(57)【要約】  陰性モードエレクトロスプレー質量分析計に連結されたキャピラリ電気泳動のための電気運動的にポンピングされるシース流ナノスプレーの界面が記載されている。この界面において、電場の印加は、オリフィスを有するガラスエミッタの内部で電気浸透流を生成する。電気浸透流は、液を分離キャピラリの遠位先端付近にポンピングし、検体をエレクトロスプレー電解質内へと覆う。陰イオンモードでは、未処理のエミッタに印加された負の電位はエミッタオリフィスから離れるシース流を駆り立て、スプレーの安定性と効率を低下させる。対照的に、エレクトロスプレーエミッタの内側をアミノアルキルシランでグラフトする場合、アミンは正電荷を有し、それが電気浸透を逆転させて、陰性電位下でエミッタオリフィスへの安定したシース流を発生させる。検出限界は、注入物の約１５０〜９００アトモルであった。陰性モードの動作は、ステージ１のアフリカツメガエルの胚からの代謝産物抽出物を分析することによって実証した。
2019510336.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析計用のエレクトロスプレーイオン化界面であって、
陰性モードのシース液の電気浸透流（ＥＯＦ）用のガラスエミッタであって、表面が、前記表面に共有結合された１つ以上の有機化学物質のコーティングを含み、前記有機化学物質は１つ以上の官能基を含むガラスエミッタと、
シース液の注入口と
を含み、
前記ガラスエミッタに導入されたシース液にエレクトロスプレー電圧が印加されるとき、前記官能基に形成された正電荷は、陰性モードで前記ＥＯＦの方向を安定させる、エレクトロスプレーイオン化界面。
【請求項２】
前記ガラスエミッタは、遠位端にオリフィスを備えた中空シリンダであり、前記オリフィスの内径は、前記シリンダ本体の内径よりも小さく、前記シース液の前記ＥＯＦは、前記オリフィスに向かう方向に横切り、前記シース液が前記オリフィスを出るときに、イオン化されたエレクトロスプレーが形成される、請求項１に記載の界面。
【請求項３】
前記ガラスエミッタの全部より少ない部分が前記官能基を含む、請求項１に記載の界面。
【請求項４】
分離キャピラリをさらに含む界面であって、前記キャピラリが分離バックグラウンド電解質を含み、前記分離バックグラウンド電解質の混合物中の１つ以上の分析物が前記キャピラリで分離され、前記キャピラリを出る前記検体は前記分離キャピラリの前記遠位先端の周りの前記シース液の前記ＥＯＦにより、前記オリフィスに向かって送られる、請求項１に記載の界面。
【請求項５】
前記ガラスエミッタオリフィスの前記内径が約１０μｍ〜約２５μｍである、請求項２に記載の界面。
【請求項６】
前記官能基が、エミッタオリフィスと反対の方向にＥＯＦを実質的に防止し、それによってエレクトロスプレー強度の変動を最小化する、請求項２に記載の界面。
【請求項７】
前記ガラスエミッタを出る前記イオン化されたエレクトロスプレーのエレクトロスプレー強度の最小限の変動が、１フェムトモル未満の検体の検出限界をもたらす、請求項６に記載の界面。
【請求項８】
検体の前記検出限界が約１５０〜約９００アトモルである、請求項７に記載の界面。
【請求項９】
エレクトロスプレーイオン化−質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）用のエミッタであって、
遠位端にオリフィスを有する中空シリンダであって、前記オリフィスの内径は前記シリンダ本体の内径よりも小さく、前記エミッタの表面は前記表面に共有結合した１つ以上の有機化学物質のコーティングを含み、前記有機化学物質は、１つ以上の官能基を含む中空シリンダ、および
前記エミッタとシース液の注入口とのユニオン
を含み、
前記エミッタに導入された前記シース液に陰性モードのエレクトロスプレー電圧が印加されるとき、前記官能基に形成された正電荷が前記シース液の電気浸透流（ＥＯＦ）の方向を前記オリフィス方向に安定させ、イオン化したエレクトロスプレーが、前記シース液が前記オリフィスを出るときに形成される、エミッタ。
【請求項１０】
前記エミッタが、１つ以上の前記官能基によって完全に、実質的に、または部分的にコーティングされたボロシリケートガラスを含む、請求項９に記載のエミッタ。
【請求項１１】
前記表面エミッタの約１０％〜約９０％が１つ以上の前記官能基によってコーティングされている、請求項９に記載のエミッタ。
【請求項１２】
前記エミッタの前記表面に共有結合した前記有機化学物質は、有機アミンを含む、請求項９に記載のエミッタ。
【請求項１３】
前記エミッタオリフィスの前記内径が約５μｍ〜約３０μｍである、請求項９に記載のエミッタ。
【請求項１４】
使用中に前記エミッタオリフィスを出るイオン化されたエレクトロスプレーバックグラウンド信号の強度が、約±２×１０４強度ユニット未満に安定化され、対応するエレクトロフェログラムベースラインの変動性が少なくとも１０倍減少する、請求項９に記載のエミッタ。
【請求項１５】
陰性モードエレクトロスプレーイオン化−質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）用のガラスエミッタを適合させるための方法であって、
ガラスエミッタの表面に官能基を有する有機化学物質を共有結合させることであって、ここで前記ガラスエミッタは遠位端にオリフィスを含む中空シリンダであり、前記オリフィスの内径は前記シリンダ本体の内径より小さい、共有結合させること、および
前記ガラスエミッタと分離キャピラリとを質量分析計に接続することであって、ここで分離バックグラウンド電解質の１つ以上の検体の混合物は前記キャピラリで分離される、接続すること
を含み、
前記エミッタに導入されたシース液に陰性モードのエレクトロスプレー電圧が印加されたとき、前記シース液の前記オリフィス方向への電気浸透流（ＥＯＦ）の方向を安定化させるために前記官能基に正電荷が形成され、前記キャピラリを出る前記検体が、前記キャピラリの前記遠位先端の周りの前記ＥＯＦによって前記オリフィスに向けて移送され、前記シース液と前記検体が前記オリフィスを出るときにイオン化されたエレクトロスプレーを形成する方法。
【請求項１６】
アミノアルキルシランがガラスエミッタの表面に共有結合し、アミノアルキルシランのアミノ部分は正に荷電している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ガラスエミッタオリフィスの前記内径が約１０μｍ〜約２５μｍである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記安定させたＥＯＦが安定したエレクトロスプレーを生成する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出限界が約１フェムトモル未満である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
試料を分析するためのＥＳＩ−ＭＳ分析方法であって、
ｉ）質量分析計を、ａ）請求項１の前記エミッタおよび前記シース液注入口と、ｂ）分離バックグラウンド電解質の１つ以上の検体の混合物が前記キャピラリで分離されている分離キャピラリとに接続することであって、
ここで陰性モードのエレクトロスプレー電圧が、前記注入口を介して前記エミッタに導入されたシース液に印加されると、前記キャピラリを出る前記検体は前記キャピラリの前記遠位先端の周囲の前記シース液の前記安定したＥＯＦによって前記オリフィスに向かって移送され、それによって前記シース液と前記検体が前記オリフィスを出て、続いて前記質量分析計に入るときに安定化されたエレクトロスプレーを生じる、接続すること、および
ｉｉ）約１フェムトモル未満の検出レベルで質量分析によって前記試料を分析し、それにより前記試料の検体の存在および相対量を判定すること
を含む方法。
【請求項２１】
前記試料の検体がキャピラリゾーン電気泳動（ＣＺＥ）によって分離される、請求項２０に記載の分析方法。
【請求項２２】
前記試料が、１つ以上の脂質、１つ以上の炭水化物、１つ以上の代謝化合物、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２１に記載の分析方法。
【請求項２３】
ＣＺＥ用の分離バックグラウンド電解質および前記シース液が有機添加物を含まない、請求項２１に記載の分析方法。
【請求項２４】
前記シース液の高い流速またはエレクトロスプレーバックグラウンド電解質の高速流により検出限界が実質的に減少しない、請求項２３に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で、２０１５年１２月３１日に提出された米国仮特許出願第６２／２７４，０９７号に対する優先権を主張するものであり、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって付与された助成金番号Ｒ０１  ＧＭ０９６７６７の下での政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は、質量分析（ＭＳ）のためのイオン化技術として導入されて以来、生体分子の分析に不可欠であった。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やキャピラリ電気泳動（ＣＺＥ）などの高分解能分離技術を、ＥＳＩ界面を介して質量分析に連結させることにより、プロテオミクスやメタボロミクスにおいて頻繁に直面する非常に複雑な混合物の分析が可能になる。エレクトロスプレーによりタンデム質量分析に連結されるＣＺＥは、生物学的試料の分析のためのナノＬＣＭＳに対する最近開発された強力な代替手段である。エレクトロスプレーの界面はシステムの性能にとって重要である。分離キャピラリの遠位端の電位を制御し、その間にエレクトロスプレーを同時に駆動しなければならないのである。
【０００４】
キャピラリ電気泳動−エレクトロスプレーの界面には、少なくとも３つの種類がある。Ａｇｉｌｅｎｔによる商用の界面は、従来のＨＰＬＣエレクトロスプレーの界面に似ている。それは、機械でポンピングされたシース液および噴霧ガスを使用する。シース液は、エレクトロスプレーを支えながら分離キャピラリに電気的接続をもたらす。この界面は非常に丈夫であるはずだが、比較的高速のシース流速を使用するのに起因して、高希釈で損害を受ける可能性がある。
【０００５】
第２の界面は、キャピラリの壁自体の小さな部分を通して分離キャピラリの内部に電気的に接触することによってシース液を除去するものである。キャピラリの遠位先端をエッチングして、電気泳動を駆動するのに十分な導電性を有する非常に薄い壁を作製する。エッチングされたキャピラリの壁の外面は、エレクトロスプレー電圧で保持された電解質と接触している。システムはまた、シースガスを使用するのでなく、キャピラリを介して検体の電気運動的な移送を補うために圧力駆動の流れを頻繁に採用している。メタノールやアセトニトリルなどの有機溶媒を含む酸性電解質がよく使用されており、時おり電気泳動の間に電解質をキャピラリを通してポンピングするためにキャピラリの近位端に低圧が加えられている。
【０００６】
第３の界面は、安定したナノスプレーを生成するために、電気運動的に駆動されるシース流を使用するものである。界面は電解質で満たされたガラスエミッタを使用し、以前の界面と同様に、噴霧ガスを使用しない。エミッタの内部のシリケート基は、ほとんどの条件下で負の電荷を帯びる。電場の印加は、ｎＬ／ｍｉｎレジームにおいて非常に安定したポンプとして作用する電気浸透流を生成する。流れの方向および速度は、エミッタの印加電位および表面の電荷に依存する。質量分析計および未処理のガラスエミッタに関して正の電位の下では、電気浸透がエミッタオリフィスに向けられ、安定したエレクトロスプレーが生成される。負の電位および未処理のガラスエミッタの下では、流れはエミッタオリフィスから遠ざかる方に向けられ、不安定なエレクトロスプレーを生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
陰イオンエレクトロスプレーは、多数の検体の分析において価値があり、エミッタに負の電位を印加する必要があるものである。しかし、安定したエレクトロスプレーを生成するためには、エミッタの表面の化学的性質を改変して、陰イオン操作下でエレクトロスプレーのエミッタオリフィスに確実に電気浸透流を向け、それによって適度な感度で安定している流れを作り出すことが必要である。したがって、この問題に対処する技術的解決法によって、質量分析および電気泳動の技術が進歩するであろう。
【０００８】
陰性モードエレクトロスプレーイオン化−質量分析（ＥＳＩＭＳ）に連結されたキャピラリ電気泳動（ＣＥ）のための第１の電気運動的にポンピングされるシース流の界面を実証する。この界面において、電場の印加は、ガラスエミッタの内部（約１０μｍの内径オリフィス）で電気浸透流を生成する。この電気浸透流は、シース液を分離キャピラリの遠位先端付近にポンピングし、検体をエレクトロスプレーに引き込む。陽イオンモードでは、接地された質量分析計の入口オリフィスに対して正の電位がエミッタに印加される。この正の電位は、ガラスの表面の負に荷電したシラノール基と相互作用して、エミッタオリフィスに向かう流れを生じる。対照的に、陰イオンモードでは、エミッタに印加された負の電位はエミッタオリフィスから離れるシース流を駆動し、スプレーの安定性と効率を低下させる。本開示では、電気浸透を逆流させ、エミッタオリフィスへのシース流を駆動するのに適切な化学物質で、エレクトロスプレーエミッタの内部の一部を処理した。界面の能力は、Ｔｈｅｒｍｏ  ＱＥｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計のアミノ酸標準の混合物を分析することによって実証している。線形の較正曲線を、３３０アトモルのわずかな注入量で３桁の大きさにわたって生成した。検出限界（ＬＯＤ）は、注入された試料の１５０〜９００アトモルの間であった。濃度に関する安定性および線形反応は、処理されたエミッタ界面によりもたらされる能力の改善を示している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本開示は、質量分析計用のエレクトロスプレーイオン化界面用の装置であって、
陰性モードのシース液の電気浸透流（ＥＯＦ）用のガラスエミッタであって、表面が、表面に共有結合された１つ以上の有機化学物質のコーティングを含み、有機化学物質は１つ以上の官能基（例えば、エレクトロスプレー電圧に曝されたときに、部分に正電荷を形成させる）を含むガラスエミッタと、
シース液の注入口と
を含み、
ガラスエミッタに導入されたシース液にエレクトロスプレー電圧が印加されるとき、官能基に形成された正電荷は、陰性モードでＥＯＦの方向を安定させる、エレクトロスプレーイオン化界面用の装置を提供する。
【００１０】
また、エレクトロスプレーイオン化−質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）用のエミッタは、
遠位端にオリフィスを有する中空シリンダであって、オリフィスの内径はシリンダ本体の内径よりも小さく、エミッタの表面は表面に共有結合した１つ以上の有機化学物質のコーティングを含み、有機化学物質は、１つ以上の官能基を含む中空シリンダ、および
エミッタとシース液の注入口とのユニオン
を含むことができ、
エミッタに導入されたシース液に陰性モードのエレクトロスプレー電圧が印加されるとき、官能基に形成された正電荷がシース液の電気浸透流（ＥＯＦ）の方向をオリフィス方向に安定させ、イオン化したエレクトロスプレーが、シース液がオリフィスを出るときに形成される。
【００１１】
本開示はまた、陰性モードエレクトロスプレーイオン化−質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）用のガラスエミッタを適合させるための方法であって、
ガラスエミッタの表面に官能基を有する有機化学物質を共有結合させることであって、ここでガラスエミッタは遠位端にオリフィスを含む中空シリンダであり、オリフィスの内径はシリンダ本体の内径より小さい、共有結合させること、および
ガラスエミッタと分離キャピラリとを質量分析計に接続することであって、ここで分離バックグラウンド電解質の１つ以上の検体の混合物をキャピラリで分離する、接続すること
を含み、
エミッタに導入されたシース液に陰性モードのエレクトロスプレー電圧が印加されたとき、シース液のオリフィス方向への電気浸透流（ＥＯＦ）の方向を安定化させるために官能基に正電荷が形成され、キャピラリを出る検体が、キャピラリの遠位先端の周りのＥＯＦによってオリフィスに向けて移送され、シース液と検体がオリフィスを出るときにイオン化されたエレクトロスプレーを形成する方法を提供する。
【００１２】
さらに、本開示は、試料を分析するためのＥＳＩ−ＭＳ分析方法であって、
ｉ）質量分析計を、ａ）本明細書に記載のエミッタおよびシース液注入口と、ｂ）分離バックグラウンド電解質の１つ以上の検体の混合物がキャピラリで分離されている分離キャピラリとに接続することであって、
ここで陰性モードのエレクトロスプレー電圧が、注入口を介してエミッタに導入されたシース液に印加されると、キャピラリを出る検体はキャピラリの遠位先端の周囲のシース液の安定したＥＯＦによってオリフィスに向かって移送され、それによってシース液と検体がオリフィスを出て、続いて質量分析計に入るときに安定化されたエレクトロスプレーを生じる、接続すること、および
ｉｉ）約１フェムトモル未満の検出限界で質量分析によって試料を分析すること
を含む方法を提供する。
【００１３】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の実施形態または様々な態様をさらに示すために含まれている。いくつかの例では、本発明の実施形態は、添付の図面を本明細書に提示される詳細な説明と組み合わせて参照することによって、最もよく理解することができる。説明および添付の図面は、ある特定の例、または本発明の特定の態様を強調することができる。しかし、当業者であれば、実施例または態様の一部を、本発明の他の実施例または態様と組み合わせて使用できることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施形態による、陰性モードＥＳＩ（上の画像）およびガラスエミッタの概略図（下の画像）に関するＣＥＭＳ界面の図である。上の画像：（Ａ）分離キャピラリをバックグラウンド電解液（ＢＧＥ）で満たし、スリーブを通して４方向のＰＥＥＫユニオン（Ｂ）に通した。（Ｃ）アミノコーティングボロシリケートガラスエミッタをスリーブに嵌め込み、４方向のユニオンに取り付け、分離キャピラリをエミッタ先端に通した。（Ｄ）エレクトロスプレー電圧をバイアルの噴霧緩衝液に印加した。エレクトロスプレー電圧はまた、エミッタのＥＯＦを、エミッタの開口および質量分析計の入口に向かって駆動する。（Ｅ）噴霧緩衝液を含むシリンジを、４方向のユニオンの最終開口部に取り付けて、バイアルの噴霧緩衝液を補充し、気泡を除去した。ガラスエミッタの詳細（下の画像）。エミッタの壁のカチオンの部位は、電気二重層を形成するアニオンを引き付ける。エレクトロスプレー電位は、これらのアニオンをエミッタ先端に駆動し、アニオンはそれらと共に緩衝液を引き出し、電気浸透流を作り出す。この電気浸透流は、試料の流れが分離キャピラリを出るときにそれを覆う。溶液がエミッタを出るとき、エレクトロスプレーが生成された。
【図２】逆ＥＯＦを最小にするために、酸性の噴霧緩衝液で満たされたコーティングされていないボロシリケートガラスエミッタからの陰性モードのエレクトロスプレーのベースピークエレクトロフェログラムである（上のエレクトロフェログラム）。分離バックグラウンド電解質はメタノールを含み、即時の放電を防いだ。エレクトロスプレーは、スプレー強度の急激な振動が明白に示されており、ＥＯＦが最小であっても非常に不安定であった。エレクトロスプレーは、試料分析を行うのに、この構成では十分に安定した状態を維持しない。アミノアルキルシランでコーティングされたボロシリケートガラスエミッタ（上のエレクトロフェログラム）からの陰性モードのエレクトロスプレーにおけるホスホコリン試料のベースピークエレクトロフェログラムは、安定したベースラインと、信号対雑音の明確な分離を示す。
【図３】実施形態によるエミッタの概略図である。エミッタの円筒形部分は、引っ張りプロセスの間、コーティングの熱への曝露を最小限にするために、先細の先端に対して長く維持される。これらの寸法を維持することにより、エミッタのＥＯＦに対する有害な影響を最小限に抑えることができる。エミッタ開口の有利な大きさは１５〜２０μｍである。
【図４】５つのアミノ酸の標準の較正曲線である。較正は、ほぼ３桁の大きさにわたり２つの標準について直線的であった。最低注入量は３００〜５００アトモルであった。
【図５】５倍希釈から得た５つのアミノ酸の標準の、抽出されたイオンのエレクトロフェログラムである。ピーク幅（ＦＷＨＭ）は２〜５秒であった。理論的なプレート数は１５，０００〜２０，０００であった。
【図６】ステージ１のアフリカツメガエルの胚から抽出された代謝物から生成している、正規化した抽出されたイオンのエレクトロフェログラムである。エレクトロフェログラムを３点中央値フィルターで処理し、次いでスパン１０の１次ローウェスフィルター（Ｌｏｗｅｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ）で処理した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
基本的な噴霧電解質とコーティングされていないエミッタとの組み合わせは、エミッタの放電および破壊の迅速な開始をもたらす。陰イオンモードで安定したエレクトロスプレーを生成するためには、負電位を印加すると電気浸透流がオリフィスに向けられるように、エミッタ表面の化学的性質を制御する必要があるように見える。この流れには、付随して負に荷電した二重層を有する正に荷電したエミッタ表面が必要である。本発明者らはまず、ボロシリケートのチューブの内部をアミノプロピルトリメトキシシランで処理した後、加熱したピペットプラーで狭い先端に管を引っ張ることにより、正に荷電したエミッタ表面を生成した。引っ張りプロセスの間、エミッタの内面の大部分は加熱されず、この領域のアミノプロピルトリメトキシシランのコーティングは存続する。エミッタのこのコーティングされた部分は、エミッタオリフィスに向かって電気浸透を生成する。
【００１６】
定義
以下の定義は、明細書および請求項の明確かつ一貫した理解をもたらすために含まれる。本明細書で使用する場合、列挙された用語は以下の意味を有する。当業者が理解するように、本明細書で使用している他のすべての用語および表現は、それらの通常の意味を有する。このような通常の意味は、Ｒ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、によるＨａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  １４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、２００１などの専門辞書を参考にして得ることができる。
【００１７】
本明細書における「一実施形態」、「実施形態」などの言及は、記載された実施形態が特定の態様、特徴、構造、部分、または特性を含むことができるが、すべての実施形態が必ずしもその態様、特徴、構造、部分、または特性を含むわけではないことを示している。さらに、そのような語句は、必ずしもそうである必要はないが、本明細書の他の部分で言及される同じ実施形態を示してもよい。さらに、特定の態様、特徴、構造、部分、または特性を実施形態に関連して記載している場合、明示的に記載されているか否かにかかわらず、そのような態様、特徴、構造、部分または特性に影響を及ぼすまたはそれらを他の実施形態について繋げることは、当業者の知識の範囲内である。
【００１８】
単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数形の言及が含まれる。したがって、例えば、「化合物」への言及は複数のこのような化合物を含み、化合物Ｘは複数の化合物Ｘを含む。さらに、いずれかの任意の要素を排除するように請求項を記載することができることに留意されたい。したがって、この記述は、本明細書に記載される任意の要素および／または請求項の要素の記載または「否定的な」制限の使用に関連して、「単独で」「のみ」などの排他的な用語を使用するための前提として役立つことを意図している。
【００１９】
「および／または」という用語は、項目のいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、またはその用語が関連しているすべての項目を意味する。「１つ以上」および「少なくとも１つ」という語句は、特にその使用法の文脈で読んでいるとき、当業者によって容易に理解される。例えば、この語句は、１、２、３、４、５、６、１０、１００、または列挙された下限より約１０、１００、または１０００倍高いいずれかの上限を意味することがある。
【００２０】
「約」および「およそ」という用語は交換可能で使用されている。両方の用語は、指定された値の±５％、±１０％、±２０％、または±２５％の変動を示すことがある。例えば、「約５０パーセント」は、いくつかの実施形態では、さもなければ特定の請求項によって別途定義されるものとして、４５〜５５パーセントの変動を有することが可能である。整数範囲の場合、「約」という用語は、範囲の両端に、列挙された整数より大きいおよび／または小さい１つまたは２つの整数を含むことができる。本明細書で他に示されない限り、「約」および「およそ」という用語は、個々の成分、組成物または実施形態の機能性に関して等価である、列挙された範囲に近接する値、例えば重量パーセントを含むことが意図されている。「約」および「およそ」という用語は、この段落で上述したように、列挙された範囲の終点を変えることもできる。
【００２１】
当業者が理解するように、成分の量、分子量、反応条件などの性質を表すものを含むすべての数字は近似値であり、すべての場合において任意に「約」という用語で修飾しているものとして、理解される。これらの値は、本明細書に記載の教示を利用する当業者が得ることを求める所望の特性に依存して変えてもよい。このような値は、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる変動性を本質的に含むことも理解される。値が接頭辞「約」を使用して近似値として表されているとき、修飾語「約」を伴わない特定の値もさらなる態様を形成していることが理解される。
【００２２】
当業者に理解されるように、任意の目的およびすべての目的のために、特に書面による説明を提供する観点から、本明細書に列挙されたすべての範囲はまた、任意のおよびすべての可能な下位範囲およびその下位範囲の組み合わせ、ならびにその範囲を構成する個々の値、特に整数値を包含する。したがって、２つの特定のユニット間の各ユニットも開示されることが理解される。例えば、１０〜１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も個別に、および範囲の一部として開示されている。列挙された範囲（例えば、重量パーセントまたは炭素基）は、範囲内の各々の特定の値、整数、１０進数、または同一性を含む。列挙された範囲は、十分に記述され、同じ範囲を少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、または１０分の１に分割し得ることを容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で説明する各範囲は、下３分の１、中間の３分の１、および上３分の１などに容易に分解することができる。また、当業者には理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」、「より多い」、「またはより多い」などのすべての語は、列挙された数字を含み、そのような用語は、上で論じたように、後で部分範囲に分解され得る範囲を示す。同じように、本明細書に列挙されたすべての比率は、より広い比率に含まれるすべての部分的な比率も含む。したがって、ラジカル、置換基、および範囲について記載された特定の値は、例示のみのためのものであり、他の定義した値またはラジカルおよび置換基のために定義した範囲内の他の値を排除するものではない。さらに、各範囲の終点は、他方の終点に関連し、かつ他方の終点と独立していることがさらに理解されるであろう。
【００２３】
当業者であれば、メンバーがマーカッシュグループのような一般的な様式で一緒に群化されている場合、本発明は全体として列挙された群全体を包含するだけでなく、群の各メンバーを個々に、また主要な群のあらゆる可能な下位群をも包含することもたやすく認識されよう。さらに、すべての目的のために、本発明は、主要な群だけでなく、１つ以上の群のメンバーが存在していない主要な群も包含する。したがって、本発明は、列挙された群のメンバーのいずれか１つ以上の明示的な除外を想定している。したがって、条件が、開示されたカテゴリまたは実施形態のいずれかに適用でき、それによって、記載した要素、種、または実施形態のいずれか１つ以上が、例えば、明示的な否定的制限で使用するために、そのようなカテゴリまたは実施形態から除外され得る。
【００２４】
「接触させる」という用語は、例えば溶液中、反応混合物中で、インビトロで、またはインビボで、例えば、生理学的反応、化学反応、または物理的変化を引き起こすために、細胞レベルや分子レベルなどで、接触する（ｔｏｕｃｈ、ｍａｋｅ  ｃｏｎｔａｃｔ）、または直接的にまたは近接させる行為を示す。
【００２５】
「有効量」とは、反応混合物中に生成物を形成するのに必要な量などの、列挙された効果をもたらすのに有効な量を示す。有効量の決定は、典型的には、特に本明細書で提供される詳細な開示を考慮して、当業者の能力の範囲内である。「有効量」という用語は、本明細書に記載の化合物または試薬の量、または例えば反応混合物中に生成物を形成するのに有効な、本明細書に記載の化合物または試薬の組み合わせの量を含むことが意図される。したがって、「有効量」は、一般に、所望の効果をもたらす量を意味する。
【００２６】
本明細書で使用される「実質的に」という用語は、広義の用語であり、限定するものではないが、特定されている大部分であるが必ずしも全体ではないということを含む、その通常の意味で使用されている。
【００２７】
「有機化学物質」という用語は、炭素および水素を含有する類の化学物質を意味し、他の原子、例えば窒素、酸素、硫黄、ケイ素、およびハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素）を含み得るが、それらに限定されない。本開示における有機化学物質はまた、炭素ベースの（有機化学物質）フレームワークの置換基である官能基を含む。例えば、有機化学物質は、分岐していてもよい炭素原子の実質的に直鎖であり得る炭素原子数１〜約２０のアルキル炭化水素であり得るか、前述のアルキル炭化水素は、シクロプロパン、シクロペンタンまたはシクロヘキサンなどの環式であり得る。官能基の例は、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、アミドおよびエステルであり得るが、これらに限定されない。官能基は、他の官能基によってさらに官能基化することができる。本開示における官能基は、陰性エレクトロスプレーモードでエミッタオリフィスに向かって電気浸透流を安定させるため電荷を伝える目的を果たし、例えば、アミン官能基はプロトン化されて正電荷を有することができる。官能基はまた、有機化学物質を表面に結合するためのケイ素を含むことができる。表面は、有機化学物質のシリコン部分に共有結合することができるシラノール部分を有するガラスであってもよい。シラノール部分と反応する有機化学物質は、ハロゲンまたはアルコキシ（例えば、メトキシ）などの反応性官能基を有することができる。例えば、試薬３−アミノプロピルトリメトキシシラン中のメトキシ部分は、当業者に公知の適切な反応条件下でガラスの表面上のシラノールと反応する。炭素骨格に２つ以上の官能基を有する、大きな数だが限られた数の小有機化学物質（例えば、約１０００ダルトン未満の分子量を有する）があり、それにおいて、その官能基の１つが電荷を伝えることができ、有機化学物質の他の官能基は、例えばガラス表面に共有結合させることができる。
【００２８】
「代謝化合物」という用語は、代謝過程を経て生体内で化学的に変化した化学物質を意味する。
【００２９】
本発明の実施形態
本開示の第１の実施形態では、質量分析計用のエレクトロスプレーイオン化界面であって、陰性モードのシース液の電気浸透流（ＥＯＦ）用のガラスエミッタであって、表面が、表面に共有結合された１つ以上の有機化学物質のコーティングを含み、有機化学物質は１つ以上の官能基を含むガラスエミッタと、シース液の注入口とを含み、ガラスエミッタに導入されたシース液にエレクトロスプレー電圧が印加されるとき、官能基に形成された正電荷は、陰性モードでＥＯＦの方向を安定させる。
【００３０】
様々な実施形態で、ガラスエミッタは、遠位端にオリフィスを備えた中空シリンダであり、オリフィスの内径はシリンダ本体の内径よりも小さく、シース液のＥＯＦはオリフィスに向かう方向に横切り、シース液がオリフィスを出るときに、イオン化されたエレクトロスプレーが形成される。
【００３１】
他の実施形態では、ガラスエミッタの全部よりも少ない部分が官能基を含む。さらなる実施形態では、エミッタは、１つ以上の官能基によって完全に、実質的に、または部分的にコーティングされたボロシリケートガラスを含む。さらに他の実施形態では、表面エミッタの約１０％〜約９０％、２０％〜約８０％、または３０％〜約７０％が、１つ以上の官能基によりコーティングされる。様々な他の実施形態では、エミッタの表面に共有結合している有機化学物質は、アミノアルキル部分などの有機アミンを含む。
【００３２】
様々な実施形態において、界面は分離キャピラリを含み、キャピラリは分離バックグラウンド電解質を含み、分離バックグラウンド電解質の混合物中の１つ以上の検体がキャピラリで分離され、キャピラリを出る検体は分離キャピラリの遠位先端の周りのシース液のＥＯＦにより、オリフィスに向かって送られる。
【００３３】
別の実施形態では、ガラスエミッタオリフィスの内径は、約５μｍ〜約５０μｍ、約５μｍ〜約３０μｍ、約１５μｍ〜約３５μｍ、約１５μｍ〜約２０μｍ、または約１０μｍ〜約２５μｍである。ガラスエミッタの様々な他の実施形態では、官能基はエミッタオリフィスと反対方向のＥＯＦを実質的に防止し、それによってエレクトロスプレーの強度の変動を最小にする。
【００３４】
本開示の実施形態は、ガラスエミッタを出るイオン化されたエレクトロスプレーのエレクトロスプレー強度の最小限の変動を含み、約１フェムトモル未満、または約９００アトモル未満の検体という検出限界をもたらす。さらなる実施形態において、検体の検出限界は、約１５０〜約９００アトモルであり得る。
【００３５】
エミッタオリフィスを出るイオン化されたエレクトロスプレーバックグラウンド信号の強度は、約±２×１０４強度ユニット未満、約±１×１０４強度ユニット未満、または約±０．１×１０４強度ユニット未満に、コーティングされたエミッタによって安定化される。したがって、コーティングされたエミッタを使用する場合のエレクトロフェログラムにおけるベースラインの変動性は、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍低減することができる（図２参照）。さらに、コーティングされたエミッタにより、検体のベースピークが、エレクトロフェログラムのバックグラウンドノイズ（ベースライン）と比較して、強度ユニットの点で少なくとも３０倍、少なくとも５０倍または少なくとも７０倍大きい、エレクトロフェログラムにおけるシグナルの生成が可能になる。
【００３６】
本開示は、エレクトロスプレーイオン化−質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）用のエミッタの第２の実施形態を包含し、遠位端にオリフィスを有する中空シリンダであって、オリフィスの内径はシリンダ本体の内径よりも小さく、エミッタの表面は表面に共有結合した１つ以上の有機化学物質のコーティングを含み、有機化学物質は、１つ以上の官能基を含む中空シリンダ、およびエミッタとシース液の注入口とのユニオンを含み、エミッタに導入されたシース液に陰性モードのエレクトロスプレー電圧が印加されるとき、官能基に形成された正電荷がシース液の電気浸透流（ＥＯＦ）の方向をオリフィス方向に安定させ、イオン化したエレクトロスプレーが、シース液がオリフィスを出るときに形成される。
【００３７】
第３の実施形態は、陰性モードエレクトロスプレーイオン化−質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）用のガラスエミッタを適合させるための方法であって、
ガラスエミッタの表面に官能基を有する有機化学物質を共有結合させることであって、ここでガラスエミッタは遠位端にオリフィスを含む中空シリンダであり、オリフィスの内径はシリンダ本体の内径より小さい、共有結合させること、および
ガラスエミッタと分離キャピラリとを質量分析計に接続することであって、ここで分離バックグラウンド電解質の１つ以上の検体の混合物はキャピラリで分離される、接続すること
を含み、
エミッタに導入されたシース液に陰性モードのエレクトロスプレー電圧が印加されたとき、シース液のオリフィス方向への電気浸透流（ＥＯＦ）の方向を安定化させるために官能基に正電荷が形成され、キャピラリを出る検体が、キャピラリの遠位先端の周りのＥＯＦによってオリフィスに向けて移送され、シース液と検体がオリフィスを出るときにイオン化されたエレクトロスプレーを形成する方法を包含する。
【００３８】
様々な実施形態において、アミノアルキルシランはガラスエミッタの表面に共有結合し、アミノアルキルシランのアミノ部分は正に荷電している。別の実施形態では、ガラスエミッタオリフィスの内径は、約１０μｍ〜約２５μｍ、または約１５μｍ〜約２０μｍとすることができる。他の実施形態では、安定させたＥＯＦは安定したエレクトロスプレーを生成する。さらに、様々な実施形態において、検出限界は、約２フェムトモル、１フェムトモル、０．５フェムトモル、または約０．２５フェムトモル未満である。
【００３９】
第４の実施形態は、試料を分析するためのＥＳＩ−ＭＳ分析方法であって、
ｉ）質量分析計を、ａ）本明細書に記載のエミッタおよびシース液注入口と、ｂ）分離バックグラウンド電解質の１つ以上の検体の混合物がキャピラリで分離されている分離キャピラリとに接続することであって、
ここで陰性モードのエレクトロスプレー電圧が、注入口を介してエミッタに導入されたシース液に印加されると、キャピラリを出る検体はキャピラリの遠位先端の周囲のシース液の安定したＥＯＦによってオリフィスに向かって移送され、それによってシース液と検体がオリフィスを出て、続いて質量分析計に入るときに安定化されたエレクトロスプレーを生じる、接続すること、および
ｉｉ）約２フェムトモル、約１フェムトモル、または約０．５フェムトモル未満の検出レベルで質量分析によって試料を分析すること
を含む方法を包含する。
【００４０】
様々な実施形態において、試料中の検体は、キャピラリゾーン電気泳動（ＣＺＥ）により分離される。試料は、１つ以上のタンパク質、１つ以上の炭水化物、１つ以上の代謝化合物、アミン部分を含む１つ以上の化合物、陰イオン化官能基を含む１つ以上の化合物（例えば、カルボン酸が陰性モードでカルボン酸塩イオンを形成する）、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、試料は、１つ以上の脂質、１つ以上の炭水化物、１つ以上の代謝化合物、またはそれらの組み合わせを含む。様々な実施形態において、分析される試料は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、またはグリカンを含み得る。グリカンは、抗体のペプチドグリカンまたはグリカン、例えば、シアル酸含有抗体を含む組換え抗体であり得る。上述の検体の任意の組み合わせは、本明細書に記載の方法によって検出することができる。
【００４１】
様々な実施形態において、ＣＺＥ用の分離バックグラウンド電解質およびシース液は、有機添加剤を含まない。さらなる実施形態では、シース液の高い流速またはエレクトロ噴霧緩衝液の高流速により、検出限界が実質的に低下しない。
【００４２】
ステージ１のアフリカツメガエルの胚から抽出した代謝産物の分析により、界面の評価を行った。１００を超える特徴を、データ内で、手動で識別した。中央値のピーク幅は１．３秒であり、理論的プレートの平均数は１５，０００であり、おそらく実験で使用された比較的大きな注入量によって制限された。図６は、１０個の特徴に対する選択されたイオンエレクトロフェログラムを示す。
【００４３】
要約すると、本発明者らのエミッタは、電気運動的にポンピングされるシースフローのナノスプレー界面において使用されるガラスエミッタの内部に、共有結合でグラフトしているアミンを有している。これらのアミンは、陰性モードの動作中にエミッタオリフィスに向かって移動する負に荷電した二重層を生成する。この系は、ステージ１のアフリカツメガエルの胚から単離された代謝産物についてキャピラリゾーン電気泳動を行うことによって評価した。陰性モードで１００を超える特徴が検出された。
【００４４】
電気運動的にポンピングされた界面で陰性モードＥＳＩ−ＭＳに結合させるキャピラリ電気泳動
本発明者らは、ナノフロー法で動作するＣＺＥ−ＭＳ用のシースフローの界面を開発した。界面（図１）は、電解質で満たされたガラスエミッタを使用している。エミッタの内側のシリケート基は電荷を帯び、印加電場の下では、電気浸透はｎＬ／ｍｉｎレジームで非常に安定したポンプとして作動する。シリケート基の等電点ｐＩは２未満であり、大部分の条件下でシリケート基は脱プロトン化され、ガラス面にアニオン性基を、またガラス壁付近で溶液においてカチオンの雲を生成する。電場の印加により、低いｎＬ／分の速度で、陽極から陰極へカチオンが進む。このフロー方式では、キャピラリの遠位端を出るとき、検体の希釈度は無視できる。シース液へのメタノールまたはアセトニトリルのような有機物の添加は、分離電解質を変更する必要なくエレクトロスプレーを安定化させる便利な手段である。
【００４５】
現代のプロテオミクスのワークフローは、一般に、陽イオン化モードでエレクトロスプレーを行っており、本発明者らの界面は、陽イオン化モードで使用する際の迅速な最適化を確認している。しかし、多くの検体のクラスは、陰イオン化モードでより良好にイオン化し、より多くの公開された断片化データを有している。例えば、分析前に誘導体化または脱シアリル化する必要なくグリカンの完全な特徴付けを可能にする陰性モードＥＳＩを使用するＣＥＭＳ実験がある。キャピラリ電気泳動はまた、メタボロームの頻繁な成分である小さな極性分子を分離するのに理想的である。陰性モードでの安定した動作を可能にするために本発明者らのＣＥＭＳ界面を採用することにより、この技術の有用性が広がり、広範な化合物の高感度の分析が可能になる。
【００４６】
エレクトロスプレーエミッタに負の電圧を印加すると、陽性モードよりも低い大きさでコロナ放電が生じる。これを補うために、有機物を、陽性モードより高い濃度で、噴霧する溶液に添加する。それにより、表面張力およびコロナ放電開始電位が低下する。本発明者らの界面では、エミッタ溶液は電気浸透流により補充した。陰イオン化モードで界面を操作すると、噴霧溶液がエミッタ開口部から離れるように駆動される。毛管作用はシース緩衝液を補充するように作用するが、このポンピング機構は弱い不安定な流れを生じる。安定した陰性モードのエレクトロスプレーは、前方の電気浸透流を減少させ、噴霧緩衝液の希釈を減少させるために分離キャピラリをコーティングした場合にのみ実証された。コーティングされていないキャピラリで界面を操作すると、シース緩衝液の組成にかかわらず、シース緩衝液の希釈に起因して、放電開始およびエレクトロスプレーエミッタの破壊が迅速に生じる。メタノールを分離バックグラウンド電解質に添加して放電を防ぐことができるが、図２の上のチャートに示すように、それが不安定なエレクトロスプレーが発生させる。さらに、電気泳動添加剤としてのメタノールは、分離バックグラウンド電解質の分離特性および導電性を劇的に変化させる。
【００４７】
非コーティングのボロシリケートガラスエミッタは、電気浸透流がシース電解質を噴霧先端開口部から離れるように駆動するため、負の極性での不良なエレクトロスプレー性能に至る。図２（３分後に終了した不安定なエレクトロフェログラムを示す上のチャート）は、３：１のメタノール：水に０．１％のギ酸を含む噴霧電解質、およびＴｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ質量分析計を用いた非コーティングエミッタの陰イオンモードのバックグラウンド電解質のベースピークエレクトロフェログラムを示している。この酸性噴霧電解質でさえ、エレクトロスプレーは非常に不安定で、大きな振動を生じていた。これらの振動は、毛管作用、電気浸透流、およびエレクトロスプレーの組み合わせによる可能性が高い。負電位を電解質補充エミッタに印加すると、エレクトロスプレーが形成される。エレクトロスプレーの間、エレクトロスプレー電解質は、エレクトロスプレーと電気浸透の組み合わせによってエミッタから消耗される。最終的に、エミッタは、過度に枯渇してエレクトロスプレーを維持できなくなり、エレクトロスプレーが停止する。エレクトロスプレーが停止すると、毛管作用がエミッタ先端を補充し、エレクトロスプレーが再確立され、サイクルが繰り返される。
【００４８】
本発明者らは上記の回避策の代替案を提示している。エミッタの化学的性質を変えることにより、エミッタ内の電気浸透流を操作し、分離バックグラウンド電解質または分離キャピラリを変更することなく安定した陰性モードエレクトロスプレーを生成することができる。既に知られている分離バックグラウンド電解質および比較的安価なコーティングされていないキャピラリを利用する陰イオン化モードでの鋭敏な分析は、変更されたエミッタを使用している場合に可能である。
【００４９】
緩衝液の組成およびエレクトロスプレーエミッタの開口サイズは、陰性モードエレクトロスプレーイオン化を行う際の重要なパラメータである。陰イオン化モードでの放電開始電位は、同じエミッタオリフィスサイズに対して陽イオン化モードでの放電開始電位よりもずっと低い。適当な改変がなければ、コロナ放電は、先端を融解することによって、ボロシリケートエミッタを急速に破壊する。メタノール含有量の増加は、シース液の表面張力を減少させ、エレクトロスプレー開始電位を低下させることによって、安定したエレクトロスプレーを作り出すよう促す。シース緩衝液が５０容量％未満のメタノールを含有する場合、安定したエレクトロスプレーが任意の電圧で達成し得る前に、コロナ放電が観察された。２５ミクロン超の開口を有するエレクトロスプレーエミッタも容易に放電し、安定したエレクトロスプレー開始電位はコロナ放電開始電位に非常に近かった。
【００５０】
シース緩衝液のｐＨはエミッタのＥＯＦを決定する。１５〜２０ミクロンの開口を有するコーティングされたボロシリケートエミッタの３：１メタノール：水混合物の１０ｍＭの酢酸アンモニウムからなるシース緩衝液は、−１．０ｋＶ〜−１．７５ｋＶの印加電位で、安定した陰性モードエレクトロスプレーおよび−１．７５ｋＶ超の放電を生成する。酢酸アンモニウム溶液は、新しく製造されたとき、通常約６．２のｐＨを有する。噴霧溶液のｐＨが約６であるのを確実にすることは、陰性モードイオン化のための電荷利用可能性を最大化するために重要であり、塩基性のｐＨへ曝露することでエミッタコーティングに損傷を与えない。
【００５１】
コーティングされたエミッタの製造において、チューブはまずアミノプロピルトリメトキシシランで処理した。次にこのプレコートされたチューブを約２０μｍの内径のオリフィスに引っ張った。図３にエミッタの概略図を示す。エミッタの円錐状の引っ張られた部分は、およそ２ｍｍの長さであった。エミッタのこの部分は、引っ張り中に加熱した。このことは、アミノプロピルトリメトキシシランコーティングを破壊する。エミッタのこの部分は、先端から遠ざかる方向に向けられた電気浸透を生成する。しかし、エミッタの内面の＞９０％が引っ張りプロセス中に加熱されず、そのため加熱されていないアミノプロピルトリメトキシシランコーティングは、引っ張りプロセスに耐え、エミッタオリフィスに対して十分な電気浸透を生成する。
【００５２】
エミッタがコーティングされていない場合、メタノールを含まないＣＺＥバックグラウンド電解質は、エレクトロスプレー界面のメタノール含有を希釈し、陰性モードで放電させるが、コーティングを適用する場合、これは必要ではない。したがって、１Ｍの酢酸を、その後の全実験用のＣＺＥバックグラウンド電解質として選択した。コーティングはエミッタの開口部に向かってＥＯＦを生成するので、噴霧緩衝液はコーティングされていないエミッタと同じ程度まで希釈されず、分離バックグラウンド電解質を変更することなく安定したエレクトロスプレーを維持することができる。分離バックグラウンド電解質がメタノールを含有しない場合であっても安定したエレクトロスプレーを作り出したことは、エミッタ先端において噴霧緩衝液を補充するのに十分なＥＯＦが生成されたという証拠である。
【００５３】
５つのアミノ酸標準の較正曲線を図４に示す。アミノ酸の感受性はセリンを除いて等電点に基づいて変化した。標準混合物の中で最も酸性のアミノ酸であるアスパラギン酸は、同等の量の注入に対して最高の強度を生じたが、アルギニンはセリンの他に、最も産生が少なかった。ロイシンおよびアルギニンの強度は、３桁の大きさにわたって線形であったが、他の３つのアミノ酸については２５０倍の希釈で非直線性が観察され、これらの点は較正から除外された。アルギニンおよびセリンの較正は、それぞれ、注入された３３０および５９０アトモルに直線的に低下したままであった。他の較正は、３〜７フェムトモルに注入され、直線的なままであった。表１は、各アミノ酸の検出限界を列挙する。検出限界（ＬＯＤ）は、キャピラリに注入されたものの１５０〜９００アトモルである。ＨＰＬＣおよびＴｈｅｒｍｏ  Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅの機器を用いて以前に分離および検出したアミノ酸は、３分の分離で注入された１フェムトモル〜２．５ピコモルの同じアミノ酸の検出限界を生じた。本発明者らのＣＥ−ＭＳベースの方法は、同様の分離時間において１〜３桁の大きさだけ良好なＬＯＤで、このＵＰＬＣベースの方法を改善する。本発明者らのＣＥ−ＭＳ法は、比較的安価なコーティングされていないキャピラリを使用するというさらなる利点がある。
【００５４】
表１  分析される５つのアミノ酸の検出限界。値は、キャピラリ上に注入されたアトモルとして報告されている。ＬＯＤは、較正曲線を構築するために行った各注入についてのシグナル対ノイズ比を測定することによって計算した。ＬＯＤは、すべての注入および濃度にわたって平均された。誤差の値は、標準偏差によって算出された９５％信頼区間を表す。
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【００５５】
５つの標準のそれぞれについて抽出されたイオンエレクトロフェログラムを図５に提示している。すべての基準の分離は５分で完了した。各エレクトロフェログラムは、テーリングがほとんどまたはまったくない良好なピーク形状を示す。ピーク幅（ＦＷＨＭ）は２〜５秒であり、プレート数は１５，０００〜２０，０００である。陽性モードで動作するエレクトロスプレー界面も同様の結果をもたらした。分析が良好なピーク形状および再現性であることは、コーティングされたエミッタが使用されたときの界面の安定性を実証している。
【００５６】
以下の実施例は、上記の本発明を説明するためのものであって、その範囲を狭めるものとして限定するものではない。当業者は、実施例が本発明を実施することができる他の多くの方法を示唆していることを容易に認識するであろう。本発明の範囲内にとどまりながら、多くの変形および修正を行うことができることを理解されたい。
【実施例】
【００５７】
［実施例１］
材料
酢酸、３−アミノプロピルトリメトキシシランおよび酢酸アンモニウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、米国）から購入した。ギ酸（ＦＡ）およびアセトニトリル（ＡＣＮ）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ピッツバーグ、米国）から購入した。メタノールはＨｏｎｅｙｗｅｌｌ  Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｗｉｃｋｌｏｗ、アイルランド）から購入した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ウォルサム、マサチューセッツ州）のＮａｎｏ  Ｐｕｒｅシステムを用いて脱イオン水を生成した。コーティングされていない溶融シリカキャピラリはＰｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｈｏｅｎｉｘ、米国）から購入した。Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｎｏｖａｔｏ、米国）からのボロシリケートガラスキャピラリ（外径１．０ｍｍ、内径０．７５ｍｍ、および長さ１０ｃｍ）からエミッタを調製した。分析に使用した溶媒はすべてＨＰＬＣおよびＭＳグレードであった。ボロシリケートガラスキャピラリ（１０００ＯＤ／７５０ＩＤ）はＳｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｎｏｖａｔｏ、米国）から入手した。分離キャピラリはＰｏｌｙｍｉｃｒｏ（Ｐｈｏｅｎｉｘ、米国）から入手した。ＰＥＥＫスリーブおよび継手は、ＩＤＥＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ、イリノイ州、米国）から購入した。
【００５８】
キャピラリゾーンの電気泳動−質量分析
実験は、電気運動的にポンピングされた図１のナノエレクトロスプレー界面に連結させた局所的に構築されたＣＺＥ機器を用いて実施した（Ｓｕｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４（２０１５）２３１２−２３２１）。この界面については、他の箇所で詳細に説明している。分離キャピラリを、プラスチックのクロスを介してガラスエミッタに通した。クロスの片側の腕部を、エレクトロスプレーシース電解質を含むリザーバに接続した。クロスのもう一方の側方の腕部は、キャピラリの設置後に界面を洗い流すために使用された注射器に接続させた。
【００５９】
このシステムは、ＬａｂＶＩＥＷプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｕｓｔｉｎ、米国）によってコンピュータによって制御される２つのＳｐｅｌｌｍａｎ  ＣＺＥ−１０００Ｒの電源（Ｓｐｅｌｌｍａｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、米国）を使用する。１つの電源を注入端リザーバに接続した。第２の電源をエレクトロスプレー界面に接続した。電気泳動は、電源間の電位差によって駆動される。エレクトロスプレーは、第２の電源と接地された質量分析計の入口との間の電位差によって駆動される。
【００６０】
バックグラウンド電解質（ＢＧＥ）は水に１Ｍの酢酸を入れたものであり、エレクトロスプレー溶液は７５％メタノールに１０ｍＭの酢酸アンモニウムを入れたものであった。噴霧溶液のｐＨは典型的には６．２である。試料は、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）で、三つ組で実行する。解像度は３０，０００（ｍ／ｚ＝２００）、ＡＧＣの標的は３Ｅ６、ｍ／ｚスキャンウィンドウは９０〜５００に設定した。
【００６１】
試料を１０ｐｓｉで１秒間の圧力注入によってキャピラリ上に導入し、約１ｎＬの注入体積が得られた。分離は、２６．５ｋＶ（７５０Ｖ／ｃｍ）の電位を使用して、３５ｃｍの長さのコーティングされていない外径１５０μｍ、内径２０μｍの溶融シリカキャピラリで行った。エレクトロスプレーは−１．５ｋＶで行った。
【００６２】
コーティングされたエミッタの調製
コーティングプロセスは３つのステップからなっていた。最初に、ボロシリケートエミッタキャピラリを、３０分間０．１ＭのＮａＯＨで、流出液がｐＨ７．０に達するまで水で、６０分間０．１ＭのＨＣｌで、ｐＨが７．０に達するまで再度水で、最後にメタノールで連続して洗い流すことで、前処理した。エミッタキャピラリを、コーティング前に室温で、窒素流の下で乾燥させた。コーティングプロセスの第２のステップは、その時にエミッタキャピラリに３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）の５０％（ｖ／ｖ）溶液を充填することであった。エミッタキャピラリの両端をシールし、キャピラリを４５℃の水浴で１２時間置いた。最後のステップは、エミッタキャピラリをメタノールで完全にすすぎ、次に室温の窒素流の下で乾燥させることであった。
【００６３】
エミッタキャピラリを、次に、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｐ−１０００マイクロピペットプラーにより、熱の設定を４７５、引っ張りの設定を０、速度の設定を２０、ディレイを２５０、圧力を５５０、ディレイモードを使用、安全な加熱を使用、ランプを４９０というパラメータを用いて、２つの先細りしている先端エミッタに引っ張った。ランプのパラメータは、ランプテストの特徴を使用する各引っ張りセッションの前に、調整されている。これらの設定では、出口オリフィスの直径が１５〜２０μｍの先端を引っ張った。エミッタ開口の大きさは光学顕微鏡で測定した。先端のプラーがエミッタキャピラリの遠位端を加熱し、コーティングのその部分を破壊することに留意されたい。しかし、エミッタのコーティングの大部分は加熱によって損傷を受けず、陰イオンモードで安定したエレクトロスプレーを生じるのに十分なＥＯＦを支える。
【００６４】
エミッタの先端を、４方向のＰＥＥＫユニオンにねじ込まれたナットおよびフェルールを備えた適切なサイズのＰＥＥＫスリーブに挿入した。エミッタの反対側で、分離キャピラリ（外径１５０μｍ、内径２０μｍ、長さ３５ｃｍ）をナットとフェルールで別のＰＥＥＫスリーブに挿入し、ユニオンにねじ込んだ。その後、分離キャピラリを、ユニオンを経てエミッタ内に通すことができる。ユニオンの他の２つの開口は、洗い流すためのシリンジアタッチメントを取り付けるため、および高電圧電源に接続されたシースリザーバに通じるチューブを接続するために使用する。エミッタ装置を図１に示す。
【００６５】
図２の下のチャートは、コーティングされたエミッタを用いて分析されたホスホコリン試料のベースピークのエレクトロフェログラムを提示している。１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよび１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを凍結乾燥粉末として購入し、メタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）で再構成した。次いで、ＣＥＭＳによる分析のために、それらを１Ｍの酢酸において１００μＭに希釈した。１０ｐｓｉで４秒間の圧力注入により、試料を長さ６０ｃｍ、外径１５０μｍ、および内径２０μｍのキャピラリに挿入した。２８ｋＶ（４６７Ｖ／ｃｍ）の分離電圧を印加した。−１．４ｋＶをエレクトロスプレー界面に印加した。分離バックグラウンド電解質は７５：２０：５の水：メタノール：酢酸であった。ＥＳＩのために、２０ミクロンの開口を有する先細の先端に引っ張った３−ＡＰＳコーティングエミッタを使用した。陰性モードのＥＳＩ用の噴霧緩衝液は、３：１のメタノール：水の混合物に１０ｍＭの重炭酸アンモニウムを入れたものであった。質量分析の検出は、４００〜２０００ｍ／ｚの範囲で陰イオンモードで操作するＬＴＱ  ＸＬ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州、ウォルサム）で行った。
【００６６】
アミノ酸較正曲線
５つのアミノ酸を選択して、界面の安定性および感度を実証する較正曲線を作成した。５つのアミノ酸は、すべてのアミノ酸を代表する等電点および疎水性などの特性に基づいて選択された。ストックは、ＭＳグレードの水に各アミノ酸を入れたものから作製され、次いで分離バックグラウンド電解質で連続する濃度に希釈された。標準の初期の混合物の濃度を表２で挙げている。
【００６７】
表２  全連続希釈液を作成した初期の標準混合物の濃度。１倍、５倍、２５倍および２５０倍の希釈で混合を実行して、較正曲線を構築した。
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【００６８】
分離バックグラウンド電解質は１Ｍの酢酸であり、エレクトロスプレーの緩衝液は７５％メタノールに１０ｍＭの酢酸アンモニウムを入れたものであった。噴霧緩衝液のｐＨは６．２であった。標準混合物の連続希釈を５倍、２５倍および２５０倍で行い、較正曲線を作成した。試料は、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）で、三つ組で測定した。解像度は３０，０００に設定し、ＡＧＣの標的は３Ｅ６であり、ｍ／ｚスキャンウィンドウは９０〜５００に設定した。試料を１０ｐｓｉで１秒間の圧力注入によってキャピラリ上に導入し、１ｎＬの注入体積となった。分離は２６．５ｋＶ（７５０Ｖ／ｃｍ）で行い、エレクトロスプレーは−１．５ｋＶで行った。Ｔｈｅｒｍｏ  ＲＡＷファイルは、ＭＳｃｏｎｖｅｒｔによってｍｚＸＭＬに変換した。データは、ＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．、Ｎａｔｉｃｋ、マサチューセッツ州、米国）で分析した。エレクトロフェログラムを、標的質量の５ｐｐｍの耐性で抽出した。その後、ローウェスフィルタリング（Ｌｏｗｅｓｓ  ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）、ガウシアンの畳み込みおよびベースラインの調整を施した。各標準に対応するピークの最大強度を用いて較正曲線を構築した。
【００６９】
胚の採取と代謝産物の抽出
すべての動物の処置は、ノートルダム大学動物実験委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ）によって承認されたプロトコルに従って行った。アフリカツメガエルの胚を受精させ、採取し、公表されているプロトコル（Ｐｅｕｃｈｅｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４０８（２０１６）４７４３−４７４９）を用いて処理した。胚は発育段階１で採取した。胚につき、５５μＬの２：２：１のアセトニトリル：水：メタノールにて、胚をエッペンドルフチューブに入れた。混合物をまずピペッターを用いて粉砕し、次いでボルテックスして低分子代謝産物を遊離させた。チューブを遠心分離し、上清を除去し、清澄化し、液体窒素で急速凍結した。抽出物は、ＣＺＥ−ＭＳにより直接分析するまで−８０℃で保存した（図６）。
【００７０】
データの分
Ｔｈｅｒｍｏ  ＲＡＷファイルは、ＭＳｃｏｎｖｅｒｔによってｍｚＸＭＬに変換した。さらなる分析のために、データをＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、マサチューセッツ州、米国）に移入した。
【００７１】
概要
アミノプロピルトリメトキシシランによるＥＳＩエミッタのコーティングは、エミッタのＥＯＦの方向を逆転させ、ＣＺＥ−ＭＳ用の電気運動的に駆動されるシース流の陰極性ＥＳＩ界面の構築を可能にする。この界面は、アミノ酸標準の分析に成功裏に適用されている。陰性モードＥＳＩ用の電気運動的に駆動される界面の安定性および感度を、３桁の大きさにわたって実証し、検出限界は、５分の分離に対して注入されて１５０〜９００アトモルであり、比較可能なＨＰＬＣ法よりも著しく改善していた。有機添加剤を含まない分離バックグラウンド電解質の使用を可能にするエレクトロスプレーエミッタにおいて、前方ＥＯＦを維持する。陰性モードのＥＳＩに連結されたＣＺＥの電気運動的に駆動されるシース流の界面は、従来の機械的にポンピングされたシース流の界面において高い流速でエレクトロスプレー緩衝液をポンピングすることによって生じる感度の低下なしに、分離バックグラウンド電解質およびエレクトロスプレーの緩衝液の独立した最適化を可能にする。
【００７２】
開示された実施形態および実施例を参照して特定の実施形態を上で説明してきたが、そのような実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明から逸脱することなく、以下の特許請求の範囲に定義されているより広範な態様において、当業者に変更および修正を加えることができる。
【００７３】
すべての刊行物、特許、および特許文書は、参照により個々に組み込まれているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。本開示と矛盾していない制限を、本開示から理解するべきではない。本発明を、様々な具体的かつ好ましい実施形態および技術を参照しながら説明した。しかし、本発明の精神および範囲内にとどまりながら、多くの変形および修正を行うことができることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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