(57)【要約】  本発明は全般的には新規結合性分子、特に抗体、ならびにそれを含む組成物およびキットに関する。該結合性分子はヒト第ＸＩ因子に結合可能であり、したがって、止血を損なうことなく血栓症を抑制するのに特に有用であると想定される。したがって、本発明で提供する結合性分子、組成物およびキットは、とりわけ、血栓症関連疾患および状態の治療を意図したものである。更に、本発明の結合性分子をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび該ポリヌクレオチドを製造するための宿主細胞を本発明で提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列ＫＡＳＱＳＶＬＹＳＧＤＮＹＬＮ（配列番号８）を含む軽鎖のＣＤＲ１、
（ｂ）配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号９）を含む軽鎖のＣＤＲ２、
（ｃ）配列ＱＱＹＮＧＤＰＷＴ（配列番号１０）を含む軽鎖のＣＤＲ３、
（ｄ）配列ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１１）を含む重鎖のＣＤＲ１、
（ｅ）配列ＨＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１２）を含む重鎖のＣＤＲ２、および
（ｆ）配列ＩＲＳＳＶＹＡＨＹＹＧＭＤＹ（配列番号１３）を含む重鎖のＣＤＲ３
を含む、ヒト第ＸＩ因子および／またはヒト第ＸＩａ因子に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
配列番号１７に示されているＶＬ領域を含む、請求項１記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
該モノクローナル抗体が、配列番号１８に示されているＶＨ領域を含む、前記請求項のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
該モノクローナル抗体が、配列番号１７に示されているＶＬ領域と、配列番号１８に示されているＶＨ領域とを含む、前記請求項のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
該モノクローナル抗体が、配列番号２７に示されている軽鎖を含む、前記請求項のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
該モノクローナル抗体が、配列番号２８に示されている重鎖を含む、前記請求項のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
該モノクローナル抗体が、配列番号２７に示されている軽鎖と、配列番号２８に示されている重鎖とを含む、前記請求項のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
該モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
該モノクローナル抗体がＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、前記請求項のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１項記載のベクターおよび／または請求項１０記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの発現を可能にする条件下、請求項１２記載の宿主細胞を培養し、所望により、産生された抗体またはその抗原結合性フラグメントを培養から回収することを含む、請求項１〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、請求項１３記載の製造方法により製造されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、請求項１０記載のポリヌクレオチド、請求項１１記載のベクターおよび／または請求項１２記載の宿主細胞と、所望により、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントと、所望により、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
１以上の追加的な活性物質を更に含む、請求項１４または１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
医薬としての使用のための、請求項１〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、請求項１３記載の製造方法により製造されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、請求項１０記載のポリヌクレオチド、請求項１１記載のベクター、請求項１２記載の宿主細胞、または請求項１４〜１６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１８】
血栓性もしくは血栓塞栓性障害および／または血栓性もしくは血栓塞栓性合併症の治療および／または予防における使用のための、請求項１〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、請求項１３記載の製造方法により製造されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、請求項１０記載のポリヌクレオチド、請求項１１記載のベクター、請求項１２記載の宿主細胞、または請求項１４〜１６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、請求項１３記載の製造方法により製造されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、請求項１０記載のポリヌクレオチド、請求項１１記載のベクター、請求項１２記載の宿主細胞、または請求項１４〜１６のいずれか１項記載の医薬組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は第ＸＩ因子に対する新規抗体およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
静脈血栓症および動脈血栓症の両方を含む血栓塞栓性障害は全世界における罹患および死亡の主要原因である。それらは正常な血液凝固（止血）の調節不全によって引き起こされ、これはフィブリンからの血餅（血栓）の異常形成をもたらし、最終的には組織虚血、そして場合によっては血栓からの血餅断片の移動および移行による塞栓形成をもたらす。
【０００３】
正常な状況下では、止血は、血小板活性化およびフィブリン形成を誘導することによって血管損傷部位からの失血を防ぐ極めて重要なメカニズムである。メカニズムレベルでは、止血は２段階で進行する。一次止血の間に、血小板は外傷部位に付着して活性化され、最終的に、互いに結合することによって凝集して血小板血栓を形成する。血小板血栓の形成は二次止血［血管壁における裂け目を塞ぐ安定な血餅を形成させるためにフィブリノーゲンをフィブリンに変換するプロテアーゼであるトロンビンの形成を最終的にもたらす凝固タンパク質を含む一連の酵素反応（血液凝固系とも称される）］中に増強され、安定化される。
【０００４】
１９６４年に、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ（Ｎａｔｕｒｅ．１９６４  Ｍａｙ  ２；２０２：４９８−９）は血液凝固の過程に関するカスケード仮説を導入した。それ以来、インビボでの血液凝固の機能の知見は増大した。過去数年において、凝固を開始させ、共通の経路に収束し、最終的にトロンビン生成およびフィブリン沈着を招く２つの異なる経路の学説、すなわち、いわゆる、外因性経路および内因性経路が修正された。
【０００５】
現在のモデルにおいては、凝固の開始は、血漿プロテアーゼ活性化第ＶＩＩ因子が組織因子（ＴＦ）と接触し、これにより組織因子との複合体を形成する際に生じる。この組織因子−ＦＶＩＩａ複合体はチモーゲンＦＸをその活性形態ＦＸａへと活性化し、これが今度は、補因子ＦＶａの存在下、プロトロンビン（凝固第ＩＩ因子）を切断してトロンビン（ＩＩａ）を形成する。そして、凝固における中心的作用因子であるトロンビンはフィブリノーゲンからフィブリンへの変換を触媒しうる。また、トロンビンは、血小板により発現される特異的受容体を活性化し、これは血小板の活性化を引き起こす。活性化された血小板はフィブリンと共に血餅形成に不可欠であり、したがって、正常な止血の基本的作用因子である。また、ＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体はＦＩＸをプロテアーゼＦＩＸａに変換し、これは、ＦＶＩＩＩａの存在下、追加的なＦＸを活性化して、トロンビン産生を維持させる。
【０００６】
凝固経路は凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ）を含む。ＦＸＩは、凝固カスケードのその他のメンバーと同様に、インビボの血液凝固の開始段階と増幅段階との橋渡しにおける中心的役割を有する血漿セリンプロテアーゼ  チモーゲンであることが、十分に確認されている（Ｄａｖｉｅ  ＥＷら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９１  Ｏｃｔ  ２９；３０（４３）：１０３６３−７０，Ｇａｉｌａｎｉ  ＤおよびＢｒｏｚｅ  ＧＪ  Ｊｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９１  Ａｕｇ  ２３；２５３（５０２２）：９０９−１２；Ｋｒａｖｔｓｏｖ  ＤＶら，Ｂｌｏｏｄ．２００９  Ｊｕｌ  ９；１１４（２）：４５２−８）。
【０００７】
興味深いことに、ＦＸＩ欠損症は、通常、特発性出血を引き起こさないが、止血困難を伴う出血のリスクの増加に関連しており、一方、出血の重症度はＦＸＩの血漿レベルに対して低い相関性を示す。ヒトにおける重篤なＦＸＩ欠損症は、虚血性脳卒中および深部静脈血栓症（ＤＶＴ）を含む血栓性疾患からの或る防御効果を有することが報告されている（Ｓａｌｏｍｏｎ  Ｏら，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２０１１  Ｆｅｂ；１０５（２）：２６９−７３；Ｓａｌｏｍｏｎ  Ｏら，Ｂｌｏｏｄ．２００８  Ａｐｒ  １５；１１１（８）：４１１３−７）。しかし、高レベルのＦＸＩは血栓事象に関連づけられており、ＤＶＴ、心筋梗塞（ＭＩ）および脳卒中の、より高いリスクをもたらすことが報告されている（Ｍｅｉｊｅｒｓ  ＪＣら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０００  Ｍａｒ  ９；３４２（１０）：６９６−７０１）。
【０００８】
総合すると、これまでの研究が示唆しているところによると、ＦＸＩは止血の維持においては補助的な役割しか果たさないが、血栓症の病因には決定的に重要な寄与因子であり、それにより、ＦＸＩは抗血栓療法の有望な標的となる。このように言えるのは、血栓症と止血とは同じ分子的過程ではないが、それらは、現在使用されている抗血栓薬が両方を偶発的に標的化するほど十分に類似しているからである。現在利用可能な抗血栓薬は、血栓の構成要素（フィブリンおよび血小板）を標的化するか、または分子（凝固因子）および細胞（血小板）が血栓形成過程に関与するのを抑制するかのいずれかである。抗血小板薬、線維素溶解促進薬および抗凝固薬は、何十年もの間、血栓塞栓症の治療および予防のための主力であり、臨床実施における最も一般的な処方薬の１つである。それでも、これらの薬剤のほとんどは、有効量で投与された場合に、血栓症および止血の両方を完全に阻止する可能性がある。
【０００９】
これまでのところ、治療可能性を示す抗ＦＸＩ抗体の数少ない例の１つは、Ｔｕｃｋｅｒら（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｇｒａｆｔ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ．Ｅｒｉｋ  Ｉ．Ｔｕｃｋｅｒ，Ｕｌｌａ  Ｍ．Ｍａｒｚｅｃ，Ｔａｒａ  Ｃ．Ｗｈｉｔｅ，Ｓａｗａｎ  Ｈｕｒｓｔ，Ｓａｎｄｒａ  Ｒｕｇｏｎｙｉ，Ｏｗｅｎ  Ｊ．Ｔ．ＭｃＣａｒｔｙ，Ｄａｖｉｄ  Ｇａｉｌａｎｉ，Ａｎｄｒａｓ  ＧｒｕｂｅｒおよびＳｔｅｐｈｅｎ  Ｒ．Ｈａｎｓｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．２００９  Ｊａｎ  ２２；１１３（４）：９３６−９４４）によって公開されているマウス抗体１Ａ６（ａＸＩＭａｂとも称される）である。抗体１Ａ６は特許出願ＷＯ  ２００９／０６７６６０  Ａ２（米国特許第９，１２５，８９５号としても公開されており、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）にも開示されている。しかし、抗体１Ａ６はマウス抗体であるため、それはヒトに対する療法、特に、抗血栓療法のような慢性的適用そのものには不適当である。マウス抗体を、許容される治療用抗体に変換するための１つの方法は、いわゆるヒト化である。標準的な技術、例えば、Ｏ’ＢｒｉｅｎおよびＪｏｎｅｓ，Ｈｕｍａｎｉｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ＣＤＲ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４０；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌｓ  ｐｐ  ５６７−５９０；Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら（編），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ２００１、ならびにＨｗａｎｇ，Ａｌｍａｇｒｏ，Ｂｕｓｓ，ＴａｎおよびＦｏｏｔｅ（２００５）Ｕｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ａ  ＣＤＲ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｍａｙ；３６（１）：３５−４２、ならびにそれらにおける参考文献に記載されているものが当業者に利用可能である。ヒト化抗体の固有の免疫原性の可能性を更に低減するためには、更なる配列最適化および生殖系列化が必要である。
【００１０】
本出願人が、非経口抗体１Ａ６をヒト化し最適化するためにこれらの標準的な方法を適用したところ、得られた抗体の幾つかは、生化学アッセイにおいては、非経口１Ａ６に匹敵する結合活性を示したが、血漿に基づくアッセイにおいては、活性の有意な低下を示し、凝固のインビボモデルにおいては不適当であった。このように、これまでのところ、親マウス抗体１Ａ６およびヒト化変異体の同等な生化学的プロファイルが、効率的な抗血栓活性につながらない理由の説明は容易には得られていない。驚くべきことに、更なる配列変化を導入することにより、同等の生化学的プロファイルおよび抗血栓効力（インビボ）の両方を示す親マウス抗体１Ａ６のヒト化変異体（抗体ＴＰＰ−３５８３）が得られた。
【００１１】
止血を損なうことなく免疫原性リスクを低減し、血栓症を有効に阻止し、それにより抗血栓療法をより安全にして、抗血栓療法が適用されうる臨床適応および状況の範囲を広げる治療用分子が、本発明の抗体により得られた。
【発明の概要】
【００１２】
概括
第１の態様において、本発明は、
配列ＫＡＳＱＳＶＬＹＳＧＤＮＹＬＮ（配列番号８）を含む軽鎖のＣＤＲ１、
配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号９）を含む軽鎖のＣＤＲ２、
配列ＱＱＹＮＧＤＰＷＴ（配列番号１０）を含む軽鎖のＣＤＲ３、
配列ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１１）を含む重鎖のＣＤＲ１、
配列ＨＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１２）を含む重鎖のＣＤＲ２、および
配列ＩＲＳＳＶＹＡＨＹＹＧＭＤＹ（配列番号１３）を含む重鎖のＣＤＲ３
を含む結合性分子を提供する。
【００１３】
該結合性分子は、配列番号１７に示されているＶＬ領域および／または配列番号１８に示されているＶＨ領域を含みうる。
【００１４】
該結合性分子は、第ＸＩ因子および／または第ＸＩａ因子、特に、ヒトもしくは非ヒト霊長類第ＸＩ因子またはヒトもしくは非ヒト霊長類第ＸＩａ因子に結合しうると想定される。
【００１５】
特に、該結合性分子は、配列番号７のアミノ酸２００〜２８３を含む第ＸＩ因子のＡ３ドメインに対応するアミノ酸配列内に結合すると想定され、特に、ａ）配列番号７のアミノ酸２００〜２１５、ｂ）配列番号７のアミノ酸２２１〜２２２、ｃ）配列番号７のアミノ酸２５２〜２５４、ｄ）配列番号７のアミノ酸２５９〜２６１、ｅ）配列番号７のアミノ酸２７０〜２７２、およびｆ）配列番号７のアミノ酸２７６〜２７８に対応するアミノ酸配列内のドメインに結合すると想定される。ここで、ヒト第ＸＩ因子のアミノ酸の番号付けは、１位のメチオニンから始まるシグナル配列を含む。該結合性分子は抗体、特にヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント、例えばＩｇＧ抗体でありうる。
【００１６】
もう１つの態様においては、本発明は、本明細書中に定められている結合性分子をコードするポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターを提供する。本発明はまた、該ベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【００１７】
もう１つの態様においては、本明細書に記載されている結合性分子の製造方法を提供し、該製造方法は、該結合性分子の発現を可能にする条件下、本明細書中に定められている宿主細胞を培養し、所望により、産生された結合性分子を培養から回収することを含む。
【００１８】
更に、本発明は、本明細書中に定められている結合性分子、ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または宿主細胞と、所望により、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。該医薬組成物は追加的な活性剤、特に抗血栓剤および／または抗凝固剤を含むことが可能であり、あるいは、追加的な活性剤との併用療法の一部として投与されうる。
【００１９】
本発明によれば、該結合性分子、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または医薬組成物は、対象における血液凝固、血小板凝集および／または血栓症を抑制する方法において使用可能であり、したがって、障害、特に心血管障害、好ましくは血栓性もしくは血栓塞栓性障害および／または血栓性もしくは血栓塞栓性合併症の治療および／または予防において使用されることが想定される。
【００２０】
本発明は更に、血液サンプル、血液保存剤、血漿製剤、生物学的サンプルもしくは医学的添加剤における抗凝固剤としての、または医療装置上のコーティングとしての該結合性分子の使用を提供する。
【００２１】
更に、本発明は、本明細書に記載されている結合性分子、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または医薬組成物を含むキットに関する。
【００２２】
詳細な説明
ＦＸＩは病的血栓形成の発生において重要な役割を果たしているが、生理的止血には、限られた影響しか及ぼさず（または全く影響を及ぼさず）、ＦＸＩの阻害は、改善された利益−リスク比を与える新規抗血栓剤の開発における有望な新規アプローチである。本発明は、とりわけ、ＦＸＩに特異的に結合してＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換を阻害しうる新規結合性分子を提供する。更に、該結合性分子はＦＸＩａに結合することも示されている。それにより、本発明で提供する結合性分子は、血液凝固および血栓症に関与する下流作用因子の活性化を遮断すると考えられている。特に、本発明者らは、１Ａ６に匹敵する高い結合アフィニティで、ＦＸＩに、そしてＦＸＩａにも有利に結合する、マウス１Ａ６抗ＦＸＩ抗体のヒト化形態を提供する。更に、該結合性分子は、低濃度で活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を延長するそれらの能力によって示されるとおり、血液凝固を有効に低減する。したがって、本発明の結合性分子は血栓性もしくは血栓塞栓性障害および／または血栓性もしくは血栓塞栓性合併症の有効な治療および／または予防のための有望な新規物質であり、更に、止血を著しく損なうことなく有効であり、それにより、出血のリスクを最小にすると考えられている。
【００２３】
結合性分子
本発明の結合性分子は、ＷＯ  ２００９／０６７６６０  Ａ２に開示されているマウス抗ＦＸＩ抗体１Ａ６のヒト化およびそれに続くＣＤＲ最適化によって得られた。驚くべきことに、本発明者らは、１Ａ６  ＣＤＲと比較してＣＤＲ領域内に幾つかのアミノ酸置換を含む結合性分子が有利な特性を示すことを見出した。本発明の結合性分子は、１Ａ６に匹敵する結合アフィニティでＦＸＩに結合することが可能であり、その活性形態ＦＸＩａへのその変換を阻害し、血液凝固を有効に低減した。これとは対照的に、より少数または多数のアミノ酸置換を有する他の候補結合性分子は同じ有利な特性を示さなかった。
【００２４】
したがって、本発明は、第１の態様においては、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ａ）軽鎖のＣＤＲ１：ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号１）、
ｂ）軽鎖のＣＤＲ２：ＡＡＳＮＬＥＳ（配列番号２）、
ｃ）軽鎖のＣＤＲ３：ＱＱＳＮＧＤＰＷＴ（配列番号３）、
ｄ）重鎖のＣＤＲ１：ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号４）、
ｅ）重鎖のＣＤＲ２：ＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）、および
ｆ）重鎖のＣＤＲ３：ＫＲＳＳＶＶＡＨＹＹＡＭＤ（配列番号６）
を含む、第ＸＩ因子に特異的に結合しうる結合性分子であって、該ＣＤＲが、少なくとも２つのＣＤＲが１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸置換を累積的に含むことを特徴とする、結合性分子に関する。
【００２５】
「アミノ酸」または「アミノ酸残基」なる語は、典型的には、当技術分野で認識されている定義を有するアミノ酸、例えば、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＨｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）およびバリン（ＶａｌまたはＶ）からなる群から選択されるアミノ酸を意味するが、所望により、修飾アミノ酸、合成アミノ酸または希少アミノ酸が用いられうる。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖を有するもの（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）、負荷電側鎖を有するもの（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、正荷電側鎖を有するもの（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）、または非荷電極性側鎖を有するもの（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）を有するものとして分類されうる。
【００２６】
置換の数および分布
アミノ酸置換は、一般に、ＣＤＲ全体にわたって任意の様態で分布することが可能である。すなわち、１つのＣＤＲは例えば１つの置換を含むことが可能であり、第２のＣＤＲは９、１０、１１、１２または１３個の置換を含むことが可能である。あるいは、２つのＣＤＲが５つのアミノ酸置換を含むことが可能であり、あるいは、６つ全てのＣＤＲがアミノ酸置換（例えば、ＣＤＲ当たり２つの置換）を含むことが可能である。本発明において特に想定されるのは、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３における少なくとも５つのアミノ酸置換ならびに重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３における少なくとも５つのアミノ酸置換を含む結合性分子である。一般に、１Ａ６  ＣＤＲアミノ酸配列と比較した場合の累積アミノ酸置換の数が１０〜１４（すなわち、１０、１１、１２、１３または１４を含む）の範囲であり、好ましくは、第ＸＩ因子に結合する該結合性分子の能力を損なわない限り、アミノ酸置換は実質的に任意の様態で分布しうる。
【００２７】
置換のタイプ
一般に、本発明の結合性分子の有利な特性を損なわない限り、１Ａ６と比較した場合のＣＤＲにおけるアミノ酸置換の任意の組合せが考えられうる。アミノ酸置換は保存的（すなわち、１つのクラスまたはグループのアミノ酸を前記と同じクラスまたはグループの別のアミノ酸で置換すること）または非保存的（すなわち、１つのクラス／グループのアミノ酸を別のクラス／グループの別のアミノ酸で置換すること）でありうる。
【００２８】
本発明に従い想定される特定のアミノ酸置換は以下のものを含む：
（ａ）配列番号１に関するＤ９→Ｌ９、Ｄ１１→Ｓ１１および／またはＳ１４→Ｎ１４；
（ｂ）配列番号２に関するＮ６→Ｔ６；
（ｃ）配列番号３に関するＳ５→Ｙ５；
（ｄ）配列番号４に関するＧ１２→Ｃ１２；
（ｅ）配列番号５に関するＷ５→Ｄ５、Ｎ１３→Ｓ１３；
（ｆ）配列番号６に関するＫ３→Ｉ３、Ｖ８→Ｙ８、Ａ１３→Ｇ１３および／またはＹ１６→Ｖ１６。
【００２９】
好ましい置換は、０．０３μＭ以下または０．０１５μＭ以下または０．０１μＭ以下の濃度で（本明細書における他の箇所に記載されているとおり）１．５倍のａＰＴＴの延長をもたらす本発明の結合性分子を与える。
【００３０】
特に、本発明の結合性分子は以下のＣＤＲを含みうる：
（ａ）配列ＫＡＳＱＳＶＬＹＳＧＤＮＹＬＮ（配列番号８）もしくはＫＳＳＱＳＶＬＹＳＧＤＮＹＬＮ（配列番号１４）（配列番号８が好ましい）を含む軽鎖のＣＤＲ１、および／または
（ｂ）配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号９）を含む軽鎖のＣＤＲ２、および／または
（ｃ）配列ＱＱＹＮＧＤＰＷＴ（配列番号１０）を含む軽鎖のＣＤＲ３、および／または
（ｄ）配列ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１１）を含む重鎖のＣＤＲ１、および／または
（ｅ）配列ＨＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１２）もしくはＨＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＴＳＬＫＳ（配列番号１５）（配列番号１２が好ましい）を含む重鎖のＣＤＲ２、および／または
（ｆ）配列ＩＲＳＳＶＹＡＨＹＹＧＭＤＹ（配列番号１３）もしくはＩＲＳＳＶＹＡＨ  ＹＹＧＭＤＶ（配列番号１６）（配列番号１３が好ましい）を含む重鎖のＣＤＲ３。
【００３１】
前記から明らかなとおり、本発明の結合性分子は前記ＣＤＲの１以上を、所望により組合せて、含みうる。
【００３２】
本発明の特に好ましい結合性分子はモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントであることが可能であり、以下のＣＤＲを含む：配列ＫＡＳＱＳＶＬＹＳＧＤＮＹＬＮ（配列番号８）を含む軽鎖のＣＤＲ１、配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号９）を含む軽鎖のＣＤＲ２、配列ＱＱＹＮＧＤＰＷＴ（配列番号１０）を含む軽鎖のＣＤＲ３、配列ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１１）を含む重鎖のＣＤＲ１、配列ＨＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１２）を含む重鎖のＣＤＲ２、および配列ＩＲＳＳＶＹＡＨＹＹＧＭＤＹ（配列番号１３）を含む重鎖のＣＤＲ３。本発明の更に特に好ましい結合性分子はモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントであることが可能であり、以下のＣＤＲを含む：配列ＫＡＳＱＳＶＬＹＳＧＤＮＹＬＮ（配列番号８）からなる軽鎖のＣＤＲ１、配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号９）からなる軽鎖のＣＤＲ２、配列ＱＱＹＮＧＤＰＷＴ（配列番号１０）からなる軽鎖のＣＤＲ３、配列ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１１）からなる重鎖のＣＤＲ１、配列ＨＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１２）からなる重鎖のＣＤＲ２、および配列ＩＲＳＳＶＹＡＨＹＹＧＭＤＹ（配列番号１３）からなる重鎖のＣＤＲ３。
【００３３】
更に、本発明の結合性分子は、配列番号１７もしくは配列番号１９に示されている軽鎖の可変領域（ＶＬまたはＶＬ領域）（配列番号１７に示されているＶＬ領域が好ましい）および／または配列番号１８もしくは配列番号２０に示されている重鎖の可変領域（ＶＨまたはＶＨ領域）（配列番号１８に示されているＶＨ領域が好ましい）を含むと想定される。したがって、本発明の好ましい結合性分子は、配列番号１７に示されているＶＬ領域および配列番号１８に示されているＶＨ領域を含む。しかし、本明細書に開示されているＶＬおよびＶＨ領域の他の組合せも考えられうる。したがって、好ましい実施形態は、図１に示されている配列を有するヒト化モノクローナル抗体ＴＰＰ−３５８３である。
【００３４】
第ＸＩ因子
本明細書中に既に記載されているとおり、本発明の結合性分子は、好ましくは、第ＸＩ因子に結合しうる。
【００３５】
「第ＸＩ因子」は本明細書においては「凝固第ＸＩ因子」、「ＦＸＩ」または「ｆＸＩ」とも称され、約１６０キロダルトン（ｋＤ）の分子量を有する二本鎖糖タンパク質である。それらの２本の鎖は、約８０，０００ダルトンの分子量を有する同一のジスルフィド結合ポリペプチドである。ＦＸＩは４つの「アップルドメイン」（重鎖のＮ末端からＡ１〜Ａ４）およびＣ末端触媒ドメイン（軽鎖）を含む。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、４つのアップルドメインは他のタンパク質に対するＦＸＩ結合部位、例えばトロンビンに対するＡ１、ＨＫに対するＡ２、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、ＧＰＩｂおよびヘパリンに対するＡ３、ならびにＦＸＩＩａに対するＡ４を含有すると考えられている。ＦＸＩは、第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）により、その活性形態である凝固第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）に変換されうる。セリンプロテアーゼＦＸＩａは凝固第ＩＸ因子をＩＸａに変換し、ついでこれは凝固第Ｘ因子（Ｘａ）を活性化する。ついでＸａは凝固第ＩＩ因子／トロンビンの活性化をもたらしうる。
【００３６】
特に、「第ＸＩ因子」なる語は、２０１５年１０月１４日のＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０３９５１、エントリーバージョン１９４（配列番号７）を有するヒト凝固第ＸＩ因子を意味する。本明細書中の他の箇所に記載されているとおり、本発明の結合性分子は特に、配列番号７のアミノ酸２００〜２８３に対応するアミノ酸配列内のドメインに結合すると想定される。ヒトＦＸＩのアミノ酸の番号付けは、１位のアミノ酸メチオニンから開始する配列シグナルを含む。
【００３７】
本開示において用いられる「位置（または位）」なる語は、本明細書中に示されているアミノ酸配列内のアミノ酸の位置、または本明細書中に示されている核酸配列内のヌクレオチドの位置のいずれかを意味する。本明細書中で用いる「対応（する）」なる語は、位置が先行ヌクレオチド／アミノ酸の数によって決定されるだけでなく、配列の周囲の部分の状況において検討されるべきであることも含む。したがって、本開示における与えられたアミノ酸またはヌクレオチドの位置は配列における他の箇所のアミノ酸またはヌクレオチドの欠失または付加によって変動しうる。したがって、ある位置が本開示において「対応位置」と称される場合、ヌクレオチド／アミノ酸は、特定されている数字に関しては異なりうるが、類似した隣接ヌクレオチド／アミノ酸を尚も有しうると理解される。与えられた配列におけるアミノ酸残基（またはヌクレオチド）が「親」アミノ酸（またはポリヌクレオチド配列）のアミノ酸配列（またはポリヌクレオチド配列）（例えば、配列番号７に示されているヒトＦＸＩのもの）における或る位置に対応するかどうかを決定するため、当業者は、当技術分野でよく知られている手段および方法、例えば配列アラインメントを、手動で、または本明細書に例示されているコンピュータプログラムを使用することにより、用いることが可能である。
【００３８】
「エピトープ」なる語は、一般に、結合ドメインが認識する、抗原、典型的には（ポリ）ペプチド上の部位を意味し、「抗原構造」または「抗原決定基」とも称されうる。「結合ドメイン」なる語は「抗原結合部位」を意味し、すなわち、抗原または抗原群（例えば、異なる種における同一抗原）上の所与標的エピトープと結合／相互作用する結合性分子のドメインを示す。標的抗原は単一のエピトープを含みうるが、典型的には、少なくとも２つのエピトープを含み、抗原のサイズ、コンホメーションおよびタイプに応じて任意の数のエピトープを含みうる。更に、標的抗原上の「エピトープ」は、典型的には、標的（ポリ）ペプチドであるが、非ポリペプチド要素であること又は非ポリペプチド要素を含むことも可能であり、例えば、エピトープは炭水化物側鎖を含みうる。「エピトープ」なる語は一般に、直鎖状エピトープおよびコンホメーションエピトープを含む。直鎖状エピトープは、アミノ酸一次配列内に含まれる連続的エピトープであり、典型的には、少なくとも２つまたはそれ以上のアミノ酸を含む。コンホメーションエピトープは、標的抗原、特に標的（ポリ）ペプチドのフォールディングにより並置される不連続的アミノ酸により形成される。
【００３９】
本発明の結合性分子は、第ＸＩ因子（配列番号７）の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０個の連続的または不連続的アミノ酸の配列を含有する第ＸＩ因子の重鎖上に位置するエピトープを認識すると想定される。
【００４０】
本発明で提供する結合性分子は、配列番号７のアミノ酸２００〜２８３を含むヒト第ＸＩ因子のＡ３ドメインに結合することが特に想定される。
【００４１】
しかし、該結合性分子はまた、前記で特定されているヒトＦＸＩの変異体に結合しうると想定される。ＦＸＩに関して用いられる場合の「変異体」なる語は、「親」ＦＸＩ配列と比較して１以上のアミノ酸配列置換、欠失および／または付加を含む、同じ生物学的機能を示すポリペプチド（すなわち、セリンプロテアーゼ活性を有し、第ＩＸ因子の活性化を触媒することにより、血液凝固の内因性経路を惹起するその活性形態ＦＸＩａに変換されうるもの）を意味する。アミノ酸置換は、本明細書中に定義されているとおり保存的であること、または非保存的であること、またはそれらの任意の組合せであることが可能である。ＦＸＩ変異体は、カルボキシ末端またはアミノ末端（この場合、アミノ末端はリーダー配列を含んでいても含んでいなくてもよい）のいずれかにアミノ酸残基の付加を有しうる。特に、ＦＸＩに関して用いられる場合の「変異体」なる語は公知ＦＸＩポリペプチド（例えば、配列番号７に示されている配列を有するＦＸＩポリペプチド）のアイソフォーム、対立遺伝子もしくはスプライス変異体または翻訳後修飾変異体（例えば、グリコシル化変異体）を含む。本発明の結合性分子は、配列番号７のアミノ酸２００〜２８３に対応するアミノ酸配列、あるいは特に、ａ）配列番号７のアミノ酸２０１〜２１５、ｂ）配列番号７のアミノ酸２２１〜２２２、ｃ）配列番号７のアミノ酸２５２〜２５４、ｄ）配列番号７のアミノ酸２５９〜２６１、ｅ）配列番号７のアミノ酸２７０〜２７３、および／またはｆ）配列番号７のアミノ酸２７６〜２７８に対応するアミノ酸配列を含むＦＸＩ変異体に対する結合アフィニティを特に示しうることが容易に理解されるであろう。前記によれば、該結合性分子は、それが前記アミノ酸伸長またはそれに対応するアミノ酸位置の少なくとも１つを含む場合には、ＦＸＩａおよびその変異体にも結合しうると想定される。
【００４２】
本発明の結合性分子はまた、他の哺乳類種、好ましくは非ヒト霊長類種由来のＦＸＩに結合可能でありうる。これらの非ヒトＦＸＩポリペプチドは、好ましくは、ＦＸＩ遺伝子またはそのオルソログもしくはパラログによってコードされ、ヒトＦＸＩと同じ生物学的機能を示す。本発明の結合性分子の潜在的非ヒト霊長類タンパク質標的には、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｈ２ＱＱＪ４［２０１５年１１月１１日のパン・トログロディテス（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、エントリーバージョン２６］、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｈ２ＰＥＸ７［２０１５年１１月１１日のポンゴ・アベリイ（Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ）、エントリーバージョン２７］、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ０Ｄ９Ｓ２Ｍ６［２０１５年１１月１１日のクロロセブス・サベウス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｓａｂａｅｕｓ）、エントリーバージョン６］、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｇ３Ｒ２Ｘ１［２０１５年１０月１４日のゴリラ・ゴリラ・ゴリア（Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ）、エントリーバージョン２７］、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ０９６ＮＣ９５［２０１５年１１月１１日のパピオ・アヌビス（Ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ）、エントリーバージョン１１］、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｇ１ＲＬＥ８［２０１５年１１月１１日のノマスクス・ロイコゲニス（Ｎｏｍａｓｃｕｓ  ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ）、エントリーバージョン２８］、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｇ７ＰＫＦ５［２０１５年１０月１４日のマカカ・ファスシクラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、エントリーバージョン１３］、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｇ７ＭＳＦ８［２０１５年１０月１４日のマカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、エントリーバージョン１２］を有するポリペプチドが含まれる。前記ポリペプチドの変異体も本発明の結合性分子の標的として想定される。本発明の結合性分子によって認識される想定非ヒト霊長類ポリペプチド標的は、配列番号７のアミノ酸２００〜２８３に対応する配列、ならびに／またはａ）配列番号７のアミノ酸２０１〜２１５、ｂ）配列番号７のアミノ酸２２１〜２２２、ｃ）配列番号７のアミノ酸２５２〜２５４、ｄ）配列番号７のアミノ酸２５９〜２６１、ｅ）配列番号７のアミノ酸２７０〜２７３、および／もしくはｆ）配列番号７のアミノ酸２７６〜２７８に対応するアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むと特に想定される。したがって、特に非ヒト霊長類におけるＦＸＩに対する異種間特異的結合性分子も本発明で提供する。したがって、本明細書中で用いる「異種間認識」または「種間特異性」なる語は、ヒトおよび非ヒト、特に非ヒト霊長類種における同一標的ポリペプチドへの本明細書に記載されている結合性分子の結合を意味する。
【００４３】
前記のとおり、本明細書に記載されている結合性分子はヒトまたは非ヒト霊長類第ＸＩａ因子にも結合しうると想定される。したがって、第ＸＩ因子に関する結合性分子の結合特性の文脈で開示されているものは、好ましくは、必要な変更を加えて、第ＸＩａ因子に関するその結合特性にも等しく適用可能である。
【００４４】
抗体
本発明の結合性分子は抗体であると特に想定される。当技術分野においてよく知られているとおり、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して標的エピトープに特異的に結合しうる免疫グロブリン分子である。「抗体」、「抗体分子」および「免疫グロブリン」なる語は本明細書において互換的に用いられ、それらの最も広い意味で用いられ、天然抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、（天然に存在する又は合成）抗体誘導体、フラグメントまたは変異体、必要な特異性の抗原結合性フラグメントを含む融合タンパク質、および必要な特異性の抗原結合部位を含む抗体の任意の他の修飾形態を包含する。本発明の抗体は、本明細書の他の箇所に記載されているとおりＦＸＩに結合可能であり、好ましくは、実施例に記載されているとおり、抗体ＴＴＰ−３５８３およびＴＴＰ−３５７７の有利な特性を示すと想定される。
【００４５】
天然抗体
「天然抗体」は四量体糖タンパク質である。天然に存在する天然抗体においては、各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアから構成され、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の「（超）可変」領域を含む。超可変領域は「相補性決定領域」またはＣＤＲまたは「ＣＤＲ領域」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」またはＦＲ残基は超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４６】
軽鎖および重鎖は共に、「定常領域」および「可変領域」と称される構造的および機能的相同性の領域に分けられる。「定常」および「可変」なる語は機能的に用いられる。これに関しては、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域が抗原認識および特異性を決定すると理解されるであろう。「ＶＬ」、「ＶＬ領域」、および「ＶＬドメイン」なる語は、軽鎖の可変領域を示すために本明細書の全体にわたって互換的に用いられる。同様に、「ＶＨ」、「ＶＨ領域」および「ＶＨドメイン」なる語は、重鎖の可変領域を示すために本明細書において互換的に用いられる。
【００４７】
「ＣＬ」、「ＣＬ領域」および「ＣＬドメイン」なる語は、軽鎖の定常領域を示すために本明細書において互換的に用いられる。「ＣＨ」、「ＣＨ領域」および「ＣＨドメイン」なる語は、重鎖の定常領域を示すために本明細書において互換的に用いられ、「ＣＨ１」、「ＣＨ２」、および「ＣＨ３」領域またはドメインを含む。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤運動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などのような重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、それが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり、ＣＨ３およびＣＬ領域は実際に、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００４８】
前記のとおり、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶＬおよびＶＨ領域、またはこれらの可変ドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、三次元抗原結合部位を定める可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より詳細には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬのそれぞれにおける３つのＣＤＲ（Ｋａｂａｔ番号付け系に従い決定されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）によって定められる。軽鎖の３つのＣＤＲは本明細書においてはＣＤＲ１  ＬＣまたはＣＤＲＬ１、ＣＤＲ２  ＬＣまたはＣＤＲＬ２およびＣＤＲ３  ＬＣまたはＣＤＲＬ３とも称される。重鎖の３つのＣＤＲはＣＤＲ１  ＨＣまたはＣＤＲＨ１、ＣＤＲ２  ＨＣまたはＣＤＲＨ２およびＣＤＲ３  ＨＣまたはＣＤＲＨ３と称される。天然抗体においては、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」または「ＣＤＲ領域」は、典型的には、抗体がその三次元立体配置を水性環境中でとる際に抗原結合ドメインを形成するように特異的に位置するアミノ酸の短い非隣接（不連続）配列である。
【００４９】
本明細書中で既に記載されているとおり、本発明の結合性分子、特に抗体は、配列ＫＡＳＱＳＶＬＹＳＧＤＮＹＬＮ（配列番号８）もしくはＫＳＳＱＳＶＬＹＳＧＤＮＹＬＮ（配列番号１４）（配列番号８が好ましい）を含む若しくはそれからなる軽鎖のＣＤＲ１、および／または配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号９）を含む若しくはそれからなる軽鎖のＣＤＲ２、および／または配列ＱＱＹＮＧＤＰＷＴ（配列番号１０）を含む若しくはそれからなる軽鎖のＣＤＲ３、および／または配列ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１１）を含む若しくはそれからなる重鎖のＣＤＲ１、および／または配列ＨＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１２）もしくはＨＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＴＳＬＫＳ（配列番号１５）（配列番号１２が好ましい）を含む若しくはそれからなる重鎖のＣＤＲ２、および／または配列ＩＲＳＳＶＹＡＨＹＹＧＭＤＹ（配列番号１３）もしくはＩＲＳＳＶＹＡＨＹＹＧＭＤＶ（配列番号１６）（配列番号１３が好ましい）を含む若しくはそれからなる重鎖のＣＤＲ３を含むと想定される。
【００５０】
本発明の特に好ましい結合性分子はモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントであることが可能であり、以下のＣＤＲを含む：配列ＫＡＳＱＳＶＬＹＳＧＤＮＹＬＮ（配列番号８）を含む若しくはそれからなる軽鎖のＣＤＲ１、配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号９）を含む若しくはそれからなる軽鎖のＣＤＲ２、配列ＱＱＹＮＧＤＰＷＴ（配列番号１０）を含む若しくはそれからなる軽鎖のＣＤＲ３、配列ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１１）を含む若しくはそれからなる重鎖のＣＤＲ１、配列ＨＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１２）を含む若しくはそれからなる重鎖のＣＤＲ２、および配列ＩＲＳＳＶＹＡＨＹＹＧＭＤＹ（配列番号１３）を含む若しくはそれからなる重鎖のＣＤＲ３（それらは全て、図１に示されている）。当業者は、ＣＤＲがそれぞれ軽鎖および重鎖の可変領域内に位置することを容易に理解するであろう。本発明の特に好ましい実施形態は、配列番号８に示されている配列を含む軽鎖のＣＤＲ１、配列番号９に示されている配列を含む軽鎖のＣＤＲ２、および配列番号１０に示されている配列を含む軽鎖のＣＤＲ３を含む軽鎖の抗原結合部位、ならびに配列番号１１に示されている配列を含む重鎖のＣＤＲ１、配列番号１２に示されている配列を含む重鎖のＣＤＲ２、および配列番号１３に示されている配列を含む重鎖のＣＤＲ３を含む重鎖の抗原結合部位を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントである。本発明の更に特に好ましい実施形態は、配列番号８に示されている配列からなる軽鎖のＣＤＲ１、配列番号９に示されている配列からなる軽鎖のＣＤＲ２、および配列番号１０に示されている配列からなる軽鎖のＣＤＲ３を含む軽鎖の抗原結合部位、ならびに配列番号１１に示されている配列からなる重鎖のＣＤＲ１、配列番号１２に示されている配列からなる重鎖のＣＤＲ２、および配列番号１３に示されている配列からなる重鎖のＣＤＲ３を含む重鎖の抗原結合部位を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントである。前記ＣＤＲを含むモノクローナル抗体はの実施例において評価されており、本明細書においては「ＴＴＰ−３５８３」と称される。
【００５１】
本発明の結合性分子、特に抗体は、配列番号１７もしくは配列番号１９に示されているＶＬ領域（配列番号１７に示されているＶＬ領域が好ましい）および／または配列番号１８もしくは配列番号２０に示されているＶＨ領域（配列番号１８に示されているＶＨ領域が好ましい）を含むと想定される。したがって、本発明の好ましい抗体は、配列番号１７に示されているＶＬ領域および配列番号１８に示されているＶＨ領域を含む。しかし、本明細書に開示されているＶＬおよびＶＨ領域の他の組合せも考えられうる。
【００５２】
本発明の結合性分子、特に抗体は、配列番号２７もしくは配列番号２９に示されている軽鎖（配列番号２７に示されている軽鎖が好ましい）および／または配列番号２８もしくは配列番号３０に示されている重鎖（配列番号２８に示されている重鎖が好ましい）を含むと想定される。したがって、本発明の好ましい抗体は、配列番号２７に示されている軽鎖および配列番号２に示されている重鎖を含む。しかし、本明細書に開示されている軽鎖および重鎖の他の組合せも考えられうる。
【００５３】
本発明の特に好ましい実施形態は、配列番号１７に示されているＶＬ領域と配列番号１８に示されているＶＨ領域とを含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである。本発明の特に好ましい結合性分子は、配列番号２７に示されている軽鎖配列と配列番号２８に示されている重鎖配列とを含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである。本発明の特に好ましい結合性分子は、配列番号２７に示されている軽鎖配列と配列番号２８に示されている重鎖配列とからなるモノクローナル抗体である。本発明の特に好ましいモノクローナル抗体は抗体ＴＰＰ−３５８３である。
【００５４】
各軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能をもたらす定常領域を定める。免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて種々のクラスに帰属されうる。重鎖はミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）およびイプシロン（ε）として分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして、抗体のアイソタイプを定める。これらの幾つかは更に、サブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類されうる。アイソタイプが異なればエフェクター機能も異なる。例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、しばしば、ＡＤＣＣ活性を有する。軽鎖はカッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖クラスはカッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合可能である。一般に、軽鎖と重鎖とは互いに共有結合しており、２つの重鎖の「尾」部は共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合している。本発明の抗体は、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１でありうる。
【００５５】
モノクローナル抗体
本発明において特に想定されるのはモノクローナル抗体およびその抗原結合性フラグメントである。本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」なる語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる可能な天然で生じる突然変異以外は同一である。種々のエピトープに対する種々の抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体は、実質的に類似したエピトープ結合部位を含有し、したがって、典型的には、抗原上の同一エピトープに対するものである。したがって、「モノクローナル抗体」なる語は、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはＨｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）モノクローナル抗体を含む。
【００５６】
モノクローナル抗体を製造するための種々の方法が当技術分野において公知であり、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．１１６−２２７（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）に記載されている。適切な技術には、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡの単離および配列決定ならびに適切な宿主細胞におけるその後続の導入および発現を含む組換えＤＮＡ法、ならびにＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２〜５５４（１９９０）に最初に記載された技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーからの抗体の単離が含まれる。
【００５７】
キメラ抗体
本明細書中の他の箇所に記載されているとおり、「抗体」なる語はキメラ抗体をも含む。本明細書中で用いる「キメラ抗体」なる語は、異なる種に典型的に由来する２つの異なる抗体に由来する配列を含有する抗体を意味する。特に、この語は、重鎖および／または軽鎖の一部が、個々の種に由来する又は個々の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同である一方で、該鎖の残部が、別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同である抗体およびそのような抗体のフラグメントを意味する。
【００５８】
換言すれば、「キメラ抗体」なる語は、抗原結合部位が第１種から得られた又は由来し、定常領域（これは本発明における無傷体、部分体または修飾体でありうる）が第２種から得られた任意の抗体を意味するとみなされるであろう。例えば、抗原結合部位は非ヒト（例えば、マウスまたは霊長類）に由来することが可能であり、定常領域はヒト体であることが可能である。
【００５９】
典型的には、キメラ抗体は、例えば、ヒト抗体フラグメントおよびマウス抗体フラグメント、一般には、ヒト定常領域およびマウス可変領域を含みうる。
【００６０】
ヒト化抗体
本明細書中に既に記載されているとおり、本発明は特に、ＷＯ  ２００９／０６７６６０  Ａ２に記載されているマウス抗ヒトＦＸＩ  １Ａ６に由来する（モノクローナル）ヒト化抗体およびその抗原結合性フラグメントに関する。
【００６１】
「ヒト化抗体」は、一般に、（Ｉ）非ヒト（例えば、異種免疫系を有するトランスジェニックマウス）に由来し、ヒト生殖系列に基づく抗体、または（ＩＩ）ＣＤＲグラフト化体（ここで、可変領域のＣＤＲは非ヒト由来であり、一方、可変領域の１以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ配列の一部はヒト由来であり、典型的には、定常領域は（存在する場合には）ヒト由来である）として定義される。
【００６２】
したがって、「ヒト化抗体」なる語は、ヒト抗体の重鎖もしくは軽鎖のいずれか又はその両方における可変領域が、既知特異性の非ヒト抗体からの１以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換により、そして必要に応じて、部分的フレームワーク領域置換および配列変化により改変されている抗体を含む。換言すれば、既知特異性の非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類抗体）からの１以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域内にグラフト化（移植）されている抗体が本明細書においては「ヒト化抗体」と称される。１つの可変ドメインの抗原結合能をもう１つの可変ドメインに移すためには、ＣＤＲの全てをドナー可変ドメインからの完全なＣＤＲで置換する必要はないかもしれない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するのに必要な残基を導入することだけが必要でありうる。
【００６３】
本発明者らは、実験１に詳細に記載されているとおり、１Ａ６  ＣＤＲ残基を決定し、それぞれＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲをグラフト化するためのアクセプター（受容）ヒト生殖系列フレームワークとしてマウスＶＨおよびＶＬ配列に対して最良の全体的相同性を有するヒト生殖系列配列をデータベースから選択することにより、マウス１Ａ６抗体をヒト化した。ついで、実験２に記載されているとおり、配列同一性および相同性において最も近いヒト生殖系列配列における対応アミノ酸で１Ａ６におけるアミノ酸を置換することにより、得られたヒト化抗体をＣＤＲ最適化に付した（「生殖系列化」）。ついで、ＣＤＲ配列内に１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸置換を含む、特に本明細書における他の箇所に開示されているＣＤＲ配列を含む生殖系列化ヒト化１Ａ６抗体は、結合特性および生物活性に関して有利な特性を示すが、より多数のアミノ酸置換を有する抗体（ＴＴＰ−３２８３、ＴＴＰ３２９０）またはより少数のアミノ酸置換を有する抗体はそうではないことを、本発明者らは見出した。
【００６４】
本発明の目的においては、ＣＤＲ最適化（「生殖系列化」）されたヒト化抗体は「ヒト化」抗体なる語に含まれる。
【００６５】
ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその両方における可変領域内のフレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来の残基のみを含むことが可能であり、この場合、ヒト化抗体のこれらのフレームワーク領域は「完全ヒトフレームワーク領域」と称される。ヒトフレームワーク残基とドナーフレームワーク残基との混合物を含むヒトフレームワーク領域は本明細書においては「部分的ヒトフレームワーク領域」と称される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の特性を更に改善するために（例えば、所望のアフィニティを得るために）行われる。
【００６６】
したがって、一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的に全てを含み、ＣＤＲの全部または一部は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全部または実質的に全部はヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものを含みうる。
【００６７】
ヒト抗体
「ヒト」抗体は、本明細書においては、キメラ体でも「ヒト化」体でもなく、（全体的にも部分的にも）非ヒト種に由来しないものとして定義される。ヒト抗体または機能的抗体フラグメントはヒト由来であることが可能であり、あるいは、合成ヒト抗体でありうる。「合成ヒト抗体」は、本明細書においては、既知ヒト抗体配列の分析に基づく合成配列から全体的または部分的にインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で誘導された配列を有する抗体として定義される。ヒト抗体配列またはそのフラグメントのインシリコ設計は、例えば、ヒト抗体または抗体フラグメント配列のデータベースを分析し、それらから得られたデータを利用してアミノ酸配列を設計することによって達成されうる。ヒト抗体または機能的抗体フラグメントのもう１つの例は、ヒト由来の抗体配列のライブラリー（すなわち、そのようなライブラリーは、ヒト天然源から採取された抗体に基づく）から単離された核酸によってコードされるものである。
【００６８】
フラグメント、変異体および誘導体
本明細書中で既に記載されているとおり、本発明は完全長抗体ならびにその抗原結合性フラグメント、変異体および誘導体を含む。
【００６９】
フラグメント
「抗体フラグメント」なる語は、「親」抗体に由来する、その基本構造および機能を保有するポリペプチドを意味する。したがって、抗体フラグメントは、好ましくは、その特異的抗原、すなわちＦＸＩに結合しうる。更に、本発明による抗体フラグメントは、抗原結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、すなわち、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）および／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、すなわち、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）の存在によって定義される。換言すれば、「抗体フラグメント」なる語は、「親」抗体の抗原結合部位（すなわち、ＣＤＲおよび場合によってはＦＲ（の一部））を保有する「機能的」または「抗原結合性」ポリペプチドを意味する。本発明の抗体フラグメントは、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト「親」抗体に由来しうる。
【００７０】
好ましい抗原結合性抗体フラグメントは、配列ＫＡＳＱＳＶＬＹＳＧＤＮＹＬＮ（配列番号８）を含む軽鎖のＣＤＲ１、配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号９）を含む軽鎖のＣＤＲ２、配列ＱＱＹＮＧＤＰＷＴ（配列番号１０）を含む軽鎖のＣＤＲ３、配列ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１１）を含む重鎖のＣＤＲ１、配列ＨＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１２）を含む重鎖のＣＤＲ２、および配列ＩＲＳＳＶＹＡＨＹＹＧＭＤＹ（配列番号１３）を含む重鎖のＣＤＲ３の少なくとも１つ、好ましくは全てを含む。
【００７１】
前記に従い、「抗原結合性抗体フラグメント」なる語は、特に、完全長抗体のフラグメント、例えば、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または「ｒ  ＩｇＧ」（「半抗体」）を意味する。本発明の抗体フラグメントはまた、抗体の修飾フラグメント、例えば、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖまたはｂｉ（ｓ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ジアボディ（二重特異性抗体）、一本鎖ジアボディ、タンデム・ジアボディ（Ｔａｎｄａｂ）、タンデム・ジ−ｓｃＦｖ、タンデム・トリ−ｓｃＦｖ、以下の構造により例示される「ミニボディ」：（ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２または（ｓｃＦｖ−ＣＨ３−ｓｃＦｖ）２、マルチボディ、例えば、トリアボディまたはテトラボディでありうる。更に、「抗体フラグメント」なる語の定義は、前記フラグメントを含む構築物、すなわち、１価、２価および多価構築物、したがって、ただ１つの標的抗原に特異的に結合する単一特異性構築物、ならびに異なる抗原結合部位を介して複数（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）の標的抗原に特異的に結合する二重特異性構築物および多重特異性構築物を含む。更に、「抗体フラグメント」なる語の定義は、ただ１つのポリペプチド鎖からなる分子、および複数のポリペプチド鎖［それらの鎖は同一（ホモ二量体、ホモ三量体またはホモオリゴマー）または異なる（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロオリゴマー）ことが可能である］からなる分子を含む。
【００７２】
抗体フラグメントは、組換えＤＮＡ技術により、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断により製造されうる。そのようなフラグメントを製造するための方法は当技術分野でよく知られている。
【００７３】
変異体
「変異体」なる語は、抗体または抗体フラグメントのような「親」結合性分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、「親」アミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失または挿入）を含有するものを意味する。ただし、変異体は、ＦＸＩ、特に、配列番号７に示されているヒトＦＸＩに尚も（特異的に）結合可能であり、好ましくは、実施例において評価されるとおり抗体ＴＴＰ−３５８３および／またはＴＴＰ−３５７７と比較して類似した又は更に改善した特性を示す。本発明の結合性分子、特に抗体および抗体フラグメントの変異体は、典型的には、該抗体または抗体フラグメントをコードする核酸内に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、またはペプチド合成により製造される。一般に、変異体ＣＤＲの２以上が、配列番号１、２、３、４、５および６に示されている１Ａ６  ＣＤＲと比較して１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸置換を累積的に含むという前提の下で、前記アミノ酸修飾は可変領域または定常領域に導入されること又は存在することが可能である。アミノ酸修飾は、例えば、医薬品開発に影響を及ぼす熱力学的安定性、溶解性または粘度のような抗体特性を調整するために導入されうる（「配列最適化」）。
【００７４】
前記のとおり、アミノ酸修飾には、例えば、本明細書に記載されている結合性分子、好ましくは抗体または抗原結合性抗体フラグメントのアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または該残基内への挿入、および／または該残基の置換が含まれる。最終産物が、本明細書における他の箇所に記載されている所望の特性を有する限り、最終産物を得るために、欠失、挿入および置換の任意の組合せを「親」アミノ酸配列内に導入することが可能である。アミノ酸修飾は該結合性分子の翻訳後プロセスをも変化させることが可能であり、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させうる。
【００７５】
例えば、ＣＤＲのそれぞれにおいて（勿論、それらの長さに応じて）、１、２、３、４、５または６個のアミノ酸を挿入し、または欠失させることが可能であり、一方、ＦＲのそれぞれにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２５個のアミノ酸を挿入し、または欠失させることが可能である。本発明において想定されるアミノ酸配列挿入は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０残基から数百個以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。本発明の結合性分子、特に抗体または抗体フラグメントの挿入変異体には、抗体または抗体フラグメントと酵素または他の機能的ポリペプチド（例えば、該結合性分子、例えば抗体または抗体フラグメントの血清半減期を増加させるもの）との融合産物が含まれる。
【００７６】
アミノ酸置換は、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域、または重鎖および／または軽鎖のＦＲ領域内に導入されうる。本発明において特に想定されるのは、例えば、関与残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて施されうる保存的アミノ酸置換である。
【００７７】
抗体変異体が、配列番号１〜６に示されている１Ａ６  ＣＤＲと比較して１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸を累積的に含む限り、ＣＤＲまたはＦＲの長さに応じて、好ましくは、ＣＤＲにおいては１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸を置換することが可能であり、一方、フレームワーク領域（ＦＲ）においては１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２５個のアミノ酸を置換することが可能である。
【００７８】
一般に、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲの１以上または全てにおいてアミノ酸が置換される場合、その際に得られる「変異体」配列は「親」ＣＤＲ配列に対して少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であることが好ましい。したがって、変異体配列が本発明に尚も含まれるように、ＣＤＲの長さは、可能なアミノ酸置換の数に影響を及ぼす。例えば、５個のアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１個のアミノ酸が置換されるためには、好ましくは、その置換配列に対して８０％同一である。したがって、抗体構築物のＣＤＲはそれらの置換配列に対して種々の度合の同一性を有しうる。例えば、ＣＤＲＬ１は８０％を有しうる一方、ＣＤＲＬ３は９０％を有しうる。
【００７９】
好ましい置換（または交換）は保存的置換である。しかし、抗体構築物がＦＸＩへのその結合能を保有し、および／またはそのＣＤＲが置換配列に対して少なくとも８０、更に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する限り、任意の置換（非保存的置換、または典型的な置換からの１以上を含む）が想定される。
【００８０】
本明細書中で用いる「配列同一性」なる語は、２つの（ヌクレオチドまたはアミノ酸）配列がアラインメントにおける同一位置に同一残基を有する度合を示し、しばしば、百分率として表される。好ましくは、同一性は、比較される配列の全長にわたって決定される。したがって、全く同じ配列の２つのコピーは１００％の同一性を有するが、それほど高度には保存されておらず、欠失、付加または置換を有する配列は、より低い度合の同一性を有しうる。標準的なパラメータを使用して配列同一性を決定するためには、幾つかのアルゴリズム、例えば、Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈら，（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）およびＣｌｕｓｔａｌＷが利用可能である、と当業者は認識するであろう。したがって、配列番号８、９、１０、１１、１２もしくは１３のアミノ酸配列または配列番号３１もしくは３２のヌクレオチド配列は「対象配列」もしくは「参照配列」として役立ちうる。一方、それとは異なるポリペプチドのアミノ酸配列または核酸配列は、「クエリー配列」として役立ちうる。
【００８１】
「配列相同性」なる語は、共通の祖先からの系統に起因する２つの（ヌクレオチドまたはアミノ酸）配列の類似性を示す。相同生物学的成分（遺伝子、タンパク質、構造）はホモログと称され、オルソログおよびパラログを含む。
【００８２】
本発明の好ましい結合性分子変異体は、ＣＤＲ領域において、少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはほぼ１００％の配列同一性または相同性を有し、「親」ＣＤＲ、特に配列番号８、９、１０、１１、１２および１３を含む結合性分子と比較して同等な若しくは改善したＦＸＩ結合アフィニティおよび／または同等な若しくは改善した生物活性を示す。
【００８３】
更に、個々の変異体ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されているヌクレオチド配列との間の核酸配列の相同性または類似性は少なくとも８０％、より典型的には、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％およびほぼ１００％（相同性または同一性が次第に増加する）である。
【００８４】
アミノ酸修飾は、ＣＤＲおよびＦＲに加えて、該結合性分子（これは、好ましくは、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである）のＦｃ部分にも導入されうる。そのような修飾は、抗体の機能的特性（例えば、補体タンパク質、例えば、Ｃ１ｑ、および／または他の免疫細胞上のＦｃ受容体との相互作用）をモジュレーションするために、または血清半減期もしくは抗原依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をモジュレーションするために用いられうる。したがって、エフェクター機能の修飾のための突然変異は、当技術分野で公知の通常の方法を用いて、Ｆｃドメイン内に導入されうる。典型的な修飾には、Ａｓｎ２９７→Ａｌａ２９７およびＡｓｎ２９７→Ｇｌｎ２９７（これらＩｇＧ１の非グリコシル化をもたらす）、またはＬｙｓ３２２→Ａｌａ３２２、および所望により、Ｌｅｕ２３４→Ａｌａ２３４およびＬｅｕ２３５→Ａｌａ２３４［これらは抗体由来細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体由来細胞傷害（ＣＤＣ）を低減または阻止すると報告されている］が含まれる。
【００８５】
誘導体
「結合性分子」なる語は誘導体をも含む。本発明において特に想定されるのは、本明細書の他の箇所に開示されている抗体または抗体フラグメントの誘導体である。「誘導体」なる語は、一般に、追加的な官能性を導入するために共有結合により修飾されている結合性分子を意味する。該結合性分子の共有結合性修飾は、常にというわけではないが一般的には、翻訳後に行われ、該分子の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応しうる有機誘導体化剤と反応させることにより、該結合性分子内に導入されうる。結合性分子の誘導体化は、治療用もしくは診断用物質、標識、該分子の血清半減期を延長させる基の結合または非天然アミノ酸の挿入のために用いられうる。本発明の結合性分子の可能な化学修飾には、Ｎ末端のアシル化またはアセチル化、あるいはＣ末端のアミド化またはエステル化、あるいはその両方におけるものが含まれる。アルキル化（例えば、メチル化、プロピル化、ブチル化）、アリール化およびエーテル化のような化学修飾も想定される。
【００８６】
血清半減期の延長
本発明の結合性分子、特に抗体およびその抗原結合性フラグメントの血清半減期を延長させるための手段の例には、ヒトの体内の他のタンパク質、例えば、血清アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域または新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合するペプチドまたはタンパク質ドメインの結合が含まれる。血清半減期を延長させるための更なる想定される修飾は、種々の長さのポリペプチド鎖（例えば、ＸＴＥＮ技術またはＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標））でのアミノ基の延長、非タンパク質性重合体、限定的なものではないが例えば、種々のポリオール、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマー、または炭水化物、例えば、ヒドロキシエチルデンプン（例えば、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標））またはポリシアル酸（例えば、ＰｏｌｙＸｅｎ（登録商標）技術）のコンジュゲート化を含む。また、当技術分野で公知のとおり、該重合体の付加を容易にするために、該結合性分子内の種々の位置でアミノ酸置換が施されうる。
【００８７】
グリコシル化
本発明の結合性分子、特に抗体およびその抗原結合性フラグメントの、もう１つのタイプの共有結合性修飾は、そのグリコシル化パターンを改変することを含む。当技術分野で公知のとおり、グリコシル化パターンは、該分子のアミノ酸配列（例えば、後記の特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）、またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物の両方に左右されうる。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型はアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。該結合性分子へのＮ結合型グリコシル化部位の付加は、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択される１以上のトリペプチド配列をアミノ酸配列が含むようにアミノ酸配列を改変することによって、簡便に達成される。Ｏ結合型グリコシル化部位は出発配列への１以上のセリンまたはトレオニン残基の付加またはそれによる置換によって導入されうる。
【００８８】
該結合性分子のグリコシル化のもう１つの手段はタンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによるものである。これらの方法は、それらが、Ｎ−およびＯ−結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で有利である。用いられるカップリング様態に応じて、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのもの、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの、あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基に糖が結合されうる。
【００８９】
同様に、脱グリコシル化（すなわち、該結合性分子上に存在する炭水化物部分の除去）は、化学的に、例えば、該結合性分子をトリフルオロメタンスルホン酸にさらすことによって、またはエンド−およびエキソ−グリコシダーゼを使用することによって酵素的に達成されうる。
【００９０】
標識
本発明の結合性分子の更なる潜在的共有結合性修飾は１以上の標識の付加を含む。標識基は、潜在的な立体障害を低減するために種々の長さのスペーサーを介して該結合性分子に結合されうる。タンパク質を標識するための種々の方法が当技術分野で公知であり、本発明の実施において使用されうる。「標識」または「標識基」なる語は任意の検出可能な標識を意味する。一般に、標識は、それらが検出されるアッセイに応じて種々のクラスに分類される。典型的な標識には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：放射活性同位体または重同位体、例えば放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）でありうる同位体標識；磁気標識（例えば、磁性粒子）；レドックス活性部分；光学的色素（限定的なものではないが、発色団、リン光体および蛍光体を含む）、例えば蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、化学発光基および発蛍光団（これらは「小分子」発蛍光団またはタンパク質性発蛍光団のいずれかでありうる）；酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；ビオチン化基；または二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。
【００９１】
ＡＤＣ
該結合性分子、特に抗体またはその抗原結合性フラグメントに、薬物、例えば小分子化合物を付加することも想定される。「抗体薬物コンジュゲート」（「ＡＤＣ」と略記される）は、薬物または薬剤に連結された抗体またはその抗原結合性フラグメントである。該連結は、共有結合、または非共有結合性相互作用、例えば静電気力によって確立されうる。当技術分野で公知であり本明細書に記載されているとおり、ＡＤＣを形成させるために、当技術分野で公知の種々のリンカーが使用されうる。
【００９２】
アフィニティタグ
本発明の結合性分子、特に抗体またはその抗原結合性フラグメントは、該分子の精製および単離を補助する追加的ドメイン（アフィニティタグ）をも含みうる。そのような追加的ドメインの非限定的な例は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグおよびその変異体（例えば、Ｓｔｒｅｐ  ＩＩタグ）およびＨｉｓタグとして公知のペプチドモチーフを含む。
【００９３】
前記のフラグメント、変異体および誘導体は、例えばそれらの抗原結合特性を改善するために更に適合化されうる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小にする又は完全に除去するように操作されうる。Ｆｖポリペプチドは更に、抗原結合に望ましい構造をＦｖが形成するのを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを含みうる。Ｆａｂフラグメントは軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常領域（ＣＨ１）をも含有する。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端における数個の残基が付加されている点で、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に関する、本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは当初は、ヒンジシステイン残基を間に含有するＦａｂ’フラグメントのペアとして産生された。
【００９４】
本発明の結合性分子は、「単離された」または「実質的に純粋な」形態で提供されうる。本明細書中で用いる「単離された」または「実質的に純粋な」は、「単離された」結合性分子が、その治療的または診断的使用を妨げうるその生産環境からの他の汚染成分を含有しない又は実質的に含有しないように、該結合性分子が同定されており、その生産環境の成分から分離および／または回収されていることを意味する。汚染成分には、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれうる。したがって、「単離された」結合性分子は、これらの汚染成分を除去する又は実質的に除去する少なくとも１つの精製工程によって製造される。前記の定義は、必要な変更を加えて「単離された」ポリヌクレオチドにも同様に適用可能である。
【００９５】
特異的結合
本発明の結合性分子、特に抗体およびその抗原結合性フラグメントは、有利には、第ＸＩ因子、特に、配列番号７に示されているアミノ酸配列を含む又はそれからなるヒト第ＸＩ因子に結合しうる。全ての文法形態における「結合する」および「認識する」なる語は本明細書において互換的に用いられる。好ましくは、前記結合性分子は第ＸＩ因子に特異的に結合する。「特異的に結合する」なる語は、一般に、本明細書に記載されている結合性分子、特に抗体またはその抗原結合性フラグメントが、その抗原結合部位を介して、その意図される標的エピトープに対しては、ランダムで無関係な非標的エピトープに対してよりも容易に結合することを示す。特に、「特異的に結合する」なる語は、該結合性分子のその標的エピトープに対するアフィニティが、非標的エピトープに対するそのアフィニティより少なくとも約５倍、好ましくは１０倍、より好ましくは２５倍、更に好ましくは５０倍、最も好ましくは１００倍以上大きいことを示す。
【００９６】
したがって、結合性分子、特に抗体またはその抗原結合性フラグメントがその標的エピトープに特異的に結合するとみなされうるのは、それが、非標的エピトープに対する該抗体のＫＤより小さい解離定数（ＫＤ）で該エピトープに結合する場合である。本発明の結合性分子は、第ＸＩ因子、特にヒト第ＸＩ因子へのその結合アフィニティに関しても記述されうる。「アフィニティ」または「結合アフィニティ」なる語は抗原結合性ドメイン（および特に該結合性分子のＣＤＲ）への個々のエピトープの結合の強度を意味する。所与の結合性分子のその特異的エピトープへの結合のアフィニティは、しばしば、平衡会合定数（ｋａ）および平衡解離定数（ｋｄ）の測定ならびにｋａに対するｋｄの比率（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）の計算により決定される。結合アフィニティは、従来の技術を用いて、例えば、平衡透析により、またはＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００装置を使用することにより、または放射性標識標的抗原を使用するラジオイムノアッセイにより、または当業者に公知の別の方法により、容易に決定されうる。アフィニティデータは、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪおよびＳｈａｒｐ  ＰＡ．（１９８２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されている方法により分析されうる。本発明の結合性分子の好ましい結合アフィニティには、多くとも５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍまたは１０−１５Ｍの解離定数またはＫＤを有するものが含まれる。
【００９７】
交差反応性
しかし、「特異的に結合する」なる語は、ヒト第ＸＩ因子に（特異的に）結合する結合性分子が、異なる種由来の第ＸＩ因子タンパク質と交差反応することを除外するものではない。したがって、本発明の結合性分子はまた、他の哺乳動物種、好ましくは、本明細書の他の箇所に例示されている非ヒト霊長類種に由来するＦＸＩに結合可能でありうる。
【００９８】
「異種間」結合または認識は、本明細書に記載されている結合ドメインの、ヒトおよび非ヒト種における同じ標的抗原への結合を意味する。したがって、「異種間特異性」は、第ＸＩ因子以外の抗原に対するものではなく、異なる種において発現された第ＸＩ因子に対する種間反応性として理解されるべきである。例えば、ヒト第ＸＩ因子、特に、配列番号７に示されているアミノ酸配列のアミノ酸２００〜２８３を含むＡ３ドメインに結合する結合ドメインは、非ヒト霊長類第ＸＩ因子、特に、配列番号７に示されているアミノ酸配列のアミノ酸２００〜２８３に対応する領域にも結合しうる。
【００９９】
生物活性
本発明で提供する結合性分子は、生物学的に活性である、すなわち、第ＸＩ因子および／または第ＸＩａ因子に結合し、そのそれぞれの生物学的機能を遮断すると想定される。特に、本発明による「生物学的に活性な」結合性分子は第ＸＩ因子からその活性形態（第ＸＩａ因子）への変換を遮断し、および／または第ＸＩａ因子への下流凝固第ＩＸ因子の結合を遮断して、好ましくは、第ＸＩ因子および／または第ＸＩａ因子の活性の完全または部分的な抑制をもたらす。したがって、生物学的に活性な結合性分子のその標的第ＸＩ因子および／または第ＸＩａ因子への結合は抗凝固活性をもたらすと想定される。換言すれば、本発明の結合性分子は、ａ）第ＸＩａ因子に結合し、それにより、その活性形態第ＸＩａ因子へのその変換を遮断すること、および／またはｂ）第ＸＩａ因子に結合し、それにより、下流凝固第ＩＸ因子へのその結合および該因子の活性化を遮断することによって、その有益な機能を発揮すると想定される。それにより、本発明の結合性分子は、好ましくは、凝固カスケードの「ＦＸＩ分岐」を遮断し、それにより、有利には正常な止血を損なうことなく、血栓症を予防する。
【０１００】
結合性分子の抗凝固活性は、実験例に記載されているとおり、インビトロで決定されうる。簡潔に説明すると、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、市販の試験キット（ＲｏｃｈｅのＰＴＴ試薬）を使用して、種々の濃度の該結合性分子または対応溶媒の存在下で決定される。試験化合物を血漿およびＰＴＴ試薬（セファリン、カオリン）と共に３７℃で３分間インキュベートする。ついで、２５ｍＭ  塩化カルシウムの添加により凝固を開始させ、凝固が生じた時間を決定する。ａＰＴＴの１．５倍の延長をもたらす試験物質の濃度を決定する。
【０１０１】
本発明の結合性分子の濃度は、０．０３μＭ以下、または０．０１５μＭ以下、または０．０１μＭ以下の濃度で、ａＰＴＴの１．５倍の延長をもたらすと想定される。
【０１０２】
有利には、本発明の結合性分子、特にモノクローナル抗体およびその抗原結合性フラグメントは前記の生物学的特性を示し、したがって、血栓症の抑制のための新規物質として有望である。該結合性分子は、特に、第ＸＩ因子に特異的に結合すると想定されるため、それは止血を損なわず、または著しくは損なわず、それにより、好ましくは、出血のリスクを増加させないと想定される。
【０１０３】
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本発明の結合性分子またはＶＨもしくはＶＬドメインをコードするポリヌクレオチド／核酸分子を提供する。
【０１０４】
本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」なる語はポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチド、例えば、修飾または非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡを含み、それぞれは一本鎖および／または二本鎖形態、直鎖状または環状、あるいはそれらの混合物（ハイブリッド分子を含む）である。ポリヌクレオチドは通常のホスホジエステル結合または通常でない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で見られるようなアミド結合）を含みうる。本発明のポリヌクレオチドは、１以上の修飾塩基、例えば、トリチル化塩基、および普通でない塩基、例えばイノシンをも含有しうる。本発明の結合性分子がポリヌクレオチドから発現されうる限り、化学的、酵素的または代謝的修飾を含む他の修飾も想定されうる。ポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に定められている単離された形態で提供されうる。ポリヌクレオチドは、調節配列、例えば転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルを含む）、リボソーム結合部位、イントロンなど含みうる。
【０１０５】
したがって、本発明は、免疫グロブリン重鎖領域（ＶＨ領域）をコードする核酸を含む又はそれからなるポリヌクレオチドを提供し、ここで、ＶＨ領域のＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号１１、１２、１３、１５または１６（配列番号１１〜１３が好ましい）のいずれかに対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または同一であるアミノ酸配列を有する。更に、本発明は、配列番号１８および２０（配列番号１８が好ましい）からなる群から選択される参照ＶＨ領域アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨ領域をコードする核酸を含む又はそれからなるポリヌクレオチドを含む。コード化ＣＤＲまたはＶＨドメインを含む結合性分子はＦＸＩに結合可能であり、好ましくは、本明細書の他の箇所に記載されている所望の生物活性を示すと想定される。
【０１０６】
更に、本発明は、免疫グロブリン軽鎖領域（ＶＬ領域）をコードする核酸を含む又はそれからなるポリヌクレオチドを提供し、ここで、ＶＬ領域のＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号８、９、１０または１４（配列番号８〜１０が好ましい）のいずれかに対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または同一であるアミノ酸配列を有する。更に、本発明は、配列番号１７および１９（配列番号１７が好ましい）からなる群から選択される参照ＶＬ領域アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬ領域をコードする核酸を含む又はそれからなるポリヌクレオチドを含む。コード化ＣＤＲまたはＶＬドメインを含む結合性分子はＦＸＩに結合可能であり、好ましくは、本明細書の他の箇所に記載されている所望の生物活性を示すと想定される。
【０１０７】
更に、本発明は、配列番号３１、３２、３３および３４からなる群から選択される参照ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％同一である核酸を含む又はそれからなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１０８】
前記ポリヌクレオチドは、例えば、コード化ポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチド、本明細書に記載されている抗体定常領域または本明細書に記載されている他の異種ポリペプチドをコードする追加的ヌクレオチド配列を含んでもいても含んでいなくてもよい。したがって、そのようなポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている結合性分子の融合ポリペプチド、断片、変異体および他の誘導体をコードしうる。
【０１０９】
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドの１以上を含む組成物を含む。本発明はまた、第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドとを含む組成物を提供し、ここで、第１ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているＶＨ領域をコードし、第２ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているＶＬ領域をコードする。該組成物は特に、配列番号１８および２０（配列番号１８が好ましい）からなる群から選択されるＶＨ領域ならびに／または配列番号１７および１９（配列番号１７が好ましい）からなる群から選択されるＶＬ領域を含む又はそれからなる組成物である。
【０１１０】
ポリヌクレオチドの製造
本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の通常の方法により製造されうる。例えば、該結合性分子のヌクレオチド配列が既知である場合には、該結合性分子をコードするポリヌクレオチドを化学合成オリゴヌクレオチドから合体させ、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結を行い、ついで連結オリゴヌクレオチドの増幅をＰＣＲにより行うことが可能である。結合性分子をコードするポリヌクレオチドは、該配列の３’および５’末端にハイブリダイズしうる合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または例えば、該結合性分子をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを特定するために個々の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって、適切な起源（例えば、ｃＤＮＡライブラリー、または該結合性分子を発現する任意の組織または細胞、例えばハイブリドーマ細胞から単離されたポリ（Ａ）＋  ｍＲＮＡのような核酸）から得られうる。
【０１１１】
該結合性分子のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列が決定されたら、ヌクレオチド配列の操作のための当技術分野でよく知られた方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなどを用いて、そのヌクレオチド配列を修飾することが可能であり、それにより、１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失をポリヌクレオチド配列内に導入して（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１２）に記載されている技術を参照されたい）、本明細書に記載されている結合性分子、特にモノクローナル抗ＦＸＩ抗体（例えば、免疫グロブリン重鎖領域または軽鎖領域）の天然に存在しない断片、変異体または誘導体を作製することが可能である。
【０１１２】
ベクター
更に、本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。該ポリヌクレオチドは本発明の結合性分子、特にモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする。「ベクター」は、それが例えば複製および／または発現されうる宿主細胞内に（外来）遺伝物質を導入するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。
【０１１３】
「ベクター」なる語は、プラスミド、ウイルスベクター（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクターおよびアデノウイルス関連ベクター（ＡＡＶ）を含む）、ファージ、ファージミド、コスミドおよび人工染色体（ＢＡＣおよびＹＡＣを含む）を含むが、これらに限定されるものではない。ベクター自体は、一般に、インサート（トランスジーン）と、ベクターの「骨格」として働く、より大きな配列とを含むヌクレオチド配列、一般にＤＮＡ配列である。操作されたベクターは、典型的には、宿主細胞における自律複製のための起点（ポリヌクレオチドの安定発現が望まれる場合）、選択マーカーおよび制限酵素切断部位（例えば、マルチクローニング部位、ＭＣＳ）を含む。ベクターは、プロモーター、遺伝的マーカー、レポーター遺伝子、標的化配列および／またはタンパク質精製タグを更に含みうる。発現ベクター（発現構築物）と称されるベクターは、特に、標的細胞におけるトランスジーンの発現のために設計されており、一般には制御配列を有する。
【０１１４】
多数の適切なベクターが当業者に公知であり、多数が商業的に入手可能である。適切なベクターの例は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１２）に記載されている。
【０１１５】
標的化ベクター
標的化ベクターは、ポリヌクレオチドを宿主細胞の染色体内に組込むために使用されうる（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１２）に記載されている）。簡潔に説明すると、適切な手段は、相同組換え、または組込み部位において配列を特異的に標的化するハイブリッドリコンビナーゼの使用を含む。標的化ベクターは典型的には環状であり、相同組換えに使用される前に線状化される。代替手段として、外来ポリヌクレオチドは、融合ＰＣＲによって連結されたＤＮＡ断片、または後に宿主細胞内で組換えられる合成的に構築されたＤＮＡ断片でありうる。ランダムまたは非標的化組込みをもたらす異種組換えを用いることも可能である。
【０１１６】
製造
発現ベクター
「発現ベクター」または「発現構築物」は、異種ポリヌクレオチド配列、例えば本発明の結合性分子をコードするものの転写、および適切な宿主細胞におけるそれらのｍＲＮＡの翻訳に使用されうる。この過程は本明細書においては本発明の結合性分子の「発現」とも称される。複製起点、選択マーカーおよび制限酵素切断部位に加えて、発現ベクターは、典型的には、発現される異種ポリヌクレオチドに機能的に連結された１以上の調節配列を含む。
【０１１７】
「調節配列」なる語は、特定の宿主生物における（異種）ポリヌクレオチドの機能的に連結されたコード配列の発現に必要な核酸配列を意味し、したがって、転写および翻訳調節配列を含む。典型的には、原核生物における異種ポリヌクレオチド配列の発現に必要な調節配列には、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核生物においては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーおよび場合によってはスプライスシグナルが典型的に必要とされる。更に、関心のあるポリペプチドの培地内への分泌を可能にするために、特異的な開始シグナルおよび分泌シグナルもベクター内に導入されうる。
【０１１８】
核酸が「機能的に連結されている」と言えるのは、それが、特に同一ポリヌクレオチド分子上で、別の核酸配列に対して機能的な関係で配置されている場合である。例えば、プロモーターが異種遺伝子のコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、それがそのコード配列の発現をもたらしうる場合である。プロモーターは典型的には、関心のあるポリペプチドをコードする遺伝子の上流に配置され、遺伝子の発現を調節する。
【０１１９】
哺乳類宿主細胞発現のための典型的な調節配列には、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマが含まれる。ウイルス調節エレメントおよびその配列の更なる説明は、Ｓｔｉｎｓｋｉ，Ｕ．Ｓ．５，１６８，０６２、Ｂｅｌｌ，Ｕ．Ｓ．４，５１０，２４５、Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら，Ｕ．Ｓ．４，９６８，６１５を参照されたい。既に記載されているとおり、発現ベクターは複製起点および選択マーカーをも含みうる。
【０１２０】
既に記載されているとおり、本発明のベクターは１以上の選択マーカーを更に含みうる。真核生物宿主細胞と共に使用するための適切な選択マーカーには、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｇｐｒｔ）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ａｐｒｔ）遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の遺伝子には、ｄｈｆｒ（メトトレキサート耐性）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸耐性）、ｎｅｏ（Ｇ−４１８耐性）およびｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシン耐性）が含まれる。発現レベルを増加させるために、ベクター増幅が用いられうる。一般に、選択マーカー遺伝子は、発現されるべきポリヌクレオチド配列に直接的に連結されることが可能であり、あるいは、同時形質転換によって同一宿主細胞内に導入されうる。
【０１２１】
したがって、前記を考慮して、本発明は更に、ベクター内に挿入された本明細書に記載されているポリヌクレオチド配列の１以上を提供する。したがって、本発明は特に、プロモーターに機能的に連結された、本発明の結合性分子またはその重鎖もしくは軽鎖または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、該結合性分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことが可能であり、該結合性分子の可変ドメインは、重鎖または軽鎖全体の発現のために、そのようなベクター内にクローニングされうる。
【０１２２】
宿主細胞
一般に、発現ベクターから本発明の結合性分子を発現させるために、種々の宿主細胞が使用されうる。本明細書中で用いる「宿主細胞」は、本発明の結合性分子をコードするポリヌクレオチドまたはベクターのレシピエントでありうる又はレシピエントとなっている細胞を意味する。特に、宿主細胞は更に、該結合性分子を発現し、所望により分泌しうる。宿主細胞から結合性分子を得るための方法の説明において、「細胞」および「細胞培養」なる語は、特に明記されていない限り、結合性分子の起源を示すために互換的に用いられる。「宿主細胞」なる語は「宿主細胞系」をも含む。
【０１２３】
一般に、この語は原核細胞または真核細胞を含み、細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、および動物細胞、例えば昆虫細胞、および哺乳類細胞、例えばマウス、ラット、マカクまたはヒト細胞をも含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、当技術分野で公知の通常の方法を用いて、例えばトランスフェクション、形質転換などにより、宿主細胞内に導入されうる。
【０１２５】
「トランスフェクション」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞内に意図的に導入する方法である。この語は主に真核細胞における非ウイルス的方法に関して用いられる。トランスダクション（形質導入）は、しばしば、核酸分子またはポリヌクレオチドのウイルス媒介性導入を示すために用いられる。動物細胞のトランスフェクションは、典型的には、物質の取り込みを可能にするために、細胞膜に一過性の孔または「穴」を開けることを含む。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを用いて、またはエレクトロポレーションにより、または細胞圧搾により、またはカチオン性脂質を物質と混合してリポソーム［これは細胞膜と融合し、そのカーゴ（運搬物）を内部に沈着させる］を形成させることにより行われうる。真核宿主細胞をトランスフェクトするための典型的な技術には、脂質小胞媒介性取り込み、熱ショック媒介性取り込み、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈）、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションが含まれる。
【０１２６】
「形質転換」なる語は、細菌内への、そしてまた、植物細胞を含む非動物真核細胞内への核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）の非ウイルス性導入を示すために用いられる。したがって、形質転換は細菌細胞または非動物真核細胞の遺伝的改変であり、これは、外因性遺伝物質（核酸分子）が細胞の周囲から細胞膜を介して直接的に取り込まれ、ついで組込まれることによるものである。形質転換は人工的手段によって行われうる。形質転換が生じるためには、細胞または細菌はコンピテンスの状態になければならず、これは飢餓および細胞密度のような環境条件に対する時間限定応答として生じうる。原核生物の形質転換のための技術には、熱ショック媒介性取り込み、無傷細胞との細菌プロトプラスト融合、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションが含まれうる。植物の形質転換のための技術には、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によるアグロバクテリウム媒介性導入、高速推進タングステンまたは金マイクロプロジェクタイル、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびポリエチレングリコール媒介性取り込みが含まれる。
【０１２７】
したがって、前記を考慮して、本発明は更に、本明細書に記載されている少なくとも１つのポリヌクレオチド配列および／またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１２８】
本発明の結合性分子の発現のためには、挿入されたポリヌクレオチド配列の発現をモジュレーションする、および／または所望により遺伝子産物（すなわち、ＲＮＡおよび／またはタンパク質）を修飾しプロセシングする宿主細胞が選択されうる。遺伝子産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は該結合性分子の機能に重要でありうる。種々の宿主細胞は遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的メカニズムを有する。産物の適切な修飾およびプロセシングが確保されるように、適切な細胞系または宿主系が選択されうる。この目的のためには、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用されうる。
【０１２９】
本発明で提供する結合性分子を発現させるために使用されうる典型的な哺乳類宿主細胞には、以下のものが含まれる：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、例えばＤＨＦＲマイナスＣＨＯ細胞、例えばＤＧ４４およびＤＵＸＢｌ  １、およびＵ．Ｓ．  ４，６３４，６６５に記載されているもの（例えば、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるもの、例えば、ＵＳ  ５，１７９，０１７に記載されているもの）、ＮＳＯ、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＨＥＫ２９３（ヒト腎臓）、およびＳＰ２（マウス骨髄腫）細胞。他の典型的な宿主細胞系には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎系）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベイビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎系）、Ｐ３×６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃＩＢＰＴ（ウシ内皮細胞）およびＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）。宿主細胞系は、典型的には、商業的サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または公開文献から利用可能である。
【０１３０】
細菌、酵母、昆虫または植物細胞のような非哺乳類細胞も容易に利用可能であり、原則として、本発明の結合性分子の発現に使用されうる。典型的な細菌宿主細胞には、腸内細菌科細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；バチルス科細菌（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、例えばバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）が含まれる。
【０１３１】
他の宿主細胞には、酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。昆虫細胞には、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１３２】
前記に従い、想定される発現系（すなわち、前記の発現ベクターを含む宿主細胞）には、以下のものが含まれる：組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））のような微生物；組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ））；組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）に感染した又は組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を含む哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。
【０１３３】
本発明の結合性分子の発現のためには、真核細胞が特に想定される。したがって、本発明の結合性分子をコードするポリヌクレオチド配列［これは、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の主要最初期プロモーター（ＭＩＥＰ）に機能的に連結されていてもよい］を含有する真核生物ベクターを含むＣＨＯ細胞は本発明の結合性分子の製造のための有用な発現系である。
【０１３４】
培養
発現ベクターを含有する宿主細胞を、本明細書に記載されている結合性分子、特に本明細書の他の箇所に記載されている軽鎖および重鎖の産生に適した条件下で増殖させ、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成に関してアッセイする。したがって、本発明は、プロモーターに機能的に連結された本発明の結合性分子またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現のために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを全分子の発現のために宿主細胞において同時発現させることが可能である。
【０１３５】
精製
本発明の結合性分子が組換え発現されたら、それは、当技術分野で公知の任意の精製方法、例えば、クロマトグラフィー［例えば、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、アフィニティクロマトグラフィー、特にプロテインＡ、プロテインＧまたはレクチンアフィニティクロマトグラフィー、サイジングカラムクロマトグラフィー］、遠心分離、溶解度差、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術により精製されうる。当業者は、回収されるべき結合性分子の個々の特性に基づいて、適切な精製方法を容易に選択しうるであろう。
【０１３６】
したがって、前記を考慮して、本発明はまた、該結合性分子の発現を可能にする条件下、本明細書中に定められている宿主細胞を培養し、所望により、産生された結合性分子を培養から回収することを含む、本発明の結合性分子の製造方法を提供する。
【０１３７】
医薬組成物
本発明は更に、本発明の結合性分子、核酸、ベクターおよび／または宿主細胞と所望により１以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。好ましい医薬組成物は、本発明の抗体と、所望により１以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む。
【０１３８】
したがって、１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されている結合性分子、特に抗ＦＸＩ抗体またはその抗原結合性フラグメントを活性物質として含む医薬組成物に関する。したがって、医薬組成物の製造のための該結合性分子の使用も本明細書において想定される。「医薬組成物」なる語は特に、ヒトへの投与に適した組成物を意味する。しかし、非ヒト動物への投与に適した組成物もこの語に含まれる。
【０１３９】
医薬組成物およびその成分（すなわち、活性物質および所望により賦形剤）は、好ましくは、薬学的に許容される、すなわち、被投与者において望ましくない局所的または全身的作用を引き起こすことなく所望の治療効果をもたらしうる。本発明の薬学的に許容される組成物は、特に、無菌であり、および／または薬学的に不活性でありうる。特に、「薬学的に許容される」なる語は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、規制当局または他の一般に認められている薬局方によって承認されていることを意味しうる。
【０１４０】
本明細書に記載されている結合性分子は、好ましくは、医薬組成物中に治療的有効量で存在する。「治療的有効量」は、所望の治療効果をもたらす該結合性分子の量を意味する。治療有効性および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％において致死的な用量）により決定されうる。治療効果と毒性効果との用量比は治療指数であり、それはＥＤ５０／ＬＤ５０なる比として表されうる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。
【０１４１】
前記のとおり、医薬組成物は、所望により、１以上の賦形剤および／または追加的な活性物質を含みうる。
【０１４２】
抗体およびそのフラグメントは、一般に、非経口的に、特に静脈内（注射または注入）または皮下に投与される。非経口投与用の組成物には、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれるが、これらに限定されるものではない。水性溶媒は、水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液、例えば塩類液および緩衝媒体、例えばリン酸緩衝食塩水（これに限定されるものではない）からなる群から選択されうる。非経口ビヒクルには更に、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。他の適切な医薬担体、希釈剤および／または賦形剤は当技術分野においてよく知られている。本発明の結合性分子、例えば抗体またはその抗体フラグメントは、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤（例えば、前記のもの）と組合されて医薬組成物を構成しうる。医薬組成物は、ヒスチジンバッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファーおよびヒスチジン／ＨＣｌバッファーからなる群から選択される緩衝剤を含む水性担体中に本発明の結合性分子を含みうる。追加的なバッファーおよび処方情報は、例えば、Ｗａｎｇ  Ｗら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉ．２００７  Ｊａｎ（１）：１−２６において当業者に利用可能である。保存剤、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在しうる。
【０１４３】
医薬組成物は更に、タンパク質性担体、例えば血清アルブミンまたは免疫グロブリン、特にヒト由来のものを含みうる。１つの実施形態においては、医薬組成物は凍結乾燥形態の該結合性分子を含み、好ましくは、投与前に溶液または懸濁液中に再構成（還元）される。もう１つの実施形態においては、医薬組成物は該結合性分子を含み、液体形態である。
【０１４４】
本発明の医薬組成物および所望により適切な賦形剤が製造された後、それらは適切な容器内に配置され、適応状態の治療に関してラベル表示されうる。そのようなラベル表示は、例えば、投与の量、頻度および方法を含むであろう。
【０１４５】
追加的な活性物質
本発明は更に、特に本明細書に記載されている障害の治療および／または予防のための、本発明の化合物および１以上の更なる活性成分を含む医薬または医薬組成物を提供する。組合せに適した活性成分の好ましい例には以下のものが含まれる：
・脂質低下物質、特にＨＭＧ−ＣｏＡ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ）レダクターゼインヒビター、限定的なものではないが例えば、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）（Ｍｅｖａｃｏｒ）、シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）（Ｚｏｃｏｒ）、プラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ）、フルバスタチン（ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）（Ｌｅｓｃｏｌ）およびアトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）（Ｌｉｐｉｔｏｒ）（これらに限定されるものではない）；
・冠動脈治療薬／血管拡張薬、特にＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）インヒビター、限定的なものではないが例えば、カプトプリル（ｃａｐｔｏｐｒｉｌ）、リシノプリル（ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌ）、エナラプリル（ｅｎａｌａｐｒｉｌ）、ラミプリル（ｒａｍｉｐｒｉｌ）、シラザプリル（ｃｉｌａｚａｐｒｉｌ）、ベナゼプリル（ｂｅｎａｚｅｐｒｉｌ）、フォシノプリル（ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ）、キナプリル（ｑｕｉｎａｐｒｉｌ）およびペリンドプリル（ｐｅｒｉｎｄｏｐｒｉｌ）、またはＡＩＩ（アンジオテンシンＩＩ）受容体アンタゴニスト、限定的なものではないが例えば、エンブサルタン（ｅｍｂｕｓａｒｔａｎ）、ロサルタン（ｌｏｓａｒｔａｎ）、バルサルタン（ｖａｌｓａｒｔａｎ）、イルベサルタン（ｉｒｂｅｓａｒｔａｎ）、カンデサルタン（ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ）、エプロサルタン（ｅｐｒｏｓａｒｔａｎ）およびテミサルタン（ｔｅｍｉｓａｒｔａｎ）、またはアドレナリン受容体アンタゴニスト、限定的なものではないが例えば、カルベジロール（ｃａｒｖｅｄｉｌｏｌ）、アルプレノロール（ａｌｐｒｅｎｏｌｏｌ）、ビソプロロール（ｂｉｓｏｐｒｏｌｏｌ）、アセブトロール（ａｃｅｂｕｔｏｌｏｌ）、アテノロール（ａｔｅｎｏｌｏｌ）、ベタキソロール（ｂｅｔａｘｏｌｏｌ）、カルテオロール（ｃａｒｔｅｏｌｏｌ）、メトプロロール（ｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌ）、ナドロール（ｎａｄｏｌｏｌ）、ペンブトロール（ｐｅｎｂｕｔｏｌｏｌ）、ピンドロール（ｐｉｎｄｏｌｏｌ）、プロパノロール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）およびチモロール（ｔｉｍｏｌｏｌ）、またはアルファ−１−アドレナリン受容体アンタゴニスト、限定的なものではないが例えば、プラゾシン（ｐｒａｚｏｓｉｎｅ）、ブナゾシン（ｂｕｎａｚｏｓｉｎｅ）、ドキサゾシン（ｄｏｘａｚｏｓｉｎｅ）およびテラゾシン（ｔｅｒａｚｏｓｉｎｅ）、または利尿薬、限定的なものではないが例えば、ヒドロクロロチアジド（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｉａｚｉｄｅ）、フロセミド（ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ）、ブメタニド（ｂｕｍｅｔａｎｉｄｅ）、ピレタニド（ｐｉｒｅｔａｎｉｄｅ）、トランセミド（ｔｏｒａｓｅｍｉｄｅ）、アミロリド（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）およびジヒドララジン（ｄｉｈｙｄｒａｌａｚｉｎｅ）、またはカルシウムチャネルブロッカー、限定的なものではないが例えば、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）およびジルチアゼム（ｄｉｌｔｉａｚｅｍ）、またはジヒドロピリジン誘導体、限定的なものではないが例えば、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎ）（Ａｄａｌａｔ）およびニトレンジピン（ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎｅ）（Ｂａｙｏｔｅｎｓｉｎ）、またはニトロ製剤、限定的なものではないが例えば、イソソルビド（ｉｓｏｓｏｒｂｉｄｅ）５−モノニトラート、イソソルビドジニトラートおよびグリセロールトリニトラート、または環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の増加を引き起こす物質、限定的なものではないが例えば、可溶性グアニル酸シクラーゼの刺激物質、限定的なものではないが例えば、リオシグアト（ｒｉｏｃｉｇｕａｔ）；
・プラスミノーゲンアクチベーター（血栓溶解剤／線溶剤）および血栓溶解／線溶を促進する化合物、限定的なものではないが例えば、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターのインヒビター（ＰＡＩインヒビター）またはトロンビン活性化フィブリン溶解インヒビターのインヒビター（ＴＡＦＩインヒビター）、限定的なものではないが例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、レテプラーゼ（ｒｅｔｅｐｌａｓｅ）およびウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）；
・抗凝固性物質（抗凝固剤）、限定的なものではないが例えば、ヘパリン（ＵＦＨ）、低分子量ヘパリン（ＬＭＷ）、限定的なものではないが例えば、チンザパリン（ｔｉｎｚａｐａｒｉｎ）、セルトパリン（ｃｅｒｔｏｐａｒｉｎ）、パルナパリン（ｐａｒｎａｐａｒｉｎ）、ナドロパリン（ｎａｄｒｏｐａｒｉｎ）、アルデパリン（ａｒｄｅｐａｒｉｎ）、エノキサパリン（ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ）、レビパリン（ｒｅｖｉｐａｒｉｎ）、ダルテパリン（ｄａｌｔｅｐａｒｉｎ）、ダナパロイド（ｄａｎａｐａｒｏｉｄ）、セムロパリン（ｓｅｍｕｌｏｐａｒｉｎ）（ＡＶＥ５０２６）、アドミパリン（ａｄｏｍｉｐａｒｉｎ）（Ｍ１１８）およびＥＰ−４２６７５／ＯＲＧ４２６７５；
・直接トロンビンインヒビター（ＤＴＩ）、限定的なものではないが例えば、プラダキサ（Ｐｒａｄａｘａ）（ダビガトラン（ｄａｂｉｇａｔｒａｎ））、アテセガトラン（ａｔｅｃｅｇａｔｒａｎ）（ＡＺＤ−０８３７）、ＤＰ−４０８８、ＳＳＲ−１８２２８９Ａ、アルガトロバン（ａｒｇａｔｒｏｂａｎ）、ビバリルジン（ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）およびタノギトラン（ｔａｎｏｇｉｔｒａｎ）（ＢＩＢＴ−９８６およびプロドラッグＢＩＢＴ−１０１１）、ヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）；
・直接第Ｘａ因子インヒビター、限定的なものではないが例えば、リバロキサバン（ｒｉｖａｒｏｘａｂａｎ）、アピキサバン（ａｐｉｘａｂａｎ）、エドキサバン（ｅｄｏｘａｂａｎ）（ＤＵ−１７６ｂ）、ベトリキサバン（ｂｅｔｒｉｘａｂａｎ）（ＰＲＴ−５４０２１）、Ｒ−１６６３、ダレキサバン（ｄａｒｅｘａｂａｎ）（ＹＭ−１５０）、オタミキサバン（ｏｔａｍｉｘａｂａｎ）（ＦＸＶ−６７３／ＲＰＲ−１３０６７３）、レタキサバン（ｌｅｔａｘａｂａｎ）（ＴＡＫ−４４２）、ラザキサバン（ｒａｚａｘａｂａｎ）（ＤＰＣ−９０６）、ＤＸ−９０６５ａ、ＬＹ−５１７７１７、タノギトラン（ｔａｎｏｇｉｔｒａｎ）（ＢＩＢＴ−９８６、プロドラッグ：ＢＩＢＴ−１０１１）、イドラパリヌクス（ｉｄｒａｐａｒｉｎｕｘ）およびフォンダパリヌクス（ｆｏｎｄａｐａｒｉｎｕｘ）、
・血小板凝集抑制物質（血小板凝集インヒビター、栓球凝集インヒビター）、限定的なものではないが例えば、アセチルサリチル酸（例えば、アスピリン（Ａｓｐｉｒｉｎ））、チクロピジン（ｔｉｃｌｏｐｉｄｉｎｅ）（チクリド（Ｔｉｃｌｉｄ））、クロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）（プラビックス（Ｐｌａｖｉｘ））、プラスグレル（ｐｒａｓｕｇｒｅｌ）、チカグレロール（ｔｉｃａｇｒｅｌｏｒ）、カングレロール（ｃａｎｇｒｅｌｏｒ）、エリノグレル（ｅｌｉｎｏｇｒｅｌ）、ボラパキサール（ｖｏｒａｐａｘａｒ）；
・フィブリノーゲン受容体アンタゴニスト（糖タンパク質−ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト）、限定的なものではないが例えば、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、エプチフィバチド（ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）、チロフィバン（ｔｉｒｏｆｉｂａｎ）、ラミフィバン（ｌａｍｉｆｉｂａｎ）、レフラダフィバン（ｌｅｆｒａｄａｆｉｂａｎ）およびフラダフィバン（ｆｒａｄａｆｉｂａｎ）；
・抗不整脈薬；
・種々の抗生物質または抗真菌薬であって、計画的な療法（微生物診断の存在前）または特定の療法としてのもの；
・昇圧薬、限定的なものではないが例えば、ノルエピネフリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）およびバソプレシン（ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）；
・変力療法、限定的なものではないが例えば、ドブタミン（ｄｏｂｕｔａｍｉｎｅ）；
・組換えヒト活性化プロテインＣ、例えばキシグリス（Ｘｉｇｒｉｓ）；
・血液製剤、限定的なものではないが例えば、赤血球濃縮物、血小板濃縮物、エリスロピエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｉｅｔｉｎ）および新鮮凍結血漿；
・血小板粘着のインヒビター、例えばＧＰＶＩおよび／またはＧＰＩｂアンタゴニスト、限定的なものではないが例えば、レバセプト（Ｒｅｖａｃｅｐｔ）またはカプラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）；
・ＶＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦ依存性シグナル伝達経路のインヒビター、限定的なものではないが例えば、アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）、ＫＨ−９０２、ペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、スクアラミン（Ｓｑｕａｌａｍｉｎ）またはベバシラニブ（Ｂｅｖａｓｉｒａｎｉｂ）、アパチニブ（Ａｐａｔｉｎｉｂ）、アキシチニブ（Ａｘｉｔｉｎｉｂ）、ブリバニブ（Ｂｒｉｖａｎｉｂ）、セジラニブ（Ｃｅｄｉｒａｎｉｂ）、ドビチニブ（Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ）、レンバチニブ（Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、リニファニブ（Ｌｉｎｉｆａｎｉｂ）、モテサニブ（Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、レゴラフェニブ（Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、チボザニブ（Ｔｉｖｏｚａｎｉｂ）、バンデタニブ（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）、バタラニブ（Ｖａｔａｌａｎｉｂ）、バルガテフ（Ｖａｒｇａｔｅｆ）またはＥ−１００３０；
・アンジオポエチン−Ｔｉｅシグナル伝達経路のインヒビター、限定的なものではないが例えば、ＡＭＧ３８６；
・Ｔｉｅ２受容体チロシンキナーゼ活性のインヒビター；
・インテグリン依存性シグナル伝達経路のインヒビター、限定的なものではないが例えば、ボロシキシマブ（Ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、シレンジチド（Ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄ）またはＡＬＧ１００１；
・ＰＩ３キナーゼ−ＡＫＴ−ｍＴｏｒ依存性シグナル伝達のインヒビター、限定的なものではないが例えば、ＸＬ−１４７、ペリフォシン（Ｐｅｒｉｆｏｓｉｎ）、ＭＫ２２０６、シロリムス（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、テムシロリムス（Ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）またはエベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）；
・コルチコステロイド、限定的なものではないが例えば、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、フルドロコルチゾン（ｆｌｕｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、アネコルタブ（Ａｎｅｃｏｒｔａｖｅ）、ベタメタソン（Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ）、トリアムシノロン（Ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎ）、フルオシノロン（Ｆｌｕｏｃｉｎｏｌｏｎ）またはフルオシノロンアセトニド（Ｆｌｕｏｃｉｎｏｌｏｎａｃｅｔｏｎｉｄ）；
・ＡＬＫ１−Ｓｍａｄ１／５依存性シグナル伝達経路のインヒビター、限定的なものではないが例えば、ＡＣＥ０４１；
・シクロオキシゲナーゼのインヒビター、限定的なものではないが例えば、ブロムフェナク（Ｂｒｏｍｆｅｎａｃ）またはネパフェナク（Ｎｅｐａｆｅｎａｃ）；
・カリクレイン−キニン系のインヒビター、限定的なものではないが例えば、サフォチバント（Ｓａｆｏｔｉｂａｎｔ）またはエカランチド（Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄ）；
・スフィンゴシン−１−ホスファート依存性シグナル伝達経路のインヒビター、限定的なものではないが例えば、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）；
・補体Ｃ５ａ受容体のインヒビター、限定的なものではないが例えば、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）；
・５ＨＴ  １ａ受容体のインヒビター、限定的なものではないが例えば、タンドスピロン（Ｔａｎｄｏｓｐｉｒｏｎ）；
・Ｒａｆ−Ｍｅｋ−Ｅｒｋ依存性シグナル伝達経路のインヒビター、ＭＡＰＫシグナル伝達経路のインヒビター、ＦＧＦシグナル伝達経路のインヒビター、内皮細胞増殖のインヒビター、およびアポトーシスを誘導しうる化合物；または
・活性物質および光への曝露からなる光線力学療法［ここで、活性物質は、例えば、ベルテポルフィン（Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）である］；
本発明の目的における「組合せ」は、全ての成分を含有する剤形（いわゆる固定組合せ）および互いから分離した成分を含有する組合せパックだけでなく、同時または連続的に投与される成分をも意味する。ただし、それらは同一疾患の予防および／または治療に使用される。２以上の活性成分を互いに組合せることも同様に可能であり、このことは、それらがそれぞれ二成分または多成分の組合せであることを意味している。
【０１４６】
投与
本発明の医薬組成物の投与には種々の経路が適用可能である。典型的には、投与は非経口的に行われる。非経口運搬の方法には、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内、舌下または鼻腔内投与が含まれる。
【０１４７】
非経口投与用の医薬製剤には、活性化合物の水溶液が含まれる。注射の場合、本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは、生理的に許容されるバッファー、例えば、ハンクス液、リンガー液、たは生理緩衝食塩水中で製剤化されうる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有しうる。また、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁液として製造されうる。典型的な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。所望により、該懸濁液は、適切な安定剤、または該化合物の溶解度を増加させて高濃度溶液の調製を可能にする物質をも含有しうる。局所または経鼻投与の場合には、浸透させる個々の障壁に適した浸透剤が製剤中で使用される。そのような浸透剤は当技術分野において一般に公知である。製剤化（処方）および投与のための技術に関する更なる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｅｄ．Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，２０１２）において見出されうる。
【０１４８】
治療
「治療」なる語は、その全ての文法形態において、本明細書に記載されている疾患の治療的または予防的処置を含む。「治療的または予防的処置」は、臨床的および／もしくは病理学的徴候の完全な予防を目的とした予防的処置、または臨床的および／もしくは病理学的徴候の改善もしくは寛解を目的とする治療的処置を含む。したがって、「治療」なる語は、記載されている疾患の改善または予防をも含む。
【０１４９】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」なる語は、治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を示すために本明細書においては互換的に用いられる。哺乳動物対象には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシなどが含まれる。
【０１５０】
投与量
該結合性分子、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の厳密な投与量は、公知技術を用いて、当業者により確認されうるであろう。適切な投与量は十分な量の該結合性分子を提供し、好ましくは、治療的に有効であり、すなわち、所望の治療効果をもたらす。
【０１５１】
当技術分野において公知のとおり、治療目的（例えば、寛解維持なのか、疾患の急性再燃なのか）、投与の経路、時間および頻度、投与処方の時間および頻度、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、病態の重症度、薬物の組合せ、反応感受性ならびに治療に対する耐性／応答に関する調整が必要かもしれない。適切な投与量範囲は、細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて決定可能であり、好ましくは、ＥＤ５０を含む。典型的には、投与量は、投与経路に応じて、約２ｇまでの総用量で、０．１〜１０００００マイクログラムの範囲で変動しうる。該結合性分子の典型的な投与量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲である。個々の投与量および運搬方法に関する指針は文献に記載されている。治療は本発明の結合性分子、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の治療的有効用量の単回投与または治療的有効用量の複数回投与を要しうると認識されている。例えば、幾つかの医薬組成物は、製剤（処方）、個々の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、３〜４日ごと、毎週、または２週間に１回、または１ヶ月以内に１回投与されうる。
【０１５２】
キット
本発明は更に、本発明の前記医薬組成物の活性物質の１以上が充填された１以上の容器またはバイアルを含む医薬パックおよびキットに関する。したがって、本発明は、本明細書に記載されている結合性分子、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞および／または医薬組成物を含むキットをも提供する。本明細書に記載されている前記キットは、本明細書の他の箇所に記載されている疾患の治療または他の目的に使用されうる。
【０１５３】
医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売に関して政府機関によって規定された形態の通知であって、該製品の製造、使用または販売の該機関による承認を示す通知が、前記容器に付随しうる。
【０１５４】
該キットは１以上の活性物質（所望により、１以上の賦形剤を含有する医薬組成物として製剤化されている）を含みうる。適切な活性物質は医薬組成物に関して既に挙げられており、本発明のキットの一部としても想定されうる。追加的な活性物質は該結合性分子、核酸配列、ベクター、宿主細胞および／または医薬組成物と同時または連続的に患者に投与されうる。本発明は更に、種々の経路（例えば、経口的および静脈内）による活性物質の投与を含む。
【０１５５】
本発明において更に想定されるのは、本発明の結合性分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むキットである。該ポリヌクレオチドは、典型的には、宿主細胞内へのトランスフェクションおよび宿主細胞による発現に適したベクター、例えばプラスミドにおいて提供される。そのようなベクターおよび宿主細胞は本明細書の他の箇所に記載されている。
【０１５６】
治療的使用
本発明は更に、ヒトおよび／または動物における疾患の治療および／または予防用の医薬としての使用のための、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１５７】
本発明は更に、障害、特に心血管障害、好ましくは血栓性もしくは血栓塞栓性障害および／または血栓性もしくは血栓塞栓性合併症の治療および／または予防における使用のための、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１５８】
第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）は凝固に関して重要な酵素であり、それはトロンビンおよび第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）の両方によって活性化されることが可能であり、したがって、凝固の２つの必須過程に関与する。すなわち、それは凝固の開始から増幅および伝播への移行の中心的成分であり、正のフィードバックループにおいて、トロンビンは、第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子に加えて、第ＸＩを第ＸＩａ因子へと活性化し、それにより、第ＩＸ因子は第ＩＸａ因子に変換され、このようにして生成した第ＩＸａ因子／第ＸＩＩＩａ因子複合体を介して、第Ｘ因子が活性化され、したがって今度はトロンビン生成が高度に刺激されて強力な血栓成長をもたらし、血栓を安定化させる。
【０１５９】
更に、第ＸＩａ因子は凝固の内因的開始のための重要な成分である。組織因子（ＴＦ）による刺激に加えて、凝固系は負荷電表面上においても活性化可能であり、該負荷電表面は、外来細胞（例えば、細菌）の表面構造だけではなく、人工表面、例えば脈管用人工装具、ステントおよび体外循環をも含む。該表面上で、最初に第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）が第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩＡ）へと活性化され、ついでこれは、細胞表面に付着したＦＸＩをＦＸＩａへと活性化する。これは前記のとおりの凝固カスケードの更なる活性化を招く。
【０１６０】
これとは対照的に、開始期におけるトロンビン生成はＴＦ／第ＶＩＩａ因子を介して影響を受けないままであり、第Ｘ因子活性化、そして最終的に、血管損傷に対する生理的反応であるトロンビン生成が生じる。これは、ＦＸＩａインヒビターの投与により、ウサギおよび他の種における場合と同様に、ＦＸＩａノックアウトマウスにおいて出血時間の延長が見られなかった理由を説明しうるであろう。該物質により引き起こされるこの低い出血傾向は、ヒトにおける使用、特に、出血のリスクが高い患者における使用にとって非常に有利である。
【０１６１】
したがって、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、血餅の形成から生じうる障害または合併症の治療および／または予防に使用される。
【０１６２】
本発明の目的においては、「血栓性または血栓塞栓性障害」は、動脈および静脈血管系の両方で生じる障害であって、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントで治療されうる障害を含み、特に、心臓の冠状動脈における障害、例えば、急性冠症候群（ＡＣＳ）、ＳＴ上昇を伴う心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）およびＳＴ上昇を伴わない心筋梗塞（非ＳＴＥＭＩ）、安定狭心症、不安定狭心症、冠状動脈介入（血管形成術、ステント留置術または大動脈冠動脈バイパス術）の後の再閉塞および再狭窄、そしてまた、末梢動脈閉塞性疾患、肺塞栓症、静脈血栓塞栓症、静脈血栓症（特に深部下肢静脈および腎臓静脈におけるもの）、一過性脳虚血発作、そしてまた、血栓性脳卒中および血栓塞栓性脳卒中を招く他の血管における血栓性または血栓塞栓性障害を含む。
【０１６３】
凝固系の刺激は種々の原因または関連障害によって生じうる。とりわけ、外科的介入、不動、寝床への拘束、感染症、炎症または癌もしくは癌治療の状況では、凝固系が高度に活性化される可能性があり、血栓性合併症、特に静脈血栓症が生じうる。したがって、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、外科的介入の状況における、例えば、癌に罹患している患者または股関節もしくは膝関節置換術のような整形外科手術を受けている患者における血栓症の予防に使用される。したがって、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、活性化された凝固系を有する患者、例えば、記載されている刺激状況における血栓症の予防においても使用される。
【０１６４】
したがって、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントはまた、急性、間欠性または持続性心不整脈、例えば心房細動を有する患者、および電気的除細動を受けている患者、そしてまた、心臓弁障害または人工心臓弁を有する患者において、心原性血栓塞栓症、例えば脳虚血、脳卒中および全身性血栓塞栓症および虚血の治療および／または予防において使用される。
【０１６５】
また、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）（これは、とりわけ敗血症に関連して生じうるが、外科的介入、腫瘍性障害、火傷または他の損傷によっても生じる可能性があり、微小血栓症により重度の臓器障害を招きうる）の治療および／または予防に使用される。
【０１６６】
血栓塞栓性合併症は更に、微小血管障害性溶血性貧血において、ならびに例えば血液透析、ＥＣＭＯ（「体外膜酸素供給」）、ＬＶＡＤ（「左心室補助装置」）および同様の方法、ＡＶ瘻孔、血管および心臓弁プロテーゼのような体外循環の状況における異物表面に血液が接触することによって生じる。
【０１６７】
更に、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、血管性認知症またはアルツハイマー病のような痴呆障害を招きうる脳血管内のフィブリン沈着または微小血栓形成が関わる障害の治療および／または予防に使用される。ここで、血餅は閉塞および更なる疾患関連因子への結合の両方によって障害に関与しうる。
【０１６８】
更に、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、血栓性および／または血栓塞栓性合併症、例えば、癌患者、特に、大きな外科的介入または化学もしくは放射線療法を受けている患者における静脈血栓塞栓症の予防および／または治療に使用されうる。
【０１６９】
本発明の文脈における「肺高血圧」なる語は、肺動脈性高血圧、左心疾患に関連した肺高血圧、肺障害および／または低酸素症に関連した肺高血圧、ならびに慢性血栓塞栓症による肺高血圧（ＣＴＥＰＨ）を含む。
【０１７０】
また、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、感染症および／または全身性炎症性症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症性臓器障害、敗血症性臓器不全および多臓器不全、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、敗血症性ショックおよび／または敗血症性臓器不全の状況における播種性血管内凝固の治療および／または予防にも使用される。感染の過程において、種々の臓器における微小血栓症を伴う凝固系の全身性活性化（播種性血管内凝固または消費性凝固障害；本明細書においては以下「ＤＩＣ」と称される）および続発性出血性合併症が生じうる。更に、血管透過性の増加および血管外腔への体液およびタンパク質の拡散を伴う内皮損傷が生じうる。感染が進行するにつれて、臓器不全（例えば、腎不全、肝不全、呼吸不全、中枢神経障害および心血管不全）または多臓器不全が生じうる。ＤＩＣの場合には、損傷内皮細胞の表面、異物表面または架橋血管外組織において凝固系の大規模な活性化が生じる。結果として、低酸素およびそれに続く臓器機能不全を伴う種々の臓器の小血管における凝固が生じる。二次的影響は、凝固因子（例えば、第Ｘ因子、プロトロンビンおよびフィブリノーゲン）および血小板の消費であり、これは血液の凝固性を低下させ、大量出血をもたらしうる。
【０１７１】
本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、遺伝子突然変異が酵素の活性の増強またはチモーゲンレベルの上昇（これらは酵素活性またはチモーゲン濃度の関連試験／測定によって確認される）を招く患者における血栓性もしくは血栓塞栓性障害および／または炎症性障害および／または血管透過性の亢進を示す障害の一次予防にも使用される。
【０１７２】
また、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントは、エクスビボでの凝固の予防、例えば、血餅の形成によって引き起こされる臓器損傷に対する移植臓器の保護、移植臓器からの血栓塞栓に対する臓器レシピエントの保護、血液および血漿製剤の保存、カテーテルおよび他の医療用補助具および装置の洗浄／前処理、インビボまたはエクスビボで使用される医療用補助具および装置の合成表面のコーティング、あるいは第ＸＩａ因子を含みうるサンプルのためにも使用されうる。
【０１７３】
本発明は更に、障害、特に前記障害の治療および／または予防のための、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントの使用を提供する。
【０１７４】
本発明は更に、障害、特に前記障害の治療および／または予防用の医薬の製造のための、好ましくは、血栓性もしくは血栓塞栓性障害の治療および／または予防用の医薬の製造のための、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントの使用を提供する。
【０１７５】
本発明は更に、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントの治療的有効量を使用する、障害、特に前記障害の治療および／または予防方法を提供する。
【０１７６】
本発明は更に、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントの治療有効量を使用する、障害、特に前記障害の治療および／または予防方法における使用のための、本発明の結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１７７】
本発明は更に、本発明の少なくとも１つの結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントまたは本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することによる、ヒトおよび／または動物における血栓性もしくは血栓塞栓性障害の治療方法を提供する。本発明は更に、本発明の少なくとも１つの結合性分子、好ましくは抗体およびその抗原結合性フラグメントまたは本発明の医薬組成物の治療的有効量を投与することによる、対象における血液凝固、血小板凝集および／または血栓症の抑制方法を提供する。
【０１７８】
遺伝子治療
本発明は更に、本明細書に開示されているポリヌクレオチドを含む、哺乳動物の遺伝子治療における使用のための導入ベクター、および疾患の治療または予防を要する哺乳動物患者の細胞内に本明細書に記載されている外因性核酸を組込み、それにより、該外因性核酸を発現させ、該疾患を予防または治療することを含む、疾患の治療または予防方法を提供する。
【０１７９】
１つの実施形態においては、重鎖および軽鎖の両方をコードする核酸分子を患者に投与する。好ましい実施形態においては、該核酸分子を投与して、それをＢ細胞の染色体内に安定に組込む。なぜなら、これらの細胞は抗体の産生のために専門化されているからである。１つの実施形態においては、前駆体Ｂ細胞にエクスビボでトランスフェクトし、または感染させ、それを必要とする患者に再移植する。もう１つの実施形態においては、関心のある細胞型に感染することが知られている組換えウイルスを使用して、前駆体Ｂ細胞または他の細胞にインビボで感染させる。
【０１８０】
好ましい実施形態においては、該遺伝子治療方法は、本明細書に開示されている抗ＦＸＩ抗体の重鎖またはその抗原結合性部分をコードする単離された核酸分子を投与し、該核酸分子を発現させることを含む。もう１つの好ましい実施形態においては、該遺伝子治療方法は、本明細書に開示されている抗ＦＸＩ抗体の軽鎖またはその抗原結合性部分をコードする単離された核酸分子を投与し、該核酸分子を発現させることを含む。もう１つの実施形態においては、該遺伝子治療方法は、本明細書に開示されている抗ＦＸＩ抗体の重鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子および本明細書に開示されている抗ＦＸＩ抗体の軽鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与し、該核酸分子を発現させることを含む。
【０１８１】
外因性核酸の取り込みのための具体的な条件は当技術分野においてよく知られている。それらには、レトロウイルス感染、アデノウイルス感染、プラスミドでの形質転換、外因性核酸を含有するリポソームでの形質転換、バイオリスティック核酸送達（すなわち、核酸を金または他の金属粒子上に装填し、細胞内に射撃または注入する）、アデノ随伴ウイルス感染およびエプスタインバーウイルス感染が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらは全て、本発明の目的における「発現ベクター」とみなされうる。
【０１８２】
発現ベクターは、染色体外ベクター、または宿主ゲノム内に組込まれるベクターのいずれかでありうる。一般に、これらの発現ベクターは、外因性核酸に機能的に連結された、転写および翻訳調節核酸を含む。一般に、転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれうるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態においては、調節配列には、プロモーター、ならびに転写開始および終結配列が含まれる。
【０１８３】
また、発現ベクターは追加的エレメントを含みうる。例えば、組込み性発現ベクターの場合、該発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも１つの配列、および好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。該組込みベクターは、ベクターに含めるための適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞内の特定の遺伝子座に指向されうる。組込みベクターのための構築物は当技術分野でよく知られている。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】抗ＦＸＩ抗体ＴＰＰ−３５８３の配列。
【図２】ヒト凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ）に対するマウス抗ＦＸＩ抗体１Ａ６の結合活性（ＥＣ５０値）。
【図３】可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列に関する配列番号１７および可変重鎖のアミノ酸配列に関する配列番号１８を含むヒト化および生殖系列化抗ＦＸＩ抗体ＴＰＰ−３５８３の結合活性（ＥＣ５０値）。
【図４】可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列に関する配列番号１９および可変重鎖のアミノ酸配列に関する配列番号２０を含むヒト化および生殖系列化抗ＦＸＩ抗体ＴＰＰ−３５７７の結合活性（ＥＣ５０値）。
【図５】可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列に関する配列番号２１および可変重鎖のアミノ酸配列に関する配列番号２２を含むヒト化および生殖系列化抗ＦＸＩ抗体ＴＰＰ−３２９０の結合活性（ＥＣ５０値）。
【図６】可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列に関する配列番号２３および可変重鎖のアミノ酸配列に関する配列番号２４を含むヒト化および生殖系列化抗ＦＸＩ抗体ＴＰＰ−３２３８の結合活性（ＥＣ５０値）。
【図７】抗体ＴＰＰ−３５８３に関する競合ＥＬＩＳＡアッセイによるドメイン分析。
【図８】ＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換の、本発明の抗体による機能的中和。ＦＸＩＩａの阻害はＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換を誘導した。ヒト化および生殖系列化抗ＦＸＩ抗体ＴＰＰ−３５８３の阻害活性（ＩＣ５０値）。
【図９】特定の抗体についてのＥＣ５０値およびａＰＴＴ値の一覧。
【図１０】ＴＰＰ３５８３の静脈内適用後のコラーゲン被覆血管移植片上の血小板沈着のインビボ測定。
【図１１】ＴＰＰ３５８３静脈内適用後のコラーゲン被覆血管移植片上のフィブリン沈着のインビボ測定。
【０１８５】
実験
マウス１Ａ６抗ＦＸＩ抗体から出発して、新規ヒト化抗体（実験１を参照されたい）を作製した。固有の免疫原性の可能性を更に低減するために、これらの抗体を、後記のとおり、ＣＤＲ領域における配列最適化に付した（実験２）。候補抗体を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定されたそれらのＦＸＩ結合活性に関して、およびＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換を阻害するそれらの能力により試験した（実験４および５）。２つの典型的な抗体、すなわち、ＴＰＰ−３２９０およびＴＰＰ−３２３８に関する、ＥＬＩＳＡおよび変換アッセイについてのＥＣ５０値を図９に示す。明らかに、ＥＣ５０値は１Ａ  ６に匹敵し、したがって、これら２つの抗体は更なる探索のための貴重な候補であると思われる。したがって、１Ａ６との同等性を確認するために、実験１０に記載されているインビボヒヒ血栓症モデルにおいて抗体ＴＰＰ−３２９０およびＴＰＰ−３２３８を試験した。驚くべきことに、合理的な薬理学的投与レジメンを用いた場合、これら２つの抗体は抗血栓活性を全く示さなかった。両方の分子に関して、コラーゲン誘発性血栓形成の減少は全く検出され得なかった。このインビボ実験の追跡調査において、これらの抗体を、血漿に基づく活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験系で分析した。このタイプの分析は該インビボデータを再確認するものであり、両方の抗体に関して、遮断効果は非常に僅かしか又は更には全く観察されなかった（実験６および図８）。したがって、抗体ＴＰＰ−３２９０およびＴＰＰ−３２３８抗体は、ＥＬＩＳＡおよび変換アッセイにおいて、１Ａ６と比較してほぼ同一のＥＣ５０値を有するにもかかわらず（図９を参照されたい）、それらはインビボで抗血栓効果を示さない。１Ａ６と同等のＥＬＩＳＡおよび変換アッセイの値がインビボでの抗血栓活性またはａＰＴＴの延長につながらない理由は容易には得られない。
【０１８６】
しかし、更なる配列改変は抗体ＴＴＰ−３５８３およびＴＴＰ−３５７７を与える。これら２つの抗体は標的ＦＸＩに対する優れた結合アフィニティを示した（実験３、図３および４、図９）。また、抗体ＴＴＰ−３５８３およびＴＴＰ−３５７７はＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換を有効に遮断する（実験５ならびに図７および８）。驚くべきことに、抗体ＴＴＰ−３５８３およびＴＴＰ−３５７７は、１Ａ６に匹敵する濃度で、またはＴＰＰ−３５８３の場合には更に低い濃度で、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を延長する（実験６および図９）。このように、得られた２つの抗体は、それらの結合活性に関する生化学的アッセイにおいて、マウス出発変異体１Ａ６と同等である。ＴＰＰ−３５８３は、血漿に基づくａＰＴＴアッセイにおいて、更に僅かに高い活性を示した。
【０１８７】
これはインビボモデルにおけるＴＰＰ−３５８３の抗血栓活性によっても確認された（実験９を参照されたい）。したがって、抗体ＴＰＰ−３５８３およびＴＰＰ−３５７７を提供することにより、本発明は、免疫原性の低下および出血リスクの最小化の両方に関して有効であり、かつ治療において安全であると予想されるヒト化および生殖系列化抗体を提供する。したがって、ここで評価されている抗体は血栓性もしくは血栓塞栓性障害および／または血栓性もしくは血栓塞栓性合併症の有効な治療および／または予防のための有望な新規物質である。
【０１８８】
実験１：マウス抗体のヒト化
マウス抗体１Ａ６のヒト化を、標準的な技術を用いて行った。
【０１８９】
詳細には、生殖系列アクセプターファミリーサブセットの選択のために、マウス抗体のＣＤＲ残基を決定し、Ｋａｂａｔ番号付け系（詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｋａｂａｔｎｕｍを参照されたい）に従い注釈を付けた。重鎖および軽鎖ＣＤＲの標準構造を、以下の刊行物に基づいて決定した。
【０１９０】
・Ｏ’ＢｒｉｅｎおよびＪｏｎｅｓ，Ｈｕｍａｎｉｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ＣＤＲ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４０；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌｓ  ｐｐ  ５６７−５９０；Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら（編），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ２００１。
【０１９１】
・Ｈｗａｎｇ，Ａｌｍａｇｒｏ，Ｂｕｓｓ，ＴａｎおよびＦｏｏｔｅ（２００５）Ｕｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ａ  ＣＤＲ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｍａｙ；３６（１）：３５−４２。
【０１９２】
これらの刊行物に基づいて、同じ標準構造を有するヒト生殖系列フレームワークアクセプターを選択した。
【０１９３】
次の工程において、Ｋａｂａｔ番号付け系（詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｋａｂａｔｎｕｍを参照されたい）に基づいて、ループ構造ならびにＶＨおよびＶＬ境界を維持する残基を特定した。必要に応じて、ループコンホメーションに並びにＶＨおよびＶＬ境界に重要なアミノ酸を復帰突然変異させた。
【０１９４】
同じ標準サブセット内の各個のヒト生殖系列フレームワーク配列に対する同一性および類似性を分析し、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩスイートのＡｌｉｇｎ  Ｘプログラムを使用することにより、マウスＶＨおよびＶＬ配列に対して最良の全体的相同性を有する生殖系列配列を特定した。これらの配列は、それぞれ、ＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲをグラフト化するためのアクセプターヒト生殖系列フレームワークとして選択された。
【０１９５】
ヒト重鎖結合領域（ＪＨ領域）およびヒトＶＬ領域を、最良の配列相同性に基づいて選択した。
【０１９６】
これらのインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）設計ヒト化変異体をＦＸＩ結合活性に関して分析するために、対応ｃＤＮＡを合成し、ヒト化抗体の発現に使用した。このために、ＨＥＫ２９３細胞を該ｃＤＮＡでトランスフェクトし、５日間の培養の後、これらの細胞の上清から抗体を精製した。標準的なＥＬＩＳＡ法を用いることによって結合活性に関して、およびサイズ排除クロマトグラフィーにより該分子を分析することによって物理化学的特性に関して、各精製ヒト化抗体を特徴づけした。
【０１９７】
実験２：ＣＤＲの生殖系列化および配列最適化
内因性免疫原性リスクを更に低減するために、次の工程で、該ヒト化抗体のＣＤＲの生殖系列化および配列最適化を行った。
【０１９８】
したがって、最も近い生殖系列配列と異なるアミノ酸を置換し、対応ｃＤＮＡを合成し、ＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクトし、本発明の発現抗体を定量し、それらのヒトＦＸＩ結合能に関して試験した（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．；ヒトＦＸＩ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＣＸＩ−０１５０）。
【０１９９】
実験３：抗体変異体の発現および定量化
Ｔｏｍら，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｃｈｅａｌ  Ｒ．ＤｙｓｏｎおよびＹｖｅｓ  Ｄｕｒｏｃｈｅｒ編，Ｓｃｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ，２００７に記載されているとおりに、前記のＩｇＧを哺乳類細胞において一過性に発現させた。簡潔に説明すると、ＣＭＶプロモーターに基づく発現プラスミドをＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞内にトランスフェクトし、Ｆｅｒｎｂａｃｈ−ＦｌａｓｋｓまたはＷａｖｅ−Ｂａｇｓ内でインキュベートした。トランスフェクトされた細胞をＦ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で３７℃で５〜６日間培養した。トランスフェクションの２４時間後、１％  超低ＩｇＧ  ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．５ｍＭ  バルプロ酸（Ｓｉｇｍａ）を補充した。該抗体をプロテインＡクロマトグラフィーにより精製し、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、それらの結合アフィニティに関して、更に特徴づけした。本発明の抗体の配列に関しては、後記の表１および２を参照されたい。後記表３は更なる抗体の配列を列挙している。
【０２００】
実験４：酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）：
ＥＬＩＳＡ
ＦＸＩに対する本発明の抗体の結合アフィニティを分析するために、標準的なＥＬＩＳＡ形態を使用した。ヒトＦＸＩをＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（ヒトＦＸＩ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＣＸＩ−０１５０）から得、ヒヒＦＸＩを、以下に記載されているとおりに作製した。これらの抗原を、１×コーティングバッファー（Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１２１１２５）中で１μｇ／ｍｌの濃度に希釈して黒色３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ；Ｃａｔ．Ｎｏ．４６０５１８）にコートした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーションの後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ８６６２）＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ９４１６）を使用して、プレートを５０μｌ／ウェルで２回洗浄した。これに続いて、５０μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（Ｓｍａｒｔ  Ｂｌｏｃｋ；Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１１３５００）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。ついで、５０μｌ／ウェルのＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０バッファーを使用して、プレートを３回洗浄した。本発明の抗体を３０μｌ／ウェルの最終容量における種々の濃度で加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。このインキュベーション工程の後、５０μｌ／ウェルのＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０バッファーを使用して、プレートを３回洗浄した。結合候補抗体の検出のために、抗ｈ−Ｆｃ−ＰＯＤ抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ０１７０）を、１０％  ブロッキングバッファー中、１：１００００の倍率で希釈した。この希釈検出抗体の３０μｌ／ウェルを加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。このインキュベーション工程の後、５０μｌ／ウェルのＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０バッファーを使用して、プレートを３回洗浄した。基質として、３０μｌ／ウェルの１：１０００希釈したＡｍｐｌｅｘレッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１２２２２；ＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストック溶液）と１：１００００の過酸化水素（Ｍｅｒｃｋ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７２０９；３０％  ストック溶液）との混合物を加え、プレートを暗所で２０分間インキュベートした。
【０２０１】
測定には、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ｆ５００リーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用した。
【０２０２】
測定モード：
・蛍光
・トップリーディング（ｔｏｐ  ｒｅａｄｉｎｇ）
・Ｅｘ  ５３５ｎｍ
・５９０ｎｍ。
【０２０３】
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、本発明の結合活性をＥＣ５０値として計算した。全ての実験は４回重複して行った。データは平均±ＳＥＭとして示されている。抗体１Ａ６、ＴＰＰ−３５８３、ＴＰＰ−３５７７、ＴＰＰ−３２９０およびＴＰＰ−３２３８のヒトＦＸＩ  ＥＬＩＳＡに関するデータを図２〜６に、数値データを図９に示す。曲線の形状およびＥＣ５０値は１Ａ６と同等であり、したがって、更なる分析のために分類される。
【０２０４】
競合ＥＬＩＳＡによる結合ドメイン分析
ヒト化および最適化変異体が出発変異体１Ａ６と同じドメインに尚も結合していることを示すために、競合的ＥＬＩＳＡを使用した。このために、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）ＮＨＳ−ＰＥＧ４ビオチン化キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２１４５５）を該製造業者の説明に従い使用して、１Ａ６をビオチン化した。前記のとおり、ＦＸＩをコーティングし、種々の濃度の本発明の抗体と混合された一定濃度のビオチン化１Ａ６を加えた。ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ５５１２）を使用することにより、ビオチン化１Ａ６の結合を検出した。基質として、３０μｌ／ウェルの１：１０００希釈Ａｍｐｌｅｘレッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１２２２２；ＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストック溶液）と１：１００００の過酸化水素（Ｍｅｒｃｋ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７２０９；３０％  ストック溶液）との混合物を加え、プレートを暗所で２０分間インキュベートした。本発明の抗体の、１Ａ６と同じドメインへの結合は、該ヒト化および最適化変異体の濃度を増加させることにより、後者のものの置換をもたらす。この効果は、本発明において記載されている全ての抗体に関して示されている。例えば、ＴＰＰ−３５８３および１Ａ６の競合結合アッセイのデータを図７に示す。この図は、これら２つの抗体がＦＸＩ分子における同じドメインに結合することを示している。
【０２０５】
ヒヒＦＸＩの作製
パピオ・アヌビス（Ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ）ＦＸＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ０９６ＮＣ９５）のｃＤＮＡを合成し、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９０−２０）内にクローニングした。発現および精製のために、ＰＬＵＳ試薬を伴うリポフェクタミンＬＴＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣａｔＮｏ．Ａ１２６２１）を製造業者の説明に従い使用することにより、ＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクトした。ヒヒＦＸＩの組換え発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ヒヒＦＸＩ結合に対する、本発明に記載されている抗体の結合活性を、図９に示す。
【０２０６】
実験５：ＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換の本発明の抗体による機能的中和
ＦＸＩＩａによるＦＸＩ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号ＨＣＸＩＡ−０１５０）からその活性形態ＦＸＩａへの変換の阻害を試験するために、１０ｎＭのヒトＦＸＩを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．１％  ＢＳＡ中、種々の濃度の該抗体と共に、３７℃で１時間インキュベートした。次の工程において、ヒトＦＸＩＩａ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号ＨＦＸＩＩａ  １２１２ａ）を１単位／ｍｇの最終濃度で加え、３７℃で２４時間インキュベートした。次に、最終濃度２００ｎＭのコーントリプシンインヒビター（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＴＩ）および蛍光標識基質（Ｉ−１５７５，Ｂａｃｈｅｍ，最終濃度２５μＭ）を加えた。ＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒｐｌｕｓ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を使用して、３６０／４６５ｎｍで蛍光を連続的にモニターした。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して、データを分析した。データは平均±ＳＥＭ，ｎ＝４として示されている（図８におけるＴＰＰ−３５８３に関するグラフを参照されたい；他の抗体に関する数値は図９に列挙されている）。
【０２０７】
実験６：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）：
ヒト血漿のアリコートを漸増濃度の本発明の抗体と共に３７℃で３分間インキュベートした。内因性凝固経路を開始させるために、０．０５ｍｌの血漿を０．０５ｍｌのａＰＴＴ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，Ｋ．Ｃ  Ｐｅｒｓｔ  ５）と共に厳密に３分間インキュベートした。０．０５ｍｌの０．０２５Ｍ  予熱塩化カルシウム溶液でサンプルを再石灰化することにより、凝固を開始させた。自動凝固計（ＡＭＡＸ  ２００，Ｔｒｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｅｍｇｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が血漿を３７℃で混合し、凝固までの時間を機械的に記録した。ａＰＴＴを１．５倍延長させる試験薬物濃度を計算し、表示した（図９）。
【０２０８】
実験９：インビボヒヒ血栓症モデル
ヒヒのＡＶシャントモデルにおいては、低血栓形成性慢性ＡＶシャント内への血栓形成装置の一時的により、血栓形成装置を開始させた。血栓の開始および増殖に対する抗体の効果を評価するために使用した血栓形成装置は、内径４ｍｍ（ｉ．ｄ．）、長さ２０ｍｍのコラーゲン被覆ｅＰＴＦＥ移植片、およびそれに続く内径９ｍｍ、長さ２０ｍｍのシリコーンゴム拡張チャンバーからなるものであった。移植片における剪断速度は動脈型血液凝固を模倣することを意味し、拡張チャンバーにおける剪断速度は静脈型血液凝固を模倣することを意味した。移植片断片内の放射能標識血小板蓄積の定量的ガンマカメライメージングにより、および放射能標識フィブリノーゲン／フィブリン沈着のエンドポイント決定により、実験中に血栓形成をリアルタイムで評価した（更なる詳細は、Ｔｕｃｋｅｒら，Ｂｌｏｏｄ．２００９  Ｊａｎ  ２２；１１３（４）：９３６−９４４，９３７頁，左欄，“Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ”の見出しの章を参照されたい）。図１０に示されているとおり、ＴＰＰ−３５８３のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１ｍｇ／ｋｇの静脈内投与は血小板沈着の約８０％の減少をもたらした。これらのデータは、Ｔｕｃｋｅｒら（Ｂｌｏｏｄ．２００９  Ｊａｎ  ２２；１１３（４）：９３６−９４４）により公開されているマウス１Ａ６抗体の抗血栓活性に匹敵する。
【０２０９】
血小板沈着の抑制のもとでは、ＴＰＰ−３５８３の投与はまた、コラーゲン被覆移植片におけるフィブリン蓄積の約８０％の有意な減少をもたらした（図１１）。
【表１】
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【０２１０】
更に好ましい実施形態は以下のものである。
【０２１１】
１．（ａ）配列ＫＡＳＱＳＶＬＹＳＧＤＮＹＬＮ（配列番号８）を含む軽鎖のＣＤＲ１、
（ｂ）配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号９）を含む軽鎖のＣＤＲ２、
（ｃ）配列ＱＱＹＮＧＤＰＷＴ（配列番号１０）を含む軽鎖のＣＤＲ３、
（ｄ）配列ＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号１１）を含む重鎖のＣＤＲ１、
（ｅ）配列ＨＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１２）を含む重鎖のＣＤＲ２、および
（ｆ）配列ＩＲＳＳＶＹＡＨＹＹＧＭＤＹ（配列番号１３）を含む重鎖のＣＤＲ３
を含む結合性分子。
【０２１２】
好ましくは、該結合性分子は、
（ａ）配列番号８に示されている配列を含む軽鎖のＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号９に示されている配列を含む軽鎖のＣＤＲ２、および
（ｃ）配列番号１０に示されている配列を含む軽鎖のＣＤＲ３
を含む軽鎖の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号１１に示されている配列を含む重鎖のＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１２に示されている配列を含む重鎖のＣＤＲ２、および
（ｃ）配列番号１３に示されている配列を含む重鎖のＣＤＲ３
を含む重鎖の抗原結合部位とを含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
【０２１３】
２．第ＸＩ因子および／または第ＸＩａ因子に結合しうる、実施形態１記載の結合性分子。好ましくは、実施形態１記載の結合性分子は第ＸＩ因子および／または第ＸＩａ因子に特異的に結合する。
【０２１４】
３．第ＸＩ因子または第ＸＩａ因子が霊長類第ＸＩ因子または霊長類第ＸＩａ因子である、実施形態１または２記載の結合性分子。
【０２１５】
４．霊長類がヒトまたは非ヒト霊長類である、実施形態３記載の結合性分子。
【０２１６】
５．非ヒト霊長類がヒヒ、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、カニクイザルまたはアカゲザルである、実施形態４記載の結合性分子。
【０２１７】
６．該結合性分子が、配列番号７のアミノ酸２００〜２８３を含む第ＸＩ因子のＡ３ドメインに対応するアミノ酸配列内に結合する、前記実施形態のいずれか１項記載の結合性分子。
【０２１８】
７．該結合性分子が、ａ）配列番号７のアミノ酸２０１〜２１５、ｂ）配列番号７のアミノ酸２２１〜２２２、ｃ）配列番号７のアミノ酸２５２〜２５４、ｄ）配列番号７のアミノ酸２５９〜２６１、ｅ）配列番号７のアミノ酸２７０〜２７２、および／またはｆ）配列番号７のアミノ酸２７６〜２７８に対応するアミノ酸配列内のエピトープに結合する、前記実施形態のいずれか１項記載の結合性分子。
【０２１９】
８．配列番号１７に示されているＶＬ領域を含む、前記実施形態のいずれか１項記載の結合性分子。
【０２２０】
９．該結合性分子が、配列番号１８に示されているＶＨ領域を含む、前記実施形態のいずれか１項記載の結合性分子。
【０２２１】
１０．配列番号１７に示されているＶＬ領域と配列番号１８に示されているＶＨ領域とを含む、前記実施形態のいずれか１項記載の結合性分子。
【０２２２】
１１．該結合性分子が、配列番号２７に示されている軽鎖を含む、前記実施形態のいずれか１項記載の結合性分子。
【０２２３】
１２．該結合性分子が、配列番号２８に示されている重鎖を含む、前記実施形態のいずれか１項記載の結合性分子。
【０２２４】
１３．該結合性分子が、配列番号２７に示されている軽鎖と、配列番号２８に示されている重鎖とを含む、前記実施形態のいずれか１項記載の結合性分子。
【０２２５】
１４．該結合性分子が抗体である、前記実施形態のいずれか１項記載の結合性分子。
【０２２６】
１５．該結合性分子がモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記実施形態のいずれか１項記載の結合性分子。
【０２２７】
１６．該モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体である、実施形態１５記載の結合性分子。
【０２２８】
好ましくは、ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト由来の全可変ドメインおよび全定常ドメインフレームワークを含有する抗体である。
【０２２９】
１７．抗体がＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、実施形態１４〜１６のいずれか１項記載の結合性分子。
【０２３０】
１８．実施形態１〜１７のいずれか１項記載の結合性分子をコードするポリヌクレオチド。
【０２３１】
１９．実施形態１８記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【０２３２】
２０．該ベクターが、実施形態１８記載ポリヌクレオチドに機能的に連結された少なくとも１つの調節配列を更に含む、実施形態１９記載のベクター。
【０２３３】
２１．該ベクターが発現ベクターである、実施形態１９または２０記載のベクター。
【０２３４】
２２．実施形態１９〜２１のいずれか１項記載のベクターおよび／または実施形態１８記載の核酸を含む宿主細胞。
【０２３５】
２３．実施形態１〜１７のいずれか１項記載の結合性分子の発現を可能にする条件下、実施形態２２記載の宿主細胞を培養し、所望により、産生された結合性分子を培養から回収することを含む、実施形態１〜１７のいずれか１項記載の結合性分子の製造方法。
【０２３６】
２４．実施形態１〜１７のいずれか１項記載の結合性分子、実施形態２３記載の製造方法により製造された結合性分子、実施形態１８記載のポリヌクレオチド、実施形態１９〜２１のいずれか１項記載のベクター、および／または実施形態２２記載の宿主細胞と、所望により、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【０２３７】
２５．１以上の追加的な活性物質を更に含む、実施形態２４記載の医薬組成物。
【０２３８】
２６．前記の更なる追加的な活性物質が、プラスミノーゲンアクチベーター（血栓溶解剤／線溶剤）；プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターのインヒビター；組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ、レテプラーゼおよびウロキナーゼを含むトロンビン活性化フィブリン溶解インヒビター（ＴＡＦＩ）のインヒビター；非分画ヘパリン；低分子量ヘパリン；ヘパリノイド；ヒルジン；ビバリルジンおよび／またはアルガトロバンから選択される、実施形態２５記載の医薬組成物。
【０２３９】
２７．医薬としての使用のための、実施形態１〜１７のいずれか１項記載の結合性分子、実施形態２３記載の製造方法により製造された結合性分子、実施形態１８記載のポリヌクレオチド、実施形態１９〜２１のいずれか１項記載のベクター、実施形態２２記載の宿主細胞、または実施形態２４〜２６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【０２４０】
２８．血栓性もしくは血栓塞栓性障害および／または血栓性もしくは血栓塞栓性合併症の治療および／または予防における使用のための、実施形態１〜１７のいずれか１項記載の結合性分子、実施形態２３記載の製造方法により製造された結合性分子、実施形態１８記載のポリヌクレオチド、実施形態１９〜２１のいずれか１項記載のベクター、実施形態２２記載の宿主細胞、または実施形態２４〜２６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【０２４１】
２９．対象における血液凝固、血小板凝集および／または血栓症を抑制する方法における使用のための、実施形態１〜１７のいずれか１項記載の結合性分子、実施形態２３記載の製造方法により製造された結合性分子、実施形態１８記載のポリヌクレオチド、実施形態１９〜２１のいずれか１項記載のベクター、実施形態２２記載の宿主細胞、または実施形態２４〜２６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【０２４２】
３０．血液サンプル、血液保存剤、血漿製剤、生物学的サンプルまたは医学的添加剤もしくは装置における抗凝固剤としての、実施形態１〜１７のいずれか１項記載の結合性分子または実施形態２３記載の製造方法により製造された結合性分子の使用。
【０２４３】
３１．実施形態１〜１７のいずれか１項記載の結合性分子、実施形態２３記載の製造方法により製造された結合性分子、実施形態１８記載のポリヌクレオチド、実施形態１９〜２１のいずれか１項記載のベクター、実施形態２２記載の宿主細胞または実施形態２４〜２６のいずれか１項記載の医薬組成物を含むキット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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