(57)【要約】  本発明は、可溶性線維芽細胞成長因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドを特徴とする。本発明はまた、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを使用して骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症を治療する方法を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３２のアミノ酸残基２３〜３５７と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む可溶性線維芽細胞成長因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドであって、ＦＧＦＲ３のシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを欠き、（ｉ）５００アミノ酸長未満であるか；（ｉｉ）２００以下の連続アミノ酸のＦＧＦＲ３の細胞内ドメインを含むか；または（ｉｉｉ）ＦＧＦＲ３のチロシンキナーゼドメインを欠く、ポリペプチド。
【請求項２】
４７５、４５０、４２５、４００、３７５、または３５０アミノ酸長未満である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、４０、３０、２０、１５以下の連続アミノ酸のＦＧＦＲ３の細胞内ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号３２のアミノ酸残基４２３〜４３５と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号３２のアミノ酸残基４２３〜４３５をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３２のアミノ酸残基２３〜３５７と少なくとも９２％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号３３と少なくとも９２％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号３３を含む、またはそれからなる、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可溶性線維芽細胞成長因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドであって、配列番号１の２５３位におけるシステイン残基を除去するアミノ酸置換をさらに含む、ポリペプチド。
【請求項１０】
前記２５３位におけるシステイン残基が、セリン残基により置換されている、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８７％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９または１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項９から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
単離ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドである、請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８）、線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ１９）または線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）に結合する、請求項１から１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記結合が、約０．２ｎＭ〜約２０ｎＭの平衡解離定数（Ｋｄ）により特徴付けられる、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記結合が、約１ｎＭ〜約１０ｎＭのＫｄにより特徴付けられ、場合により、前記Ｋｄが、約１ｎｍ、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、または約１０ｎｍである、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号２０、２１、３６または３７の核酸配列と少なくとも８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２０、２１、３６または３７の核酸配列を含む、またはそれからなる、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドが単離ポリヌクレオチドである、請求項１７または１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１７から１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２１】
プラスミド、人工染色体、ウイルスベクター、およびファージベクターからなる群より選択される、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
単離ポリヌクレオチドである、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
請求項１７から１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２０から２２のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２４】
単離宿主細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項２３または２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１７から１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のベクター、または請求項２３から２５のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む、組成物。
【請求項２７】
薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
約０．００２ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量における投与のために配合される、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項２９】
約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量における投与のために配合される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
１日１回、週１回、または月１回の投与のために配合される、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
週７回、週６回、週５回、週４回、週３回、週２回、週１回、２週間に１回、または月１回の投与のために配合される、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量における週１回または週２回の投与のために配合される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
非経口投与、腸内投与または局所投与のために配合される、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与または腹腔内投与のために配合される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
皮下投与のために配合される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項２６から３５のいずれか一項に記載の組成物を含む、医薬品。
【請求項３７】
患者における骨格成長遅滞障害を治療する方法であって、請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１７から１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のベクター、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項２６から３５のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３６に記載の医薬品を投与することを含む、方法。
【請求項３８】
骨格成長遅滞障害を有する患者において組織にポリペプチドを送達する方法であって、該患者に有効量の請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１７から１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のベクター、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項２６から３５のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３６に記載の医薬品を投与することを含む、方法。
【請求項３９】
前記組織が骨格組織である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記骨格成長遅滞障害が、ＦＧＦＲ３関連骨格疾患である、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＦＧＦＲ３関連骨格疾患が、軟骨無形成症、タナトフォリック骨異形成症Ｉ型（ＴＤＩ）、タナトフォリック骨異形成症ＩＩ型（ＴＤＩＩ）、発育遅延および黒色表皮症を伴う重度の軟骨無形成症（ＳＡＤＤＥＮ）、軟骨低形成症、頭蓋骨縫合早期癒合症候群、ならびに屈指・高身長・難聴症候群（ＣＡＴＳＨＬ）からなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記骨格成長遅滞障害が、軟骨無形成症である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記頭蓋骨縫合早期癒合症候群が、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、クルーゾン症候群、およびクルーゾン皮膚骨格症候群からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＦＧＦＲ３関連骨格疾患が、前記患者における構成的に活性なＦＧＦＲ３の発現により引き起こされる、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記構成的に活性なＦＧＦＲ３が、配列番号５の３８０位のアミノ酸におけるアルギニン残基によるグリシン残基の置換を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記患者が、骨格成長遅滞障害と診断されている、請求項３７から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記患者が、四肢短縮、短い胴体、Ｏ脚、動揺性歩行、頭蓋異形、クローバー葉頭蓋、頭蓋骨縫合早期癒合症、ウォルム骨、手の奇形、足の奇形、ヒッチハイカーの親指、および胸部奇形からなる群より選択される前記骨格成長遅滞障害の１つ以上の症状を呈する、請求項３７から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記患者が、前記ポリペプチドの投与後に前記骨格成長遅滞障害の１つ以上の症状の改善を呈する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記患者が、ポリペプチドを予め投与されていない、請求項３７から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記患者が、幼児、小児、若年者および成人からなる群より選択される、請求項３７から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記患者がヒトである、請求項３７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリペプチドを、患者に約０．００２ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項３７から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポリペプチドを、患者に約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポリペプチドを、患者に１日１回以上、週１回以上、月１回以上、または年１回以上投与する、請求項３７から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ポリペプチドを、患者に週７回、週６回、週５回、週４回、週３回、週２回、週１回、２週間に１回、または月１回投与する、請求項３７から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポリペプチドを、患者に約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で、少なくとも約週１回または２回以上投与する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ポリペプチドを、患者に約２．５ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇの用量で、週１回または２回投与する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリペプチドを、患者に薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤を含む組成物中で投与する、請求項３７から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物を、患者に皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内または腹腔内投与する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記組成物を、患者に皮下注射により投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリペプチドが、約２時間〜約２５時間のインビボ半減期を有する、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリペプチドの投与が、患者の生存率を増加させる、請求項３７から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリペプチドの投与が、患者のロコモーションを改善する、請求項３７から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ポリペプチドの投与が、患者における腹式呼吸を改善する、請求項３７から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリペプチドの投与が、患者の体長および／または骨長を増加させる、請求項３７から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリペプチドの投与が、患者における頭蓋比を改善し、および／または大後頭孔形状を回復させる、請求項３７から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ポリペプチドの発現を生じさせるために好適な条件下で培養培地中で請求項２３から２５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、前記培養培地から前記ポリペプチドを回収することを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチドの産生方法。
【請求項６８】
前記回収がクロマトグラフィーを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記クロマトグラフィーが、親和性クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記親和性クロマトグラフィーが、イオン交換クロマトグラフィーまたは抗ＦＬＡＧクロマトグラフィーを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗ＦＬＡＧクロマトグラフィーが、免疫沈降を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
患者における骨格成長遅滞障害を治療するための、請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
前記骨格成長遅滞障害が、ＦＧＦＲ３関連骨格疾患である、請求項７２に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
前記ＦＧＦＲ３関連骨格疾患が、軟骨無形成症、ＴＤＩ、ＴＤＩＩ、ＳＡＤＤＥＮ、軟骨低形成症、頭蓋骨縫合早期癒合症候群およびＣＡＴＳＨＬからなる群より選択される、請求項７３に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
前記ＦＧＦＲ３関連骨格疾患が、軟骨無形成症である、請求項７４に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
前記頭蓋骨縫合早期癒合症候群が、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、クルーゾン症候群およびクルーゾン皮膚骨格症候群からなる群より選択される、請求項７５に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
前記ＦＧＦＲ３関連骨格疾患が、構成的に活性なＦＧＦＲ３の前記患者における発現により引き起こされる、請求項７３〜７６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
前記構成的に活性なＦＧＦＲ３が、配列番号５の３８０位のアミノ酸におけるアルギニン残基によるグリシン残基の置換を含む、請求項７７に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
前記患者が、前記骨格成長遅滞障害と診断されている、請求項７２から７８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
前記患者が、四肢短縮、短い胴体、Ｏ脚、動揺性歩行、頭蓋異形、クローバー葉頭蓋、頭蓋骨縫合早期癒合症、ウォルム骨、手の奇形、足の奇形、ヒッチハイカーの親指、および胸部奇形からなる群より選択される前記骨格成長遅滞障害の１つ以上の症状を呈する、請求項７２から７９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
前記患者が、前記ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの投与後に前記骨格成長遅滞障害の１つ以上の症状の改善を呈する、請求項８０に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
前記患者が、前記ポリペプチドを予め投与されていない、請求項７２から８１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
前記患者が、幼児、小児、若年者および成人からなる群より選択される、請求項７２から８２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
前記患者がヒトである、請求項７２から８３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
前記患者に約０．００２ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項７２から８４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
前記患者に約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項８５に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
前記患者に１日１回以上、週１回以上、月１回以上、または年１回以上投与される、請求項７２から８６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
前記患者に週７回、週６回、週５回、週４回、週３回、週２回、週１回、２週間に１回、または月１回投与される、請求項７２から８７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
前記患者に約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で、週２回投与される、請求項８８に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
前記患者に、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤を含む組成物中で投与される、請求項７２から８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
前記組成物が、前記患者に非経口、腸内、または局所投与される、請求項９０に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
前記組成物が、前記患者に皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、または腹腔内投与される、請求項９１に記載のポリペプチド。
【請求項９３】
前記組成物が、前記患者に皮下注射により投与される、請求項９２に記載のポリペプチド。
【請求項９４】
線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８）、線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ１９）、または線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）に結合する、請求項７２から９３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９５】
ＦＧＦＲ３ポリペプチドからシグナルペプチド、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインの一部を欠失させることを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項９６】
前記細胞内ドメインの前記一部が、配列番号３２のアミノ酸残基４３６〜８０６からなる、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
配列番号１の２５３位におけるシステイン残基を除去するアミノ酸置換を導入することを含む、請求項９から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項９８】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１７から１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のベクター、または請求項２３から２５のいずれか一項に記載の宿主細胞を含むキットであって、場合により、前記キットの使用説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶性線維芽細胞成長因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドおよびその組成物を特徴とする。本発明はまた、骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症を治療する方法を特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）は、ファミリーメンバー間に高いアミノ酸配列保存が存在する線維芽細胞成長因子（ＦＧＦＲ）ファミリーのメンバーである。ＦＧＦＲファミリーのメンバーは、リガンド結合親和性および組織分布の両方により分化される。全長ＦＧＦＲポリペプチドは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、疎水性膜貫通ドメイン、および細胞質チロシンキナーゼドメインを含有する。ＦＧＦＲポリペプチドのＥＣＤは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と相互作用して下流シグナリングを媒介し、それが最終的に細胞分化に影響を与える。特に、ＦＧＦＲ３タンパク質の活性化は、成長板における軟骨増殖を阻害し、骨伸長を制限することにより骨の発育における役割を担う。
【０００３】
ＦＧＦＲ３における機能獲得点突然変異は、いくつかのタイプのヒト骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症、タナトフォリック骨異形成症Ｉ型（ＴＤＩ）、タナトフォリック骨異形成症ＩＩ型（ＴＤＩＩ）、発育遅延および黒色表皮症を伴う重度の軟骨無形成症（ＳＡＤＤＡＮ）、軟骨低形成症、および頭蓋骨縫合早期癒合症候群（例えば、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、クルーゾン症候群、およびクルーゾン皮膚骨格症候群（Ｃｒｏｕｚｏｎｏｄｅｒｍｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ））を引き起こすことが公知である。ＦＧＦＲ３における機能損失点突然変異も、骨格成長遅滞障害、例えば、屈指・高身長・難聴症候群（ＣＡＴＳＨＬ）を引き起こすことが公知である。軟骨無形成症は四肢短縮小人症の最も一般的な形態であり、不均衡な四肢の短さおよび相対的巨頭頭蓋により特徴付けられる。軟骨無形成症の約９７％は、ＦＧＦＲ３をコードする遺伝子中の単一点突然変異により引き起こされ、ＦＧＦＲ３アミノ酸配列の３８０位においてグリシン残基がアルギニン残基により置換されている。リガンド結合時、突然変異は、受容体／リガンド複合体の排除を減少させ、長期の細胞内シグナリングをもたらす。この長期のＦＧＦＲ３シグナリングは、軟骨成長板の増殖および分化を阻害し、結果的に軟骨内骨成長を損傷する。
【０００４】
骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症を治療するために機能不全ＦＧＦＲ３を標的化する改善された治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、可溶性線維芽細胞成長因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドおよびその使用、例として、患者（例えば、ヒト、特に、幼児、小児、または若年者）における骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）の治療のためのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの使用を特徴とする。特に、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、以下のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを提供するために、例えば、野生型ＦＧＦＲ３ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸２８９〜４００の欠失を特徴とする（例えば、配列番号５または３２のアミノ酸配列を有するポリペプチド）：２５３位におけるセリン残基によるシステイン残基のアミノ酸置換を含むｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ；配列番号２）および拡張Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン３を含むｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３；配列番号３３）ならびにそれらのバリアント、例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するｓＦＧＦＲ３ポリペプチド。さらに、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、シグナルペプチドを含み得、例えば、配列番号１８または３４のアミノ酸配列を有するｓＦＧＦＲ３ポリペプチドである。
【０００６】
本発明の第１の態様は、配列番号３２のアミノ酸残基２３〜３５７と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上（例えば、１００％）の配列同一性）を有するポリペプチド配列を含む可溶性線維芽細胞成長因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドを特徴とする。特に、ポリペプチドは、ＦＧＦＲ３のシグナルペプチド（例えば、配列番号３２のアミノ酸１〜２２）および膜貫通ドメイン（例えば、配列番号３２の３６７〜３９９のアミノ酸）を欠き、（ｉ）５００アミノ酸長未満（例えば、４７５、４５０、４２５、４００、３７５、または３５０アミノ酸長未満）であり；（ｉｉ）２００個以下の連続アミノ酸（例えば、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、４０、３０、２０、１５個以下の連続アミノ酸）のＦＧＦＲ３の細胞内ドメインを含み；および／または（ｉｉｉ）ＦＧＦＲ３のチロシンキナーゼドメインを欠く。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ＦＧＦＲ３の細胞内ドメイン、例えば、配列番号３２のアミノ酸残基４２３〜４３５または配列番号３２のアミノ酸残基４２３〜４３５と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列も含み得る。特に、ポリペプチドは、配列番号３３と少なくとも９２％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む（例えば、ポリペプチドは、配列番号３３を含む、またはそれからなる）。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、シグナルペプチドも含み得る（例えば、シグナルペプチドは、配列番号６もしくは３５のアミノ酸配列または配列番号６もしくは３５と少なくとも９２％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る）。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号３４と少なくとも９２％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号３４を含む、またはそれからなる）。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、異種シグナルペプチドも有し得る（例えば、ポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列を有する異種シグナルペプチドを含む）。
【０００７】
本発明の第２の態様は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチドであって、配列番号１の２５３位におけるシステイン残基を除去するアミノ酸置換をさらに含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを特徴とする。例えば、２５３位におけるシステイン残基は、セリン残基または例えば、別の保存的アミノ酸置換、例えば、アラニン、グリシン、プロリン、もしくはトレオニンにより置換されている。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、単離ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドであり得る。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、シグナルペプチドも含み得る（例えば、シグナルペプチドは、配列番号６もしくは３５のアミノ酸配列または配列番号６もしくは３５と少なくとも９２％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る）。例えば、ｓＦＧＦＲ３は、配列番号１８と少なくとも９２％、９５％、９７％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号１８を含む、またはそれからなる）。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、異種シグナルペプチドも有し得る（例えば、ポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列を有する異種シグナルペプチドを含む）。
【０００８】
本発明の第３の態様は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチドであって、配列番号３のアミノ酸配列の全てまたは断片（例えば、配列番号３の少なくとも１０、２０、３０、４０、４５個以上の連続アミノ酸）と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むドメインをさらに含み、ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基２８８および２８９間に挿入されているｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを特徴とする。例えば、ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る（例えば、ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなる）。場合により、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号１の２５３位および／または配列番号３の２８位における、セリン残基または例えば、別の保存的アミノ酸置換、例えば、アラニン、グリシン、プロリン、もしくはトレオニンによるシステイン残基のアミノ酸置換を含む。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、単離ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドであり得る。
【０００９】
配列番号２０、２１、３６、または３７の核酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む本発明の第１、第２、または第３の態様のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）も特徴とされる（例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号２０、２１、３６、または３７の核酸を含む、またはそれからなる）。本発明はまた、ポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、単離ベクター）、例えば、プラスミド、人工染色体、ウイルスベクター、またはファージベクターを特徴とする。さらに、本発明は、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞（例えば、単離宿主細胞）、例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞を特徴とする。
【００１０】
本発明は、本発明の第１、第２、もしくは第３の態様のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたは本発明の第１、第２、もしくは第３の態様のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を特徴とする。さらに、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターまたは宿主細胞は、組成物中で配合することができる。組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含み得る。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターを含む組成物は、約０．００２ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量における投与のために配合することができる。宿主細胞を含む組成物は、約１×１０３個の細胞／ｍＬ〜約１×１０１２個の細胞／ｍＬの用量における投与のために配合することができる。組成物は、１日１回、週１回、または月１回の投与、例えば、週７回、週６回、週５回、週４回、週３回、週２回、週１回、２週間に１回、または月１回の投与のために配合することができる。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターを含む組成物は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量における週１回または２回の投与のために配合される。組成物は、非経口投与（例えば、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与、または腹腔内投与）、腸内投与、または局所投与のために配合することができる。好ましくは、組成物は、皮下投与のために配合される。本発明はまた、上記組成物の１つ以上を含む医薬品を特徴とする。
【００１１】
本発明はまた、患者に有効量の本発明の第１、第２、もしくは第３の態様のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含有するベクター、ポリヌクレオチドもしくはベクターを含有する宿主細胞、またはポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含有する組成物を投与することを含む、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を有する患者（例えば、ヒト）における組織（例えば、骨格組織）にｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを送達する方法を特徴とする。
【００１２】
本発明の第４の態様は、本発明の第１、第２、もしくは第３の態様のポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含有するベクター、ポリヌクレオチドもしくはベクターを含有する宿主細胞、またはポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含有する組成物を投与することを含む、患者（例えば、ヒト）における骨格成長遅滞障害（例えば、ＦＧＦＲ３関連骨格疾患）を治療する方法を特徴とする。ＦＧＦＲ３関連骨格疾患は、軟骨無形成症、タナトフォリック骨異形成症Ｉ型（ＴＤＩ）、タナトフォリック骨異形成症ＩＩ型（ＴＤＩＩ）、発育遅延および黒色表皮症を伴う重度の軟骨無形成症（ＳＡＤＤＥＮ）、軟骨低形成症、頭蓋骨縫合早期癒合症候群（例えば、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、クルーゾン症候群、およびクルーゾン皮膚骨格症候群）、および屈指・高身長・難聴症候群（ＣＡＴＳＨＬ）からなる群より選択される。特に、骨格成長遅滞障害は、軟骨無形成症である。
【００１３】
ＦＧＦＲ３関連骨格疾患は、構成的に活性なＦＧＦＲ３の患者における発現、例えば、配列番号５または３２の３８０位におけるアルギニン残基によるグリシン残基のアミノ酸置換により引き起こされ得る。特に、患者は、骨格成長遅滞障害と診断されていてよい（例えば、治療前）。例えば、患者は、四肢短縮、短い胴体、Ｏ脚、動揺性歩行、頭蓋異形、クローバー葉頭蓋、頭蓋骨縫合早期癒合症、ウォルム骨、手の奇形、足の奇形、ヒッチハイカーの親指、および胸部奇形からなる群より選択される骨格成長遅滞障害の１つ以上の症状を呈し、その結果、患者は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含有するベクター、ポリヌクレオチドもしくはベクターを含有する宿主細胞、またはポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含有する組成物）の投与後に骨格成長遅滞障害の１つ以上の症状の改善を呈する。さらに、患者は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを予め投与されていなくてよい。例えば、患者は、幼児、小児、若年者、成人であり得る。
【００１４】
例えば、ポリペプチドは、患者に約０．００２ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量）の用量において投与される。ポリペプチドは、患者に１日１回以上、週１回以上（例えば、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、または週７回）、２週間に１回以上、月１回以上、または年１回以上投与することができる。例えば、ポリペプチドは、患者に約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量において少なくとも約週１回または２回以上投与される（例えば、ポリペプチドは、患者に約２．５ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇの用量において週１回または２回投与される）。ポリペプチドは、患者に薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤を含む組成物中で投与することができる。ポリペプチドは、患者に非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、または腹腔内）、腸内、または局所投与することができる。好ましくは、組成物は、患者に皮下注射により投与される。さらに、ポリペプチドは、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８）、線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ１９）、または線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）に結合し得る。特に、結合は、約０．２ｎＭ〜約２０ｎＭの平衡解離定数（Ｋｄ）により特徴付けることができ、例えば、結合は、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ（例えば、約１ｎｍ、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、または約１０ｎｍ）のＫｄにより特徴付けられる。ポリペプチドは、ＦＧＦ１９およびＦＧＦ２１に対するポリペプチドの結合親和性に対してＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９、およびＦＧＦ１８に対する大きな結合親和性を示し得る。
【００１５】
ポリペプチドは、約２時間〜約２５時間（例えば、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、または２５時間）のインビボ半減期を有し得る。好ましくは、ポリペプチドの投与は、以下の１つ以上、または全て：患者の生存率の増加、患者のロコモーションの改善、患者における腹部呼吸の改善、患者の体長および／もしくは骨長の増加、患者の頭蓋比の改善、ならびに／または例えば、非治療患者（例えば、非治療軟骨無形成症患者）に対する患者における大後頭孔形状の回復を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの発現を生じさせるために好適な条件下で培養培地中で上記宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞）を培養し、培養培地からｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを回収することを含む、本発明の第１、第２、または第３の態様のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを産生する方法を特徴とする。特に、回収は、クロマトグラフィー、例えば、親和性クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは抗ＦＬＡＧクロマトグラフィー、例えば、免疫沈降）またはサイズ排除クロマトグラフィーを含む。
【００１７】
本発明の第５の態様は、患者における骨格成長遅滞障害を治療するための本発明の第１、第２、または第３の態様のポリペプチド（またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含有するベクター、ポリヌクレオチドもしくはベクターを含有する宿主細胞、またはポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含有する組成物）を特徴とする。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８）、線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ１９）、または線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）に結合し得る。
【００１８】
本発明の第６の態様は、患者（例えば、ヒト）における骨格成長遅滞障害を治療するための、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含有するベクター、ポリヌクレオチドもしくはベクターを含有する宿主細胞、またはポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含有する組成物）であって、配列番号１の２５３位におけるシステイン残基を除去するアミノ酸置換をさらに含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを特徴とする。例えば、２５３位におけるシステイン残基は、セリン残基、または例えば、別の保存的アミノ酸置換、例えば、アラニン、グリシン、プロリン、もしくはトレオニンにより置換されている。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、単離ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドであり得る。さらに、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８）、線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ１９）、または線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）に結合し得る。
【００１９】
本発明の第７の態様は、患者（例えば、ヒト）における骨格成長遅滞障害を治療するための、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含有するベクター、ポリヌクレオチドもしくはベクターを含有する宿主細胞、またはポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含有する組成物）であって、配列番号３のアミノ酸配列の全てまたは断片（例えば、配列番号３の少なくとも１０、２０、３０、４０、４５個以上の連続アミノ酸）と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むドメインをさらに含み、ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基２８８および２８９間に挿入されているｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを特徴とする。例えば、ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る（例えば、ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなる）。場合により、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号１の２５３位および／または配列番号３の２８位におけるセリン残基または例えば、別の保存的アミノ酸置換、例えば、アラニン、グリシン、プロリン、もしくはトレオニンによるシステイン残基のアミノ酸置換を含む。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、単離ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドであり得る。さらに、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８）、線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ１９）、または線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）に結合し得る。
【００２０】
第５、第６、または第７の態様の使用はまた、本発明の第１、第２、または第３の態様のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組成物の投与を特徴とする。本発明の第６の態様のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号２０または３６の核酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ得る（例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号２０または３６の核酸を含む、またはそれからなる）。本発明の第５または第７の態様のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号２１または３７の核酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ得る（例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号２１または３７の核酸を含む、またはそれからなる）。
【００２１】
本発明の第５、第６、または第７の態様の骨格成長遅滞障害は、任意のＦＧＦＲ３関連骨格疾患、例えば、軟骨無形成症、ＴＤＩ、ＴＤＩＩ、発育遅延および黒色表皮症を伴う重度の軟骨無形成症（ＳＡＤＤＥＮ）、軟骨低形成症、頭蓋骨縫合早期癒合症候群（例えば、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、クルーゾン症候群、およびクルーゾン皮膚骨格症候群）、またはＣＡＴＳＨＬであり得る。特に、骨格成長遅滞障害は、軟骨無形成症である。ＦＧＦＲ３関連骨格疾患は、構成的に活性なＦＧＦＲ３の患者における発現により引き起こされ得、例えば、構成的に活性なＦＧＦＲ３は、配列番号５の３８０位におけるアルギニン残基によるグリシン残基のアミノ酸置換を含む。
【００２２】
本発明の第５、第６、または第７の態様の患者（例えば、ヒト）は、骨格成長遅滞障害と診断されている者（例えば、治療前）であり得る。患者は、四肢短縮、短い胴体、Ｏ脚、動揺性歩行、頭蓋異形、クローバー葉頭蓋、頭蓋骨縫合早期癒合症、ウォルム骨、手の奇形、足の奇形、ヒッチハイカーの親指、および胸部奇形からなる群より選択される骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）の１つ以上の症状を呈し得る。本方法の結果として、患者は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの投与後に骨格成長遅滞障害の１つ以上の症状の改善を呈し得る。さらに、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの投与は、患者の生存率を増加させ、および／または患者の大後頭孔の形状を回復させ得る。患者は、幼児、小児、若年者、または成人であり得る。さらに、患者は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含有するベクター、ポリヌクレオチドもしくはベクターを含有する宿主細胞、またはポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含有する組成物）を予め投与されていない者であり得る。
【００２３】
本発明の第５、第６、または第７の態様のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターは、患者（例えば、ヒト）に約０．００２ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量において投与することができる。本発明の第４または第５の態様の宿主細胞を含む組成物は、患者（例えば、ヒト）に約１×１０３個の細胞／ｍＬ〜約１×１０１２個の細胞／ｍＬの用量において投与することができる。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞は、患者に１日１回以上、週１回以上、月１回以上、または年１回以上投与される（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、患者に週７回、週６回、週５回、週４回、週３回、週２回、２週間に１回、または月１回投与される）。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、患者に約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量において週１回または２回投与される。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、患者に薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤を含む組成物中で投与することができる。例えば、組成物は、患者に非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、または腹腔内）、腸内、または局所投与される。特に、組成物は、患者に皮下注射により投与される。
【００２４】
本発明は、（例えば、配列番号３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを製造するため）ＦＧＦＲ３ポリペプチドからシグナルペプチド、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインの一部を欠失させることにより、本発明の第１の態様のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを製造する方法を特徴とする。特に、細胞内ドメインは、配列番号３２のアミノ酸残基４３６〜８０６からなる。本発明はまた、（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを製造するため）配列番号１の２５３位におけるシステイン残基を除去するアミノ酸置換を導入することにより、本発明の第２の態様のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを製造する方法を特徴とする。例えば、２５３位におけるシステイン残基は、セリン残基または例えば、別の保存的アミノ酸置換、例えば、アラニン、グリシン、プロリン、もしくはトレオニンにより置換される。
【００２５】
本発明はまた、本発明の第１、第２、もしくは第３の態様のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、配列番号２、４、または３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、本発明の第１、第２、もしくは第３の態様のポリヌクレオチド（例えば、配列番号２０、２１、３６、または３７の核酸配列を有するポリヌクレオチド）、本発明の第１、第２、もしくは第３の態様のベクター（例えば、プラスミド、人工染色体、ウイルスベクター、またはファージベクター）、または本発明の第１、第２、もしくは第３の態様の宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞）を含むキットであって、場合により、キットの使用説明書を含むキットを特徴とする。
【００２６】
定義
本明細書において使用される「ａ」および「ａｎ」は、特に示されない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。さらに、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に文脈が明確に示さない限り、複数の参照対象を含む。
【００２７】
本明細書において使用される「約」は、引用値の±１０％である量を指し、好ましくは、引用値の±５％、より好ましくは、引用値の±２％である。例えば、用語「約」は、本明細書に引用される全ての投与量または範囲を、引用値または範囲終点の±１０％だけ改変するために使用することができる。
【００２８】
用語「ドメイン」は、ポリペプチド内の同定可能な構造および／または機能を有するポリペプチド（例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド）のアミノ酸配列の保存領域を指す。ドメインは、例えば、約２０個のアミノ酸〜約６００個のアミノ酸で長さが変動し得る。例示的なドメインとしては、ＦＧＦＲ３の免疫グロブリンドメイン（例えば、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン１、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン２、およびＩｇ様Ｃ２型ドメイン３）が挙げられる。
【００２９】
用語「投与量」は、活性剤が患者（例えば、骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症を有する患者）に投与された場合に所望の治療効果（例えば、骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症の治療）をもたらすために計算される活性剤（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはそのバリアント、例えば、配列番号２、４、または３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の所定量を指す。投与量は、活性剤の規定量または特定の投与頻度と結び付く規定量に関して定義することができる。剤形は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその断片を任意の好適な医薬賦形剤、担体、または希釈剤との会合で含む。
【００３０】
用語「有効量」、「に有効な量」および「治療有効量」は、所望の結果、例えば、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）の治療をもたらすために十分なｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ｓＦＧＲ３をコードするベクター、および／またはｓＦＧＦＲ３組成物の量を指す。
【００３１】
用語「細胞外ドメイン」および「ＥＣＤ」は、膜貫通ドメインを越えて細胞外空間中に伸びるＦＧＦＲ３ポリペプチドの一部を指す。ＥＣＤは、１つ以上の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）へのＦＧＦＲ３の結合を媒介する。例えば、ＥＣＤは、ＦＧＦＲ３ポリペプチドのＩｇ様Ｃ２型ドメイン１〜３を含む。特に、ＥＣＤは、野生型（ｗｔ）ＦＧＦＲ３ポリペプチドのＩｇ様Ｃ２型ドメイン１（例えば、配列番号５（シグナル配列を有さない成熟ＦＧＦＲ３タンパク質）のアミノ酸配列を有するｗｔＦＧＦＲ３ポリペプチドのアミノ酸３６〜８８または配列番号３２（シグナル配列を有する前駆体ＦＧＦＲ３タンパク質）のアミノ酸配列を有するｗｔＦＧＦＲ３ポリペプチドのアミノ酸５７〜１１０）、野生型（ｗｔ）ＦＧＦＲ３ポリペプチドのＩｇ様Ｃ２型ドメイン２（例えば、配列番号５のアミノ酸配列を有するｗｔＦＧＦＲ３ポリペプチドのアミノ酸１３９〜２３４または配列番号３２のアミノ酸配列を有するｗｔＦＧＦＲ３ポリペプチドのアミノ酸１６１〜２４５）、およびｗｔＦＧＦＲ３ポリペプチドのＩｇ様Ｃ２型ドメイン３（例えば、配列番号５のアミノ酸配列を有するｗｔＦＧＦＲ３ポリペプチドのアミノ酸２４７〜３３５または配列番号３２のアミノ酸配列を有するｗｔＦＧＦＲ３ポリペプチドのアミノ酸２６８〜３１０）を含む。ＦＧＦＲ３のＥＣＤは、野生型ＦＧＦＲ３Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン３の断片、例えば、配列番号１のａａ２４７〜２８８も含み得、それは例えば、配列番号の２５３位におけるセリン残基または別の保存的アミノ酸置換（例えば、アラニン、グリシン、プロリン、またはトレオニン）によるシステイン残基のアミノ酸置換をさらに含み得る（例えば、配列番号２のａａ２４７〜２８８）。さらに、ＥＣＤは、例えば、配列番号４のａａ２４７〜３３５のＩｇ様Ｃ２型ドメイン３を含み得る。したがって、ＦＧＦＲ３ポリペプチドの例示的なＥＣＤとしては、例えば、配列番号１および２のａａ１〜２８８または配列番号４および３３のａａ１〜３３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。特に、ＦＧＦＲ３ポリペプチドのＥＣＤは、配列番号３３のａａ１〜３３５を含む。
【００３２】
本明細書において使用される用語「ＦＧＦＲ３関連骨格疾患」は、例えば、ＦＧＦＲ３の機能獲得突然変異体の発現によるＦＧＦＲ３の活性化の異常増加により引き起こされる骨格疾患を指す。語句「ＦＧＦＲ３の機能獲得突然変異体」は、ＦＧＦリガンドの存在下で例えば、対応する野生型ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の生物学的活性よりも高い、下流シグナリングをトリガーする生物学的活性を示すＦＧＦＲ３の突然変異体を指す。ＦＧＦＲ３関連骨格疾患としては、遺伝性または散発性疾患を挙げることができる。例示的なＦＧＦＲ３関連骨格疾患としては、限定されるものではないが、軟骨無形成症、タナトフォリック骨異形成症Ｉ型（ＴＤＩ）、タナトフォリック骨異形成症ＩＩ型（ＴＤＩＩ）、発育遅延および黒色表皮症を伴う重度の軟骨無形成症（ＳＡＤＤＡＮ）、軟骨低形成症、および頭蓋骨縫合早期癒合症候群（例えば、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、クルーゾン症候群、およびクルーゾン皮膚骨格症候群）、ならびに屈指・高身長・難聴症候群（ＣＡＴＳＨＬ）が挙げられる。
【００３３】
用語「線維芽細胞成長因子」および「ＦＧＦ」は、種々の代謝プロセス、例として、内分泌シグナリング経路、発育、創傷治癒、および血管新生に関与する構造的に関連するシグナリング分子が挙げられるＦＧＦファミリーのメンバーを指す。ＦＧＦは、広範な細胞および組織タイプの増殖および分化における重要な役割を担う。この用語は、好ましくは、ＦＧＦＲ３に結合することが示されているＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、およびＦＧＦ２１を指す。例えば、ＦＧＦとしては、ヒトＦＧＦ１（例えば、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ヒトＦＧＦ２（例えば、配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ヒトＦＧＦ９（例えば、配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ヒトＦＧＦ１８（例えば、配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ヒトＦＧＦ１９（例えば、配列番号３８のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、およびヒトＦＧＦ２１（例えば、配列番号３９のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を挙げることができる。
【００３４】
本明細書において使用される用語「線維芽細胞成長因子受容体３」、「ＦＧＦＲ３」または「ＦＧＦＲ３受容体」は、１つ以上のＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、および／またはＦＧＦ２１）に特異的に結合するポリペプチドを指す。ヒトＦＧＦＲ３遺伝子は、第４染色体の遠位短腕上に局在し、１９個のエキソンを含有し、シグナルペプチドを含む８０６アミノ酸タンパク質前駆体（線維芽細胞成長因子受容体３アイソフォーム１前駆体）（例えば、配列番号６または３５のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする。骨格成長障害（例えば、軟骨無形成症）をもたらすＦＧＦＲ３アミノ酸配列中の突然変異としては、例えば、アルギニン残基による３８０位におけるグリシン残基の置換（すなわち、Ｇ３８０Ｒ）が挙げられる。天然発生ヒトＦＧＦＲ３遺伝子はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１４２．４に示されるヌクレオチド配列を有し、天然発生ヒトＦＧＦＲ３タンパク質はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００１３３に示されるアミノ酸配列を有し、本明細書において配列番号５により表される。野生型ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド）は、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン１〜３を含む細胞外免疫グロブリン様膜ドメイン（アミノ酸残基１〜３３５）、膜貫通ドメイン（アミノ酸残基３４５〜３７７）、および細胞内ドメイン（アミノ酸残基３７８〜７８４）からなる。ＦＧＦＲ３としては、全長野生型ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の断片および／またはバリアント（例えば、スプライスバリアント、例えば、エキソン９ではなく代替エキソン８を利用するスプライスバリアント）を挙げることができる。
【００３５】
用語「断片」および「一部」は、全体の一部分、例えば、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上を含有するポリペプチドまたは核酸分子を指す。断片または一部は、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、５００、６００、７００個以上のアミノ酸残基、最大で参照ポリペプチド（例えば、配列番号５または３２のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の全長を含有し得る。例えば、ＦＧＦＲ３断片は、配列番号１または２の少なくとも２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３５、２３０、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７５、２８０、２８５、２９０、または３００個の連続アミノ酸を有する任意のポリペプチドを含み得る。さらに、ＦＧＦＲ３断片は、配列番号４または３３の少なくとも２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３５、２３０、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７５、２８０、２８５、２９０、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４５、または３４５個の連続アミノ酸を有する任意のポリペプチドを含み得る。
【００３６】
本明細書において使用される用語「宿主細胞」は、対応するポリヌクレオチドからｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを発現させるために必要とされる必須細胞構成成分、例えば、細胞小器官を含む輸送体を指す。ポリヌクレオチドの核酸配列は、典型的には、当分野における公知の慣用技術（例えば、形質転換、形質移入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、および直接マイクロインジェクション）により宿主細胞中に導入することができる核酸ベクター（例えば、プラスミド、人工染色体、ウイルスベクター、またはファージベクター）中に含まれる。宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌もしくは古細菌細胞、または真核細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒト胚性腎２９３（ＨＥＫ２９３））であり得る。好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である。
【００３７】
「単離」は、その天然環境から分離され、回収され、または精製されたものを意味する。例えば、単離ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはそのバリアント、例えば、配列番号２または４のアミノ酸配列を有するポリペプチド）は、例えば、細胞培養培地からｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを単離した後のある程度の純度により特徴付けることができる。単離ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドが調製物中に存在する総材料（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、細胞残屑、および環境汚染物）の少なくとも７５重量％（例えば、調製物中に存在する総材料の少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９６重量％、少なくとも９７重量％、少なくとも９９重量％または少なくとも９９．５重量％）を構成するように少なくとも７５％純粋であり得る。同様に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド（例えば、配列番号２０、２１、３６、または３７の核酸配列を有するポリヌクレオチド）、または単離宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、またはＣＯＳ−７細胞）は、ポリヌクレオチドまたは宿主細胞が調製物中に存在する総材料（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、細胞残屑、および環境汚染物）の少なくとも７５重量％（例えば、調製物中に存在する総材料の少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９６重量％、少なくとも９７重量％、少なくとも９９重量％または少なくとも９９．５重量％）を構成するように少なくとも７５％純粋であり得る。
【００３８】
「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、それとしてはＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリマーの集合前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分により中断されていてよい。ポリヌクレオチドは、例えば、標識とのコンジュゲーションにより合成後にさらに改変することができる。
【００３９】
用語「患者」および「対象」は、哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒト（例えば、骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症を有するヒト）または非ヒト哺乳動物（例えば、骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症を有する非ヒト哺乳動物）、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコを指す。好ましくは、患者は、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を有するヒト、特に、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を有する幼児、小児、または若年者である。
【００４０】
本明細書において使用される用語「非経口投与」、「非経口投与する」および他の文法的に同等の語句は、通常、注射による腸内および局所投与以外の、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはそのバリアント、例えば、配列番号２、４、もしくは３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、例えば、配列番号１８もしくは３４のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を含む組成物の投与方式を指し、それとしては、限定されるものではないが、皮下、皮内、静脈内、鼻腔内、眼内、経肺、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、肺内、腹腔内、経気管、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、脳内、頭蓋内、頸動脈内、および胸骨内注射および注入が挙げられる。
【００４１】
「薬学的に許容可能な賦形剤、担体、またはアジュバント」は、それぞれ、対象（例えば、ヒト）に対して生理学的に許容可能である一方、それとともに投与される医薬組成物（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはそのバリアント、例えば、配列番号２、４、もしくは３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、例えば、配列番号１８もしくは３４のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の治療特性を保持する希釈剤、賦形剤、担体、またはアジュバントを意味する。１つの例示的な薬学的に許容可能な担体は、生理食塩水である。他の生理学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、担体、またはアジュバントおよびそれらの配合物は、当業者に公知である。
【００４２】
「医薬組成物」は、活性剤、例えば、ｓＦＧＦＲ３（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはそのバリアント、例えば、配列番号２、４、もしくは３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、例えば、配列番号１８もしくは３４のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤との配合で含有する組成物を意味する。医薬組成物は、患者（例えば、骨格成長遅滞障害を有する患者、例えば、軟骨無形成症を有する患者）における疾患またはイベント（例えば、骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症）の治療のための治療レジメンの一部として政府規制機関の承認を受けて製造し、または販売することができる。医薬組成物は、例えば、非経口投与のために、例えば、皮下投与（例えば、皮下注射による）もしくは静脈内投与（例えば、粒子状塞栓物質を有さない、静脈内使用に好適な溶媒系中の無菌液剤として）のために、または経口投与（例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、ゲルキャップ剤、またはシロップ剤として）のために配合することができる。
【００４３】
本明細書において使用される用語「配列同一性」は、配列をアラインし、必要によりギャップを導入して最大同一性パーセントを達成した後の、参照配列、例えば、野生型ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、配列番号５または３２のアミノ酸配列を有するポリペプチド）またはｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはそのバリアント、例えば、配列番号２、４、もしくは３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、例えば、配列番号１８もしくは３４のアミノ酸配列を有するポリペプチド）のアミノ酸（または核酸）残基と同一である候補配列、例えば、ＦＧＦＲ３ポリペプチドのアミノ酸（または核酸）残基の割合を指す（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのために候補および参照配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列は、比較目的のために無視することができる）。同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技能の範囲内の種々の手法で、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、アラインメントの計測に適切なパラメータ、例として、比較される配列の全長にわたり最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを決定することができる。例えば、所与の参照配列との、それについての、またはそれに対する所与の候補配列のアミノ酸（または核酸）配列同一性パーセント（所与の参照配列との、それについての、またはそれに対するあるアミノ酸（または核酸）配列同一性パーセントを有し、または含む所与の候補配列と代替的に表現することができる）は、以下のとおり計算される：
１００×（Ａ／Ｂの率）
（式中、Ａは、候補配列および参照配列のアラインメントにおいて同一とスコアリングされるアミノ酸（または核酸）残基の数であり、Ｂは、参照配列中のアミノ酸（または核酸）残基の総数である）。特に、候補配列との比較のためにアラインされる参照配列は、候補配列が例えば、候補配列の全長または候補配列の連続アミノ酸（または核酸）残基の選択部分にわたり５０％〜１００％の同一性を示すことを示し得る。比較目的のためにアラインされる候補配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％である。候補配列中の位置が、参照配列中の対応位置と同一のアミノ酸（または核酸）残基により占有される場合、その分子はその位置において同一である。
【００４４】
「シグナルペプチド」は、ポリペプチドを分泌経路（例えば、細胞外空間）に指向するポリペプチドのＮ末端における短鎖ペプチド（例えば、５〜３０アミノ酸長、例えば、２２アミノ酸長）を意味する。シグナルペプチドは、典型的には、ポリペプチドの分泌の間に開裂される。シグナル配列は、ポリペプチドを細胞内コンパートメントまたは細胞小器官、例えば、ゴルジ装置に指向し得る。シグナル配列は、ポリペプチドを細胞の特定の領域に標的化する公知の機能を有するペプチドとの相同性、または生物学的活性により同定することができる。当業者は、容易に利用可能なソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用することによりシグナルペプチドを同定することができる。シグナルペプチドは、例えば、配列番号６または３５のアミノ酸配列と実質的に同一のものであり得る。
【００４５】
本明細書において使用される用語「骨格成長遅滞障害」は、骨の変形および／または異形により特徴付けられる骨格疾患を指す。これらの障害としては、限定されるものではないが、成長板（骨端軟骨）骨折により引き起こされる骨格成長遅滞障害、特発性骨格成長遅滞障害、またはＦＧＦＲ３関連骨格疾患が挙げられる。特に、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を有する患者は、健常患者の骨よりも短い骨を有し得る。例えば、骨格成長遅滞障害としては、骨異形成症、例えば、軟骨無形成症、ホモ接合性軟骨無形成症、ヘテロ接合性軟骨無形成症、軟骨無発生症、先端骨形成不全症、遠位中間肢異形成症、骨発生不全症、屈曲肢異形成症、点状軟骨異形成症、肢根型点状軟骨異形成症、鎖骨頭蓋骨異形成症、先天性大腿骨短縮症、頭蓋骨縫合早期癒合症（例えば、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、クルーゾン症候群、アペール症候群、Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｗｅｉｓｓ症候群、ファイファー症候群、またはクルーゾン皮膚骨格症候群）、指奇形（ｄａｃｔｙｌｙ）、短指症、屈指症、多指症、合指症、捻曲性骨異形成症、小人症、分節異常骨異形成症、内軟骨腫症、線維性軟骨発生症、線維性骨異形成症、遺伝性多発性外骨腫症、軟骨低形成症、低ホスファターゼ症、低リン血症性くる病、Ｊａｆｆｅ−Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ症候群、クニースト骨異形成症、クニースト症候群、ランガー型中間肢異形成症、マルファン症候群、マッキューン・オルブライト症候群、小肢症、骨幹端異形成症、Ｊａｎｓｅｎ型骨幹端異形成症、変容性異形成症、モルキオ症候群、ニーベルゲルト型中間肢異形成症、神経線維腫症、変形性関節症、骨軟骨異形成症、骨形成不全症、骨形成不全症周産期致死型、大理石骨病、骨斑紋症、末梢骨形成不全症、Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ症候群、Ｒｏｂｅｒｔｓ症候群、ロビノウ症候群、短肋骨多指症候群、低身長、先天性脊椎・骨端骨異形成症、および脊椎・骨端・骨幹端異形成症を挙げることができる。
【００４６】
用語「可溶性線維芽細胞成長因子受容体３」、「可溶性ＦＧＦＲ３」、および「ｓＦＧＦＲ３」は、膜貫通ドメインおよびＦＧＦＲ３ポリペプチドを細胞膜に固定する任意のポリペプチド部分（例えば、チロシンキナーゼドメイン）の全てまたは要部の不存在または機能破壊により特徴付けられるＦＧＦＲ３を指す。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ＦＧＦＲ３ポリペプチドの非膜結合形態である。特に、ＦＧＦＲ３の膜貫通ドメインは、野生型ＦＧＦＲ３配列（例えば、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド）のアミノ酸残基３４５から３７７またはシグナルペプチドを含む野生型ＦＧＦＲ３配列（例えば、配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチド）のアミノ酸残基３６７から３９９に伸びる。したがって、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、野生型ＦＧＦＲ３ポリペプチド配列（例えば、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド）のアミノ酸残基３４５〜３７７またはシグナルペプチドを含む野生型ＦＧＦＲ３配列（例えば、配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチド）のアミノ酸残基３６７〜３９９の一部または全てを欠失し得る。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、野生型ＦＧＦＲ３ポリペプチド配列の細胞質ドメイン（配列番号５のアミノ酸残基３７８〜７８４）またはシグナルペプチド配列を含む野生型ＦＧＦＲ３ポリペプチド配列の細胞質ドメイン（配列番号３２のアミノ酸残基３７８〜８０６）をさらに欠失し得る。
【００４７】
例示的なｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号１または２の少なくともアミノ酸１〜１００、１〜１２５、１〜１５０、１〜１７５、１〜２００、１〜２０５、１〜２１０、１〜２１５、１〜２２０、１〜２２５、１〜２３０、１〜２３５、１〜２４０、１〜２４５、１〜２５０、１〜２５２、１〜２５５、１〜２６０、１〜２６５、１〜２７０、１〜２７５、１〜２８０、１〜２８５、１〜２９０、１〜２９５、または１〜３００、または１〜３０１を含み得る。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとしては、配列番号１または２のそれらのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのいずれかと少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有する任意のポリペプチドを挙げることができる。さらに、例示的なｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、限定されるものではないが、配列番号４または３３の少なくともアミノ酸１〜１００、１〜１２５、１〜１５０、１〜１７５、１〜２００、１〜２０５、１〜２１０、１〜２１５、１〜２２０、１〜２２５、１〜２３０、１〜２３５、１〜２４０、１〜２４５、１〜２５０、１〜２５５、１〜２６０、１〜２６５、１〜２７０、１〜２７５、１〜２８０、１〜２８５、１〜２９０、１〜２９５、１〜３００、１〜３０５、１〜３１０、１〜３１５、１〜３２０、１〜３２５、１〜３３０、１〜３３５、１〜３４０、１〜３４５、または１〜３４８を含み得る。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとしては、配列番号４または３３のアミノ酸配列を有するそれらのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのいずれかと少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有する任意のポリペプチドを挙げることができる。上記ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはそのバリアントのいずれも、場合により、Ｎ末端位置におけるシグナルペプチド、例えば、配列番号６のアミノ酸１〜２２（ＭＧＡＰＡＣＡＬＡＬＣＶＡＶＡＩＶＡＧＡＳＳ）または配列番号３５のアミノ酸１〜１９（例えば、ＭＭＳＦＶＳＬＬＬＶＧＩＬＦＨＡＴＱＡ）を含み得る。
【００４８】
「治療すること」および「治療」は、患者（例えば、ヒト、例えば、幼児、小児、または若年者）における骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）の進行もしくは重症度の、または骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）の１つ以上の症状の進行、重症度、もしくは頻度の低減（例えば、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％またはさらには１００％だけ）を意味する。治療は、骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症を有する患者（例えば、ヒト、例えば、幼児、小児、または若年者）を治療するためにｓＦＧＦＲ３ポリペプチドが一定期間（例えば、数日間、数ヵ月間、数年間以上）投与される治療期間生じ得る。ｓＦＧＦＲ３（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはそのバリアント、例えば、配列番号２、４、もしくは３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、例えば、配列番号１８もしくは３４のアミノ酸配列を有するポリペプチド）により治療することができる軟骨無形成症の例示的な症状としては、限定されるものではないが、低身長、長い胴体、短縮四肢、約４２〜約５６インチの成人身長、相対的に大きな頭部、隆起した額、未発育の顔面部分、Ｘ脚（例えば、「外反膝」）、動揺性歩行、短く太い指、短く太い足指、肘における腕部を伸ばす能力の制限、腰部の過剰な屈曲、歯科疾病（例えば、歯の密集からのもの）、肥満疾病、神経疾病、呼吸器疾病、ならびに／または腰部および／もしくは脊椎における疼痛および無感覚が挙げられる。
【００４９】
ポリペプチドに関する用語「バリアント」は、バリアントが由来するポリペプチド（例えば、親ポリペプチド、例えば、配列番号１または７のアミノ酸配列を有するポリペプチド）とアミノ酸配列中の１つ以上の変化だけ異なるポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはそのバリアント、例えば、配列番号２、４、もしくは３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、例えば、配列番号１８もしくは３４のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を指す。ポリヌクレオチドに関する用語「バリアント」は、バリアントが由来するポリヌクレオチド（例えば、親ポリヌクレオチド）と核酸配列中の１つ以上の変化だけ異なるポリヌクレオチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号２０、２１、３６、または３７の核酸配列を有するポリヌクレオチド）を指す。バリアントのアミノ酸または核酸配列中の変化は、例えば、アミノ酸または核酸置換、挿入、欠失、Ｎ末端トランケーション、もしくはＣ末端トランケーション、またはそれらの任意の組合せであり得る。特に、アミノ酸置換は、保存的および／または非保存的置換であり得る。バリアントは、それぞれ親ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはそのバリアント、例えば、配列番号２、４、もしくは３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、例えば、配列番号１８もしくは３４のアミノ酸配列を有するポリペプチド）または親ポリヌクレオチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号２０、２１、３６、または３７の核酸配列を有するポリヌクレオチド）とのアミノ酸配列同一性または核酸配列同一性により特徴付けることができる。例えば、バリアントとしては、配列番号１、２、４、または３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有する任意のポリペプチドを挙げることができる。バリアントとしては、配列番号２０、２１、３６、または３７の核酸配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有する任意のポリヌクレオチドを挙げることもできる。
【００５０】
「ベクター」は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはそのバリアント、例えば、配列番号２、４、もしくは３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、例えば、配列番号１８もしくは３４のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、またはその断片を含むＤＮＡ構築物を意味する。ベクターは、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドへのベクターのポリヌクレオチドの翻訳をもたらす細胞（例えば、宿主細胞またはヒト骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症を有する患者の細胞）に感染させるために使用することができる。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、それは、追加のＤＮＡセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。あるベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製し得る（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターは、それらが作動可能に結合している遺伝子の発現を指向し得る。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
【００５１】
用語「単位剤形」は、それぞれの単位が所望の治療効果をもたらすために計算された所定量の活性材料を、任意の好適な医薬賦形剤、担体、または希釈剤との会合で含有するヒト対象および他の哺乳動物についての単位投与量として好適な物理的に区別される単位を指す。
【００５２】
終点による数値範囲の本明細書における引用は、その範囲内に含まれる全ての数字を含むものとする（例えば、１〜５の引用は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、および５を含む）。
【００５３】
本発明の他の特徴部および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１Ａ−Ｄ】ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのセンサーグラムを示すグラフである。センサーグラムを、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号７）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（配列番号１）、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号１０；図１Ａ）；ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号７）およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１−Ｄ３（配列番号９；図１Ｂ）；ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号１０）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２−Ｃ２５３Ｓ（配列番号１１）、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２−Ｄ３（配列番号１２；図１Ｃ）；ならびにｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（配列番号１）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３；図１Ｄ）について示す。
【図２Ａ−Ｃ】ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのウエスタンブロットの画像である。還元（Ｒ）および非還元（ＮＲ）条件下のウエスタンブロットを、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１−Ｃ２５３Ｓ（配列番号８）、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１−Ｄ３（図２Ａ）；ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２−Ｃ２５３Ｓ、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２−Ｄ３（図２Ｂ）；ならびにｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（図２Ｃ）について示す。
【図３Ａ−Ｂ】ＦＧＦ２の存在下でＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋軟骨細胞を使用したｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３のセンサーグラム（図３Ａ）および増殖アッセイ（図３Ｂ）を示すグラフである。
【図４】１ｎｇ／ｍＬのｈＦＧＦ２を用いてまたは用いずに０ｎＭ、７０ｎＭ、および２８０ｎＭにおけるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３とインキュベートしたＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒを発現する血清応答エレメント−ルシフェラーゼ（ＳＲＥ−Ｌｕｃ）ＨＥＫ細胞におけるルシフェラーゼシグナリングを示すグラフである（＊は、０ｎＭにおけるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３と比較したｐ値＜０．０５を示し；＊＊＊は、ｐ値＜０．００１を示す）。
【図５】日齢（日数）に対する低用量（０．２５ｍｇ／ｋｇ）のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３による処理３日後の生存動物（野生型（ｗｔ）およびＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス）の割合を示すグラフである。ビヒクル（ＰＢＳ）を受容した生存ｗｔマウスの割合も示す。
【図６】野生型ＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号５または３２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）のバリアントのＩｇ様Ｃ２型ドメイン１（ＩｇＩ）、２（ＩｇＩＩ）、および３（ＩｇＩＩＩ）に対応するアミノ酸残基を示す画像である。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓは、配列番号１の２５３位におけるセリン残基によるシステイン残基のアミノ酸置換を含む。
【図７Ａ−Ｂ】ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのウエスタンブロットの画像である。還元（Ｒ）および非還元（ＮＲ）条件下のウエスタンブロットを、２．３ｍｇ／ｍｌおよび２３ｍｇ／ｍｌのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１−Ｄ３（図７Ａ）ならびに１．５ｍｇ／ｍｌおよび１５ｍｇ／ｍｌのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１−Ｃ２５３Ｓ（図７Ｂ）について示す。
【図８Ａ−Ｂ】２０ｍＭのリン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液および４０ｍＭのクエン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５緩衝液中のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの融解温度（Ｔｍ）（図８Ａ）ならびに２０ｍＭのリン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液および２０ｍＭのクエン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５緩衝液中のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３のＴｍ（図８Ｂ）を示すグラフである。
【図９Ａ−Ｃ】ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）溶出プロファイルを示すグラフである。ＦＰＬＣ溶出プロファイルを、図９Ａ：０分、２時間、および２４時間におけるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３、ｃｐｍ／分画（図９Ａ）；図９Ｂ：１分、１５分、３０分、２時間、および２４時間における静脈内ボーラスにより投与されたｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３、ｃｐｍ／分画および最大ピークに正規化したもの（図９Ｂ（続き）に示す）；図９Ｃ：３０分、２時間、４時間、および２４時間における皮下注射により投与されたｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３、ｃｐｍ／分画および最大ピークに正規化したもの（図９Ｃ（続き）に示す）について示す。
【図１０Ａ−Ｂ】ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの存在下でのＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋の軟骨細胞の増殖の割合（％）を示すグラフである。Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋軟骨細胞増殖を、１ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、および５０ｕｇ／ｍｌのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（図１０Ａ）ならびに１ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、および５０ｕｇ／ｍｌのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（図１０Ｂ）について示す。
【図１１】皮下投与された２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３および静脈内投与された２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３のＰＫプロファイルを示すグラフである。
【図１２】静脈内投与の３０分、１２０分、および１４４０分後における腎臓、肝臓、脾臓、肺、および心臓組織中の１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の濃度を示すグラフである。濃度を１グラム当たりの注射用量のパーセント（％ＩＤ／ｇ）として表現する。
【図１３】皮下投与の３０分、１２０分、２４０分、４８０分、および１４４０分後における腎臓、肝臓、脾臓、肺、および心臓組織中の１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の濃度を示すグラフである。濃度を％ＩＤ／ｇとして表現する。
【図１４Ａ−Ｂ】脳組織中の１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の濃度（ｃ）および分布容量（Ｖｄ）を示すグラフである。静脈内ボーラスの３０分、２時間、および２４時間後における血管含有率および分解についての補正前後の１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３のｃ（図１４Ａ）ならびに静脈内ボーラスの３０分、２時間、および２４時間後における１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびＲＳＡのＶｄ（図１４Ｂ）を示す。
【図１５】ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を投与された生存Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの割合を示すグラフである。２２日間にわたり、ビヒクルとしてのＰＢＳを投与された生存野生型マウス、生存Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週１回投与された生存Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与された生存Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス、および１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与された生存Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスを示す。
【図１６】ビヒクルとしてのＰＢＳ、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週１回、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回、および１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおけるロコモーターおよび腹式呼吸合併症の割合（％）を示すグラフである。
【図１７Ａ−Ｄ】ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの体長を示すグラフおよびｘ線写真である。ビヒクルとしてのＰＢＳを投与された野生型マウス、ならびにビヒクルとしてのＰＢＳ、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週１回、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回、および１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの軸長（図１７Ａ）、尾長（図１７Ｂ）、および脛骨長（図１７Ｃ）を示す。ビヒクルとしてのＰＢＳを投与された野生型マウスならびにビヒクルとしてのＰＢＳ、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回、および１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスのｘ線写真（図１７Ｄ）も示す。全ての計測値はミリメートル（ｍｍ）におけるものである。
【図１８Ａ−Ｂ】それぞれ、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの頭蓋比を示すグラフおよび頭蓋を示すｘ線写真である。グラフ（図１８Ａ）において、ビヒクルとしてのＰＢＳを投与された野生型マウスならびにビヒクルとしてのＰＢＳ、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週１回、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回、および１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの頭蓋比（Ｌ／Ｗ）を示す。ｘ線写真（図１８Ｂ）において、ビヒクルとしてのＰＢＳを投与された野生型マウス、ビヒクルとしてのＰＢＳを投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス、１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与された野生型マウス、および１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの頭蓋を示す。
【図１９Ａ−Ｅ】固定化ＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３への異なる濃度のｈＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ｈＦＧＦ９、ｈＦＧＦ１８、ｈＦＧＦ１９、およびｈＦＧＦ２１の結合についてのリアルタイムでのカイネティックプロファイルを示すグラフである。固定化ＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３への０．５ｎＭ〜１２ｎＭの濃度におけるｈＦＧＦ１（図１９Ａ）；固定化ＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３への２ｎＭ〜１０ｎＭの濃度におけるｈＦＧＦ２（図１９Ｂ）；固定化ＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３への１ｎＭ〜５ｎＭの濃度におけるｈＦＧＦ９（図１９Ｃ）；固定化ＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３への１ｎＭ〜１０ｎＭの濃度におけるｈＦＧＦ１８（図１９Ｄ）；固定化ＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３への２ｎＭ〜２０ｎＭの濃度におけるｈＦＧＦ１９（図１９Ｅ）；および固定化ＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３への１００ｎＭ〜１００００ｎＭの濃度におけるｈＦＧＦ２１（図１９Ｆ）の結合についてのカイネティックプロファイルを示す。暗色重複線は、Ｋｄ値を生成するために使用された２：１結合モデルを表す。
【図２０】非誘導野生型ＡＴＤＣ５およびＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒを発現するレトロウイルス感染ＡＴＤＣ５細胞のウエスタンブロットの画像である。
【図２１】３回の実験についてのＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３の存在下でのＡＴＤＣ５  ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ細胞の増殖の誘導を示すグラフである。非処理ＡＴＤＣ５  ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ細胞を対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明者らは、可溶性線維芽細胞成長因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドおよびそのバリアントを使用して患者（例えば、ヒト、特に、幼児、小児、または若年者）における骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症を治療することができることを発見した。特に、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、以下の例示的なｓＦＧＦＲ３ポリペプチド：２５３位におけるセリン残基によるシステイン残基のアミノ酸置換を含むｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ；配列番号２）および拡張Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン３を含むｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３；配列番号３３）ならびにそれらのバリアント、例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを提供するため、例えば、配列番号５のアミノ酸２８９〜４００または配列番号３２のアミノ酸３１１〜４２２の欠失を特徴とする。さらに、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドはシグナルペプチドを含み得、例えば、配列番号１８または３４のアミノ酸配列を有するｓＦＧＦＲ３ポリペプチドである。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（配列番号１）の説明については、米国仮特許出願第６２／２７６，２２２号明細書および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／１２５５３号明細書（それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００５６】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびそのバリアントは、配列番号１の２５３位におけるシステイン残基を除去するアミノ酸置換を含み得る（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ；配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド）。特に、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、例えば、セリン残基による配列番号１の２５３位におけるシステイン残基の置換を含み得る。例えば、２５３位におけるシステイン残基は、セリン残基または例えば、別の保存的アミノ酸置換、例えば、アラニン、グリシン、プロリン、もしくはトレオニンにより置換されている。
【００５７】
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸残基２３〜３５７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列も含み得、ポリペプチドは、ＦＧＦＲ３のシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを欠き、（ｉ）５００アミノ酸長未満であり；（ｉｉ）２００個以下の連続アミノ酸のＦＧＦＲ３の細胞内ドメインを含み；および／または（ｉｉｉ）ＦＧＦＲ３のチロシンキナーゼドメインを欠く（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３；配列番号３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド）。本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを投与して患者（例えば、ヒト、特に、幼児、小児、または若年者）における骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を治療する方法も記載される。
【００５８】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、産生方法、治療方法、組成物、およびキットが本明細書に記載される。
【００５９】
可溶性線維芽細胞成長因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチド
本発明は、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）の治療のために配合されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびそのバリアントを特徴とする。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有し得、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号１の２５３位におけるシステイン残基を除去するアミノ酸置換を含む（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ；配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド）。例えば、配列番号１の２５３位におけるシステイン残基は、セリン残基または保存的アミノ酸置換、例えば、アラニン、グリシン、プロリン、もしくはトレオニンにより置換されている。
【００６０】
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびそのバリアントとしては、配列番号２と少なくとも５０％の配列同一性（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％上の配列同一性）を有する配列番号２のアミノ酸配列の断片（例えば、配列番号２の少なくともアミノ酸１〜２００、１〜２０５、１〜２１０、１〜２１５、１〜２２０、１〜２２５、１〜２３５、１〜２３０、１〜２４０、１〜２４５、１〜２５０、１〜２５３、１〜２５５、１〜２６０、１〜２６５、１〜２７５、１〜２８０、１〜２８５、１〜２９０、または１〜３００）を含み得る。さらに、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜３０１を含み得、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号１の２５３位におけるセリン残基によるシステイン残基のアミノ酸置換を含む（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド）。
【００６１】
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびそのバリアントは、配列番号３３と少なくとも５０％の配列同一性（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有する配列番号３３のアミノ酸配列の断片（例えば、配列番号３３の少なくともアミノ酸１〜２００、１〜２１０、１〜２２０、１〜２３０、１〜２４０、１〜２５０、１〜２６０、１〜２７０、１〜２８０、１〜２９０、１〜３００、１〜３１０、１〜３２０、１〜３３０、１〜３４０、１〜３４０、または１〜３４５）も含み得る。さらに、配列番号４もしくは３３の２５３位および／または配列番号４の３１６位におけるシステイン残基は、存在する場合、セリン残基または保存的アミノ酸置換、例えば、アラニン、グリシン、プロリン、もしくはトレオニンにより置換されていてよい。
【００６２】
本明細書に記載の結果を考慮すると、本発明は、特定のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドにもそのバリアントにも限定されない。上記で考察される例示的なｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびそのバリアントに加え、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））と類似の結合親和性を有する１つ以上のＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１（例えば、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ＦＧＦ２（例えば、配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ＦＧＦ９（例えば、配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ＦＧＦ１８（例えば、配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ＦＧＦ１９（例えば、配列番号３８のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、および／またはＦＧＦ２１（例えば、配列番号３９のアミノ酸配列を有するポリペプチド））に結合する任意のポリペプチドを、例えば、骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症を治療する方法において使用することができる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、例えば、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン３のＣ末端半分をコードするエキソン８および９ならびに膜貫通ドメインを含むエキソン１０を欠くＦＧＦＲ３アイソフォーム２の断片（例えば、配列番号５または３２のアミノ酸配列の断片）であり得、それはＦＧＦＲ３転写物バリアント２（アクセッション番号ＮＭ＿０２２９６５）の断片に対応する。
【００６３】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４））は、Ｎ末端位置におけるシグナルペプチドを含み得る。例示的なシグナルペプチドとしては、限定されるものではないが、配列番号６のアミノ酸１〜２２（例えば、ＭＧＡＰＡＣＡＬＡＬＣＶＡＶＡＩＶＡＧＡＳＳ）または配列番号３５のアミノ酸１〜１９（例えば、ＭＭＳＦＶＳＬＬＬＶＧＩＬＦＨＡＴＱＡ）を挙げることができる。したがって、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとしては、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く分泌形態、およびＮ末端シグナルペプチドを含む非分泌形態の両方が挙げられる。例えば、分泌ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号２、４、または３３のアミノ酸配列を含み得る。あるいは、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドはシグナルペプチドを含み、例えば、配列番号１８、１９、または３４のアミノ酸配列である。当業者は、Ｎ末端シグナルペプチドの位置が異なるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドにおいて変動し、例えば、ポリペプチドのＮ末端上の最初の５、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、３０個以上のアミノ酸残基を含み得ることを認識する。当業者は、例えば、適切なコンピュータアルゴリズム、例えば、Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（４）７８３−７９５，２００４）に記載のものおよびｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／においてウェブ上で利用可能なものによりシグナル配列開裂部位の位置を予測することができる。
【００６４】
さらに、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））は、グリコシル化することができる。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドがグリコシル化される程度を増加させ、または減少させるように変更することができる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作出され、または除去されるようにアミノ酸配列を変更することにより達成することができる。例えば、オリゴ糖がアスパラギン残基のアミド窒素に付着されるＮ−結合グリコシル化は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号４または３３）、およびそれらのバリアントのアミノ酸配列のＡｓｎ７６、Ａｓｎ１４８、Ａｓｎ１６９、Ａｓｎ２０３、Ａｓｎ２４０、Ａｓｎ２７２、および／またはＡｓｎ２９４の位置において生じ得る。これらのＡｓｎ残基の１つ以上は、グリコシル化部位を除去するように置換することもできる。例えば、オリゴ糖がアミノ酸残基の酸素原子に付着されるＯ−結合グリコシル化は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、それらのバリアント（配列番号４）、およびシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４）のアミノ酸配列のＳｅｒ１０９、Ｔｈｒ１２６、Ｓｅｒ１９９、Ｓｅｒ２７４、Ｔｈｒ２８１、Ｓｅｒ２９８、Ｓｅｒ２９９、および／またはＴｈｒ３０１の位置において生じ得る。さらに、Ｏ−結合グリコシル化は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）およびそれらのバリアント（配列番号４）のＳｅｒ３１０および／またはＳｅｒ３２１の位置において生じ得る。これらのＳｅｒまたはＴｈｒ残基の１つ以上は、グリコシル化部位を除去するように置換することもできる。
【００６５】
ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））は、異種ポリペプチドからの機能ドメイン（例えば、免疫グロブリンの断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域；例えば、配列番号２５および２６のアミノ酸配列を有するポリペプチド）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；例えば、配列番号２７のアミノ酸配列を有するポリペプチド））に融合させてｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドを提供することができる。場合により、フレキシブルリンカー、例えば、セリンまたはグリシンリッチ配列（例えば、ポリ−グリシンまたはポリ−グリシン／セリンリンカー、例えば、配列番号２８および２９）を、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよび異種ポリペプチド（例えば、Ｆｃ領域またはＨＳＡ）間に含めることができる。
【００６６】
例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））は、例えば、Ｎ末端またはＣ末端ドメインにおける免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドであり得る。特に、有用なＦｃ領域としては、任意の哺乳動物（例えば、ヒト）からの任意の免疫グロブリン分子、例として、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥおよびそれらの種々のサブクラス（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１、ＩｇＡ−２）のＦｃ断片を挙げることができる。例えば、Ｆｃ断片ヒトＩｇＧ−１（配列番号２５）またはヒトＩｇＧ−１のバリアント、例えば、アラニンによる配列番号２５の２９７位におけるアスパラギンの置換を含むバリアント（例えば、配列番号２６のアミノ酸配列を有するポリペプチド）である。本発明のＦｃ断片は、例えば、重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびにヒンジ領域の任意の部分を含み得る。本発明のｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドは、例えば、単量体Ｆｃ、例えば、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインも含み得る。Ｆｃ領域は、場合により、当業者に公知の任意の適切な１つ以上のアミノ酸残基においてグリコシル化することができる。本明細書に記載のＦｃ断片は、本明細書に記載のＦｃ断片のいずれかに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０個以上の付加、欠失、または置換を有し得る。
【００６７】
さらに、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））は、水溶液中のタンパク質の溶解度および安定性を改善する目的のためにＮ末端またはＣ末端ドメインにおいて他の分子にコンジュゲートすることができる。このような分子の例としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＰＥＧ、ＰＳＡ、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が挙げられる。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ヒトＨＳＡ（例えば、配列番号２７のアミノ酸配列を有するポリペプチド）またはその断片にコンジュゲートすることができる。
【００６８】
ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドは、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））と、異種ポリペプチド（例えば、Ｆｃ領域またはＨＳＡ）との間のペプチドリンカー領域を含み得る。リンカー領域は、ｓＦＧＦＲ３が生物学的に活性のままであること、例えば、立体障害を受けないことを可能とする任意の配列および長さのものであり得る。例示的なリンカーの長さは、１〜２００アミノ酸残基、例えば、１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、４６〜５０、５１〜５５、５６〜６０、６１〜６５、６６〜７０、７１〜７５、７６〜８０、８１〜８５、８６〜９０、９１〜９５、９６〜１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１７１〜１８０、１８１〜１９０、または１９１〜２００アミノ酸残基である。例えば、リンカーは、フレキシブル部分、例えば、顕著な固定二次構造も三次構造も有さない領域を含む、またはそれからなる。好ましい範囲は、５〜２５および１０〜２０アミノ酸長である。このようなフレキシビリティは、アミノ酸が小さく、アミノ酸鎖の回転または屈曲を妨害するかさ高い側鎖を有さない場合に一般に増加する。したがって、好ましくは、本発明のペプチドリンカーは、小型アミノ酸、特に、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、ロイシンおよびイソロイシンの増加した含有率を有する。
【００６９】
例示的なフレキシブルリンカーは、例えば、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには１００％のグリシン残基を含有するグリシンリッチリンカーである。リンカーは、例えば、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには１００％のセリン残基を含有するセリンリッチリンカーなども含有し得る。一部の場合、リンカーのアミノ酸配列は、グリシンおよびセリン残基のみからなる。例えば、リンカーは、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号２８）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列であり得る。リンカーは、場合により、任意の適切な１つ以上のアミノ酸残基においてグリコシル化することができる。リンカーは不存在であってもよく、その場合、ＦＧＦＲ３ポリペプチドおよび異種ポリペプチド（例えば、Ｆｃ領域またはＨＳＡ）は介在残基を有さずに一緒に直接融合している。
【００７０】
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明はさらに、患者（例えば、ヒト、例えば、幼児、小児、または若年者）における骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を治療するために使用することができるｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号２０、２１、３６、または３７を含む。例えば、ポリヌクレオチドは、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）をコードする配列番号２０もしくは３６の核酸配列、または配列番号２０もしくは３６の核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するバリアントであり得る。さらに、ポリヌクレオチドは、配列番号２１または３７の核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）をコードする配列番号２１または３７の核酸配列であり得る。本発明はまた、ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（例えば、異種ポリペプチド、例えば、Ｆｃ領域またはＨＳＡに融合しているｓＦＧＦＲ３ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドおよびシグナルペプチドを有さないｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、配列番号２、４、および３３のアミノ酸配列を有するポリペプチド）またはシグナルペプチドを有するｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、配列番号１８、１９、および３４のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む。さらに、本発明は、本明細書に記載のグリコシル化部位のいずれかを変更するための１つ以上の突然変異を含むポリヌクレオチドを含む。
【００７１】
場合により、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリヌクレオチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））は、ポリヌクレオチドの核酸配列によりコードされるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを変更せずに核酸中のコドンを変更するように、特に、宿主生物（例えば、ヒト）の典型的なコドン使用頻度を反映するようにコドン最適化することができる。コドン最適化ポリヌクレオチド（例えば、配列番号２０、２１、３６、または３７の核酸配列を有するポリヌクレオチド）は、例えば、ＧＣ含量を減少させることにより、および／または宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞）中での発現のために遺伝子操作を容易にし得る。コドン最適化は、当業者により、例えば、オンラインツール、例えば、ＪＡＶＡ  Ｃｏｄｏｎ  Ａｄａｐｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｅｕ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ）を使用することにより、ポリヌクレオチドの核酸配列およびコドンを最適化すべき宿主生物を簡易に入力することにより実施することができる。様々な生物のコドン使用頻度が、オンラインデータベース、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎにおいて利用可能である。
【００７２】
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの発現のための宿主細胞
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））の発現のための宿主細胞として哺乳動物細胞を使用することができる。本方法において有用な例示的な哺乳動物細胞タイプとしては、限定されるものではないが、ヒト胚性腎（ＨＥＫ；例えば、ＨＥＫ２９３）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＣ３細胞、ベロ細胞、ＭＣ３Ｔ３細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＶＥＲＹ細胞、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＴ４８３細胞、Ｈｓ５７８Ｔ細胞、ＨＴＢ２細胞、ＢＴ２０細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＮＳ０細胞、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞、およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞、または当分野における公知の任意の他の好適な哺乳動物宿主細胞が挙げられる。あるいは、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの発現のための宿主細胞として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を使用することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の例としては、限定されるものではないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２９４（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，４４６）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）λ１７７６（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，５３７、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−１０２５）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，６０８）、または当分野における公知の任意の他の好適な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が挙げられる。
【００７３】
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター
本発明はまた、上記ポリヌクレオチドのいずれか１つ以上を含む組換えベクターを特徴とする。本発明のベクターを使用して本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））をコードするポリヌクレオチドを送達することができ、それとしては、哺乳動物、ウイルス、および細菌発現ベクターを挙げることができる。例えば、ベクターは、プラスミド、人工染色体（例えば、ＢＡＧ、ＰＡＣ、およびＹＡＣ）、およびウイルスまたはファージベクターであり得、場合により、プロモーター、エンハンサー、またはポリヌクレオチドの発現のための調節因子を含み得る。ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合のアンピシリン、ネオマイシン、および／もしくはカナマイシン耐性遺伝子、または真菌ベクターについての耐性遺伝子も含有し得る。ベクターは、ＤＮＡもしくはＲＮＡの産生のためにインビトロで使用することができ、またはそれを使用してベクターによりコードされるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの産生のための宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞を形質移入もしくは形質転換することができる。ベクターは、遺伝子療法の方法においてインビボで使用するために適合させることもできる。
【００７４】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））をコードするポリヌクレオチドを送達するために使用することができる例示的なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４８、Ａｄ４９、Ａｄ５０、およびＰａｎ９（ＡｄＣ６８としても公知））、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、および二本鎖ＤＮＡウイルス、例として、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１および２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、鶏痘およびカナリア痘）が挙げられる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達するために有用な他のウイルスとしては、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶグループ、レンチウイルス、およびスプマウイルスが挙げられる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。
【００７５】
産生方法
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））をコードするポリヌクレオチドは、当分野における公知の任意の方法により産生することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、分子クローニング法を使用して生成され、ベクター、例えば、プラスミド、人工染色体、ウイルスベクター、またはファージベクター内に配置される。ベクターは、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞中にポリヌクレオチドを形質転換するために使用される。
【００７６】
核酸ベクター構築および宿主細胞
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））は、宿主細胞から産生することができる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２０、２１、３６、または３７の核酸配列を有するポリヌクレオチドまたはそれらのバリアント）は、当分野における公知の慣用の技術（例えば、形質転換、形質移入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、または感染）により宿主細胞中に導入することができるベクター中に含めることができる。ベクターの選択は、部分的には、使用すべき宿主細胞に依存する。一般に、宿主細胞は、原核生物（例えば、細菌）または真核生物（例えば、哺乳動物）のいずれかの起源のものであり得る。
【００７７】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））をコードするポリヌクレオチドは、当分野における公知の種々の方法により調製することができる。これらの方法としては、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発が挙げられる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、標準的な技術、例えば、遺伝子合成を使用して得ることができる。あるいは、野生型ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、配列番号５または３２のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、当分野における標準的技術、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発を使用して規定のアミノ酸置換（例えば、配列番号３３の２５３位および／または配列番号４の３１６位におけるセリン残基または保存的アミノ酸置換、例えば、アラニン、グリシン、プロリン、もしくはトレオニンによるシステイン残基のアミノ酸置換）を含有するように突然変異させることができる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチド合成装置またはＰＣＲ技術を使用して合成することができる。
【００７８】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））をコードするポリヌクレオチドは、原核または真核宿主細胞中で複製し、ポリヌクレオチドを発現し得るベクター中に挿入することができる。本方法において有用な例示的なベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミド、人工染色体、ウイルスベクター、およびファージベクターを挙げることができる。例えば、ウイルスベクターとしては、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列を含有する上記ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスベクター、例えば、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ））、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクター））を挙げることができる。それぞれのベクターは、特定の宿主細胞との適合性のために調整し、最適化することができる種々の構成成分を含有し得る。例えば、ベクター構成成分としては、限定されるものではないが、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位、シグナル配列、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列、および／または転写終結配列を挙げることができる。
【００７９】
上記ベクターは、当分野における慣用の技術、例えば、形質転換、形質移入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、および直接マイクロインジェクションを使用して適切な宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞）中に導入することができる。本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））の産生のための宿主細胞中にベクターが導入されたら、宿主細胞は、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、またはｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２０および２１ならびにそれらのバリアント）の増幅のために適宜改変された慣用の栄養培地中で培養される。治療タンパク質、例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの発現方法は、当分野において公知であり、例えば、Ｐａｕｌｉｎａ  Ｂａｌｂａｓ，Ａｒｇｅｌｉａ  Ｌｏｒｅｎｃｅ（ｅｄｓ．）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ  ｅｄ．２００４（Ｊｕｌｙ  ２０，２００４）およびＶｌａｄｉｍｉｒ  Ｖｏｙｎｏｖ  ａｎｄ  Ｊｕｓｔｉｎ  Ａ．Ｃａｒａｖｅｌｌａ（ｅｄｓ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓ；２ｎｄ  ｅｄ．２０１２（Ｊｕｎｅ  ２８，２０１２）（それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００８０】
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド産生、回収、および精製
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））を産生するために使用される宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞）は、当分野において公知であり、選択宿主細胞の培養に好適な培地中で成長させることができる。哺乳動物宿主細胞に好適な培地の例としては、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補給されたＤＭＥＭ、およびＲＰＭＩ−１６４０が挙げられる。細菌宿主細胞に好適な培地の例としては、ルリアブロス（ＬＢ）と必須サプリメント、例えば、選択薬剤、例えば、アンピシリンが挙げられる。宿主細胞は、好適な温度、例えば、約２０℃〜約３９℃、例えば、約２５℃〜約３７℃、好ましくは、３７℃、およびＣＯ２レベル、例えば、５〜１０％（好ましくは、８％）において培養される。培地のｐＨは、一般に、主に宿主生物に応じて約６．８〜７．４、例えば、７．０である。誘導性プロモーターが発現ベクター中で使用される場合、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。
【００８１】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））は、宿主細胞の上清から回収することができる。あるいは、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、宿主細胞を破壊し（例えば、浸透圧ショック、超音波処理、または溶解を使用）、次いで遠心分離し、または濾過してｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを取り出すことにより回収することができる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの回収時、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをさらに精製することができる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、タンパク質精製分野における公知の任意の方法、例えば、プロテインＡ親和性、他のクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差異により、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的技術（Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｕｗｅ  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ（ｅｄ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００９（参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照されたい）により精製することができる。
【００８２】
場合により、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））は、精製のための検出可能標識にコンジュゲートすることができる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの精製において使用される好適な標識の例としては、限定されるものではないが、タンパク質タグ、フルオロフォア、発色団、放射標識、金属コロイド、酵素、または化学発光、もしくは生物発光分子が挙げられる。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの精製に有用なタンパク質タグとしては、限定されるものではないが、クロマトグラフィータグ（例えば、ポリアニオン性アミノ酸からなるペプチドタグ、例えば、ＦＬＡＧ−タグ、またはヘマグルチニン「ＨＡ」タグ）、親和性タグ（例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））、可溶化タグ（例えば、チオレドキシン（ＴＲＸ）およびポリ（ＮＡＮＰ））、エピトープタグ（例えば、Ｖ５−タグ、Ｍｙｃ−タグ、およびＨＡ−タグ）、または蛍光タグ（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰバリアント、ＲＦＰ、およびＲＦＰバリアント）を挙げることができる。
【００８３】
治療方法
本明細書において、患者、例えば、軟骨無形成症を有する患者（例えば、軟骨無形成症を有するヒト）における骨格成長遅滞障害を治療する方法が提供される。特に、患者は、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）の１つ以上の症状を呈し、または発症する可能性が高い者である。本方法は、骨格成長遅滞障害を有する患者、例えば、軟骨無形成症を有する患者（例えば、軟骨無形成症を有するヒト）に本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））を投与することを含む。特に、本方法は、骨格成長遅滞障害を有する患者、例えば、軟骨無形成症を有する患者（例えば、軟骨無形成症を有するヒト）にｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）またはｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）を投与することを含む。例えば、患者は、骨格成長遅滞障害を有する幼児または小児、例えば、軟骨無形成症を有する幼児、小児、または若年者（例えば、軟骨無形成症を有するヒト）である。
【００８４】
患者（例えば、ヒト）は、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）の症状が出現する前または骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）の症状が発症した後に治療することができる。特に、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））により治療することができる患者は、症状、例として、限定されるものではないが、四肢短縮、短い胴体、Ｏ脚、動揺性歩行、頭蓋異形、クローバー葉頭蓋、頭蓋骨縫合早期癒合症、ウォルム骨、手の奇形、足の奇形、ヒッチハイカーの親指、および／または胸部奇形を呈する者である。さらに、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドによる治療は、骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症の上記症状の１つ以上の改善を（例えば、非治療患者に対して）もたらし得る。
【００８５】
患者（例えば、ヒト）は、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））の投与前に骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症と診断されていてよい。さらに、骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症を有する患者は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドにより予め治療されなかった者であり得る。
【００８６】
骨格成長遅滞障害
骨格成長遅滞障害は、骨格成長遅滞障害の治療が必要とされる患者（例えば、ヒト）に本明細書に記載のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを投与することにより治療することができる。本方法は、骨格成長遅滞障害を有する患者（例えば、ヒト）に本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））を投与することを含む。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドにより治療することができる骨格成長遅滞障害は、骨の変形および／または奇形により特徴付けられ、それとしては、限定されるものではないが、ＦＧＦＲ３関連骨格疾患を挙げることができる。特に、患者は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）またはｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）により治療される。
【００８７】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））の投与は、骨格成長遅滞障害、例として、限定されるものではないが、軟骨無形成症、軟骨無発生症、先端骨形成不全症、遠位中間肢異形成症、骨発生不全症、屈曲肢異形成症、点状軟骨異形成症、肢根型点状軟骨異形成症、鎖骨頭蓋骨異形成症、先天性大腿骨短縮症、クルーゾン症候群、アペール症候群、Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｗｅｉｓｓ症候群、ファイファー症候群、クルーゾン皮膚骨格症候群、指奇形、短指症、屈指症、多指症、合指症、捻曲性骨異形成症、小人症、分節異常骨異形成症、内軟骨腫症、線維性軟骨発生症、線維性骨異形成症、遺伝性多発性外骨腫症、低ホスファターゼ症、低リン血症性くる病、Ｊａｆｆｅ−Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ症候群、クニースト骨異形成症、クニースト症候群、ランガー型中間肢異形成症、マルファン症候群、マッキューン・オルブライト症候群、小肢症、骨幹端異形成症、Ｊａｎｓｅｎ型骨幹端異形成症、変容性異形成症、モルキオ症候群、ニーベルゲルト型中間肢異形成症、神経線維腫症（例えば、１型（例えば、骨所見を伴うもの、または骨所見を伴わないもの）、２型、またはシュワノマトーシス）、変形性関節症、骨軟骨異形成症、骨形成不全症、骨形成不全症周産期致死型、大理石骨病、骨斑紋症、末梢骨形成不全症、Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ症候群、Ｒｏｂｅｒｔｓ症候群、ロビノウ症候群、短肋骨多指症候群、低身長、先天性脊椎・骨端骨異形成症、および脊椎・骨端・骨幹端異形成症を治療し得る。
【００８８】
例えば、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））を使用して骨格成長遅滞障害、例として、上記障害、例えば、軟骨無形成症に伴う症状を治療することができる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドにより治療することができる骨格成長遅滞障害の症状の非限定的な例としては、四肢短縮および短い胴体、Ｏ脚、動揺性歩行、頭蓋異形（例えば、大きな頭部）、クローバー葉頭蓋、頭蓋骨縫合早期癒合症（例えば、頭蓋内の骨の早期癒合）、ウォルム骨（例えば、頭蓋内の骨間の異常な糸状連結）、手足の奇形（例えば、多指症または余剰の指）、「ヒッチハイカー」の親指および異常な指の爪および足指の爪、ならびに胸部奇形（例えば、ナシ形状胸部または狭い胸郭）が挙げられる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを投与することにより治療することができる追加の症状としては、骨格成長遅滞障害を有する患者における非骨格異常、例えば、眼、口、および耳の奇形、例えば、先天性白内障、近視、口蓋裂、または難聴；脳異形、例えば、水頭症、孔脳症、水無脳症、または脳梁欠損症；心臓欠陥、例えば、心房中隔欠損症、動脈管開存症、または大血管の転位；発育遅延；または精神障害を挙げることもできる。
【００８９】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））による治療は、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を有する患者（例えば、ヒト）の生存率も増加させ得る。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドによる治療される患者の生存率は、例えば、数日間、数ヵ月間、数年間以上の治療期間にわたり、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を有する非治療患者に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上だけ増加し得る。特に、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の投与は、骨格成長遅滞障害、例えば、軟骨無形成症を有する患者（例えば、ヒト）の生存率を（例えば、非治療患者に対して）増加させ得る。
【００９０】
患者（例えば、ヒト）に本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））を投与することにより、ＦＧＦＲ３関連骨格疾患（例えば、機能獲得ＦＧＦＲ３突然変異の結果としてのＦＧＦＲ３の過剰活性化により引き起こされ、またはそれに伴う）である任意の骨格成長遅滞障害を治療することができる。例えば、ＦＧＦＲ３関連骨格疾患としては、限定されるものではないが、軟骨無形成症、タナトフォリック骨異形成症Ｉ型（ＴＤＩ）、タナトフォリック骨異形成症ＩＩ型（ＴＤＩＩ）、発育遅延および黒色表皮症を伴う重度の軟骨無形成症（ＳＡＤＤＡＮ）、軟骨低形成症、および頭蓋骨縫合早期癒合症（例えば、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、クルーゾン症候群、およびクルーゾン皮膚骨格症候群）を挙げることができる。
【００９１】
様々なＦＧＦＲ３関連骨格障害、例えば、軟骨無形成症、軟骨低形成症、ＳＡＤＤＡＮ、ＴＤＩ、およびＴＤＩＩに関連するＦＧＦＲ３遺伝子中の突然変異を有する患者（例えば、ヒト）は、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））により治療することができる。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを投与してＦＧＦＲ３遺伝子のＧ３８０Ｒ、Ｇ３７５Ｃ、Ｇ３４６ＥまたはＳ２７９Ｃ突然変異から生じる軟骨無形成症を治療することができる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの投与を使用して以下の例示的なＦＧＦＲ３関連骨格障害：ＦＧＦＲ３遺伝子のＧ３７５Ｃ、Ｇ３４６ＥまたはＳ２７９Ｃ突然変異から生じる軟骨低形成症；ＦＧＦＲ３遺伝子のＲ２４８Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｇ３７０Ｃ、Ｓ３７１Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｘ８０７Ｒ、Ｘ８０７Ｃ、Ｘ８０７Ｇ、Ｘ８０７Ｓ、Ｘ８０７ＷおよびＫ６５０Ｍ突然変異から生じるＴＤＩ；ＦＧＦＲ３遺伝子のＫ６５０Ｅ突然変異から生じるＴＤＩＩ；ならびにＦＧＦＲ３遺伝子のＫ６５０Ｍ突然変異から生じるＳＡＤＤＡＮを治療することができる。
【００９２】
ＦＧＦＲ３遺伝子中の上記突然変異（例えば、ＦＧＦＲ３遺伝子のＧ３８０Ｒ突然変異）のいずれも、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、またはそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））による治療前または後に患者（例えば、軟骨無形成症、軟骨低形成症、ＳＡＤＤＡＮ、ＴＤＩ、およびＴＤＩＩを有するヒト）からの試料中で検出することができる。さらに、患者の親および／または胎児試料（例えば、母体血液、胎盤、または胎児試料から得られる胎児核酸）を、ＦＧＦＲ３遺伝子中の突然変異についての当分野における公知の方法により試験してそれらの治療必要性を決定することができる。
【００９３】
軟骨無形成症
軟骨無形成症は、ヒトにおける小人症の最も一般的な原因であり、本明細書に記載のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを投与することにより治療することができる。特に、軟骨無形成症は、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））を投与することにより治療することができる。したがって、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの投与は、症状、例として、限定されるものではないが、成長遅滞、頭蓋変形、歯列矯正欠陥、頸髄圧迫（例えば、中枢性無呼吸または発作からの死亡リスクを伴うもの）、脊髄の狭窄（例えば、脚部および腰部の疼痛）、水頭症（例えば、脳シャント手術を要求するもの）、慢性耳炎に起因する難聴、心血管疾患、神経疾患、呼吸疾病、疲労、疼痛、腰部および／もしくは脊柱における無感覚、ならびに／または肥満症の改善をもたらし得る。
【００９４】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））を使用して治療される患者としては、軟骨無形成症を有する幼児、小児、および成人を挙げることができる。特に、幼児は、出生時に軟骨無形成症と診断されることが多く、したがって、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドによる治療は、患者の生涯において可能な限り早期に、例えば、出生直後、または出生前（子宮内）に開始することができる。
【００９５】
患者（例えば、ヒト）における軟骨無形成症の症状は、患者を本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））により治療する前または後にモニタリングすることもできる。例えば、軟骨無形成症の症状は、治療前にモニタリングして本方法の実施前に患者の軟骨無形成症の重症度および状態を評価することができる。
【００９６】
本方法は、患者における軟骨無形成症の診断ならびに軟骨無形成症の症状の変化、例えば、患者の体重および頭蓋サイズ（例えば、頭蓋長および／または頭蓋幅）の変化についての患者のモニタリングを含み得る。体重および頭蓋サイズの変化は、一定期間にわたり、例えば、１ヵ月もしくは１年当たり１、２、３、４回以上、または本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））による治療過程にわたり約１、２、３、４、５、６、７、８、１２または１６週間ごとにモニタリングすることができる。軟骨無形成症を有する患者の体重および／または頭蓋サイズは、治療の規定イベントにおいて、例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの投与前および／または後に測定することもできる。
【００９７】
例えば、体重および／または頭蓋サイズは、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））の投与に応答して計測することができる。体重は、軟骨無形成症を有する患者をスケール上で、好ましくは、標準化様式で、例えば、同一の衣類でもしくは衣類なしで、または１日のある時間において、好ましくは、絶食状態（例えば、朝食前の朝または絶食の少なくとも１、２、３、４、５時間以上後で）で秤量することにより計測することができる。頭蓋サイズは、頭蓋の長さ、高さ、幅、および／また外周により表すことができる。計測は、任意の公知のまたは自己考案標準化方法を使用して実施することができる。ヒト対象について、頭蓋外周の計測が好ましく、それは、フレキシブルな非伸縮性材料、例えば、巻き尺を使用して、頭部の考えられる最大外周（例えば、額の最も突出した部分から、後頭部の最大幅の部分まで）を巻き付けて計測することができる。対象（例えば、ヒト）の頭蓋の高さは、顎の底部から頭部の最上部まで測定することもできる。好ましくは、任意の計測は、２回以上、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上実施される。
【００９８】
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの投与
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））は、当分野における公知の任意の経路により、例えば、非経口投与、腸内投与、または局所投与により投与することができる。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を有する患者に皮下（例えば、皮下注射による）、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内または腹腔内投与することができる。
【００９９】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））は、患者（例えば、ヒト）に所定投与量において、例えば、重大な毒性を誘導せずに骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を治療するための有効量で投与することができる。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を有する患者に、約０．００２ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、２．５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ）の範囲の個々の用量で投与することができる。特に、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの個々の用量で投与することができる。
【０１００】
骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を有する患者（例えば、ヒト）への投与のための本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの例示的な用量（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））としては、例えば、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。これらの用量は、１日、１週間、１ヵ月、または１年当たり１回以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回以上）投与することができる。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、患者に例えば、約０．００１４ｍｇ／ｋｇ／週〜約１４０ｍｇ／ｋｇ／週、例えば、約０．１４ｍｇ／ｋｇ／週〜約１０５ｍｇ／ｋｇ／週、または例えば、約１．４ｍｇ／ｋｇ／週〜約７０ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、２．５ｍｇ／ｋｇ／週、５ｍｇ／ｋｇ／週、１０ｍｇ／ｋｇ／週、２０ｍｇ／ｋｇ／週、３０ｍｇ／ｋｇ／週、４０ｍｇ／ｋｇ／週、または５０ｍｇ／ｋｇ／週）の範囲の１週間の投与量で投与することができる。
【０１０１】
遺伝子療法
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを目的の組織に送達し、インビボで発現させる遺伝子療法を介して送達することもできる。遺伝子療法の方法は、例えば、Ｖｅｒｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：２３９−２４２，１９９７）、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７：Ｓ６７−Ｓ６８，２００９）、およびＹａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２６：１３５−１４２，２０１１）（それらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）に考察されている。
【０１０２】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））は、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を有する患者（例えば、ヒト）の細胞により、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列を含有するベクター（例えば、プラスミド、人工染色体（例えば、ＢＡＧ、ＰＡＣ、およびＹＡＣ）、またはウイルスベクター）を投与することにより産生することができる。例えば、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスベクター、例えば、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ））、アデノ随伴ウイルスベクター、またはアルファウイルスベクターであり得る。ベクターは、例えば、形質転換、形質移入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、または直接マイクロインジェクションにより、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を有する患者（例えば、ヒト）の細胞内側に存在させたら、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの発現を促進し、次いでそれが細胞から分泌される。本発明はさらに、患者（例えば、ヒト）にｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを発現する細胞を投与する細胞ベース療法を含む。
【０１０３】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または宿主細胞を含み得る。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または宿主細胞を含む組成物は、投与量の範囲において、種々の配合物中で、および薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤との組合せで配合することができる。
【０１０４】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または宿主細胞を含む医薬組成物は、規定の投与量、例えば、重大な毒性を誘導せずに患者（例えば、ヒト）の骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を治療するために有効な投与量において配合することができる。例えば、組成物は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５００ｍｇ／ｍＬのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、１０ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ〜１２０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬ、または６０ｍｇ／ｍＬ〜７０ｍｇ／ｍＬのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド）を含むように配合することができる。
【０１０５】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または宿主細胞を含む医薬組成物は、種々の形態で、例えば、液体液剤、分散剤もしくは懸濁液剤、散剤、または安定的な貯蔵に好適な他の秩序構造で調製することができる。例えば、全身または局所送達が意図されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを含む組成物は、例えば、非経口投与（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、または腹腔内投与）のための注射または注入液剤の形態であり得る。注射（例えば、皮下または静脈内注射）用ｓＦＧＦＲ３組成物は、ビヒクルとしての無菌溶液または任意の薬学的に許容可能な液体を使用して配合することができる。薬学的に許容可能なビヒクルとしては、限定されるものではないが、滅菌水、生理食塩水、および細胞培養培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−改変イーグル培地（α−ＭＥＭ）、Ｆ−１２培地）が挙げられる。配合方法は当分野において公知であり、例えば、Ｂａｎｇａ（ｅｄ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２ｎｄ  ｅｄ．）Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００６）（参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１０６】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または宿主細胞を含む組成物は、骨格成長遅滞障害（例えば、軟骨無形成症）を有する患者（例えば、ヒト）に薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤との組合せで提供することができる。許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤としては、緩衝剤、酸化防止剤、保存剤、ポリマー、アミノ酸、および炭水化物を挙げることができる。水性賦形剤、担体、または希釈剤としては、水、水−アルコール溶液、生理食塩水を含むエマルションまたは懸濁液、緩衝医薬非経口ビヒクル、例として、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース溶液、デキストロースと塩化ナトリウムの溶液、ラクトースを含有するリンガー溶液、および固定油を挙げることができる。非水性賦形剤、担体、または希釈剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、および注射用有機エステルである。
【０１０７】
薬学的に許容可能な塩も、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または宿主細胞を含む組成物中に含めることができる。例示的な薬学的に許容可能な塩としては、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩）および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、および安息香酸塩）を挙げることができる。さらに、補助物質、例えば、湿潤または乳化剤およびｐＨ緩衝物質が存在し得る。薬学的に許容可能な賦形剤、担体、および希釈剤の詳細な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄＥｄ．，Ａｌｌｅｎ  （２０１２）（参照により全体として本明細書に組み込まれる）において利用可能である。
【０１０８】
本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または宿主細胞を含む医薬組成物は、急速放出からｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを保護する担体と配合することもでき、例えば、制御放出配合物、例として、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系である。例えば、ｓＦＧＦＲ３組成物は、コアセルベーション技術により、または界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、またはポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル；コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、またはナノカプセル）；またはマクロエマルション中で捕捉することができる。さらに、ｓＦＧＦＲ３組成物は、徐放組成物として配合することができる。例えば、徐放組成物は、本発明のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを含み得、マトリックスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。
【０１０９】
キット
本発明のキットは、本明細書に記載の本発明の１つ以上のｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）、およびそれらのバリアント（配列番号４）またはシグナルペプチドを含むｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（配列番号１８または３４））、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または細胞を含み得る。例えば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または細胞は、容器（例えば、ガラスバイアル）中で液体形態（例えば、水または緩衝塩溶液、例えば、２ｍＭ〜２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５または７．０、および２５ｍＭ〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム中）で存在し得る。あるいは、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはベクターは、容器（例えば、ガラスバイアル）中で、場合により、投与前の液体形態への凍結乾燥ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または細胞の再構成のための希釈剤（例えば、水または緩衝塩溶液）を含み得る凍結乾燥形態で存在する。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または細胞は、キット中で本明細書に記載の別の配合物中でも存在し得る。キット構成成分は、投与を容易にするための剤形で提供することができ、場合により、投与に要求される材料および／または本方法に従う患者治療についての説明書を含み得る。例えば、キットは、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または細胞の投与に関して使用者（例えば、医師）にガイドする使用説明書を含み得る。
【実施例】
【０１１０】
以下の実施例は本開示を説明するためのものであり、限定するものではない。これらの試験は、軟骨無形成症およびそれに伴う症状を治療するための軟骨無形成症を有する患者（例えば、ヒト）へのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの投与を特徴とする。
【０１１１】
実施例１：ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの産生
３つの異なる懸濁細胞タイプ：ＨＥＫ２９３  ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ、ＣＨＯ−Ｓ  ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞およびＥｘｐｉ  ＣＨＯ−Ｓ細胞中の一過的形質移入により、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（配列番号２）およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）を産生した。ＨＥＫ２９３  ｆｒｅｅｓｔｙｌｅおよびＣＨＯ−Ｓ  ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞中での産生のため、ポリエチレンイミン（ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）−Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を製造業者の指示書に従って使用して形質移入を実施した。３日後にタンパク質を回収した。Ｅｘｐｉ  ＣＨＯ−Ｓ細胞中でのｓＦＧＦＲ３ポリペプチド産生のため、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを製造業者による記載のとおりに使用して、Ｈｉｇｈ  Ｔｉｔｅｒ産生プロトコルを使用して形質移入を実施した。タイムコースを実施し、１２日後にｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを最適に回収した。次いで、５０ｎｇのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを使用してウエスタンブロットを実施した。ブロッキング緩衝液中で１：２０００希釈された一次抗体としてのＢ９（抗ＦＧＦＲ３、ｓｃ−１３１２１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびブロッキング緩衝液中で１：５０００希釈された抗マウスＩｇＧ二次抗体（抗マウスＩｇＧ、＃７０７６、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて古典的ウエスタンブロットプロトコルを使用した。
【０１１２】
実施例２：ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの精製
イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを含む２ステップ精製プロセスを使用してｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳおよびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３をそれぞれ精製した。
【０１１３】
イオン交換クロマトグラフィーのため、５μｍおよび０．２μｍのカプセル（それぞれＫＧＦ−Ａ０５０４ＴＴおよびＫＭＰ−ＨＥＣ９２０４ＴＴ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するクロスフロー濾過（ＡＫＴＡ（商標）ｆｌｕｘ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により３００ｍＬの培養上清を精製した。次いで、１４ｍＳ／ｃｍへの試料の伝導度の調整後に平衡化カラム上で２０ｍＬ／分においてｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳまたはｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を含む精製試料をロードした（ＡＫＴＡ（商標）ｐｕｒｅ２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））。使用カラムは、５３ｍＬのベッドボリュームを有するＨｉＰｒｅｐ  Ｑ  ＦＦ２６／１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。結合緩衝液は１×ＰＢＳであり、溶出緩衝液はＰＢＳ  １×＋１ＭのＮａＣｌであった。カラムを４カラム容量の１×ＰＢＳにより洗浄した。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳおよびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の溶出を、それぞれの４カラム容量を使用する５％のＮａＣｌおよび１０％のＮａＣｌの２ステップにより実施した。５％のＮａＣｌおよび１０％のＮａＣｌの両方をプールし、クロスフロー濾過（ＡＫＴＡ（商標）ｆｌｕｘ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により濃縮した。次いで、残留容量を、４℃、３，９００ｇにおける１０分間の遠心分離（ＭＩＬＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標）ＵＦＣ９０３０２４ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）により３０ｋＤａフィルター上で濃縮した。サイズ排除クロマトグラフィーのため、３２０ｍＬのベッドボリュームを有するＨｉＬｏａｄ２６／６００ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ（２８−９８９３−３６、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で残留容量をロードした。負荷容量は、１２．８ｍＬを超過しなかった。溶出を１×ＰＢＳ中で実施した。
【０１１４】
実施例３：ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのカイネティックアッセイおよび解離定数（Ｋｄ）計測
Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳおよびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３のキャリブレーションフリー濃度分析およびカイネティックアッセイを実施した。ヒトＦＧＦ２（ｈＦＧＦ２）を、Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５に約５０００ＲＵのレベルにおいてアミンカップリングにより共有結合により固定化した。５０００ＲＵを達成するため、ｈＦＧＦ２を流速１０μｌ／分および濃度２５μｇ／ｍｌにおいて４２０秒間固定化した。ランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。再生緩衝液は、２Ｍの塩化ナトリウムを有する１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５であった。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴によりＦＧＦ結合、解離定数（Ｋｄ）計測、およびカイネティックパラメータを測定した。カイネティックアッセイおよびＫｄ測定に使用されたモデルは、１：１結合アルゴリズムであった。
【０１１５】
実施例４：ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの増殖アッセイ
ＡＴＤＣ５およびＡＴＤＣ５  ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ細胞系の両方を、ＮＵＮＣ（商標）ＭＩＣＲＯＷＥＬＬ（商標）９６−Ｗｅｌｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ−Ｂｏｔｔｏｍ  Ｐｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｂａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１６５３０５）中で２５，０００個の細胞／ｃｍ２の密度において播種した。２４時間のインキュベーション期間後、細胞を０．５％のＢＳＡ中で４８時間枯渇させ、次いでｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳまたはｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３によりｈＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いてまたは用いずに７２時間刺激した。次いで、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｃ３５０１２）を使用して細胞増殖を計測した。刺激後、１ウェル当たり１０μＬのＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１ｍｌの１×ＰＢＳ、２５０μＬのバックグラウンド抑制剤、および５０μＬの核染色）を添加した。次いで、ＡＴＤＣ５およびＡＴＤＣ５  ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ細胞を、暗所で室温において２時間インキュベートした。ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ（商標）ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して蛍光を読み取った。
【０１１６】
実施例５：ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのルシフェラーゼアッセイ
ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒを発現する血清応答エレメント−ルシフェラーゼ（ＳＲＥ−Ｌｕｃ）ＨＥＫ細胞を、標準培養９６ウェルプレート中で１００，０００個の細胞／ｃｍ２の密度において播種した。次いで、細胞を０．５％の熱不活化ウシ胎仔血清（ｈｉＦＢＳ）により２４時間枯渇させてから、０ｎｍ、７０ｎｍ、および２８０ｎｍの濃度におけるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３により１ｎｇ／ｍｌのｈＦＧＦ２を用いてまたは用いずに２４時間処理した。培養プレートを室温に１５分間平衡化してから１ウェル当たり１００μＬのＦｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｇｌｏｗ  Ａｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１６１９７）を添加し、次いで６００ｒｐｍにおいて３分間振盪させた。プレートを室温において１０分間インキュベートし、それぞれの細胞溶解物を白色不透明９６ウェルプレートに移して発光シグナルを増加させ、交差汚染を減少させた。ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ（商標）ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して発光シグナルを読み取った。
【０１１７】
実施例６：ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのインビボ効力試験
突然変異ＦＧＦＲ３の発現がＣｏｌ２ａ１プロモーター／エンハンサーによりドライブされるトランスジェニックＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋動物に対して実験を実施した。マウスを１２時間の明／暗サイクルに曝露し、標準的な実験室飼料および水に自由にアクセスさせた。ＦＧＦＲ３導入遺伝子の３６０ｂｐを増幅させるプライマー５’−ＡＧＧＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡＣＣＴＡＣＣＡＧＧ−３’（配列番号３０）および５’−ＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＴＧＧ−３’（配列番号３１）を使用するゲノムＤＮＡのＰＣＲによりゲノタイプを確認した。
【０１１８】
ＣＨＯ細胞を使用して産生されたｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を、０．２５ｍｇ／ｋｇの週２回の皮下用量において評価した。３日目、単一リッターからの全ての新生マウスは同一用量を受容した。対照リッターは、１０μｌのＰＢＳ（ビヒクル）を受容した。その後、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（０．２５ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射を、背中の左側および右側上に交互に３週間にわたり週２回投与した。マウスをロコモーションおよび排尿の変更に特に留意して毎日観察した。繁殖を実施して半数の野生型および半数のヘテロ接合性Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスを有するリッターを生成した。表現型浸透度変動に起因するバイアスを回避するため、同一のブリーダーからの少なくとも２匹のリッター（処理１匹、対照１匹）に対して実験を実施した。事前のデータは、雄および雌間で統計的差異が存在しないことを示し、したがって、雄および雌を全ての分析について１つの群とみなした。
【０１１９】
２２日目、ペントバルビタールの致死注射により全ての動物を屠殺し、性別を判定した。全ての後続の計測および分析をマウスのゲノタイプの知識なしで実施して調査者のバイアスを回避した。試験の終了時にゲノタイピングを実施してデータと規定のゲノタイプとの対応を明らかにした。軟骨無形成症は表現型変異を有する疾患であるため、全ての動物を試験に含めた。２２日目前に死亡した動物を使用して早期死亡に対する処理の影響を調査した。２２日目における生存動物を全ての分析に使用した。全ての実験およびデータ計測を全ての時点において盲検化実験者により実施した。
【０１２０】
２２日目における屠殺後、体重を計測した。死体の皮を慎重に剥ぎ、内臓摘出し、骨格計測をＸ線に基づき実施した。標準的なパラフィン包埋技術を使用するさらなる組織学的分析のために臓器を回収し、秤量し、１０％のホルマリン中で貯蔵した。次いで、臓器を肉眼異常、例えば、色または質感の改変および結節の存在について観察した。全ての動物実験の間、Ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．８５−２３，ｒｅｖｉｓｅｄ  １９８５；ｈｔｔｐ：／／ｇｒａｎｔｓ１．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｒａｎｔｓ／ｏｌａｗ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｐｈｓｐｏｌ．ｈｔｍ）およびＥｕｒｏｐｅａｎ  ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ／ｃｈｅｍｉｃａｌｓ／ｌａｂ＿ａｎｉｍａｌｓ／ｌｅｇｉｓｌａｔｉｏｎ＿ｅｎ．ｈｔｍ）に従った。全ての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｅｔｈｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＣＩＥＰＡＬ  Ａｚｕｒ）により承認された（承認番号ＮＣＥ−２０１２−５２）。
【０１２１】
実施例７：ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを産生するために使用された細胞系は、活性に影響を与えなかった
懸濁ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞中で産生されたｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号７）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（配列番号１）、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号１０）のＦＧＦ２結合活性、Ｋｄ、および細胞シグナリングに対する効果を比較した。ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞は、タンパク質の翻訳後修飾が異なる。異なる細胞系中でのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの発現は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのＫｄにも、結合活性にも、細胞内シグナリング阻害に対する効果にも影響を与えなかった（図１Ａ〜１Ｄ）。
【０１２２】
実施例８：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳおよびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の産生の改善
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１（配列番号７）、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４（配列番号１）、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２（配列番号１０）のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを、２５３位におけるセリン残基によるシステイン残基のアミノ酸置換または拡張Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン３（配列番号３３）のいずれかを含むようにそれぞれ改変した。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−ＬＫ１−ＬＫ２のこれらの改変は、凝集が依然として可視的であったため、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの産生に対する効果を有さず、または最小の効果を有した（それぞれ、図２Ａおよび２Ｂ）。驚くべきことに、２５３位におけるセリン残基によるシステイン残基のアミノ酸置換（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ）または拡張Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン３（配列番号３３））のいずれかを含めるためのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４の改変は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの産生を改善した。特に、還元および非還元の両方の条件下でｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳおよびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の最小の凝集が存在した（図２Ｃ）。Ｃ２５３ＳまたはＤ３の包含は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４と比較して産生の相対的増加ももたらし、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ産生においては２倍の増加およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３産生においては３倍の増加をもたらした。
【０１２３】
さらに、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は類似のＫｄを示し、翻訳後修飾の細胞タイプ特異的変化により影響を受けなかった。Ｅｘｐｉ  ＣＨＯ細胞において、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４のＫｄは０．８ｎＭであり、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳのＫｄは０．６ｎＭであり、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３のＫｄは０．７ｎＭであった（図３Ａおよび表１）。
【０１２４】
【表１】
2019527053.tif 000002
【０１２５】
実施例９：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳおよびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は、インビトロで同等に活性である
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ、およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は、ＦＧＦＲ３ａｃｈ突然変異を過剰発現するように遺伝子改変させたＡＴＤＣ５細胞（ＡＴＤＣ５  ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ細胞系）の増殖を回復させた。３６ｎＭの用量において、ＨＥＫ２９３細胞を使用して産生されたｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４は増殖を１１５．５％に増加させ、ＣＨＯ−Ｓ細胞を使用して産生されたｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４は増殖を１１６％に増加させ、ＣＨＯ−Ｓ細胞を使用して産生されたｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓは増殖を１１４．４％に増加させ、ＣＨＯ−Ｓ細胞を使用して産生されたｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は増殖を１２０．１％に増加させた（図３Ｂ）。
【０１２６】
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を、ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ発現ＳＲＥ（−Ｌｕｃ）ＨＥＫ細胞系においても、０ｎＭ、７０ｎＭ、および２８０ｎＭの用量において、１ｎｇ／ｍｌのｈＦＧＦ２を用いてまたは用いずに試験した（図４；ｎ＝８）。図４に示されるデータは、平均値＋／−平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。これらのデータは正規分布に従い、ダゴスティーノ・ピアソンオムニバス正規性検定に基づく等分散を有する。スチューデントのｔ検定を使用してｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を用いるまたは用いない統計的比較を実施した。図４に示されるとおり、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は、ＳＲＥ細胞系中でルシフェラーゼシグナリングを減少させる。
【０１２７】
実施例１０：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は、軟骨無形成症を有するマウスの骨成長を回復させ、死亡を予防し、大後頭孔形状を回復させる
低用量（０．２５ｍｇ／ｋｇ）のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を使用してインビボ効力試験を実施例６のとおり実施した。合計６０匹のマウスをビヒクル群に含め、３２匹の野生型（ｗｔ）マウスおよび２８匹のＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスであった。処理群は４０匹のマウスを含み、１９匹のｗｔマウスおよび２１匹のＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスであった。驚くべきことに、低用量のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は、軟骨無形成症を有するマウスの早期死亡をほぼ完全に予防した（図５）。対照群において、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの５３．６％が離乳前に死亡した一方、処理群のマウスの４．８％のみが２２日目前に死亡し、０．２５ｍｇ／ｋｇにおけるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１による処理後にマウスの２０％が死亡した（表２；Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５：２０３ｒａ１２４，２０１３（参照により全体として本明細書に組み込まれる）も参照されたい）。
【０１２８】
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は、軸および付属肢骨格に関するｗｔおよびＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス間の初期相違を矯正して骨成長も部分的に回復させた（表２）。低用量のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１による処理の事前の結果とは対照的に、低用量のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は正常な大後頭孔形状を回復させた。
【０１２９】
【表２】
2019527053.tif 000003
【０１３０】
実施例１１：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの投与による軟骨無形成症の治療
軟骨無形成症を罹患するヒト患者（例えば、幼児、小児、若年者、または成人）は、特定の投与量（例えば、０．０００２ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜７ｍｇ／ｋｇ／日）において適切な経路（例えば、皮下注射による）によりｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ（図６；配列番号２）を数日間、数週間、数ヵ月間、または数年間の過程にわたり投与することにより治療することができる。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓにより治療される軟骨無形成症の進行は、いくつかの確立された方法の１つ以上によりモニタリングすることができる。医師は、患者を直接的な観察によりモニタリングして患者により呈される軟骨無形成症の症状が治療に応答していかに変化したかを評価することができる。例えば、医師は、患者の体重、頭蓋長および／または頭蓋幅の変化を一定期間にわたり、例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓによる治療過程にわたり１ヵ月当たりもしくは１年当たり１、２、３、４回以上または約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、もしくは１６週間ごとにモニタリングすることができる。患者の体重および／もしくは頭蓋サイズまたはそれらの変化は、治療の規定イベントにおいて、例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの投与前および／または後に測定することもできる。例えば、体重および／または頭蓋サイズは、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの投与に応答して計測する。
【０１３１】
実施例１２：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の投与による軟骨無形成症の治療
さらに、軟骨無形成症を罹患するヒト患者（例えば、幼児、小児、若年者、または成人）は、特定の投与量（例えば、０．０００２ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜７ｍｇ／ｋｇ／日）において適切な経路により（例えば、皮下注射による）ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（配列番号３３）のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを数日間、数週間、数ヵ月間、または数年間の過程にわたり投与することにより治療することができる。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３により治療される軟骨無形成症の進行は、いくつかの確立された方法の１つ以上によりモニタリングすることができる。医師は、患者を直接的な観察によりモニタリングして患者により呈される軟骨無形成症の症状が治療に応答していかに変化したかを評価することができる。例えば、医師は、患者の体重、頭蓋長および／または頭蓋幅の変化を一定期間にわたり、例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３による治療過程にわたり１ヵ月当たりもしくは１年当たり１、２、３、４回以上または約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、もしくは１６週間ごとにモニタリングすることができる。患者の体重および／もしくは頭蓋サイズまたはそれらの変化は、治療の規定イベントにおいて、例えば、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の投与前および／または後に測定することもできる。例えば、体重および／または頭蓋サイズは、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の投与に応答して計測する。
【０１３２】
実施例１３：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの産生
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓポリペプチドを実施例２に記載のとおり精製した。拡張Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン３（ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３）または２５３位におけるセリン残基によるシステイン残基のアミノ酸置換（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓ）のいずれかを含めるためのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４の改変は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの産生を改善した。特に、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用する還元および非還元の両方の条件（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；それぞれ図７Ａおよび７Ｂ）下でｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの約２％未満の凝集が存在した（ＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３について２．３ｍｇ／ｍｌまたは２３ｍｇ／ｍｌおよびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓについて１．５ｍｇ／ｍｌおよび１５ｍｇ／ｍｌの濃度を使用するロード時に観察）。流加培養におけるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの産生後、キャピラリー電気泳動を使用して上位５つのクローンを分離して０．９３〜１．０ｇ／Ｌおよび０．９８〜１．１ｇ／ＬのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓをそれぞれ得た。イオン交換クロマトグラフィーを使用するウイルス濾過は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの両方について６０％超の収率をもたらした。
【０１３３】
実施例１４：インビボでのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の薬物動態および組織分布
インビボ試験を実施してｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の薬物動態パラメータ、血液脳関門を越えるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の取り込み、ならびに腎臓、肝臓、脾臓、肺、および心臓中のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の組織分布を調査した。本明細書に記載の試験は４つの処理群を含み、１処理群当たり５つの群のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび１群当たり合計４匹のマウス（ｎ＝４）を有した（表３）。マウスは雄であり、２５〜３０グラムの体重であった。
【０１３４】
【表３】
2019527053.tif 000004
【０１３５】
第１群を１分、１５分、および３０分において試料採取し；第２群を４時間において試料採取し；第３群を２４時間において試料採取し；第４群を３６時間において試料採取し；第５群を４８時間において試料採取した。第１群については、留置動脈内カテーテル（ＰＥ−１０）をイソフルラン麻酔下で１本の総頸動脈中に挿入し、３０分の最終試料採取時点における反復採血に使用した。静脈内注射のため、１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を、イソフルラン麻酔下で皮膚切開により曝露させた頸静脈中に静脈内注射した。第１群マウスは、実験全体にわたり麻酔したままであった。反復血液試料（２×約５０μＬ）を動脈カテーテルから静脈内注射の１分および１５分後に抜き取った。第２〜５群については、１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の注射後、皮膚を外科用クリップにより閉じ、マウスを起床させ、ケージに戻した。第３群についての終了時間５分前、マウスを再麻酔化し、マウスは頸静脈中への３Ｈ−アルブミンの静脈内ボーラスを受容した。３Ｈトレーサー用量は、後の試料採取時間におけるより低用量による二重同位体標識に好適な血中の１２５Ｉと３Ｈとの比を得るように標的化した。最終試料採取時間（２時間、３時間、２４時間、３６時間、および４８時間）において、血液試料を回収し、動物を安楽死させた。ホモジナイゼーションおよびトレーサーの組織濃度の測定のために脳を試料採取した。試験の終点は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３についての薬物動態パラメータ（終末相半減期）、血液脳関門を越えるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の取り込み、ならびに腎臓、肝臓、脾臓、肺、および心臓中のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の組織分布を含んだ。
【０１３６】
実施例１５：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの熱および血漿安定性
示差走査熱量測定を使用してマウス血漿中のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの熱安定性を調査した。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３については、２つの緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５、および２０ｍＭのクエン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）をポリペプチド試料に添加した。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓについては、２つの緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５、および４０ｍＭのクエン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）をポリペプチド試料に添加した。２０ｍＭのリン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液中のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓについての融解温度（Ｔｍ）は５２℃および５６℃であり、４０ｍＭのクエン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５緩衝液中のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳについてのＴｍは５５℃および６０℃であった（図８Ａ）。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３については、２つの緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５、および２０ｍＭのクエン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）をポリペプチド試料に添加した。２０ｍＭのリン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液中のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３についてのＴｍは５０℃および５４℃であり、２０ｍＭのクエン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５緩衝液中のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３についてのＴｍは５３℃および５８℃であった（図８Ｂ）。これらの結果は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの両方がポリペプチド安定性およびアンフォールディングの２つのドメインを示すことを示す。
【０１３７】
ヒスチジンタグを有するｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３のエクスビボ血漿安定性は、ボルトン・ハンター法を使用して１２５Ｉ−トレーサーにより精製ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を標識し、次いでＰＤ−１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５）カラム上で精製することにより測定した。ピーク分画のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿性も測定して１２５Ｉ−トレーサーの安定性を確認した。３７℃に予備加温したマウス血漿（ｎ＝４）に１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を−１０ｃｐｍ／ｍＬの濃度までスパイクし、次いでボルテックスに供した。血漿試料をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）中で穏やかな回転（３００ｒｐｍ）下で１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３とインキュベートした。次いで、ＴＣＡ沈殿（１０μｌの試料および１００μｌの２％のＢＳＡ）のため、および高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）カラム上へのインジェクション（２０μｌの試料および１５０μｌの１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４）のために、０、３０、６０、１２０、１８０、および３６０分の間隔においてアリコートを回収した。ＴＣＡ沈殿またはＦＰＬＣインジェクションを実施するまでアリコートを氷上で貯蔵した。
【０１３８】
ＴＣＡ沈殿のため、１ｍＬの氷冷１０％ＴＣＡを血漿試料に添加し、氷上で１０分間インキュベートし、４，０００ｇにおいて５分間遠心分離し、次いで上清およびペレットを分離し、両方をガンマカウンターで計数した。エクスビボ血漿安定性の評価のため、１００μｌの試料をＦＰＬＣカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００  １０／３００ＧＬ）上でインジェクトし、１．５カラム容量について０．７５ｍｌ／分の速度において溶出させた。カラムから１ｍｌの分画を回収し、次いでガンマカウンターで計測した。３７℃におけるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の血漿安定性は、０分において９５％、２時間において９５％、および２４時間において約９２％と測定され、わずかな凝集を伴うにすぎなかった（図９Ａ）。
【０１３９】
静脈内および皮下注射による投与後の血漿中のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３のインビボ安定性も測定した。ボルトン・ハンター法を使用して１２５Ｉ−トレーサーによりｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を標識し、次いでＰＤ−１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５）カラム上で精製した。１２５Ｉ−標識ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３（約５０μＬのＰＢＳ中１０μＣｉ）を、静脈内または皮下注射により麻酔Ｃ５７Ｂｌ／６マウス中に投与した。１２５Ｉ−トレーサータンパク質用量（約０．１ｍｇ／ｋｇ）に非標識タンパク質を２．５ｍｇ／ｋｇの総用量まで補った。血管マーカーとして使用されるラット血清アルブミンを［３Ｈ］−ＮＳＰ（Ｎ−スクシンイニジル（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｎｉｄｙｌ）［２，３−３Ｈ］プロピオネート；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により標識し、ＰＤ−１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５）カラム上で精製した。
【０１４０】
静脈内ボーラス注射後の血漿中のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の安定性について、ＦＰＬＣ溶出プロファイルは、１５分まで血漿中で分解産物を示さなかった（図９Ｂ）。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の投与３０分後において、少量の低分子量の分解産物が出現し、それは２時間までに増加したが、２４時間までに大部分が消失した。皮下注射後の血漿中のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の安定性について、ＦＰＬＣ溶出プロファイルは、３０分において血漿中でいくらかの分解産物を示し、２時間および４時間までに分解が増加した（図９Ｃ）。２４時間後に血漿中に残る少量のトレーサーは、大部分が、インタクトｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３ポリペプチドとして出現する。図９Ｂおよび９Ｃについての下段パネルのクロマトグラムを、溶出パターンのより容易な比較のためにそれぞれの個々のランにおける最大ピークに正規化したものとして提示する。
【０１４１】
実施例１６：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓのリガンド結合活性
ヒトＦＧＦ２についてのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの結合親和性を特徴付けるための実験を実施した。ＦＧＦ２についてのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の解離定数（Ｋｄ）およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳのＫｄを実施例３に記載のとおり測定し、２０ｍＭのリン酸塩、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５の再生緩衝液を用いた。１３ｎＭ、６．５ｎＭ、３．２５ｎＭ、および１．７５ｎＭの濃度を、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの両方について試験した。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３のＫｄは約３．６ｎｍであることが測定され、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳのＫｄは約６．９ｎｍであることが測定された。これらの結果は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓが低いｎＭ範囲でＦＧＦ２についての結合活性を有することを示す。
【０１４２】
実施例１７：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓは、インビトロで機能的活性を示す
増殖アッセイを使用してｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの機能的活性を試験した。ＦＧＦＲ３ａｃｈ突然変異を過剰発現するように遺伝子改変されたＡＴＤＣ５細胞（ＡＴＤＣ５  ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ細胞系）を使用する増殖アッセイを実施例４に記載のとおり実施し、濃度はｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓについて１ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、および５０ｕｇ／ｍｌであった。これらの濃度のそれぞれにおいて、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３ＳおよびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は、ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ細胞の増殖を回復させた（図１０Ａおよび１０Ｂ）。ＥＣ５０は、１ｕｇ／ｍｌの濃度に基づきｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの両方について約１０ｎＭであることが測定された。これらの結果は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓが低いｎＭ範囲で生物学的に活性であることを示す。
【０１４３】
実施例１８：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの薬物動態プロファイル
２．５ｍｇ／ｋｇの用量において皮下または静脈内投与されるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを使用してｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の終末期消失半減期を測定した（図１１）。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を皮下投与されたマウスについて３０分、２時間、４時間、８時間、２４時間、３６時間および４８時間において試料を回収した。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を静脈内投与されたマウスについて１分、１５分、３０分、２時間、２４時間、および３６時間において試料を回収した。２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の皮下終末期消失半減期は約２０時間であった一方、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の静脈内終末期消失半減期は約７時間であった。ＰＫプロファイルから、皮下投与された２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３についてＴｍａｘは約８時間であり、Ｃｍａｘは約４．５ｎＭであり、推定バイオアベイラビリティは約３０％であった。α相の間の静脈内投与されたｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の急速なクリアランスとそれに続くより緩慢なβ相クリアランスが存在し、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓについて類似の静脈内ＰＫプロファイルであった。
【０１４４】
実施例１９：腎臓および肝臓は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の主なクリアランス経路である
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３のクリアランスを腎臓、肝臓、脾臓、肺、および心臓組織において２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の静脈内投与の３０分、１２０分、および１４４０分後、ならびに２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の皮下投与の３０分、１２０分、２４０分、４８０分、および１４４０分後に評価した。肝臓および腎臓は、静脈内投与についてのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３クリアランスの主要な経路であった（図１２）。腎臓は、皮下投与についてのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３クリアランスの主要な経路であった（図１３）。
【０１４５】
実施例２０：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は血液脳関門を越えない
野生型マウスにおける血液脳関門を越えるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の取り込みを測定するための薬物動態試験も実施した。静脈内ボーラス注射後、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の脳組織の取り込みを３つの時点（３０分、２時間、および２４時間）において計測した。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を放射性標識トレーサー（１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３）として、２．５ｍｇ／ｋｇの非標識ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３と注射した。１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の注射用量は１動物当たり約１０μＣｉであり、それは０．１ｍｇ／ｋｇ未満に対応する。マウスを３０分、２時間、および２４時間において安楽死させた後、臓器および血漿中の１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の濃度を液体シンチレーション計数により計測した。
【０１４６】
トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿性材料（例えば、インタクトトレーサー）の分画を計測することにより血漿中および脳試料中での代謝について１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３濃度を補正した。ＴＣＡ補正の妥当性は、試料をサイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）カラム上にインジェクトすることによっても確認した。動物の屠殺直前に放射性標識アルブミン（３Ｈ−ＲＳＡ）を注射することにより血管内含有量（Ｖ０）について１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の臓器濃度を補正した。ＲＳＡの見かけの臓器の分布容量は、Ｖ０を表す。アルブミンの用量は無視可能であった（生理学的濃度の１％のオーダー）。脳以外の全ての臓器について、血管含有量を減算し、血漿中のＴＣＡ沈殿性分画を考慮することにより濃度を計算した。しかしながら、脳以外のそれらの臓器中への分解材料の取り込みについては、ＴＣＡ沈殿を実施しなかったため補正を行わなかった。
【０１４７】
脳濃度は、以下の式：Ｃｂｒａｉｎ（ｃｏｒｒ．）＝［Ｖｄ（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３）−Ｖ０］×Ｃｐｌａｓｍａ（ｔｅｒｍｉｎａｌ）（式中、Ｖｄ（ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３）は、脳内のｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の分布容量（Ｃｂｒａｉｎ／Ｃｐｌａｓｍａとして計算）であり、Ｖ０は、脳内で分布するアルブミンの容量であり、Ｃｐｌａｓｍａ（ｔｅｒｍｉｎａｌ）は、最終試料採取の時間におけるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の血漿濃度である）により計算した。全ての濃度を１グラムまたは１ｍｌ当たりの注射用量のパーセント（％ＩＤ／ｇまたは％ＩＤ／ｍＬ）としてそれぞれ表現し、静脈内ボーラス注射の用量は１００％に等しい。これらの値は、注射用量：（体重、ｇ／１０００ｇ）×２．５ｍｇにより乗算することにより［ｍｇ／ｇ］または［ｍｇ／ｍＬ］に変換することができる。全ての体重は２５ｇ〜３０ｇの範囲であった。
【０１４８】
補正脳濃度（血管含有量および分解（ＴＣＡ沈殿性）について補正後）により示されるとおり、計測時点のいずれにおいても１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の検出可能な脳の取り込みは存在しなかった（図１４Ａ）。さらに、ＲＳＡのＶｄ（＝Ｖ０）および１２５Ｉ−ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は、対応のあるｔ検定により決定されたとおり、計測時点（３０分、２時間、および２４時間）のいずれにおいても有意に異なることはなかった（図１４Ｂ）。まとめると、静脈内ボーラスとして注射された２．５ｍｇ／ｋｇの用量における３０分、２時間、および２４時間におけるマウスの脳組織中へのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の計測可能な取り込みは存在しなかった。
【０１４９】
実施例２１：軟骨無形成症の治療についてのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３のインビボ効力
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓを、２．５ｍｇ／ｋｇの週１回もしくは２回または１０ｍｇ／ｋｇの週２回の皮下用量においてそれぞれ評価した。繁殖を実施して半数の野生型および半数のヘテロ接合性Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスを有する３０匹のリッターを生成した（表４）。
【０１５０】
【表４】
2019527053.tif 000005
【０１５１】
３日目、単一リッターからの全ての新生マウスは同一用量を受容した。対照リッターは、１０μｌのＰＢＳ（ビヒクル）を受容した。その後、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３およびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｃ２５３Ｓの皮下注射を、２．５ｍｇ／ｋｇの週１回もしくは２回または１０ｍｇ／ｋｇの週２回の用量において背中の左側または右側上に交互に３週間投与した。マウスを特にロコモーションおよび排尿の変更に留意して毎日観察し、注射日に秤量した。合併症を有するマウスを監視のために１日２回観察した。事前のデータは、雌および雄間に統計的差異が存在しないことを示し、したがって、雌および雄を全ての分析について１つの群とみなした。
【０１５２】
２２日目、全ての動物をペントバルビタールの致死注射により屠殺し、性別を判定した。全ての後続の計測および分析は、マウスゲノタイプの知識なしで実施して調査者のバイアスを回避した。試験の終了時にゲノタイピングを実施してデータと規定のゲノタイプとの対応を明らかにした。軟骨無形成症は表現型変異を有する疾患であるため、全ての動物を試験に含めた。２２日目前に死亡した動物を使用して早期死亡に関する治療の影響を調査した。２２日目における生存動物を全ての分析に使用した。全ての実験およびデータ計測を全ての時点において盲検化実験者により実施した。
【０１５３】
２．５ｍｇ／ｋｇの週１回もしくは２回または１０ｍｇ／ｋｇの週２回におけるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の皮下投与は、ＰＢＳを受容したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスに対してＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの生存率を増加させた（図１５および表４）。特に、１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の週２回の投与はＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの９３％の生存率をもたらし、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の週１回の投与はＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの８４％の生存率をもたらし、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の週２回の投与はＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの７２％の生存率をもたらした一方、ＰＢＳを受容したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの生存率は６２．８％であった。１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの死亡率は６．７％であり、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週１回投与されたマウスの死亡率は１５．４％であり、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの死亡率は２８．０％であり、ＰＢＳを投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの死亡率は３７．２％であった。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３による処理後のＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウス生存率の統計的分析は、アゴスティーノ（Ａｇｏｓｔｉｎｏ）・ピアソンオムニバス正規性検定とそれに続くｔ検定を使用して実施した。全ての調査群は、正規性検定をパスした。これらの分析からのＰ値を以下に示し、＊は＜０．０５のＰ値を表し、＊＊＊は＜０．００１のＰ値を表す（表５）。
【０１５４】
【表５】
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【０１５５】
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の２．５ｍｇ／ｋｇにおける週１回もしくは２回または１０ｍｇ／ｋｇの週２回の皮下投与も、ＰＢＳを受容したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスに対してＦｇｆｒ３ａｃｈ／マウスにおけるロコモーター疾病および腹式呼吸における合併症の重症度および頻度を減少させた（図１６）。特に、ロコモーター疾病は、１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回皮下投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスで最も大きく減少し、それに続きｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３  ２．５ｍｇ／ｋｇを週２回投与されたマウスおよびｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３  ２．５ｍｇ／ｋｇを週１回投与されたマウスで減少した。腹式呼吸における合併症は、１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回皮下投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスで最も大きく減少し、それに続きｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３  ２．５ｍｇ／ｋｇを週１回投与されたマウス、次いでｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３  ２．５ｍｇ／ｋｇを週２回投与されたマウスで減少した。これらの結果は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３がＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおける軟骨無形成症の症状を低減させることを示す。
【０１５６】
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の皮下投与は、ＰＢＳを受容体したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスに対して２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週１回もしくは２回または１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回受容したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスにおいて軸長および尾長、ならびに長骨を含めた総体長も有意に増加させた（ｐ＝０．０７）（図１７Ａ〜１７Ｃ）。尾長および体長（軸長）は、全骨格上で同一のデジタルキャリパーを使用して計測した。脛骨長は、デジタルＸ線上で計測した。１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の週２回の投与は、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの５１％の軸矯正率（体長および尾長）をもたらし、それに続き２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回受容したＦｇｆｒ３ａｃｈ／マウスの４３％の軸矯正率、および２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週１回受容したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの３９％の軸矯正率をもたらした。骨長および体長の増加は、ＰＢＳを受容体したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスに対して２．５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスのｘ線写真からも明らかであった（図１７Ｄ）。１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の週２回の投与は、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの８６％の付属肢矯正率（脛骨および大腿骨長）をもたらし、それに続き２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回受容したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの６８％の付属肢矯正率および２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週１回受容したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの５４％の付属肢矯正率をもたらした。
【０１５７】
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の皮下投与は、ＰＢＳを受容体したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスに対してＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの頭蓋比（長さ／幅（Ｌ／Ｗ））の用量依存的な改善ももたらした（図１８Ａ）。１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回皮下投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスが頭蓋比（Ｌ／Ｗ）の最大改善を呈し、それに続き２ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスおよび２ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週１回投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスが改善を呈した。特に、１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の週２回の投与はＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの３７％の頭蓋形状矯正率（Ｌ／Ｗ比）をもたらし、それに続き２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回受容したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋の２９％の頭蓋形状矯正率および２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週１回受容したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの１９％の頭蓋形状矯正率をもたらした。頭蓋比の改善は、ＰＢＳを受容したＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスに対して１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスのｘ線写真からも明らかであった（図１８Ｂ）。体長、尾、大腿骨、脛骨、および頭蓋比についての骨計測値（ｍｍおよび平均±ＳＥＭで提示）を以下に示す（表６）。これらの結果は、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの生存率の増加、合併症の数の低減、骨成長の増加、および骨格比率の改善により実証されるとおり、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の用量依存的インビボ効力を示す。
【０１５８】
【表６】
2019527053.tif 000007
【０１５９】
さらに、２．５ｍｇ／ｋｇの週２回の投与量においてｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスについての骨計測値の比較は、２．５ｍｇ／ｋｇの週２回の投与量におけるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の投与が、Ｆｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの骨、尾、大腿骨、および脛骨長の増加ならびに頭蓋比の改善において同等またはそれよりも有効であったことを示す（表７）。特に、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの体長は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスについての１３４．４±１．１７ｍｍに対して１３５．５±１．７５ｍｍに改善し；ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの尾長は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスについての７１．５８±０．８６ｍｍに対して７３．６９±１．５ｍｍに改善し；ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの大腿骨長は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスについての１０．０１±０．０６ｍｍに対して１０．５８±０．０９ｍｍに改善し；ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの脛骨長は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスについての１３．２７±０．３１ｍｍに対して１４．０９±０．１２ｍｍに改善し；ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスの頭蓋比は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ１を投与されたＦｇｆｒ３ａｃｈ／＋マウスについての１．８１±０．０２ｍｍに対して１．８５±０．０１ｍｍに改善した。
【０１６０】
【表７】
2019527053.tif 000008
【０１６１】
実施例２２：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の投与に伴う臓器毒性は存在しない
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３投与に伴う臓器毒性を特徴付けるための病理組織学的試験を実施した。野生型マウス（１用量当たり６匹の雄および６匹の雌）にＰＢＳ、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週１回、２．５ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回、または１０ｍｇ／ｋｇのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３を週２回投与した。調査臓器は、腎臓、皮膚、唾液腺、下顎リンパ節、胆嚢、脾臓、膵臓、肺、心臓、大動脈、空腸、結腸、および肝臓を含んだ。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の用量のいずれかを投与された野生型マウス中の臓器毒性を示す病理組織学的結果は存在しなかった。これらの結果は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の１０ｍｇ／ｋｇまでの週２回の投与に伴う毒性が存在しないことを示す。
【０１６２】
実施例２３：線維芽細胞成長因子に対するｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の結合親和性の測定
本発明者らは、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）リガンドに結合し、膜結合ＦＧＦＲ３へのＦＧＦの結合を妨害するためのデコイとして作用することを決定した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴を実施して固定化ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３への異なるヒトＦＧＦ（ｈＦＧＦ）結合についてのＫｄ値を測定した。特に、ｈＦＧＦ１（図１９Ａ）、ｈＦＧＦ２（図１９Ｂ）、ｈＦＧＦ９（図１９Ｃ）、およびｈＦＧＦ１８（図１９Ｄ）の傍分泌ｈＦＧＦならびにｈＦＧＦ１９（図１９Ｅ）およびｈＦＧＦ２１（図１９Ｆ）の内分泌ｈＦＧＦについてのＫｄ値を測定した。４つ全ての傍分泌ＦＧＦリガンドは、ナノモル濃度（ｎＭ）の親和性でｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３に結合した（表８）。
【０１６３】
【表８】
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【０１６４】
ＦＧＦ２およびＦＧＦ１８について、結合親和性の最も直接的なモデルである１：１結合モデルで良好なフィットが達成された。このモデルは、単一のオンおよびオフ速度で異なるＦＧＦに結合する固定化ＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３を有するチップの表面における１：１結合相互作用：Ａ＋Ｂ＝ＡＢを説明する。２：１モデルも、ＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３へのＦＧＦ結合の１：１相互作用を説明するが、複合体を安定化させる立体構造変化：Ａ＋Ｂ＝ＡＢ＝ＡＢ＊も想定し、２つのオンおよびオフ速度を表す。このモデルは、立体構造的に変化した複合体（ＦＧＦに結合したＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３）が、立体構造変化を逆転させることによってのみ解離し得ることを想定する。２：１モデルを極めて十分にフィットさせるようにｈＦＧＦ１、ｈＦＧＦ９、ｈＦＧＦ１９、およびｈＦＧＦ２１についての実験データを測定し、したがって、ｈＦＧＦ１、ｈＦＧＦ９、ｈＦＧＦ１９、およびｈＦＧＦ２１についてのＫｄをその２：１モデルから導いた。
【０１６５】
ｈＦＧＦ１、ｈＦＧＦ９、ｈＦＧＦ１９、およびｈＦＧＦ２１が全て低いｎＭ範囲のＫｄを有するにもかかわらず、それらのｈＦＧＦのカイネティックプロファイルは有意に異なった。例えば、ＦＧＦ１は、極めて速いオン速度およびオフ速度でｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３に結合する一方、ＦＧＦ２は、ＦＧＦ１と同一の速さのオン速度またはオフ速度でｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３に結合せず、ＦＧＦ１と比較してＦＧＦ２についての全体的に小さいＫｄをもたらす（表８）。有意に低い親和性が、傍分泌ｈＦＧＦに対してｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３と、内分泌ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９サブファミリーのメンバーであるｈＦＧＦ１９またはｈＦＧＦ２１との間で計測された（表８ならびに図１９Ｄおよび１９Ｅ）。ＦＧＦ１５／ＦＧＦ１９サブファミリーは、補因子としてプロテオグリカンに代えてＫｌｏｔｈｏを使用し、代謝パラメータ、例えば、リン酸塩、胆汁酸、炭水化物、および脂質代謝の全身調節に重要な内分泌作用成長因子に進化した。
【０１６６】
これらの結果は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３と、ｈＦＧＦ１、ｈＦＧＦ２、ｈＦＧＦ９、およびｈＦＧＦ１８との間の高い親和性相互作用が存在した一方、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３と、ＦＧＦ１９およびＦＧＦ２１との間の低い親和性相互作用が存在したことを実証する。ＦＧＦ１９およびＦＧＦ２１についてのｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の低い親和性は、有利である。それというのも、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３は、インビボでそれらのＦＧＦの機能を干渉する低い確率を有するためである。
【０１６７】
実施例２４：ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３のインビトロ増殖アッセイ
ＦＧＦの結合後、ＦＧＦＲ３は二量体化してシグナリングカスケードを開始する。いくつかの下流シグナリング経路がＦＧＦシグナリングに関連する。軟骨細胞において、二量体化ＦＧＦＲ３は、軟骨細胞への抗増殖シグナル／早期分化シグナルをもたらし、それが最終的に骨成長の阻害をもたらす。例えば、ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路は、増殖、最終分化、および有糸分裂後マトリックス合成に負の影響を与えるためのシグナルを伝播し、ＳＴＡＴ１経路は、細胞周期調節因子ｐ１０７および１３０ならびに細胞周期阻害因子ｐ２１Ｗａｆ／Ｃｉｐ１と協調して軟骨細胞増殖の阻害を媒介する。遺伝子発現試験は、多数の他の経路も成長促進分子の下方調節または抗増殖機能の誘導に関与することを示唆する。
【０１６８】
軟骨細胞モデルにおけるＦＧＦＲ３Ｇ３８０ＲのＦＧＦＲ３デコイ誘導阻害を試験するため、ＦＧＦＲ３ａｃｈ突然変異を過剰発現するように遺伝子改変されたＡＴＤＣ５細胞（ＡＴＤＣ５  ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ細胞）の増殖に対するｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４−Ｄ３の効果を測定するための試験を実施した。軟骨細胞系ＡＴＤＣ５細胞は、最初に分化奇形癌幹細胞系ＡＴ８０５から単離され、一般に、インビトロ軟骨細胞研究用モデルとして使用される。ＡＴＤＣ５細胞は、最初にレトロウイルス発現ベクターにより感染され、ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒを発現する安定細胞系が生成された。ＡＴＤＣ５細胞系中でのＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒの発現をウエスタンブロットを介して測定した（図２０）。耐性細胞選択後の第１継代（Ｇ３８０Ｒ＃１）および第２継代（Ｇ３８０Ｒ＃２）におけるＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒを発現するＡＴＤＣ５細胞の抽出物ならびに対照ＡＴＤＣ５細胞の抽出物をブロットし、ＦＧＦＲ３の総リン酸化（ｐＦＧＦＲ３）、ＦＧＦＲ３中の規定のホスホチロシン７２４（ｐＦＧＦＲ３  Ｙ７２４）、および総ＦＧＦＲ３発現（ＦＧＦＲ３）について抗体により検出した。総細胞外シグナル関連キナーゼ発現をローディング対照（ＥＲＫ）として使用した。ＡＴＤＣ５  ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ細胞へのＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３の添加は、ＡＴＤＣ５  ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ細胞の増殖指数を２倍だけ用量依存的に増加させ、ＥＣ５０は１．２５＋／−０．２７ｎＭであった（図２１）。これらの結果は、ＡＴＤＣ５  ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ細胞へのＳＦＧＦＲ３＿ＤＥＬ４−Ｄ３の添加が軟骨無形成症の細胞モデルにおいてＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒにより媒介される負の成長シグナルを克服し、軟骨細胞中でＦＧＦＲ３により媒介される抗増殖シグナルと一致し、それは、軟骨細胞がＧ３８０Ｒ突然変異を含むＦＧＦＲ３を発現する場合により傑出していることを実証する。
【０１６９】
他の実施形態
上記明細書に挙げられる全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により全体として組み込まれることが具体的および個別的に示されるのと同一の程度に参照して本明細書に組み込まれる。本発明の記載の方法、医薬組成物、およびキットの種々の改変および変形は、本発明の範囲および主旨から逸脱せずに当業者に明らかである。本発明を具体的な実施形態と関連付けて記載してきたが、それがさらに改変され得ることおよび特許請求される本発明がそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解される。実際、当業者に明らかな記載の本発明の実施方式の種々の改変は、本発明の範囲であるものとする。本出願は、一般に、本発明の原理に従って本発明の任意の変形、使用、または適合を包含し、本開示からのそのような逸脱は、本発明が属する分野内の公知の慣習的な実務の範囲内に収まるものとし、本明細書に上記の必須の特徴部に適用することができる。
【図１Ａ】
2019527053.tif 000010
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−１】
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【図９Ｂ−２】
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【図９Ｃ−１】
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【図９Ｃ−２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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