(57)【要約】  本発明は、標的タンパク質上のペプチド相互作用部位を同定する方法を提供し、標的タンパク質は、哺乳動物細胞の表現型を、哺乳動物でコードされたペプチド（ＳＥＰ）、例えば短鎖翻訳領域（ｓＯＲＦ）でコードされたペプチドを使用して調節する。本発明は、更に、薬物発見において使用するための、新しい治療標的及びタンパク質相互作用部位の識別のための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞の表現型を調節する標的タンパク質を同定する方法であって、前記方法は、前記表現型を示すことが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された哺乳動物細胞の集団を、ＳＥＰのライブラリーに暴露すること、前記細胞集団中の前記表現型中の前記曝露後の変更を同定すること、表現型の変化を受けた前記細胞を選択して細胞の前記表現型を変更するＳＥＰを同定すること、前記ＳＥＰを提供して前記ＳＥＰに結合する前記細胞タンパク質を同定することを含んでなり、前記細胞タンパク質が、哺乳動物細胞の表現型を調節する標的タンパク質である、前記方法。
【請求項２】
ＳＥＰのライブラリーが、ヒトＳＥＰを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＥＰのライブラリーが、ｓＯＲＦのペプチド産物を含む、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
ＳＥＰが、６−１３０個のアミノ酸のペプチド又は前記ペプチドをコードする核酸配列である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＳＥＰが、６ないし１００個のアミノ酸のペプチド又は前記ペプチドをコードする核酸配列である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細胞タンパク質及びＳＥＰが、前記細胞タンパク質に結合してＳＥＰ結合を破壊するリガンドを同定するアッセイにおいて使用される、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
標的タンパク質に結合して前記ＳＥＰの結合を置換又は遮断する化合物を同定する方法であって、ここにおいて、該化合物は哺乳動物の表現型を調節する、
次の工程を含んでなる前記方法：
ｉ．前記表現型を示すことが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された哺乳動物細胞の集団を、ＳＥＰのライブラリーに暴露し；
ｉｉ．前記曝露後に前記表現型中の変更を示す集団中の細胞を同定し；
ｉｉｉ．細胞の前記表現型を変更するＳＥＰを同定し；
ｉｖ．前記ＳＥＰに結合する細胞タンパク質を同定し、前記細胞タンパク質は哺乳動物細胞の前記表現型を調節する標的タンパク質であり；
ｖ．前記標的タンパク質に結合し、そして前記ＳＥＰの結合を置換又は遮断する化合物を同定すること。
【請求項８】
哺乳動物細胞の表現型が、疾病関連経路に伴うものである、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記疾病関連経路が、活性化された細胞シグナル伝達経路であるか；及び／又は、分化、転写活性、タンパク質発現、感染に対する耐性、透過性及び増殖からなるリストから選択されるものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法であって：（ｉ）ＳＥＰの前記ライブラリーが、複数の別個の、そしてアドレス可能なＳＥＰを含んでなるか；又は（ｉｉ）ＳＥＰの前記ライブラリーが、ＳＥＰをコードする複数の別個の又はアドレス可能な核酸から発現される、方法。
【請求項１１】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法であって：（ｉ）ＳＥＰの前記ライブラリーが、プールされた複数のＳＥＰを含んでなるか；又は（ｉｉ）ＳＥＰの前記ライブラリーが、ＳＥＰをコードするプールされた複数の核酸から発現される、方法。
【請求項１２】
対照細胞と比較して疾病細胞中で差次的に発現されたｓＯＲＦを同定する方法であって、変更された表現型を示すことが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された哺乳動物細胞の集団を、前記差次的に発現されたｓＯＲＦのライブラリーに暴露すること；前記曝露後に前記表現型中で変化を示す集団中の細胞を同定すること；細胞の前記表現型を変更するＳＥＰを同定すること；前記標的タンパク質に結合して前記ＳＥＰの結合と競合し又は結合を遮断する試験化合物を同定すること；前記同定された化合物を提供すること；による方法。
【請求項１３】
前記疾病細胞が、癌細胞、自己反応性Ｔ細胞、炎症に罹った軟骨細胞及びインスリン耐性細胞から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）複数の別個の、そしてアドレス可能なＳＥＰ；又は（ｉｉ）ＳＥＰをコードする複数の別個の又はアドレス可能な核酸を含んでなる、ＳＥＰのライブラリー。
【請求項１５】
本明細書中に記載されたとおりのＳＥＰのライブラリー。
【請求項１６】
請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法において同定されたＳＥＰの、前記ＳＥＰと相互作用する化合物を同定するためのスクリーニング法における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物発見において使用するための新しい治療標的及び新規な薬物の開発に繋がるような（druggable）タンパク質相互作用部位の識別のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新しい治療標的の識別は、薬物発見の重要な出発点である。薬物発見の努力は、伝統的に、古典的な薬物の開発に繋がるような標的、例えばキナーゼ、Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）及びイオンチャンネルを同定することに焦点が当てられてきた。然しながら、このような化学的に手軽な標的は、治療的介入のための最も生物学的に関連する標的には必ずしもならない。薬物タンパク質：タンパク質相互作用（protein:protein interactions  ＰＰＩｓ）は、これらが、癌細胞及びヒトの疾病において潜在的に使用可能な界面の大きな一組によって使用される、欠陥のあるシグナル伝達経路に関係する標的の主要な型であるために、特に興味あるものである。残念なことに、薬物ＰＰＩ及び他の“薬物の開発に繋がらない（undruggable）”標的に対する系統的試みは技術的制限によって制約され、それは大部分、現時点のハイスループットＤＮＡ及びＲＮＡに基づくゲノム技術で、新しい薬物の開発に繋がる空間をプロテオームレベルで同定し得ることにおける制約のせいである。
【０００３】
先入観のない‘表現型’アッセイを使用する疾病の生物学に関連する候補薬物標的を同定することができる現時点のゲノム科学に基づく技術は、典型的には遺伝子ノックアウト（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）を使用して、又はＲＮＡｉを使用するトランスクリプトームレベルで行われている。これらの方法は、これらが、タンパク質レベルではなく、遺伝子レベルでスクリーニングするために、どの標的が、疾病の進行及び疾病における治療的介入において重要なノードを表すことができるかに対する重要な情報を得るが、しかし重大な制約を受ける：それらは、タンパク質レベルではなく、遺伝子レベルでスクリーニングを行うために、如何にこれらの標的に薬物を与えるか特定することができず、又はこれらが、この方法の本質的な部分としての薬物の開発に繋がる候補であるかを決定できない。これは、このような遺伝子的スクリーニングが、これらを阻害するのではなく、標的タンパク質を除去するためである。薬物の開発に繋がる可能性に対するこのような重大な更なる情報を得るためには、新しい高処理量のプロテオームレベルのスクリーニング技術を使用する必要がある；遺伝子機能（約３０，０００個の遺伝子及びそのスプライス変種）と比較して、タンパク質機能（＞３００，０００個の独特なタンパク質転写物及び数百万個の独特なＰＰＩ）のスクリーニングというより高度の複雑さを取り扱うことができるものが、必要である。
【０００４】
最近、直接的にヒトのプロテオーム中における新規な薬物標的部位の系統的識別が、発現型アッセイ（例えば、ＷＯ２０１３／１１６９０３中に記載されるような）において高処理量でスクリーニングすることができる、ＤＮＡにコード化されたタンパク質断片発現ライブラリーの導入を伴って、あるレベルの扱いやすさ及び注目を得ており；しばしば‘タンパク質干渉’（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｉ）と言い換えられる。このようなタンパク質断片ライブラリーは、典型的には多様な細菌ゲノム由来であり、より大きいタンパク質の進化的構成要素を形成する小さな自己折り畳み（self-folding）サブドメインから構成される。哺乳動物細胞中の細胞内発現のためにライブラリーに組込まれる場合、これらは、標的タンパク質へのドッキング及びヒトのプロテオーム中の新規な薬物の開発に繋がるような候補部位を探索するための３次元型の高度に多様な収集物を表す。決定的には、これらのタンパク質断片は、標的タンパク質中の別個の空間的部位を記述するために十分に小さく、そして従って、その形状に適合するようにその後に設計される小分子薬物と共に再捕獲することができる。更に、タンパク質断片ライブラリーは、現時点の小分子ライブラリーより多い更なる形状を記述しているために、これは、新規な確認された標的に対する将来の小分子薬物の合理的設計を伝えるための更に頑強な方法を提供する。
【０００５】
細菌由来のタンパク質断片ライブラリーが、タンパク質干渉スクリーニングにおいて有効であり、そして細菌のゲノムが、殆どコード配列からなるために、発現ライブラリーへの断片化及びクローン化によって高度に効率よく／直接的に産生されることが示されている。然しながら、これらは、哺乳動物又はヒトのプロテオーム自体からの断片の使用と比較して、哺乳動物（例えばヒト）タンパク質と機能的に相互作用することができるタンパク質断片の大きい画分を保有することにおいて力不足であり得る。
【０００６】
然しながら、直接的に哺乳動物（例えばヒト）ゲノムからタンパク質断片のライブラリーを作成することは、高等な生命体が、非常に大きい数のコード配列を有し、そして従って、一般的にその断片を発現型スクリーニングのための発現ライブラリーに組込むためにかなり手動の特別なクローニングを必要とするという事実によって複雑である。これは、高等生物体のＤＮＡが、殆ど非コード配列を（ヒトＤＮＡの＞９５％は、非コード領域であると推定される）、そしてかなり大きい絶対数のコード配列を含有するためである。従って、これらは、その断片を発現型スクリーニングのための発現ライブラリーに組込むための独特な、そして別個の方法を必要とする。
【０００７】
今日まで記述されたこれらの細菌由来のタンパク質断片ライブラリー（例えば、ＷＯ２０１３／１１６９０３中に）は、ゲノムを機械的に剪断し、そして断片をベクターに無作為に挿入することによって得られている。これは、細菌中のオリジナルの遺伝子でフレーム内（１：６の確率）又はフレーム外（５：６の確率）のいずれかであるランダムなサイズの多くの断片に導く。同じ戦略は、そのＤＮＡの殆どが非コードであるために、真核生物に対してはうまくいかないであろう。更に、これらのような細菌由来のタンパク質断片ライブラリーは“目録”を持たない、即ち配列がランダムにクローンされているので、所定のライブラリー内に何が含有されているかを正確に言及することは、非常に大規模な配列決定による以外は可能ではない。
【０００８】
これらの実用上の制約は、ヒト細胞における標的の同定及び検証スクリーニングにおいて、直接的に関連するタンパク質折り畳み構造の多様性という潜在的に豊富な代替鉱脈のマイニングにおける顕著な不活発性を導く。
【０００９】
他のスクリーニング法が、例えばＷＯ０１／８６２９７中に記載されている。ここでは、ランダムな短い（４０-mer及び２０-mer）ペプチドファージディスプレイライブラリーが産生され、そして事前に選択された標的又は既知の事前に確認されたコンセンサスモチーフに結合するペプチドを見出すために使用される。これは、既知／認識された既存の疾病の標的に依存し、そして新しい標的の識別を容易にするものではない。
【００１０】
従って、哺乳動物のタンパク質及び／又はタンパク質断片のライブラリーをスクリーニングする方法を提供することが、本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際特許出願公開ＷＯ２０１３／１１６９０３；
【特許文献２】ＷＯ０１／８６２９７。
【発明の概要】
【００１２】
一つの側面において、本発明は、哺乳動物細胞の表現型を調節する標的タンパク質を特定（同定）する方法を提供し、前記方法は、ＳＥＰ（“短鎖発現ペプチド”；short expressed peptides）のライブラリーに、前記表現型を表示することが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された哺乳動物細胞の集団を曝露し；前記細胞集団において前記曝露後のの前記表現型の変化を特定し、表現型の変化を受ける前記細胞の選択、及び細胞の表現型を変更するＳＥＰを特定し、前記ＳＥＰを提供し、そしてＳＥＰに結合する細胞タンパク質を特定することを含んでなり、前記細胞タンパク質は、哺乳動物細胞の表現型を調節する標的タンパク質である。
【００１３】
“ＳＥＰ”は、ＤＮＡコード配列のライブラリー由来の“短鎖発現ペプチド”である。ＳＥＰは、短鎖ペプチド（＜１５０個のアミノ酸）である。好ましい態様において、ＳＥＰは、６ないし１３０個のアミノ酸、好ましくは６ないし１００個のアミノ酸のペプチドである。このようなペプチドは、２０、３０、４０、４５、４６、５０、６０個又はそれより多いアミノ酸までであることができる。例えば、このようなペプチドは、６ないし４５個のアミノ酸、又は６ないし６０個、６ないし７０個、６ないし８０個、６ないし９０個、或いは６０ないし１００個のアミノ酸であることができる。一つの態様において、ＳＥＰは、４０個又はそれより多いアミノ酸、好ましくは４０ないし６０個のアミノ酸のペプチドである。ＳＥＰは、ヌクレオチド配列の断片によってコードされる。本明細書中で使用される場合、用語“ＳＥＰ”は、ペプチド又はアミノ酸配列、或いは前記ペプチド／アミノ酸配列をコードする核酸配列を指すことができる。一つの態様において、ＳＥＰは、哺乳動物、適当にはヒトである。これらは、ヒトゲノム中の潜在的に新規な機能的な薬物開発に繋がる標的を明確にするための、生物学的に機能性のペプチドの未開発のリザバーである。
【００１４】
本発明のいずれもの側面の一つの態様において、“ＳＥＰのライブラリー”は、単一の種、生命体からの、或いは個々の又は混合した起源からの核酸分子によってコードされたペプチドを含むことができる。好都合には、“ＳＥＰのライブラリー”は、単一の生命体、好ましくは哺乳動物、例えばヒトからのものである。“ＳＥＰのライブラリー”は、ペプチドのライブラリー又は前記ペプチドをコードする核酸分子のライブラリーを指すことができる。本発明のいずれもの側面の一つの態様において、ＳＥＰのライブラリーは、哺乳動物、例えばヒト由来のペプチド、核酸配列で構成される。
【００１５】
好都合には、本発明によるＳＥＰのライブラリーは、プロテオームのコンセンサスデータベースから発現されたタンパク質のみを使用するためにコンピューターで設計される。更に、一つの態様において、ライブラリー中のＳＥＰは、一定のサイズのものである（これは、ライブラリーの産生／クローニング及び次世代配列決定（ＮＧＳ）分析／スクリーニングにおいて有益である）。従って、適当には、ライブラリーは、６ないし１００個のアミノ酸（又は同一物をコードする核酸分子）、好ましくは４０又は４５ないし１００個のアミノ酸のＳＥＰを含んでなる。更に、本発明によるヒトのライブラリーは、インフレームであるように設計され（フレームシフトによる中途での停止はない）、そしてペプチドは、１００％の時間ヒトのタンパク質に適合するように発現される。更に、本発明によるヒトのライブラリーは、断片がランダムなクローニング法ではなく、大量の並行合成によって産生されるために、ヒトのプロテオーム中の全てのタンパク質中に間隔をあけて置かれ、そして完全な目録中に存在する。
【００１６】
もう一つの態様において、ライブラリーは、更に、微生物からのペプチド及び／又は真核生物種の小さいゲノムからのペプチドを更に含むことができる。一つの態様において、ライブラリーは、非細菌配列、例えば哺乳動物由来の配列と組合せた、細菌由来のライブラリー（例えば、ＷＯ２０１３／１１６９０３及びその中で言及された引用文献を参照されたい）によってコードされたペプチドを含むことができる。
【００１７】
恐らく制限された断片サイズ内で生物学的に関係する、ＳＥＰライブラリー及びこれらの配列、特にヒトの配列の優先順位を産生するために、ヒトゲノム中に天然に短鎖発現した機能的配列、又はドメイン構造の現時点の生物情報学的予測に基づいて大きいタンパク質から合理的に選択された断片のいずれかを探求し、そして活用することができる。
【００１８】
前者の方法に関して、小さい（典型的には、＜１００個のアミノ酸）、発現した、そして進化的に保存されたタンパク質コード配列の新しい群が、ゲノム、例えばヒトゲノム中で最近特定された。これらの配列は、‘短鎖翻訳領域’（ｓＯＲＦ）と呼ばれ、そして一定の細菌からヒトへのその進化的保存は、機能的ペプチド（又はマイクロペプチド）をコードする可能性がある。ｓＯＲＦの識別は、例えば、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．によってＣｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ５０，Ｉｓｓｕｅ  ２，ｐａｇｅｓ  １３４−１４１，２０１５中で総括されている。
【００１９】
一つの態様において、ＳＥＰは、天然の単鎖翻訳領域（ｓＯＲＦ）配列によってコードされたペプチドを含む。このようなｓＯＲＦ配列は、いずれもの生命体由来であることができる。一つの態様において、ｓＯＲＦは、哺乳動物の核酸、適当にはヒトの核酸からのものである。
【００２０】
ｓＯＲＦの推定的機能を記載することは、なお未熟な段階であるが、しかし幾つかは、生物学的に関連する活性を保有することが今や示されている；他の大きいタンパク質の内在特性（ＰＰＩ標的中の新規な薬物の開発に繋がるような部位を特定することを試みることにおける潜在的に興味ある特徴）を変更することによって、しばしば大きい制御性の結果を達成する。例えば、‘Ｐｏｌｉｓｈｅｄ  Ｒｉｃｅ’と呼ばれるショウジョウバエ中で特定されたｓＯＲＦは、‘Ｓｈａｖｅｎ  Ｂａｂｙ’と呼ばれる遥かに大きい抑圧的転写因子の活性を実質的に調節することが示されている（Ｃｈｕ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，５０（２），１３４−１４１）。‘Ｐｏｌｉｓｈｅｄ  Ｒｉｃｅ’は、通常非選択的なタンパク質分解（プロテアソーム）機構を補充し、そして導くことによって作用して、Ｓｈａｖｅｎ  Ｂａｂｙを、抑圧因子ではなく、転写活性化因子である切断型に、今や特異的に開裂する。‘薬物の開発に繋がらないような’ＰＰＩ標的の普通の、そして重要な群中に誘発されるこのような主要な変化は、多くの他のｓＯＲＦによって系統的に宿される場合、ＰＰＩの新規な小分子阻害剤を設計するための豊富な供給源であることができる。
【００２１】
ゲノム注釈アルゴリズムの改良によって、多くの更なるｓＯＲＦが存在することが今や示されている。これらの従来の不明瞭性は、これらがしばしば大きい慣用的な遺伝子構造内に‘パッセンジャー’として発現するか、又は独立遺伝子として出現する場合、非慣用的プロモーター領域及び／又は転写出発コドンを保有するという事実にあった。現在、約２０００個の予測されるｓＯＲＦの候補が記載され、これらの多くは発現することは示されているが、しかし殆どは機能がいまだ記述されていない。
【００２２】
従って、一つの態様において、ＳＥＰは、ｓＯＲＦのペプチド産物、例えばヒトのゲノム中に見出される天然のｓＯＲＦを含む。適当には、ＳＥＰのライブラリーは、発現したｓＯＲＦのライブラリーを含んでなる。このようなライブラリーは、２０００個又はそれより多い異なった仮想のｓＯＲＦを含んでなることができる。本発明の方法は、大きなライブラリー、例えば高処理量様式でスクリーニングされたものを可能にする生細胞アッセイ系を提供する。
【００２３】
もう一つの側面又は態様において、ＳＥＰライブラリーは、ドメイン構造の現時点の生物情報学的予測、即ち、ヒト及び／又は哺乳動物のペプチド、又はマイクロペプチドの特注でクローン化され、事前定義されたサブドメインに基づき（例えばヒトサブドメインライブラリー）、より大きいタンパク質から合理的に選択された断片を含むことができる。適当には、選択された断片は、自己保持潜在性を有するものであり、そして最大の形状の多様性のために選択される。このような特注のクローニングは、例えばＤＮＡ合成又は特定の機能、例えばシグナル伝達受容体、転写因子等を持つ分子をコードする配列の特定の配列の特徴を認識するプライマーを使用するＰＣＲ法によって達成することができる。
【００２４】
もう一つの側面又は態様において、ＳＥＰライブラリーは、ランダムにクローン化されたｃＤＮＡライブラリー、例えばショットガンクローニングによってコードされたペプチドによって構成することができる。ランダムクローニングの方法は、本明細書中に記載されている。
【００２５】
もう一つの側面又は態様において、ＳＥＰライブラリーは、利用可能な発現タンパク質データベースに基づく、コンピューター設計の単鎖配列由来の断片によってコードされたペプチドで構成することができる。このような設計の方法は、本明細書中に記載されている。
【００２６】
本発明は、更に、ｓＯＲＦライブラリー、好ましくは全“ｓＯＲＦｏｍｅ”ライブラリー（即ち全ての天然に発現するｓＯＲＦを表す）の産生、及びｓＯＲＦの得られたペプチドライブラリー、或いはｓＯＲＦの、疾病関連経路を調節する一つ又はそれより多いＳＥＰを特定するための他のＳＥＰ（例えば“ＳＥＰｏｍｅライブラリー”）と組合せたライブラリーをスクリーニングすることに関する。これらの方法は、新規な薬物の開発に繋がるような標的タンパク質を、そして更にタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）又はこれらの経路の調節のための薬物標的として使用するためのアロステリック部位を特定し、そして特徴付けすることにおいて有用であることができる。
【００２７】
本明細書中に記載される本発明によって提供される利益は、生細胞の‘発現型’アッセイ様式で、その機能に対してスクリーニングされる“ｓＯＲＦｏｍｅ”及び／又は“ＳＥＰｏｍｅライブラリー”及び／又は大きいスケールのＳＥＰライブラリーの完全な複雑さを許容することである。この方法は、非常に多くの非的中ペプチド配列からの、適当には疾病との明確な関連を確立することを可能にする少数の真に的中したペプチドの強力な正の選択及び単離を可能にする。
【００２８】
ＳＥＰ及びその薬物の開発に繋がるような結合部位を含むその標的タンパク質の識別は、疾病モデルとして表されるように、実際的に、効率よく、そして信頼できる様式で、直接疾病に関連することができ、そして疾病の治療のために適した薬物候補の開発において明確な利益を提供する。
【００２９】
特に、本発明の方法は、疾病の進行において役割を演じる手がかりとなる新規な薬物の開発に繋がるような部位の識別を提供し、これは、他の方法では特定不可能であることができる。
【００３０】
ＳＥＰライブラリーをスクリーニングする利益は、これらが、小分子薬物と同様に、標的機能を直接的に、そして急性的に阻害する（又は活性化する）ことによって作用することである（標的の長期の発現を排除するのではなく）。癌の研究の場合にしばしばある、経路抑制因子のスクリーニングにおいて、この方法の手がかりは、‘負’の細胞表現型シグナル（例えば、シグナル伝達経路の活動停止又はタンパク質間相互作用の破壊）を、不活性なペプチド配列を宿す細胞の大きいプールから選択、又は単離することができる、正のシグナルに転換することである。
【００３１】
好都合には、一つの態様において、本発明による方法は、類似のコンセンサス配列を含んでなる既知の標的又は分子との相互作用を特定するためにスクリーニングせず、しかし表現型に対してスクリーニングする。これは、本発明の方法が、多くの数百、数千の遺伝子産物を、潜在的標的として試験及び／又は特定することを可能にする。本発明は、ランダムライブラリー及びモチーフの構築を使用せずに、天然に存在する結合を検出するための方法を可能にする。
【００３２】
本発明は、主として、ＳＥＰを産生及び特定するためのヒトＳＥＰ（ｓＯＲＦを含む）ライブラリー及びヒトサブドメインライブラリーの使用、及びそれによる新規な薬物の開発に繋がるような標的に焦点があてられているが、本発明の新規な側面は、非ヒト源の低級生命体からのｃＤＮＡ由来のＳＥＰライブラリー、例えばショットガンクローニングされたｃＤＭＡ由来ライブラリーに由来することができる。例えば、配列は、ヒトの疾病を起こすことが知られた細菌、ウイルス及び寄生虫のプロテオームから得ることができる。これらは、特定の細胞過程を破壊することにより疾病を起こすことが知られたこれらの生命体に関しては興味あることである。特に興味あることは、更に腸内細菌叢を構成する細菌であり、これらの多くは、粘膜免疫の過程に関係することが知られている。このような生命体からのｃＤＮＡ由来のＳＥＰは、免疫系の細胞に免疫調節効果を発揮することが期待され、そして従って自己免疫性疾患の治療において用途を見出すことができる。一般的に、細胞過程がｃＤＮＡ由来のＳＥＰライブラリーに対して特定された場合、このような過程を測定するアッセイを使用して表現型効果を特定することが可能である。従って、特注のｃＤＮＡ由来のＳＥＰライブラリーを、特注の知識主導の表現型アッセイとカップリングすることが可能である。
【００３３】
一つの態様において、細胞タンパク質及びＳＥＰが、前記細胞タンパク質に結合し、そしてＳＥＰ結合を破壊する、例えば前記ＳＥＰの前記細胞タンパク質への結合を破壊するリガンドを特定するアッセイにおいて使用される、本発明のいずれかの側面による方法が提供される。
【００３４】
好都合には、本発明による方法において、スクリーニングに先立ち候補標的を特定する必要性はない。
もう一つの側面において、標的タンパク質に結合し、そして前記ＳＥＰの結合を置換又は遮断する化合物を特定する方法が提供され、ここにおいて、化合物は哺乳動物の細胞の表現型を調節し、前記方法は、以下の工程：
ｉ．前記表現型を示すことが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された哺乳動物細胞の集団を、ＳＥＰのライブラリーに曝露し；
ｉｉ．前記曝露後、前記表現型の変化を示す集団中の細胞を特定し；
ｉｉｉ．前記細胞の表現型を変更するＳＥＰを特定し；
ｉｖ．前記ＳＥＰに結合する、前記細胞タンパク質が前記哺乳動物細胞の表現型を調節する標的タンパク質である細胞タンパク質を特定し；
ｖ．前記標的タンパク質に結合する化合物を特定し、そして前記ＳＥＰの結合を置換又は遮断すること；
を含んでなる。
【００３５】
一つの態様において、哺乳動物細胞の表現型は、疾病関連経路に伴うものである。適した疾病関連経路は、活性化された細胞のシグナル伝達経路；及び／又は：分化、転写活性、タンパク質発現、感染に対する耐性、透過性及び増殖からなるリストから選択されるものを含む。
【００３６】
一つの態様において、前記ＳＥＰのライブラリーは、（ｉ）複数の別個の、そしてアドレス可能なＳＥＰ；又は（ｉｉ）前記ＳＥＰのライブラリーは、ＳＥＰをコードする複数の別個の又はアドレス可能な核酸から発現されることを含んでなる。
【００３７】
一つの態様において、（ｉ）前記ＳＥＰのライブラリーは、プールされた複数のＳＥＰを含んでなるか；又は（ｉｉ）前記ＳＥＰのライブラリーは、ＳＥＰをコードするプールされた複数の核酸から発現される。
【００３８】
もう一つの側面において、本明細書中に記載されるようなＳＥＰのライブラリーが提供される。一つの態様において、本明細書中の実施例の部において記載されるようなＳＥＰのライブラリーが提供される。
【００３９】
一つの態様において、前記疾病の細胞は、癌細胞、自己反応性Ｔ細胞、炎症に罹った軟骨細胞及びインスリン耐性細胞から選択される。
もう一つの態様において、前記疾病の細胞は、原発性／患者由来細胞及び／又は人工多能性幹細胞から選択される。
【００４０】
もう一つの側面において、（ｉ）複数の別個の、そしてアドレス可能なＳＥＰ；或いは（ｉｉ）ＳＥＰをコードする複数の別個の又はアドレス可能な核酸を含んでなるＳＥＰのライブラリーが提供される。一つの態様において、ＳＥＰのライブラリーは、複数のｓＯＲＦを含んでなる。
【００４１】
もう一つの側面において、前記ＳＥＰと相互作用する化合物を特定するためのスクリーニング法における、本発明による方法において特定されたＳＥＰの使用が提供される。
もう一つの側面において、本発明の態様のいずれかの側面による方法において特定された医薬として使用するためのＳＥＰが提供される。もう一つの側面において、それを必要とする患者の、治療的に有効な量の本発明による方法において特定されたＳＥＰを前記患者に投与することを含んでなる、疾病の治療の方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、ＮＦカッパーＢのスクリーニングから得られた、ＮＦｋＢプロモーターの下流のホタルルシフェラーゼからの蛍光（即ちＮＦｋＢ転写性レポーターによって駆動されたホタルルシフェラーゼ活性）及び対照のＣＭＶ−プロモーターの下流のウミシイタケルシフェラーゼからの蛍光のプロットを示す。ルシフェラーゼ活性は、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔｅｒプレートリーダーで読取った。
【図２】図２は、ある範囲のＳＥＰの存在中のＮＦカッパーＢのスクリーニングから得られたホタルルシフェラーゼからの相対的蛍光を示す。
【図３】図３は、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔｅｒプレートリーダーで読取られたノッチのスクリーニングから得られた、ホタルルシフェラーゼ（ノッチ反応性プロモーターの下流）及びウミシイタケルシフェラーゼ（対照のＣＭＶ−プロモーターの下流）活性からの蛍光のプロットを示す。
【図４】図４は、ある範囲のＳＥＰの存在中のノッチのスクリーニングから得られたホタルルシフェラーゼからの相対的蛍光を示す。
【図５】図５は、６−ＴＧ毒性を克服することが可能なＳＥＰに対するスクリーニングを示す。ＳＥＰのライブラリーを保持する細胞を５００ｎＭの６−ＴＧで６日間処理した。６−ＴＧ処理（ｎ＝３）及びＤＭＳＯ対照（ｎ＝３）間の富化を示す。
【図６】図６は、ＹＡＰシグナル伝達を下方調節することが可能なＳＥＰに対するスクリーニングを示す。ＳＥＰのライブラリーを保持する細胞及びＧＦＰレポーターに関連したＹＡＰ反応性要素を含有する構築物を、低いＹＡＰ／ＧＦＰ及び基本のＹＡＰ／ＧＦＰ集団中で探索した。基線ＹＡＰシグナルに対する低いＹＡＰ  ＳＥＰの富化の倍数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
好ましくは、ＳＥＰはｃＤＮＡ配列由来である。一つ又はそれより多い遺伝子導入又は形質移入された細胞からのＳＥＰをコードする核酸は、増幅、クローン化及び／又は配列決定することができる。ＳＥＰをコードする核酸は、発現して、ＳＥＰを産生することができる。
【００４４】
幾つかの態様において、細胞又は細胞の集団は、ＳＥＰをコードする核酸又はＳＥＰの多様な集団をコードする核酸のライブラリーで、それぞれ遺伝子導入又は形質移入することができる。
【００４５】
ＳＥＰを産生するために使用される核酸は、一つ又はそれより多い異なった生命体、好ましくはヒト又は哺乳動物種から得られたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むことができる。一つの態様において、ＳＥＰは、原核生物を含むことができる異なった生命体の混合物から産生される。一つの態様において、ＳＥＰは、ヒト及び／又は他の哺乳動物源の概略１００個のコドンの短鎖翻訳領域（ｓＯＲＦ）によってコードされる。ＳＥＰライブラリーは、いずれもの慣用的技術を使用して構成することができる。
【００４６】
もう一つの態様において、ＳＥＰは、一つ又はそれより多い哺乳動物の核酸からのヌクレオチド配列の短い断片を発現ベクターにクローニングすることによって、構築することができる。一つの態様において、ＳＥＰは、一つ又はそれより多い哺乳動物の核酸からのヌクレオチド配列の短い断片を、発現ベクターにランダムにクローニングすることによって構築することができる。断片産生のために適した方法は、例えば、機械的剪断（例えば、超音波処理又は核酸を微細なゲージの針を通して通過させることによる）、ヌクレアーゼ（例えばＤＮアーゼ１）による消化、一つ又はそれより多い制限酵素、好ましくは４塩基制限酵素部位を認識する高頻度切断酵素による消化、及びＤＮＡ試料の照射（例えば、ガンマ線照射又は紫外線照射）による処理を含む。一つの態様において、断片は、生物情報学に基づく断片の設計、それに続くＤＮＡ合成により産生することができる。幾つかの態様において、核酸の断片は、一つ、二つ又はそれより多い哺乳動物のゲノム又はトランスクリプトームから、例えばランダム又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生することができる。ランダム又は縮重オリゴヌクレオチドは、制限酵素認識配列を含んで、増幅された核酸の適当な核酸ベクターへのクローニングを可能にすることができる。
【００４７】
ＳＥＰライブラリーは：
（ｉ）哺乳動物の組織からの核酸からの選択された断片を産生し；
（ｉｉ）核酸断片を、断片を発現するために適合させた発現ベクターに挿入し；そして
（ｉｉｉ）核酸断片によってコードされたペプチドを発現すること；
を含んでなる方法によって産生することができる。
【００４８】
一つの態様において、選択された核酸は、本明細書中に記載されるように合成することができる。
核酸断片は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、或いは一つ又はそれより多いゲノム又はトランスクリプトーム、好ましくはゲノム、そして好ましくはヒトゲノムから増幅された核酸から産生することができる。適当には、核酸断片は、ヒトゲノム又はトランスクリプトームに由来する。
【００４９】
核酸断片は、異なった生命体からの核酸（即ちゲノム又はトランスクリプトーム）の混合物から産生することができる。核酸は、例えば、混合物中の他のゲノムの複雑さ及びサイズと比較した、ゲノム（又はトランスクリプトーム）の複雑さ及びサイズに比例した量で混合物中に存在することができる。これは、概略等しいゲノム断片の提示をもたらす。
【００５０】
核酸断片は、一つ又は二つ或いはそれより多い哺乳動物のゲノム又はトランスクリプトームから、一つ又はそれより多い当業者にとって既知の、各種の方法によって産生することができる。適した方法は、先に記載したようなランダムクローニングのための方法を含む。
【００５１】
ＳＥＰをコードする核酸は、特異的な配列標識によって隣接されること（例えばコード配列に対して５’及び３’）ができる。配列標識は、例えば、オリゴヌクレオチドプライマーのための結合部位として使用することができる既知の配列の、１０ないし５０個のヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、標識の配列は、哺乳動物のゲノム中に見出すことができない。これは、必要な場合、ＳＥＰのコード配列が哺乳動物の細胞から、例えばＰＣＲによって、都合よく増幅されることを可能にする。バーコード及びドロップアウトスクリーンを含む、高処理量スクリーニングのための適した自動化された方法は、例えばＳｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１，１２：Ｒ１０４中に記載されている。
【００５２】
従って、ＳＥＰのライブラリーは、（ｉ）複数の別個の、そしてアドレス可能なＳＥＰ；或いは（ｉｉ）ＳＥＰをコードする複数の別個の又はアドレス可能な核酸から発現された前記ＳＥＰのライブラリーを含んでなる。ＳＥＰのライブラリーは、哺乳動物の細胞の集団に、前記哺乳動物細胞の集団中のＳＥＰの多様な集団をコードする核酸のライブラリーを発現することによって導入することができる。
【００５３】
一つの態様において、ＳＥＰライブラリーは、１×１０６又は１×１０５個或いはそれより多い異なったアミノ酸配列を含んでなることができるか、或いはＳＥＰをコードする１×１０６又は１×１０５個或いはそれより多い異なった核酸配列を含んでなる複数の核酸から発現される。適当には、異なったアミノ酸又は核酸配列の数は、１×１０６又は１×１０５個ないし１×１０１０個の異なった配列、例えば１×１０８ないし１×１０９個の異なった配列である。
【００５４】
更なるライブラリーは、既知のより小さいサブドメインを提示する大きいヒトのタンパク質からの特注のクローン化されたＳＥＰを包含することができる。これらは、天然のＳＥＰと類似のサイズであるものであるが、しかし慣用的に特徴付けられたｃＤＮＡ配列に由来する。
【００５５】
好ましい態様において、哺乳動物細胞の集団は、ＳＥＰの多様な集団をコードする核酸のライブラリーで遺伝子導入又は形質移入される。ライブラリーは、ライブラリーの全てのメンバーの、同時の遺伝子導入又は形質移入及びスクリーニングを可能にするためにプールすることができる。
【００５６】
例えば細胞の表現型を変更するもののような、興味あるＳＥＰが特定された時点で、ＳＥＰは、本明細書中に記載されるように更なる分析のために単離することができる。哺乳動物細胞からの核酸の単離ための技術は、当技術において公知である。例えば、全ＤＮＡを細胞から単離することができ、そして次いでＳＥＰをコードする核酸を単離された全ＤＮＡから増幅することができる。幾つかの好ましい態様において、核酸は、ＳＥＰコード配列に隣接する配列特異的標識にハイブリダイズするプライマーを使用して増幅することができる。
【００５７】
ＳＥＰをコードする核酸又はその増幅された産物は、ベクターにクローン化するか及び／又は配列決定される。
幾つかの態様において、特定された核酸は、例えば再クローニングによって、更に操作することができる。幾つかの態様において、核酸は、異種ペプチドをコードするもう一つの核酸に隣接する発現ベクターに、ベクターが異種ペプチドに融合したＳＥＰを含んでなる融合タンパク質を発現するようにクローンすることができる。適した異種ペプチドは、エピトープ標識、親和性標識、及び細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。
【００５８】
ＳＥＰの産生のために各種の方法が使用可能である。核酸をコードすることは、ＳＥＰを産生するために発現することができる（例えば、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｅｄ  ＲＳ  Ｔｕａｎ（Ｍａｒ  １９９７）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃを参照されたい）。別の方法として、ＳＥＰは、化学合成によって全体的に又は部分的に産生することができる。ＳＥＰは、液体又は固相合成法を使用して；溶液中で；又は固相、液相及び溶液化学のいずれもの組合せによって、例えば最初にそれぞれのペプチド部分を完結することによって、そして次いで所望する場合又は適宜に、存在する保護基の除去後、それぞれのカルボン酸又はスルホン酸或いはその反応性の誘導体の反応による残基Ｘの導入によって合成することができる。ペプチドの化学合成は、当技術において公知である（Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９８４）；Ｍ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｊ．Ｈ．Ｊｏｎｅｓ，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  １９９１；ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＢＩ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，（Ｅｄ．）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２，Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９  ａｎｄ  ｉｎ  Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ，（Ｅｄ．）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２８９）．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ  １９９７）。
【００５９】
次いで、表現型のスクリーニングが、配列、例えばＳＥＰ配列に対する内因性の機能的役割を系統的に列挙するために使用される。ＳＥＰライブラリーの一部としての天然のｓＯＲＦ及び／又はＳＥＰライブラリーをスクリーニングすることに加えて、疾病細胞、例えば癌細胞が、正常な非疾病の細胞よりも異なったレパートリーのｓＯＲＦ又はＳＥＰを発現することができることが更に予測される。差次的に発現されたｓＯＲＦ又はＳＥＰは、丁度マイクロＲＮＡ発現プロファイルが、正常細胞に比べて癌／疾病において変更されるように、疾病細胞、例えば癌細胞中に観察される調節不全のシグナル伝達経路の一部を形成することができる。これらは、更にいずれもの疾病状態のための表現型アッセイ中でスクリーニングするためにｓＯＲＦ又はＳＥＰの富化されたプールを表す。
【００６０】
もう一つの側面において、対照細胞と比較した疾病細胞中で差次的に発現したｓＯＲＦ又はＳＥＰを、変更された表現型を示すことが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された哺乳動物細胞の集団を、前記差次的に発現されたｓＯＲＦ又はＳＥＰのライブラリーに暴露することによって特定し；前記曝露後、前記表現型の変更を示す集団中の細胞を特定し；前記細胞の表現型を変更するｓＯＲＦ又はＳＥＰを特定し；前記標的タンパク質に結合する試験化合物を特定し、そして前記ｓＯＲＦ又はＳＥＰの結合に競合し、又はそれを遮断する、前記特定された試験化合物を提供する、疾病細胞中で差次的に発現したｓＯＲＦ又はＳＥＰを特定する方法が提供される。
【００６１】
ＳＥＰを使用する表現型スクリーニングを行うための方法は：１）全タンパク質レベル、タンパク質局在化又は生細胞中の遺伝子転写のレベルにおける、最終的経路活性のいずれかを登録する異種レポーター（例えばＧＦＰ又はルシフェラーゼ）を使用する経路特異的読取り；２）内因性タンパク質レベル、或いは、抗体又は他の親和性試薬を使用するその局在化、或いは固定された‘非生細胞’のｑＰＣＲ又はＲＮＡ配列決定を使用して経路特異的転写結果を登録すること；３）治療的関連性、例えば分化、老化及び細胞死の特異的‘行き先’の表現型の読取りを登録することが可能な、生細胞中の高い含有率、又は‘全体論’に基づく読取り、の範囲であることができ、これらの全ては、調和され、そして複数の細胞経路の複雑な相互作用によって特異的に調節することができる。
【００６２】
‘全体論的’表現型アッセイを包含する本発明の具体的側面において、‘合成致死’スクリーニングは特に重要なものである。合成致死スクリーニングは、標的、例えば癌標的、及び候補治療剤を探索する方法であり、これは、予想できない脆弱性の第２の点を開発することによって正常細胞に比べて腫瘍細胞が選択的に影響することができ、これは、これらが、無制限な細胞増殖を支持するために、これらのシグナル伝達経路を大量に配線し直すために腫瘍細胞において起こることができる。従ってこのようなスクリーニングは、生細胞中で、そして先入観のない様式で、細胞中の遺伝子（ＣＲＩＳＰＲを使用して）、ｍＲＮＡ（ＲＮＡｉを使用して）、又はタンパク質、或いはタンパク質構造（タンパク質ｉを使用して）を抑制又は調節し、そして次いで腫瘍細胞型の；好ましくは正常な細胞型に比べて腫瘍の状況において起こる特異的遺伝子の変更（一つ又は複数）を宿すものの、全体的な増殖又は生存に対する一貫した負の影響が起こったか否かを特定することによって行われなければならない。これらの直接的‘全体論的’細胞生存率の結果に基づくスクリーニングは、腫瘍の遺伝子型依存性反応に対する相関性の情報を得るために、遺伝子的に特徴付けられた腫瘍細胞及び正常な細胞の大きい一団を使用するか、又は更に効率よくは、正常な細胞に比べて癌細胞中に存在する正常な遺伝子型に比べて選択された変異体に対して、同質遺伝子的である特異的に設計された細胞系を使用するかのいずれかで、それぞれ行われる。
【００６３】
従って本発明のもう一つの側面は、疾病の哺乳動物細胞の表現型を特異的に調節する標的タンパク質を特定する方法を提供し、前記方法は、前記表現型を示すことが可能な培養された哺乳動物細胞の、例えばここにおいて前記培養された細胞が疾病モデルを提供する集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＥＰのライブラリーに暴露し；前記曝露後の前記表現型の変更を前記細胞集団中で特定し、表現型の変化を受けた前記細胞の選択、及び細胞の表現型を変更するＳＥＰを特定し、前記ＳＥＰを提供し、そして前記ＳＥＰに結合する細胞タンパク質を特定することを含んでなる。
【００６４】
用語、調節は、阻害、不活化、抑制又は増加した発現及び活性化を含むことができる。試験化合物は、細胞を生体分子と接触させることによって細胞に導入されるか、又は細胞中のＳＥＰをコードする核酸を発現することによる生体分子であることができる。
【００６５】
正常な組織に比べて疾病の組織中に差次的に発現するｓＯＲＦ又はＳＥＰを定義する場合、ゲノムに基づく技術、例えばマイクロアレイ及び非慣用的なｓＯＲＦ又はＳＥＰを点数化する改変されたＲＮＡ配列決定が、薬物の開発に繋がらないような標的及び経路、例えばＫＲＡＳ、及びゲノムデータベース及び文献の報告から選択される多くの他の薬物の開発に繋がらないような疾病遺伝子を調査するために使用される。これらの未処理の、そして疾病特異的ｓＯＲＦ（及び／又はＳＥＰ）ライブラリーを使用する表現型スクリーニングは、活性を調節する候補の経路に対して行われる；これが使用された選択の基準であるならば、経路中で最初にこれらが差次的に発現されたことが示される。これは、例えば、制約されるものではないが、ＡＰＩ、Ｅｌｋ１、ＮＦ−カッパーＢ及びＮＦＡＴを含む各種のＫ−Ｒａｓで活性化されたシグナル伝達経路に対するｓＯＲＦ（又はＳＥＰ）の影響を評価するために構成された、転写性レポーターアッセイを包含することができる。これらの経路を調節する能力を示す的中したｓＯＲＦ（又はＳＥＰ）は、他の経路に対するその効果を分析することによって、そして得られた特異的な的中を正常細胞に比べて疾病の生存能又は機能に差次的に影響するその能力に対して分析することによって経路特異的に評価される。他の表現型スクリーニングの形式において、ｓＯＲＦ（又はＳＥＰ）は、正常な生物学的読取りに対する疾病のこれらの最終的な差に対して、直接スクリーニングされる。
【００６６】
上記の初期の‘表現型スクリーニング’段階において頑強な疾病関連反応を発揮するｓＯＲＦ／ＳＥＰは、次いで、細胞内の物理的結合パートナーが特定される第２の‘標的−ＩＤ’段階に入る。これは、タンパク質間相互作用を検出するために適した方法を使用することによって行われる。例えば、ヒト細胞内のＳＥＰの親和性標的バージョンを発現するか、ＰＰＩを維持することにおいて適合性の標準的な溶解技術を使用して細胞を押し破るか、ＳＥＰ及び内因性タンパク質結合パートナーを親和性クロマトグラフィーによって単離し、そして次いでＳＥＰ結合パートナーを質量分析によって（潜在的に介在性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分離工程を伴って）特定することによる。これらの技術は、ＳＥＰの天然のリガンドである細胞中の分子のＳＥＰ結合パートナー（一つ又は複数）の識別を可能にする。他の類似の生化学的親和性プルダウン技術を使用することができる。特定されたいずれもの結合パートナーは、直交性アッセイ、例えば免疫沈澱法又は哺乳類−２−ハイブリッドアッセイのように確認される。確認されたパートナーは、確立された細胞生物学技術、例えば過剰発現、ＲＮＡｉによるノックダウン、ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子標的化又は前記方法の組合せを使用して、細胞のシグナル伝達経路（例えばＫ−Ｒａｓ経路）において役割を有するとして検証される。検証された役割を持つこれらの結合パートナーは、小分子プローブ発見の第３の、そして最終段階のための真実の標的である。
【００６７】
本発明の更なる側面において、標的タンパク質上のタンパク質相互作用部位を特定する方法が提供され、ここにおいて、標的タンパク質は、哺乳動物細胞の表現型を調節し、前記方法は：
ｉ．前記表現型を示すことが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された哺乳動物細胞の集団を、ＳＥＰのライブラリーに暴露し；
ｉｉ．前記曝露後、前記表現型中の変更を示す集団中の細胞を、非反応性細胞の大量のバルクから特定し、そして選択し；
ｉｉｉ．前記細胞の表現型を変更するＳＥＰを特定し；
ｉｖ．前記ＳＥＰに結合する細胞タンパク質を特定し、前記細胞タンパク質は前記哺乳動物細胞の表現型を調節する標的タンパク質であり；
ｖ．前記標的タンパク質に結合し、そして前記ＳＥＰの結合を置換又は遮断する試験化合物を特定すること；
の工程を含んでなる。
【００６８】
本発明は、更に、疾病関連経路を調節するＳＥＰを特定するための、これらのＳＥＰ（疾病細胞中に存在）の結合パートナーを特定し、これらの結合パートナーを薬物発見のための新規な標的として特定し、そして疾病状態又は疾病の進行を変更するために新規な標的を調節する分子に対してスクリーニングする、ＳＥＰライブラリーの表現型スクリーニングの方法に関する。
【００６９】
本発明の更なる側面において、対照細胞と比較して疾病細胞中に差次的に発現したｓＯＲＦ又はＳＥＰを特定し、そして次いで変更された表現型を示すことが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された哺乳動物細胞の集団を、前記差次的に発現されたｓＯＲＦ又はＳＥＰのライブラリーに曝露し；前記曝露後、前記表現型中の変更を示す集団中の細胞を特定し；前記細胞の表現型を変更するｓＯＲＦ又はＳＥＰを特定し；前記標的タンパク質に結合する試験化合物を特定し、そして前記ｓＯＲＦ又はＳＥＰの結合と競合するか又はそれを遮断し、そして前記特定された試験化合物を得る方法を提供する。
【００７０】
疾病細胞は、好ましくは癌細胞、自己反応性Ｔ細胞、炎症に罹った軟骨細胞及びインスリン耐性細胞から選択される。
一つの方法は、細胞のシグナル伝達経路を調節するＳＥＰの識別及びシグナル変換に関与し、そして細胞のシグナル伝達経路、特に癌細胞中で活性な経路を調節する薬物標的として有用であることができるタンパク質上のＰＰＩ上の表面部位の識別に関する。
【００７１】
細胞のシグナル伝達経路は、細胞表面における細胞外刺激に反応し、そして細胞の表現型の変化に導く細胞内の細胞内シグナルを伝達する細胞中の一連の相互作用因子である。細胞のシグナル伝達経路に沿ったシグナルの伝達は、遺伝子発現を変更する一つ又はそれより多い転写因子の活性化をもたらす。ＳＥＰスクリーニングのための好ましい細胞のシグナル伝達経路は、疾病モデル、例えば癌細胞のような疾病細胞の活性化、上方制御又は誤制御において異常な活性を示す。例えば、経路は、癌細胞において恒常的に活性化される（即ち、永久的にスイッチが入る）か、又は、例えばリウマチ様関節炎の炎症性細胞において、細胞外リガンドによって不適当に活性化される。
【００７２】
機能的細胞のシグナル伝達経路は、例えば適当な細胞外刺激によって、経路にスイッチが入るか又は活性化された場合、インタクトな、そしてシグナルを伝達することが可能な経路である。活性な細胞のシグナル伝達経路は、例えば適当な細胞外刺激によってスイッチが入り、そして活発にシグナルを伝達する経路である。
【００７３】
適した細胞のシグナル伝達経路は、細胞によって受取られたシグナルに反応して転写的事象をもたらすいずれものシグナル伝達経路を含む。
本明細書中に記載されるような調査のための細胞のシグナル伝達経路は、癌細胞、例えばＲａｓ／Ｒａｆ、ヘッジホッグ、Ｆａｓ、Ｗｎｔ、Ａｋｔ、ＥＲＫ、ＴＧＦβ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｍｅｔ、ＰＩ３Ｋ及びノッチシグナル伝達経路中で活性化又は変更することができる細胞のシグナル伝達経路を含むことができる。
【００７４】
ＳＥＰの結合パートナーの識別後、ＳＥＰと相互作用する結合パートナーの結合部位、領域又はドメインを特定することができる。この部位、領域又はドメインは、更に経路を調節する治療剤の開発のための標的部位として有用であることができる。
【００７５】
例えば、一連の欠失構築物に基づく、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ又は標準的な生化学的技術、例えば免疫沈澱法を行うことができる。例えば、ＳＥＰは、標的タンパク質と同時結晶化し、そして構造を解析することができる。
【００７６】
本明細書中に記載される方法による標的タンパク質の識別後、標的タンパク質の相互作用部位を、調査することができる。相互作用部位は、ＳＥＰが標的タンパク質の活性を調節するために結合する部位又は領域である。相互作用部位における結合は活性を調節するために、相互作用部位は、それを通して標的タンパク質が結合パートナーと結合する標的タンパク質の部位又は領域である。例えば、相互作用部位は、標的タンパク質がその結合パートナーと結合する場合、タンパク質間界面の部位であることができる。
【００７７】
細胞の表現型を変更するＳＥＰを特定し、そして所望により融合タンパク質としてＳＥＰを産生した後で、方法は、更に哺乳動物細胞の発現型に対するＳＥＰの影響を確認することを含んでなることができる。例えば、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と共に合成されたＳＥＰは、表現型の偏りを発揮するために細胞上に直接使用することができる。
【００７８】
その部位において結合するＳＥＰによる相互作用部位の遮断は、標的タンパク質の結合パートナーへの結合を妨害することができる。従って、相互作用部位における結合は、標的タンパク質の活性を調節し、そして一つ又はそれより多い表現型の形質又は特徴を変更することができる。
【００７９】
従って、本発明は：１）ヒトの疾病経路の調節におけるその生物学的官能性を決定し；２）これらの表現型を発揮する内因性細胞の標的（一つ又は複数）を単離し；そして３）これらの標的内の新規な薬物の開発に繋がるような空間を明確にするために、高処理量アッセイでスクリーニングされるヒト細胞中の高い複雑性のＳＥＰライブラリー及び／又は‘ＳＥＰｏｍｅ’の完全な複雑性を許容する方法を提供し、これらは、次いで新規な小分子薬物を設計するために活用することができる。
【００８０】
従って、本発明の更なる側面において、特定することができるＳＥＰを結合する結合パートナーが提供され、前記結合パートナーは、疾病関連経路の調節のための候補の標的タンパク質である。
【００８１】
先に記載したように、ライブラリーから特定された試験核酸から発現された阻害性生体分子は、細胞内結合パートナー、例えば生体分子に結合する細胞タンパク質のためのスクリーニングのために使用することができる。例えば、発現された生体分子は、哺乳動物細胞又は細胞抽出物中の細胞内結合パートナーを特定するためのベイトとして使用することができる。ベイト生体分子に結合する細胞タンパク質は、単離することができる。
【００８２】
本明細書中に記載されるように、ＳＥＰの結合特性及び表現型を再現する小分子の発見は、ＳＥＰのその結合パートナーとの結晶化、及び得られた界面の３Ｄ構造を新規な設計を伝えるために使用することによるか、又はＳＥＰ：内因性パートナー複合体を置換することができる化学化合物に対する暴露の用量設定を増加することにおいて、高処理量小分子ライブラリー中でスクリーニングするための、競合アッセイ（例えば、蛍光偏光アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＢｉａＣｏｒｅ又はＡｌｐｈａＬＩＳＡ）の産生によるかのいずれかによって達成することができる。このような小分子は、本来のＳＥＰの表現型を再現するその能力に対して試験され、そしてこれらの小分子の形状及び結合特性の最適化は、典型的には、再びＸ線結晶学的タンパク質構造情報に基づく技術を使用して的中する。
【００８３】
慣用的な技術、例えば置換アッセイを、標的タンパク質に結合するためにＳＥＰと競合する化合物をスクリーニングするために使用することができる。例えば、方法は、ＳＥＰに結合した標的タンパク質を含んでなる複合体を試験化合物と接触させることを含んでなることができる。試験化合物によるＳＥＰの置換は、試験化合物が、ＳＥＰと同じ部位で標的タンパク質と結合することを意味している。標準的な置換アッセイのプラットフォーム、例えばＡｌｐｈａ−ＬＩＳＡＴＭ又は蛍光偏光を使用することができる。
【００８４】
標的タンパク質から試験化合物を置換することができるＳＥＰ及び／又はＳＥＰを置換することができる化合物は、細胞中の標的タンパク質の活性を阻害することも更に予測され、そして治療剤の開発において有用であることができる。
【００８５】
従って、本発明の方法は、試験化合物、例えば先に記載したように特定されたＳＥＰのような標的タンパク質上の同じ相互作用部位に結合する有機小分子、抗体、核酸又はペプチドに対するスクリーニングを更に含んでなることができる。
【００８６】
本発明のもう一つの側面は、ＳＥＰ：ＳＥＰ−パートナーの相互作用を遮断又は変更することが可能な化合物に対するスクリーニングの方法を提供し、ここにおいて、化合物は、疾病関連経路を調節し、これによって化合物及びＳＥＰは、ＳＥＰ−パートナーを発現する哺乳動物細胞の集団に同時導入され、そしてＳＥＰ：ＳＥＰ−パートナー相互作用によって調節される同じ疾病関連経路の調節のために分析される。
【００８７】
本発明の各種の更なる側面及び態様は、本開示の観点から当業者にとって明白となるものである。
本明細書中に記述される全ての文書は、その全てが参考文献として本明細書中に援用される。
【００８８】
“及び／又は”は、本明細書中で使用される場合、他方を伴うか又は伴わない二つの規定された特徴或いは成分のそれぞれの具体的開示と解釈されるべきである。例えば、“Ａ及び／又はＢ”は、丁度、それぞれが個々に本明細書中に記載されているように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの具体的開示と解釈されるべきである。
【００８９】
文脈が他に指示しない限り、上記に提示した特徴の記載及び定義は、本発明のいずれもの特定的な側面又は態様を制約するものではなく、そして記載される全ての側面及び態様に、等しく適用されるものである。
【００９０】
本発明のある種の側面及び態様は、ここに、実施例によって、そして先に記載した図面及び以下に記載される表を参照して例示されるものである。
【実施例】
【００９１】
Ａ）  新規な表現型関連標的を見出すためのｓＯＲＦライブラリー由来ＳＥＰの使用
ヒト細胞中の、ＳＥＰの発現及びＳＥＰの表現型スクリーニングのための予測されるｓＯＲＦのライブラリーを構築するために、慣用的なプロモーター又はゲノム調節構造を必ずしも宿さない＜１５０個アミノ酸のサイズの仮想の翻訳領域に対するゲノム全体にわたる探求を、非ランダム出現の指標としての種間保存の更なる分析を伴って行った。次いで、ヒトのゲノム中に存在するこれらの候補のｓＯＲＦは、ＳＥＰ発現のためにレンチウイルス発現ベクターにクローン化された。２０００個を超える仮想のｓＯＲＦを、ヒトの細胞中のタンパク質−ｉに基づく表現型スクリーニングにおいて使用するための発現ライブラリーに構築した。ｓＯＲＦのライブラリーを、これらの治療的に重要な経路に対するｓＯＲＦ活性を特定するために、ノッチ及びＮＦ−カッパーＢシグナル伝達に対してスクリーニングした。これらのスクリーニングの方法は、以下のとおりである：
１）ＮＦ−カッパーＢのスクリーニング
９６ウェルプレート上のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ＮＦ−カッパーＢ転写因子の活性化に反応性であるＤＮＡ要素の下流に位置するホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するプラスミド構築物、及び ‘ハウスキーピング’ＤＮＡ要素の制御下にあり、ＮＦ−カッパーＢに反応性ではないウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含有するプラスミドで遺伝子導入した。これらのレポーター構築物に加えて、そのサブセットがｓＯＲＦ配列であるペプチドコード配列（タンパク質−ｉ挿入物）を含有する発現プラスミドを、同時遺伝子導入した。遺伝子導入後６時間目に、１ｎｇ／ｍｌの、既知のＮＦ−カッパーＢ経路の活性化剤である組換えＴＮＦ−アルファの添加によって細胞を刺激した。正（４Ｇ９）及び負（ＣＹＬＤ）の対照を含めた。刺激の２４時間後、それぞれのウェルを、市販の試薬系を使用して、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して分析し、そして蛍光をＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔｅｒプレートリーダーで読取った。データを、ＮＦ−カッパーＢ依存性ホタルルシフェラーゼ活性を、ＮＦ−カッパーＢ非依存性のウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化することによって解析した。このスクリーニングから現れるデータを、図１に示す。
【００９２】
図１は、ｓＯＲＦライブラリーの成分の圧倒的多数は、ＮＦ−カッパーＢシグナル伝達にいずれかの影響を示すことに失敗しているが、ＴＮＦ−アルファに対する反応を反映することが可能な幾つかのｓＯＲＦライブラリー成分が存在することを示している。散布図のこの部分に対するこれらのｓＯＲＦマップは、ＮＦ−カッパーＢシグナル伝達の既知の調節物質であるＣＹＬＤによって特徴づけられる。興味あることには、更に幾つかのＮＦ−カッパーＢシグナル伝達の仮想のエンハンサーが存在し、ｓＯＲＦが、経路阻害剤及びエンハンサーの両方の豊富な供給源であることができることを示唆する。
【００９３】
上記のスクリーニングから的中した候補の再分析を図２に示し、これは、５個の真の又は検証された的中を示し、その二つは、ｓＯＲＦである（‘Ｓ’を前置）。
２）ノッチのスクリーニング
９６ウェルプレート上のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ノッチの重要な下流標的であるＣＢＦ１転写因子の活性化に反応性であるＤＮＡ要素の下流に位置する、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するプラスミド構築物、及び ‘ハウスキーピング’ＤＮＡ要素の制御下にあり、ノッチに反応性ではないウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含有するプラスミドで遺伝子導入した。これらのレポーター構築物に加えて、ノッチのシグナル伝達は、ノッチの恒常的に活性な形態、即ち、ノッチ細胞内ドメイン又はＮＩＣＤを発現するプラスミドの同時遺伝子導入によって活性化された。ＮＦ−カッパーＢに関して、ｓＯＲＦを含むペプチドコードベクター（タンパク質−ｉベクター）を、その発現プラスミドの同時遺伝子導入によって発現した。遺伝子導入の２４時間後、それぞれのウェルを市販の試薬系を使用して、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して分析し、そして蛍光をＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔｅｒプレートリーダーで読取った。データを、ノッチ依存性ホタルルシフェラーゼ活性をノッチ非依存性のウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化することによって解析した。このスクリーニングから現れるデータを、図３に示す。
【００９４】
ＮＦ−カッパーＢのスクリーニングに対して観察されたように、図３は、ｓＯＲＦライブラリーの成分の圧倒的多数がノッチシグナル伝達にいずれかの影響を示すことに失敗しているが、一方ノッチ反応を反映することが可能な幾つかのｓＯＲＦライブラリー成分が存在することを示している。これらのｓＯＲＦは、ＭＡＭＬ１（ＭＡＭＬと記述）のドミナントネガティブバージョンによって特徴づけられる散布図の部分に向かう傾向があり、これは、ノッチのシグナル伝達の既知の、そして非常に強力な異所的阻害剤である。
【００９５】
上記のスクリーニングからの的中した候補の再分析は、三つの真の又は検証された的中を示し、その一つはｓＯＲＦである（‘Ｓ’を前置）（図４）。
Ｂ）  新規な表現型関連標的を見出すための特注のｃＤＮＡ由来ＳＥＰの使用
ＮＣＢＩ又はＵｎｉＰｒｏｔから入手可能な発現データベースを使用して、特定のヒトの細胞中に発現する、全てのｃＤＮＡが、そして従ってタンパク質が記載される。プロテオームは、ＳＥＰ様の長さのタンパク質配列に生物情報学的に分解される。この場合、４６個のアミノ酸のＳＥＰが使用された。可能な場合、タンパク質ドメイン、例えばデータベースによって特定されたもの、例えばＰｆａｍ（例えばＦｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１４）Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ  ４２：Ｄ２２２−Ｄ２３０中に記載されている）が、最終ライブラリーが、具体的な注釈を付けられたタンパク質ドメインに対応する発現クローンを含有するように、ｃＤＮＡ由来ＳＥＰの境界を特定するために使用される。遺伝子合成技術を使用して、‘ｃＤＮＡ由来ＳＥＰ’の一組が産生され、そして日常的遺伝子クローニング技術を使用して発現ベクターにクローン化される。ライブラリーは、プールされた又は整列されたライブラリーのいずれかとして、先に記載したアッセイ形式を使用する表現型の変更のためにスクリーニングするために使用される。
【００９６】
１）プールされた６−チオグアニン耐性スクリーニング
化学療法薬物の６−チオグアニンに対する耐性は、表現型を仲介することが可能であるタンパク質の狭いグループを伴う、かなり厳密な選択系であることが以前に示されている（比較のために、Ｗａｎｇ  ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４，３４３（６１６６）：８０−８４を参照されたい）。本出願人等は、この系を、如何にＳＥＰを、このような厳密な条件下でもタンパク質を調節する表現型を特定することにおいて使用することができるかを証明するために使用するために探索した。
【００９７】
ＨＥＫ２９３細胞を、レンチウイルスベクター中に含有されたＳＥＰのプールされたライブラリーで遺伝子導入した。ウイルスを回収し、タイターし（ｔｉｔｅｒ）、そしてＫＢＭ７細胞のバッチをＳＥＰで感染した。ＳＥＰで形質移入された細胞のライブラリーを、その後、９９．９９９％のＫＢＭ７細胞を殺すことが実験的に決定された濃度の６−チオグアニンに曝露した。耐性誘導ＳＥＰの挿入物を保持する生存者をプールから単離し、拡大し、そしてゲノムＤＮＡを回収した。ＳＥＰをＰＣＲを使用して増幅し、そして次世代配列決定にかけた。データの生物情報学的解析後、６−チオグアニジンに対する耐性を仲介し、そして恐らくミスマッチ修復過程で作用する的中ＳＥＰを特定した（図５）。
【００９８】
２）プールされたＨｉｐｐｏシグナル伝達スクリーニング
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の活性を測定するために、本出願人等は、ＧＦＰ発現に関連するＹＡＰ／ＴＥＡＤ結合要素に対する転写レポーターを設計した。このような構築物で形質移入された細胞は、ＹＡＰ癌遺伝子シグナル伝達が活性である場合、強力なＧＦＰ発現を、そしてシグナル伝達が阻害された場合、ＹＡＰの低い発現を示すものである。
【００９９】
１）のように、本発明人等は、レンチウイルスを使用して、細胞のプールをＳＥＰのライブラリーで形質移入した。標的細胞系、ＨＥＫ２９３Ａは、細胞密度に依存する異なったＨｉｐｐｏシグナル伝達を示すことが以前に示されている。本出願人等は、ＹＡＰ活性（及びその後のＧＦＰ発現）を導入するために、細胞を低い密度でプレートに入れ、そしてフローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰの平均的発現より低い細胞の集団、及びＧＦＰの平均的発現を伴う対照集団を単離した。次いで、本出願人等は、１）のように両方の試料を次世代配列決定分析にかけた。対照の一組及び低ＹＡＰの一組中のＳＥＰ配列の存在量を比較し、そしてＳＥＰが低ＹＡＰの組で富化され、そして従って、ＹＡＰ癌細胞のシグナル伝達を減少する可能性があることが特定された（図６）。
【０１００】
３）疾病細胞のスクリーニング
ｃＤＮＡ由来ＳＥＰのライブラリーを、正常及び疾病の組織から生物情報学的発現特性を使用して産生する。例えば、正常組織に比べて癌中に差次的に発現されたｃＤＮＡ由来ＳＥＰを特定する。例えば、Ｋ−Ｒａｓがこの型の癌の主要な発癌性駆動物質であるために、膵臓癌細胞中に差次的に発現されると特定されたｃＤＮＡ由来ＳＥＰのライブラリーを、これがＫ−Ｒａｓ依存性シグナル伝達に影響するか否かを観察するためにスクリーニングする。
【図１】
2019502120.tif 000002
【図２】
2019502120.tif 000003
【図３】
2019502120.tif 000004
【図４】
2019502120.tif 000005
【図５】
2019502120.tif 000006
【図６】
2019502120.tif 000007
【国際調査報告】
2019502120.tif 000008
2019502120.tif 000009
2019502120.tif 000010
2019502120.tif 000011
2019502120.tif 000012