(57)【要約】  分子マーカー、参照遺伝子、及びその応用、検出キット、並びに検出モデルの構築方法を提供する。比較方法としてフォローアップ情報を使用して、提供されたキットは、ＥＲ・ＰＲ陽性の乳癌と新たに診断された患者術後３〜１０年再発又は死亡リスクに対する予測の精度は７０％であり、ここで、低リスク群と高リスク群への予測の精度はそれぞれ８１．１％と５４．４％である。対応するＦＦＰＥ病理学的検出結果による予測の精度はそれぞれ７１．９％と５６．８％である。そのキットにマッチするリスク予測モデルは、分子マーカーのＣｔ値、患者年齢、ＰＴ分類、ＬＮ数のみが必要で、他の臨床病理情報に頼る必要はなく、乳癌予後への評価性能は、単純な病理学的予測結果より優れ、ある程度病理診断の誤予測による不適切な治療を低減させ、更に乳癌予後予測の技術方法を改善することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子マーカーであるＭＡＰＴ及び／又はＭＳ４Ａ１を含むことを特徴とする、遺伝子組成物。
【請求項２】
分子マーカーであるＢＣＬ２、ＰＧＲ、ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＲ１、ＭＫｉ６７、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＧＲＢ７、ＥＲＢＢ２、ＭＭＰ１１、ＣＤ６８、ＢＡＧ１、ＭＡＰＴ、及びＭＳ４Ａ１からなることを特徴とする、遺伝子組成物。
【請求項３】
さらに、参照遺伝子であるＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＮＵＰ２１４、及びＶＣＡＮを含むことを特徴とする、請求項２に記載の遺伝子組成物。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載の遺伝子組成物の、乳癌術後３〜１０年再発及び／又は死亡リスクを予測するための検出装置の製造における使用。
【請求項５】
前記乳癌術後３〜１０年再発及び／又は死亡リスクの予測は、具体的には、測定するサンプルの全ＲＮＡを取得し、逆転写してｃＤＮＡを取得し、リアルタイムＰＣＲ法（ｒｅａｌｔｉｍｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ，ＲＴＦＱ  ＰＣＲ）により前記分子マーカーと前記参照遺伝子のＣｔ値を求め、前記参照遺伝子のＣｔ値を平均して、参照遺伝子の組み合わせの平均Ｃｔ値（Ｃｔ’）を求め、その後、それぞれ前記分子マーカーのＣｔ値から参照遺伝子の組み合わせのＣｔ’値を差し引いて正規化し、△Ｃｔを求め、△Ｃｔ値、及び被験者の年齢、ｐＴ値、ＬＮ値を、ランダムフォレストのアルゴリズムで構築された乳癌術後３〜１０年再発又は死亡リスク予測モデルにより解析し、結果を取得することを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記乳癌予後３〜１０年再発又は死亡リスク予測モデルの構築方法は、測定するサンプルの分子マーカーの△Ｃｔ値及び被験者年齢、ｐＴ値、ＬＮ値について数学マトリックスを構築し、それらの１／２を訓練データ集合として、１／２を検証データ集合としてランダムに選択し、ランダムフォレストのアルゴリズムにより１０，０００個の決定木を含む予測モデルを構築し、合計で１，０００回以上無作為抽出し、１，０００個以上の予測モデルを構築し、１，０００個以上の予測モデルから最もフォローアップ情報との一致率の高い３９個以上の最適化モデルを最終モデルのサブモデルとして選択し、３９個以上のサブモデルの中央値を最終的な予後リスク予測因子として採用することを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記測定するサンプルは、未治療のＥＲ又はＰＲ早・中期陽性乳癌と新たに診断された患者のＦＦＰＥサンプルであることを特徴とする、請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
配列は、配列番号１〜配列番号２８に示されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の遺伝子組成物を増幅するためのプライマーセット。
【請求項９】
配列は、配列番号２９〜配列番号４２に示されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の遺伝子組成物を増幅するためのプローブセット。
【請求項１０】
配列番号４３〜配列番号４７に示されていることを特徴とする、請求項３に記載の遺伝子組成物の参照遺伝子を増幅するためのプライマーセット。
【請求項１１】
配列番号４８〜配列番号５２に示されていることを特徴とする、請求項３に記載の遺伝子組成物の参照遺伝子を増幅するためのプローブセット。
【請求項１２】
請求項８及び／若しくは１０に記載のプライマーセット、並びに／又は、請求項９及び／若しくは１１に記載のプローブセット、並びにキットによく用いられる試薬を含むことを特徴とする、乳癌術後３〜１０年再発及び／又は死亡リスク予測の検出キット。
【請求項１３】
測定するサンプルの分子マーカーの△Ｃｔ値、被験者年齢、ｐＴ値、ＬＮ値について数学マトリックスを構築し、それらの１／２を訓練データ集合として、１／２を検証データ集合としてランダムに選択し、ランダムフォレストのアルゴリズムにより１０，０００個の決定木を含む予測モデルを構築し、合計で１，０００回以上無作為抽出し、１，０００個以上の予測モデルを構築し、１，０００個以上の予測モデルから最もフォローアップ情報との一致率の高い３９個以上の最適化モデルを最終モデルのサブモデルとして選択し、３９個以上のサブモデルの中央値を最終的な予後リスク予測因子として採用することを特徴とする、乳癌術後３〜１０年再発又は死亡リスク予測モデルの構築方法。
【請求項１４】
測定するサンプルにおける全ＲＮＡを取得し、逆転写してｃＤＮＡを取得し、リアルタイムＰＣＲ法により前記分子マーカーと前記参照遺伝子のＣｔ値を求め、前記参照遺伝子のＣｔ値を平均して、参照遺伝子の組み合わせの平均Ｃｔ値（Ｃｔ’）を求め、その後、それぞれ前記分子マーカーのＣｔ値から参照遺伝子の組み合わせのＣｔ’値を差し引いて正規化し、△Ｃｔを求め、△Ｃｔ値、及び被験者の年齢、ｐＴ値、ＬＮ値を、ランダムフォレストのアルゴリズムで構築された乳癌術後３〜１０年再発又は死亡リスク予測モデルにより解析し、結果を取得することを特徴とする、乳癌術後３〜１０年再発又は死亡リスクの検出方法。
【請求項１５】
前記測定するサンプルは、未治療のＥＲ又はＰＲ早・中期陽性乳癌と新たに診断された患者のＦＦＰＥサンプルであることを特徴とする、請求項１３に記載の構築方法、又は請求項１４に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［相互参照］
本願は、２０１６年０６月３０日に中国特許庁へ提出された、出願番号２０１６１０５０９９８３．０、発明の名称「分子マーカー、参照遺伝子、及びその応用、検出キット、並びに検出モデルの構築方法」である中国特許出願に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、生物技術の分野に関し、特に、分子マーカー、参照遺伝子、及びその応用、検出キット、並びに検出モデルの構築方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
乳癌は、世界中の女性の健康を脅かす主な理由の１つである。２０１３年にアメリカがん協会は、全米のがん統計を発表し、乳がんは、女性のがんの中で発生率が第１位であり、死亡率が第２位であることが示されている。アメリカ国立癌研究センターの最新データによれば、２０１３年にアメリカの女性では新たに診断された乳癌が２３２，３４０例であり、死亡者が３９，６２０人である。米国では、平均して８人に１人の女性が乳がんに罹っている。中国は乳がんの発症率の低い国だが、近年、その発生率及び死亡率は有意に増加している。世界で毎年新たに診断された１３０万例の乳がん患者のうち、約１５％が中国出身である。中国乳癌ネットワークの統計によると、中国で毎年新たに増加している乳癌は３％〜４％に達し、世界レベルの１％〜２％を超え、発症率は、女性のかかりやすい癌の第１位である。乳がんの予防、診断、予後、個別化医療技術を開発することが期待されている。
【０００４】
乳癌は高度に異種性である腫瘍であり、その予後に影響を及ぼす多くの要因があり、同じ臨床段階、組織学的グレード分類及びホルモン受容体発現を有する乳癌患者は、同じ治療計画を受けても、その予後が異なる可能性がある。如何に乳がん患者の予後を正確に判断し、対応する個別化治療計画を作成し、過剰治療及び不適切な治療による傷害及び負担を避けるかは、臨床的に解決する必要がある緊急の問題である。
【０００５】
分子生物学技術の急速な発展に伴い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、プローブの分子交雑、及び遺伝子チップなどの分子生物学的手法により乳癌の予後に関連する遺伝子を発見・検出することが可能となる。２００２年、Ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒらは、ＤＮＡチップ技術によって１１７名の乳癌患者のケースをスクリーニングし、乳癌の予後に関連する７０個の遺伝子を見出し、２００４年、アメリカの科学者もＲＴ−ＰＣＲ法によって６７５例の乳癌サンプルを検証し、２１個の予後関連遺伝子が得られ、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ社は、この研究に基づいて乳がん予後関連製品Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（登録商標）を開発した。Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸは、現在でＮＣＣＮガイドライン、ＡＳＣＯ臨床ガイドライン、ＳｔＧａｌｌｅｎ臨床コンセンサスの３つの世界で最も権威ある臨床ガイドラインによって推奨される唯一の乳癌予後検査製品である。さらに、直居靖人らは、ＤＮＡチップ技術によって日本人のＥＲ陽性、リンパ節陰性の乳癌患者の癌組織サンプルを研究し、９５個の予後関連遺伝子を発見した。Ｔｏｒｓｔｅｎ  Ｏ．Ｎｉｅｌｓｅｎのチームは、臨床的要因・免疫組織化学的染色に比べて、５０個の遺伝子の組み合わせが、より多くの乳癌の予後予測情報を提供することができるとともに、新鮮サンプル又は凍結サンプルの代わりにＦＦＰＥサンプルを使用して検出し、検出可能なサンプルの範囲を拡大していることを見出した。２００２年〜２０１３年の間で乳癌予後関連検出製品Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ、Ｍａｍｍａｐｒｉｎｔ、ＰｒｏｓＩｇｎａＴＭ、ＭａｐＱｕａｎｔ  ＤｘＴＭは、ＦＤＡ、ＣＥ認証を相継いで取得している。しかし、現在、これらの製品は、いずれも欧米人に基づいて研究開発されたものであるが、中国へ導入するには高価なだけでなく、遺伝子やその検出モデルが中国人にも適用するか否かも検証する必要がある。従って、経済的で効果的な、中国人に対応する乳癌予後検出技術を開発することが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記状況に鑑み、分子マーカー、及びその応用、検出キット、並びに検出モデルの構築方法を提供する。そのキットは、乳癌予後評価検査の性能が臨床病理学的評価結果より優れ、ある程度で病理診断の誤診による過剰治療及び不適切な治療を低減させ、乳がん患者の個別化正確治療のニーズを満たし、更に中国国内の乳癌予後予測の技術方法を改善することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の発明目的を達成するために、本発明は、以下の技術案を提供する。
【０００８】
本発明は、分子マーカーであるＭＡＰＴ及び／又はＭＳ４Ａ１を含む遺伝子組成物を提供する。
【０００９】
本発明は、分子マーカーＢＣＬ２、ＰＧＲ、ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＲ１、ＭＫｉ６７、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＧＲＢ７、ＥＲＢＢ２、ＭＭＰ１１、ＣＤ６８、ＢＡＧ１、ＭＡＰＴ、及びＭＳ４Ａ１からなる遺伝子組成物を提供する。
【００１０】
本発明の幾つかの具体的な実施形態において、上記遺伝子組成物は、更に参照遺伝子ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＮＵＰ２１４、ＶＣＡＮを含む。
【００１１】
本発明は、更に、上記遺伝子組成物の、乳癌術後３〜１０年再発及び／又は死亡リスクを予測のための検出装置の製造における使用を提供する。
【００１２】
本発明の幾つかの具体的な実施形態において、上記使用では乳癌予後３〜１０年再発及び／又は死亡リスク評価の検出は、具体的には、測定するサンプルにおける全ＲＮＡを取得し、逆転写してｃＤＮＡを取得し、リアルタイムＰＣＲ法（ｒｅａｌｔｉｍｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ，ＲＴＦＱ  ＰＣＲ）により上記分子マーカーと上記参照遺伝子のＣｔ値を求め、上記参照遺伝子のＣｔ値を平均し、参照遺伝子の組み合わせの平均Ｃｔ値（Ｃｔ’）を求め、その後、それぞれ上記分子マーカーのＣｔ値から参照遺伝子の組み合わせのＣｔ’値を差し引いて正規化し、△Ｃｔを求め、△Ｃｔ値、及び被験者の年齢、ｐＴ値、ＬＮ値をランダムフォレストのアルゴリズムで構築された乳癌術後３〜１０年再発又は死亡リスク予測モデルにより解析し、結果を取得する。ここで、ｐＴ値は、病理学的病期分類であり、ＬＮ値は、リンパ節転移個数である。上記解析で得られた数値を、閾値と比較したところ、上記閾値は、５である。上記解析で得られた数値≧５では、予後良好であり、上記解析で得られた数値＜５では、予後不良である。
【００１３】
本発明の幾つかの具体的な実施形態において、上記使用では乳癌予後３〜１０年再発又は死亡リスク評価の検出モデルの構築方法は、測定するサンプルの分子マーカーの△Ｃｔ値、及び被験者年齢、ｐＴ値、ＬＮ値について数学マトリックスを構築し、それらの１／２を訓練データ集合として、残りの１／２を検証データ集合としてランダムに選択し、ランダムフォレストのアルゴリズムにより１０，０００個の決定木を含む予測モデルを構築し、合計で１，０００回以上無作為抽出し、１，０００個以上の予測モデルを構築し、１，０００個以上の予測モデルから最もフォローアップ情報との一致率の高い３９個以上の最適化モデルを最終モデルのサブモデルとして選択し、３９個以上のサブモデルの中央値を最終的な予後リスク予測因子として採用する。
【００１４】
ランダムフォレスト（Ｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｆｏｒｅｓｔｓ）は、多くの決定木で構成され、決定木の構築は、属性とサンプルに基づく二重ランダム化選択法を用いるので、ランダム化決定木（ｒａｎｄｏｍ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｆｏｒｅｓｔｓ）とも言われる。ランダムフォレストにおいて、各決定木の間には関連がない。テストデータがランダムフォレストに入力された場合には、個々の決定木によって分類され、最後に、全ての決定木のうちの最も分類結果の多いクラスを最終的な結果、即ち、決定木の「投票」の結果とし、換言すれば、ランダムフォレストは、複数の決定木を含む分類器であり、且つその出力したクラスが各決定木から出力したクラスの多数決によるものである。本発明では、伝統的なランダムフォレストに基づいて最適化し、サンプルを１，０００回ランダムサンプリングし、１，０００個のモデルを構築し、１，０００個のモデルから正解率と特異度とも比較的高い３９個の最適化モデルを最終モデルのサブモデルとして選択し、３９個のサブモデルの中央値を最終的な予測結果として採用する。
【００１５】
未治療のＥＲ又はＰＲ陽性早・中期乳癌と新たに診断された患者の年齢、ＰＴ分類、ＬＮ転移個数、及び１４個の分子マーカーであるＢＣＬ２、ＰＧＲ、ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＲ１、ＭＫｉ６７、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＧＲＢ７、ＥＲＢＢ２、ＭＭＰ１１、ＣＤ６８、ＢＡＧ１、ＭＡＰＴ、ＭＳ４Ａ１、並びに５個のハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＮＵＰ２１４、ＶＣＡＮのＣｔ値を、３９個の予測モデルに入力して解析し、予測分析結果を取得し、３〜１０年再発又は死亡リスク値を得、リスク閾値（閾値は５）に基づいて予後良好であり、或いは予後不良であると予測する。
【００１６】
本発明の幾つかの具体的な実施形態において、本発明の測定するサンプルは、未治療のＥＲ又はＰＲ陽性早・中期乳癌と新たに診断された患者のＦＦＰＥサンプルである。
【００１７】
本発明は、さらに、配列が配列番号１〜２８に示されている、上記遺伝子組成物を増幅するためのプライマーセットを提供する。
【００１８】
本発明は、さらに、配列が配列番号２９〜４２に示されている、上記遺伝子組成物を増幅するためのプローブセットを提供する。
【００１９】
本発明は、さらに、配列が配列番号４３〜４７に示されている、上記遺伝子組成物の参照遺伝子を増幅するためのプライマーセットを提供する。
【００２０】
本発明は、さらに、配列が配列番号４８〜５２に示されている、上記遺伝子組成物の参照遺伝子を増幅するためのプローブセットを提供する。
【００２１】
本発明は、さらに、上記プライマーセット、及び／又は、上記プローブセット、及びキットで一般的に使用されている試薬を含む、乳癌術後３〜１０年再発及び／又は死亡リスク予測の検出キットを提供する。
【００２２】
本発明は、更に、測定するサンプルの分子マーカーの△Ｃｔ値、被験者年齢、ｐＴ値、ＬＮ値について数学マトリックスを構築し、それらの１／２を訓練データ集合として、残りの１／２を検証データ集合としてランダムに選択し、ランダムフォレストのアルゴリズムにより１０，０００個の決定木を含む予測モデルを構築し、合計で１，０００回以上無作為抽出し、１，０００個以上の予測モデルを構築し、１，０００個以上の予測モデルから最もフォローアップ情報との一致率の高い３９個以上の最適化モデルを最終モデルのサブモデルとして選択し、３９個以上のサブモデルの中央値を最終的な予後リスク予測因子として採用する、乳癌予後３〜１０年再発又は死亡リスク評価の検出モデルの構築方法を提供する。
【００２３】
本発明は、更に、測定するサンプルにおける全ＲＮＡを取得し、逆転写してｃＤＮＡを取得し、リアルタイムＰＣＲ法により上記分子マーカー及び上記参照遺伝子のＣｔ値を求め、上記参照遺伝子のＣｔ値を平均して、参照遺伝子の組み合わせの平均Ｃｔ値（Ｃｔ’）を求め、その後、それぞれ上記分子マーカーのＣｔ値から参照遺伝子の組み合わせのＣｔ’値を差し引いて正規化し、△Ｃｔを求め、△Ｃｔ値、及び被験者の年齢、ｐＴ値、ＬＮ値をランダムフォレストのアルゴリズムで構築された乳癌術後３〜１０年再発又は死亡リスク予測モデルにより解析し、結果を取得し、即ち、３〜１０年再発又は死亡リスク値を取得し、リスク閾値（閾値は５である）に基づいて、予後良好であり、或いは予後不良であると予測する、乳癌予後３〜１０年再発又は死亡リスク評価の検出方法を提供する。
【００２４】
本発明の測定するサンプルは、未治療のＥＲ又はＰＲ陽性早・中期乳癌と新たに診断された患者のＦＦＰＥサンプルである。
【００２５】
本発明の課題を解決するための技術案は、（１）文献・データベースから調査・研究し、１９２個の乳癌に関連する候補遺伝子（乳癌予後関連に限定されず、参照遺伝子を含み）を選択し、ＴＬＤＡ遺伝子発現検出チップ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）をカスタマイズすること、（２）完全な人口統計データ、臨床データ、及びフォローアップデータ（再発・転移時間、生存時間）を体系的に収集し、未治療のＥＲ又はＰＲ陽性早・中期乳癌と新たに診断された患者のＦＦＰＥサンプルを選択し、カスタマイズされたＴＬＤＡチップにより１９２個の遺伝子検出を行い、参照遺伝子及び乳癌予後関連の分子マーカーのスクリーニングを行うこと、（３）スクリーニングされた候補分子マーカー及び参照遺伝子は、独立したサンプルで検証され、ランダムフォレストのアルゴリズムにより患者術後３〜１０年再発又は死亡リスクの予測モデルを構築し、予測モデルとフォローアップ結果との一致率を評価すること、（４）更に、独立臨床サンプル、即ち、既知の臨床的なフォローアップデータを有する１９例のＥＲ又はＰＲ陽性早・中期乳癌と新たに診断された患者のＦＦＰＥサンプルを用いて検証し、検出結果とフォローアップ結果との一致率を評価すること、を含む。
【００２６】
本発明は、未治療のＥＲ又はＰＲ陽性早・中期乳癌と新たに診断された患者術後３〜１０年再発又は死亡の予後評価のために用いられる遺伝子検出システムを提供する。ホルマリン固定・パラフィン包埋（Ｆｏｒｍａｌｉｎ−Ｆｉｘｅｄ  ａｎｄ  Ｐａｒｒｆｆｉｎ−Ｅｍｂｅｄｄｅｄ、ＦＦＰＥ）乳癌組織サンプル中の全ＲＮＡを抽出し、ユニバーサルプライマーによる逆転写を行った後、ＰＣＲ法により乳癌の予後と関連する１４個の分子マーカー及び５個の参照遺伝子が発現しているＣｔ値を検出する。Ｃｔ値、被験者年齢、ｐＴ値、及びＬＮ値をランダムフォレストで構築されたＥＲ又はＰＲ陽性早・中期乳癌患者術後３〜１０年再発又は死亡リスクの予測モデルに入力し、予後良好か予後不良かを判断する。そのシステムは、フォローアップ情報と比較して、精度が７０％に達し、患者年齢、ＰＴ分類、ＬＮ数の以外は、他の臨床病理情報に頼る必要はない。
【００２７】
本発明で提供されたキットは、３〜１０年再発又は死亡リスク値が低い乳癌と新たに診断された患者に対する予測の正解率が８１．１％であり、病理学的な予測への検出の精度が７１．９％であり、３〜１０年再発又は死亡リスク値が高い乳癌と新たに診断された患者に対する予測の正解率の感度が５４．４％であり、対応する病理学的な予測への検出精度５６．８％に近づく。そのキットは、臨床的なフォローアップ情報と比較して、一致率が７０％に達し、患者年齢、ＰＴ分類、ＬＮ数の以外は、他の臨床病理情報に頼る必要はない。
【発明の効果】
【００２８】
本検出システム、及びキットは、乳癌予後評価の検出性能において臨床病理学的予測結果より優れ、ある程度病理診断の誤診による過剰治療及び不適切な治療を低減させ、乳がん患者の個別化治療のニーズを満たし、更に中国国内の乳癌予後予測の技術方法を改善する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本発明の実施例又は先行技術の技術案をより明確に説明するために、実施例又は先行技術の説明で使用される図面を以下に簡単に説明する。
【００３０】
【図１】図１は、参照遺伝子と検出遺伝子との関連性に対する分析結果を示す。
【図２】図２は、乳癌予後３〜１０年再発又は死亡リスク評価モデルの構築を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、分子マーカー、参照遺伝子、及びその応用、検出キット、並びに検出モデルの構築方法を開示し、当業者は、本明細書の記述を参照して、適当にプロセスのパラメータを改良して実現することができる。特に、全ての類似の置換及び変更が当業者にとって明らかであり、それらも本発明に含まれると指摘すべきである。本発明にかかる方法及び使用は、既に好適な実施例によって述べたが、当業者にとっては、本発明の内容、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び使用を改良し、或いは適当に変更し、また組み合わせることにより、本発明の技術を実現、適用することが明らかである。
【００３２】
本発明の課題を解決する技術案は、（１）文献・データベースから調査・研究し、１９２個の乳癌に関連する候補遺伝子（乳癌予後関連に限定せず、参照遺伝子を含み）を選択し、ＴＬＤＡ遺伝子発現検出チップ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）をカスタマイズすること、（２）完全な人口統計データ、臨床データ、及びフォローアップデータ（再発・転移時間、生存時間）を体系的に収集し、未治療のＥＲ又はＰＲ陽性早・中期乳癌と新たに診断された患者のＦＦＰＥサンプルを選択し、カスタマイズされたＴＬＤＡチップにより１９２個の遺伝子検出を行い、参照遺伝子及び乳癌予後関連の分子マーカーのスクリーニングを行うこと、（３）スクリーニングされた候補分子マーカー及び参照遺伝子は、独立したサンプルで検証され、ランダムフォレストのアルゴリズムにより患者術後３〜１０年再発又は死亡リスクの予測モデルを構築し、予測モデルとフォローアップ結果との一致率を評価すること、（４）更に、独立臨床サンプル、即ち、既知の臨床的なフォローアップデータを有する１９例のＥＲ又はＰＲ陽性早・中期乳癌と新たに診断された患者のＦＦＰＥサンプルを用いて検証し、検出結果とフォローアップ結果との一致率を評価する。
【００３３】
１．研究サンプルの選択
（１）未治療の早・中期乳癌と新たに診断された患者、
（２）未治療のＥＲ及び／又はＰＲ陽性早・中期乳癌患者、
（３）ＬＮ転移の有及び／又は無、及びＬＮ転移個数、
（４）正確で詳細なフォローアップ情報  があること。
本研究は、基準を満たす合計で３３９例のサンプルを使用する。
【００３４】
２．ＦＦＰＥサンプルの全ＲＮＡ抽出
Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＦＦＰＥＴ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＦＦＰＥサンプルの全ＲＮＡを抽出し、濃度が２５ｎｇ〜４００ｎｇ／μＬ、ＯＤ２６０／２８０が１．８〜２．０の範囲、ＯＤ２６０／２３０が１．５〜２．０にある。
【００３５】
３．ＴＬＤＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）チップによる検出
既知の臨床的なフォローアップ情報を有する２６群の予後良好と予後不良のサンプルを使用して実験を行う。
（１）全ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡ試料を得、
（２）ｃＤＮＡ産物は、ＴＬＤＡチップによる検出を行い、
（３）データを解析、処理し、候補分子マーカー及び参照遺伝子を取得する。
【００３６】
４．  リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）法
既知の臨床的なフォローアップ情報を有する２８９例のサンプルを使用して候補分子マーカーの検証を行う。
（１）全ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡ試料を得、
（２）ｃＤＮＡ産物は、Ｔ−ＰＣＲ検出を行い、
（３）データを分析・処理する。
【００３７】
５．診断キットの製造方法
カスタマイズされたＴＬＤＡチップによる検出方法により、２６例の乳癌予後良好のサンプルと２６例の乳癌予後不良のサンプルとの参照遺伝子及び遺伝子発現の違いを確認し、参照遺伝子と差次的に発現された遺伝子をスクリーニングする。候補分子マーカーは、定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）法により大規模サンプルを検証する。最後的にスクリーニングされた乳癌予後と関連する１４個の遺伝子及び５個の参照遺伝子から診断キット（ＢＣＬ２、ＰＧＲ、ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＲ１、ＭＫｉ６７、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＧＲＢ７、ＥＲＢＢ２、ＭＭＰ１１、ＣＤ６８、ＢＡＧ１、ＭＡＰＴ、ＭＳ４Ａ１；ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＮＵＰ２１４、ＶＣＡＮ）を構成する。診断キットは、かかるキットは、更に予測モデルを含み、そのうち、ＢＣＬ２、ＰＧＲ、ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＲ１、ＭＫｉ６７、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＧＲＢ７、ＥＲＢＢ２、ＭＭＰ１１、ＣＤ６８、ＢＡＧ１、ＭＡＰＴ、及びＭＳ４Ａ１の発現レベルは、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＮＵＰ２１４、ＶＣＡＮの平均値を参照遺伝子として検出されたものであり、同時に乳癌患者年齢、ＰＴ、ＬＮなどの臨床的な情報を総合してその術後３〜１０年予後再発又は死亡リスクを総合的に評価し、予後良好又は予後不良を判断する。
【００３８】
６．リスク評価の検出モデルの構築
（１）乳癌術後３〜１０年再発又は死亡リスク予測モデルの構築
機械学習アルゴリズムにおけるランダムフォレストのアルゴリズムを用いて検出サンプルの術後３〜１０年再発又は死亡リスク値を評価し、乳癌予後評価遺伝子の検出モデルを構築する。ランダムフォレスト（Ｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｆｏｒｅｓｔｓ）は、多くの決定木で構成され、決定木の構築は、属性とサンプルに基づく二重ランダム化選択法を用いるので、ランダム化決定木（ｒａｎｄｏｍ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｆｏｒｅｓｔｓ）とも言われる。ランダムフォレストにおいて、各決定木の間には相関がない。テストデータがランダムフォレストに入力された場合には、個々の決定木によって分類され、最後に、全ての決定木の中で最も分類結果の多いクラスを最終的な結果、即ち、決定木の「投票」の結果とし、換言すれば、ランダムフォレストは、複数の決定木を含む分類器であり、且つその出力したクラスは各決定木から出力したクラスの多数決によるものである。本発明では、伝統的なランダムフォレストに基づいて最適化し、サンプルを１，０００回ランダムサンプリングし、１，０００個のモデルを構築し、１，０００個のモデルから最も正解率の高い３９個の最適化モデルを最終モデルのサブモデルとして選択し、３９個のサブモデルの中央値を最終的な予測結果として採用する。
【００３９】
以下、本発明をさらに説明する。
研究の第一段階では、ＴＬＤＡのような検出技術を用いて合計で１９２個の乳癌に関連する候補遺伝子を検出し、２６例の乳癌予後良好のサンプルと２６例の乳癌予後不良のサンプルの遺伝子発現の違いを検出し、差次的に発現された遺伝子をスクリーニングする。遺伝子の異なる発現レベルは、２−ΔＣｔで表され、ここで、ΔＣｔ＝ＣＴサンプル−ＣＴ参照であり、スクリーニングされた参照遺伝子を参照として標準化し、相対発現量を算出する。そのうち、参照遺伝子のスクリーニングプロセスは、ｇｅｎｏｒｍ、ｂｅｓｔｋｅｅｐｅｒ、ｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ、ｄｅｌｔａ  Ｃｔの４種を用い、安定性アルゴリズムに基づき、変動の少ない遺伝子の生物学的機能及びそれと腫瘍の関係を考慮して、候補参照遺伝子をスクリーニングし、全ての候補参照遺伝子の組み合わせの平均Ｃｔ値と１９２個の遺伝子の平均Ｃｔ値の関連性を算出し、最も関連性の高い組み合わせは、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＮＵＰ２１４、ＶＣＡＮを含む参照遺伝子である。候補遺伝子のスクリーニング基準は、（１）全体的な分析として、予後良好と予後不良の両群の差は、２倍又は０．５未満であり、且つＣｔ＜３５のケースの占める割合が、５０％に達し、（２）階層分析として、リンパ節転移なし群の予後良好と予後不良の両群の差は、２倍以上であり、且つ統計学的な有意差＜０．０５があり、（３）全体的な分析において両群の差が有意ではないが、乳癌予後に関する文献で報告され、且つＣｔ＜３５のケースの占める割合が９０％に達する、ことである。上記スクリーニング基準を満たす遺伝子はＢＣＬ２、ＰＧＲ、ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＲ１、ＭＫｉ６７、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＧＲＢ７、ＥＲＢＢ２、ＭＭＰ１１、ＣＤ６８、ＢＡＧ１、ＭＡＰＴ、ＭＳ４Ａ１を含む。
【００４０】
まず、本発明は中国の女性の特徴を持つ乳癌予後評価遺伝子を提供する。現在で外国の類似製品はいずれも欧米人に基づいて開発されたものであり、異なる種族の人は異なる遺伝子発現を持つ。本発明は、１９個の遺伝子をスクリーニングし、そのうちのＭＡＰＴとＭＳ４Ａ１は、中国の女性の乳癌患者に基づいてスクリーニングされた術後３〜１０年再発又は死亡評価に関連する遺伝子であり、それらの遺伝子は、乳癌に関連していると報告されているが、乳癌予後に関連する直接の報告は見つかっていない。次に、本発明は、他の発明及び製品と異なる新たな参照遺伝子の組み合わせを構築し、その遺伝子の組み合わせは、ＦＦＰＥサンプル中のＲＮＡ品質の影響を少なく受け、分子マーカーの検出結果の信頼性をより向上させる。第三に、ランダムフォレストによる予測モデルを用いて総合分析を行い、そのモデルは、ＥＲ＋又はＰＲ＋の早・中期乳癌と新たに診断された患者に対して術後３〜１０年再発又は死亡のリスク予測を行う。
【００４１】
以上から、本発明は、未治療のＥＲ又はＰＲ陽性の乳癌Ｉ・ＩＩ期患者術後３〜１０年再発又は死亡の予後評価のための遺伝子の検出システムを提供する。そのシステムはフォローアップ情報と比較して、精度が７０％に達し、患者年齢、ＰＴ分類、ＬＮ数の以外は、他の臨床病理情報に頼る必要はない。
【００４２】
本発明で提供される分子マーカー、参照遺伝子、及びその応用、検出キット、並びに検出モデルの構築方法に用いられる原料と試薬は、ともに市場から購入することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。
【００４４】
［実施例１  試料の收集、試料資料の整理］
未治療の乳癌と新たに診断された患者のＦＦＰＥサンプルを用いて、完全な臨床的なフォローアップデータを体系的に収集し、試料資料を整理することにより、発明者は、その中から以下の基準を満たす３４１例のサンプルをＴＬＤＡ（Ｔａｑｍａｎ  Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙ、ＴＬＤＡ）チップ検出及びその後の一連のｑＲＴ−ＰＣＲ検証の実験試料として選択した。
（１）未治療の早・中期乳癌と新たに診断された患者、
（２）未治療のＥＲ及び／又はＰＲ陽性早・中期乳癌患者、
（３）ＬＮ転移の有及び／又は無、並びにＬＮ転移個数、
（４）正確で詳細なフォローアップ情報があること。
【００４５】
［実施例２  ＴＬＤＡチップによる分子マーカー及び参照遺伝子のスクリーニング］
上記条件を満たす２６例の乳癌予後良好のサンプルと２６例の乳癌予後不良のサンプルをＴＬＤＡチップによる検出を行い、関連結果を取得した。具体的には、
（１）ＦＦＰＥサンプルからのＲＮＡ抽出：各サンプルについては２０μｍの切片を４枚取り出し、或いは１０μｍの切片を８枚取り出し、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＦＦＰＥＴ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）の取扱説明書に従ってＲＮＡ抽出を行い、抽出されたＲＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐ−２０００による定量的コントロールを行った後、下流の逆転写反応に供されるステップと、
（２）全ＲＮＡの逆転写反応によるｃＤＮＡ試料の取得：１μｇの全ＲＮＡを取りＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯＴＭ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）取扱説明書に従って逆転写するステップと、
（３）ｃＤＮＡ試料に対するＴＬＤＡ検出：上記ｃＤＮＡ産物とＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘとを十分に均一となるように混合した後、ＡＢＩ  ７９００  リアルタイムＰＣＲ分析装置でＴＬＤＡの標準手順にて検出実験を行うステップと、
（４）データ解析・処理：
【００４６】
研究の第一段階では、ＴＬＤＡのような検出技術を用いて合計で１９２個の乳癌に関連する候補遺伝子を検出し、２６例の乳癌予後良好のサンプルと２６例の乳癌予後不良のサンプルとの遺伝子発現の違いを検出し、差次的に発現された遺伝子をスクリーニングした。遺伝子の異なる発現レベルは、２−ΔＣｔで表され、ここで、ΔＣｔ＝ＣＴサンプル−ＣＴ参照、スクリーニングされた参照遺伝子を参照として標準化し、相対発現量を算出する。そのうち、参照遺伝子のスクリーニングプロセスは、ｇｅｎｏｒｍ、ｂｅｓｔｋｅｅｐｅｒ、ｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ、ｄｅｌｔａ  Ｃｔの４種を用いて安定性アルゴリズムに基づき、変動の少ない遺伝子の生物学的機能及びそれと腫瘍の関係を考慮して、候補参照遺伝子をスクリーニングし、全ての候補参照遺伝子の組み合わせの平均Ｃｔ値と１９２個の遺伝子の平均Ｃｔ値の関連性を算出し、最も関連性の高い組み合わせは、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＮＵＰ２１４、ＶＣＡＮを含む参照遺伝子である。候補遺伝子のスクリーニング基準は、（１）全体的な分析、予後良好と予後不良の両群の差は、２倍又は０．５未満であり、且つＣｔ＜３５のケースの占める割合は、５０％になり、（２）階層分析、リンパ節転移なし群の予後良好と予後不良との両群の差は、２倍以上であり、且つ統計学的な有意差＜０．０５であり、（３）全体的な分析での両群の差が有意ではないが、乳癌予後に関する文献で報告され、且つＣｔ＜３５のケースの占める割合は９０％に達する、ことである。上記スクリーニング基準に満たす遺伝子は、ＢＣＬ２、ＰＧＲ、  ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＲ１、ＭＫｉ６７、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＧＲＢ７、ＥＲＢＢ２、ＭＭＰ１１、ＣＤ６８、ＢＡＧ１、ＭＡＰＴ、ＭＳ４Ａ１を含むステップと、を含むものである。以上の１４個の遺伝子の機能は表１に示されている。
【００４７】
【表１】
2019527544.tif 000003
【００４８】
［実施例３  分子マーカーの大規模サンプルのｑＲＴ−ＰＣＲによる検証］
ＴＬＤＡによりスクリーニングされた１４個の分子マーカーと５個の参照遺伝子は、ＢＣＬ２、ＰＧＲ、ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＲ１、ＭＫｉ６７、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＧＲＢ７、ＥＲＢＢ２、ＭＭＰ１１、ＣＤ６８、ＢＡＧ１、ＭＡＰＴ、ＭＳ４Ａ１；ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＮＵＰ２１４、ＶＣＡＮである。上記サンプル収集要件を満たし、且つ臨床的なフォローアップ情報が完全なＦＦＰＥサンプルを２８９例用いて、単一チューブでｑＲＴ−ＰＣＲによる検証を行った。
【００４９】
（１）２８９例のＦＦＰＥサンプルからのＲＮＡ抽出：各サンプルについては２０μｍの切片を４枚取り出し、或いは１０μｍの切片を８枚取り出し、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＦＦＰＥＴ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）の取扱説明書に従ってＲＮＡ抽出を行い、抽出されたＲＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐ−２０００による定量的コントロールを行った後、逆転写反応に供された。
（２）２８９例のＦＦＰＥサンプルのＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡ：１μｇの全ＲＮＡを取り出してＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯＴＭＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の取扱説明書に従って逆転写した。
（３）２８９例のＦＦＰＥサンプルのｃＤＮＡ産物のｑＰＣＲ検出：各サンプルのｃＤＮＡ産物、プローブ、及びプライマー、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩを均一に混合した後、ＡＢＩ  ７９００  リアルタイムＰＣＲ分析装置で検出した。ｑＰＣＲのプライマー及びプローブ配列は、表２〜表５に示される。
【００５０】
【表２】
2019527544.tif 000004
【００５１】
【表３】
2019527544.tif 000005
【００５２】
【表４】
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【００５３】
【表５】
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【００５４】
［実施例４  乳癌予後３〜１０年再発又は死亡リスク予測モデルの構築］
機械学習のアルゴリズムにおけるランダムフォレストのアルゴリズムを用いて検出サンプルの術後３〜１０年再発又は死亡リスク値を評価し、乳癌予後評価遺伝子の検出モデルを構築した。ランダムフォレスト（Ｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｆｏｒｅｓｔｓ）は、多くの決定木で構成され、決定木の構築は、属性とサンプルに基づく二重ランダム化選択法を用いるので、ランダム化決定木（ｒａｎｄｏｍ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｆｏｒｅｓｔｓ）とも言われる。ランダムフォレストにおいて、各決定木の間には関連がない。テストデータがランダムフォレストに入力された場合には、個々の決定木によって分類され、最後に、全ての決定木の中で最も分類結果の多いクラスを最終的な結果、即ち、決定木の「投票」の結果とし、換言すれば、ランダムフォレストは、複数の決定木を含む分類器であり、且つその出力したクラスが各決定木から出力したクラスの多数決によるものである。本発明では、伝統的なランダムフォレストに基づいて最適化し、サンプルを１，０００回ランダムサンプリングし、１，０００個のモデルを構築し、１，０００個のモデルから最も正解率の高い３９個の最適化モデルを最終モデルのサブモデルとして選択し、３９個のサブモデルの中央値を最終的な予測結果として採用した。
【００５５】
［実施例５  独立臨床サンプルによる更なる検証］
既知の臨床的なフォローアップデータを有する１９例のＥＲ又はＰＲ陽性の早・中期乳癌患者のＦＦＰＥサンプル：ＰＴ分類はＩ期とＩＩ期であり、ここで、患者手術時間は２００４年〜２００８年であり、２０１１年〜２０１５年にフォローアップで観察し、フォローアップ時間は３〜１０年以上である。
【００５６】
Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＦＦＰＥＴ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて以上の１９部のＦＦＰＥサンプルの全ＲＮＡを抽出し、品質管理で合格した後、ＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡ試料を得、ｃＤＮＡ産物はｑＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、参照遺伝子であるＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＮＵＰ２１４、ＶＣＡＮ、並びにＢＣＬ２、ＰＧＲ、ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＲ１、ＭＫｉ６７、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２、ＧＲＢ７、ＥＲＢＢ２、ＭＭＰ１１、ＣＤ６８、ＢＡＧ１、ＭＡＰＴ、ＭＳ４Ａ１という遺伝子を検出した。上記遺伝子のＣｔ値は、ランダムフォレストのアルゴリズムで構築された乳癌術後３〜１０年再発又は死亡リスク評価モデルに入力されて３〜１０年再発又は死亡リスク値を求め、リスク閾値に基づいて予後良好又は予後不良を予測した。予測分析結果は、既知のフォローアップ情報との一致率が７３．６％であり、具体的な結果は表６に示される。
【００５７】
【表６】
2019527544.tif 000008
【００５８】
【表７】
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【００５９】
［実施例６］
現在、乳がんの臨床的な治療と治療計画の決定は、最終的には病理学的検査の結果に依存し、病理学的検査の結果も予後を判断するための最も重要な客観的基礎である。本検出システムは、天津医科大学腫瘍病院と河南省腫瘍病院で収集された、既知の臨床的なフォローアップデータを有する２８９例の乳癌と新たに診断された患者のＦＦＰＥサンプルを用いて、５個の参照遺伝子と１４個の分子マーカーをそれぞれ検出した。
検出結果は、表８に示される。
【００６０】
【表８】
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【００６１】
本発明で提供されたキットは、３〜１０年再発又は死亡リスク値が低い乳癌と新たに診断された患者に対する予測正解率が８１．１％であり、病理学的な予測の検出精度が７１．９％であり、３〜１０年再発又は死亡リスク値が高い乳癌と新たに診断された患者に対する予測正解率の感度が５４．４％であり、対応する病理学的な予測の検出精度５６．８％に近づく。そのキットは、臨床的なフォローアップ情報と比較して、一致率が７０％に達し、患者年齢、ＰＴ分類、ＬＮ数の以外は、他の臨床病理情報に頼る必要はない。
【００６２】
本検出システム及びキットは、乳癌予後評価の検査性能で臨床病理学的評価結果よりも優れ、ある程度病理診断の誤診による過剰治療及び不適切な治療を低減させ、乳がん患者の個別化治療のニーズを満たし、更に国内の乳癌予後予測の技術方法を改善することができる。
【００６３】
以上、本発明で提供された分子マーカー、及びその応用、検出キット、並びに検出モデルの構築方法を詳しく説明した。本明細書において、具体的な例により本発明の原理及び実施形態を説明したが、上記実施例の説明は、本発明の方法及びその核心的な考えへの理解を助けるためだけである。なお、当業者によれば、本発明の原理から逸脱することなく、本発明に対して若干のいくつかの改良及び修飾も可能であり、これらの改良及び修飾も本発明の範囲内に含まれると指摘する必要があるべきである。
【図１】
2019527544.tif 000011
【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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