(57)【要約】  レンズレス画像処理によって試料（１０）を観測するための方法において、試料（１０）はレーザダイオード（１１）と画像センサ（２０）との間に配置され、レーザダイオード（１１）には供給電流が供給され、その供給電流の強度（ｉ）は臨界値（ｉｃ）以下である。臨界強度（ｉｃ）は、予備的ステップ中に決定され、そのステップ中に、強度（ｉ）は初期にレーザダイオード（１１）のレーザ閾値と称す閾値（ｉｓ）よりも大きい。画像センサ（２０）で形成された画像（２５）を観測することで、形成された画像（２５）上に干渉画像の減衰が観測されるまで、強度（ｉ）は減少され、臨界強度（ｉｃ）は、この減衰が最適となる強度に対応している。【選択図】図１
2019509466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含んでいる、試料（１０）を観測するための方法であって、
ａ）前記試料に向けて伝播する入射光波（１２）を放射することができるレーザダイオード（１１）を用いて前記試料を照射し、
供給電流（ｉ）が閾値強度（ｉｓ）を超えたときレーザ効果が得られるように、前記レーザダイオードには、前記供給電流が供給され、
ｂ）画像センサ（２０）を用いて、前記試料の画像（２５）を取得し、
前記試料は前記レーザダイオード（１１）と前記画像センサ（２０）との間に配置され、
各画像は、前記照射の影響下で、前記試料により送られる光波（２４）を表しており、
前記方法において、
前記レーザダイオードの供給電流の強度（ｉ）は、臨界強度（ｉｃ）以下であり、
前記臨界強度は、ステップ（ａ）の前に、次の予備的ステップに従って決定されており、
ｉ）前記レーザダイオード（１１）が放射する前記入射光波（１２）が前記画像センサ（２０）まで伝播するように前記レーザダイオード（１１）を配置し、
ｉｉ）前記レーザダイオード（１１）に、初期の供給電流を供給し、該供給電流の強度は前記閾値強度（ｉｓ）以上であり、前記画像センサを用いて、初期画像と称す画像を取得し、該初期画像は横方向の干渉縞を有しており、
ｉｉｉ）前記供給電流の強度を変更し、前記画像センサ（２０）を用いて画像を取得し、このステップは、前記初期画像と比較して減衰した横方向の干渉縞を有する画像が取得されるまで、繰り返され、前記供給電流の強度は前記臨界強度（ｉｃ）に対応している、
ことを特徴とする、試料（１０）を観測するための方法。
【請求項２】
請求項１に記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記臨界強度（ｉｃ）は、前記閾値強度（ｉｓ）よりも小さい、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項３】
請求項２に記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記臨界強度（ｉｃ）は、前記閾値強度（ｉｓ）の０．７倍と前記閾値強度（ｉｓ）との間、又は、前記閾値強度（ｉｓ）の０．８倍と前記閾値強度（ｉｓ）との間、である、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のうちのいずれか１項記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記初期画像上で、２つの隣接する横方向の干渉縞は、前記干渉縞間のコントラストを示すコントラスト表示（ｉｎｄ）によって特徴付けられており、前記臨界強度は、２５％よりも大きな係数の前記コントラスト表示での低減に対応している、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のうちのいずれか１項記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記予備的ステップｉ）乃至ｉｉｉ）において、前記観測された試料を表す基準試料は、前記画像センサ（２０）と前記レーザダイオード（１１）との間に配置されている、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のうちのいずれか１項記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記予備的ステップｉ）乃至ｉｉｉ）において、試料は、前記画像センサ（２０）と前記レーザダイオード（１１）との間に配置されていない、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のうちのいずれか１項記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記試料（１０）は、回折要素（１３）を含み、該回折要素（１３）は、前記光波（１２）によって前記照射の影響下で、回折波（２３）を形成することができ、前記画像センサは、前記試料及び前記回折波（２３）によって送られる入射波（２２）を含む露出波（２４）と称す波にさらされる、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項８】
請求項１記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記ステップｂ）において、前記供給電流（ｉ）の強度は、前記閾値強度（ｉｓ）の０．５倍と前記閾値強度（ｉｓ）との間、又は、前記閾値強度（ｉｓ）の０．７倍と前記閾値強度（ｉｓ）との間、である、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項９】
請求項１記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記ステップｂ）において、前記供給電流（ｉ）の強度は、前記閾値強度（ｉｓ）の０．５倍と前記閾値強度（ｉｓ）の０．９倍との間、又は、前記閾値強度（ｉｓ）の０．７倍と前記閾値強度（ｉｓ）の０．９倍との間、である、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９のうちのいずれか１項記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
拡大光学素子が前記試料と前記画像センサ（２０）との間に延在していない、
試料（１０）を観測するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、レンズレス画像処理による試料、特に、生物試料の観測に関する。
【背景技術】
【０００２】
レンズレスによる試料、特に生物試料の観測は最近の１０年で大きな進歩を遂げている。この技術によって、試料は光源と画像センサとの間に配置され、試料と画像センサとの間に光学拡大レンズを配置することなく、観測される。画像センサは、試料から送られる光波の画像を収集する。
【０００３】
この画像は、光源によって放射され試料によって送られた光波と、試料による、光源により放射された光波の回折によって生じる回折波と、の間の干渉縞から形成されている。これら干渉縞は、時々、“回折パターン”という用語を用いて、述べられる。試料の光学特性を推定するために、画像センサ上に形成された画像は、デジタル伝播アルゴリズムによって処理されてもよい。そのようなアルゴリズムは、ホログラフィック再構成の分野で周知である。このために、試料と画像センサとの間の距離は既知であり、ホログラフィック再構成アルゴリズムは、この距離を考慮して、適用される。
【０００４】
Garcia-Sucerquia J.による刊行物、“Digital in-line holographic microscopy’, Applied Optics, Vol. 45, No. 5, February 10, 2006”には、レーザ光線を用いた、粒子、特に、生物粒子の観測、および、ＣＣＤセンサ上に形成された画像に対する再構成アルゴリズムの適用、が記載されている。
【０００５】
ＷＯ２００８０９０３３０には、光放射ダイオードを有するレーザ光源を空間フィルタに置き換えることで、レンズレス画像処理による細胞のこの場合における生物試料の使用可能な画像を取得できる、ということが開示されている。この文献に記載された装置は、各細胞と干渉縞とを関連付けることができ、干渉縞の形態によって、細胞のタイプを認識できる。さらに、続く刊行物は、そのような技術、例えば、米国出願２０１２／０２１８３７９の利益を確認する。
【０００６】
現在、レンズレス画像処理は、現状の顕微鏡に対して簡易で低価な代替であるようである。さらに、観測の分野は、顕微鏡の分野よりもずっと広い。この技術に関連した応用の期待はかなり大きい、ということが理解される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報２００８０９０３３０号公報
【特許文献２】米国特許２０１２／０２１８３７９
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Garcia-Sucerquia J.著、“Digital in-line holographic microscopy”, Applied Optics, Vol. 45, No. 5, February 10, 2006
【非特許文献２】Ryle et al著, “Digital in-line holography of biological specimens”, Proc. Of SPIE Vol.6311 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記方法と比較して改良された試料を観測するための方法を提案し、従来と比較して改良された信号対雑音比の画像を取得できる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１主題は、次のステップを含んでいる、試料を観測するための方法であって、
ａ）入射光波を放射することができるレーザダイオードを用いて前記試料を照射し、
供給電流の強度が閾値強度と称す強度を超えたときレーザ効果が得られるように、レーザダイオードには、供給電流が供給され、
ｂ）画像センサを用いて、前記試料の画像を取得し、
前記試料は前記レーザダイオードと前記画像センサとの間に配置され、
各画像は、前記照射の影響下で、前記試料により送られる光波を表しており、
前記方法において、
前記レーザダイオードの供給電流の強度は、臨界強度以下であり、
前記臨界強度は、ステップａ）の前に、次の予備的ステップに従って決定されており、
ｉ）前記レーザダイオードが放射する前記入射光波が前記画像センサまで伝播するように前記レーザダイオードを配置し、
ｉｉ）前記レーザダイオードに、初期の供給電流を供給し、該供給電流の強度は前記閾値強度以上であり、前記画像センサを用いて、初期画像と称す画像を取得し、該初期画像は前記画像を通り延びる横方向の干渉縞を有しており、
ｉｉｉ）前記供給電流の強度を変更し、前記画像センサを用いて画像を取得し、
このステップは、前記初期画像と比較して横方向の干渉縞が減衰した画像が取得されるまで、繰り返され、前記供給電流の強度は前記臨界強度に対応している、ことを特徴する。
【００１１】
減衰した干渉縞とは、これら干渉縞が見えない、又は見えるときに前記初期画像の干渉縞と比較して減衰している、という意味で理解される。前記初期画像上の２つの横方向の干渉縞は、前記干渉縞間のコントラストを表すコントラスト表示によって特徴付けられてもよい。減衰は、少なくとも２５％又はそれ以上の前記コントラスト表示における減少に対応している。
【００１２】
前記方法は、次の特徴のうちいずれか１つを含んでいてもよく、単独あるいは、技術的に可能な組合せであってもよい。前記臨界強度は前記閾値強度よりも小さい。前記供給電流の強度は、前記閾値強度の０．５倍と前記閾値強度との間、及び、好ましくは、前記閾値強度の０．７倍又は０．８倍と前記閾値強度との間、であってもよい。予備的ステップにおいて、前記観測された試料を表す基準試料は、前記画像センサと前記レーザダイオードとの間に配置されている。選択肢として、予備的ステップｉ）乃至ｉｉｉ）において、試料が前記画像センサと前記レーザダイオードとの間に配置されていない。前記試料は、回折要素を含み、該回折要素は、前記光波によって前記照射の影響下で、回折波を形成することができ、前記画像センサは、前記試料及び前記回折波によって送られる入射波を含む露出波と称す波にさらされる。前記試料は特に生物液のような液体を含んでいてもよく、その液体中には、粒子が浮遊し、試料の厚さは、例えば、５０μｍと２ｃｍとの間である。前記試料は、組織のスライドであってもよく、そのスライドの厚さは５０μｍよりも小さい。ステップｂ）において、前記供給電流の強度は、前記閾値強度の０．５倍と前記閾値強度との間、又は、前記閾値強度の０．５倍と前記閾値強度の０．９倍との間、である。好ましくは、前記強度は、前記閾値強度の０．７倍と、前記閾値強度の０．９倍から０．９５倍又は１倍と、の間である。前記レーザダイオードは、可視スペクトル領域で放射する。
【００１３】
本発明の別の主題は、次のステップを含んでいる、試料を観測するための方法であって、
ａ）前記試料に向けて伝播する入射光波と称す光波を生成できるレーザダイオードを用いて前記試料を照射し、
ｂ）画像センサを用いて、検出面に形成された前記試料の画像を取得し、
前記試料は前記レーザダイオードと前記画像センサとの間に配置され、
各画像は、前記照射の影響下で、前記試料により送られる光波を表しており、
前記方法において、前記レーザダイオードは、前記レーザダイオードの供給電流の強度に対応する閾値強度と関連しており、レーザ効果は前記閾値強度を超えて得られ、前記試料が照射されたとき、前記レーザダイオードには供給電流が供給され、該供給電流の強度は厳密に前記閾値強度、例えば、前記閾値強度の０．５倍と前記閾値強度との間の値、よりも小さい、ことを特徴とする。
【００１４】
好ましくは、前記強度は、前記閾値強度の０．７倍と、前記閾値強度の０．９倍から０．９５倍と、の間である。
【００１５】
他の利点及び特徴は、制限されない例によって与えられ、及び、次の添付図面に示される、本発明の特別な実施形態の次の説明からより明確となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】試料を観測するための装置の一例を示す。
【図２Ａ】レーザダイオードの供給電流の強度の関数として、レーザダイオードにより放射される光パワーの展開を示している。
【図２Ｂ】レーザダイオードの供給電流の強度の関数として、レーザダイオードの光波長の展開を示している。
【図２Ｃ】レーザダイオードの供給電流の強度の関数として、レーザダイオードによって放射される光波のコヒーレンス長の展開を示している。
【図３Ａ】試料を照明するためのレーザダイオードの供給電流の様々な量を考慮して、図１を参照して説明した装置を用いて得られた試料の画像を示している。
【図３Ｂ】試料を照明するためのレーザダイオードの供給電流の様々な量を考慮して、図１を参照して説明した装置を用いて得られた試料の画像を示している。
【図３Ｃ】試料を照明するためのレーザダイオードの供給電流の様々な量を考慮して、図１を参照して説明した装置を用いて得られた試料の画像を示している。
【図３Ｄ】試料を照明するためのレーザダイオードの供給電流の様々な量を考慮して、図１を参照して説明した装置を用いて得られた試料の画像を示している。
【図３Ｅ】試料を照明するためのレーザダイオードの供給電流の様々な量を考慮して、図１を参照して説明した装置を用いて得られた試料の画像を示している。
【図３Ｆ】試料を照明するためのレーザダイオードの供給電流の様々な量を考慮して、図１を参照して説明した装置を用いて得られた試料の画像を示している。
【図４Ａ】レーザダイオードの供給電流の強度の関数として、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、及び３Ｆに存在する回折パターンの放射プロファイルの展開を示している。
【図４Ｂ】レーザダイオードの供給電流の強度の関数として、図４Ａに示すプロファイルの標準偏差の展開を示している。
【図５Ａ】レーザダイオードの供給電流の強度が上記及び下記でそれぞれ閾値強度と称した、夫々２つの異なる値に用いられ、レーザダイオードと試料との間に挿入された試料を除いて図１に示す装置を用いて得られた画像を示している。
【図５Ｂ】レーザダイオードの供給電流の強度が上記及び下記でそれぞれ閾値強度と称した、夫々２つの異なる値に用いられ、レーザダイオードと試料との間に挿入された試料を除いて図１に示す装置を用いて得られた画像を示している。
【図５Ｃ】液体で満たされた流体空間がレーザダイオードと試料間に挿入され、変化の係数はレーザダイオードの供給電流の強度の関数として変化する、図１に示す装置を用いて得られた画像の背景を表す変化の係数の展開を示している。
【図６Ａ】再構成距離の関数として、再構成された画像の線に沿って延びる画素の強度を示しており、画像はホログラフィック再構成アルゴリズムをそれぞれ画像に適用することによって得られ、レーザダイオードの供給電流の様々な強さを用いて得られた２つのビードの画像によって獲得される。
【図６Ｂ】再構成距離の関数として、再構成された画像の線に沿って延びる画素の強度を示しており、画像はホログラフィック再構成アルゴリズムをそれぞれ画像に適用することによって得られ、レーザダイオードの供給電流の様々な強さを用いて得られた２つのビードの画像によって獲得される。
【図６Ｃ】再構成距離の関数として、再構成された画像の線に沿って延びる画素の強度を示しており、画像はホログラフィック再構成アルゴリズムをそれぞれ画像に適用することによって得られ、レーザダイオードの供給電流の様々な強さを用いて得られた２つのビードの画像によって獲得される。
【図６Ｄ】再構成距離の関数として、再構成された画像の線に沿って延びる画素の強度を示しており、画像はホログラフィック再構成アルゴリズムをそれぞれ画像に適用することによって得られ、レーザダイオードの供給電流の様々な強さを用いて得られた２つのビードの画像によって獲得される。
【図６Ｅ】再構成距離の関数として、再構成された画像の線に沿って延びる画素の強度を示しており、画像はホログラフィック再構成アルゴリズムをそれぞれ画像に適用することによって得られ、レーザダイオードの供給電流の様々な強さを用いて得られた２つのビードの画像によって獲得される。
【図６Ｆ】再構成距離の関数として、再構成された画像の線に沿って延びる画素の強度を示しており、画像はホログラフィック再構成アルゴリズムをそれぞれ画像に適用することによって得られ、レーザダイオードの供給電流の様々な強さを用いて得られた２つのビードの画像によって獲得される。
【図７Ａ】画像が従来技術を用いて得られた試料の画像を示しており、光源は光照射ダイオードである。
【図７Ｂ】画像が本発明による装置を用いた生成された試料の画像を示しており、レーザダイオードの強度は便宜上調整されている。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図１は本発明の１つの主題である装置の一例を示している。レーザダイオード１１は、伝播軸ｚに沿って、試料１０の方向に、入射光波と称す、光波１２を生成することができる。この例において、レーザダイオードはCivillaserによって販売されたダイオードであり、４０５ｎｍ近くの波長で放射する。レーザダイオードは、可視スペクトル領域で放射する。
【００１８】
試料１０は、特徴付ける生物試料であってもよい。試料１０は、固体、あるいは、特徴付ける粒子１３を含む液体媒体１４を含んでいてもよい。これは、例えば、培養基あるいは体流体に生物粒子を含んでいてもよい。生物粒子は、細胞、バクテリア、あるいは、他の微生物、菌類、胞子などを意味する、ことが理解される。粒子という用語は、マイクロビード、例えば、生物学的なプロトコルで共通で使用される、金属のマイクロビード、ガラスのマイクロビード、有機のマイクロビードに対して称してもよい。これは、液体媒体に浮遊した不溶性の小滴、例えば、水中油型乳剤における脂質小滴、を含んでいてもよい。このように、粒子という用語は、検査される試料に初期的に存在する内因的な粒子、および、分析前にこの試料に加えられる外因的な粒子、の両方に対して述べられる。一般に、粒子は、有利には、１ｍｍあるいは５００μｍよりも小さく、０．５μｍ及び５００μｍの間の大きさであるのが好ましい。試料１０の厚さによって、入射光１２の一部は画像センサ２０に伝達され、伝達された光波２２を形成する。試料が粒子を含む液体の場合、その厚さεは、試料による入射光の減衰に従って、数十ミクロンと数ミルメートルあるいは数センチメートルとの間であってもよい。
【００１９】
別の例によれば、試料は、透明なスライド上に配置された薄い厚さの組織を含む、組織の薄いスライド、あるいは解剖病理学のスライドであってもよい。この薄い厚さは、好ましくは、１００μｍより小さい及び１０μｍより小さい、典型的には、数マイクロメータを意味すると理解される。
【００２０】
レーザダイオードと試料との距離Δは、好ましくは、１ｃｍよりも大きい。好ましくは、２及び３０ｃｍの間である。好ましくは、試料によって見られるレーザダイオードは点のようなものと考えられる。これは、その直径（又はその対角線）は、試料とレーザダイオードとの距離の１／１０よりも小さいのが好ましく、１／１００よりも小さいのがよりよい、ということを意味する。このように、光は平面波、又は、そのように考えられてもよい波の形態で、試料に到達する。
【００２１】
装置は、検出面Ｐ２０で画像を形成することができる画像センサ２０を含む。示された例において、これは、ＣＣＤタイプ又はＣＭＯＳのマトリックスアレイ画素を含むマトリックスアレイの光検出器である。ＣＭＯＳは好ましい画像センサである。なぜなら、画素の大きさがより小さく、それにより、画像が獲得され、その空間解像度がより好ましいからである。画像センサは、マトリックスアレイ画素１７を有しており、その上に透明保護用窓１８が配置されている。この例において、透明保護用窓１８は、マトリックスアレイ画素１７から１２５μｍ離れて配置されており、その厚さは４００μｍに達する。マトリックスアレイ画素１７と保護用窓１８との距離は、一般に、数十μｍから１５０又は２００μｍの間である。この例において、検出器は、１．６７μｍの画素間ピッチの３８８４×２７６４画素を有する８ビットＣＭＯＳセンサである。検出面Ｐ２０は、好ましくは、入射光波１２の伝播軸ｚに対して垂直に延びている。画像センサの画素間ピッチは３μｍよりも小さく、画像センサは画像の空間解像度を改善するためのものであるのが好ましい。
【００２２】
この例において、試料１０と画像センサ２０のマトリックスアレイ画素１７との間の距離ｄは、２ｃｍよりも小さく、好ましくは１ｃｍよりも小さい。それは、例えば、５ｍｍ程度である。試料１０及び画像センサ２０の近接によって、広視野の観測が可能となる。選択的に、試料をレーザダイオードにより近付け、観測の視野を減少させることもできる。しかし、そのような構成によって、その試料に関してより詳細な情報を取得できる。
【００２３】
なお、画像センサ２０と試料１０との間に、画像形成の光学素子、例えば、拡大光学素子がない。これは、画像センサ２０の各画素で焦点マイクロレンズの可能な存在を除外しており、これらマイクロレンズは画像拡大機能を有していない。
【００２４】
入射光波１２の影響下で、試料１０は、検出面Ｐ２０において、特に、試料によって送られる光波２２で、干渉を生成しやすい回折波２３を生成してもよい。この干渉は画像センサ２０によって取得された画像２５上に、複数の基本回折パターン２６を生じさせ、各基本回折パターンは、中心領域および複数の同心の回折リングを含んでおり、各回折リングは円形の干渉縞を構成している。各基本回折パターンは、この場合、粒子において、試料における回折物体１３から生じる。画像センサ２０がさらされる光波２４は、試料によって入射波１２の回折から生じる構成要素２３と、試料によって入射波１２の伝達から生じる構成要素２２と、を有している。
【００２５】
これら２つの構成要素は、画像センサによって取得された画像２５上に干渉を生成し、その干渉は基本回折パターン２６の形態を得る。基本回折パターンの例は、後に、図３Ａ乃至３Ｆ又は７Ａ及び７Ｂを参照して示されるであろう。一般に、基本回折パターン２６は、試料において、各回折要素と関連付けられていてもよい。試料１０がレーザダイオード１１に近づけられると、基本回折パターン２６はより詳細となり、画像センサ上で識別できるリングの数が高くなる。試料１０が画像センサ２０に近づけられると、観測の視野が大きくなり、１つ及び同一画像２５上のより高い数の基本回折パターン２６が観測される。
【００２６】
プロセッサ３０、例えば、マイクロプロセッサは、画像センサ２０により取得された各画像２５を処理できる。特に、プロセッサは、プログラム可能なメモリ３２に接続されたマイクロプロセッサであり、メモリには、画像処理を行うため、および、ここに記載された動作を計算するための一連の指令が記憶されている。プロセッサ３０は、画面３４に接続されていてもよい。
【００２７】
画像処理の一例は、ホログラフィック再構成アルゴリズムのアプリケーションであり、そのアルゴリズムは画像センサにより取得された画像２５から、再構成画像と称す画像２８、を再構成することができる。このタイプのアルゴリズムは、従来のものであり、図６Ａ乃至６Ｆを参照して、後に議論されるであろう。
【００２８】
レーザダイオード１１は電子回路１１ｃに接続されており、この電子回路によりレーザダイオードには電流が供給される。レーザダイオード１１は半導体材料から形成されたアクティブ領域を含む。レーザ閾値強度ｉｓと称すある強度の値を超えると、レーザ放射が観測される。このレーザ閾値強度ｉｓは、レーザダイオードのアクティブ領域においてレーザの影響を得るのに十分な電子の注入に対応している。
【００２９】
使用されたレーザダイオードには、供給電流が供給され、その電流の基準強度ｉｎは１５０ｍＡに等しい。発明者は、供給電流の強度ｉの関数として、光パワーメータを用いてレーザダイオードによって伝えられた光パワーを計測した。３つの計測が、１５ｍＡと１７０ｍＡとの間で基準強度のいずれかの側で供給電流の強度ｉを変えて、３つの異なる瞬間１、２、３で行われた。得られた曲線は図２Ａに示されている。得られたものは、レーザダイオードの光パワー特性における変化である。各曲線は、アクティブ領域への電荷の注入が不十分となる第１部分と、電荷の注入がレーザダイオードの出力を大きく増加させるのに十分であり、誘導された光放射と称されるものの出現において反映された第２部分と、を有する。この第１動作期間Ｉにおいて、レーザダイオードによる光の放射は、自発的であり、放射された光パワーは、アクティブ領域に注入される電荷担体の密度、すなわち、供給電流の強度ｉに比例している。この第２動作期間ＩＩ又はレーザ動作期間において、レーザの影響が得られ、光パワーは、強度ｉに関し線形的に増加し、増幅の影響は曲線の勾配の増加に反映される。レーザダイオードの基準強度ｉｎは１５０ｍＡに等しく、この動作期間に対応している。
【００３０】
第１及び第２動作期間の間の過渡期は、１２５ｍＡと１３５ｍＡとの間で、正確な値が確立されることなく、起きる。特に、レーザダイオードの特性は、特に温度の関数として変動する。さらに、過渡動作期間Ｔが、上述した２つの動作期間の間に存在し、その期間では、ダイオードの放射は、それによるダイオードのある損失を補償することなく、誘導される。強度ｉに関する光パワーの展開は、損失のためにもはや線形ではない。示された曲線において、この過渡期は１２０ｍＡと１３５ｍＡとの間の供給電流の強度ｉ間で延びている。閾値強度ｉｓは、レーザ閾値電流と称す、ダイオードの供給電流に対応しており、１４０ｍＡである、と考えられてもよい。
【００３１】
この記載において、閾値強度ｉｓは誘導された光の増幅が超えて起きる値を示し、これは、上述したレーザ動作期間（期間ＩＩ）の最小の強度に対応している。図２Ａで観測されたように、この閾値強度ｉｓは、レーザの影響から生じる光パワーがレーザダイオードの供給電流の強度に関して、線形で増加し超える値である。
【００３２】
強度ｉの各値で、レーザダイオード１１により生成された光波１２の放射スペクトルは、スペクトルメータを用いて決定される。様々なスペクトルが図２Ｂに記載されている。各スペクトルは４０１ｎｍの中心波長λｃを中心にした放射ピークを有している。予測されるように、放射ピークの拡大は、供給電流の強度が閾値ｉｓより小さくなると直ぐに、観測される。
【００３３】
レーザダイオード１１により生成される光波１２のコヒーレンス長Ｌｃは次の式を用いて決定されてもよい。
【数１】
2019509466.tif 000003
・・・(1)
λは波長を示し、Δλは放射ピークの幅を示す。
【００３４】
この式は、放射スペクトルのピークは、この例で採用された仮定である、ガウス分布に類似しているという条件下で、真を保持する。
【００３５】
コヒーレンス長Ｌｃは、第２光源として行動する２つの物体、例えば、反射又は回折の物体がコヒーレンス長よりも短い距離で離れている場合、これら物体により放射される光波は干渉を形成するという事実を反映する。
【００３６】
図２Ｃは供給電流の強度ｉの関数として、レーザダイオードによって放射された光波１２のコヒーレンス長Ｌｃを示している。供給電流の強度ｉが閾値強度ｉｓよりも小さい場合、このコヒーレンス長は数十ミクロン、５０ミクロン（マイクロメータ）又は、２０ミクロン程度の短さである。強度閾値ｉｓを超えて、コヒーレンス長は、１００μｍに到達あるいは超え、使用されたスペクトルメータのスペクトル解像度のために高精度で決定されない。
【００３７】
コヒーレンス長Ｌｃは、観測される試料の能力を決定するパラメータであり、検出され得る干渉を形成する。図１に示す例において、試料は、透明な液体１４、又は、粒子１３その中で浮遊するように考えられる液体、を有している。これら粒子は、回折性を有し、画像センサ２０により形成された画像２５上に回折パターン２６を出現させる。
【００３８】
発明者は、画像センサ２０により取得され、画像上でレーザダイオード１１の供給電流の強度ｉを変化させる効果を研究した。図３Ａ、３Ｂ, ３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ 、及び３Ｆは、それぞれ、レーザダイオードの供給電流の強度ｉが４１ ｍＡ、 ６７ ｍＡ、 ９２ ｍＡ、 １１０ ｍＡ、 １２６ ｍＡ 、及び１３５ ｍＡのときの試料の画像を示している。基本回折パターン２６は、これらの図に出現し、これらのパターンの大部分は、試料１０に存在する粒子１３と関連付けられ得る。この例において、試料は、ＰＢＳ（燐酸緩衝生理食塩水）タイプの塩類の緩衝液内に配置された、直径３μｍ及び６μｍを有するラテックスのビードの混合からなる。これら画像のそれぞれに、各画像の平均濃度値が類似し、これら画像が光力の発生にもかかわらず比較可能なように、露出時間が調整される。供給電流の強度が増加した場合、各回折パターンを形成するリングの数が増加傾向にあり、これらリングが円干渉縞に対応するものとして予期される、ということが観測されるかもしれない。このように、画像に存在する情報は豊富である。さらに、従来技術を参照して示したように、そのような回折パターンは、ホログラフィック再構成を受けてもよく、そのような再構成の結果が、回折リングの数及びコントラストが増加した場合に、改善する、ということが受け入れられる。
【００３９】
他の観測は、供給電流の強度が閾値強度ｉｓよりも大きい又は近い場合に、実質的に直線で、画像を横切って延びる横方向の干渉縞２９の出現である。これら横方向の干渉縞の出現は、画像の信号対雑音比を大きく減損する。同心の干渉縞に対して、画像センサ２０によって形成された画像２５のいくつかの部分に位置する基本回折パターン２６を形成し、横方向の干渉縞２９は全画像を通り延びている。それらはノイズを構成し、ノイズは基本回折パターン２６を有する画像の領域と、基本回折パターンを有しない画像の背景を形成する画像の領域と、の両方に影響する。これら横方向の干渉縞は直線、楕円、あるいは円であってもよい。横方向という用語は、それらが全画像２５に影響を与え、画像の一端から他端に延びている、という事実を示している。
【００４０】
１つの基本回折パターン２６が各画像２５上で選択され、そのパターンに対して、平均放射プロファイルが確立される。平均放射プロファイルは、様々なプロファイルの平均を決定することで得られた増幅プロファイルを意味するということが理解され、各基本プロファイルは、選択された回折パターンの中心とその図の端部との間を延びる軸２７に沿っている。１つおよび同一の回折パターン２６に対して、図３Ａに示すように、いくつかの軸２７が考えられ、軸２７は白点の形態で示されている。各画像上の選択された基本回折パターン２６は、白点の形で形成されている。図４Ａは、画像３Ａ乃至３Ｆのそれぞれ上で得られた平均放射プロファイルを示している。強度ｉがより増加すると、リングの数が高くなることが観測される。
【００４１】
図４Ａに示された各放射プロファイルの標準偏差は決定されている。図４Ｂは、レーザダイオード１１の供給電流の強度ｉの関数として、この標準偏差の展開を示している。この表示は、選択された回折パターンのコントラストを表しており、識別可能な回折リングの全てを考慮している。それが、i＝１２１ｍＡで最大値に到達し、強度がこの値を超えた時に減少する。回折パターンのコントラストが高くなると、このパターンがより識別可能となり、この回折パターンに基づいて再構成された画像の質がより良くなるであろう。図３Ａ乃至３Ｆおよび図４Ａ及び４Ｂは、ダイオードの供給電流の最適な強度範囲が６０ｍＡと１２５ｍＡとの間にあり、その範囲で回折パターン２６のコントラストが高い、ということを示している。それら図は、１３０ｍＡを超え、全画像２５に影響を与える干渉縞の出現が、画像のノイズレベルを著しく増加させる、ということを示している。さらに、このノイズは静的ではなく、除去を困難にしている。強度ｉが、回折パターンにコントラスが十分に高く生じ、十分な数の回折リングを有し、同時に、臨界強度ｉｃと称す強度よりも低く、画像センサ２０によって取得された画像２５を通り延びている干渉縞がその強度を超えて出現するように、供給電流を調整することでレーザダイオードを用いることは重要である。この例において、供給電流の強度の最適範囲は、６０ｍＡと１３５ｍＡとの間であり、すなわち、閾値強度ｉｓの約０．５倍と閾値強度ｉｓとの間であり、特に、８０ｍＡと１２０ｍＡとの間、すなわち、閾値強度ｉｓの０．６倍と０．９倍と間が最適である、ということが観測される。
【００４２】
図５Ａ及び５Ｂは、画像センサ２０とレーザダイオード１１との間に試料１０を挿入することなく、画像センサ２０によって得られた画像を示しており、供給電流の強度ｉは、それぞれ、１２０ｍＡ、すなわち、閾値強度ｉｓより低く、１４０ｍＡ、すなわち、閾値強度ｉｓ以上である。強度が強度閾値ｉｓ以下の臨界値ｉｃを超えたときに、干渉縞の出現が観測される。過剰に長いコヒーレンス長はセンサにより取得された画像の質に有害であるようである。したがって、レーザダイオードによって放射された光波１２のコヒーレンス長が１００μｍより小さいあるいは、８０μｍ又は５０μｍよりも小さくなるように、レーザダイオードの供給電流の強度ｉを調整するのが好ましい。発明者は、干渉縞の出現を、マトリックスアレイ画素１７と、そのマトリックスアレイ画素１７から約１００μｍ離れた検出器の保護用窓１８と、の間に生じる迷反射に下げる。そのような干渉縞は、試料がこの大きさの程度で分離した２つの平行なインターフェースを有するとき、出現するかもしれない。典型的に、観測された試料の厚さεは、２０μｍと２００μｍ又は５００μｍとの間である。
【００４３】
発明者は、７０ｍＡと１５０ｍＡとの間でレーザダイオード１１の供給電流の強度ｉを変化させることで、変数ＣＶの係数の展開を評価した。試料１０は回折粒子を有することなく、塩類の緩衝液で満たされた厚さε＝１００μｍの流体空間からなる。画像の変数ＣＶの係数は、その画像の平均によって除算された画像の標準偏差を意味すると理解される。各画像の平均強度が一定となり、ダイオードの光力における変化を補償するように、各画像の露出時間は、調整される。この変化の係数は、迷回折パターンを有する画像のある部分を除外することで算出される。したがって、それは、各画像の“背景”、すなわち、可能な回折パターンを有しない領域を表している。図５Ｃは、レーザダイオードの供給電流の強度ｉの関数として、変数ＣＶの係数の展開を示している。７０ｍＡと１２０ｍＡとの間の安定が観測され、画像におけるパターンすなわち、上記図３Ｆ及び５Ｂを参照して説明した干渉縞、の出現を反映した大きな増加、が続く。
【００４４】
発明者は、画像センサとレーザダイオードとの間に試料を配置することで、臨界強度が変化することを観測した。したがって、干渉縞の出現は、レーザダイオード１１と画像センサ２０との間に配置された試料１０に依存しているようである。
【００４５】
このため、レーザダイオード１１の供給電流の強度ｉは、個別的に、予備的ステップと称す次のステップを行うことによって、調整されるのが好ましい。レーザダイオードの使用の基準条件下で、すなわち、レーザダイオードにより放射された光波１２がレーザ効果によって取得されるように、閾値強度ｉｓよりも大きい供給電流の強度ｉを採用することで、初期画像を取得する。この画像は、ホログラフィック再構成に適していない横方向の干渉縞を有する。レーザダイオードの供給電流の強度ｉを変化させ、特に、この強度を低減させ、画像センサを用いて画像を取得し、このステップは、横方向の干渉縞の大きな減衰が観測されるまで、繰り返される。そのような減衰が観測されたとき、レーザダイオードの供給電流の強度は臨界強度ｉｃに対応していると考えられる。
【００４６】
レーザダイオード１１の供給電流の強度ｉはレンズレス画像処理による試料の観測に貢献するものであり、この臨界強度ｉｃの関数として、決定される。強度ｉは、臨界強度ｉｃに等しい又は少し低い、例えば、０．８ｉｃとｉｃとの間であっても良い。特に、この強度ｉは、臨界強度に近付けるのが好ましいと考えられている。この上で、干渉縞が出現する。この下で、光パワーが減少する。臨界強度の下に行くことで、例えば、０．９ｉｃ又は０．９５ｉｃで、臨界強度の可能な変動は、例えば、レーザダイオードの浮動の効果下、例えば、熱ドリフトで、克服される。そのような“安全余地”が有益であることを証明してもよい。
【００４７】
上述のステップは、予備的ステップとしてみなされている。なぜなら、それらステップは試料の観測の前に実施されるからである。上記ステップは、以降で観測される試料を表している、基準試料１０ｒｅｆを配置することで行われるのが好ましい。上記ステップは、試料無しで実施されてもよく、画像センサ２０は、挿入される試料が無く、直接レーザダイオード１１に向けられ、配置される。２つの干渉縞は、光縞を表す最大強度レベルＳｍａｘと、光縞に隣接する暗縞を表す最小強度レベルＳｍｉｎと、の差異を表す、コントラスト表示ｉｎｄによって特徴付けられてもよい。コントラスト表示は、簡易な減算、Ｓｍａｘ−Ｓｍｉｎ、または、加算Ｓｍａｘ＋Ｓｍｉｎによるこの差異を標準化することで、取得されてもよい。このように、コントラスト表示は、次の式で表現されてもよい。
【数２】
2019509466.tif 000004
式（３）は、対比の従来の定義に対応している。
【００４８】
干渉縞がもはや画像センサにより取得された画像上に大きく出現しないとき、または、それらが十分に大きく減衰されないとき、臨界強度ｉｃに到達している。減衰が大きいとは、横方向の干渉縞に対し、２５％、又は５０％、又は８０％又は、それよりも大きく、初期画像と臨界強度で取得された画像との間、のコントラスト表示ｉｎｄにおける減少に対応している。
【００４９】
上述したように、画像センサにより取得された各画像２５は、伝播演算子ｈ（ｘ、ｙ、ｚ）を用いてその画像を巻込むことを目的して、ホログラフィック再構成を受けても良い。伝播演算子ｈ（ｘ、ｙ、ｚ）の役割は、画像センサ２０と座標点（ｘ、ｙ、ｚ）との間の光の伝播を表すことである。ホログラフィック再構成の原理は、例えば、刊行物Ryle et al, ‘Digital in-line holography of biological specimens’, Proc. Of SPIE Vol.6311 (2006)に記載されている。ホログラフィック再構成によって、光波２４に対する複雑な式Ｕ（ｘ、ｙ、ｚ）を決定できる。検出器は、空間のいずれかの座標点（ｘ、ｙ、ｚ）で、特に、画像センサから距離｜ｚ｜に位置する面で、光波２４にさらされる。式を用いてこの光波の振幅ｕ（ｘ、ｙ、ｚ）及び位相φ（ｘ、ｙ、ｚ）を決定することができる。
u(x,y,z) = abs [U(x,y,z)]  ・・・(4),
又は φ(x,y,z) = arg [U(x,y,z)] ・・・(5)
【００５０】
演算子ａｂｓ及びａｒｇは、絶対値及び引数をそれぞれ返す。
【００５１】
デジタル再構成は、特に、フレネル回折モデルに基づいていてもよい。この例において、伝播演算子は、以下のフレネル−ヘルムホルツ関数である。
【数３】
2019509466.tif 000005
・・・(6)
λは波長である。
【数４】
2019509466.tif 000006
・・・(7)
ｘ′及びｙ′は、画像センサの面における座標を表す。Ｓ（ｘ′、ｙ′）は、座標ｘ′及びｙ′で画像センサにより取得された画像の強度を表す。ｘ及びｙは、再構成面における座標を表し、後者は画像センサから距離｜ｚ｜に位置している。ｚは入射波の伝播軸ｚに沿った再構成された画像の座標を表す。
【００５２】
発明者は、図１に示す装置を用いて、切端径６μｍを有する２つのラテックスのビードを、厚さ１００μｍを有し、上記定義されたようにＰＢＳの塩類の緩衝液で満たされた流体空間の底に配置することで、画像２５を取得した。画像２５は、画像センサ２０を用いて、４１ｍＡと１３５ｍＡとの間で、レーザダイオード１１の供給電流の強度ｉを調整することで取得された。
【００５３】
この画像は、画像センサと上記ビードとの間の距離に等しいｚの値を考慮して、上述の原理に従って、ホログラフィック再構成を受けた。画像６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ及び６Ｆは、再構成距離｜ｚ｜の関数として、再構成された画像２８の画素の強度を示している。より正確には、各画像は、再構成距離｜ｚ｜の関数として、２つのビードを通り抜ける線に沿った画素の強度の分布を表しており、レーザダイオード１１の供給電流の強度ｉは、それぞれ、４１ｍＡ、６７ｍＡ、９２ｍＡ、１１０ｍＡ、１２６ｍＡ、及び１３５ｍＡに達する。点線は、検出器とビードとの間の距離に等しい再構成距離に対応している。図６Ｅは、ｉ＝１２６ｍＡに対応しており、画像６Ｄ（ｉ＝１１０ｍＡ）又は６Ｃ（ｉ＝９２ｍＡ）によって再構成画像２８上でビードの明確な分離が可能となる知識を用いると、最適である、ということが観測される。図６Ｆ（ｉ＝１３５ｍＡ）によって、満足な分離が可能となるが、上述のように横方向の干渉縞が存在するため、画像の残余の高い背景ノイズによって影響される。
【００５４】
図７Ａ及び７Ｂは、光源が、それぞれ、青色光放射ダイオード及びレーザダイオードであり、その強度が臨界強度ｉｃ、ここでは１２５ｍＡである場合に、画像センサを用いて取得された画像を示している。図７Ｂに形成された回折パターンは、図７Ａに形成された回折パターンよりも、より識別可能な回折リングを含んでいる。
【００５５】
レーザダイオードの使用は、供給電流の強度を調整するという条件下で、試料のより正確な観測が可能となる。
【００５６】
本発明は、流体を形成する粒子を検出及び／又は識別するという目的で、体流体分析において実施されてもよい。本発明によって、生物組織の薄いスライドの特徴付けを行っても良い。生物学以外で、本発明は、産業上の流体、農業−食品領域、又は、固体マトリックスにおける粒子の検出及び／又は識別に適用されてもよい。
【図１】
2019509466.tif 000007
【図２Ａ】
2019509466.tif 000008
【図２Ｂ】
2019509466.tif 000009
【図２Ｃ】
2019509466.tif 000010
【図３Ａ】
2019509466.tif 000011
【図３Ｂ】
2019509466.tif 000012
【図３Ｃ】
2019509466.tif 000013
【図３Ｄ】
2019509466.tif 000014
【図３Ｅ】
2019509466.tif 000015
【図３Ｆ】
2019509466.tif 000016
【図４Ａ】
2019509466.tif 000017
【図４Ｂ】
2019509466.tif 000018
【図５Ａ】
2019509466.tif 000019
【図５Ｂ】
2019509466.tif 000020
【図５Ｃ】
2019509466.tif 000021
【図６Ａ】
2019509466.tif 000022
【図６Ｂ】
2019509466.tif 000023
【図６Ｃ】
2019509466.tif 000024
【図６Ｄ】
2019509466.tif 000025
【図６Ｅ】
2019509466.tif 000026
【図６Ｆ】
2019509466.tif 000027
【図７Ａ】
2019509466.tif 000028
【図７Ｂ】
2019509466.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月23日(2018.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含んでいる、試料（１０）を観測するための方法であって、
ａ）前記試料に向けて伝播する入射光波（１２）を放射するように構成されたレーザダイオード（１１）を用いて前記試料を照射し、
供給電流（ｉ）が閾値強度（ｉｓ）を超えたときレーザ効果が得られるように、前記レーザダイオードには、前記供給電流が供給され、
ｂ）画像センサ（２０）を用いて、前記試料の画像（２５）を取得し、
前記試料は前記レーザダイオード（１１）と前記画像センサ（２０）との間に配置され、
各画像は、前記照射の影響下で、前記試料により送られる光波（２４）を表しており、
前記レーザダイオードの供給電流の強度（ｉ）は、臨界強度（ｉｃ）以下であり、
前記臨界強度は、ステップ（ａ）の前に、次の予備的ステップに従って決定されており、
ｉ）前記レーザダイオード（１１）が放射する前記入射光波（１２）が前記画像センサ（２０）に向けて伝播するように前記レーザダイオード（１１）を配置し、
ｉｉ）前記レーザダイオード（１１）に、初期の供給電流を供給し、該供給電流の強度は前記閾値強度（ｉｓ）以上であり、前記画像センサを用いて、初期画像を取得し、該初期画像は横方向の干渉縞を有しており、
ｉｉｉ）前記供給電流の強度を変更し、前記画像センサ（２０）を用いて画像を取得し、このステップは、前記初期画像と比較して減衰した横方向の干渉縞を有する画像が取得されるまで、繰り返され、前記供給電流の強度は前記臨界強度（ｉｃ）に対応している、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項２】
請求項１に記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記臨界強度（ｉｃ）は、前記閾値強度（ｉｓ）よりも小さい、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項３】
請求項２に記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記臨界強度（ｉｃ）は、前記閾値強度（ｉｓ）の０．７倍と前記閾値強度（ｉｓ）との間、又は、前記閾値強度（ｉｓ）の０．８倍と前記閾値強度（ｉｓ）との間、である、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のうちのいずれか１項記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記初期画像上で、２つの隣接する横方向の干渉縞は、前記干渉縞間のコントラストを示すコントラスト表示（ｉｎｄ）によって特徴付けられており、前記臨界強度は、２５％よりも大きな係数の前記コントラスト表示での低減に対応している、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のうちのいずれか１項記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記予備的ステップｉ）乃至ｉｉｉ）において、前記観測された試料を表す基準試料は、前記画像センサ（２０）と前記レーザダイオード（１１）との間に配置されている、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のうちのいずれか１項記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記予備的ステップｉ）乃至ｉｉｉ）において、試料は、前記画像センサ（２０）と前記レーザダイオード（１１）との間に配置されていない、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のうちのいずれか１項記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記試料（１０）は、回折要素（１３）を含み、該回折要素（１３）は、前記光波（１２）によって前記照射の影響下で、回折波（２３）を形成し、前記画像センサは、前記試料及び前記回折波（２３）によって送られる入射波（１２）を含む露出波（２４）にさらされる、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のうちいずれか１項記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記ステップｂ）において、前記供給電流（ｉ）の強度は、前記閾値強度（ｉｓ）の０．５倍と前記閾値強度（ｉｓ）との間、又は、前記閾値強度（ｉｓ）の０．７倍と前記閾値強度（ｉｓ）との間、である、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のうちいずれか１項記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
前記ステップｂ）において、前記供給電流（ｉ）の強度は、前記閾値強度（ｉｓ）の０．５倍と前記閾値強度（ｉｓ）の０．９倍との間、又は、前記閾値強度（ｉｓ）の０．７倍と前記閾値強度（ｉｓ）の０．９倍との間、である、
試料（１０）を観測するための方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９のうちのいずれか１項記載の試料（１０）を観測するための方法であって、
拡大光学素子が前記試料と前記画像センサ（２０）との間に延在していない、
試料（１０）を観測するための方法。
【国際調査報告】
2019509466.tif 000030
2019509466.tif 000031
2019509466.tif 000032
2019509466.tif 000033