(57)【要約】本発明は、サンプル内の、１つ以上の検体タイプなどの材料の存在を検査するための方法およびシステムに関し、詳細には、改善した単一酵素結合免疫吸着法（ｓＥＬＩＳＡ）検査、そして単一酵素結合分子分析（ＳＥＬＭＡ）の他の変形のためのものである。バックグラウンドおよび偽ポジティブが、少なくとも２つの検出サイクルの存在に起因して減少する。各検出サイクルは、ａ）捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ、ｂ）捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ、ｃ）追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ、を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法であって、サンプルは、複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも１つの検体を捕獲可能であり、
該方法は、少なくとも２つの検出サイクルを含み、各検出サイクルは、
ａ）捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップと、
ｂ）捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップと、
ｃ）追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップと、を含む方法。
【請求項２】
サンプルおよび複数の個別の捕獲部位を有する固相は、少なくとも１つの検体の捕獲前または捕獲中に区画化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
捕獲された検体および標識剤は、少なくとも１つの検体の標識化の前または標識化の間に区画化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
検体は、ステップａ）の前に各検出サイクルにおける標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって、標識化される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
固相上の検体の捕獲前または捕獲中に標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって、捕獲された検体が標識化され、ステップｃ）は、追加の検出サイクルが行われる前に行われ、続いて再標識化ステップが行われ、捕獲された検体は標識剤を添加することによって標識化される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
捕獲され標識化された検体は、区画化され、少なくとも１つの検体を含む液体区画を生成する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
サンプルは、ターゲット検体および非ターゲット化合物を含み、または潜在的に含み、ターゲット検体は、捕獲部位によって捕獲効率Ｃ１で捕獲され、非ターゲット化合物は、捕獲部位によって捕獲効率Ｃ２（Ｃ１≧Ｃ２）で捕獲され、ターゲット検体は、第１標識剤によって標識効率Ｌ１で標識化され、非ターゲット化合物は、第１標識剤によって標識効率Ｌ２（Ｌ１≧Ｌ２）で標識化され、検出サイクル数ＮＣは、下記の式で示す比αが、
【数１】
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１〜１０の間、好ましくは１０〜１００の間、好ましくは１００〜１０００の間、好ましくは１０００〜１００００の間、好ましくは１０００〜１００００の間、好ましくは１００００〜１０００００の間、好ましくは１０００００より大きいように調整され、そして各検出サイクルは、標識化ステップにおいて第１標識剤を適用する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該方法は、偽ポジティブ検出サイクルを含み、標識化ステップにおいて第１標識剤の代わりに第２標識剤が適用され、非ターゲット化合物は、標識効率Ｌ１で第２標識剤によって標識化され、ターゲット検体は、第２標識剤によって標識効率Ｌ２（Ｌ１≧Ｌ２）で標識化される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中に存在する非ターゲット化合物の数は、偽ポジティブ検出サイクルにおいて信号を示す捕獲部位の数から推定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サンプル中に存在するターゲット検体の数は、偽ポジティブ検出サイクルの前の全ての検出サイクルにおいて、信号を繰り返し示す捕獲部位の数から、およびサンプル中に存在する非ターゲット化合物の推定された数から推定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該方法は、偽ポジティブ検出サイクルを含み、該方法は、いずれの標識化ステップを含まない、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
標識剤は検出様式を含み、信号を起動するステップは、検出剤を検出様式に配給することによる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
信号の非活性化ステップは、
ａ）捕獲された検体から標識剤を分離するステップ、
ｂ）標識剤が信号を促進する能力を非活性化させるステップ、または
ｃ）ａ）およびｂ）の組合せ、から選択され、
ここで、信号の非活性化ステップの後、必要に応じてリンスステップが行われる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
サンプルからの少なくとも１つの検体の捕獲は、固相への固定化による、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
サンプルから少なくとも１つの検体の捕獲は、検体に特異的な１つ以上の捕獲プローブを使用することによるものであり、捕獲プローブは固相に付着されている、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、洗浄によって除去される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
捕獲され標識化された検体は、親水性液体を複数の個別の捕獲部位に導入して引き出すことによって区画化されて、捕獲され標識化された検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位は親水性にされており、複数の個別の捕獲部位が疎水性基板上に配置され、そのため親水性液体を引き出す際、複数の液滴が形成され、各液滴が１つの個別の捕獲部位を占有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
各検出サイクルにおいて信号を示す液体区画の位置は、他の検出サイクルにおいて信号を示す液体区画の位置と比較され、その結果、液体区画が信号を示す連続的な検出サイクルの数が計数され、液体区画は、少なくとも２つのカテゴリーに分類され、液体区画の第１カテゴリーは第２カテゴリーよりも多い計数を示す、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
個別の捕獲部位は、円形または球状であり、個々の個別の部位の直径は、１ｍｍ未満、好ましくは１００μｍ未満、好ましくは１０μｍ未満、好ましくは１μｍ未満である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
個別の捕獲部位は、円形または球状であり、個別の部位の直径は、０．５〜５μｍ、０．５〜１０μｍ、０．５〜５０μｍ、０．５〜１００μｍ、１０〜１０００μｍ、５０〜１０００μｍ、１００〜１０００μｍの間である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
固相は、
ａ）固体基板、
ｂ）コロイドビーズ、または、
ｃ）コロイドビーズの集合体、
である、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
液体区画は、気相シール下の複数の液体ナノリットルからアトリットル液滴の形態である、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
デジタル計数は、サンプル中の１つ以上の検体タイプのデジタル計数のためのフローシステム（１０）において実施され、
該フローシステムは、
疎水性基板（１６）の中または上に親水性機構（１４）のパターンを有する支持体（１２）を備え、
疎水性基板（１６）は、少なくとも１つの開口（２０）を含むフロー区画（１８）の中に組み込まれ、
親水性機構（１４）は、それぞれ最大液滴体積を有する複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成され、
フロー区画（１８）は、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を低減する気相シールを支持するように構成される、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
気相シールは、マイクロ液滴の蒸発を低減できる、フローシステム内の蒸気圧を確立する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ｉ）疎水性基板（１６）の中または上にある親水性機構（１４）のパターンを、１つ以上の検体タイプを含むサンプルに接触させるステップを含む、請求項２３〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
（ｉｉ）親水性機構（１４）の上で１つ以上の検体タイプを捕獲するステップを含む、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
（ｉｉｉ）少なくとも１つの捕獲された検体タイプを、検出される検体タイプに特異的な標識剤を用いて標識化するステップを含む、請求項２３〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
捕獲され標識化された検体は、検出剤を、パターンを横断して流し、パターンから引き出して、個々の液滴をナノリットルからアトリットルの液滴の形態に生成するステップ（ｉｖ）によって、区画化されて、少なくとも１つの検体を収容する液体区画を生成する、請求項２３〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
（ｖ）標識剤および検出剤の両方を収容する液滴の数を計数するステップを含む、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を１回以上繰り返すことを含む、請求項２３〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を繰り返す前に、前回ステップに存在する標識剤を不活性化するステップを含む、請求項２３〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
捕獲プローブ（２２）は、下記のプローブグループ、即ち、オリゴヌクレオチド、アプタマー、タンパク質、抗体、ペプチド、またはその合成変異体から選択される、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
検体は、下記の検体グループ、即ち、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質、タンパク質／オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質／脂質複合体、ペプチド、エキソソーム、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ナノ粒子、細胞断片または細胞から選択される、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織から選択される、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織の研究室処理サンプルから選択される、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
１つ以上の捕獲した検体は、捕獲に続いて、捕獲プローブ（２２）と共有結合できる、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
デジタル計数測定は、単一酵素結合分子分析（ＳＥＬＭＡ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）、単一酵素結合免疫吸着法（ｓＥＬＩＳＡ）またはデジタル単一酵素結合免疫吸着法（ｄＥＬＩＳＡ）である、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
サンプルの単一分子デジタル計数分析において偽ポジティブ検出及び／又はバックグラウンドノイズの低減のための、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法で少なくとも１つの検体を捕獲可能である、使用。
【請求項４０】
複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、デジタル計数分析における計数誤差を減少させるために、例えば、偽ポジティブ検出及び／又はバックグラウンドノイズの低減のために、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法で少なくとも１つの検体を捕獲可能である、使用。
【請求項４１】
複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、デジタル計数分析における計数誤差を減少させるために、例えば、偽ポジティブ検出及び／又はバックグラウンドノイズの低減のために、請求項１〜３８のいずれかに定義される少なくとも２つの検出サイクルを行うことによって、少なくとも１つの検体を捕獲可能である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル内の、１つ以上の検体(analyte)タイプなどの材料の存在を検査するための方法およびシステムに関し、詳細には、改善した単一酵素結合免疫吸着法（single enzyme-linked immunosorbent assay:ｓＥＬＩＳＡ）検査、そして単一酵素結合分子分析（single-enzyme linked molecular analysis:ＳＥＬＭＡ）の他の変形のためのものである。本発明はさらに、偽ポジティブ検出及び／又はバックグラウンドノイズの低減など、単一分子デジタル計数分析における改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
単一分子を検出するための多くのアプローチが過去数十年間に科学者によって開発されてきており、単一オリゴヌクレオチド、単一タンパク質および単一ペプチドを含む種々のタイプの分子の高感度測定を可能にしている。単一分子測定は、単一（または少数）の検体分子が区画に閉じ込められ、該区画が単一の検体の存在を検出するための適切な環境を提供するデジタル検出またはデジタル診断検査のために使用される。例えば、単一酵素結合免疫吸着法（ｓＥＬＩＳＡ）の場合、捕獲抗体と酵素結合検出抗体との間に挟まれた検体分子を含む単一免疫複合体を個々の微小区画に入れ、そして最後に蛍光性または発色性酵素を基板に供給し、区画内で検出可能な光信号を生成する。他の例は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）であり、ここでは単一のオリゴヌクレオチド検体が区画内でＰＣＲプライマーおよびＰＣＲ混合物と一緒にカプセル封入され、これにより蛍光標識化アンプリコン(amplicon)の検体テンプレート式指数関数的増幅をもたらす。
【０００３】
最新のデジタル検出の利点にもかかわらず、該分野での大きな課題は、不要なバックグラウンドノイズを抑制することである。バックグラウンドノイズは、典型的には分子の複雑な混合物からなるサンプルを分析する場合に生ずる。例えば、この場合、血液由来のサンプルをｓＥＬＩＳＡで分析した場合、バックグラウンドノイズは、主に２つの機構によって発生する。
【０００４】
機構１：サンプル処理中に、主としてターゲット検体は免疫複合体を形成するが、捕獲および検出抗体の両方とも、サンプル中に存在する、ターゲット検体と類似の非ターゲット分子（ここでは非ターゲット化合物とも称する）（タンパク質、ペプチドなど）とを完全に区別できず、その結果、非ターゲット分子のごく一部も免疫複合体を形成することが可能になるであろう。非ターゲット分子の濃度は、通常、ターゲット分子の濃度よりも数桁大きいため、ごくわずかな「偽の」免疫複合体でも、ターゲット検体の免疫複合体の数を圧倒することがある。
【０００５】
機構２：抗体がターゲットと非ターゲットとを完全に区別できないことは、ターゲット検体が存在しない領域または区画への酵素結合検出抗体の非特異的結合／吸着を可能にする。この問題は、検出抗体がより少ない程度で非特異的に結合するように、検査における表面化学を改善することによって低減できる。しかしながら、非特異的結合の完全な否定は実験的に達成することは不可能であり、これにより単一の酵素結合検出抗体のみから生じる「偽の」信号を導く。
【０００６】
これらの２つの機構は、単分子検出文献（例えば、D. M. Rissin et al entitled "Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations" published in Nature Biotechnology (2010), vol. 28, pp. 595-599 (DOI: 10.1038/nbt.1641)）において議論されている。この研究論文では、Ｒｉｓｓｉｎらは、ｓＥＬＩＳＡへのアプローチを説明し、較正サンプルを分析する場合に２２０ゼプトモル（２２０×１０−２１Ｍ、約１５個の分子）の検出限界（ＬＯＤ）を報告している。しかしながら、較正サンプルを血清サンプルと交換した場合、ＬＯＤは、２００アトモル（２００×１０−１８Ｍまたは２００ａＭ、約１２０００個の分子）まで約３桁増加した。この劇的な感度低下は、機構１，２に記載されているように、血清中の非ターゲット化合物がターゲット検体と検出／捕獲抗体ペアの間の特異的相互作用を妨害する方法から理解できる。
【０００７】
機構１は、タンパク質およびペプチド以外の検体分子の他の場合にも適用され得る。この顕著な例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による一塩基対置換及び／又は単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出である。ここで、ＳＮＰに特異的なＰＣＲプライマーは、ＳＮＰ配列を含むオリゴヌクレオチド検体を特異的に増幅するために適用される。しかしながら、通常、サンプルは高濃度の野生型非ターゲットオリゴヌクレオチドを含むことがあるため、ＳＮＰ検出は非常に困難であり、これはＳＮＰ特異的ＰＣＲプライマーを大幅に妨害する。高度に最適化されたプライマーの使用により、従来のＰＣＲ検出は、１００個の野生型分子（１００：１の比）のバックグラウンドで１個のＳＮＰオリゴヌクレオチド分子を確実に検出できる。野生型対ターゲットの比率がさらに増加すると、偽ポジティブの結果が生じる。ｄＰＣＲの場合、単一（または少数）のオリゴヌクレオチドが個々の区画に封入されているため、高い比率の野生型対ターゲットが許容され得る。従って、個々の区画では、野生型対ターゲット比が非常に有利であり、即ち、単一のＳＮＰ検体オリゴヌクレオチド、単一の野生型オリゴヌクレオチドおよびそれぞれ一つを含有する区画については、それぞれ０：１、１：０、または１：１である。それでも区画当たりの単一（または少数）のオリゴヌクレオチドの信頼できる封入を達成するために、区画の大部分は空である必要がある（例えば、研究論文（D. Pekin et al entitled "Quantitative and sensitive detection of rare mutations using droplet-based microfluidics" published in Lab on a Chip （2011）, vol. 11, pp. 2156-2166 （DOI: 10.1039/c1lc20128j））を参照）。ｄＰＣＲの一般的な規則は、サンプル中の野生型＋ターゲット分子の予想される数よりも５〜１０倍多い区画を調製することであり、こうして調製された区画の大部分は基本的に分析から捨てられる。
【０００８】
科学者は、生物学および化学システムでの変化を分析するための手法を開発しており、これらの変化は、しばしば２つ以上の状態間のスイッチングに関連している。例えば、文献（Witters et al. in Digital Biology and Chemistry (DOI: 10.1039/C4LC00248B, (Frontier) Lab on a Chip, 2014, 14, pp. 3225-3232)）は、種々のデジタル生物学および化学技術の開発を議論している。デジタル技術が堅牢性、アッセイ(assay)設計、簡潔性の意味で利点を提供し、定性的測定とともに定量的情報が得られるため、これらのデジタル技術はとても上手く機能する。しかしながら、デジタル技術は、単一分子を隔離し操作する際の技術的困難さに部分的に起因して、比較的複雑になることがある。例えば、幾つかの手法は、ミクロンサイズの磁気ビーズを使用して、フェムトリットル体積のサンプルを処理する。文献（Rissin et al., in Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations (DOI:10.1038/nbt.1641, Nature Biotechnology 2010, 28, pp. 595-599)）を参照。他の手法は、さらにアトリットルのより小さい体積を使用する。これらの微量体積は、処理を困難にする典型的な研究室の温度および圧力で小さい体積の流体動力学が挙動を示すため、課題を作り出すことがある。
【０００９】
例えば、大部分のデジタル検出手法は、液体含有検体および種々の検出プローブおよび捕獲プローブのマイクロ区画化に依拠している。検体および検出／捕獲プローブは、典型的にはピコリットルからアトリットル体積のマイクロサイズの液滴内に搬送されまたは存在する。
【００１０】
従って、サンプルをより小さい体積に区画化する方法は、デジタル検出プロセスの重要な部分である。最も容易に利用できるデバイスフォーマットは、サンプルが移送できるマイクロ区画(compartment)のアレイを形成する固体またはポリマーの基板に依拠する。これらのアレイは、主として２つの種類、即ち、（ｉ）マイクロウェルアレイ、（ｉｉ）毛細管(capillary)アレイという形式がある。マイクロウェルアレイでは、区画が基板内の凹部によって作成され、一方、毛細管アレイでは、区画が基板を通じて初めから終わりまで延びており、貫通孔を形成する。これらのアレイタイプの両方において固有の主要な課題は、これらがサンプルおよび付属試薬が装填される方法である。マイクロウェルアレイでは、凹部は、液体サンプルを容易に充填することができず、その理由はウェルの微視的寸法に起因して空気がウェルを去ることができないためである。この例として、研究論文（Kim et al. entitled "Large-scale femtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules" published in Lab on a Chip, (2012) vol. 12, pp. 4986-4991 (DOI: 10.1039/c2lc40632b)）を参照。この問題は、毛細管アレイでは存在せず、その理由は、各区画は２つの開口を有し、もし液体サンプルが上部開口から追加されると、空気は下部開口を通って逃げることができるためである。しかしながら、マイクロウェルまたは毛細管区画内に保持された液体を他の液体と交換することになった場合、分子の遅い拡散によって生ずる追加の問題が起こる。マイクロウェルおよび毛細管の両方が追加される液相のフローに対して垂直に位置決めされるため、良好な混合が生じることができず、液体交換が、バルク液体から毛細管への分子拡散およびその逆も同様によって生じることができるだけである。その結果、適切な液体交換を確保するために、時間遅延（その長さは、マイクロウェル／毛細管の寸法および、追加される分子種のタイプに依存する）を適用する必要があることになる。
【００１１】
これらの課題を克服するために、第３の種類のアレイが開発されており、これは表面張力アレイと称される。表面張力アレイは、平面的であり、疎水性基板の中または上にパターン化された親水性機構(feature)からなる。表面張力アレイが水性サンプルと接触した場合（例えば、水相の中への浸漬およびアレイの引き出しによって）、機構と周囲の基板との間の表面張力差に起因して、個別の液滴が親水性機構の上に形成できる。液滴は、平面的表面の上に静止するため、液体サンプルがアレイ上に導入された場合、液体装填および液体交換が瞬時に（または拡散律速の輸送とは少なくとも数桁のオーダーでより高速に）生じることができる。マイクロウェルアレイとは異なり、空気が液体および親水性機構の直ぐ下に捕獲されることがなく、アレイは、基板内の窪み／凹部／空洞に依存していないため、液滴とバルク液体との間の液体混合が分子拡散によって制限されない。しかしながら、全部で３つのタイプのマイクロ区画化フォーマット（マイクロウェル、毛細管および表面張力アレイ）は、デジタル計数(counting)を実行できるために充分に長い時間に渡って多数の液体マイクロ液滴を保存するという課題に直面している。
【００１２】
研究室での典型的な周囲温度および圧力において、これらのマイクロ液滴は数秒内で蒸発する。例えば、研究論文（Birdi, K. S., Vu, D. T. and Winter, A. entitled "A study of the evaporation rates of small water drops placed on a solid surface" published in The Journal of Physical Chemistry, 1989, vol. 93, pp. 3702-3703 (DOI: 10.1021/j100346a065)）を参照。
【００１３】
いったん蒸発すると、マイクロ液滴内の分子を処理する能力が失われ、デジタル手法は実行できない。
【００１４】
従って、急速な蒸発を防止し、関心のある分子の存在を測定するのに充分な時間のマイクロ液滴を維持することが必要である。
【００１５】
このために科学者および技術者は、マイクロ液滴を保持する区画を封止(seal)するある手法を開発した。これらのシールは、マイクロ液滴が周囲環境と接触するを防止し、蒸発を防止する。
【００１６】
一般に、区画を封止するために２つの手法があり、即ち、物理的シールおよび化学的シールがある。物理的シールは、区画が基板にマイクロ凹部またはマイクロ空洞として構造化された場合に使用される。区画を物理的に封止するには、気密蓋(lid)が区画の上部に装着される。こうして個別の区画の内容物は蒸発できず、隣接した区画はその内容物を交換できず、そうでなければ交差汚染をもたらすことになる。物理的シールを有する不都合は、いったん区画が密閉されると、分析が終了することであり、その理由は、マイクロ区画の完全性(integrity)を分断させることなく、蓋が容易に除去できないためである。さらに、物理的シールを適用するために、区画は、マイクロウェル／空洞／凹部として構造化する必要があり、これは、遅い分子拡散に起因して、初期の準備ステップの際に区画内で液体を交換することに伴う技術的困難さをもたらす。
【００１７】
１つのタイプの化学的シールは、油（または無極性液体）相で区画を覆うことに依拠する。こうしてサンプルの蒸発が減少し、その理由は、サンプルからの水が油相の中にゆっくりとだけ分配するためである。化学的シールの利点は、それは界面張力に基づいており、よって区画は空洞として構造化される必要がなく、代わりに表面上に静止する液滴として形成できることである。この機構は、高速な試薬交換を可能にし、これは分子拡散によって制限されないが、代わりに新しい試薬が導入される流量(flowrate)によって決定される。さらに物理的シールと異なり、化学的シールは、サンプルから油相を吸引することによって容易に除去できることである。しかしながら、化学的シールの不都合の１つは、サンプルからの検体または他の生体分子が無極性相の中に分配することがあり、（ｉ）サンプル損失、及び／又は（ｉｉ）液滴間汚染をもたらすことがあることである。特に、タンパク質などの生体分子は、タンパク質中の疎水性アミノ酸が、疎水性界面への露出の際に自らを再配置することがあることに主に起因して、無極性液体に溶解性になる傾向がある。水から無極性相の中に分配する分子のこの性質は、分配係数、即ち、油−水分配係数、水−オクタノール分配係数などによって記述され、例えば、文献（Lien, E. J. and Ren, S. S. in Chapter 186 in Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Third Edition, 2006, ISBN: 9780849393990）。さらに、水でさえも、ゆっくりであるが周囲の油相に分配することが示され、例えば、文献（A. et al published in Lab on a Chip, 2009, vol. 9, pp. 692-698 (DOI: 10.1039/B813709A)を参照。さらに、バルク水相がバルク油相によって置換した場合、または逆も同様に、エマルション(emulsion)液滴を生成するリスク、即ち、即ち、油でのミクロンサイズの水の含有または逆も同様のリスクがある。エマルション液滴は、表面を汚染し、及び／又は、デバイスのフロー性能を劣化させることがあるため、実験的な邪魔者を構成することがある。
【００１８】
国際公開第２００９０２９０７３Ａ１号は（名称" Methods for determining the concentration of an analyte in solution"）は、閉じ込められた反応容器中で単一分子デジタル計数を行う方法を記載する。国際公開第２０１５０６１３６２Ａ１号（名称"Enrichment and detection of nucleic acids with ultrahigh sensitivity"）は、高速な蒸発レートを示す液滴の非封止表面張力アレイを調製する方法を記載する。国際公開第２０１３１１０１４６Ａ２号（名称"Patterning device"）は、液滴表面張力アレイを調製する方法および化学的シールの下でのバイオアッセイ(bioassay)のためにそれを使用する方法を記載する。国際公開第２０１３０６３２３０Ａ１（名称"Device and method for apportionment and manipulation of sample volumes"）は、デジタル計数測定を含むバイオアッセイのための化学的に封止した表面張力アレイを調製し使用する方法を記載する。日本公開第２０１４０２１０２５Ａ号（名称"Apparatus and method for forming artificial lipid membrane"）は、脂質(lipid)膜を用いて化学的に封止した表面張力アレイを調製する方法を記載する。国際公開第２０１００３９１８０Ａ２（名称" High sensitivity determination of the concentration of analyte molecules or particles in a fluid sample"）は、サンプルを物理的に封止したマイクロウェル区画の中に分割することによる、検体のデジタル計数を記載する。国際公開第２０１００１９３８８Ａ２号（名称"Method and apparatus for discretization and manipulation of sample volumes"）は、マイクロウェル区画を記載しており、これは、１つ以上の非混合性液体で構成された化学的シールを付与することによって液体サンプルを捕獲し分割するために使用できる。国際公開第２０１２０２２４８２Ａ１号（名称"Microwell arrays for direct quantification of analytes on a flat sample"）は、平坦な基板上に収容されたサンプルを分析するための物理的に封止したマイクロウェル区画の使用を記載する。米国公開第２０１０００７５４０７Ａ１号（名称"Ultrasensitive detection of molecules on single molecule arrays"）は、物理的に封止したマイクロウェル区画で実行されるデジタル計数測定を記載する。国際公開第２０１２１００１９８Ａ２号（名称"Methods and systems for performing digital measurements"）は、液滴のアレイを調製し分析することによって実行されるデジタル計数測定を記載する。米国公開第２０１３００５２６４９Ａ１号（名称"Multilayer high density microwells"）は、バイオ分析のためのマイクロウェル区画の化学的に封止したアレイを記載する。国際公開第２００１０６１０５４Ａ２号（名称"Apparatus and methods for parallel processing of micro-volume liquid reactions"）は、バイオアッセイを実行するための化学的に封止した毛細管アレイの使用を記載する。国際公開第２０１４００１４５９Ａ１号（名称"A method of charging a test carrier and a test carrier"）は、バイオアッセイを実行するための毛細管アレイの使用を記載する。国際公開第１９９８０４７００３Ａ１号（名称"An analytical assembly for polymerase chain reaction"）は、オリゴヌクレオチドのデジタル計数を記載する。国際公開第２０１１０９７０２８Ａ１号（名称"Systems and methods for manipulating a molecule in a nanopore"）は、膜ナノ細孔中の単一分子を操作する方法を記載する。米国特許出願公開第２００８０２６３７９Ａ１号（名称"Nucleotide analogs"）は、単一のオリゴヌクレオチド分子のシーケンス配列決定を記載��る。米国特許出願公開第２００９１４２７５５Ａ１号（名称"Assay for detecting genetic abnormalities in genomic nucleic acids"）は、固体支持体上に捕獲することによる核酸の検出を記載する。米国特許第２０１２１９００３０Ａ１号（名称"Detection of target nucleic acid sequences by cyclic exonucleolytic reactions"）は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用しない核酸の検出を記載する。国際公開第２０１７０３４９７０Ａ１号（名称"Combinatorial single molecule analysis of chromatin"）は、固体支持体上のオリゴヌクレオチド／クロマチン複合体のシーケンス標識化および検出を記載する。欧州公開第３０４８４４５Ａ２号（名称"Method and apparatus for the analysis and identification of molecules"）は、ナノ細孔を用いて単一のオリゴヌクレオチドをどのように配列決定できるかを記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って、分析される材料を含むマイクロ液滴を保持する区画を封止するための改善したシステムおよび方法について先行技術でのニーズがある。
【００２０】
これまで、多重化を達成するために単一分子デジタル計数に反復標識化が適用されていおり、即ち、標識化反応１において検体１に特異的な標識剤を用い、標識化反応２において検体２に特異的な標識剤を用いることなどによって、より多くのターゲット検体タイプが検出可能になる（例えば、国際公開第２００９０２９０７３Ａ１号および国際公開第２０１７０３４９７０Ａ１号を参照）。
【００２１】
先行技術では、デジタル計数、例えば、単一分子検出または定量化を含む分析におけるノイズの低減のためのニーズがある。デジタル計数における計数誤差をもたらすノイズの低減または防止は、既存の単一分子検出アッセイの感度および特異性を大きく改善できる。特に、アッセイが検体に結合する標識剤に基づく最新の単一分子検出分析法の感度および特異性の点での改善は、（ｉ）検体への標識剤の不完全な結合、（ｉｉ）異なる検体タイプの交差標識化、および（ｉｉｉ）捕獲部位への標識剤の非特異的結合、という課題がある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者は、驚くべきことに、デジタル計数分析において、例えば、偽ポジティブ検出及び／又はバックグラウンドノイズなどの計数誤差が、（ｉ）サンプルから検体を捕獲するために複数の個別の捕獲部位を用いること、および（ｉｉ）捕獲された検体は１つ以上の検出サイクルに曝されことによって大きく低減できることを見出した。ここで各検出サイクルは、結合標識剤からの信号の検出、そして結合標識剤の任意的な除去を可能にする。こうしてバックグラウンドノイズ、特に偽ポジティブ検出は、各検出サイクルにおいて個々の捕獲部位が信号を表示したものの記録との組合せで、同じ検体を同じ標識剤で標識化および再標識化することによって、大きく低減できることが本発明者によって見出された。
【００２３】
空の捕獲部位または捕獲された非ターゲット分子への標識剤の非特異的結合相互作用は、捕獲された検体に対する標識剤の特異的結合相互作用と比較して、低い確率で起こり、そして、非ターゲット分子の反復標識化または空の捕獲部位への標識剤の反復非特異的結合は、検出サイクルが繰り返される毎にますます起こりにくくなると予想される。他方では、捕獲された検体の特異的標識化は、ほとんど影響を受けないままであると予想され、こうして各検出サイクルにおいて信号を繰り返し生成する可能性がより高い。よって、標識剤の非特異的相互作用は抑制され、こうしてより少ない計数誤差をもたらし、結果として改善された検出感度および特異性をもたらす。
【００２４】
第１態様において、少なくとも１つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法が開示され、サンプルは、複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも１つの検体を捕獲可能であり、この方法は、少なくとも２つの検出サイクルを含み、各検出サイクルは、下記ステップを含む。
ａ）捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
ｂ）捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
ｃ）追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
【００２５】
第２態様において、少なくとも１つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法が開示され、サンプルは複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも１つの検体を捕獲可能であり、この方法は、少なくとも２つの検出サイクルを含み、各検出サイクルは、標識剤を添加することによって少なくとも１つの検体を標識化し、そして、少なくとも１つの捕獲され標識化された検体を区画化して、少なくとも１つの検体を含む液体区画を生成するステップを含み、そして、ステップａ）〜ｃ）を含む。
ａ）捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
ｂ）捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
ｃ）追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
【００２６】
第３態様において、少なくとも１つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法が開示され、サンプルは複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも１つの検体を捕獲可能であり、少なくとも１つの検体は、固相上の少なくとも１つの検体の捕獲前または捕獲中に、標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって標識化され、この方法は、少なくとも２つの検出サイクルを含み、少なくとも１つの捕獲され標識化された検体は、区画化され、少なくとも１つの検体を含む液体区画を生成し、そして、ステップａ）〜ｃ）を含む。
ａ）捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
ｂ）捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
ｃ）追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
ここで、追加の検出サイクルが行われる前にステップｃ）が行われ、続いて再標識化ステップが行われ、少なくとも１つの捕獲された検体は、標識剤を添加することによって標識化される。
【００２７】
更なる態様において、複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用が開示され、各部位は、ここに記載される方法で少なくとも１つの検体を捕獲可能である。
【００２８】
更なる態様において、複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用が開示され、各部位は、デジタル計数分析における計数誤差を減少させるために、ここに記載される方法で少なくとも１つの検体を捕獲可能である。
【００２９】
更なる態様において、複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用が開示され、各部位は、デジタル計数分析における計数誤差を減少させるために、ここに記載される少なくとも２つの検出サイクルを行うことによって、少なくとも１つの検体を捕獲可能である。
【００３０】
他の態様において、少なくとも１つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための方法がここでは開示され、該方法は、気相シールの下での複数のナノリットルからアトリットルの液滴に含まれる検体タイプを計数することを含む。
【００３１】
他の態様において、少なくとも１つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のために、気相シールの下での複数のナノリットルからアトリットルの液滴の使用がここでは開示される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
本発明の前述のおよび他の目的および利点は、添付図面を参照して下記の更なる説明からより完全に理解されるであろう。
【００３３】
【図１】複数のマイクロ液滴２６を有するフロー区画１８の一例を示す。略図は縮尺どおりに描いていない。
【００３４】
【図２】図１中のフロー区画１８の端部の一例を示す。略図は縮尺どおりに描いていない。
【００３５】
【図３】気体シールを形成する気相を備えたフロー区画１８の例示表現を示す。略図は縮尺どおりに描いていない。
【００３６】
【図４】フロー区画から流体を引いて気相シールを生成するプロセスの例示表現を示す。描写は、フローシステムが動作しているときに獲得される明視野顕微鏡写真からの抜粋である（例１〜５を参照）。明視野顕微鏡写真での縮尺バーは２０μｍである。
【００３７】
【図５】（ｉ）平面的機構、（ｉｉ）疎水性基板１６での窪みのような形状の機構、（ｉｉｉ）疎水性基板からの突起を備え、窪みは親水性ゾーンを含む機構、を含む親水性機構１４の例示表現を示す。略図は縮尺どおりに描いていない。
【００３８】
【図６】固体支持体と接触した液滴の例を示す。本例において、（ｉ）ガス雰囲気中の疎水性基板上に静止する液滴の接触角（γ）、（ｉｉ）円形状平面的親水性機構の半径（ＲＤ）、（ｉｉｉ）円形状平面的親水性機構上に静止する液滴の接触角（α）、（ｉｖ）円形状平面的親水性機構についての最大液滴体積の幾何学的定義の例を略図で示す。略図は縮尺どおりに描いていない。
【００３９】
【図７】疎水性基板によって包囲された平面的親水性機構のパターンを調製するための２つの例示のフォトリソグラフィ式プロセスを示す。図示したステップは、下記を含む。  Ａ−親水性ウエハ基板を用意する。  Ｂ２−感光性薄膜コーティングの堆積、または、Ｂ１−ウエハの均質な表面改質。  Ｃ２−コーティングのＵＶ露光および現像、または、  Ｃ１−感光性薄膜コーティングの堆積、続いて、  Ｃ１’−コーティングのＵＶ露光および現像。  Ｄ２−ウエハの疎水性表面改質、またはＤ１−疎水性層の選択エッチング。  Ｅ−薄膜コーティングを除去し、Ｆ−親水性機構の平面的パターンを達成する。
【００４０】
【図８】一般のデジタル計数測定の例を概略的に示しており、サンプルからの検体の濃度は、ポジティブ信号を表示する区画の数の分析によって得られる。
【００４１】
【図９】平面的親水性機構に基づいたＳＥＬＭＡプロセスの例示略図を示す。ステップ（Ａ）において、サンプルからの検体は、単一ステップで結合され、親水性機構の上に位置するプローブを捕獲する。ステップ（Ｂ１）において、バルク液体中に存在する捕獲プローブ（捕獲プローブ部分２）がサンプルからの検体と結合し、こうしてステップ（Ｂ２）において、検体／捕獲プローブ部分２−複合体(complex)の形成を導く。ステップ（Ｂ３）は、Ｂ２に続いて、固体支持体上に存在する捕獲プローブ（捕獲プローブ部分１）との検体／捕獲プローブ部分２−複合体の結合を示す。捕獲プローブ部分１，２は、互いに結合(recognize)させ、よって捕獲プローブ部分１／捕獲プローブ部分２／検体−複合体を固体支持体上に形成し、こうして検体を親水性機構の上に固定する。ステップ（Ｃ）において、標識(labelling)剤が捕獲プローブ／検体−複合体に追加され、例えば、捕獲プローブ／検体／標識剤−複合体を形成する。ステップ（Ｄ）において、捕獲プローブ／検体−複合体は、標識剤の第１部分（標識剤部分１）によって標識化される。ステップ（Ｅ）において、捕獲プローブ／検体／標識剤部分１−複合体は、標識剤の第２部分（標識剤部分２）によって２次標識化される。ステップ（Ｆ）において、機能的捕獲プローブ／検体／標識剤−複合体が形成された。ステップ（Ｇ）において、液滴が親水性機構の表面上に形成される。液滴は、検出剤を含み、気相シールによって蒸発から保護される。ステップ（Ｈ）において、検出剤は、標識剤の処理によって分子レポータ(reporter)に変換される。略図は縮尺どおりに描いていない。
【００４２】
【図１０】例示のフローシステムの略図を示す。フローシステムは、５つの機能的エレメントを備える矩形スラブ(slab)で構成される。各エレメントは、数字でマークされ、破線四角によって包囲される。エレメント１は、吸引を提供するために圧力源に接続された液体出口である。エレメント２は、フロー区画である。エレメント３は、フロー区画を液体装填パッドに接続する液体入口である。エレメント４は、液体試薬のためのレセプタクルとして成形された液体装填パッドである。エレメント５は、液滴領域であり、疎水性基板によって包囲された親水性機構のパターンを提示する。液滴領域は、フロー区画の下部の上に位置する。略図は縮尺どおりに描いていない。
【００４３】
【図１１】蒸発とフローチャネル／液滴／アレイ−幾何形状との間の理論的関係の一例を示す。（Ａ）２．５μｍの液滴半径およびＮ＝４およびφ＝２のスケーリング係数を備えたアレイについての式(Eqn.)（１７）のプロットであり、温度が増加するとともに、そしてフローチャネル高さが１００μｍから１５００μｍに増加した場合、蒸発割合が増加する。（Ｂ）３５℃での最大許容蒸発割合（θＭＡＸ）の関数として、そして種々のアレイ／液滴幾何形状について、最大高さ（ｈＭＡＸ）についての式（１８）のプロットである。（Ｃ）１００μｍの高さ、φ＝２のスケーリング係数を表示し、３５℃の温度に保持されたフローチャネルについての式（１７）のプロットである。隣接液滴間のより大きい間隔（より大きいＮ値）は、より高い蒸発割合をもたらし、一方、より大きい液滴サイズは蒸発を減少させる。
【００４４】
【図１２】気相シールの下での蒸発耐性マイクロ液滴の例および種々のフローチャネル幾何形状および温度についての液滴安定性を示す。明視野顕微鏡写真は、（Ａ）２０００μｍ、（Ｂ）８００μｍ、（Ｃ）１５０μｍの高さを示すフローチャネルに形成される液滴を示す。アレイパラメータは、Ａ〜Ｃで同一であり、即ち、液滴半径ＲＤ＝２．５μｍ、余剰部(excess)対アレイ長さ比率φ＝１、アレイピッチＮ＝４である。３つのアレイを同じ方法で調製した。即ち、水溶液を注入し、フローチャネルから引き出し、温度を２５℃に調整した。３０分の平衡時間の後、顕微鏡写真を撮り、温度を３５℃に上昇した。３０分の平衡後に再び顕微鏡写真を撮った。この手順を４５℃で繰り返した。パネルＡにおいて、液滴は２５℃でだけ明確に識別可能である。より高い温度では、液滴は蒸発する。パネルＢにおいて、液滴は２５℃および３５℃で識別可能になるが、蒸発に起因して液滴直径が収縮したように見える。４５℃において、アレイは、蒸発および水−蒸気の再凝縮に起因して大きく分裂され、フローチャネル／アレイが、顕微鏡写真を撮った時に熱平衡に到達していないことを示す。パネルＣにおいて、液滴は、全ての温度で明確に識別可能であり、液滴半径は大きく変化していないように見える。縮尺バーは２０μｍである。
【００４５】
【図１３】（Ａ）例示のフローチャネル２８、および（Ｂ）フローチャネルに組み込まれた例示のマイクロ液滴アレイ３０を定義するパラメータの例示略図を示す。略図は縮尺どおりに描いていない。
【００４６】
【図１４】１ｐＭのＤＮＡターゲットを含む較正サンプルについての明視野（ｉ）および蛍光（ｉｉ）顕微鏡写真の対応するペアを示す。蛍光信号は、例４に説明したように識別され、白丸でマークした。蛍光信号の位置は、明視野顕微鏡写真に付与し、黒丸でマークした。蛍光信号の位置は、液滴の位置に対応することが明らかである。縮尺バーは１０μｍである。
【００４７】
【図１５】ＤＮＡターゲットの下記濃度、（Ａ）１００ａＭ、（Ｂ）１ｆＭ（１フェムトモル／ｌまたは１×１０−１５Ｍ）、および（Ｃ）１０ｆＭを含むサンプルからの３つの代表的な蛍光顕微鏡写真を示す。蛍光液滴の数は、各サンプルについて計数し、アレイ上に存在する液滴の合計数に正規化され、例えば、蛍光液滴の百分率割合、即ちポジティブ割合を提供する。ポジティブ割合は、１００ａＭのＤＮＡターゲット、１ｆＭのＤＮＡターゲット、１０ｆＭのＤＮＡターゲット、そしてＤＮＡターゲット無しのコントロール(control)サンプル（Ｄ）を含むサンプルについてプロットした。棒グラフ上の値は、各サンプルについて５つの検出実験から収集した平均値を表す。エラーバーは、５つの同じように行った実験についてポジティブ割合の標準偏差を表す。
【００４８】
【図１６】例５に概説したように１００ａＭのターゲットＤＮＡを含むサンプルについて蛍光顕微鏡写真のシリーズを示す。シリーズの第１顕微鏡写真（ｉ）は、第１検出ステップの後に撮ったもので、シリーズの第２顕微鏡写真（ｉｉ）は、第２検出ステップの後に同じ位置で撮ったもので、シリーズの第３顕微鏡写真（ｉｉｉ）は、第３検出ステップの後に同じ位置で撮ったものである。
【００４９】
【図１７】親水性機構（１４）のパターンを表示する支持体（１２）を備えた、サンプル中の１つ以上の検体のデジタル計数のための例示のフローシステム（１０）の断面の略図を示す。パターンは、疎水性基板（１６）に組み込まれ、その上に配置され、またはそれによって包囲され、そして開口（２０）を示すフロー区画（１８）に組み込まれる。各親水性機構は、表面に付着された捕獲プローブ（２２）を有する。支持体は、２つの領域（２４）に分割され、各領域は特異タイプの捕獲プローブを表す。略図は縮尺どおりに描いていない。
【００５０】
【図１８】適用された検出サイクル数の関数として、単一分子計数分析において信号を示す捕獲部位の数の間の理論的関係の例を示す。グラフは式（２５）〜（２８）に従ってプロットされ、下記パラメータを適用する。（Ａ）ＮＴＡ＝１０、ＮＮＭ＝１０．０００、ＮＣ＝１００．０００、ＰＴＡ＝０．９、ＰＮＭ＝０．０５、およびｆＮＳＲ＝０、（Ｂ）ＮＴＡ＝１０、ＮＮＭ＝１００，０００、ＮＣ＝１００．０００、ＰＴＡ＝０．９、ＰＮＭ＝０．０５、およびｆＮＳＲ＝０．０５、（Ｃ）ＮＴＡ＝１０、ＮＮＭ＝１．０００．０００、ＮＣ＝１００．０００、ＰＴＡ＝０．９、ＰＮＭ＝０．０５、およびｆＮＳＲ＝０、（Ｄ）ＮＴＡ＝１０、ＮＮＭ＝１．０００．０００、ＮＣ＝１．０００．０００、ＰＴＡ＝０．９、ＰＮＭ＝０．０５、およびｆＮＳＲ＝０．０５。パネルＡ〜Ｄにおいて、ＣＴ（ｘ）、ＬＴＡ（ｘ）、ＬＮＭ（ｘ）およびＬＮＳＲ（ｘ）は、信号ポジティブ捕獲部位の総数、信号が（ｉ）ターゲット検体に由来する信号ポジティブ捕獲部位の数、（ｉｉ）非ターゲット分子、および（ｉｉｉ）非特異的に保持された標識剤をそれぞれ表し、ここでｘは検出サイクル数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
（定義）
本文脈において、用語「デジタル計数(counting)」、「デジタル計数分析」、「単一分子デジタル計数」、または「単一分子デジタル計数分析」は、サンプルの特異成分が区画の中に限界濃度で分配される任意の検体を参照し、区画の数は特異サンプル成分の数より大きい。こうして２値／デジタル値が、それが空（値０）または装填（値１）であるかに応じて各区画に割当てできる。本文脈において、装填とは、特異サンプル成分の少なくとも１つを含む区画を参照し、一方、空とは、特異サンプル成分を含まない区画を参照する。デジタル計数は、装填および空の区画の数が、特異サンプル成分から、または特異サンプル成分の存在に結合した付属検出試薬から由来する特異信号に基づいて評価される場合に行う。
【００５２】
本文脈において、用語「デジタル計数測定」は、上述したようなデジタル計数プロセスを参照するが、例えば、全ての区画に存在する特異サンプル成分の絶対数を推測するために、デジタル計数結果の任意の数学的処置または較正をさらに含む。これは、（ｉ）装填区画が、同じサンプル成分の１つ、２つ、３つなどのコピーを含むことがあるという事実を説明すること、または（ｉｉ）信号発生プロセスでの欠陥に起因して、装填区画が、空として誤って分類されることがあり、また逆も同様であるという事実を説明すること、を含んでもよい。デジタル計数測定の例は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）、単一酵素結合免疫吸着法（ｓＥＬＩＳＡ）またはデジタル単一酵素結合免疫吸着法（ｄＥＬＩＳＡ）を含む。デジタル計数測定の略図が図８に概説されている。
【００５３】
本文脈において、用語「ＳＥＬＭＡ」は、single-enzyme linked molecular analysisの略称として使用され、デジタル計数測定の特定の種類を参照する。ＳＥＬＭＡにおいて、デジタル計数測定はフローシステムにおいて行われ、液滴区画があるパターンに編成され、特異サンプル成分が区画の内部に固定／捕獲された状態になる。こうしてサンプル成分は、失われることなく、幾つかの反応ステップに曝すことができ、各ステップは、フローシステムからの溶液または試薬の浸漬および引き出しによって構成される。例示のＳＥＬＭＡプロセスの略図が図９において示される。
【００５４】
本文脈において、「親水性機構」は、他のセットの材料特性を有する固体基板によって包囲または支持された、第１セットの材料特性を有する構造を参照する。構造および固体基板の材料特性は、構造が固体基板より濡れ性が高いように調整すべきである。換言すると、構造を構成する材料は、固体基板よりも水とのより小さい接触角を示すべきである。構造は、化学的及び／又は物理的手段によって定義できる。可能性のある構造の非限定セットは、（ｉ）周囲基板より親水性の高い材料で構成された閉じた平面的領域、（ｉｉ）周囲基板に形成された窪み、突起またはその組合せであり、１つ以上の側面(side)が周囲基板より親水性の高い材料で構成される、を含む。例示の親水性機構の略図が図５に示される。ＳＥＬＭＡの文脈において、親水性機構は、例えば、検体捕獲のために区別できる化学官能性を設けることによって、そして信号発生および検出のために液滴パターンを設けることによって、デジタル計数測定にとって適切な反応区画を提示するように操作してもよい。
【００５５】
本文脈において、用語「平面的親水性機構」は、疎水性基板が平面的であり、疎水性基板に組み込まれた親水性機構が平面的である設計を参照する。平面性の理想的ケースを図５に示しているが、実用的応用では、平面性は、表面粗さの観点で定義する必要がある。例えば、疎水性基板および親水性機構は異なる材料で形成できるため、疎水性領域と親水性領域との間で高さに微細な差が存在するであろう。一実施形態において、平面的と考えられる親水性機構のための適切な基準は、疎水性領域と親水性領域との間の高さの差（代替的には表面粗さ）（Δｈ）は、特性機構サイズと比較して無視できるものにすべきであることであろう。半径ＲＤを有する円形親水性機構の場合、基準はＲＤ＞＞Δｈにできる。一実施形態において、２０ｎｍより小さいΔｈ値を示す機構は、平面的であると考えられる。
【００５６】
本文脈において、用語「接触角」は、液体／蒸気／固体の界面で測定される特性角を参照する。液滴が固体表面の上に気相中に堆積される文脈において、接触角は、ライン上のポイントにある液体を介して測定され、液体／蒸気の界面は固体表面に出会う。文献（W.C. Bigelow, D.L. Pickett and W.A.J. Zisman in "Oleophobic monolayers I: Films adsorbed from solution in non-polar liquids" published in Journal of Colloid Science, vol. 1, pp. 513-538 (1946) (DOI: 10.1016/0095-8522(46)90059-1)）で定義されるように、角度は、固体表面と液体界面の接線との間で測定される。例示の接触角の略図が図６において示される。
【００５７】
本文脈において、用語「ＲＨ」は、「液体の気体成分の相対蒸気飽和」を意味し、用語「相対湿度」の一般化である。相対湿度は、水の部分蒸気圧（ＰＷ）と大気中の水の飽和圧力（ＰＳＡＴ）との比率、即ち、ＲＨ＝ＰＷ／ＰＳＡＴとして定義される。飽和圧力は、ここでは液体水と熱平衡にある水蒸気によって作用される部分圧力として定義される。ＲＨ値は、水以外の液体を含むように一般化できる。この場合、ＲＨは、ＰＷ／ＰＳＡＴに等しいが、ここでＰＷは、所定の液体の気体成分によって作用される部分圧力として理解することになり、ＰＳＡＴは、所定の液体と熱平衡にある気体成分によって作用される部分圧力として理解することになる。部分圧力は、気相が幾つかの気体種によって構成される場合を参照する。こうしてＲＨは、対応する気相の蒸気飽和レベルの指標として考えられる。即ち、ＲＨ＝０では、気相は液体の気体成分を含んでおらず、一方、ＲＨ＝１では、気相は液体の気体成分の最大可能含有量を取り上げている。
【００５８】
本文脈において、用語「ＲＨＩ」は、「液体の気体成分の初期の相対蒸気飽和」を意味する。用語「液体の気体成分の初期の相対蒸気飽和」が適用される場合、それは、変化が起こりそうであり、熱平衡がまだ確立されていない状況を示す。例えば、もしＰＳＡＴの特性飽和圧力を有する液体１が気相を含む閉じた環境に配置され、液体１の気体成分の部分圧力がＰ１である場合、Ｐ１＜ＰＳＡＴであれば、液体は蒸発するようになる。こうして液体の気体成分の初期の相対蒸気飽和は、ＲＨＩ＝Ｐ１／ＰＳＡＴであり、その理由は、何れかの変化が起きる前にそれが計算されるためである。しかしながら、いったん液体１の蒸発が開始すると、ＲＨ値は、（ｉ）気相を飽和させるＲＨ＝１まで、または（ｉｉ）全ての液体が蒸発するまで、ＲＨＩ値から徐々に増加するようになる。
【００５９】
本文脈において、用語「最大液滴体積」は、最適な条件で調製した場合、単一の親水性機構が支持できる最大液体堆積を参照する。液滴からの液体の蒸発の文脈において、蒸発した液体の体積割合は、最大液滴体積に対して計算される。平面的円形親水性機構についての例示の最大液滴体積の略図が図６において示される。
【００６０】
本文脈において、用語「凝集(aggregate)最大液滴体積」は、複数の液滴を含むパターンの最大液滴体積を一緒に加算することによって得られる体積の合計を参照する。パターンからの液体の蒸発の文脈において、蒸発した液体の体積割合は、凝集最大液滴体積に対して計算される。
【００６１】
本文脈において、用語「サンプル」は、生物学的または化学的材料の収集物を参照し、これは研究室処理の対象であっても、そうでなくてもよい。サンプルは、液体または固体の形態を想定してもよく、デジタル計数のための入力として機能する特定の成分を含んでもよい。
【００６２】
本文脈において、「少なくとも１つの検体を潜在的に含有するサンプル」は、１つ以上の特異検体タイプを含有することが疑われるか、または１つ以上の特異検体タイプをサンプル中に１つ以上の特定の濃度で含有することが疑われる生物サンプルを参照する。
【００６３】
本文脈において、用語「検体(analyte)」は、特異サンプル成分を参照し、これはデジタル計数測定で利用されることになる。検体は、生物学的または分子の性質のものであり、（ｉ）残りのサンプル材料から分離されることになり、及び／又は（ｉｉ）デジタル計数プロセスの際に明確に操作されることになる。
【００６４】
本文脈において、用語「検体タイプ」は、特定のクラスまたは種の検体を参照する。例えば、２つの異なる検体タイプは、それぞれオリゴヌクレオチドおよびタンパク質でもよい。２つの異なる検体タイプの他の例は、タンパク質および細胞でもよいが、検体タイプはまた、例えば、２つの異なるタンパク質、２つの異なるオリゴヌクレオチドまたは２つの異なる細胞を参照してもよい。
【００６５】
本文脈において、用語「捕獲プローブ」は、例えば、検体を反応区画に保持し及び／又は閉じ込めるために、検体の特異領域を認識し結合することが可能な分子性質の化学的または生物学的物質(agent)である。
【００６６】
本文脈において、用語「標識(labelling)剤」は、検体の特異領域を認識し結合することが可能な分子性質の化学的または生物学的物質である。標識剤の結合領域は、捕獲プローブの結合領域とは異なり、そのためデジタル計数測定の際、捕獲プローブ／検体／標識剤／−複合体が確立できる。さらに、１つ以上の検体−結合様式(modalities)とは別に、標識剤は、１つ以上の検出様式を含む。用語「標識剤」はさらに、１つ以上の物質を参照し、これは、共に結合した場合、検体−結合様式および検出様式を提供する。
【００６７】
本文脈において、用語「検出様式」は、検出器によって検出可能な信号の発生を介在することが可能な生化学的、化学的、生物学的または物理的な部位(moiety)を参照する。信号は、性質が光学的、電気的または磁気的なものでもよい。さらに、検出様式は、信号発生を達成するために、検出剤に依拠してもよい。
【００６８】
本文脈において、用語「検出剤」は、通常は分子性質の化合物を参照し、これは、適合した検出様式によって接触した場合、化学的または物理的状態を変化できる。検出剤の状態の変化は、適切な検出器によって記録され信号に転換できる。さらに、状態の変化を受けた検出剤は、レポータ分子または分子レポータと称してもよい。
【００６９】
本文脈において、用語「検出可能濃度」または「最小検出可能濃度」は、反応区画に閉じ込められた分子レポータの最低濃度を参照し、これは適切な検出器によって検出可能にできる。濃度が検出可能になるために、分子レポータから得られる信号は、検出器のノイズレベルを超えることが必要である。一般に、分子レポータのより高い濃度は、検出器によって記録されるように、相応のより高い信号を生成する傾向がある。
【００７０】
本文脈において、用語「個別の捕獲部位」は、検体を捕獲または付着できる固相上の特定の領域を参照する。捕獲部位領域は、検体タイプに特異的な捕獲プローブで機能化してもよい。固相は、個々の捕獲部位の領域が交差しないように、複数の個別の捕獲部位を表示する連続的な表面または基板でもよい。さらに、固相は、１つ以上のコロイド状ビーズで構成してもよく、ビーズの表面は捕獲プローブを用いて機能化されている。この場合、単一のビーズが単一の捕獲部位を構成し、例えば、液体中に浮遊したビーズの集合が複数の個別の捕獲部位を構成するであろう。
【００７１】
本文脈において、用語「液体区画」は、個々の液体区画が、存在する他の液体区画から流体的に隔離されている液体の体積（典型的にはナノリットルからアトリットルの範囲）を参照する。
【００７２】
本文脈において、用語「流体的に隔離された」は、１つの個々の区画からの液体内容物が、存在する他のどの区画にも容易に漏れることができないように調製された液体区画を参照する。液体区画は、例えば、バルク液体を、（ｉ）ウェル／キャビティ／キャピラリーに、（ｉｉ）各液体体積が表面張力によって所定場所に保持されるように、親水性機構を含む疎水性基板の上により小さな液体体積に、または、（ｉｉｉ）エマルジョン液滴に、区分することによって流体的に隔離するようにしてもよい。
【００７３】
本文脈において、用語「区画化」は、各体積が液体区画を形成するように、バルク液体およびその内容物をより小さな体積に区分するプロセスを参照する。
【００７４】
本文脈において、用語「信号の起動」は、検出可能な信号を生成するために液体区画に閉じ込められた標識剤を誘発するプロセスを参照する。検出可能な信号は、標識剤の検出様式を適切な検出剤と接触させることによって誘発してもよい。そして検出様式は、検出剤を分子レポータに変換することができ、これは、液体区画の流体隔離性に起因して、検出可能な最小濃度の分子レポータが区画内に確立されるまで区画内に蓄積する。
【００７５】
本文脈において、用語「信号の非活性化」は、それが閉じ込められている液体区画内で信号を起動する標識剤の能力を永久に無効にするプロセスを参照する。液体区画内で標識剤が信号を起動することを不可能にする１つの方法は、区画から標識剤を除去することでもよい。標識剤が液体区画内で信号を起動するのを不可能にする他の方法は、化学的、生化学的または物理的手段によって、検出剤を分子レポータに変換することができないように標識剤の検出様式を不可能にすることでもよい。
【００７６】
本文脈において、用語「非特異的に結合した」は、例えば、空の捕獲部位に直接付着しており、よって捕獲された検体に直接付着していない標識剤を参照する。標識剤が、もし捕獲された検体の代わりに、捕獲された非ターゲット分子に付着している場合、標識剤は非特異的に結合していると考えてもよい。非特異的に結合した標識剤を収容する液体区画が検体を捕獲しなかったが、依然として検出可能な信号を生成することができるため、非特異的に結合した標識剤は、誤りまたは偽ポジティブの信号を生成する。
【００７７】
本文脈において、用語「計数誤差」または「デジタル計数誤差」は、例えば、非特異的に結合した標識剤から生じる偽ポジティブ信号を参照する。非特異的に結合した標識剤を収容し、捕獲された検体を収容していない液体区画は、それらが検体からの真の信号を表さないため、デジタル計数分析においてノイズと考えられる。例えば、標識剤は、（ｉ）検体／標識剤−複合体を形成することなく、捕獲部位に物理吸着または化学吸着されている場合、または（ｉｉ）標識剤と、捕獲部位に存在する他の非ターゲット化合物／分子との間に複合体が形成されている場合、非特異的に結合すると考えられる。
【００７８】
本文脈において、用語「偽ポジティブ検出サイクル」は、例えば、複数の捕獲部位を標識剤と接触させることなく、標識化または再標識化ステップが実行される検出サイクルを参照する。これにより偽ポジティブ信号（非特異的に結合した標識剤の形態）を検出することが可能になる。例えば、先行する検出サイクルにおいて、捕獲された検体に結合した標識剤が特異的に除去されるように信号非活性化ステップが実行された場合、非特異的に結合した標識剤は捕獲部位に残るであろう。標識化または再標識化ステップにおいて複数の捕獲部位に新しい標識剤が供給されないため、信号起動ステップは、非特異的に結合された標識剤を収容する液体区画からの検出可能な信号を生じさせるだけであり、こうして液体区画の検出を可能して、偽ポジティブ信号を提供する。偽ポジティブ検出サイクルの他の例は、検出サイクルを適用することによってサンプル中の非ターゲット化合物／分子の数の識別および定量化を可能にする。ここで標識化または再標識化ステップは、非ターゲット化合物／分子に対して特異的な標識剤を用いて行われる。
【００７９】
本文脈において、用語「断続的な信号パターン」は、２つ以上の検出サイクルに曝された液体区画を参照し、液体区画はすべての検出サイクルにおいて信号を生成しなかった。例えば、もし４つの検出サイクルが実行され、液体区画が第２および第４の検出サイクルにおいてのみ信号を生成した場合、それは断続的な信号パターンを生じさせると考えられる。他方では、もし他の液体区画が４つの検出サイクルに曝され、そして全てのサイクルにおいて信号を生成した場合、それは断続的な信号パターンを生じさせるとは考えられず、その代わり信号を繰り返し生成すると考えられる。
【００８０】
本文脈において、用語「フロー区画」は、ある区画を参照しており、これは、チャネル形状でもよく、液体が複数の個別の捕獲部位と接触するように液体のフローを案内するように機能する。フロー区画は、液体がフロー区画に入ることができる入口と、液体がフロー区画から出ることができる出口とを有してもよい。入口と出口の間には、複数の個別の捕獲部位を配置してもよい。
【００８１】
本文脈において、用語「フローシステム」は、１つ以上のフロー区画のアセンブリを参照し、これはさらに、液体を収容する１つ以上の貯留部(reservoir)と、液体を貯留部からフロー区画に分配するため、またはフロー区画への液体アクセスを許可または防止するための１つ以上のバルブまたはスイッチング機構とを含んでもよい。さらに、フローシステムはまた、フロー区画への液体フローを可能にするために、液体駆動ユニットを含んでもよく、またはそれに接続されてもよい。
【００８２】
本文脈において、用語「気相シール」は、気相シールを確立するプロセスの結果を参照し、気相シールの目的は、液体区画からの蒸発を防止または低減することである。一実施形態において、プロセスは、フローシステム内に複数のナノリットルからアトリットルの液体区画を配置することによって開始され、フローシステムの寸法および複数の液体区画の空間構成は、個々の液体区画の液体体積のほんの僅かな量だけが、フローシステムのフロー区画内の気相が液体の気体成分で飽和する前に蒸発してもよいように構成される。こうして蒸発した液体は、気相シールを確立し、これは、ナノリットルからアトリットルの液体区画が、蒸発することなく、フロー区画内で長期間に渡って安定に維持されることを確保できる。
【００８３】
本文脈において、用語「固定化」は、例えば、検体などのサンプルからの可動(mobile)成分を固相に固定するプロセスを参照し、例えば、いったん固定されると、それがサンプル中に逆に拡散するのを防止している。
【００８４】
ここで開示した本発明は、単一分子測定において、偽ポジティブ検出及び／又はノイズの低減／除去などの計数誤差を低減するための方法を提供するものであり、こうして改善した定量化、改善した感度および改善した特異性を可能にする。
【００８５】
第１実施形態において、少なくとも１つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法が開示され、サンプルは、複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも１つの検体を捕獲可能であり、この方法は、少なくとも２つの検出サイクルを含み、各検出サイクルは、下記ステップを含む。
ａ）捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
ｂ）捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
ｃ）追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
【００８６】
ここで開示する実施形態において、捕獲部位は、信号起動プロセス中に液体区画によって包囲される。
【００８７】
第１実施形態において、デジタル計数分析は、あるフォーマットで実行されるのに適しており、捕獲部位は基板に空洞、窪み／またはスルーホールとして設けられ、検出サイクルの個々のステップが、試薬溶液の複数の捕獲部位への吸引および分配によって、あるいは試薬溶液からの基板の完全な浸漬および引上げによって行われる。
【００８８】
個別の捕獲部位は、固体基板、例えば、固体チップの表面の化学的パターニング、または、基板の地形学的パターニング、例えば、マイクロタイタープレート中のウェルによって提供できる。そして化学的パターンまたは地形学的パターンの機構は、表面を捕獲プローブで誘導体化することによってサンプルからの検体に結合する能力を示すことができる。  個別の捕獲部位は、コロイドビーズの収集物または懸濁物としても提供してもよい。その場合、ビーズの表面が捕獲プローブで誘導体化されていれば、各ビーズは、単一の捕獲部位を構成する。
【００８９】
更なる実施形態において、デジタル計数分析はまた、ここで説明するようなフロー区画において実行されるのに特に適しており、親水性機構は、複数の液体ナノリットルからアトリットル液滴を支持するように構成され、フロー区画はさらに、各ナノリットルからアトリットル液滴の蒸発を低減する気相シールを支持するように構成される。
【００９０】
第２実施形態において、少なくとも１つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法が開示され、サンプルは複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも１つの検体を捕獲可能であり、この方法は、少なくとも２つの検出サイクルを含み、各検出サイクルは、標識剤を添加することによって少なくとも１つの検体を標識化し、そして、少なくとも１つの捕獲され標識化された検体を区画化して、少なくとも１つの検体を含む液体区画を生成するステップを含み、そして、ステップａ）〜ｃ）を含む。
ａ）捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
ｂ）捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
ｃ）追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
【００９１】
第２実施形態において、デジタル計数分析は、あるフォーマットで実行されるのに適しており、検出サイクルの全てのステップおよび捕獲に至る全てのステップが、複数の捕獲部位を含む固体基板の上またはそれに隣接して起こり得る。基板は、例えば、親水性捕獲部位のパターンを備えた疎水性でもよく、その結果、基板からの試薬溶液の浸漬および引上げの際に捕獲区画上に液体区画が形成できる。
【００９２】
第３実施形態において、少なくとも１つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法が開示され、サンプルは複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも１つの検体を捕獲可能であり、少なくとも１つの検体は、固相上の少なくとも１つの検体の捕獲前または捕獲中に、標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって標識化され、この方法は、少なくとも２つの検出サイクルを含み、少なくとも１つの捕獲され標識化された検体は、区画化され、少なくとも１つの検体を含む液体区画を生成し、そして、ステップａ）〜ｃ）を含む。
ａ）捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
ｂ）捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
ｃ）追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
追加の検出サイクルが行われる前に、ステップｃ）後に再標識化ステップが行われ、少なくとも１つの検体は、標識剤を添加することによって標識化される。
【００９３】
第３実施形態において、デジタル計数分析は、あるフォーマットで実行されるのに適しており、初期の捕獲および標識化がバルク溶液中で行われ、検出サイクルおよび再標識化は検体及び／又は標識剤の区画化を含む。例えば、初期の捕獲および標識化は、コロイドビーズの収集物を複数の捕獲部位として使用し、コロイドビーズの収集物をサンプルおよび標識剤を含有する溶液中に浮遊させることによってすることによって実行してもよく、その結果、ビーズは、捕獲され標識化された検体を抱えることができる。次に、ビーズの収集物は、例えば、エマルジョン液滴中にカプセル化されることによって、または固体基材上の空洞、窪みまたはスルーホールに分散されることによって区画化してもよい。他の例は、検体を含有するサンプルが標識剤と混合され、複数の個別の捕獲部位を有する固体基板上に導入して、その結果、捕獲され標識化された検体は単一ステップで形成できるようにできる。
【００９４】
一実施形態において、方法は、ターゲット検体が分析の第１ステップの１つにおいて固定化できるように、捕獲エレメントによるターゲット検体の捕獲を可能にするステップ（捕獲ステップ）を含む。捕獲エレメントは、必ずしもターゲットのみに特異的である必要はなく、非ターゲット化合物に対してある程度の交差反応性を示してもよい。
【００９５】
固定化は、バルク溶液中で生じてもよいが、単一または少数のターゲット検体だけが液体区画内に閉じ込められた液体区画内で生じてもよい。一実施形態において、離散した捕獲部位の数はサンプル中の検体の数よりも多く、そのため各液体区画が、空（即ち、捕獲された検体がない）であるか、または装填（即ち、１つ以上の捕獲された検体）されている。未知の量の検体を備えたサンプルでは、この分布は、さらに希釈されたサンプルに対してここで開示する方法を実行することによって確保できる。液体区画当たりの捕獲検体の占有はランダムであり、ポアソン分布によって近似してもよい。
【００９６】
捕獲エレメントは、例えば、タンパク質、ポリペプチドを含む非常に多様な化合物に結合可能である抗体、抗体フラグメントまたはアプタマーで構成してもよい。捕獲エレメントはまた、一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドまたはそれらの合成変異体でもよく、これらは配列相補性および／または鎖侵入(strand invasion)を介して他のオリゴヌクレオチドを捕獲してもよい。さらに、捕獲エレメントはまた、分子の全クラスに対して反応性のある化学種でもよく、例えば、タンパク質、アミノ酸、オリゴヌクレオチドなどでもよく、検体が捕獲部位に共有結合できるようにする。
【００９７】
さらに一実施形態において、方法は、１つ以上の標識剤によってターゲット検体の標識化を達成する他のステップ（標識化ステップ）を含み、捕獲されたターゲット検体と１つ以上の標識剤との間に複合体(complex)が形成される。標識剤は、ターゲット検体と特異的に相互作用できるが、非ターゲット化合物ともより少ない程度で相互作用し得る。標識化反応は、バルク溶液中で生じてもよいが、液体区画中で生じてもよく、単一または少数のターゲット検体のみが液体区画内に固定化される。
【００９８】
標識剤は、例えば、抗体、抗体フラグメントまたはアプタマーで構成してもよいが、一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドまたはそれらの合成変異体でもよい。標識剤は、検体に結合するための領域、および信号を提供または促進するための他の領域を含んでもよい。あるタイプの標識剤は、酵素または任意の他の（生物）化学触媒に結合した結合領域によって構成でき、酵素または触媒は信号生成を促進できる。
【００９９】
バルク内で進行する標識化反応は、例えば、複数の捕獲部位を含有する固体基板を、標識剤を含有する溶液中に浸漬することによって、またはコロイドビーズの収集物（各ビーズは単一の捕獲部位を構成する）を標識剤の溶液中に浮遊させることによって生じてもよい。液体区画内で進行する標識化反応は、複数の液体区画を形成することによって生じてもよく、そこでは単一の液体区画は単一の捕獲要素を占有し、そして液体区画の液体が標識剤の溶液である。これは、（ｉ）ウェルが捕獲部位を構成するマイクロタイタープレートのウェルに標識剤の溶液を分配することによって、（ｉｉ）コロイドビーズをカプセル封入する油中水型エマルジョン液滴を調製することによって（単一のビーズが単一の捕獲部位であり、ビーズは標識剤と共にカプセル封入される）、または（ｉｉｉ）複数の個別の親水性捕獲部位を含有する固体疎水性基板を標識剤の水溶液に浸漬し、続いて溶液から基板を引き上げ、その結果、親水性捕獲部位の上／中に液滴が形成されることによって、達成される。
【０１００】
さらに一実施形態における方法は、単一または少数の固定化され標識化されたターゲット検体を収容する液体区画を生成し、１つ以上の標識剤を起動して検出可能な信号を生成するさらに他のステップ（検出ステップ）を含む。しかしながら、捕獲エレメントおよび標識剤の両方が非ターゲット化合物に対して親和性を示すことがあるため、（ｉ）捕獲され標識化された非ターゲット化合物の複合体、および（ｉｉ）非特異的に結合した標識剤を収容する区画も起動されて、検出可能な信号を生成することがある。
【０１０１】
さらにまた、一実施形態における方法は、検出可能な信号を示す液体区画の数および空間位置を記録するさらに他のステップ（記録ステップ）を含む。
【０１０２】
さらにまた、一実施形態における方法は、捕獲され標識化されたターゲット検体から、そして捕獲され標識化された非ターゲット化合物から１つ以上の標識剤を除去するさらに他のステップ（非活性化ステップ）を含む。さらに、この方法は、以前に信号を生成した全ての標識剤の信号を生成する能力を非活性化することを含む。
【０１０３】
さらにまた、一実施形態における方法は、１つ以上のステップを１回以上繰り返すことを含む。第２のステップは、前回ステップと同じ標識剤を適用してもよく、あるいは異なる特異性を示す他のタイプの標識剤も適用してもよい。
【０１０４】
一実施形態において、本方法は、記録ステップの各繰り返しの間に信号ポジティブ液体区画の空間位置を比較することによって終了する。こうしてターゲット検体は、非ターゲット化合物および非特異的に結合した標識剤と区別でき、理由は、標識剤は、ターゲット検体を好ましく標識化するように選択されているためである。よってターゲット検体を収容する液体区画は、信号を一貫して繰り返し発生する傾向が高くなり、一方、非ターゲット化合物および非特異的に結合した標識剤を収容する液体区画は、信号を繰り返す傾向が低くなる。
【０１０５】
一実施形態において、サンプルおよび複数の個別の捕獲部位を有する固相は、少なくとも１つの検体の捕獲前または捕獲中に区画化される。
【０１０６】
捕獲部位上の検体の捕獲前または捕獲中での区画化は、例えば、（ｉ）検体を含む溶液をマイクロタイタープレートのウェル（単一ウェルが捕獲部位である）に分配すること、（ｉｉ）油中水型エマルジョン液滴（各液滴は、検体を含む溶液およびコロイドビーズをカプセル封入する（ビーズは捕獲部位））を調製すること、または、（ｉｉｉ）複数の個別の親水性捕獲部位を含む固体疎水性基板を、検体を含有する水溶液に浸漬し、続いて溶液から基板の引上げを行い、検体を含有する液滴が親水性捕獲部位の上／中に形成されること、によって達成してもよい。
【０１０７】
一実施形態において、捕獲された検体および標識剤は、少なくとも１つの検体の標識化の前または標識化の間に区画化される。
【０１０８】
捕獲された検体の標識化の前または標識化の間の区画化は、例えば、（ｉ）標識剤を含有する溶液をマイクロタイタープレートのウェル（単一ウェルが捕獲部位であり、ウェルのいくつかが捕獲された検体を含む）に分配すること、（ｉｉ）油中水型エマルジョン液滴（各液滴は、コロイドビーズをカプセル封入し、ビーズは捕獲部位である）を調製すること、または、（ｉｉｉ）複数の個別の親水性捕獲部位を含む固体疎水性基板を、標識剤の水溶液に浸漬し、続いて溶液から基板の引上げを行い、標識剤を含有する液滴が親水性捕獲部位の上／中に形成され、捕獲部位のいくつかは捕獲された検体を含むこと、によって達成してもよい。
【０１０９】
一実施形態において、捕獲され標識化された検体は、区画化され、少なくとも１つの検体を含む液体区画を生成する。
【０１１０】
捕獲され標識化された検体は、例えば、（ｉ）疎水性基板上にある複数の親水性捕獲部位を浸漬して引上げること（捕獲部位のいくつかは液体中に捕獲され標識化された検体を含有し、液体区画は、親水性捕獲部位の表面上に形成できる）、（ｉｉ）捕獲され標識化された検体をカプセル封入する油中水型エマルジョン液滴を生成すること、または（ｉｉｉ）捕獲され標識化された検体を基板上のウェルに分配することによって、区画化でき、液体区画を生成してもよい。
【０１１１】
一実施形態において、検体は、ステップａ）の前に各検出サイクルにおける標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって、標識化される。
【０１１２】
一実施形態において、固相上の検体の捕獲前または捕獲中に標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって、捕獲された検体が標識化され、ステップｃ）は、追加の検出サイクルが行われる前に行われ、続いて再標識化ステップが行われ、捕獲された検体は標識剤を添加することによって標識化される。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、検体の標識化は、検体の捕獲前または捕獲と同時に実行してもよい。例えば、コロイドビーズ形態の捕獲部位は、（ｉ）検体が捕獲され、そして標識化される、または、（ｉｉ）検体が標識化され、そして捕獲されるように、標識剤および検体を含有する溶液と混合してもよい。他の例は、標識剤および検体を含有する溶液を、複数の個別の捕獲部位を収容する固体基板に注入して、標識化および捕獲が同時に生ずるようにしてもよい。
【０１１４】
ここに開示する実施形態において、液体区画のせいぜい９９％、例えば、、せいぜい９５％、せいぜい９０％、せいぜい８５％、せいぜい８０％、せいぜい最大７５％、せいぜい７０％、せいぜい６５％が、捕獲され標識化された検体を含む。
【０１１５】
定量的デジタル計数分析では、全ての捕獲部位が、捕獲され標識された検体を含まないことが好ましく、理由は、このことが全ての捕獲部位の飽和を導いて、全ての検体の正確な計数を阻害することがあるためである。正確な計数を達成するために、捕獲部位の少量は空にすべきであり、即ち、捕獲され標識化された検体を含まないようにすべきである。占有されおよび空の捕獲部位の最適分布に到達するために、関連したサンプルをいくつかの希釈で提供でき、それによって許容されまたは最適な分布を提供する希釈サンプルに対して計数を実行できる。空の捕獲部位の数を計数し、それを占有された捕獲部位の数と比較することによって、捕獲部位上の検体の総数は、統計的分析、例えば、ポアソン統計を用いることによって推定することが可能である。  
【０１１６】
ここで開示する実施形態において、サンプルは、ターゲット検体および非ターゲット化合物を含み、または潜在的に含み、ターゲット検体は、捕獲部位によって捕獲効率Ｃ１で捕獲され、非ターゲット化合物は、捕獲部位によって捕獲効率Ｃ２（Ｃ１≧Ｃ２）で捕獲され、ターゲット検体は、第１標識剤によって標識効率Ｌ１で標識化され、非ターゲット化合物は、第１標識剤によって標識効率Ｌ２（Ｌ１≧Ｌ２）で標識化され、検出サイクル数ＮＣは、下記の式で示す比αが、
【０１１７】
【数１】
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１〜１０の間、好ましくは１０〜１００の間、好ましくは１００〜１０００の間、好ましくは１０００〜１００００の間、好ましくは１０００〜１００００の間、好ましくは１００００〜１０００００の間、好ましくは１０００００より大きいように調整され、そして各検出サイクルは、標識化ステップにおいて第１標識剤を適用する。
【０１１８】
ここに開示する実施形態において、該方法は、偽ポジティブ検出サイクルを含み、標識化ステップにおいて第１標識剤の代わりに第２標識剤が適用され、非ターゲット化合物は、標識効率Ｌ１で第２標識剤によって標識化され、ターゲット検体は、第２標識剤によって標識効率Ｌ２（Ｌ１≧Ｌ２）で標識化される。ここに開示する実施形態において、サンプル中に存在する非ターゲット化合物の数は、偽ポジティブ検出サイクルにおいて信号を示す捕獲部位の数から推定される。ここに開示する更なる実施形態において、サンプル中に存在するターゲット検体の数は、偽ポジティブ検出サイクルの前の全ての検出サイクルにおいて、信号を繰り返し示す捕獲部位の数から、およびサンプル中に存在する非ターゲット化合物の推定された数から推定される。
【０１１９】
ここに開示する実施形態において、該方法は、偽ポジティブ検出サイクルを含み、該方法は、いずれの標識化ステップを含まない。
【０１２０】
偽ポジティブ検出サイクルは、非特異的に結合した標識剤に由来する偽ポジティブ信号を識別し、分析から廃棄することを可能にしてもよい。例えば、一実施形態において、偽ポジティブ検出サイクルの前に、捕獲された検体からの特異的な除去によって、特異的に結合した標識剤を非活性化してもよい。偽ポジティブ検出サイクルの間は、捕獲された検体に新たな標識剤が導入されることはなく、よって非活性化ステップ後に残留した非特異的に結合した標識剤のみが起動されて、信号を生成できる。
【０１２１】
ここに開示する実施形態において、標識剤は検出様式(modality)を含み、信号を起動するステップは、検出剤を検出様式に配給することによる。
【０１２２】
一実施形態において、検出様式は、検出剤を分子レポータに連続的に変換することが可能な酵素または（生物）化学触媒によって構成してもよい。分子レポータは、光信号、電気信号、磁気信号、または撮像検出器を使用して検出可能な任意の他の信号を生成してもよい。分子レポータが液体区画内の検出様式によって連続的に生成される場合、分子レポータの濃度は、区画内の検出可能な濃度に急速に達成できる。
【０１２３】
ここに開示する実施形態において、検出サイクルは、少なくとも１つの捕獲され標識化された検体からの信号を起動する前に、検体を標識化しなかった標識剤を続いて除去するステップを含む。
【０１２４】
標識剤は、例えば、迅速な結合動態を可能にするためになど、高濃度で捕獲された検体に添加してもよい。その結果、過剰の標識剤は、標識化または再標識化ステップに続いて洗浄(flushing)することによって除去してもよい。
【０１２５】
ここに開示する実施形態において、結合していないサンプル成分は、捕獲された検体または捕獲され標識化された検体から除去される。
【０１２６】
サンプルは、化学材料または生物学的材料の複雑な混合物で構成されもよいが、検体のみがデジタル計数分析にとって興味があってもよい。よって、結合していないサンプル成分は、例えば、洗浄またはリンス処理によって、捕獲された検体または捕獲され標識化された検体から除去してもよい。
【０１２７】
ここに開示する実施形態において、信号の非活性化ステップは、下記から選択される。
ａ）捕獲された検体から標識剤を分離するステップ。
ｂ）標識剤が信号を促進する能力を非活性化させるステップ。または、
ｃ）ａ）およびｂ）の組合せ。
ここで、信号の非活性化ステップの後、必要に応じてリンスステップが行われる。
【０１２８】
捕獲された検体からの標識剤の分離は、捕獲された検体に対する標識剤の結合能力を分裂することによって達成できる。分離は、例えば、温度を上昇させたり、捕獲され標識化された検体を収容する液体の化学的組成を変化させたり、または捕獲された検体から標識剤を生化学的もしくは化学的に切除することによって実行してもよい。分離プロセスが実行可能であるためには、捕獲部位への捕獲された検体の結合を分裂させるべきではない。分離に寄与する有用な化学物質は、種々のカオトロピック(chaotropic)物質（即ち、その存在がエントロピーの増加をもたらす物質）である。有用なカオトロピック剤は、例えば、ｎ−ブタノール、エタノール、塩化グアニジン、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２−プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、および尿素からなるグループから選択される。
【０１２９】
信号を介在する標識剤の能力の非活性化は、標識剤の検出様式を分裂することによって達成してもよい。例えば、検出様式が酵素で構成される場合、検出剤を分子レポータに変換する酵素の能力は分裂されるべきである。これは、通常、酵素の分子機構の知識を必要とするが、当業者に知られているいくつかの方法が存在する。例えば、アルカリホスファターゼ酵素をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理することにより非活性化でき、あるいは西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素をフェノール溶液で処理することにより非活性化できる。
【０１３０】
標識剤の分離は、特異的に結合した標識剤の選択的除去にとって有用となり得るが、標識剤の信号介在能力の非活性化は、非特異的に結合した標識剤から信号を除去するために有用となり得る。非特異的に結合した標識剤は、例えば、捕獲された検体ではなく、捕獲部位の表面に付着してもよく、こうして潜在的に標識剤を特定の分離手順に対して耐性にできる。その結果、非特異的に結合した標識剤の信号介在能力を非活性化することによって、標識剤は、後続の検出サイクルにおいて偽ポジティブ信号を生成しなくなる。
【０１３１】
ここに開示する実施形態において、該方法は、サンプルからの少なくとも１つの検体の捕獲は、固相への固定化による。
【０１３２】
ここに開示する実施形態において、該方法は、サンプルから少なくとも１つの検体の捕獲は、検体に特異的な１つ以上の捕獲プローブを使用することによるものであり、捕獲プローブは固相に付着されている。
【０１３３】
ここに開示する実施形態において、第１の数の検出サイクルおよび第２の数の検出サイクルが使用され、第１の数の検出サイクルは、第２の数の検出サイクルとは異なる標識剤を使用する。
【０１３４】
異なるタイプの捕獲された検体を標識化し、または同じタイプの捕獲された検体を異なる標識剤で標識化するためなど、異なる検出サイクルで異なるタイプの標識剤が使用できる。第１プロセスは、多数の異なる検体タイプの検出に有用になり、一方、前者のプロセスは、（ｉ）特定の検体の同一性を確認するため、または（ｉｉ）捕獲部位上の非ターゲット化合物の存在を定量化するために、有用になり得る。
【０１３５】
ここに開示する実施形態において、１つ以上の異なる検体タイプ用の１つ以上の異なる捕獲プローブが固相に付着している。
【０１３６】
複数の捕獲部位は、捕獲部位の領域または集合に分割してもよく、各領域または集合は、それに付着している捕獲プローブのタイプによって他のものと区別される。こうして非極めて多数の異なる検体タイプが捕獲され編成可能になり、デジタル計数分析が、同じ測定においていくつかの異なる検体タイプの定量化を可能にできる。
【０１３７】
ここに開示する実施形態において、１つ以上の異なる標識剤を使用して、１つ以上の異なる検体タイプを標識化する。
【０１３８】
一実施形態において、複数の捕獲部位が、異なる捕獲プローブを備えたいくつかの領域を示し、いくつかの検体タイプがいくつかの領域に捕獲されている場合、標識化または再標識化ステップの際、複数の捕獲部位を異なるタイプの標識剤の集合で補足することが有用となり得る。これは、複数の捕獲部位に存在する全ての異なる検体タイプの同時標識化を可能にし、よってデジタル計数分析の多重化能力を改善する。
【０１３９】
ここに開示する実施形態において、検出サイクルの数は、少なくとも３サイクル、少なくとも４サイクル、少なくとも５サイクル、少なくとも６サイクル、少なくとも７サイクル、少なくとも８サイクル、少なくとも９サイクル、または少なくとも１０サイクルである。
【０１４０】
ここに開示する実施形態において、検出サイクル数は、３〜２０サイクル、３〜１５サイクル、３〜１０サイクル、３〜９サイクル、３〜８サイクル、３〜７サイクル、３〜６サイクル、または３〜５サイクルである。
【０１４１】
ここに開示する実施形態において、標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、洗浄によって除去される。
【０１４２】
ここに開示する実施形態において、信号を非活性化するステップは、複数の液体区画において実施される。
【０１４３】
ここに開示する実施形態において、標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、分離は、酵素的開裂によるものである。
【０１４４】
ここに開示する実施形態において、標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、分離は、ｐＨを調整したり、イオン強度を調整したり、変性塩を添加し、または界面活性剤を添加することによって、化学的開裂または脱着によるものである。
【０１４５】
ここに開示する実施形態において、標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、分離は加熱によるものである。
【０１４６】
ここに開示する実施形態において、標識剤は、その化学的状態または物理的状態を変化させることによって非活性化される。
【０１４７】
ここに開示する実施形態において、標識剤は、酵素を含み、酵素の状態は、活性部位の化学的修飾または生化学的修飾によって変化する。
【０１４８】
ここに開示する実施形態において、標識剤は、酵素を含み、酵素の状態は、酵素の三次構造の化学的分裂または物理的分裂によって変化する。
【０１４９】
ここに開示する実施形態において、捕獲され標識化された検体は、親水性液体を複数の個別の捕獲部位に導入して引き出すことによって区画化されて、捕獲され標識化された検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位は親水性にされており、複数の個別の捕獲部位が疎水性基板上に配置され、そのため親水性液体を引き出す際、複数の液滴が形成され、各液滴が１つの個別の捕獲部位を占有する。
【０１５０】
ここに開示する実施形態において、捕獲され標識化された検体は、複数の個別の捕獲部位に第１親水性液体を導入し、続いて第１親水性液体を第２液体と置換することによって区画化されて、検体を収容する液体区画を生成し、２つの液体は非混和性であり、第２液体は第１液体よりも軽く、各個別の捕獲部位が親水性にされており、複数の個別の捕獲部位が疎水性基板上に配置され、そのため第１親水性液体を第２液体と置換する際、第１親水性液体を含む複数の液滴が形成され、各液滴は１つの個別の捕獲部位を占有する。
【０１５１】
ここに開示する実施形態において、捕獲され標識化された検体は、第１液体を複数の個別の捕獲部位に導入することによって区画化されて、検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位はウェル形状または毛細管形状であり、第１液体は第２液体と置換され、２つの液体は非混和性であり、第２液体は第１液体よりも軽く、そのため第１液体の置換の際、第１液体を含む複数の液滴が形成され、各液滴は１つの個別の捕獲部位を占有する。
【０１５２】
ここに開示する実施形態において、捕獲され標識化された検体は、液体を複数の個別の捕獲部位に導入することによって区画化されて、検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位はウェル形状または毛細管形状であり、液体は個別の捕獲部位に分配され、そのため各液体区画は１つの個別の捕獲部位を占有する。
【０１５３】
ここに開示する実施形態において、捕獲され標識化された検体は、液体を複数の個別の捕獲部位に導入することによって区画化されて、検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位はウェル形状であり、液体は、蓋を複数の捕獲部位の上に付与することによって置換され、そのため複数の捕獲部位が形成され、各液滴は、蓋によって境界設定された１つのウェル形状の捕獲部位を占有する。
【０１５４】
ここに開示する実施形態において、捕獲され標識化された検体は、複数の個別の捕獲部位および捕獲され標識化された検体を含む第１液体を第２液体に導入することによって区画化されて、捕獲され標識化された検体を収容する液体区画を生成し、第２液体は第１液体と非混和性であり、そのため第１液体で構成され、第２液体によって包囲された複数のエマルジョン液滴が形成され、各エマルジョン液滴は、少なくとも１つの個別の捕獲部位および少なくとも１つの捕獲され標識化された検体を含む。
【０１５５】
ここに開示する実施形態において、各検出サイクルにおいて信号を示す液体区画の位置は、他の検出サイクルにおいて信号を示す液体区画の位置と比較され、その結果、液体区画が信号を示す連続的な検出サイクルの数が計数され、液体区画は、少なくとも２つのカテゴリーに分類され、液体区画の第１カテゴリーは第２カテゴリーよりも多い計数を示す。
【０１５６】
液体区画が信号を示す回数は、区画内での捕獲された化合物の同一性に関連している。例えば、検体が捕獲された捕獲部位および非ターゲット化合物が捕獲された別の捕獲部位を考える。検体はオリゴヌクレオチドでもよく、その配列は、単一ヌクレオチド多型など、一塩基対変化を含み、そして非ターゲット化合物は、検体と同じ配列を有するが、単一ヌクレオチド多型を有さず、即ち、野生型配列を有するオリゴヌクレオチドでもよい。本実施形態において、両方の捕獲部位が検体に特異的な標識剤を受容した場合、検体は優先的に標識化される。しかしながら、非ターゲット化合物もまた標識化されてもよいが、効率は低い。このようにターゲット検体を収容する液体区画は、検出サイクルの全てまたは大部分において信号を示すことがあり、そして非ターゲット化合物を収容する液体区画は、検出サイクルの全てまたは大部分において信号を示さない。各液体区画が信号を示した検出サイクル数を比較することによって、検体を収容する区画は、非ターゲット化合物を収容する区画から区別可能になる。
【０１５７】
ここに開示する実施形態において、連続検出サイクルにおいて信号を繰り返し示す液体区画の数は、サンプル中のターゲット検体の濃度を計算するために適用される。
【０１５８】
ここに開示する実施形態において、個別の捕獲部位の数は、少なくとも１０００個、好ましくは少なくとも１００００個、好ましくは少なくとも１０００００個、好ましくは少なくとも１００００００個、好ましくは少なくとも１０００００００個である。
【０１５９】
ここに開示する実施形態において、個別の捕獲部位は、円形または球状であり、個々の個別の部位の直径は、１ｍｍ未満、好ましくは１００μｍ未満、好ましくは１０μｍ未満、好ましくは１μｍ未満である。
【０１６０】
円形の捕獲部位は、固体基板の化学的パターニングまたは地形学的パターニングによって形成してもよく、一方、球状の捕獲部位は、コロイドビーズの集合体によって構成してもよい。
【０１６１】
ここに開示する実施形態において、個別の捕獲部位は、円形または球状であり、個別の部位の直径は、０．５〜５μｍ、０．５〜１０μｍ、０．５〜５０μｍ、０．５〜１００μｍ、１０〜１０００μｍ、５０〜１０００μｍ、１００〜１０００μｍの間である。
【０１６２】
ここに開示する実施形態において、個別の捕獲部位は、正方形(quadratic)であり、個別の部位の長さは、１ｍｍ未満、好ましくは１００μｍ未満、好ましくは１０μｍ未満、好ましくは１μｍ未満である。
【０１６３】
ここに開示する実施形態において、個別の捕獲部位は、正方形(quadratic)であり、個別の部位の長さは、０．５〜５μｍ、０．５〜１０μｍ、０．５〜５０μｍ、０．５〜１００μｍ、１０〜１０００μｍ、５０〜１０００μｍ、１００〜１０００μｍの間である。
【０１６４】
ここに開示する実施形態において、固相は、下記のものである。
ａ）固体基板、
ｂ）コロイドビーズ、または、
ｃ）コロイドビーズの集合体。
【０１６５】
ここに開示する実施形態において、液体区画は、気相シール下の複数の液体ナノリットルからアトリットル液滴の形態である。
【０１６６】
ここに開示する実施形態において、液体区画は、ウェル形状の捕獲部位、空洞形状の捕獲部位、または毛細管形状の捕獲部位を占有する。
【０１６７】
ここに開示する実施形態において、液体区画は、複数の油中水型エマルジョン液滴の形態である。
【０１６８】
ここに開示する実施形態において、液体区画は、水非混和性の液相の下で複数の水性ナノリットルからアトリットル液滴の形態である。
【０１６９】
ここに開示する実施形態において、デジタル計数は、サンプル中の１つ以上の検体タイプのデジタル計数のためのフローシステムにおいて行われ、フローシステムは、疎水性基板の内または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備え、疎水性基板は、少なくとも１つの開口を含むフロー区画内に埋め込まれ、親水性機構は、最大液滴体積をそれぞれ有する複数の液体ナノリットルからアトリットル液滴を支持するように構成され、そしてフロー区画は、各ナノリットルからアトリットル液滴の蒸発を低減する気相シールを支持するように構成される。
【０１７０】
ここに開示する実施形態において、気相シールは、マイクロ液滴の蒸発を低減できるフローシステム内の蒸気圧を確立する。
【０１７１】
ここに開示する実施形態において、気相シールは、各ナノリットルからアトリットル液滴の蒸発を最大液滴体積の５０パーセント未満まで減少させる。
【０１７２】
一実施形態において、ここに開示する方法は、（ｉ）疎水性基板の内または上にある親水性機構のパターンを、１つ以上の検体タイプを含むサンプルと接触させるステップを含む。
【０１７３】
一実施形態において、ここに開示する方法は、（ｉｉ）親水性機構の上に１つ以上の検体タイプを捕獲するステップを含む。
【０１７４】
一実施形態において、ここに開示する方法は、（ｉｉｉ）少なくとも１つの捕獲された検体タイプを、検出対象の検体タイプに特異的な標識剤で標識化するステップを含む。
【０１７５】
ここに開示する実施形態において、捕獲され標識化された検体は、検出剤を、パターンを横断するように流し、パターンから引き出して、個々の液滴をナノリットルからアトリットル液滴の形態に生成するステップ（ｉｖ）によって、区画化されて、少なくとも１つの検体を収容する液体区画を生成する。
【０１７６】
ここに開示する実施形態において、該方法は、標識剤と検出剤の両方を収容する液滴の数を計数するステップ（ｖ）を含む。
【０１７７】
ここに開示する実施形態において、該方法は、ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を１回以上繰り返すことを含む。
【０１７８】
ここに開示する実施形態において、該方法は、第１標識剤の代わりに、検出対象の第２検体タイプに特異的な第２標識剤を使用することによって、ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を繰り返すことを含む。
【０１７９】
ここに開示する実施形態において、該方法は、ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を繰り返す前に、前回のステップに存在する標識剤を非活性化させるステップを含む。
【０１８０】
ここに開示する実施形態において、標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、そしてフローシステムの洗浄によって除去される。
【０１８１】
ここに開示する実施形態において、標識剤は、酵素および特定の検体認識部位(moiety)を含み、検体認識部位は、下記の分子グループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、それらの複合体またはそれらの合成変異体から選択される。
【０１８２】
ここに開示する実施形態において、個別の捕獲部位は、親水性機構である。
【０１８３】
ここに開示する実施形態において、１つ以上の異なる検体タイプのための１つ以上の捕獲プローブが、親水性機構に付着している。
【０１８４】
ここに開示する実施形態において、該方法は、親水性機構に付着した２つ以上のタイプの捕獲プローブを含み、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域内に配置される。
【０１８５】
ここに開示する実施形態において、捕獲プローブは、下記のプローブグループ、即ち、オリゴヌクレオチド、アプタマー、タンパク質、抗体、ペプチドまたはそれらの合成変異体から選択される。
【０１８６】
ここに開示する実施形態において、液体中に１つ以上のタイプの検体を含有するサンプルは、完全浸漬によって親水性機構を含む基板と接触する。
【０１８７】
ここに開示する実施形態において、標識化は、検体のための標識剤を含有する溶液を、捕獲された検体と完全浸漬によって接触させることによって行われる。
【０１８８】
ここに開示する実施形態において、検体は、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、単一ヌクレオチドの多型、挿入または欠失など、１つ以上の塩基対変化を有するゲノム配列または転写ゲノム配列である。
【０１８９】
ここに開示する実施形態において、検体は、下記の検体グループ、即ち、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質、タンパク質／オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質／脂質複合体、ペプチド、エキソソーム、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ナノ粒子、細胞断片または細胞から選択される。
【０１９０】
ここに開示する実施形態において、サンプルは、全血、血漿または血清に由来する。
【０１９１】
ここに開示する実施形態において、サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織から選択される。
【０１９２】
ここに開示する実施形態において、サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織、の研究室処理サンプルから選択される。
【０１９３】
ここに開示する実施形態において、デジタル計数分析は、単一分子の検出と定量化の両方を含む。
【０１９４】
ここに開示する実施形態において、捕獲された検体は、捕獲の後に捕獲プローブと共有結合するようになる。
【０１９５】
捕獲された検体と固相との間の共有結合は、信号を非活性化するステップの際に捕獲された検体が固相から分離しないことを確保する。一実施形態において、非活性化ステップは、捕獲された検体から標識剤を除去するように機能するが、捕獲された検体を固相上に保存するような方法で実施されるべきである。共有結合は、大部分の条件下で捕獲された検体を固相上に保持するのに充分に強いため、標識剤を分離するために適用される条件に関してより高い柔軟性を提供できる。
【０１９６】
ここに開示する実施形態において、捕獲プローブは、オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドであり、検体は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む分子複合体であり、検体は、捕獲プローブ配列に対して相補的な配列を介して捕獲プローブと結合され、共有結合架橋は、鎖間架橋剤、例えば、白金錯体、マイトマイシンＣ、ナイトロジェンマスタード、ソラレンまたはアルデヒドなどを使用することによって実行される。
【０１９７】
ここに開示する実施形態において、捕獲プローブは、タンパク質、アプタマー、ペプチドまたはその合成変異体であり、検体は、タンパク質、ペプチドまたは、タンパク質もしくはペプチドを含む複合体であり、検体は、検体の特異領域の構造的認識によって捕獲プローブに結合され、共有結合架橋は、化学固定剤、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、メチルグリオキサールまたは酢酸ウラニルなどを使用することによって実行される。
【０１９８】
ここに開示する実施形態において、捕獲プローブは、合成オリゴヌクレオチドであり、合成修飾は、捕獲の後に検体と捕獲プローブとの間に共有結合が確立できるように検体に対して反応性の化学基を組み込む。ここに開示する実施形態において、検体と捕獲プローブとの間の共有結合は、検体／捕獲プローブ複合体を化学物質と接触させることによって起動される。ここに開示する実施形態において、検体と捕獲プローブとの間の共有結合は、検体／捕獲プローブ複合体を電磁放射線と接触させることによって起動される。
【０１９９】
ここに開示する実施形態において、分析は、単一分子デジタル計数分析である。ここに開示する更なる実施形態において、デジタル計数測定は、単一酵素結合分子分析（ＳＥＬＭＡ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）、単一酵素結合免疫吸着法（ｓＥＬＩＳＡ）またはデジタル単一酵素結合免疫吸着法（ｄＥＬＩＳＡ）を含む。
【０２００】
ここに開示する実施形態において、少なくとも１つの検体は、オリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、単一ヌクレオチドの多型、挿入または欠失など、１つ以上の塩基対変化を有するゲノム配列または転写ゲノム配列であり、サンプルは、潜在的に、２つ以上の非ターゲットオリゴヌクレオチドを含み、非ターゲットオリゴヌクレオチドは、ターゲットと同じゲノム配列または転写されたゲノム配列を有するが、１つ以上の塩基対変化を伴わない。
【０２０１】
ここに開示する実施形態において、サンプルは、第１および第２検体タイプを含み、第１検体タイプはサンプル中に第１配列および第１濃度を有し、第２検体タイプはサンプル中に第２配列および第２濃度を有し、第１配列および第２配列は異なり、第１および第２配列はゲノム配列または転写されたゲノム配列であり、ここに開示するように、第１および第２濃度は測定され、互いに比較してコピー数の変動を識別する。
【０２０２】
ここに開示する実施形態において、気相は、大気によって提供され、捕獲プローブは一本鎖ＤＮＡオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択され、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置され、検体は、処理した血液サンプルから抽出された一本鎖ＤＮＡであり、標識剤は、検出様式(modality)および認識部位を備え、検出様式は酵素であり、認識部位は、一本鎖ＤＮＡオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択される。
【０２０３】
デジタル計数測定は、単一検体分子が直接に検出可能であり、よってサンプル中のその濃度を決定するように計数可能にする。デジタル計数測定は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）、デジタル酵素結合免疫吸着法（ｄＥＬＩＳＡ）、およびその変形において適用される。ｄＰＣＲでは、単一ヌクレオチド検体が反応区画に隔離され、ポリメラーゼ支援ヌクレオチド増幅およびアンプリコン(amplicon)の蛍光標識化に曝される。ｄＥＬＩＳＡでは、単一タンパク質／ペプチド検体がマイクロコロイド粒子の表面に捕獲され、酵素標識抗体(enzyme-conjugated antibody)を用いて標識化され、顕微鏡的反応区画に隔離され、検出試薬が供給される。検出試薬は、酵素によって処理された場合、光学信号（例えば、蛍光、化学発光、吸光度）を発生し、これは、反応区画の顕微鏡的体積に起因して検出可能濃度に迅速に到達する。デジタル計数測定の原理は、図８において概説している。
【０２０４】
ここで開示する実施形態において、ここで説明するようなフローシステムを用いて所定の検体のデジタル計数測定を実行するには、少なくとも下記の３つの一般ステップが必要であり、即ち、（１）検体捕獲、（２）検体標識化、（３）検体計数、例えば、図９の略図を参照。ステップ１において、サンプルからの検体は、親水性機構の上に特異的に捕獲される状態になる。ステップ２において、捕獲された検体は、適切な薬剤、例えば、酵素複合体(enzyme-conjugate)を用いて特異的に標識化される状態になる。ステップ３において、マイクロ液滴のアレイは、液体が検出剤を含むように形成される。標識剤が酵素である場合、検出剤は、酵素のための蛍光性／発色性／化学発光性の基板にできる。基板の処理時に、検出可能な光学信号が液滴中に生成され、これは、標識剤および検出試薬の両方を初期に抱えていた。次に、信号を生成する液滴が、アレイの光学イメージングによって計数できる。
【０２０５】
一実施形態において、フローシステムは、１つ以上の区別できる検体タイプのための１つ以上の捕獲プローブを備え、捕獲プローブは、親水性機構に付着される。更なる実施形態において、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置される。
【０２０６】
ｄＰＣＲおよびマイクロコロイド支援ｄＥＬＩＳＡに対する本発明の利点が、検体が親水性機構の上に特異的に捕獲、編成される状態になれることである。これは、（ｉ）単一測定でのいくつかの異なる検体タイプを測定する場合、および（ｉｉ）繰り返し測定が要望される場合に評価される。
【０２０７】
第１のケースでは、異なる捕獲プローブがフロー区画内の異なる領域に配置でき、そのため一方の検体タイプに特異的な捕獲プローブが第１領域に局所化され、他の検体タイプに特異的な他の捕獲プローブが第２領域に局所化され、以下同様である。これは、数百のターゲット検体が単一測定で検出できるＤＮＡおよびタンパク質のマイクロアレイ研究の分野において周知の戦略であり、例えば、文献（Weinrich, D. et al entitled "Applications of Protein Biochips in Biomedical and Biotechnological Research" published in Angewandte Chemie International Edition (2009), vol. 48, pp. 7744-7751. (DOI: 10.1002/anie.200901480)）を参照。
【０２０８】
第２のケースでは、標識剤および検出剤を除去し、これらをフローシステムに再導入することによって、デジタル計数を繰り返すことが可能である。捕獲した検体は、親水性機構の上に固定された状態で残留し、例えば、信号対ノイズ比を改善するために、デジタル計数測定を繰り返すことができ、例５を参照。これは、ｄＰＣＲまたはｄＥＬＩＳＡでは可能ではなく、その理由は、検体を除去することなく、標識剤および検出剤が除去できないためである。
【０２０９】
一実施形態において、１つ以上の区別できる検体タイプのための１つ以上の捕獲プローブは、リンカー(linker)部位によって親水性機構に付着される。リンカー分子は、多くの場合、親水性機構の硬い無機表面を柔軟な有機捕獲プローブに接続するように機能する。こうしてリンカー分子は、捕獲プローブを表面に接続するために、二重化学官能性を含むことができる。リンカー分子は、ポリ（エチレン−グリコール）ポリマーであるように選択でき、これは柔軟かつ不活性で親水性である。これらはまた、直線アルカン鎖であるように選択できる。ポリ（エチレングリコール）リンカーは、異なるサイズ／長さに調製でき、よって表面と捕獲プローブとの間により大きい分離を提供し、一方、アルカン鎖は一般的により短い。他のリンカー分子は、これに限定されないが、ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドを含む。リンカー分子に存在する化学官能性は、反応性化学基、例えば、アルデヒド、アルキン、アミン、アジド、ビオチン、Ｂｏｃ／Ｆｍｏｃ保護アミン、カルボン酸、エポキシド、ヒドラジド、ヒドロキシル、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、チオール、ビニルスルホンおよびその変異体などの大きな選択から選択できる。
【０２１０】
一実施形態において、２つ以上のタイプの捕獲プローブが親水性機構に付着され、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置される。一実施形態において、捕獲プローブは、下記のプローブグループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、またはその合成変異体から選択される。
【０２１１】
捕獲プローブがオリゴヌクレオチドである場合、プローブは、他のオリゴヌクレオチドを捕獲することができ、これは、相補配列を捕獲プローブのそれに提示する。合成オリゴヌクレオチド変異体、例えば、ロックド(locked)核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）などは、ストランド侵入特性を示し、一本鎖または二本鎖のＤＮＡを捕獲するためにも利用できる。アプタマー(aptamer)も、タンパク質またはペプチドの捕獲を可能にする捕獲プローブとして利用できる。さらに、抗体または抗体の断片が、タンパク質、ペプチドまたは小分子の特異的捕獲に介在するために、捕獲プローブとして使用できる。
【０２１２】
ここで開示する実施形態において、方法はさらに、（ｉ）疎水性基板の中または上にある親水性機構のパターンを、１つ以上の検体タイプを含むサンプルに接触させるステップを含む。
【０２１３】
ここで開示する実施形態において、方法はさらに、（ｉｉ）親水性機構の上で少なくとも１つの検体タイプを捕獲するステップを含む。
【０２１４】
多数の検体タイプが、親水性機構の上で捕獲することができ、これらは、より詳細に前述したように、（生）化学的機能化が施されている。例えば、オリゴヌクレオチド系検体、例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、バクテリアＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ−複合体またはタンパク質／ＤＮＡ／ＲＮＡ−複合体などを特異的に捕獲するためには、相補オリゴヌクレオチド配列を提示するオリゴヌクレオチド系捕獲プローブを検体のものに付与することが必要であろう。タンパク質系またはペプチド系の検体またはその複合体を特異的に捕獲するためには、抗体系またはアプタマー系の捕獲プローブを付与することが必要であり、これは検体の三次構造、即ち、抗原／抗体会合を特異的に認識する。全体の生物学的実体またはマクロ分子集合体、例えば、細胞、バクテリア、ウイルス、ウイルス様粒子、ナノ粒子、または細胞断片などを含む検体は、検体によって提示された抗原を特異的にターゲットにする抗体を使用することによって、同じ方法で捕獲できる。代替として、上述した検体タイプは、捕獲プローブの支援なしで捕獲できるが、代わりにマイクロ液滴のサイズ（即ち、ＶＤ値）を検体のサイズに整合させることによって捕獲でき、そのため１つの検体だけが液滴の中に存在できるようになる。
【０２１５】
さらに、捕獲プローブは、捕獲に介在するヘルパープローブを用いて補完でき、そのためヘルパープローブは、最初に検体に特異的に結合し、次に表面で捕獲プローブに特異的に結合し、こうして繋留綱(tether)として機能する。例えば、図９の略図を参照。
【０２１６】
さらに、上述した検体タイプの全ては、ヘテロ二機能性化学架橋結合剤を用いて親水性機構の上で非特異的に捕獲でき、そのため架橋結合剤の一端が検体に結合し、他端が表面に結合する。
【０２１７】
ここで開示する実施形態において、方法はさらに、（ｉｉｉ）少なくとも１つの捕獲された検体タイプを、検出される検体タイプに特異的な標識剤を用いて標識化するステップを含む。
【０２１８】
標識剤は、検体の特異的標識化に介在するために、捕獲プローブと同じ方法で選択することができる。例えば、検体がオリゴヌクレオチドである場合、捕獲プローブおよび標識剤の両方が、オリゴヌクレオチドまたはその合成変異体でもよい。この場合、捕獲プローブは、検体上の一方の特異配列を認識でき、標識剤は、他方の特異配列を認識できる。標識剤は、検体の特異認識のための一方のモジュールおよび検体の後続検出のための他方のモジュールを含んでもよい。標識剤の少なくとも３つのクラスがこれらの基準、即ち、酵素共役オリゴヌクレオチド、酵素共役タンパク質／ペプチドまたは酵素共役アプタマーを成就する。検体認識モジュールは、オリゴヌクレオチド、タンパク質／ペプチドまたはアプタマーによってそれぞれ提供され、一方、検出モジュールは、酵素によって提供される。
【０２１９】
ここで開示する実施形態において、方法はさらに、（ｉｖ）検出剤を、パターンを横断して流し、パターンから引き出して、個々の液滴をナノリットルからアトリットルの液滴の形態に生成するステップを含む。
【０２２０】
検出剤を含む水性マイクロ液滴の形成とともに、標識剤および検出剤の両方を提示する液滴のサブセットにおいて信号発生を起動することが可能である。標識剤が酵素を含む場合、適切な検出試薬が、酵素的処理に応答して光学信号を発生できる任意の適合した酵素基板でもよい。例えば、酵素がペルオキシダーゼのクラスに属する場合、適切な検出剤は、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］−二アンモニウム塩）、ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）、そして下記の商標名製品Ｑｕａｎｔａｂｌｕ、ＱｕａｎｔａＲｅｄ、Ａｍｐｌｅｘ  ＵｌｔｒａＲｅｄまたはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  ｐｉｃｏ／ｆｅｍｔｏを含む。酵素がホスファターゼのクラスに属する場合、適切な検出剤は、ＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェノールりん酸）、４−ＭＵＰ（りん酸４−メチルウンベリフェリル）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルりん酸／ニトロブルーテトラゾリウム）、そして下記の商標名製品ＣＳＰＤ、ＣＰＤ  ＳｔａｒまたはＤｙｎａｌｉｇｈｔを含む。酵素がガラクトシダーゼのクラスに属する場合、適切な検出剤は、ＦＤＧ（フルオレセイン−ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ＤＤＡＯガラクトシド（９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、レソルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、そして下記の商標名製品Ｇａｌａｃｔｏｎ−ＳｔａｒまたはＢｌｕｏ−Ｇａｌを含む。さらに、任意のＥＬＩＳＡ適合酵素／基板のペアが適用できる。
【０２２１】
ここで開示する実施形態において、方法はさらに、（ｖ）標識剤および検出剤の両方を収容する液滴の数を計数するステップを含む。
【０２２２】
光学信号を示す液滴の計数は、例えば、光学顕微鏡などのイメージングデバイスの支援で最も便利に実行される。顕微鏡を用いて、個々の液滴が画像化でき、その信号レベルが顕微鏡写真の相対強度単位から評価される。信号が実際に化学発光または蛍光である場合、撮影した顕微鏡写真は、蛍光フィルタセットを用いて記録できる。さらに、例４に示すように、蛍光顕微鏡写真は、同じ位置で撮影した明視野顕微鏡写真を用いて補完でき、例えば、液滴の位置および外観を確認して、それを蛍光信号の位置と相関させる。
【０２２３】
信号が実際に比色分析的である場合、撮影した顕微鏡写真は、明視野顕微鏡イメージングによって記録でき、例えば、個々の液滴の吸光度、反射率または透過率を評価する。
【０２２４】
液滴アレイが大きなエリアをカバーし、単一の顕微鏡写真の視野がそれを含むことができない場合、いくつかの顕微鏡写真がいくつかの位置で記録して、アレイ全体を表示するより大きい顕微鏡写真を再構成できる。イメージング再構成（例えば、顕微鏡写真繋ぎ合せ(stitching)）を案内するために、容易に認識可能なマイクロパターンをアレイ上に組み込んでもよい。
【０２２５】
ここで開示する実施形態において、方法はさらに、ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）を１回以上繰り返すことを含む。
【０２２６】
ここで開示する実施形態において、方法はさらに、ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）を１回以上繰り返すことを含む。
【０２２７】
ここで開示する実施形態において、方法はさらに、ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）を繰り返す前に、前回ステップに存在する標識剤を不活性化するステップを含む。
【０２２８】
標識化し、検出試薬を追加し、信号ポジティブ液滴を計数するステップを繰り返す能力は、ＳＥＬＭＡ測定の特有の特性であり、これは少なくとも２つの利点を提示する。
【０２２９】
第１に、前回測定から標識剤および検出剤を除去し、続いてこれらを再導入することによって、信号対ノイズ比が増加できる。これは、標識剤が、存在する検体なしで、親水性機構の表面に非特異的に結合できるという事実に起因する。非特異的に結合した標識剤は、計数測定においてバックグランドノイズを含み、潜在的に低い信号対ノイズ比をもたらす。しかしながら、非特異的な結合は、アレイ上のランダム位置で起こり、一方、検体への特異的結合は、存在する検体を有するアレイ機構の上で起こるため、２つの結合モードは、繰り返し測定によって区別できる。繰り返し測定において、非特異的な結合を示すだけの液滴が、測定が繰り返されるたびにポジティブ信号を提供できず、一方、特異的結合を示す液滴が、ポジティブ信号を毎回提供できる。こうしてバックグランドノイズは、著しく低減でき、こうしてより大きい測定感度をもたらす。
【０２３０】
第２に、前回測定から第１検体タイプに特異的な標識剤および検出剤を除去し、続いて他の検体タイプに特異的な標識剤および検出剤を導入することによって、より高い多重化容量を提供できる。この場合、測定は繰り返されるごとに、検体タイプの新しいセットが計数される。例えば、アレイが、１０個の異なる検体タイプに特異的な捕獲プローブを用いて機能化された場合、測定を１０回繰り返すことによって（各回ごとに新しい標識剤および検出剤を導入する）、全部で１０個の検体が定量化できる。
【０２３１】
ここで開示する実施形態において、標識剤は、表面結合した検体からの脱離によって不活性化され、フローシステムの洗浄(flushing)によって除去される。
【０２３２】
当業者に知られているように、分子プローブを不活性化する多数の手法が存在する。ＳＥＬＭＡ測定の場合、最も便利な手法は、検体から標識剤を解放しつつ、捕獲プローブに結合した検体を保持することに依拠する。いったん標識剤が脱離すると、それは、リンス溶液を用いてフローチャネルを洗浄することによって除去できる。検出剤は、アレイ表面に結合することを意図していないため、より容易に除去され、よって脱離ステップを必要としない。
【０２３３】
ここで開示する実施形態において、標識剤は、酵素的切断によって脱離される。
【０２３４】
捕獲プローブ、検体および標識剤がオリゴヌクレオチドである場合、エクソヌクレアーゼ処置によって標識剤を特異的に除去することが可能である。エクソヌクレアーゼは酵素であり、二本鎖ＤＮＡ、例えば、検体と標識剤との間の相補配列を分解する。捕獲プローブを、エクソヌクレアーゼ処置に対して不活性にすることによって（例えば、ペプチド核酸、ロックド核酸または化学的に修飾された一本鎖ＤＮＡを捕獲プローブとして選択することによって）、検体と標識剤との間の結合だけが分断できる。
【０２３５】
一実施形態において、標識剤は、例えば、ｐＨ、イオン強度を追加または調整し、塩または洗浄剤を変性させることによって、化学的切断または脱着によって脱離される。
【０２３６】
一実施形態において、標識剤は、フローシステムの温度を上昇させることによって脱離される。
【０２３７】
一実施形態において、標識剤は、その化学的または物理的な状態を変化させることによって不活性化される。
【０２３８】
実施形態において、検体および標識剤が両方ともオリゴヌクレオチドであり、塩基対配列相補性によって互いに結合している場合、溶液のｐＨまたはイオン強度を変化させることによって、標識剤を特異的に除去することが可能である。例えば、ｐＨが上昇した場合、ＤＮＡの二本鎖構造は、核酸塩基の脱プロトン化に起因して分断される。さらに、二本鎖ＤＮＡの脱離はまた、溶液のイオン強度を減少させることによって達成でき、こうしてＤＮＡ骨格で帯電したリン酸基の間の静電反発力を増強する。さらに、温度を二本鎖ＤＮＡの融解転移より上に増加させることによって、検体からの標識剤の分離をもたらすことができる。
【０２３９】
実施形態において、検体および標識剤がタンパク質系またはペプチド系である場合、標識剤は、洗浄剤を使用し、塩を変性させ、または温度を増加させることによって、三次構造を分断／変性させることによって脱離できる。
【０２４０】
一実施形態において、標識剤は酵素を含み、標識剤は、活性部位の化学的または生化学的修飾によって酵素の状態を変化させることによって不活性化できる。
【０２４１】
酵素は、活性部位を分断することによって不活性化でき、そのため更なる酵素的処理は可能ではない。例えば、酵素がペルオキシダーゼ酵素のクラスに属する場合、活性部位は、フェノール溶液に曝された場合、不可逆的に分断された状態になる。例えば、文献（Mao, L., Luo, S., Huang, Q. and Lu, J. in "Horseradish peroxidase inactivation: Heme destruction and influence of polyethylene glycol" published in Scientific Reports, vol. 3, article number 3126 (2013) (DOI: 10.1038/srep03126)）を参照。さらに、酵素がホスファターゼ酵素のクラスに属する場合、活性部位は、機能する亜鉛およびマグネシウムイオン複合体を必要とする。その結果、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を用いてこれらのイオンの除去によって、酵素の不可逆的不活性化、即ち、酵素活性の終止をもたらす。例えば、文献（Ackermann, B. P. and Ahlers, J. in "Kinetics of alkaline phosphatase from pig kidney. Influence of complexing agents on stability and activity" published in Biochemical Journal, vol. 153, pp. 151-157 (1976) (DOI: 10.1042/bj1530151)）を参照。
【０２４２】
一実施形態において、標識剤は酵素を含み、酵素の状態は、酵素の三次構造の化学的または物理的分断によって変化する。
【０２４３】
例えば、酵素の構造は、溶液の温度を増加させることによって、ｐＨを増加または減少させることによって、溶液のイオン強度を増加または減少させることによって、洗浄剤を追加することによって、または化学架橋結合剤を使用して酵素を共有結合的に修飾することによって変化できる。
【０２４４】
一実施形態において、標識剤は、酵素および特異検体認識部位を含み、検体認識部位は、下記の分子グループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、その複合体またはその合成変異体から選択される。
【０２４５】
一実施形態において、液体中に１つ以上の検体タイプを含むサンプルは、完全浸漬によって親水性機構を含む基板と接触させられる。
【０２４６】
一実施形態において、方法はさらに、液体を除去し、基板を洗浄することを含む。
【０２４７】
一実施形態において、標識化は、完全浸漬によって、検体用の標識剤を含む溶液を、捕獲した検体と接触させることによって実施される。
【０２４８】
一実施形態において、方法はさらに、残りの標識剤を含む溶液を除去し、基板を洗浄することを含む。
【０２４９】
ここで開示する実施形態において、親水性機構を収容する基板はフロー区画の内側に位置し、こうして入口から出口への液体プラグの圧力駆動の作動によって液体接触を可能にする。異なる試薬を含む異なる溶液（標識剤、検出剤、不活性化剤、リンス溶液）は、液体装填パッドに装填でき、フロー区画の中に駆動される。液体接触モードは、（ｉ）フロー経由接触として、または（ｉｉ）注入−停止−引き出し接触として分類できる。フロー経由接触モードでは、プラグの全体体積が通過するまで、液体プラグがフロー区画を横断して駆動される。注入−停止−引き出し接触モードでは、フロー区画の全体体積を充填し、そして停止するまで、液体プラグが駆動される。一定の待機期間に続いて、プラグはフローチャネルから押し出され、液体出口に入る。
【０２５０】
フロー経由接触モードは、典型的には試薬が過剰である反応ステップに適している。こうしたステップの持続期間は、フローレート（体積／時間）および液体プラグの体積によって決定でき、必要な処理時間を達成するように調整できる。例えば、リンスステップ、標識化ステップ、不活性化ステップおよび検出ステップなどのステップは、典型的にはフロー経由接触モードで実施できる。
【０２５１】
注入−停止−引き出し接触は、より長い培養時間を必要とし、試薬が低濃度で存在するステップに適している。例えば、低濃度の検体を含むサンプルが親水性機構の表面で捕獲プローブに結合される捕獲ステップ。捕獲ステップでは、サンプルからの全ての検体の完全な捕獲を確保するために、即ち、検体がフロー区画の上部から下部に拡散できるのに充分な培養時間、そして表面で成功した捕獲を可能にするのに充分な時間に、ステップの持続期間を長くすることが好都合である。注入−停止−引き出し接触は、ある溶液中の親水性パターンの完全浸漬に等価である。
【０２５２】
一実施形態において、検体は、下記の検体グループ、即ち、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質、タンパク質／オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質／脂質複合体、ペプチド、エキソソーム(exosome)、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ナノ粒子、細胞断片または細胞から選択される。
【０２５３】
一実施形態において、サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織から選択される。
【０２５４】
一実施形態において、サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または、血液などの組織、の研究室処理サンプルから選択される。
【０２５５】
サンプルのタイプに依存して、異なる種類の検体タイプが存在でき、異なる研究室手順が測定用の検体を調製するために必要になる。例えば、サンプルが血液サンプルである場合、凝固を防止するために、抗凝固剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸またはシュウ酸）を用いて血液を処理する必要があるであろう。血液サンプルの研究室処理の他の例が、サンプルから細胞を除去するために、血液を遠心分離またはフィルタ処理にかけることであろう。血液サンプルの研究室処理のさらに他の例が、血液を希釈し、または活性成分を追加して、関心あるバイオマーカーの特殊抽出を容易にすることであろう。例えば、ＤＮＡ検体が、固相可逆的固定化を用いて液体サンプルから精製でき、血液はクラウディング剤およびカルボン酸コート常磁性マイクロ粒子と混合される。これらの反応条件は、マイクロ粒子の表面へのＤＮＡの選択吸着を有利にでき、これは磁界の印加によって抽出できる。他の用途では、希釈され、または他の方法で処理されたサンプルを、（ｉ）電気泳動ステップ、または（ｉｉ）透析ステップにかけて、その電荷、サイズおよび分子量に基づいてサンプルから分子を選択することが好都合であろう。
【０２５６】
一実施形態において、１つ以上の捕獲した検体は、捕獲に続いて、捕獲プローブと共有結合的に架橋または結合できる。
【０２５７】
検体と捕獲プローブとの間の共有結合を確立することが好都合であり、その理由は、表面への検体の本質的に不可逆的の固定化を提供するためである。こうして標識剤の脱離がより容易に達成でき、その理由は、検体と標識剤との間の結合は非共有結合性であり、より弱いためである。例えば、捕獲プローブおよび検体の両方がオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対合によって共に結合され、さらに１つ以上の共有結合を介して共に結合される場合、そして標識剤もオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対合によって検体に結合するだけである場合、標識剤は、複合体をアルカリ性ｐＨに曝すことによって、検体から容易に解離できる。アルカリ性ｐＨは、捕獲プローブ／検体の間の強い共有結合に対して、検体／標識剤の間のより弱い塩基対合結合と同じ程度に影響を及ぼすことがない。
【０２５８】
他の例として、捕獲プローブが抗体であり、検体がタンパク質またはペプチドであり、共有結合が両者間で確立されていることを検討する。標識剤が抗体系であり、抗体／抗原−相互作用を介して検体に結合される場合、それは、洗浄剤を追加し、または変性剤を追加することによって、容易に除去できるとともに、捕獲プローブと検体との間の共有結合を保持する。
【０２５９】
一実施形態において、捕獲プローブは、オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドであり、検体は、捕獲プローブ配列との塩基対合を介して捕獲プローブと結合されたオリゴヌクレオチドであり、共有結合架橋は、鎖間架橋剤、例えば、白金錯体、マイトマイシンＣ、ナイトロジェンマスタード、ソラレンまたはアルデヒドなどを使用することによって実行される。上述したものなどの鎖間架橋剤は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡまたは、核酸塩基を含むその合成変異体での対向する鎖の上の核酸塩基間の共有結合を形成できる。鎖間共有結合が、非共有結合鎖間塩基対合結合と比較して増強された安定性を提供し、捕獲プローブへの検体の実質的に不可逆的な固定化を提供し、よって親水性機構を提供する。
【０２６０】
一実施形態において、捕獲プローブは、タンパク質、ペプチドまたはその合成変異体であり、検体は、タンパク質、ペプチドまたは、タンパク質もしくはペプチドを含む複合体であり、検体は、検体の特異領域の構造的認識によって捕獲プローブに結合され、共有結合架橋は、化学固定(fixation)剤、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウムまたは酢酸ウラニルなどを使用することによって実行される。上述したものなどの化学固定剤は、アミノ酸を架橋することが可能であり、検体と捕獲プローブとの間の接触ゾーンにおいて共有結合架橋を提供する。これは、捕獲プローブへの検体の実質的に不可逆的な固定化をもたらし、よって親水性機構をもたらす。
【０２６１】
ここで説明する方法およびフローシステムの実施形態において、気相は、大気によって提供され、及び／又は、捕獲プローブは、一本鎖ＤＮＡオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択され、及び／又は、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置され、及び／又は、検体は、処理した血液サンプルから抽出された一本鎖ＤＮＡであり、標識剤は、検出様式(modality)および認識部位を備え、及び／又は、検出様式は酵素であり、及び／又は、認識部位は、一本鎖ＤＮＡオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択される。
【０２６２】
ここで説明する方法およびフローシステムの実施形態において、気相は、大気によって提供され、及び／又は、捕獲プローブは、一本鎖ＤＮＡオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択され、及び／又は、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置され、及び／又は、検体は、処理した血液サンプルから抽出された一本鎖ＤＮＡであり、標識剤は、検出様式(modality)および認識部位を備え、及び／又は、検出様式は酵素であり、及び／又は、認識部位は、一本鎖ＤＮＡオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択される。
【０２６３】
下記において、用途のいくつかの非限定的例を説明する。
【０２６４】
実施形態において、複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用が開示され、各部位は、ここに記載される方法で少なくとも１つの検体を捕獲可能である。
【０２６５】
実施形態において、複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用が開示され、各部位は、デジタル計数分析における計数誤差を減少させるために、ここに記載される方法で少なくとも１つの検体を捕獲可能である。
【０２６６】
実施形態において、複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用が開示され、各部位は、デジタル計数分析における計数誤差を減少させるために、ここに記載される少なくとも２つの検出サイクルを行うことによって、少なくとも１つの検体を捕獲可能である。
【０２６７】
単一酵素結合免疫吸着法（ｓＥＬＩＳＡ）では、タンパク質またはペプチドの検体が表面結合抗体プローブによって捕獲され、後で標識化され、単一酵素標識検出プローブによって検出される。
【０２６８】
単一オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションアッセイでは、オリゴヌクレオチド検体が表面結合相補オリゴヌクレオチドプローブによって捕獲され、後で標識化され、単一酵素標識検出プローブによって検出される。
【０２６９】
他のクラスの用途は、単一の生物学的実体、例えば、細胞、細胞断片／オルガネラ、バクテリア、ウイルスカプシドなどの操作および定量化を扱う。これらの場合、アッセイは、表面結合捕獲プローブを使用して、上述した生物学的実体のいずれかを固定化し、後で特異検出プローブを付与して、これらの数および種類を定量化できる。代替として、生物学的実体を捕獲した後、これらは破裂されてもよく、タンパク質、ペプチド、脂質またはオリゴヌクレオチドのその含量が他のセットの表面結合捕獲プローブによって捕獲され、後で標識化され、単一酵素標識検出プローブによって検出される。
【０２７０】
さらに、本発明は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）またはその変形を実行するのに適している。本発明の一実施形態において、ｄＰＣＲアッセイは、単一液滴内にターゲット配列そして増幅試薬および検出プローブを含むことによって、特定のオリゴヌクレオチド配列を検出する。ＰＣＲが起こると、ターゲット配列は増幅でき、検出プローブによって検出可能にする。本発明の他の実施形態において、ターゲットオリゴヌクレオチドは、最初に表面結合プローブによって特異的に捕獲され、次に増幅試薬および検出プローブが個々の液滴に供給されて、ＰＣＲおよび検出反応が生じるようする。
【０２７１】
一実施形態において、ここで説明するシステムおよび方法は、複数のマイクロ液滴を支持するための表面を有するチャネル形状のフロー区画を含む。実施形態において、ここで開示するように、チャネル形状のフロー区画はまた、マイクロ液滴を支持する表面の上に延びる表面を有し、チャネル形状のフロー区画が２つの開口を有し、１つがフロー区画の各側にあるようにした壁を含む。一実施形態において、チャネルは、四角形(square)断面を備えた矩形状であり、各開口が四角形である。他の実施形態において、フロー区画は、円柱形状であり、各開口は円形である。これらの実施形態の両方において、マイクロ液滴は、例えば、アレイ状に互いに離隔しており、フロー区画内の中央に配置される。実施形態において、中央に配置されたマイクロ液滴は、開口の各々から長さ（ＬＥ）だけ離隔している。一実施形態において、フロー区画の高さ（ｈ）は、マイクロ液滴に含まれる流体の凝集体積に部分的に基づいて選択され、周囲環境の温度および圧力は、フロー区画および長さＬＥに接触する。一実施形態において、高さｈは、マイクロ液滴が蒸発するレートを低減するフロー区画内の蒸気圧を生成するように選択される。理論によって縛られないが、マイクロ液滴が蒸発すると、蒸発からの蒸気が、周囲環境に全体的に露出した場合にマイクロ液滴が経験するレートと比較して、蒸発が生ずるレートを低減する気相シールを生成する。一実践では、水溶液では、特定の割合の水が気相に蒸発することが理解される。しかしながら、蒸発の程度は、（ｉ）正しいフローチャネル深さおよび幾何形状、（ｉｉ）正しい液滴体積、（ｉｉｉ）正しい液滴アレイ幾何形状を選択することによって予測でき、合理的に制御できる。パラメータを適正に選択することによって、マイクロ液滴は、蒸気圧に起因して蒸発しなくなり、こうしてフローチャネルでの湿度が増加する。これは、化学的シールに類似した気相シールを提供するが、フロー区画を液相で覆う代わりに、マイクロ液滴が気相、例えば、空気の中に維持される。気相の利点は、液相と比較して、多くの大きな生体分子（タンパク質、ＤＮＡ、脂質など）は、その沸点が水より著しく高いため、空気中に分配しないことである。化学的シールとは異なり、気相シールは、油相を除去する必要なしで、試薬をアレイ上に容易に導入できる。
【０２７２】
フロー区画が、表面張力によって所定場所に保持され、フローチャネルの中に集積される、平面基板上に静止するマイクロ液滴を保存する実施形態では、気相シールが、液体引き出しに続いてアレイを液体と接触させることによって確立できる。液体引き出しの際、アレイは、マイクロ液滴を保持し、フローチャネルは、例えば、空気で充填され、こうして気相シールを確立する。こうしてここで説明するシステムおよび方法は、とりわけフローチャネルに組み込まれた表面張力式マイクロ液滴アレイを提供し、フローチャネルの幾何形状は、アレイの幾何形状に整合し、例えば、蒸発を特定の割合以下、例えば、５％未満に低減する。
【０２７３】
ここで、複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成された親水性機構の特徴は、親水性機構は、第２親水特性を有する材料によつて包囲された第１親水特性を有する材料のパターンを形成し、第１親水特性は第２親水特性よりも親水性であることを特に意味しており、接触角は、第１親水特性を備えた材料の上での液滴ではより低いことを意味する。一例では、第２親水特性を備えた材料は疎水性であると考えられ、液滴は、第１親水特性を有する材料に本質的に専ら配置される。
【０２７４】
蒸発を低減する気相シールを支持するように構成されたフロー区画の特徴は、液滴の体積に対するフロー区画の体積を参照する。下記式によって設定される境界内にある体積ＶＣを有するフロー区画が、
【０２７５】
【数２】
2019523419.tif 000004
【０２７６】
蒸発を低減する気相シールを支持するように構成された区画の定義内であると考えられる。
【０２７７】
蒸発を低減する気相の例が、本質的にその飽和温度および圧力にあり、相対湿度を増加できない、即ち、ほぼ１００％湿度、または少なくとも９０〜１００％の範囲、例えば、９５〜１００％湿度の範囲のような蒸気とすることができる。用語「開口」は、サンプルが疎水性基板上の親水性機構に入るための入り口を意味する。開口は、外部から区画内への同じまたは異なるサイズの１つ以上の入口によって形成できる。
【０２７８】
フロー区画は、サンプルが流れることができ、疎水性基板上に親水性機構を収容する区画である。フロー区画は、１つ以上の区別できるチャンバ(chamber)によって形成できる。２つ以上のチャンバによって画定される場合、チャンバは流体接続される。
【０２７９】
捕獲プローブが、特定の構成物質を捕獲できる機構である。捕獲プローブは、例えば、ＰＮＡまたはＤＮＡ、例えば、一本鎖ＰＮＡオリゴをベースにできる。
【０２８０】
一実施形態において、親水性機構のための支持体は、フロー区画内に中央に設置される。一例において、親水性機構のための支持体は、親水性機構のための支持体の周りに境界を形成する疎水性材料によってフロー区画内で包囲される。
【０２８１】
（本発明の特定の実施形態）
フロー区画を使用したデジタルカウント用フローシステム
【０２８２】
疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備えた、ここに記載した方法および使用などのサンプル中の１つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のために有用なフローシステムがここでは開示され、疎水性基板は、少なくとも１つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。実施形態において、フロー区画は、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を低減する気相シールを支持するように構成される。実施形態において、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を最大液滴体積の５０％未満に低減する。
【０２８３】
ここで開示する実施形態において、フローシステムは、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを提供する液滴領域を備え、蒸発耐性気相封止のナノリットルからアトリットルの液滴の形成を可能にする。
【０２８４】
ここで開示する実施形態において、フローシステムは、親水性／疎水性パターンとの液体接触を可能にするために、液滴領域を覆う１つ以上のフロー区画、例えば、フローチャネルを備える。
【０２８５】
ここで開示する実施形態において、フローシステムは、フロー区画および液滴領域に液体および試薬を供給するための液体装填パッドを備える。
【０２８６】
ここで開示する実施形態において、フローシステムは、フロー区画を液体装填パッドに接続する液体入口を備える。
【０２８７】
ここで開示する実施形態において、フローシステムは、吸引を提供し、そしてフロー区画を介して液体駆動に介在する圧力源にフロー区画を接続する液体出口を備える。
【０２８８】
ここで開示する実施形態において、フローシステムは、単一分子デジタル計数デバイスとして機能するために、少なくとも５つの区別できるエレメントを備える。図１０も参照。
【０２８９】
これらは下記に示す。
・疎水性基板によって包囲された親水性機構のパターンを提示する液滴領域であり、蒸発耐性気相封止のナノリットルからアトリットルの液滴の形成を可能にする。
・液滴領域を覆う１つ以上のフロー区画であり、親水性／疎水性パターンとの液体接触を可能にする。
・フロー区画に液体および試薬を供給するための液体装填パッド。
・フロー区画を液体装填パッドに接続する液体入口。
・吸引を提供し、そしてフロー区画を介して液体駆動に介在する圧力源にフロー区画を接続する液体出口。
【０２９０】
上述した５つの機構は、例示のフローシステムを画定し、液体は、入口から出口への圧力降下を用いてフロー区画を横断して駆動される。吸引を印加する代わりに、装填パッド中の液体試薬をフローチャネルを介して押し込んでもよい。これは、装填パッドが、一方の側で圧力源に接続され、他方の側で液体入口に接続されることが必要である。この場合、液体出口は、圧力源に接続される必要がない。液体フローを駆動する代替手段は、重力によるものでもよく、この場合、圧力源は必要ではなく、あるいは、誘電泳動駆動によるものでもよく、これは電極をフローチャネルに組み込む必要がある。ここで開示する一実施形態において、液体駆動は吸引駆動される。
【０２９１】
当業者に知られているように、類似の機能的フローシステムが多くの異なる手法によって製造できる。これらは下記の手法を含むが、これに限定されない。
１．コンピュータ数値制御（ＣＮＣ）フライス加工、射出成形、熱エンボス加工、または３次元印刷を用いて、固体基板にフロー区画を製造する。
２．ＣＮＣフライス加工、射出成形、熱エンボス加工、または３次元印刷に適合した任意の固体基板を適用する。
３．１つ以上のコンポーネントからフローシステムを作成し、続いてコンポーネントを共に接合して、所望の幾何形状または機能性を達成する。接合する手法は、感圧接着フィルム、液体接着剤のスプレーコーティング、熱接合、超音波溶接またはレーザ溶接を含む。接合する代わりに、個々のコンポーネントは、例えば、最終アセンブリを生産するために、機械的、電気機械的または磁気的にクランプしてもよい。マイクロ流体用途のために利用される接合および製造プロセスの概要は、文献（Temiz, Y., Lovchik, R., Kaigala, G. V. and Delamarche, E. in "Lab-on-a-chip devices: How to close and plug the lab" published in Microelectronics Engineering, vol. 132, pp. 156-175 (2015) (DOI: 10.1016/j.mee.2014.10.013)）を参照。
【０２９２】
ここで開示するように、基板上の親水性機構は、それぞれ最大液滴体積を有する複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。親水性表面は、該最大液滴体積を有する液滴を保持できる任意の種類でもよい。即ち、該最大液滴体積の液滴が親水性機構の上に残留するようになる限り、親水性機構は、こうした液滴を支持するように構成される。
【０２９３】
ここで開示する実施形態において、液滴領域は、疎水性媒体によって包囲された親水性機構のパターンからなる。この実施形態において、親水性機構の幾何形状、液体および疎水性基板の物理的／化学的特性は、最大液滴体積を決定し、単一機構がこれを保持することが可能であり、そのため液体は周囲の疎水性媒体と接触しない。最大液滴体積を実験的に決定する１つの方法は、増加する量の液体を初期乾燥親水性機構の上に堆積することである。液体堆積は、自動化マイクロディスペンサを用いて実施でき、あるいは、ミクロンサイズの機構の場合は、圧電駆動マイクロマニピュレータを用いて実施できるが、蒸発が起きないように加湿チャンバ内で行う必要がある。さらに、顕微鏡を用いて、堆積した液滴の設置面積が測定できる。その結果、測定した設置面積が親水性機構によって画定される外周をいったん超えると、最大液滴体積に到達し、そして上回る。
【０２９４】
実験的手法とは別に、最大液滴体積はまた、簡単な理論モデルから推定できる。この場合、親水性機構がＲＤの半径を有する円形であり、疎水性媒体と接触した場合、液体がγの接触角を示し、液滴が平面的表面の上に静止する（図５と図６を参照）ものと仮定する。さらに液滴は、重力が液滴の形状に著しく影響しないように充分に小さいものと仮定する。液体が親水性機構の上に堆積した場合、それは外周まで広がり、液体は接触角αを形成する。接触角αは、液滴表面への接線が外周において平面的親水性表面と形成する角度として定義される。液滴の体積が増加すると、αも増加するが、特定のポイントまでだけである。もしαがγを超えた場合、液滴が疎水性媒体の上に広がることがエネルギー的により有利になり、こうして疎水性外周を超える。その結果、最大液滴体積においてαはγと等しく、体積（ＶＤ）は、下記式（１）のように、キャップ付球体の幾何学的記述から得られる。
【０２９５】
【数３】
2019523419.tif 000005
【０２９６】
９０°に充分に近いγ値では、式（１）は、液滴を半球形状のキャップであると仮定することによってさらに簡略化でき、下記のＶＤ値を示す
【０２９７】
【数４】
2019523419.tif 000006
【０２９８】
さらに他の場合、親水性機構が、半径ＲＤおよび深さｄを備えた円形空洞として形状を有する場合、最大体積は、πｄＲＤ２の空洞体積を式（１）に追加することによって見出される。
【０２９９】
一実施形態において、親水性機構は、ナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成され、液滴は、少なくとも９０度、多くても１５０度の、疎水性基板での接触角を示す。一実施形態において、親水性機構は、少なくとも０．１μｍ、多くても１００μｍの半径（ＲＤ）を有するナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。
【０３００】
疎水性媒体によって包囲された親水性機構のアレイを製造するために多くの手法が採用できるが、最も容易に適用可能なものはフォトリソグラフィを含む。フォトリソグラフィは、ミクロンサイズの化学的及び／又は物理的構造を正確に生産することが可能であり、感光性薄膜を用いた平坦なウエハ基板のコーティングに依拠する。次のステップにおいて、薄膜は、意図したパターンを提供するフォトマスクを介して高強度の紫外光への露光によって選択的に除去される。例示の製造プロセスの略図が図７において示される。しかしながら、ＵＶフォトリソグラフィの光学分解能に起因して、０．１μｍ以下の機構を正確に生産することは技術的に困難である。パターン化された親水性機構が平面的円形であり、０．１μｍのＲＤ値を示す場合、対応する最大液滴体積は、式（１）に従って、９０°のγ値ではＶＤ＝２．９アトリットルであり、１５０°のγ値ではＶＤ＝３３．１アトリットルである。
【０３０１】
０．１μｍまで下がるＲＤ値を示す親水性機構は高密度のアレイを許容し、これは、単一分子デジタル計数の文脈において、（ｉ）拡張したダイナミックレンジ、および（ｉｉ）より高速な検出時間につながる。
【０３０２】
拡張したダイナミックレンジは、デジタル計数では、測定に存在する液滴区画の数は信号線形性を決定するという事実に起因する。信号は、全ての液滴区画が信号を生成し、即ち、アレイが飽和するまで、線形であると考えられる。例えば、０．１μｍのＲＤ値および０．４μｍの機構間間隔を有する１０ｍｍ×１０ｍｍをカバーする規則的な矩形アレイが、６２５００００００個の液滴を収容し、約８桁に及ぶ線形ダイナミックレンジを示す。
【０３０３】
より高速な検出時間は、デジタル計数では、分子レポータは、通常、酵素または酵素的に結合したシステムによって生成されるという事実に依拠する。本実施形態において、単一酵素は、非−蛍光性／−化学発光性／−比色分析性の分子の蛍光し／発光し／吸収するもの（分子レポータ）への繰り返し変換によって信号を生成する。レポータ分子の最小検出可能濃度は、液滴体積に依存し、、一定の酵素ターンオーバーレートを仮定すると、体積が小さいほど、より高速に濃度に到達する。
【０３０４】
他方において、ナノリットル範囲のより大きい体積を示す液滴（例えば、１００μｍのＲＤ値を備えた円形平面的親水性機構は、９０°のγ値では２．１ナノリットルの最大体積を有し、１５０°のγ値では３３．１ナノリットルの最大体積を有する）は、（ｉ）大きいダイナミックレンジが必要でない、例えば、検体濃度がアレイを飽和させるには低すぎると予想される状況、または（ｉｉ）サブナノリットル液滴が撮像センサによって解像できない状況において、好都合であろう。
【０３０５】
代替として、ナノリットル体積液滴は、測定前に、より大きい生物学的実体、例えば、細胞、細胞片、ウイルス粒子、ベシクル(vesicle)、オルガネラ(organelle)などをアレイ化して編成するために使用できる。
【０３０６】
一実施形態において、親水性基板は、ガラス、親水性ポリマーまたは金属酸化物化合物である。
【０３０７】
親水性基板についての主要な要件は、液体がその上に接触角を形成する必要があり、それが疎水性基板より小さいことである。さらに、基板は、好ましくは、マイクロ製造手法、例えば、フォトリソグラフィ、ソフトリソグラフィ、マイクロインプリンティングなどにとって従順であることが必要である。二酸化シリコンおよびその純粋およびドープした異形は、この目的に適した選択肢であり、その理由は、フォトリソグラフィのために良好に特徴付けられた基板として機能するだけでなく、多数の化学的および生化学的な表面機能化手順が利用可能であるためである。例えば、広範囲のシラン化合物が市販されており（例えば、ゲレスト(Gelest)社によって発表されている"Silane coupling agents, version 3.0"を参照）、これは二酸化シリコン表面の直接的誘導体化のために使用できる。シラン化(silanization)が、その表面、例えば、二酸化シリコンでシラノール基を提示する材料にとって最も効率的であるが、多くの他の材料がこのプロセスにとって従順にできる。これらは、これに限定されないが、アルミニウム、アルミノケイ酸、シリコン、銅、錫、タルク(talc)、無機酸化物（例えば、鉄酸化物、チタン酸化物、クロム酸化物）、鋼、鉄、ニッケル、亜鉛を含む。
【０３０８】
基板のシラン誘導体化の際、新しい化学官能性が材料に導入され、液体は、機能化の後に基板上で変更された接触角を示すことができる。この理由のため、初期の親水性基板、例えば、ガラスは、疎水性シラン部位、例えば、フッ化炭素シランを用いた機能化によって疎水性にできる。代替として、初期の僅かに親水性の基板が、高い親水性のシラン部位、例えば、ポリ（エチレングリコール）シランを用いた機能化によってより親水性にできる。これは、当業者によく知られており、液体／固体接触角は、本文書で参照されており、任意の初期基板材料の表面改質に続いて得られた液体／固体接触角に関連しているだけである。
【０３０９】
無機基板のシラン誘導体化は、新しい化学的機能を基板に導入する多くの手順の中から１つだけを構成する。他の手法は、例えば、自己組織化単分子層を生成するために、金基板へのモノチオール化化合物の吸着を含む。さらに他の手法は、柔軟な有機基板、例えば、プラスチックにとって従順である、プラズマ重合であり、所望の化学ポリマーの薄い層が、対応するモノマーのプラズマからプラスチック表面に堆積される。
【０３１０】
親水性機構の構成は、下記の少なくとも１つと関連できる。
・親水性機構を構成する材料の親水性
・疎水性基板を構成する材料の疎水性
・機構のエリア
・機構の厚さ
【０３１１】
一実施形態において、最大液滴体積は、式（１）によって計算されるようなＶＤである。従って、親水性機構は、この体積の液滴が親水性機構の各々に保持できるように提供できる。
【０３１２】
最大液滴体積から個々の親水性機構の特定の構成に至る方法の例として、下記ステップが実行できる。
１．最初に、目前の応用のために適切な液滴体積を選択する。液滴体積についての前述した議論を参照。
２．次に、この応用で適用される液体について固体／液体接触角γを取得する。
３．親水性機構の所望の幾何形状、即ち、円形、四角、六角形などについて決定する。形状は、パターンを生成するために適用される製造手順に依拠することになる。
４．ステップ３からの特定形状の外周長と対応する最大液滴体積との間の関係を計算する。円形形状の場合、関係は式（１）で提供される。他の幾何形状については、関係は、式（１）の誘導について記述したのと同様な方法で誘導する必要があるであろう。
５．ステップ４での関係から、選択した液滴体積に対応する外周長を取得する。円形形状の場合、それはＲＤについて式（１）を解くのに充分である。
【０３１３】
更なる実施形態において、親水性機構のパターンが位置するフロー区画の構成は、機能的気相シールを設けてミクロンサイズの液滴からの蒸発を低減するために決定する必要がある。例えば、アトリットルの水性液滴が周囲条件で基板上に堆積した場合、それは、高い表面／体積比に起因して、数秒以内に蒸発するようになる。その結果、液滴内容物を測定する必要がある用途では、液滴は、延長した時間に渡って安定であることが要求され、蒸発は、大きく減少させたり、または完全になくす必要がある。
【０３１４】
更なる実施形態において、親水性機構のパターンを収容するフロー区画がここでは開示され、親水性機構は、上述したような特定の最大体積の液滴を支持するように構成され、フロー区画は、体積ＶＣを示し、液滴支持親水性パターンの最大到達可能凝集体積は、ＶＤＡで示される。該パターンが、それぞれ同じ最大液滴体積（ＶＤ）を示す多数の液滴（ＮＤ）を収容する場合、ＶＤＡ＝ＶＤ・ＮＤである。該パターンが、変化するサイズの液滴を収容する場合、対応するＶＤＡ値は、下記の式（２）として与えられる。
【０３１５】
【数５】
2019523419.tif 000007
【０３１６】
ここで、ＶＤ，ｉはパターン上のｉ’番目の液滴の最大体積である。その結果、液体の対応するモル量（ｎＤＡ）は、下記の式（３）である。
【０３１７】
【数６】
2019523419.tif 000008
【０３１８】
ここでＭＷは液体のモル重量であり、ρＬは液体の密度である。もし全ての液滴が完全に蒸発するとした場合、蒸発した蒸気は理想気体として挙動すると仮定して、得られた蒸気は、下記の式（４）のように、フロー区画において対応する蒸気圧（ＰＶＡＰ）を生成する。
【０３１９】
【数７】
2019523419.tif 000009
【０３２０】
ここで、Ｒは、モル気体定数であり、Ｔは、温度である。しかしながら、完全な液滴蒸発がＶＣ＞＞ＶＤＡについて可能なだけであり、理由は、その場合、完全な液滴蒸発によって生成される蒸気量がフロー区画の初期の蒸気圧を著しく変化させないためである。しかしながら、ＶＤＡのそれに接近するフロー区画体積では、飽和蒸気圧（ＰＳＡＴ）が確立状態になるまで、液滴蒸気はフロー区画での圧力を増加させる。いったんＰＳＡＴに到達すると、更なる蒸発は可能ではない。ＰＳＡＴ値、即ち、熱力学的平衡において液体の気体成分によって作用される蒸気圧は、下記の式（５）のように、クラウジウス・クラペイロンの式によって与えられる。
【０３２１】
【数８】
2019523419.tif 000010
【０３２２】
ここで、ΔＨＶＡＰは液体の蒸発のエンタルピーであり、Ｐ０は対応する基準温度Ｔ０での液体の基準蒸気圧である。
【０３２３】
その結果、蒸発することが可能な液体の最大許容モル量（ｎＶＡＰ）は、下記の式（６）のように、理想気体方程式から取得できる。
【０３２４】
【数９】
2019523419.tif 000011
【０３２５】
ｎＶＡＰ≧ｎＤＡでは、完全な液滴蒸発が起こる。最大フロー区画体積（ＶＭＡＸ）、即ち、液滴が完全には蒸発しない最大可能フロー区画体積についての表現は、ここでは下記の式（７）のように取得できる。
【０３２６】
【数１０】
2019523419.tif 000012
【０３２７】
その結果、機能的で長期安定な液滴パターンを収容することが可能なフロー区画は、ＶＣ＜ＶＭＡＸのように構成する必要がある。
【０３２８】
式（７）での表現は、平衡の状態を参照する。平衡への経路は多数であるが、下記のように説明できる。（ｉ）親水性機構のパターンが液体と接触して、例えば、液滴のパターンを生成し、各液滴は初期に最大可能体積を示すようにする。（ｉｉ）飽和圧力がフロー区画内で確立するまで、液体が液滴から蒸発する。（ｉｉｉ）蒸発に起因して減少した体積を有する液滴が安定に留まる。
【０３２９】
重要なのは、パターンは、機能的気相シールを生成するのに適した方法で液体と接触する必要がある。例えば、液体プラグをパターンを横断して駆動することによって、液体マイクロ液滴を親水性機構の上に堆積する。いったん液体プラグがアレイ上の全ての機構に接触すると、液体入口および出口は封鎖して、例えば、閉じた環境を提供する必要がある。これは、多くの方法、例えば、（ｉ）液体入口および出口にバルブを設置することによって、または（ｉｉ）液体フローを同期させて、第１液体プラグが第２液体プラグによって続くようにし、第１のものは液体出口に駆動されて、そして停止し、第２のものは液体入口に駆動され、こうして入口および出口を液体で封鎖することによって達成できる。こうして液滴から蒸発した液体は、フロー区画において飽和圧力を確立するようになり、よって蒸発耐性になる。これは、例１と例２に例示される。
【０３３０】
さらに、式（７）および下記議論において、フローシステムが調製される気相は、親水性機構のパターンを液体と接触させる前に、蒸発した液体（即ち、液体の気体成分）を含まないと仮定した。しかしながら、これは、常にそうではないことがある。例えば、液体が水で、気相が大気である場合は、空気は、初期に一定割合の水蒸気を含むことがある。大気では、相対湿度（ＲＨ）は、飽和圧力に対する水蒸気圧力を提供し、即ち、ＲＨ＝ＰＷ／ＰＳＡＴであり、ここでＰＷは大気中の水蒸気の部分圧力である。大気の初期の相対水蒸気飽和（ＲＨＩ）が０に等しい場合、空気は水蒸気含量を有することがなく、よって式（７）が適用できる。他方では、ＲＨＩ＞０の場合、式（７）は、変更を必要とし、その理由は、飽和圧力を確立するために蒸発する必要がある液滴がより少ないためであり、こうして式（６）を参照。
【０３３１】
【数１１】
2019523419.tif 000013
【０３３２】
これは、ＶＭＡＸについて下記の式（９）に転換する。
【０３３３】
【数１２】
2019523419.tif 000014
【０３３４】
本文脈において、ＲＨＩは、可能な限り一般的に理解され、即ち、水に関連するだけでなく、いずれか他の液体にも関連する（定義についての上記セクションを参照）。この場合、ＲＨＩのより一般的な定義は、ＲＨＩ＝ＰＬ／ＰＳＡＴであり、ここでＰＬは適用した液体の気体成分の初期蒸気圧である。ＰＬ値は、液滴アレイの形成の前にフローシステムが使用される気相を参照する。気相シールは、いったんフロー区画の内側で飽和圧力に到達すると、確立状態になる。こうしてフロー区画では局所的に、ＲＨ値は、初期値から１に上昇し、完全な飽和および機能的気相シールを示す。
【０３３５】
一実施形態において、ここで開示するフロー区画は、体積（ＶＣ）を有し、体積（ＶＣ）は、全てのナノリットルからアトリットルの液滴の凝集最大液滴体積（ＶＤＡ）より大きく、式（９）で計算されるようなＶＭＡＸより小さい。
【０３３６】
ここで開示する実施形態において、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを備えた、検体のデジタル計数のためのフローシステムの最適な構成を得るために、（ｉ）個々の親水性機構の構成、（ｉｉ）機構のパターンの構成、（ｉｉｉ）パターンが位置する区画の構成、を考える必要がある。集合的に、これらの３つの構成は、フローシステムに、気相シールを用いてマイクロ液滴の蒸発耐性パターンを維持する能力を提供する。個々の親水性機構の構成は上述している。フローシステム構成を決定する例示の次のステップは、下記のとおりである。
１）用途に必要とされる液滴の合計数を決定する。上述したように、液滴の合計数は、測定のダイナミックレンジを決定し、検体の予想される濃度範囲に整合させる必要がある。
２）パターンについてのＶＤＡ値は、ここでは式（２）から計算でき、フロー区画体積、即ち、ＶＣ値について下限を提供する。
３）適用される液体の公称モル重量（ＭＷ）および体積密度（ρＬ）、そして測定が行われる温度（Ｔ）およびＲＨＩ値を決定する。基準温度、圧力、蒸気のエンタルピーについて適切な値セットを適用して、式（９）を用いてフロー区画体積についてＶＭＡＸを計算する。例えば、水についてはＰ０＝１．０ａｔｍ、Ｔ０＝３７３Ｋであり、４０．７ｋＪ／ｍｏｌのΔＨＶＡＰ値を示す。
４）親水性機構のパターンの特定配置、例えば、正方形格子アレイ、六角形格子アレイ、矩形格子アレイ、菱形格子アレイなどを決定する。好ましいアレイ幾何形状は、通常、製造方法によって決定されることになる。液滴の合計数を収容するために、アレイの長さおよび幅を決定する。
５）フロー区画幾何形状、例えば、矩形チャネル、円形チャネル、半円形チャネルなどを決定する。好ましいアレイ幾何形状は、通常、製造方法によって決定されることになる。
６）合計体積がＶＭＡＸより小さくなるように、フロー区画幾何形状を拡大縮小する。この例が例２において提供される。簡潔には、矩形チャネルの場合、合計体積は、チャネルの幅×長さ×高さとして与えられる。チャネルの幅および長さは、例えば、アレイと整合でき、高さを可変にする。こうして高さは、ＶＭＡＸより小さい合計体積を提供するように選択できる。
【０３３７】
更なる実施形態において、親水性機構は半径（ＲＤ）を有する円形であり、単一親水性円が支持できる最大液滴体積（ＶＤ）は式（１）で提供されるフローシステムがここでは開示される。
【０３３８】
実施形態において、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発は、各ナノリットルからアトリットルの液滴の最大液滴体積の、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満である。
【０３３９】
フローシステムの所定の構成では、即ち、ＶＣ値およびＶＤＡ値の特定のセットでは、対応する蒸発割合θＶＡＰが計算できる。蒸発割合は、気相の中に蒸発する液滴体積割合、即ち、θＶＡＰ＝ｎＶＡＰ／ｎＤＡとして定義される。式（３）および式（８）をこの表現の中に挿入すると、下記の式（１０）が得られる。
【０３４０】
【数１３】
2019523419.tif 000015
【０３４１】
θＶＡＰが１より大きい値を仮定した場合、液滴アレイ全体は、例えば、大きすぎるフロー区画体積、アレイ上の少なすぎる液滴、高すぎる温度、小さすぎる親水性機構などに起因して蒸発した。他方、θＶＡＰが１より小さい場合、気相シールは機能的と考えられ、理由は、無傷の液滴（減少した体積を示すが）が親水性機構の上に残留できるためである。
【０３４２】
原理上は、液滴を蒸発に対して封止可能である、当業者に知られたいずれの気体も使用できる。気相シールの例は、大気、窒素、アルゴンまたはヘリウム、あるいはこれらの混合である。一実施形態において、気相シールは、大気、窒素、アルゴンまたはヘリウムによって設けられる。更なる実施形態において、気相シールは、大気によって設けられる。
【０３４３】
一実施形態において、親水性機構基板のパターンを有する疎水性支持体は平面的である。更なる実施形態において、親水性機構のパターンは、親水性機構がアレイ状に配置された少なくとも１つの領域を含む。
【０３４４】
実施形態において、親水性機構は、正方形平面アレイ状に編成され、機構は、半径（ＲＤ）を有する円として形状をなし、アレイは、隣接する機構の間のピッチ（δ）を有し、δは少なくとも３ＲＤであり、アレイは、フロー方向に沿って長さ（ＬＡＸ）に延びており、アレイは、フロー方向に対して垂直な長さ（ＬＡＹ）に延びており、チャネルは、フロー方向に沿って長さ（ＬＣＸ）を有し、ＬＣＸはＬＡＸより大きいか、またはこれに等しく、チャネルは、フロー方向に対して垂直な長さ（ＬＣＹ）を有し、ＬＣＹはＬＡＹより大きいか、またはこれに等しく、チャネルは、高さ（ｈ）を有し、これは少なくとも２ＲＤで、多くてもｈＭＡＸであり、ｈＭＡＸは下記の式（１１）から計算される。
【０３４５】
【数１４】
2019523419.tif 000016
【０３４６】
ここで、θＭＡＸは液滴の最大許容蒸発体積割合であり、ＶＤ（ＲＤ，γ）は式（１）に係る最大液滴体積である。式（１１）に到着するために、式（１０）を検討する必要があり、これは蒸発割合（θＶＡＰ）を、フロー区画体積（ＶＣ）および液滴アレイの最大凝集体積（ＶＤＡ）の関数として表現する。上述した幾何形状を示すフロー区画では、フロー区画体積はＶＣ＝ｈＬＣＸＬＣＹであり、最大凝集液滴アレイ体積はＶＤＡ＝ＶＤ（ＲＤ，γ）ＬＡＸＬＡＹδ−２である。気相シールを提供するために、フロー区画の機能的構成を確立する１つの手法は、液滴の最大許容蒸発体積割合を適切な値、例えば、θＭＡＸ＝０．０５に設定することである。次に、フロー区画高さを唯一の可変パラメータとして残すことによって、最大許容高さ（ｈＭＡＸ）は、ＶＣ＝ＶＭＡＸ＝ｈＭＡＸＬＣＸＬＣＹ、ＶＤＡおよびθＭＡＸを式（１０）に挿入し、ｈＭＡＸについて解くことによって得られ、こうして式（１１）の結果に到着する。
【０３４７】
一実施形態において、親水性機構のパターンは、少なくとも２つの領域を備え、一方の領域のアレイは、他方の領域のアレイと相違する。
【０３４８】
親水性機構が種々のサイズの液滴を支持するように構成された場合、式（１１）のｈＭＡＸの計算は、パターン上の液滴体積の最小値に対応するＶＤ値を用いて実行する必要がある。こうしてアレイ上の最小液滴および最大液滴の両方は、θＭＡＸ値で記述されるものより多く蒸発することなく、安定に残留できる。
【０３４９】
一実施形態において、親水性機構のための支持体は、フロー区画内に中央に設置される。
【０３５０】
親水性機構を備えるアレイのフロー区画での中央場所が通常は好ましいが、アレイの正確な場所は前回の計算の結果に影響しない。これは、計算が、熱力学的平衡、即ち、親水性機構によって支持された液滴からの蒸発レートが、フロー区画内の蒸気の液滴への凝縮レートに等しいという平衡がフロー区画内で確立されるという仮定に基づいていることに起因している。しかしながら、区画内の蒸気の輸送動態に起因して、中央設置アレイが、非中央設置のものと比較してより高速に平衡に到達できる。
【０３５１】
一実施形態において、親水性機構の数は、少なくとも１０００個、少なくとも１００００個、少なくとも１０００００個、少なくとも１００００００個、少なくとも１０００００００個である。
【０３５２】
一実施形態において、疎水性層は、基板に共有結合的に接合した分子単層(monolayer)である。一実施形態において、疎水性層は、金属基板上に化学吸着した分子単層である。
【０３５３】
一実施形態において、フロー区画は、チャネル形状であり、フロー区画の対向端部での２つの開口の間でフロー方向を形成する。一実施形態において、フロー区画および開口は、フロー方向に対して垂直な断面で矩形形状を有する。一実施形態において、フロー区画は、矩形形状を有し、開口は、フロー方向に対して垂直な断面で円形形状を有する。
【０３５４】
一態様において、フローシステムを調製する方法がここでは開示される。
【０３５５】
本発明の全体理解を提供するために、酵素のｓＥＬＩＳＡ分析を可能にするマイクロ液滴のアレイを支持するシステムを含む、特定の例示の実施形態をここでは説明する。しかしながら、ここで説明するシステムおよび方法は、他の適切な用途のために適合でき変更でき、そしてこうした他の追加および変更がその範囲から逸脱しないことは、当業者によって理解されよう。
【０３５６】
図１は、減少した蒸発レートを備えた、複数のマイクロ液滴を支持するためのシステムの一実施形態を示す。詳細には、図１は、矩形フロー区画が複数のマイクロ液滴を収容するシステム１８を示す。マイクロ液滴は、フロー区画の底表面に配置される。フロー区画の各端部は、周囲環境に対して開放される。
【０３５７】
図２は、フロー区画の端部の断面図である。図２は、本実施形態では、端部が、高さｈ（垂直矢印で示す）の形状の四角であることを示す。図１に戻って、マイクロ液滴のアレイの各端部は、フロー区画の端部から距離ＬＥ（二重矢印で示す）だけ離れていることを示す。
【０３５８】
図１のフロー区画は、マイクロ液滴のアレイを支持するフローチャネルである。マイクロ液滴は、いずれか既知の手法を用いてフローチャネルの中に挿入できる。図示したフローチャネルの寸法は、図１から全体的に理解でき、チャネルの高さｈ、マイクロ液滴のアレイによって覆われるフローチャネルの長さであるＬＡ、入口および出口からマイクロアレイを分離するチャネルの長さであるＬＥ（マイクロ液滴のアレイのいずれの部分も支持しない）によって特徴付けられる。フローチャネルの長さ、高さおよび形状が与えられると、該フローチャネルの体積を計算することが可能である。こうした計算の１つの詳細が例２に設定される。
【０３５９】
各液滴が、本質的に半球であり、そのようにモデル化できる。半球状液滴は、ある半径を有することになる。液滴は、本質的には標準ピッチで離隔している。ドットは、直線アレイ、四角アレイまたはいずれか他の適切な配置でもよい。当然ながら、マイクロ液滴のアレイに含まれる液体の合計凝集体積を液滴の半径および数の関数として推定することが可能である。こうした計算の１つの詳細が例２に設定される。
【０３６０】
いったんフローチャネルの幾何形状が知られると、利用可能な体積が計算できる。体積および平衡水蒸気圧（ＰＷ）は、クラウジウス・クラペイロンの式によって記述されるように、蒸発する水の量を決定する。こうした計算の１つの詳細が例２に設定される。蒸気圧は、液滴から蒸発した水によって発生するため、それはフローチャネル内の空気を加湿し飽和させる。その結果、凝集液滴体積の小さい割合だけが平衡蒸気圧を確立するのに充分である場合、残りの水体積は、液滴として表面に保存されることになる。こうして加湿された空気は、図３に示すように気相シール（マイクロ液滴を包囲するドット状充填で示す）を提供する。
【０３６１】
溶液の特定の体積について、例えば、特定の高さｈを選択することによって、図１１Ｂに示すように、蒸発した水の量を約５％に保持できる。
【０３６２】
気相シールが確立されたプロセスは、図４に顕微鏡写真で示している。ここで、水のプラグが、フローチャネルの一方の端部から他方へ駆動され、明確に画定されたミクロンサイズの水性液滴を残す。後退する水際(water-front)は顕微鏡写真の左側に見えており、液滴のアレイは水際の右に見えている。黒矢印は、液体が駆動される方向を示す。
【０３６３】
（用途）
ここで説明する本発明は、多くの可能性ある用途を有し、これは当業者に知られており、例えば、文献（Witters et al. in Digital Biology and Chemistry (DOI: 10.1039/C4LC00248B, (Frontier) Lab on a Chip, 2014, 14, pp. 3225-3232)）を参照。これらは、アッセイのクラスを含み、我々は単一酵素結合分子分析（ＳＥＬＭＡ）と称している。ＳＥＬＭＡ式アッセイは、単一のペプチド、タンパク質及び／又はオリゴヌクレオチド分子の操作および検出に依拠している。
【０３６４】
一態様において、ここで開示されるフローシステムは、１つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数の方法において使用できる。
【０３６５】
ＳＥＬＭＡ式測定は、検体が、気相封止された液滴内に固定されるデジタル計数アッセイであり、続いて検体は、１つ以上のステップで酵素共役剤を用いた標識化が施される。液滴のナノリットルからアトリットルの体積に起因して、単一酵素が、検出剤の連続的な酵素的変換によって数秒から数分以内に検出可能な信号を生成することができる。図９において、例示のＳＥＬＭＡ式測定の略図を示しており、例４においてＳＥＬＭＡの実験的論証を説明している。
【０３６６】
一態様において、１つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための方法がここでは開示され、該方法は、気相シールの下での複数のナノリットルからアトリットルの液滴に含まれる検体タイプを計数することを含む。
【０３６７】
ここで開示する実施形態において、気相シールは、マイクロ液滴の蒸発を低減できる、フロー区画内の蒸気圧を確立する。
【０３６８】
ここで開示する実施形態において、デジタル計数は、フローシステムにおいて実施され、該フローシステムは、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備え、疎水性基板は、少なくとも１つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。
【０３６９】
ここで開示する実施形態において、親水性機構は、半径（ＲＤ）を有する円形であり、単一の親水性円が支持できる最大液滴体積（ＶＤ）は、下記の式である。
【０３７０】
【数１５】
2019523419.tif 000017
【０３７１】
ここで、γは疎水性基板上の液体接触角である。
【０３７２】
ここで開示する実施形態において、気相シールは、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を最大液滴体積の５０％未満に低減する。
【０３７３】
ここで開示する実施形態において、ここで開示するフローシステムは、ここで開示する方法において使用される。
【０３７４】
当業者は、ただ型どおりの実験を用いて、ここで説明した実施形態および実例の多くの同等物を理解するようになり、または究明できる。
【０３７５】
従って、本発明は、ここで説明した実施形態に限定されず、下記請求項から理解されるべきであり、法律に基づいて許容される限り広く解釈されるべきであることは理解されよう。
【０３７６】
特に本発明は、下記の番号付け項目に関する。
【０３７７】
番号付け項目１．
少なくとも１つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法であって、サンプルは、複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも１つの検体を捕獲可能であり、この方法は、少なくとも２つの検出サイクルを含み、各検出サイクルは、下記ステップを含む。
ａ）捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
ｂ）捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
ｃ）追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
【０３７８】
番号付け項目２．
サンプル、および複数の個別の捕獲部位を有する固相は、少なくとも１つの検体の捕獲前または捕獲中に区分化される、番号付き項目１に記載の方法。
【０３７９】
番号付き項目３．
捕獲された検体および標識剤は、少なくとも１つの検体の標識化の前または標識化中に区画化される、番号付き項目１に記載の方法。
【０３８０】
番号付き項目４．
検体は、ステップａ）の前に各検出サイクルにおける標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって、標識化される、番号付き項目１〜３のいずれかに記載の方法。
【０３８１】
番号付き項目５．
固相上の検体の捕獲前または捕獲中に標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって、捕獲された検体が標識化され、ステップｃ）は、追加の検出サイクルが行われる前に行われ、続いて再標識化ステップが行われ、捕獲された検体は標識剤を添加することによって標識化される、番号付き項目１〜４のいずれかに記載の方法。
【０３８２】
番号付き項目６．
捕獲され標識化された検体は、区画化され、少なくとも１つの検体を含む液体区画を生成する、番号付き項目１〜５のいずれかに記載の方法。
【０３８３】
番号付き項目７．
少なくとも１つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法であって、サンプルは複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも１つの検体を捕獲可能であり、この方法は、少なくとも２つの検出サイクルを含み、各検出サイクルは、標識剤を添加することによって少なくとも１つの検体を標識化し、そして、少なくとも１つの捕獲され標識化された検体を区画化して、少なくとも１つの検体を含む液体区画を生成するステップを含み、そして、ステップａ）〜ｃ）を含む。
ａ）捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
ｂ）捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
ｃ）追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
【０３８４】
番号付き項目８．
少なくとも１つの検体を潜在的に含有するサンプルのデジタル計数分析方法であって、サンプルは複数の個別の捕獲部位を有する固相と接触しており、各部位は、少なくとも１つの検体を捕獲可能であり、少なくとも１つの検体は、固相上の少なくとも１つの検体の捕獲前または捕獲中に、標識化ステップにおいて標識剤を添加することによって標識化され、この方法は、少なくとも２つの検出サイクルを含み、少なくとも１つの捕獲され標識化された検体は、区画化され、少なくとも１つの検体を含む液体区画を生成し、そして、ステップａ）〜ｃ）を含む。
ａ）捕獲され標識化された検体からの信号を起動するステップ。
ｂ）捕獲され標識化された検体からの信号を示す、捕獲部位の数および位置の記録ステップ。
ｃ）追加の検出サイクルが行われる前に、信号を非活性化するステップ。
追加の検出サイクルが行われる前にステップｃ）が行われ、続いて再標識化ステップが行われ、少なくとも１つの検体は、標識剤を添加することによって標識化される。
【０３８５】
番号付き項目９．
分析は、単一分子デジタル計数分析である、番号付き項目１〜８のいずれかに記載の方法。
【０３８６】
番号付き項目１０．
サンプルの単一分子デジタル計数分析において偽ポジティブ検出及び／又はバックグラウンドノイズの低減のための、番号付き項目１〜９のいずれかに記載の方法。
【０３８７】
番号付き項目１１．
サンプルは、ターゲット検体および非ターゲット化合物を含み、または潜在的に含み、ターゲット検体は、捕獲部位によって捕獲効率Ｃ１で捕獲され、非ターゲット化合物は、捕獲部位によって捕獲効率Ｃ２（Ｃ１≧Ｃ２）で捕獲され、ターゲット検体は、第１標識剤によって標識効率Ｌ１で標識化され、非ターゲット化合物は、第１標識剤によって標識効率Ｌ２（Ｌ１≧Ｌ２）で標識化され、検出サイクル数ＮＣは、下記の式で示す比αが、
【０３８８】
【数１６】
2019523419.tif 000018
１〜１０の間、好ましくは１０〜１００の間、好ましくは１００〜１０００の間、好ましくは１０００〜１００００の間、好ましくは１０００〜１００００の間、好ましくは１００００〜１０００００の間、好ましくは１０００００より大きいように調整され、そして各検出サイクルは、標識化ステップにおいて第１標識剤を適用する、番号付き項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
【０３８９】
番号付き項目１２．
該方法は、偽ポジティブ検出サイクルを含み、標識化ステップにおいて第１標識剤の代わりに第２標識剤が適用され、非ターゲット化合物は、標識効率Ｌ１で第２標識剤によって標識化され、ターゲット検体は、第２標識剤によって標識効率Ｌ２（Ｌ１≧Ｌ２）で標識化される、番号付き項目１１に記載の方法。
【０３９０】
番号付き項目１３．
サンプル中に存在する非ターゲット化合物の数は、偽ポジティブ検出サイクルにおいて信号を示す捕獲部位の数から推定される、番号付き項目１２に記載の方法。
【０３９１】
番号付き項目１４．
サンプル中に存在するターゲット検体の数は、偽ポジティブ検出サイクルの前の全ての検出サイクルにおいて、信号を繰り返し示す捕獲部位の数およびサンプル中に存在する非ターゲット化合物の推定された数から推定される、番号付き項目１３に記載の方法。
【０３９２】
番号付き項目１５．
液体区画のせいぜい９９％、例えば、せいぜい９５％、せいぜい９０％、せいぜい８５％、せいぜい８０％、せいぜい最大７５％、せいぜい７０％、せいぜい６５％が、捕獲され標識化された検体を含む、番号付き項目１〜１４のいずれかに記載の方法。
【０３９３】
番号付き項目１６．
該方法は、偽ポジティブ検出サイクルを含み、該方法は、いずれの標識化ステップを含まない、番号付き項目１〜１５のいずれかに記載の方法。
【０３９４】
番号付き項目１７．
標識剤は検出様式(modality)を含み、信号を起動するステップは、検出剤を検出様式に配給することによる、番号付き項目１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０３９５】
番号付き項目１８．
検出サイクルは、少なくとも１つの捕獲され標識化された検体からの信号を起動する前に、検体を標識化しなかった標識剤を続いて除去するステップを含む、番号付き項目１〜１７のいずれかに記載の方法。
【０３９６】
番号付き項目１９．
結合していないサンプル成分は、捕獲された検体または捕獲され標識化された検体から除去される、番号付き項目１〜１８のいずれかに記載の方法。
【０３９７】
番号付き項目２０．
信号の非活性化ステップは、下記から選択される。
ａ）捕獲された検体から標識剤を分離するステップ。
ｂ）標識剤が信号を促進する能力を非活性化させるステップ。
ｃ）ａ）およびｂ）の組合せ。
ここで、信号の非活性化ステップの後、必要に応じてリンスステップが行われる、番号付き項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
【０３９８】
番号付き項目２１．
サンプルからの少なくとも１つの検体の捕獲は、固相への固定化によるものである、番号付き項目１〜２０のいずれかに記載の方法。
【０３９９】
番号付き項目２２．
サンプルから少なくとも１つの検体の捕獲は、検体に特異的な１つ以上の捕獲プローブを使用することによるものであり、捕獲プローブは固相に付着されている、番号付き項目１〜２１のいずれかに記載の方法。
【０４００】
番号付き項目２３．
第１の数の検出サイクルおよび第２の数の検出サイクルが使用され、第１の数の検出サイクルは、第２の数の検出サイクルとは異なる標識剤を使用する、番号付き項目１〜２２のいずれかに記載の方法。
【０４０１】
番号付き項目２４．
１つ以上の異なる検体タイプ用の１つ以上の異なる捕獲プローブが固相に付着している、番号付き項目１〜２３のいずれかに記載の方法。
【０４０２】
番号付き項目２５．
１つ以上の異なる標識剤を使用して、１つ以上の異なる検体タイプを標識化する、番号付き項目１〜２４のいずれかに記載の方法。
【０４０３】
番号付き項目２６．
検出サイクルの数は、少なくとも３サイクル、少なくとも４サイクル、少なくとも５サイクル、少なくとも６サイクル、少なくとも７サイクル、少なくとも８サイクル、少なくとも９サイクル、または少なくとも１０サイクルである、番号付き項目１〜２５のいずれかに記載の方法。
【０４０４】
番号付き項目２７．
検出サイクル数は、３〜２０サイクル、３〜１５サイクル、３〜１０サイクル、３〜９サイクル、３〜８サイクル、３〜７サイクル、３〜６サイクル、または３〜５サイクルである、番号付き項目１〜２６のいずれかに記載の方法。
【０４０５】
番号付き項目２８．
標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、洗浄によって除去される、番号付き項目１〜２７のいずれかに記載の方法。
【０４０６】
番号付き項目２９．
信号を非活性化するステップは、複数の液体区画において実施される、番号付き項目１〜２８のいずれかに記載の方法。
【０４０７】
番号付き項目３０．
標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、分離は、酵素的開裂によるものである、番号付き項目１〜２９のいずれかに記載の方法。
【０４０８】
番号付き項目３１．
標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、分離は、ｐＨを調整したり、イオン強度を調整したり、変性塩を添加し、または界面活性剤を添加することによって、化学的開裂または脱着によるものである、番号付き項目１〜３０のいずれかに記載の方法。
【０４０９】
番号付き項目３２．
標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、分離は加熱によるものである、番号付き項目１〜３１のいずれかに記載の方法。
【０４１０】
番号付き項目３３．
標識剤は、その化学的状態または物理的状態を変化させることによって非活性化される、番号付き項目１〜３２のいずれかに記載の方法。
【０４１１】
番号付き項目３４．
標識剤は、酵素を含み、酵素の状態は、活性部位の化学的修飾または生化学的修飾によって変化する、番号付き項目１〜３３のいずれかに記載の方法。
【０４１２】
番号付き項目３５．
標識剤は、酵素を含み、酵素の状態は、酵素の三次構造の化学的分裂または物理的分裂によって変化する、番号付き項目１〜３４のいずれかに記載の方法。
【０４１３】
番号付き項目３６．
捕獲され標識化された検体は、親水性液体を複数の個別の捕獲部位に導入して引き出すことによって区画化されて、捕獲され標識化された検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位は親水性にされており、複数の個別の捕獲部位が１つの疎水性基板上に配置され、そのため親水性液体を引き出す際、複数の液滴が形成され、各液滴が１つの個別の捕獲部位を占有する、番号付き項目１〜３５のいずれかに記載の方法。
【０４１４】
番号付き項目３７．
捕獲され標識化された検体は、複数の個別の捕獲部位に第１親水性液体を導入し、続いて第１親水性液体を第２液体と置換することによって区画化されて、検体を収容する液体区画を生成し、２つの液体は非混和性であり、第２液体は第１液体よりも軽く、各個別の捕獲部位が親水性にされており、複数の個別の捕獲部位が疎水性基板上に配置され、そのため第１親水性液体を第２液体と置換する際、第１親水性液体を含む複数の液滴が形成され、各液滴は１つの個別の捕獲部位を占有する、番号付き項目１〜３６のいずれかに記載の方法。
【０４１５】
番号付き項目３８．
捕獲され標識化された検体は、第１液体を複数の個別の捕獲部位に導入することによって区画化されて、検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位はウェル形状または毛細管形状であり、第１液体は第２液体と置換され、２つの液体は非混和性であり、第２液体は第１液体よりも軽く、そのため第１液体の置換の際、第１液体を含む複数の液滴が形成され、各液滴は１つの個別の捕獲部位を占有する、番号付き項目１〜３７のいずれかに記載の方法。
【０４１６】
番号付き項目３９．
捕獲され標識化された検体は、液体を複数の個別の捕獲部位に導入することによって区画化されて、検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位はウェル形状または毛細管形状であり、液体は個別の捕獲部位に分配され、そのため各液体区画は１つの個別の捕獲部位を占有する、番号付き項目１〜３８のいずれかに記載の方法。
【０４１７】
番号付き項目４０．
捕獲され標識化された検体は、液体を複数の個別の捕獲部位に導入することによって区画化されて、検体を収容する液体区画を生成し、各個別の捕獲部位はウェル形状であり、液体は、蓋を複数の捕獲部位の上に付与することによって置換され、そのため複数の捕獲部位が形成され、各液滴は、蓋によって境界設定された１つのウェル形状の捕獲部位を占有する、番号付き項目１〜３９のいずれかに記載の方法。
【０４１８】
番号付き項目４１．
捕獲され標識化された検体は、複数の個別の捕獲部位および捕獲され標識化された検体を含む第１液体を第２液体に導入することによって区画化されて、捕獲され標識化された検体を収容する液体区画を生成し、第２液体は第１液体と非混和性であり、そのため第１液体で構成され、第２液体によって包囲された複数のエマルジョン液滴が形成され、各エマルジョン液滴は、少なくとも１つの個別の捕獲部位および少なくとも１つの捕獲され標識化された検体を含む、番号付き項目１〜４０のいずれかに記載の方法。
【０４１９】
番号付き項目４２．
各検出サイクルにおいて信号を示す液体区画の位置は、他の検出サイクルにおいて信号を示す液体区画の位置と比較され、その結果、液体区画が信号を示す連続的な検出サイクルの数が計数され、液体区画は、少なくとも２つのカテゴリーに分類され、液体区画の第１カテゴリーは第２カテゴリーよりも多い計数を示す、番号付き項目１〜４１のいずれかに記載の方法。
【０４２０】
番号付き項目４３．
連続検出サイクルにおいて信号を繰り返し示す液体区画の数は、サンプル中のターゲット検体の濃度を計算するために適用される、番号付き項目４２に記載の方法。
【０４２１】
番号付き項目４４．
個別の捕獲部位の数は、少なくとも１０００個、好ましくは少なくとも１００００個、好ましくは少なくとも１０００００個、好ましくは少なくとも１００００００個、好ましくは少なくとも１０００００００個である、番号付き項目１〜４３のいずれかに記載の方法。
【０４２２】
番号付き項目４５．
個別の捕獲部位は、円形または球状であり、個々の個別の部位の直径は、１ｍｍ未満、好ましくは１００μｍ未満、好ましくは１０μｍ未満、好ましくは１μｍ未満である、番号付き項目１〜４４のいずれかに記載の方法。
【０４２３】
番号付き項目４６．
個別の捕獲部位は、円形または球状であり、個別の部位の直径は、０．５〜５μｍ、０．５〜１０μｍ、０．５〜５０μｍ、０．５〜１００μｍ、１０〜１０００μｍ、５０〜１０００μｍ、１００〜１０００μｍの間である、番号付き項目１〜４５のいずれかに記載の方法。
【０４２４】
番号付き項目４７．
個別の捕獲部位は、正方形(quadratic)であり、個別の部位の長さは、１ｍｍ未満、好ましくは１００μｍ未満、好ましくは１０μｍ未満、好ましくは１μｍ未満である、番号付き項目１〜４６のいずれかに記載の方法。
【０４２５】
番号付き項目４８．
個別の捕獲部位は、正方形(quadratic)であり、個別の部位の長さは、０．５〜５μｍ、０．５〜１０μｍ、０．５〜５０μｍ、０．５〜１００μｍ、１０〜１０００μｍ、５０〜１０００μｍ、１００〜１０００μｍの間である、番号付き項目１〜４７のいずれかに記載の方法。
【０４２６】
番号付き項目４９．
固相は、下記のものである、番号付き項目１〜４８のいずれかに記載の方法。
ａ）固体基板、
ｂ）コロイドビーズ、または、
ｃ）コロイドビーズの集合体。
【０４２７】
番号付き項目５０．
液体区画は、気相シール下の複数の液体ナノリットルからアトリットル液滴の形態である、番号付き項目１〜４９のいずれかに記載の方法。
【０４２８】
番号付き項目５１．
液体区画は、ウェル形状の捕獲部位、空洞形状の捕獲部位、または毛細管形状の捕獲部位を占有する、番号付き項目１〜５０のいずれかに記載の方法。
【０４２９】
番号付き項目５２．
液体区画は、複数の油中水型エマルジョン液滴の形態である、番号付き項目１〜５１のいずれかに記載の方法。
【０４３０】
番号付き項目５３．
液体区画は、水非混和性の液相の下で複数の水性ナノリットルからアトリットル液滴の形態である、番号付き項目１〜５２のいずれかに記載の方法。
【０４３１】
番号付き項目５４．
デジタル計数は、サンプル中の１つ以上の検体タイプのデジタル計数のためのフローシステム（１０）において行われ、フローシステムは、疎水性基板（１６）の内または上に親水性機構（１４）のパターンを有する支持体（１２）を備え、疎水性基板（１６）は、少なくとも１つの開口を含むフロー区画（１８）内に埋め込まれ、親水性機構（１４）は、最大液滴体積をそれぞれ有する複数の液体ナノリットルからアトリットル液滴を支持するように構成され、そしてフロー区画（１８）は、各ナノリットルからアトリットル液滴の蒸発を低減する気相シールを支持するように構成される、番号付き項目１〜５３のいずれかに記載の方法。
【０４３２】
番号付き項目５５．
気相シールは、マイクロ液滴の蒸発を低減できるフローシステム内の蒸気圧を確立する、番号付き項目５４に記載の方法。
【０４３３】
番号付き項目５６．
気相シールは、各ナノリットルからアトリットル液滴の蒸発を最大液滴体積の５０パーセント未満まで減少させる、番号付き項目５４〜５５のいずれかに記載の方法。
【０４３４】
番号付き項目５７．
（ｉ）疎水性基板（１６）の内または上にある親水性機構（１４）のパターンを、１つ以上の検体タイプを含むサンプルと接触させるステップを含む、番号付き項目５４〜５６のいずれかに記載の方法。
【０４３５】
番号付き項目５８．
（ｉｉ）親水性機構（１４）の上に１つ以上の検体タイプを捕獲するステップを含む、番号付き項目５４〜５７のいずれかに記載の方法。
【０４３６】
番号付き項目５９．
（ｉｉｉ）少なくとも１つの捕獲された検体タイプを、検出対象の検体タイプに特異的な標識剤で標識化するステップを含む、番号付き項目５４〜５８のいずれかに記載の方法。
【０４３７】
番号付き項目６０．
捕獲され標識化された検体は、検出剤を、パターンを横断するように流し、パターンから引き出して、個々の液滴をナノリットルからアトリットル液滴の形態に生成するステップ（ｉｖ）によって、区画化されて、少なくとも１つの検体を収容する液体区画を生成する、番号付き項目５４〜５９のいずれかに記載の方法。
【０４３８】
番号付き項目６１．
標識剤と検出剤の両方を収容する液滴の数を計数するステップ（ｖ）を含む、番号付き項目５４〜６０のいずれかに記載の方法。
【０４３９】
番号付き項目６２．
ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を１回以上繰り返すことを含む、番号付き項目５４〜６１のいずれかに記載の方法。
【０４４０】
番号付き項目６３．
第１標識剤の代わりに、検出対象の第２検体タイプに特異的な第２標識剤を使用することによって、ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を繰り返すことを含む、番号付き項目５４〜６２のいずれかに記載の方法。
【０４４１】
番号付き項目６４．
ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を繰り返す前に、前回のステップに存在する標識剤を非活性化させるステップを含む、番号付き項目５４〜６３のいずれかに記載の方法。
【０４４２】
番号付き項目６５．
標識剤は、捕獲された検体からの分離によって非活性化され、そしてフローシステムの洗浄によって除去される、番号付き項目５４〜６４のいずれかに記載の方法。
【０４４３】
番号付き項目６６．
標識剤は、酵素および特定の検体認識部位(moiety)を含み、検体認識部位は、下記の分子グループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、それらの複合体またはそれらの合成変異体から選択される、番号付き項目１〜６５のいずれかに記載の方法。
【０４４４】
番号付き項目６７．
個別の捕獲部位は、親水性機構である、番号付き項目１〜６６のいずれかに記載の方法。
【０４４５】
番号付き項目６８．
１つ以上の異なる検体タイプのための１つ以上の捕獲プローブ（２２）が、親水性機構（１４）に付着している、番号付き項目１〜６７のいずれかに記載の方法。
【０４４６】
番号付き項目６９．
親水性機構に付着した２つ以上のタイプの捕獲プローブ（２２）を含み、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域（２４）内に配置される、番号付き項目１〜６８のいずれかに記載の方法。
【０４４７】
番号付き項目７０．
捕獲プローブ（２２）は、下記のプローブグループ、即ち、オリゴヌクレオチド、アプタマー、タンパク質、抗体、ペプチドまたはそれらの合成変異体から選択される、番号付き項目１〜６９のいずれかに記載の方法。
【０４４８】
番号付き項目７１．
液体中に１つ以上のタイプの検体を含有するサンプルは、完全浸漬によって親水性機構（１４）を含む基板と接触する、番号付き項目１〜７０のいずれかに記載の方法。
【０４４９】
番号付き項目７２．
標識化は、検体のための標識剤を含有する溶液を、捕獲された検体と完全浸漬によって接触させることによって行われる、番号付き項目１〜７１のいずれかに記載の方法。
【０４５０】
番号付き項目７３．
検体は、下記の検体グループ、即ち、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質、タンパク質／オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質／脂質複合体、ペプチド、エキソソーム、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ナノ粒子、細胞断片または細胞から選択される、番号付き項目１〜７２のいずれかに記載の方法。
【０４５１】
番号付き項目７４．
サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織から選択される、番号付き項目１〜７３のいずれかに記載の方法。
【０４５２】
番号付き項目７５．
サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織、の研究室処理サンプルから選択される、番号付き項目１〜７４のいずれかに記載の方法。
【０４５３】
番号付き項目７６．
デジタル計数分析は、単一分子の検出と定量化の両方を含む、番号付き項目１〜７５のいずれかに記載の方法。
【０４５４】
番号付き項目７７．
捕獲された検体は、捕獲の後に捕獲プローブ（２２）と共有結合するようになる、番号付き項目１〜７６のいずれかに記載の方法。
【０４５５】
番号付き項目７８．
捕獲プローブは、オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドであり、検体は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む分子複合体であり、検体は、捕獲プローブ配列に対して相補的な配列を介して捕獲プローブと結合され、共有結合架橋は、鎖間架橋剤、例えば、白金錯体、マイトマイシンＣ、ナイトロジェンマスタード、ソラレンまたはアルデヒドなどを使用することによって実行される、番号付き項目１〜７７のいずれかに記載の方法。
【０４５６】
番号付き項目７９．
捕獲プローブは、タンパク質、アプタマー、ペプチドまたはその合成変異体であり、検体は、タンパク質、ペプチドまたは、タンパク質もしくはペプチドを含む複合体であり、検体は、検体の特異領域の構造的認識によって捕獲プローブに結合され、共有結合架橋は、化学固定剤、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、メチルグリオキサールまたは酢酸ウラニルなどを使用することによって実行される、番号付き項目１〜７８のいずれかに記載の方法。
【０４５７】
番号付き項目８０．
捕獲プローブは、合成オリゴヌクレオチドであり、合成修飾は、捕獲の後に検体と捕獲プローブとの間に共有結合が確立できるように検体に対して反応性の化学基を組み込む、番号付き項目１〜７９のいずれかに記載の方法。
【０４５８】
番号付き項目８１．
検体と捕獲プローブとの間の共有結合は、検体／捕獲プローブ複合体を化学物質と接触させることによって起動される、番号付き項目８０に記載の方法。
【０４５９】
番号付き項目８２．
検体と捕獲プローブとの間の共有結合は、検体／捕獲プローブ複合体を電磁放射線と接触させることによって起動される、番号付き項目８０に記載の方法。
【０４６０】
番号付き項目８３．
デジタル計数測定は、単一酵素結合分子分析（ＳＥＬＭＡ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）、単一酵素結合免疫吸着法（ｓＥＬＩＳＡ）またはデジタル単一酵素結合免疫吸着法（ｄＥＬＩＳＡ）を含む、番号付き項目１〜８２のいずれかに記載の方法。
【０４６１】
番号付き項目８４．
少なくとも１つの検体は、オリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、単一ヌクレオチドの多型、挿入または欠失など、１つ以上の塩基対変化を有するゲノム配列または転写ゲノム配列であり、サンプルは、潜在的に、２つ以上の非ターゲットオリゴヌクレオチドを含み、非ターゲットオリゴヌクレオチドは、ターゲットと同じゲノム配列または転写されたゲノム配列を有するが、１つ以上の塩基対変化を伴わない、番号付き項目１〜８３のいずれかに記載の方法。
【０４６２】
番号付き項目８５．
サンプルは、第１および第２検体タイプを含み、第１検体タイプはサンプル中に第１配列および第１濃度を有し、第２検体タイプはサンプル中に第２配列および第２濃度を有し、第１配列および第２配列は異なり、第１および第２配列はゲノム配列または転写されたゲノム配列であり、ここに開示するように、第１および第２濃度は測定され、互いに比較してコピー数の変動を識別する、番号付き項目１〜８４のいずれかに記載の方法。
【０４６３】
番号付き項目８６．
気相は、大気によって提供され、捕獲プローブは一本鎖ＤＮＡオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択され、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置され、検体は、処理した血液サンプルから抽出された一本鎖ＤＮＡであり、標識剤は、検出様式(modality)および認識部位を備え、検出様式は酵素であり、認識部位は、一本鎖ＤＮＡオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択される、番号付き項目１〜８５のいずれかに記載の方法。
【０４６４】
番号付き項目８７．
複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、番号付き項目１〜８６のいずれかに記載の方法で少なくとも１つの検体を捕獲可能である。
【０４６５】
番号付き項目８８．
複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、デジタル計数分析における計数誤差を減少させるために、例えば、偽ポジティブ検出及び／又はバックグラウンドノイズの低減のために、番号付き項目１〜８７のいずれかに記載の方法で少なくとも１つの検体を捕獲可能である。
【０４６６】
番号付き項目８９．
複数の個別の捕獲部位を有する固相の使用であって、各部位は、デジタル計数分析における計数誤差を減少させるために、例えば、偽ポジティブ検出及び／又はバックグラウンドノイズの低減のために、番号付き項目１〜８６のいずれかに定義される少なくとも２つの検出サイクルを行うことによって、少なくとも１つの検体を捕獲可能である。
【０４６７】
（本発明の更なる詳細な実施形態）
体積がピコリットル以下のマイクロ液滴を基板上の所定場所に液相で保持するプロセスが、マイクロ液滴を、少なくとも１つの開口を有するチャネル内に配置することと、チャネルの空間を、マイクロ液滴の蒸発を低減できるチャネル内蒸気圧を確立する値に設定することとを含む。
【０４６８】
本発明はさらに、下記の実施形態に関する。
【０４６９】
実施形態１．
サンプル中の１つ以上の検体タイプのデジタル計数のためのフローシステムが、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備え、疎水性基板は、少なくとも１つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、それぞれ最大液滴体積を有する複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成され、フロー区画は、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を低減する気相シールを支持するように構成される。
【０４７０】
実施形態２．
実施形態１に係るフローシステムにおいて、フロー区画は、体積（ＶＣ）を有し、体積（ＶＣ）は、全てのナノリットルからアトリットルの液滴の凝集最大液滴体積（ＶＤＡ）より大きく、下記式によって計算されるＶＭＡＸより小さい。
【０４７１】
【数１７】
2019523419.tif 000019
【０４７２】
ここで、ρＬは液体の体積密度であり、Ｒはモル気体定数であり、Ｔは温度であり、ＲＨＩは液体の気体成分の初期相対蒸気飽和であり、Ｐ０は対応する基準温度Ｔ０での液体の基準蒸気圧であり、ＭＷは液体のモル重量であり、ΔＨＶＡＰは液体の蒸発のエンタルピーである。
【０４７３】
実施形態３．
実施形態１〜２のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構が（ＲＤ）の半径を有する円形であり、単一の親水性円が支持できる最大液滴体積（ＶＤ）は、下記式である。
【０４７４】
【数１８】
2019523419.tif 000020
【０４７５】
ここで、γは疎水性基板での液体接触角である。
【０４７６】
実施形態４．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発は、最大液滴体積の５０％未満、各ナノリットルからアトリットルの液滴の最大液滴体積の、４０％未満、好ましくは３０％未満、好ましくは２０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満、好ましくは１％未満である。
【０４７７】
実施形態５．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相シールは、大気、窒素、アルゴン及び／又はヘリウムによって構成される。
【０４７８】
実施形態６．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相シールは、大気によって構成される。
【０４７９】
実施形態７．
サンプル中の１つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のためのフローシステムが、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備え、疎水性基板は、少なくとも１つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。
【０４８０】
実施形態８．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、親水性／疎水性パターンとの液体接触を可能にするために、液滴領域を覆う１つ以上のフロー区画を備える。
【０４８１】
実施形態９．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、フローシステムに液体および試薬を供給するための１つ以上の液体装填パッドを備える。
【０４８２】
実施形態１０．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、フロー区画を液体装填パッドに接続する液体入口を備える。
【０４８３】
実施形態１１．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、液体は、入口から出口への圧力降下を用いてフロー区画を横断して駆動される。
【０４８４】
実施形態１２．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、フローチャネルを圧力源に接続する液体出口を備え、吸引を提供し、よってフローチャネルを介して液体駆動に介在する。
【０４８５】
実施形態１３．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相シールは、大気、窒素、アルゴン及び／又はヘリウムによって構成される。
【０４８６】
実施形態１４．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相シールは、大気によって構成される。
【０４８７】
実施形態１５．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムは、１つ以上の区別できる検体タイプのための１つ以上の捕獲プローブを備え、捕獲プローブは、親水性機構に付着される。
【０４８８】
実施形態１６．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置される。
【０４８９】
実施形態１７．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、支持体は平面的である。
【０４９０】
実施形態１８．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構は平面的である。
【０４９１】
実施形態１９．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構のパターンは、親水性機構がアレイ状に配置された少なくとも１つの領域を含む。
【０４９２】
実施形態２０．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構は、正方形平面アレイ状に編成され、機構は、半径（ＲＤ）を有する円として形状をなし、アレイは、隣接する機構の間のピッチ（δ）を有し、δは少なくとも３ＲＤであり、アレイは、フロー方向に沿って長さ（ＬＡＸ）に延びており、アレイは、フロー方向に対して垂直な長さ（ＬＡＹ）に延びており、チャネルは、フロー方向に沿って長さ（ＬＣＸ）を有し、ＬＣＸはＬＡＸより大きいか、またはこれに等しく、チャネルは、フロー方向に対して垂直な長さ（ＬＣＹ）を有し、ＬＣＹはＬＡＹより大きいか、またはこれに等しく、チャネルは、高さ（ｈ）を有し、これは少なくとも２ＲＤで、多くてもｈＭＡＸであり、ｈＭＡＸは下記の式から計算される。
【０４９３】
【数１９】
2019523419.tif 000021
【０４９４】
ここで、γは疎水性材料についての液体接触角であり、θＭＡＸは液滴の最大許容蒸発体積割合であり、ρＬは液体の体積密度であり、Ｒはモル気体定数であり、Ｔは温度であり、ＲＨＩは液体の気体成分の初期相対蒸気飽和であり、Ｐ０は対応する基準温度Ｔ０での液体の基準蒸気圧であり、ＭＷは液体のモル重量であり、ΔＨＶＡＰは液体の蒸発のエンタルピーである。
【０４９５】
実施形態２１．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構のパターンは、少なくとも２つの領域を備え、一方の領域のアレイは、他方の領域のアレイと相違する。
【０４９６】
実施形態２２．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構を支持する領域は、フロー区画内に中央に設置される。
【０４９７】
実施形態２３．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構の数は、少なくとも１０００個、好ましくは少なくとも１００００個、好ましくは少なくとも１０００００個、好ましくは少なくとも１００００００個、好ましくは少なくとも１０００００００個である。
【０４９８】
実施形態２４．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、フロー区画は、チャネル形状であり、区画の対向端部での２つの開口の間でフロー方向を形成する。
【０４９９】
実施形態２５．
実施形態１３に係るフローシステムにおいて、フロー区画および開口は、フロー方向に対して垂直な断面で矩形形状を有する。
【０５００】
実施形態２６．
実施形態１３に係るフローシステムにおいて、フロー区画は、矩形形状を有し、開口は、フロー方向に対して垂直な断面で円形形状を有する。
【０５０１】
実施形態２７．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構は、ナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成され、液滴は、少なくとも９０度、多くても１５０度の、疎水性基板での接触角を示す。
【０５０２】
実施形態２８．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性機構は、少なくとも０．１μｍ、多くても１００μｍの半径を有するナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。
【０５０３】
実施形態２９．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、親水性基板は、ガラス、親水性ポリマーまたは金属酸化物化合物である。
【０５０４】
実施形態３０．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、疎水性層は、基板に共有結合的に接合した分子単層である。
【０５０５】
実施形態３１．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、疎水性層は、金属基板上に化学吸着した分子単層である。
【０５０６】
実施形態３２．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、１つ以上の捕獲した検体は、捕獲に続いて、捕獲プローブと共有結合的に架橋または結合できる。
【０５０７】
実施形態３３．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、捕獲プローブは、オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドであり、検体は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む分子複合体であり、検体は、捕獲プローブ配列に対して相補的な配列を介して捕獲プローブと結合され、共有結合架橋は、鎖間架橋剤、例えば、白金錯体、マイトマイシンＣ、ナイトロジェンマスタード、ソラレンまたはアルデヒドなどを使用することによって実行される。
【０５０８】
実施形態３４．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、捕獲プローブは、タンパク質、ペプチドまたはその合成変異体であり、検体は、タンパク質、ペプチドまたは、タンパク質もしくはペプチドを含む複合体であり、検体は、検体の特異領域の構造的認識によって捕獲プローブに結合され、共有結合架橋は、化学固定剤、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウムまたは酢酸ウラニルなどを使用することによって実行される。
【０５０９】
実施形態３５．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、デジタル計数は、デジタル計数測定である。
【０５１０】
実施形態３６．
前述した実施形態のいずれかに係るフローシステムにおいて、デジタル計数測定は、単一酵素結合分子分析（ＳＥＬＭＡ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）、単一酵素結合免疫吸着法（ｓＥＬＩＳＡ）またはデジタル単一酵素結合免疫吸着法（ｄＥＬＩＳＡ）である。
【０５１１】
実施形態３７．
前述した実施形態のいずれかで定義されるフローシステムを調製する方法。
【０５１２】
実施形態３８．
少なくとも１つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための、前述した実施形態のいずれかで定義されるフローシステムを使用する方法。
【０５１３】
実施形態３９．
少なくとも１つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための方法であり、該方法は、気相シールの下での複数のナノリットルからアトリットルの液滴に含まれる検体タイプを計数することを含む。
【０５１４】
実施形態４０．
実施形態３９に係る方法において、気相シールは、マイクロ液滴の蒸発を低減できる、フローシステム内の蒸気圧を確立する。
【０５１５】
実施形態４１．
実施形態３９〜４０のいずれかに係る方法において、デジタル計数は、フローシステムにおいて実施され、該フローシステムは、疎水性基板の中または上に親水性機構のパターンを有する支持体を備え、疎水性基板は、少なくとも１つの開口を含むフロー区画の中に組み込まれ、親水性機構は、複数のナノリットルからアトリットルの液滴を支持するように構成される。
【０５１６】
実施形態４２．
実施形態３９〜４１のいずれかに係る方法において、親水性機構は、半径（ＲＤ）を有する円形であり、単一の親水性円が支持できる最大液滴体積（ＶＤ）は、下記の式である。
【０５１７】
【数２０】
2019523419.tif 000022
【０５１８】
ここで、γは疎水性基板上の液体接触角である。
【０５１９】
実施形態４３．
実施形態３９〜４２のいずれかに係る方法において、気相シールは、各ナノリットルからアトリットルの液滴の蒸発を最大液滴体積の５０％未満に低減する。
【０５２０】
実施形態４４．
実施形態３９〜４３のいずれかに係る方法において、フローシステムは、実施形態１〜３６のいずれかにおいて定義される。
【０５２１】
実施形態４５．
実施形態３９〜４４のいずれかに係る方法はさらに、（ｉ）疎水性基板の中または上にある親水性機構のパターンを、１つ以上の検体タイプを含むサンプルに接触させるステップを含む。
【０５２２】
実施形態４６．
実施形態３９〜４５のいずれかに係る方法は、（ｉｉ）親水性機構の上で少なくとも１つの検体タイプを捕獲するステップを含む。
【０５２３】
実施形態４７．
実施形態３９〜４６のいずれかに係る方法は、（ｉｉｉ）少なくとも１つの捕獲された検体タイプを、検出される検体タイプに特異的な標識剤を用いて標識化するステップを含む。
【０５２４】
実施形態４８．
実施形態３９〜４７のいずれかに係る方法は、（ｉｖ）検出剤を、パターンを横断して流し、パターンから引き出して、個々の液滴をナノリットルからアトリットルの液滴の形態に生成するステップを含む。
【０５２５】
実施形態４９．
実施形態３９〜４８のいずれかに係る方法は、（ｖ）標識剤および検出剤の両方を収容する液滴の数を計数するステップを含む。
【０５２６】
実施形態５０．
実施形態３９〜４９のいずれかに係る方法は、ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を１回以上繰り返すことを含む。
【０５２７】
実施形態５１．
実施形態３９〜５０のいずれかに係る方法は、第１標識剤の代わりに、検出される第２検体タイプに特異的な第２標識剤を使用することによって、ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を繰り返すことを含む。
【０５２８】
実施形態５２．
実施形態３９〜５１のいずれかに係る方法は、ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を繰り返す前に、前回ステップに存在する標識剤を不活性化するステップを含む。
【０５２９】
実施形態５３．
実施形態３９〜５２のいずれかに係る方法において、標識剤は、表面結合した検体からの脱離によって不活性化され、フローシステムの洗浄(flushing)によって除去される。
【０５３０】
実施形態５４．
実施形態３９〜５３のいずれかに係る方法において、標識剤は、酵素的切断によって脱離される。
【０５３１】
実施形態５５．
実施形態３９〜５４のいずれかに係る方法において、標識剤は、ｐＨを調整し、イオン強度を調整し、変性塩を追加し、または洗浄剤を追加することによって、化学的切断または脱着によって脱離される。
【０５３２】
実施形態５６．
実施形態３９〜５５のいずれかに係る方法において、標識剤は、フローシステムの温度を上昇させることによって脱離される。
【０５３３】
実施形態５７．
実施形態３９〜５６のいずれかに係る方法において、標識剤は、その化学的または物理的な状態を変化させることによって不活性化される。
【０５３４】
実施形態５８．
実施形態３９〜５７のいずれかに係る方法において、標識剤は酵素を含み、酵素の状態は、活性部位の化学的または生化学的修飾によって変化する。
【０５３５】
実施形態５９．
実施形態３９〜５８のいずれかに係る方法において、標識剤は酵素を含み、酵素の状態は、酵素の三次構造の化学的または物理的分断によって変化する。
【０５３６】
実施形態６０．
実施形態３９〜５９のいずれかに係る方法において、標識剤は、酵素および特異検体認識部位を含み、検体認識部位は、下記の分子グループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、その複合体またはその合成変異体から選択される。
【０５３７】
実施形態６１．
実施形態３９〜６０のいずれかに係る方法において、１つ以上の区別できる検体タイプのための１つ以上の捕獲プローブは、親水性機構に付着される。
【０５３８】
実施形態６２．
実施形態３９〜６１のいずれかに係る方法において、１つ以上の区別できる検体タイプのための１つ以上の捕獲プローブは、リンカー(linker)部位によって親水性機構に付着され、リンカー部位は、下記の分子グループ、即ち、ポリ（エチレングリコール）、直鎖または分岐アルカン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはその合成変異体から選択される。
【０５３９】
実施形態６３．
実施形態３９〜６２のいずれかに係る方法は、親水性機構に付着された２つ以上のタイプの捕獲プローブを備え、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置される。
【０５４０】
実施形態６４．
実施形態３９〜６３のいずれかに係る方法において、捕獲プローブは、下記のプローブグループ、即ち、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、またはその合成変異体から選択される。
【０５４１】
実施形態６５．
実施形態３９〜６４のいずれかに係る方法において、液体中に１つ以上の検体タイプを含むサンプルは、完全浸漬によって親水性機構を含む基板と接触する。
【０５４２】
実施形態６６．
実施形態３９〜６５のいずれかに係る方法は、液体を除去し、基板を洗浄することを含む。
【０５４３】
実施形態６７．
実施形態３９〜６６のいずれかに係る方法において、標識化は、完全浸漬によって、検体用の標識剤を含む溶液を、捕獲した検体と接触させることによって実施される。
【０５４４】
実施形態６８．
実施形態３９〜６７のいずれかに係る方法は、残りのプローブを含む溶液を除去し、基板を洗浄することを含む。
【０５４５】
実施形態６９．
実施形態３９〜６８のいずれかに係る方法において、液体は、入口から出口への圧力降下を用いてフロー区画を横断して駆動される。
【０５４６】
実施形態７０．
実施形態３９〜６９のいずれかに係る方法において、検体は、下記の検体グループ、即ち、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質、タンパク質／オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質／脂質複合体、ペプチド、エキソソーム(exosome)、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ナノ粒子、細胞断片または細胞から選択される。
【０５４７】
実施形態７１．
実施形態３９〜７０のいずれかに係る方法において、サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または組織から選択される。
【０５４８】
実施形態７２．
実施形態３９〜７１のいずれかに係る方法において、サンプルは、下記のサンプルグループ、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙液または、処理した血液サンプルなどの組織、の研究室処理サンプルから選択される。
【０５４９】
実施形態７３．
実施形態３９〜７２のいずれかに係る方法において、１つ以上の捕獲した検体は、捕獲に続いて、捕獲プローブと共有結合的に架橋または結合できる。
【０５５０】
実施形態７４．
実施形態３９〜７３のいずれかに係る方法において、捕獲プローブは、オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドであり、検体は、捕獲プローブ配列に対して相補的な配列を介して捕獲プローブと結合されたオリゴヌクレオチドであり、共有結合架橋は、鎖間架橋剤、例えば、白金錯体、マイトマイシンＣ、ナイトロジェンマスタード、ソラレンまたはアルデヒドなどを使用することによって実行される。
【０５５１】
実施形態７５．
実施形態３９〜７４のいずれかに係る方法において、捕獲プローブは、タンパク質、ペプチドまたはその合成変異体であり、検体は、タンパク質、ペプチドまたは、タンパク質もしくはペプチドを含む複合体であり、検体は、検体の特異領域の構造的認識によって捕獲プローブに結合され、共有結合架橋は、化学固定剤、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウムまたは酢酸ウラニルなどを使用することによって実行される。
【０５５２】
実施形態７６．
実施形態３９〜７５のいずれかに係る方法において、デジタル計数は、デジタル計数測定である。
【０５５３】
実施形態７７．
実施形態３９〜７６のいずれかに係る方法において、デジタル計数測定は、単一酵素結合分子分析（ＳＥＬＭＡ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）、単一酵素結合免疫吸着法（ｓＥＬＩＳＡ）またはデジタル単一酵素結合免疫吸着法（ｄＥＬＩＳＡ）である。
【０５５４】
実施形態７８．
実施形態１〜３８のいずれかに係るフローシステムにおいて、気相は、大気によって提供され、及び／又は、捕獲プローブは、一本鎖ＤＮＡオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択され、及び／又は、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置され、及び／又は、検体は、処理した血液サンプルから抽出された一本鎖または二本鎖のＤＮＡであり、及び／又は、標識剤は、検出様式(modality)および認識部位を備え、及び／又は、検出様式は酵素であり、及び／又は、認識部位は、一本鎖ＤＮＡオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択される。
【０５５５】
実施形態７９．
実施形態３９〜７７のいずれかに係る方法において、気相は、大気によって提供され、及び／又は、捕獲プローブは、一本鎖ＤＮＡオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択され、及び／又は、異なるタイプの捕獲プローブが複数領域に配置され、及び／又は、異なるタイプの捕獲プローブは複数領域に配置され、及び／又は、検体は、処理した血液サンプルから抽出された一本鎖または二本鎖のＤＮＡであり、及び／又は、標識剤は、検出様式および認識部位を備え、及び／又は、検出様式は酵素であり、及び／又は、認識部位は、一本鎖ＤＮＡオリゴ、一本鎖ロックド核酸オリゴまたは一本鎖ペプチド核酸オリゴのグループから選択される。
【０５５６】
実施形態８０．
少なくとも１つ以上の区別できる検体タイプのデジタル計数のための、気相シールの下での複数のナノリットルからアトリットルの液滴の使用。
【０５５７】
実施形態８１．
実施形態８０に係る使用は、実施形態３９〜７７、７９のいずれかに係る方法によって実行される。
【０５５８】
実施形態８２．
実施形態８０〜８１のいずれかに係る使用は、実施形態１〜３８、７８のいずれかに係るフローシステムにおいて実行される。
【０５５９】
下記において、用途のいくつかの非限定的例を説明する。
【０５６０】
（例１：フェムトリットル水性マイクロ液滴アレイの形成および保存）
安定したマイクロ液滴を形成するために、平面的な疎水性領域の上に組み込まれた親水性円形機構の正方形アレイをリン酸緩衝水溶液と接触させた。溶液の１０μｌプラグをアレイの表面を横断するように駆動して、図４の顕微鏡写真に示すように、親水性機構の上にマイクロ液滴を残した。
【０５６１】
フローシステムは、液体を案内するために、矩形チャネルの各端部において２つの開口によって画定した。チャネルの幅は３ｍｍ、長さは１６ｍｍ、高さは１５０μｍであった。アレイは、チャネル内に中央に配置し、２．９ｍｍの幅、１４ｍｍの長さを備え、合計４０６０００個の親水性機構を含んだ。親水性円の直径は５μｍ、円同士の間隔は１０μｍであった。疎水性表面での水溶液の接触角は約１１０度で、実験は２１℃の周囲温度で行った。液滴体積のせいぜい３％が蒸発するのが許容され、これは、式（１１）に従って、乾燥空気（ＲＨＩ＝０）について約６８０μｍのチャネルの最大高さを意味する。フロー区画の高さは１５０μｍに過ぎず、最大高さ未満であるため、気相シールは機能的であり、マイクロ液滴を無傷に維持できた。
【０５６２】
１０μｌ体積をチャネル入口に接続された装填パッドの中に配置することによって、アレイは、バルク水溶液と接触した。次に、チャネル出口において負圧を印加し、１０μｌ液体プラグを５μｌ／ｍｉｎのフローレートでチャネルを横断するように駆動した。いったんバルク液体の後退エッジがチャネル出口に到達すると、圧力を終了して、新しい液体プラグを装填パッドに配置した。機能的気相シールに起因して、親水性機構の上部に形成された液滴は、著しい蒸発を経験することなく、１時間を超えて安定に残留した。例えば、図１２Ｃを参照。
【０５６３】
（例２：フローチャネル、液滴およびアレイの幾何形状を最適化することによって、水性マイクロ液滴のアレイを蒸発耐性にする方法）
化学的にパターン化された固体基板が組み込まれたフローチャネルについて検討する。化学パターンは、アレイに編成された円形の親水性領域からなる。親水性アレイは、連続的な疎水性領域によって包囲される。こうして、例１に示すように、いったん水溶液が注入され、続いてフローチャネルから引き出されると、マイクロ液滴のアレイが親水性機構の上部に形成される。
【０５６４】
フローチャネルの寸法は、図１３で定義され、チャネルの高さであるｈ、アレイによってカバーされるフローチャネルの長さであるｌＡ、入口／出口に至り、アレイを収容していない、チャネルの余剰部の長さであるｌＥ、によって特徴付けられる。アレイを定義するパラメータは、固体基板上の親水性機構の半径として定義される液滴半径ＲＤ、および隣接する液滴の間の中心間距離であるδである。下記において、我々は、正方パターンに編成されたアレイを仮定しているが、他のアレイパターンについての手法が下記に示すものと同じ原理を用いて導出できる。
【０５６５】
最初に我々は、フローチャネルに存在する水の合計モル量を計算する。これは、液滴（ＶＤ）の体積を計算し、それを存在する液滴の合計数で乗算することによって行われる。我々は、液滴が球の体積の半分を示す半球によって表現できると仮定する。アレイおよびフローチャネルは、ｙ方向に沿って同一であるため、我々は、液滴の単一ラインで構成される１次元アレイ（略図したもののように）、そして液滴間間隔δの幅を備えた疑似１次元フローチャネルを検討する必要があるだけである。１次元アレイに沿った液滴の合計数（ＮＤ）は、下記の式（１２）である。
【０５６６】
【数２１】
2019523419.tif 000023
【０５６７】
全液滴の合計モル量（ｎＴＯＴ）は、下記の式（１３）として評価できる。
【０５６８】
【数２２】
2019523419.tif 000024
【０５６９】
ここで、ｍｗは全液滴の合計質量であり、ＭＷは水のモル重量（１８．０１６ｇ／ｍｏｌ）であり、ρｗは水の密度（１０００ｇ／ｌ）である。所定の温度でどのぐらいの水の量が蒸発するかを計算するために、我々は、クラウジウス・クラペイロンの式を利用して、水の平衡蒸気圧（ＰＷ）を計算する必要がある。
【０５７０】
【数２３】
2019523419.tif 000025
【０５７１】
ここで、Ｐ０は基準温度Ｔ０での基準平衡蒸気圧であり、Ｔは反応温度であり、Ｒは気体定数（８．３１Ｊ・ｍｏｌ−１・Ｋ−１）であり、ΔＨＶＡＰ（４０．６５ｋＪ・ｍｏｌ−１）は水の蒸発時のエンタルピー変化である。Ｐ０およびＴ０についての適切な値は、それぞれ２９３Ｋの温度で２．３４ｋＰａとできる。ＶＦの体積を有する閉じたフローチャネルでは、水の蒸気圧は、どのぐらいの水が水蒸気として空気中に転移するかを示す。平衡時の水蒸気のモル量（ｎＥＶＡＰ）は、理想気体の法則から下記の式（１５）として得られる。
【０５７２】
【数２４】
2019523419.tif 000026
【０５７３】
蒸発した水の割合（θＷ）は、ここでは蒸発した水と水の合計モル量との比として評価できる。
【０５７４】
【数２５】
2019523419.tif 000027
【０５７５】
ここで我々は、（ｉ）無次元の倍率(scaling factor)Ｎ＝δ／ＲＤ（これはアレイを特徴付ける幾何形状パラメータである（即ち、より大きいＮ値は、より希少に存在するアレイを導く））、および（ｉｉ）無次元の倍率(scaling factor)φ＝ｌＥ／ｌＡ（これはフローチャネル設計を特徴付ける幾何形状パラメータである（即ち、大きなφ−値は、アレイがフローチャネルの小さい部分だけを占拠することを示す））。この表記を用いて、式（１６）は、下記の式（１７）として書き換えられる。
【０５７６】
【数２６】
2019523419.tif 000028
【０５７７】
式（１７）は、所望の最大蒸発割合（θＭＡＸ）が選ばれた場合、対応する最大高さ（ｈＭＡＸ）が評価できるように再整理できる。
【０５７８】
【数２７】
2019523419.tif 000029
【０５７９】
図１１において、式（１７）および式（１８）が、種々のフローチャネル／液滴／アレイの幾何形状および温度についてプロットされている。さらに図１２において、温度およびフローチャネル幾何形状の関数として液滴安定性の実験論証が示される。液滴保存のために最適化されたフローチャネル（図１２Ｃ）では、液滴アレイは、温度の範囲（ここで論証するように、２５〜４５℃）で、少なくとも１．５時間の延長期間に渡って安定に残留する。原理上は、いったん熱力学的平衡が確立すると、液滴アレイは無期限に安定的になる。しかしながら、現実には、フローチャネル／アレイは、外部環境から完全に封止できず、よって液滴はゆっくり蒸発することがある。
【０５８０】
（例３：フローシステムの製造）
フローシステムの製造は、２つの主要ステップで行った。１つのステップは、ＵＶフォトリソグラフィおよびマイクロ加工(microfabrication)処理を利用して、パターン化した親水性機構を製造するものであり、一方、第２ステップは、親水性パターンを、直角(right)の幾何形状を示すフロー区画に集積化することに取り組むものである。以下、両方のステップについてより詳細に説明する。
【０５８１】
・パターン化親水性基板のマイクロ加工
本発明の実施形態において、親水性機構は、石英(quartz)（ＳｉＯ２）で構成し、疎水性領域は、ペルフルオロデシルトリクロロシラン（ＦＤＴＳ）で構成した。製造プロセスの第１ステップにおいて、ＦＤＴＳの分子単層を、ＭＶＤ１００分子気相成膜システム（アプライド・マイクロストラクチャ社）を用いて分子気相成膜によって石英ウエハの上に堆積した。ＦＤＴＳは、石英の表面でのシラノール基との共有結合を受け、ウエハ表面での疎水性単分子層を生成した。
【０５８２】
次に、ＡＺ５２１４Ｅフォトレジスト（マイクロケミカルズ社、ＧｍｂＨ）の層をスピンコーティングによってＦＤＴＳ処理ウエハの上部に堆積し、続いて９０℃でウエハのソフトベークを行い、余分な溶媒を蒸発させた。フォトレジストは、ズース・マスクアライナー・モデルＭＡ６（ズースマイクロテック社）を用いてクロムマスクを介してＵＶ照射に露光し、続いてＡＺ３５１Ｂ現像液（マイクロケミカルズ社、ＧｍｂＨ）でウエハの現像を行った。こうしてフォトレジストの接続パターンがウエハに残留し、円形孔を下方のＦＤＴＳ単分子層に露出させた。
【０５８３】
最後の処理ステップにおいて、ＦＤＴＳ単分子層を選択的に除去し、下方の親水性石英表面を露出させた。これは、モデル３００プラズマプロセッサ（テプラ社）を用いて短期間、ウエハを酸素プラズマに曝すことによって達成し、こうしてＦＤＴＳ単分子層を除去し、より厚いフォトレジスト膜を残した。フォトレジスト膜を除去するために、ウエハを１０分間、アセトン中で超音波処理して膜を溶解し、こうして疎水性ＦＤＴＳ分子単層によって包囲された親水性石英機構のパターンを設けた。
【０５８４】
・フローチャネルでのマイクロ加工アレイの集積化
集積化の前に、フロー区画に嵌め込むために、マイクロ加工ウエハを矩形ピース（２５ｍｍ×１２ｍｍ）に切断した。アレイが更なる表面機能化を必要とする場合、下記の例４〜５で説明するように、区画集積化の前に機能化プロトコルを行った。
【０５８５】
フローチャネルおよび液体装填パッドは、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）シートのＣＮＣフライス加工によって調製した。フローチャネルは、１ｍｍの幅、８ｍｍの長さ、１００μｍの高さおよび２００μｍの壁厚を有した。フローチャネルは、蠕動ポンプに接続された出口によって終端され、蠕動ポンプは、液体駆動のために必要になる吸引を提供した。液体装填パッドは、約１００μｌの体積を示し、入口を介してフローチャネルに接続した。フローチャネル、装填パッド、入口および出口は、単一の８ｍｍ厚のＰＭＭＡスラブから彫刻され、以下ではＰＭＭＡフロー構造と称している。
【０５８６】
親水性機構のマイクロ加工アレイを収容する矩形ウエハピース（チップ）をＰＭＭＡフロー構造に装着するために、１４２μｍの公称厚さを備えた両面感圧接着フィルム（ＡＲｃａｒｅ  ９０１０６、アドヒーシィブリサーチ社）のピースをＣＯ２レーザ機器を用いて切断した。レーザ切断した接着フィルムの幾何形状は、ＰＭＭＡフロー構造と整合させ、僅かに小さくして、フローチャネルが、接着材で接着しないように包囲されるようにした。次に、接着材をＰＭＭＡフロー構造の底面に付着し、続いてアレイチップを接着材の上部に配置した。そしてアセンブリ（ＰＭＭＡフロー構造、接着材、アレイチップ）を２つの平坦な５ｍｍ厚のＰＭＭＡシートの間に挟んで(sandwich)、接合プレスに配置した。このサンドイッチを４０℃、６０秒間、６ｋＮの圧力でクランプした。こうして接着材は、フローチャネルの高さによって規定されたように、１００μｍの厚さに圧縮された。得られた接合アセンブリは、機能的フローシステムを規定した。
【０５８７】
（例４：単一ＤＮＡ分子のデジタル計数）
本例では、集積化液滴アレイチップを備えたフローシステムを用いて単一の生体分子（本ケースでは、一本鎖ＤＮＡ）がどのように検出され、デジタル計数できるかを示す。フローシステムアセンブリは、例１〜３で説明した手順に従って製造し動作させたが、液滴アレイチップのＰＭＭＡフロー構造への集積化の前に、チップは、一本鎖ターゲットＤＮＡの特異的捕獲を可能にするために、更なる表面機能化を施した。マイクロ加工チップは、４μｍの直径を有し、８μｍの機構間間隔で正方アレイ状に配置された９３７５０個の円形親水性機構で構成した。
【０５８８】
・表面機能化プロトコル
液滴アレイチップは、アセトン中で１０分間の超音波処理によって全面的に洗浄し、続いてイソプロパノール中で１０分間の超音波処理を行い、続いてエタノール中で１０分間の超音波処理を行った。チップは、窒素フロー下で乾燥し、９５％（ｖ／ｖ）エタノール中の１％（ｖ／ｖ）エポキシシラン（Ｄｙｎａｓｙｌａｎ  ＧＬＹＥＯ、エボニック インダストリーズ社）液の溶液に浸漬した。チップは、３０分間、エポキシシラン溶液中で培養し、続いて９５％エタノールを用いて３回洗浄し、窒素フロー下で乾燥し、１１０℃で３０分間、硬化させた。
【０５８９】
次に、シラン処理したチップ上のエポキシ基は、ポリ（エチレングリコール）部位に存在するアミン基と反応した。ポリ（エチレングリコール）は、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００−アミン（ＯＨ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２）（ジェンケム・テクノロジ社）およびカルボン酸−ポリ（エチレングリコール）２０００−アミン（ＣＯＯＨ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２）（ジェンケム・テクノロジ社）の混合物で構成した。混合物は、ＯＨ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２とＣＯＯＨ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２の１０：１のモル比を有し、１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．４において１００ｇ／ｌの公称総濃度を有した。チップは、混合物とともに４０℃で２０時間、培養した。続いて、チップは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（ミリポア社）を用いて３回洗浄し、窒素フロー下で乾燥した。
【０５９０】
最後の表面改質ステップにおいて、チップは、ＤＮＡターゲットに特異的な捕獲プローブを用いて機能化した。捕獲プローブは、Ｎ−末端にリジン基を備えた１４ｍｅｒのペプチド核酸（ＰＮＡ）であり、表面グラフト化したＣＯＯＨ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２上のカルボン酸基への付着のために使用した。Ｎ−末端からＣ−末端へのＰＮＡプローブの配列は、Ｋ−Ｏ−ＡＣＡ  ＴＡＧ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＣＧ−ＯＯ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：ＡＣＡ  ＴＡＧ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＣＧ）（パナジーン社）であり、Ｋはリジン基を表し、Ｏはエチレングリコールリンカーを表し、文字Ｇ，Ｃ，Ａ，Ｔは、ＤＮＡ核酸塩基のＰＮＡ類似体を表す。
【０５９１】
最初に、ＰＮＡプローブとの反応のために、チップの表面を、１００ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン（ＭＥＳ）緩衝剤中で化合物の各々について２５ｇ／ｌの公称濃度で、１：１のモル比でＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩の混合物に浸漬することによって、調製した。チップは、４℃で３０分間、混合物中で培養し、続いて１００ｍＭのＭＥＳ緩衝剤の中で短い洗浄を行った。次に、チップは、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝剤でのＰＮＡプローブの１００ｎＭ溶液に浸漬し、３０分間、周囲温度で培養した。続いて、チップは、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝剤を用いて短く洗浄を行い、続いて５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの中に１０分間、浸漬した。チップは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて３回洗浄し、窒素フロー下で乾燥し、そして、例３において概説したように、ＰＭＭＡフロー構造に接合するまで真空デシケータの中で保存した。
【０５９２】
・検出プロトコル
検出のターゲットは、５０−ｂｐのＤＮＡオリゴ（５’−ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２））であった。ＤＮＡオリゴの最後の１４個の塩基対は、ＰＮＡ捕獲プローブに対して相補的であり、一方、ＤＮＡオリゴの最初の１２個の塩基対は、ＤＮＡ系標識剤に対して相補的であった。標識剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素に共役した１つ以上の１２−ｂｐのＤＮＡオリゴによって構成した。標識ＤＮＡオリゴの配列は、５’−ＧＣＣ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＡＧＡ−３’−ＴＥＧ−ビオチン（ＴＥＧ−ビオチンに結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）であって、ＴＥＧは、テトラエチレングリコールリンカーを表す。
【０５９３】
標識剤は、ニュートラアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＮＡｖ−ＨＲＰ）共役(conjugate)（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ２６６４）を、１：３モル比のＮＡｖ−ＨＲＰ対オリゴの中で標識オリゴと混合することによって調製した。ＮＡｖ−ＨＲＰの最終濃度は１００ｎＭであり、混合物は、５×サリンソジウムシトレート（ＳＳＣ）緩衝液、１．０ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、  ０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、ｐＨ７．０で調製した。混合物は、４℃で２４時間、培養し、ビオチン化ＤＮＡオリゴをＮＡｖ−ＨＲＰでのニュートラアビジン部位(moiety)に付着できるようにした。得られた共役は、ＮＡｖ−ＨＲＰ当り３つの結合ＤＮＡオリゴの平均を示し、以下ではＮＡｖ−ＨＲＰ−ＬＯ３と省略することにする。
【０５９４】
下記の緩衝液は、検出実験のために使用した。
【０５９５】
パッシベーション緩衝液：５×ＳＳＣ緩衝液、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、１０ｇ／ｌのＢＳＡ、ｐＨ７．０。
標識緩衝液：５×ＳＳＣ緩衝液、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、１０ｇ／ｌのＢＳＡ、ｐＨ７．０。
洗浄緩衝液１：１０ｍＭのＰＢＳ、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、５０ｇ／ｌの２０ｋＤａモル重量のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ２００００）、ｐＨ７．４。
洗浄緩衝液２：１０ｍＭのＰＢＳ、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、５０ｇ／ｌのＰＥＧ２００００、ｐＨ７．４。
検出緩衝液：１０ｍＭのＰＢＳ、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｇ／ｌのＰＥＧ２００００、１．０ｍＭのＨ２Ｏ２、ｐＨ７．４。
【０５９６】
変化する公称ＤＮＡターゲット濃度（１０ｆＭ，１ｆＭ，１００ａＭ）の溶液、そしてＤＮＡターゲットを含まないコントロールを、検出実験の直前に、５×ＳＳＣ緩衝液、０．５％のトリトンＸ−１００、ｐＨ７．０の中で調製した。検出実験を実施するために、フローシステムを下記の方法で動作させた。
ステップ１：２５μｌのＤＮＡターゲット溶液を０．２μｌ／分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ２：フローチャネルを１０μｌのパッシベーション緩衝液で注入する。
ステップ３：１０分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ４：フローチャネルを、標識緩衝液中の５０ｐＭのＮＡｖ−ＨＲＰ−ＬＯ３の１０μｌで注入する。
ステップ５：１０分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ６：１００μｌの洗浄緩衝液１を１０μｌ／分のフローレートで作動させる。
ステップ７：１００μｌの洗浄緩衝液２を１０μｌ／分のフローレートで作動させる。
ステップ８：検出緩衝液中の２００μＭのａｍｐｌｉｆｌｕ  ｒｅｄ（シグマアルドリッチ社、９０１０１−５ＭＧ−Ｆ）溶液の３μｌを５μｌ／分のフローレートで作動させる。
【０５９７】
簡潔には、上記プロトコルは、ステップ１において、ＤＮＡターゲットを、表面付着したＰＮＡ捕獲プローブに結合できるようにした。次にステップ４〜５において、捕獲したＤＮＡターゲットをＮＡｖ−ＨＲＰ−ＬＯ３で標識化した。ステップ６〜７において余分な標識剤を除去した後、ステップ８において、検出試薬ａｍｐｌｉｆｌｕ  ｒｅｄを含むマイクロ液滴を確立した。ａｍｐｌｉｆｌｕ  ｒｅｄは、西洋ワサビペルオキシダーゼのための蛍光性基質であり、この上で酵素的処理が蛍光化合物レソルフィン（励起５７０ｎｍ、発光５８５ｎｍ）に変換される。その結果、標識剤を収容する液滴は、蛍光信号を発生し、これは蛍光顕微鏡を用いて容易に検出された。
【０５９８】
ステップ８に続いて、フローシステムは、蛍光顕微鏡（ツァイス社Ａｘｉｏ  Ｖｅｒｔ．Ａ１）の下で５５５ｎｍのＬＥＤ励起光源を用いて適切な蛍光フィルタセットと組合せで検査され、レソルフィンからの発光信号を検出した。対応する明視野および蛍光顕微鏡写真は、図１４に示すように、１．４ＭＰのＣＣＤカメラ（ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲ３）を用いて記録した。
【０５９９】
蛍光顕微鏡写真は、画像解析ソフトウエアＩｍａｇｅＪを用いて定量化し、蛍光液滴の数を計数した。簡潔には、グレースケールの顕微鏡写真は、特定の強度閾値未満の画素値を０に、閾値超えの画素値を１にフォーマット化することによって、２値フォーマットに変換した。次に、値「１」の接続された画素クラスタを計数した。４画素未満からなるクラスタは、ノイズとして破棄した。全体アレイについてのクラスタの合計数は、後続のデータ解析のために記録した。同じ強度閾値を全ての検出実験からの全ての蛍光顕微鏡写真に適用した。
【０６００】
２０回の検出実験の合計からの結果を図１５に示す。図は、ＤＮＡターゲットの異なる濃度について検出可能な蛍光信号を示す、アレイ上に存在する液滴の百分率割合を示す。コントロールサンプルでは、ＤＮＡターゲットが存在せず、多数の液滴が検出可能であった。これはたぶん、アレイ上での非特異的に結合した（例えば、物理吸着または化学吸着）標識剤の存在に起因している。非特異的結合（ＮＳＢ）は、ありふれた現象であり、単一分子計数などの高感度応用において顕著である。ここで示す実験において、ＮＳＢ標識剤を収容する液滴の割合は、０．２８０＋／−０．０９７％（５回の実験からの平均＋／−標準偏差）であった。他方では、ターゲットＤＮＡを含むサンプルは、検出可能なマイクロ液滴のより高い割合を示すことが判り、分子ターゲットの微量の特異的検出および定量化を論証している。しかしながら、ターゲットＤＮＡの濃度が増加すると、蛍光液滴の数は、正比例的な方法で増加しなかった。これは、例えば、フローシステムの他の表面での非特異的吸着、あるいは、可能性として表面結合したＤＮＡターゲットの不完全標識化によるターゲットの濃度依存損失に起因しているであろう。
【０６０１】
（例５：単一ＤＮＡ分子の繰り返し検出）
本例において、捕獲されたＤＮＡターゲットが、標識剤の不活性化によってどのようにして繰り返し検出できるかを示す。本例で使用したフローシステムは、例１〜３に従って製造し動作し、そして例４で提供された表面機能化プロトコルに従って機能化した。
【０６０２】
後述するように、捕獲されたターゲットの繰り返し検出を使用する利点は、検出が繰り返される度に信号対ノイズ比が改善され、検出限界が改善されることである。さらに、これは、１つ以上の単一ヌクレオチド多型(polymorphism)（ＳＮＰ）を抱えるＤＮＡターゲットと、ＳＮＰなしで他は同じである野生型ＤＮＡ鎖、例えば、例６との間を識別する観点で、増加した特異性を可能にする。
【０６０３】
本例において、我々は、例４で説明したものと同じ検出プロトコルを適用し、標識化ステップおよび検出ステップを３回繰り返した。捕獲プローブはＰＮＡをベースとし、標識剤はＤＮＡをベースとしているため、Ｔ７エクソヌクレアーゼを用いて標識剤を選択的に除去して、標識剤を消化するとともに、捕獲プローブ／ターゲット複合体を無傷に維持することが可能であった。さらに、ＮＳＢ標識剤からの信号を除去するために、プローブの酵素部分をフェノールの溶液を用いて不活性化し、これはペルオキシダーゼ酵素の活性部位の構造を選択的に変更し、下記の検出アッセイ(assay)において信号を生成するのを防止する。
【０６０４】
パッシベーション緩衝液、標識緩衝液、洗浄緩衝液１、洗浄緩衝液２および検出緩衝液は、例４において適用したものと同じであった。さらに、下記の２つの試薬を適用した。
【０６０５】
消化(digestion) 緩衝液：５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭの酢酸トリス、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９での１５００単位／ｍｌのＴ７エクソヌクレアーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社、Ｍ０２６３Ｌ）。
【０６０６】
不活性化緩衝液：５．０ｍＭのフェノール、１０ｍＭのＰＢＳでの１．０ｍＭのＨ２Ｏ２、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４。
【０６０７】
同じ捕獲ＤＮＡターゲットの３つの区別できる検出ステップを可能にするため、実験を下記の方法で実行した。
ステップ１：２５μｌのＤＮＡターゲット溶液を０．２μｌ／分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ２：フローチャネルを１０μｌのパッシベーション緩衝液で注入する。
ステップ３：１０分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ４：フローチャネルを、標識緩衝液中の５０ｐＭのＮＡｖ−ＨＲＰ−ＬＯ３の１０μｌで注入する。
ステップ５：１０分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ６：１００μｌの洗浄緩衝液１を１０μｌ／分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ７：１００μｌの洗浄緩衝液２を１０μｌ／分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ８：検出緩衝液中の２００μＭのａｍｐｌｉｆｌｕ  ｒｅｄ（シグマアルドリッチ社、９０１０１−５ＭＧ−Ｆ）溶液の３μｌを５μｌ／分のフローレートで作動させる。
ステップ９：液滴アレイの蛍光および明視野顕微鏡写真を記録する。
ステップ１０：フローチャネルを１０μｌの消化緩衝液で注入する。
ステップ１１：１０分間培養し、そして溶液をフローチャネルから排出する。
ステップ１２：２０μｌの不活性化緩衝液を５μｌ／分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ１３：５０μｌの洗浄緩衝液１を１０μｌ／分のフローレートでフローチャネルを通過させる。
ステップ１４：ステップ４〜１３を繰り返す。
ステップ１５：ステップ４〜９を繰り返す。
【０６０８】
各サンプルについて、例４で概説したものと同じ設定および手順を用いて、一連の３つの連続した蛍光顕微鏡写真を記録し解析した。シリーズの第１顕微鏡写真は、第１検出ステップに対応しており、シリーズの次の顕微鏡写真は、第２検出ステップに対応しており、以下同様である。明視野顕微鏡写真で可視である、フローシステム表面での特定マーキングを使用することによって、蛍光顕微鏡写真の座標は、検出ステップ間のＸＹ位置の変化のために修正した。こうして、異なる検出ステップについて個々の液滴のＸＹ位置を比較することが可能であった。次に、検出シリーズの各顕微鏡写真について、蛍光信号を示す液滴のＸＹ画素位置を記録し、シリーズの残りの２つのメンバーと比較した。標識剤および検出剤を追加した場合、検出ステップ間で５画素以上は相違しない液滴位置は、「永続的」液滴、即ち、信号を繰り返し生成する液滴であると考えた。
【０６０９】
３回の検出ステップの結果は図１６に示しており、１００ａＭのＤＮＡターゲットを含むサンプルについて一連の蛍光顕微鏡写真を示す。顕微鏡写真において、永続的液滴は円で標識化した。ＤＮＡターゲットが追加されていないコントロールサンプルでは、永続的液滴は、全ての３つの検出ステップにおいて識別できなかった。
【０６１０】
下記の表は、１００ａＭのＤＮＡターゲットサンプルとコントロールサンプルとの間の定量的比較を示す。表は、１００ａＭのターゲットＤＮＡを含む５つの同様に調製したサンプル、およびターゲットＤＮＡを含まない５つの同様に調製したコントロールサンプルからの平均結果を要約している。表は、コントロールサンプル（第１行）および１００ａＭのターゲットＤＮＡサンプル（第２行）について、例５で定義されるように、永続的液滴の平均ポジティブ割合（Ａｖｇ．）を提供する。標準偏差（Ｓｔ．ｄｅｖ．）は、５つのサンプルの標準偏差に対応する。第３行は、各後続ステップから得られる信号対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を提供する。Ｓ／Ｎ比は、理論値によって括弧内に補完された、実験的に測定された値として提供される。実験値は、第２行の平均値を第１行の平均値で除算することによって得られた。理論値は、１００ａＭのサンプルについての平均値を、（ｉ）第１検出ステップについては０．２８％、（ｉｉ）第２検出ステップについては７．８４・１０−４％（０．２８％・０．２８％）、（ｉｉｉ）第３検出ステップについては２．２・１０−６％（０．２８％・０．２８％・０．２８％）で除算することによって計算した。
【０６１１】
【表１】
2019523419.tif 000030
【０６１２】
コントロールサンプルについて永続的液滴の百分率割合は、検出ステップの各繰り返しごとに減少し、その結果、Ｓ／Ｎ比の増加をもたらす。この理由は、コントロールサンプルにおいてＮＳＢ標識剤だけが蛍光信号を提供するためである。これらはアレイにランダム式で結合しており、これらの信号は後続の検出ステップの間で不活性化されるため、同じ液滴が後続の検出ステップで信号を生成するようにならない。例えば、ＮＳＢ標識剤のランダム結合パターンを仮定すると、ＮＳＢ標識剤を収容する液滴の割合が各検出ステップにおいて０．２８％である場合（例えば、図１５Ｄ）、全３回の検出ステップにおいて永続的液滴を観測する２．２・１０−６％（０．２８％・０．２８％・０．２８％）の機会だけが存在する。１０００００個の液滴を収容するアレイでは、２．２・１０−６％の偽ポジティブ検出レートは、０．００２回の偽ポジティブ検出だけに対応する。こうしてコントロールサンプルでは永続的液滴を観測するようにならない。
【０６１３】
その結果、これらの特定の実験設定では、ＮＳＢ標識剤から由来する全てのノイズが排除でき、よって、少なくとも３回の連続した検出ステップについて永続する液滴は、極めて高い確率で、機能的に組織化された捕獲プローブ／ＤＮＡターゲット／標識化プローブ複合体を表す。
【０６１４】
（例６：ターゲットとは単一の塩基対だけ配列が相違する非ターゲットＤＮＡの１：１００００（ターゲット：非ターゲット）バックグランドでの単一ＤＮＡ分子の検出のためのフローシステム設定の説明）
本例において、１００μｌのサンプル溶液中に存在するＤＮＡ検体のデジタル検出を実施できるフローシステムが、後述するステップを続けることによって得られる。検体（ターゲットＤＮＡ）は、サンプル中に約１０ａＭの濃度で存在すると予想され、下記の配列セグメント：５’−ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＴＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を含む。検体に加えて、サンプルは、約１００００倍以上の濃度、即ち、１００ｆＭの他の非ターゲットＤＮＡ分子（野生型ＤＮＡ）を含むと予想され、下記の配列セグメント：５’−ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を含む。ターゲットおよび野生型ＤＮＡは、ボールド体の下線付き位置だけ配列が相違する。
【０６１５】
捕獲プローブは、ターゲットおよび野生型ＤＮＡの５’末端に対して相補的であるように選択された一本鎖ＰＮＡオリゴであり、これは、下記の配列５’−ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を含む捕獲プローブを用いることによって達成でき、５’および３’は、プローブのＮ−末端およびＣ−末端にそれぞれ対応する。ＩＤＴオリゴアナライザソフトウェア(https://eu.idtdna.com/calc/analyzer)によれば、捕獲プローブについての溶融温度は、少なくとも４６．８℃であると予想され、よってターゲットおよび野生型ＤＮＡの１００％が、周囲温度、即ち、２３℃で結合するようになる。その結果、アレイは、少なくとも６百万個(mio.)のＤＮＡ分子の結合を収容するように設計される必要があり、これは、１００ｆＭのＤＮＡを含む１００μｌサンプルの１００％結合に対応する。
【０６１６】
デジタル計数測定を実施するには、捕獲されたターゲットＤＮＡは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ（これらの全てが市販されている蛍光性基質を有する）などの酵素に共役した下記配列５−ＡＴＡ  ＧＴＴ  ＧＡＣ  ＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を含む一本鎖ＤＮＡオリゴからなる標識剤を用いて標識化される必要がある。標識剤は、３’−末端においてＤＮＡターゲットの配列に正確に整合する。最適結合条件の下で、ターゲットＤＮＡの８２．６％が２３℃の温度で標識剤と結合するようになる（ＩＤＴオリゴアナライザ）。しかしながら、同じ条件の下で、ターゲットと野生型との間の高い配列類似性に起因して、野生型ＤＮＡの１％も標識剤によって結合されるようになる。その結果、デジタル計数測定を実施するには、アレイは、少なくとも１２００００個の親水性機構を提示することが必要になる。１２００００個の機構の量は、第１標識ステップおよび第１検出ステップが実施された場合、アレイの液滴の約半分が蛍光信号を生成するように（即ち、６百万個の野生型ＤＮＡの１％＋６００個のターゲットＤＮＡの８２．６％）、選択される。
【０６１７】
１２００００個の親水性機構を収容するために、機構は、５μｍの直径を有する円として形状をなし、１０μｍの最隣接間隔を持つ正方形アレイ状に配置することになる。式（１）によれば、個々の親水性機構は、ＶＤ＝５２フェムトリットルの最大体積を有する水性液滴を支持できる。最大液滴体積を計算するために、ペルフルオロデシルトリクロロシラン（ＦＤＴＳ）支持体上での水の接触角に対応する１１０°のγ値を適用した。その結果、液滴アレイの凝集体積は、ＶＤＡ＝６．２ナノリットル（５２フェムトリットルの１２００００倍）である。そして最大フロー区画体積は、式（９）からＶＭＡＸ＝３２６μｌとして得られる。
【０６１８】
最大フロー区画体積を計算するために、下記の値を適用した。ρＬ＝１０００ｋｇ／ｍ３は水の体積密度であり、Ｒ＝８．３１Ｊ／（ｍｏｌ・Ｋ）はモル気体定数であり、Ｔ＝２９６Ｋ（２３℃）は温度であり、ＲＨＩ＝０は乾燥大気の初期相対蒸気飽和として採用され、Ｐ０＝１２２６ＰａはＴ０＝２８３Ｋ（１０℃）の温度での水蒸気の蒸気圧であり、ＭＷ＝１８．０１６・１０−３ｋｇ／ｍｏｌは水のモル重量であり、ΔＨＶＡＰ＝４０．６５・１０３Ｊ／ｍｏｌは水の蒸発のエンタルピーである。これらの値は、ランゲ(Lange)物理化学ハンドブック(ISBN-13: 9780070163843)およびアトキンス物理化学、第１巻、熱力学と動力学(ISBN-13: 9780716785675)から入手した。
【０６１９】
しかしながら、液滴が、（ｉ）撮像検出ステップ時に安定に留まるように、（ｉｉ）酵素反応のための最適条件を提供するために、少量の液滴体積だけが蒸発するのを許容される。液滴の最大許容蒸発体積割合は、５％、即ち、θＭＡＸ＝０．０５に設定され、よってＶＣ＝１６．３μｌ、即ち、ＶＣ＝θＭＡＸ・ＶＭＡＸのフロー区画体積を導く。
【０６２０】
フロー区画の最終幾何形状設計は、１０：１のアスペクト比、ＬＣＸ＝１５ｍｍの長さおよびＬＣＹ＝１．５ｍｍの幅を示す区画について矩形チャネル形状を選択することによって得られる。チャネルの高さは、最大液滴体積の５％未満が蒸発するのを確保するために、ｈＭＡＸ＝７２４μｍ（ｈＭＡＸ＝ＶＣ／（ＬＣＹ・ＬＣＸ））未満にすることが必要とされる。１０：１のアスペクト比は、親水性機構のアレイに適用でき、アレイは、ＬＡＸ＝１０．９ｍｍおよびＬＡＹ＝１．１ｍｍに対応した、１０９１×１１０個の円形機構を提示するようになる。
【０６２１】
上述したフローシステム設定では、ＤＮＡターゲットは、例５で説明したように、標識ステップおよび検出ステップを３回繰り返すことによって、ターゲットを１００００倍上回るバックグランドで容易に検出可能になる。こうして平均で６０４９６個のＤＮＡ分子（６百万個の野生型ＤＮＡの１％＋ターゲットＤＮＡの８２．６％）が第１検出ステップにおいて信号を提供すると予想され、野生型ＤＮＡの６００００個の偽ポジティブ検出およびターゲットＤＮＡの４９６個の正しい検出に対応する。
【０６２２】
第２検出ステップにおいて、平均で１０１０個のＤＮＡ分子（６００００個の野生型ＤＮＡの１％＋４９６個のターゲットＤＮＡの８２．６％）が永続的な信号を提供すると予想され、野生型ＤＮＡの６００個の偽ポジティブ検出およびターゲットＤＮＡの４１０個の正しい検出に対応する。第３検出ステップにおいて、平均で３４４個のＤＮＡ分子（６００個の野生型ＤＮＡの１％＋４１０個のターゲットＤＮＡの８２．６％）が永続的な信号を提供すると予想され、野生型ＤＮＡの６個の偽ポジティブ検出およびターゲットＤＮＡの３３８個の正しい検出に対応する。
【０６２３】
第３検出ステップでは、正しい検出の数は、偽ポジティブ検出の数を５６倍だけ上回ると予想され、優れた定量化精度を提供する。しかしながら、標識および検出ステップを４回繰り返すことによって、偽ポジティブ検出は、完全に除去できるものと予想される。
【０６２４】
（例７：信号ポジティブ捕獲部位の数と適用した検出サイクル数との間の分析的関係）
【０６２５】
基準（野生型）オリゴヌクレオチド配列と比較して、単一塩基対置換の形態で遺伝子変化を示す配列を有するターゲットオリゴヌクレオチドを検出し定量化するように設計された本発明の実施形態を検討する。この場合、ターゲット検体は、単一塩基対置換オリゴヌクレオチドであり、したがって基準（野生型）オリゴヌクレオチドは、非常に類似した非ターゲット分子を構成し、これは従来の単一分子計数法の偽ポジティブ検出率に大きく寄与するであろう。本実施形態では、捕獲部位は、ターゲット検体と非ターゲット分子の両方に共通した配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド捕獲プローブで機能化できる。他方、標識剤は、単一塩基対置換を示すターゲット検体の部分に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドで構成してもよい。その結果、ターゲット検体の標識化効率は、非ターゲット分子の標識化効率よりも高いと予想されるが、必ずしもかなり高いわけではない。
【０６２６】
本例において、捕獲部位上に捕獲されたターゲット検体および非ターゲット分子の数は、それぞれＮＴＡおよびＮＮＭであり、利用可能な捕獲部位の総数はＮＣであると考える。本例では、ターゲット検体と非ターゲット検体の両方がポアソン分布に従って捕獲部位間に分布すると仮定する。その結果、少なくとも１つのターゲット検体を収容する区画の数（ＣＴＡ）および少なくとも１つの非ターゲット分子を収容する区画の数（ＣＮＭ）は、下記の式（１９）（２０）である。
【０６２７】
【数２８】
2019523419.tif 000031
【０６２８】
標識剤によるターゲット検体の標識化効率はＰＴＡであり、標識剤による非ターゲット分子の標識化効率はＰＮＭであることをさらに検討する。本例では、標識化効率は、標識剤にそれぞれハイブリッド結合(hybridize)したターゲット検体および非ターゲット分子の割合を表す。標識化効率は、例えば、融解曲線分析によって直接測定してもよく、あるいはターゲット検体、非ターゲット分子および標識剤のオリゴヌクレオチド配列に基づいて推定してもよい。
【０６２９】
ｎ個の個々のターゲット検体を収容する捕獲部位が少なくとも１つの標識剤でうまく標識化される確率（ＰＴＡ（ｎ））は、下記の式（２１）である。
【０６３０】
【数２９】
2019523419.tif 000032
【０６３１】
同様に、ｎ個の個々の非ターゲット分子を収容する捕獲部位が少なくとも１つの標識剤でうまく標識される確率（ＰＮＭ（ｎ））は、下記の式（２２）である。
【０６３２】
【数３０】
2019523419.tif 000033
【０６３３】
さらに、正確にｎ個のターゲット検体を含む捕獲部位の分布（ｆＴＡ（ｎ））は、下記のようにポアソン分布によって与えられる。
【０６３４】
【数３１】
2019523419.tif 000034
【０６３５】
その結果、正確にｎ個のターゲット検体を示す捕獲部位の数（ＣＴＡ（ｎ））は、ＣＴＡ（ｎ）＝ＮＣ・ｆＴＡ（ｎ）である。同様に、正確にｎ個の非ターゲット分子（ｆＮＭ（ｎ））を含有する捕獲部位の分布は、下記の式（２４）によって与えられ、正確にｎ個の非ターゲット分子を示す捕獲部位の数（ＣＮＭ（ｎ））は、ＣＮＭ（ｎ）＝ＮＣ・ｆＮＭ（ｎ）である。
【０６３６】
【数３２】
2019523419.tif 000035
【０６３７】
標識化ステップにおいて同じタイプの標識剤を再適用する多数の反復検出サイクルを含む分析では、各検出ステップについてターゲット検体を含む連続的に標識化された捕獲部位の平均数（ＬＴＡ（ｘ））（ｘは検出サイクルの数を表す）は、少なくとも１つの標識剤を有する捕獲部位の全ての可能な配置を合計することによって見出される。
【０６３８】
【数３３】
2019523419.tif 000036
【０６３９】
同様に、各検出サイクルについての非ターゲット分子を含む連続的に標識された捕獲部位の平均数（ＬＮＭ（ｘ））（ｘは反復数を表す）は、下記の式（２６）として与えられる。
【０６４０】
【数３４】
2019523419.tif 000037
【０６４１】
ターゲット検体および非ターゲット分子の配列依存の標識化に加えて、標識剤はまた、例えば、疎水性または静電的な相互作用によって、捕獲部位上に非特異的に保持されるようにできる。本例では、非特異的に保持された標識剤の数（ＬＮＳＲ（ｘ））は、下記の式（２７）のように計算できると仮定している。
【０６４２】
【数３５】
2019523419.tif 000038
【０６４３】
ここで、ｘは反復数であり、ｆＮＳＲは少なくとも１つの非特異的に保持された標識剤を収容する区画の割合である。ｆＮＳＲの値は、ターゲット検体および非ターゲット分子の両方が存在しない状態で検出サイクルを実行し、そして信号を表示する捕獲部位の計数することによって実験的に得られる。その結果、区画化後に検出サイクル数（ＣＴ（ｘ））の関数として検出可能な信号を示す捕獲部位の予想される数は、ターゲット検体の配列依存の標識化、非ターゲット分子の配列依存の標識化、および配列独立の非特異的に保持された標識剤からの寄与を合計することによって見出される。
【０６４４】
【数３６】
2019523419.tif 000039
【０６４５】
図１８において、ＬＴＡ、ＬＮＭおよびＬＮＳＲからの寄与が４つの異なる構成についてプロットされている。図１８において、ＣＴ、ＬＴＡ、ＬＮＭおよびＬＮＳＲの値は、（Ａ）ＮＴＡ＝１０、ＮＮＭ＝１０．０００、ＮＣ＝１００．０００、ＰＴＡ＝０．９、ＰＮＭ＝０．０５、およびｆＮＳＲ＝０、（Ｂ）ＮＴＡ＝１０、ＮＮＭ＝１００．０００、ＮＣ＝１００．０００、ＰＴＡ＝０．９、ＰＮＭ＝０．０５、およびｆＮＳＲ＝０．０５、（Ｃ）ＮＴＡ＝１０、ＮＮＭ＝１．０００．０００、ＮＣ＝１００．０００、ＰＴＡ＝０．９、ＰＮＭ＝０．０５、およびｆＮＳＲ＝０、ならびに、（Ｄ）ＮＴＡ＝１０、ＮＮＭ＝１．０００．０００、ＮＣ＝１．０００．０００、ＰＴＡ＝０．９、ＰＮＭ＝０．０５、およびｆＮＳＲ＝０．０５について計算される。
【０６４６】
図１８Ａ〜図１８Ｄにおいて、ターゲット検体は、非ターゲット分子および非特異的に保持された標識剤の両方によって非常に数が多くなり、そうでなければ従来の単一検出サイクル実験の精度を損なうであろう。非特異的に保持された標識剤を示す捕獲部位の５％集団（ｆＮＳＲ＝０．０５）の存在は、最初の３〜４検出サイクル内で迅速に排除される。さらに、非ターゲット分子に由来する偽ポジティブ信号は、最初の３〜６検出サイクル内で数桁の大きさで急速に減少するとともに、ターゲット検体からの特定の信号は実質的に変化しないままである。
【０６４７】
（例８：適用した検出サイクル数の関数として、単一分子デジタル計数分析の検出限界（ＬＯＤ）、定量化限界（ＬＯＱ）およびダイナミックレンジ（ＤＲ）の評価）
【０６４８】
（表１）および（表２）は、１回（Ｃ１）、２回（Ｃ２）、回数（Ｃ３）、４回（Ｃ４）の検出サイクルを示す分析について、偽ポジティブ捕獲部位の平均数（ＮＦＰ）、信号ポジティブ捕獲部位の数の標準偏差（δＮＦＰ）、検出限界（ＬＯＤ）、定量化限界（ＬＯＱ）、およびダイナミックレンジ（ＤＲ）のシミュレーション値を列挙する。
【０６４９】
本例において、ＮＦＰ値は、捕獲部位の数（ＮＣ）、ターゲット検体の数（ＮＴＡ）、非ターゲット分子の数（ＮＮＭ）、標識剤によるターゲット検体の標識化効率（ＰＴＡ）、標識剤による非ターゲット分子の標識化効率（ＰＮＭ）、および非特異的に保持された標識剤の割合（ｆＮＳＲ）についての値を特定することによってシミュレーションによって得られた。例７を参照。
【０６５０】
シミュレーションを初期化するために、各捕獲部位には一意的なインデックスを割り当てた。捕獲ステップをシミュレートするために、シミュレーションアルゴリズムは、利用可能な数の捕獲部位の間でターゲット検体および非ターゲット分子をランダムに分布させた。個々のターゲット検体または非ターゲット分子に割り当てられた捕獲部位は、シミュレーションの残部については変化しなかった。次に、標識化ステップは、（各捕獲部位について）（式２１）〜（式２２）に従ってＰＴＡ（ｎ）およびＰＮＭ（ｎ）を計算するためにシミュレーションを行った。ここで、ｎは、それぞれ捕獲部位に存在するターゲット検体および非ターゲット分子の総数を表し、次に０から１までの２つのランダム値を引き出す。もし第１ランダム値がＰＴＡ（ｎ）未満であった場合、捕獲部位は、ターゲット検体／標識剤複合体を含むものと考えられた。もし第２ランダム値がＰＮＭ（ｎ）未満であった場合、捕獲部位は、非ターゲット分子／標識剤複合体を含むものと考えられた。両方の場合、捕獲部位は、標識化されたものとして登録され、それ以外は登録されなかった。
【０６５１】
非特異的に保持された標識剤を説明するために、ｆＮＳＲ・ＮＣ個の捕獲部位をランダムに選択し、標識化されたものとして登録した。全ての捕獲部位の一意的なインデックスのリストは、標識化状態または非標識化状態と共に編集され、各標識化ステップの終わりに保存した。後続の検出サイクルをシミュレーションするために、新しいシミュレーションした標識化プロセスを実施し、全ての捕獲部位についての一意的なインデックスおよび標識化状態の新しいリストを編集した。
【０６５２】
全ての検出サイクルをシミュレーションした後、各検出サイクルの標識化リストを互いに比較して、全ての検出サイクルにおいて永続的に標識化された捕獲部位を識別した。単一のシミュレーションの結果は、永続的に標識化された捕獲部位の数（ＮＰＬ）であった。ＮＦＰ値を得るために、同じ初期化パラメータを適用する１０００回のシミュレーションを行って、ＮＦＰは、全ての記録されたＮＰＬ値の平均値として計算した。同様に、δＮＦＰ値を得るために、全ての記録されたＮＰＬ値の標準偏差を計算した。ＬＯＤ値、ＬＯＱ値およびＤＲ値を得るために、シミュレーションをＮＴＡ＝０で行い、偽ポジティブ事象のみが生じるようにし、よってシミュレーションは、測定の固有の計数誤差の推定値を提供するであろう。ＬＯＤ値、ＬＯＱ値およびＤＲ値は、それぞれＮＦＰ＋３δＮＦＰ、ＮＦＰ＋１０δＮＦＰおよびＮＣ／ＬＯＱとして計算した。
【０６５３】
（表１）および（表２）に示すシミュレーション結果について、下記の値を適用した。即ち、ＮＣ＝１０５、ＮＴＡ＝０、ＰＮＭ＝０．０５、ｆＮＳＲ＝０、およびＮＮＭ＝１０３〜１０５。表から判るように、試験のＬＯＤ値、ＬＯＱ値およびＤＲ値は、検出サイクルが繰り返されるたびに、ますます良くなり（値は減少する）、これは、少ない偽ポジティブ検出（ＮＦＰ）に起因する。しかしながら、サンプル中の非ターゲット分子の数は、ＬＯＤ値、ＬＯＱ値およびＤＲ値に悪影響を及ぼし、これは、利用可能な捕獲部位の総数に対する偽ポジティブ捕獲部位の高い割合に起因する。
【０６５４】
（下記表２）１０００個（左）および１００００個（右）の非ターゲット分子を含有するサンプルに対するＳＥＬＭＡ試験の理論的な分析性能。
【０６５５】
【表２】
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【０６５６】
（下記表３）１０００００個（左）および１００００００個（右）の非ターゲット分子を含有するサンプルに対するＳＥＬＭＡ試験の理論的な分析性能。
【０６５７】
【表３】
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【配列表フリーテキスト】
【０６５８】
配列表
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：ＡＣＡ  ＴＡＧ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＣＧ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：５’−ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＧＴ−３’
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３：５’−ＧＣＣ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＡＧＡ−３’
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：５’−ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＴＡＴ−３’
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：５’−ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＡＴ−３’
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：５’−ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＡ−３’
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：５’−ＡＴＡ  ＧＴＴ  ＧＡＣ  ＡＣ−３’
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
2019523419.tif 000054
【図１１−２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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