(57)【要約】  ＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤、および肺動脈高血圧の１つまたは複数の症状または生殖器の癌の１つまたは複数の症状の処置、予防、または軽減におけるその使用が、本明細書において提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＴＡＲ抗体および緩衝液を含む、ＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤であって、約５〜７の範囲のｐＨを有する製剤。
【請求項２】
前記ＥＴＡＲ抗体が、１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号３０；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、および配列番号４８；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、および配列番号６８；
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、および配列番号９０；
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、および配列番号１１４；および
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６
から選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記ＥＴＡＲ抗体が、１または２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号３０；および
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、および配列番号９０
から選択される、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
前記ＥＴＡＲ抗体が、１または２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、および配列番号４８；および
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、および配列番号１１４
から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
前記ＥＴＡＲ抗体が、１または２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、および配列番号６８；および
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６
から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
前記ＥＴＡＲ抗体が、１または２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：配列番号８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、および配列番号６８から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
前記ＥＴＡＲ抗体が、１または２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：配列番号７０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
前記ＥＴＡＲ抗体が、以下のリスト：配列番号５０および配列番号１１６、配列番号６２および配列番号１２８、配列番号６２および配列番号１３０、配列番号６４および配列番号１３２、配列番号６６および配列番号１３４、および配列番号６８および配列番号１３６から独立して選択される、軽鎖および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列の組合せを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
前記ＥＴＡＲ抗体が、１または２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列：配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、および配列番号１６４；および
ｂ．重鎖可変ドメインのアミノ酸配列：配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、および配列番号１９２
から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
前記ＥＴＡＲ抗体のポリヌクレオチドコード配列が、１または２つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで、各ポリヌクレオチド配列が、独立して、以下に列挙されるポリヌクレオチド配列：
ａ．軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列：配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、および配列番号１６３；および
ｂ．重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列：配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、および配列番号１９１
から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
前記ＥＴＡＲ抗体が、以下のリスト：配列番号１３８および配列番号１６６、配列番号１４０および配列番号１６８、配列番号１４２および配列番号１７０、配列番号１４４および配列番号１７２、配列番号１４６および配列番号１７４、配列番号１４８および配列番号１７６、配列番号１５０および配列番号１７８、配列番号１５２および配列番号１８０、配列番号１５４および配列番号１８２、配列番号１５６および配列番号１８４、配列番号１５８および配列番号１８６、配列番号１６０および配列番号１８８、配列番号１６２および配列番号１９０、および配列番号１６４および配列番号１９２から独立して選択される、アミノ酸配列の組合せを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２】
前記ＥＴＡＲ抗体が、以下のリスト：配列番号１３８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、および配列番号１６４から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３】
前記ＥＴＡＲ抗体が、以下のリスト：配列番号１６６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、および配列番号１９２から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４】
前記ＥＴＡＲ抗体が、以下のリスト：配列番号１３８および配列番号１６６、配列番号１５０および配列番号１７８、配列番号１５２および配列番号１８０、配列番号１５４および配列番号１８２、配列番号１５６および配列番号１８４、配列番号１５８および配列番号１８６、配列番号１６０および配列番号１８８、配列番号１６２および配列番号１９０、および配列番号１６４および配列番号１９２から独立して選択される、軽鎖および重鎖可変ドメインのアミノ酸配列の組合せを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５】
前記ＥＴＡＲ抗体が、アミノ酸配列  配列番号１３８または配列番号１６６を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１６】
前記ＥＴＡＲ抗体が、アミノ酸配列  配列番号１３８および配列番号１６６の組合せを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１７】
前記ＥＴＡＲ抗体が、１または２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列：配列番号１９４および配列番号１９６；および
ｂ．重鎖定常ドメインのアミノ酸配列：配列番号１９８
から選択される、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１８】
前記ＥＴＡＲ抗体が、マウスＥＴＡＲ抗体またはヒト化ＥＴＡＲ抗体を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１９】
前記ＥＴＡＲ抗体が、モノクローナルＥＴＡＲ抗体を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２０】
前記ＥＴＡＲ抗体が、モノクローナル抗体を含み、前記モノクローナル抗体が、配列番号１３８および配列番号１６６、配列番号１５０および配列番号１７８、配列番号１５２および配列番号１８０、配列番号１５４および配列番号１８２、配列番号１５６および配列番号１８４、配列番号１５８および配列番号１８６、配列番号１６０および配列番号１８８、配列番号１６２および配列番号１９０、または配列番号１６４および配列番号１９２を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２１】
前記ＥＴＡＲ抗体が、エンドセリンのシグナル伝達を低減する際に、約１ｎＭ〜２００ｎＭまたは１０ｎＭ〜１００ｎＭの範囲のＩＣ５０を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２２】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬまたは１０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２３】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、または１００ｍｇ／ｍＬである、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２４】
前記緩衝液の濃度が、約１ｍＭ〜２００ｍＭ、２ｍＭ〜５０ｍＭ、または５ｍＭ〜２５ｍＭの範囲である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２５】
前記緩衝液の濃度が、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、または３０ｍＭである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２６】
前記緩衝液が、クエン酸の塩またはヒスチジンを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２７】
界面活性剤をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２８】
前記界面活性剤が、ポリソルベートを含む、請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０を含む、請求項２７または２８に記載の製剤。
【請求項３０】
前記界面活性剤の濃度が、約０．００１〜１重量／体積パーセント、０．０１〜０．５重量／体積パーセント、または０．０１〜０．１重量／体積パーセントの範囲である、請求項２７または２９に記載の製剤。
【請求項３１】
前記界面活性剤の濃度が、約０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、または０．０６重量／体積パーセントである、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３２】
アミノ酸保護剤をさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３３】
前記アミノ酸保護剤が、アルギニンまたはその塩を含む、請求項３２に記載の製剤。
【請求項３４】
前記アミノ酸保護剤が、アルギニン塩酸塩を含む、請求項３２または３３に記載の製剤。
【請求項３５】
前記アミノ酸保護剤の濃度が、約１ｍＭ〜５００ｍＭまたは１０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲である、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３６】
前記アミノ酸保護剤の濃度が、約１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、または１６０ｍＭである、請求項３５に記載の製剤。
【請求項３７】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲であり；前記界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントの範囲であり；前記アミノ酸保護剤の濃度が、約１０〜２００ｍＭの範囲であり；前記緩衝液の濃度が、約１〜５０ｍＭの範囲であり；ここで、前記製剤のｐＨが、約５〜７の範囲である、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３８】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍＬであり；前記界面活性剤の濃度が、約０．０４重量／体積パーセントであり；前記アミノ酸保護剤の濃度が、約１４０ｍＭであり；前記緩衝液の濃度が、約２０ｍＭであり；ここで、前記製剤のｐＨが、約５〜６の範囲である、請求項３７に記載の製剤。
【請求項３９】
ポリオール保護剤をさらに含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の安定した溶液製剤。
【請求項４０】
前記ポリオール保護剤が、ソルビトール、マンニトール、スクロース、またはトレハロースを含む、請求項３９に記載の製剤。
【請求項４１】
前記ポリオール保護剤が、ソルビトール、マンニトール、またはスクロースを含む、請求項３９または４０に記載の製剤。
【請求項４２】
前記ポリオール保護剤の濃度が、約０．１〜５０重量／体積パーセント、１〜２０重量／体積パーセント、または１〜１０重量／体積パーセントの範囲である、請求項３９または４１に記載の製剤。
【請求項４３】
前記ポリオール保護剤の濃度が、約４〜１０重量／体積パーセントの範囲である、請求項４２に記載の製剤。
【請求項４４】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲であり；前記界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントの範囲であり；前記ポリオール保護剤の濃度が、約１〜２０重量／体積パーセントの範囲であり；前記緩衝液の濃度が、約１〜５０ｍＭの範囲であり；ここで、前記製剤のｐＨが、約５〜７の範囲である、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４５】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍＬであり；前記界面活性剤の濃度が、約０．０４重量／体積パーセントであり；前記ポリオール保護剤の濃度が、約４〜１０重量／体積パーセントの範囲であり；前記緩衝液の濃度が、約２０ｍＭであり；ここで、前記製剤のｐＨが、約５〜６の範囲である、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４６】
金属キレート剤をさらに含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４７】
前記金属キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、またはエチレングリコールジエチルエーテルジアミン四酢酸を含む、請求項４６に記載の製剤。
【請求項４８】
前記金属キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸を含む、請求項４７に記載の製剤。
【請求項４９】
前記金属キレート剤の濃度が、約０．００１ｍＭ〜１ｍＭ、０．００５ｍＭ〜０．５ｍＭ、または０．０１ｍＭ〜０．２ｍＭの範囲である、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５０】
前記金属キレート剤の濃度が、約０．０３ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、または０．０７ｍＭである、請求項４９に記載の製剤。
【請求項５１】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲であり；前記金属キレート剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜０．２ｍＭの範囲であり；前記界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントの範囲であり；前記アミノ酸保護剤の濃度が、約１０〜２００ｍＭの範囲であり；前記緩衝液の濃度が、約１〜５０ｍＭの範囲であり；ここで、前記製剤のｐＨが、約５〜７の範囲である、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５２】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍＬであり；前記金属キレート剤の濃度が、約０．０５ｍＭであり；前記界面活性剤の濃度が、約０．０４重量／体積パーセントの範囲であり；前記アミノ酸保護剤の濃度が、約１４０ｍＭであり；前記緩衝液の濃度が、約２０ｍＭであり；ここで、前記製剤のｐＨが、約５〜６の範囲である、請求項５１に記載の製剤。
【請求項５３】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲であり；前記金属キレート剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜０．２ｍＭの範囲であり；前記界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントの範囲であり；前記ポリオール保護剤の濃度が、約１〜２０重量／体積パーセントの範囲であり；前記緩衝液の濃度が、約１〜５０ｍＭの範囲であり；ここで、前記製剤のｐＨが、約５〜７の範囲である、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５４】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍＬであり；前記金属キレート剤の濃度が、約０．０５ｍＭであり；前記界面活性剤の濃度が、約０．０４重量／体積パーセントであり；前記ポリオール保護剤の濃度が、約４〜１０重量／体積パーセントの範囲であり；前記緩衝液の濃度が、約２０ｍＭであり；ここで、前記製剤のｐＨが、約５〜６の範囲である、請求項５３に記載の製剤。
【請求項５５】
酸化防止剤をさらに含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５６】
前記酸化防止剤が、メチオニン、ビタミンＣ、チオサルフェート、チオサルフェート、またはベンジルメチオニンを含む、請求項５５に記載の製剤。
【請求項５７】
前記酸化防止剤が、メチオニンを含む、請求項５５または５６に記載の製剤。
【請求項５８】
前記酸化防止剤の濃度が、約０．５ｍＭ〜２０ｍＭまたは１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５９】
前記酸化防止剤の濃度が、約３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、または７ｍＭである、請求項５８に記載の製剤。
【請求項６０】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲であり；前記酸化防止剤の濃度が、約１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲であり；前記界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントの範囲であり；前記アミノ酸保護剤の濃度が、約１０〜２００ｍＭの範囲であり；前記緩衝液の濃度が、約１〜５０ｍＭの範囲であり；ここで、前記製剤のｐＨが、約５〜７の範囲である、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６１】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍＬであり；前記酸化防止剤の濃度が、約５ｍＭであり；前記界面活性剤の濃度が、約０．０４重量／体積パーセントであり；前記アミノ酸保護剤の濃度が、約１４０ｍＭであり；前記緩衝液の濃度が、約２０ｍＭであり；ここで、前記製剤のｐＨが、約５〜６の範囲である、請求項６０に記載の製剤。
【請求項６２】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲であり；前記酸化防止剤の濃度が、約１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲であり；前記界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントの範囲であり；前記ポリオール保護剤の濃度が、約１〜２０重量／体積パーセントの範囲であり；前記緩衝液の濃度が、約１〜５０ｍＭの範囲であり；ここで、前記製剤のｐＨが、約５〜７の範囲である、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６３】
前記ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍＬであり；前記酸化防止剤の濃度が、約５ｍＭであり；前記界面活性剤の濃度が、約０．０４重量／体積パーセントの範囲であり；前記ポリオール保護剤の濃度が、約４〜１０重量／体積パーセントの範囲であり；前記緩衝液の濃度が、約２０ｍＭの範囲であり；ここで、前記製剤のｐＨが、約５〜６の範囲である、請求項６２に記載の製剤。
【請求項６４】
前記製剤が、水溶液である、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６５】
前記製剤が、２〜８℃で１２ヶ月間の貯蔵後に、約１０％以下の凝集ＥＴＡＲ抗体を含有する、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６６】
抗体の分解度が、２〜８℃で１２ヶ月間の貯蔵後に、約１０％を超えない、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６７】
前記ＥＴＡＲ抗体の生物学的活性が、２〜８℃で１２ヶ月間の貯蔵後に、元の生物学的活性の５０％以上である、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６８】
被験体の肺動脈高血圧の１つまたは複数の症状を処置、予防、または軽減する方法であって、治療有効量の請求項１〜６７のいずれか一項に記載の製剤を、前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項６９】
被験体の肺動脈圧の上昇と関連する疾患の１つまたは複数の症状を処置、予防、または軽減する方法であって、治療有効量の請求項１〜６７のいずれか一項に記載の製剤を、前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項７０】
被験体の生殖器の癌の１つまたは複数の症状を処置、予防、または軽減する方法であって、治療有効量の請求項１〜６７のいずれか一項に記載の製剤を、前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項７１】
前記生殖器の癌が、肺動脈圧の上昇を伴う生殖器の癌である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記被験体がヒトである、請求項７８〜７１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７３】
前記製剤が、静脈内にまたは皮下に投与される、請求項７８〜７２のいずれか一項に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＥＴＡＲ抗体およびその医薬組成物、例えば、ＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤が、本明細書において提供される。肺動脈高血圧の１つまたは複数の症状または生殖器の癌の１つまたは複数の症状を処置、予防、または軽減する方法も、本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００２】
エンドセリン（ＥＴ）は、心血管系の生物学的機能の恒常性および調節にとって重要な血管収縮ペプチドホルモンである。ＥＴは、内皮だけでなく、多くの他の組織および細胞型においても見られる（Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８６：４８５−４９８）。ＥＴは、そのＮ末端に、１番目および１５番目のシステイン残基および３番目および１１番目のシステイン残基をそれぞれ連結する２つのジスルフィド結合を有する２１アミノ酸の２，４００Ｄａペプチドである。そのＣ末端は、疎水性アミノ酸残基を含む。そのＮ末端構造は、その受容体に結合するのに重要である一方、そのＣ末端構造は、受容体が結合する場所として重要である。ＥＴは、３つのアイソフォーム：ＥＴ−１、ＥＴ−２およびＥＴ−３を有する。それらは、少しのアミノ酸残基が異なる。ＥＴ−１は、心血管系の生物学的機能の調節に主な役割を果たす。刺激すると、内皮細胞は、ＥＴ−１を合成し、放出する。ＥＴ−１は、主に、転写レベルで調節される。
【０００３】
エンドセリン受容体（ＥＴＲ）は、２つのアイソフォーム：ＥＴＡＲおよびＥＴＢＲを有し、これらは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーに属する。刺激すると、ＥＴＡＲは、膜Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（ＮＣＸ）およびＮａ＋／Ｈ＋交換輸送体（ＮＨＥ）を活性化して、細胞内Ｃａ２＋濃度を増加させ、筋繊維をＣａ２＋に対して感受性にして、血管平滑筋および心筋の収縮をもたらす（Ｎｅｙｌｏｎ，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６：１４９−１５３）。ＥＴＡＲと異なり、ＥＴＢＲは、主に、血管平滑筋細胞および心筋細胞を弛緩させる（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ３：１１０−１１３）。
【０００４】
ＥＴＡＲは、ＧＰＣＲファミリーＡに属し、７つの膜貫通ドメインを有する。細胞外ドメインは、短くかつ小さく、完全長受容体の約７分の１を占めるに過ぎない一方、ＧＰＣＲ抗体は、その細胞外ドメインのみを標的にし得る。したがって、ＧＰＣＲは、構造的特徴および天然で低い発現レベルにより、生物学的に活性な抗原を産生するのは難しい。
【０００５】
肺動脈高血圧（ＰＡＨ）は、肺動脈不全および心臓の血圧の代償的増加を引き起こす、肺または肺に関連した血管系の血管収縮に起因する。顕微鏡スケールで、内膜線維症、中膜肥厚、および叢状病変を含む、小肺動脈の変化があるように見え、これらは、弾性および小肺動脈のインサイチュ血栓を引き起こし、全肺血管系における血液循環抵抗を増大させる（Ｓｉｍｏｎｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４３：５Ｓ−１２Ｓ；Ｂａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４３：４０Ｓ−４７Ｓ）。ＰＡＨは、身体障害または死亡の率がかなり高い疾患である。ＰＡＨは、患者の健康に深刻な影響を与え、社会にかなりの負担を課す深刻な疾患である。
【０００６】
ＰＡＨの重症度は、関連する心臓奇形の程度に依存し、二次的ＰＡＨをもたらす一般的な先天性心臓異常としては、大動脈弁狭窄症、大動脈肺動脈窓、心房中隔欠損、完全型房室中隔欠損、動脈縮窄、拡張型心筋症、両大血管右室起始症、肥大型心筋症、僧帽弁狭窄症、動脈管開存症、単心室、総動脈幹遺残症、および心室中隔欠損が挙げられる。ＰＡＨは、主に、肺動脈および右心に影響を与え、右心室肥大、右心房拡張、肺動脈幹の拡張、およびまばらな周囲の肺細動脈を引き起こす。肺細動脈の内皮および平滑筋細胞の肥大は、内膜線維症、中膜肥厚、内腔狭窄、閉塞または変形、および神経叢の変化（ｐｌｅｘｕｓ  ｃｈａｎｇｅ）をもたらす。内膜線維症および内腔閉塞は、肺小静脈も冒し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＥＴＡＲアンタゴニストが、エンドセリンによって引き起こされる血管圧の上昇を効果的に阻止して、ＰＡＨ症状を改善し、ＰＡＨ患者の運動能力および血行動態を改善することができることが示されている（Ｓｅｒａｓｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．５：１８４−９５）。本明細書において提供される抗体は、ヒトＥＴＡＲに特異的に結合し、動物モデルの肺動脈圧を軽減することができる。それは、動物モデルのＰＡＨの症状を著しく改善することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＥＴＡＲ抗体およびその医薬組成物、例えば、ＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤が、本明細書において提供される。肺動脈高血圧の１つまたは複数の症状または生殖器の癌の１つまたは複数の症状を処置、予防、または軽減する方法も、本明細書において提供される。
【０００９】
本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号３０；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、および配列番号４８；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、および配列番号６８；
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、および配列番号９０；
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、および配列番号１１４；および
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６
から選択される。
【００１０】
本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体と、１つまたは複数の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物も、本明細書において提供される。
【００１１】
本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体および緩衝液を含む、ＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤が、本明細書において提供される。
【００１２】
被験体の肺動脈高血圧の１つまたは複数の症状を処置、予防または軽減する方法であって、治療有効量の本明細書において提供される医薬組成物、例えば、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤を、被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【００１３】
被験体の肺動脈圧の上昇と関連する疾患の１つまたは複数の症状を処置、予防、または軽減する方法であって、治療有効量の本明細書において提供される医薬組成物、例えば、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤を、被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【００１４】
被験体の生殖器の癌の１つまたは複数の症状を処置、予防、または軽減する方法であって、治療有効量の本明細書において提供される医薬組成物、例えば、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤を、被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【００１５】
肺動脈高血圧、肺動脈圧の上昇と関連する疾患、または生殖器の癌を処置するためのキットであって、本明細書において提供される医薬組成物を含むキットが、本明細書において提供される。
【００１６】
肺動脈高血圧、肺動脈圧の上昇と関連する疾患、または生殖器の癌を処置するための薬剤の製造における本明細書において提供される医薬組成物の使用が、本明細書において提供される。
【００１７】
本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離核酸が、本明細書において提供される。
【００１８】
本明細書において提供される核酸を含む組み換え発現ベクターが、本明細書において提供される。
【００１９】
本明細書において提供されるベクターを含む宿主細胞が、本明細書において提供される。
【００２０】
ＥＴＡＲ抗体を産生するための方法であって、本明細書において提供される抗体を発現するのに好適な条件下で宿主細胞を培養することを含む方法が、本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ＥＴＡＲ細胞（図中でＣＨＯ−ＥＴＡＲとして表示される）に結合するハイブリドーマの上清のＥＬＩＳＡスクリーニング結果を示す。中でも特に、ＥＴＡＲ抗体Ａ−１（配列番号１３８および配列番号１６６を含む）が、ハイブリドーマクローン１５Ｆ３から得られた。
【図２】ＦＡＣＳによって決定した際のヒトＥＴＡＲへの組み換えＥＴＡＲ抗体（Ａ−１、Ａ−２（配列番号１４０および配列番号１６８を含む）、Ａ−７（配列番号１５０および配列番号１７８を含む）、およびＡ−１２（配列番号１６０および配列番号１８８を含む））の特異的結合を示す。灰色のピークおよび点線のピークは、陰性対照であり、点線のピークは、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−に対するＥＴＡＲ抗体の結合曲線を表し、実線のピークは、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ＥＴＡＲに対するＥＴＡＲ抗体の結合曲線を表す。
【図３】カルシウム流出アッセイを用いて決定した際の細胞内のＥＴＡＲ媒介性Ｃａ２＋変化に対するハイブリドーマの上清の阻害効果を示す。
【図４】カルシウム流出アッセイを用いて決定した際のヒトＥＴＡＲの阻害に対する組み換えＥＴＡＲ抗体の用量反応を示す（ＩＣ５０＝３７．９１ｎＭ、Ｒ２＝０．９７）（Ａ−１）；（ＩＣ５０＝８７．８４ｎＭ、Ｒ２＝０．９７）（Ａ−９（配列番号１５４および配列番号１８２を含む））。
【図５】低酸素誘発性ＰＡＨカニクイザルモデルにおける組み換えＥＴＡＲ（Ａ−１）のインビボ活性を示す。Ａ−１は、低酸素誘発性肺動脈収縮期圧（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を著しく低下させることができ、また経時的な肺動脈収縮期圧の曲線下の面積によって測定した際に９６時間以内に有効であることが分かった。
【図６】ＥＴＡＲ抗体Ａ−１（２５ｍｇ／ｍＬ）の生物学的活性が、ｐＨ５．８および４℃で、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１４０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、および０．０４％のＴＷＥＥＮ−８０を含有する製剤溶液中での３ヶ月の貯蔵後にそれほど変化しなかったことを示す。
【図７】ＥＴＡＲ抗体Ａ−１（２５ｍｇ／ｍＬ）の生物学的活性が、ｐＨ５．８および２５℃で、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１４０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、および０．０４％のＴＷＥＥＮ−８０を含有する製剤溶液中での３ヶ月の貯蔵後にそれほど変化しなかったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本明細書において特に定義されない限り、本明細書において示される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。一般に、薬理学、生物学、生化学、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して、本明細書において示される命名法および技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。
【００２３】
本明細書において示される標準的な一文字または三文字略語は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を表す。特に規定されない限り、ポリペプチド配列は、左側にそれらのアミノ末端および右側にそれらのカルボキシル末端を有し、一本鎖核酸配列および二本鎖核酸配列の上鎖（ｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ）は、左側にそれらの５’末端および右側にそれらの３’末端を有する。ポリペプチドの特定の部分は、アミノ酸８０〜１３０などのアミノ酸残基数によって、またはＬｙｓ８０〜Ｌｙｓ１３０などの対応する実際の残基と組み合わせて示され得る。特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、参照配列との相違を示すことによって表すこともできる。
【００２４】
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はそれぞれ、ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。これらの用語は、例えば、天然および人工タンパク質、タンパク質フラグメントおよびタンパク質配列のポリペプチド類似体（突然変異タンパク質、変異体、および融合タンパク質など）ならびに翻訳後、あるいは共有結合的にまたは非共有結合的に修飾されたタンパク質を包含する。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、モノマーまたはポリマーであり得る。
【００２５】
「ポリペプチドフラグメント」という用語は、対応する完全長タンパク質と比較して、アミノ末端および／またはカルボキシル末端欠失を有するポリペプチドを指す。フラグメントは、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸長であり得る。フラグメントはまた、例えば、多くとも１，０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１、または１０アミノ酸長であり得る。フラグメントは、その末端のいずれかまたは両方において、１つまたは複数のさらなるアミノ酸、例えば、異なる天然タンパク質からのアミノ酸の配列（例えば、Ｆｃまたはロイシンジッパードメイン）または人工アミノ酸配列（例えば、人工リンカー配列）をさらに含み得る。
【００２６】
本開示のポリペプチドは、任意の方法および任意の理由で、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するように感受性を改変し、（４）結合親和性を改変し、（４）他の物理化学的または機能的特性を与え、調節するように修飾されたポリペプチドを含む。類似体は、ポリペプチドの突然変異タンパク質を含む。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）は、天然配列中で行われ得る（例えば、分子間接触を形成するドメインの外部のポリペプチドの部分において）。「保存的アミノ酸置換」は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させないものである（例えば、アミノ酸の置換は、親配列に存在するヘリックスを破壊すべきでなく、または親配列を特徴付けるかもしくはその機能性のために必要とされる他のタイプの二次的な構造を破壊すべきでない）。
【００２７】
ポリペプチドの「変異体」は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、別のポリペプチド配列と比べて、そのアミノ酸配列に挿入され、それから欠失されおよび／またはそれに置換されるアミノ酸配列を含む。本開示の変異体は、融合タンパク質を含む。
【００２８】
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、リン酸化、およびグリコシル化などの、例えば別の化学部分への結合によって化学修飾されたポリペプチドである。
【００２９】
特に示されない限り、「抗体」という用語は、２つの完全長重鎖および２つの完全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、フラグメント、および突然変異タンパク質を含み、その例は後述される。
【００３０】
「抗体」は、抗原に結合する部分、および任意選択的に、抗原への抗体の結合を促進する立体配座を抗体が取るのを可能にする足場またはフレームワーク部分を含むタンパク質である。抗体の例としては、抗体、抗体フラグメント（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体、および抗体類似体が挙げられる。抗体は、例えば、グラフト化ＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を含む、代替的なタンパク質足場または人口足場を含み得る。このような足場としては、限定はされないが、例えば、抗体の三次元構造を安定させるために導入された変異を含む、抗体由来の足場、ならびに例えば、生体適合性ポリマーを含む、完全に合成の足場が挙げられる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，５３：１２１−１２９；Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４を参照されたい。さらに、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）、ならびに足場としてフィブロネクチン成分を用いる抗体模倣体に基づく足場が使用され得る。
【００３１】
抗体は、例えば、天然免疫グロブリンの構造を有し得る。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然免疫グロブリンにおいて、各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う、約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシル末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを画定する。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合される。重鎖は、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（あらゆる目的のために、全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【００３２】
天然免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を示す。Ｎ末端からＣ末端へと、軽鎖および重鎖の両方は、領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各領域へのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１の定義にしたがう。
【００３３】
特に規定されない限り、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン、または特異的結合についてインタクトな抗体と競合する、その抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術によってまたはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生され得る。抗原結合部分としては、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むフラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、およびポリペプチドへの特異的抗原結合を与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。
【００３４】
Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１領域を有する一価フラグメントであり；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを有する二価フラグメントであり；Ｆｄフラグメントは、ＶＨおよびＣＨ１領域を有し；ｄＡｂフラグメントは、ＶＨ領域、ＶＬ領域、またはＶＨもしくはＶＬ領域の抗原結合フラグメントを有する（米国特許第６８４６６３４号明細書、同第６６９６２４５号明細書、米国特許出願公開第０５／０２０２５１２号明細書、同第０４／０２０２９９５号明細書、同第０４／００３８２９１号明細書、同第０４／０００９５０７号明細書、同第０３／００３９９５８号明細書、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）。
【００３５】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して連結されて、連続タンパク質鎖を形成する抗体であり、ここで、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体で折り畳まれて、一価抗原結合部位を形成するのを可能にするのに十分に長い（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３を参照）。二重特異性抗体は、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、ここで、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の２つの領域間で対形成するのを可能にするには短過ぎ、したがって、各領域が別のポリペプチド鎖上の相補的領域と対形成するのを可能にするリンカーによって結合されたＶＨおよびＶＬ領域を含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−４８、およびＰｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−２３を参照）。二重特異性抗体の２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対形成から生じる二重特異性抗体は、２つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いて、２つの異なる抗原結合部位を有する二重特異性抗体を作製することができる。同様に、三重特異性抗体および四重特異性抗体は、それぞれ３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、同じかまたは異なり得る、それぞれ３つおよび４つの抗原結合部位を形成する抗体である。
【００３６】
所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）が、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２，１９９１によって記載されるシステムを用いて同定され得る。１つまたは複数のＣＤＲを、共有結合的または非共有結合的に分子中に組み込んで、それを抗体にし得る。抗体は、より大きいポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを組み込むことができ、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結することができ、またはＣＤＲを非共有結合的に組み込むことができる。ＣＤＲは、抗体が、該当する特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
【００３７】
抗体は、１つまたは複数の結合部位を有し得る。２つ以上の結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一であってもまたは異なっていてもよい。例えば、天然ヒト免疫グロブリンは、典型的に、２つの同一の結合部位を有する一方、「二重特異性」または「二機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【００３８】
「マウス抗体」という用語は、マウス免疫グロブリン配列に由来する１つまたは複数の可変および定常領域を有する全ての抗体を含む。
【００３９】
「ヒト化抗体」という用語は、マウス抗体分子の相補性決定領域配列を、ヒト抗体可変領域フレームワークにグラフトすることによって産生される抗体を指す。
【００４０】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、または「抗体結合部位」という用語は、抗原と相互作用し、抗原に対する抗体の特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含む抗体の部分である。それらの抗原に特異的に結合する抗体については、これは、そのＣＤＲ領域の少なくとも１つの少なくとも一部を含む。
【００４１】
「エピトープ」という用語は、抗体によって（例えば、抗体によって）結合される分子の部分である。エピトープは、分子の非隣接部分（例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチドの一次配列において隣接していないが、ポリペプチドの三次および四次構造に関して、抗体によって互いに結合されるのに十分に近いアミノ酸残基）を含み得る。
【００４２】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」は、そのデフォルトパラメータを用いて、ＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）の一部）を用いて配列を比較することによって決定される。
【００４３】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」という用語は、全体を通して同義的に使用され、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体（例えば、ペプチド核酸および非天然ヌクレオチド類似体）を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、ならびにそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。一実施形態において、本発明の核酸分子は、本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、もしくは変異体をコードする隣接オープンリーディングフレームを含む。
【００４４】
２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、ギャップを導入せず、いずれの配列の５’または３’末端においても対形成しないヌクレオチドを含まずに、一方のポリヌクレオチド中の全てのヌクレオチドが、他方のポリヌクレオチド中のその相補的ヌクレオチドと反対であるように、それらの配列が逆平行配向で整列可能である場合、互いに「相補的」である。ポリヌクレオチドは、２つのポリヌクレオチドが、中程度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズし得る場合、別のポリヌクレオチドに「相補的」である。したがって、ポリヌクレオチドは、その補体でなくても、別のポリヌクレオチドに相補的であり得る。
【００４５】
「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を、細胞内に導入するのに使用され得る核酸である。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、さらなる核酸セグメントを連結可能な直鎖状または環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクター（例えば、複製不全レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）であり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノム内に導入され得る。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自己複製可能である（例えば、細菌複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入によって宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。「発現ベクター」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を指令し得るベクターのタイプである。
【００４６】
ヌクレオチド配列は、制御配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、時期、または位置）に影響を及ぼす場合、制御配列に「操作可能に連結される」。「制御配列」は、それが操作可能に連結される核酸の発現（例えば、発現のレベル、時期、または位置）に影響を及ぼす核酸である。制御配列は、例えば、制御される核酸に対して直接、または１つまたは複数の他の分子（例えば、制御配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を介して、その効果を発揮し得る。制御配列の例としては、プロモータ、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。制御配列のさらなる例が、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥｎＺｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．およびＢａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３６０５−０６に記載されている。
【００４７】
「宿主細胞」という用語は、核酸、例えば、本発明の核酸を発現するのに使用され得る細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得るか、またはそれは、真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）またはハイブリドーマであり得る。典型的に、宿主細胞は、宿主細胞において後に発現され得るポリペプチドコード核酸で形質転換またはトランスフェクトされ得る培養細胞である。「組み換え宿主細胞」という語句は、発現される核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を示すのに使用され得る。宿主細胞はまた、核酸を含むが、制御配列が、核酸と操作可能に連結されるように宿主細胞中に導入されない限り、所望のレベルでその核酸を発現しない細胞であり得る。宿主細胞という用語が、特定の被験体の細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。例えば、突然変異または環境的影響のため、続く世代で特定の修飾が起こり得るため、このような子孫は、実際に、親細胞と同一でないことがあるが、なお、本明細書において使用される際、この用語の範囲内に含まれる。
【００４８】
エンドセリン受容体
エンドセリンＡ受容体（ＥＴＡＲ）は、ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を介して１つまたは複数の細胞内シグナル伝達経路に結合される７−膜貫通受容体のファミリーＡに属する（Ｊｅｌｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６１４−１６１６、Ｓｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．４：３０９−３１４）。本明細書において使用される際、「エンドセリン受容体」および「ＥＴＡＲ」は、同義的に使用される。
【００４９】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、細胞において発現される際に膜結合エンドセリン受容体に結合し、エンドセリン受容体を介してエンドセリンシグナル伝達を阻害または阻止するように選択され得る。一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合する。さらなる実施形態において、ヒトエンドセリン受容体に結合する抗体はまた、他の種、例えば、ラットのエンドセリン受容体に結合し得る。以下の例は、ヒト膜結合エンドセリン受容体に結合し、さらなる実施形態において、他の種のエンドセリン受容体に結合するマウス抗体を生成する一方法を提供する。
【００５０】
エンドセリン受容体のいくつかの種のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列が知られている。配列番号１〜配列番号６は、ヒト、サル、およびラットの配列を示す。配列データは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｅＢａｎｋデータベースから入手した。
【００５１】
エンドセリンＡ受容体：
ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））ポリヌクレオチド（配列番号１）；受託番号：Ｓ６３９３８。
ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））アミノ酸（配列番号２）；受託番号：ＡＡＢ２０２７８。
カニクイザル（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））ポリヌクレオチド（配列番号３）；受託番号：ＪＶ６３５７７１。
カニクイザル（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））アミノ酸（配列番号４）；受託番号：ＡＦＪ７１１１１。
ラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））ポリヌクレオチド（配列番号５）；受託番号：Ｍ６０７８６。
ラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））アミノ酸（配列番号６）；受託番号：ＡＡＡ４１１１４。
【００５２】
エンドセリン受容体Ａ（ＥＴＡＲ）抗体
一実施形態において、ＥＴＡＲ抗体（例えば、完全長抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体変異体、および抗体突然変異タンパク質）が、本明細書において提供される。
【００５３】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号３０；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、および配列番号４８；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、および配列番号６８；
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、および配列番号９０；
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、および配列番号１１４；および
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６
から選択される。
【００５４】
表１は、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列、ならびにそれらのポリヌクレオチドコード配列を列挙している。表２は、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、ならびにそれらのポリヌクレオチドコード配列を列挙している。
【００５５】
【表１】
2019523764.tif 000002
2019523764.tif 000003
2019523764.tif 000004
【００５６】
【表２】
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2019523764.tif 000007
【００５７】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、５、４、３、２または１つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失が、表１および表２に列挙されるＣＤＲ配列と異なる配列を含む。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、４、３、２または１つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失が、表１および表２に列挙されるＣＤＲ配列と異なる配列を含む。さらに別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、３、２または１つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失が、表１および表２に列挙されるＣＤＲ配列と異なる配列を含む。さらに別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、２または１つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失が、表１および表２に列挙されるＣＤＲ配列と異なる配列を含む。さらに別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、１つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失が、表１および表２に列挙されるＣＤＲ配列と異なる配列を含む。
【００５８】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体（ＥＴＡＲ−１抗体）は、１または２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号３０；および
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、および配列番号９０
から選択される。
【００５９】
一態様において、ＥＴＡＲ−１抗体は、１または２つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、および配列番号４８；および
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、および配列番号１１４
から選択される。
【００６０】
別の態様において、ＥＴＡＲ−１抗体は、１または２つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、および配列番号６８；および
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６
から選択される。
【００６１】
さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体（ＥＴＡＲ−２抗体）は、１または２アミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、および配列番号４８；および
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、および配列番号１１４
から選択される。
【００６２】
一態様において、ＥＴＡＲ−２抗体は、１または２つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ  軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号３０；および
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、および配列番号９０
から選択される。
【００６３】
別の態様において、ＥＴＡＲ−２抗体は、１または２つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、および配列番号６８；および
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６
から選択される。
【００６４】
さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体（ＥＴＡＲ−３抗体）は、１または２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、および配列番号６８；および
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６
から選択される。
【００６５】
一態様において、ＥＴＡＲ−３抗体は、１または２つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ  軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号３０；および
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、および配列番号９０
から選択される。
【００６６】
別の態様において、ＥＴＡＲ−３抗体は、１または２つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、および配列番号４８；および
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、および配列番号１１４
から選択される。
【００６７】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号３０から独立して選択される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
ｂ．以下のリスト：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、および配列番号４８から独立して選択される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；
ｃ．以下のリスト：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、および配列番号６８から独立して選択される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｄ．以下のリスト：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、および配列番号９０から独立して選択される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
ｅ．以下のリスト：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、および配列番号１１４から独立して選択される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；および
ｆ．以下のリスト：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６から独立して選択される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列
を含む。
【００６８】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、以下のリスト：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、および配列番号６８から独立して選択される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、以下のリスト：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、および配列番号１３６から独立して選択される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、ＥＴＡＲ抗体は、以下のリスト：配列番号５０対配列番号１１６、配列番号６２対配列番号１２８、配列番号６２対配列番号１３０、配列番号６４対配列番号１３２、配列番号６６対配列番号１３４、および配列番号６８対配列番号１３６から独立して選択される軽鎖および重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せを含む。
【００６９】
別の実施形態において、ＥＴＡＲ抗体は、１または２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列：配列番号１３８（Ｌ１）、配列番号１４０（Ｌ２）、配列番号１４２（Ｌ３）、配列番号１４４（Ｌ４）、配列番号１４６（Ｌ５）、配列番号１４８（Ｌ６）、配列番号１５０（Ｌ７）、配列番号１５２（Ｌ８）、配列番号１５４（Ｌ９）、配列番号１５６（Ｌ１０）、配列番号１５８（Ｌ１１）、配列番号１６０（Ｌ１２）、配列番号１６２（Ｌ１３）、配列番号１６４（Ｌ１４）および上に列挙されるアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列；
および
ｂ．重鎖可変ドメインのアミノ酸配列：配列番号１６６（Ｈ１）、配列番号１６８（Ｈ２）、配列番号１７０（Ｈ３）、配列番号１７２（Ｈ４）、配列番号１７４（Ｈ５）、配列番号１７６（Ｈ６）、配列番号１７８（Ｈ７）、配列番号１８０（Ｈ８）、配列番号１８２（Ｈ９）、配列番号１８４（Ｈ１０）、配列番号１８６（Ｈ１１）、配列番号１８８（Ｈ１２）、配列番号１９０（Ｈ１３）、および配列番号１９２（Ｈ１４）、および上に列挙されるアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列
から選択される。
【００７０】
さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体のポリヌクレオチドコード配列は、１または２つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで、各ポリヌクレオチド配列が、独立して、以下に列挙されるポリヌクレオチド配列：
ａ．軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列：配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、および上に列挙されるポリヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるポリヌクレオチド配列、および
ｂ．重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列：配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、および上に列挙されるポリヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるポリヌクレオチド配列
から選択される。
【００７１】
さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号１３８（Ｌ１）、配列番号１４０（Ｌ２）、配列番号１４２（Ｌ３）、配列番号１４４（Ｌ４）、配列番号１４６（Ｌ５）、配列番号１４８（Ｌ６）、配列番号１５０（Ｌ７）、配列番号１５２（Ｌ８）、配列番号１５４（Ｌ９）、配列番号１５６（Ｌ１０）、配列番号１５８（Ｌ１１）、配列番号１６０（Ｌ１２）、配列番号１６２（Ｌ１３）、配列番号１６４（Ｌ１４）から独立して選択される軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、および上に列挙されるアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列、および
ｂ．以下のリスト：配列番号１６６（Ｈ１）、配列番号１６８（Ｈ２）、配列番号１７０（Ｈ３）、配列番号１７２（Ｈ４）、配列番号１７４（Ｈ５）、配列番号１７６（Ｈ６）、配列番号１７８（Ｈ７）、配列番号１８０（Ｈ８）、配列番号１８２（Ｈ９）、配列番号１８４（Ｈ１０）、配列番号１８６（Ｈ１１）、配列番号１８８（Ｈ１２）、配列番号１９０（Ｈ１３）、配列番号１９２（Ｈ１４）から独立して選択される重鎖可変ドメインのアミノ酸配列、および上に列挙されるアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列
を含む。
【００７２】
さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号１３８（Ｌ１）、配列番号１４０（Ｌ２）、配列番号１４２（Ｌ３）、配列番号１４４（Ｌ４）、配列番号１４６（Ｌ５）、配列番号１４８（Ｌ６）、配列番号１５０（Ｌ７）、配列番号１５２（Ｌ８）、配列番号１５４（Ｌ９）、配列番号１５６（Ｌ１０）、配列番号１５８（Ｌ１１）、配列番号１６０（Ｌ１２）、配列番号１６２（Ｌ１３）、および配列番号１６４（Ｌ１４）から独立して選択される軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、および
ｂ．以下のリスト：配列番号１６６（Ｈ１）、配列番号１６８（Ｈ２）、配列番号１７０（Ｈ３）、配列番号１７２（Ｈ４）、配列番号１７４（Ｈ５）、配列番号１７６（Ｈ６）、配列番号１７８（Ｈ７）、配列番号１８０（Ｈ８）、配列番号１８２（Ｈ９）、配列番号１８４（Ｈ１０）、配列番号１８６（Ｈ１１）、配列番号１８８（Ｈ１２）、配列番号１９０（Ｈ１３）、および配列番号１９２（Ｈ１４）から独立して選択される重鎖可変ドメインのアミノ酸配列
を含む。
【００７３】
さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、以下のリスト：配列番号１３８および配列番号１６６（Ｌ１Ｈ１）、配列番号１４０および配列番号１６８（Ｌ２Ｈ２）、配列番号１４２および配列番号１７０（Ｌ３Ｈ３）、配列番号１４４および配列番号１７２（Ｌ４Ｈ４）、配列番号１４６および配列番号１７４（Ｌ５Ｈ５）、配列番号１４８および配列番号１７６（Ｌ６Ｈ６）、配列番号１５０および配列番号１７８（Ｌ７Ｈ７）、配列番号１５２および配列番号１８０（Ｌ８Ｈ８）、配列番号１５４および配列番号１８２（Ｌ９Ｈ９）、配列番号１５６および配列番号１８４（Ｌ１０Ｈ１０）、配列番号１５８および配列番号１８６（Ｌ１１Ｈ１１）、配列番号１６０および配列番号１８８（Ｌ１２Ｈ１２）、配列番号１６２および配列番号１９０（Ｌ１３Ｈ１３）、および配列番号１６４および配列番号１９２（Ｌ１４Ｈ１４）から独立して選択される、軽鎖および重鎖可変ドメインのアミノ酸配列の組合せを含む。
【００７４】
本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、「ＬｘＨｙ」の名称を用いて示すこともでき、ここで、「ｘ」が、軽鎖可変領域の配列番号に対応し、「ｙ」が、重鎖可変領域の配列番号に対応する。例えば、Ｌ２Ｈ１は、配列番号１４０（Ｌ２）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１６６（Ｈ１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体を指す。
【００７５】
さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、Ｌ１〜Ｌ１４から選択される軽鎖可変ドメインまたはＨ１〜Ｈ１４から選択される重鎖可変ドメイン、およびそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、または変異体を含む。
【００７６】
さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、以下のリスト：配列番号１３８および配列番号１６６、配列番号１５０および配列番号１７８、配列番号１５２および配列番号１８０、配列番号１５４および配列番号１８２、配列番号１５６および配列番号１８４、配列番号１５８および配列番号１８６、配列番号１６０および配列番号１８８、配列番号１６２および配列番号１９０、および配列番号１６４および配列番号１９２から独立して選択される、軽鎖および重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せを含む。
【００７７】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列  配列番号１３８または重鎖可変ドメインアミノ酸配列  配列番号１６６を含む。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列  配列番号１３８および重鎖可変ドメインアミノ酸配列  配列番号１６６の組合せを含む。
【００７８】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、定常ドメインのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、定常ドメインのアミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖定常ドメインアミノ酸配列：配列番号１９４および配列番号１９６；および
ｂ．重鎖定常ドメインアミノ酸配列：配列番号１９８
から選択される。
【００７９】
さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、定常ドメインアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各定常ドメインアミノ酸配列が、独立して、以下に列挙される軽鎖および重鎖定常ドメインアミノ酸配列の組合せ：
ａ．軽鎖定常ドメインアミノ酸配列  配列番号１９４および重鎖定常ドメインアミノ酸配列  配列番号１９８の組合せ；および
ｂ．軽鎖定常ドメインアミノ酸配列  配列番号１９６および重鎖定常ドメインアミノ酸配列  配列番号１９８の組合せ
から選択される。
【００８０】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、上に示される軽鎖および重鎖ＣＤＲおよびＦＲ（フレームワーク）のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される重鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される重鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される重鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖ＦＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖ＦＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖ＦＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖ＦＲ４配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される重鎖ＦＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される重鎖ＦＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される重鎖ＦＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される重鎖ＦＲ４配列を含む。
【００８１】
一実施形態において、抗体のＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２または１以下のアミノ酸付加、置換、および／または欠失が、上に示される軽鎖および重鎖ＣＤＲ３配列の配列番号５０および配列番号１１６の組合せと異なる。別の実施形態において、抗体の軽鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２または１以下のアミノ酸付加、置換、および／または欠失が、上に示される軽鎖ＣＤＲ３配列の配列番号５０と異なる。別の実施形態において、抗体の軽鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２または１以下のアミノ酸付加、置換、および／または欠失が、上に示される軽鎖ＣＤＲ３配列の配列番号５０と異なり、抗体の重鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２または１以下のアミノ酸付加、置換、および／または欠失が、上に示される重鎖ＣＤＲ３配列の配列番号１１６または配列番号１１８と異なる。別の実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖および重鎖ＣＤＲ配列の１、２、３、４、５または６つの組合せをさらに含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖および重鎖ＣＤＲ配列の１、２、３、４、５または６つの組合せをさらに含み、ここで、各配列が、独立して、６、５、４、３、２または１つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失が、軽鎖および重鎖ＣＤＲ３配列の配列番号５０および配列番号１１６の組合せと異なる。別の実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖可変領域のＣＤＲおよび重鎖可変領域のＣＤＲを含む。別の実施形態において、抗体は、上に示される軽鎖および重鎖ＣＤＲ配列の１、２、３、４、５、および／または６つの組合せを含む。
【００８２】
一実施形態において、抗体（抗体または抗体フラグメントなど）は、上に示される軽鎖可変ドメインＬ１のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、軽鎖可変ドメインの配列は、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つのアミノ酸欠失、挿入、または置換が、軽鎖可変ドメインＬ１の配列と異なる。別の実施形態において、軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインＬ１の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｌ１のポリヌクレオチドコード配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチドコード配列を含む。別の実施形態において、軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、軽鎖可変ドメインＬ１のポリヌクレオチドコード配列の補体に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、軽鎖可変ドメインＬ１のポリヌクレオチドコード配列の補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【００８３】
一実施形態において、抗体（抗体または抗体フラグメントなど）は、上に示される重鎖可変ドメインＨ１のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、重鎖可変ドメインの配列は、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つのアミノ酸欠失、挿入、または置換が、重鎖可変ドメインＨ１の配列と異なる。別の実施形態において、重鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインＨ１の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｈ１のポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、重鎖可変ドメインＨ１のポリヌクレオチドコード配列の補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、重鎖可変ドメインＨ１のポリヌクレオチドコード配列の補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【００８４】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３またはＬ１４Ｈ１４；またはそのアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ）またはそのＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントの組合せを含む。
【００８５】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、Ｌ１Ｈ１、またはその変換アイソタイプ抗体（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ）またはそのＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントの組合せを含む抗体を含む。
【００８６】
本明細書において提供される抗体（例えば、抗体、抗体フラグメント、および抗体誘導体）は、当該技術分野において公知の任意の定常領域を含み得る。軽鎖定常領域は、例えば、κ−またはλ−型軽鎖定常領域、例えば、マウスκ−またはλ−型軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、α−、δ−、ε−、γ−、またはμ−型重鎖定常領域、例えば、マウスα−、δ−、ε−、γ−、またはμ−型重鎖定常領域であり得る。一実施形態において、軽鎖または重鎖定常領域は、天然定常領域のフラグメント、誘導体、変異体、または突然変異タンパク質である。
【００８７】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、定常軽鎖κまたはλ領域またはそのフラグメントをさらに含む。軽鎖定常領域配列およびそのポリヌクレオチドコード配列は、以下のように提供される：
軽鎖定常領域：
ポリヌクレオチド（κ）、（配列番号１９３）；アミノ酸（κ）、（配列番号１９４）
ポリヌクレオチド（λ）、（配列番号１９５）；アミノ酸（λ）、（配列番号１９６）
【００８８】
別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、重鎖定常領域またはそのフラグメントをさらに含む。重鎖定常領域配列およびそのポリヌクレオチドコード配列は、以下のように提供される：
ポリヌクレオチド（ＩｇＧ１）、（配列番号１９７）；アミノ酸（ＩｇＧ１）、（配列番号１９８）
【００８９】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、二重鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）ｘフラグメント、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、およびＩｇＧ４抗体から選択される。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、ＥＴＡＲモノクローナル抗体である。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、マウスＥＴＡＲ抗体である。本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、ヒト化ＥＴＡＲ抗体である。
【００９０】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、モノクローナル抗体Ａ−１（配列番号１３８および配列番号１６６を含む）、Ａ−７（配列番号１５０および配列番号１７８を含む）、Ａ−８（配列番号１５２および配列番号１８０を含む）、Ａ−９（配列番号１５４および配列番号１８２を含む）、Ａ−１０（配列番号１５６および配列番号１８４を含む）、Ａ−１１（配列番号１５８および配列番号１８６を含む）、Ａ−１２（配列番号１６０および配列番号１８８を含む）、Ａ−１３（配列番号１６２および配列番号１９０を含む）、またはＡ−１４（配列番号１６４および配列番号１９２を含む）である。
【００９１】
抗体および抗体フラグメント
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、完全長抗体（完全長重鎖および／または軽鎖を有するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を含む）である。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ、またはＦｄフラグメントであり、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、二重鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに組み込まれ得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，９，１１２６−１１３６を参照）。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、フィブロネクチンポリペプチド単一特異性抗体（ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ）を含む、米国特許第６７０３１９９号明細書に開示されるものなどの抗体ポリペプチドも含む。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、一本鎖ポリペプチドである、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４６号明細書に開示される他の抗体ポリペプチドも含む。
【００９２】
一実施形態において、該当するモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域は、ハイブリドーマ中のヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。これらのプライマーは、当業者によって合成され得るか、または中でも特に、ＶＨａ、ＶＨｂ、ＶＨｃ、ＶＨｄ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬ領域のためのプライマーを含む、マウスおよびヒト可変領域のためのプライマーを販売する市販源から購入され得る（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．を参照）。これらのプライマーは、それぞれＩＭＭＵＮＯＺＡＰ（商標）ＨまたはＩＭＭＵＮＯＺＡＰ（商標）Ｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのベクターに後に挿入され得る重鎖または軽鎖可変領域を増幅するのに使用され得る。次に、これらのベクターは、発現のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、または哺乳動物に基づく系に導入され得る。ＶＨおよびＶＬ領域の融合を含む大量の一本鎖タンパク質が、これらの方法を用いて産生され得る（Ｂｉｒｄ  ｅｌ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６を参照）。
【００９３】
本発明の抗体産生細胞が、任意の上記の免疫付与および他の技術を用いて得られた後、特定の抗体の遺伝子が、本明細書に記載される標準的な手順にしたがってそれからＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、増幅することによってクローニングされ得る。それから産生された抗体は、ＣＤＲを同定するために配列を決定され得、ＣＤＲのコードＤＮＡが、本明細書において提供される他の抗体を産生するように、上述されるように操作され得る。
【００９４】
本明細書において提供される抗体は、好ましくは、本明細書に記載される細胞に基づくアッセイおよび／または本明細書に記載されるインビボアッセイにおいてエンドセリンシグナル伝達を調節し、および／または本明細書に記載される抗体の１つの結合をクロスブロックし（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋ）、および／または本明細書に記載される抗体の１つによって結合ＥＴＡＲからクロスブロックされる。したがって、このような結合剤は、本明細書に記載されるアッセイを用いて同定され得る。
【００９５】
特定の実施形態において、抗体は、ＥＴＡＲを過剰発現する細胞に結合し、および／または細胞に基づくおよび／または本明細書に記載されるインビボアッセイにおいて中和し、および／または本明細書に記載される抗体をクロスブロックし、および／または本明細書に記載される抗体の１つによって結合ＥＴＡＲからクロスブロックされる抗体をまず同定することによって生成される。
【００９６】
抗体などの特定のタンパク質が、様々な翻訳後修飾を受けることができることが、当業者によって理解されるべきである。これらの修飾のタイプおよび程度は、タンパク質を発現するのに使用される宿主細胞系ならびに培養条件に左右されることが多い。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペリジン（ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒｉｚｉｎｅ）形成、アスパラギン酸塩異性化およびアスパラギン脱アミド化の変化を含み得る。高頻度の修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシル末端塩基性残基（リジンまたはアルギニンなど）の損失である（Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．Ｊ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９−１３４に記載されるように）。
【００９７】
マウスモノクローナル抗体の産生のための代替的な方法は、同種マウス、例えば、モノクローナル抗体を含有する腹水の形成を促進するように処理された（例えば、初回抗原刺激を受けた（ｐｒｉｓｔｉｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ））マウスの腹腔内にハイブリドーマ細胞を注入することである。モノクローナル抗体は、様々な確立した技術によって単離および精製され得る。このような単離技術としては、プロテイン−Ａセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．７．１−２．７．１２  ａｎｄ  ｐａｇｅｓ  ２．９．１−２．９．３；Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）”，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ  ７９−１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）を参照）。モノクローナル抗体は、抗体の特定の特性（例えば、重鎖または軽鎖アイソタイプ、結合特異性など）に基づいて選択される適切なリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。固体担体上に固定される好適なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、および抗定常領域（軽鎖または重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、およびＴＧＦ−β結合タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体が挙げられる。
【００９８】
Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７によって記載されるように、抗体結合部位の中心における相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化も、増加した親和性を有する抗体、例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する増加した親和性を有する抗体を単離するのに使用されている。したがって、このような技術は、ヒトエンドセリンＡ受容体の抗体を調製するのに有用である。
【００９９】
ヒトエンドセリンＡ受容体に対する抗体が、例えば、インビトロまたはインビボのいずれかで、エンドセリンＡ受容体の存在を検出するアッセイにおいて使用され得る。
【０１００】
抗体はまた、従来の技術のいずれかによって調製され得る。例えば、抗体は、それらを天然で発現する細胞から精製され得るか（例えば、抗体は、それを産生するハイブリドーマから精製され得る）または当該技術分野において公知の任意の技術を用いて組み換え発現系において産生され得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）を参照されたい。これは、以下の核酸の節において説明されている。
【０１０１】
抗体は、任意の公知の技術によって、調製され、所望の特性についてスクリーニングされ得る。いくつかの技術は、関連する抗体（例えば、抗ＥＴＡＲ抗体）のポリペプチド鎖（またはその部分）をコードする核酸の単離および核酸の操作に関連する。核酸は、別の関連する核酸と融合されるか、または１つまたは複数のアミノ酸残基を付加、削除または置換するための組み換えＤＮＡ技術（例えば、誘発突然変異または他の従来の技術）によって修飾され得る。
【０１０２】
上述されるＣＤＲの１つまたは複数を含有する本発明に係る抗体の親和性を向上させることが必要とされる場合、このような抗体は、ＣＤＲの維持（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３）、鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異株の使用（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５０−３６８）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８：７２４−７３３）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６：７−８８）およびさらなるＰＣＲ技術（Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８−２９１）を含む、いくつかの親和性成熟プロトコルによって得られる。これらの方法または親和性成熟の全ては、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９）に記載されている。
【０１０３】
一実施形態において、ＥＴＡＲ抗体のフラグメントが、本明細書において提供される。このようなフラグメントは、全体的に、抗体に由来する配列またはさらなる配列を含み得る。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、およびドメイン抗体が挙げられる。他の例が、Ｌｕｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：５００−０６において提供されている。
【０１０４】
一本鎖抗体は、単一ポリペプチド鎖を生じるように、アミノ酸架橋（短ペプチドリンカー）によって重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）フラグメントを連結することによって形成され得る。このような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードする融合ＤＮＡによって調製されている。得られるポリペプチドは、それ自体で折り畳まれて、抗原結合モノマーを形成し得るか、またはそれらは、２つの可変ドメイン間のフレキシブルリンカーの長さに応じて、多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体）を形成し得る（Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３；Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。様々なＶＬおよびＶＨ含有ポリペプチドを組み合わせることによって、様々なエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖが形成され得る（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。一本鎖抗体の産生のために開発された技術としては、米国特許第４９４６７７８号明細書；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４；ｄｅ  Ｇｒａａｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７に記載されるものが挙げられる。限定はされないが、可変ドメイン組合せＬ１Ｈ１を含むｓｃＦｖを含む、本明細書において提供される抗体に由来する一本鎖抗体が、本発明によって包含される。
【０１０５】
１つの抗体に由来する複数の抗体はまた、従来の方法にしたがって、例えば、抗体のタンパク質分解的加水分解、例えば、全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得られる。例として、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれるＳＳフラグメントを生じる、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって、生成され得る。このフラグメントは、チオール還元剤を用いてさらに切断されて、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントを生じ得る。任意選択的に、切断反応は、ジスルフィド結合の切断から得られるスルフヒドリル基のブロッキング基を用いて行われ得る。代替例として、パパインを用いた酵素的切断により、２つの一価ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを直接生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４３３１６４７号明細書、Ｎｉｓｏｎｏｆｆｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０；Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９；Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）；およびＡｎｄｒｅｗｓ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ  Ｔｉｔｕｓ，Ｊ．Ａ．ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００３），ｐａｇｅｓ  ２．８．１−２．８．１０  ａｎｄ  ２．１０Ａ．１−２．１０Ａ．５によって記載されている。重鎖を分離して一価軽鎖−重鎖フラグメント（Ｆｄ）を形成するなどの、抗体を切断するための他の方法、フラグメントの他の切断、または他の酵素的、化学的、または遺伝子学的技術も、フラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
【０１０６】
抗体フラグメントの別の形態は、抗体の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲは、ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得られる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、鋳型としてｍＲＮＡまたは抗体産生細胞を用いて可変領域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を用いることによって調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，“（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １６６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；およびＷａｒｄ  ｅｌ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １３７（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）を参照。抗体フラグメントは、本明細書に記載される抗体の少なくとも１つの可変領域ドメインをさらに含み得る。したがって、例えば、Ｖ領域ドメインは、モノマーおよびＶＨまたはＶＬドメインであり得、これは、後述されるように１×１０−７Ｍ以下の親和性でＥＴＡＲに結合し得る。
【０１０７】
可変領域ドメインは、任意の天然可変ドメインまたはその操作された形態であり得る。操作された形態とは、組み換えＤＮＡ操作技術を用いて生成された可変領域ドメインを意味する。このような操作された形態は、例えば、または特定の抗体のアミノ酸配列におけるまたはそれに対する挿入、欠失、または変化によって、特定の抗体可変領域から生成されるものを含む。具体的な例は、第１の抗体からの少なくとも１つのＣＤＲおよび任意選択的に１つまたは複数のフレームワークアミノ酸を含有する操作された可変領域ドメイン、および第２の抗体からの可変領域ドメインの残りの部分を含む。
【０１０８】
可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸において、少なくとも１つの他の抗体ドメインまたはそのフラグメントに共有結合され得る。したがって、例えば、可変領域ドメイン中に存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたはそのフラグメントに連結され得る。同様に、ＶＬドメインは、ＣＫドメインまたはそのフラグメントに連結され得る。このように、例えば、抗体は、Ｆａｂフラグメントであり得、ここで、抗原結合ドメインは、それらのＣ末端において、それぞれＣＨ１およびＣκドメインに共有結合的に連結される関連するＶＨおよびＶＬドメインを含有する。ＣＨ１ドメインは、さらなるアミノ酸で拡張されて、例えば、Ｆａｂ’フラグメントに見られるようなヒンジ領域またはヒンジ領域ドメインの部分を生じるか、または抗体ＣＨ２およびＣＨ３ドメインなどのさらなるドメインを生じ得る。
【０１０９】
抗体の誘導体および変異体
Ａ−１の対応するアミノ酸配列をコードする、Ｌ１およびＨ１のヌクレオチド配列が、例えば、ランダム突然変異誘発によってまたは部位特異的突然変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチド特異的部位特異的突然変異）によって改変されて、非突然変異ポリヌクレオチドと比較して、１つまたは複数の特定のヌクレオチド置換、欠失、または挿入を含む改変ポリヌクレオチドを生成し得る。このような改変を行うための技術の例が、Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４２：１３３；Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅ  ３７：７３；Ｃｒａｉｋ，１９８５，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３：１２−１９；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；および米国特許第４５１８５８４号明細書および同第４７３７４６２号明細書に記載されている。これらのおよび他の方法が、非誘導体化抗体と比較して、所望の特性、例えば、エンドセリン受容体に対する親和性、アビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）、もしくは特異性またはインビボもしくはインビトロ安定性の向上、または生体内副作用の減少を有する、例えば、抗エンドセリンＡ受容体抗体の誘導体を作製するのに使用され得る。
【０１１０】
本発明の範囲内の抗エンドセリン受容体抗体の他の誘導体は、Ｎ末端またはＣ末端または抗エンドセリン受容体抗体ポリペプチドに融合された異種ポリペプチドを含む発現または組み換え融合タンパク質などによって、他のタンパク質またはポリペプチドとともに、共有結合的または凝集性コンジュゲートまたは抗エンドセリン受容体抗体、またはそのフラグメントを含む。例えば、共役ペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母α−因子リーダーまたはエピトープタグなどのペプチドであり得る。融合タンパク質を含有する抗体は、抗原結合タンパク質（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の精製または同定を促進するために加えられるペプチドを含み得る。抗体はまた、Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４、および米国特許第５０１１９１２号明細書に記載されるように、ＦＬＡＧペプチドに連結され得る。ＦＬＡＧペプチドは、高度に抗原性であり、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組み換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所与のポリペプチドに融合された融合タンパク質を調製するのに有用な試薬は市販されている（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）。別の実施形態において、１つまたは複数の抗体を含有するオリゴマーが、エンドセリン受容体アンタゴニストとして用いられ得る。オリゴマーは、共有結合的に連結されたまたは非共有結合的に連結された二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーの形態であり得る。２つ以上の抗体を含むオリゴマーの使用が想定され、一例はホモ二量体である。他のオリゴマーとしては、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが挙げられる。
【０１１１】
一実施形態は、抗体に融合されたペプチド部分間の共有結合的または非共有結合的相互作用を介して結合された複数の抗体を含むオリゴマーに関する。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサ）、またはオリゴマー形成を促進する特性を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパーおよび抗体に由来する特定のポリペプチドは、以下により詳細に記載されるように、それに結合された抗体のオリゴマー形成を促進し得るペプチドである。
【０１１２】
特定の実施形態において、オリゴマーは、２〜４つの抗体を含む。オリゴマーの抗体は、上述される形態のいずれか、例えば、変異体またはフラグメントなどの任意の形態であり得る。好ましくは、オリゴマーは、エンドセリン受容体結合活性を有する抗体を含む。
【０１１３】
一実施形態において、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いて調製される。抗体由来ポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製が、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５；Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ  １０．１９．１−１０．１９．１１によって記載されている。本明細書において提供される一実施形態は、抗エンドセリンＡ受容体抗体のエンドセリン受容体結合フラグメントを、抗体のＦｃ領域に融合することによって生成された２つの融合タンパク質を含む二量体に関する。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合を、適切な発現ベクターに挿入し、組み換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞において遺伝子融合を発現させ、発現された融合タンパク質に、よく似た抗体分子を組み立てさせることによって作製され得、その直後に、鎖間ジスルフィド結合が、Ｆｃ部分間に形成されて、二量体が得られる。
【０１１４】
本明細書において使用される際の「Ｆｃポリペプチド」という用語は、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドの天然および突然変異タンパク質形態を含む。二量化を促進するヒンジ領域を含むこのようなポリペプチドの切断形態も含まれる。Ｆｃ部分（およびそれから形成されたオリゴマー）を含む融合タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提供する。
【０１１５】
ＰＣＴ出願国際公開第９３／１０１５１号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載される１つの好適なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＮ末端ヒンジ領域から、Ｆｃ領域の天然Ｃ末端まで伸びる一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５４５７０３５号明細書およびＢａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３９９２−４００１に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化されており、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化されており、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化されていることを除いて、国際公開第９３／１０１５１号パンフレットに示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対する低下した親和性を示す。他の実施形態において、抗エンドセリン受容体抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分が、抗体重鎖および／または軽鎖の可変部分と置換され得る。
【０１１６】
あるいは、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサペプチド）を伴うかまたは伴わずに複数の抗体を含む融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーの中には、米国特許第４７５１１８０号明細書および同第４９３５２３３号明細書に記載されるものがある。
【０１１７】
オリゴマー抗体を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見られるタンパク質のオリゴマー形成を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９）、それ以来、様々な異なるタンパク質において見出されている。公知のロイシンジッパーの中には、二量化または三量化する天然ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに好適なロイシンジッパードメインの例が、ＰＣＴ出願国際公開第９４／１０３０８号パンフレットに記載され、肺表面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーは、Ｈｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１（参照により本明細書に援用される）に記載される。それに融合された異種タンパク質の安定した三量化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載される。一方法において、ロイシンジッパーペプチドに融合された抗エンドセリン受容体抗体フラグメントまたは誘導体を含む組み換え融合タンパク質が、好適な宿主細胞において発現され、形成された可溶性オリゴマー抗エンドセリン受容体抗体フラグメントまたは誘導体が、培養上清から回収される。
【０１１８】
別の実施形態において、抗体誘導体は、本明細書に開示されるＣＤＲの少なくとも１つを含み得る。例えば、１つまたは複数のＣＤＲは、公知の抗体フレームワーク領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）に組み込まれるか、またはその半減期を増加させるために好適なビヒクルに共役され得る。好適なビヒクルとしては、限定はされないが、Ｆｃ、アルブミン、トランスフェリンなどが挙げられる。これらのおよび他の好適なビヒクルは、当該技術分野において公知である。このような共役ＣＤＲペプチドは、モノマー、二量体、四量体、または他の形態であり得る。一実施形態において、１つまたは複数の水溶性ポリマーが、１つまたは複数の特定の位置で、例えば結合剤のアミノ末端で結合される。一例において、抗体誘導体は、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールを含む、１つまたは複数の水溶性ポリマー結合を含む。例えば、米国特許第４６４０８３５号明細書、同第４４９６６８９号明細書、同第４３０１１４４号明細書、同第４６７０４１７号明細書、同第４７９１１９２号明細書および同第４１７９３３７号明細書を参照されたい。特定の実施形態において、誘導体は、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、ならびにこのようなポリマーの混合物のうちの１つまたは複数を含む。特定の実施形態において、１つまたは複数の水溶性ポリマーは、１つまたは複数の側鎖にランダムに結合される。特定の実施形態において、ＰＥＧは、抗体などの結合剤の治療的能力を向上させるように働き得る。いくつかのこのような方法が、例えば、任意の目的のために参照により本明細書に援用される米国特許第６１３３４２６号明細書において説明されている。
【０１１９】
抗体が結合特異性を保持する限り、本明細書において提供される抗体が、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得ることが理解されよう。したがって、抗体構造への修飾が、本発明の範囲内に包含される。これらは、抗体のヒトエンドセリン受容体結合能を破壊しない、保存的または非保存的であり得るアミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、生物系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって典型的に組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらは、ペプチド模倣薬およびアミノ酸部分の他の逆または反転形態を含む。保存的アミノ酸置換はまた、その位置においてアミノ酸残基の極性または電荷に対する影響がほとんどまたは全くないように、標準的残基による天然アミノ酸残基の置換を含み得る。非保存的置換は、アミノ酸またはアミノ酸模倣体のあるクラスのメンバーを、様々な物理的特性（例えば、サイズ、極性、疎水性、電荷）を有する別のクラスからのメンバーと交換することを含み得る。
【０１２０】
さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基において単一のアミノ酸置換を含む、試験される変異体を生成し得る。次に、変異体は、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングされ得る。このような変異体は、好適な変異体についての情報を収集するのに使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が、破壊された、望ましくないほど低下した、または不適切な活性をもたらすことが発見された場合、このような変化を有する変異体は、回避され得る。言い換えると、このような日常的な実験から収集される情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が単独でまたは他の突然変異と組み合わせて回避されるべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。
【０１２１】
当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に記載されるポリペプチドの好適な変異体を決定することができる。特定の実施形態において、当業者は、活性にとって重要でない領域を標的にすることによって、活性を破壊せずに変化され得る分子の好適な領域を特定し得る。特定の実施形態において、類似のポリペプチドの中で、残基および保存される分子の部分を特定することができる。特定の実施形態において、生物学的活性または構造にとって重要であり得る領域でも、生物学的活性を破壊せずに、またはポリペプチド構造に悪影響を与えずに保存的アミノ酸置換に供され得る。さらに、当業者は、活性または構造にとって重要である、類似のポリペプチドにおける残基を特定する構造−機能試験を検討することができる。このような比較を考慮して、類似のタンパク質における活性または構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測される重要なアミノ酸残基の代わりの化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。
【０１２２】
当業者は、類似のポリペプチドにおける該当する構造に関連する三次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアライメントを予測し得る。特定の実施形態において、当業者は、タンパク質の表面にあることが予測されるアミノ酸残基に根本的な変更を行わないことを選択してもよく、これは、このような残基が、他の分子との重要な相互作用に関与し得るためである。いくつかの科学出版物が、二次構造の予測をテーマにしている。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−２４５；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２２；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６およびＣｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４を参照されたい。さらに、二次構造を予測するのを支援するコンピュータプログラムが、現在入手可能である。例えば、３０％超の配列同一性、または４０％超の類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の成長は、ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の折り畳みの潜在的な数を含む、二次構造の向上した予測可能性を提供した。Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質中に限られた数の折り畳みがあること、および臨界数の構造が決定された後、構造予測が著しく正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６）。
【０１２３】
二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４−１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８）、および「進化学的関連性（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ、上記参照（１９９９）、およびＢｒｅｎｎｅｒ、上記参照（１９９７）を参照）が挙げられる。特定の実施形態において、抗体の変異体は、グリコシル化変異体を含み、ここで、グリコシル化部位の数および／またはタイプが、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して改変されている。特定の実施形態において、変異体は、天然タンパク質より多いまたは少ない数のＮ−結合グリコシル化部位を含む。あるいは、置換によるこのような配列の除去は、存在するＮ−結合炭水化物鎖を除去する。Ｎ−結合炭水化物鎖の再配列も提供され、ここで、１つまたは複数のＮ−結合グリコシル化部位（典型的に、天然に存在するもの）が削除され、１つまたは複数の新しいＮ−結合部位が生成される。さらなる好ましい抗体変異体は、システイン変異体を含み、ここで、１つまたは複数のシステイン残基は、親アミノ酸配列と比較して、欠失されるか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）と置換される。システイン変異体は、抗体が、例えば不溶性封入体の単離の後、生物学的に活性な立体配座に再度折り畳まれなければならない場合に有用であり得る。システイン変異体は、一般に、天然タンパク質より少ないシステイン残基を有し、典型的に、不対システインから生じる相互作用を最小限に抑えるために偶数を有する。
【０１２４】
（保存的かまたは非保存的かにかかわらず）所望のアミノ酸置換が、このような置換が所望されるときに当業者によって決定され得る。特定の実施形態において、アミノ酸置換が、ヒトエンドセリン受容体に対する抗体の重要な残基を同定するため、または本明細書に記載されるヒトエンドセリン受容体に対する抗体の親和性を増大もしくは低下させるために使用され得る。
【０１２５】
特定の実施形態によれば、好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するように結合親和性を改変し、（４）結合親和性を改変し、および／または（４）このようなポリペプチドにおける他の物理化学的または機能的特性を与え、調節するものである。特定の実施形態によれば、単一または複数のアミノ酸置換（特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換）は、天然配列中で行われ得る（特定の実施形態において、分子間接触を形成するドメインの外部のポリペプチドの部分において）。特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、典型的に、親配列の構造的特徴を実質的に変更することができない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊すべきでなく、または親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊すべきでない）。当該技術分野において認識されているポリペプチドの二次および三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｏｚｅ，Ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５に記載され、これらのそれぞれが、参照により本明細書に援用される。
【０１２６】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ポリマー、脂質、または他の部分と化学結合され得る。
【０１２７】
抗原結合剤は、生体適合性フレームワーク構造に組み込まれる本明細書に記載されるＣＤＲの少なくとも１つを含み得る。一実施形態において、生体適合性フレームワーク構造は、局在化した表面領域における抗原（例えば、ＣＤＲ、可変領域など）に結合するアミノ酸の１つまたは複数の配列を提示することができる、立体配座的に安定した構造的支持体、またはフレームワーク、または足場を形成するのに十分なポリペプチドまたはその部分を含む。このような構造は、天然ポリペプチドまたはポリペプチド「折り畳み」（構造モチーフ）であり得るか、または天然ポリペプチドまたは折り畳みと比べて、アミノ酸の付加、欠失または置換などの１つまたは複数の修飾を有し得る。これらの足場は、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌またはウイルスなどの任意の種の（または２つ以上の種の）ポリペプチドに由来し得る。
【０１２８】
典型的に、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質足場または骨格に基づいている。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタチン、シトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメインおよびテンダミスタットドメインに基づくものが使用され得る（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎ，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：４６３−４６９を参照）。
【０１２９】
さらに、当業者は、好適な結合剤が、本明細書に具体的に開示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のうちの１つまたは複数などの、これらの抗体の部分を含むことを認識するであろう。重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の領域の少なくとも１つは、抗体が非置換ＣＤＲの結合特異性を保持する限り、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク分子であり得、ここで、結合剤は、ヒトエンドセリン受容体に対する本明細書に開示される抗体の結合をクロスブロックし、および／または受容体を介したエンドセリン−１シグナル伝達の活性を阻害する。抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク分子であり得、ここで、抗体は、競合結合アッセイにおいてヒトエンドセリン受容体ペプチドへの、抗体Ａ１／Ａ２の少なくとも１つによって示されるものと類似の結合パターンを示し、および／またはエンドセリン−１の活性を中和する。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から構成され得、ここで、抗体は、組み換え結合タンパク質または合成ペプチドであり、組み換え結合タンパク質は、ヒトＥＴＡＲへの本明細書に開示される抗体の結合をクロスブロックし、および／またはインビトロまたはインビボでエンドセリン−１活性を中和する。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から構成され得、ここで、抗体は、組み換え抗体であり、組み換え抗体は、競合結合アッセイにおいてヒトＥＴＡＲペプチドへの、抗体Ａ１／Ａ２の少なくとも１つによって示されるものと類似の結合パターンを示し、および／またはエンドセリン−１シグナル伝達を中和する。
【０１３０】
核酸
一態様において、本発明は、本明細書において提供される抗体をコードする単離核酸分子を提供する。核酸は、例えば、抗体の全てまたは部分、例えば、本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、もしくは変異体の一方または両方の鎖をコードするポリヌクレオチド；ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド；ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異させ、または増幅するためのＰＣＲプライマーまたはシーケンシングプライマー；ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および上記のものの相補的配列を含む。核酸は、任意の長さであり得る。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００またはそれ以上のヌクレオチド長であり得、および／または１つまたは複数のさらなる配列、例えば、制御配列を含み得、および／またはより大きい核酸、例えば、ベクターの一部であり得る。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、およびその人工変異体（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。
【０１３１】
抗体ポリペプチド（例えば、重鎖または軽鎖、可変ドメインのみ、または完全長）をコードする核酸は、ＥＴＡＲ抗原で免疫付与されたマウスのＢ細胞から単離され得る。核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手順によって単離され得る。
【０１３２】
重鎖および軽鎖可変領域の可変領域をコードする核酸配列が上に示される。当業者は、遺伝暗号の縮重により、本明細書に開示されるポリペプチド配列のそれぞれが、多数の他の核酸配列によってコードされることを理解するであろう。本発明は、本発明の各抗体をコードする各縮重ヌクレオチド配列を提供する。
【０１３３】
本発明は、特定のハイブリダイゼーション下で他の核酸（例えば、Ａ−１／Ａ−２のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸）にハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズさせるための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６を参照されたい。本明細書において定義されるように、例えば、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約５０％のホルムアミドのハイブリダイゼーション緩衝液、６×ＳＳＣを含有する予洗（ｐｒｅｗａｓｈｉｎｇ）溶液、および５５℃のハイブリダイゼーション温度（または４２℃のハイブリダイゼーション温度で、約５０％のホルムアミドを含有するものなどの他の類似のハイブリダイゼーション溶液）、および０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で、６０℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４５℃で６×ＳＳＣ中でハイブリダイズし、続いて、６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中で１回以上洗浄する。さらに、当業者は、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的に、互いにハイブリダイズされたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大または低下させるように、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を操作することができる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的パラメータおよび好適な条件を考案するための指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０  ａｎｄ  ６．３−６．４）によって記載されており、例えば、ＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。変化が、突然変異によって、核酸に導入され得、それによって、それがコードするポリペプチド（例えば、抗体）のアミノ酸配列の変化をもたらす。突然変異が、当該技術分野において公知の任意の技術を用いて導入され得る。一実施形態において、１つまたは複数の特定のアミノ酸残基が、例えば、部位特異的突然変異誘発プロトコルを用いて変化される。別の実施形態において、１つまたは複数のランダムに選択された残基が、例えば、ランダム突然変異誘発プロトコルを用いて変化される。それがいかに作製されても、突然変異体ポリペプチドは、発現され、所望の特性についてスクリーニングされ得る。
【０１３４】
突然変異が、それがコードするポリペプチドの生物学的活性をそれほど変更せずに、核酸に導入され得る。例えば、ヌクレオチド置換を行って、非必須アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらし得る。一実施形態において、Ｌ１〜Ｌ２およびＨ１〜Ｈ２について本明細書において提供されるヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、それらが、２つ以上の異なるアミノ酸残基を有する配列を生じるように、アミノ酸残基の１つまたは複数の欠失または置換を含む、Ｌ１〜Ｌ２およびＨ１〜Ｈ２について本明細書において提供されるアミノ酸配列をコードするように突然変異される。別の実施形態において、突然変異誘発は、２つ以上の異なるアミノ酸残基を有する配列を生じるように、Ｌ１〜Ｌ２およびＨ１〜Ｈ２について本明細書に示される１つまたは複数のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸を挿入する。あるいは、１つまたは複数の突然変異が、核酸に導入され得、この核酸が、それがコードするポリペプチドの生物学的活性（例えば、ＥＴＡＲへの結合）を選択的に変化させる。例えば、突然変異が、生物学的活性を定量的にまたは定性的に変化させ得る。定量的変化の例は、活性を増大させ、低下させ、またはなくすことを含む。定性的変化の例は、抗体の抗原特異性を変化させることを含む。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸配列の検出のためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに好適な核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみ、例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメントまたは本発明のポリペプチドの活性部分（例えば、ＥＴＡＲ結合部分）をコードするフラグメントを含み得る。
【０１３６】
本発明の核酸の配列に基づくプローブを用いて、核酸または類似の核酸、例えば、本発明のポリペプチドをコードする転写産物を検出することができる。プローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含み得る。このようなプローブを用いて、ポリペプチドを発現する細胞を同定することができる。
【０１３７】
別の態様において、本明細書において提供されるベクターは、本発明のポリペプチドまたはその一部をコードする核酸を含む。ベクターの例としては、限定はされないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターが挙げられる。
【０１３８】
本明細書において提供される組み換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含み得る。組み換え発現ベクターは、発現される核酸配列に操作可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つまたは複数の制御配列を含む。制御配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモータおよびサイトメガロウイルスプロモータ）、特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的制御配列、Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７を参照、これらのそれぞれの開示内容は、全体が参照により本明細書に援用される）、および特定の処理または条件に応答して、ヌクレオチド配列の誘導性発現を指令するもの（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオネインプロモータ、および原核生物細胞系および真核生物細胞系の両方におけるｔｅｔ−応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモータ（同文献参照）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要因に左右され得ることが、当業者によって理解されよう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それによって、本明細書に記載される核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを産生し得る。
【０１３９】
別の態様において、本発明は、本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。原核生物宿主細胞は、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバシラス属（ｂａｃｉｌｌｉ）を含む。より高等な真核生物細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳動物由来の樹立細胞系を含む。好適な哺乳動物宿主細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＶｅｇｇｉｅ  ＣＨＯなどのそれらの誘導体および無血清培地中で増殖する関連する細胞系（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：３１を参照）またはＤＨＦＲが欠乏したＣＨＯ株ＤＸＢ−１１（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−２０を参照）を含む。さらなるＣＨＯ細胞系は、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）、ＥＭ９（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１８６１）、およびＷ２０（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１８６２）を含む。さらなる宿主細胞は、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５を参照）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１６３）、ＡＭ−１／Ｄ細胞（米国特許第６２１０９２４号明細書に記載される）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）（ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１を参照）、２９３、２９３  ＥＢＮＡまたはＭＳＲ  ２９３などのヒト胚腎臓細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常な２倍体細胞、初代組織、初代移植のインビトロ培養物に由来する細胞株、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞を含む。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主とともに使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターが、Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）によって記載されている。
【０１４０】
ベクターＤＮＡが、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって、原核生物または真核生物細胞に導入され得る。哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションについて、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞のごく一部のみが、外来性ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの成分を同定し、選択するために、（例えば、抗生物質に対する耐性のために）選択可能なマーカーをコードする遺伝子が、一般に、該当する遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を与えるものを含む。導入された核酸が安定にトランスフェクトされた細胞が、他の方法の中でも特に、薬剤選択によって同定され得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は、生存するであろうが、他の細胞は死亡する）。
【０１４１】
形質転換された細胞は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養され得、ポリペプチドは、従来のタンパク質精製手順によって回収される。１つのこのような精製手順が、以下の実施例に記載されている。本明細書において使用することが想定されたポリペプチドは、汚染性内因性物質を実質的に含まない実質的に均一な組み換え哺乳動物抗エンドセリン受容体抗体ポリペプチドを含む。
【０１４２】
抗体の活性
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、エンドセリン受容体に特異的に結合し、シグナル伝達を阻害し、治療的生物学的効果、例えば、動物モデルにおける肺動脈高血圧の軽減を示す。別の実施形態において、本明細書において提供されるマウスまたはヒト化抗体は、ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合する。このような抗体は、エンドセリンシグナル伝達を低減または中和する拮抗または中和抗体を含む。
【０１４３】
一実施形態において、ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡＲに結合する本明細書において提供される抗体のＫｄは、約０．０１ｎＭ〜１０００ｎＭ、０．１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５ｎＭ〜２００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ、または１０ｎＭ〜１００ｎＭの範囲である。別の実施形態において、ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡＲに結合する本明細書において提供される抗体のＫｄは、約１ｎＭ〜２００ｎＭである。さらに別の実施形態において、ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡＲに結合する本明細書において提供される抗体のＫｄは、約１０ｎＭ〜１００ｎＭである。さらに別の実施形態において、ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡＲに結合する本明細書において提供される抗体のＫｄは、約１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、または１００ｎＭである。
【０１４４】
一実施形態において、エンドセリンシグナル伝達に拮抗する本明細書において提供される抗体のＩＣ５０は、約０．０１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．１ｎＭ〜２００ｎＭ、０．５ｎＭ〜２００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ、または１０ｎＭ〜１００ｎＭの範囲である。別の実施形態において、エンドセリンシグナル伝達に拮抗する本明細書において提供される抗体のＩＣ５０は、約１ｎＭ〜２００ｎＭである。さらに別の実施形態において、エンドセリンシグナル伝達に拮抗する本明細書において提供される抗体のＩＣ５０は、約１０ｎＭ〜１００ｎＭである。さらに別の実施形態において、エンドセリンシグナル伝達に拮抗する本明細書において提供される抗体のＩＣ５０は、約１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、または１００ｎＭである。
【０１４５】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡＲに特異的に結合し、１つまたは複数の以下の特性を有する：
ａ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡＲに結合する際に、参照抗体と同じＫｄを有すること；
ｂ．エンドセリンによって活性化されるヒトエンドセリン受容体ＥＴＡＲに拮抗する際に、参照抗体と同じＩＣ５０を有すること；および
ｃ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡＲに対する参照抗体との交差競合的結合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ）。
【０１４６】
一態様において、参照抗体は、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列  配列番号１３８および重鎖可変ドメインアミノ酸配列  配列番号１６６の組合せを含む。別の態様において、参照抗体は、モノクローナル抗体Ａ−１、Ａ−２、Ａ−７、Ａ−９、またはＡ−１２である。
【０１４７】
本明細書において使用される際、「実質的に同様」という用語は、参照抗体のＩＣ５０またはＫｂ（またはＫｄ）と同等であるか、または約１００％、９９％、９８％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、または５０％同一であることを意味する。一実施形態において、参照抗体は、例えば、重鎖および軽鎖組合せＬ１Ｈ１またはＬ２Ｈ２を含む抗体である。別の実施形態において、参照抗体は、Ａ−１を含む。
【０１４８】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体は、ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合し、動物モデルにおいて肺動脈高血圧を低下させることができる。一実施形態において、肺動脈高血圧は、処理なしの動物と比較して約２％低下される。別の実施形態において、肺動脈高血圧は、処理なしの動物と比較して約５％低下される。さらに別の実施形態において、肺動脈圧は、処理なしの動物と比較して約１０％低下される。さらに別の実施形態において、肺動脈高血圧は、処理なしの動物と比較して約１５％低下される。さらに別の実施形態において、肺動脈高血圧は、処理なしの動物と比較して約２０％低下される。さらに別の実施形態において、肺動脈高血圧は、処理なしの動物と比較して約２５％低下される。肺動脈高血圧の低下の量は、投与量によって制御される。治療的に有効な投与量は、肺動脈高血圧を、動物またはヒト患者の正常範囲内に低下させるのに必要な投与量である。
【０１４９】
医薬組成物
一実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物は、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体と、１つまたは複数の薬学的に許容できる担体とを含む。
【０１５０】
一実施形態において、ＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤が、本明細書において提供される。ＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、より長い生体内半減期を有して、安定かつ有効であり、肺動脈高血圧および関連疾患および生殖器の癌を有効に処置するのに使用され得る。
【０１５１】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体および緩衝液を含む。一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤のｐＨは、約４〜１１、５〜７、または５〜６の範囲である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤のｐＨは、約５〜７である。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤のｐＨは、約５〜６である。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤のｐＨは、約５．３〜６．５である。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤のｐＨは、約５．８である。
【０１５２】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜５００ｍｇ／ｍＬ、１０〜２５０ｍｇ／ｍＬ、１０〜２００ｍｇ／ｍＬ、または１０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ、または１００ｍｇ／ｍＬである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１１０ｍｇ／ｍＬ、１２０ｍｇ／ｍＬ、１３０ｍｇ／ｍＬ、１４０ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１６０ｍｇ／ｍＬ、１７０ｍｇ／ｍＬ、１８０ｍｇ／ｍＬ、１９０ｍｇ／ｍＬ、または２００ｍｇ／ｍＬである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、または１００ｍｇ／ｍＬである。
【０１５３】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される緩衝液の濃度が、約１ｍＭ〜２００ｍＭ、２ｍＭ〜５０ｍＭ、または５ｍＭ〜２５ｍＭの範囲である。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される緩衝液の濃度が、約５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される緩衝液の濃度が、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、または３０ｍＭである。
【０１５４】
一実施形態において、本明細書に記載される緩衝液は、クエン酸、クエン酸の塩、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩、グルコン酸、グルコン酸の塩、炭酸、炭酸の塩、酒石酸、酒石酸の塩、コハク酸、コハク酸の塩、酢酸、酢酸の塩、フタル酸、フタル酸の塩、リン酸、リン酸の塩、塩酸、トリス、トロメタミン、およびアミノ酸から選択される１つまたは複数を含む。別の実施形態において、本明細書に記載される緩衝液は、クエン酸の塩である。さらに別の実施形態において、本明細書に記載される緩衝液は、クエン酸ナトリウムである。さらに別の実施形態において、本明細書に記載される緩衝液は、ヒスチジンである。
【０１５５】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤は、界面活性剤も含む。
【０１５６】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される界面活性剤の濃度が、約０．００１〜１重量／体積パーセント、０．０１〜０．５重量／体積パーセント、または０．０１〜０．１重量／体積パーセントの範囲である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される界面活性剤の濃度が、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、または０．１重量／体積パーセントである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される界面活性剤の濃度が、約０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、または０．０６重量／体積パーセントである。
【０１５７】
一実施形態において、本明細書に記載される界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油、ポリオキシエチレン蜜ろう誘導体、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、Ｃ１０〜Ｃ１８アルキルサルフェート、平均して２〜４モルの付加オキシラン基を有するポリオキシエチレンＣ１０〜Ｃ１６アルキルエーテルサルフェート、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルスルホサクシネートエステル塩、天然界面活性剤、スフィンゴリン脂質、およびＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸のスクロースエステルから選択される１つまたは複数である。
【０１５８】
別の実施形態において、本明細書に記載される界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステル、例えば、モノカプリル酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン；グリセリン脂肪酸エステル、例えば、モノカプリル酸グリセリン、モノミリスチン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン；ポリグリセリン脂肪酸エステル、例えば、モノステアリン酸デカグリセリル、ジステアリン酸デカグリセリル、モノリノール酸デカグリセリル；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ここで、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートは、ＴＷＥＥＮ−２０であり、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートは、ＴＷＥＥＮ−４０である）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ここで、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレエートは、ＴＷＥＥＮ−８０である）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ここで、ポリオキシエチレン（６０）ソルビタンモノステアレートは、ＴＷＥＥＮ−６０であり、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエートは、ＴＷＥＥＮ−８５であり、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレートは、ＴＷＥＥＮ−６５である）；ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビトールテトラオレエート；ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレンモノステアリン酸グリセリル；ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、例えば、ポリエチレングリコールジステアレート；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、例えば、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル；ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、例えば、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル；ポリオキシエチレン水添ヒマシ油、例えば、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油；ポリオキシエチレン蜜ろう誘導体、例えば、ポリオキシエチレンソルビトール蜜ろう；ポリオキシエチレンラノリン誘導体、例えば、ポリオキシエチレンラノリン；およびポリオキシエチレン脂肪酸アミド、例えば、ポリオキシエチレンステアリン酸アミド；Ｃ１０〜Ｃ１８アルキルサルフェート、例えば、セチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム；平均して２〜４モルのエチレンオキシド単位が付加されたポリオキシエチレンＣ１０〜Ｃ１６アルキルエーテルサルフェート、例えば、ナトリウムポリオキシエチレンラウリルサルフェート；およびＣ１〜Ｃ１８アルキルスルホサクシネートエステル塩、例えば、ナトリウムラウリルスルホサクシネートエステル；および天然界面活性剤、例えば、レシチン、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、例えば、スフィンゴミエリン、およびＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸のスクロースエステルから選択される１つまたは複数である。
【０１５９】
一実施形態において、本明細書に記載される界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えば、ＴＷＥＥＮ−２０、ＴＷＥＥＮ−４０、ＴＷＥＥＮ−６０およびＴＷＥＥＮ−８０である。別の実施形態において、本明細書に記載される界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ−２０またはＴＷＥＥＮ−８０である。
【０１６０】
別の実施形態において、ＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、アミノ酸保護剤も含む。
【０１６１】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載されるアミノ酸保護剤の濃度が、約１ｍＭ〜５００ｍＭまたは１０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載されるアミノ酸保護剤の濃度が、約１０ｍＭ〜２００ｍＭである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載されるアミノ酸保護剤の濃度が、約１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、または２００ｍＭである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載されるアミノ酸保護剤の濃度が、約１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、または１６０ｍＭである。
【０１６２】
一実施形態において、アミノ酸保護剤は、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、およびプロリンから選択される１つまたは複数である。別の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸保護剤は、ヒスチジン、アルギニン、およびグリシンから選択される１つまたは複数である。さらに別の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸保護剤は、アルギニンまたはその塩である。さらに別の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸保護剤は、アルギニン塩酸塩である。
【０１６３】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬであり；界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントであり；アミノ酸保護剤の濃度が、約１０〜２００ｍＭであり；緩衝液の濃度が、約１〜５０ｍＭであり；ここで、製剤のｐＨが、約５〜７である。
【０１６４】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍＬであり；界面活性剤の濃度が、約０．０４重量／体積パーセントであり；アミノ酸保護剤の濃度が、約１４０ｍＭであり；緩衝液の濃度が、約２０ｍＭであり；ここで、製剤のｐＨが、約５〜６である。
【０１６５】
さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、ポリオール保護剤も含む。
【０１６６】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載されるポリオールの濃度が、約０．１％〜５０％、１％〜２０％、１％〜１５％、２％〜１０％、または４％〜１０％の範囲である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤中で、本明細書に記載されるポリオールの濃度が、約４〜１０重量／体積パーセントである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤中で、本明細書に記載されるポリオールの濃度が、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０重量／体積パーセントである。
【０１６７】
一実施形態において、本明細書に記載されるポリオール保護剤は、ソルビトール、マンニトール、スクロース、またはトレハロースである。別の実施形態において、本明細書に記載されるポリオール保護剤は、ソルビトールまたはマンニトールである。
【０１６８】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、ＥＴＡＲの濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬであり；界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントであり；ポリオール保護剤の濃度が、約１〜２０重量／体積パーセントであり；緩衝液の濃度が、約１〜５０ｍＭであり；ここで、製剤のｐＨが、約５〜７である。
【０１６９】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５、５０、７５または１００ｍｇ／ｍＬであり；界面活性剤の濃度が、約０．０４重量／体積パーセントであり；ポリオール保護剤の濃度が、約４〜１０重量／体積パーセントであり；緩衝液の濃度が、約２０ｍＭであり；ここで、製剤のｐＨが、約５〜６である。
【０１７０】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤は、金属キレート剤も含む。
【０１７１】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される金属キレート剤の濃度が、約０．００１ｍＭ〜１ｍＭ、０．００５ｍＭ〜０．５ｍＭ、または０．０１ｍＭ〜０．２ｍＭの範囲である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される金属キレート剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜０．２ｍＭである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される金属キレート剤の濃度が、約０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０９ｍＭ、または０．１ｍＭである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される金属キレート剤の濃度が、約０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０９ｍＭ、または０．１ｍＭである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される金属キレート剤の濃度が、約０．０３ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、または０．０７ｍＭである。
【０１７２】
一実施形態において、本明細書に記載される金属キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、またはＥＧＴＡである。別の実施形態において、本明細書に記載される金属キレート剤は、ＥＤＴＡである。
【０１７３】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬであり；金属キレート剤の濃度が、約０．０１〜０．２ｍＭであり；界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントであり；アミノ酸保護剤の濃度が、約１０〜２００ｍＭであり；緩衝液の濃度が、約１〜５０ｍＭであり；ここで、製剤のｐＨが、約５〜７である。
【０１７４】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍＬであり；金属キレート剤の濃度が、約０．０５ｍＭであり；界面活性剤の濃度が、約０．０４重量／体積パーセントであり；アミノ酸保護剤の濃度が、約１４０ｍＭであり；緩衝液の濃度が、約２０ｍＭであり；ここで、製剤のｐＨが、約５〜６である。
【０１７５】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬであり；金属キレート剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜０．２ｍＭであり；界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントであり；ポリオール保護剤の濃度が、約１〜２０重量／体積パーセントであり；緩衝液の濃度が、約１〜５０ｍＭであり；ここで、製剤のｐＨが、約５〜７である。
【０１７６】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５、５０、または１００ｍｇ／ｍＬであり；金属キレート剤の濃度が、約０．０５ｍＭであり；界面活性剤の濃度が、約０．０４重量／体積パーセントであり；ポリオール保護剤の濃度が、約４〜１０重量／体積パーセントであり；緩衝液の濃度が、約２０ｍＭであり；ここで、製剤のｐＨが、約５〜６である。
【０１７７】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤は、酸化防止剤も含む。
【０１７８】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される酸化防止剤の濃度が、約０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、０．５ｍＭ〜２０ｍＭ、または１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される酸化防止剤の濃度が、約１〜１０ｍＭである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される酸化防止剤の濃度が、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、または１０ｍＭである。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、本明細書に記載される酸化防止剤の濃度が、約３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、または７ｍＭである。
【０１７９】
一実施形態において、本明細書に記載される酸化防止剤は、メチオニン、ビタミンＣ、チオサルフェート、チオサルフェート、またはベンジルメチオニンである。別の実施形態において、本明細書に記載される酸化防止剤は、メチオニンである。
【０１８０】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬであり；酸化防止剤の濃度が、約１〜１０ｍＭであり；界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントであり；アミノ酸保護剤の濃度が、約１０〜２００ｍＭであり；緩衝液の濃度が、約１〜５０ｍＭであり；ここで、製剤のｐＨが、約５〜７である。
【０１８１】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍＬであり；酸化防止剤の濃度が、約５ｍＭであり；界面活性剤の濃度が、約０．０４重量／体積パーセントであり；アミノ酸保護剤の濃度が、約１４０ｍＭであり；緩衝液の濃度が、約２０ｍＭであり；ここで、製剤のｐＨが、約５〜６である。
【０１８２】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬであり；酸化防止剤の濃度が、約１ｍＭ〜１０ｍＭであり；界面活性剤の濃度が、約０．０１〜０．１重量／体積パーセントであり；ポリオール保護剤の濃度が、約１〜２０重量／体積パーセントであり；緩衝液の濃度が、約１〜５０ｍＭであり；ここで、製剤のｐＨが、約５〜７である。
【０１８３】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した溶液製剤中で、ＥＴＡＲ抗体の濃度が、約２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍＬであり；酸化防止剤の濃度が、約５ｍＭであり；界面活性剤の濃度が、約０．０４重量／体積パーセントであり；ポリオール保護剤の濃度が、約４〜１０重量／体積パーセントであり；緩衝液の濃度が、約２０ｍＭであり；ここで、製剤のｐＨが、約５〜６である。
【０１８４】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、
１０〜１５０ｍｇ／ｍＬのＥＴＡＲモノクローナル抗体；
０．１ｍＭ〜１ｍＭの金属キレート剤；
０．０１％〜０．１％の界面活性剤；
１％〜５０％のポリオール保護剤または１０〜２００ｍＭのアミノ酸保護剤；および
５．０〜７．０のｐＨをもたらす緩衝系
を含む。
【０１８５】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、
１０〜１５０ｍｇ／ｍＬのＥＴＡＲモノクローナル抗体；
０．０２ｍＭ〜０．２ｍＭの金属キレート剤；
０．０１％〜０．１％の界面活性剤；
１％〜１０％のポリオール保護剤または５０〜２００ｍＭのアミノ酸保護剤；および
５．３〜６．５のｐＨをもたらす緩衝系
を含む。
【０１８６】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、
１０〜１５０ｍｇ／ｍＬのＥＴＡＲモノクローナル抗体；
０〜１ｍｇ／ｍＬの金属キレート剤；
０〜０．１％の界面活性剤；
０〜５０％のポリオール保護剤または０〜２００ｍＭのアミノ酸保護剤；および
５．０〜７．０のｐＨをもたらす緩衝系
を含む。
【０１８７】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、
１０〜１５０ｍｇ／ｍＬのＥＴＡＲモノクローナル抗体；
０〜０．１ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ
０〜０．１％の界面活性剤；
０〜１０％のポリオール保護剤または５０〜２００ｍＭのアミノ酸保護剤；および
５．３〜６．５のｐＨをもたらす緩衝系
を含む。
【０１８８】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、水溶液である。別の実施形態において、本明細書において提供される薬剤ＥＴＡＲ抗体の安定した製剤は、滅菌溶液である。
【０１８９】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤の安定性が、ＥＴＡＲ抗体の凝集度によって決定される。一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、１、２、３、６、１２、または２４ヶ月間にわたって約４０℃および約７５％の湿度で貯蔵した後、２０％、１５％、１０％、８％、６％、５，％、４％、３％、２％、１％、または０．１％以下の凝集ＥＴＡＲ抗体を含有する。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、３、６、１２、または２４ヶ月間にわたって室温および約６５％の湿度で貯蔵した後、２０％、１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．１％以下の凝集ＥＴＡＲ抗体を含有する。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、６、１２、１８、２４、３６または４８ヶ月間にわたって２〜８℃で貯蔵した後、２０％、１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．１％以下の凝集ＥＴＡＲ抗体を含有する。
【０１９０】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤の安定性が、ＥＴＡＲ抗体の分解度によって決定される。一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、１、２、３、６、１２または２４ヶ月間にわたって約４０℃および約７５％の湿度で貯蔵した後、２０％、１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．１％以下のＥＴＡＲ抗体の分解度を有する。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、３、６、１２、または２４ヶ月間にわたって室温および約６５％の湿度で貯蔵した後、２０％、１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．１％以下のＥＴＡＲ抗体の分解度を有する。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤は、６、１２、１８、２４、３６または４８ヶ月間にわたって２〜８℃で貯蔵した後、２０％、１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．１％以下のＥＴＡＲ抗体の分解度を有する。
【０１９１】
一実施形態において、ＥＴＡＲ抗体の凝集およびモノマーＥＴＡＲ抗体の損失が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって決定される。
【０１９２】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤の安定性が、ＥＴＡＲ抗体の生物学的活性の変化によって決定される。一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤中のＥＴＡＲ抗体は、１、２、３、６、１２または２４ヶ月間にわたって約４０℃および約７５％の湿度で貯蔵した後、その元の生物学的活性の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％以上の生物学的活性を有する。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤中のＥＴＡＲ抗体は、３、６、１２、または２４ヶ月間にわたって室温および約６５％の湿度で貯蔵した後、その元の生物学的活性の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％以上の生物学的活性を有する。さらに別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤中のＥＴＡＲ抗体は、６、１２、１８、２４、３６または４８ヶ月間にわたって２〜８℃の温度で貯蔵した後、その元の生物学的活性の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％以上の生物学的活性を有する。
【０１９３】
一実施形態において、ＥＴＡＲ抗体の生物学的活性の変化が、インビトロでＥＴＡＲを阻害するＥＴＡＲ抗体の能力を決定するためにカルシウム流出検出方法によって決定される。
【０１９４】
処置の方法
一実施形態において、被験体の高血圧（例えば、ＰＡＨ）を低下させる方法であって、治療有効量の本明細書において提供される医薬組成物、例えば、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤を、被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１９５】
別の実施形態において、被験体のＰＡＨを処置する方法であって、治療有効量の本明細書において提供される医薬組成物、例えば、本明細書において提供されるＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤を、被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【０１９６】
本明細書において使用される際、「被験体」という用語は、ヒトを含む哺乳動物を指し、「患者」という用語と同義的に使用される。「処置」という用語は、疾患の少なくとも１つの症状または他の側面の軽減または予防、または疾患重症度の低下などを包含する。本明細書において提供される抗体は、有効な治療剤であるために、完治を提供し、または疾患の全ての症状または兆候を根絶する必要はない。関連分野において認識されるように、治療剤は、所与の病態の重症度を低下させ得るが、有効であるために、疾患の全ての兆候をなくす必要はない。同様に、予防薬は、有効であるために、病態の発生を完全に予防する必要はない。（例えば、その症状の数または重症度を低減することによって、または別の処置の有効性を増加させることによって、または別の有益な効果を生じることによって）疾患の影響を単に低減すること、または疾患が被験体において発生または悪化する可能性を低下されることで十分である。本発明の一実施形態は、特定の疾患の重症度を反映する指標としてベースラインに対する持続的改善を誘発するのに十分な量および時間にわたって抗体を患者に投与することを含む方法に関する。
【０１９７】
医薬組成物は、限定はされないが、非経口で、局所的に、または吸入によるなどの任意の好適な技術によって投与され得る。注入される場合、医薬組成物は、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内または皮下経路を介して、ボーラス注入または持続注入によって投与され得る。例えば、経皮投与および埋め込み型製剤（ｉｍｐｌａｎｔ）の持続放出などの疾患または損傷部位における局部的な投与が考えられる。吸入による送達としては、例えば、経鼻または経口吸入、噴霧器の使用、エアロゾル形態の抗体の吸入などが挙げられる。他の代替例としては、丸薬、シロップ、またはトローチ剤を含む経口製剤が挙げられる。
【０１９８】
有利には、本明細書において提供される抗体は、生理学的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤などの１つまたは複数のさらなる成分を含む組成物中で投与される。組成物は、後述される１つまたは複数の生理学的に活性な薬剤をさらに含む。多くの特定の実施形態において、組成物は、本明細書において提供される１つまたは複数の抗体（例えば、マウス抗体またはヒト化抗体）に加えて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの生理学的に活性な薬剤を含む。
【０１９９】
一実施形態において、医薬組成物は、好適なｐＨで抗体に好適な緩衝液、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量ポリペプチド（１０個未満のアミノ酸を有するものなど）、タンパク質、アミノ酸、デキストリンなどの炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン、安定剤、および賦形剤からなる群から選択される１つまたは複数の物質と一緒に、本発明のマウス抗体またはヒト化抗体を含む。適切な業界標準にしたがって、防腐剤も加えられ得る。組成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液を用いて、凍結乾燥物として製剤化され得る。好適な成分は、用いられる投与量および濃度でレシピエントに無害である。医薬製剤に用いられ得る成分のさらなる例が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄ．（１９８０）ａｎｄ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．（２０００）に示されている。本発明の１つまたは複数の抗体およびラベルまたは本明細書に記載される病態のいずれかを処置するのに使用するための他の使用説明書を含む、医師による使用のためのＭａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙキットが提供される。一実施形態において、キットは、１つまたは複数のヒト抗体の滅菌製剤を含み、これは、上に開示される組成物の形態であり得、１つまたは複数のバイアル中にあり得る。
【０２００】
投与量および投与の頻度は、投与経路、用いられる具体的な抗体、処置される疾患の性質および重症度、病態が急性か慢性か、および被験体の大きさおよび全身状態などの要因に応じて変化し得る。適切な投与量は、関連技術において公知の手順によって、例えば用量漸増試験を含み得る臨床試験において決定され得る。
【０２０１】
本明細書において提供される抗体は、例えば、所定の期間にわたって一定の間隔で、例えば、１回または２回以上投与され得る。特定の実施形態において、マウス抗体またはヒト化抗体は、１ヶ月に少なくとも１回またはそれ以上、例えば、１、２、または３ヶ月間の期間にわたって、あるいは無期限に投与される。慢性疾患を処置するために、長期処置が、一般に最も有効である。しかしながら、急性疾患を処置するために、例えば、１〜６週間のより短い期間にわたる投与で、十分であり得る。一般に、ヒト化抗体は、１つまたは複数の選択された指標についてベースラインに対する医学的に関連する改善の程度が患者に見られるまで投与される。
【０２０２】
本明細書において提供される治療計画の一例は、肺動脈圧レベルが関与する病態を処置するために、適切な投与量で、週に１回の抗体の皮下注入を含む。抗体の週に１回または月に１回の投与は、所望の結果が得られるまで、例えば、被験体の症状が治まるまで続けられるであろう。処置は、必要に応じて再開してもよく、あるいは、維持量が投与され得る。
【０２０３】
被験体の肺動脈圧のレベルは、それらのレベルの変化があった場合にそれを検出するために、ヒト化抗体などの抗体による処置の前、その間および／またはその後にモニターされ得る。いくつかの疾患については、肺動脈圧の上昇の発生率は、疾患の段階などの要因に応じて変化し得る。肺動脈圧レベルを測定するための公知の技術が用いられ得る。
【０２０４】
本発明の方法および組成物の特定の実施形態は、抗体および１つまたは複数のＥＴＡＲアンタゴニスト、例えば、本発明の２つ以上の抗体、または本開示の抗体および１つまたは複数の他のＥＴＡＲアンタゴニストの使用を含む。さらなる実施形態において、抗体は、単独で、または患者が罹患している病態を処置するのに有用な他の薬剤と組み合わせて投与される。このような薬剤の例は、タンパク性および非タンパク性薬剤の両方を含む。複数の治療薬が共投与される場合、投与量は、関連技術において認識されるように、それ相応に調整され得る。「共投与」および併用療法は、同時投与に限定されず、少なくとも１つの他の治療剤を患者に投与することを含む処置過程の間に抗体が少なくとも１回投与される処置計画も含む。
【０２０５】
別の態様において、肺動脈高血圧および関連疾患を処置するための薬剤を調製する方法は、本明細書において提供される抗体および薬学的に許容できる賦形剤の混合物を含む。薬剤の調製方法は、上述した。
【０２０６】
ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合する抗体に関連する組成物、キット、および方法が、本明細書においてさらに提供される。ＥＴＡＲと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部または全ポリヌクレオチドを含む核酸分子およびその誘導体およびフラグメント、例えば、エンドセリン受容体抗体、抗体フラグメントまたは抗体誘導体の全てまたは一部をコードする核酸も提供される。核酸を含むベクターおよびプラスミド、ならびに核酸および／またはベクターおよびプラスミドを含む細胞および細胞系が、本明細書においてさらに提供される。本明細書において提供される方法は、例えば、ヒトＥＴＡＲと相互作用する抗体の調製、同定または分離のための方法、例えば、ＥＴＡＲ抗体の方法、抗体がＥＴＡＲに結合するかどうかを決定するための方法、およびＥＴＡＲに結合する抗体を動物モデルに投与するための方法を含む。
【０２０７】
本明細書に記載される技術的解決法は、以下の実施例によってさらに理解されよう。
【実施例】
【０２０８】
規定されない場合、本明細書に記載される出発材料および機器は、市販されているか、または当該技術分野において一般的に使用されるものである。以下の実施例における方法は全て、特に規定されない限り、当該技術分野における従来の方法である。
【０２０９】
１、免疫付与のための安定した抗原細胞系の構築
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞を、６ウェルプレート中に播種した。２４時間の培養後、細胞に、ｈＥＴＡＲ遺伝子（ヌクレオチド配列については配列番号１、およびアミノ酸配列については配列番号２を参照）を有するように修飾されたｐＩＲＥＳプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、市販）をトランスフェクトした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００のためにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって推奨されるトランスフェクション条件にしたがうことによって、トランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後、培地を、１０ｎＭのＭＴＸ（メトトレキサート）を含有する完全培地と交換した。安定したクローンが現れるまで、約２週間にわたって３日置きに培地を交換した。分散された細胞群体を、プレートから取り出し、収集した。細胞が約５０％コンフルエンスになるまで増殖した後、ＭＴＸの濃度を、圧力選択のために１０μＭまで徐々に増加させた。構築された安定した細胞系を、圧力選択後に細胞クローンを同定するために、ｈＥＴＡＲに対するポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて、ＦＡＣＳによって分析した。大量のｈＥＴＡＲ発現が、選択されたＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＥＴＡＲ細胞膜において検出された。最初に、サブクローニングによって、６つの高ＥＴＡＲ発現および安定した細胞系が同定され、得られた。
【０２１０】
２、抗体の調製
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＥＴＡＲ全細胞およびフロイントアジュバントのエマルジョンを、２×１０６個の細胞／マウスで、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）の皮下に注入した。２週間後、マウスに、不完全フロイントアジュバントで乳化した免疫原で追加免疫し、その後、週に１回追加免疫した。合計６回の免疫付与後、血液試料を、剃毛した尾の末端（ｃｌｉｐｐｅｄ  ｔａｉｌ  ｅｎｄ）から採取し、遠心分離して、血清を収集した。血清を、ＦＡＣＳによって血清力価について分析した。許容できる抗体力価が得られた後、マウスを殺処分し、その脾臓細胞を、無菌状態で採取した。ＳＰ２／０細胞を、２，０００ｒｐｍで３分間の遠心分離により、対数増殖期に収集した。細胞ペレットを、無血清培地で再度懸濁させ、次に、遠心分離し、再度二度目の懸濁を行い、計数した。脾臓細胞およびＳＰ２／０細胞を、ＳＰ２／０細胞：脾臓細胞≧１：１の比率で混合した後、３回の洗浄−遠心分離を行った。最後の遠心分離からペレットを取り出した後、１ｍＬの予め洗浄されたＰＥＧ−１３５０を、滴下して加え（３０秒で終了）、１分間ピペット混合した後、３０ｍＬの予め洗浄された無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をゆっくりと加えて、ＰＥＧ融合を停止させた。１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離の後、細胞ペレットを、融合培地中で再度懸濁させた。１００μＬ中の脾臓細胞（２０，０００個）および支持細胞層細胞（５，０００個）を、９６ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。融合されたハイブリドーマ細胞および支持細胞層細胞を、非融合細胞を取り除くために、ＨＡＴ（サルシン、アメトプテリンおよびチミジン）選択を用いて、９６ウェルプレート中で共培養した。１０日後、培養プレート中のハイブリドーマ細胞の上清を、ＥＬＩＳＡ分析のために収集した。
【０２１１】
３、全細胞のＥＬＩＳＡスクリーニング
ｈＥＴＡＲを過剰発現するＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＥＴＡＲ細胞およびｈＥＴＡＲを発現しないＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞を、９６ウェルプレート中に別々に移し、９０％コンフルエントになるまで増殖させた。培地の上清を除去し、付着した細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、次に、１００μＬの、１００％メタノールを加えて、４℃で１０分間にわたって細胞を固定した。次に、１００μＬの、作製したばかりの０．６％のＨ２Ｏ２−ＰＢＳを加え、室温で２０分間にわたるインキュベーションの後、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳ−１％のＢＳＡ溶液でブロックした後、ハイブリドーマ上清を加え、４℃で９０分間インキュベートした。数回の洗浄後、１００μＬの二次抗体ＧｘＭ−ＨＲＰ−Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、各ウェルに加え、３７℃で０．５時間インキュベートした。５回の洗浄後、１００μＬのＴＭＢ発色性基質を、各ウェルに加え、３７℃で１５分間インキュベートし、次に、２ＭのＨ２ＳＯ４を加えて停止させ、ＯＤ４５０値を読み取った。陽性対照は、免疫付与後のマウス血清であり；陰性対照は、細胞培養上清であった。図１に示されるように、ＥＬＩＳＡによる初期の分析の後、抗ｈＥＴＡＲ抗体を分泌するいくつかのハイブリドーマクローンを選択し、ｈＥＴＡＲに対する安定した分泌細胞系が、細胞クローニング後に得られた。最後に、ハイブリドーマによって分泌された抗体上清を、ＦＡＣＳ分析によって確認した。
【０２１２】
４、抗体遺伝子のクローニングおよびサブクローニング
抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を収集した。ハイブリドーマｍＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  ｍＲＮＡ抽出キットの製造業者のプロトコルにしたがって抽出した。次に、抽出されたｍＲＮＡを、ｃＤＮＡに逆転写した。逆転写プライマーは、マウスの軽鎖および重鎖定常領域に対して特異的なプライマーであり、重鎖逆転写プライマーは、（５’−ＴＴＴＧＧＲＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣ−３’）（配列番号１９９）であり、軽鎖逆転写プライマーは、（５’−ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’）（配列番号２００）および（５’−ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’）（配列番号２０１）であった。ＲＴ−ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった：２５℃で５分、５０℃で６０分、および７０℃で１５分。逆転写されたｃＤＮＡを、５００μＬになるまで０．１ｍＭのＴＥで希釈し、限外ろ過遠心分離管（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５）に加え、１０分間にわたって２，０００ｇで遠心分離した。ろ液を除去し、５００μＬの０．１ｍＭのＴＥを加え、１０分間にわたって２，０００ｇで遠心分離した。ろ液を除去し、調製管を、新しい遠心分離管に逆さに入れ、１０分間にわたって２，０００ｇで遠心分離して、精製されたｃＤＮＡを得た。精製されたｃＤＮＡ（１０μＬ）を鋳型として取った後、４μＬの５倍のテーリングバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）、４μＬのｄＡＴＰ（１ｍＭ）および１０Ｕ末端トランスフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、均一に混合し、３７℃で５分間、次に、６５℃で５分間インキュベートした。ポリＡテイルｃＤＮＡを、鋳型として使用し、抗体の軽鎖および重鎖可変領域遺伝子を増幅するために、ＰＣＲを行った。上流プライマーは全て、オリゴｄＴであり、重鎖下流プライマーは、（５’−ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣ−３’）（配列番号２０２）および（５’−ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＣＣ−３’）（配列番号２０３）であり、軽鎖下流プライマーは、（５’−ＡＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣＧＴＧ−３’）（配列番号２０４）であった。ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった：９５℃で５分；９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分、４０サイクル；および７２℃で７分。ＰＣＲ産物を、配列決定のためにＰＭＤ  １８−Ｔベクター（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）に連結した。抗体クローンの配列を表２に列挙した。
【０２１３】
ＰＣＲプライマーを、抗体のＤＮＡ配列に基づいて設計し、したがって、完全な軽鎖、重鎖シグナルペプチドおよび可変ドメインおよびマウスＩｇＧ１定常領域を、発現ベクターｐＴＭ５に連結した。
【０２１４】
５、抗体ヒト化および最適化
最初に、スクリーニングされたマウス抗体の軽鎖および重鎖可変領域の配列を、ＮＣＢＩオンライン抗体可変領域配列アライメントツール（Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ）を用いて、同種抗体と位置合わせして、ヒト化のための選択された抗体可変領域配列と相同のヒト化抗体の生殖系列遺伝子配列（Ｉｇ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅ配列）を検索し、ＣＤＲ配列を除いて最も高い相同性を有するヒト化遺伝子配列を、ＣＤＲグラフト化のための鋳型として使用して、ヒト化抗体可変領域配列を得て、ＣＲＯによってヒト化抗体軽鎖および重鎖遺伝子を合成した。この配列にしたがって、ＰＣＲプライマーを設計し、適切な制限酵素部位を、５’末端および３’末端において導入した。ＰＣＲによって、ヒト化抗体可変領域を増幅させ、次に、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４定常領域配列と組み合わせて、完全な組み換えヒト化抗体配列を得た。組み換え抗体の発現を、工程７にしたがって行い、ＥＴＡＲに対するそれらの親和性を、工程９に記載されるようにＦＡＣＳによって分析した。ＥＴＡＲに対する親和性を保持する最良のヒト化抗体候補が、群から選択され、その可変領域配列が、ＥＴＡＲに対する改善した親和性のために、部位特異的突然変異誘発によってさらに改善された。
【０２１５】
６、ヒト化抗ｈＥＴＡＲ抗体の遺伝子のサブクローニング
最適化ヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変領域遺伝子配列が、ＮｈｅＩの２つの制限部位を５’末端におよびＳａｌＩを３’末端に導入することによって、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＣＯ．，ＬＴＤによって合成された。全重鎖可変領域を、ｐＴＭ５の発現ベクターにおける重鎖定常領域と連結した。同様に、ＮｈｅＩを５’末端におよびＢｓｉｗＩを３’末端に導入することによって、軽鎖可変領域を、ｐＴＭ５の発現ベクターにおける軽鎖定常領域と連結した。
【０２１６】
７、抗ＥＴＡＲ抗体の一過性発現
ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ発現細胞系（５×１０５個／ｍＬ）の懸濁液を、振とうフラスコに接種した。３７℃で２４時間回転させた後、細胞密度は、１×１０６個／ｍＬに達し、トランスフェクションに対して準備が整った。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、ＰＥＩ対ＤＮＡについて３：１の最適混合比（ＤＮＡの量、０．５μｇ／Ｌ×１０６個の細胞；抗体軽鎖ＤＮＡおよび抗体重鎖ＤＮＡの比率、３：２）で、トランスフェクション試薬として使用した。両方の混合物を、１５分間のインキュベーションの後、細胞培養物に加えた。ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物で処理された後の細胞を、３７℃および５％のＣＯ２で２４時間超にわたって回転させた。次に、０．５％のトリプトンを、発現に必要とされる上清として細胞培養物に加え、発現の完了（９６時間超）後、細胞の上清を、抗体精製および分離のために収集した。
【０２１７】
８、抗体の精製および調製
細胞および細胞残屑を、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分）後に培養物から除去し、上清を、精製のために０．４５μｍフィルタに通してろ過した。精製プロセスを、クロマトグラフィーによって行った。まず、上清を、Ｇタンパク質結合アフィニティークロマトグラフィーカラムに通し、Ｇタンパク質に結合された抗体が、カラムに残っていた。３．０以下のｐＨを有する溶離剤を用いて、クロマトグラフィーカラムから抗体を溶離した。低ｐＨ溶離剤を、１Ｍのトリス−ＨＣｌで直ぐに中和して、抗体の変性および活性の低下を避けた。次に、抗体溶液を、１６時間にわたってＰＢＳ緩衝液中に透析した。
【０２１８】
９、機能性抗体のＦＡＣＳ分析
１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを用いて、１０５個のＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＥＴＡＲ細胞を取り出し、１．５ｍＬのＥＰ管中に収集した。上清を、遠心分離後に除去し、陰性対照試料を、ローディングバッファー（ＰＢＳ、２％のＦＢＳ）で再度懸濁させた。陽性対照については、２００μＬの抗体上清を、再懸濁細胞に加え、室温でインキュベーションを行い；次に、細胞を、１５００ｒｐｍで遠心分離して、上清を除去し、ＦＡＣＳローディングバッファーで洗浄し、再度遠心分離した。細胞を、１：５０の希釈率でのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス蛍光抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の添加（２００μＬ／ウェル）により再度懸濁させ、暗所で３０分間にわたって室温でインキュベートした。上清を、遠心分離後に除去し、細胞を、ＦＡＣＳローディングバッファーで洗浄し、再度遠心分離し、分析のためにローディングバッファーで再度懸濁させた。組み換え抗体上清およびＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＥＴＡＲ細胞は、特異的結合を有していた。灰色のピークおよび点線のピークは、陰性対照であり；抗体上清に対応する実線のピークは、著しく右に移動した。
【０２１９】
１０、機能性抗体についてのカルシウム流出アッセイ
ｈＥＴＡＲ−イクオリンを共発現するＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞を、ウェル当たり２５０００個の細胞で９６ウェル細胞培養プレートに播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、培養上清を除去した。セレンテラジン（５０μＬ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、暗所で加え、３７℃で２時間インキュベートし、次に、５０μＬのハイブリドーマ上清または精製された抗体を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、５０μＬのエンドセリン１を加え、４０秒以内のカルシウム流出の変化を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって記録した。異なるハイブリドーマ上清が、ｈＥＴＡＲによって媒介されるカルシウム流出を様々に阻害し、Ａ−１抗体が、ｈＥＴＡＲによって媒介されるカルシウム流出を著しく阻害した。組み換え抗ｈＥＴＡＲ機能性抗体は、抗体濃度の増加とともに増加する、ｈＥＴＡＲによって媒介されるカルシウム流出を著しく阻害した。
【０２２０】
１１、抗体のインビボ活性を試験するための低酸素誘発性ＰＡＨカニクイザルモデルの確立
カニクイザルの急性低酸素誘発性肺動脈高血圧（ＰＡＨ）モデルを、Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（Ｔａｉｃａｎｇ）と共同開発し、単回の静脈注射としてのＡ−１抗体の有効性を、このＰＡＨモデルにおいて評価した。全ての動物を、一晩絶食させ、秤量し、次に、１０ｍｇ／ｋｇのＡ−１抗体の単回静脈注射を受けさせた。３時間後、動物に麻酔をかけた。心拍数および酸素飽和度とともにドップラーカラー心エコーによる三尖弁逆流速度を、同時にモニターした。ベースラインが得られ、１２％の低酸素の誘発が続き、同時に、三尖弁逆流速度を測定し；抗体が、１２％の低酸素下で低酸素誘発性肺動脈圧を改善し得るかどうかを決定するために、分析を行った。４８時間の投与の後、試験を再度行った。動物に麻酔をかけ、心拍数および酸素飽和度とともにドップラーカラー心エコーによる三尖弁逆流速度を、同時にモニターした。ベースラインンが得られ、１２％の低酸素の誘発が続き、同時に、三尖弁逆流速度を測定した。抗体が、低酸素誘発性肺動脈圧をなお改善し得るかどうかを決定するために、分析を行った。有効性が、４８時間後に維持されていた場合、９６時間後に、低酸素誘発実験を再度行った。時間に対する肺動脈収縮期圧の曲線下の面積を計算し、曲線下の面積を比較することによって、Ａ−１が、９６時間以内に肺動脈圧を低下させる有効性を維持していたことが分かった。
【０２２１】
１２．ＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤：
以下は、ＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤の例である。
【０２２２】
実施例１：
【０２２３】
【表３】
2019523764.tif 000008
【０２２４】
実施例１の安定した溶液製剤のｐＨは、５．８である。
【０２２５】
実施例２：
【０２２６】
【表４】
2019523764.tif 000009
【０２２７】
実施例２の安定した溶液製剤のｐＨは、５．８である。
【０２２８】
実施例３：
【０２２９】
【表５】
2019523764.tif 000010
【０２３０】
実施例３の安定した溶液製剤のｐＨは、５．８である。
【０２３１】
実施例４：
【０２３２】
【表６】
2019523764.tif 000011
【０２３３】
実施例４の安定した溶液製剤のｐＨは、５．８である。
【０２３４】
実施例５：
【０２３５】
【表７】
2019523764.tif 000012
【０２３６】
実施例５の安定した溶液製剤のｐＨは、５．８である。
【０２３７】
実施例６：
【０２３８】
【表８】
2019523764.tif 000013
【０２３９】
実施例６の安定した溶液製剤のｐＨは、５．８である。
【０２４０】
実施例７：
【０２４１】
【表９】
2019523764.tif 000014
【０２４２】
実施例７の安定した溶液製剤のｐＨは、５．８である。
【０２４３】
実施例８：
【０２４４】
【表１０】
2019523764.tif 000015
【０２４５】
実施例８の安定した溶液製剤のｐＨは、５．８である。
【０２４６】
実施例９：
【０２４７】
【表１１】
2019523764.tif 000016
【０２４８】
実施例９の安定した溶液製剤のｐＨは、５．８である。
【０２４９】
実施例１０：
【０２５０】
【表１２】
2019523764.tif 000017
【０２５１】
実施例１０の安定した溶液製剤のｐＨは、５．８である。
【０２５２】
１３．ＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤を分析するための方法：
モノマーおよび凝集ＥＴＡＲ抗体を分析するためのサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）。
ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、ＥＴＡＲ抗体の凝集物（可溶性凝集物）の形成およびそのモノマー形態の喪失を決定した。２５℃でＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣにおいて、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷｘｌ高速ＳＥＣカラムに、ＵＶ吸光度のベースラインが一定で安定するまで、移動相として２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）をフラッシュした。１〜３ｍｇ／ｍＬ（移動相で予め希釈された）の濃度のＥＴＡＲ抗体の安定した薬剤溶液製剤を、５０μＬの量で注入した。試料を、０．５ｍＬ／分の流量で移動相を用いて溶離し、ＵＶ  ２８０ｎｍにおける吸光度を記録した。各試験の後、モノマー（主要ピーク）、二量体および多量体の吸光度ピークのＡＵＣを計算し、総ＡＵＣに対する主要ピークのＡＵＣのパーセンテージを計算し、試料の純度として報告した。
【０２５３】
還元および非還元ＥＴＡＲ抗体試料の純度を分析するためのキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）。
キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  ＭＤＱＰ／ＡＣＥ）を使用し、β−メルカプトエタノールを還元試料に加え、またはヨードアセトアミドを非還元試料に加えることによって、試料をＩｇＧ純度／不均一性アッセイキット（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）で処理した。分離させるためにＢｅｃｋｍａｎｎ非被覆キャピラリーを使用し、試料を、１ｍｇ／ｍＬの濃度で自動的に充填した。試料の充填を完了した後、分離を、１５ｋＶの逆電圧で行って、ＵＶ２１４ｎｍ吸光度時間曲線を記録した。プロセスが完了したとき、主要ピーク、フラグメントおよび凝集物のＵＶ２１４ｎｍにおける吸収ピークを積分した。非還元試料については、総面積に対する主要ピークの比率を計算し、これは、非還元試料の純度を表す。還元試料については、総面積に対する軽鎖および重鎖ピーク面積の比率を計算し、これは、還元試料の純度を表す。
【０２５４】
インビトロのＥＴＡＲに対するＥＴＡＲ抗体の阻害活性を決定するためのカルシウム流出検出方法。
ｈＥＴＡＲ−イクオリンを安定に発現するＥＴＡＲ−Ａｑ−＃１０５細胞を、３．５×１０４個の細胞／ウェルの密度および１００μＬ／ウェルで、９６ウェルプレートに播種し、プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で一晩置いた。１００μＬのセレンテラジン−ｈ（０．２３μＭのストック溶液）を、フェノールレッドを含まない３．２ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で希釈した。プレートを、培養器から取り出し、培地を吸引し、５０μＬ／ウェルの希釈されたセレンテラジン−ｈを加え（暗所で）、プレートを、２時間にわたって３７℃の培養器に入れた。参照抗体Ａ−１および試験試料を連続希釈し、５０μＬ／ウェルの希釈物を、９６ウェルプレートに加えた（暗所で）。試料の添加の後、プレートを、さらに３０分間にわたって３７℃および５％のＣＯ２で培養器に入れた。各ウェルの蛍光強度を、マイクロプレートリーダーで読み取った。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（フェノールレッドなし）のみを用いた３つのウェルの読み取り値が、バックグラウンド値であり、ウェルの残りには、２０ｎＭのエンドセリン−１が加えられた。
【０２５５】
読み取りデータを、分析のためにＥｘｃｅｌに通し、ピーク蛍光強度の時点を、計算値として選択した。ブランク対照の蛍光値の平均が得られ、次に、平均値を、各元の値から減算した。処理の後、最大蛍光強度の値を平均し、最大応答平均の平均に対する各ウェルの相対パーセンテージを最後に計算した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって、各ウェルのパーセンテージおよび濃度を用いて、参照ＥＴＡＲ抗体および試験試料についてのＩＣ５０値、ならびに曲線適合相関係数Ｒ２を計算した。試験試料の生物学的活性（％）＝（対照のＩＣ５０／試験試料のＩＣ５０）×１００。
【０２５６】
１４．ｐＨおよび緩衝液スクリーニング：
６５℃の水浴中で２時間後の抗体Ａ−１の外観およびＡ３４０吸収を決定するために、合計で７つの実験（表３を参照）により、４．７〜６．３のｐＨを有する２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液中の抗体Ａ−１を用いて、ｐＨを、ｐＨ単一要因実験からスクリーニングした。表３に示されるように、実験結果は、抗体Ａ−１が、ｐＨ５．０および５．７〜６．３内で、比較的良好な熱安定性を有していたことを示した。
【０２５７】
【表１３】
2019523764.tif 000018
【０２５８】
１５．タンパク質安定性に対する緩衝塩の濃度およびタイプの影響：
上記のｐＨスクリーニング結果に基づいて、さらなるスクリーニング実験を、ｐＨおよび緩衝液に対して行った。クエン酸ナトリウムおよびヒスチジンの２つの緩衝液系を選択し、実験を、２つの影響因子を用いて設計した。２組の試料を、３つの異なるｐＨ値の緩衝液、ｐＨ４．７、５．１、および５．３で、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウム、０．０２％のＴＷＥＥＮ−８０；ｐＨ５．７、６．０、および６．３で、２０ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭの塩化ナトリウム、０．０２％のＴＷＥＥＮ−８０（表４を参照）へと調製した。１〜６つの群の加速分解実験を行い、抗体Ａ−１の濃度を、５０ｍｇ／ｍＬに保持した。実験条件は、凍結融解：−２０℃で凍結、室温で融解、３サイクル；高温：３７℃で１０日、１３日；照明：５０００ｌｘ、３００μＷ／ｃｍ２、２５℃、５日；試験パラメータ：外観、可視粒子、純度（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、非還元ＣＥ−ＳＤＳ）、チャージバリアントであった。
【０２５９】
【表１４】
2019523764.tif 000019
【０２６０】
結果を、表５〜８に要約した。実験結果は、凍結融解サイクルが、抗体Ａ−１にそれほど影響を与えなかったが、高温および光照射での結果に基づいて、クエン酸ナトリウムのより低いｐＨが、凝集および純度の低下を容易にもたらしたことを示した。抗体Ａ−１は、特にチャージバリアントについて、光に対して比較的感受性であり、５日間の光照射後に、主要ピークが、著しく低下し、基本ピークが低下した。製剤４のみがほとんど変化せず、続いて、製剤５であった。したがって、製剤４を、次の保護剤スクリーニングのための製剤として選択した。
【０２６１】
【表１５】
2019523764.tif 000020
【０２６２】
【表１６】
2019523764.tif 000021
【０２６３】
【表１７】
2019523764.tif 000022
【０２６４】
【表１８】
2019523764.tif 000023
【０２６５】
１６．保護剤スクリーニング：
実験計画
２つの群の実験を行った。６つの保護剤を、第１の群の実験において試験し、それらは、５％のスクロース、２％のマンニトール、２％のソルビトール、１００ｍＭのＮａＣｌ、１４０ｍＭのアルギニン、および１５０ｍＭのプロリンであった。この群では、抗体Ａ−１のタンパク質濃度は、６０ｍｇ／ｍＬであり、緩衝塩としてのヒスチジンの濃度は、２０ｍＭであり、ＴＷＥＥＮ−８０濃度は、０．０２％であり、ｐＨは５．８であった。実験条件は、凍結融解：−２０℃で凍結、室温で融解、５サイクル；高温：４０℃で１０日、１３日；照明：５０００ｌｘ、３００μＷ／ｃｍ２、２５℃、５日；振とう：３００ｒｐｍ、暗所で、室温で３日；試験パラメータ：外観、可視粒子、純度（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、非還元ＣＥ−ＳＤＳ）、チャージバリアントであった。設計計画が表９に示される。
【０２６６】
【表１９】
2019523764.tif 000024
【０２６７】
第２の群の実験を、第１の群の実験に基づいて行い、クエン酸ナトリウムを、緩衝系として選択した。クエン酸ナトリウムの濃度は、２０ｍＭであり、ｐＨは５．８であり、抗体Ａ−１の濃度は、約３０ｍｇ／ｍＬであった。Ｆ１製剤において、アルギニンをアルギニン塩酸塩と取り替え、その濃度は、１４０ｍＭであった。さらに、保護剤の選択のための実験を行い、高温および照明の条件を、４０℃／２ワット、１ヶ月間、５０００ｌｘ、０日、２日、５日、１０日に変更した。設計計画が表１０に示される。
【０２６８】
【表２０】
2019523764.tif 000025
【０２６９】
実験結果
第１の群の実験の結果は、５日間の照明の後、６つの製剤試料の色が全て、様々な程度に黄色に変化したことを示した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果は、他の保護剤と比較して、アルギニンが、凝集物形成を減少させるのにより有効であったことを示した（表１１）。
【０２７０】
高温４０℃で７、１３日間：ＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果は、０日の時点のモノマー純度（９８％）と比較して、各製剤中のモノマーの減少についての有意な差はなく、スクロース、アルギニンおよびプロリンを含有する製剤の純度のさらに少ない低下があったことを示した。結果が以下の表１２に示される。
【０２７１】
【表２１】
2019523764.tif 000026
【０２７２】
【表２２】
2019523764.tif 000027
【０２７３】
振とうおよび凍結融解の試験結果（表１３を参照）は、０日と比較して、凝集物およびチャージバリアントについての有意な差がなかったことを示した。
【０２７４】
第２の群の実験において、クエン酸ナトリウムを緩衝液として使用し、結果は、高温および照明後、抗体Ａ−１の製剤が、わずかな乳白光を示したことを示す（表１４を参照）。いくつかの保護剤の影響を比較して、本発明者らは、アルギニン塩酸塩が抗体Ａ−１の純度を保つのに最良であると見なした（表１５を参照）。照明が、チャージバリアントの有意な変化を誘発したため（表１６を参照）、抗体Ａ−１を暗所で貯蔵することが推奨された。
【０２７５】
【表２３】
2019523764.tif 000028
【０２７６】
【表２４】
2019523764.tif 000029
【０２７７】
【表２５】
2019523764.tif 000030
【０２７８】
【表２６】
2019523764.tif 000031
【０２７９】
１７、酸化防止剤に影響を与える要因についての実験：
実験計画
実験は、０．０１８７ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡの保護効果を評価するためのものであり、２つの緩衝液、０．０２％および０．１％のＴｗｅｅｎ−８０を含む、２０ｍＭのヒスチジン塩および２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを選択した（表１７）。抗体Ａ−１の濃度は、６０ｍｇ／ｍＬであり、アルギニン塩酸塩は、１４０ｍＭであり、ｐＨは５．８であった。３つの製剤試料を、加速分解実験に供し、実験条件は、照明：５０００ｌｘ、３００μＷ／ｃｍ２、２５℃、３日、６日；試験項目：外観、可視粒子、純度（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、およびチャージバリアントであった。
【０２８０】
【表２７】
2019523764.tif 000032
【０２８１】
上記の実験に基づいて、メチオニンを、スクリーニング酸化防止剤として加え、詳細な計画を表１８に示した。実験条件は：高温４０℃で２週間、１ヶ月間；照明５０００ｌｘで０日、２日、５日、１０日であった。
【０２８２】
【表２８】
2019523764.tif 000033
【０２８３】
実験結果
２つの群の実験の結果に基づいて、２つの保護剤のいずれも、抗体Ａ−１にそれほど影響を与えなかった。使用される異なる濃度のＴｗｅｅｎにおいて差は見られなかったが（表１９、表２０、表２１、表２２）、製剤緩衝塩としてヒスチジンを用いた場合、製剤は、照明後に黄色に変化したため、クエン酸ナトリウムが、製剤緩衝塩としてより良好な選択である。照明による３日間の破壊の後、製剤試料１３〜１５のＳＥＣ−ＨＰＬＣピークは低下し、それらの間に顕著な差はなかった。３日の製剤試料のピークは、暗所で０日と同じである。照明による６日間の破壊の後、試料１３のピークは、さらなる低下を示した一方、試料１４および１５は、さらなる低下を示さなかった。６日の製剤試料のピークは、暗所で０日と同じである。
【０２８４】
【表２９】
2019523764.tif 000034
【０２８５】
【表３０】
2019523764.tif 000035
【０２８６】
【表３１】
2019523764.tif 000036
【０２８７】
【表３２】
2019523764.tif 000037
【０２８８】
１８、様々なタンパク質濃度における長期加速安定性試験：
実験計画
初期の製剤を決定した後、本発明者らはまた、様々な濃度の抗体Ａ−１に対して長期加速安定性試験を行った。本発明者らは、抗体濃度を、２５、５０、および１００ｍｇ／ｍＬに設定し、長期（４℃、０日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月）および加速（２５℃、０日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月）安定性試験を進めるために、規定の製剤を使用した。試験項目は、タンパク質濃度、外観、可視粒子、ｐＨ、純度（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、非還元ＣＥ−ＳＤＳ）、チャージバリアント、生物活性である。設計計画が以下の表２３に示される。
【０２８９】
【表３３】
2019523764.tif 000038
【０２９０】
実験結果
外観から、タンパク質濃度が増加するにつれて、乳白光が増加し、製剤試料は、高濃度の抗体で黄色に変化しやすい（表２４を参照）。しかし、９ヶ月の長期加速安定性試験の後、製剤試料はなお透明であり、可視粒子を含まず、注入の要件を満たしていた。試験中、タンパク質濃度およびｐＨの有意な変化はなかった（表２５および表２６を参照）。
【０２９１】
純度試験結果は、抗体Ａ−１のＳＥＣおよびＣＥ−ＳＤＳ純度が、時間の経過とともにおよび濃度の増加とともに低下したことを示した。試料のＣＥ−ＳＤＳ純度は、よりわずかに低下した（表２７、表２８および表２９を参照）。しかしながら、９ヶ月の安定性試験の後、生成物の純度は、対応する品質基準をなお満たし、純度の変化は、許容できる範囲内であった。
【０２９２】
チャージバリアントの試験結果（表３０を参照）は、凝集物および酸性／塩基性チャージバリアントが、抗体Ａ−１のタンパク質濃度が増加するにつれて増加し、より低いタンパク質濃度で安定性がより良好であることを示した。しかしながら、ピークの形状から判断して、３つの濃度で大きな差はなく、傾向が一致していた。３ヶ月の試料の生物活性試験は、図６および図７に示されるように、生物活性が、比較的安定していたことを示した。上記の結果に基づいて、タンパク質は、少なくとも１８ヶ月間にわたって、この製剤中で安定している。
【０２９３】
【表３４】
2019523764.tif 000039
【０２９４】
【表３５】
2019523764.tif 000040
【０２９５】
【表３６】
2019523764.tif 000041
【０２９６】
【表３７】
2019523764.tif 000042
【０２９７】
【表３８】
2019523764.tif 000043
【０２９８】
【表３９】
2019523764.tif 000044
【０２９９】
【表４０】
2019523764.tif 000045
【０３００】
抗体Ａ−１の製剤（２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１４０ｍＭのアルギニン塩酸塩、０．０４％のＴＷＥＥＮ−８０、ｐＨ５．８）を、長期加速安定性試験において３つの異なる抗体濃度で試験した。９ヶ月後、加速長期安定性試験にもかかわらず、タンパク質の品質は、品質基準設定をなお満たしていた。特に、９ヶ月間の長期貯蔵後、抗体Ａ−１の純度は、９８％超を保っていた。
【０３０１】
上記の実施形態は、権利請求される実施形態を作製および使用する方法を、当業者に十分に開示および説明するために提供され、本開示の範囲を限定することは意図されていない。当業者に明らかな変更は、特許請求の範囲内である。本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、それらのそれぞれが具体的にかつ独立して参照により本明細書に援用されているかのように、参照により本明細書に援用される。
【図１】
2019523764.tif 000046
【図２】
2019523764.tif 000047
【図３】
2019523764.tif 000048
【図４】
2019523764.tif 000049
【図５】
2019523764.tif 000050
【図６】
2019523764.tif 000051
【図７】
2019523764.tif 000052
【配列表】
2019523764000001.xml
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月29日(2019.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
【表１】
2019523764.tif 000120
2019523764.tif 000121
2019523764.tif 000122
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019523764000001.app
【国際調査報告】
2019523764.tif 000123
2019523764.tif 000124
2019523764.tif 000125
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