(57)【要約】標的化抗体にコンジュゲートしてＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲート）を形成するアマニチン誘導体が開示される。本開示は、ＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲート）構造で使用される、改善されたアマトキシン誘導体を提供する。より具体的には、本開示は、式Ｉの構造を有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）または薬学的に許容されるその塩を提供する。好ましくは、開示されるＡＤＣは、本明細書に記載される化合物からなる群から選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの構造を有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
【化２１】
2019523761.tif 000029
または薬学的に許容されるその塩
［式中、
Ａｂは、モノクローナル抗体であり、
Ｌ１−Ｌ２は、
【化２２】
2019523761.tif 000030
からなる群から選択されるリンカーであり、波線は、Ａｂとの結合点を示し、
Ｌ２−Ｘは、
【化２３】
2019523761.tif 000031
の構造を有し、Ｒ４は、水素、Ｃ１〜６アルキル、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−であり、ｍは、１〜２４の整数であり、波線は、Ｄとの結合点を示し、
Ｌ２は、単一アミノ酸、２〜１０個のアミノ酸長を有するペプチド、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジル）、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ、−Ｒ６ＯＣ（Ｏ）ＮＲ５−、−Ｒ８−Ｓ−Ｓ−Ｒ７、またはそれらの組合せからなる群から選択されるリンカーであり、Ｒ５は、水素、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、またはそれらの組合せからなる群から選択され、Ｒ６は、アミノ酸、１０個までのアミノ酸からなるペプチド、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ、またはそれらの組合せからなる群から選択され、Ｒ７は、Ｃ２〜６アルキレン、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−からなる群から選択され、Ｒ８は、アミノ酸、１０個までのアミノ酸からなるペプチド、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキレン、置換Ｃ１〜６アルキレン、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＲ９−ＣＲ１０Ｒ１１−、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＣＨＲ９−ＣＲ１０Ｒ１１−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ、またはそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ９は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキレン、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＳＯ３Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ２Ｈ、またはそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、またはそれらの組合せからなる群から選択され、
−Ｒ６ＯＣ（Ｏ）ＮＲ５−は、Ｒ５またはＲ６を介してＬ１と接続し、
−Ｒ８−Ｓ−Ｓ−Ｒ７−は、Ｒ８を介してＬ１と接続し、
Ｄは、アマトキシンから誘導された薬物部分の活性薬剤であり、アルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、およびイプシロン−アマニチンからなる群から選択され、
ｎは、１〜１０の整数であり、
ｍは、１〜２４の整数であり、
ｐは、１〜６の整数である］。
【請求項２】
Ｄが、式ＩＩの構造
【化２４】
2019523761.tif 000032
を有し、波線が、Ｘとの結合点を示し、
Ｒ１が、ＮＨ２またはＯＲ２であり、Ｒ２が、Ｈ、またはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、Ｒ３が、ＨまたはＯＨである、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項３】
前記ＡＤＣが、
【化２５】
2019523761.tif 000033
【化２６】
2019523761.tif 000034
【化２７】
2019523761.tif 000035
からなる群から選択される、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項４】
式
【化２８】
2019523761.tif 000036
を有するＡＤＣ。
【請求項５】
式
【化２９】
2019523761.tif 000037
を有するＡＤＣ。
【請求項６】
式
【化３０】
2019523761.tif 000038
を有するＡＤＣ。
【請求項７】
式
【化３１】
2019523761.tif 000039
を有するＡＤＣ。
【請求項８】
式
【化３２】
2019523761.tif 000040
を有するＡＤＣ。
【請求項９】
式
【化３３】
2019523761.tif 000041
を有するＡＤＣ。
【請求項１０】
式
【化３４】
2019523761.tif 000042
を有するＡＤＣ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年５月３１日に出願された米国仮特許出願第62/343,825号に対する優先権を主張し、この出願の内容は本明細書において参照として援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、標的化抗体にコンジュゲートしてＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲート）を形成するアマニチンの誘導体を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
アマトキシンは、８個のアミノ酸単位を有する剛性二環式ペプチドである。これらの化合物は、様々なキノコ種（例えば、Ａｍａｎｉｔａ  ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓ（タマゴテングダケとしても公知）、Ｇａｌｅｒｉｎａ  ｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｌｅｐｉｏｔａ  ｂｒｕｎｎｅｏ−ｉｎｃａｍａｔａ）から単離されるか、または合成により調製される。様々なキノコ種が、多様な量の様々なアマトキシンファミリーメンバーを含有している。このファミリーの一員であるアルファ−アマニチンは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＥＣ２．７．７．６）の阻害剤であり、比較的程度は低いがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの阻害剤であり、それによって、転写およびタンパク質生合成を阻害することが公知である。Wieland（１９８３年）Int.  J.  Pept.  Protein  Res.２２巻（３号）：２５７〜２７６頁。アルファ−アマニチンは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに非共有結合的に結合し、ゆっくり解離するため、酵素が回復する可能性は低い。転写阻害が長引くと、細胞アポトーシスが誘発されると考えられる。
【０００４】
例示的なアマトキシンとして、
【化１】
2019523761.tif 000002
【化２】
2019523761.tif 000003
【化３】
2019523761.tif 000004
が挙げられる。
【０００５】
腫瘍細胞を死滅させるか、または阻害する薬物を含めた細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤を局所送達するために抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を使用することによって、腫瘍への薬物部分の標的化送達およびその細胞内蓄積が可能になる。SyrigosおよびEpenetos（１９９９年）Anticancer  Res.１９巻：６０５〜６１４頁；Niculescu-DuvazおよびSpringer（１９９７年）Adv.  Drug  Delivery  Rev.２６巻：１５１〜１７２頁；米国特許第４，９７５，２７８号；Baldwinら（１９８６年）Lancet（１９８６年３月１５日）：６０３〜０５頁；Thorpe（１９８５年）「Antibody  Carriers  of  Cytotoxic  Agents  in  Cancer  Therapy:  A  Review」、Monoclonal  Antibodies  '84:  Biological  and  Clinical  Applications、A.  Pincheraら（編）、４７５〜５０６頁。このタイプの送達機序は、コンジュゲートしていない薬物薬剤の全身投与から生じるおそれがある正常細胞への毒性を、最小限に抑える一助になる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含めた様々な機序を介して、それらの細胞傷害作用および細胞増殖抑制作用を引き起こすことができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が、これらの戦略において有用であると報告されている。Rowlandら（１９８６年）Cancer  Immunol.  Immunother.２１巻：１８３〜８７頁。抗体−毒素コンジュゲートにおいて使用される毒素には、放射性同位体、細菌性毒素、例えばジフテリア毒素、植物毒素、例えばリシン、真菌毒素、例えばアマトキシン（国際公開第２０１０／１１５６２９号、国際公開第２０１２／０４１５０４号または国際公開第２０１２／１１９７８７号）、ならびに低分子毒素、例えばゲルダナマイシン（Mandlerら（２０００年）J.  Natl.  Cancer  Inst.９２巻（１９号）：１５７３〜１５８１頁；Mandlerら（２０００年）Bioorg.  Med.  Chem.  Lett.１０巻：１０２５〜１０２８頁；Mandlerら（２００２年）Bioconjugate  Chem.１３巻：７８６〜７９１頁）、マイタンシノイド（欧州特許第１３９１２１３号；Liuら（１９９６年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９３巻：８６１８〜８６２３頁）、カリチアマイシン（Lodeら（１９９８年）Cancer  Res.５８巻：２９２８頁；Hinmanら（１９９３年）Cancer  Res.５３巻：３３３６〜３３４２頁）、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、およびビンデシン（Rowlandら（１９８６年）、上記）が含まれる。
【０００６】
チオ尿素リンカー−キレーターを介して１１１Ｉｎまたは９０Ｙ放射性同位体と接続されたマウスＩｇＧｌカッパモノクローナル抗体（正常Ｂリンパ球および悪性Ｂリンパ球の表面上に見出されるＣＤ２０抗原を対象とする）から構成された抗体−放射性同位体コンジュゲートである、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）を含めたいくつかの抗体−薬物コンジュゲートは、臨床治験において、がんに対して有望な結果をもたらすことが示されている。
【０００７】
腫瘍細胞を死滅させるか、または阻害する薬物を含めた細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤を局所送達するために抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を使用することによって、腫瘍への薬物部分の標的化送達およびその細胞内蓄積が可能になる。このタイプの送達機序は、コンジュゲートしていない薬物薬剤の全身投与から生じるおそれがある正常細胞への毒性を、最小限に抑える一助になる。毒素は、チューブリン結合を含めた様々な機序を介して、それらの細胞傷害作用および細胞増殖抑制作用を引き起こすことができる。
【０００８】
したがって、望ましい薬学的特性を有する強力なＲＮＡポリメラーゼ阻害剤である抗体コンジュゲートが、依然必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，９７５，２７８号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１０／１１５６２９号
【特許文献３】国際公開第２０１２／０４１５０４号
【特許文献４】国際公開第２０１２／１１９７８７号
【特許文献５】欧州特許第１３９１２１３号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Wieland（１９８３年）Int.  J.  Pept.  Protein  Res.２２巻（３号）：２５７〜２７６頁
【非特許文献２】SyrigosおよびEpenetos（１９９９年）Anticancer  Res.１９巻：６０５〜６１４頁
【非特許文献３】Niculescu-DuvazおよびSpringer（１９９７年）Adv.  Drug  Delivery  Rev.２６巻：１５１〜１７２頁
【非特許文献４】Baldwinら（１９８６年）Lancet（１９８６年３月１５日）：６０３〜０５頁
【非特許文献５】Thorpe（１９８５年）「Antibody  Carriers  of  Cytotoxic  Agents  in  Cancer  Therapy:  A  Review」、Monoclonal  Antibodies  '84:  Biological  and  Clinical  Applications、A.  Pincheraら（編）、４７５〜５０６頁
【非特許文献６】Rowlandら（１９８６年）Cancer  Immunol.  Immunother.２１巻：１８３〜８７頁
【非特許文献７】Mandlerら（２０００年）J.  Natl.  Cancer  Inst.９２巻（１９号）：１５７３〜１５８１頁
【非特許文献８】Mandlerら（２０００年）Bioorg.  Med.  Chem.  Lett.１０巻：１０２５〜１０２８頁
【非特許文献９】Mandlerら（２００２年）Bioconjugate  Chem.１３巻：７８６〜７９１頁
【非特許文献１０】Liuら（１９９６年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９３巻：８６１８〜８６２３頁
【非特許文献１１】Lodeら（１９９８年）Cancer  Res.５８巻：２９２８頁
【非特許文献１２】Hinmanら（１９９３年）Cancer  Res.５３巻：３３３６〜３３４２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
要旨
本開示は、ＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲート）構造で使用される、改善されたアマトキシン誘導体を提供する。より具体的には、本開示は、式Ｉの構造を有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
【化４】
2019523761.tif 000005
または薬学的に許容されるその塩を提供する
［式中、
Ａｂは、モノクローナル抗体であり、
Ｌ１−Ｌ２は、
【化５】
2019523761.tif 000006
からなる群から選択されるリンカーであり、波線は、Ａｂとの結合点を示し、
Ｌ２−Ｘは、
【化６】
2019523761.tif 000007
の構造を有するリンカーであり、Ｒ４は、水素、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、またはそれらの組合せであり、ｍは、１〜２４の整数であり、
波線は、Ｄとの結合点を示し、
Ｄは、アマトキシンから誘導された薬物部分の活性薬剤であり、以下の構造を有するアルファ−アマニチン、ベータ−アマニチン、ガンマ−アマニチン、およびイプシロン−アマニチンからなる群から選択され、
【化７】
2019523761.tif 000008
ｎは、１〜１０の整数であり、
Ｌ２は、アミノ酸、１０個までのアミノ酸からなるペプチド、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジル）、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ、−Ｒ６ＯＣ（Ｏ）ＮＲ５−、−Ｒ８−Ｓ−Ｓ−Ｒ７、およびそれらの組合せからなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ６は、アミノ酸、１０個までのアミノ酸からなるペプチド、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ７は、Ｃ２〜６アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−であり、
Ｒ８は、アミノ酸、１０個までのアミノ酸からなるペプチド、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキレン、置換Ｃ１〜６アルキレン、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＲ９−ＣＲ１０Ｒ１１−、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＣＨＲ９−ＣＲ１０Ｒ１１−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ９は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキレン、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＳＯ３Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ２Ｈおよびそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
−Ｒ６ＯＣ（Ｏ）ＮＲ５−は、Ｒ５またはＲ６を介してＬ１と接続し、
−Ｒ８−Ｓ−Ｓ−Ｒ７−は、Ｒ８を介してＬ１と接続し、
ｍは、１〜２４の整数であり、
ｐは、１〜６の整数である］。
【００１２】
別の態様では、式Ｉの構造を有する化合物のＬ２は、アミノ酸、１０個までのアミノ酸からなるペプチド、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジル）、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−、−Ｒ６ＯＣ（Ｏ）ＮＲ５−、−Ｒ８−Ｓ−Ｓ−Ｒ７、およびそれらの組合せからなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ６は、アミノ酸、１０個までのアミノ酸からなるペプチド、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、ＰＡＢ、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ７は、Ｃ２〜６アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−であり、
Ｒ８は、アミノ酸、１０個までのアミノ酸からなるペプチド、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキレン、置換Ｃ１〜６アルキレン、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＲ９−ＣＲ１０Ｒ１１−、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＣＨＲ９−ＣＲ１０Ｒ１１−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、ＰＡＢ、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ９は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキレン、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＳＯ３Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ２Ｈおよびそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
−Ｒ６ＯＣ（Ｏ）ＮＲ５−は、Ｒ５またはＲ６を介してＬ１と接続し、
−Ｒ８−Ｓ−Ｓ−Ｒ７−は、Ｒ８を介してＬ１と接続し、
ｍは、１〜２４の整数であり、
ｐは、１〜６の整数であり、残りの値は、式Ｉについて前述される通りである。
【００１３】
さらに別の態様では、式Ｉの構造を有する化合物のＬ２は、アミノ酸、１０個までのアミノ酸からなるペプチド、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ（４−フェニル）ＣＨ２Ｏ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＮＨ（４−フェニル）ＣＨ２Ｏ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＮＨ（４−フェニル）ＣＨ２Ｏ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＮＨ（４−フェニル）ＣＨ２Ｏ−、−Ｒ６ＯＣ（Ｏ）ＮＲ５−、−Ｒ８−Ｓ−Ｓ−Ｒ７−、およびそれらの組合せからなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ６は、アミノ酸、１０個までのアミノ酸からなるペプチド、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ（４−フェニル）ＣＨ２−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＮＨ（４−フェニル）ＣＨ２−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＮＨ（４−フェニル）ＣＨ２−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＮＨ（４−フェニル）ＣＨ２−、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ７は、Ｃ２〜６アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−であり、
Ｒ８は、アミノ酸、１０個までのアミノ酸からなるペプチド、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキレン、置換Ｃ１〜６アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＲ９−ＣＲ１０Ｒ１１−、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＣＨＲ９−ＣＲ１０Ｒ１１−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−ＰＡＢ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＮＨ（４−フェニル）ＣＨ２−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＮＨ（４−フェニル）ＣＨ２−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＮＨ（４−フェニル）ＣＨ２−、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ９は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキレン、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＳＯ３Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ２Ｈおよびそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、およびそれらの組合せからなる群から選択され、
−Ｒ６ＯＣ（Ｏ）ＮＲ５−は、Ｒ６を介してＬ１と接続し、
−Ｒ８−Ｓ−Ｓ−Ｒ７−は、Ｒ８を介してＬ１と接続し、
ｍは、１〜２４の整数であり、
ｐは、１〜６の整数であり、残りの値は、式Ｉについて前述される通りである。
【００１４】
好ましくは、Ｄは、式ＩＩの構造
【化８】
2019523761.tif 000009
を有し、波線は、Ｘとの結合点を示し、
Ｒ１は、ＮＨ２またはＯＲ２であり、Ｒ２は、Ｈ、またはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、Ｒ３は、ＨまたはＯＨである。
【００１５】
好ましくは、開示されるＡＤＣは、
【化９】
2019523761.tif 000010
【化１０】
2019523761.tif 000011
【化１１】
2019523761.tif 000012
からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】図１は、図１の４つのパネルのそれぞれにおける１種の細胞系の、４種の細胞系に対するＡＤＣ  Ａ（２２）およびＡＤＣ  Ｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性の比較を示す。
【図１−２】図１は、図１の４つのパネルのそれぞれにおける１種の細胞系の、４種の細胞系に対するＡＤＣ  Ａ（２２）およびＡＤＣ  Ｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性の比較を示す。
【００１７】
【図２】図２は、ＡＤＣ２４（表２参照）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。
【００１８】
【図３】図３は、様々な細胞系に対するＡＤＣ２２（表２参照）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。
【００１９】
【図４】図４は、様々な細胞系に対するＡＤＣ２６のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。
【００２０】
【図５】図５は、様々な細胞系に対するＡＤＣ２７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。
【００２１】
【図６】図６は、様々な細胞系に対するＡＤＣ２５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。
【００２２】
【図７】図７は、様々な細胞系に対するＡＤＣ２９のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。
【００２３】
【図８】図８は、Ｈ２９２異種移植におけるｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２２、ｃＭｅｔ−２２およびＮｉｍｏ−２２の有効性を示す。ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２２およびＮｉｍｏ−２２は、ＰＢＳ対照群と比較してＨ２９２腫瘍成長を著しく阻害した。
【００２４】
【図９】図９は、化合物２９の腫瘍サイズの比較を示す。ｃＭｅｔ／ＥＦＦＲ−２２およびＮｉｍｏ−２２は、ＰＢＳ対照群と比較して腫瘍サイズ／重量を著しく低減した。Ｎｉｍｏ−２２は、完全な腫瘍退行をある程度有していた（マウス７匹のうち４匹に、腫瘍がなかった）。
【００２５】
【図１０】図１０は、ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２２、ｃＭｅｔ−２２、Ｎｉｍｏ−２２処置に関係する著しい体重減少が観測されなかったことを示す。
【００２６】
【図１１】図１１は、ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２３、ｃＭｅｔ−２３およびＮｉｍｏ−２３で処置した群が、ＰＢＳ対照群と比較して腫瘍体積の著しい低減を示したことを示す。
【００２７】
【図１２】図１２は、ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２３、ｃＭｅｔ−２３およびＮｉｍｏ−２３で処置した群が、ＰＢＳ対照群と比較して腫瘍重量の著しい低減を示したことを示す。
【００２８】
【図１３】図１３は、ｃＭｅｔ−２３、ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２３、およびＮｉｍｏ−２３で処置した群において体重減少が観測されなかったことを示す。
【００２９】
【図１４】図１４は、３ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２５の単回投与では、Ｈ１９７５異種移植における著しい腫瘍成長阻害がなかったことを示す。
【００３０】
【図１５】図１５は、３ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇのｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２７の単回投与、またはｃＭｅｔ−２７の単回投与では、ＨＣＣ８２７異種移植における著しい腫瘍成長阻害がなかったことを示す。
【００３１】
【図１６】図１６は、研究中、３ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇのｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−ＡＤＣ２７の単回投与、または０．３ｍｇ／ｋｇのｃＭｅｔ−ＡＤＣ２７の単回投与では、著しい体重減少が観測されなかったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
【表１−１】
2019523761.tif 000013
【表１−２】
2019523761.tif 000014
【表１−３】
2019523761.tif 000015
【００３３】
【表２−１】
2019523761.tif 000016
【表２−２】
2019523761.tif 000017
【表２−３】
2019523761.tif 000018
【００３４】
定義
本明細書で使用される場合、一般的な有機に関する略語は、以下の通り定義される。
Ａｃ  アセチル
ａｑ．  水性
ＢＯＣまたはＢｏｃ  ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
Ｂｕ  ｎ−ブチル
℃  摂氏温度
Ｃｉｔ  シトルリン
ＤＣＭ  塩化メチレン
ＤＥＰＣ  ジエチルシアノホスホネート
ＤＩＣ  ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＥＡ  ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡ  Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド
ＤＭＦ  Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
Ｅｔ  エチル
ＥｔＯＡｃ  酢酸エチル
Ｅｑ  当量
Ｆｍｏｃ  ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ｇ  グラム
ｈ  時間
ＨＡＴＵ  ２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢＴ  Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＳｕ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ／ＭＳ  液体クロマトグラフィー−質量分析
Ｍｅ  メチル
ＭｅＯＨ  メタノール
ＭｅＣＮ  アセトニトリル
ｍＬ  ミリリットル
ＭＳ  質量分析
ＰＡＢ  ｐ−アミノベンジル
ＲＰ−ＨＰＬＣ  逆相ＨＰＬＣ
ｒｔ  室温
ｔ−Ｂｕ  ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＥＡ  トリエチルアミン
Ｔｅｒｔ、ｔ  第三級
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸（Trifluoracetic  acid）
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
ＴＬＣ  薄層クロマトグラフィー
μＬ  マイクロリットル
【００３５】
ハイフン（−）は、使用される場合、基が、定義された変数に結合している点を示す。左側にあるハイフンは、式（Ｉ）の左側の構造的構成成分との接続を示し、右側にあるハイフンは、式（Ｉ）の右側の構造的構成成分との接続を示す。例えば、他に特定されない限り、Ｌ２が−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−と定義される場合、これは、Ｌ１との結合が、−ＣＨ２の炭素にあり、Ｘとの結合が酸素原子にあることを意味する。
【００３６】
一般合成手順。−酸からの活性化エステル（例えばＮＨＳ）の形成
酸を、ＤＣＭ（塩化メチレン）に溶解させ、必要に応じてＤＭＦ（Ｎ，Ｎ’ジメチルホルムアミド）を添加して溶解を助けた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．５当量）を添加した後、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（１．５当量）を添加した。酸の大部分が消費されるまで、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応の進行を、ＲＰ−ＨＰＬＣによってモニタリングした。次に、混合物をＤＣＭで希釈し、クエン酸（１０％水溶液）およびブラインで逐次的に洗浄した。有機層を乾燥させ、濃縮乾固させた。粗製生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣまたはシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって任意選択で精製した。
【実施例】
【００３７】
実施例１
化合物６の調製
【化１２】
2019523761.tif 000019
【００３８】
アルファ−アマニチン（amainitin）１（４６ｍｇ、５０μｍｏｌ）の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１ｍＬ）溶液に、ビス（４−ニトロフェノール）カーボネート（１７ｍｇ、５５μｍｏｌ）を添加した後、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１０μＬ）を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した。化合物３（１２ｍｇ）を添加した後、ＤＩＥＡ（１０μＬ）を添加した。ＬＣ／ＭＳによって、すべての化合物２が１時間後に消費されたことが示された。すべての溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタン（ＤＣＭ）（２０％、ｖ／ｖ、２ｍＬ）中トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理した。３０分後に反応混合物を濃縮し、残留物を逆相ＨＰＬＣによって精製して、凍結乾燥後に、化合物４を白色の固体としてＴＦＡ塩形態で得た（４５ｍｇ、７８％）。ＭＳ：ｍ／ｚ１０３３．４（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００３９】
化合物４（４５ｍｇ）を、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１ｍＬ）に溶解させ、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−バリル−シトルリル−（４−アミノベンジル）−（４−ニトロフェニル）カーボネート（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＰＮＰ、３８ｍｇ）を添加した後、ＤＩＥＡ（２０μＬ）を添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳ分析によって反応の完了が示された。ピペリジン（５０μＬ）を添加し、２時間後、酢酸（２００μＬ）を添加することによって反応混合物を中和した。粗製混合物を、逆相ＨＰＬＣによって直接精製して、凍結乾燥後に、化合物５を白色の固体としてＴＦＡ塩形態で得た（４８ｍｇ、８０％）。ＭＳ：ｍ／ｚ１４３８．７（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００４０】
撹拌した化合物５（１６ｍｇ、１０μｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシスクシンイミドエステル（４ｍｇ）を添加した後、ＤＩＥＡ（４μＬ）を添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。粗製反応混合物を、精製のために分取ＨＰＬＣカラムに注入した。化合物６を、凍結乾燥後に白色の固体として得た（１２ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ１６３１．８（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００４１】
実施例２
化合物８の調製
【化１３】
2019523761.tif 000020
【００４２】
撹拌した化合物５（１６ｍｇ、１０μｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、酸７（６ｍｇ）を添加した後、ジイソプロピルカルボジイミド（５μＬ）を添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。粗製反応混合物を、精製のために分取ＨＰＬＣカラムに注入した。化合物８を、凍結乾燥後に白色の固体として得た（８ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ１７６１．８（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００４３】
実施例３
化合物１０の調製
【化１４】
2019523761.tif 000021
【００４４】
撹拌した化合物２（３０μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１ｍＬ）溶液に、アミン９（４０ｍｇ）を添加した後、ＤＩＥＡ（１５μＬ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。粗製反応混合物を、精製のために分取ＨＰＬＣカラムに注入した。化合物１０を、凍結乾燥後に白色の固体として得た（３２ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ２０４６．２（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００４５】
化合物１０を、一般手順に従って対応する活性化エステルに変換した後、抗体にコンジュゲートさせた。
【００４６】
実施例４
化合物１４の調製
【化１５】
2019523761.tif 000022
【００４７】
撹拌した化合物２（５０μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１ｍＬ）溶液に、ＤＭＦ（１ｍＬ）中アミン１１（６５ｍｇ）を添加した後、ＤＩＥＡ（２０μＬ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。ピペリジン（１００μＬ）を添加した。３０分後、混合物を逆相ＨＰＬＣによって直接精製して、化合物１２を白色の固体としてＴＦＡ塩形態で得た（５４ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ１８６２．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００４８】
化合物１２（２０ｍｇ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させた。無水物１３（１１ｍｇ）を添加した後、ＤＩＥＡ（５μＬ）を添加した。反応混合物を室温で５分間撹拌し、逆相ＨＰＬＣによって精製して、凍結乾燥後に、化合物１４を白色の固体として得た（１９ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ２２０３．９（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００４９】
実施例５
化合物１７の調製
【化１６】
2019523761.tif 000023
【００５０】
撹拌した化合物２（５０μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１ｍＬ）溶液に、ＤＭＦ（１ｍＬ）中アミン１５（６５ｍｇ）を添加した後、ＤＩＥＡ（２０μＬ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。ピペリジン（１００μＬ）を添加した。３０分後、混合物を逆相ＨＰＬＣによって直接精製して、化合物１６を白色の固体としてＴＦＡ塩形態で得た（４９ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ１８６２．３（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００５１】
化合物１６（２０ｍｇ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させた。無水物１３（１１ｍｇ）を添加した後、ＤＩＥＡ（５μＬ）を添加した。反応混合物を室温で５分間撹拌し、逆相ＨＰＬＣによって精製して、凍結乾燥後に、化合物１７を白色の固体として得た（２０ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ２２０４．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００５２】
実施例６
化合物２１の調製
【化１７】
2019523761.tif 000024
【００５３】
撹拌した化合物２（５０μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１ｍＬ）溶液に、ＤＭＦ（１ｍＬ）中アミン１５（２５ｍｇ）を添加した後、ＤＩＥＡ（２０μＬ）を添加した。混合物を室温で５時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を２０％ＴＦＡ／ＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解させた。３０分後、混合物を逆相ＨＰＬＣによって直接精製して、化合物１９を白色の固体として得た（３１ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ１３０９．５（Ｍ＋ＮＨ４＋）。
【００５４】
撹拌した化合物１９（２５ｍｇ、２０μｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、酸２０（１６ｍｇ）を添加した後、ジイソプロピルカルボジイミド（８μＬ）を添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。粗製反応混合物を、精製のために分取ＨＰＬＣカラムに注入した。化合物２１を、凍結乾燥後に白色の固体として得た（１２ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ１７９１．４（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００５５】
実施例７
化合物２８の調製
【化１８】
2019523761.tif 000025
【００５６】
撹拌した化合物２（５０μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１ｍＬ）溶液に、ＤＭＦ（１ｍＬ）中アミン３０（４６ｍｇ、５０μｍｏｌ）を添加した後、ＤＩＥＡ（２０μＬ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。ピペリジン（１００μＬ）を添加した。３０分後、混合物を逆相ＨＰＬＣによって直接精製して、化合物３１を白色の固体としてＴＦＡ塩形態で得た（２５ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ１６４０．５（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００５７】
化合物３１（２０ｍｇ、１１．４μｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させた。無水物１３（８ｍｇ）を添加した後、ＤＩＥＡ（５μＬ）を添加した。反応混合物を室温で５分間撹拌し、逆相ＨＰＬＣによって精製して、凍結乾燥後に、化合物２８を白色の固体として得た（１６ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ１９８１．９（Ｍ＋Ｈ＋）。
【００５８】
実施例８
この実施例は、以下「Ａ」および「Ｂ」と示される２つの異なるアマニチン（amatinin）コンジュゲートを比較する比較研究を提供する。
【化１９】
2019523761.tif 000026
アマニチン抗体コンジュゲート構造Ａ（ＡＤＣ２２）
【化２０】
2019523761.tif 000027
アマニチン抗体コンジュゲート構造Ｂ
【００５９】
様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞死滅アッセイにおいて比較研究を行って、アルファ−アマニチン（amaintin）が、切断可能なカルバメート結合を介してリンカーに結合しているアマニチン抗体コンジュゲート構造Ａ（本開示に報告されている）、およびアルファアマニチンが、切断不可能なエーテル結合を介して結合しているアマニチン抗体コンジュゲート構造Ｂ（国際公開第２０１２／０４１５０４号に報告されている）の有効性を評価した（図１の４つのパネルは４種の異なる細胞系に関する）。ＡＤＣ  Ａは、試験したすべての４種のＨｅｒ−２陽性細胞系においてＡＤＣ  Ｂを完全に上回っていた。
【００６０】
実施例９
この実施例は、特定の細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された、指定された薬物とコンジュゲートした抗体のＥＣ５０アッセイの結果（ｎＭ）を提供する。使用した抗体は、抗ＨＥＲ２  ＩｇＧクラスの抗体であった。以下の表においてプラスまたはマイナスの印で示される通り、様々なＨｅｒ２発現レベルの７種の乳がん細胞系を、９６ウェルプレートに蒔いた。ＡＤＣを連続希釈し、処理のために細胞上に添加し５日間置いた。研究の最後に、細胞増殖をＰｒｏｍｅｇａ製ＣｅｌｌＴｉｔｒｅＧｌｏによって測定した。ＥＣ５０（ｎＭ）を、５０％細胞成長阻害濃度として決定した。成果を挙げる化合物の選択基準には、標的受容体の高い発現を伴って３ｎＭ未満のＥＣ５０で細胞系を死滅させるなどの高い有効性が含まれていた。また、成果を挙げる候補は、標的受容体の低度の発現と共に対照細胞系（ＭＤＡ４６８）の相対的に低度の死滅によって決定される通り、低毒性および良好な治療ウィンドウを有するはずである。ＡＤＣ２２（図３）および２４（図２）の両方を、高い有効性および良好な治療ウィンドウを伴う成果を挙げる候補として選択した。
【００６１】
実施例１０
この実施例は、特定の細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された、本明細書に記載の指定されたＡＤＣのＥＣ５０アッセイの結果（ｎＭ）を提供する。使用した抗体は、細胞表面上の受容体チロシンキナーゼを標的とする。以下の表においてプラスまたはマイナスの印で示される通り、様々なレベルの受容体発現を伴う８種のがん細胞系を、９６ウェルプレートに蒔いた。ＡＤＣを連続希釈し、処理のために細胞上に添加し５日間置いた。研究の最後に、細胞増殖をＰｒｏｍｅｇａ製ＣｅｌｌＴｉｔｒｅＧｌｏによって測定した。ＥＣ５０（ｎＭ）を、以下に示し、５０％細胞成長阻害濃度として決定した。成果を挙げる化合物の選択基準には、標的受容体の高い発現を伴って３ｎＭ未満のＥＣ５０で細胞系を死滅させるなどの高い有効性が含まれる。また、成果を挙げる候補は、標的受容体の低度の発現と共に対照細胞系（Ｔ−４７Ｄ）の相対的に低度の死滅によって決定される通り、低毒性および良好な治療ウィンドウを有するはずである。ＡＤＣ２５（図６）は、細胞系Ｈ１９９３、ＨＣＣ８２７、ＳＮＵ−５、およびＨ２９２において良好な細胞死滅有効性を示すが、Ｈｓ７４６Ｔ、ＥＢＣ−１およびＵ８７において有効性を示さなかった。ＡＤＣ２５は、陰性対照細胞系Ｔ−４７Ｄを死滅させなかったので、良好な治療ウィンドウを示した。ＡＤＣ２６（図４）は、Ｈ１９９３およびＳＮｕ−５において良好な細胞死滅活性を示す。しかし、その他の６種の細胞系において活性ではない。ＡＤＣ２７（図５）は、Ｈ１９９３（ＥＣ５０＝１１ｐＭ）およびＳＮｕ−５（ＥＣ５０＝７５ｐＭ）において優れた細胞死滅活性を示す。ＡＤＣ２７はまた、Ｈｓ７４６Ｔおいて良好な有効性を示す（ＥＣ５０＝０．４ｎＭ）。ＡＤＣ２９（図７）は、細胞系Ｈｓ７４６Ｔにおいて良好な細胞死滅有効性を示すが、ＥＢＣ−１、Ｕ８７、ＨＣＣ８２７、Ｈ１９９３およびＴ−４７において有効性を示さなかった。
【００６２】
実施例１１
この実施例は、ヌードマウスのＨ２９２、ＨＣＣ８２７、およびＨ１９７５ヒト異種移植腫瘍成長モデルにおける、低分子２２、２３、２５、または２７とコンジュゲートしたＡＤＣの有効性に関する結果を提供する。ＨＣＣ８２７、Ｈ２９２、Ｈ１９７５細胞系を、ＡＴＣＣから得た。細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｓｅｒａｄｉｇｍ  １５００−５００）およびペニシリンストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３０−００２−ＣＩ）を含むＲＰＭＩ１６４０  １×（Ｃｏｒｎｉｎｇ  １０−０４１−ＣＶ）培地中、３７℃において５％二酸化炭素加湿環境で培養した。細胞を２週間培養し、４回継代した後、収集した。細胞を、０．２５％トリプシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ２５−０５０−ＣＩ）を用いて収集した。注射前に、ＨＣＣ８２７細胞を１：１比のＨＢＳＳ（ハンクス緩衝塩溶液；Ｗａｒｄ製４７０１８０−７８４）およびマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５４２３４）混合物に混合し、０．２ｍｌ当たり７００万個の細胞を、各マウスの右上側腹部に皮下注射した。Ｈ２９２細胞をＨＢＳＳに再懸濁させ、０．２ｍｌ当たり５００万個の細胞を、各マウスの右上側腹部に皮下注射した。Ｈ１９７５細胞をＨＢＳＳに再懸濁させ、０．２ｍｌ当たり３００万個の細胞を、各マウスの右上側腹部に皮下注射した。
【００６３】
これらの研究を通して、５〜７週齢の雌性Ｎｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を使用した。
【００６４】
マウスを受け取ったら、制御環境の室内でケージ１つ当たり５匹のマウスを収容した。げっ歯類の固形飼料および水を自由に摂取させた。マウスを実験室条件に７２時間順化させた後、投与を開始した。順化期間中、動物の健康状態をモニタリングした。各ケージを、群番号および研究番号によって識別し、マウスを、耳標によって個々に識別した。
【００６５】
研究設計および投与レジメンを、表３に示す。
【表３】
2019523761.tif 000028
【００６６】
腫瘍の幅および長さの測定を、デジタルノギスを使用して接種後５〜７日目に開始し、その後、腫瘍体積が約１００〜２５０ｍｍ３に達するまで週２回測定することによって、腫瘍成長をモニタリングした。腫瘍体積を、式：体積（ｍｍ３）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２を使用して算出した。腫瘍を所望の体積に段階分けしたら、動物を無作為化し、非常に大きいまたは小さい腫瘍を有するマウスを間引いた。マウスを、研究設計に示される１群当たりの動物数で、各群に分けた。次に、マウスを、ＰＢＳ、または２２、２３、２５もしくは２７とコンジュゲートした抗体のいずれかで、研究設計に示される用量として静脈内処置した（０．２ｍｌ／動物）。腫瘍成長をモニタリングし、対照群の平均腫瘍量が２０００ｍｍ３を超えたら、各群のマウスを屠殺した。
【００６７】
腫瘍体積を、実験期間を通して週２回測定して、ＴＧＩ（腫瘍成長阻害％）を決定した。各マウスの体重を、電子天秤によって週２回測定した。群の平均および標準偏差を算出し、統計分析（ダネット多重比較試験を伴う一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０）を行った。すべての処置群をＰＢＳ群と比較した。Ｐ＜０．０５を、統計的に有意とみなした。
【００６８】
３ｍｇ／ｋｇのｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２２およびＮｉｍｏ−２２処置の単回投与では、ＰＢＳで処置した対照群と比較して、Ｈ２９２腫瘍成長が著しく阻害された。ｃＭｅｔ−２２は、処置後最初の１０日間で腫瘍成長を阻害したが、腫瘍は、１０日間以降、再び成長した（図８および９）。この研究では、３ｍｇ／ｋｇのｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２２およびｃＭｅｔ−２２の単回投与によって、処置後３〜６日に皮膚発疹が示され、６〜１４日目の間に乾燥した鱗状皮膚が示された。こうした皮膚の問題は、１４日目以降、回復した。研究中、処置に関係する著しい体重減少は観測されなかった（図１０）。ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２２で処置した群において、最初の週の間に体重減少があったが、体重減少は一過性であり、全体重の１０％未満であった。また、動物は、体重が再び増え、ＰＢＳで処置した対照群と比較して全体的に健康であった。
【００６９】
３ｍｇ／ｋｇのｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２３、ｃＭｅｔ−２３、またはＮｉｍｏ−２３処置の単回投与では、ＰＢＳで処置した対照群と比較して、それぞれＨ２９２腫瘍成長が著しく阻害された（図１１および１２）。ｃＭｅｔ−２３、ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２３、およびＮｉｍｏ−２３で処置した群（３ｍｇ／ｋｇ）において、体重減少は観測されなかった（図１３）。
【００７０】
３ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２５の単回投与では、Ｈ１９７５異種移植において著しい腫瘍成長阻害はなかった（図１４）。３ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇのｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ−２７の単回投与、または０．３ｍｇ／ｋｇのｃＭｅｔ−２７の単回投与では、ＨＣＣ８２７異種移植において著しい腫瘍成長阻害はなかった（図１５）。研究中、著しい体重減少は観測されなかった（図１６）。
【図１−１】
2019523761.tif 000043
【図１−２】
2019523761.tif 000044
【図２】
2019523761.tif 000045
【図３】
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【図４】
2019523761.tif 000047
【図５】
2019523761.tif 000048
【図６】
2019523761.tif 000049
【図７】
2019523761.tif 000050
【図８】
2019523761.tif 000051
【図９】
2019523761.tif 000052
【図１０】
2019523761.tif 000053
【図１１】
2019523761.tif 000054
【図１２】
2019523761.tif 000055
【図１３】
2019523761.tif 000056
【図１４】
2019523761.tif 000057
【図１５】
2019523761.tif 000058
【図１６】
2019523761.tif 000059
【国際調査報告】
2019523761.tif 000060
2019523761.tif 000061
2019523761.tif 000062