(57)【要約】  本発明は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを使用して、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、及び／又は医学的に難治性の潰瘍性大腸炎（ＭＲ−ＵＣ）を含むがこれらに限定されない炎症性腸疾患を診断する方法を記載する。本発明は更に、患者の識別及び／又は層別化のためのプロセスを提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を診断する方法であって、該方法は：
被験体からサンプルを得る工程；
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在の有無を判定するのに適したアッセイにサンプルをさらす工程；及び
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在に基づいて被験体のＩＢＤを診断する工程
を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、又は医学的に難治性の潰瘍性大腸炎である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、又はｒｓ９３６６０９３である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＩＢＤと診断された被験体は、チオプリン及び抗ＴＮＦ治療の治療不全を実証する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩＢＤと診断された被験体は、外科的介入を必要とすると判定される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
外科的介入は腸切除である、ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＲＮＡＳＥＴ２のメチル化のレベルを判定する工程を更に含み、ここで増加したメチル化は、外科的介入を必要とする被験体を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
処置のために炎症性腸疾患を持つ被験体を識別するプロセスであって、該プロセスは：
ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γの発現レベルを判定する工程；及び
処置を必要とする被験体を、ＲＮＡＳＥＴ２が減少した及び／又はＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γのレベルが増大した被験体として識別する工程
を含む、ことを特徴とするプロセス。
【請求項１０】
炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、又は医学的に難治性の潰瘍性大腸炎である、ことを特徴とする請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
ＲＮＡＳＥＴ２のメチル化のレベルを判定する工程、及び、処置を必要とする被験体を、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化が増加した被験体として識別する工程を更に含む、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１２】
処置は外科的介入である、ことを特徴とする請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γの発現レベルについての分析に被験体の生物学的サンプルをさらす工程；及び
ＲＮＡＳＥＴ２の発現減少、及び／又はＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γの発現増加が見出された時に、ＩＢＤを持つ被験体を診断する工程
を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、又は医学的に難治性の潰瘍性大腸炎である、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡＳＥＴ２のメチル化のレベルを判定する工程を更に含み、ここで増加したメチル化は、外科的介入を必要とする被験体を示す、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡＳＥＴ２での１つ以上のリスク変異体の存在の有無を判定するために被験体の生物学的サンプルを評価する工程；及び
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在が見出された時に、処置を必要とするＩＢＤを持つ被験体を識別する工程
を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項１７】
炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、又は医学的に難治性の潰瘍性大腸炎である、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、及び／又はｒｓ２１４９０８５を含む、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、及び／又はｒｓ９３６６０９３を含む、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ＩＢＤを持つと識別された被験体は、チオプリン及び抗ＴＮＦ治療の治療不全を実証する、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＢＤを持つと識別された被験体は、外科的介入を必要とすると判定される、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
外科的介入は腸切除である、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＲＮＡＳＥＴ２のメチル化のレベルを判定する工程を更に含み、ここで増加したメチル化は、外科的介入を必要とする被験体を示す、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
医学的に難治性の潰瘍性大腸炎（ＭＲ−ＵＣ）を診断する方法であって、該方法は：
被験体からサンプルを得る工程；
ＲＮＡＳＥＴ２での１つ以上のリスク変異体の存在の有無を判定するのに適したアッセイにサンプルをさらす工程；及び
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在に基づいて被験体のＭＲ−ＵＣを診断する工程
を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項２５】
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５である、ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、又はｒｓ９３６６０９３である、ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は、チオプリン及び抗ＴＮＦ治療の治療不全を実証する、ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は、外科的介入を必要とすると判定される、ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
外科的介入は腸切除である、ことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＲＮＡＳＥＴ２のメチル化のレベルを判定する工程を更に含み、ここで増加したメチル化は、外科的介入を必要とする被験体を示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
炎症性腸疾患を持つ被験体のための治療を選択する方法であって、該方法は：
被験体からサンプルを得る工程；
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在の有無を判定するのに適したアッセイにサンプルをさらす工程；
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在に基づいて被験体の医学的に難治性の潰瘍性大腸炎（ＭＲ−ＵＣ）を診断する工程；及び
ＭＲ−ＵＣと診断された被験体のための処置としてチオプリン又は抗ＴＮＦを選択せず、治療として手術を選択する工程
を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項３２】
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５である、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、又はｒｓ９３６６０９３である、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＲＮＡＳＥＴ２のメチル化のレベルを判定する工程を更に含み、ここで増加したメチル化は、外科的介入を必要とする被験体を示す、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発の記載
本発明は、国立衛生研究所により与えられた登録番号ＤＫ０４３２１１、ＤＫ０４６７６３、ＤＫ０６２４１３、ＨＳ０２１７４７、ＡＩ０６７０６８、ＤＥ０２３７９８、ＤＫ０８４５５４、ＲＲ０３３１７６、及びＴＲ０００１２４の下で、政府支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有している。
【０００２】
＜発明の分野＞
本発明は、炎症性腸疾患、及び、疾患の重症度と標的抗ＴＬ１Ａ治療のためのバイオマーカーとしてのＲＮＡＳＥＴ２に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書中の全ての刊行物は、あたかも個々の刊行物又は特許出願が参照によって組み込まれるよう具体的且つ個別に示されるかのように、同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれるものとする。以下の記載は、本発明を理解するのに役立つ情報を含んでいる。本明細書に提供される情報の何れかが先行技術である又はここで請求される発明に関連するものであること、或いは、具体的又は暗黙に言及されるいずれの刊行物も先行技術であることは、認められるものではない。
【０００４】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）には、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）といった２つの一般的な形態があり、これらは消化管の慢性で再発性の炎症性疾患である。アシュケナージ系ユダヤ人におけるＩＢＤの速度増大、ＩＢＤの家族的集積、及び二卵性双生児ペアと比較して増大した一卵性双生児ペアにおけるＩＢＤの一致によって証明されるように、遺伝因子がＩＢＤの病因において重要な役割を果たす（Ｓ．  Ｖｅｒｍｅｉｒｅ，  Ｐ．  Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ  ６，  ６３７  （２００５））。更に、遺伝子分析はＩＢＤを特定の遺伝子変異体に関連づけた。ＣＤとＵＣは、幾つかの遺伝的感受性遺伝子座を共有するが他のものとは異なる、関連疾患であると考えられている。
【０００５】
ＩＢＤは一般的に、共生的なフローラに対する不適当な免疫応答によって遺伝的に敏感な個体に引き起こされると考えられる。ＣＤとＵＣの高度な臨床的不均一性及び遺伝的複雑性は、疾患を引き起こす（ｄｒｉｖｉｎｇ）根本的な生物学的経路が患者の亜群においてほぼ確実に異なることを示唆している。故に、早期且つ標的とされた治療の進行は、特に重度の疾患経過と比べて全体的に軽度であると予測する際に、亜群の層別化及び予後のバイオマーカーの識別を必要とする。２０１  ＩＢＤ感受性遺伝子座が識別されているが、それらの機能的意義に関してはほとんど知られていない。ＴＮＦＳＦ１５における遺伝変異は多数の人口におけるＣＤに関連付けられ、それがコードするタンパク質であるＴＬ１Ａは、粘膜の炎症の重要な媒介物質である。ＴＬ１Ａ発現は、ＣＤとＵＣの両方における腸の炎症領域においてアップレギュレートされる。ＩＢＤ患者において、上昇したＴＬ１Ａレベルは、ＴＮＦＳＦ１５遺伝子型及び疾患の重症度と関連する。ＴＬ１Ａの血清／組織レベルが上昇したＣＤ患者は、繊維症／狭窄性疾患挙動（ｓｔｒｉｃｔｕｒｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）を進行させるリスクを増大した。インビトロで、ＴＬ１Ａは、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）及びインターロイキン１８（ＩＬ−１８）（１２／１８）と協同して、ＩＦＮ−γ、即ち粘膜の炎症の別の重要な媒介物質の産生の急速な増強を引き起こす。
【０００６】
それ故、ＩＢＤ、ＣＤ、ＵＣ、及び／又はＭＲ−ＵＣでの処置のために患者を診断及び識別する方法が、当該技術分野において必要とされたままである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
典型的な実施形態を参照図面において例示する。本明細書に開示される実施形態及び図面は、限定的ではなく例示的なものと考慮されるべきことが、意図されている。
【図１】本発明の様々な実施形態に従って、未関与の小腸におけるＲＮＡＳＥＴ２  ｅＱＴＬマイクロアレイを表す。
【図２】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２のメジャーアレルがＣＤ患者のＳ状結腸及び直腸におけるＲＮＡＳＥＴ２の発現減少に関連することを示す。
【図３】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２のメジャーアレルがＵＣ患者のＳ状結腸及び直腸におけるＲＮＡＳＥＴ２の発現減少に関連することを示す。
【図４】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２のリスクアレルがＵＣ患者の炎症を受けた大腸におけるＲＮＡＳＥＴ２の発現減少に関連することを示す。同様の結果がｒｓ１８１９３３３について観察された。
【図５】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２のメジャーアレルがＣＤ手術からの小腸におけるＲＮＡＳＥＴ２のＲＮＡＳＥＴ２発現減少に関連することを示す。
【図６】本発明の様々な実施形態に従って、ＥＢＶにより形質転換したＢ細胞株におけるＲＮＡＳＥＴ２  ｅＱＴＬを表す。メジャーアレルは、ＥＢＶにより形質転換したＢ細胞株における低レベルのＲＮＡＳＥＴ２  ｍＲＮＡ発現に関連付けられる。
【図７】本発明の様々な実施形態に従って、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及び／又はＴＬ１Ａ、並びに処置の後のＲＮＡＳＥＴ２発現を表す。
【図８−１】本発明の様々な実施形態に従って、ＣＤ患者におけるＲＮＡＳＥＴ２発現を表す。A）１年当たりの多発性疾患の再燃が無い又は１つある患者におけるＲＮＡＳＥＴ２発現。Ｂ）疾患管理のために外科的介入を必要とする又は手術を必要としない、医学的に難治性の患者におけるＴＬ１Ａ処置後のＲＮＡＳＥＴ２発現。
【図８−２】本発明の様々な実施形態に従って、ＣＤ患者におけるＲＮＡＳＥＴ２発現を表す。C）追加のデータサンプルを包含する、３２人のＣＤ患者における１年当たりの疾患再燃に基づくＲＮＡＳＥＴ２発現。
【図９】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２リスクアレルを持つＩＢＤ患者におけるＲＮＡＳＥＴ２の発現減少を示す。
【図１０】本発明の様々な実施形態に従って、ＣＤ及びＵＣの患者におけるＲＮＡＳＥＴ２メチル化対ＧＷＡＳ  ｐ値を表す。
【図１１】本発明の様々な実施形態に従って、難治性ＩＢＤにおけるＲＮＡＳＥＴ２のｅＱＴＬを表す。Ｉｌｌｕｍｉｎａ発現アレイを使用した、疾患管理のための外科的介入を必要とする１１人のＣＤ患者及び１０人のＵＣ患者からのＣＤ３＋末梢性Ｔ細胞からのＲＮＡＳＥＴ２  ＳＮＰ（ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１８１９３３３、及びｒｓ９３５５６１０）。
【図１２】本発明の様々な実施形態に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ発現アレイを使用した、８５人のＣＤ患者のＣＤ小腸（回腸）の外科的切除におけるＲＮＡＳＥＴ２のｅＱＴＬを表す。
【図１３−１】本発明の様々な実施形態に従って、難治性ＩＢＤにおけるＲＮＡＳＥＴ２のｍＱＴＬを表す。A）難治性ＩＢＤにおけるＲＮＡＳＥＴ２のｍＱＴＬ。Ｂ）標準又は軽度の疾患患者におけるＲＮＡＳＥＴ２のｍＱＴＬ。
【図１３−２】本発明の様々な実施形態に従って、難治性ＩＢＤにおけるＲＮＡＳＥＴ２のｍＱＴＬを表す。Ｃ）疾患管理のために外科的介入を必要とする難治性疾患を持つ２０人のＣＤ患者からの、ＣＤ３＋末梢性Ｔ細胞のｍＱＴＬ（ｃｇ２５２５８０３３）。Ｄ）追加のデータサンプルを包含するＩＢＤ治療に応答した１６人の患者と９人の標準の対照からの、ＣＤ３＋末梢性Ｔ細胞のｍＱＴＬ（ｃｇ２５２５８０３３）。
【図１４Ａ】本発明の様々な実施形態に従って、難治性又は軽度の疾患を持つ患者におけるＲＮＡＳＥＴ２にわたるｅＱＴＬ及びｍＱＴＬのマッピングを表す。難治性又は軽度の疾患を持つ患者におけるＲＮＡＳＥＴ２にわたるｅＱＴＬ及びｍＱＴＬ。
【図１４Ｂ】本発明の様々な実施形態に従って、難治性又は軽度の疾患を持つ患者におけるＲＮＡＳＥＴ２にわたるｅＱＴＬ及びｍＱＴＬのマッピングを表す。追加のデータサンプルを包含する難治性又は軽度の疾患を持つ患者（通常の患者を含む）からの周辺及び粘膜の区画両方からのＣＤ３＋Ｔ細胞を使用して計算されるｅＱＴＬ及びｍＱＴＬ。
【図１５】本発明の様々な実施形態に従って、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及び／又はＴＬ１Ａで刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞の選別及びＩＦＮγ発現を表す。４つのドナー（Ｄ１−４）から８時間にわたる、組み換え型のヒトＩＬ−１２（５００ｐｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＴＬ１Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞に関する、側方散乱対ＩＦＮ−γのヒストグラム。
【図１６】本発明の様々な実施形態に従って、中心とされた相関性及び平均連結法を使用した、階層的クラスタリングのデンドログラムを表す。
【図１７】本発明の様々な実施形態に従って、発現レベルに基づいてＩＦＮγを分泌する及び分泌しない亜群を分類する、分類予測解析を表す。７６４の予測遺伝子のヒートマップ。
【図１８】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＷＡＳ対他の領域において増大した、差次的に発現される遺伝子の比率を表す。
【図１９】本発明の様々な実施形態に従って、Ｔ細胞における１８３の転写されたＩＢＤ関連ＳＮＰ領域を表す。
【図２０】本発明の様々な実施形態に従って、ＩＢＤリスク予測遺伝子の分類予測因子ＧＷＡＳ転写のボルケーノプロットを表す。
【図２１Ａ】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２のサイレンシングがＩＦＮ−γの分泌を増強することを示す。ＲＮＡＳＥＴ２  ｓｉＲＮＡによるＲＮＡＳＥＴ２の阻害。対照のスクランブルされたｓｉＲＮＡと比較した、ＲＮＡＳＥＴ２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（ｃｅｌｌｏｓ）におけるＩＦＮ−γ発現の増強。
【図２１Ｂ】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２のサイレンシングがＩＦＮ−γの分泌を増強することを示す。ＩＦＮ−γの分泌に対するＲＮＡＳＥＴ２サイレンシングの効果。対照のスクランブルされたｓｉＲＮＡと比較した、ＲＮＡＳＥＴ２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞におけるＩＦＮ−γ発現の増強。
【図２２】本発明の様々な実施形態に従って、ＩＦＮ−γ及びＲＮＡＳＥＴ２の発現の逆相関を実証する。
【図２３】本発明の様々な実施形態に従って、２１人のＩＢＤ患者におけるＣＤ３＋Ｔ細胞（第１のイントロン内に１．４ｋｂで位置付けられる、ｃｇ２５２５８０３３）のＲＮＡＳＥＴ２のメチル化及び発現の負の相関を実証する。
【図２４Ａ】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡ−ｓｅｑを使用した、疾患管理のために外科的介入を必要とする難治性患者からのＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＲＮＡＳＥＴ２及びＴＮＦＳＦ１５の発現の相関を表す。難治性ＣＤにおけるＲＮＡＳＥＴ２対ＴＬ１Ａの相関性。
【図２４Ｂ】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡ−ｓｅｑを使用した、疾患管理のために外科的介入を必要とする難治性患者からのＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＲＮＡＳＥＴ２及びＴＮＦＳＦ１５の発現の相関を表す。３８人のＣＤ患者からのＣＤ３＋末梢性Ｔ細胞におけるＲＮＡＳＥＴ２及びＴＮＦＳＦ１５の発現の相関を表す。
【図２４Ｃ】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡ−ｓｅｑを使用した、疾患管理のために外科的介入を必要とする難治性患者からのＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＲＮＡＳＥＴ２及びＴＮＦＳＦ１５の発現の相関を表す。１００人のＣＤ患者からのデータを表す。
【図２４Ｄ】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡ−ｓｅｑを使用した、疾患管理のために外科的介入を必要とする難治性患者からのＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＲＮＡＳＥＴ２及びＴＮＦＳＦ１５の発現の相関を表す。１３８人の患者からの組み合わされたデータを表す。
【図２５】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２対Ａ）ＰＵ．１及びＢ）ＥＬＦ１の相関発現を表す。リスクＳＮＰ  ｒｓ２１４９０９２  Ｃ／Ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は、ＩＲＦ４、ＰＵ．１及びＥＬＦ−１の結合部位を無効にする。Ｃ−非−リスク及びＴ＝リスクアレル。
【図２６】本発明の様々な実施形態に従って、２１人のＩＢＤ患者における１００ｋｂのＲＮＡＳＥＴ２の転写開始部位内に位置する発現及びメチル化の相関性を表す。
【図２７】本発明の様々な実施形態に従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生レベル及び非産生レベルのＩＦＮ−γ発現を表す。
【図２８】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子座上でのＧＷＡＳ  ｐ値とｅＱＴＬ  ｐ値の相関性を表す。ＧＷＡＳ  ｐ値は１８７２９人のＣＤ及び３４８９７人の対照からのデータに基づく。ｅＱＴＬ  ｐ値は、疾患管理のために外科的介入を必要とする、難治性疾患を持つ７１人のＣＤ患者のためのＲＮＡＳＥＴ２の遺伝子型判定及びＲＮＡ−ｓｅｑに基づく発現に基づいている。
【図２９】本発明の様々な実施形態に従って、ＩＦＮ−γ分泌に対するＲＮＡＳＥＴ２サイレンシングの効果を表す。ＲＮＡＳＥＴ２に特異的なｓｉＲＮＡによるＲＮＡＳＥＴ２発現の阻害は、全ての試験において５０％より上であった。
【図３０】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＳＣＡ血清陽性とのＲＮＡＳＥＴ２の発現減少の関連付けを表す。
【図３１】本発明の様々な実施形態に従って、浸潤性疾患とのＲＮＡＳＥＴ２の発現減少の関連付けを表す。モントリオール疾患分類（Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３）に基づいた７１人のＣＤ患者に関するＲＮＡ−ｓｅｑによるＲＮＡＳＥＴ２の発現。
【図３２】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２疾患関連ＳＮＰを持つ患者が再手術までの時間が短かったことを示していることを表す。手術間の時間は、多数の手術を受けた１５４人のＣＤ患者に関するＩＢＤリスクＳＮＰ  ｒｓ９３５５６１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のための輸送に基づく。
【図３３】ｒｓ２１４９０９２  ＳＮＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）がＤＮＡ形状を変更することを表す。
【図３４】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２対Ｅｔｓ１発現の相関性を表す。
【図３５】ｒｓ２１４９０９２  ＳＮＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）がＥｔｓ１結合部位にてＤＮＡ形状を歪めることを表す。
【図３６−１】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２疾患関連変異体ｒｓ２１４９０９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の潜在的な調節的機能の識別、ＲＮＡＳＥＴ２変異体ｒｓ２１４９０９２（Ｃ−非リスクアレル／Ｔ−リスクアレル）の予期される調節性の役割を表す。Ａ）ＥＴＳ及びＩＲＦ４の転写因子に関する結合モチーフにおけるｒｓ２１４９０９２のＣからＴへの変位の予測される破壊。変異体モチーフにおける中心ＥＴＳが強調される。Ｂ）ＥＴＳ１、ＩＲＦ４、及びＳＰＩ１の転写因子結合のためのＣＨＩＰ−ｓｅｑ及びヒストン修飾プロファイル、及び、ｒｓ２１４９０９２変異体を囲むゲノム配列と位置合わせされるヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ４ａｃ。
【図３６−２】本発明の様々な実施形態に従って、ＲＮＡＳＥＴ２疾患関連変異体ｒｓ２１４９０９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の潜在的な調節的機能の識別、ＲＮＡＳＥＴ２変異体ｒｓ２１４９０９２（Ｃ−非リスクアレル／Ｔ−リスクアレル）の予期される調節性の役割を表す。C）ＲＮＡ−ｓｅｑを使用した、疾患管理のために外科的介入を必要とする１０８人のＣＤ患者からのＣＤ３＋末梢性Ｔ細胞におけるＲＮＡＳＥＴ２及び多数のＥＴＳ、並びにＪＵＮ転写因子の発現の相関。
【図３７−１】本発明の様々な実施形態に従って、ＩＦＮ−γ分泌及び細胞凝集に対するＲＮＡＳＥＴ２サイレンシングの効果を表す。Ａ）ＲＮＡＳＥＴ２又は対照（ＮＣ）ｓｉＲＮＡによるＲＮＡＳＥＴ２発現のサイレンシング。Ｂ）ＩＦＮ−γの分泌に対するＲＮＡＳＥＴ２サイレンシングの効果。パネルＡ及びＢは、同様の結果が伴う７つの試験（図２９）のうちの６つを表す。
【図３７−２】本発明の様々な実施形態に従って、ＩＦＮ−γ分泌及び細胞凝集に対するＲＮＡＳＥＴ２サイレンシングの効果を表す。Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞は処理されない（ＵＴ）。または、Ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞は２４時間ＴＬ１Ａで刺激された。細胞内のＩＦＮ−γ染色及び細胞凝集は、フローサイトメトリーにより測定された。細胞は、ＩＦＮ−γを分泌する及び分泌しない集団（左のパネル）上でゲートされ（ｇａｔｅｄ）、次にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用して、単一及び凝集した細胞分画（ヒストグラム、右のパネル）について分析した。各ヒストグラムにおける第１のピークは単細胞（黒い丸括弧）に想到し、残りのピークは細胞凝集体（灰色の丸括弧）に相当する。４つの実験を表す。
【図３７−３】本発明の様々な実施形態に従って、ＩＦＮ−γ分泌及び細胞凝集に対するＲＮＡＳＥＴ２サイレンシングの効果を表す。Ｅ）ＴＬ１Ａ刺激後の、ＩＦＮ−γを分泌する（ＩＦＮ−γ＋）及び分泌しない（ＩＦＮ−γ−）集団における、単細胞及び細胞凝集体の比率。Ｆ）本発明の様々な実施形態に従って、ＩＦＮ−γ分泌及び細胞凝集に対するＲＮＡＳＥＴ２サイレンシングの効果を表す。ＩＦＮ−γ分泌細胞の数の倍率増加（４つの実験の平均）。Ｇ）ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＬ１Ａ刺激の前に対照ＩｇＧ又はＬＦＡ１遮断抗体（ａＬＦＡ１）で前処理された。ＥＬＩＳＡにより測定された、ＩＦＮ−γ分泌のＬＦＡ１を媒介とした遮断に関する全体的なｐ値は、０．０４７であった。
【図３８】本発明の様々な実施形態に従って、チオプリン又は抗ＴＮＦ治療の治療不全、ＡＮＣＡ血清陽性、及び長時間の腸切除術を伴う手術時の、ＲＮＡＳＥＴ２疾患リスク変異体ＳＮＰの関連性を表す（データは表１８に要約する）。
【図３９】本発明の様々な実施形態に従って、術後の予防処置を受けていなかった３８人の患者における疾患再発を伴う、ＲＮＡＳＥＴ２疾患リスク変異体ＳＮＰの関連性を表す。手術後の内視鏡検査を行い、Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓスコアによって分類した。（データは表１８に要約する）。
【図４０】ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子座の組織特異的な機能注解を表す。ＲＥＭＣからのＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、及びＲＮＡｓｅｑのデータのヒートマップ。
【図４１】ＲＮＡ−ｓｅｑを使用した、難治性疾患を持つ１０８人のＣＤ患者からのＣＤ３＋末梢性Ｔ細胞における、ＲＮＡＳＥＴ２発現と多数のＥＴＳ及びＩＲＦ４転写因子との相関を表す。
【図４２】本発明の様々な実施形態に従って、対照（ＮＣ）又はＲＮＡＳＥＴ２  ｓｉＲＮＡでのサイレンシングの後の、未処置の細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の示された遺伝子のタンパク質発現を例示するヒートマップを表す。結果は４人の健康なドナーから得られる。右の列は、ＩＦＮ−γを分泌しないＣＤ４＋Ｔ細胞と比較した、ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞における差次的遺伝子発現を表す。
【図４３】本発明の様々な実施形態に従って、ＩｇＧ  ＡＳＣＡ血清陽性（左のパネル）、抗ＴＮＦの手術前の治療不全（中央のパネル）、又はチオプリン（右のパネル）に基づいた、７１人のＣＤ患者に関するＩＣＡＭ１発現のレベル（ＲＮＡ−ｓｅｑにより測定される）の臨床的疾患パラメータを表す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書で引用される全ての引用文献は、あたかも完全に明記されているかのように参照によって全体が組み込まれる。ＲＮＡＳＥＴ２に関連する配列も、あたかも開示されたｒｓ番号を介して完全に明記されているかのように、参照によって全体が組み込まれる。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野における当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｒｅｖｉｓｅｄ，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  ２００６）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  ２０１２）は、当業者に、本出願で使用される用語の多くに関する一般的な指針を提供する。抗体を調製する方法に関する参照については、Ｄ．  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，  ２０１３）；  Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  （１９７６）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：  ５１１；  Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  の米国特許第５，５８５，０８９号；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：  ３２３  （１９８８）；  Ｂｉｒｄ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２  （１９８８）；  Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｉ．  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．  （２０００）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  ３２６，  ４６１−４７９；  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．  （２００５）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｓｅｐ；２３（９）：１１２６−３６）を参照。
【０００９】
当業者は、本発明の実施の差異に使用され得る、本明細書に記載されるものと同様又は同等の多くの方法及び物質を認識している。実際、本発明は、記載される方法及び物質には全く限定されていない。本発明の目的ために、次の用語が、以下で定義される。
【００１０】
本明細書で使用されるような「生物学的サンプル」の非限定的な例は、核酸及び／又はタンパク質を得ることができる任意の生体サンプルを意味する。非限定的な例として、この用語は、全血、末梢血、血漿、血清、唾液、粘液、尿、精液、リンパ液、糞の抽出物、頬の採取物（ｃｈｅｅｋ  ｓｗａｂ）、細胞、或いは、外科的生検又は外科的切除を介して得られた組織を含むがこれに限定されない他の体液又は組織を包含する。代替的に、サンプルは、主要な患者由来の細胞株、或いは、保存されたサンプルの形の収録された患者サンプル、又は新鮮な凍結サンプルを介して得ることができる。
【００１１】
本明細書に使用されるような「処置」及び「処置すること」は、治療上の処置及び予防手段又は防止手段の両方を指し、その目的は、標的とされた病理的疾病を予防又は遅延（和らげる）すること、病理的疾病を予防すること、優れた全生存を追求する又は獲得すること、或いは、処置が最終的に成功しなかった場合であっても個体が前記疾病を進行させる可能性を下げることである。処置を必要性とする者には、既に疾病を抱える者に加えて、疾病を抱える傾向がある者、又は疾病が予防されるべき者が挙げられる。
【００１２】
本明細書で使用されるような「ＳＮＰ」は一塩基多型を意味する。
【００１３】
本明細書で使用されるような「リスク変異体」は、リスク変異体を持たない個体と比べた、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び医学的に難治性の潰瘍性大腸炎を含むがこれらに限定されない炎症性腸疾患に対する感受性の増大にその存在が関連付けられるアレルを指す。
【００１４】
本明細書で使用されるような「ＩＢＤ」、「ＣＤ」、「ＵＣ」、及び「ＭＲ−ＵＣ」はそれぞれ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び医学的に難治性の潰瘍性大腸炎を指す。
【００１５】
本明細書で使用されるように「ＩＢＤ」は、「ＣＤ」、「ＵＣ」、及び／又は「ＭＲ−ＵＣ」を含む。
【００１６】
本明細書で使用されるように、「ＡＮＣＡ」は抗好中球細胞質抗体を意味する。
【００１７】
本明細書で使用されているように、「ＯｍｐＣ」は外部膜タンパク質Ｃを意味する。
【００１８】
本明細書で使用されるように、「ｅＱＴＬ」は発現量的形質遺伝子座を意味する。
【００１９】
本明細書で使用されるように、「ｍＱＴＬ」はメチル化量的形質遺伝子座を意味する。
【００２０】
ＲＮＡＳＥＴ２  ＳＮＰの非限定的な例は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、及びｒｓ９３６６０９３である。
【００２１】
本明細書には、患者集団における疾患の重症度のバイオマーカーとしてＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを使用し、且つ抗ＴＬ１Ａ治療のために患者集団を選択する、炎症性腸疾患を診断する方法が記載される。更に、これら患者集団を処置する方法が記載される。
【００２２】
ＲＮＡＳＥＴ２（リボヌクレアーゼＴ２）は細胞外ＲＮアーゼをコードするものであり、且つ、酸性ｐＨにおいてのみ活性である酸リボヌクレアーゼ（酸加水分解）のヒトＲｈ／Ｔ２／Ｓファミリーの唯一のメンバーである。ＲＮＡＳＥＴ２の最適活性はｐＨ５にあり、且つポリＡ及びポリＵの優先的な切断がある。これは、触媒機能を持つ２つの領域を含み、アデニル酸、続いてグアニル酸の近くの優先的な切断を実証する。３つのアイソフォームが、ＲＮＡＳＥＴ２、２７ＫＤ、３１ＫＤ、及び３６ＫＤのアイソフォームについて検出された。２７ＫＤと３１ＫＤのアイソフォームは、３６ＫＤアイソフォームのタンパク質分解切断に起因すると考えられる。３つのアイソフォームは全てグリコシル化される。細胞下分画は、完全長のＲＮＡＳＥＴ２が小胞体に位置し、２つのより小さなＲＮＡＳＥＴ２タンパク質分解産物がリソソーム分画に位置することを明らかにする。ＲＮＡＳＥＴ２はウイルスからヒトまでの門の中で高度に保存され、このことは重要な進化論的な機能を示唆している。
【００２３】
ＴＬ１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５）は、免疫複合体による刺激の後、又は腸内微生物との相互作用を介して、単球、マクロファージ、及び樹状細胞などの免疫系の活性化細胞上で主に発現される腫瘍壊死因子のファミリーメンバーである。ＴＬ１Ａ発現は、炎症性腸疾患において増強され、より高いＴＬ１Ａレベルは疾患の重症度に関連付けられる。ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）は、ＩＢＤに関連付けられるＴＮＦＳＦ１５  ＳＮＰを識別した。中和ＴＬ１Ａ抗体がマウス大腸炎モデルにおける大腸炎を減らし、一方で構成的ＴＬ１Ａ発現が、悪化したマウス回盲部炎症及び腸の線維性狭窄を表すことが、研究により示された。
【００２４】
ＩＦＮ−γは、ＩＢＤでの粘膜炎症の生成及び持続永続において重要な役割を果たす。ＴＬ１Ａは、ＰＢ  Ｔ細胞のＩＬ−１２／ＩＬ−１８媒介性のＩＦＮ−γ分泌を増大する。
【００２５】
発明者は、ＲＮＡＳＥＴ２、即ちＩＢＤ感受性遺伝子を、ＩＦＮ−γ産生のＴＬ１Ａ媒介性の増強の要素であると識別する。更に、ＲＮＡＳＥＴ２の機能的な変異体は、１つ以上の疾患の再燃及び狭窄性／浸潤性疾患の挙動によって特徴付けられたより「重度の」ＣＤ表現型に関連付けられる。どんな特定の理論にも縛られることなく、発明者は、ＲＮＡＳＥＴ２が、重度の疾患の病理生物学に関連付けられる治療上のバイオマーカーとして機能し、且つ、ＴＬ１Ａにより引き起こされる炎症性経路へと標的とされた治療から利益を得るであろう、患者集団の識別を可能にする。ＴＮＦＳＦ１５疾患関連変異体は、ＴＬ１Ａの増大され且つ持続された発現に関連している。ＴＮＦＳＦ１５は、ＩＢＤ関連遺伝子としてＧＷＡＳにおいて識別且つ確認され、腸炎症の位置及び重症度の調節の他、狭窄性疾患の進行において役割を果たすと考えられる。ＴＬ１Ａの構成的発現を伴うトランスジェニックマウスは、回腸及び結腸の繊維症と共に腸の炎症を進行させ、これは抗ＴＬ１Ａ処置により逆転された。ＵＣには、医学的に難治性の疾患の進行とＴＬ１Ａ遺伝子座の発現との間に強固な関連性がある。ＴＬ１ＡはＩＢＤの病因に関連した重要な炎症促進性サイトカインであるが、増強されたサイトカイン分泌及び炎症の基礎となる分子経路はあまり理解されていなかった。本明細書に記載されるように、発明者は、Ｔ細胞においてサイトカイン発現を誘導するＴＬ１Ａ依存性の分子のトリガー、具体的にはＩＦＮ−γを調べた。この方法は、ＩＦＮ−γ産生のＴＬ１Ａ媒介性の増強の要素としてＲＮＡＳＥＴ２の下方調節を識別した。
【００２６】
発明者は、ＣＤ患者から単離されたＴ細胞における発現減少及び過剰メチル化を伴うＲＮＡＳＥＴ２疾患リスクＳＮＰの機能的会合の他に、複雑な／抵抗性の疾患の挙動及び疾患の急速な再発を示唆する臨床的パラメータとの関連性を実証する。発明者は、ＲＮＡＳＥＴ２発現を調整する際のＥＴＳ  ＴＦの制御力、及び、ＩＦＮ−γ産生のＲＮＡＳＥＴ２媒介性のアップレギュレーションの要素としてＩＣＡＭ１を介した同型Ｔ細胞凝集の関与を示す。データは、潜在的な治療上のバイオマーカーとしてＲＮＡＳＥＴ２を見分け、且つ、定義されたＩＢＤ集団内の追加の治療上の変化について固有の経路を識別する。
【００２７】
発明者は、ＩＢＤ患者において、ＲＮＡＳＥＴ２とＴＮＦＳＦ１５の発現間に有意な逆相関があることを見出した。加えて、発明者は、ＤＮＡ過剰メチル化とＲＮＡＳＥＴ２の発現減少との間の機能的会合を実証する。
【００２８】
発明者は、末梢性Ｔ細胞及び小腸の外科的切除から単離されたサンプルにおけるＧＷＡＳを通じて識別されたＲＮＡＳＥＴ２  ＩＢＤリスクアレルとの有意なｅＱＴＬの重複があることを見出した。有意なＲＮＡＳＥＴ２  ｅＱＴＬ（ｒｓ４２９０８３）は、全体の胸腺組織サンプルにおける自己免疫関連リスク変異体を測定した最近のレポートに記載されている。同様に、このＳＮＰは、データにおいて最も有意なｅＱＴＬを実証した。更に、研究は、ＲＮＡＳＥＴ２の発現レベルの減少が、複雑且つ抵抗性の疾患を示唆する臨床的パラメータを持つＣＤ患者において関連していたという、臨床的に関連する証拠を提供している。著しくは、ＲＮＡＳＥＴ２疾患リスクＳＮＰを持つＣＤ患者は、狭窄性／浸潤性疾患の挙動の発達の増大を表示した。ＲＮＡＳＥＴ２発現は、１年につき１つ以上の疾患炎を示すＣＤ患者から単離されたＴ細胞において、有意に少ないものである。同様に、ＲＮＡＳＥＴ２発現は、小腸粘膜サンプルの他、疾病管理のために外科的介入を必要とする医学的に難治性のＣＤ患者（１１人のうち９人が抗ＴＮＦ治療に反応しなかった）からの末梢サンプルにおいて減少する。発見と一貫して、最近の研究は、抗ＴＮＦ治療に耐性のある患者の全血における有意なＲＮＡＳＥＴ２  ｅＱＴＬを報告した。更に、ＲＮＡＳＥＴ２疾患関連ＳＮＰは、抗ＴＮＦ治療の治療不全、及び、全体的な疾患重症度の＞４０ｃｍの臨床的特徴の腸切除と関連した。多数の切除の履歴のある患者において、ＲＮＡＳＥＴ２疾患リスクＳＮＰは、再手術までのより速い時間に関連付けられた。同様に、ＲＮＡＳＥＴ２疾患関連ＳＮＰは、患者において、より重度（＞２）のＲｕｔｇｅｅｒｔｓスコアによって特徴付けられる内視鏡的再発に関連しており、これは特定の理論に縛られることなく、早い臨床的再発及び再手術の必要性について予測的となり得る。
【００２９】
ＲＮＡＳＥＴ２発現を調整する転写調節領域及び結合因子は、同様に乏しく定義される。ＧＷＡＳにより識別された、大多数の疾患関連変異体は、プロモーター配列又はエンハンサー配列に相当する調節性非コード領域内に存在する。特定の理論に縛られることなく、研究は、転写因子結合部位の破壊を介した転写調節の変更が疾患プロセスにおいて役割を果たし得ることを示唆する。本研究において、発明者は、ｅＱＴＬ及びｍＱＴＬを実証する多くの変異体から、予測的な調節性ＳＮＰの優先順位を付け且つそれを識別するために、ＴＦモチーフ分析を利用した。ｒｓ２１４９０９２疾患関連ＳＮＰは、保存されたＥＴＳコンセンサス結合配列を変更し、ＩＲＦ４、ＳＰＩ１、及びＥＬＦ１を含む、多数の重なり合うＴＦ結合部位の結合を恐らく妨害する。更に、ＲＮＡＳＥＴ２発現のレベルとＥＴＳ及びＪＵＮ  ＴＦのファミリーメンバーとの間に強固な正の相関が存在する。興味深いことに、ＩＲＦ４、ＳＰＩ１、及びＥＬＦ１はＴ細胞の発達に関係し、ＩＲＦ４とＥＬＦ１はＧＷＡＳによりＩＢＤと関連付けられた。特定の理論に縛られることなく、これらのデータは、ＴＦ−ＤＮＡの相互作用のモジュレーターとしてｒｓ２０４９０９２についての機能的役割を支持するものであり、且つ、ＴＬ１Ａが疾患におけるＲＮＡＳＥＴ２の発現を減らす機構経路を判定するための将来の研究の準備を行う。
【００３０】
本研究において、発明者は、ＲＮＡＳＥＴ２と細胞接着分子であるＩＣＡＭ１との間の機能関係について記載している。ＴＬ１Ａに応じて増強されたＩＦＮ−γ分泌は、一方ではＲＮＡＳＥＴ２発現の減少を、他方ではＩＣＡＭ１レベルの増加を伴う。ＴＬ１Ａ媒介性のＩＦＮ−γ分泌は、ＩＣＡＭ１−ＬＦＡ１の相互作用のＡｂ遮断により阻害された。ＩＣＡＭ１−ＬＦＡ１の結合は内皮細胞とＴ細胞との間に生じるものとして古典的に定義されるが、これらの相互作用はごく最近、活性化Ｔ細胞の同型細胞凝集を媒介する際に重大な役割を果たすと示されている。同型Ｔ−Ｔ凝集体は、１つのＴ細胞から別のＴ細胞へのＩＦＮ−γ及びＩＬ２のシナプスベースのサイトカイン送達を促進し、ＩＬ−２受容体ライゲーション及びその後のＳＴＡＴ５リン酸化を結果としてもたらすことが示されている。発明者は、増強された細胞の凝集がＩＦＮ−γ産生細胞の証（ｈａｌｌｍａｒｋ）であり、ＴＬ１Ａ刺激が細胞凝集体の数と大きさを増大させることを実証する。特定の理論に縛られることなく、これらの発見は、ＩＦＮ−γ分泌を下流に調整するためにＲＮＡＳＥＴ２がインテグリンシグナル経路を通って作用し得ることを示唆している。
【００３１】
結論として、発明者は、２つのＩＢＤ感受性遺伝子であるＴＮＦＳＦ１５とＲＮＡＳＥＴ２との間に、新たな機能的且つ生物学的な関係を識別した。発明者は、ＲＮＡＳＥＴ２発現の減少が、活性化Ｔ細胞によるＴＬ１Ａで引き起こされる炎症促進性サイトカインの産生に機能的に関係し、且つＲＮＡＳＥＴ２  ＩＢＤ感受性変異体に機能的に関連するという証拠を提供する。同様に、本研究は、ＲＮＡＳＥＴ２発現の減少とＩＢＤ炎症のより重度の形態との関連性を実証し、これは、特定の理論に縛られることなく、ＴＬ１Ａ媒介性経路によって引き起こされる疾患病状の根底をなすと考えられるものである。ＲＮＡＳＥＴ２の発現減少及び後成的なＤＮＡメチル化の変更は、より重度の疾患表現型を持つＩＢＤ患者の亜群を特徴づける。発明者は、ＣＤ患者から単離されたＴ細胞における発現減少及び過剰メチル化を伴うＲＮＡＳＥＴ２疾患リスクＳＮＰの機能的会合の他に、複雑な／抵抗性の疾患の挙動及び疾患の急速な再発を示唆する臨床的パラメータとの関連性を実証する。発明者は、ＲＮＡＳＥＴ２発現を調整する際のＥＴＳ  ＴＦの制御力、及び、ＩＦＮ−γ産生のＲＮＡＳＥＴ２媒介性のアップレギュレーションの要素としてＩＣＡＭ１を介した同型Ｔ細胞凝集の関与を示す。データは、潜在的な治療上のバイオマーカーとしてＲＮＡＳＥＴ２を見分け、且つ、定義されたＩＢＤ集団内の追加の治療上の変化について固有の経路を識別する。故に、ＲＮＡＳＥＴ２発現は、現行の処置戦略に反応しない患者集団を識別する、炎症のより重度の形態の新たな疾患バイオマーカーとして役立ち、前記患者集団は、代替的なＲＮＡＳＥＴ２媒介性の治療方法から利益を得ることもある。
【００３２】
本明細書に開示されるように、発明者は、ＩＢＤ患者のコホートにおけるＲＮＡＳＥＴ２関連ＳＮＰを識別した。発明者は、ＣＤ患者のコホートにおけるＲＮＡＳＥＴ２関連ＳＮＰを識別した。発明者は、ＵＣ患者のコホートにおけるＲＮＡＳＥＴ２関連ＳＮＰを識別した。発明者は、ＭＲ−ＵＣ患者のコホートにおけるＲＮＡＳＥＴ２関連ＳＮＰを識別した。ＳＮＰは、疾患の場所、疾患の挙動、及び手術の必要性に関連付けられる。発明者は更に、ＩＢＤの患者のコホートにおける疾患の重症度及び関連するＲＮＡＳＥＴ２リスクＳＮＰのためのバイオマーカーとして、ＲＮＡＳＥＴ２を識別した。ＲＮＡＳＥＴ２は、ＣＤの患者のコホートにおける疾患の重症度及び関連するＲＮＡＳＥＴ２リスクＳＮＰのためのバイオマーカーとして識別される。ＲＮＡＳＥＴ２は、ＵＣ患者のコホートにおける疾患の重症度及び関連するＲＮＡＳＥＴ２リスクＳＮＰのためのバイオマーカーとして識別される。ＲＮＡＳＥＴ２は、ＭＲ−ＵＣ患者のコホートにおける疾患の重症度及び関連するＲＮＡＳＥＴ２リスクＳＮＰのためのバイオマーカーとして識別される。加えて、発明者は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ発現とＩＦＮ−γ分泌との相関性を実証する。
【００３３】
本発明は、これらの発見に少なくとも部分的に基づく。本発明は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを使用して、ＩＢＤを持つ患者を診断し且つ処置を必要とする患者を識別する方法に関する、当該技術分野での必要性に対処する。本発明は更に、患者の識別及び／又は層別化のためのプロセスを提供する。
【００３４】
＜診断＞
本発明の様々な実施形態は、被験体の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を診断する方法を提供し、該方法は：被験体からサンプルを得る工程；ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在の有無を判定するのに適したアッセイにサンプルをさらす工程；及びＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在に基づいて被験体のＩＢＤを診断する工程を含む。幾つかの実施形態において、炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、又は医学的に難治性の潰瘍性大腸炎である。様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、又はｒｓ９３６６０９３である。様々な実施形態において、本明細書に記載されるような２、３、４、５、又は６つのＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体が存在する場合、被験体はＩＢＤと診断される。様々な実施形態において、ｒｓ２１４９０８５のリスクアレルはＴアレルである。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体は、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体ｒｓ４２９０８３、及び、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、ｒｓ９３６６０９３、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体である。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体は、表２、３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１３におけるＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体のうち１つ以上、及び、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、ｒｓ９３６６０９３、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体である。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５である。様々な実施形態において、本明細書に記載されるような２、３、又は４つのＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５が存在する場合、被験体はＩＢＤと診断される。他の実施形態において、サンプル中の多くのリスク変異体の存在は、被験体が処置を更に必要としていることを示す。幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体の検出は、被験体の処置の必要性を示す。また他の実施形態において、被験体は、抗ＴＬ１Ａ治療を必要としていると識別される。様々な実施形態において、ＩＢＤと診断された被験体は、チオプリン及び抗ＴＮＦ治療の治療不全を実証する。様々な他の実施形態において、ＩＢＤと診断された被験体は外科的介入を必要とすると判定される。幾つかの実施形態において、外科的介入は腸切除である。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
他の実施形態において、本明細書に記載される被験体の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を診断する方法は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γの発現レベルを判定する工程を含む。幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２が減少し、及び／又はＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γのレベルが増大した被験体は、ＩＢＤと診断される。様々な実施形態において、炎症性腸疾患はクローン病である。様々な実施形態において、炎症性腸疾患は潰瘍性大腸炎である。様々な実施形態において、炎症性腸疾患は医学的に難治性の潰瘍性大腸炎である。様々な実施形態において、炎症性腸疾患は、疾患管理のために外科的介入を必要としたＣＤ患者である。また他の実施形態の中で、ＲＮＡＳＥＴ２が減少し、及び／又はＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γのレベルが増大した被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２を増大させ、及び／又はＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γを減少させる処置を必要とする被験体と識別される。他の実施形態において、被験体は、抗ＴＬ１Ａ治療を必要としていると識別される。また他の実施形態において、被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２の増加を引き起こす処置を必要としていると識別される。特定の他の実施形態において、被験体は、ＩＦＮ−γ及び／又はＴＬ１Ａの減少を引き起こす処置を必要としていると識別される。
【００３７】
様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体、及び／又はＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γの発現レベルの検出は、被験体の生物学的サンプルの核酸を分析することによって達成され得る。限定されないがポリメラーゼ連鎖反応ベースの分析、配列分析、及び電気泳動分析を含む、様々な装置及び／又は方法は、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体を検出するために使用され得る。ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γの発現レベルは、限定されないが量的ＰＣＲ、ノーザンブロット、及びマイクロアレイを含む様々な装置及び／又は方法を使用して検出され得る。本明細書で使用されるように、用語「核酸」は、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡを含む、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドを意味する。核酸という用語は、天然及び合成由来の核酸分子の他に、天然の核酸分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖、或いはその両方を表す線形、環状、又は分枝の構成の分子も包含する。
【００３８】
様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γの発現レベルの判定は、被験体の生物学的サンプルのタンパク質を分析することによって達成され得る。限定されないがＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、及びウェスタンブロットを含む、様々な装置及び／又は方法は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γの発現レベルを検出するために使用され得る。
【００３９】
本発明の様々な実施形態はまた、医学的に難治性の潰瘍性大腸炎（ＭＲ−ＵＣ）を診断する方法を提供し、該方法は：被験体からサンプルを得る工程；ＲＮＡＳＥＴ２での１つ以上のリスク変異体の存在の有無を判定するのに適したアッセイにサンプルをさらす工程；及びＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在に基づいて被験体のＭＲ−ＵＣを診断する工程を含む。様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、又はｒｓ９３６６０９３である。様々な実施形態において、ｒｓ２１４９０８５のリスクアレルはＴアレルである。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体は、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体ｒｓ４２９０８３、及び、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、ｒｓ９３６６０９３、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体である。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体は、表２、３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１３におけるＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体のうち１つ以上、及び、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、ｒｓ９３６６０９３、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体である。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５である。様々な実施形態において、本明細書に記載されるような２、３、又は４つのＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５が存在する場合、被験体はＩＢＤと診断される。
【００４０】
様々な実施形態において、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は、チオプリン及び抗ＴＮＦ治療の治療不全を実証する。様々な他の実施形態において、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は外科的介入を必要とすると判定される。幾つかの実施形態において、外科的介入は腸切除である。様々な実施形態において、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は、限定されないが組み換え型のＲＮＡＳＥＴ２及び抗ＩＣＡＭ１などの、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療を必要とすると判定される。様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療は、ＲＮＡＳＥＴ２の上流及び／又は下流にある遺伝子を標的とする抗体又は小分子である。
【００４１】
様々な他の実施形態において、前記方法は更に、ＲＮＡＳＥＴ２のメチル化のレベルを判定する工程、及びＲＮＡＳＥＴ２メチル化が増大している被験体におけるＩＢＤを診断する工程を含む。他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化のレベルは、ＭＲ−ＵＣを持つ被験体を診断するために判定される。幾つかの実施形態において、被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化の減少を引き起こす処置を必要としていると識別される。他の実施形態において、被験体は、抗ＴＬ１Ａ治療を必要としていると識別される。
【００４２】
本発明の様々な実施形態は、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体の処置を提供する。ＭＲ−ＵＣ被験体は、抗ＴＮＦ治療、チオプリン治療、コルチコイド及びシクロスポリンなどの、使用される現行の従来の薬物療法では効果が無い。様々な実施形態において、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は、限定されないが、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置などの、従来にない処置で処置される。様々な実施形態処置において、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置は、抗体及び／又はサイレンシングオリゴヌクレオチドを含み得る。様々な実施形態において、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は、限定されないが組み換え型のＲＮＡＳＥＴ２及び抗ＩＣＡＭ１などの、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療を必要とすると判定される。様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療は、ＲＮＡＳＥＴ２の上流及び／又は下流にある遺伝子を標的とする抗体又は小分子である。
【００４３】
様々な実施形態において、被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣する処置を必要としていると識別される。他の実施形態において、被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを調節する処置を必要としていると識別される。他の幾つかの実施形態において、被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを標的とする処置を必要としていると識別される。また他の実施形態において、被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調節、及び／又は標的とする処置を必要としていると識別される。様々な実施形態処置において、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置は、抗体及び／又はサイレンシングオリゴヌクレオチドを含み得る。様々な実施形態において、疾患はＩＢＤである。様々な実施形態において、疾患はＣＤである。様々な実施形態において、疾患はＵＣである。様々な実施形態において、疾患はＭＲ−ＵＣである。様々な実施形態において、診断される被験体は、疾患管理のために外科的介入を必要としたＣＤ患者である。
【００４４】
様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在は、ＲＮＡＳＥＴ２の発現減少に関連付けられる。他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在は、末梢組織及び粘膜組織におけるＲＮＡＳＥＴ２の発現減少に関連付けられる。他の幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在は、疾患管理のために外科的介入を必要とする患者におけるＤＮＡ過剰メチル化に関連付けられる。また他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子の１つ以上のリスク変異体の存在は、チオプリン及び／又は抗ＴＮＦ治療の治療不全に関連付けられる。他の幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在は、ＡＮＣＡ血清陽性に関連付けられる。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在は、腸切除の全体的な長さの増大に関連付けられる。
【００４５】
＜被験体の識別及び／又は層別化＞
本発明の様々な実施形態は、処置のために炎症性腸疾患を持つ被験体を識別するプロセスを提供し、該プロセスは：ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γの発現レベルを判定する工程；及び処置を必要とする被験体を、ＲＮＡＳＥＴ２が減少した及び／又はＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γのレベルが増大した被験体として識別する工程を含む。様々な実施形態において、炎症性腸疾患はクローン病である。様々な実施形態において、炎症性腸疾患は潰瘍性大腸炎である。様々な実施形態において、炎症性腸疾患は医学的に難治性の潰瘍性大腸炎である。様々な他の実施形態において、被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２の増加を引き起こす処置を必要としていると識別される。また他の実施形態において、被験体は、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γの減少を引き起こす処置を必要としていると識別される。特定の実施形態において、被験体は、抗ＴＬ１Ａ治療を必要としていると識別される。幾つかの実施形態において、被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調節、及び／又は標的とする処置を必要としていると識別される。様々な実施形態処置において、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置は、抗体及び／又はサイレンシングオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００４６】
本明細書で使用されるような「患者のリスク層別化」は、処置を必要とするリスク群に被験体を分けるプロセスを意味する。
【００４７】
本発明の様々な実施形態は、健康な個体に比べて処置を必要とする被験体を識別するための、患者のリスク層別化のプロセスを提供する。様々な実施形態において、被験体は、被験体の生物学的サンプル中のＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γの検出に基づいて層別化される。幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２の減少は、処置を必要とするＩＢＤを持つ患者を示す。幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２の減少は、処置を必要とするＣＤを持つ患者を示す。幾つかの実施形態において、患者は、疾患管理のために外科的介入を必要とするＣＤ患者である。幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２の減少は、処置を必要とするＵＣを持つ患者を示す。幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２の減少は、処置を必要とするＭＲ−ＵＣを持つ患者を示す。他の様々な実施形態において、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γの増加は、処置を必要とするＩＢＤを持つ患者を示す。他の様々な実施形態において、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γの増加は、処置を必要とするＣＤを持つ患者を示す。他の様々な実施形態において、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γの増加は、処置を必要とするＵＣを持つ患者を示す。他の様々な実施形態において、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γの増加は、処置を必要とするＭＲ−ＵＣを持つ患者を示す。他の特定の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２の減少、ＴＬ１Ａの増加、及びＩＦＮ−γの増加は、処置を必要とするＩＢＤを持つ被験体を示す。他の特定の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２の減少、ＴＬ１Ａの増加、及びＩＦＮ−γの増加は、処置を必要とするＣＤを持つ被験体を示す。他の特定の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２の減少、ＴＬ１Ａの増加、及びＩＦＮ−γの増加は、処置を必要とするＵＣを持つ被験体を示す。他の特定の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２の減少、ＴＬ１Ａの増加、及びＩＦＮ−γの増加は、処置を必要とするＭＲ−ＵＣを持つ被験体を示す。様々な実施形態において、遺伝子の検出は、被験体の処置のための指針を提供する。特定の実施形態において、被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調節、及び／又は標的とする処置を必要としていると識別される。様々な実施形態処置において、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置は、抗体及び／又はサイレンシングオリゴヌクレオチドを含み得る。他の様々な実施形態において、処置を必要とする被験体を識別する患者のリスク層別化のプロセスは、以前に処置された健康な個体に関連する。他の様々な実施形態において、処置を必要とする被験体を識別する患者のリスク層別化のプロセスは、医学的に反応的な個体に関連する。
【００４８】
本発明の様々な実施形態は、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体の処置を提供する。ＭＲ−ＵＣ被験体は、抗ＴＮＦ治療、チオプリン治療、コルチコイド及びシクロスポリンなどの、使用される現行の従来の薬物療法では効果が無い。様々な実施形態において、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は、限定されないが、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置などの、従来にない処置で処置される。様々な実施形態処置において、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置は、抗体及び／又はサイレンシングオリゴヌクレオチドを含み得る。様々な実施形態において、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は、限定されないが組み換え型のＲＮＡＳＥＴ２及び抗ＩＣＡＭ１などの、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療を必要とすると判定される。様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療は、ＲＮＡＳＥＴ２の上流及び／又は下流にある遺伝子を標的とする抗体又は小分子である。
【００４９】
他の実施形態において、本明細書に記載される被験体の識別及び／又は層別化のプロセスは、１つ以上のリスク変異体の存在を判定する工程を含む。特定の実施形態において、１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、又はｒｓ９３６６０９３を含む。様々な実施形態において、前記プロセスは、本明細書に記載されるような２、３、４、５、又は６つのＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体が存在する場合、処置を必要とするＩＢＤを持つ被験体を識別する工程を含む。様々な実施形態において、ｒｓ２１４９０８５のリスクアレルはＴアレルである。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体は、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体ｒｓ４２９０８３、及び、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、ｒｓ９３６６０９３、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体である。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体は、表２、３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１３におけるＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体のうち１つ以上、及び、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、ｒｓ９３６６０９３、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体である。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５である。様々な実施形態において、本明細書に記載されるような２、３、又は４つのＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５が存在する場合、被験体はＩＢＤと診断される。他の様々な実施形態において、生物学的サンプル中のリスク変異体の検出は、処置を必要とする群へと被験体を層別化する。他の実施形態において、サンプル中の多くのリスク変異体の存在は、被験体が処置を更に必要としていることを示す。幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体の検出は、被験体の処置の必要性を示す。幾つかの実施形態において、被験体は、抗ＴＬ１Ａ治療を必要としていると識別される。様々な実施形態において、被験体は、限定されないが組み換え型のＲＮＡＳＥＴ２及び抗ＩＣＡＭ１などの、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療を必要としていると識別される。様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療は、ＲＮＡＳＥＴ２の上流及び／又は下流にある遺伝子を標的とする抗体又は小分子である。
【００５０】
様々な実施形態において、本明細書で議論されるように、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体の検出は、被験体の生物学的サンプルの核酸を分析することによって遂行され得る。
【００５１】
他の実施形態において、本明細書に記載される被験体の識別及び／又は層別化のプロセスは更に、健康な個体と比べて、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化のレベルを検出するためにサンプルを分析する工程を含む。幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化のレベルが増大した被験体は、処置を必要とする被験体と識別される。幾つかの実施形態において、サンプルは、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化及び１つ以上のＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体のレベルについて評価される。特定の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化が増加し、且つ１つ以上のＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体の存在を持つ被験体は、処置を必要とする被験体と識別される。他の実施形態において、サンプルは、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化のレベル、及びＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γの発現レベルについて評価される。特定の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化が増加し、ＲＮＡＳＥＴ２が減少し、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γが増加した被験体は、処置を必要とする被験体と識別される。特定の実施形態において、被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調節、及び／又は標的とする処置を必要としていると識別される。様々な実施形態処置において、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置は、抗体及び／又はサイレンシングオリゴヌクレオチドを含み得る。幾つかの実施形態において、被験体は、抗ＴＬ１Ａ治療を必要としていると識別される。幾つかの実施形態において、被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化の減少を引き起こす処置を必要としていると識別される。他の様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化の増加の検出は、手術を必要とする重度のＣＤを持つ患者を示す。更なる実施形態において、被験体は、結腸切除及び／又は抗ＴＬ１Ａ治療を含む処置を必要としていると識別される。
【００５２】
他の様々な実施形態において、本明細書に記載される被験体の識別及び／又は層別化のプロセスは、健康な個体と比べて、少なくとも１つの微生物抗原（血清因子（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆａｃｔｏｒ））の増加又は減少を検出するためにサンプルを分析する工程を更に含み得る。幾つかの実施形態において、評価された微生物抗原（血清因子）は、ＡＮＣＡ、ＡＳＣＡ、ＯｍｐＣ、Ｉ２、及びＣＢｉｒを含む。幾つかの実施形態において、サンプルは、１つ以上の微生物抗原（血清因子）及び１つ以上のＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体について評価される。特定の実施形態において、１つ以上のリスク血清因子及び１つ以上のＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体の存在を持つ被験体は、処置を必要とする被験体と識別される。また他の実施形態において、サンプルは、１つ以上のリスク血清因子、及びＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γの発現レベルについて評価される。特定の実施形態において、１つ以上のリスク血清因子を持ち、ＲＮＡＳＥＴ２が減少し、ＴＬ１Ａ及び／又はＩＦＮ−γが増加した被験体は、処置を必要とする被験体と識別される。幾つかの実施形態において、被験体は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調節、及び／又は標的とする処置を必要としていると識別される。様々な実施形態処置において、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置は、抗体及び／又はサイレンシングオリゴヌクレオチドを含み得る。他の実施形態において、処置は抗ＴＬ１Ａ治療である。様々な実施形態において、処置は、限定されないが組み換え型のＲＮＡＳＥＴ２及び抗ＩＣＡＭ１などの、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療である。様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療は、ＲＮＡＳＥＴ２の上流及び／又は下流にある遺伝子を標的とする抗体又は小分子である。
【００５３】
様々な実施形態において、ＩＢＤを持つと診断された被験体は、チオプリン及び抗ＴＮＦ治療の治療不全を実証する。他の様々な実施形態において、ＩＢＤを持つと診断された被験体は外科的介入を必要とすると判定される。他の幾つかの実施形態において、外科的介入は腸切除である。本発明の様々な実施形態はまた、炎症性腸疾患を持つ被験体のための手術を選択する方法を提供し、該方法は：被験体からサンプルを得る工程；ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在の有無を判定するのに適したアッセイにサンプルをさらす工程；ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在に基づいて被験体のＭＲ−ＵＣを診断する工程；及びＭＲ−ＵＣと診断された被験体のために手術を選択する工程を含む。幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、又はｒｓ９３６６０９３である。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体は、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体ｒｓ４２９０８３、及び、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、ｒｓ９３６６０９３、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体である。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体は、表２、３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１３におけるＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体のうち１つ以上、及び、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、ｒｓ９３６６０９３、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体である。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５である。様々な実施形態において、本明細書に記載されるような２、３、又は４つのＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５が存在する場合、被験体はＩＢＤと診断される。幾つかの実施形態において、前記方法は、ＲＮＡＳＥＴ２のメチル化のレベルを判定する工程を更に含む。様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化のレベルが増大した被験体は、手術を必要とする被験体と識別される。他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化が増加し、且つＲＮＡＳＥＴ２遺伝子にて１つ以上のＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体の存在を持つ被験体は、手術を必要とする被験体と識別される。
【００５４】
様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在は、ＲＮＡＳＥＴ２の発現減少に関連付けられる。他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在は、末梢組織及び粘膜組織におけるＲＮＡＳＥＴ２の発現減少に関連付けられる。他の幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在は、疾患管理のために外科的介入を必要とする患者におけるＤＮＡ過剰メチル化に関連付けられる。また他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子の１つ以上のリスク変異体の存在は、チオプリン及び／又は抗ＴＮＦ治療の治療不全に関連付けられる。他の幾つかの実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在は、ＡＮＣＡ血清陽性に関連付けられる。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在は、腸切除の全体的な長さの増大に関連付けられる。
【００５５】
本発明の様々な実施形態は、炎症性腸疾患を持つ被験体のための治療を選択する方法を提供し、該方法は：被験体からサンプルを得る工程；ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在の有無を判定するのに適したアッセイにサンプルをさらす工程；ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在に基づいて被験体の医学的に難治性の潰瘍性大腸炎（ＭＲ−ＵＣ）を診断する工程；及びＭＲ−ＵＣと診断された被験体のための処置としてチオプリン又は抗ＴＮＦを選択せず、治療として手術を選択する工程を含む。様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、又はｒｓ９３６６０９３である。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体は、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体ｒｓ４２９０８３、及び、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、ｒｓ９３６６０９３、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体である。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体は、表２、３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１３におけるＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体のうち１つ以上、及び、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１４１０２９５、ｒｓ９３６６０９３、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されたＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体である。様々な他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体は、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５である。様々な実施形態において、本明細書に記載されるような２、３、又は４つのＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０９２、ｒｓ９３５５６１０、又はｒｓ２１４９０８５が存在する場合、被験体はＩＢＤと診断される。また他の実施形態において、前記方法は更に、ＲＮＡＳＥＴ２のメチル化のレベルを判定する工程を含み、ここで増加したメチル化は、外科的介入を必要とする被験体を示す。
【００５６】
本発明の様々な実施形態は、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体の処置を提供する。ＭＲ−ＵＣ被験体は、抗ＴＮＦ治療、チオプリン治療、コルチコイド及びシクロスポリンなどの、使用される現行の従来の薬物療法では効果が無い。様々な実施形態において、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は、限定されないが、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置などの、従来にない処置で処置される。様々な実施形態処置において、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置は、抗体及び／又はサイレンシングオリゴヌクレオチドを含み得る。様々な実施形態において、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は、限定されないが組み換え型のＲＮＡＳＥＴ２及び抗ＩＣＡＭ１などの、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療を必要とすると判定される。様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療は、ＲＮＡＳＥＴ２の上流及び／又は下流にある遺伝子を標的とする抗体又は小分子である。
【００５７】
＜メチル化の検出＞
様々な実施形態は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を持つ被験体を診断する方法を提供する。幾つかの実施形態において、前記方法は、ＲＮＡＳＥＴ２のメチル化のレベルを判定する工程；及びＩＢＤを持つ被験体をＲＮＡＳＥＴ２メチル化が増加した被験体と識別する工程を含む。他の実施形態において、前記方法は、ＩＢＤを持つ被験体を、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化が増加し、且つＲＮＡＳＥＴ２遺伝子にて１つ以上のリスク変異体の存在を持つ被験体と識別する工程を含む。他の様々な実施形態において、前記方法は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γの発現レベルを判定する工程；及び、ＩＢＤを持つ被験体のＲＮＡＳＥＴ２が減少し、ＴＬ１Ａが増加し、ＩＦＮ−γが増加し、及び／又はＲＮＡＳＥＴ２メチル化が増加する場合に、前記被験体を診断する工程を含む。
【００５８】
様々な実施形態は、処置を必要性とする炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を持つ被験体を識別するプロセスを提供する。幾つかの実施形態において、前記方法は、ＲＮＡＳＥＴ２のメチル化のレベルを判定する工程；及び処置を必要とする被験体をＲＮＡＳＥＴ２メチル化が増加した被験体と識別する工程を含む。他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γの発現レベル、及びＲＮＡＳＥＴ２のメチル化のレベルは、処置を必要とする炎症性腸疾患を持つ被験体を識別するために判定される。様々な実施形態において、前記方法は、処置を必要とする被験体を、ＲＮＡＳＥＴ２が減少し、ＴＬ１Ａが増加し、ＩＦＮ−γが増加し、及び／又はＲＮＡＳＥＴ２メチル化が増加した被験体として判定する工程を含む。他の様々な実施形態において、前記方法は、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在の有無を判定する工程、及び、処置を必要とするＩＢＤを持つ被験体を、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化が増加し且つ１つ以上のＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体の存在を持つ被験体と識別する工程を含む。
【００５９】
様々な実施形態において、メチル化の増加は、外科的介入を必要とする被験体を示す。また他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化の増加は、外科的介入を必要とすることを示す。
【００６０】
メチル化のレベルを検出する様々な方法は、限定されないが、以下のアッセイ、即ち、質量分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＢＳ−Ｓｅｑ）、ＨＥＬＰアッセイ、ＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐアッセイ、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ、ＭｅＤＩＰ−ｃｈｉｐ、ＭｅＤＩＰｓｅｑ）、バイサルファイト処理したＤＮＡのパイロシーケンシング、ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ活性のための分子破壊光アッセイ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅａｋ  ｌｉｇｈｔ  ａｓｓａｙ）、メチル感受性のサザンブロッティング、ＭｅｔｈｙｌＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＰ）及び／又はメチル結合ドメイン（ＭＢＤ）を使用した天然ＤＮＡのメチル化及び非メチル化分画への分離、ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ  ＢｅａｄＣｈｉｐ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ、高解像度融解曲線分析（ＨＲＭ又はＨＲＭＡ）、及び／又は古代ＤＮＡメチル化再構成を含む。
【００６１】
本発明の様々な実施形態は、方法により炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と診断された被験体の処置を提供し、前記方法は、被験体からサンプルを得る工程；ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在の有無を判定するのに適したアッセイにサンプルをさらす工程；及びＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在に基づいて被験体のＩＢＤを診断する工程を含む。様々な実施形態において、炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、又は医学的に難治性の潰瘍性大腸炎である。
【００６２】
本発明の様々な実施形態は、方法により医学的に難治性の潰瘍性大腸炎（ＭＲ−ＵＣ）と診断された被験体の処置を提供し、前記方法は、被験体からサンプルを得る工程；ＲＮＡＳＥＴ２での１つ以上のリスク変異体の存在の有無を判定するのに適したアッセイにサンプルをさらす工程；及びＲＮＡＳＥＴ２遺伝子での１つ以上のリスク変異体の存在に基づいて被験体のＭＲ−ＵＣを診断する工程を含む。
【００６３】
本発明の様々な実施形態は、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体の処置を提供する。ＭＲ−ＵＣ被験体は、抗ＴＮＦ治療及びチオプリン治療などの、使用される現行の従来の薬物療法では効果が無い。様々な実施形態において、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は、限定されないが、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置などの、従来にない処置で処置される。様々な実施形態処置において、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを模倣、調整、及び／又は標的とする処置は、抗体及び／又はサイレンシングオリゴヌクレオチドを含み得る。様々な実施形態において、ＭＲ−ＵＣと診断された被験体は、限定されないが組み換え型のＲＮＡＳＥＴ２及び抗ＩＣＡＭ１などの、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療を必要とすると判定される。様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２媒介性治療は、ＲＮＡＳＥＴ２の上流及び／又は下流にある遺伝子を標的とする抗体又は小分子である。
【００６４】
＜生物学的サンプル、サンプル調製、及び遺伝子発現検出＞
様々な実施形態において、本発明に関与する工程は、被験体から生物学的サンプルを得ることを含む。生物学的サンプルは、外科的生検又は外科的切除の何れかによって得られてもよい。代替的に、サンプルは、主要な患者由来の細胞株、或いは、ＦＦＰＥ（ホルマリン固定、パラフィン包埋）の形態の収録された患者サンプル、又は新鮮な凍結サンプルを介して得ることができる。サンプルはまた、全血、末梢血、血漿、血清、唾液、頬の最終物、又は他の体液或いは組織を含み得る。様々な実施形態において、サンプルは、大腸及び／又は小腸の組織を含む。他の様々な他の実施形態において、大腸サンプルは、盲腸、結腸（上行結腸、横行結腸、下行結腸、及びＳ状結腸）、直腸、及び／又は肛門管を含む。また他の実施形態において、小腸サンプルは、十二指腸、空腸、及び／又は回腸を含む。
【００６５】
本発明の方法において使用され得る被験体の生物学的サンプル（即ち組織及び／又は細胞）から由来する核酸又はタンパク質サンプルは、当該技術分野で周知の手段により調製され得る。例えば、外科手術手順又は針生検吸引が、被験体から生物学的サンプルを集めるために使用され得る。幾つかの実施形態において、正常な組織及び／又は細胞のサンプルから異常な組織及び／又は細胞のサンプルを富化及び／又は精製することが重要である。他の実施形態において、異常な組織及び／又は細胞のサンプルはその後、本発明の方法での使用のために、ゲノム核酸又はｐｒｅ−ＲＮＡの抽出前に正常組織の汚染の量を減らすために顕微解剖され得る。そのような富化及び／又は精製は、針顕微解剖、レーザー顕微解剖、蛍光活性化細胞分類、及び免疫学的細胞選別などの、当該技術分野で周知の方法によって遂行され得る。
【００６６】
個体の核酸及び／又はタンパク質の分析は、様々な技術のうち何れかを使用して実行されてもよい。様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２の遺伝子発現レベルの分析は、ノーザンブロット、逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、ＤＮＡマイクロアレイ、タイリングアレイ、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、又はそれらの組み合わせを含む。他の様々な実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γの遺伝子発現レベルが分析される。他の実施形態において、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化のレベルが判定される。
【００６７】
様々な実施形態において、タンパク質発現を検出する方法及びシステムは、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ラジオイムノアッセイ、及びアフィニティー精製を含む。
【００６８】
遺伝子発現レベルの分析は、ポリメラーゼ連鎖反応による個体の核酸の増幅を含み得る。核酸の増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応の使用は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ．），  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，  Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  （１９９４）を参照）。
【００６９】
「量的」増幅の方法は、当業者に周知である。例えば、量的ＰＣＲは、同じプライマーを使用して、既知量の制御配列をほぼ同時に増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応を較正するために使用され得る内部標準を提供する。量的ＰＣＲのための詳細なプロトコルは、Ｉｎｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．）において提供される。量的ＰＣＲ分析を使用したマイクロサテライト遺伝子座のＤＮＡコピー数の測定は、Ｇｉｎｚｏｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０：５４０５−５４０９に記載されている。遺伝子に関する既知の核酸配列は、当業者が遺伝子の任意の部分を増幅するためにプライマーを慣例的に選択することを可能にするのに十分なものである。蛍光性量的ＰＣＲも、本発明の方法に使用され得る。蛍光性量的ＰＣＲにおいて、定量化は、蛍光シグナル、例えばＴａｑＭａｎ及びサイバーグリーンの量に基づく。
【００７０】
他の適切な増幅方法は、限定されないが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ  （１９８９）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：  ５６０、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７、及びＢａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｇｅｎｅ  ８９：  １１７を参照）、転写増幅（Ｋｗｏｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：  １１７３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：  １８７４）、ドットＰＣＲ、及びリンカーアダプターＰＣＲなどを含む。
【００７１】
ハイブリダイゼーションに適しているＤＮＡサンプルは、例えば、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの断片、アダプター配列にライゲートされたゲノムＤＮＡの断片、又はクローン配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により得ることができる。当該技術分野で周知のコンピュータープログラムは、Ｏｌｉｇｏのバージョン５．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの望ましい特異性及び最適な増幅特性を備えたプライマーの設計において使用され得る。ＰＣＲ方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９０，  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆに記載されている。制御されたロボットシステムが核酸を単離且つ増幅するのに有用であり、且つ使用可能であることは、当業者に明白である。
【００７２】
＜ハイブリダイゼーション＞
本発明の方法で使用される被験体に由来する核酸サンプルは、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γを識別するためにプローブ（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）を含むアレイにハイブリダイズすることができ、例えば、ハウスキーピング遺伝子発現も評価される場合には、選択されたハウスキーピング遺伝子を識別するためにプローブを含む。特定の実施形態において、本発明の方法において使用されるプローブは、ＤＮＡチップの上に葺く（ｔｉｌｅｄ）ことができるプローブのアレイ（例えばＳＮＰオリゴヌクレオチドプローブ）を含む。本発明の方法に使用されるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、本発明によって分析される核酸サンプルが、アレイの相補的なオリゴヌクレオチド配列、好ましくは特定のアレイ部位に特異的に結合又は特異的にハイブリダイズするように選択され、ここで、その相補的ＤＮＡは位置付けられる。幾つかの実施形態において、相補的ＤＮＡは、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのオリゴヌクレオチドアレイにおいて使用されるように、完全に一致され得るか、又はある程度一致しないこともある。アレイの一本鎖合成オリゴデオキシリボ核酸ＤＮＡプローブは、例えば自己相補的な配列が原因で生ずるヘアピン又は二量体を除去するために、被験体からの核酸サンプルとの接触前に変性させられる必要があるかもしれない。
【００７３】
最適なハイブリダイゼーション条件は、プローブの長さ、及び被験体の核酸サンプルのタイプに依存する。核酸の特異的な（即ち厳密な）ハイブリダイゼーション条件の一般的なパラメータは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  ２０１２）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ａｔ  ｐｐ．  ２．１０．１−２．１０．１６に記載されている。典型的な有用なハイブリダイゼーション条件は、例えばＴｉｊｅｓｓｅｎ，  １９９３，  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．  Ｖ．  ａｎｄ  Ｋｒｉｃｋａ，  １９９２，  Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆにて提供される。
【００７４】
＜オリゴヌクレオチド核酸アレイ＞
本発明の方法の幾つかの実施形態において、ＤＮＡアレイは、相補的配列を含むオリゴヌクレオチドプローブへの核酸配列のハイブリダイゼーションのレベルを測定することにより、遺伝子の発現レベルを判定するために使用され得る。オリゴヌクレオチド「プローブ」（即ち、定義された配列を持つ核酸分子）を利用するＤＮＡアレイの様々なフォーマットは、当業者に周知である。典型的に、各々が定義された配列を持つ、核酸プローブのセットは、異なるプローブがそれぞれ予め定められた部位に固定されるような方式で固形支持体上に固定される。特定の実施形態において、プローブのセットは、支持体上で位置的に対処可能な結合（例えばハイブリダイゼーション）部位のアレイを形成する。そのような結合部位の各々は、支持体上で予め定められた部位に結合されるプローブの複数のオリゴヌクレオチド分子を含む。より具体的には、アレイの各プローブは好ましくは、固形支持体上で既知の予め定められた位置に位置付けられ、それにより、各プローブの同一性（すなわち配列）が、アレイ上（即ち支持体又は表面上）でその位置から判定され得る。マイクロアレイは多くの方法で作ることができ、その幾つかは本明細書に記載されている。しかし、生成されたマイクロアレイは、特定の特徴を共有し、それらは複製可能であり、与えられたアレイの複数のコピーが生成され且つ互いに容易に比較することが可能となる。
【００７５】
幾つかの実施形態において、結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）条件下で安定している材料からマイクロアレイが作られる。マイクロアレイは小さいものが好ましく、例えば約１ｃｍ２〜２５ｃｍ２、好ましくは約１〜３ｃｍ２である。しかし、より大きな且つ小さなアレイも考慮され、例えば、非常に多くの異なるプローブを同時に評価するのに好ましい場合もある。オリゴヌクレオチドプローブは、アレイを形成するために支持体上で直接合成され得る。プローブは、固形支持体又は表面に付けることができ、これらは、例えばガラス、プラスチック（例えばポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ゲル、又は他の多孔質或いは無孔質の材料から作られ得る。固定されたプローブのセット又は固定されたプローブのアレイは、標識された核酸種を含有するサンプルと接触させられ、その結果、固定されたプローブに相補的な配列を持つ核酸がプローブにハイブリダイズし、或いは結合する。例えば洗浄による結合していない物質の分離後、結合され標識された配列が検出され、測定される。測定は典型的に、コンピューター支援により行なわれる。ＤＮＡアレイ技術は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γの発現レベル、ハウスキーピング遺伝子、及びＲＮＡＳＥＴ２のメチル化状態を判定することを可能にした。
【００７６】
特定の実施形態において、高密度のオリゴヌクレオチドアレイが本発明の方法に使用される。表面上の定義された位置にて、定義された配列に相補的な何千ものオリゴヌクレオチドを含む、このようなアレイは、例えば、フォトリソグラフィー技術によって表面上にインサイツで合成され得る（例えば、Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３；  Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９１：５０２２−５０２６；  Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１６７５；米国特許第５，５７８，８３２号；５，５５６，７５２号；５，５１０，２７０号；５，４４５，９３４号；５，７４４，３０５号；及び６，０４０，１３８号を参照）。インサイツのオリゴヌクレオチド合成のためにインクジェット技術を使用してアレイを生成する方法も、当該技術分野で知られている（例えば、Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ９８／４１５３１，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｓｅｐ．  ２４，  １９９８；  Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １１：６８７−６９０；  Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，  １９９８，  ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  ２０，  Ｊ．  Ｋ．  Ｓｅｔｌｏｗ，  Ｅｄ．，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  １１１−１２３を参照）。Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０）によって一般的に記載されるように、表面に核酸を付ける別の方法は、ガラス板上に印刷することによって行われる。例えばマスキングによってマイクロアレイを作る他の方法（Ｍａｓｋｏｓ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  １９９２，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２０：１６７９−１６８４）も、使用され得る。これらの方法が使用されると、既知の配列のオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜６０−ｍｅｒｓ）は、誘導化されたスライドガラスなどの表面上で直接合成される。生成されたアレイは冗長となる場合があり、様々なオリゴヌクレオチド分子が対照の各情報の遺伝子座（例えばＳＮＰ、ＲＦＬＰ、ＳＴＲなど）に対応する。
【００７７】
ＤＮＡアレイのオリゴヌクレオチドプローブを生成するための１つの典型的な手段は、例えばＮ−ホスホン酸塩又はホスホラミダイト化学物質を使用した合成ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの合成によって行われる（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １４：５３９９−５４０７；  ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２４：２４６−２４８）。合成配列は典型的に、長さが約１５〜約６００ベース、より典型的には約２０〜約１００ベース、最も好ましくは約４０〜約７０ベースである。幾つかの実施形態において、合成核酸は、限定されないがイノシンなどの非天然塩基を含む。上述のように、核酸アナログは、ハイブリダイゼーションのための結合部位として使用されてもよい。適切な核酸アナログの一例はペプチド核酸である（例えば、Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：５６６−５６８；米国特許第５，５３９，０８３号を参照）。代替的な実施形態において、ハイブリダイゼーション部位（即ちプローブ）は、ＳＮＰ又はその補体に対応するゲノムＤＮＡの領域のプラスミド又はファージのクローンから作られる。本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチドプローブの大きさは、長さが少なくとも１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０のヌクレオチドであり得る。ハイブリダイゼーションは相補的配列には選択的であるが、完全に相補的でない他の配列も幾つかのレベルで与えられたプローブにハイブリダイズし得ることは、当該技術分野で周知である。故に、わずかな変化が伴う多数のオリゴヌクレオチドプローブは、サンプルのハイブリダイゼーションを最適化するために使用され得る。ハイブリダイゼーションを更に最適化するために、ハイブリダイゼーションの厳密条件、例えばハイブリダイゼーション温度及び塩濃度は、当該技術分野で周知の方法により変更されてもよい。
【００７８】
様々な実施形態において、本発明の方法に使用される高密度オリゴヌクレオチドアレイは、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γに対応するオリゴヌクレオチド、及びハウスキーピング遺伝子を含む。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドはメチル化されたＲＮＡＳＥＴ２に相当する。オリゴヌクレオチドプローブは、被験体のゲノムにおける対象の各情報の遺伝子座（例えばＳＮＰ、ＲＦＬＰ、ＳＴＲなど）の一部に対応するＤＮＡ又はＤＮＡ「模倣体」（例えば誘導体及びアナログ）を含み得る。オリゴヌクレオチドプローブは、塩基部分、糖部分、又はリン酸主鎖にて修飾され得る。典型的なＤＮＡは、例えばホスホロチオエートを含む。各ＳＮＰ遺伝子座について、試料核酸の配列に相補的な、複数の異なるオリゴヌクレオチドが使用され得る。例えば、対象の単一の情報の遺伝子座（例えばＳＮＰ、ＲＦＬＰ、ＳＴＲなど）について、約２３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、又はそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドが、使用され得る。対象の特定の情報の遺伝子座のためのオリゴヌクレオチドの各々は、完全な一致、誤った一致、及びＳＮＰの周囲の隣接する配列においてわずかな変動を備え得る。特定の実施形態において、プローブは、対象の特定の情報の遺伝子座のためのプローブが、標的部位を含むゲノムの領域におよぶか、又はそれにわたって葺かれるオーバーラッピング配列及び／又は連続オーバーラッピング配列を含み、ここでプローブは全て標的部位を含む。一例として、オーバーラッピングプローブ配列は、予め定められた塩基の間隔の工程、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の塩基の間隔の工程で葺くことができる。特定の実施形態において、アッセイは、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  ８，  Ｒ２４６によって記載されるものなどの分子反転プローブプロトコルとの使用に適しているアレイを使用して、実行され得る。非常に類似した（即ち、相同の）配列の核酸種にて標的とされたオリゴヌクレオチドプローブについて、同様のプローブ中の「交差反応」は、ハイブリダイゼーション測定の結果をかなり損ない、且つ混乱させかねない。検出される配列（即ち、特定のＳＮＰ）が、単一のヌクレオチドのみによって異なる他の配列と区別されなければならないので、クロスハイブリダイゼーションは、ＳＮＰの検出において特に重要である。クロスハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションの厳密条件を調節することにより、及び／又はハイブリダイゼーション後の洗浄中に最小限にされ得る。非常に厳密な条件により、ヌクレオチド配列のアレル変異体、例えば１０−３０のヌクレオチド当たり約１つの誤った一致の検出を可能にする。全ての異なる核酸配列に最適な単一のハイブリダイゼーションも洗浄条件も存在せず、これら条件は、製造業者により示唆されたものと同一でもよく、或いは当業者によって調整され得る。幾つかの実��形態において、本発明の方法に使用されるプローブは、チップと呼ばれるスライドガラス上で固定される（即ち、葺かれる）。例えば、ＤＮＡマイクロアレイは、オリゴヌクレオチド（溶液中の精製された一本鎖ＤＮＡ配列）が（ほぼ）長方形のアレイにおいてロボット印刷されたチップを含むことができ、アレイ上の各スポットはオリゴヌクレオチドをコードする単一のＤＮＡサンプルに対応する。要するに、前記プロセスは、ハイブリダイゼーションがスライド配列と標識されたサンプルとの間に生じるのに適切な条件下で標識されたサンプルでＤＮＡマイクロアレイチップを溢れさせる工程（ｆｌｏｏｄｉｎｇ）を含み、その後、アレイは洗浄されて乾燥され、ハイブリダイゼーションを検出するためにレーザー顕微鏡で走査される。特定の実施形態において、プローブがアレイ上に現われる、少なくとも２５０、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、２９，０００、３０，０００、３１，０００、３２，０００、３３，０００、３４，０００、３５，０００、３６，０００、３７，０００、３８，０００、３９，０００、４０，０００、４１，０００、４２，０００、４３，０００、４４，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、又はそれ以上、或いはその中間の範囲の、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γ、或いはハウスキーピング遺伝子が存在する（単一の遺伝子座のためのマッチ／ミスマッチのプローブ、或いは対象の１つの遺伝子座として数える対象の単一の遺伝子座にわたって葺かれるプローブを伴う）。アレイごとに探索されるＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γ、或いはハウスキーピング遺伝子の最大数は、被験体の種のゲノム及び遺伝子の多様性の大きさによって判定される。ＤＮＡチップは当該技術分野で周知であり、特定の種に特異的な配列を持つ、ｐｒｅ−５の作り上げられた形態で購入することができる。他の実施形態において、ＳＮＰ及び／又はＤＮＡコピー数は、更に上述されるように、「次世代配列決定方法」などの配列決定方法を使用して検出し且つ定量化され得る。
【００７９】
標識化
幾つかの実施形態において、タンパク質、ポリペプチド、核酸、それらの断片、或いは、本発明の方法に使用されるアダプター領域へライゲートされたそれらの断片は、検出可能に標識される。例えば、検出可能な標識は、例えばヌクレオチドアナログの組み込みによる蛍光標識であり得る。本発明で使用するのに適切な他のラベルは、限定されないが、ビオチン、イミノビオチン、抗原、補助因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン化合物、検出可能なポリペプチド、電子の豊富な分子、基質に対する作用により検出可能なシグナルを生成することができる酵素、及び放射性同位体を含む。
【００８０】
本発明の方法と共に使用され得る放射性同位体は、限定されないが３２Ｐ及び１４Ｃを含む。本発明に適切な蛍光分子は、限定されないが、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、テキサスレッド、５’カルボキシ−フルオレセイン（「ＦＡＭ」）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（「ＪＯＥ」）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシ−ローダミン（「ＴＡＭＲＡ」）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（「ＲＯＸ」）、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＩＲＤ４０、及びＩＲＤ４１を含む。
【００８１】
本発明に係る使用に適している蛍光分子は更に以下を含む：限定されないがＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、ＣＹ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、及びＦＬＵＯＲＸを含む、シアミン色素；限定されないがＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−６３０／６５０、及びＢＯＤＩＰＹ−６５０／６７０を含む、ＢＯＤＩＰＹ色素；及び、限定されないがＡＬＥＸＡ−４８８、ＡＬＥＸＡ−５３２、ＡＬＥＸＡ−５４６、ＡＬＥＸＡ−５６８、及びＡＬＥＸＡ−５９４を含む、ＡＬＥＸＡ色素；その他に、当業者に既知の他の蛍光染料。本発明に適切な電子が豊富なインジケーター分子は、限定されないが、フェリチン、ヘモシアニン、及びコロイド金を含む。
【００８２】
二色の色蛍光標識及び検出のスキームも使用され得る（Ｓｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０）。２つ以上の標識の使用は、実験条件（例えばハイブリダイゼーション条件）における僅かな相違による変動を検出するのに有用であり得る。本発明の幾つかの実施形態において、異なる色の少なくとも５、１０、２０、又は１００の色素が、標識化のために使用され得る。そのような標識化はまた、本発明により包含される多数のサンプルの分析を同時に可能とする。
【００８３】
標識された核酸サンプル、その断片、或いは、本発明の方法に使用され得るアダプター領域へライゲートされたその断片は、プローブに相補的な配列を持つサンプル核酸がそれにハイブリダイズすることを可能にする条件下で、複数のオリゴヌクレオチドプローブに接触させられる。使用される標識のタイプにより、ハイブリダイゼーションシグナルは、Ｘ線フィルム、ホスフォイメージャー、又はＣＣＤカメラを含むがこれらに限定されない、当業者に周知の方法を使用して検出され得る。蛍光標識されたプローブが使用される時、転写アレイの各部位での蛍光放射は、共焦点のレーザー顕微鏡の走査によって検出することが好ましい場合もある。１つの実施形態において、適切な励起線を使用する別個の走査が、使用される２つのフルオロフォアの各々について実行される。代替的に、２つのフルオロフォアに特異的な波長で同時の標本の証明を可能にするレーザーが使用され得、２つのフルオロフォアからの照射は同時に分析され得る（Ｓｈａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ６，  ６３９−６４５を参照）。好ましい実施形態において、アレイは、コンピューターで制御されたＸ−Ｙステージ及び顕微鏡対象を備えたレーザー蛍光スキャナーで走査される。２つのフルオロフォアの連続する励起は、多重線の混合ガスレーザーで達成され、放たれた光は波長により分割され、２つの光電子増倍管で検出される。そのような蛍光レーザースキャニングデバイスは、例えば、Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ６，  ６３９−６４５に記載されている。代替的に、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １４，  １６８１−１６８４により記載されるものなどの光ファイバー束が使用され得る。その後、結果として生じるシグナルは、コンピューターソフトウェアを使用して、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γ、及びハウスキーピング遺伝子の発現を判定するために分析され得る。
【００８４】
他の実施形態において、被験体のゲノムＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼを使用して断片化され且つ分析の前に増幅される場合、増幅は、被験体のゲノムＤＮＡのクローニング部位を含み得る。そのような方法において、ＤＮＡ領域の増幅は、クローニングプロセスを通じて達成される。例えば、発現ベクターは、被験体のゲノムＤＮＡの大量の特定の断片を発現するように操作され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  ２０１２））。
【００８５】
また他の実施形態において、制限エンドヌクレアーゼを使用して被験体のＤＮＡが断片化され、分析前に増幅される場合、増幅は、被験体の遺伝子、或いは核酸の遺伝子及び隣接するゲノム領域をコードする核酸を発現することを含む。その後、イントロンを含む転写物全体を含んでいるＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ前駆体）は単離され、癌の遺伝子シグネチャを分析且つ提供するために本発明の方法に使用される。特定の実施形態において、増幅は必要とされない。そのような実施形態において、被験体のゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡ前駆体は、制限エンドヌクレアーゼ又は他の方法を使用して断片化され得る。結果として生じる断片はＳＮＰプローブにハイブリダイズされ得る。典型的に、より大量のＤＮＡは、断片が増幅される場合に必要とされるＤＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体の量との比較において単離される必要がある。例えば、被験体の核酸が増幅されない場合、ハイブリダイゼーションに使用される被験体のＤＮＡサンプルは、約４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１０００ｎｇ、或いはそれよりも大きなＤＮＡであり得る。代替的に他の実施形態において、分子反転プローブ（ＭＩＰ）アッセイに使用されるものなど、４００ｎｇ、３００ｎｇ、２００ｎｇ、１００ｎｇ、９０ｎｇ、８５ｎｇ、８０ｎｇ、７５ｎｇ、７０ｎｇ、６５ｎｇ、６０ｎｇ、５５ｎｇ、５０ｎｇ、或いはそれよりも下などの分析のための非常に少量の核酸を必要とする方法が、使用される。これらの技術は、容易に利用可能ではあるが通常はＤＮＡの質が低く（例えば、小さな断片化されたＤＮＡ）及び／又は大量の核酸を提供しないことを特徴とする、パラフィン包埋・ホルマリン固定された物質或いは小さなコアニードル生検などの、臨床サンプルを分析するのに特に有用である。
【００８６】
一旦発現レベルが判定されると、結果として生じるデータは、当業者により使用される周知の方法に基づいて様々なアルゴリズムを使用して分析され得る。
【００８７】
＜キット＞
本発明はまた、ＩＢＤを持つ被験体を診断し且つ処置を必要とする被験体を識別するためのキットにも関連する。キットは、被験体を診断する及び／又は処置を必要とする被験体を識別する、創造性のある方法を実行するのに有用である。キットは、創造性のある組成物の少なくとも１つを含む、物質又は成分の構築物である。故に、幾つか実施形態において、キットは、上述のようにＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γのためのプライマー及びプローブを含む組成物を含んでいる。
【００８８】
創造性のあるキットにおいて構成された成分の正確な性質は、その使用目的に依存する。例えば、幾つかの実施形態は、リスク変異体及び／又は遺伝子発現レベルを評価するために構成される。幾つかの実施形態において、キットは、サンプル中のＲＮＡＳＥＴ２の遺伝子発現レベルを検出するように構成される。また他の実施形態において、キットは、サンプル中のＲＮＡＳＥＴ２及び／又はＴＬ１Ａの遺伝子発現レベルを検出するように構成される。他の幾つかの実施形態において、キットは、サンプル中のＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、及び／又はＩＦＮ−γの遺伝子発現レベルを検出するようにされる。他の様々な実施形態において、キットは、サンプル中のＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体を検出するように構成される。また他の実施形態において、キットは、サンプル中のＲＮＡＳＥＴ２メチル化のレベルを検出するように構成される。１つの実施形態において、キットは、特に哺乳動物被験体を評価するために構成される。別の実施形態において、キットは、特にヒト被験体を評価するために構成される。更なる実施形態において、キットは、限定されないが家畜、家庭動物、及び実験動物などの被験体を評価する、獣医学的な用途のために構成される。
【００８９】
使用説明書がキットに含まれ得る。「使用説明書」は典型的に、ＩＢＤを持つ被験体を診断及び／又は処置を必要とするＩＢＤを持つ被験体を識別するなど、望ましい結果を達成するためのキットの構成要素を使用する際に利用される技術を説明する、手に触れることのできる表現を含む。随意に、キットはまた、プライマー、希釈剤、バッファー、ピペッティングツール又は測定ツール、或いは当業者により容易に認識されるような他の有用な道具一式など、他の有用な構成要素を含む。
【００９０】
キットにおいて組み立てられた物質又は構成要素は、従事者に提供され、それらの操作性と有用性を維持する好都合且つ適切な方法で保管され得る。例えば、構成要素は、溶かされ、脱水され、或いは凍結乾燥された形態の場合があり；室温、冷蔵温度、又は冷凍温度で提供され得る。構成要素は典型的に適切な包装材料に含まれる。本明細書で利用されるように、句「包装材料」は、創造性のある組成物などの、キットの内容物を収容するために使用される１つ以上の物理構造を指す。包装材料は、好ましくは無菌の汚染物質が無い環境を提供するために、周知の方法で構築される。キットに利用される包装材料は、遺伝子発現アッセイに慣習的に利用されるものである。本明細書で使用されるように、用語「包装」は、個々のキットの構成要素を保持することができる、ガラス、プラスチック、紙、ホイルなどの適切な固体マトリクス又は物質を指す。故に、例えば、包装は、ＲＮＡＳＥＴ２、ＴＬ１Ａ、ＩＦＮ−γ、及び／又はＲＮＡＳＥＴ２メチル化のためのプライマー及びプローブを含んでいる適切な量の創造性のある組成物を含むように使用される、ガラスバイアルであり得る。包装材料には通常、内容物、及び／又は、キット及び／又はその構成要素を示す外部ラベルがある。
【００９１】
＜実施例＞
次の実施例は本特許請求の発明をよりよく例示するために提供され、本発明の範囲を制限するとは解釈されるべきではない。特定の材料が言及される点では、これは単に例示のためでしかなく、本発明を制限することを意図しない。当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の能力を発揮することなく同等の手段または反応物を開発することができる。
【００９２】
＜実施例１＞
ゼブラフィッシュのＲＮＡＳＥＴ２の欠損は、リソソーム内に消化されていないｒＲＮＡの蓄積をもたらす。ＲＮＡＳＥＴ２のメジャーアレルは（ｉ）ＩＢＤ、ＣＤ（ｒｓ９３５５６１０）、Ｂ１ならびにＡＮＣＡレベルおよびｐｏｓ／ｎｅｇ（ｒｓ１４１０９２５））の両方についてリスクであり、（ｉｉ）Ｂ３ならびにＡＳＣＡ  ＩｇＡおよびＩｇＧレベルとｐｏｓ／ｎｅｇ（ｒｓ１４１０９２５）との両方に対し保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）である（表２）。メジャーアレルｒｓ９３５５６１０は、ＣＤの小腸および直腸と、ＥＢＶにより形質転換したＢ細胞と、ＩＢＤ患者由来のＣＤ３＋ＰＢＬと、における低レベルのＲＮＡＳＥＴ２  ｍＲＮＡ発現と関連している。メジャーアレルはまた、ＣＤのＳ状結腸中のＲＮＡＳＥＴ２  ｍＲＮＡに関連している。低レベルのＲＮＡＳＥＴ２およびｐＡＮＣＡのレベルの上昇はメジャーアレルに関連する。ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子座におけるメチル化は、ＲＮＡＳＥＴ２  ｍＲＮＡ発現と逆相関する。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
【表３】
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【００９５】
【表４】
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【００９６】
【表５】
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【００９７】
【表６】
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【００９８】
【表７】
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【００９９】
【表８】
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【０１００】
【表９】
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【０１０１】
【表１０】
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【０１０２】
【表１１】
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【０１０３】
【表１２】
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【０１０４】
【表１３】
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【０１０５】
アレルのリスクはオッズ比（ＯＲ）によって定義される。Ａ１アレルおよびＯＲ＜１が示されている場合、メジャーアレルがリスクアレルである（Ａ２はリスクである）。ＯＲが＞１である場合、マイナーアレル（Ａ１）がリスクアレルである。Ａ１およびオッズ比を知ることで、どのアレルがリスクであり、どのアレルが保護か、判定することができる。
【０１０６】
＜実施例２＞
増強されたＩＦＮ−γ発現による炎症のＴＬ１Ａ増大の分子メカニズムを、ＲＮＡｓｅｑを使用して定義した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を未処置状態で分析し、または、１ｕｇスケールでＩＬ１２およびＩＬ１８、または、ＩＬ１２およびＩＬ１８およびＴＬＡ１で処置した。１０ｎｇスケールで、ＩＦＮ−γの有無にかかわらず、ＩＬ１２およびＩＬ１８およびＴＬＡ１で処理した場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞を分析した。ＲＮＡｓｅｑデータプレスクリーンにより、全ての失敗したプローブデータ、すなわちＦＰＫＭが５より上のサンプルが３つ未満の全ての遺伝子を除去した。この基準を使用して８６９５個の遺伝子がプレスクリーンを通過し、ＢＲＢ  Ａｒｒａｙ  Ｔｏｏｌｓを、ペアードサンプルを使用するクラス比較に用いた。
【０１０７】
本発明者らは、分子レベルで、ＴＬ１Ａ処置が、ＲＮＡＳＥＴ２の減少した発現を媒介することに加えて、ＩＦＮ−γの増強された発現を媒介することを実証する。ＲＮＡＳＥＴ２の発現の減少は、ＣＤ患者において、１）慢性的に活性な疾患、２）外科的介入を必要とする難治性の疾患、３）抗ＴＮＦ療法にナイーブな患者、により検出され、４）ＯｍｐＣ＋、ＡＮＣＡ−血清学的因子と関係しており、かつ、５）ＲＮＡＳＥＴ２リスクＳＮＰ  ｒｓ９３５５６１０、ｒｓ１８１９３３３、ｒｓ２１４９０８５に関係している。
【０１０８】
＜実施例３＞
ＴＮＦＳＦ１５およびそれがＴＬ１Ａをコードするタンパク質は、ＩＢＤと関連し、粘膜炎症の重要な媒介物質である。ＩＢＤ患者において、上昇したＴＬ１Ａレベルは、疾患の重症度および遺伝子型と関連する。ＴＬ１Ａは、ＩＦＮ−γ産生の増強を媒介する。ＴＬ１Ａ応答バイオマーカーを、ＲＮＡｓｅｑによって同定し、正常なもの（ＮＬ）と比較して、ＩＢＤ患者（２０人のクローン病患者［ＣＤ］、２０人の潰瘍性大腸炎患者［ＵＣ］）から単離されたＴ細胞におけるｑＰＣＲによって確認した。ＮＬおよびＩＢＤ患者由来のサンプルのさらなるコホートを用いて、ＧＷＡＳのコンテクストにおける発現／メチル化の量的形質遺伝子座（ｅＱＴＬ  ／  ｍＱＴＬ）を検証および測定した。ＲＮＡｓｅｑ発現クラスタリングは、処置されていない細胞に対して処置されたＴＬ１Ａを分化させた。ＲＮＡＳＥＴ２、すなわち細胞外のＴ２ＲＮａｓｅをコードする遺伝子は、ＴＬ１Ａ処置後にダウンレギュレートされた。従来の研究ではＲＮＡＳＥＴ２とＣＤに対する感受性とを関連させていた。ＣＤ患者におけるＲＮＡＳＥＴ２発現は、軽度の疾患に対しての「重症」な疾患、すなわち複数の疾患の再燃（ｐ＜０．００９）、医学的に難治性のもの（ｐ＜０．０２４）においては、より低かった。増強されたＴＬ１Ａ発現、ｒｓ６４７８１０８、ｒｓ６４７８１０９およびｒｓ７８４８６４７（ｐ＝０．０１）に関連する、ＲＮＡＳＥＴ２  ｒｓ１８１９３３３（ｐ＝０．０１５）およびＴＮＦＳＦ１５アレルの疾患リスクアレルは、ＲＮＡＳＥＴ２発現の減少と相関していた。さらに、ＲＮＡＳＥＴ２のｓｉＲＮＡサイレンシングはＴＬ１Ａ媒介ＩＦＮ−γ分泌を増強した。いかなる理論にも拘束されるものではないが、発明者らは、ＲＮＡＳＥＴ２のダウンレギュレーションが、ＴＬ１Ａに起因する重度のＣＤの特徴であると考えている。
【０１０９】
ＲＮＡＳＥＴ２発現およびＤＮＡメチル化を、ＮＬ、ＣＤまたはＵＣ患者由来の新たに単離された非刺激Ｔ細胞の別のコホートにおいて試験した。ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子座のメチル化はｍＲＮＡ発現と逆相関していた。ＲＮＡＳＥＴ２アレルのｅＱＴＬは発現の減少に関連していた。外科的介入を必要とする重度の疾患を有するＣＤ患者において、ＮＡＳＥＴ２メチル化の有意な増強が観察された（表１４）。ＮＬまたは軽度の疾患を有する患者においては、相関は観察されなかった。同様に、ＲＮＡＳＥＴ２メチル化の増加は、ＴＬ１Ａ発現の増強に関連するＴＮＦＳＦ１５リスクアレルと関連していた（表１４）。後成的に、ＲＮＡＳＥＴ２  ｅＱＴＬ／ｍＱＴＬ領域は、ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ａｃおよびＤＮａｓｅ  ＨＳ活性化部位と重複している。この領域は、ＮＦκＢ、ｊｕｎ、ＡＴＦ３およびＣＥＢＰＤの転写因子結合と共局在し、これらの全てがＴＬ１Ａ治療に応答してアップレギュレートされる。該結果は、ＩＦＮ−γ産生の調節に関与するＴＬ１Ａ応答遺伝子としてＲＮＡＳＥＴ２を同定する。重度の疾患を有するＣＤ患者では、過剰メチル化およびＲＮＡＳＥＴ２の発現の低下があり、これは、ＴＬ１Ａに対するインビボでの事前暴露を反映している可能性がある。したがって、いかなる理論にも拘束されるものではないが、本発明者らは、ＲＮＡＳＥＴ２が、抗ＴＬ１Ａ治療から利益を受ける可能性が最も高いＣＤ患者のサブセットを同定するための新規な潜在的な疾患重症度バイオマーカーとして機能すると考えている。
【０１１０】
【表１４】
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【０１１１】
本発明者らは、さらに１１のＵＣ  ＣＤ３＋ＰＢＴ（医学的に難治性）、４３のＣＤ  ＣＤ３＋ＰＢＴ（２３は医学的に難治性であり、２０は軽度）および１７の正常なＣＤ３＋ＰＢＴを含む、患者の３つのコホートを分析した。サンプルをＩｎｆｉｎｉｕｍ  ４５０  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ａｒｒａｙで実行し、１１個のＣＤと、１２個のＵＣと、４個のＮＬサンプルとをＩｎｆｉｎｉｕｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙで実行した。本発明者らは、ＲＮＡＳＥＴ２発現がＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＬ１Ａ処理後に減少し、ＲＮＡＳＥＴ２のサイレンシングがＴＬ１Ａ媒介ＩＦＮ−γ分泌を増強することを実証する。
【０１１２】
【表１５】
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【０１１３】
後成的な研究は、ＲＮＡＳＥＴ２  ｅＱＴＬ／ｍＱＴＬ領域が、１）ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ａｃの後成的活性化部位と重なり、２）ＤＮａｓｅ  ＨＳの後成的活性化部位と重なり、３）ＮＦκＢ、ｊｕｎ、ＡＴＦ３およびＣＥＢＰＤに結合する転写因子と共局在し、これらはすべてＴＬ１Ａ治療に応答してアップレギュレートされることを立証した。さらに、末梢血由来の初代Ｔメモリー細胞中のエンハンサーエレメント、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞中のＤＮＡｓｅ  ＨＳ部位、および、ｅＱＴＬ  ＲＰＳ６ＫＡ２単球は、ｒｓ１８１９３３３アレルに結びついていた。
【０１１４】
＜実施例４＞
ＴＬ１ＡはＩＬ−１２／ＩＬ−１８と相乗作用して、ＩＦＮ−γ発現の急速（６〜８時間以内の）かつ顕著な増強をもたらす。ＲＮＡｓｅｑ分析を用いて、ＩＦＮ−γ発現を調節するＴＬ１Ａ応答遺伝子を同定した。ＴＬ１Ａが活性化した総ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において、２０の遺伝子が差次的に発現された（少なくとも２倍）。これは、主に、ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞が総ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の非常に小さなサブセット（１−３％）のみを構成するという事実による（図１５）。健康なドナー由来のＣＤ４  Ｔ細胞をＩＬ１２／ＩＬ１８およびＴＬ１Ａで８時間処理し、次いで、ＩＦＮ−γ分泌サブセットおよび非分泌サブセット（図１５）にソートし、および、ｍＲＮＡの全ゲノム転写分析（ＧＷＡＳ）を実行した。８０７５発現遺伝子セット全体の教師なし階層的クラスタリングは、ＴＬ１Ａ媒介ＩＦＮ−γ分泌サブグループと非分泌サブグループとを明確に区別した（図１６）。
【０１１５】
発現レベルに基づくＩＦＮ−γ分泌サブグループおよび非分泌サブグループを分類するクラス予測分析を実施した。最良の予測因子転写リストは、ＩＦＮ−γ分泌サブセットの間で少なくとも２倍の差次的発現を有する７６４個の遺伝子からなっていた（ｐ値＜０．００００５）（図１７）。遺伝子オントロジー解析により、差次的に発現された遺伝子が、プロテアソーム、アポトーシス、ＲＮＡ発現およびＴ細胞受容体シグナル伝達に関連する経路において富化され、インフリキシマブの下流標的であった（活性化ｚスコア＝−４、ｐ値＝２ｅ−１５）ことが示された。ＧＷＡＳは多数のＩＢＤリスク変異体ＳＮＰを同定した。これらは、他の領域の予測遺伝子の割合と比較して、ＩＢＤリスクＳＮＰ（１４％対９％、ｐ値＝３．３ｅ−６）から０．５ＭＢ以内に位置する転写産物の割合が有意に増加した。実際、差示的に発現された転写産物は、すべてのＩＢＤリスク関連領域の３４％にマッピングされた（図１８）。いかなる理論にも拘束されるものではないが、データは、ＩＦＮ−γ発現のＴＬ１Ａ媒介調節においてのみならず、ＩＢＤ感受性および病因を調節する寄与因子としての、これらの遺伝子に対する強い寄与を示した。
【０１１６】
ＩＢＤリスク遺伝子座に関連する差示的に発現される予測因子転写産物の有意性および規模を視覚化するボルケーノプロットは、候補の遺伝子に優先順位を付けることを可能にした（図２０）。これらの遺伝子のうち、ＴＬ１Ａ媒介ＩＦＮ−γ発現は、最も有意にアップレギュレートされていることが確認され、ＲＮＡＳＥＴ２が最も有意にダウンレギュレーションされたものとして確認された（図２０）。リボヌクレアーゼのＲｈ／Ｔ２／ＳファミリーのメンバーであるＲＮＡＳＥＴ２は、発現において５倍を超えるＴＬ１Ａ媒介ダウンレギュレーションを示す唯一のＩＢＤリスク関連遺伝子であった。ＲＮＡＳＥＴ２は潜在的なＩＢＤリスク遺伝子としてＧＷＡＳに同定された。ＩＢＤ病因におけるＲＮＡＳＥＴ２の機能的な役割が未知であったため、ＩＢＤにおけるＲＮＡＳＥＴ２発現のレギュレーションが試験された。いかなる理論にも拘束されるものではないが、本発明者らは、ＲＮＡＳＥＴ２が「クラス予測因子（ｃｌａｓｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）」遺伝子であるため、総ＣＤ４＋Ｔ細胞において差示的発現を検出できると考えている。ＣＤ、ＵＣ患者またはＮＬ対照由来の休止細胞またはＩＬ１２／ＩＬ１８処理ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、ＲＮＡＳＥＴ２レベルをＴＬ１Ａの存在下または非存在下で８時間比較した。図７に見られるように、ＮＬドナー由来の細胞において観察されたものとは対照的に、ＩＢＤ患者は、ＴＬ１Ａが媒介する、ＲＮＡＳＥＴ２発現レベルの低下を示さなかった。むしろ、低下したＲＮＡＳＥＴ２の発現レベルは、軽度の疾患経過と比較して「重度」のＣＤ患者に伴っていた。ＲＮＡＳＥＴ２発現は、１年あたり複数の疾患の再燃を示すＣＤ患者から単離された細胞において有意に低く（ｐ＜０．００１）（図８−１のＡおよび図８−２のＣ）、および、同様に、疾患管理のために外科的介入を必要とする医学的に難治性のＣＤ患者において、ＲＮＡＳＥＴ２発現の低下が検出された（ｐ＜０．０２４）（図８−１のＢ）。同様の傾向がＵＣ患者に見られた。
【０１１７】
遺伝子発現量的形質（Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ）（ｅＱＴＬ）を、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子変異体と遺伝子転写産物発現レベルとの間の機能的な相関を特徴づけるために行なった。コーカサス人においてしているタグ付けＩＢＤリスクＳＮＰ、すなわちｒｓ１８１９３３３、および、ＣＤ韓国人集団において同定されたｒｓ２１４９０８５は、両方とも、ＲＮＡＳＥＴ２プロモーター領域内にあり、転写開始部位から約−３．５ｋｂ以内に位置する。さらなるプロモーターＳＮＰ、すなわちｒｓ９３５５６１０は、グレーブの自己免疫性甲状腺疾患の感受性に関連することが示されている。ＣＤ患者から単離した末梢血において、ＲＮＡＳＥＴ２疾患リスクアレルｒｓ１８１９３３３（ｐ＝０．０１５）およびｒｓ２１４９０８５（ｐ＝０．０１５）、ならびにｒｓ９３５５６１０（ｐ＝０．０４）はｅＱＴＬを示し、ＲＮＡＳＥＴ２発現の減少と相関した（図９）。いかなる理論にも拘束されるものではないが、データは、ＲＮＡＳＥＴ２のダウンレギュレーションがＩＦＮ−γ発現を変化させる経路を示した。ＩＦＮ−γ発現のレギュレーションにおけるＲＮＡＳＥＴ２の機能的な役割を、ｓｉＲＮＡ媒介サイレンシングを使用して確認した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＲＮＡＳＥＴ２  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、次に、ＩＬ１２／ＩＬ１８およびＴＬ１Ａで処置した。ＲＮＡＳＥＴ２  ｍＲＮＡ自体の発現は、ＲＮＡＳＥＴ２  ｓｉＲＮＡによる６０−７０％の阻害を表示した（図２１Ａ）。平行して、対照のスクランブルｓｉＲＮＡと比較して、ＲＮＡＳＥＴ２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞では、ＩＦＮ−γ発現の有意な増強（＞１．５倍）が見られた（図２１Ｂ）。
【０１１８】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、発明者らは、クローン病の病因におけるＩＦＮ−γの中心的な役割を考慮すると、これらのデータは、ＲＮＡＳＥＴ２のダウンレギュレーションが、ＴＬ１Ａに起因する重度のＣＤのバイオマーカーとして役立つことを総括的に示している、と考える。ＲＮＡＳＥＴ２発現を、ＮＬ、ＣＤおよびＵＣ患者からの新たに単離された未刺激のＴ細胞の別個のコホートで検討した。ＤＮＡメチル化は遺伝子発現に影響を及ぼし、ほとんどの疾患リスク遺伝子多型は、後生的な修飾を受ける領域内の、転写されたエキソームの外側にマッピングされるため、ＲＮＡＳＥＴ２のＤＮＡメチル化状態も同様に調べた。ＣＤおよびＵＣ患者からの未刺激Ｔ細胞では、ＩＦＮγ発現レベルとＲＮＡＳＥＴ２の間で逆相関が観察された（図２２）。さらに、図１０で見られるように、主に転写開始部位（ＴＳＳ）の上流および下流５０ｋｂ以内に、距離に反比例する、発現とメチル化との間の有意な負の相関があった。さらに、ＩＢＤ疾患リスク遺伝子変異体と、メチル化および発現レベルに相関する領域との間に重大な重複があった（図１０）。最も強い相関（ｐ＝８．５×１０−５）が第１のイントロン内のＣｐＧ部位（１．４ｋｂ）で観察された（図２３）。
【０１１９】
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子変異体と遺伝子記録発現レベルとの間の機能的な相関が、難治性の疾患を有するＩＢＤ患者由来の未刺激末梢Ｔ細胞において確認され（図１１）、発現の低下は、ＲＮＡＳＥＴ２リスクアレル変異体ＳＮＰと相関する。さらに、同様のｅＱＴＬは、遺伝子発現マイクロアレイを使用する小腸の外科的切除から得られた組織から抽出されたｍＲＮＡに観察された（図１２）。ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子変異体とメチル化ｍＱＴＬとの間の相関も試験され、有意なｍＱＴＬが、難治性の疾患を有するＩＢＤ患者におけるメチル化の増加で観察された（図１３のＡ−Ｄ）。これに対して、ｍＱＴＬは、軽度の疾患有する患者またはＮＬ被験体から単離された細胞には検出されなかった。
【０１２０】
遺伝子発現（ｅＱＴＬ）およびＤＮＡメチル化（ｍＱＴＬ）に影響するこれらの遺伝変異の役割が、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子座に及ぶすべての情報価値のあるＳＮＰにわたりマッピングされた（図１４）。医学的に難治性の疾患を有するＩＢＤ患者から単離されたＴ細胞では、ＣＣＲ６遺伝子座内の、ＲＮＡＳＥＴ２  ＴＳＳの１０ｋｂ下流から−１７０Ｋｂ上流に、強力に重複するｅＱＴＬおよびｍＱＴＬが存在した。同様に、難治性の疾患を有する患者における未刺激の末梢Ｔ細胞から小腸外科的切除までのＲＮＡＳＥＴ２発現を比較すると、ｅＱＴＬに顕著な重複があった。これに対して、軽度の疾患を有する患者またはＮＬ被験体では、ｍＱＴＬは検出されなかった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。これは、いかなる理論にも拘束されるものではないが、このデータは、ＲＮＡＳＥＴ２のダウンレギュレーションが、ＴＬ１Ａが媒介するＩＦＮ−γ発現の増強の要素であることを示唆している。さらに、既知のＩＢＤリスク変異体ＳＮＰを有するＩＢＤ患者におけるＲＮＡＳＥＴ２の後成的な調節および遺伝子発現の低減は、より重篤な疾患の経過に関連する。
【０１２１】
＜実施例５＞
＜方法＞
ＮＬ（正常）ドナーから単離された末梢Ｔ細胞を、ＴＬ１Ａとともに、またはＴＬ１Ａなしで、８時間培養した。フローサイトメトリーによって精製されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）産生細胞のサブセットを用いて、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって遺伝子発現プロファイリングを行った。酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）阻害およびｑＰＣＲを使用して、ＩＦＮ−γのＴＬ１Ａ媒介発現におけるリボヌクレアーゼＴ２（ＲＮＡＳＥＴ２）の役割を測定した。ＩＢＤにおけるＲＮＡＳＥＴ２の役割を、同様の方法で刺激されたＩＢＤ患者（２０ＣＤおよび２０ＵＣ）から単離された末梢Ｔ細胞を使用して調査した。所見を、ＮＬおよびＩＢＤ患者または小腸（ＳＢ）外科的切除からの未刺激Ｔ細胞の追加サンプルを用いて検証し、遺伝子型および臨床データに基づいて発現量形質遺伝子座（ｅＱＴＬ）およびメチル化量的形質遺伝子座（ｍＱＴＬ）について分析した。
【０１２２】
転写因子（ＴＦ）結合部位の予測されたモチーフ破壊のスクリーニングは、候補の調節ＳＮＰを同定した。プロテオーム分析およびサイトカイン分泌の測定を使用して、タンパク質発現に対するＲＮＡＳＥＴ２指向性低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の効果を判定した。細胞凝集をフローサイトメトリーによって測定した。
【０１２３】
＜研究被験体＞
ヒト被験体は、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＦ．  Ｗｉｄｊａｊａ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭＩＲＩＡＤ  ＩＢＤ  Ｂｉｏｂａｎｋを通じて集められた。全ての対照被験体は健康な個体であり、投薬がなく、自己免疫疾患またはＩＢＤの既知の個人病歴または家族歴はなかった。インフォームドコンセント（Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより承認された）を、参加したすべての被験者から得た。外科的介入が薬物療法不全後の疾患管理に必要とされた場合、ＩＢＤ患者は「難治性」として定義された。ＩＢＤ患者は、以前に手術を受けておらず、サンプル採取時に活動的な病気がない場合、「軽度」と定義された。１年あたり１つ以上の疾患再燃を示すＣＤ患者は、１年あたり疾患の再燃のない患者と比較して「重度の疾患」を有すると定義された。臨床的特徴は、外科的切除を受けた５６４人のＣＤ患者から、将来を見越して収集した。
【０１２４】
＜リンパ球集団の単離＞
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール−ハイパック勾配（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）での分離によって健康なボランティアから単離した。ＣＤ３＋免疫磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いてＣＤ３＋Ｔ細胞（ＰＢＴ）を単離し、このＣＤ３＋Ｔ細胞は少なくとも９５％の純度であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気ビーズ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）での消耗（ｓｅｐｌｅｔｉｏｎ）による負の選択を用いて単離し、このＣＤ４＋Ｔ細胞は少なくとも９５％の純度であった。
【０１２５】
＜Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ４５０Ｋビーズチップアッセイ＞
ＣＤ３＋Ｔ細胞由来のＤＮＡサンプルは、１μｇの投入量のＺｙｍｏ  ＥＺ  ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて変換した重亜硫酸塩だった。このアッセイは、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎの指示に従って行った。ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して、データを視覚化し正規化した。メチル化β値は、（メチル化プローブシグナル）／（全シグナル）比率として再計算された。
【０１２６】
＜ＩＦＮ−γアッセイ＞
ＩＦＮ−γを増幅ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ（Ｌｏｎｇｗｏｏｄ、ＦＬ）ＥＬＩＳＡプレートを、１００μｌの５μｇ／ｍｌモノクローナル抗ＩＦＮ−γ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）で一晩被覆した。サンプルおよび標準物質を２４時間加え、続いて１００μｌの２．５μｇ／  ｍｌポリクローナルビオチン化ウサギ抗ＩＦＮ−γ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を２時間加えた。これに１００μｌの１／１０００希釈アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を２時間添加した。基質、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を３０分間添加した後、アンプリファイア（３％２−プロパノール、１ｍＭヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、７５μｇ／  ｍｌアルコールデヒドロゲナーゼおよび５０μｇ／  ｍｌ  ジアホラーゼ；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を３０分間加えた。Ｅ  ｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いてプレートを４９０ｎｍで読み取った。
【０１２７】
＜ＣＤ３＋Ｔ細胞についての遺伝子発現アッセイ＞
Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノムワイド発現ＢｅａｄＣｈｉｐ（ＨｕｍａｎＨＴ−１２＿Ｖ４＿０＿Ｒ２）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）またはＮｕｇｅｎヒトＦＦＰＥ  ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーシステムを用いて、ＣＤ３＋Ｔ細胞の発現分析を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ遺伝子発現データを、ＢＲＢアレイツールおよびＲのルミパッケージ（ｌｕｍｉ  ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎ  Ｒ）を用いて処理した。データをｌｏｇ２変換し、ロバストスプライン正規化を使用して正規化した。ＲＮＡ−Ｓｅｑのライブラリーを、ＮｕｇｅｎヒトＦＦＰＥ  ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーシステムを用いて調製した。ワークフローは、ｃＤＮＡ生成、断片化、末端修復、アダプターライゲーションおよびＰＣＲ増幅からなる。１つのレーンでサンプルを多重化するために、異なるアダプターを使用した。配列決定をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００でシングルリード７５回実行した。データ品質チェックをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＳＡＶで行った。デマルチプレクシングをＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｂｃｌ２ｆａｓｔｑ２  ｖ  ２．１７プログラムで行った。読み取りは、Ｂｏｗｔｉｅ２バージョン２．１．０を使用して最新のＵＣＳＣ転写産物セットに最初にマッピングされ、遺伝子発現レベルはＲＳＥＭ  ｖ１．２．１５を使用して推定された。遺伝子発現を正規化するためにＦＰＫＭを使用した。
【０１２８】
＜ｓｉＲＮＡ阻害および定量的プロテオミクス解析＞
新たに単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞（１５×１０６）を、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で一晩中培養し、洗浄し、２５０μＬの新鮮な培地で再懸濁し、かつ、ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ  ＥＣＭ  ８３０（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）において４ｍｍ（ギャップ幅）のキュベットを用いて１５０ｐｍｏｌｅのＲＮＡＳＥＴ２  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡ（６００Ｖ、５００μｓｅｃの９パルス、パルス間１００μｓｅｃ）の存在下で電気穿孔した。ｓｉＲＮＡ阻害に使用される配列を表１６に示す。
【０１２９】
【表１６】
2019509739.tif 000018
【０１３０】
タンデム質量標識（ＴＭＴ）に基づく量的プロテオミクス分析を、記載されているように行った（Ｑｕら、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１６；  ６：３２００７）。各サンプルについて、５０μｇのタンパク質を、フィルター補助サンプル調製（ＦＡＳＰ）を用いてトリプシンペプチドに並行して消化した（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９；６：３５９−６２）。８つのサンプル由来のペプチドおよびプールされた内部標準を一連のＴＭＴ１０ｐｌｅｘ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識し、混合し、脱塩し、高ｐＨ液体クロマトグラフィーにより２４の分画に分離し、８の分画につなぎ合わせた（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ）。分画したペプチドを５０ｃｍ  ＥＡＳＹ−Ｓｐｒａｙ分析カラムで分離し、タンデム質量分析のための高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）法を用いて、データ依存性取得モード（ｄａｔａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ）でＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した  。取得した生データを、ＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムを用いて、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（ｖ２．１）でヒトＵｎｉｐｒｏｔデータベース（１０／１７／１５にリリース、２０，９８２配列を含む）に対して検索した。ペプチドおよびタンパク質の同定をフィルタリングするために、厳格な１％の偽発見率が設定された。３０％を超える前駆イオン干渉を有するペプチドは、タンパク質の定量化から除外された。
【０１３１】
＜細胞凝集のフローサイトメトリーおよび分析＞
ＩＦＮ−γ−分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって単離し、続いて、組換え型ヒトＩＬ−１２（５００ｐｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＴＬ１Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）で８時間、細胞を活性化した。ＩＦＮ−γ分泌アッセイ細胞濃縮および検出キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、ＩＦＮ−γ−分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出した。細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で選別した。
【０１３２】
細胞内ＩＦＮ−γ産生および細胞凝集の分析は、実質的に記載されているように行った（Ｄｅｚｏｒｅｌｌａら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｂ  Ｃｌｉｎ  Ｃｙｔｏｍ  ２０１６：９０：２５７−６６）。簡潔に述べると、細胞をＩＬ１２／ＩＬ１８およびＴＬ１Ａで２４時間静置または刺激し、最後の４時間にベルフェルディンＡ（１０ｕｇ／ｍｌ）を加えた。細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．２％サポニンで透過処理し、細胞内ＩＦＮ−γ（ブリリアントバイオレット４２１−ＩＦＮ−γｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはアイソタイプ対照について染色した。サンプルを洗浄し、細胞凝集を染色した（ヨウ化プロピジウム）。細胞をＣｙＡｎ  ＴＭ  ＡＤＰフローサイトメーター（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏｓｏｆｔｗａｒｅ（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）で分析した。ＬＦＡ１遮断分析のために、細胞をモノクローナル対照マウスＩｇＧ１ｋ（１５μｇ／ｍｌ）または抗ＬＦＡ１（ＴＳ１  ／  １８）と円錐形マイクロプレート中で一晩プレインキュベートし、その後ＩＬ１２、ＩＬ１８およびＴＬ１Ａで２４時間刺激した。
【０１３３】
＜ｑＰＣＲ＞
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて全ＲＮＡを単離し、遺伝子発現をリアルタイム量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔキットおよびプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、オリゴ（ｄＴ）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をプライマーとして各ＲＴ−ＰＣＲ反応において５００ナノグラムの全ＲＮＡを使用した。リアルタイムＰＣＲを、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ｅｐ  ｒｅａｌｐｌｅｘ  ＰＣＲ検出システム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）を用いて行った。ＰＣＲアッセイを二重に行った。プライマー配列（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）はイントロンにわたり、また表１７に描写される。
【０１３４】
【表１７】
2019509739.tif 000019
【０１３５】
＜遺伝子型判定＞
遺伝子型データをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏ  ＢｅａｄＣｈｉｐアレイを使用して、コーカサス人の被験体について得た。マーカーは以下に基づいて除外された：ｐ≦１０−３の有意な閾値を用いたハーディ・ワインベルグ平衡検定；遺伝子型判定率が１００％未満（ｅＱＴＬおよびｍＱＴＬ関連について）または９８％未満（ＧＷＡＳについて）、およびマイナーアレル頻度が５％未満である場合。ＰＬＩＮＫを使用して関連する個体（Ｐｉハットスコア＞０．２５）を排除するために、家系同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ−ｂｙ−ｄｅｓｃｅｎｔ）を使用した。ＡＤＭＩＸＴＵＲＥを使用して、民族性分析を実施して個人の民族性の割合の概算を得た。コーカサス系の割合が０．７５以上の個人はコーカサス人として分類した。独立したコーカサス人のサンプルは、関連性チェック（カットオフｐｉ−ｈａｔスコア（ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｐｉ−ｈａｔ  ｓｃｏｒｅｓ）を用いる）およびＡｄｍｉｘｔｕｒｅによる民族性分析に基づいて同定され、その後のすべての関連付けは、これらのサンプルを用いて行われた。独立したコーカサス人のサンプルについての遺伝子型データ中の主な要素を、ＴＲＡＣＥを使用して生成した。ＬＤＨｅａｔｍａｐ  Ｒパッケージ（ＬＤＨｅａｔｍａｐ  Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ）を使用して、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子座におけるＳＮＰについてのＬＤプロットを、１３９人の被験体の遺伝子型データを用いて生成した。ＩＩＢＤＧＣコホートにおけるＱＣおよび遺伝子型判定の詳細は、以前の報告（Ｊｏｓｔｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１２；  ４９１：１１９−２４およびＬｉｕら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１５；  ４７：９７９−８６）に見ることができる。簡単に言うと、ＩｍｍｕｎｏＣｈｉｐを使用して遺伝子型判定された１８，６０２個のＣＤの症例および３３，９３８の非ＩＢＤ対照を、５％を超えるデータが欠落したサンプルと、集団層別化由来または異常な平均強度値を有する非ヨーロッパ祖先のサンプルと、対照において２％を超えるデータ欠損またはＨＷＥｐ値＜１０−１０を有するＳＮＰと、を除去した後に、解析に含めた。ＩＩＢＤＧＣからのＣＤの症例のうち、１３，５１１は、以前に報告されたようにモントリオール分類に基づいて収集された疾患行動情報を有する（Ｃｌｅｙｎｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ  ２０１６；  ３８７：Ｐ１５６−６７）（Ｂ１は非狭窄性（ｎｏｎ−ｓｔｒｉｃｔｕｒｉｎｇ）、非浸潤性（ｎｏｎ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ）、Ｂ２は狭窄性およびＢ３、浸潤性疾患として記載されている）
【０１３６】
＜小腸の外科的サンプルについての発現データ＞
Ａｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して抽出された単一チャネルマイクロアレイ発現データを、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）のＧｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｃｅｎｔｅｒから受け取った。技術的な複写（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）で利用できる生の表現データを、Ｒバージョン３．２．２で実装されたＬＩＭＭＡパッケージを使用して正規化した。発現データ前処理は、発現データのバックグラウンド補正、それに続くｌｏｇ２変換および分数正規化が含まれていた。
【０１３７】
＜ＥＱＴＬおよびｍＱＴＬマッピング＞
ｅＱＴＬとｍＱＴＬのマッピングをＭａｔｒｉｘ  ｅＱＴＬ  Ｒパッケージで実行した。小腸の外科的サンプルについては、独立したコーカサス人の被験体（ｎ＝８５）を用いてｅＱＴＬマッピングを行った。遺伝子型と、プローブ発現レベル（ｅＱＴＬについての）またはメチル化β値（ｍＱＴＬについての）と、の間の関連付けは、相加的な遺伝子型効果を用いる線形回帰モデルを使用して行った。すべての関連付けを、遺伝子型に沿って共変量として性別および遺伝子型データの最初の２つの主成分を用いて行った。ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子発現またはメチル化レベルとの関連付けを行うために、ＲＮＡＳＥＴ２  ＴＳＳの２００ＫＢ以内の約２００の遺伝的変異体を使用した。
【０１３８】
＜モチーフ分析および候補の調節ＳＮＰ（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ＳＮＰｓ）の同定＞
ｅＱＴＬおよびｍＱＴＬを示す全ての変異体を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｍｏｔｉｆｂｒｅａｋＲパッケージ）を用いて、ＴＦ結合モチーフの予測される破壊について分析した（Ｃｏｅｔｚｅｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０１５；  ３１：３８４７−９。ＣＤ患者からのＲＮＡｓｅｑデータを用いて、発現されたと同定されたＴ細胞特異的ＴＦのみが次に進んだ。その後、次いで、候補の調節ＳＮＰを、Ｒｏａｄｍａｐ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＲＥＭＣ）データに基づいて潜在的な機能性について分析した（Ｒｏａｄｍａｐ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１５；５１８：３１７−３０）。潜在的な活性エンハンサー領域を、ヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ１とＨ３Ｋ２７ａｃシグナルとの重複に基づいて判定した（Ｃｏｅｔｚｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１５；２４：３５９５−６０７）。ＴＦ調節の潜在的機能性を、ＲＥＭＣ  ＣＨＩＰ−ｓｅｑ結合シグナルおよびＲｅｇｕｌｏｍｅデータに基づいて判定した。
【０１３９】
＜経路分析＞
経路分析を、ＱｉａｇｅｎのＩｎｇｅｎｕｉｔｙＲ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ、  Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ）およびＤａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ、Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  （ＤＡＶＩＤ、  ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ）を使用して遂行した。
【０１４０】
＜統計的分析＞
モデリング、データ分析およびデータマイニングを、ＢＲＢアレイツール（ｂｒｂ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＲＢ−ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ）およびＲ−ｐｒｏｇｒａｍ（バージョン２．２．２；  ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用して行なった。クラス予測分析は、０．００１の最小ｐ値に基づいて、化合物共変数予測因子、対角線形判別分析、ｋ−最近傍（ｋ＝１および３を使用）、最近傍重心、およびサポートベクターマシンを使用した。クラスター分析をＣｌｕｓｔｅｒ３．０およびＪａｖａＴｒｅｅｖｉｅｗ１．１．６ｒ４を使用して行なった。ＪＭＰ統計ソフトウェア（Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて統計学的有意性についての試験を判定した。ｒｓ１８１９３３３とｒｓ９３５５６１０  ＳＮＰと、治療不全、ＡＮＣＡ血清陽性、腸切除の長さ、および、再手術までの時間、の臨床的関連性の試験を、パラメトリックスチューデントＴ検定およびピアソン相関；フィッシャー直接検定とカプラン・マイヤー生存曲線を用いた関連性と傾向の検定、によって計算した。内視鏡的再発との関連付けはコクラン＝リチャード・アーミテージ傾向テストによって計算した。
【０１４１】
＜結果＞
この研究では、本発明者らは、ＴＬ１Ａ媒介サイトカイン産生増強の要素として、および疾患の重症度の新規な潜在的なバイオマーカーとして、ＩＢＤ感受性遺伝子であるＲＮＡＳＥＴ２のダウンレギュレーションを同定した。ｓｉＲＮＡサイレンシング後のＲＮＡＳＥＴ２のダウンレギュレーションは、いかなる理論にも拘束されることなく、炎症応答の調節における役割をサポートするＩＦＮ−γ分泌の増加をもたらした。ＲＮＡＳＥＴ２発現の減少も、毎年の疾患の再燃のない患者と比較して、毎年１回以上の疾患の再燃を有するＣＤ患者の末梢Ｔ細胞において見られた。機能的に、量的形質遺伝子座は、軽度の疾患ではなく医学的に難治性であるＣＤ患者からの、末梢および粘膜組織における発現減少（ｅＱＴＬ）およびＤＮＡ過剰メチル化（ｍＱＴＬ）に関するＲＮＡＳＥＴ２−リスク変異体と関連していた。さらに、ＲＮＡＳＥＴ２疾患リスク変異体は、狭窄／浸潤性の疾患の挙動の進行の増大と関連していた。さらに、ＲＮＡＳＥＴ２疾患リスク変異体は、治療薬不全、ＡＮＣＡ血清陽性、腸切除の長さの延長、再手術までの時間の短縮、および高い（＞２）Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓスコアの術後内視鏡検査により、部分的に定義される、複雑性／抵抗性のＣＤ表現型と関連していた。ＲＮＡＳＥＴ２疾患リスク変異体のモチーフスクリーニングは、潜在的なエンハンサー領域内に位置するコンセンサスＥＴＳ−ＴＦ結合部位の予測された破壊を有するｒｓ２１４９０９２を同定し、ＲＮＡＳＥＴ２シス調節エレメントについての洞察を提供する。ＲＮＡＳＥＴ２は多数のＥＴＳ転写因子の発現と相関していた。最終的には、ＲＮＡＳＥＴ２のｓｉＲＮＡサイレンシングは、ＩＦＮ−γの増強、ＩＣＡＭ１の増加および付随するＴ細胞凝集をもたらし、一方、抗ＬＦＡ１凝集の遮断はＩＦＮ−γ分泌を抑制した。
【０１４２】
＜ＩＦＮ−γ産生のＴＬ１Ａが媒介する増強に関連する差次的遺伝子発現の同定＞
ＴＬ１Ａ媒介ＩＦＮ−γ産生増強に関与する基礎となる分子経路を同定するために、主要なＩＢＤ炎症誘発性サイトカインであるＣＤ４＋Ｔ細胞をＴＬ１Ａで処理し、ＩＦＮ−γ−分泌および非分泌サブセットに分け、ＲＮＡ−ｓｅｑで分析した（図１５および図２７）。発現遺伝子のセットの教師なし階層的クラスタリングは、ＴＬ１Ａ媒介ＩＦＮ−γ分泌および非分泌グループを明確に区別した（図１６）。ＩＦＮ−γ分泌／非分泌サブセット（ｐ値＜１×１０−５）（図１７）間の少なくとも２倍の差示的発現を有する７６４個の「予測因子（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）」遺伝子が同定された。遺伝子オントロジー分析は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達、アポトーシス、およびＲＮＡ発現に関連した経路において、差次的に発現される遺伝子が豊富であり、抗ＴＮＦ生物学的薬剤であるインフリキシマブの下流標的であることを示した。予測因子遺伝子は、他の領域と比較して、ＧＷＡＳ同定ＩＢＤ感受性変異体（一塩基多型（ＳＮＰ）の０．２５ＭＢ上流または下流）に隣接する領域において、有意に豊富だった（１４％対９％、ｐ値は３．３×１０−６、超幾何分布検定）。いかなる理論にも拘束されるものではないが、これらのデータは、これらの遺伝子が、ＩＦＮ−γ発現のＴＬ１Ａ媒介性調節に寄与するだけでなく、ＩＢＤリスク関連遺伝子座と重複することを示唆する。ＩＢＤリスク関連予測遺伝子のうち、ＩＦＮ−γの発現が最も有意にアップレギュレートされたと確認され、ＲＮＡＳＥＴ２が最も有意にダウンレギュレートされた遺伝子として確認された（図２０）。ＲＮＡＳＥＴ２は、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４＋サブセットにおいて５倍を超えるダウンレギュレーションを有する唯一のＩＢＤリスク関連遺伝子であった。
【０１４３】
＜発現およびＤＮＡメチル化レベルの逆相関を示すＲＮＡＳＥＴ２領域は疾患リスク関連変異体に隣接する領域と重複する＞
ＲＮＡＳＥＴ２は、リボヌクレアーゼのＲｈ／Ｔ２／Ｓファミリーの唯一のヒトメンバーであり、その発現は卵巣癌、メラノーマおよび非ホジキンリンパ腫で減少する。クローン病／ＩＢＤの病因におけるＩＦＮ−γの重要な役割を考慮すると、いかなる理論にも拘束されるものではないが、これらのデータは、ＲＮＡＳＥＴ２のダウンレギュレーションが、ＴＬ１Ａが媒介する「重症」のＣＤを同定することを総括的に示唆している。ＲＮＡＳＥＴ２発現を、ＮＬ、ＣＤおよびＵＣ患者の別個のコホートからの新しく単離した刺激されていない末梢ＣＤ３＋Ｔ細胞で調べた。ＤＮＡメチル化は遺伝子発現に影響を与える機構の１つであると理解されているので、特に転写されたエキソームの外側にマッピングされた疾患関連遺伝子変異体において、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子座のＤＮＡメチル化状態を調べた。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析は、組み合わせた１３８人のＣＤ患者からなる２つの独立したコホートからの末梢Ｔ細胞におけるＴＮＦＳＦ１５発現レベルとＲＮＡＳＥＴ２との間に逆相関があることを実証した（図２４Ａおよび２４Ｄ）。コホートがそれぞれ別々に（図２４Ｂおよび２４Ｃ）分析された時さえ、この結果は一貫していた。さらに、主として転写開始部位（ＴＳＳ）（図２６）からの５０ｋｂの上流および下流内に、発現とメチル化（図２３）の間に有意な負の相関があった。ＲＮＡＳＥＴ２の最初のイントロン内のＣｐＧ部位（１．４ｋｂ）において、メチル化および発現の最も強い相関が観察された（ｐ＝８．５×１０−５）（図２６）。さらに、ヨーロッパの祖先集団であるｒｓ１８１９３３３にＲＮＡＳＥＴ２遺伝子座をタグ付けするＩＢＤリスクＳＮＰを含むＣＤ疾患遺伝子リスク変異体は、メチル化および発現レベルに相関する領域と重複している（図１０）。
【０１４４】
＜ＲＮＡＳＥＴ２疾患のリスクアレルは、難治性疾患を有するＣＤ患者におけるＲＮＡＳＥＴ２発現の減少およびＤＮＡメチル化の増加と関連している＞
ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子変異と遺伝子転写産物発現レベルとの間の機能的相関関係を特徴付けるために、遺伝子発現量的形質（ｅＱＴＬ）を行った。ヨーロッパ人におけるＩＢＤリスクに関する疾患関連ＳＮＰのｒｓ１８１９３３３、および韓国人におけるｒｓ２１４９０８５、ならびに、グレーブス病に関連するリスクＳＮＰのｒｓ９３５５６１０は、ＲＮＡＳＥＴ２の転写開始部位から１３ｋｂに位置する。ＲＮＡＳＥＴ２  ＩＢＤリスク遺伝子型と遺伝子転写産物発現レベルとの間の機能的相関は、難治性疾患を有するＩＢＤ患者から単離された未刺激の末梢ＣＤ３＋Ｔ細胞において確立された。データは、ＲＮＡＳＥＴ２リスクアレルｒｓ２１４９０８５、ｒｓ１８１９３３３、およびｒｓ９３５５６１０を有する被験体由来のＴ細胞におけるＲＮＡＳＥＴ２発現の有意な減少を実証した（図１１）。これらの所見は、外科的切除でＣＤ被験体から得られた非炎症小腸組織から抽出されたｍＲＮＡについて観察された有意なｅＱＴＬが確認された（図１２）。ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子変異体とメチル化との相関であるｍＱＴＬも調査した。有意なｍＱＴＬが、難治性疾患のＣＤ患者におけるメチル化の増加とともに観察された（図１３−１のＡおよび１３−２のＣ）。これに対して、軽度の疾患を有するＣＤ患者またはＮＬ被験体から単離された細胞ではｍＱＴＬは検出されなかった（図１３−１のＢおよび１３−２のＤ）。さらに、ＲＮＡＳＥＴ２疾患リスクＳＮＰ（ｒｓ１８１９３３３／ｒｓ２１４９０８５  ｐ＝０．０５、ｒｓ９３５５６１０  ｐ＝０．０１）を有するＣＤ患者に関連する、複雑な疾患の挙動である、狭窄／浸潤性の表現型（モントリオール分類Ｂ１対Ｂ２およびＢ３）の有意な増加があった。
【０１４５】
遺伝子発現（ｅＱＴＬ）およびＤＮＡメチル化（ｍＱＴＬ）は、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子座にわたるすべての情報価値のあるＳＮＰにわたってマッピングされた（ＬＤプロット）。医学的に難治性の疾患を有する患者から単離されたＴ細胞では、線維芽細胞増殖因子受容体１癌遺伝子パートナー（ＦＧＦＲ１ＯＰ）からケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６（ＣＣＲ６）の最初のイントロンに及ぶ、ＲＮＡＳＥＴ２  ＴＳＳの１０ｋｂ下流から−１７０ｋｂ上流までの強力な重複するｅＱＴＬおよびｍＱＴＬがある。同様に、難治性の疾患を有するＣＤ患者において、未刺激の末梢Ｔ細胞から小腸外科的切除までのＲＮＡＳＥＴ２発現を比較すると、ｅＱＴＬに重複があった。これに対して、軽度の疾患を有するＣＤ患者またはＮＬ被験体にはｍＱＴＬとの関連は少ししか検出されなかった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。ｅＱＴＬとの関連はＦＧＦＲ１ＯＰまたはＣＣＲ６については検出されなかった。これらのデータは、医学的に難治性の疾患を有するＣＤ患者から単離された末梢Ｔ細胞の別個のコホートにおいてさらに検証された。ＣＤに関連するＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体と対応するｅＱＴＬ（図２８）との間に有意な重複があり、このことは、特定の理論に縛られることなく、ＲＮＡＳＥＴ２が疾患を媒介する上での機能的役割を示唆している。
【０１４６】
＜ＣＤにおけるＲＮＡＳＥＴ２の弱い発現＞
ＩＢＤ病因におけるＲＮＡＳＥＴ２の役割を確立するために、ＩＢＤ患者から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＲＮＡＳＥＴ２発現の調節を調べ、ＴＬ１Ａの存在下または非存在下で正常（ＮＬ）ドナーと比較した。図７で見られるように、ＩＢＤ患者ではなくＮＬドナーは、ＴＬ１Ａが媒介するＲＮＡＳＥＴ２発現レベルの低下を示した。代わりに、ＲＮＡＳＥＴ２の発現レベルの低下は、毎年の疾患の再燃がない患者（図８−１のＡおよび図８−２のＣ）と比較して、より重篤な疾患（１年あたり１つ以上の疾患の再燃を示す）のＣＤ患者において見られた。
【０１４７】
＜ＲＮＡＳＥＴ２疾患リスクアレルは複雑で抵抗性の疾患の挙動に関連する＞
ＲＮＡＳＥＴ２と疾患活性および重症度との間の関連を評価するために、発明者らは、外科的切除を受けた５６４人のＣＤ患者のコホートを利用し、その後、将来を見越して追跡した。外科手術への指標を含む臨床的特徴を、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体（ｒｓ１８１９３３３およびｒｓ９３５５６１０）との関連について評価した。ＲＮＡＳＥＴ２疾患リスク変異体ＳＮＰは、複雑な狭窄／浸潤性表現型（モントリオール分類Ｂ１対Ｂ２およびＢ３）と関連していた（表１８）。外科手術の時に、ＲＮＡＳＥＴ２疾患リスク変異体ＳＮＰを有する患者は、チオプリンまたは抗ＴＮＦ療法の治療不全、ＡＮＣＡ血清陽性（抗ＴＮＦ療法に対する応答の欠如に伴うマーカー）、および、全体の疾患の重症度に起因する特徴の腸切除の長さの増加、を伴っていた（表１８および図３８−３９）。ステロイドまたはスルファサラジンでの治療不全については関連が認められなかった。さらに、疾患管理のために複数の切除を必要としたＲＮＡＳＥＴ２疾患リスク変異体ＳＮＰ患者は、再手術までの時間が短かった（図３２）。
【０１４８】
【表１８】
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【０１４９】
同様に、ＲＮＡＳＥＴ２リスクＳＮＰはより重度の疾患再発に関連した。手術後の内視鏡検査は、手術後の予防を受けていなかった、高いＲｕｔｇｅｅｒｔｓスコア（＞２）で分類された患者におけるＲＮＡＳＥＴ２リスクＳＮＰの関連性を明らかにした（表１８）。関連性は臨床的再発では観察されなかった。ＲＮＡＳＥＴ２の発現の減少は、浸潤性疾患表現型（図３１）およびＡＳＣＡ血清陽性（図３０）にも関連した。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、このデータは、複雑かつ抵抗性の疾患挙動を示唆する臨床的パラメータとのＲＮＡＳＥＴ２疾患リスクＳＮＰの関連性を裏付ける。
【０１５０】
＜疾患をタグ付けるＳＮＰを有する、ＬＤにおけるＲＮＡＳＥＴ２変異体は、ＥＴＳ転写因子結合モチーフを破壊する＞
上に示されたデータは、機能／因果関係を判定するのを難しくするｅＱＴＬおよびｍＱＴＬに関連する、多くが連鎖不平衡におけるものである、１００を超えるＣＤ ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体の間の著しい重複を実証する。ＣＤに関連する大部分のＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体が、非コード領域に位置するが故に、これらのＳＮＰは調節的機能の調整によって発現を変えるだろう。さらに、いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、研究は、疾患に関連するＳＮＰは、しばしば、疾患に関係する細胞型の活性エンハンサー領域内に存在し、ＴＦ結合モチーフを破壊できることを示唆する。ＲＥＭＣデータは、他の組織と比較して、ＲＮＡＳＥＴ２遺伝子座が、推定上の活性エンハンサーのヒストン修飾および活性遺伝子発現によって、初代Ｔ細胞中でマーキングされることを実証する（図４０）。ＲＮＡＳＥＴ２発現を調節する分子経路の洞察を得て、かつ候補の機能的なＳＮＰの数に優先順位を付けるために、本発明者らは、ｅＱＴＬ／ｍＱＴＬに関連していたすべてのＳＮＰにわたるＴＦモチーフの破壊を予測するために、モチーフ分析を実施した。Ｔ細胞に発現させられたＴＦのモチーフを破壊する変異体が選択され、そして、ＲＮＡＳＥＴ２疾患指標ＳＮＰ ｒｓ１８１９３３３を有する、ＬＤにおける候補の変異体が注目された。指標ＳＮＰ（ＬＤ Ｒ２＝１）から−５６９ｂｐに位置するｒｓ２０４９０９２ ＳＮＰ疾患リスク変異体は、高度に保存されたＴＴＣＣモチーフ内に存在し、大部分のＥＴＳ転写因子によって活用され、ＴＦ結合を破壊することが予測される。配列分析は、ＪＵＮ結合部位に隣接するＩＲＦ４およびＳｐｉ１の結合部位の重複を実証する（図３６−１のＡ）。ＲｅｇｕｌｏｍｅおよびＲＥＭＣのデータは、活性エンハンサー要素を示すヒストン修飾と共に重複する、リンパ芽球様細胞株に結合する、ＥＴＳ１、ＩＲＦ４、およびＳｐｉ１のＴＦ占有率を確認する（図３６−１のＢ）。さらに、ＥＴＳの多数のメンバーを有するＲＮＡＳＥＴ２の発現とＪＵＮ ＴＦとの間に強い相関がある（図３６−２のＣおよび図４１）。相関は、ＩＲＦ４では観察されなかった（図４１）。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、これらのデータは、免疫の区画（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ）中のＲＮＡＳＥＴ２の発現の関係性を強化し、かつＲＮＡＳＥＴ２の転写を調節する際の、ＥＴＳおよびＪＵＮの転写因子の機能的な役割を裏付ける。
【０１５１】
＜ＲＮＡＳＥＴ２のサイレンシングは、ＩＣＡＭ１の発現および同型性のＴ細胞の凝集のアップレギュレーションを介して、ＩＦＮ−γの分泌を増強する＞
ＩＦＮ−γの分泌の調節におけるＲＮＡＳＥＴ２の機能的な役割を、ｓｉＲＮＡサイレンシングを使用して試験した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲＮＡＳＥＴ２ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、その後、ＴＬ１Ａで刺激した。ＲＮＡＳＥＴ２を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、ＲＮＡＳＥＴ２の発現の６０−７０％の阻害（図２１Ａおよび図３７−１のＡ）を示し、そして対照のｓｉＲＮＡと比較して、ＴＬ１Ａ媒介ＩＦＮ−γの分泌における平行で有意な増強（＞１．５倍）が見られた（図２１Ｂおよび図３７−１のＢ）。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、これらのデータは、ＲＮＡＳＥＴ２のダウンレギュレーションがＩＦＮ−γの発現を調整することを示唆する。
【０１５２】
このプロセスに関与するシグナル伝達経路を定義するために、プロテオーム解析を実行した。候補の標的は、ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞およびＩＦＮγ非分泌Ｔ細胞（ＲＮＡｓｅｑ分析からのデータ）を比較するとき、ＲＮＡＳＥＴ２のｓｉＲＮＡサイレンシングに次ぐ発現の調整、およびＴＬ１Ａを媒介とした差次的な発現の両方を示すことに基づいて選択された。ＲＮＡＳＥＴ２サイレンシングに応じてアップレギュレートされ、かつＩＦＮγ非分泌Ｔ細胞と比較してＩＦＮγ分泌Ｔ細胞中にあったタンパク質のうちの１つは、ＩＣＡＭ１であった（図４２）。ＩＣＡＭ１は、最近では、ＩＢＤ感受性遺伝子座として同定され、アップレギュレートされた遺伝子発現は、疾患リスク変異体に関連していた。ＩＣＡＭ１は、一般的には、血管内皮および白血球によって発現させられる膜貫通接着タンパク質である。Ｔ細胞上のＬＦＡ１受容体にＩＣＡＭを結合することにより、細胞間相互作用が促進かつ安定化する。研究は、活性化Ｔ細胞上のＩＣＡＭ１の発現の増大を実証し、同型のＴ細胞の凝集および続くＴ細胞の分化を誘発する際の、ＩＣＡＭ１−ＬＦＡ１間の結合のための役割を提唱してきた。ＴＬ１Ａを媒介としたＩＦＮ−γの分泌に対する、細胞間接着の効果を検討するために、底が平らなマイクロウェルおよび底が円錐形のマイクロウェ中で、細胞を培養した。接近した細胞間の円錐形の幾可学的形状中で細胞が培養されたときに、３倍を超えるＩＦＮ−γ生産量の増加が一貫して観察された（データは示されず）。その後、ＩＦＮ−γ生産量のＴＬ１Ａを媒介とした増強が、同型のＴ細胞の凝集によって促進されるという仮説を試験するために、フローサイトメトリーを使用した。簡潔に言えば、Ｔ細胞を、ＴＬ１Ａの存在下または非存在下で刺激し、その後、細胞内のＩＦＮ−γ（図３７−２のＣおよび図３７−２のＤ、左のパネル）のため、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用する細胞の凝集（図３７−２のＣおよび図３７−２のＤ、右パネルの上部および下部）のために、抗体で染色した。ＰＩで標識されたピークは、単細胞対細胞凝集体を同定可能にする１事象当たりの細胞の数に対応し、各ヒストグラム中の第１のピークは、単細胞の事象（黒色の括弧）に対応し、そして 連続するピークは、多細胞凝集体（灰色の括弧）に対応する。少ない割合の刺激されていないＴ細胞しかＩＦＮ−γを分泌せず、およびこれらの細胞は、単細胞の事象および細胞凝集体としてほぼ均等に分散された（図３７−３のＥ、左のパネル）。ＴＬ１Ａの刺激の後、細胞凝集体のパーセンテージおよび大きさの両方の有意な増加（図３７−２のＤと比較された図３７−２のＣの右上のパネル）、ならびにＩＦＮ−γ産生細胞の全体数の有意な増加（６倍）（図３７−３のＥおよび図３７−３のＦ）、 およびＩＦＮ−γの分泌の３０倍の増加（データは示されず）があった。これに対して、ＩＦＮ−γを産生しない大部分のＴ細胞は、ＴＬ１Ａを刺激するか、または刺激せずに培養されたかどうかにかかわらず、単細胞の事象で構成される（図３７−３のＥ、右パネル）。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、これらの結果は、細胞の凝集が、ＩＦＮ−γを産生する細胞の数の増加と、ＩＦＮ−γ生産量の全体的な量との両方に寄与することもあり、そしてＴＬ１Ａの刺激がこのプロセスを増強しうることを示唆する。ＩＣＡＭ１−ＬＦＡ１の結合を介する細胞の凝集を媒介する際のＴＬ１Ａの機能的な役割を、ＬＦＡ−１遮断抗体を使用して試験した。図３７−３のＧに見られるように、ＩｇＧ対照抗体（ｐ値＝０．０４７）と比較すると、ＬＦＡ−１の結合の遮断に応じて、ＩＦＮ−γの分泌の全体的な４３％の減少があった。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、まとめると、これらのデータは、ＴＬ１Ａを媒介としたＲＮＡＳＥＴ２のダウンレギュレーション、およびＩＣＡＭ１の発現の同時に起こる増強が、同型のＴ細胞の凝集およびＩＦＮ−γの生産量の増大を促進することを示す。ＩＣＡＭ１の発現の増加が、ＣＤにおいて、ＡＳＣＡ血清陽性および抗ＴＮＦおよびチオプリンの手術前の治療不全（図４３）と、ＲＮＡＳＥＴ２の減少に関連する臨床的パラメータと、疾患活性とに関連していたことが留意される。
【０１５３】
＜実施例６＞
ＲＮＡＳＥＴ２およびＴＮＦＳＦ１５の両方は、２０１ ＧＷＡＳ ＩＢＤ感受性遺伝子座の中で同定されてきた。ＴＮＦＳＦ１５によってコードされたタンパク質であるＴＬ１Ａは、粘膜炎のキーとなる媒介物質である。上昇したＴＬ１Ａレベルは、ＴＮＦＳＦ１５遺伝子型及び疾患の重症度と相関する。本発明者は、ＴＬ１ＡがＴ細胞中でＲＮＡＳＥＴ２の発現を減少させることを識別した。ＴＮＦＳＦ１５およびＲＮＡＳＥＴ２の発現は、ＣＤ患者（ｐ＝５ｘ１０−１６）からのＴ細胞中で、逆相関する。ＩＢＤの予後バイオマーカーとしてのＲＮＡＳＥＴ２の可能性を検討した。
【０１５４】
ＩＢＤにおけるＲＮＡＳＥＴ２疾患関連ＳＮＰの役割を、手術を受ける患者（ｎ＝２１）および小腸の外科的サンプル（ｎ＝８５）からの末梢性Ｔ細胞において、発現およびメチル化の量的形質遺伝子座（ｅＱＴＬ／ｍＱＴＬ）を検討することにより分析した。外科的切除を受けたＣＤ患者（ｎ＝５８４）を、先を見越して経過観察した。手術に対する示唆を含む臨床的特徴を、ＲＮＡＳＥＴ２リスク変異体（ｒｓ１８１９３３３およびｒｓ９３５５６１０）との関連性について評価した。
【０１５５】
ＲＮＡＳＥＴ２疾患関連ＳＮＰは、末梢組織および粘膜組織（ｐ＜０．００１）において減少したＲＮＡＳＥＴ２の発現（ｅＱＴＬ）、およびＩＢＤの治療に反応した患者と比較して、疾患管理のための外科的介入を必要とする患者（ｎ＝１６）におけるＤＮＡの過剰メチル化 （ｍＱＴＬ）（ｐ＜０．００１）に相関があった。ＲＮＡＳＥＴ２疾患関連ＳＮＰは、チオプリン治療（ｐ＝０．０２、ＯＲ＝１．７）もしくは抗ＴＮＦ治療（ｐ＝０．０４、ＯＲ＝１．５９）の治療不全、ＡＮＣＡ血清陽性（抗ＴＮＦ治療に対する反応の欠如に関連するマーカー）（ｐ＝０．０２、ＯＲ＝２．２７）、ならびに腸切除の長さの増大（＞３０ｃｍ ｐ＝０．００４、ＯＲ＝２．１３／＞４０ｃｍ ｐ＝０．０３、ＯＲ＝１．９６）に関連した。ＲＮＡＳＥＴ２疾患関連ＳＮＰを有する患者は、再手術までの時間がより短いことを示した（ｐ＝０．０４、ｚスコア＝２．１６）。高いＲｕｔｇｅｅｒｔｓスコア（＞２）での手術後の内視鏡検査（ｎ＝３６９）は、手術後の予防を受けない患者（ｐ＝０．０２、ｚスコア＝２．５６）または、抗ＴＮＦ治療を単独で受ける患者（ｐ＝０．０３、ｚスコア＝２．４６）におけるＲＮＡＳＥＴ２リスクＳＮＰに関連したが、他のＩＢＤ治療を受けた患者では、関連性は検出されなかった。
【０１５６】
この研究は、臨床的に関係のある疾患挙動に関連する、ＲＮＡＳＥＴ２疾患関連ＳＮＰの機能的意義を見極める。ＲＮＡＳＥＴ２リスクＳＮＰは、複雑かつ抵抗性の疾患挙動を示唆する臨床的パラメータに関連した。さらに、手術後の治療に対する反応、および疾患の再発は、ＲＮＡＳＥＴ２リスクＳＮＰに関連した。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、我々の先の発見と共に得られたこれらの結果は、ＲＮＡＳＥＴ２の調節が、ＴＬ１Ａに影響された疾患病態の基礎となることもあり、そして代替的な治療アプローチから利益を得ることもある、現在の治療方針に対して反応しない被験体を識別する疾患バイオマーカーとして役立つこともあることを示す。
【０１５７】
＜実施例７＞
【０１５８】
【表１９】
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【０１５９】
【表２０】
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【０１６０】
ｒｓ２１４９０９２（Ｃ−非リスクアレル／Ｔ−リスクアレル）リスクＳＮＰは、ＩＲＦ４／ＰＵ．１／ＥＬＦ−１の結合部位を消失させる。ＩＲＦ４はリンパ球特異的で、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７およびＴｒｅｇのサブセットの分化のために不可欠なＩＢＤ感受性ＳＮＰである。ＥＬＦ−１は日本人集団中のＣＤ感受性ＳＮＰである。それは、リンパ球細胞中で発現させられ、発現のエンハンサーおよび抑制因子の両方として作用し、ならびにＩＬ２およびＩＬ２３シグナル伝達に関与するＥＴＳファミリーの転写因子である。ＰＵ．１もまた、ＥＴＳファミリーの転写因子であり、Ｔ細胞の発達の初期段階にとって不可欠である。それは、粘膜中に見られγδＴ細胞をダウンレギュレートして、 自然免疫において役割を果たし、そしてＴＨ９細胞中で発現させられたとき、これらの細胞は、腸の上皮細胞におけるＩＬ−９受容体のシグナル伝達を介して、Ｔ細胞を媒介とした大腸炎を引き起こす）
【０１６１】
ＲＮＡＳＥＴ２の発現は、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＬ１Ａの処置後に減少し、ＲＮＡＳＥＴ２のサイレンシングがＴＬ１Ａを媒介としたＩＦＮ−γ分泌を増強した。臨床的な相互関係もまた、チオプリン治療の治療不全、抗ＴＮＦ治療の治療不全、ＡＮＣＡ血清陽性、Ｂ２／Ｂ３対Ｂ１（狭窄／浸潤 対 非浸潤／非狭窄）疾患、腸切除の長さの増大、第２の手術までの時間の短縮、高いＲｕｔｇｅｅｒｔｓスコアの疾患の内視鏡的再発などが含まれるがこれらに限定されない、ＲＮＡＳＥＴ２疾患関連ＳＮＰに対して識別されてきた。
【０１６２】
本発明の様々な実施形態は、詳細な説明において上述される。これらの記載が上述の実施形態について直接説明する一方、当業者が、本明細書において示され説明された特定の実施形態まで、変更および／または変化を考えうることが理解される。本説明の範囲内に属するいかなる変更または変化も、同様に本明細書に含まれていることが意図される。もし、具体的に明記されていなければ、それは、本明細書および特許請求の範囲中の単語およびフレーズが、当業者に対して通常かつ慣用の意味で伝わるという本発明者らの意向である。
【０１６３】
本出願の提出時の、出願人に対して既知の本発明の様々な実施形態の先の記述が提示されており、例示および説明の目的を意図している。本説明は、網羅的であることも、開示された正確な形状へ本発明を限定することも意図しておらず、多くの変更および変化が、上述の教示の観点から可能である。記述された実施形態は、本発明の原理およびその実際的応用について説明し、そして当業者が、様々な実施形態において、かつ特定の企図された使用に適するような様々な変更で、本発明を活用することを可能にする役割を果たす。したがって、本発明が、本発明を実行するために開示された特定の実施形態に限定されないことが意図されている。
【０１６４】
本発明の特定の実施形態が示され、説明された一方、本明細書の教示に基づいて、変化および変更が、本発明およびそのより広範囲の態様から逸脱することなく行われてもよく、そしてそれ故に、添付された特許請求の範囲が、変化および変更が本発明の精神および範囲内にあるように、それらのすべての範囲内に包含されることは、当業者にとって明白だろう。概して、 本明細書において使用される用語は、「開放的な」用語（”ｏｐｅｎ” ｔｅｒｍｓ）として通常は意図される（例えば、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「などを含んでいるが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」として解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」ことは「少なくとも有する（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」と解釈されるべきであり、用語は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、「などを含む、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」として解釈されるべきである、等）ことが、当業者によって理解されるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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