(57)【要約】  非侵襲的分子対照を製造する方法および分析を記載する。非侵襲的分子対照を製造する方法は、目的の状態のための陽性対照を予め決定すること、目的の状態のための対照マーカーを含む細胞株を選択すること、選択された細胞株からのｃｆＤＮＡの放出を増幅すること、選択された細胞株から放出されたｃｆＤＮＡを単離すること、単離されたｃｆＤＮＡから対照マーカーを定量すること、単離された対照血漿に加えるために、対照マーカーの体積を決定すること、対照試料から対照血漿を単離すること、単離された対照血漿を対照安定化剤で処理すること、当該体積の対照マーカーに加えるために、対照血漿の体積を決定すること、当該体積の対照マーカーを単離された対照血漿と組み合わせること、および試料を非侵襲的分子対照に対して分析して、目的の状態の存在または不存在を決定することを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の状態の存在または不存在を決定するための非侵襲的分子対照を製造する方法であって、
目的の状態のための陽性対照を予め決定すること、
目的の状態のための第１の対照マーカーを含む第１の細胞外小胞を産生する、陽性対照のための第１の細胞株を選択すること、
選択された第１の細胞株からの第１の細胞外小胞の産生を増幅すること、
選択された第１の細胞株から、産生された対照マーカーを単離すること、
単離された第１の対照マーカーから第１の対照マーカーを定量すること、
単離された対照血漿に加えるために、第１の対照マーカーの体積を決定すること、
対照試料から対照血漿を単離すること、
単離された対照血漿を対照安定化剤によって処理すること、
当該体積の第１の対照マーカーに加えるために、対照血漿の体積を決定すること、
当該体積の対照血漿を当該体積の第１の対照マーカーと組み合わせること、および
非侵襲的分子対照を生成すること
を含む、方法。
【請求項２】
目的の状態が妊娠である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
選択された第１の細胞株がＴｏｖ  ２１Ｇであり、
第１の対照マーカーが高メチル化ｒａｓ関連ドメイン含有タンパク質１プロモーター領域である、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
選択された第１の細胞株がＪＡＲであり、
第１の対照マーカーが胎盤特異的４メッセンジャーリボ核酸である、
請求項２に記載の方法。
【請求項５】
選択された第１の細胞株がＪＡＲであり、
第１の対照マーカーがメタロプロテアーゼタンパク質１２胎盤タンパク質である、
請求項２に記載の方法。
【請求項６】
目的の状態が２１トリソミーである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
選択された第１の細胞株がＤｅｔｒｏｉｔ  ５３２であり、
第１の対照マーカーが２１番染色体のセントロメアである、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
選択された第１の細胞株がＪＡＲであり、
第１の対照マーカーが胎盤特異的４メッセンジャーリボ核酸である、
請求項６に記載の方法。
【請求項９】
目的の状態が１８トリソミーである、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
選択された第１の細胞株がＪＡＲであり、
第１の対照マーカーがメタロプロテアーゼタンパク質１２胎盤タンパク質である、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
目的の状態のための二次対照マーカーを含む第２の細胞外小胞を産生する、陽性対照のための第２の細胞株を選択することであって、
二次対照マーカーは高メチル化ｒａｓ関連ドメイン含有タンパク質１プロモーター領域であること、
選択された第２の細胞株からの第２の細胞外小胞の産生を増幅すること、
選択された第２の細胞株から、産生された第２の対照マーカーを単離すること、
単離された第２の対照マーカーから第２の対照マーカーを定量すること、
単離された対照血漿に加えるために、第２の対照マーカーの体積を決定すること、
当該体積の二次対照マーカーを、当該体積の対照血漿および当該体積の第１の対照マーカーと組み合わせること、ならびに
非侵襲的分子対照を生成すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
目的の状態が大腸がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
選択された第１の細胞株がＨＣＴ  １１６であり、
第１の対照マーカーが、カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログエキソン２  Ｇ１３Ｄである、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１の細胞外小胞の放出を増幅することが、第１の細胞株を、５−１５ｍＭの有効濃度を有するイオノフォアであるモネンシンによって、摂氏３７度で５パーセント二酸化炭素の湿潤雰囲気中、少なくとも２４時間処理することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
対照安定化剤が、０．０５−０．５重量／体積パーセントの濃度の２−ブロモ−２ニトロプロパン−１，３−ジオールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
対照安定化剤が、０．１−０．５重量／体積パーセントの濃度のアミノカプロン酸である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
対照安定化剤が、０．１５−０．２重量／体積パーセントのイミダゾリジニル尿素をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
対照安定化剤が、０．１５−０．２重量／体積パーセントのイミダゾリジニル尿素をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
試料がヒト血液である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
試料がヒト尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
対照試料が動物起源由来の血液である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
対照試料が人工血漿である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
対照試料が合成尿である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
目的の状態の存在または不存在を決定するために、試料を非侵襲的分子対照に対して分析する方法であって、
試料における第１の対照マーカーを定量すること、
非侵襲的分子対照における第１の対照マーカーを定量すること、
非侵襲的分子対照における第１の対照マーカーの示された百分率を、試料における予め決定された第１の対照マーカーの閾値と比較することを含み、
非侵襲的分子対照を予め決定することは、
目的の状態のための陽性対照を予め決定すること、
目的の状態の存在または不存在を決定すること、
目的の状態のための第１の対照マーカーを含む第１の細胞外小胞を産生する、陽性対照のための第１の細胞株を予め選択すること、
選択された第１の細胞株からの第１の細胞外小胞の産生を増幅すること、
選択された第１の細胞株から、産生された第１の対照マーカーを単離すること、
単離された第１の対照マーカーから第１の対照マーカーを定量すること、
単離された対照血漿に加えるために、第１の対照マーカーの体積を決定すること、
対照試料から対照血漿を単離すること、
単離された対照血漿を対照安定化剤によって処理すること、
当該体積の第１の対照マーカーに加えるために、当該体積の対照血漿を決定すること、および
当該体積の対照血漿を当該体積の対照マーカーと組み合わせて、非侵襲的分子対照を生成すること
を含む方法。
【請求項２５】
決定することは、第１の対照マーカーのためにデオキシリボ核酸配列決定を介して試料を分析することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
決定することは、逆転写酵素ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応を介して試料を分析することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
決定することは、酵素結合免疫吸着アッセイを介して試料を分析することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
目的の状態の存在または不存在を決定するために、試料を非侵襲的分子対照に対して分析する方法であって、
試料における二次対照マーカーを定量すること、
非侵襲的分子対照における二次対照マーカーを定量すること、
非侵襲的分子対照における二次対照マーカーの示された百分率を、試料における予め決定された対照マーカーの閾値と比較することを含み、
非侵襲的分子対照を予め決定することは、
目的の状態のための陽性対照を予め決定すること、
目的の状態の存在または不存在を決定すること、
目的の状態のための第１の対照マーカーを含む細胞外小胞を産生する、陽性対照のための第１の細胞株を予め選択すること、
選択された第１の細胞株からの細胞外小胞の産生を増幅すること、
選択された第１の細胞株から、産生された対照マーカーを単離すること、
単離された対照マーカーから第１の対照マーカーを定量すること、
単離された対照血漿に加えるために、第１の対照マーカーの体積を決定すること、
対照試料から対照血漿を単離すること、
単離された対照血漿を対照安定化剤によって処理すること、
当該体積の第１の対照マーカーに加えるために、対照血漿の体積を決定すること、
当該体積の対照血漿を、当該体積の第１の対照マーカーと組み合わせること、
目的の状態のための二次対照マーカーを含む第２の細胞外小胞を産生する、陽性対照のための第２の細胞を予め選択すること、
選択された第２の細胞株からの第２の細胞外小胞の産生を増幅すること、
選択された第２の細胞株から、産生された第２の対照マーカーを単離すること、
単離された第２の対照マーカーから第２の対照マーカーを定量すること、
単離された対照血漿に加えるために、第２の対照マーカーの体積を決定すること、
当該体積の二次対照マーカーを、当該体積の対照血漿および当該体積の第１の対照マーカーと組み合わせること、ならびに
非侵襲的分子対照を生成すること
を含む、方法。
【請求項２９】
決定することは、第１の対照のためにデオキシリボ核酸配列決定を介して試料を分析することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
非侵襲的分子対照の総体積の１０−２０パーセントを構成する第１の対照マーカーであって、
高メチル化ｒａｓ関連ドメイン含有タンパク質プロモーター領域、２１番染色体のセントロメア、およびカーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログエキソン２  Ｇ１３Ｄからなる群から選択される第１の対照マーカー、
非侵襲的分子対照の総体積の１０−３０パーセント（重量／体積）の対照充填剤であって、
低メチル化ｒａｓ関連ドメイン含有タンパク質プロモーター領域および野生型カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログエキソン２  Ｇ１３Ｄからなる群から選択される対照充填剤、
非侵襲的分子対照の総体積の０．１−５パーセント（重量／体積）を構成する対照安定化剤、ならびに
非侵襲的分子対照の総体積の３０−８０パーセント（重量／体積）を構成する対照血漿であって、
生体液である対照血漿
を含む非侵襲的分子対照。
【請求項３１】
１ミリリットルあたり２５０−７５０コピーの対照マーカーを含む第１の対照マーカーであって、
胎盤特異的４メッセンジャーリボ核酸である第１の対照マーカー、
非侵襲的分子対照の総体積の３０−８０パーセント（重量／体積）を構成する対照血漿であって、
生体液である対照血漿、ならびに
０．０５−０．５重量／体積％の２−ブロモ−２ニトロプロパン−１，３−ジオール、０．１−０．５重量／体積％のアミノカプロン酸、０．１５−０．２重量／体積％のイミダゾリジニル尿素、およびこれらの組合せからなる群から選択される対照安定化剤
を含む非侵襲的分子対照。
【請求項３２】
１ミリリットルあたり０．１５−０．５マイクログラムを含む第１の対照マーカーであって、
メタロプロテアーゼタンパク質１２である第１の対照マーカー、
非侵襲的分子対照の総体積の３０−８０パーセント（重量／体積）を構成する対照血漿であって、
生体液である対照血漿、ならびに
０．０５−０．５重量／体積％の２−ブロモ−２ニトロプロパン−１，３−ジオール、０．１−０．５重量／体積％のアミノカプロン酸、０．１５−０．２重量／体積％のイミダゾリジニル尿素、およびこれらの組合せからなる群から選択される対照安定化剤
を含む非侵襲的分子対照。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトにおける特定の状態または疾患の早期検出が望まれている。たとえば妊娠、胎児の染色体異常、またはがんの早期検出は、介入型療法が使用され得るような患者のためにより良好な予後を導き得る。しかし、単に状態または疾患のためのスクリーニングではなく、診断をもたらす利用可能な早期検出メカニズムは、典型的には侵襲的処置を必要とする（たとえば羊水穿刺、大腸内視鏡検査等）。侵襲的処置は、感染、感染伝播、処置の間に投与される麻酔への反応等のような有害反応における増加したリスクを有する。その上、これらの侵襲的処置は高価で高度に技術的であり、そのため広範囲にわたる使用のためには適応していない。これらの侵襲的処置による増加したリスクおよび合併症のために、目的の状態について試験するための非侵襲的診断試験（たとえば採血または尿を通じて採取された試料）を得ることが望ましい。
【０００２】
従来の非侵襲的早期検出メカニズムは、目的の状態のためのスクリーニングとしては有効であるが、典型的には診断試験としては推奨されない。そのような従来の非侵襲的早期検出メカニズムに関するさらなる詳細は、Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｂｙ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｂｌｏｏｄ（Fan, HC、Blumenfeld, YJ、Chitkara, U、Hudgins, L、およびQuake, SR. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008年10月21日; 105(42): 16266-16271）およびＮｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ  （ＮＩＰＴ）：  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｗａｙ  ｔｏ  ｂｅｃｏｍｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ（Kotsopoulou, I、Tsoplou P、Mavrommatis, K、およびKroupis, C. Diagnosis 2015; 2 (3): 141-158）において見出し得る。そのような従来の非侵襲的早期検出メカニズムの使用を、診断を確定するためのフォローアップ侵襲的処置を伴うスクリーニング試験として推奨することは、しばしば、スクリーニング試験を使用して試料を分析する場合に、非侵襲的早期検出メカニズムにおいてそれに対する適切な内部品質対照を欠いていることに起因する。
【０００３】
診断試験（たとえば、特定の状態または疾患の診断をもたらす試験）を作り出すためには、患者からの試料（たとえば血液または尿）を対照に対して分析して、特定の状態または疾患の存在または不存在を決定しなければならない。対照は好ましくは陽性対照であり、そのため、対照は、目的の状態が存在する試料と実質的に同じ組成を有し得る。さらに、陽性対照は、診断試験方法が、目的の状態の分析をもたらすことを示し得る（たとえば、分析方法は、定量的または定性的のいずれかにおいて、目的の状態の指標を有効に単離および分析する）。そのような診断試験は、目的の状態（特定の状態または疾患）の存在または不存在を決定するための、コストがかかり侵襲的な診断試験への必要性を低減または除去することができるはずである。そのため、試料における目的の状態の存在または不存在を決定するために、試料の非侵襲的診断試験を可能にする陽性対照を得ることもまた、望ましいはずである。
【発明の概要】
【０００４】
非侵襲的分子対照および非侵襲的分子対照を使用する方法を記載する。本発明の１つの側面においては、目的の状態の存在または不存在を決定するための非侵襲的分子対照を製造する方法であって、目的の状態のための陽性対照を予め決定すること、目的の状態のための第１の対照マーカーを含む第１の細胞外小胞を産生する、陽性対照のための第１の細胞株を選択すること、選択された第１の細胞株からの第１の細胞外小胞の産生を増幅すること、選択された第１の細胞株から、産生された対照マーカーを単離すること、単離された第１の対照マーカーから第１の対照マーカーを定量すること、単離された対照血漿に加えるために、第１の対照マーカーの体積を決定すること、対照試料から対照血漿を単離すること、単離された対照血漿を対照安定化剤によって処理すること、当該体積の第１の対照マーカーに加えるために、対照血漿の体積を決定すること、当該体積の対照血漿を当該体積の第１の対照マーカーと組み合わせること、および非侵襲的分子対照を生成することを含む方法である。
【０００５】
本発明の別の側面においては、目的の状態の存在または不存在を決定するために、試料を非侵襲的分子対照に対して分析する方法であって、試料における第１の対照マーカーを定量すること、非侵襲的分子対照における第１の対照マーカーを定量すること、非侵襲的分子対照における第１の対照マーカーの示された百分率を、試料における予め決定された第１の対照マーカーの閾値と比較することを含み、非侵襲的分子対照を予め決定することは、目的の状態のための陽性対照を予め決定すること、目的の状態の存在または不存在を決定すること、目的の状態のための第１の対照マーカーを含む第１の細胞外小胞を産生する、陽性対照のための第１の細胞株を予め選択すること、選択された第１の細胞株からの第１の細胞外小胞の産生を増幅すること、選択された第１の細胞株から、産生された第１の対照マーカーを単離すること、単離された第１の対照マーカーから第１の対照マーカーを定量すること、単離された対照血漿に加えるために、第１の対照マーカーの体積を決定すること、対照試料から対照血漿を単離すること、単離された対照血漿を対照安定化剤によって処理すること、当該体積の第１の対照マーカーに加えるために、対照血漿の体積を決定すること、および当該体積の対照血漿を当該体積の対照マーカーと組み合わせて、非侵襲的分子対照を生成することを含む方法である。
【０００６】
本発明の別の側面においては、目的の状態の存在または不存在を決定するために、試料を非侵襲的分子対照に対して分析する方法であって、試料における二次対照マーカーを定量すること、非侵襲的分子対照における二次対照マーカーを定量すること、非侵襲的分子対照における二次対照マーカーの示された百分率を、試料における予め決定された対照マーカーの閾値と比較することを含み、非侵襲的分子対照を予め決定することは、目的の状態のための陽性対照を予め決定すること、目的の状態の存在または不存在を決定すること、目的の状態のための第１の対照マーカーを含む細胞外小胞を産生する、陽性対照のための第１の細胞株を予め選択すること、選択された第１の細胞株からの細胞外小胞の産生を増幅すること、選択された第１の細胞株から、産生された対照マーカーを単離すること、単離された対照マーカーから第１の対照マーカーを定量すること、単離された対照血漿に加えるために、第１の対照マーカーの体積を決定すること、対照試料から対照血漿を単離すること、単離された対照血漿を対照安定化剤によって処理すること、当該体積の第１の対照マーカーに加えるために、対照血漿の体積を決定すること、当該体積の対照血漿を当該体積の第１の対照マーカーと組み合わせること、目的の状態のための二次対照マーカーを含む第２の細胞外小胞を産生する、陽性対照のための第２の細胞を予め選択すること、選択された第２の細胞株からの第２の細胞外小胞の産生を増幅すること、選択された第二の細胞株から、産生された第二の対照マーカーを単離すること、単離された第２の対照マーカーから第２の対照マーカーを定量すること、単離された対照血漿に加えるために、第２の対照マーカーの体積を決定すること、当該体積の二次対照マーカーを当該体積の対照血漿および当該体積の第１の対照マーカーと組み合わせること、ならびに非侵襲的分子対照を生成することを含む方法である。
【０００７】
本発明の別の側面においては、非侵襲的分子対照の総体積の１０−２０パーセントを構成する第１の対照マーカーであって、高メチル化ｒａｓ関連ドメイン含有タンパク質プロモーター領域、２１番染色体のセントロメア、およびカーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログエキソン２  Ｇ１３Ｄからなる群から選択される第１の対照マーカー、非侵襲的分子対照の総体積の１０−３０パーセント（重量／体積）の対照充填剤であって、低メチル化ｒａｓ関連ドメイン含有タンパク質プロモーター領域および野生型カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログエキソン２  Ｇ１３Ｄからなる群から選択される対照充填剤、非侵襲的分子対照の総体積の０．１−５パーセント（重量／体積）を構成する対照安定化剤、ならびに非侵襲的分子対照の総体積の３０−８０パーセント（重量／体積）を構成する対照血漿であって、生体液である対照血漿を含む非侵襲的分子対照である。
【０００８】
本発明の別の側面においては、１ミリリットルあたり２５０−７５０コピーの対照マーカーを含む第１の対照マーカーであって、胎盤特異的４メッセンジャーリボ核酸である第１の対照マーカー、非侵襲的分子対照の総体積の３０−８０パーセント（重量／体積）を構成する対照血漿であって、生体液である対照血漿、ならびに０．０５−０．５重量／体積％の２−ブロモ−２ニトロプロパン−１，３−ジオール、０．１−０．５重量／体積％のアミノカプロン酸、０．１５−０．２重量／体積％のイミダゾリジニル尿素、およびこれらの組合せからなる群から選択される対照安定化剤を含む非侵襲的分子対照である。
【０００９】
本発明の別の側面においては、１ミリリットルあたり０．１５−０．５マイクログラムを含む第１の対照マーカーであって、メタロプロテアーゼタンパク質１２である第１の対照マーカー、非侵襲的分子対照の総体積の３０−８０パーセント（重量／体積）を構成する対照血漿であって、生体液である対照血漿、ならびに０．０５−０．５重量／体積％の２−ブロモ−２ニトロプロパン−１，３−ジオール、０．１−０．５重量／体積％のアミノカプロン酸、０．１５−０．２重量／体積％のイミダゾリジニル尿素、およびこれらの組合せからなる群から選択される対照安定化剤を含む非侵襲的分子対照である。
【００１０】
以下の詳細な説明は、単に例示的かつ説明的なものであり、特許請求された本発明を必ずしも限定するものではない。添付した図面であって、本明細書内に組み込まれ、本明細書の一部を構成するものは、本発明の実施態様を例示し、詳細な説明と共に、本発明の原理を説明する役割を果たすものである。
【００１１】
本発明における多数の利点は、添付した図を参照することによって当業者がより良く理解し得るものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】非侵襲的分子対照を製造する方法を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
非侵襲的分子対照を製造する方法および非侵襲的分子対照を使用する分析を記載する。非侵襲的分子対照を製造する方法は、目的の状態のための陽性対照を予め決定すること、目的の状態のための対照マーカーを含む細胞株を選択すること、選択された細胞株からの対照マーカーを含有する細胞外小胞の産生を増幅すること、選択された細胞株から、産生された対照マーカーを単離すること、単離された細胞外小胞から対照マーカーを定量すること、単離された対照血漿に加えるために対照マーカーの体積を決定すること、対照試料から対照血漿を単離すること、単離された対照血漿を対照安定化剤によって処理すること、当該体積の対照マーカーに加えるために、対照血漿の体積を決定すること、当該体積の対照マーカーを単離された対照血漿と組み合わせること、および試料を非侵襲的分子対照に対して分析することを含む。結果として生じた非侵襲的分子対照は、対照マーカー、対照安定化剤、および対照血漿を含む。非侵襲的分子対照は、対照充填剤をさらに含んでよい。非侵襲的分子対照は、試料を分析して目的の状態の存在または不存在について試験するために使用される陽性対照である。好ましい非侵襲的分子対照は、目的の状態の対照マーカーを、目的の状態を有するヒトと実質的に同様の割合で含有する陽性対照である。そのような陽性対照は、その後、それに対して試料を測定するために、およびそれによって目的の状態の存在または不存在を検出するために使用されてよい。
【００１４】
目的の状態とは、早期検出が望まれている状態または疾患である。たとえば、目的の状態は、ヒトの妊娠、ヒト胎児の染色体異常（たとえば２１トリソミー、１８トリソミー）、またはヒトのがん（たとえば大腸がん）であってよい。目的の状態の各々は、目的の状態に特有な、ヒトにおける対照マーカーを産生する。
【００１５】
対照マーカーは、細胞外小胞（たとえば微小小胞体およびエキソソーム）におけるｃｆＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質において見出される。細胞外小胞は細胞によって産生され、バイオマーカー（たとえば膜受容体、接着分子、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ、ｃｆＤＮＡ、等）を含有し、これは細胞の起源、およびこれが由来する細胞における生理学的状態を反映する。本方法において、細胞外小胞において見出される対照マーカーは、ｃｆＤＮＡ（たとえば細胞外小胞において見出されるｄｓＤＮＡ）であってよい。本方法において、対照マーカーは、細胞外小胞におけるｍＲＮＡであってよい。さらに、本方法において、対照マーカーは、細胞外小胞におけるタンパク質（たとえば膜受容体、サイトカイン、接着分子、その他）であってよい。対照マーカーは、変異遺伝子、染色体異常、ｍＲＮＡ異常、またはタンパク質異常であってよい。対照マーカーは細胞外小胞のｃｆＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質において見出されることから、非侵襲的試験（たとえば採血または尿試料）を使用して、試料における目的の状態の存在または不存在を検出してよい。
【００１６】
目的の状態の存在または不存在を決定するために使用される試料は、ヒト由来の血液であってよい。試料がヒト血液である場合、これは採血を介して採取し、２段階遠心分離プロトコールに供して、実質的に細胞および細胞性デブリを含まない血漿を得てよい。ヒト血液試料は、１６００（１．１１８×１０−５）（たとえば×ｇ）において１０分間にわたり室温で遠心分離してよい。血液試料における血漿部分は、その後、バフィーコートを破壊することなく、新しい遠心チューブに移して、１６，０００ｇにおいて１０分間にわたり室温で遠心分離に供し、残りの細胞および細胞性デブリを血漿から分離してよい。ヒト血液試料から結果として生じた血漿は、実質的に細胞および細胞性デブリを含まず、細胞外小胞を含有する。目的の状態の存在または不存在を識別するバイオマーカー（対照マーカー）が、その後、血漿における細胞外小胞から単離される。バイオマーカーがｃｆＤＮＡである場合、これは、ＱＩＡＧＥＮの循環核酸単離キットのような、結合のためにシリカベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介して単離してよい。バイオマーカーがｍＲＮＡである場合、これは、結合のためにセルロースベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介して単離してよい。バイオマーカーがタンパク質である場合、単離は、たとえば１分間にわたる超音波処理であって、氷上で生じてよい超音波処理を介したホモジナイズを含んでよい。結果として生じたホモジネートは、タンパク質バイオマーカーを含む。試料がヒト尿である場合、これは中間尿採取プロトコールを介して採取してよい。尿試料は、その後、２０００ｇ、室温で３０分間遠心分離に供してよい。結果として生じた上清は、実質的に細胞および細胞性デブリを含まず、細胞外小胞を含有する。バイオマーカーがｃｆＤＮＡである場合、これはその後、ＱＩＡＧＥＮの循環核酸単離キットのような、結合のためにシリカベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介して、尿上清における細胞外小胞から単離してよい。バイオマーカーがｍＲＮＡである場合、これは、結合のためにセルロースベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介して単離してよい。バイオマーカーがタンパク質である場合、これは細胞外小胞の破壊を介して単離してよい。バイオマーカーがタンパク質である場合、単離は、たとえば１分間にわたる超音波処理であって、氷上で生じてよい超音波処理を介したホモジナイズを含んでよい。結果として生じたホモジネートは、タンパク質バイオマーカーを含む。
【００１７】
方法１００は、非侵襲的分子対照を製造するために使用される。非侵襲的分子対照は、対照マーカー、対照安定化剤、および対照血漿を含む。非侵襲的分子対照は、対照充填剤を含んでよい。
【００１８】
１０１において、目的の状態のための陽性対照は、予め決定される。目的の状態は、ヒトの妊娠、２１トリソミー、１８トリソミー、またはヒト大腸がんのような、早期検出が望まれている疾患または状態である。陽性対照のための対照マーカーは、試料における目的の状態に特有のバイオマーカーの発現に基づいて選択される。バイオマーカーは、細胞外小胞において見出されるｃｆＤＮＡ（たとえば細胞外小胞において見出されるｄｓＤＮＡ）であってよく、これは変異しているか、または染色体異常を含有している。バイオマーカーは、細胞外小胞において見出されるｍＲＮＡであってよく、これは一定の疾患または状態（異常）に特異的である。さらに、バイオマーカーは、細胞外小胞において見出されるタンパク質であってよく、これは疾患または状態（異常）に特異的である。バイオマーカーは対照マーカーの選択を決定するが、それは対照マーカーがバイオマーカーと実質的に同様であるからである（たとえば、バイオマーカーおよび対照マーカーは、同じ変異遺伝子、変異、染色体異常、染色体異数性、疾患特異的ｍＲＮＡ、疾患特異的マイクロＲＮＡまたは疾患特異的タンパク質である）。非侵襲的分子対照は、目的の状態の対照マーカーを含有する陽性対照である。陽性対照は、対照マーカーを、目的の状態を有する試料におけるバイオマーカーと実質的に同様の割合で含有してよい。
【００１９】
１０２において、予め決定された対照マーカーを産生する細胞株が、陽性対照のために選択される。細胞株は、初代培養細胞（たとえば、腫瘍のような生体組織から単離され、培養された細胞）または別のヒト細胞株（たとえば確立された細胞株）であって、目的の状態におけるバイオマーカーに特異的な対照マーカーを産生するものであってよい。対照マーカーは、変異したＤＲＡＳ、ｐ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２のような遺伝的に変化した遺伝子であってよい。対照マーカーは、遺伝的に変化した（変異した）ｍＲＮＡであってよい。対照マーカーは、異常な量における正常なｍＲＮＡであってよい。対照マーカーは、異常（たとえば構造的欠陥、異常な量、その他）を有するタンパク質であってよい。細胞株は、対照マーカーを含むｃｆＤＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはタンパク質を含有する細胞外小胞を産生する。したがって、細胞株は、対照マーカーを含有する細胞株から放出されたｃｆＤＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはタンパク質に依存して選択される。
【００２０】
たとえば、ヒトの妊娠が目的の状態である場合、対照マーカーは、ｒａｓ関連ドメイン含有タンパク質１（たとえばＲＡＳＳＦ１Ａ）プロモーター領域であって、高メチル化されたもの（たとえば高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ）であってよい。妊娠した女性のヒト（たとえば母親）において、バイオマーカーは、母親の細胞外小胞に存在する高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａを含有する胎児性ｃｆＤＮＡである。母親はさらに、低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａプロモーター領域（たとえば低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ）を含む彼女自身の細胞から産生されたｃｆＤＮＡを有する。妊娠していない女性のヒトは、高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａを含む胎児性ｃｆＤＮＡを有さず、低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａを含むｃｆＤＮＡのみを有する。したがって、目的の状態が妊娠である場合の細胞株はＴＯＶ  ２１Ｇ細胞株であり、これは高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａを含むｃｆＤＮＡを含有する細胞外小胞を産生する。ＴＯＶ  ２１Ｇ細胞株は、グレード３、ステージＩＩＩの原発性悪性腺がん腫である明細胞がん腫を含む、ヒト女性の卵巣上皮細胞から単離され、培養されたヒト細胞株である。
【００２１】
さらに、ヒトの妊娠が目的の状態である場合、対照マーカーは胎盤特異的４（ＰＬＡＣ４）ｍＲＮＡであってよい。母親において、バイオマーカーは、母親の細胞外小胞に存在する胎児性ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡである。妊娠していない女性のヒトは、ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡを含有する胎児性細胞外小胞を有さない。したがって、目的の状態が妊娠である場合の細胞株はＪＡＲ細胞株であってよく、これはＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡを含有する細胞外小胞を産生する。ＪＡＲ細胞株は、胎児が絨毛がん腫を有していたヒト女性の胎盤から単離され、培養されたヒト細胞株である。
【００２２】
さらに、ヒトの妊娠が目的の状態である場合、対照マーカーは、メタロプロテアーゼタンパク質１２（ＡＤＡＭ１２）胎盤タンパク質であってよい。母親において、バイオマーカーは、母親の細胞外小胞におけるＡＤＡＭ１２胎盤タンパク質である。妊娠していない女性のヒトは、ＡＤＡＭ１２胎盤タンパク質を含有する胎児性細胞外小胞を有さない。したがって、目的の状態が妊娠である場合の細胞株はＪＡＲ細胞株であってよく、これはＡＤＡＭ１２胎盤タンパク質を含有する細胞外小胞を産生する。
【００２３】
ヒト胎児（たとえば胎児）における２１トリソミーが目的の状態である場合、対照マーカーは２１番染色体のセントロメアであってよい。２１トリソミーを有する胎児における胎児性ｃｆＤＮＡは、２１番染色体を３コピー含有し、したがって２１番染色体のセントロメアを３コピー含有する。２１トリソミーを有する胎児を有する母親において、バイオマーカーは、２１番染色体のセントロメアを３コピー含有する胎児性ｃｆＤＮＡであり、これは母親の細胞外小胞に存在する。母親はさらに、２１番染色体のセントロメアを２コピー含む彼女自身の細胞から産生されたｃｆＤＮＡを有する。したがって、目的の状態が２１トリソミーである場合の細胞株はＤｅｔｒｏｉｔ  ５３２であってよく、これは２１番染色体のセントロメアを３コピー含むｃｆＤＮＡを産生する。Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５３２細胞株は、ヒト男性線維芽細胞から単離され、培養されたヒト細胞株である。
【００２４】
さらに、胎児における２１トリソミーが目的の状態である場合、対照マーカーは、胎児性ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡであってよい。２１トリソミーを有する胎児の胎児性ｍＲＮＡは、２１番染色体を３コピー含有し、したがって、２１番染色体における３つすべてのコピーのＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの付加的な発現を含有する。したがって、２１トリソミーを有する胎児は、２１トリソミーを有さない胎児におけるものよりも高い胎児性ＰＬＡＣ４の発現を有し得る。そのため、目的の状態が２１トリソミーである場合の細胞株はＪＡＲ細胞株であってよく、これはＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡを産生する。
【００２５】
胎児における１８トリソミーが目的の状態である場合、対照マーカーはＡＤＡＭ１２胎盤タンパク質であってよい。ＡＤＡＭ１２胎盤タンパク質の発現は、１８トリソミーを有する胎児において抑制される。したがって、１８トリソミーを有する胎児は、１８トリソミーを有さない胎児におけるものよりも低いＡＤＡＭ１２胎盤タンパク質の発現を有し得る。そのため、目的の状態が１８トリソミーである場合の細胞株はＪＡＲ細胞株であってよく、これはＡＤＡＭ１２胎盤タンパク質を産生する。
【００２６】
ヒト大腸がんが目的の状態である場合、対照マーカーは、ヘテロ接合変異を有するカーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）エキソン２  Ｇ１３Ｄである。大腸がんを有するヒトは、ＫＲＡＳエキソン２  Ｇ１３Ｄにおけるヘテロ接合変異を有するｃｆＤＮＡのバイオマーカーを産生する。したがって、目的の状態がヒト大腸がんである場合の細胞株はＨＣＴ１１６であるが、それはこれがＫＲＡＳエキソン２  Ｇ１３Ｄにおけるヘテロ接合変異を有するｃｆＤＮＡを産生するからである。ＨＣＴ  １１６細胞株は、結腸直腸がん腫を含む男性の上皮性結腸細胞から単離され、培養されたヒト細胞株である。
【００２７】
１０３において、細胞株からの対照マーカーの放出が増幅される。細胞株は、化学物質および他の処理によって誘導を受けて、細胞外小胞の産生を増幅してよいが、これは細胞株がなお培養培地中にある場合に、細胞外小胞中に対照マーカーを含有する。これらの化学物質および他の処理は、細胞株を低酸素もしくはグルコース枯渇に供すること、または、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ヒドロキシラーゼ阻害剤であるジメチルオキサロイルグリシン（ＤＭＯＧ）、概ね１−３ミリモル（ｍＭ）の濃度の２−オキソグルタル酸アナログ、概ね１−５ｍＭの濃度のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、もしくは概ね１−１０マイクロモル（μＭ）の濃度のイオノフォアである（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｓ，５Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，９Ｓ）−２−［（２Ｒ，５Ｓ）−５−エチル−５−［（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）−５−［（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−６−ヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−３，５−ジメチルオキサン−２−イル］−３−メチルオキソラン−２−イル］オキソラン−２−イル］−７−ヒドロキシ−２，８−ジメチル−１，１０−ジオキサスピロ［４．５］デカン−９−イル］−３−メトキシ−２−メチル吉草酸（モネンシン）のような化学的化合物を添加することを含む。
【００２８】
たとえば、細胞株がＴＯＶ  ２１Ｇである場合、細胞株はイオノフォアであるモネンシンによって、５−１５μＭの有効濃度において、摂氏３７度の条件下、５％二酸化炭素の湿潤雰囲気中で、少なくとも１日間にわたって処理される。細胞株がＤｅｔｒｏｉｔ  ５３２である場合、細胞株はイオノフォアであるモネンシンによって、５−１５μＭの有効濃度において、摂氏３７度の条件下、５％二酸化炭素の湿潤雰囲気中で、少なくとも１日間にわたって処理される。
【００２９】
細胞株がＪＡＲ細胞であり、対照マーカーがＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡである場合、細胞株はイオノフォアであるモネンシンによって、５−１５μＭの有効濃度において、摂氏３７度の条件下、５％二酸化炭素の湿潤雰囲気中で、少なくとも１日間にわたって処理される。細胞株がＪＡＲ細胞であり、対照マーカーがＡＤＡＭ１２胎盤タンパク質である場合、細胞株はイオノフォアであるモネンシンによって、５−１５μＭの有効濃度において、摂氏３７度の条件下、５％二酸化炭素の湿潤雰囲気中で、少なくとも１日間にわたって処理される。細胞株がＨＣＴ  １１６である場合、細胞株はイオノフォアであるモネンシンによって、５−１５μＭの有効濃度において、摂氏３７度の条件下、５％二酸化炭素の湿潤雰囲気中で、少なくとも１日間にわたって処理される。本明細書で使用する場合、有効濃度は、実在溶液におけるイオノフォアであるモネンシンの化学ポテンシャルを考慮した、溶液中のイオノフォアであるモネンシンの濃度を意味する。
【００３０】
１０４において、細胞外小胞における対照マーカーが、細胞株の細胞培養培地から単離される。細胞株は、ｃｆＤＮＡを含有する細胞外小胞を、細胞培養培地中に放出する。細胞外小胞は、細胞培養培地から、細胞培養培地からの全エキソソーム単離のためのエキソソーム単離キットを使用して単離してよい。たとえば、全エキソソーム単離キットは、細胞外小胞を単離する化学物質（たとえば全エキソソーム単離試薬）として作用するためのアジ化ナトリウムを含有してよい。全エキソソーム単離キットを使用するプロトコールに続いて、細胞外小胞を単離する。たとえば、細胞培養培地の回収および室温で３０分間の２０００×（１．１１８×１０−５）（たとえば×ｇ）での遠心分離が、細胞ならびに他の細胞性および生物学的デブリを除去するために行われる。遠心分離後、細胞外小胞を含有する細胞培養培地を回収チューブ（たとえば試験管）に移し、ある体積（たとえば２５ｍＬ）の全エキソソーム単離試薬と混合する。細胞培養培地を、その後、４度において一晩（たとえば概ね１２時間）インキュベートする。一晩のインキュベーション後、細胞培養培地を、摂氏４度で１時間、１０，０００×ｇで遠心分離する。遠心分離後、上清は残りの細胞性および生物学的デブリを含有し、吸引および破棄される。細胞外小胞は細胞外小胞ペレット中に残り、これはさらにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁し、摂氏マイナス８０度において保存してよい。対照マーカーは、その後、細胞外小胞ペレット中の細胞外小胞から単離される。対照マーカーがｃｆＤＮＡである場合、これは、ＱＩＡＧＥＮの循環核酸単離キットのような、結合のためにシリカベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介して単離してよい。対照マーカーがｍＲＮＡである場合、これは、結合のためにセルロースベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介して単離してよい。対照マーカーがタンパク質である場合、単離はさらに、氷上における概ね１分間にわたる超音波処理のような、細胞外小胞ペレットの超音波処理を含む。
【００３１】
１０５において、対照マーカーが、単離された対照マーカーから定量される。対照マーカーがｃｆＤＮＡである場合、対照マーカーのコピー数は、ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を使用して定量される。対照マーカーがｍＲＮＡである場合、対照マーカーのコピー数は、逆転写ｄｄＰＣＲを使用して定量される。対照マーカーがタンパク質である場合、対照マーカーのコピー数は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して定量される。定量は、その後、体積あたりコピー（たとえばコピー／ｍＬ）、または体積あたりマイクログラム（マイクログラム／ｍＬ）のような、対照マーカーの濃度を得るために変換してよい。
【００３２】
１０６において、単離された対照血漿に加えるために、対照マーカーの体積を決定する。体積は、非侵襲的分子対照の対応する百分率を構成する。対照マーカーが高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａである場合、対照マーカーは、非侵襲的分子対照の総体積の１０％、１５％、または２０％であってよく（たとえば対照マーカーは、非侵襲的分子対照におけるｃｆＤＮＡの総体積の１０％である）、これは試験される対象の胎児の妊娠期間によって決定されるとおりである。妊娠したヒトにおいて、高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａを含む胎児性ｃｆＤＮＡの百分率は、胎児の妊娠期間が増加するにつれて増加し、全ＲＡＳＳＦ１Ａ組成における組成を変化させるが、その百分率は、妊娠第１期の間において概ね１０％、妊娠第２期の間において概ね１５％、および妊娠第３期の間において概ね２０％である。
【００３３】
たとえば、１００ミリリットル（ｍＬ）の妊娠第１期非侵襲的分子対照が望まれている場合、高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａの百分率は、好ましくは概ね１０％に調整される。妊娠していないヒトにおけるｃｆＤＮＡ濃度は、概ね１０００−１５００コピー／ｍＬの血漿の範囲であり、これはまた、１０００−１５００コピー／ｍＬの低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａと同等である。妊娠している間の妊娠したヒトにおけるＲＡＳＳＦ１Ａのコピー数（低メチル化および高メチル化の両方）は、低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ濃度の上限が妊娠していないヒトの濃度から使用された場合、１ｍＬあたり概ね１，８００まで増加する。したがって、妊娠第１期のための非侵襲的分子対照は、好ましくは１８０コピー／ｍＬの濃度の高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ（すなわち対照マーカー）、および１６２０コピー／ｍＬの濃度の対照充填剤を含む。
【００３４】
非侵襲的分子対照が妊娠第２期のためのものである場合、これは好ましくは、２７０コピー／ｍＬの濃度の高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ、および１５３０コピー／ｍＬの濃度の対照充填剤を含む。非侵襲的分子対照が妊娠第３期のためのものである場合、これは好ましくは、３６０コピー／ｍＬの濃度の高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ、および１４４０コピー／ｍＬの濃度の対照充填剤を含む。対照マーカーが高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａである場合、対照充填剤は低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａである。
【００３５】
加えられる対照マーカーの体積は、式Ｙ＝（Ａ×Ｖ）／Ｘによって決定され、式中、Ｙは非侵襲的分子対照に加えられる対照マーカーの体積であり、Ａは非侵襲的分子対照において必要な対照マーカーの濃度（たとえばコピー／ｍＬ、マイクログラム／ｍＬ）であり、Ｖは非侵襲的分子対照の総体積であり、Ｘは単離された対照マーカーの濃度（たとえばコピー／ｍＬ、マイクログラム／ｍＬ）である。１００ｍＬの妊娠第１期分子対照については、Ａは１８０コピー／ｍＬの高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａであり、Ｖは１００ｍＬであり、Ｘは３５，０００コピー／ｍＬである。Ｙは（１８０コピー／ｍＬ×１００ｍＬ）／３５，０００コピー／ｍＬであり、Ｙ＝０．５１４ｍＬである。
【００３６】
非侵襲的分子対照が対照充填剤を含む場合、加えられる対照充填剤コピーの体積は、式Ｒ＝（（Ｓ−Ａ）×Ｖ）／Ｚによって決定され、式中、Ｒは、非侵襲的分子対照に加えられる対照充填剤、この例においては低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａの体積（たとえばｍＬ）であり、Ｓは非侵襲的分子対照におけるＲＡＳＳＦ１Ａコピー（低メチル化＋高メチル化）の望ましい濃度（たとえばコピー／ｍＬ、マイクログラム／ｍＬ）であり、Ａは対照血漿における対照マーカーの濃度（たとえばコピー／ｍＬ）であり、Ｖは非侵襲的分子対照の総体積であり、Ｚは低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａストック溶液の濃度（たとえばコピー／ｍＬ）である。
【００３７】
低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａストック溶液は、初代ヒト皮膚線維芽細胞由来の細胞外小胞の単離、または妊娠していないヒト女性の血液由来の細胞外小胞の単離のいずれかによって、１０４におけるものと同じプロトコールを利用して得てよい。低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａストック溶液の濃度は、予め決定された体積の低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａストック溶液からｃｆＤＮＡを抽出すること、およびｄｄＰＣＲによってＲＡＳＳＦ１Ａのコピー数を定量することによって決定される。１００ｍＬの妊娠第１期分子対照については、Ｓは１８００コピー／ｍＬであり、Ａは１８０コピー／ｍＬであり、Ｖは１００ｍＬであり、Ｚは１５０，０００コピー／ｍＬである。Ｒは（１８００コピー／ｍＬ−１８０コピー／ｍＬ）×１００ｍＬ／１５０，０００コピー／ｍＬであり、Ｒ＝１．０８ｍＬである。
【００３８】
目的の状態がヒトの妊娠である場合、対照マーカーはＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡであってよく、対照マーカーは２５０、５００、および７５０（コピー／ｍＬの非侵襲的分子対照）の濃度であってよく、これは試験される対象の胎児の妊娠期間によって決定されるとおりである。妊娠したヒトにおいて、ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡの濃度は、胎児の妊娠期間が増加するにつれて増加し、これは細胞外小胞におけるＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡの組成を変化させるが、その濃度は、妊娠第１期、第２期、および第３期の間においてそれぞれ概ね２５０、５００、および７５０コピー／ｍＬの非侵襲的分子対照である。妊娠していないヒトの女性において、細胞外小胞におけるＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡは存在せず、したがって非侵襲的分子対照には対照充填剤がない。加えられる対照マーカーの体積は、式Ｙ＝（Ａ×Ｖ）／Ｘによって決定される。
【００３９】
目的の状態がヒトの妊娠である場合、対照マーカーはＡＤＡＭ１２タンパク質であってよく、対照マーカー濃度は、０．１５−０．５０（マイクログラム／ｍＬの非侵襲的分子対照）であってよい。好ましくは、対照マーカーは０．１５マイクログラム／ｍＬである。妊娠していないヒトの女性において、細胞外小胞におけるＡＤＡＭ１２は存在せず、したがって非侵襲的分子対照には対照充填剤がない。加えられる対照マーカーの体積は、式Ｙ＝（Ａ×Ｖ）／Ｘによって決定される。
【００４０】
目的の状態が２１トリソミーである場合、対照マーカーは２１番染色体のセントロメアであってよく、対照マーカーは非侵襲的分子対照の総体積の１０％、１５％、または２０％であってよく、これは試験される対象の胎児の妊娠期間によって決定されるとおりである。目的の状態が２１トリソミーである場合、高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａの二次対照マーカーも存在し、これは、胎児性ｃｆＤＮＡの存在または不存在について試験するための対照である。二次対照マーカーは、非侵襲的分子対照における総濃度の１０％、１５％、または２０％であってよく、これは試験される対象の胎児の妊娠期間によって決定されるとおりである。目的の状態が２１トリソミーである場合、対照充填剤は低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａである。妊娠したヒトにおいて、高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａを含む胎児性ｃｆＤＮＡの百分率は、胎児の妊娠期間が増加するにつれて増加し、全ＲＡＳＳＦ１Ａ組成における組成を変化させるが、その百分率は、妊娠第１期の間において概ね１０％、妊娠第２期の間において概ね１５％、および妊娠第３期の間において概ね２０％である。非侵襲的分子対照における対照マーカーおよび二次対照マーカーの割合は、妊娠したヒトにおける胎児性ｃｆＤＮＡの百分率と実質的に同様である。加えられる対照マーカーの体積は、式Ｙ＝（Ａ×Ｖ）／Ｘによって決定される。加えられる二次対照マーカーの体積は、式Ｙ＝（Ａ２×Ｖ）／Ｘによって決定され、式中、Ａ２は、非侵襲的分子対照において必要な二次対照マーカーの濃度（コピー／ｍＬ）である。加えられる対照充填剤（たとえば低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ）の体積は、式Ｒ＝（（Ｓ−（Ａ＋Ａ２））×Ｖ）／Ｚによって決定される。目的の状態が２１トリソミーである場合における妊娠第１期のための１００ｍＬの非侵襲的分子対照について、Ｓは１８００コピー／ｍＬであり、Ａは１８０コピー／ｍＬであり、Ａ２は１８０コピー／ｍＬであり、Ｖは１００ｍＬであり、Ｚは１５０，０００コピー／ｍＬであり、Ｒ＝０．９６ｍＬである。
【００４１】
目的の状態が２１トリソミーである場合、対照マーカーはＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡであってよい。対照マーカーの濃度は、非侵襲的分子対照の２５０、５００、および７５０コピー／ｍＬであってよく、これは試験される対象の胎児の妊娠期間によって決定されるとおりである。妊娠していないヒトの女性において、ＰＬＡＣ４  ｍＲＮＡは存在せず、したがって非侵襲的分子対照には、対照充填剤または二次対照がない。加えられる対照マーカーの体積は、式Ｙ＝（Ａ×Ｖ）／Ｘによって決定される。
【００４２】
目的の状態が１８トリソミーである場合、対照マーカーはＡＤＡＭ１２胎盤タンパク質であってよい。対照マーカーは、非侵襲的分子対照の０．１５−０．５０（マイクログラム／ｍＬ）であってよい。好ましくは、対照マーカーは０．１５マイクログラム／ｍＬである。１８トリソミーを有する胎児を有する妊娠したヒトにおいて、ＡＤＡＭ１２の濃度は概ね０．１０（マイクログラム／ｍＬの血漿）である。妊娠していないヒトの女性において、細胞外小胞におけるＡＤＡＭ１２は存在せず、したがって非侵襲的分子対照には対照充填剤または二次対照マーカーがない。加えられる対照マーカーの体積は、式Ｙ＝（Ａ×Ｖ）／Ｘによって決定される。非侵襲的分子対照における対照マーカーの濃度は、正常な胎児を有する妊娠したヒトにおけるＡＤＡＭ１２の濃度と実質的に同様である。
【００４３】
目的の状態が大腸がんである場合、対照マーカーは、ヘテロ接合変異を含むＫＲＡＳエキソン２  Ｇ１３Ｄであり、対照充填剤は野生型ＫＲＡＳ遺伝子である。対照充填剤（たとえば野生型ＫＲＡＳ）は、ヒトドナーの血液から、または対照充填剤を産生する細胞株から得てよい。細胞株は初代培養細胞（たとえば、腫瘍、皮膚組織、その他のような生体組織から単離され、培養された細胞）または別のヒト細胞株（たとえば確立された細胞株）であって、対照充填剤を産生するものであってよく、これは１０４におけるプロトコールに従って単離してよい。対照マーカーは、非侵襲的分子対照の総体積の１０％、１５％、または２０％であってよい。対照マーカーおよび対照充填剤の総濃度は、１８００コピー／ｍＬである。加えられる対照マーカーの体積は、式Ｙ＝（Ａ×Ｖ）／Ｘによって決定される。加えられる対照充填剤の体積は、式Ｒ＝（（Ｓ−Ａ）×Ｖ）／Ｚによって決定される。
【００４４】
１０７において、対照血漿は対照試料から単離される。対照血漿は、ヒト血液、動物血液、人工血漿、または合成尿のような生体液である。試料がヒト血液である場合、対照血漿は対照試料から単離されてよいか、またはこれは人工成分の人工血漿であってよい。人工血漿は、記載された量における以下の組み合わされた人工成分であってよい：８０グラム（たとえばｇ）のヒト血清アルブミン、１．７ｇのエチレンジアミン四酢酸三カリウム（Ｋ３ＥＤＴＡ）、１ｇの２−ブロモ−２ニトロプロパン−１，３−ジオール、１ｇのアミノカプロン酸、２ｇのイミダゾリジニル尿素（ＩＤＵ）、０．０００１ｇのビリルビン、８ｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．２ｇの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４４ｇのリン酸二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、および０．２４ｇのリン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）を、８００ｍＬの蒸留水に溶解し、塩酸（ＨＣｌ）を使用して７．４に調整されたｐＨを有するもの。体積は、その後、蒸留水を加えることによって１リットルに調整される。人工血漿は、その後、概ね２０分間にわたって１平方インチあたり約１５ポンド（ｌｂ／ｓｑ．ｉｎ）で、オートクレーブの液体サイクルにおいてオートクレーブすることによって滅菌してよい。人工血漿は、その後、−８０℃のような低温において、使用時まで保存してよい。
【００４５】
対照試料は、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、トリ、または魚のようなあらゆる動物起源由来の血液であってよい。対照血液がヒト血液である場合、対照血漿は２相遠心分離によって単離してよい。対照血漿はまず、室温で１０分間の約１６００×ｇでの遠心分離によって、血液から分離する。対照血漿はその後、バフィーコートを乱すことなく除去され、新しい遠心チューブに移されて、室温で１０分間、１６，０００×ｇで遠心分離される。その時点で清澄化されている対照血漿は、遠心分離ペレットを実質的に乱すことなく除去される。対照血液が、非ヒト起源のものである場合、対照血漿は、内在的な細胞外小胞を除去するための２段階遠心分離プロトコールによって単離してよい。対照血漿はまず、室温で１０分間の１６００×ｇでの遠心分離によって、血液から分離する。対照血漿はその後、バフィーコートを乱すことなく除去され、新しい遠心チューブに移されて、４℃で２時間１００，０００×ｇで遠心分離される。その時点で清澄化されている対照血漿は、遠心分離ペレットを実質的に乱すことなく除去される。対照血漿は、−８０℃で保存してよい。
【００４６】
試料がヒト尿である場合、対照血漿は合成尿であってよい。合成尿は、硫酸ナトリウムを２グラム（たとえばｇ）、リン酸二水素アンモニウムを０．８５ｇ、リン酸水素アンモニウムを０．１５ｇ、無水（ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）塩化カルシウムを０．２５ｇ、塩化マグネシウム六水和物を０．５ｇ、塩化カリウムを２ｇ、１．７ｇのエチレンジアミン四酢酸三カリウム（Ｋ３ＥＤＴＡ）、１ｇの２−ブロモ−２ニトロプロパン−１，３−ジオール、１ｇのアミノカプロン酸、２ｇのイミダゾリジニル尿素（ＩＤＵ）、０．０００１ｇのビリルビンおよび尿素０．２ｇを、８００ｍＬの蒸留水に溶解したもののような、人工成分の組合せであってよい。合成尿の体積は、その後、蒸留水を加えることによって１リットルに調整される。合成尿は、その後、２０分間にわたって１平方インチあたり１５ポンド（ｌｂ／ｓｑ．ｉｎ）で、オートクレーブの液体サイクルにおいてオートクレーブすることによって滅菌してよい。合成尿は、その後、−８０℃において使用時まで保存してよい。
【００４７】
１０８において、対照血漿は、プロテアーゼ活性を阻害するために対照安定化剤によって処理される。対照安定化剤は、０．０５−０．５重量／体積％の濃度の、好ましくは０．１重量／体積％の濃度を有する２−ブロモ−２ニトロプロパン−１，３−ジオールであってよく、０．０５重量／体積％未満および０．５重量／体積％を超える濃度は、対照血漿の安定化のために有効ではない。対照安定化剤は、０．１−０．５重量／体積％の濃度の、好ましくは０．１重量／体積％の濃度を有するアミノカプロン酸であってよく、０．１重量／体積％未満および０．５重量／体積％を超える濃度は、対照血漿の安定化のために有効ではない。対照安定化剤は、さらに、０．１５−０．２重量／体積％の濃度の、好ましくは０．２重量／体積％の濃度を有するイミダゾリジニル尿素を含んでよく、０．１５重量／体積％未満および０．２重量／体積％を超える濃度は、細胞外小胞膜を安定化するために有効ではない。
【００４８】
１０９において、当該体積の対照マーカーおよび対照安定化剤に加えるために、対照血漿の体積を決定する。たとえば、非侵襲的分子対照の望ましい体積が１００ｍＬである場合、１０７において対照マーカーの望ましい百分率が決定され、対照安定化剤が加えられる対照血漿の体積は、式Ｃ＝Ｖ−Ｙによって決定され、式中、Ｃは加えられる対照血漿の体積であり、Ｖは非侵襲的分子対照の総体積であり、Ｙは加えられる対照マーカーの体積である。非侵襲的分子対照が対照充填剤を含む場合、対照血漿の体積は式Ｃ＝Ｖ−（Ｙ＋Ｒ）によって決定され、式中、Ｒは対照充填剤の体積である。
【００４９】
１１０において、対照安定化剤を含む当該体積の対照マーカーは、たとえば回収チューブ内の当該体積の対照血漿と組み合わされて、非侵襲的分子対照を生成する。
【００５０】
１１１において、試料を非侵襲的分子対照に対して分析して、目的の状態の存在または不存在を決定する。バイオマーカーは、試料および非侵襲的分子対照から、同時に抽出される。バイオマーカーがｃｆＤＮＡである場合、抽出は、ＱＩＡＧＥＮの循環核酸単離キットのような、結合のためにシリカベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介するものである。試料および非侵襲的分子対照由来のｃｆＤＮＡを定量し、定量値を比較して、必要なレベルのｃｆＤＮＡがさらなる分析のために存在することを決定する。試料および非侵襲的分子対照由来のｃｆＤＮＡを、その後、大規模並列ＤＮＡ配列決定のようなＤＮＡ配列決定法を介して配列決定して、目的の状態の存在または不存在を示す対照マーカーの存在または不存在を決定する。
【００５１】
バイオマーカーがｍＲＮＡである場合、抽出は、結合のためにセルロースベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介するものである。試料および非侵襲的分子対照由来のｍＲＮＡを定量し、定量値を比較して、必要なレベルのｍＲＮＡがさらなる分析のために存在することを決定する。試料および非侵襲的分子対照由来のｍＲＮＡを、その後、逆転写酵素ｄｄＰＣＲまたは逆転写酵素リアルタイムＰＣＲのようなｍＲＮＡ配列決定法を介して配列決定して、目的の状態の存在または不存在を示す対照マーカーの存在または不存在を決定する。
【００５２】
バイオマーカーがタンパク質である場合、抽出は、超音波処理を介したホモジナイズによるものである。試料および非侵襲的分子対照由来のタンパク質を定量し、定量値を比較して、必要なレベルのタンパク質がさらなる分析のために存在することを決定する。試料および非侵襲的分子対照由来のタンパク質を、その後、ＥＬＩＳＡのようなタンパク質定量法を介して定量して、目的の状態の存在または不存在を示す対照マーカーの存在または不存在を決定する。
【００５３】
たとえば、目的の状態が妊娠であり、対照マーカーがｃｆＤＮＡである場合、ｃｆＤＮＡは、試料から、および非侵襲的分子対照から同時に、ＱＩＡＧＥＮの循環核酸単離キットのような、結合のためにシリカベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介して抽出される。その後、試料から、および非侵襲的分子対照から抽出されたｃｆＤＮＡの一部分を使用して、リアルタイムＰＣＲまたはデジタルＰＣＲを使用して対照マーカーを定量する。目的の状態の存在によって、対照マーカーの示された百分率を非侵襲的分子対照が示し（たとえば、非侵襲性分子対照が１０％の対照マーカーを含有する場合、結果は概ね１０％の対照マーカーという定量的量を示し得る）、対照マーカーの５％を超えるような閾値（たとえば、現存する対照マーカーを試料が有することを示す対照試料の量）を試料が示し、試料および非侵襲的分子対照におけるＤＮＡ配列決定、または他の遺伝的配列検出方法に際しては、両方とも目的の状態のための対照マーカーを提示するという結果が表され得る。
【００５４】
たとえば、目的の状態が妊娠であり、対照マーカーがｍＲＮＡである場合、ｍＲＮＡは試料から、および非侵襲的分子対照から同時に、結合のためにセルロースベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介して抽出される。その後、試料から、および非侵襲的分子対照から抽出されたｍＲＮＡの一部分を使用して、逆転写酵素ｄｄＰＣＲまたは逆転写酵素ＰＣＲを使用して対照マーカーを定量する。目的の状態の存在によって、対照マーカーの示された百分率を非侵襲的分子対照が示し（たとえば、非侵襲的分子対照が２５０コピー／ｍＬの濃度の対照マーカーを含有する場合、結果は２５０コピー／ｍＬの対照マーカーという定量的濃度を示し得る）、２５０コピー／ｍＬを超える濃度の対照マーカーのような閾値（たとえば、現存する対照マーカーを試料が有することを示す対照試料の量）を試料が示し、試料および非侵襲的分子対照におけるｍＲＮＡ配列決定、または他の遺伝的配列検出方法に際しては、両方とも目的の状態のための対照マーカーを提示するという結果が表され得る。
【００５５】
たとえば、目的の状態が妊娠であり、対照マーカーがタンパク質である場合、タンパク質は試料から、および非侵襲的分子対照から同時に、超音波処理を介したホモジナイズによって抽出される。その後、試料から、および非侵襲的分子対照から抽出されたタンパク質の一部分を使用して、ＥＬＩＳＡによって対照マーカーを定量する。目的の状態の存在によって、対照マーカーの示された百分率を非侵襲的分子対照が示し（たとえば、非侵襲的分子対照が０．１５マイクログラム／ｍＬの濃度の対照マーカーを含有する場合、結果は概ね０．１５マイクログラム／ｍＬという定量的濃度を示し得る）、０．１５マイクログラム／ｍＬを超える濃度の対照マーカーのような閾値（たとえば、現存する対照マーカーを試料が有することを示す対照試料の量）を試料が示し、試料および非侵襲的分子対照におけるＥＬＩＳＡまたは他の検出方法に際しては、両方とも目的の状態のための対照マーカーを提示するという結果が表され得る。
【００５６】
目的の状態が２１トリソミーであり、ｃｆＤＮＡが対照マーカーである場合、ｃｆＤＮＡは、試料から、および非侵襲的分子対照から同時に、ＱＩＡＧＥＮの循環核酸単離キットのような、結合のためにシリカベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介して抽出される。その後、試料から、および非侵襲的分子対照から抽出されたｃｆＤＮＡの一部分を使用して、リアルタイムＰＣＲまたはデジタルＰＣＲを使用して対照マーカーを定量する。目的の状態の存在によって、二次対照マーカーの示された百分率を非侵襲的分子対照が示し（たとえば、非侵襲的分子対照が１０％の二次対照マーカーを含有する場合、結果は概ね１０％の二次対照マーカーという定量的量を示し得る）、５％を超える対照マーカーのような閾値（たとえば、現存する対照マーカーを試料が有することを示す対照試料の量）を試料が示し、試料および非侵襲的分子対照におけるＤＮＡ配列決定、または他の遺伝的配列検出方法に際しては、両方とも目的の状態のための対照マーカーを提示するという結果が、表され得る。
【００５７】
目的の状態が２１トリソミーであり、ｍＲＮＡが対照マーカーである場合、ｍＲＮＡは、試料から、および非侵襲的分子対照から同時に、結合のためにセルロースベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介して抽出される。その後、試料から、および非侵襲的分子対照から抽出されたｍＲＮＡの一部分を使用して、逆転写酵素リアルタイムＰＣＲまたは逆転写酵素ｄｄＰＣＲを使用して対照マーカーを定量する。目的の状態の存在によって、対照マーカーの示された百分率を非侵襲的分子対照が示し（たとえば、非侵襲的分子対照が５００コピー／ｍＬの対照マーカーを含有する場合、結果は概ね５００コピー／ｍＬの対照マーカーという定量的量を示し得る）、５００コピー／ｍＬ以上の濃度の対照マーカーのような閾値（たとえば、現存する対照マーカーを試料が有することを示す対照試料の量）を試料が示し、試料および非侵襲的分子対照におけるｍＲＮＡ配列決定、または他の遺伝的配列検出方法に際しては、両方とも目的の状態のための対照マーカーを提示するという結果が、表され得る。
【００５８】
目的の状態が１８トリソミーであり、タンパク質が対照マーカーである場合、タンパク質は、試料から、および非侵襲的分子対照から同時に、超音波処理を介したホモジナイズによって抽出される。その後、試料から、および非侵襲的分子対照から抽出されたタンパク質の一部分を使用して、ＥＬＩＳＡを使用して対照マーカーを定量する。目的の状態の存在によって、対照マーカーの示された百分率を非侵襲的分子対照が示し（たとえば、非侵襲的分子対照が０．１５マイクログラム／ｍＬの濃度の対照マーカーを含有する場合、結果は概ね０．１５マイクログラム／ｍＬという定量的濃度を示し得る）、０．１５マイクログラム／ｍＬを下回る濃度の対照マーカーのような閾値（たとえば、現存する対照マーカーを試料が有することを示す対照試料の量）を試料が示し、試料および非侵襲的分子対照におけるＥＬＩＳＡ分析、または他の検出方法に際しては、両方とも目的の状態のための対照マーカーを提示するという結果が、表され得る。
【００５９】
目的の状態が大腸がんである場合、ｃｆＤＮＡは、試料から、および非侵襲的分子対照から同時に、ＱＩＡＧＥＮの循環核酸単離キットのような、結合のためにシリカベースの膜によるカラム溶出プロトコールを利用し得る市販のキットを介して抽出される。試料および非侵襲的分子対照から抽出されたｃｆＤＮＡは、その後、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、またはｉｃｅ−ＣＯＬＤ−ＰＣＲを使用して、対照マーカー（たとえばＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異）について定量および分析される。目的の状態の存在によって、対照マーカーの示された百分率を非侵襲的分子対照が示し（たとえば、非侵襲的分子対照が１０％の対照マーカーを含有する場合、結果は概ね１０％の対照マーカーというという定量的量を示し得る）、２％を超える対照マーカーのような閾値（たとえば、現存する対照マーカーを試料が有することを示す対照試料の量）を試料が示し、試料および非侵襲的分子対照におけるＤＮＡ配列決定、または他の遺伝的配列検出方法に際しては、両方とも目的の状態のための対照マーカーを提示するという結果が表され得る。
【００６０】
本発明およびそれに付随する多くの利点は、前述した説明から理解されるだろうと信じる。さらに、本発明の範囲および趣旨から外れることなく、またはその相当な利益のすべてを犠牲にすることなく、形態、構成およびその構成要素の配置において種々の変更を行ってよいことが明らかであるだろうと信じる。本明細書において先に記載した形態は単にその説明的な実施態様であり、以下の特許請求の範囲は、そのような変更を包含し、含むことを意図する。
【図１】
2019509486.tif 000003
【国際調査報告】
2019509486.tif 000004