(57)【要約】  本発明は、テトラピロール共役化合物の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）における造影剤としての使用に関する。とくに、ゲルおよびインプラントに埋め込むことができ、ＭＲＩにおける局所送達を画像化するための天然ヘミンの共役体。
2019529449.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
2019529449.tif 000007
式中、
Ｍは、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｏからなり、
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ピリジン、ピラゾール、イミダゾール、ヒスチジン、イソチオシアナート、アセトニトリル、メタノールからなり、
ここで、式（２）
【化２】
2019529449.tif 000008
のリンカーが、テトラピロールと、少なくとも部分的に水溶性である化合物Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つとの間に位置付けられ、
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＨｉｓＧＬｙＯＭｅ、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリビニルラクタム、ＰＧＬＡ、ポリアクリル酸、ＰＶＰ、ヒアルロン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン、ＰＥＧ、ポリエーテルアミン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびそれらの塩、溶媒和物およびこれらの塩の溶媒和物からなる、
で表されるテトラピロール共役化合物。
【請求項２】
テトラピロールと少なくとも部分的に水溶性である化合物との間のリンカーが、エチレンジアミン、アミノエタノール、エチレングリコール、メルカプトエタノール、エタンジチオールを含む、請求項１に記載のテトラピロール共役化合物。
【請求項３】
式（３）
【化３】
2019529449.tif 000009
式中、
Ｒ１、Ｒ２は、ＯＨ、ＨｉｓＧｌｙＯＭｅ、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリビニルラクタム、ＰＧＬＡ、ポリアクリル酸、ＰＶＰ、ヒアルロン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジンおよびＰＥＧ、ポリエーテルアミン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびそれらの塩、溶媒和物およびこれらの塩の溶媒和物を含む、
で表される、請求項１または２に記載のテトラピロール共役化合物。
【請求項４】
式（４）
【化４】
2019529449.tif 000010
式中、ｎ＝１〜２０である、
で表される、請求項１に記載のテトラピロール共役化合物。
【請求項５】
１分子内に、少なくとも１つのテトラピロール化合物、少なくとも部分的に水溶性である化合物およびそれらの塩、溶媒和物およびこれらの塩の溶媒和物を含むテトラピロール共役化合物を製造する方法であって、
式（１）
【化５】
2019529449.tif 000011
式中、
Ｍは、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｏからなり、
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ピリジン、ピラゾール、イミダゾール、ヒスチジン、イソチオシアナート、アセトニトリル、メタノールからなり、
ここで、テトラピロールと水溶性である化合物との間のリンカーがカルボジイミドからなり、
Ｒ１、Ｒ２は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＨｉｓＧＬｙＯＭｅ、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリビニルラクタム、ＰＧＬＡ、ポリアクリル酸、ＰＶＰ、ヒアルロン酸、アルギニン、リシンおよびＰＥＧ、ポリエーテルアミン、ポリリシン、ポリアルギニンおよびそれらの塩、溶媒和物およびこれらの塩の溶媒和物からなる、
で表されるテトラピロール共役化合物、
ここで、テトラピロール化合物を有機溶媒に溶解し、少なくとも部分的に水溶性である化合物とのカップリングを、アセトン、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡｃ、アセトニトリル、または、アセトン、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡｃ、アセトニトリルの混合物において行うことを特徴とする、前記方法。
【請求項６】
テトラピロールと水溶性である化合物との間のリンカーが、
１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、
１-シクロヘキシル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＣＤＣ）、
１-イソプロピル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＩＤＣ）、
１-シクロヘキシル-３-（２-モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）
からなる群から選択される、請求項５に記載のテトラピロール共役化合物を製造する方法。
【請求項７】
反応を、テトラピロール化合物に対するリンカー化合物の量が水溶液に基づくあるレベルにおいて一定である量で行う、請求項５または６に記載のテトラピロール共役化合物を製造する方法。
【請求項８】
反応を、テトラピロール化合物に対する水溶性である化合物の量が水溶液に基づくあるレベルにおいて一定である量で行う、請求項５〜７のいずれか一項に記載のテトラピロール共役化合物を製造する方法。
【請求項９】
テトラピロール共役体を極性のプロトン性キャリア液に溶解する、請求項５〜８のいずれか一項に記載のテトラピロール共役化合物を製造する方法。
【請求項１０】
極性のプロトン性キャリア液が、ＰＥＧ、ＰＧＬＡまたは誘導体である、請求項９に記載のテトラピロール共役化合物を製造する方法。
【請求項１１】
リンカーが、テトラピロール共役化合物と少なくとも部分的に水溶性である化合物の少なくとも１つとの間に位置付けられる、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のテトラピロール共役化合物を製造する方法。
【請求項１２】
１分子内に、少なくとも１つのテトラピロール化合物、少なくとも部分的に水溶性である化合物およびそれらの塩、溶媒和物およびこれらの塩の溶媒和物の少なくとも１つを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のテトラピロール共役化合物の、ＭＲＩ用における造影剤としての使用。
【請求項１３】
テトラピロール化合物が、ＭＲＩ用のインプラントグラフト、とくに、ステント、ガイドワイヤーまたはカテーテル内に、少なくとも部分的に位置付けられている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のテトラピロール共役化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１分子内に、少なくとも１つのテトラピロール化合物、少なくとも部分的に水溶性である化合物およびそれらの塩、溶媒和物およびこれらの塩の溶媒和物を含むテトラピロール共役化合物、かかる共役体を製造する方法および使用に関する。
【０００２】
体内の構造または流体の視認性を高める医療用画像化において用いられる物質である造影媒体のグローバル市場は、コンサルタント事務所GlobalData.によると、２０１５年の４３億ドル強から２０２２年までに６０億ドル超へと上昇すると予測されており、年平均成長率は４．９％である。米国、フランス、ドイツ、イタリア、スペイン、英国、日本、ブラジル、中国およびインドの１０の主要市場（major markets）（１０ＭＭ）で生じるだろうこの成長は、年間のコンピューター断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）および心エコー検査の手法の数の増加、ならびに、１０ＭＭ全体での疾病負担の増加などのいくつかの要因によって推進されるとするべきである。 
【０００３】
種々の臨床的適応症のために、世界中で毎年２，０００，０００を超える磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の手法が実施されている。治療における電離放射線の使用の重要性が増していること、および、低侵襲治療への関心が高まっていることの観点から、磁気共鳴断層撮影法が１９９５年頃から放射線学の分野で徐々に定着してきたことは驚くことではない。磁気共鳴断層撮影法はもともと診断画像用に開発されたものであるが、現在では低侵襲的治療的介入を実行および評価するためのツールとして用いられている。比較的新しい使用分野は、術中および血管内ＭＲＩ手法などの領域に関する。低侵襲的血管内手法は、患者の治療においてますます重要な役割を果たす。多くの理由で、放射線学的手法は、外科的介入および対応する治療に対する魅力的な代替法である。その観点において、造影剤は、ＭＲＩ画像を構築するのを助けるので、日々の医療手法において重要な役割を果たす。現在、用いられる造影剤は、主にＴ１を減少させることによるMagnavist（登録商標）などの低分子量ガドリニウム錯体、または、Ｔ２またはＴ２ ＊を減少させることによるCombidex（登録商標）などのコロイド状鉄錯体である。（感受性）。
【０００４】
ガドリニウムはそれ自体で有毒であり得る。造影剤に用いられる場合、ガドリニウムは、体内のガドリニウムの分布をコントロールするキレート剤と呼ばれる分子と結合する。ガドリニウムに関する安全性の懸念は、２００６年に噴出し、ＧＢＣＡの使用が腎性全身性線維症（ＮＳＦ）の発症と、時々致死的な状態と関連していた。最近の研究では、ガドリニウムの安全性、特に造影を受けた個人の脳に元素残留の痕跡が残っているかどうかについて、新たな懸念を引き起こしている。最近の病院ベースの症例−対照の研究において、カンダおよび共同研究者は、施設で２０１０年〜２０１３年の間に剖検が行われた１９０人の対象のプールから始めた。対象のプールは、いくつかのグループに分けられた：１つのグループは、ガドリニウム造影を２回以上与えられた５人のランダムに選択された患者を含む（ＧＢＣＡグループ）。これらの対象は、ガドペンテテートジメグルミン（Magnevist（登録商標）、Bracco Imaging）、ガドジアミド（Omniscan（登録商標）、GE Healthcare）；またはガドテリドール（ProHance（登録商標）、Bracco）を受けた。彼らは、各検査につき体重１ｋｇ当たり０．１ｍｍｏｌの用量を受けた。この試験には、対照グループとして、一度も造影物質を受けたことのない５人も含まれた（非ＧＢＣＡグループ）。
【０００５】
どちらのグループも重度の腎機能障害または急性腎不全の病歴を有する対象はいなかった。研究者らは、歯状核や淡蒼球を含む脳組織におけるガドリニウムの蓄積を評価するために、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いた。歯状核と淡蒼球の両方が、身体の随意運動をコントロールする。分析すると、研究者らは、ＧＢＣＡグループの５人全員からの標本中に微量のガドリニウム（脳組織１ｇ当たり平均０．２５μｇ）が、ガドリニウム造影を使用したことのない人と比較して、各領域で有意に高い濃度であることを見出した。さらに、ＧＢＣＡグループでは、歯状核および淡蒼球が、脳の他の領域よりも有意に高いガドリニウム濃度を示した。最も注目すべきことに、ガドリニウム蓄積の存在は、重度の腎機能障害の病歴のない対象において発見された。これらの知見は、ガドリニウム由来Ｔ１造影剤の安全性についての議論に加わるであろう。Ｔ２造影剤も徐々に市場から消えつつある。したがって、Ｔ１、Ｔ２または両方のタイプの画像化において用いることができる新しい非毒性の造影剤に対する大きな要求がある。
【０００６】
ゆえに、それにより画像化の結果はＧｄ造影剤を用いるものと匹敵するような非毒性のＭＲＩ造影剤を達成することが研究の目的である。
【０００７】
ヘミンは天然のＦｅ３＋含有赤血球色素であり、純粋な物質として種々の会社から商業的に入手可能である。３ｄ軌道電子の配置によるＭＲＩ測定に特に適している。ヘミン中の鉄のＦｅ３＋イオンは、高スピン状態にあり、これは不対電子軌道が存在することを意味し、これは両方のスピン−スピン相互作用がより起こりやすいことを意味する。塩素、イソチオシアナートおよびイミダゾール環などの弱い配位子を使用すると、高スピン状態がシフトすることが知られている。例えば、ニトロイミダゾール支持ポルフィリン錯体は、ミサイル療法について特許請求されており、ここでＭＲＩの可視性と放射線療法とを組み合わ得る（EP 114 8057）。他の特許は、天然および新規ポルフィリン中にマンガン（Ｍｎ）などの他の金属イオンを組み込んで、ある種のキレートが１．５テスラを超える高い緩和度（relaxivity）を有することを示し（US 20 060 137 74）、診断および治療目的に用いることができる。
【０００８】
しかしながら、ヘミンは、生理学的条件において実質的に不溶であり、肝臓の適用によって直ちに捕らえられるだろう。タンパク質結合ヘミン共役体を介してのみＭＲ造影剤として有用であり得るものを作製することができる。この主題において、EP 0470 086 B1は、例えばＬ−アルギニンなどの塩基性アミノ酸を有する水溶性化合物の合成を記載している。得られた化合物は、種々のタイプの貧血症およびポルフィリズムの治療について特許請求されている。ヘミン−タンパク質共役体は、造影剤としてのＭＲＩでの使用が特許請求されているが、特に、外来タンパク質としての免疫系による認識を防ぐためにアルブミンなどのタンパク質を使用し（(DE 100 06 570）、細胞内蓄積を促進して、腫瘍および炎症部位の画像化を可能にする。
【０００９】
Suree M Spaltro et al. “synthesis and characterization of conjugates of poly (amino acids) and manganese (III) IX as relaxation enhancement agents for mri”、Journal of applied polymer science、１９９０年１月１日などのさらなる最先端技術には、Ｍｎ含有ポルフィリンとポリリジンまたはポリグルタミン酸との付加物が開示され、ここで反応はＤＭＦと水との混合物中で行われる。
【００１０】
Raffaella Roncone et al. “catalytic activity, stability, unfolding an degradation pathways of properties and reactivity of myoglobin reconstituted with chemically modified protohemin complexes”、Biochemistry, vol.39, no.31、２０００年８月１日、１１〜２４頁などの他の開示には、ＤＭＦ中でのプロトヘミンクロリドとヒスタミンメチルエステルとの反応が記載されている。
【００１１】
Enrico Monzani et al. “Properties and reactivity of myoglobin reconstituted with chemically modified protohemin complexes”、Biochemistry, vol.39, no.31、２０００年８月１日、９５７１〜９５８２頁。
【００１２】
RU 2238950 C2には、ＤＭＦ中でのプロトヘミンクロリドとＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ａｌａ−Ｏ−ｔＢｕとの反応が記載されている。
【００１３】
WO 2014/144633 A1において、置換基が、アミノ酸、ペプチドまたはその誘導体であることができ、中心イオンがＦｅであることができ、その配位子の一つが塩化物であるヘミンの誘導体が開示されている。
【００１４】
かかる特許の欠点は、それらのほとんどがナノ粒子を使用していることであり、それはいくつかの場合には血流中に入り込む可能性があり、有意な毒物学的懸念を有する。特定のバイオ医学のための注射可能なＭＲＩ造影剤としてのヘミン誘導体の使用を開示する上記の例に基づき、同様に、ナノ粒子に関連する全ての問題を克服するために、本発明の目的は、ヘミンまたはヘミン誘導体をＭＲで高品質の視覚化を可能にする造影剤として利用可能にすることである。本発明の文脈において、ＭＲＩ造影剤は、鉄含有テトラピロールとしてのヘミンに基づく。より具体的には、それは塩化物配位子と共に第二鉄イオン（ヘムｂ）を含有するプロトポルフィリンＩＸであり、酸素運搬ヘモグロビンの分解生成物である。
【００１５】
ゆえに、本発明によって解決すべき課題は、インプラント、キャリアゲル、および、造影剤としてさえ画像化するために用いることができる、良好な画像結果を有する無毒性の造影剤として、ヘミン様テトラピロール共役体を見出すことである。
【００１６】
本課題の解決は、独立請求項１および５の処方によって与えられる。本発明の文脈において、状態は好ましくは、Ｆｅ ＩＩ／Ｆｅ ＩＩＩテトラピロール共役体造影剤が、生体適合性である。特に、化合物は、Ｆｅ ＩＩ／ ＦｅＩＩＩテトラピロール造影剤が、ポルフィリンであることを特徴とすることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、異なる濃度のヘミン誘導体で２４時間インキュベーションした後のＨＣＴ１１６細胞の全細胞数（死／生（dead/alive））示す。
【図２】図２（上のパネル）は、異なる濃度のヘミン誘導体で２４時間インキュベートしたＨＣＴ１１６細胞のインキュベーションでの初期アポトーシス細胞の量を示す。
【図３】図３は、ＨＬを有する／有しないコラーゲン骨格のＭＲ画像を示す。
【００１８】
本発明の特定の態様は、補因子がヘムタンパク質（すなわち、ヘムａ、ヘムｂ、ヘムｃおよびヘムｏ）の誘導体であることを特徴とする。
【００１９】
本発明の特定の態様は、Ｆｅ ＩＩ／Ｆｅ ＩＩＩテトラピロール造影剤が、水溶性ポリマーと共役しているか、または、ＡＲＧ、ＬＹＳなどの塩基性アミノ酸で処理されていることを特徴とする。
【００２０】
本発明の特定の態様は、Ｆｅ ＩＩ／Ｆｅ ＩＩＩテトラピロールまたはポルフィリン共役体造影剤が、例えば、ポリアクリレート、コラーゲン、ヒドロゲル、ポリビニルラクタム、ＰＥＧ、ＰＧＬＡ、ポリアクリル酸、ＰＶＰ、多価ポリマーおよびコポリマーならびにこれらの成分の混合物に官能化または共有結合していることを特徴とする。
【００２１】
本発明の特定の態様は、Ｆｅ ＩＩ／Ｆｅ ＩＩＩテトラピロールまたはポルフィリン共役造影剤が、テトラピロールまたはポルフィリン環とポリマー鎖との間にスペーサーを含むことを特徴とする。
【００２２】
本発明の特定の態様は、複数のＦｅ ＩＩ／Ｆｅ ＩＩＩテトラピロールまたはポルフィリン共役造影剤をポリマー鎖に結合させることができることを特徴とする。
【００２３】
本発明の特定の態様は、Ｆｅ ＩＩ／Ｆｅ ＩＩＩテトラピロールまたはポルフィリン共役造影剤が、水素原子を交換することができる極性キャリア液またはヒドロゲルに溶解されることを特徴とする。
【００２４】
本発明による好ましいＦｅ ＩＩ／Ｆｅ ＩＩＩテトラピロールまたはポルフィリン共役造影剤は、Ｆｅ ＩＩ／Ｆｅ ＩＩＩテトラピロールまたはポルフィリン共役造影剤が、部分的に可溶化され、キャリア液中に懸濁されることを特徴とする。
【００２５】
例：
例１
ヘミンのようなテトラピロール化合物のＰＥＧ化（PEGylation）反応の例を、次のインストラクションにおいて記載する。ヘミン（２９ｍｇ、０．０４４５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．６ｍＬ）を添加する。続いて、懸濁液を０℃に冷却し、１時間撹拌したままにする。次に、クロロギ酸エチル（０．４２５ｍＬ、４．４６ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌は、別の２時間、０℃で継続した。混合物をろ過し、ろ液をエチレンジアミン（０．３ｍＬ、４．４８ｍｍｏｌ）で処理し、一晩、室温で撹拌した。混合物を真空中（in vacuo）で濃縮し、そのまま次の反応（Ｉ）に用いた。
【００２６】
【化１】
2019529449.tif 000003
【００２７】
ヘミン誘導体（３）が（１５ｍｇ、５０％）の量で得られた。ヘミン誘導体をクロロホルムに溶解し、異なる分子量のスクシンイミジルＰＥＧ（succinymidyl PEG）で処理し、透析後、所望のＰＥＧ化ヘミン誘導体（４）が得られた。
【００２８】
例２
さらなるＰＥＧ化反応の例を以下の（ＩＩ）に記載する。０．１５ｍｌのトリエチルアミンを、１００ｍｌテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中３２．６ｇヘミン（１）の懸濁液に添加し、懸濁液を０℃へ１時間冷却した。次いで、１９．２ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を、ヘミンの懸濁液に添加し、中のカルボキシル基（２）を活性化する。
【００２９】
【化２】
2019529449.tif 000004
【００３０】
アミン−ＰＥＧ化合物を反応直後に添加し、撹拌しながら、一晩室温でさらに進行させる。異なる分子量のアミン−ＰＥＧでの処理により、透析後、所望のＰＥＧ化ヘミン誘導体（３）が得られた。
【００３１】
例３
塩基としてアミノ酸で処理することによってヘミンを可溶化する方法の例を以下に記載するが、US5008388 A においてIngberg et al.によって記載されている手法と同様である。６．５２ｇの結晶性ヘミン（０．０１Ｍ）および３．４８ｇの結晶性Ｌ−アルギニン（０．０２Ｍ）を、メカニカルスターターを備え、３００ｍｌのアセトンおよび２０ｍｌの水の溶媒混合物を含むビーカーにおいて１０〜１５時間、激しく撹拌した。形成された生成物をろ別し、アセトンで洗浄し、乾燥した。ヘミンアルギナートの収量：９．５ｇ（９５％）。上記の方法によって測定した不溶性残渣：０．１４ｇ（１．４％）。
【００３２】
例４
塩基としてアミノ酸で処理することによってヘミンを可溶化する方法の例を以下に記載するが、US5008388 A においてIngberg et al.によって記載されている手法と同様である。６．５２ｇの結晶性ヘミン（０．０１Ｍ）および４．３９ｇの３０結晶性Ｌ−リシン（０．０３Ｍ）を、例２に記載のように処理した。ヘミンリシナートの収量：１０．８ｇ（９９％）。不溶性残渣：０．０２０ｇ（０．２０％）。これがヘミンアルギナートの最高収量であり、一方で不溶性残渣の量が最小であったから、ヘミン３５対アルギナートの最適なモル比は１：３であると思われる。
【００３３】
例５
ヘミン誘導体のヒドロゲルへの組み込みの例を以下に詳述する：
ヒアルロン酸ベースのヒドロゲル（１ｇ）をＰＢＳ緩衝液（２０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。続いて、ＥＤＣ（２．５ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（０．３４５ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、１５分間撹拌したままにした。アミノ化ヘミン２（９．７ｇ、１５ｍｍｏｌ）を添加し、反応を室温で２４時間継続した。透析（ＭＣＯＷ ２ｋ）後、生成物を得て、ＵＶ−ＶＩＳで確認した。
【００３４】
例６
前記したゲルマトリックスを備えた／備えていないヘミン複合構造（hemin complex structure）の誘導体は、ＭＲ画像法用のＣＥＳＴまたは化学交換飽和移動剤として用いられている。異なるカップリング比内のヒアルロン酸ゲルとの複合ヘミン誘導体は、新規のＭＲＩインビトロコントラストをもたらし、処方物を、部位での対象における細胞生存能（cell viability）を提示する造影剤の存在を検出するために、ＭＲＩを介する画像化用に異なる細胞株に適用されており、それにより、例えば、線維芽細胞、平滑筋細胞などの対象における細胞活性化を提示する造影剤が可視化される。
【００３５】
毒性試験（インビトロ）
ヘミン水溶性誘導体（アルギナート−ＨＡ、リシナート−ＨＡ）およびＰＥＧ化ヘミン（ＨＰ）を、２５０ｕｇ／ｍｌまでの濃度、２４時間までのインキュベーションで、ＨＣＴ１１６細胞株において試験した。この濃度は、Omniscanなどの環状Ｇｄ−コントラストの一般的な用量である患者への１ｍｍｏｌ／ｋｇの注射後の最大血漿濃度であるため選択した。
【００３６】
図１において、異なる濃度のヘミン誘導体で２４時間インキュベーションした後のＨＣＴ１１６細胞の全細胞数（死／生（dead/alive））を示す。シスプラチン（ＣＤＤＰ）を５０μｍｏｌ／Ｌの濃度で、陽性対照として用いた。
【００３７】
図２において、上のパネルは、異なる濃度のヘミン誘導体で２４時間インキュベートしたＨＣＴ１１６細胞のインキュベーションでの初期アポトーシス細胞の量を示す。ＣＤＤＰを５０μｍｏｌ／Ｌの濃度で、陽性対照として用いた。下のパネルは、核凝縮（有意なアポトーシス）を有する、および膜損傷を有する細胞の量を示す。
【００３８】
骨格画像化（Scaffold imaging）
取り扱いが容易であるため、０．２５Ｍ酢酸溶液中、０．５％（ｗ／ｖ）コラーゲンのセットを選択した。１．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液中、ヘミンリシナート（ＨＬ）溶液に、１．５ｍｌのコラーゲン溶液を０．１ｍＭ〜１ｍＭ  ＨＬの終濃度で混合し、室温で一晩中混合した。最終組成物に２つの異なる相が生じ、サンプルの均質性は十分ではなかった。試験を中断した。
【００３９】
実験の第２のセットにおいて、コイル支持体のない０．５％（ｗ／ｖ）コラーゲンのチューブ状骨格を選択した。凍結乾燥の手法の後、チューブ状形状が達成された。終濃度０．１ｍＭ〜１ｍＭ  ＨＬである１．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液中ＨＬ溶液にチューブ状コラーゲン骨格の１．５ｃｍを導入し、室温で混合した。ＨＬの導入直後、骨格が縮み始め、３Ｄ構造が失われた。試験を中断した。
【００４０】
第３の試験セットのために、コイル支持体を有する０．５％（ｗ／ｖ）コラーゲンのチューブ状骨格を選択した。架橋の手法を完了させ、末端構造はＰＢＳ緩衝液中で安定であって、使用前に３０分間予め湿らせた。チューブ状コラーゲン骨格の１．５ｃｍを、終濃度０．１ｍＭ〜１ｍＭ  ＨＬである１．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液中ＨＬ溶液に導入し、室温で一晩混合した。上清の溶液を各サンプルから収集し、ＨＬの非積分濃度を決定し、ＨＬ−Ｄａｙ０溶液として標識した。続いて、１．５ｍｌのＰＢＳでの洗浄手法を、次の１２時間および２４時間、ＰＢＳ溶液中で行った。各サンプルから洗浄液を収集し、ＨＬ−Ｄａｙ１およびＨＬ−Ｄａｙ２と標識した。
【００４１】
第４の試験セットについては、コイルを有するヘミンアルギナート（ＨＡ）および０．５％（ｗ／ｖ）コラーゲンのチューブ状骨格を用いて、第３のセットについて記載された手法を続けた。架橋されたチューブ状骨格の１．５ｃｍを、終濃度０．１ｍＭ〜１ｍＭ  ＨＡである１．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液中ＨＡ溶液に導入し、室温で一晩混合した。上清の溶液を各サンプルから収集し、ＨＡの非積分濃度を決定し、ＨＡ−Ｄａｙ０溶液として標識した。続いて、１．５ｍｌのＰＢＳでの洗浄手法を、次の１２時間および２４時間、ＰＢＳ溶液中で行った。各サンプルから洗浄液を収集し、ＨＡ−Ｄａｙ１およびＨＡ−Ｄａｙ２と標識した。
【００４２】
第５の研究セットについては、サンプルの利用可能性のために、コイルを有するヘミン−ＰＥＧ（ＨＰＥＧ）および０．７％（ｗ／ｖ）コラーゲンのチューブ状骨格を用いて、第３のセットについて記載された手法を続けた。ＨＰＥＧサンプルは、１ＫＤａ、５ＫＤａおよび１０ＫＤａの異なるＰＥＧ長で変化した。１．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液中の架橋したチューブ状コラーゲン骨格を１．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液中の３つのＨＰＥＧ溶液に、それぞれのＨＰＥＧストック溶液の最大有効濃度で導入し、室温で一晩混合した。上清の溶液を各サンプルから収集し、ＨＰＥＧの非積分濃度を決定し、ＨＰＥＧ−Ｄａｙ０溶液として標識した。続いて、１．５ｍｌのＰＢＳでの洗浄手法を、次の１２時間および２４時間、ＰＢＳ溶液中で行った。各サンプルから洗浄液を収集し、ＨＰＥＧ−Ｄａｙ１およびＨＰＥＧ−Ｄａｙ２と標識した。
【００４３】
化学的相互作用：第６の試験セットについては、ヘミンリシナート（ＨＬ）を選択し、ＨＬのカルボキシル基の活性化を、ＭＥＳ溶液中のＥＤＣ／ＮＨＳカップリングを介して行い（表１）、夫々を３．３ｍＭ  ＥＤＣの含量の３ｍｌのＥＤＣ／ＮＨＳ溶液＊に溶解した。（＊比率ＥＤＣ：ＮＨＳは、０．５：２として５％（ｗ／ｖ）コラーゲンのチューブ状骨格での以前の試験から得られ、これは、２５ｍｌのＭＥＳ緩衝液について１５．６２５ｍｇのＥＤＣ対１７．２５ｍｇのＮＨＳの重量に換算された。）
【００４４】
【表１】
2019529449.tif 000005
【００４５】
その間、湿潤状態への移行のために、コイルを有する０．５（ｗ／ｖ）の架橋していないチューブ状コラーゲン骨格をＭＥＳ緩衝液中で３０分間インキュベートし、ＭＥＳ緩衝液は適用前に除いた。ＨＬのカルボキシル基の活性化の後、サンプルをコラーゲン骨格に導入し、回転しながら４時間混合し、均質な標識化を達成した。最終的なサンプルは、暗褐色で均質であった（サンプルを除いて０．２５％）。組織学のために少量のサンプルを収集した。次いで、サンプルは、ＭＲ測定のために１％アガロースで固定した。サンプルをさらに、３Ｔ臨床ＭＲＩ（Philips）および１１．７Ｔ前臨床ＭＲＩ（Bruker）で調査した。画像を図１に示し、各サンプルの緩和時間を表２に示す。各スキャンにおいて、２つの関心領域（ＲＯＩ）が選択され、複数のスライスの平均値がリストされている。ＲＯＩを骨格領域上のものとして、および、骨格を埋め込んだ対照としてアガロースのものを選んだ。
【００４６】
【表２】
2019529449.tif 000006
【００４７】
ＭＲＩ条件
磁気共鳴画像：標識化骨格の核ＭＲ弛緩は、室温でニーコイル（knee coil）（SENSE-flex-M; Philips, Best, オランダ）を用いて、臨床３Ｔ全身ＭＲスキャナー（Philips Achieva, Best, オランダ）において行った。縦（Ｔ１）緩和時間は、１０°フリップ角のリフォーカスパルスを用いたターボフィールドエコーシークエンスの２次元スキャンモードで測定した［ＴＲ＝５２ｍｓ、ＴＥ＝３〜４８ｍｓ、エコー数＝１０］。横（Ｔ２）緩和時間は、９０°励起パルスと続く等間隔の１８０°のリフォーカスパルスを伴うマルチスライス、マルチショットスピンエコーシークエンスを用いた２Ｄスキャンモードで測定した［ＴＲ＝１５００ｍｓ、ＴＥ＝８〜１６８ｍｓ、エコー数＝２０］。Ｔ２＊リラクソメトリーでは、３２エコー時間（ＴＥ範囲＝３〜９９ｍｓ）での画像を、マルチショット、マルチスライス高速フィールドグラジエントエコーシークエンスを用いることによって取得した［ＴＲ＝１９６ｍｓ、２エコー間の間隔３ｍｓ、スライスの厚さ＝２ｍｍ、３０°フリップ角］。Ｔ２およびＴ２＊緩和時間（Ｒ２およびＲ２＊）は、Imalytics Preclinical Softwareを用いて各セグメント化骨格領域に対するエコー時間（ＴＥ）の関数として指数曲線をシグナル振幅に適合させることによって計算した。指数曲線は、ノイズまたは信号減衰が遅い成分によって生成される信号プラトーと考えるためのオフセットを含む。さらに、Ｔ１およびＴ２強調画像は、Ｔ１強調ターボスピンエコー（ＴＳＥ）シークエンス［ＴＲ＝９ｍｓ、ＴＥ＝７００ｍｓ、スライスの厚さ＝２ｍｍ］、およびＴ２強調ＴＳＥシークエンス［ＴＲ＝１２００ｍｓ、ＴＥ＝１００ｍｓ、スライスの厚さ＝２ｍｍ］を用いて取得した。ヒドロゲルのサイズおよび体積は、Imalytics Preclinical Softwareを用いてＴ１およびＴ２強調ＴＳＥ画像に基づいて評価した。少なくとも、図３において、３Ｔ  ＭＲにおいて、ＨＬを有する／有しないコラーゲン骨格のＭＲ画像を見ることができる。Ｔ１-（ａ）およびＴ２-（ｂ）の強調画像。１〜５の番号タグは、ＨＬ標識サンプルＣｘＬ ０．１、ＣｘＬ ０．２、ＣｘＬ ０．２５、ＣｘＬ ０．５、および、ＨＬを有しない対照ＣｘＬ骨格に対応して示す。
【図１】
2019529449.tif 000012
【図２】
2019529449.tif 000013
【図３】
2019529449.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月13日(2019.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
2019529449.tif 000015
式中、
Ｍは、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｏからなり、
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ピリジン、ピラゾール、イミダゾール、ヒスチジン、イソチオシアナート、アセトニトリル、メタノールからなり、
ここで、式（２）
【化２】
2019529449.tif 000016
のリンカーが、テトラピロールと、少なくとも部分的に水溶性である化合物Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つとの間に位置付けられ、
ここで、Ｒ１、Ｒ２は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＨｉｓＧＬｙＯＭｅ、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリビニルラクタム、ＰＧＬＡ、ポリアクリル酸、ＰＶＰ、ヒアルロン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン、ＰＥＧ、ポリエーテルアミン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびそれらの塩、溶媒和物およびこれらの塩の溶媒和物からなる、
で表されるテトラピロール共役化合物。
【請求項２】
テトラピロールと少なくとも部分的に水溶性である化合物との間のリンカーが、エチレンジアミン、アミノエタノール、エチレングリコール、メルカプトエタノール、エタンジチオールを含む、請求項１に記載のテトラピロール共役化合物。
【請求項３】
式（３）
【化３】
2019529449.tif 000017
式中、
ｎ＝１〜２０、および、
Ｒ１、Ｒ２は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＨｉｓＧｌｙＯＭｅ、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリビニルラクタム、ＰＧＬＡ、ポリアクリル酸、ＰＶＰ、ヒアルロン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジンおよびＰＥＧ、ポリエーテルアミン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびそれらの塩、溶媒和物およびこれらの塩の溶媒和物を含む、
で表される、請求項１または２に記載のテトラピロール共役化合物。
【請求項４】
式（４）
【化４】
2019529449.tif 000018
式中、ｎ＝１〜２０である、
で表される、請求項１に記載のテトラピロール共役化合物。
【請求項５】
１分子内に、少なくとも１つのテトラピロール化合物、少なくとも部分的に水溶性である化合物およびそれらの塩、溶媒和物およびこれらの塩の溶媒和物を含むテトラピロール共役化合物を製造する方法であって、
式（１）
【化５】
2019529449.tif 000019
式中、
Ｍは、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｏからなり、
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ピリジン、ピラゾール、イミダゾール、ヒスチジン、イソチオシアナート、アセトニトリル、メタノールからなり、
ここで、式（２）
【化６】
2019529449.tif 000020
で表されるリンカーが、テトラピロールと少なくとも部分的に水溶性である化合物Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つとの間に位置付けられており、
Ｒ１、Ｒ２は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＨｉｓＧＬｙＯＭｅ、ポリウレタン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリビニルラクタム、ＰＧＬＡ、ポリアクリル酸、ＰＶＰ、ヒアルロン酸、アルギニン、リシンおよびＰＥＧ、ポリエーテルアミン、ポリリシン、ポリアルギニンおよびそれらの塩、溶媒和物およびこれらの塩の溶媒和物からなる、
で表されるテトラピロール共役化合物、
ここで、カルボジイミドが、テトラピロール化合物（１）とリンカー（２）とのカップリング反応のための活性化剤として用いられ、および、
ここで、テトラピロール化合物を有機溶媒に溶解し、少なくとも部分的に水溶性である化合物とのカップリングを、アセトン、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡｃ、アセトニトリル、または、アセトン、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡｃ、アセトニトリルの混合物において行うことを特徴とする、前記方法。
【請求項６】
活性化剤が、
１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、
１-シクロヘキシル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＣＤＣ）、
１-イソプロピル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＩＤＣ）、
１-シクロヘキシル-３-（２-モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）
からなる群から選択される、請求項５に記載のテトラピロール共役化合物を製造する方法。
【請求項７】
テトラピロール共役体を極性のプロトン性キャリア液に溶解する、請求項５または６に記載のテトラピロール共役化合物を製造する方法。
【請求項８】
極性のプロトン性キャリア液が、ＰＥＧ、ＰＧＬＡまたは誘導体である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のテトラピロール共役化合物を製造する方法。
【請求項９】
１分子内に、少なくとも１つのテトラピロール化合物、少なくとも部分的に水溶性である化合物およびそれらの塩、溶媒和物およびこれらの塩の溶媒和物の少なくとも１つを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のテトラピロール共役化合物の、ＭＲＩ用における造影剤としての使用。
【請求項１０】
テトラピロール化合物が、ＭＲＩ用のインプラントグラフト、とくに、ステント、ガイドワイヤーまたはカテーテル内に位置付けられている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のテトラピロール共役化合物の使用。
【国際調査報告】
2019529449.tif 000021
2019529449.tif 000022
2019529449.tif 000023