(57)【要約】  HLA-Cw*0802分子との関連で提示された、変異キルステンラット肉腫ウィルスがん遺伝子ホモログ (KRAS)に対する抗原特異性を有する、単離又は精製されたT細胞受容体 (TCR)が開示される。関連するポリペプチド及びタンパク質、並びに関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団及び医薬組成物がまた提供される。また、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法、及び哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離又は精製されたＴＣＲであって、以下：
(a) 配列番号９〜１４；
(b) 配列番号１７〜２２；
(c) 配列番号２５〜３０；又は
(d) 配列番号３３〜３８
のアミノ酸配列を含む、ＴＣＲ。
【請求項２】
以下：
(i) 配列番号１５〜１６；
(ii) 配列番号２３〜２４；
(iii) 配列番号３１〜３２；又は
(iv) 配列番号３９〜４０
のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離又は精製されたＴＣＲ。
【請求項３】
以下：
（Ａ）配列番号４６のアミノ酸配列であって：
（ｉ）配列番号４６の４８位のＸがＴｈｒ又はＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号４６の１１２位のＸがＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号４６の１１４位のＸがＭｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ又はＴｒｐであり；及び
（ｉｖ）配列番号４６の１１５位のＸがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＴｒｐである配列；
並びに
（Ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列であって、配列番号４７の５７位のＸがＳｅｒ又はＣｙｓである配列
を更に含む、請求項１又は２に記載の単離又は精製されたＴＣＲ。
【請求項４】
以下：
(1) 配列番号５０〜５１；
(2) 配列番号５２〜５３；
(3) 配列番号５４〜５５；又は
(4) 配列番号５６〜５７
のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離又は精製されたＴＣＲ。
【請求項５】
単離又は精製されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号９〜１４；
（ｂ）配列番号１７〜２２；
（ｃ）配列番号２５〜３０；又は
（ｄ）配列番号３３〜３８
のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６】
以下：
（ｉ）配列番号１５〜１６；
（ｉｉ）配列番号２３〜２４；
（ｉｉｉ）配列番号３１〜３２；又は 
（ｉｖ）配列番号３９〜４０
のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項７】
以下：
（Ａ）配列番号46のアミノ酸配列であって：
（ｉ）配列番号４６の４８位のＸがＴｈｒ又はＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号４６の１１２位のＸがＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号４６の１１４位のＸがＭｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ又はＴｒｐであり；及び
（ｉｖ）配列番号４６の１１５位のＸがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＴｒｐである配列；
並びに
（Ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列であって、配列番号４７の５７位のＸがＳｅｒ又はＣｙｓである配列
を更に含む、請求項５又は６に記載の単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項８】
以下：
（１）配列番号５０〜５１；
（２）配列番号５２〜５３；
（３）配列番号５４〜５５；又は
（４）配列番号５６〜５７
のアミノ酸配列を含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項９】
単離又は精製されたタンパク質であって、以下：
（ａ）配列番号９〜１１のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号１２〜１４のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；
（ｂ）配列番号１７〜１９のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号２０〜２２のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；
（ｃ）配列番号２５〜２７のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号２８〜３０のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；又は
（ｄ）配列番号３３〜３５のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号３６〜３８のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖
を含む、タンパク質。
【請求項１０】
以下：
（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；
（ｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；又は
（ｉｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖
を含む、請求項９に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１１】
以下：
（Ａ）第一のポリペプチド鎖が配列番号４６のアミノ酸配列を更に含み：
（ｉ）配列番号４６の４８位のＸがＴｈｒ又はＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号４６の１１２位のＸがＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号４６の１１４位のＸがＭｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ又はＴｒｐであり；及び
（ｉｖ）配列番号４６の１１５位のＸがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＴｒｐであり；
並びに
（Ｂ）第二のポリペプチド鎖が、配列番号４７のアミノ酸配列を更に含み、配列番号４７の５７位のＸがＳｅｒ又はＣｙｓである、
請求項９又は１０に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１２】
以下：
（１）第一のポリペプチド鎖が配列番号５０のアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチド鎖が配列番号５１のアミノ酸配列を含む；
（２）第一のポリペプチド鎖が配列番号５２のアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチド鎖が配列番号５３のアミノ酸配列を含む；
（３）第一のポリペプチド鎖が配列番号５４のアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチド鎖が配列番号５５のアミノ酸配列を含む；又は
（４）第一のポリペプチド鎖が配列番号５６のアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチド鎖が配列番号５７のアミノ酸配列を含む、
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項５〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項９〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換え発現ベクターを含む、単離又は精製された宿主細胞。
【請求項１６】
少なくとも１つの請求項１５に記載の単離又は精製された宿主細胞を含む、細胞集団。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項５〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載の組換え発現ベクター、請求項１５に記載の宿主細胞、又は請求項１６に記載の宿主細胞集団、及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法であって、前記方法が以下：
（ａ）がんの細胞を含む試料と、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項５〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載の組換え発現ベクター、請求項１５に記載の宿主細胞、請求項１６に記載の宿主細胞集団又は請求項１７に記載の医薬組成物とを接触させ、それにより複合体を形成すること；及び
（ｂ）前記複合体を検出すること
を含み、前記複合体の検出が哺乳動物におけるがんの存在を示す、方法。
【請求項１９】
前記がんが、膵臓、結腸直腸、肺、子宮内膜、卵巣又は前立腺のがんである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物におけるがんの治療又は予防において使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項５〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載の組換え発現ベクター、請求項１５に記載の宿主細胞、請求項１６に記載の宿主細胞集団、又は請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記がんが、膵臓、結腸直腸、肺、子宮内膜、卵巣又は前立腺のがんである、請求項２０に記載の使用のための、ＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞集団、又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、2016年8月2日に出願された米国仮特許出願番号第62/369,883号（参照によりその全体がそれぞれ本明細書に取り込まれる）についての利益を主張する。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による取り込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り識別される、コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、参照により、その全体が本明細書に取り込まれる：2017年7月26日付けの「728242_ST25.txt」という名前の60,828バイトのASCII（テキスト）ファイル1件。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
幾つかのがんは、特にがんが転移性で切除不能となる場合、治療のオプションが極めて限定され得る。例えば、例、手術、化学療法及び放射線治療等の治療における進歩にも関わらず、例えば、例、膵臓、結腸直腸、肺、子宮内膜、卵巣及び前立腺がん等の多くのがんについての予後は悪い場合がある。従って、がんに対する追加的な治療の満たされていないニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要約
本発明の実施形態によって、以下：(a) 配列番号9〜14；(b) 配列番号17〜22；(c) 配列番号25〜30；又は(d) 配列番号33〜38のアミノ酸配列を含む、単離又は精製されたTCRが提供される。
【０００５】
本発明の別の実施形態によって、以下：(a) 配列番号9〜14；(b) 配列番号17〜22；(c) 配列番号25〜30；又は(d) 配列番号33〜38のアミノ酸配列を含む、単離又は精製されたポリペプチドが提供される。
【０００６】
本発明の別の実施形態によって、以下：(a) 配列番号9〜11のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号12〜14のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；(b) 配列番号17〜19のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号20〜22のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；(c) 配列番号25〜27のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号28〜30のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；又は(d) 配列番号33〜35のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号36〜38のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖を含む、単離又は精製されたタンパク質が提供される。
【０００７】
本発明は、関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、並びに本発明のTCR、ポリペプチド及びタンパク質に関連する医薬組成物を更に提供する。
【０００８】
本発明によって、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法、及び哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法が更に提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図面（複数可）の幾つかの視点における簡単な説明
【図１】図1Aは、無関係なタンデムミニ遺伝子 (TMG) RNA (黒丸)、又は全エクソーム及びトランスクリプトームシーケンシングにより特定された61変異をコードする、表示されたTMGコンストラクト（TMG-1 (星)、TMG-2 (△)、TMG-3 (▽)、TMG-4 (白色菱形)、TMG-5 (黒色菱形)）を用いてトランスフェクトした自己樹状細胞と共に共培養した後の、24個の個別のTIL培養物のELISPOTアッセイによって決定した、IFN-γ産生 (スポット／2e4細胞)を示すグラフである。図1Bは、無関係なTMG RNA若しくはTMG-1を用いてトランスフェクトした樹状細胞(DC)と共に共培養したか、又はTMG-1によってコードされる長い変異ペプチドを用いて終夜インキュベートした後の、TIL培養物6番のELISPOTアッセイによって決定したIFN-γ産生 (スポット／2e4細胞) (左軸；影なしバー)、及びCD8+ T細胞 (%)上での4-1BB発現のフローサイトメトリー分析 (右軸；影付きバー)を示すグラフである。図1Cは、表示されたTMG RNAを用いてトランスフェクトしたDCと共に共培養したか、又は24-AA長のKRAS-野生型 (WT)若しくはKRASG12Dペプチドを用いて終夜インキュベートした後の、注入産物 (臨床スケールでの急速な増幅を経た後のTIL培養物6番)のELISPOTアッセイによって決定したIFN-γ産生 (左軸；影なしバー)、及びCD8+ T細胞 (%)上での4-1BBの発現のフローサイトメトリー分析 (右軸；影付きバー)を示すグラフである。
【図２】図2A〜2Dは、注入産物(Rx1、黒バー)中の4個の特定されたKRASG12D反応性T細胞クローン、細胞移入の前の3つの転移性肺試料 (Tu-1、菱形；Tu-2A、四角形；及びTu-2B、三角形)、細胞移入後の1つの進行性病変(Tu-Pro、逆三角形)、並びに細胞注入の前及び後の様々な時点での患者の末梢血 (丸)の各々の頻度を定量する、TCR-Vβディープシーケンシング分析の結果を示すグラフである。カッコ内の数字は、所定の試料中のTCR配列のランクを示す。
【００１０】
【化１】
2019527555.tif 000002
【００１１】
及びNDは、検出されず (< 0.0002%)。A (TRAV4/TRBV5-6(A))。B (TRAV12-2/TRBV10-2)。C (TRAV4/TRBV5-6(B))。D (TRAV4/TRBV5-6 (C))。
【図３】図3A〜3Dは、滴定量のKRAS 野生型 (WT) 9-mer (白丸)、G12D変異KRAS 9-mer (黒丸)、KRAS WT 10-mer (白三角形)又はKRAS G12D 変異KRAS 10-mer (黒三角形)のペプチド（KRAS G12D mutant KRAS 10-mer peptide (closed triangle)）を用いてインキュベートした自己PBMCと共に終夜、共培養した後、配列番号50及び51 (TRAV4/TRBV5-6 (A)) (図3A)、配列番号56及び57 (TRAV12-2/TRBV10-2) (図3B)、配列番号54及び55 (TRAV4/TRBV5-6 (B)) (図3C)又は配列番号52及び53 (TRAV4/TRBV5-6 (C)) (図3D)のアミノ酸配列を含むTCRを用いて改変したT細胞上のT細胞活性化マーカーの4-1BBの発現を示すグラフである。
【図４】図4A及び4Bは、HLA-C*08:02アレルを発現していないか（モック）又は発現している、2つのKRASG12D陽性膵臓がん細胞株と共に、終夜、共培養した後の、表示されたTCRを用いて遺伝的に改変した、T細胞のIFN-γ産生 (スポット／2e4細胞) (A)及び4-1BB発現 (B)を示すグラフである。TRBV5-6(A) TCR (影なしバー)；TRBV10-02 TCR (影付きバー)；TRBV5-6(B) TCR (水平ストライプ)；TRBV5-6(C) TCR (斜めストライプ)。MD、MDA-Panc48；HP、HPAC。フローサイトメトリーデータは、CD8+ KRASG12D特異的なTCR+細胞でゲートする。「>」、500スポット超（正確ではない）。
【図５】図5A〜5Dは、完全長の野生型 (wt) KRAS (影なしバー)又はKRAS-G12D遺伝子 (影付きバー)及び表示されたHLAアレルを用いて形質導入した、標的COS細胞を用いて、終夜、共培養した後、表示されたTCRを用いて遺伝的に改変したT細胞の4-1BB発現 (%)を示すグラフである。TRBV5-6(A) TCR (図5A)；TRBV10-02 TCR (図5B)；TRBV5-6(B) TCR (図5C)；TRBV5-6(C) TCR (図5D)。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
GTPアーゼKRas、V-Ki-Ras2キルステンラット肉腫ウィルスがん遺伝子又はKRAS2としても参照される、キルステンラット肉腫ウィルスがん遺伝子ホモログ (KRAS)は、低分子量（small）GTPアーゼ・スーパーファミリーのメンバーである。KRASには2つの転写産物変異体：KRAS変異体A及びKRAS変異体Bがある。以降、他で特定されない限り、「KRAS」（変異又は未変異）への言及は、変異体A及び変異体Bの両方を指す。特定の理論又は機構に拘束されることはないが、変異した場合、KRASは多くのヒトがんの発がんの早期においてシグナル伝達に関与する場合があると考えられる。単一のアミノ酸置換が、タンパク質を活性化し得る。活性化した場合、変異KRASはグアノシン-5'-三リン酸(GTP)に結合し、GTPをグアノシン5'-二リン酸 (GDP)に変換する。変異KRASタンパク質産物は、構成的に活性化され得る。変異KRASタンパク質は、多様なヒトがん、例えば、例、膵臓 (例、膵臓がん)、結腸直腸、肺 (例、肺腺がん)、子宮内膜、卵巣(例、上皮卵巣がん)及び前立腺がん等のいずれかにおいて発現され得る。
【００１３】
本発明の一実施形態は、ヒトの変異KRAS (以降、「変異KRAS」)に対して抗原特異性を有する、単離又は精製されたTCRを提供する。以降、他で特定されない限り、「TCR」への言及は、TCRの機能的部分及び機能的変異体も指す。本発明のTCRは、G12D変異を有する任意のKRAS (タンパク質、ポリペプチド又はペプチド)に対する抗原特異性を有し得る。
【００１４】
本発明の一実施形態においては、TCRは、配列番号3又は4のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるKRASタンパク質である、G12D変異を有するKRASタンパク質に対する抗原特異性を有する。配列番号3の変異KRAS変異体Aタンパク質のアミノ酸配列は、一般的に、配列番号3においては12位のグリシンがアスパラギン酸で置換されていることを除き、変異していない、配列番号1の野生型 (WT)KRASタンパク質変異体Aのアミノ酸配列の1〜189位に対応する。配列番号4の変異KRAS変異体Bタンパク質のアミノ酸配列は、一般的に、配列番号4においては12位のグリシンがアスパラギン酸で置換されていることを除き、変異していない、配列番号2のWT KRASタンパク質変異体Bのアミノ酸配列の1〜188位に対応する。
【００１５】
本発明の一実施形態においては、TCRは上記のG12D変異を有するKRASペプチドに対する抗原特異性を有し、該KRASペプチドは任意の長さを有する。例えば、TCRはG12D変異を有するKRASペプチドに対する抗原特異性を有し得、該KRASペプチドは、約8〜約24アミノ酸残基、好ましくは約9〜約11アミノ酸残基の長さを有する。本発明の一実施形態においては、TCRはG12D変異を有するKRASペプチドに対する抗原特異性を有し得、該KRASペプチドは、約8アミノ酸残基、約9アミノ酸残基、約10アミノ酸残基、約11アミノ酸残基、約12アミノ酸残基又は約24アミノ酸残基の長さを有する。例えば、TCRは、GADGVGKSA (配列番号8)のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドである、G12D変異を有するKRAS10-18ペプチドに対する抗原特異性を有し得る。G12D変異を有する、配列番号8の変異KRASペプチドのアミノ酸配列は、一般的に、配列番号8において、3位のグリシンがアスパラギン酸で置換されていることを除き、変異していない、配列番号7のWT KRAS10-18ペプチドのアミノ酸配列の1〜9位に対応する。
【００１６】
本発明の更に別の実施形態においては、TCRはG12D変異を有するKRASペプチドに対する抗原特異性を有し得、該変異KRASペプチドは、GADGVGKSA (変異KRAS10-18；配列番号8)；又はGADGVGKSAL (変異KRAS10-19；配列番号6)のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。例示的な実施形態においては、TCRは変異KRASエピトープに対する抗原特異性を有し、該変異KRASエピトープは、GADGVGKSA (変異KRAS10-18；配列番号8)又はGADGVGKSAL (変異KRAS10-19；配列番号6)のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００１７】
本発明の一実施形態においては、本発明のTCRは、HLA-Cw8分子の関連で変異KRASを認識することができる。これに関して、TCRが、HLA-Cw8分子との関連で変異KRASに結合する際に、免疫応答を誘発し得ることを意味する。本発明のTCRは、HLA-Cw8分子によって提示される変異KRASを認識することができ、変異KRASに加えてHLA-Cw8分子に結合し得る。関連して、本発明のTCRが変異KRASを認識する例示的なHLA-Cw8分子としては、HLA-Cw*0801、HLA-Cw*0802、HLA-Cw*0803、HLA-Cw*0804、HLA-Cw*0805、HLA-Cw*0806、HLA-Cw*0807、HLA-Cw*0808及びHLA-Cw*0809アレルによってコードされるものが挙げられる。好ましい実施形態においては、TCRは、HLA-Cw*0802分子との関連で変異KRASを認識する。
【００１８】
本発明の一実施形態においては、HLA-Cw8分子の関連内で、変異KRASを認識する能力を有することに加えて、本発明のTCRの1つ (TRAV12-2/TRBV10-2 (表5))はまた、HLA-Cw5分子の関連内で変異KRASを認識することができる。これに関して、TCRは、HLA-Cw5分子の関連内で変異KRASに結合する際、免疫応答を誘発し得る。本発明のTCRは、HLA-Cw5分子によって提示されている変異KRASを認識することができ、変異KRASに加えて、HLA-Cw5分子に結合し得る。本発明のTCRが変異KRASを認識する関連内では、例示的なHLA-Cw5分子としては、HLA-Cw*0501、HLA-Cw*0502、HLA-Cw*0503、HLA-Cw*0504、HLA-Cw*0505、HLA-Cw*0506、HLA- HLA-Cw*0508、HLA-Cw*0509及びHLA-Cw*0510アレルによってコードされる分子が挙げられる。好ましい実施形態においては、TCRは、HLA-Cw*0501分子の関連内で、変異KRASを認識する。HLA-Cw*0802及びHLA-Cw*0501のアミノ酸配列は、2つのアミノ酸残基のみで互いに異なっている。特定の理論又は機構に拘束されることはないが、TRAV12-2/TRBV10-2 TCRはまた、HLA-Cw*0802及びHLA-Cw*0501の一方又は両方に類似している、他のHLA分子によって提示される変異KRASを認識し得ると考えられる。
【００１９】
本発明のTCRは、養子細胞移入のために用いられる細胞によって発現される場合を含め、多くの利点を提供する。変異KRASはがん細胞によって発現され、健常な非がん細胞によっては発現されない。特定の理論又は機構に拘束されることはないが、本発明のTCRは、健常な非がん細胞の破壊を最小化又は排除し、それにより例えば毒性を最小化又は排除することによって毒性を低減する一方、有利にがん細胞の破壊を目的とすると考えられる。更に、本発明のTCRは、例えば、例、化学療法、手術又は放射線療法等の他の型の治療に応答しない変異KRAS陽性がんを、有利に成功裏に治療又は予防し得る。追加的に、本発明のTCRは、変異KRASの高度に貪欲な認識を提供し、これは、操作されていない腫瘍細胞 (例、インターフェロン（IFN）γで処理されていない、変異KRAS及びHLA-Cw*0802の一方若しくは両方をコードするベクターでトランスフェクトされていない、G12D変異を有するKRASペプチドでパルスされていない、又はそれらの組み合わせの腫瘍細胞)を認識する能力を提供し得る。更に、HLA-Cw*0802アレルは、アメリカ系コーカシアンとアフリカ系アメリカ人の人種のそれぞれ最大約8％及び最大約11％で発現している。従って、本発明のTCRは、他のMHC分子との関連で抗原を認識するTCRを用いた免疫療法に適していない場合があるHLA-Cw*0802アレルを発現する患者を含む、免疫療法に適格ながん患者数を増加し得る。
【００２０】
本明細書において用いられる場合、「抗原特異性」という表現は、TCRが高いアビディティーを有する変異KRASに特異的に結合し得、免疫学的に認識し得ることを意味する。例えば、(a)低濃度の変異KRASペプチド (例、約0.05 ng/mL〜約10 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、8 ng/mL、10 ng/mL、又は前記値の任意の2つによって定義される範囲)でパルスした抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、又は(b)標的細胞が変異KRASを発現するよう、変異KRASをコードするヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、との共培養の際、TCRを発現する約1×104〜約1×105のT細胞が、少なくとも約200 pg/mL以上(例、200 pg/mL以上、300 pg/mL以上、400 pg/mL以上、500 pg/mL以上、600 pg/mL以上、700 pg/mL以上、1000 pg/mL以上、5,000 pg/mL以上、7,000 pg/mL以上、10,000 pg/mL以上、20,000 pg/mL以上、又は前記値の任意の2つによって定義される範囲)のIFN-γを分泌する場合、TCRは変異KRASに対して「抗原特異性」を有すると考えられ得る。本発明のTCRを発現する細胞はまた、より高濃度の変異KRASペプチドでパルスした抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞との共培養の際、IFN-γを分泌し得る。
【００２１】
代替的に又は追加的に、(a)低濃度の変異KRASペプチドでパルスした抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、又は(b)標的細胞が、変異KRASを発現するよう、変異KRASをコードするヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、との共培養の際、TCRを発現するT細胞が、陰性対照によって発現されるIFN-γの量と比べて少なくとも2倍のIFN-γを分泌する場合、TCRは変異KRASに対して「抗原特異性」を有すると考えられ得る。陰性対照は、例えば、(i)(a)同じ濃度の無関係のペプチド (例、変異KRASペプチドとは異なる配列を有する幾つかの他のペプチド)でパルスした抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、若しくは(b)標的細胞が無関係のペプチドを発現するよう、無関係のペプチドをコードするヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、と共培養した、TCRを発現するT細胞、又は(ii)(a)同じ濃度の変異KRASペプチドでパルスした抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、若しくは(b)標的細胞が変異KRASを発現するよう、変異KRASをコードするヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、と共培養した、形質導入されていないT細胞 (例、TCRを発現しないPBMC由来)であり得る。IFN-γ分泌は、例えば、例、酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA)等の当該技術分野において公知の方法によって測定され得る。
【００２２】
代替的に又は追加的に、(a)低濃度の変異KRASペプチドでパルスした抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、又は(b)標的細胞が変異KRASを発現するよう、変異KRASをコードするヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、との共培養の際、IFN-γを分泌するTCRを発現するT細胞数が、IFN-γを分泌する陰性対照T細胞の数と比べて、少なくとも2倍である場合、TCRは変異KRASに対して「抗原特異性」を有すると考えられ得る。ペプチドの濃度及び陰性対照は、本発明の他の態様に関して明細書に記載されたものであり得る。IFN-γを分泌する細胞数は、例えば、例、ELISPOT等の当該技術分野において公知の方法によって測定され得る。
【００２３】
代替的に又は追加的に、TCRを発現するT細胞が、例えば、変異KRASを発現する標的細胞で刺激後にフローサイトメトリーによって測定された、1以上のT細胞活性化マーカーの発現を上方制御する場合、TCRは変異KRASに対して「抗原特異性」を有すると考えられ得る。T細胞活性化マーカーの例としては、4-1BB、OX40、CD107a、CD69、及び抗原刺激によって上方制御されるサイトカイン（例、腫瘍壊死因子 (TNF)、インターロイキン (IL)-2等）が挙げられる。
【００２４】
本発明は、例えば、TCRのアルファ(α)鎖、TCRのベータ(β)鎖、TCRのガンマ(γ)鎖、TCRのデルタ(δ)鎖又はそれらの組合せ等の、2のポリペプチド (即ち、ポリペプチド鎖)を含むTCRを提供する。本発明のTCRのポリペプチドは、TCRが変異KRASに対する抗原特異性を有するという条件で、任意のアミノ酸配列を含み得る。
【００２５】
本発明の一実施形態においては、TCRは、各々がTCRの相補性決定領域(CDR)1、CDR2及びCDR3を含む可変領域を含む、2のポリペプチド鎖を含む。本発明の一実施形態においては、TCRは、配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR1 (α鎖のCDR1)、配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR2 (α鎖のCDR2)、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR3 (α鎖のCDR3)を含む第一のポリペプチド鎖、並びに配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR1 (β鎖のCDR1)、配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR2 (β鎖のCDR2)、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR3 (β鎖のCDR3)を含む第二のポリペプチド鎖を含む。
【００２６】
本発明の別の実施形態においては、TCRは、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR1 (α鎖のCDR1)、配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR2 (α鎖のCDR2)、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3 (α鎖のCDR3)を含む第一のポリペプチド鎖、並びに配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR1 (β鎖のCDR1)、配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR2 (β鎖のCDR2)、及び配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR3 (β鎖のCDR3)を含む第二のポリペプチド鎖、を含む。
【００２７】
本発明の別の実施形態においては、TCRは、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR1 (α鎖のCDR1)、配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR2 (α鎖のCDR2)、及び配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR3 (α鎖のCDR3)を含む第一のポリペプチド鎖、並びに配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR1 (β鎖のCDR1)、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR2 (β鎖のCDR2)、及び配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR3 (β鎖のCDR3)を含む第二のポリペプチド鎖、を含む。
【００２８】
本発明の別の実施形態においては、TCRは、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR1 (α鎖のCDR1)、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR2 (α鎖のCDR2)、及び配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR3 (α鎖のCDR3)を含む第一のポリペプチド鎖、並びに配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR1 (β鎖のCDR1)、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR2 (β鎖のCDR2)、及び配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR3 (β鎖のCDR3)を含む第二のポリペプチド鎖、を含む。
【００２９】
これに関して、本発明のTCRは、配列番号9〜14、17〜22、25〜30及び33〜38からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか1以上を含み得る。本発明の一実施形態においては、TCRは、以下：(i) 配列番号9〜11；(ii)；配列番号12〜14；(iii) 配列番号17〜19；(iv) 配列番号20〜22；(v) 配列番号25〜27；(vi) 配列番号28〜30；(vii) 配列番号33〜35；又は(viii) 配列番号36〜38のアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態においては、TCRは、以下：(a) 配列番号9〜14の全て；(b) 配列番号17〜22の全て；(c) 配列番号25〜30の全て；又は(d) 配列番号33〜38の全てのアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本発明の一実施形態においては、TCRは、上記のCDRを含むTCRの可変領域のアミノ酸配列を含む。これに関して、TCRは、以下：配列番号15 (α鎖の可変領域)；配列番号23 (α鎖の可変領域)；配列番号31 (α鎖の可変領域)；配列番号39 (α鎖の可変領域)；配列番号16 (β鎖の可変領域)；配列番号24 (β鎖の可変領域)；配列番号32 (β鎖の可変領域)；配列番号40 (β鎖の可変領域)；配列番号15及び16の両方；配列番号23及び24の両方；配列番号31及び32の両方；又は配列番号39及び40の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のTCRは、(i) 配列番号15〜16の両方；(ii) 配列番号23〜24の両方；(iii) 配列番号31〜32の両方；又は(iv) 配列番号39〜40の両方のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本発明のTCRは、α鎖定常領域及びβ鎖定常領域を更に含み得る。定常領域は、例えば、例、ヒト又はマウス等の任意の好適な種に由来し得る。本発明の一実施形態においては、TCRは、マウスのα鎖及びβ鎖定常領域、又はヒトのα鎖及びβ鎖定常領域を更に含む。本明細書において用いられる場合、用語「マウスの」又は「ヒトの」は、本明細書に記載されたTCR又はTCRの任意の構成要素(例、相補性決定領域 (CDR)、可変領域、定常領域、α鎖及び／又はβ鎖)を参照する場合、マウス又はヒトのそれぞれに由来するTCR (又はその構成要素)、即ち、マウスT細胞又はヒトT細胞のそれぞれに起源するか又はかつて発現したTCR (又はその構成要素)を意味する。
【００３２】
本発明の一実施形態においては、TCRは、ヒトα鎖及びβ鎖定常領域を更に含む。これに関して、TCRは、1位のXが天然で生じた任意のアミノ酸残基である、配列番号41 (ヒトα鎖の定常領域)、配列番号42 (ヒトβ鎖の定常領域)、配列番号43 (ヒトβ鎖の定常領域)、配列番号41及び42の両方、又は配列番号41及び43の両方のアミノ酸配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、TCRは、本明細書に記載されたCDR領域のいずれかとの組合せで、本明細書に記載されたヒト定常領域のいずれかを含む。これに関して、TCRは、以下：(a) 配列番号9〜14、41及び42の全て；(b) 配列番号17〜22、41及び42の全て；(c) 配列番号25〜30、41及び42の全て；(d) 配列番号33〜38、41及び42の全て；(e) 配列番号9〜14、41及び43の全て；(f) 配列番号17〜22、41及び43の全て；(g) 配列番号25〜30、41及び43の全て；又は(h) 配列番号33〜38、41及び43の全てのアミノ酸配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、TCRは、本明細書に記載された可変領域のいずれかとの組合せで、本明細書に記載されたヒト定常領域のいずれかを含む。これに関して、TCRは、以下：(i) 配列番号15〜16、41及び42の全て；(ii) 配列番号23〜24、41及び42の全て；(iii) 配列番号31〜32、41及び42の全て；(iv) 配列番号39〜42の全て；(v) 配列番号15〜16、41及び43の全て；(vi) 配列番号23〜24、41及び43の全て；(vii) 配列番号31〜32、41及び43の全て；又は(viii) 配列番号39〜40、41及び43の全てのアミノ酸配列を含み得る。
【００３３】
本発明の一実施形態は、ヒト可変領域及びマウス定常領域を含むキメラTCRであって、該TCRがHLA-Cw8分子との関連で提示された変異KRASに対する抗原特異性を有する、キメラTCRを提供する。マウス定常領域は、1以上の任意の利益を提供し得る。例えば、マウス定常領域は、本発明のTCRが導入される宿主細胞の内在的なTCRと、本発明のTCRとのミスペアリングを減殺し得る。代替的に又は追加的に、マウス定常領域は、本発明のTCRの発現を、ヒト定常領域を伴う同じTCRと比較して増大させ得る。キメラTCRは、配列番号44 (野生型(WT)マウスα鎖定常領域)、配列番号45 (WTマウスβ鎖定常領域)、又は配列番号44及び45の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のTCRは、配列番号44及び45の両方のアミノ酸配列を含む。キメラTCRは、本発明の他の態様に関して、本明細書に記載されたCDR領域のいずれかとの組合せで、本明細書に記載されたマウス定常領域のいずれかを含み得る。これに関して、TCRは、以下：(a) 配列番号9〜14、44及び45の全て；(b) 配列番号17〜22、44及び45の全て；(c) 配列番号25〜30、44及び45の全て；又は(d) 配列番号33〜38、44及び45の全てのアミノ酸配列を含み得る。本発明の別の実施形態においては、キメラTCRは、本発明の他の態様に関して、本明細書に記載された可変領域のいずれかとの組合せで、本明細書に記載されたマウス定常領域のいずれかを含み得る。これに関して、TCRは、以下：(i) 配列番号15〜16、44及び45；(ii) 配列番号23〜24、44及び45；(iii) 配列番号31〜32、44及び45；又は(iv) 配列番号39〜40、44及び45；のアミノ酸配列を含み得る。
【００３４】
本発明の一実施形態においては、TCRは置換されている定常領域を含む。これに関して、TCRは、α及びβ鎖の一方又は両方の定常領域において、1、2、3又は4のアミノ酸置換（複数可）を有する本明細書に記載されたTCRのいずれかのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、TCRは、α鎖及びβ鎖の一方又は両方のマウス定常領域において、1、2、3又は4のアミノ酸置換（複数可）を有するマウス定常領域を含む。特に好ましい実施形態においては、TCRは、α鎖のマウス定常領域における1、2、3又は4のアミノ酸置換（複数可）、及びβ鎖のマウス定常領域における1つのアミノ酸置換を有するマウス定常領域を含む。幾つかの実施形態においては、置換されている定常領域を含むTCRは、置換されていない(野生型)定常領域を含む親TCRと比べて、変異KRAS+標的の増加した認識、宿主細胞による増加した発現、内在的なTCRとのミスペアリングの減殺、及び増加した抗腫瘍活性の1以上を有利に提供する。一般的に、TCRα鎖及びβ鎖のマウス定常領域の置換されているアミノ酸配列（それぞれ配列番号46及び47）は、置換されていないマウス定常領域のアミノ酸配列（それぞれ配列番号44及び45）の全部または一部に対応し、配列番号46は、配列番号44と比べた場合に1つ、2つ、3つ又は4つのアミノ酸置換（複数可）を有し、及び配列番号47は、配列番号45と比べた場合に1つのアミノ酸置換を有する。これに関して、本発明の一実施形態は、(a) 配列番号46 (α鎖の定常領域)であって、(i)48位のXがThr又はCysであり；(ii)112位のXがSer、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであり；(iii)114位のXがMet、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe又はTrpであり；及び(iv)115位のXがGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpである配列番号46；並びに(b) 配列番号47 (β鎖の定常領域)であって、57位のXがSer又はCysである配列番号47、のアミノ酸配列を含むTCRを提供する。本発明の一実施形態においては、配列番号46を含むTCRは、配列番号44 (α鎖の置換されていないマウス定常領域)を含まない。本発明の一実施形態においては、配列番号47を含むTCRは配列番号45 (β鎖の置換されていないマウス定常領域)を含まない。
【００３５】
本発明の一実施形態においては、置換されている定常領域は、α及びβ鎖の一方又は両方の定常領域においてシステイン置換を含み、システインで置換されているTCRを提供する。α及びβ鎖中の対向するシステインは、置換されているTCRのα及びβ鎖の定常領域を互いに連結するジスルフィド結合を提供し、それは置換されていないマウス定常領域を含むTCR中には存在しない。これに関して、TCRは、配列番号44のネイティブの48位のThr（Thr48）及び配列番号45のネイティブの57位のSer(Ser57)の一方又は両方がCysで置換され得る、システイン置換TCRであり得る。好ましくは、配列番号44のネイティブThr48及び配列番号45のネイティブのSer57の両方がCysで置換されている。一実施形態においては、システイン置換TCRは、配列番号46のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域であって、48位のXがCysであり、112位のXがネイティブのSerであり、114位のXがネイティブのMetであり、及び115位のXがネイティブのGlyである領域、並びに配列番号47のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域であって、57位のXがCysである領域、を含む。本発明のシステイン置換TCRは、本明細書に記載されたCDR又は可変領域のいずれかに加え、置換されている定常領域を含み得る。
【００３６】
本発明の一実施形態においては、置換されているアミノ酸配列としては、疎水性アミノ酸で置換されているTCRを提供するための、α鎖及びβ鎖の一方又は両方の定常領域の膜貫通 (TM)ドメインにおける、1つ、2つ又は3つアミノ酸の、疎水性アミノ酸との置換が挙げられる。TCRのTMドメインにおける疎水性アミノ酸置換（複数可）は、TMドメイン中に疎水性アミノ酸置換（複数可）を欠くTCRと比べて、TCRのTMドメインの疎水性を上昇させ得る。これに関して、TCRは、配列番号44のネイティブのSer112、Met114及びGly115のうちの1つ、2つ又は3つが独立してAla、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrp；好ましくはLeu、Ile又はValで置換され得る、疎水性アミノ酸置換TCRである。好ましくは、配列番号44のネイティブのSer112、Met114及びGly115の3つ全てが独立してAla、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrp；好ましくはLeu、Ile又はValで置換され得る。一実施形態においては、疎水性アミノ酸置換TCRは、配列番号46のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域であって、48位のXがネイティブのThrであり、112位のXがSer、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであり、114位のXがMet、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe又はTrpであり、及び115位のXがGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpである領域、並びに配列番号47のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域であって、57位のXがネイティブのSerである領域を含む（配列番号46を含む疎水性アミノ酸置換TCRは配列番号44 (α鎖の置換されていないマウス定常領域)を含まない）。好ましい実施形態においては、疎水性アミノ酸置換TCRは、配列番号46のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域であって、48位のXがネイティブのThrであり、112位のXがLeuであり、114位のXがIleであり、及び115位のXがValである領域、並びに配列番号47のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域であって、並びに57位のXがネイティブのSerである領域を含む。本発明の疎水性アミノ酸置換TCRは、本明細書に記載されたCDR又は可変領域のいずれかに加えて、置換されている定常領域を含み得る。
【００３７】
本発明の一実施形態においては、置換されているアミノ酸配列は、α及びβ鎖の一方又は両方の定常領域の膜貫通 (TM)ドメイン中の1つ、2つ又は3つのアミノ酸の疎水性アミノ酸での置換（複数可）と組合せて、α及びβ鎖の一方又は両方の定常領域におけるシステイン置換を含む(本明細書においてまた「システイン置換・疎水性アミノ酸置換TCR」として参照する)。これに関して、TCRは、配列番号46のネイティブのThr48がCysで置換され；配列番号46のネイティブのSer112、Met114及びGly115のうちの1つ、2つ又は3つが独立してAla、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrp；好ましくはLeu、Ile又はValで置換され；及び配列番号47のネイティブのSer57がCysで置換されている、システイン置換・疎水性アミノ酸置換TCRである。好ましくは、配列番号46のネイティブのSer112、Met114及びGly115の3つ全てが独立してAla、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrp；好ましくはLeu、Ile又はValで置換され得る。一実施形態においては、システイン置換・疎水性アミノ酸置換TCRは、配列番号46のアミノ酸配列を含むα鎖であって、48位のXがCysであり、112位のXがSer、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであり、114位のXがMet、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe又はTrpであり、115位のXがGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであるα鎖、並びに配列番号47のアミノ酸配列を含むβ鎖であって、57位のXがCysであるβ鎖を含む（配列番号46は配列番号44 (置換されていないα鎖)を含まず、配列番号47は配列番号45 (置換されていないβ鎖)を含まない）。好ましくは、システイン置換・疎水性アミノ酸置換TCRは、配列番号46のアミノ酸配列を含むα鎖であって、48位のXがCysであり、112位のXがLeuであり、114位のXがIleであり、115位のXがValであるα鎖、並びに配列番号47のアミノ酸配列を含むβ鎖であって、57位のXがCysであるβ鎖を含む。これに関して、システイン置換・疎水性アミノ酸置換TCRは、配列番号48のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域、及び配列番号49のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域を含む。本発明のシステイン置換・疎水性アミノ酸置換TCRは、本明細書に記載されたCDR又は可変領域のいずれかに加えて、置換されている定常領域を含み得る。
【００３８】
本発明の一実施形態においては、本発明のシステイン置換・疎水性アミノ酸置換TCRは、TCRのα鎖及びTCRのβ鎖を含み得る。本発明のTCRのα鎖及びβ鎖の各々は、任意のアミノ酸配列を独立して含み得る。これに関して、本発明のTCRのα鎖は、配列番号50、52、54又は56のアミノ酸配列を含み得る。この型のα鎖は、TCRの任意のβ鎖と対になり得る。これに関して、本発明のTCRのβ鎖は、配列番号51、53、55又は57のアミノ酸配列を含み得る。それゆえ、本発明のTCRは、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号50及び51の両方、配列番号52及び53の両方、配列番号54及び55の両方、又は配列番号56及び57の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のTCRは、(1) 配列番号50〜51の両方；(2) 配列番号52〜53の両方；(3) 配列番号54〜55の両方；又は(4) 配列番号56〜57の両方のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
また、本発明によって、本明細書に記載のTCRのいずれかの機能的部分を含むポリペプチドが提供される。本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、オリゴペプチドを含み、１以上のペプチド結合によって連結した一本鎖のアミノ酸を指す。
【００４０】
本発明のポリペプチドに関して、機能的部分が変異KRASに特異的に結合するという条件で、機能的部分はTCRの一部である連続するアミノ酸を含む任意の部分であり得る。TCRに準拠して使用される場合、用語「機能的部分」は、本発明のTCRの任意の部分又はフラグメントを指し、そしてその部分又はフラグメントは、一部であるTCR（親TCR）の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、変異KRASに特異的に結合する能力（例、HLA-Cw*0802分子の関連内で）、又は親TCRと類似する程度、同じ程度、又はより高い程度にがんを検出、治療若しくは予防する能力、を保持するTCRの部分を含有する。親TCRに準拠して、機能的部分は、例えば、親TCRの約10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％以上を含み得る。
【００４１】
機能的部分は、追加的なアミノ酸が親TCRのアミノ酸配列に見られない、部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端、又はその両方の末端に、追加的なアミノ酸を含み得る。望ましくは、追加のアミノ酸は、機能的部分の生物学的機能、例、変異KRASに特異的に結合すること；及び／又はがんを検出し、がんを治療し若しくは予防する能力を有することと干渉しない。より望ましくは、追加のアミノ酸は、親TCRの生物学的活性と比較して、その生物学的活性を増強する。
【００４２】
ポリペプチドは、本発明のTCRのα及びβ鎖のいずれか又は両方の機能的部分、例えば、本発明のTCRのα鎖及び／又はβ鎖の可変領域（複数可）のCDR1、CDR2及びCDR3の1以上を含む機能的部分等、を含み得る。本発明の一実施形態においては、ポリペプチドは配列番号9 (α鎖のCDR1)、配列番号10 (α鎖のCDR2)、配列番号11 (α鎖のCDR3)、配列番号12 (β鎖のCDR1)、配列番号13 (β鎖のCDR2)、配列番号14 (β鎖のCDR3)又はそれらの組合せのアミノ酸配列を含み得る。本発明の別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号17 (α鎖のCDR1)、配列番号18 (α鎖のCDR2)、配列番号19 (α鎖のCDR3)、配列番号20 (β鎖のCDR1)、配列番号21 (β鎖のCDR2)、配列番号22 (β鎖のCDR3)、又はそれらの組合せのアミノ酸配列を含み得る。本発明の別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号25 (α鎖のCDR1)、配列番号26 (α鎖のCDR2)、配列番号27 (α鎖のCDR3)、配列番号28 (β鎖のCDR1)、配列番号29 (β鎖のCDR2)、配列番号30 (β鎖のCDR3)、又はそれらの組合せのアミノ酸配列を含み得る。本発明の別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号33 (α鎖のCDR1)、配列番号34 (α鎖のCDR2)、配列番号35 (α鎖のCDR3)、配列番号36 (β鎖のCDR1)、配列番号37 (β鎖のCDR2)、配列番号38 (β鎖のCDR3)、又はそれらの組合せのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、(a) 配列番号9〜14の両方；(b) 配列番号17〜22の両方；(c) 配列番号25〜30の両方；又は(d) 配列番号33〜38の両方のアミノ酸配列を含む。
【００４３】
本発明の一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、例えば、上記のCDR領域の組合せを含む本発明のTCRの可変領域を含み得る。これに関して、ポリペプチドは、配列番号15 (α鎖の可変領域)、配列番号16 (β鎖の可変領域)、配列番号15及び16の両方、配列番号23 (α鎖の可変領域)、配列番号24 (β鎖の可変領域)、配列番号23及び24の両方、配列番号31 (α鎖の可変領域)、配列番号32 (β鎖の可変領域)、配列番号31及び32の両方、配列番号39 (α鎖の可変領域)、配列番号40 (β鎖の可変領域)、又は配列番号39及び40の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、(i) 配列番号15及び16の両方、(ii) 配列番号23及び24の両方、(iii) 配列番号31及び32の両方、又は(iv) 配列番号39及び40の両方のアミノ酸配列を含む。
【００４４】
本発明の一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、上記の本発明のTCRの定常領域を更に含み得る。これに関して、ポリペプチドは、配列番号41 (α鎖のヒト定常領域)、配列番号42 (β鎖のヒト定常領域)、配列番号43 (β鎖のヒト定常領域)、配列番号44 (α鎖のWTマウス定常領域)、配列番号45 (β鎖のWTマウス定常領域)、配列番号46 (α鎖の置換されたマウス定常領域)、配列番号47 (β鎖の置換されたマウス定常領域)、配列番号48 (α鎖のシステイン置換され、疎水性アミノ酸置換されたマウス定常領域)、配列番号49 (α鎖のシステイン置換され、疎水性アミノ酸置換されたマウス定常領域)、配列番号44及び45の両方、配列番号46及び47の両方、又は配列番号48及び49の両方、配列番号41及び42の両方、又は配列番号41及び43の両方のアミノ酸配列を更に含み得る。好ましくは、本発明の他の態様に関して、ポリペプチドは、本明細書に記載されたCDR領域又は可変領域のいずれかとの組合せで、(i) 配列番号44及び45の両方、(ii) 配列番号46及び47の両方、(iii) 配列番号48及び49の両方、(iv) 配列番号41及び42の両方、又は(v) 配列番号41及び43の両方のアミノ酸配列を更に含む。
【００４５】
本発明の一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載されたTCRのα又はβ鎖の全長を含み得る。これに関して、本発明のポリペプチドは、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56又は配列番号57のアミノ酸配列を含み得る。代替的には、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載されたTCRの両方の鎖を含み得る。例えば、本発明のポリペプチドは、配列番号50及び51のアミノ酸配列の両方、配列番号52及び53の両方、配列番号54及び55の両方、又は配列番号56及び57の両方を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、(1) 配列番号50〜51の両方；(2) 配列番号52〜53の両方；(3) 配列番号54〜55の両方；又は(4) 配列番号56〜57の両方のアミノ酸配列を含む。
【００４６】
本発明は、本明細書に記載された少なくとも1のポリペプチドを含むタンパク質を更に提供する。「タンパク質」は、1以上のポリペプチド鎖を含む分子を意味する。
【００４７】
一実施形態においては、本発明のタンパク質は、(a) 配列番号9〜11のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号12〜14のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；(b) 配列番号17〜19のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号20〜22のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；(c) 配列番号25〜27のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号28〜30のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；又は(d) 配列番号33〜35のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号36〜38のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖を含み得る。
【００４８】
本発明の別の実施形態においては、タンパク質は、(i) 配列番号15のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号16のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；(ii) 配列番号23のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号24のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；(iii) 配列番号31のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号32のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；又は(iv) 配列番号39のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号40のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖を含み得る。
【００４９】
本発明のタンパク質は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載された定常領域のいずれかを更に含み得る。これに関して、本発明の実施形態においては、第一のポリペプチド鎖は、以下：(i) 配列番号46の48位のXがThr又はCysであり；(ii) 配列番号46の112位のXがSer、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであり；(iii) 配列番号46の114位のXがMet、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe又はTrpであり；及び(iv) 配列番号46の115位のXがGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpである、配列番号46のアミノ酸配列を更に含み得；並びに(B) 第二のポリペプチド鎖は、配列番号47の57位のXがSer又はCysである、配列番号47のアミノ酸配列を更に含み得る。本発明の別の実施形態においては、第一のポリペプチド鎖は、配列番号41 (ヒトα鎖の定常領域)、配列番号44 (α鎖のマウスWT定常領域)又は配列番号48 (α鎖のシステイン置換され、疎水性アミノ酸置換されたマウス定常領域)のアミノ酸配列を更に含み得、第二のポリペプチド鎖は、配列番号42 (β鎖のヒト定常領域)、配列番号43 (β鎖のヒト定常領域)、配列番号45 (β鎖のマウスWT定常領域)又は配列番号49 (β鎖のシステイン置換され、疎水性アミノ酸置換されたマウス定常領域)のアミノ酸配列を更に含み得る。
【００５０】
代替的に又は追加的に、本発明のタンパク質は、(1) 配列番号50のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号51のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；(2) 配列番号52のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号53のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；(3) 配列番号54のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号55のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖；又は(4) 配列番号56のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号57のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖を含み得る。この例においては、本発明のタンパク質はTCRであり得る。代替的には、例えば、タンパク質が、配列番号50及び51の両方、配列番号52及び53の両方、配列番号54及び55の両方、若しくは配列番号55及び56の両方のアミノ酸配列を含む単一のポリペプチド鎖を含む場合、又はタンパク質の第一及び／若しくは第二のポリペプチド鎖（複数可）が他のアミノ酸配列、例、免疫グロブリン又はその部分をコードするアミノ酸配列を更に含む場合、本発明のタンパク質は融合タンパク質であり得る。これに関して、本発明はまた、少なくとも1の他のポリペプチドと共に、本明細書に記載された本発明のポリペプチドの少なくとも1を含む融合タンパク質を提供する。他のポリペプチドは、融合タンパク質の別のポリペプチドとして存在し得、又は本明細書に記載された本発明のポリペプチドの1つとインフレームで（in frame）（タンデムで）発現されるポリペプチドとして存在し得る。他のポリペプチドは、免疫グロブリン、CD3、CD4、CD8、MHC分子、CD1分子、例、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d等を含むがそれらに限定されない、任意のペプチド性若しくはタンパク質性の分子、又はそれらの部分をコードし得る。
【００５１】
融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの1以上のコピー及び／又は他のポリペプチドの1以上のコピーを含み得る。例えば、融合タンパク質は、本発明のポリペプチド及び／又は他のポリペプチドの1、2、3、4、5以上のコピーを含み得る。融合タンパク質を作製する好適な方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、組換え法が挙げられる。
【００５２】
本発明の幾つかの実施形態においては、本発明のTCR、ポリペプチド及びタンパク質は、α鎖及びβ鎖を連結するリンカーペプチドを含む単一のタンパク質として発現され得る。これに関して、本発明のTCR、ポリペプチド及びタンパク質はリンカーペプチドを更に含み得る。リンカーペプチドは、宿主細胞内で、組換えTCR、ポリペプチド及び／又はタンパク質の発現を有利に促進し得る。リンカーペプチドは、任意の好適なアミノ酸配列を含み得る。例えば、リンカーペプチドは、配列番号58を含み得る。宿主細胞によるリンカーペプチドを含むコンストラクトの発現の際、リンカーペプチドは切断され得、結果として別のα及びβ鎖となる。本発明の一実施形態においては、TCR、ポリペプチド又はタンパク質は、完全長α鎖、完全長β鎖、並びにα鎖とβ鎖との間に位置するリンカーペプチドを含むアミノ酸配列を含み得る。
【００５３】
本発明のタンパク質は、本明細書に記載された本発明のポリペプチドの少なくとも1を含む組換え抗体又はその抗原結合部分であり得る。本明細書において用いられる場合、「組換え抗体」は、本発明のポリペプチド、抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分の少なくとも1を含む組換え(例、遺伝学的に操作された)タンパク質を指す。抗体のポリペプチド又はその抗原結合部分は、抗体の重鎖、軽鎖、重鎖若しくは軽鎖の可変領域若しくは定常領域、一本鎖可変フラグメント（scFv）、又はFc、Fab若しくはF(ab)2'フラグメント等であり得る。抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分は、組換え抗体の別のポリペプチドとして存在し得る。代替的には、抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分は、本発明のポリペプチドとインフレームで（タンデムで）で発現されるポリペプチドとして存在し得る。抗体のポリペプチド又はその抗原結合部分は、本明細書に記載された抗体及び抗体フラグメントのいずれかを含む、任意の抗体又は任意の抗体フラグメントのポリペプチドであり得る。
【００５４】
本発明の範囲内には、本明細書に記載された本発明のTCR、ポリペプチド又はタンパク質の機能的変異体が含まれる。本明細書において用いられる場合、用語「機能的変異体」は、機能的変異体が、変異体であるTCR、ポリペプチド又はタンパク質の生物学的活性を保持している、親TCR、ポリペプチド又はタンパク質に対する実質的又は有意な配列同一性又は類似性を有するTCR、ポリペプチド又はタンパク質を指す。機能的変異体は、例えば、親TCRが抗原特異性を有するか、又は親ポリペプチド若しくはタンパク質が、特異的に結合する変異KRASに、親TCR、ポリペプチド又はタンパク質と類似する程度、同じ程度若しくはより高い程度に特異的に結合する能力を保持する、本明細書に記載されたTCR、ポリペプチド又はタンパク質（親TCR、ポリペプチド又はタンパク質）の変異体を包含する。親TCR、ポリペプチド又はタンパク質に準拠して、例えば、機能的変異体は、親TCR、ポリペプチド又はタンパク質のそれぞれに対して、アミノ酸配列で、少なくとも、約30%、50%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であり得る。
【００５５】
例えば、機能的変異体は、少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する親TCR、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。保存的アミノ酸置換は当該技術分野において公知であり、ある物理的及び／又は化学的特性を有する1個のアミノ酸が、同じ化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸に置き換えられるアミノ酸置換が挙げられる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸 (例、Asp又はGlu)に置換、非極性側鎖を有するアミノ酸を非極性側鎖を有する別のアミノ酸 (例、Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)に置換、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸 (Lys、Arg等)に置換、極性側鎖を有するアミノ酸を極性側鎖を有する別のアミノ酸 (Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)に置換等であり得る。
【００５６】
代替的に又は追加的に、機能的変異体は、少なくとも1つの非保存的アミノ酸置換を有する親TCR、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。この場合においては、非保存的アミノ酸置換が、機能的変異体の生物学的活性と干渉しないか又は阻害しないことが好ましい。好ましくは、機能的変異体の生物学的活性が、親TCR、ポリペプチド又はタンパク質と比較して増加するよう、非保存的アミノ酸置換は機能的変異体の生物学的活性を増大させる。
【００５７】
TCR、ポリペプチド又はタンパク質の他の構成要素、例、他のアミノ酸が、TCR、ポリペプチド又はタンパク質の生物学的活性を実質的に変化させないよう、TCR、ポリペプチド又はタンパク質は、本明細書に記載された特定のアミノ酸配列又は配列から本質的になり得る。これに関して、例えば、本発明のTCR、ポリペプチド又はタンパク質は、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、(1) 配列番号50〜51の両方；(2) 配列番号52〜53の両方；(3) 配列番号54〜55の両方；又は(4) 配列番号56〜57の両方のアミノ酸配列から本質的になり得る。また、例えば、本発明のTCR、ポリペプチド又はタンパク質は、配列番号15、配列番号16、配列番号23、配列番号24、配列番号31、配列番号32、配列番号39、配列番号40、(i) 配列番号15〜16の両方；(ii) 配列番号23〜24の両方；(iii) 配列番号31〜32の両方；又は(iv) 配列番号39〜40の両方のアミノ酸配列（複数可）から本質的になり得る。更に、本発明のTCR、ポリペプチド又はタンパク質は、(a) 配列番号9〜14の全て；(b) 配列番号17〜22の全て；(c) 配列番号25〜30の全て；又は(d) 配列番号33〜38の全てのアミノ酸配列から本質的になり得る。
【００５８】
本発明のTCR、ポリペプチド及びタンパク質は、TCR、ポリペプチド又はタンパク質が、それらの生物学的活性、例、変異KRASに特異的に結合し；哺乳動物におけるがんを検出し；又は哺乳動物におけるがんを治療若しくは予防する能力等を保持するという条件で、任意の長さ、即ち、任意の数のアミノ酸を含み得る。例えば、ポリペプチドは、約50〜約5000アミノ酸長の範囲であり得、例えば、50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000以上のアミノ酸長等であり得る。これに関して、本発明のポリペプチドはまたオリゴペプチドを含む。
【００５９】
本発明のTCR、ポリペプチド及びタンパク質は、天然で生じた１以上のアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。そのような合成アミノ酸は、当該技術分野において公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α-アミノ-n-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミノメチル−システイン、トランス-3-及びトランス-4-ヒドロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリン、β-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α-ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、N'-ベンジル-N'-メチル-リジン、N',N'-ジベンジルリジン、6-ヒドロキシリシン、オルニチン、α-アミノシクロペンタンカルボン酸、α-アミノシクロヘキサンカルボン酸、α-アミノシクロヘプタンカルボン酸、α-(2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボン酸、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン及びα-tert-ブチルグリシンが挙げられる。
【００６０】
本発明のTCR、ポリペプチド及びタンパク質は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、N-アシル化、環化、例えばジスルフィド架橋を介したもの、又は酸付加塩への変換、及び／又は任意選択で二量体化若しくは重合化、又はコンジュゲート化し得る。
【００６１】
本発明のTCR、ポリペプチド及び／又はタンパク質は、例えば、例、デノボ合成等の当該技術分野で公知の方法によって得ることができる。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換え法により本明細書に記載の核酸を用いて、組換えにより作製することができる。例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning：A Laboratory Manual（第4版）Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(2012)を参照。代替的には、本明細書に記載のTCR、ポリペプチド及び／又はタンパク質は、例えばSynpep (Dublin, CA)、Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD)及びMultiple Peptide Systems (Sandiego, CA)等の企業によって商業的に合成され得る。これに関して、本発明のTCR、ポリペプチド及びタンパク質は、合成、組換え、単離及び／又は精製され得る。
【００６２】
本発明の範囲には、本発明のTCR、ポリペプチド又はタンパク質（それらの機能的部分又は変異体のいずれかを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞集団、又は抗体若しくはその抗原結合部分のいずれかを含む、コンジュゲート、例、バイオコンジュゲートが含まれる。コンジュゲート及びコンジュゲートを合成する方法は、一般的に、当該技術分野において公知である。
【００６３】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載されたTCR、ポリペプチド又はタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本明細書において用いられる場合、「核酸」は「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を含み、一般にDNA又はRNAのポリマーを意味し、一本鎖又は二本鎖であり得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含み得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチド間結合、例えば、未修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にみられるホスホジエステルの代わりに、ホスホロアミデート結合又はホスホロチオエート結合等を含み得る。一実施形態においては、核酸は相補的DNA（cDNA）を含む。核酸が、挿入、欠失、逆位及び／又は置換も何ら含まないことが一般には好ましい。しかし、本明細書で考察される通り、幾つかの例においては核酸が１以上の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含むことが、好適であり得る。
【００６４】
好ましくは、本発明の核酸は組換え体である。本明細書において使用される場合、用語「組換え体」は、(i)天然又は合成の核酸セグメントを、生細胞内で複製することができる核酸分子に加えることによって、生細胞外で構築される分子、又は(ii)上記(i)に記載されたものの複製で得られる分子を指す。本明細書の目的のためには、複製はin vitro複製、又はin vivo複製であり得る。
【００６５】
核酸は、当技術分野で公知の手順を用いて、化学合成及び／又は酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、上記のGreen and Sambrookら、を参照。例えば、核酸は、天然で生じたヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を高めるよう、若しくはハイブリダイゼーション時に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるよう設計された、様々な修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）、を用いて化学的に合成され得る。核酸を生成するために使用し得る修飾ヌクレオチドの例としては、5-フルオロウラシル（fluorouracil）、5-ブロモウラシル（5-bromouracil）、5-クロロウラシル（5-chlorouracil）、5-ヨードウラシウル（5-iodouracil）、ヒポキサンチン（hypoxanthine）、キサンチン（xanthine）、4-アセチルシトシン（4-acetylcytosine）、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル（5-(carboxyhydroxymethyl)uracil）、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン（5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine）、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル（5-carboxymethylaminomethyluracil）、ジヒドロウラシル（dihydrouracil）、β-D-ガラクトシルキューオシン（β-D-galactosylqueosine）、イノシン（inosine）、N6-イソペンテニルアデニン（N6-isopentenyladenine）、1-メチルグアニン（1-methylguanine）、1-メチルイノシン（1-methylinosine）、2,2-ジメチルグアニン（2,2-dimethylguanine）、2-メチルアデニン（2-methyladenine）、2-メチルグアニン（2-methylguanine）、3-メチルシトシン（3-methylcytosine）、5-メチルシトシン（5-methylcytosine）、N6-置換アデニン（N6-substituted adenine）、7-メチルグアニン（7-methylguanine）、5-メチルアミノメチルウラシル（5-methylaminomethyluracil）、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル（5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil）、β-D-マンノシルキューオシン（β-D-mannosylqueosine）、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル（5'-methoxycarboxymethyluracil）、5-メトキシウラシル（5-methoxyuracil）、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン（2-methylthio-N6-isopentenyladenine）、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)（uracil-5-oxyacetic acid (v)）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル（pseudouracil）、キューオシン（queosine）、2-チオシトシン（2-thiocytosine）、5-メチル−2-チオウラシル（5-methyl-2-thiouracil）、2-チオウラシル（2-thiouracil）、4-チオウラシル（4-thiouracil）、5-メチルウラシル（5-methyluracil）、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル（uracil-5-oxyacetic acid methylester）、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル（3-(3-amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil）及び2,6-ジアミノプリン（2,6-diaminopurine）が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、本発明の核酸の１以上は、例えばMacromolecular Resources (Fort Collins, CO)及びSynthegen (Houston, TX)等の企業から購入することができる。
【００６６】
核酸は、本明細書に記載されたTCR、ポリペプチド又はタンパク質のいずれかをコードする、任意のヌクレオチド配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、核酸は、配列番号63〜70のいずれか1つのヌクレオチド配列を含み得る（表１）。本発明の一実施形態においては、核酸は配列番号63〜64の両方、配列番号65〜66の両方、配列番号67〜68の両方又は配列番号69〜70の両方のヌクレオチド配列を含む。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
本発明の一実施形態においては、核酸は、本明細書に記載されたTCR、ポリペプチド又はタンパク質のいずれかをコードする、コドンを最適化したヌクレオチド配列を含む。如何なる特定の理論又は機構にも拘束されることはないが、ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、mRNA転写産物の翻訳効率を上昇させると考えられる。ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、ネイティブのコドンを、同じアミノ酸をコードするが、細胞内でより容易に利用できるtRNAによって翻訳され得る、別のコドンに置換することを含み得、従って、翻訳効率が上昇する。ヌクレオチド配列の最適化はまた、翻訳に干渉するmRNAの二次構造を減少させ得、従って、翻訳効率が上昇する。
【００６９】
本発明はまた、本明細書に記載された核酸のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は本明細書に記載された核酸のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００７０】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的なハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度に濃い量で、標的配列（本明細書に記載された核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件には、ヌクレオチド配列と一致する幾つかの小さな領域（例、3〜10塩基）を偶然有するランダム配列から、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド又は散在する僅かなミスマッチを含有するに過ぎないポリヌクレオチドを区別する条件が含まれる。そのような相補性の小領域は、14〜17塩基又はそれ超の完全長の相補体よりも容易に融解し、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションによりそれらが容易に区別され得る。比較的高ストリンジェンシーの条件には、例えば約50〜70℃の温度で、約0.02〜0.1MのNaCl又はそれと同等なものによって提供される等の、低塩条件及び／又は高温条件が含まれる。そのような高ストリンジェンシー条件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖との間のミスマッチがあれば、ほとんど許容せず、本発明のいずれかのTCRの発現を検出するのに特に好適である。ホルムアミド添加量を増加することによって、条件をよりストリンジェントにし得ることは一般的に理解されている。
【００７１】
本発明はまた、本明細書に記載された核酸のいずれかに対して、少なくとも約70％以上、例、約80％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％又は約99％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これに関して、該核酸は、本明細書に記載されたヌクレオチド配列のいずれかから本質的になり得る。
【００７２】
本発明の核酸は、組換え発現ベクターに組み込まれ得る。これに関して、本発明は、本発明の核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本発明の一実施形態においては、組換え発現ベクターは、α鎖、β鎖及びリンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００７３】
本明細書の目的のためには、用語「組換え発現ベクター」は、コンストラクトがmRNA、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、細胞内でmRNA、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを発現させるために十分な条件下でベクターと細胞とを接触させる場合、宿主細胞によって、mRNA、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現を可能にする、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのコンストラクトを意味する。本発明のベクターは、全体として天然で生じたものではない。しかしながら、ベクターの部分は天然に生じたものであり得る。本発明の組換え発現ベクターは、一本鎖又は二本鎖であり得、天然のソースから部分的に合成又は取得され得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含有し得る、DNA及びRNAを含むが、それらに限定されない任意の型のヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然で生じたヌクレオチド間結合、非天然で生じたヌクレオチド間結合、又はその両方の型の結合を含み得る。好ましくは、非天然で生じた若しくは改変されたヌクレオチド、又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写又は複製を妨害しない。
【００７４】
本発明の組換え発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであり得、任意の好適な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために使用され得る。好適なベクターとしては、例えばプラスミド及びウイルス等の増殖及び増幅（expansion）のため、若しくは発現、又はその両方のために設計されたものが挙げられる。ベクターは、pUCシリーズ（Fermentas Life Sciences）、pBluescriptシリーズ（Stratagene, LaJolla, CA）、pETシリーズ（Novagen, Madison, WI）、pGEXシリーズ（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）及びpEXシリーズ（Clontech, Palo Alto, CA）からなる群から選択され得る。バクテリオファージベクター、例えばλGT10、λGT11、λZapII（Stratagene）、λEMBL4及びλNM1149等もまた使用され得る。植物発現ベクターの例としては、pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121及びpBIN19（Clontech）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、pEUK-C1、pMAM及びpMAMneo（Clontech）が挙げられる。好ましくは、組換え発現ベクターはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターである。特に好ましい実施形態においては、組換え発現ベクターはMSGV1ベクターである。
【００７５】
本発明の組換え発現ベクターは、例えば上記のGreen and Sambrookら、に記載された、標準的な組換えDNA技術を用いて調製され得る。環状又は線状である発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核宿主細胞内で機能的である複製システムを含有するよう調製され得る。複製システムは、例、ColE1、2μプラスミド、λ、SV40、ウシパピローマウイルス等に由来し得る。
【００７６】
望ましくは、組換え発現ベクターは、適宜、ベクターがDNAベースであるか又はRNAベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主細胞の型（例、細菌、真菌、植物又は動物）に特異的な、例えば転写の、並びに翻訳の開始及び終止コドン等の、制御配列を含む。
【００７７】
組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞の選択を可能にする１以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子としては、殺生物剤耐性、例、抗生物質、重金属等に対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主細胞における相補等が挙げられる。本発明の発現ベクターのための好適なマーカー遺伝子としては、例えばネオマイシン／G418耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００７８】
組換え発現ベクターは、TCR、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又はTCR、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的であるか若しくはハイブリダイズするヌクレオチド配列、に作動可能に連結した、ネイティブ又は非ネイティブのプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例、強、弱、誘導性、組織特異性及び発生段階特異性は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとを組み合わせることも当業者の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター、例、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター、及びマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復に見出されるプロモーターであり得る。
【００７９】
本発明の組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定した発現のためのいずれか、又はその両方のために、設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導的発現のために作製され得る。
【００８０】
更に、組換え発現ベクターは自殺遺伝子を含むよう作製され得る。本明細書において用いられる場合、用語「自殺遺伝子」は、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に、試薬、例えば、薬剤、に対する感受性を付与し、細胞がその試薬と接触若しくはそれに対して曝露される場合に細胞を死滅させる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野で公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼ及び誘導性カスパーゼ9遺伝子系が挙げられる。
【００８１】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載された組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意の型の細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞、例、植物、動物、菌類若しくは藻類であり得、又は原核細胞、例、バクテリア又は原生動物であり得る。宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞、即ち生物、例、ヒトから直接単離し得る。宿主細胞は、付着細胞又は懸濁細胞、即ち懸濁液中で増殖する細胞であり得る。好適な宿主細胞は当該技術分野で公知であり、例、DH5α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルVERO細胞、COS細胞、HEK293細胞等が挙げられる。組換え発現ベクターを増幅又は複製する目的のために、宿主細胞は好ましくは原核細胞、例、DH5α細胞である。組換えTCR、ポリペプチド又はタンパク質を産生する目的のために、宿主細胞は好ましくは哺乳動物細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞は任意の細胞型であり得、任意の型の組織に由来し得、任意の発生段階であり得る一方、宿主細胞は好ましくは末梢血リンパ球（PBL）又は末梢血単核細胞（PBMC）である。より好ましくは、宿主細胞はT細胞である。
【００８２】
本明細書の目的のために、T細胞は、例えば培養T細胞、例、初代T細胞、又は培養T細胞株由来のT細胞、例、Jurkat, SupT1等、又は哺乳動物から得られたT細胞等の任意のT細胞であり得る。哺乳動物から得られた場合、T細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺又は他の組織若しくは体液を含むが、これらに限定されない多数の供給源から得ることができる。T細胞はまた濃縮又は精製し得る。好ましくは、T細胞はヒトT細胞である。T細胞は、CD4＋／CD8＋二重陽性T細胞、CD4＋ヘルパーT細胞、例、Th1及びTh2細胞、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞（例、細胞傷害性T細胞）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、記憶T細胞（例、中央記憶T細胞及びエフェクター記憶T細胞）、ナイーブT細胞等を含むが、これらに限定されない、任意の型のT細胞であり得、任意の発生段階のT細胞であり得る。
【００８３】
また本発明は、本明細書に記載された少なくとも1の宿主細胞を含む細胞集団を提供する。細胞集団は、少なくとも1の他の細胞、例、組換え発現ベクターのいずれも含まない宿主細胞（例えば、T細胞）、又はT細胞以外の細胞、例、B細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等に加え、記載された組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む、不均一な集団であり得る。代替的には、細胞集団は、集団が組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例、本質的にそれからなる）、実質的に均質な集団であり得る。集団はまた、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含むような、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンである、細胞のクローン集団であり得る。本発明の一実施形態においては、細胞集団は、本明細書に記載された組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【００８４】
本発明の一実施形態においては、集団内の細胞数を急速に増幅させ得る。T細胞数の増幅は、例えば米国特許第8,034,334号；米国特許第8,383,099号；米国特許出願公開番号第2012/0244133号；Dudleyら、J. Immunother., 26:332-42 (2003)；及びRiddellら、J. Immunol. Methods, 128:189-201 (1990)に記載のように、当該技術分野において公知である多くの方法のいずれかによって達成され得る。一実施形態においては、T細胞数の増幅は、T細胞をOKT3抗体、IL-2及びフィーダーPBMC（例、放射線照射した同種異系PBMC）と共に培養することによって実施される。
【００８５】
本発明のTCR、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター及び宿主細胞（その集団を含む）は、単離及び／又は精製し得る。本明細書において用いられる場合、用語「単離した」は天然環境から取り出されていることを意味する。本明細書において用いられる場合、用語「精製した」は純度において上昇していることを意味し、「純度」は相対的な用語であり、絶対の純度として解釈される必要がない。例えば、純度は少なくとも約50％以上であり得、60％、70％、80％、90％、95％超であり得、又は約100％であり得る。
【００８６】
本発明のTCR、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター及び宿主細胞（その集団を含む）（以降、これらは全て「本発明のTCR材料」として総称的に言及される）は、例えば医薬組成物等の組成物に製剤化し得る。これに関して、本発明は、本明細書に記載されたTCR、ポリペプチド、タンパク質、核酸、発現ベクター及び宿主細胞（その集団を含む）のいずれか、並びに医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明のTCR材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、1超の本発明のTCR材料、例、ポリペプチド及び核酸、又は2以上の異なるTCRを含み得る。代替的には、医薬組成物は、例えば、化学療法剤、例、アスパラギナーゼ（asparaginase）、ブスルファン（busulfan）、カルボプラチン（carboplatin）、シスプラチン（cisplatin）、ダウノルビシン（daunorubicin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、フルオロウラシル（fluorouracil）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシウレア（hydroxyurea）、メトトレキセート（methotrexate）、パクリタキセル（paclitaxel）、リツキシマブ（rituximab）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビンクリスチン（vincristine）等の、別の医薬的な活性剤（複数可）又は薬剤（複数可）と組み合わせた本発明のTCR材料を含み得る。
【００８７】
好ましくは、担体は医薬的に許容される担体である。医薬組成物に関して、担体は、特定の本発明のTCR材料のために慣用的に使用が考慮されるもののいずれかであり得る。投与できる組成物を調製する方法は、当業者に公知又は明らかであり、例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Pharmaceutical Press (2012)においてより詳細に記載されている。医薬的に許容される担体は、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
【００８８】
担体の選択は、特定の本発明のTCR材料によって、及び本発明のTCR材料を投与するために使用される特定の方法によってある程度決定される。従って、本発明の医薬組成物の多様な好適な製剤がある。好適な製剤は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、腫瘍内又は腹腔内投与のための製剤のいずれかを含み得る。1超の経路が、本発明のTCR材料を投与するために使用され得、ある場合には、特定の経路は、別の経路よりも迅速かつ効果的な応答を提供し得る。
【００８９】
好ましくは、本発明のTCR材料は、注射（例、静脈内）によって投与される。本発明のTCR材料が本発明のTCRを発現する宿主細胞である場合、注射用細胞のための医薬的に許容される担体は、例えば、例、通常の生理食塩水（水に溶解中、約0.90％w/vのNaCl、水中約300 mOsm/LのNaCl、又は水1L当たり約9.0gのNaCl）、NORMOSOL R電解質溶液（Abbott, Chicago, IL）、PLASMA-LYTE A（Baxter, Deerfield, IL）、水中約5％のデキストロース又はリンゲル乳酸塩等の任意の等張な担体を含んでもよい。一実施形態においては、医薬的に許容される担体に、ヒト血清アルブミンが補充される。
【００９０】
本発明の目的のために、投与される本発明のTCR材料の量又は用量（例、本発明のTCR材料が1以上の細胞である場合は細胞数）は、作用、例、妥当な時間に亘って、対象又は動物内で治療又は予防応答するために十分でなければならない。例えば、本発明のTCR材料の用量は、がん抗原（例、変異KRAS）に結合するのに十分でなければならず、又は投与時から約２時間以上、例、12〜24時間若しくはそれ超の期間内にがんを検出、治療若しくは予防するのに十分でなければならない。ある実施形態においては、期間はさらに長くなる可能性がある。用量は、特定の本発明のTCR材料の有効性及び動物（例、ヒト）の状態、並びに治療される動物（例、ヒト）の体重によって決定される。
【００９１】
投与される量を決定するための多くのアッセイは、当技術分野で公知である。本発明の目的のために、標的細胞が溶解される程度、又はT細胞の異なる用量がそれぞれ与えられる哺乳動物の１セットのうち、一匹の哺乳動物にそのようなT細胞を所与の用量で投与した際に、本発明のTCR、ポリペプチド又はタンパク質を発現するT細胞によって分泌されるIFN-γの程度を比較することを含むアッセイ法を、哺乳動物に投与する初期用量を決定するために使用し得る。ある用量の投与の際に標的細胞が溶解される又はIFN-γが分泌される程度は、当該技術分野で公知の方法によってアッセイされ得る。
【００９２】
本発明のTCR材料の用量はまた、特定の本発明のTCR材料の投与に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質及び程度によって決定される。典型的には、主治医は、例えば年齢、体重、一般的健康状態、食事、性別、投与される本発明のTCR材料、投与経路及び治療されているがんの重篤度等の様々な要因を考慮に入れて、個々の患者を治療する本発明のTCR材料の投薬量を決定する。本発明のTCR材料が細胞集団である実施形態においては、１回の注入当たりに投与される細胞数は、例、約1×106〜約1×1012細胞、又はそれ超で変化し得る。ある実施形態においては、1×106未満の細胞が投与され得る。
【００９３】
当業者であれば、改良によって本発明のTCR材料の治療効果又は予防効果が増幅するよう、本発明のTCR材料（inventive TCR materials of the invention）を任意の数の方法で改変し得ることを容易に理解する。例えば、本発明のTCR材料は、化学療法剤に対する架橋によって直接的又は間接的のいずれかで結合され得る。化合物を化学療法剤に結合させる実務は当該技術分野において公知である。当業者であれば、本発明のTCR材料へ結合時に、架橋及び／又は化学療法剤が、本発明のTCR材料の機能、即ち、変異KRASに結合する、又はがんを検出、治療若しくは予防する能力と干渉しないという条件で、本発明のTCR材料の機能のために必要でない本発明のTCR材料の部位が、架橋及び／又は化学療法剤を結合させるための理想的な部位であることを認識する。
【００９４】
本発明の医薬組成物、TCR、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞及び細胞集団は、がんを治療又は予防する方法において使用され得ると期待される。特定の理論に拘束されることはないが、本発明のTCRは、TCR（又は関連する本発明のポリペプチド若しくはタンパク質）が、細胞によって発現される場合、変異KRASを発現する標的細胞に対する免疫応答を媒介することができるよう、変異KRASに対して特異的に結合すると考えられる。これに関して、本発明は、哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法を提供するものであって、哺乳動物のがんを治療又は予防するための有効量で、本明細書に記載された医薬組成物、TCR、ポリペプチド若しくはタンパク質のいずれか、本明細書に記載されたTCR、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む任意の核酸若しくは組換え発現ベクター、又は本明細書に記載されたTCR、ポリペプチド若しくはタンパク質のいずれかをコードする組換えベクターを含む任意の宿主細胞若しくは細胞集団を哺乳動物に投与すること含む。
【００９５】
本発明の一実施形態は、哺乳動物におけるがんの治療又は予防における使用のために、本明細書に記載された医薬組成物、TCR、ポリペプチド若しくはタンパク質のいずれか、本明細書に記載されたTCR、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む任意の核酸若しくは組換え発現ベクター、又は本明細書に記載されたTCR、ポリペプチド若しくはタンパク質のいずれかをコードする組換えベクターを含む任意の宿主細胞若しくは細胞集団を提供する。
【００９６】
本明細書において用いられる場合、用語「治療」及び「予防」、並びにそれに由来する用語は、必ずしも100％又は完全な治療若しくは予防を意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する、治療又は予防の様々な程度がある。これに関して、本発明の方法は、哺乳動物における、任意の量又は任意のレベル（any amount of any level）のがんの治療又は予防を提供し得る。更には、本発明の方法によって提供される治療又は予防は、治療又は予防されている、がんの１以上の状態又は症状の治療又は予防を含み得る。例えば、治療又は予防は、腫瘍の退縮を促進することを含み得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、がん、又はその症状若しくは状態の発症を遅延させることを含み得る。代替的に又は追加的に、「予防」は、がん、又はその症状若しくは状態の再発を予防又は遅延させることを包含し得る。
【００９７】
また、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法が提供される。該方法は、(i)本明細書に記載された本発明のTCR、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団又は医薬組成物のいずれかと、哺乳動物由来の１以上の細胞を含む試料とを接触させること、それにより複合体を形成し、該複合体を検出することを含み、該複合体の検出が哺乳動物におけるがんの存在を示す。
【００９８】
哺乳動物におけるがんを検出する本発明の方法に関して、細胞の試料は、全細胞、その溶解物又は全細胞溶解物の画分、例、核若しくは細胞質画分、全タンパク質画分又は核酸画分を含む試料であり得る。
【００９９】
本発明の検出方法の目的のために、接触を哺乳動物に関してin vitro又はin vitroで行い得る。好ましくは接触はin vitroである。
【０１００】
また、該複合体の検出は、当技術分野で公知の任意の数の方法によって行われ得る。例えば、本明細書に記載された本発明のTCR、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞又は細胞集団は、検出可能な標識、例えば、例、放射性同位体、フルオロフォア（例、フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）、フィコエリトリン（PE））、酵素（例、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ）及び元素粒子（例、金粒子）等で標識され得る。
【０１０１】
本発明の方法の目的のために、宿主細胞又は細胞集団が投与され得、該細胞は、哺乳動物に対して同種異系又は自己の細胞であり得る。好ましくは、該細胞は哺乳動物に対して自己である。
【０１０２】
本発明の方法に関して、がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管又は肛門直腸のがん、目のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、首、胆嚢又は胸膜のがん、鼻、鼻腔又は中耳のがん、口腔のがん、膣のがん、外陰部のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、子宮頚がん、胃腸カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、口中咽頭のがん、卵巣がん、陰茎のがん、膵臓がん、腹膜、大網及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、尿管がん及び膀胱がんのいずれかを含むがんであり得る。好ましいがんは（cancer is cancer is）、膵臓、結腸直腸、肺、子宮内膜、卵巣又は前立腺がんである。好ましくは、肺がんは肺腺がんであり、卵巣がんは上皮卵巣がんであり、膵臓がんは膵臓腺がんである。別の好ましい実施形態においては、がんは、G12D変異を有する変異KRASアミノ酸配列を発現するがんである。
【０１０３】
本発明の方法で言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」は、例えばマウス及びハムスター等のネズミ目の哺乳動物、及び例えばウサギ等のウサギ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物を指す。好ましくは、哺乳動物はネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ科）を含むネコ目由来である。より好ましくは、哺乳動物はウシ科（ウシ）及びイノシシ科（ブタ）を含むウシ目、又はウマ科（ウマ）を含むウマ目由来である。最も好ましくは、哺乳動物は霊長目、セボイド目若しくはシモイド目（サル）又は類人目（ヒト及び類人猿）である。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
【０１０４】
以下の実施例において、本発明をさらに説明するが、言うまでもなく、決してその範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０５】
次世代シーケンシング
QIAGEN AllPrep DNA/RNAキット (Qiagen, Venlo, Netherlands)を使用して、製造業者の提案に従って、ゲノムDNA (gDNA)及び全RNAを様々な腫瘍及びマッチした通常のアフェレーシス試料から精製した。1個の試料（Tu-Pri）をホルマリン固定し、パラフィン包埋し（FFPE）、Covaris truXTRACTMFFPE DNAキットを使用して、製造業者(Covaris, Woburn, MA)の指示通りにgDNAを抽出した。ペアエンドライブラリー用のAgilent Technologies SureSelectXTターゲットエンリッチメントシステムを、Human All Exon V6 RNAベイト (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)と組合せて使用し、全エクソームライブラリー構築物及び約20,000個のコード遺伝子のエキソンキャプチャを調製した。その後、NEXTSEQ 500卓上シーケンサー（Illumina, San Diego, CA, USA）で、全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）ライブラリーをシーケンスした。製造業者のプロトコールに従って、新鮮な腫瘍組織試料由来の3 μgのgDNA及びFFPE腫瘍試料由来の200 ngのgDNAを使用して、ライブラリーを調製した。Illumina高出力フローセルキット (300サイクル)により、最初は試薬/フローセルキットのv1を使用して、ペアエンドシーケンシングを行い、試薬/フローセルキットのv2において、同じライブラリー調製物のその後の実行を続けた。Illumina TruSeq RNA鎖ライブラリー調製キットを使用して、製造業者のプロトコールに従って、2 μgの全RNAを用いてRNA-seqライブラリーを調製した。NextSeq 500卓上シーケンサー(Illumina, San Diego, CA, USA)において、RNA-seqライブラリーをペアエンドシーケンシングした。
【０１０６】
アラインメント、プロセッシング及びバリアントコーリング
WESについては、Novocraft (Selangor, Malaysia) (novocraft.com/)のnovoalignMPIプログラムを使用して、ヒトゲノムビルドhg19に対するアラインメントを行った。ピカードMARKDUPLICATESツールを使用して重複をマークした。GATKベストプラクティス・ワークフロー(broadinstitute.org/gatk/)に従って、挿入／欠失リアラインメント及びベースリキャリブレーションを行った。データのクリーンアップ後、samtoolsユーティリティ(samtools.sourceforge.net)を使用して、パイルアップファイルを生成し、以下の基準：10以上の腫瘍及び正常のリード数、10%以上のバリアントアレル頻度及び4以上の腫瘍バリアントリードを使用して、体細胞のバリアントをコールするために、Varscan2プラットフォーム独立変異コーラー (varscan.sourceforge.net)を使用した。次いで、Annovarソフトウェアツール (annovar.openbioinformatics.org)を使用して、これらのバリアントについてアノテーションした。
【０１０７】
RNA-seqについては、STAR (github.com/alexdobin/STAR)の2パス法を使用して、ヒトゲノムビルドhg19に対するアラインメントを行った。ピカードMARKDUPLICATESツールを使用して重複をマークした。GATK SplitNTrimツールを使用して、リードを分割し、トリミングした。その後、GATKツールボックスを使用して、挿入／欠失リアラインメント及びベースリキャリブレーションを行った。最終的に再調整したbamファイル及びsamtools mpileupツールを使用して、パイルアップファイルを作成した。最後に、VARSCAN2プラットフォーム独立変異コーラーを使用して、バリアントをコールした。
【０１０８】
3つの転移性の新鮮な腫瘍試料 (Tu-1、Tu-2A及びTu-2B)において、WES及びRNA-seqを行った。次いで、シーケンシング又はマッピングのエラーに起因すると思われる擬陽性のコールを除去するために、Integrated Genomics Viewer (IGV)ツール (Broad Institute, Cambridge, MA)を使用して、7%の最小エクソーム頻度を含むバリアント及び最小の3つの代替的なリードを手動でキュレートした（curated）。クローンであるか、又はドミナントなクローン集団に代表される可能性がある変異に焦点を当てるために、2つ以上の腫瘍試料中での検出に基づいて、61変異を更なる分析のために選択した。これらの61変異のうちの1つがKRASである (表2)。これらには、最小の1つのWES及び1つのRNA-seqライブラリーで特定された29変異、並びに2つ以上の転移性病変に由来するWESライブラリーにおいて特定された32変異が含まれていた。
【０１０９】
【表２】
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【０１１０】
腫瘍浸潤リンパ球 (TIL)、注入TIL及び抗原提示樹状細胞 (DC)の生成
Tranら、Science, 350：1387-90 (2015)に記載の通り、TIL、注入TIL及び樹状細胞を生成した。簡易には、TILを生成するために、手術で切除した腫瘍を、約1〜2 mmのサイズの24個の断片にカットし、各断片を、高用量のIL-2 (6000 IU/ml、Chiron, Emeryville, CA)を含む、2mlの完全培地（CM）を含む、24ウェルプレートのウェルに別々に置いた。CMは、10%ヒト血清（内製）、2 mM L-グルタミン、25 mM HEPES及び10 μg/ml ゲンタマイシンを補充した、RPMI培地を含んでいた。TILの断片培養物6番を治療のために選択し、5%ヒトAB血清、3000 IU/mlのIL-2及び30 ng/mlのOKT3抗体 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)を補充した、400mlの50/50培地中において、放射線照射したPBMCを1：100の比で使用して、ガス透過性G-REX100フラスコ中で、急速増幅過程を行った。50/50培地は、CMとAIM-V培地の1：1の混合液を含んでいた。全細胞を、5% CO2、37℃で培養した。
【０１１１】
プラスチック接着法を使用して、末梢血単球から未成熟なDCを生成した。簡易には、患者アフェレーシスを解凍し、洗浄し、AIM-V培地 (Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いて7.5-10e6細胞/mlに設定し、次いで組織培養フラスコ (162 cm2の表面積)中において約1e6細胞/cm2でインキュベートし、5% CO2、37℃でインキュベートした。90分 (min)後、非接着細胞を回収し、フラスコ中でAIM-V培地を用いて非接着細胞を激しく洗浄し、次いで60分間、AIM-V培地を用いて更にインキュベートした。培地及び非接着細胞を除去し、次いでフラスコ中でAIM-V培地を用いて接着細胞を再度、激しく洗浄し、次いでDC培地を用いてインキュベートした。DC培地は、5%ヒト血清、100 U/mlペニシリン及び100 μg/mlストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、800 IU/ml GM-CSF（Leukine (サルグラモスティム(sargramostim))）及び200 U/ml IL-4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)を含むRPMIを含んでいた。2〜3日目に、新鮮なDC培地を培養液に添加した。培養開始後、4又は5日目に、DCを凍結保存した。培養開始後、4日目と6日目の間に、実験においてDCを使用した。
【０１１２】
変異反応性T細胞の特定と共培養実験
詳細な方法は、Tranら、Science, 350：1387-90 (2015)に記載されている。簡易には、全エクソーム及びトランスクリプトームシーケンシングによって、61変異を特定した。これらの61変異のうちの1つがKRASであった (表2)。各変異について、親タンパク質のいずれの側においても12アミノ酸が隣接する、変異をコードするミニ遺伝子を生成し、タンデムに合成し、タンデムミニ遺伝子 (TMG)コンストラクトを作製した。61変異をコードする5つのTMG (TMG1〜5)を作製し、in vitroにおいてRNAに転写し、患者自身のHLA-I及びHLA-II分子との関連で（表4）、全ての変異をプロセッシングし、提示することを可能にした、自己抗原提示DC中にエレクトロポレーションした。野生型及び変異KRASについてのTMGを表3に示す。表4に示したHLAデータは、Baiら、BMC Genomics, 15：325 (2014)に記載の通り、アルゴリズムPHLATを使用して、次世代シーケンシングデータから決定した。次いで、患者由来の24個の個別のTIL培養物を、これらのTMG発現DCと共に共培養し、IFN-γ酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイ (図1A)、並びにT細胞活性化マーカーの4-1BB及びOX40のフローサイトメトリー分析によって、T細胞反応性を決定した。TMG-1に対して反応性であった複数のTIL培養物を特定した。TMG-1中のどの変異抗原がTIL培養物6番によって認識されているかを特定するために、TMG-1中にコードされたペプチドを合成し (ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)及びGenScript Inc. (Piscataway Township, NJ))、次いで、DCに対して、終夜個別にパルスし、TIL培養物6番と共に共培養を続けた (図1B)。
【０１１３】
【表３】
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【０１１４】
【表４】
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【０１１５】
以下のHPLC精製ペプチド (GenScript Inc.)：野生型 (WT)-9-mer：GAGGVGKSA (配列番号7)；変異した (G12D)-9-mer：GADGVGKSA (配列番号8)；WT-10-mer：GAGGVGKSAL (配列番号5)；G12D-10-mer：GADGVGKSAL (配列番号6)を、ペプチド力価実験において使用した。
【０１１６】
Tranら、Science, 344：641-5 (2014)に記載の通り、サイトカインIFN-γ、TNF及びIL-2、並びに脱顆粒マーカー CD107aの発現を決定するために、細胞内サイトカイン染色 (ICS)及びフローサイトメトリーを使用した。簡易には、96ウェルプレートのウェル中で、標的細胞及びエフェクター細胞を組合せ、GolgiStop及びGolgiPlugタンパク質輸送阻害剤の両方（両方とも推奨される濃度の1／2）(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)を培養物に添加した。刺激後、t＝6時間で、Cytofix/Cytopermキット (BD Biosciences)を使用して、製造業者の指示に従って、細胞を処理した。FACSCantoIIフローサイトメーター上で細胞を取得し、FlowJoソフトウェア (TreeStar Inc., Ashland, OR)を使用してデータを分析した。Booleanゲート分析を使用して、表示された数のエフェクター機能 (サイトカイン及び脱顆粒マーカー)を発現している細胞のパーセンテージを決定した。
【０１１７】
KRASG12D反応性T細胞クローンの特定
様々な方法を使用して、4個のKRASG12D反応性TCRを特定した。急速増幅に先立って、注入バッグ中のドミナントなTRBV5-6 (Vβ5.2)クローンを、TILの断片培養物6番から単離した。簡易には、抗Vβ5.2-PE (フィコエリトリン)抗体 (Beckman Coulter, Schaumburg, IL)を用いて、TIL培養物6番を染色し、磁性マイクロビーズにコンジュゲートした抗PE特異的抗体を使用して、製造業者 (Miltenyi Biotec)の指示通りに、Vβ5.2＋細胞を濃縮した。Vβ5.2＋ T細胞から全RNAを単離し (RNeasy Miniキット、Qiagen)、製造業者の指示通りに、TCR-アルファ鎖及びベータ鎖の定常プライマーを使用して、5’RACEを行った (SMARTER RACE cDNA amplificationキット、Clontech)。アルファ鎖及びベータ鎖の定常プライマーの配列は、以下：TCR-アルファ、5’ -GCC ACA GCA CTG TTG CTC TTG AAG TCC-3’ (配列番号59)；TCR-ベータ、5’ -CAG GCA GTA TCT GGA GTC ATT GAG-3 (配列番号60)であった。PCRのために、伸長時間に変更を加えて（3分の代わりに2分）、キットのプログラム1を使用した。次いで、TCRのPCR産物は、標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出（zymogen）によって単離し、次いで産物をシーケンシングした (Macrogen, Seoul, Korea)。
【０１１８】
注入バッグ中の、2番目及び3番目に順位付けられたTCRもまたKRASG12D反応性であり、長いKRASG12Dペプチドで終夜、パルスしたDCを用いて、細胞移入後40日のアフェレーシス試料を最初に刺激することによって単離した。次いで、終夜の刺激後、T細胞活性化マーカーの4-1BBが上方制御されたVβ5.2陽性及び陰性のCD8+ T細胞を、FACSにより別々に選別した。上記の通り、5’RACEを行うのに先立って、Vβ5.2+細胞を更に増幅させ、その後にTCRのPCR産物のTOPO-TAクローニング、及び個々のコロニーのシーケンシングを続け、TCR-アルファ鎖及びベータ鎖を特定した。Pasettoら、Cancer Immunol. Res., (2016)に記載の通り、Vβ5.2陰性細胞で単一細胞のTCRのマルチプレックスPCRを行い、TCR-アルファ鎖及びベータ鎖を特定した。
【０１１９】
4番目のKRASG12D反応性TCR (注入バッグ中において45番目に順位付けられる)は、別の単一細胞技術アプローチを使用して、異なるTIL断片 (TIL断片5番)から特定した。簡易には、TIL培養物5番を、TMG-1 (KRASG12Dをコードする)を用いてトランスフェクトしたDCと共に共培養し、4時間（h）後、TILを回収し、Fluidigm C1システム (Fluidigm, San Francisco, CA)に供し、製造業者のプロトコールに従って、単一細胞のRNA-seq試料を調製した。次いで、Illumina MiSeqシステムにより、単一細胞のRNA-seq試料をシーケンシングし、社内のバイオインフォマティクスプログラムによりデータを分析した。刺激によってIFN-γ転写産物の上方制御を示した試料から、TCR-アルファ及びベータ配列を抽出した。
【０１２０】
KRASG12D反応性T細胞のin vivoでの追跡
試料中におけるKRASG12D反応性T細胞の頻度を決定するために、KRASG12D反応性T細胞クローンのTCR配列を最初に特定し、これらの配列を、表示された試料由来のTCR-Vβディープシーケンシングデータに対してインターロゲートした（interrogated）。試料中のインフレームの実益性のある (productive)TCRのリード数は、522,499〜1,990,345の範囲であった。
【０１２１】
フローサイトメトリー抗体
以下の抗ヒトフローサイトメトリー抗体：CD3-AF700 (クローン：UCHT1, BioLegend)、CD8-PE-Cy7 (クローン：SK1, BD Biosciences)、CD4-APC-Cy7 (クローン：SK3, BioLegend)、OX40-FITC (クローン：Ber-ACT35, BD Biosciences)、4-1BB-APC (クローン：4B4-1, BioLegend)及びVβ5.2-PE (Beckman Coulter)を本報告において使用した。蛍光色素をコンジュゲートした抗マウスTCR-ベータの定常領域抗体 (H57-597, eBioscience)を使用し、TCRの形質導入効率を評価した。IO Test beta Mark TCR Vキットを使用し、TCR-Vβのレパートリーを評価した(Beckman Coulter)。
【０１２２】
変異反応性T細胞の特定及び注入産物の生成
既に記載された方法（Luら、Clin. Cancer Res., 20：3401-10 (2014)；Tranら、Science, 344：641-5 (2014)；Tranら、Science, 350：1387-90 (2015)）を使用して、患者4095に由来するTILが、彼女の転移性肺腫瘍が発現していた体細胞変異を認識できるかどうかをテストした。TIL培養物6番は、最も高い頻度でKRASG12D反応性CD8+ T細胞を含んでおり、従って、Tranら、Science, 344：641-5 (2014)に記載の通り、細胞注入に先立って、2週間の急速増幅過程を行った。
【０１２３】
KRASG12D特異的なT細胞クローンのin vivoでの追跡
患者の注入産物、処置前の3つの別々の肺結節、進行性病変 (病変3)、並びに細胞注入前及び後の様々な時点の末梢血から単離したgDNAにおいてT細胞レセプター (TCR)ディープシーケンシングを行い (Adaptive Biotechnologies, Seattle WA)、KRASG12D反応性TCR配列の頻度をインターロゲートした。
【０１２４】
KRASG12D特異的なTCRの反応性の評価
4つのKRASG12D反応性TCRを特定し、TCR-アルファ鎖及びベータ鎖配列を合成し、次いでMSGV1 レトロウイルスベクター (GenScript Inc.)にクローニングした。Tranら、Science, 344：641-5 (2014)に記載の通り、TCRをコードするレトロウイルス上清を生成し、自己末梢血T細胞を形質導入するために使用した。次いで、TCRを形質導入したT細胞を、様々なKRASペプチドの段階希釈した用量をロードした自己末梢血単核細胞 (PBMC)、又は拘束性のHLA-C*08:02アレルを安定して発現しているか若しくは発現していないKRASG12D陽性膵臓がん細胞株と共に共培養した（Tranら、Science, 350：1387-90 (2015)）。IFN-γELISPOTアッセイ、並びにT細胞活性化マーカーの4-1BB及びOX40のフローサイトメトリー分析 (Tranら、Science, 350：1387-90 (2015))により、T細胞の反応性を翌日に決定した。
【０１２５】
実施例1
本実施例は、KRASG12D変異反応性 CD8+ T細胞のin vivoでの頻度を実証する。
患者は、49歳の女性であり、結腸直腸腺がん及び多発両側肺転移を有していた。既に彼女は、S状結腸切除術及び部分膀胱摘出後に、12サイクルのFOLFOX化学療法を受けており、それに続き膀胱の縫合ラインに対する4182 cGyの放射線照射が行われた。この直後に、彼女にFDGが集中した両側肺結節の数及びサイズの増大が起きた。右下葉結節の生検は転移性の結腸直腸腺がんと一致していた。
【０１２６】
がんの変異を標的とするT細胞を含むex vivoで増幅した腫瘍浸潤リンパ球 (TIL)の養子移入が、転移性の固形がんの退縮を媒介し得るかどうかをテストするために設計した、施設内審査委員会に承認された第II相臨床試験(ClinicalTrials.gov number, NCT01174121)に、患者を登録した。ベースラインCTスキャンによって、がんの進行の唯一のソースとしての肺の疾患が明らかにされた。3つの肺病変は、ビデオ補助胸腔鏡手術(VATS)を使用して切除し、複数の腫瘍断片から24個の個別のTIL培養物を生成した。腫瘍が発現している変異を特定するために、3病変では、また、全エクソーム及びトランスクリプトームシーケンシングを行った(表2)。各TIL培養物を、これらの変異に対する反応性について評価した。患者のTILは、KRASG12D変異を特異的に認識するCD8+ T細胞を含むことが見い出された（図1A及びB）。KRASG12D反応性CD8+ T細胞の頻度が最も高かったTIL培養物を選択した。選択した細胞の数を治療のために増幅した (図1B及びC)。細胞注入に先立って、患者には、2日間の60 mg/kgのシクロフォスファミド、続けて、5日間の25 mg/m2のフルダラビンを含む、骨髄非破壊的なリンパ枯渇化学療法レジメン (Dudleyら、J. Clin. Oncol., 23：2346-57 (2005))を行った。患者に、1.48×1011 TILの単回注入を行い、続けて、720,000 IU/kgのインターロイキン2（IL-2）の5回投与を行い、疲労のために中止していた。該治療に良く耐え、患者は、細胞注入の2週間後に帰宅した。注入産物の約75%は、KRASG12D変異を特異的に認識するCD8+ T細胞を含み、これらのT細胞の大部分は、複数のエフェクターサイトカイン (IFN-γ、TNF及びIL-2)を産生し、細胞溶解の潜在性を示した。7つの転移性肺病変の全てが、細胞移入後の最初の40日の追跡調査において退縮し、1つの病変（病変3）が治療の約9カ月後に進行するまで、6/7の病変は退縮を続けたか又は完全な反応を続けた。細胞移入の約9カ月後、唯一の進行性病変 (病変3)、並びにPET陰性で、病理学分析において生きている腫瘍細胞がなく完全に壊死していた反応性の病変（病変2）を切除するために、左下肺のVATS切除を行った。患者は、肺の切除後3カ月、臨床的な疾患がないままである。
【０１２７】
注入TIL産物は、様々な頻度の少なくとも4つのKRASG12D反応性T細胞クローン型を含んでいた。注入バッグの49.5%、19.1%及び6.9%を構成する、注入産物中の最も高い頻度の3つのTCRは、KRASG12Dに対して反応性である一方で、4番目のKRASG12D反応性TCRは、45番目の頻度であり、注入バッグの0.04%しか存在しなかった（図2A〜2D及び表5）。これらのKRASG12D反応性TCRは、注入の1週間前の患者の末梢血においては、検出されなかった（頻度＜0.0002%、図2A〜2D）。細胞移入後、KRASG12D反応性TCRの生着において劇的な相違が観察された。注入されたT細胞の最もドミナントなクローン型 (〜7.3×1010細胞)は、細胞移入の40日後の血中において検出されなかった一方で、残りのKRASG12D反応性T細胞クローンはこの時点で検出された (図2A〜2D)。末梢血中に残っていたKRASG12D反応性T細胞クローンは、細胞移入の後約9カ月で、末梢血T細胞全体の10.4%、4.5%及び0.005%であり、その時に末梢血中で最もドミナントであったT細胞クローンはTRBV10-02変異KRASG12D反応性TCRであった (図2A〜2D及び表5)。末梢血と比べて進行している腫瘍中では、KRASG12D反応性T細胞クローンの濃縮は起こらないようであった (図2A〜2D)。
【０１２８】
【表５】
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【０１２９】
実施例2
本実施例は、KRASG12D反応性TCRの特異性及び感受性を実証する。
TCRをコードするヌクレオチド配列を、実施例1のKRASG12D反応性T細胞の4つのクローン型の各々からクローニングした。各TCRを、MSGV1-レトロウイルスベクターにクローニングした。4つの各々のTCRのアルファ鎖及びベータ鎖のアミノ酸配列を表6に示す。
【０１３０】
【表６】
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【０１３１】
MSGV1-レトロウイルスベクターにクローニングしたヌクレオチド配列は、TCR アルファ鎖の可変領域（表6に示す）及びマウスTCRアルファ鎖の定常領域をコードし、それにP2Aリンカー配列 (配列番号58)、並びにTCR ベータ鎖の可変領域（表6に示す）及びマウスTCRベータ鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列が続いていた。TCRは、アルファ鎖のマウス定常領域のTM領域において、3アミノ酸の、疎水性アミノ酸との置換（複数可）と組合わせて、α鎖及びβ鎖の両方のマウス定常領域におけるシステイン置換を含むよう更に改変した。4つのTCRの各々の完全長アミノ酸配列を表7に示す。特定の理論又は機構に拘束されることはないが、TCRアルファ及びベータのマウス定常鎖は、内在的なTCRとのミスペアリングが減殺され得、導入されたTCRの宿主細胞による発現を促進し得ると考えられる。また、導入されたTCRアルファ鎖及びベータ鎖の促進された発現及びペアリングは、TCRアルファの定常鎖に疎水性アミノ酸を組み込むこと、並びにアルファ鎖及びベータ鎖の定常領域の間に二番目のジスルフィド結合を導入することにより達成し得ると考えられる。
【０１３２】
【表７】
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【０１３３】
これらの4つのTCRのうちの1つを発現させるために、自己の末梢血T細胞を遺伝的に改変した。TCRは、マウスTCR-アルファ及びベータの定常領域により設計したので、導入されたTCRの細胞表面での発現を、マウスTCR-βの定常領域 (mTCR-β)についてのフローサイトメトリー分析により、TCR遺伝子を改変した10日後に評価した。ベクター導入細胞を陰性対照とした。データは、CD8+ T細胞上でゲートした（are gated were gated）。マウスTCR-β定常領域を発現している細胞のパーセンテージを表8に示す。
【０１３４】
【表８】
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【０１３５】
段階的な量のKRASの野生型 (WT)又はG12D変異9-mer若しくは10-merのペプチドを用いてインキュベートした自己PBMCと共に、TCR改変T細胞を、終夜、共培養した。T細胞活性化マーカーの4-1BBを発現している細胞のパーセンテージを測定した。結果を図3A〜3Dに示す。4つのTCRのうちの3つは、9アミノ酸長のKRASG12Dペプチド
【０１３６】
【化２】
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【０１３７】
に対して選択的に反応性であった一方で、1つのTCRは、10アミノ酸長のKRASG12Dペプチド
【０１３８】
【化３】
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【０１３９】
に対してのみ反応性であった (図3A〜3D)。全てのTCRは、変異に特異的であり、野生型KRASペプチドを認識しなかった (図3A〜3D)。ペプチドの力価実験によって、自己PBMCに対してパルスした場合、TCRは1〜10 nMの間の濃度でペプチドを認識することができることが実証された (図3A〜3D)。
【０１４０】
HLA-C*08:02アレルを発現していないか又は発現している、2つのKRASG12D陽性膵臓がん細胞株のうちの1つ (MDA-Panc48又はHPAC)と共に、TCR改変T細胞を、終夜、共培養した。ELISPOTアッセイによりIFN-γの分泌を測定し、フローサイトメトリーにより4-1BB発現を測定した。結果を図4A〜4Bに示す。膵臓がん細胞株が、KRASG12D変異及びHLA-C*08:02アレルの両方を発現していた場合にのみ、TCRは膵臓がん細胞株を特異的に認識した (図4A〜4B)。
【０１４１】
実施例3
本実施例は、TRAV12-2/TRBV10-2 TCR (配列番号56及び57)を発現するよう形質導入した細胞は、HLAアレル C*08:02又はC*05:01の関連で、変異KRASを認識することを実証する。
実施例2に記載の通り、4つのTCRのうちの1つを発現させるために、自己末梢血T細胞を遺伝的に改変した。COS7細胞は、完全長の野生型 (wt)KRAS又はKRAS-G12D遺伝子、及びHLAアレルC*07:01、C*08:02又はC*05:01を用いて共トランスフェクションし、その後、表示されたKRASG12D反応性TCR導入細胞と共に共培養を続けた。その次の日、フローサイトメトリーにより、4-1BBの発現について細胞を分析した。結果は、図5A〜5Dに示されている。データは、TCRを形質導入した (マウスTCRβ+) CD8+ T細胞でゲートした。HLA-C*07:01を陰性対照のHLAアレルとした。
【０１４２】
本明細書において引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個別に、具体的に、参照によって取り込まれることが示されているのと同程度に、かつ全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参照することによって本明細書に取り込まれる。
【０１４３】
本発明を記載する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「a」及び「an」及び「the」及び「少なくとも1つ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、単数及び複数形の両方を含むものとして解釈されるべきである。1以上の項目の列記が続く、用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「A及びBの少なくとも1つ」）は、本明細書に別段の記載がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、列記された項目から選択された１つの項目（A又はB）、又は列記された項目の2以上の任意の組合せ（A及びB）を意味するものとして解釈されるべきである。「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」及び「含有する（containing）」という用語は、別段の記載がない限り、制限のない用語（open-ended terms）（即ち、「含むが、これに限定されない（including, but not limited to）」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中に別段の指示がない限り、単に範囲内の各別個の値を個別に指す簡略方法として役立つことを意図しており、本明細書において個々の値はそれぞれ個別に列挙されているかのように、個々の値は明細書に取り込まれる。本明細書中に記載された全ての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は特に文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施し得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば「など（such as）」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠であるとして、特許請求されていない任意の要素を示すものと解釈されるべきではない。
【０１４４】
本発明を実施するための発明者が知るベストモードを含む、本発明の好ましい実施形態は、本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読むことで当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用することを予測し、本発明者らは本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることを意図する。従って、本発明は適用法によって許容されるように、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載された主題の全ての改変及び均等物を含む。更に、本明細書中で別段の指示がない限り、又は特に文脈によって明らかに矛盾しない限り、それらの全ての可能な変形における上記要素の任意の組合せが本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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