(57)【要約】  本発明は、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを保存する方法に関する。この方法は、ａ）少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液を準備する工程；ｂ）分離マトリックスに保存液を浸透させる工程；およびｃ）保存液を浸透させた分離マトリックスを少なくとも５日の保存時間の間保存する工程を含む。アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも８０％、例えば９０％、９５％または９８％などの同一性を有するブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくともアスパラギン残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを保存する方法であって、前記アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または配列番号５２の１３位および４４位の位置の前記アミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくとも前記アスパラギン残基が、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に、例えばグルタミン酸に変異しており；かつ、前記方法が：
ａ）少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液を準備する工程と；
ｂ）前記保存液を前記分離マトリックスに浸透させる工程と；
ｃ）前記保存液を浸透させた分離マトリックスを少なくとも５日の保存時間の間保存する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記変異体が、配列番号５１または５２の１、２、７、１０、１５、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３４、３５、３６、３９、４２および４３位の１以上においてさらなる変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号５１または５２の１位の前記グルタミン残基がアラニンに変異しており、および／または、配列番号５１または５２の３５位の前記アスパラギンまたはグルタミン酸残基がアラニンに変異している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体が、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体からなる群から選択されるホモ多量体であり、および／または、前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体が、各々、前記多孔質支持体と共有結合するためのＣ末端システイン残基を含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記分離マトリックスが、少なくとも１１ｍｇ／ｍｌ、例えば少なくとも１５ｍｇ／ｍｌなどの、前記多孔質支持体と共有結合した前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記多孔質支持体が高度に架橋されたアガロースビーズである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記アルカリ金属水酸化物水溶液が、１０ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば３０ｍＭ〜５０ｍＭなどのモル濃度を有する、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記保存液が、少なくとも７０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液、例えば少なくとも９０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液、好ましくは少なくとも９９体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記保存時間が、少なくとも１０日、例えば少なくとも２５日など、または例えば少なくとも５０日など、または例えば少なくとも１００日など、または例えば少なくとも２００など、例えば最大４００日、または例えば最大７００日である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離マトリックスが、工程ｂ）の後に、その最初の動的結合容量の少なくとも８０％、例えばその最初の動的結合容量の少なくとも９０％などを保持する、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを保存する方法に関する。本発明はさらに、分離マトリックス製品、および分離マトリックスの保存のための少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、世界中で製造または開発のいずれにおいても最も普及しているバイオ医薬品を代表する。この特定の治療薬市場の商業的需要の高まりとそれに伴う価値により、製薬会社は、それぞれの免疫グロブリン製造プロセスの生産性を最大化するとともに、関連するコストを抑えることに重点を置くようになっている。
【０００３】
アフィニティークロマトグラフィーは、これらの免疫グロブリン分子、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）またはポリクローナル抗体（ｐＡｂｓ）などの精製の重要なステップの１つとして、大部分の例で使用される。特に興味深い種類のアフィニティー試薬は、免疫グロブリン分子の不変部分と特異的結合することの可能なタンパク質であり、そのような相互作用は、抗体の抗原結合特異性とは独立している。そのような試薬は、限定されるものではないが血清もしくは血漿調製物または細胞培養由来のフィードストックなどの異なる試料から、免疫グロブリンをアフィニティークロマトグラフィーによって回収するために広く使用されることができる。そのようなタンパク質の一例は、異なる種由来のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部分およびＦａｂ部分と結合することのできるドメインを含む、ブドウ球菌のプロテインＡである。これらのドメインは、一般にＥ−、Ｄ−、Ａ−、Ｂ−およびＣ−ドメインと表示される。
【０００４】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）に基づく試薬は、その高い親和性および選択性に起因して、バイオテクノロジーの分野、特に抗体の捕捉および精製のための、ならびに検出または定量化のためのアフィニティークロマトグラフィーにおいて広範な用途が見出されている。現在、ＳｐＡに基づくアフィニティー媒体は、おそらく、工業用の細胞培養上清を含む、異なる試料からモノクローナル抗体およびその断片を単離するための最も広く使用されるアフィニティー媒体である。したがって、プロテインＡ−リガンドを含む様々なマトリックスが、例えば、天然のプロテインＡ（例えば、プロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）の形態で市販されており、組換えプロテインＡからなるものもある（例えばｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。より具体的には、市販の組換えプロテインＡ製品で実施した遺伝子操作は、その支持体との付着を促進し、リガンドの生産性を増加することを目的とする。
【０００５】
バイオ医薬品産業で現在進行中の傾向は、１つの品種の生産設備の代わりに用途の広い多品種生産設備の使用であり、それはバイオ医薬品のオンデマンド製造およびより多様な製品、例えば個人向けまたはオーファン・バイオ医薬品の製造を可能にする。そのような多品種設備での生産キャンペーンは短く、キャンペーンとキャンペーンとの間にアフィニティー分離マトリックスを効果的に保存することが必要である。
【０００６】
キャンペーンとキャンペーンとの間に分離マトリックスを保存するための一般的な媒体は水酸化ナトリウムである。ＰＤＡバイオテクノロジー洗浄検証委員会によれば、濃度０．１〜１．０Ｍの水酸化ナトリウムが、充填されたクロマトグラフィーカラムを保存するために一般的である。しかし、そのような保存条件は、１３を上回るｐＨ値をもつ溶液にマトリックスを長期間曝露することに関連する。タンパク質性アフィニティーリガンドを含有する多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに関して、そのようなアルカリ環境は非常に厳しい条件であり、結果的に、関与する高いｐＨに対するリガンドの不安定性による、アフィニティー分離マトリックスの能力の低下をもたらす。
【０００７】
そのため、広範な研究がアルカリ性ｐＨ値に耐える能力の改善を示す、操作されたタンパク質リガンドの開発に着目してきした。例えば、Ｇｕｌｉｃｈら（Ｓｕｓａｎｎｅ  Ｇｕｌｉｃｈ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｌｉｎｈｕｌｔ，Ｐｅｒ−Ａｋｅ  Ｎｙｇｒｅｎ，Ｍａｔｈｉａｓ  Ｕｈｌｅｎ，Ｓｏｐｈｉａ  Ｈｏｂｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８０（２０００），１６９−１７８）は、アルカリ性環境での連鎖球菌アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の安定性を改善するためにタンパク質工学を提案した。Ｇｕｌｉｃｈらは、４つ全てのアスパラギン残基がロイシン（１つの残基）、アスパラギン酸（２つの残基）およびリジン（１つの残基）に置き換えられている、ＡＢＤの変異体を作製した。さらに、Ｇｕｌｉｃｈらは、作製した変異体が天然のタンパク質に似た標的タンパク質結合挙動を示すこと、および操作されたリガンドを含有するアフィニティーカラムが、アルカリ条件に繰り返し曝露した後に、操作されていない親リガンドを用いて調製したカラムよりも高い結合容量を示すことを報告している。よって、４つ全てのアスパラギン残基は、構造および機能に重大な影響を及ぼすことなく置き換えられることができることがその中で結論付けられる。
【０００８】
最近の研究は、その変更をプロテインＡ（ＳｐＡ）にも行って類似した性質をもたらすことができることを示す。参照によりその全文が本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号明細書は、少なくとも１つのアスパラギン残基をグルタミン酸またはアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させると、その変異が、約１３〜１４までのｐＨ値で親ＳｐＡ、例えばＳｐＡのＢドメイン、または、ＳｐＡのＢドメインから誘導した合成構築物であるプロテインＺ（米国特許第５，１４３，８４４号明細書、参照によりその全文が援用される）などと比較して、増加した化学安定性を付与することを開示する。著者らは、これらの変異タンパク質をアフィニティーリガンドとして使用する場合、予想通り分離媒体がアルカリ化剤を用いる洗浄方法により良く耐えることができることを示す。アルカリ安定性を向上させる目的をもつプロテインＡドメインのさらなる変異は、米国特許第８，３２９，８６０号、特開２００６−３０４６３３Ａ号、米国特許第８，６７４，０７３号、米国特許出願公開第２０１０／０２２１８４４号、米国特許出願公開第２０１２／０２０８２３４号、米国特許第９，０５１，３７５号、米国特許出願公開第２０１４／００３１５２２号、米国特許出願公開第２０１３／０２７４４５１号および国際公開第２０１４／１４６３５０号にも公開されており、その全ては参照によりその全文が本明細書に援用される。しかし、現在利用可能な変異体はなおアルカリ性のｐＨに対して感受性があり、そのため、対応するアフィニティー分離マトリックスは一般に２０％エタノール溶液または２％ベンジルアルコール溶液に保存される。
【０００９】
よって、この分野では、アルカリ保存方法に対してさらに改善された安定性を有するタンパク質リガンドを含有する分離マトリックスを得る必要性がなおある。また、治療抗体の経済効率の高い精製を可能にする、改善された結合容量をもつ、そのような分離マトリックスも必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０７９０３３号
【発明の概要】
【００１１】
本発明の発明者らは、アルコール溶液がアフィニティー分離マトリックスの保存に最適とはいえないことを認識していた。アルコールは可燃性であり、規制を受けていて、処分が困難である。本発明者らは、アルカリ金属水酸化物水溶液が保存溶液としていくつかの利点を有することを認識していた。アルカリ金属水酸化物溶液は、濃度に応じて殺菌性であるかまたは静菌性である。それらは大部分のウイルス、細菌、酵母、真菌およびエンドトキシンを不活性化し得る。それらは比較的安価であり、処分が容易であり、分離マトリックスからの除去はｐＨおよび／または伝導率測定値を用いて検出が簡単である。
【００１２】
そのため、本発明の目的は、アルカリ金属水酸化物溶液に保存される、免疫グロブリンの精製のためのアフィニティー分離マトリックスを提供することである。本発明のさらなる目的は、免疫グロブリンの精製のためのアフィニティー分離マトリックスをアルカリ金属水酸化物溶液中で保存するための方法を提供することである。
【００１３】
これらの目的は、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを保存する、添付される特許請求の範囲による方法によって達成される。アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも８０％、例えば９０％、９５％または９８％などの同一性を有するブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくともアスパラギン残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している。この方法は、
ａ）少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液を準備する工程；
ｂ）分離マトリックスに保存液を浸透させる工程；および
ｃ）保存液を浸透させた分離マトリックスを少なくとも５日の保存時間の間保存する工程を含む。
【００１４】
上に定義されるような免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを用いることにより、高い動的結合容量を有する、アルカリ安定性の高い分離マトリックスが得られる。本発明の発明者らは、そのような分離マトリックスが、アルカリ金属水酸化物水溶液に５日以上などの長期間浸漬しても安定していて、そのような長期間の浸漬後も動的結合容量を実質的に保持していることを観察した。このことは、そのような分離マトリックスがアルカリ金属水酸化物溶液での保存に適していることを意味する。
【００１５】
さらに免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインへ変異させると、アルカリ安定性の向上などの特性のさらなる向上が得られることがある。例えば、配列番号５１または５２の１位のグルタミン残基は、アラニンに変異させてよい；かつ／または配列番号５１または５２の３５位のアスパラギンまたはグルタミン酸残基は、アラニンに変異させてよい。
【００１６】
免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体からなる群から選択されるホモ多量体であってよい。適切な多量体を使用することにより、分離マトリックスの免疫グロブリン結合容量およびアルカリ安定性が増加することがある。
【００１７】
免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体は、各々、多孔質支持体と共有結合するためのＣ末端システイン残基を含んでよい。免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体は、チオエーテル結合によって多孔質支持体に結合されてよい。これにより、リガンドを固相支持体に付着させる、堅牢で、アルカリ安定性の、十分に証明された方法が得られる。
【００１８】
分離マトリックスは、少なくとも１１ｍｇ／ｍｌ、例えば少なくとも１５ｍｇ／ｍｌなどの、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含んでよい。このことが、良好な結合容量をもつ分離マトリックスを確実にする。
【００１９】
多孔質支持体は、５６〜７０マイクロメートルの体積加重メジアン径（ｄ５０，ｖ）および５５〜８０ｍｇ／ｍｌの乾燥固体重量を有する架橋ポリマー粒子を含んでよい。多孔質支持体は、例えば高度に架橋されたアガロースビーズであってよい。
【００２０】
保存液で用いられるアルカリ金属水酸化物水溶液は、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液またはその混合物、好ましくは水酸化ナトリウム溶液であってよい。水酸化ナトリウム溶液は比較的安価であり、容易に入手でき、保存溶液として広く認められている。アルカリ金属水酸化物水溶液は、１０ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば３０ｍＭ〜５０ｍＭなどのモル濃度を有してよい。このことは、安定なｐＨおよび良好な静菌性または殺菌性をもつ溶液を確実にする。
【００２１】
保存液は、場合によって、Ｃ２−Ｃ７アルコール、例えばエタノール、イソプロパノールまたはベンジルアルコールなどをさらに含む。アルコールとアルカリ金属水酸化物を組み合わせた保存液は、特定の微生物、例えば一部の胞子形成細菌を不活性化するのにより効果的であり得る。
【００２２】
保存液は、少なくとも７０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液、例えば少なくとも９０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液、好ましくは少なくとも９９体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含んでよい。
【００２３】
いくつかの例では、保存液は、アルカリ金属水酸化物水溶液からなるか、またはそれから本質的になってよい。
【００２４】
分離マトリックスの最小保存時間は、保存が必要とされるだけ短い時間、例えば少なくとも５日、例えば少なくとも１０日、例えば少なくとも５０日、例えば少なくとも１００日、または例えば少なくとも２００日であってよい。分離マトリックスの最大保存時間は、保存が必要とされるだけ長い時間、例えば最大４００日、または例えば最大７００日であってよい。
【００２５】
保存の前に、分離マトリックスは、洗浄流体で洗浄かつ／または消毒されてよく、該洗浄流体は少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含み、該アルカリ金属水酸化物水溶液のモル濃度は５００ｍＭ〜５Ｍ、例えば１Ｍ〜２Ｍである。洗浄流体は、アルカリ金属水酸化物水溶液からなるか、またはそれから本質的になってよい。したがって、分離マトリックスは、アルコールを使用する必要条件がほとんどないか、または全くなく、洗浄され、消毒され、保存されてよい。
【００２６】
分離マトリックスは、工程ｂ）の後、すなわち長期間の保存の後に、その最初の動的結合容量の少なくとも８０％、例えばその最初の動的結合容量の少なくとも９０％などを保持する。したがって、分離マトリックスは、その後の免疫グロブリンを精製する能力への過度の悪影響なく、アルカリ金属水酸化物水溶液に保存されてよい。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の目的は、添付される特許請求の範囲に記載の保存液を使用することによって達成される。それは、つまり、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスの保存のための、少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液の使用である。
【００２８】
保存液は、分離マトリックスを保存する方法に関して既に上に記載した保存液と同じであってよい。例えば、保存液は、１０ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば３０ｍＭ〜５０ｍＭなどのモル濃度を有する水酸化ナトリウム溶液を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなってよい。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の目的は、添付される特許請求の範囲に記載の分離マトリックス製品によって達成される。分離マトリックス製品は、保存容器、分離マトリックスおよび保存液を含む。保存容器は、保存液を浸透させた分離マトリックスを含む。分離マトリックスは、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含み、該アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも８０％、例えば９０％、９５％または９８％などの同一性を有するブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくともアスパラギン残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している。保存液は、少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む。
【００３０】
したがって、アルカリ金属水酸化物水溶液に保存される分離マトリックスをパッケージし、保存し、輸送することが可能である。このことは、アルコール溶液に保存する必要条件を回避し、したがって保存液に揮発性で可燃性の成分を使用する必要を回避する。
【００３１】
保存容器は、例えば、プラスチックまたはガラスなどの液体を通さない材料で作製された瓶、缶またはドラムであってよい。保存容器はまた、予め充填可能なカラム、すなわち、製造現場で分離マトリックスで満たした分離カラムであってよい。
【００３２】
保存液は、分離マトリックスを保存する方法に関して既に上に記載した保存液と同じであってよい。例えば、保存液は、１０ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば３０ｍＭ〜５０ｍＭなどのモル濃度を有する水酸化ナトリウム溶液を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなってよい。
【００３３】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【００３４】
定義
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、抗体の断片、抗体または抗体断片を含む融合タンパク質および抗体または抗体断片を含むコンジュゲートも含むと理解される。
【００３５】
用語「Ｆｃ結合ポリペプチド」、「Ｆｃ結合ドメイン」および「Ｆｃ結合タンパク質」とは、抗体の結晶化可能部分（Ｆｃ）と結合することのできるポリペプチド、ドメインまたはタンパク質をそれぞれ意味し、それには、例えばプロテインＡおよびプロテインＧ、または結合特性が維持されたその任意のフラグメントまたは融合タンパク質が挙げられる。
【００３６】
用語「リンカー」は、本明細書において、多量体の２つのポリペプチド単位、単量体またはドメインを互いに連結する要素を意味する。
【００３７】
用語「スペーサー」は、本明細書において、ポリペプチドまたはポリペプチド多量体を支持体に結合する要素を意味する。
【００３８】
アミノ酸配列の比較に関する用語「同一性％」は、標準的なアライメントアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標））などによって求められる。これのウェブベースのソフトウェアは、米国国立医学図書館のｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅから自由に入手可能である。ここでは、アルゴリズム「ｂｌａｓｔｐ（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）」が、クエリ配列と対象配列のアライメントおよび特に同一性％の決定に使用される。
【００３９】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてこれらの語のものとされている意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る；同様に、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は米国特許法においてこれらの語のものとされている意味を有する。この用語はオープンエンドであり、列挙される内容の基本的または新規な特徴が、先行技術の実施形態を除いて列挙される内容よりも多く存在することで変化しない限り、列挙される内容よりも多くの存在が考慮に入れられる。
【００４０】
本発明ならびにそのさらなる目的および利点をより完全に理解するために、下に述べる詳細な説明は、添付の図面とともに読まれるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】配列番号１〜７および５１〜５２によって定義されるＦｃ結合ドメインのアライメントを示す図である。
【図２】ＳＰＲバイオセンサーチップと結合した親および変異四量体Ｚｖａｒ（配列番号７）ポリペプチドバリアントのアルカリ安定性について実施例２から得た結果を示す図である。
【図３】アガロースビーズと結合した親および変異四量体Ｚｖａｒ（配列番号７）ポリペプチドバリアントのアルカリ安定性（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）について実施例４から得た結果を示す図である。
【図４】アガロースビーズと結合した親および変異四量体Ｚｖａｒ（配列番号７）ポリペプチドバリアントのアルカリ安定性（１．０Ｍ  ＮａＯＨ）について実施例４から得た結果を示す図である。
【図５】異なる量の変異多量体バリアント（配列番号２０）が結合したアガロースビーズのアルカリ安定性（１．０Ｍ  ＮａＯＨ）について実施例７から得た結果を示す図である。結果は、１Ｍ  ＮａＯＨ中のインキュベーション時間に対する相対残存動的容量（Ｑｂ１０％、滞留時間６分）としてプロットされる。
【図６】異なる量の変異多量体バリアント（配列番号２０）が結合したアガロースビーズのアルカリ安定性（１．０Ｍ  ＮａＯＨ）について実施例７から得た結果を示す図である。結果は、プロトタイプのリガンド含有量に対する、１Ｍ  ＮａＯＨ中３１時間のインキュベーション後の相対残存動的容量（Ｑｂ１０％、滞留時間６分）としてプロットされる。
【図７】ａ）基準マトリックスＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸおよびｂ）本発明によるマトリックスからの、ポリクローナルヒトＩｇＧのｐＨ勾配溶出の結果を示す図である。
【図８】図７のクロマトグラムの画分中のＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４成分の分析を示す図である。ａ）基準マトリックスおよびｂ）本発明によるマトリックス。各画分について、第１のバー（青色）はＩｇＧ１を表し、第２（赤色）はＩｇＧ４を表し、第３（緑色）はＩｇＧ２を表す。
【図９】基準マトリックスＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ（ＭＳＳ  ＬＸ）および本発明によるマトリックスについて１Ｍ  ＮａＯＨインキュベーションによる、加速アルカリ安定性測定の結果を示す図である。安定性は、インキュベーション後に残っている１０％貫流容量の百分率として表される。
【図１０】基準マトリックスＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＭＳＳ）および本発明による分離マトリックス（Ｉｎｖ．Ｅｘ）について最大５０ｍＭの濃度を有するＮａＯＨ溶液による、延長させたインキュベーションの結果を示す図である。１０％貫流での動的結合容量が、アルカリインキュベーションの前および後のマトリックスについて示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の一態様は、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを保存する方法に関する。
【００４３】
この詳細な説明を通して、２つの別個の番号付けの慣習が使用されることがある。別段の記載がない限り、図１のアミノ酸残基位置番号付けの慣習が使用され、位置番号は、配列番号４〜７の位置番号に対応するように指定される。これは多量体にもあてはまり、そこで位置番号は別段の記載がない限り、図１の慣習によるポリペプチド単位またはモノマーの位置を指定する。しかし、特許請求の範囲、発明の概要および時に発明を実施するための形態を通じて、配列番号５１および５２の位置番号に対応する位置番号が使用される。配列番号５１または配列番号５２の１位は配列番号４〜７の９位に相当すること、そしてこのように異なる番号付けの慣習は相互変換されてよいことに注意されたい。
【００４４】
本発明の免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインは、本明細書において「ポリペプチド」とも呼ばれ、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも８０％、例えば９０％、９５％または９８％などの同一性を有するブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、この際、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくともアスパラギン残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している。
【００４５】
配列番号５１（末端切断型Ｚｖａｒ）
ＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱ
配列番号５２（末端切断型Ｃドメイン）
ＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱ
そのような免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインは、図１に図示される配列番号１（Ｅドメイン）、配列番号２（Ｄドメイン）、配列番号３（Ａドメイン）、配列番号２２（バリアントＡドメイン）、配列番号４（Ｂドメイン）、配列番号５（Ｃドメイン）、配列番号６（プロテインＺ）、配列番号７（Ｚｖａｒ）、配列番号５１（リンカー領域アミノ酸１〜８および５６〜５８を含まないＺｖａｒ）または配列番号５２（リンカー領域アミノ酸１〜８および５６〜５８を含まないＣドメイン）によって定義されるかあるいはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性を有する、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなってよく、この際、配列番号４〜７の１１位に対応する位置の少なくともアスパラギン（または配列番号２の例ではセリン）残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異しており、配列番号４〜７の２１位および５２位に対応するアスパラギン残基（配列番号５１または５２の１３位および４４位）は保存される。
【００４６】
上に列挙したＦｃ結合ドメインのいくつかを図１にアラインさせて示す。親の、すなわち操作されていないブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）は、ドメインＥ（配列番号１）、Ｄ（配列番号２）、Ａ（配列番号３）、Ｂ（配列番号４）およびＣ（配列番号５）と呼ばれる５つのＦｃ結合ドメインを含む。プロテインＺ（配列番号６）は、参照によりその全文がここに援用される米国特許第５１４３８４４号に開示される変異Ｂドメインである。配列番号７は、変異Ｎ３Ａ、Ｎ６Ｄ、Ｎ２３Ｔを含む、本明細書においてＺｖａｒと呼ばれるプロテインＺのさらに変異したバリアントを示す。配列番号２２（図１に図示せず）は、図１の位置用語法を用いて、Ａ４６Ｓ変異を有する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｎ３１５株由来のプロテインＡのＡドメインの天然バリアントである。配列番号５１は、１〜８位および５６〜５８位にリンカー領域アミノ酸を含まないＺｖａｒ（配列番号７）である。配列番号５２は、図１に図示されるようにリンカー領域アミノ酸１〜８および５６〜５８を含まないプロテインＡのＣドメインである。
【００４７】
これらのドメインのＮ１１（配列番号５１：５２のＮ３）の変異は、アスパラギン残基Ｎ２１およびＮ５２（配列番号５１：５２のＮ１３およびＮ４４）の保存とともに、免疫グロブリン結合性を損なうことなく親ドメイン／ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を付与する。そのため、このポリペプチドは、Ｆｃまたは免疫グロブリン結合ポリペプチド、あるいはＦｃまたは免疫グロブリン結合ポリペプチド単位としても記載され得る。
【００４８】
代わりの言葉で説明すると、免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５３によって定義されるか、あるいは、配列番号５３との少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなってよい。
【００４９】
配列番号５３
Ｘ１Ｑ  Ｘ２ＡＦＹＥＩＬＸ３ＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＸ４Ｘ５Ｆ  ＩＸ６Ｘ７ＬＫＤＸ８ＰＳＸ９  ＳＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＬＡＥＡＫＸ１３  Ｘ１４ＮＸ１５ＡＱ
ここで、互いに個別に：
Ｘ１＝Ａ、Ｑまたは欠失
Ｘ２＝Ｅ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ａ、ＨまたはＲ
Ｘ３＝ＨまたはＫ
Ｘ４＝ＡまたはＮ
Ｘ５＝Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫ、例えばＳ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫなど
Ｘ６＝ＱまたはＥ
Ｘ７＝ＳまたはＫ
Ｘ８＝ＥまたはＤ
Ｘ９＝Ｑ、Ｖまたは欠失
Ｘ１０＝Ｋ、Ｒ、Ａまたは欠失
Ｘ１１＝Ａ、Ｅ、Ｎまたは欠失
Ｘ１２＝ＩまたはＬ
Ｘ１３＝ＫまたはＲ
Ｘ１４＝ＬまたはＹ
Ｘ１５＝Ｄ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＫまたはＲ
である。
【００５０】
具体的には、配列番号５３のアミノ酸残基は、互いに個別に：
Ｘ１＝Ａまたは欠失
Ｘ２＝Ｅ
Ｘ３＝Ｈ
Ｘ４＝Ｎ
Ｘ６＝Ｑ
Ｘ７＝Ｓ
Ｘ８＝Ｄ
Ｘ９＝Ｖまたは欠失
Ｘ１０＝Ｋまたは欠失
Ｘ１１＝Ａまたは欠失
Ｘ１２＝Ｉ
Ｘ１３＝Ｋ
Ｘ１４＝Ｌ
である。
【００５１】
ある種の実施形態では、配列番号５３のアミノ酸残基は：
Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌであってよい。いくつかの実施形態では、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝ＬおよびＸ１５＝Ｄであり、Ｘ１、Ｘ９、Ｘ１０およびＸ１１の１以上は欠失している。さらなる実施形態では、Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝ＬおよびＸ１５＝Ｄ、あるいはＸ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝ＬおよびＸ１５＝Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＫまたはＲである。
【００５２】
いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、互いに個別に：
ａ）Ｘ１＝Ａまたは欠失、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖまたは欠失、Ｘ１０＝Ｋまたは欠失、Ｘ１１＝Ａまたは欠失、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ；
ｂ）Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝ＬおよびＸ１５＝Ｄ；
ｃ）Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝ＬおよびＸ１５＝Ｄ；または
ｄ）Ｘ１＝Ａ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝ＬおよびＸ１５＝Ｄであってよい。
【００５３】
Ｎ１１（Ｘ２）変異（例えばＮ１１ＥまたはＮ１１Ｋ変異）は、唯一の変異であってよく、あるいは、ポリペプチドは、さらなる変異、例えば配列番号４〜７の３、６、９、１０、１５、１８、２３、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４２、４３、４４、４７、５０、５１、５５および５７位に対応する位置の少なくとも１つでの置換などを含んでもよい。これらの位置の１または複数で、最初のアミノ酸残基は、例えばアスパラギン、プロリンまたはシステインでないアミノ酸で置換されていてよい。最初のアミノ酸残基は、例えばアラニン、バリン、トレオニン、セリン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置換されていてよい。さらに、１または複数のアミノ酸残基が、例えば１〜６位および／または５６〜５８位から欠失されていてよい。
【００５４】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の９位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１）は、グルタミン、アスパラギン、プロリンまたはシステイン以外のアミノ酸、例えばアラニンなどであるか、あるいはそれは欠失され得る。９位および１１位の変異の組合せは、例によって示されるように、特に良好なアルカリ安定性をもたらす。具体的な実施形態では、配列番号７において９位のアミノ酸残基はアラニンであり、１１位のアミノ酸残基はリジンまたはグルタミン酸、例えばリジンなどである。９位の変異は、参照によりその全文が本明細書に援用される同時係属出願ＰＣＴ／ＳＥ２０１４／０５０８７２号明細書においても考察されている。
【００５５】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の５０位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１３）は、アルギニンまたはグルタミン酸である。
【００５６】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の３位に対応する位置のアミノ酸残基は、アラニンであり、かつ／または配列番号４〜７の６位に対応する位置のアミノ酸残基は、アスパラギン酸である。３位および６位のアミノ酸残基の１つはアスパラギンであってよく、代替実施形態では、３位および６位の両方のアミノ酸残基がアスパラギンであってよい。
【００５７】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の４３位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１１）は、アラニンまたはグルタミン酸、例えばアラニンなどであるか、あるいはそれは欠失され得る。具体的な実施形態では、配列番号７の９位および１１位のアミノ酸残基は、それぞれ、アラニンおよびリジン／グルタミン酸であり、一方、４３位のアミノ酸残基は、アラニンまたはグルタミン酸である。
【００５８】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の２８位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ５）は、アラニンまたはアスパラギン、例えばアラニンなどである。
【００５９】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の４０位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ９）は、アスパラギン、アラニン、グルタミン酸およびバリンからなる群から選択されるか、またはグルタミン酸およびバリンからなる群から選択されるか、またはバリンであるか、またはそれは欠失され得る。具体的な実施形態では、配列番号７の９位および１１位のアミノ酸残基は、それぞれ、アラニンおよびグルタミン酸であり、一方、４０位のアミノ酸残基は、バリンである。随意に、４３位のアミノ酸残基は、アラニンまたはグルタミン酸であってよい。
【００６０】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の４２位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１０）は、アラニン、リジンまたはアルギニンであるか、あるいはそれは欠失され得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の１８位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ３）は、リジンまたはヒスチジン、例えばリジンなどである。
【００６２】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の３３位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ７）は、リジンまたはセリン、例えばリジンなどである。
【００６３】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の３７位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ８）は、グルタミン酸またはアスパラギン酸、例えばグルタミン酸などである。
【００６４】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の５１位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１４）は、チロシンまたはロイシン、例えばチロシンなどである。
【００６５】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の４４位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１２）は、ロイシンまたはイソロイシンである。具体的な実施形態では、配列番号７の９位および１１位のアミノ酸残基は、それぞれ、アラニンおよびリジン／グルタミン酸であり、一方、４４位のアミノ酸残基はイソロイシンである。随意に、４３位のアミノ酸残基は、アラニンまたはグルタミン酸であってよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の１、２、３および４位、または３、４、５および６位に対応する位置のアミノ酸残基は欠失されている。これらの実施形態の特定のバリアントでは、親ポリペプチドは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号５）である。これらの欠失の天然のＣドメインへの影響は、参照によりその全文が本明細書に援用される米国特許第９０１８３０５号明細書および米国特許第８３２９８６０号明細書に記載されている。
【００６７】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７における、例えば配列番号７における変異は、以下からなる群から選択される：Ｎ１１Ｋ；Ｎ１１Ｅ；Ｎ１１Ｙ；Ｎ１１Ｔ；Ｎ１１Ｆ；Ｎ１１Ｌ；Ｎ１１Ｗ；Ｎ１１Ｉ；Ｎ１１Ｍ；Ｎ１１Ｖ；Ｎ１１Ａ；Ｎ１１Ｈ；Ｎ１１Ｒ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ａ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｑ４０Ｅ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｋ５０Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４ＩおよびＱ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ。これらの変異は、特に高いアルカリ安定性をもたらす。配列番号４〜７における、例えば配列番号７における変異はまた、以下からなる群から選択され得る：Ｎ１１Ｋ；Ｎ１１Ｙ；Ｎ１１Ｆ；Ｎ１１Ｌ；Ｎ１１Ｗ；Ｎ１１Ｉ；Ｎ１１Ｍ；Ｎ１１Ｖ；Ｎ１１Ａ；Ｎ１１Ｈ；Ｎ１１Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４ＩおよびＱ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になる：配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０。それは例えば、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になってよい：配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９。また、それは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になり得る：配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８。
【００６９】
ある種の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５４〜７０からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になり；配列番号７１〜７５からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になり；あるいは、それは、配列番号７６〜７９からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になってよい。それはさらに、配列番号８９〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になってよい。
【００７０】
ポリペプチドは、例えば上記の群から、またはこれらの群の部分集合から選択される配列によって定義されてよいが、それはまた、Ｎおよび／またはＣ末端にさらなるアミノ酸残基、例えばＮ末端のリーダー配列および／またはＣ末端のテール配列を含んでもよい。
【００７１】
配列番号８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ４３Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ２８Ａ，Ｎ４３Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ｅ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１１  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１２  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ，Ｑ３２Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＡＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１３  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１４  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ，Ｑ３２Ｅ，Ｑ４０Ｅ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＥＳＬＫＤＤＰＳＥ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１５  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ，Ｑ３２Ｅ，Ｋ５０Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＥＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＲ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１６  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２３  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｓ３３Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５０Ｒ，Ｌ５１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ２８Ａ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｓ３３Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５０Ｒ，Ｌ５１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２６  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５０Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３６  Ｂ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３７  Ｃ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｅ４３Ａ）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３８  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＹＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３９  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｔ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＴＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４０  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｆ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＦＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４１  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｌ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＬＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４２  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｗ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＷＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４３  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＩＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４４  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｍ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＭＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４５  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｖ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＶＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４６  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＡＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４７  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｈ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＨＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４８  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＲＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｄ３７Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｄ３７Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｇ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｓ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＳＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５６  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｙ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＹＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｑ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＱＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｔ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＴＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｎ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＮＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｆ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＦＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６１  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｌ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＬＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６２  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｗ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＷＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６３  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｉ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＩＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｍ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＭＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｖ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＶＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６６  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｄ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＤＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＥＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｈ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＨＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｒ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＲＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｋ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＫＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７１  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｆ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＦＡＱＡＰＫ
配列番号７２  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＹＡＱＡＰＫ
配列番号７３  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｗ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＷＡＱＡＰＫ
配列番号７４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｋ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＫＡＱＡＰＫ
配列番号７５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＲＡＱＡＰＫ
配列番号７６  Ｚｖａｒ（Ｑ９ｄｅｌ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥ＿Ｑ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０ｄｅｌ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳ＿  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２ｄｅｌ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  Ｓ＿ＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３ｄｅｌ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫ＿ＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号８９  Ｚｖａｒ（Ｄ２ｄｅｌ，Ａ３ｄｅｌ，Ｋ４ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
Ｖ＿＿＿ＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９０  Ｚｖａｒ（Ｖ１ｄｅｌ，Ｄ２ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５８ｄｅｌ）
＿＿ＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰ＿
配列番号９１  Ｚｖａｒ（Ｋ４ｄｅｌ，Ｆ５ｄｅｌ，Ｄ６ｄｅｌ，Ｋ７ｄｅｌ，Ｅ８ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡ＿＿＿＿＿ＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９２  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ａ５６ｄｅｌ，Ｐ５７ｄｅｌ，Ｋ５８ｄｅｌ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱ＿＿＿
配列番号９３  Ｚｖａｒ（Ｖ１ｄｅｌ，Ｄ２ｄｅｌ，Ａ３ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
＿＿＿ＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９４  Ｚｖａｒ（Ｖ１ｄｅｌ，Ｄ２ｄｅｌ，Ａ３ｄｅｌ，Ｋ４ｄｅｌ，Ｆ５ｄｅｌ，Ｄ６ｄｅｌ，Ｋ７ｄｅｌ，Ｅ８ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
＿＿＿＿＿＿＿＿ＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５８＿ｉｎｓＹＥＤＧ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＹＥ  ＤＧ
分離マトリックスは、免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む。そのような多量体は、上記のいずれかの実施形態によって定義される複数の免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメイン（ポリペプチド単位）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。多量体を使用することにより、免疫グロブリン結合容量を増加させることができ、多量体はモノマーよりも高いアルカリ安定性を有することもができる。多量体は、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体であり得る。多量体は、多量体の全ての単位が同一であるホモ多量体であってもよいし、少なくとも１つの単位が他の単位と異なるヘテロ多量体であってもよい。有利には、多量体中の全ての単位は、例えば、上記で開示された変異／保存を含むことによってアルカリ安定性である。ポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端とＮ末端との間のペプチド結合によって直接に互いと結合することができる。あるいは、多量体中の２以上の単位は、オリゴマー種またはポリマー種、例えば最大２５または３０アミノ酸、例えば３〜２５または３〜２０アミノ酸などを有するペプチドを含むリンカーによって結合することができる。リンカーは、例えば、ＡＰＫＶＤＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥ、ＡＰＫＡＤＮＫＦＮＫＥ、ＡＰＫＶＦＤＫＥ、ＡＰＡＫＦＤＫＥ、ＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＶＤＡ、ＶＤＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＫＦＤＫＥ、ＡＰＫ、ＡＰＫＹＥＤＧＶＤＡＫＦＤＫＥおよびＹＥＤＧからなる群から選択されるか、あるいは、ＡＰＫＡＤＮＫＦＮＫＥ、ＡＰＫＶＦＤＫＥ、ＡＰＡＫＦＤＫＥ、ＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＶＤＡ、ＶＤＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＹＥＤＧＶＤＡＫＦＤＫＥおよびＹＥＤＧからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるか、あるいはそれとの少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有するペプチド配列を含むかまたはそれから本質的になる。それらはまた、ＡＰＫＡＤＮＫＦＮＫＥ、ＡＰＫＶＦＤＫＥ、ＡＰＡＫＦＤＫＥ、ＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＶＤＡ、ＶＤＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＫＦＤＫＥ、ＡＰＫおよびＡＰＫＹＥＤＧＶＤＡＫＦＤＫＥからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるか、あるいはそれとの少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有するペプチド配列から本質的になる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドＡＰＫＶＤＡＫＦＤＫＥまたはＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥからならない、あるいは、ペプチドＡＰＫＶＤＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥ、ＡＰＫＦＮＫＥ、ＡＰＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＶＤＫＥまたはＡＰＫＡＤＫＥからならない。
【００７２】
そのようなリンカーの性質は、好ましくはタンパク質単位の空間的立体構造を不安定化するべきではない。これは、例えばリンカー中にプロリンが存在しないようにすることによって達成することができる。さらに、前記リンカーはまた、好ましくは変異したタンパク質単位の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきでもある。この目的のため、リンカーがアスパラギンを含まない場合は有利である。リンカーがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。多量体はさらにＮ末端で複数のアミノ酸残基、例えばクローニングプロセスに由来するか、または切断されるシグナル伝達配列由来の残基を構成するアミノ酸残基などを含むことがある。さらなるアミノ酸残基の数は、例えば２０以下、例えば１５以下、例えば１０以下または５以下であってよい。具体例として、多量体はＡＱ、ＡＱＧＴ、ＶＤＡＫＦＤＫＥ、ＡＱＶＤＡＫＦＤＫＥまたはＡＱＧＴＶＤＡＫＦＤＫＥ配列をＮ末端に含むことがある。
【００７３】
ある種の実施形態では、多量体は、配列番号８０〜８７からなる群から選択される配列を含むかまたはそれから本質的になってよい。これらのおよびさらなる配列は下の表に記載され、親（変異）ｎと命名される。ここでｎは多量体中の単量体単位の数である。
【００７４】
配列番号１７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ４３Ａ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号１８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ２８Ａ，Ｎ４３Ａ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号１９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ｅ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号２０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３０  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｓ３３Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５０Ｒ，Ｌ５１Ｙ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３１  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３２  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ２８Ａ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３３  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）６
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｄ３７Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｄ３７Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８０  リンカーのＤ２、Ａ３およびＫ４が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８１  リンカーのＫ５８、Ｖ１およびＤ２が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰ  ＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８２  リンカーのＰ５７、Ｋ５８、Ｖ１、Ｄ２およびＡ３が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰ  ＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８３  リンカーのＫ４、Ｆ５、Ｄ６、Ｋ７およびＥ８が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８４  リンカーのＡ５６、Ｐ５７およびＫ５８が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８５  リンカーのＶ１、Ｄ２およびＡ３が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８６  リンカーのＶ１、Ｄ２、Ａ３、Ｋ４、Ｆ５、Ｄ６、Ｋ７およびＥ８が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８７  ＹＥＤＧがリンカーのＫ５８とＶ１の間に挿入されたＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＹＥＤＧ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８８  Ｚｖａｒ２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
いくつかの実施形態では、上に開示されるポリペプチドおよび／または多量体は、Ｃ末端またはＮ末端に、１または複数のシステイン残基、複数のリジン残基および複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、１または複数の連結要素をさらに含む。１または複数の連結要素はまた、Ｃ末端またはＮ末端から１〜５アミノ酸残基の範囲内、例えば１〜３または１〜２アミノ酸残基の範囲内に位置してもよい。連結要素は、例えばＣ末端の単一のシステインであることがある。１または複数の連結要素は、ＣまたはＮ末端に直接に結合してもよいし、あるいは連結要素は、最大１５アミノ酸、例えば１〜５、１〜１０または５〜１０アミノ酸を含むストレッチを介して結合してもよい。このストレッチもまた、好ましくは変異したタンパク質の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきである。この目的のために、ストレッチがアスパラギンを含まない場合に有利である。ストレッチがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。Ｃ末端システインを有する利点は、タンパク質のエンドポイントカップリングがシステインチオールと支持体上の求電子基との反応を通じて達成され得ることである。これは、結合容量にとって重要な、カップリングタンパク質の優れた可動性を提供する。
【００７５】
ポリペプチドまたは多量体のアルカリ安定性は、例えばＮＨＳ−またはマレイミドカップリング化学を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）チップ、例えば実施例に記載されるようなＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップとそれをカップリングさせ、指定された温度、例えば２２＋／−２℃のアルカリ溶液中でのインキュベーションの前後に一般にポリクローナルヒトＩｇＧを用いてチップの免疫グロブリン結合容量を測定することによって評価することができる。インキュベーションは、例えば０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で何回かの１０分サイクル、例えば１００、２００または３００サイクルなどで実施することができる。２２＋／−２℃の０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で１００回の１０分インキュベーションサイクルの後のマトリックスのＩｇＧ容量は、インキュベーション前のＩｇＧ容量の少なくとも５５、例えば少なくとも６０、少なくとも８０または少なくとも９０％などであり得る。あるいは、上記のように測定される特定の変異体の１００サイクル後の残存ＩｇＧ容量は、親ポリペプチド／多量体の残存ＩｇＧ容量と比較することができる。この例では、変異体の残存ＩｇＧ容量は、親ポリペプチド／多量体の少なくとも１０５％、例えば少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％または少なくとも２００％などであることがある。
【００７６】
免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインおよび／またはその多量体は、核酸配列、例えばポリペプチドまたは多量体をコードするＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列などによってコードされることがある。コード配列に加えて必要なシグナル配列を含む、プラスミドなどのベクターがポリペプチドまたは多量体の発現に使用されることがある。ベクターは、上記のような多量体をコードする核酸を含むことがあり、この際、各単位をコードする個別の核酸は、相同または異種のＤＮＡ配列を有することがある。
【００７７】
上記のような核酸またはベクターを含む発現系は、ポリペプチドまたは多量体の発現に使用されてよい。発現系は、例えば、本発明のポリペプチドまたは多量体を発現するよう改変されている、グラム陽性またはグラム陰性の原核生物宿主細胞系、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）であってよい。あるいは、発現系は、真核生物宿主細胞系、例えば酵母、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など、または哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞であってよい。
【００７８】
分離マトリックスは、多孔質支持体と共有結合した、上記のような免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【００７９】
分離マトリックスは、多孔質支持体と共有結合した、少なくとも１１、例えば１１〜２１、１５〜２１または１５〜１８ｍｇ／ｍｌのＦｃ結合リガンドを含んでよく、この際：
ａ）リガンドはアルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含み、
ｂ）多孔質支持体は５６〜７０、例えば５６〜６６マイクロメートルの体積加重メジアン径（ｄ５０，ｖ）および５５〜８０、例えば６０〜７８または６５〜７８ｍｇ／ｍｌの乾燥固体重量を有する架橋ポリマー粒子を含む。架橋ポリマー粒子はさらに、分子量１１０ｋＤａのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのＫｄ値０．６９〜０．８５、例えば０．７０〜０．８５または０．６９〜０．８０に相当する孔径を有してよい。多量体は、例えばアルカリ安定化プロテインＡドメインの四量体、五量体、六量体または七量体、例えばアルカリ安定化プロテインＡドメインの六量体などを含んでよい。高いリガンド含有量と粒度範囲、乾燥固体重量範囲および随意のＫｄ範囲を組み合わせることにより、例えば、ＩｇＧに対する１０％貫流の動的結合容量が２．４分の滞留時間で少なくとも４５ｍｇ／ｍｌ、例えば少なくとも５０または少なくとも５５ｍｇ／ｍｌであるような、高い結合容量が得られる。あるいは、またはさらに、ＩｇＧに対する１０％貫流の動的結合容量は、６分の滞留時間で少なくとも６０ｍｇ／ｍｌ、例えば少なくとも６５、少なくとも７０または少なくとも７５ｍｇ／ｍｌなどであることがある。
【００８０】
アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体は、ＩｇＧに対して選択性が高く、分離マトリックスは、２０ｍＭリン酸緩衝液、１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中で、ヒトＩｇＧ２に対して０．２ｍｇ／ｍｌよりも低い、例えば０．１ｍｇ／ｍｌよりも低い解離定数を適切に有することができる。これは、Ｎ  Ｐａｋｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｓｃｉ  １２，１１３６−１１４１（２０１２）に記載の吸着等温線法に従って求めることができる。
【００８１】
ある種の実施形態では、分離マトリックスは、多孔質支持体と共有結合した、少なくとも１５、例えば１５〜２１または１５〜１８ｍｇ／ｍｌのＦｃ結合リガンドを含み、この際、リガンドは、アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む。これらの多量体は、適切に、上記の実施形態または下に指定される実施形態のいずれかに開示される通りであり得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、分離マトリックスは、支持体と結合した、５〜２５、例えば５〜２０ｍｇ／ｍｌ、５〜１５ｍｇ／ｍｌ、５〜１１ｍｇ／ｍｌまたは６〜１１ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは多量体を含む。結合したポリペプチド／多量体の量は、カップリングプロセスで使用したポリペプチド／多量体の濃度、使用した活性化およびカップリング条件、および／または使用した支持体の多孔構造によって制御することができる。概して、マトリックスの絶対結合容量は、カップリングされたポリペプチド／多量体の量に伴い、少なくとも細孔がカップリングされたポリペプチド／多量体によって著しく狭窄される点まで増加する。理論に縛られるものではないが、しかし、支持体に対して列挙されるＫｄ値に関して、結合したリガンドによる細孔の狭窄はそれほど重要ではないと思われる。カップリングされたポリペプチド／多量体１ｍｇ当たりの相対結合容量はカップリングレベルが高くなると減少し、上記の範囲内で最適な費用便益をもたらす。
【００８３】
そのような分離マトリックスは、免疫グロブリンまたはその他のＦｃ含有タンパク質の分離に有用である。そして、ポリペプチド／多量体のアルカリ安定性が改善されたために、マトリックスは洗浄中の高アルカリ条件に耐え、それはバイオプロセス分離の状況において長期の反復使用に不可欠である。マトリックスのアルカリ安定性は、指定された温度、例えば２２＋／−２℃のアルカリ溶液中でのインキュベーションの前後に一般にポリクローナルヒトＩｇＧを使用して、免疫グロブリン結合容量を測定することによって評価することができる。インキュベーションは、例えば、０．５Ｍまたは１．０Ｍ  ＮａＯＨ中で何回かの１５分サイクル、例えば２５、５０または７５時間の総インキュベーション時間に相当する１００、２００または３００サイクルなどで実施することができる。２２＋／−２℃の０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で９６〜１００回の１５分インキュベーションサイクルあるいは２４または２５時間の総インキュベーション時間の後のマトリックスのＩｇＧ容量は、インキュベーション前のＩｇＧ容量の少なくとも８０、例えば少なくとも８５、少なくとも９０または少なくとも９５％などであり得る。２２＋／−２℃の１．０Ｍ  ＮａＯＨ中で合計２４時間のインキュベーションの後のマトリックスの容量は、インキュベーション前のＩｇＧ容量の少なくとも７０、例えば少なくとも８０または少なくとも９０％などであり得る。２．４分または６分の滞留時間のＩｇＧに対する１０％貫流の動的結合容量（Ｑｂ１０％）は、例えば、２２＋／−２℃の１．０Ｍ  ＮａＯＨ水溶液中、３１時間のインキュベーションの後に２０％未満低下していることがある。
【００８４】
当業者の理解するように、発現したポリペプチドまたは多量体は、支持体に固定される前に適切な程度まで精製されるべきである。そのような精製方法は当分野で周知であり、タンパク質に基づくリガンドの支持体への固定は標準法を用いて容易に実行される。適切な方法および支持体は、以下により詳細に述べる。
【００８５】
分離マトリックスの多孔質支持体は、任意の適した周知の種類のものであってよい。従来のアフィニティー分離マトリックスは多くの場合有機性であり、使用する水性媒体に親水性表面を曝露している、すなわちヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキシアミド（−ＣＯＮＨ２、Ｎ−置換型であってもよい）、アミノ（−ＮＨ２、置換されていてもよい）、オリゴ−またはポリエチレンオキシ基をそれらの外部に曝露し、存在する場合にはその内部にも曝露しているポリマーに基づく。支持体の空隙率は、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，ｐｐ６−１３に記載の方法による逆サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されたＫａｖまたはＫｄ値（特定のサイズのプローブ分子に利用可能な細孔容積の割合）として表すことができる。Ｋａｖは、比（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）として求められ、式中、Ｖｅは、プローブ分子の溶出量（例えば、デキストラン１１０ｋＤ）であり、Ｖ０は、カラムの空隙容量（例えば、高Ｍｗのボイドマーカー、例えば未加工のデキストランなどの溶出量）であり、Ｖｔはカラムの総容積である。Ｋｄは、（Ｖｅ−Ｖ０）／Ｖｉとして求めることができ、式中、Ｖｉは、マトリックス体積（マトリックスポリマー分子によって占有される体積）を除く全ての容積に入ることのできる塩（例えば、ＮａＣｌ）の溶出量である。定義上、ＫｄおよびＫａｖ値は両方とも常に０〜１の範囲内にある。有利には、分子量１１０ｋＤａのデキストランをプローブ分子として用いて測定した場合、Ｋａｖ値は０．６〜０．９５、例えば、０．７〜０．９０または０．６〜０．８であり得る。分子量１１０ｋＤａのデキストランで測定されるＫｄ値は、適切には０．６８〜０．９０、例えば０．６８〜０．８５または０．７０〜０．８５などであり得る。この有利性は、支持体が、本発明のポリペプチド／多量体および該ポリペプチド／多量体に結合する免疫グロブリンの両方を収容することができ、結合部位への、および結合部位からの免疫グロブリンの質量輸送を提供することができる細孔を大きな割合で有することである。
【００８６】
ポリペプチドまたは多量体は、例えば、リガンド中に存在するチオール、アミノおよび／またはカルボキシ基を利用する従来のカップリング技術を介して多孔質支持体に結合させることができる。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などは、周知のカップリング試薬である。支持体とポリペプチド／多量体との間には、ポリペプチド／多量体の有効性を改善し、ポリペプチド／多量体と支持体との化学カップリングを促進する、スペーサーとして公知の分子を導入することができる。ポリペプチド／多量体の性質およびカップリング条件に応じて、カップリングは、マルチポイントカップリング（例えば複数のリジンを介するもの）であってもよいし、シングルポイントカップリング（例えば単一のシステインを介するもの）であってもよい。
【００８７】
特定の実施形態において、ポリペプチドまたは多量体は、チオエーテル結合を介して支持体にカップリングされる。このような結合を実施する方法は、この分野において周知であり、標準的な技術および装置を使用して当業者によって容易に実施される。チオエーテル結合は、柔軟で安定であり、一般的にアフィニティークロマトグラフィーでの使用に適している。特に、チオエーテル結合が、ポリペプチドまたは多量体上の末端または近末端のシステイン残基を介している場合、カップリングされたポリペプチド／多量体の可動性が向上し、結合容量および結合反応速度が改善される。いくつかの実施形態において、ポリペプチド／多量体は、上記のタンパク質に提供されるＣ末端システインを介してカップリングされる。このことは、システインチオールと支持体上の求電子基、例えばエポキシド基、ハロヒドリン基等との効率的なカップリングを可能にし、その結果チオエーテル架橋結合となる。
【００８８】
特定の実施形態において、支持体は、ポリヒドロキシポリマー、例えば多糖類を含む。多糖類の例としては、例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロースなどが挙げられる。多糖類は本質的に親水性であり、非特異的相互作用の程度は低く、反応性（活性化可能な）ヒドロキシル基含量が高く、バイオプロセスに使用されるアルカリ清浄化液に対して一般に安定である。
【００８９】
いくつかの実施形態において、支持体は、寒天またはアガロースを含む。本発明で使用する支持体は、標準的な方法、例えば逆懸濁ゲル化（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４））により容易に調製することができる。または、塩基性マトリクッスは、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の名称で販売されている架橋アガロースビーズなどの市販品である。大規模分離に特に有利な一実施形態において、支持体は、米国特許第６６０２９９０号または米国特許第７３９６４６７号（当該特許は参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されている方法を使用して、その剛性を増加させるように適合されており、そのためにマトリックスは高い流量により適したものとなる。
【００９０】
特定の実施形態において、支持体、例えばポリマー、多糖類またはアガロースなどは、ヒドロキシアルキルエーテル架橋などで架橋される。このような架橋を生成する架橋剤試薬は、例えば、エピクロロヒドリンのようなエピハロヒドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジエポキシド、アリルハライドまたはアリルグリシジルエーテルのようなアリル化試薬であってよい。架橋は、支持体の剛性に有益であり、化学的安定性を改善する。ヒドロキシアルキルエーテル架橋はアルカリ安定性であり、著しい非特異的吸着を引き起こさない。
【００９１】
あるいは、多孔質支持体は、合成ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどに基づく。ジビニルおよびモノビニル置換ベンゼンに基づくマトリックスなどの疎水性ポリマーの場合、マトリックス表面は、多くの場合親水化されて、上で定義した親水性基を周囲の水性液体に曝露する。そのようなポリマーは、標準法に従って容易に製造される、例えば「Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），７０−７５（１９８８））を参照されたい。または、ＳＯＵＲＣＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの市販品が使用される。別の代替法では、本発明による多孔質支持体は、無機性の支持体、例えばシリカ、酸化ジルコニウムなどを含む。
【００９２】
さらに別の実施形態において、固相支持体は、表面、チップ、キャピラリー、またはフィルタ（例えば、膜または深層フィルタマトリックス）などの別の形態である。
【００９３】
本発明によるマトリックスの形状に関して、一実施形態において、マトリックスは多孔質モノリスの形態である。別の実施形態において、マトリックスは、多孔質または非多孔質であり得るビーズまたは粒子の形態である。ビーズまたは粒子の形態のマトリックスは、充填床として、または懸濁形態で使用することができる。懸濁形態には、粒子またはビーズが自由に移動する膨張床および純粋な懸濁液として知られている形態が含まれる。モノリス、充填床および膨張床の場合、分離手順は一般に、濃度勾配を用いた従来のクロマトグラフィーに従う。純粋な懸濁液の場合、バッチ様式が使用される。
【００９４】
上に開示される分離マトリックスは優れたアルカリ安定性を有するので、アルカリ性保存液中で保存されてよい。分離マトリックスを保存する方法は、以下の工程を含む：
ａ）少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液を準備する工程；
ｂ）分離マトリックスに保存液を浸透させる工程；および
ｃ）保存液を浸透させた分離マトリックスを少なくとも５日の保存時間の間保存する工程。
【００９５】
アルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液を使用することにより、エタノール、イソプロパノール、またはベンジルアルコールなどのアルコールの使用を必要とすることなく、静菌性または殺菌性の溶液を得ることができる。このことは、公知のプロテインＡアフィニティー分離マトリックスに現在使用される保存溶液よりも安価で、規制上の負担になりにくく、不燃性で、処分が簡単である保存液を使用できることを意味する。
【００９６】
分離マトリックスは、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む、上に開示されるような分離マトリックスであり、この際、アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも８０％、例えば９０％、９５％または９８％などの同一性を有するブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくともアスパラギン残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している。免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインは、さらなる変異を含むことがある。例えば、配列番号５１または５２の１位のグルタミン残基は、アラニンに変異させてよい；かつ／または配列番号５１または５２の３５位のアスパラギンまたはグルタミン酸残基は、アラニンに変異させてよい。
【００９７】
保存液は、少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む。アルカリ金属水酸化物水溶液は、単一のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ金属水酸化物の混合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムと水酸化カリウムの混合物などを含んでよい。アルカリ金属水酸化物水溶液は、アルカリ金属水酸化物の混合物を使用する場合のアルカリ金属水酸化物の総合濃度として表して、１０ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば３０ｍＭ〜５０ｍＭなどのモル濃度を有してよい。保存液は、アルカリ金属水酸化物水溶液から本質的になるか、またはそれからなってよい。しかし、保存液は、いくつかの実施形態においてさらなる成分も含んでよい。そのようなさらなる成分には、アルコール、例えばＣ２−Ｃ７アルコール、例えばエタノール、イソプロパノールまたはベンジルアルコールなどが含まれてよい。そのようなさらなる成分には、塩、例えば塩化ナトリウムなどが含まれてよい。アルコールおよび／または塩を保存液中に使用することにより、ある種の微生物、例えば胞子形成細菌などを抑制または不活性化する保存液の効力を増加させることができる。
【００９８】
保存液の限定されない例としては、以下が挙げられる：
水酸化ナトリウム溶液（０．０１Ｍ、０．０３Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ）；
水酸化カリウム溶液（０．０１Ｍ、０．０３Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ）；
１０〜２０体積％のエタノールを含む水酸化ナトリウム溶液（０．０１Ｍ、０．０３Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ）；
１０〜５０体積％のイソプロパノールを含む水酸化ナトリウム溶液（０．０１Ｍ、０．０３Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ）；
１〜５体積％のベンジルアルコールを含む水酸化ナトリウム溶液（０．０１Ｍ、０．０３Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ）；
１０〜２０体積％のエタノールを含む水酸化カリウム溶液（０．０１Ｍ、０．０３Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ）；
１０〜５０体積％のイソプロパノールを含む水酸化カリウム溶液（０．０１Ｍ、０．０３Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ）；または
１〜５体積％のベンジルアルコールを含む水酸化カリウム溶液（０．０１Ｍ、０．０３Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ）。
【００９９】
分離マトリックスは、保存前および保存中に保存液で浸透させる。保存液を浸透させるとは、分離マトリックスの細孔および隙間がかなりの程度まで保存液で満たされることを意味する。分離マトリックスは、保存した分離マトリックスでの微生物の増殖を抑制するのに十分な量の保存液で浸透させるべきである。分離マトリックスは、保存液で含浸されるか、飽和させるか、または保存液に浸漬されてよい。一般に、保存に適した保存液中の分離マトリックスのスラリーは、スラリーの総重量に対して約５０％〜８０重量％の分離マトリックスを含んでよい。
【０１００】
分離マトリックスは、保存液中に必要なだけ長い期間保存されてよい。一般に、分離マトリックスを保存する場合、これは少なくとも５日間、多くの場合少なくとも１０日間、例えば少なくとも５０日、または例えば少なくとも１００日、または例えば少なくとも２００日である。分離マトリックスの最大保存時間、または有効期間は、使用する保存液の性質、すなわちアルカリ濃度、ならびに使用者の許容できる容量損失の程度に依存するが、例えば最大４００日または最大７００日であり得る。
【０１０１】
保存液と分離マトリックスの混合物は、適した保存容器に含められる。保存容器は、プラスチック、例えばポリエチレン、またはガラスなどの液体不浸透性材料で作製した瓶、缶またはドラムであってよい。分離マトリックスは、初期保存および製造後の流通のためにそのような保存容器に詰められてもよいし、免疫グロブリンを精製する際に使用後にそのような保存容器に再び充填されてもよい。あるいは保存容器は免疫グロブリンの開発または製造で用いるための事前充填製品であってもよい。そのような事前充填製品としては、濾板、例えば９６ウェル濾板など、および事前充填カラムが挙げられる。そのような事前充填カラムとしては、研究所規模からプロセス規模までの、当業者に公知の全てのサイズのカラムが挙げられる。そのようなカラムは、事前充填され、認定され、消毒されて出荷されることができる、したがって免疫グロブリン精製プロセスに必要な時間を実質的に減らすことができる。
【０１０２】
分離マトリックスを保存するための保存容器は、開いていてもよいし、孔があけられていてもよいし、密封されていてもよい。アルカリ金属水酸化物水溶液は不燃性であり、比較的非揮発性であるので、保存容器内の圧力上昇および保存室の換気に関して特に考慮しなくてもよい。分離媒体のドライアウトを防ぐために、保存媒体を気密容器に保存するのであればそれが好ましい。
【０１０３】
分離マトリックスは、アフィニティー媒体の保存のための当技術分野で公知の温度、例えば１℃〜３０℃、または１０〜２０℃などで保存されてよい。しかし、高温での長期保存は、分離マトリックスの容量を低下させることがあり、そのため分離マトリックスを２〜８℃の温度で保存することができるのであればそれが好ましい。
【０１０４】
分離マトリックスがこれまでに保存の前に免疫グロブリンを精製するために使用されている場合、例えばそれが現在は終わっている製造キャンペーンで使用されている場合、分離マトリックスは保存の前に洗浄および／または消毒されることが好ましい。少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含み、０．５Ｍ〜５Ｍのモル濃度を有する洗浄液は、分離マトリックスを洗浄および／または消毒するために適切に使用されてよい。
【０１０５】
実施例
タンパク質の変異誘発
部位特異的変異誘発を、変異をコードするオリゴヌクレオチドを用いて２工程のＰＣＲによって実施した。鋳型として、Ｚ、ＢまたはＣのいずれかの単一のドメインを含有するプラスミドを使用した。ＰＣＲ断片を大腸菌発現ベクターに連結した。ＤＮＡ塩基配列決定法を使用して、挿入した断片の正しい配列を検証した。
【０１０６】
変異体の多量体を形成するために、アミノ酸ＶＤに対応する、Ｂ、ＣまたはＺドメインの出発コドン（ＧＴＡ  ＧＡＣ）に位置するＡｃｃ  Ｉ部位を使用した。単量体ドメインのベクターをＡｃｃ  Ｉで消化し、ホスファターゼ処理した。各々のバリアントに特異的なＡｃｃ  Ｉ粘着末端プライマーを設計し、２つのオーバーラップＰＣＲ産物を各々の鋳型から作製した。ＰＣＲ産物を精製し、２％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を比較することによって濃度を推定した。等量の対のＰＣＲ産物をライゲーション緩衝液中でハイブリダイズした（４５分で９０℃→２５℃）。結果として得られる産物は、Ａｃｃ  Ｉ部位（正しいＰＣＲ断片および／または消化ベクター）に連結される可能性の高い断片の約１／４からなる。ライゲーションおよび形質転換の後、コロニーをＰＣＲスクリーニングして所望の変異体を含む構築物を同定した。陽性クローンは、ＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
【０１０７】
構築物の発現および精製
構築物を、標準培地中の大腸菌Ｋ１２の発酵によって細菌ペリプラズム内に発現させた。発酵後、細胞を熱処理してペリプラズムの内容物を培地に放出させた。培地に放出された構築物を、孔径０．２μｍの膜を用いる精密濾過法によって回収した。
【０１０８】
各々の構築物（ここでは濾過工程からの透過液中にある）を、アフィニティーによって精製した。透過液を、固定化ＩｇＧ（ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するクロマトグラフィー培地に添加した。添加した産物をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ｐＨを低下させることによって溶出した。
【０１０９】
溶出プールを中性ｐＨ（ｐＨ８）に調節し、ジチオトレイトールの添加によって還元した。次に、試料を陰イオン交換体に添加した。洗浄工程の後、構築物をＮａＣｌ勾配に溶出し、それを夾雑物から分離した。溶出プールを限外濾過によって４０〜５０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。固定ＩｇＧ培地での構築物のアフィニティー精製の成功は、問題の構築物がＩｇＧに対して高い親和性を有することを意味することに留意する必要がある。
【０１１０】
精製したリガンドをＲＰＣ  ＬＣ−ＭＳで分析して、純度を求め、分子量が（アミノ酸配列に基づく）予測値と一致することを確かめた。
【実施例１】
【０１１１】
配列番号８〜１６、２３〜２８および３６〜４８についてＮ末端のＡＱＧＴリーダー配列およびＣ末端のシステインをさらに含む、表１に記載の精製単量体リガンドを、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）上に固定化し、十分な量でＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのアミンカップリングキット（チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用）を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）計測器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）で約２００〜１５００ＲＵのシグナル強度を得た。固定化表面のＩｇＧ結合容量を追跡するため、１ｍｇ／ｍｌヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）をチップの上に流し、シグナル強度（結合量に比例）を記録した。次に、表面を定置洗浄した（ＣＩＰ）、すなわち、室温で（２２＋／−２℃）１０分間、５００ｍＭ  ＮａＯＨを流した。これを９６〜１００サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクルの後に残存ＩｇＧ結合容量（シグナル強度）として追跡した。結果は表１に示され、少なくともリガンドＺｖａｒ（Ｎ１１Ｋ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｔ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｆ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｌ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｗ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｍ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｖ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｈ１）、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｒ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｑ４０Ｅ）１およびＺｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｋ５０Ｒ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１およびＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ）１、ならびに２９位にＧ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫを有するＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１の変種、５３位にＦ、Ｙ、Ｗ、ＫまたはＲを有するＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１の変種、およびＱ９、Ｑ４０、Ａ４２またはＮ４３を欠失しているＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１の変種が、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ１と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。さらに、リガンドＢ（Ｑ９Ａ、Ｎ１��Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１およびＣ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｅ４３Ａ）１は、基準として使用した親ＢドメインおよびＣドメインと比較して安定性が改善された。
【０１１２】
表１．Ｂｉａｃｏｒｅ（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）で評価した単量体リガンド
【０１１３】
【表１−１】
2019523215.tif 000002
【０１１４】
【表１−２】
2019523215.tif 000003
【０１１５】
【表１−３】
2019523215.tif 000004
Ｂｉａｃｏｒｅ実験は、リガンドとＩｇＧとの結合速度および解離速度を求めるためにも使用することができる。これを上記の設定でプローブ分子としてＩｇＧ１モノクローナル抗体を用いて使用した。基準Ｚｖａｒ１に関して、オンレート（１０５Ｍ−１ｓ−１）は３．１であり、オフレート（１０５ｓ−１）は２２．１であり、親和性（オフレート／オンレート）は７１３ｐＭとなった。Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１（配列番号１１）に関して、オンレートは４．１であり、オフレートは４３．７で、親和性は１０７０ｐＭであった。このようにＩｇＧ親和性は変異バリアントについて多少高かった。
【実施例２】
【０１１６】
表２に記載の精製二量体、四量体および六量体リガンドを、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）上に固定化し、十分な量でＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのアミンカップリングキット（チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用）を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ計測器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）で約２００〜１５００ＲＵのシグナル強度を得た。固定化表面のＩｇＧ結合容量を追跡するため、１ｍｇ／ｍｌヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）をチップの上に流し、シグナル強度（結合量に比例）を記録した。次に、表面を定置洗浄した（ＣＩＰ）、すなわち、室温で（２２＋／−２℃）１０分間、５００ｍＭ  ＮａＯＨを流した。これを３００サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクルの後に残存ＩｇＧ結合容量（シグナル強度）として追跡した。結果は表２および図２に示され、少なくともリガンドＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ）４、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）４、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）４およびＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４およびＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４が、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ４と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。六量体リガンドＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）６も、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ６と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。さらに、２つの単量体単位間のリンカー領域のａ）Ｄ２、Ａ３、Ｋ４；ｂ）Ｋ５８、Ｖ１、Ｄ２；ｃ）Ｐ５７、Ｋ５８、Ｖ１、Ｄ２、Ａ３；ｄ）Ｋ４、Ｆ５、Ｄ６、Ｋ７、Ｅ８；ｅ）Ａ５６、Ｐ５７、Ｋ５８；Ｖ１、Ｄ２、Ａ３またはｆ）Ｖ１、Ｄ２、Ａ３、Ｋ４、Ｆ５、Ｄ６、Ｋ７、Ｅ８が欠失した、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）二量体は、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ２と比較してアルカリ安定性を改善させた。また、リンカー領域のＫ５８とＶ１の間にＹＥＤＧが挿入された、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）二量体は、Ｚｖａｒ２と比較してアルカリ安定性を改善させた。
【０１１７】
表２．Ｂｉａｃｏｒｅ（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）で評価した二量体、四量体および六量体リガンド
【０１１８】
【表２−１】
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【０１１９】
【表２−２】
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【実施例３】
【０１２０】
実施例２のような５００ｍＭの代わりに１Ｍ  ＮａＯＨを用いて、３つのリガンドの１００回のＣＩＰサイクルを用いて実施例２を繰り返した。結果は表３に示され、３つ全てのリガンドが、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ４と比較して１Ｍ  ＮａＯＨ中でも安定性を改善したことを示す。
【０１２１】
表３．Ｂｉａｃｏｒｅ（１Ｍ  ＮａＯＨ）で評価した四量体リガンド
【０１２２】
【表３】
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【実施例４】
【０１２３】
表２の精製四量体リガンド（全てＮ末端にさらなるシステインを含む）を、下に記載される方法を用いてアガロースビーズに上に固定化し、能力および安定性について評価した。結果を表４および図３に示す。
【０１２４】
表４．カラム（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）で評価した、四量体リガンドを含むマトリックス。
【０１２５】
【表４】
2019523215.tif 000008
活性化
使用したベースマトリックスは、参照によりその全文がここに援用される米国特許第６６０２９９０号に記載の方法に従って調製し、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，ｐｐ  ６−１３に記載の方法に従う、Ｍｗ１１０ｋＤａのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのＫａｖ値０．７０に相当する孔径をもつ、８５マイクロメートル（容積重量、ｄ５０Ｖ）の中位径の硬質架橋アガロースビーズであった。
【０１２６】
２５ｍＬ（ｇ）の水切りしたベースマトリックス、１０．０ｍＬの蒸留水および２．０２ｇのＮａＯＨを、１００ｍＬフラスコ中で機械的に撹拌しながら２５℃において１０分間混合した。４．０ｍＬのエピクロロヒドリンを加え、反応を２時間進行させた。活性化されたゲルを、１０ゲル沈殿物体積（ＧＶ）の水で洗浄した。
【０１２７】
カップリング
５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中２０ｍＬのリガンド溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に、１６９ｍｇのＮａＨＣＯ３、２１ｍｇのＮａ２ＣＯ３、１７５ｍｇのＮａＣｌおよび７ｍｇのＥＤＴＡを添加した。Ｆａｌｃｏｎチューブをローラーテーブルの上に５〜１０分間載せた後、７７ｍｇのＤＴＥを添加した。還元は４５分超進行した。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を充填したＰＤ１０カラムでリガンド溶液を脱塩した。脱塩した溶液中のリガンド含有量を、２７６ｎｍのＵＶ吸収を測定することによって求めた。
【０１２８】
活性化したゲルを３〜５ＧＶ｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６｝で洗浄し、次に参照によりその全文がここに援用される米国特許第６３９９７５０号に記載の方法に従ってリガンドを結合させた。この実験で使用した全ての緩衝液を、窒素ガスによって少なくとも５〜１０分間脱気した。ゲルのリガンド含有量は、リガンド溶液の量および濃度を変化させることによって制御することができた。
【０１２９】
固定化の後、ゲルを３ｘＧＶの蒸留水で洗浄した。ゲル＋１ＧＶ｛０．１Ｍ  リン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０％チオグリセロールｐＨ８．６｝を混合し、チューブを室温で一晩振動台に置いた。次に、ゲルを３ｘＧＶ｛０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．６｝および０．５Ｍ  ＨＡｃで、その後８〜１０ｘＧＶの蒸留水で交互に洗浄した。ゲル試料をアミノ酸分析のために外部の試験所に送り、リガンド含有量（ｍｇ／ｍｌゲル）を全アミノ酸含有量から計算した。
【０１３０】
タンパク質
Ｇａｍｍａｎｏｒｍ１６５ｍｇ／ｍｌ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、平衡化緩衝液中２ｍｇ／ｍｌに希釈。
【０１３１】
平衡化緩衝液
ＰＢＳリン酸緩衝液１０ｍＭ＋０．１４Ｍ  ＮａＣｌ＋０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）
吸着緩衝液
ＰＢＳリン酸緩衝液１０ｍＭ＋０．１４Ｍ  ＮａＣｌ＋０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）
溶出緩衝液
１００ｍＭ酢酸塩ｐＨ２．９
動的結合容量
２ｍｌの樹脂を、ＴＲＩＣＯＲＮ（商標）５  １００カラムに充填した。貫流容量を、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ１０システムで滞留時間６分（流量０．３３ｍｌ／分）で求めた。安定したベースラインが得られるまで平衡化緩衝液をバイパスカラムに流した。これは自動ゼロ化の前に行なった。１００％ＵＶシグナルが得られるまで試料をカラムに適用した。その後、安定したベースラインが得られるまで、平衡バッファーを再度適用した。
【０１３２】
ＵＶシグナルが最大吸光度の８５％に達するまで試料をカラムに添加した。その後、流量０．５ｍｌ／分の５カラム容量（ＣＶ）の平衡緩衝液でカラムを洗浄した。タンパク質を５ＣＶの溶出緩衝液で流量０．５ｍｌ／分で溶出した。次に、カラムを流量０．２ｍｌ／分の０．５Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、平衡化緩衝液で再び平衡化させた。
【０１３３】
１０％の貫流容量の計算には、下の式を使用した。それは、カラム流出液中のＩｇＧの濃度がフィード液中のＩｇＧ濃度の１０％になるまでカラムに添加されるＩｇＧの量である。
【０１３４】
【数１】
2019523215.tif 000009
Ａ１００％＝１００％ＵＶシグナル；
Ａｓｕｂ＝非結合ＩｇＧサブクラスによる吸光度への寄与；
Ａ（Ｖ）＝所与添加容量での吸光度；
Ｖｃ＝カラム容量；
Ｖａｐｐ＝１０％貫流までの添加量；
Ｖｓｙｓ＝システムのデッドボリューム；
Ｃ０＝フィード濃度。
【０１３５】
１０％貫流での動的結合容量（ＤＢＣ）を計算した。動的結合容量（ＤＢＣ）は、１０および８０％貫流について計算した。
【０１３６】
ＣＩＰ−０．５Ｍ  ＮａＯＨ
１０％貫流のＤＢＣ（Ｑｂ１０）は、アルカリ洗浄溶液に繰り返し曝露する前と後に求めた。各々のサイクルには、０．５Ｍ  ＮａＯＨを０．５／分の速度で２０分間カラムに通してポンプ送達し、その後カラムを４時間静置するＣＩＰ工程が含まれた。曝露は室温（２２＋／−２℃）で行った。このインキュベーションの後、カラムを平衡緩衝液で流量０．５ｍｌ／分で２０分間洗浄した。表４は、６回の４時間サイクル後の残存容量（すなわち、０．５Ｍ  ＮａＯＨへの累積曝露時間は２４時間）を、絶対数で、そして初期容量と比較して表す。
【実施例５】
【０１３７】
実施例４を、表５に示される四量体リガンドを用いて、但しＣＩＰ工程で０．５Ｍの代わりに１．０Ｍ  ＮａＯＨを使用して繰り返した。結果を表５および図４に示す。
【０１３８】
表５．カラム−１．０Ｍ  ＮａＯＨで評価した、四量体リガンドを含むマトリックス。
【０１３９】
【表５】
2019523215.tif 000010
【実施例６】
【０１４０】
ベースマトリックス
使用したベースマトリックスは、米国特許第６６０２９９０号の方法に従って調製され、上記の方法に従って、０．２Ｍ  ＮａＣｌ中のプロトタイプとプローブ分子として一連のデキストラン画分を充填したＨＲ１０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる（流量０．２ｍｌ／分）分子量１１０ｋＤａのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのＫｄ値０．６２〜０．８２に相当する孔径をもつ、５９〜９３マイクロメートル（体積加重、ｄ５０Ｖ）の中位径（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００レーザー回折装置で測定）の、一組の剛性架橋アガロースビーズ試料であった。１．０ｍｌの排水した濾過ケーキ試料を１０５℃で一晩乾燥させ、秤量することによって求めたビーズ試料の乾燥重量は、５３から８６ｍｇ／ｍｌに及んだ。
【０１４１】
表６ベースマトリックス試料
【０１４２】
【表６】
2019523215.tif 000011
カップリング
１００ｍｌのベースマトリックスをガラスフィルタ上で１０ゲル体積の蒸留水で洗った。ゲルを秤量し（１ｇ＝１ｍｌ）、撹拌器を備えた２５０ｍｌフラスコ中で３０ｍｌの蒸留水および８．０８ｇのＮａＯＨ（０．２０２ｍｏｌ）と混合した。温度は水浴中２７＋／−２℃に調節した。１６ｍｌのエピクロロヒドリン（０．２０２ｍｏｌ）を、９０＋／−１０分の間に激しい撹拌下で（約２５０ｒｐｍ）添加した。反応をさらに８０＋／−１０分間継続させ、その後、ゲルをガラスフィルタ上で１０ゲル体積を上回る蒸留水で中性のｐＨに達するまで洗った。この活性化したゲルを下のようなカップリングに直接使用した。
【０１４３】
５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中１６．４ｍＬのリガンド溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に、１３９ｍｇのＮａＨＣＯ３、１７．４ｍｇのＮａ２ＣＯ３、１４３．８ｍｇのＮａＣｌおよび１４１ｍｇのＥＤＴＡを添加した。Ｆａｌｃｏｎチューブをローラーテーブルの上に５〜１０分間載せた後、６３ｍｇのＤＴＥを添加した。還元は４５分超進行した。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を充填したＰＤ１０カラムでリガンド溶液を脱塩した。脱塩した溶液中のリガンド含有量を、２７６ｎｍのＵＶ吸収を測定することによって求めた。
【０１４４】
活性化したゲルを３〜５ＧＶ｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６｝で洗い、次に、かなり高いリガンド量であるが、米国特許第６３９９７５０号明細書５．２．２に記載の方法に従ってリガンドを結合させた（下記参照）。この実験で使用した全ての緩衝液を、窒素ガスによって少なくとも５〜１０分間脱気した。ゲルのリガンド含有量は、ゲル１ｍｌ当たり５〜２０ｍｇのリガンドを添加して、リガンド溶液の量および濃度を変化させることによって制御した。リガンドは、アルカリ安定化変異体の四量体（配列番号２０）かまたは六量体（配列番号３３）であった。
【０１４５】
固定化の後、ゲルを３ｘＧＶの蒸留水で洗浄した。ゲル＋１ＧＶ｛０．１Ｍ  リン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０％チオグリセロールｐＨ８．６｝を混合し、チューブを室温で一晩振動台に置いた。次に、ゲルを３ｘＧＶ｛０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．６｝および０．５Ｍ  ＨＡｃで、その後８〜１０ｘＧＶの蒸留水で交互に洗浄した。ゲル試料をアミノ酸分析のために外部の試験所に送り、リガンド含有量（ｍｇ／ｍｌゲル）を全アミノ酸含有量から計算した。
【０１４６】
評価
２．４分および６分の滞留時間でのポリクローナルヒトＩｇＧに対するＱｂ１０％動的容量を、実施例４に概説されるように決定した。
【０１４７】
表７．プロトタイプの結果
【０１４８】
【表７−１】
2019523215.tif 000012
【０１４９】
【表７−２】
2019523215.tif 000013
【０１５０】
【表７−３】
2019523215.tif 000014
【実施例７】
【０１５１】
上記の通り調製した、異なるリガンド含有量をもつ一連のプロトタイプ（四量体、配列番号２０）を１Ｍ  ＮａＯＨ中２２＋／−２℃で４、８および３１時間インキュベートし、インキュベーションの前後に動的ＩｇＧ容量（Ｑｂ１０％、滞留時間６分）を測定した。プロトタイプを表８に示し、結果を図５および６に示す。この厳しいアルカリ処理に対する安定性は、リガンド含有量の増加に伴って増加することが分かる。
【０１５２】
表８．１Ｍ  ＮａＯＨでのインキュベーションの試料
【０１５３】
【表８】
2019523215.tif 000015
【実施例８】
【０１５４】
上記の通り調製した、異なるリガンド含有量（六量体、配列番号３３）、ビーズメジアン径（ｄ５０，ｖ）６２μｍおよび分子量１１０ｋＤのデキストランのＫｄ０．７０をもつ、２つの架橋アガロースビーズプロトタイプを、実際のｍＡｂフィード液によって評価した。プロトタイプＡのリガンド含有量は１４．３ｍｇ／ｍｌであり、プロトタイプＢのリガンド含有量は１８．９ｍｇ／ｍｌであった。比較のために、市販品ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）ＬＸ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、リガンド配列番号２１）を使用した。樹脂をＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にベッド高１０ｃｍまで詰めて、２ｍｌのベッドボリュームを得、カラムが０．８〜１．５の区間内でピーク非対称を有することが示された。負荷した試料は、生理学的ｐＨで４．９ｍｇ／ｍｌのモノクローナルＩｇＧ１抗体を含む清澄化したＣＨＯ細胞上清であり、実験条件は下の表９に記載される通りであった（ＣＶ＝カラム体積、ＲＴ＝滞留時間）。
【０１５５】
表９．実際のフィード液による評価の条件。
【０１５６】
【表９】
2019523215.tif 000016
ＵＶウォッチ機能を用いてｍＡｂピークを回収し、２８０ｎｍでのＵＶ測定によってｍＡｂの濃度を求めた（吸光係数１．５）。全ての吸光度の検出は、分光光度計を使用して実施された（収量計算のための測定を含む）。
【０１５７】
ＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）分析用の試料は、各回の実施後に、１０％保存緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ（５．３％）、０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４＊１２Ｈ２Ｏ（９４．７％）、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０、１％  ＢＳＡ  ｐＨ８）を直接試料に（例えば５０μｌの保存緩衝液を４５０μｌの試料に）添加することによって調製した。ＨＣＰ含有量は、市販の抗ＣＨＯ抗体（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＧｙｒｏｌａｂ（Ｇｙｒｏｓ  ＡＢ、スウェーデン）ワークステーションを用いて測定した。
【０１５８】
結果は下の表１０に示され、プロトタイプの成績が市販品と同じ範囲内であることを示す。フィード液中のＨＣＰ含有量は３３１０００ｐｐｍであった。
【０１５９】
表１０．実際のフィード液での評価の結果
【０１６０】
【表１０】
2019523215.tif 000017
【実施例９】
【０１６１】
上記の通り調製した、１４．５ｍｇ／ｍｌのリガンド（六量体、配列番号３３）を含み、ビーズメジアン径（ｄ５０，ｖ）が５７．４μＭであり、分子量１１０ｋＤのデキストランのＫｄが０．７２であり、乾燥重量が７０．３ｍｇ／ｍｌである、架橋アガロースビーズマトリックスのプロトタイプを、２つの実際のｍＡｂフィード液（ｍＡｂ１  ２．４ｇ／ｌおよびｍＡｂ２  ４．９ｇ／ｌ）ＩｇＧ１の溶出ｐＨ、生理学的ｐＨ、およびポリクローナルヒトＩｇＧの試料（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）について評価した。比較のために、市販品ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）ＬＸ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。樹脂をＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にベッド高１０ｃｍまで詰めて、２ｍｌのベッドボリュームを得、カラムが０．８〜１．５の区間内でピーク非対称を有することが示された。負荷した試料は、生理学的ｐＨでＩｇＧ１  ｍＡｂｓを含む清澄化したＣＨＯ細胞上清であり、実験条件は下の表１１に記載される通りであった（ＣＶ＝カラム体積、ＲＴ＝滞留時間）。
【０１６２】
表１１．溶出ｐＨの評価の条件。
【０１６３】
【表１１】
2019523215.tif 000018
結果は下の表１２に示され、特定の抗体と樹脂の組合せに応じていくつかの個々の変化を伴うが、抗体が基準と同様のｐＨレベルで溶出することを示す。
【０１６４】
表１２．溶出ｐＨの評価の結果
【０１６５】
【表１２】
2019523215.tif 000019
ポリクローナルＩｇＧのｐＨ勾配溶出から得られる画分も、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲ計測器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップに固定化された４つの異なるＩｇＧクラスに対する抗体とともに用いて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の含有量について分析した。
【０１６６】
基準およびプロトタイプのポリクローナルＩｇＧのクロマトグラムを図７に示し、ＩｇＧクラス分析を図８に示す。データは、３つ全てのクラスが同様の方法で両方の樹脂と結合すること、および第１のピークが主にＩｇＧ２を含み、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４は主に第２のピークで溶出することを示す。抗ＩｇＧ３抗体はＩｇＧ４と交差反応したので、ＩｇＧ３について信頼できる結果は得られなかった。ＩｇＧ３は通常、プロテインＡと結合しないか、ごく弱くしか結合しないことが公知である。
【実施例１０】
【０１６７】
上記の通り調製した、１２．６ｍｇ／ｍｌのリガンド（四量体、配列番号２０）を含み、ビーズメジアン径（ｄ５０，ｖ）が８４．９μｍであり、分子量１１０ｋＤのデキストランのＫｄが０．７１であり、乾燥重量が６２．２ｍｇ／ｍｌである、架橋アガロースビーズマトリックスのプロトタイプを、市販品のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸを基準として用いてアルカリ安定性に関して評価した。樹脂を１０ｃｍのベッド高まで詰めたＴｒｉｃｏｒｎ５カラムを、３カラム体積の１Ｍ  ＮａＯＨでフラッシした。それから、流れを２４０分間（１５分／サイクルの通常のＣＩＰサイクル１６回に相当）停止させた後、３カラム体積のＰＢＳ緩衝液でＮａＯＨ溶液を洗い流した。次に、ポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）の動的結合容量を測定し、１Ｍ  ＮａＯＨをもう１回注入してこのプロセスを繰り返した。動的容量は、１Ｍ  ＮａＯＨによる各２４０分のインキュベーションサイクルの後に測定した。容量測定では、カラムをＰＢＳ緩衝液で平衡化し、その後に最大吸光度の８５％のＵＶシグナルに達するまで２ｍｇ／ｍｌの試料を負荷した（滞留時間６分）。次に、カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、５００ｍＭ酢酸ｐＨ３．０で溶出し、再平衡化した。１０％および８０％貫流の動的結合容量を上記のように計算した。結果は図９に示され、プロトタイプが市販品よりも大いに安定していたことを示す。
【実施例１１】
【０１６８】
本発明による分離マトリックスの長期保存安定性を評価した。本発明の例（Ｉｎｖ．Ｅｘ．）を、基準として市販品のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＭＳＳ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、リガンド配列番号２１）と比較した。分離マトリックス（Ｉｎｖ．Ｅｘ  またはＭＳＳ）を保存液とともに所定の期間（２週間）インキュベートした。試験した保存液は、２０％エタノール溶液；０．０１Ｍ  ＮａＯＨ溶液；０．０３Ｍ  ＮａＯＨ溶液および０．０５Ｍ  ＮａＯＨ溶液であった。所定期間の間の保存液とのインキュベーションの後、１０％貫流の動的結合容量を、２．４分の滞留時間を用いて、実施例４に記載されるようなヒトポリクローナルＩｇＧを用いて求めた。保存の前の分離マトリックスの１０％貫流容量も比較のために求めた。結果を図１０および下の表１３に示す。
【０１６９】
表１０．長期保存評価の結果
【０１７０】
【表１３】
2019523215.tif 000020
本発明の例は、市販のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅと比較してかなり高い初期動的結合容量を有することが分かる。５０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液中で４週間保存した後、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅは、その最初の動的結合容量の約５２％しか保持しないが、本発明の例は、その最初の動的結合容量の約９６％を保持する。したがって、本発明の例の分離マトリックスは、少なくとも５０ｍＭまでの濃度のＮａＯＨ溶液中での長期保存に適していることが分かる。
［実施態様１］
多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを保存する方法であって、前記アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または配列番号５２の１３位および４４位の位置の前記アミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくとも前記アスパラギン残基が、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に、例えばグルタミン酸に変異しており；かつ、前記方法が：
ａ）少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液を準備する工程と；
ｂ）前記保存液を前記分離マトリックスに浸透させる工程と；
ｃ）前記保存液を浸透させた分離マトリックスを少なくとも５日の保存時間の間保存する工程と
を含む、方法。
［実施態様２］
前記変異体が、配列番号５１または５２の１、２、７、１０、１５、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３４、３５、３６、３９、４２および４３位の１以上においてさらなる変異を含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
配列番号５１または５２の１位の前記グルタミン残基がアラニンに変異している、実施態様１または２に記載の方法。
［実施態様４］
配列番号５１または５２の３５位の前記アスパラギンまたはグルタミン酸残基がアラニンに変異している、実施態様１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様５］
前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体が、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体からなる群から選択されるホモ多量体である、実施態様１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様６］
前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体が、各々、前記多孔質支持体と共有結合するためのＣ末端システイン残基を含む、実施態様１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様７］
前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体が、チオエーテル結合によって前記多孔質支持体に結合されている、実施態様１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様８］
前記分離マトリックスが、少なくとも１１ｍｇ／ｍｌ、例えば少なくとも１５ｍｇ／ｍｌなどの、前記多孔質支持体と共有結合した前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む、実施態様１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様９］
前記多孔質支持体が高度に架橋されたアガロースビーズである、実施態様１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１０］
前記アルカリ金属水酸化物水溶液が、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液またはその混合物、好ましくは水酸化ナトリウム溶液である、実施態様１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１１］
前記アルカリ金属水酸化物水溶液が、１０ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば３０ｍＭ〜５０ｍＭなどのモル濃度を有する、実施態様１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１２］
前記保存液が、Ｃ２−Ｃ７アルコール、例えばエタノール、イソプロパノールまたはベンジルアルコールなどをさらに含む、実施態様１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１３］
前記保存液が、少なくとも７０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液、例えば少なくとも９０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液、好ましくは少なくとも９９体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む、実施態様１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１４］
前記保存時間が、少なくとも１０日、例えば少なくとも２５日など、または例えば少なくとも５０日など、または例えば少なくとも１００日など、または例えば少なくとも２００など、例えば最大４００日、または例えば最大７００日である、実施態様１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１５］
前記分離マトリックスが、保存の前に洗浄流体で洗浄および／または消毒され、前記洗浄流体が少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含み、前記アルカリ金属水酸化物水溶液のモル濃度が５００ｍＭ〜５Ｍ、例えば１Ｍ〜２Ｍである、実施態様１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１６］
前記分離マトリックスが、工程ｂ）の後に、その最初の動的結合容量の少なくとも８０％、例えばその最初の動的結合容量の少なくとも９０％などを保持する、実施態様１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１７］
前記多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスの保存のための、少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む保存液の使用。
［実施態様１８］
保存容器、分離マトリックスおよび保存液を含む分離マトリックス製品であって；前記保存容器は、前記保存液を浸透させた前記分離マトリックスを含有し；前記分離マトリックスは多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含み、前記アルカリ安定化プロテインＡドメインは配列番号５１または配列番号５２によって定義されるブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、前記配列番号５１または配列番号５２の１３位および４４位の位置のアミノ酸残基はアスパラギンであり、前記配列番号５１または５２の３位の少なくともアスパラギン残基はグルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異し；前記保存液は少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む、分離マトリックス製品。
【図１】
2019523215.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019523215.tif 000028
【図９】
2019523215.tif 000029
【図１０】
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【配列表】
2019523215000001.app
【国際調査報告】
2019523215.tif 000031
2019523215.tif 000032
2019523215.tif 000033