(57)【要約】  ヒトＰＤ−１に対するＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の結合を阻害するヒト化抗ＰＤ−１抗体のサブセットである。これらの結合タンパク質は、例えば癌を含む免疫不全疾患を治療するために、ＰＤ−１シグナル経路の操作を通して、免疫系を調節する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３に記載のＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４〜６に記載のＣＤＲ配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＰＤ−１に結合する抗体又は抗体断片。
【請求項２】
ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に結合するのを阻害又は抑制する請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項３】
キメラ抗体又は抗体断片である請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項４】
ヒト化抗体又は抗体断片である請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項５】
ヒトＰＤ−１がＬ１２８Ａ、Ｐ１３０Ａ、Ｉ１３４Ａ、Ｅ１３６Ａ及びＫ７８Ａからなる群から選択される１つ以上の変異を含む場合に、ヒトＰＤ−１に結合する請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項６】
前記重鎖可変領域は、配列番号７〜９に記載の接触配列のいずれか、任意に配列番号７〜９の３つ全ての接触配列からなる群から選択される接触配列を含む請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項７】
前記重鎖可変領域は、配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性、任意に配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項８】
前記重鎖可変領域は、配列番号１３に対して少なくとも９５％の配列同一性、任意に配列番号１３に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項９】
前記重鎖可変領域は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項１０】
前記軽鎖可変領域は、配列番号１０〜１２に記載の接触配列のいずれか、任意に配列番号１０〜１２の３つ全ての接触配列からなる群から選択される接触配列を含む請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項１１】
前記軽鎖可変領域は、配列番号１４に対して少なくとも８５％の配列同一性、任意に配列番号１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項１２】
前記軽鎖可変領域は、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性、任意に配列番号１４に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項１３】
前記軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項１４】
前記重鎖可変領域は、配列番号７〜９に記載の接触配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１０〜１２に記載の接触配列を含む請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項１５】
ａ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、配列番号１〜３に記載の３つのＣＤＲ配列及び配列番号７〜９に記載の３つの接触配列を含む重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、配列番号４〜６に記載の３つのＣＤＲ配列及び配列番号１０〜１２に記載の３つの接触配列を含む軽鎖可変領域と、を含むヒトＰＤ−１に結合できる抗体又は抗体断片。
【請求項１６】
前記重鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記軽鎖可変領域は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する請求項１５に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項１７】
前記重鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記軽鎖可変領域は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する請求項１５に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項１８】
前記重鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有し、前記軽鎖可変領域は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する請求項１５に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項１９】
前記重鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む請求項１５に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項２０】
医薬的に許容可能なキャリアに含まれた請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片をコードする核酸配列。
【請求項２２】
ａ）ＰＤ−１を含むサンプルを準備することと、
ｂ）前記ＰＤ−１を請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片と接触することと、
ｃ）前記ＰＤ−１をＰＤ−Ｌ１に曝露することと、を含むＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との相互作用を阻害する方法。
【請求項２３】
ａ）ＰＤ−１を含むサンプルを準備することと、
ｂ）前記ＰＤ−１を請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片と接触することと、
ｃ）前記ＰＤ−１をＰＤ−Ｌ２に曝露することと、を含むＰＤ−Ｌ２とＰＤ−１との相互作用を阻害する方法。
【請求項２４】
ａ）ＰＤ−１を含むサンプルを準備することと、
ｂ）前記ＰＤ−１を請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片と接触することと、
ｃ）前記ＰＤ−１をＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に曝露することと、を含むＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２とＰＤ−１との相互作用を阻害する方法。
【請求項２５】
ａ）ＰＤ−１を発現する細胞を準備することと、
ｂ）前記細胞を請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片と接触することと、
ｃ）前記細胞をＰＤ−Ｌ１に曝露することと、を含む細胞内のＰＤ−１シグナリングを抑制する方法。
【請求項２６】
ａ）ＰＤ−１を発現する細胞を準備することと、
ｂ）前記細胞を請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片と接触することと、
ｃ）前記細胞をＰＤ−Ｌ２に曝露することと、を含む細胞内のＰＤ−１シグナリングを抑制する方法。
【請求項２７】
ａ）ＰＤ−１を発現する細胞を準備することと、
ｂ）前記細胞を請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片と接触することと、
ｃ）前記細胞をＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に曝露することと、を含む細胞内のＰＤ−１シグナリングを抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１６年１月１４日に出願された米国出願番号第６２／２７８６６９号の優先権の利益を主張するものであり、その内容の全てが本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
［電子的に提出された配列表の参照］
配列表の正式な写しは、２０１７年１月１３日に作成され、１４キロバイトのサイズを有する「ＢＰＳ＿ＰＣＴ＿ＳＥＱ＿ＩＤ」ファイルを含み、ＡＳＣＩＩフォーマットされた配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された。このＡＳＣＩＩフォーマットされた書類に含まれる配列表は、明細書の一部を構成し、本明細書に参照として組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
リンパ球は静止期で存在し、増殖のためには抗原による刺激を必要とし、有効な免疫反応を開始する。Ｔ細胞の場合、このシグナルは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）結合抗原により伝達される。Ｔ細胞の完全な活性化は、ＴＣＲの活性化に加えて種々の共刺激及び共抑制経路の入力を必要とする(Croft, M. (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:609)。
【０００４】
ＰＤ−１及びＣＤ２７９としても知られているプログラム細胞死１は、５５ｋＤａで細胞表面にあり、リンパ球、特にＴ細胞に主に発現された共抑制受容体である(Blank, C. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307)。ＰＤ−１に対するリガンドは、Ｂ７−Ｈ１及びＣＤ２７４としても知られているＰＤ−Ｌ１、並びにＢ７−ＤＣ及びＣＤ２７３としても知られているＰＤ−Ｌ２を含む。ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ２の相互作用は、Ｔ細胞の活性化の阻害を引き起こし、増殖、炎症性サイトカインの分泌、及びＴ細胞の細胞溶解等のＴ細胞エフェクター機能の抑制を引き起こす(Freeman, G. (2000) J. Exp. Med. 192:1027; Latchman, Y. (2001) Nat. Immunol. 2:261; Rodig, N. (2003) Eur. J. Immunol. 33:3117)。
【０００５】
健康な個人において、ＰＤ−１発現は、Ｔ細胞の活性化により誘導され、免疫反応が有効に病原体を除去した後に低減する(Vibhakar, R. (1997) Exp. Cell Res. 232:25; Zajac, A. (1998) J. Exp. Med. 188:2205)。いくつかの例において、不成功の免疫反応での延長された抗原刺激は、ＰＤ−１発現の上昇及び消耗されたＴ細胞の表現型を引き起こす(Zajac, A. (1998) J. Exp. Med. 188:2205)。マウスにおけるＰＤ−１のノックアウトは致命的でなく、非肥満マウス糖尿病モデルにおいて、ＰＤ−１リガンドであるＰＤ−Ｌ１のノックアウトは、免疫介在性疾病の発生を促進させる(Wang, J. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci USA 102:1823)。従って、その主要な役割は、Ｔ細胞の活性をダウンレギュレートすることにより、自己免疫疾患の発生を防ぐために免疫反応を制御することと信じられている。
【０００６】
多くの腫瘍は、ＰＤ−１によるリンパ球の負の調節のために必要とされるリガンド（ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）の増大された発現レベルを示してきた。これは、特にＰＤ−Ｌ１において真実である。扁平上皮癌、結腸腺癌及び乳腺癌は、全てＰＤ−Ｌ１の上昇したレベルを示してきた(Brown, J. (2003) J. Immunol. 170:1257)。さらに、マウスの腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１の導入遺伝子発現は、腫瘍形成及び浸潤の増大を引き起こし(Iwai, Y. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:12293)、マウスメラノーマモデルにおける腫瘍成長はＰＤ−１ノックアウトにより抑制される(Iwai, Y. (2005) Int. Immunol. 17:133)。
【０００７】
これらの前臨床試験は、抗ＰＤ−１抗体を用いて増強されたＴ細胞の機能が、例えば癌といった免疫機能不全疾患の有望な治療法となることの証拠を提供する。また、臨床試験もこの仮説を支持する。抗ＰＤ−１抗体の使用を介する等の免疫チェックポイント阻害剤の遮断は、いくつかの型の固形腫瘍における臨床活性を示した(Brahmer, J. (2010) J. Clin. Oncol. 28:3167; Brahmer J. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2455; Hamid, O. (2013) N. Engl. J. Med. 369:134; Topalian, S. (2014) J. Clin. Oncol. 32:1020; Wolchok, J. (2013) N. Engl. J. Med. 369:122)。細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）を阻害する第１免疫チェックポイント阻害剤である、完全ヒト型イムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇ１モノクローナル抗体は、２０１１年に転移性メラノーマの治療のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された。３年後、米国ＦＤＡは、進行性メラノーマの治療のために最初の抗ＰＤ−１抗体を承認し、ＰＤ−１遮断薬の第ＩＩＩ相試験の最初の公開が米国にて２０１５年に始まった(Robert, C. (2015) N. Engl. J. Med. 372:320)。
【０００８】
ＰＤ−１は、治療処置のための有望な標的を明らかにする一方で、ＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２との相互作用を防止できる改善された組成物の開発の必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ヒトＰＤ−１に特異的に結合し、ヒトＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２のそれぞれとの結合を阻害するヒト化抗体を提供する。特に、本発明の一態様において、ヒトＰＤ−１に結合する抗体又は抗体断片を提供し、その抗体又は抗体断片は、配列番号１〜３に記載のＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４〜６に記載のＣＤＲ配列を含む軽鎖可変領域とを有する。
【００１０】
抗体又は抗体断片は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２とに結合するＰＤ−１を阻害又は抑制する。抗体は、医薬組成物の有効成分として、又は薬剤として用いるための好ましくはキメラ型、最も好ましくはヒト型である。好ましくは、抗体又は抗体断片は、ヒトＰＤ−１がＬ１２８Ａ、Ｐ１３０Ａ、Ｉ１３４Ａ、Ｅ１３６Ａ及びＫ７８Ａからなる群から選択される１つ以上の変異を有する場合に、ヒトＰＤ−１に結合する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号７〜９に記載の接触配列のいずれかからなる群から選択される接触配列、又は配列番号７〜９に記載の接触配列のうちの複数を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。更なる実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１３に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。更なる実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１３】
軽鎖可変領域は、配列番号１０〜１２に記載の接触配列のいずれかからなる群から選択される接触配列、又は配列番号１０〜１２に記載の接触配列のうちの複数を有する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。更なる実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１４に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。更なる実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
関連する実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号７〜９に記載の接触配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１０〜１２に記載の接触配列を有する。
【００１６】
関連する態様において、提供されるヒトＰＤ−１に結合できる抗体又は抗体断片は、重鎖可変領域が配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、また、重鎖可変領域が配列番号１〜３に記載の３つのＣＤＲ配列及び配列番号７〜９に記載の３つの接触配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号１４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、また、軽鎖可変領域が配列番号４〜６に記載の３つのＣＤＲ配列及び配列番号１０〜１２に記載の３つの接触配列を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。更なる実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。更なる実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。更なる実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸配列を有し、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
種々の態様の抗体のそれぞれは、単離型で提供され得る。治療用途に適応される場合、抗体のそれぞれは医薬的に適用可能なキャリアと共に提供され得る。
【００１９】
本発明の他の関連する態様において、上記抗ＰＤ−１抗体又は抗体断片のいずれかをコードする核酸配列が提供され得る。
【００２０】
更なる他の関連する態様において、ヒトＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害する方法が提供され、その方法は、ヒトＰＤ−１を含むサンプルを準備することと、当該ＰＤ−１と上記抗ＰＤ−１抗体又は抗体断片の１つを接触することと、当該ＰＤ−１をＰＤ−Ｌ１に曝露することとを含む。
【００２１】
更なる他の関連する態様において、ヒトＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用を阻害する方法が提供され、その方法は、ヒトＰＤ−１を含むサンプルを準備することと、当該ＰＤ−１と上記抗ＰＤ−１抗体又は抗体断片の１つを接触することと、当該ＰＤ−１をＰＤ−Ｌ２に曝露することとを含む。
【００２２】
更なる他の関連する態様において、ヒトＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２との相互作用を阻害する方法が提供され、その方法は、ヒトＰＤ−１を含むサンプルを準備することと、当該ＰＤ−１と上記抗ＰＤ−１抗体又は抗体断片の１つを接触することと、当該ＰＤ−１をＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ２に曝露することとを含む。
【００２３】
更なる他の関連する態様において、細胞におけるＰＤ−１シグナリングを低減する方法が提供され、その方法は、ヒトＰＤ−１を発現する細胞を準備することと、当該細胞と上記抗ＰＤ−１抗体又は抗体断片とを接触することと、当該細胞をＰＤ−Ｌ１に曝露することとを含む。
【００２４】
更なる他の関連する態様において、細胞におけるＰＤ−１シグナリングを低減する方法が提供され、その方法は、ヒトＰＤ−１を発現する細胞を準備することと、当該細胞と上記抗ＰＤ−１抗体又は抗体断片とを接触することと、当該細胞をＰＤ−Ｌ２に曝露することとを含む。
【００２５】
更なる他の関連する態様において、細胞におけるＰＤ−１シグナリングを低減する方法が提供され、その方法は、ヒトＰＤ−１を発現する細胞を準備することと、当該細胞と上記抗ＰＤ−１抗体又は抗体断片とを接触することと、当該細胞をＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に曝露することとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、陽性対照（図１Ｂ）と比較される、ヒトＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用に対する一連の濃度のＢＰＳｈＡｂ−１０Ｄ３による阻害を示すグラフ（図１Ａ）である。
【００２７】
【図２】図２は、ヒトＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ２相互作用に対する一連の濃度のｈＡｂ−１０Ｄ３による阻害を示すグラフである。
【００２８】
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、陽性対照と比較される、M.fascicularisのＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用に対する一連の濃度のｈＡｂ−１０Ｄ３による阻害を示すグラフである。
【００２９】
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、対照と比較される、一連の濃度のｈＡｂ−１０Ｄ３によるヒトＰＤ−１シグナリングの中和を示すグラフである。
【００３０】
【図５】図５は、抗ＰＤ−１抗体との結合を試験されるためのヒトＰＤ−１融合タンパク質を示す。
【００３１】
【図６】図６は、結合相互作用に関連するヒトＰＤ−１における種々のアミノ酸群を確認するための、ヒトＰＤ−１の種々の変異体に対する商業的に入手可能なメルク抗ＰＤ−１抗体(CAT#71120)の結合をＢＰＳｈＡｂ−１０Ｄ３と比較したグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、抗ヒトＰＤ−１抗体及びその抗体断片を提供し、それらは簡便のために合わせて抗ＰＤ−１抗体と呼ばれる。これらの抗体は、ヒトＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１、ヒトＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２、又はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の両方との相互作用を抑制又は阻害する。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１に対するアンタゴニストとして作用し、これにより、Ｔ細胞の活性化を負に調節するＰＤ−１抑制性シグナルを弱める又は遮断する。ＰＤ−１抑制性シグナルを遮断できる抗ＰＤ−１抗体は、例えば持続性感染を治療する際の宿主の抗菌免疫の増強、宿主の抗癌免疫を増強するための腫瘍免疫回避の無効化、及び細胞性免疫反応の誘導のためのワクチンと組み合わせる際のアジュバント様特性の提供を含む種々の臨床適用の用途を有する。
【００３３】
Ａ．定義
他に定義されていない限り、本明細書において用いられる全ての技術的及び科学的用語は、クレームされた対象が属する分野で一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において、用語に複数の定義がある場合は、この項における定義を優先する。本明細書において参照される全ての特許、特許出願、公開、並びに公表されたヌクレオチド及びアミノ酸配列（例えばＧｅｎＢａｎｋ又は他のデータベースで入手できる配列）は、参照として組み込まれる。参照は、ＵＲＬ又は他の識別子若しくはアドレスからなる場合、そのような識別子は変更でき、インターネットにおける特定の情報は入れ替わるが、同等の情報はインターネットをサーチすることにより発見され得る。その上、参照は、そのような情報の利用可能性及び公に普及していることの証拠となる。
【００３４】
前述の概要及び以下の詳説は、例示であり、単に説明のためであり、特許請求の範囲の対象のいずれも制限するものでない。本願において、他に特に述べない限り、単数形の使用は複数形を含む。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、他に明示しない限り複数対象を含むということを留意すべきである。本願において、他で述べられない限り、「又は」の使用は「及び／又は」を意味する。さらに、「含んでいる（including）」の語、並びに「含む（include）」、「含む（includes）」及び「含まれた（included）」等の他の形態の語の使用は制限しない。
【００３５】
本明細書で用いられる項の見出しは、組織化の目的のためであって、記載された対象を限定するように解釈されるものでない。
【００３６】
標準の化学用語の定義は、以下に限られないが、Carey and Sundberg "ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4th ED." Vols. A (2000) and B (2001), Plenum Press, New Yorkを含む参考図書において見つけることができる。他に示されていない限り、質量分析法、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生物化学、組換えＤＮＡ技術及び薬学の従来の方法が用いられる。
【００３７】
特定の定義が提供されていない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、並びに薬及び医薬化学の実験法及び技術に関する専門用語は、本分野において認知されるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、輸送及び患者の処置のために用いられ得る。標準的技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）のために用いられ得る。反応及び精製技術は、例えばキットの製造者の説明書を用いて、又は本分野において一般に知られている若しくは本明細書に記載されている方法で行われ得る。上記技術及び方法は、従来の方法及び本明細書において述べられ、論じられた種々の概説及び詳細な説明で説明されるように、概して行われ得る。
【００３８】
本明細書に記載された方法及び組成物は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコール、細胞株、コンストラクト及び試薬に限定されず、異なり得ることが理解される。本明細書で用いられた用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、本明細書で記載された方法、化合物、組成物の範囲を限定することを意図していないことが理解される。
【００３９】
項ＰＤ−１抗体を用いて「処置する（treat）」、「処置している（treating）」又は「処置（treatment）」の用語は、疾病、障害若しくは状態の症状の軽減、緩和若しくは改善、更なる症状の予防、症状の原因となる代謝の改善若しくは予防、例えば疾病、障害若しくは状態の発生の阻害、疾病、障害若しくは状態の緩和、疾病、障害若しくは状態の退行を起こすこと、疾病、障害若しくは状態により引き起こされる状態の緩和、又は疾病、障害若しくは状態の症状の停止といった疾病、障害若しくは状態の阻害を含む。「処置する（treat）」、「処置している（treating）」又は「処置（treatment）」の用語は、以下に限られないが、予防的及び／又は治療的処置を含む。
【００４０】
抗ＰＤ−１抗体の製剤化に関して「許容可能」又は「医薬的に許容可能」の用語は、処置される対象の健康状態に対する持続的な有害効果を有していない、又は本明細書に記載された１つ以上の抗ＰＤ−１抗体の生物学的活性又は特性を無効にしない成分であることを意味し、比較的に非毒性である。
【００４１】
抗ＰＤ−１抗体又は医薬組成物の投与による特定の疾病、障害又は状態の症状の「改善」の用語は、永続的又は一時的、持続性又は一過性のどちらにせよ抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−１抗体を含む医薬組成物の投与に起因する又は関連する重症度の低減、発症の遅延、進行の減速、又は期間の短縮を意味する。
【００４２】
本明細書で用いられる「医薬的組合せ」の用語は、１つの有効成分（例えば抗ＰＤ−１抗体）以上の混合又は組合せにより生じた製品を意味し、有効成分の固定された及び固定されていない組合せを含む。「固定された組合せ」の用語は、１つの有効成分（例えば抗ＰＤ−１抗体）及び共薬剤が単一体又は用量の形態で患者に同時に投与されることを意味する。「固定されていない組合せ」の用語は、１つの有効成分（例えば抗ＰＤ−１抗体）及び共薬剤が別体で同時に又は特に間隔の制限なく順次患者に投与されることを意味し、そのような投与は、患者の体内に有効なレベルの２つの薬剤を提供する。また、後者は、例えば３つ以上の有効成分の投与といったカクテル療法に適用される。
【００４３】
本明細書で用いられる「医薬組成物」の用語は、キャリア、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤及び／又は賦形剤等の１つ以上の他の化学成分を含む１つ以上の抗ＰＤ−１抗体を意味する。医薬組成物は、生物に対する抗ＰＤ−１抗体の投与を容易にする。抗ＰＤ−１抗体を投与する複数の技術は、本分野に存在し、以下に限定されないが、局所投与、点眼投与、眼球内投与、眼球周囲投与、静脈投与、経口投与、エアロゾル投与、非経口投与を含む。
【００４４】
本明細書で用いられる「キャリア」の用語は、細胞又は組織内への所望の薬剤（例えば抗ＰＤ−１抗体）の導入を容易にする比較的に非毒性の化合物又は薬剤を意味する。
【００４５】
「希釈剤」の用語は、輸送前に所望の薬剤（例えば抗ＰＤ−１抗体）を希釈するのに用いられる化合物を意味する。希釈剤は、より安定な環境を提供できるため安定剤のためにも用いられ得る。（ｐＨを制御又は維持できる）緩衝液に溶解された塩は、本分野で希釈剤として有益であり、以下に限られないが、リン酸緩衝生理食塩水を含む。
【００４６】
「同時投与」または類似の用語は、単一の患者への選択された薬剤（例えば抗ＰＤ−１抗体又はそれと共薬剤との組成物）の投与を含むことを意味し、薬剤が同一若しくは異なる投与経路又は同一若しくは異なる時間により投与されるといった治療計画を含むことが意図される。
【００４７】
「有効量」又は「治療的有効量」の用語は、治療されるための疾病、障害又は状態の症状の１つ以上の程度を緩和するのに投与される本明細書で記載される抗ＰＤ−１抗体、薬剤、組合せ又は医薬組成物の十分な量を意味する。その結果、疾病の兆候、症状若しくは原因の軽減及び／又は緩和を可能とし、又は生体系の所望の変更を可能とする。例えば、治療用途における「有効量」は、過度の副作用がなく、所望の薬理効果、治療的改善又は疾病症状の臨床的に顕著な低減を提供するのに必要とする抗ＰＤ−１抗体、薬剤、組合せ又は医薬組成物の量である。個々の場合における適切な「有効量」は、用量漸増試験等の技術を用いて決定され得る。「治療的有効量」の用語は、例えば予防的有効量を含む。「有効量」は、抗ＰＤ−１抗体の代謝、遺伝学、組合せ若しくは医薬組成物、年齢、体重、対象の全身状態、治療される条件、治療される条件の重症度、及び処方医師の判断の違いにより対象毎に異なり得る。単なる例示として、治療的有効量は、以下に限定されないが、用量漸増臨床試験を含む通常の試験によって決定され得る。
【００４８】
「予防的有効量」の用語は、治療される疾病、状態又は障害の症状の１つ以上の程度を緩和するのに患者に適用される本明細書で記載される抗ＰＤ−１抗体、化合物、薬剤、組合せ又は医薬組成物の量を意味する。そのような予防的適用において、そのような量は、患者の健康状態、体重等に依存し得る。以下に限定されないが用量漸増臨床試験を含む通常の試験によりそのような予防的有効量を決定することは当業者に容易に考えられる。
【００４９】
本明細書で用いられる「対象」又は「患者」の用語は、動物を意味し、それは治療、観察又は試験の対象となる。単なる例示として、対象は、以下に限定されないが、ヒトを含む哺乳動物であってもよい。
【００５０】
「増強」又は「増強する」の用語は、所望の効果の抗力又は持続期間を増大する又は延長することを意味する。例示として、治療的薬剤の単一又は組合せの効果の「増強」は、疾病、障害又は状態の治療における薬剤の効果の抗力、持続期間及び／又は大きさを増大又は延長する能力を意味する。患者に用いる場合、この使用に有効な量は、疾病、障害又は状態の重症度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物反応、並びに治療医師の判断に依存するであろう。
【００５１】
「調節する」の用語は、単なる例示として、標的の活性を増強すること、標的の活性を阻害若しくは中和すること、標的の活性を制限すること、又は標的の活性を拡大することを含む標的の活性を変更するために直接又は間接に標的に相互作用することを意味する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された抗ＰＤ−１抗体及び医薬組成物は、１つ以上のそれぞれの標的（例えば１つ以上の抗ＰＤ−１抗体）の活性を変更できる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された抗ＰＤ−１抗体は、細胞（例えばＴ細胞）におけるＰＤ−１の活性を変更（例えば低減）し、その結果、例えばＴ細胞の活性化及びＴ細胞エフェクター機能の増大を引き起こす。
【００５２】
本明細書で用いられる「標的」の用語は、ＰＤ−１等の生物学的分子（例えば標的タンパク質又はタンパク質複合体）、又は本明細書に記載された選択的結合剤（例えば抗ＰＤ−１抗体）若しくは医薬組成物により結合されることが可能な生物学的分子の一部を意味する。本明細書で用いられる「非標的」の用語は、本明細書に記載された選択的結合剤又は医薬組成物により選択的に結合されない生物学的分子又は生物学的分子の一部を意味する。
【００５３】
「標的活性」又は「細胞反応」の用語は、抗ＰＤ−１抗体により変更されることが可能な生物学的活性、又は抗ＰＤ−１抗体のＰＤ−１受容体への結合により生じる細胞反応を意味する。特定の例示的標的活性及び細胞反応は、以下に限定されないが、結合親和性、シグナル伝達、遺伝子発現、細胞遊走、細胞増殖、細胞分化、細胞媒介細胞傷害性、及び１つ以上の癌に関連する症状の改善を含む。
【００５４】
「アミノ酸」の用語は、末端アミン、及び該アミンとの間に炭素原子を有するカルボン酸官能基で構成された分子を意味し、その炭素原子に結合した側鎖官能基（例えばセリンではメトキシ基）を含む場合もある。通常、アミノ酸は天然及び非天然に分類される。天然アミノ酸の例は、中でも、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。非天然アミノ酸の例は、中でも、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、２−アミノブチル酸、デヒドロアラニン、ｇ−カルボキシグルタミン酸、カルニチン、γ‐アミノブチル酸、ヒロドキシプロリン及びセレノメチオインを含む。本明細書において、アミノ酸は、Ｌ−光学異性体又はＤ−光学異性体であってもよいことが理解されるべきである。
【００５５】
Ｂ．抗ＰＤ−１抗体
本発明は抗体を提供し、それは抗体断片をも意味し、ヒトＰＤ−１に結合する。ＢＰＳ抗体１０Ｄ３（ヒト化されており、ｈＡｂ１０Ｄ３とも呼ぶ。）は、ＰＤ−１に対する高い特異性、及びＰＤ−１シグナリングを有効に阻害又は抑制する能力を示す。図１〜４に示すように、ｈＡｂ１０Ｄ３クローンは、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１の結合及びＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ２の結合の両方を阻害する。さらに、ＰＤ−１の変異分析は、ｈＡｂ１０Ｄ３クローンがメルク社の抗ＰＤ−１(CAT#71120)と比較して異なるエピトープを認識することを示した（図６）。ｈＡｂ１０Ｄ３クローンのキーとなる領域の配列データを表１に示す。
【表１】
2019509759.tif 000003
2019509759.tif 000004
2019509759.tif 000005
【００５６】
従って、本発明は、ヒトＰＤ−１に結合する抗体を提供する。特に、その抗体は、配列番号１〜３に記載のＣＤＲ配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４〜６に記載のＣＤＲ配列を有する軽鎖可変領域とを有する。更なる実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号７〜９に記載の接触配列のいずれかからなる群から選択される接触配列、任意に配列番号７〜９の３つ全ての接触配列を有する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性、任意に配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸を有する。更なる実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３に対して少なくとも９５％の配列同一性、任意に配列番号１３に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸を有する。ヒト化抗ＰＤ−１抗体であるｈＡｂ１０Ｄ３は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する。
【００５８】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号１０〜１２に記載の接触配列のいずれかからなる群から選択される接触配列、任意に配列番号１０〜１２の３つ全ての接触配列を有する軽鎖可変領域を有する。好ましくは、軽鎖可変領域は、配列番号１４に対して少なくとも８５％の配列同一性、任意に配列番号１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸を有する。更なる実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性、任意に配列番号１４に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸を有する。ヒト化抗ＰＤ−１抗体であるｈＡｂ１０Ｄ３は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【００５９】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、ＰＤ−１結合性を維持できれば、それぞれ他方の軽鎖可変領域及び他方の重鎖可変領域と結合されてもよく、いくつかの実施形態において、抗ヒトＰＤ−１抗体は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号１４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域は、さらに配列番号１〜３に記載の３つのＣＤＲ配列と配列番号７〜９に記載の３つの接触配列とを有し、軽鎖可変領域も配列番号４〜６に記載の３つのＣＤＲ配列と配列番号１０〜１２に記載の３つの接触配列とを有する。
【００６０】
更なる実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。更なる実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。更なる実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。ヒト化抗ＰＤ−１抗体であるｈＡｂ１０Ｄ３は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを有する。
【００６１】
上記のように、本発明は、配列同一性の割合内でＣＤＲ周辺の配列に変異を含む。２つのアミノ酸又はポリヌクレオチド配列に関する「配列同一性の割合」の用語は、配列同士が最適に整列された場合に２つの配列の同一である残基の割合を意味する。従って、８０％のアミノ酸配列同一性は、２つの最適に整列されたポリペプチド配列において８０％のアミノ酸が同一であることを意味する。同様に、８５％のアミノ酸配列同一性は、２つの最適に整列されたポリペプチド配列において８５％のアミノ酸が同一であることを意味し、９０％、９５％及び９９％のアミノ酸配列同一性は、２つの最適に整列されたポリペプチド配列においてそれぞれ９０％、９５％及び９９％のアミノ酸が同一であることを意味する。
【００６２】
同一性の割合は、例えば配列同士を整列し、２つの整列された配列間で同一の数をカウントし、より短い配列の長さで割り、１００を掛けることによって、２つの分子間の配列情報を直接に比較することにより決定され得る。容易に入手可能なコンピュータプログラムは、ペプチド分析のためのSmith及びWatermanの局所ホモロジーアルゴリズム(1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489を適応するALIGN（Dayhoff, M. O. in "Atlas of Protein Sequence and Structure", M. O. Dayhoff et., Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.）等の分析を補助するのに用いられ得る。ヌクレオチド配列同一性を決定するプログラムは、Wisconsin Sequence Analysis Package, 8版 (Genetics Computer Group, Madison, Wis.から入手可能)で利用可能であり、例えばＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＧＡＰプログラムであり、それらもSmith及びWatermanアルゴリズムに依存する。これらのプログラムは、製造者により推薦され、上記のWisconsin Sequence Analysis Packageに記載されたデフォルトパラメータ５を用いて容易に利用される。配列類似性を決定するのに適するアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、それは、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターを通して公に入手可能である。同様に、割合ホモロジーを決定するためのコンピュータプログラムも容易に入手可能である。
【００６３】
配列同一性の変動は、重鎖及び軽鎖可変領域内のアミノ酸配列の全てがＰＤ−１に結合するのに必要であるわけではないため、ＣＤＲの外側で許容される。フレームワーク領域等のＣＤＲの外側の特定の領域又はＣＤＲ及び接触領域は、ＰＤ−１結合能を失うことなく変異され得る。さらに、フレームワーク領域は、更なる変異を受けてもよく、従って、異なる種の治療においてＣＤＲを適応する場合に配列が異なる。変異又は変化は以下の表記の使用により記載され得る：位置（＃）；置換されたアミノ酸残基。この表記によると、例えばある位置でのアラニン残基のグリシン残基への置換は、Ａ＃Ｇとして示され、＃は位置を示す。所定の位置でアミノ酸残基が２つ以上の代替アミノ酸残基に置換される場合、これらの残基は、コンマ又はスラッシュにより分けられる。例えばアラニンのグリシン又はグルタミン酸のいずれかへの置換は、＃Ｇ／Ｅ、又は＃Ｇ，＃Ｅと示され得る。同一の位置におけるアラニンの欠失は、Ａｌａ＃＊、Ａ＃＊、＊＃Ａｌａ又は＊＃Ａと示され、＃はアミノ酸の位置を意味する。複数の変異は、プラス記号又はスラッシュにより分けられる。例えば、所定の位置でアラニン及びグルタミン酸がそれぞれグリシン及びセリンに置換される２つの変異は、Ａ＃Ｇ＋Ｅ＃Ｓ又はＡ＃Ｇ／Ｅ＃Ｓと示される。所定の位置＃でアミノ酸残基が２つ以上の代替アミノ酸残基に置換される場合、これらの残基はコンマ又はスラッシュにより分けられる。例えば、位置＃のアラニンのグリシン又はグルタミン酸のいずれかへの置換は、Ａ＃Ｇ，Ｅ、Ａ＃Ｇ／Ｅ、又はＡ＃Ｇ，Ａ＃Ｅと示される。特定の変異が提示されることなく本明細書において変異に適する位置＃が明らかにされる場合、いずれかのアミノ酸残基は、その位置に存在するアミノ酸残基に置換され得る。従って、例えばある位置＃でアラニンの変異が言及されているが、特定されていない場合、そのアラニンは、欠失又は他のアミノ酸残基（すなわち、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶのいずれか）への置換を受けていてもよい。
【００６４】
ＣＤＲの外側又はＣＤＲ及び接触配列の置換は、保存的変異又は保存的置換であってもよい。「保存的変異」又は「保存的置換」の用語は、それぞれ当業者が第１の変異に保存的と考えるであろうアミノ酸変異を意味する。ここでの「保存的」は、アミノ酸特性の観点で類似のアミノ酸を意味する。例えば特定の位置で変異が非脂肪族アミノ酸残基（例えばＳｅｒ）の脂肪族アミノ酸（例えばＬｅｕ）への置換を引き起こし、その後、同一の位置における異なる脂肪族アミノ酸（例えばＩｌｅ又はＶａｌ）への置換が、保存的変異を意味する。更なるアミノ酸特性は、残基の大きさ、疎水性、極性、電荷、ｐＫ値及び本分野で周知の他のアミノ酸特性を含む。従って、保存的置換は、塩基性から塩基性、酸性から酸性、極性から極性等の置換を含み得る。派生のアミノ酸のセットは、構造的理由で保存されている可能性がある。これらのセットは、Ｖｅｎｎダイヤグラム(Livingstone C. D. and Barton G. J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl Biosci. 9: 745-756; Taylor W. R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218)の形態で記載され得る。保存的置換は、例えば一般的に許容されたＶｅｎｎダイヤグラムのアミノ酸分類を記載する以下の表によってなされ得る。
【表２】
2019509759.tif 000006
【００６５】
表２のＶｅｎｎダイヤグラムを参照して、配列番号１３〜１６（配列番号１〜６及び任意に７〜１２の外側）に対する配列同一性の変動は、疎水性アミノ酸から他の疎水性アミノ酸、芳香族脂肪族アミノ酸から他の芳香族脂肪族アミノ酸、極性アミノ酸から他の極性アミノ酸、正電荷アミノ酸から他の正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸から他の負電荷アミノ酸、低分子アミノ酸から他の低分子アミノ酸、超低分子アミノ酸から超低分子アミノ酸への置換により生じ得る。
【００６６】
ＰＤ−１の変異分析は、ＰＤ−１のＬ１２８Ａ、Ｐ１３０Ａ、Ｉ１３４Ａ及びＫ７８Ａのアミノ酸置換が、ＰＤ−１に結合するｈＡｂ１０Ｄ３に顕著に影響しなイことを示した。Ｅ１３６Ａ変異は、低い親和性を示したが、抗ＰＤ−１は結合可能であった。Ｉ１２６Ａは抗体結合のために必要であった。メルク社の抗ＰＤ−１抗体(CAT#71120)で同一の試験を行った場合、Ｉ１２６、Ｐ１３０、Ｉ１３４、Ｅ１３６及びＫ１７８のそれぞれのアラニンによる置換は、メルク社の抗体に対して顕著に結合性が低下した。Ｌ１２８のアラニンによる置換は、メルク社の抗体のＰＤ−１結合性を完全に無効にし、それは、ヒトＰＤ−１の種々のアミノ酸がＰＤ−１結合に必要とされることを確認する。図６は、その試験の結果を要約している。さらに、この試験は、抗ＰＤ−１抗体における対応する位置が結合性を喪失することなく変異され得ることを提示する。
【００６７】
好ましくは、その抗体又は抗体断片は、ヒトＰＤ−１がＬ１２８Ａ、Ｐ１３０Ａ、Ｉ１３４Ａ、Ｅ１３６Ａ及びＫ７８Ａからなる群から選択される１つ以上の変異を有する場合にヒトＰＤ−１に結合する。
【００６８】
配列番号１〜６を参照して、本発明は、抗ＰＤ−１結合活性を有するＣＤＲのセットとして定義されることが可能であるが、好ましい実施形態において、（それぞれ単一のＣＤＲに対応する）ＣＤＲペプチドは、ＰＤ−１エピトープに特異的に結合するための可変領域を有する抗ＰＤ−１抗体を形成するように結合される。また、その抗体の可変領域は、例えば完全抗体、抗体断片（例えばＦ（ａｂ）、Ｆ（Ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ミニボディ、テトラボディ等）又は抗体若しくは抗体断片由来の組換体に存在し得る。
【００６９】
「抗体」の用語は、天然の又は部分的若しくは全体的に合成された単離されたイムノグロブリンを言う。従って、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、いくつかの実施形態において、ＰＤ−１エピトープに特異的に結合する本明細書で記載された抗体可変領域内のＣＤＲのセットである、又はそのセットと実質的に同一である結合ドメインを有するポリペプチド又はタンパク質を含む（例えば本明細書に記載されたものと少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９９％同一である。）。
【００７０】
いくつかの実施形態において、種々の抗体領域は、ＩｇＧを参照して説明され、ＩｇＧは、ジスルフィド結合により互いに結合された２つの長い重鎖と２つの短い軽鎖との４つのアミノ酸鎖を含む。重鎖及び軽鎖のそれぞれは、定常領域及び可変領域を含む。重鎖は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含む。軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、可変領域内に抗原特異性をもたらす３つの超可変領域がある。いくつかの実施形態において、超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を意味し、フレームワーク領域（ＦＷ）を意味するより保存された隣接領域間に挟まれている。種々の実施形態において、重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００７１】
いくつかの態様において、抗体可変領域は、組換え誘導体に存在する。組換え誘導体の例は、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及びミニ抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、同一又は異なるエピトープを認識する１つ以上の可変領域を含む。
【００７２】
既に述べたように、ｈＡｂ１０Ｄ３のＣＤＲはマウスに由来するが、ｈＡｂ１０Ｄ３はヒト化抗体である。そのように、抗ＰＤ−１抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体であってもよい。キメラ抗体は、定常領域とは異なる生物由来の可変領域で構築されたモノクローナル抗体である。例えば、キメラ抗体は、マウス由来の可変領域と、所定の宿主（例えばヒト）由来の定常領域とを含み得る。この目的を達成するために、抗ＰＤ−１キメラ抗体は、配列番号１〜６を組み込んだげっ歯類（例えばマウス）抗体由来の軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子を、それぞれヒト軽鎖及び重鎖定常ドメインのコーディング領域を適切に含む哺乳動物発現ベクターに挿入することにより形成され得る。これらの重鎖及び軽鎖「キメラ」発現ベクターは、受容細胞株内にコトランスフェクトされ、周知の培養技術を受け、その結果、キメラ抗体の軽鎖及び重鎖の両方を生成する。そのようなキメラ抗体は、宿主への投与による免疫原性を顕著に低減する一方で、元のげっ歯類モノクローナル抗体の結合能を有することが歴史的に示されている。
【００７３】
ヒト化抗体は、タンパク質配列がヒトにおいて天然に生成された抗体変異体に対する類似性を増大するように変異された非ヒト種由来の抗体として本分野において周知である。特に、「ヒト化」のプロセスは、ヒトに投与するために開発されたモノクローナル抗体に通常適用される（例えば抗癌剤として開発された抗体）。ヒト化は、特定の抗体を開発するプロセスが非ヒト免疫系（ラット／マウス等）での発生に関わる場合に必要となり得る。この方法で生成される抗体のタンパク質配列は、ヒトで天然に生じる同種抗体と部分的に異なり、従って、ヒト患者に投与される際に潜在的に免疫原性となる。完全性のために、ヒト化抗体はキメラ抗体と異なる。後者は、ヒト抗体により類似されたタンパク質配列を有するが、非ヒトタンパク質の長さがより長い。従って、ＣＤＲ１〜６は、マウス型又は他の哺乳動物型で存在し得るが、治療での使用がヒト化により改善される。この目的を達成するために、配列番号１〜６のＣＤＲは、医薬製剤での使用のためにヒト化される。ヒト化の技術は、本発明が属する分野において周知である。これに加えて、本明細書で提供された１つ以上のポリペプチドのヒト化は、中でも「再形成」、「超キメラ化」、「ＣＤＲ接合」、「ベニヤリング」及び「ＳＤＲ接合」により行われ得る。
【００７４】
抗ＰＤ−１抗体は、以下のものに限られないが、有用及び／又は追加の活性を提供する又は提供を補助する可変領域以外の成分又は追加の可変領域を含む追加の成分を含み得る。有用な活性は、例えば抗体依存性細胞傷害、食作用、補体依存性細胞傷害及び半減期／クリアランス率等の抗体エフェクター機能を含む。いくつかの実施形態において、抗体エフェクター機能は、Ｆｃγ受容体、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）及びＣ１ｑ等の種々の宿主成分により媒介される。種々の実施形態において、種々の型の抗体成分又は改変物は、エフェクター機能を増強するのに用いられる。有用な成分又は改変物の例は、非フコシル化オリゴ糖、増大された安定性を有するように改変されたアミノ酸（例えばＳ２２８Ｐ変異がされたＩｇＧ４）、ＦｃＲｎに対する増強された結合性を有するアミノ酸、Ｆｃγ受容体に対する増強された結合性を有するアミノ酸改変物、及びＦｃγ受容体に対する低減された結合親和性を有するアミノ酸改変物（例えばＤ２６５Ａ変異がされたＩｇＧ１）の使用を含む。
【００７５】
抗ＰＤ−１抗体は、細胞媒介性細胞傷害、Ｆｃγ受容体結合性及び／又は補体媒介性細胞傷害に依存して抗体を最小に変更されたＦｃ定常ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるようなＰＤ−Ｌ１遮断領域、ＰＤ−Ｌ２遮断領域、ＰＤ−Ｌ１非遮断領域又はＰＤ−Ｌ２非遮断領域を標的とする抗ＰＤ−１抗体は、二重特異性抗体内に含まれる。種々の実施形態において、二重特異性抗体は、抗体エフェクター機能を媒介することができるＦｃ又は改変されたＦｃを含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、二価、三価又は四価である。
【００７６】
抗ＰＤ−１抗体は、薬理学的利益を提供してタンパク質の生理化学的特性を変更するための追加の成分を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子への付加は、治療用途の際に、分子の毒性を低減し、効果を増大することにより、安全性を改善する。生理化学的変更は、以下のものに限定されないが、治療剤の全身での維持性を増大するように協力できる立体構造、静電結合及び疎水性の変更を含む。さらに、ＰＥＧ部分を付加することによって抗ＰＤ−１抗体の分子量を増大することによる薬理学的利点は、延長された循環期間、増大された安定性及び宿主のプロテアーゼからの増強された保護性を含み得る。ＰＥＧの付加は、細胞受容体に対する治療部分の結合親和性に影響し得る。ＰＥＧは、４００から１５０００以上の分子量のポリマーの範囲となるように（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）繰り返し単位で構成された非イオン性ポリマーである（例えば分子量４０００００までのＰＥＧポリマーは商業的に入手可能である。）。
【００７７】
Ｃ．核酸
配列番号１〜１６のいずれかを含む抗ＰＤ−１ポリペプチド配列をコートする核酸配列が提供される。抗ＰＤ−１抗体をコードする組換え核酸は、抗ＰＤ−１抗体の製造のために有効な宿主細胞に発現するのに特に有用である。種々の実施形態において、核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動及び他の本分野において周知の方法を含む標準的技術により、他の細胞成分又は他の汚染物質（例えば細胞内に存在する他の核酸又はタンパク質）から精製される際に単離される。例えばF. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York.を参照。種々の実施形態において、核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであり、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。種々の実施形態において、組換え核酸は、宿主細胞ゲノムから独立して又は宿主細胞ゲノムの一部として存在する抗ＰＤ−１抗体をコードする組換え遺伝子を提供する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、組換え遺伝子は、タンパク質発現のための制御エレメントと共にタンパク質をコードする核酸を含む。一般に、組換え遺伝子に存在する制御エレメントは、転写プロモータ、リボソーム結合サイト、ターミネータ及び任意に存在するオペレータを含む。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合するように指向させ、ＲＮＡ合成を開始するＤＮＡ配列として定義される。強いプロモータは、高い頻度でｍＲＮＡの生成を開始する。真核細胞におけるプロセスのために好ましいエレメントは、ポリアデニル化シグナルである。抗体に関連するイントロンが存在してもよい。遺伝子コードの縮重は、２つのアミノ酸の他は全て、一つよりも多いコドンが特定のアミノ酸をコードする。これは、合成ＤＮＡのヌクレオチド配列が本明細書において開示されたヌクレオチド配列と顕著に異なるが、そのようなタンパク質をコードする場合に、タンパク質をコードする合成ＤＮＡの構築を許容する。そのような合成ＤＮＡは、本発明の範囲内と意図される。
【００７９】
特定の宿主細胞又は生物にＤＮＡを発現することが望まれる場合、そのようなＤＮＡのコドン利用は、タンパク質の発現を最大にするように調節され得る。一つのアプローチは、特定の宿主のコドン利用を反映するコドンを選択することである。同一のアミノ酸をコードする代替のコドンは表３に示され、それはＵ−ウラシルをＴ−チミジンに変えることにより自然にｃＤＮＡ分子に変換され得る。
【表３】
2019509759.tif 000007
【００８０】
細胞内における組換え遺伝子の発現は、発現ベクターを用いて容易にされ得る。発現ベクターは、適切な宿主においてクローン化ＤＮＡの転写及びそのｍＲＮＡの翻訳のために必要なＤＮＡ配列としてここに定義される。種々の実施形態において、そのようなベクターは、細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞等の種々の宿主において、真核生物ＤＮＡを発現するために用いられる。特別に設計されたベクターは、細菌‐酵母又は細菌−動物細胞等の宿主間のＤＮＡのシャトリングを可能とする。好ましくは、組換え遺伝子に加えて発現ベクターは、宿主細胞内での自律的複製のための開始点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素サイト、及び高いコピー数のための潜在力を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、以下のものに限られないが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミド又はウィルスを含む。そのような発現ベクターは、哺乳動物、細菌、真菌（例えばPichia）及び昆虫細胞の発現ベクターは、商業的に入手可能である。いくつかの実施形態において、抗体をコードする核酸は、本分野に周知の技術を用いて宿主の染色体に統合され得る。
【００８２】
抗ＰＤ−１抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のいずれか又は両方をコードする１つ以上の組換え遺伝子を有する核酸は、同定された標的領域又は結合タンパク質の成分に結合する完全結合タンパク質を生成するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、完全結合タンパク質は、例えばｓｃＦｖ等の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単鎖タンパク質をコードする単一遺伝子を用いて、又は例えば重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を生成する複数の組換え領域を用いて提供される。いくつかの実施形態において、結合タンパク質の領域は、例えば重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むポリペプチドを生成することにより生成される。核酸配列の非制限的な例は、配列番号１８（逆翻訳重鎖Ｆ（ａｂ））及び配列番号１９（逆翻訳軽鎖Ｆ（ａｂ））を含む。
【００８３】
Ｅ．医薬製剤
抗ＰＤ−１抗体は、好ましくはヒトのために、単独で又は医薬組成物若しくは薬物として提供され得る。この目的を達成するために、化合物は、予防的又は治療的目的に従って種々の医薬的剤形に製造され得る。医薬的剤形の例は、経口剤、注射、坐剤、軟膏、膏薬等である。そのような剤形は、本発明が属する分野の当業者に周知であり、従来の方法で製剤化され得る。
【００８４】
単位剤形のそれぞれに組み込まれる抗ＰＤ−１抗体の量は、患者の健康状態又は製剤の型によって異なり得る。好ましい単位剤形当たりの量は、経口投与では約１〜１０００ｍｇ、注射では約０．１〜５００ｍｇ又は坐剤では約５〜１０００ｍｇである。１日当たりの用量は、患者の症状、体重、年齢、性別及び他の要因で異なり、通常の範囲は１日当たり成人で約０．１〜５０００ｍｇ、好ましくは約１〜１０００ｍｇである。製剤は、好ましくは単回投与又は２〜４回の分割投与で投与される。
【００８５】
経口投与用の固形製剤の製剤化のために、賦形剤、及び必要な場合は結合剤、崩壊剤、潤滑剤、着色剤、矯正剤、香料等が抗ＰＤ−１製剤に加えられ、製剤は通常の方法により錠剤、コーティング錠、顆粒剤、粉末剤又はカプセル剤等に製剤化される。そのような添加剤は、本分野において周知であり、有用な例は、ラクトース、スクロース、塩化ナトリウム、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース及びケイ酸等の賦形剤、水、エタノールプロパノール、単シロップ、グルコース溶液、デンプン溶液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム及びポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、アガー粉末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド及びラクトース等の崩壊剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂及びポリエチレングリコール等の潤滑剤、スクロース、橙皮、クエン酸及び酒石酸等の矯正剤である。
【００８６】
非限定的実施形態として、錠剤は、以下に示す割合の成分から従来の方法で調整され得る。
【表４】
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【００８７】
非限定的実施形態として、顆粒剤は、以下に示す割合の成分を用いて従来の方法で調整され得る。
【表５】
2019509759.tif 000009
【００８８】
非限定的実施形態として、カプセル剤は、以下に示す割合の成分を用いて従来の方法で調整され得る。
【表６】
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【００８９】
経口投与用液体製剤の製剤化のために、矯正剤、緩衝剤、安定剤、香料等が化合物に加えられ、その混合物は、従来の方法により経口液製剤、シロップ剤又はエリキシル剤等に製剤化され得る。有用な矯正剤の例は、上記の通りである。緩衝剤の例は、クエン酸ナトリウム等である。安定剤の例は、トラガカント、アラビアガム、ゼラチン等である。非限定的実施形態として、シロップ剤は、以下に示す割合の成分を用いて従来の方法で調整され得る。
【表７】
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【００９０】
注射剤は、抗ＰＤ−１抗体に、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定剤、等張剤、局所麻酔剤等を加えることにより、従来の方法で、皮下、筋肉内又は静脈注射剤として調製される。ｐＨ調整剤及び緩衝剤の例は、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等である。安定剤の例は、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸等である。局所麻酔剤の例は、プロカリン塩酸塩、リドカイン塩酸塩等である。等張剤の例は、塩化ナトリウム、グルコース等である。非限定的実施形態として、注射剤は、以下に示す割合の成分を用いて従来の方法で調整され得る。
【表８】
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【００９１】
坐剤は、抗ＰＤ−１抗体に、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂及び油、脂肪酸トリグリセリド等の本分野において周知の医薬的に許容可能なキャリアが加えられ、また所望の場合ＴＷＥＥＮ等の界面活性剤が加えられ、通常の方法で調製され得る。非限定的実施形態として、坐剤は、以下に示す割合の成分を用いて従来の方法で調整され得る。
【表９】
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【００９２】
軟膏の調製のために、本分野で従来から用いられている基剤、安定剤、保湿剤、防腐剤等が必要に応じて用いられる。抗ＰＤ−１抗体と共に用いられるこれらの添加剤は、通常の方法により軟膏内に加えられる。基剤の有用な例は、例えば液体パラフィン、白色ワセリン、白色ミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等を含む。防腐剤として、メチルパラヒドロキシベンゾエート。エチルパラヒドロキシベンゾエート、パラヒドロキシプロピルベンゾエート等が挙げられ得る。
【００９３】
膏薬、坐剤、クリーム、ゲル又はペーストの調製のために、化合物は、通常の方法で本分野に一般に用いられる基質に適用される。基質の適当な例は、綿、レーヨン又は化学繊維等の織布又は不織布、及び軟質塩化ビニル、ポリエチレン又はポリウレタン等のフィルム又は発泡シートである。
【００９４】
Ｆ．抗ＰＤ−１抗体による処置
抗ＰＤ−１抗体、すなわちｈＡｂ１０Ｄ３及び本明細書に記載のその変異体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用を阻害するために治療的に用いられ得る。抗ＰＤ−１抗体の単独又は添加物との組合せの投与は、医薬的に許容可能なキャリアを含む組成物の形態でなされるであろう。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるような抗ＰＤ−１抗体は、増強又は増大された免疫反応、特に増強されたＴ細胞反応がＰＤ−１により媒介される抑制シグナルを減衰することを介して望まれる状況下で用いられる。ＰＤ−１活性のダウンレギュレーションは、微生物感染（例えば細菌、真菌、ウィルス）及び癌の治療に特に望まれる。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体を用いたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２の相互作用の遮断は、ＰＤ−１経路における抑制的役割に一致する増強されたＴ細胞反応を引き起こす。従って、対象における細胞免疫反応を増強する方法は、好ましくはヒト対象に提供され、それは、抗ＰＤ−１抗体又はその医薬組成物を投与することを含む。細胞免疫の増強は、抗ＰＤ−１抗体を投与する治療的及び／又は予防的処置の結果である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、予防的処置の方法の一部として用いられる。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、以下に限定されないが、微生物感染又は癌を含む特定の疾病に対して、対象、好ましくはヒト対象に免疫を付与するためのワクチン接種レジームにおけるアジュバントとして用いられる。ワクチン接種レジメンは、一般集団又は一般集団のサブセットにおいて用いられ得る。一般集団のサブセットは、微生物感染又は癌の発症の増大されたリスク下にいる人々である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ワクチン（予防的又は治療的ワクチンのいずれか）及び抗ＰＤ−１抗体を含む組成物は、単回投与又は初回／増強型ワクチンレジメンの範囲内で投与される。好ましくは、ワクチンの初回及び増強投与は、特にワクチンは組換え非ウィルス（例えばプラスミド）又はウィルス（例えばアデノウィルス、ＡＡＶ等）等の「非自己」組換えビヒクルの一部として輸送される場合、最初に輸送されたワクチンに対して向かう宿主免疫を回避するために異なる。従って、対象の予防的免疫付与及び／又は治療的処置のための１つ以上のワクチンと組み合わせられた本明細書に記載された１つ以上の抗ＰＤ−１抗体を有する組成物が提供され、対象に対するそのようなワクチン組成物の投与が提供される。代替的に、抗ＰＤ−１抗体及びワクチンは、別々に製剤化され、同時投与又は別々の時点で投与され得る。いくつかの実施形態において、ワクチンは細胞ベースワクチンを含む。種々の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体を有する細胞ベースワクチンは、「初回投与」の方法として細胞治療の前に宿主の外部に投与される。種々の実施形態において、ＰＤ−１抗体を含む細胞ベースワクチンは、「初回投与」の方法として細胞治療の前に宿主の外部に投与される。
【００９７】
抗ＰＤ−１抗体は、患者の細胞免疫反応を増強するための治療剤として用いられ得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、単独又は追加の治療剤と組み合わせて投与される。従って、本発明は、さらに、追加の治療剤（例えば治療的ワクチン、抗微生物薬、化学療法剤、他の治療的標的に対する抗体）と組み合わせられた本明細書に記載された１つ以上の抗ＰＤ−１抗体を有する組成物として説明される。追加の治療剤と組み合わせられて投与される際に、いくつかの実施形態において、各成分（すなわち抗ＰＤ−１抗体及び追加の治療剤）は、単独の組成物内に存在し、単回投与で投与される。代替的に、いくつかの実施形態において、各成分は、別々に製剤化され、対象に対して同時に又は別々の時点で投与される。
【００９８】
抗ＰＤ−１抗体は、患者に本明細書に記載されるような抗ＰＤ−１抗体又はその医薬組成物の有効量を患者に投与するステップを含む微生物感染を受けた患者を治療する方法に用いられ得る。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、単独又は追加の抗微生物薬と組み合わせて投与される。種々の実施形態において、本発明に記載されるような抗ＰＤ−１抗体の投与は、病原性微生物に既に感染された患者を治療するための治療的レジームの一部である（治療的処置）。代替的に、いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、感染され得る個々を保護する助けとなる予防的方法の一部として用いられる（ワクチン接種に基づく方法）。例えば、抗ＰＤ−１抗体はアジュバントとして用いられる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、微生物感染は、本明細書に記載された抗ＰＤ−１抗体を投与することにより治療され得る。いくつかの実施形態において、微生物感染は持続性感染である。急性感染は、一般に、比較的早くに免疫系により解決されるが、持続性感染は、数ヶ月、数年又は一生に亘って続き得る。従って、持続性感染は、免疫反応の誘導後でさえ宿主から有効に除かれない又は排除されない感染性微生物因子（例えばウィルス、細菌、寄生虫、マイコプラズマ、真菌）の結果である。持続性感染は、慢性感染及び／又は潜伏感染であってもよい。これらの感染は、宿主細胞に対する細胞致死又は過度の傷害さえ無い無症状感染及び増殖性感染の段階に関わり再発し得る。
【０１００】
ＰＤ−１に結合する本明細書に記載された抗ＰＤ−１抗体は、対象、好ましくは癌を患うヒト対象を治療するための治療的レジームの一部、又は癌の発生に感受性がある個々に投与される予防的レジームの一部として用いられ得る。これらの方法は、抗ＰＤ−１抗体、又はその組成物の有効量を患者又は個々に投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、単剤療法として段独で、又は追加の抗癌剤と組み合わせて投与される。非限定的例として、本明細書で記載された抗ＰＤ−１抗体は、微生物感染に対する上記と類似する方法を用いた予防的又は治療的レジームにおいてアジュバントとして作用するために、抗癌ワクチンに組み合わせられる。従って、一実施形態において、本発明は、本明細書に記載された抗ＰＤ−１抗体の治療的有効量を対象に投与することを含む、対象、好ましくはヒト対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【０１０１】
癌の治療及び／又は予防方法は、高い頻度で診断される１つ以上の一般型の癌（例えば血液、乳、前立腺、結腸及び直腸、肺、前立腺、脳及び皮膚の癌）、特に免疫療法に対して一般的に反応性である癌の治療及び／又は予防を含む。従って、１つ以上の癌の治療のために本明細書に記載された抗ＰＤ−１抗体を投与することにより、ＰＤ−１からの抑制シグナルを遮断する方法は、本発明の一部として含まれる（例えば、卵巣癌；心臓、胎盤、骨格筋及び肺を含む非リンパ系実質器官の癌；乳癌；マントル細胞リンパ腫、非ホジキンＢ細胞リンパ腫、ＰＴＣＬ、腺腫、扁平上皮癌、喉頭癌、唾液腺癌、胸腺腫及び胸腺癌等の種々のリンパ腫を含む頭部及び首部の癌；網膜癌；食道癌；多発性骨髄腫；悪性黒色腫；大腸癌；肺癌；子宮頸癌；子宮内膜癌；胆嚢癌、肝臓癌；甲状腺濾胞癌；胃癌；非小細胞性肺癌；神経膠腫；尿路上皮癌；膀胱癌；前立腺癌；腎細胞癌、浸潤性乳管癌；並びに多形膠芽細胞腫）。
【０１０２】
本発明の抗ＰＤ−１抗体は、癌細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド及び炭水化物分子を含む）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞等の改変免疫細胞、及び免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクションされた細胞等の免疫原と組み合わせられ得る。
【０１０３】
本発明の抗ＰＤ−１抗体は、標準的な癌治療と組み合わせられ得る。例えば、いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体の投与は、化学療法レジームと組み合わせられる。これらの例におけるいくつかの実施形態において、投与される化学療法剤の用量を低減することが可能となる。抗ＰＤ−１抗体と化学療法との組み合わせの使用の裏にある科学的根拠は、多くの化学療法剤の細胞傷害作用により生じる細胞死が抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルを増大させるはずであるということである。ＰＤ−Ｌ１抑制シグナルと組み合わせて有効となり得る他の組合せ療法は、放射線、手術、ホルモン除去、及び他の免疫チェックポイント経路を標的とする抗体（例えば抗ＣＴＬＡ４抗体）である。これらのプロトコールのそれぞれは、宿主内の腫瘍抗原の源を生成する。血管新生阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１遮断薬と組み合わせられ得る。血管新生の阻害は、宿主の抗原提示経路内に腫瘍抗原を提供し得る腫瘍細胞死を引き起こす。
【０１０４】
「抗癌」活性を有する物質又は「抗癌物質」は、がん細胞の増殖を阻害する物質を意味し、腫瘍の成長を阻害する物質を含む。抗癌活性を示す物質は、以下に限定されないが、細胞傷害化学療法効果を有する物質及び抗癌ワクチンを含む。
【０１０５】
抗ＰＤ−１抗体及びその組成物は、以下の経路の１つ以上を用いて宿主対象に投与され得る：静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）及び皮下（ＳＣ）、ＩＶ投与は治療的抗体投与の分野内で標準的である。いくつかの実施形態において、これらの組成物は、一価又は多価の組成物及び種々の組み合わせられた様式の適用を含み得るレジメンで用いられる。従って、いくつかの実施形態において、これらの製剤は、別々又は複数の用法で投与される（すなわち。処置レジームを通して製剤の無菌状態を維持することにより交互に抗ＰＤ−１抗体の投与がなされる）。
【０１０６】
本発明の抗ＰＤ−１抗体を用いる投与レジメンは、患者の型、種、年齢、体重、性別及び健康状態；治療されるための状態の重症度；並びに採用される特定の抗ＰＤ−１を含む種々の因子に従って選択され得る。いくつかの実施形態において、投与頻度は、化合物の有効性及び安定性に依存して変わる。投与頻度の例は、毎日、二週毎、一週毎、一月毎及び二ヵ月毎を含む。通常の能力を有する医師又は獣医師は、治療的及び／又は予防的に有効な量の抗ＰＤ−１抗体を容易に決定及び処方できる。毒性無く有効性を示す範囲内の抗ＰＤ−１抗体の濃度を達成する最適な精度は、標的部位に対するタンパク質の利用可能性の動態学に基づくレジメンを必要とする。これは、薬物の分布、平衡及び排出の検討に関わる。有効量の範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇであろうことが期待される。
【０１０７】
本明細書に記載された抗ＰＤ−１抗体は、適切な投与量で単独で用いられ得る。いくつかの実施形態において、他の薬剤との同時投与又は連続投与が望まれる。いくつかの実施形態において、併用療法レジームの個々の成分は、治療過程の別の時点で別々に投与される、又は別々若しくは単一の組合せ形態で同時に投与される。従って、本発明は、同時又は交互の処置のそのようなレジメンの全てを含むと理解され、「投与」の用語は、それに応じて解釈される。本発明の抗ＰＤ−１抗体と他の薬剤との組合せの範囲は、以下に限定されないが、微生物感染及び癌を含む特定の疾病の状態の処置のための医薬組成物を含むいずれの組合せをも原則として含む。本明細書に記載された抗ＰＤ−１抗体が追加の治療的薬剤と組み合わせて用いられる場合、各成分の用量はそれらの成分が単独で用いられる場合と同一又は異なってもよい。
【実施例】
【０１０８】
実施例は、本発明の種々の特徴をさらに説明するために以下に提供される。実施例は、本発明を実施するための有用な方法論を示す。実施例は、クレームされた発明の範囲を制限しない。
【０１０９】
（実施例１：抗ＰＤ−１抗体の作製）
５匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスに対し、５０μｇの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で精製組換えヒトＰＤ−１ペプチドを皮下に免疫し、その後４度、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で２５μｇの用量で免疫した。前ブリード及び試験ブリードサンプルを、尾静脈を介してマイクロチューブに回収し、凝血させ、血清を回収するために遠心分離を行った。遠心分離の後、抗原に対するＥＬＩＳＡを行い、血清をマイクロチューブで−２０℃において保存した。ＥＬＩＳＡを行うために、簡単に述べると、マイクロタイタープレートをトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞からの精製組換えＰＤ−１融合タンパク質でコーティングし、それはＰＢＳを溶媒として１〜２μｇ／ｍｌであり、１００μｌ／ウェルで４℃で一晩中インキュベートし、その後、溶媒をＰＢＳとする３％ＢＳＡを２５０μｌ／ウェルでブロッキングした。ＰＤ−１免疫マウスからの血清の希釈液を各ウェルに添加し、外気温で１〜２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質（ＫＰＬ製、#52-00-01）で発色させ、ＯＤ６５０を用いて分光光度計により分析した。抗ＰＤ−１抗体の最も高いタイターを示すマウスを融合のために用いた。以下に示すように、融合を行い、ハイブリドーマの上清に対してＥＬＩＳＡにより抗ＰＤ−１抗体の活性を試験した。
【０１１０】
ハイブリドーマを作製するために、５匹のマウスを１２７日目に安楽死させて脾臓を回収し、その細胞を、標準プロトコールに基づいてＰＥＧを用いて０日目に不死化細胞株と融合させた。これらの細胞を選択前に約１０日間培養した。
【０１１１】
クローン培養上清を回収し、上述のようにＥＬＩＳＡにより精製ヒトＰＤ−１ペプチドに対してヒットするものを選別した。ＥＬＩＳＡでヒットしたものを増やし、精製組換えペプチドを用いた生化学的スクリーンにおいてヒトＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌ２）相互作用を阻害する能力を選別した。その生化学的スクリーンを行うために、簡単に述べると、１００ｎｇのＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌ２）を、ＰＤ−１アッセイバッファーを含む９６ウェルプレートにコーティングし、ハイブリドーマ培養上清と共に１０ｎｇのヒトＰＤ−１‐ビオチンを加えた。洗浄ステップ後、結合されたＰＤ−１‐ビオチンの量を、Ｓｔｒｅｐ−ＨＲＰ及びＨＲＰ化学発光基質を用いて定量化した。最大阻害効果を有するクローン１０Ｄ３を選択し、サブクローンし、ＥＬＩＳＡ及び上記の生化学的ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌ２）相互作用アッセイにより精製ヒトＰＤ−１ペプチドに対して選別した。陽性サブクローンを増やし、ハイブリドーマから総ＲＮＡを調製し、抗体のｃＤＮＡをＰＣＲし、標準シークエンシング技術を用いて配列決定した。
【０１１２】
クローン１０Ｄ３のキメラ抗体を、クローン１０Ｄ３の可変領域を、マウス定常領域の代わりにヒトＩｇＧの定常領域と融合することにより作製し、標準クローニング技術を用いて哺乳動物発現系内に融合物をクローニングした。クローン化融合物を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてトランスフェクションによりＨＥＫ２９３細胞に一過的に発現させた。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞の懸濁液を、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で播種した。抗ＰＤ−１を発現するＤＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中においてＰＥＩと結合させ、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＮＡ−ＰＥＩ混合液を、２μｇ／ｍＬのＤＮＡ及び４μｇ／ｍＬのＰＥＩの量で細胞懸濁液に加えた。培養液を４日間培養した。キメラ抗体をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィを用いてＨＥＫ２９３細胞から精製し、その抗体を上記のようにＥＬＩＳＡ及びＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌ２）結合アッセイにより特徴付けた。
【０１１３】
キメラ抗ＰＤ−１抗体を、公に利用可能なツールのAntiBody HUminzation (Tabhu) サーバ (circe.med.uniroma1.it/tabhu)を用いてヒト化した。キメラ抗ＰＤ−１抗体の重鎖及び軽鎖の配列をそのサーバにアップロードした。これらの配列を２５００以上の抗体配列データベースに対してＢＬＡＳＴを行い、標準構造を生殖細胞系列遺伝子と共に算出した。重鎖及び軽鎖の両方の配列において、ＡＡＢ２４４０５の名称のクローンは、キメラ抗ＰＤ−１抗体に対して高い相同性を示した。クローンＡＡＢ２４４０５に対して非相同のキメラ抗ＰＤ−１抗体のＦａｂ領域における選択的フレームワーク領域を、合成遺伝子の合成を用いて対応するヒトアミノ酸に復帰変異するために選択した。このヒト化抗ＰＤ−１抗体の発現コンストラクトを、ヒトＩｇＧ４の定常領域（Ｓ２２８Ｐ）に融合することにより作製し、上述のように発現し、精製し、更なる特徴付けのために調製した。
【０１１４】
（実施例２：ヒトＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害）
ＰＤ−１アッセイバッファーに含まれた１００ｎｇのヒトＰＤ−Ｌ１を９６ウェルプレートにコーティングし、１０ｎｇヒトＰＤ−１‐ビオチン及び種々の量のｈＡｂ１０Ｄ３抗ＰＤ−１中和抗体を加えた。洗浄ステップの後、結合したＰＤ−１‐ビオチンの量を、Ｓｔｒｅｐ−ＨＲＰ及びＨＲＰ化学発光基質を用いて定量した。その結果を図１Ａに示し、それは、濃度依存的なｈＡｂ１０３ＤによるＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１結合の有効的阻害を示す。図１Ｂは、キメラ抗ＰＤ−１抗体を用いて比較のための陽性対照である。
【０１１５】
（実施例３：ヒトＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ２相互作用の阻害）
ＰＤ−１アッセイバッファーに含まれた１００ｎｇのヒトＰＤ−Ｌ２を９６ウェルプレートにコーティングし、６ｎｇのヒトＰＤ−１‐ビオチン及び種々の濃度のｈＡｂ１０３Ｄ抗ＰＤ−１中和抗体を加えた。洗浄ステップ後、結合したＰＤ−１‐ビオチンの量をＳｔｒｅｐ−ＨＲＰ及びＨＲＰ化学発光基質を用いて定量した。その結果を図２に示し、それは、濃度依存的なｈＡｂ１０Ｄ３によるＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ２結合の有効的阻害を示す。
【０１１６】
（実施例４：M. fascicularisのＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害）
ＰＤ−１アッセイバッファーに含まれた１００ｎｇのM. fascicularisＰＤ−１を９６ウェルプレートにコーティングし、４０ｎｇのM. fascicularisのＰＤ−Ｌ１‐ビオチン及び種々の濃度のｈＡｂ１０３Ｄ抗ＰＤ−１中和抗体を加えた。洗浄ステップ後、結合したＰＤ−Ｌ１‐ビオチンの量をＳｔｒｅｐ−ＨＲＰ及びＨＲＰ化学発光基質を用いて定量した。その結果を図３のパネルＡに示し、それは、濃度依存的なｈＡｂ１０Ｄ３によるＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ２結合の有効的阻害を示す。図３Ｂはキメラ抗ＰＤ−１抗体を用いた比較のための陽性対照である。
【０１１７】
（実施例５：ヒト化抗ヒトＰＤ−１中和抗体を用いたＴ細胞活性の阻害）
ＰＤ−Ｌ１を発現するＨＥＫ２９３細胞をＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター及びＰＤ−１を発現するＪｕｒｋａｔＴ細胞と共にインキュベートした。Ｔ細胞を種々の量の抗ＰＤ−１抗体の存在下でＣＤ３クロスリンクにより活性させた。活性のレベルをルシフェラーゼ活性を測定することにより間接的に測定した。この試験において、ＢＰＳｈＡｂ１０３Ｄ抗ＰＤ−１中和抗体（図４）を、ＰＤ−１活性を阻害することが周知の参照のキメラ抗ＰＤ−１抗体（図４Ｂ）と比較した。要約すると、ｈＡｂ１０Ｄ３は、０．３８μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＰＤ−１シグナルを阻害し、陽性対照のキメラ抗体は、０．２９μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＰＤ−１シグナルを阻害した。
【０１１８】
（実施例６：ビオチンラベル化ＰＤ−１変異体のヒトＰＤ−Ｌ１、メルク社抗ＰＤ−１抗体及びＢＰＳｈＡｂ１０Ｄ３との結合性比較）
ウェルをＰＢＳに含まれた１００ｎｇのＰＤ−Ｌ１、メルク社の抗ＰＤ−１抗体(CAT#71120)又はＢＰＳｈＡｂ１０３Ｄ(CAT#H10D3)により一晩中コーティングした。その後の洗浄及びブロッキングステップの後、５０μＬのアッセイバッファーに含まれた１ｎｇのビオチン化ＰＤ−１又は変異体をコーティングされたウェルに加えた。配列番号１７は塩基配列を提供し、変異体はその塩基配列から生成された。図５は、リンカー配列（太字）に結合され、ヒトＩｇＧ１のＦｃ（アミノ酸１００〜３３０（下線部））に結合され、アビジンタグ（イタリック体）に結合されたヒトＰＤ−１のアミノ酸２５〜１６７番目を示す配列番号１７を示す。Ｋ７８Ａ、Ｉ１２６Ａ、Ｌ１２８Ａ、Ｐ１３０Ａ、Ｉ１３４Ａ、Ｅ１３６Ａの点変異は、大きいフォントで示される。その反応は、ｓｔｒｅｐ−ＨＲＰの添加前に室温で２時間インキュベートされ、化学発光基質を添加した。発光を化学発光プレートリーダで読み取った。
【０１１９】
図６は結果を示す。メルク社の抗ＰＤ−１抗体及びＢＰＳｈＡｂ１０Ｄ３は、横軸の抗体構造及び結合部位が異なることを示すヒトＰＤ−１変異体について異なる結合プロファイルを示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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