方法は、撮影画像を生成するために撮像システムを使用して、生体試料を保持する基板上に分配される流体の画像を撮影するステップであって、流体が基板とカバーガラスとの間の空間に閉じ込められているステップと、基板上に分配され、基板とカバーガラスとの間の空間に閉じ込められた流体の流体境界を識別するために撮影画像を解析するステップと、流体境界から決定された流体幅を使用して、基板上に分配された流体の流体体積を計算するステップと、計算流体体積および所定の流体体積に基づいて流体の補給量を計算するステップとを含む。
【００１８】
[0035]本明細書で使用されるように、「流体幅」は、カバーガラスと下層の基板との間の空間内にある液体の１つまたは複数の観察される幅を示し、より一般には、撮影画像内で観察されるような液体によって占有される面積の計算を可能にする１つまたは複数の測定値を示す。その最も単純な形状では、流体は、カバーガラス下に正方形または長方形の形状を占有すると見ることができ、液体の測定された単一の幅は、カバーガラスと基板との間の空間の既知の形状に基づいた体積計算を支援するのに十分である。別法として、単一の幅は、既知の体積を空間に置き、観察される対応する幅を測定することによって作成される検量線と共に利用され得る。「流体幅」対体積の関係への数学的なフィッティング（一次またはそれ以上の関数、対数、指数関数、および他の周知のカーブフィッティング関数など）は、その上で計算体積が測定済みの流体幅から決定され得る検量線を提供し得る。流体は、流体の基板との相互作用に応じて、または流体がたとえば蒸発によって流体がなくなるようにカバーガラスと基板との間の空間から引き離されるので、通常、卵形または他の幾何学的形状のように見え得る可能性もある。したがって、画像は、１つまたは複数の方向のいくつかの幅から流体本体の複数の部分の体積を計算し、計算体積を提供するためにそれらを組み合わせるための原理を提供し得る。全くさらに洗練された実施形態では、カバーガラスと下層の基板との間の空間内の流体によって占有される面積は、液体本体または本体の集合が画像分析方法によって分離され得る一連の幾何学的形状の面積を合計することによって決定され得る。全体的に、カバーガラスと基板との間の空間の形状の図形は、空間内の流体の体積を概算するために、１つまたは複数の「流体幅」の組合せで決定され、使用され得る。
【００１９】
[0036]具体的な実施形態では、開示される方法は、撮影画像内にエラーまたは異常があるか否かを判断するためにフレームチェックを実行するステップをさらに含み、フレームチェックが撮影画像内にエラーまたは異常を検出する場合、撮影画像がフレームチェックを通過するまで、またはフレームチェックのエラー反復最大回数に到達するまで、画像を繰り返し撮影する。さらに具体的な実施形態では、カバーガラスが、基板を横断して流体を動かす可動カバーガラスであり、方法は、基板上に分配された流体の流体位置を決定するステップと、流体位置を所定の位置と比較するステップとをさらに含む。流体位置が所定の位置の外側にあるとき、画像は、流体が可動カバーガラスによって所定の位置へ移動されるまで、繰り返し撮影され得て、流体位置が所定の位置内に入った後、流体体積は計算され得る。別のさらに具体的な実施形態では、フレームチェックを実行するステップは、撮影画像内の暗画素に対する明画素の比を計算するステップを含み、撮影画像内で暗画素に対する明画素の比が約５０％よりも大きいとき、画像は、フレームチェックを失敗し、撮影画像内で暗画素に対する明画素の比が約５０％よりも小さいとき、画像は、フレームチェックを通過する。また別のさらに具体的な実施形態では、フレームチェックを実行するステップは、体積差を得るために、計算流体体積を所定の流体体積または少なくとも１つの事前に計算された体積と比較するステップを含み、体積差と所定の流体体積または事前に計算された体積との比の絶対値が、流体の所定の蒸発速度を使用して計算された差よりも大きいとき、画像は、フレームチェックを失敗する。なおいっそうさらに具体的な実施形態では、フレームチェックを実行する開示される方法は、フレームチェックエラー反復最大回数に、たとえば約５回の反復に到達した場合に、ユーザに通知するステップをさらに含む。
【００２０】
[0037]別の具体的な実施形態では、撮像システムは、カバーガラス上に配置されたカメラと、少なくとも２つの光源とを含み、第１の光源は、第１の光源から発せられる第１の光が、カメラの視野（ＦＯＶ）内にあるように位置決めされ、第２の光源は、第２の光源から発せられる第２の光が、カメラの視野外にあるように位置決めされ、暗視野撮像用に構成された撮像配置を提供する。さらに具体的な実施形態では、暗視野撮像は、撮影画像を分析するとき、流体境界を識別するために、方法において使用される。別のさらに具体的な実施形態では、撮影画像を分析するステップは、流体境界を識別するために、動作に基づいた前景検出などの前景検出を撮影画像に適用するステップを含む。たとえば、流体が透明な流体であるとき、流体動作に基づいた前景検出は、流体境界を識別するために使用され得る。さらに別のより具体的な実施形態では、流体が着色された流体であり、色しきい値検出が、流体境界を識別するために、方法において使用される。ノイズが、撮影画像のバックグラウンドから除去され得る。別の具体的な実施形態では、カメラとカバーガラスとの間の距離は、約３８．１ｃｍから約５０．８ｃｍの間（約１５から約２０インチの間）である。
【００２１】
[0038]開示される方法の別の具体的な実施形態では、流体体積を計算するステップは、計算流体体積を提供するために流体幅を検量線と比較するステップを含み得て、検量線は、対応する流体幅に対する既知の流体体積をプロットすることによって準備される。さらに具体的な実施形態では、検量線は、一次の検量線である。他の具体的な実施形態では、開示される方法は、撮影画像内の気泡を識別するために円形検出を実行することによって、基板とカバーガラスとの間の空間に閉じ込められた分配された流体内の気泡を検出するステップをさらに含み得る。気泡体積は、気泡の数および各気泡の気泡体積を計算することによって補償され得て、総気泡体積は、流体幅を使用して決定された計算体積から減じられ、補正計算体積を提供する。以下にさらに詳細に示すように、補給量を計算するためにそのような「気泡補償」体積を使用することは、決定された補給量に改善された精度をもたらす。
【００２２】
[0039]別の具体的な実施形態では、開示される方法は、補給量だけ流体体積を補給するステップをさらに含む。補給は、ロボットのピペッタなどの流体ディスペンサ、貯蔵部から流体を給送する流体ライン、または機械的ディスペンサを使用して自動的に実現され、あるいは手動的に実現され得る。組織を染色する試薬などの流体の補給は、同一の流体の追加によってなされ得て、または補給は、試薬が中に溶存または懸濁され蒸発などによって失われる、溶媒の追加であり得る。
【００２３】
[0040]他の具体的な実施形態では、開示される方法は、可動カバーガラスの位置と流体位置との間に通常は相関があるので、流体位置を決定するために、可動カバーガラスの位置を利用するステップ（画像撮影をトリガするために使用され得る）をさらに含み得る。可動カバーガラスの位置が所定領域の外側にある場合、流体位置は、所定位置の外側にある。さらに具体的な実施形態では、可動カバーガラスは、流体を転がすカバーガラス（ｆｌｕｉｄ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｏｖｅｒ）を含み得て、所定の領域は、流体を転がすカバーガラスの位置に対する流体位置の動作の遅れを補償するために、流体を転がすカバーガラスの中心線からオフセットしている。さらにより具体的な実施形態では、開示される方法は、流体を転がすカバーガラスが、基板を横断して流体を動かそうとするとき、流体を転がすカバーガラスの中心線に対する流体の動作の方向を決定するステップをさらに含む。
【００２４】
[0041]別の態様では、分析中の生体試料を含む基板上に分配される流体補給量を概算するシステムが開示され、ここで流体は基板とカバーガラスとの間の空間に閉じ込められている。開示されるシステムは、基板およびカバーガラス上に配置されたカメラと、少なくとも２つの光源とをそれ自体が含む、画像取得記憶システムを含む。第１の光源は、第１の光源から発せられる第１の光が、カメラの視野（ＦＯＶ）内にあるように位置決めされ、第２の光源は、第２の光源から発せられる第２の光が、カメラの視野外にあるように位置決めされ、それにより暗視野撮像用に構成された撮像配置を作成する。システムは、画像取得記憶システムに動作可能に結合されたプロセッサと、プロセッサに動作可能に結合されたメモリとをさらに含む。メモリは、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに一定の動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するように構成される。これらの動作は、撮影画像を生成するためにカメラを使用して、生体試料を保持する基板上に分配される流体の画像を撮影することと、基板上に分配され、基板とカバーガラスとの間の空間に閉じ込められた流体の流体境界を識別するために撮影画像を解析することと、流体境界から決定された流体幅を使用して、基板上に分配された流体の流体体積を計算することと、計算流体体積および所定の流体体積に基づいて流体の補給量を計算することとを含む。具体的な実施形態では、カメラとカバーガラスとの間の距離は、約３８．１ｃｍから約５０．８ｃｍの間（約１５から約２０インチの間）である。ある実施形態では、システムは、プロセッサの制御下の補給ディスペンサをさらに含み、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、補給ディスペンサに流体補給量をカバーガラスと基板との間の空間に送達させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される。
【００２５】
[0042]開示されるシステムの具体的な実施形態では、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに撮影画像内にエラーまたは異常があるか否かを判断するためにフレームチェックを実行することを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成され、フレームチェックが撮影画像内にエラーまたは異常を検出する場合、プロセッサは、撮影画像がフレームチェックを通過するまで、またはフレームチェックのエラー反復最大回数に到達するまで、画像を繰り返し撮影する。さらに具体的な実施形態では、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに撮影画像内の暗画素に対する明画素の比を計算することを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成され、撮影画像内で暗画素に対する明画素の比が約５０％よりも大きいとき、画像は、フレームチェックを失敗し、撮影画像内で暗画素に対する明画素の比が約５０％よりも小さいとき、画像は、フレームチェックを通過する。別のさらに具体的な実施形態では、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに体積差を得るために、計算流体体積を所定の流体体積または少なくとも１つの事前に計算された体積と比較することを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成され、体積差と所定の流体体積または事前に計算された体積との比の絶対値が、流体の所定の蒸発速度を使用して計算された差よりも大きいとき、画像は、フレームチェックを失敗する。さらに別のより具体的な実施形態では、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに、フレームチェックエラー反復最大回数に到達した場合に、ユーザに通知することを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される。他のさらに具体的な実施形態では、フレームチェックエラー反復最大回数は、約５回の反復である。
【００２６】
[0043]開示されるシステムの別の実施形態では、カバーガラスが、基板を横断して流体を動かす可動カバーガラスであり、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに、基板上に分配される流体の流体位置を決定することと、流体位置を所定の位置と比較することとを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される。流体位置が所定の位置の外側にあるとき、流体は、可動カバーガラスによって所定の位置へ移動され、流体位置が所定の位置内に入った場合、流体体積を計算する。
【００２７】
[0044]開示されるシステムの具体的な実施形態では、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、流体境界を識別するために暗視野撮像を適用する、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される。他の具体的な実施形態では、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、流体境界を識別するために前景検出を撮影画像に適用する、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される。より具体的な実施形態では、体積が計算される流体は、透明な流体であり、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、流体境界を決定するために動作に基づいた前景検出を適用する、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される。他のより具体的な実施形態では、体積が計算される流体は、着色された流体であり、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、流体境界を決定するために色しきい値検出を適用する、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される。他の実施形態では、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、撮影画像のバックグラウンドからノイズを除去する、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される。
【００２８】
[0045]開示されるシステムのさらに他の実施形態では、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに、計算流体体積を提供するために流体幅を検量線と比較することを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成され、検量線は、対応する流体幅に対する既知の流体体積をプロットすることによって準備される。具体的な実施形態では、検量線は、一次の検量線である。
【００２９】
[0046]システムのさらなる実施形態では、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに、撮影画像内の気泡を識別するために円形検出を実行することによって、基板とカバーガラスとの間の空間に閉じ込められた分配された流体内の気泡を検出することと、気泡の数および各気泡の気泡体積を計算し、流体幅を使用して決定された計算体積から全気泡体積を減じることによって気泡体積を補償して、補正計算体積を提供することと、補給量を計算するために補正計算体積を使用することとを含む動作を実行させる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される。さらなる実施形態では、自動化された補給ディスペンサも、プロセッサの制御下にあり、メモリは、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに補給ディスペンサが流体補給量をカバーガラスと基板との間の空間に分配するようにさせる、デジタルコード化された命令を記憶するようにさらに構成される。
【００３０】
[0047]以下に、曲線状のカバーガラスを利用する、生体試料が載せられた基板に、基板を横断して「転がされる（ｒｏｌｌｅｄ）」流体を適用する具体的なシステムに関して論じられるが、開示される方法およびシステムは、（顕微鏡のスライドガラスまたは質量分析試料基板などの）基板と、生体試料に適用されることになる流体が中に配置され得る（毛管現象空間などの）空間を形成するために基板から間隔を空けられる（カバースリップなどの）カバーガラスとを含む任意のシステムで使用され得ることが理解されるであろう。カバーガラスは、固定式または連結式であっても、あるいはそうでなければ、流体に動きを与えるためにカバーガラスを動かす機構による可動式であってもよい。固定式のカバーガラスを含むシステムの例は、ＵＳ２０１４０３２９２７０、ＵＳ２０１５０２５３２２５、ＵＳ２０１３０１９６３３９、ＵＳ２００３０１３８３５３、ＵＳ８９３２５４３、およびＵＳ２０１５００３１０７１で開示された例を含む。カバーガラスと基板との間の空間の高さを変化させるために角度式に動かされるカバーガラスを含むシステムの例は、ＵＳ７４７６５４３、ＵＳ８４５４９０８、およびＷＯ２００６１１６０３９を含む。
【００３１】
[0048]ここで図１を参照すると、いくつかの実施形態では、撮像システム（１００）は、カメラ（１２５）ならびに前部光源（１１０）および後部光源（１２０）を含み得る。
他の実施形態では、撮像システムは、１つ以上のカメラ、１つ以上の前部光源、および１つ以上の後部光源を含み得る。ある実施形態では、撮像システムの構成要素のいくつかまたは全ては、試料処理システム上に搭載され得る。撮像システムは、照明し、試料処理システムでの１つまたは複数の基板の画像を撮影するために使用され得る。試料処理システムは、試料を横断して流体を移動させるための流体動作機構と、流体を試料に追加するための流体ディスペンサ、および流体を試料から除去するための流体除去装置を有する、流体交換システムとを含み得る。ある実施形態では、流体動作機構は、流体ローラ、すなわち流体を転がすカバーガラス（１３０）または「ＡＲＣ」を含み得る。本方法およびシステムで使用され得る流体を転がすカバーガラスの実施形態は、通常指定される「Ｓｐｅｃｉｍｅｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｓｌｉｄｅｓ（標本処理システムおよびスライドガラスを保持する方法）」という名称の２０１５年１１月１２日公開の米国特許出願公開第２０１５／０３２３７７６号で説明されており、その明細書は参照により本明細書に組み込まれる。たとえば、流体を転がすカバーガラスは、表面、タイル、帯状体、またはスライドガラス上で標本を処理するために試薬流体を操作することが可能となる任意の構造であり得る。流体を転がすカバーガラスは、スライドガラスに沿って転がるまたはそうでなければ移動する非平面の流体操作表面を有し得る。流体を転がすカバーガラスは、全体がまたは部分的に、重合体、プラスチック、エラストマ、複合材、セラミクス、ガラス、または任意の、十分に半透明な、試薬流体および標本と化学的に共存できる材料からなり得る。
【００３２】
[0049]他の実施形態では、流体動作機構は、分析中の１つまたは複数の試料を有する１つまたは複数の染色カセットを含み得る。試料処理システム内のカセットによって保持される組織試料の各々は、分析によって分析されることになる１つまたは複数の標本を保持するスライドガラス（１０２）を含み得る。試薬および／または染料などの１つまたは複数の流体（１０５）は、流体ディスペンサシステムによって標本に適用され得る。ある実施形態では、試薬および／または染料５６は、それだけに限定されないが、抗体希釈液、プロテアーゼ３、反応緩衝液、システム流体、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）抑制体、抗体、ＨＱリンカ、ＨＲＰ多量体、Ｈ２Ｏ２、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）、銅試薬、ヘマトキシリン（ＨＴＸ）、プローブ試薬、および青味試薬を含み得る。カバーガラスは、次に標本ならびに試薬および／または染料の上に配置され得る。いくつかの実施形態では、カバーは、透明または半透明の固体プラスチックまたはアクリルであり得て、異なる色の色合い、たとえば、黄色の色合いを、他の実施形態では有し得る。さらなる実施形態では、カバーは、透明な流体であり得る。開示されるシステムおよび方法で使用され得る試料処理システムの例は、米国特許出願公開第２０１５／０３２３７７６号、および通常指定される「Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（生物学的サンプル処理用装置と方法）」という名称の２０１４年１１月１１日登録の米国特許第８，８８３，５０９号でさらに説明されており、その明細書は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
[0050]撮像システムの適切なカメラおよび照明は、画像分析、体積計算、および流体体積検知のための基板およびカバーガラスの高品質画像の確保を支援する。画像内で流体縁部および標本を撮影するために、十分な分解能（または画素ごとの距離）および良好なコントラストを有することが望ましい。例示的な実施形態では、１６００×１２００画素（２メガピクセルすなわち２ＭＰ）カメラが使用され得る。別の実施形態では、カメラは、およそ９８８×７４０ｍｍの視野（ＦＯＶ）および約６１．２５μｍ／ピクセルの分解能を有する３５ｍｍ固定焦点距離レンズを含み得る。しかしながら、他の実施形態では、カメラは、２メガピクセルよりも多いことも少ないこともあり、固定焦点距離は、３５ｍｍより長いことも短いこともあり、視野は、９８８×７４０ｍｍより大きいことも小さいこともあり、かつ／あるいは分解能は、約６１．２５μｍ／ピクセルより高いことも低いこともあり得る。さらに別の実施形態では、カメラは、０．１６ｍｍまたはより低い画素スケール（または分解能）を有し得る。さらなる実施形態では、カメラは、より小さいＦＯＶだがより高い分解能を有する５０ｍｍ固定焦点距離レンズを使用し得る。例示的な実施形態では、３５ｍｍ固定焦点距離レンズが、少なくとも３つのスライドガラスを同時に撮像するときに使用され得る。より多くの撮像されるスライドガラスがある場合、画像品質が妥協されないように、画素アレイのサイズは、増大され、レンズの焦点距離は、短縮され得る。
【００３４】
[0051]いくつかの実施形態では、フレームレートは、視野を横断する移動する流体の速度に依存し得る。たとえば、視野が１００ｍｍ／幅で、流体の最大速度が４０ｍｍ／ｓとすれば、約６０フレーム毎秒（ｆｐｓ）は、１２００ピクセル全体で約８ピクセルのボケをもたらし、これは画像分析に用いられ得る。
【００３５】
[0052]いくつかの実施形態では、カメラは、基板がカメラのＦＯＶ内にあるように、基板上の所定の距離（１２８）で配置され得る。ある実施形態では、カメラは、移動物体すなわち試薬および／または染料のひずみを防止するためにグローバルシャッタを有するエリアスキャンカメラであり得る。グローバルシャッタは、画像内の行ごとに沿って画素を掃引するとき、液滴領域をひずませことになるローリングシャッタよりも好適である。しかしながら、他のタイプのカメラが、他の実施形態で使用され得る。
【００３６】
[0053]基板上でカメラを位置決めする所定の距離は、カメラの分解能およびカメラのＦＯＶ内で撮影されることになる基板の数に依存し得る。ある実施形態では、所定の距離は、約３８．１ｃｍ〜約５０．８ｃｍ（約１５〜２０インチ）であり得る。たとえば、所定の距離は、３つの基板を撮影するために４９．５３ｃｍ（１９．５インチ）であり得る。しかしながら、他の所定の距離が、他の実施形態で使用され得る。別の実施形態では、３つ以上の基板が撮影されることになる場合、カメラは、同様の画像品質を維持するために、増大されたサイズの画素アレイと、短縮された焦点距離のレンズとを使用し得る。他の実施形態では、カメラは、さらに詳細に基板の画像を撮影するために、より高い分解能、すなわちより低い画素毎の距離、およびより小さい視野を有するレンズを有し得る。
【００３７】
[0054]いくつかの実施形態では、試薬の流体境界（１０７）は、組織試料が色を有するときでも、背景から容易に識別され得るように、照明される。流体境界（１０７）を照らすために、組織のスライドガラス（１０２）の、後部近傍に配置された１つの光源（１２０）、および前部近傍に配置された他の光源（１１０）の２つの光源が使用され得る。いくつかの実施形態では、前部光源は、ＬＥＤ発光体であってもよく、後部光源は、別のＬＥＤ発光体であってもよい。いくつかの実施形態では、光源は、基板を照明するために使用される白色光を各々生成してもよい。いくつかの実施形態では、前部光源（１１０）および／または後部光源（１２０）は、照明固定具と共に使用する照明装置に組み立てられ得る。一例として、光源は、白熱電球、発光ダイオード（ＬＥＤ）、または蛍光灯によって実装されてもよい。しかし、他の光源のタイプおよび光のタイプも、他の実施形態では可能である。図１の実施形態に示すように、前部光源（１１０）は、カメラの視野内に配置され、光（１１１）を基板の１つの側面の方に向け得て、一方、後部光源（１２１）は、カメラの視野外に配置され、第２の光（１２１）を基板の他方の側面の方に向け得る。他の実施形態では、前部光源および後部光源のうち１つまたは両方が、カメラの視野の内側または外側のどちらかであり得る。
【００３８】
[0055]代替の実施形態では、撮像の図式は、分析プロセスの監視に使用され得る。より高い分解能を有するカメラおよびより小さい視野を有するレンズが、より良好に詳細に組織領域を撮像するために使用され得る。有利なことに、前部光源および後部光源は、基板に均一な照明を提供するために基板の周りに配置され得て、それにより、結果は照明によって偏らされたり、ゆがめられたりしない。
【００３９】
[0056]ある実施形態では、後部光源（１２０）は、流体内の流体境界（１０７）または縁部を明るくする暗視野撮像を提供するためにカメラの視野外に配置され得て、その結果、流体の縁部または境界（１０７）は、暗い通常の背景に対して強いコントラストを有する。さらに、暗視野撮像を用いることによって、影または光源を遮断するピペットからの妨害などのいくつかの他の問題が、さらに解決され得る。代替の実施形態では、明視野撮像が、カメラ（１２５）の視野内に前部光源（１１０）を配置することによる撮像システムによって使用され得る。
【００４０】
[0057]図２に示すように別の実施形態では、開示されるシステムは、基板とカバーガラスとの間の空間内の流体体積（１０９）を追跡するためにリアルタイム補給システム（ＲＴＲＳ）を提供し、もしあるなら流体交換システム（２８０）によって、試料に追加されるまたはそこから除去される流体（２７９）の量を決定するように構成される。ＲＴＲＳは、撮像システム（１００）、画像分析装置（２４０）、体積概算装置（２６０）、ディスペンサ体積計算装置（２７０）、流体交換システム（２８０）、およびたとえば染色カセット（５０）および流体を転がすカバーガラス、またはＡＲＣローラ（１３０）などの流体動作機構からの位置信号（１３７）を使用し得る。
【００４１】
[0058]図２でさらに示すように、リアルタイム補給システム（ＲＴＲＳ）は、メモリ（２１０）、プロセッサ（２００）、カメラおよび照明を備える撮像システム（１００）、染色カセット（５０）、ならびに補給ディスペンサ（２８０）を備える。撮像システム（１００）は、基板の画像情報（１２７）をプロセッサ（２００）内に給送し得る。染色カセット（５０）が、測定値を採取する時刻のプロセッサへの信号（１３７）を送信するとき、プロセッサ（２００）は、フィードバック制御ループを形成して、フレームチェックを実行し、ディスペンサ体積計算装置（２７０）から染色カセット（５０）への補給量（２７９）を提案し得る。一例として、ＭＡＴＬＡＢプログラムは、提案された値を、フィードバック概念を示すようにリアルタイムでユーザインタフェースに出力し得る。別の実施形態では、ディスペンサ体積計算装置（２７０）からの補給量（２７９）は、ユーザインタフェースへ提供され得て、ユーザはその後、試薬および／または染料を試料に提供するために流体交換システム（２８０）を制御することができる。別法として、フィードバック制御ループは、補給量（２７９）を送達するために、補給ディスペンサ（２８０）を染色カセット（５０）に自動的に向け得る。
【００４２】
[0059]プロセッサ（２００）は、カメラ（１２５）から取得または撮影された画像を受信するためにカメラに動作可能に接続され得る。プロセッサは、染色カセット（５０）内の流体（１３７）の位置を示すデジタル信号を受信するために、流体動作機構に付随するデジタルＩ／Ｏ装置に動作可能にさらに接続され得る。ある実施形態では、カメラからの画像は、首尾一貫した結果のために、同一の流体位置で撮影され、そして分析され得る。別の実施形態では、画像分析は、カラーまたはグレースケール画像のいずれでも実行され得る。
【００４３】
[0060]いくつかの実施形態では、メモリ（２１０）は、プロセッサ（２００）に、試料と共に用いられる試薬および／または染料などの流体量を決定するために体積（３６０）を概算することと、画像（３４０）を分析することと、どれだけの試薬および／または染料を、概算体積からの情報に基づいて流体交換システムを用いて試料へ適用するかを決定するために補給体積（３８０）を計算することとを含む、図５に示した動作を実行させる命令を含み得る。命令は、ソフトウェア、ハードウェア、ファームウェア、または任意のその組合せで実施され得る。たとえば、命令は、ソフトウェアで実施され、メモリ内に記憶される。ソフトウェアで実施されるとき、命令は、命令を取り出し、実行する命令実行装置によってまたはそれに関連して使用するための非一時的コンピュータ可読媒体上に、記憶され移送され得る。
【００４４】
[0061]一例として、プロセッサは、中央処理装置（ＣＰＵ）またはデジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）を含み得る。バスなどのローカルインタフェースが、プロセッサと通信し得る。そのうえ、キーパッド、キーボード、またはマウスなどの入力インタフェースが、ユーザからのデータを入力するために使用され得て、プリンタ、モニタ、液晶表示装置（ＬＣＤ）、または他の表示装置などの出力インタフェースが、ユーザへデータを出力するために使用され得る。また、通信インタフェースが、前部光源、後部光源、カメラ、流体動作機構、および流体交換システムを有する１つまたは複数のネットワークを通じて、データを交換するために使用され得る。
【００４５】
[0062]ＲＴＲＳによって用いられる境界検出方法は、境界検出（３４１）用の流体（対象）の特徴と異なる特徴を使用し得る。具体的な実施形態では、動作に基づいた前景検出が、透明な流体の境界を検知するために使用され得て、色しきい値検出が、着色された流体の境界を検知するために使用され得る。これらの方法の頑強性により、それらは、組織色変化、任意の組織形態の存在などの多様な条件で機能することが可能になる。
【００４６】
[0063]いくつかの実施形態では、対象の最も明確な特徴が、検出に使用される。たとえば、動作は、それが視野内でスライドガラスに対して移動する唯一の部品であるため、透明な流体の最も明確な特徴である。アルゴリズムは、スライドガラス上の透明な流体の境界を検知するように適合され得る。たとえば、混合ガウス分布モデルの前景検出が、用いられ得る。混合ガウス分布モデルの前景検出算アルゴリズムでは、液滴の左右に配置された２つの流体液滴の境界が、流体体積を計算するために抽出され得る。モデル用パラメータは、実験により選択され、試験は、図３Ａおよび３Ｂによって明白にされたように、信頼できる結果を作成した。図３Ａは、透明な流体の撮影画像を示し、図３Ｂｂは、前景検出後のその図３Ａの撮影画像を示す。動作に基づいた前景検出方法は、縁どられた透明な流体の識別には好適であるが、この方法を用いたＨＴＸなどの着色された試薬の検出は、図３Ｅｅおよび３Ｆに示すように、問題があることを証明している。図３Ｅは、着色された試薬の撮影画像を示し、図３Ｆは、前景検出後のその図３Ｅの撮影画像を示す。視野内での移動領域が非常に広いので、プログラムがフレームの背景を識別することは、困難になる。
【００４７】
[0064]染料または着色された試薬の縁部または境界を識別するために、色しきい値検出算アルゴリズムは、流体の明確な色特徴により、着色された試薬用に好適である。組織が、染色処理中に試薬と同様の色に染められるが、試薬の強度は、さらにより強く、それゆえ色しきい値検出方法は、試薬を染料された組織から識別し得る。検出を実行するために、画像は、色相、彩度、および明度（ＨＳＶ）カラーマップに転送される。適切な色相範囲が試薬の領域を抽出するために選択される。ヘマトキシリンの一例を図３Ｃｃおよび３Ｄに示す。図３Ｃは、着色された試薬の撮影画像を示し、図３Ｄは、前景検出後のその図３Ｃの撮影画像を示す。色しきい値前景検出アルゴリズムでは、試薬の領域が抽出され得て、流体体積は、抽出された領域から計算され得る。
【００４８】
[0065]カバーガラスおよび基板が互いに対して角度式に動かされる他の実施形態（ＵＳ７４７６５４３、ＵＳ８４５４９０８、およびＷＯ２００６１１６０３９で開示されたシステムなどの）では、流体本体の一方の境界は、固定位置にあり得て、ただ１つの流体本体の境界が、開示された方法およびシステムで使用する流体幅を決定するために監視される必要があり得る。
【００４９】
[0066]通常、補給は、体積計算が透明な流体境界を用いた良好な画像を使用して決定されるとき、最も正確である。染色プロセスでは、体積概算の精度に影響を及ぼし、それにより補給量の計算に影響を及ぼし得る問題に遭遇し得る。たとえば、図４Ａは、視野を通過し動くピペットアームを有するフレームの前景検出結果の画像である。このフレームは、過大な計算体積をもたらし得て、補給の提案に使用されるべきでない。本問題を克服するために、フレーム内の明画素の比が、フレームチェックの一部として計算され、明画素が、通常予測されるまたは「暗い」画素に対してフレームの約５０％以上存在するとき、補給が提案されないことを保証する。すなわち、受け入れ可能なフレームは、通常予測されるまたは「暗い」画素に対して約５０％未満の過大な明画素を有する。通常予測されるまたは「暗い」画素が、画像が撮影される際にフレームを通過して動くピペットアームなどの物体からの妨害がないとき、分析中の試料の画素強度に対応し得る画素である。
【００５０】
[0067]別の実施形態では、正確な体積計算は、流体境界の一方の部分が視野内にない場合、見出され得ない。図４Ｂは、流体境界の一部が視野内にない場合の、前景検出の結果画像の一例である。たとえば、流体境界は、大きな体積（２００μＬ以上）がより高速度（１００ｍｍ／ｓより大きい）で転がるとき、範囲外に、すなわち視野内にない可能性がある。さらなる実施形態では、前景分析が正しい流体境界をもたらすことができないとき、正確な体積計算は、見出し得ない。これらの場合、ＲＴＲＳは、先行の体積を現在の体積と比較し得る。２つの体積間に大きな差がある場合、システムは、現在の体積を決定するために後続の測定を用い得る。すなわち、２つの計算体積間に大きな差があるとき、フレームチェック（３７０）は、体積測定を却下し、新しい画像を取得するプロセスに戻り得る。
【００５１】
[0068]図５を参照すると、ＲＴＲＳプロセスは、画像およびＳＰＳデジタル信号出力を取得するために、カメラおよびデジタル入力／出力（Ｉ／Ｏ）装置に接続する。画像および信号を用いて、ＲＴＲＳプログラムは、適切な補給体積を提案するために、画像分析、エラーチェック、および体積計算を実行する。プロセスの開始時点で、カメラおよびＩ／Ｏ装置段取りが開始される（３１０、３２０）。露出、明るさ、およびゲインなどのカメラのパラメータが、このステップで設定される。カメラおよびＩ／Ｏ装置が設定された後、プロセスは、カメラからの画像取得（３３０）のループへと進み、そして取得された画像の分析（３４０）へと進む。前景検出アルゴリズムは、流体境界を識別するために、画像分析装置によって撮影画像へ適用され得る（３４１）。ある実施形態では、画像分析装置は、機械学習によって画像背景を識別するために画像または動画と共に継続的に提供され得る。画像分析装置は、処理される画像から任意のノイズを除去し得る（３４２）。体積計算は、Ｉ／Ｏ装置が、適切なＡＲＣ位置、すなわち適切なカバーガラス位置を示す信号を受信するとき、流体測定値を作成するためになされ得る（３５０）。適切なＩ／Ｏ信号が受信されなかったとき、プロセスは、別の画像を取得することになる。
【００５２】
[0069]ある実施形態では、試薬および／または染料の体積は、システム（または「ＡＲＣ」）図形および測定された流体幅（１０８）すなわち検出された流体境界間の距離に基づいて、計算され得る（３６０）。ある実施形態では、計算体積は、体積計算に使用される前提および／または計算精度に影響を及ぼし得る他の可能性のある要素を打ち消すために、較正される必要があり得る。フレームチェック（３７０）は、次に、フレームおよび対応する体積計算が受け入れ可能であるか否かの判定を実行する。フレームチェックにより、過大な体積変化およびピペットのＦＯＶ遮断などの他の異常なフレーム状況を有するフレームを除去することによるエラーチェックを可能にする。フレームチェックが不良フレームを識別する場合、すなわちフレームと関連したエラーまたは異常がある場合、プロセスは、画像取得へと戻る。体積計算が受け入れ可能でない場合、すなわち体積計算と関連したエラーまたは異常がある場合、プロセスは、別の画像取得へと戻る。他の方法では、補給量は、ディスペンサ体積計算装置によって計算され（３８０）、次のループが、別の画像を取得し始める。
【００５３】
[0070]いくつかの実施形態では、ＡＲＣ位置は、測定点を識別するためにフレームごとに取得され得る。ＡＲＣ位置は、ステップモータ位置によって決定される。図６に示すように、ステップモータ位置は、流体がスライドガラスの縁部付近にあるとき、中心から＋４５００および−４５００付近にある。理想的には、測定値は、ＡＲＣ位置０が最適の測定点を意味する、スライドガラスの中心で取得されるべきである。しかしながら、いくつかの実施形態では、流体は、動作中ＡＲＣの背後に引っ張られており、それゆえ、ＡＲＣ位置が＋４５００からの場合、−３００付近のＡＲＣ位置が測定点として採られるべきである。ＲＴＲＳは、ＡＲＣ位置を周期的にチェックし得るので、ＳＰＳは、ＡＲＣ位置が−３００と＋４５００との間にある場合は、信号１に、他の位置にある場合は、信号０に調整される。したがって、信号が記録され、先行の信号が１であり、現在の信号が０になる場合、ＡＲＣ位置が＋４５００から動いており、体積計算およびフレームチェックを実行するためにＲＴＲＳに信号を出す測定点である−３００を横切っている。
【００５４】
[0071]図６に示すように、カバーガラス位置は、Ｉ／Ｏ信号によって提供されるように、画像を毎回取得され得て、またはフレームが、基板とカバーガラスとの間の空間内の試薬および／または染料の位置を識別するために取得される。カバーガラス位置は、カバーガラスを動かしそれにより試薬および／または染料を試料上で動かす、流体動作機構内のステップモータ位置によって決定され得る。ある実施形態では、ステップモータ位置および対応するカバーガラス位置は、中心位置から、スライドガラス（図６Ｂを参照のこと）の右端の試薬および／または染料に対応する一方の端部位置を示す＋４５００付近、ならびにスライドガラス（図６Ａを参照のこと）の左端の試薬および／または染料に対応するもう一方の端部位置を示す−４５００付近にあり得る。測定を行うための適切なカバーガラス位置は、試薬および／または染料が、スライドガラスの中心に配置されているときであり得る。図６Ｃは、試薬および／または染料が、図６Ｃで右から左へ動くときの中心位置に対応するカバーガラス位置０にある、試薬および／または染料を示し、このとき、カバーガラス位置は、スライドガラスの中心にある試薬および／または染料に対応しない。試薬および／または染料が、カバーガラスと、基板との間の空間内を動くので、適切なカバーガラス位置は、移動する方向ならびに試薬および／または染料の粘性によって決まる、基板の中心（カバーガラス位置０に対応する）に対する所定の場所にあり得る。別の実施形態では、図６ｄに示すように、試薬および／または染料は、測定点にあり、すなわち、試薬および／または染料は、試薬および／または染料が基板との間の空間内を右から左へ動くとき、スライドガラスの中心、カバーガラス位置−３００にある。図６Ａ〜６Ｄで示した実施形態は、カバーガラス位置に対する試薬および／または染料の位置を示すために使用される概略図であり、構成要素の相対的サイズに関するいかなる詳細も提供することは意図されない。
【００５５】
[0072]ある実施形態では、ＲＴＲＳは、カバーガラス位置を周期的にチェックし得る。Ｉ／Ｏ信号を生成する流体動作機構の検出機構は、カバーガラスが、カバーガラス位置＋４５００から移動するとき、カバーガラス位置−３００を通過するか否かを判定し得る。検出機構は、カバーガラス位置が−３００と＋４５００との間にある場合、Ｉ／Ｏ信号を「１」に調整し、他の位置では、Ｉ／Ｏ信号を「０」に調整し得る。ＲＴＲＳは、Ｉ／Ｏ信号を記録または記憶し得て、先行のＩ／Ｏ信号が１に等しく、目下のＩ／Ｏ信号が０に変わった場合、このことは、試薬および／または染料が、＋４５００のカバーガラス位置から移動し、測定に適切な位置にある試薬および／または染料に対応する−３００のカバーガラス位置をまさに横切っていることを示し得る。別の実施形態では、検出機構は、カバーガラス位置に対応する信号を送信し得て、ＲＴＲＳは、検出機構からの信号を評価して、信号からの対応するカバーガラス位置が、カバーガラス位置の所定の場所の所定の範囲内にあるか否かを判断し得る。たとえば、ＲＴＲＳは、試薬および／または染料が基板との間の空間内を右から左へ動くとき、カバーガラス位置がおよそ−２００と−４００との間にある場合、正のＩ／Ｏ信号を示し得る。
【００５６】
[0073]上述のように、試薬および／または染料は、カバーガラス位置の中心の背後に引っ張られている可能性があるので、測定は、基板位置の中心点からわずかに離れて行われるべきである。たとえば、流体動作機構の中心点（１３８）にある画像を取得するとき、試薬および／または染料が右に動いている場合、試薬および／または染料の大部分は、中心点の左側にあり、試薬および／または染料が左に動いている場合、試薬および／または染料の大部分は、中心点の右側にあり得る。図７に示すように、ＡＲＣの中心点（１３８）が黒線で印をつけられているとき、異なる流体位置が観察され得て、一方、画像はＡＲＣ動作の中心点で取得される。図７Ａおよび７Ｂでは、流体が右に動くとき背後に引っ張られているので、流体本体は、中心点（１３８）の左側にあることを見出すことができる。同様に、図７Ｃおよび７Ｄに示すように、流体が左へ戻るとき、同一の現象が見出し得る。
【００５７】
[0074]いくつかの実施形態では、ＲＴＲＳが一定のカバーガラス位置で画像を取得し得るので、ＲＴＲＳは、どのように試薬および／または染料が、異なる転がり速度および試薬体積で移動するのか、どのように異なる粘性を有する異なる試薬が、転がる動作中に振る舞うのかを理解するために、試薬および／または染料の動作と、流体動作機構との間の関係を特徴づけるために使用され得る。
【００５８】
[0075]ある実施形態では、ＲＴＲＳは、画像取得、カバーガラス位置取得、および画像分析を約０．０６秒内で実行することができ、およそ毎秒１６フレームのフレームレートを有し得る。処理時間は、画像分析を実行するために用いられるプログラミング言語、および画像分析を実行するために用いられるコンピュータの性能に基づき得る。処理時間の改善は、より効果的なプログラミング言語またはより良好に実行するコンピュータを使用することによって、獲得され得る。
【００５９】
[0076]図８の例示的な実施形態に示すように、ＲＴＲＳのインタフェースは、４つのパネルを備える。上段左側のパネルは、カメラによって取得された目下の画像を示す。上段右側のパネルは、ヘマトキシリンの場合の、混合ガウス分布モデルまたは色しきい値方法を用いて検出された前景を示す。下段左側のパネルは、前景に基づいて計算された目下の体積を示す。測定体積の低下が、観察され得る。たとえば、１２０秒の転がしの後、８μＬの試薬が蒸発した。下段右側のパネルは、ユーザ入力の目標体積、オフセット体積、および測定体積に基づいて示唆される補給を示す。
【００６０】
[0077]流体領域での気泡形成は、測定される流体幅を増大させ、ＲＴＲＳに目下の体積を過大評価させることになる。現象は、カバーガラスと用いられるとき、抗体希釈液などの試薬内で発生し得る。したがって、気泡を除去または補償する方法が必要である。ある実施形態では、流体内部の気泡の円形状が、気泡の存在を検出するために用いられ、次に気泡の補償が実行され得る。円形検出方式は、取得される画像の検出される前景内の任意の気泡を識別するために用いられ得る。例示的な円形検出方式は、画像内の気泡を識別するためにハフ変換に基づき得る。画像内の気泡数を計算し、気泡の体積補償を決定することによって、試薬および／または染料の体積は、試薬および／または染料内の気泡の存在下でより正確に測定されることが可能になる。
【００６１】
[0078]図９に示すように、検出される気泡は、円を描く。図９は、さらに示す。気泡がない場合（目下の体積）と、気泡補償がある場合（補償ありの目下の体積）との測定蒸発速度の比較を示す。結果は、１分の転がし操作後にわずか４μＬほどの差が見られた。補償なしで、目下の体積は、約１５１μＬから約１５６μＬへの増加として計算され得て、一方気泡補償ありでは、目下の体積は、１４１μＬから１３４μＬへと減少することになると計算される。気泡補償は、図８の目下の体積の同様の傾向に追随し、それは、予測されたように、蒸発により体積損失を示す。
【００６２】
[0079]いくつかの実施形態は、ＡＲＣ図形およびが測定される流体幅に基づいて体積を概算するために一次近似を提供する体積計算方法を使用する。この手法は、より良好な体積評価のための検量線を必要とする。検量線を導出するために、７０から２５０μＬの異なる体積が手動で分配され、転がしプロセスで各体積少なくとも５回ずつテストされた。散布図に既知の分配された体積（２０９）と、計算体積（１０９）とをプロットすることによる。検量線が、Ｒ２＝０．９８７１を有する検量線図１０に示すように見出され得る。さらなる実施形態では、改善された検量線が、検量線のより高い次元を用いて導出され得る。
【００６３】
[0080]
【実施例１】
【００６４】
[0081]以下は、振動、ピペットによる視野遮断などのシステム妨害を伴う全負荷状態下で試験されるＲＴＲＳの非限定的な実施例である。扁桃腺の試料でのＣＤ−２０染色処理が実行され、記録された。結果は、検出システムが流体の領域／縁部を識別できるか否かによって評価された。
【００６５】
[0082]染色分析での６つの処理が、ＲＴＲＳを試験するために代表的な事例として列挙された。これらの６つの事例は全て、補給を要するＡＲＣシステムを用いて実行された目下の分析プロセスを表す。事例毎に、目標体積が、ピペットによって１０回手動で分配され、最初の５データ点が、測定体積とみなされ、事例毎に総数で５０のデータポイントとなる。蒸発が５データポイント後に効力を生じ始めるので、最初の５ポイントのみが選択された。事例毎に５０データポイントを収集した後、母集団に基づく平均値および標準偏差が、性能を評価するために計算された。未処理のデータが、測定値の分布を示すために四角点を用いてさらに表示されている。
【００６６】
[0083]扁桃腺の試料に関する全装填されたＣＤ−２０染色プロセスが記録され、前景検出を試験するために使用された。図１１に示すように、前景検出がカメラの振動および組織色の変化に耐性を示めすことが見出された。たとえば、図１１Ｂは、組織が色を変化させていく、すなわち図１１Ａの組織からさらに染色されていくことを示す。明視野撮像内の流体縁部は、流体縁部が組織の背景に溶け込み得るので、組織がより暗い色になるとき観察することが困難であった。この問題は、縁部を明るくするために暗視野撮像を用いることによって解決され、その結果、縁部は、暗い通常の背景に対して強いコントラストを有した。撮像方法を変更することによって、他のＡＲＣシステムの陰による干渉および光源を遮断するピペットなどのいくつかの他の問題がさらに解決される。ピペット動作は、視野を遮断するためにさらに観察され、このことは、分析中不回避の処理である。したがって、それが発生することを防止するのではなく、過剰な明画素が、フレームに入り込む大きな物体を多くの場合表すので、視野内に存在するか否かを確認するために、追加の機能がフレームチェックプログラムに追加された。
【００６７】
[0084]下の表１に示すように、測定体積は、目標体積に標準偏差±１．５％で一致する。このパーセンテージをマイクロリットルに逆変換すると、性能は、±１０μＬへの変換を果たす。測定体積の分布は、図１２で見ることができる。２００μＬ付近の目標体積での分析は、より広いデータの広がりをもたらす。異なる試薬は、異なる粘性を有するので、種々のＡＲＣ位置範囲が、異なる試薬に使用されるべきであることが分かる。表内の位置範囲は、流体領域を対象領域の中央で撮影する最良の範囲を示す。最終的に、検量線が、計算体積と実際の体積との間の傾きを描写するために導出された。多様な較正定数が、各目標体積の周りの誤差を最小化するために使用された。
【００６８】
[0085]
【００６９】
【表１】
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【００７０】
[0086]前述したように、暗視野撮像により、物体の縁部が検出のために明るくされることが可能になる。図１３Ａは、照明角度とカメラ位置との間の関係を示し、図１３Ｂは、暗視野撮像内で明るくされた縁部を有する物体を示す。暗視野撮像と明視野撮像とによって取得された透明な流体の写真が、図１４で見られる。明視野撮像が、分析用の高品質画像を提供するが（図１４Ａおよび１４Ｂ）、流体境界の暗さは、標本が染色されたとき、分析中に課題をもたらす（図１４Ｅおよび１４Ｆ）。したがって、いくつかの開示された実施形態では、暗視野撮像が、ＲＴＲＳに利用される（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。
【００７１】
[0087]
【実施例２】
【００７２】
[0088]いくつかの一般に用いられる縁部検出器アルゴリズムが利用可能である。これらのアルゴリズムは、Ｃａｎｎｙ、Ｌｏｇ、Ｐｒｅｗｉｔｔ、Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｓｏｂｅｌ、およびＺｅｒｏ  Ｃｒｏｓｓを含む。各エッジ検出器は、フレーム内の縁部を識別するためにそれ独自の数学モデルを使用する。図１５で示したフレームは、その検出アルゴリズムを使用した縁部検出の例として使用される。
【００７３】
[0089]ハフ線検出を使用する縁部検出は、ＲＴＲＳが異なる組織背景および撮像条件に直面するため、理想的方法とは見られなかった。組織形態は、一旦染色された後、流体縁部検出を悪化させ得る。さらに、異なる縁部検出方法は、異なる感度を有し得る。たとえば、弱い検知方法は、境界の片側を失敗し得て、強い検知方法は、背景内の過剰に多くの不規則な縁部を検知し、流体境界を識別困難にさせ得る。
【００７４】
[0090]多様なアルゴリズムを使用する図１５Ａの縁部検出を図１６に示す。ＳｏｂｅｌおよびＰｒｅｗｉｔｔ検出器は、ヘマトキシリンの縁部をプロットすることができる。しかしながら、染料済み組織の境界も同様に観察可能である。このことは、縁部識別の歩留まりに影響を及ぼす。強い検出器は、Ｃａｎｎｙ、Ｌｏｇ、およびＺｅｒｏ  Ｃｒｏｓｓの事例で示したように、過剰なノイズをプロットし得る。弱い検出器は、流体の縁部を失敗し得る。多様なアルゴリズムを使用する図１５Ｂの縁部検出を図１７に示す。ＳｏｂｅｌおよびＰｒｅｗｉｔｔ検出器は、流体縁部を識別することがさらにできる。Ｒｏｂｅｒｔ検出器によって、流体境界の一部が明確でない結果になる。Ｃａｎｎｙ、Ｌｏｇ、およびＺｅｒｏ  Ｃｒｏｓｓ検出器によって、組織から過大なノイズ（またはパターン）がもたらされ、それが縁部識別を困難にする。
【００７５】
[0091]染色システムは、ＲＴＲＳと共存できるようにするために、列パターンを形成しないヒータを有することが好ましい。列パターンを有するヒータは、図１８に示すように、性能を妥協し画像処理に影響を及ぼし得る。この問題は、着色された試薬が染料済み組織上に適用されるとき、背景内の列パターンによって生成される強いコントラストによって、より顕著になり得る。
【００７６】
[0092]コンピュータは通常、プロセッサ、オペレーティングシステム、システムメモリ、メモリ記憶装置、入出力制御装置、入出力機構、および表示機器などの周知の構成要素を含む。コンピュータの多くの可能な構成および構成要素が、存在し、キャッシュメモリ、データバックアップ装置、および多くの他の装置をさらに含み得ることを、当業者はさらに理解されたい。入力デバイスの例は、キーボード、カーソル制御装置（たとえば、マウス）、マイクロホン、スキャナ、などを含む。出力装置の例は、表示機器（たとえば、モニタまたはプロジェクタ）、スピーカ、プリンタ、ネットワークカード、などを含む。表示機器は、視覚的な情報を提供する表示機器を含み得て、この情報は通常、論理的かつ／または物理的に画素の配列として構成され得る。入力および出力インタフェースを提供する、種々の既知または将来のソフトウェアプログラムの任意のものを備え得る、インタフェース制御装置もまた含まれ得る。たとえば、インタフェースは、１つまたは複数の図形表現をユーザに提供する、一般に「グラフィカル・ユーザ・インタフェース」と呼ばれる（多くの場合ＧＵＩと呼ばれる）ものを含み得る。インタフェースは通常、当業者に知られる選択または入力の手段を使用して、ユーザ入力を受け取ることが可能になる。インタフェースは、タッチ画面であってもよい。同様のまたは代替の実施形態では、コンピュータ上のアプリケーションは、「コマンド・ライン・インタフェース」と呼ばれる（多くの場合ＣＬＩと呼ばれる）ものを含み得るインタフェースを利用し得る。ＣＬＩは通常、アプリケーションとユーザとの間の文字に基づく相互作用を提供する。通常、コマンド・ライン・インタフェースは、表示機器を介して文字ラインとして、出力を提供し、入力を受信する。たとえば、いくつかの実施態様は、当業者に知られるＵｎｉｘ  Ｓｈｅｌｌ、またはマイクロソフト社の．ＮＥＴ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋなどのオブジェクト指向型プログラミング・アーキテクチャを利用するマイクロソフト社のＷｉｎｄｏｗｓ  Ｐｏｗｅｒｓｈｅｌｌなどの「シェル」と呼ばれるものを含み得る。
【００７７】
[0093]インタフェースが１つまたは複数のＧＵＩ、ＣＬＩ、またはその組合せを含み得ることを当業者には理解されたい。プロセッサは、インテル社製のＣｅｌｅｒｏｎ、Ｃｏｒｅ、またはＰｅｎｔｉｕｍプロセッサ、サン・マイクロシステムズ社製のＳＰＡＲＣプロセッサ、ＡＭＤ社製のＡｔｈｌｏｎ、Ｓｅｍｐｒｏｎ、Ｐｈｅｎｏｍ、またはＯｐｔｅｒｏｎプロセッサなどの市販されているプロセッサ、あるいは入手可能なまたはこれから入手可能になる他のプロセッサのうちの１つであり得る。プロセッサのいくつかの実施形態は、マルチコアプロセッサというものを含み、かつ／またはシングルまたはマルチコア構成での並列処理技術を利用することが可能にされ得る。たとえば、マルチコア・アーキテクチャは通常、２つ以上のプロセッサ「実行コア」を備える。本実施例では、各実行コアは、マルチスレッドの並列実行を可能にする独立したプロセッサとして実行し得る。さらに、プロセッサは、一般に３２または６４ビットアーキテクチャと呼ばれるものに構成され得るか、現在知られるもしくは将来開発され得る他のアーキテクチャ構成であり得ることを、当業者は理解されたい。
【００７８】
[0094]プロセッサは通常、オペレーティングシステムを実行するが、それは、たとえばマイクロソフト社のＷｉｎｄｏｗｓ型のオペレーティングシステム、アップルコンピュータ社のＭａｃ  ＯＳ  Ｘオペレーティングシステム、多くの販売店またはオープンソースというものから入手可能なＵｎｉｘまたはＬｉｎｕｘ（登録商標）タイプのオペレーティングシステム、別のまたは将来のオペレーティングシステム、あるいはいくつかのその組合せであり得る、オペレーティングシステムは、よく知られている方法でファームウェアおよびハードウェアとインタフェースし、種々のプログラミング言語で記述され得る多様なコンピュータプログラムの機能を調整し実行するプロセッサを支援する。オペレーティングシステムは、通常プロセッサと共同で、コンピュータの他の構成要素の機能を調整し実行する。オペレーティングシステムは、全て周知の技術による、スケジューリング、入出力制御、ファイルおよびデータ管理、メモリ管理、ならびに通信の制御および関連処理をさらに提供する。
【００７９】
[0095]システムメモリは、所望の情報を記憶するために使用し得る、コンピュータによってアクセスされ得る、種々の周知のまたは将来のメモリ記憶装置の任意のものを含み得る。コンピュータ可読記憶媒体は、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュール、または他のデータなどの情報のストレージ用の任意の方法または技術で実装された、揮発性および不揮発性媒体、取り外し可能および取り外し不可能なメディアを含み得る。実施例は、任意の一般に入手可能な、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、電子的に消去可能なプログラマブル読み出し専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、内蔵ハードディスクまたはテープなどの磁気媒体、読出しおよび書込みコンパクトディスクなどの光学的媒体、あるいは他のメモリ記憶装置を含む。メモリ記憶装置は、コンパクトディスクドライブ、テープドライブ、取り外し可能なハードディスクドライブ、ＵＳＢまたはフラッシュドライブ、あるいはフロッピーディスクドライブを含む、種々の周知のまたは将来の装置の任意のものを含み得る。そのようなタイプのメモリ記憶装置は通常、個々に、コンパクトディスク、磁気テープ、取り外し可能なハードディスク、ＵＳＢまたはフラッシュドライブ、あるいはフロッピーディスクなどのプログラム記憶媒体から読み出し、かつ／またはそれに書き込む。これらのプログラム記憶媒体、または現在使用されている他のものもしくは後に開発されるもののうちの任意のものは、コンピュータプログラム製品と考えられ得る。上記の内容から分かるように、これらのプログラム記憶媒体は通常、コンピュータソフトウェアのプログラムおよび／またはデータを記憶する。コンピュータ制御ロジックとも呼ばれるコンピュータソフトウェアプログラムは通常、システムメモリ内に、および／またはメモリ記憶装置に結合されて使用されるプログラムストレージデバイス内に記憶される。いくつかの実施形態では、コンピュータプログラム製品は、その中に記憶された制御ロジック（プログラムコードを含むコンピュータソフトウェアプログラム）を有するコンピュータ使用可能媒体を備えると説明される。制御ロジックは、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに本明細書で説明した機能を実行させることになる。他の実施形態では、いくつかの機能は、たとえばハードウェア状態機械を使用するハードウェア内に主に実装される。本明細書で説明した機能を実行するハードウェア状態機械の実施態様は、当業者には明らかであろう。入出力制御装置は、人間または機械の、ローカルまたはリモートの、ユーザからの情報を受け入れて処理する任意の種々の周知の装置を含み得る。そのような装置は、たとえばモデムカード、無線カード、ネットワークインタフェースカード、音声カード、または任意の種々の周知の入力装置の他のタイプの制御装置を含む。出力制御装置は、人間または機械の、ローカルまたはリモートの、ユーザへの情報を提供する任意の種々の周知の表示装置の制御装置を含み得る。ここで説明する実施形態では、コンピュータの機能要素は、システムバスを介して互いに通信する。コンピュータのいくつかの実施形態は、ネットワークまたは他のタイプの遠隔通信を用いていくつかの機能要素と通信し得る。当業者には明白であるように、測定器制御および／またはデータ処理アプリケーションは、ソフトウェアで実装されている場合、システムメモリおよび／またはメモリ記憶装置内にロードされ、そこから実行され得る。測定器制御および／またはデータ処理のアプリケーションの全部または部分は、メモリ記憶装置の読み出し専用メモリまたは同様のデバイス内に存在し、そのようなデバイスは、先に測定器制御および／またはデータ処理のアプリケーションが、入出力制御装置を介してロードされていることを必要としない。測定器制御および／またはデータ処理のアプリケーション、またはその一部は、実行に有利なようにシステムメモリまたはキャッシュメモリあるいは両方へ、周知の方法でプロセッサによってロードされ得ることが、当業者には理解されよう。さらに、コンピュータは、システムメモリに記憶された、１つまたは複数のライブラリファイル、試験データファイル、およびインターネットクライアントを含み得る。たとえば、試験データは、検出された信号値、または合成試験またはプロセスによる１つまたは複数の配列決定に関連付けられた他の値などの、１つまたは複数の試験または分析に関するデータを含み得る。さらに、インターネットクライアントは、ネットワークを用いて、別のコンピュータ上のリモートサービスにアクセス可能にされたアプリケーションを含み得て、たとえば一般に「ウェブブラウザ」と呼ばれるものを備え得る。ここでの例では、いくつかの一般に利用されるウェブブラウザは、マイクロソフト社から入手可能なマイクロソフト・インターネット・エクスプローラ、モジラ社のモジラ・ファイアフォックス、アップルコンピュータ社のサファリ、グーグル社のグーグルクローム、または現在当技術分野で知られているもしくは将来開発されることになる他のタイプのウェブブラウザを含む。さらに、同様のまたは他の実施形態では、インターネットクライアントは、生物学のアプリケーション用のデータ処理アプリケーションなどの、ネットワークを介した遠隔情報へのアクセスが可能な特殊用途のソフトウェアアプリケーションを含み得る、またはその構成要素であり得る。
【００８０】
[0096]ネットワークは、当業者によく知られる多くの多様なタイプのネットワークの１つまたは複数を含み得る。たとえば、ネットワークは、一般にＴＣＰ／ＩＰプロトコル・スイートと呼ばれるものを通信に利用し得る、ローカルまたは広域ネットワークを含み得る。ネットワークは、インターネットと一般に呼ばれる、相互接続コンピュータネットワークの世界的システムを備えるネットワークを含み得る、または多様なイントラネットアーキテクチャをさらに含み得る。ネットワーク環境にいるユーザには、ハードウェアおよび／またはソフトウェアシステムへのおよびからの情報トラフィックを制御するために「ファイアウォール」と一般に呼ばれるもの（パケットフィルタまたは境界保護装置と呼ばれる場合もある）を利用することを好み得るユーザもいることが、当業者には理解されよう。たとえば、ファイアウォールは、ハードウェアもしくはソフトウェア構成要素またはいくつかのその組合せを備え得て、たとえばネットワーク管理者などのように、ユーザによって導入されるセキュリティポリシーを強化するように通常設計される。
【００８１】
[0097]本明細書で使用されるとき、用語「約」は、参照数のプラスマイナス１０％を示す。
[0098]多様な変形例が当業者には、本明細書で説明したそれらの実施形態に加えて、前述の記述から明らかになるであろう。そのような変形例は、添付の請求項の範囲に含まれることがさらに意図されている。本出願で引用された各参照は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８２】
[0099]請求項で引用される参照番号は、例示であり、特許局による審査を容易にするためだけのものであり、何ら限定しない。いくつかの実施形態では、本特許出願書類内で提示された図は、角度、寸法の比、などを含めて、縮尺を合わせて描かれている。いくつかの実施形態では、図は単なる代表物であり、請求項は、図の寸法によって限定されない。いくつかの実施形態では、語句「備える」または「含む」を用いた本明細書での説明は、「から成る」としてさらに説明され得て、そのように、語句「から成る」を用いた１つまたは複数の実施形態を請求するための記述された説明要件は、満足される。
【００８３】
参考文献
[00100]Ｐ．Ｋａｅｗｔｒａｋｕｌｐｏｎｇ、Ｒ．Ｂｏｗｄｅｎ著「Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｓｈａｄｏｗ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、Ｉｎ  Ｐｒｏｃ．２ｎｄＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｖｉｄｅｏ  Ｂａｓｅｄ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＶＢＳ０１、ＶＩＤＥＯ  ＢＡＳＥ  ＳＵＲＶＥＩＬＬＡＮＣＥ  ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｃｏｍｐｕｔｅ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（２００１年９月）。
【００８４】
[00101]Ｓｔａｕｆｆｅｒ，Ｃ．およびＧｒｉｍｓｏｎ，Ｗ．Ｅ．Ｌ．，、Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、ＩＥＥＥ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ、第２巻（１９９９年８月５日）、２２４６〜２２５２ページ、第２巻。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【国際調査報告】
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