(57)【要約】  本明細書には、ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質を有効成分として含む皮膚美白用組成物及びＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質のスクリーニング方法が開示される。前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質を有効成分として含む組成物は、皮膚内メラニンの含量を低減させ、優れた美白効果を提供することができる。また、前記スクリーニング方法によれば、ＴＮＦＲＳＦ  １４遺伝子の相対的発現抑制度合を確認することで、簡便に皮膚美白物質をスクリーニングすることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦＲＳＦ  １４（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １４）の発現又は活性抑制物質を有効成分として含む、皮膚美白用組成物。
【請求項２】
前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質は、ＴＮＦＲＳＦ  １４  ｍＲＮＡの翻訳を抑制する物質を含む、請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項３】
前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質は、ＴＮＦＲＳＦ  １４  ｍＲＮＡの少なくとも一部に結合するオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡのいずれか一つ以上である、請求項３に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、且つ配列番号１で表される塩基配列及び前記配列番号１にハイブリダイズ可能な塩基配列を含む、請求項３に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、且つ配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列を含み、前記配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列はハイブリダイズされた、請求項３に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、且つ配列番号３で表される塩基配列及び前記配列番号３にハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項３に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、且つ配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列を含み、前記配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列はハイブリダイズされた、請求項３に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドは、リポソームに捕集された形態又はベクターに挿入された形態で含まれる、請求項３〜８のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項１０】
当該組成物は皮膚化粧料組成物である、請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項１１】
当該組成物は薬学的組成物である、請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項１２】
当該組成物は、ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質を組成物の総質量を基準に、０．００００１〜３０質量％の範囲で含む、請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項１３】
皮膚美白物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）を試験物質で処理する段階；及び
（ｂ）前記試験物質がメラニン細胞においてＴＮＦＲＳＦ  １４（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １４）の発現を抑制するか否かを確認する段階；を含む、皮膚美白物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記段階（ｂ）のＴＮＦＲＳＦ  １４の発現抑制の可否は、ＴＮＦＲＳＦ  １４  ｍＲＮＡの翻訳抑制の可否である、請求項１３に記載の皮膚美白物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記段階（ｂ）は、メラニン細胞を試験物質で処理する前と後のＴＮＦＲＳＦ  １４の相対的発現抑制度合を確認する段階を含む、請求項１３に記載の皮膚美白物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記段階（ｂ）は、試験物質で処理したメラニン細胞と試験物質で処理していないメラニン細胞の相対的発現抑制度合を確認する段階を含む、請求項１３に記載の皮膚美白物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記段階（ｂ）の確認結果、前記試験物質がＴＮＦＲＳＦ  １４の発現を抑制させたとき、皮膚美白物質と判定する段階を更に含む、請求項１５に記載の皮膚美白物質のスクリーニング方法。
【請求項１８】
ＴＮＦＲＳＦ  １４のｍＲＮＡ又はＴＮＦＲＳＦ  １４タンパク質検出試薬を含む、色素関連の皮膚状態診断用組成物。
【請求項１９】
試験対象から分離された皮膚細胞においてＴＮＦＲＳＦ  １４（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １４）の発現量を確認する段階を含み、
前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量は、ＴＮＦＲＳＦ  １４のｍＲＮＡ又はＴＮＦＲＳＦ  １４タンパク質の発現量である、色素関連の皮膚状態診断用基礎情報の提供方法。
【請求項２０】
前記試験対象から分離された皮膚細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量を正常対照群皮膚細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量と比べる段階を更に含む、請求項１９に記載の色素関連の皮膚状態診断用基礎情報の提供方法。
【請求項２１】
前記試験対象から分離された皮膚細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量が正常対照群皮膚細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量よりも高いとき、色素関連の皮膚状態に異常があるとの情報を提供する段階を更に含む、請求項２０に記載の色素関連の皮膚状態診断用基礎情報の提供方法。
【請求項２２】
ＴＮＦＲＳＦ  １４のｍＲＮＡ又はＴＮＦＲＳＦ  １４タンパク質検出試薬を含む、色素関連の皮膚状態診断用キット。
【請求項２３】
請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法が記載されている指示書を更に含む、請求項２２に記載の色素関連の皮膚状態診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、皮膚美白用組成物及び皮膚美白物質スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人の肌色を決める最も重要な要因は、人体内のメラノサイトにおいてチロシナーゼなどの種々の酵素が働いて生成されるメラニンであって、該メラニンが必要以上に過剰に生成されると、しみやそばかす、斑点などのような過色素沈着症を引き起こし、美容上によくない結果を来たしてしまう。また、皮膚内における外部のストレス的刺激によってできたメラニンは、ストレスが消えても皮膚角化により外部に排出されるまではなくならない。
【０００３】
したがって、このようなメラニンの生成を抑制するための研究が進められてきており、アスコルビン酸、コウジ酸、アルブチン、ヒドロキノン、グルタチオン若しくはこれらの誘導体、又はチロシナーゼ阻害活性を有する物質を化粧料や医薬品に配合して用いられてきている。しかし、これらの不十分な美白効果、皮膚に対する安全性の問題によってその使用が制限されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】韓国公開特許第１０-２０１３-００２５７６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一側面において、本発明の目的は、皮膚内のメラニン合成を調節する新規な皮膚美白物質判別マーカーを提供することである。
【０００６】
他の一側面において、本発明の目的は、前記皮膚美白物質判別マーカーの発現又は活性抑制物質を有効成分として含む皮膚美白用組成物を提供することである。
【０００７】
他の一側面において、本発明の目的は、前記皮膚美白物質判別マーカーを用いて皮膚美白物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【０００８】
他の一側面において、本発明の目的は、前記皮膚美白物質判別マーカーを用いた色素関連の皮膚状態診断用組成物又はキットを提供することである。
【０００９】
他の一側面において、本発明の目的は、前記皮膚美白物質判別マーカーを用いた色素関連の皮膚状態診断用基礎情報の提供方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一側面は、ＴＮＦＲＳＦ  １４（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １４）の発現又は活性抑制物質を有効成分として含む皮膚美白用組成物を提供する。
【００１１】
本発明の一側面は、皮膚美白物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）を試験物質で処理する段階；及び
（ｂ）前記試験物質がメラニン細胞においてＴＮＦＲＳＦ  １４（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １４）の発現を抑制するか否かを確認する段階；
を含む皮膚美白物質スクリーニング方法を提供する。
【００１２】
本発明の一側面は、ＴＮＦＲＳＦ  １４のｍＲＮＡ又はＴＮＦＲＳＦ  １４タンパク質検出試薬を含む色素関連の皮膚状態診断用組成物を提供する。
【００１３】
本発明の一側面は、ＴＮＦＲＳＦ  １４のｍＲＮＡ又はＴＮＦＲＳＦ  １４ タンパク質検出試薬を含む色素関連の皮膚状態診断用キットを提供する。
【００１４】
本発明の一側面は、試験対象から分離された皮膚細胞においてＴＮＦＲＳＦ  １４のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を確認する段階を含む色素関連の皮膚状態診断用基礎情報の提供方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の一側面に係る新規な皮膚美白物質判別マーカーとしてのＴＮＦＲＳＦ  １４は、皮膚内でのメラニンの合成を低減させることができる。よって、前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質を有効成分として含む組成物を皮膚美白に有効に用いることができる。また、本発明の一側面によれば、皮膚美白物質スクリーニング方法は、皮膚を試験物質で処理し、ＴＮＦＲＳＦ  １４遺伝子の相対的発現抑制度合を確認することで、簡便且つ効率的に皮膚美白物質を判別することができる。本発明の一側面に係る色素関連の皮膚状態診断用組成物又はキットと色素関連の皮膚状態診断用基礎情報の提供方法は、皮膚に含まれているＴＮＦＲＳＦ  １４遺伝子の検出によって色素関連の皮膚状態を迅速且つ簡単に診断したり、このための基礎情報を提供したりすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＴＮＦＲＳＦ  １４遺伝子の発現抑制によるメラニン細胞におけるメラニン相対量を比べた図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本明細書において「皮膚」とは、生物の外部を覆っている器官を意味するものであって、表皮、真皮及び皮下脂肪層から構成されており、顔又はからだ全体の外部を覆う組織だけでなく、頭皮と毛髪を含む最広義の概念である。
【００１９】
本発明の一実施例は、ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質を、皮膚美白を必要とする対象に投与する段階を含む皮膚美白方法を提供することができる。
【００２０】
また他の一実施例は、ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質を有効成分として含む皮膚美白用組成物を提供することができる。
【００２１】
また他の一実施例は、皮膚美白のための組成物の製造に用いるためのＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質の用途を提供することができる。
【００２２】
さらにまた他の一実施例は、皮膚美白に用いるためのＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質を提供することができる。
【００２３】
本発明の一実施例において、前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質は、ＴＮＦＲＳＦ  １４  ｍＲＮＡの翻訳を抑制する物質であってよく、より具体的には、ＴＮＦＲＳＦ  １４  ｍＲＮＡの少なくとも一部に結合するオリゴヌクレオチドを含んでいてよい。
【００２４】
前記ＴＮＦＲＳＦ  １４とメラニン合成との関係は未だ知られていないが、本発明の発明者らは、研究を通じて前記ＴＮＦＲＳＦ  １４が皮膚メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）においてメラニンの合成を調節することができることを見出した。より具体的に、皮膚メラニン細胞において前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性を抑制又は低減させると、メラニンの生成量が低減することを確認した。
【００２５】
本発明の一実施例として、前記オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡのいずれか一つ以上であってよい。前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）現象を誘導するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡのいずれか一つ以上であってよい。本発明の一実施例は、前記ＴＮＦＲＳＦ  １４  ｍＲＮＡの干渉を誘導するＲＮＡｉ現象を用いてＴＮＦＲＳＦ  １４遺伝子のｍＲＮＡ発現を抑制することができる。
【００２６】
ｍｉＲＮＡは、細胞内に存在する小さいＲＮＡ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）の一種であってタンパク質を合成しないＤＮＡに由来し、ヘアピン型転写体（ｈａｉｒｐｉｎ−ｓｈａｐｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）から生成される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲの相補的配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に結合して該ｍＲＮＡの翻訳抑制又は不安定化を誘導し、究極的にその標的ｍＲＮＡのタンパク質合成を抑制するリプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）の役割をするようになる。一つのｍｉＲＮＡは、複数個のｍＲＮＡをターゲットとすることができ、ｍＲＮＡもまた、複数個のｍｉＲＮＡによって調節され得ると知られている。ＲＮＡｉ現象を誘導する他のＲＮＡとして、１９〜２７ｍｅｒ前後の短いＲＮＡであるｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）があり、また、短いヘアピン（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ）構造を有するｓｈＲＮＡがある。
【００２７】
本発明の一実施例として、前記オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、具体的に、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡのいずれか一つであってよく、配列番号１で表される塩基配列及び前記配列番号１にハイブリダイズ可能な塩基配列を含んでいてよい。
５’−ＧＵＧＵＧＧＵＧＵＵＵＡＧＵＧＧＡＵＡ−３’（配列番号１）
【００２８】
一実施例として、前記オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、具体的に、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡのいずれか一つであってよく、配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列を含み、前記配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列はハイブリダイズされていてよい。
Ｓｅｎｓｅ：５’−ＧＵＧＵＧＧＵＧＵＵＵＡＧＵＧＧＡＵＡ−３’（配列番号１）
Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’−ＵＡＵＣＣＡＣＵＡＡＡＣＡＣＣＡＣＡＣ−３’（配列番号２）
【００２９】
一実施例として、前記オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、具体的に、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのいずれか一つであってよく、配列番号３で表される塩基配列及び前記配列番号３でハイブリダイズ可能な塩基配列を含んでいてよい。
５’−ＣＡＧＧＵＵＡＵＣＧＵＧＵＧＡＡＧＧＡ−３’（配列番号３）
【００３０】
一実施例として、前記オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、具体的に、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡのいずれか一つであってよく、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列を含み、前記配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列はハイブリダイズされていてよい。
Ｓｅｎｓｅ：５’−ＣＡＧＧＵＵＡＵＣＧＵＧＵＧＡＡＧＧＡ−３’（配列番号３）
Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’−ＵＣＣＵＵＣＡＣＡＣＧＡＵＡＡＣＣＵＧ−３’（配列番号４）
【００３１】
本発明の一実施例に係る前記オリゴヌクレオチドは、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）に捕集又はベクターに挿入された形態で含まれていてよい。
【００３２】
一実施例として、前記オリゴヌクレオチドは、濃度が１〜２００ｎＭであってよい。より具体的に、前記オリゴヌクレオチドの濃度は５〜５０ｎＭであってよい。
【００３３】
前記オリゴヌクレオチドは、濃度が１ｎＭ以上、２ｎＭ以上、３ｎＭ以上、５ｎＭ以上、７ｎＭ以上、９ｎＭ以上、１１ｎＭ以上、１５ｎＭ以上、１６ｎＭ以上、１７ｎＭ以上、１８ｎＭ以上、１９ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、２１ｎＭ以上、２２ｎＭ以上、２３ｎＭ以上、２４ｎＭ以上、２５ｎＭ以上又は５０ｎＭ以上であってよい。
【００３４】
また、前記オリゴヌクレオチドは、濃度が２００ｎＭ以下、１９０ｎＭ以下、１８０ｎＭ以下、１７０ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１３０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２９ｎＭ以下、２８ｎＭ以下、２７ｎＭ以下、２６ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、２４ｎＭ以下、２３ｎＭ以下、２２ｎＭ以下、２１ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１９ｎＭ以下、１８ｎＭ以下、１７ｎＭ以下、１６ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、１４ｎＭ以下、１３ｎＭ以下、１２ｎＭ以下、１１ｎＭ以下又は１０ｎＭ以下であってよい。
【００３５】
前記オリゴヌクレオチドの濃度が前記範囲内であるよき、ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現抑制効果に優れ、且つ皮膚美白用途に適合する。
【００３６】
一実施例として、前記ＴＮＦＲＳＦ  １４（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １４）のｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＭ＿００３８２０.３であり、より具体的に、下記の配列番号５の塩基配列で表されていてよい。（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｎｕｃｃｏｒｅ/ＮＭ＿００３８２０.３?ｒｅｐｏｒｔ＝ＧｅｎＢａｎｋ）
【００３７】
【化１】
2019529462.tif 000003
【００３８】
本発明の一実施例に係る前記組成物は、前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質を組成物の総質量に対して、０．００００１〜３０質量％の範囲で含んでいてよい。
【００３９】
また、本発明の一実施例に係る前記組成物は、皮膚外用剤組成物であってよく、より具体的に、化粧品組成物又は薬学組成物を含んでいてよい。
【００４０】
一実施例として、前記化粧品組成物は、局所適用に適合したあらゆる剤形で提供されていてよい。例えば、溶液、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、油相に水相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、固体、ゲル、粉末、ペースト、泡沫（ｆｏａｍ）又はエアロゾル組成物の剤形で提供されていてよい。このような剤形の組成物は、当該分野の通常的な方法に従い製造されていてよい。
【００４１】
一実施例として、前記化粧品組成物は、前記した物質の他、主効果を損なわない範囲内で、好ましくは、主効果に相乗効果を与え得る他の成分を含有していてよい。本発明に係る化粧品組成物は、ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖及びスフィンゴ脂質からなる群より選ばれた物質を含んでいてよい。また、前記化粧品組成物は、一実施例として、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、有機及び無機顔料、香料、冷感剤、又は制汗剤を含んでいてよい。前記成分の配合量は、本発明の目的及び効果を損なわない範囲内で当業者が容易に選択可能であり、その配合量は、組成物の総質量を基準に０．０１〜５質量％、具体的に、０．０１〜３質量％の範囲であってよい。
【００４２】
また、一実施例として、前記薬学組成物は、局所適用に適合したあらゆる剤形で提供されていてよい。例えば、経口、経皮（ｔｒａｎｄｅｒｍａｌｌｙ）、静脈、筋肉、皮下注射によって投与されていてよい。一実施例として、前記薬学組成物は、注射剤、皮膚外用溶液剤、懸濁剤、乳液剤、ゲル、パッチ又は噴霧剤であってよいが、これらに制限されるものではない。前記剤形は、当該分野の通常的な方法に従い容易に製造されていてよく、界面活性剤、賦形剤、水和剤、乳化促進剤、懸濁剤、浸透圧調節のための塩又は緩衝剤、着色剤、香辛料、安定化剤、防腐剤、保存剤、又はその他常用する補助剤を適当に用いていてよい。
【００４３】
本発明の一実施例に係る薬学組成物の有効成分は、対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその深刻度、投与経路又は処方者の判断によって異なり得る。このような因子に基づく適用量の決定は当業者の水準内にあり、その１日の適用量は、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０００ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には、５０ｍｇ／ｋｇ／日〜５００ｍｇ／ｋｇ／日であってよいが、これに制限されることではない。
【００４４】
本発明の他の一実施例は、前記ＴＮＦＲＳＦ  １４を用いて皮膚美白物質をスクリーニングする方法を提供することができる。
【００４５】
一実施例として、前記方法は、（ａ）メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）を試験物質で処理する段階；及び（ｂ）前記試験物質がメラニン細胞においてＴＮＦＲＳＦ  １４の発現を抑制するか否かを確認する段階を含んでいてよい。このとき、前記段階（ｂ）のＴＮＦＲＳＦ  １４発現抑制の可否は、ＴＮＦＲＳＦ  １４  ｍＲＮＡの翻訳抑制の可否であってよい。
【００４６】
一実施例として、前記段階（ｂ）は、メラニン細胞を試験物質で処理する前と後のＴＮＦＲＳＦ  １４の相対的発現抑制度合を確認する段階を含んでいてよい。又は、一実施例として、前記段階（ｂ）は、試験物質で処理したメラニン細胞と試験物質で処理していないメラニン細胞の相対的発現抑制度合を確認する段階を含んでいてよい。
【００４７】
また、一実施例は、前記段階（ｂ）の確認結果、前記試験物質がＴＮＦＲＳＦ  １４の発現を抑制させたときに皮膚美白物質と判定する段階を更に含んでいてよい。
【００４８】
本明細書において、「相対的発現抑制度合」は、試験物質で処理する前のメラニン細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現度合に対する、試験物質で処理した後のメラニン細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現度合を比べたときの発現が抑制された程度のことを意味していてよい。又は、「相対的発現抑制度合」は、試験物質で処理したメラニン細胞における ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現度合を試験物質で処理していないメラニン細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現程度と比べたときの、発現が抑制された程度のことを意味してもよい。前記発現度合は、発現量及び発現質（ｑｕａｌｉｔｙ）を含んでいてよい。また、発現度合は、例えば、タンパク質の発現度合を含んでいてよい。より具体的に、前記発現度合は、メラニン細胞におけるメラニンの合成度合を含んでいてよい。
【００４９】
本発明の一実施例として、前記皮膚美白物質と判定する段階は、「相対的発現抑制度合」が２倍以上であるとき、皮膚美白物質と判定することを含んでいてよい。すなわち、試験物質で処理する前のメラニン細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現度合に対する、試験物質で処理した後のメラニン細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現度合を比べたときの発現が約１．１〜２倍以上抑制されたとき、皮膚美白物質と判定していてよい。又は、試験物質で処理したメラニン細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現度合を試験物質で処理していないメラニン細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現度合と比べたときの発現が約１．１〜２倍以上抑制されたとき、皮膚美白物質と判定していてよい。
【００５０】
例えば、前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の相対的発現抑制度合が、試験物質での処理後が試験物質での処理前に比べ、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、又は２倍以上であってよいが、これに制限されることではない。前記発現度合は、統計的有意性を確保した状態で測定された結果である。統計的有意性という概念は、生物学的統計分析法によって有意的な差を示す場合であって、定量的な場合にｐ  ｖａｌｕｅが０．０５未満の差を示す場合を含む。
【００５１】
一実施例に係る前記段階（ａ）において、前記試験物質は、細胞のリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）又はベクター（ｖｅｃｔｏｒ）にトランスフェクションさせることができ、細胞はメラニン細胞、すなわちメラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）であってよい。前記トランスフェクションは、微細注入法、リン酸カルシウム共沈法、電気穿孔法又はリポソーム利用法などを用いて実施していてよいが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
また、一実施例として、前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現度合は、公知の技術、例えば、逆転社重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット又はイムノブロット（ｉｍｍｕｎｅ  ｂｌｏｔ）を用いて確認していてよく、これらに限定されるものではない。
【００５３】
また、本発明の一実施例は、色素関連の皮膚状態度合を診断することができるバイオマーカーを提供することができる。また、本発明の一実施例は、これを用いた色素関連の皮膚状態診断用組成物又は色素関連の皮膚状態診断用キットを提供することができる。本発明の他の一実施例は、これを用いた色素関連の皮膚状態診断用基礎情報の提供方法又は色素関連の皮膚状態診断方法を提供することができる。
【００５４】
具体的に、本発明の一実施例は、前記ＴＮＦＲＳＦ  １４のｍＲＮＡ又はＴＮＦＲＳＦ  １４タンパク質検出試薬を含む色素関連の皮膚状態診断用組成物を提供することができる。
【００５５】
また他の本発明の一実施例は、色素関連の皮膚状態診断のための組成物の製造に用いるためのＴＮＦＲＳＦ  １４のｍＲＮＡ又はＴＮＦＲＳＦ  １４タンパク質検出試薬の用途を提供することができる。
【００５６】
また他の本発明の一実施例は、色素関連の皮膚状態診断に用いるためのＴＮＦＲＳＦ  １４のｍＲＮＡ又はＴＮＦＲＳＦ  １４タンパク質検出試薬を提供することができる。
【００５７】
また、また他の本発明の一実施例は、試験対象から分離された皮膚細胞においてＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量を確認する段階を含む色素関連の皮膚状態診断用基礎情報の提供方法又は色素関連の皮膚状態診断方法を提供することができる。このとき、一実施例として、前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量は、ＴＮＦＲＳＦ  １４のｍＲＮＡ又はＴＮＦＲＳＦ  １４タンパク質の発現量であってよく、前記試験対象から分離された皮膚細胞及び正常対照群皮膚細胞は、メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）であってよい。
【００５８】
一実施例として、色素関連の皮膚状態診断用基礎情報の提供方法又は色素関連の皮膚状態診断方法は、前記試験対象から分離された皮膚細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量を正常対照群皮膚細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量と比べる段階を更に含んでいてよい。また、一実施例として、前記方法は、前記試験対象から分離された皮膚細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量が正常対照群皮膚細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量よりも高いとき、色素関連の皮膚状態に異常があるとの情報を提供し、又は診断する段階を更に含んでいてよい。例えば、前記試験対象から分離された皮膚細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量が正常対照群皮膚細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量よりも約１．１〜２倍以上高いとき、色素関連の皮膚状態に異常があると判断していてよい。より具体的に、例えば、前記試験対象から分離された皮膚細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量が正常対照群皮膚細胞におけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現量に比べ、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、又は２倍以上であるとき、色素関連の皮膚状態に異常があると判断してもよい。前記発現量は、統計的有意性を確保した状態で測定された結果である。統計的有意性という概念は、生物学的統計分析法によって有意的な差示す場合であって、定量的な場合にｐ  ｖａｌｕｅが０．０５未満の差を示す場合を含む。
【００５９】
また他の本発明の一実施例は、前記ＴＮＦＲＳＦ  １４のｍＲＮＡ又はＴＮＦＲＳＦ  １４タンパク質検出試薬を含む色素関連の皮膚状態診断用キットを提供することができ、前記キットは、上述した色素関連の皮膚状態診断用基礎情報の提供方法又は色素関連の皮膚状態診断方法が記載している指示書を更に含んでいてよい。
【００６０】
また、一実施例として、前記色素関連の皮膚状態診断用組成物又は色素関連の皮膚状態診断用キットに含まれるＴＮＦＲＳＦ  １４  ｍＲＮＡ検出試薬は、ＴＮＦＲＳＦ  １４に特異的に結合するプライマー及びプローブの一つ以上を含んでいてよい。一実施例として、前記ＴＮＦＲＳＦ  １４タンパク質検出試薬は、ＴＮＦＲＳＦ  １４に特異的に結合する抗体及びプローブの一つ以上を含んでいてよい。
【００６１】
以下、実施例を通じて、本発明の構成及び効果をより具体的に説明する。なお、下記の実施例は本発明に関する理解を助けるための目的から例示したものに過ぎず、本発明の範疇及び範囲がそれらによって制限されるものではない。
【００６２】
［実験例１］
ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現抑制による色素形成の低減を確認するために、下記の実験を実施した。
【００６３】
中間程度に色素のある組織から分離したヒト初代メラノサイト（ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社から購入、ｈｔｔｐｓ：//ｗｗｗ.ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ.ｃｏｍ/ｏｒｄｅｒ/ｃａｔａｌｏｇ/ｐｒｏｄｕｃｔ/Ｃ１０２５Ｃ?ＩＣＩＤ＝ｓｅａｒｃｈ−ｐｒｏｄｕｃｔ）を準備した。
【００６４】
前記メラノサイトにおけるＴＮＦＲＳＦ  １４の発現を低減させるために、ＴＮＦＲＳＦ  １４  ｍＲＮＡ配列に特異的な、下記の二種のＴＮＦＲＳＦ  １４  ｓｉＲＮＡを導入した。
- 実施例１：ｓｉ−ＴＮＦＲＳＦ  １４  #１
Ｓｅｎｓｅ：５’−ＧＵＧＵＧＧＵＧＵＵＵＡＧＵＧＧＡＵＡ−３’（配列番号１）
Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’−ＵＡＵＣＣＡＣＵＡＡＡＣＡＣＣＡＣＡＣ−３’（配列番号２）
- 実施例２：ｓｉ−ＴＮＦＲＳＦ  １４  #２
Ｓｅｎｓｅ：５’−ＣＡＧＧＵＵＡＵＣＧＵＧＵＧＡＡＧＧＡ−３’（配列番号３）
Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’−ＵＣＣＵＵＣＡＣＡＣＧＡＵＡＡＣＣＵＧ−３’（配列番号４）
【００６５】
具体的に、メラニン細胞株である前記ヒト初代メラノサイト上に前記実施例１のＴＮＦＲＳＦ  １４  ｓｉＲＮＡを濃度２０ｎＭになるようにリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を用いてトランスフェクションして細胞中に移動させた。前記リポソームは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅｒ  ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｈｔｔｐｓ：//ｗｗｗ.ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ.ｃｏｍ/ｏｒｄｅｒ/ｃａｔａｌｏｇ/ｐｒｏｄｕｃｔ/１３７７８１５０）を用いた。前記実施例２のＴＮＦＲＳＦ  １４  ｓｉＲＮＡも前記実施例１と同じ方法にて濃度２０ｎＭになるようにリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を用いてトランスフェクションして細胞中に移動させた。
【００６６】
陰性対照群として、ヒトのどの遺伝子も減少させていない、すなわち細胞増殖及び細胞活性に及ぼす影響が最小水準であるものと機能的に立証されたｓｉＲＮＡであるＳｉｌｅｎｃｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｎｏ．１  ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｈｔｔｐｓ：//ｗｗｗ.ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ.ｃｏｍ/ｏｒｄｅｒ/ｃａｔａｌｏｇ/ｐｒｏｄｕｃｔ/４３９０８４３?ＩＣＩＤ＝ｓｅａｒｃｈ−ｐｒｏｄｕｃｔ）を用いた。前記陰性対照群のｓｉＲＮＡも、前記実施例１と同じ方法にて濃度２０ｎＭになるようにリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を用いてトランスフェクションして細胞中に移動させた。
【００６７】
前記各トランスフェクションさせた実施例１及び２、陰性対照群の細胞を３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで約７日間培養した。
【００６８】
前記各細胞をＰＢＳ緩衝液５ｍｌを用いて２回洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）した後、ＰＢＳ緩衝液１ｍｌを入れ、スクレーパー（ｓｃｒｉｐｐｅｒ）を用いて細胞をすべてかき集めた後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を施して細胞ペレット（ｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔ）を作り、該細胞ペレットの色を観察して色素形成度合を比べた。また、前記細胞ペレットを２００μｌ体積の１Ｎ  ＮａＯＨに溶かした後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定してメラニンの量を測定した。
【００６９】
その結果、図１に示すように、ＴＮＦＲＳＦ  １４  ｓｉＲＮＡを用いてＴＮＦＲＳＦ  １４の発現を抑制させた実施例１及び２の場合、メラノサイトに含まれたメラニンの量が、陰性対照群に比べ、約１．５倍以上顕著に低減したことを確認することができる。これは、皮膚内ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制すると、皮膚美白効果を奏し得ることを意味する。
【００７０】
以下、本発明の一実施例に係る組成物の剤形例について説明するが、他の種々の剤形への応用も可能であり、これらは本発明を限定するためのものではなく、単に具体的に説明するためのものである。
【００７１】
［剤形例１］栄養化粧水
下記の表１に記載の組成に従い、通常の方法にて栄養化粧水を製造することができる。
【００７２】
【表１】
2019529462.tif 000004
【００７３】
［剤形例２］栄養ローション
下記の表２に記載の組成に従い、通常の方法にて栄養ローションを製造することができる。
【００７４】
【表２】
2019529462.tif 000005
【００７５】
［剤形例３］栄養クリーム
下記の表３に記載の組成に従い、通常の方法にて栄養クリームを製造することができる。
【００７６】
【表３】
2019529462.tif 000006
【００７７】
［剤形例４］注射剤
下記の表４に記載の組成に従い、通常の方法にて注射剤を製造することができる。
【００７８】
【表４】
2019529462.tif 000007
【００７９】
［剤形例５］軟膏
下記の表５に記載の組成に従い、通常の方法にて軟膏を製造することができる。
【００８０】
【表５】
2019529462.tif 000008
【図１】
2019529462.tif 000009
【配列表】
2019529462000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月23日(2019.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦＲＳＦ  １４（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １４）の発現又は活性抑制物質を有効成分として含む、皮膚美白用組成物。
【請求項２】
前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡのいずれか一つ以上のオリゴヌクレオチドである、
請求項1に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項３】
前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質は、配列番号１で表される塩基配列及び前記配列番号１で表される塩基配列にハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである、
請求項１又は２に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項４】
前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質は、配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列を含み、
前記配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列は、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドである、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項５】
前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質は、配列番号３で表される塩基配列及び前記配列番号３で表される塩基配列にハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドである、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項６】
前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質は、配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列を含み、
前記配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列は、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドである、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項７】
前記ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質は、リポソームに捕集された形態又はベクターに挿入された形態で含まれる、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項８】
前記組成物は皮膚化粧料組成物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項９】
前記組成物は薬学的組成物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、ＴＮＦＲＳＦ  １４の発現又は活性抑制物質を組成物の総質量を基準に、０．００００１〜３０質量％の範囲で含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【国際調査報告】
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