(57)【要約】本発明は疼痛を軽減または処置する組成物に関する。本発明の医薬組成物は、ＧＡＤ、ＩＬ−１０およびＧＤＮＦをコードする遺伝子からなる群から選択される２つ以上を含む。本発明の医薬組成物は遺伝子を同時投与するため、個別投与の用量よりも低い用量で優れた鎮痛効果を示し、したがって従来の副作用および毒性が減少し得る。したがって、本発明の医薬組成物は疼痛を軽減または処置するのに有用であり得る。
2019537595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）をコードする遺伝子、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）をコードする遺伝子、およびグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をコードする遺伝子からなる群から選択される２つ以上を含む、疼痛を軽減または処置する医薬組成物。
【請求項２】
遺伝子がベクター中に動作可能に含まれた形態である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスおよびポックスウイルスからなる群から選択される少なくとも１つのウイルスベクターである、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
ベクターが、プラスミド、リポソーム、カチオン性ポリマー、ミセル、エマルジョンおよび固体脂質ナノ粒子からなる群から選択される少なくとも１つの非ウイルスベクターである、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＧＡＤがＧＡＤ６５またはＧＡＤ６７である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＧＡＤをコードする遺伝子が、配列番号１、配列番号４、配列番号３２、配列番号３４または配列番号３６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＧＡＤをコードする遺伝子が、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号３３、配列番号３５または配列番号３７に示されるヌクレオチド配列である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＩＬ−１０をコードする遺伝子が、配列番号６、配列番号９、配列番号３８、配列番号４０または配列番号４２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＩＬ−１０をコードする遺伝子が、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４１または配列番号４３に示されるヌクレオチド配列である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＧＤＮＦをコードする遺伝子が、配列番号１１、配列番号４４、配列番号４６または配列番号４８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＧＤＮＦをコードする遺伝子が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号４５、配列番号４７または配列番号４９に示されるヌクレオチド配列である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１２】
疼痛が、侵害受容性疼痛、心因性疼痛、炎症性疼痛、病的疼痛、神経障害性疼痛、がん性疼痛、術後疼痛、三叉神経痛、特発性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛または片頭痛である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
生理学的に許容され得る担体をさらに含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
注射剤である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、疼痛を軽減または処置する方法。
【請求項１６】
投与が硬膜外注射または髄腔内注射による投与である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
疼痛が、侵害受容性疼痛、心因性疼痛、炎症性疼痛、病的疼痛、神経障害性疼痛、がん性疼痛、術後疼痛、三叉神経痛、特発性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛または片頭痛である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
疼痛を軽減または処置するための請求項１記載の医薬組成物の使用。
【請求項１９】
疼痛を軽減または処置する治療薬を調製するための請求項１記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疼痛を軽減または処置する組成物および該組成物を用いて疼痛を軽減または処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疼痛は、実際のもしくは潜在的な組織損傷またはそのような損傷に関連する不快な感覚および感情の経験を意味する。疼痛は、損傷した組織を損傷した状態から治癒する間、損傷した身体の部分を保護し、将来類似の経験を避ける動機を与える。ほとんどの疼痛は原因となる刺激が除去されると徐々に軽減するが、刺激が消失して損傷が明らかに治癒し、組織が治癒しているにもかかわらず疼痛が持続する場合があり、または疼痛はいかなる刺激、損傷もしくは疾患もない状態で起こる場合がある。
【０００３】
疼痛の処置のために、主にオピオイドアルカロイドである麻薬性鎮痛剤（モルヒネなど）、または非麻薬性鎮痛剤（アセチルサリチル酸、イブプロフェンまたはアセトアミノフェンの成分を有する非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）など）が広く用いられている。
【０００４】
麻薬性鎮痛剤は用量反応および高い有効性を示すという利点があるが、麻薬性鎮痛剤は神経系の副作用を導き得、長期間使用した場合、抵抗性および身体的依存を導き得、疼痛が悪化し得る。
【０００５】
アセチルサリチル酸を主成分とする非麻薬性鎮痛剤であるアスピリンを鎮痛目的で使用する場合、アスピリンは少なくとも５００ｍｇの高用量で投与されるべきである。しかしながら、アスピリンは胃を保護するプロスタグランジンの産生を促進する酵素（ＣＯＸ−１）を遮断する非ステロイド性抗炎症鎮痛剤であり、これにより胃粘膜形成を妨げる。したがって、胃は胃酸によって容易に損傷し得、消化管出血が起こり得る。さらに、イブプロフェンもまた非ステロイド性抗炎症鎮痛剤であり、胃の障害を引き起こし得る。また、アセトアミノフェンを主成分とする鎮痛剤（タイレノールなど）の場合、アセトアミノフェンの大部分は肝臓で代謝され、肝臓の損傷を誘導し得る。
【０００６】
上記の鎮痛剤が初期段階において有効であったとしても、長期間使用される場合には抵抗性のために無効になることが多い。具体的には、神経障害性疼痛の場合には、疼痛は最大投与量の非ステロイド性抗炎症物質に反応しないため、短期間に高用量で投与されるという問題がある。
【０００７】
最近、神経障害性疼痛の新規な治療薬が開発されているが、未だ副作用がある。例えば、ナトリウムチャネル遮断薬は大部分が小分子の形態であり、アイソフォームタンパク質の低い選択性を示す。さらに、これらは心毒性および運動障害などの副作用を示す。
【０００８】
したがって、副作用を減少させつつ鎮痛効果が優れている神経障害性疼痛のための新規な鎮痛剤を開発することが緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
技術的問題
したがって、本発明者らは、低用量においても優れた鎮痛効果を示す神経障害性疼痛の新規な鎮痛剤を開発することを試みた。結果として、本発明者らは、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、抗炎症性サイトカインおよびグリア細胞由来神経栄養因子のうち２つ以上の組合せを使用した場合に、疼痛が個別の使用と比較して有意に軽減または処置され得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
問題に対する解決方法
本発明は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）をコードする遺伝子、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）をコードする遺伝子、およびグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をコードする遺伝子からなる群から選択される２つ以上を含む、疼痛を軽減または処置する医薬組成物を提供する。
【００１１】
さらに本発明は、本発明における医薬組成物を投与することを含む、疼痛を軽減または処置する方法を提供する。
【００１２】
本発明の有利な効果
本発明の医薬組成物は、ＧＡＤ、ＩＬ−１０およびＧＤＮＦをコードする遺伝子からなる群から選択される２つ以上を含む。したがって、本発明の医薬組成物は遺伝子を同時投与しているため、個別投与の用量よりも低い用量で優れた鎮痛効果を示し、したがって従来の副作用および毒性が減少し得る。したがって、本発明の医薬組成物は、疼痛の軽減または処置に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、組換えアデノ随伴ウイルスの作成に使用したプラスミドｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉの模式図を示す：（ａ）はｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５の模式図を示し、（ｂ）はｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉの模式図を示す。
【００１４】
【図２】図２は、組換えアデノ随伴ウイルスの作成に使用したプラスミドｐＡＡＶ−ＩＬ−１０の模式図を示す。
【００１５】
【図３】図３は、組換えアデノ随伴ウイルスの作成に使用したプラスミドｐＡＡＶ−ＧＤＮＦの模式図を示す。
【００１６】
【図４】図４は、ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０プラスミドを示す模式図である。
【００１７】
【図５】図５は、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０またはｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドによって導入された各遺伝子の発現を示す：  （ａ）はｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５プラスミドによるＧＡＤ６５の発現を示す；（ｂ）はｐＡＡＶ−ＩＬ−１０プラスミドによるＩＬ−１０の発現を示す；および（ｃ）はｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドによるＧＤＮＦの発現を示す。
【００１８】
【図６】図６は、ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０プラスミドによるＧＤＮＦ遺伝子およびＩＬ−１０遺伝子の発現を示す：  （ａ）はｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０プラスミドによるＩＬ−１０の発現を示す；および（ｂ）はｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０プラスミドによるＧＤＮＦの発現を示す。
【００１９】
【図７】図７は、ＧＡＤ６５遺伝子、ＩＬ−１０遺伝子およびＧＤＮＦ遺伝子をそれぞれ導入した組換えアデノ随伴ウイルスを作成した後、２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞を各組換えアデノ随伴ウイルスで処理した後の各タンパク質の発現を示すウエスタンブロットの結果を示す：  （ａ）は、２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞を組換えアデノ随伴ウイルスＡＡＶ−ＧＡＤ６５で処理した後のＧＡＤ６５の発現を示す；（ｂ）は、２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞を組換えアデノ随伴ウイルスＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉで処理した後のＧＡＤ６５の発現を示す；（ｃ）は、２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞を組換えアデノ随伴ウイルスＡＡＶ−ＩＬ−１０で処理した後のＩＬ−１０の発現を示す；および（ｄ）は、２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞を組換えアデノ随伴ウイルスＡＡＶ−ＧＤＮＦで処理した後のＧＤＮＦの発現を示す。
【００２０】
【図８】図８は、２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞を組換えアデノ随伴ウイルスＡＡＶ−ＧＡＤ６５またはＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉで処理した後、ＥＬＩＳＡで測定されたＧＡＢＡ発現のレベルを示す。  （ａ）は、２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞を組換えアデノ随伴ウイルスＡＡＶ−ＧＡＤ６５で処理した後のＧＡＢＡ発現のレベルを示すグラフである；および（ｂ）は、２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞を組換えアデノ随伴ウイルスＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉで処理した後のＧＡＢＡ発現のレベルを示すグラフである。
【００２１】
【図９】図９は、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０またはＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの個別投与と、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルス、またはＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの同時投与との間で疼痛軽減効果を比較した結果を示すグラフである。
【００２２】
【図１０】図１０は、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０またはＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの個別投与と、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＩＬ−１０ウイルスの同時投与との間で疼痛軽減効果を比較した結果を示すグラフである。
【００２３】
【図１１】図１１は、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルス、またはＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの同時投与と、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルス全ての同時投与との間で疼痛軽減効果を比較した結果を示すグラフである。
【００２４】
【図１２】図１２は、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０またはｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの個別投与と、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミド、またはｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの同時投与との間で疼痛軽減効果を比較した結果を示すグラフである。
【００２５】
【図１３】図１３は、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０またはｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの個別投与と、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミド全ての同時投与との間で疼痛軽減効果を比較した結果を示すグラフである。
【００２６】
【図１４】図１４は、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミド、またはｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの同時投与と、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミド全ての同時投与との間で疼痛軽減効果を比較した結果を示すグラフである。
【００２７】
【図１５】図１５は、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉおよびＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０ウイルスの同時投与と、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルス全ての同時投与との間で疼痛軽減効果を比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に、本発明を詳細に記述する。
【００２９】
本発明は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）をコードする遺伝子、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）をコードする遺伝子、およびグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をコードする遺伝子からなる群から選択される２つ以上を含む、疼痛を軽減または処置する医薬組成物を提供する。
【００３０】
ある実施態様において、２つ以上の組み合わせは、ＧＡＤおよびＩＬ−１０、ＧＡＤおよびＧＤＮＦ、ＩＬ−１０およびＧＤＮＦ、またはＧＡＤ、ＩＬ−１０およびＧＤＮＦであり得る。
【００３１】
ＧＡＤをコードする遺伝子、ＩＬ−１０をコードする遺伝子およびＧＤＮＦをコードする遺伝子からなる群から選択される２つ以上の遺伝子は、担体中に含まれた形態であり得る。本明細書において、担体はウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（プラスミドおよびリポソームなど）であり得る。さらに遺伝子は、いくつかの遺伝子がウイルスベクター中に含まれ、残りの遺伝子が非ウイルスベクター中に含まれた形態であり得る。
【００３２】
ある実施態様において、遺伝子は、ＧＡＤがウイルスベクター中に含まれ、ＩＬ−１０が非ウイルスベクター中に含まれた形態であり得る。さらに遺伝子は、ＧＡＤがウイルスベクター中に含まれ、ＧＤＮＦが非ウイルスベクター中に含まれた形態であり得る。さらに遺伝子は、ＩＬ−１０がウイルスベクター中に含まれ、ＧＤＮＦが非ウイルスベクター中に含まれた形態であり得る。さらに遺伝子は、ＧＡＤがウイルスベクター中に含まれ、ＩＬ−１０およびＧＤＮＦが非ウイルスベクター中に含まれた形態であり得る。さらに遺伝子は、ＧＡＤおよびＩＬ−１０がウイルスベクター中に含まれ、ＧＤＮＦが非ウイルスベクター中に含まれた形態であり得る。さらに遺伝子は、ＧＡＤおよびＧＤＮＦがウイルスベクター中に含まれ、ＩＬ−１０が非ウイルスベクター中に含まれた形態であり得る。さらに遺伝子は、ＩＬ−１０がウイルスベクター中に含まれ、ＧＡＤおよびＧＤＮＦが非ウイルスベクター中に含まれた形態であり得る。さらに遺伝子は、ＩＬ−１０およびＧＤＮＦがウイルスベクター中に含まれ、ＧＡＤが非ウイルスベクター中に含まれた形態であり得る。また遺伝子は、ＧＤＮＦがウイルスベクター中に含まれ、ＧＡＤおよびＩＬ−１０が非ウイルスベクター中に含まれた形態であり得る。
【００３３】
さらに遺伝子は、ベクター中に動作可能に含まれた形態であり得る。具体的には、遺伝子は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター中に動作可能に含まれた形態であり得る。
【００３４】
ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルスおよびポックスウイルスなどからなる群から選択される少なくとも１つであり得る。具体的には、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスであり得る。
【００３５】
ある実施態様において、ＧＡＤをコードする遺伝子は担体１（例えば第１のベクター）中に動作可能に含まれ得、ＩＬ−１０をコードする遺伝子は担体２（例えば第２のベクター）中に動作可能に含まれ得、ＧＤＮＦをコードする遺伝子は担体３（例えば第３のベクター）中に動作可能に含まれ得る。さらに、１つの担体は２以上の遺伝子を含み得る。
【００３６】
非ウイルスベクターは、プラスミド、リポソーム、カチオン性ポリマー、ミセル、エマルジョンおよび固体脂質ナノ粒子からなる群から選択される少なくとも１つであり得る。
【００３７】
本明細書における用語「プラスミド」は、細菌の染色体の外側に別個に存在する環状ＤＮＡフラグメントを指す。プラスミドは細菌の生存に必須の遺伝子を持たないが、特定の抗生物質に対する抵抗性に必須の遺伝子および細菌間の遺伝子交換に必須な遺伝子を含む。さらに、プラスミドは染色体とは独立に増殖し得、選択可能なマーカーを含み得る。
【００３８】
本明細書における用語「リポソーム」は、分子内に疎水性部分および親水性部分の両方を有する分子（リン脂質など）を水溶液に懸濁した場合に、親水性部分および疎水性部分による二重層を形成することによって生成される小胞を指す。リポソームは脂質二重層で構成される膜によって外膜から単離され、ＤＮＡおよびｍＲＮＡなどを含むリポソームは遺伝情報のメディエーターとして使用され得る。
【００３９】
本明細書における用語「カチオン性ポリマー」は、アニオン性ＤＮＡとのイオン結合によって複合体を形成し、ＤＮＡを細胞内に送達する物質であるカチオン性脂質またはポリマー化合物を指す。
【００４０】
本明細書における用語「ミセル」は、極性基および非極性疎水性基からなる分子（界面活性物質および脂質分子など）から溶液中のファンデルワールス力などによる会合によって形成される熱力学的に安定なコロイド状凝集体を指す。さらに、ＤＮＡおよびｍＲＮＡなどを含むミセルは遺伝情報のメディエーターとして使用され得る。
【００４１】
本明細書における用語「エマルジョン」は、異なる相の２つの溶液を混合した場合に、一方の液体が微粒子を形成し、他方の液体中に分散することを意味する。ＤＮＡおよびｍＲＮＡなどがエマルジョン粒子の中心に含まれ得、遺伝情報のメディエーターとして使用され得る。
【００４２】
本明細書において、用語「固体脂質ナノ粒子」は、液体脂質の代わりに固体脂質で作成されたナノサイズの微粒子中に薬物が含まれている形態の調製物を指す。
【００４３】
本発明におけるＧＡＤ、ＩＬ−１０およびＧＤＮＦからなる群から選択される任意の１つの遺伝子を含む担体１（例えば第１のベクター）および担体１に含まれていない残りの遺伝子群から選択される任意の１つの遺伝子を含む担体２（例えば第２のベクター）は、単位体積当たりのウイルス力価に基づく混合比が１：１〜１００または１〜１００：１であり得る。具体的には、担体１と担体２との単位体積当たりのウイルス力価に基づく混合比は、１：１〜１０または１〜１０：１であり得る。
【００４４】
本発明におけるＧＡＤをコードする遺伝子を含む担体１（例えば第１のベクター）、ＩＬ−１０をコードする遺伝子を含む担体２（例えば第２のベクター）、およびＧＤＮＦをコードする遺伝子を含む担体３（例えば第３のベクター）は、単位体積当たりのウイルス力価に基づく混合比が１：０．１〜１０：０．１〜１０であり得る。
【００４５】
本明細書において、用語「動作可能に」は、発現が宿主細胞中で起こり得るように、導入遺伝子が調節配列に連結していることを意味する。調節配列は遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列であり、他の調節エレメント（プロモーターおよびエンハンサーなど）またはポリアデニル化を含み得る。さらに、調節配列は導入遺伝子の発現を制御する転写因子の結合部位を提供し、転写因子との複合体構造に影響を与えて転写因子の機能を決定し得る。
【００４６】
本明細書における用語「ＧＡＤ」は、グルタミン酸塩を脱炭酸してＧＡＢＡ（ガンマアミノ酪酸）を生成する酵素を指す。ＧＡＤはＧＡＤ６５またはＧＡＤ６７であり得る。具体的には、ＧＡＤ６５はヒト、ラット、イヌ、ネコまたはウマに由来し得るが、これらに限定されない。ＧＡＤをコードする遺伝子は、配列番号１、４、３２、３４または３６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり得る。
【００４７】
さらに、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２または３に示されるＤＮＡ配列であり得、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００８１８．２に示されるｍＲＮＡ配列であり得る。さらに、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるＤＮＡ配列に適合するようにコドン最適化されたヌクレオチド配列、または配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であり得、これはＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００８１７．２に示されるｍＲＮＡ配列であり得る。さらに、配列番号３２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３３に示されるＤＮＡ配列であり得る。配列番号３４に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号３５に示されるＤＮＡ配列であり得、配列番号３６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７に示されるＤＮＡ配列であり得る。
【００４８】
さらに、ＧＡＤをコードする遺伝子は、ＧＡＤ活性を保持し得、ＧＡＢＡを生成し得るＧＡＤ変異体をコードするヌクレオチド配列であり得る。ＧＡＤ変異体は、ＧＡＢＡを生成するというＧＡＤの特徴を保持するあらゆる配列を含む。いずれの配列にも限定されないが、ＧＡＤ変異体をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは上述のＧＡＤアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり得、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり得る。
【００４９】
さらに、ＧＡＤ変異体をコードするヌクレオチド配列は、上述のＧＡＤヌクレオチド配列と少なくとも６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列であり得、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【００５０】
「配列相同性の％」は、２つの配列が最適にアラインした状態において比較領域を比較することによって決定される。さらに、比較領域におけるヌクレオチド配列のいくつかは、２つの配列の最適なアラインメントのために（負荷または欠失（すなわちギャップ）を持たない）参照配列に対して付加または欠失を含み得る。
【００５１】
本明細書における用語「ＩＬ−１０」は、クラスＩＩサイトカインに属する抗炎症性サイトカインを指す(Renauld, Nat Rev Immunol, 2003)。ＩＬ−１０は２つのサブユニットからなるホモ二量体の形態であり、各サブユニットは１７８アミノ酸長である。ＩＬ−１０はヒトにおいてサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）としても知られている。ＩＬ−１０は免疫応答においてＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の活性を阻害する機能を果たし、ＩＬ−１０受容体と複合体を形成してシグナル伝達に関与する。ＩＬ−１０はヒト、ラット、イヌ、ネコまたはウマに由来するタンパク質であり得るが、これらに限定されない。ＩＬ−１０をコードする遺伝子は、配列番号６、９、３８、４０または４２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり得る。
【００５２】
具体的には、配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７または８に示されるＤＮＡ配列であり得、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１２８５４．２に示されるｍＲＮＡ配列であり得る。さらに、配列番号９に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０または１４に示されるＤＮＡ配列であり得、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００５７２．２に示されるｍＲＮＡ配列であり得る。配列番号３８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３９に示されるＤＮＡ配列であり得る。さらに、配列番号４０に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号４１に示されるＤＮＡ配列であり得、配列番号４２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号４３に示されるＤＮＡであり得る。
【００５３】
さらに、ＩＬ−１０をコードする遺伝子は、ＩＬ−１０の活性を保持するＩＬ−１０変異体をコードするヌクレオチド配列であり得る。ＩＬ−１０変異体をコードするヌクレオチド配列は、上記で示されるＩＬ−１０アミノ酸配列と少なくとも６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり得、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり得る。
【００５４】
ＩＬ−１０変異体をコードするヌクレオチド配列は、上記で示されるＩＬ−１０ヌクレオチド配列と少なくとも６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列であり得、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【００５５】
本明細書における用語「ＧＤＮＦ」は、ＧＤＮＦリガンドファミリーを構成するタンパク質を指す。ＧＤＮＦリガンドファミリーは、ＧＤＮＦ、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）およびパーセフィン（ＰＳＰＮ）からなる。さらに、ＧＤＮＦは様々な種類のニューロンの生存を促進し、ＧＦＲα１受容体を介してシグナルを伝達するタンパク質である。ＧＤＮＦはヒト、ラット、イヌ、ネコまたはウマに由来するタンパク質であり得るが、これらに限定されない。ＧＤＮＦをコードする遺伝子は、配列番号１１、４４、４６または４８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり得る。
【００５６】
具体的には、配列番号１１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２または１３に示されるＤＮＡ配列であり得、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿１９９２３１．２に示されるｍＲＮＡ配列であり得る。さらに、配列番号４４に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４５に示されるＤＮＡ配列であり得る。配列番号４６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号４７に示されるＤＮＡ配列であり得、配列番号４８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号４９に示されるＤＮＡ配列であり得る。
【００５７】
さらに、ＧＤＮＦをコードする遺伝子は、ＧＤＮＦの活性を保持するＧＤＮＦ変異体をコードするヌクレオチド配列であり得る。ＧＤＮＦ変異体をコードするヌクレオチド配列は、上記で示されるＧＤＮＦアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり得、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり得る。
【００５８】
さらに、ＧＤＮＦ変異体をコードするヌクレオチド配列は、上記で示されるＧＤＮＦヌクレオチド配列と少なくとも６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列であり得、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【００５９】
ＧＡＤ遺伝子の産物であるＧＡＢＡは疼痛のシグナル伝達を遮断する効果を有するが、過剰量はそう痒、めまい、眠気などの症状、および心拍数または呼吸数の増加などの副作用を生じ得る(Longo, Am Fam Physician, 2000)。
【００６０】
ＩＬ−１０は抗炎症作用を示すサイトカインとして知られているが、インフルエンザ症状などの副作用が起こり得る(Friedrich, J Invest Dermatol, 2002)。
【００６１】
さらに、ＧＤＮＦの発現は様々な疼痛（神経障害性疼痛など）に対して鎮痛効果を示すことが知られているが、過剰量の投与が脳の神経損傷を引き起こしたことがサルの実験において報告されている(Hovland, Toxicol Pathol, 2007)。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、少量の遺伝子またはそれを含む担体を用いて鎮痛作用を示し得る。本発明の医薬組成物は、ＧＡＤをコードする遺伝子を含むベクター、神経組織中の抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子を含むベクター、および/またはＧＤＮＦをコードする遺伝子を含むベクターからなる。そして異なる鎮痛機構を有する物質を同時投与することによって、個別投与の用量よりも低い用量で同一またはより良い疼痛の軽減または処置の効果を達成できる。
【００６３】
特に本発明において、ＧＡＤ６５、ＩＬ−１０およびＧＤＮＦをコードする遺伝子からなる群から選択される２つ以上の遺伝子を同時投与する場合、相乗的な疼痛軽減効果が起こる。したがって、本発明の医薬組成物は、疼痛を軽減または処置するのに有用であり得る。
【００６４】
本発明のある実施態様において、第１のベクター、第２のベクターおよび／または第３のベクターはアデノ随伴ウイルスであり得る。アデノ随伴ウイルスは特定の血清型に限定されないが、好ましくはＡＡＶ１〜ＡＡＶ９のいずれかであり得る。
【００６５】
疼痛は、侵害受容性疼痛、心因性疼痛、炎症性疼痛、病的疼痛、神経障害性疼痛、がん性疼痛、術後疼痛、三叉神経痛、特発性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛、または片頭痛からなる群から選択され得る。具体的な例において、疼痛は腰仙部神経根障害（ＬＳＲ）であり得る。
【００６６】
炎症性疼痛は組織損傷および免疫細胞の浸潤に関連する疼痛を指す。さらに、病的疼痛は疼痛が神経組織への損傷またはその異常な機能によって起こる病状を意味する。また、病的疼痛は機能不全性疼痛（線維筋痛症、過敏性腸症候群または緊張性頭痛など）であり得る。
【００６７】
さらに、疼痛は解剖学的に区別され得る背部痛を含み得る：頚部痛、中背部痛、下背部痛または尾骨痛。さらに、疼痛は、神経障害性疼痛、がん性疼痛、術後疼痛、三叉神経痛、特発性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛および片頭痛などからなる群から選択される少なくとも１つであり得る。具体的な例において、疼痛は腰仙部神経根障害であり得る。
【００６８】
神経障害性疼痛は体性感覚系に影響を与える損傷または疾患によって起こり得る。神経因性疼痛は異痛症と呼ばれる知覚異常および感覚異常であり得る。さらに神経障害性疼痛の一般的な特徴には、熱感または冷感、ピリピリとしたしびれ、しびれ感およびそう痒が含まれる。対照的に、侵害受容性疼痛は痛みとして発現することが多い。
【００６９】
さらに、片頭痛は多数の自律神経系症状に関連し、正常から重篤な重症度の頭痛を引き起こす慢性障害である。片頭痛は大脳皮質の興奮性の増加および脳幹の三叉神経核における疼痛ニューロン(pain neuron)の異常制御に関連していることが知られている(Noseda, Pain, 2013)。
【００７０】
具体的には、本発明の医薬組成物は、神経障害性疼痛および慢性がん性疼痛を軽減または処置するのに使用され得る。
【００７１】
本明細書において、用語「軽減または処置する」は、本発明の医薬組成物を投与することによって疼痛症状を有益な方向に改善または変更するあらゆる作用を意味する。
【００７２】
本発明の医薬組成物は生理的に許容され得る担体をさらに含み得る。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の調製に通常使用される適切な賦形剤および希釈剤をさらに含み得る。さらに、本発明の医薬組成物は、それらを経口製剤（粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなど）、外用製剤、坐剤、または注射剤として一般的な方法によって調製することにより使用され得る。具体的には、医薬組成物は注射剤の形態であり得る。当分野で公知の適切な製剤に関して、Remington’s Pharmaceutical Science (1985)に記載の製剤が使用され得る。
【００７３】
さらに、医薬組成物は、塩（塩化ナトリウム）、ラクトース、ブドウ糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油などを担体、賦形剤および希釈剤として含み得る。本発明の医薬組成物の製剤のために、一般的に使用される希釈剤または賦形剤（充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤など）が利用され得る。
【００７４】
非経口投与用の製剤には、滅菌溶液、非水性溶媒、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥製剤および坐剤が含まれ得る。プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびエチルオラート(ethylolate)などの注射用エステルなどが、非水性溶媒および懸濁液に使用され得る。Ｗｉｔｅｐｓｏｌ、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ ６１、カカオ油、ラウリン油(laurin oil)、グリセロゼラチンなどが坐剤の基剤に使用され得る。
【００７５】
本発明はまた、ＧＡＤ、ＩＬ−１０およびＧＤＮＦをコードする遺伝子からなる群から選択される２つ以上を含む医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、疼痛を軽減または処置する方法を提供する。
【００７６】
疼痛は、医薬組成物に関して上述されたものである。
【００７７】
対象は、ヒトを含む哺乳類、またはヒトを含む哺乳類から単離された細胞および／または組織であり得る。本明細書における用語「非ヒト動物」は、哺乳類および非哺乳類（霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類など）を含むあらゆる脊椎動物を包含することが意図される。
【００７８】
投与経路、投与量および投与頻度に関して、医薬組成物は患者の状態および副作用の有無に応じて様々な方法および量で対象に投与され得、最適な投与方法、投与量および投与頻度の範囲は当業者によって適切に選択され得る。さらに医薬組成物は、別の薬物または処置される障害に対して治療効果を示すことが知られている生理活性物質と組み合わせて投与され得る。また医薬組成物は、併用製剤の形態で調製され得る。
【００７９】
具体的には、本発明の医薬組成物は、注射剤の形態で提供され得る。例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、硬膜外注射または髄腔内注射などが含まれ得る。具体的には、医薬組成物は硬膜外注射または髄腔内注射によって投与され得、より具体的には、経椎間孔硬膜外注射(transforaminal epidural injection)または髄腔内注射によって投与され得る。
【００８０】
本明細書において、用語「経椎間孔硬膜外注射」は、神経が脊髄から脊椎骨の間の空間を通って出てくる空間である椎間孔の内側、ならびに脊髄および脊髄神経を囲む硬膜の外側の空間に薬物を注射する方法を指す。ある実施態様において、本発明の医薬組成物がウイルスで構成されている場合、薬物は硬膜外注射療法を行うことによって対象の椎間孔の内側に投与され得る。
【００８１】
本明細書において、用語「髄腔内注射」は、薬物を脊柱管の硬膜の内側の空間に注射することによる投与方法を指す。ある実施態様において、本発明の医薬組成物がプラスミドで構成されている場合、薬物は髄腔内注射療法を行うことによって対象の脊柱管の内側に投与され得る。
【００８２】
具体的には、医薬組成物がウイルスベクターで構成されている場合、医薬組成物は成人基準に対して１．０×１０６〜１．０×１０１４ｖｇの量で投与され得る。さらに、２種類のウイルスが投与される場合、各種類のウイルスは５．０×１０５〜５．０×１０１３ｖｇの量で投与され得る。３種類のウイルスが投与される場合、各種類のウイルスは３．０×１０５〜３．０×１０１３ｖｇの量で投与され得る。
【００８３】
さらに、医薬組成物が非ウイルスベクターで構成されている場合、医薬組成物は成人基準に対して０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で投与され得る。また、医薬組成物がプラスミドベクターで構成されている場合、投与量は、０．１ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌまたはそれ以上であり得、これらの間のあらゆる値および範囲を含む。
【００８４】
ウイルスベクターの投与頻度に関して、ウイルスベクターは１回以上、または１〜１０回投与され得る。また、ウイルスベクターは１日〜１ヶ月、または反復投与の場合には１ヶ月〜１年の間隔で投与され得る。さらに、医薬組成物が非ウイルスベクターで構成されている場合、医薬組成物は１回以上、または１〜１０回投与され得る。また、反復投与の場合には、医薬組成物は１２〜２４時間または１〜１４日の間隔で投与され得る。
【００８５】
本発明は、疼痛を軽減または処置するための本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【００８６】
本発明は、疼痛を軽減または処置する治療薬を調製するための本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【００８７】
本発明を実施するための形態
以下に、本発明を実施例に関連して詳細に記述する。しかしながら、以下の実施例は単なる説明の目的に過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００８８】
実施例１．組換えアデノ随伴ウイルスの調製および特性解析
本発明に必要なアデノ随伴ウイルスを作成し、ＡＡＶヘルパーフリーシステム(Agilent)に基づいて生成した。
【００８９】
実施例１．１．ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５プラスミドの作成
図１のｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５プラスミドを作成するために、ｐＪＤＫ−ｒＧＡＤ６５(Lee, Gene Ther, 2005)のＣＭＶプロモーター領域をＰＣＲで増幅し、結果物をｐＧＥＭ−Ｔ(Promega)に導入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶを作成した。ＣＭＶプロモーターの増幅に使用したプライマー配列は以下である：
Ｆ−ＪＤＫ（配列番号１５）：５’−ＴＴＣＧＧＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣＡＴＴＧ−３’
Ｒ−ＪＤＫ（配列番号１６）：５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧ−３’。
【００９０】
ＧＡＤ６５遺伝子に関して、配列番号３に示される遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるヒトＧＡＤ６５（ＮＣＢＩ ＮＭ＿０００８１８．２）に基づいてヒトに適合するようにコドン最適化によって設計され、遺伝子合成のためにＢｉｏｎｅｅｒに付託された。ｐＧＥＭ−Ｔに導入されたｈＧＡＤ６５遺伝子をＮｈｅＩおよびＳａｌＩで処理し、１．７ＫｂのＤＮＡフラグメントを調製した。その後、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶをＮｈｅＩおよびＳａｌＩで処理することによって得られた３．７ＫｂのＤＮＡフラグメントと連結し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５の作成を完成させた。
【００９１】
ＳＶ４０ｐＡをｐＣＩ(Invitrogen)を鋳型として用いてＰＣＲを行うことによって増幅し、結果物をＣｌａＩおよびＳａｌＩで処理して２２２ｂｐのＤＮＡフラグメントを調製した。ＤＮＡフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５をＣｌａＩおよびＳａｌＩで切断することによって調製した５．４ＫｂのＤＮＡフラグメントと連結し、最終的にｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５−ＳＶ４０ｐＡを調製した。ＳＶ４０ｐＡの増幅に使用したプライマー配列は以下である：
Ｆ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号１７）：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧ−３’
Ｒ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号１８）：５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＣＴＴＧ−３’。
【００９２】
アデノ随伴ウイルスベクターを作成するために、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ(Agilent)内のアンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に交換した。カナマイシン耐性遺伝子をｐＥＴ−２８（ａ）（Novagen）を鋳型として用いてＰＣＲで増幅した。増幅した８１６ｂｐのカナマイシン耐性遺伝子をｐＧＥＭ−Ｔと連結し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｋａｎｒを作成した。カナマイシン耐性遺伝子の増幅に使用したプライマー配列は以下である：
Ｆ−Ｋａｎ（配列番号１９）：５’−ＡＧＧＣＧＣＣＡＴＧＡＧＣＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡ−３’
Ｒ−Ｋａｎ（配列番号２０）：５’−ＴＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＴＣ−３’。
【００９３】
カナマイシン耐性遺伝子を導入するために、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＶ部位を、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ内のアンピシリン耐性遺伝子の上流および下流に変異誘発によってそれぞれ作成し、結果物をＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＶで再度処理した。結果物を、既に作成されたｐＧＥＭ−Ｔ−ＫａｎｒをＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＶで切断することによって得られたＤＮＡフラグメントと連結し、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−Ｋａｎｒを作成した。
【００９４】
作成したｐＡＡＶ−ＭＣＳ−ＫａｎｒをＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで処理し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５−ＳＶ４０ｐＡをＥａｇＩおよびＰｖｕＩで切断することによって得られた２．７ＫｂのＤＮＡフラグメントと連結し、ｐｓｓＡＡＶ−ＧＡＤ６５を作成した。
【００９５】
ＧＡＤ６５発現カセットをｐＶＡＸ１(Invitrogen)に導入するために、ＢａｍＨＩ部位をｂＧＨｐＡの下流に変異誘発によって作成した。次いで、結果物をＭｌｕＩおよびＮｈｅＩで切断し、ＤＮＡフラグメントを調製した。ＬＩＴＲおよびＣＭＶプロモーター領域を、ｐｓｓａＡＶ−ＧＡＤ６５を鋳型として用いてＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ(Promega)にクローン化した。その後、結果物をＡｓｃＩおよびＮｈｅＩで切断し、既に調製されたｐＶＡＸ１ベクターに連結し、ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶを作成した。ＬＩＴＲおよびＣＭＶプロモーター領域の増幅に使用したプライマー配列は以下である：
Ｆ−ＩＴＲ（配列番号２１）：５’−ＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣ−３’、
Ｒ−ＪＤＫ（配列番号１６）：５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧ−３’。
【００９６】
ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶをＮｏｔＩおよびＮｈｅＩで再度切断し、ＤＮＡフラグメントを調製した。ＰＳＳＡＡＶ−ＧＡＤ６５をＥａｇＩおよびＮｈｅＩで切断し、既に調製されたＤＮＡフラグメントと連結し、ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５−ＳＶ４０ｐＡを作成した。
【００９７】
ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５−ＳＶ４０ｐＡをＨｐａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡフラグメントを調製した。さらに、ｐｓＡ−ＳＶ４０ｐＡ−ＲＩＴＲ（これはｐｓｓａＡＶ−ＧＡＤ６５を鋳型として用いてＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙにクローン化することによって調製された）をＨｐａＩおよびＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡフラグメントを調製した。この２つのＤＮＡフラグメントを連結し、ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５−ＳＶ４０ｐＡ−ＲＩＴＲ（以下、「ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５」と略す）を完成させた。ＳＶ４０ｐＡおよびＲＩＴＲ領域の増幅に用いたプライマー配列は以下である：
Ｆ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号１７）：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧ−３’
Ｒ−ＩＴＲ（配列番号２２）：５’−ＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧ−３’。
【００９８】
ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５プラスミドの模式図を図１に示す。
【００９９】
改変ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５を作成するために以下の手順を実行した。
【０１００】
まずベクターをＮｈｅ１で切断し、次いで任意のランダムヌクレオチド配列をＣＭＶプロモーターとＧＡＤ６５遺伝子との間にインフュージョン法によって挿入した。挿入したヌクレオチド配列は以下である：
スクランブルスタッファー(scramble stuffer)（配列番号２９）：
５’−ＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣ−３’
ｓｔｕｆｆｅｒ＿ｓｃｒａｍｂｌｅ＿Ｆ（配列番号３０）：
５’−ＣＴＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣ−３’
ｓｔｕｆｆｅｒ＿ｓｃｒａｍｂｌｅ＿Ｒ（配列番号３１）：
５’−ＣＴＡＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣ−３’。
【０１０１】
次に、発がん効果を与え得るＸタンパク質領域を除去したＷＰＲＥヌクレオチド配列(Schambach, Gene Ther, 2006)をＰＣＲで増幅し、Ｐａｃ１およびＨｐａ１制限酵素を用いてＧＡＤ６５遺伝子の後部に挿入した。同時に、ＳＶ４０ｐＡの一部を除去し、改変ＳＶ４０ｐＡを作成した。ＷＰＲＥの増幅に用いたプライマー配列は以下である：
ＷＰＲＥ＿Ｐａｃ１＿Ｆ（配列番号２５）：
５’−ＧＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧ−３’
ＷＰＲＥ＿ｍｏｄｉ＿Ｈｐａ１＿Ｒ（配列番号２６）：
５’−ＧＧＴＧＧＴＧＴＴＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＡＣＧＧＡＡＴＴＧ−３’。
【０１０２】
最終的に改変されたプラスミドは、ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶ−スクランブルスタッファー−ｈＧＡＤ６５−ＷＰＲＥ（ｍｏｄｉ）−ＳＶ４０ｐＡ（ｍｏｄｉ）−ＲＩＴＲ（以下、「ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉ」と略す）であった。模式図を図１に示す。
【０１０３】
実施例１．２．ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０プラスミドの作成
ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０プラスミドを実施例１．１と同じ方法で作成した。ラットＩＬ−１０遺伝子に関して、配列番号８のヌクレオチド配列によって示される遺伝子は、配列番号６のアミノ酸配列によって示されるヒトＩＬ−１０（ＮＣＢＩ ＮＭ−０１２８５４）に基づいて、ラットに適合するようにコドン最適化によって設計され、遺伝子合成のためにＢｉｏｎｅｅｒに付託された。ｒＩＬ−１０遺伝子を、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙに導入されたラットＩＬ−１０遺伝子を鋳型として用いてＰＣＲを行うことで増幅し、次いで結果物をＮｈｅＩおよびＳａｌＩで処理し、０．５ＫｂのＤＮＡフラグメントを調製した。さらに、ＰＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶをＮｈｅＩおよびＳａｌＩで処理し、３．７ＫｂのＤＮＡフラグメントを調製した。この２つのＤＮＡフラグメントを連結し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｒＩＬ−１０を調製した。ｒＩＬ−１０の増幅に用いたプライマー配列は以下である：
Ｆ−ｒＩＬ−１０（配列番号２３）：５’−ＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＴ−３’
Ｒ−ｒＩＬ−１０（配列番号２４）：５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣ−３’。
【０１０４】
ＳＶ４０ｐＡに関して、遺伝子を、ｐＣＩを鋳型として用いてＰＣＲを行うことで増幅し、次いでＮｏｔＩおよびＳａｌＩで処理し、２２２ｂｐのＤＮＡフラグメントを調製した。さらに、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｒＩＬ−１０をＣｌａＩおよびＳａｌＩで処理し、４．２ＫｂのＤＮＡフラグメントを調製した。この２つのＤＮＡフラグメントを連結し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｒＩＬ−１０−ＳＶ４０ｐＡを作成した。ＳＶ４０ｐＡの増幅に用いたプライマー配列は以下である：
Ｆ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号１７）：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧ−３’
Ｒ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号１８）：５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＣＴＴＧ−３’。
【０１０５】
ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｒＩＬ−１０−ＳＶ４０ｐＡをＥａｇＩで処理して１．６ＫｂのＤＮＡフラグメントを調製した。さらに、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−ＫａｎｒをＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで処理してＤＮＡフラグメントを調製した。その後、この２つのＤＮＡフラグメントを連結し、ｐｓｓＡＡＶ−ＣＭＶ−ｒＩＬ−１０−ＳＶ４０ｐＡ（以下、「ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０」と略す）を作成した。ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０プラスミドの模式図を図２に示す。
【０１０６】
実施例１．３．ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの作成
ヒトＧＤＮＦ遺伝子に関して、配列番号１３に示される遺伝子は、配列番号１１のアミノ酸配列によって示されるヒトＧＤＮＦ（ＮＣＢＩ ＮＭ＿１９９２３１．２）に基づいて、ヒトに適合するようにコドン最適化によって設計され、遺伝子合成のためにＢｉｏｎｅｅｒに付託された。ｐＧＥＭ−Ｂ１プラスミドに導入したｈＧＤＮＦ遺伝子をＮｈｅＩおよびＰａｃＩで処理し、約０．６ＫｂのＤＮＡフラグメントを調製した。ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｒＩＬ−１０−ＳＶ４０ｐＡプラスミドをＮｈｅＩおよびＰａｃＩで処理し、ｒＩＬ−１０遺伝子を除去した２．８Ｋｂのフラグメントを調製した。この２つのＤＮＡフラグメントを連結し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｈＧＤＮＦ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドを作成した。
【０１０７】
次に、完成したｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｈＧＤＮＦ−ＳＶ４０ｐＡプラスミドをＥａｇＩで処理し、１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを調製した。さらに、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−ＫａｎｒをＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで処理し、１．８ｋｂのＤＮＡフラグメントを調製した。この２つのＤＮＡフラグメントを連結し、ｐｓｓＡＡＶ−ＣＭＶ−ｈＧＤＮＦ−ＳＶ４０ｐＡ−Ｋａｎｒ（以下、「ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ」と略す）を作成した。ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの模式図を図３に示す。
【０１０８】
実施例１．４．ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０プラスミドの作成
ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーターおよびウサギβグロビンポリＡシグナル）を、アデノウイルス二重発現キット(Takara)に含まれるｐＡｘＣＡｗｔｉｔ２を用いてＰＣＲ増幅し、ＡｐａＩおよびＸｂａＩで処理して発現を改善し、これによりＣＡＧプロモーターにおけるニワトリβアクチン領域の約８０％を除去し、短ＣＡＧ（ｓＣＡＧ）プロモーターを生成した(Fagoe, Gene Ther, 2014)。ヒトＩＬ−１０遺伝子に関して、配列番号１４をコードする遺伝子は、ヒトに適合するように配列番号９をコードする遺伝子のコドン最適化によって設計され、遺伝子合成のためにＢｉｏｎｅｅｒに付託された。次に、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅によって取得した。ｐＶＡＸ１／ｓＣＡＧ−ｈＩＬ−１０−ｂＧＨｐＡを、プロモーターおよびポリＡならびにヒトＩＬ−１０遺伝子を含むようにｐＶＡＸ１(Invitrogen)を用いて作成した。
【０１０９】
次に、ｐＶＡＸ１／ＣＭＶ−ｈＧＤＮＦ−ＳＶ４０ｐＡを、実施例１．３のヒトＧＤＮＦ遺伝子を用いて実施例１．１と同じ方法で調製した。その後、ＳＶ４０ｐＡ−ｈＧＤＮＦ−ＣＭＶ遺伝子カセットを、ｐＶＡＸ１／ＣＭＶ−ｈＧＤＮＦ−ＳＶ４０ｐＡを鋳型として用いてＰＣＲを行うことで増幅し、１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを調製した。遺伝子カセットの増幅に用いたプライマー配列は以下である：
ＳＶ４０−ＣＭＶ−ｓＣＡＧ−ｂＧＨｐＡ−Ｉｎｆｕ−Ｆ（配列番号２７）：
５’−ＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＣＴＴＧＣ−３’
ＳＶ４０−ＣＭＶ−ｓＣＡＧ−ｂＧＨｐＡ−Ｉｎｆｕ−Ｒ（配列番号２８）：
５’−ＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣＡＴＴ−３’。
【０１１０】
次に、ｐＶＡＸ１／ｓＣＡＧ−ｈＩＬ−１０−ｂＧＨｐＡをＳａｌＩで処理し、約３．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを調製した。上述の１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを３．９ｋｂのＤＮＡフラグメントにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット(Clontech)を用いて挿入し、ｐＶＡＸ１／ＳＶ４０ｐＡ−ｈＧＤＮＦ−ＣＭＶ−ｓＣＡＧ−ｈＩＬ−１０−ｂＧＨｐＡ（以下、「ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０」と略す）を作成した。ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０プラスミドを図４に模式的に示す。
【０１１１】
実験例１．ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０、ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦおよびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０プラスミドの発現の確認
実施例１．１〜１．４で調製したｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０、ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦまたはｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０プラスミドを、ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｔ細胞にｊｅｔＰＲＩＭＥ(Polyplus)を用いてそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を３７℃のインキュベーター中で４８時間培養した。その後、細胞培地または培養細胞を回収した。細胞を溶媒で溶解し、調製した試料を、ＧＡＤ６５(Merck Millipore)、ＩＬ−１０(Santa Cruz)およびＧＤＮＦ(R&D systems)に対する抗体でそれぞれ処理し、ウエスタンブロッティングを行った。
【０１１２】
具体的には、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５の場合、ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｔ細胞を２μｇのｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５プラスミドで処理し、４８時間培養した。その後、培養細胞を溶解し、細胞内のＧＡＤ６５の発現をウエスタンブロッティングによって確認した。
【０１１３】
ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの場合、ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｔ細胞を１μｇのｐＡＡＶ−ＩＬ−１０またはｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドで処理し、４８時間培養した。その後、培地を回収し、培地中のＩＬ−１０またはＧＤＮＦの発現をウエスタンブロッティングによって確認した。
【０１１４】
ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０プラスミドの場合、ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｔ細胞を１μｇのｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０プラスミドで処理し、４８時間培養した。その後、培養細胞を溶解し、細胞内ＩＬ−１０およびＧＤＮＦの発現をウエスタンブロッティングによって確認した。
【０１１５】
結果として、トランスフェクトされたｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０、ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦまたはｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０プラスミドは発現していたことが確認された（図５および６）。
【０１１６】
実施例２．組換えアデノ随伴ウイルスの調製
実験で使用したＡＡＶ−ＩＬ−１０ウイルスをＵＮＣ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｒｅによって生成および精製した。生成方法は以下である。ｐＶａｘ−ｒＩＬ−１０、ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＲＣ５をヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。その後、結果物をカラムクロマトグラフィーで精製し、ＡＡＶ５−ＩＬ−１０ウイルスを確保した。生成したウイルスの力価をｑＰＣＲを用いて測定した。
【０１１７】
ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスをＫＲｃｒｏｇｅｎによって生成および精製した。生成方法は以下である。ＡＡＶ−導入遺伝子（ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミド）をヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｔ細胞にｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＲＣと共にリン酸カルシウム法を用いてそれぞれトランスフェクトした。ＧＡＤ６５の場合には、血清型５のカプシド遺伝子を導入したｐＲＣ５を用いた。ＧＤＮＦの場合には、ＡＡＶ血清型１のカプシド遺伝子を導入したｐＲＣ１を用いた。トランスフェクト細胞を３７℃のインキュベーター中で培養し、４８時間後に細胞を回収した。
【０１１８】
その後、セシウム濃度勾配に従って超高速遠心分離法によってウイルスを含むバンドのみを単離および精製し、ＡＡＶ５−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ１−ＧＤＮＦウイルスを確保した。生成したウイルスの力価をｑＰＣＲを用いて測定した。
【０１１９】
ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０ウイルスをＣｄｍｏｇｅｎによって生成および精製した。生成方法は以下である。ＡＡＶ−導入遺伝子（ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０プラスミド）をヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｔ細胞にｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＲＣ５と共にリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を３７℃のインキュベーター中で培養し、４８時間後に細胞を回収した。
【０１２０】
その後、セシウム濃度勾配に従って超高速遠心分離によってウイルスを含むバンドのみを単離および精製し、ＡＡＶ５−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０ウイルスを確保した。生成したウイルスの力価をｑＰＣＲを用いて測定した。
【０１２１】
ＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉウイルスをＣｄｍｏｇｅｎによって生成および精製した。生成方法は以下である。ＡＡＶ−導入遺伝子（ｐＡＡＶ−ｈＧＡＤ６５−ｍｏｄｉプラスミド）をヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｔ細胞にｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＲＣ５と共にリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を３７℃のインキュベーター中で培養し、４８時間後に細胞を回収した。
【０１２２】
その後、セシウム濃度勾配に従って超高速遠心分離によってウイルスを含むバンドのみを単離および精製し、ＡＡＶ５−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉウイルスを確保した。生成したウイルスの力価をｑＰＣＲを用いて測定した。
【０１２３】
実験例２．組換えアデノ随伴ウイルスの特性解析
細胞に送達された組換えアデノ随伴ウイルスのタンパク質発現を調べるため、ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞を上記で得られたＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉ、ＡＡＶ−ＩＬ−１０またはＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスで処理し、タンパク質発現をウエスタンブロッティングで調べた。具体的には、２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞を５×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を３種類のウイルスで１０，０００ｖｇ／ウェルにおいて処理し、３７℃のインキュベーター中で培養した。４８時間後に、細胞を回収して溶媒に溶解し、培地をアミコン(Merck Millipore)を用いて濃縮した。次いで、調製した試料をＧＡＤ６５(Cell signaling)、ＩＬ−１０(Santa Cruz)およびＧＤＮＦ(R&D systems)に対する抗体でそれぞれ処理し、ウエスタンブロッティングを行った。
【０１２４】
結果として、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉ、ＡＡＶ−ＩＬ−１０またはＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスで処理されたヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｔ細胞株またはＨｅＬａ細胞株の細胞溶解物において、各標的タンパク質が発現していたことが確認された（図７）。したがって、実験で使用された組換えアデノ随伴ウイルスの構造および特性に異常がないことが確認された。
【０１２５】
また、ＧＡＢＡがＡＡＶ−ＧＡＤ６５またはＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉウイルスによって産生されることを確認するため、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５またはＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉウイルスで処理された細胞の培地を回収し、ＧＡＢＡ ＥＬＩＳＡ(LDN)解析を行った。各実験群について、２つの同一の試料を別々に調製して解析を行った。棒グラフは各試料の値を示す。
【０１２６】
結果として、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５またはＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉウイルスによって細胞に導入されたＧＡＤ６５によって、ＧＡＢＡが培地に分泌されたことが確認された（図８）。
【０１２７】
実験例３．ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０またはＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの個別投与と、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＧＤＮＦ、またはＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの同時投与との間の鎮痛効果の比較
実験例３．１．投与試料の調製
実施例２で調製したウイルスを試験に用いた。動物投与実験の３０分前に、−８０℃で保存していた試薬を室温で解凍し、ボルテクサーで混合することによって調製した。ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０、ＡＡＶ−ＧＤＮＦおよびＡＡＶ−ＧＦＰウイルスをＰＢＳで希釈し、表１に示される力価を得た。ＡＡＶ−ＧＦＰウイルスを他の組換えアデノ随伴ウイルスと同じ量で投与した。ＧＦＰは鎮痛効果を持たないタンパク質である。必要とされるウイルスを表１に示される含量に従って混合し、動物１匹当たり９．０×１０８ｖｇ／５μｌ（ｖｇ：ウイルスゲノム）の量で投与した。
【表１】
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【０１２８】
実験例３．２．神経障害性疼痛誘発性ラットの作製および試料の投与
１５０〜２００ｇの雄性ＳＤラットを吸入麻酔した。次いでふくらはぎの上部を切開し、総腓骨神経および脛骨神経の両端を結び、結び目を０．５〜１ｃｍ間隔で７−０縫合(7-0 suture)によって作成した。２つの神経束の結び目間の領域をはさみで切断し、切開部位を縫合した。その後、ラットを麻酔から覚めるように回復させ、ケージに戻した。２週間後、ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を行い、疼痛誘導を調べ、次いで実施例２．１で調製した試料をそれぞれ投与した(Decosterd, Pain, 2000)。
【０１２９】
試料を経椎間孔硬膜外注射法によって後根神経節（ＤＲＧ）に隣接する位置に投与した。疼痛誘発性ラットを吸入麻酔し、ラットの背部を腰椎Ｌ３からＬ５のレベルにおいて直線的に切開することによって椎骨を露出させた。露出した空間の側面において、脊髄の突起の１つであるＬ４横突起を可視化させた。ラットの側面が上から見え、Ｌ４椎間孔が見えるようにラットを横向きに置いた。
【０１３０】
その後、カテーテルに取り付けた針を調製した試料中に挿入し、ハミルトンシリンジをカテーテルの反対端に接続し、５μＬの標線まで引き、試料をカテーテルに注入した。ハミルトンシリンジをカテーテルから取り外し、次いで針の先端から１ｃｍの位置をハルステッド・モスキート(Halsted-Mosquito)を用いて掴むことによりカテーテルを確保した。次に、Ｌ４の脊椎をピンセットで掴んで上向きに引っ張りながら、ハルステッド・モスキートで確保した針の先端を他方の手でＬ４椎間孔付近に置いた。針の先端を、空間が確保されている椎間孔内部の屈曲領域に挿入した。次いで、掴んでいた針を解放した。
【０１３１】
針が固定されたことを確認した後、１ｍＬシリンジを針の反対側に接続されたカテーテルに接続した。シリンジのピストンを穏やかに押すことによって、試料をラットの後根神経節の周りにゆっくりと注射した。その後、切開部位を縫合した。試料投与の４週間後に、ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を用いて疼痛応答を観察した。
【０１３２】
実験例３．３．ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を用いた疼痛観察
疼痛をｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を用いて観察した。この方法は、０．４、０．６、１、２、４、６、８および１５ｇの全８つのフィラメントを用いて疼痛応答の所定のパターンに従って閾値を計算するものである。
【０１３３】
疼痛発生領域を、疼痛が発生した最も外側のつま先の先端部分から足底の踵まで位置を変化させることによって探索した。疼痛が発生した場合、ラットは突然足底を持ち上げ、足底を縮ませ、または足底を口でなめるため、疼痛発生領域を見出すことができる。周辺領域を各段階のフィラメントで５回穿刺して３回以上の反応があった場合、これを疼痛応答と見なした。そして、フィラメントを次の段階のフィラメントに交換することで試験を進行させた。このような方法で各段階のパターンを記録した。
【０１３４】
疼痛パターンをS.R. Chaplanによって確立されたパターンの表に基づいて記録し、疼痛パターンを用いて閾値を計算した(Chaplan, J Neurosci Methods, 1994)。行動解析に関して、動物群を特定の時間目隠しし、少なくとも３人の研究者が観察し、記録したパターンの結果を統計処理し、疼痛の結果を分析した。
【０１３５】
結果として、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＧＤＮＦ、またはＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスを組み合わせて同時投与した場合、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０またはＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの個別投与と比較して、疼痛軽減効果がより高かったことが見出された（図９）。
【０１３６】
実験例４．ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０またはＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの個別投与と、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの同時投与との間の鎮痛効果の比較
実施例２で調製したウイルスを試験に用いた。動物投与実験の３０分前に、−８０℃で保存していた試薬を室温で解凍し、ボルテクサーで混合することによって調製した。ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０、ＡＡＶ−ＧＤＮＦおよびＡＡＶ−ＧＦＰウイルスをＰＢＳで希釈し、表２に示される力価を得た。ＡＡＶ−ＧＦＰウイルスを他の組換えアデノ随伴ウイルスと同じ量で投与した。ＧＦＰは鎮痛効果が報告されていないタンパク質である。ウイルスを表２に示される含量に従って混合し、動物１匹当たり９．０×１０８ｖｇ／５μｌの量で投与した。
【表２】
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【０１３７】
実験例３．２と同一の方法で作製された疼痛動物モデルに、表２に示されるウイルス含量に従って調製された試料を投与した。その後、実験例３．３と同一の方法によってｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を行い、疼痛応答を観察した。
【０１３８】
結果として、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの全てを同時投与した場合、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０またはＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの個別投与と比較して、疼痛軽減効果がより高かったことが見出された（図１０）。
【０１３９】
実験例５．ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＧＤＮＦ、またはＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの同時投与と、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの同時投与との間の鎮痛効果の比較
実施例２で調製したアデノ随伴ウイルスを試験に用いた。動物投与実験の３０分前に、−８０℃で保存していた試薬を室温で解凍し、ボルテクサーで混合することによって調製した。ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０、ＡＡＶ−ＧＤＮＦおよびＡＡＶ−ＧＦＰウイルスをＰＢＳで希釈し、表３に示される力価を得た。ＡＡＶ−ＧＦＰを他の組換えアデノ随伴ウイルスと同じ量で投与した。ＧＦＰは鎮痛効果を持たないタンパク質である。必要とされるウイルスを表３に示される含量に従って混合し、動物１匹当たり９．０×１０８ｖｇ／５μｌの量で投与した。
【表３】
2019537595.tif 000005
【０１４０】
実験例３．２と同一の方法で作製された疼痛動物モデルに、表３に示されるウイルス含量に従って調製された試料を投与した。その後、実験例３．３と同一の方法によってｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を行い、疼痛応答を観察した。
【０１４１】
結果として、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの全てを同時投与した場合、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＧＤＮＦ、またはＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの同時投与と比較して、疼痛軽減効果がより高かったことが見出された（図１１）。
【０１４２】
実験例６．ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０またはｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの個別投与と、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ、またはｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの同時投与との間の鎮痛効果の比較
実験例６．１．投与試料の調製
実施例１で調製したプラスミドを試験に用いた。動物投与実験の３０分前に、−８０℃で保存していた試薬を室温で解凍し、ボルテクサーで混合することによって調製した。ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０、ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦおよびｐＶＡＸ１プラスミドをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で希釈し、表４に示される濃度を得た。ｐＶＡＸ１プラスミドを他のプラスミドと同じ量で投与した。ｐＶＡＸ１プラスミドは鎮痛効果を持つことが報告されていない。必要とされるプラスミドを表４に示される含量に従って混合し、動物１匹当たり３０μｇ／５０μｌの量で投与した。
【表４】
2019537595.tif 000006
【０１４３】
実験例６．２．神経障害性疼痛動物モデルの作製および試料投与
１５０〜２００ｇの雄性ＳＤラットを吸入麻酔した。次いでふくらはぎの上部を切開し、総腓骨神経および脛骨神経の両端を結び、結び目を０．５〜１ｃｍ間隔で７−０縫合によって作成した。２つの神経束の結び目間の領域をはさみで切断し、切開部位を縫合した。その後、ラットを麻酔から覚めるように回復させ、ケージに戻した。２週間後、ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を行い、疼痛誘導を調べ、次いで実施例６．１で調製した試料を投与した(Decosterd, Pain, 2000)。
【０１４４】
試料を髄腔内注射法によって投与した。疼痛誘発性ラットを吸入麻酔し、ラットの背部を腰椎Ｌ５の領域において直線的に切開することによって棘突起を露出させた。５０ｍｌチューブをラットの下に置いてＬ５とＬ６の間の空間を広げ、２７Ｇ×１３ｍｍサイズの針を挿入した。その後、５０μｌの試料を充填した１ｍＬシリンジを針に接続した。シリンジのピストンを穏やかに押すことによって試料をゆっくりと注射した。その後、切開部位を縫合し、この手順を完了した。物質投与の１日後に、ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を用いて疼痛応答を観察した。
【０１４５】
実験例６．３．ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を用いた疼痛観察
ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を実験例３．３と同一の方法によって行った。結果として、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ、またはｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドを同時投与した場合、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０またはｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの個別投与と比較して、疼痛軽減効果がより高かったことが見出された（図１２）。
【０１４６】
実験例７．ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０またはｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの個別投与と、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの同時投与との間の鎮痛効果の比較
実施例１で調製したプラスミドを試験に用いた。動物投与実験の３０分前に、−８０℃で保存していた試薬を室温で解凍し、ボルテクサーで混合することによって調製した。ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０、ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦおよびｐＶＡＸ１プラスミドをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で希釈し、表５に示される濃度を得た。ｐＶＡＸ１プラスミドを他のプラスミドと同じ量で投与した。ｐＶＡＸ１プラスミドは鎮痛効果を持つことが報告されていない。必要とされるプラスミドを表５に示される含量に従って混合し、動物１匹当たり３０μｇ／５０μｌの量で投与した。
【表５】
2019537595.tif 000007
【０１４７】
実験例６．２と同一の方法で作製された疼痛動物モデルに、表５に示されるウイルス含量に従って調製された試料を投与した。その後、実験例３．３と同一の方法によってｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を行い、疼痛応答を観察した。
【０１４８】
結果として、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ５−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ５−ＧＤＮＦプラスミドの全てを同時投与した場合、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０またはｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの個別投与と比較して、疼痛軽減効果がより高かったことが見出された（図１３）。
【０１４９】
実験例８．ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ、またはｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの同時投与と、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの同時投与との間の鎮痛効果の比較
実施例１で調製したプラスミドを試験に用いた。動物投与実験の３０分前に、−８０℃で保存していた試薬を室温で解凍し、ボルテクサーで混合することによって調製した。ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０、ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦおよびｐＶＡＸ１プラスミドをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で希釈し、表６に示される濃度を得た。ｐＶＡＸ１プラスミドを他のプラスミドと同じ濃度および量で投与した。ｐＶＡＸ１プラスミドは鎮痛効果を持つことが報告されていない。必要とされるプラスミドを表６に示される含量に従って混合し、動物１匹当たり３０μｇ／５０μｌの量で投与した。
【表６】
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【０１５０】
実験例６．２と同一の方法で作製された疼痛動物モデルに、表６に示される血漿含量に従って調製された試料を投与した。その後、実験例６．３と同一の方法によってｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を行い、疼痛応答を観察した。
【０１５１】
結果として、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの全てを同時に投与した場合、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ、またはｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの同時投与と比較して、疼痛軽減効果がより高かったことが見出された（図１４）。
【０１５２】
実験例９．ＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉおよびＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０ウイルスの同時投与と、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの同時投与との鎮痛効果の比較
実施例２で調製したアデノ随伴ウイルスを試験に用いた。動物投与実験の３０分前に、−８０℃で保存していた試薬を室温で解凍し、ボルテクサーで混合することによって調製した。ＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉ、ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスをＰＢＳで希釈し、表７に示される力価を得た。必要とされるウイルスを表７に示される含量に従って混合し、動物１匹当たり１．０×１０９ｖｇ／５μｌまたは１．５×１０９ｖｇ／５μｌの量で投与した。
【表７】
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【０１５３】
実験例３．２と同一の方法で作製された疼痛動物モデルに、表７に示されるウイルス含量に従って調製された試料を投与した。その後、実験例３．３と同一の方法によってｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を行い、疼痛応答を観察した。
【０１５４】
結果として、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５−ｍｏｄｉおよびＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＩＬ−１０ウイルスを同時投与した場合、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルス全ての同時投与と比較して、疼痛軽減効果がより高かったことが見出された（図１５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月5日(2019.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）をコードする遺伝子、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）をコードする遺伝子、およびグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をコードする遺伝子からなる群から選択される２つ以上を含む、疼痛を軽減または処置する医薬組成物。
【請求項２】
遺伝子がベクター中に動作可能に含まれた形態である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスおよびポックスウイルスからなる群から選択される少なくとも１つのウイルスベクターである、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
ベクターが、プラスミド、リポソーム、カチオン性ポリマー、ミセル、エマルジョンおよび固体脂質ナノ粒子からなる群から選択される少なくとも１つの非ウイルスベクターである、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＧＡＤがＧＡＤ６５またはＧＡＤ６７である、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＧＡＤをコードする遺伝子が、配列番号１、配列番号４、配列番号３２、配列番号３４または配列番号３６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＧＡＤをコードする遺伝子が、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号３３、配列番号３５または配列番号３７に示されるヌクレオチド配列である、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＩＬ−１０をコードする遺伝子が、配列番号６、配列番号９、配列番号３８、配列番号４０または配列番号４２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＩＬ−１０をコードする遺伝子が、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４１または配列番号４３に示されるヌクレオチド配列である、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＧＤＮＦをコードする遺伝子が、配列番号１１、配列番号４４、配列番号４６または配列番号４８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＧＤＮＦをコードする遺伝子が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号４５、配列番号４７または配列番号４９に示されるヌクレオチド配列である、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
疼痛が、侵害受容性疼痛、心因性疼痛、炎症性疼痛、病的疼痛、神経障害性疼痛、がん性疼痛、術後疼痛、三叉神経痛、特発性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛または片頭痛である、請求項１〜１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
生理学的に許容され得る担体をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
注射剤である、請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
硬膜外注射用または髄腔内注射用である、請求項１〜１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
疼痛を軽減または処置する治療薬を調製するための請求項１〜１５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
【図１０】図１０は、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０またはＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの個別投与と、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの同時投与との間で疼痛軽減効果を比較した結果を示すグラフである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５−ＳＶ４０ｐＡをＨｐａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡフラグメントを調製した。さらに、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ−ＳＶ４０ｐＡ−ＲＩＴＲ（これはｐｓｓａＡＶ−ＧＡＤ６５を鋳型として用いてＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙにクローン化することによって調製された）をＨｐａＩおよびＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡフラグメントを調製した。この２つのＤＮＡフラグメントを連結し、ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５−ＳＶ４０ｐＡ−ＲＩＴＲ（以下、「ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５」と略す）を完成させた。ＳＶ４０ｐＡおよびＲＩＴＲ領域の増幅に用いたプライマー配列は以下である：
Ｆ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号１７）：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧ−３’
Ｒ−ＩＴＲ（配列番号２２）：５’−ＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧ−３’。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
実験例３．ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０またはＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの個別投与と、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＧＤＮＦ、またはＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＤＮＦウイルスの同時投与との間の鎮痛効果の比較
実験例３．１．投与試料の調製
実施例２で調製したウイルスを試験に用いた。動物投与実験の３０分前に、−８０℃で保存していた試薬を室温で解凍し、ボルテクサーで混合することによって調製した。ＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ＡＡＶ−ＩＬ−１０、ＡＡＶ−ＧＤＮＦおよびＡＡＶ−ＧＦＰウイルスをＰＢＳで希釈し、表１に示される力価を得た。ＡＡＶ−ＧＦＰウイルスを他の組換えアデノ随伴ウイルスと同じ量で投与した。ＧＦＰは鎮痛効果を持たないタンパク質である。必要とされるウイルスを表１に示される含量に従って混合し、動物１匹当たり９．０×１０８ｖｇ／５μｌ（ｖｇ：ウイルスゲノム）の量で投与した。
【表１】
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【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
実験例６．ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０またはｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの個別投与と、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ、またはｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの同時投与との間の鎮痛効果の比較
実験例６．１．投与試料の調製
実施例１で調製したプラスミドを試験に用いた。動物投与実験の３０分前に、−８０℃で保存していた試薬を室温で解凍し、ボルテクサーで混合することによって調製した。ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０、ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦおよびｐＶＡＸ１プラスミドをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で希釈し、表４に示される濃度を得た。ｐＶＡＸ１プラスミドを他のプラスミドと同じ量で投与した。ｐＶＡＸ１プラスミドは鎮痛効果を持つことが報告されていない。必要とされるプラスミドを表４に示される含量に従って混合し、動物１匹当たり３０μｇ／５０μｌの量で投与した。
【表４】
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【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
実験例７．ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０またはｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの個別投与と、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの同時投与との間の鎮痛効果の比較
実施例１で調製したプラスミドを試験に用いた。動物投与実験の３０分前に、−８０℃で保存していた試薬を室温で解凍し、ボルテクサーで混合することによって調製した。ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０、ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦおよびｐＶＡＸ１プラスミドをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で希釈し、表５に示される濃度を得た。ｐＶＡＸ１プラスミドを他のプラスミドと同じ量で投与した。ｐＶＡＸ１プラスミドは鎮痛効果を持つことが報告されていない。必要とされるプラスミドを表５に示される含量に従って混合し、動物１匹当たり３０μｇ／５０μｌの量で投与した。
【表５】
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【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
実験例６．２と同一の方法で作製された疼痛動物モデルに、表５に示されるプラスミド含量に従って調製された試料を投与した。その後、実験例３．３と同一の方法によってｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を行い、疼痛応答を観察した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
実験例８．ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ、またはｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの同時投与と、ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミドの同時投与との間の鎮痛効果の比較
実施例１で調製したプラスミドを試験に用いた。動物投与実験の３０分前に、−８０℃で保存していた試薬を室温で解凍し、ボルテクサーで混合することによって調製した。ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ＩＬ−１０、ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦおよびｐＶＡＸ１プラスミドをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で希釈し、表６に示される濃度を得た。ｐＶＡＸ１プラスミドを他のプラスミドと同じ濃度および量で投与した。ｐＶＡＸ１プラスミドは鎮痛効果を持つことが報告されていない。必要とされるプラスミドを表６に示される含量に従って混合し、動物１匹当たり３０μｇ／５０μｌの量で投与した。
【表６】
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【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
実験例６．２と同一の方法で作製された疼痛動物モデルに、表６に示されるプラスミド含量に従って調製された試料を投与した。その後、実験例６．３と同一の方法によってｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を行い、疼痛応答を観察した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
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【国際調査報告】
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2019537595.tif 000031
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2019537595.tif 000035
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