(57)【要約】  本発明は、組織因子（ＴＦ）モノクローナル抗体及びその調製方法を提供する。本発明により提供されるモノクローナル抗体は、ＴＦ抗原を特異的に結合し、高い親和性及び低い免疫原性を有し、そして腫瘍に抵抗する活性、などを有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の重鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域が以下の３種の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み：
配列番号１に記載の配列を有するＣＤＲ１、
配列番号２に記載の配列を有するＣＤＲ２、及び
配列番号３に記載の配列を有するＣＤＲ３；
ここで前記アミノ酸配列中の任意のアミノ酸配列がさらに、少なくとも１つのアミノ酸の任意の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を保持する誘導体配列を含むことを特徴とする、抗体の重鎖可変領域。
【請求項２】
前記重鎖が、請求項１に記載の重鎖可変領域を有することを特徴とする、抗体の重鎖。
【請求項３】
抗体の軽鎖可変領域であって、前記軽鎖可変領域が、下記：
配列番号４に記載の配列を有するＣＤＲ１′
配列番号５に記載の配列を有するＣＤＲ２′及び
配列番号６に記載の配列を有するＣＤＲ３′
から成る群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
前記アミノ酸配列中の任意のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を有する誘導体配列を含むことを特徴とする、抗体の軽鎖可変領域。
【請求項４】
前記軽鎖が、請求項３に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とする、抗体の軽鎖。
【請求項５】
抗体であって、前記抗体が、以下：
（１）請求項１に記載の重鎖可変領域；及び／又は
（２）請求項３に記載の軽鎖可変領域、
を有し、又は
前記抗体が請求項２に記載の重鎖；及び／又は請求項４に記載の軽鎖を有することを特徴とする、抗体。
【請求項６】
動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はそれらの組合せから選択されることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号７、９、１０、１１、１２又は１３から成る群から選択され；そして／又は
前記抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号８、１４、１５、１６又は１７から成る群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
付加された、欠失された、修飾された、及び／又は置換されたアミノ酸の数が１〜７であることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項９】
少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じる配列が、少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項１０】
（ａ）診断剤の製造；及び／又は（ｂ）ＴＦ−関連疾患の予防及び／又は治療のための医薬の製造のために使用されることを特徴とする、請求項５に記載の抗体の使用。
【請求項１１】
前記ＴＦ−関連疾患が、下記：
腫瘍の発生、増殖及び／又は転移；
血栓症関連疾患；
炎症；及び
代謝関連疾患
から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記腫瘍が、高ＴＦ−発現を有する腫瘍であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
（ｉ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、又は請求項５に記載の抗体；及び
（ii）任意には、発現及び／又は精製を補助するタグ配列、
を有することにより特徴づけられる組換えタンパク質。
【請求項１４】
（１）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、又は請求項５に記載の抗体；又は
（２）請求項１３に記載の組換えタンパク質、
から成る群から選択されたポリペプチドをコードすることにより特徴づけられるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
本発明の請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含むことにより特徴づけられるベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含むか、又はゲノムに組込まれた請求項１４に記載のポリヌクレオチドを有することにより特徴づけられる、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１７】
（ａ）請求項１に記載重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、請求項５に記載の抗体、又はそれらの組合せから選択された抗体部分；及び
（ｂ）前記抗体部分に接合された接合部分、ここで前記接合部分は、検出可能マーカー、トキシン、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はそれらの組合せから選択される、を含むことにより特徴づけられる、抗体−薬物接合体。
【請求項１８】
請求項５に記載の抗体を発現するか、又は細胞膜外に露出される請求項５に記載の抗体を発現する免疫細胞。
【請求項１９】
（ｉ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、請求項５に記載の抗体、請求項１３に記載の組換えタンパク質、請求項１７に記載の抗体−薬物接合体、請求項１８に記載の免疫細胞、又はそれらの組合せから選択された活性成分；及び
（ii）医薬的に許容できる担体、
を含むことにより特徴づけられる、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、請求項５に記載の抗体、請求項１３に記載の組換えタンパク質、請求項１７に記載の抗体−薬物接合体、請求項１８に記載の免疫細胞、又はそれらの組合せから選択されることを特徴とする、医薬、剤、試験パネル又はキットの製造のための活性成分の使用。
【請求項２１】
インビトロでサンプル中のＴＦタンパク質を決定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）インビトロで請求項５に記載の抗体と、サンプルとを接触し；そして
（ｂ）抗原−抗体複合体が形成されるかどうかを決定することを含み、ここで前記複合体の形成がサンプル中のＴＦタンパク質の存在を示す、方法。
【請求項２２】
基板（支持プレート）及び試験片を含み、前記試験片が請求項５に記載の抗体又は請求項１７に記載の免疫接合体を含むことを特徴とする、試験パネル。
【請求項２３】
組換えポリペプチドの調製方法であって、
（ａ）発現のために適切な条件下で請求項１６に記載の宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）培養物から組換えポリペプチドを分離し、前記組換えポリペプチドが請求項５に記載の抗体又は請求項１３に記載の組換えタンパク質である、方法。
【請求項２４】
請求項５に記載の抗体、前記抗体の抗体−薬物接合体、又は前記抗体を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞を用いることを含む、腫瘍、血栓性疾患、炎症性疾患及び/又は代謝性疾患の治療方法。
【請求項２５】
ヒトＴＦタンパク質に対する親和性について０．０１〜０．０３ｎＭのＥＤ５０を有することを特徴とする、抗体−ＴＦ抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体、特にヒト組織因子（ＴＦ）を標的とする抗体、その調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織因子（ＴＦ）は、４７ｋＤａのトランスメンブラン糖タンパク質である。通常の生理学的条件下で、ＴＦ発現は主に、内皮下層の細胞に限定され；血管が生体内で損傷されると、ＴＦが血流に暴露され、そして第VII因子に結合し、そして活性化することにより、外因性凝固反応を開始する。
【０００３】
ＴＦが異常に活性化され、そして多くの腫瘍組織において発現され、そして腫瘍の発生及び進行において重要な役割を演じることが研究において見出された。特に癌の進行期において、ほとんどの患者は、自発的血栓症、例えば深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）及び肺塞栓症（ＰＥ）を伴い（Thrombosis research, 2013, 131: S59-S62; Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2011, 9(s1): 306-315）；腫瘍細胞におけるＴＦの異常発現は、それらの症状の主なる原因である。多くの腫瘍の臨床サンプルについての分析は、ＴＦの発現レベルが悪化指標、例えば患者における腫瘍の転移及び血栓症の発生に直接的に影響を及ぼし、例えば異常ＴＦ発現の割合が、乳癌で８５．８％、膵臓癌で８８．５％、肺癌で８３．６％及び食道癌において９１．３％、等であったことを示している（Blood, 2012, 119: 924-932）。
【０００４】
外因性凝固反応の開始に加えて、ＴＦ／ＦＶIIａ複合体は、トランスメンブランＧタンパク質共役受容体、すなわちプロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）に直接的に結合し、そして活性化を誘発することができる。ＰＡＲ２は、炎症応答を調節する重要なシグナル経路である。腫瘍の分野におけるＰＡＲ２についての研究はほとんどないが、ＴＦがＰＡＲ２により細胞における一連の腫瘍機能シグナルに影響を及ぼすことができると考えられる。要約すると、ＴＦ−ＰＡＲ２は重要な成長因子、免疫調節剤、及びケモカイン（例えば、ＶＥＧＦ、ＣＳＦ１／２、ＩＬ８、ＣＸＣＬ１、等）の遺伝子発現を誘発し、血管新生を促進し、そしてＭＡＰＫ／ＥＲＫリン酸化による腫瘍増殖のための適切な栄養素、エネルギー及び適切な環境を提供する。さらに、ＴＦはまた、Ｒａｃ１及びβ１ファミリー関連インテグリンとの相互作用により腫瘍細胞の移動及び付着を増強することができ、それにより、一般的に腫瘍細胞の血行性転移能力を増強することができる（Journal of Thrombosis research, 2012, 130: S84-S87; Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2013, 11: 285-293; International Journal of Cancer, 2014, doi: 10.1002/ijc.28959; Blood, 2012, 119: 924-932）。
【０００５】
一方、ＴＦ誘発性凝固亢進状態は、腫瘍細胞の生存及び血行性転移を直接促進し（Blood, 2008, 111: 190-9; Cancer Res., 2015, 75 (1 Suppl): Abstract nr B19）、すなわちＴＦ／ＦＶIIａ開始の凝固は、トロンビンの形成、及びフィブリンの沈着をもたらし、それは腫瘍細胞が免疫攻撃から逃れることを可能にするのみならず、腫瘍細胞と内皮細胞との間の相互作用を増強し、腫瘍細胞の拡散及び浸潤を助け、そして血行性転移の発生を促進する。これはまた、現在、癌を治療することが困難である重要な理由である。
【０００６】
ＴＦはまた、血栓性疾患においても役割を果たすことが、研究により示されている。腫瘍の発生及び進行におけるその役割に加えて、ＴＦ又はＭＰＴＦ（微小粒子組織因子）−開始の凝固もまた、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）を誘発する重要な理由であり、そしてさらに、その血液中の含有量がＶＴＥの重症度に正比例している。現在、ＴＦが臨床におけるＶＴＥ患者の診断及び状態評価のための重要なマーカーとして、及びＶＴＥ治療のための潜在的標的として使用され得ることを示す多くの研究が存在する（Thrombosis research, 2010, 125: 511-512; Lupus., 2010, 19: 370-378; Annual review of physiology, 2011, 73: 515-525）。動脈血栓症におけるＴＦの役割もまた無視できない。多くの臨床データは、ＴＦがアテローム性動脈硬化症の発症及び進行に重要な役割を果たすことを示している。２００９年に、Steppich BA, Braun SL等は、不安定性狭心症（ｕＡＰ）の１７４人の患者、及び急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の１１２人の患者の研究を行い、そしてその結果は、血漿中のＴＦの活性が心血管疾患の患者の死亡率に直接的な影響を有し、そしてＴＦが心血管患者の診断及び予後のためのマーカーとして使用され得ることを示し（Thrombosis research, 2012, 129: 279-284; Thromb J., 2009, 7(11): 1-9）；２０１４年に、Jiang P, Xue D等は、光化学的に誘発された血栓症モデアル及びＦｅＣｌ３により誘発された血栓症モデルの研究を行い、そして血液凝固の内因性経路と比較し、血液凝固のＴＦ開始された外因性経路が動脈血栓症患者の発症及び進行に重要な役割を果たしたことを示し、そして実験結果はさらに、血液凝固のＴＦ開始外因性経路が動脈血栓性患者の治療のための標的として使用され得ることを証明した（Thrombosis research, 2014, 133(4): 657-666）。
【０００７】
ＴＦはまた、炎症及び代謝性疾患においても役割を果たす。炎症性患者の発症が異常な血管形成及び凝固を伴うことが研究により示されている。Maria I Bokarewa等により行われた研究は、種々の炎症性刺激が内因細胞及び単核細胞の表面上のＴＦの発現を促進することを示しており、そしてそれらの実験は、ＴＦの過剰発現がまた、炎症を誘発し、そして促進するための主要因子であることも示している（Arthritis Res 2002, 4:190-195）。
【０００８】
さらに、研究はまた、ＴＦが肥満及び糖尿病の治療において有意な調節役割を果たすことを示している。例えば、Leylla Badeanlou等により行われた研究は、ＴＦを標的とする特異的抗体、又はＴＦのノックアウトによるＴＦ−ＰＡＲ２シグナル経路の遮断が食事誘発性肥満及び脂肪組織炎症の発症を有意に阻害し、そして糖尿病に対するインスリンの治療効果を有意に改善し得ることを示している（Nature medicine, 2011, 17(11): 1490-1497）。
【０００９】
従って、種々の関連疾患におけるＴＦの役割及び機能を考慮すると、ＴＦを標的とする特異的治療抗体の開発は、種々の患者、例えば癌、血栓症及び炎症においてＴＦにより引起される、血管増殖、異常凝固等に起因する病理学的特徴の診断、治療及び予防に極めて有益である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ヒトＴＦを特異的に標的とし、腫瘍増殖及び転移を阻害する活性を有し、そして抗凝固活性、活性化された凝固因子Ｘ（ＦXａ）の産生を阻害する活性などを有するＴＦ抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の側面によれば、本発明は、以下の３種の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み：
配列番号１に記載の配列を有するＣＤＲ１、
配列番号２に記載の配列を有するＣＤＲ２、及び
配列番号３に記載の配列を有するＣＤＲ３；
ここで前記アミノ酸配列中の任意のアミノ酸配列がさらに、少なくとも１つのアミノ酸の任意の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を保持する誘導体配列を含む、抗体の重鎖可変領域を提供する。
【００１２】
第２の側面によれば、本発明は、第１の側面の重鎖可変領域を有する、抗体の重鎖を提供する。
【００１３】
別の好ましい側面によれば、重鎖可変領域は、配列番号７に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【００１４】
第３の側面によれば、本発明は、下記：
配列番号４に記載の配列を有するＣＤＲ１′
配列番号５に記載の配列を有するＣＤＲ２′
配列番号６に記載の配列を有するＣＤＲ３′
から成る群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
前記アミノ酸配列中の任意のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を有する誘導体配列を含む、抗体の軽鎖可変領域を提供する。
【００１５】
第４の側面によれば、本発明は、第３の側面の軽鎖可変領域を有する、抗体の軽鎖を提供する。
【００１６】
別の好ましい側面によれば、軽鎖可変領域は、配列番号８に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【００１７】
第５の側面によれば、本発明は、以下：
（１）第１の側面の重鎖可変領域；及び／又は
（２）第３の側面の軽鎖可変領域、
を有する抗体を提供し、又は
前記抗体は第２の側面の重鎖；及び／又は第４の側面の軽鎖を有する。
【００１８】
別の好ましい例によれば、抗体は、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はそれらの組合せから選択される。
【００１９】
別の好ましい例によれば、付加され、欠失され、修飾され、そして／又は置換されたアミノ酸の数は、初期アミノ酸配列のアミノ酸の合計数の９０％を越えない。
【００２０】
別の好ましい例によれば、付加され、欠失され、修飾され、そして／又は置換されたアミノ酸の数は、１〜７である。
【００２１】
別の好ましい例によれば、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じる配列は、少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列である。
【００２２】
別の好ましい例によれば、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じる配列は、ＴＦ関連シグナル経路を阻害する活性、抗凝固活性、及びＦＸａの産生を阻害する活性を有する。
【００２３】
別の好ましい例によれば、抗体は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ1、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈ、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９及びＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４から成る群から選択される。
【００２４】
第６の側面によれば、本発明は、（ａ）診断剤の製造；及び／又は（ｂ）ＴＦ−関連疾患の予防及び／又は治療のための医薬の製造のための本発明の抗体の使用を提供する。
【００２５】
別の好ましい例によれば、ＴＦ−関連疾患は、腫瘍の発生、増殖及び／又は転移；血栓症関連疾患；炎症；及び代謝関連疾患から成る群から選択される。
【００２６】
別の好ましい例によれば、腫瘍は、高ＴＦ発現を有する腫瘍である。
【００２７】
別の好ましい例によれば、発現の「高ＴＦ発現」とは、腫瘍組織中のＴＦ転写体及び／又はタンパク質レベルＬ１が正常組織中の転写体及び／又はタンパク質レベルＬＯと比較される場合、Ｌ１／Ｌ０≧２、好ましくは≧３であることを意味する。
【００２８】
別の好ましい例によれば、腫瘍は、トリプルネガティブ乳癌、膵臓癌、肺癌及び悪性神経膠腫から成る群から選択される。
【００２９】
別の好ましい例によれば、薬物は、抗体−薬物接合体である。
【００３０】
第７の側面によれば、本発明は、（ｉ）第１の側面の重鎖可変領域第２の側面の重鎖、第３の側面の軽鎖可変領域、第４の側面の軽鎖、又は第５の側面の抗体；及び
（ii）任意には、発現及び／又は精製を補助するタグ配列を有する組換えタンパク質を提供する。
【００３１】
第８の側面によれば、本発明は、（１）第１の側面の重鎖可変領域、第２の側面の重鎖、第３の側面の軽鎖可変領域、第４の側面の軽鎖、又は第５の側面の抗体；又は
（２）第７の側面の組換えタンパク質、
から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３２】
第９の側面によれば、本発明は、第８の側面のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００３３】
第１０の側面によれば、本発明は、第９の側面のベクターを含むか、又はゲノムに組込まれた第８の側面のポリヌクレオチドを有する、遺伝子操作された宿主細胞を提供する。
【００３４】
第１１の側面によれば、本発明は、
（ａ第１の側面の重鎖可変領域、第２の側面の重鎖、第３の側面の軽鎖可変領域、第４の側面の軽鎖、又は第５の側面の抗体、又はそれらの組合せから選択された抗体部分；及び
（ｂ）前記抗体部分に接合された接合部分、ここで前記接合部分は、検出可能マーカー、トキシン、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はそれらの組合せから選択される、を含む抗体−薬物接合体を提供する。
【００３５】
別の好ましい例によれば、抗体部分は、化学結合又はリンカーを介して接合部分に接合される。
【００３６】
別の好ましい例によれば、抗体−薬物接合体中の抗体部分は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈ、又はＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ２９からＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４８から成る群から選択され；より好ましくは、抗体部分は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９及びＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４から成る群から選択される。
【００３７】
第１２の側面によれば、本発明は、本発明の第５の側面の抗体を発現するか、又は細胞膜外に露出される本発明の第５の側面の抗体を発現する免疫細胞を提供する。
【００３８】
別の好ましい例によれば、免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞を含む。
【００３９】
別の好ましい例によれば、免疫細胞は、ヒト免疫細胞である。
【００４０】
別の好ましい例によれば、抗体は、単鎖抗体である。
【００４１】
第１３の側面によれば、本発明は、
（ｉ）第１の側面の重鎖可変領域、第２の側面の重鎖、第３の側面の軽鎖可変領域、第４の側面の軽鎖、第５の側面の抗体、第７の側面の組換えタンパク質、第１１の側面の抗体−薬物接合体、第１２の側面の免疫細胞、又はそれらの組合せから選択された活性成分；及び
（ii）医薬的に許容できる担体、を含む医薬組成物を提供する。
【００４２】
第１４の側面によれば、本発明は、第１の側面の重鎖可変領域、第２の側面の重鎖、第３の側面の軽鎖可変領域、第４の側面の軽鎖、第５の側面の抗体、第７の側面の組換えタンパク質、第１１の側面の抗体−薬物接合体、第１２の側面の免疫細胞、又はそれらの組合せから選択された、医薬、剤、試験パネル又はキットの製造のための活性成分の使用を提供する。
【００４３】
別の好ましい例によれば、前記剤、試験パネル又はキットは、
（１）サンプル中のＴＦタンパク質を検出し；そして／又は
（２）腫瘍細胞中の内因性ＴＦタンパク質を検出し；そして／又は
（３）ＴＦタンパク質を発現する腫瘍細胞を検出するために使用され；そして
前記医薬は、疾患、例えばTFタンパク質発現腫瘍、血栓性疾患、肥満及び糖尿病を治療するか又は予防するために使用される。
【００４４】
第１５の側面によれば、本発明は、以下の工程：
（ａ）インビトロで本発明の抗体と、サンプルとを接触し；そして
（ｂ）抗原−抗体複合体が形成されるかどうかを決定することを含み、ここで前記複合体の形成がサンプル中のＴＦタンパク質の存在を示す、インビトロでサンプル中のＴＦタンパク質を決定するための（診断的に又は非−診断的に決定することを含む）方法を提供する。
【００４５】
第１６の側面によれば、本発明は、基板（支持プレート）及び試験片を含み、前記試験片が第５の側面の抗体又は第１１の側面の免疫接合体を含む、試験パネルを提供する。
【００４６】
第１７の側面によれば、本発明は、
（１）本発明の抗体を含む第１容器；及び／又は
（２）本発明の抗体に対する第２抗体を含む第２容器を含むキットを提供し、又は
第１６の側面の試験パネルを含むキットを提供する。
【００４７】
第１８の側面によれば、本発明は、
（ａ）発現のために適切な条件下で第１０の側面の宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）培養物から組換えポリペプチドを分離し、前記組換えポリペプチドが第５の側面の抗体又は第７の側面の組換えタンパク質である、組換えポリペプチドの調製方法を提供する。
【００４８】
第１９の側面によれば、本発明は、第５の側面の抗体、前記抗体の抗体−薬物接合体、又は前記抗体を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞を用いる（例えば、その必要な対象に投与する）ことを含む、腫瘍、血栓性疾患、炎症性疾患及び/又は代謝性疾患の治療方法を提供する。
【００４９】
別の好ましい例によれば、代謝性疾患は、肥満又は糖尿病を含む。
【００５０】
第２０の側面によれば、本発明は、ヒトＴＦタンパク質に対する親和性について０．００５〜０．１０ｎＭ、好ましくは０．００５〜０．０５ｎＭ、より好ましくは０．０１〜０．０３ｎＭ又は０．０１〜０．０２ｎＭのＥＤ５０を有することを特徴とする、抗体−ＴＦ抗体を提供する。
【００５１】
別の好ましい例によれば、抗体は、野生型マウスＴＦタンパク質に結合しない。
【００５２】
別の好ましい例によれば、抗体は、下記；
（ａ）腫瘍細胞の移動又は転移の阻害；及び
（ｂ）腫瘍増殖の阻害、から成る群から選択される１又は２以上の特徴を有する。
【００５３】
別の好ましい例によれば、抗体は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈ、又はＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ２９〜ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４８であり；好ましくは、抗体は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈ、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９、及びＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４から成る群から選択される。
【００５４】
第２１の側面によれば、本発明は、下記工程：
本発明のネズミ抗体可変領域のヌクレオチド配列を、ヒト抗体不変領域を含む発現ベクター中にクローニングした後、動物細胞をトランスフェクトすることにより、ヒト−マウスキメラ抗体を発現する工程；
本発明のヒトＦＲ領域を含む抗体可変領域のヌクレオチド配列を、ヒト抗体不変領域を含む発現ベクター中にクローニングした後、動物細胞をトランスフェクトすることにより、ヒト化抗体を発現する工程を含む、ヒト化又はキメラ抗体の調製方法を提供する。
【００５５】
別の好ましい例によれば、抗体は、部分的に又は完全にヒト化されたモノクローナル抗体である。
【００５６】
第２２の側面によれば、本発明は、本発明の抗体、その抗体の抗体−薬物接合体、又はその抗体を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞を、その必要な対象に投与する工程を含むことにより特徴づけられる、腫瘍細胞の転移を阻害するための方法を提供する。
【００５７】
本発明の範囲内で、上述の本発明の技術的特徴と以下に（例えば実施例において）記載される技術的特徴とを互いに組み合わせて、新規又は好ましい技術的解決策を構成することができることが理解されるべきである。スペースを節約するために、これらの組み合わせはここではこれ以上説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、ヒトＴＦ陽性（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢｘＰＣ−３）及びネズミＴＦ陽性（Ｂ１６−Ｆ１０）細胞に対する一連のオリジナル抗ヒトＴＦモノクローナル抗体（オリジナルハイブリドーマ）の結合活性を示し、ここでＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は、１０μｇ／ｍｌの濃度で最良の結合活性を示した。
【００５９】
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡにより決定された、ＴＦの細胞外ドメインタンパク質に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の結合親和性を示す。
【００６０】
【図３】図３は、ウェルターンブロットにより決定された、ＢｘＰＣ−３におけるＴＦ−ＰＡＲ２細胞内シグナル経路に対する一連のオリジナルモノクローナル抗体の阻害効果を示す。
【００６１】
【図４Ａ】図４は、単一酵素消化及び二重酵素消化によるヒト−マウスキメラ抗体（ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈ）の発現プラスミドの制限酵素消化を示し、ここで図４Ａは、単一酵素消化及び二重酵素消化による重鎖可変領域の発現プラスミドの同定結果を示し、図４Ｂは、単一酵素消化及び二重酵素消化による軽鎖可変領域の発現プラスミドの同定結果を示す。
【図４Ｂ】図４は、単一酵素消化及び二重酵素消化によるヒト−マウスキメラ抗体（ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈ）の発現プラスミドの制限酵素消化を示し、ここで図４Ａは、単一酵素消化及び二重酵素消化による重鎖可変領域の発現プラスミドの同定結果を示し、図４Ｂは、単一酵素消化及び二重酵素消化による軽鎖可変領域の発現プラスミドの同定結果を示す。
【００６２】
【図５Ａ】図５は、癌細胞表面ＴＦへのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の結合親和性を示し、ここで図５Ａは、ＢｘＰＣ−３細胞への結合親和性の結果を示し、図５Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への結合親和性の結果を示し、図５Ｃは、Ｕ８７ＭＧ細胞への結合親和性の結果を示し、そして図５Ｄは、Ｈ１９７５細胞への結合親和性の結果を示す。
【図５Ｂ】図５は、癌細胞表面ＴＦへのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の結合親和性を示し、ここで図５Ａは、ＢｘＰＣ−３細胞への結合親和性の結果を示し、図５Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への結合親和性の結果を示し、図５Ｃは、Ｕ８７ＭＧ細胞への結合親和性の結果を示し、そして図５Ｄは、Ｈ１９７５細胞への結合親和性の結果を示す。
【図５Ｃ】図５は、癌細胞表面ＴＦへのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の結合親和性を示し、ここで図５Ａは、ＢｘＰＣ−３細胞への結合親和性の結果を示し、図５Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への結合親和性の結果を示し、図５Ｃは、Ｕ８７ＭＧ細胞への結合親和性の結果を示し、そして図５Ｄは、Ｈ１９７５細胞への結合親和性の結果を示す。
【図５Ｄ】図５は、癌細胞表面ＴＦへのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の結合親和性を示し、ここで図５Ａは、ＢｘＰＣ−３細胞への結合親和性の結果を示し、図５Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への結合親和性の結果を示し、図５Ｃは、Ｕ８７ＭＧ細胞への結合親和性の結果を示し、そして図５Ｄは、Ｈ１９７５細胞への結合親和性の結果を示す。
【００６３】
【図６】図６は、ＢｘＰＣ−３細胞におけるＦＶIIa−活性化ＴＦ−ＰＡＲ２の細胞内シグナル経路に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の効果を示す。
【００６４】
【図７Ａ】図７は、ＢｘＰＣ−３細胞（図７Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図７Ｂ）由来のＴＦにより開始される凝固を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の活性を示す。
【図７Ｂ】図７は、ＢｘＰＣ−３細胞（図７Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図７Ｂ）由来のＴＦにより開始される凝固を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の活性を示す。
【００６５】
【図８Ａ】図８は、ＢｘＰＣ−３細胞（図８Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図８Ｂ）由来のＴＦにより誘発されるＦＸａ産生を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−Ｓｃ１の活性の結果を示す。
【図８Ｂ】図８は、ＢｘＰＣ−３細胞（図８Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図８Ｂ）由来のＴＦにより誘発されるＦＸａ産生を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−Ｓｃ１の活性の結果を示す。
【００６６】
【図９】図９は、ヌードマウスにおける皮下ＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍増殖を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の活性を示す（矢印は投与開始の時間を示す）。
【００６７】
【図１０】図１０は、ヌードマウスにおける皮下Ｕ８７ＭＧ異種移植腫瘍増殖を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の活性の結果を示す（矢印は投与開始の時間を示す）。
【００６８】
【図１１】図１１は、ＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍増殖を現場阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の活性の結果を示す（矢印は投与開始の時間を示す）。
【００６９】
【図１２】図１２は、ＢｘＰＣ−３腫瘍マトリックスコラーゲンの蓄積を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の活性、及びＩｍａｇｅ−ｐｒｏ  ｐｌｕｓを用いての統計学的分析の結果を示す。
【００７０】
【図１３】図１３は、ＢｘＰＣ−３腫瘍血管の内腔領域を縮小するためのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の活性及びその統計学的結果を示す。
【００７１】
【図１４Ａ】図１４は、ＴＦ遺伝子がノックアウトされている条件下でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図１４Ａ）、及びＢｘＰＣ−３細胞（図１４Ｂ）の移動能力の決定を示す。
【図１４Ｂ】図１４は、ＴＦ遺伝子がノックアウトされている条件下でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図１４Ａ）、及びＢｘＰＣ−３細胞（図１４Ｂ）の移動能力の決定を示す。
【００７２】
【図１５Ａ】図１５は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図１５Ａ）、及びＢｘＰＣ−３細胞（図１５Ｂ）の移動能力を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の活性の決定を示す。
【図１５Ｂ】図１５は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図１５Ａ）、及びＢｘＰＣ−３細胞（図１５Ｂ）の移動能力を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の活性の決定を示す。
【００７３】
【図１６】図１６は、ＴＦ遺伝子がノックアウトされた後、マウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞の血行性移動能力の決定、及びその蛍光強度の統計学的結果を示す。
【００７４】
【図１７】図１７は、マウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞の血行性移動能力を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の活性の決定、及びその蛍光強度の統計学的結果を示す。
【００７５】
【図１８Ａ】図１８Ａは、マウスの肺上でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍転移巣の形成に関する代表的な画像及び統計学的分析を示し、そして図１８Ｂは、各グループにおける肺重量に関する統計学的分析の結果を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａは、マウスの肺上でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍転移巣の形成に関する代表的な画像及び統計学的分析を示し、そして図１８Ｂは、各グループにおける肺重量に関する統計学的分析の結果を示す。
【００７６】
【図１９】図１９は、レーザー共焦点顕微鏡下で観察された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるリソソームへのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の内在化の結果を示す。
【００７７】
【図２０】図２０は、ＥＬＩＳＡにより決定された、ＴＦの細胞外ドメインタンパク質へのキメラ抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈの結合親和性を示す。
【００７８】
【図２１Ａ】図２１Ａは、ＴＦ陽性腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１へのＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈの結合親和性を示し、図２１Ｂは、ＴＦ陽性腫瘍細胞ＨＣＣ１８０６へのＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈの結合親和性の結果を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａは、ＴＦ陽性腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１へのＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈの結合親和性を示し、図２１Ｂは、ＴＦ陽性腫瘍細胞ＨＣＣ１８０６へのＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈの結合親和性の結果を示す。
【００７９】
【図２２】図２２は、ＢｘＰＣ−３細胞におけるＴＦ−ＰＡＲ２細胞内シグナル経路を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈの活性を示す。
【００８０】
【図２３】図２３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるリソソームへのＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈの内在化の結果を示す。
【００８１】
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＥＬＩＳＡにより決定された、ＴＦの細胞外ドメインタンパク質へのヒト化抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９の結合親和性を示し、図２４Ｂは、ＥＬＩＳＡにより決定された、ＴＦの細胞外ドメインタンパク質へのヒト化抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４の結合親和性を示す。
【図２４Ｂ】図２４Ａは、ＥＬＩＳＡにより決定された、ＴＦの細胞外ドメインタンパク質へのヒト化抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９の結合親和性を示し、図２４Ｂは、ＥＬＩＳＡにより決定された、ＴＦの細胞外ドメインタンパク質へのヒト化抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４の結合親和性を示す。
【００８２】
【図２５】図２５は、ＢｘＰＣ−３細胞におけるＴＦ−ＰＡＲ２細胞内シグナル経路に対するヒト化抗体の効果の結果を示す。
【００８３】
【図２６】図２６は、ＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍増殖を阻害するための種々のヒト化抗体の活性の結果を示す。
【００８４】
【図２７】図２７は、ＨＣＣ１８０６異種移植腫瘍増殖を阻害するためのキメラ抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈ及びヒト化抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９の用量反応活性を示す。
【００８５】
【図２８】図２８は、ウェスターンブロットにより決定された、高浸潤性及び高転移性基底様乳癌（特に、トリプルネガティブ乳癌）細胞系、及び内腔サブタイプ乳癌細胞系におけるＴＦタンパク質の発現結果の比較を示す。
【００８６】
【図２９】図２９は、データベースＥ−ＴＡＢＭ−１５７ (European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute, EMBL-EBI)に従って分析された、高浸潤性及び高転移性基底様乳癌（特に、トリプルネガティブ乳癌）細胞系、及び内腔サブタイプ乳癌細胞系におけるＴＦ  ｍＲＮＡの発現レベル比較の結果を示す。
【００８７】
【図３０】図３０は、ウェスターンブロットにより決定された、異なる膵臓癌細胞系におけるＴＦタンパク質レベルを示す。
【００８８】
【図３１】図３１は、データベースＧＳＥ１５４７１ (Gene Expression Omnibus, GEO)に従って分析された、隣接する正常組織と比較しての膵臓癌組織におけるＴＦ  ｍＲＮＡの異常活性化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
本発明者は、広範且つ詳細な研究及び多数のスクリーニングを実施することにより、意外にも抗−ＴＦモノクローナル抗体（ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１）を得、そしてその実験結果は、ＴＦタンパク質に対するモノクローナル抗体がＩｇＧ２ｂ抗体であることを示す。抗体は、高い特異性及び高い親和性でＴＦ抗原に結合することができ（ＥＣ５０は、ＥＬＩＳＡにより決定される場合、約０．０１９ｎＭである）、そして抗体は有意な抗腫瘍活性を有し、そして哺乳動物自体に対して明らかな毒性副作用を有さない。さらに、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１に基いて得られる、キメラ抗体、ヒト化抗体及びその対応するＡＤＣもまた、卓越した特性を有する。本発明は、それらに基いて達成された。
【００９０】
抗体
本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody）」又は「免疫グロブリン（immunoglobulin）」とは、２つの同一の軽鎖（Ｌ）及び２つの同一の重鎖（Ｈ）から成る、同じ構造特性を有する約１５０，０００Ｄａのヘテロテトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は、共有ジスルフィド結合を介して重鎖に結合され、そして異なる免疫グロブリンイソタイプは、重鎖間に異なる数のジスルフィド結合を有する。各重鎖及び各軽鎖に規則的等間隔の鎖内ジスルフィド結合も存在する。各重鎖は、一端で可変領域（ＶＨ）、続いて多くの不変領域を有する。各軽鎖は、一端で可変領域（ＶＬ）及び他端で不変領域；重鎖の第１不変領域に対応する軽鎖の不変領域、及び重鎖の不変領域に対応する軽鎖の可変領域を有する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域との間に界面を形成する。
【００９１】
本明細書において使用される場合、用語「可変（variable）」とは、可変領域の特定部分における配列に関して、抗体がお互いに異なり、それが種々の特定の抗体のそれらの特定の抗原への結合及び特異性を担当していることを意味する。しかしながら、可変性は、抗体の可変領域全体に均一に分布されない。それは、軽鎖及び重鎖可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中されている。可変領域の保存部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然に存在する重鎖及び軽鎖の各可変領域は、一般的に、結合ループを形成する３つのＣＤＲにより連結されるβ−シート構造で存在し、そして場合によっては、部分的β−シート構造を形成できる、４つのＦＲ領域を含む。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域を介して互いに密接に結合され、そして他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位を形成する（Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pp. 647-669 (1991)を参照のこと）。不変領域は、抗原への抗体の結合に直接関与していないが、しかしながら、それらは異なる効果及び機能を示し、例えば抗体の抗体依存性細胞毒性に関与している。
【００９２】
脊椎動物抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖（light chain）」は、その不変領域のアミノ酸配列に依存して、２つの明白に異なるクラス（κ及びλと呼ばれる）のうちの１つに分類され得る。免疫グリブリンは、それらの重鎖不変領域のアミノ酸配列に依存して、異なるクラスに分類され得る。免疫グロブリンには主に以下の５つのクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、それらのいくつかはさらに、以下のサブクラス（アイソタイプ）に分類され得る：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖不変領域はそれぞれ、α、δ、 ε、 γ、 及び μと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット機構及び三次元配置は、当業者に良く知られている。
【００９３】
一般的に、抗体の抗原結合特性は、可変領域を４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分割する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、重鎖及び軽鎖可変領域に位置する３つの特定領域により説明され得；４つのＦＲのアミノ酸配列は比較的保存的であり、そして結合反応には直接的に関与していない。それらのＣＤＲは環構造を形成し、そしてそれらの環のＦＲにより形成されるβ−シートを介して立体構造内で互いに接近し、そして重鎖上のＣＤＲ及び対応する軽鎖上のＣＤＲは抗体の抗原結合部位を構成する。同じタイプの抗体のアミノ酸配列を比較することにより、どのアミノ酸がＦＲ又はＣＤＲを形成するかが決定され得る。
【００９４】
本発明は、損なわれていない抗体のみならず、また免疫学的活性を有する抗体のフラグメント、又は抗体及び別の配列により形成される融合タンパク質も含む。従って、本発明はまた、抗体のフラグメント、誘導体及び類似体を含む。
【００９５】
本発明においては、抗体は、当業者に周知の技法により調製される、マウス、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗体を含む。ヒト及び非ヒト部分を含む、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体は、標準的なＤＮＡ組換え技法により得られ、それらのすべては有用な抗体である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えばマウス由来のモノクローナル抗体からの可変領域、及びヒト免疫グロブリンからの不変領域を有するキメラ抗体である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及び第４，８１６，３９７号を参照のこと；それらはそれらの全体が参照により本明細書に組込まれる）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１又は２以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子を言及する（米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと；それはその全体が参照により本明細書に組込まれる）。それらのキメラ及びヒト化抗体は、当業界において良く知られている組換えＤＮＡ技法により調製され得る。
【００９６】
本発明においては、抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又は多重特異性であり得る。
【００９７】
本発明においては、本発明の抗体はさらに、その保存的変異体を含み、それは本発明の抗体のアミノ酸配列に比較して最大１０、好ましくは最大８、より好ましくは最大５及び最も好ましくは最大３個のアミノ酸の類似アミノ酸による置換により形成されるポリペプチドを言及する。それらの保存的変異体ポリペプチドは好ましくは、表Ａによるアミノ酸置換により調製される。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
抗−ＴＦ抗体
本発明は、重鎖及び軽鎖を含む、ＴＦに対して高い特異性及び高い親和性を有する抗体を提供し、ここで重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を含み、そして軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む。
【０１００】
好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列に対するＣＤＲは、下記から選択される：
ａ１) 配列番号１;
ａ２) 配列番号２;
ａ３) 配列番号３;
ａ４) 配列番号４;
ａ５) 配列番号５;
ａ６) 配列番号６;
ａ７) 前記アミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、ＴＦ−結合親和性を有する配列。
【０１０１】
別の好ましい例によれば、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じる配列は好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列である。
【０１０２】
好ましくは、抗体は、ＴＦ−関連シグナル経路を阻害する活性を有し；抗凝固活性を有し；ＦＸａ産生を阻害する活性を有し；又はそれらの組合を有する。
【０１０３】
本発明の抗体は、二本鎖又は単鎖抗体であり得、そして動物由来の抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体から成る群から選択され得；より好ましくは、ヒト化抗体及びヒト−動物キメラ抗体から成る群から選択され得；そして完全ヒト抗体であり得る。
【０１０４】
本発明の抗体は、単鎖抗体、及び／又は抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ′、（Ｆａｂ′）２、又は当業界において知られている他の抗体誘導体であり得、そしてＩｇＡ，ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体又はサブタイプの抗体のいずれか１又２以上であり得る。
【０１０５】
本発明においては、動物は好ましくは、哺乳類、例えばマウスである。
【０１０６】
本発明の抗体は、ヒトＴＦを標的とするキメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植及び／又は修飾抗体であり得る。
【０１０７】
本発明の好ましい例によれば、配列番号１〜３のいずれか１又は２以上の配列、又は少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を有するそれらの配列は、重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲに位置する。
【０１０８】
本発明の好ましい例によれば、配列番号４〜６のいずれか１又は２以上の配列、又は少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を有するそれらの配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲに位置する。
【０１０９】
本発明のより好ましい例によれば、ＶＨ  ＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３は、配列番号１〜３のいずれか１又は２以上の配列、又は少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を有するそれらの配列から独立して選択され；ＶＬ  ＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３は、配列番号４〜６のいずれか１又は２以上の配列、又は少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換から生じ、そしてＴＦ−結合親和性を有するそれらの配列から独立して選択される。
【０１１０】
本発明においては、付加され、欠失され、修飾され、そして／又は置換されるアミノ酸の数は、初期アミノ酸配列のアミノ酸の合計数の、好ましくは、４０％を越えず、より好ましくは３５％を越えず、より好ましくは１〜３３％であり、より好ましくは５〜３０％であり、より好ましくは１０〜２５％であり、そしてより好ましくは１５〜２０％である。
【０１１１】
本発明においては、より好ましくは、付加され、欠失され、修飾され及び／又は置換されるアミノ酸の数は、１〜７、より好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２である。
【０１１２】
別の好ましい例によれば、ＴＦを標的とする抗体は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１（オリジナル名称はＴＦ−ｍＡｂである）である。
【０１１３】
別の好ましい例によれば、抗体ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号７に示されるようなアミノ酸配列である。
【０１１４】
別の好ましい例によれば、抗体ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の軽鎖可変領域（Ｖ−κ）のアミノ酸配列は、配列番号８に示されるようなアミノ酸配列である。
【０１１５】
抗体の調製
本発明の抗体又はそのフラグメントに対するＤＮＡ分子の配列は、従来の技法、例えばＰＣＲ増幅又はゲノムライブラリースクリーニングのような方法により得られる。さらに、軽鎖及び重鎖をコードする配列は、一緒に融合され、単鎖抗体が形成される。
【０１１６】
関連配列が得られると、組換え方法を用いて、関連配列を多量に得ることができる。これは通常、配列をベクター中にクローニングし、そのベクターにより細胞を形質転換し、そして次に、増殖された宿主細胞から関連配列を、従来の方法により分離することにより実施される。
【０１１７】
さらに、関連配列は、特に、フラグメントの長さが短い場合、人工的に合成される。通常、いくつかの小フラグメントが、まず合成され、そして次に、一緒に連結され、長い配列を有するフラグメントが得られる。
【０１１８】
本発明の抗体（又はそのフラグメント、又はその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を、化学合成により得ることは、現在可能である。次に、そのＤＮＡ配列は、当業界において知られている種々の既存のＤＮＡ分子（又は、例えばベクター）及び細胞中に導入され得る。さらに、突然変異がまた、化学合成により、本発明のタンパク質配列中に導入され得る。
【０１１９】
本発明はさらに、前記適切なＤＮＡ配列、及び適切なプロモーター又は制御配列を含むベクターに関する。それらのベクターは、それらがタンパク質を発現することを可能にするために適切な宿主細胞を形質転換するために使用され得る。
【０１２０】
宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞；又は下等真核細胞、例えば酵母細胞；又は高等真核細胞、例えば哺乳類細胞であり得る。好ましい動物細胞は、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３細胞を含むが、但しそれらだけには限定されない。
【０１２１】
一般的に、本発明の抗体の発現のために適切な条件下で、得られる宿主細胞は培養される。次に、本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製工程、例えば当業者に良く知られている従来の分離及び精製手段、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー又は親和性クロマトグラフィーを用いることにより精製される。
【０１２２】
得られるモノクローナル抗体は、従来の手段により同定され得る。例えば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））により決定され得る。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばScatchard分析（Anal. Biochem., 107: 220 (1980)）により決定され得る。
【０１２３】
本発明の抗体は、細胞において又は細胞膜上に発現され、又は細胞外に分泌される。必要に応じて、組換えタンパク質は、その物理的、化学的又は他の特性に従って種々の分離方法により分離され、そして精製され得る。それらの方法は、当業者に良く知られている。それらの方法の例は、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透性細菌の破砕、超音波処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、他の様々な液体クロマトグラフィー技法及びそれらの方法の組合せ。
【０１２４】
抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）
本発明はまた、本発明の抗体に基く抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）も提供する。
【０１２５】
典型的には、抗体−薬物接合体は、抗体及びエフェクター分子を含み、ここで抗体はエフェクター分子に接合され、そして化学的接合が好ましい。好ましくは、エフェクター分子は、治療的活性薬物である。さらに、エフェクター分子は、１又は２以上の毒性タンパク質、化学療法薬物又は放射性核種であり得る。
【０１２６】
本発明の抗体及びエフェクター分子は、カップリング剤によりカップリングされ得る。カップリング剤の例としては、非選択的カップリング剤、カルボキシル基を利用するカップリング剤、ペプチド鎖、及びジスルフィド結合を利用するカップリング剤のいずれか１つ又は２以上のものであり得る。非選択的カップリング剤は、共有結合、例えばグルタルアルデヒドなどを介してエフェクター分子と抗体との間の連結をもたらす化合物を言及する。カルボキシル基を利用するカップリング剤は、シス−アコニット酸無水物カップリング剤（例えば、シス−アコニット酸無水物）及びアシルヒドラゾンカップリング剤（カップリング部位はアシルヒドラゾンである）のいずれか１つ又は２以上のものであり得る。
【０１２７】
抗体上の特定の残基（例えば、Ｃｙｓ又はＬｙｓ、等）は、造影剤（例えば、発色団及び蛍光体）、診断剤（例えば、ＭＲＩ造影剤及び放射性同位体）、安定化剤（例えば、ポリ（エチレングリコール））及び治療剤を含む種々の官能基を連結するために使用される。抗体は、抗体−機能剤の接合体を形成するために機能剤に接合され得る。機能剤（例えば、薬物、検出試薬、安定化剤）は、抗体に接合される（共有結合による）。機能剤は、リンカーを介して直接的に又は間接的に抗体に連結される。
【０１２８】
抗体は、抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）を形成するために、薬物に接合され得る。典型的には、ＡＤＣは、薬物と抗体との間にリンカーを含む。リンカーは、分解性又は非分解性リンカーであり得る。典型的には、分解性リンカーは、細胞内環境下で容易に分解され、例えば、リンカーは標的部位で分解され、それにより、抗体から薬物を放出する。適切な分解性リンカーは、細胞内でプロテアーゼ（例えば、リソソームプロテアーゼ又はエンドソームプロテアーゼ）により分解され得るペプチジル含有リンカーを含む酵素分解リンカー、糖リンカー、例えばグルクロニダーゼにより分解され得るグルクロニド含有リンカーを含む。ペプチジルリンカーは例えば、ジペプチド、例えばバリン−シトルリン、フェニルアラニン−リシン又はバリン−アラニンを含むことができる。他の適切な分解性リンカーは、例えばｐＨ感受性リンカー（例えば、５．５以下のｐＨで水分解されるリンカー、例えばヒドラゾンリンカー）及び還元条件下で分解されるリンカー（例えば、ジスルフィド結合リンカー）を含む。非分解性リンカーは、典型的には、抗体がプロテアーゼにより加水分解される条件下で薬物を放出する。
【０１２９】
抗体への連結の前、リンカーは特定のアミノ酸残基と反応できる反応基を有し、そして連結がその反応基により達成される。チオール特異的反応基が好ましく、これは例えば、マレイミド化合物、ハロゲン化（例えば、ヨード、ブロモ、又はクロロ置換された）アミド；ハロゲン化（例えば、ヨード、ブロモ、又はクロロ置換された）エステル；ハロゲン化（例えば、ヨード、ブロモ、又はクロロ置換された）ハロゲン化ベンジル；ビニルスルホン；ピリジルジスルフィド；水銀誘導体、例えば３、６−ジ−（水銀メチル）ジオキサン（対イオンがＣＨ３ＣＯＯ−、Ｃｌ−又はＮＯ３−である）；及びポリメチレンジメチルスルフィドチオスルホネートを含む。リンカーは例えば、チオスクシンイミドを介して抗体に連結されるマレイミドを含む。
【０１３０】
薬物は、任意の細胞毒性、細胞増殖抑制又は免疫抑制薬物であり得る。１つの実施形態によれば、抗体はリンカーを介して薬物に連結され、そして薬物は、リンカーと共に結合を形成できる官能基を有する。例えば、薬物は、リンカーと共に結合を形成できる、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基、又はケトン基を有することができる。薬物がリンカーに直接連結される場合、薬物は、抗体に連結される前、反応基を有する。
【０１３１】
有用な薬物は以下を含む：抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、葉酸拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなど。特に有用な細胞毒性薬物の例は、以下を含み：DNA副溝結合剤、ＤＮＡアルキル化剤、及びチューブリン阻害剤；典型的な細胞毒性薬物は、例えば以下を含む：アウリスタチン、カンプトテシン、ドカマイシン／デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシン及びメイタンシノイド（例えば、ＤＭ１及びＤＭ４）、タキサン、ベンゾジアゼピン又はベンゾジアゼピン含有薬物（例えば、ピロロ[１，４]ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン及びオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、並びにビンカアルカロイド。
【０１３２】
本発明においては、薬物−リンカーは、簡単な工程プロセスでＡＤＣを形成するために使用され得る。他の実施形態によれば、二官能性リンカー化合物が、二段階又は多段階プロセスでＡＤＣを形成するために使用され得る。例えば、システイン残基は、第１段階においてリンカーの反応性部分と反応され、そして次に、リンカー上の官能基が、ＡＤＣを形成するために続く段階において薬物と反応される。
【０１３３】
一般的に、リンカー上の官能基は、薬物部分上の適切な反応性基と特別に反応できるよう選択される。非限定的な例として、アジトベースの部分が、薬物部分上の反応性アルキニル基と特別に反応するために使用され得る。薬物は、アジト基とアルキニル基との間の１，３−双極子環状付加によりリンカーに共有結合される。他の有用な官能基は例えば、以下を含む：ケトン及びアルデヒド（ヒドラジド及びアルコキシアミンとの反応のために適切な）、ホスフィン（アジドとの反応のために適切な）；イソシアネート及びイソチオシアネート（アミン及びアルコールとの反応のために適切な）；及び活性化エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（アミン及びアルコールとの反応のために適切な）。それらの及び他の連結法、例えばBioconjugation Technology (2nd Edition (Elsevier))は、当業者に良く知られている。当業者は、相補的対の反応性官能基が薬物部分とリンカーとの間の選択的反応のために選択される場合、相補的対の各メンバーがリンカーのために使用され、そしてまた、薬物のために使用され得ることを理解できる。
【０１３４】
本発明はさらに、抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）を形成するために十分な条件下で、薬物−リンカー化合物に抗体を結合されることをさらに含む、ＡＤＣの調製方法を提供する。
【０１３５】
特定の実施形態によれば、本発明の方法は、抗体−リンカー接合体を形成するのに十分な条件下で、二官能性リンカー化合物に抗体を結合されることを含む。それらの実施形態によれば、本発明の方法は、リンカーを介して薬物部分を抗体に共存結合するのに十分な条件下で、抗体−リンカー接合体を薬物部分に結合されることを含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態によれば、抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）は、以下のような式：
【化１】
2019526256.tif 000003
［式中、Ａｂは抗体であり；
ＬＵはリンカーであり、
Ｄは薬物であり；そして
下付文字ｐは、１〜８から選択された値である］を有する。
【０１３７】
検出用途及びキット
本発明の抗体又はそのＡＤＣは、例えば診断情報を提供するためにサンプルの検出に使用するための検出用途に使用され得る。
【０１３８】
本発明においては、使用される検体（サンプル）は、細胞、組織サンプル及び生検検体を含む。本発明に使用される用語「生検（biopsy）」は、当業者に知られている全ての種類の生検を含むべきである。本発明で使用される生検検体は例えば、腫瘍の切除サンプル、及び器官の内視鏡的方法又は穿剌又は針穿剌生検により調製された組織サンプルを含む。
【０１３９】
本発明で使用するサンプルには、固定された又は保存された細胞又は組織サンプルを含む。
【０１４０】
本発明はさらに、本発明の抗体（又はそのフラグメント）を単に含むキットを提供し；本発明の好ましい例によれば、キットはさらに、容器、説明書、緩衝液、等を含む。好ましい例によれば、本発明の抗体は、試験パネル上に固定され得る。
【０１４１】
用途
本発明はさらに、診断剤の製造、又はＴＦ関連疾患を予防し、そして／又は治療するための医薬の製造のための本発明の抗体の使用を提供する。ＴＦ関連疾患は、腫瘍形成、腫瘍増殖及び/又は転移、血栓症関連疾患、炎症、代謝関連疾患などを包含する。
【０１４２】
本発明の抗体、ＡＤＣ又はＣＡＲ−Ｔの使用は、以下のためを包含する（但し、それらだけには限定されない）：
（ｉ）腫瘍形成、腫瘍増殖及び／又は転移、特に高ＴＦ発現を有する腫瘍の診断、予防及び／又は治療、ここで腫瘍は以下を含む（但し、それらだけには限定されない）：乳癌（例、トリプルネガティブ乳がん）、膵臓癌、肺癌、悪性神経膠腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、腎臓癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、白血病、骨髄癌、血管肉腫など；特に、トリプルネガティブ乳癌、膵臓癌、悪性神経膠腫及び肺癌；より好ましくは、トリプルネガティブ乳癌及び/又は膵臓癌；
（ii）血栓症関連疾患の診断、予防及び／又は治療、ここで血栓症関連疾患は、以下を含む（但し、それらだけには限定されない）：アテローム性動脈硬化症、急性冠症候群、急性心筋梗塞、脳卒中、高血圧、深部静脈血栓症、肺塞栓症、腎塞栓症及び動脈手術、冠状動脈バイパス術による血栓症など；
（iii）炎症の診断、予防及び／又は治療、ここで炎症は、以下を含む（但し、それらだけには限定されない）：リウマチ性関節炎、変形性関節症、強直性脊椎炎、痛風、リトル症候群、乾癬性関節炎、感染性関節炎、結核性関節炎、ウイルス性関節炎、真菌性関節炎、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患、及び特発性肺線維症；
（iv）代謝関連疾患の診断、予防及び／又は治療、ここで代謝関連疾患は、以下を含む（但し、それらだけには限定されない）：糖尿病、食事性肥満、脂肪炎症など。
【０１４３】
医薬組成物
本発明はさらに、組成物を提供する。好ましい例によれば、組成物は、抗体、又はその活性フラグメント、融合タンパク質又はＡＤＣ、又は対応するＣＡＲ−Ｔ細胞、及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物である。一般的に、それらの物質は、非毒性、不活性及び医薬的に許容できる水性担体媒体において配合され得、ここでｐＨは一般的に約５〜８であり、好ましくは、ｐＨは約６〜８であり、但しそのｐＨ値は、配合される物質の性質及び治療される状態に依存して変えられ得る。配合される医薬組成物は、従来の経路、例えば腫瘍内、腹腔内、静脈内、又は局所投与（但し、それらだけには限定されない）により投与され得る。
【０１４４】
本発明の抗体はまた、細胞においてヌクレオチド配列から発現され、そして細胞療法に使用され得、例えば抗体はキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫治療（ＣＡＲ−Ｔ）、などに使用される。
【０１４５】
本発明の医薬組成物は、ＴＦタンパク質分子を結合するために直接使用され得、そして従って、疾患、例えば腫瘍を予防し、そして治療するために使用され得る。さらに、併用治療剤もまた、同時に使用され得る。
【０１４６】
本発明の医薬組成物は、安全且つ有効な量（例えば、０．００１〜９９重量％、好ましくは０．０１〜９０重量％、好ましくは０．１〜８０重量％）の本発明のモノクローナル抗体（又はその接合体）及び医薬的に許容できる担体又は賦形剤を含む。そのような担体は、以下を含む（但し、それらだけには限定されない）：食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組合せ。医薬製剤は、投与法に対応すべきである。本発明の医薬組成物は、生理食塩水、又はグルコース及び他のアジュバントを含む水溶液を用いて従来の方法により、注射剤の形で調製され得る。医薬組成物、例えば注射剤及び溶液は、無菌条件で調製されるべきである。活性成分の投与量は、治療的有効量、例えば約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。さらに、本発明のポリペプチドはまた、追加の治療剤と組合しても使用され得る。
【０１４７】
医薬組成物が使用される場合、安全且つ有効な量の免疫接合体が哺乳類に投与され、ここで前記安全且つ有効な量は、一般的に、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重、及びほとんどの場合、約５０ｍｇ以下／ｋｇ体重である。好ましくは、用量は、約１０μｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん、特定の用量は、投与経路及び患者の体調など、熟練した医師の技量の範囲内である要因に依存するはずである。
【０１４８】
本発明の主な利点は、以下を含む：
ａ）本発明の抗体は、卓越した生物活性及び特性を有し、そして高い親和性を有し（ＥＣ５０は、ＥＬＩＳＡにより決定される場合、０．０１〜００３ｎＭである）；さらに、細胞表面ＴＦに対して良好な結合親和性を有し、そしてＴＦ−標的抗体として使用され得；
（ｂ）本発明のヒト化抗体は、免疫抗体の活性に匹敵する活性を有するのみならず、また、低い免疫原性も有し；
（ｃ）本発明の抗体及びＡＤＣの両者は、有意な抗腫瘍活性を有し、そし的哺乳類動物自体に対して明らかな毒性副作用を有さず、そして
（ｄ）本発明の抗体及びＡＤＣは、腫瘍モデルにおいて有意な治療効果を有するのみならず、また、他の高ＴＦ発現関連疾患、例えば血栓性疾患及び代謝性疾患にも適用できる。
【０１４９】
本発明はさらに、続く特定の実施例を参照して説明される。続く実施例は、本発明を説明するために単に使用されるが、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。続く実施例における実験方法は、その特定の条件は示されていないが、通常、従来の条件、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載される条件、又は製造業者により推薦される条件に従って、実施される。特にことわらない限り、百分率及び部は、重量百分率及び重量部を意味する。細胞系は、市販されているか又はＡＴＣＣから購入される従来の製品であり、そしてすべてのプラスミドは、市販されている製品である。
【実施例】
【０１５０】
実施例１：ヒトＴＦを標的とするモノクローナル抗体の発現及び調製
工程１：ハイブリドーマ細胞の調製：
最初に、生後８週の雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、ヒトＴＦタンパク質の細胞外ドメイン（UniProtKB/Swiss-Prot: P13726.1、位置３４〜２５１からのアミノ酸）により免疫化し、ここでＴＦの細胞外ドメインは、免疫化された脾細胞を調製するために１００μｇ／マウスの量で使用され；マウス骨髄腫細胞（ＳＰ２／０）及びフィーダー細胞を、融合の目的で適時に調製した。
【０１５１】
前記３種の細胞を調製した後、脾細胞及びＳＰ２／０の細胞の融合を、ＰＥＧにより媒介し、ＰＥＧを除去し、そして得られる細胞を、フィーダー細胞を含むＨＡＴ完全培地に再懸濁し、そして９６ウェルプレートにおいて培養した。陽性ウェルを、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。最終的に、陽性ウェル中の細胞を、限界希釈法によりクローン培養にゆだね、そして高力価及び良好な形態を有し、そしてモノクローナル様式で増殖した細胞を、ＥＬＩＳＡ又は免疫蛍光技法によりスクリーニングした。モノクローナル様式で増殖された細胞をさらに、３回の連続したスクリーニングについて陽性クローニング率が１００％になるまで、サブクローニングスクリーニングにゆだねた。
【０１５２】
工程２：ヒトＴＦを標的とするネズミモノクローナル抗体の腹水の調製：
工程１でスクリーニングされたハイブリドーマ細胞を、増幅培養にゆだねた。適応性の上昇の後、プリスタン（０．５ｍｌ／マウス）を、マウスの腹腔内に注射し、ハイブリドーマ細胞の増殖のために好ましい環境を提供した。７〜１０日後、１０×１０６個のハイブリドーマ細胞を、各マウスの腹腔内に注射した。マウスを、７日目以降、腹水及び精神状態の産生を毎日観察し、そして腹水を採取し、遠心分離し、細胞を除去し、そして後での精製のために−８０℃で凍結保存した。
【０１５３】
工程３：ヒトＴＦを標的とするネズミモノクローナル抗体の精製：
工程２で凍結保存された腹水を、氷上で融解し、そして０．４５μｍのフィルターを通して濾過した後、４℃で一晩、ＰＢＳにより透析した。最終的に、抗体を、ＦＰＬＣ技法により精製し、限外濾過し、所望する濃度に濃縮し、再包装し、そしてさらなる使用のために−８０℃で凍結保存した。
【０１５４】
工程４：ヒトＴＦを標的とするネズミモノクローナル抗体の生物活性及び標的特異性の決定：
予備スクリーニングの後、約３０個のハイブリドーマを、二次限界希釈クローニングのために選択し、そして次に６個の抗体を、大規模発現及び精製のために選択した。各抗体を、フローサイトメトリーにより、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト膵臓癌細胞ＢｘＰＣ−３及びネズミ黒色腫細胞Ｂ１６−Ｆ１０に対するその親和性について１０μｇ／ｍｌの濃度で決定した。
【０１５５】
図１に示される結果は、試験された抗体がネズミＴＦ（Ｂ１６−Ｆ１０細胞）への特異的結合を伴わないで、ヒトＴＦ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢｘＰＣ−３細胞）に対して特異的に結合し、ここで、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は、他の５個の抗体よりもヒトＴＦに対して高い親和性を有したことを示した。
【０１５６】
抗原（ＴＦの細胞外ドメインタンパク質）を、コーチング溶液により０．５μｇ/ｍｌに希釈し、そして１００μｌ／ウェル及び４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレートを被覆するために使用した。過剰の抗原を、線状により除去した。プレートを室温で２時間、２％ＢＳＡによりブロックし、そして次に、３倍に連続希釈されたモノクローナル抗原の個々を、１００μｌ／ウェルで添加し、そして室温で２時間インキュベートした。未結合抗体を、洗浄により除去し、そして適切な濃度の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の抗マウス二次抗体を、１００μｌ／ウェルで添加し、そして室温で１時間インキュベートした。未結合二次抗体を、洗浄により除去し、ＴＭＢ発色性溶液を添加し、色を適切な色深度に発色した。２ＭのＨ２ＳＯ４を、５０μｌ／ウェルで添加し、発色反応を停止し、次に、４５０ｎｍでの吸光度を決定し、そしてデータを分析した。図２に示されるように、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は、ＴＦの細胞外ドメインタンパク質に対する強い親和性を有し、そして約０．０１９ｎＭのＥＣ５０を有した。
【０１５７】
一方、３×１０５個の膵臓癌細胞ＢｘＰＣ−３を、１２ウェルプレートに広げた。１２時間後、細胞を減菌ＰＢＳにより３度、洗浄し、そして次に、無血清培地の添加の後、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃で４時間、飢餓状態にした。各モノクローナル抗体を、３倍勾配希釈にゆだね、そしてインキュベーターにおいてＢｘＰＣ−３と共に、１時間インキュベートし、続いてＢｘＰＣ−３における２５ｎＭのＦＶIIａによりＰＡＲ２細胞内シグナル経路を活性化した。３７℃で１５分間の相互作用の後、細胞を前もって冷却されたＰＢＳにより１度、洗浄し、細胞中のタンパク質を氷上に集め、そして下流のＭＡＰＫ／ＥＲＫのリン酸化レベルに対するＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の効果をウェスターンブロットにより同定し、ここでＦＶIIａ刺激のみを実施し、そしてモノクローナル抗体と共にインキュベートされなかった細胞を陽性対照として使用した。溶媒のみが得られ、そして抗体が添加されなかった場合、それはＶｅｈとして指定された。ＢｘＰＣ−３におけるＴＦ−ＰＡＲ２細胞内シグナル経路に対する前記６個の抗体の効果を、ウェスターンブロットにより決定した。
【０１５８】
図３に示される結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１のみが、特定の程度の容量依存性を伴って、下流のＭＡＰＫ／ＥＲＫのリン酸化レベルを有意に阻害したことを示唆した。
【０１５９】
ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は非常に高い特異性、非常に高い親和性、及びＭＡＰＫ／ＥＲＫのリン酸化レベルに対する有意な阻害効果を示したので、それを配列決定及び続く研究のために選択した。
【０１６０】
Ｋａｂａｔのデータベースに従っての従来の配列決定及び分析により、以下の配列情報を得た：
重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の通りであった：
配列番号１: ＳＹＷＭＮ;
配列番号２: ＭＩＹＰＡＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＫＤ;
配列番号３: ＥＤＹＧＳＳＤＹ。
【０１６１】
完全ＶＨアミノ酸配列は、配列番号７に示される通りであった：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＩＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＹＰＡＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＤＹＧＳＳＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ (配列番号７)。
【０１６２】
軽鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の通りであった：
配列番号４: ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮ;
配列番号５: ＧＩＳＮＬＡＳ;
配列番号６: ＱＱＫＳＳＦＰＷＴ。
【０１６３】
完全ＶＬアミノ酸配列は、配列番号８に示される通りであった：
ＥＩＬＬＴＱＳＰＡＩＩＡＡＳＰＧＥＫＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＬＱＫＰＧＳＳＰＫＩＷＩＹＧＩＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＳＦＴＩＮＳＭＥＴＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＫＳＳＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ(配列番号８)。
【０１６４】
実施例２：ヒト−マウスキメラ抗体の調製
ヒト−マウス抗体を、得られた高い活性の及び特異的ネズミＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１に基いて構成した。
【０１６５】
関連データベースに従っての分析により、重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下であった：
配列番号１８：ＭＩＹＰＸＤＳＥＴＲＬＮＸＫＦＫＤ（Ｘは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｑ及びＹから成る群から選択された任意の１つである）
配列番号１９：ＧＹＳＦＸＳＹＷＭＮ（Ｘは、Ａ、Ｉ、Ｙ、Ｑ及びＷから成る群から選択された任意の１つである）
配列番号２０：ＡＲＥＤＹＧＸＳＤＹ（Ｘは、Ｓ、Ｐ、Ｇ、Ｄ、Ｍ及びＮから成る群から選択された任意の１つである）。
【０１６６】
関連データベースに従っての分析により、軽鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下であった：
配列番号２１：ＱＱＸＳＳＦＸＷＴ（Ｘは、Ｓ、Ｐ、Ｋ、Ｇ、及びＨから成る群から選択された任意の１つである）
配列番号２２：ＳＡＳＳＸＶＳＹＭＮ（Ｘは、Ａ、Ｐ、Ｄ、及びＳから成る群から選択された任意の１つである）
配列番号２３：ＧＸＳＮＬＡＳ（Ｘは、Ｐ、Ｄ、Ｉ、及びＳから成る群から選択された任意の１つである）。
【０１６７】
プライマーを、重鎖可変領域にＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩを導入し、そして軽鎖可変領域にＡｇｅＩ及びＢｓｉＷＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するよう設計し、そして次に、上記で得られた抗体重鎖及び軽鎖の可変領域配列を、重鎖不変領域及びヒトＩｇＧ１のκ鎖不変領域を含むベクター中に別々にクローン化した。同定による確認の後（図４Ａは、重鎖の酵素消化の同定結果を示し、そして図４Ｂは、軽鎖の酵素消化の同定結果を示し、ここでサンプル１は対応する重鎖／軽鎖のブランクベクターであり、サンプル２は、重鎖／軽鎖可変領域がクローン化されているベクターであり、サンプル３及び４は、単一の酵素消化の後のサンプルであり、そしてサンプル５は二重酵素消化の後のサンプルであった）、構成されたキメラ抗体を、トランスフェクション技法及び哺乳類発現系（ＣＨＯ−Ｓ又はＨＥＫ−２９３細胞）を用いることにより、発現し、そして精製し、そして得られたヒト−マウスキメラ抗体を、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈと命名した。
【０１６８】
実施例３：ＴＦ−陽性腫瘍細胞に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の結合親和性の決定
この実験においては、細胞表面上にＴＦを高く発現している、トリプルネガティブ乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、膵臓癌細胞ＢｘＰＣ−３、悪性神経膠腫細胞Ｕ８７ＭＧ及び非小細胞肺癌細胞Ｈ１９７５を、標的細胞として使用し；そして３３３．３３ｎＭ〜０．１５ｎＭまで、３倍連続希釈により希釈された、１００μｌのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１を一次抗体として使用し、それぞれ、１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０無血清培地に懸濁された３×１０５個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１又はＢｘＰＣ−３と共に均質に混合するか；又は６６．６７ｎＭ〜０．０３ｎＭまで、３倍連続希釈により希釈された１００μｌのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１を、一次抗体として使用し、そして１００μｌのＭＥＭ無血清培地に懸濁された３×１０５個のＵ８７ＭＧと共に均質に混合するか；又は一次抗体としての１００μｌの３３．３ｎＭ及び３．３３ｎＭのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１を、１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０無血清培地の懸濁された３×１０５個のＨ１９７５と共に混合し、そして次に４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳにより２度、洗浄し、末結合一次抗体を除去し、そして標的細胞を、２００μｌのＰＥ標識された二次抗体（２μｇ／ｍｌ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳにより２度、洗浄し、末結合二次抗体を除去し、そして最終的に細胞を、４００μｌのＰＢＳに再懸濁した。ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１を、その対応する細胞表面ＴＦに対する結合親和性についてフローサイトメトリーにより決定した。
【０１６９】
図５に示されるＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は、ＢｘＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＵ８７ＭＧ細胞に対する良好な結合親和性を有し、それぞれ、２．６ｎＭ（図５Ａ）、２．５ｎＭ（図５Ｂ）及び１．６ｎＭ（図５Ｃ）のＥＣ５０を有し；そして図５Ｄは、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１がまた、Ｈ１９７５細胞に対する良好な結合親和性を有したことを示した。
【０１７０】
これは、実施例１におけるモノクローナル抗体がヒトＴＦを標的として使用できたことを示唆した。
【０１７１】
実施例４：ＴＦ−ＰＡＲ２細胞内シグナル経路に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の効果
３×１０５個の膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ−３）を、１２ウェルプレートにプレートした。１２時間後、細胞を減菌ＰＢＳにより、洗浄し、次に、無血清培地の添加の後、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で４時間、飢餓状態にした。次に、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１を、３倍の連続希釈により１００ｎＭ〜１．２ｎＭに希釈し、そしてインキュベーターにおいてＢｘＰＣ−３細胞と共にインキュベートし、続いてＢｘＰＣ−３細胞における２５ｎＭのＦＶIIａによりＰＡＲ２細胞内シグナル経路を活性化した。３７℃での１５分間の相互作用の後、細胞を予備冷却されたＰＢＳにより１度、洗浄し、そして細胞タンパク質を氷上に集めた。下流ＭＡＰＫ／ＥＲＫのリン酸化レベルに対するＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の効果を、ウェスターンブロットにより同定し、ここでＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１処理なしでのＦＶIIａ刺激のみが対照として使用された。
【０１７２】
図６に示されるような結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１が下流ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達のリン酸化レベルを強力且つ用量依存的に阻害することを示した。
【０１７３】
実施例５：ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の抗凝固活性の決定
１００ｎＭのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１を、１．５６２５ｎＭ（５０μｌの最終体積）に連続希釈し、そして５ｍＭのＣａＣｌ２を含む、５０μｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁された３×１０４個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢｘＰＣ−３細胞と共に、室温で１５分間インキュベートした。次に、５０μｌのクエン酸ヒト血漿を添加し、そして得られる混合物を急速に均質に混合した。４０５ｎＭでの吸光度を、次の２時間以内に１５秒毎に測定し、細胞表面上のＴＦにより開始された凝固に対する抗凝固効果を計算した。
【０１７４】
図７においては、縦座標は最大凝固速度の達成時間を表し、横座標は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の濃度を表し、そしてＢｘＰＣ−３（図７Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図７Ｂ）の細胞表面上のＴＦを、ＴＦの供給源として使用した。実験結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１が１２．５ｎＭ以下の濃度で有意な抗凝固活性を有することを示した。
【０１７５】
実施例６：ＦＸａ産生を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の活性の決定
１００ｎＭのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１を、１．５６２５ｎＭ（５０μｌの最終体積）に連続希釈し、そして５０μｌのＨＢＳＳ（３ｎＭのＦＶIIaを含む）に懸濁された１．５×１０４個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢｘＰＣ−３細胞と共に、室温で振盪下で、別々にインキュベートした。次に、５０μｌのＦＸ（５０ｎＭの最終濃度で）を添加し、反応を開始し、そして５分後、１ＭのＥＤＴＡ（２５μｌ）を添加し、反応を停止した。その後、３ｍＭのＳ２７６５（２５μｌ）を添加し、そして得られる混合物を急速に均質に混合した。速度論的反応曲線を、次の６０分間、１５秒毎に測定し、ＦＸａ産生を阻害する活性を測定した。
【０１７６】
図８に示されるように、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は、ＦＸａを阻害する良好な活性を示し、そして９．０ｎＭ（図８Ａ）及び６．４ｎＭ（図８Ｂ）のＩＣ５０を有した。
【０１７７】
実施例７：インビボで腫瘍増殖を阻害するその活性に対するＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の評価
ヌードマウスを、２つのグループにランダムに分け、各グループは１０匹であった。最初に腫瘍細胞（１×１０７個のＢｘＰＣ−３、又は５×１０６個のＵ８７ＭＧ、又は２．５×１０６個のＨＣＣ１８０６）を、１００μｇのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１と共に室温で混合した。室温での３０分間インキュベーションの後、生後６週の免疫不全雌マウス（Ｂａｌｌ／ｃヌードマウス）の背中又は乳房脂肪パッドに、得られる混合物を接種し、ＢｘＰＣ−３の皮下腫瘍増殖に対する阻害効果を観察した。正常マウスＩｇＧ（図においてはＩｇＧとして示される）により接種された他のマウスグループを、対照として使用した。ヌードマウスをそれらの体重及び腫瘍サイズについて定期的に測定し、腫瘍増殖曲線をブロットし、そして活性を評価した。
【０１７８】
図９に示されるように、ＩｇＧと比較して、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は、ＢｘＰＣ−３皮下異種移植腫瘍増殖に対して有意な阻害効果を有し、そして最大８０％までの阻害率を有し、そして実験を終了した時、腫瘍増加の阻害率は５５％であった。
【０１７９】
図１０に示されるように、ＩｇＧと比較して、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は、Ｕ８７ＭＧ皮下異種移植腫瘍増殖に対して有意な阻害効果を有し、そして最大６０％までの阻害率を有し、そして実験を終了した時、腫瘍増加の阻害率は３６％であった。
【０１８０】
図１１に示されるように、ＩｇＧと比較して、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は、ＨＣＣ１８０６皮下異種移植腫瘍増殖に対して有意な阻害効果を有し、そして最大９０以％以の阻害率を有し、そして実験を終了した時、腫瘍増加の阻害率は８３％であった。
【０１８１】
実施例８：ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１による腫瘍マトリックスコラーゲンの蓄積の有意な阻害
実施７からのＢｘＰＣ−３腫瘍を収集し、そして４％中性ホルムアルデヒド中で固定し、続いて、パラフィン包埋し、そして断片化し、日常的に水にワックス除去し、そしてＭａｓｓｏｎ染色した。各染色されたサンプルについて、５〜１０のフィールドを、１００倍の倍率（説明文においては１００μｍ）で撮影し、そして統計学的に分析した。
【０１８２】
図１２に示される結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１が腫瘍増殖阻害に寄与し得る腫瘍マトリックスコラーゲンの蓄積（青色領域）を有意に阻害することを示し、ここで右パネルはＩｍａｇｅ−ｐｒｏ  ｐｌｕｓを用いた統計学的分析の結果を示した。
【０１８３】
実施例９：ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１による腫瘍血管の内腔領域の有意な縮小
実施７からのＢｘＰＣ−３腫瘍を収集し、そして４％中性ホルムアルデヒド中で固定し、続いて、パラフィン包埋し、そして断片化し、日常的に水にワックス除去し、そしてＣＤ３１免疫組織学的染色した。各免疫組織学的に染色されたサンプルについて、５〜１０のフィールドを、２００倍の倍率（説明文においては５０μｍ）で撮影し、そして統計学的に分析した。
【０１８４】
図１３に示される結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１が腫瘍血管の内腔領域を有意に縮小したことを示し、ここで右図は、血管の内腔領域の統計学的結果を示した。
【０１８５】
実施例１０：腫瘍細胞の移動を阻害するその活性についてのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の決定
腫瘍細胞移動レベルに対するＴＦ−ｍＡｂの効率を、トランスウェルチャンバーシステムを用いて、インビトロで評価した：１×１０５個のＭＤＡ−ＭＢ―２３１又は８×１０４個のＢｘＰｃ−３細胞を、２００μｌの無血清培地中、特定濃度のＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１（１００ｎＭ、３３．３ｎＭ又は１１．１ｎＭ）又はマウスＩｇＧ（図においてはＩｇＧとして示される）と共に別々に混合し；得られる混合物を、上部チャンバーに添加し、そして１０％ＦＢＳを含む、６００μｌの完全培地を下部チャンバーに添加し；細胞を５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートし；８時間後、チャンバー膜の上面上の細胞を、湿った綿棒により拭き取った。膜の下面上の細胞を、９５％エタノールにより３０分間、固定し、そして次に、０．２％クリスタルバイオレットにより３０分間、染色し、そして蒸留水により洗浄し、過剰のクリスタルバイオレットを除去した。室温での乾燥の後、５つの代表的フィールドを、顕微鏡下でランダムに選択し、そしてチャンバー膜の下面に移動する細胞の数を計数し、そして分析した。この実験においては、ＴＦノックアウト細胞（ｓｈ−ＴＦ）及び対応するベクター対照細胞（ｓｈ−ＮＴ）の両者を用いて、腫瘍細胞の移動を阻害するためのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の活性を確かめた。
【０１８６】
図１４に示されるように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１４Ａ）及びＢｘＰＣ−３（図１４Ｂ）細胞の移動は、ＴＦ遺伝子をノックアウトすることにより有意に阻害された。
【０１８７】
図１５に示されるように、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は、濃度依存性態様で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１５Ａ）及びＢｘＰＣ−３（図１５Ｂ）の移動レベルを有意に阻害できた。
【０１８８】
結果は、腫瘍細胞の移動がＴＦを阻害することにより効果的に阻害され得たことを示した。
【０１８９】
実施例１１：ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１による腫瘍細胞のインビボ血行性転移の有意な阻害
腫瘍細胞の移動レベルに対するＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の効果を、血行性転移の実験モデルを用いて、インビボで評価した：２×１０６個のルシファラーゼ標識されたＭＤＡ−ＭＢ−２１３細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ）を、２００μｌのＰＢＳ中、１００μｇのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１又はマウスＩｇＧと共に混合し、氷上で２０分間インキュベートし、そして次に、生後６週のＢａｌｂ／ｃ雌ヌードマウスの尾静脈中にゆっくり注射し；４時間後、ヌードマウスに麻酔し、そしてＰＢＳ中、Ｄ−ルシフェリンカリウム塩の溶液を、１５０ｍｇ／ｋｇの容量でヌードマウスに腹腔内注射し；６分後、マウスを、小動物インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ  ＳＰＥＣＴＲＵＭ）に１分間暴露し、そして蛍光強度を測定し；そして統計学的分析を、各グループ当たり５匹のヌードマウスを用いて行った。
【０１９０】
図１６に示されるように、ＴＦ遺伝子のノックアウトは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃの血行性移動能力を有意に阻害できた。同様に、図１７に示されるように、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１はまた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞の血行性移動能力を有意に阻害でき、ここで右図は、肺に移動される細胞の蛍光強度の統計学的結果を示した。
【０１９１】
３×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、２００μｌのＰＢＳ中、１００μｇのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１又はＩｇＧと共に混合し、氷上で２０分間インキュベートし、そして次に、生後６週の雌のＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスの尾静脈中にゆっくり注射した。６週間後、マウスを屠殺し、そして肺を撮影し、そしてＢｏｕｉｎ溶液に固定し、そして次に、写真撮影し、そして体重測定した。各グループ当たり７匹のマウスを用いて、各肺上の転移巣の数を記録した。
【０１９２】
図１８に示される結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１がマウス肺上の腫瘍転移巣の形成及び増殖を有意に阻害したことを示唆した。
【０１９３】
実施例１２：リソソームへのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の急速且つ高率的な内在化
５０％の密度のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、レーザー共焦点顕微鏡への使用のために特異的な培養皿にプレートした。約１６時間後、１０μｇ／ｍｌのＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１を添加し、そして細胞を３８℃又は４℃で１時間インキュベートし、そして次に、室温で３０分間、４％パラホルムアルデヒドにより固定した。ＰＢＳにより３度、洗浄した後、細胞を、３７℃で１時間、Ｌａｍｐ−２（ウサギ抗−ヒト）抗体と共にインキュベートし、リソソームの位置を標識し、未結合抗体を、ＰＢＳによる洗浄により除去した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５９４−標識されたロバ抗−マウス二次抗体及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−標識されたロバ抗−ウサギ二次抗体と共に３７℃での３０分間のインキュベーションの後、末結合抗体を、洗浄により除去し、核の位置を、ＤＡＰＩ染色により標識し、そして次に、抗体の内在化をレーザー共焦点顕微鏡下で観察した。
【０１９４】
図１９に示されるように、ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１は、リソソームに内在化され得る。
【０１９５】
実施例１３；ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈの生物活性の決定
この実験法はまた、実施例１の工程４を参照する。
【０１９６】
図２０に示される結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＣｈがＴＦの細胞ドメインタンパク質に対する強い親和性を有し、そして約０．０１１ｎＭのＥＣ５０を有することを示唆した。
【０１９７】
実施例１４：；ＴＦ−陽性腫瘍細胞に対するＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈの結合親和性の決定
この実験方法は、実施例３を参照する。
【０１９８】
この結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−ＣがＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図２１Ａ）及びＨ１８０６（図２１Ｂ）細胞の両者に対する良好な結合親和性を有し、そしてそれぞれ、２．３ｎＭ及び２．１ｎＭのＥＤ５０を有したことを示した。
【０１９９】
実施例１５：ＴＦ−ＰＡＲ２細胞内シグナル経路に対するＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈの効果
この実験方法は、実施例４を参照する。
【０２００】
図２２に示される結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈが濃度依存性態様でＭＡＰＫ／ＥＲＫのＦＶIIａ誘発されたリン酸化レベルを阻害したことを示した。
【０２０１】
実施例１６：リソソームへのＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈの急速且つ効率的内在化
この実験方法は、実施例１２を参照する。
【０２０２】
図２３に示される結果は、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈがリソソームに内在化され得たことを示した。
【０２０３】
上記実験は、本発明のＴＦ−ｍＡｂ抗体は容易に内在化され得るので、それは抗体−薬物接合体（ＡＤＣ）への進行のために、及び高ＴＦ発現関連腫瘍の治療への適用のために適切であった。
【０２０４】
実施例１７：ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１のヒト化及び活性の決定
抗体ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１の重鎖可変領域（配列番号７）及び軽鎖可変領域（配列番号８）の配列を参照することにより、非ＣＤＲ領域と最も良く一致したヒト化鋳型を、Ｇｅｒｍｌｉｎｅデータベースで選択した。次に、ネズミ抗体ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１のＣＤＲ領域を、選択されたヒト化鋳型に移植し、ヒト化鋳型のＣＤＲ領域を置換し、続いてＩｇＧ１／κ不変領域と組換えた。一方、ネズミ抗体の三次元構造に基いて、ＣＤＲ領域と直接的に相互作用された残基、及びＶＬ及びＶＨの立体配座に対する重要な効果を有した残基に対して復帰突然変異を行い、それにより、５つのヒト化重鎖可変領域（配列番号９、１０、１１、１２及び１３）及び４つのヒト化軽鎖可変領域（配列番号１４、１５、１６及び１７）を得た。
【０２０５】
【表２】
2019526256.tif 000004
【０２０６】
操作されたＶＨ及びＶＬに基いて、それらのヒト化重鎖及び軽鎖を別々に組合して発現し、最終的に合計２０のヒト化抗体、すなわちＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ２９〜ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４８を得た。各抗体についての重鎖及び軽鎖の対応する組合せは、以下の表に示された：
【０２０７】
【表３】
2019526256.tif 000005
【０２０８】
最初に、２０のヒト化抗体を、ＥＬＩＳＡ結合アッセイによりＴＦの細胞外ドメインタンパク質に対するそれらの親和性について決定した（実験方法は、実施例１の工程４を参照する）。結果は、表１に示される。ＴＦの細胞外ドメインタンパク質に対するＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９及びＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４の結合親和性曲線が、それぞれ、図２４Ａ及び図２４Ｂに示された。
【０２０９】
【表４】
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【０２１０】
それらの２０のヒト化抗体を、フローサイトメトリーにより、１０μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌでＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するそれらの結合親和性について決定した。実験方法は、実施例３を参照し、そして結果は表２に示された。
【０２１１】
【表５】
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【０２１２】
ＴＦ−ＰＡＲ２細胞内シグナル経路に対する９つのヒト化抗体の効果をまた決定した。実験方法は、実施例４を参照する。
【０２１３】
図２５に示される実験結果は、各ヒト化抗体がＭＡＰＫ／ＥＲＫのＦＶIIａ誘発されたリン酸化レベルを、濃度依存性態様で異なる程度、阻害したことを示した。
【０２１４】
さらに、６つのヒト化抗体を、腫瘍細胞ＨＣＣ１８０６と共にインキュベートした後、６つのヒト化抗体の個々（各抗体につき１００μｇ）により、ヌードマウスの乳房脂肪パッドに現場接種することによる腫瘍に対するそれらの阻害効果について決定した。実験方法は、実施例１７を参照する。
【０２１５】
図２６に示される実験結果は、すべてのヒト抗体が腫瘍増殖を阻害する有意な活性を示し、そしてそれらの中で、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３５、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４０、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４及びＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４５が腫瘍増殖を阻害する卓越した活性を示したことを示唆した。
【０２１６】
さらに、ヒト化抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９及びキメラ抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈをまた、腫瘍細胞ＨＣＣ１８０６と共にインキュベートした後、異なる容量（１００μｇ、３０μｇ及び１０μｇ）で、ヒト化抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９及びキメラ抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈによるヌードマウスの乳房脂肪パッドの別の接種によるＨＣＣ１８０６異種移植片の増殖を阻害するそれらの効果についても決定した。実験方法は、実施例７を参照する。実験結果は、図２７に示された。その結果は、ヒト化抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９が、キメラ抗体ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈの活性に匹敵する腫瘍増殖阻害活性を有した。
【０２１７】
実施例１８：基底様及びトリプルネガティブ乳癌におけるＴＦの非常に異常な活性化
最初に、全細胞タンパク質を、異なる組織に由来する種々の腫瘍細胞について調製した。正確な定量化の後、ＴＦタンパク質の発現レベルを、ウェスターンブロットにより決定した。
【０２１８】
結果は、ＴＦタンパク質の非常に異常な活性化及び発現が、いくつかの高侵襲性及び高転移性の基底様又は基底Ａ／Ｂ及びトリプルネガティブ乳癌（図２８に示されるような）細胞系に有することを示し；しかしながら、ＴＦタンパク質の高発現は、悪性度の低いいくつかの管腔内乳癌の細胞系においてのみ生じた。
【０２１９】
次に、データベースＥ−ＴＡＢＭ−１５７ (European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute, EMBL-EBI)中の乳癌細胞系におけるＴＦ  ｍＲＮＡの発現レベルを分析した。その結果は、高侵襲性及び高転移性基底Ａ／Ｂ及びトリプルネガティブ乳癌（特に、トリプルネガティブ乳癌）細胞系におけるＴＦ  ｍＲＮＡの発現レベルが内腔サブタイプ乳癌細胞系におけるそれよりも一般的に高いことを示し、これは統計学的に有意なものであった（図２９）。従って、本発明のＴＦを標的とする抗体は、トリプルネガティブ乳癌の診断、予防及び治療においてより顕著な効果を有した。
【０２２０】
実施例１９：膵臓癌におけるＴＦの非常に異常な活性化
最初に、全細胞タンパク質を、異なる組織に由来する種々の腫瘍細胞系について調製した。正確な定量化の後、ＴＦタンパク質の発現レベルを、ウェスターンブロットにより決定した。結果は、ＴＦタンパク質の非常に異常な活性化及び発現が高侵襲性及び高転移性膵臓癌（図３０に示されるような）細胞系に存在することを示した。
【０２２１】
次に、データベースＧＳＥ１５４７１ (Gene Expression Omnibus, GEO)中の膵臓腫瘍及び正常組織におけるＴＦ  ｍＲＮＡの発現レベルを分析した。結果は、ＴＦ  ｍＲＮＡが一般的に、膵臓腫瘍組織において高レベルで発現されたことを示した（図３１）。従って、本発明のＴＦ標的抗体は、膵臓癌の診断、予防及び治療においてより顕著な効果を有した。
【０２２２】
本発明において言及される全ての文書は、あたかも各個々の文書が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に参照により本出願に組み込まれる。 さらに、本発明で教示された内容を読んだ後、当業者によって本発明に対して様々な修正及び変更がなされてもよく、これらの同等物もまた特許請求の範囲によって定義される範囲に含まれることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２５−１】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月23日(2019.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ヒト組織因子モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、当該抗体が：
配列番号１に記載の配列を有するＨＣＤＲ１、
配列番号２に記載の配列を有するＨＣＤＲ２、及び
配列番号３に記載の配列を有するＨＣＤＲ３；
を含む重鎖可変領域、及び以下：
配列番号４に記載の配列を有するＬＣＤＲ１
配列番号５に記載の配列を有するＬＣＤＲ２及び
配列番号６に記載の配列を有するＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域、を有する、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号７、９、１０、１１、１２又は１３から成る群から選択され；そして／又は
前記抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号８、１４、１５、１６又は１７から成る群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ＴＦ−ｍＡｂ−ＳＣ１、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｃｈ、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ２９、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３０、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３１、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３２、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３３、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３４、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３５、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３６、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３７、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３８、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ３９、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４０、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４１、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４２、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４３、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４４、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４５、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４６、ＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４７、及びＴＦ−ｍＡｂ−Ｈ４８からなる群から選択される、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
ヒトＴＦタンパク質に対する親和性のＥＣ５０が０．０１〜０．０３ｎＭである、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
ＴＦ−関連疾患の予防及び／又は治療のための医薬の製造のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項７】
前記ＴＦ−関連疾患が、下記：
腫瘍の発生、増殖及び／又は転移；
血栓症関連疾患；
炎症；及び
代謝関連疾患
から成る群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記腫瘍が、高ＴＦ−発現を有する腫瘍である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ヒト組織因子モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする核酸、及び当該モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸、を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体を発現する、免疫細胞。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体、及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
インビトロでサンプル中のＴＦタンパク質を決定するための方法であって、以下：
（１）インビトロで請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体と、サンプルとを接触する工程；及び
（２）抗原−抗体複合体が形成されるかどうかを決定する工程；
を含み、ここで前記複合体の形成がサンプル中のＴＦタンパク質の存在を示す、方法。
【請求項１５】
抗体の調製方法であって、
（ａ）発現のために適切な条件下で請求項１１に記載の宿主細胞を培養する工程；及び
（ｂ）培養物から抗体を分離する工程；
を含む方法。
【国際調査報告】
2019526256.tif 000051
2019526256.tif 000052
2019526256.tif 000053
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