(57)【要約】  本明細書では、蝸牛シナプトパチーもしくは前庭シナプトパチーまたは中枢神経系の疾患もしくは状態を患う対象における、シナプス形成および／もしくは神経突起形成を増強し、神経変性を低減し、かつ／またはタウタンパク質の蓄積もしくは凝集を低減するための方法であって、それを必要とする前記対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法が開示される。方法は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を、対象へと投与するステップをさらに含みうる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蝸牛シナプトパチーまたは前庭シナプトパチーを患う対象における、シナプス形成および／または神経突起形成を増強するための方法であって、それを必要とする前記対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物として投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、対象へと、経口投与、静脈内投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与、舌下投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与、髄腔内投与、吸入により投与、または耳内に局所投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｎ−アセチルシステイン、アセチル−Ｌ−カルニチン、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニン、カルバマチオン、およびＳｚｅｔｏ−Ｓｃｈｉｌｌｅｒペプチド、ならびにこれらの機能的な類似体からなる群から選択される、１または複数の化合物を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｎ−アセチルシステインを投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
対象が、慢性聴覚損傷または慢性難聴を患う、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
慢性聴覚損傷または慢性難聴が、老化により引き起こされたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
慢性聴覚損傷または慢性難聴が、急性または慢性の、爆音または騒音への曝露により引き起こされたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
慢性聴覚損傷または慢性難聴が、感染により引き起こされたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、感染の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、感染の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
慢性聴覚損傷または慢性難聴が、毒素への曝露により引き起こされたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、毒素への曝露の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、毒素への曝露の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
対象がまた、耳鳴りも患う、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
対象がまた、聴覚過敏も患う、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
対象がまた、老人性難聴も患う、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
対象がまた、平衡障害またはシナプス喪失を伴うメニエール病も患う、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩の投与が、対象における蝸牛神経突起または前庭神経突起の再生を増強する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
対象における内有毛細胞上の、生存神経接合の数を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
対象におけるコルチ器の、トノトピー領域内のシナプスの数を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
対象が、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の実質的な喪失を患っていない、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
対象が、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の実質的な喪失を患っている、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、聴覚損傷または難聴の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、聴覚損傷または難聴の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
対象における、神経変性を低減するための方法であって、それを必要とする前記対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法。
【請求項２９】
対象における、タウタンパク質の蓄積を低減するための方法であって、それを必要とする前記対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法。
【請求項３０】
中枢神経系の疾患または状態を患う対象における、シナプス形成および神経突起形成を増強するための方法であって、それを必要とする前記対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１６年１０月３１日に出願された、米国仮出願第６２／４１５，１０１号、２０１７年４月２２日に出願された、米国仮出願第６２／４８８，７４０号、２０１７年５月２４日に出願された、米国仮出願第６２／５１０，５９６号、および２０１７年８月２５日に出願された、米国仮出願第６２／５５０，３４５号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
慢性難聴、耳鳴り、聴覚過敏、老人性難聴、または平衡障害などの慢性疾患は、患者における、有毛細胞の喪失に依存しない、騒音関連および／または加齢関連の、蝸牛シナプトパチーおよび前庭シナプトパチーと関連することが多い。例えば、Ｋｕｊａｗａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２９：１４０７７〜１４０８５（２００９）；およびＬｉｎら、ＪＡＲＯ、１２：６０５〜６１６（２０１１）は、軽度騒音外傷についての、マウスモデルおよびモルモットモデルにおける、正常な有毛細胞の補充にもかかわらず、騒音誘導性の内有毛細胞神経突起喪失（例えば、シナプトパチー）が、広範にわたりうることを裏付けた。この機構は、騒音損傷または累積的な加齢関連難聴（例えば、老人性難聴）により引き起こされる聴力障害に寄与する可能性が高い。
【０００３】
Ｓｅｒｇｅｙｅｎｋｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、３３：１３６８６〜１３６９４（２０１３）は、蝸牛におけるシナプスの喪失が、若齢〜老齢において進行し、老人性難聴についてのマウスモデルでは、加齢関連の、閾値または有毛細胞カウントの変化のはるか以前に、蝸牛全体にわたることを裏付けた。さらに、Ｍａｋａｒｙら、ＪＡＲＯ、１２：７１１〜７１７（２０１１）は、老化しつつあるヒトの耳では、有毛細胞を完全に補充しても、平均値螺旋神経節細胞（ＳＧＣ、すなわち、蝸牛ニューロン）喪失が、９５歳で、約３０％に達することから、神経変性が、有毛細胞の喪失に先行し、かつ／またはこれとは独立に生じうることが指し示されることを裏付けた。さらに、ヒトにおける関連する研究では、Ｖｉａｎａら、Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ．、３２７：７８〜８８（２０１５）は、蝸牛シナプトパチーおよび末梢神経軸索の変性が、有毛細胞の喪失と独立に生じ、老人性難聴に寄与する可能性が高いことの証拠を提示した。これらの種類の、拡散性のシナプスまたはＳＧＣの喪失は、必ずしも、聴力閾値に影響を及ぼさない場合もあるが、騒がしい環境における、聴覚処理の困難および聴力の低下に寄与する場合もあり、耳鳴りまたは聴覚過敏など、関連する不適応の続発症をもたらす場合もある。蝸牛シナプトパチーおよびその機能的な帰結についてはまた、Ｓｃｈａｅｔｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、３１：１３４５２〜１３４５７（２０１１）；Ｗａｎら、Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ．、３２９：１〜１０（２０１５）；およびＬｉｂｅｒｍａｎら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、１１（９）：ｅ０１６２７２６（２０１６）においても記載されている。
【０００４】
耳に対する爆音損傷は、簡易爆発物（ＩＥＤ）のために、現代の軍事行動では、極めて一般的であり、感覚神経性難聴および耳鳴りを引き起こしうる。耳鳴りおよび難聴は、兵役関連の身体障害を伴う退役軍人の間で報告される、最も一般的な有害医学状態である。爆音曝露はまた、中枢聴覚系に対する損傷も誘導する場合があるが、この病態生理学的応答では、遷延性の酸化ストレスが、基本的な役割を果たすと考えられる。
【０００５】
タウオパチーと、蝸牛神経変性とは、酸化ストレスが、進行中の損傷と病態生理学的に相関し、それを潜在的に伝搬させる点が共通する。より具体的には、いくつかの研究は、酸化ストレスが、タウの高リン酸化および凝集の両方を誘導するための直接的な触媒として作用することを明らかにしている。この相関は、スーパーオキシドジスムターゼ２ヌルマウスにおける研究によりさらに裏付けられ、このマウスは、慢性酸化ストレス条件下で、高用量の触媒性抗酸化剤処置により効率的に軽減されうる出生後早期の病理学的事象として、構成的な高リン酸化タウを呈する。この機構的な優位点と符合して、抗酸化剤を使用する、酸化ストレスの治療的ターゲティングが、広範なスペクトルにわたるタウオパチーにおいて改善をもたらすことが実証されている。
【０００６】
さらに、Ｓｅｌｋｏｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８：７８９〜７９１（２００２）は、アルツハイマー病が、ニューロンの変性の前に、海馬シナプスの機能不全で始まること、シナプスの機能不全が、アミロイドベータタンパク質の、拡散性のオリゴマーアセンブリーにより引き起こされること、および少なくとも１つのマウス系統が、シナプス数の有意な低減により引き起こされる機能障害を示したことを観察した。Ｓｈｅｎｇら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ、４：ａ００５７７７（２０１２）は、アルツハイマー病の発症機序についての、２つの主要な主題について論じた。第１に、オリゴマーＡｂ分子種は、シナプスの機能および構造、特に、シナプス後側に対して、強い有害作用を及ぼし、第２に、プレセニリン機能の低下は、シナプス伝達を損ない、神経変性を促進する。加えて、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、４（１３４）：ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００３７１６（２０１２）は、アメリカンフットボール選手において観察されるＣＴＥの神経病態と同様な、単回の爆音への曝露の２週間後の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）の証拠を報告し、爆音誘導性の、海馬依存的な学習および記憶の欠損の遷延が、軸索伝導の機能障害、および活動依存的長期シナプス伝達強化の欠損と相関することを開示した。これらの観察は、アルツハイマー病、ＣＴＥ、および他の中枢神経系疾患の処置のための、シナプス形成および神経突起形成の重要性を強調する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、蝸牛シナプトパチーもしくは前庭シナプトパチー、または中枢神経系の疾患もしくは状態、特に、慢性難聴、耳鳴り、聴覚過敏、老人性難聴、または平衡障害と関連する、蝸牛シナプトパチーまたは前庭シナプトパチーを患う患者における、シナプス形成および神経突起形成を増強する方法に対する必要が存在する。神経変性およびタウタンパク質の凝集（例えば、爆音への曝露により引き起こされる）はまた、神経変性およびタウタンパク質の蓄積または凝集を低減する方法に対する別の必要も強調する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、蝸牛シナプトパチーまたは前庭シナプトパチーを患う患者における、シナプス形成および神経突起形成を増強するための方法および組成物を提供することにより、前述の医療上の必要を満たすことに成功した。したがって、本明細書で記載される本発明の、少なくとも１つの態様は、蝸牛シナプトパチーまたは前庭シナプトパチーを患う対象における、シナプス形成および神経突起形成を増強するための方法であって、それを必要とする前記対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法に関する。本開示はまた、対象における神経変性またはタウタンパク質の蓄積を低減する方法であって、前記対象へと、有効な２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法も提示する。
【０００９】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として投与する。
【００１０】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、対象へと、経口投与、静脈内投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与、舌下投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与、髄腔内投与、吸入により投与、または耳内に局所投与する。
【００１１】
一部の実施形態では、方法は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、アセチル−Ｌ−カルニチン、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニン、カルバマチオン、およびＳｚｅｔｏ−Ｓｃｈｉｌｌｅｒペプチド、ならびにこれらの機能的な類似体からなる群から選択される、１または複数の化合物を投与するステップをさらに含む。
【００１２】
一部の実施形態では、方法は、ＮＡＣを投与するステップをさらに含む。
【００１３】
一部の実施形態では、対象は、慢性聴覚損傷または慢性難聴を患う。一部の実施形態では、慢性聴覚損傷または慢性難聴は、老化により引き起こされたものである。
【００１４】
一部の実施形態では、慢性聴覚損傷または慢性難聴は、急性または慢性の、爆音または騒音への曝露により引き起こされたものである。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１年後において、対象へと投与する。
【００１５】
一部の実施形態では、慢性聴覚損傷または慢性難聴は、感染により引き起こされたものである。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、感染の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、感染の、少なくとも１年後において、対象へと投与する。
【００１６】
一部の実施形態では、慢性聴覚損傷または慢性難聴は、毒素への曝露により引き起こされたものである。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、毒素への曝露の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、毒素への曝露の、少なくとも１年後において、対象へと投与する。
【００１７】
一部の実施形態では、対象は、耳鳴りを患う。
【００１８】
一部の実施形態では、対象は、聴覚過敏を患う。
【００１９】
一部の実施形態では、対象は、老人性難聴を患う。
【００２０】
一部の実施形態では、対象は、平衡障害を患う。一部の実施形態では、対象は、シナプス喪失を伴うメニエール病を患う。
【００２１】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩の投与は、対象における蝸牛神経突起または前庭神経突起の再生をもたらす。一部の実施形態では、内有毛細胞上の、生存神経接合の数を増大させる。一部の実施形態では、コルチ器の、トノトピー領域内のシナプスの数を増大させる。
【００２２】
一部の実施形態では、患者は、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の実質的な喪失を患っていない。
【００２３】
本明細書で記載される、本発明の、少なくとも別の態様は、中枢神経系の疾患または状態を患う対象における、シナプス形成および神経突起形成を増強するための方法であって、それを必要とする前記対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法に関する。
【００２４】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として投与する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、対象へと、経口投与、静脈内投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与、舌下投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与、髄腔内投与、吸入により投与、または耳内に局所投与する。一部の実施形態では、方法は、ＮＡＣを、前記対象へと、共投与するステップをさらに含む。
【００２５】
一部の実施形態では、対象は、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、前頭側頭型認知症、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性皮質下神経膠症、筋委縮性側索硬化症、石灰化を伴う、びまん性神経原線維変化、慢性外傷性脳症、拳闘家認知症、ＴＯＤ（ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、クロイツフェルト−ヤコブ病、多系統委縮症、Ｃ型ニーマン−ピック病、ＰｒＰ−ＣＡＡ（ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う、非グアム型運動ニューロン疾患、および脳炎後パーキンソニズムから選択される、中枢神経系の疾患または状態を患う。
【００２６】
これらの特徴および他の特徴は、これらの組織化および作用方式と併せて、付属の図面と共に理解される場合、以下の、発明を実施するための形態から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＨＰＮ−０７が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの、マウス螺旋神経節（ＳＧ）組織外植片内で、神経突起形成性応答を誘導したことを示す図である。ＨＰＮ−０７は、同じ器官型培養培地中で培養された非処置対照（ＮＣ、正常対照）と比べて、顕著な神経突起の成長を誘導した。ＨＰＮ−０７の存在下において、各ＳＧ外植片から放射状に伸びる神経突起の数、および増大したこれらの伸展の各々の、対応する長さの両方である。
【図２】ＨＰＮ−０７が、カノニカルの蝸牛の神経突起形成性成長因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）により誘導される神経突起形成を強化したことを示す図である。マウス螺旋神経節外植片を、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）またはＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＨＰＮ−０７（０．１μＭ）を伴うか、または伴わない無血清培地中で、４８時間にわたり培養し、次いで、固定し、β−チューブリンで免疫標識化して、神経突起を可視化した。
【図３】ＰＣ１２細胞系内の、細胞１個当たりの平均値神経突起長を示す図である。ＨＰＮ−０７と、漸増用量のＮＧＦとによる組合せ処置は、ＨＰＮ−０７が、ニューロン様のＰＣ１２細胞系内の、ＮＧＦ媒介性の神経突起の伸長（すなわち、平均値神経突起長の増大）を著明に増強することを明らかにした。
【図４】著明な神経突起の成長を呈する、ＰＣ１２細胞の百分率を示す図である。ＨＰＮ−０７と、漸増用量のＮＧＦとによる組合せ処置は、ＨＰＮ−０７が、処置後において、神経突起を有する細胞の百分率の有意な増大により証拠立てられる通り、ニューロン様のＰＣ１２細胞内の、ＮＧＦ誘導性の神経突起形成を著明に増強することを明らかにした。
【図５】ＨＰＮ−０７による、カイニン酸（ＫＡ）誘導性の興奮毒性による、内有毛細胞（ＩＨＣ）のリボンシナプスの完全性の喪失の好転を示す図である。
【図６】ＫＡへの興奮毒性曝露後における、非処置蝸牛外植片、ＢＤＮＦ処置蝸牛外植片、またはＨＰＮ−０７処置蝸牛外植片に由来するＩＨＣ間の、リボンの数および空間的分布についてのターゲティングされた比較による定量的査定をまとめる図である。
【図７】シナプス前マーカーの定量化（Ｃ末端結合性タンパク質２、ＣｔＢＰ２）およびシナプス後マーカーの定量化（ＧｌｕＲ２／３）を示す図である。上パネルでは、ラットを、１．５分間隔で繰り返される、１４ｐｓｉで、３回にわたる、継起的なオープンフィールドの爆音へと曝露し、次いで、最後の爆音の１時間後に、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣを注射し（ｉ．ｐ．）、次いで、続く４８時間にわたり、１日２回ずつ注射した。下パネルでは、ラットを、単回で、８ｐｓｉの、ショックチューブ内の爆音へと曝露し、次いで、最後の爆音の１時間後に、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣを注射し（ｉ．ｐ．）、次いで、続く４８時間にわたり、１日２回ずつ注射した。
【図８】抗酸化剤処置が、爆音誘導性の外傷に応答する、蝸牛リボンシナプスの喪失に対して保護することを示す図である。共焦点イメージングは、曝露の２１日後における、爆音へと曝露された動物（Ｄ〜Ｆ）におけるＯＣの、中回転（１６ｋＨｚ領域）内の、ＩＨＣ基底外側膜に沿った、ＣｔＢＰ２およびＧｌｕＲ２／３による免疫標識化の、非曝露非投薬の、週齢をマッチさせた対照（Ａ〜Ｃ）と比べた低減を示す。爆音への曝露後に、ＨＰＮ−０７と、ＮＡＣとの組合せで処置された動物は、ＯＣのこの領域内の、シナプス叢の、このような粗大なＩＨＣの喪失を示さなかった（Ｇ〜Ｉ）。シナプス前リボンを、抗ＣｔＢＰ２抗体（赤）で標識化し、シナプス後肥厚を、抗ＧｌｕＲ２／３抗体（緑）で標識化する。右端パネル内の融合画像は、各状態について、２つのシナプスマーカーの、重複シグナル強度（黄）を明らかにする。共焦点画像は、１６ｋＨｚ領域内の、ＩＨＣ  ８〜１０個以内のリボンの、ｚスタックの最大射影である。Ａ〜Ｉの、Ｉ内で、スケールバー＝５μｍである。
【図９】ＨＰＮ−０７およびＮＡＣによる急性治療的介入が、爆音へと曝露された動物のＯＣの、１６〜３２ｋＨｚ領域における、ＩＨＣ内のリボンシナプスの喪失を低減することを示す図である。週齢をマッチさせた、非曝露非投薬対照、ならびに爆音への曝露の７日後（７Ｄ；ＡおよびＢ）または２１日後（２１Ｄ；ＣおよびＤ）における、爆音へと曝露された動物の、非処置コホートおよび抗酸化剤処置コホートにおける、ＯＣの、２、４、８、１６、３２、および４８ｋＨｚ領域内のＩＨＣにおいて、シナプスマーカーの計数を実施した。非処置の爆音へと曝露された動物の、８〜４８ｋＨｚ領域（７Ｄ）および１６〜４８ｋＨｚ領域（２１Ｄ）におけるＩＨＣでは、シナプス前マーカーおよびシナプス後マーカーの両方の、同時発生的で、統計学的に有意な喪失が観察された。ＯＣの８ｋＨｚ領域および１６ｋＨｚ領域では、これらのシナプスのマーカーの、爆音誘導性の喪失に抗するための、抗酸化剤による著明な処置効果が同定され、３２ｋＨｚ領域（７Ｄおよび２１Ｄ）および４８ｋＨｚ領域（７Ｄ）では、抗酸化剤処置について、統計学的に有意となる傾向が観察された。爆音への曝露の２１日後における、４８ｋＨｚ領域では、このような処置効果は観察されなかった。リボンシナプスの喪失についての、群の統計学的有意差を、＊、＊＊、または ＊＊＊のそれぞれを、ｐ＜０．０５、０．０１、または０．００１とするアステリスクで指し示す一方、抗酸化剤処置効果の統計学的有意性を、ｐ＜０．０１について、＃＃で表示する。誤差バーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。カッコ内の数は、各コホート内で査定されるＯＣの総数を表す。
【図１０】抗酸化剤との組合せによる介入が、骨ＳＬ内の、爆音誘導性の神経線維の喪失に対して保護することを示す図である。Ａ〜Ｃにおける画像は、正常対照（Ａ）；傷害の２１日後における、非処置の爆音へと曝露されたラット（Ｂ）；および爆音の２１日後における、抗酸化剤で処置された爆音へと曝露されたラット（Ｃ）の中回転に由来する、ＳＬの断面図（Ａ〜Ｃ）内の、ＮＦ−２００で陽性染色された神経線維の例である。爆音への曝露の２１日後における、非処置の爆音へと曝露された動物の蝸牛のＳＬ（Ｂ）では、正常対照（Ａ）、ならびにＨＰＮ−０７およびＮＡＣで処置された爆音へと曝露された動物（Ｃ）と比較して、少数のＮＦ−２００陽性神経線維が観察された。各実験コホートに由来する蝸牛の中回転および基底回転におけるＳＬ内の、ＮＦ−２００陽性神経線維の定量化を行い、神経突起の密度を推定し、統計学的に解析した（Ｄ）。非処置の爆音へと曝露された動物のＳＬ内の、ＮＦ−２００陽性神経突起の数は、爆音への曝露の２１日後において、ＮＣと比較して、著明に減少した（ｐ＜０．０５；＊）。ＳＬ内の、ＮＦ−２００陽性神経突起の、このような低減は、爆音への曝露の２１日後における、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣで処置された爆音へと曝露された動物では観察されなかった（ｐ＜０．０１；＃＃；非処置の爆音へと曝露された動物と比較した）。早期の時点では、コホートのうちのいずれの間でも、神経突起密度の有意な変化は観察されなかった（全てについて、ｐ＞０．０５）。Ａ〜ＣのＣでは、スケールバー＝１０μｍである。カッコ内の数は、各時点において、各コホート内で査定された動物の総数を表す。Ｄにおける誤差バーは、ＳＥＭを表す。
【図１１】抗酸化剤処置が、ＳＧ内の、爆音誘導性の神経変性の証拠を低減することを示す図である。Ａ〜Ｃにおける画像は、正常対照（Ａ）；爆音の２１日後における、非処置の爆音へと曝露されたラット（Ｂ）；および２１日後における、処置された爆音へと曝露されたラット（Ｃ）の基底回転における、ＳＧ内の、ＮＦ−２００染色の例である。ＳＧ内のニューロンの大部分が、ＮＦ−２００について陽性染色される（軽度の陽性）一方で、各コホート内の、少数のニューロンは、強く免疫反応性であった（強く陽性；Ａ〜Ｃにおける矢印）。Ａ〜Ｃにおける矢印は、ＮＦ−２００抗体により免疫標識化されなかったニューロンを描示する。ＳＧ内の、ＮＦ−２００による軽度の陽性ニューロン、または強い陽性ニューロンの数を定量化し、各試料中の、それらの相対百分率を、ニューロンの総数との比較に基づき計算した（ＤおよびＥ）。次いで、各時点における、コホート間の、これらの百分位数の差違を、統計学的に解析した。爆音への曝露の２１日後における、非処置の爆音へと曝露された動物のＳＧ内では、ＮＣと比較して、軽度のＮＦ−２００陽性ニューロンの百分率の減少が観察された（ｐ＜０．００１；＊＊＊）。この時点では、軽度のＮＦ−２００陽性細胞の喪失に対する、統計学的に有意な、肯定的な処置効果が観察された（２１Ｄ−Ｂ対２１Ｄ−Ｂ／Ｔ、ｐ＜０．００１；＃＃＃；Ｄ）。爆音への曝露の７および２１日後における、非処置の爆音へと曝露された動物のＳＧ内では、ＮＣと比較して、強いＮＦ−２００陽性ニューロンの百分率の増大が観察された（全てについて、ｐ＜０．０１；＊＊）。爆音への曝露の２１日後には、強いＮＦ−２００陽性細胞の増大に対する、統計学的に有意な、肯定的な処置効果が観察された（２１Ｄ−Ｂ対２１Ｄ−Ｂ／Ｔ、ｐ＜０．０５；＃；Ｅ）。カッコ内の数は、各時点において、各コホート内で査定された動物の総数を表す。誤差バーは、ＤおよびＥにおけるＳＥＭを表す。Ａ〜ＣのＣでは、スケールバー＝２０μｍである。
【図１２】ＨＰＮ−０７およびＮＡＣによる治療的介入が、爆音に応答する、ＳＧ内の、ＮＦ−６８による免疫標識化の病理学的増大を、著明に低減したことを示す図である。Ａ〜Ｃにおける画像は、ＮＣラット（Ａ）；損傷の７日後における、非処置の爆音へと曝露されたラット（Ｂ）；および爆音への曝露の７日後における、抗酸化剤処置動物（Ｃ）に由来する基底回転における、ＳＧについてのＮＦ−６８免疫染色の例である。一部の小型のニューロンは、全ての条件下で、ＮＦ−６８陽性（Ａ〜Ｃにおける矢印）であったが、独特なことには、複数の、大型の、ＮＦ−６８陽性ニューロンが存在することが、損傷の７日後の、爆音へと曝露された動物において明白であった（Ｂにおける矢印）ことに注目されたい。ＮＦ−６８陽性ニューロンの総数を、各コホート内、各サンプリング間隔でカウントし、ＮＦ−６８陽性ニューロンの百分率を計算し、統計学的に解析した（Ｄ）。爆音への曝露の７および２１日後における、非処置の爆音へと曝露された動物のＳＧ内では、ＮＦ−６８陽性ニューロンの数の有意な増大が観察された（全てについて、ｐ＜０．００１；＊＊＊）。爆音への曝露後７および２１日間のいずれの時点においても、有意な抗酸化剤処置効果が同定された（全てについて、ｐ＜０．０５；＃）。Ａ〜ＣのＣにおけるスケールバー＝２０μｍである。Ｄにおける誤差バーは、ＳＥＭを表す。カッコ内の数は、各時点において、各コホート内で査定された動物の総数を表す。
【図１３】抗酸化剤処置が、ＳＧ内の、爆音誘導性の神経変性の証拠を低減することを示す図である。非曝露非投薬対照、ならびに爆音への曝露の２１日後の、非処置動物およびＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置動物の両方において、螺旋神経節ニューロンの最大直径を測定し、統計学的に解析した。非処置の爆音へと曝露された動物の蝸牛では、３つの回転全てにおける、非曝露非投薬対照と比較して、細胞体直径の、有意な減少が観察された（全てについて、ｐ＜０．００１；＊＊＊）。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣで処置された爆音へと曝露された動物では、３つの回転全てにおける、平均値細胞体直径が、非曝露非投薬対照と、統計学的に識別不能であった（全てについて、ｐ＞０．０５）。カッコ内の数は、各コホート内で査定された動物の総数を表す。
【図１４】抗酸化剤処置が、ＳＧ内の、爆音誘導性の、高リン酸化タウの蓄積を低減することを示す図である。Ａ〜Ｃにおける画像は、正常対照動物（Ａ）；爆音の７日後における、非処置の爆音へと曝露されたラット（Ｂ）；および損傷の７日後における、抗酸化剤処置ラット（Ｃ）に由来する中回転における、ＳＧのＡＴ８免疫染色の例である。ＡＴ８陽性ＳＧＮ（ＢおよびＣにおける矢印）の数をカウントし、ＡＴ８陽性ニューロンの百分率を計算し、各時点における、実験コホート間の統計学的比較のために使用した（Ｄ）。爆音への曝露の７日後の、非処置ラットおよび処置ラットでは、ＳＧＮ内の、ＡＴ８の蓄積の増大が観察された（ｐ＜０．０１または０．００１；＊＊または＊＊＊）。爆音への曝露後のこの時点では、有意なＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置効果が観察された（ｐ＜０．０５；＃）。Ａ〜ＣのＣでは、スケールバー＝２０μｍである。カッコ内の数は、各時点において、各コホート内で査定された動物の総数を表す。Ｄにおける誤差バーは、ＳＥＭを表す。
【図１５】抗酸化剤処置が、ＳＧ内の、爆音誘導性の、病原性タウオリゴマーの蓄積を低減することを示す図である。Ａ〜Ｃにおける画像は、正常対照ラット（Ａ）；爆音の７日後における、非処置の爆音へと曝露されたラット（Ｂ）；および損傷の７日後における、抗酸化剤処置ラット（Ｃ）に由来する中回転における、ＳＧの、オリゴマータウの免疫染色（Ｔ２２）の例である。非処置の爆音へと曝露された動物（Ｂにおける矢印）および抗酸化剤で処置された爆音へと曝露された動物（Ｃにおける矢印）では、Ｔ２２陽性ニューロンが観察された。ＳＧ内のＴ２２陽性ニューロンの数を定量化し、各時点における、各コホート内のＴ２２陽性ニューロンの百分率を計算し、統計学的に解析した（Ｄ）。全ての被験時点の、非処置の爆音へと曝露された動物のＳＧ内では、Ｔ２２陽性ニューロンの数の増大が観察された（ｐ＜０．０５または０．００１；＊または＊＊＊）。爆音への曝露後７および２１日間の時点については、有意な処置効果が観察された（ｐ＜０．０５または０．０１；＃または＃＃）が、爆音後急性、２４時間の時点では、有意な処置効果が観察されなかった（ｐ＞０．０５）。Ａ〜ＣのＣでは、スケールバー＝２０μｍである。カッコ内の数は、各時点において、各コホート内で査定された動物の総数を表す。Ｄにおける誤差バーは、ＳＥＭを表す。
【図１６】爆音への曝露が、ＳＧＮ内の細胞体における、オリゴマータウとＮＦ−６８断片との、同時的な蓄積を結果としてもたらすことを示す図である。画像は、爆音への曝露の２４時間後（Ａ〜Ｄ）、または７日後（Ｅ〜Ｈ）の非処置動物の、中回転におけるＳＧ内の、Ｔ２２およびＮＦ−６８による二重標識化の例である。爆音に応答するＳＧ内では、独特なことに、細胞体におけるＮＦ−６８、ならびに核および細胞質におけるＴ２２の両方について免疫陽性のＳＧＮが観察された（緑；Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＨにおける矢印）。ＳＧ内では、一部の、ＮＦ−６８標識化を伴わない、Ｔ２２陽性ニューロンもまた観察された（赤；Ａ、Ｅ、Ｄ、およびＨにおける矢印）。核は、ＤＡＰＩにより染色した（青）。Ａ〜ＨのＨでは、スケールバー＝５μｍである。
【図１７】抗酸化剤処置が、聴覚野（ＡＣ）内の細胞体における、爆音誘導性の、タウの蓄積を低減することを示す図である。Ａ〜Ｃにおける画像は、正常対照ラット（Ａ）；爆音の７日後における、非処置の爆音へと曝露されたラット（Ｂ）；および損傷の２１日後における、抗酸化剤処置ラット（Ｃ）の深部層における、タウ１による免疫染色の例である。正常対照（Ａにおける矢印）、非処置の爆音へと曝露された動物（Ｂにおける矢印）、および抗酸化剤で処置された爆音へと曝露された動物（Ｃにおける矢印）では、タウ１陽性ニューロンが観察された。ＡＣ内のタウ１陽性ニューロンの数を定量化し、各時点における、各コホート内のタウ１陽性ニューロンの百分率を計算し、統計学的に解析した（Ｄ）。損傷後全ての時点の、爆音へと曝露された動物のＡＣ内では、タウ１陽性細胞体を伴うニューロンの数の増大が観察された（ｐ＜０．０５、０．００１、または０．００１；＊、＊＊、または＊＊＊）。抗酸化剤処置は、７および２１日間のサンプリング間隔の、爆音へと曝露されたラットにおける、この異常な免疫染色パターンを低減したが、肯定的な処置効果についての統計学的有意性が結論づけられたのは、２１日間のコホートに限られた（ｐ＜０．００１；＃＃＃）。カッコ内の数は、各時点において、各コホート内で査定された動物の総数を表す。Ａ〜ＣのＣでは、スケールバー＝２０μｍである。誤差バーは、ＳＥＭを表す。
【図１８】ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置が、ＳＧ内の、爆音誘導性の酸化ストレスを低減することを示す図である。画像は、非曝露非投薬ラット（Ａ）；爆音への曝露の２４時間後における、非処置の爆音へと曝露されたラット（Ｂ）；およびＨＰＮ−０７／ＮＡＣで処置された爆音へと曝露されたラット（Ｃ）に由来する、蝸牛の基底回転における、ＳＧ内の８−ＯＨｄＧ免疫染色の例である。ＳＧ内の、８−ＯＨｄＧ陽性ニューロンの数を定量化し、各コホート内で結果として得られる百分位数を計算し、統計学的に解析した（Ｄ）。非処置の爆音へと曝露された動物のＳＧ内では、８−ＯＨｄＧ陽性ニューロンの数の増大が観察された（ｐ＜０．００１；＊＊＊）。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、この爆音誘導性のストレス応答を、有意に低減した（ｐ＜０．０１；＊＊＊）。カッコ内の数は、各コホート内で査定された動物の総数を表す。Ａ〜ＣのＣでは、スケールバー＝２５μｍである。誤差バーは、ＳＥＭを表す。
【図１９】抗酸化剤処置が、ＩＨＣの神経支配帯域内における、爆音誘導性の、神経突起の喪失に対して保護することを示す図である。Ａ〜Ｆにおける画像は、非曝露非投薬ラット（Ａ、Ｄ）；爆音への曝露の２１日後における、非処置の爆音へと曝露された動物（Ｂ、Ｅ）；および爆音の２１日後における、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣで処置された爆音へと曝露された動物（Ｃ、Ｆ）に由来する、蝸牛の中回転の、ＩＨＣ領域内の、ＮＦ−２００で陽性染色された神経突起（ピンク；Ａ〜Ｃにおける矢印）の例である。Ａ〜Ｃにおける矩形は、Ｄ〜Ｆの画像を収集した位置を指し示す。非処置の爆音へと曝露された動物の蝸牛内の、ＩＨＣの神経支配帯域（Ｅにおける矢印）に沿って、正常対照（Ｄにおける矢印）またはＨＰＮ−０７およびＮＡＣで処置された爆音へと曝露された動物（Ｆにおける矢印）と比較して少数のＮＦ−２００陽性神経突起が観察された。Ａ〜Ｃにおける矢印およびブラケットは、それぞれ、ＩＨＣおよびＯＨＣ（緑）を指し示す。核は、ＤＡＰＩにより染色した（青）。蝸牛の中回転内および基底回転内各ＩＨＣに隣接する、ＮＦ−２００陽性神経突起の数を、カウントし、各サンプリング間隔の、各コホートについて、統計学的に解析した（Ｇ）。爆音の７および２１日後における、非処置の爆音へと曝露された動物（７Ｄ−Ｂおよび２１Ｄ−Ｂ）では、ＩＨＣ  １個当たりのＮＦ−２００陽性神経突起の数の、正常対照と比較して有意な低減（ＮＣ；＊＊または＊＊＊、ｐ＜０．０１または０．００１）が見られた。爆音への曝露の７および２１日後の両方において、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣで急性処置された、爆音へと曝露された動物（７Ｄ−Ｂ／Ｔおよび２１Ｄ−Ｂ／Ｔ）では、ＩＨＣの神経支配帯域内の、ＮＦ−２００陽性神経突起の喪失に対する、非処置の爆音へと曝露された動物と比較して有意な程度の保護（＃または＃＃＃、ｐ＜０．０５または０．００１）が観察された。誤差バーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。カッコ内の数は、各時点において、各コホート内で査定された動物の総数を表す。Ｃにおけるスケールバー＝５μｍは、Ａ〜Ｃに当てはまり、Ｆにおけるスケールバー＝５μｍは、Ｄ〜Ｆに当てはまる。
【図２０】ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置が、爆音誘導性の難聴を軽減することを示す図である。ＡＢＲ閾値のシフトは、２〜１６ｋＨｚにわたり平均したものであり、爆音への曝露後３つの時点における、処置動物と、非処置動物とを比較する。各時点において、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣで処置された爆音へと曝露された動物（Ｂ／Ｔ）の、平均ＡＢＲ閾値のシフトは、非処置の爆音へと曝露された対照のシフトより有意に小さかった（Ｂ）。カッコ内の数は、群１つ当たりの耳の数を表す。＊＊、＊＊＊は、処置された爆音へと曝露された動物と、非処置の爆音へと曝露された動物との間の、ｐ＜０．０１および０．００１を指し示す。＃＃＃は、爆音の７日後（７Ｄ）または２１日後（２１Ｄ）における、ＡＢＲ閾値のシフトのＨＰＮ−０７／ＮＡＣ媒介性の低減を、爆音の２４時間後（２４Ｈ）において観察されるシフトの低減と比較する、ｐ＜０．００１を指し示す。誤差バーは、ＳＥＭを指し示す。
【図２１】ＨＰＮ−０７およびＮＡＣが、騒音誘導性の難聴を緩和したことを示す図である。（Ａ）騒音の１日後における、ＡＢＲ閾値のシフトを示す図であり；（Ｂ）騒音の１５日後における、ＡＢＲ閾値のシフトを示す図である。騒音により引き起こされた難聴は、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置により緩和された。＊および＊＊＊は、それぞれ、二元ＡＮＯＶＡに続く、ボンフェローニの事後検定について、所与の任意の周波数における、有意な試料効果である、ｐ＜０．０５および０．００１を表す。
【図２２】騒音への曝露後における、有毛細胞の喪失が、最小限であり、蝸牛の基底領域内だけで現れたことを示す図である。
【図２３】ＨＰＮ−０７およびＮＡＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、騒音誘導性の、ＩＨＣリボンシナプスの興奮毒性喪失を好転させたことを示す図である。１回の騒音（１１０ｄＢで、２時間にわたる、８〜１６ｋＨｚの騒音）は、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの高周波数におけるシナプスのうちの、３０％〜４０％の喪失を引き起こした。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、損傷を好転させた。騒音単独群と、騒音＋ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ群との比較を行った。＊＊および＊＊＊は、それぞれ、ｐ＜０．０１および０．００１を表す。損傷の２４時間後には、リボンシナプスの喪失は、恒久的となるので、回復は、再生性でなければならない。
【図２４】ＨＰＮ−０７が、螺旋神経節ニューロン外植片内の、ＢＤＮＦ誘導性の神経突起形成を強化することを示す図である。螺旋神経節ニューロンは、損傷後で神経線維を再増殖させる、生得的であるが、限定的な能力を有する。内因性ニューロトロフィン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、回復を容易としうる。ＨＰＮ−０７は、ＢＤＮＦに加えて、神経線維の数および広がりを、大幅に増大させた。＊＊＊は、ＮＣと比較したｐ＜０．００１を表す。＃＃は、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）と比較したｐ＜０．０１を表す。
【図２５】ＨＰＮ−０７が、螺旋神経節ニューロン外植片内の、ＢＤＮＦ誘導性の神経突起形成を強化する実験では、神経突起長が、処置のうちのいずれによっても、正常対照（ＮＣ）と比較して、それほど変化しないことを示す図である。
【図２６】ＨＰＮ−０７が、ＮＴ−３誘導性の神経突起形成を強化したことを示す図である。ＢＤＮＦ誘導性の神経突起形成と同様に、ＮＴ−３誘導性の神経突起形成もまた、ＨＰＮ−０７により増強される。＊＊＊は、ＮＣと比較した、ｐ＜０．００１を表す。＃および＃＃は、それぞれ、ＮＴ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）と比較した、ｐ＜０．１およびｐ＜０．０１を表す。
【図２７】ＨＰＮ−０７が、ＮＴ−３誘導性の神経突起形成を強化した実験では、神経突起長が、処置のうちのいずれによっても、正常対照（ＮＣ）と比較して、それほど変化しないことを示す図である。
【図２８】ＮＨＰＮ−１０１０処置（ＨＰＮ−０７＋ＮＡＣ）が、確立された難聴についてのパイロット研究において、聴力機能を回復したことを示す図である。オープンフィールドの爆音傷害により、恒久的な閾値シフトを確立した。損傷の４週間後に、毎日２回、３００ｍｇ／ｋｇで、１４日間にわたり投与される、ＨＰＮ−０７＋ＮＡＣによる処置を開始した。損傷の１４週間後（処置の８週間後）におけるＡＢＲ閾値の改善が、処置前と対比して示された。
【図２９】ＮＨＰＮ−１０１０処置（ＨＰＮ−０７＋ＮＡＣ）が、確立された慢性難聴モデルにおいて、ＩＨＣリボンシナプス数を回復させたことを示す図である。ＮＨＰＮ−１０１０処置は、損傷の４週間後に開始し、１４日間にわたり、毎日投与した。損傷の８週間後に、リボンシナプスカウントは、有意に回復した。
【図３０】ＮＨＰＮ−１０１０処置（ＨＰＮ−０７＋ＮＡＣ）が、確立された慢性難聴モデルにおいて、ＡＢＲの波Ｉの振幅の回復をもたらしたことを示す図である。プラセボ群における、８０および７０ｄＢの両方の音圧レベル（ＳＰＬ）の、４ｋＨｚおよび８ｋＨｚの刺激に応答する振幅は、爆音への曝露により低減され、時間の経過と共に減少し続けた。８０ｄＢのＳＰＬの、８ｋＨｚの刺激に応答する振幅の低減は、ＮＨＰＮ−１０１０処置の８週間後に、処置前のレベルへと、完全に回復した。
【図３１】１６、３２、４８ｋＨｚの爆音の後で、リボンシナプスが、低減され、ＮＨＰＮ−１０１０処置（ＨＰＮ−０７＋ＮＡＣ）により、保存／回復されることを示す図である。
【図３２】ＮＨＰＮ−１０１０処置（ＨＰＮ−０７＋ＮＡＣ）が、一次求心性聴覚ニューロンが低減される、逆行性神経変性に対する、爆音の影響を改善しうることを示す図である。
【図３３】ＨＰＮ−０７およびＮＡＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、騒音誘導性のシナプス喪失を好転させたことを示す図である。この実験では、５回にわたるＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置の投与が、騒音誘導性のシナプス喪失を好転させるのに、２回の投与より有効であると考えられた。騒音単独群と、騒音＋ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ群（５回の投与）との比較を行った。＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。
【図３４】ＨＰＮ−０７／ＮＡＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、騒音誘導性のＡＢＲ振幅異常を回復させることを示す図である。処置群の、ＡＢＲの波Ｉの振幅および波Ｖ／Ｉの振幅比は、非処置群とは対照的に、騒音への曝露の１５日後において、騒音前と比較して変化しなかった。いずれの群の波Ｖの振幅も、変化しなかった。＊＊反復測定二元ＡＮＯＶＡについて、周波数にわたり有意な主要効果である、ｐ＜０．０１。
【図３５】中枢聴覚系における、活性調節型細胞骨格関連タンパク質（ＡＲＣ）についての免疫染色を示す図である。Ａｒｇ３．１としてもまた公知のＡＲＣは、可塑性タンパク質である。中枢聴覚系におけるＡＲＣの減少は、耳鳴りと関連する。爆音への曝露は、ＡＣ内、ＩＣ内、およびＤＣＮ内のＡＲＣを下方調節した。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、ＡＣ内、ＩＣ内、およびＤＣＮ内のＡＲＣの発現を、処置を伴わない爆音群と比較して正常化した。＊、＊＊＊は、ＮＣと比較した場合の、ｐ＜０．０５または０．００１を指し示し、＃＃＃は、処置を伴わない爆音群と比較した場合のｐ＜０．００１を指し示す。
【図３６】中枢聴覚系における、成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ−４３）についての免疫染色およびウェスタンブロットを示す図である。ＧＡＰ−４３は、軸索の成長円錐に位置する、膜関連リンタンパク質である。ＧＡＰ−４３は、軸索の成長、シナプス形成、およびシナプスのリモデリングについてのマーカーである。爆音への曝露は、ＡＣ内、ＩＣ内、およびＤＣＮ内のＧＡＰ−４３を上方調節した。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、ＡＣ内、ＩＣ内、およびＤＣＮ内のＧＡＰ−４３の発現を、処置を伴わない爆音群と比較して正常化した。
【図３７】蝸牛背側核（ＤＣＮ）内の、ＧＡＢＡＡ受容体α１（ＧＡＢＡＡ  Ｒα１）についての免疫染色を示す図である。ＧＡＢＡＡ受容体は、イオンチャネル型受容体であり、リガンド開口型イオンチャネルである。その内因性リガンドは、中枢神経系における、主要な阻害性神経伝達物質である、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である。爆音への曝露は、ＤＣＮ内の、ＧＡＢＡＡ  Ｒα１の発現を上方調節した。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、ＤＣＮ内のＧＡＢＡＡ  Ｒα１の発現を、処置を伴わない爆音群と比較して正常化した。
【図３８】ＤＣＮ内の、ＧＡＢＡＡ  Ｒα１（赤）およびＧＡＤ６７（緑）についての共標識化を示す図である。ＧＡＤ６７が、阻害性ニューロンについてのバイオマーカーであることから、ＧＡＢＡＡ  Ｒα１陽性細胞は、阻害性ニューロンであることが指し示される。
【図３９】ＤＣＮ内の、グルタミン酸受容体２（ＧｌｕＲ２）についての免疫染色を示す図である。ＧｌｕＲ２は、中枢神経系における興奮性神経伝達物質である、ＡＭＰＡのイオンチャネル型受容体である。グルタミン酸受容体の過剰刺激は、興奮毒性を介して、神経変性およびニューロンの損傷を引き起こす。爆音への曝露は、ＤＣＮ内の、ＧｌｕＲ２の発現を上方調節した。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、ＤＣＮ内のＧｌｕＲ２の発現を、処置を伴わない爆音群と比較して正常化した。
【図４０】螺旋神経節（ＳＧ）内の、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（ＴＲＰＶ１）についての免疫染色を示す図である。カプサイシン受容体およびバニロイド受容体１としてもまた公知のＴＲＰＶ１は、高温の酸性条件、カプサイシン、および刺激性化合物により活性化する。ＳＧ内の、ＴＲＰＶ１の上方調節は、耳鳴りと関連する。爆音への曝露は、ＳＧ内の、ＴＲＰＶ１を上方調節した。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、ＳＧ内のＴＲＰＶ１を、処置を伴わない爆音群と比較して正常化した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書で記載される本発明は、シナプス形成および神経突起形成を促進または増強するための方法であって、蝸牛シナプトパチーまたは前庭シナプトパチーを患う対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン （２，４−ＤＳＰＢＮ、またはＨＰＮ−０７）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法を提供する。任意選択で、２，４−ＤＳＰＢＮを、ＮＡＣと共に共投与する。
【００２９】
略号
ＡＶＣＮ：蝸牛腹側前核；ＡＣ：聴覚野；ｂＴＢＩ、爆音誘導性外傷性脳損傷である。ＣｔＢＰ２：Ｃ末端結合性タンパク質２；ＤＣＮ：蝸牛背側核；ＧｌｕＲ２／３：グルタミン酸受容体２／３；ＨＰＮ−０７：２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン；ＩＣ：下丘；ＩＨＣ：内有毛細胞；ｍＴＢＩ：軽度爆音誘導性外傷性脳損傷；ＮＡＣ：Ｎ−アセチルシステイン；ＮＦ：神経線維；ＯＣ：コルチ器；ＯＨＣ：外有毛細胞；８−ＯＨｄＧ：８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン；ｐｓｉ：１平方インチ当たりのポンド；ＰＶＣＮ：蝸牛腹側後核；ＳＮＨＬ：感覚神経性難聴；ＳＧ：螺旋神経節；ＳＧＮ：螺旋神経節ニューロン；ＳＬ：螺旋板である。
【００３０】
２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）
２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロンはまた、２，４−ジスルホニルＰＢＮ、２，４−ＤＳＰＢＮ、ＮＸＹ−０５９、またはＨＰＮ−０７とも称する。これは、以下の構造：
【００３１】
【化１】
2019537582.tif 000003
を有する。
【００３２】
化合物の酸形態は、以下の構造：
【００３３】
【化２】
2019537582.tif 000004
を有する。
【００３４】
酸形態は、固体の場合もあり、低ｐＨ溶液中で見出される場合もある。化合物のイオン化塩形態は、高ｐＨで存在し、以下の構造：
【００３５】
【化３】
2019537582.tif 000005
のうちのいずれかにより表されうる。
【００３６】
塩形態では、Ｘは、薬学的に許容されるカチオンである。最も一般に、このカチオンは、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムなどの一価材料であるが、また、多価材料単独の場合もあり、薬学的に許容される一価アニオンと組み合わせたカチオン、例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物、ヒドロキシル、硝酸、スルホン酸、酢酸、酒石酸、シュウ酸、コハク酸、パモ酸などのアニオンと組み合わせたカルシウム；このようなアニオンと組み合わせたマグネシウム；このようなアニオンと組み合わせた亜鉛などの場合もある。これらの材料の中では、遊離酸、および単純なナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩が最も好ましく、カルシウム塩およびマグネシウム塩もまた好ましいが、何らかの形で、それほど好ましくはない。２，４−ＤＳＰＢＮについては、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４８８，１４５号により、詳細に記載されている。２，４−ＤＳＰＢＮの塩もまた、本明細書で記載される２，４−ＤＳＰＢＮの使用と同様の形で、シナプス形成および神経突起形成を促進または増強するために使用されうる。
【００３７】
シナプス形成および神経突起形成を促進または増強するために、２，４−ＤＳＰＢＮを、例えば、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約５００ｍｇの間、または体重１ｋｇ当たり約５ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約４００ｍｇの間、または体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約３００ｍｇの間、または体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり約２０ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり約１５０ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり約２００ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり約２５０ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり約３００ｍｇの用量で投与することができる。
【００３８】
ヒト対象における、シナプス形成および神経突起形成を促進または増強するために、２，４−ＤＳＰＢＮを、例えば、毎日約１００ｍｇ〜約２０，０００ｍｇの間、または約５００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇの間、または約１，０００ｍｇ〜約５，０００ｍｇの間、または約１００ｍｇ、または約２００ｍｇ、または約５００ｍｇ、または約１，０００ｍｇ、または約２，０００ｍｇ、または約３，０００ｍｇ、または約５，０００ｍｇ、または約８，０００ｍｇ、または約１０，０００ｍｇの用量で投与することができる。
【００３９】
対象に、毎日１回の投与、または毎日２回の投与、または毎日３回の投与、または毎日４回の投与、または毎日５回の投与を行うことができる。
【００４０】
２，４−ＤＳＰＢＮを、ＮＡＣと組み合わせて、シナプス形成および神経突起形成を促進または増強することができる。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮと、ＮＡＣとを、混合物として共投与する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮと、ＮＡＣとを、別個の剤形として、逐次的に投与し、または同時に投与する。
【００４１】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮと、任意選択で、ＮＡＣとは、経口投与される。他の送達法は、静脈内送達、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）送達、舌下送達、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）送達、髄腔内送達、吸入による送達、または耳内への局所送達を含むがこれらに限定されない。さらに、活性組成物は、ナノ粒子またはデンドリマー製剤としても投与することができる。ナノ粒子は、多機能性であり、ポリマーと、常磁性の酸化鉄粒子とから構成されて、内耳または蝸牛背側核など、所望の標的への薬物の送達の一助となるように、外部の磁力の適用を可能としうる。加えて、組成物は、経口吸収を増強し、バイオアベイラビリティー動態を変更するように、当業者に公知の添加剤と共に製剤化されうる。
【００４２】
２，４−ＤＳＰＢＮの代わりに、またはこれに加えて、シナプス形成および神経突起形成を促進または増強するのに、他のニトロン化合物もまた使用することができる。一部の実施形態では、ニトロン化合物は、フェニルブチルニトロン（ＰＢＮ）およびその誘導体から選択される。一部の実施形態では、ニトロン化合物は、ＰＢＮである。一部の実施形態では、ニトロン化合物は、４−ヒドロキシ−α−フェニルブチルニトロン（４−ＯＨＰＢＮ）である。一部の実施形態では、ニトロン化合物は、２−スルホニル−α−フェニル三級ブチルニトロン（Ｓ−ＰＢＮ）である。
【００４３】
したがって、本明細書で開示される実施形態の全てにおいて、本出願は、２，４−ＤＳＰＢＮの代わりに、またはこれに加えて、前述のニトロン化合物のうちのいずれかの使用を明示的に対象とする。よって、フェニルブチルニトロン（ＰＢＮ）、４−ヒドロキシ−α−フェニルブチルニトロン（４−ＯＨＰＢＮ）、および２−スルホニル−α−フェニル三級ブチルニトロン（Ｓ−ＰＢＮ）のうちの１または複数を、２，４−ＤＳＰＢＮの代わりに、またはこれに加えて使用する方法が開示される。
【００４４】
シナプス形成および／または神経突起形成を増強するための方法
本明細書で記載される本発明は、シナプス形成および神経突起形成を促進または増強するための方法であって、蝸牛シナプトパチーまたは前庭シナプトパチーを患う対象へと、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法を提供する。任意選択で、２，４−ＤＳＰＢＮを、ＮＡＣと共に共投与する。また、蝸牛シナプトパチーまたは前庭シナプトパチーを患う対象における、シナプス形成または神経突起形成を促進または増強するための方法であって、それを必要とする対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロンまたは薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法も提供される。
【００４５】
シナプトパチーとは、シナプスの機能不全または喪失と関連する、脳、脊髄または末梢神経系の疾患を指す。慢性難聴、耳鳴り、聴覚過敏、老人性難聴、または平衡障害は、有毛細胞の喪失に依存しない、騒音関連および加齢関連の蝸牛シナプトパチーまたは前庭シナプトパチーと関連することが多い。蝸牛シナプトパチーについては、それらの全てが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｋｕｊａｗａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２９：１４０７７〜１４０８５（２００９）；Ｌｉｎら、ＪＡＲＯ、１２：６０５〜６１６（２０１１）；Ｓｅｒｇｅｙｅｎｋｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、３３：１３６８６〜１３６９４（２０１３）；Ｍａｋａｒｙら、ＪＡＲＯ、１２：７１１〜７１７（２０１１）；Ｖｉａｎａら、Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ．、３２７：７８〜８８（２０１５）；Ｓｃｈａｅｔｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、３１：１３４５２〜１３４５７（２０１１）；Ｗａｎら、Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ．、３２９：１〜１０（２０１５）；およびＬｉｂｅｒｍａｎら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、１１（９）：ｅ０１６２７２６（２０１６）において記載されている。
【００４６】
一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、慢性聴覚損傷または慢性難聴を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、慢性聴覚損傷または慢性難聴に対する治療的利益を、対象へと送達するのに十分なレベルまで、蝸牛神経突起の再生を増強する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとを、聴覚損傷または難聴を患っている対象へと、少なくとも１カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、または少なくとも２年間にわたり投与する。
【００４７】
一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、老化により引き起こされた慢性聴覚損傷または慢性難聴を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、老化により引き起こされた慢性聴覚損傷または慢性難聴に対する治療的利益を、対象へと送達するのに十分なレベルまで、蝸牛神経突起の再生を増強する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとを、少なくとも６５歳、または少なくとも７０歳、または少なくとも７５歳、または少なくとも８０歳である対象へと投与する。
【００４８】
一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、爆音または騒音への曝露により引き起こされた慢性聴覚損傷または慢性難聴を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、爆音または騒音への曝露により引き起こされた慢性聴覚損傷または慢性難聴に対する治療的利益を、対象へと送達するのに十分なレベルまで、蝸牛神経突起の再生を増強する。
【００４９】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとを、対象へと、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１カ月後、少なくとも３カ月後、少なくとも６カ月後、少なくとも１年後、または少なくとも２年後に投与する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとを、対象へと、爆音または騒音への曝露後２週間以内、１週間以内、４日間以内、２日間以内、１日間以内、１２時間以内、または４時間以内には投与しない。
【００５０】
一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、感染により引き起こされた慢性聴覚損傷または慢性難聴を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、感染により引き起こされた慢性聴覚損傷または慢性難聴に対する治療的利益を、対象へと送達するのに十分なレベルまで、蝸牛神経突起の再生を増強する。
【００５１】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとを、対象へと、感染の、少なくとも１カ月後、少なくとも３カ月後、少なくとも６カ月後、少なくとも１年後、または少なくとも２年後に投与する。
【００５２】
一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、毒素への曝露により引き起こされた慢性聴覚損傷または慢性難聴を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、毒素への曝露により引き起こされた慢性聴覚損傷または慢性難聴に対する治療的利益を、対象へと送達するのに十分なレベルまで、蝸牛神経突起の再生を増強する。
【００５３】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとを、対象へと、毒素への曝露の、少なくとも１カ月後、少なくとも３カ月後、少なくとも６カ月後、少なくとも１年後、または少なくとも２年後に投与する。
【００５４】
一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、耳鳴りを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、耳鳴りに対する治療的利益を、対象へと送達するのに十分なレベルまで、蝸牛神経突起の再生を増強する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとを、耳鳴りを患っている対象へと、少なくとも１カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、または少なくとも２年間にわたり投与する。
【００５５】
一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、聴覚過敏を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、聴覚過敏に対する治療的利益を、対象へと送達するのに十分なレベルまで、蝸牛神経突起の再生を増強する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとを、聴覚過敏を患っている対象へと、少なくとも１カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、または少なくとも２年間にわたり投与する。
【００５６】
一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、老人性難聴を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、老人性難聴に対する治療的利益を、対象へと送達するのに十分なレベルまで、蝸牛神経突起の再生を増強する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとを、老人性難聴を患っている対象へと、少なくとも１カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、または少なくとも２年間にわたり投与する。
【００５７】
一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、平衡障害を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、平衡障害に対する治療的利益を、対象へと送達するのに十分なレベルまで、前庭神経突起の再生を増強する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとを、平衡障害を患っている対象へと、少なくとも１カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、または少なくとも２年間にわたり投与する。
【００５８】
一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、シナプス喪失を伴うメニエール病を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、シナプス喪失を伴うメニエール病に対する治療的利益を、対象へと送達するのに十分なレベルまで、前庭神経突起の再生を増強する。一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとを、シナプス喪失を伴うメニエール病を患っている対象へと、少なくとも１カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、または少なくとも２年間にわたり投与する。
【００５９】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとの投与は、蝸牛神経突起または前庭神経突起の再生率を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増大させる。
【００６０】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとの投与は、処置の１もしくは２もしくは４週間後に、または処置の４週間を超える期間の後に、内有毛細胞上の、生存神経接合の数を、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増大させる。内有毛細胞上の、生存神経接合の数の増大を測定するための方法については、Ｋｕｊａｗａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２９：１４０７７〜１４０８５（２００９）；およびＬｉｂｅｒｍａｎら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、１１（９）：ｅ０１６２７２６（２０１６）において記載されている。
【００６１】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとの投与は、処置の１もしくは２もしくは４週間後に、または処置の４週間を超える期間の後に、コルチ器の、トノトピー領域内のシナプス（例えば、リボンシナプス）の数を、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増大させる。コルチ器の、トノトピー領域内のシナプスの数の増大を測定するための方法については、Ｋｕｊａｗａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２９：１４０７７〜１４０８５（２００９）；およびＬｉｂｅｒｍａｎら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、１１（９）：ｅ０１６２７２６（２０１６）において記載されている。
【００６２】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとの投与は、処置の１もしくは２もしくは４週間後に、または処置の４週間を超える期間の後に、ＩＨＣのリボンシナプスカウントを、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増大させる。
【００６３】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとの投与は、処置の１もしくは２もしくは４週間後に、または処置の４週間を超える期間の後に、ＡＣ、ＩＣ、および／またはＤＣＮにおけるＡＲＣの発現を、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増大させる。
【００６４】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとの投与は、処置の１もしくは２もしくは４週間後に、または処置の４週間を超える期間の後に、ＡＣ、ＩＣ、および／またはＤＣＮにおけるＧＡＰ−４３の発現を、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増大させる。
【００６５】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとの投与は、処置の１もしくは２もしくは４週間後に、または処置の４週間を超える期間の後に、ＤＣＮにおけるＧＡＢＡＡ  Ｒα１の発現を、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％減少させる。
【００６６】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとの投与は、処置の１もしくは２もしくは４週間後に、または処置の４週間を超える期間の後に、ＤＣＮにおけるＧｌｕＲ２の発現を、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％減少させる。
【００６７】
一部の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとの投与は、処置の１もしくは２もしくは４週間後に、または処置の４週間を超える期間の後に、ＳＧにおけるＴＲＰＶ１の発現を、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％減少させる。
【００６８】
聴覚系における、神経変性および／またはタウタンパク質の蓄積を低減する方法
蝸牛の神経変性一般に、老化、耳毒性、または騒音または爆音の強い過圧への曝露から生じる、有毛細胞の喪失を伴う。爆音過圧へと曝露された非トランスジェニックラットは、微小管関連タンパク質である、タウの神経毒性変異体の、海馬内の細胞体への顕著な蓄積を呈した。別の態様では、本開示は、爆音への曝露に応答する、聴覚系における、神経変性および病原性タウの蓄積を低減することと、この病理学的過程の回避に対する、抗酸化剤の潜在的治療効果について査定することとに関する。爆音による損傷は、非処置動物の蝸牛内で、リボンシナプス喪失と、逆行性神経変性とを誘導した。螺旋神経節〜聴覚野にわたる、末梢聴覚系および中枢聴覚系のいずれに由来するニューロン内でも、核周部における、ニューロフィラメント軽鎖および病原性タウオリゴマーの蓄積の随伴が観察された。
【００６９】
その同時的な蓄積パターン、および十分に記録された神経毒性のために、病原性タウオリゴマーの蓄積は、爆音誘導性の蝸牛神経変性に、能動的に寄与しうる。２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（ＨＰＮ−０７）と、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）との組合せレジメンによる治療的介入は、蝸牛および聴覚野における、病原性タウの蓄積、および進行中の神経変性の徴候のいずれも、著明に低減した。本開示は、爆音への曝露の直後に投与される、ＨＰＮ−０７と、ＮＡＣとの組合せが、爆音誘導性外傷性脳損傷を伴う軍人または民間人において、聴覚機能を保存するための、潜在的治療戦略として用いられうることを提起する。
【００７０】
したがって、本明細書で記載される本開示は、聴覚系における、神経変性および／またはタウタンパク質の蓄積を、低減または緩徐化するための方法であって、罹患する対象へと、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法を提示する。任意選択で、２，４−ＤＳＰＢＮを、ＮＡＣと共に共投与する。別の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮを、タウ凝集阻害剤と共に共投与する。本開示では、「タウ」という用語は、タウの天然単量体形態、またはタウの他の配座異性体、例えば、タウのオリゴマーまたは凝集物を指す。「タウ」という用語はまた、集合的に、タウの、全ての種類および形態を指すのにも使用される。神経細胞内で夥多であり、はるかに低度ではあるが、希突起膠細胞内および星状細胞内にも存在するタウタンパク質は、微小管を安定化させる機能を果たす。タウタンパク質が、欠損し、微小管を十分に安定化させなくなると、アルツハイマー病など、神経系の病態が発症しうる。
【００７１】
一実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物として投与する。別の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、対象へと、経口投与、静脈内投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与、舌下投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与、髄腔内投与、吸入により投与、または耳内に局所投与する。
【００７２】
一実施形態では、方法は、Ｎ−アセチルシステイン、アセチル−Ｌ−カルニチン、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニン、カルバマチオン、およびＳｚｅｔｏ−Ｓｃｈｉｌｌｅｒペプチド、ならびにこれらの機能的な類似体からなる群から選択される、１または複数の化合物を投与するステップをさらに含む。別の実施形態では、方法は、Ｎ−アセチルシステインを投与するステップをさらに含む。
【００７３】
一実施形態では、神経変性は、老化により引き起こされたものであり、または急性もしくは慢性の、爆音もしくは騒音への曝露により引き起こされたものである。別の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する。一実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１年後において、対象へと投与する。
【００７４】
一実施形態では、神経変性は、感染により引き起こされたものである。一実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、感染の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する。別の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、感染の、少なくとも１年後において、対象へと投与する。
【００７５】
一実施形態では、神経変性は、毒素への曝露により引き起こされたものである。別の実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、毒素への曝露の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する。一実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、毒素への曝露の、少なくとも１年後において、対象へと投与する。
【００７６】
一実施形態では、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩の投与は、対象におけるタウタンパク質の蓄積を低減する。一実施形態では、タウタンパク質は、聴覚系に蓄積されている。一部の実施形態では、方法は、タウ凝集阻害剤を投与するステップをさらに含む。タウ凝集阻害剤は、共有結合性阻害剤の場合もあり、非共有結合性阻害剤の場合もある。タウ凝集阻害剤の非限定例は、クルクミン、分子的ピンセット（例えば、ＣＬＲ０１）、テトラスルホン酸フタロシアニン、オレオカンタール、シンナムアルデヒド、バイカレイン、イソプレナリン、ドパミン、ドブタミン、レボドパ、レボドパ／カルビドパ、トリメトキノール、ヘキソプレナリン、メチルドパ、およびドロキシドパを含む。
【００７７】
中枢神経系疾患を処置するための方法
本明細書で記載される本発明はまた、それを必要とする対象の中枢神経系における、シナプス形成および神経突起形成を促進または増強するための方法であって、対象へと、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、対象が、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、前頭側頭型認知症、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性皮質下神経膠症、筋委縮性側索硬化症、石灰化を伴う、びまん性神経原線維変化、慢性外傷性脳症、拳闘家認知症、ＴＯＤ（ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、クロイツフェルト−ヤコブ病、多系統委縮症、Ｃ型ニーマン−ピック病、ＰｒＰ−ＣＡＡ（ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う、非グアム型運動ニューロン疾患、および脳炎後パーキンソニズムから選択される、中枢神経系の疾患または状態を患う方法も提示する。任意選択で、２，４−ＤＳＰＢＮを、有効量のＮＡＣと共に共投与する。２，４−ＤＳＰＢＮと、ＮＡＣとは、同時に共投与することもでき、逐次的に共投与することもできる。２，４−ＤＳＰＢＮと、ＮＡＣとは、１つの組成物により共投与することもでき、個別の組成物により共投与することもできる。
【００７８】
本発明のさらなる態様は、アルツハイマー病を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、アルツハイマー病を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはアルツハイマー病に対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００７９】
本発明のさらなる態様は、パーキンソン病を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、パーキンソン病を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはパーキンソン病に対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。一部の実施形態では、方法は、患者の中枢神経系における、タウタンパク質の蓄積を低減する。
【００８０】
本発明のさらなる態様は、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＰＳＰを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＰＳＰに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００８１】
本発明のさらなる態様は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＦＴＤを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＦＴＤに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００８２】
本発明のさらなる態様は、ピック病を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ピック病を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはピック病に対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００８３】
本発明のさらなる態様は、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＡＧＤを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＡＧＤに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００８４】
本発明のさらなる態様は、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＣＢＤを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＣＢＤに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００８５】
本発明のさらなる態様は、進行性皮質下神経膠症（ＰＳＧ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＰＳＧを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＰＳＧに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００８６】
本発明のさらなる態様は、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＡＬＳを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＡＬＳに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００８７】
本発明のさらなる態様は、石灰化を伴う、びまん性神経原線維変化（ＤＮＴＣ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＤＮＴＣを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＤＮＴＣに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００８８】
本発明のさらなる態様は、慢性外傷性脳症を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、慢性外傷性脳症を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／または慢性外傷性脳症に対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００８９】
本発明のさらなる態様は、拳闘家認知症（ＤＰ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＤＰを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＤＰに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００９０】
本発明のさらなる態様は、ＴＯＤ（ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＴＯＤを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＴＯＤに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００９１】
本発明のさらなる態様は、ダウン症候群を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ダウン症候群を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはダウン症候群に対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００９２】
本発明のさらなる態様は、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＧＳＳを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＧＳＳに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００９３】
本発明のさらなる態様は、ハラーフォルデン−シュパッツ病（ＨＳＤ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＨＳＤを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＨＳＤに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００９４】
本発明のさらなる態様は、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＣＪＤを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＣＪＤに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００９５】
本発明のさらなる態様は、多系統委縮症（ＭＳＡ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＭＳＡを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＭＳＡに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００９６】
本発明のさらなる態様は、Ｃ型ニーマン−ピック病（ＮＰＣ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＮＰＣを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＮＰＣに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００９７】
本発明のさらなる態様は、ＰｒＰ−ＣＡＡ（ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＰｒＰ−ＣＡＡを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＰｒＰ−ＣＡＡに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００９８】
本発明のさらなる態様は、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＳＳＰＥを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＳＳＰＥに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【００９９】
本発明のさらなる態様は、筋強直性ジストロフィーを処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、筋強直性ジストロフィーを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／または筋強直性ジストロフィーに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【０１００】
本発明のさらなる態様は、神経原線維変化を伴う、非グアム型運動ニューロン疾患を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、神経原線維変化を伴う、非グアム型運動ニューロン疾患を患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／または神経原線維変化を伴う、非グアム型運動ニューロン疾患に対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【０１０１】
本発明のさらなる態様は、脳炎後パーキンソニズム（ＰＥＰ）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、有効量の２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択で、ＮＡＣとを、ＰＥＰを患うヒト患者へと投与するが、この場合、２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩と、任意選択のＮＡＣとは、神経突起形成および／もしくはシナプス形成を増強し、かつ／またはＰＥＰに対する治療的利益を、患者へと送達するのに十分なレベルまで、中枢神経系における、病原性タウタンパク質の量を低減する。
【０１０２】
一部の実施形態では、方法は、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、前頭側頭型認知症、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性皮質下神経膠症、筋委縮性側索硬化症、石灰化を伴う、びまん性神経原線維変化、慢性外傷性脳症、拳闘家認知症、ＴＯＤ（ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、クロイツフェルト−ヤコブ病、多系統委縮症、Ｃ型ニーマン−ピック病、ＰｒＰ−ＣＡＡ（ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う、非グアム型運動ニューロン疾患、および脳炎後パーキンソニズムから選択される、中枢神経系の疾患または状態を患う患者の中枢神経系における、タウタンパク質の蓄積を低減する。
【０１０３】
一部の実施形態では、方法は、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、前頭側頭型認知症、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性皮質下神経膠症、筋委縮性側索硬化症、石灰化を伴う、びまん性神経原線維変化、慢性外傷性脳症、拳闘家認知症、ＴＯＤ（ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、クロイツフェルト−ヤコブ病、多系統委縮症、Ｃ型ニーマン−ピック病、ＰｒＰ−ＣＡＡ（ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う、非グアム型運動ニューロン疾患、および脳炎後パーキンソニズムから選択される、中枢神経系の疾患または状態を患う患者の中枢神経系における神経変性を緩徐化するか、を停止させるか、またはこれを好転させる。
【０１０４】
さらなる実施形態
実施形態１．蝸牛シナプトパチーまたは前庭シナプトパチーを患う対象における、シナプス形成および神経突起形成を増強するための方法であって、それを必要とする前記対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法。
実施形態２．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物として投与する、実施形態１の方法。
実施形態３．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、対象へと、経口投与、静脈内投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与、舌下投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与、髄腔内投与、吸入により投与、または耳内に局所投与する、実施形態１の方法。
実施形態４．Ｎ−アセチルシステイン、アセチル−Ｌ−カルニチン、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニン、カルバマチオン、およびＳｚｅｔｏ−Ｓｃｈｉｌｌｅｒペプチド、ならびにこれらの機能的な類似体からなる群から選択される、１または複数の化合物を投与するステップをさらに含む、実施形態１の方法。
実施形態５．Ｎ−アセチルシステインを投与するステップをさらに含む、実施形態１の方法。
実施形態６．対象が、慢性聴覚損傷または慢性難聴を患う、実施形態１の方法。
実施形態７．慢性聴覚損傷または慢性難聴が、老化により引き起こされたものである、実施形態６の方法。
実施形態８．慢性聴覚損傷または慢性難聴が、急性または慢性の、爆音または騒音への曝露により引き起こされたものである、実施形態６の方法。
実施形態９．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、実施形態８の方法。
実施形態１０．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、実施形態８の方法。
実施形態１１．慢性聴覚損傷または慢性難聴が、感染により引き起こされたものである、実施形態６の方法。
実施形態１２．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、感染の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、実施形態１１の方法。
実施形態１３．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、感染の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、実施形態１１の方法。
実施形態１４．慢性聴覚損傷または慢性難聴が、毒素への曝露により引き起こされたものである、実施形態６の方法。
実施形態１５．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、毒素への曝露の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、実施形態１４の方法。
実施形態１６．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、毒素への曝露の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、実施形態１４の方法。
実施形態１７．対象がまた、耳鳴りも患う、実施形態１の方法。
実施形態１８．対象がまた、聴覚過敏も患う、実施形態１の方法。
実施形態１９．対象がまた、老人性難聴も患う、実施形態１の方法。
実施形態２０．対象がまた、平衡障害またはシナプス喪失を伴うメニエール病も患う、実施形態１の方法。
実施形態２１．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩の投与が、対象における蝸牛神経突起または前庭神経突起の再生を増強する、実施形態１の方法。
実施形態２２．対象における内有毛細胞上の、生存神経接合の数を増大させる、実施形態１の方法。
実施形態２３．対象におけるコルチ器の、トノトピー領域内のシナプスの数を増大させる、実施形態１の方法。
実施形態２４．対象が、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の実質的な喪失を患っていない、実施形態１の方法。
実施形態２５．対象が、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の実質的な喪失を患っている、実施形態１の方法。
実施形態２６．蝸牛シナプトパチーまたは前庭シナプトパチーを患う対象における、シナプス形成または神経突起形成を増強するための方法であって、それを必要とする前記対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法。
実施形態２７．対象における、神経変性を低減するための方法であって、それを必要とする前記対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法。
実施形態２８．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物として投与する、実施形態２７の方法。
実施形態２９．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、対象へと、経口投与、静脈内投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与、舌下投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与、髄腔内投与、吸入により投与、または耳内に局所投与する、実施形態２７の方法。
実施形態３０．Ｎ−アセチルシステイン、アセチル−Ｌ−カルニチン、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニン、カルバマチオン、およびＳｚｅｔｏ−Ｓｃｈｉｌｌｅｒペプチド、ならびにこれらの機能的な類似体からなる群から選択される、１または複数の化合物を投与するステップをさらに含む、実施形態２７の方法。
実施形態３１．Ｎ−アセチルシステインを投与するステップをさらに含む、実施形態２７の方法。
実施形態３２．神経変性が、老化により引き起こされたものである、実施形態２７の方法。
実施形態３３．神経変性が、急性または慢性の、爆音または騒音への曝露により引き起こされたものである、実施形態２７の方法。
実施形態３４．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、実施形態３３の方法。
実施形態３５．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、実施形態３３の方法。
実施形態３６．神経変性が、感染により引き起こされたものである、実施形態２７の方法。
実施形態３７．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、感染の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、実施形態３６の方法。
実施形態３８．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、感染の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、実施形態３６の方法。
実施形態３９．神経変性が、毒素への曝露により引き起こされたものである、実施形態２７の方法。
実施形態４０．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、毒素への曝露の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、実施形態３９の方法。
実施形態４１．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、毒素への曝露の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、実施形態３９の方法。
実施形態４２．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩の投与が、対象におけるタウタンパク質の蓄積を低減する、実施形態２７の方法。
実施形態４３．タウタンパク質が、聴覚系に蓄積されている、実施形態４２の方法。
実施形態４４．タウ凝集阻害剤を投与するステップをさらに含む、実施形態２７の方法。
実施形態４５．対象における、タウタンパク質の蓄積を低減するための方法であって、それを必要とする前記対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法。
実施形態４６．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物として投与する、実施形態４５の方法。
実施形態４７．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、対象へと、経口投与、静脈内投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与、舌下投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与、髄腔内投与、吸入により投与、または耳内に局所投与する、実施形態４５の方法。
実施形態４８．Ｎ−アセチルシステイン、アセチル−Ｌ−カルニチン、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニン、カルバマチオン、およびＳｚｅｔｏ−Ｓｃｈｉｌｌｅｒペプチド、ならびにこれらの機能的な類似体からなる群から選択される、１または複数の化合物を投与するステップをさらに含む、実施形態４５の方法。
実施形態４９．Ｎ−アセチルシステインを投与するステップをさらに含む、実施形態４５の方法。
実施形態５０．タウタンパク質の蓄積が、老化により引き起こされたものである、実施形態４５の方法。
実施形態５１．タウタンパク質の蓄積が、急性または慢性の、爆音または騒音への曝露により引き起こされたものである、実施形態４５の方法。
実施形態５２．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、実施形態５１の方法。
実施形態５３．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、爆音または騒音への曝露の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、実施形態５１の方法。
実施形態５４．タウタンパク質の蓄積が、感染により引き起こされたものである、実施形態４５の方法。
実施形態５５．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、感染の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、実施形態５４の方法。
実施形態５６．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、感染の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、実施形態５４の方法。
実施形態５７．タウタンパク質の蓄積が、毒素への曝露により引き起こされたものである、実施形態４５の方法。
実施形態５８．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、毒素への曝露の、少なくとも１カ月後において、対象へと投与する、実施形態５７の方法。
実施形態５９．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、毒素への曝露の、少なくとも１年後において、対象へと投与する、実施形態５７の方法。
実施形態６０．タウ凝集阻害剤を投与するステップをさらに含む、実施形態４５の方法。
実施形態６１．中枢神経系の疾患または状態を患う対象における、シナプス形成および神経突起形成を増強するための方法であって、それを必要とする前記対象へと、有効量の２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（２，４−ＤＳＰＢＮ）または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法。
実施形態６２．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物として投与する、実施形態６１の方法。
実施形態６３．２，４−ＤＳＰＢＮまたは薬学的に許容されるその塩を、対象へと、経口投与、静脈内投与、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与、舌下投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与、髄腔内投与、吸入により投与、または耳内に局所投与する、実施形態６１の方法。
実施形態６４．Ｎ−アセチルシステインを、前記対象へと投与するステップをさらに含む、実施形態６１の方法。
実施形態６５．対象が、アルツハイマー病を患う、実施形態６１の方法。
実施形態６６．対象が、パーキンソン病を患う、実施形態６１の方法。
実施形態６７．対象が、進行性核上性麻痺を患う、実施形態６１の方法。
実施形態６８．対象が、前頭側頭型認知症を患う、実施形態６１の方法。
実施形態６９．対象が、ピック病を患う、実施形態６１の方法。
実施形態７０．対象が、嗜銀顆粒性認知症を患う、実施形態６１の方法。
実施形態７１．対象が、大脳皮質基底核変性症を患う、実施形態６１の方法。
実施形態７２．対象が、進行性皮質下神経膠症を患う、実施形態６１の方法。
実施形態７３．対象が、筋委縮性側索硬化症を患う、実施形態６１の方法。
実施形態７４．対象が、石灰化を伴う、びまん性神経原線維変化を患う、実施形態６１の方法。
実施形態７５．対象が、拳闘家認知症を患う、実施形態６１の方法。
実施形態７６．対象が、ＴＯＤ（ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）を患う、実施形態６１の方法。
実施形態７７．対象が、ダウン症候群を患う、実施形態６１の方法。
実施形態７８．対象が、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病を患う、実施形態６１の方法。
実施形態７９．対象が、ハラーフォルデン−シュパッツ病を患う、実施形態６１の方法。
実施形態８０．対象が、クロイツフェルト−ヤコブ病を患う、実施形態６１の方法。
実施形態８１．対象が、多系統委縮症を患う、実施形態６１の方法。
実施形態８２．対象が、Ｃ型ニーマン−ピック病を患う、実施形態６１の方法。
実施形態８３．対象が、ＰｒＰ−ＣＡＡ（ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）を患う、実施形態６１の方法。
実施形態８４．対象が、亜急性硬化性全脳炎を患う、実施形態６１の方法。
実施形態８５．対象が、筋強直性ジストロフィーを患う、実施形態６１の方法。
実施形態８６．対象が、神経原線維変化を伴う、非グアム型運動ニューロン疾患を患う、実施形態６１の方法。
実施形態８７．対象が、脳炎後パーキンソニズムを患う、実施形態６１の方法。
実施形態８８．対象が、慢性外傷性脳症を患う、実施形態６１の方法。
【０１０５】
実施例
以下の例は、例示的な目的だけのものであり、特許請求される本発明に対する限定として解釈すべきではない。当業者には、意図される発明を実施して成功することを同様に可能とする、多種多様な、代替的技法および代替的手順が利用可能である。
【実施例１】
【０１０６】
生存動物研究では、２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（ＨＰＮ−０７）で処置された騒音損傷チンチラが、非処置対照と比べて著明に大きな内有毛細胞神経突起集団を呈し、独特なことには、処置期間後、長期にわたり、漸進的な度合いの機能的な回復を呈することが発見されたが、これは、ＨＰＮ−０７により誘導される、有毛細胞に対する再神経支配が進行中であることを示す。これは、ＨＰＮ−０７が、特に、蝸牛螺旋神経節ニューロン（ＳＧＮ）において、神経突起形成促進特性を有する潜在的可能性が導かれた。ＨＰＮ−０７を、３つのｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経突起形成性モデル（蝸牛螺旋神経節外植片、ＰＣ１２細胞、およびＳＧＮ外植片の、付着させた有毛細胞との共培養物［ＳＧＮ−ＨＣ］）において調べた。これらの解析からの実験データは、（１）ＨＰＮ−０７が、有毛細胞を伴わない螺旋神経節外植片内で、神経突起形成を促進したこと；（２）ＨＰＮ−０７が、ＰＣ１２細胞系において、神経成長因子（ＮＧＦ）誘導性神経突起形成を強化すること；および（３）ＨＰＮ−０７が、興奮毒性によるリボンシナプス喪失を好転させ、カイニン酸（ＫＡ）により誘導される興奮毒性外傷後において、ＳＧＮ−ＨＣ共培養物中のＩＨＣの基部に沿って、神経突起密度を増大させることを裏付けた。爆音へと曝露された生存ラットにおけるＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、爆音後において、著明に多数の、内有毛細胞上の、生存神経接合を促進し、一部のトノトピー領域内では、非曝露非投薬の、損傷していない耳において典型的に観察されるシナプス数を超えるシナプス数をもたらした。
【０１０７】
図１に示される通り、ＨＰＮ−０７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの、マウス螺旋神経節組織外植片内で、神経突起形成性応答を誘導した。ＨＰＮ−０７は、同じ器官型培養培地中で培養された非処置対照（ＮＣ、正常対照）と比べて、顕著な神経突起の成長を誘導した。ＨＰＮ−０７の存在下において、各ＳＧ外植片から放射状に伸びる神経突起の数、および増大したこれらの伸展の各々の、対応する長さの両方である。ＰＣ１２細胞内で、神経突起形成を誘導するのに、１０ｍＭの濃度を要求するＰＢＮとは対照的に、ＨＰＮ−０７は、マウス螺旋神経節ニューロンの器官型培養物中の神経突起形成性応答を誘導するのに、１００μＭの濃度で十分であった。
【０１０８】
図２に示される通り、ＨＰＮ−０７は、カノニカルの蝸牛の神経突起形成性成長因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）により誘導される神経突起形成を強化した。マウス螺旋神経節ニューロン外植片を、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）またはＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＨＰＮ−０７（０．１μＭ）を伴うか、または伴わない無血清培地中で、４８時間にわたり培養し、次いで、固定し、β−チューブリン抗体で免疫標識化して、神経突起を可視化した。
【０１０９】
図３に示される通り、ＨＰＮ−０７はまた、ＰＣ１２細胞系内の、ＮＧＦ誘導性の神経突起の伸長も強化した。神経成長因子（ＮＧＦ）による処置は、神経突起形成研究のための、標準的なニューロンのモデルである、ＰＣ１２細胞内の、神経突起の伸長を、用量依存的に誘導した。この文脈では、このＮＧＦ誘導性の神経突起形成性応答は、見かけ上、１０ｎｇ／ｍＬおよびこれを上回る濃度で可飽和であった。しかし、この系において、ＨＰＮ−０７単独による処置が、低濃度では、神経突起長を増大させなかったのに対し、１μＭのＨＰＮ−０７と、漸増用量のＮＧＦ（１、５または１０ｎｇ／ｍＬ）とによる組合せ処置は、ＨＰＮ−０７が、ＮＧＦを増強（１および５ｎｇ／ｍＬのＮＧＦ）し、おそらく、これと相乗作用して（１０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦ）、神経突起形成を促進することを明らかにした。１０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦおよび１μＭのＨＰＮ−０７の濃度で、平均値神経突起長は、可飽和ＮＧＦの用量漸増系列で達成された、最大長を顕著に超えた（細胞は、６日間にわたり処置した）。
【０１１０】
図４は、有意な神経突起の成長を伴うＰＣ１２細胞の百分率を描示する。この図で観察されるパターンは、処置に誘導される、平均神経突起長の増大について観察されるパターンと同様である。まとめると、これらの査定は、ＨＰＮ−０７が、ＮＧＦと協調的に作用して、平均値神経突起長の増大を裏付けるような形で、デノボの神経突起の成長、および神経突起の安定性またはアセンブリー動態の変化の両方を促進するが、これらの両方は、ＩＨＣによる再神経支配の所望される特徴であるという解釈を裏付ける。成長因子は、哺乳動物の蝸牛内で構成的に発現し、聴覚外傷後において、上方調節されることが多いので、この治療的特質は、聴覚機能を回復するために、著明な臨床的影響を及ぼすことができた。
【０１１１】
さらに、図５に示される通り、ＨＰＮ−０７は、ＩＨＣリボンシナプスの完全性の、カイニン酸（ＫＡ）誘導性の興奮毒性喪失を好転させた。かつての知見を、興奮毒性外傷についての、マウスＳＧＮ−ＩＨＣ共培養物モデルへと適用した。聴覚感覚上皮（コルチ器官、ＯＣ）と、関連する螺旋神経節ニューロン（ＮＣ）との、非損傷の共培養物のＩＨＣでは、シナプス前Ｃ末端結合性タンパク質２（ＣｔＢＰ２）と免疫反応性の点（小さな赤色ドット）の大半は、ＩＨＣ核（大きな赤丸）の下方にあるか、またはこれを取り囲む、細胞の基底面に沿って位置する、「典型的」な細胞構築位置に位置している。この典型的な、ＣｔＢＰ２の、基底側の免疫反応性パターンから、より頂端側の分布パターンへの顕著なシフトは、興奮毒性グルタミン酸類似体であるカイニン酸（ＫＡ）への曝露の後で生じた。この異常な傾向は、シナプス後肥厚マーカーである、ＰＳＤ−９５についての共免疫標識化の粗大な喪失と相関したことから、ＣｔＢＰ２で標識化された点の、頂端側へのシフトは、ＫＡ誘導性の、リボンシナプスの完全性の喪失と、基底面に沿って活動性のシナプスにアンカリングしたＰＳＤの解離とに帰せられる可能性が高かったことが指し示される。ＳＧ外植片（１０μＭ）内の神経突起形成を誘導することが示された濃度のＨＰＮ−０７による興奮毒性後処置は、この病原性シフトを好転させ、ＩＨＣに、ＣｔＢＰ２で共標識化される基底側ＰＳＤを、カノニカルの神経栄養成長因子であるＢＤＮＦにより達成される形と同様の形で再生させた。ＨＰＮ−０７が、この共培養物モデルにおける、興奮毒性外傷後のＩＨＣにおいて、リボンシナプスの構造的完全性を回復させる能力は、この文脈では、シナプス形成（すなわち、再神経支配）を促進するように作用するＨＰＮ−０７と符合する。
【０１１２】
図６は、ＫＡへの興奮毒性曝露後における、非処置外植片、ＢＤＮＦ処置外植片、またはＨＰＮ−０７処置外植片に由来するＩＨＣ間の、リボンの数および空間的分布についてのターゲティングされた比較による定量的査定についてまとめる。ＫＡへの曝露後、非処置培養物は、シナプス前密度の、「典型的」（核の下方における）分布から「頂端側」（核の上方における）分布へのシフトを呈した。ＢＤＮＦおよびＨＰＮ−０７のいずれも、この病原性変化を好転させたことから、この文脈において、ＩＨＣを再神経支配するための、それらの有用性が裏書きされる。しかし、ＨＰＮ−０７による処置は、損傷していない組織内で観察される全リボン数により近接する、より大きな全リボン数を結果としてもたらした。各データ点は、約１０回にわたる独立の測定の合成数を表す。
【０１１３】
図７に示される通り、爆音へと曝露された生存ラットにおけるＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、爆音後において、著明に多数の、内有毛細胞上の、生存神経接合を促進し、一部のトノトピー領域内では、非曝露非投薬の、損傷していない耳において典型的に観察されるシナプス数を超える、シナプス数へと移行した。上パネルでは、ラットを、１．５分間隔で繰り返される、１４ｐｓｉで、３回にわたる、継起的なオープンフィールドの爆音へと曝露した。次いで、動物に、最後の爆音の１時間後に、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣを注射し（ｉ．ｐ．）、次いで、続く４８時間にわたり、１日２回ずつ注射した。３週間後に、動物を安楽死させ、それらの蝸牛組織を固定し、採取し、顕微解剖し、内有毛細胞（ＣｔＢＰ２）内のリボンシナプスと、これと関連する神経突起とのシナプス界面におけるシナプス後肥厚（ＧｌｕＲ２／３）とをターゲティングする抗体で共免疫標識化した。両方のマーカーの存在は、存続可能なシナプス接合を示す。コルチ器の、１６ｋＨｚのトノトピー領域では、シナプスの密度に対する、著明な処置効果が観察され、この位置における、正常数を超えるシナプス数（非曝露非投薬対照と比べて）となる傾向が示された。下パネルでは、ラットを、単回で、８ｐｓｉの、ショックチューブ内の爆音へと曝露した。次いで、動物に、最後の爆音の１時間後に、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣを注射し（ｉ．ｐ．）、次いで、続く４８時間にわたり、１日２回ずつ注射した。８週間後に、動物を安楽死させ、それらの蝸牛組織を固定し、採取し、顕微解剖し、上記で記載した、ＣｔＢＰ２およびＧｌｕＲ２／３に対する抗体で共免疫標識化した。これらのラットのコルチ器の、３２ｋＨｚのトノトピー領域では、著明な処置効果が観察され、８および１６ｋＨｚの領域における、正常数を超えるシナプス数（非曝露非投薬対照と比べて）となる傾向が示された。
【実施例２】
【０１１４】
動物、爆音への曝露、および薬物の投与
本研究で使用される組織試料は、リボンシナプスの査定のために使用された蝸牛組織試料を除き、既に記載されている（Ｅｗｅｒｔら、Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．、２８５、２９〜３９（２０１２））通りに回収した。爆音への曝露、抗酸化剤の投与、および聴性脳幹反応の測定については、本発明者らのかつての報告（Ｅｗｅｒｔら、Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．、２８５、２９〜３９（２０１２））において、詳細に記載した。動物の使用および取扱いに関する全ての手順は、Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＯＭＲＦ）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ＣｏｍｍｉｔｔｅｅおよびＵ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎａｖｙ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｎａｖａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにより精査および承認された。
【０１１５】
本研究では、体重を、３６０〜４００ｇの間とする、雄ロング−エバンス有色ラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）を使用した。動物は、ＯＭＲＦの動物施設内で飼育した。各ラットを、１．５分間の間隔で繰り返される、３回の継起的な、１平方インチ当たり１４ポンド（ｐｓｉ）の爆音へと曝露した。爆音プロトコールは、著明な難聴と、低発生率の鼓膜破裂とを誘導した（Ｅｗｅｒｔら、Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．、２８５、２９〜３９（２０１２））。鼓膜が破裂した耳は、研究から除外した。聴性脳幹反応（ＡＢＲ）閾値および歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）レベルは、爆音への曝露前、ならびに曝露の２４時間後（２４Ｈ）、７日後（７Ｄ）、および２１日後（２１Ｄ）のサンプリング間隔で得、本発明者らのかつての刊行物において報告した（Ｄｕら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、ｅ８０１３８（２０１３）；Ｅｗｅｒｔら、Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．、２８５、２９〜３９（２０１２））。
【０１１６】
ＮＡＣの２０％溶液は、Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）から購入され、ＨＰＮ−０７は、ＡＰＡＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）により合成され、用意された。爆音へと曝露された、抗酸化剤処置群（Ｂ／Ｔ）内の動物に、生理食塩液溶液（５ｍＬ／ｋｇ）中に溶解させた、３００ｍｇ／ｋｇのＮＡＣ＋３００ｍｇ／ｋｇのＨＰＮ−０７の組合せを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。薬物投与は、爆音への曝露の１時間後に開始し、次いで、後続の２日間にわたり、１日２回ずつ継続した。非処置の爆音へと曝露された群（Ｂ）内の動物には、処置群と同じスケジュールに従い、等容量の生理食塩液を、ｉ．ｐ．注射した。爆音へも曝露されず、薬物処置も施されない、さらなる１１匹のラットを、正常対照（ＮＣ）として使用した。
【０１１７】
リボンシナプスの査定のための、蝸牛組織の回収
爆音への曝露の、１または３週間後に、動物の頭部を、ケタミンおよびキシラジンによる深い麻酔下で切り落とした。蝸牛を、側頭骨から、速やかに切り分け、低温ＰＢＳに入れた。正円窓および卵円窓を切開し、頂回転骨を除去した。組織固定のために、ＰＢＳ中に４パーセントのホルムアルデヒド溶液を、蝸牛へと還流させた。蝸牛を、同じ固定剤中に、４℃で、さらに１０分間にわたり入れた。固定の後、蝸牛を、ＰＢＳ中で、さらに切り分け、次いで、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５％の正常ウマ血清を含有するＰＢＳ中で、１時間にわたりブロッキングしてから、ウサギ抗ＧｌｕＲ２／３抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、型番ＡＢ１５０６、１：１００）と、マウス抗Ｃ末端結合性タンパク質抗体（ＣｔＢＰ２、ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、型番６１２０４４、１：２００）との組合せにより、３７℃で、２０時間にわたり免疫標識化した。組織を、ＰＢＳですすぎ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ニワトリ抗ウサギ（１：１０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏ．、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）と共に、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。組織を、ＰＢＳですすぎ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ニワトリ抗体（１：１０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏ．、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８ヤギ抗マウス抗体（１：１０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏ．、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）と共に、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした（Ｆｕｒｍａｎら、２０１３）。組織を、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）により、室温で、１０分間にわたり対比染色して、核を標識化し、次いで、抗褪色剤培地と共に、スライド上にマウントした。
【０１１８】
全蝸牛を、落射蛍光顕微鏡で撮影した。蝸牛の長さを測定し、周波数は、カスタムのプラグイン型ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｓｓｅｙｅａｎｄｅａｒ．ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｅｎｔ／ｅａｔｏｎ−ｐｅａｂｏｄｙ／ｅｐｌ−ｈｉｓｔｏｌｏｇｙｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／）を使用して計算した。蝸牛の６つの周波数位置である、２、４、８、１６、３２、４８ｋＨｚを、共焦点ｚスタックとしての画像収集のために選択した。画像は、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−７１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ，ＬＬＣ、ＮＹ）を使用して、ｚ面内に０．５μｍのステップを伴う、１０２４×１０２４ピクセルのフレーム内に収集した。コルチ器を、内リンパ面から見ると、各スタックは、リボンシナプスのセット全体を伴う、６〜９個のＩＨＣを含有した。３Ｄ形態計測は、Ａｍｉｒａ  ３Ｄソフトウェア（ＦＥＩ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用することにより処理した。全ての定量的解析は、生の画像スタックにより実施した。シナプス前リボン（赤チャネル）およびシナプス後肥厚（緑チャネル）は、既に公表された方法（ＫｕｊａｗａおよびＬｉｂｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２９、１４０７７〜１４０８５（２００９））に従い、セグメンテーションにより同定し；各スタック内の、重合せの曖昧さまたは過大評価を回避するために、ｚ次元で定量化し、追跡し、顕微鏡視野内のＩＨＣ総数で除した。
【０１１９】
蝸牛および脳組織の回収および切片化
爆音の２４時間後、７日後、または２１日後に、各実験群（時点１つ当たりのラット６〜８匹）内で、蝸牛および脳の切片化のために使用した動物を安楽死させ、生理食塩液に続き、０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中に４％のパラホルムアルデヒドで心内還流した。蝸牛、脳、および脳幹を摘出し、同じ固定剤で（蝸牛については、一晩にわたり、脳組織については、１週間にわたり）後固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中、４℃で保存した。固定された蝸牛を、ＰＢＳで洗浄し、次いで、１０％のＥＤＴＡ中で、各週２回ずつ溶液を交換しながら、２週間にわたり脱灰した。蝸牛を乾燥させ、パラフィン内に包埋し、蝸牛軸を含む面内、６μｍの厚さで切片化し、１０番目ごとの切片を、スライド上にマウントした（蝸牛１つ当たり、合計１０枚のスライド）。次いで、マウントされた切片を、免疫組織化学解析のために加工した。
【０１２０】
各動物に由来する脳および脳幹は、ＰＢＳ中に３０％のスクロース中、４℃で、組織が、容器の底部へと沈殿するまで凍結防止処理し、このとき、組織を、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）内に包埋し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｒｙｏｔｏｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により、１８〜２０μｍごとに継起的に、冠状面内で切片化した。各脳および脳幹に由来する、切片１０個ごとに、そのうちの１個を、ゼラチンであらかじめコーティングされたスライドへとマウントした（各脳幹について、合計１０枚のスライドであり、各脳について、合計２０枚のスライドである）。各スライド上の、２つの隣接する切片の間の距離は、約２００μｍであった。次いで、切片を、免疫組織化学解析のために加工した。
【０１２１】
蝸牛内の螺旋神経節ニューロンおよび神経突起の定量化
２つのバイオマーカーである、ニューロフィラメント（ＮＦ）軽鎖サブユニット（６８ｋＤａ、ＮＦ−６８）および重鎖サブユニット（２００ｋＤａ、ＮＦ−２００）を使用して、爆音へと曝露されたラットにおける、蝸牛神経変性について検討した。蝸牛切片を、キシレン中で脱パラフィン化し、系列濃度のエタノールおよび蒸留水中で再水和させた。次いで、これらの切片を、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に１％のウシ血清アルブミン（第Ｖ画分）と、１％の正常ウマ血清または１％の正常ヤギ血清とによりブロッキングし、ＰＢＳ中に０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳ／Ｔ）中で透過処理した。次いで、ブロッキングされ、透過処理された切片を、マウス抗ニューロフィラメント６８（１：２００、クローンＮＲ４、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、型番Ｎ５１３９）またはニワトリ抗ニューロフィラメント２００（１：１０００、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、型番ＡＢ５５３９）と共に、室温で、一晩にわたりインキュベートした。ＰＢＳ／Ｔによる洗浄の後で、ビオチニル化ヤギ抗ニワトリＩｇＧまたはウマ抗マウスＩｇＧ（１：２００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を、スライドへと、室温で、１時間にわたり適用し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  ａｎｄ  ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を、免疫標識の視覚化のために使用した。免疫陽性細胞は、標的エピトープ部位において、褐色の反応生成物を呈した。メチルグリーンを、核の対比染色のために使用した。陰性対照は、一次抗体を除外することによりなされた。正常対照および爆音へと曝露されたラットのＳＧ内のニューロンを染色して、平均ニューロンサイズおよび損傷誘導性の損耗について検討するのに、トルイジンブルーを使用した。
【０１２２】
脳および蝸牛における、タウについての免疫組織化学染色
上記で記載したのと同じ免疫組織化学染色プロトコールを、タウ染色のために使用した。組織切片を、セリン部位１９５、１９８、１９９、および２０２におけるリン酸化を欠くタウタンパク質の、公知の電気泳動分子種の全てを認識する、マウス抗タウ−１抗体（１：２００、クローンＰＣ１Ｃ６、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、型番ＭＡＢ３４２０）、タウの６つの天然アイソフォーム全てを認識する、マウス抗タウ４６（１：１００、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、型番Ｔ９４５０）、マウス抗ホスホ（Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５）タウ抗体（１：２５０、クローンＡＴ８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、型番ＭＮ１０２０）、またはウサギ抗オリゴマータウ抗体（Ｔ２２血清、１：３００；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｒａｎｃｈ、Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ、ＴＸのＲａｋｅｚ  Ｋａｙｅｄ博士の恵与；Ｈａｗｋｉｎｓら、２０１３）と共に、一晩にわたりインキュベートした。
【０１２３】
爆音への曝露後の蝸牛における、オリゴマータウ／ＮＦ−６８およびミオシンＶＩＩａ／ＮＦ−２００による二重標識化解析
蝸牛切片を、Ｔ２２抗体（１：２００）および抗ニューロフィラメント６８（１：２００）、またはＮＦ−２００（１：１０００）およびウサギ抗ミオシンＶＩＩａ（１：１０００；Ｐｒｏｔｅｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ、型番２５−６７９０）と共に、室温で、一晩にわたりインキュベートした。ＰＢＳによる洗浄の後で、切片を、適切なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、同５６８、または同６４７二次抗体（１：１０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏ．、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）と共に、室温で、２時間にわたりインキュベートするのに続き、ＤＡＰＩ標識化を行い、抗褪色剤培地中にマウントした。画像は、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−７１０共焦点顕微鏡により収集した。
【０１２４】
爆音への曝露後の蝸牛における、酸化ストレスバイオマーカーについての解析
ＤＮＡ酸化の生成物である、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）のレベルを、爆音へと曝露された動物における、蝸牛ニューロン内の酸化ストレス誘導性の損傷の変化について査定するためのバイオマーカーとして検討した。上記で記載した、同じ免疫組織化学染色プロトコールを、８−ＯＨｄＧ免疫染色のために使用した。組織切片を、ウサギ抗８−ＯＨｄＧ抗体（１：１００、Ｂｉｏｓｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、型番ｂｓ−１２７８Ｒ）と共に、一晩にわたりインキュベートした。
【０１２５】
バイオマーカーについての免疫染色の定量化
画像は、ＢＸ５１  Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡（ＳＧおよび脳）またはＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００ｍ  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（螺旋板（ＳＬ）内およびコルチ器（ＯＣ）内の神経線維）により収集した。蝸牛内で、画像（ＳＧ、ＳＬおよびＨＣ（ＩＨＣ）領域内の神経線維）は、各スライド上の全ての切片の基底回転および中回転から収集した。ＮＦ−６８陽性ニューロン、ＮＦ−２００陽性ニューロン、または８−ＯＨｄＧ陽性ニューロンの数は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国立保健研究所）を使用して定量化した。ＳＧ内の、ＮＦ−６８陽性ニューロン、ＮＦ−２００陽性ニューロン（弱く染色されるか、または強く染色された）、および８−ＯＨｄＧ陽性ニューロンの百分率（陽性染色されたニューロン数／ニューロン総数×１００％）を計算し、統計学的に解析した。ＳＬ内の、ＮＦ−２００陽性神経線維、タウ４６陽性神経線維、ＡＴ８陽性神経線維、またはＴ２２陽性神経線維の密度（１ｍｍ２当たりの神経線維の数）もまた、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して推定した（Ｊｅｎｓｅｎら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２５１６０（２０１５））。爆音への曝露の２１日後における、ＳＧＮの喪失について検討するため、ＮＣおよび爆音へと曝露されたラットの中回転および基底回転におけるＳＧのサイズを測定し、ＳＧＮの相対密度（１ｍｍ２当たりの、トルイジンブルー染色されたニューロンの数）を計算し、統計学的に解析した。爆音への曝露の２１日後における、ＳＧＮのサイズについて検討するため、ＮＣおよび爆音へと曝露されたラットの蝸牛内の、トルイジンブルー染色されたＳＧＮの最大直径を測定した（Ｂｉｃｈｌｅｒ、１９８４）。画像は、蝸牛切片の、頂回転、基底回転、および中回転から収集し、ＳＧＮ（μｍ）の平均最大直径を計算し、統計学的に解析した。トルイジンブルー陽性ニューロンだけを、解析に組み入れた。
【０１２６】
蝸牛背側核（ＤＣＮ）では、画像は、内側第３切片（内側）、中間第３切片（中間）、および外側第３切片（外側）から収集した。下丘（ＩＣ）では、画像は、ＩＣの中心核（ＣＩＣ）から収集した。ＡＣでは、画像は、全ての層（１つの切片上の全ての層をカバーする、２つの画像）から収集した。改変二次元定量化法を用いて、これらの核内または領域内の陽性免疫染色細胞をカウントした（Ｄｕら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、ｅ８０１３８（２０１３））。各画像内の陽性細胞の総数は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化し、各クラスのタウ陽性細胞の密度（１ｍｍ２当たりの陽性細胞の数）を計算し、統計学的に解析した。暗褐色の染色細胞だけをカウントした。細胞および神経突起の計数は、各スライド上の試料の識別を知らされていない技師が行った。
【０１２７】
統計学的解析
一元ＡＮＯＶＡまたは二元ＡＮＯＶＡ（ＳＰＳＳ  １４．０  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ）および事後検定（チューキーのＨＳＤ）を使用して、各サンプリング間隔において、３群（ＮＣ、Ｂ、およびＢ／Ｔ）間で、統計学的有意差が存在するのかどうかを決定した。これらの解析では、０．０５未満のｐ値を、統計学的に有意であると考えた。
【０１２８】
爆音への曝露後における、蝸牛内の神経変性
蝸牛の神経変性は、典型的に、ＨＣを神経支配する、脆弱な軸索の神経突起内で始まり、しばしば、ＳＬ内の神経線維の喪失として、進行性に顕在化し、最終的に、ＳＧＮの喪失に至る（Ｊｅｎｓｅｎら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２５１６０（２０１５））。結果としての、ＯＣ内の、爆音誘導性の神経外傷は、非曝露非投薬ラットおよび爆音へと曝露されたラットにおける、ＩＨＣの神経支配帯域内の、リボンシナプスおよびＮＦ−２００陽性（Ｉ型）神経突起の相対密度を検討することにより査定した。主要なリボンマーカー（Ｃ末端結合性タンパク質２、ＣｔＢＰ２）、およびシナプス後グルタミン酸受容体パッチについてのマーカー（ＧｌｕＲ２／３）に対する抗体を使用する、二重免疫標識化解析は、損傷の７および２１日後の両方における、ＯＣの基底回転〜中回転にわたる、シナプス前構造およびシナプス後構造の、同時発生的な、爆音誘導性の低減（図８、Ａ〜Ｆ）を明らかにした。これに対し、頂回転内の、低周波数のトノトピー位置は、一見すると、爆音誘導性のシナプス喪失を免れていた。これらのシナプス前マーカーおよびシナプス後マーカーについての、独立の定量化は、爆音へと曝露されたラットの、基底回転〜中回転において、重症度がグレード付けされた、トノトピー特異的シナプトパチーについての明らかな証拠をもたらした（図９）。非曝露非投薬ラットでは、ＯＣの基底回転〜中回転にわたる、全載標本共焦点切片内の、ＩＨＣ  １個当たり、約１１〜２４の、二重標識化されたシナプス叢が観察された。非処置の爆音へと曝露されたラットでは、曝露の７日後の、基底回転（すなわち、４８ｋＨｚトノトピー領域）内のＩＨＣにおいて、正常数の５０％未満のシナプス後エレメントが観察されるように、これらの数は、急激に低下した。リボンシナプス密度もまた、この査定間隔における、非処置ラットの、８〜３２ｋＨｚのトノトピー範囲（８、１６、および３２ｋＨｚ領域において、それぞれ、ＩＨＣ  １個当たりのＣｔＢＰ２点の、３８．１、３５．８、および３７．３％の低減、ならびにＩＨＣ  １個当たりのＧｌｕＲ２／３点の、３４．７、２８．８、および３４．７％の低減）にわたり、有意に低減された。曝露の２１日後において、リボンシナプス密度の有意な低減は、非処置動物の、１６〜４８ｋＨｚのトノトピー範囲にわたり、依然として明白であった（図９）。しかし、リボンシナプス密度は、これらの動物の、より頂端側の、８ｋＨｚのトノトピー位置では、この最終時点までに回復すると考えられた（図９）ことから、おそらく、時間経過にわたる、限局的な程度の、自発的な再神経支配が示される。
【０１２９】
この爆音誘導性の神経障害性応答が、末梢の軸索退縮へと転換されたのかどうかを、時間経過にわたり追跡するために、相対神経突起密度の縦断的な変化を、爆音後、２４時間、７日間、および２１日間の継起的時点における、ＩＨＣの神経支配帯域に沿って精査した。非曝露非投薬ラットでは、ＩＨＣ  １個当たり約８つの、はっきりとしたＮＦ−２００陽性神経突起が、ＯＣの基底回転〜中回転にわたる切片系列において観察された（図１９Ａおよび１９Ｄ）。爆音へと曝露されたラットにおける縦断的解析は、損傷による傷害後の継起的時点における、ＩＨＣの神経支配帯域に沿って、ＮＦ−２００陽性神経突起数の明らかな減少を明らかにした（図１９Ｂおよび１９Ｅ）。これらの神経突起の、正式の定量化は、この界面に沿う、免疫標識化の、明らかな時間依存的喪失を確認し、有意な損耗は、爆音の７日後に初めて明白となった（図１９Ｇ）。２１日間の最終サンプリング間隔では、非処置の爆音へと曝露された動物における、ＯＣの基底回転〜中回転内の中回転におけるＩＨＣに隣接して、約６０％の平均神経突起の喪失が観察された。この神経突起喪失の程度は、この時点において、この同じ領域に沿って測定された、爆音誘導性の平均リボンシナプス喪失から予期される程度より、やや大きく、接線方向断面による、神経突起密度の定量化と関連する、固有の分解能の低減を反映しうる。にもかかわらず、これらの結果は、わずか１〜２％のＩＨＣの喪失が記録された条件下における、爆音損傷に応答する、中〜高周波数範囲内の末梢聴覚系からの神経伝達の顕著な減少を指し示す（図９および図１９）。
【０１３０】
骨ＳＬ内の、ＮＦ−２００陽性神経線維の相対密度を、非処置の爆音へと曝露されたラットの蝸牛内の進行性逆行性神経変性について、さらに査定する手段として研究した。図１０に示される通り、ＳＧから外部の側方へと突出して、ＨＣを神経支配する、ＮＦ−２００陽性神経線維の束は、非曝露非投薬対照ラットの骨ＳＬ内に緊密に充填されている（図１０Ａ）。爆音の２４時間後および７日後には、これらの神経線維の密度の見かけの差違は、明白ではなかったが、爆音への曝露の２１日後には、ＮＦ−２００染色強度および神経線維密度の、感知可能な低減が、ラットにおいて、初めて区別可能となった（図１０Ｂ）。時間経過にわたる、ＳＬ神経線維密度についての、正式の定量化は、これらの初期観察を裏付けることから、有意な損耗が、爆音後７日間〜２１日間の間に生じたことを明らかにした（図１０Ｄ）。これらの結果は、ＩＨＣシナプス接合に沿った、神経突起の初期喪失より進んだ、進行性逆行性神経変性が、７日間のサンプリング間隔で、初めて観察されたこと（図１９Ｇ）を指し示す。
【０１３１】
この一時的な神経障害性傾向はまた、ＳＧを含むニューロンにおいても、爆音への曝露の２１日後において、この蝸牛神経中枢の、中回転および基底回転におけるＮＦ−２００染色の、最初の感知可能な喪失が明白となるように顕在化した（図１１Ｂ）。正常対照動物では、ニューロンの細胞体の大部分は、ＮＦ−２００による標識化について、免疫陽性であり、各断面内の少数の細胞体は、強い免疫組織化学強度を呈した（図１１Ａ）。これらの強く標識化されたＮＦ−２００陽性ニューロンは、ＩＩ型ニューロンを表すことが既に示されており、したがって、非曝露非投薬対照において、軽度の核周部染色を伴うニューロンは、Ｉ型ニューロンであると推定される。爆音へと曝露された動物に由来するＳＧにおいて観察される変性ニューロンの種類を明らかにするために、弱く染色されたＮＦ−２００陽性細胞体および強く染色されたＮＦ−２００陽性細胞体の両方の百分率を、独立に計算し、統計学的に解析した。爆音の２１日後において、弱いＮＦ−２００免疫陽性ニューロンの百分率が、正常対照動物と比較して、有意に減少する一方で、ＮＦ−２００染色について強く免疫陽性であるニューロンは、爆音への曝露の７日後には、著明に増大し、２１日間の回復期間の残余を通して、高値を維持した（図１１Ｄおよび１１Ｅ）。爆音へと曝露された動物のＳＧ内の、ＮＦ−２００の、核周部への蓄積のこの増大は、外傷誘導性の脱髄および進行中の神経変性と関連する、Ｉ型ニューロンの、細胞骨格の不安定化を表す可能性が高い。
【０１３２】
まとめると、これらの時空間的査定からの結果は、初期の爆音誘導性の外傷後において、進行性蝸牛神経変性は、逆行的に生じ、最終的には、ＳＧ内のＩ型ニューロンにおける、ニューロフィラメントの完全性の見かけの喪失に至ることを示唆した。理論に束縛されずに述べると、蝸牛ニューロンの進行性不安定化は、爆音に応答する、ＳＧ内のＮＦ−６８免疫染色の、時間依存的な増大により補完されうる。
【０１３３】
図１２に示される通り、非曝露非投薬ラットに由来するＳＧの、ＮＦ−６８による免疫標識化は、暗色で染色されたニューロンが、比較的希少である、拡散性の染色パターン（すなわち、０．５％未満；図１２Ａおよび１２Ｄ）を結果としてもたらした。しかし、爆音へと曝露されたラットでは、爆音の２４時間後に、異常なＮＦ−６８免疫反応性パターンが、急性で観察され、ｂＴＢＩの２１日後には、強いＮＦ−６８免疫染色を伴うＳＧＮの数が、非曝露非投薬対照において観察される数の７倍を越えて増大するように、時間と共に、ますます顕著となった（図１２Ｂおよび１２Ｄ）。これらの結果は、ＮＦ−２００による免疫標識化で明らかにされ、感知された、神経変性応答パターンと符合する（図１１）。細胞体における、その測定可能な蓄積にもかかわらず、非曝露非投薬対照、または爆音への曝露後の任意の時点における爆音へと曝露されたラットに由来するＳＬ内のＳＧ神経線維では、異常なＮＦ−６８免疫反応性は検出されなかった。
【０１３４】
外傷の２１日後の、非処置の爆音へと曝露された動物の蝸牛の、３つの回転全てではまた、ＳＧニューロンの平均細胞体直径も、非曝露非投薬対照と比較して、有意に減少したこと（全てにおいて、ｐ＜０．００１；図１３）は、この、明らかな神経変性応答を裏付けた。しかし、ＳＧＮ密度についての解析は、トルイジンブルー陽性ＳＧＮの総数は、この最終時点において、有意に低減されなかったので、ニューロンの萎縮が、いまだ、ニューロンの有意な喪失へと転換されなかったこと（全てについて、ｐ＞０．０５）を指し示した。
【０１３５】
抗酸化剤は、爆音への曝露後における、蝸牛内の神経変性を低減する
この処置レジメンの、爆音へと曝露された蝸牛ニューロンの構造的完全性に対する一時的な効果について具体的に検討するために、本出願者らは、爆音へと曝露され、その後、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣで処置された動物のコホートにおいて、上記で記載したリボンシナプスおよびニューロフィラメントの免疫染色パターンについて査定した。非処置の爆音へと曝露された動物と対照的に、外傷の７日後に、抗酸化剤処置ラットは、ＯＣの８ｋＨｚ領域および１６ｋＨｚ領域における、リボンシナプスの、統計学的に有意な喪失を呈さなかった（図９、ＡおよびＢ）。抗酸化剤処置動物の、１６ｋＨｚ領域内では、リボンシナプス密度が、非曝露非投薬対照と識別不能であったので、これらの治療効果は、爆音の２１日後まで、一時的に拡張された（図８、パネルＧ〜Ｉおよび図９、ＣおよびＤ）。この最終時点では、抗酸化剤による、見かけの肯定的な処置効果はまた、３２ｋＨｚ領域でも観察されたが、効果の程度は、統計学的有意性についての、本発明者らの基準を満たさなかった（すなわち、ｐ＞０．０５、図９、ＣおよびＤ）。ＨＰＮ−０７およびＮＡＣ処置また、神経障害性爆音レベルに応答する、中回転および基底回転における、ＩＨＣの神経支配帯域内の、粗大な神経突起喪失も低減した（図１９Ｃおよび１９Ｆ）。さらに、最終の２１日後の時点で、処置された爆音へと曝露された動物では、ＩＨＣ  １個当たりの神経突起数の、非曝露非投薬対照と比べた有意差が見られなかった（図１９Ｇ）ように、抗酸化剤処置動物では、非処置ラットで観察された、シナプスの神経突起の進行性喪失が、事実上存在しなかった。
【０１３６】
抗酸化剤による介入は、急性爆音傷害により誘導された、骨ＳＬ内の神経線維の、伝搬性の喪失に、効率的に対抗した（図１０Ｃ）ので、この治療効果の派生効果はまた、逆行的な形でも顕在化した。これらの処置動物では、ＳＬ神経線維の密度は、爆音の２１日後の、最終サンプリング間隔において、非曝露非投薬対照と識別不能であった（図１０Ｄ）。処置効果はまた、弱く染色された、ＮＦ−２００陽性Ｉ型ニューロンの完全な補充が、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣを投与された爆音へと曝露されたラットにおける実験の時間経過を通して検出されたＳＧにおいても明白であった（図１１）。この観察は、爆音後の各サンプリング間隔における、ＳＧ内のＮＦ−６８陽性ニューロン数の、処置誘導性の、有意な低減により補完された（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。さらに、非処置の爆音へと曝露されたラットにおいて観察された効果とは対照的に、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣで処置された動物の、３つの回転全てにおけるＳＧニューロンの平均サイズは、爆音の２１日後の、最終サンプリング間隔において、非曝露非投薬対照と識別不能であった（全てにおいて、ｐ＞０．０５；図１３）。したがって、抗酸化剤との組合せによる介入は、末梢聴覚系における、爆音誘導性の神経変性を、効率的に回避すると考えられた。
【０１３７】
爆音への曝露は、螺旋神経節ニューロン内のタウの、高リン酸化およびオリゴマー化を誘導する
これらの爆音条件に応答して、海馬タウの、広汎性の高リン酸化およびオリゴマー化が誘導されたが、これらのいずれも、損傷の明白な進行とは独立に、プリオン様の伝搬する、細胞間機能不全の波を誘発することが示されている。蝸牛ニューロン内の、神経毒性タウの蓄積を、爆音と同時的な続発症として検討した。
【０１３８】
蝸牛の査定は、セリン部位１９５、１９８、１９９、および２０２においてリン酸化を欠く、タウの生理学的アイソフォームを認識し、病理学的区別と対比した、生理学的区別を行うのに有用な内因性タウ抗体である、タウ１により開始した。しかし、タウ１抗体は、正常な蝸牛ニューロンまたは神経線維との、検出可能な免疫反応性を呈しなかった。生理学的条件下で、タウは、代替的スプライシングから生じる、６つの別個のアイソフォームのうちの１つとして存在しうる（Ｂｕｅｅら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．、３３、９５〜１３０（２０００））。さらに、これらのアイソフォームは、微小管との機能的な相互作用をモジュレートする、示差的なリン酸化を含む、文脈特異的翻訳後修飾を受ける。したがって、本出願者らは、タウの６つの天然アイソフォームの全てを認識する、代替的な、生理学的に妥当な抗体であるタウ４６を使用した。この抗体を使用したところ、ＳＬ内の神経線維、および正常なＯＣ内のＨＣ下方の神経線維において、強いタウ４６陽性染色が観察された。柱状細胞、ダイテルス細胞、およびヘンセン細胞の細胞質ではまた、中程度のタウ４６免疫標識化も観察され、ＩＨＣおよび外ＨＣ（ＯＨＣ）では、比較的弱い染色が観察された。この蝸牛分布パターンは、この器官内の生理学的タウ、ならびにアルファ−チューブリンおよびベータ−チューブリンなど、他の微小管関連タンパク質について、かつての報告（Ｄｅｓｐｒｅｓら、１９９４；Ｏｓｈｉｍａら、１９９２；Ｄｕら、２００３；ＳｌｅｐｅｃｋｙおよびＵｌｆｅｎｄａｈｌ  １９９２）において記載されたパターンと同様である。ＳＧでは、ニューロンの細胞体内で、拡散性の陽性タウ４６染色が観察された。しかし、非曝露非投薬ラットでは、ＳＧＮのうちの約１０％は、強い陽性染色を呈した（表１）。螺旋靱帯および血管条もまた、拡散性のタウ４６染色を呈した（データは示さない）。これらの結果は、かつての報告とは対照的に、タウタンパク質の局在および分布は、一見すると、蝸牛内で、極めて広範にわたり（Ｄｅｓｐｒｅｓら、１９９４；Ｏｓｈｉｍａら、１９９２；ＳｌｅｐｅｃｋｙおよびＵｌｆｅｎｄａｈｌ  １９９２）蝸牛ニューロン内および感覚上皮内のタウの、正常なリン酸化状態は、海馬ニューロン内で観察されるリン酸化状態とは、異なる可能性が高い（Ｄｕら、２０１６）ことを指し示す。
【０１３９】
表1:爆音への曝露および抗酸化剤処置の後の聴覚系における、正常タウ染色
【表１】
2019537582.tif 000006
注:数は、平均値±SEMを表し;「NS」とは、陽性染色なしを意味し;「*、**、***」とは、NCと比較して、それぞれ、p<0.05、0.01、0.001を意味し;「処置効果」とは、爆音へと曝露された場合(B)と、爆音へと曝露され、処置された場合(B/T)との比較を意味する。
【０１４０】
正常なタウタンパク質の、細胞体における蓄積は、軸索の微小管の不安定化に応答する、多くの、急性および慢性の神経変性障害の特徴である（ＫｏｗａｌｌおよびＫｏｓｉｋ、１９８７；Ｗｏｌｆｅ、２０１２）。しかし、非処置の爆音へと曝露されたラットのＳＧＮにおける、細胞体タウ４６の免疫反応性パターンについての、定性的査定および定量的査定は、爆音への曝露後の任意の時点において、全タウレベルの、非曝露非投薬対照で観察される全タウレベルとの、検出可能な差違を明らかにしなかった（全てにおいて、ｐ＞０．０５）。ＳＬ内の、タウ４６免疫反応性もまた、最終の２１日後の時点に測定し、統計学的に解析したところ、この解析からの結果は、タウ４６について強く免疫陽性である神経線維の数の、中程度の増大（非曝露非投薬対照における１４６２±１５８．６６／ｍｍ２と比較して、１８４６±１８２．８３／ｍｍ２（ｐ＜０．０５））を明らかにした。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣで処置された爆音へと曝露されたラットでは、タウ４６陽性の神経線維密度（１３１３．９８±１２８．２３／ｍｍ２）は、非処置の爆音へと曝露されたラットと比較して、有意に低減され（ｐ＜０．０１）、非曝露非投薬対照と、統計学的に識別不能（ｐ＞０．０５）であった。
【０１４１】
病理学的状態では、酸化ストレスを含む毒性傷害は、特殊なキナーゼおよびホスファターゼの活性の不均衡をもたらす場合があるが、これは、極めて重要な微小管調節部位における、タウの高リン酸化を結果としてもたらすことから、ニューロンの細胞体内の、非結合性の、高リン酸化タウレベルの上昇をもたらす（Ｎｏｂｌｅら、２０１３；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、２００１）。爆音へと曝露されたラットでは、ＳＧＮが、この不安定性のストレス応答パターンの影響を受けやすいのかどうかを見分けるために、本出願者らは、これらの動物および非曝露非投薬対照に由来する蝸牛組織を、高リン酸化タウを特異的に認識する抗体である、ＡＴ８で免疫標識化した。図１４に示される通り、非曝露非投薬ラットのＳＧは、大部分、ＡＴ８抗体による免疫標識化に対して、応答しなかった（図１４Ａおよび１４Ｄ）。しかし、爆音への曝露は、ＳＧＮの細胞体におけるＡＴ８免疫標識化の、急性および慢性両方の増大を誘導し、ピークの免疫反応性は、爆音後７日間のサンプリング間隔において観察された（図１４Ｂおよび１４Ｄ；表２）。しかし、爆音の２１日後のＳＧＮでは、これらの神経毒性変異体のレベルが、一見すると、低下していたことから、爆音の、この微小管関連タンパク質に対する有害な影響は、一過性の現象でありうることが示唆された。ＳＧＮが、非処置ラットにおいて、統計学的に有意なＡＴ８の蓄積を呈した時点である、爆音への曝露の７日後には、ＳＬ内の、ＡＴ８陽性神経線維の密度もまた測定し、統計学的に解析した。しかし、爆音へと曝露されたラットのＳＬでは、ＡＴ８陽性神経線維の相対密度は、この時点において、処置にかかわらず（非処置ラットおよび処置ラットについて、それぞれ、２２７．５３±２２．２０および２５３．９３±２４．９０／ｍｍ２）、非曝露非投薬対照（１６９．１７±２０．９８；全てにおいて、ｐ＞０．０５）と比較して、有意に増大しなかった。
【０１４２】
表2:爆音への曝露および抗酸化剤処置の後の聴覚系における、AT8染色
【表２】
2019537582.tif 000007
【０１４３】
初期に、その微小管結合能を不安定化させるリン酸化事象は、自己会合する傾向を呈する構造的コンフォメーションを結果としてもたらす（Ｉｑｂａｌら、２０１３）ので、タウの高リン酸化は、タウオリゴマー化の病因的前駆症状であることが多い。タウの生理学的アイソフォームも、高リン酸化アイソフォームと共に、終端の病理学的複合体へと動員され、それらの神経変性特性を強化する（Ｔａｋａｓｈｉｍａ、２０１３）ので、このアフィニティーパターンの変更は、さらなるタウの機能不全をもたらしうる。本発明者らの爆音への曝露モデルがまた、ＳＧＮ内のタウに対して、オリゴマー化の影響も誘導したのかどうかについて調べるため、本出願者らは、爆音後の縦断的な時点からのＳＧ切片を、病理学的タウオリゴマーを特異的に認識する抗体である、Ｔ２２で免疫標識化した（Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓら、２０１２）。ＡＴ８抗体についての観察（図１４Ａ）と同様に、非曝露非投薬ＳＧＮの大部分（＞９９％；図１５Ｄ）は、Ｔ２２抗体と免疫反応性ではなかった（図１５Ａ）。これに対し、解析された全ての時点の、爆音へと曝露されたラットに由来するＳＧＮでは、細胞体における、新規で広汎性のＴ２２免疫反応性が観察された（図１５Ｂおよび１５Ｄ；表３）。このＴ２２免疫標識化パターンの遍在度は、時間と共により大きくなったことから、その免疫反応性が、爆音の７日後においてピークレベルに達した後で、低下した、ＡＴ８抗体について観察される傾向（図１４Ｄ）と対比される。ＳＧＮ内のＴ２２の蓄積が最大となる時点（すなわち、爆音の２１日後）において、ＳＬ内の、Ｔ２２陽性神経線維の密度もまた測定し、統計学的に解析した。この時点では、Ｔ２２陽性神経線維の、顕著で、非曝露非投薬対照（１３６．６７±１５．３８／ｍｍ２；ｐ＜０．００１）と比較して、統計学的に有意な増大はまた、非処置の爆音へと曝露されたラット（５１６．９９±５８．１７／ｍｍ２）のＳＬでも観察された。爆音へと曝露されたラットにおける、この異常なＴ２２ＳＧＮ免疫標識化パターンの恒常化は、この聴覚神経中枢における、持続性または進行性の病態を示す。
【０１４４】
表3:爆音への曝露および抗酸化剤処置の後の聴覚系における、T22染色
【表３】
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【０１４５】
爆音へと曝露されたラットにおいて観察されたＴ２２プロファイルは、このコホートについて上記で記載した、ＮＦ−６８の、縦断的な免疫標識化パターンを想起させた。これは、本発明者らに、これらの相補的な傾向が、同じ変性ＳＧＮ内の、同時的な病態生理学的応答として顕在化したのかどうかを決定するように促した。この目的で、爆音へと曝露されたラットに由来するＳＧ組織切片を、ＮＦ−６８およびオリゴマータウに対する抗体と共に共インキュベートし、次いで、これらの２つの病理学的エピトープの、潜在的な共局在化について査定した。この免疫蛍光解析の例を、図１６に描示する。これらの解析に基づくと、Ｔ２２による免疫標識化は一般に、急性サンプリング間隔および慢性サンプリング間隔のいずれにおいても、ＮＦ−６８より遍在的であるが、各時点において、複数のＴ２２陽性ニューロンが、ＮＦ−６８抗体と共に共標識化される（図１６）ことが明白であった。これらの二重標識化されたニューロンのサイズおよび形状は、Ｉ型ＳＧＮと符合した。これらの結果は、タウ機能の、進行性で神経毒性の不安定化と、ニューロフィラメントの不安定化とは、爆音へと曝露されたラットにおけるＳＧＮの変性において、関連する事象であることを指し示す。
【０１４６】
抗酸化剤処置は、螺旋神経節ニューロン内の、神経毒性タウ変異体の、爆音誘導性の蓄積を低減する
示差的なニューロフィラメント染色により明らかにされた、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣによる介入の、蝸牛神経変性に対する、明らかな治療効果が、ＳＧ内のタウ機能不全へと拡張されうるのかどうかを決定するために、本出願者らは、各サンプリング間隔における、抗酸化剤で処置された爆音へと曝露されたラットに由来する適切な組織切片を、非曝露非投薬対照および非処置の爆音へと曝露されたコホートとの比較のために、ＡＴ８抗体およびＴ２２抗体で免疫標識化した。図１４（パネルＣおよびＤ）で描示される通り、ＨＰＮ−０７と、ＮＡＣとの組合せレジメンによる損傷後急性介入は、全ての被験時点における、高リン酸化タウの発現を低減した。非処置の爆音コホート内で、ＡＴ８レベルがピークに達した、７日間のサンプリング間隔では、処置されたラットにおいて、ＡＴ８免疫陽性ニューロン数の有意な低減が観察された（図１４Ｄおよび表２）ことは、特に、注目に値する。しかし、この時点では、抗酸化剤処置は、ＡＴ８陽性ニューロンの数を、非曝露非投薬対照において観察されるレベルまでは低減しなかったことから、おそらく、ＳＧ内の、異常なタウリン酸化に対する、爆音の可飽和影響または酸化ストレス非依存性影響が裏書きされる。
【０１４７】
オリゴマータウ抗体による補完的解析は、爆音へと曝露された動物のＳＧ内のニューロンにおける、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣによる介入の、なおより顕著な効果を明らかにした。これらの条件下で、抗酸化剤による介入は、研究時間経過全体を通して、非処置の爆音へと曝露されたラットの細胞体内で観察される、Ｔ２２による免疫標識化の病理学的増大を、著明かつ効率的に遮断した（図１５、パネルＣおよびＤ；表３）。この肯定的な処置効果は、ＳＬでもまた観察され、この場合、Ｔ２２陽性神経線維密度（１９３．５３±２１．３７／ｍｍ２）は、最終サンプリング間隔において、非処置の爆音へと曝露されたラットの場合（５１６．９９±５８．１７／ｍｍ２、ｐ＜０．００１）より有意に小さく、非曝露非投薬対照とは、統計学的に識別不能（ｐ＞０．０５）であった。ＳＧＮ内のＮＦ−２００染色の保存に対する、肯定的な処置効果（図１１）、および病原性ＮＦ−６８の蓄積の緩和（図１２）と共に、これらの結果は、爆音へと曝露された動物における、この組合せによる抗酸化剤レジメンの、既に指し示された治療的効果を、末梢聴覚系における、神経変性および進行性タウ調節異常の阻害を含むように拡張しうることを裏付ける。   
【０１４８】
抗酸化剤は、爆音へと曝露されたラットの聴覚野内のニューロンにおける、細胞体へのタウの蓄積を低減する
ＨＰＮ−０７／ＮＡＣによる組合せ処置は、末梢聴覚系における、進行中の、ｂＴＢＩに関連するタウ機能不全の徴候を明らかに改善したが、実験は、爆音への繰り返しの曝露が、中枢聴覚系のタウにおいてもまた、病原性変化を誘導し、抗酸化剤による治療的介入が、これに対抗するのかどうかを決定しようとした。この目的で、蝸牛腹側前核（ＡＶＣＮ）、蝸牛腹側後核（ＰＶＣＮ）、ＤＣＮ、ＩＣ、およびＡＣに由来する組織切片を、爆音に応答するタウの調節異常の、免疫細胞学的証拠について査定した。蝸牛組織と対照的に、中枢聴覚経路内のニューロンは、非曝露非投薬の対照ラットにおいて、従来の生理学的タウ１抗体と、拡散的に免疫反応性であった（図１７Ａ）。この観察は、海馬ニューロンにおける、タウの免疫プロファイリングについての、本出願者らによるかつての研究（Ｄｕら、２０１６）と符合する。非曝露非投薬対照では、タウ１陽性ニューロンは、ＤＣＮの全ての層、ならびにＶＣＮおよびＩＣの全ての領域に分布し（表１）、細胞体における強い免疫反応性は、極めて低頻度であった。本発明者らによる、海馬ニューロンについてのかつての査定と対照的に、爆音への曝露は、ＡＶＣＮ内またはＤＣＮ内の細胞体におけるタウ１染色の有意な変化を誘導せず、細胞体におけるタウ１免疫反応性の一過性増大だけが、曝露後７日間のサンプリング間隔において、非処置の爆音へと曝露された動物のＰＶＣＮ内で検出された（ｐ＜０．０５；表１）。
【０１４９】
非曝露非投薬対照のＡＣでは、タウ１陽性ニューロンは主に、ニューロンの深部層に位置した。しかし、爆音への曝露後では、タウ１陽性ニューロンはまた、中層内でも観察された。図１７のグラフにまとめられる通り、爆音への曝露後の全ての時点では、ＡＣ内のニューロンにおいて、有意に多くのタウ１陽性細胞体が観察された。この爆音誘導性の影響は、爆音の２４時間後〜７日後の間の初期のプラトーの後、ＡＣ内の、細胞体が、タウ１により、暗色に染色されたニューロンの数は、爆音の２１日後に、おそらく、正常なタウ機能の、急性かつ進行性の調節異常を反映して、さらに増大したので、二相性であると考えられる。
【０１５０】
ＡＴ８抗体による中枢聴覚組織切片の検討は、ＡＶＣＮ内、ＰＶＣＮ内、またはＩＣ内の、爆音誘導性の高リン酸化の有意な誘導を明らかにしなかった（表２）。爆音の７日後の、ＤＣＮのニューロンでは、細胞体におけるＡＴ８免疫標識化の、わずかな、一過性の増大（ｐ＜０．０５；２．８倍の増大）が観察されたが、２４時間後または２１日後の時点には、検出可能な変化が明白ではなかった（表２）。一次ＡＣでは、爆音の７日後において、ＡＴ８免疫反応性の、ＤＣＮ内で検出された増大と比べて、より顕著ではあるが（ｐ＜０．０１；４．７６倍の増大）、なおさらに一過性の増大が観察された。しかし、この病原性の染色パターンは、一見すると、２１日間のサンプリング間隔までに消失した。
【０１５１】
Ｔ２２による免疫標識化は、爆音へと曝露された動物の、中枢聴覚経路内のＡＴ８抗体により観察されたパターンと同様の免疫標識化パターンを呈した。非曝露非投薬動物の、ＡＶＣＮ内、ＰＶＣＮ内、ＤＣＮ内、またはＩＣ内では、Ｔ２２反応性ニューロンが検出されなかった（表３）。さらに、本発明者らのｂＴＢＩモデルは、研究による実験の時間経過にわたり、脳の、これらの中枢聴覚領域内で、細胞体におけるＴ２２免疫反応性の、有意な増大を誘導しなかった（表３）。これに対し、ＡＣ内の、Ｔ２２陽性ニューロンの遍在度は、爆音の７日後において、有意に上昇した（ｐ＜０．００１；１００倍の増大）。しかし、この異常な免疫標識化パターンは、研究の最終（２１日後）時点までに、有意に低減された（表３）。まとめると、これらの結果は、ｂＴＢＩが、ＡＣのニューロン内の、生理学的タウの、進行性ではないが、持続的な、細胞体における蓄積を誘導し、これは、この中枢聴覚の中枢内の、高リン酸化タウおよびオリゴマータウの、一過性であるが、遅延した（爆音の７日後）蓄積と連動することを明らかにした。
【０１５２】
爆音後において、ラットに、抗酸化剤との組合せ（ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ）処置レジメンを投与したところ、爆音後７日間および２１日間のいずれの時点でも、一次ＡＣのニューロンの、細胞体における生理学的タウ蓄積の発生（すなわち、細胞体におけるタウ１との反応性）は、有意に低減された（図１７；表１）。肯定的な処置効果は、細胞体におけるタウ１陽性ニューロンの相対遍在度が、非処置の爆音へと曝露されたラットにおいて観察された相対遍在度の約２倍未満となった、最終の２１日後の時点において、最も顕著であったことから、処置特異的な効果が示される（ｐ＜０．００１）。しかし、細胞体におけるタウ１の蓄積について観察された効果とは対照的に、抗酸化剤処置は、爆音へと曝露された動物の、これらの中枢聴覚核内で観察された、タウの高リン酸化およびオリゴマー化の、一過性であるが、遅延した増大に対して、区別可能な影響を及ぼさないと考えられた（表２および３）ので、この処置効果は、ＤＣＮ内および／またはＡＣ内で観察される、異常なＡＴ８またはＴ２２の免疫反応性パターンへは拡張されなかった。したがって、爆音へと曝露されたラットのニューロン内の、神経毒性タウ蓄積についての、病原性パターンおよび処置応答パターンは、末梢聴覚経路におけるニューロンと、中枢聴覚経路におけるニューロンとで、明らかに異なり、おそらく、それらの相対的な解剖学的位置、ならびに爆音により誘導される、伝搬性の酸化ストレスおよび神経変性の、状況による影響の受けやすさを反映する。
【０１５３】
抗酸化剤は、爆音へと曝露されたラットの螺旋神経節内のニューロンにおける、酸化ストレスを低減する
爆音誘導性の酸化ストレスが、実のところ、蝸牛の神経変性と関連する病態生理学的応答に寄与することを確認するため、本出願者らは、爆音の２４時間後において、ＳＧＮ組織を、酸化によるＤＮＡ損傷についてのバイオマーカーである、８−ＯＨｄＧで免疫標識化した（Ｖａｌａｖａｎｉｄｉｓら、２００９）。非処置の爆音へと曝露されたラットの、ＳＧＮの核内では、強い８−ＯＨｄＧ陽性染色が観察されたことから、これらのニューロン内の、酸化ストレスによる損傷レベルが示される（図１８Ｂ）。図１８Ｄのグラフにまとめられる通り、これらの動物のＳＧ内では、非曝露非投薬対照と比較して、有意に多数の８−ＯＨｄＧ陽性ニューロンが観察された（ｐ＜０．００１）。組合せ抗酸化剤レジメンで処置された動物では、強い８−ＯＨｄＧ免疫反応性を伴うＳＧＮの遍在度が、有意に低減された（ｐ＜０．００１）。これらの結果は、ＳＧ内の爆音誘導性の神経変性における、主要な因子ではないにせよ、寄与的な因子としての、酸化ストレスと、抗酸化剤処置の、ストレス応答の低減に対する、肯定的な治療的効果とについての、直接的な証拠を提示する。
【０１５４】
抗酸化剤は、爆音へと曝露されたラットにおける聴覚機能の喪失を低減する
本研究によるＡＢＲ結果は、本発明者らのかつての報告（Ｅｗｅｒｔら、２０１２）で詳述されており、図２０にまとめられる。一般に、爆音への曝露後の全ての時点において、非処置の爆音へと曝露された動物では、有意なＡＢＲ閾値のシフトが観察された。非処置の爆音へと曝露された群と比較して、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置群におけるＡＢＲ閾値のシフトは、爆音の２４時間後において、約１０ｄＢ低減され、爆音７日後および２１日後において、２１ｄＢ低減された（全て、ｐ＜０．００１）。抗酸化剤処置群では、爆音への曝露の７および２１日後のいずれにおいても、全ての被験周波数（２〜１６ＫＨｚ）にわたり、ＡＢＲ閾値シフトの有意な回復が測定された（ｐ＜０．０１または０．００１）。これらのＡＢＲ結果が、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣの、爆音へと曝露されたラットにおいて、聴覚機能の進行性喪失を結果としてもたらす、進行中の病態生理学的応答を中断させる、明確に肯定的な特質を反映することは、進行性のＳＧ神経変性について観察される治療効果と符合する。
【０１５５】
さらなる解析
本発明者らの爆音モデルは、感覚神経機能の減弱を示す、有意かつ恒久的なＡＢＲ閾値のシフトを誘導することが示されたが、損傷の２１日後における、非処置の爆音へと曝露されたラットの中回転および基底回転で観察された、ＩＨＣの喪失は、１〜２パーセントだけであったことから、これらの動物において評価がなされていない、ある程度の神経変性が示唆される（Ｅｗｅｒｔら、２０１２；Ｄｕら、２０１３であるが、データは示さない）。
【０１５６】
実際、損傷の７日後に始めて、本発明者らは、非処置の爆音へと曝露されたラットにおける、ＯＣの、中回転および基底回転の、ＩＨＣの神経支配帯域に沿って、神経突起数の有意な減少を観察し、これらの領域では、研究の、最終の２１日後の時点において、元の神経突起集団のうちの半分を超える集団の明らかな喪失を測定した（図１９）。これらの結果は、外傷の、最終の２１日後の時点における、この領域の広がりに沿ったＩＨＣにおける、有意な爆音誘導性のリボンシナプスの喪失と相関し（図８および９）、末梢聴覚の、脳へのシグナル伝達の、顕著な低減を示す。これらの動物では、ＳＬ内の末梢軸索の数骨は、爆音の２１日後まで、それほど減少しなかった（図１０）。これらの結果は、急性音響外傷へと曝露されたマウスにおいて記録されていること（Ｊｅｎｓｅｎら、２０１５）と同様に、本発明者らによる爆音へと曝露されたパラダイムに応答する、ＩＨＣシナプスの喪失による、段階的ではあるが、進行性の、軸索退縮と符合する。この期間にわたり、病原性のＮＦ−６８染色は、ＳＧＮの細胞体内で、有意な上昇を維持した（図１２）ことから、持続的な機能不全が指し示される。他方、ＳＧＮの細胞体の、正常なＮＦ−２００免疫標識化パターンにおける有意な不均衡は、爆音の７日後まで、観察されず、Ｉ型様の免疫反応性パターンを有するニューロン数の明らかな減少は、損傷の２１日後において、初めて明白となった（図１１）。これらの結果は、病原性ＮＦ−６８の蓄積が、ＳＧＮにおける、ＮＦ−２００の免疫反応性の喪失より、進行中の爆音誘導性の神経障害についての、より高感度であるか、または優位の病原性マーカーであることを指し示すと考えられる。
【０１５７】
本発明者らの爆音損傷モデルに応答して、ＳＧＮ内で観察される、進行性の病態生理学的応答パターンは、軽度の爆音誘導性ＴＢＩ（ｍＴＢＩ）、および他の臨床的に類縁の神経障害と関連する神経変性に特徴的である（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、２０１２；Ｓａｊｊａら、２０１５；ＷａｌｋｅｒおよびＴｅｓｃｏ、２０１３）。本発明者らの爆音過圧モデルの強度（１４ｐｓｉ）が、ＳＧ内の、爆音誘導性の神経変性のタイミングおよび程度において、鍵となる役割を果たした可能性が高い。マウスにおける関連する研究では、Ｃｈｏらは、９４ｋＰａ（１３．６３ｐｓｉ）または１２３ｋＰａ（１７．８４ｐｓｉ）の爆音へと曝露された動物では、ＳＧニューロンの喪失が観察されなかったが、１８１ｋＰａ（２６．２５ｐｓｉ）の爆音は、外傷の７日後という早期に、有意なＳＧＮ喪失を誘導すること（Ｃｈｏら、２０１３）を裏付けた。本研究では、トルイジンブルー染色およびＮＦ−２００染色の結果は、最終実験の時点（２１日後）において、ＳＧでは、有意なニューロンの喪失が見られないことを指し示した。にもかかわらず、本発明者らが、本発明者らの研究の時間経過を通して観察した、ＳＧＮ内の、ＮＦ−６８および神経毒性タウ変異体の両方の、持続的な病原性蓄積は、最終的に、この末梢ニューロン集団の有意な減少をもたらす可能性がある、ある程度の、爆音誘導性の神経障害と符合する。本発明者らが、爆音の２１日後の、非処置の爆音へと曝露されたラットの蝸牛内のＳＧＮにおける、平均値細胞体直径の、統計学的に有意な低減を観察したことから、これらの動物における、進行中のニューロンの萎縮が示されることは、この原理と符合する（図１３）（Ｒａｆｆら、２００２）。さらに、本明細書で用いられるｍＴＢＩモデルは、軍人が遭遇するｍＴＢＩを模倣する可能性が高いので、退役軍人において一般に観察される、時空間進行性の神経変性（ＭｃＫｅｅおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、２０１４；Ｙａｎｋａｓｋａｓ、２０１３）に対する潜在的な洞察ももたらす。
【０１５８】
爆音の過圧への曝露から生じるｍＴＢＩは、酸化ストレスの遷延を誘導することが公知である（Ａｂｄｕｌ−Ｍｕｎｅｅｒら、２０１３；Ｋｏｃｈａｎｅｋら、２０１３；Ｒｅａｄｎｏｗｅｒら、２０１０）。したがって、本発明者らは、カノニカルの抗酸化剤である、Ｎ−アセチルシステインと、フリーラジカルスピントラップ剤である、ＨＰＮ−０７とから構成される抗酸化剤製剤による、外傷後介入の、ＯＣ内の、爆音誘導性の病態生理学的応答に対する治療効果について検討した。本発明者らは、この治療戦略が、本発明者らの爆音損傷モデルに対する病態生理学的応答により発生する酸化ストレスの直接的な症状に対して、有意に保護し（図１８）、爆音へと曝露されたラットにおける、ＩＨＣの神経支配帯域内の、ＮＦ−２００陽性神経突起の、急性および慢性両方の喪失に対して保護し、ＳＬ内の神経線維の喪失に対しても保護する（図１９および図１０）ことを見出した。この治療効果はまた、ＯＣの、１６ｋＨｚ領域内の、有意なリボンシナプスの保存、および３２ｋＨｚ領域内の、肯定的な処置効果の徴候へも転換された（図８および９）。さらに、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ介入また、ＳＧＮの細胞体内の、病原性ＮＦ−６８の蓄積、およびＮＦ−２００免疫染色の神経障害性不均衡も著明に低減し、これらのニューロン集団内の、平均値細胞体直径の、爆音誘導性の低減を緩和した（図１１〜１３）。これらの肯定的な処置効果が、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣの、ニューロン内および神経突起内の酸化ストレスの低減に対する直接的な効果の結果であったのか、持続的なＨＣの生存を介する、間接的な保護効果の結果であったのか、またはこれらの両方の組合せであったのかは、明らかでなかった。しかし、上記で述べた通り、本発明者らの研究の全時間経過にわたり観察された、ＩＨＣの喪失は、１〜２％に過ぎなかった（Ｅｗｅｒｔら、２０１２；Ｄｕら、２０１３）。非処置の爆音へと曝露されたラットにおける、ＩＨＣによる神経突起の、比較的早期の喪失に照らし、抗酸化剤処置動物において観察された治療効果は、ＳＧＮの神経突起に対する直接的な保護の論拠となる。実際、ＯＣの広がりに沿った、平均末梢軸索密度の維持について観察される、リボンシナプスの完全性の保存と比べて、より頑健な処置効果は、抗酸化剤による介入が、さらなる軸索退縮を緩徐化するか、または停止させることを指し示しうるが、これは、生得的であるか、または治療による、再神経支配戦略の効果を増強する治療転帰である（Ｔｏｎｇら、２０１３；Ｗａｎら、２０１４）。
【０１５９】
微小管関連タンパク質であるタウの、異常なリン酸化および凝集は、酸化ストレスにより、誘導され、かつ、強化される（Ｍｅｌｏｖら、２００７；Ｍｏｎｄｒａｇｏｎ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、２０１３）。さらに、多くの場合、タウ機能の急性の低下は、慢性の細胞骨格の不安定化をもたらす可能性があり、これは、変性ニューロンに由来する病原性タウオリゴマーが、機能的なタウを、神経毒性オリゴマーへと徴集するので、細胞間で伝搬する（Ｃｌａｖａｇｕｒａら、２０１３；Ｇｕｏら、２０１１）。これらの観察と、本発明者らによる、爆音へと曝露されたラットのＣＮＳにおけるタウについてのかつての研究（Ｄｕら、２０１６）とに基づき、本発明者らは、末梢聴覚経路および中枢聴覚経路が、感覚神経性難聴に寄与しうる、タウオパチー性応答についての証拠を示すのかどうかについて検討した。
【０１６０】
本発明者らの、ｂＴＢＩについてのモデルを使用して、本発明者らは、爆音への曝露が、非処置ラットにおけるＳＧニューロンの細胞体内で、急性タウ高リン酸化を誘導し、これが、外傷の７日後において、ピークに達すること（表２および図１４）を発見した。この病原性応答は、本発明者らの研究の、実験の時間経過を通して、高値を維持した、オリゴマータウ封入体の蓄積により反映された（表３および図１５）。まとめると、これらの結果は、爆音誘導性のタウ機能不全が、ＯＣ内の、ニューロフィラメントの不安定化および神経変性と同時的な、分子的続発症であることを指し示し、ＳＧニューロン間における、細胞骨格の完全性に対する、広範かつ持続的な負の影響を示す。
【０１６１】
本発明者らの爆音モデルにおける、ＮＦ−６８についての病原性応答パターンと、タウ染色についての病原性応答パターンとが、互いに、緊密に反映され合うという事実、ならびにニューロフィラメントと、タウ機能不全とが、しばしば、慢性外傷性脳症、筋委縮性側索硬化症、およびアルツハイマー病などの神経変性障害において、相互連関するという事実に基づき、本発明者らは、これらの２つの病原性マーカーが、爆音後における、変性ＳＧＮの細胞体内で、共存するのかどうかについて検討した（Ｄｅｋｏｓｋｙら、２０１３；ＬｉｎおよびＳｃｈｌａｅｐｆｅｒ、２００６；Ｎｇｕｙｅｎら、２００１；Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９０；Ｖｉｃｋｅｒｓら、１９９４）。本発明者らは、ＮＦ−６８の蓄積と、タウのオリゴマー化とが、実際、ＳＧＮ内で、共局在化可能な続発症であるが、それらの相対遍在度に基づくと、タウのオリゴマー化が、この病原性の文脈では、ニューロフィラメントの不安定化に対して、優位の前駆症状でありうること（図１６）を発見した。
【０１６２】
酸化ストレスは、ＣＮＳにおける、タウの高リン酸化およびオリゴマー化の誘導および恒久化を統御する因子であるが、これらの病理学的応答を連関させる、正確な生理学的機構については、ほとんど知られていない（Ａｌａｖｉ  ＮａｉｎｉおよびＳｏｕｓｓｉ−Ｙａｎｉｃｏｓｔａｓ、２０１５）。にもかかわらず、本発明者らの結果が、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣによる早期の介入の、ＳＧニューロンおよびそれらの末梢神経線維における、タウによる、これらの神経毒性症状の軽減に対する、明らかな治療的利益を裏付けた（図１４および１５）ことは、爆音誘導性の酸化ストレスがまた、末梢聴覚系における、このタウオパチー性応答も駆動しうることの根拠と符合する。本発明者らによる、抗酸化剤との組合せ製剤が、ＳＧ内の、爆音への急性曝露後における、急性および慢性両方のオリゴマータウの蓄積を、顕著に低減した（図１５）ことは、特に、注目に値する。タウオリゴマーは、アルツハイマー病を含む、多くのタウオパチーにおいて、主要な伝播性神経毒性物質として作用すると、広く考えられている（Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓら、２０１０および２０１２；Ｕｓｅｎｏｖｉｃら、２０１５；Ｖｉｏｌｅｔら、２０１５）ので、早期のＨＰＮ−０７およびＮＡＣによる介入が、ＳＧＮ内のそれらの形成を抑制する能力は、蝸牛内の、進行性神経変性に対する、長期にわたる著明な保護を付与しうる。
【０１６３】
タウと同様に、ＮＦ−６８は、酸化ストレス誘導性の高リン酸化およびオリゴマー化の影響を受けやすく、機能不全性のＮＦ−６８の凝集物が、タウのオリゴマー化を促進する、非生理学的シャペロンとして作用しうるという証拠が存在する（Ｉｓｈｉｈａｒａら、２００１）。かつてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、古典的な抗酸化剤（例えば、ＮＡＣ）、およびアルファ−フェニルＮ−三級ブチルニトロン（ＰＢＮ）など、ＨＰＮ−０７と類縁のフリーラジカルスピントラップ剤のいずれも、天然タウおよびＮＦ−６８を、酸化ストレス誘導性の凝集から保護しうること（Ｋｉｍら、２００３および２００４；Ｏｌｉｖｉｅｒｉら、２００１）を裏付けた。本発明者らの神経障害性爆音研究における、ＮＦ−６８および神経毒性タウ変異体の、ＳＧＮの細胞体における蓄積に対する、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣによる、同時的な改善の効果は、この治療用製剤による外傷後の介入が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、これらの相互関連性の分子的ストレス応答パターンもまた回避する潜在的可能性を有することを指し示す。
【０１６４】
爆音への曝露は、末梢聴覚系および中枢聴覚系のいずれにおいても、病原性のタウについての免疫染色を結果としてもたらしたが、本発明者らは、ＳＧ内およびＡＣ内のニューロンが、ＣＮ内およびＩＣ内のニューロンより、この不適応応答の影響を受けやすいことを見出した（Ｖａｌｉｙａｖｅｅｔｔｉｌら、２０１２）。しかし、抗酸化剤による介入は、処置効果が、高リン酸化タウまたはオリゴマータウの蓄積ではなく、生理学的タウの、細胞体における蓄積に限定される、中枢聴覚系より、末梢聴覚器官における、異常なタウ修飾を軽減するのに有効であった（表１〜３および図１７）。この懸隔は、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣの、血液蝸牛関門と対比した、血液脳関門の相対透過度の差違、またはこれらの組織に由来する病態生理学的応答の差違を反映しうる。同じ抗酸化剤との組合せレジメンが、海馬ニューロン内の、これらのタウオパチー性応答の各々を中断するのに十分であることが裏付けられたことから、少なくとも、脳の、この皮質下領域内では、薬物が、爆音誘導性のタウ機能不全を軽減するのに十分な濃度に到達した（Ｄｕら、２０１６）ことが示唆される。したがって、中枢聴覚系における、病原性のタウ蓄積に、より有効に対処するには、これらの抗酸化剤処置の延長または高用量が要求される可能性がある。
【０１６５】
まとめると、本発明者らの結果は、爆音への曝露により引き起こされたｍＴＢＩが、末梢聴覚系における、進行性の逆行性神経変性を誘導し、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣによる早期の介入が、この転帰に対する有意な保護をもたらすことを裏付ける。さらに、爆音に応答する、広範にわたるタウ機能不全、およびＳＧＮ内の病原性凝集を防止する、これらの抗酸化剤の能力は、内耳内の伝搬性の神経毒性を制限するための、それらの長期にわたる改善の利益をさらに裏書きする。
【実施例３】
【０１６６】
２，４−ジスルホニルα−フェニル三級ブチルニトロン（ＨＰＮ−０７）で処置された騒音損傷動物が、非処置対照と比べて、著明に大きなＩＨＣ神経突起集団を呈し、ＨＰＮ−０７処置は、独特なことに、これらの動物において、漸進的な度合いの機能的な回復を誘導したことが発見され、これは、再神経支配が進行中であることを示す。したがって、本発明者らは、ＨＰＮ−０７が、神経突起形成およびシナプス形成を誘導するのに強力であるのかどうかについて調べた。
【０１６７】
ＨＰＮ−０７を、３つのｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経突起形成性モデル（ＰＣ１２細胞、蝸牛螺旋神経節外植片、およびＳＧＮ外植片の、付着させた有毛細胞（ＨＣ）との共培養物）において調べた。これらの解析からの実験データは、（１）ＨＰＮ−０７が、ＰＣ１２細胞系において、ＮＧＦ誘導性神経突起形成を強化すること；（２）ＨＰＮ−０７が、有毛細胞を伴わない螺旋神経節外植片内で、神経突起形成を促進したこと；および（３）ＨＰＮ−０７が、興奮毒性によるリボンシナプス喪失を好転させ、カイニン酸（ＫＡ）により誘導される興奮毒性外傷後において、ＳＧＮ−ＨＣ共培養物中のＩＨＣの基部に沿って、神経突起密度を増大させることを裏付けた。
【０１６８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＨＰＮ−０７の神経突起形成促進特性をさらに特徴付け最適化し、また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＨＰＮ−０７による処置がＩＨＣ−ＳＧＮシナプスを再生する効果を調べるために、蝸牛のＩＨＣの最小限閾値シフトは誘導するが恒久的求心路遮断は誘導しないことが示されている音響過剰曝露パラダイムを使用してデザインされた生存動物実験において、これらの知見を治療転帰へと橋渡しするようにＨＰＮ−０７を拡張した。実験結果は、（１）ＨＰＮ−０７が、ＳＧＮ外植片内の、ＢＤＮＦ誘導性の神経突起形成およびＮＴ−３誘導性の神経突起形成のいずれも強化したこと；（２）ＨＰＮ−０７（ＮＡＣと共に製剤化された、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ）が、ラットにおける、騒音誘導性の難聴を防止したこと；（３）ＨＰＮ−０７／ＮＡＣが、ラットにおける、ＩＨＣリボンシナプスの、騒音誘導性の興奮毒性喪失を好転させたこと；および（４）ＨＰＮ−０７／ＮＡＣが、ラットにおける、騒音誘導性のＡＢＲ振幅異常を回復したことを示した。
【０１６９】
本発明者らは、ＨＰＮ−０７が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、螺旋神経節組織外植片内のＩ型軸索の、ＢＤＮＦ誘導性の神経突起形成およびＮＴ−３誘導性の神経突起形成を、用量依存的に強化したことを確認した。ＢＤＮＦおよびＮＴ−３は、蝸牛螺旋神経節（ＳＧＮ）の発生および生存に不可欠な、内耳内の、生得的な神経栄養因子である。図２４〜２７において示される通り、外因性のＢＤＮＦおよびＮＴ−３は、１０μＭで、同じ器官型培養培地中で培養された非処置対照（ＮＣ、正常対照、図２４Ａおよび図２６Ａ）と比べて、有意な神経突起の成長（図２４Ｂおよび図２６Ｂ）を誘導した。ＨＰＮ−０７は、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３に加えて、神経線維の数および広がりをさらに増大させた（図２４Ｃ〜２４Ｄおよび図２６Ｃ〜２６Ｄ）。処置のうちのいずれによっても、神経突起長は、ＮＣと比較して変化しなかった（図２５および図２７）。
【０１７０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるシナプス形成実験は、以下の通りにデザインした。体重を２５０〜３００ｇとするＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を、３つの群：ＮＣ（騒音なし）、騒音単独（生理食塩液で処置される）、および騒音＋ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ（ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ、３００ｍｇ／ｋｇで処置される）へと分けた。ラットを、１１０ｄＢで、２時間にわたる、オクターブバンドの騒音（８〜１６ｋＨｚ）へと曝露した。処置は、騒音への曝露の２４時間後に開始したが、この場合、処置の５回の投与は、３日間以内に行った。処置の２週間後、蝸牛試料を回収し、解析した（有毛細胞およびシナプスの計数）。聴力は、ＡＢＲにより、騒音の前に調べ、騒音の１日後および１５日後に、再度調べた。
【０１７１】
騒音の１日間後に測定される、一時的閾値シフト（ＴＴＳ）により検出された短期難聴は、非処置群と処置群との間で同様であり（図２１Ａ）、これは、騒音が、いずれの群においても、同様の損傷を引き起こしたことを意味する。後続のＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、騒音への曝露の１５日後に測定された、騒音誘導性の恒久的難聴を防止した（図２１Ｂ）。ＴＴＳとは、騒音への曝露後すぐの難聴であって、時間経過にわたり回復する難聴である。全てのＴＴＳが、消失するわけではなく、最終的な難聴の残存を、恒久的難聴と呼ぶ。騒音への曝露後における、有毛細胞の喪失は、最小限であり、蝸牛の最基底領域だけに現れた（図２２）。研究された３群の間で、有意差は見られなかった。
【０１７２】
１回の騒音（１１０ｄＢで、２時間にわたる、８〜１６ｋＨｚの騒音）は、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの高周波数におけるシナプスのうちの、３０％〜４０％の喪失を引き起こした。損傷の２４時間後から始まるＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、損傷を好転させた。シナプスとは、感覚有毛細胞により解読された音情報を、脳へと受け渡す「コネクター」である（図２３の赤色および緑色の点を参照されたい）。シナプスの喪失は、騒がしい環境における発話の理解の困難、加齢関連難聴、耳鳴り（耳内で音が鳴ること）などを引き起こすことが示唆されている。
【０１７３】
図３４に示される通り、曝露の２週間後、ＳＰＬを８０ｄＢとするときの、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）の波Ｉの振幅および波Ｖ／Ｉの振幅比は、騒音前ベースラインの非処置群と比較して、著明に減少した。これと比較して、ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置群では、ＡＢＲの波Ｉの振幅および波Ｖ／Ｉの振幅比は、変化しなかった。ＡＢＲの波Ｖの振幅は、処置群または非処置群で変化しなかった。ＡＢＲ試験は、音に応答する聴覚神経反応を、客観的に測定し、聴力のための、内耳（蝸牛）および脳経路についての情報を与える。ＡＢＲ試験は一般に、臨床および研究のいずれにおいても使用される。ＡＢＲの波Ｉは、末梢または聴覚神経の遠位部分において発生すると考えられる。ＡＢＲの波Ｉは、脳幹の外側毛帯および下丘において発生すると考えられる。非処置群では、波Ｉの振幅が減少したことから、シナプスの喪失に起因する、内耳からの聴覚入力の低減が指し示されるので、これを補償しようと、脳幹において、波Ｖの振幅および波Ｖ／Ｉの振幅比が増大したことから、中枢神経系における神経活動の増大が指し示されるが、これは、耳鳴り（耳内で音が鳴ること）を引き起こすことが示唆されている。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置により、波Ｉの振幅が回復したことは、シナプス喪失の回復と符合し（図３４を参照されたい）、このため、波Ｖは、変化しなかった。本発明者らの結果は、ＨＰＮ−７／ＮＡＣが、騒音により引き起こされた聴力機能不全を回復させることが可能であり、ＡＢＲ波振幅を使用して、シナプスの喪失および薬による処置効果をモニタリングしうることを示す。
【０１７４】
まとめると、本発明者らの結果は、ＨＰＮ−０７が、内耳内の失われたリボンシナプスを再生する、安全な薬理学的手段を表し、蝸牛シナプトパチー、および騒がしい環境における発話の理解の困難、老人性関連難聴、聴覚過敏、および耳鳴りなど、その関連する一般的な臨床症状を処置するための、有望で非侵襲的な代替法をもたらすことを示す。
【実施例４】
【０１７５】
確立された難聴／慢性難聴
図２８に示される通りに、確立された難聴についてのパイロット研究をデザインした。オープンフィールドの爆音傷害により、恒久的な閾値シフトを確立した。損傷の４週間後に、毎日２回、３００ｍｇ／ｋｇで、１４日間にわたり投与される、ＨＰＮ−０７＋ＮＡＣによる処置を開始した。図２８は、損傷の１４週間後（処置の８週間後）における、処置前と対比した、ＡＢＲ閾値の改善をさらに示す。
【０１７６】
図２９に示される通り、ＮＨＰＮ−１０１０処置（ＨＰＮ−０７＋ＮＡＣ）は、確立された慢性難聴モデルにおいて、ＩＨＣリボンシナプス数を回復させた。ＮＨＰＮ−１０１０処置は、損傷の４週間後に開始し、１４日間にわたり、毎日投与した。損傷の８週間後に、リボンシナプスカウントは、有意に回復した。
【０１７７】
図３０に示される通り、ＮＨＰＮ−１０１０処置は、確立された慢性難聴モデルにおいて、ＡＢＲの波Ｉの振幅の回復を結果としてもたらした。プラセボ群における、８０および７０ｄＢの両方のＳＰＬの、４ｋＨｚおよび８ｋＨｚの刺激に応答する振幅は、爆音への曝露により低減され、時間の経過と共に減少した。８０ｄＢのＳＰＬの、８ｋＨｚの刺激に応答する振幅の低減は、ＮＨＰＮ−１０１０処置の８週間後に、処置前のレベルへと、完全に回復した。
【０１７８】
さらに、図３１に示される通り、リボンシナプスは、１６、３２、４８ｋＨｚの爆音の後で低減され、ＮＨＰＮ−１０１０処置（ＨＰＮ−０７＋ＮＡＣ）により、保存／回復される。加えて、図３２にまとめられる通り、ＮＨＰＮ−１０１０処置（ＨＰＮ−０７＋ＮＡＣ）は、一次求心性聴覚ニューロンが低減される、逆行性神経変性に対する、爆音の影響を改善しうる。
【実施例５】
【０１７９】
耳鳴りバイオマーカー
爆音（Ｂ）群には、１回のショックチューブ爆音（１０ｐｓｉ）を施した。爆音／処置（Ｂ／Ｔ）群には、合計５回のＨＰＮ−０７／ＮＡＣ投与をさらに施した。組織は、爆音への曝露の８〜９週間後に回収した。各実験群（時点１つ当たりのラット６〜８匹）内動物を安楽死させ、生理食塩液に続き、０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中に４％のパラホルムアルデヒドで心内還流した。蝸牛、脳、および脳幹を摘出し、同じ固定剤中で（蝸牛については、一晩にわたり、脳組織については、１週間にわたり）後固定した。固定された蝸牛を、ＰＢＳで洗浄し、次いで、１０％のＥＤＴＡ中で、各週２回ずつ溶液を交換しながら、２週間にわたり脱灰した。蝸牛を乾燥させ、パラフィン内に包埋し、蝸牛軸を含む面内、６μｍの厚さで切片化し、１０番目ごとの切片を、スライド上にマウントした（蝸牛１つ当たり、合計１０枚のスライド）。次いで、マウントされた切片を、免疫組織化学解析のために加工した。各動物に由来する脳および脳幹は、ＰＢＳ中に３０％のスクロース中、４℃で、組織が、容器の底部へと沈殿するまで凍結防止処理し、このとき、組織を、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）内に包埋し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｒｙｏｔｏｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により、１８〜２０μｍごとに継起的に、冠状面内で切片化した。各脳および脳幹に由来する、切片１０個ごとに、そのうちの１個を、ゼラチンであらかじめコーティングされたスライドへとマウントした（各脳幹について、合計１０枚のスライドであり、各脳について、合計２０枚のスライドである）。次いで、これらの切片を、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中に１％のウシ血清アルブミンと、１％の正常ウマ血清または１％の正常ヤギ血清とによりブロッキングし、ＰＢＳ中に０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳ／Ｔ）中で透過処理した。次いで、ブロッキングされ、透過処理された切片を、一次抗体と共に、室温で、一晩にわたりインキュベートした。ＰＢＳ／Ｔによる洗浄の後で、ビオチニル化二次抗体（１：２００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を、スライドへと、室温で、１時間にわたり適用し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  ａｎｄ  ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を、免疫標識の視覚化のために使用した。画像は、バイオマーカー定量化のために、ＢＸ５１  Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡により収集した。蛍光免疫標識化のために、切片を、適切なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）二次抗体（１：１０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏ．、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）と共に、室温で、２時間にわたりインキュベートするのに続き、ＤＡＰＩ標識化を行い、抗褪色剤培地中にマウントした。画像は、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−７１０共焦点顕微鏡により収集した。
【０１８０】
Ａｒｇ３．１としてもまた公知の活性調節型細胞骨格関連タンパク質（ＡＲＣ）は、可塑性タンパク質である。中枢聴覚系におけるＡＲＣの減少は、耳鳴りと関連する。図３５は、中枢聴覚系における、ＡＲＣについての免疫染色を示す。爆音への曝露は、ＡＣ内、ＩＣ内、およびＤＣＮ内のＡＲＣを下方調節した。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、ＡＣ内、ＩＣ内、およびＤＣＮ内のＡＲＣの発現を、処置を伴わない爆音群と比較して正常化した。
【０１８１】
成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ−４３）は、軸索の成長円錐に位置する、膜関連リンタンパク質である。ＧＡＰ−４３は、軸索の成長、シナプス形成、およびシナプスのリモデリングについてのマーカーである。図３６は、中枢聴覚系における、ＧＡＰ−４３についての免疫染色およびウェスタンブロットを示す。爆音への曝露は、ＡＣ内、ＩＣ内、およびＤＣＮ内のＧＡＰ−４３を上方調節した。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、ＡＣ内、ＩＣ内、およびＤＣＮ内のＧＡＰ−４３の発現を、処置を伴わない爆音群と比較して正常化した。
【０１８２】
ＧＡＢＡＡ受容体は、イオンチャネル型受容体であり、リガンド開口型イオンチャネルである。その内因性リガンドは、中枢神経系における主要な阻害性神経伝達物質であるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である。図３７は、ＤＣＮ内の、ＧＡＢＡＡ受容体α１（ＧＡＢＡＡ  Ｒα１）についての免疫染色を示す。図３８は、ＤＣＮ内の、ＧＡＢＡＡ  Ｒα１（赤）およびＧＡＤ６７（緑）についての共標識化を示す。ＧＡＤ６７が、阻害性ニューロンについてのバイオマーカーであることから、ＧＡＢＡＡ  Ｒα１陽性細胞は、阻害性ニューロンことが指し示される。
【０１８３】
グルタミン酸受容体２（ＧｌｕＲ２）は、中枢神経系における興奮性神経伝達物質である、ＡＭＰＡのイオンチャネル型受容体である。グルタミン酸受容体の過剰刺激は、興奮毒性を介して、神経変性およびニューロンの損傷を引き起こす。図３９は、ＤＣＮ内の、ＧｌｕＲ２についての免疫染色を示す。
【０１８４】
爆音への曝露は、ＤＣＮ内のＧＡＢＡＡ受容体およびグルタミン酸受容体の両方の発現を上方調節したことから、ＤＣＮ内の阻害および興奮の再組織化が指し示される。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、ＤＣＮ内のＧＡＢＡＡ受容体およびグルタミン酸受容体の発現を、処置を伴わない爆音群と比較して正常化し、ＤＣＮ内の阻害と興奮との平衡を回復した。
【０１８５】
カプサイシン受容体およびバニロイド受容体１としてもまた公知の、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（ＴＲＰＶ１）は、高温の酸性条件、カプサイシン、および刺激性化合物により活性化する。ＳＧ内の、ＴＲＰＶ１の上方調節は、耳鳴りと関連する。図４０は、ＳＧ内の、ＴＲＰＶ１の免疫染色を示す。爆音への曝露は、ＳＧ内の、ＴＲＰＶ１を上方調節した。ＨＰＮ−０７／ＮＡＣ処置は、ＳＧ内のＴＲＰＶ１を、処置を伴わない爆音群と比較して正常化した。
【０１８６】
そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、本明細書で使用される単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」とは、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、ある化合物に対する言及は、複数の化合物を含みうる。
【０１８７】
本明細書で使用される「実質的に」、「実質的な」、および「約」という用語は、小さな変動について記載し、説明するのに使用される。事象または状況と共に使用される場合、用語は、事象または状況が、正確に生じる場合のほか、事象または状況が、近似的に生じる場合を指す場合もある。例えば、用語は、±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％以下、または±０．０５％以下など、±１０％以下を指す場合がある。
【０１８８】
加えて、本明細書では、場合によって、量、比、および他の数値は、範囲フォーマットで提示される。このような範囲フォーマットは、簡便さおよび簡略さのために使用されるものであり、範囲の限界として、明示的に指定された数値を含むが、また、各数値および部分範囲が、明示的に指定された場合と同様に、この範囲内に包含される、全ての個々の数値または部分範囲も含むように、柔軟に理解すべきであることを理解されたい。例えば、約１〜約２００の範囲内の比は、明示的に列挙された、約１および約２００の限界値を含むが、また、約２、約３、および約４などの個々の比、ならびに約１０〜約５０、約２０〜約１００などの部分範囲も含むように理解すべきである。
【０１８９】
前出の記載で、当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱しない限りにおいて、本明細書で開示される本発明に対して、様々な代用および改変を施しうることがたやすく明らかであろう。本明細書で例示的に記載される本発明は、本明細書で具体的には開示されていない、任意の、１または複数の要素、１または複数の限定の非存在下で実施しうると適切である。用いられた用語および表現は、記載の用語として使用されるものであり、限定の用語として使用されるものではなく、このような用語および表現の使用においては、示される特徴、記載される特徴、またはこれらの部分のいかなる均等物を除外する意図も存在せず、本発明の範囲内では、多様な改変が可能であることが認識されている。したがって、本発明を、特殊な実施形態および任意選択の特徴により例示してきたが、当業者は、本明細書で開示される概念の改変および／または変動を採用することができ、このような改変および変動が、本発明の範囲内にあると考えられることを理解されたい。
【０１９０】
均等物
本開示について、上記の実施形態と共に記載してきたが、前出の記載および例は、本開示の範囲を例示することを意図するものであり、これを限定することを意図するものではないことを理解されたい。本開示が関する技術分野の当業者には、本開示の範囲内の、他の態様、利点、および改変も明らかであろう。
【０１９１】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【０１９２】
本明細書で例示的に記載される実施形態は、本明細書で具体的には開示されていない、任意の、１または複数の要素、１または複数の限定の非存在下で実施しうると適切である。したがって、例えば、「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「〜を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含有すること」などの用語は、限定を伴わずに、包括的に読むべきである。加えて、本明細書で用いられる用語および表現は、記載の用語として使用されるものであり、限定の用語として使用されるものではなく、このような用語および表現の使用においては、示される特徴、および記載される特徴、またはこれらの部分のいかなる均等物を除外する意図も存在せず、本開示の範囲内では、多様な改変が可能であることが認識されている。
【０１９３】
したがって、本開示について、特殊な実施形態および任意選択の特徴により、具体的に開示してきたが、当業者は、本明細書で開示される、その中の実施形態の改変、改善、および変動を採用することができ、このような改変、改善、および変動は、本開示の範囲内にあると考えられることを理解されたい。本明細書で提示される、材料、方法、および例は、特定の実施形態を表し、例示的なものであり、本開示の範囲に対する限定として意図されるものではない。
【０１９４】
本明細書では、本開示の範囲について、広範に、かつ、一般的に記載してきた。一般的な開示内に収まる、より狭い種および亜属の群分けの各々もまた、本開示の一部を形成する。これは、除外される材料が、本明細書で、具体的に列挙されるのかどうかにかかわらず、条件付きであるか、または任意の対象物を属から除外する、否定的な限定を伴う、一般的な記載を含む。
【０１９５】
加えて、本開示の特徴または態様を、マーカッシュ群との関係で記載する場合、当業者は、これにより、本開示の実施形態はまた、マーカッシュ群の個々のメンバーまたはメンバーの亜群との関係でも記載されうることを認識するであろう。
【０１９６】
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各々が、参照により個別に組み込まれた場合と同じ程度に、参照によりそれらの全体において、明示的に組み込まれる。齟齬の場合は、定義を含む本明細書により管理する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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