(57)【要約】  本発明は、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の処置又は予防に使用するための、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する抗ＴＮＦ抗体を利用する組成物及び方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１０２】
（新規）Ｉ型糖尿病の処置又は予防に使用するための、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する、少なくとも１つの単離された哺乳類抗ＴＮＦ抗体。
【請求項１０３】
（新規）ＴＮＦ関連状態の処置又は予防方法であって、前記ＴＮＦ関連状態が、１型糖尿病であり、前記方法が、
（ａ）配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する単離された哺乳類抗ＴＮＦ抗体を被験体に投与することを含む、前記方法。
【請求項１０４】
（新規）前記抗ＴＮＦ抗体は、前記被験体の体重が４５ｋｇ未満の場合、第０週及び第２週に６０ｍｇ／ｍ２の導入量、続いて第４週及びｑ２ｗで第５２週まで３０ｍｇ／ｍ２の維持量で前記被験体に皮下（ＳＣ）投与され、前記被験体の体重が４５ｋｇ以上の場合、第０週及び第２週に１００ｍｇ／ｍ２の導入量、続いて第４週及びｑ２ｗで第５２週まで５０ｍｇ／ｍ２の維持量で前記被験体に投与される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
（新規）前記抗ＴＮＦ抗体は、自己投与に適した医療用デバイスで投与され、前記デバイスは、プレフィルドシリンジ、ＵｌｔｒａＳａｆｅ  Ｐａｓｓｉｖｅニードルガードを有するプレフィルドシリンジ、ＶａｒｉｏＪｅｃｔ、及びＶａｒｉｏＪｅｃｔとＵｌｔｒａＳａｆｅ  Ｐａｓｓｉｖｅニードルガードを有するプレフィルドシリンジとの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
（新規）前記デバイスは、前記被験体の体重が４５ｋｇ以上の場合、ＵｌｔｒａＳａｆｅ  Ｐａｓｓｉｖｅニードルガードを有するプレフィルドシリンジであり、前記被験体の体重が４５ｋｇ未満の場合、ＶａｒｉｏＪｅｃｔである、請求項１０５に記載の医療用デバイス。
【請求項１０７】
（新規）前記デバイスは、針の長さが４．５ｍｍのＶａｒｉｏＪｅｃｔである、請求項１０５に記載の医療用デバイス。
【請求項１０８】
（新規）Ｉ型糖尿病の処置又は予防に使用するための、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する、少なくとも１つの単離された哺乳類抗ＴＮＦ抗体と、少なくとも１つの製薬学的に許容できる担体又は希釈剤とを含む、組成物。
【請求項１０９】
（新規）ＴＮＦ関連状態の処置又は予防方法であって、前記ＴＮＦ関連状態が、１型糖尿病であり、前記方法が、
（ａ）配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する単離された哺乳類抗ＴＮＦ抗体を含む組成物を被験体に投与することを含む、前記方法。
【請求項１１０】
（新規）前記組成物は、前記抗ＴＮＦ抗体が、前記被験体の体重が４５ｋｇ未満の場合、第０週及び第２週に６０ｍｇ／ｍ２の導入量、続いて第４週及びｑ２ｗで第５２週まで３０ｍｇ／ｍ２の維持量で投与され、前記被験体の体重が４５ｋｇ以上の場合、第０週及び第２週に１００ｍｇ／ｍ２の導入量、続いて第４週及びｑ２ｗで第５２週まで５０ｍｇ／ｍ２の維持量で前記被験体に投与されるように、前記被験体に皮下（ＳＣ）投与される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
（新規）前記組成物は、自己投与に適した医療用デバイスで投与され、前記デバイスは、プレフィルドシリンジ、ＵｌｔｒａＳａｆｅ  Ｐａｓｓｉｖｅニードルガードを有するプレフィルドシリンジ、ＶａｒｉｏＪｅｃｔ、及びＶａｒｉｏＪｅｃｔとＵｌｔｒａＳａｆｅ  Ｐａｓｓｉｖｅニードルガードを有するプレフィルドシリンジとの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
（新規）前記デバイスは、前記被験体の体重が４５ｋｇ以上の場合、ＵｌｔｒａＳａｆｅ  Ｐａｓｓｉｖｅニードルガードを有するプレフィルドシリンジであり、前記被験体の体重が４５ｋｇ未満の場合、ＶａｒｉｏＪｅｃｔである、請求項１１１に記載の医療用デバイス。
【請求項１１３】
（新規）前記デバイスは、針の長さが４．５ｍｍのＶａｒｉｏＪｅｃｔである、請求項１１１に記載の医療用デバイス。
【請求項１１４】
（新規）Ｉ型糖尿病の処置又は予防に使用するための医療用デバイスであって、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する、少なくとも１つの単離された哺乳類抗ＴＮＦ抗体を含み、前記デバイスは、前記少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を皮下（ＳＣ）投与するのに適している、前記医療用デバイス。
【請求項１１５】
（新規）前記デバイスは、自己投与に適しており、前記デバイスは、プレフィルドシリンジ、ＵｌｔｒａＳａｆｅ  Ｐａｓｓｉｖｅニードルガードを有するプレフィルドシリンジ、及びＶａｒｉｏＪｅｃｔからなる群から選択される、請求項１１４に記載の医療用デバイス。
【請求項１１６】
（新規）前記デバイスは、針の長さが４．５ｍｍのＶａｒｉｏＪｅｃｔである、請求項１１５に記載の医療用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の処置又は予防に使用するための、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する抗ＴＮＦ抗体を利用する組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦαは、１７ｋＤのタンパク質サブユニットの可溶性ホモ三量体である。ＴＮＦの膜結合型の２６ｋＤの前駆体形態もまた存在する。
【０００３】
単球又はマクロファージ以外の細胞もＴＮＦαを生成する。例えば、ヒト非単球腫瘍細胞株はＴＮＦα並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋末梢血Ｔリンパ球を生成し、いくつかの培養されたＴ及びＢ細胞株もＴＮＦαを生成する。
【０００４】
ＴＮＦαは、軟骨及び骨の分解、接着分子の誘導、血管内皮細胞で凝血促進活性を誘導する、好中球及びリンパ球の接着を増大させる、並びにマクロファージ、好中球及び血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出を刺激するなどの組織損傷をもたらす炎症誘発作用を引き起こす。
【０００５】
ＴＮＦαは、感染、免疫障害、腫瘍性病態、自己免疫病態及び移植片対宿主病態に関連している。ＴＮＦαと癌及び感染性病態との関連は、宿主の異化状態に関連していることが多い。癌患者は、通常食欲不振に関連する体重減少に悩まされる。
【０００６】
癌及びその他の疾患に関連する大幅な衰弱は、「悪液質」として知られる。悪液質は、悪性腫瘍の成長に応答する、進行性の体重減少、食欲不振、及び除脂肪体重の持続的衰えを含む。悪液質状態は、多くの癌罹患率及び死亡率の原因となる。ＴＮＦαが、癌、感染性病態及びその他の異化状態における悪液質に関与するという証拠がある。
【０００７】
ＴＮＦαは、発熱、倦怠感、食欲不振、及び悪液質を含む、グラム陰性敗血症及び内毒素ショックにおいて中心的な役割を果たすと考えられている。内毒素は、単球／マクロファージ生成並びにＴＮＦα及びその他のサイトカインの分泌を強く活性化する。ＴＮＦα及びその他の単球由来サイトカインは、内毒素に対する代謝及び神経ホルモン応答を媒介する。ヒトボランティアへの内毒素投与は、発熱、頻脈、増加した代謝速度、及びストレスホルモン放出など、インフルエンザのような症状を伴う急性疾患をもたらす。ＴＮＦαの循環が、グラム陰性敗血症に罹患した患者において増加する。
【０００８】
したがって、ＴＮＦαは、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス、細菌及び寄生虫感染、悪性腫瘍、並びに／又は神経変性疾患に関連付けられており、関節リウマチ及びクローン病などの疾患における特定の生物学的治療に有用な標的である。ＴＮＦαに対するキメラモノクローナル抗体（ｃＡ２）を用いた非盲検試験における有益な作用が、炎症の抑制、並びに関節リウマチ及びクローン病における再発後の良好な再処置とともに報告されている。ｃＡ２を用いた無作為の二重盲検プラセボ対照試験における有益な結果も、関節リウマチにおいて炎症の抑制とともに報告されている。
【０００９】
他の研究者は、インビトロで中和活性を有した組換えヒトＴＮＦに特異的なｍＡｂを説明している。これらのｍＡｂのうちのいくつかが、ヒトＴＮＦのエピトープをマッピングし、酵素イムノアッセイを開発するため、また組換えＴＮＦの精製を補助するために使用された。しかしながら、これらの研究は、免疫原性、低特異性、及び／又は製薬学的不適性により、ヒトにおけるインビボ診断又は治療用途に使用することができるＴＮＦ中和抗体を生成するための基礎を提供しない。
【００１０】
ＴＮＦに対する中和抗血清又はｍＡｂは、ヒト以外の哺乳動物において、実験的内毒素血症及び菌血症における致死的攻撃後の有害な生理学的変化を抑止し、死亡を阻止することが示されている。この作用は、例えば、げっ歯類致死率アッセイ及び霊長類病理モデル系において示されている。
【００１１】
ｈＴＮＦの推定受容体結合座位が開示されており、ＴＮＦのアミノ酸１１〜１３、３７〜４２、４９〜５７及び１５５〜１５７からなるＴＮＦαの受容体結合座位が開示されている。
【００１２】
非ヒト哺乳類、キメラ、ポリクローナル（例えば、抗血清）、及び／又はモノクローナル抗体（Ｍａｂ）並びに断片（例えば、タンパク質分解消化又はその融合タンパク質生成物）は、場合によっては、ある特定の疾患を処置する試みのために調査されている有力な治療薬である。しかしながら、かかる抗体又は断片は、ヒトに投与された場合、免疫応答を誘発する場合がある。かかる免疫応答は、血液循環からの抗体又は断片の免疫複合媒介クリアランスをもたらし、反復投与を、治療に適さないものとし得、それにより、患者に対する治療的利益が低減し、抗体又は断片の再投与が制限される。例えば、非ヒト部分を含む抗体又は断片の反復投与は、血清病及び／又はアナフィラキシーをもたらし得る。これら及びその他の問題を回避するために、当該技術分野において周知のように、キメラ化及びヒト化を含む、かかる抗体及びその部分の免疫原性を低減するための多くのアプローチが取られてきた。しかしながら、これら及びその他のアプローチは尚も、多少の免疫原性、低親和性、低結合活性を有する、又は細胞培養、スケールアップ、生成及び／若しくは低収率における問題を伴う抗体又は断片をもたらし得る。したがって、かかる抗体又は断片は、治療用タンパク質としての製造又は使用にあまり理想的には適していない可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、これらの問題のうちのもう１つを克服する抗ＴＮＦ抗体又は断片、並びに既知の抗体又はその断片の改善を提供する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、当該技術分野において既知のものと組み合わせて、本明細書に記載され可能になる、配列番号１、２、及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て、並びに／若しくは配列番号４、５、及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む、単離されたヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化、及び／又は抗ＣＤＲ移植された抗ＴＮＦ抗体、免疫グロブリン、切断生成物、並びにそれらの他の特定された部分及び変異体、並びに抗ＴＮＦα抗体組成物、コード又は相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、デバイス、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、並びにそれらの作製及び使用方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、本明細書に記載されるように、配列番号１、２及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て、並びに／又は配列番号４、５及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む、少なくとも１つの単離された抗ＴＮＦ抗体も提供する。本発明による抗体は、配列番号１、２、及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て、並びに／又は配列番号４、５、及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む、本発明の抗体に組み込むことができる、重鎖若しくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、又はそのリガンド結合部分、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、又はそれらの任意の部分などであるがこれらに限定されない免疫グロブリン分子の少なくとも一つの部分を含む、任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含む。本発明の抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類、又はそれらの任意の組み合わせなどであるがこれらに限定されない、任意の哺乳動物を含むか、又はそれに由来し得る。
【００１６】
本発明は、一態様において、少なくとも１つの特定された配列、そのドメイン、部分、又は変異体を含む、特定の抗ＴＮＦ抗体をコード化するポリヌクレオチドを含み、それと相補的な、又はそれとハイブリダイズする、単離核酸分子を提供する。本発明は更に、この抗ＴＮＦ抗体核酸分子を含む組換えベクター、かかる核酸及び／又は組換えベクターを含有する宿主細胞、並びにかかる抗体核酸、ベクター及び／又は宿主細胞の作製及び／又は使用方法を提供する。
【００１７】
本発明の少なくとも１つの抗体は、少なくとも１つのＴＮＦタンパク質、サブユニット、断片、部分、又はそれらの任意の組み合わせに特異的な少なくとも１つの特定のエピトープに結合する。この少なくとも１つのエピトープは、このタンパク質の少なくとも一つの部分を含む少なくとも１つの抗体結合領域を含み得、このエピトープは好ましくは、このタンパク質の少なくとも１つの機能性、細胞外、可溶性、親水性、外部若しくは細胞質ドメイン、又はそれらの任意の部分などであるがこれらに限定されない、その少なくとも一つの部分の少なくとも１〜５個のアミノ酸から構成されている。
【００１８】
この少なくとも１つの抗体は、所望により、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、重鎖又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３）の少なくとも１つの特定された部分、及び／又は少なくとも１つの定常若しくは可変フレームワーク領域、又はその任意の部分を含むことができる。この少なくとも１つの抗体のアミノ酸配列は更に、所望により、本明細書に記載されるように、又は当該技術分野において既知であるように、少なくとも１つの特定の置換、挿入、又は欠失を含むことができる。
【００１９】
本発明は、本明細書に記載されるように、少なくとも１つの単離された抗ＴＮＦ抗体も提供し、本抗体は、ＴＮＦ誘導細胞接着分子の阻害、受容体へのＴＮＦ結合の阻害、マウスモデルにおける関節炎指数の改善（例えば、実施例３〜７を参照のこと）などであるがこれらに限定されない、少なくとも１つの活性を有する。したがって、抗ＴＮＦ抗体を、既知の方法により、ＴＮＦタンパク質に対する少なくとも１つの生物学的活性などであるがこれに限定されない、対応する活性についてスクリーニングすることができる。
【００２０】
本発明は更に、本発明の少なくとも１つのＴＮＦ抗体に対する少なくとも１つのＴＮＦ抗イディオタイプ抗体を提供する。抗イディオタイプ抗体は、本発明の抗体に組み込むことができる、重鎖若しくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）若しくはそのリガンド結合部分、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、又はそれらの任意の部分であるがこれらに限定されない、免疫グロブリン分子の少なくとも一つの部分を含む、任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含む。本発明の抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類などであるがこれらに限定されない、任意の哺乳動物を含むか、又はそれに由来し得る。
【００２１】
本発明は、一態様において、少なくとも１つの特定された配列、そのドメイン、部分又は変異体を含む、少なくとも１つのＴＮＦ抗イディオタイプ抗体をコード化するポリヌクレオチドを含み、それと相補的な、又はそれとハイブリダイズする、単離核酸分子を提供する。本発明は更に、核酸分子をコード化するこのＴＮＦ抗イディオタイプ抗体を含む組換えベクター、かかる核酸及び／又は組換えベクターを含有する宿主細胞、並びにかかる抗イディオタイプ抗体核酸、ベクター及び／又は宿主細胞の作製及び／又は使用方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体が検出可能及び／又は回収可能な量で発現される条件下で、本明細書に記載されるように宿主細胞を培養することを含む、宿主細胞中で少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体、又はＴＮＦ抗イディオタイプ抗体を発現させるための少なくとも１つの方法も提供する。
【００２３】
本発明はまた、（ａ）本明細書に記載されるように核酸及び／又は抗体をコード化する単離された抗ＴＮＦ抗体と、（ｂ）好適な担体又は希釈剤と、を含む、少なくとも１つの組成物も提供する。担体又は希釈剤は、所望により、既知の担体又は希釈剤に従って、製薬的に許容できるものであり得る。本組成物は、所望により、少なくとも１つの更なる化合物、タンパク質、又は組成物を更に含むことができる。
【００２４】
本発明は更に、当該技術分野において既知であり、かつ／又は本明細書に記載されるように、細胞、組織、器官、動物又は患者において、及び／又は関連する状態前、状態後若しくは状態中に、少なくとも１つのＴＮＦ関連状態を調節若しくは処置するために、治療有効量を投与するための、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の方法又は組成物を提供する。
【００２５】
本発明はまた、本発明により、少なくとも１つの組成物、デバイス、及び／又は治療若しくは予防有効量の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の送達方法も提供する。
【００２６】
本発明は更に、当該技術分野において既知であり、かつ／又は本明細書に記載されるように、細胞、組織、器官、動物若しくは患者において、及び／又は関連する状態前、状態後、若しくは状態中に、少なくとも１つのＴＮＦ関連状態を診断するための、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の方法又は組成物を提供する。
【００２７】
本発明はまた、本発明により、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を診断するための、少なくとも１つの組成物、デバイス、及び／又は送達方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ハイブリドーマ細胞上清中のＴＮＶ  ｍＡｂが組換えＴＮＦ受容体へのＴＮＦα結合を阻害する能力のアッセイを示すグラフ表示を示す。既知量のＴＮＶ  ｍＡｂを含有する様々な量のハイブリドーマ細胞上清を、固定濃度（５ｎｇ／ｍｌ）の１２５Ｉ標識ＴＮＦαとともにプレインキュベートした。混合物を、組換えＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質ｐ５５−ｓｆ２で予めコーティングされた９６ウェルのＯｐｔｉｐｌａｔｅに移した。ｍＡｂの存在下でｐ５５受容体に結合したＴＮＦαの量は、未結合の材料を洗い流し、γ計数器を使用して計数した後に決定した。これらの実験において８つのＴＮＶ  ｍＡｂ試料を試験したが、簡潔化のため、ＤＮＡ配列分析により、他のＴＮＶ  ｍＡｂのうちの１つと同一であることを示したｍＡｂのうちの３つ（セクション５．２．２を参照のこと）は、ここに示されていない。各試料を二重に試験した。示される結果は、２つの独立した実験を代表する。
【図２Ａ】ＴＮＶ  ｍＡｂ重鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す。示される生殖系列遺伝子は、ＤＰ−４６遺伝子である。「ＴＮＶｓ」は、示される配列がＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６の配列であることを示す。ＴＮＶ配列の最初の３つのヌクレオチドは、翻訳開始Ｍｅｔコドンを定義する。ＴＮＶ  ｍＡｂ遺伝子配列中の点線は、ヌクレオチドが生殖系列配列中のものと同じであることを示す。ＴＮＶ配列の最初の１９のヌクレオチド（下線付き）は、可変領域をＰＣＲ増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドに対応する。成熟ｍＡｂで始まるアミノ酸翻訳（一文字表記）は、生殖系列遺伝子についてのみ示される。生殖系列アミノ酸翻訳における３つのＣＤＲドメインは、太字で示され、下線付きである。ＴＮＶ１４８（Ｂ）と標識された行は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。生殖系列ＤＮＡ配列（ＣＤＲ３）中のギャップは、知られていないか、又は生殖系列遺伝子に存在しない配列のためである。ＴＮＶ  ｍＡｂ重鎖は、Ｊ６結合領域を使用する。
【図２Ｂ】ＴＮＶ  ｍＡｂ重鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す。示される生殖系列遺伝子は、ＤＰ−４６遺伝子である。「ＴＮＶｓ」は、示される配列がＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６の配列であることを示す。ＴＮＶ配列の最初の３つのヌクレオチドは、翻訳開始Ｍｅｔコドンを定義する。ＴＮＶ  ｍＡｂ遺伝子配列中の点線は、ヌクレオチドが生殖系列配列中のものと同じであることを示す。ＴＮＶ配列の最初の１９のヌクレオチド（下線付き）は、可変領域をＰＣＲ増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドに対応する。成熟ｍＡｂで始まるアミノ酸翻訳（一文字表記）は、生殖系列遺伝子についてのみ示される。生殖系列アミノ酸翻訳における３つのＣＤＲドメインは、太字で示され、下線付きである。ＴＮＶ１４８（Ｂ）と標識された行は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。生殖系列ＤＮＡ配列（ＣＤＲ３）中のギャップは、知られていないか、又は生殖系列遺伝子に存在しない配列のためである。ＴＮＶ  ｍＡｂ重鎖は、Ｊ６結合領域を使用する。
【図３】ＴＮＶ  ｍＡｂ軽鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す。示される生殖系列遺伝子は、ヒトκ生殖系列可変領域遺伝子のＶｇ／３８Ｋファミリーの代表的なメンバーである。ＴＮＶ  ｍＡｂ遺伝子配列中の点線は、ヌクレオチドが生殖系列配列中のものと同じであることを示す。ＴＮＶ配列の最初の１６のヌクレオチド（下線付き）は、可変領域をＰＣＲ増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドに対応する。成熟ｍＡｂのアミノ酸翻訳（一文字表記）は、生殖系列遺伝子についてのみ示される。生殖系列アミノ酸翻訳における３つのＣＤＲドメインは、太字で示され、下線付きである。ＴＮＶ１４８（Ｂ）と標識された行は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。生殖系列ＤＮＡ配列（ＣＤＲ３）中のギャップは、知られていないか又は生殖系列遺伝子に存在しない配列のためである。ＴＮＶ  ｍＡｂ軽鎖は、Ｊ３結合領域を使用する。
【図４】ＴＮＶ  ｍＡｂ重鎖可変領域の推定アミノ酸配列を示す。示されるアミノ酸配列（一文字表記）は、非クローン化ＰＣＲ生成物及びクローン化ＰＣＲ生成物の両方から決定されたＤＮＡ配列から推定された。分泌シグナル配列（シグナル）、フレームワーク（ＦＷ）、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインに分割したアミノ配列が示される。ＤＰ−４６生殖系列遺伝子のアミノ酸配列は、各ドメインの上の行に示されている。点線は、ＴＮＶ  ｍＡｂにおけるアミノ酸が生殖系列遺伝子と同一であることを示す。ＴＮＶ１４８（Ｂ）は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。「ＴＮＶ」は、異なる配列が示されない限り、示される配列が全てのＴＮＶ  ｍＡｂに関することを示す。生殖系列配列（ＣＤＲ３）中の破線は、配列が知られていないか又は生殖系列遺伝子に存在しないことを示す。
【図５】ＴＮＶ  ｍＡｂ軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列を示す。示されるアミノ酸配列（一文字表記）は、非クローン化ＰＣＲ生成物及びクローン化ＰＣＲ生成物の両方から決定されたＤＮＡ配列から推定された。分泌シグナル配列（シグナル）、フレームワーク（ＦＷ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインに分割したアミノ配列が示される。Ｖｇ／３８Ｋ型軽鎖生殖系列遺伝子のアミノ酸配列は、各ドメインの上の行に示される。点線は、ＴＮＶ  ｍＡｂにおけるアミノ酸が生殖系列遺伝子と同一であることを示す。ＴＮＶ１４８（Ｂ）は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。「Ａｌｌ」は、示される配列がＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、ＴＮＶ１４８Ｂ、及びＴＮＶ１８６に関することを示す。
【図６】ｒＴＮＶ１４８Ｂ発現Ｃ４６６細胞を作製するために使用された重鎖及び軽鎖発現プラスミドの模式図を示す。ｐ１７８３は重鎖プラスミドであり、ｐ１７７６は軽鎖プラスミドである。ｒＴＮＶ１４８Ｂ可変及び定常領域コードドメインは、黒色のボックスで示される。Ｊ−Ｃイントロンの免疫グロブリンエンハンサーは、灰色のボックスで示される。関連する制限部位が示される。Ａｂ遺伝子の転写が時計方向に進むように配向されたプラスミドが示される。プラスミドｐ１７８３の長さは１９．５３ｋｂであり、プラスミドｐ１７７６の長さは１５．０６ｋｂである。両プラスミドの完全なヌクレオチド配列は既知である。ｐ１７８３の可変領域コード配列は、ＢｓｉＷＩ／ＢｓｔＢＩ制限断片を置き換えることにより、別の重鎖可変領域配列に容易に置き換えることができる。ｐ１７７６の可変領域コード配列は、ＳａｌＩ／ＡｆｌＩＩ制限断片を置き換えることにより、別の可変領域配列に置き換えることができる。
【図７】５つのｒＴＮＶ１４８Ｂ生成細胞株の成長曲線分析のグラフ表示を示す。３０ｍｌの容量中に１．０×１０５細胞／ｍｌの生存細胞密度を有するように、Ｔ７５フラスコ内のＩ５Ｑ＋ＭＨＸ培地に細胞を播種することにより、０日目に培養を開始した。これらの研究に使用された細胞培養物は、トランスフェクション及びサブクローニングが行われるため、連続培養であった。その後、Ｔフラスコ内の細胞を十分に再懸濁し、０．３ｍｌの培養物のアリコートを取り出した。成長曲線研究は、細胞計数が１．５×１０５細胞／ｍｌ未満に低下したときに終了した。アリコート中の生細胞数をトリパン（ｔｙｐａｎ）ブルー排除により決定し、残りのアリコートは後のｍＡｂ濃度決定のために保管された。ヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡが、同じ時に全ての試料アリコートに対して行われた。
【図８】様々なＭＨＸ選択物濃度の存在下での細胞成長速度の比較のグラフ表示を示す。細胞サブクローンＣ４６６Ａ及びＣ４６６Ｂを、無ＭＨＸ培地（ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン）に解凍し、更に２日間培養した。次いで、両細胞培養物を、ＭＨＸなし、０．２Ｘ  ＭＨＸ又は１Ｘ  ＭＨＸのいずれかを含有した３つの培養に分割した。１日後、新しいＴ７５フラスコに、１×１０５細胞／ｍｌの開始密度で培養物を播種し、細胞を１週間、２４時間間隔で計数した。最初の５日間の倍加時間は、ＳＯＰ  ＰＤ３２．０２５の式を使用して計算し、バーの上に示す。
【図９】２つのｒＴＮＶ１４８Ｂ生成細胞株からの経時的なｍＡｂ生成の安定性のグラフ表示を示す。トランスフェクション及びサブクローニングを行った後、連続培養にあった細胞のサブクローンを使用して、２４ウェル培養皿中での長期連続培養を開始した。ＭＨＸ選択物を伴う又は伴わないＩ５Ｑ培地中で細胞を培養した。細胞を、４〜６日毎に培養物を分けることにより連続して継代して、新たな生存培養物を維持し、同時に前の培養物を消耗させた。消耗した細胞上清のアリコートは、培養物が消耗した直後に回収し、ｍＡｂ濃度が決定されるまで保管した。ヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡが、同じ時に全ての試料アリコートに対して行われた。
【図１０】実施例４の対照と比較した、本発明の抗ＴＮＦ抗体に応答した関節炎マウスモデルマウスＴｇ  １９７の体重変化を示す。約４週齢のＴｇ１９７研究マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの本発明の抗ＴＮＦ抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８又はＴＮＶ１９６）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。体重を投与前からの変化として分析したとき、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、研究を通してＤ−ＰＢＳ処置動物よりも一貫して高い体重増加を示した。この体重増加は、３〜７週目で有意であった。１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物も、研究の７週目に有意な体重増加を達成した。
【図１１Ａ】実施例４に示す関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、３週目から始まり、残りの研究の間中継続して（７週目）Ｄ−ＰＢＳ対照群よりも低かった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、Ｄ−ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目以降のＡＩにおいて有意な減少を示すことができなかった。各々を類似の用量のその他のものと比較したとき（１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４、１４８及び１９６と比較した１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２）、１０ｍｇ／ｋｇの処置群の間に有意差はなかった。１ｍｇ／ｋｇの処置群を比較したとき、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２よりも３、４及び７週で有意に低いＡＩを示した。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８も、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４処置群よりも３及び４週目で有意に低かった。ＴＮＶ１９６は研究の６週目までＡＩにおいて有意な減少を示したが（Ｄ−ＰＢＳ処置群と比較したとき）、ＴＮＶ１４８はこの研究の終了時に有意のままであった唯一の１ｍｇ／ｋｇ処置群であった。
【図１１Ｂ】実施例４に示す関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、３週目から始まり、残りの研究の間中継続して（７週目）Ｄ−ＰＢＳ対照群よりも低かった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、Ｄ−ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目以降のＡＩにおいて有意な減少を示すことができなかった。各々を類似の用量のその他のものと比較したとき（１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４、１４８及び１９６と比較した１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２）、１０ｍｇ／ｋｇの処置群の間に有意差はなかった。１ｍｇ／ｋｇの処置群を比較したとき、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２よりも３、４及び７週で有意に低いＡＩを示した。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８も、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４処置群よりも３及び４週目で有意に低かった。ＴＮＶ１９６は研究の６週目までＡＩにおいて有意な減少を示したが（Ｄ−ＰＢＳ処置群と比較したとき）、ＴＮＶ１４８はこの研究の終了時に有意のままであった唯一の１ｍｇ／ｋｇ処置群であった。
【図１１Ｃ】実施例４に示す関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、３週目から始まり、残りの研究の間中継続して（７週目）Ｄ−ＰＢＳ対照群よりも低かった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、Ｄ−ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目以降のＡＩにおいて有意な減少を示すことができなかった。各々を類似の用量のその他のものと比較したとき（１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４、１４８及び１９６と比較した１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２）、１０ｍｇ／ｋｇの処置群の間に有意差はなかった。１ｍｇ／ｋｇの処置群を比較したとき、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２よりも３、４及び７週で有意に低いＡＩを示した。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８も、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４処置群よりも３及び４週目で有意に低かった。ＴＮＶ１９６は研究の６週目までＡＩにおいて有意な減少を示したが（Ｄ−ＰＢＳ処置群と比較したとき）、ＴＮＶ１４８はこの研究の終了時に有意のままであった唯一の１ｍｇ／ｋｇ処置群であった。
【図１２】実施例５の対照と比較した、本発明の抗ＴＮＦ抗体に応答した関節炎マウスモデルマウスＴｇ  １９７の体重変化を示す。約４週齢のＴｇ１９７研究マウスを体重に基づき８つの処置群のうちの１つに割り当て、対照品（Ｄ−ＰＢＳ）、又は３ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８）（０週目）の腹腔内ボーラス投与で処置した。注射は１、２、３及び４週目に全ての動物において繰り返された。群１〜６は、試験品の有効性に関して評価された。群７及び８の動物から得られた血清試料は、２、３及び４週目のＴＮＶ１４又はＴＮＶ１４８の免疫応答誘導及び薬物動態クリアランスに関して評価された。
【図１３Ａ】関節炎指数に基づく実施例５の疾患の重症度の進行を表すグラフである。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、２週目から始まり、残りの研究の間中継続して（５週目）Ｄ−ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった。１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物及び３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物は、ｄ−ＰＢＳ対照群と比較したときに、研究を通して任意の時点でＡＩにおいて任意の有意な減少を達成することができなかった。３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は、ｄ−ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目から始まり、５週目まで継続する有意な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、研究の４及び５週目でより低い用量の両ｃＡ２（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）と比較したとき、ＡＩにおいて有意な減少を示し、また３〜５週目でＴＮＶ１４で処置した動物よりも有意に低かった。３ｍｇ／ｋｇの処置群のいずれかの間に有意差はなかったようだが、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物に関するＡＩは、ある時点で１０ｍｇ／ｋｇよりも有意に高く、一方ＴＮＶ１４８で処置した動物は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物と有意に異ならなかった。
【図１３Ｂ】関節炎指数に基づく実施例５の疾患の重症度の進行を表すグラフである。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、２週目から始まり、残りの研究の間中継続して（５週目）Ｄ−ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった。１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物及び３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物は、ｄ−ＰＢＳ対照群と比較したときに、研究を通して任意の時点でＡＩにおいて任意の有意な減少を達成することができなかった。３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は、ｄ−ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目から始まり、５週目まで継続する有意な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、研究の４及び５週目でより低い用量の両ｃＡ２（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）と比較したとき、ＡＩにおいて有意な減少を示し、また３〜５週目でＴＮＶ１４で処置した動物よりも有意に低かった。３ｍｇ／ｋｇの処置群のいずれかの間に有意差はなかったようだが、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物に関するＡＩは、ある時点で１０ｍｇ／ｋｇよりも有意に高く、一方ＴＮＶ１４８で処置した動物は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物と有意に異ならなかった。
【図１３Ｃ】関節炎指数に基づく実施例５の疾患の重症度の進行を表すグラフである。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、２週目から始まり、残りの研究の間中継続して（５週目）Ｄ−ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった。１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物及び３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物は、ｄ−ＰＢＳ対照群と比較したときに、研究を通して任意の時点でＡＩにおいて任意の有意な減少を達成することができなかった。３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は、ｄ−ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目から始まり、５週目まで継続する有意な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、研究の４及び５週目でより低い用量の両ｃＡ２（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）と比較したとき、ＡＩにおいて有意な減少を示し、また３〜５週目でＴＮＶ１４で処置した動物よりも有意に低かった。３ｍｇ／ｋｇの処置群のいずれかの間に有意差はなかったようだが、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物に関するＡＩは、ある時点で１０ｍｇ／ｋｇよりも有意に高く、一方ＴＮＶ１４８で処置した動物は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物と有意に異ならなかった。
【図１４】実施例６の対照と比較した、本発明の抗ＴＮＦ抗体に応答した関節炎マウスモデルマウスＴｇ  １９７の体重変化を示す。約４週齢のＴｇ１９７研究マウスを性別及び体重に基づき６つの処置群のうちの１つに割り当て、３ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇのいずれかの抗体（ｃＡ２又はＴＮＶ１４８）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。この研究は、Ｄ−ＰＢＳ及び１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２対照群を利用した。
【図１５】実施例６に示す関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。全ての処置群が初期の時点で多少の保護を示し、５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２及び５ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１〜３週目にＡＩにおいて有意な減少を示し、全ての処置群が２週目で有意な減少を示した。実験の後期に、５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は多少の保護を示し、４、６及び７週目で有意に減少した。低用量（３ｍｇ／ｋｇ）のｃＡ２及びＴＮＶ１４８は両方とも、６週目で有意な減少を示し、全ての処置群が７週目で有意な減少を示した。研究の終わりで（８週目）有意な減少を維持することができた処置群はなかった。任意の時点で処置群のいずれかの間（食塩水対照群は除く）に有意差はなかった。
【図１６】実施例７の対照と比較した、本発明の抗ＴＮＦ抗体に応答した関節炎マウスモデルマウスＴｇ  １９７の体重変化を示す。ＴＮＶ１４８（ハイブリドーマ細胞に由来する）及びｒＴＮＶ１４８Ｂ（トランスフェクトした細胞に由来する）の単回腹腔内投与の有効性を比較するために。約４週齢のＴｇ１９７研究マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４８、ｒＴＮＶ１４８Ｂ）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。
【図１７】実施例７に示す関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、４週目から始まり、残りの研究の間中継続して（８週目）Ｄ−ＰＢＳ対照群よりも低かった。ＴＮＶ１４８で処置した群及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群は両方とも、４週目でＡＩにおける有意な減少を示した。以前の研究（Ｐ−０９９−０１７）は、ＴＮＶ１４８が単回の１ｍｇ／ｋｇの腹腔内ボーラス後の関節炎指数の減少にわずかにより効果的であることを示したが、この研究では、両バージョンのＴＮＶ抗体で処置した群からのＡＩがわずかに高いことを示した。１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群（６週目を除く）は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２群と比較したとき、有意に増加せず、ＴＮＶ１４８で処置した群は、７及び８週目で有意に高かったが、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８及び１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８Ｂの間には研究の任意の時点でＡＩにおいて有意差はなかった。
【図１８】研究ＣＮＴＯ１４８ＤＭＬ２００１の研究スキーマを示す。
【図１９】６〜２１歳の仮想患者における、様々な投与レジメン（ＭＴＸなし）の、２４週目までのシミュレーションゴリムマブ濃度（中央値及び９５％予測区間）を示す。パネルＡ：Ｔ１Ｄ（赤色）対ＪＩＡ（青色）及びパネルＢ：Ｔ１Ｄ（赤色）対ｐｅｄＵＣ（緑色）。
【図２０】遊離ＴＮＦα抑制の模擬時間コースを、左側のパネルに誘導期間（最初の月）及び右側のパネルに維持期間（６ヶ月間）で示す。
【図２１】Ｕｌｔｒａｓａｆｅの特徴を示す。
【図２２】ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）ＶａｒｉｏＪｅｃｔ（商標）の特徴の図を示す。
【図２３】ＶａｒｉｏＪｅｃｔ（商標）デバイスを使用したＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）の投与における工程を示す。
【図２４】ＶａｒｉｏＪｅｃｔ（商標）デバイスに対する提案された設計改良例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、配列番号１、２、及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て、並びに／若しくは配列番号４、５、及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む、単離された組換え及び／又は合成抗ＴＮＦヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化若しくはＣＤＲ移植された抗体、及びそれに対するＴＮＦ抗イディオタイプ抗体、並びに少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体又は抗イディオタイプ抗体をコード化する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物及びコード核酸分子を提供する。本発明は、診断用及び治療用組成物、方法、並びにデバイスを含む、かかる核酸及び抗体、並びに抗イディオタイプ抗体の作製及び使用方法を更に含むが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「抗腫瘍壊死因子α抗体」、「抗ＴＮＦ抗体」、「抗ＴＮＦ抗体部分」若しくは「抗ＴＮＦ抗体断片」、及び／又は「抗ＴＮＦ抗体変異体」などは、本発明の抗体の中に組み込むことができる、重鎖若しくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）若しくはそのリガンド結合部分、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域又はこれらの任意の部分、あるいはＴＮＦ受容体又は結合タンパク質の少なくとも一つの部分などであるがこれらに限定されない免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含む、任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含む。かかる抗体は所望により、特定のリガンドに更に影響を及ぼし、これらに限定されないが、かかる抗体は、インビトロで、その場で、及び／又はインビボで、少なくとも１つのＴＮＦ活性若しくは結合又はＴＮＦ受容体活性若しくは結合を、調節、減少、増加、拮抗、作動、軽減、緩和、遮断、阻害、抑止及び／又は干渉する。非限定的な例として、本発明の好適な抗ＴＮＦ抗体、特定された部分又は変異体は、少なくとも１つのＴＮＦ又はその特定された部分、変異体若しくはドメインに結合することができる。好適な抗ＴＮＦ抗体、特定された部分又は変異体はまた、所望により、ＲＮＡ、ＤＮＡ、若しくはタンパク質合成、ＴＮＦ放出、ＴＮＦ受容体シグナル伝達、膜ＴＮＦ切断、ＴＮＦ活性、ＴＮＦ生成、及び／又は合成などであるがこれらに限定されない、ＴＮＦ活性又は機能のうちの少なくとも１つに影響を及ぼすこともできる。用語「抗体」は更に、抗体、その消化断片、特定された部分及び変異体を包含することを意図し、これには抗体模倣薬が挙げられるか、あるいは抗体の構造及び／若しくは機能を模倣する抗体の部分又はその特定された断片若しくは部分を含み、単鎖抗体及びその断片が挙げられる。機能断片としては、哺乳類のＴＮＦに結合する抗原結合断片が挙げられる。例えば、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）及びＦ（ａｂ’）２（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシン又はプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元及び再集合による）、Ｆｖ又はｓｃＦｖ（例えば、分子生物学的技術による）断片が挙げられるがこれらに限定されない、ＴＮＦ又はその部分に結合することができる抗体断片が、本発明に包含される（例えば、上記のＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照のこと）。
【００３１】
かかる断片は、当該技術分野において既知であるように、及び／又は本明細書に記載されるように、酵素切断、合成又は組換え技術により生成することができる。抗体は、１つ以上の終止コドンが自然な終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して、様々な切断型でも生成され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコード化する遺伝子の組み合わせは、重鎖のＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域をコード化するＤＮＡ配列を含むよう設計することができる。抗体の様々な部分を従来の技術により化学的に結合でき、又は遺伝子工学技術を用いて隣接タンパク質（contiguous protein）として調製できる。
【００３２】
本明細書で使用するとき、用語「ヒト抗体」は、実質的にタンパク質の全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ（ＶＬ、ＶＨ））が軽微な配列の変化又は変異だけで実質的にヒトにおいて非免疫原性である抗体を指す。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなど）及びその他の哺乳類動物を指定された抗体は、かかる種、亜属、属、亜科及び科の特異的抗体を指定する。更に、キメラ抗体は、上記の任意の組み合わせを含む。このような変化又は変異は、所望により、また好ましくは、非改変抗体に比べて、ヒト又は他の種における免疫原性を保持するか又は低下させる。したがって、ヒト抗体は、キメラ又はヒト化抗体とは異なる。ヒト抗体は、機能的に再構成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖及び／又は軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物、又は原核若しくは真核細胞により生成され得ることが指摘される。その上、ヒト抗体が単鎖抗体である場合、天然のヒト抗体では見られないリンカーペプチドを含み得る。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を接続する２〜約８個のグリシン又はその他のアミノ酸残基などのリンカーペプチドを含み得る。このようなリンカーペプチドはヒト由来のものと見なされる。
【００３３】
また、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒト又はヒト化抗体である、二重特異的、異種特異的、異種結合性、又は類似の抗体を使用してもよい。この場合では、結合特異性のうち一方は少なくとも１つのＴＮＦタンパク質に対するものであり、他方は任意のその他の抗原に対するものである。二重特異的抗体の製造方法は、当該技術分野において既知である。従来、二重特異的抗体の組換え体生成は、２種の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づくが、ここで２本の重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の可能な混合物を生成し、これらのうち１種のみが正しい二重特異的構造を有する。正しい分子の精製（通常アフィニティクロマトグラフィー工程により行われる）はかなり面倒であり、生成物の収率は低い。類似する手順が、例えば、国際公開第９３／０８８２９号、米国特許第６，２１０，６６８号、同第６，１９３，９６７号、同第６，１３２，９９２号、同第６，１０６，８３３号、同第６，０６０，２８５号、同第６，０３７，４５３号、同第６，０１０，９０２号、同第５，９８９，５３０号、同第５，９５９，０８４号、同第５，９５９，０８３号、同第５，９３２，４４８号、同第５，８３３，９８５号、同第５，８２１，３３３号、同第５，８０７，７０６号、同第５，６４３，７５９号、同第５，６０１，８１９号、同第５，５８２，９９６号、同第５，４９６，５４９号、同第４，６７６，９８０号、国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／００３７３号、欧州特許第０３０８９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）に開示されており、これらの各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００３４】
本発明の方法及び組成物において有用である抗ＴＮＦ抗体（ＴＮＦ抗体とも称される）は、ＴＮＦへの高親和性結合、並びに所望によりかつ好ましくは低毒性を有することを任意に特徴とし得る。具体的には、可変領域、定常領域、及びフレームワークなどの個々の構成要素が、個々に及び／又は集合的に、所望によりまた好ましくは低い免疫原性を有する、本発明の抗体、その特定された断片、又は変異体が本発明において有用である。本発明で使用することができる抗体は、所望により、長期間測定可能な程度症状を緩和する患者を処置する能力、並びに低い及び／又は許容できる毒性を特徴とする。低い若しくは許容できる免疫原性、及び／又は高い親和性、並びにその他の好適な特性は、得られる治療結果に寄与することができる。「低い免疫原性」は、本明細書では、処置される患者の約７５％未満、若しくは好ましくは約５０％未満で有意にＨＡＨＡ、ＨＡＣＡ若しくはＨＡＭＡ応答が増加する、及び／又は処置される患者において低い力価（二重抗原酵素イムノアッセイで測定したとき約３００未満、好ましくは約１００未満）が増加することとして定義される（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３４４：１１２５〜１１２７（１９９４）、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【００３５】
有用性：本発明の単離核酸は、細胞、組織、器官又は動物（哺乳類及びヒトを含む）において測定し、又は作用して、免疫障害若しくは疾患、循環器障害若しくは疾患、感染性、悪性及び／若しくは神経性障害又は疾患のうちの少なくとも１つから選択されるがこれらに限定されない、少なくとも１つのＴＮＦ状態を診断、監視、調節、処置、緩和、発生を予防するのを助ける、又はその症状を低減するために使用され得る、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体又はその特定された変異体を生成するために使用され得る。
【００３６】
かかる方法は、症状、作用、又は機序のかかる調節、処置、緩和、予防、若しくは低減を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を投与することを含み得る。有効量は、本明細書に記載される、又は関連分野で既知である、既知の方法を使用して行い決定するとき、単回（例えば、ボーラス）、複数回、若しくは持続投与あたり約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇの量、又は単回、複数回、若しくは持続投与あたり０．０１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を達成する量、又はこの中の任意の有効範囲若しくは値を含み得る。引用文献。本明細書で引用する全ての刊行物又は特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本発明の時点での最高水準を示し、かつ／又は本発明の説明及び使用可能性を提供する。刊行物は、任意の科学刊行物若しくは特許公報、又は全ての記録された電子若しくは印刷型式を含む、任意の媒体形式で利用可能なその他の任意の情報を指す。以下の文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる：Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７〜２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２００１）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７〜２００１）。
【００３７】
本発明の抗体：配列番号１、２、及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て、並びに／又は配列番号４、５、及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む、本発明の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体は、所望により、当該技術分野において周知であるように、細胞株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン集団により生成され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７〜２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２００１）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７〜２００１）を参照されたく、各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００３８】
ヒトＴＮＦタンパク質又はその断片に特異的なヒト抗体は、単離された及び／若しくはＴＮＦタンパク質、又はそれらの一部分（合成ペプチドなどの合成分子を含む）などの適切な免疫原性抗原に対して生じ得る。他の特定の又は一般的な哺乳類抗体も同様に生じ得る。免疫原性抗原の調製及びモノクローナル抗体の生成は、任意の好適な技術を使用して行うことができる。
【００３９】
１つのアプローチでは、ハイブリドーマは、適切な不死化細胞株（例えば、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２  ＳＡ３、Ｓｐ２  ＭＡＩ、Ｓｐ２  ＳＳ１、Ｓｐ２  ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ  １４４、ＡＣＴ  ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ  １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ  ２Ａなどであるがこれらに限定されない骨髄腫細胞株、又はヘテロミローマ（heteromylomas）、その融合生成物、又はそれらに由来する任意の細胞若しくは融合細胞、又は当該技術分野において既知の任意のその他の好適な細胞株を融合させることにより生成される。例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．などを参照のこと。単離若しくはクローニングされた脾臓、末梢血、リンパ、扁桃、又はその他の免疫若しくはＢ細胞含有細胞などであるがこれらに限定されない抗体生成細胞、あるいは組換え若しくは内因性、ウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫類、爬虫類、魚類、哺乳類、げっ歯類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒツジ、霊長類、真核生物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ，ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ若しくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖若しくは三本鎖、ハイブリダイズなど、又はそれらの組み合わせのような、内因性若しくは異種の核酸のいずれかとして、重鎖若しくは軽鎖定常若しくは可変若しくはフレームワーク若しくはＣＤＲ配列を発現する任意のその他の細胞を有する。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ及びＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（上記）ｃｈａｐｔｅｒ  ２を参照されたく、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００４０】
抗体生成細胞はまた、目的の抗原で免疫化されたヒト又はその他の好適な動物の末梢血、又は好ましくは脾臓若しくはリンパ節から得ることもできる。任意のその他の好適な宿主細胞も、本発明の抗体、特定された断片又はその変異体をコード化する異種若しくは内因性の核酸を発現するために使用され得る。融合細胞（ハイブリドーマ）又は組換え細胞は、選択的培養条件又はその他の好適な既知の方法を使用して単離され、限界希釈若しくは細胞選別又はその他の既知の方法によってクローニングされ得る。所望の特異性を有する抗体を生成する細胞は、好適なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）によって選択することができる。
【００４１】
ペプチド又はタンパク質ライブラリから組換え抗体を選択する（例えば、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどのディスプレイライブラリであるがこれに限定されない、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，ＤＥ、Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ、Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｅｎｚｏｎ，Ａｆｆｙｍａｘ／Ｂｉｏｓｉｔｅ、Ｘｏｍａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ、Ｉｘｓｙｓ。例えば、欧州特許第３６８，６８４号、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５号、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９２／００２２４０号、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９２／００８８３号、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９３／００６０５号、米国特許出願公開第０８／３５０２６０号（５／１２／９４）、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９４／０１４２２号、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９４／０２６６２号、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９７／０１８３５号、（ＣＡＴ／ＭＲＣ）、国際公開第９０／１４４４３号、国際公開第９０／１４４２４号、国際公開第９０／１４４３０号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２３４号、国際公開第９２／１８６１９号、国際公開第９６／０７７５４号、（Ｓｃｒｉｐｐｓ）、欧州特許第６１４  ９８９号（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）、国際公開第９５／１６０２７号（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ）、国際公開第８８／０６６３０号、国際公開第９０／３８０９号（Ｄｙａｘ）、米国特許第４，７０４，６９２号（Ｅｎｚｏｎ）、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２９８９号、国際公開第８９／０６２８３号、欧州特許第３７１  ９９８号、欧州特許第５５０  ４００号、（Ｘｏｍａ）、欧州特許第２２９  ０４６号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０７１４９号、又は確率論的に生成されるペプチド若しくはタンパク質−米国特許第５７２３３２３号、同第５７６３１９２号、同第５８１４４７６号、同第５８１７４８３号、同第５８２４５１４号、同第５９７６８６２号、国際公開第８６／０５８０３号、欧州特許第５９０  ６８９号（Ｉｘｓｙｓ、現在はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＡＭＥ）、各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）か、又は当該技術分野において既知であり、かつ／又は本明細書に記載される、ヒト抗体のレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物の免疫化に依存する（例えば、ＳＣＩＤマウス、Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１〜９０７（１９９７）、Ｓａｎｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９５〜１１８（１９９６）、Ｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：１５４〜１６１（１９９８）（各々は、参照により全体が組み込まれる）、並びに関連する特許及び出願）方法を含むがこれらに限定されない、必要な特異性の抗体を生成又は単離する他の好適な方法を使用することができる。かかる技術には、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４９３７〜４９４２（Ｍａｙ  １９９７）、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４１３０〜１４１３５（Ｎｏｖ．１９９８））、単一細胞抗体生成技術（例えば、選択リンパ球抗体方法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号、Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７〜８９２，（１９８７）、Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３〜７８４８（１９９６））、ゲルマイクロドロップレット（ｇｅｌ  ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）、及びフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３〜３３７（１９９０）、Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５〜１６３（１９９５）、Ｋｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７〜７９０（１９９５））、Ｂ細胞選択物（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９：１２５〜１３４（１９９４）、Ｊｏｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．５，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８８））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
非ヒト抗体又はヒト抗体を工学的処理又はヒト化するための方法も同様に使用でき、当該技術分野において周知である。一般に、ヒト化又は工学処理された抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、又はその他の哺乳動物などであるがこれらに限定されない、非ヒトの供給源からの１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には既知のヒト配列の「インポート」可変領域、定常領域又はその他のドメインから採取される。既知のヒトＩｇ配列が開示されており、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／、ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／、ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／〜ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ、ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／、ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／、ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／、ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／〜ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／〜ｈｃｌ／、ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／、ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ、ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／〜ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ、ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ＡＥＰＳｔａｒｔ．ｈｔｍｌ、ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／〜ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／、ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ、ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／、ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／、ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／〜ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ／、ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ、ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ−ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒ＿ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ、ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）である（各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４３】
このようなインポートされた配列は、免疫原性を減少させるため、あるいは、当該技術分野において既知のように、結合、親和性、オン速度、オフ速度、結合活性、特異性、半減期、又はその他の適切な任意の特性を低減、増強又は改変するために使用することができる。一般に、非ヒト若しくはヒトＣＤＲ配列の一部又は全ては、可変及び定常領域の非ヒト配列がヒト若しくは他のアミノ酸に置き換えられる間も維持される。抗体はまた、所望により、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持したままで、ヒト化され得る。この目的を達成するために、所望により、ヒト化抗体を、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを使用した、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製することが可能である。３次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補の免疫グロブリン配列について、可能性の高い３次元立体構造を図示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補の免疫グロブリン配列の機能における残基の役割として可能性の高いものの分析、即ち候補の免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大など、望ましい抗体特性が達成されるように、コンセンサス配列及びインポート配列から、ＦＲ残基を選択し組合せることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は抗原結合に対する影響において、直接的かつ最も実質的に関与している。本発明の抗体のヒト化又は工学的処理は、Ｗｉｎｔｅｒ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７），Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５７２３３２３号、同第５９７６８６２号、同第５８２４５１４号、同第５８１７４８３号、同第５８１４４７６号、同第５７６３１９２号、同第５７２３３２３号、同第５，７６６８８６号、同第５７１４３５２号、同第６２０４０２３号、同第６１８０３７０号、同第５６９３７６２号、同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５２２５５３９号、同第４８１６５６７号、国際出願ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０号、ＵＳ９６／１８９７８号、ＵＳ９１／０９６３０号、ＵＳ９１／０５９３９号、ＵＳ９４／０１２３４号、ＧＢ８９／０１３３４号、ＧＢ９１／０１１３４号、ＧＢ９２／０１７５５号、国際公開第９０／１４４４３号、国際公開第９０／１４４２４号、国際公開第９０／１４４３０号、欧州特許第２２９２４６号（各々、参照により全体が明細書に組み込まれ、その中に引用される文献を含む）に記載されるものなどであるがこれらに限��されない、任意の既知の方法を使用して行うことができる。
【００４４】
抗ＴＮＦ抗体はまた、所望により、本明細書に記載されかつ／又は当該技術分野において既知である、ヒト抗体のレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類など）の免疫化により生成することもできる。ヒト抗ＴＮＦ抗体を生成する細胞をかかる動物から単離し、本明細書に記載される方法などの好適な方法を使用して不死化してもよい。
【００４５】
ヒト抗原に結合するヒト抗体のレパートリーを生成することができるトランスジェニックマウスは、既知の方法によって生成することができる（例えば、これらに限定されないが、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．に発行された米国特許第５，７７０，４２８号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、及び同第５，７８９，６５０号、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９８／５０４３３号、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９８／２４８９３号、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９８／２４８８４号、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９７／１３８５２号、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９４／２５５８５号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９６／３４０９６号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許第０４６３  １５１（Ｂ１），号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許第０７１０  ７１９（Ａ１）号、Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，５４５，８０７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９０／０４０３６号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許第０４３８  ４７４（Ｂ１）号、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許第０８１４  ２５９（Ａ２）号、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．イギリス特許第２  ２７２  ４４０（Ａ）号、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（４）５７９〜５９１（１９９４）、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３〜２１（１９９４）、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６〜１５６（１９９７）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０（２３）：６２８７〜６２９５（１９９２）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０（８）３７２０〜３７２４（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３（１）：６５〜９３（１９９５）、及びＦｉｓｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４（７）：８４５〜８５１（１９９６）であり、これらは各々、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。一般に、これらのマウスは、機能的に再配列された、又は機能的な再配列を受けることができる少なくとも１つのヒト免疫グロブリン遺伝子座からのＤＮＡを含む、少なくとも１つの導入遺伝子を含む。このようなマウスの内因性免疫グロブリン遺伝子座を分断又は欠失させて、内因性遺伝子によりコード化されている抗体を産生する動物の能力を除去することができる。
【００４６】
類似のタンパク質又は断片への特異的結合についての抗体のスクリーニングは、ペプチドディスプレイライブラリを使用して便宜的に達成することができる。この方法は、望ましい機能又は構造をもつ個々のメンバーについてペプチドの多数の試料採集をスクリーニングすることを伴う。ペプチドディスプレイライブラリの抗体スクリーニングは、当該技術分野において周知である。ディスプレイされたペプチド配列の長さは、３〜５０００個以上のアミノ酸であり、頻繁には５〜１００個のアミノ酸長、多くは約８〜２５個のアミノ酸長であり得る。ペプチドライブラリを作成する直接的化学合成方法に加えて、いくつかの組換えＤＮＡ方法も記述されている。１つのタイプには、バクテリオファージ又は細胞の、表面上のペプチド配列のディスプレイが関与している。各バクテリオファージ又は細胞は、特定のディスプレイされたペプチド配列をコード化するヌクレオチド配列を含有する。このような方法は、国際公開第９１／１７２７１号、同第９１／１８９８０号、同第９１／１９８１８号、及び同第９３／０８２７８号に記載されている。ペプチドのライブラリを作成するための他のシステムは、インビトロ化学合成及び組換え方法の両方の局面を有する。国際公開第９２／０５２５８号、同第９２／１４８４３号、及び同第９６／１９２５６号を参照のこと。米国特許第５，６５８，７５４号及び同第５，６４３，７６８号も参照のこと。ペプチドディスプレイライブラリ、ベクター、及びスクリーニングキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）のような供給元から市販されている。例えば、Ｅｎｚｏｎに譲渡された米国特許第４７０４６９２号、同第４９３９６６６号、同第４９４６７７８号、同第５２６０２０３号、同第５４５５０３０号、同第５５１８８８９号、同第５５３４６２１号、同第５６５６７３０号、同第５７６３７３３号、同第５７６７２６０号、同第５８５６４５６号、Ｄｙａｘに譲渡された同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６９８号、同第５８３７５００号、Ａｆｆｙｍａｘに譲渡された同第５４２７９０８号、同第５５８０７１７号、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに譲渡された同第５８８５７９３号、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに譲渡された同第５７５０３７３号、Ｘｏｍａに譲渡された同第５６１８９２０号、同第５５９５８９８号、同第５５７６１９５号、同第５６９８４３５号、同第５６９３４９３号、同第５６９８４１７号、Ｃｏｌｌｉｇａｎ（上記）、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記）、又はＳａｍｂｒｏｏｋ（上記）を参照のこと（上記特許及び刊行物の各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４７】
本発明の抗体はまた、かかる抗体を乳中に生成するヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどのトランスジェニック動物又は哺乳動物を提供するために、核酸をコード化する少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を使用して調製することもできる。かかる動物は、既知の方法を使用して提供することができる。例えば、これらに限定されないが、米国特許第５，８２７，６９０号、同第５，８４９，９９２号、同第４，８７３，３１６号、同第５，８４９，９９２号、同第５，９９４，６１６号、同第５，５６５，３６２号、同第５，３０４，４８９号などを参照のこと（それらの各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４８】
本発明の抗体は、植物部分又はそれから培養された細胞において、かかる抗体、特定された部分又は変異体を生成するトランスジェニック植物及び培養された植物細胞（例えば、タバコ及びトウモロコシであるが、これらに限定されない）を提供するために、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体コード核酸を使用して更に調製することができる。非限定的な例として、例えば、誘導プロモーターを使用して、組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉をうまく使用して大量の組換えタンパク質が提供されてきた。例えば、Ｃｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５〜１１８（１９９９）及びその中で引用される文献を参照のこと。また、トランスジェニックトウモロコシは、他の組換え系において生成されるか、又は天然源から精製されるタンパク質に等しい生物学的活性を有する、商業生成レベルで哺乳類タンパク質を発現するために使用されてきた。例えば、Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６４：１２７〜１４７（１９９９）及びその中で引用される文献を参照のこと。抗体はまた、タバコ種子及びポテト塊茎を含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を含むトランスジェニック植物種子からも大量に生成されてきた。例えば、Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１〜１０９（１９９８）及びその中で引用される文献を参照のこと。したがって、本発明の抗体はまた、既知の方法により、トランスジェニック植物を使用して生成することもできる。例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９〜１０８（Ｏｃｔ．，１９９９），Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５２２〜７（１９９５）、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１〜６（１９９５）、Ｗｈｉｔｅｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０〜９４４（１９９４）、及びその中で引用される文献も参照のこと。また、限定されないが、一般に抗体の植物発現についても参照のこと。上記文献の各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００４９】
本発明の抗体は、広範囲にわたる親和性（ＫＤ）でヒトＴＮＦに結合することができる。好ましい実施形態では、本発明の少なくとも１つのヒトｍＡｂは、所望によりヒトＴＮＦに高い親和性で結合することができる。例えば、ヒトｍＡｂは、ヒトＴＮＦを約１０−７Ｍ以下、例えば０．１〜９．９（又はその中の任意の範囲若しくは値）Ｘ１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３又はその中の任意の範囲若しくは値など（ただしこれらに限定されない）のＫＤで結合することができる。
【００５０】
抗原に対する抗体の親和性又は結合活性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、及び本明細書に記載される方法を参照のこと）。特定の抗体抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定された場合に異なり得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）の測定は、好ましくは、抗体及び抗原の標準化溶液、並びに本明細書で記載される緩衝剤などの標準化緩衝剤を用いて行われる。
【００５１】
核酸分子。配列番号１、２、３、４、５、６、７、８のうちの少なくとも１つの隣接アミノ酸の少なくとも７０〜１００％をコード化するヌクレオチド配列、特定された断片、変異体若しくはそれらのコンセンサス配列、又はこれらの配列のうちの少なくとも１つを含む寄託ベクターなどの本明細書に提供される情報を使用して、配列番号１、２、及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て並びに／又は配列番号４、５、及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体をコード化する本発明の核酸分子は、本明細書に記載されるか、又は当該技術分において既知の方法を使用して得ることができる。
【００５２】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ若しくは任意の他の形態のようなＲＮＡ、又はクローニングにより得られる若しくは合成的に生成されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されないＤＮＡの形態、又はこれらの任意の組み合わせであってよい。ＤＮＡは、３本鎖、２本鎖若しくは１本鎖、又はこれらの任意の組み合わせであってよい。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１本の鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよいし、又はアンチセンス鎖と呼ばれる、非コード鎖であってもよい。
【００５３】
本発明の単離された核酸分子は、所望により１つ以上のイントロンを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、これらに限定されないが、少なくとも１つの重鎖（例えば、配列番号１〜３）若しくは軽鎖（例えば、配列番号４〜６）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３のような、少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも１つの特定された部分を含む核酸分子、抗ＴＮＦ抗体若しくは可変領域のコード配列（例えば、配列番号７、８）を含む核酸分子、並びに上述の核酸分子とは実質的に異なるが、遺伝コードの縮重により、本明細書に記載されかつ／又は当該技術分野において既知である少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を尚もコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み得る。当然のことながら、遺伝コードは、当該技術分野においてよく知られている。したがって、当業者には、本発明の特定の抗ＴＮＦ抗体をコード化する、かかる縮重核酸変異体を生成することは、日常的であろう。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたく、かかる核酸変異体は、本発明に含まれる。本発明の単離核酸分子の非限定的な例としては、それぞれＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、ＬＣ  ＣＤＲ３、ＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域をコード化する核酸の非限定的な例に対応する、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５が挙げられる。
【００５４】
本明細書に示されるように、抗ＴＮＦ抗体をコード化する核酸を含む本発明の核酸分子は、それ自体で抗体断片のアミノ酸配列をコード化するもの、全抗体若しくはその一部のコード配列、抗体、断片若しくは部分のコード配列、並びに追加の配列、例えば、少なくとも１つのイントロンなど、前述の追加のコード配列を伴って、又は伴わずに、非コード５’及び３’配列、例えば、スプライシング及びポリアデニル化シグナル（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合及び安定性）を含む、転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割を果たす転写された非翻訳配列を含むがこれに限定されない追加の非コード配列とともに、少なくとも１つのシグナルリーダー若しくは融合ペプチドのコード配列、更なるアミノ酸、例えば、更なる機能性を提供するアミノ酸をコード化する追加のコード配列を挙げることができるが、これらに限定されない。したがって、抗体をコード化する配列は、抗体断片又は部分を含む融合された抗体の精製を促進するペプチドをコード化する配列などのマーカー配列に融合させることができる。
【００５５】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド。本発明は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドに対して、選択的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離核酸を提供する。したがって、本実施形態のポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出、及び／又は定量化するために使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを使用して、蓄積されたライブラリにおける部分又は完全長クローンを同定、単離、又は増幅することができる。いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドは、単離された、又はそうでなければヒト若しくは哺乳類の核酸ライブラリからのｃＤＮＡに相補的な、ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列である。
【００５６】
好ましくは、ｃＤＮＡライブラリは、完全長配列の少なくとも８０％、好ましくは完全長配列の少なくとも８５％又は９０％、及びより好ましくは完全長配列の少なくとも９５％を含む。ｃＤＮＡライブラリは、稀な配列の発現量を増大させるために正規化してよい。相補的な配列に対して低い配列同一性をもつ配列とともに使用される、ストリンジェンシーが低度又は中程度のハイブリダイゼーション条件が典型的であるが、排他的ではない。ストリンジェンシーが中程度及び高度の条件は、所望により、より高い同一性をもつ配列に対して使用することができる。低ストリンジェンシー条件は、約７０％の配列同一性をもつ配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オーソロガス又はパラロガス配列を同定するために利用できる。
【００５７】
所望により、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているポリヌクレオチドによってコード化される抗体の少なくとも一部をコード化することになる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコード化するポリヌクレオチドに対する選択的ハイブリダイゼーションのために利用可能な核酸配列を包含する。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、上記のＣｏｌｌｉｇａｎを参照のこと（各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５８】
核酸の構築。本発明の単離核酸は、当技術分野にて周知のように、（ａ）組換え方法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、又はこれらの組み合わせを使用して作製することができる。
【００５９】
核酸は、本発明のポリヌクレオチドに加えて、便利に配列を含むことができる。例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニングサイトを核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。また、翻訳可能な配列を挿入して、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。本発明の核酸（コード配列を除く）は、所望により、本発明のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクター、アダプター又はリンカーである。
【００６０】
追加の配列をかかるクローニング及び／又は発現配列に付加して、クローニング及び／又は発現におけるそれらの機能を最適化し、ポリヌクレオチドの単離に役立てることができるか、又は細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善することができる。クローン化ベクター、発現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は、当該技術分野においてよく知られている。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
【００６１】
核酸を構築するための組換え方法。ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせのような本発明の単離核酸組成物は、当業者に既知の任意の数のクローニング手順を用いて生物源から得ることができる。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドに対して厳しい条件下で選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリ内の望ましい配列を同定するために使用される。ＲＮＡの単離、並びにｃＤＮＡ及びゲノムライブラリの構築は、当業者には周知である。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。）
【００６２】
核酸のスクリーニング及び単離方法。本明細書で開示されているような、本発明のポリヌクレオチドの配列に基づいたプローブを用いて、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることができる。プローブを使用して、同じ又は異なる生体内の相同遺伝子を単離するため、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることができる。当業者であれば、アッセイに様々な度合のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを用いることができ、ハイブリダイゼーション又は洗浄媒質のいずれかが厳しい可能性があることは明らかであろう。ハイブリダイゼーションのための条件が厳しくなるにつれて、二重鎖形成が生じるために、プローブと標的との間の相補性の程度が大きくなるはずである。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、及びホルムアミドのような部分的に変性する溶媒の存在、のうちの１つ以上によって制御され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、０％〜５０％の範囲内でのホルムアミド濃度の操作により反応溶液の極性を変えることにより都合良く変更される。検出可能な結合のために必要な相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒質及び／又は洗浄媒質のストリンジェンシーに従って変化する。相補性の程度は、最適には１００％、又は７０〜１００％、又はその中の任意の範囲若しくは値である。しかしながら、プローブ及びプライマー内のわずかな配列変動は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄媒質のストリンジェンシーを低下させることで補償できるということを理解すべきである。
【００６３】
ＲＮＡ又はＤＮＡの増幅方法は当該技術分野において周知であり、本明細書で紹介する教示及び指針に基づいて、過度の実験なしに、本発明に従って使用可能である。
【００６４】
ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅の既知の方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び関連する増幅プロセス（例えば、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号、Ｔａｂｏｒらの同第４，７９５，６９９号及び同第４，９２１，７９４号、Ｉｎｎｉｓの同第５，１４２，０３３号、Ｗｉｌｓｏｎらの同第５，１２２，４６４号、Ｉｎｎｉｓの同第５，０９１，３１０号、Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎらの同第５，０６６，５８４号、Ｇｅｌｆａｎｄらの同第４，８８９，８１８号、Ｓｉｌｖｅｒらの同第４，９９４，３７０号、Ｂｉｓｗａｓの同第４，７６６，０６７号、Ｒｉｎｇｏｌｄの同第４，６５６，１３４号を参照のこと）、及び二本鎖ＤＮＡ合成のためのテンプレートとして標的配列に対してアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ媒介増幅（Ｍａｌｅｋらの米国特許第５，１３０，２３８号、商標名ＮＡＳＢＡをもつ）が挙げられるが、これらに限定されない（これらの文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。）
【００６５】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリから直接、本発明のポリヌクレオチド及び関連する遺伝子の配列を増幅することができる。ＰＣＲ及びその他のインビトロ増幅方法はまた、例えば、発現すべきタンパク質をコード化する核酸配列をクローニングする、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するため、核酸の配列決定のため、又はその他の目的のためのプローブとして用いるための核酸を作製するのに有用であり得る。インビトロ増幅方法によって当業者を導くのに十分な技術の例は、上記のＢｅｒｇｅｒ、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ及び上記のＡｕｓｕｂｅｌ並びに米国特許第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら、１９８７）、及びＩｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に見られる。ゲノムＰＣＲ増幅用の市販キットは当該技術分野において既知である。例えば、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照のこと。加えて、例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、長いＰＣＲ産物の収率を改善することができる。
【００６６】
核酸を構築するための合成方法。本発明の単離核酸は、既知の方法による直接化学合成によっても調製可能である（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照）。化学合成は、一般に、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、又は１本鎖をテンプレートとして使用するＤＮＡポリメラーゼとの重合によって、２本鎖ＤＮＡに変換可能な１本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。当業者であれば、ＤＮＡの化学合成は約１００以上の塩基の配列に限定され得るものの、より長い配列は、より短い配列の連結反応によって得ることができることを認識するであろう。
【００６７】
組換え発現カセット。本発明は、本発明の核酸を含む組換え発現カセットを更に提供する。本発明の核酸配列、例えば本発明の抗体をコード化するｃＤＮＡ又はゲノム配列を用いて、少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入できる組換え発現カセットを構築することができる。組換え発現カセットは、典型的には、意図される宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を導く、転写開始調節配列に機能的に連結される、本発明のポリヌクレオチドを含む。異種及び非異種（すなわち、内因性）プロモーターの両方を使用して、本発明の核酸の発現を導くことができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、プロモーター、エンハンサー、又は他の要素として機能する単離核酸を、本発明のポリヌクレオチドの発現を上方又は下方調節するために、本発明のポリヌクレオチドの非異種形の適切な位置（上流、下流、又はイントロン内）に導入することができる。例えば、インビボ又はインビトロで、突然変異、欠失及び／又は置換により、内因性プロモーターを変えることができる。
【００６９】
ベクター及び宿主細胞。本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子工学処理された宿主細胞、及び当該技術分野において周知である組換え技術による少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の生成にも関する。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋら、上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照のこと（各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【００７０】
ポリヌクレオチドは、所望により、宿主の増殖についての選択マーカーを含有するベクターに結合することができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物内、又は荷電脂質との複合体内に導入される。ベクターがウイルスである場合は、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでこれをパッケージングし、その後、宿主細胞内に形質導入することができる。
【００７１】
ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーターに機能的に連結されるべきである。発現コンストラクトは、転写開始部位、転写終結部位、及び転写された領域内では翻訳のためのリボソーム結合部位を更に含む。コンストラクトにより発現される成熟した転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきｍＲＮＡの最後に適切に位置する開始及び終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）に翻訳開始部位を含み、哺乳類又は真核生物細胞の発現ではＵＡＡ及びＵＡＧが好ましい。
【００７２】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含むが、これは任意である。かかるマーカーは、例えば、真核細胞培養のためのメトトレキサート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、同第４，６５６，１３４号、同第４，９５６，２８８号、同第５，１４９，６３６号、同第５，１７９，０１７号、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、マイコフェノール酸又はグルタミンシンセターゼ（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号、同第５，７７０，３５９号、同第５，８２７，７３９号）抵抗性遺伝子、並びに大腸菌及びその他の細菌又は原核生物における培養のためのテトラサイクリン又はアンピシリン抵抗性遺伝子を含むが、これらに限定されない（上記特許は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。上記の宿主細胞に対して適切な培養培地及び条件は、当該技術分野において既知である。適切なベクターは、当事者にとって容易に明白となるであろう。宿主細胞へのベクターコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染又は他の既知の方法により影響を受け得る。かかる方法については、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、第１〜４章及び第１６〜１８章、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、第１、９、１３、１５、１６章など、当該技術分野において記載されている。
【００７３】
本発明の少なくとも１つの抗体は、融合タンパク質などの修飾された形態で発現され得、分泌シグナルだけでなく、追加の異種機能領域も含み得る。例えば、追加アミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸を抗体のＮ末端に追加して、精製中又は後続の処理及び保存中に、宿主細胞における安定性及び持続性を改善することができる。また、ペプチド部分を本発明の抗体に追加して、精製を促進することもできる。抗体又は少なくとも１つのその断片の最終調製前に、かかる領域を除去することができる。かかる方法は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、第１７．２９〜１７．４２章及び第１８．１〜１８．７４章、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、第１６、１７及び１８章など、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
【００７４】
当業者であれば、本発明のタンパク質をコード化する核酸の発現に利用可能な多数の発現系について精通している。
【００７５】
別の方法としては、本発明の核酸は、本発明の抗体をコード化する内因性ＤＮＡを含む宿主細胞内で、（操作により）オン切換えすることにより、宿主細胞中で発現させることができる。このような方法は、米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号、及び同第５，７３３，７６１号に記載されているように、当該技術分野において周知であり、これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００７６】
抗体、その特定された部分又は変異体の産生にとって有用な細胞培養の一例は哺乳動物細胞である。哺乳類細胞系は、単層の細胞の形を取ることが多いが、哺乳類細胞の懸濁液又はバイオリアクターも使用可能である。無傷なグリコシル化タンパク質を発現可能な多数の好適な宿主細胞株が当該技術分野において開発されており、これにはＣＯＳ−１（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１０）及びＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６）細胞株、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ  Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられ、これらは例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ）（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手できる。好適な宿主細胞には、骨髄腫及びリンパ腫細胞などのリンパ系起源の細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細胞はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１５８０）及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１８５１）である。特に好ましい実施形態では、組換え細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３又はＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である。
【００７７】
これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター（例えば、後期又は初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号、同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセレートキナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒト免疫グロブリンプロモーター、エンハンサー、及び／又はリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ  Ａｇポリ付加部位）、並びに転写終結配列などのプロセシング情報部位などであるがこれらに限定されない発現制御配列のうちの１つ以上を含み得る。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌら、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと。本発明の核酸又はタンパク質の生成に有用なその他の細胞は既知であり、並びに／あるいは例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの細胞株及びハイブリドーマのカタログ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）又はその他の既知の若しくは商業的供給源から入手可能である。
【００７８】
真核宿主細胞が利用されるとき、典型的には、ベクター内にポリアデニル化又は転写終結配列が組み込まれる。終結配列の一例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写の正確なスプライシングのための配列も、同様に含むことができる。スプライシング配列の一例は、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３〜７８１（１９８３））。加えて、当該技術分野において既知であるように、宿主細胞内の複製を制御するための遺伝子配列をベクター内に組み込むことができる。
【００７９】
抗体の精製。抗ＴＮＦ抗体は、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない周知の方法により、組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に利用することもできる。例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９９７〜２００１）の、例えば、第１、４、６、８、９、１０章を参照されたく、それぞれは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００８０】
本発明の抗体には、天然に精製された生成物、化学合成処置の生成物、並びに例えば、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類細胞を含む、真核宿主から組換え技法により生成された生成物が含まれる。組換え生成処置に用いられる宿主に応じて、本発明の抗体は、グリコシル化されてもグリコシル化されなくてもよいが、グリコシル化されるのが好ましい。かかる方法は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、セクション１７．３７〜１７．４２、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、第１０、１２、１３、１６、１８、及び２０章、上記のＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１２〜１４章などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されており、全てが参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００８１】
抗ＴＮＦ抗体
配列番号１、２、及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て並びに／又は配列番号４、５、及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む本発明の単離された抗体は、任意の好適なポリヌクレオチドによってコード化される本明細書で開示される抗体のアミノ酸配列、又は任意の単離又は調製された抗体を含む。好ましくは、ヒト抗体又は抗原結合断片は、ヒトＴＮＦに結合し、それにより、タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を部分的又は実質的に中和する。少なくとも１つのＴＮＦタンパク質又は断片の少なくとも１つの生物学的活性を部分的に又は好ましくは実質的に中和する抗体又はその特定された部分若しくは変異体は、タンパク質又は断片に結合し、それによりＴＮＦのＴＮＦ受容体への結合を通して、又は他のＴＮＦ依存性又は媒介型機序を通して媒介される活性を阻害することができる。本明細書で使用するとき、「中和抗体」という用語は、アッセイに応じて約２０〜１２０％、好ましくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％又はそれ以上、ＴＮＦ依存性活性を阻害することができる抗体を指す。ＴＮＦ依存性活性を阻害する抗ＴＮＦ抗体の能力は、好ましくは、本明細書に記載されかつ／又は当該技術分野において既知の、少なくとも１つの好適なＴＮＦタンパク質又は受容体アッセイによって評価される。本発明のヒト抗体は、任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）又はアイソタイプのものであってもよく、κ又はλ軽鎖を含み得る。一実施形態において、ヒト抗体は、ＩｇＧ重鎖又は規定された断片、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のうちの少なくとも１つのアイソタイプを含む。このタイプの抗体は、本明細書に記載されかつ／又は当該技術分野において既知の、少なくとも１つのヒト軽鎖（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ）及びＩｇＭ（例えば、γ１、γ２、γ３、γ４）導入遺伝子を含む、トランスジェニックマウス又は他のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることによって調製することができる。別の実施形態において、抗ヒトＴＮＦヒト抗体は、ＩｇＧ１重鎖及びＩｇＧ１軽鎖を含む。
【００８２】
本発明の少なくとも１つの抗体は、少なくとも１つのＴＮＦタンパク質、サブユニット、断片、部分、又はそれらの任意の組み合わせに特異的な少なくとも１つの特定のエピトープに結合する。この少なくとも１つのエピトープは、このタンパク質の少なくとも一つの部分を含む少なくとも１つの抗体結合領域を含むことができ、このエピトープは好ましくは、このタンパク質の少なくとも１つの細胞外、可溶性、親水性、外部、又は細胞質部分から構成されている。少なくとも１つの特定されたエピトープは、配列番号９の隣接アミノ酸の特定された部分全体に対する少なくとも１〜３個のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸配列の任意の組み合わせを含むことができる。
【００８３】
一般に、本発明のヒト抗体又は抗原結合断片は、少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）又は少なくとも１つの重鎖可変領域の変異体、及び少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）又は少なくとも１つの軽鎖可変領域の変異体を含む抗原結合領域を含む。非限定的な例として、抗体又は抗原結合部分若しくは変異体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３及び／又は配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含み得る。特定の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、対応するＣＤＲ１、２、及び／又は３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、２、及び／又は３）を有する少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ（即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３）の少なくとも一つの部分を含む抗原結合領域を有することができる。別の特定の実施形態において、抗体又は抗原結合部分若しくは変異体は、対応するＣＤＲ１、２、及び／又は３のアミノ酸配列（例えば、配列番号４、５及び／又は６）を有する少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ（即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３）の少なくとも一部を含む抗原結合領域を有することができる。好ましい実施形態において、抗体又は抗原結合断片の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲは、本明細書に記載される、ｍＡｂ  ＴＮＶ１４８、ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１９６、ＴＮＶ１１８、ＴＮＶ３２、及びＴＮＶ８６のうちの少なくとも１つの対応するＣＤＲのアミノ酸配列を有する。かかる抗体は、組換えＤＮＡ技術の従来技術を使用して抗体をコード化する（すなわち、１つ以上の）核酸分子を調製し発現させることによって、又は任意のその他の適切な方法を使用することによって、従来技術を使用して抗体の様々な部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク）を一緒に化学的に結合させることにより調製できる。
【００８４】
抗ＴＮＦ抗体は、規定されたアミノ酸配列を有する重鎖又は軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つを含むことができる。例えば、好ましい実施態様において、抗ＴＮＦ抗体は、所望により配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び／又は所望により配列番号８のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つを含む。ヒトＴＮＦに結合し、規定された重鎖又は軽鎖可変領域を含む抗体は、好適な方法、例えば、当該技術分野において既知でありかつ／又は本明細書に記載される、ファージディスプレイ（Ｋａｔｓｕｂｅ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ，１（５）：８６３〜８６８（１９９８））又はトランスジェニック動物を用いる方法を使用して調製することができる。例えば、機能的に再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子と、機能的な再配列を受けることが可能なヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座からのＤＮＡを含む導入遺伝子と、を含むトランスジェニックマウスを、ヒトＴＮＦ又はその断片で免疫化して抗体の生成を誘発することができる。所望する場合、抗体生成細胞を単離することができ、本明細書に記載されるように、かつ／又は当該技術分野において既知であるように、ハイブリドーマ又はその他の不死化抗体生成細胞を調製することができる。あるいは、抗体、特定された部分又は変異体は、好適な宿主細胞内で、コード核酸又はその一部分を使用して発現させることができる。
【００８５】
本発明はまた、本明細書に記載されるアミノ酸配列と実質的に同じである配列内のアミノ酸を含む抗体、抗原結合断片、免疫グロブリン鎖及びＣＤＲにも関する。好ましくは、かかる抗体又は抗原結合断片及びかかる鎖若しくはＣＤＲを含む抗体は、高い親和性（例えば、ＫＤが約１０−９Ｍ以下）で、ヒトＴＮＦに結合することができる。本明細書に記載されている配列と実質的に同じであるアミノ酸配列には、保存的アミノ酸置換、並びにアミノ酸欠失及び／又は挿入を含む配列が挙げられる。保存的アミノ酸置換は、第１のアミノ酸のものに類似した化学的及び／又は物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）をもつ第２のアミノ酸で、第１のアミノ酸を置換することを指す。保存的置換は、１個のアミノ酸を、以下の群内の別のアミノ酸で置き換えることを含む：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸塩（Ｄ）及びグルタミン酸塩（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、及びＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、及びグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ、及びＹ；Ｃ、Ｓ、及びＴ。
【００８６】
アミノ酸コード。本発明の抗ＴＮＦ抗体を構成するアミノ酸は、略されることが多い。アミノ酸表記は、その１文字コード、その３文字コード、名称、又は３つのヌクレオチドコドン（複数可）によりアミノ酸を表記することにより示すことができ、当該技術分野においてよく理解されている（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４を参照のこと）。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
本発明の抗ＴＮＦ抗体は、本明細書で特定されるように、自然突然変異又はヒトによる操作のいずれかによる、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を含み得る。
【００８９】
当然のことながら、当業者が行い得るアミノ酸置換の数は、上述のものを含む数多くの要因に依存する。一般的に言えば、任意の所与の抗ＴＮＦ抗体、断片又は変異体についてのアミノ酸置換、挿入、又は欠失の数は、本明細書で特定されるように、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、例えば、１〜３０、又はこの中の任意の範囲若しくは値を超えない。
【００９０】
機能上不可欠である本発明の抗ＴＮＦ抗体内のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発などの、当該技術分野において既知の方法により特定することができる（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、第８，１５章；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１〜１０８５（１９８９））。後者の手順では、分子内の各残基毎に１つのアラニン置換変異が導入される。次いで、結果として得られた突然変異分子は、例えば、少なくとも１つのＴＮＦ中和活性などがあるがこれに限定されない生物学的活性について試験される。抗体結合にとってきわめて重要である部位もまた、結晶化、核磁気共鳴又は光親和性標識などの構造分析によって特定することができる（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９〜９０４（１９９２）及びｄｅ  Ｖｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６〜３１２（１９９２））。
【００９１】
本発明の抗ＴＮＦ抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６のうちの少なくとも１つの隣接アミノ酸のうちの１個〜全てから選択された、少なくとも１つの部分、配列又は組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。
【００９２】
抗ＴＮＦ抗体は更に、所望により、配列番号７、８のうちの少なくとも１つの、隣接アミノ酸の７０〜１００％の少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。
【００９３】
一実施形態において、免疫グロブリン鎖又はその一部分（例えば、可変領域、ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、配列番号７、８のうちの少なくとも１つの対応する鎖のアミノ酸配列と、約７０〜１００％の同一性（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、又はこの中の任意の範囲若しくは値）を有する。例えば、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、配列番号８の配列と比較することができ、又は重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号７と比較することができる。好ましくは、７０〜１００％のアミノ酸同一性（すなわち、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、又はこの中の任意の範囲若しくは値）は、当該技術分野において既知であるように、適切なコンピュータアルゴリズムを用いて決定される。
【００９４】
代表的な重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、配列番号７、８に示されている。本発明の抗体又はその特定された変異体は、本発明の抗体から任意の数の隣接アミノ酸残基を含み得、その数は、抗ＴＮＦ抗体における隣接残基数の１０〜１００％からなる整数の群から選択される。任意で、隣接アミノ酸のこの部分列は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、又はそれ以上のアミノ酸長、又はその中の任意の範囲若しくは値である。更に、かかる部分列の数は、少なくとも２、３、４、又は５などの、１〜２０からなる群から選択される任意の整数であり得る。
【００９５】
当業者には明らかとなるように、本発明には、本発明の少なくとも１つの生物活性抗体が含まれている。生物学的活性抗体は、天然（非合成）、内因性又は関連する及び既知の抗体のものの、少なくとも２０％、３０％又は４０％、及び好ましくは少なくとも５０％、６０％又は７０％、及び最も好ましくは少なくとも８０％、９０％又は９５％〜１０００％の比活性を有する。酵素活性及び基質特異性のアッセイ及び定量化測定の方法は、当業者には周知である。
【００９６】
別の態様では、本発明は、有機部分の共有結合により修飾される、本明細書に記載されるヒト抗体及び抗原結合断片に関する。かかる修飾は、改善された薬物動態特性（例えば、増大した、インビボでの血清半減期）を有する抗体又は抗原結合断片を生成することができる。有機部分は、直鎖又は分枝鎖親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であることができる。特定の実施形態では、親水性ポリマー基は、分子量が約８００〜約１２０，０００ダルトンであって、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー又はポリビニルピロリドンであり得、また、脂肪酸基又は脂肪酸エステル基は、約８〜約４０の炭素原子を含み得る。
【００９７】
本発明の修飾された抗体及び抗原結合断片は、直接的又は間接的に抗体に共有結合される、１つ以上の有機部分を含み得る。本発明の抗体又は抗原結合断片に結合される各有機部分は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用するとき、「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を含む。本明細書で使用するとき、「親水性ポリマー基」という用語は、オクタンよりも水に対する溶解度が高い有機ポリマーを意味する。例えば、ポリリシンは、オクタンよりも水に対する溶解度が高い。よって、ポリリシンの共有結合により修飾された抗体は、本発明に包含される。本発明の抗体を修飾するために適切な親水性ポリマーは、直線状又は分岐状であり得、例えば、ポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など）、ポリアルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、及びポリビニルピロリドンを含む。好ましくは、本発明の抗体を修飾する親水性ポリマーは、個別の分子体として、約８００〜約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ５０００及びＰＥＧ２０，０００を使用することができ、下付き文字は、ポリマーの平均分子量（ダルトン）である。親水性ポリマー基は、１〜約６個のアルキル基、脂肪酸基又は脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸又は脂肪酸エステル基で置換される親水性ポリマー類は、適切な方法を利用することによって調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーを、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボン酸塩に連結させることができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボン酸塩（例えば、Ｎ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化されている）をポリマー上のヒドロキシル基に連結させることができる。
【００９８】
本発明の抗体を修飾するために好適な脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和されてもよいし、又は１つ以上の不飽和単位を含有してもよい。本発明の抗体を修飾するのに好適な脂肪酸としては、例えば、ｎ−ドデカン酸塩（Ｃ１２、ラウリン酸塩）、ｎ−テトラデカン酸塩（Ｃ１４、ミリスチン酸塩）、ｎ−オクタデカン酸塩（Ｃ１８、ステアリン酸塩）、ｎ−エイコサン酸塩（Ｃ２０、アラキジン酸塩）、ｎ−ドコサン酸塩（Ｃ２２、ベヘン酸）、ｎ−トリアコンタン酸塩（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタン酸塩（Ｃ４０）、シス−Δ９−オクタデカン酸塩（Ｃ１８、オレイン酸塩）、全てのシス−Δ５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸塩（Ｃ２０、アラキドン酸塩）、オクタンジオン酸、テトラデカンジオン酸、オクタデカンジオン酸、ドコサンジオン酸などが挙げられる。好適な脂肪酸エステルは、直鎖又は分枝鎖の低級アルキル基を含む、ジカルボン酸のモノエステルを含む。低級アルキル基は、１〜約１２個、好ましくは１〜約６個の炭素原子を含み得る。
【００９９】
修飾されたヒト抗体及び抗原結合断片は、１つ以上の修飾剤と反応させるなど、好適な方法を使用して調製することができる。本明細書で使用されるとき、用語「修飾剤」は、活性化基を含む適切な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を意味する。「活性化基」とは、適切な条件下で第２の化学基と反応し、これにより修飾剤と第２の化学基との間に共有結合を形成することのできる、化学部分又は官能基である。例えば、アミン反応性活性化基は、トシル酸塩、メシル酸塩、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）などの求電子性基、Ｎヒドロキシスクシニミジルエステル（ＮＨＳ）などを含む。チオール類と反応可能な活性化基としては、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などが挙げられる。アルデヒド官能基は、アミン−又はヒドラジド−含有分子と連結することができ、また、アジド基は、三価リン基と反応してホスホルアミデート又はホスホルイミド結合を形成することができる。分子中に活性化基を導入するための好適な方法が、当該技術分野において既知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）を参照のこと）。活性化基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接的に、又はリンカー部分、例えば二価のＣ１〜Ｃ１２基（ここで１つ以上の炭素原子は酸素、窒素又は硫黄などのヘテロ原子で置換され得る）を介して、結合することができる。好適なリンカー部分は、例えば、テトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−を含む。リンカー部分を含む修飾剤は、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で、モノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えば、モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノへキサン）を脂肪酸と反応させることにより、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間のアミド結合を形成することによって生成可能である。Ｂｏｃ保護基を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）処理により生成物から除去して、記載されているように別のカルボン酸塩に連結し得る一級アミンを露出させることができ、あるいは、これを無水マレイン酸と反応させ、結果として得られた生成物を環化させて脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる。（例えば、参照により教示の全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらの国際公開第９２／１６２２１号を参照のこと。）
【０１００】
本発明の修飾された抗体は、ヒト抗体又は抗原結合断片を修飾剤と反応させることによって生成することができる。例えば、有機部分は、アミン反応性修飾剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを採用することによって、非部位特異的方法で抗体に結合させることができる。抗体又は抗原結合断片のジスルフィド結合（例えば鎖内ジスルフィド結合）を還元することによって、修飾されたヒト抗体又は抗原結合断片を調製することもできる。このとき、還元された抗体又は抗原結合断片をチオール反応性修飾剤と反応させて、本発明の修飾された抗体を生産することが可能である。本発明の抗体の特定の部位に結合される有機部分を含む修飾されたヒト抗体及び抗原結合断片は、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，３：１４７〜１５３（１９９２）、Ｗｅｒｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，５：４１１〜４１７（１９９４）、Ｋｕｍａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３〜２２４１（１９９７）、Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１）：５９〜６８（１９９６）、Ｃａｐｅｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６〜４６３（１９９７））及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）に記載される方法などの好適な方法を使用して調製することができる。
【０１０１】
抗Ｔｎｆ抗体組成物に対する抗イディオタイプ抗体。モノクローナル又はキメラ抗ＴＮＦ抗体に加えて、本発明は、本発明のかかる抗体に特異的な抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体にも関する。抗Ｉｄ抗体は、一般に別の抗体の抗原結合領域に関連する固有の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、Ｉｄ抗体源と同じ種及び遺伝子型の動物（例えばマウス株）を、抗体又はそのＣＤＲ含有領域により免疫化することによって調製することができる。免疫化された動物は、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識かつ応答し、抗Ｉｄ抗体を生成する。抗Ｉｄ抗体はまた、更に別の動物で免疫応答を誘導する「免疫原」として使用され得、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を生成する。
【０１０２】
抗Ｔｎｆ抗体組成物。本発明はまた、本明細書に記載され、かつ／又は当該技術分野において既知であるように、非自然発生組成物、混合物、又は形態で提供される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又はそれ以上のその抗ＴＮＦ抗体を含む、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物も提供する。かかる組成物は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８の隣接アミノ酸の７０〜１００％、又はその特定される断片、ドメイン若しくは変異体からなる群から選択される抗ＴＮＦ抗体のアミノ酸配列の少なくとも１つ又は２つの完全長、Ｃ及び／若しくはＮ末端欠失変異体、ドメイン、断片、又は特定される変異体を含む非自然発生組成物を含む。好ましい抗ＴＮＦ抗体組成物は、配列番号１、２、３、４、５、６の７０〜１００％の抗ＴＮＦ抗体、又はその特定された断片、ドメイン若しくは変異体の、少なくとも１つのＣＤＲ又はＬＢＲ含有部分として少なくとも１つ又は２つの完全長、断片、ドメイン、又は変異体を含む。更に好ましい組成物は、配列番号１、２、３、４、５、６の７０〜１００％、又は特定された断片、ドメイン若しくはその変異体のうちの少なくとも１つを４０〜９９％含む。このような組成物の百分率は、当該技術分野において既知であるように、又は本明細書に記載されるように、重量、体積、濃度、容量モル濃度、あるいは液体若しくは乾燥溶液、混合物、懸濁液、エマルション、又はコロイドとしての容量モル濃度によるものである。
【０１０３】
本発明の抗ＴＮＦ抗体組成物は更に、かかる調節、処置又は治療を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に対する少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含み、所望により、少なくとも１つのＴＮＦ拮抗薬（例えば、ＴＮＦ抗体若しくは断片、可溶性ＴＮＦ受容体若しくは断片、それらの融合タンパク質、又は小分子ＴＮＦ拮抗薬などであるが、これらに限定されない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサルジン）、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断剤、抗菌剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌剤、駆虫薬、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌剤）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養薬、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉剤、鎮咳剤、制吐剤、抗潰瘍剤、緩下剤、抗凝固薬、エリスロピエチン（例えば、エポエチンα）、フィルグラスチム（例えばＧ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節薬、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経作動薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、ぜんそく薬、β作動薬、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害薬、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン又は類似薬、ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカイン又はサイトカイン拮抗薬から選択される少なくとも１つを更に含む、任意の好適かつ有効量の組成物又は医薬組成物のうちの少なくとも１つを含み得る。このようなサイトカインの非限定的な例としては、ＩＬ−１〜ＩＬ−２３のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。適切な投与量は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ（２０００）、ＰＤＲ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ，ＣＡ（２０００）を参照のこと（これらの各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０４】
このような抗癌剤又は抗感染薬はまた、本発明の少なくとも１つの抗体と関連、結合、同時処方、又は併用される毒素分子も含み得る。毒素は、病態細胞又は組織を選択的に死滅させるように、任意に作用させることができる。病態細胞は、癌細胞又は他の細胞であり得る。このような毒素は、これらに限定するものではないが、例えば、リシン、ジフテリア毒素、ヘビ毒素、又は細菌毒素の少なくとも１つから選択される、毒素の少なくとも１つの機能的細胞毒性ドメインを含む、精製若しくは組換え毒素又は毒素断片であり得る。毒素という用語はまた、ヒト及び他の哺乳類において、死に至り得る毒素性ショックを含む、任意の病態をもたらし得る任意の自然発生するか、突然変異若しくは組換え細菌又はウイルスによって生成される内毒素及び外毒素の両方を含む。かかる毒素には、腸管毒素原性大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）、赤痢菌細胞毒素、アエロモナス属エンテロトキシン、毒素性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、Ｂ（ＳＥＢ）、又はＣ（ＳＥＣ）、連鎖球菌エンテロトキシンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。かかる細菌は、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管出血性大腸菌（例えば血清型０１５７の株：Ｈ７）、ブドウ球菌種（例えば、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス−ピオゲネス）、赤痢菌種（例えば、志賀赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ボイド赤痢菌及びソンネ赤痢菌）、サルモネラ種（例えば、腸チフス菌、サルモネラコレラ−スイス、サルモネラエンテリティディス）、クロストリジウム種（例えば、クロストリジウム−パーフリンジェンス、クロストリジウム−ディフィシル、クロストリジウム−ボツリヌス）、カンピロバクター種（例えば、カンピロバクター−ジュジュニ、カンピロバクター−フィータス）、ヘリコバクター種（例えば、ヘリコバクター−ピロリ）、アエロモナス種（例えば、アエロモナス−ソブリア、アエロモナス−ハイドロフィラ、アエロモナス−キャビエ）、プレシオモナス−シゲロイデス、腸炎エルシニア、ビブリオ種（例えば、コレラ菌、ビブリオ−パラヘモリティカス）、クレブシエラ種、緑膿菌、及び連鎖球菌の種の株を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｐｐ  １〜１３，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９９０）、Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，２ｄ．Ｅｄ．，ｐｐ  ２３９〜２５４，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）、Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３ｄ．Ｅｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）、Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９９２、Ｗｏｏｄ  ｅ���  ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７６：１２１〜１３４（１９９１）、Ｍａｒｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：７０５〜７１１（１９９０）を参照のこと（これらの文献の内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０５】
本発明の抗ＴＮＦ抗体化合物、組成物又は混合物は更に、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどであるがこれらに限定されない、任意の好適な助剤のうちの少なくとも１つを含み得る。製薬学的に許容できる助剤が好ましい。かかる滅菌溶液を調製する非限定的な例及びその方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ），１９９０などであるが、これに限定されない。当該技術分野において周知、又は本明細書に記載されるように、抗ＴＮＦ抗体、断片、又は変異体組成物の投与方法、溶解度、及び／又は安定性に好適な製薬学的に許容できる担体を、日常的に選択することができる。
【０１０６】
本組成物において有用な製薬学的賦形剤及び添加剤は、これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質及び炭水化物（例えば、単糖類、二糖、三糖、四糖、及びオリゴ糖を含む糖類、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などの誘導体化糖、並びに多糖類又は糖ポリマー）を含み、これらは、単独で又は組み合わせて存在してよく、単独で又は組み合わせて１〜９９．９９重量％又は容量％含まれる。典型的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどを含む。緩衝能においても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体構成要素には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。好ましいアミノ酸の１つはグリシンである。
【０１０７】
本発明に使用するのに好適な炭水化物賦形剤としては、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類、乳糖、ショ糖、トレハロース、セロビオースなどの二糖類、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン類などの多糖類、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどのアルジトールが挙げられる。本発明で使用するのに好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、及びラフィノースである。
【０１０８】
抗ＴＮＦ抗体組成物は、緩衝剤又はｐＨ調整剤も含み得、典型的には、緩衝剤は、有機酸又は塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤としては、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸の塩などの有機酸塩、トリス、トロメタミン塩酸塩、又はリン酸緩衝剤が挙げられる。本組成物における使用に好ましい緩衝剤は、クエン酸塩などの有機酸塩である。
【０１０９】
加えて、本発明の抗ＴＮＦ抗体組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、着香剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、「ＴＷＥＥＮ  ２０」及び「ＴＷＥＥＮ  ８０」などのポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、及びキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）などのポリマー賦形剤／添加剤を含み得る。
【０１１０】
本発明による抗ＴＮＦ抗体、部分又は変異体組成物における使用に適したこれら及び追加の既知の製薬学的賦形剤及び／又は添加剤は、当該技術分野において既知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）、及び「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、５２ｎｄ  ｅｄ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８）に列挙されており、これらの開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。好ましい担体又は賦形剤材料は、炭水化物（例えば、単糖類及びアルジトール類）並びに緩衝剤（例えば、クエン酸塩）又は高分子試薬である。
【０１１１】
製剤。上述したとおり、本発明は、好ましくは、生理食塩水又は選択された塩を含むリン酸緩衝剤である安定した製剤、並びに保存剤を含有する保存溶液及び製剤、並びに製薬学的に許容できる製剤中に少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む薬剤学的又は獣医学的用途に好適な多用途保存製剤を提供する。保存製剤は、水性希釈剤中に、少なくとも１つの既知の、すなわち少なくとも１つのフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば、六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はそれらの混合物からなる群から任意に選択される保存剤を含有する。当該技術分野において既知であるように、０．００１〜５％、又は０．００１、０．００３、０．００５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４．、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．３、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又はその中の任意の範囲若しくは値などであるがこれらに限定されない、その中の任意の範囲若しくは値の、任意の好適な濃度又は混合物が使用され得る。非限定的な例としては、保存剤無添加、０．１〜２％  ｍクレゾール（例えば、０．２、０．３．０．４、０．５、０．９、１．０％）、約０．１〜３％のベンジルアルコール（例えば、０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、０．００１〜０．５％のチメロサール（例えば、０．００５、０．０１）、０．００１〜２．０％フェノール（例えば、０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５〜１．０％のアルキルパラベン（複数可）（例えば、０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）などが挙げられる。
【０１１２】
上述のとおり、本発明は、包装材と、所望により水性希釈剤中に処方された緩衝剤及び／又は保存剤を伴う少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の溶液を含む少なくとも１つのバイアルと、を含む製品を提供し、この包装材は、かかる溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間以上にわたり保持することができることを記したラベルを含む。本発明は、包装材と、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む第１のバイアルと、処方された緩衝剤又は保存剤の水性希釈剤を含む第２のバイアルと、を含む製品を更に含み、この包装材は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を水性希釈剤でもどして、２４時間以上にわたって保持することができる溶液を形成するように患者に指示するラベルを含む。
【０１１３】
本発明により使用される少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体は、本明細書に記載されるか又は当該技術分野において既知の、哺乳類細胞又はトランスジェニック調製物から生成することを含む組換え手段により生成してもよいし、又は他の生物源から精製してもよい。
【０１１４】
本発明の製品中に含まれる、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の範囲は、湿式／乾式系の場合、もどす時に約１．０μｇ／ｍＬ〜約１０００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度が得られる量で含まれるが、これより低い濃度及び高い濃度でも作業可能であり、これらの濃度は意図される送達ビヒクルによって決まり、例えば溶液製剤では、経皮パッチ、肺、経粘膜、又は浸透圧性若しくはマイクロポンプ方法とは異なる。
【０１１５】
好ましくは、水性希釈剤は所望により、製薬学的に許容できる保存剤を更に含む。好ましい保存剤には、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール又はこれらの混合物からなる群から選択されるものが含まれる。製剤中で使用される保存剤の濃度は、抗菌効果を生み出すのに十分な濃度である。このような濃度は選択された保存剤によって異なり、当業者により容易に決定される。
【０１１６】
他の賦形剤、例えば、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤エンハンサーは、所望によりかつ好ましくは希釈剤に添加することができる。グリセリンなどの等張剤が、既知の濃度で一般に使用される。好ましくは、生理学的に耐容性の緩衝剤を添加して、改善されたｐＨ制御を提供する。製剤は、約ｐＨ４〜約ｐＨ１０、及び好ましくは約ｐＨ５〜約ｐＨ９の範囲、及び最も好ましくは約６．０〜約８．０の範囲などの、広範囲のｐＨ範囲を対象にすることができる。好ましくは、本発明の製剤は、約６．８〜約７．８のｐＨを有する。好適な緩衝剤には、リン酸塩緩衝剤を含み、最も好ましくは、リン酸ナトリウム、特にリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【０１１７】
他の添加剤、例えばＴｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの、製薬学的に許容できる可溶化剤、又はポリソルベート２０若しくは８０又はポロキサマー１８４若しくは１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオールなどの非イオン性界面活性剤、その他のブロックコポリマー、並びにＥＤＴＡ及びＥＧＴＡなどのキレート剤を製剤又は組成物に任意に添加することで、凝集を低減させることができる。これらの添加物は、製剤を投与するためにポンプ又はプラスチック容器が使用される場合に特に有用である。製薬学的に許容できる界面活性剤の存在により、タンパク質が凝集する傾向が軽減される。
【０１１８】
本発明の製剤は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体と、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール又はこれらの混合物からなる群から選択される保存剤と、を水性希釈剤中で混合することを含むプロセスにより調製することができる。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体と保存剤との水性希釈剤中での混合は、従来の溶解及び混合手順を使用して実施される。好適な製剤を調製するために、例えば、緩衝溶液中の一定量の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を、所望の濃度のタンパク質及び保存剤を提供するのに十分な量の緩衝溶液中で所望の保存剤と組み合わせる。このプロセスの変化形態は、当業者によって認識されるであろう。例えば、構成成分の添加順序、追加の添加剤の使用の有無、製剤調製時の温度及びｐＨは全て、使用する投与濃度及び投与手段に関して最適化することのできる因子である。
【０１１９】
特許請求される製剤は、透明な溶液として、又は水、保存剤及び／若しくは賦形剤、好ましくはリン酸塩緩衝剤及び／若しくは生理食塩水、並びに選択された塩を水性希釈剤中に含有する第２のバイアルでもどされる、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体のバイアルを含む併用バイアル（dual vial）として患者に提供することができる。単一溶液バイアル又はもどすことを必要とする併用バイアルはいずれも複数回再利用することができ、患者処置の単一又は複数サイクルを満たすことができ、したがって、現在使用できるよりも便利な処置レジメンを提供することができる。
【０１２０】
特許請求される本製品は、即時から２４時間以上の期間にわたる投与に有用である。したがって、本発明により特許請求される製品は、患者に大きな利益を提供する。本発明の製剤は、約２〜約４０℃の温度で任意に安全に保管し、タンパク質の生物学的活性を長期間保持することができ、したがって包装ラベルは、溶液が６、１２、１８、２４、３６、４８、７２、又は９６時間以上の期間にわたって保持及び／又は使用できることを示すことができる。保存されている希釈剤を使用する場合には、このようなラベルに最高１〜１２ヵ月、半年、１年半及び／又は２年までの使用を含むことができる。
【０１２１】
本発明の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の溶液は、少なくとも１つの抗体を水性希釈剤中で混合することを含むプロセスにより調製することができる。混合は、従来の溶解及び混合手順を使用して実施される。好適な希釈剤を調製するために、例えば、水又は緩衝剤中の一定量の少なくとも１つの抗体を、所望の濃度のタンパク質、及び所望により保存剤又は緩衝剤を提供するのに十分な量で組み合わせる。このプロセスの変化形態は、当業者によって認識されるであろう。例えば、構成成分の添加順序、追加の添加剤の使用の有無、製剤調製時の温度及びｐＨは全て、使用する投与濃度及び投与手段に関して最適化することのできる因子である。
【０１２２】
特許請求される製品は、透明な溶液として、又は水性希釈剤を含有する第２のバイアルでもどされる、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体のバイアルを含む併用バイアルとして、患者に提供することができる。単一溶液バイアル又はもどすことを必要とする併用バイアルはいずれも複数回再利用することができ、患者処置の単一又は複数サイクルを満たすことができ、したがって、現在使用できるよりも便利な処置レジメンを提供する。
【０１２３】
特許請求される製品は、透明な溶液、又は水性希釈剤を含有する第２のバイアルでもどされる、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体のバイアルを含む併用バイアルを、薬局、診療所、又はその他のかかる機関及び施設に提供することによって、患者に対し間接的に提供することができる。この場合の透明溶液は最高１リットル又は更にはそれ以上の容量であってよく、この大きな容器からより少量の少なくとも１つの抗体溶液を１回又は複数回取り出してより小さなバイアルに移し、かつ薬局又は診療所により顧客及び／又は患者に提供できる。
【０１２４】
これらの単一バイアル系を含む承認済みデバイスとしては、ＢＤ  Ｐｅｎｓ、ＢＤ  Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（登録商標）、ＮｏｖｏＰｅｎ（登録商標）、Ｂ−Ｄ（登録商標）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（登録商標）、及びＯｐｔｉＰｅｎ（登録商標）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎ（登録商標）、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ  Ｐｅｎ（登録商標）、Ｈｕｍａｔｒｏ  Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｅｃｏ−Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｏｆｅｒｏｎ  Ｐｅｎ（登録商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、ｉｊｅｃｔ（登録商標）、Ｊ−ｔｉｐ  Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｎｔｒａｊｅｃｔ（登録商標）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ（登録商標）などの溶液送達用のペン型インジェクタデバイスが挙げられ、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ｗｗｗ．ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｅｎｓｏｎ．ｃｏｍ）、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（Ｂｕｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ｗｗｗ．ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍ）、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ（ｗｗｗ．ｂｉｏｊｅｃｔ．ｃｏｍ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ，ｗｗｗ．ｗｅｓｔｏｎ−ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ  Ｃｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ｗｗｗ．ｍｅｄｉｊｅｃｔ．ｃｏｍ）によって製造又は開発されている。併用バイアル系を含む承認済みデバイスとしては、ＨｕｍａｔｒｏＰｅｎ（登録商標）などの、もどした溶液を送達するためのカートリッジ内で凍結乾燥された薬物をもどすためのペン型インジェクタシステムが挙げられる。
【０１２５】
ここで特許請求される製品は、包装材を含む。包装材は、規制当局によって必要とされる情報に加えて、製品を使用できる条件を提供する。本発明の包装材は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を水性希釈剤でもどして溶液を形成し、２〜２４時間以上の期間にわたって、この溶液を湿式／乾式の２つのバイアル製品に使用する、という指示を患者に提供する。単一バイアルの溶液製品の場合、ラベルは、この溶液が２〜２４時間又はそれ以上にわたって使用できることを示す。ここで特許請求される製品は、ヒト用医薬製品用途に有用である。
【０１２６】
本発明の製剤は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体及び選択された緩衝剤、好ましくは生理食塩水又は選択された塩を含有するリン酸塩緩衝剤を混合することを含むプロセスにより調製することができる。少なくとも１つの抗体と緩衝剤との水性希釈剤中での混合は、従来の溶解及び混合手順を使用して実施される。好適な製剤を調製するために、例えば、水又は緩衝剤中の一定量の少なくとも１つの抗体を、所望の濃度のタンパク質及び緩衝剤を提供するのに十分な量の水中で所望の緩衝剤と組み合わせる。このプロセスの変化形態は、当業者によって認識されるであろう。例えば、構成成分の添加順序、追加の添加剤の使用の有無、製剤調製時の温度及びｐＨは全て、使用する投与濃度及び投与手段に関して最適化することのできる因子である。
【０１２７】
特許請求される安定又は保存製剤は、透明な溶液として、又は水性希釈剤中に保存剤若しくは緩衝剤及び賦形剤を含有する第２のバイアルでもどされる、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体のバイアルを含む併用バイアルとして、患者に提供することができる。単一溶液バイアル又はもどすことを必要とする併用バイアルはいずれも複数回再利用することができ、患者処置の単一又は複数サイクルを満たすことができ、したがって、現在使用できるよりも便利な処置レジメンを提供する。
【０１２８】
本明細書に記載される安定若しくは保存製剤又は溶液のいずれかの少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体は、当該技術分野において周知のように、ＳＣ若しくはＩＭ注射、経皮、経肺、経粘膜、埋め込み、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ又は当業者により理解されるその他の手段などの様々な送達方法を介して、本発明により患者に投与することができる。
【０１２９】
治療適用。本発明はまた、当該技術分野において既知である、又は本明細書に記載されるように、本発明の少なくとも１つの二重インテグリン抗体を使用して、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つのＴＮＦ関連疾患を調節又は処置するための方法も提供する。
【０１３０】
本発明はまた、肥満、免疫関連疾患、循環器疾患、感染症、悪性疾患又は神経学的疾患のうち少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つのＴＮＦ関連疾患を調節又は処置するための方法も提供する。
【０１３１】
本発明はまた、関節リウマチ、若年性、全身性発症若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、変形性関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎／ヴェグナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎／精管切除修復術、アレルギー性／アトピー性疾患、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植、器官移植拒絶反応、移植片対宿主病、全身性炎症反応症候群、敗血症症候群、グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、好中球減少性発熱、尿性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、熱傷、電離放射線暴露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、関節リウマチ、アルコール性肝炎、慢性炎症性病変、サルコイドーシス、クローン病変、鎌状赤血球貧血症、糖尿病、ネフローゼ、アトピー性疾患、過敏性反応、アレルギー性鼻炎、枯草熱、通年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、ぜんそく、じん麻疹、全身性アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、任意の器官又は組織の移植片拒絶反応、腎移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応、肝臓移植拒絶反応、膵臓移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶反応、皮膚同種移植拒絶反応、軟骨移植拒絶反応、骨移植片拒絶反応、小腸移植拒絶反応、胎児胸腺移植拒絶反応、副甲状腺移植拒絶反応、任意の器官又は組織の異種移植拒絶反応、同種移植拒絶反応、抗受容体過剰反応、グレーブス病、レイノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、ぜんそく、重症筋無力症、抗体媒介性細胞障害、ＩＩＩ型過剰反応、全身性エリテマトーデス、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経障害、臓器肥大、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症、及び皮膚症状症候群）、多発性神経障害、臓器肥大、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症、皮膚症状症候群、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合性結合組織病、特発性アジソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、白斑、血管炎、ＭＩ後心臓切開術症候群、ＩＶ型免疫過剰、接触性皮膚炎、過敏性肺炎、同種移植拒絶反応、細胞内生物による肉芽腫、薬物過敏、代謝性／特発性ウィルソン病、ヘマクロマトーシス、α−１−アンチトリプシン欠乏症、糖尿病性網膜症、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性血球貪食性リンパ組織球症、皮膚科学的状態、乾癬、脱毛症、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、ｏｋｔ３療法、抗ｃｄ３療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法（例えば、無力症、貧血、悪液質などが挙げられるがこれらに限定されない）、慢性サリチル酸塩中毒などの少なくとも１つが挙げられるがそれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つの免疫関連疾患を調節又は処置するための方法も提供する。例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１２ｔｈ〜１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒ��ｈｗａｙ，ＮＪ（１９７２，１９７７，１９８２，１９８７，１９９２，１９９９），Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（１９９８，２０００）を参照されたく、それぞれは参照することにより全体が組み込まれる。
【０１３２】
本発明は、心機能不全症候群（cardiac stun syndrome）、心筋梗塞、うっ血性心不全、卒中、虚血発作、出血、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化性疾患、高血圧、動脈性高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、不整脈、心房異所性拍動、心房粗動、心房細動（持続性又は発作性）、還流後症候群、心肺バイパス炎症応答、無秩序型又は多源性心房頻脈、規則的狭ＱＲＳ頻脈（regular narrow QRS tachycardia）、固有不整脈（specific arrythmias）、心室細動、ヒス束不整脈（His bundle arrythmias）、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性疾患、冠動脈疾病、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁膜症、心内膜炎、心膜疾患、心臓腫瘍、大動脈瘤及び末梢動脈瘤、大動脈切開、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分岐の閉塞、末梢血管障害、閉塞性動脈障害、末梢アテローム性動脈硬化症、閉塞性血栓性血管炎、機能性末梢動脈障害、レイノー現象及び疾患、先端チアノーゼ、紅痛症、静脈性疾患、静脈血栓症、静脈瘤、動静脈瘻、リンパ浮腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再灌流傷害、ポンプ後症候群（post pump syndrome）、虚血再灌流傷害などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における循環器疾患の調節又は処置するための方法も提供する。かかる方法は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を、かかる調節、処置又は治療を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に投与することを、所望により含み得る。
【０１３３】
本発明はまた、急性又は慢性細菌感染、細菌、ウイルス及び真菌感染を含む急性及び慢性寄生又は感染プロセス、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎（Ａ、Ｂ又はＣなど）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、大腸菌０１５７：ｈ７、溶血性尿毒症性症候群／塞栓性血小板減少性紫斑病、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、中毒性ショック症候群、連鎖球菌筋炎、ガス壊疽、結核菌、マイコバクテリウム−アビウム−イントラセルラーレ、ニューモシスティスカリニ肺炎、骨盤内炎症性疾患、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、ａ型インフルエンザ、エプスタイン−バーウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者において少なくとも１つの感染症を調節又は処置するための方法も提供する。
【０１３４】
本発明はまた、白血病、急性白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＦＡＢ  ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、直腸結腸癌、膵臓癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、癌関連骨痛などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つの悪性疾患を調節又は処置するための方法も提供する。
【０１３５】
本本発明はまた、神経変性疾患、多発性硬化症、片頭痛、エイズ痴呆症候群、脱髄疾患、例えば、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎、錐体外路及び小脳障害、例えば、皮質脊髄系の病変、大脳基底核の障害若しくは小脳障害、多動性運動障害、例えば、ハンチントン舞踏病及び老年性舞踏病、薬剤誘発性運動障害、例えば、ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬物により誘発されるもの、運動低下性運動障害、例えば、パーキンソン病、進行性核上麻痺、小脳の構造病変、脊髄小脳変性症、例えば、脊髄性運動失調症、フリードライヒ失調症、小脳皮質変性症、多系統変性症（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ及びＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）、全身性疾患（レフスム病、無βリポタンパク血症、運動失調症、毛細血管拡張症及びミトコンドリア多系統障害）、脱髄性コア障害（demyelinating core disorder）、例えば、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎及び運動単位’の障害、例えば、神経性筋委縮症（前角細胞変性症、例えば、筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症）、アルツハイマー病、中年層のダウン症候群、びまん性レヴィー小体病、レヴィー小体型の老人性痴呆症、ウェルニッケコルサコフ症候群、慢性アルコール中毒、クロイツフェルト−ヤコブ病、亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン−スパッツ病、並びにボクサー認知症などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つの神経学的疾患を調節又は処置するための方法も提供する。所望により、少なくとも１つのＴＮＦ抗体又は特定された部分又は変異体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を、このような調節、処置又は治療を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に対し投与する工程を含むことができる。例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９９２）を参照のこと。
【０１３６】
本発明のいずれの方法も、かかる調節、処置、又は治療を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を投与することを含み得る。かかる方法は、所望により、かかる免疫疾患の処置のための同時投与又は併用療法を更に含み得、この少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体、特定された部分又はその変異体の投与は、少なくとも１つのＴＮＦ拮抗薬（例えば、ＴＮＦ抗体若しくは断片、可溶性ＴＮＦ受容体若しくは断片、その融合タンパク質、又は低分子ＴＮＦ拮抗薬などであるが、これらに限定されない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌薬（例えば、アミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペナム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌薬）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養薬、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐剤、抗潰瘍剤、緩下剤、抗凝固薬、エリスロポエチン（例えば、エポエチンα）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節薬、散瞳薬、毛様筋麻痺薬、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経作動薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、ぜんそく薬、ベータ作動薬、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン若しくは類似体、ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカイン若しくはサイトカイン拮抗薬から選択される少なくとも１つの前に、同時に、及び／又は後に投与することを更に含む。適切な投与量は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ（２０００）、ＰＤＲ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ，ＣＡ（２０００）を参照のこと（これらの各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１３７】
本発明の組成物、併用療法、同時投与、デバイス及び／又は方法（本発明の少なくとも１つの抗体、その特定された部分及び変異体を更に含む）に好適なＴＮＦ拮抗薬は、抗ＴＮＦ抗体、その抗原結合断片、及びＴＮＦに特異的に結合する受容体分子、ＴＮＦ合成、ＴＮＦ放出若しくは標的細胞に対するその作用を阻止及び／又は阻害する化合物、例えば、サリドマイド、テニダプ、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ペントキシフィリン及びロリプラム）、Ａ２ｂアデノシン受容体作動薬及びＡ２ｂアデノシン受容体エンハンサー、ＴＮＦ受容体シグナル伝達を阻止及び／又は阻害する化合物、例えば、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ阻害剤、膜ＴＮＦ切断を遮断及び／又は阻害する化合物、例えば、メタロプロテイナーゼ阻害剤、ＴＮＦ活性を遮断及び／又は阻害する化合物、例えば、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル）、並びにＴＮＦ生成及び／又は合成を遮断及び／又は阻害する化合物、例えば、ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない。
【０１３８】
本明細書で使用されるとき、「腫瘍壊死因子抗体」、「ＴＮＦ抗体」、「ＴＮＦα抗体」又は「断片」などは、インビトロ、その場で、及び／又は好ましくはインビボで、ＴＮＦα活性を減少、遮断、阻害、抑止又は干渉する。例えば、本発明の好適なＴＮＦヒト抗体は、ＴＮＦαに結合することができ、抗ＴＮＦ抗体、その抗原結合断片、及びＴＮＦαに特異的に結合する特定された変異体又はそのドメインを含む。好適なＴＮＦ抗体又は断片は、ＴＮＦ  ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質合成、ＴＮＦ放出、ＴＮＦ受容体シグナル伝達、膜ＴＮＦ切断、ＴＮＦ活性、ＴＮＦ生成及び／又は合成を、減少、遮断、抑止、干渉、阻止及び／又は阻害することもできる。
【０１３９】
キメラ抗体ｃＡ２は、Ａ２と呼ばれる高親和性中和マウス抗ヒトＴＮＦα  ＩｇＧ１抗体の抗原結合可変領域及びヒトＩｇＧ１のκ免疫グロブリンの定常領域からなる。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、同種の抗体のエフェクター機能を改善し、循環血清半減期を増加させ、抗体の免疫原性を減少させる。キメラ抗体ｃＡ２の結合活性及びエピトープの特異性は、マウス抗体Ａ２の可変領域に由来する。特定の実施形態において、マウス抗体Ａ２の可変領域をコード化する核酸の好ましい供給源は、Ａ２ハイブリドーマ細胞株である。
【０１４０】
キメラＡ２（ｃＡ２）は、天然及び組換え両方のヒトＴＮＦαの細胞傷害性作用を用量依存的に中和する。キメラ抗体ｃＡ２と組換えヒトＴＮＦαとの結合アッセイから、キメラ抗体ｃＡ２の親和性定数は、１．０４×ｌ０１０Ｍ−１であると計算された。競合阻害によるモノクローナル抗体の特異性及び親和性を決定するための好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９２〜２０００）、Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，４：７２〜７９（１９８３）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７〜２０００）、及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：５８９〜６０１（１９８３）に見ることができ、これらの参照文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
特定の実施形態において、マウスモノクローナル抗体Ａ２は、ｃ１３４Ａと呼ばれる細胞株によって生成される。キメラ抗体ｃＡ２は、ｃ１６８Ａと呼ばれる細胞株によって生成される。
【０１４２】
本発明において使用することができるモノクローナル抗ＴＮＦ抗体の更なる例は、当該技術分野において記載されている（例えば、米国特許第５，２３１，０２４号、Ｍｏｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２（３）：１６２〜１６９（１９９０）、米国出願第０７／９４３，８５２号（１９９２年９月１１日出願）、Ｒａｔｈｊｅｎ，ｅｔ  ａｌ．、国際公開第９１／０２０７８号（１９９１年２月２１日公開）、Ｒｕｂｉｎ，ｅｔ  ａｌ．、ＥＰＯ特許公開第０  ２１８  ８６８号（１９８７年４月２２日公開）、Ｙｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ．、ＥＰＯ特許公開第０  ２８８  ０８８号（１９８８年１０月２６日）、Ｌｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３７：８４７〜８５４（１９８６）、Ｍｅａｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６：３０５〜３１１（１９８７）、Ｆｅｎｄｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６：３５９〜３６９（１９８７）、Ｂｒｉｎｇｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６：４８９〜５０７（１９８７）及びＨｉｒａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．９６：５７〜６２（１９８７）を参照のこと。これらの参照文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１４３】
ＴＮＦ受容体分子。本発明に有用な好ましいＴＮＦ受容体分子は、ＴＮＦαに高い親和性で結合し（例えば、Ｆｅｌｄｍａｎｎら、国際公開第９２／０７０７６号（１９９２年４月３０日公開）、Ｓｃｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１：３６１〜３７０，１９９０）及びＬｏｅｔｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１：３５１〜３５９（１９９０）を参照のこと。これらの参照文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）、所望により低い免疫原性を有するものである。特に、５５ｋＤａ（ｐ５５  ＴＮＦ−Ｒ）及び７５ｋＤａ（ｐ７５  ＴＮＦ−Ｒ）のＴＮＦ細胞表面受容体は、本発明において有用である。受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はその機能的部分を含むこれらの受容体の切断型（例えば、Ｃｏｒｃｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：８３１〜８４０（１９９４）を参照のこと）も本発明において有用である。ＥＣＤを含むＴＮＦ受容体の切断型は、尿及び血清中で、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのＴＮＦα阻害結合タンパク質として検出されでいる（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５３１〜１５３６（１９９０））。ＴＮＦ受容体多量体分子及びＴＮＦ免疫受容体融合分子、並びにそれらの誘導体及び断片又は部分は、本発明の方法及び組成物において有用であるＴＮＦ受容体分子の更なる例である。本発明に使用することができるＴＮＦ受容体分子は、症状の良好〜優れた緩和及び低毒性で患者を長期間処置する能力を特徴とする。低い免疫原性及び／又は高い親和性並びにその他の未定義の特性は、得られる治療結果に寄与し得る。
【０１４４】
本発明において有用なＴＮＦ受容体多量体分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの、１つ以上のポリペプチドリンカー又はその他の非ペプチドリンカーを介して連結された２つ以上のＴＮＦ受容体のＥＣＤの全て又は機能的部分を含む。多量体分子は、多量体分子の発現をもたらすための分泌タンパク質のシグナルペプチドを更に含むことができる。これらの多量体分子及びそれらの生成方法は、米国出願第０８／４３７，５３３号（１９９５年５月９日出願）に記載されており、その内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
本発明の方法及び組成物において有用なＴＮＦ免疫受容体融合分子は、１つ以上の免疫グロブリン分子の少なくとも一つの部分及び１つ以上のＴＮＦ受容体の全て又は機能的部分を含む。これらの免疫受容体融合分子は、モノマー又はヘテロ若しくはホモ多量体として集合させることができる。免疫受容体融合分子はまた、一価であっても多価であってもよい。かかるＴＮＦ免疫受容体融合分子の例は、ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質である。ＴＮＦ免疫受容体融合分子及びそれらの生成方法は、当該技術分野において記載されている（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２８８３〜２８８６（１９９１）、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５〜１０５３９（１９９１）、Ｐｅｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３〜１４８９（１９９１）、Ｋｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１５〜２１９（１９９４）、Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ６（６）：６１６〜６２３（１９９４）、Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２０４０〜２０４８（１９９４）、Ｂｅｕｔｌｅｒら、米国特許第５，４４７，８５１号及び米国出願第０８／４４２，１３３号（１９９５年５月１６日出願）、これらの参照文献の各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。免疫受容体融合分子の生成方法は、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５，１１６，９６４号、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５，２２５，５３８号及びＣａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５〜５３１（１９８９）にも見ることができ、これらの参照文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
ＴＮＦ受容体分子の機能的等価物、誘導体、断片、又は領域は、本発明に使用することができるＴＮＦ受容体分子に機能的に類似するのに十分な大きさ及び配列のものである（例えば、ＴＮＦαに高い親和性で結合し、低い免疫原性を有する）、ＴＮＦ受容体分子の部分、又はＴＮＦ受容体分子をコード化するＴＮＦ受容体分子配列の部分を指す。ＴＮＦ受容体分子の機能的等価物はまた、本発明に使用することができるＴＮＦ受容体分子に機能的に類似する（例えば、ＴＮＦαに高い親和性で結合し、低い免疫原性を有する）修飾されたＴＮＦ受容体分子も含む。例えば、ＴＮＦ受容体分子の機能的等価物は「ＳＩＬＥＮＴ」コドン、又は１つ以上のアミノ酸置換、欠失、若しくは付加（例えば、１個の酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸の代わりに用いるか、又は同じ若しくは異なる疎水性アミノ酸をコード化する１つのコドンを、疎水性アミノ酸をコード化する別のコドンの代わりに用いる）を含有し得る。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７〜２０００）を参照のこと。
【０１４７】
サイトカインは、いかなる既知のサイトカインも包含する。例えば、ＣｏｐｅｗｉｔｈＣｙｔｏｋｉｎｅｓ．ｃｏｍを参照されたい。サイトカイン拮抗薬としては、任意の抗体、断片若しくは模倣薬、任意の可溶性受容体、断片若しくは模倣薬、任意の低分子拮抗薬、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
治療処置。本発明の任意の方法は、かかる調節、処置又は治療を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を投与することを含む、ＴＮＦ媒介障害を処置するための方法を含み得る。かかる方法は、所望により、かかる免疫疾患の処置のための同時投与又は併用療法を更に含み得、この少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体、特定された部分又はその変異体の投与は、少なくとも１つのＴＮＦ拮抗薬（例えば、ＴＮＦ抗体若しくは断片、可溶性ＴＮＦ受容体若しくは断片、その融合タンパク質、又は低分子ＴＮＦ拮抗薬などであるが、これらに限定されない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌薬（例えば、アミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペナム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌薬）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養薬、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐剤、抗潰瘍剤、緩下剤、抗凝固薬、エリスロポエチン（例えば、エポエチンα）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節薬、散瞳薬、毛様筋麻痺薬、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経作動薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、ぜんそく薬、β作動薬、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン若しくは類似体、ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカイン若しくはサイトカイン拮抗薬から選択される少なくとも１つの前に、同時に、及び／又は後に投与することを更に含む。
【０１４９】
典型的には、病態の処置は、組成物中に含有される比活性に応じ、平均して、合計、１回の投与あたり患者の体重１ｋｇあたり少なくとも約０．０１〜５００ミリグラムの範囲の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体、好ましくは、単回又は複数回投与あたり患者の体重１ｋｇあたり少なくとも約０．１〜１００ミリグラムの範囲の抗体の、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物の有効量又は投与量を投与することにより達成される。あるいは、有効な血清濃度は、単回又は複数回投与あたり０．１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を含み得る。適切な投与量は、医療実践者には周知であり、当然のことながら、具体的な疾患状態、投与される組成物の比活性、及び処置を受けている具体的な患者に依存する。場合によっては、望ましい治療量を得るために、反復投与、即ち、特定の監視された量又は定量の反復個別投与を提供することが必要となる場合があり、この場合、個別投与は、望ましい日用量又は作用が得られるまで繰り返される。
【０１５０】
好ましい用量は、所望により、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び／若しくは１００〜５００ｍｇ／ｋｇ／投与、又はその任意の範囲、値若しくは分画を含むか、あるいは単回若しくは複数回投与あたり０．１、０．５、０．９、１．０、１．１、１．２、１．５、１．９、２．０、２．５、２．９、３．０、３．５、３．９、４．０、４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、２０、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４．０、１４．５、１５、１５．５、１５．９、１６、１６．５、１６．９、１７、１７．５、１７．９、１８、１８．５、１８．９、１９、１９．５、１９．９、２０、２０．５、２０．９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９６、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００及び／若しくは５０００μｇ／ｍｌの血清濃度、又はその任意の範囲、値若しくは分画を得るように含み得る。
【０１５１】
あるいは、投与される投与量は、特定の薬剤の薬物動態特徴並びにその投与方法及び経路、レシピエントの年齢、健康及び体重、症状の性質及び程度、同時処置の種類、処置頻度、並びに所望の作用などの既知の因子により変動し得る。活性成分の投与量は、通常、体重１キログラムあたり約０．１〜１００ミリグラムであり得る。通常、投与あたり１キログラムあたり０．１〜５０、好ましくは０．１〜１０ミリグラム又は徐放性形態が、望ましい結果を得るために有効である。
【０１５２】
非限定的な例として、ヒト又は動物の処置は、単回、注入又は反復投与を使用して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０日目のうちの少なくとも１日に、あるいは又は追加的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１若しくは５２週目のうちの少なくとも１週に、あるいは又は追加的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０年目のうちの少なくとも１年に、又はこれらの任意の組み合わせで、１日あたり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇの、本発明の少なくとも１つの抗体の１回又は周期的な投与量として提供され得る。
【０１５３】
体内投与に好適な剤形（組成物）は、一般に、１単位又は容器あたり約０．１ミリグラム〜約５００ミリグラムの活性成分を含有する。これらの医薬組成物において、活性成分は、組成物の総重量に基づいて、通常、約０．５〜９９．９９９重量％の量で存在する。
【０１５４】
非経口投与には、抗体は、製薬学的に許容できる非経口ビヒクルと合わせて、又は別途供給される、溶液、懸濁液、エマルション若しくは凍結乾燥粉末として、処方することができる。かかるビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及び１〜１０％ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び固定油などの非水性ビヒクルを使用することもできる。ビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性及び化学安定性を維持する添加剤（例えば、等張性に関しては塩化ナトリウム、マンニトール；化学安定性に関しては緩衝剤及び保存剤）を含有することができる。製剤は、既知の又は適切な技術によって滅菌される。
【０１５５】
適切な製薬学的担体は、この分野での標準的参考テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌの最新版の中で記載されている。
【０１５６】
代替的投与。製薬学的に有効な量の、本発明による少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を投与するために、本発明により、多くの既知の及び開発された投与方法を使用することができる。以下の記述では経肺投与が使用されているが、本発明に従ってその他の投与方式を使用して、適切な結果を得てもよい。
【０１５７】
本発明のＴＮＦ抗体は、担体中で、溶液、エマルション、コロイド若しくは懸濁液として、又は乾燥粉末として、吸入によるか、又は本明細書に記載される若しくは当該技術分野において既知である他の方法による投与に適した様々なデバイス及び方法のいずれかを使用して、送達することができる。
【０１５８】
非経口製剤及び投与。非経口投与用製剤は、一般的な賦形剤として滅菌水又は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物に由来する油、水素化ナフタレンなどを含有し得る。注射用の水性又は油性懸濁液は、既知の方法に従って、適切な乳化剤又は加湿剤及び懸濁剤を使用することによって調製可能である。注射剤は、例えば、水溶液若しくは無菌注射液又は溶媒中懸濁液などの非毒性の非経口投与可能な希釈剤であってよい。使用可能なビヒクル又は溶媒としては、水、リンゲル液、等張生理食塩水などが可能であり、通常の溶媒又は懸濁溶媒としては、無菌の不揮発性油を使用することができる。これらの目的では、天然又は合成若しくは半合成の、脂肪油又は脂肪酸、天然又は合成若しくは半合成の、モノグリセリド又はジグリセリド又はトリグリセリドを含む、あらゆる種類の不揮発性油及び脂肪酸を使用することができる。非経口投与は当該技術分野において既知であり、従来の注射手段、米国特許第５，８５１，１９８号に記載されているようなガス加圧式無針注入デバイス、及び米国特許第５，８３９，４４６号に記載されているようなレーザー穿孔機デバイスが挙げられるが、これらに限定されず、これらは参照によって全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
代替的送達。本発明は更に、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内又は経皮手段による少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の投与に関する。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物は、非経口（皮下、筋肉内又は静脈内）又は任意のその他の投与、特に、液体溶液若しくは懸濁液の形態で使用するために、特に、クリーム及び座薬などであるがこれらに限定されない半固体形態で、膣若しくは直腸の投与における使用のために、錠剤若しくはカプセルなどであるがこれらに限定されない形態で、口腔若しくは舌下投与用に、あるいは粉末、点鼻剤若しくはエアロゾル、又はある特定の薬剤などであるがこれらに限定されない形態で、鼻腔内に、あるいは皮膚構造を改変するか、又は経皮パッチ中の薬物濃度を増加させるかのいずれかのために、ジメチルスルホキシドなどの化学的促進剤を用いて（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ「Ｄｒｕｇ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ」；Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ．５９〜９０（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４、参照により全体が本明細書に組み込まれる）、又はタンパク質及びペプチドを含有する製剤の皮膚への適用（国際公開第９８／５３８４７号）、又はエレクトロポレーションなどの一過性の輸送経路を作り出すための、若しくはイオントフォレシスなどの皮膚を通して荷電薬物の移動度を増加させるための電界の適用、又は超音波導入などの超音波の適用（米国特許第４，３０９，９８９号及び同第４，７６７，４０２号）を可能にする酸化剤を用いて、ゲル、軟膏、ローション、懸濁液若しくはパッチ送達系などであるが、これらに限定されない、経皮的に、調製することができる（上記の刊行物及び特許は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１６０】
経肺／鼻腔内投与。経肺投与のためには、好ましくは、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物は、肺の下気道又は洞に達するのに有効な粒径で送達される。本発明により、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体は、吸入により治療薬を投与するための、当該技術分野において既知の様々な吸入又は鼻腔内デバイスのいずれかにより送達することができる。患者の洞腔又は肺胞内にエアロゾル化した製剤を被着させることができるこれらのデバイスとしては、定量吸入器、ネブライザー、乾燥粉末発生器、噴霧器などが挙げられる。抗体の経肺又は鼻腔内投与を目的とするのに適したその他のデバイスも、当該技術分野において既知である。かかるデバイスは全てエアロゾル中の抗体を分配するための投与に適した製剤を使用することができる。このようなエアロゾルは、溶液（水性及び非水性の両方）又は固体粒子のいずれかで構成されることができる。Ｖｅｎｔｏｌｉｎ（登録商標）定量吸入器のような定量吸入器は、典型的には噴射ガスを使用し、吸息中の作動を必要とする（例えば、国際公開第９４／１６９７０号、国際公開第９８／３５８８８号を参照のこと）。Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（商標）（Ａｓｔｒａ）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｄｉｓｋｕｓ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｓｐｉｒｏｓ（商標）吸入器（Ｄｕｒａ）、Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより市販されているデバイス、及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ（登録商標）パウダー吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ）などの乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼気作動を使用する（米国特許第４６６８２１８号（Ａｓｔｒａ）、欧州特許第２３７５０７号（Ａｓｔｒａ）、国際公開第９７／２５０８６号（Ｇｌａｘｏ）、国際公開第９４／０８５５２号（Ｄｕｒａ）、米国特許第５４５８１３５号（Ｉｎｈａｌｅ）、国際公開第９４／０６４９８号（Ｆｉｓｏｎｓ）、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ＡＥＲｘ（商標）（Ａｒａｄｉｇｍ）、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、及びＡｃｏｒｎ  ＩＩ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）などのネブライザー（米国特許第５４０４８７１号（Ａｒａｄｉｇｍ）、国際公開第９７／２２３７６号）（上記の文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる）は溶液からエアロゾルを生じさせるのに対し、定量吸入器、乾燥粉末吸入器などは小粒子エアロゾルを発生させる。市販の吸入デバイスのこれらの具体例は、本発明の実施に適した特定のデバイスを代表するものとして意図されており、本発明の範囲を制限するものとして意図されているものではない。好ましくは、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む組成物は、乾燥粉末吸入器又は噴霧器によって送達される。本発明の少なくとも１つの抗体を投与するための吸入デバイスには、複数の望ましい特徴が存在する。例えば、吸入デバイスによる送達は、有利に信頼性が高く、再現可能であり、かつ正確である。吸入デバイスは所望により、うまく呼吸できるように、例えば、約１０μｍ未満、好ましくは約１〜５μｍの小さな乾燥粒子を送達することができる。
【０１６１】
スプレーでのＴＮＦ抗体組成物の投与。ＴＮＦ抗体組成物タンパク質を含むスプレーは、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の懸濁液又は溶液に加圧下でノズルを通過させることにより生じさせることができる。ノズルの大きさ及び構成、適用される圧力並びに液体供給速度は、所望の出力及び粒径を達成するように選定することができる。例えば、キャピラリー又はノズルフィードとともに電界により電気スプレーを作製することができる。有利なことに、噴霧器により送達される少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍの範囲の粒径を有する。
【０１６２】
噴霧器とともに使用するのに適した少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の製剤は、典型的には、水溶液中に、例えば、．１、．２．、．３、．４、．５、．６、．７、．８、．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｍｌ若しくはｍｇ／ｇｍであるがこれらに限定されない、１ｍｌ若しくはｍｇ／ｇｍの溶液あたり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、又はその中の任意の範囲若しくは値の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の濃度で抗体組成物タンパク質を含む。この製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、保存剤、界面活性剤及び好ましくは亜鉛などの薬剤を含み得る。この製剤は、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質又は炭水化物などの抗体組成物タンパク質を安定化させるための賦形剤又は薬剤も含み得る。抗体組成物タンパク質の処方において有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが挙げられる。抗体組成物タンパク質の処方において有用な典型的な炭水化物としては、ショ糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、グルコースなどが挙げられる。抗体組成物タンパク質製剤はまた、エアロゾル形成時の溶液の霧化により引き起こされる抗体組成物タンパク質の表面誘発性の凝集を低減又は阻止することができる界面活性剤も含み得る。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルのような様々な従来の界面活性剤を使用することができる。量は一般に、製剤の０．００１〜１４重量％の範囲にわたる。本発明の目的上とりわけ好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。ＴＮＦ抗体又は特定された部分若しくは変異体などのタンパク質の製剤には、当該技術分野において既知の更なる薬剤もまた製剤中に含むことができる。
【０１６３】
ネブライザーによるＴＮＦ抗体組成物の投与。抗体組成物タンパク質は、ジェットネブライザー又は超音波ネブライザーなどのネブライザーにより投与することができる。典型的には、ジェットネブライザーでは、オリフィスを通して高速の空気ジェットを作り出すのに圧縮空気供給源を使用する。ガスがノズルを超えて膨脹する際に低圧領域が作り出され、それが液体リザーバに接続された毛細管を通して抗体組成物タンパク質の溶液を引き出す。毛細管からの液体流は、それが管を出る際に不安定な糸状体及び液滴に剪断されてエアロゾルを作り出す。ある範囲の構成、流速及びバッフル型を、所定のジェットネブライザーからの所望の性能の特徴を達成するのに使用することができる。超音波ネブライザーにおいては、高周波電気エネルギーを使用して、典型的には圧電変換器を使用して、振動性の機械的エネルギーを作り出す。このエネルギーが、直接又はカップリング液を通じてのいずれかで抗体組成物タンパク質の製剤に伝播されて、抗体組成物タンパク質を含むエアロゾルを作り出す。有利なことに、ネブライザーにより送達される抗体組成物タンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍの範囲の粒径を有する。
【０１６４】
ジェット又は超音波いずれかのネブライザーでの使用に適した少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の製剤は、典型的には、溶液１ｍＬあたり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇの少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体タンパク質の濃度を含む。この製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、保存剤、界面活性剤、及び好ましくは亜鉛などの薬剤を含み得る。この製剤は、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質、又は炭水化物などの少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の安定化のための賦形剤又は薬剤も含み得る。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の処方において有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが挙げられる。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の処方において有用な典型的な炭水化物としては、ショ糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、グルコースなどが挙げられる。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体製剤はまた、エアロゾル形成時に溶液の霧化により引き起こされる少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の表面誘発性の凝集を低減又は阻止し得る界面活性剤も含み得る。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビタル脂肪酸エステルのような様々な従来の界面活性剤を使用することができる。量は、一般に製剤の０．００１〜４重量％の範囲である。本発明の目的上とりわけ好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。抗体タンパク質などのタンパク質の製剤には、当該技術分野において既知の更なる薬剤もまた製剤中に含むことができる。
【０１６５】
定量吸入器によるＴＮＦ抗体組成物の投与。定量吸入器（ＭＤＩ）では、噴射剤、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体及び任意の賦形剤又はその他の添加剤が、液化圧縮ガスを含む混合物としてキャニスター内に収容される。絞り弁の作動により、好ましくは、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ〜３μｍの範囲のサイズの粒子を含有するエアロゾルとしての混合物が放出される。ジェット粉砕、噴霧乾燥、臨界点凝結などを含む、当業者に既知の様々な方法により生成された抗体組成物タンパク質の製剤を用いることにより、所望のエアロゾル粒径を得ることができる。好ましい定量吸入器としては、３Ｍ又はＧｌａｘｏにより製造されかつヒドロフルオロカーボン噴射剤を使用するものが挙げられる。
【０１６６】
定量吸入器デバイスで使用するための少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の製剤は、一般に、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を、例えば、界面活性剤の助けを借りて噴射剤中に懸濁した非水性溶媒中の懸濁液として含有する微粉を含む。噴射剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン、ＨＦＡ−１３４ａ（ヒドロフルオロアルカン−１３４ａ）、ＨＦＡ−２２７（ヒドロフルオロアルカン−２２７）などが挙げられる、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、又は炭化水素のような本目的上使用される任意の従来の物質であることができる。好ましくは、噴射剤はヒドロフルオロカーボンである。界面活性剤は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を噴射剤中の懸濁液として安定化させる、活性薬剤を化学的分解に対して保護するなどのために選択することができる。好適な界面活性剤には、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、オレイン酸などが挙げられる。場合によっては、エタノールなどの溶媒を使用する溶液エアロゾルが好ましい。タンパク質の処方のための当該技術分野で既知の更なる薬剤を薬剤中に含んでもよい。
【０１６７】
当業者は、本発明の方法が、本明細書に記載されないデバイスを介する少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物の経肺投与により達成され得ることを認識するであろう。
【０１６８】
経口製剤及び投与。経口のための製剤は、腸壁の浸透性を人工的に増加させるためのアジュバント（例えば、レゾルシノール、並びにポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルなどの非イオン性界面活性剤）の同時投与、並びに酵素的分解を阻害するための酵素阻害剤（例えば、膵トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＦ）及びトラシロール）の同時投与による。経口投与のための固体型剤形の活性成分化合物は、ショ糖、乳糖、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成又は半合成ポリマー、及びグリセリドなどの、少なくとも１つの添加物と混合することができる。これらの剤形はまた、他の種類（複数可）の添加剤、例えば、不活性希釈剤、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、パラベンなど）、保存剤（ソルビン酸、アスコルビン酸、α−トコフェロールなど）、抗酸化剤（システインなど）、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、着香剤、香料なども含有し得る。
【０１６９】
錠剤及び丸剤は腸溶コーティング調製物に更に加工することができる。経口投与のための液体調製物には、医学的用途に許容できるエマルション、シロップ、エリキシル剤、懸濁剤及び溶液調製物が挙げられる。これらの調製物は、その分野で通例に使用される不活性希釈剤、例えば水を含有することができる。リポソームはインスリン及びヘパリンの薬物送達系としても記述されている（米国特許第４，２３９，７５４号）。より最近では、混合アミノ酸の人工的ポリマーのミクロスフェア（プロテイノイド）が、医薬品を送達するために使用されている（米国特許第４，９２５，６７３号）。更に、米国特許第５，８７９，６８１号及び米国特許第５，５，８７１，７５３号に記載される担体化合物が、生物学的活性薬剤を経口で送達するのに使用されることは、当該技術分野において既知である。
【０１７０】
粘膜製剤及び投与。粘膜表面を通る吸収のため、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を投与するための組成物及び方法は、複数のサブミクロン粒子と、粘膜付着性巨大分子と、生物活性ペプチドと、エマルション粒子の粘膜付着を達成することにより粘膜表面を通る吸収を促進する水性連続相と、を含む、エマルションを含む（米国特許第５，５１４，６７０号）。本発明のエマルションの適用に適する粘膜表面には、角膜、結膜、口腔内、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸及び直腸投与経路を挙げることができる。膣又は直腸投与のための製剤、例えば坐薬は、賦形剤として、例えば、ポリアルキレングリコール、ワセリン、カカオバターなどを含有し得る。鼻内投与のための処方は固体であってよく、賦形剤として、例えば乳糖を含有することができ、又は水性若しくは油性溶液の点鼻薬であることができる。口腔内投与のために、賦形剤として、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、αデンプン（pregelinatined starch）などが挙げられる（米国特許第５，８４９，６９５号）。
【０１７１】
経皮製剤及び投与。経皮投与のために、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を、リポソーム若しくはポリマーナノ粒子、微小粒子、マイクロカプセル又はミクロスフェア（特に明示しない限り、集合的に微小粒子と称する）などの送達デバイス中にカプセル化する。ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びそれらのコポリマーなどのポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物及びポリホスファゼンなどの合成ポリマー、並びにコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン及びその他のタンパク質などの天然ポリマー、アルギン酸塩及びその他の多糖類並びにそれらの組み合わせから作製される微小粒子を含む多くの好適なデバイスが既知である（米国特許第５，８１４，５９９号）。
【０１７２】
長時間投与及び製剤。本発明の化合物を、単回投与により、長期間にわたり、例えば、１週〜１年間、被験体に送達することが時折望ましい場合がある。様々な徐放、デポー又は埋め込み剤形を利用することができる。例えば、剤形は、体液において溶解度が低い化合物の製薬的に許容できる非毒性塩、例えば、（ａ）リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノ−又はジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの多塩基酸との酸付加塩、（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属カチオン、又は例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジル−エチレンジアミン若しくはエチレンジアミンから形成された有機カチオンを有する塩、あるいは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ、例えば、タンニン酸亜鉛塩を含有し得る。加えて、本発明の化合物、又は好ましくは前述したものなどの比較的不溶性の塩を、注射に好適な、例えばゴマ油とともに、例えば、モノステアリン酸アルミニウムゲルなどのゲル中に処方することができる。とりわけ好ましい塩は、亜鉛塩、亜鉛タンニン酸塩、パモ酸塩などである。別の種類の注射用徐放デポー製剤は、例えば米国特許第３，７７３，９１９号に記載されるポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーなどのゆっくりと分解する非毒性の非抗原性ポリマー中にカプセル化されるために分散された化合物又は塩を含有する。化合物、又は好ましくは上述したものなどの比較的不溶性の塩は、特に動物での使用のために、コレステロールマトリックスのシラスティックペレット中に処方することもできる。更なる徐放デポー又は埋め込み製剤、例えば、ガス又は液体リポソームは、文献（米国特許第５，７７０，２２２号、及び「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９７８）で既知である。
【０１７３】
本発明を全般的に記述したことから、同様物は、具体的説明として提供されるが制限することを意図していない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１７４】
実施例１：哺乳類細胞におけるＴＮＦ抗体のクローニング及び発現。
典型的な哺乳類発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する少なくとも１つのプロモーター要素、抗体コード配列、並びに転写の終結及び転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。付加的な要素には、エンハンサー、コザック配列並びにＲＮＡスプライシングのためのドナー及びアクセプター部位に隣接している介在配列が含まれる。高効率の転写は、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター、レトロウイルス、例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからの長端末反復（ＬＴＲＳ）、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターで達成することができる。しかしながら、細胞要素を使用することもできる（例えば、ヒトアクチンプロモーター）。本発明の実施において使用するのに好適な発現ベクターとしては、例えば、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ若しくはｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）又はｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬ及びＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ  ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）並びにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ  ６７１０９）などのベクターが挙げられる。使用することができる哺乳類の宿主細胞には、ヒトＨｅｌａ  ２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３及びＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。
【０１７５】
あるいは、遺伝子を、染色体に組み込まれた遺伝子を含有する安定した細胞株において発現させることができる。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン又はハイグロマイシンなどの選択マーカーとの共トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の特定及び単離を可能にする。
【０１７６】
トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコード化された抗体を発現するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の遺伝子の数百又は更には数千のコピーを有する細胞株を開発するのに有用である。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２７：２７７〜２７９（１９９１）、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９〜１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳類細胞を選択的培地中で成長させ、最も高い耐性を有する細胞が選択される。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた増幅遺伝子（複数可）を含有する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＮＳＯ細胞が抗体の生成に使用されることが多い。
【０１７７】
発現ベクターｐＣ１及びｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強いプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８〜４４７（１９８５））に加え、ＣＭＶエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１〜５３０（１９８５））の断片を含有する。例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＡｓｐ７ｌ８を伴う複数のクローニング部位は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターは更に、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化及び終結シグナルを含有する。
【０１７８】
ＣＨＯ細胞におけるクローニング及び発現。ベクターｐＣ４は、ＴＮＦ抗体の発現に使用される。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下でマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する。これらのプラスミドでトランスフェクトされる、ジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞又はその他の細胞は、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択的培地（例えば、α−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で細胞を成長させることによって選択することができる。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性の細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、十分に文書化されている（例えば、Ｆ．Ｗ．Ａｌｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７〜１３７０（１９７８）、Ｊ．Ｌ．Ｈａｍｌｉｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０９７：１０７〜１４３（１９９０）及びＭ．Ｊ．Ｐａｇｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｓｙｄｅｎｈａｍ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：６４〜６８（１９９１）を参照のこと）。増大したＭＴＸ濃度において成長した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素であるＤＨＦＲの過剰生成により、薬物に対する耐性を発達させる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結されている場合、通常、共増幅され、過剰発現される。このアプローチを使用して、増幅遺伝子（複数可）の１，０００を超えるコピーを有する細胞株を開発することができることが、当該技術分野において知られている。続いて、メトトレキサートを回収する際、宿主細胞の１つ以上の染色体（複数可）に組み込まれた増幅遺伝子を含有する細胞株が得られる。
【０１７９】
プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）の強いプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８〜４４７（１９８５））に加え、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即初期遺伝子のエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１〜５３０（１９８５））から単離された断片を含有する。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＡｓｐ７１８制限酵素切断部位である。これらのクローニング部位の後に、プラスミドは、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロン及びポリアデニル化部位を含有する。他の高効率のプロモーター、例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期若しくは後期プロモーター、又は他のレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶＩからの長末端反復も発現のために使用することができる。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−Ｏｆｆ及びＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系、並びに類似の系を使用して、哺乳類細胞において調節された方法で、ＴＮＦを発現させることができる（Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎ，ａｎｄ  Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７〜５５５１（１９９２））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、例えば、ヒト成長ホルモン又はグロビン遺伝子からの他のシグナルも使用することができる。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定した細胞株は、ｇｐｔ、Ｇ４１８又はハイグロマイシンなどの選択マーカーとの共トランスフェクションの際に選択することもできる。最初に１つを超える選択マーカー、例えばＧ４１８、に加えてメトトレキサートを使用するのが有利である。
【０１８０】
このプラスミドｐＣ４を制限酵素で消化した後に、当該技術分野において既知の手順により、子ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。次に、ベクターは１％アガロースゲルから単離される。
【０１８１】
次に、単離された可変及び定常領域コードＤＮＡ及び脱リン酸化ベクターをＴ４  ＤＮＡリガーゼでライゲートする。次に、大腸菌ＨＢ１０１又はＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、例えば、制限酵素分析を使用して、プラスミドｐＣ４に挿入された断片を含有する細菌を特定する。
【０１８２】
トランスフェクションには、活性ＤＨＦＲ遺伝子が欠損しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が使用される。５μｇの発現プラスミドｐＣ４は、リポフェクチンを使用して、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏで共トランスフェクトされる。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性の選択マーカーである、Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対して耐性を付与する酵素をコード化するＴｎ５からのｎｅｏ遺伝子を含有する。１μｇ／ｍｌのＧ４１８で補充したαーＭＥＭに細胞を播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、ハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中の、１０、２５又は５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサート＋１μｇ／ｍｌのＧ４１８で補充したαーＭＥＭに播種する。約１０〜１４日後、単一クローンをトリプシン処理した後、異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６ウェルペトリ皿又は１０ｍｌフラスコに播種する。次に、最高濃度のメトトレキサートで成長させているクローンを、更に高い濃度のメトトレキサート（１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新しい６ウェルプレートに移す。１００〜２００ｍＭの濃度で成長するクローンが得られるまで同じ手順を繰り返す。所望の遺伝子生成物の発現は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって、又は逆相ＨＰＬＣ分析によって分析される。
【０１８３】
実施例２：トランスジェニックマウスを使用する、ヒトＴＮＦと反応する高親和性ヒトＩｇＧモノクローナル抗体の生成。
要約。ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを使用して、１つ以上のＴＮＦ媒介性疾患の処置のための、ＴＮＦ作用を阻害するために治療的に使用することができる高親和性の完全ヒトモノクローナル抗体を生成する。重鎖及び軽鎖両方のヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有する（ＣＢＡ／Ｊ  ｘ  Ｃ５７／ＢＬ６／Ｊ）Ｆ２ハイブリッドマウスをヒト組換えＴＮＦで免疫化する（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５７９〜５９１（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９（１９９４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：８２６（１９９６）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜８５１（１９９６））。いくつかの融合物が完全ヒトＴＮＦ反応性ＩｇＧモノクローナル抗体の１つ以上のパネルを生み出した。完全ヒト抗ＴＮＦ抗体を更に特徴付けする。全てはＩｇＧ１κである。かかる抗体は、およそ１×１０９〜９×１０１２の親和性定数を有することが分かった。これらの完全ヒトモノクローナル抗体の予期せぬ高親和性により、それらはＴＮＦ関連疾患、病態、又は障害における治療用途のための好適な候補となる。
【０１８４】
略語。ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン、ＣＯ２−二酸化炭素、ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド、ＥＩＡ−酵素イムノアッセイ、ＦＢＳ−ウシ胎児血清、Ｈ２Ｏ２−過酸化水素、ＨＲＰ−西洋わさびペルオキシダーゼ、ＩＤ−皮内、Ｉｇ−免疫グロブリン、ＴＮＦ−組織壊死因子α、ＩＰ−腹腔内、ＩＶ−静脈内、Ｍａｂ−モノクローナル抗体、ＯＤ−光学密度、ＯＰＤ−ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、ＰＥＧ−ポリエチレングリコール、ＰＳＡ−ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、ＲＴ−室温、ＳＱ−皮下、ｖ／ｖ−単位容量あたりの容量、ｗ／ｖ−単位容量あたりの重量。
【０１８５】
材料及び方法。
動物。ヒト免疫グロブリンを発現するがマウスＩｇＭ又はＩｇκを発現しない、ヒト抗体を発現することができるトランスジェニックマウスは、当該技術分野において既知である（及び市販されている（例えば、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ及びその他）。例えば、かかるトランスジェニックマウスは、Ｖ（Ｄ）Ｊ結合、重鎖クラススイッチ及び体細胞突然変異を受けてヒト配列免疫グロブリンのレパートリーを生成する、ヒト配列導入遺伝子を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９（１９９４））。軽鎖導入遺伝子は、例えば、部分的に、生殖系列ヒトＶκ領域のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンに由来し得る。加えて、重鎖導入遺伝子は、ヒトμ及びヒトγ１の両方（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜８５１（１９９６））並びに／又はγ３定常領域をコード化することができる。適切なゲノトピック系統由来のマウスを免疫化及び融合プロセスにおいて使用して、ＴＮＦに対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成することができる。
【０１８６】
免疫化。１つ以上の免疫化スケジュールは、抗ＴＮＦヒトハイブリドーマを生成するために使用することができる。以下の例示的な免疫化プロトコル後に、最初のいくつかの融合を行うことができるが、他の類似の既知のプロトコルを使用することもできる。数匹の１４〜２０週齢の雌及び／又は外科的に去勢した雄のトランスジェニックマウスに対して、最終容量１００〜４００μｌ（例えば、２００）で等量のＴＩＴＥＲＭＡＸ又は完全フロイントアジュバントで乳化した１〜１０００μｇの組換えヒトＴＮＦをＩＰ又はＩＤに接種する。各マウスはまた、所望により、２ＳＱ部位の各々に１００μＬの生理学的生理食塩水中１〜１０μｇを受けることもできる。その後、マウスは、１〜７、５〜１２、１０〜１８、１７〜２５及び／又は２１〜３４日後にＩＰ（１〜４００μｇ）及びＳＱ（１〜４００μｇ×２）により等量のＴＩＴＥＲＭＡＸ又は完全フロイントアジュバントで乳化したＴＮＦで、免疫化され得る。抗凝固薬なしで１２〜２５及び２５〜４０日後に眼窩後方穿刺によりマウスを出血させることができる。次に、血液を室温で１時間凝固させ、血清を回収し、既知の方法によりＴＮＦ  ＥＩＡアッセイを使用して滴定する。反復注射が力価の増加を生じなければ、融合を行う。その際、マウスに、１００μＬの生理学的生理食塩水に希釈した１〜４００μｇのＴＮＦの最終ＩＶブースター注射を与えることができる。３日後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、脾臓を無菌的に除去し、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（ＰＳＡ）を含有する、１０ｍＬの冷リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬することができる。ＰＳＡ−ＰＢＳで脾臓を無菌灌流することにより、脾細胞を採取する。細胞を冷ＰＳＡ−ＰＢＳ中で１回洗浄し、トリパンブルー染料排除を使用して計数し、２５ｍＭへぺスを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁する。
【０１８７】
細胞融合。既知の方法により、例えば、当該技術分野において既知である、１：１〜１：１０のマウス骨髄腫細胞対生脾臓細胞比率で融合を行うことができる。非限定的な例として、脾臓細胞及び骨髄腫細胞は一緒にペレット化することができる。次に、３０秒かけてペレットを３７℃でゆっくり１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ／ＰＢＳ溶液（ＰＥＧ分子量１，４５０、Ｓｉｇｍａ）に再懸濁することができる。その後、１分かけて２５ｍＭへぺスを含有する１０．５ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０培地（３７℃）をゆっくり添加することによって、融合を停止させることができる。融合細胞を５分間５００〜１５００ｒｐｍで遠心分離する。その後、細胞をＨＡＴ培地（２５ｍＭへぺス、１０％胎児クローンＩ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２．５％  Ｏｒｉｇｅｎ培養サプリメント（Ｆｉｓｈｅｒ）、１０％  ６５３調整ＲＰＭＩ１６４０／へぺス培地、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジンを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地）に再懸濁した後、１５の９６ウェル平底組織培養プレートに２００μＬ／ウェルで平板培養する。次に、７〜１０日間、５％  ＣＯ２及び９５％空気を含有する加湿した３７℃のインキュベータにプレートを配置する。
【０１８８】
マウス血清におけるヒトＩｇＧ抗ＴＮＦ抗体の検出。固相ＥＩＡを使用して、ヒトＴＮＦに特異的なヒトＩｇＧ抗体についてマウス血清をスクリーニングすることができる。簡潔に、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのＴＮＦで一晩プレートをコーティングすることができる。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する０．１５Ｍ生理食塩水で洗浄した後、ウェルをＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２００μＬ／ウェルで、室温で１時間遮断することができる。プレートは、直ちに使用するか、又は後に使用するために−２０℃で凍結する。マウス血清希釈物を、５０μＬ／ウェルでＴＮＦコーティングしたプレート上で、室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中に１：３０，０００で希釈したＦｃ特異的の５０μＬ／ウェルＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧで、室温で１時間プローブする。プレートを再度洗浄することができ、１００μＬ／ウェルのクエン酸塩−リン酸塩基質溶液（０．１Ｍクエン酸及び０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．０１％  Ｈ２Ｏ２及び１ｍｇ／ｍＬ  ＯＰＤ）を１５分かけて室温で添加する。次に、２５μＬ／ウェルで反応停止溶液（４Ｎ硫酸）を添加し、自動プレート分光光度計により４９０ｎｍでＯＤを読み取る。
【０１８９】
ハイブリドーマ上清における完全ヒト免疫グロブリンの検出。好適なＥＩＡを使用して、完全ヒト免疫グロブリンを分泌する成長陽性ハイブリドーマを検出することができる。簡潔に、９６ウェルのポップアウトプレート（ＶＷＲ、６１０７４４）を、４℃で一晩、炭酸ナトリウム緩衝剤中１０μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃでコーティングすることができる。プレートを洗浄し、３７℃で１時間、１％  ＢＳＡ−ＰＢＳで遮断し、直ちに使用するか、又は−２０℃で凍結する。未希釈ハイブリドーマ上清を、プレート上で、３７℃で１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、１％  ＢＳＡ−ＰＢＳ中に１：１０，０００で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトκで、３７℃で１時間プローブする。次に、上述のように、プレートを基質溶液とともにインキュベートする。
【０１９０】
完全ヒト抗ＴＮＦ反応性の決定。上記のハイブリドーマは、好適なＲＩＡ又は他のアッセイを使用してＴＮＦに対する反応性について同時にアッセイすることができる。例えば、上記のように、上清をヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃプレート上でインキュベートし、洗浄した後、室温で１時間、ウェルあたり適切な計数で、放射線標識されたＴＮＦでプローブする。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、好適な計数器を使用して、結合した放射線標識されたＴＮＦを定量化する。
【０１９１】
ヒトＩｇＧ１κ抗ＴＮＦ分泌ハイブリドーマを細胞培養において拡張し、限定希釈により系列的にサブクローニングすることができる。結果として得られたクローン集団を拡張し、凍結培地（９５％  ＦＢＳ、５％  ＤＭＳＯ）中で凍結保存し、液体窒素中で保管する。
【０１９２】
アイソタイプ。抗体のアイソタイプの決定は、特定の滴定に対するマウス免疫血清をスクリーニングするために使用されたものと類似の形式のＥＩＡを使用して達成することができる。上述のように９６ウェルプレート上にＴＮＦをコーティングすることができ、２μｇ／ｍＬの精製された抗体を、室温で１時間プレート上でインキュベートすることができる。プレートを洗浄し、１％  ＢＳＡ−ＰＢＳ中に１：４０００で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ１又はＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ３で、室温で１時間プローブする。プレートを再度洗浄し、上述のように基質溶液とともにインキュベートする。
【０１９３】
ヒトＴＮＦによるヒト抗ヒトＴＮＦ抗体の結合動態。抗体の結合特徴は、例えば、ＴＮＦ捕捉ＥＩＡ及びＢＩＡｃｏｒｅ技術を使用して好適に評価することができる。精製されたヒトＴＮＦ抗体の段階的濃度は、上述のように、アッセイにおいて、２μｇ／ｍＬのＴＮＦでコーティングされたＥＩＡプレートへの結合について評価することができる。その後、相対結合効率を示す片対数プロットとしてＯＤを表すことができる。
【０１９４】
定量的結合定数は、例えば、以下のように、又は任意のその他の既知の好適な方法によって得ることができる。ＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ−５（カルボキシメチル）チップをＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００ユニットに配置する。ＨＢＳ緩衝剤（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  ｖ／ｖ  Ｐ２０界面活性剤、ｐＨ７．４）を、安定したベースラインが得られるまで、５μｌ／分でチップのフローセル上に流す。２００μＬの水中１５ｍｇのＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）の溶液（１００μＬ）を、２００μＬの水中２．３ｍｇのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）の１００μＬの溶液に添加する。結果として得られた溶液の４０μＬをチップ上に注入する。６μＬのヒトＴＮＦの溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中１５μｇ／ｍＬ、ｐＨ  ４．８）をチップ上に注入し、約５００ＲＵの増加をもたらす。緩衝剤をＴＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ／ＢＳＡ泳動緩衝剤（２０ｍＭトリス、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５％トリトンＸ−１００、２５μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に変更し、一晩チップ上に流してそれを平衡化し、全ての未反応のコハク酸エステルを加水分解又はキャップする。
【０１９５】
３３．３３、１６．６７、８．３３、及び４．１７ｎＭで泳動緩衝剤中に抗体を溶解する。流量を３０μＬ／分に調整し、器具の温度を２５℃に調整する。１つはＴＮＦが固定化され（試料）、２つ目は非誘導化フローセル（ブランク）である、２つのフローセルを動態実行に使用する。各抗体濃度を１２０μＬ、フローセル上に３０μＬ／分で注入し（会合相）、続いて３６０秒間連続して緩衝剤を流す（解離相）。各３０μＬの２Ｍチオシアン酸グアニジンを２回順次注入することにより、チップの表面を再生する（組織壊死因子α／抗体複合体の解離）。
【０１９６】
データの分析は、当該技術分野において既知であるＢＩＡ評価３．０又はＣＬＡＭＰ  ２．０を使用して行われる。各抗体濃度について、ブランクセンソグラムを試料センソグラムから減ずる。解離（ｋｄ，ｓｅｃ−１）及び会合（ｋａ，ｍｏｌ−１  ｓｅｃ−１）の両方についてグローバルフィットを行い、解離定数（ＫＤ，ｍｏｌ）を算出する（ｋｄ／ｋａ）。抗体親和性が十分に高いため、捕捉された抗体のＲＵが１００超である場合、抗体の追加希釈が実行される。
【０１９７】
結果及び考察。
抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体の生成。いくつかの融合を行い、ヒトＴＮＦに特異的な数十の抗体を生み出す各融合物を１５のプレート（１４４０ウェル／融合物）に播種する。これらのうち、いくつかは、ヒト及びマウスＩｇ鎖の組み合わせからなることがわ分かる。残りのハイブリドーマは、ヒト重鎖及び軽鎖のみからなる抗ＴＮＦ抗体を分泌（secret）する。ヒトハイブリドーマの全てがＩｇＧ１κであることが予想される。
【０１９８】
ヒト抗ヒトＴＮＦ抗体の結合動態。ＥＬＩＳＡ分析は、これらのハイブリドーマのほとんど又は全てからの精製された抗体が、濃度依存的にＴＮＦに結合することを確認する。図１〜２は、これらの抗体の相対的結合効率の結果を示す。この場合、抗体のその同族抗原（エピトープ）に対する結合活性度を測定する。ＴＮＦを直接ＥＩＡプレートに結合すると、タンパク質の変性を引き起こし得、見かけ上の結合親和性は、未変性タンパク質への結合を反映することができないことに留意するべきである。５０パーセントの結合が広範な濃度にわたって見られる。
【０１９９】
定量的結合定数はヒト抗体のＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して得られ、ヒトモノクローナル抗体のいくつかが１×１０−９〜７×１０−１２の範囲のＫＤを有して非常に高い親和性であることを明らかにする。
【０２００】
結論。
いくつかの融合は、ヒトＴＮＦで免疫化されるヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有するハイブリッドマウスからの脾細胞を利用して行われる。ＩｇＧ１κアイソタイプのいくつかの完全ヒトＴＮＦ反応性ＩｇＧモノクローナル抗体のセットを生成する。完全ヒト抗ＴＮＦ抗体を更に特徴付けする。生成された抗体のうちのいくつかは、１×１０９〜９×１０１２の親和性定数を有する。これらの完全ヒトモノクローナル抗体の予期せぬ高親和性により、それらはＴＮＦ依存疾患、病態又は関連状態における治療用途に好適なものとなる。
【０２０１】
実施例３：ヒトＴＮＦαに反応性のヒトＩｇＧモノクローナル抗体の生成。
要約。重鎖及び軽鎖両方のヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有する（ＣＢＡ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６Ｊ）Ｆ２ハイブリッドマウス（１〜４）を組換えヒトＴＮＦαで免疫化した。ＧｅｎＴＮＶと命名された１つの融合が、固定化された組換えヒトＴＮＦαに結合する完全ヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗体を８つ生み出した。特定直後、８つの細胞株は、更に特徴付けするためにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに譲渡された。これらＭａｂは配列が完全にヒトであるため、それらはヒトにおけるｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）よりも免疫原性が低いと予想される。
【０２０２】
略語。ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン、ＣＯ２−二酸化炭素、ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド、ＥＩＡ−酵素イムノアッセイ、ＦＢＳ−ウシ胎児血清、Ｈ２Ｏ２−過酸化水素、ＨＣ−重鎖、ＨＲＰ−西洋わさびペルオキシダーゼ、ＩＤ−皮内（interadermal）、Ｉｇ−免疫グロブリン、ＴＮＦ−組織壊死因子α、ＩＰ−腹腔内、ＩＶ−静脈内、Ｍａｂ−モノクローナル抗体、ＯＤ−光学密度、ＯＰＤ−ｏフェニレンジアミン二塩酸塩、ＰＥＧ−ポリエチレングリコール、ＰＳＡ−ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、ＲＴ−室温、ＳＱ−皮下、ＴＮＦα−腫瘍壊死因子α、ｖ／ｖ−単位容量あたりの容量、ｗ／ｖ−単位容量あたりの重量。
【０２０３】
序論。ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを利用して、組換えヒトＴＮＦαに特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を生成した。ｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）は、血清半減期が増加し、免疫原性に関する副作用が減少する利益を有して、ＴＮＦα媒介性疾患に関与する炎症性プロセスを治療的に阻害するために使用されるため、これらの固有の抗体を使用することができると期待される。
【０２０４】
材料及び方法。
動物ヒト免疫グロブリンを発現するが、マウスＩｇＭ又はＩｇκを発現しないトランスジェニックマウスは、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより開発されてきた。これらのマウスは、Ｖ（Ｄ）Ｊ結合、重鎖クラススイッチ及び体細胞突然変異を受けて抗原特異的ヒト免疫グロブリン（１）のレパートリーを生成する、機能性ヒト抗体導入遺伝子を含有する。軽鎖導入遺伝子は、部分的に、生殖系列ヒトＶκ遺伝子座のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンに由来する。いくつかのＶＨ遺伝子に加えて、重鎖（ＨＣ）導入遺伝子は、ヒトμ及びヒトγ１（２）、並びに／又はγ３定常領域の両方をコード化する。本明細書に記載されるモノクローナル抗体を生成するための免疫化及び融合プロセスにおいて、ＨＣｏ１２／ＫＣｏ５遺伝子型系統由来のマウスを使用した。
【０２０５】
ヒトＴＮＦαの精製。セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結されたＴＮＦα受容体−Ｆｃ融合タンパク質（ｐ５５−ｓｆ２）（５）を充填したカラムを使用して、アフィニティクロマトグラフィーにより、ヒトＴＮＦαを、Ｃ２３７Ａ細胞からの組織培養上清から精製した。細胞上清を、その容量の９分の１の１０ｘ  ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）と混合し、４ｍＬ／分で４℃でカラムを通過させた。次に、ＰＢＳでカラムを洗浄し、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５でＴＮＦαを溶出し、２ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５で中和した。精製されたＴＮＦαは、１０ｍＭトリス、０．１２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５に緩衝剤交換され、０．２ｕｍのシリンジフィルタを通して濾過された。
【０２０６】
免疫化。約１６週齢の雌のＧｅｎＰｈａｒｍマウスを、０、１２及び２８日目に等量のＴｉｔｅｒｍａｘアジュバントで乳化した合計１００μｇのＴＮＦα（ロットＪＧ１０２２９８又はＪＧ１０２０９８）で、ＩＰ（２００μＬ）及びＩＤ（尾の付け根にて１００μＬ）により免疫化した。抗凝固薬なしで２１及び３５日目に眼窩後方穿刺によりマウスを出血させた。血液を室温で１時間凝固させ、血清を回収し、ＴＮＦα固相ＥＩＡアッセイを使用して滴定した。２８日目の注射後、マウスを７週間休ませた後に、ＧｅｎＴＮＶと命名された融合を行った。その後、ＴＮＦαに対して１：１６０の特定のヒトＩｇＧ力価を有するマウスに、１００μＬの生理学的生理食塩水で希釈した５０μｇのＴＮＦαの最終ＩＶブースター注射を与えた。３日後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、脾臓を無菌的に除去し、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（ＰＳＡ）を含有する、１０ｍＬの冷リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬した。ＰＳＡ−ＰＢＳで脾臓を無菌灌流することにより、脾細胞を採取した。細胞を冷ＰＳＡ−ＰＢＳ中で１回洗浄し、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器を使用して計数し、２５ｍＭへぺスを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁した。
【０２０７】
細胞株。Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＢＳ）グループは、９７年５月１４日に、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ’ｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔグループから非分泌マウス骨髄腫融合パートナー６５３を受け取った。細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌａｂｓ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）で補充したＲＰＭＩ培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で拡張し、９５％ＦＢＳ及び５％  ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中で凍結保存した後、ＣＢＳの蒸気相液体窒素冷凍庫に保管した。細胞バンクは無菌であり（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ）、マイコプラズマ（Ｂｉｏｎｉｑｕｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）がなかった。細胞は融合まで対数増殖期培養物内で維持された。融合前に、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、トリパンブルー染料排除により生存率を決定した（９５％超）。
【０２０８】
ヒトＴＮＦαは、組換え細胞株により生成され、Ｃ２３７Ａと命名され、ＣｅｎｔｏｃｏｒのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙで生成された。細胞株を、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌａｂｓ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）及び０．５：ｇ／ｍＬのマイコフェノール酸で補充したＩＭＤＭ培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で拡張し、９５％  ＦＢＳ及び５％  ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中で凍結保存した後、ＣＢＳ（１３）の蒸気相液体窒素冷凍庫に保管した。細胞バンクは無菌であり（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ）、マイコプラズマ（Ｂｉｏｎｉｑｕｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）がなかった。
【０２０９】
細胞融合。細胞融合は、１：１の比率の６５３マウス骨髄腫細胞及びマウス生脾臓細胞を使用して行った。簡潔に、脾臓細胞及び骨髄腫細胞を一緒にペレット化した。３０秒間かけてペレットを３７℃でゆっくり１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ／ＰＢＳ溶液（ＰＥＧ分子量１，４５０ｇ／モル、Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。１分かけて１０．５ｍＬのＲＰＭＩ培地（添加剤なし）（ＪＲＨ）（３７℃）をゆっくり添加することにより、融合を停止させた。融合細胞を５分間７５０ｒｐｍで遠心分離した。その後、細胞をＨＡＴ培地（１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２．５％  Ｏｒｉｇｅｎ培養サプリメント（Ｆｉｓｈｅｒ）、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１％  ６５３調整ＲＰＭＩ培地、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジンを含有するＲＰＭＩ／ＨＥＰＥＳ培地）に再懸濁した後、５つの９６ウェル平底組織培養プレートを２００μＬ／ウェルで平板培養した。次に、７〜１０日間、５％  ＣＯ２及び９５％空気を含有する加湿した３７℃のインキュベータにプレートを配置した。
【０２１０】
マウス血清におけるヒトＩｇＧ抗ＴＮＦα抗体の検出。固相ＥＩＡを使用して、ヒトＴＮＦαに特異的なヒトＩｇＧ抗体についてマウス血清をスクリーニングした。簡潔に、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのＴＮＦαで一晩プレートをコーティングした。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する０．１５Ｍ生理食塩水で洗浄した後、ウェルをＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２００μＬ／ウェルで、室温で１時間遮断した。プレートは、直ちに使用するか、又は後に使用するために−２０℃で凍結されるかのいずれかであった。マウス血清を、５０μＬ／ウェルで、室温で１時間、２倍階段希釈法で、ヒトＴＮＦαコーティングされたプレート上でインキュベートした。プレートを洗浄した後、１％  ＢＳＡ−ＰＢＳ中に１：３０，０００で希釈したＦｃ特異的（Ａｃｃｕｒａｔｅ）の５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧで、室温で１時間プローブした。プレートを再度洗浄し、１００μＬ／ウェルのクエン酸塩−リン酸塩基質溶液（０．１Ｍクエン酸及び０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．０１％  Ｈ２Ｏ２及び１ｍｇ／ｍＬ  ＯＰＤ）を１５分かけて室温で添加した。次いで、２５μＬ／ウェルで反応停止溶液（４Ｎ硫酸）を添加し、自動プレート分光光度計を使用して４９０ｎｍでＯＤを読み取った。
【０２１１】
ハイブリドーマ上清における完全ヒト免疫グロブリンの検出。ＧｅｎＰｈａｒｍマウスは、マウス及びヒト免疫グロブリン鎖の両方を生成することができるため、２つの別個のＥＩＡアッセイを使用して、ヒト軽鎖及びヒト重鎖の両方の存在について成長陽性ハイブリドーマクローンを試験した。プレートを上述のようにコーティングし、未希釈のハイブリドーマ上清を３７℃で１時間、プレート上でインキュベートした。プレートを洗浄し、３７℃で１時間、１％  ＢＳＡ−ＨＢＳＳ中で１：１０，０００に希釈したＨＲＰ抱合ヤギ抗ヒトκ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）抗体、又は１％  ＢＳＡ−ＨＢＳＳ中で１：３０，０００に希釈したＨＲＰ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体のいずれかでプローブした。次に、上述のように、プレートを基質溶液とともにインキュベートした。抗ヒトκ及び抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＥＩＡ形式の両方で陽性シグナルをもたらさなかったハイブリドーマクローンは廃棄された。
【０２１２】
アイソタイプ。抗体のアイソタイプの決定は、特定の滴定に対するマウス免疫血清をスクリーニングするために使用されたものと類似の形式のＥＩＡを使用して達成した。４℃で一晩、炭酸ナトリウム緩衝剤中１０：ｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）でＥＩＡプレートをコーティングし、上述のように遮断した。２４ウェル培養物からの純粋な上清を、室温で１時間、プレート上でインキュベートした。プレートを洗浄し、１％  ＢＳＡ−ＰＢＳ中に１：４０００で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）で、室温で１時間プローブした。プレートを再度洗浄し、上述のように基質溶液とともにインキュベートした。
【０２１３】
結果及び考察。完全ヒト抗ヒトＴＮＦαモノクローナル抗体の生成。組換えヒトＴＮＦαタンパク質で免疫化されたＧｅｎＰｈａｒｍマウスから、ＧｅｎＴＮＶと命名された融合を１回行った。この融合から、１９６の成長陽性ハイブリッドがスクリーニングされた。ヒトＴＮＦαと反応性の完全ヒトＩｇＧ抗体を分泌した８つのハイブリドーマ細胞株を特定した。これらの８つの細胞株はそれぞれ、ヒトＩｇＧ１κアイソタイプの免疫グロブリンを分泌し、限界希釈により全てを２回サブクローニングして、安定した細胞株を得た（９０％超均質）。細胞株名及びそれぞれのＣコード表記を表１に列挙する。細胞株の各々は、液体窒素中に保管された１２−バイアル研究細胞バンクにおいて凍結された。
【０２１４】
８つの細胞株のそれぞれの２４ウェル培養皿のウェルから回収した親細胞は、トランスフェクション及び更なる特徴付けのために、１９９９年２月１８日にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙグループに引き渡された。
【０２１５】
【表２】
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【０２１６】
結論。
ＧｅｎＴＮＶ融合は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒで調製された組換えヒトＴＮＦαで免疫化されたヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有するハイブリッドマウスからの脾細胞を利用して行われた。ＩｇＧ１κアイソタイプの８つの完全ヒトＴＮＦα反応性ＩｇＧモノクローナル抗体を生成した。更なる特徴付け及び開発のために、親細胞株をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙグループに移した。これらの新しいヒト抗体のうちの１つは、Ｒｅｍｉｃａｄｅと比較して、免疫原性及びアレルギー型合併症が減少する潜在的な利益を有して、抗炎症に有用である可能性がある。
【０２１７】
参考文献
Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９〜５９１（１９９３）。
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Ｓｃａｌｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ７：７５９〜７７０（１９９５）。
【０２１８】
実施例４：ヒト抗ＴＮＦα抗体を発現する細胞株のクローニング及び調製。
要約。ＴＮＶ表記の８つのヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルは、明らかに高結合活性で固定化されたヒトＴＮＦαに結合することが認められた。８つのｍＡｂのうちの７つは、組換えＴＮＦ受容体へのヒトＴＮＦαの結合を効率的に遮断することを示した。７つのｍＡｂをコード化するＤＮＡの配列分析は、全てのｍＡｂがヒトＶ領域を有していることを確認した。ＤＮＡ配列は、３対のｍＡｂが互いに同一であり、そのため８つのｍＡｂの元のパネルがＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６で表される４つの別個のｍＡｂのみを含有していることも明らかにした。ｍＡｂの推定アミノ酸配列の分析及びインビトロＴＮＦα中和データの結果に基づいて、ｍＡｂ  ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４を更なる研究のために選択した。
【０２１９】
ＴＮＶ１４８重鎖の位置７５（フレームワーク３）のプロリン残基がデータベース検索中同じサブグループの他のヒト抗体のその位置に見られなかったため、それを既知の生殖系列フレームワークｅ配列と一致させるために、部位特異的ＤＮＡ突然変異誘発を行って、その位置にセリン残基をコード化した。セリン修飾ｍＡｂはＴＮＶ１４８Ｂと表記された。ＴＮＶ１４８Ｂ及びＴＮＶ１４の重鎖及び軽鎖可変領域をコード化するＰＣＲ増幅ＤＮＡを、別のヒトｍＡｂ（１２Ｂ７５）の最近クローニングされた重鎖及び軽鎖遺伝子に基づいた（国際公開第０２／１２５００号として公開された、ＩＬ−１２  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓと題される、２０００年１０月７日出願の米国特許出願第６０／２３６，８２７号、参照により全体が本明細書に組み込まれる）、新しく調製した発現ベクター内にクローニングした。
【０２２０】
Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）細胞又はＳｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）マウス骨髄腫細胞を、それぞれの重鎖及び軽鎖発現プラスミドでトランスフェクトし、高レベルの組換えＴＮＶ１４８Ｂ及びＴＮＶ１４（ｒＴＮＶ１４８Ｂ及びｒＴＮＶ１４）ｍＡｂを生成する細胞株について２回のサブクローニングによりスクリーニングした。経時的なｍＡｂ生成の成長曲線及び安定性の評価は、６５３トランスフェクタントクローンＣ４６６Ｄ及びＣ４６６Ｃが使用済培養物において安定して約１２５：ｇ／ｍｌのｒＴＮＶ１４８Ｂ  ｍＡｂを生成し、一方Ｓｐ２／０トランスフェクタント１．７３−１２−１２２（Ｃ４６７Ａ）が使用済培養物において安定して約２５：ｇ／ｍｌのｒＴＮＶ１４８Ｂ  ｍＡｂを生成したことを示した。同様の分析が、Ｓｐ２／０トランスフェクタントクローンＣ４７６Ａが使用済培養物において１８：ｇ／ｍｌのｒＴＮＶ１４を生成したことを示した。
【０２２１】
序論。ヒトＴＮＦα免疫化ＧｅｎＰｈａｒｍ／Ｍｅｄａｒｅｘマウス（ＨＣｏ１２／ＫＣｏ５遺伝子型）由来の８つのｍＡｂのパネルは、ヒトＴＮＦαに結合しかつ完全ヒトＩｇＧ１κアイソタイプを有することを前に示した。単純な結合アッセイを使用して、ＴＮＦαが組換えＴＮＦ受容体に結合するのを遮断する能力を評価することにより、本発明の例示的なｍＡｂがＴＮＦα中和活性を有する可能性があるかどうかを決定した。これらの結果、ＤＮＡ配列結果、及びｍＡｂのいくつかのインビトロ特徴付けに基づいて、更に特徴付けされるｍＡｂとしてＴＮＶ１４８が選択された。
【０２２２】
ＴＮＶ１４８  ｍＡｂをコード化するＤＮＡ配列をクローニングし、好適な定常領域をコード化する遺伝子発現ベクター内に合うように修飾し、十分に特徴付けされた６５３及びＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞内に導入し、結果として得られたトランスフェクトされた細胞株を、元のハイブリドーマ細胞株の４０倍のｍＡｂを生成するサブクローンが特定されるまでスクリーニングした。
【０２２３】
材料及び方法。
試薬及び細胞。ＴＲＩＺＯＬ試薬はＧｉｂｃｏ  ＢＲＬから購入した。プロテイナーゼＫはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから得た。逆転写酵素はＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から得た。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ又はＧｉｂｃｏ  ＢＲＬのいずれかから得た。制限酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔはＱｉａｇｅｎから得た。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＫｉｔはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した。Ｗｉｚａｒｄプラスミドミニプレップキット及びＲＮａｓｉｎはＰｒｏｍｅｇａからであった。ＯｐｔｉｐｌａｔｅｓはＰａｃｋａｒｄから得た。１２５ＩｏｄｉｎｅはＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。カスタムオリゴヌクレオチドはＫｅｙｓｔｏｎｅ／Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。この作業で使用したオリゴヌクレオチドの名称、識別番号、及び配列を表２に示す。
【０２２４】
表２．ＴＮＶ  ｍＡｂ遺伝子をクローニング、工学処理、又は配列決定するために使用されたオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチド５’１４ｓ及びＨｕＨ−Ｊ６によりコード化されるアミノ酸を配列の上に示す。「Ｍ」アミノ酸残基は翻訳開始コドンを表す。オリゴヌクレオチド５’１４ｓ及びＨｕＨ−Ｊ６の下線付き配列は、それぞれ、ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩ制限部位を示す。ＨｕＨ−Ｊ６の斜線はエクソン／イントロン境界に対応する。配列がマイナス鎖に対応するオリゴヌクレオチドは、３’−５’配向で書かれていることに留意する。
【０２２５】
【表３】
2019509988.tif 000004
【０２２６】
６５３マウス骨髄腫細胞の凍結バイアルを１つ得た。バイアルをその日に解凍し、Ｔフラスコ中のＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、及び２ｍＭグルタミン（培地）中で拡張させた。これらの細胞は、本明細書に記載される抗ＴＮＦ  ＤＮＡで２〜３週間後にトランスフェクトされるまで、連続培養において維持された。解凍した５日後に培養物のいくつかを採取し、遠心分離によりペレット化し、９５％  ＦＢＳ、５％  ＤＭＳＯに再懸濁し、３０のバイアルに等分し、凍結し、後に使用するために保管した。同様に、Ｓｐ２／０マウス骨髄腫細胞の凍結バイアルを１つ得た。バイアルを解凍し、上述のように新しい凍結物（freeze-down）を調製し、凍結バイアルをＣＢＣの冷凍庫ボックスＡＡ及びＡＢ内で保管した。これらの細胞を解凍し、本明細書に記載される全てのＳｐ２／０トランスフェクションに使用した。
【０２２７】
受容体へのＴＮＦの結合の阻害のためのアッセイ。ＴＮＶ  ｍＡｂを含有するハイブリドーマ細胞上清を使用して、ｍＡｂが組換えＴＮＦ受容体融合タンパク質ｐ５５−ｓｆ２への１２５Ｉ標識ＴＮＦαの結合を遮断する能力についてアッセイした（Ｓｃａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ７：７５９〜７７０）。３７℃で１時間インキュベートする間に、ＰＢＳ中０．５：ｇ／ｍｌで５０：ｌのｐ５５−ｓｆ２をＯｐｔｉｐｌａｔｅｓに添加してウェルをコーティングした。ＰＢＳ／０．１％  ＢＳＡを希釈剤として使用して、８つのＴＮＶ細胞上清の系列希釈を、９６ウェル丸底プレートにおいて調製した。抗ＩＬ−１８  ｍＡｂを含有する細胞上清が陰性対照として含まれ、ｃＡ２（抗ＴＮＦキメラ抗体、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、米国特許第５，７７０，１９８号、参照により全体が本明細書に組み込まれる）でスパイクされた同じ抗ＩＬ−１８上清が陽性対照として含まれた。最終ＴＮＦα濃度が５ｎｇ／ｍｌとなるように、１２５Ｉ標識ＴＮＦα（５８：Ｃｉ／：ｇ，Ｄ．Ｓｈｅａｌｙ）を１００：ｌの細胞上清に添加した。混合物を室温で１時間プレインキュベートした。コーティングされたＯｐｔｉｐｌａｔｅｓを洗浄して未結合のｐ５５−ｓｆ２を除去し、５０：ｌの１２５Ｉ−ＴＮＦα／細胞上清混合物をＯｐｔｉｐｌａｔｅｓに移した。室温で２時間後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回、Ｏｐｔｉｐｌａｔｅｓを洗浄した。１００：ｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０を添加し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  γ計数器を使用して、結合したｃｐｍを決定した。
【０２２８】
Ｖ遺伝子の増幅及びＤＮＡ配列分析。ＲＮＡの調製のために、ハイブリドーマ細胞をＰＢＳで１回洗浄した後にＴＲＩＺＯＬ試薬を添加した。７×１０６〜１．７×１０７の細胞を１ｍｌのＴＲＩＺＯＬに再懸濁した。２００μｌのクロロホルムの添加後に管を激しく振った。試料を４℃で１０分間遠心分離した。水相を新しいｍｉｃｒｏｆｕｇｅ管に移し、等量のイソプロパノールを添加した。管を激しく振り、室温で１０分間インキュベートした。次に、試料を４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを１ｍｌの７０％エタノールで１回洗浄し、真空乾燥機で短時間乾燥させた。ＲＮＡペレットを４０μｌのＤＥＰＣ処理水で再懸濁した。ＲＮＡ調製物の品質は、１％アガロースゲル中で０．５μｌを分画することによって決定された。使用するまで、ＲＮＡを−８０℃の冷凍庫に保管した。
【０２２９】
重鎖及び軽鎖のｃＤＮＡを調製するために、１１．５μｌの容量に３μｌのＲＮＡ及び１μｇのオリゴヌクレオチド１１９（重鎖）又はオリゴヌクレオチド１１７（軽鎖）のいずれか（表１を参照のこと）を含む混合物を調製した。この混合物を水浴中で７０℃で１０分間インキュベートした後、氷上で１０分間冷却した。２．５μｌの１０×逆転写酵素緩衝剤、１０μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌの逆転写酵素（２０単位）、及び０．４μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１単位）から構成される別個の混合物を調製した。１３．５μｌのこの混合物を、１１．５μｌの冷ＲＮＡ／オリゴヌクレオチド混合物に添加し、反応物を４２℃で４０分間インキュベートした。その後、使用するまでｃＤＮＡ合成反応物を−２０℃の冷凍庫に保管した。
【０２３０】
未精製の重鎖及び軽鎖のｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、可変領域コード配列をＰＣＲ増幅した。重鎖ＤＮＡの増幅をプライムする能力について、５つのオリゴヌクレオチド対（３６６／３５４、３６７／３５４、３６８／３５４、３６９／３５４、及び３７０／３５４、表１）を同時に試験した。軽鎖ＤＮＡの増幅をプライムする能力について、２つのオリゴヌクレオチド対（３６２／２０８及び３６３／２０８）を同時に試験した。総容量５０μｌにおいて２単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（商標）高忠実度（ＨＩＦＩ）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲ反応を行った。各反応物は、２μｌのｃＤＮＡ反応物、１０ピコモルの各オリゴヌクレオチド、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、５μｌの１０ＸＨＩＦＩ緩衝剤、及び２ｍＭの硫酸マグネシウムを含んでいた。熱サイクラープログラムは、９５℃で５分間、続いて（９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、６８℃で１．５分間）を３０サイクルであった。その後、６８℃で１０分間の最終インキュベーションが行われた。
【０２３１】
直接ＤＮＡ配列決定のためのＰＣＲ生成物を調製するために、製造業者のプロトコルに従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してそれらを精製した。５０μｌの減菌水を使用してスピンカラムからＤＮＡを溶出させた後、真空乾燥機を使用して１０μｌの容量まで乾燥させた。次に、総容量２０μｌの、１μｌの精製されたＰＣＲ生成物、１０μＭオリゴヌクレオチドプライマー、４μｌのＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ｒｅａｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ、及び１４μｌの減菌水でＤＮＡ配列決定反応物を設定した。オリゴヌクレオチド対３６７／３５４で作製された重鎖ＰＣＲ生成物は、オリゴヌクレオチドプライマー１５９及び３６０を用いて配列決定された。オリゴヌクレオチド対３６３／２０８で作製された軽鎖ＰＣＲ生成物は、オリゴヌクレオチド３４及び１６３を用いて配列決定された。配列決定の熱サイクラープログラムは、２５サイクルの（９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、６０℃で４分間）、続いて４℃で一晩であった。反応生成物は、ポリアクリルアミドゲルを介して分画され、ＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡシーケンサを使用して検出された。
【０２３２】
アミノ酸を変更するための部位特異的変異誘発。ＴＮＶ１４８  ｍＡｂにおいてＰｒｏ７５をセリン残基に置き換えるために、ＴＮＶ１４８重鎖可変領域ＤＮＡ配列の単一ヌクレオチドを変更した。相補的オリゴヌクレオチド３９９及び４００（表１）を設計し、製造業者により説明されるように、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発法を使用して、この変更を起こさせた。１５％ポリアクリルアミドゲルにより２つのオリゴヌクレオチドを最初に分画し、主要バンドを精製した。１０ｎｇ又は５０ｎｇのいずれかのＴＮＶ１４８重鎖プラスミドテンプレート（ｐ１７５３）、５μｌの１０Ｘ反応緩衝剤、１μｌのｄＮＴＰミックス、１２５ｎｇのプライマー３９９、１２５ｎｇのプライマー４００及び１μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、突然変異誘発反応物を調製した。減菌水を添加して総容量を５０μｌにした。次に、９５℃で３０秒間、その後、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、６４℃で１分間、そして６８℃で７分間のサイクルを１４回繰り返し、続いて３０℃で２分間（１サイクル）インキュベートするようにプログラムされた熱サイクラーにおいて、反応ミックスをインキュベートした。これらの反応物は、変異原性オリゴヌクレオチドを、その他の点では同一の新しく合成されたプラスミドに組み込むように設計された。元のＴＮＶ１４８プラスミドを除去するために、元のメチル化プラスミドのみを切断する１μｌのＤｐｎＩエンドヌクレアーゼを添加した後、試料を３７℃で１時間インキュベートした。次に、１μｌの反応物を使用して、標準的な熱ショック方法によりＥｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅスーパーコンピテント大腸菌を形質転換し、ＬＢ−アンピシリン寒天プレート上で平板培養した後に形質転換された細菌を特定した。製造業者により説明されるＷｉｚａｒｄ（商標）キットを使用して、プラスミドミニプレップを調製した。Ｗｉｚａｒｄ（商標）カラムから試料を溶出した後、エタノールでプラスミドＤＮＡを沈殿させてプラスミドＤＮＡを更に精製し、その後２０μｌの減菌水に再懸濁した。次に、ＤＮＡ配列分析を行って、所望の塩基変更を有するプラスミドクローンを特定し、他の塩基変更が不注意にＴＮＶ１４８コード配列内に導入されなかったことを確認した。セクション４．３に記載される同じパラメータを使用して、１μｌのプラスミドを、３μｌのＢｉｇＤｙｅミックス、１μｌのｐＵＣ１９フォワードプライマー、及び１０μｌの減菌水で調製されたサイクル配列決定反応物に供した。
【０２３３】
１２Ｂ７５遺伝子からの発現ベクターの構築。いくつかの組換えＤＮＡ工程を行って、前にクローニングされた１２Ｂ７５コード重鎖及び軽鎖遺伝子のゲノムコピーから、それぞれ、新しいヒトＩｇＧ１発現ベクター及び新しいヒトκ発現ベクターを調製した（これは、国際公開第０２／１２５００号として公開された、ＩＬ−１２  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓと題される、２０００年１０月７日出願の米国特許出願第６０／２３６，８２７号に開示され、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。最終ベクターは、任意の適切に設計されたＰＣＲ増幅可変領域で、既存の可変領域配列の簡単な一工程置換を可能にするように設計された。
【０２３４】
プラスミドｐ１５６０の１２Ｂ７５重鎖遺伝子を修飾するために、プロモーター及び可変領域を含有する６．８５ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐ１５６０からｐＵＣ１９に移してｐ１７４３を作製した。ｐ１５６０と比較してサイズがより小さいこのプラスミドは、製造業者のプロトコルに従い、翻訳開始部位のすぐ上流に固有のＢｓｉＷＩクローニング部位を導入するための、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発の使用（オリゴヌクレオチドＢｓｉＷＩ−１及びＢｓｉＷＩ−２を使用する）を可能にした。結果として得られたプラスミドはｐ１７４７と呼ばれた。ＢｓｔＢＩ部位を可変領域の３’端に導入するために、５’オリゴヌクレオチドプライマーはＳａｌＩ及びＢｓｔＢＩ部位で設計された。このプライマーをｐＵＣリバースプライマーとともに使用してｐ１７４７から２．７５ｋｂの断片を増幅した。次に、この断片を１２Ｂ７５可変領域の自然に生じるＳａｌＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングして戻し、それにより固有のＢｓｔＢ１部位を導入した。ｐ１７５０と表記される結果として得られた中間ベクターは、ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩ端を有する可変領域断片を受容することができた。定常領域も１２Ｂ７５遺伝子に由来する重鎖ベクターのバージョンを調製するために、ｐ１７５０のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩインサートは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の下流にＥｃｏＲＩ部位を有するためにｐＢＲ３２２に移された。次に、結果として得られたプラスミドｐ１７６８を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐ１５６０からｐＢＣに大きなＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片をクローニングすることによって得られたサブクローンであるｐ１７４４からの５．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ  ＥｃｏＲＩ断片にライゲートした。次に、結果として得られたプラスミドｐ１７８４は、ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩ端を有するＴＮＶ  Ａｂ  ｃＤＮＡ断片のベクターとして使用された。追加の作業は、１２Ｂ７５遺伝子からのＩｇＧ１定常領域を含み、１２Ｂ７５重鎖Ｊ−Ｃイントロンをどの程度含有するかによって互いに異なる、発現ベクターｐ１７８８及びｐ１７９８を調製するために行われた。
【０２３５】
プラスミドｐ１５５８の１２Ｂ７５軽鎖遺伝子を修飾するために、１２Ｂ７５プロモーター及び可変領域を含有する５．７ｋｂのＳａｌＩ／ＡｆｌＩＩ断片を、ｐ１５５８からプラスミドＬ２８のＸｈｏＩ／ＡｆｌＩＩ部位に移した。この新しいプラスミドｐ１７４５は、突然変異誘発工程のためのより小さなテンプレートを提供した。オリゴヌクレオチド（Ｃ３４０ｓａｌＩ及びＣ３４０ｓａｌ２）を使用して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発により、可変領域の５’端に固有のＳａｌＩ制限部位を導入した。結果として得られた中間ベクターｐ１７４６は、可変領域断片がクローニングされ得る固有のＳａｌＩ及びＡｆｌＩＩ制限部位を有していた。ｐ１７４６にクローニングされた任意の可変領域断片は、軽鎖遺伝子の３’半分と結合されることが好ましいであろう。この目的のために使用され得る１２Ｂ７５軽鎖遺伝子の３’半分からの制限断片を調製するために、オリゴヌクレオチドＢＡＨＮ−１及びＢＡＨＮ−２を互いにアニールして、制限部位ＢｓｉＷ１、ＡｆｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、及びＮｏｔＩを含有し、ＫｐｎＩ及びＳａｃＩ部位にライゲートされ得る端部を含有する二本鎖リンカーを形成した。このリンカーをｐＢＣのＫｐｎＩ部位とＳａｃＩ部位との間にクローニングして、プラスミドｐ１７５７を得た。ｐ１５５８をＡｆｌＩＩで消化した後、ＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化することにより生成された、１２Ｂ７５軽鎖定常領域を含有する７．１ｋｂの断片を、ｐ１７５７のＡｆｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩ部位との間にクローニングしてｐ１７６２を得た。この新しいプラスミドは、遺伝子の２つの半分をつなぐ、プロモーター及び可変領域を含有するＢｓｉＷＩ／ＡｆｌＩＩ断片が移され得るＢｓｉＷＩ及びＡｆｌＩＩの固有の部位を含有していた。
【０２３６】
発現プラスミドのｃＤＮＡクローニング及びアセンブリ。ＤＮＡ端部を更に埋めるために、全てのＲＴ−ＰＣＲ反応物（上記を参照のこと）をＫｌｅｎｏｗ酵素で処理した。重鎖ＰＣＲ断片を制限酵素ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩで消化した後、プラスミドＬ２８（１２Ｂ７５系中間ベクターｐ１７５０はまだ調製されていなかったため、Ｌ２８を使用した）のＢｓｉＷＩ部位とＢｓｔＢＩ部位との間にクローニングした。クローニングされたインサートのＤＮＡ配列分析は、結果として得られたコンストラクトが正しく、ＰＣＲ増幅中に誤差が導入されなかったことを示した。これらのＬ２８プラスミドコンストラクト（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、ＴＮＶ１４８Ｂ、及びＴＮＶ１９６）に割り当てられた識別番号を表３に示す。
【０２３７】
ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１４８Ｂ重鎖のＢｓｉＷＩ／ＢｓｔＢＩインサートは、Ｌ２８ベクターから新しく調製された中間ベクターｐ１７５０に移された。これらの中間プラスミドに割り当てられた識別番号を表２に示す。このクローニング工程及び後続の工程は、ＴＮＶ１５及びＴＮＶ１９６には行われなかった。次に、可変領域は、２つの異なるヒトＩｇＧ１発現ベクター内に移された。制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用して、可変領域を、Ｃｅｎｔｏｃｏｒの以前使用されたＩｇＧ１ベクターｐ１０４内に移した。Ｇｍ（ｆ＋）アロタイプのＩｇＧ１をコード化する、結果として得られた発現プラスミドは、ｐ１７８１（ＴＮＶ１４）、ｐ１７８２（ＴＮＶ１４８）、及びｐ１７８３（ＴＮＶ１４８Ｂ）と表記された（表２を参照のこと）。可変領域はまた、１２Ｂ７５（ＧｅｎＰｈａｒｍ）遺伝子に由来するＩｇＧ１定常領域の上流にもクローニングされた。Ｇ１ｍ（ｚ）アロタイプのＩｇＧ１をコード化するこれらの発現プラスミドも表３に列記される。
【０２３８】
表３．様々な重鎖及び軽鎖プラスミドのプラスミド識別番号。
Ｌ２８ベクター又はｐＢＣベクターは、初期のＡｂ  ｃＤＮＡクローンを表す。これらのプラスミドのインサートは、中間プラスミドを作製するために不完全な１２Ｂ７５系ベクターに移された。１つの追加の移動工程により、線形化された後に細胞に導入されたか、又は細胞のトランスフェクション前にｍＡｂ遺伝子インサートを精製するために使用されたかのいずれかであった最終発現プラスミドがもたらされた。ＮＤ＝実施せず。
【０２３９】
【表４】
2019509988.tif 000005
【０２４０】
軽鎖ＰＣＲ生成物を制限酵素ＳａｌＩ及びＳａｃＩＩで消化した後、プラスミドｐＢＣのＳａｌＩ部位とＳａｃＩＩ部位との間にクローニングした。１つのアミノ酸で異なる２つの異なる軽鎖バージョンは、ｐ１７４８及びｐ１７４９と表記された（表２）。ＤＮＡ配列分析により、これらのコンストラクトが正しい配列を有することが確認された。次に、ｐ１７４８及びｐ１７４９のＳａｌＩ／ＡｆｌＩＩ断片を、中間ベクターｐ１７４６のＳａｌＩ部位とＡｆｌＩＩ部位との間にクローニングして、それぞれｐ１７５５及びｐ１７５６を作製した。次に、軽鎖遺伝子のこれらの５’等分を、ＢｓｉＷＩ／ＡｆｌＩＩ断片をｐ１７５５及びｐ１７５６から新しく調製されたコンストラクトｐ１７６２に移すことにより遺伝子の３’等分に結合し、それぞれ最終発現プラスミドｐ１７７５及びｐ１７７６を作製した（表２）。
【０２４１】
細胞のトランスフェクション、スクリーニング及びサブクローニング。合計１５のマウス骨髄腫細胞のトランスフェクションを様々なＴＮＶ発現プラスミドで行った（結果及び考察セクションの表３を参照のこと）。これらのトランスフェクションは、（１）宿主細胞がＳｐ２／０又は６５３であるか、（２）重鎖定常領域がＣｅｎｔｏｃｏｒの以前のＩｇＧ１ベクター又は１２Ｂ７５重鎖定常領域でコード化されたか、（３）ｍＡｂがＴＮＶ１４８Ｂ、ＴＮＶ１４８、ＴＮＶ１４、又は新しいＨＣ／ＬＣの組み合わせであったか、（４）ＤＮＡが、線形化プラスミド又は精製されたＡｂ遺伝子インサートであるかどうか、及び（５）重鎖遺伝子における完全なＪ−Ｃイントロン配列が存在又は不在であるかどうかにより区別された。加えて、トランスフェクションのいくつかは、多数のクローンをスクリーニングすることができる可能性を増大させるために繰り返された。
【０２４２】
Ｓｐ２／０細胞及び６５３細胞は各々、前に記載された標準条件下で（Ｋｎｉｇｈｔ  ＤＭ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：１４４３〜１４５３）、エレクトロポレーションにより重鎖及び軽鎖ＤＮＡ（それぞれ８〜１２：ｇ）の混合物でトランスフェクトされた。トランスフェクション番号１、２、３、及び１６に関して、トランスフェクション前に制限酵素で消化することにより、適切な発現プラスミドが線形化された。例えば、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限酵素は、それぞれＴＮＶ１４８Ｂ重鎖プラスミドｐ１７８３及び軽鎖プラスミドｐ１７７６を線形化するために使用された。残りのトランスフェクションに関して、ＢａｍＨＩで重鎖プラスミドを、そしてＢｓｉＷＩ及びＮｏｔＩで軽鎖プラスミドを消化することにより、ｍＡｂ遺伝子のみを含有するＤＮＡインサートをプラスミドベクターから分離した。次に、アガロースゲル電気泳動及びＱｉｅｘ精製樹脂により、ｍＡｂ遺伝子インサートを精製した。精製された遺伝子インサートでトランスフェクトされた細胞は、選択マーカー源として、３〜５：ｇのＰｓｔＩ線形化ｐＳＶ２ｇｐｔプラスミド（ｐ１３）で同時にトランスフェクトされた。エレクトロポレーション後に、９６ウェル組織培養皿中のＩＭＤＭ、１５％  ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン中に細胞を播種し、５％  ＣＯ２のインキュベータにおいて、３７℃でインキュベートした。２日後、等量のＩＭＤＭ、５％  ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、２  Ｘ  ＭＨＸ選択物（１  Ｘ  ＭＨＸ＝０．５：ｇ／ｍｌのマイコフェノール酸、２．５：ｇ／ｍｌのヒポキサンチン、５０：ｇ／ｍｌのキサンチン）を添加し、コロニーが形成される間、更に２〜３週間プレートをインキュベートした。
【０２４３】
コロニーを有するウェルから回収された細胞上清を、記載されるようにＥＬＩＳＡによりヒトＩｇＧについてアッセイした。簡潔に言うと、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片でコーティングされた９６ウェルＥＩＡプレート内で、様々な希釈の細胞上清をインキュベートした後、アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）及び適切な色基質を使用して結合ヒトＩｇＧを検出した。細胞上清において測定された同じ精製されたｍＡｂを標準として使用した標準曲線は、上清中のヒトＩｇＧの定量化を可能にするために各ＥＩＡプレートに含まれた。最もヒトＩｇＧを生成しているように見えたそれらのコロニー中の細胞を、使用済培養物における更なる生成判断のために２４ウェルプレート内に継代し、生成が最も高い親クローンを特定した。
【０２４４】
生成が最も高い親クローンをサブクローニングして、生成がより高いサブクローンを特定し、より均質な細胞株を調製した。９６ウェル組織培養プレートに、ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１Ｘ  ＭＨＸの、ウェルあたり１つの細胞又はウェルあたり４つの細胞を播種し、コロニーが現れるまで、１２〜２０日間、５％  ＣＯ２インキュベータにおいて３７℃でインキュベートした。ウェルあたり１つのコロニーを含有するウェルから細胞上清を回収し、上述のようにＥＬＩＳＡにより分析した。選択したコロニーを２４ウェルプレートに継代し、培養物を消耗させた後、それらの上清におけるヒトＩｇＧレベルを定量化することにより、生成が最も高いサブクローンを特定した。このプロセスは、選択された初回のサブクローンを２回目のサブクローニングに供したときに繰り返された。２回目の最良のサブクローンを開発の細胞株として選択した。
【０２４５】
細胞サブクローンの特徴付け。２回目の最良のサブクローンを選択し、成長曲線を行って、ｍＡｂの生成レベル及び細胞成長特徴を評価した。Ｔ７５フラスコに、３０ｍｌのＩＭＤＭ、５％  ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、及び１Ｘ  ＭＨＸ（又は無血清培地）中１×１０５細胞／ｍｌで播種した。３００μｌのアリコートを２４時間間隔で取り出し、生細胞密度を測定した。生細胞数が１×１０５細胞／ｍｌ未満になるまで分析を継続した。回収された細胞上清のアリコートは、存在する抗体の濃度についてアッセイされた。標準としてｒＴＮＶ１４８Ｂ又はｒＴＮＶ１４  ＪＧ９２３９９を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＦｃでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上で試料を１時間インキュベートし、結合ｍＡｂを、１：１０００希釈のアルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で検出した。
【０２４６】
様々な量のＭＨＸ選択物の存在下での成長速度を比較する目的のため、２つの細胞株について異なる成長曲線分析も行われた。細胞株Ｃ４６６Ａ及びＣ４６６Ｂを、無ＭＨＸ培地（ＩＭＤＭ、５％  ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン）に解凍し、更に２日間培養した。その後、両細胞培養物を、ＭＨＸなし、０．２Ｘ  ＭＨＸ、又は１Ｘ  ＭＨＸ（１Ｘ  ＭＨＸ＝０．５：ｇ／ｍｌのマイコフェノール酸、２．５：ｇ／ｍｌのヒポキサンチン、５０：ｇ／ｍｌのキサンチン）のいずれかを含有する３つの培養物に分けた。１日後、新しいＴ７５フラスコに、１×１０５細胞／ｍｌの開始密度で培養物を播種し、細胞を１週間、２４時間間隔で計数した。ｍＡｂ生成のためのアリコートは回収されなかった。ＳＯＰ  ＰＤ３２．０２５に提供される式を使用して、これらの試料についての倍加時間を算出した。
【０２４７】
経時的なｍＡｂ生成の安定性を評価するために、追加の研究が行われた。ＭＨＸ選択物を有する、又は有さないのいずれかで、２４ウェルプレート中のＩＭＤＭ、５％  ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン中で培養物を成長させた。培養物がコンフルエントになったら、新しい培養物に分割し、その後、古い培養物は消耗させた。この時に、上清のアリコートを取り出し、４℃で保管した。５５〜７８日の期間にわたって、アリコートを取り出した。この期間の終了時に、上に概説するように、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＥＬＩＳＡにより、存在する抗体の量について上清を試験した。
【０２４８】
結果及び考察。
組換え受容体へのＴＮＦ結合の阻害。
ハイブリドーマ細胞上清に含有される８つのＴＮＶ  ｍＡｂが、受容体へのＴＮＦα結合を阻害することができるかどうかを決定するために、簡単な結合アッセイが行われた。ヒトＩｇＧの標準ＥＬＩＳＡ分析により、それぞれの細胞上清におけるＴＮＶ  ｍＡｂの濃度を最初に決定した。次に、組換えｐ５５ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質ｐ５５−ｓｆ２をＥＩＡプレート上にコーティングし、様々な量のＴＮＶ  ｍＡｂの存在下で、１２５Ｉ標識ＴＮＦαをｐ５５受容体に結合させた。図１に示すように、８つのＴＮＶ  ｍＡｂのうちの１つ（ＴＮＶ１２２）を除く全てが、ｐ５５受容体へのＴＮＦαの結合を効率的に遮断した。実際、ＴＮＶ  ｍＡｂは、陰性対照ハイブリドーマ上清にスパイクされたｃＡ２陽性対照ｍＡｂよりもＴＮＦα結合を阻害するのにより有効であるように見えた。これらの結果は、ＴＮＶ  ｍＡｂが細胞系アッセイ及びインビボでＴＮＦαの生物活性を遮断するであろう可能性が高く、したがって、追加の分析が必要であることを示すと解釈された。
【０２４９】
ＤＮＡ配列の分析。
ＲＮＡがヒトｍＡｂをコード化することの確認。
受容体結合アッセイにおいてＴＮＦα遮断活性を示した７つのＴＮＶ  ｍＡｂ（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ３２、ＴＮＶ８６、ＴＮＶ１１８、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６）を特徴付ける際の最初の工程として、これらのｍＡｂを生成する７つのハイブリドーマ細胞株から全ＲＮＡを単離した。次に、各ＲＮＡ試料を使用して、各ｍＡｂの完全なシグナル配列、完全な可変領域配列、及び定常領域配列の一部を含むヒト抗体重鎖又は軽鎖ｃＤＮＡを調製した。次に、これらのｃＤＮＡ生成物をＰＣＲ反応で増幅させ、最初に断片をクローニングすることなくＰＣＲ増幅ＤＮＡを直接配列決定した。配列決定した重鎖ｃＤＮＡは、マウスに存在する５つのヒト生殖系列遺伝子のうちの１つであるＤＰ−４６と＞９０％同一であった（図２）。同様に、配列決定した軽鎖ｃＤＮＡは、マウスに存在するヒト生殖系列遺伝子のうちの１つと１００％又は９８％のいずれかと同一であった（図３）。これらの配列結果は、ｃＤＮＡに転写され配列決定されたＲＮＡ分子がヒト抗体重鎖及びヒト抗体軽鎖をコード化したことを確認した。可変領域がシグナル配列コード配列の５’端にマッピングされるオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅されたため、シグナル配列の最初の数個のアミノ酸は元のＴＮＶ翻訳生成物の実際の配列ではない可能性があるが、組換えＴＮＶ  ｍＡｂの実際の配列を表すことに留意するべきである。
【０２５０】
固有の中和ｍＡｂ。
各ｍＡｂの重鎖及び軽鎖両方の可変領域全体のｃＤＮＡ配列の分析は、ＴＮＶ３２がＴＮＶ１５と同一であり、ＴＮＶ１１８がＴＮＶ１４と同一であり、ＴＮＶ８６がＴＮＶ１４８と同一であることを明らかにした。受容体結合アッセイの結果は、ＤＮＡ配列分析と一致していた、即ち、ＴＮＶ８６及びＴＮＶ１４８の両方が、ＴＮＦ結合の遮断においてＴＮＶ１１８及びＴＮＶ１４の両方よりも約４倍良好であった。したがって、後続の作業は、４つの固有のＴＮＶ  ｍＡｂである、ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６にのみ焦点を当てた。
【０２５１】
４つのｍＡｂの関連性
ＤＮＡ配列結果は、４つのＴＮＶ  ｍＡｂの重鎖をコード化する遺伝子が全て互いに高度に相同であり、全てが同じ生殖系列遺伝子ＤＰ−４６に由来するように見えることを明らかにした（図２）。加えて、重鎖ＣＤＲ３配列の各々は非常に類似し、同じ長さのものであるため、そしてそれらが全てＪ６エクソンを使用するため、それらは明らかに、単一のＶＤＪ遺伝子再配列事象から生じ、この後に各ｍＡｂを固有のものにする体細胞変化が続いた。ＤＮＡ配列分析は、４つのｍＡｂにおいて２つの別個の軽鎖遺伝子のみが存在したことを明らかにした（図３）。ＴＮＶ１４及びＴＮＶ１５における軽鎖可変領域コード配列は、互いに同一であり、ヒトκ鎖のＶｇ／３８  Ｋファミリーの代表的な生殖系列配列と同一である。ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６軽鎖コード配列は、互いに同一であるが、２つのヌクレオチド位置での生殖系列配列が異なる（図３）。
【０２５２】
４つのｍＡｂの推定アミノ酸配列は、実際のｍＡｂの関連性を明らかにした。４つのｍＡｂは、４つの別個の重鎖（図４）を含有するが、別個の軽鎖は２つのみである（図５）。ＴＮＶ  ｍＡｂ配列と生殖系列配列との間の差異は、大半はＣＤＲドメインに限定されていたが、ｍＡｂ重鎖のうちの３つもフレームワーク領域において生殖系列配列とは異なっていた（図４）。ＤＰ−４６生殖系列コードＡｂフレームワーク領域と比較して、ＴＮＶ１４は同一であり、ＴＮＶ１５は１つのアミノ酸が異なり、ＴＮＶ１４８は２つのアミノ酸が異なり、ＴＮＶ１９６は３つのアミノ酸が異なっていた。
【０２５３】
ｃＤＮＡのクローニング、部位特異的変異誘発、及び最終発現プラスミドのアセンブリ。ｃＤＮＡのクローニング。ＰＣＲ増幅可変領域のＤＮＡ配列に基づいて、クローニングされるコード配列を発現ベクター内に適応させる目的のため、新しいオリゴヌクレオチドは別のＰＣＲ増幅を行うように命じられた。重鎖の場合、この２回目のＰＣＲの生成物は制限酵素ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩで消化され、プラスミドベクターＬ２８（表２に示されるプラスミド識別番号）にクローニングされた。軽鎖の場合、２回目のＰＣＲ生成物はＳａｌＩ及びＡｆｌＩＩで消化され、プラスミドベクターｐＢＣにクローニングされた。次に、個々のクローンを配列決定して、それらの配列が、潜在的に異種の分子集団の各位置での最も豊富なヌクレオチドを明らかにするＰＣＲ生成物の直接配列決定から得られた前回の配列と同一であることを確認した。
【０２５４】
ＴＮＶ１４８を変更するための部位特異的変異誘発。ｍＡｂ  ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６は、ＴＮＦα生理活性の中和において、次に最良のｍＡｂ（ＴＮＶ１４）よりも４倍強力であることが一貫して観察された。しかしながら、上述のように、ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６重鎖フレームワーク配列は、生殖系列フレームワーク配列とは異なる。ＴＮＶ１４８重鎖配列と他のヒト抗体との比較は、多くの他のヒトｍＡｂがフレームワーク１の位置２８でＩｌｅ残基を含有し（成熟配列のみ計数）、一方でフレームワーク３の位置７５でのＰｒｏ残基は、その位置では稀なアミノ酸であったことを示した。
【０２５５】
ＴＮＶ１９６重鎖の類似の比較は、フレームワーク３で生殖系列配列とは異なる３つのアミノ酸がヒトｍＡｂにおいて希であり得ることを示唆した。これらの差異は、ヒトに投与された場合、ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６を免疫原性にする可能性があった。ＴＮＶ１４８は、関心のアミノ酸残基を１個しか有しておらず、この残基はＴＮＦα結合に重要ではないと考えられているため、部位特異的変異誘発技術を使用して、生殖系列Ｓｅｒ残基が位置７５でＰｒｏ残基の代わりにコード化されるように、ＴＮＶ１４８重鎖コード配列（プラスミドｐ１７５３の）の単一のヌクレオチドを変更した。結果として得られたプラスミドはｐ１７６０と呼ばれた（表２を参照のこと）。結果として得られた遺伝子及びｍＡｂは、それを元のＴＮＶ１４８遺伝子及びｍＡｂと区別するためにＴＮＶ１４８Ｂと呼ばれた（図５を参照のこと）。
【０２５６】
最終発現プラスミドのアセンブリ。ゲノム断片として前にクローニングされた１２Ｂ７５重鎖及び軽鎖遺伝子に基づいた新しい抗体発現ベクターを調製した。異なるＴＮＶ発現プラスミドが調製されたが（表２を参照のこと）、それぞれの場合において、５’フランキング配列、プロモーター、及びイントロンエンハンサーは、それぞれの１２Ｂ７５遺伝子に由来した。軽鎖発現プラスミドに関して、完全なＪ−Ｃイントロン、定常領域コード配列、及び３’フランキング配列も１２Ｂ７５の軽鎖遺伝子に由来した。最終生成細胞株（ｐ１７８１及びｐ１７８３、以下を参照のこと）をもたらした重鎖発現プラスミドに関して、ヒトＩｇＧ１定常領域コード配列は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒの前に使用された発現ベクター（ｐ１０４）に由来した。重要なことには、ここで報告される最終生成細胞株は、元のハイブリドーマ由来ＴＮＶ  ｍＡｂ（Ｇ１ｍ（ｚ））とは異なるアロタイプ（Ｇｍ（ｆ＋））のＴＮＶ  ｍＡｂを発現する。これは、ＧｅｎＰｈａｒｍマウスに由来する１２Ｂ７５重鎖遺伝子はＣＨ１ドメインのＣ末端部でＡｒｇ残基をコード化するが、ＣｅｎｔｏｃｏｒのＩｇＧ１発現ベクターｐ１０４はその位置でＬｙｓ残基をコード化するためである。Ｊ−Ｃイントロン、完全定常領域コード配列、及び３’フラランキング配列が１２Ｂ７５重鎖遺伝子に由来する他の重鎖発現プラスミド（例えば、ｐ１７８６、ｐ１７８８）が調製されたが、これらの遺伝子でトランスフェクトされた細胞株は、生成細胞株として選択されなかった。ベクターは、最終発現プラスミドをもたらすであろう後のＰＣＲ増幅Ｖ領域の一工程クローニングを可能にするように慎重に設計された。
【０２５７】
ＰＣＲ増幅可変領域ｃＤＮＡは、Ｌ２８又はｐＢＣベクターから、プロモーター領域及びＪ−Ｃイントロンの一部を提供する中間段階の１２Ｂ７５系ベクターに移された（プラスミド識別番号に関しては表２を参照のこと）。次に、抗体遺伝子の５’半分を含有する制限断片を、これらの中間段階のベクターから、それぞれの遺伝子の３’半分を提供する最終発現ベクターに移して、最終発現プラスミド（プラスミド識別番号に関しては表２を参照のこと）を形成した。
【０２５８】
細胞のトランスフェクション及びサブクローニング。発現プラスミドは、制限消化によって線形化されたか、又は各プラスミド中の抗体遺伝子インサートがプラスミド骨格鎖から精製されたかのいずれかであった。Ｓｐ２／０及び６５３マウス骨髄腫細胞は、エレクトロポレーションにより重鎖ＤＮＡ及び軽鎖ＤＮＡでトランスフェクトされた。１５の異なるトランスフェクションが行われ、そのほとんどはＡｂで規定されるように固有であり、遺伝子が線形化された全プラスミド又は精製された遺伝子インサート上にあるかどうかにかかわらずＡｂ遺伝子の特定の特徴であり、宿主細胞株であった（表５に要約される）。マイコフェノール酸に耐性のクローンからの細胞上清を、ヒトＩｇＧの存在についてＥＬＩＳＡによりアッセイし、精製されたｒＴＮＶ１４８Ｂを参照標準曲線として使用して定量化した。
【０２５９】
生成が最も高いｒＴＮＶ１４８Ｂ細胞株
ｒＴＮＶ１４８Ｂトランスフェクション２からの、生成が最高の６５３親株のうちの１０（使用済２４ウェル培養物において５〜１０：ｇ／ｍｌを生成）をサブクローニングして、生成がより高い細胞株についてスクリーニングし、より均質な細胞集団を調製した。親株２．３２０、２．３２０−１７、及び２．３２０−２０のサブクローンのうちの２つは、使用済２４ウェル培養物において約５０：ｇ／ｍｌを生成し、これは、それらの親株に対して５倍の増加であった。サブクローニングした株２．３２０−１７及び２．３２０−２０の２回目のサブクローニングがもたらした。
【０２６０】
各ｍＡｂをコード化する重鎖及び軽鎖プラスミドの識別番号を示す。精製されたｍＡｂ遺伝子インサートで行われたトランスフェクションの場合、ｇｐｔ選択マーカーの供給源としてプラスミドｐ１３（ｐＳＶ２ｇｐｔ）が含まれた。重鎖定常領域は、Ｒｅｍｉｃａｄｅをコード化するために使用された同じヒトＩｇＧ１発現ベクター（「旧」）又は１２Ｂ７５（ＧｅｎＰｈａｒｍ／Ｍｅｄａｒｅｘ）重鎖遺伝子内に含有される定常領域（「新規」）のいずれかによりコード化された。Ｈ１／Ｌ２は、ＴＮＶ１４重鎖及びＴＮＶ１４８軽鎖で構成される「新規」ｍＡｂを指す。プラスミドｐ１７８３及びｐ１８０１は、それらの重鎖遺伝子がＪ−Ｃイントロンをどの程度含有するかによってのみ異なる。細胞クローンの遺伝子名の最初の数字を定義するトランスフェクション番号は右側に示される。本明細書に記載されるｒＴＮＶ１４８Ｂ生成細胞株Ｃ４６６（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）及びＣ４６７Ａは、それぞれトランスフェクション番号２及び１に由来した。ｒＴＮＶ１４生成細胞株Ｃ４７６Ａはトランスフェクション番号３に由来した。
【０２６１】
【表５】
2019509988.tif 000006
【０２６２】
使用済の２４ウェル培養上清でのＥＬＩＳＡアッセイは、これらの２回目のサブクローンが全て９８〜１２４：ｇ／ｍｌを生成したことを示し、これは初回のサブクローンに対して少なくとも２倍の増加であった。これらの６５３細胞株は、表６に示されるように、Ｃコード表記が割り当てられた。
【０２６３】
ｒＴＮＶ１４８Ｂトランスフェクション１からの生成が最高のＳｐ２／０親株のうちの３つをサブクローニングした。親株１．７３の２回のサブクローニングは、使用済２４ウェル培養物において２５：ｇ／ｍｌを生成したクローンの特定につながった。このＳｐ２／０細胞株はＣ４６７Ａと表記された（表６）。
【０２６４】
生成が最も高いｒＴＮＶ１４細胞株
ｒＴＮＶ１４トランスフェクション３からの生成が最高のＳｐ２／０親株のうちの３つを１回サブクローニングした。サブクローン３．２７−１は、生成が１９：ｇ／ｍｌであり、使用済の２４ウェル培養物において最も高い生産体であることが分かった。この細胞株はＣ４７６Ａと表記された（表６）。
【０２６５】
表６．選択された生成細胞株及びそれらのＣコードの要約。
元のクローン名の最初の１桁は、細胞株がどのトランスフェクションに由来するかを示す。本明細書に報告されるＣコード細胞株の全てが制限酵素で線形化された重鎖及び軽鎖全プラスミドでのトランスフェクションに由来した。
【０２６６】
【表６】
2019509988.tif 000007
【０２６７】
サブクローニングされた細胞株の特徴付け
細胞株成長特徴をより慎重に特徴付けし、大規模でｍＡｂ生成レベルを決定するために、Ｔ７５培養物を使用して成長曲線分析を行った。結果は、細胞株の４つのＣ４６６シリーズの各々が１．０×１０６〜１．２５×１０６細胞／ｍｌのピーク細胞密度及び１１０〜１４０：ｇ／ｍｌの最大ｍＡｂ蓄積レベルに達したことを示した（図７）。対照的に、生成が最高のＳｐ２／０サブクローンＣ４６７Ａは、２．０×１０６細胞／ｍｌのピーク細胞密度及び２５：ｇ／ｍｌの最大ｍＡｂ蓄積レベルに達した（図７）。成長曲線分析は、ｒＴＮＶ１４生成細胞株Ｃ４７６Ａに対して行われなかった。
【０２６８】
更なる成長曲線分析を行って、異なる濃度のＭＨＸ選択物における成長速度を比較した。この比較は、ＭＨＸの不在下で培養されたＣ４６６細胞が、通常量のＭＨＸ（１Ｘ）で培養された同じ細胞よりも速く成長しているように思われる近年の観測によって促された。マイコフェノール酸などの化合物の細胞傷害性濃度は桁違いで測定される傾向にあるため、より低い濃度のＭＨＸを使用することにより、ｍＡｂ生成の安定性を犠牲にすることなく細胞の倍加時間を大幅に速くし得ることが可能であると考えられた。細胞株Ｃ４６６Ａ及びＣ４６６Ｂは、ＭＨＸなし、０．２Ｘ  ＭＨＸ、又は１Ｘ  ＭＨＸのいずれかで培養された。生細胞の計数は、７日間、２４時間間隔で行われた。結果により、ＭＨＸ濃度依存性細胞成長率が明らかになった（図８）。細胞株Ｃ４６６Ａは、１Ｘ  ＭＨＸにおいて２５．０時間の倍加時間を示したが、ＭＨＸなしではわずか２０．７時間の倍加時間を示した。同様に、細胞株Ｃ４６６Ｂは、１Ｘ  ＭＨＸにおいて３２．４時間の倍加時間を示したが、ＭＨＸなしではわずか２２．９時間の倍加時間を示した。重要なことには、０．２Ｘ  ＭＨＸにおける両細胞株の倍加時間は、１Ｘ  ＭＨＸよりもＭＨＸなしで観測されたものとより類似していた（図８）。この観測は、倍加時間が重要なパラメータであるバイオリアクターにおいて、増強された細胞性能がより少ないＭＨＸを使用することにより実現され得る可能性を示す。しかしながら、安定性試験結果（以下を参照のこと）は、細胞株Ｃ４６６ＤがＭＨＸの不在下でも少なくとも６０日間、ｒＴＮＶ１４８Ｂを安定して生成することが可能であることを示唆するが、安定性試験はまた、ＭＨＸの不在と比較して、細胞がＭＨＸの存在下で培養されたとき、より高いｍＡｂ生成レベルも示した。
【０２６９】
約６０日の期間にわたって様々な細胞株からのｍＡｂの生成を評価するために、ＭＨＸ選択物を含有する又は含有しない、いずれかの培養物で安定性試験を行った。細胞株の全てが高ｍＡｂ生成を維持したわけではなかった。培養のちょうど２週間後、クローンＣ４６６Ａの生成は研究開始時よりも約４５％少なかった。クローンＣ４６６Ｂからの生成も大幅に低下したように思われた。しかしながら、クローンＣ４６６Ｃ及びＣ４６６Ｄは、かなり安定した生成を維持し、Ｃ４６６Ｄは最も高い絶対生成レベルを示した（図９）。
【０２７０】
結論
ヒトＴＮＦαに対する８つのヒトｍＡｂの初期パネルから、タンパク質配列及びＴＮＦ中和効力を含むいくつかの基準に基づいて、ＴＮＶ１４８Ｂ並びにＴＮＶ１４が好ましいものとして選ばれた。１００：ｇ／ｍｌ超のｒＴＮＶ１４８Ｂ及び１９：ｇ／ｍｌ超のｒＴＮＶ１４を生成する細胞株を調製した。
【０２７１】
実施例５：単回ボーラス注射を使用した抗ＴＮＦ抗体及び対照を使用した関節炎マウスの研究
約４週齢のＴｇ１９７研究マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの本発明の抗ＴＮＦ抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８又はＴＮＶ１９６）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。
【０２７２】
結果：体重を投与前からの変化として分析したとき、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、研究を通してＤ−ＰＢＳ処置動物よりも一貫して高い体重増加を示した。この体重増加は、３〜７週目で有意であった。１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物も、研究の７週目に有意な体重増加を達成した。（図１０を参照のこと）。
【０２７３】
図１１Ａ〜Ｃは、関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、３週目から始まり、残りの研究の間中継続して（７週目）Ｄ−ＰＢＳ対照群よりも低かった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、Ｄ−ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目以降のＡＩにおいて有意な減少を示すことができなかった。各々を類似の用量のその他のものと比較したとき（１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４、１４８及び１９６と比較した１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２）、１０ｍｇ／ｋｇの処置群の間に有意差はなかった。１ｍｇ／ｋｇの処置群を比較したとき、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２よりも３、４及び７週で有意に低いＡＩを示した。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８も、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４処置群よりも３及び４週目で有意に低かった。ＴＮＶ１９６は研究の６週目までＡＩにおいて有意な減少を示したが（Ｄ−ＰＢＳ処置群と比較したとき）、ＴＮＶ１４８はこの研究の終了時に有意のままであった唯一の１ｍｇ／ｋｇ処置群であった。
【０２７４】
実施例６：複数ボーラス投与として抗ＴＮＦ抗体及び対照を使用した関節炎マウスの研究
約４週齢のＴｇ１９７研究マウスを体重に基づき８つの処置群のうちの１つに割り当て、対照品（Ｄ−ＰＢＳ）、又は３ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８）（０週目）の腹腔内ボーラス投与で処置した。注射は１、２、３及び４週目に全ての動物において繰り返された。群１〜６は、試験品の有効性に関して評価された。群７及び８の動物から得られた血清試料は、２、３及び４週目のＴＮＶ１４又はＴＮＶ１４８の免疫応答誘導及び薬物動態クリアランスに関して評価された。
【０２７５】
結果：体重を投与前からの変化として分析したとき、有意差は認められなかった。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、研究を通してＤ−ＰＢＳ処置動物よりも一貫して高い体重増加を示した。（図１２を参照のこと）。
【０２７６】
図１３Ａ〜Ｃは、関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、２週目から始まり、残りの研究の間中継続して（５週目）Ｄ−ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった。１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物及び３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物は、ｄ−ＰＢＳ対照群と比較したときに、研究を通して任意の時点でＡＩにおいて任意の有意な減少を達成することができなかった。３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は、ｄ−ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目から始まり、５週目まで継続する有意な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、研究の４及び５週目でより低い用量の両ｃＡ２（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）と比較したとき、ＡＩにおいて有意な減少を示し、また３〜５週目でＴＮＶ１４で処置した動物よりも有意に低かった。３ｍｇ／ｋｇの処置群のいずれかの間に有意差はなかったようだが、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物に関するＡＩは、ある時点で１０ｍｇ／ｋｇよりも有意に高く、一方ＴＮＶ１４８で処置した動物は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物と有意に異ならなかった。
【０２７７】
実施例７：単回腹腔内ボーラス投与として抗ＴＮＦ抗体及び対照を使用した関節炎マウスの研究
約４週齢のＴｇ１９７研究マウスを性別及び体重に基づき６つの処置群のうちの１つに割り当て、３ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇのいずれかの抗体（ｃＡ２又はＴＮＶ１４８）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。この研究は、Ｄ−ＰＢＳ及び１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２対照群を利用した。
【０２７８】
体重を投与前からの変化として分析したとき、全ての処置は似たような体重増加を達成した。３又は５ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８又は５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２のいずれかで処置した動物は、研究の早期（２及び３週目）に体重量が有意に増加した。ＴＮＶ１４８で処置した動物のみが後の時点において有意な体重増加を維持した。３及び５ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物はどちらも、７週目で有意を示し、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は注射の８週間後に尚も有意に上昇した。（図１４を参照のこと）。
【０２７９】
図１５は、関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。全ての処置群が初期の時点で多少の保護を示し、５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２及び５ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１〜３週目にＡＩにおいて有意な減少を示し、全ての処置群が２週目で有意な減少を示した。実験の後期に、５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は多少の保護を示し、４、６及び７週目で有意に減少した。低用量（３ｍｇ／ｋｇ）のｃＡ２及びＴＮＶ１４８は両方とも、６週目で有意な減少を示し、全ての処置群が７週目で有意な減少を示した。研究の終わりで（８週目）有意な減少を維持することができた処置群はなかった。任意の時点で処置群のいずれかの間（食塩水対照群は除く）に有意差はなかった。
【０２８０】
実施例８：抗ＴＮＦ抗体と修飾された抗ＴＮＦ抗体との間の単回腹腔内ボーラス投与として抗ＴＮＦ抗体及び対照を使用した関節炎マウスの研究
ＴＮＶ１４８（ハイブリドーマ細胞に由来する）及びｒＴＮＶ１４８Ｂ（トランスフェクトした細胞に由来する）の単回腹腔内投与の有効性を比較するために。約４週齢のＴｇ１９７研究マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）又は１ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４８、ｒＴＮＶ１４８Ｂ）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。
【０２８１】
体重を投与前からの変化として分析したとき、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、研究を通してＤ−ＰＢＳ処置動物よりも一貫して高い体重増加を示した。この体重増加は、１週目及び３〜８週目で有意であった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物も、研究の５、６、及び８週目に有意な体重増加を達成した。（図１６を参照のこと）。
【０２８２】
図１７は、関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、４週目から始まり、残りの研究の間中継続して（８週目）Ｄ−ＰＢＳ対照群よりも低かった。ＴＮＶ１４８で処置した群及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群は両方とも、４週目でＡＩにおける有意な減少を示した。以前の研究（Ｐ−０９９〜０１７）は、ＴＮＶ１４８が単回の１ｍｇ／ｋｇの腹腔内ボーラス後の関節炎指数の減少にわずかにより効果的であることを示したが、この研究では、両バージョンのＴＮＶ抗体で処置した群からのＡＩがわずかに高いことを示した。１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群（６週目を除く）は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２群と比較したとき、有意に増加せず、ＴＮＶ１４８で処置した群は、７及び８週目で有意に高かったが、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８及び１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８Ｂの間には研究の任意の時点でＡＩにおいて有意差はなかった。
【０２８３】
実施例９：１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の処置又は予防のための抗ＴＮＦ抗体
序論
スポンサー（Sponsor）は、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）での利益が第２ａ相の有効性及び安全性研究において、新たに診断されたＴ１Ｄ患者において確立され得るかどうかを決定するために、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の処置において皮下（ＳＣ）投与されるＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の開発計画を協議するための前ＩＮＤタイプＢ相談を要求している。新たに診断された集団におけるこの研究は、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）が、前Ｔ１Ｄ患者において内因性インスリン生成を安定させて疾患の進行を阻止又は遅延させる利益を有するかどうかを理解するための、開発プログラムにおける初期工程であろう。
【０２８４】
製品名及び申請番号
ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）
【０２８５】
化学名及び構造
ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）１重鎖アイソタイプを（Ｇ１ｍ［ｚ］アロタイプ）及びκ軽鎖アイソタイプを有するヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。ゴリムマブは、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する。ゴリムマブは、可溶性及び膜貫通形態の両方の腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に高い親和性で結合し、ＴＮＦα生理活性を阻害する。ゴリムマブは、解剖治療化学（Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（ＡＴＣ）分類法に従い、ＴＮＦα阻害剤に分類される（ＡＴＣコード：Ｌ０４ＡＢ０６）。
【０２８６】
ゴリムマブは、２０１５年１０月６日の時点で、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、及び強直性脊椎炎（ＡＳ）の処置のため、月に１回投与される５０ｍｇのＳＣ注射として、米国（ＵＳ）及び世界で合計８９ヵ国において、並びに潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の処置のため、０週目に２００ｍｇのＳＣ注射、その後２週目に１００ｍｇの導入レジメン、そしてその後４週間毎に１００ｍｇの維持療法として、６７ヵ国において、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）の商品名で承認されている。
【０２８７】
特に米国では、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）は、以下の適応症に承認されている：
●メトトレキサート（ＭＴＸ）との組み合わせで、中程度から重度の活動性ＲＡを有する成人患者の処置のため
●単独で又はＭＴＸとの組み合わせで、活動性ＰｓＡを有する成人患者の処置のため
●活動性ＡＳを有する成人患者の処置のため
●潰瘍性大腸炎を有する成人患者の処置のため
【０２８８】
剤形、投与経路、及び投与
スポンサーは、標的集団間で提案された用量を支持するために、初期の第２ａ相研究において２つの剤形を使用することを意図している。これらの２つの剤形は、以下に記載される。
【０２８９】
プレフィルドシリンジ
各５０ｍｇの単回投与プレフィルドガラスシリンジ（２７ゲージの１．３センチメートル（１／２インチ）の針）は、０．５ｍＬの溶液あたり５０ｍｇのＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）を収容する。
【０２９０】
ＶａｒｉｏＪｅｃｔ
ＶａｒｉｏＪｅｃｔとして知られる新しい小児提示が、体表面積（ＢＳＡ）によって投与される小児患者において変動−固定投与を提供する、複数の小児適応症を対象としたプラットホームデバイスとして、スポンサーにより開発されている。ＶａｒｉｏＪｅｃｔは、５ｍｇの増加分で１０ｍｇ〜４５ｍｇの用量を送達することができる手動インジェクタである。
【０２９１】
以下の仕様により、及び図において、更なる詳細が提供される。
【０２９２】
疾患背景
疾患の病因及び有病率
米国において、Ｔ１Ｄは小児期の最も流行している３つの慢性疾患のうちの１つであり、約３００万人がこの疾患を有する（Ｄａｎｅｍａｎ  ２００６，Ｓｔａｎｅｓｃｕ，Ｌｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。年間発生率は、２０歳未満のものにおいて、約２０症例／１００，０００／年で、小児及び青年で最も高く、新たな症例が年間ほぼ１５，０００を占める．（Ｍａａｈｓ，Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｓｔａｎｅｓｃｕ，Ｌｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。米国及び全世界において、Ｔ１Ｄの発生率は上昇しており、大半の領域で年間約３〜５％増加している（Ｄａｎｅｍａｎ  ２００６，Ｓｔａｎｅｓｃｕ，Ｌｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。米国では、２００１〜２００９年の間に、小児及び青年のＴ１Ｄの有病率は２３％上昇した（ＪＤＲＦ２０１３）。Ｔ１Ｄの診断は小児期の間に増加し、青年期にピークとなり、これらの０〜４、５〜９、１０〜１４及び１５〜１９歳の年率は、それぞれ、１４、２２、２６、及び１３症例／１００，０００である（Ｓｔａｎｅｓｃｕ，Ｌｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。比較すると、Ｔ１Ｄ率は、成人では非常に低く、最大わずか約８／１００，０００の発生率である（Ｍｏｌｂａｋ，Ｃｈｒｉｓｔａｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）。小児において、診断に至る臨床経過は、比較的劇症であり、症状（即ち、多渇症、多尿症、及び体重減少）は通常、診断のわずか数日から数週間前に現れ、一方成人において、経過は通常、より遅発性であり、軽度の症状が数ヶ月以上にわたって生じる。新規発症及び既存Ｔ１Ｄを有する小児は、糖尿病性ケトアシドーシス（ＤＫＡ）の重度の代謝異常を被ることが多く、その期間中、脳浮腫、ヘルニア、及び死のリスクが高い。
【０２９３】
過去４０年からのデータは、Ｔ１Ｄが膵臓β細胞に対する自己免疫攻撃に起因することを示している（Ｍｏｒｄｅｓ，Ｂｏｒｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ２００４，Ｈａｎ，Ｄｏｎｅｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。先天性及び適応性並びに細胞性及び体液性応答の前炎症性の組み合わせがＴ１Ｄの原因となる（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｈｅｒｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。他の自己免疫疾患と同様、Ｔ１Ｄは、糖尿病誘発性環境トリガに遭遇する、影響を受けやすい個体において生じると仮定される（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。多くのＨＬＡ−及びその他の免疫系関連遺伝子が、Ｔ１Ｄ感受性に関連している（ｖａｎ  Ｂｅｌｌｅ，Ｃｏｐｐｉｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。Ｔ１Ｄを有するものは、β細胞反応性Ｔ細胞を伴う中枢性及び末梢性寛容機構の両方に異常があるように思われる（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ２００４）。食事及び感染因子の両方が関連付けられていたが、いずれもＴ１Ｄと因果関係があるとは認められなかった。ある環境遭遇が、影響を受けやすい個体において、マクロファージ、樹状細胞、ＣＤ４、及びＣＤ８  Ｔ細胞、並びにＢ細胞の活性化、及び膵島への補充をもたらす炎症性応答を活性化すると仮定されている（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｈｅｒｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。炎症性サイトカイン及びβ細胞自己抗体を含む可溶性因子は、この応答に関与し、それを増幅し、その最終結果がβ細胞の末端破壊である。
【０２９４】
現在の処置パラダイム
現在、Ｔ１Ｄを有するものに利用可能な唯一の治療は、毎日の複数の皮下注射として、又は皮下ポンプを介する連続プラスパルスインスリンにより与えられなければならない外因性インスリンである。インスリン並びに多くの血糖チェックはＴ１Ｄを有するものには毎日必要であり、現在の血糖レベル、食事、及び運動のバランスを慎重に考慮して毎回インスリンを投与し、両方とも命にかかわる可能性がある高血糖と低血糖とのバランスを慎重に維持しなければならない。Ｔ１Ｄを有するものに利用可能な補助治療又は疾患修飾治療は存在せず、この疾患を発症するものの生活には外因性インスリンによる血糖管理が必要である。微小血管合併症の転帰に対する集中インスリン処置のプラスの効果は、画期的な研究であるＤｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｒｉａｌ（ＤＣＣＴ）により示され、このＤＣＣＴにおいて、集中処置コホートに登録した被験体（７０〜１２０ｍｇ／ｄＬの絶食時及び食事前血糖レベル、１８０ｍｇ／ｄＬの食事後血糖レベル、及び非糖尿病範囲のヘモグロビンＡ１ｃ［ＨｂＡ１ｃ；グリコシル化ヘモグロビン］を目標とする）は、従来の処置コホートに登録した被験体に対して、腎症、網膜症、及び神経障害の発症並びに／又は進行が減少した。
【０２９５】
しかしながら、旧世代のタイプのインスリン製剤と比較して、より良好な薬物動態及び薬物動力学的プロファイルを有する短期及び長期作用のインスリン類似体の過去数十年にわたる開発並びにインスリン送達デバイスの技術改善にも関わらず、多くの被験体は尚も推奨される標的である７％未満のＨｂＡ１ｃを達成することができない。Ｔ１ＤＭを有する３２０，０００超の被験体の血糖制御を比較する、欧州、北米、及び西オーストラリアの１９ヵ国からの地域及び国別登録簿からのデータを使用した近年の分析は、全体的に３０％未満の患者が７．５％未満のＨｂＡ１ｃを有していたことを示した（ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ２０１５）。Ｔ１ＤＭ処置に関連する制限は、低血糖、過剰なグルコース変動、及び体重増加の恐れを含む（Ｃｒｙｅｒ  ２００３，Ｌａｒｇｅｒ  ２００５）。
【０２９６】
報告された低血糖症の発生率は研究間でかなり変動し、症候性及び重度の低血糖の両方のより大きな発生率が被験体において観察された（Ｃｒｙｅｒ  １９８９）。更に、長期間にわたる連続的な血糖測定を使用した研究により、低血糖、特に夜間低血糖の頻度及び持続時間が以前考えられていたものよりも更に大きいことが概して分かった（Ｇｕｉｌｌｏｄ  ２００７，Ｗｅｎｔｈｏｌｔ  ２００７）。Ｔ１ＤＭを有する患者が適切な血糖を達成することを妨げる別の因子は、後に糖尿の減少を伴う集中インスリン処置の結果として生じることが多い、望ましくない体重増加である。以前の不十分な血糖制御による尿に出てしまうカロリーは、グルコース制御が強化されたインスリンレジメンにより改善されたとき、増加した体重の７０％〜１００％を占める可能性があると推定される（Ｃａｒｌｓｏｎ  １９９３）。更に、異化から同化に代謝状態を逆転させることにより、インスリンが脂肪生成作用を有して、体脂肪の増加につながり（Ｊａｃｏｂ  ２００６，Ｎａｉｒ  １９８３）、タンパク質に対する抗異化作用が除脂肪体重の増加につながる（Ｔｏｒｂａｙ  １９８５）。
【０２９７】
多くの処置オプションが利用可能である２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）とは異なり、インスリンが今でもＴ１ＤＭを有する患者の治療の主体である。１９２２年の動物インスリンの治療用途の発見以来、従来のインスリンからより最新のインスリン類似体まで、様々な種類のインスリンが開発され、インスリンリスプロは、１９９６年にＦＤＡによって承認された最初の短時間作用類似体であり、グラルギンは、２０００年に承認された最初の長時間作用類似体である。それ以来、他の短期及び長時間作用類似体が承認され、それらの使用がますます一般的になってきた。これは一部、Ｔ１ＤＭを有する被験体において正常血糖付近を達成する必要があり、重度の低血糖のリスクが顕著に増加することが非類似体インスリンで見られるためである。実際、有効性及び耐容性をＮｅｕｔｒａｌ  Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  Ｈａｇｅｄｏｒｎ（ＮＰＨ）インスリンと比較した長時間作用インスリンを伴う大多数の臨床研究は、一般にそれらの１日１回の投与レジメンが血糖制御に関してＮＰＨに類似するように思われ、有意に低い低血糖率（特に夜間）及びグルコース変動が低いことに関連することを示した（Ｒａｔｎｅｒ  ２０００，Ｐｏｒｃｅｌｌａｔｉ  ２００４，Ｈｅｒｍａｎｓｅｎ  ２００４，Ｒａｓｋｉｎ  ２００７）。短期作用類似体に関して、これらは、ＨｂＡ１ｃを低下させる際のレギュラーインスリンと概して類似しており、同時に、それらは、食後の高血糖におけるより良好な制御、改善された患者間及び患者内変動性、並びに低血糖のリスクの低減など、他の重要な利点を示す。重要なことには、短時間作用類似体は、食事の直前又は更には食後においても（レギュラーインスリンの食事前３０分と比較して）注射することができ、長時間作用類似体は１日１回の注射でよい（ＮＰＨの１日２回と比較して）ため、それらの改善された薬物動態により、これらの類似体は、良好なコンプライアンスとともに、患者により大きな柔軟性及び利便性を提供する。
【０２９８】
プラムリンタイドがＴ１ＤＭにおいて補助治療として承認された現在唯一の非インスリン剤であり、インスリン単独治療の弱点であることを所与として、Ｔ１ＤＭにおける新規治療に関する満たされていない必要性が存在する。
【０２９９】
新規発症Ｔ１Ｄにおいてβ細胞機能を保存するための研究の理論的根拠
上述のように、ＤＣＣＴは、長期合併症の発達及び進行に対する標準的なインスリン治療と比較して、集中インスリン治療の利益の可能性を評価するために、Ｔ１Ｄを有する被験体における大規模な研究である（ＤＣＣＴ  １９９３）。この研究からの集中治療群からの結果の重要な分析において、有意な残存β細胞機能（≧０．２ｐｍｏｌ／ｍＬのＣ−ペプチドで評価）を保持した被験体と、有意なβ細胞機能（Ｃ−ペプチドは０．２ｐｍｏｌ／ｍＬ未満）を保持しなかった被験体とを比較した。残存β細胞機能を有するものは、残存β細胞機能を有さないものと比べて、重度の低血糖事象率が大幅に低減し、微小血管合併症の進行率を低減したことが分かった（ＤＣＣＴ  １９８７、ＤＣＣＴ  １９９８、Ｓｔｅｆｆｅｓ  ２００３、Ｐａｌｍｅｒ  ２００４）。加えて、ＤＣＣＴ研究（Ｌａｃｈｉｎら）からのデータによる近年の評価は、≧０．２ｐｍｏｌの刺激されたＣ−ペプチドを有するものにおける短期間及び長期間の臨床利益を支持し、０．２ｐｍｏｌ／ｍＬ閾値を下回ってもＣ−ペプチド維持の臨床利益があるように思われる。
【０３００】
内因性インスリン生成の維持はＴ１Ｄを有する被験体において重要な短期間及び長期間の利益があるという見解は、過去１０年から２０年の新規発症Ｔ１Ｄにおける多数の介入試験の最も重要な妥当性の一部であった。この分野における最終目標は、Ｔ１Ｄの「完全な」寛解（したがって、インスリン非依存性）であり得、より現実的かつおそらくより達成可能な目標は、診断時に存在するβ細胞の破壊（ベースライン数値の約１０〜２０％と考えられることが多い）を阻止することである。個体がある程度の外因性インスリンを尚も必要とする場合であっても、代謝制御が改善され、Ｔ１Ｄ関連合併症が軽減されるであろう。Ｔ１Ｄの近年のデータはこの概念を支持している。具体的には、膵島細胞移植を受けるＴ１Ｄ被験体においてある程度の移植片機能を維持することにより、インスリン非依存性が達成されていない又は完全に失われたものでも、重度の低血糖事象が軽減され、血糖制御が改善される（Ａｇａｒｗａｌ  ａｎｄ  Ｂｒａｙｍａｎ  ２０１２，Ｂｌａｕ，Ａｂｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。Ｔ１Ｄにおけるアレファセプトの介在新規発症試験において、処置群の個体は、プラセボ群の個体よりも高いＣ−ペプチド生成レベルを維持し、インスリン非依存性は達成されなくても、主要低血糖の発生率は約半分であった（ＢＧレベルは５５ｍｇ／ｄＬ以下で定義される）（Ｒｉｇｂｙ，ＪＣＩ，２０１５）。したがって、ある程度の内因性インスリン生成の保存が多くの長期間の、特にＴ１Ｄ関連微小血管損傷に対して重要な利益があるという十分に受け入れられている見解に加えて、この疾患において最も短期間での罹患率及び死亡率をもたらす状態である、Ｔ１Ｄにおける低血糖を軽減するという重要な即時利益がある。
【０３０１】
１型糖尿病における発症状況
Ｔ１Ｄの自己免疫基礎の解明及び後のげっ歯類モデルにおける研究の成功により、最近Ｔ１Ｄと診断された患者において強力な非特異的免疫抑制剤を評価するために、いくつかの小規模な臨床治験が１９８０年代及び１９９０年代に行われた（Ｂｏｕｇｎｅｒｅｓ，Ｃａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８８、Ｇｌａｎｄｔ  ａｎｄ  Ｈｅｒｏｌｄ  ２００４、Ｈｅｒｏｌｄ，Ｇｉｔｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。臨床診断時には、相当な数（おそらく最大２０％）のβ細胞は残存するが、消耗及び局所炎症により機能不全であると考えられる。これらの残存細胞は、おそらく、「ハネムーン」期間として知られる診断数週間から数ヶ月後に見られることが多い、外因性インスリンの最低値に関与し得る。初期の臨床治験は、シクロスポリン、アザチオプリン、及び／又はプレドニゾンを含む非選択的免疫抑制剤を使用した（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｃｏｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８５，Ｂｏｕｇｎｅｒｅｓ，Ｃａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ｃｏｏｋ，Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｂｏｕｇｎｅｒｅｓ，Ｌａｎｄａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）。いくつかの試験においてインスリン非依存性が観察されたが、免疫抑制が停止したときにこの効果は失われた。これらの研究は、β細胞に対する炎症応答及び免疫攻撃を疾患の早期に緩和することができた場合、機能性β細胞を温存することができることを示した。
【０３０２】
糖尿病自己免疫を逆転させる他のアプローチ（例えば、ニコチンアミド、抗酸化剤）を使用する多くの試験が行われたが、これは、総合すれば、有効性を示さなかった（Ｃｈａｓｅ，Ｂｕｔｌｅｒ−Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｌｕｄｖｉｇｓｓｏｎ，Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。したがって、糖尿病自己免疫を逆転させる唯一の一貫したアプローチは、研究において、免疫細胞又はそれらのプロセスの活性に直接影響を及ぼす、他の状態において証明された強力な免疫抑制剤を使用することであった。リスクがある集団（即ち、小児）及び治療代替（即ち、インスリン）のため、理想的な治療は、低免疫から非免疫副作用、そして好ましくは、延長された休薬時効果を有するものであろう。
【０３０３】
過去２０年にわたって、特定の炎症性メディエーター及び細胞を標的とし、他のヒト自己免疫及び炎症状態に有意な有効性を有する生物薬剤が開発されてきた。多くのこれらの薬剤は、臨床治験におけるＴ１Ｄの評価について理論的根拠を提供したげっ歯類モデルにおいて、自己免疫疾患を逆転させることができた。抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０、ＬＦＡ−３Ｉｇ、及びＣＴＬＡ４−Ｉｇを使用した研究は、β細胞の損失は止めないが、緩徐する能力を示し（Ｐｅｓｃｏｖｉｔｚ，Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｑｕｉｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｏｒｂａｎ，Ｂｕｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｓｈｅｒｒｙ，Ｈａｇｏｐｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｔｏｌｅｒｘ  ２０１１、Ｇｉｔｅｌｍａｎ，Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  ｅｔ  ａｌ．２０１３、Ｍｏｒａｎ，Ｂｕｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）、一方で、ＩＬ１−β遮断、抗ＣＤ２５、及び抗胸腺細胞グロブリンは、β細胞損失に効果がなかった（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｑｕｉｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｇｉｔｅｌｍａｎ，Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  ｅｔ  ａｌ．２０１３、Ｍｏｒａｎ，Ｂｕｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。以下により詳細に論じられるように、薬剤の唯一のクラス、抗ＴＮＦα、つまりエタネルセプトは、新たに診断された糖尿病において内因性インスリン生成を保存するだけではなく、実際にそれを増加させることを小規模の第Ｉ相試験において示した。したがって、大半の他の自己免疫状態と比較して、Ｔ１Ｄ疾患修飾治療から最も利益を受ける集団である小児において日常的な使用に許容できる安全プロファイルを有するＴ１Ｄにおいて一貫して有効であると示された免疫調節薬（生物学的ないしは別の方法で）はない。
【０３０４】
抗腫瘍壊死因子α阻害剤
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、様々な刺激に応答して、主にマクロファージ及びＴ細胞によって生成される主要な炎症性サイトカインであり、広範な生物学的活性を媒介する。それは、タンパク質分解時に、生物学的に活性な三量体形態に自己会合する可溶性の１７ｋＤａのモノマーとして放出される、２６キロダルトン（ｋＤａ）のＩＩ型膜タンパク質として表される。腫瘍壊死因子αは、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの一部であり、発達から免疫応答に至る過程で細胞増殖及び細胞死に影響を及ぼす重複機能を有する関連サイトカインの群である。その名が示すように、ＴＮＦαは、マウス腫瘍細胞株によるアポトーシスの誘発因子として初めに説明されたが、より近年の研究は、ＴＮＦαによる慢性炎症が腫瘍の促進及び転移をもたらし得ることを示唆する。
【０３０５】
ＴＮＦαによって調節される機能活性は、サイトカインの増殖、分化、誘導、及びケモカイン生成、並びに接着タンパク質の誘導をもたらす細胞活性化又はプログラムされた細胞死の開始を含み得る。ＴＮＦαを結合する２つの受容体は、実質上、全ての細胞型に見られる。ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦ−Ｒ１）（又はｐ５５）は、細胞内デスドメインを含有し、細胞傷害性事象をシグナル伝達することができ、一方で、ＴＮＦ受容体２（ＴＮＦ−Ｒ２）（又はｐ７５）は、リンパ球においてＴＮＦαシグナル伝達に関与するように思われる。ＴＮＦα生成に対する生理学的応答の複雑さは、多因子性が理由であり、それには存在するＴＮＦα（可溶性又は膜貫通性）、機能性受容体（ＴＮＦ−Ｒ１及び／又はＴＮＦＲ２）、アクセサリタンパク質、及び標的細胞において利用可能なシグナル伝達経路の生物学的形態、それが生成される組織、並びに発現のタイミング及び持続時間が含まれる。
【０３０６】
ＴＮＦαの限定された局所発現は、傷害及び感染病原体に対する宿主炎症及び保護免疫応答において重要であるが、特定の器官におけるＴＮＦαの慢性発現は、重大な病態をもたらし得る。高レベルのＴＮＦαは、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、炎症性腸疾患、及びＴ１Ｄなどの疾患の病態生理に関連付けられている。ＴＮＦの阻害は、関節炎及び大腸炎の動物モデルにおいて疾患活動性を軽減することが示されており、これは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ゴリムマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、及びセルトリズマブペゴルを含む抗ＴＮＦα剤、並びにＲＡ、炎症性腸疾患、及び近接適応症などの免疫媒介炎症性疾患の処置のための可溶性ＴＮＦ受容体ｐ７５断片結晶性（Ｆｃ）融合タンパク質であるエタネルセプトの臨床及び商業的開発の成功をもたらした。
【０３０７】
１型糖尿病におけるＴＮＦの遮断機序
研究は、ＴＮＦαが炎症性サイトカインがＴ１Ｄにおける自己免疫プロセス及びβ細胞の破壊に重要であることを示した。（Ｃａｖａｌｌｏ，Ｐｏｚｚｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  １９９８）活性化マクロファージ、樹状細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞により生成された腫瘍壊死因子−αは、即時的位相応答、前増殖効果、並びに先天性及び適応性免疫応答における他の細胞の活性化及び補充におけるその関与を介して炎症を促進する。腫瘍壊死因子−α、樹状細胞（ＤＣ）、単球、及びＣＤ４＋Ｔ細胞は全て、Ｔ１Ｄにおける膵島病変（insulitic lesion）において認められ、全てがβ細胞炎症（膵島炎）及びβ細胞殺傷に関連付けられている。（Ｃａｖａｌｌｏ，Ｐｏｚｚｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  １９９８）前臨床研究において、若年期のＴＮＦαによる非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウス（自発性自己免疫糖尿病のモデル）の全身処置は、糖尿病発症の頻度を増加させ、その発症を加速する。ＴＮＦαに対する抗体による処置は、発症を緩徐し、頻度を減少させ、場合によっては、糖尿病を完全に阻止する。（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  １９９８）いくつかの非糖尿易発性マウス株（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６）において、ＴＮＦαによる全身処置は膵島炎をもたらす。（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  １９９８）若年期にＴＮＦαを発現するＮＯＤマウス膵島におけるＴＮＦα（ＮＦ−α−ＮＯＤ）のトランスジェニック発現は、疾患の進行を加速させる。（Ｋｏｕｌｍａｎｄａ，Ｂｈａｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）Ｔ１Ｄのげっ歯類モデルにおいて糖尿病を予防又は逆転させるために、具体的にＴＮＦα阻害剤を使用した研究はない。
【０３０８】
腫瘍壊死因子−αは、炎症細胞の膵島への補充を増強する、細胞を活性化する、及び自己抗原提示を増強することにより糖尿病自己免疫を促進するように思われる。（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  １９９８，Ｋｏｄａｍａ，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２００５）腫瘍壊死因子−αは、血管内皮を活性化し、ＭＨＣ  Ｉ及び接着分子を上方調節する。（Ａｒｇｉｌｅｓ，Ｌｏｐｅｚ−Ｓｏｒｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）Ｔ１ＤＭのマウスモデルにおいて、膵島を浸潤する最初の細胞のうちのいくつかは樹状細胞（ＤＣ）である。（Ａｒｇｉｌｅｓ，Ｌｏｐｅｚ−Ｓｏｒｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  １９９８）Ｔ細胞へのβ細胞抗原提示に重要である樹状細胞及びその他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＭＨＣ  Ｉ及びＩＩ、並びに共刺激分子を上方調節することにより、ＴＮＦαよって活性化される。（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  １９９８，Ｋｌｅｉｊｗｅｇｔ，Ｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）腫瘍壊死因子−αは更に、ＭＨＣ  Ｉを直接増加させ、β細胞上でＩＦＮγとともに相乗作用してＭＨＣ  ＩＩを上方調節し、それらの両方がＴ細胞殺傷に対するそれらの感受性を増加させるように思われる（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【０３０９】
加えて、Ｔ１Ｄにおいてその遮断を魅力的なものとするＴＮＦαの重要な非免疫効果がある。腫瘍壊死因子−αは、直接細胞増殖抑制効果があり、インスリン生成及び分泌を弱め、また細胞破壊活性を有して、β細胞を直接殺傷する。（Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｂｅｎｄｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ｋａｗａｈａｒａ  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｙ  １９９１，Ｄｕｎｇｅｒ，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  １９９８）腫瘍壊死因子−αはまた、インスリンシグナル伝達を弱め、末梢インスリン抵抗性を増大させるが、これは、実験モデルにおいて、ＴＮＦαを遮断することにより逆転させることができる（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  １９９８，Ｋｏｕｌｍａｎｄａ，Ｂｈａｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）新規発症Ｔ１Ｄを有する患者は、長期経過疾患を有するもの又は健康な対照と比較して、上昇した血清ＴＮＦαレベルを有する。（Ｃａｖａｌｌｏ，Ｐｏｚｚｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）インスリン感受性の明らかな増大によりインスリン必要量が低下した、他の自己免疫疾患のためにＴＮＦα遮断剤を開始したＴ１Ｄを有する患者の症例報告がある。（Ｙａｚｄａｎｉ−Ｂｉｕｋｉ，Ｓｔｅｌｚｌ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｂｏｕｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｏｕｒｎｅ  ２００７，ｖａｎ  Ｅｉｊｋ，Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７，Ａｒｉｆ，Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）したがって、ＴＮＦαは、β細胞のストレス及び死を増加させることによって糖尿病に寄与し得る強力な代謝効果も有する。
【０３１０】
Ｔ１ＤにおけるＴＮＦαの役割を支持し、その遮断がヒトにおける疾患の経過を修正する能力を有し得るというデータは、Ｍａｓｔｒａｎｄｒｅａらによって行われた、新たに診断されたＴ１Ｄにおける、エタネルセプトの小規模のパイロット臨床治験の報告によるものである。（Ｍａｓｔｒａｎｄｒｅａ，Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２００９）適格性には、自己抗体（即ち、ＧＡＤ−６５及び／又は膵島細胞抗体）陽性の糖尿病であり、ＷＢＣ及び血小板数が正常であり、肝臓及び腎臓機能が正常である年齢３〜１８歳、診断から約６週間の患者が含まれた。患者は、２４週間の間、週に２回、皮下投与でエタネルセプト０．４ｍｇ／ｋｇ（最大２５ｍｇ）又はプラセボを受けた。研究には１８人の被験体（平均年齢約１２．５歳）が登録され、１０人がエタネルセプト群（０．４ｍｇ／ｋｇ、週２回ＳＱ×２４週間）に、そして８人がプラセボ群に登録された。患者を６ヶ月経過観察した。エタネルセプト処置参加者は、プラセボ参加者よりも低いインスリン必要量及び低いＨｂＡ１ｃを示し、重要なことには、混合食負荷試験（ＭＭＴＴ）に応答して２時間の曲線下面積（ＡＵＣ）Ｃ−ペプチドレベルにより評価されたベースラインから、Ｃ−ペプチド生成において３９％増加が見られた。対照的に、プラセボ群では、Ｃ−ペプチド生成において２０％の低下があった。いずれの群にも重度の有害事象はなかった。３人のエタネルセプト処置患者が、軽度の一過性の感覚異常症を報告したが、それ以外は有害事象（全て軽度）の頻度は２つの群で類似していた。これらの非常に有望な初期観測に対してフォローアップはなかったが、スポンサーは、この研究で生成されたデータが、Ｔ１ＤにおけるＴＮＦα遮断剤の潜在的な利益の重要な理論的根拠を提供し、この集団における更なる研究を正当化すると主張している。
【０３１１】
前臨床及び臨床研究からの上記の証拠は、ＴＮＦαがＴ１Ｄの発達及び進行において重要な役割を有することを示す。このサイトカインの遮断が臨床的に更に調査するための非常に魅力的なアプローチであることを示唆する、ＴＮＦαの免疫、直接毒性及び代謝効果がある。Ｔ１Ｄを有する患者に利用可能な疾患修飾治療がなく、またインスリンによる最良の血糖制御を伴っても深刻な短期及び長期罹患率及び死亡率が継続しているという事実は、Ｔ１Ｄを有するものの経過、血糖制御、及び生活を改善するための治療を見出すという、重要な満たされていない必要性が存在するという見解を支持する。
【０３１２】
上述のように、多くの他の自己免疫障害と同様に、Ｔ１Ｄにおいて、ＴＮＦαは、疾患の開始及び進行に主要な役割を果たすように思われる。他の自己免疫障害におけるＴＮＦα遮断の臨床的有用性は十分に確立されている。アダリムマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、及びエタネルセプトを含む、ＴＮＦαを遮断する多くのＦＤＡ承認の薬剤が存在し、このクラスの生物治療は、最も広範に評価、処方され、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、及びクローン病などの成人及び小児における自己免疫疾患の領域の処置に成功している。ＴＮＦα阻害剤のための多くの適応外及び実験的使用が存在する。これには、おそらくこの適応症におけるβ細胞生存に対するＴＮＦα遮断の有益な免疫及び代謝効果の両方を反映する、ＴＮＦα阻害剤の添加が移植片の生存を改善することが示された同種膵島移植レジメンが含まれる。ゴリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、及びアダリムマブは、ＴＮＦαに結合するモノクローナル抗体であり、一方、エタネルセプトは、ＩｇＧ尾部に結合したＴＮＦ受容体からなる融合タンパク質であり、リンホトキシンα（ＬＴα）にも結合する。リンフォトキシンαは、げっ歯類の自己免疫糖尿病において役割を果たすように思えるが、ヒトＴ１Ｄに直接関与していることは示されていない。小児における臨床的使用に関して、エタネルセプトは、１９９９年以降、ＪＩＡを有する２歳以上の小児においてＦＤＡ承認されており、インフリキシマブは、２００９年及び２０１１年に、それぞれ、クローン病及び潰瘍性大腸炎を有する６歳以上の小児において承認され、アダリムマブは、２００８年に２歳以上の小児においてＪＩＡに対して承認され、２０１４年に６歳以上の小児においてクローン病に対して承認された。ゴリムマブは、ＪＩＡ及び小児ＵＣを有する２歳以上の２００人を超える小児において研究されてきた。有効性に加えて、小児におけるこれらの薬剤の安全プロファイルは、十分に文書化されており、多数の適応症に対する成人の安全プロファイルと類似する。
【０３１３】
要約すると、ＴＮＦαがＴ１Ｄの免疫及び代謝病因に関与している、並びにＴＮＦαの遮断が糖尿病自己免疫と干渉しβ細胞を保存する能力を有するという強い前臨床及び臨床データがある。２歳の幼い小児を含む様々なヒト自己免疫疾患でのＴＮＦα遮断剤のほぼ２０年の成功した臨床経験がある。Ｔ１Ｄは、個人、その家族、及び社会に大きな負担であり続け、内因性β細胞機能を維持する際に補助することができかつこの疾患の短期及び長期後遺症を軽減するＴ１Ｄの疾患修飾治療の重要な満たされていない必要性が存在する。
【０３１４】
ゴリムマブを用いた臨床経験
成人プログラム
適応症に対する全体的な開発プログラムの説明
ＳＣ注射として投与されるＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）は、現在、メトトレキサート（ＭＴＸ）と組み合わせて、軽度から重度の活動性関節リウマチ（ＲＡ）、単独で、又はＭＴＸと組み合わせて活動性乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、活動性強直性脊椎炎（ＡＳ）、及び以前の処置に対する不適切な応答若しくはそれに対する不耐性を有する、又は継続的なステロイド治療を必要とする患者における軽度から重度の活動性ＵＣの処置のために、成人に対して米国で承認されている。
【０３１５】
成人のリウマチ学適応症において承認されている投与量は、月１回ＳＣ注射により投与される５０ｍｇである。ＵＣを有する成人に対して承認されている投与量は、０週目に２００ｍｇのＳＣ注射、続いて２週目に導入として１００ｍｇ  ＳＣ（２００ｍｇ→１００ｍｇ）であり、その後１００ｍｇ  ＳＣ  ｑ４ｗの維持治療が続く。
【０３１６】
確立された安全性プロファイル
長期安全性（最大５年の安全性延長）は、ＲＡ、ＡＳ、及びＰｓＡの研究において評価されており、約４年のフォローアップの長期延長がＵＣにおいて完了している。臨床研究において、１１，０００人を超える被験体がゴリムマブに曝露され、製品の発売以降、２０１５年１０月０６日の時点で、世界的に別に推定３９３，０００人の患者がゴリムマブに曝露された。（各研究において曝露された被験体の数とともに、このプログラムにおける全ての臨床研究のリストを表８に提供する）。
【０３１７】
ゴリムマブの安全性プロファイルは、ＴＮＦα阻害剤クラスの薬物製品と一致する。
【０３１８】
臨床研究のゴリムマブで観察されたＡＤＲを表７に提示する。
【０３１９】
表７のＡＤＲ頻度は、第２相及び３相臨床研究の５，７１７人のゴリムマブ処置被験体からのデータに基づく：ＲＡ研究において３，０９０人（Ｃ０５２４Ｔ０２、Ｃ０５２４Ｔ０５、Ｃ０５２４Ｔ０６、Ｃ０５２４Ｔ１１、Ｃ０５２４Ｔ２８、Ｃ０５２４Ｔ１２及びＣＮＴＯ１４８ＡＲＴ３００１）、ＰｓＡ研究において３９４人の被験体（Ｃ０５２４Ｔ０８）、ＡＳ研究において５６４人の被験体（Ｃ０５２４Ｔ０９、Ｃ０５２４Ｔ２９）、ＵＣ研究において１，２４５人の被験体（Ｃ０５２４Ｔ１６、Ｃ０５２４Ｔ１７及びＣ０５２４Ｔ１８）、重度の持続性喘息研究において２３１人の被験体（Ｃ０５２４Ｔ０３）、並びに活動性ｎｒ−軸ＳｐＡを有する１９３人の被験体（Ｐ０７６４２［ＭＫ８２５９−００６−］）。
【０３２０】
下の表に列挙されたＡＤＲは、頻度及びＳＯＣに応じて分類される。頻度のカテゴリは、非常に一般的、一般的、一般的ではない、希、非常に希、及び不明として表の脚注に定義される。
【０３２１】
【表７】
2019509988.tif 000008
【０３２２】
小児プログラム
適応症に対する全体的な小児開発プログラムの説明
ゴリムマブは、小児患者での使用には、現在承認されていない。しかしながら、ｐＪＩＡを有する小児におけるＳＣゴリムマブの研究（ＣＮＴＯ１４８ＪＩＡ３００１）が行われ、小児ＵＣに皮下投与されたゴリムマブでの臨床開発プログラムが現在進行中である（ＣＮＴＯ１４８ＵＣＯ１００１）。
【０３２３】
ＣＮＴＯ１４８ＪＩＡ３００１は、３ヶ月間以上のメトトレキサート（ＭＴＸ）治療にもかかわらず、活動性関節炎を有する５以上の関節によって示されるｐＪＩＡを有する小児被験体（２〜１８歳未満）においてゴリムマブのＳＣ投与の臨床有効度を評価することが主な目的である、第３相、多施設共同、二重盲検、ランダム化治療中止研究であった。ＣＮＴＯ１４８ＪＩＡ３００１研究は、患者が１６週間ＳＣゴリムマブ３０ｍｇ／ｍ２  ｑ４ｗ＋ＭＴＸを受けた非盲検相、続いて１６週目に米国リウマチ学会（ＡＣＲ）の小児（Ｐｅｄ）３０応答を達成した患者がゴリムマブ３０ｍｇ／ｍ２＋ＭＴＸ又はプラセボ＋ＭＴＸのいずれかをｑ４ｗで４８週目まで受けたランダム化治療中止相からなった。これは追跡期間中央値が約２年の長期延長でもあった。合計１７３人の被験体（女児７５．７％、男児２４．３％）が研究に登録され、１５４人の被験体が１６週目にランダム化治療中止相に入った。平均年齢は１１．２歳（５２．０％が１２〜１７歳、４８．０％が２〜１１歳）であり、平均重量は４３．１ｋｇであった。
【０３２４】
ＣＮＴＯ１４８ＵＣＯ１００１は、小児ＵＣを有する小児におけるＰＫ、安全性、及びゴリムマブの有効性を評価するための、第１ｂ相、多施設共同、非盲検研究であった。この多施設共同、非盲検研究には、従来の治療（即ち、ＩＶ若しくは経口コルチコステロイド、又は免疫調薬ＡＺＡ若しくは６−ＭＰ）に対して不適切な応答を示す、それを耐容することができない、又は医学的禁忌を有することを示し、抗ＴＮＦα剤に無感作であった軽度から重度の活動性ＵＣを有する２〜１７歳の小児被験体が登録された。被験体は、以下のように、ＳＣゴリムマブの体重に基づく投与レジメンを受けた：
●体重が４５ｋｇ未満の被験体：０週目に９０ｍｇ／ｍ２、そして２週目に４５ｍｇ／ｍ２、そして６週目の応答者の間で６週目から始めてｑ４ｗで４５ｍｇ／ｍ２
●体重が４５ｋｇ以上の被験体：０週目に２００ｍｇ／ｍ２、そして２週目に１００ｍｇ／ｍ２、そして６週目の応答者の間で６週目から始めてｑ４ｗで１００ｍｇ／ｍ２
【０３２５】
研究は、１４週目までのＰＫ部分と、１２６週目までの研究延長の２つの部分に分けられた。研究１（ＣＮＴＯ１４８ＵＣＯ１００１）の１４週ＰＫ部分は完了し、研究延長は進行中である。合計３５人の被験体（女児５１．４％、男児４８．６％）が研究に登録された。平均年齢は１３．４歳（７１．４％が１２〜１７歳、２８．６％が２〜１１歳）であり、平均重量は５１．７ｋｇであった。
【０３２６】
確立された安全性プロファイル
ゴリムマブは、２〜１８歳未満の小児被験体において十分に耐容性であった。一般に、見られる有害反応の種類及び頻度を含むｐＪＩＡ及び小児ＵＣ研究におけるゴリムマブの安全性プロファイルは、研究された成人集団の既知の安全性プロファイルと一致し、他のＴＮＦα阻害剤と一致した。新たな安全性シグナルは観察されなかった。
【０３２７】
提案された第２ａ相新規発症Ｔ１Ｄ研究−ＣＮＴＯ１４８ＤＭＬ２００１
スポンサーは、内因性インスリンの維持のためのβ細胞の保存に対するＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）の効果を評価するために、新たに診断されたＴ１Ｄ患者において第２ａ相新規発症Ｔ１Ｄ研究を計画している。この研究の結果は、ＴＮＦα遮断を介するＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）がＴ１Ｄ疾患の進行に影響を及ぼし、新たな発症疾患及び「前疾患」状態における更なる発達、症状の発症前、及び外因性インスリンの必要量を支持するかどうかの重要な情報を提供するであろう。この研究の重要な態様を以下に概説する。
【０３２８】
実験計画
これは、Ｔ１Ｄを有する被験体におけるゴリムマブの第２ａ相、ランダム化、二重盲検、プラセボ対照、並行群間、多施設共同研究である。６〜２１歳の約８１人の被験体を、皮下（ＳＣ）投与されるゴリムマブ又はプラセボを受けるように２：１の比にランダムに割り当てる。ゴリムマブ処置群にランダム化される体重が４５ｋｇ未満の研究被験体は、０及び２週目にＳＣゴリムマブ６０ｍｇ／ｍ２の導入量、続いて４週目及びｑ２ｗで５２週目まで３０ｍｇ／ｍ２の維持量を受ける。ゴリムマブ処置群にランダム化される体重が４５ｋｇ以上の研究被験体は、０及び２週目にＳＣゴリムマブ１００ｍｇの導入量、続いて４週目及びｑ２ｗで５２週目までＳＣゴリムマブ５０ｍｇの維持量を受ける（セクション０）。プラセボ処置群にランダム化された被験体は、ｑ２ｗで５２週目までＳＣプラセボ注射を受ける（図１８）。被験体の動員及び保持を容易にするために、スポンサーは自宅で研究剤を自己投与することを許可する。
【０３２９】
研究の間、被験体全員が、外因性インスリンによる糖尿病の集中管理を受ける。被験体、及び該当する場合、彼らの介護者は、米国糖尿病学会（American Diabetes Association）によって定義される具体的なＨｂＡ１ｃ標的の、厳格な血糖制御の現在の推奨に従うことに同意しなければならない。これらの現在の推奨は、Ｔ１Ｄの短期及び長期後遺症の一部を減少するようであるグルコースレベルを達成することを意図する。この研究に特定して、これには、６〜１２歳のものに関しては８％未満、１３〜１８歳のものに関しては７．５％未満、そして１９歳以上のものに関しては７％未満のＨｂＡ１ｃ標的が含まれる。被験体の血糖制御は、被験体の主治医により監視される。加えて、ＨｂＡ１ｃ及び血糖制御のその他のパラメータがスクリーニング時及び研究中に評価される。
【０３３０】
研究集団
新たに診断されたＴ１Ｄを有する６〜２１歳の男性及び女性がこの研究に登録される。参加者は、現在のＴ１ＤのＡＤＡ定義を満たしていること、認識されている５つのＴ１Ｄ自己抗体のうちの少なくとも１つに対して陽性であること、残存β細胞機能の証拠（混合食負荷試験後の少なくとも０．２ｐｍｏｌ／ｍＬのピークｃ−ペプチドにより定義される）を示すこと、及びＴ１Ｄ診断の１００日以内に試験にランダム化されることを含む、新規発症Ｔ１Ｄ研究への登録に関して受け入れられている基準を満たす。試験に含まれた場合、除外基準は、免疫による任意の特定のリスクにある、又は感染のリスクにある可能性がある個人の特定に焦点を当てる。
【０３３１】
年齢範囲は以下の理由のため選択された。
【０３３２】
高齢成人と比較した小児及び若年成人におけるＴＩＤの固有の属性：
最近のデータが、小児及び若年成人（即ち、２１歳まで）と高齢成人とのＴ１Ｄ疾患において重要な差異があることを確認した。若年群におけるより活動的な提示（即ち、完全なインスリン交換の必要性がより早急）及び初期経過として説明することができるものを含む、新たに診断されたＴ１Ｄを有する若年個体及び高齢個体の疾患の提示及び経過において多くの臨床差異があることが受け入れられている。多くの最近の新規発症Ｔ１Ｄ研究のプラセボ被験体におけるｃ−ペプチド減少の自然歴の評価を通して行われたＧｒｅｅｎｂａｕｍらによる最近の報告では、知見が、２１歳超のものよりも速い減少を有する約７〜２１歳のものにおいて類似のｃ−ペプチド減少率を示し、これらの「若年」及び「高齢」個体において異なる免疫病理があることを強く示唆する。加えて、この主張を支持するために、Ｔ１Ｄのいくつかの免疫療法試験において、若年個体と高齢個体とに異なる有効性がある。例えば、アレファセプト（ＬＦＡ３−Ｉｇ）及びアバタセプト（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）は、若年個体（１８未満〜２１歳）において優先的効果を有するように思われ、一方サイモグロブリンは高齢個体（２１歳超、（Ｇｉｔｅｌｍａｎ，Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｏｒｂａｎ、Ｂｕｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１４、Ｒｉｇｂｙ，Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）においてのみ有益な効果を有するように思われる。Ｔ１Ｄの性質及び経過、並びにこの疾患に関連する生涯及び累積罹患率並びに死亡率のため、疾患の進行を緩徐又は安定させる治療によって最もプラスの影響を受けるものは小児及び若年成人である。高齢の成人個体と比較したこの集団における疾患の前述の差異のため、Ｔ１Ｄを有する小児及び若年成人の直接研究は、この疾患において最も影響力の強い疾患修飾治療を最も適切に開発するために必須である。
【０３３３】
小児の新規発症Ｔ１ＤにおけるＴＮＦα遮断剤の利益の展望を支持するデータ：
スポンサーは、成人集団における治療介入による臨床利益を示すことが小児集団の評価前に所望される場合があることを認識している。しかしながら、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｕｆｆａｌｏで研究者により行われた小規模のエタネルセプトパイロット研究（上にも言及される）から、２４週間にわたるＴＮＦα遮断剤エタネルセプトを用いた、７〜１８歳の小児におけるｃ−ペプチド生成、ＨｂＡ１ｃ及び外因性インスリンの使用（プロトコルは３歳からの小児を認めている）に対する有益な効果があることが示された。これは小規模の試験であるが（総参加者が１８人で、１０人がエタネルセプトを受けた）、結果は非常に有望であり、プラセボ群においてｃ−ペプチドの損失があった時期に、２４週対登録時で、平均してエタネルセプトでの内因性インスリン生成の増加があったことを示した。これらの結果を所与として、また成人及び小児両方の適応症におけるゴリムマブ及びその他のＴＮＦα遮断剤を用いた広範な経験を考慮し、スポンサーは、新たに診断されたＴ１Ｄを有する小児におけるＴＮＦα遮断の利益の展望が示され、したがって、疾患修飾治療としてこの特定の集団においてゴリムマブを評価することが適切であると主張する。
【０３３４】
ゴリムマブを含むＴＮＦα遮断剤の広範な安全性及び有効性経験
スポンサーは、年齢に関して、意図する研究集団のいくつかが免疫療法を評価するために特に感受性のある集団であると見なされ得ることを認識している。我々は、ゴリムマブ自体について、そしてＴＮＦα遮断剤のクラスのメンバーとして、他の自己免疫疾患における２歳に至る小児において強固な安全性（及び有効性）経験があると信じている。エタネルセプトは、１９９９年以降、ＪＩＡを有する２歳以上の小児においてＦＤＡ承認されている。インフリキシマブは、２００９年及び２０１１年に、それぞれ、クローン病及び潰瘍性大腸炎を有する６歳以上の小児において承認された。アダリムマブは、２００８年に２歳以上のものにおけるＪＩＡについて承認され、２０１４年に６歳以上のものにおけるクローン病について承認された。ゴリムマブは、ＪＩＡを有する２歳以上の２００人を超える小児において研究されており、現在、欧州においてこの適応症について登録中である。加えて、上記の薬剤の全ては、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び乾癬を含む、成人における多種多様な自己免疫状態について承認されている。したがって、ゴリムマブを含むＴＮＦα遮断剤の安全性及び副作用プロファイルは、おそらくＴ１Ｄにおいて評価されている任意のその他の免疫療法よりも、成人だけでなく、特に小児集団においても十分に確立されている。
【０３３５】
総合すれば、新規発症Ｔ１Ｄにおけるゴリムマブ研究を若年個体に集中させ、６〜２１歳の小児及び若年成人のみを含む強い理論的根拠がある。小児自己免疫におけるゴリムマブ及びＴＮＦα遮断剤のクラスからの強固な特定の有効性及び安全性データがあるだけでなく、ＴＮＦα遮断が、逆転させない場合でも、新たに診断されたＴ１Ｄのものにおいて、β細胞の損失を緩徐する能力を有し、したがって、この年齢群におけるＴＮＦα遮断の「利益の展望」の重要な制約を満たす、この若年の年齢範囲において非常に有望なデータもある。Ｔ１Ｄ型糖尿病は若年対高齢の個体では異なり、一方の群における有効性（又はその欠如）が実際には他方には有益ではない可能性がある、これらの群における免疫療法に対する応答が有意に異ない得ることは十分に同意され、示されている。これらの研究の多くは、「若年」及び「高齢」の疾患において、２１歳が識別分岐点（differentiating break）を示すように思われるため、スポンサーは、上限年齢の「カットオフ」を２１歳と選択している。６歳は、他の新規発症Ｔ１Ｄ研究（即ち、アバタセプト、カナキヌマブ）の登録の許容される下限年齢であり、小児における承認されたＵＣの年齢カットオフでもあり、承認されたＴＮＦα遮断剤のクラスのＪＩＡ年齢範囲を含む。
【０３３６】
用量の選択
この試験におけるゴリムマブの提案された投与は、Ｔ１Ｄにおける疾患特異的考慮に関する知識、Ｔ１Ｄを有する小児における前述のパイロット試験におけるエタネルセプトのＴＮＦα阻害の比較有効性の理解、及びゴリムマブによるスポンサーの経験を統合する。Ｔ１Ｄにおいて、β細胞の破壊は不可逆的であり、臨床疾患の発症時に急速であるように思われる。より炎症性の免疫媒介性疾患に関して、例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎に対して抗ＴＮＦα剤を使用するなど、より高い又はより頻繁な導入量、続いてより低い維持量を使用することが多い。７，８，９  Ｔ１Ｄに関しては、研究の登録時に存在するβ細胞の更なる破壊を阻止するために、疾患活性を迅速に抑制する必要もある。ゴリムマブの定常状態濃度は一般に１２週間後に確立されることを所与として、より早期に定常状態濃度を達成して更なるβ細胞損失を相殺するために、導入量、続いて維持投与レジメンを用いるべきである。前の成人及び小児研究からのデータを、母集団ＰＫ及び機械論的ＰＫ／標的結合（ＴＥ）モデリングとともに評価して、この第２ａ相新規発症Ｔ１Ｄ研究のための提案された投与レジメンを決定した。
【０３３７】
Ｔ１Ｄにおける導入及び維持投与の期待される必要性を考慮して、様々なＢＳＡ調節用量レジメンが、母集団ＰＫモデル及び遊離ＴＮＦα抑制を評価する機械論的ＰＫ／ＴＥモデルによるシミュレーションを介して探求された。ゴリムマブの母集団ＰＫモデルは、全被験体が併用メトトレキサート（ＭＴＸ）を受けていた、確立された多関節性ＪＩＡモデルに基づいていた。ＭＴＸは前にゴリムマブ曝露に影響を及ぼすことが示され５、またＴ１Ｄを有する患者は、メトトレキサートで同時に処置されることが予想されていないため、ゴリムマブクリアランスの３６％増加がシミュレーションにおいて考慮された（図１９）。身長及び体重のＣＤＣ成長チャートを使用する６〜２１歳の被験体の分析は、ＪＩＡに対して提案されたＴ１Ｄ投与レジメン（図１９パネルＡ）及びｐｅｄ  ＵＣ（図１９パネルＢ）と小児集団で既に研究された投与レジメンとを比較して行われた。シミュレーションは、Ｔ１Ｄ集団におけるＭＴＸの非共投与により、ゴリムマブのより速いクリアランス（３６％）の確立されたＪＩＡ母集団ＰＫモデルに基づいていた。小児に関して、ゴリムマブ３０ｍｇ／ｍ２（５０ｍｇ／１．６７ｍ２）は、体重６０ｋｇの成人被験体の５０ｍｇの用量（１．６７ｍ２のＢＳＡで）にほぼ相当するであろう。したがって、３０ｍｇ／ｍ２の用量は、成人の５０ｍｇの用量と類似するように考案され、６０ｍｇ／ｍ２の用量は、成人の１００ｍｇの用量と類似するように考案された。これらのシミュレーションに基づいて、提案されたＴ１Ｄ投与レジメンのＰＫ曝露は、ＪＩＡとｐｅｄ  ＵＣ曝露との間であると予想されるが（両方ともＭＴＸなしでシミュレーションされた）、ｑ２ｗでの維持投与間隔は、わずかに高いトラフ濃度をもたらす。成人において、ｑ４ｗでのゴリムマブ５０ｍｇは、ＲＡ、ＰｓＡ、又はＡＳの処置のための最小有効投与レジメンであった。Ｔ１Ｄ被験体において併用ＭＴＸは不在であるため、成人のｑ４ｗでの５０ｍｇの用量の小児等量であるｑ４ｗでの３０ｍｇ／ｍ２の投与レジメンは、ＴＮＦαの抑制に対して十分な全身曝露をもたらさない可能性があると予想され、したがって、スポンサーは、より高い用量又はより頻繁な投与間隔が研究されるべきであると主張している。
【０３３８】
標的媒介薬物動態（target-mediated drug disposition）（ＴＭＤＤ）モデルと組み合わされた上記の母集団ＰＫモデル（併用ＭＴＸなしで３６％高いクリアランス）からのＰＫ曝露を組み込んだ機械論的ＰＫ／ＴＥを使用して、薬物と標的との相互作用を評価し、抗ＴＮＦα投与後のＴＮＦαの抑制をシミュレーションした（図２０）。ＰＫ／ＴＥモデルは、プラスの結果が前に観察されたことを所与として、Ｔ１Ｄにおいて試験されたエタネルセプト投与レジメンが適切なＴＮＦα抑制をもたらすという前提に基づいて開発された。６ＴＮＦα動態パラメータを前臨床研究及び相対成長率から得、同じセットのＴＮＦα動態パラメータを使用して、ゴリムマブ及びエタネルセプトの効果を比較した。全身循環におけるＴＮＦα抑制は膵臓におけるＴＮＦα抑制も表すと仮定された。ゴリムマブ投与レジメンは、ゴリムマブとエタネルセプトとの間のＰＫ及びＴＮＦα結合親和性の差異を考慮した後、新規発症ＴＩＤを有する小児のパイロット試験におけるエタネルセプト投与レジメンに従うＴＮＦα抑制の程度に近似するように考案された６（Ｍａｓｔｒａｎｄｒｅａ，２００９）。ＰＫ／ＴＥモデルは、０週目及び２週目の６０ｍｇ／ｍ２  ＳＣ（最大１００ｍｇまで）の導入量レジメン、その後、ｑ２ｗで３０ｍｇ／ｍ２  ＳＣ（最大５０ｍｇまで）又はｑ４ｗで６０ｍｇ／ｍ２  ＳＣ（最大１００ｍｇまで）の維持量レジメンが、ｑ４ｗで３０ｍｇ／ｍ２  ＳＣの維持量とは対照的に、エタネルセプトの近似レベルに近いレベルにＴＮＦαの抑制を可能にすることを示唆した（図２０）。ｑ２ｗで３０ｍｇ／ｍ２及びｑ４ｗで６０ｍｇ／ｍ２の維持量レジメンは、同じ全体的曝露（ＡＵＣ）及び類似のＴＮＦα抑制を有するであろうが、ｑ４ｗで６０ｍｇ／ｍ２のレジメンは、より高いピーク／トラフ濃度変動を有し、したがって、ＴＮＦαの抑制に対する変動はより大きいであろう。ＴＮＦαは、β細胞に対して直接的な細胞増殖抑制及び殺細胞効果を有することが知られている。したがって、より高いが少ない頻度投与でトラフ中に生じることが予想されるであろうＴＮＦα上昇は、残存β細胞に損傷を与える可能性がある。これらの投与レジメンのゴリムマブ曝露は同等と考えられ得るため、シミュレーションが、ｑ２ｗの維持投与間隔がわずかに高いトラフ濃度をもたらして、β細胞をＴＮＦαの直接的作用から最適に保護するためにより小さいピーク／トラフ変動をもたらすことを示したので、ｑ２ｗで３０ｍｇ／ｍ２  ＳＣ（最大５０ｍｇまで）の用量レジメンが好ましい。
【０３３９】
ゴリムマブの安全性及び有効性は、ＲＡ、ＰｓＡ、ＡＳ、及びＵＣを有する被験体において広範に特徴付けされている。Ｒａを有する被験体の第２相研究において、４つの異なる投与レジメン（ｑ２ｗ又はｑ４ｗで５０ｍｇ及びｑ２ｗ又はｑ４ｗで１００ｍｇ）が評価され、その試験した全ての用量が一般に５２週目まで十分に耐容され、臨床応答の維持に有効であった。ｐＪＩＡにおいて、ｑ４ｗで３０ｍｇ／ｍ２の投与レジメンは、最大５０ｍｇ（承認された成人ＲＡ用量）まで研究された。ｐｅｄ  ＵＣにおいて、４５ｋｇ未満の被験体は、０週目に９０ｍｇ／ｍ２（最大２００ｍｇまで）及び２週目に４５ｍｇ／ｍ２（最大１００ｍｇまで）のＳＣ導入量、続いてｑ４ｗで４５ｍｇ／ｍ２（最大１００ｍｇまで）Ｓｃの維持投与レジメンを受け、一方４５ｋｇ以上の被験体は、０週目に２００ｍｇ及び２週目に１００ｍｇの導入量、続いてｑ４ｗで１００ｍｇの維持量を受けた。今まで、研究された投与レジメンは、成人のリウマチ学及びＩＢＤ研究において観察されたものと類似する頻度、種類、及び重症度で特定される新しい有害薬物反応なく、全体的に十分に耐容された。結論として、Ｔ１Ｄの疾患に特定の問題、ゴリムマブ及びエタネルセプトの薬理学的比較、並びにゴリムマブによる特定の臨床経験を考慮して、０週目及び２週目に６０ｍｇ／ｍ２  ＳＣ（最大１００ｍｇまで）の導入、続いてｑ２ｗで３０ｍｇ／ｍ２  ＳＣ（最大５０ｍｇまで）が推奨される用量レジメンとして選択された。体重カットオフ（４５ｋｇ）を超える患者は既に承認された成人ＰＦＳ提示からゴリムマブを受けるため、体重カットオフも研究される。スポンサーは、この概念実証試験に成功のための最良の機会を与えるるために、疾患及び治療の両方に特定の考慮を使用して、この投与レジメンを開発した。過去に特異的に使用されたレジメンではないが、提案されるＴ１Ｄ投与レジメンは、小児における前述のＪＩＡとＵＣ投与との間で観察されたゴリムマブ曝露を達成し（機関は重複する年齢範囲の研究を支持した）、したがって、この特定のアプローチの安全性の懸念を緩和する。この試験が成功した場合、用量範囲の考慮は、後続の臨床研究において探求される。
【０３４０】
処置期間
被験体は、５２週目までＳＣゴリムマブ又はプラセボを受ける。一部、この試験の目標は、ＴＮＦαを中和することによるβ細胞温存を示す、Ｔ１Ｄにおけるエタネルセプトの２４週間のパイロット臨床治験の知見を再現し延長することである。診断後のβ細胞損失の自然歴により、妥当な規模の試験において、β細胞を温存する薬剤の統計的に有意かつ臨床的に意義のあるプラスの効果の文書化は、およそ１年で可能性が最も高く、受け入れられている主要（一次を含む）エンドポイントは１２ヶ月での誘発されたｃ−ペプチド生成である。承認された適応症において、ゴリムマブは慢性治療として使用され、したがって、提案される処置の長さはこの薬剤の臨床使用と一致する。追加で休薬時の評価を伴う、１年の治療中の評価を通して、我々は、Ｔ１Ｄにおけるこの治療の更なる臨床開発を誘導するのに役立つ重要な有効性及び安全性データを得られると考える。
【０３４１】
主要エンドポイントの理論的根拠及び選択
ＣＮＴＯ１４８ＤＭＬ２００１研究における主要な試験エンドポイントは、代表的なＴ１Ｄリサーチネットワーク（Ｔ１Ｄ  ＴｒｉａｌＮｅｔ及びＩｍｍｕｎｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋを含む）により使用及び受け入れられているもの、並びに主要な保健局ガイドライン（ＦＤＡ及びＥＭＡのものを含む）により引用されるものと一致する。具体的には、主要なエンドポイントは、内因性インスリン生成の客観的な尺度として、５２週目の混合食負荷試験後にｃ−ペプチド応答（４ｈ  ＡＵＣ）を刺激することである。これはプラセボ比較試験であるため、実証的研究は、５２週目の実薬対プラセボ処置群におけるｃ−ペプチドＡＵＣの統計的有意差を示すとして定義される。誘発されたｃ−ペプチド評価も二次エンドポイントとして約１３、２６、３９、７８、及び１０４週目に行われる。これらの評価の目標は、β細胞保存に対するゴリムマブの効果の時間経過（１２、２６、及び３８週目）、及び休薬時の応答の持続性（７８及び１０４週目の評価）の見解を得ることである。主要な二次エンドポイントは、血糖制御（ＨｂＡ１ｃ）、インスリン使用（Ｕ／ｋｇ／日）、及び低血糖率（レベル≦７０、５５、及び３５ｍｇを含む）に対する他の潜在的な明白な効果を評価する。
【０３４２】
安全性監視
β細胞機能の継続的な損失を阻止する際のゴリムマブの有効性を評価することに加え、広範な安全性が評価される。免疫調節薬として、これらの評価の焦点は、感染のリスク又は免疫状態に対して悪影響が増加するかどうかを決定することである。これには、研究来院中及び自宅（患者が報告した結果を使用する）での局所又は全身感染の徴候又は症状の慎重な文書化が含まれる。スポンサーはまた、白血球数並びにＥＢＶ及びＣＭＶ状態の定期的な評価を介して衰えた免疫応答の適応症についても監視する。ゴリムマブ及び他のＴＮＦα遮断剤の経験により、スポンサーは、非免疫副作用が低い可能性を期待するが、腎機能試験、肝機能、及び血液学的検査を含む身体的検査及び実験室評価によるかかる効果の任意の臨床又は化学的証拠について監視する。このプロジェクトの目標は、Ｔ１Ｄの進行に対して有益な効果があるかどうかを決定することであり、期待はされないが、スポンサーは、このために評価を使用して、低血糖率の増加、血糖制御の不良、又は内因性β細胞機能のより急速な損失などの内分泌的有害効果があるかを決定することができる。
【０３４３】
独立した外部データ監視委員会（ＤＭＣ）を設立して、継続してデータを監視し、この研究に登録した被験体の継続した安全性を確実にする。委員会は定期的に集まり暫定データを見直す。見直した後、ＤＭＣは研究の継続について勧告を行う。安全性の見直しは、特定のＡＥ、ＳＡＥ、及び死亡率に焦点を当てる。
【０３４４】
ＳＡＥの報告は、継続的にＤＭＣのメンバーに提供される。ＤＭＣは、非盲検データにアクセスし、表にまとめられた安全性の要約（適切な場合）及びＤＭＣが研究の実施中に要求し得る任意の追加データを見直す。正式な統計的仮説試験は計画されていない。加えて、研究中に、スポンサーの研究担当医師（又は被指名人）は、現場からの盲検安全性データを定期的に見直し、あらゆる問題をＤＭＣ及び適切なスポンサー担当者に通知する。機関への治験新薬（ＩＮＤ）申請とともに提出されるプロトコルは、この研究において行われる全ての安全性の評価及び監視、並びに特定の停止規則を含むＤＭＣの構成及び役割及び責任を記載する。
【０３４５】
重要な安全対策の１つには、現在の障害又は治療により免疫抑制を有する被験体の除外も含まれ、結核を含む既存の有意な感染又は履歴を有する個体を除外する。
【０３４６】
投与方法
第２ａ相研究の維持部分の提案されたｑ２ｗ投与レジメンを考えると、自宅投与のオプションは患者の日課を補助し（即ち、投与のたびに治療現場を訪問する必要がない）、また研究の登録及び保持も増加することが期待される。患者又は介護者が自宅投与を行う場合、患者又は介護者には注射技術が指示されるべきであり、皮下注射する能力を評価して適切な投与を確実にするべきである。加えて、最初の自己注射又は介護者による注射は、資格のある医療従事者の監視下で行われることが推奨される。
【０３４７】
第２ａ相新規発症Ｔ１Ｄ研究における使用に提案される提示
Ｕｌｔｒａｓａｆｅ
体重が４５ｋｇ以上の小児被験体に関して、ゴリムマブは、既に成人使用に承認されている５０ｍｇのＰＦＳ−Ｕデバイスを使用して皮下投与される。更なる詳細は、以下及び図２１を参照のこと。
【０３４８】
ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）ＵｌｔｒａＳａｆｅ  Ｐａｓｓｉｖｅ（登録商標）針ガード（ＰＦＳ−Ｕ）
ＵｌｔｒａＳａｆｅは、プレフィルドシリンジの付属品である手動の単回使用使い捨て針ガードシステムであり、投与後及び使用済のプレフィルドシリンジの廃棄中に医療従事者及び患者又は患者の介護者への偶発的な針刺しの発生を低減するための安全機構として使用することが意図される。ＵｌｔｒａＳａｆｅは０．５ｍＬ又は１．０ｍＬのいずれかのＰＦＳを受容する。組み立て中又は使用中のいずれかにかかわらず、薬物製品はデバイスと直接接触しない。
【０３４９】
デバイスの透明なプラスチック構成及び視認用スロットの設計により、シリンジを視覚化することができる。デバイスの受身的な性質は、正常な針の挿入を可能にし、シリンジのプランジャストッパが完全に前進し、薬物用量が送達されると、バネ補助ガードが解放される。ユーザーが把持を緩めると、ガードは、ロック位置にラッチされるまで、自動的にシリンジ及び針上を前進する。
【０３５０】
ＵｌｔｒａＳａｆｅの特徴を図２１に示す。
【０３５１】
ＶａｒｉｏＪｅｃｔ
スポンサーは、ＢＳＡ投与を容易にするために、複数の小児プログラムにわたるプラットホームデバイスとして、ＶａｒｉｏＪｅｃｔと知られる小児用提示を開発しており、この研究にＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスを利用する予定である。スポンサーは、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）のその他の小児プログラムにおいてＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスの登録を支持するために必要なデータについて前に論じており、これには、実際の使用及びラベル理解の評価、人的要因研究からのデータ、並びに追加のデバイス性能データが含まれる。
【０３５２】
投与量及びデバイス選択チャート（表９）は、医療提供者、介護者及び／又は小児被験体（該当する場合）が、対応する絶対ミリグラム（ｍｇ）用量及び使用する注射デバイスの組み合わせを決定することができるように開発される。
【０３５３】
ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）ＶａｒｉｏＪｅｃｔ
ＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスは、５ｍｇの増加分で１０ｍｇ〜４５ｍｇの用量の範囲で、ＢＳＡ投与レジメンに基づいて単回投与の薬物を送達することを意図している。ＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスは、既に承認されているＳＩＭＰＯＮＩ  ＳｍａｒｔＪｅｃｔオートインジェクタ及びＰＦＳ−Ｕにおいて使用されている、０．５ｍＬのＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）薬物製品（ＰＦＳ）を収容する同じ１ｍＬのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ  Ｈｙｐａｋシリンジと組み立てられるように設計されている。ＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスは、薬物製品と接触がなく、したがって、ＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスは、薬物製品の生化学的特性及び安定性に影響がないことに留意されたい。
【０３５４】
ＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスは、他の適応症のためのプレフィルドペンの経験豊富な供給者であるＹｐｓｏｍｅｄ，Ｈｏｌｄｉｎｇ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって、プラットホーム技術として開発された。このデバイスは、品質システム規則２１  ＣＦＲ  Ｐａｒｔ  ８２０の設計管理要件に従って設計されている。
【０３５５】
ＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスの全体的な構成及びその特徴を図２２に示す。
【０３５６】
図２３は、異なる使用段階のデバイスを示す。デバイスをプライム状態にし、用量設定は、プランジャを所望の固定用量に回すことにより選択され、用量はプランジャを押すことにより投与される。
【０３５７】
デバイスを使用するために、ユーザーはまずキャップを取り外し（図２４、工程Ｂ）、次に気泡（図２４、工程Ｃに示されるように、視認用窓を通して可視）をシリンジの上部へと近づけ、プランジャを押下して空気を除去することによりＶａｒｉｏＪｅｃｔをプライム状態にする（図２４、工程Ｃ）。次に、ユーザーはプランジャをダイヤルして適切な用量を選択する（図２４、工程Ｄ）。次の工程では、ユーザーは約９０度の角度で皮膚に対してデバイスを押下し、針ガードを後退させ、選択されたＳＣ注射部位に針を挿入した後（図２４、工程Ｅ）、プランジャを押して用量を送達させる（図２４、工程Ｆ）。送達後、ユーザーはデバイスを取り外し、針ガードが受動的に伸長し針上でロックし、偶発的な針刺しに対する保護を提供する（図２４、工程Ｆ）。用量が投与された後、プランジャを下方位置にロックして、デバイスの再使用を防止する。
【０３５８】
ペンは、０．０５ｍＬの増加分で０．１０ｍＬ〜０．４５ｍＬを送達するように設計される。投与量精度に関する要件は、ＩＳＯ  １１６０８−１  ２０１２  Ｎｅｅｄｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｕｓｅ，Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐａｒｔ  １：Ｎｅｅｄｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄ  ＵＳＰ  ３１  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ／Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓに基づいて確立された。送達精度に関する技術的設計要件は、ペンがダイヤルされた用量−０．００／＋０．０５ｍＬを送達しなければならないことであり、最小増加分は０．０５ｍＬである。公称４．５ｍｍの針突出距離は皮下組織への注射の深度を制限する。
【０３５９】
デバイスは、適切かつ安全に使用されることを確実にするのを助けるための多くの特徴を有する。プランジャが押されなければならないことを示すオレンジ色のプライミングバンド及び白色の矢印は、デバイスが使用前にプライム状態にされなければならないことをユーザーに再認識させるのに役立つ。オレンジ色のプライミングバンドはプライミング後に消え、この工程が完了したことを示し、用量はデバイスがプライム状態となるまで選択することができない。プランジャ上の図形は、用量選択ノッチと整列し、選択されている用量をはっきりと示し、戻り止めはデバイスが適切に整列されているという触覚フィードバックをユーザーに提供する。用量の投与後、プランジャは下方位置にロックされ、送達された用量は、用量ノッチにロックされ、両方とも送達された用量の記録を確認及び提供する。加えて、ロックは、残った製品の無断再使用の可能性から守る。ペンが注射部位から取り除かれると、針ガードは自動的に伸長し、ロックアウトする。この受動的な針安全機構は、偶発的な針刺しの可能性を低減するのに役立ち、また針を恐れる可能性がある一部の患者及び介護者に対する針の視覚的露出を最小限に抑える。
【０３６０】
ＶａｒｉｏＪｅｃｔの開発
デバイスの設計及び開発は、ＩＳＯ  １１６０８−１  ２０１２  Ｎｅｅｄｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｕｓｅ，Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐａｒｔ  １：Ｎｅｅｄｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ並びにＦＤＡ  Ｄｒａｆｔ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ：Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｎ，Ｊｅｔ，ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｉｎｊｅｃｔｏｒｓ  Ｉｎｔｅｎｄｅｄ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓを指針とした。
【０３６１】
試験は、薬物製品の正確な送達を確実するベンチテスト、並びにその他の適性及び人的要因研究を含む。
【０３６２】
初期の研究は、デバイスの形態、特徴、及び一般的な有用性に関して行われた。１回の民族学的調査が行われ、この調査において、スポンサーは、小児がインスリン又は成長ホルモン注射を受けていた親子を観察及び面接した。加えて、小児被験体の親、介護者、及び子供を含む５つの形成的人的要因研究を行って、設計を試験及び改良した。写真に基づいたＩＦＵ案を開発し、デバイス概念とともに試験した。選択されたデバイス設計及びＩＦＵの全体的な形態を確認する試験の結果は概して肯定的であった。誤使用を低減するためにいくつかの設計増強が組み込まれ、更新された設計はユーザーによって再度試験された。例えば、プランジャにサムレストを追加して、デバイスが保持されるべき配向をユーザーが理解するのを助け、フランジの形状を調節して、使用中の好ましい把持を可能にした。
【０３６３】
ＶａｒｉｏＪｅｃｔの今後の開発
臨床研究の準備において、スポンサーは、ＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスの安全性、有用性、及び性能を評価するための全ての実証及び検証試験を完了した。スポンサーは、臨床研究に使用されるデバイスに対して任意の重要な設計変更を期待していないが、スポンサーは、所定の開発努力における所見に基づいて、ＶａｒｉｏＪｅｃｔ設計の堅牢性を増強することを意図している。シミュレーション使用安全性研究において、研究はデバイスの鋭利物による事故防止機構の機能性を示すことに成功したが、典型的な送達力を超える（７０Ｎ超）非常に高い力を使用する選択ユーザーが、デバイスのプライミング及び投与中に最大押し力を越えることができた稀な場合があったことが認められた。シミュレーション使用安全性研究の参加者は、急速度でパッドに各々２６〜３３のＶａｒｉｏＪｅｃｔ注射（１８人の参加者間で合計５５７のデバイス）を行ったが、これは、ユーザーが時間をかけ、過剰な力が使用されないであろう、患者に注射するときの代表的な使用とはみなされない。この不具合は、このデバイスで行われた複数の人的要因研究のいずれにおいても以前には観察されなかったことに留意されたい。スポンサーは、間違った用量を患者に投与するリスクを軽減するために、接触するエンドストップ表面間の重複面積を増加させることによって、プライミング及び投与エンドストップ機構を更に増強するための軽微な設計強化を追及することを目指す。
【０３６４】
現在のプライミングエンドストップの仕様は４６Ｎであり、投与エンドストップの仕様は６９Ｎである。投与エンドストップ仕様は、投与エンドストップの不具合による過剰投与のリスクのため、プライミングエンドストップ仕様の１．５倍である。これらの機構の実証試験は、現在の設計が、仕様をプライミングに関しては約５０％、そして投与に関しては３５％超えることを示す。シミュレーション使用安全性研究からの結果に基づいて、スポンサーは仕様を拡大し、軽微な設計変更を実施して、プライミング及び投与エンドストップを超えて押すために必要な力を増加させる。提案された修正は、ユーザーインターフェースへの影響はなく（操作のための全ての力及び使用工程は変更されないままである）、したがって、臨床的に使用されるデバイスは、商業用デバイスを代表するものとなる。これらの軽微な変更を含む商業用デバイスは、デバイスの性能への影響がないことを確認し、仕様が拡大され、使用中の潜在的な過剰な力に適切であることを確実にするために、ベンチテストにより完全に実証される。デバイスの外部機構に対して軽微な変更のみが行われる。変更の概要を図２４に示す。
【０３６５】
修正に対応する外部機構
１用量ボタンの直径を０．５〜１．０ｍｍ増加させる。
２エンドキャップの直径を０．５〜１．０ｍｍ増加させる。
【０３６６】
改善によりデバイスの性能の堅牢性が増加し、同時にユーザーインターフェースを変更することなく、患者への間違った投与のリスクを低減する。臨床研究に関して、エンドストップを超えて押す可能性を最小限に抑えるために、適切なトレーニングが提供される。
【０３６７】
小児使用に関するＶａｒｉｏＪｅｃｔの適性
ＶａｒｉｏＪｅｃｔの注射特徴は、手動で注射される皮下の皮下注射針を使用して、医療提供者によって行われるものの注射深度及び持続時間に類似する。加えて、上述のように、この手動インジェクタは、小児患者において適切かつ安全に使用されることを確実にするのを助ける多くの機構を用いて設計されており、受動的針安全機構を含む。この重要な針安全機構は、偶発的な針刺しの可能性を低減するのに役立ち、また針を恐れる可能性がある一部の若年患者に対する針の露出を最小限に抑える。このデバイスの針挿入深度はわずか４．５ｍｍであり、小児患者の皮下組織への注射を制限するように設計される。加えて、インスリンペンと同様、このデバイスは、自己投与が可能な適切に訓練された小児患者による自己投与を含む、介護者及び患者による自宅投与に適している。
【０３６８】
自宅での使用及び針の長さに関連するリスク管理活動の概要は、以下に論じられる。
【０３６９】
自宅での使用
ＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスの初期の開発において、スポンサーは、主にインスリン及びヒト成長ホルモンの注射を必要とする小児の家庭において民族学的調査を行った。見解は、家庭環境におけるＶａｒｉｏＪｅｃｔの安全かつ有効な使用を確実にするのを助けるための設計改善につながったこれらの調査から収集され、これらの改善は、後に人的要因研究に有効であることが確認された。
【０３７０】
例としては以下のものが挙げられる。
●親介護者にとって主な懸念である正しい用量選択の保証を提供する用量選択ノブ上の明確な用量表示及び戻り止め
●ユーザーが正しい用量が送達されたことを確認することができるように、使用後に用量選択ノッチに用量を記録
●親が用量を準備した後に注射を行うために子供のところへ行くようにさせる、小児の自宅での注射のための一般的な慣行である、使用工程の順序付け
●処置中に中断された場合に、ユーザーがどの注射プロセスにあるかを容易に見つけることができる指示の構造化
【０３７１】
加えて、自宅での注射に関連するリスクは、適切な軽減を確実にするためにＦＭＥＡアプリケーションにおいて捉えられた。
【０３７２】
例としては以下のものが挙げられる。
●薬物の劣化につながる、ユーザーによるデバイスの不適切な輸送若しくは保管、又は期限切れ製品。使用前の製品の適切な冷蔵及び検査を確実にするのを助けるために明確なラベル表示が加えられた。
●キャップに関連する窒息の危険性。キャップに穴を付けて気道閉塞時の呼吸を可能にし、小児の手が届かないところに置くという警告を加えた。
●小児によるデバイスへの意図しないアクセス。意図しないアクセスを制限するために、加温時にパッケージ内にデバイスを維持するようにユーザーに指示した。
【０３７３】
更に、家庭環境において起こり得るデバイスの乱用の可能性について分析を行った。スポンサーは、小児に処方されるインスリン送達ペンを含む、家庭環境で使用される薬物送達デバイスのエキスパートであるＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを雇い、ＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスの乱用の可能性を調査した。異なる乱用シナリオの分析が、適切な軽減とともに、ユーザーがシリンジをデバイスから分離する、又はシリンジから第２の用量を抽出するのを困難にする仕様を含むＦＭＥＡアプリケーションに含まれた。
【０３７４】
ＶａｒｉｏＪｅｃｔ及びその関連する使用説明書は、いくつかの安全機構、並びに家庭での使用を容易にする全体的な有用性を改善するための機構も有する。このデバイスが意図する集団における自宅での使用に適切であることを確認するために、スポンサーは、意図するユーザー集団を代表すると考えられる被験体（小児被験体及び介護者の両方）による自宅での使用を評価するために考案された小児人的要因検証研究を行う。人的要因検証研究中、患者及び介護者の自宅のような設定を代表するように設計された室内で全ての注射を行う。小児に自己注射器を処方することは保健医療界にとって深刻な問題であり、介護者が自宅で小児に注射することができる、又は患者に自分で注射させる前に、要件としてトレーニングが常に提供される。本デバイス及びＩＦＵは、この背景で開発された。更に、スポンサーは、形成的試験において注射未経験患者集団を評価した。この試験に基づいて、ＶａｒｉｏＪｅｃｔは、ユーザーにとって合理的に使いやすいと考えられる。スポンサーは、以前の形成的試験に基づいて設計を改善する措置を取った。一例として、形成的試験は、トレーニングされていないユーザーがプライミングに関する工程（適切なデバイス配向を確実にし、気泡を上部へ近づける）を省略する傾向にあることを示した。ユーザーにとってリスクが低いと分類される過小投与の原因となり得る不適切なプライミングのリスクを軽減するために、スポンサーは、デバイス上に着色した図形及び明確な段階的指示を組み込んだ。デバイス及び関連ＩＦＵの有用性を改善するために非常に重点を置き努力したにもかかわらず、必要なトレーニングが適切な使用を確実にする最良の方法であることが証明された。このため、人的要因研究に関して、全ての患者及び家族の介護者に最小であるが代表的なトレーニングを提供することによって、これらのデバイスが展開される現実世界の状況を模倣する。スポンサーは、シミュレーション人的要因研究を、このデバイスが自宅での使用に安全であり、このデバイスに関連する臨床リスクに対処するのに十分であることを示す中心的なものであると考える。しかしながら、規制要件に対処するために、スポンサーは、苦情及び使用不具合を含む、実生活でのＶａｒｉｏＪｅｃｔの取り扱い、並びに自宅環境において被験体及び介護者によって投与された注射からの使用経験データを捕捉及び文書化するように考案されたＶａｒｉｏＪｅｃｔの実際の使用研究（小児ＵＣ患者で）を行うことを意図している。実際の使用研究は、中心的な人的要因データの追加的な援助であると考えられる。
【０３７５】
針の長さ
小児における皮下注射のための針の長さに関する公表文献１、２に基づいて、４．５ｍｍの針の長さがＶａｒｉｏＪｅｃｔに選択された。この針の長さは、筋肉内及び皮内送達の小さなリスクバランスを適切に取るために、ガラスシリンジに対する製造公差並びにＶａｒｉｏＪｅｃｔのシリンジの組み立てに関連する公差の両方を考慮するように選択された。公表文献に提供されるデータに基づいて、７〜１７歳群における筋肉内注射のリスクは低く、筋肉内注射のリスクは２〜６歳群においてはわずかに高いが、リスクは依然として低い。同様に、２〜６歳群における皮内注射のリスクは低く、皮内注射のリスクは７〜１７歳群においてはわずかに高いが、リスクは依然として低い。豚の生体分布研究を行って、ＶａｒｉｏＪｅｃｔによる注射の深度を更に評価した。この研究は、ＶａｒｉｏＪｅｃｔを使用した注射の深度は、針及びシリンジに関して予想された範囲内であることを示した。この結論は、針及びシリンジによる注射の深度が注射物を投与している個人により影響を受け、挿入の角度及び針がどの程度深く挿入されたかに依存し、一方、ＶａｒｉｏＪｅｃｔによる提案された送達方法は、固定された針挿入角度及び深度を有するため、期待される結果を支持する。ガラスシリンジに対する製造寸法変動、並びにＶａｒｉｏＪｅｃｔのシリンジの組み立てに関連する変動を考慮して、注射の深度の公差は±１．２５ｍｍである。同じＢＤＨｙｐａｋシリンジを使用しているＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）ＳｍａｒｔＪｅｃｔオートインジェクタ（７．４〜８．６ｍｍ）の過去の針突出測定によって示されるように、商業的に期待される公差は非常に少ない。更に、一般的に、シリンジ及び針の選択、並びに多くの液体薬物を皮下投与するために使用される投与技術には幅広いバリエーションがあるが、公表された研究は、皮下注射の変動性に関する有意な臨床懸念を見出していない。また、クラスとしては、ｍＡｂが、安全かつ有効である皮下空間の特定の位置への厳密な又はデバイス特有の投与を必要とするようには思えず、ＰＫにおける小さな変動（予期されないが）は、有効性の結果に影響を及ぼす可能性はない。それにもかかわらず、安全性評価は、提案された研究の一部として収集される。
【０３７６】
「前Ｔ１Ｄ」の評価につながる１型糖尿病における開発目標の概要
上述のように、Ｔ１Ｄの進行は、初期の生活の質に対する重要な影響、並びに最終的な罹患率及び死亡率に関連する。今まで、血糖制御を向上させ、疾患の短期及び長期合併症を減少させる、残存β細胞の機能を維持するために、新たにＴ１Ｄと診断されたものにおいて、多くの化合物が検討されてきた。しかしながら、スポンサーは、リスクが高いものにおいてＴ１Ｄを遅延又は予防するための満たされていない医療ニーズ及び重要な好機があると考えている。自己免疫媒介β細胞の損失が臨床診断より何年も前に始まったことは十分に確立されている。臨床診断時には発生しており、したがって「新規発症」研究の標的になる自己免疫プロセスは、過去数ヶ月又は過去数年に発生していたものと非常に類似している可能性があり、したがって、新たに診断されたＴ１Ｄにおいて（中程度でも）有効性を示す薬剤は、Ｔ１Ｄを発達するリスクが高いもの（即ち、「前Ｔ１Ｄ」）において検査する候補として考慮され得る。これは、Ｔ１Ｄ自己免疫の血清学的証拠を有するが、真性糖尿病の臨床基準を満たしていないものにおける、アバタセプト（ＮＣＴ０１７７３７０７）及びテプリズマブ（ＮＣＴ０１０３０８６１）を研究する機関の支持／承認により証明される。疾患（即ち、自己抗体陽性及び高血糖）に向かって進行することが特定され得る高リスク患者において、疾患の発症を阻止又は遅延するために初期に処置を行うことは、短期及び長期両方に有益であり得る。短期において、若年小児／青年は、１日に複数の外因性インスリン注射の必要性を回避することができる。更に、より若い年齢でＴ１Ｄと診断された患者はより侵襲性の疾患を有し得ると予測される。したがって、２年以上発症を遅延させることにより、β細胞破壊のより急速な進行を回避することができる。長期において、早期のβ細胞集団の保存及び良好な血糖制御は、循環器疾患などの後年の重度の合併症又は有意な罹患率及び死亡率に関連する入院、並びに社会経済上の負担を軽減し得る。
【０３７７】
スポンサーは、Ｔ１Ｄにおいて一連の疾患進行があると考えているため、新規発症疾患における治療としての開発の考慮に加えて、本明細書に概説される試験においてプラスの結果が観察された場合、スポンサーは、Ｔ１Ｄ前疾患又は「阻止」における更なる評価を期待するであろう。スポンサーは、まだインスリン依存性ではない高血糖を伴うＴ１Ｄの２以上の自己抗体を有する６〜２１歳の小児／青年患者は臨床疾患に進行するリスクが最大の患者であり、前疾患状態の処置から最も利益を受けるであろうと考える。スポンサーは、ゴリムマブが上述の標的集団において利益を提供する有効な処置であるかを決定する際に、段階的アプローチを取ることを提案している。
【０３７８】
段階的アプローチにおけるスポンサーの第１工程は、この概要文書に記載される新規発症Ｔ１Ｄ研究においてゴリムマブの利益−リスクを確立することである。この研究の結果は、β細胞集団の保存並びにこの患者集団における安全性プロファイルに対するゴリムマブの効果の重要な情報を提供するであろう。Ｔ１Ｄの正式な臨床診断をまだ満たしていないが、Ｔ１Ｄの一等親血縁者をもつ６〜２１歳のパイロット研究の初期計画段階では、Ｔ１Ｄに対して二重自己抗体陽性であり、わずかに上昇したＨｂＡ１ｃ（即ち、５．６〜６．４％）を有する。このパイロット研究の目標は、初期の安全性及び有効性情報を得て、前疾患状態におけるゴリムマブによる利益の機序を確立することである。この試験は、上述の新規発症個体における研究の後に開始される。これら２つの初期の研究は補完であり、標的の前Ｔ１Ｄ集団におけるゴリムマブによる処置の利益−リスクを評価するためのＴ１Ｄ研究の開発のために、リスクの高いものにおける、より大規模で、より正式な「概念実証」臨床治験の計画を伝える重要なデータを提供する。
【０３７９】
スポンサーは、Ｔ１Ｄのリスクにあるものにおける概念実証研究の準備という観点から、これら２つの初期の研究からの結果を伝えて、前Ｔ１Ｄの処置におけるゴリムマブの強固な開発計画に対して機関と協調するつもりである。
【０３８０】
表８：Ｓｉｍｐｏｎｉ小児用提示の支持における研究
この提示は既に成人での使用に承認されているため、以前に提出されたデータに対して相互参照が行われる。
【０３８１】
略語：ＦＤＡ＝食品医薬品局、ＨＣＰ＝医療専門家、ＨＦＳ＝人的要因研究、ＩＦＵ＝使用説明書、ＰＦＳ＝プレフィルドシリンジ、ＰＦＳ−Ｕ＝ＵｌｔｒａＳａｆｅ  Ｐａｓｓｉｖｅ（登録商標）針ガードのプレフィルドシリンジ、ＰＫ＝薬物動態（複数可）、ｓＢＬＡ＝生物製剤認可追加申請書（Supplemental Biologics License Application）、ＵＣ＝潰瘍性大腸炎。
【０３８２】
Ａ−ＶａｒｉｏＪｅｃｔの使用実態研究
研究：
ＶａｒｉｏＪｅｃｔ使用実態研究（ラベル表示理解、安全性、及びデバイス耐久性／堅牢性の評価を含む）。この研究は、小児ＵＣ適応症に対する外挿に基づくアプローチを支持し、ＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスが意図する小児集団において期待される薬物曝露を達成することができることを示すために、体重４５ｋｇ未満の小児におけるＰＫデータを提供するために行われるＣＮＴＯ１４８ＵＣＯ１００２の下位研究として行われる。
【０３８３】
目的：
適切なトレーニング及び書面による使用説明書とともに、設計どおりにＶａｒｉｏＪｅｃｔが被験体又は被験体の介護者による自宅投与に適しているという支持的データを提供すること。ＶａｒｉｏＪｅｃｔが小児患者集団における使用に適していることを示す支持的安全性データを提供すること。支持的なＶａｒｉｏＪｅｃｔの耐久性及び堅牢性データを提供すること。
【０３８４】
説明：注射を行う全ての研究参加者は、２回目の自宅投与後に、ＶａｒｉｏＪｅｃｔを使用した彼らの経験に関する質問に回答することを求められる。検査のためにデバイスを返却することを含む、全てのデバイスの苦情及びデバイス関連ＡＥを捕捉し調査する。約５０〜１００の使用済ＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスのランダムサンプリングの視覚的評価を行い、デバイスの耐久性及び堅牢性を評価する。
【０３８５】
備考：研究及び質問は、苦情及び使用不具合を含む、実生活でのＶａｒｉｏＪｅｃｔの取り扱い、並びに自宅環境において被験体及び介護者によって投与された注射からの使用経験データを捕捉及び文書化するように考案されている。
【０３８６】
Ｂ−ＰＦＳ使用実態研究
研究：
ＰＦＳ−Ｕ使用実態研究（ラベル表示理解及び安全性の評価を含む）。この研究はＣＮＴＯ１４８ＵＣＯ１００２の下位研究として行われる。
【０３８７】
目的：
適切なトレーニング及び書面による使用説明書とともに、設計どおりにＰＦＳ−Ｕが小児被験体又は被験体の介護者による自宅投与に適しているという支持的データを提供すること。ＰＦＳ−Ｕが小児患者集団における使用に適していることを示す支持的安全性データを提供すること。
【０３８８】
説明：
注射を行う全ての研究参加者は、２回目の自宅投与後に、ＰＦＳ−Ｕを使用した彼らの経験に関する質問に回答することを求められる。検査のためにデバイスを返却することを含む、全てのデバイスの苦情及びデバイス関連ＡＥを捕捉し調査する。
【０３８９】
備考
研究及び質問は、苦情及び使用不具合を含む、実生活でのＰＦＳ−Ｕの取り扱い、並びに自宅環境において被験体及び介護者によって投与された注射からの使用経験データを捕捉及び文書化するように考案されている。
【０３９０】
Ｃ−小児の累積的人的要因の研究
研究：
小児の累積的人的要因（ラベル理解の評価を含む）
目的：
この研究の目的は、ＶａｒｉｏＪｅｃｔ及びＰＦＳ−Ｕが現実的な条件下で（介護者、医療専門家［ＨＣＰ］により、又は自己投与）意図する集団において、安全に使用され得ることを示す中心的なデバイスの有用性データを提供し、デバイスの使用説明書を検証することである。
【０３９１】
説明：
ＦＤＡ  ｇｕｉｄａｎｃｅ：Ａｐｐｌｙｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｕｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｔｏ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ（２０１１）を指針として、代表的な使用環境において、標的集団におけるシミュレーションデバイス使用研究が人的要因エキスパートにより行われた。この研究において、約４５人の被験体を３つの群に分ける。群１は、家族介護者及びＨＣＰの混合である（ＶａｒｉｏＪｅｃｔ注射）。群２は、自己注射（ＶａｒｉｏＪｅｃｔ注射）が可能な小児被験体である。群３は、自己注射（ＰＦＳ−Ｕ注射）が可能な小児被験体である。全体的な性能の成功は、ユーザーが深刻な害をもたらす可能性のある誤使用が何もなく完全な用量を送達するときに達成される。提案された研究は、個々のタスクレベルで合否基準を割り当て、エラー、間一髪、及び／又は困難などの挙動が個々のタスクレベルで記録される。主観的な参加者のフィードバックは説話形式で収集され、参加者は、手順及びデバイス設計についてフリーアンサーの質問を尋ねられる。参加者は、ＩＦＵに提供される指示の知識及び理解を評価するための探査質問を尋ねられる。
【０３９２】
備考
使用説明書とともに、プロトコルが見直し及び備考のためにＦＤＡに提出された（ｅＣＴＤ  ＩＮＤ  １００１８１；シーケンス番号０３０７）。形成的研究においてこれまでに見られた使用エラーの要約、及びこれらの研究がどのように製品設計及びラベル表示を伝えたかの考察がこの提出物に含まれた。この人的要因研究の結果は、最終ＨＦＳ報告書とともにｓＢＬＡに要約され、そして新たなＶａｒｉｏＪｅｃｔの登録を支持し、小児用使用のためのＰＦＳ−Ｕの使用を拡大することを意図する。
【０３９３】
Ｄ−ＶａｒｉｏＪｅｃｔ性能試験
研究：
１．）実証試験
２．）機能安定性試験
３．）デバイス構成要素の加速劣化及び実劣化
４．）組み立てプロセスの検証
５．）シミュレーション使用（安全性）研究
６．）生体適合性試験
７．）出荷試験
８．）ＶａｒｉｏＪｅｃｔ送達後の生化学試験
【０３９４】
目的：
これらの研究の目的は、ＶａｒｉｏＪｅｃｔデバイスがその設計要件を満たすことを示すことである。
【０３９５】
説明：
１．実証試験は以下に従い行われる。
●ＩＳＯ  １１６０８：２０１２  Ｎｅｅｄｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｕｓｅ−Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ．ＶａｒｉｏＪｅｃｔは、指定されたＤ２一体型、単回投与、非交換式の容器であり、そのため、送達可能量の一部が排出される。
●ＦＤＡ  Ｄｒａｆｔ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｎ，Ｊｅｔ，ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｉｎｊｅｃｔｏｒｓ  Ｉｎｔｅｎｄｅｄ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ。
【０３９６】
開発及び試験プログラムの重要な要素は以下を含む：
●選択されダイヤルされた用量が製品の貯蔵寿命にわたって精度基準を満たす設計及び実証
●針の延長が制限され、皮下投与に適した設計及び実証
●予測される使用における設計及び製造耐久性の実証
●偶発的な針刺しから保護するように意図されたデバイス安全機構が確実に動作することの実証
【０３９７】
２．機能安定性試験は、薬物−デバイスの組み合わせ製品の老化、その後デバイスの機能性を確実にするためのデバイス試験を評価する。組み立てられた製品は、２〜８℃の推奨温度並びに加速（２５℃）条件で保管される。
【０３９８】
３．加速劣化試験のために、デバイスの下位組立体を高温劣化に曝し、その後薬物が充填されたＰＦＳとともに組み立て、デバイスの機能性を確実にするためのデバイス試験を行う。加速劣化データは、室温で保管されたデバイスの下位組立体の実時間劣化試験により支持される。
【０３９９】
４．組み立てプロセス検証は、商業発売のＶａｒｉｏＪｅｃｔを組み立てるために使用される機器を使用して薬物−デバイスの組み合わせ製品を組み立て、続いてデバイス試験を行うことを伴う。
【０４００】
５．シミュレーション使用（安全性）研究は、ＩＳＯ  ２３９０８：２０１１  Ｓｈａｒｐｓ  ｉｎｊｕｒｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ−−Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ−Ｓｈａｒｐｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｕｓｅ  ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｃ  ｎｅｅｄｌｅｓ，ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｒｓ  ｆｏｒ  ｃａｔｈｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  ｎｅｅｄｌｅｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ａｎｄ  ＦＤＡ  Ｓｔａｆｆ：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｈａｒｐｓ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｆｅａｔｕｒｅｓに従い、針安全機構の成功した動作を示す５００＋の模擬注射を含む。
【０４０１】
６．生体適合性試験は、制限された接触持続時間（２４時間以下）を有する皮膚接触表面デバイスのためのＩＳＯ−１０９９３−１：２００９  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ−−Ｐａｒｔ  １：Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｒｉｓｋ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓに従い行われる。
【０４０２】
７．出荷試験は、ＡＳＴＭ  Ｄ４１６９：Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｈｉｐｐｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓに従い行われ、容器閉鎖完全性の評価を含む。
【０４０３】
８．ＶａｒｉｏＪｅｃｔ送達後の生化学試験は、ＶａｒｉｏＪｅｃｔによる送達中に発生したＳＩＭＰＯＮＩに対する剪断力がＳＩＭＰＯＮＩの生化学属性に悪影響を与えたかどうかを決定するために行われる。
【０４０４】
【表８】
2019509988.tif 000009
【０４０５】
【表９】
2019509988.tif 000010
【０４０６】
【表１０】
2019509988.tif 000011
【０４０７】
【表１１】
2019509988.tif 000012
【０４０８】
規制上の考慮
Ｔ１ＤのためのＩＮＤの提出予定
スポンサーは、２０１６年第２四半期までにＴ１Ｄの処置のためのゴリムマブの研究に関してＩＮＤを提出することを予定している。ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び潰瘍性大腸炎の処置に関して米国において承認されている。
【０４０９】
スポンサーは、以下の肺、アレルギー、及びリウマチ製品（ＤＰＡＲＰ）部門、又は胃腸及び先天性異常製品ＤＧＩＥＰ）部門の有効なＢＬＡを有する。
【０４１０】
ＢＬＡ１２５２８９：以下の適応症の、２００９年４月２４日に承認されたゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標））に対して：
●ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）は、メトトレキサート（ＭＴＸ）との組み合わせで、中程度から重度の活動性関節リウマチを有する成人患者の処置に適応する。
●ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）は、単独で又はメトトレキサート（ＭＴＸ）との組み合わせで、活動性乾癬性関節炎を有する成人患者の処置に適応する。
●ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）は、活動性強直性脊椎炎を有する成人患者の処置に適応する。
●ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）は、コルチコステロイド依存性を示した、又は以下のための経口アミノサリチル酸、経口コルチコステロイド、アザチオプリン、若しくは６−メルカプトプリンに対して不適切な応答を有するか、又は耐性のなかった、中程度から重度の活動性潰瘍性大腸炎を有する成人患者において適応する：
○臨床応答の誘導及び維持
○誘導中の粘膜の内視鏡的外観の改善
○臨床的寛解の誘導
○誘導応答における臨床寛解の達成及び維持。
【０４１１】
スポンサーは、ＤＰＡＲＰ又はＤＧＩＥＰのゴリムマブ成長プログラムを支持する４つの有効ＩＮＤを有する。
●中程度から重度の活動性関節リウマチ（多関節ＪＩＡを含む）の処置のためのＣＮＴＯ１４８（ゴリムマブ）の研究に関するＩＮＤ  ０９９２５
●活動性乾癬性関節炎の処置のためのＣＮＴＯ１４８（ゴリムマブ）の研究に関するＩＮＤ  １２７２３
●活動性強直性脊椎炎の処置のためのＣＮＴＯ１４８（ゴリムマブ）の研究に関するＩＮＤ  １２７２９
●潰瘍性大腸炎（小児ＵＣを含む）の処置のためのＣＮＴＯ１４８（ゴリムマブ）の研究に関するＩＮＤ  １００１８１
【０４１２】
下のＩＮＤ要件表（表１０）に記されるように、スポンサーは、新しいＩＮＤに対する項目又はＩＮＤ  ０９９２５若しくはＢＬＡ１２５２８９に対する相互参照いずれかを提出することを提案している。これらはテキスト相互参照のみ（電子ハイパーリンクなし）である。
【０４１３】
【表１２】
2019509988.tif 000013
【０４１４】
以上の記述及び実施例中で特に記されたものとは異なる形で本発明を実施できることは明白となるであろう。
【０４１５】
以上の教示に照らして、本発明の数多くの修正及び変形形態が可能であり、したがって、これらは添付の特許請求の範囲内に入るものである。
【０４１６】
参考文献
Ａｇａｒｗａｌ，Ａ．ａｎｄ  Ｋ．Ｌ．Ｂｒａｙｍａｎ（２０１２）。「Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ。」Ｓｅｍｉｎ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ  Ｒａｄｉｏｌ  ２９（２）：９０〜９８。
【０４１７】
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【０４１８】
Ａｒｉｆ，Ｓ．，Ｐ．Ｃｏｘ，Ｂ．Ａｆｚａｌｉ，Ｇ．Ｌｏｍｂａｒｄｉ，Ｒ．Ｉ．Ｌｅｃｈｌｅｒ，Ｍ．Ｐｅａｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｖ．Ｍｉｒｅｎｄａ（２０１０）。「Ａｎｔｉ−ＴＮＦａｌｐｈａ  ｔｈｅｒａｐｙ−−ｋｉｌｌｉｎｇ  ｔｗｏ  ｂｉｒｄｓ  ｗｉｔｈ  ｏｎｅ  ｓｔｏｎｅ？」Ｌａｎｃｅｔ  ３７５（９７３３）：２２７８。
【０４１９】
Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｊ．Ａ．Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｇ．Ｓ．Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ，Ｍ．Ｈｅｂｒｏｋ，Ｋ．Ｃ．Ｈｅｒｏｌｄ，Ｄ．Ａｃｃｉｌｉ，Ｍ．Ｐｉｅｔｒｏｐａｏｌｏ，Ｐ．Ｒ．Ａｒｖａｎ，Ｍ．Ｖｏｎ  Ｈｅｒｒａｔｈ，Ｄ．Ｓ．Ｍａｒｋｅｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．Ｒｈｏｄｅｓ（２０１１）。「Ｈｏｗ  ｄｏｅｓ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐ？：ｔｈｅ  ｎｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｉｃｉｄｅ  ｏｒ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．」Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６０（５）：１３７０〜１３７９。
【０４２０】
Ｂｌａｕ，Ｊ．Ｅ．，Ｍ．Ｒ．Ａｂｅｇｇ，Ｗ．Ａ．Ｆｌｅｇｅｌ，Ｘ．Ｚｈａｏ，Ｄ．Ｍ．Ｈａｒｌａｎ  ａｎｄ  Ｋ．Ｉ．Ｒｏｔｈｅｒ（２０１５）。「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｓｏｌｉｔａｒｙ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ａ  ｄｅｃａｄｅ。」Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５（１１）：２９９５〜３００１。
【０４２１】
Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｊ．Ａ．，Ｋ．Ｈｅｒｏｌｄ  ａｎｄ  Ｇ．Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ（２０１０）。「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ。」Ｎａｔｕｒｅ  ４６４（７２９３）：１２９３〜１３００。
【０４２２】
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Ｍｏｌｂａｋ，Ａ．Ｇ．，Ｂ．Ｃｈｒｉｓｔａｕ，Ｂ．Ｍａｒｎｅｒ，Ｋ．Ｂｏｒｃｈ−Ｊｏｈｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｎｅｒｕｐ（１９９４）。「Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ｉｎ  ａｇｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｖｅｒ  ３０  ｙｅａｒｓ  ｉｎ  Ｄｅｎｍａｒｋ。」Ｄｉａｂｅｔ  Ｍｅｄ  １１（７）：６５０〜６５５。
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Ｍｏｒａｎ，Ａ．，Ｂ．Ｂｕｎｄｙ，Ｄ．Ｊ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｌ．Ａ．ＤｉＭｅｇｌｉｏ，Ｓ．Ｅ．Ｇｉｔｅｌｍａｎ，Ｒ．Ｇｏｌａｎｄ，Ｃ．Ｊ．Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ，Ｋ．Ｃ．Ｈｅｒｏｌｄ，Ｊ．Ｂ．Ｍａｒｋｓ，Ｐ．Ｒａｓｋｉｎ，Ｓ．Ｓａｎｄａ，Ｄ．Ｓｃｈａｔｚ，Ｄ．Ｋ．Ｗｈｅｒｒｅｔｔ，Ｄ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｋｒｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｓｋｙｌｅｒ，Ｇ．Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ＴｒｉａｌＮｅｔ  Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ  Ｓｔｕｄｙ，Ｌ．Ｐｉｃｋｅｒｓｇｉｌｌ，Ｅ．ｄｅ  Ｋｏｎｉｎｇ，Ａ．Ｇ．Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｂ．Ｂｏｅｈｍ，Ｋ．Ｂａｄｅｎｈｏｏｐ，Ｎ．Ｓｃｈｌｏｏｔ，Ｊ．Ｆ．Ｂａｋ，Ｐ．Ｐｏｚｚｉｌｌｉ，Ｄ．Ｍａｕｒｉｃｉｏ，Ｍ．Ｙ．Ｄｏｎａｔｈ，Ｌ．Ｃａｓｔａｎｏ，Ａ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．Ｈ．Ｌｅｒｖａｎｇ，Ｈ．Ｐｅｒｒｉｌｄ，Ｔ．Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ａ．Ｓ．Ｇｒｏｕｐ，Ｆ．Ｐｏｃｉｏｔ  ａｎｄ  Ｃ．Ａ．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ（２０１３）。「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｅｎｔ  ｏｎｓｅｔ：ｔｗｏ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌｓ。」Ｌａｎｃｅｔ  ３８１（９８８１）：１９０５〜１９１５。
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Ｍｏｒｄｅｓ，Ｊ．Ｐ．，Ｒ．Ｂｏｒｔｅｌｌ，Ｊ．Ｄｏｕｋａｓ，Ｍ．Ｒｉｇｂｙ，Ｂ．Ｗｈａｌｅｎ，Ｄ．Ｚｉｐｒｉｓ，Ｄ．Ｌ．Ｇｒｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ａ．Ｒｏｓｓｉｎｉ（１９９６）。「Ｔｈｅ  ＢＢ／Ｗｏｒ  ｒａｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ。」Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｖ  １２（２）：１０３〜１０９。
【０４５０】
Ｏｒｂａｎ，Ｔ．，Ｂ．Ｂｕｎｄｙ，Ｄ．Ｊ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｌ．Ａ．Ｄｉｍｅｇｌｉｏ，Ｓ．Ｅ．Ｇｉｔｅｌｍａｎ，Ｒ．Ｇｏｌａｎｄ，Ｐ．Ａ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｃ．Ｊ．Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｂ．Ｍａｒｋｓ，Ｒ．Ｍｏｎｚａｖｉ，Ａ．Ｍｏｒａｎ，Ｍ．Ｐｅａｋｍａｎ，Ｐ．Ｒａｓｋｉｎ，Ｗ．Ｅ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓｃｈａｔｚ，Ｄ．Ｋ．Ｗｈｅｒｒｅｔｔ，Ｄ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｋｒｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｓｋｙｌｅｒ  ａｎｄ  Ｇ．Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ＴｒｉａｌＮｅｔ  Ａｂａｔａｃｅｐｔ  Ｓｔｕｄｙ（２０１４）。「Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｂａｔａｃｅｐｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｅｎｔ−ｏｎｓｅｔ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  １  ｙｅａｒ  ａｆｔｅｒ  ｃｅｓｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ。」Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ３７（４）：１０６９〜１０７５。
【０４５１】
Ｏｒｂａｎ，Ｔ．，Ｂ．Ｂｕｎｄｙ，Ｄ．Ｊ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｌ．Ａ．ＤｉＭｅｇｌｉｏ，Ｓ．Ｅ．Ｇｉｔｅｌｍａｎ，Ｒ．Ｇｏｌａｎｄ，Ｐ．Ａ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｃ．Ｊ．Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｂ．Ｍａｒｋｓ，Ｒ．Ｍｏｎｚａｖｉ，Ａ．Ｍｏｒａｎ，Ｐ．Ｒａｓｋｉｎ，Ｈ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｗ．Ｅ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓｃｈａｔｚ，Ｄ．Ｗｈｅｒｒｅｔｔ，Ｄ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｋｒｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｓｋｙｌｅｒ  ａｎｄ  Ｇ．Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ＴｒｉａｌＮｅｔ  Ａｂａｔａｃｅｐｔ  Ｓｔｕｄｙ（２０１１）。「Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｂａｔａｃｅｐｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｅｎｔ−ｏｎｓｅｔ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ。」Ｌａｎｃｅｔ  ３７８（９７８９）：４１２〜４１９。
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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