(57)【要約】  本明細書において、ＥＭＰ２を発現または過剰発現する癌の治療及び診断に有用な新規抗ＥＭＰ２抗体が提供される。１つの態様では、本明細書において、上皮膜タンパク質２（ＥＭＰ２）に結合し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、単離抗体が提供される。重鎖可変領域は、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含み、軽鎖可変領域は、３つの軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１の配列は、配列番号１１であり、ＨＣＤＲ２の配列は、配列番号１２であり、ＨＣＤＲ３の配列は、配列番号１３であり、ＬＣＤＲ１の配列は、配列番号１４であり、ＬＣＤＲ２の配列は、配列番号１５であり、ＬＣＤＲ３の配列は、配列番号１６である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮膜タンパク質２（ＥＭＰ２）に結合する単離抗体であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含み、前記軽鎖可変領域が、３つの軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ）を含み、ＨＣＤＲ１の配列が、配列番号１１であり、ＨＣＤＲ２の配列が、配列番号１２であり、ＨＣＤＲ３の配列が、配列番号１３であり、ＬＣＤＲ１の配列が、配列番号１４であり、ＬＣＤＲ２の配列が、配列番号１５であり、ＬＣＤＲ３の配列が、配列番号１６である、抗体。
【請求項２】
上皮膜タンパク質２（ＥＭＰ２）に結合する単離抗体であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号３と９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４または配列番号５と９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項３】
前記抗体が、配列番号３に従ったアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号６に従ったアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号３に従ったアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号６に従ったアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号８に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト抗体、ダイアボディ、ミニボディ、もしくはトリアボディ、キメラ抗体、または組換え抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、またはトリアボディ形式である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、細胞毒性剤または標識と複合される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載の抗体のうちのいずれか１つ及び生理学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
患者における癌の治療または再発率の低減方法であって、前記方法が、
前記患者に、有効量の、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＥＭＰ２抗体を投与することを含み、前記重鎖可変領域が、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含み、前記軽鎖可変領域が、３つの軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ）を含み、ＨＣＤＲ１の配列が、配列番号１１であり、ＨＣＤＲ２の配列が、配列番号１２であり、ＨＣＤＲ３の配列が、配列番号１３であり、ＬＣＤＲ１の配列が、配列番号１４であり、ＬＣＤＲ２の配列が、配列番号１５であり、ＬＣＤＲ３の配列が、配列番号１６である、方法。
【請求項１２】
前記重鎖可変領域が、配列番号３と９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４または配列番号５と９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、配列番号３に従ったアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、配列番号６に従ったアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、配列番号４に従ったアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、配列番号６に従ったアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号８に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、前記投与ステップの前に、ＥＭＰ２と、ＣＤ４４、ＣＤ１３３  ＡＢＣＧ２、及びＡＬＤＨからなる群から選択される１つ以上のマーカーとを発現する患者における癌幹細胞を検出するステップを含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、生理学的に許容される担体または薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者に、有効量の少なくとも１つの追加の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの追加の抗癌剤が、白金系化学療法薬、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの追加の抗癌剤が、ＥＧＦＲ阻害剤を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、抗ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、マツズマブ、パニツムマブ、及びニモツズマブからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤が、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、及びＡＧ１４７８からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの追加の抗癌剤が、ＶＥＧＦ阻害剤を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が、抗ＶＥＧＦ抗体を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が、ベバシズマブである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、エフェクター部分と複合される、請求項１２〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記エフェクター部分が、毒剤である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記毒剤が、例えば、リシンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療が、前記癌の侵襲性を遮断することを含む、請求項１１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が、前記癌のためのワクチン療法において使用される、請求項１１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記患者が、ヒトまたは哺乳動物である、請求項１１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記癌が、乳癌である、請求項１１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が、脳癌、結腸癌、黒色腫、白血病（例えば、ＡＭＬ）、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、及び胃癌を含む群から選択される癌である、請求項１１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
コンパニオン診断薬をさらに含む、請求項１１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記コンパニオン診断薬が、抗ＥＭＰ２抗体を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
癌幹細胞を検出する方法であって、前記方法が、
癌を有するか、またはその疑いがあるヒトに由来する生体試料を得ることと、
発現ＥＭＰ２ならびにＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、及びＡＬＤＨからなる群から選択される１つ以上のマーカーを検出することと、を含み、
前記検出が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＥＭＰ２抗体を使用して行われ、前記重鎖可変領域が、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含み、前記軽鎖可変領域が、３つの軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ）を含み、ＨＣＤＲ１の配列が、配列番号１１であり、ＨＣＤＲ２の配列が、配列番号１２であり、ＨＣＤＲ３の配列が、配列番号１３であり、ＬＣＤＲ１の配列が、配列番号１４であり、ＬＣＤＲ２の配列が、配列番号１５であり、ＬＣＤＲ３の配列が、配列番号１６である、方法。
【請求項４１】
前記ヒトが、乳癌を有するか、またはその疑いがある、請求項４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記ヒトが、トリプルネガティブ乳癌を有するか、またはその疑いがある、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ヒトが、子宮内膜癌を有するか、またはその疑いがある、請求項４０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法１１９条（ｅ）の下、全ての目的についてその全体において参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年１２月４日に出願された米国仮出願第６２／２６３，５６１号の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により付与された、ＣＡ１６３９７１の政府支援で創案された。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、抗ＥＭＰ２抗体、それらの薬学的組成物、ならびに、トリプルネガティブ乳癌及び子宮内膜癌のような、ＥＭＰ２を発現する癌の検出及び治療におけるそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
上皮膜タンパク質−２（ＥＭＰ２）は、テトラスパンタンパク質の増殖停止特異的−３／末梢性ミエリンタンパク質−２２（ＧＡＳ３／ＰＭＰ２２）ファミリーのメンバーである。他の４回膜貫通ファミリー、コネクシン、及びテトラスパニンは、ギャップ結合、細胞間認識プロセス、及び細胞内輸送において役割を果たす。ＧＡＳ３／ＰＭＰ２２ファミリーについては、あまり知られていない。入手可能な情報は、主に、様々な疾患におけるそれらの潜在的役割に関する。例えば、原型ＧＡＳ３ファミリーメンバーＰＭＰ２２における変異は、神経変性疾患（すなわち、デジェリン・ソッタス症候群及びシャルコー・マリー・トゥース症候群）を引き起こすことが見出された。ＥＭＰ２は、Ｂ細胞腫瘍進行及びストレス誘導性アポトーシスにおいても関係している。
【０００５】
ＥＭＰ２は、肺、目、及び尿生殖路の上皮細胞において高レベルで発現する。いくつかのテトラスパンタンパク質（ＣＤ９、ＣＤ８１、ＰＭＰ２２）と同様に、ネズミ線維芽細胞中のＥＭＰ２は、脂質ラフトドメインに局在化する。ＥＭＰ２は、特定のインテグリン、ＧＰＩ結合タンパク質、及びＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面輸送及び機能を制御し、カベオリン発現を相互調整する。Ｃｌａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：７９７４−８４（２００１）、Ｈａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ６９：２２７−３２（２００２）、Ｗａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ７４：１０６−１２（２００３）、Ｗａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １５：２０７３−２０８３（２００４）、Ｗａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４１０９４−４１１００（２００２）、及びＷａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０７：１２９−１３６（２００３）を参照されたい。
【０００６】
子宮内膜癌（ＥＣ）は、最も一般的な婦人科悪性腫瘍である。米国では、ＥＣの死亡率は過去２０年で２倍となり、現在女性が生涯の間にＥＣを発症する確率は約３％である（Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒｓ：Ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｆｅｍａｌｅ  Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｔｒａｃｔ，Ｌｙｏｎ：ＩＡＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．２２１−５７（２００３）、Ｓｏｒｏｓｋｙ  ＪＩ，Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １１１：４３６−４７（２００８））。ＥＣは、組織学、臨床的挙動、及び疫学に基づき、２つの主要なサブグループに分類される。より一般的なタイプＩは、エストロゲン優位性及び前悪性子宮内膜増殖症と関連付けられる（Ｈｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：４７８３−９１（２００６）、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  １３：２９５−３０８（２０００））。タイプＩＩは、非ホルモン性リスク因子により媒介され、侵襲性臨床経過を伴う高グレードまたは高リスクの組織構造を有することが多い（Ｈｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：４７８３−９１（２００６））。ＥＣの発生率は一般的には年齢と共に増加し、新規症例の７５〜８０％は閉経後の女性において発生する（Ｃｒｅａｓｍａｎ，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：Ｓ１−１４０−Ｓ１−５０（１９９７））。
【０００７】
１つの有望なバイオマーカーは、ＥＭＰ２であるように思われる。ＥＭＰ２発現は、ＥＭＰ２腫瘍症と関連付けられる（Ｗａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １０７：９０−８（２００６））。子宮内膜癌において、ＥＭＰ２は、臨床転帰不良を伴う腫瘍についての独立した予後指標である。ＥＭＰ２陽性腫瘍は、ＥＭＰ２陰性腫瘍と比較して、顕著に大きな子宮筋層侵襲性、高い臨床状態、外科的切除後の再発または持続性疾患、及び早期死亡率を有していた。ＥＭＰ２発現は、エストロゲン受容体及びプロゲステロン受容体のような他の既知のバイオマーカーから独立し（Ｗａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １０７：９０−８（２００６））、ＥＭＰ２は、ホルモンまたは化学療法に応答しない患者のための特有のバイオマーカーを表す。また、ＥＭＰ２発現レベルは、増殖期子宮内膜の増加する前悪性度と正に相関する。すなわち、正常な増殖期または静止期閉経前子宮内膜における最小発現、及び増殖期子宮内膜不調、子宮内膜増殖症、及び子宮内膜癌腫を有する患者における増加する発現を伴う、段階的な子宮内膜ＥＭＰ２発現がある。
【０００８】
乳癌は、依然として世界中の女性の間で最も一般的な悪性腫瘍のままである。乳癌は、幅広い臨床的挙動、予後、及び組織構造を示す、不均一な疾患である（Ｔａｖａｓｓｏｌｉ  Ｆ，Ｄｅｖｉｌｅｅ  Ｐ，ｅｄｉｔｏｒｓ．（２００３）ＷＨＯ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒｓ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｆｅｍａｌｅ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｏｒｇａｎｓ．Ｌｙｏｎ（Ｆｒａｎｃｅ）：ＩＡＲＣ  Ｐｒｅｓ）。乳癌は、乳房組織管及び小葉系列の細胞の異常な増殖であり、癌が管または小葉で発症したか、細胞が管または小葉を通って侵襲（増殖または拡散）しているか、及び顕微鏡下での細胞の外観（組織の組織構造）により分類される。単一の乳房腫瘍が侵襲性及び非侵襲性癌の混合物を有するのは珍しいことではない。
【０００９】
乳癌の分子分類は、しばしば「固有」サブタイプと呼ばれる、臨床的及び生物学的意味を有する、固有ルミナールサブタイプ、（ＨＥＲ２＋またはＥＲ−／ＨＥＲ２＋サブタイプとも称される）固有ＨＥＲ２富化サブタイプ、及び固有基底様乳癌（ＢＬＢＣ）サブタイプを含む、具体的なサブタイプを特定した。（Ｐｅｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。固有サブタイプの特定は、典型的には、（１）組織病理学的検出、（２）エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、及びヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）発現状態、ならびに（３）特徴的な細胞マーカーの検出を含む、方法の組み合わせにより達成されている。
【００１０】
正常な乳腺中の基底上皮細胞に特徴的な遺伝子を発現する基底様乳癌（ＢＬＢＣ）は、全ての乳癌の最大１５％〜２５％を構成し（Ｋｒｅｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７）、全ての乳癌タイプのうちの最悪の予後と関連付けられる。ＢＬＢＣは、エストロゲン受容体（ＥＲ−）、プロゲステロン受容体（ＰＲ−）、及びヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２−）を過小発現し、いわゆる「トリプルネガティブ」（ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−）乳癌の６０％〜９０％を包含する。ほとんどの基底様乳癌は、ＥＲ、ＰＲ、及びＨＥＲ２の発現状態に基づき、トリプルネガティブと称されることが多いが、全ての基底様乳癌がトリプルネガティブというわけではない。
【００１１】
ＥＭＰ２は、トリプルネガティブ乳癌において過剰発現する。ＥＭＰ２は、増殖停止特異的−３（ＧＡＳ３）ファミリーに属するテトラスパンタンパク質である。機能的には、ＥＭＰ２は、インテグリンαｖβ３及び焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）両方の局在化及び活性と関連し、これらを調節する。ＥＭＰ２（配列番号１）は、肺、目、及び尿生殖路の上皮細胞において高レベルで発現する。いくつかのテトラスパンタンパク質（ＣＤ９、ＣＤ８１、ＰＭＰ２２）と同様に、ネズミ線維芽細胞中のＥＭＰ２は、脂質ラフトドメインに局在化する。ＥＭＰ２は、特定のインテグリン、ＧＰＩ結合タンパク質、及びＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面輸送及び機能を制御し、カベオリン発現を相互調整する。Ｃｌａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：７９７４−８４（２００１）、Ｈａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ６９：２２７−３２（２００２）、Ｗａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ７４：１０６−１２（２００３）、Ｗａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １５：２０７３−２０８３（２００４）、Ｗａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４１０９４−４１１００（２００２）、及びＷａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０７：１２９−１３６（２００３）を参照されたい。
【００１２】
配列番号１（アクセッションＰ５４８５Ｉ）ＭＬＶＬＬＡＦＩＩＡ  ＦＨＩＴＳＡＡＬＬＦ  ＩＡＴＶＤＮＡＷＷＶ  ＧＤＥＦＦＡＤＶＷＲ  ＩＣＴＮＮＴＮＣＴＶ  ＩＮＤＳＦＱＥＹＳＴ  ＬＱＡＶＱＡＴＭＩＬ  ＳＴＩＬＣＣＩＡＦＦ  ＩＦＶＬＱＬＦＲＬＫ  ＱＧＥＲＦＶＬＴＳＩ  ＩＱＬＭＳＣＬＣＶＭ  ＩＡＡＳＩＹＴＤＲＲ  ＥＤＩＨＤＫＮＡＫＦ  ＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧ  ＹＳＹＩＬＡＷＶＡＦ  ＡＣＴＦＩＳＧＭＭＹ  ＬＩＬＲＫＲＫ
【００１３】
ＥＭＰ２は、ゴルジ後エンドソーム区間から適切な形質膜位置への分子の移動を促進することにより、様々なタンパク質及び糖脂質の輸送を調整すると思われる。具体的には、ＥＭＰ２は、選択分子の糖脂質富化脂質ラフト微小ドメイン（ＧＥＭ）への適切な輸送を促進すると考えられている（Ｗａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １５：２０７３−８３（２００４））。ＧＥＭは、効率的なシグナル伝達にとって重要なシャペロン、レセプトソーム、及びタンパク質複合体と関連付けられることが多いコレステロールに富んだ微小ドメインである（Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１５：９６３−７２（２００２）、Ｍｏｆｆｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：２１９１−８（２０００））。また、ＧＥＭは、ゴルジ装置から形質膜までのタンパク質の正確な選別に関与している（Ａｂｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：３０７２９−３６（２００１）、Ｇａｌｂｉａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０６：４０３−１１（２００１）、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：５５２−６３（１９９５））。この点において、ＥＭＰ２発現レベルの調節または形質膜上のその位置は、インテグリン、焦点接着キナーゼ、クラスＩ主要組織適合性分子、ならびにＣＤ５４及びＧＰＩ結合タンパク質のような他の免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーを含む、いくつかのクラスの分子の表面レパートリーを変更させる（Ｗａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２８７：３３６−４５（２００５）、Ｗａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０７：１２９−３６（２００３）、Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ（２００８））。
【００１４】
ＥＭＰ２発現は、ＥＭＰ２腫瘍症と関連付けられる（Ｗａｄｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １０７：９０−８（２００６））。子宮内膜癌において、例えば、ＥＭＰ２は、臨床転帰不良を伴う腫瘍についての独立した予後指標である。ＥＭＰ２陽性腫瘍は、ＥＭＰ２陰性腫瘍と比較して、顕著に大きな子宮筋層侵襲性、高い臨床状態、外科的切除後の再発または持続性疾患、及び早期死亡率を有していた。
【００１５】
ＥＭＰ２を、トリプルネガティブ乳癌及び子宮内膜癌のような、ＥＭＰ２を発現または過剰発現する癌の治療において標的として使用することができることは、以前に示されている。上述されるように、こうしたＥＭＰ２発現癌の予防、治療、及び調節において有用な他の新規方法及び組成物の大きなニーズが残っている。したがって、本明細書において、これら及び他のニーズを満たすための新規組成物及び方法が提供される。
【発明の概要】
【００１６】
本明細書において、ＥＭＰ２を発現または過剰発現する癌の治療及び診断に有用な新規抗ＥＭＰ２抗体が提供される。
【００１７】
１つの態様では、本明細書において、上皮膜タンパク質２（ＥＭＰ２）に結合し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、単離抗体が提供される。重鎖可変領域は、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含み、軽鎖可変領域は、３つの軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＤＲ１の配列は、配列番号１１であり、ＨＣＤＲ２の配列は、配列番号１２であり、ＨＣＤＲ３の配列は、配列番号１３であり、ＬＣＤＲ１の配列は、配列番号１４であり、ＬＣＤＲ２の配列は、配列番号１５であり、ＬＣＤＲ３の配列は、配列番号１６である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３と９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号４または配列番号５と９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。
【００１９】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号３に従ったアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６に従ったアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３に従ったアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号６に従ったアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号８に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００２１】
例示的な実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト抗体、ダイアボディ、ミニボディ、もしくはトリアボディ、キメラ抗体、または組換え抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、またはトリアボディ形式である。特定の実施形態では、当該抗体は、細胞毒性剤または標識と複合される。
【００２２】
別の態様では、本明細書において、本明細書で提供される当該抗体のいずれか１つ及び生理学的に許容される担体を含む、薬学的組成物が提供される。
【００２３】
別の態様では、本明細書において、患者における癌の治療または再発率の低減方法が提供される。方法は、患者に、有効量の、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＥＭＰ２抗体を投与することを含む。重鎖可変領域は、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含み、軽鎖可変領域は、３つの軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ）を含む。例示的な実施形態では、ＨＣＤＲ１の配列は、配列番号１１であり、ＨＣＤＲ２の配列は、配列番号１２であり、ＨＣＤＲ３の配列は、配列番号１３であり、ＬＣＤＲ１の配列は、配列番号１４であり、ＬＣＤＲ２の配列は、配列番号１５であり、ＬＣＤＲ３の配列は、配列番号１６である。
【００２４】
特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３と９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号４または配列番号５と９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３に従ったアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号６に従ったアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４に従ったアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号６に従ったアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号８に従ったアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、方法は、投与ステップの前に、ＥＭＰ２ならびにＣＤ４４、ＣＤ１３３  ＡＢＣＧ２、及びＡＬＤＨからなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する患者における癌幹細胞を検出するステップを含む。
【００２８】
当該方法のいくつかの実施形態では、抗体は、生理学的に許容される担体または薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００２９】
特定の実施形態では、方法は、患者に、有効量の、少なくとも１つの追加の抗癌剤を投与することを含む。例示的な実施形態では、少なくとも１つの追加の抗癌剤は、白金系化学療法薬、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３０】
特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の抗癌剤は、ＶＥＧＦ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、抗ＶＥＧＦ抗体を含む。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブである。
【００３１】
特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の抗癌剤は、ＥＧＦＲ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブを含む。例示的な実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、マツズマブ、パニツムマブ、及びニモツズマブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤である。特定の実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤は、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、及びＡＧ１４７８からなる群から選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、エフェクター部分と複合される。特定の実施形態では、エフェクター部分は、毒剤である。いくつかの実施形態では、毒剤は、例えば、リシンである。
【００３３】
当該方法の特定の実施形態では、治療は、癌の侵襲性を遮断することを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、当該抗体は、癌のためのワクチン療法において使用される。いくつかの実施形態では、患者は、ヒトまたは哺乳動物である。
【００３５】
当該方法のいくつかの実施形態では、癌は、乳癌である。当該方法の特定の実施形態では、癌は、脳癌、結腸癌、黒色腫、白血病（例えば、ＡＭＬ）、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、及び胃癌を含む群から選択される癌である。
【００３６】
当該方法のいくつかの実施形態では、方法は、コンパニオン診断薬を含む。特定の実施形態では、コンパニオン診断薬は、抗ＥＭＰ２抗体を含む。
【００３７】
別の態様では、本明細書において、癌幹細胞を検出する方法であって、癌を有するか、またはその疑いがあるヒトに由来する生体試料を得ることと、発現ＥＭＰ２を検出することと、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、及びＡＬＤＨからなる群から選択される１つ以上のマーカーの発現を検出することをさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、検出は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＥＭＰ２抗体を使用して行われる。重鎖可変領域は、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含み、軽鎖可変領域は、３つの軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ）を含み、ＨＣＤＲ１の配列は、配列番号１１であり、ＨＣＤＲ２の配列は、配列番号１２であり、ＨＣＤＲ３の配列は、配列番号１３であり、ＬＣＤＲ１の配列は、配列番号１４であり、ＬＣＤＲ２の配列は、配列番号１５であり、ＬＣＤＲ３の配列は、配列番号１６である。
【００３９】
検出方法の特定の実施形態では、ヒトは、癌を有するか、またはその疑いがある。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。例示的な実施形態では、ヒトは、トリプルネガティブ乳癌を有するか、またはその疑いがある。他の実施形態では、ヒトは、子宮内膜癌を有するか、またはその疑いがある。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＳＵＭ１４９細胞についての抗ＥＭＰ２ＩｇＧ１抗体の滴定を示す、グラフを含む。左、ＰＧ−１０１の再配合を、ＳＵＭ１４９細胞について、フローサイトメトリーを使用してその結合を測定することにより試験した。右、結合の特異性及び感度を確認するために、リツキシマブを陰性対照として使用した。
【図２】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に結合するＰＧ−１０１及びバリアントを示す、グラフを含む。ＰＧ−１０１（配合前）を、再配合されたＰＧ−１０１、バリアント１、及びバリアント２と比較した。
【図３】ＰＧ−１０１の再配合の安定性を試験するように設計された実験を表す、グラフを含む。左は、フローサイトメトリーを使用してＳＵＭ１４９細胞についてのＰＧ−１０１の結合親和性を測定するグラフである。右は、凍結及び解凍後のＰＧ−１０１の結合を示すグラフである。
【図４】抗ＥＭＰ２バリアント１が向上した親和性でのＥＭＰ２への結合を保持することを示す、グラフを含む。ＥＭＰ２へのＰＧ−１０１及びバリアント１結合を、ＳＵＭ１４９及びフローサイトメトリーを使用して決定した。
【図５】細胞死を誘発するＰＧ−１０１対バリアント１の能力を示す、グラフを含む。左、細胞死を、フローサイトメトリーを使用してアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム染色を定量化することにより測定した。右、５日間のインキュベーション後の総細胞数を、トリパンブルー色素排除を使用して計数した。
【図６】第２の独立した実験において細胞死を誘発するＰＧ−１０１対バリアント１の能力を示す、グラフである。細胞死を、フローサイトメトリーを使用してアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム染色を定量化することにより測定した。
【図７】第３の独立した実験において、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞中の細胞死を誘発するＰＧ−１０１対バリアント１の能力を示す、グラフである。左、細胞死を、フローサイトメトリーを使用してアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム染色を定量化することにより決定した。細胞を、５０μｇ／ｍｌ対照ＩｇＧ、ＰＧ−１０１、またはバリアント１で５日間インキュベートした。右、細胞数を、トリパンブルー色素排除を使用して計数した。
【図８】２つの独立した実験において、癌幹細胞の尺度である、ＡＬＤＨ活性を低減する抗ＥＭＰ２抗体の能力を示す２つのグラフを含む。
【図９】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８中のＡＬＤＨ活性を低減する当該抗ＥＭＰ２抗体能力を示す第３の独立した研究を表す。フローサイトメトリーの生の結果は、左に表され、右にグラフで示される。
【図１０】マンモスフィア形成アッセイを使用して癌幹細胞を阻害する当該抗ＥＭＰ２抗体の能力を示す。図１０は、対照ＩｇＧ、ＰＧ−１０１、またはバリアント１のインキュベーション後の細胞を２週間ＢＴ４７４細胞でインキュベートした生の画像を示す。
【図１１】マンモスフィア形成アッセイを使用して癌幹細胞を阻害する当該抗ＥＭＰ２抗体の能力を示す。図１１は、トリプリケートウェル中のマンモスフィアの計数を示す。＊、スチューデントのｔ検定を使用してｐ＜０．０５。
【図１２】可変軽鎖ＣＤＲ３またはＰＧ−１０１中の脱アミド化部位のコンピュータアルゴリズム予測を示す。
【図１３】潜在的ＰＧ−１０１脱アミド化部位が開裂に対して感受性であったかを特定するトリプシン開裂実験の要約を示す。配列易罹患性を確認するために、ＰＧ−１０１を、トリプシンを使用して開裂した後、質量分光分析を行った。質量分光分析は、ＣＤＲ３中の予測部位が開裂に対して感受性であったことを確認した。
【図１４】子宮内膜癌モデルにおいてインビボで腫瘍負荷を低減するＰＧ１０１及び（ここで「ＰＧ−２０１」と称される）バリアント１の能力の要約を提供する。
【図１５】乳癌細胞モデルにおいてインビボで腫瘍負荷を低減するバリアント１（「ＰＧ−２０１」）の能力の要約を提供する。
【図１６】ＰＧ−１０１中のＣＤＲ３脱アミン化部位が抗体薬物複合体としてのその使用を防止することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
序論
以前に、ヒト子宮内膜腺癌細胞株の抗ＥＭＰ２ダイアボディでの処理は、インビトロで顕著な細胞死及びカスパーゼ３開裂を誘発することが見出されたと示されている。例えば、米国特許公開第２０１０／０２７２７３２号を参照されたい。これらの応答は、細胞ＥＭＰ２発現と相関し、（ＥＭＰ２発現を生理学的に誘発する）プロゲステロンにより増強された。インビボでは、ＨＥＣ−１Ａ細胞株の皮下ヒト異種移植片の抗ＥＭＰ２ダイアボディでの処理は、腫瘍増殖を抑制し、顕著な異種移植片の細胞死を誘発した。ＥＭＰ２の標的化が乳癌の治療において治療戦略をもたらし得ることも以前に報告されている。例えば、その全体で参照により組み込まれる、米国特許公開第２０１０／０２７２７３２号を参照されたい。したがって、本明細書において、新規抗ＥＭＰ２抗体、それらの薬学的組成物、ならびにこうした新規抗ＥＭＰ２抗体を使用する、子宮内膜癌及び乳癌のような、癌の治療及び診断の方法が提供される。本明細書で提供される抗体は、既存の抗ＥＭＰ２抗体と比較して、少なくとも同等の安定性を示しながら、こうした既存の抗ＥＭＰ２抗体と比較して、ＥＭＰ２の第２の細胞外ループへの増加した結合親和性を示す。
【００４２】
したがって、その第１の態様では、本明細書において、癌（例えば、子宮内膜癌及び乳癌）を治療する新規抗ＥＭＰ２抗体及び方法が提供される。別の態様では、本発明は、こうした癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌及び子宮内膜癌）を検出する新規抗ＥＭＰ２抗体の組成物及び方法を提供する。別の態様では、本発明は、１つ以上の追加の療法との共投与の抗ＥＭＰ２抗体の組成物及び方法を提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法及び抗体との使用のためのコンパニオン診断方法及び生成物を提供する。
【００４３】
抗体
本発明において用途を見出す抗体は、従来の抗体、ならびに抗体誘導体、断片、及び模倣体のような、多数の形式をとることができる。特定の実施形態では、抗体は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む抗ＥＭＰ２抗体である。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、本明細書に記載される重鎖可変ドメインのいずれかを含み、軽鎖可変ドメインは、本明細書に記載される軽鎖可変ドメインのいずれかを含む。特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、本明細書に記載される重鎖のいずれかであり、軽鎖は、本明細書に記載されるいずれかの軽鎖である。
【００４４】
従来の抗体構造単位は、典型的にはテトラマーを含む。各テトラマーは、典型的にはポリペプチド鎖の２つの同一対からなり、各対は、（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）１つの「軽」及び（典型的には約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）１つの「重」鎖を有する。ヒト軽鎖は、κ及びλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして定義する。ＩｇＧは、これらに限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、これらに限定されないが、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含む、サブクラスを有する。よって、本明細書で使用される「アイソタイプ」とは、それらの定常領域の化学的及び抗原的特徴により定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。治療抗体は、アイソタイプ及び／またはサブクラスのハイブリッドも含むことができると理解されたい。
【００４５】
各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に寄与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。可変領域では、重鎖及び軽鎖のＶドメインの各々について、３つのループが集合して抗原結合部位を形成する。ループの各々は相補性決定領域と称され（以降「ＣＤＲ」と称され）、アミノ酸配列中の変化が最も顕著である。「可変」とは、可変領域の特定のセグメントが抗体間で配列が広範囲にわたって異なるという事実を指す。可変領域内の可変性は、均一に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、各々９〜１５のアミノ酸長以上である「超可変領域」と呼ばれる極度の可変性のより短い領域により分離される１５〜３０のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる相対的に不変の範囲からなる。
【００４６】
各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で配置される、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）及び４つのＦＲからなる。
【００４７】
超可変領域は、一般的には、軽鎖可変領域中の約アミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域中の約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を示す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）辺りからのアミノ酸残基、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈＥｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）ならびに／または超可変ループを形成する残基（例えば、軽鎖可変領域中の残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域中の２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、及び９６〜１０１（ＨＣＤＲ３））、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）を包含する。本発明の具体的なＣＤＲを下に記載する。
【００４８】
本明細書を通して、可変ドメイン中の残基（おおよそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７及び重鎖可変領域の残基１〜１１３）に言及する際は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムが一般的には使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，上記（１９９１））。
【００４９】
ＣＤＲは、抗体の抗原結合、またはより具体的には、エピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特異的な抗原結合部位と相互作用する決定因子を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖のような分子の分類であり、通常は特異的な構造特徴、及び特異的な電荷特徴を有する。単一抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。例えば、本明細書に記載されるように、抗体は、ＥＭＰ２の推定第２の細胞外ドメイン中のエピトープに結合する。
【００５０】
エピトープは、（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）結合に直接関与しているアミノ酸残基、及び特異的抗原結合ペプチドにより効果的に遮断されるアミノ酸残基のような、結合に直接関与していない他のアミノ酸残基を含み得、換言すると、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。
【００５１】
いくつかの実施形態では、エピトープは、配列番号２から誘導され、配列番号２は、ＥＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧであり、ヒトＥＭＰ２の第２の細胞外ループからの２０マーポリペプチド配列を表す。
【００５２】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスでは、重鎖中にいくつかの免疫グロブリンドメインがある。本明細書における「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、別個の三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明において興味深いのは、定常重（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む、重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体の文脈では、ＩｇＧアイソタイプは各々３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧの文脈における「ＣＨ」ドメインは次の通りである。「ＣＨ１」とは、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従った１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」とは、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従った２３７〜３４０位を指し、「ＣＨ３」とは、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従った３４１〜４４７位を指す。
【００５３】
重鎖のＩｇドメインの別のタイプは、ヒンジ領域である。本明細書における「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１と第２の定常ドメインの間のアミノ酸を含む柔軟性ポリペプチドを意味する。構造的には、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインはＥＵ２２０位で終わり、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは残基ＥＵ２３７位で始まる。よってＩｇＧについて、抗体ヒンジは、本明細書において、２２１（ＩｇＧ１中のＤ２２１）〜２３６（ＩｇＧ１中のＧ２３６）位を含むと定義され、ナンバリングはＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃ領域の文脈において、下方ヒンジが含まれ、「下方ヒンジ」とは一般的には２２６または２３０位を指す。
【００５４】
本発明において興味深いのは、Ｆｃ領域である。本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン及びいくつかの場合でヒンジの一部を除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。よってＦｃとは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインに対してＮ末端の柔軟性ヒンジを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについて、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧについて、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３（Ｃγ２及びＣγ３）ならびにＣγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）との間の下方ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は、そのカルボキシル末端に対する残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、ナンバリングはＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、下でさらに十分に説明するように、例えば、１つ以上のＦＣγＲ受容体またはＦＣＲｎ受容体への結合を変更するために、ＦＣ領域にはアミノ酸修飾が行われる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、抗体は、全長である。本明細書における「全長抗体」とは、本明細書で概説されるような１つ以上の修飾を含む、可変及び定常領域を含む、抗体の天然生物学的形態を構成する構造を意味する。
【００５６】
あるいは、抗体は、これらに限定されないが、それぞれ、抗体断片、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、（本明細書では「抗体模倣体」と称されることもある）合成抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、（「抗体複合体」と称されることもある）抗体融合体、及び各々の断片を含む、様々な構造であり得る。依然として依存する構造
【００５７】
１つの実施形態では、抗体は、抗体断片である。具体的な抗体断片としては、これらに限定されないが、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）単一可変からなるｄＡｂ断片（参照により完全に組み込まれる、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、（ｖ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの連結したＦａｂ断片を含む二価断片、（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーにより連結される、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（参照により完全に組み込まれる、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３）、（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ（これによって参照により組み込まれる、ＷＯ０３／１１１６１）、ならびに（ｉｘ）「ダイアボディ」または「トリアボディ」、遺伝子融合により構成される多価または多重特異性断片（全て参照により完全に組み込まれる、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１−４７９、ＷＯ９４／１３８０４、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８）が挙げられる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、抗体は、異なる種からの混合物、例えば、キメラ抗体及び／またはヒト化抗体であり得る。すなわち、本発明では、ＣＤＲセットは、本明細書で配列により具体的に記載されるもの以外のフレームワーク及び定常領域で使用することができる。
【００５９】
一般に、「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」の両方は、２つ以上の種からの領域を組み合わせる抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、従来より、マウス（またはいくつかの場合ではラット）からの可変領域及びヒトからの定常領域を含む。「ヒト化抗体」とは、一般的には、可変ドメインフレームワーク領域をヒト抗体中で見られる配列で交換した非ヒト抗体を指す。一般的には、ヒト化抗体では、全抗体は、ＣＤＲを除き、ヒト由来のポリヌクレオチドによりコード化されるか、またはこうした抗体とそのＣＤＲ内を除き同一である。その一部または全部が非ヒト生物由来の核酸によりコード化されるＣＤＲは、ヒト抗体可変領域のβシートフレームワークへ移植され、抗体が形成され、その特異性は移植されたＣＤＲにより決定される。こうした抗体の形成については、例えば、全て参照により完全に組み込まれる、ＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６に記載されている。初期移植構成物において失われた親和性を回復するには、対応するドナー残基への選択されたアクセプターフレームワーク残基の「復帰突然変異」が必要となることが多い（全て参照により完全に組み込まれる、ＵＳ５５３０１０１、ＵＳ５５８５０８９、ＵＳ５６９３７６１、ＵＳ５６９３７６２、ＵＳ６１８０３７０、ＵＳ５８５９２０５、ＵＳ５８２１３３７、ＵＳ６０５４２９７、ＵＳ６４０７２１３）。ヒト化抗体は、最適にはまた、典型的にはヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含み、よって典型的にはヒトＦｃ領域を含むであろう。ヒト化抗体はまた、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを使用して産生することができる。参照により完全に組み込まれる、Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４。非ヒト抗体をヒト化及び再構成するための様々な技法及び方法は、当該技術分野において周知である（全て参照により完全に組み込まれる、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ  ＆  Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、及びその中で引用される参考文献参照）。ヒト化方法としては、これらに限定されないが、全て参照により完全に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ８６：１００２９−３３、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９���−９、Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１：３２１−８に記載される方法が挙げられる。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低減するヒト化または他の方法は、例えば、参照により完全に組み込まれる、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３に記載されるような、再表面加工方法を含み得る。１つの実施形態では、親抗体は、当該技術分野において知られているように、親和性成熟が行われている。ヒト化及び親和性成熟には、例えば、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載されるような、構造ベースの方法が使用され得る。抗体可変領域のヒト化及び／または親和性成熟には、これらに限定されないが、全て参照により完全に組み込まれる、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４、Ｒｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８、Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８９１０−８９１５、Ｋｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（１０）：７５３−７５９に記載される方法を含む、選択ベースの方法が使用され得る。これらに限定されないが、全て参照により完全に組み込まれる、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５、Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４に記載される方法を含む、他のヒト化方法は、ＣＤＲの一部のみの移植を含み得る。
【００６０】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、多重特異性抗体、及び特に二重特異性抗体であり得る。これらは、２つ（以上）の異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに結合する抗体である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、抗体は、ダイアボディである。
【００６２】
１つの実施形態では、抗体はミニボディである。ミニボディとは、ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含む最小化された抗体様タンパク質である。参照により完全に組み込まれる、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１。いくつかの場合、ｓｃＦｖは、Ｆｃ領域に結合することができ、一部または全ヒンジ領域を含み得る。
【００６３】
本明細書に記載される抗体は、単離または組換えであり得る。「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的には含まない抗体を指す。例えば、ＥＭＰ２に特異的に結合する単離抗体は、ＥＭＰ２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的には含まない。
【００６４】
ヒトＥＭＰ２またはネズミＥＭＰ２のエピトープ、アイソフォーム、またはバリアントに特異的に結合する単離抗体は、しかしながら、例えば、ＥＭＰ２種相同体のような、他の種からの、他の関連抗原との相互反応性を有し得る。また、単離抗体は、他の細胞物質及び／または化学物質を実質的には含まない場合がある。
【００６５】
天然抗体、断片抗体、または合成骨格を含む骨格上のタンパク質をコード化するのに使用される、抗ＥＭＰ２可変領域配列は、ＥＭＰ−２に貪欲に結合し得る。この結合を介して、これらのタンパク質は、ＥＭＰ２検出、及びＥＭＰ２機能の遮断に使用することができる。天然抗体骨格上の、または放射性核種で標識された、ｓｃＦｖ、トリアボディ、ダイアボディ、もしくはミニボディとしての、これらの可変領域配列の発現は、ＥＭＰ−２保有細胞のインビボ検出において特に有用である。これらの骨格または天然抗体骨格上での発現は、インビボでＥＭＰ−２の機能を遮断及び／またはＥＭＰ−２保有細胞（例えば、婦人科腫瘍）を殺滅するのに有利である。
【００６６】
本発明の抗ＥＭＰ２抗体は、ＥＭＰ２配位子（例えば、配列番号１及び２のヒト及びネズミＥＭＰ２タンパク質）に特異的に結合する。
【００６７】
特定の抗原またはエピトープについての特異的な結合は、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ以上の、抗原またはエピトープについてのＫＤを有する抗体により示され得、ＫＤとは特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープに対して対照分子について２０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００倍以上のＫＤを有するであろう。
【００６８】
また、特定の抗原またはエピトープについての特異的な結合は、例えば、対照に対してエピトープについて２０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００倍以上の抗原またはエピトープについてのＫＡまたはＫａを有する抗体により示され得、ＫＡまたはＫａとは特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、下に示されるような、配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４または配列番号５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＲＧＲＫＳＡＧＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３）。ＰＧ−１０１重鎖可変領域ドメイン。
【００７０】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＹＳＧＷＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫ（配列番号４）。ＰＧ−１０１バリアント１軽鎖可変領域ドメイン。
【００７１】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＹＮＬＷＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫ（配列番号５）。ＰＧ−１０１バリアント２軽鎖可変領域ドメイン。
【００７２】
本明細書に記載されるように、こうした抗ＥＭＰ２抗体は、既知の抗ＥＭＰ２抗体と比較して増加したエピトープ（配列番号２）結合を有利に示す、バリアント抗ＥＭＰ２抗体である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６に従ったアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有する重鎖、及び配列番号７に従ったアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６に従ったアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号７に従ったアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【００７５】
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＲＧＲＫＳＡＧＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号６）。ＰＧ−１０１重鎖。
【００７６】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＹＳＧＷＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号７）。ＰＧ−１０１バリアント１軽鎖。
【００７７】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号５に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６に従ったアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有する重鎖、及び配列番号８に従ったアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６に従ったアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号８に従ったアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【００７９】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＹＮＬＷＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号８）。ＰＧ−１０１バリアント２軽鎖。
【００８０】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号９に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００８１】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＹＮＧＷＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫ（配列番号９）。ＰＧ−１０１親軽鎖可変領域ドメイン。
【００８２】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６に従ったアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有する重鎖、及び配列番号１０に従ったアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の配列同一性を共有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６に従ったアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１０に従ったアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【００８３】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＹＮＧＷＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１０）。ＰＧ−１０１親軽鎖。
【００８４】
いくつかの実施形態では、抗ＥＭＰ２は、下に表されるような、配列番号１１に従ったＨＣＤＲ１、配列番号１２に従ったＨＣＤＲ２、配列番号１３に従ったＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１４に従ったＬＣＤＲ１、配列番号１５に従ったＬＣＤＲ２、及び配列番号１６に従ったＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む。本明細書で提供される研究において示されるように、こうしたＣＤＲを有する抗ＥＭＰ２抗体は、既知の抗ＥＭＰ２抗体に対して、増加したＥＭＰ２への結合及び少なくとも同等の安定性を有利に示す。
可変重鎖ＣＤＲ１：ＳＹＡＭＨ（配列番号１１）
可変重鎖ＣＤＲ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）
可変重鎖ＣＤＲ３：ＤＲＲＧＲＫＳＡＧＩＤＹ（配列番号１３）
可変軽鎖ＣＤＲ１：ＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１４）
可変軽鎖ＣＤＲ２：ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１５）
可変軽鎖ＣＤＲ３：ＬＱＤＹＳＧＷＴ（配列番号１６）
【００８５】
本発明は、バリアント抗体をさらに提供する。すなわち、これらに限定されないが、ＣＤＲ中のアミノ酸修飾（親和性成熟）、Ｆｃ領域中のアミノ酸修飾、グリコシル化バリアント、他のタイプの共有結合修飾、等を含む、本発明の抗体に行うことができる多数の修飾がある。本明細書で提供される当該抗体のＣＤＲは、下記の通りである。
【００８６】
本明細書における「バリアント」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親ポリペプチドのそれとは異なるポリペプチド配列を意味する。アミノ酸修飾は、置換、挿入、及び欠失を含むことができ、多くの場合で前者が好ましい。
【００８７】
一般に、バリアントは、本明細書に記載されるように、タンパク質の機能が依然として存在する限り、いずれかの数の修飾を含むことができる。すなわち、本明細書に記載される重鎖または軽鎖可変領域で産生されるアミノ酸バリアントの場合、例えば、抗体は、依然としてヒト及び／またはネズミＥＭＰ２の両方に特異的に結合するべきである。同様に、アミノ酸バリアントがＦｃ領域で産生される場合、例えば、バリアント抗体は、抗体の特定の用途または適応症に必要な受容体結合機能を維持するべきである。
【００８８】
しかしながら、一般に、多くの場合、目標は最小限の数の修飾で機能を変更することであるので、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換が一般的には使用される。いくつかの場合では、１〜５個の修飾があり、１〜２、１〜３、及び１〜４個も多くの実施形態において用途を見出す。
【００８９】
アミノ酸修飾の数が機能的ドメイン内であり得、例えば、野生型または操作されたタンパク質のＦｃ領域中の１〜５個の修飾、及び例えば、Ｆｖ領域中の１〜５個の修飾を有することが望ましい場合があることは、留意されるべきである。バリアントポリペプチド配列は、好ましくは、親配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または最大９８もしくは９９％の同一性を有するであろう。配列のサイズに応じて、同一性パーセントがアミノ酸の数に依存するであろうことは、留意されるべきである。
【００９０】
本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置にあるアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることを意味する。例えば、置換Ｓ１００Ａとは、１００位にあるセリンがアラニンで置き換えられているバリアントポリペプチドを指す。本明細書で使用される「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。本明細書で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置にあるアミノ酸の除去を意味する。
【００９１】
本明細書における「バリアントＦｃ領域」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって野生型Ｆｃ配列のそれとは異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃバリアントとは、Ｆｃポリペプチドそのもの、Ｆｃバリアントポリペプチドを含む組成物、またはアミノ酸配列を指し得る。
【００９２】
親和性成熟を行い、抗原についての抗体の結合親和性を、「親」抗体と比較して、少なくとも約１０％〜５０〜１００〜１５０％以上、または１〜５倍増加させることができる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原についてナノモルまたはさらにピコモル親和性を有するであろう。親和性成熟抗体は、既知の手順により産生される。例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインシャッフリングによる親和性成熟について記載する、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３を参照されたい。ＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基のランダム変異導入については、例えば、Ｂａｒｂａｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３、Ｓｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９、及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６に記載されている。
【００９３】
あるいは、アミノ酸修飾は、「サイレント」である、例えば、抗原についての抗体の親和性を顕著に変更しない、本発明の抗体のＣＤＲのうちの１つ以上において行うことができる。これらは、（本発明の抗体をコード化する核酸について行うことができるような）発現の最適化を含む、多数の理由で行われ得る。
【００９４】
よって、ＣＤＲ及び本発明の抗体の定義にはバリアントＣＤＲ及び抗体が含まれ、すなわち、本発明の抗体は、本明細書に記載される当該抗体のＣＤＲのうちの１つ以上においてアミノ酸修飾を含むことができる（配列番号１１〜１６）。加えて、下で概説されるように、アミノ酸修飾はまた、フレームワーク及び定常領域を含む、ＣＤＲ外のいずれかの領域において独立してかつ任意に行うことができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＥＭＰ２抗体は、バリアントＦｃドメインからなる。当該技術分野において知られているように、抗体のＦｃ領域は、多数のＦｃ受容体及び配位子と相互作用し、エフェクター機能と称される多数の重要な機能的能力を与える。これらのＦｃ受容体としては、これらに限定されないが、（ヒトにおいて）アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、及びＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）アイソフォームＦｃγＲＩＩａ、（ＦｃγＲＩＩｂ−１及びＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩｃを含む、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ならびに（抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）と相関した、アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）アイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ及び（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃＲｎ（胎児性受容体）、Ｃ１ｑ（補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に関与する補体タンパク質）、ならびにＦｃＲｎ（血清半減期に関与する胎児性受容体）を含む、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が挙げられる。適切な修飾は、例えば、その全てがそれらの全体として参照により明示的に組み込まれる、米国特許出願１１／８４１，６５４及びその中で引用される参考文献、ＵＳ２００４／０１３２１０、ＵＳ２００５／００５４８３２、ＵＳ２００６／００２４２９８、ＵＳ２００６／０１２１０３２、ＵＳ２００６／０２３５２０８、ＵＳ２００７／０１４８１７０、ＵＳＳＮ１２／３４１，７６９、米国特許第６，７３７，０５６号、米国特許第７，６７０，６００号、米国特許第６，０８６，８７５号において一般的に概説されるように、及び特にＦｃ受容体への結合を増加させる特異的なアミノ酸置換について、１つ以上の位置で行うことができる。
【００９６】
上で概説された修飾に加えて、他の修飾を行うことができる。例えば、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みにより、分子を安定化してよい（参照により完全に組み込まれる、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１２３９−１２４５）。加えて、下で概説されるように行うことができる抗体の様々な共有結合修飾がある。
【００９７】
抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれ、一般的には、常にではないが、翻訳後に行われる。例えば、抗体の共有結合修飾のいくつかのタイプは、抗体の特異的なアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応させることができる有機誘導体化剤と反応させることにより、分子に導入される。
【００９８】
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドのような、α−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応させ、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、二硫化３−ニトロ−２−ピリジル、二硫化メチル２−ピリジル、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸塩、２−クロロ第二水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール、等との反応により誘導体化してよい。
【００９９】
加えて、システインでの修飾は、下でさらに記載されるように、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）用途において特に有用である。いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、薬物部分のより特異的かつ制御された配置を可能にするために、特に「チオール反応性」である１つ以上のシステインを含有するように操作することができる。例えば、本明細書にその全体として参照により組み込まれる、米国特許第７，５２１，５４１号を参照されたい。
【０１００】
ヒスチジル残基は、この物質がヒスチジル側鎖について相対的に特異的であるので、ｐＨ５．５〜７．０のジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化される。臭化パラ−ブロモフェナシルも有用であり、反応は、好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中でｐＨ６．０で行われる。
【０１０１】
リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの物質での誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するのに適した他の試薬としては、メチルピコリニミデートのようなイミドエステル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、及びグリオキシル酸塩とのトランスアミナーゼ触媒反応物が挙げられる。
【０１０２】
アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来型試薬、とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高ｐＫａのため、反応がアルカリ性条件において行われることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジン及びアルギニンε−アミノ基と反応し得る。
【０１０３】
チロシル残基の特異的な修飾を行ってよく、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりスペクトル標識をチロシル残基に導入することが特に興味深い。最も一般的には、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成するのに、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンが使用される。チロシル残基は、１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してヨウ素化され、放射免疫測定における使用のための標識化タンパク質が調製され、上で記載されたクロラミンＴ法が適している。
【０１０４】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）との反応により選択的に修飾され、Ｒ及びＲ’は、任意で、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのような、異なるアルキル基である。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。
【０１０５】
二官能性物質での誘導体化は、下に記載される方法に加えて、様々な方法における使用のための水不溶性支持マトリックスまたは表面に抗体を架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸を有するエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステルを含む、ホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化性中間体をもたらす。あるいは、臭化サイノモルガソジェン活性化炭水化物のような反応性水不溶性マトリックスならびに、全て参照により完全に組み込まれる、米国特許第３，９６９，２８７号、３，６９１，０１６号、４，１９５，１２８号、４，２４７，６４２号、４，２２９，５３７号、及び４，３３０，４４０号に記載される反応性基質が、タンパク質固定化のために使用される。
【０１０６】
グルタミル及びアスパラギニル残基は、それぞれ、対応するグルタミル及びアスパルチル残基にしばしば脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲内に該当する。
【０１０７】
他の修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（参照により完全に組み込まれる、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにいずれかのＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１０８】
加えて、当業者により理解されるように、（蛍光、酵素、磁気、放射性、等を含む）標識を全て（本発明の他の組成物と同様に）抗体に添加することができる。
【０１０９】
別のタイプの共有結合修飾は、グリコシル化における変更である。別の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、１つ以上の操作された糖型を含むように修飾することができる。本明細書で使用される「操作された糖型」とは、抗体に共有結合した炭水化物組成物を意味し、その炭水化物組成物は親抗体のそれとは化学的に異なる。操作された糖型は、これらに限定されないが、エフェクター機能の向上または低減を含む、様々な目的に有用であり得る。操作された糖型の好ましい形態は、おそらくＦｃγＲＩＩＩａ受容体へのより強力な結合を通して、ＡＤＣＣ機能の増加と相関することが示されている、アフコシル化である。この文脈では、「アフコシル化」とは、宿主細胞中で産生される抗体の大部分がフコースを実質的には含まず、例えば、産生された抗体の９０〜９５〜９８％が（一般的にはＦｃ領域中のＮ２９７で結合した）抗体の炭水化物部分の成分として感知できるフコースを有さないことを意味する。機能的に定義された、アフコシル化抗体は、一般的には、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する少なくとも５０％以上の親和性を示す。
【０１１０】
操作された糖型は、当該技術分野において知られている様々な方法により産生され得る（全て参照により完全に組み込まれる、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３、ＵＳ６，６０２，６８４、ＵＳＳＮ１０／２７７，３７０、ＵＳＳＮ１０／１１３，９２９、ＰＣＴ  ＷＯ００／６１７３９Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０１／２９２４６Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０２／３１１４０Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０２／３０９５４Ａ１、（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）技術［Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ］、ＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）グリコシル化操作技術［Ｇｌｙｃａｒｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ］）。これらの技法の多くは、例えば、ＩｇＧを、操作された、もしくは操作されていない、様々な生物もしくは細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ＣＨＯ細胞もしくはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）中で発現させることにより、グリコシル化経路に含まれる酵素（例えば、ＦＵＴ８［α１，６−フコシルトランスフェラーゼ］及び／もしくはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を調整することにより、またはＩｇＧが発現した後に炭水化物を修飾することにより、フコシル化のレベルを制御及び／またはＦｃ領域に共有結合したオリゴ糖を二等分することに基づく。例えば、「糖操作抗体」またはＳｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの「ＳＥＡ技術」は、産生中にフコシル化を阻害する修飾された糖類を添加することにより機能する。例えば、これによってその全体として参照により組み込まれる、２００９０３１７８６９を参照されたい。操作された糖型は、典型的には、異なる炭水化物またはオリゴ糖を指し、よって抗体は、操作された糖型を含み得る。
【０１１１】
あるいは、操作された糖型は、異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むＩｇＧバリアントを指し得る。当該技術分野において知られているように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、後述する、特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）、または宿主細胞もしくはその中でタンパク質が産生される生物の両方に依存し得る。特定の発現系については後述する。
【０１１２】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列、Ｘがプロリンを除くいずれかのアミノ酸である、アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合のための認識配列である。よって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を形成する。Ｏ結合グリコシル化とは、糖、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンとの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンを使用してもよい。
【０１１３】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位について）上述したトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を変更することにより、便利に達成される。（Ｏ結合グリコシル化部位について）出発配列に対する１つ以上のセリンもしくはトレオニン残基の付加、またはこれによる置換により、変更を行ってもよい。簡単に、抗体アミノ酸配列は、好ましくはＤＮＡレベルでの変化を通して、特に、所望のアミノ酸に変換するであろうコドンが生成されるように、予め選択された塩基で標的ポリペプチドをコード化するＤＮＡを変異させることにより、変更される。
【０１１４】
抗体上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドのタンパク質との化学または酵素カップリングによる。これらの手順は、Ｎ及びＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞中でのタンパク質の産生を必要としない点で有利である。使用されるカップリングモードに応じて、糖は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのもののような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのもののような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのもののような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。これらの方法は、共に参照により完全に組み込まれる、ＷＯ８７／０５３３０及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。
【０１１５】
出発抗体上に存在する炭水化物部分の（例えば、翻訳後の）除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、化合物、トリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理は、ポリペプチドは完全なまま、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖の開裂をもたらす。化学的な脱グリコシル化は、共に参照により完全に組み込まれる、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素開裂は、参照により完全に組み込まれる、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０により記載されるように、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、参照により完全に組み込まれる、Ｄｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５により記載されるように、化合物、ツニカマイシンの使用により防止することができる。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を遮断する。
【０１１６】
抗体の共有結合修飾の別のタイプは、抗体を、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのような様々なポリオールを含む、様々な非タンパク質性ポリマーに、例えば、全て参照により完全に組み込まれる、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからの２００５−２００６ＰＥＧ  Ｃａｔａｌｏｇ（Ｎｅｋｔａｒウェブサイトから入手可能）、ＵＳ特許４，６４０，８３５、４，４９６，６８９、４，３０１，１４４、４，６７０，４１７、４，７９１，１９２、または４，１７９，３３７に記載される方法で、結合することを含む。加えて、当該技術分野において知られているように、アミノ酸置換は、ＰＥＧのようなポリマーの付加を促進する抗体内の様々な位置において行われ得る。例えば、参照により完全に組み込まれる、米国公開第２００５／０１１４０３７Ａ１号を参照されたい。
【０１１７】
いくつかの場合では、競合結合アッセイの成分のうちの１つ以上は標識される。
【０１１８】
例えば、様々な試験断片またはＥＭＰ２と同様に十分に大きなＥＭＰ２断片で表される立体構造エピトープ中に位置する、うまく表された線形エピトープの場合のような、ＥＭＰ２の特定の領域の抗体結合特性がその断片中に保持される文脈では、ＥＭＰ２エピトープの２つ以上、及び／またはＥＭＰ２の一部分に対して、抗ＥＭＰ２抗体間に競合が存在し得る場合もあり得る。
【０１１９】
競合の評価は、典型的には、本発明の抗体、ＥＭＰ２（ヒトもしくはネズミのいずれか、または両方）、及び試験分子を使用する相対的阻害結合の評価を含む。試験分子は、他の抗体、小分子、ペプチド、等を含む、いずれかの分子を含むことができる。化合物は、他の存在する分子に対して対象の分子の選択性及び／または特異性についての情報を与える比較を行うのに十分な量で混合される。
【０１２０】
試験化合物、ＥＭＰ２、及び本発明の抗体の量は、変動し得る。例えば、ＥＬＩＳＡ評価について、競合が存在するかを評価するには、約５〜５０μｇ（例えば、約１０〜５０μｇ、約２０〜５０μｇ、約５〜２０μｇ、約１０〜２０μｇ、等）の抗ＥＭＰ２抗体及び／またはＥＭＰ２標的が必要である。条件も結合に適しているべきである。典型的には、生理学的または近生理学的条件（例えば、約２０〜４０℃の温度、約７〜８のｐＨ、等）が抗ＥＭＰ２：ＥＭＰ２結合に適している。
【０１２１】
多くの場合、競合は、ＥＬＩＳＡ及び／またはＦＡＣＳ分析により決定される約５％より顕著に大きな相対的阻害により特徴付けられる。特定の文脈（例えば、ＥＭＰ２に結合する別のペプチドまたは分子（例えば、ＥＭＰ２の天然結合パートナーまたは天然に存在する抗ＥＭＰ２抗体）の結合を遮断する機能を意図して設計された新規抗体を選別またはスクリーニングするのに競合分析が使用される場合）において、何が競合の適切なレベルであるかの基準／決定因子として相対的阻害のより高い閾値を設定することが望ましい場合がある。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＥＭＰ２抗体は、ＥＭＰ２中の１つ以上の残基または領域に特異的に結合するが、またＥＭＰ２に対する相同性を有する他のタンパク質とは相互反応しない。
【０１２３】
典型的には、相互反応性の欠如とは、十分な量の分子を適切なアッセイ条件下で使用するＥＬＩＳＡ及び／またはＦＡＣＳ分析により評価される場合の分子間の約５％未満の相対的競合阻害を意味する。
【０１２４】
開示される抗体は、配位子−受容体相互作用の遮断または受容体成分相互作用の阻害において用途を見出し得る。本発明の抗ＥＭＰ２抗体は、「遮断」または「中和」であり得る。「中和抗体」とは、ＥＭＰ２とのその結合がＥＭＰ２の生物活性、例えば、配位子と相互作用するその能力、酵素活性、及び／またはシグナル伝達能力の阻害をもたらす抗体を指すことを意図する。ＥＭＰ２の生物活性の阻害は、当該技術分野において知られているいくつかの標準的なインビトロまたはインビボアッセイのうちの１つ以上により評価することができる。
【０１２５】
「結合を阻害する」または「結合を遮断する」とは、（例えば、ＥＭＰ２結合パートナーのＥＭＰ２との結合の阻害／遮断を指すとき）部分及び完全阻害／遮断の両方を包含する。ＥＭＰ２結合パートナーのＥＭＰ２との結合の阻害／遮断は、阻害または遮断なくＥＭＰ２結合パートナーがＥＭＰ２に結合する場合に発生する正常レベルまたはタイプの細胞シグナル伝達を低減または変更し得る。阻害及び遮断は、抗ＥＭＰ２抗体と接触していない配位子と比較して、抗ＥＭＰ２抗体と接触している場合、ＥＭＰ２結合パートナーのＥＭＰ２との結合親和性におけるいずれかの測定可能な減少、例えば、ＥＭＰ２結合パートナーのＥＭＰ２との結合の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％の遮断を含むことも意図する。
【０１２６】
本発明は、開示された抗ＥＭＰ２抗体を産生するための方法をさらに提供する。これらの方法は、本発明の抗体をコード化する単離核酸を含有する宿主細胞を培養することを包含する。当業者により理解されるように、これは、抗体の性質に応じて、様々な方法で行うことができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体が全長従来型抗体である場合、例えば、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、抗体が産生され、単離され得るような条件下にある。
【０１２７】
一般に、本発明の抗体をコード化する核酸が提供される（例えば、配列番号２１〜２４参照）。こうしたポリヌクレオチドは、重鎖及び軽鎖の各々の可変及び定常領域の両方についてコード化するが、本明細書に記載される組成物に従って本発明により他の組み合わせも考慮される。本発明は、開示されたポリヌクレオチド及びこれらのポリヌクレオチドと相補的な核酸配列から誘導されるオリゴヌクレオチド断片も考慮する。
【０１２８】
ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸類似体、及び合成ＤＮＡの形態のポリヌクレオチドは、本発明の範囲内である。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であってよく、一本鎖の場合、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖であってよい。ポリペプチドをコード化するコード配列は、本明細書で提供されるコード配列と同一であってよく、または異なるコード配列であってよく、その配列は、遺伝コードの冗長性または縮退の結果として、本明細書で提供されるＤＮＡと同じポリペプチドをコード化する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体をコード化する核酸は、染色体外であり得るか、または導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれるように設計され得る、発現ベクターに組み込まれる。発現ベクターは、（これらに限定されないが、転写及び翻訳制御配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点、等を含む）いずれかの数の適切な調節配列または他の成分（選択遺伝子、等）を含有することができ、その全ては、当該技術分野において知られているように、操作可能に結合している。いくつかの場合では、２つの核酸が使用され、各々は異なる発現ベクター（例えば、重鎖は第１の発現ベクター、軽鎖は第２の発現ベクター）に入れられるか、またはあるいはそれらは同じ発現ベクターに入れられ得る。調節配列の選択を含む、発現ベクターの設計が、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、等のような因子に依存し得ることは、当業者により理解されるであろう。
【０１３０】
一般に、核酸及び／または発現は、核酸分子が（例えば、ベクター中、細胞中でのプロセスにより形成され、宿主細胞ゲノム中に組み込まれた構成物中の）１つ以上の発現制御要素に操作可能に結合するように、適切な宿主細胞に導入し、選択された宿主細胞に適したいずれかの方法（例えば、形質転換、形質移入、電気穿孔、感染）を使用して組換え宿主細胞を作製することができる。得られた組換え宿主細胞は、発現に適した条件下に（例えば、誘発因子の存在下、適切な非ヒト動物において、適切な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補給剤、等が補充された適切な培地中に）維持することができ、これによりコード化ポリペプチドが産生される。いくつかの場合では、重鎖は１つの細胞において産生され、軽鎖は別の細胞において産生される。
【０１３１】
発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当該技術分野において知られており、これらに限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、及び多数の他の細胞株を含む、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能な多くの不死化細胞株を含む。これらに限定されないが、細菌、酵母、昆虫、及び植物を含む非哺乳類細胞も、組換え抗体を発現するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、ウシまたはニワトリのようなトランスジェニック動物において産生することができる。
【０１３２】
本明細書で提供される抗ＥＭＰ２抗体は、それに付着した標識または検出可能部分をさらに含むことができる。「標識」または「検出可能部分」とは、分光分析、光化学、生物化学、免疫化学、化学、または他の物理的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン及び、例えば、放射性標識をペプチドに組み込むことにより検出可能にすることができる、またはペプチドと特異的に反応性である抗体を検出するのに使用することができるタンパク質が挙げられる。
【０１３３】
組成物
薬学的目的のために使用される場合、本明細書で提供される抗ＥＭＰ２抗体は、典型的には適切な緩衝液中で配合され、これはリン酸緩衝生理食塩水またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシリン緩衝液、無菌水、及びＧｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：４６７（１９６６）に記載されるもののような当業者に知られている他の緩衝液のような、いずれかの薬学的に許容される緩衝液であり得る。組成物は、安定化剤、増強剤、または他の薬学的に許容される担体もしくはビヒクルをさらに含むことができる。薬学的に許容される担体は、例えば、本発明の核酸またはポリペプチド及びいずれかの関連ベクターを安定化するように作用する生理学的に許容される化合物を含有することができる。生理学的に許容される化合物は、例えば、グルコース、スクロース、もしくはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤を含むことができる。他の生理学的に許容される化合物としては、微生物の増殖または作用を防止するのに特に有用である、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または防腐剤が挙げられる。様々な防腐剤が周知であり、例えば、フェノール及びアスコルビン酸が挙げられる。担体、安定化剤、または補助剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）において見ることができる。
【０１３４】
本発明に従った薬学的組成物は、治療有効量の当該抗ＥＭＰ２抗体及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書における「治療有効用量または量」とは、投与の目的である効果（例えば、癌の治療または予防）をもたらす用量を意味する。正確な用量及び配合は、治療の目的に依存し、当業者により既知の技法を使用して確認可能であろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄｉｔｏｒ（２００３）、及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）参照）。ＥＭＰ２クラミジア阻害剤は、塩の場合、「薬学的に許容される塩」として配合される。
【０１３５】
「薬学的に許容される塩」とは、投与経路に従って、比較的に非毒性の酸または塩基で調製される活性化合物の塩を含む。本発明の阻害剤が比較的に酸性の官能基を含有する場合、塩基付加塩は、こうした化合物の中和形態を、ニートまたは適切な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の塩基と接触させることにより得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的に塩基性の官能基を含有する場合、酸付加塩は、こうした化合物の中和形態を、ニートまたは適切な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の酸と接触させることにより得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸、等のような無機酸から誘導されるもの、及び酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、クエン酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、等のような比較的に非毒性の有機酸から誘導される塩が挙げられる。アルギニン酸塩、等のような、アミノ酸の塩、及びグルクロン酸またはガラクツロン酸、等のような有機酸の塩も挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６６：１−１９（１９７７）参照）。本発明の特定の特異的な化合物は、化合物を塩基または酸付加塩に変換することを可能にする塩基性及び酸性官能基の両方を含有する。
【０１３６】
化合物の中和形態は、塩を塩基または酸と接触させ、親化合物を従来の方法で単離することにより再生され得る。化合物の親形態は、極性溶媒中での可溶性のような、特定の物理特性において様々な塩形態とは異なるが、その他の点では塩は本発明の目的のための化合物の親形態と同等である。
【０１３７】
塩形態に加えて、本発明は、プロドラッグ形態である化合物を提供する。本明細書に記載される化合物のプロドラッグは、本発明の化合物を提供する生理学的条件下で化学変化が容易に行われる化合物である。また、プロドラッグは、エクスビボ環境において化学または生化学的方法により本発明の化合物に変換することができる。例えば、プロドラッグは、適切な酵素または化学試薬と共に経皮パッチリザーバー中に配置される場合、本発明の化合物にゆっくり変換することができる。
【０１３８】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和形態及び、水和形態を含む、溶媒和形態で存在し得る。一般に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と同等であり、本発明の範囲内に包含されることを意図する。本発明の特定の化合物は、多重結晶または非晶質形態で存在してよい。一般に、全ての物理形態は、本発明により考慮される使用について同等であり、本発明の範囲内であることを意図する。
【０１３９】
核酸及びポリペプチドのようなバイオポリマーとは別に、本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学的中心）または二重結合を有し、ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体、及び個別の異性体は、全て本発明の範囲内に包含されることを意図する。好ましい実施形態では、化合物がアミノ酸または核酸を含む場合、アミノ酸及び核酸は、各々優勢な天然に存在する生物学的エナンチオマーである。
【０１４０】
投与のための組成物は、一般的には、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された本明細書に記載される薬剤を含むであろう。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水、等を使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般的には望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来型の周知の殺菌技法により殺菌され得る。組成物は、ｐＨ調節及び緩衝剤、毒性調節剤、等、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、等のような、生理学的条件に近づけるのに必要な薬学的に許容される補助物質を含有してよい。これらの配合物中の活性剤の濃度は、幅広く変動し得、選択された特定の投与モード及び患者のニーズに従って、主に液量、粘度、体重、等に基づき選択されるであろう。
【０１４１】
本発明における使用のための適切な配合物は、本明細書に参照により組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄｉｔｏｒ（２００３）において見られる。また、薬物送達のための方法の概要については、本明細書に参照により組み込まれる、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照されたい。本明細書に記載される薬学的組成物は、当業者に知られている方法で、すなわち、従来型混合、溶解、顆粒化、ドラジェ作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスの手段により、製造することができる。下記の方法及び賦形剤は、単に例示的であり、決して限定的ではない。
【０１４２】
注入のために、本明細書で提供される抗ＥＭＰ２抗体は、水性溶液中、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理食塩水緩衝液のような生理学的に相溶性の緩衝液中で配合することができる。経粘膜投与のために、透過するバリアに適した浸透剤が配合物に使用される。こうした浸透剤は、一般的には当該技術分野において知られている。
【０１４３】
経口投与のために、本明細書で提供される抗ＥＭＰ２抗体は、当該技術分野において周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることにより、容易に配合することができる。こうした担体は、化合物を、治療される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、ドラジェ、カプセル、エマルジョン、親油性及び親水性懸濁液、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、等として配合することを可能にする。経口使用のための薬学的調製物は、化合物を固体賦形剤と混合し、任意で得られた混合物を粉砕し、適切な補助剤を、所望に応じて、錠剤またはドラジェコアに添加した後に、顆粒の混合物を加工することにより得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む、糖のような充填剤、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような、セルロース調製物である。所望に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような、崩壊剤を添加することができる。
【０１４４】
ドラジェコアは、適切なコーティングが施される。この目的のために、任意でアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有することができる、濃縮糖溶液を使用することができる。染料または顔料を、識別のために、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤またはドラジェコーティングに添加することができる。
【０１４５】
経口使用することができる薬学的調製物は、ゼラチンでできたプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチン及び、グリセロールまたはソルビトールのような、可塑剤でできた軟性封止カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤、及び／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ならびに任意で安定化剤との混合物中に有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような、適切な液体中に溶解または懸濁させることができる。加えて、安定化剤を添加することができる。経口投与のための全ての配合物は、こうした投与に適した投与量であるべきである。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、静脈内投与のための薬学的組成物は、患者１人１日当たり約０．１〜１００ｍｇを提供し得る。患者１人１日当たり０．１〜最大約１００ｍｇの投与量が使用され得る。局所投与において実質的にはより高い投与量が可能である。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者には知られているか、または明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００５，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓのような刊行物においてより詳細に記載されている。
【０１４７】
薬学的組成物は、投与の方法に応じて様々な剤形及び量で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位剤形としては、これらに限定されないが、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、及びトローチが挙げられる。抗体は、経口投与される場合、消化から保護されるべきであることが認識されている。これは、典型的には、分子を組成物と錯体化して酸性及び酵素加水分解に対して耐性にすること、または分子をリポソームもしくは保護バリアのような適切に耐性の担体中にパッケージングすることのいずれかにより達成される。薬剤を消化から保護する手段は、当該技術分野において周知である。
【０１４８】
薬学的配合物は、所望の純度を有する抗ＥＭＰ２抗体を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と混合することにより調製することができる。こうした配合物は、凍結乾燥配合物または水性溶液であり得る。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性である。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、防腐剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミンもしくはゼラチンのような、タンパク質、またはポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、ならびにアミノ酸、単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物、キレート剤、ならびにイオン性及び非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、ナトリウムのような塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、ならびに／または非イオン性界面活性剤であり得る。抗体は、０．５〜２００ｍｇ／ｍｌ、または１０〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で配合することができる。
【０１４９】
当該抗ＥＭＰ２抗体を含有する組成物は、治療または予防処置のために投与することができる。治療用途において、組成物は、患者に「治療有効用量」で投与される。組成物の単一または複数投与は、患者により要求及び許容される投与量及び頻度に応じて投与され得る。本発明の目的のための「患者」または「対象」は、ヒト及び他の動物の両方、特に哺乳動物を含む。よって方法は、ヒト療法及び獣医学用途の両方に適用可能である。好ましい実施形態では、患者は哺乳動物、好ましくは霊長類であり、最も好ましい実施形態では、患者はヒトである。
【０１５０】
薬学的組成物は、下記、鎮痛剤、抗炎症剤、抗生物質、抗微生物剤、潤滑剤、避妊薬、殺精子剤、局所麻酔薬、及び鎮痒剤のうちのいずれか１つ以上を含む、追加の活性剤を含むことができる。
【０１５１】
本明細書で使用されるとき、「担体」という用語は、インビボまたはインビトロで生物系に適用される活性剤のための希釈剤またはビヒクルとして使用される典型的には不活性な物質を指す。（例えば、治療薬のような薬物）。この用語はまた、組成物に凝集的性質を与える典型的には不活性な物質を包含する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＥＭＰ２阻害剤及び生理学的に許容される担体を細胞または生物レベルで含む組成物を提供する。典型的には、生理学的に許容される担体は、液体、固体、または半固体形態で存在する。液体担体の例としては、生理食塩水、リン酸緩衝液、通常緩衝生理食塩水（１３５〜１５０ｍＭＮａＣｌ）、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、向上した安定性を提供する糖タンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン、等）、等が挙げられる。固体または半固体担体の例としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、モルトデキストリン、ラクトース、デキストロース、スクロース、グルコース、イノシトール、粉糖、糖蜜、デンプン、セルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、アカシアガム、グアーガム、トラガカントガム、アルギン酸塩、アイリッシュモスの抽出物、パンワーガム、ガティガム、イサポール外皮の粘液、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）、カラマツアラボガラクタン、ゼラチン、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリアクリル酸（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ）、ケイ酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、カオリン、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール、及びこれらの組み合わせが挙げられる。生理学的に許容される担体は、部分的には、投与される特定の組成物により、及び組成物を投与するのに使用される特定の方法により決定されるので、本発明の薬学的組成物の適切な配合物は多種多様である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈｅｄ．，１９８９参照）。担体及び組成物は、好ましくは無菌である。
【０１５３】
本明細書で提供される組成物は、従来の周知の殺菌技法により殺菌され得るか、または無菌条件下で生成され得る。水性溶液は、無菌条件下で使用のためにパッケージングまたは濾過し、凍結乾燥し、凍結乾燥調製物を投与前に無菌水性溶液と組み合わせることができる。組成物は、ｐＨ調節及び緩衝剤、毒性調節剤、湿潤剤、等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、及びオレイン酸トリエタノールアミンのような、生理学的条件に近づけるのに必要な薬学的または生理学的に許容される補助物質を含有することができる。
【０１５４】
経口投与に適した配合物は、（ａ）有効量の、希釈剤、例えば、水、生理食塩水、またはＰＥＧ４００中に懸濁させた、パッケージングされた白金系薬物のような、液体溶液、（ｂ）各々所定の量の白金系薬物を、液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして含有する、カプセル、サシェ、または錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁液、ならびに（ｄ）適切なエマルジョンを含むことができる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、着香剤、色素、崩壊剤、ならびに薬学的に相溶性の担体のうちの１つ以上を含むことができる。
【０１５５】
治療の方法
別の態様では、本明細書において、患者に、有効量の、本明細書に記載される当該抗ＥＭＰ２抗体のうちのいずれか１つ、または当該抗ＥＭＰ２抗体を含む免疫複合体を投与することにより、対象における癌（例えば、侵襲性癌または転移）を治療、ＥＭＰ２発現癌の進行を予防、または癌の割合を低減する方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳類対象である。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。例示的な実施形態では、対象は、少なくとも２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、または１００歳である。
【０１５６】
本明細書で使用されるとき、「癌」とは、固形腫瘍及びリンパ系癌、腎臓癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、脳癌、頭頸部癌、皮膚癌、子宮癌、精巣癌、食道癌、ならびに肝臓癌、非ホジキン及びホジキンリンパ腫を含む、リンパ腫、白血病、ならびに多発性骨髄腫を含む、ヒト癌及び癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病、等を指す。「泌尿生殖器癌」とは、これらに限定されないが、腎臓、膀胱、尿路、尿道、前立腺、陰茎、精巣、陰門、膣、子宮頸部、及び卵巣組織を含む、尿路及び生殖器組織のヒト癌を指す。本明細書において検出、診断、または治療される癌は、ＥＭＰ２を発現または過剰発現する。ＥＭＰ２を過剰発現する癌としては、これらに限定されないが、子宮内膜癌、卵巣癌、膠芽腫、乳癌、前立腺癌、精巣癌、及び骨髄腫が挙げられる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、療法耐性癌の治療のためのものである。「療法耐性」癌、腫瘍細胞、及び腫瘍とは、（例えば、死受容体細胞シグナル伝達、例えば、Ｆａｓ配位子受容体、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−Ｒ１、化学療法薬、放射線を通した）アポトーシス媒介性ならびに、化学療法、ホルモン療法、放射線療法、及び免疫療法を含む、非アポトーシス媒介性（例えば、毒性剤、化学薬剤）癌療法のいずれかまたは両方に対して耐性または難治性となった癌を指す。本発明は、両方のタイプの治療を考慮する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される当該方法は、ＥＭＰ２を過剰発現する癌の治療のためのものである。「過剰発現」とは、対照組織試料中のＲＮＡまたはタンパク質発現より顕著に高い組織中のＥＭＰ２のＲＮＡまたはタンパク質発現を指す。１つの実施形態では、組織試料は自己である。侵襲性、転移、ホルモン非依存性（例えば、アンドロゲン非依存性）、または治療に対する難治性もしくはその増加した可能性と関連した癌性試験組織試料は、転移へ進行する可能性の低い患者からの癌組織または正常（すなわち、非癌）組織試料との比較において、少なくとも２倍高いＥＭＰ２ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現、多くの場合、最大３、４、５、８、１０倍以上高いＥＭＰ２タンパク質の発現を有する。こうした相違は、試験及び対照飼料をほぼ同様に装填したゲルのバンドを観察する際に容易に明らかとなり得る。増加した量のＥＭＰ２を発現する前立腺癌は、侵襲性となる、転移する、または難治性癌へと進行する可能性がより高い。原発腫瘍中のＥＭＰ２陽性細胞の小さな割合が、再発及び転移の高いリスクを有する腫瘍を特定し得ることが可能であるので、様々なカットオフは、ＥＭＰ２過剰発現に適している。「過剰発現する」、「過剰発現」、または「過剰発現した」という用語は、相互互換的に、通常は癌細胞中の、同じタイプの正常細胞との比較において、検出可能により大きなレベルで転写または翻訳される遺伝子を指す。過剰発現は、したがって、タンパク質及びＲＮＡの（増加した転写、転写後プロセシング、翻訳、翻訳後プロセシング、変化した安定性、及び変化したタンパク質分解による）過剰発現、ならびに変化したタンパク質輸送パターン（増加した核局在化）、及び例えば、基質の増加した酵素加水分解のような、増強した機能的活性による局所過剰発現の両方を指す。過剰発現はまた、同じタイプの非癌性細胞との比較において５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上（２倍、３倍、４倍）であり得る。過剰発現は、ＥＭＰ２タンパク質または核酸を検出する免疫組織化学方法を使用して視覚的に検出可能または定量化可能な相違に基づき得る。「ＥＭＰ２を過剰発現する癌」及び「ＥＭＰ２の過剰発現と関連した癌」という用語は、相互互換的に、上記の定義に従ってＥＭＰ２を過剰発現する癌細胞または組織を指す。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、方法は、免疫複合体の対象への投与を含む。免疫複合体は、治療薬に結合した当該抗ＥＭＰ２抗体または断片を含むことができる。いくつかの実施形態では、治療薬は、細胞毒性剤である。細胞毒性剤は、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アルブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、ゲロニンマイトゲリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロチン、カリケアマイシン、サパオナリアオフィシナリス阻害剤、メイタンシノイド、及びグルココルチコイドリシンからなる群から選択することができる。治療薬は、放射性同位体であり得る。治療同位体は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅからなる群から選択することができる。
【０１６０】
上記の実施形態のいずれかでは、化学療法薬及び／または放射線療法をさらに投与することができる。いくつかの実施形態では、患者は、ホルモンアンタゴニスト療法も受ける。患者を抗体または抗体断片と接触させることは、抗体を患者に静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、または皮内投与することにより行うことができる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、免疫複合体は、小分子である細胞毒性剤を含む。メイタンシン、メイタンシノイド、サポリン、ゲロニン、リシン、またはカリケマイシン、及びそれらの類似体または誘導体のような毒素も適している。抗ＥＭＰ２抗体と複合することができる他の細胞毒性剤としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、及び５−フルオロウラシルが挙げられる。酵素活性毒素及びその断片を使用することもできる。放射性エフェクター部分は、既知の方法（例えば、二官能性リンカー、融合タンパク質）で複合体中に組み込まれ得る。本発明の抗体は、プロドラッグを活性化学療法薬に変換する酵素であるエフェクター部分とも複合され得る。ＷＯ８８／０７３７８、米国特許第４，９７５，２７８号、及び米国特許第６，９４９，２４５号を参照されたい。抗体または免疫複合体は、任意で、非タンパク質ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマー）に結合され得る。
【０１６２】
抗体及び細胞毒性剤の複合体は、当該技術分野において周知の方法を使用して作製され得る（米国特許第６，９４９，２４５号参照）。例えば、複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＣＬのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トリエン２，６−ジイソシアネートのような）ジイソシアネート、及び（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素−１４−標識化１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体との複合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞中での細胞毒性剤の放出を促進する「開裂性リンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））を使用してよい。
【０１６３】
他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、他の癌療法（例えば、根治的前立腺切除術）、放射線療法（外部ビームまたは小線源療法）、ホルモン療法、または化学療法と共に実施される。根治的前立腺切除術は、前立腺全体及びいくつかの周辺組織の除去を伴う。この治療は、癌が組織を越えて拡散していないと考えられる場合、一般的に使用される。放射線療法は、依然として前立腺に限定されるか、または近くの組織に拡散した前立腺癌を治療するのに一般的に使用される。疾患がより進行している場合、腫瘍のサイズを低減するのに放射線が使用され得る。ホルモン療法は、前立腺癌が前立腺を越えて拡散または再発している患者に使用されることが多い。ホルモン療法の目的は、男性ホルモン、アンドロゲンのレベルを低下させ、これにより前立腺癌を縮小またはよりゆっくりと増殖させることである。
【０１６４】
インビボ投与のための抗体組成物
本明細書で提供される当該抗ＥＭＰ２抗体の配合物は、所望の純度を有する抗体を任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）と、凍結乾燥配合物または水性溶液の形態で混合することにより、保存のために調製される。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のような緩衝液、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメチオニウム、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールのような）防腐剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンのょうなアミノ酸、単糖、二糖、ならびにグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールのような糖、ナトリウムのような塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
【０１６５】
配合物はまた、化学療法薬、細胞毒性剤、サイトカイン、増殖阻害剤、及び抗ホルモン剤を含む、追加の活性化合物を提供し得る。有効成分はまた、持続放出調製物（例えば、固体疎水性ポリマー（例えば、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド）の半透過性マトリックス）として調製され得る。抗体及び免疫複合体はまた、例えば、コアセルベーション技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、それぞれ、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中またはマクロエマルジョン中で封入され得る。
【０１６６】
組成物は、治療または予防処置のために投与することができる。治療用途において、組成物は、疾患（例えば、癌）を患っている患者に「治療有効用量」で投与される。この使用に効果的な量は、疾患の重症度及び患者の全体的な容態に依存するであろう。組成物の単一または複数投与は、患者により要求及び許容される投与量及び頻度に応じて投与され得る。本発明の目的のための「患者」または「対象」は、ヒト及び他の動物の両方、特に哺乳動物を含む。よって方法は、ヒト療法及び獣医学用途の両方に適用可能である。好ましい実施形態では、患者は哺乳動物、好ましくは霊長類であり、最も好ましい実施形態では、患者はヒトである。他の既知の癌療法は、本発明の方法と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明に従った使用のための組成物はまた、細胞を、５ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、メトトレキサート、等のような他の癌治療薬に対して、標的化または感受性化するのに使用され得る。
【０１６７】
併用投与は、別個の配合物または単一の薬学的配合物を使用する、同時投与、及びいずれかの順序での連続投与を考慮し、好ましくは、両方（または全て）の活性剤がそれらの生物活性を同時に発揮する期間がある。
【０１６８】
ＥＭＰ２の発現及び／または機能を間接または直接的に調節することが特定された分子及び化合物は、それぞれ、ＥＭＰ２を過剰発現する癌を治療するのに有用であり得る。これらの調節因子は、単独で投与または、従来の化学療法、放射線療法、もしくは免疫療法及び現在開発されている治療薬と組み合わせて同時投与することができる。
【０１６９】
本明細書における配合物はまた、治療される特定の適応症に必要な１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有し得る。例えば、抗体に他の特異性をもたらすことが望ましい場合がある。あるいは、または加えて、組成物は、細胞毒性剤、サイトカイン、増殖阻害剤、及び／または小分子アンタゴニストを含み得る。こうした分子は、適切には、意図する目的のために効果的な量で組み合わせて存在する。
【０１７０】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、それぞれ、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中またはマクロエマルジョン中で封入され得る。こうした技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０１７１】
インビボ投与に使用される配合物は、無菌、またはほぼ無菌であるべきである。これは無菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１７２】
持続放出調製物が調製され得る。持続放出調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）のような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日にわたる分子の放出を可能にするが、特定のハイドロゲルはタンパク質をより短期間で放出する。
【０１７３】
カプセル化された抗体が体内に長時間残留する場合、それらは３７℃での水分への曝露の結果として変性または凝集し、生物活性の喪失及び免疫原性の変化の可能性をもたらし得る。合理的な戦略は、関与するメカニズムに応じた安定化について考案され得る。例えば、凝集メカニズムが、チオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−−Ｓ結合形成であると見出される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を制御し、適切な添加剤を使用し、特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することにより、達成され得る。
【０１７４】
投与モダリティ
本発明の抗体及び化学療法薬は、対象に、ボーラスとしてまたは一定期間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路のような、既知の方法に従って投与される。特定の態様では、本発明の抗体及び化学療法薬は、癌を有する対象に投与される。特定の態様では、本発明の抗体及び化学療法薬は、乳癌を有する対象に投与される。特定の態様では、本発明の抗体及び化学療法薬は、トリプルネガティブ乳癌を有する対象に投与される。抗体の静脈内または皮下投与が好ましい。
【０１７５】
治療モダリティ
本発明の方法では、疾患または病態に対して陽性治療応答をもたらす療法が使用される。「陽性治療応答」とは、疾患もしくは病態の改善、及び／または疾患もしくは病態に関連した症状の改善を意図する。例えば、陽性治療応答とは、疾患における次の改善：（１）新生細胞数の低減、（２）新生細胞死の増加、（３）新生細胞生存の阻害、（５）腫瘍増殖の阻害（すなわちある程度までの遅延、好ましくは停止）、（６）増加した患者生存率、及び（７）疾患または病態に関連した１つ以上の症状のいくからの緩和のうちの１つ以上を指すであろう。
【０１７６】
いずれかの所定の疾患または病態における陽性治療応答は、その疾患または病態に特異的な標準化された応答基準により決定することができる。腫瘍応答は、腫瘍形態（すなわち、全体的な腫瘍負荷、腫瘍サイズ、等）における変化について、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャン、ｘ放射線イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャンイメージング、内視鏡、及び腫瘍生検サンプリングのようなスクリーニング技法を使用して評価することができる。
【０１７７】
これらの陽性治療応答に加えて、療法を行っている対象は、疾患に関連した症状の改善という有益な効果を経験し得る。
【０１７８】
こうした応答は、本発明の方法に従った治療後、少なくとも４〜８週間、または場合によっては６〜８週間持続し得る。あるいは、疾患の改善は、部分応答であるとして分類され得る。「部分応答」とは、４〜８週間、または６〜８週間持続し得る、新たな病変の非存在下での、全ての測定可能な腫瘍負荷（すなわち、対象中に存在する悪性細胞の数、または測定された腫瘍の塊の質量もしくは異常モノクローナルタンパク質の量）の少なくとも約５０％減少を意図する。
【０１７９】
本発明に従った治療は、「治療有効量」の使用薬剤を含む。「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な投与量及び時間で、効果的な量を指す。
【０１８０】
治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個体中で所望の応答を引き出す薬剤の能力のような因子に従って、変動し得る。治療有効量はまた、抗体または抗体部分のいずれかの毒性または有害作用を、治療有益作用が上回るものである。
【０１８１】
腫瘍療法のための「治療有効量」はまた、疾患の進行を安定化するその能力により測定され得る。癌を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデルシステムにおいて評価され得る。
【０１８２】
あるいは、組成物のこの特性は、当業者に知られているインビトロアッセイによって、細胞増殖を阻害またはアポトーシスを誘発する化合物の能力を調査することにより評価され得る。治療有効量の治療化合物は、対象における腫瘍サイズを減少、またはそうでなければ症状を改善し得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び選択された特定の組成物または投与経路のような要因に基づき、こうした量を決定することができるであろう。
【０１８３】
投与量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすように調節される。例えば、単一ボーラスを投与してよく、いくつかの分割用量を時間をかけて投与してよく、または用量を治療状況の緊急性により示されるように比例的に低減もしくは増加してよい。非経口組成物は、投与しやすさ及び投与量の均一性のために単位剤形で配合され得る。本明細書で使用される単位剤形とは、治療される対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。
【０１８４】
本発明の単位剤形についての仕様は、（ａ）活性化合物の独自の特徴及び達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における治療感度についてこうした活性化合物を配合する技術分野に固有の限界により規定され、これらに直接依存している。
【０１８５】
本発明において使用される抗ＥＭＰ２抗体についての効率的な投与量及び投与量レジメンは、治療される疾患または態様に依存し、当業者により決定され得る。
【０１８６】
本発明において使用される抗ＥＭＰ２抗体の治療有効量についての例示的な非限定的な範囲は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇのような、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇのような、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．３、約１、または約３ｍｇ／ｋｇのような、０．５ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、抗体は、１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量のような、１ｍｇ／ｋｇ以上の用量、例えば、５〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１８７】
当該技術分野における通常の技術を有する医療従事者は、必要な薬学的組成物の効果的な量を容易に決定し、処方し得る。例えば、医師または獣医師は、薬学的組成物中で使用される薬剤の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要なものより低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加することができる。
【０１８８】
１つの実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、２００〜４００ｍｇ／ｋｇのような、１０〜５００ｍｇ／ｋｇの１週間の投与量での注入により投与される。こうした投与は、例えば、３〜５回のような、１〜８回繰り返され得る。投与は、２〜１２時間のような、２〜２４時間の期間にわたる連続注入により行われ得る。
【０１８９】
１つの実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、毒性を含む副作用を低減するのに必要な場合、２４時間超のような、長期にわたるゆっくりとした連続注入により投与される。
【０１９０】
１つの実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、または２０００ｍｇのような、２５０ｍｇ〜２０００ｍｇの１週間の投与量で、４〜６回のような、最大８回投与される。投与は、２〜１２時間のような、２〜２４時間の期間にわたる連続注入により行われ得る。こうしたレジメンは、例えば、６か月または１２か月後、必要に応じて１回以上繰り返され得る。投与量は、例えば、生体試料を採取し、抗ＥＭＰ２抗体の抗原結合領域を標的化する抗イディオタイプ抗体を使用することによって、投与後の血液中の本発明の化合物の量を測定することにより、決定または調節され得る。
【０１９１】
さらなる実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、３〜１０週間、４〜８週間のような、２〜１２週間にわたって週１回投与される。
【０１９２】
１つの実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、例えば、６か月以上の期間にわたって週１回のような、維持療法により投与される。
【０１９３】
１つの実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、抗ＥＭＰ２抗体の１回の注入、続いて放射性同位体と複合した抗ＥＭＰ２抗体の１回の注入を含むレジメンにより投与される。レジメンは、例えば、７〜９日後、繰り返され得る。
【０１９４】
非限定的な例としては、本発明に従った治療は、治療の開始後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０日目のいずれか１日で、またはあるいは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０週目のうちの少なくとも１週間で、１日当たり、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｋｇの量の抗体の一日投与量、またはこれらのいずれかの組み合わせとして、２４、１２、８、６、４、もしくは２時間、またはこれらの組み合わせの単一または分割用量を使用して提供され得る。
【０１９５】
併用療法
いくつかの実施形態では、その抗ＥＭＰ２抗体分子は、１つ以上の追加の治療薬、例えば、化学療法薬と組み合わせて使用される。ＤＮＡ損傷化学療法薬の非限定的な例としては、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、及びこれらの類似体または代謝物、ならびにドキソルビシン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、及びダウノルビシン）、アルキル化剤（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イフォスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、及びシクロホスファミド）、ＤＮＡインターカレータ（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン）、ブレオマイシンのようなＤＮＡインターカレータ及びフリーラジカル発生剤、ならびにヌクレオシド模倣体（例えば、５−フルオロウラシル、カペシチビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、及びヒドロキシ尿素）が挙げられる。
【０１９６】
細胞複製を崩壊させる化学療法薬としては、パクリタキセル、ドセタキセル、及び関連類似体、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及び関連類似体、タリドミド、レナリドミド、及び関連類似体（例えば、ＣＣ−５０１３及びＣＣ−４０４７）、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブメシレート、及びゲフィチニブ）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、ＩκＢキナーゼの阻害剤を含む、ＮＦ−κＢ阻害剤、癌において過剰発現したタンパク質に結合する抗体、及び癌において上方調節、過剰発現、または活性化することが知られるタンパク質または酵素の他の阻害剤が挙げられ、その阻害は細胞複製を下方調節する。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載されるか、または現時点もしくはその後当業者に知られる化学療法薬のいずれかでの治療前、それと同時、またはその後に使用され得る。
【０１９８】
本明細書に記載される方法の有効性
本発明の特定の態様では、抗ＥＭＰ２療法の有効性は、腫瘍特異的マーカーの減少した血清濃度、増加した全体的な生存時間、減少した腫瘍サイズ、癌寛解、減少した転移マーカー応答、及び減少した化学療法の有害作用により測定される。
【０１９９】
本発明の特定の態様では、有効性は、コンパニオン診断方法及び製品で測定される。コンパニオン診断測定は、抗ＥＭＰ２治療の前、その間、またはその後に行われ得る。
【０２００】
コンパニオン診断薬
本発明の第２の態様の１つの実施形態では、診断または予防アッセイは、患者の癌がＥＭＰ２を過剰発現により特徴付けられるかを決定するために行われるだろう。こうした増幅／過剰発現を決定するための様々なアッセイが考慮され、免疫組織化学、ＦＩＳＨ及びｓｈｅｄ抗原アッセイ、サザンブロッティング、またはＰＣＲ技法が挙げられる。また、ＥＭＰ２過剰発現または増幅は、インビボ診断アッセイを使用して、例えば、検出される分子に結合し、検出可能な標識（例えば、放射性同位体）で標識される（抗体のような）分子を投与し、患者を標識の局在化について外部スキャンすることにより、評価され得る。いくつかの実施形態では、治療される癌は、まだ侵襲性でないが、ＥＭＰ２を過剰発現する。
【０２０１】
他の実施形態では、本開示は、コンパニオン診断方法及び製品に関する。１つの実施形態では、コンパニオン診断方法及び製品は、本明細書に記載されるように、乳癌、特にトリプルネガティブ乳癌の治療をモニタリングするのに使用することができる。いくつかの実施形態では、コンパニオン診断方法及び製品は、タンパク質、遺伝子、または特異的な遺伝子変異のレベルを測定する分子アッセイを含む。こうした測定は、例えば、抗ＥＭＰ２療法が特定の個体に利益をもたらすかを予測し、抗ＥＭＰ２療法の効果的な投与量を予測し、抗ＥＭＰ２療法をモニタリングし、抗ＥＭＰ２療法を調節し、抗ＥＭＰ２療法を個体に適応させ、癌進行及び寛解を追跡するのに使用することができる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、コンパニオン診断薬は、併用療法をモニタリングするのに使用することができる。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、コンパニオン診断薬は、本明細書に記載される抗ＥＭＰ２抗体を含むことができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、コンパニオン診断薬は、抗ＥＭＰ２療法の前、その間、またはその後に使用することができる。
【０２０５】
製造物品
他の実施形態では、上で記載される障害の治療に有用な物質を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器及びラベルを含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、及び試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な物質から形成され得る。容器は、病態を治療するのに効果的である組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針により穿刺可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の活性剤は、抗体である。容器上の、またはこれに関連したラベルは、組成物が選択される病態を治療するのに使用されることを示す。製造物品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液のような、薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含み得る。これは、他の緩衝液、希釈剤、充填剤、針、シリンジ、及び使用説明を有する添付文書を含む、商業的及びユーザー観点から望ましい他の物質をさらに含み得る。
【０２０６】
本発明をここで下記の実施例を参照しながら説明する。これらの実施例は、例示の目的でのみ提供され、本発明は、決してこれらの実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ本明細書で提供される教示の結果として明らかとなるいずれか及び全ての変更を包含するものと解釈されるべきである。
【０２０７】
一方、本発明の特定の実施形態は、本明細書において説明の目的で記載されており、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に記載される発明から逸脱することなく、詳細の多数の変更が行われ得ることを理解するであろう。
【実施例】
【０２０８】
実施例１：当該抗ＥＭＰ２抗体の構成
コンピュータアルゴリズムは、ＰＧ−１０１の軽鎖ＣＤＲ３中の潜在的な脱アミド化部位を予測した。（図１２）。配列易罹患性を確認するために、ＰＧ−１０１を、トリプシンを使用して開裂した後、質量分光分析を行った。質量分光分析は、可変軽鎖ＣＤＲ３中の予測部位が開裂に対して感受性であったことを確認した。（図１３）。
【０２０９】
（ＰＧ−１０１親と称される）抗ＥＭＰ２抗体ＰＧ−１０１の（「バリアント１」及び「バリアント２」と称される）２つのバリアントを、ＰＧ−１０１の可変軽鎖ＣＤＲ３中の脱アミド化部位を除去するように構成した。
【０２１０】
ＰＧ−１０１親、ＰＧ−１０１バリアント１、及びＰＧ−１０１バリアント２抗体を、高発現哺乳類ベクター系にクローニングし、３つの小規模（０．０３リットル）プレミアム一過性産生ランを、ＨＥＫ２９３細胞において完了した。抗体を、タンパク質Ａ精製により精製し、４．５８ｍｇのＰＧ−１０１親、３．１８ｍｇのＰＧ−１０１バリアント１、及び５．１０ｍｇのＰＧ−１０１バリアント２を得た。
【０２１１】
ＰＧ−１０１親、ＰＧ−１０１バリアント１、及びＰＧ−１０１バリアント２抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を下に示し、各々の可変領域を灰色で網掛けした。
【０２１２】
ＰＧ−１０１親ＨＣ−ｈｌｇＧ１：
【表１】
2019502670.tif 000003
ＰＧ−１０１親ＬＣ−ｈκ：
【表２】
2019502670.tif 000004
ＰＧ−１０１ＬＣバリアント１−ｈκ：
【表３】
2019502670.tif 000005
ＰＧ−１０１ＬＣバリアント２−ｈκ：
【表４】
2019502670.tif 000006
【０２１３】
各重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列を下に示す。
【０２１４】
ＰＧ−１０１親ＨＣ−ｈｌｇＧ１：
ＡＴＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＡＣＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＡＣＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＴＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＴＣＣＧＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＡＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＴＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＡＴＡＧ（配列番号２１）
ＰＧ−１０１親ＬＣ−ｈκ：
ＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＧＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＡＣＡＡＣＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＡＡ（配列番号２２）
ＰＧ−１０１ＬＣバリアント１−ｈκ：
ＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＧＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＡＡ（配列番号２３）
ＰＧ−１０１ＬＣバリアント２−ｈκ：
ＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＧＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＡＡ（配列番号２４）
【０２１５】
実施例２：ＰＧ−１０１抗体及びバリアントの結合特徴
ＰＧ−１０１抗体及びバリアントの結合特徴を試験した。まず、ＳＵＭ１４９細胞についての抗ＥＭＰ２ＩｇＧ１抗体の滴定を、フローサイトメトリーを使用して試験した（図１、左）。ＫＤを、非線形回帰分析を使用して２．６で決定した。結合の特異性及び感度を確認するために、リツキシマブを陰性対照として使用した（図１、右）。次に、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞へのＰＧ−１０１及びバリアント結合を試験した（図２）。ＰＧ−１０１（配合前）を、再配合されたＰＧ−１０１、バリアント１、及びバリアント２と比較した。バリアント２は、飽和に到達せず、緩衝液再形成は、ＥＭＰ２に対する親抗体の結合親和性を向上させた。
【０２１６】
再配合されたＰＧ−１０１の安定性も試験した。（図３）。具体的には、ＳＵＭ１４９細胞についての再配合ＰＧ−１０１の結合親和性を、フローサイトメトリーを使用して試験した（図３、左）。ＫＤを、非線形回帰分析を使用して２．６で決定した加えて、凍結及び解凍後のＳＵＭ１４９細胞についてのＰＧ−１０１の結合を試験した。図３に示されるように、調製したばかりの抗体（左）と凍結解凍した試料（右）との間に相違は観察されなかった。
【０２１７】
ＥＭＰ２についての抗ＥＭＰ２バリアント１及びＰＧ−１０１結合親和性の比較を行った。図４に示されるように、抗ＥＭＰ２バリアント１は、向上した親和性でのＥＭＰ２への結合を保持する。ＥＭＰ２へのＰＧ−１０１及びバリアント１結合を、ＳＵＭ１４９及びフローサイトメトリーを使用して決定した。バリアント１は、向上した親和性でのＥＭＰ２への結合を保持する。フローサイトメトリーを使用して、ＳＵＭ１４９細胞についてのＥＭＰ２に結合する両方の抗体の能力を決定した。親抗体についてのＫＤは、２．６μｇ／ｍｌの非線形回帰分析であり、バリアント１では結合において２倍超の増加があった。
【０２１８】
実施例３：インビトロでのＰＧ−１０１対バリアント抗ＥＭＰ２抗体の機能的活性
細胞死を誘発するＰＧ−１０１及びバリアント１の能力を、３つの独立した実験において決定した（図５〜７）。簡潔に、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、変動する濃度の抗ＥＭＰ２抗体で５日間インキュベートした。細胞死を、フローサイトメトリーを使用してアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム染色を定量化することにより測定した（図５、左）。５日間のインキュベーション後の総細胞数を、トリパンブルー色素排除を使用して計数した（図５、右）。図５及び６における２つの独立した実験は、変動する濃度の抗ＥＭＰ２抗体及び対照を使用して行い、図７における実験は、５０μｇ／ｍｌの抗体及び対照を５日間使用して行った。これらの図において示されるように、ＰＧ−１０１及びバリアント１は、共に細胞死を誘発することができた。
【０２１９】
癌幹細胞を阻害する当該抗ＥＭＰ２抗体の能力を決定するために、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、変動する濃度のＰＧ−１０１及びバリアント１でインキュベートし、ＡＬＤＨ活性を３つの独立した実験において評価した（図８及び９）。図８では、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、変動する濃度のＰＧ−１０１及びバリアント１でインキュベートした。両方の試薬は、癌幹細胞の尺度であるＡＬＤＨ活性を顕著に低減した。図９では、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の２４時間の処理は、ＡＬＤＨ活性の低減を示した。フローサイトメトリーの生の結果は、左に表され、右にグラフで示される。
【０２２０】
癌幹細胞を阻害する当該抗ＥＭＰ２抗体の能力はまた、マンモスフィア形成アッセイを使用して評価した（図１０及び１１）。マンモスフィア形成は、癌幹細胞の別の尺度である。簡潔に、対照ＩｇＧ、ＰＧ−１０１、またはバリアント１を、２週間ＢＴ４７４細胞でインキュベートした。図１０は、インキュベーション後の細胞の生の画像を示す。図１１は、トリプリケートウェル中のマンモスフィアの計数を示す。＊、スチューデントのｔ検定を使用してｐ＜０．０５。これらの研究において示されるように、ＰＧ−１０１及びバリアント１の両方は、マンモスフィア形成を低減することができ、バリアント１は、ＰＧ−１０１よりもマンモスフィア形成を低減することができた。
【０２２１】
実施例４：インビボでのＰＧ−１０１対バリアント抗ＥＭＰ２抗体の機能的活性
インビボで腫瘍負荷を低減するＰＧ１０１及び（ここで「ＰＧ−２０１」と称される）バリアント１の能力を決定した（図１４及び１５）。簡潔に、ＨＥＣ１ａ子宮内膜癌異種移植片を、Ｂａｌｂ／ｃヌード動物において形成した。腫瘍が１００ｍｍ３に到達した際、それらを１０ｍｇ／ｋｇのＩＰで週に２回、ビヒクル対照、ＰＧ−１０１、またはＰＧ−２０１で処理した。図１４において示されるように、ＰＧ−１０１及びＰＧ−２０１は共に腫瘍負荷を顕著に低減した。
【０２２２】
図１５において示されるように、ＰＧ−２０１も、乳癌のネズミモデルにおいて腫瘍負荷を効果的に低減した。４Ｔ１細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳房脂肪体に移植した。マウスを週２回、１０ｍｇ／ｋｇのＰＧ−２０１または生理食塩水で処理した。図１３において示されるように、ＰＧ−２０１は、生理食塩水対照と比較して、腫瘍負荷を低減した。
【０２２３】
実施例５：ＰＧ−２０１は抗体薬物複合体として有用である
ＰＧ−１０１及びＰＧ−２０１を薬物複合体として使用することができたかを評価するために、ＰＧ−１０１及びＰＧ−２０１を、鎖間ジスルフィド結合を露出するように還元した後、チオリンカーを使用して再架橋した（図１６）。チオリンカーを次に、クリックケミストリーを使用してＤＢＣＯ−ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）に付着し、抗体薬物複合体を生成した。うまく再架橋された抗体は、〜１６０ｋＤ（天然）のみを示す（ＰＧ−２０１、図１６、右）。ＰＧ−１０１は、天然抗体中の軽鎖断片（図１６、左）を一貫して示し、抗体薬物複合体の安定性の欠如を示した。
【０２２４】
前述の発明は、理解の明瞭性の目的で例示及び例によっていくらか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それに特定の変更及び修正が行われ得ることは、当業者には本発明の教示に照らして容易に明らかとなるであろう。
【図１】
2019502670.tif 000007
【図２】
2019502670.tif 000008
【図３】
2019502670.tif 000009
【図４】
2019502670.tif 000010
【図５】
2019502670.tif 000011
【図６】
2019502670.tif 000012
【図７】
2019502670.tif 000013
【図８】
2019502670.tif 000014
【図９】
2019502670.tif 000015
【図１０】
2019502670.tif 000016
【図１１】
2019502670.tif 000017
【図１２】
2019502670.tif 000018
【図１３】
2019502670.tif 000019
【図１４】
2019502670.tif 000020
【図１５】
2019502670.tif 000021
【図１６】
2019502670.tif 000022
【配列表】
2019502670000001.app
【国際調査報告】
2019502670.tif 000023
2019502670.tif 000024