(57)【要約】  本発明は、角膜細胞モデルと、３つの区分、すなわち、適用２１日後の不可逆的な眼の損傷（区分１）、適用２１日後の可逆的な眼の損傷(区分２)および刺激なし（区分外）に化合物を分類するための予測的かつ定性的な分子マーカーの選択とを組み合わせた、化学物質の刺激性を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に関する。従って、本発明者らは、刺激性物質の作用後の応答がｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生角膜上皮に直接起こること、ならびに分子の、刺激の程度およびこの刺激の適格性は眼刺激の特異的バイオマーカーの使用によって決定され得ることを実証した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物の眼刺激性を評価するための方法であって、
ａ）試験化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生角膜サンプルと接触させる工程；
ｂ）ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも２種の遺伝子の発現を測定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程ａ）における試験化合物の接触が固体形態の試験化合物を用いて行われることを特徴とし、工程ｂ）が、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも２種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）における試験化合物の接触が液体形態の試験化合物を用いて行われることを特徴とし、工程ｂ）が、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２およびＣＣＮＤ１からなる群から選択される少なくとも２種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
試験化合物の眼刺激指数を決定する追加の工程ｃ）を含んでなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物を、得られた眼刺激指数の値に応じて眼刺激性があるとして分類する工程ｄ）を含んでなることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生角膜サンプルが、規定培養培地で増殖され、水−空気界面で合成膜上の薄層として配置された不死化角膜上皮細胞を含んでなるサンプルであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物の眼刺激指数の決定が、発現が測定される各遺伝子に過剰発現閾値を割り当てることを含んでなることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
発現が測定される遺伝子の有意な過剰発現を示す閾値が１．１〜１０の間に含まれ得ることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記眼刺激指数の決定が、前記遺伝子の過剰発現閾値に達した場合に各遺伝子に重み値を割り当てることを含んでなることを特徴とする、請求項７または８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記重み値が１〜１０の範囲の離散値の群から選択される、すなわち、値１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記眼刺激指数が、発現が過剰発現閾値を超える遺伝子の重み値を加算することによって決定されることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分類工程が、得られた眼刺激指数の値に基づいて前記試験化合物に刺激区分を割り当てることを含んでなることを特徴とする、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質の眼刺激性を評価および分類するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼に関する化学物質の安全性を評価するために、米国食品医薬品局(the Food AND Drug Administration)（ＦＤＡ）で働く毒科学者であるＪｏｈｎ  Ｈ．ＤｒａｉｚｅおよびＪａｃｏｂ  Ｍ．Ｓｐｉｎｅｓによって１９４４年に開発された動物試験プロトコールに基づく侵襲的毒性試験としてドレイズ試験がある。この試験は、眼の安全性を評価するために動物の眼で製品を試験することからなる。
【０００３】
実際には、この試験は、０．１ミリリットルまたは０．１グラムの物質を覚醒動物、多くの場合ウサギの眼に、１〜２４時間適用することからなる。その後、角膜混濁、結膜炎、浮腫、または分泌物の出現がするかどうか、動物を最大２１日間監視する。
【０００４】
ドレイズ試験のための実験室での動物の使用は、動物福祉擁護団体から強い反対を受けている。欧州連合内では、動物試験は、ＥＵ指令２０１０／６３によって規制されており、これが代替試験法の開発を促している。
【０００５】
化学物質は、国際連合世界調和システム(the United Nations Globally Harmonized System)として知られる国際連合によって実施されている国際化されたシステムに従って分類され、眼刺激特性に関して、製品はいくつかの区分に分類される。区分１は、２１日以内に回復しない損傷を引き起こす製品に関するものであり、区分２Ａは、２１日以内に可逆的な眼刺激を引き起こす製品に関するものであり、区分２Ｂは、２１日以内に可逆的な軽度の眼刺激を引き起こす製品に関するものである。刺激性のない製品は分類されない。欧州の法律は、区分２Ａと２Ｂを合わせて可逆的眼刺激剤の単一の区分２としている。
【０００６】
化粧品などの化学物質の眼の不快感または刺激性を推定するための手順もある。このプロセスは、表皮モデルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養すること、培養された表皮モデル上に被験製品を置くこと、および生存している生細胞数を定量して眼の不快感または刺激性を評価することを含んでなる。動物実験に代わるものとして開発されたこのような方法は、長く、費用がかかり、あまり識別力がないという欠点を有する。さらに、この方法は、全範囲の中間刺激を確実に検出するものではないために完全な代替方法とは言えない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、ドレイズ試験を置き換えるため、具体的には、２１日目に不可逆的な眼刺激を引き起こす化合物と、２１日以内に効果が可逆的なものとを迅速に区別し分類する方法を提供するための試験または方法の必要があると思われる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本出願の本発明者らは、角膜細胞モデルと、３つの区分、すなわち、適用２１日後の不可逆的な眼の損傷（区分１）、適用２１日後の可逆的な眼の損傷(区分２)および刺激なし（区分外）に化合物を分類するための予測的かつ定性的な分子マーカーの選択とを組み合わせた、化学物質の刺激性を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の開発を研究した。
【０００９】
驚くべきことに、本発明者らは、刺激性物質の作用に対する応答はｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生角膜上皮に直接起こること、ならびに分子の、刺激の程度、およびこの刺激の適格性は眼刺激の特異的バイオマーカーの使用によって決定することができることを示した。使用される分子マーカーは眼刺激に関して記載されたことも開示されたこともないことは特に注目すべきことであり、これは本方法の驚くべき特徴である。
【００１０】
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生角膜上皮はヒトおける眼刺激の特異的バイオマーカーを同定するのに十分なモデルであること、およびこれらのバイオマーカーは刺激の程度を予測するため、その結果、上記に示したような３つの区分に従って、試験した製品を予測的に分類するためにも使用できることを実証した。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、様々な刺激性および非刺激性の液体化学物質で処理した３Ｄ再生ヒト角膜組織における遺伝子発現の解析を示す図である。
【図２】図２ＡおよびＢは、異なる刺激性および非刺激性の固体化学物質で処理した３Ｄ再生ヒト角膜組織における遺伝子発現の解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
従って、本発明は、試験化合物の眼刺激性を評価するための方法であって、
ａ）試験化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生角膜サンプルと接触させる工程；
ｂ）ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を測定する工程
を含んでなる方法に関する。
【００１３】
好ましくは、本発明による方法は、試験化合物の眼刺激指数を決定する工程ｃ）をさらに含んでなり得る。
【００１４】
優先的には、前記方法はまた、前記化合物を、得られた眼刺激指数の値に基づいて眼刺激性があるとして分類する工程ｄ）も含んでなる。
【００１５】
好ましくは、本発明による方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である。
【００１６】
本明細書において使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生角膜サンプル」とは、規定培養培地で培養された角膜上皮細胞、またはヒト扁平上皮細胞を使用しヒト角膜に類似した形態を有する任意のモデル、例えば、ＥｐｉＯｃｕｌａｒ（登録商標）の商標で市販されているタイプのｉｎ  ｖｉｔｒｏ角膜モデルなどのサンプルを指す。
【００１７】
さらに詳しくは、この「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生角膜サンプル」は、規定培養培地で増殖させ、水−空気界面で合成膜上の薄層として配置された不死化角膜上皮細胞を含んでなるまたはからなるサンプルである。
【００１８】
好ましくは、前記不死化角膜上皮細胞はヒト細胞である。
【００１９】
ある特定の実施形態では、この「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生角膜サンプル」は、Ｅｐｉｓｋｉｎ（リヨン、フランス）によって市販されているＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標）ＨＣＥサンプルであり、これは、ヒト角膜のケラチノサイト、特に、不死化するように形質転換された細胞からなる再生角膜上皮である。
【００２０】
本発明のある特定の実施形態では、工程ａ）における試験化合物の接触は、固体形態、例えば粉末形態の試験化合物を用いて行われる。
【００２１】
本発明のある特定の実施形態では、工程ａ）における試験化合物の接触は、液体形態の試験化合物を用いて行われる。
【００２２】
本発明の目的では、工程ｂ）からの前記少なくとも１種の遺伝子の発現を測定することは、前記遺伝子の発現レベルを決定することを可能にする。
【００２３】
試験化合物は、様々な性質、構造および起源の化合物、とりわけ、生物学的化合物、化学化合物、合成化合物などであり得る。
【００２４】
試験化合物は、単離された形態であるかまたは他の生成物と混合されている任意の生成物であり得る。試験化合物は、構造および／もしくは組成に関して定義することもできるし、または機能的に定義することもできる。試験化合物は、例えば、単離され構造的に定義された生成物、未知の構造の単離された生成物、既知のおよび特徴付けられた生成物の混合物または１種以上の生成物を含んでなる組成物であり得る。従って、１種以上の化合物を、混合してまたは別々に試験し得る。
【００２５】
本発明は、多数の化合物を同定するのに特に好適である。この単純で効率的なスクリーニングは、非常に短期間で達成され得る。具体的には、記載された方法は、部分的に自動することができ、従って、混合物としてでも個別でも、多くの異なる化合物の効率的かつ同時のスクリーニングが可能となる。
【００２６】
好ましくは、本発明による方法において、前記遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子もしくはそのフラグメントによってコードされるポリペプチドの発現レベルを測定することによって、または前記遺伝子もしくはそのフラグメントのｍＲＮＡの発現レベルを測定することによって評価される。
【００２７】
好ましい実施形態では、前記少なくとも１種の遺伝子の発現は、前記遺伝子の、ｍＲＮＡ転写物またはｍＲＮＡ前駆体、例えばネイティブＲＮＡの発現を解析することによって行われる。この解析は、患者由来の生物学的サンプルから細胞のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを調製し、そのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることによって行うことができる。調製されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡは、限定されるものではないが、サザンおよびノーザンアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、例えば定量的ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）、ならびにＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＤＮＡマトリックス（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）などのプローブアレイの使用を含む、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用され得る。
【００２８】
有利には、前記少なくとも１種の遺伝子の転写されたｍＲＮＡのレベルの発現の解析は、核酸増幅法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている実験形態）、リガーゼ連鎖反応（ＢＡＲＡＮＹ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８８巻）、１８９−１９３頁、１９９１）、自立型配列複製（ＧＵＡＴＥＬＬＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻、１８７４−１８７８頁、１９９０）、転写増幅システム（ＫＷＯＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８６巻、１１７３−１１７７頁、１９８９）、「Ｑ−ベータレプリカーゼ」（ＬＩＺＡＲＤＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、１１９７頁、１９８８）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）または任意の他の核酸増幅法とその後の、当業者に周知の技術により増幅分子を検出する工程が含まれる。これらの検出方法は、ごく少量の核酸分子を検出するのに特に有用である。
【００２９】
従って、好ましい実施形態によれば、本発明による方法は、前記遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ、その相補配列またはそのフラグメントを増幅する追加の工程を含んでなる。
【００３０】
本明細書において使用される場合、増幅プライマーは、遺伝子のそれぞれの３’領域および５’領域（プラス鎖およびマイナス鎖、またはその逆）と特異的に適合し、前記遺伝子の短い領域に隣接し得る一対の核酸分子として定義される。一般的に、増幅プライマーは、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、５０〜２００ヌクレオチドの間に含まれる長さの領域の増幅を可能にする。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、前記少なくとも１種の遺伝子の発現の測定は、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現レベルを測定することによって実施される。前記解析は、前記遺伝子によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する、抗体（例えば、放射性同位元素、発色団、蛍光団または酵素によって標識された抗体）、抗体誘導体（例えば、基質またはリガンド／タンパク質対（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン）のタンパク質もしくはタンパク質のリガンドにコンジュゲートされた抗体）または抗体フラグメント（例えば、単鎖抗体、単離された抗体の超可変ドメイン）を用いて実施され得る。これらの解析は、当業者によく知られている多くの技術、限定されるものではないが、酵素活性の使用に基づく免疫学的検査（酵素免疫測定法、ＥＩＡ）、放射性同位元素の使用に基づく免疫学的検査（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット解析および酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を含む技術によって行うことができる。
【００３２】
本発明の目的で「ポリペプチド」とは、少なくとも２個のアミノ酸を含んでなる配列を意味し、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用できる。
【００３３】
「ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのフラグメント」とは、少なくとも５０個の核酸、例として少なくとも１００個または１５０個の核酸、好ましくは少なくとも２００個の核酸、例として少なくとも２５０個または３５０個の核酸の配列、特に好ましくは少なくとも４００個の核酸のポリペプチドを意味する。
【００３４】
「ポリペプチドのフラグメント」とは、少なくとも５０個のアミノ酸、例として少なくとも１００個または１５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、例として少なくとも２５０個または３５０個のアミノ酸の配列、特に好ましくは少なくとも４００個のアミノ酸のポリペプチドを意味する。
【００３５】
優先的には、前記方法は、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも２種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００３６】
優先的には、前記方法は、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも３種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００３７】
優先的には、前記方法は、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも４種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる：。
【００３８】
優先的には、前記方法は、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも５種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００３９】
優先的には、前記方法は、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも６種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００４０】
優先的には、前記方法は、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも７種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００４１】
優先的には、前記方法は、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも８種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００４２】
優先的には、前記方法は、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも９種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００４３】
優先的には、前記方法は、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも１０種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００４４】
優先的には、前記方法は、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも１１種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００４５】
優先的には、前記方法は、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも１２種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００４６】
優先的には、前記方法は、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１からなる群から選択される少なくとも１３種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００４７】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が液体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２およびＣＣＮＤ１からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００４８】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が液体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２およびＣＣＮＤ１からなる群から選択される少なくとも２種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００４９】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が液体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２およびＣＣＮＤ１からなる群から選択される少なくとも３種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００５０】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が液体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２およびＣＣＮＤ１からなる群から選択される少なくとも４種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００５１】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が液体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ１Ｒ２およびＣＣＮＤ１からなる群から選択される少なくとも５種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００５２】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が液体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ１Ｒ２およびＣＣＮＤ１からなる群から選択される少なくとも６種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００５３】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が液体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ１Ｒ２およびＣＣＮＤ１からなる群から選択される少なくとも７種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００５４】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が液体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ１Ｒ２およびＣＣＮＤ１からなる群から選択される少なくとも８種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００５５】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が液体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ１Ｒ２およびＣＣＮＤ１からなる群から選択される少なくとも９種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００５６】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が液体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ１Ｒ２およびＣＣＮＤ１からなる群の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００５７】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００５８】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも２種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００５９】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも３種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００６０】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも４種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００６１】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも５種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００６２】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも６種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００６３】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも７種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００６４】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも８種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００６５】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも９種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００６６】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも１０種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００６７】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも１１種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００６８】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群から選択される少なくとも１２種の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００６９】
優先的には、前記方法は、特に、工程ａ）における試験化合物の接触が、固体形態の試験化合物を用いて行われる場合に、試験化合物の眼刺激性を評価し、ここで、工程ｂ）は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２  ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４からなる群の遺伝子の発現を測定することを含んでなる。
【００７０】
前記方法のある特定の実施形態では、工程ａ）において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生角膜サンプルと接触させる試験化合物は、液体または固体の形態である。試験化合物が液体である場合、それは純粋なものでも希釈したものでも使用し得る。
【００７１】
試験化合物は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの生理学上許容可能な溶媒で希釈してもよく、従って、０．１％〜１００％の間に含まれる質量濃度で存在する。試験化合物が希釈される場合、それは、１０〜６０％の間、より特に２０〜５０％の間、より特に２５〜４０％の間に含まれる質量濃度、さらに特に３０％で存在する。
【００７２】
前記方法の工程ｃ）は、試験化合物の眼刺激指数を決定することを含んでなる。
【００７３】
より特に、試験化合物の眼刺激指数の決定は、発現が測定される各遺伝子に過剰発現閾値を割り当てることを含んでなる。
【００７４】
過剰発現閾値は、対照と接触させた際の前記遺伝子の発現と比較した、試験化合物と接触させた際のその遺伝子の発現の増加率に相当する。
【００７５】
好ましくは、本発明による方法は、前記遺伝子の発現レベルを参照値と比較する工程をさらに含んでなる。この参照値は、陽性対照および／または陰性対照として使用され得る。
【００７６】
陽性対照は、例えば、試験化合物の存在下での前記少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを、眼刺激剤であることが知られている化合物の存在下での前記少なくとも１種の遺伝子の発現レベルと比較することによって実施することができる。
【００７７】
例えば、試験化合物の存在下での前記少なくとも１種の遺伝子の発現レベルが、刺激剤性が知られている化合物の存在下での前記少なくとも１種の遺伝子の発現レベル以上である場合、前記化合物は刺激性があると結論づけることができる。
【００７８】
陰性対照は、試験化合物の不在下またはオリーブ油、１，９−デカジエン（ＣＡＳ番号１６４７−１６−１）、トリクロカルバン（ＣＡＳ番号１０１−２０−２）または前記方法で使用される際に試験製品が溶解または希釈されるバッファーなどの非刺激性であることが知られている化合物の存在下で実施することができる。
【００７９】
本発明の文脈において、前記遺伝子の過剰発現が、前記試験化合物の不在下でのその発現レベルと比較して観察される場合、試験化合物は眼刺激性があると結論づけることができる。
【００８０】
「過剰発現」は、その正常な発現レベルと比較して有意に高い、前記遺伝子の発現レベルを意味する。好ましくは、過剰発現は、前記遺伝子の正常な発現レベルよりも少なくとも２０％高い（すなわち、１．２倍高い）、好ましくは、前記遺伝子の正常な発現レベルよりも少なくとも５０％高い（すなわち、１．５倍高い）、特に好ましくは、前記遺伝子の正常な発現レベルよりも少なくとも９０％高い（すなわち、１．９倍高い）生物学的サンプルにおける発現レベルを意味する。
【００８１】
「前記試験化合物の不在下での発現レベル」または「正常なレベル」は、刺激反応を示さない組織の生物学的サンプルまたは、好ましくは、試験化合物に曝露されていない異なる対照サンプルにおける前記遺伝子の発現レベルの平均に潜在的に対応する、対照サンプルにおける前記遺伝子の発現レベルである。
【００８２】
好ましくは、工程ｂ）は、工程ａ）の２〜２４時間後、より好ましくは工程ａ）の４〜１８時間後、特に好ましくは工程ａ）の５〜７時間後、さらに好ましくは工程ａ）の６時間後に実施される。
【００８３】
正常な発現レベルを有する対照は、試験化合物が溶解または希釈される液体、例えばバッファー、より特にＰＢＳ、などの非刺激性の生理学上許容可能な液体とｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生角膜サンプルとを接触させることからなる。
【００８４】
発現が測定される遺伝子の有意な過剰発現を示す閾値は、１．１〜１０の間、より特に１．１〜７の間、より特に１．４〜６の間、さらに特に２〜５の間、一層特に２〜４の間に含まれ得る。
【００８５】
選択された遺伝子群の１つにおいて上に示したように、工程ａ）において接触させる液体形態の試験化合物の場合、好ましい遺伝子は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２およびＣＣＮＤ１を少なくとも含んでなるかまたはそれらからなる群から選択される。
【００８６】
ＨＳＰ９０ＡＡ１の場合、過剰発現閾値は、１．１〜２の間に含まれ、より特に１．４である。
【００８７】
ＣＡＳＰ１の場合、過剰発現閾値は、１．１〜２の間に含まれ、より特に約１．５である。
【００８８】
ＤＬＫ１の場合、過剰発現閾値は、３〜８の間に含まれ、より特に約５、さらに特に５．２５である。
【００８９】
ＣＬＥＣ４Ｄの場合、過剰発現閾値は、１．１〜４の間に含まれ、より特に約３．６である。
【００９０】
ＩＬ−２４の場合、過剰発現閾値は、３〜８の間に含まれ、より特に約６．２である。
【００９１】
ＳＬＩＴ２の場合、過剰発現閾値は、１．１〜２の間に含まれ、より特に約１．３である。
【００９２】
ＨＳＰＡ１Ａの場合、過剰発現閾値は、１．１〜５の間に含まれ、より特に約３である。
【００９３】
ＦＳＨＲの場合、過剰発現閾値は、１．１〜４の間に含まれ、より特に約２．６である。
【００９４】
ＩＬ−１Ｒ２の場合、過剰発現閾値は、１．１〜２の間に含まれ、より特に約１．３である。
【００９５】
ＣＣＮＤ１の場合、過剰発現閾値は、１．１〜２の間に含まれ、より特に約１．５である。
【００９６】
可能性ある別の遺伝子群について上に示したように、工程ａ）において接触させる固体形態の試験化合物の場合、好ましい遺伝子は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２ ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４を少なくとも含んでなるかまたはそれらからなる群から選択される。
【００９７】
ＩＬ−２４の場合、過剰発現閾値は、１．５〜１５の間、より特に２〜１０の間に含まれ、より特に２．３である。
【００９８】
ＩＬ−２４の場合、過剰発現閾値は、５〜１５の間に含まれ得、より特に１０でもあり得る。
【００９９】
ＩＬ−２３Ｒの場合、過剰発現閾値は、１．５〜３の間に含まれ、より特に約１．９である。
【０１００】
ＤＤＩＴ３の場合、過剰発現閾値は、１．５〜３の間に含まれ、より特に約５、さらに特に２である。
【０１０１】
ＭＭＰ８の場合、過剰発現閾値は、１．１〜２．５の間に含まれ、より特に約１．４である。
【０１０２】
ＤＬＫ１の場合、過剰発現閾値は、２〜８の間に含まれ、より特に約４である。
【０１０３】
ＨＡＳ１の場合、過剰発現閾値は、１．５〜５の間に含まれ、より特に約３である。
【０１０４】
ＣＹＲ６１の場合、過剰発現閾値は、１．１〜２の間に含まれ、より特に約１．３である。
【０１０５】
ＩＬ−１Ｒ２の場合、過剰発現閾値は、１．４〜３の間に含まれ、より特に約２である。
【０１０６】
ＣＬＥＣ４Ｄの場合、過剰発現閾値は、１．５〜３．５の間に含まれ、より特に約２．８である。
【０１０７】
ＩＣＡＭ２の場合、過剰発現閾値は、３〜５の間に含まれ、より特に約４である。
【０１０８】
ＣＡＳＰ１の場合、過剰発現閾値は、１．１〜２の間に含まれ、より特に約１．４である。
【０１０９】
ＭＵＣ１３の場合、過剰発現閾値は、１．４〜３の間に含まれ、より特に約１．８である。
【０１１０】
ＭＵＣ４の場合、過剰発現閾値は、２〜４の間に含まれ、より特に約２．５である。
【０１１１】
有意な過剰発現閾値は、各遺伝子について、当業者によって容易に評価され、決定され得る。
【０１１２】
さらに詳しくは、眼刺激指数の決定は、発現測定後に前記遺伝子の過剰発現閾値に達した場合に各遺伝子に重み値を割り当てることを含んでなる。
【０１１３】
従って、所与の遺伝子の有意な過剰発現閾値に達した際に、この遺伝子には、その遺伝子に応じて異なる場合も同一である場合もある重み値が割り当てられる。この重み値は、１〜１０の範囲の離散値または連続値、優先的には離散値を取り得、すなわち、値１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択され得る。より特に、離散値は、値１、２、３、３、４、５からなる群から選択され得る。より特に、前記離散値は１または２であり得る。
【０１１４】
例示として、何ら限定されるものではないが、重み値は、その有意な過剰発現閾値に達したかまたはそれを超えた際にその遺伝子に割り当てられる２つの値、１または２に限定され得る。
【０１１５】
より高いまたはより低い重み値を割り当てるための選択は、対象とする遺伝子の性質、および細胞性ストレス応答、インターロイキンの代謝経路、炎症過程、細胞増殖の調節、創傷治癒、細胞リモデリング、さらには、例えば、その遺伝子の過剰発現閾値へのその関与に依存する。
【０１１６】
また、単に例示として、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ１Ｒ２およびＣＣＮＤ１を含んでなるかまたはそれらからなる群から選択される、本明細書において選択される遺伝子について、重み値は、１〜２の間の選択される値を取り得る。
【０１１７】
ＨＳＰ９０ＡＡ１の場合、重み値は２であり得る。
【０１１８】
ＣＡＳＰ１の場合、重み値は２であり得る。
【０１１９】
ＤＬＫ１の場合、重み値は２であり得る。
【０１２０】
ＣＬＥＣ４Ｄの場合、重み値は２であり得る。
【０１２１】
ＩＬ２４の場合、重み値は１であり得る。
【０１２２】
ＳＬＩＴ２の場合、重み値は１であり得る。
【０１２３】
ＨＳＰＡ１Ａの場合、重み値は２であり得る。
【０１２４】
ＦＳＨＲの場合、重み値は２であり得る。
【０１２５】
ＩＬ−１Ｒ２の場合、重み値は１であり得る。
【０１２６】
ＣＣＮＤ１の場合、重み値は２であり得る。
【０１２７】
同様に、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２ ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ４を含んでなるかまたはそれらからなる群から選択される、本明細書において選択される遺伝子については、重み値は、１〜４の間で選択される値を取り得る。
【０１２８】
ＩＬ−２４の場合、２．３の過剰発現閾値を有し、重み値は１であり得る。
【０１２９】
ＩＬ−２４の場合、１０の過剰発現閾値を有し、重み値は４であり得る。
【０１３０】
ＩＬ−２３Ｒの場合、重み値は４であり得る。
【０１３１】
ＤＤＩＴ３の場合、重み値は２であり得る。
【０１３２】
ＭＭＰ８の場合、重み値は１であり得る。
【０１３３】
ＤＬＫ１の場合、重み値は２であり得る。
【０１３４】
ＨＡＳ１の場合、重み値は２であり得る。
【０１３５】
ＣＹＲ６１の場合、重み値は１であり得る。
【０１３６】
ＩＬ−１Ｒ２の場合、重み値は４であり得る。
【０１３７】
ＣＬＥＣ４Ｄの場合、重み値は２であり得る。
【０１３８】
ＩＣＡＭ２の場合、重み値は４であり得る。
【０１３９】
ＣＡＳＰ１の場合、重み値は２であり得る。
【０１４０】
ＭＵＣ１３の場合、重み値は３であり得る。
【０１４１】
ＭＵＣ４の場合、重み値は４であり得る。
【０１４２】
より特に、眼刺激指数は、発現が過剰発現閾値を超える遺伝子の重み値を加算することによって決定される。
【０１４３】
本発明による方法はまた、得られた眼刺激指数の値に基づいて試験化合物に刺激区分を割り当てることを含んでなる、試験化合物を分類する工程も含んでなり得る。
【０１４４】
従って、本発明による方法は、欧州の分類、すなわち、刺激性なし、可逆的刺激剤または不可逆的刺激剤に従って化合物をその眼刺激性により分類するための予測的方法を当業者に提供する。
【０１４５】
本出願の実験の項に示された結果は本発明のこの利点を実証し、既存の方法に対する本方法の優位性はこれらの結果から明らかである。
【実施例】
【０１４６】
材料および方法
再生ヒト角膜上皮モデル（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（商標）ＨＣＥ）
再生ヒト角膜上皮モデル（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（商標）ＨＣＥ）は、リヨンのＥｐｉｓｋｉｎから購入した。このモデルは、規定培地中の気液界面で増殖させた不死化ヒト角膜上皮細胞からなる。得られた組織構造は、ヒト角膜の自然組織構造に類似した、０．５ｃｍ２の表面積を有する５〜７層を含んでなる多層上皮である。多面形細胞および翼状細胞もまた存在する。その組織はまた、中間径フィラメント、成熟したヘミデスモソームおよびデスモソームなどの特定の超微細構造も含んでなる。６５ｋＤのサイトケラチン（Ｋ３）もまた検出された（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。組織はアガロース培養培地の半固体層の状態で出荷される。受け取り次第、組織を６ウェルプレート中の維持培地に移し（１ｍｌ／ウェル）、人工気候室中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。組織は２４時間後に使用される。
【０１４７】
化学物質
試験した総ての化学物質はフランスのＳｉｇｍａから購入した。純度は、試験した総ての化学物質で８７％より高く、それらには広範囲の潜在的眼刺激剤が含まれた。
【０１４８】
液体化学物質の調製
液体製品は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはオリーブ油への溶解度について試験する。要約すれば、１００μｌの試験製品を２００μｌのＰＢＳまたはオリーブ油と混合する。サンプルをボルテックスミキサーで混合する。濁度および起こり得る相分離は目視で評価する。製品は、純粋なものまたは３０％希釈したものを試験する。ＰＢＳまたはオリーブ油に溶けない製品は３０％で試験することはできない。
【０１４９】
液体製品についての処理プロトコール
液体製品を組織に適用するための手順は以下のように最適化した：化学物質は１００％とび３０％の２種類の濃度で試験する。要約すれば、３７℃で２０μｌのＰＢＳを添加し、３７℃／５％ ＣＯ２で１０分間インキュベートすることによって組織表面を湿らせる。次いで、角膜上皮を、５０±２μＬの試験製品（１００μＬ／ｃｍ２に相当）で局所的に処理し、室温で１０分間インキュベートする。次に、組織を３７℃にて無菌ＰＢＳ（２×２５ｍｌ）で洗浄する。ＰＢＳを（組織に直接ではなく）インサートの端に適用して、化学物質を除去する緩やかな渦巻き流を発生させる。次いで、それらのインサート上の組織を、５ｍｌの維持培地中に室温で３０分間「埋め込み」、組織表面上に残留する製品を可能な限り除去する。次に、インサートを吸湿紙上に軽くたたきつけることによって培地を除去し、３７℃の５０μｌの維持培地を添加する。次いで、インサートを３７℃／５％ ＣＯ２で６時間インキュベートする。
【０１５０】
固体製品についての処理プロトコール
固体（粉末）製品を組織に適用するための手順は以下のように最適化した。まず、製品を、乳鉢で可能な限り微細な粉末とする。化学物質は単回投与で試験する。要約すれば、３７℃の２０μｌのＰＢＳを添加し、３７℃／５％ ＣＯ２で１０分間インキュベートすることによって組織表面を湿らせる。次いで、角膜上皮を、３０±２ｍｇ（６０ｍｇ／ｃｍ２に相当）で局所的に処理し、室温で３０分間インキュベートする。次に、組織を３７℃にて無菌ＰＢＳ（２×２５ｍｌ）で洗浄する。ＰＢＳを（組織に直接ではなく）インサートの端に適用して、化学物質を除去する緩やかな渦巻き流を発生させる。次いで、それらのインサート上の組織を、５ｍｌの維持培地中に室温で３０分間「埋め込み」、組織表面上に残留する製品を可能な限り除去する。次に、インサートを吸湿紙上に軽くたたきつけることによって培地を除去し、３７℃の５０μｌの維持培地を添加する。次いで、インサートを３７℃／５％ ＣＯ２で６時間インキュベートする。
【０１５１】
トータルＲＮＡの精製
トータルＲＮＡ精製プロセスは、Ｃｏｔｔｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５によって記載されている。要約すれば、角膜組織をピンセットで回収し、液体窒素中で急速凍結するためにチューブに入れる。次いで、「ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ」を製造者の使用説明書に従って用い、ＱＩＡｚｏｌ技術（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）によってＲＮＡを抽出する。要約すれば、組織を１ｍｌのＱＩＡｚｏｌ中に入れ、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用い、２個のスチールビーズでホモジナイズする。遠心分離後、上清を回収し、０．２ｍｌのブロモクロロプロパン（Ｓｉｇｍａ、フランス）を添加し、その後、全体を激しく混合する。ホモジネートを、４℃で１５分間、１２，０００ｇで遠心分離する。上相（水相）を６００μｌの７０％エタノールに加え、ピペット操作により直ちに混合する。この混合物を、２ｍｌコレクションチューブ上に取り付けたＲＮｅａｓｙスピンカラムに移し、製造者の使用説明書（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）に従ってＲＮＡを回収する。
【０１５２】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析
定量的ＲＴ−ＰＣＲ手順は、Ｃｏｔｔｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５によって記載されている。要約すれば、トータルＲＮＡの転写は、「Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒｓ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、フランス）および「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、フランス）を製造者の使用説明書に従って用い、最終容量２０μｌで１μgのトータルＲＮＡを用いて実施する。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲ試薬ミックス：ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＲＯＣＨＥ、フランス）を最終容量２５μｌの０．４μＭの各ヌクレオチドプライマーとともに使用する。反応は、ＬＣ４８０  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＯＣＨＥ、フランス）にて実施する。増幅プログラムは、９５℃で１分間の１サイクル、続いて、９５℃で１５秒間の変性、６０℃で１５秒間のハイブリダイゼーションおよび増幅段階、続いて、７２℃で４０秒間の最終伸長段階を伴う４０サイクルを含んでなる。
【０１５３】
各転写物の相対量は、５つのいわゆるハウスキーピング遺伝子（グルクロニダーゼβ−ＧＵＳＢ、液胞型ＡＴＰアーゼ−ＡＴＰ６Ｖ０Ｅ１、Ｈ２Ａヒストンファミリー、メンバーＹ−Ｈ２ＡＦＹ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ−Ｇ６ＰＤおよび「非ＰＯＵドメイン含有八量体結合」−ＮＯＮＯ）の平均発現量に対して正規化する。
【０１５４】
データ解析
遺伝子発現の測定
遺伝子発現率は、Ｒｏｃｈｅによって開発された二次導関数の最大値に基づくアルゴリズムを用いた絶対定量解析法により測定される。次いで、相対過剰発現率（増加倍率）をＰＢＳ単独で処理した組織に対して計算する。
【０１５５】
液体についての眼刺激試験の予測モデルの定義
上に示したように、１００％または３０％用量の試験製品を適用した後、１０種の遺伝子（すなわち、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＣＣＮＤ１（図１の星印）の発現を角膜上皮モデルにおいて測定する。有意な過剰発現値は、各遺伝子に対して、それぞれ１．４、１．５、５．２５、３．６、６．２、１．３、３、２．６、１．３および１．５に設定した。次に、各過剰発現遺伝子にそれぞれ設定値２、２、２、２、１、１、２、２、１または２を与える。次いで、液体物質の眼刺激指数（ＬＩＩ：Ｌｉｑｕｉｄ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）を、各過剰発現遺伝子に割り当てられた値を加算することによって計算し、最大値１７を得る。組織を被試験製品で処理した後、組織破壊が高すぎると考えられる（回収されたトータルＲＮＡが、ＰＢＳ処理組織で回収されたＲＮＡの量の１０％未満に相当する）場合、ＬＩＩ値２０を割り当てる。
【０１５６】
予測・分類モデルは次のように機能する。各製品を１００％および３０％で試験する（上記参照）。１００％および３０％でＬＩＩ≧１０の場合、被験製品は「区分１」として分類される。１００％でＬＩＩ≧１０および３０％でＬＩＩ＜１０の場合、被験製品は「区分２」として分類される。１００％および３０％でＬＩＩ＜１０の場合、被験製品は「区分外」として分類される。
【０１５７】
固体についての眼刺激試験の予測モデルの定義
上に示したように、６０ｍｇ／ｃｍ２の用量の試験製品を適用した後、１３種の遺伝子（すなわち、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２ ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４（図２の星印））の発現を角膜上皮モデルにおいて測定する。有意な過剰発現値は、各遺伝子に対して、ＩＬ−２４についてはそれぞれ２．３および１０に、次いで、他の各遺伝子については１．９、２、１．４、４、３、１．３、２、２．８、４、１．４、１．８および２．５の順に設定した。次に、各過剰発現遺伝子（またはＩＬ−２４については超過した各閾値）にそれぞれ設定値１、４、４、２、１、２、２、１、４、２、４、２、３および４を与える。次いで、固形物質の眼刺激指数（ＳＩＩ：Ｓｏｌｉｄ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）を、各過剰発現遺伝子に割り当てられた値を加算することによって計算し、最大値３６を得る。組織を被験製品で処理した後、組織破壊が高すぎると考えられる（回収されたトータルＲＮＡが、ＰＢＳ処理組織で回収されたＲＮＡの量の１０％未満に相当する）場合、ＳＩＩ値４０を割り当てる。
【０１５８】
予測・分類モデルは次のように機能する。各製品を６０ｍｇ／ｃｍ２で試験する（上記参照）。ＳＩＩ≧２０の場合、被験製品は「区分１」として分類される。１０≦ＳＩＩ＜２０の場合、被験製品は「区分２」として分類される。ＳＩＩ＜１０の場合、被験製品は「区分外」に分類される。
【０１５９】
液体についての許容基準
２つの「対照」化学物質を被験製品と並行して試験する。非刺激剤：１００％で試験した１，９−デカジエン（ＣＡＳ番号１６４７−１６−１）、および区分２の製品：１００％および３０％で試験した２−メチル−１−ペンタノール（ＣＡＳ番号１０５−３０−６）。１００％で試験した１，９−デカジエンおよび３０％で試験した２−メチル−１−ペンタノールについて得られたＬＩＩ値が１０未満である場合、および１００％で試験した２−メチル−１−ペンタノールのＬＩＩが＞１０である場合、その試験は有効であると考えられる。
【０１６０】
各化学物質は、２つの異なるバッチの角膜上皮組織で２回試験する。これら２つの解析が同じ分類を与えた場合、その試験は有効であると考えられ、そうでなければ、第３または第４の解析を実施する。
【０１６１】
固体についての許容基準
２つの「対照」化学物質を被験製品と並行して試験する。非刺激剤：トリクロカルバン（ＣＡＳ番号１０１−２０−２）および区分２の製品：ナフタレンジオン（ＣＡＳ番号８３−５６−７）。トリクロカルバンについて得られたＳＩＩ値が＜１０であり、ナフタレンジオンについて得られたその値が１０〜２０の間に含まれる場合、その試験は有効であると考えられる。
【０１６２】
各化学物質は、２つの異なるバッチの角膜上皮組織で２回試験する。これら２つの解析が同じ分類を与えた場合、その試験は有効であると考えられ、そうでなければ、第３または第４の解析を実施する。
【０１６３】
統計解析
Ｃｏｏｐｅｒ統計
Ｃｏｏｐｅｒによる統計解析の値（感度、特異性および正確度）(Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９)を、参照としてドレイズ試験の文献データ（Ｂａｒｒｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）を用いて、眼刺激試験について計算する。眼刺激試験で得られた結果を用いて、刺激剤および非刺激剤をパラメーターとする２×２分割表を構築する。次いで、感度、特異性および正確度を、Ｃｏｏｐｅｒの推奨（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）を用いて計算する。
【０１６４】
混同行列解析
混同行列およびカッパ算出を用いた統計については、本発明者らはＬａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｋｏｃｈの推奨（Ｌａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｋｏｃｈ、１９７７）を使用した。
【０１６５】
結果
眼刺激の機構についてのバイオマーカー遺伝子の選択
眼刺激の機構に関与する遺伝子を同定するために、本発明者らは、Ｄｉｅｎｇ−Ｋｕｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．と共同で開発したデータ解析ツールを使用した（Ｄｉｅｎｇ−Ｋｕｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。９００種の遺伝子の第１群を選択した。この大きな候補遺伝子群から、本発明者らは、結膜圧迫装置によってヒト眼の表面から採取されたサンプルにおいて発現が調節される遺伝子を選択した(Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３)。次に、本発明者らは、既存の文献のデータマイニング検索と組み合わせて、Ｓｋｉｎｅｔｈｉｃ  ＨＣＥ組織モデルに適用した１０種の化学物質の群（表１の１番〜１０番）を使用した後に得られた遺伝子発現の解析を使用した。この解析により、本発明者らは、眼刺激を引き起こす機構に関与する９２種の遺伝子の群を定義することができた（表２）。
【０１６６】
液体についての眼刺激試験の予測モデルの開発
潜在的な候補バイオマーカーの代表として選択した９２種の遺伝子（表２）の発現の変化を、３９種の化学物質（表１）での処理後に解析した。２９種の遺伝子：ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１の部分群（図１）を使用して、３９種の化学物質を、ＵＮ−ＧＨＳ規格によって実施されている３つの眼刺激区分の１つに分類することができた。しかしながら、これらの遺伝子のいくつかは重複した役割を有し、相互に代用し得たため、本発明者らは、刺激剤の３つの区分間を識別可能な液体刺激指数（ＬＩＩ）を開発するために１０種の遺伝子の部分群を選択することが可能であった。液体に関して選択した遺伝子のリストには、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２およびＣＣＮＤ１（図１に示す）が含まれた。ＬＩＩは二段階で開発した。まず、本発明者らは、有意な過剰発現を示すために各遺伝子についての閾値を選択した。異なる閾値を試験し、これら１０種の遺伝子について得られた最適値は、それぞれ１．４、１．５、５．２５、３．６、６．２、１．３、３、２．６、１．３および１．５であった。次いで、本発明者らは、眼刺激の機構における対象遺伝子の過剰発現の重要性に基づいて、これらの値に重みを割り当てた。次に、閾値を超えて過剰発現した各遺伝子に、それぞれ２、２、２、２、１、１、２、２、１および２の重み付き値を与えた。次いで、ＬＩＩを、各過剰発現遺伝子に対して重み値を加算することによって計算し、最大は１７である。組織破壊のレベルが高すぎると考えられる場合（「材料および方法」を参照）、値２０が適用される。
【０１６７】
試験した３９種の液体製品を用いた眼刺激試験によって得られた結果の解析
３９種の化学物質に関する眼刺激試験で得られた分類予測（表３）を、ドレイズ試験で２×２分割表により得られた分類予測と比較して、刺激性製品（区分１および区分２）と非刺激性製品（区分外）とを最初に区別する試験の予測能力を評価した（表４）。３９種の化学物質のこの群に関して１００％の特異性、感度および正確度が得られた。
【０１６８】
次いで、本発明者らは、３つのクラス（区分１、区分２および区分外、表５参照）を含む混同行列を解析して、ＵＮ−ＧＨＳ規格によって製品を分類するための試験の性能を計算した。区分１、区分２および区分外の製品についてそれぞれ、９１．６６％、９３．３３％および１００％の使用者正確度が得られた。全体の正確度は９５％、高度に有意なカッパは０．９２３であった。
【０１６９】
これらの結果は、眼刺激試験が、液体化学物質の眼刺激性を、ＵＮ−ＧＨＳ規格によって定義された３クラスに分類するのに極めて効果的であることを示している。
【０１７０】
固体についての眼刺激試験の予測モデルの開発
固体については、本発明者らは１５種の化学物質を試験した（表６）。２９種の遺伝子：ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＮＯＳ３、ＭＭＰ８、ＣＡＳＰ１、ＥＬＮ、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＣＣＬ２２、ＳＬＩＴ２、ＩＣＡＭ２、ＭＵＣ１３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、ＫＬ、ＣＯＬ６Ａ２、ＭＵＣ４、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ３、ＨＡＳ１、ＩＲＦ１、ＣＹＲ６１（図２）の同じ群を使用して、１５種の化学物質を、ＵＮ−ＧＨＳ規格によって実施されている３つの眼刺激区分の１つに分類することができた。しかしながら、これらの遺伝子のいくつかは重複した役割を有し、相互に代用し得たため、本発明者らは、刺激剤の３つの区分間を識別可能な固体刺激指数（ＳＩＩ）を開発するために１３種の遺伝子の部分群を選択することが可能であった。固体に関して選択した遺伝子のリストには、以下が含まれた(ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４。図２)。ＳＩＩは二段階で開発した。まず、本発明者らは、有意な過剰発現を示すために各遺伝子についての閾値を選択した。異なる閾値を試験し、これら１３種の遺伝子について得られた最適値は、ＩＬ−２４についてはそれぞれ２．３および１０、次いで、他の各遺伝子については１．９、２、１．４、４、３、１．３、２、２．８、４、１．４、１．８および２．５の順であった。次いで、本発明者らは、眼刺激の機構における対象遺伝子の過剰発現の重要性に基づいて、これらの値に重みを割り当てた。次に、閾値を超えて過剰発現した各遺伝子に、それぞれ１、４、４、２、１、２、２、１、４、２、４、２、３および４の重み付き値を与えた。次いで、ＳＩＩを、過剰発現遺伝子の各々に対して重み値を加算することによって計算し、最大は３６である。組織破壊のレベルが高度すぎると考えられる場合（「材料および方法」を参照）、値４０が適用される。
【０１７１】
試験した１５種の固体製品を用いた眼刺激試験によって得られた結果の解析
１５種の固体化学物質に関する眼刺激試験で得られた分類予測（表７）を、ドレイズ試験で２×２分割表により得られた分類予測と比較して、刺激性製品（区分１および区分２）と非刺激性製品（区分外）とを最初に区別する試験の予測能力を評価した（表８）。１５種の化学物質のこの群に関して１００％の特異性、感度および正確度が得られた。
【０１７２】
次いで、本発明者らは、３つのクラス（区分１、区分２および区分外、表９参照）を含む混同行列を解析して、ＵＮ−ＧＨＳ規格によって製品を分類するための試験の性能を計算した。区分１、区分２および区分外として分類された製品について１００％の使用者正確度が得られた。全体的な正確度は１００％、完全に有意なカッパは１であった。
【０１７３】
これらの結果は、眼刺激試験が、化学物質の眼刺激性を、ＵＮ−ＧＨＳ規格によって定義された３クラスに分類するのに極めて効果的であることを示している。
【０１７４】
図の説明
図１Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ：様々な刺激性および非刺激性の液体化学物質で処理した３Ｄ再生ヒト角膜組織における遺伝子発現の解析。
【０１７５】
示した２９種の遺伝子についての過剰発現率（倍率増加）の値は、４種の区分１の化学物質（黒色バー、左から右へ順に：乳酸、チオグリコール酸メチル、ラウリル硫酸ナトリウム（１５％）、塩化ベンザルコニウム（１０％））、４種の区分２の化学物質（灰色バー、左から右へ順に：αヘキシルシンナムアルデヒド、アセトン、メチルエチルケトン、３−クロロプロパンニトリル）および４種の未分類製品（区分外、白色バー  左から右へ順に：１，９−デカジエン、グリセロール、Ｔｗｅｅｎ  ２０、２，４−ペンタンジオール）について表した。各化学物質は１００％で（ＡおよびＢ）または３０％に希釈したもので（ＣおよびＤ）適用した。実施例のために使用した遺伝子は、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＣＡＳＰ１、ＤＬＫ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＬ−２４、ＳＬＩＴ２、ＨＳＰＡ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＩＬ−１Ｒ２およびＣＣＮＤ１である。
【０１７６】
図２ＡおよびＢ：異なる刺激性および非刺激性の固体化学物質で処理した３Ｄ再生ヒト角膜組織における遺伝子発現の解析。
示した２９種の遺伝子についての過剰発現率（倍率増加）の値は、５種の区分１の化学物質（黒色バー、左から右へ順に：２−ヒドロキシイソ酪酸、塩酸プロメタジン、シュウ酸ナトリウム、２，５−ジメチルヘキサンジオール、１−ナフタレン酢酸）、２種の区分２の化学物質（灰色バー、左から右へ順に：ナフタレンジオール、カンフェン）および８種の未分類製品（区分外、白色バー  左から右へ順に：トリクロカルバン、メチレン−ビスベンゾトリアゾールテトラメチルブチルフェノール、ピリメタニル、ミリスチン酸ミリスチル、４，４’−メチレンビス−(２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール)、４−ブロモフェネトール、テトラフルオロホウ酸カリウム）について表した。各化学物質は粉末形態で純粋なもの（３０±２ｍｇ（６０ｍｇ／ｃｍ２に相当））を適用した。実施例のために選択した遺伝子は、ＩＬ−２４、ＩＬ−２３Ｒ、ＤＤＩＴ３、ＭＭＰ８、ＤＬＫ１、ＨＡＳ１、ＣＹＲ６１、ＩＬ−１Ｒ２ ＣＬＥＣ４Ｄ、ＩＣＡＭ２、ＣＡＳＰ１、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ４である。
【０１７７】
【表１】
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2019537428.tif 000003
【０１７８】
【表２】
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【０１７９】
【表３】
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2019537428.tif 000012
2019537428.tif 000013
【０１８０】
【表４】
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【０１８１】
【表５】
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【０１８２】
【表６】
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【０１８３】
【表７】
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【０１８４】
【表８】
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【０１８５】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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