(57)【要約】  本発明は、少なくとも哺乳動物、好ましくは、ヒトタンパク質の断片と同一または相同であるアミノ酸配列を含むグリコシル化ポリペプチドであって、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有し、哺乳動物タンパク質またはその断片と比較してＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９から選択される１つ以上のＳＩＧＬＥＣに対する増加した結合親和性を示すグリコシル化ポリペプチドに関する。本発明はさらに、第１および第２のポリペプチドを含む組成物であって、第１のポリペプチドは、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有するグリコシル化ポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、第２の哺乳動物、特に、ヒトタンパク質と相同または同一であるアミノ酸配列を含有し、第２のポリペプチドと比較して、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９から選択される１つ以上のＳＩＧＬＥＣから選択されるＳＩＧＬＥＣに対する増加した結合親和性を有する組成物に関する。
2019519220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも哺乳動物、好ましくは、ヒトタンパク質の断片と同一または相同であるアミノ酸配列を含むグリコシル化ポリペプチドであって、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有し、前記哺乳動物タンパク質またはその断片と比較してＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９から選択される１つ以上のＳＩＧＬＥＣに対する増加した結合親和性を示すグリコシル化ポリペプチド。
【請求項２】
ＳＩＧＬＥＣのＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９への増加した結合を示す、請求項１に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項３】
前記グリコシル化ポリペプチドのシアル酸化コア２型および伸長コア１型Ｏ−グリカンの合わせた数が、前記哺乳動物タンパク質またはその断片のシアル酸化コア２型および伸長コア１型Ｏ−グリカンの数よりも多い、請求項１または２に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項４】
前記グリコシル化ポリペプチドのシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンの数が、前記哺乳動物タンパク質またはその断片のシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンの数よりも多い、請求項１または２に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項５】
Ｏ−グリコシル化部位の１つ以上のクラスターを含有し、クラスターは、少なくとも２つのＯ−グリコシル化部位、より好ましくは、少なくとも３つのＯ−グリコシル化部位、最も好ましくは、少なくとも４つのＯ−グリコシル化部位を含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項６】
前記１つ以上のクラスターが、１０個のアミノ酸中の少なくとも１つのＯ−グリコシル化部位、好ましくは、４つのアミノ酸中の少なくとも１つのグリコシル化部位、より好ましくは、３つのアミノ酸中の少なくとも１つのＯ−グリコシル化部位、最も好ましくは、２つのアミノ酸中の１つのＯ−グリコシル化部位を含有する、請求項５に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項７】
少なくとも２つのクラスター、より好ましくは、少なくとも３つのクラスターを含有する、請求項５または６に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項８】
前記クラスターが、１００アミノ酸未満だけ、好ましくは、５０未満、より好ましくは、３０アミノ酸未満だけ離隔している、請求項５〜７のいずれか一項に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項９】
前記シアル酸化Ｏ−グリカンが、α２−３結合および／またはα２−８グリコシド結合で少なくとも２つのシアル酸、より好ましくは、少なくとも３つのシアル酸を含有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項１０】
シアル酸化Ｏ−グリカンの数に基づくコア２型Ｏ−グリカンの割合が、少なくとも５％、より好ましくは、少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも３５％、最も好ましくは、少なくとも５０％である、請求項９に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項１１】
多量体化ドメインをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のグリコシル化タンパク質。
【請求項１２】
前記ヒトタンパク質が、ｖＷＦ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ＡＤＡＭＴＳ１３から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項１３】
ヒトタンパク質またはその断片が、ＦＶＩＩＩタンパク質、特に、全長ＦＶＩＩＩ、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ、またはＢドメインの一部がスペーサーペプチドにより置き換えられたＦＶＩＩＩタンパク質である、請求項１２に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項１４】
１つ以上のＯ−グリコシル化部位が、前記哺乳動物タンパク質またはその断片と相同または同一であるアミノ酸配列内に局在し、特に、前記哺乳動物タンパク質またはその断片のアミノ酸と置き換わって局在する、請求項３〜１３のいずれか一項に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項１５】
融合タンパク質であり、１つ以上のＯ−グリコシル化部位を含有する第２のアミノ酸配列は、前記ヒトタンパク質またはその断片と同一または相同であるアミノ酸配列に共有結合している、請求項３〜１３のいずれか一項に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項１６】
共有結合リンカーが、ペプチド結合、化学リンカー、またはグリコシド結合から選択される、請求項１５に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項１７】
前記第２のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸１２３８〜１２６８と、または配列番号１のアミノ酸１２３８〜１２６８の２つの連続コピーと少なくとも９８％相同であり、好ましくは、同一である、請求項１５または１６に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項１８】
好ましくは、ヒト細胞株中での発現により産生される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のグリコシル化ポリペプチド。
【請求項１９】
第２のポリペプチド、特に、治療タンパク質の免疫応答を低減させるための、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有し、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９から選択される１つ以上のＳＩＧＬＥＣへの結合を示すグリコシル化ポリペプチドの使用。
【請求項２０】
第１および第２のポリペプチドを含む組成物であって、前記第１のポリペプチドは、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有するグリコシル化ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチドは、第２の哺乳動物、特に、ヒトタンパク質と相同または同一であるアミノ酸配列を含有し、前記第２のポリペプチドと比較して、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９から選択される１つ以上のＳＩＧＬＥＣから選択されるＳＩＧＬＥＣに対する増加した結合親和性を有する組成物。
【請求項２１】
前記第１および第２のポリペプチドが、タンパク質複合体を形成する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第１のポリペプチドが、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチドである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第２のポリペプチドが、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ＡＤＡＭＴＳ１３、特に、全長ＦＶＩＩＩタンパク質、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質、またはＢドメインの一部がリンカーにより置き換えられたＦＶＩＩＩタンパク質から選択される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記第１のポリペプチドが、少なくともヒトｖＷＦの断片を含み、特に、前記ｖＷＦ断片は、配列番号１の７６４〜１２６８により定義される配列と少なくとも９５％同一であるか、配列番号２と少なくとも９５％同一であるか、配列番号３と少なくとも９５％同一であるか、配列番号４と少なくとも９５％同一であるか、または配列番号５と少なくとも９５％同一であるか、またはおよび前記第２のポリペプチドが、ＦＶＩＩＩタンパク質である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のグリコシル化ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記グリコシル化ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５から選択される配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、コードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
ベクター骨格および請求項２５または２６に記載のポリヌクレオチドを含有するベクターであって、前記ベクター骨格は、好ましくは、ｐＣＤＮＡ３、ｐＣＤＮＡ３．１、ｐＣＤＮＡ４、ｐＣＤＮＡ５、ｐＣＤＮＡ６、ｐＣＥＰ４、ｐＣＥＰ−ｐｕｒｏ、ｐＣＥＴ１０１９、ｐＣＭＶ、ｐＥＦ１、ｐＥＦ４、ｐＥＦ５、ｐＥＦ６、ｐＥｘｃｈａｎｇｅ、ｐＥＸＰＲ、ｐＩＲＥＳ、およびｐＳＣＡＳから選択されるベクター。
【請求項２８】
請求項２５もしくは２６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２７に記載のベクターを含有する宿主細胞であって、好ましくは、哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞、より好ましくは、ヒト腎細胞、最も好ましくは、ヒト胚性腎細胞株、特に、ＨＥＫ２９３細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３Ｆである宿主細胞。
【請求項２９】
好ましくは、ＰＵＰの治療およびＩＴＩ治療から選択される出血性障害の治療または予防における使用のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のグリコシル化ポリペプチドまたは請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記使用が、静脈内または非静脈内注射、好ましくは、皮下注射を含む、請求項２９に記載の使用のためのグリコシル化ポリペプチドまたはタンパク質複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モジュレートされるＳＩＧＬＥＣ結合に起因する低減した免疫応答または増加した免疫寛容を示す哺乳動物タンパク質をベースとするグリコシル化ポリペプチドおよびそのグリコシル化ポリペプチドを使用する治療方法に関する。本発明はさらに、モジュレートされるＳＩＧＬＥＣ結合に起因する低減した免疫応答または増加した免疫寛容を示すタンパク質複合体およびそのタンパク質複合体を使用する治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病は、血液凝固または凝血を制御する身体の能力を害する遺伝性障害のグループである。この最も一般的な形態の血友病Ａにおいて、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）が欠損しており、血友病Ａは、５，０００〜１０，０００人の男児出生につき１人に生じる。ＦＶＩＩＩタンパク質は、多機能特性を有する血液凝血における必須の補因子である。ＦＶＩＩＩの欠損は、ＦＶＩＩＩの血小板由来濃縮剤により、または組換え産生ＦＶＩＩＩにより治療することができる。ＦＶＩＩＩ濃縮剤による治療は、血友病患者の生活の正常化をもたらしている。歴史的に、血友病Ａは、ヒト血漿に由来するＦＶＩＩＩにより治療されてきた。血漿において、正常条件下で、ＦＶＩＩＩ分子は、その補因子；様々な変性の形態からＦＶＩＩＩ分子を安定させるフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）と常に会合している。
【０００３】
フォン・ヴィレブランド因子の有無にかかわらず、血漿または第ＶＩＩＩ因子を組換え産生する培養物（ｒＦＶＩＩＩ）から第ＶＩＩＩ因子を精製する多くの方法が記載されている。９０年代において、最初の組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）製品が市販され、血漿中のＦＶＩＩＩの主形態を模倣する全長ｒＦＶＩＩＩ分子、および１つの不活性部分（Ｂドメイン）が除去されたＢドメイン欠失ｒＦＶＩＩＩ分子（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）に分けられ、両方とも高い純度を有する（全てｖＷＦを有さない）。
【０００４】
血友病Ａ患者は、要求に応じて、または１週間に数回投与される予防的治療法としてＦＶＩＩＩにより治療される。予防的治療については、１５〜２５ＩＵ／ｋｇ体重のＦＶＩＩＩが１週間に３回投与され、それは、ＦＶＩＩＩの持続的必要性およびヒトにおいて約１１時間にすぎない血液系中でのその短い半減期に起因して必要である。（Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００５】
高頻度で、外部投与されるＦＶＩＩＩによる持続的治療は、患者の免疫系の応答を引き起こし（Ｓａｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ８：１−１１（２００２）、それは治療法の深刻な限定を表す。
【０００６】
現在、血友病Ａ（先天性ＦＶＩＩＩ欠損）を有する患者において免疫寛容を達成するための最も一般的なオプションおよびインヒビターは、免疫寛容誘導（ＩＴＩ）であり、高用量のＦＶＩＩＩが長期間投与される。しかしながら、この治療は最大２年を要し得、患者の約３０％において不成功のままであり、非常にコストがかかり、阻害抗体の初期発生を抑制するための予防的様式で使用することができない。
【０００７】
したがって、免疫応答を減衰させるアプローチが必要とされている。１つの有望なアプローチは、ＦＶＩＩＩまたはその結合パートナーｖＷＦのいずれかのグリコシル化の最適化である。
【０００８】
例えば、国際公開第２０１４／１７６１２５Ａ１号パンフレットは、ＦＶＩＩＩに対する抗原特異的免疫寛容を誘導するための免疫コンジュゲートに関する。免疫コンジュゲートは、Ｂ細胞上で発現されるＳＩＧＬＥＣ、すなわち、ＳＩＧ−１またはＳＩＧ−１０（またはオルソログＳＩＧ−Ｇ）を標的化する特異的グリカンリガンドにコンジュゲートしているＦＶＩＩＩタンパク質である。グリカンリガンドは、特に、ＦＶＩＩＩが導入されるリポソームにカップリングしている。
【０００９】
シアル酸結合免疫グロブリンレクチン（Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｌｅｃｔｉｎ）（ＳＩＧＬＥＣ）は、マウスおよびヒトにおけるほとんどのＴ細胞を除く免疫系の種々の白血球上で発現される１５個のヒトおよび９つのネズミ細胞表面受容体のファミリーをなす。ＳＩＧＬＥＣは、異なる細胞タイプ上で局在し、異なるグリカン構造に結合する（Ｐａｕｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２に概説されている）。例えば、ＳＩＧ−５へのｖＷＦおよびＦＶＩＩＩの結合が実証されている（Ｐｅｇｏｎ  ２０１２）。しかしながら、結合機序は不明のままである。
【００１０】
異なるアプローチが国際公開第２０１４／１７９１８４Ａ１号パンフレットに記載されている。著者らは、ＳＩＧＬＥＣリガンドの添加による不所望な抗体免疫応答の低減および血液凝血因子、例えば、ＦＶＩＩＩの免疫寛容の誘導を示唆している。ＳＩＧＬＥＣリガンドは、９−Ｎ−ビフェニルカルボキシル−ＮｅｕＡｃａ２−６Ｇａｌ〜ｌ−４ＧｌｃＮＡｃ（６’−ＢＰＣＮｅｕＡｃ）、ＮｅｕＡｃａ２−６Ｇａｌｗｌ−４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕＡｃａ２−６Ｇａｌｗｌ−４（６−スルホ）ＧｌｃＮＡｃから選択される。ＳＩＧＬＥＣリガンドは、水溶性ポリマーを介して凝血因子に結合している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、とりわけ、血漿由来タンパク質、特にｖＷＦ中で天然に発生するグリカン構造が、ＳＩＧＬＥＣのグループ、特に、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８およびＳＩＧ−９との相互作用を可能とするという知見に基づく。さらに、本発明者らは、タンパク質上のグリカン構造の改変により、ＳＩＧＬＥＣ、例えば、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８およびＳＩＧ−９との相互作用を増加させることができることを見出した。この増加は、タンパク質が投与される患者の低減した免疫応答および／または増加した免疫寛容をもたらす。
【００１２】
したがって、第１の態様によれば、本発明は、少なくとも哺乳動物、好ましくは、ヒトタンパク質の断片と同一または相同であるアミノ酸配列を含むグリコシル化ポリペプチドであって、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有し、哺乳動物タンパク質またはその断片と比較してＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９からなる群から選択される１つ以上のＳＩＧＬＥＣに対する増加した結合親和性を有するグリコシル化ポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明者らは、一方でＳＩＧＬＥＣとの相互作用に必要とされるが、付加がＳＩＧＬＥＣへの増加した結合ももたらすグリカン構造を具体的に定義した。シアル酸化コア２型Ｏ−グリカンおよび／または伸長コア１型Ｏ−グリカンがこれを担う。
【００１４】
したがって、第１の態様によるグリコシル化ポリペプチドは、少なくとも哺乳動物、好ましくは、ヒトタンパク質の断片と同一または相同であるアミノ酸配列を含むグリコシル化ポリペプチドであって、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有し、グリコシル化ポリペプチドのシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンおよびシアル酸化伸長コア１型Ｏ−グリカンの合わせた数が、哺乳動物タンパク質またはその断片のシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンおよびシアル酸化伸長コア１型Ｏ−グリカンの合わせた数よりも多いグリコシル化ポリペプチドと定義することもできる。
【００１５】
シアル酸化コア２型Ｏ−グリカンおよび／またはシアル酸化伸長コア１型Ｏ−グリカン、特に、シアル酸化コア２型Ｏ−グリカンを含むグリカン組成を有するタンパク質は、組合せ投与による治療タンパク質に対する患者の免疫応答を改変するために使用することができる。
【００１６】
したがって、第２の態様によれば、本発明は、治療タンパク質に対する患者の免疫応答を低減させ、または免疫寛容を増加させるための、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有し、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９から選択される１つ以上のＳＩＧＬＥＣへの結合を示すグリコシル化ポリペプチドの使用に関する。
【００１７】
ＳＩＧＬＥＣに対する結合親和性を有するグリコシル化ポリペプチドの改変の使用により、改変ポリペプチド自体のＳＩＧＬＥＣ結合親和性を直接改変することが可能であるだけでなく、グリコシル化ポリペプチドが一部であるタンパク質複合体または組成物、例えば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）およびフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の複合体のＳＩＧＬＥＣ結合親和性も改変することも可能である。
【００１８】
したがって、第３の態様によれば、本発明は、第１および第２のポリペプチドを含むタンパク質組成物であって、第１のポリペプチドは、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有するグリコシル化ポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、第２の哺乳動物、特に、ヒトタンパク質と相同または同一であるアミノ酸配列を含有し、第２のポリペプチドと比較して、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９から選択される１つ以上のＳＩＧＬＥＣに対する増加した結合親和性を有するタンパク質組成物を提供する。第３の態様による組成物の第１および第２のポリペプチドは、好ましくは、タンパク質複合体を形成する。
【００１９】
第４の態様によれば、本発明は、本発明の第１の態様によるグリコシル化ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。第５の態様において、本発明はまた、本発明の第４の態様によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【００２０】
第１の態様によるグリコシル化ポリペプチド、特に、ｖＷＦまたはＦＶＩＩＩおよび第３の態様による組成物、特に、ＦＶＩＩＩおよびｖＷＦの複合体は、低減した免疫応答に起因して、特に医学的治療において有用である。
【００２１】
したがって、第４の態様によれば、本発明は、出血性疾患の治療又は予防における使用のための、第１の態様により定義されるグリコシル化ポリペプチドまたは第３の態様により定義される組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】異なるＳＩＧＬＥＣへのｖＷＦの結合試験の結果を示す。４９２ｎｍにおける吸光度は、それぞれ特定されるＳＩＧＬＥＣまたは対照に結合しているｖＷＦに比例する。ＳＩＧ−２、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−Ｆ、ＳＩＧ−９およびＳＩＧ−１０をプロテインＡを介してマイクロタイタープレート上に５００ｎｇ／ウェルにおいて固定化した。ビオチン化ｖＷＦを０〜０．８μｇ／ｍＬの濃度において添加し、洗浄後、結合をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンにより可視化し、吸光度を４９２ｎｍにおいて計測した。抗ｖＷＦおよび抗ニワトリＩｇＹを対照に使用した。
【図２】Ｎ−およびＯ−グリコシル化、Ｖ８プロテアーゼ開裂部位を含むｖＷＦドメイン構造およびＶ８プロテアーゼ開裂後に得られる断片の模式的表示を示す。
【図３】ＳＩＧＬＥＣのＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−ＦおよびＳＩＧ−９へのｖＷＦのＮ末端およびＣ末端断片の結合試験の結果を示す。４９２ｎｍにおける吸光度は、それぞれ特定されるＳＩＧＬＥＣまたは対照に結合しているｖＷＦ断片に比例する。ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−ＦおよびＳＩＧ−９を、プロテインＡを介してマイクロタイタープレート上に５００ｎｇ／ウェルにおいて固定化した。ビオチン化Ｎ末端ＶＷＦ断片（暗灰色バー）およびＣ末端ｖＷＦ断片（淡灰色バー）を１μｇ／ｍＬの濃度において添加し、洗浄後、結合をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンにより可視化し、吸光度を４９２ｎｍにおいて計測した。抗ニワトリＩｇＹを陰性対照として使用した。
【図４】脱シアル酸化、脱Ｎ−グリコシル化および非処理形態のｖＷＦ  Ｎ末端断片の結合試験の結果を示す。４９２ｎｍにおける吸光度は、それぞれ特定されるＳＩＧＬＥＣまたは対照に結合しているｖＷＦ  Ｎ末端断片に比例する。消化前のＮ末端ＶＷＦ断片は白色バーにより、ＰＮＧアーゼＦ脱Ｎ−グリコシル化断片は灰色バーにより、および脱シアル酸化断片は黒色バーにより表される。ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−ＦおよびＳＩＧ−９を、プロテインＡを介してマイクロタイタープレート上に５００ｎｇ／ウェルにおいて固定化した。ビオチン化Ｎ末端ｖＷＦ断片（消化前、ＰＮＧアーゼＦまたはシアリダーゼＡにより消化）を８μｇ／ｍＬの濃度において添加し、洗浄後、結合をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンにより可視化し、吸光度を４９２ｎｍにおいて計測した。抗ニワトリＩｇＹを対照に使用した。
【図５】ＳＩＧＬＥＣへのＯ−グリコシル化クラスターＩおよびクラスターＩＩの結合試験の結果を示す。４９２ｎｍにおける吸光度は、それぞれ特定されるＳＩＧＬＥＣまたは対照に結合しているクラスターＩ断片（淡灰色バー）またはクラスターＩＩ断片（暗灰色バー）に比例する。ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−Ｆ、ＳＩＧ−９およびＳＩＧ−１０を、プロテインＡを介してマイクロタイタープレート上に５００ｎｇ／ウェルにおいて固定化した。ビオチン化クラスターＩおよびクラスターＩＩを４μｇ／ｍＬの濃度において添加し、洗浄後、結合をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンにより可視化し、吸光度を４９２ｎｍにおいて計測した。抗ニワトリＩｇＹを陰性対照として使用した。
【図６】シアリダーゼＡによる処理前後のＳＩＧＬＥＣへのＯ−グリコシル化クラスターＩＩの結合試験の結果を示す。４９２ｎｍにおける吸光度は、それぞれ特定されるＳＩＧＬＥＣまたは対照に結合している非処理クラスターＩＩ断片（淡灰色バー）またはシアリダーゼＡにより消化されたクラスターＩＩ断片（暗灰色バー）に比例する。ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−ＦおよびＳＩＧ−９を、プロテインＡを介してマイクロタイタープレート上に５００ｎｇ／ウェルにおいて固定化した。消化前（淡灰色バー）およびシアリダーゼＡにより消化されたビオチン化クラスターＩＩを２μｇ／ｍＬの濃度において添加し、洗浄後、結合をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンにより可視化し、吸光度を４９２ｎｍにおいて計測した。抗ニワトリＩｇＹを陰性対照として使用した。
【図７】組換え発現ｖＷＦ断片Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２の模式的表示を示す。
【図８】トリプシン／キモトリプシン消化；シアリダーゼＡ消化およびレクチン濃縮後のＳｅｑ１１から単離されたＯ−糖ペプチドのＭＡＬＤＩ  ＭＳスペクトルを示す。特定されたペプチド配列は、KVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHGSAW（配列番号６）であり、最後の４つのアミノ酸（下線）は、配列のＣ末端に付着しているタグに対応する。上段のスペクトルは完全Ｏ−グリコシル化糖ペプチドを示し、下段のスペクトルはＯ−グリコシダーゼ消化後の同一の糖ペプチドを示す。
【図９】トリプシン／キモトリプシン消化；シアリダーゼＡ消化およびレクチン濃縮後のＳｅｑ１２から単離されたＯ−糖ペプチドのＭＡＬＤＩ  ＭＳスペクトルを示す。特定されたペプチド配列は、[KVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHGSAW（配列番号７）であり、最後の４つのアミノ酸（下線）は、配列のＣ末端に付着しているタグに対応する。上段スペクトルは完全Ｏ−グリコシル化糖ペプチドを示し、下段スペクトルはＯ−グリコシダーゼ消化後の同一の糖ペプチドを示す。
【図１０】ＳＩＧＬＥＣへの組換えポリペプチドＳｅｑ１１およびＳｅｑ１２の結合試験の結果を示す。４９２ｎｍにおける吸光度は、それぞれ特定されるＳＩＧＬＥＣまたは対照に結合しているＳｅｑ１１（暗灰色バー）またはＳｅｑ１２（淡灰色バー）に比例する。ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−ＦおよびＳＩＧ−９を、プロテインＡを介してマイクロタイタープレート上に５００ｎｇ／ウェルにおいて固定化した。Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ担持配列を、４２ｎＭの等モル濃度においてプレート上でアプライし、洗浄後、結合をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンにより可視化し、吸光度を４９２ｎｍにおいて計測した。抗ニワトリＩｇＹを陰性対照として使用し、抗ｖＷＦ  ｐＡｂを陽性対照として使用した。
【図１１】ＳＩＧＬＥＣへのシアリダーゼＡ処理後の組換えポリペプチドＳｅｑ１１およびＳｅｑ１２の結合試験の結果を示す。４９２ｎｍにおける吸光度は、それぞれ特定されるＳＩＧＬＥＣまたは対照に結合しているＳｅｑ１１（暗灰色バー）またはＳｅｑ１２（淡灰色バー）に比例する。ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−ＦおよびＳＩＧ−９を、プロテインＡを介してマイクロタイタープレート上に５００ｎｇ／ウェルにおいて固定化した。Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ担持配列を酵素的に脱シアル酸化し、４２ｎＭの等モル濃度においてプレート上にアプライし、洗浄後、結合をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンにより可視化し、吸光度を４９２ｎｍにおいて計測した。抗ニワトリＩｇＹを陰性対照として使用し、抗ｖＷＦ  ｐＡｂを陽性対照として使用した。
【図１２】ＳＩＧＬＥＣへの組換えポリペプチドＳｅｑ１１の濃度依存的結合および特異的結合曲線のスキャッチャード分析の結果を示す。
【図１３】ＳＩＧＬＥＣへの組換えポリペプチドＳｅｑ１２の濃度依存的結合および特異的結合曲線のスキャッチャード分析の結果を示す。
【図１４】図１２および図１３に提示される曲線について実施されたスキャッチャード分析から得られたＫD値のまとめを示す。
【図１５】組換えＦＶＩＩＩへのＳｅｑ１１、Ｓｅｑ１２および全長血漿ＶＷＦの結合について計算された解離親和性定数（ＫＤ）値を示す。データをＳＰＲにより得た。
【図１６】ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γに対するＮおよびＣ末端ＶＷＦ断片の効果。ｍｏＤＣを、０．１μｇ／ｍｌのＬＰＳの添加なし（左列）または添加あり（右列）のいずれかで種々の濃度のＶＷＦ断片と培養した。サイトカインの細胞外レベルを、サイトメトリックビーズアレイを介して同時に測定した。非刺激細胞のＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γレベルは、ほとんどのドナーについて、検出限界未満であった（ｂｄ、ＩＬ−１２ｐ７０について０．６ｐｇ／ｍｌおよびＩＦＮ−γについて１．８ｐｇ／ｍｌ）。データを平均±ＳＥＭとして提示し、それぞれのドットは１人のドナーを表す。
【図１７】５００ｎＭのＶＷＦのＮ末端断片による１０分間のｍｏＤＣの刺激後のＳＩＧＬＥＣならびにＳＩＧＬＥＣシグナリングに関与するアダプター分子ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２のリン酸化の結果を示す。同一容量の１００ｍＭのＮａＣｌにより刺激された細胞が対照として機能した。細胞溶解物における免疫受容体−リン酸化の分析を、プロテオームプロファイラーヒトホスホ−免疫受容体アレイキットにより実施した。結果を、２〜４回の個々の実験の平均画素密度±ＳＥＭとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書および特許請求の範囲、ならびにそのような用語に与えられるべき範囲の明確で一貫した理解を提供するため、以下の定義が提供される。
【００２４】
定義
本明細書において使用される「ペプチド」は、好ましくは、ペプチド結合により結合している任意のタイプの任意数のアミノ酸、好ましくは、天然発生アミノ酸から構成され得る。特に、ペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸、好ましくは、少なくとも５つ、少なくとも７つ、少なくとも９つ、少なくとも１２個、または少なくとも１５個のアミノ酸を含む。さらに、ペプチドの長さについての上限は存在しない。しかしながら、好ましくは、本発明によるペプチドは、５００アミノ酸の長さを超過せず、より好ましくは、それは、３００アミノ酸の長さを超過せず；いっそうより好ましくは、それは、２５０アミノ酸よりも長くない。
【００２５】
したがって、用語「ペプチド」は、通常、２〜１０アミノ酸の長さを有するペプチドを指す「オリゴペプチド」、および通常、１０アミノ酸超の長さを有するペプチドを指す「ポリペプチド」を含む。
【００２６】
本明細書において使用される用語「タンパク質」は、少なくとも６０個、少なくとも８０個、好ましくは、少なくとも１００個のアミノ酸を有するペプチドを指す。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用される。本明細書において使用されるポリペプチドおよびタンパク質としては、化学合成タンパク質および遺伝子によりコードされる天然合成タンパク質が挙げられる。ポリペプチドまたはタンパク質は、天然資源、例えば、ヒト血液から得、または細胞培養物中で組換えタンパク質として産生することができる。
【００２７】
本明細書において使用される用語「哺乳動物タンパク質」は、天然発生哺乳動物タンパク質、すなわち、哺乳動物生物体により天然に発現されるタンパク質に関する。したがって、哺乳動物タンパク質は、天然発生アミノ酸配列および天然発生翻訳後修飾、例えば、グリコシル化を有する。本発明によれば、哺乳動物タンパク質および天然発生哺乳動物タンパク質という用語は、互換的に使用することができる。
【００２８】
本明細書において使用される用語「ヒトタンパク質」は、天然発生ヒトタンパク質、すなわち、ヒト生物体により天然に発現されるタンパク質に関する。したがって、ヒトタンパク質は、天然発生アミノ酸配列および天然発生翻訳後修飾、例えば、グリコシル化を有する。本発明によれば、ヒトタンパク質および天然発生ヒトタンパク質という用語は、互換的に使用される。
【００２９】
本明細書において使用される「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、分子生物学技術により細胞中に導入されるトランス遺伝子によりコードされるものである。タンパク質は、化学的方法により、または翻訳後プロセスにおいて酵素により修飾することができる。
【００３０】
本発明による用語「融合タンパク質」は、２つ以上の遺伝子、ｃＤＮＡまたは元々、別個のタンパク質／ペプチドをコードした配列の結合を介して作出されるタンパク質に関する。遺伝子は、同一生物体もしくは異なる生物体中で天然に発生し得、または合成ポリヌクレオチドであり得る。
【００３１】
本明細書において使用される用語「治療タンパク質」は、治療効果を有するタンパク質またはポリペプチド、すなわち、活性医薬成分として使用されるタンパク質に関する。
【００３２】
２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「配列同一性」により記載される。本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａ／．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）、好ましくは、バージョン３．０．０以降のもののＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実行されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を使用して決定される。使用される任意選択のパラメータは、ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」（ノーブリーフ（ｎｏ  ｂｒｉｅｆ）オプションを使用して得る）と表示されるＮｅｅｄｌｅの出力値が同一性パーセントとして使用され、以下のとおり計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００３３】
暫定的用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」または「〜を特徴とする」と同義であり、包括的または非限定であり、追加の列挙されない要素も方法ステップも除外しない。暫定的語句「〜からなる」は、特許請求の範囲において規定されない任意の要素、ステップ、または成分を、通常それに伴う不純物を除き、除外する。語句「〜からなる」が、以下のプリアンブル直後でなく、特許請求の範囲の本体の節において出現する場合、それは、その節に記載の要素のみを限定し；他の要素は、全体として特許請求の範囲から除外されない。暫定的語句「本質的に〜からなる」は、特許請求の範囲の範囲を、特許請求される発明の規定の材料またはステップ「および基本および新規特徴に実質的に影響しないもの」に限定する。「特許請求の範囲の「本質的に〜からなる」は、「からなる」形式において記述される閉鎖クレームおよび「含む」形式で起草される完全開放クレーム間の中立を占める」。
【００３４】
本明細書において使用される「相同」は、それぞれのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列が、参照アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列との規定の同一性の程度を有することを意味する。相同配列は、慣用の配列アラインメントツールＣｌｕｓｔａｌ  Ｖをデフォルトパラメータで使用して対象配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％またはさらには９９％同一であるアミノ酸配列を含むと解釈される。典型的には、相同体は、対象アミノ酸配列と同一の活性部位残基を含むが、任意数の保存アミノ酸置換を含み得る。本明細書において使用される「同一」は、１００％の参照配列とのアミノ酸またはヌクレオチド配列同一性を指す。
【００３５】
用語「組換え体」は、対象の細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して使用される場合、対象が異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然核酸もしくはタンパク質の変更により改変されたこと、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内で見出されない遺伝子を発現し、または天然遺伝子を天然で見出されるものと異なるレベルにおいてもしくは異なる条件下で発現する。
【００３６】
細胞に関して使用される本明細書において使用される用語「形質転換」、「安定的形質転換」、および「トランスジェニック」は、細胞がそのゲノム中に組み込まれ、または複数世代を介して維持されるエピソームとして担持される非天然（例えば、異種）核酸配列を含有することを意味する。
【００３７】
本明細書において使用される用語「断片」は、天然または野生型タンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシル末端欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が全長ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列中の対応する部分と同一であるポリペプチドを指す。断片は、典型的には、少なくとも５０アミノ酸長である。
【００３８】
本明細書において使用される用語「グリコシル化」は、分子、例えば、タンパク質へのグリカンの付着を指す。グリコシル化は、酵素反応であり得る。形成される付着は、共有結合を介するものであり得る。したがって、本明細書において使用されるグリコシル化ポリペプチドは、グリカンが付着しているポリペプチドである。語句「高グリコシル化」は、利用可能なグリコシル化部位、例えば、Ｏ−結合またはＮ−結合グリコシル化部位の全てまたはほぼ全てにおいてグリコシル化されている酵素のような分子を指す。
【００３９】
本明細書において使用される用語「グリカン」は、多糖もしくはオリゴ糖、または糖タンパク質もしくはグリコシル化ポリペプチドの炭水化物区分を指す。グリカンは、単糖残基のホモまたはヘテロポリマーであり得る。これらは、直鎖または分枝鎖分子であり得る。しかし、グリカンは、典型的には、少なくとも３つの糖を含有し、直鎖または分枝鎖であり得る。グリカンとしては、天然糖残基（例えば、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、フコース、ヘキソース、アラビノース、リボース、キシロースなど）および／または修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、ホスホマンノース、６’スルホＮ−アセチルグルコサミンなど）を挙げることができる。
【００４０】
本明細書において使用される用語「Ｏ−グリカン」は、哺乳動物糖タンパク質のセリンおよびトレオニン残基に共有結合している一般に見出されるグリカンを指す。Ｏ−グリカンは、Ｏ−グリコシド結合によりセリンまたはトレオニンの−ＯＨにＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を介してα−結合していてよい。他の結合としては、α−結合Ｏ−フコース、β−結合Ｏ−キシロース、α−結合Ｏ−マンノース、β−結合Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）、α−またはβ−結合Ｏ−ガラクトース、およびα−またはβ−結合Ｏ−グルコースグリカンが挙げられる。
【００４１】
本明細書において使用される用語「シアル酸化」は、シアル酸またはその誘導体と反応した分子、特に、グリカンを指す。
【００４２】
本明細書において使用される用語「結合親和性」または「親和性」は、２つの分子、特に、リガンドおよびタンパク質標的間の結合の強度を示す。結合親和性は、２つの分子間の非共有分子間相互作用、例えば、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用、およびファンデルワールス力により影響を受ける。
【００４３】
本明細書において使用される免疫応答は、適応または自然免疫応答に関する。自然免疫応答は、体内での抗原出現直後または数時間以内に活性化される非特異的防御機序を指す。これらの機序としては、物理的障壁、例えば、皮膚、血液中の化学物質、および体内の外来細胞を攻撃する免疫系細胞が挙げられる。自然免疫応答は、抗原の化学的特性により活性化される。適応免疫応答は、抗原特異的免疫応答を指す。このため、抗原は最初にプロセシングおよび認識されなければならない。抗原が認識されると、適応免疫系は、その抗原を攻撃するように特異的に設計された多数の免疫細胞を作出する。
【００４４】
本明細書において使用される「免疫寛容」（または単に「寛容」）は、免疫系が抗原を攻撃しないプロセスである。これは、３つの形態：中枢寛容、末梢寛容および獲得寛容で生じる。寛容は、身体が自己抗原に対する免疫応答を開始しない「天然」もしくは「自己寛容」、または抗原に対する寛容が免疫系の操作により作出され得る「誘導寛容」のいずれかであり得る。
【００４５】
グリコシル化ポリペプチド
第１の態様によれば、本発明は、少なくとも哺乳動物、好ましくは、ヒトタンパク質の断片と同一または相同であるアミノ酸配列を含むグリコシル化ポリペプチドであって、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有し、哺乳動物タンパク質またはその断片と比較して１つ以上のＳＩＧＬＥＣに対する増加した結合親和性を有するグリコシル化ポリペプチドを提供する。
【００４６】
本発明によるグリコシル化ポリペプチドは、哺乳動物タンパク質をベースとし、すなわち、哺乳動物タンパク質と同一または相同であるアミノ酸配列を含有する。哺乳動物タンパク質は、特に、ヒトタンパク質である。グリコシル化ペプチドのアミノ酸配列が相同または同一であるヒトタンパク質は、好ましくは、グリコシル化タンパク質である。
【００４７】
ヒトタンパク質は、より好ましくは、ヒト血液タンパク質である。ヒト血液タンパク質は、ヒト血液凝固因子、輸送タンパク質、プロテアーゼインヒビター、免疫グロブリン、細胞関連血漿タンパク質、アポリポタンパク質、補体因子、成長因子、抗血管新生（ａｎｔｉａｎｇｉｏｎｅｔｉｃ）タンパク質、高グリコシル化タンパク質、血液因子または別のヒト血液タンパク質であり得る。
【００４８】
ヒト血液凝固因子は、特に、フィブリノーゲン、フィブリン単量体、プロトロンビン、トロンビン、ＦＶ、ＦＸ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩ、フォン・ヴィレブランド因子、ならびにＡＤＡＭＴＳ１３からなる群から選択される。
【００４９】
凝固因子ＦＶ、ＦＸ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩは、不活性、活性形態であることが認識される。したがって、本発明に関して、ＦＶ、ＦＸ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩへの言及は、それぞれ、特に明示されない限り、または文脈から、活性化形態が論理的に含まれ得ない限り、活性化形態ＦＶａ、ＦＸａ、ＦＩＸａ、ＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、およびＦＸＩＩＩａを含む。したがって、例えば、これに関して、ＦＶ、ＦＸ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩは、ＦＶ／ＦＶａ、ＦＸ／ＦＸａ、ＦＩＸ／ＦＩＸａ、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩＩ／ＦＶＩＩＩａ、ＦＸＩ／ＦＸＩａ、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ、ＦＸＩＩＩ／ＦＸＩＩＩａと読むことができる。
【００５０】
輸送タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、ヘモグロビン、およびヘモペキシンから選択することができる。
【００５１】
考えられるプロテアーゼインヒビターは、例えば、β−アンチトロンビン、α−アンチトロンビン、酸化型アンチトロンビン、２−マクログロブリン、Ｃｌインヒビター、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣインヒビター（ＰＡＩ−３）、プロテインＣ、プロテインＳ、およびプロテインＺである。
【００５２】
免疫グロブリンの例は、例えば、ポリクローナル抗体（ＩｇＧ）、モノクローナル抗体、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびベンスジョーンズタンパク質である。
【００５３】
細胞関連血漿タンパク質は、例えば、フィブロネクチン、トロンボグロブリン、血小板第４因子であり得る。アポリポタンパク質の例は、ａｐｏ  Ａ−Ｉ、ａｐｏ  Ａ−ＩＩ、およびａｐｏ  Ｅである。
【００５４】
本発明による補体因子は、例えば、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｈ因子、Ｉ因子、Ｃ３ｂ不活性化因子、プロパージン、Ｃ４結合タンパク質などである。
【００５５】
成長因子の例としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−α）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）および肝細胞成長因子が挙げられる。
【００５６】
抗血管新生タンパク質としては、潜在型アンチトロンビン、プレ潜在型アンチトロンビン、酸化型アンチトロンビンおよびプラスミノーゲンが挙げられる。
【００５７】
高グリコシル化タンパク質の例は、アルファ−１−酸糖タンパク質、アンチキモトリプシン、インター−α−トリプシンインヒビター、α−２−ＨＳ糖タンパク質、Ｃ反応性タンパク質である。血液因子は、例えば、エリスロポエチン、インターフェロン、腫瘍因子、ｔＰＡ、ｇＣＳＦなどであり得る。
【００５８】
他のヒト血液タンパク質としては、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、マンナン結合レクチン、Ｃ４結合タンパク質、フィブロネクチン、ＧＣ−グロブリン、プラスミノーゲン／プラスミン、α−１マイクログロブリン、Ｃ反応性タンパク質が挙げられる。
【００５９】
ヒトタンパク質は、特に、ｖＷＦ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ＡＤＡＭＴＳ１３から選択される。
【００６０】
ヒトにおける第ＶＩＩＩ因子は、６つのエクソン中の１８７．０００個の塩基対を含むＦ８遺伝子によりコードされる。転写されるｍＲＮＡは、９．０２９塩基対の長さを有し、２．３５１個のアミノ酸を有するタンパク質に翻訳され、翻訳後修飾により１９個のアミノ酸がそれから除去される。ヒトにおけるＦＶＩＩＩ分子は、３１個のアミノ酸側鎖上でグリコシル化される（２５×Ｎ−グリコシル化、６×Ｏ−グリコシル化）。
【００６１】
翻訳後、アミノ酸鎖は特異的プロテアーゼにより、約２００ｋＤａを有する重鎖および約８０ｋＤａを有する軽鎖の形成をもたらす位置上で開裂される。ドメイン組織化は、典型的には、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２として特徴づけられる。軽鎖は、ドメインＡ３−Ｃ１−Ｃ２から構成される。重鎖は、原則として、ドメインＡ１−Ａ２−Ｂから構成される。血漿中で見出される重鎖は、９０〜２００ｋＤａで変動する分子量を有する不均一組成を有する。この理由は、そのグリコシル化の不均一性、スプライスバリアントの存在およびタンパク質分解産物、例えば、Ｂドメイン枯渇重鎖Ａ1Ａ2の存在である。全長ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ，Ｊｕｌｙ  ２１，１９８６のＰ００４５１のアミノ酸２０〜２．３５１により特定される。
【００６２】
ヒトタンパク質は、好ましくは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ，Ｊｕｌｙ  ２１，１９８６のＰ００４５１のアミノ酸２０〜２．３５１により特定される全長ＦＶＩＩＩ、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩまたはＢドメインの一部がリンカーにより置き換えられたＦＶＩＩＩタンパク質である。
【００６３】
ｖＷＦは、複数の生理学的機能を有する、哺乳動物の血漿中に存在する多量体接着糖タンパク質である。一次止血の間、ｖＷＦは、血小板表面上の特異的受容体および細胞外マトリックスの構成成分、例えば、コラーゲン間のメディエーターとして作用する。さらに、ｖＷＦは、凝血促進第ＶＩＩＩ因子のための担体および安定化タンパク質として機能する。ｖＷＦは、内皮細胞および巨核球中で、２８１３アミノ酸の前駆分子として合成される。前駆ポリペプチドのプレプロｖＷＦは、２２残基のシグナルペプチド、７４１残基のプロペプチドおよび成熟血漿フォン・ヴィレブランド因子中に見出される２０５０残基のポリペプチドからなる（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。全長ｖＷＦは、ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０４２７５により特定される。
【００６４】
ｖＷＦは、血漿中への分泌時、異なる分子サイズを有する種々の種の形態で循環する。これらのｖＷＦ分子は、２０５０個のアミノ酸残基の成熟サブユニットのオリゴマーおよび多量体からなる。ｖＷＦは、通常、血漿中で、約５００〜２０．０００ｋＤａのサイズの範囲の多量体として見出すことができる（Ｆｕｒｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。ｖＷＦは、特に、ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０４２７５の配列のいずれかのアミノ酸配列を有する。より好ましくは、ｖＷＦタンパク質は、配列番号１により特定される。
SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCSQPLDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANIGPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNVVPEKAHLLSLVDVMQREGGPSQIGDALGFAVRYLTSEMHGARPGASKAVVILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGIGDRYDAAQLRILAGPAGDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGNEKRPGDVWTLPDQCHTVTCQPDGQTLLKSHRVNCDRGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVCTGSSTRHIVTFDGQNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGARQGCMKSIEVKHSALSVELHSDMEVTVNGRLVSVPYVGGNMEVNVYGAIMHEVRFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSPKTFASKTYGLCGICDENGANDFMLRDGTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILEEQCLVPDSSHCQVLLLPLFAECHKVLAPATFYAICQQDSCHQEQVCEVIASYAHLCRTNGVCVDWRTPDFCAMSCPPSLVYNHCEHGCPRHCDGNVSSCGDHPSEGCFCPPDKVMLEGSCVPEEACTQCIGEDGVQHQFLEAWVPDHQPCQICTCLSGRKVNCTTQPCPTAKAPTCGLCEVARLRQNADQCCPEYECVCDPVSCDLPPVPHCERGLQPTLTNPGECRPNFTCACRKEECKRVSPPSCPPHRLPTLRKTQCCDEYECACNCVNSTVSCPLGYLASTATNDCGCTTTTCLPDKVCVHRSTIYPVGQFWEEGCDVCTCTDMEDAVMGLRVAQCSQKPCEDSCRSGFTYVLHEGECCGRCLPSACEVVTGSPRGDSQSSWKSVGSQWASPENPCLINECVRVKEEVFIQQRNVSCPQLEVPVCPSGFQLSCKTSACCPSCRCERMEACMLNGTVIGPGKTVMIDVCTTCRCMVQVGVISGFKLECRKTTCNPCPLGYKEENNTGECCGRCLPTACTIQLRGGQIMTLKRDETLQDGCDTHFCKVNERGEYFWEKRVTGCPPFDEHKCLAEGGKIMKIPGTCCDTCEEPECNDITARLQYVKVGSCKSEVEVDIHYCQGKCASKAMYSIDINDVQDQCSCCSPTRTEPMQVALHCTNGSVVYHEVLNAMECKCSPRKCSK（配列番号１）
【００６５】
グリコシル化ポリペプチドは、例えば、国際公開第２０１５／１８５７５８Ａ２号パンフレットに定義されるｖＷＦの断片を含有し得る。国際公開第２０１５／１８５７５８Ａ２号パンフレットに示されるとおり、それに定義されるＦＶＩＩＩおよびｖＷＦ断片の複合体は、ＦＶＩＩＩ単独と比較して低減したリン脂質膜への結合ならびにＦＶＩＩＩおよび全長ｖＷＦの複合体と比較して低減したコラーゲンＩＩＩおよびヘパリンへの結合を示す。
【００６６】
これに関して、ｖＷＦの断片は、特に、配列番号１のアミノ酸７６４から開始する断片である。配列番号１のアミノ酸７６４〜１０３５は、ｖＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメインを含む。
【００６７】
ｖＷＦの断片は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸７６４から開始し、好ましくは、１９０５〜２１５３の範囲の配列番号１のアミノ酸で終了する。断片は、より好ましくは、２０３０〜２１５３の範囲のｖＷＦ断片のアミノ酸で終了する。より好ましくは、ｖＷＦ断片は、２１００〜２１５３の範囲の配列番号１のアミノ酸で終了する。
【００６８】
グリコシル化ポリペプチドは、グリコシル化ペプチド中に含有されるアミノ酸配列により定義される哺乳動物タンパク質または断片と比較して増加した結合親和性を有することを理解すべきである。したがって、グリコシル化ポリペプチドが全長哺乳動物タンパク質のアミノ酸配列を含む場合、グリコシル化ポリペプチドは、全長哺乳動物タンパク質と比較してＳＩＧＬＥＣに対する高い親和性を有する。
【００６９】
他方、グリコシル化ポリペプチドが哺乳動物タンパク質の部分配列により定義される哺乳動物タンパク質の断片を含む場合、グリコシル化ポリペプチドは、天然発生タンパク質に由来する同一断片と比較して増加した結合親和性を有する。例えば、グリコシル化ポリペプチド中のアミノ酸配列がｖＷＦの断片と同一または相同である場合、第１の態様によるグリコシル化ポリペプチドは、血漿由来ｖＷＦの断片化から得られる同一断片と比較して１つ以上のＳＩＧＬＥＣに対する増加した結合親和性を有する。
【００７０】
実施例に示されるとおり、少なくともＳＩＧＬＥＣのＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８およびＳＩＧ−９に特異的に結合するｖＷＦのグリカン構造が決定された（実施例１参照）。したがって、第１の態様の一実施形態によれば、１つ以上のＳＩＧＬＥＣは、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８およびＳＩＧ−９の群から選択される。
【００７１】
本発明者らは、驚くべきことに、ヒトｖＷＦにおいて、Ｏ−グリカンがＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８およびＳＩＧ−９への結合を担うことを見出した。対照的に、Ｎ−グリカンは、それらのＳＩＧＬＥＣへのいかなる結合も示さない（実施例２参照）。これまでのところ、ＳＩＧＬＥＣと相互作用することが示されたのはむしろＮ−グリカンであったため（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）、このことは特に驚くべきことである。
【００７２】
本発明者らは、Ｏ−グリカンが、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、ＳＩＧ−９への結合のためにシアル酸化されていなければならないだけでなく、最小割合のコア２グリカンも存在しなければならないことをさらに決定した（実施例４参照）。
【００７３】
したがって、ＳＩＧＬＥＣ結合および結果的に低減した免疫応答は、哺乳動物タンパク質またはその断片のシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンの数と比較して増加したグリコシル化タンパク質中のシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンの数または割合に基づく。
【００７４】
構造類似性に起因して、シアル酸化伸長コア１型Ｏ−グリカンが、シアル酸化コア２グリカンと同一の効果を有することが想定される。したがって、上記定義のＳＩＧＬＥＣに対する結合親和性を増加させるため、好ましくは、シアル酸化コア２型および伸長コア１型Ｏ−グリカンの合わせた数または割合を増加させる。
【００７５】
したがって、一実施形態によれば、グリコシル化ポリペプチドのシアル酸化コア２型および／または伸長コア１型Ｏ−グリカンの数は、哺乳動物タンパク質またはその断片のシアル酸化コア２型および／または伸長コア１型Ｏ−グリカンの数よりも多い。これに関して、シアル酸化コア２型および／または伸長コア１型Ｏ−グリカンの割合も、哺乳動物タンパク質のコア２型および／または伸長コア１型Ｏ−グリカンの割合と比較して増加している。
【００７６】
これは、グリコシル化ポリペプチドのシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンおよびシアル酸化伸長コア１型Ｏ−グリカンの合わせた数が、哺乳動物タンパク質またはその断片のシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンおよびシアル酸化伸長コア１型Ｏ−グリカンの合わせた数よりも多いことを意味する。
【００７７】
あるいは、シアル酸化コア２型Ｏ−グリカンの数のみを増加させることができる。これに関して、シアル酸化コア２型Ｏ−グリカンの割合も、哺乳動物タンパク質のコア２型Ｏ−グリカンの割合と比較して増加している。
【００７８】
結合が示されたＳＩＧＬＥＣは、ヒトおよびマウスの免疫応答に関与する。ＳＩＧＬＥＣは共通して、シアル酸含有リガンドに結合する１つのＮ末端ＶセットＩｇドメイン、および膜の表面から遠位のリガンド結合側を伸長する変動数のＣ２セットＩｇドメインを有する。
【００７９】
さらに、多くのＳＩＧＬＥＣは、細胞シグナリングの調節に関与する補助受容体中で共通して見出される細胞質チロシンモチーフ、例として、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）およびＩＴＩＭ様モチーフを有する。他のＳＩＧＬＥＣはチロシンモチーフを含有しないが、アダプタータンパク質との会合を許容する正荷電膜貫通領域を含有する。ＳＩＧＬＥＣは、危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を認識しないが、代わりに「自己」の決定因子を認識する。
【００８０】
ＳＩＧＬＥＣは、同一細胞上で「シス」で、および隣接細胞上で「トランス」でそのようなシアル酸化自己リガンドに結合する。ヒトＳＩＧＬＥＣは、通常、ＳＩＧ−１〜ＳＩＧ−１４と称される。マウスＳＩＧＬＥＣのＳＩＧ−Ｅ、ＳＩＧ−ＦおよびＳＩＧ−Ｇは、それぞれヒトＳＩＧＬＥＣのＳＩＧ−９、ＳＩＧ−８およびＳＩＧ−１０のオルソログである。
【００８１】
ＳＩＧ−１〜ＳＩＧ−４は、それぞれ、名称シアロアテシン（Ｓｉａｌｏａｔｅｓｉｎ）、ＣＤ２２、ＣＤ３３およびＭＡＧとも称される。ＣＤ２２およびＳＩＧ−１０はＢ細胞に、ＳＩＧ−５は好中球および単球に、ＳＩＧ−７はＮＫ細胞上に、ＳＩＧ−８は好酸球上に、ＳＩＧ−９は単球、好中球および樹状細胞上に局在する（Ｐａｕｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２）。
【００８２】
ＳＩＧＬＥＣは、種々の異なるグリカン構造に結合する。ＳＩＧＬＥＣのＳＩＧ−２、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、ＳＩＧ−９およびＳＩＧ−１０のそれぞれは、異なるグリカン優先性を有する（Ｐａｕｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＳＩＧＬＥＣは、自然および適応免疫における役割を担う。特に、ヒトおよびマウスのＢ細胞上に局在するＳＩＧ−２およびＳＩＧ−１０である。
【００８３】
Ｐａｕｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．によれば、ＳＩＧ−２およびＳＩＧ−１０は、末梢Ｂ細胞寛容に相乗的に寄与すると考えられる。さらに、ＳＩＧＬＥＣは、トル様受容体（ＴＲＬ）についての阻害補助受容体として作用すると考えられる。これに関して、活性化受容体へのＳＩＧ−７またはＳＩＧ−９の架橋がそれぞれ、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞溶解活性およびマスト細胞からの化学メディエーターの放出の阻害をもたらすことが示された。
【００８４】
さらに、固定化抗体によるＳＩＧ−Ｅ（ＳＩＧ−９）およびＳＩＧ−１１の架橋は、マクロファージにおけるＬＰＳに応答するサイトカイン産生の阻害をもたらす。
【００８５】
注目すべきことに、マクロファージ細胞株中のＳＩＧ−５およびＳＩＧ−９の局所的発現は、ペプチドグリカン、ＡＴＬＲ２リガンド、ＬＰＳおよびＣｐＧに応答してＴＮＦ−アルファ産生を阻害し、ＩＬ−１０産生を向上させることが示されている。さらに、マクロファージ中のＬＰＳ誘導ＳＩＧ−Ｅ（ＳＩＧ−９）発現は、ＴＲＬシグナリングを生じさせる効果と考えられる。さらに、シアル酸化病原体は、ＳＩＧＬＥＣを介して免疫応答を減衰させる。一例として、Ｂ群連鎖球菌は、莢膜多糖上でＮｅｕ−Ａｃα−１Ｇａｌβ−１  ４ＧｌｃＮＡｃ残基を発現し、好中球上のＳＩＧＬＥＣ−９をリクルートし、好中球の殺菌機能の抑制をもたらす。
【００８６】
したがって、理論により拘束されるものではないが、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞など）上のＳＩＧＬＥＣへの結合は、炎症促進の下方調節および細胞表面上の免疫抑制受容体発現の上方調節をもたらすことが考えられる。さらに、結合は、抗炎症性サイトカインの向上した産生をもたらし、炎症促進性サイトカインの産生を低下させ、結果的に、Ｔ細胞増殖および抗体産生に対する阻害をもたらす。したがって、ＳＩＧＬＥＣのＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８およびＳＩＧ−９の結合は、グリコシル化ポリペプチドが患者に投与された場合に低減した免疫応答または増加した免疫寛容をもたらす。
【００８７】
したがって、第１の態様によるグリコシル化ポリペプチドは、少なくとも哺乳動物、好ましくは、ヒトタンパク質の断片と同一または相同であるアミノ酸配列を含むグリコシル化ポリペプチドであって、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有し、哺乳動物タンパク質またはその断片と比較して、
−  グリコシル化ポリペプチドに対するヒトの免疫応答が低減しており；および／または
−  グリコシル化ポリペプチドに対するヒトの免疫寛容が増加している
グリコシル化ポリペプチドと定義することもできる。
【００８８】
他方、本発明の第１の態様のより構造的な定義は、少なくとも哺乳動物、好ましくは、ヒトタンパク質の断片と同一または相同であるアミノ酸配列を含むグリコシル化ポリペプチドであって、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有し、グリコシル化ポリペプチドのシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンおよびシアル酸化伸長コア１型Ｏ−グリカンの合わせた数が、哺乳動物タンパク質またはその断片のシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンおよびシアル酸化伸長コア１型Ｏ−グリカンの合わせた数よりも多いグリコシル化ポリペプチドである。
【００８９】
好ましくは、少なくとも哺乳動物、好ましくは、ヒトタンパク質の断片と同一または相同であるアミノ酸配列を含むグリコシル化ポリペプチドであって、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有し、グリコシル化ポリペプチドのシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンの数が、哺乳動物タンパク質またはその断片のシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンの合わせた数よりも多いグリコシル化ポリペプチド。
【００９０】
Ｏ−グリカンをグリコシル化ポリペプチドのアミノ酸配列にカップリングさせるため、それは１つ以上のＯ−グリコシル化部位を含有した。グリコシル化ポリペプチドのＯ−グリコシル化部位は、標準的なＯ−グリコシル化部位セリン（Ｓｅｒ）、およびトレオニン（Ｔｈｒ）であり得る。しかしながら、さらに、チロシン（Ｔｙｒ）、ヒドロキシリジン（ヒドロキシ−Ｌｙｓ）またはヒドロキシプロリン（ヒドロキシ−Ｐｒｏ）へのＯ−グリカンの結合が記載されており、本発明に関して考えられる。したがって、グリコシル化ポリペプチド中の１つ以上のＯ−グリコシル化部位は、任意のさらなる考えられるＯ−グリコシル化部位中のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ヒドロキシ−Ｌｙｓおよびヒドロキシ−Ｐｒｏから選択することができる。好ましくは、Ｏ−グリコシル化部位は、ＳｅｒおよびＴｈｒから選択される。
【００９１】
標準的なグリコシル化部位ＳｅｒおよびＴｈｒは、一般に、Ｏ−グリカンによる最大占有を示す。したがって、一実施形態によれば、１つ以上のグリコシル化部位は、ＳｅｒおよびＴｈｒから選択される。
【００９２】
本発明に関して、実用的理由から、用語「グリコシル化ポリペプチド」は、単数形で使用される。一般に、グリコシル化ポリペプチドは、同一タイプのポリペプチドの組成物の形態で生じる。これに関して、早期形態のグリコシル化ポリペプチドは、同一のアミノ酸配列を有するが、グリコシル化の分散を有するグリコシル化ポリペプチドの組成物である。例えば、組成物の個々の分子の全てが１００パーセントまでグリコシル化され得るわけではない。さらに、規定のＯ−グリコシル化部位に結合しているグリカンにおける差異が生じ得る。したがって、本発明はまた、少なくとも第１のタイプのグリコシル化ポリペプチド分子を含む組成物であって、第１のタイプのタンパク質分子のアミノ酸配列は、少なくとも哺乳動物、好ましくは、ヒトタンパク質の断片と同一または相同であり、タンパク質分子は、１つ以上のグリコシル化部位を含有する組成物に関する。
【００９３】
好ましくは、ポリペプチドは、グリコシル化部位の１つ以上のクラスターを含有する。単一グリコシル化部位がＳＩＧＬＥＣ結合に十分であり得るが、Ｏ−グリコシル化部位のクラスターの形成がＳＩＧＬＥＣへの改善された結合をもたらすことが想定される。グリコシル化部位のクラスター形成は哺乳動物タンパク質において観察されることが多く、例は、ヒンジ領域（Ｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．２０１３参照）およびヒトムチン（Ｇｕｚｍａｎ−Ａｒａｎｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ａｒｇｕｅｅｓｏ  ２０１０参照）中のクラスター化Ｏ−グリカンを含有するヒトＩｇＡである。
【００９４】
これに関して、近接している既に２つのＯ−グリコシル化部位が、Ｏ−グリコシル化クラスターにおいて考慮される。したがって、Ｏ−グリコシル化部位の１つ以上のクラスターは、少なくとも２つのＯ−グリコシル化部位を含有する。Ｏ−グリコシル化部位のクラスターは、異なる数のＯ−グリコシル化部位を有し得る。例えば、グリコシル化ポリペプチドは、２つのグリコシル化部位を有する１つのクラスターおよび３つのグリコシル化部位を有する第２のクラスターを含有し得る。クラスターのＯ−グリコシル化部位間には、Ｎ−グリコシル化部位も存在し得る。好ましくは、Ｏ−グリコシル化クラスター中にＮ−グリコシル化部位は存在しない。
【００９５】
さらに、１つのクラスターは３つのグリコシル化部位を含有し得、他のクラスターは４つのＯ−グリコシル化部位を含有し得る。多数の３つのＯ−グリコシル化部位は、全てがＳＩＧＬＥＣと相互作用し、したがって、増加した効果をもたらし得る３つの隣接Ｏ−グリカンをもたらす。一実施形態によれば、Ｏ−グリコシル化部位の１つ以上のクラスターは、好ましくは、少なくとも３つのＯ−グリコシル化部位を含有する。
【００９６】
ｖＷＦにおいて、それぞれ４つのＯ−グリコシル化部位を有する２つのクラスターが存在する。したがって、好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも４つのＯ−グリコシル化部位を有する１つ以上のクラスターを含有する。現在、Ｏ−グリコシル化部位の数が多ければ多いほど、結合親和性が大きくなることが想定される。
【００９７】
Ｏ−グリコシル化部位のクラスターは、アミノ酸配列中の短い距離内の２つ以上のＯ−グリコシル化部位により定義することができる。それらのクラスターは、「配列クラスター」とも称される。しかしながら、グリコシル化ポリペプチドの三次元アセンブリに起因して、Ｏ−グリコシル化クラスターは、アミノ酸配列内で遠い距離で存在するが、フォールディング後に近接して局在するＯ−グリコシル化部位も含み得る。この後者のクラスターは、「フォールディングクラスター」とも称される。
【００９８】
ｖＷＦ  Ｏ−グリコシル化クラスター２は、２０アミノ酸内で４つのＯ−グリコシル化部位を含有し、それらはベータターンとして配置される。したがって、Ｏ−グリカンまたはＯ−グリコシル化部位の距離は２７．２Å〜３４．０Åであり、６．８Å〜８．５Åの平均距離をもたらす。したがって、クラスター中の２つのＯ−グリコシル化部位の平均距離は、４．０Å〜１５．０Åの範囲であり得る。４．０Å未満では、Ｏ−グリカンの立体障害が存在し得、特に、両方のＯ−グリコシル化部位をグリコシル化することが可能でない場合がある。２つのアミノ酸の平均距離が１５．０Å超を超えると、Ｏ−グリカンの協調効果が存在しない可能性が高い。協調効果は、例えば、同一細胞上でのＳＩＧＬＥＣとの相互作用である。好ましくは、クラスター中の２つのＯ−グリコシル化部位の平均距離は、５．０Å〜１２．０Åの範囲である。より好ましくは、クラスター中の２つのＯ−グリコシル化部位の平均距離は、６．０Å〜９．０Åの範囲である。
【００９９】
フォールディングクラスターは、１００アミノ酸超のアミノ酸配列に及び得る。しかしながら、クラスターの空間配置は８０Åを超過しないことが好ましい。Ｏ−グリコシル化部位が８０Åを超えて離れている場合、Ｏ−グリカンは組合せ効果を示さないことが想定される。クラスター中のＯ−グリカンの組合せ効果は、Ｏ−グリカンが５０Åの直径を有する区域内に局在する場合に最も強力である。したがって、より好ましくは、クラスターの空間配置は５０Åを超過しない。
【０１００】
一実施形態によれば、１つ以上のクラスター、すなわち、配列クラスターは、１０個のアミノ酸中の少なくとも１つのＯ−グリコシル化部位を含有する。Ｏ−グリコシル化がさらに拡散している場合、Ｏ−グリコシル化部位に結合しているＯ−グリカンは、おそらく、ＳＩＧＬＥＣを含有する同一細胞上で一緒に作用し得ないことが考えられる。
【０１０１】
好ましくは、１つ以上のクラスターは、４つのアミノ酸中の少なくとも１つのＯ−グリコシル化部位を含有する。４つのアミノ酸のＯ−グリコシル化部位の平均距離では、Ｏ−グリコシル化部位がフォールディング後にも近接する可能性が高い。空間的近接性は、同一細胞上でのＳＩＧＬＥＣとのクラスター中のグリカンの協調相互作用を可能とする。
【０１０２】
より好ましくは、１つ以上のクラスターは、３つのアミノ酸中の少なくとも１つのＯ−グリコシル化部位を含有する。実施例において示されるとおり、試験ｖＷＦペプチドは、２つのアミノ酸中の１つのグリコシル化部位を有するクラスターを含有する。したがって、好ましい実施形態によれば、１つ以上のクラスターは、２つのアミノ酸中の少なくとも１つのグリコシル化部位を含有する。
【０１０３】
実施例において示されるとおり、そのようなＯ−グリコシル化クラスターの既に１つが、ＳＩＧＬＥＣとの強力な相互作用に十分である。さらに、２つのｖＷＦポリペプチドの比較により、Ｏ−グリコシル化部位のより多数のクラスターがＳＩＧＬＥＣ、特に、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８およびＳＩＧ−９へのペプチドの増加した結合親和性をもたらすことも示される。したがって、グリコシル化ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも２つのグリコシル化クラスター、より好ましくは、少なくとも３つのグリコシル化クラスターを含む。
【０１０４】
理論により拘束されるものではないが、クラスターの局在が近ければ近いほど、ＳＩＧＬＥＣに対するグリコシル化ポリペプチドの結合親和性が大きくなる。これに関して、２つのクラスターが存在する場合、それらは、好ましくは、１００アミノ酸未満だけ離隔している。１００アミノ酸未満の距離は、ＳＩＧＬＥＣ結合におけるグリカンのクラスターの協調効果を可能とする。より好ましくは、２つのクラスターは、５０アミノ酸未満だけ離隔している。最も好ましくは、２つのクラスターは、３０アミノ酸未満だけ離隔している。
【０１０５】
一実施形態によれば、任意の２つの隣接クラスター間の距離は、１００アミノ酸未満であり、好ましくは、グリコシル化ポリペプチド内の任意の２つのクラスター間の距離は、５０アミノ酸未満である。より好ましくは、任意の２つの隣接クラスター間の距離は、３０アミノ酸未満である。
【０１０６】
グリコシル化ポリペプチドは、好ましくは、配列が相同または同一であるヒトタンパク質と比較してＯ−グリコシル化部位の少なくとも１つの追加のクラスターを含有する。
【０１０７】
上記定義のとおり、全てのグリコシル化ポリペプチドと同様、本発明によるグリコシル化ポリペプチドは、グリコシル化ポリペプチド分子の組成物を表す。これらの分子は、グリコシル化パターン内のある程度の不均一性を示し、特に、グリコシル化部位の全てが必ずしもＯ−グリカンにより占有されているわけではない。Ｏ−グリカンによる占有は、特に、推奨されるグリコシル化ポリペプチドが産生される宿主細胞に依存的である。好ましくは、宿主細胞、すなわち、発現系は、Ｏ−グリコシル化部位の占有の割合が７０％を超えるように選択される。占有が７０％未満では、ＳＩＧＬＥＣ結合に十分でないＯ−グリカンが存在し得る。好ましくは、Ｏ−グリコシル化部位の８０％超が、Ｏ−グリカンにより占有される。より好ましくは、Ｏ−グリコシル化部位の９０％超が、Ｏ−グリカンにより占有される。好ましい実施形態によれば、Ｏ−グリコシル化部位の９５％超が、Ｏ−グリカンにより占有される。
【０１０８】
グリコシル化ポリペプチドに付着しているグリカンの組成は、産生の方法に依存する。Ｏ−グリカンは、天然の合成グリカンであり得る。天然Ｏ−グリカンは、例えば、以下のコア構造を有するグリカンである：
コア１型Ｏ−グリカン：Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ
伸長コア１：Ｏ−グリカン：Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ
コア２型Ｏ−グリカン：Ｇａｌβ１→３（Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→６）ＧａｌＮＡｃ  α１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ
【０１０９】
ＳＩＧＬＥＣは、シアル酸に結合することが公知である。これと一致して、実施例において、脱シアル酸化がＳＩＧＬＥＣへの結合を停止させたことが示される（実施例３参照）。したがって、Ｏ−グリカンのシアル酸化は、結合のための前提条件であることが裏付けられる。したがって、グリコシル化ポリペプチド中のＯ−グリカンの高い割合のシアル酸化が好ましい。
【０１１０】
したがって、グリコシル化ポリペプチドのＯ−グリカンは、好ましくは、シアル酸化されており、すなわち、グリカン分子の一部として少なくとも１つのシアル酸を含有する。
【０１１１】
好ましくは、シアル酸化Ｏ−グリカンは、アルファ２−３グリコシド結合で少なくとも２つのシアル酸を含有する。あるいは、シアル酸化Ｏ−グリカンは、アルファ２−８グリコシド結合で２つのシアル酸を含有し得る。シアル酸化Ｏ−グリカンは、アルファ２−３およびアルファ２−８グリコシド結合も含み得る。一実施形態によれば、シアル酸化Ｏ−グリカンは、２−３および／または２−８グリコシド結合で少なくとも３つのシアル酸を含有する。グリコシル化ポリペプチド中のシアル酸化Ｏ−グリカンは、特に、コア１型またはコア２型Ｏ−グリカンである。コア１型、伸長コア１型およびコア２型Ｏ−グリカンの構造の概要を以下に挙げる：
シアル酸化コア１：Ｏ−グリカン：ＮｅｕＮＡｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ
シアル酸化伸長コア１型Ｏ−グリカン：
ＮｅｕＮＡｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ
シアル酸化コア２型Ｏ−グリカン：ＮｅｕＮＡｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（ＮｅｕＮＡｃα２→３Ｇａｌβ１→３）ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ
【０１１２】
コア１およびコア２の両方ならびに／または伸長コア１型Ｏ−グリカンが、グリコシル化ポリペプチド上に存在する必要があると考えられる。一実施形態によれば、グリコシル化ポリペプチドは、シアル酸化コア１型Ｏ−グリカンならびにシアル酸化コア２型および／または伸長コア１型Ｏ−グリカンを含む。実施例４において示されるとおり、Ｏ−グリカンの総数に基づくコア２グリカンの割合２．５％は、ＳＩＧＬＥＣ相互作用に十分でない。したがって、グリコシル化ポリペプチドの一実施形態によれば、Ｏ−グリカンの数に基づくコア２型Ｏ−グリカンの割合は、少なくとも５％である。同一の実施例において、Ｏ−グリカンの数に基づくコア２型Ｏ−グリカン割合１０．７８％を有するクラスター２が、ＳＩＧＬＥＣとの強力な相互作用をもたらすことが示される。したがって、好ましい実施形態によれば、グリコシル化ポリペプチド中のＯ−グリカンの数に基づくコア２型Ｏ−グリカンの割合は、少なくとも８％である。より好ましくは、Ｏ−グリカンの数に基づくコア２型Ｏ−グリカンの割合は、少なくとも１０％である。
【０１１３】
実施例７において、組換え産生ｖＷＦペプチドの糖ペプチド分子の約８０％が、コア２型Ｏ−グリカンまたは伸長コア１グリカンのいずれかを含有することが決定された。したがって、Ｏ−グリカンの総数に基づくシアル酸化コア２型および／または伸長コア１型Ｏ−グリカンの割合は、少なくとも２０％である。したがって、一実施形態によれば、グリコシル化ポリペプチド中のＯ−グリカンの数に基づくコア２型および／または伸長コア１型Ｏ−グリカンの濃度は、少なくとも１５％、より好ましくは、少なくとも１８％、最も好ましくは、少なくとも２０％である。
【０１１４】
グリコシル化ポリペプチド中のコア２型Ｏ−グリカンの数または割合、特に、コア２型Ｏ−グリカンを担持するグリコシル化ポリペプチドの個々の分子の数または割合は、以下の方針のいずれかにより増加させることができる：
【０１１５】
１つの方針は、酵素β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを使用することである。この酵素は、コア２型Ｏ−グリカンの形成に関与する。したがって、コア２担持分子および／またはポリペプチド分子当たりのコア２型Ｏ−グリカンの数の増加は、酵素β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを過剰発現する細胞株中でのグリコシル化ポリペプチドの発現により得ることができる。
【０１１６】
別の任意選択は、癌細胞株に由来する発現細胞株中でのグリコシル化ポリペプチドの発現である。癌細胞株は、より多量のコア２型Ｏ−グリカンを有するグリコシル化タンパク質を産生することが示されることが多い。
【０１１７】
伸長コア１の割合を増加させる１つの方針は、酵素β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを使用することである。この酵素は、伸長コア１型Ｏ−グリカンの形成に関与する。したがって、伸長コア１担持分子および／またはポリペプチド分子当たりの伸長コア１型Ｏ−グリカンの数の増加は、酵素β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを過剰発現する細胞株中でのグリコシル化ポリペプチドの発現により得ることができる。
【０１１８】
コア２および／または伸長コア１シアル酸化Ｏ−グリカンの濃度は、グリカンの化学合成により増加させることができる。
【０１１９】
したがって、本発明の教示に基づき、当業者は、グリカンを適合させて高い結合親和性を有する合成グリカンを決定することができる。好ましい実施形態によれば、Ｏ−グリカンは、天然グリカンである。
【０１２０】
一実施形態によれば、グリコシル化ポリペプチド中のシアル酸化コア２−Ｏ−グリカンの少なくとも一部は、コア２型Ｏ−グリカン中のガラクトース（Ｇａｌ）もしくはＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＧｌｃＮＡｃ）に付着しているスルフェート基またはＧｌｃＮＡｃに付着しているフコースを含有し、それはＳＩＧＬＥＣ７、８および８についての高い親和性結合リガンドを表す（Ｐａｕｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【０１２１】
追加のＯ−グリコシル化部位を産生するための当業者に公知である様々な手法が存在する。グリコシル化ポリペプチドは、ヒトタンパク質またはその断片と比較して増加したＯ−グリコシル化部位の数に起因して増加した数のシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンを有し得る。
【０１２２】
これに関して、グリコシル化ポリペプチドは、融合タンパク質であって、１つ以上のＯ−グリコシル化部位を含有する第２のアミノ酸配列が、ヒトタンパク質またはその断片と同一または相同であるアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列）に共有結合している融合タンパク質であり得る。第２のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列に関してＮ末端に局在させることができる。あるいは、第２のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列に関してＣ末端に局在させることができる。グリコシル化ポリペプチドは、第１のアミノ酸配列に対してＮおよびＣ末端の両方に追加のアミノ酸配列を含有し得る。
【０１２３】
したがって、このような融合タンパク質において、主にＯ−グリコシル化部位、特に、Ｏ−グリコシル化クラスターを含有する第２のアミノ酸配列および場合によりさらなるアミノ酸配列が、存在し得る。Ｏ−グリコシル化部位のクラスターは、公知の哺乳動物、特に、ヒトタンパク質グリコシル化タンパク質のアミノ酸配列をベースとし得る。
【０１２４】
第２のアミノ酸配列は、以下のＯ−グリコシル化クラスターの１つ以上を含み得る：
VVPPTXAPVXPTTXYVXXXSXPP（配列番号８）、
VVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPP（配列番号９）、
PPPTXPPXXAXVTVXPXXXXVSTXXP（配列番号１０）、
PPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGP（配列番号１１）、
VSSTSXXXXSTXPSXXXAAXTXXTSSXXPPSXPVXXXSXXXTTXXXX（配列番号１２）、
VSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDDTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGK（配列番号１３）、
XXXATTXPXXXXXXTXPXXX（配列番号１４）、
QFNATTIPENDIEKTDPWFA（配列番号１５）、
XXTTAATXXX（配列番号１６）、
LGTTAATELK（配列番号１７）、
XXPTPXXXSXSXXXEAX（配列番号１８）、
QSPTPHGLSLSDLQEAK（配列番号１９）；
VXXXXXXXXXTXTSXXSPXXXXXVXXSXXXXTXXAXX（配列番号２０）、および
VHIYQKDLFFTETSDGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIK（配列番号２１）。
【０１２５】
配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の配列において、Ｘは、天然アミノ酸のいずれかを意味する。
【０１２６】
配列番号９および１１はｖＷＦ中に見出され、配列番号１３、１５、１７、１９および２１はＦＶＩＩＩのＢドメインに由来する。
【０１２７】
第２のアミノ酸配列は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８および２０から選択される配列の１つ以上を含み得る。第２のアミノ酸配列は、配列の組合せを含有し得る。第２のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の配列の１つの複数コピーを含む。第２のアミノ酸配列は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の複数コピーの組合せをさらに含み得る。
【０１２８】
第２のアミノ酸配列は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９および２１から選択される配列の１つ以上を含み得る。第２のアミノ酸配列は、配列の組合せを含有し得る。第２のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９および２１の配列の１つの複数コピーを含む。第２のアミノ酸配列は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９および２１の複数コピーの組合せをさらに含み得る。
【０１２９】
好ましい実施形態によれば、第２のアミノ酸配列は、配列番号８のコピーの１つ以上を含有する。
【０１３０】
さらに第２のアミノ酸配列は、天然発生グリコシル化タンパク質の配列とのある割合の同一性を有し得る。天然発生タンパク質との同一性のレベルは、好ましくは、８０％、より好ましくは、少なくとも９０％である。
【０１３１】
あるいは、第２のアミノ酸配列中のＯ−グリコシル化部位のアミノ酸配列は、完全合成であり得る。本明細書において使用される完全合成アミノ酸配列は、公知のタンパク質、特に、哺乳動物タンパク質をベースとしない配列である。
【０１３２】
一実施形態によれば、グリコシル化ポリペプチド中で第２のアミノ酸配列をヒトタンパク質またはその断片と同一または相同であるアミノ酸配列に連結する共有結合リンカーは、ペプチド結合、化学リンカー、またはグリコシド結合から選択される。これに関して適格な化学リンカーは、
−  アミン−アミンリンカー、例えば、ビスマレイミドエタン、１，８−ビスマレイミド−ジエチレングリコール、
−  アミン−スルフヒドリルリンカー、例えば、スクシンイミジルヨードアセテート、Ｎ−α−マレイミドアセト−オキシスクシンイミドエステル、
−  カルボキシル−アミンリンカーのジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩および
−  スルフヒドリル−炭水化物リンカー、例えば、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸ヒドラジド、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸ヒドラジド
である。
【０１３３】
本発明による融合タンパク質のリンカーは、融合タンパク質を定める第１および第２のアミノ酸配列を離隔するスペーサーペプチド配列により形成することができる。スペーサーペプチド配列は、個々のタンパク質またはペプチド部分の正確なフォールディングを容易にし得、それにより、個々のタンパク質またはペプチド部分がそれらの個々の機能的特性を保持する可能性がより高くなる。スペーサーペプチド配列は、完全融合タンパク質ＤＮＡ配列を構成する個々のＤＮＡ断片のインフレームアセンブリの間、すなわち、オーバーラッピングＰＣＲまたはＤＮＡライゲーションの間に融合タンパク質ＤＮＡ配列中に挿入することができる。
【０１３４】
ペプチド結合は、完全グリコシル化ポリペプチドを融合タンパク質として一度に発現させることができるという利点を有する。
【０１３５】
第２のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列に化学リンカーにより付加することができ、したがって、タンパク質の発現後に付加することができる。
【０１３６】
実施例において示されるとおり、したがって、特に、Ｏ−グリコシル化クラスター１および／または２を含有するｖＷＦおよび断片は、ＳＩＧＬＥＣに結合する。
【０１３７】
したがって、一実施形態によれば、ヒトタンパク質は、ＦＶＩＩＩまたはその断片である。したがって、グリコシル化ポリペプチド中のＦＶＩＩＩとの配列同一性は、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、最も好ましくは、少なくとも９８％である。好ましい実施形態によれば、第１のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸７６４〜１２６８と同一または相同である。
【０１３８】
第２のアミノ酸配列の長さは、好ましくは、５〜１００アミノ酸、より好ましくは、１０〜８０アミノ酸、最も好ましくは、２０〜７０アミノ酸の範囲である。
【０１３９】
一実施形態によれば、第２のアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸１２３８〜１２６８と少なくとも９８％相同である。好ましくは、第２のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１２３８〜１２６８と同一である。より好ましい実施形態によれば、第２のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１２３８〜１２６８の２つの連続コピーと少なくとも９８％相同である。好ましくは、第２のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１２３８〜１２６８の２つの連続コピーと同一である。
【０１４０】
本発明による代表的な融合タンパク質は、Ｓｅｑ１２である。Ｓｅｑ１２は、以下のアミノ酸配列（配列番号２）を有する：
SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSIS
VVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLH
【０１４１】
以下の配列（配列番号３）は、追加の１２アミノ酸シグナルペプチド（太字および下線）を有するＳｅｑ１２を表す。このペプチドの発現は、Ｓｅｑ１２の単量体形態を提供する。シグナルペプチドは、酵素的に開裂される。
2019519220.tif 000003
【０１４２】
さらなる代表的な本発明による融合タンパク質は、Ｓｅｑ１２およびシグナルペプチド（太字および下線）を有するプロペプチド（太字）を含むＰｒｏ−Ｓｅｑ１２である。Ｐｒｏ−Ｓｅｑ１２は、配列番号４により特定される：
2019519220.tif 000004
【０１４３】
Ｐｒｏ−Ｓｅｑ１２の発現は、二量体の形成をもたらす。ペプチド二量体は、プロペプチドの開裂後もそのままである。
【０１４４】
一実施形態によれば、グリコシル化ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸７６４〜１２６８と少なくとも９８％同一である第１のアミノ酸配列を含有する。第２のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１２３８〜１２６８の２つの連続コピーと少なくとも９８％相同である。
【０１４５】
一実施形態によれば、グリコシル化ポリペプチドは、ヒト細胞株中での発現により産生される。一般に、任意のヒト細胞株がグリコシル化ポリペプチドの発現に好適である。好ましいグリコシル化ペプチドは、特にＨＥＫ細胞株を用いて得られる。
【０１４６】
グリコシル化ポリペプチドの産生のためのＨＥＫ細胞株の例は、ＨＥＫ２９３Ｆ、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ７５００７）、２９３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３）、２９３ＥＢＮＡ、２９３Ｈ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  １１６３１０１７）、２９３Ｓ、２９３Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−３２１６（商標））、２９３Ｔ／１７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１１２６８（商標））、２９３Ｔ／１７ＳＦ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＡＣＳ４５００（商標））、ＨＥＫ２９３ＳＴＦ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ３２４９（商標））、ＨＥＫ−２９３．２ｓｕｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３（商標））である。ポリペプチドの産生に好ましい細胞株は、細胞株としてのＨＥＫ２９３Ｆである。
【０１４７】
発現用宿主細胞として好適な他の細胞株としては、ヒト骨髄性白血病細胞に由来する細胞株が挙げられる。宿主細胞の具体例は、Ｋ５６２、ＮＭ−Ｆ９、ＮＭ−Ｄ４、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６、ＮＭ  Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２、ＧＴ−２Ｘ、ＧＴ−５ｓ、および前記宿主細胞のいずれか１つに由来する細胞である。Ｋ５６２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）に存在するヒト骨髄性白血病細胞株である。残りの細胞株はＫ５６２細胞に由来し、規定のグリコシル化特徴のために選択された。
【０１４８】
代替的実施形態によれば、１つ以上のグリコシル化部位は、哺乳動物タンパク質またはその断片と相同または同一であるアミノ酸配列内に局在する。哺乳動物タンパク質または断片のアミノ酸配列中に存在しないＯ−グリコシル化部位が、グリコシル化ポリペプチド内の相同または同一のアミノ酸配列内に見出されることを理解すべきである。
【０１４９】
哺乳動物タンパク質またはその断片と相同または同一であるアミノ酸配列内の１つ以上のＯ−グリコシル化部位は、配列内に挿入することができる。あるいは、１つ以上のＯ−グリコシル化部位は、哺乳動物タンパク質のアミノ酸と置き換わり得る。アミノ酸の置き換えは、それがポリペプチド鎖のサイズを変化させず、したがって、タンパク質の三次元構造に影響を与える可能性が低いため、好ましい。
【０１５０】
アミノ酸配列内の１つ以上のＯ−グリコシル化部位は、好ましくは、タンパク質の結合部位も活性中心も形成しない配列の部分中に存在する。さらに、１つ以上のＯ−グリコシル化部位は、好ましくは、フォールドしたタンパク質の表面に露出されるアミノ酸位置中で付加される。タンパク質の活性または統合性に対する最小の影響を達成するため、１つ以上のＯ−グリコシル化部位は、タンパク質のフレキシブルループに付加することができる。
【０１５１】
ＦＶＩＩＩタンパク質の場合、１つ以上のＯ−グリコシル化部位は、好ましくは、Ｂドメインの位置中で、またはそれと置き換わって付加される。
【０１５２】
一実施形態において、グリコシル化ポリペプチドは、例えば、半減期または安定性を改善するために１つ以上の生体適合性ポリマーによる付着により修飾される。好適な生体適合性ポリマーとしては、ポリアルキレンオキシド、例えば、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、コロミン酸または他のポリマーベースの炭水化物、アミノ酸のポリマー、ビオチン誘導体、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン−ｃｏ−無水マレイン酸、ポリスチレン−ｃｏ−無水リンゴ酸、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ヘパリン、アルブミン、セルロース、キトサンの加水分解物、デンプン、例えば、ヒドロキシエチル−デンプンおよびヒドロキシプロピル−デンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸加水分解物、他の生体ポリマーおよびその任意の等価物が挙げられる。一実施形態において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。別の実施形態において、ポリマーは、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。他の有用なポリアルキレングリコール化合物は、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリブチレングリコール（ＰＢＧ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）、分枝鎖ポリエチレングリコール、直鎖ポリエチレングリコール、フォーク型ポリエチレングリコールおよび多腕型または「超分枝鎖」ポリエチレングリコール（星型ＰＥＧ）である。生体適合性ポリマーは、好ましくは、以下の残基−ＳＨ、ＯＨ、−ＣＯＯＨの１つによりポリペプチドに連結されている。
【０１５３】
一実施形態によれば、グリコシル化ポリペプチドは、二量体または多量体を形成し得る。二量体、特に多量体の形成は、近接するＯ−グリカンまたはＯ−グリカンクラスターの数を増加させる。したがって、より多くのＯ−グリカンが１つの細胞上でＳＩＧＬＥＣと相互作用し得る。さらに、Ｏ−グリカンは、一緒に密接に局在するいくつかのＳＩＧＬＥＣ発現細胞と相互作用し得、それにより免疫寛容を増加させる。
【０１５４】
多量体化は、グリコシル化ポリペプチドがベースとする哺乳動物タンパク質のアミノ酸配列中の多量体化ドメインの結果であり得る。あるいは、グリコシル化ポリペプチドの多量体は、多量体化ドメインをグリコシル化ポリペプチドのアミノ酸配列中に導入することにより形成することができる。
【０１５５】
多量体を形成する本発明による融合タンパク質の一例は、Ｓｅｑ１２およびシグナルペプチド（太字および下線）を有するプロペプチド（太字）ならびにｖＷＦの多量体化配列「システインノットドメイン」（下線）を含むＰｒｏ−Ｓｅｑ１２−Ｍｕｌｔである。Ｐｒｏ−Ｓｅｑ１２−Ｍｕｌｔは、配列番号５により特定される：
2019519220.tif 000005
【０１５６】
あるいは、グリコシル化ポリペプチドの多量体化は、ポリマーまたはリポソームへの結合により得ることができる。
【０１５７】
グリコシル化ポリペプチドの使用
上記定義のとおり、本発明者らは、シアル酸化コア２型Ｏ−グリカンおよび／またはシアル酸化伸長コア１型Ｏ−グリカンを含むグリカン組成を有するタンパク質が定められるＳＩＧＬＥＣと相互作用し、したがって、哺乳動物の免疫系の細胞に影響を与えることを見出した。特に、グリコシル化ポリペプチドは、低減した免疫応答を示す。したがって、このようなグリコシル化ポリペプチドは、第２のタンパク質と投与された場合、第２のタンパク質に対する患者の免疫応答に影響を与え得る。したがって、シアル酸化コア２型Ｏ−グリカンおよび／またはシアル酸化伸長コア１型Ｏ−グリカンを有するグリコシル化ポリペプチドを使用してタンパク質、特に組合せ投与における治療タンパク質に対する患者の免疫応答を改変し、特に低減させることができる。
【０１５８】
したがって、第２の態様によれば、本発明は、治療タンパク質の免疫応答を低減させるための、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有し、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９から選択される１つ以上のＳＩＧＬＥＣへの結合を示すグリコシル化ポリペプチドの使用に関する。
【０１５９】
好ましくは、免疫応答の低減に使用されるグリコシル化ポリペプチドは、シアル酸化コア２型Ｏ−グリカンおよび／またはシアル酸化伸長コア１型Ｏ−グリカンを含む。より好ましくは、グリコシル化ポリペプチドは、第１の態様によるグリコシル化ポリペプチドとして定義される。
【０１６０】
使用は、治療タンパク質により患者を治療する方法であって、治療タンパク質の免疫応答を低減させるための、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有し、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９から選択される１つ以上のＳＩＧＬＥＣへの結合を示すグリコシル化ポリペプチドを投与することを含む方法として記載することもできる。
【０１６１】
組成物およびタンパク質複合体
したがって、本発明による概念、すなわち、例えば、１つ以上のシアル酸化コア２−Ｏ−グリカンの付加によるヒトタンパク質の低減した免疫応答は、融合タンパク質の調製またはＯ−グリコシル化部位によるアミノ酸の挿入もしくは置き換えによってだけでなく、第２の態様による使用において記載される追加のポリペプチドの付加によっても達成することができる。これは、グリコシル化ポリペプチドおよび免疫応答を低減させるべき第２のポリペプチドの組成物の形成をもたらす。
【０１６２】
したがって、第３の態様において、本発明はまた、第１および第２のポリペプチドを含む組成物であって、第１のポリペプチドは、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有するグリコシル化ポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、第２の哺乳動物、特に、ヒトタンパク質と相同または同一であるアミノ酸配列を含有し、第２のポリペプチドと比較して、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９から選択される１つ以上のＳＩＧＬＥＣから選択されるＳＩＧＬＥＣに対する増加した結合親和性を有する組成物に関する。
【０１６３】
ＳＩＧＬＥＣに対する増加した結合親和性を有するポリペプチドに結合パートナーを、２つのポリペプチドの複合体がポリペプチドと比較してＳＩＧＬＥＣに対する増加した結合親和性を有するように提供することも可能である。
【０１６４】
したがって、第３の態様によれば、本発明は、第１および第２のポリペプチドを含む組成物であって、第１のポリペプチドは、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有するグリコシル化ポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、第２の哺乳動物、特に、ヒトタンパク質と相同または同一であるアミノ酸配列を含有し、第２のポリペプチドと比較して、
−  から選択されるＳＩＧＬＥＣに対する増加した結合親和性を有し；および／または
−  複合体に対するヒトの免疫応答が低減しており；および／または
−  複合体に対するヒトの免疫寛容が増加している
組成物を提供する。
【０１６５】
第２のヒトタンパク質は、好ましくは、ヒト血液タンパク質である。ヒト血液タンパク質は、ヒト血液凝固因子、輸送タンパク質、プロテアーゼインヒビター、免疫グロブリン、細胞関連血漿タンパク質、アポリポタンパク質、補体因子、成長因子、抗血管新生タンパク質、高グリコシル化タンパク質、血液因子または別のヒト血液タンパク質であり得る。
【０１６６】
ヒト血液凝固因子は、特に、フィブリノーゲン、フィブリン単量体、プロトロンビン、トロンビン、ＦＶ／ＦＶａ、ＦＸ／ＦＸａ、ＦＩＸ／ＦＩＸａ、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩＩ／ＦＶＩＩＩａ、ＦＸＩ／ＦＸＩａ、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ、ＦＸＩＩＩ／ＦＸＩＩＩａ、フォン・ヴィレブランド因子、およびＡＤＡＭＴＳ１３からなる群から選択される。
【０１６７】
輸送タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、ヘモグロビン、およびヘモペキシンから選択することができる。
【０１６８】
考えられるプロテアーゼインヒビターは、例えば、β−アンチトロンビン、α−アンチトロンビン、酸化型アンチトロンビン、２−マクログロブリン、Ｃｌインヒビター、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣインヒビター（ＰＡＩ−３）、プロテインＣ、プロテインＳ、およびプロテインＺである。
【０１６９】
免疫グロブリンの例は、例えば、ポリクローナル抗体（ＩｇＧ）、モノクローナル抗体、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびベンスジョーンズタンパク質である。
【０１７０】
細胞関連血漿タンパク質は、例えば、フィブロネクチン、トロンボグロブリン、血小板第４因子であり得る。アポリポタンパク質の例は、ａｐｏ  Ａ−Ｉ、ａｐｏ  Ａ−ＩＩ、およびａｐｏ  Ｅである。
【０１７１】
本発明による補体因子は、例えば、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｈ因子、Ｉ因子、Ｃ３ｂ不活性化因子、プロパージン、Ｃ４結合タンパク質などである。
【０１７２】
成長因子の例としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−α）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）および肝細胞成長因子が挙げられる。
【０１７３】
抗血管新生タンパク質としては、潜在型アンチトロンビン、プレ潜在型アンチトロンビン、酸化型アンチトロンビンおよびプラスミノーゲンが挙げられる。
【０１７４】
高グリコシル化タンパク質の例は、アルファ−１−酸糖タンパク質、アンチキモトリプシン、インター−α−トリプシンインヒビター、α−２−ＨＳ糖タンパク質、Ｃ反応性タンパク質である。血液因子は、例えば、エリスロポエチン、インターフェロン、腫瘍因子、ｔＰＡ、ｇＣＳＦなどであり得る。
【０１７５】
他のヒト血液タンパク質としては、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、マンナン結合レクチン、Ｃ４結合タンパク質、フィブロネクチン、ＧＣ−グロブリン、プラスミノーゲン／プラスミン、α−１マイクログロブリン、Ｃ反応性タンパク質が挙げられる。
【０１７６】
第２のヒトタンパク質は、特に、ｖＷＦ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ、ＦＩＸ、ＡＤＡＭＴＳ１３から選択される。
【０１７７】
第３の態様による組成物は、特に、第１および第２のポリペプチドのタンパク質複合体である。
【０１７８】
第１のポリペプチドは、好ましくは、グリコシル化されており、１つ以上のシアル酸化Ｏ−グリカンを含有する。第２のポリペプチドは、哺乳動物、特に、ヒトタンパク質と同一であるアミノ酸配列を含有する。第２のポリペプチドに対するヒトの免疫応答を低減させるため、第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドとの複合体を形成する。
【０１７９】
タンパク質複合体形成のため、第１のポリペプチドは、特に、第２のポリペプチドへの結合を可能とする結合ドメインおよびグリコシル化ドメインを含む。グリコシル化ドメインは、特に、１つ以上のＯ−グリコシル化部位、好ましくは、Ｏ−グリコシル化クラスターを含む。
【０１８０】
一実施形態によれば、第２のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩタンパク質であり、第１のポリペプチドは、ｖＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメインおよびシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンが結合している１つ以上のＯ−グリコシル化部位を含む。
【０１８１】
組成物の好ましい例は、Ｐ００４５１のアミノ酸２０〜２．３５１により特定される配列と９５％同一であるアミノ酸配列を有するＦＶＩＩＩタンパク質と、配列番号１のアミノ酸７６４〜９３５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む結合パートナーとしての第１のポリペプチドとのタンパク質複合体である。
【０１８２】
第３の態様のタンパク質複合体の一実施形態によれば、第１のポリペプチドは、第１の態様によるポリペプチドである。
【０１８３】
さらなる実施形態によれば、第２のポリペプチドは、例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸおよびＡＤＡＭＴＳ１３から選択することができる。
【０１８４】
第３の態様の一実施形態において、第１のポリペプチドは、少なくともヒトｖＷＦの断片を含み、第２のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩタンパク質、特に、全長ＦＶＩＩＩタンパク質、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質またはＢドメインの一部がリンカーにより置き換えられたＦＶＩＩＩタンパク質である。一実施形態によれば、第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸７６４〜１２６８により定義され、それはＨＥＫ細胞、特に、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で産生される。
【０１８５】
さらなる実施形態によれば、第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸７６４〜１２６８および配列番号１のアミノ酸１２３８〜１２６８の１コピーにより定義される。さらに、第１のポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５から選択されるアミノ酸配列により定義することができる。
【０１８６】
実施例において示されるとおり、ＳＩＧＬＥＣ、特に、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８および／またはＳＩＧ−９に対する改善された結合親和性を有するタンパク質は、細胞株ＨＥＫ２９３Ｆを用いて産生することができる。したがって、タンパク質複合体のさらなる実施形態によれば、第１および第２のポリペプチドは、ヒト細胞株、好ましくは、ＨＥＫ細胞株中での推奨される発現により産生される。グリコシル化ポリペプチドの産生のためのＨＥＫ細胞株の例は、ＨＥＫ２９３Ｆ、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−２９３、２９３、２９３ＥＢＮＡ、２９３Ｈ、２９３Ｓ、２９３Ｔ、２９３Ｔ／１７、２９３Ｔ／１７ＳＦ、ＨＥＫ２９３ＳＴＦ、およびＨＥＫ−２９３．２ｓｕｓである。ポリペプチドの産生に好ましい細胞株は、細胞株としてのＨＥＫ２９３Ｆである。
【０１８７】
第１および第２のポリペプチドは、別個の組換え発現により産生し、その後に結合させることができる。あるいは、第１および第２のポリペプチドは、同一細胞中で組換え発現される。このため、第１および第２のポリペプチドは、同一ベクターに、または２つの異なるベクター上でコードさせることができる。
【０１８８】
ポリヌクレオチド
第４の態様によれば、本発明は、本発明の第１の態様によるグリコシル化ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０１８９】
単離ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。単離ポリヌクレオチドは、好ましくは、ＤＮＡ分子、特に、ｃＤＮＡ分子である。ペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離またはクローニングするために使用される技術は当分野において公知であり、それとしては、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、またはそれらの組合せが挙げられる。このようなゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローニングは、例えば、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用することにより行って共通の構造的特徴を有するクローニングされたＤＮＡ断片を検出することができる（例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９０参照）ＰＣＲ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。他の核酸増幅手順、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ライゲーション活性化転写（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ＬＡＴ）およびポリヌクレオチドベース増幅（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）を使用することができる。
【０１９０】
単離ポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５からなる群から選択される配列と類似または同一であるアミノ酸配列を有するグリコシル化ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子であり得る。
【０１９１】
特に、単離ポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するグリコシル化ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子であり得る。さらに、単離ポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するグリコシル化ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子であり得る。一実施形態によれば、単離ポリヌクレオチドは、配列番号４と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するグリコシル化ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子である。一実施形態によれば、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するグリコシル化ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子である。
【０１９２】
発現ベクター
第５の態様において、本発明はまた、本発明の第４の態様によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【０１９３】
発現ベクターは、好ましくは、制御エレメント、例えば、プロモーター、ならびに転写および翻訳終止シグナルをさらに含む。第４の態様によるポリヌクレオチドおよび制御エレメントを一緒に結合させ、制限部位におけるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を許容するための１つ以上の制限部位を含み得る組換え発現ベクターを産生することができる。ポリヌクレオチドは、発現のための適切な発現ベクター中に挿入することができる。発現ベクターの作出において、コード配列は、コード配列が発現に適切な制御配列と作動可能に結合するように発現ベクター中で局在させる。
【０１９４】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供することができ、本発明の第４の態様のポリヌクレオチドの発現を生じさせ得る任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。発現ベクターの選択は、典型的には、発現ベクターを導入すべき宿主細胞との発現ベクターの適合性に依存する。発現ベクターは、線形または閉環プラスミドであり得る。
【０１９５】
発現ベクターは、好ましくは、哺乳動物細胞中での発現に適合される。発現ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、複製が染色体複製に非依存的である染色体外実体、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体として存在するベクターであり得る。自律複製のため、ベクターは、当該宿主細胞中でのベクターの自律複製を可能とする複製起点をさらに含み得る。複製起点は、細胞中で機能する自律複製を媒介する任意のプラスミド複製因子であり得る。用語「複製起点」または「プラスミド複製因子」は、プラスミドまたはベクターのインビボ複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
【０１９６】
ベクターは、好ましくは、宿主細胞中に導入された場合、ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものである。宿主細胞ゲノム中への組込みのため、発現ベクターは、相同または非相同組換えによるゲノム中への組込みのための発現ベクターの任意の他のエレメントに依存し得る。あるいは、ベクターは、染色体中の正確な場所における宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組込みを指向するための追加のポリヌクレオチドを含有し得る。
【０１９７】
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換、形質移入、形質導入細胞などの容易な選択を許容する１つ以上の（例えば、いくつかの）選択マーカーを含有する。選択マーカーは、産物が殺生物またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養などを提供する遺伝子である。
【０１９８】
上記エレメントをライゲートして本発明の組換え発現ベクターを構築するために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、前掲参照）。
【０１９９】
一実施形態によれば、第５の態様によるベクターのベクター骨格は、ｐＣＤＮＡ３、ｐＣＤＮＡ３．１、ｐＣＤＮＡ４、ｐＣＤＮＡ５、ｐＣＤＮＡ６、ｐＣＥＰ４、ｐＣＥＰ−ｐｕｒｏ、ｐＣＥＴ１０１９、ｐＣＭＶ、ｐＥＦ１、ｐＥＦ４、ｐＥＦ５、ｐＥＦ６、ｐＥｘｃｈａｎｇｅ、ｐＥＸＰＲ、ｐＩＲＥＳ、およびｐＳＣＡＳから選択される。
【０２００】
第５の態様によるベクターは、宿主細胞中に一過的または非一過的に形質転換することができる。宿主細胞は、上記列記の細胞のいずれかであり得る。好ましくは、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｆである。
【０２０１】
医学的使用および治療方法
上記のとおり、本発明によるグリコシル化ポリペプチドおよび組成物、特に、タンパク質複合体は、患者、特に、ヒト患者における低減した免疫応答という利点を有する。したがって、グリコシル化ポリペプチドおよびタンパク質複合体は、特に、医学的治療のための活性成分として有用である。
【０２０２】
第６の態様によれば、本発明は、医学的治療における使用のための、第１の態様により定義されるグリコシル化ポリペプチドを提供する。代替例として、第６の態様によれば、本発明は、医学的治療における使用のための、第３の態様により定義される組成物を提供する。好ましくは、出血性障害の治療または予防である。
【０２０３】
したがって、本発明の第６の態様はまた、患者の出血性障害の治療または予防方法であって、前記患者に、第１の態様によるグリコシル化ポリペプチドまたは第３の態様による組成物、特に、タンパク質複合体を投与することを含む方法に関する。
【０２０４】
本明細書において使用される「出血性障害」は、正常な止血を害する疾患または病態を指す。出血性障害は、例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、フォン・ヴィレブランド病、グランツマン血小板無力症、ベルナール・スーリエ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、脳内出血、外傷、外傷性脳損傷などであり得る。
【０２０５】
本明細書において使用される「血友病」は、血友病を有さない健常個体における血液凝固形成時間と比較して増加した血液凝固形成時間を伴う出血性障害のグループを指す。「血友病」は、第ＶＩＩＩ因子の欠乏をもたらす障害である血友病Ａ、および第ＩＸ因子の欠乏をもたらす障害である血友病Ｂの両方を指す。
【０２０６】
出血性障害は、好ましくは、血友病である。治療は、例えば、ＰＵＰＳ（未治療患者）の血友病治療または免疫寛容誘導（ＩＴＩ）治療であり得る。
【０２０７】
第３の態様の代替実施形態によれば、本発明は、出血性障害の治療または予防における使用のための、第２の態様により定義されるタンパク質複合体を提供する。
【０２０８】
治療は、好ましくは、患者に、有効量のグリコシル化ポリペプチドまたは組成物、特に、タンパク質複合体を投与することを含む。
【０２０９】
本明細書に記載のグリコシル化ポリペプチドまたは組成物、特に、タンパク質複合体は、単独で、または医薬組成物の形態で投与することができる。本発明による医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と配合された有効量のコンジュゲートを含み得る。実施形態の医薬組成物は、製薬分野において周知の任意の方法により調製し、対象に投与することができる。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（１０ｔｈ  ｅｄ．，２００１）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０ｔｈ  ｅｄ．，２００３）；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（７ｔｈ  ｅｄ．，１９９９）参照。さらに、実施形態の医薬組成物は、他の医学的に有用な薬物または生物剤を含むように配合することもできる。医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容可能な担体と組み合わせた治療有効量のグリコシル化ポリペプチドまたはタンパク質複合体を含む。薬学的に許容可能な担体は、当分野において公知の、または確立された任意の担体である。例示的な薬学的に許容可能な担体としては、無菌パイロジェンフリー水および無菌パイロジェンフリー生理食塩溶液が挙げられる。本実施形態に利用することができる薬学的に許容可能な担体の他の形態としては、配合物の使用形態に応じて通常使用される結合剤、崩壊剤、界面活性剤、吸収促進剤、湿分保持剤、吸収剤、滑沢剤、充填剤、増量剤、湿分付与剤、保存剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を制御する塩、希釈剤、例えば、緩衝液および賦形剤が挙げられる。これらは、得られる配合物の単位投与量に応じて場合により選択され、使用される。
【０２１０】
インビボ用途のため、グリコシル化ポリペプチド、タンパク質複合体または医薬組成物は、患者に、任意の慣習的な投与経路、例えば、経口、非経口により、または吸入により投与することができる。非経口投与としては、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射および腹腔内注射、液状薬剤、懸濁液剤、エマルションおよび滴剤が挙げられる。非経口投与のため、グリコシル化ポリペプチド、タンパク質複合体または医薬組成物は、注射剤、例えば、液状薬剤または懸濁液剤であるべきである。
【０２１１】
他の実施形態において、グリコシル化ポリペプチド、タンパク質複合体または医薬組成物は、患者に経口投与される。これらの実施形態において、薬物の形態としては、固体配合物、例えば、錠剤、コーティング錠、散剤、顆粒剤、カプセル剤およびピル剤、液状配合物、例えば、液剤（例えば、点眼薬、点鼻薬）、懸濁液剤、エマルションおよびシロップ剤、吸入剤、例えば、エアゾール剤、アトマイザーおよびネブライザー、ならびにリポソーム包含剤が挙げられる。さらに一部の他の実施形態において、グリコシル化ポリペプチド、タンパク質複合体または医薬組成物は、対象の気管および／または肺を標的化するために患者の呼吸管への吸入により投与される。これらの実施形態において、市販されている。
【０２１２】
第６の態様の一実施形態によれば、使用のためのグリコシル化ポリペプチドまたは組成物、特に、タンパク質複合体において、使用は、静脈内または非静脈内注射を含む。非静脈内注射は、好ましくは、皮下注射である。
【０２１３】
本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに記載される。
【実施例】
【０２１４】
実施例１
ＳＩＧＬＥＣへの全長ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の結合：
１．１．実験手順
組換えＳＩＧ−２、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−Ｆ（ヒトＳＩＧ−８のマウス等価物）、ＳＩＧ−９およびＳＩＧ−１０を、Ｆｃ融合タンパク質としてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。第１に、プロテインＡ（ＳＥＲＶＡ  Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ）を、４℃において濃度０．５μｇ／ウェルでプレート上で一晩（Ｏ／Ｎ）コートした。ブロッキングおよび洗浄緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＢＳＡ）による洗浄ステップ後、Ｆｃ融合ＳＩＧＬＥＣまたは対照抗体を、５μｇ／ｍｌの濃度における３７℃における１時間のインキュベーションによりプロテインＡに結合させた。抗ｖＷＦ−ｐＡｂ（Ｄａｋｏ、＃Ａ００８２）を陽性対照として、抗ニワトリＩｇＹ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ２２８８）を陰性対照として抗体Ｆｃ部分を介して固定化した。
【０２１５】
血漿由来ＶＷＦ（ｐｄＶＷＦ）を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ビオチンビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチン化した。ビオチン化ｖＷＦの濃度系列を、０〜０．８μｇ／ｍＬの濃度においてウェル中にアプライした。洗浄緩衝液による５回の洗浄ステップ後、ＨＲＰカップリングストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３１００１）をウェルに添加し、３７℃において１時間インキュベートし、続いて５回の洗浄ステップを行った。
【０２１６】
結合したビオチン化ｐｄｖＷＦの可視化のため、ウェルをｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩基質（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤ、＃Ｐ９１８７、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベートした。続いて、４９２ｎｍにおける吸光度を計測した。
【０２１７】
１．２  結果
図１に示されるとおり、４９２ｎｍにおける吸光度は、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−Ｆ、およびＳＩＧ−９を用いた結合実験においてｖＷＦの出発濃度とともに増加する。値は、陽性対照（抗ｖＷＦ）よりもわずかに高く（ＳＩＧ−ＦおよびＳＩＧ−９）または低い（ＳＩＧ−５およびＳＩＧ−７）。対照的に、ＳＩＧ−２、ＳＩＧ−１０および陰性対照の抗ニワトリＩｇＹを用いた結合実験における吸光度は、濃度に無関係にほぼ０であった。
【０２１８】
したがって、ｖＷＦは、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−Ｆ、およびＳＩＧ−９に濃度依存的に結合する。他方、ｖＷＦは、ＳＩＧ−２およびＳＩＧ−１０に結合しない。
【０２１９】
実施例２
ＳＩＧＬＥＣへのｖＷＦ断片の結合
２．１  実験手順
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．８の緩衝液中で１：１００の酵素対タンパク質のｗ／ｗ比を使用して３７℃、３００ｒｐｍにおいて３時間実施したＶ８プロテアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ，＃２０１９５９）］消化により、ｖＷＦのＣおよびＮ末端断片を調製し、ＭｏｎｏＱ５／５０ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃１７−５１６６−０１）上でのアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した。ランニング緩衝液は２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４であり、溶出緩衝液は２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．４であった。１００ｍＭのＮａＣｌをランニング緩衝液として使用するＳｕｐｅｒｏｓｅ６  １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃１７−５１７２−０１）上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより断片をさらに精製および脱塩した。
【０２２０】
得られた断片（Ｃ末端およびＮ末端）を図２に模式的に示し、ドメインおよびグリコシル化部位を特定した。
【０２２１】
精製されたｖＷＦ  Ｃ末端断片およびｖＷＦ  Ｎ末端断片を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ビオチンビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチン化し、ｖＷＦ  Ｃ末端断片およびｖＷＦ  Ｎ末端断片の濃度１μｇ／ｍＬで実施例１に記載のとおりＳＩＧＬＥＣへの結合を計測した。
【０２２２】
２．２  結果
図３に示される吸光度値に基づくと、Ｏ−グリコシル化部位および２Ｏ−グリカンクラスター（クラスター１およびクラスター２）の大半を含有するｖＷＦ  Ｎ末端断片は、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−ＦおよびＳＩＧ−９に結合する。対照的に、ｖＷＦ  Ｃ末端断片について吸光度はほとんど計測されず、または計測されなかった。したがって、後者の断片は、ＳＩＧＬＥＣに結合しない。
【０２２３】
実施例３
ＳＩＧＬＥＣへのｖＷＦのＮ末端部分の結合：
３．１．実験手順
実施例２において得られたＮ末端ｖＷＦ断片の一部分を、シアリダーゼＡを使用して酵素的に脱シアル酸化した。５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中で、１００μｇのＶＷＦ断片につき２μｌの酵素（シアリダーゼＡ（商標）＃ＧＫ８００４０をＰｒｏｚｙｍｅから入手した）を使用してインキュベーションを３７℃において３時間実施した。
【０２２４】
Ｎ末端ｖＷＦ断片の第２の部分を脱Ｎ−グリコシル化した。５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５緩衝液中で、２０μｇのＶＷＦ断片につき１μｌの酵素（ＰＮＧアーゼＦ  ＃Ｐ０７０４をＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した）を使用してインキュベーションを３７℃において一晩実施した。
【０２２５】
脱シアル酸化、脱Ｎ−グリコシル化および非処理Ｎ末端ｖＷＦ断片の試料を、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８、およびＳＩＧ−９への結合について試験した。結合実験を、Ｎ末端ｖＷＦ断片の濃度８μｇ／ｍＬで実施例１に記載のとおり実施した。
【０２２６】
３．２  結果：
図４に示されるとおり、脱Ｎ−グリコシル化ｖＷＦ  Ｎ末端断片および非処理ｖＷＦ  Ｎ末端断片について測定された吸光度値は、わずかに異なるにすぎない。したがって、脱Ｎ−グリコシル化は結合に影響を与えず、その結合がＯ−グリカンを介して媒介されることを示す。
【０２２７】
Ｏ−グリカンの脱シアル酸化は、図４に示されるとおり、ＳＩＧＬＥＣへのｖＷＦ  Ｎ末端断片の結合を強力に低減させ、または停止させる。したがって、ｖＷＦ  Ｎ末端断片の結合は、Ｏ−グリカン鎖に付着しているシアル酸により媒介される。
【０２２８】
実施例４
Ｏ−グリカンクラスター１および２を含有するペプチドのＳＩＧＬＥＣ結合
４．１  実験手順
ｖＷＦは、図２に模式的に示される完全占有Ｏ−グリコシル化部位（Ｓｏｌｅｃｋａ  ｅｔ．ａｌ  ２０１６参照）の２つのクラスターを含有する。両方のクラスターは、コア２構造の相対量が異なる。糖ペプチド分子の４．９％のみが、クラスター１中のコア２構造を含有する。したがって、クラスター１中のＯ−グリカンの総数に基づくシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンの割合は、１．２５％である。
【０２２９】
他方、糖ペプチド分子の３４．８６％が、クラスター２中のコア２構造を含有する（Ｓｏｌｅｃｋａ  ｅｔ  ａｌ，２０１６参照）。したがって、クラスター２中のＯ−グリカンの総数に基づくシアル酸化コア２型Ｏ−グリカンの割合は、１０．７８％である。
【０２３０】
２つのクラスターの結合を独立して計測するため、ｖＷＦ  Ｎ末端断片をトリプシンにより処理し、以下の断片：配列番号１のＶＷＦのＡＡ１２１２〜１２７４を包含するクラスター１断片およびＡＡ１４３７〜１４９１／１４９２を包含するクラスター２断片を生成した。断片を逆相ＨＰＬＣにより精製した。簡潔に述べると、ｐｄＶＷＦを還元し、遊離システインをマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンにより製造業者の説明書に従ってブロッキングした（ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン、＃２１９０１ＢＩＤをＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した）。トリプシンにより３７℃において一晩消化した後、１０ｋＤａカットオフ遠心分離フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して高分子量ペプチドを濃縮した。続いて、ペプチドをＪｕｐｉｔｅｒ  ５μ  ３００Å  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で分離した。移動相は、Ａ−Ｈ２Ｏ中０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；Ｂ−アセトニトリル中０．０８５％のＴＦＡであり、流速は０．３  ｍＬ／分であった。溶出ペプチド／糖ペプチドを、２１５ｎｍ波長において紫外線吸収により検出した。目的の分画を回収し、凍結乾燥し、続いて１０μＬのＨ2Ｏ中で再構成した。両方のクラスターはシステインを含有するため、両方にビオチンを供給した。
【０２３１】
結合実験を、ＳＩＧＬＥＣのＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−Ｆ、ＳＩＧ−９およびＳＩＧ−１０を用いてクラスター１およびクラスター２断片の濃度４μｇ／ｍＬで実施例１に記載のとおり実施した。
【０２３２】
さらに、クラスター１およびクラスター２断片の試料を脱シアル酸化により処理し、続いて結合実験において脱シアル酸化クラスター１およびクラスター２断片の濃度２μｇ／ｍＬで実施例１に記載のとおり試験した。
【０２３３】
４．２  結果：
図５に示される吸光度値に基づくと、クラスター２断片はＳＩＧＬＥＣのＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−Ｆ、ＳＩＧ−９に結合した。ＳＩＧ−１０については、吸光度は検出されず、またはほとんど検出されず、他の実施例からの結果を裏付けた。
【０２３４】
結果的に、Ｏ−グリカンクラスター上の高い割合のコア２構造が、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−Ｆ、ＳＩＧ−９への結合のための要件である。
【０２３５】
実施例５
クラスター２ＳＩＧＬＥＣ結合のシアル酸依存性
５．１  実験手順
実施例４に記載のとおり得られたクラスター２断片の試料を脱シアル酸化した。続いて、脱シアル酸化クラスター２断片および非処理クラスター２断片を、結合実験においてＳＩＧＬＥＣのＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−Ｆ、およびＳＩＧ−９を用いて脱シアル酸化クラスター１およびクラスター２断片の濃度２μｇ／ｍＬで実施例１に記載のとおり試験した。
【０２３６】
５．２  結果
非処理クラスター２断片について検出された吸光度値は、実施例４に見出される結果を裏付けた（図６参照）。脱シアル酸化クラスター２断片は、結合を示さず、またはわずかに結合を示すにすぎない。したがって、Ｏ−グリカンクラスター上のコア２構造のシアル酸化は、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−Ｆ、ＳＩＧ−９への結合のための要件である。
【０２３７】
実施例６
ＦＶＩＩＩ結合部位を含有するＯ−結合グリカンリピートを有するまたは有さないＶＷＦ断片の組換え発現：
２つの組換えｖＷＦ断片を、ＨＥＫ細胞株２９３Ｆ中で発現させた。第１の断片、Ｓｅｑ１１は、配列番号１のＡＡ７６４〜１２６８を包含し、Ｏ−グリコシル化部位１２４８、１２５５、１２５６、１２４３）を有するクラスター１を含有する。
【０２３８】
第２の断片Ｓｅｑ１２は、配列番号１のＡＡ７６４〜１２６８およびＡＡ１２３８〜１２６８の２つの追加の反復（ＡＡ７６４〜１２６８＋２×１２３８〜１２６８）およびしたがってクラスター１Ｏ−グリカンクラスターリピートの２つの追加のコピーを包含する。
【０２３９】
Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２を、ＨＥＫ２９３細胞株中でＣ末端Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇとともに一過的に発現させ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ親和性クロマトグラフィー（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）により精製した。したがって、Ｓｅｑ１１および１２をコードする遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により合成し、Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇを含有するｐＤＳＧ−発現ベクター（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）中でクローニングした。ＴＯＰ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＩＢＡ  ｇｍｂＨ）を構築物により形質転換し、アンピシリン含有ＬＢ寒天プレート上での３７℃における一晩のインキュベーション後に単一クローンを選択した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ−ＭｉｎｉまたはＭａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の推奨に従って使用してプラスミドＤＮＡ調製を実施した。クローニングされた構築物の正確な配向および組込みをシーケンシングにより確認した。両方のｖＷＦ断片の真核細胞発現のため、ＭＥＸｉ形質移入培地（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）中で増殖させたＭＥＸｉ−２９３細胞（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）を、４．５ｍｇ／ｍｌの２５ｋＤａの直鎖ポリエチレンイミンを使用して１．５ｍｇ／ｌの構築物により形質移入した。３７℃、５％のＣＯ2および１００〜１５０ｒｐｍにおける２〜４時間のインキュベーション後、培養物をＭＥＸｉ形質移入培地により１：２に希釈し、細胞生存率が７５％に到達するまで培養を継続した。続いて、上清を４℃および３００×ｇにおける遠心分離により細胞から分離した。細胞培養培地中のビオチンの阻害効果を最小化するため、およびｐＨを調整するため、０．１容量の緩衝液（１Ｍのトリス−ＨＣｌ、１．５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）および０．０９％（ｖ／ｖ）のＢｉｏＬｏｃｋ溶液（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）を上清に添加し、４℃において２０分間インキュベートした。遠心分離後、上清をＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  ＸＴカラム（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）上でアプライし、洗浄緩衝液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）により５回洗浄し、結合したＳｔｒｅｐ−ｔａｇ含有タンパク質を溶出緩衝液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのデスチオビオチン、ｐＨ８．０）により溶出させた。
【０２４０】
両方の断片Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２を図７に模式的に示す。
【０２４１】
実施例７
ｖＷＦ断片Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２のＯ−グリコシル化の分析
７．１  実験手順
実施例６により産生された断片Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２のＯ−グリコシル化を、質量分析により分析した。
【０２４２】
このため、Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２を最初に、６０℃における５０ｍＭのジチオトレイトールとの、および続いて１００ｍＭのヨードアセトアミドとの２０分間のインキュベーションにより還元およびアルキル化した。トリプシンおよびキモトリプシンによる消化後、得られたペプチドをシアリダーゼＡ消化緩衝液中で再緩衝化し、実施例３に記載の条件を使用して一晩脱シアル酸化した。アガロース固定化レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するジャカリン（アルトカルプス・インテグリフォリア（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）レクチン）親和性クロマトグラフィーによりＯ−糖ペプチドを特異的に濃縮した。ジャカリン−アガロースを重力駆動カラム中に充填し、クロマトグラフィーを製造業者の説明書に従って実施した。溶出したＯ−糖ペプチドを、Ｃ４  Ｚｉｐｔｉｐピペットチップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用するＭＡＬＤＩ  ＭＳ計測のために精製し、５０％のアセトニトリル／０．１％のトリフルオロ酢酸中で溶解させた２５ｍｇ／ｍｌのスーパーＤＨＢマトリックスを使用するリニアポジティブイオンモードでの計測に供した。
【０２４３】
濃縮された糖ペプチドのアリコートを、Ｏ−グリコシダーゼ（エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、＃Ｐ０７３３、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によりさらに処理した。簡潔に述べると、ペプチドを、１０μｌの糖タンパク質につき１μｌの酵素を使用して酵素と３７℃において２時間インキュベートした。Ｏ−グリコシダーゼはコア１型Ｏ−グリカンのみに特異的であるため（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ二糖）、それはペプチド骨格に付着しているコア２グリカンおよび／または伸長コア１型Ｏ−グリカンを残す。
【０２４４】
７．２  結果
結果を図８および９にまとめる。
【０２４５】
Ｏ−糖ペプチドを、ポストソース分解（ＰＳＤ）ＭＡＬＤＩにより特定した。特定されたＳｅｑ１１断片のペプチド配列は、
KVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHGSAW（配列番号６）である。最後の４つのアミノ酸（下線）は、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇに対応する。このペプチドは、４つのＯ−グリコシル化部位を含有する。
【０２４６】
図８の上段スペクトルは完全Ｏ−グリコシル化糖ペプチドを示し、図８の下段スペクトルはＯ−グリコシダーゼ消化後の同一の糖ペプチドを示す。Ｏ−グリコシダーゼ消化後の１４６０．３Ｄａの質量シフト（矢印により標識）は、３６５Ｄａの質量をそれぞれ有する４つのコア１型Ｏ−グリカンに対応する。上段スペクトルにおいて観察される３６５Ｄａの質量距離は、同一のペプチドの異なる糖型に対応する一方、それぞれの追加の３６５Ｄａの質量付加は、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ二糖形成コア２構造に対応する。Ｏ−グリコシダーゼ処理後、ペプチドの完全脱グリコシル化形態（８３５８．６Ｄａ）ならびにコア２構造（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（Ｇａｌβ１→３）ＧａｌＮＡｃ、７３０Ｄａ）および／または伸長コア１構造（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ、７３０Ｄａ）を含有する糖型が観察される。
【０２４７】
Ｓｅｑ１２断片の特定されたペプチド配列は、
KVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHGSAW（配列番号７）である。最後の４つのアミノ酸（下線）は、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇに対応する。
【０２４８】
図９の上段スペクトルは完全Ｏ−グリコシル化糖ペプチドを示し、図９の下段スペクトルはＯ−グリコシダーゼ消化後の同一の糖ペプチドを示す。Ｏ−グリコシダーゼ消化後の４３８０．３Ｄａの質量シフトは、３６５Ｄａの質量をそれぞれ有する１２個のコア１型Ｏ−グリカンに対応し、それは、Ｓｅｑ１２中の１２個全てのＯ−グリコシル化部位がＯ−グリカンにより占有されていることを裏付ける。Ｓｅｑ１１について観察されるのと同様に、スペクトル中に観察される３６５Ｄａおよび７３０Ｄａの距離は、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ二糖またはコア２および／もしくは伸長コア１構造にそれぞれ対応する。
【０２４９】
コア１およびコア２型Ｏ−グリカンの定量は、それぞれのＯ−グリカンが付着している糖ペプチドの相対量に基づく。所与のペプチドの異なる糖型の定量は、ＭＡＬＤＩスペクトルにおけるシグナル強度の評価により行う。
【０２５０】
糖ペプチドＳｅｑ１１については、定量は、同一ペプチドの異なる糖型のＭＡＬＤＩシグナル強度に基づき行う。このペプチドの全ての糖型の総ピーク強度（８３５８Ｄａ、８７２４Ｄａ、９０８９Ｄａ、９４５４Ｄａ、９８１９Ｄａ、１０１８１Ｄａ、１０５４３Ｄａ、１０９１０Ｄａ、１１２７７Ｄａ）は４１２７５ａ．ｕ．に等しく、それは１００％を表す。
【０２５１】
質量８３５８Ｄａを有するコア１型Ｏ−グリカンのみを含有する糖型は８４１０ａ．ｕ．の強度を示し、それは総計の２０％に対応する。したがって、全ての他の糖型（８０％）は、付着している少なくとも１つのコア２および／または伸長コア１グリカンタイプグリカンを含有する。この計測において、コア２および伸長コア１は、区別不可能である。したがって、Ｏ−グリカンの総数に基づくコア２型および／または伸長コア１型Ｏ−グリカンの割合は、少なくとも２０％である。
【０２５２】
したがって、ＨＥＫ細胞株中で組換え産生されたＳｅｑ１１中の４つのＯ−グリコシル化部位およびＳｅｑ１２中の１２個全てのＯ−グリコシル化部位は、コア１型Ｏ−グリカンにより占有されており、高い割合までコア２型Ｏ−グリカンおよび／または伸長コア１型Ｏ−グリカンによっても占有されている。多量のコア２型Ｏ−グリカンを考慮すると、両方の配列は、ＳＩＧＬＥＣ結合についての良好なリガンドであり得る。４つのＯ−グリコシル化部位を含有する２つの追加の配列リピートの付加は、１２個のクラスター化および完全占有Ｏ−グリカンを有するタンパク質を良好にもたらした。
【０２５３】
実施例８
Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２のＳＩＧＬＥＣ結合の分析
８．１  実験手順
Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ担持組換えタンパク質Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２を、ＳＩＧＬＥＣ結合ＥＬＩＳＡにおいて実施例１に記載のとおり試験したが、以下の検出方針を除く；ストレプトアビジン−ＨＲＰに代えて、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ−ＨＲＰ（＃２−１５０２−００１、ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）コンジュゲートをＳｔｒｅｐ−ｔａｇ付きタンパク質の検出に使用した。アプライされるＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ−ＨＲＰの濃度は、０．２５μｇ／ｍｌであった。両方のタンパク質Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２を、４２ｎＭの等モル濃度において試験した。
【０２５４】
８．２  結果
図１０に示されるとおり、両方のポリペプチドＳｅｑ１１およびＳｅｑ１２は、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−ＦおよびＳＩＧ−９への結合を示した。４つ全てのＳＩＧＬＥＣに対する両方のポリペプチドＳｅｑ１１およびＳｅｑ１２について計測された吸光度は、抗ｖＷＦへのＳｅｑ１１およびＳｅｑ１２の結合と同一の範囲であった。
【０２５５】
対照的に、ＳＩＧ−２およびＳＩＧ１０を用いた実験におけるＳｅｑ１１およびＳｅｑ１２の吸光度は、抗ニワトリ抗体を用いた陰性対照実験と同一範囲であった。したがって、Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２のいずれも、ＳＩＧ−２にもＳＩＧ−１０にも結合しなかった（図１０参照）。
【０２５６】
実施例９
Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２のＳＩＧＬＥＣ結合のシアル酸依存性
９．１  実験手順
実施例８による実験プロトコルを、ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ付きポリペプチドＳｅｑ１１およびＳｅｑ１２のシアリダーゼＡ消化を追加して繰り返した。脱シアル酸化を実施例３に記載のとおり実施した。
【０２５７】
９．２  結果
脱シアル酸化Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２を用いた結合実験の結果を、図１１に示す。計測された吸光度によれば、ＳＩＧ−５への脱シアル酸化Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２の結合は、非処理ポリペプチドと比較して強力に低減する。ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−ＦおよびＳＩＧ−９への結合は完全に停止され、すなわち、吸光度はＳＩＧ−２およびＳＩＧ１０への結合について測定されたものと同一のレベルである。したがって、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−ＦおよびＳＩＧ−９への両方のポリペプチドＳｅｑ１１およびＳｅｑ１２の結合は、シアル酸依存的である。
【０２５８】
実施例１０
Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２のＳＩＧＬＥＣ結合の比較
１０．１  実験手順
Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２の見かけの結合親和性を計測および比較するため、結合曲線のスキャッチャード分析を用いるＳＩＧＬＥＣ  ＥＬＩＳＡを適用した。ＥＬＩＳＡを実施例８および９に記載のとおり実施した。スキャッチャード分析をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行った。
【０２５９】
１０．２  結果
配列１１および１２の結合曲線ならびに対応するスキャッチャードプロットを、図１２および１３に示す。スキャッチャードプロットから導かれる見かけの結合親和性（ＫD）を、図１４にまとめる。Ｓｅｑ１２中のＯ−グリカンリピートの増加は、ＳＩＧＬＥＣ結合親和性に対する有意な効果を有した。ＳＩＧＬＥＣ５についての親和性は、Ｓｅｑ１１についての０．４９４μＭから、Ｓｅｑ１２についての０．１４μＭまで増加し得た。ＳＩＧＬＥＣ７についての親和性は、Ｓｅｑ１１についての０．３７１μＭから、Ｓｅｑ１２についての０．００５μＭまで増加し得た。ＳＩＧＬＥＣ８についての親和性は、Ｓｅｑ１１についての１．０２７μＭから、Ｓｅｑ１２についての０．０１５μＭまで増加し得た。最後に、ＳＩＧＬＥＣ９についての親和性は、Ｓｅｑ１１についての０．５９１μＭから、Ｓｅｑ１２についての０．０４１μＭまで増加し得た。本文における記述：「このＥＬＩＳＡ実験から、解離親和性定数は、全てのＳｅｑ１１および１２−ＳＩＧＬＥＣ相互作用について計算される」。
【０２６０】
実施例１１
Ｓｅｑ１１およびＳｅｑ１２のＦＶＩＩＩ結合親和性の測定
１１．１  実験手順
両方の配列のＦＶＩＩＩ結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）機器を使用して実施した。配列１１および１２ポリペプチドを、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＣＭ５チップ上で固定化した。陽性対照として、全長血漿ＶＷＦ（Ｗｉｌａｔｅ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）を固定化した。続いて、ＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）濃度系列（０．２ｎＭ、０．６ｎＭ、１．７ｎＭ、５．０ｎＭ、１５ｎＭ、４５ｎＭ）を、センサチップ表面にわたりインジェクトした。ランニング緩衝液は、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ2、０．０５％であった。
【０２６１】
１１．２  結果
ＳＰＲ計測により、両方の配列のＦＶＩＩＩ結合親和性（ＫＤ）は１．４ｎＭに等しいことが明らかになり、したがって、追加のＯ−グリカンリピートはＦＶＩＩＩに対する結合親和性に対する影響を有さない。
【０２６２】
実施例１２
Ｎ末端ＶＷＦ断片はＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γの細胞外レベルを低減させるが、Ｃ末端ＶＷＦ断片は低減させない
１２．１  背景
ＳＩＧＬＥＣは、免疫系の種々の細胞、例として、単球および樹状細胞上で発現され、細胞接着、エンドサイトーシスならびに適応および自然免疫のシグナリング経路のモジュレートにおける役割を示す（Ｍａｃａｕｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。ほとんどのＳＩＧＬＥＣは、細胞増殖および活性化の阻害（Ｖｉｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｉｋｅｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００４）、アポトーシス誘導（Ｎｕｔｋｕ  ｅｔ  ａｌ．２００３）およびサイトカイン産生の抑制（Ｅｒｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）により炎症応答の減衰において機能することが示されているそれらの細胞質ドメイン中の免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）またはＩＴＩＭ様モチーフを含有する。
【０２６３】
ｍｏＤＣにより産生される炎症性サイトカインのレベルがＳＩＧＬＥＣにエンゲージするｖＷＦ断片の存在下で変更されるか否かを把握するため、刺激された未成熟単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の上清中のＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γの量を、フローサイトメトリーにより同時に分析した。
【０２６４】
１２．２  実験設計
健常ドナーからの単球をＦｉｃｏｌｌ勾配を介して濃縮し、続いてＣＤ１４＋単球を磁気細胞ソーティングにより精製した。ｍｏＤＣを得るため、ＣＤ１４＋単球を１０％のウシ胎仔血清、１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン４および１０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子が補給されたＲＰＭＩ培地中で５〜６日間培養した。ｍｏＤＣにより分泌されたサイトカインプロファイルを、それぞれのｖＷＦ断片による刺激２４時間後に、製造業者の推奨に従ってＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γを検出するサイトメトリックビーズアレイＣＢＡ  Ｆｌｅｘ（ＢＤ）を介して分析した。同一容量の１００ｍＭのＮａＣｌにより処理された細胞が対照として機能した。試料をフローサイトメーターＦＡＣＳＶｅｒｓｅにより分析した。サイトカイン濃度の最終分析および計算を、ＦＣＡＰアレイソフトウェア（ＢＤ）を使用して実施した。
【０２６５】
１２．３  結果
図１６は、ＬＰＳ刺激ありおよびなしの２つのｖＷＦ断片とのｍｏＤＣのインキュベーション後のサイトカイン濃度を示す。これらの結果によれば、ｖＷＦのＮ末端部分はＬＰＳ刺激に応答して合成される炎症促進性サイトカインの産生を低下させるが、Ｃ末端部分は低下させない。ＬＰＳ刺激なしの場合、炎症促進性サイトカインの分泌に対するｖＷＦ断片の効果は検出することができなかった。
【０２６６】
実施例１３
ＳＩＧＬＥＣおよびそれらのアダプター分子のリン酸化の分析
１３．１  背景
シアル酸含有リガンド結合時、ＳＩＧＬＥＣのＩＴＩＭおよびＩＴＩＭ様モチーフは、ＳＲＣファミリーチロシンキナーゼによりリン酸化され、それがＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ（ＳＨＰ）−１およびＳＨＰ−２のリクルートメントをもたらす。これらのホスファターゼは、活性化されると、細胞基質を脱リン酸化し得、それにより種々のシグナリング経路の活性化を制御する（Ｃｒｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＳＨＰ−１は、阻害シグナリングにおける役割に属する一方、ＳＨＰ−２は、ほとんどのシグナリング経路においてシグナル伝達を向上させるが、負に調節する細胞内シグナリングプロセスにも関与することが報告されている（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ａｖｒｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｑｕ，２０００；Ｓａｌｍｏｎｄ  ａｎｄ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，２００６）。
【０２６７】
１３．２  実験手順
ｍｏＤＣを、実施例１２に記載のとおり調製した。ＳＩＧＬＥＣならびにそれらのアダプター分子ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２のチロシンリン酸化に対するＮ末端ｖＷＦ断片の影響を測定するため、６*１０＾６個のｍｏＤＣを、５００ｎＭのＮ末端ｖＷＦ断片と１０分間インキュベートした。同一容量の１００ｍＭのＮａＣｌにより刺激された細胞が対照として機能した。免疫受容体リン酸化の分析をプロテオームプロファイラーヒトホスホ−免疫受容体アレイキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造業者の推奨に従って５００μｇの細胞溶解物を使用して実施した。
【０２６８】
１３．３  結果
ホスホ−免疫受容体アレイの結果を、図１７に示す。計測された画素密度によれば、Ｎ末端ｖＷＦ断片は、対照と比較してＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＳＩＧ−５およびＳＩＧ−７のリン酸化を特異的に変更する。ＳＩＧ−２およびＳＩＧ−１０のリン酸化は観察することができず、それはそれらのＳＩＧＬＥＣへのｖＷＦ  Ｎ末端断片の結合の欠落と密接に関連する。
【０２６９】
本明細書に記載の本発明の多くの改変および他の実施形態により、本発明が関する当業者は、上記の詳細な説明および関連する図面に提示される教示の利益を有することを想起する。したがって、本発明は開示される具体的な実施形態に限定されるものではないこと、ならびに改変および他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものであることを理解すべきである。規定の用語が本明細書において用いられるが、それらは一般的および記述的な意味でのみ使用され、限定を目的として使用されるものではない。
【０２７０】
参照文献
Ａｎ，Ｈ．，Ｚｈａｏ，Ｗ．，Ｈｏｕ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｘｉｅ，Ｙ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｈ．，Ｑｉａｎ，Ｃ．，Ｚｈｏｕ，Ｊ．，Ｙｕ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｓ．，Ｆｅｎｇ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｃａｏ，Ｘ．（２００６）．ＳＨＰ−２  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ＴＲＩＦ  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２５，９１９−９２８．
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Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．，Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｖａｒｋｉ，Ａ．（２００７）．Ｓｉｇｌｅｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，２５５−２６６．
Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ  ＢＭ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｐ，Ｔａｒａｎｔｉｎｏ  ＭＤ，Ｎｅｇｒｉｅｒ  Ｃ，Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ  Ｖ，Ｓｈａｐｉｒｏ  ＡＤ，Ｂａｋｅｒ  Ｄ，Ｓｐｏｔｔｓ  Ｇ，Ｓｅｎｓｅｌ  Ｍ，Ｙｉ  ＳＥ，Ｇｏｍｐｅｒｔｓ  ＥＤ．Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｔｅｇｏｒｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｂｙ  ａ  ｐｌａｓｍａ／ａｌｂｕｍｉｎ−ｆｒｅｅ  ｍｅｔｈｏｄ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ａ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ａｔ  ｔｈｅ  ＸＩＸｔｈ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ；２００４，ｖｏｌ．４１，ｐｇ．１−１６．
Ｅｒｄｍａｎｎ，Ｈａｎｎａ；Ｓｔｅｅｇ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｅ；Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ；Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ，Ｂｅｒｎｈａｒｄ；Ｊａｃｏｂｓ，Ｔｈｏｍａｓ（２００９）：Ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｇｌｅｃ−Ｅ（ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｉｇ−ｌｉｋｅ  ｌｅｃｔｉｎ−Ｅ）．Ｉｎ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１（１１），Ｓ．１６００−１６１１．ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１４６２−５８２２．２００９．０１３５０．ｘ．
Ｆｒａｎｃ  Ｖ，Ｒｅｈｕｌｋａ  Ｐ，Ｒａｕｓ  Ｍ，Ｓｔｕｌｉｋ  Ｊ，Ｎｏｖａｋ  Ｊ，  Ｒｅｎｆｒｏｗ  ＭＢ，Ｓｅｂｅｌａ  Ｍ．Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ＩｇＡ１  ｈｉｎｇｅ−ｒｅｇｉｏｎ  Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１３，Ｏｃｔ  ３０；ｖｏｌ．９２，ｐｇ．２９９−３１２
Ｇｕｚｍａｎ−Ａｒａｎｇｕｅｚ  Ａ，Ａｒｇｕｅｅｓｏ  Ｐ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｕｃｉｎ−ｔｙｐｅ  Ｏ−ｇｌｙｃａｎｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ．Ｔｈｅ  ｏｃｕｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｅ．２０１０；ｖｏｌ．８（１）ｐｇ−８−１７．
Ｉｋｅｈａｒａ，Ｙｕｚｕｒｕ；Ｉｋｅｈａｒａ，Ｓａｎａｅ  Ｋａｂａｔａ；Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊａｍｅｓ  Ｃ．（２００４）：Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｉｇｌｅｃ−７（ｐ７０／ＡＩＲＭ）ａｎｄ  Ｓｉｇｌｅｃ−９．Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７９（４１），Ｓ．４３１１７−４３１２５．ＤＯＩ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ４０３５３８２００．
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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