(57)【要約】  本発明は、間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む溶解された間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子およびその医薬としての使用に関する。前記医薬は、好ましくは、急性および慢性炎症性疾患ならびに自己免疫疾患の治療のためのものである。本発明はさらに、医薬としての使用のための、免疫調節性粒子を含む医薬組成物、および不活性化された間葉系幹細胞またはその一部に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬としての使用のための、間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む、溶解された前記間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子。
【請求項２】
７０〜１７０ｎｍの平均粒径を有する、請求項１に記載の免疫調節性粒子。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞は、溶解の前にインターフェロンガンマで処理される、
ことを特徴とする請求項１または２に記載の免疫調節性粒子。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞は、脂肪組織から単離される、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の免疫調節性粒子。
【請求項５】
間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含み、前記膜構造物は、免疫抑制化合物、好ましくはステロイド、細胞増殖抑制剤、抗体および／またはカルシニューリン阻害剤を含む、溶解された前記間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子。
【請求項６】
医薬としての使用のための、請求項５に記載の免疫調節性粒子。
【請求項７】
自己免疫疾患を含む、急性および慢性炎症性疾患の治療における医薬としての使用のための、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の免疫調節性粒子。
【請求項８】
移植拒絶反応の治療および予防における医薬としての使用のための、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の免疫調節性粒子。
【請求項９】
前記間葉系幹細胞は、前記粒子で治療される対象から得られる、
ことを特徴とする請求項１乃至４及び請求項６乃至８のいずれか１項に記載の免疫調節性粒子。
【請求項１０】
間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む溶解された前記間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子と、薬学的に許容される添加剤と、を含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記粒子は、免疫抑制化合物、好ましくはステロイド、細胞増殖抑制剤、抗体および／またはカルシニューリン阻害剤を含む、
ことを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
免疫抑制療法における使用のための、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
移植拒絶反応の治療および予防における使用のための、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
医薬としての使用のための不活性化された間葉系幹細胞またはその一部。
【請求項１５】
自己免疫疾患を含む急性および慢性炎症性疾患の治療における医薬としての使用のための、および／または移植拒絶反応の予防のための、不活性化された間葉系幹細胞、または前記不活性化された間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む免疫調節性粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞およびその一部、ならびに免疫調節療法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は大部分の成人のヒト組織に存在し、脂肪組織および骨髄から容易に得ることができる。ＭＳＣは、プラスチック接着様式で増殖する能力を特徴とし、骨細胞、脂肪細胞、筋細胞および軟骨細胞に分化する能力を有する（非特許文献１）。さらに、ＭＳＣは、例えば、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）および同種移植片拒絶などの実験的炎症性疾患モデルにおいて示されるような免疫抑制特性を有する（非特許文献２−９）。これらのモデルから得られた有望な結果は、ＧｖＨＤ、クローン病、真性糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および同種移植拒絶の予防を含むさまざまな免疫障害に対する臨床試験におけるＭＳＣ療法の調査をもたらした（非特許文献１０−１４）。
【０００３】
いくつかのランダム化臨床試験はＭＳＣ治療の正の効果を記述しているが、他の研究はＭＳＣ治療後の疾患症状の改善を示さない（非特許文献１５）。ＭＳＣ療法の不明瞭な有効性は、インビボ投与後のＭＳＣによる免疫調節の機構の理解不足への負債であり、それは、ＭＳＣ療法の合理的なタイミングおよび投薬を妨げ、潜在的にＭＳＣ療法の恩恵を受ける可能性のある状態とそれが不可能な状態との間の区別を妨げる。
【０００４】
インビトロ研究は、炎症性環境の影響下で、ＴＧＦ−β、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）およびインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）などの可溶性機構を介して、免疫細胞の増殖を阻害することを示している（非特許文献１６−２３）。さらに、ＭＳＣの免疫調節因子は、原形質膜、小胞体または生存するＭＳＣのエンドソームから放出されるエキソソームおよび微小胞のような小さな細胞外小胞が豊富である可能性が報告されている（非特許文献２４）。これらの知見は、近年の特許出願（特許文献１（ＰＣＴ／ＩＴ２０１２／０００２３２））において確認されたようであり、それは、生存する間葉系幹細胞から単離された微小胞が、炎症および免疫病態の治療のための免疫抑制剤として使用できると報告している。前記微小胞は、複数の免疫細胞型の機能を調節することが見出された（非特許文献２５）。これらの結果は、ＭＳＣの免疫調節効果が、生存するＭＳＣによって活発に放出される微小胞によって媒介され得ることを示唆している。
【０００５】
従って、ＭＳＣの治療的免疫調節効果は、それらの分泌源を介して媒介されることが提案されている（非特許文献２６）。しかし、ＭＳＣの分泌細胞がインビボ投与後の免疫調節効果の原因であるという明白な証拠はない。ＭＳＣは、静脈内（ｉｖ）投与後に肺の小毛細血管に取り込まれ、大部分のＭＳＣは、注入後２４時間以内に死滅する（非特許文献２７−２８）。これは、ＭＳＣが静脈内投与後も十分に長く生存して、炎症状態によって活性化され、その分泌物を介してその治療効果を発揮するか、またはそれらが肺毛細血管を脱出して炎症部位に移動し得るかどうかを決定する。
【０００６】
ＭＳＣは、標的細胞に対して直接の免疫調節効果を有するのではなく、レシピエント細胞の活性化を介して注入後にその効果の少なくともいくつかを発揮することが明らかになった。例えば、心筋梗塞修復に対するＭＳＣの保護効果は、早期マクロファージ枯渇が部分的にＭＳＣの治療効果を低減させたので、修復性Ｍ２マクロファージの調節によって部分的に媒介されることが示されている（非特許文献２９）。近年、ＭＳＣの注入は、その後の免疫抑制のイニシエーターであり得る軽度の全身性炎症応答を引き起こすことが実証された（非特許文献３０）。分泌細胞がこの炎症性応答を達成するために必要とされるか否かは現在知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０１４６９１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３−１４７
【非特許文献２】Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３６：９７８−９８９
【非特許文献３】Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７：２６２４−２６３５
【非特許文献４】Ｐｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０：５５−６０
【非特許文献５】Ｒｏｅｍｅｌｉｎｇ−ｖａｎ  Ｒｈｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｊ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  Ｓｕｐｐｌ  ６：２０７８０
【非特許文献６】Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｇｕｔ  ５８：９２９−９３９
【非特許文献７】Ａｕｇｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５６：１１７５−１１８６
【非特許文献８】Ｔｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：３３３−３４８
【非特許文献９】Ｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １２：３６１−３７０
【非特許文献１０】Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｌａｎｃｅｔ  ３７１：１５７９−８６
【非特許文献１１】Ｂｅｒｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１．Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ４６：２００−２０７
【非特許文献１２】Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｊ  ６０：３４７−３５７
【非特許文献１３】Ｆｏｒｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １２：６４−７１
【非特許文献１４】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２２：２２６７−２２７７
【非特許文献１５】Ｌｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１：６１７−６３６
【非特許文献１６】Ｗａｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５：ｅ１００８８
【非特許文献１７】Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｂｌｏｏｄ  ９９：３８３８−３８４３
【非特許文献１８】Ｇｒｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３３：９２８−９３４
【非特許文献１９】Ｓｐａｇｇｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｂｌｏｏｄ  １１１：１３２７−１１３３
【非特許文献２０】Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０：２３７２−２３８０
【非特許文献２１】Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｘｕｅｙｅｘｕｅ  Ｚａｚｈｉ  ３４：２１３−２１６
【非特許文献２２】Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７４：２６７−２７６
【非特許文献２３】Ｌｕｚ−Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ４５２７２
【非特許文献２４】Ｋｏｒｄｅｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２８：９７０−９７３
【非特許文献２５】Ｄｉ  Ｔｒａｐａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．１３；６：２４１２０
【非特許文献２６】Ｃａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｒｅａ，２０１１．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ９：１１−１５
【非特許文献２７】Ｅｇｇｅｎｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：２９７
【非特許文献２８】Ｓｃｈｒｅｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ  ３９：５７３−５７６
【非特許文献２９】Ｂｅｎ−Ｍｏｒｄｅｃｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ６２：１８９０−１９０１
【非特許文献３０】Ｈｏｏｇｄｕｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  ２２：２８２５−２８３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＭＳＣの免疫調節効果が、免疫細胞と活発に相互作用し、サイトカイン、成長因子および小胞を放出する生存するＭＳＣによってのみ媒介されるかどうかを調べることである。提示された研究は、驚くべきことに、ＭＳＣが受動的機構を介して宿主細胞の免疫調節応答を引き起こすことも示している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、前記ＭＳＣ由来の膜構造物を含む溶解されたＭＳＣ由来の免疫調節膜状粒子に関する。
【００１１】
本発明は、分泌型不全である不活性化ＭＳＣが、不活性化ＭＳＣの対象への投与後に、対象の免疫系を調節することができるという驚くべき知見に基づいている。これまでに、ＭＳＣの有益な効果は、活発に分泌される免疫応答調節因子によって媒介されると一般的に信じられていた。
【００１２】
驚くべきことに、単球の分化の誘導を含むＭＳＣのいくつかの免疫調節特性が、間葉系幹細胞由来の膜構造物を含む溶解された間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子によって媒介され得ることが今や見出されている。重要なことには、溶解されたＭＳＣ由来の免疫調節性粒子は、Ｔ細胞増殖を直接的に阻害せず、および／またはＢ細胞機能を直接調節しない。したがって、免疫調節膜状粒子は、この点においても、生存するＭＳＣの原形質膜から放出される小さな細胞外小胞とは異なる。
【００１３】
前記免疫調節性粒子は、好ましくは７０〜１７０ｎｍ、好ましくは９０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約１２０ｎｍの平均粒径を有する。
【００１４】
溶解されたＭＳＣ由来の免疫調節性粒子の使用は、対象への生存するＭＳＣの投与に関連するウイルスのような病原体の伝染の危険性を強く低減させる。
【００１５】
本発明の粒子は、好ましくは、それらの溶解の前にインターフェロンガンマで処理されたＭＳＣから生成される。インターフェロンガンマのようなサイトカインによるＭＳＣの前処置は、前処置されなかったＭＳＣと比較した場合、ＭＳＣの免疫抑制機能、およびインターフェロンガンマで前処理された溶解されたＭＳＣ由来の膜状粒子の免疫調節機能を誘発することが見出された。
【００１６】
本発明による粒子は、好ましくは、好ましくは急性および慢性の炎症性疾患および自己免疫疾患の治療における、または移植拒絶反応の治療および予防における医薬としての使用のためのものである。
【００１７】
ＭＳＣは免疫原性が低い。したがって、免疫調節膜状粒子は、好ましくは、同種異系ＭＳＣ、すなわち同じ種の１以上の対象、好ましくは１以上のヒト対象から調製される。対象への投与後の本発明の粒子に対する免疫応答をさらに予防するために、粒子は、前記粒子で治療される対象から得られるＭＳＣから調製され得る。
【００１８】
本発明はさらに、前記間葉系幹細胞由来の膜構造物を含む溶解された間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子と、薬学的に許容される媒剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
該医薬組成物は好ましくは、免疫抑制療法における使用、および／または移植拒絶反応の治療および予防における使用のためものである。
【００２０】
本発明はさらに、医薬としての使用のための、好ましくは、自己免疫疾患を含む、急性および慢性炎症性疾患の治療における使用のための、ならびに／または移植拒絶反応の治療および予防における使用のための、不活性化されたＭＳＣまたはその一部を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＭＳＣ粒子の形状およびサイズ特性を示す図である。Ａ：蛍光ＰＫＨ２６で染色した膜状粒子の球形構造をグレースケールで示す共焦点顕微鏡画像。Ｂ：７０〜６００ｎｍのサイズ範囲および１００〜１２０ｎｍのピークを示す、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔによって測定されたＭＳＣおよびＩＦＮγ処理ＭＳＣ由来の粒子のサイズ分布。
【図２】ＭＳＣおよびＭＳＣ粒子のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＭＳＣはＣＤ７３およびＣＤ９０の発現を示すが、ＰＤＬ１のレベルは非常に低い（左のカラム）。ＭＳＣをＩＦＮ−γで処理すると、ＣＤ７３およびＣＤ９０の発現が維持され、ＰＤＬ１の発現がアップレギュレートされる。ＭＳＣ粒子の免疫表現型は、ＭＳＣの免疫表現型を模倣し、ＭＳＣ由来およびＩＦＮγ処理ＭＳＣ由来の粒子においてＣＤ７３およびＣＤ９０の発現がみられ、ＩＦＮγ処理ＭＳＣ由来の粒子においてのみＰＤＬ１発現がみられる（右のカラム）。
【図３】ＭＳＣ粒子は、末梢血から単離されたヒトＣＤ１４＋単球の免疫表現型に影響を及ぼす。Ａ：２４時間の単球へのＭＳＣ粒子の添加は、単球上のＣＤ９０発現に用量依存的効果を有する。Ｂ：対照ＭＳＣ由来ではなくＩＦＮγで処理したＭＳＣ由来の粒子は、単球上の抗炎症性ＰＤ−Ｌ１発現を用量依存的に増加させる。＊は、粒子がない場合と比較した統計的有意性を示す。
【図４】ＭＳＣ粒子は、末梢血から単離されたヒトＣＤ１４＋単球のサイトカインｍＲＮＡ発現に影響を及ぼす。Ａ：ＣＤ１４＋単球は、２４時間のＭＳＣ粒子の存在下で培養した際にＩＬ６の発現を増加させた。Ｂ：ＣＤ１４＋単球は、２４時間のＭＳＣ粒子の存在下で培養した際にＩＬ１０の発現を増加させた。対照ＭＳＣまたはＩＦＮγ処理ＭＳＣ由来の粒子の効果には差異はなかった。粒子を１：４０，０００の比でＣＤ１４＋単球に添加した。
【図５】マウスにおけるＭＳＣ粒子の注入は、全身性サイトカインおよびケモカインレベルに影響を及ぼす。Ｃ５７ＢＬ６マウスに５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを投与して全身性炎症反応を誘導し、ＭＳＣ粒子（１０×１０９）を１時間後に静脈内投与した。ＬＰＳ投与の６時間後、血液をミリプレックスアッセイによってサイトカインおよびケモカインレベルについて分析した。Ａ：ＭＳＣ粒子およびＭＳＣ（ＩＦＮγ）粒子は血清Ｇ−ＣＳＦレベルを増加させた。Ｂ：ＭＩＰ１αレベル。Ｃ：ＭＳＣ（ＩＦＮγ）粒子のみがＩＬ１０レベルを増加させた。
【図６】ＭＰ特性を示す図である。非刺激およびＩＦＮ−γＭＳＣ（それぞれＭＰおよびＭＰγ）から生成されたＭＰの形態学的特性。（Ａ）ＮＴＡによって測定されたＭＰおよびＭＰγのサイズ分布。（Ｂ）ＭＳＣごとに生成される粒子の平均数。（Ｃ）ＭＰの透過型電子顕微鏡分析。
【図７Ａ】ＭＰの酵素活性を示す図である。ＡＴＰアーゼ活性を、４つの異なる濃度のＭＰ（１×１０１２、１×１０１１、１×１０１０、１×１０９／ｍｌ）で測定した。ＭＰおよびＭＰγは反応を触媒することができ、遊離リン酸塩の検出はＭＰの濃度に依存した。
【図７Ｂ】ＭＰの酵素活性を示す図である。３つの異なる濃度のＭＰ（１×１０１２、１×１０１１、１×１０１０／ｍｌ）についてＣＤ７３の活性を測定した。ＭＰおよびＭＰγは、基質（ＡＭＰ）を添加した後に遊離リン酸塩を生成することができ、それはＭＰの濃度に依存した。ＣＤ７３酵素（２および１ｎｇ）を使用して、ＭＰ中のＣＤ７３の濃度を相対的に計算した。
【図７Ｃ】ＭＰの酵素活性を示す図である。フローサイトメトリーによるＣＦＤＡ−ＳＥのＣＦＳＥへの変換により、３つの異なる濃度のＭＰ（１×１０９、１×１０８、１×１０７粒子／ｍｌ）のエステラーゼ活性を測定した。蛍光事象は、ＣＦＳＥ（ＣＦＳＥ−ＭＰ）で標識されたＭＰにおいて観察され、検出されたＣＦＳＥ−ＭＰの数は、ＭＰの濃度に依存した。実験においてＭＰとＭＰγとの間に統計的な差はなかった。
【図８】ＣＤ１４＋細胞に対するＭＰの効果を示す図である。単球を２４時間ＭＰの異なる比率（１：１０，０００，１：４０，０００，１：８０，０００）で培養して単球免疫表現型に対するＭＰの効果を測定した。（Ａ）ＭＰの存在下で培養した単球上でのＣＤ１６分子の発現（ｎ＝６；平均±ＳＥＭ）。（ＢおよびＣ）ＭＰの存在下でのＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球におけるＣＤ９０およびＰＤ−Ｌ１の発現（ｎ＝７；平均±ＳＥＭ）。（Ｄ）ＭＰとの培養後の単球のｍＲＮＡ発現。ＭＰと共に２４時間培養した後、単球をＭＰから分離し、ＣＤ９０、ＩＤＯ、ＰＤ−Ｌ１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０に対するリアルタイムＰＣＲおよびアッセイオンデマンドプライマー／プローブによって評価した（ｎ＝６；平均±ＳＥＭ）。対Ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１ｖｓ対照；＃ｐ＜０．０５および＃＃ｐ＜０．０１ｖｓＭＰ群。
【図９】単球によるＭＰの取り込みを示す図である。ＰＫＨ−ＭＰをＰＢＭＣ（比率１：４０，０００）に添加して、１時間インキュベートし、および３７℃で２４時間インキュベートした。対照として、４℃でインキュベートした。（ＡおよびＢ）リンパ球（ＣＤ３）および単球（ＣＤ１４）によるＰＫＨ−ＭＰ取り込みをフローサイトメトリーによって分析した。
【図１０】単球によるＭＰ取り込みの免疫蛍光分析を示す図である。単球によるＰＫＨ−ＭＰ取り込みの共焦点顕微鏡分析。（Ａ）経時的記録は、ＭＰが単球の原形質膜に結合するが、それらは内在化されなかったことを示した。（Ｂ）単球上のＭＰ共局在化のＺスタック画像。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（定義）
本明細書で使用される用語「間葉系幹細胞」またはＭＳＣは、自己再生することができ、例えば骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨などの複数の系統に分化することができる成体前駆細胞を指す。ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯、肝臓、筋肉、および肺などの多数の組織から単離され得る。ＭＳＣは、標準的な培養条件下で維持されるとプラスチックに付着する。ＭＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現するが、標準的な培養条件下でＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲ表面分子を発現しない。
【００２３】
本明細書で使用される用語「膜状粒子」は、細胞の溶解の際に生成される原形質膜フラグメントを指す。用語「膜状粒子」は、これらの粒子を天然に存在する細胞外微小胞と区別するために明示的に使用され、それはエキソソームを含み、それは生存細胞の細胞膜から自然に排出される小胞である、小さな細胞内生成小胞である。前記膜状粒子は、ＣＤ７３を発現し、ＣＤ７３は例えばエキソソームには存在しない。さらに、細胞外小胞などの自然に排出した小胞は、ＣＤ６３およびＣＤ８１などのテトラスパニンが非常に豊富であるが、これらのテトラスパニンは膜状粒子上では豊富ではない。膜状粒子上のＣＤ６３およびＣＤ８１などのテトラスパニンのレベル発現は、原形質膜上の発現レベルと同様である。前記発現レベルは、細胞外小胞などの自然に排出される小胞の発現レベルの多くとも２０％、より好ましくは多くとも１０％である。本明細書で使用する用語「免疫調節性」は、免疫応答を変化させる能力を指す。好ましい免疫調節活性は、移植片対宿主病、自己免疫疾患およびクローン病などの炎症性疾患のような免疫関連疾患の抑制である。それは、免疫活動が感染と戦うには不十分である場合、または切除後の免疫系の回復が損なわれる状況において、免疫系の活性化を指すこともできる。
【００２４】
（免疫調節性膜状粒子）
間葉系幹細胞は、当業者に知られているように、骨髄または脂肪組織などの組織の酵素処理、好ましくはコラゲナーゼ処理によって単離することができる。密度分画を用いて、単核細胞を赤血球および顆粒球から分離することができる。代替として、赤血球溶解は、骨髄吸引物からヒトＭＳＣを単離するために使用され得る（Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ６：１１−１４）。プラスチック上の細胞のプレーティングおよびプラスチックに接着する細胞の選択は、好ましくは、ＭＳＣの単離手順において使用される。さらに、例えば、ＣＤ４５＋細胞などの汚染細胞を除去するために、磁気ビーズカップリングを含むソーティング技術を実施して、ＭＳＣを濃縮することができる。
【００２５】
好ましい方法では、脂肪組織を、連続的に振盪しながら３７℃でＩＶ型コラゲナーゼで酵素消化する。遠心分離後、細胞ペレットを再懸濁し、室温でインキュベートする。次いで、細胞を洗浄し、３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトアビジン（ｐ／ｓ）、および１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＭＥＭ−αに再懸濁する。続いて、非接着細胞を３〜４日後に除去する。
【００２６】
単離されたＭＳＣは、機械的溶解および／または溶解緩衝液の添加を含む、当該分野で公知の任意の方法によって溶解され得る。前記溶解緩衝液は、好ましくは、イオン強度および／または浸透圧を制御する。ＭＳＣの溶解を増強するために、塩化物またはイソチオシアネートなどのカオトロピック剤を添加することができる。前記溶解緩衝液は、好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＳＤＳのような界面活性剤を含まない。
【００２７】
ＭＳＣの溶解は、好ましくは、低張溶解緩衝液中でのインキュベーションおよび例えばＤｏｕｎｃｅホモジナイザーまたはＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーによる機械的破壊の適用によって行われる。代替方法として、細胞を凍結融解によって溶解させることができる。最も好ましい溶解緩衝液は、低張溶解緩衝液である。前記低張溶解緩衝液は、好ましくは水である。
【００２８】
溶解細胞の膜画分は、好ましくは遠心分離、好ましくは超遠心分離、好ましくは１００，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって回収される。オルガネラは、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ヘペス緩衝溶液（ＨＢＳ）またはＭＥＳ緩衝溶液（ＭＢＳ）のような緩衝液で洗い流すことができる。得られた膜部分は、再アニールして膜状粒子を生成すると考えられる。これらの粒子は、ＭＳＣの表面タンパク質を保存するより小さな直径を有する構造である。
【００２９】
当業者は、膜状粒子の再アニール中に分子を添加できることを理解するであろう。それらの分子は、好ましくは免疫調節化合物、好ましくは免疫抑制化合物である。このようにして、前記免疫抑制化合物は、膜状粒子に含まれる。 そのような化合物の例は、ステロイド、好ましくはグルココルチコイド、例えばヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロンおよびデキサメタゾン、細胞分裂停止剤、抗体ならびにシクロスポリンおよびタクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤である。従って、本発明はまた、免疫抑制化合物、好ましくはステロイド、細胞分裂停止剤、抗体および／またはカルシニューリン阻害剤を含む、前記間葉系幹細胞の原形質膜由来の、膜構造を含む免疫調節性粒子を提供する。
【００３０】
得られた膜状粒子の平均粒子サイズは、動的光散乱、走査型電子顕微鏡、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、非対称フローフィールドフロー分画、分析用超遠心分離、または好ましくはナノ粒子追跡分析（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｅｎｉｇｍａ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＷＲ１４  １ＸＺ、英国）により決定され得る。本発明の膜状粒子は、７０〜１７０ｎｍ、好ましくは９０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約１２０ｎｍの平均粒径を有する。比較のために、微小胞は５０〜１０００ｎｍの平均粒径を有するが、一般に２５０ｎｍより大きい。エキソソームの平均粒径は３０〜１００ｎｍである。  ＭＳＣと比較した場合、膜状粒子の小さいサイズは、それらのより良好な全身分布のために、移植片対宿主病および敗血症のような全身性免疫疾患における膜状粒子による免疫調節を潜在的により効率的にする。さらに、膜状粒子は、毛細血管網を通過して炎症部位に達することができるので、限局性免疫障害において効率的であり得る。さらに、膜状粒子では、自然に分泌される小胞よりも臨床応用に必要な大量の生成がより容易である。無傷ＭＳＣと比較した場合の膜状粒子のさらなる利点は、膜状粒子が非腫瘍形成性であり、おそらくウイルスなどの病原性物質を伝達しないことである。
【００３１】
膜状粒子の状態または質は、好ましくは、その後の免疫調節療法での使用の前に決定される。膜状粒子の品質を決定するための好ましいアッセイは、ＡＴＰアーゼアッセイである。基質転位のためのエネルギーはＡＴＰ加水分解に由来するので、膜状粒子によるＡＴＰ切断は、膜上の基質転移に関連する。ＡＴＰ加水分解は無機リン酸塩を生じ、これは単純な比色反応によって測定することができる。遊離した無機リン酸塩の量は、ＡＴＰアーゼ活性に正比例する。前記ＡＴＰアーゼアッセイは、Ｍｅｓｈｃｈｅｒｙａｋｏｖ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ．，２０１６．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｐｒｏ．２９３２に記載されているように測定することが好ましい。
【００３２】
十分な品質の膜状粒子の閾値は、３０分で２．５×１０７個の膜状粒子あたり少なくとも０．１、０．５、１、５または好ましくは少なくとも１０μＭのＡＴＰを変換するＡＴＰアーゼ活性である。
【００３３】
単離されたＭＳＣは、好ましくは、膜状粒子を単離する前に前処理されて、ＭＳＣの免疫抑制能を高める。前処理は、好ましくは、細胞を１〜１０日間、好ましくは約３日間、１つ以上のサイトカインと共に培養することによって実施される。好ましいサイトカインには、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１α、インターロイキン１β、トランスフォーミング成長因子βおよびインターフェロンγ、またはそれらの組み合わせが含まれる。好ましいサイトカインは、インターフェロンγ、またはインターフェロンγと、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１α、インターロイキン１βおよびトランスフォーミング増殖因子βの１つ以上との組合せである。
【００３４】
ＭＳＣは、好ましくは、それらの溶解の前に２〜５日間、好ましくは約３日間、サイトカインで前処理される。前処理は、好ましくは、細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γと共にインキュベートすることを含む。ＭＳＣ上の免疫調節タンパク質は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ１）のうち、ＩＦＮ−γでの前処置後にアップレギュレートされることが見出された。
【００３５】
ＭＳＣは、それらの溶解前に不活性化され得る。不活性化は、熱処理、紫外線などの放射線、およびＸ線照射などの電離放射線、および／または化学処理を含む、当技術分野で知られている任意の機構によって行うことができる。ＭＳＣは、好ましくは熱処理により、好ましくは４５〜５５℃の温度調節水浴中で、好ましくは約５０℃で、好ましくは１０分間〜１時間、好ましくは約３０分間のインキュベーションにより不活性化される。
【００３６】
（医薬としての免疫調節性膜状粒子）
本発明はさらに、医薬として使用するための本発明の膜状粒子を提供する。前記膜状粒子は、非経口投与によって、または鼻および／または気管内投与によって、例えば吸入または鼻スプレーの使用によって、それを必要とする対象に投与することができる。非経口投与は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内、および腹腔内投与から選択される投与経路を指す。好ましい投与経路は、静脈内投与および動脈内投与、好ましくは静脈内または動脈内注射または静脈内または動脈内灌流である。
【００３７】
前記膜状粒子は、好ましくは、投与を受ける対象の体重１ｋｇあたり１０Ｅ７−１０Ｅ１３の膜状粒子、好ましくは体重１ｋｇ当たり１０Ｅ８−１０Ｅ１２の膜状粒子、体重１ｋｇあたり１０Ｅ９−１０Ｅ１１の膜状粒子、より好ましくは体重１ｋｇあたり約１０Ｅ１０の膜状粒子で投与される。
【００３８】
前記膜状粒子は、好ましくは水性懸濁液として、より好ましくは等張水性懸濁液として提供される。
【００３９】
前記膜状粒子は、自己免疫疾患を含む急性および慢性の炎症性疾患の治療における医薬として好ましく使用される。前記膜状粒子はまた、多系統萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、および脳卒中の治療における医薬として使用することもできる。
【００４０】
本発明による膜状粒子で治療することができる炎症性疾患の例には、にきび、アジソン病、喘息、セリアック病、前立腺炎、糸球体腎炎、移植片対宿主病、橋本病、間質性膀胱炎、エリテマトーデス、クローン病などの炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、乾癬、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、１型糖尿病、移植拒絶、および血管炎が含まれる。
【００４１】
前記膜状粒子は、移植片拒絶の治療および予防における医薬として好ましく使用される。移植拒絶反応は、細胞性免疫および体液性免疫による適応免疫応答によって媒介される。移植拒絶反応は急性であり、移植後最初の１週間から３ヵ月以降に起こるか、または慢性であり、何年にもわたって起こる。膜状粒子は、臓器移植中、臓器移植中、または臓器移植後に免疫調節性および寛容誘導性のツールを提供し、大きな副作用を伴う現在の免疫抑制治療を代替し、または最小限に抑えることができる。
【００４２】
前記膜状粒子は、臓器移植で使用される１つ以上の免疫抑制剤と組み合わされ得、それは例えば移植拒絶反応の治療および予防におけるプレドニゾンまたはメチルプレドニゾロンなどのコルチコステロイド、シクロスポリンおよびタクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリンまたはシロリムスなどの抗増殖剤、ムロモナブ−ＣＤ３、インターロイキン−２受容体アンタゴニスト、またはダクリズマブなどのモノクロナール抗リンパ球抗体および／または抗胸腺細胞グロブリン−ウマまたは抗胸腺細胞グロブリン−ウサギのようなポリクローナル抗リンパ球抗体である。
【００４３】
医薬として使用するための膜状粒子は、自己及び同種異系ＭＳＣから生成することができる。ＭＳＣは低免疫原性であり、膜状粒子の調製のための同種異系ＭＳＣの使用を可能にするが、膜状粒子は前記粒子で治療される対象のＭＳＣから得ることができる。自己細胞からの粒子の使用は、ＭＳＣの単離およびインビトロでの拡大のための十分な時間を可能にする自己免疫疾患または病状における治療的適用を有し得る。しかし、今日まで同種異系ＭＳＣを用いて実施された臨床応用は、重大な有害な副作用無く安全性を確認する。
【００４４】
本発明はさらに、自己免疫疾患および／または多系統萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症および脳卒中を含む急性および慢性炎症性疾患の治療方法を提供し、それは、本発明による膜状粒子を治療を必要とする対象にそれを投与することを含む。本発明はさらに、自己免疫疾患および／または多系統萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症および脳卒中を含む急性および慢性炎症性疾患の治療に使用するための医薬の製造のための本発明の膜状粒子の使用を提供する。
【００４５】
本発明はさらに、本発明の粒子と、溶媒、酸化防止剤および／または緩衝剤などの薬学的に許容される添加剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
本発明はさらに、免疫抑制療法に使用するための本発明による粒子を含む医薬組成物を提供する。該免疫抑制療法は、好ましくは、自己免疫疾患を含む急性および慢性炎症性疾患の治療のためのものである。本発明による膜状粒子で治療することができる炎症性疾患の例には、にきび、アジソン病、喘息、セリアック病、前立腺炎、糸球体腎炎、移植片対宿主病、橋本病、間質性膀胱炎、エリテマトーデス、クローン病などの炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、乾癬、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、１型糖尿病、移植拒絶、および血管炎が含まれる。前記医薬組成物はまた、多系統萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、および脳卒中の治療における医薬として使用することもできる。
【００４７】
該医薬組成物は、好ましくは、移植拒絶の治療および予防における使用のためのものである。
【００４８】
本発明はさらに、自己免疫疾患および／または多系統萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、および脳卒中を含む急性および慢性炎症性疾患の治療方法を提供し、この方法は、本発明の医薬組成物を治療を必要とする対象に投与することを含む。本発明はさらに、自己免疫疾患を含む急性および慢性炎症性疾患、および／または多系統萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、および脳卒中の治療に使用するための医薬の製造のための本発明による医薬組成物の使用を提供する。
【００４９】
本発明はさらに、医薬として使用するための不活性化された間葉系幹細胞またはその一部を提供する。不活性化は、熱処理、紫外線などの放射線、およびＸ線照射などの電離放射線、および／または化学処理を含む、当技術分野で知られている任意の機構によって行うことができる。間葉系幹細胞は、好ましくは、熱処理により、好ましくは４５〜５５℃の温度調節水浴中で、好ましくは約５０℃で、好ましくは１０分間〜１時間、好ましくは約３０分間インキュベートによって不活性化される。
【００５０】
本明細書で使用される用語「不活性化された間葉系幹細胞の一部」は、幹細胞の不活性化後に得られる膜状部分を指す。該膜状部分は原形質膜断片を含む。
【００５１】
前記不活性化された間葉系幹細胞またはその一部は、好ましくは、急性および慢性炎症性疾患およびその自己免疫疾患、ならびに／または多系統萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症および脳卒中の治療における医薬としての使用のためのものである。
【００５２】
前記不活性化された間葉系幹細胞またはその一部は、好ましくは、移植拒絶の治療および予防における医薬としての使用のためのものである。
【００５３】
明瞭化および簡潔な説明のために、同じまたは別個の態様およびその好ましい実施形態の一部として特徴が本明細書に記載されているが、本発明の範囲は、記載された特徴の全体またはその一部の組み合わせを有する実施形態を含むことができる。
【００５４】
本発明を以下の実施例によって説明するが、これらは限定ではなく例示として提供され、本発明の趣旨および添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく記載された方法および示された量の多くの変形が可能である。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
（材料および方法）
（ＭＳＣの分離と培養）
健康な腎臓ドナーの腹部切開から外科的に除去された皮下脂肪組織からヒトＭＳＣを単離した。エラスムス  ユニバーシティ  メディカルセンター  ロッテルダムの医療倫理委員会（プロトコル番号ＭＥＣ−２００６−１９０）の承認を得て、書面によるインフォームドコンセントの後、脂肪組織を採取した。前述のように、ＭＳＣを脂肪組織から単離した（Ｒｏｅｍｅｌｉｎｇ−ｖａｎ  Ｒｈｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ８２：７４８−７５８；Ｈｏｏｇｄｕｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  １６：５９７−６０４）。要約すると、組織を機械的に破壊し、ＰＢＳで洗浄した。次いで脂肪組織をｇｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中、０．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ型（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を用いて３７℃で３０分間連続振とう下で酵素消化した。間質血管画分（ＳＶＦ）を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、ベルギー）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｐ／Ｓ；１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００ＩＵ／ｍｌストレプトマイシン；Ｌｏｎｚａ）を含有する最小必須培地Ｅａｇｌｅアルファ改変（ＭＥＭ−α；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）に再懸濁した。ＭＳＣを、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）および１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｏｎｚａ）を補充したＭＥＭ−α中の１７５−ｃｍ２細胞培養フラスコ中で培養し、３７℃、５％ＣＯ２および２０％Ｏ２に維持した。培地を１週間に１回リフレッシュし、ＭＳＣを０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて約８０〜９０％コンフルエンスで継代した。免疫活性化ＭＳＣを産生するために、細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγで３日間培養した。
【００５６】
（粒子の調製）
継代２−７代間のＭＳＣを粒子調製に使用した。対照ＭＳＣおよびＩＦＮγと共に前培養したＭＳＣを、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いたトリプシン処理によって培養フラスコから取り出した。ＭＳＣ懸濁液をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を高張緩衝液またはＨ２Ｏ中で溶解し、５分間激しく振盪した。次に懸濁液を１０００ｇで５分間遠心分離して細胞残屑を除去した。回収した上清を１０００ｇで５分間、等張緩衝液で２回洗浄した。次いで、上清を１５００ｇで１０分間遠心分離した。次のステップで、上清を１００，０００ｇで２０分間超遠心分離機で遠心分離した。膜状粒子を含有するペレットを等張緩衝液中に再構成した。最後のステップは、膜状粒子を６００ｇでの遠心分離によって可溶性タンパク質から分離するＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０遠心フィルターチューブ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ−ＰＬ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、１００ｋＤ）（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた懸濁液からの粒子の濾過によって置き換えることができる。
【００５７】
（ＮａｎｏＳｉｇｈｔによるサイズ決定）
ＭＳＣ膜状粒子の絶対サイズ分布の分析は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて行った。粒子懸濁液（１０μｌ）を１ｍｌの濾過したＰＢＳで希釈した。ＮａｎｏＳｉｇｈｔの設定は、温度２３．２５±０．５℃、粘度０．９２±０．０１ｃＰ、毎秒フレーム数２５、測定時間６０秒であった。
【００５８】
（共焦点顕微鏡法）
膜に蛍光性を付与する蛍光ＰＫＨ−２６（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で標識したＭＳＣから単離した粒子を、６０倍（１．４  ＮＡ  ｏｉｌ）の対物レンズを使用した、Ｌｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ−Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＬＡＳ  ＡＦ）ソフトウェア、ＤＰＳＳ  ５６１ｎｍレーザーを備えたＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂ．Ｖ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ  Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、オランダ）で撮像した。１０２４×１０２４ピクセルと８ビット／ピクセル画像の走査モードフォーマットを用いて光学的単一セクションを取得した。ＩｍａｇｅＪ  １．４８（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いて画像を処理した。
【００５９】
（フローサイトメトリー）
ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により、ＭＳＣおよびＭＳＣ膜状粒子の免疫表現型、サイズおよび粒状性パラメータを決定した。ＭＳＣおよびＭＳＣ粒子を、ＣＤ７３−ＰＥ、ＣＤ９０−ＡＰＣおよびＰＤＬ１−ＰＥ抗体（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にＰＢＳ中、室温で１５分間、光の非存在下でインキュベートした。粒子は、粒子の損失を避けるために染色後に洗浄されなかった。ＭＳＣおよび粒子は、それらの前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）シグナルに基づいてフローサイトメーター上で同定された。蛍光シグナルを、染色されていないＭＳＣまたは染色されていない粒子と比較した。
【００６０】
（ＣＤ１４＋単球実験）
ヒト単球を、マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いたＣＤ１４＋の陽性選択によるＭＡＣＳ選別によってＰＢＭＣから単離した。ＣＤ１４＋細胞を、非付着性ポリプロピレンチューブ中のＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０％熱不活性化ＦＢＳ（３０分間５７℃）中で種々の濃度の、ＭＳＣ膜状粒子またはＩＦＮγ処理ＭＳＣ由来の粒子とともにインキュベートした。２４時間後、単球を採取し、ＣＤ９０およびＰＤＬ１の発現をフローサイトメトリーにより決定した。ＩＬ６およびＩＬ１０の定量的ｍＲＮＡ発現は、ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＩＬ−１０（Ｈｓ００１７４０８６．ｍ１）およびＩＬ６（Ｈｓ００１７４１３１．ｍ１）のためのアッセイオンデマンドを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。データは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対するＰＣＲ産物の相対コピー数として表される。相対的なコピー数は、式２（４０−Ｃｔ値）を用いて計算した。データを対照に対して標準化した（１に設定）。
【００６１】
（ＭＳＣ粒子のインビボ投与）
Ｃ５７ＢＬ６マウスに、尾静脈注射により５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を投与した。１時間後、動物に尾静脈を介して１０×１０９個のＭＳＣ粒子を投与した。ＬＰＳ注射の６時間後、動物を屠殺し、Ｍｉｎｉｃｏｌｌｅｃｔ  ＥＤＴＡチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、Ａｌｐｈｅｎ  ａ／ｄ  Ｒｉｊｎ、オランダ）で採血した。血漿を−８０℃で凍結させ、その後製造者のマニュアルに従ったマルチプレックスアッセイ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）によるサイトカイン／ケモカインレベルの測定に使用した。
【００６２】
（結果）
（ＭＳＣ膜状粒子の特徴）
低張緩衝液へのＭＳＣの暴露は、ＭＳＣの溶解をもたらした。その後の１０００ｇおよび１５００ｇでの遠心分離は、膜断片および可溶性因子からオルガネラを分離した。１００，０００ｇでの遠心分離は、膜断片を可溶性因子から分離した。膜断片は、共焦点顕微鏡（図１Ａ）によって観察されたときに、ほとんどが球形構造として現れた。ＭＳＣ膜粒子のサイズ分布は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔによって決定された。粒子のサイズは、７０〜６００ｎｍの範囲であり、１００〜１２０ｎｍでピークサイズ分布を示した（図１Ｂ）。対照ＭＳＣおよびＩＦＮγで前処置したＭＳＣ由来の粒子の間ではサイズに差はなかった。
【００６３】
（ＭＳＣ膜粒子のフローサイトメトリー分析）
ＭＳＣおよびＩＦＮγ処理したＭＳＣをフローサイトメトリーにより免疫表現型分析した。ＭＳＣおよびＩＦＮγ処理したＭＳＣは、ＭＳＣ表面マーカーＣＤ７３およびＣＤ９０の同様の発現レベルを示した（図２左側パネル）。ＰＤＬ１は、ＩＦＮγ処理後のＭＳＣにおいてのみ発現された。膜状粒子は、それらが由来するＭＳＣの発現パターンを模倣した。ＣＤ７３およびＣＤ９０は、対照ＭＳＣおよびＩＦＮγ処理ＭＳＣの両方由来の粒子上に発現された（図２右パネル）。ＩＦＮγ処理したＭＳＣに由来するが、対照ＭＳＣ由来ではない膜状粒子はＰＤＬ１を含んでいた。
【００６４】
（単球に対するＭＳＣ膜状粒子の影響）
ヒト単球に対するＭＳＣ膜状粒子の効果を調べるために、ＣＤ１４＋単球をＰＢＭＣから単離し、種々の濃度の粒子の存在下で２４時間培養した。ＭＳＣおよびＩＦＮγ処理ＭＳＣ膜状粒子は、単球の活性化を示す用量依存的様式で単球上のＣＤ９０タンパク質発現を誘導した（図３Ａ）。対照ＭＳＣ由来の膜状粒子は、単球上の抗炎症性ＰＤＬ１タンパク質発現に影響を及ぼさなかった。対照的に、ＩＦＮγ処理ＭＳＣ由来の膜状粒子は、用量依存的に単球上のＰＤＬ１発現を増加させた（図３Ｂ）。図２に示すように、ＣＤ９０およびＰＤＬ１は、（ＩＦＮ処理）ＭＳＣ膜状粒子上にも存在し、単球上でのＣＤ９０およびＰＤＬ１の発現は、単球によるタンパク質の移動またはＭＳＣ膜状粒子の取り込みを表し得る。しかし、単球上でのＣＤ９０およびＰＤＬ１タンパク質発現は、ＣＤ９０およびＰＤＬ１に対するｍＲＮＡ発現と関連していた（データ示さず）。これは、ＭＳＣ膜状粒子が単球における遺伝子発現変化を誘導することを示す。これは、ＭＳＣおよびＩＦＮγ処理ＭＳＣの膜状粒子とのインキュベーション２４時間後の単球における免疫調節ＩＬ６およびＩＬ１０のｍＲＮＡ発現の増加によってさらに証明される（図４）。
【００６５】
（インビボでのＭＳＣ粒子の免疫調節効果）
インビボでのＭＳＣ膜状粒子の安全性および免疫調節効果を調べるために、ＬＰＳ注射（５ｍｇ／ｋｇ）による敗血症様全身性炎症の誘発の１時間後に、Ｃ５７ＢＬ６マウスの尾静脈から１０×１０９ＭＳＣ粒子またはＭＳＣ（ＩＦＮγ）粒子を注入した。ＭＳＣ粒子は動物によって十分に耐容され、有害作用は観察されなかった。ＭＳＣ粒子およびＭＳＣ（ＩＦＮγ）粒子は、全身免疫調節応答を誘導し、それは粒子注入５時間後のＧ−ＣＳＦおよびＭＩＰ１αの血清レベルの上昇によって示された（図５ＡおよびＢ）。ＭＳＣ（ＩＦＮγ）粒子（ＭＳＣ粒子ではない）は、血清抗ＩＬ−１０レベルを上昇させ（図５Ｃ）、抗炎症応答を示した。
【００６６】
（実施例２）
（材料および方法）
材料および方法は、他に指示がない限り、実施例１に記載の通りであった。
【００６７】
（ＭＳＣ粒子の透過型電子顕微鏡検査）
ＭＳＣ粒子（ＭＰ）を２％パラホルムアルデヒドで固定し、炭素被覆グリッド上に５分間吸着させた。付着ＭＰを有するグリッドをｍｉｌｌｉＱ水中で１分間洗浄した。ネガティブ染色のために、グリッドをウラニルアセテートの滴上にｘ分間浮遊させた。余分な液体はグリッドの縁から手動で吸い取られた。グリッドは、ＬａＢ６陰極を備えたＴｅｃｎａｉスピリット顕微鏡（ＥＭ）（ＦＥＩ、オランダ）で分析した。画像を、１３７６×１０２４ピクセルのＣＣＤメガビュー（Ｍｅｇａｖｉｅｗ）カメラを用いて、１２０ｋＶおよび室温で取得した。
【００６８】
（ＡＴＰアーゼアッセイ）
ＭＰおよびＭＰγからのＡＴＰアーゼ活性を、ＡＴＰアーゼアッセイキットを用いて製造者の指示（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って測定した。標準曲線を作成するためにリン酸塩標準を使用した。ＭＰ（１×１０１２、１×１０１１、１×１０１０、１×１０９／ｍｌ）を  マラカイトグリーン試薬を含むアッセイ緩衝液中、室温で３０分間、４ｍＭのＡＴＰとともにインキュベートした。遊離リン酸塩の存在下で形成された比色生成物の形成を、分光光度計を用いて６２０ｎｍで測定した。
【００６９】
考えられるリン酸塩汚染の対照として、４つのＭＰ濃度をＡＴＰなしのアッセイ緩衝液中でインキュベートした。これらの試料からのシグナルを、ＡＴＰとともにインキュベートした試料から差し引いた。
【００７０】
（ＣＤ７３活性アッセイ）
ＭＰがＡＭＰをアデノシン＋リン酸塩に分解することができるかどうかを決定するために、ＣＤ７３阻害剤スクリーニングアッセイキット（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の改変プロトコールを使用した。ＭＰおよびＭＰγ（１×１０１２、１×１０１１、１×１０１０／ｍｌ）をＡＭＰ（５００μＭ）と共に３７℃で２５分間インキュベートした。次いで、比色検出試薬を添加して、ＣＤ７３反応から遊離リン酸塩を測定した。ＡＭＰを含まないサンプルを遊離リン酸塩汚染の対照として測定した。ＣＤ７３酵素（２および１ｎｇ）を用いて、ＭＰおよびＭＰγ中のＣＤ７３の濃度を算出した。
【００７１】
（ＣＦＳＥによるエステラーゼ活性）
非蛍光であるＣＦＤＡ−ＳＥは細胞の細胞質に入り、細胞内エステラーゼは酢酸基を除去し、分子を蛍光性エステル（ＣＦＳＥ）に変換する。この応用を用いて、ＭＰがエステラーゼ活性を有するかどうかを検出した。ＭＰ生成後、１×１０１０粒子／ｍｌを５０μＭのＣＦＤＡ−ＳＥで標識し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＣＦＳＥ染色の適切な化学量論を得るために、いくつかの希釈を行った（１×１０９、１×１０８、１×１０７粒子／ｍｌ）。対照として、ＰＢＳ、ＰＢＳ＋ＣＦＤＡ−ＳＥおよび非染色ＭＰを用いた。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりＣＦＳＥ蛍光を測定した。ＭＰのサイズが小さいため、信頼できるＦＳＣおよびＳＳＣ測定値を得ることができなかった。代わりに、閾値を超える事象がＣＦＳＥ負荷ＭＰとして識別されるように、ＦＩＴＣチャネル上で蛍光閾値切り替え（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）を設定することによってＭＰを同定した。
【００７２】
（ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞増殖アッセイ）
ＭＰの免疫調節能力を評価するために、ＰＢＭＣを１μＭのＣＦＳＥで標識し、５×１０４細胞／ウェルの密度で丸底９６ウェル培養プレートに蒔いた。リンカー抗体Ｉｇ（２μｌ／ｍｌ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてヒト抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（それぞれ１μｌ／ｍｌ）を添加することによってＴ細胞増殖を刺激した。ＰＢＭＣをＭＰおよびＭＰγ（１：５．０００、１：１０．０００、１：４０．０００、１：８０．０００）の異なる比率で４日間インキュベートした。４日目に、非付着ＰＢＭＣをプレートから取り出し、ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗで洗浄し、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰおよびＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７（抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）に対するモノクローナル抗体と共に室温で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗで洗浄した後、サンプルをフローサイトメトリーで分析した。
【００７３】
（ＭＰ取り込みアッセイ）
蛍光ＭＰを得るために、製造者の指示（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って、脂質二重層にインターカレートする赤色蛍光発色団ＰＫＨ−２６色素でＭＳＣを標識した。次に、ＰＫＨ−２６標識ＭＳＣ由来のＭＰを生成した（ＰＫＨ−ＭＰ）。
【００７４】
密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｉｓｏｐａｑｕｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）により健常ドナー由来のヒトＰＢＭＣを単離し、ＰＫＨ−ＭＰ（比１：４００００）と共に培養した。インキュベーション条件は、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％であった。取り込みプロセスの対照として、ＰＢＭＣを４℃でＰＫＨ−ＭＰとともにインキュベートした。リンパ球および単球によるＰＫＨ−ＭＰ取り込みをフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により１時間および２４時間の時点で分析した。
【００７５】
単球によるＰＫＨ−ＭＰ取り込みの共焦点顕微鏡分析を、陽性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）によるａｕｔｏ−ＭＡＣＳ  Ｐｒｏを用いてＰＢＭＣからＣＤ１４＋細胞を単離することによって行った。次いで、単球を１μＭのＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、ＰＫＨ−ＭＰ（比１：４×１０４）と共に培養した。Ｌｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ−Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＬＡＳ  ＡＦ）ソフトウェア、ＤＰＳＳ  ５６１ｎｍレーザーを備えたＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＢＶ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ  Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、オランダ）で６０倍（１．４倍）対物レンズを用いて単球の経時的画像を実施した。顕微鏡には、温度制御インキュベーターを装備した。温度を３７℃に維持し、ＣＯ２を５％に維持した。ＩｍａｇｅＪ  １．４８（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いて画像を処理した。
【００７６】
（統計分析）
データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用して正常性についてＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ試験で試験したデータの分布に応じて、対ｔ検定またはＷｉｌｃｏｘｏｎ符号付順位検定を使用して分析した。パラメトリックデータは平均として表され、ノンパラメトリックデータはメジアンとして表される。Ｐ＜０．０５の値は統計的に有意であると考えられた。両側のＰ値が記載されている。
【００７７】
（結果）
（ＭＰの生成と特徴）
ＭＰは、刺激されていない、およびＩＦＮ−γ刺激ＭＳＣから生成された。各分析に使用した細胞の数は、１×１０６〜１．５×１０６細胞（８０％コンフルエンシー）であった。１ｍｌ当たりの粒子濃度に基づいて、各ＭＳＣから生成された平均粒子数は、ＭＰについては１．２×１０６±２．７×１０５であり、ＭＰγについては１．１×１０６±２．８×１０５であった。ＭＰとＭＰγとの間のサイズ分布または濃度（粒子／ＭＳＣ）に有意差はなかった。
【００７８】
透過型電子顕微鏡分析により、ＮＴＡの結果が確認された。ＭＰの大部分は２００ｎｍ未満のサイズを有していたが（図６）、より大きな粒子も見出された。ＭＰは球形を示した。
【００７９】
（ＭＰは酵素活性を有する）
ＭＰが酵素活性を有するかどうかを分析するために、ＡＴＰアーゼ活性によりＡＴＰをＡＤＰに変換する、およびＣＤ７３のヌクレオチダーゼ活性によってＡＭＰをアデノシンに変換する、ＭＰ、およびＭＰγの能力を調べた。これらの２つの反応の最終生成物は遊離リン酸塩であるため、これらのアッセイのサンプルは、生理食塩水緩衝液からの遊離リン酸塩による汚染を避けるためにｍｉｌｌｉＱ水で調製された。
【００８０】
図７Ａは、既知の遊離リン酸塩濃度を用いて作成した標準曲線から計算したＡＴＰアーゼ活性（単位／ｌ）を示す。ＭＰおよびＭＰγはＡＴＰを遊離リン酸塩に変換することができ、遊離リン酸塩のレベルはＭＰの濃度に依存した。ＭＰとＭＰγとの間に統計的な差はなかった。ＭＰおよびＭＰγがＣＤ７３活性を有するかどうかを調べるために、２および１ｎｇの精製ＣＤ７３による遊離リン酸塩の産生を、異なる濃度のＭＰおよびＭＰγで比較した。両タイプのＭＰは、基質（ＡＭＰ）を添加した後に遊離リン酸塩を生成することができた。遊離リン酸塩の検出はＭＰの濃度に依存し、ＭＰ中に存在するＣＤ７３の量はＣＤ７３対照によって計算した（図７Ｂ）。
【００８１】
エステラーゼ活性は、蛍光切り替え戦略に基づいたフローサイトメトリーによるＣＦＤＡ−ＳＥのＣＦＳＥへの変換によって測定した（図７Ｃ）。蛍光粒子は対照ＰＢＳ、ＰＢＳ＋ＣＦＳＥ、および非標識ＭＰでは検出できなかった。ＭＰをＣＦＳＥで標識した場合（ＣＦＳＥ−ＭＰ）、蛍光事象が観察された。検出されたＣＦＳＥ−ＭＰの数は、サンプル中のＭＰの濃度に依存した。さらに、試料を希釈すると、ＭＰの蛍光強度は低下しなかった。この事実は、ＦＡＣＳ戦略で単一のＭＰを検出できることを意味する。さらに、ＦＡＣＳ分析は、エステラーゼ活性がＭＰの存在に関連することを実証する。
【００８２】
（ＰＢＭＣ増殖に対するＭＰの効果）
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激したＰＢＭＣを、異なる比のＭＰで４日間培養した（１：５．０００、１：１０．０００、１：４０．０００、１：８０．０００）。ＭＰまたはＭＰγの添加は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に影響しなかった（データ示さず）。
【００８３】
（ＭＰはＣＤ１６＋単球の割合を減少させ、ＣＤ９０＋およびＰＤ−Ｌ１＋単球サブセットを増加させる）
ＭＰが単球細胞表面マーカーの発現および免疫機能に影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、単球をＭＰの異なる比（１：１０．０００，１：４０．０００，１：８０．０００）で２４時間培養した。単球をポリプロピレンチューブ中で培養して、細胞の付着およびマクロファージへの分化を回避した。ＭＰまたはＭＰγ処理の存在下での単球の培養は、前炎症性ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞の頻度を１：４０．０００（それぞれ４５％および４９％）および１：８０．０００（それぞれ４８％および３５％）低減させた（図８Ａ）。
【００８４】
１：４０，０００および１：８０，０００の比でＭＰで処理した単球はさらに、ＣＤ９０の発現をそれぞれ１７％および２５％増加させた。一方、ＭＰγ群は、１：１０．０００の比で８％、１：４０．０００の比で１６％、１：８０．０００の比で２０％ＣＤ９０発現の増加を示した（図８Ｂ）。さらに、ＭＰγ処理は、単球細胞における抗炎症性ＰＤ−Ｌ１発現を１：１０．０００の比で１６％、１：４０．０００の比で４３％、１：８０．０００の比で６２％誘導した。ＭＰは１：４０．０００の比で１５％の増加でＰＤ−Ｌ１発現に及ぼす影響は小さかった（図８Ｃ）。
【００８５】
（ＭＰは、単球における前炎症性および抗炎症性遺伝子の発現に影響を及ぼす）
単球免疫機能に対するＭＰの効果をさらに調べ、観察された免疫表現型変化がタンパク質転移または遺伝子発現調節の結果であったかどうかを調べるために、前炎症性および抗炎症性機能を有する多くの遺伝子のｍＲＮＡ発現を、ＭＰで２４時間刺激した後、ｑＰＣＲによって単球において分析した。粒子刺激の結果としてのＣＤ９０遺伝子発現のアップレギュレーションは、ＭＰおよびＭＰγ処理単球で観察された（ｐ＜０．０５）（図８Ｄ）。さらに、抗炎症因子ＩＤＯおよびＰＤ−Ｌ１の発現は、ＭＰγで処理した単球で増加したが、ＭＰでは増加しなかった（ｐ＜０．０５）（図８Ｄ）。ＭＰおよびＭＰγ処理後のＩＬ−６発現の増加傾向があったが、これは有意ではなかった。前炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよび抗炎症性サイトカインＩＬ−１０についても、遺伝子発現の有意な変化は観察されなかった。
【００８６】
（リンパ球ＭＰを取り込むことができないが単球はＭＰを取り込むことができる）
これまでの結果から、ＭＰは単球では免疫調節特性を有し、リンパ球では免疫調節特性を有しないことが示されたので、我々はＭＰの両タイプの免疫細胞との相互作用を分析した。その目的で、ＰＫＨ−ＭＰをＰＢＭＣ（比１：４０，０００）に添加し、１時間および２４時間３７℃でインキュベートした。対照として、細胞を４℃でインキュベートし、その温度でＭＰ取り込みの活性は期待されない。ＭＰを添加して１時間後に、わずかな割合のＣＤ３リンパ球（１．３±０．２％）がＰＫＨ−ＭＰについて陽性であった（図９Ａ）一方、２０±５．３％のＣＤ１４単球がＭＰを取り込むことができた（ｐ＜０．０５）（図９Ｂ）。単球とリンパ球によるＭＰ取り込みの差は、２４時間後に高かった（リンパ球：５．２±１．４％、単球：９３±４．３％、ｐ＜０．０５）。４℃対照の取り込みは、すべての時点で単球およびリンパ球について常に３％未満であった。この結果は、ＭＰ取り込みがエネルギー依存プロセスにおいて媒介されたことを示した。
【００８７】
ＭＰが単球によって内在化され得るかどうかを調べるために、ＰＢＭＣ由来の単離ＣＤ１４細胞を用いて共焦点免疫蛍光顕微鏡検査を行った。単球をＣＦＳＥで標識し、ＰＫＨ−ＭＰ（１：４０，０００）で培養した。経時記録により、ＭＰは単球の原形質膜に結合するが、内在化されなかったことが示された（図１０Ａ）。単球上のＭＰの局在を詳細に見るために、ｚスタック画像を共焦点顕微鏡法によって分析した（図１０Ｂ）。これらの画像は、ＭＰが単球の細胞表面に局在したままであることを確認した。
【００８８】
（付記）
（付記１）
医薬としての使用のための、間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む、溶解された前記間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子。
【００８９】
（付記２）
７０〜１７０ｎｍの平均粒径を有する、付記１に記載の免疫調節性粒子。
【００９０】
（付記３）
前記間葉系幹細胞は、溶解の前にインターフェロンガンマで処理される、
ことを特徴とする付記１または２に記載の免疫調節性粒子。
【００９１】
（付記４）
前記間葉系幹細胞は、脂肪組織から単離される、
ことを特徴とする付記１乃至３のいずれか１つに記載の免疫調節性粒子。
【００９２】
（付記５）
間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含み、前記膜構造物は、免疫抑制化合物、好ましくはステロイド、細胞増殖抑制剤、抗体および／またはカルシニューリン阻害剤を含む、溶解された前記間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子。
【００９３】
（付記６）
医薬としての使用のための、付記５に記載の免疫調節性粒子。
【００９４】
（付記７）
自己免疫疾患を含む、急性および慢性炎症性疾患の治療における医薬としての使用のための、付記１乃至６のいずれか１つに記載の免疫調節性粒子。
【００９５】
（付記８）
移植拒絶反応の治療および予防における医薬としての使用のための、付記１乃至６のいずれか１つに記載の免疫調節性粒子。
【００９６】
（付記９）
前記間葉系幹細胞は、前記粒子で治療される対象から得られる、
ことを特徴とする付記１乃至４及び付記６乃至８のいずれか１つに記載の免疫調節性粒子。
【００９７】
（付記１０）
間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む溶解された前記間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子と、薬学的に許容される添加剤と、を含む医薬組成物。
【００９８】
（付記１１）
前記粒子は、免疫抑制化合物、好ましくはステロイド、細胞増殖抑制剤、抗体および／またはカルシニューリン阻害剤を含む、
ことを特徴とする付記１０に記載の医薬組成物。
【００９９】
（付記１２）
免疫抑制療法における使用のための、付記１０または１１に記載の医薬組成物。
【０１００】
（付記１３）
移植拒絶反応の治療および予防における使用のための、付記１０乃至１２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【０１０１】
（付記１４）
医薬としての使用のための不活性化された間葉系幹細胞またはその一部。
【０１０２】
（付記１５）
自己免疫疾患を含む急性および慢性炎症性疾患の治療における医薬としての使用のための、および／または移植拒絶反応の予防のための、不活性化された間葉系幹細胞、または前記不活性化された間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む免疫調節性粒子。
【図１Ａ】
2019516771.tif 000002
【図１Ｂ】
2019516771.tif 000003
【図２】
2019516771.tif 000004
【図３Ａ】
2019516771.tif 000005
【図３Ｂ】
2019516771.tif 000006
【図４Ａ】
2019516771.tif 000007
【図４Ｂ】
2019516771.tif 000008
【図５Ａ】
2019516771.tif 000009
【図５Ｂ】
2019516771.tif 000010
【図５Ｃ】
2019516771.tif 000011
【図６Ａ】
2019516771.tif 000012
【図６Ｂ】
2019516771.tif 000013
【図６Ｃ】
2019516771.tif 000014
【図７Ａ】
2019516771.tif 000015
【図７Ｂ】
2019516771.tif 000016
【図７Ｃ】
2019516771.tif 000017
【図８Ａ】
2019516771.tif 000018
【図８Ｂ】
2019516771.tif 000019
【図８Ｃ】
2019516771.tif 000020
【図８Ｄ】
2019516771.tif 000021
【図９Ａ】
2019516771.tif 000022
【図９Ｂ】
2019516771.tif 000023
【図１０Ａ】
2019516771.tif 000024
【図１０Ｂ】
2019516771.tif 000025
【国際調査報告】
2019516771.tif 000026
2019516771.tif 000027
2019516771.tif 000028