(57)【要約】  本発明は、ウイルス生成物を前記生成物および生成物関連不純物を含む組成物から回収するためのプロセスを提供し、そのプロセスは、組成物を、１または複数の高分子ナノファイバーを含む、官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させることを含み、ウイルス生成物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコア、またはプロウイルスを含み、その各々は１または複数のポリヌクレオチドを含有し、かつ生成物関連不純物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスを含み、その各々はポリヌクレオチドを実質的に含まない。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス生成物を前記生成物および生成物関連不純物を含む組成物から回収するためのプロセスであって、前記プロセスは、前記組成物を、１または複数の高分子ナノファイバーを含む、官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させるステップを含み、
前記ウイルス生成物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコア、またはプロウイルスを含み、その各々は１または複数のポリヌクレオチドを含有し、かつ
前記生成物関連不純物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスを含み、その各々はポリヌクレオチドを実質的に含まない、プロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスであって、
ａ）前記ウイルス生成物が、複数のウイルス、ウイルス粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されたウイルスコア、またはプロウイルスを含み、その各々が細胞を感染させる能力を有し；
ｂ）前記生成物関連不純物が、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスを含み、その各々が細胞を感染させる能力を有し；ならびに／あるいは
ｃ）前記生成物関連不純物が、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスを含み、その各々が完全なウイルスゲノムを欠き；
ｄ）前記ウイルス生成物が、各々が１または複数のトランスジェニックポリヌクレオチドを含有する複数のウイルスベクターを含む；ならびに／あるいは
ｅ）前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、１または複数の不織布高分子ナノファイバーで形成されている、プロセス。
【請求項３】
前記ウイルスが、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス、例えばアデノ随伴ウイルスなどから選択される、請求項１乃至２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４】
前記１または複数の高分子ナノファイバーが、同じであっても異なっていてもよい１または複数の配位基で官能化されていて、それが、前記１または複数の配位基を含む前記高分子ナノファイバーをクロマトグラフィー媒体としての使用に適したものにする、例えば前記同じであっても異なっていてもよい１または複数の配位基が、前記１または複数の高分子ナノファイバーに結合している、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記１または複数の高分子ナノファイバーが、同じであっても異なってもよく、それと共有結合していて、１または複数のポリマー鎖および１または複数の配位基を含む前記１または複数の高分子ナノファイバーをクロマトグラフィー媒体としての使用に所望により適したものにする、１または複数のポリマー鎖を有し、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
ａ）前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、イオン交換、疎水性相互作用および混合モード法からなる群から選択されるクロマトグラフィー法での使用に適している；
ｂ）前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、５０μｍｏｌ／ｇ〜１，５００μｍｏｌ／ｇの官能化されたクロマトグラフィー媒体中の配位基の密度を有する；
ｃ）前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、最大５０ｍｇ／ｍＬ（１０％破過）の動的結合容量を有する；
ｄ）前記組成物が、前記導電率が３０ｍＳ／ｃｍ未満となるような溶解塩濃度を有する；
ｅ）前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、膜またはシートの形態である；
ｆ）前記組成物が、１分以下の期間前記官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触する；
ｇ）前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、１または複数の荷電基で官能化されている；
ｈ）前記１または複数のポリヌクレオチドが、ＤＮＡおよびｓｉＲＮＡを含むＲＮＡから選択される１または複数の核酸である；ならびに／あるいは
ｉ）前記生成物関連不純物が二次生成物として回収される、
請求項１乃至５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
ｉ）前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、５０μｍｏｌ／ｇ〜１，５００μｍｏｌ／ｇの官能化されたクロマトグラフィー媒体中のトリメチルアンモニウム配位基の密度を有する；
ｉｉ）前記ウイルスが、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスから選択される；ならびに
ｉｉｉ）前記組成物が、前記導電率が３０ｍＳ／ｃｍ未満となるような溶解塩濃度を有する、
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が膜またはシートの形態であり、前記組成物が１または複数の前記膜またはシートおよび所望により１または複数のフリットまたはその他のスペーサー材料を含むホルダーを通過し
前記組成物が、（ａ）前記１または複数の膜／シートを通る前記経路長が２ｍｍ未満であり、または（ｂ）膜、シート、フリットおよびその他のスペーサー材料を通る前記総経路長が５０ｍｍ未満であるように、前記ホルダーを所望により通過する、請求項１乃至７に記載のプロセス。
【請求項９】
（ｉ）前記組成物を前記官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させるステップと；
（ｉｉ）所望により前記官能化されたクロマトグラフィー媒体を低イオン濃度の液相で洗浄するステップと；
（ｉｉｉ）前記官能化されたクロマトグラフィー媒体を増加するイオン強度の液相と接触させることによって、前記ウイルス生成物および前記生成物関連不純物を選択的に溶出するステップと
を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
（ｉ）前記組成物を含む溶液を前記官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させるステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で前記官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させた、前記ウイルス生成物を含む前記溶液を回収するステップと
を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記高分子ナノファイバーがセルロースナノファイバーである、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
ウイルス生成物を前記生成物および非生成物関連不純物を含む組成物から回収するためのプロセスであって、組成物を、１または複数の高分子ナノファイバーを含む官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させることを含み、
前記ウイルス生成物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコア、またはプロウイルスを含み、その各々は１または複数のポリヌクレオチドを含有し、かつ
前記非生成物関連不純物は、細胞および／または細胞成分、例えば脂質、宿主細胞タンパク質および／または宿主細胞増殖培地のその他の構成要素、例えばタンパク質および／または糖などを含む、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス生成物（一般に充填されたウイルスベクター）を、ウイルス生成物と生成物関連不純物（一般に充填されていないウイルス）の両方を含む組成物から回収するためのプロセスに関する。このプロセスは、組成物と、１または複数の高分子ナノファイバーを含む官能化されたクロマトグラフィー媒体とを接触させることを含む。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー市場は、世界の製薬市場で最も急成長している部門であり、２０１２年の全市場売上高の２０％（１５３０億ドル）を占めている。これは２００２年の市場シェアの１０％から増加し、２０１２年から２０１８年の間に１５３０億ドルから２１５０億ドルに４１％増加すると見込まれている。
【０００３】
今後成長する可能性が大いにある１つの分野が遺伝子治療である。そのような治療方法は、遺伝性の遺伝的欠陥を修正するか、または細胞をエクスビボまたはインビボで操作して癌（Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、血友病（Ｎａｔｈｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）およびパーキンソン病（Ｋａｐｌｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）などの疾患を治療する可能性がある。
【０００４】
遺伝子治療の方法では、目的の遺伝子を細胞に送達するには、ベクターの使用を必要とする。臨床用途用に開発されている多くのそのようなベクターは、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレンチウイルス（ＬＶ）などの組換えウイルスから誘導される。遺伝子治療においてベクターの目的は、核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に送達し、そこで細胞の生化学機構によってプロセシングを受けて細胞の性質を変化させて所望の治療効果を得ることである。
【０００５】
ベクター材料は、一般に、ベクターの構成要素、例えばその外被またはカプシド、および細胞に送達されることを目的とする核酸材料を産生するように改変された細胞株から生成される。ベクター作製プロセスの間に、核酸配列をベクターに組み込んで「充填（ｐａｃｋｅｄ）」または「フル」ベクターを形成する必要がある。「活性」または「感染性」ベクターは、標的細胞にうまく感染して核酸配列の発現をもたらすことのできる「充填」ベクターである。核酸材料を本質的に欠く「空」または「非充填（ｕｎｐａｃｋｅｄ）」ベクターも、典型的なベクター作製プロセスで作製される。したがって、ベクターの作製の間に上記の変異体の混合物を含有する混合集団が生成される。
【０００６】
充填ベクターの空ベクターからの分離は、一般に、実験室規模で、密度差を分離に利用する密度勾配遠心分離、例としてＣｓＣｌ（Ｖｅｌｌｅｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）またイオジキサノール勾配（Ｍａｒｔｉｎ  Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を用いて実施されている。しかし、そのような方法はスケールアップに現実的な課題をもたらすので、大きい患者集団を治療するための工業規模の精製には適していない。そのため、本質的によりスケーラブルであるという理由で、特定のクロマトグラフィー分離方法が適用されてきた。
【０００７】
フルＡＡＶベクターを空ベクターから分離するために、いくつかの市販の多孔質ビーズに基づく系がイオン交換分離（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、（Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に使用されている。陰イオン交換官能基を有するモノリスを使用する同様の分離も報告されている（Ｍ．Ｌｏｃｋ，Ａｌｖｉｒａ，＆Ｗｉｌｓｏｎ，２０１２）。さらに（Ｌｅｅ，Ｋｉｍ，＆Ｓｅｏｌ，２００９）は、感染性ＡｄＶ材料を金属親和性の膜を用いて欠陥のあるＡｄＶ粒子から分離することができたことを報告した。
【０００８】
しかし、これらの既知の吸着剤材料を、充填ウイルスベクターを非充填ベクターから分離することを含むクロマトグラフィー分離に使用することには欠点がある。したがって、従来の多孔質ビーズは高容量を有するが、そのようなビーズを含む充填層系を高い流速で運用することは不可能である。それは、多孔質ビーズに基づく系では、標的分子／不純物と固相との間の結合事象が多孔質ビーズへの拡散に依存するためであり、これは滞留時間の減少とともに結合容量が低下することを意味する。また、高い流速は何リットルものビーズ懸濁液がカラムに充填される製造規模では多孔質ビーズと特に適合しない。ここでは、多孔質ビーズの機械的不安定性が圧縮または崩壊事象を招く恐れがあり、その結果、不均一なカラム床が生じる。
【０００９】
多孔質ビーズの典型的な結合容量は、固相の官能基および結合した種に応じて３５〜１２０ｍｇ／ｍＬの範囲内である。しかし、そのような系を通る典型的な流速が低いということは、単一カラム多孔質ビーズ系の全体的な生産性がたった約１０〜１２０ｍｇ／ｍＬ／分しか達成できないことを意味する。
【００１０】
多孔質ビーズを使用するさらなる弱点は、材料の容量が、ビーズの内部表面積に到達する標的の能力に依存することである。典型的な多孔質ビーズは、１５〜３０ｎｍの間の細孔径を有するので、標的ベクターが細孔径よりもはるかに大きくなり得るベクター精製には限界がある。例はＡＡＶ（約２０ｎｍ）、ＡｄＶ（約８０ｎｍ）、およびＬＶ（約１００ｎｍ）である。
【００１１】
膜およびモノリスを含む分離は、多孔質ビーズに基づく系よりもはるかに高い流速で行うことができ、典型的な滞留時間は０．２〜０．５分ほどである。しかし、動的流れ下でのモノリス（１０〜２０ｍｇ／ｍＬ）および膜（７．５〜２９ｍｇ／ｍＬ）に対する標的の１０％破過での典型的な結合容量は、多孔質ビーズよりも低い（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｕ．２００８  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，２４（３），４９６−５０３．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｐ０７０４５２ｇ）。モノリスおよび膜材料の結合容量が低いこと（多孔質ビーズに基づく材料と比較）は、より高い流速を用いることによってある程度相殺され得る。上に考察されるモノリスおよび膜の典型的な結合容量および滞留時間は、モノリスおよび膜系に対する結合事象の全体的な生産性を約１０〜１４５ｍｇ／ｍＬ／分にする。
【００１２】
その上、膜の細孔径は、０．２〜２μｍの範囲内である多孔質ビーズよりもはるかに大きいが、膜の結合容量は、吸着種のサイズが大きくなるにつれて低下する（Ｗｉｃｋｒａｍａｓｉｎｇｈｅ，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｔｅｓｋｅ，Ｈｕｂｂｕｃｈ，＆Ｕｌｂｒｉｃｈｔ，２００６）。このことは、利用可能な表面積の大きい、高度に多孔質の吸着剤を有する必要性を強調する。
【００１３】
充填ベクターを非充填ベクターから分離して、治療用生成物を工業規模で回収することを可能にすることのできるクロマトグラフィー材料が必要とされている。また、クロマトグラフィー材料は、多孔質ビーズ系材料に関連する高い結合容量と、モノリス／膜材料によって達成可能なより高い流速とを共有するべきである。クロマトグラフィー材料はまた、結合領域が大きいベクターに利用しやすく、適切に高い流速が達成され得るように十分に多孔性でなければならない。そのような材料は、最大の生産性（精製済み生成物／ｍＬ／分）を実現するために、高い流速で高容量を提供するものであろう。
【００１４】
本発明者らは、驚くべきことに、高分子ファイバー材料、特に高分子ナノファイバー材料を、非充填ベクター材料から充填ベクター材料を分離するために使用することができることを見出した。したがって、彼らはそのような材料が非常に短い滞留時間で、すなわち高い流速でベクター材料に高容量を有することを見出した。これは、この材料がその他の吸着剤、例えばビーズ、膜およびモノリスと比較して有利に高い生産性を有することを意味する。本発明者らはまた、高分子のグラフト化度およびその後の高分子ファイバー材料の官能化を最適化して、充填種および非充填種の分解を改善した。また、驚くべきことに、本発明に従って材料を使用すると、充填画分と非充填画分の両方が非常に低い塩濃度（溶出伝導率＜６ｍＳ）で溶出され得ることも見出された。これは、導電率が約１２．５ｍＳに達するまで画分が溶出されないという文献の例とは対照的である（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【発明の概要】
【００１５】
したがって、本発明は、ウイルス生成物を前記生成物および生成物関連不純物を含む組成物から回収するためのプロセスを提供し、そのプロセスは、組成物を、１または複数の高分子ナノファイバーを含む、官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させることを含み、
ウイルス生成物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコア、またはプロウイルスを含み、その各々は１または複数のポリヌクレオチドを含有し、かつ
生成物関連不純物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスを含み、その各々はポリヌクレオチドを実質的に含まない。
【００１６】
本発明はまた、以下も提供する：
・本明細書に定義されるウイルス生成物を、前記生成物および本明細書に定義される生成物関連不純物を含む本明細書に定義される組成物から回収するためのプロセス。このプロセスは、組成物を塩不耐性のクロマトグラフィー媒体と接触させることを含み、該塩不耐性のクロマトグラフィー媒体は、ウイルス生成物を１０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率で溶出する能力がある。
【００１７】
・本明細書に定義されるウイルス生成物を、前記生成物および本明細書に定義される生成物関連不純物を含む本明細書に定義される組成物から回収するためのプロセス。このプロセスは、組成物を膜またはシートの形態のクロマトグラフィー媒体と接触させること、ならびに、１または複数の前記膜またはシートおよび所望により１または複数のフリットまたはその他のスペーサー材料を含むホルダーに組成物を通過させることを含み、
該組成物は、（ａ）前記１または複数の膜またはシートを通る経路長が２ｍｍ未満であるか、または（ｂ）膜、シート、フリットおよびその他のスペーサー材料を通る総経路長が５０ｍｍ未満であるようにホルダーを通過する。
【００１８】
・本明細書に定義されるウイルス生成物を、前記生成物および本明細書に定義される生成物関連不純物を含む本明細書に定義される組成物から回収するためのプロセス。このプロセスは、組成物を膜またはシートの形態のクロマトグラフィー媒体と接触させること、ならびに、１または複数の前記膜またはシートおよび所望により１または複数のフリットまたはその他のスペーサー材料を含むホルダーに組成物を通過させることを含み、
該組成物は、１分以下の期間クロマトグラフィー媒体と接触する。
【００１９】
・ウイルス生成物を前記生成物および非生成物関連不純物を含む組成物から回収するためのプロセス。このプロセスは、組成物を１または複数の高分子ナノファイバーを含む官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させることを含み、
該ウイルス生成物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコア、またはプロウイルスを含み、その各々は１または複数のポリヌクレオチドを含有し、かつ
該非生成物関連不純物は、細胞および／または細胞成分、例えば脂質、宿主細胞タンパク質および／または宿主細胞増殖培地のその他の構成要素、例えばタンパク質および／または糖などを含む。
【００２０】
・ウイルス生成物を、本明細書に定義される前記生成物、生成物関連不純物および非生成物関連不純物を含む組成物から回収するためのプロセス。このプロセスは、組成物を本明細書に定義される官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む。
【００２１】
・本発明のプロセスによって得ることができるかまたは得られるウイルス生成物。
【００２２】
・本発明のプロセスによって得ることができるかまたは得られる生成物関連不純物。
【００２３】
・本発明のウイルス生成物を製薬上許容される担体または希釈剤とともに含む組成物。
【００２４】
・本発明の生成物関連不純物を製薬上許容される担体または希釈剤とともに含む組成物。
【００２５】
・微生物治療、ワクチン接種または遺伝子治療の方法。この方法は、そのような治療を必要とする患者に有効量の本発明のウイルス生成物または本発明の組成物を投与することを含む。
【００２６】
・微生物治療、ワクチン接種または遺伝子治療の方法で使用するための本発明のウイルス生成物または本発明の組成物。
【００２７】
・ポリヌクレオチドを細胞に挿入するエクスビボ法。この方法は、細胞を本発明のウイルス生成物と接触させることを含む。
【００２８】
・本発明のエクスビボ法によって得られるかまたは得ることのできる細胞。
【００２９】
・１または複数の本発明の細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む治療方法。
【００３０】
・治療によってヒトまたは動物の体を治療する方法で使用するための本発明の細胞。
【００３１】
・癌を治療する際に使用するための本発明の細胞。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】いくつかの異なる官能化されたクロマトグラフィー材料に対するＢＳＡのＤＢＣを示す図である。
【図２】材料がグラフトされていない、低電荷密度材料と高電荷密度材料の比較を示す図である。
【図３】材料がグラフトされている、低電荷密度と高電荷密度の材料の比較を示す図である。
【図４】両方が高い電荷密度を有する、グラフトされた材料とグラフトされていない材料の比較を示す図である。
【図５】ＡｄＶベクターおよびＢＳＡに対する材料の容量を示す図である。
【図６】ＡＡＶ材料のクロマトグラムを示す図である。
【図７】ＡＡＶカプシドタンパク質のウエスタンブロットを示す図である。
【図８】ＡＡＶ分離から回収した画分のＰＣＲ結果を示す図である。
【図９】ＣｓＣｌ充填材料とおよび本発明のクロマトグラフィー分離から得た充填材料を比較するクロマトグラムを示す図である。
【図１０】ＣｓＣｌ材料と本発明のクロマトグラフィー分離から得た材料のさらなる比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、ウイルス生成物を前記生成物および生成物関連不純物を含む組成物から回収するためのプロセスであり、このプロセスは組成物を１または複数の高分子ナノファイバーを含む官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む。
【００３４】
もう１つの実施形態では、本発明は、ウイルス生成物を前記生成物および非生成物関連不純物を含む組成物から回収するためのプロセスであり、このプロセスは、組成物を１または複数の高分子ナノファイバーを含む、官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む。
【００３５】
ウイルス生成物
ウイルス生成物は、一般には、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコア、またはプロウイルスを含み、その各々は１または複数のポリヌクレオチドを含有する。したがって、一般に、ウイルス生成物は、「充填」または「フル」ウイルス生成物、すなわち「充填」または「フル」ウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコア、またはプロウイルスである。当業者は、「充填」または「フル」ウイルスおよび関連ウイルス生成物の概念を十分に認識している。
【００３６】
一般に、ウイルス生成物は、複数のウイルス、ウイルス粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコア、またはプロウイルスを含み、その各々が細胞を感染させる能力を有する。したがって、一般に、ウイルス生成物は、標的細胞をうまく感染させることのできる「活性」または「感染性」ウイルス生成物である。当業者は、「活性」または「感染性」ウイルスおよび関連ウイルス生成物の概念を十分に認識している。
【００３７】
一般に、ウイルス生成物は、各々が１または複数のトランスジェニックポリヌクレオチドを含有する複数のウイルスベクターを含む。したがって、本発明のプロセスは、一般に１または複数のウイルスベクターを前記ウイルスベクターおよび本明細書に定義される生成物関連不純物を含む組成物から回収するためのプロセスである。
【００３８】
１または複数のウイルスベクターは各々一般に１または複数のトランスジェニックポリヌクレオチドまたは導入遺伝子を含有する。用語「トランスジェニックポリヌクレオチド」または「導入遺伝子」が本明細書においてウイルスに対してネイティブでないポリヌクレオチドを表すために使用されることは理解されるであろう。
【００３９】
好ましくは、ウイルス生成物は１または複数のウイルスを含む。原則的にどんなウイルスを使用してもよい。遺伝子治療で用いるウイルスベクターには、ウイルスは一般に組換え型の遺伝子操作されたウイルスである。組換え型ウイルスは、一般に導入遺伝子を含有する。そのような導入遺伝子は、例えば生物学的に機能的なタンパク質またはペプチド、アンチセンス分子、またはマーカー分子をコードすることがあり得る。「ウイルス療法」で用いるウイルスベクターには、ウイルスは、野生型溶解性ウイルスまたは遺伝子組換え版であってよく、それにはウイルス活性を改変するように設計された導入遺伝子（例えば、固形腫瘍を通じてウイルスの拡散を強化することを目的とするタンパク質をコードする導入遺伝子）または抗癌剤の活性を改善するように設計された導入遺伝子（例えば、免役刺激タンパク質またはＧＤＥＰＴタンパク質をコードする導入遺伝子）で「武装した」条件的複製形態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｆｏｒｍｓ）が含まれ、さらに他のウイルスをコードし、感染時にそれらを産生するように操作されたウイルスが含まれる。ウイルスワクチン接種で用いるウイルスベクターには、ウイルスは、しばしば遺伝子改変アデノウイルス（非ヒトアデノウイルスを含む）、ヘルペスウイルスまたは抗原として導入遺伝子をコードするワクシニアである。
【００４０】
全ての場合において、ウイルスはＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスのいずれかであり、そして所望により以下の科および群の１つに由来する：アデノウイルス科；アルファモウイルス；ブロモウイルス科；アルファクリプトウイルス；パーティティウイルス：バキュロウイルス科；バドナウイルス；ベータクリプトウイルス；パルチウイルス科；ビジェミニウイルス；ジェミニウイルス科；ビルナウイルス科；ブロモウイルス；ブロモウイルス科；ビモウイルス；ポティウイルス科；ブンヤウイルス科；カリシウイルス科；カピロウイルス群；カルラウイルス群；カルモウイルス群；カリモウイルス群；クロステロウイルス群；コンメリーナ黄色斑紋ウイルス群；コモウイルスウイルス群；コロナウイルス科；ＰＭ２ファージ群；コルシコウイルス科；潜在性ウイルス群；クリプトウイルス群；ククモウイルスウイルスΦ６ファージ群；シストウイルス科；サイトハブドウイルス；ラブドウイルス科；カーネーションリングスポット群；ジアントウイルスウイルス群；ソラマメウィルト群；エナモウイルス；ファバウイルスウイルス群；フィジーウイルス；レオウイルス科；フィロウイルス科；フラビウイルス科；フロウイルス群；ジェミニウイルス群；ジアルジアウイルス群；ヘパドナウイルス科；ヘルペスウイルス科；ホルデイウイルスウイルス群；ハイブリジェミニウイルス；ジェミニウイルス科；イダイオウイルス；イラルウイルスウイルス群；イノウイルス科；イポモウイルス；イリオドウイルス科；レビウイルス科；リポトリックスウイルス科；ルテオウイルス群；マクロモウイルス；マクルアウイルス；マラフィウイルスウイルス群；トウモロコシ白化萎縮ウイルス群；イクロウイルス科；モノジェミニウイルス（Ｍｏｎｏｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓ）：ジェミニウイルス科；ミオウイルス科；ナナウイルス；ネクロウイルス群；ネポウイルスウイルス群；ノダウイルス科；ヌクレオラブドウイルス：ラブドウイルス科；オルトミクソウイルス科；オリザウイルス：レオウイルス科；ウルミアウイルス；パポバウイルス科；パラミクソウイルス科；パースニップイエローフレックウイルス群；パルティティウイルス科；アデノ随伴ウイルスを含むパルボウイルス科；エンドウひだ葉モザイクウイルス群；フィコドナウイルス科；ファイトレオウイルス：レオウイルス科；ピコルナウイルス科；プラズマウイルス科；ポドウイルス科；ポリドナウイルス科；ポテクスウイルス群；ポティウイルス；ポックスウイルス科；レオウイルス科；レトロウイルス科；ラブドウイルス科；リジディオウイルス群；ライモウイルス：ポティウイルス科；サテライトＲＮＡ；サテリウイルス（Ｓａｔｅｌｌｉｖｉｒｕｓｅｓ）；セキウイルス：セキウイルス科；ソベモウイルス；シホウイルス科；ソベモウイルス群；ＳＳＶＩ型ファージ；テクチウイルス科（Ｔｅｃｔｉｒｉｖｉｄａｅ）；テヌイウイルス；テトラウイルス科（Ｔｅｔｒａｖｉｒｉｒｄａｅ）；トバモウイルス群；トブラウイルス群；トガウイルス科；トンブスウイルス群；トスポウイルス：ブニヤウイルス科；トロウイルス群；トティウイルス科；ティモウイルス；ティモウイルス群；植物ウイルスサテライト；アンブラウイルス；未割当ポティウイルス：ポテ���ウイルス科：未割当ラブドウイルス：ラブドウイルス科；ヴァリコサウイルス；ワイカウイルス：セキウイルス科；非群化ウイルス。
【００４１】
好ましくは、ウイルスは、アデノウイルス科、アデノ随伴ウイルスを含むパルボウイルス科およびレトロウイルス科から選択される。
【００４２】
本発明での使用に特に好ましいウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレンチウイルスである。アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが特に好ましく、アデノ随伴ウイルスがより好ましい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ウイルスの成分、例えばウイルスコアまたはプロウイルス（例えばポックスウイルス由来）が使用されてよい。しかし、ウイルスまたはウイルス粒子／ビリオンを使用することが好ましい。
【００４４】
当業者は、用語「ポリヌクレオチド」の意味を十分に認識している。そのようなポリヌクレオチドには、ＤＮＡまたはＲＮＡだけでなくｓｉＲＮＡ分子などの合成分子が含まれる。
【００４５】
疑義を避けるために明記すると、「ポリヌクレオチド」は、多数の既知のヌクレオシド間結合のいずれかによって互いに結合した複数の結合した個々のヌクレオシド単位から形成されるポリヌクレオシドである。そのようなヌクレオシド間結合には、限定されるものではないが、天然のヌクレオシド間ホスホジエステル結合または実際に修飾されたヌクレオシド間結合、例えば、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホナート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダート、シロキサン、カルボナート、カルボアルコキシ、アセトアミダート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホルアミダート、架橋メチレンホスホナート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間結合が含まれる。用語「ポリヌクレオチド」は、１または複数の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（Ｒｐ）−または（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホナート、またはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドも包含する。本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」は、そのような任意のヌクレオシド間結合をその結合がリン酸基を含むかどうかに関わらず有するポリヌクレオシドを含むことをはっきりと意図する。特定の好ましい実施形態では、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合、またはその組合せであってよい。
【００４６】
用語「ポリヌクレオチド」は、限定されるものではないが、タンパク質基、親油性基、挿入剤、ジアミン、葉酸、コレステロールおよびアダマンタンをはじめとするさらなる置換基を有するポリヌクレオシドも包含する。用語「ポリヌクレオチド」は、ポリマーを含有する任意のその他の核酸塩基も包含し、それには、限定されるものではないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチド、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを有する骨格部分を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。アルキルリンカーは、分枝または非分枝の、置換または非置換の、キラル的に純粋であるかまたはラセミ混合物であってよい。
【００４７】
ポリヌクレオチドには、天然に存在するヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド、またはその混合物が含まれ得る。本明細書において、用語「修飾されたヌクレオシド」は、修飾された複素環塩基、修飾された糖部分、またはそれらの組合せを含むヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、本明細書に記載されるように非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは２’−デオキシ−２’−置換−アラビノシドである。
【００４８】
本明細書において、用語「ハイブリッドポリヌクレオチド」は、２種類以上のヌクレオシドを有するポリヌクレオチドである。
【００４９】
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、ハイブリッドおよびキメラのポリヌクレオチドが含まれる。「キメラポリヌクレオチド」は、配列構造内に２種類以上のヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオチドである。そのようなキメラポリヌクレオチドの好ましい一例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエート領域と、アルキルホスホナートまたはアルキルホスホノチオエート結合などの非イオン結合とを含むキメラオリゴヌクレオチドである（米国特許第５６３５３７７号および米国特許第５３６６８７８号）。
【００５０】
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、環状化変異体および環状ポリヌクレオチドも含まれる。
【００５１】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの天然に存在するホスホジエステル、または１つの修飾されたホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート・ヌクレオシド間結合を含むが、限定されるものではないが、メチルホスホナート、メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、スルファマート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボナート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホナート、ホスホルアミダート、特に一級アミノ−ホスホルアミダート、Ｎ３ホスホルアミダートおよびＮ５ホスホルアミダート、および立体特異的結合（例えば、（Ｒｐ）−または（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホナート、またはホスホトリエステル結合）を含む、好ましい結合または実際の骨格修飾も想定される。
【００５２】
ヌクレオシドの糖部分は、天然に存在しない糖部分であり得る。本明細書において、「天然に存在する糖部分」は、核酸、例えば，リボースおよび２’−デオキシリボースの部分として天然に存在する糖部分であり、「天然に存在しない糖部分」は、核酸の部分として天然に存在しないあらゆる糖であるが、ポリヌクレオチド、例えば限定されるものではないが、ヘキソースの骨格で使用され得る糖である。アラビノースおよびアラビノース誘導体が好ましい糖部分の例である。
【００５３】
修飾または置換されたポリヌクレオチドは、細胞取り込みの増強、核酸標的に対する親和性の増強、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増強などの望ましい性質のために、天然型よりも好ましい場合が多い。
【００５４】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「オリゴヌクレオチド」（１８〜２５ヌクレオチド長のポリヌクレオチド分子）と、２６以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの両方をさす。一般に、２６以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドは、１００以上、５００以上、さらには１０００以上のヌクレオチドを有することがある。一般に、ポリヌクレオチドは、一般に１０，０００未満のヌクレオチド、例として５，０００未満のヌクレオチドを有する。１０００〜１０，０００ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドが好ましいであろう。
【００５５】
ウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である場合、ポリヌクレオチドは、一般に最大５０００ヌクレオチドを有する。
【００５６】
ウイルスがアデノウイルス（ＡＶ）である場合、ポリヌクレオチドは、一般に最大８０００ヌクレオチドを有する。
【００５７】
ウイルスがレンチウイルスである場合、ポリヌクレオチドは、一般に最大１０，０００ヌクレオチドを有する。
【００５８】
生成物関連不純物
生成物関連不純物は、一般に、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスを含み、その各々はポリヌクレオチドを実質的に含まない。したがって、一般に、生成物関連不純物は、「非充填」または「空」のウイルス生成物、すなわち「非充填」または「空」のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコア、またはプロウイルスである。当業者は、「非充填」または「空」ウイルスおよび関連生成物の概念を十分に認識している。
【００５９】
生成物関連不純物は、ウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスに含有されておらず、遊離形態のポリヌクレオチドをさらに含むことがある。
【００６０】
一般に、生成物関連不純物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスを含み、その各々は、細胞を感染させることができない。したがって、一般に、生成物関連不純物は、細胞を感染させることができない「不活性」または「非感染性」生成物である。当業者は、「不活性」または「非感染性」ウイルスおよび関連ウイルス生成物の概念を十分に認識している。いくつかの実施形態では、生成物関連不純物は、ポリヌクレオチドを含んでいても含んでいなくてもよいが、いずれの場合も細胞を感染させることができない、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスを含む。そのような実施形態では、ポリヌクレオチド材料は、例として、ウイルスまたはウイルス生成物の中に不完全に充填されていることがあり、これは生成物が細胞を感染させることができないことを意味する。
【００６１】
一般に、生成物関連不純物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスを含み、その各々は完全なウイルスゲノムを欠く。
【００６２】
一般に、生成物関連不純物は、特異的ウイルスまたは上に定義されるウイルス成分の１または複数を含む、但し、それらのウイルスまたはウイルス成分は、上述の生成物関連不純物の１または複数の特徴、すなわち
・ポリヌクレオチドを実質的に含まない；
・充填されていない；
・空である；
・細胞を感染させることができない；
・不活性である；
・非感染性である；かつ／または
・完全なウイルスゲノムを欠く；
ことを、所望により遊離ポリヌクレオチドであることに加えて有する。
【００６３】
したがって、好ましくは、生成物関連不純物は、複数のアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレンチウイルスを含む、但し、それらは上述の生成物関連不純物の１または複数の特徴を有する。アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが特に好ましく、アデノ随伴ウイルスがより好ましい。
【００６４】
非生成物関連不純物
非生成物関連不純物は、一般に、細胞、または脂質、宿主細胞タンパク質などの細胞成分、および／または宿主細胞増殖培地のその他の構成要素、例えばタンパク質、糖などを含む。
【００６５】
したがって、一般に、非生成物関連不純物は細胞を含む。あるいは、非生成物関連不純物は、脂質、宿主細胞タンパク質などの細胞成分、および／または宿主細胞増殖培地のその他の構成要素、例えばタンパク質および／または糖などを含む。
【００６６】
疑義を避けるために明記すると、非生成物関連不純物は、当業者に周知である。
【００６７】
高分子ファイバー
官能化されたクロマトグラフィー媒体は、１または複数の高分子ナノファイバーを含み、一般に前記１または複数の高分子ナノファイバーから形成される。本明細書において「ナノファイバー」が言及される場合、これらは下に定義される高分子ナノファイバーであると理解されるべきである。
【００６８】
一般に、高分子ナノファイバーは、１または複数の不織布シートの形態であり、各シートは１または複数の前記高分子ナノファイバーを含む。１つ以上のポリマーナノファイバーを含む不織布シートは、各ファイバーが本質的にランダムに配向している前記１つ以上のポリマーナノファイバーのマットである、すなわち、それは１つまたは複数のファイバーが特定のパターンをとるように製造されていない。高分子ナノファイバーを含む不織布シートは、公知の方法によって一般に提供される。不織布シートは、特定の状況において、単一の高分子ナノファイバーで構成される。あるいは、不織布シートは、２以上の高分子ナノファイバー、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０の高分子ナノファイバーを含み得る。
【００６９】
高分子ナノファイバーは、電界紡糸高分子ナノファイバーであってよい。そのような電界紡糸高分子ナノファイバーは、当業者に周知である。高分子ナノファイバーを製造するための代替方法、例えば延伸を用いてもよい。
【００７０】
本発明で用いる高分子ナノファイバーは、一般に、１０ｎｍ〜１０００ｎｍの平均径を有する。いくつかの用途には、２００ｎｍ〜８００ｎｍの平均径を有する高分子ナノファイバーが適切である。２００ｎｍ〜４００ｎｍの平均径を有する高分子ナノファイバーは、特定の用途に適切であり得る。
【００７１】
本発明で用いる高分子ナノファイバーの長さは、特に制限されない。したがって、従来のプロセス、例えば電界紡糸は、数百メートル、さらには数キロメートルもの長さの高分子ナノファイバーを製造することができる。だが一般に、１または複数の高分子ナノファイバーは、最大１０ｋｍ、好ましくは１０ｍ〜１０ｋｍの長さを有する。
【００７２】
不織布シートは、一般に１〜４０ｇ／ｍ２、好ましくは５〜２５ｇ／ｍ２、いくつかの状況では１〜２０または５〜１５ｇ／ｍ２の面密度を有する。
【００７３】
不織布シートは、一般に５〜１２０μｍ、好ましくは１０〜１００μｍ、いくつかの状況では５０〜９０μｍ、他の状況では５〜４０、１０〜３０または１５〜２５μｍの厚さを有する。
【００７４】
本発明のプロセスで使用されるナノファイバーを製造するために使用されるポリマーは、ポリマーがクロマトグラフィー用途での使用に適している限り、特に限定されない。したがって、一般に、ポリマーは、クロマトグラフィー媒体、すなわちクロマトグラフィー法の吸着剤としての使用に適しているポリマーである。適したポリマーには、ポリアミド、例えばナイロン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリスルホン（例、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ））、ポリカプロラクトン、コラーゲン、キトサン、ポリエチレンオキシド、アガロース、酢酸アガロース、セルロース、酢酸セルロース、およびその組合せが含まれる。ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、セルロースおよび酢酸セルロースが好ましい。いくつかの例では、セルロースおよび酢酸セルロースが好ましい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、異なる高分子から形成された１または複数のナノファイバーを含む。したがって、この実施形態では、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、１または複数の異なるポリマーを含む。典型的なポリマーは、上に定義される通りである。
【００７６】
一般に、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体である。好ましくは、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、１または複数の不織布シートで形成され、各々が１または複数のセルロースまたは酢酸セルロースナノファイバーを含む。酢酸セルロースは、例えば電界紡糸によってナノファイバーに容易に形成され、電界紡糸後にセルロースに容易に変換できる。
【００７７】
特に好ましい実施形態では、官能化されたクロマトグラフィー媒体は１または複数の高分子ナノファイバーを含むが、代替実施形態では、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、１または複数の任意の種類の高分子ファイバーを含むことがある。そのような高分子ファイバーは、上記のナノファイバーと同じ性質のいずれかまたは全てを有することがある。一般に、そのような高分子ファイバーの平均径は、１０ｎｍ〜１０００μｍ、好ましくは１０ｎｍ〜７５０μｍ、より好ましくは１０ｎｍ〜５００μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜４００μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜３００μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜２００μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜１００μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜７５μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜５０μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜４０μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜３０μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜２０μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜１０μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜５μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜４μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜３μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜２μｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜１μｍ（１０００ｎｍ）であり得る。
【００７８】
官能化されたクロマトグラフィー媒体
上述のように、組成物と接触する官能化されたクロマトグラフィー媒体は、１または複数の高分子ナノファイバーを含む。高分子ナノファイバーは、所望により、同じであっても異なってもよく、それと共有結合している、１または複数のポリマー鎖を有する。しかし、特定の好ましい実施形態では、ナノファイバーは、それと共有結合したポリマー鎖を含まない。ナノファイバーは、一般に、同じであっても異なっていてもよい１または複数の配位基によって一般に官能化され、それが１または複数の配位基を含むナノファイバーをクロマトグラフィー媒体としての使用に適したものにする。
【００７９】
高分子をナノファイバーと結合させか、または１または複数の配位基によって官能化する前に、１または複数の高分子ナノファイバー（１または複数の不織布シートの形態であり得る）は、所望により、高分子ナノファイバー／不織布シートを加熱および／または加圧する、好ましくは高分子ナノファイバー／不織布シートを加熱および加圧することによって、物理的に修正されてよい。これらのステップは、材料の構造的安定性を改善する。加圧および加熱条件もまた、得られる材料の厚さおよび／または多孔性を変えるために様々であり得る。
【００８０】
高分子ナノファイバーの複数の不織布シートを使用することにより、より高い吸着能力を有するより厚い材料を作製することが可能になる。そのため、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、一般に、積み重ねた２以上の不織布シート（各々の前記シートは１または複数の高分子ナノファイバーを含む）を準備し、積み重なったシートを同時に加熱および加圧して隣接するシートのナノファイバー間の接触点を融合させることによって形成される。
【００８１】
セルロース官能化されたクロマトグラフィー媒体の場合には、これは一般に、積み重ねた２以上の不織布シート（各々の前記シートは１または複数の酢酸セルロースナノファイバーを含む）を準備し、積み重なったシートを同時に加熱およびプレスして隣接するシートのナノファイバー間の接触点を融合することによって形成される。
【００８２】
高分子ナノファイバー／不織布シートの加圧および加熱に好ましい加工条件は、国際公開第２０１５／０５２４６０号および国際公開第２０１５／０５２４６５号に見出すことができ、その全文は参照により本明細書に援用される。
【００８３】
上記のように、１または複数の不織布シートの形態であってよく、所望により加熱および／または加圧によって物理的に修正されていてよい、高分子ナノファイバーは、所望により、同じであっても異なっていてもよい、それと共有結合した１または複数のポリマー鎖を有する。ある種の実施形態では、前記高分子ナノファイバーは、特にウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である場合に、それと結合したポリマー鎖を有さない。
【００８４】
１または複数のポリマー鎖を高分子ナノファイバーに共有結合させることは、予め形成したポリマー鎖をナノファイバーにグラフトすることか、またはポリマー鎖をナノファイバーからグラフトすることのいずれかを含むことがある。
【００８５】
疑義を避けるために明記すると、ポリマー鎖は、ナノファイバーと同じではない。したがって、典型的な二次加工プロセスは、１または複数の前記高分子ナノファイバーを、所望により１または複数の前記不織布シートの形態で準備し、１または複数の予め形成されたポリマー鎖をナノファイバー／シートにグラフトすること、および／または１または複数のポリマー鎖をナノファイバー／シートからグラフトすることを含むことになる。１または複数の鎖をナノファイバー／シートからグラフトすることが好ましい。
【００８６】
予め形成されたポリマー鎖をナノファイバーにグラフトすることは、一般に、ナノファイバー上の官能基と反応する能力のある少なくとも１つの基を有する、予め形成されたポリマー鎖を反応させることを含む。
【００８７】
基材から１または複数のポリマー鎖をグラフトすることは、一般に、所望により１または複数の触媒の存在下で、ナノファイバー上に存在する１または複数の官能基から１または複数のポリマー鎖を成長させることを含む。
【００８８】
したがって、一般に、ナノファイバーは、１または複数の官能基、好ましくは予め形成されたポリマー鎖がグラフトされてよく、かつ／またはそこからポリマー鎖が成長することのある１または複数の官能基を含む。
【００８９】
１または複数の官能基からポリマー鎖を成長させるとは、個々のモノマー構成単位から１または複数の官能基でポリマーを構築することを意味する。
【００９０】
ポリマー鎖は中性であっても帯電していてもよい。ある種の実施形態では、中性のポリマー鎖が好ましい。
【００９１】
ポリマーの中性は、本質的に中性のｐＨ、例えばｐＨ６〜８、一般にｐＨ６．５〜７．５、通常はｐＨ６．７５〜７．２５、または約ｐＨ７でイオン化可能、すなわちプロトン化または脱プロトン化される基をポリマーが含有するかどうかによって評価することができる。一般に、中性のポリマーは酸性または塩基性中心を実質的に含有しない、すなわちｐＨ６〜８、一般にｐＨ６．５〜７．５、通常ｐＨ６．７５〜７．２５、または約ｐＨ７でプロトン化または脱プロトン化する官能基を実質的に含有しない。これは、当業者によって、当技術分野で典型的なアッセイで決定することができる。酸度および塩基性度の評価のための典型的な手順は、その理論的側面とともに、その全文が参照により本明細書に援用される「Ａｃｉｄｉｔｙ  ａｎｄ  ｂａｓｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄｓ：Ｔｈｅｏｒｙ，ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｔｙ」Ｆｒａｉｓａｒｄ  ａｎｄ  Ｌ．Ｐｅｔｒａｋｉｓ，ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃ，ｖｏｌｕｍｅ  ４４４，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｂｏｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４、特に５１３頁に考察されている。ここで使用される実質的にとは、１ｍｏｌ％未満、好ましくは０．１ｍｏｌ％未満、さらにより好ましくは０．０１ｍｏｌ％未満、さらには０．００１ｍｏｌ％未満を意味する。
【００９２】
一般に、１種類のポリマーだけがナノファイバーと共有結合される。しかし、その他の実施形態では、２種類以上のポリマーがナノファイバーと共有結合されることもある。
【００９３】
官能化されたクロマトグラフィー媒体が２種類以上の高分子ナノファイバー、すなわち２種類以上のポリマーから形成されるナノファイバーから形成される実施形態では、各異なる種類の高分子ナノファイバーは、異なる種類のポリマーから形成されたポリマー鎖と共有結合することがある。それは、例えば、異なる高分子ナノファイバーに存在する異なる官能基から生じることがあり得る。あるいは、同じポリマーが、異なる種類の高分子ナノファイバーの各々と共有結合することがある。
【００９４】
典型的な官能基としては、ヒドロキシル基、アミノ基およびカルボキシル基が挙げられる。官能化されたクロマトグラフィー媒体が１または複数のセルロースまたは酢酸セルロースナノファイバーで形成される場合、官能基は一般にヒドロキシル基である。
【００９５】
一般に、ナノファイバーは、１または複数の官能基を導入するために処理されるか、ナノファイバーは官能基を脱保護または活性化するために処理されるか、あるいはナノファイバーは、官能基の数／密度を増加させるために処理される。好ましくは、ナノファイバーは、基材上のどんな官能基も脱保護するために処理される。
【００９６】
官能基の脱保護は、一般に、官能基が１または複数のポリマー鎖を官能基から成長させるか、あるいは１または複数の予め形成されたポリマー鎖を官能基にグラフトさせるように行われる。脱保護はまた、下文でさらに考察される１または複数の配位基でナノファイバーが官能化されてよいように、実行されてよい。
【００９７】
例えば、クロマトグラフィー媒体がセルロースクロマトグラフィー媒体である場合、一般に酢酸セルロースナノファイバーが提供され、任意のポリマーをそれと共有結合させるかまたは１または複数の配位基で官能化する前に、酢酸セルロースを処理してそれをセルロースに変換する。これは、アセチル化ヒドロキシル基を脱保護してヒドロキシル基を得ることを含む。酢酸セルロースのセルロースへの変換は、一般に、アルカリ、好ましくは水：エタノール、より好ましくは水：エタノール２：１中のＮａＯＨを使用して、１２時間よりも長い期間、例えば１２〜３６時間行われる。同じプロトコールを、１または複数の配位基で官能化する前に、アセチル化ヒドロキシル基を脱保護する場合にも使用してよい。
【００９８】
官能基の活性化は、下文の１または複数の配位基による官能化の文脈においてさらに考察されている。その考察は、１または複数のポリマー鎖をナノファイバーと共有結合させる前の官能基の活性化に等しく当てはまる。
【００９９】
基材上の官能基の数／密度を増加させるための方法は、当業者に公知であろう。
【０１００】
１または複数の官能基をナノファイバーに導入する場合、ナノファイバー上の１または複数の官能基は、（ａ）予め形成されたポリマー鎖がグラフトされてよく、かつ／または（ｂ）それから１または複数のポリマー鎖が成長することのある、官能基を導入するために修飾される。導入ステップは、ナノファイバー上に存在する官能基を、そこに／それから１または複数のポリマー鎖をグラフトすることのできる官能基に一緒に変更する単一ステップまたは複数ステップを含んでよい。
【０１０１】
１または複数のポリマー鎖は分枝していてよく、その結果「ブッシュ」型構造となる。あるいは、基本的に非分枝ポリマー鎖を用いてよく、その結果「ブラシ」ポリマー構造となる。ある種の実施形態では、非分枝ポリマー鎖が好ましい。
【０１０２】
官能化
本発明のプロセスは、官能化されたクロマトグラフィー媒体を使用する。クロマトグラフィー媒体は、一般に１または複数の配位基で官能化され、それが材料をクロマトグラフィー媒体としての使用に適したものにする。配位基は一般に高分子ナノファイバーに担持されている。したがって、一般に１または複数の高分子ナノファイバーは、１または複数の配位基で官能化され、それは同じであっても異なっていてもよく、１または複数の配位基を含むナノファイバーをクロマトグラフィー媒体としての使用に適したものにする。
【０１０３】
ナノファイバーを形成するために使用されるポリマーは、ナノファイバーを形成するステップの前に官能化されていてよい。
【０１０４】
あるいは、そして好ましくは、ナノファイバーは、ポリマーがナノファイバーに形成された後に官能化される。
【０１０５】
一般に、１または複数の配位基は、１または複数のナノファイバーと結合している。これは、ナノファイバーがそれと共有結合した１または複数のポリマー鎖を有さない場合に典型的である。したがって、一般に、ナノファイバーは、それと共有結合した１または複数のポリマー鎖を有さない、そして１または複数の配位基は、１または複数のナノファイバーと結合している。
【０１０６】
あるいは、ナノファイバーがそれと共有結合した１または複数のポリマー鎖を有する場合、１または複数の配位基は、ナノファイバーおよび／またはポリマー鎖と共有結合していてよい。この場合、１または複数の配位基は、好ましくは少なくとも、１または複数のポリマー鎖と共有結合している。
【０１０７】
１または複数の配位基は、一般に１または複数のナノファイバーと接触させることによって導入されてよく、ナノファイバーは、所望により加圧および／または加熱され、所望によりそれと共有結合した１または複数のポリマー鎖を、生成物をクロマトグラフィー媒体として官能化する試薬とともに有する。
【０１０８】
試薬は一般に、１または複数の配位基を含む官能化された生成物をクロマトグラフィー媒体としての使用に適したものにする、１または複数の配位基を導入することによって、クロマトグラフィー媒体を官能化する。配位基は、グラフト化生成物に導入された基であり、これはグラフト化生成物をクロマトグラフィー媒体としての使用に適したものにする。適した配位基および試薬は、下文でさらに論じられる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、１種類の配位基のみによって官能化される。その他の実施形態では、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、２種類以上の配位基によって官能化される。
【０１１０】
官能化されたクロマトグラフィー媒体が異なるポリマーから形成された１または複数の高分子ナノファイバーを含む実施形態では、各異なる種類の高分子ナノファイバーは、同じであっても異なっていてもよい１または複数の配位基によって（ポリマー鎖とそれとの随意の共有結合の後に）官能化され得る。
【０１１１】
２種類以上のポリマー鎖がナノファイバーと共有結合されている実施形態では、各ポリマー鎖は、同じであっても異なっていてもよい１または複数の配位基によって官能化され得る。
【０１１２】
一般用語では、媒体／ナノファイバーの官能化は、その化学的および／または物理的性質を変化させる。これは次に、官能化されたクロマトグラフィー媒体がクロマトグラフィー法で使用された場合にどのように挙動するのかに影響を及ぼす。修飾は、例えば、官能化されたクロマトグラフィー媒体の極性、疎水性または生物学的結合特性を、その官能化されていない形態と比較して変化させることであり得る。修飾は、特定の状況では、官能化されたクロマトグラフィー媒体の極性、疎水性または生物学的結合特性の２以上を、その官能化されていない形態と比較して変化させることであり得る。一実施形態では、修飾は、官能化されたクロマトグラフィー媒体の極性および疎水性をその官能化されていない形態と比較して変化させる。
【０１１３】
一般に、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、イオン交換クロマトグラフィー、親和性捕捉クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーから選択されるクロマトグラフィー法での使用に適している。特定の状況では、クロマトグラフィー法は、「混合モード」で動作する、すなわち、相互作用、すなわちイオン交換、親和性捕捉および疎水性相互作用の２以上の形態を利用する。一般に、そのような「混合モード」クロマトグラフィーは、イオン交換（イオン性）および疎水性相互作用を含む。好ましくは、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、イオン交換クロマトグラフィー、親和性捕捉クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィー、好ましくはイオン交換クロマトグラフィーおよび親和性捕捉クロマトグラフィーから選択されるクロマトグラフィー法での使用に適している。動作中、そのようなクロマトグラフィー法は、所望の分子を含有する移動相を吸着相、ここでは官能化されたクロマトグラフィー媒体に通過させることを含む。吸着相は、一般に、移動相に同様に存在するその他の成分に優先して、所望の分子が移動相の上に保持されるように選択される。
【０１１４】
一般に、クロマトグラフィー媒体は、ＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、ＣＭ、フェニル、またはＭＥＰ基、例としてＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、またはＣＭ基によって官能化される。概して、高分子ナノファイバーはセルロースナノファイバーであり、クロマトグラフィー媒体は、ＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、ＣＭ、フェニル、またはＭＥＰ基、例としてＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、またはＣＭ基によって官能化される。したがって、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、ＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、ＣＭ、フェニル、またはＭＥＰ基、例としてＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、またはＣＭ基から誘導体化されたセルロースナノファイバーを含むことがある。これらの配位基は、高分子ナノファイバーに結合されていてよく、かつ／または、ポリマー鎖がナノファイバーに共有結合している場合には、ポリマー鎖に結合されていてもよい。
【０１１５】
官能化されたクロマトグラフィー媒体は、一般にイオン交換、親和性捕捉、疎水性または混合モードのクロマトグラフィー法での使用に適している。したがって、一般に１または複数の配位基は、負に帯電した１または複数の部分、正に帯電した１または複数の部分、１または複数のタンパク質、タンパク質リガンドの作用を模倣するミメティックまたは合成リガンド、ペプチド、抗体またはそのフラグメント、色素、ヒスチジン、金属陽イオンを含有する基、あるいは疎水基である。好ましくは、１または複数の配位基は、負に帯電した１または複数の部分、正に帯電した１または複数の部分、金属陽イオンを含有する１または複数の基、あるいは疎水基である。
【０１１６】
上記のように、配位基は、適切に選択された試薬で処理することによってナノファイバー／ポリマー鎖に導入されてよい。２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミンヒドロクロリド（ＤＥＡＣＨ）およびグリシジルトリメチルアンモニウムが、特に官能化されたクロマトグラフィー媒体が陰イオン交換クロマトグラフィー法に使用される場合には、試薬として好ましい。その他の好ましい試薬は、特に官能化されたクロマトグラフィー媒体が陽イオン交換クロマトグラフィー法に使用される場合には、１，４−ブタンスルホン、クロロ酢酸ナトリウム、ＴＥＭＰＯとそれに続く過塩素酸ナトリウム、またはアリルグリシジルエーテルとそれに続く二亜硫酸ナトリウムである。別の好ましい試薬は、特に官能化されたクロマトグラフィー媒体が疎水性クロマトグラフィー法に使用される場合には、酸化スチレンである。
【０１１７】
一般に、試薬はグリシジルトリメチルアンモニウム、１，４−ブタンスルホン、またはクロロ酢酸ナトリウムである。
【０１１８】
イオン交換クロマトグラフィーは、分子または生物学的実体をそのイオン電荷に基づいて分離するための技術である。そのため、そのような方法で用いる官能化されたクロマトグラフィー媒体は、正または負に帯電した１または複数の部分を含有する。正電荷および／または負電荷は、官能化されたクロマトグラフィー媒体中で、通常、１または複数の対イオンと釣り合っている。イオン交換クロマトグラフィーは、１または複数の陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。
【０１１９】
イオン交換クロマトグラフィーが好ましい。したがって、１または複数の配位基が、帯電した（配位）基であることが好ましい。
【０１２０】
陽イオン交換クロマトグラフィーで用いる官能化されたクロマトグラフィー媒体は、負に帯電した１または複数の部分を含有する。典型的な負に帯電した部分としては、１または複数のカルボン酸基、スルホン酸基またはホスホン酸基、またはその混合物が挙げられる、すなわち、該部分は一般に１または複数の−ＣＯＯ−、−ＳＯ３−、または−Ｐ（ＯＨ）２Ｏ−基、またはその混合物を含有する。陽イオン交換クロマトグラフィーで用いる典型的な官能化されたクロマトグラフィー媒体は、１または複数の−Ｏ−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、または−Ｐ（ＯＨ）２Ｏ−部分を含有する。
【０１２１】
陰イオン交換クロマトグラフィーで用いる官能化されたクロマトグラフィー媒体は、正に帯電した１または複数の部分を含有する。典型的な正に帯電した部分としては、１または複数の四級アミン基が挙げられる。陰イオン交換クロマトグラフィーで用いる典型的な官能化されたクロマトグラフィー媒体は、１または複数の−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）２（ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３）、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３、または−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）２Ｈ部分を含有する。
【０１２２】
疑義を避けるために明記すると、「荷電基」は、それが正または負の電荷を有するようにイオン化されている部分を含む基を意味する、すなわち「荷電基」は、陰イオン性または陽イオン性部分を含む。荷電基は、配位基の特定の例である。
【０１２３】
一般に、１または複数の荷電基は、１または複数のカルボン酸基（−ＣＯＯ−）、スルホン酸基（−ＳＯ３−）、またはホスホン酸基（−Ｐ（ＯＨ）２Ｏ−）基、または第四級アミン基、あるいはそれらの混合物を含む。一般に、１または複数の荷電基は、全ての陰性基または全ての陽性基を含むが、特定の状況では、陰性基および陽性基の混合物が想定される。一般に、１種類のみの陰性基が使用されるが、混合物も使用されてよい。一般に、１種類のみの陽性基が使用されるが、混合物も使用されてよい。
【０１２４】
代表的な荷電基としては、−Ｏ−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−Ｐ（ＯＨ）２Ｏ−、−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）２（ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３）、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３、および−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）２Ｈ部分が挙げられる。
【０１２５】
典型的な荷電基としては、ＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、およびＣＭ基が挙げられる。一般に、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、ＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、またはＣＭ基で官能化されている。したがって、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、ＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、またはＣＭ基で誘導体化されたセルロースナノファイバーを含むことがある。
【０１２６】
親和性捕捉クロマトグラフィーは、特定のリガンド、常にそうとは限らないが通常は生物学的リガンド、に対するその親和性に基づいて分子を分離するための技術である。この方法は、例えば、抗体と抗原との間、または酵素と基質との間の引力に依存し得る。親和性捕捉クロマトグラフィーで用いる官能化されたクロマトグラフィー媒体は、一般に、１または複数のタンパク質、ペプチド、抗体またはそのフラグメント、色素、ヒスチジン、または金属陽イオンを含有する基から選択された１または複数の部分を含有する。親和性捕捉クロマトグラフィーで用いる官能化されたクロマトグラフィー媒体は、好ましくは、金属陽イオンを含有する基から選択された１または複数の部分を含有する。したがって、１または複数の配位基は、１または複数のそのような部分を含むことがある。あるいは、親和性捕捉クロマトグラフィーで用いる官能化されたクロマトグラフィー媒体は、タンパク質リガンドの作用を模倣するミメティックまたは合成リガンドを含有することがある。
【０１２７】
親和性捕捉クロマトグラフィーで用いる典型的なタンパク質は、当業者に周知であり、それにはプロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬが挙げられる。プロテインＡが好ましい。
【０１２８】
プロテインＡは、当業者に周知のタンパク質である。本明細書において、「プロテインＡ」への言及は、組換え型プロテインＡ（黄色ブドウ球菌に見出されるプロテインＡと比較して配列が変更されている）および標識されたプロテインＡ（その全文が参照により本明細書に援用される欧州特許第０８７３３５３（Ｂ）号および米国特許第６３９９７５０号に記載される通り）を包含する。
【０１２９】
親和性捕捉クロマトグラフィーで用いる典型的な抗体およびその断片は、当業者に周知であり、それにはＩｇＧが挙げられる。
【０１３０】
親和性捕捉クロマトグラフィーで用いる典型的な色素は、当業者に周知であり、それにはイエローＨＥ−４Ｒ、レッドＨＥ−３ＢおよびシバクロンブルーＦ３Ｇが挙げられる。
【０１３１】
親和性捕捉クロマトグラフィーで用いる典型的な金属陽イオンを含有する基は、当業者に周知である。そのような基は一般に、金属陽イオンを固定化するためのキレート剤を含有する。金属陽イオンは一般に、銅、ニッケル、亜鉛およびコバルト陽イオン、好ましくはＣｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋およびＣｏ２＋から選択される。
【０１３２】
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、分子または生物学的実体をその疎水性に基づいて分離するための技術である。そのため、そのような方法で用いる官能化されたクロマトグラフィー媒体は、１または複数の疎水基を含有する１または複数の部分を含有する。典型的な疎水基としては、プロピル基、ブチル基、フェニル基、およびオクチル基が挙げられる。
【０１３３】
混合モード（またはマルチモーダル）クロマトグラフィーは、２以上の特徴、一般に疎水性およびイオン電荷に基づいて分子または生物学的実体を分離する技術である。これは、疎水性と陰イオン性の性質の組合せ、または疎水性と陽イオン性の性質の組合せを含み得る。そのため、そのような方法で用いる官能化されたクロマトグラフィー媒体は、一般に上に定義される正または負に帯電した１または複数の部分、および一般に上に定義される１または複数の疎水基を含有する１または複数の部分を一般に含有する。正電荷および／または負電荷は、官能化されたクロマトグラフィー媒体中で、通常、１または複数の対イオンと釣り合っている。そのような方法で使用する官能化されたクロマトグラフィー媒体は、いわゆる疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）で用いるために、イオン化可能な１または複数の疎水基も含有してよい。したがって、一実施形態では、混合モードクロマトグラフィーは、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーである。そのような方法で用いるために適した基は、４−メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）基およびオクチルアミン基である。
【０１３４】
疎水性相互作用と陰イオン性相互作用の組合せを含む混合モードクロマトグラフィー法で用いる官能化されたクロマトグラフィー媒体は、一般に上に定義される正に帯電した１または複数の部分、および一般に上に定義される１または複数の疎水基を含有する。そのような方法で用いるために適した基は、Ｎ−ベンジルメチルエタノールアミン基およびＮ−ベンゾイル−ホモシステイン基である。疎水性相互作用と陽イオン性相互作用の組合せを含む混合モードクロマトグラフィー法で用いる官能化されたクロマトグラフィー媒体は、一般に上に定義される負に帯電した１または複数の部分、および一般に上に定義される１または複数の疎水基を含有する。そのような方法で用いるために適した基は、Ｎ−ベンゾイル−ホモシステイン基である。
【０１３５】
配位基は、一般に、適した試薬と、高分子ナノファイバーおよび／またはポリマー鎖に含有される１または複数の官能基とを反応させることによって官能化されたクロマトグラフィー媒体に導入される。典型的な官能基としては、ヒドロキシル基、アミノ基、ハロゲン基およびカルボキシル基が挙げられる。高分子ナノファイバーがセルロースまたは酢酸セルロースナノファイバーである場合、官能基は一般にヒドロキシル基である。
【０１３６】
１または複数の官能基は、反応の前に試薬で活性化させてよい。当分野で公知の従来の活性化方法を用いてよい。したがって、官能基がヒドロキシル基である場合、そのような基は、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ビスオキシラン、シアン尿酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）、２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４スルホネート（ＦＭＰ）、ＮａＩＯ４、またはジビニルスルホンで処理することによって活性化させてよい。官能基がアミノ基である場合、そのような基は、エピクロルヒドリン、グルタルアルデヒドまたはエポキシドで処理することによって活性化させてよい。官能基がカルボキシル基である場合、そのような基は、ＣＤＩまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で処理することによって活性化させてよい。官能基がハロゲン原子である場合、そのような基は、ジビニルスルホンで処理することによって活性化させてよい。
【０１３７】
当業者は、特定のナノファイバー／ポリマー鎖の上に特定の基および部分を導入するために、適した試薬を、例えば所望の配位基および部分と、それらのナノファイバー／ポリマー鎖に含有される官能基に基づいて選択することができる。典型的な試薬としては、２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミンヒドロクロリド（ＤＥＡＣＨ）、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＭＡＣ）、１，４−ブタンスルホン、またはクロロ酢酸ナトリウムが挙げられる。
【０１３８】
一般に、
−クロマトグラフィー法は、陽イオン交換方法であり、クロマトグラフィー媒体は、１または複数のカルボン酸塩部分、スルホン酸塩部分またはホスホン酸塩部分を含む１または複数の荷電基で官能化されている；または
−クロマトグラフィー法は、陰イオン交換方法であり、クロマトグラフィー媒体は、１または複数の第四級アミノ部分またはジエチルアミン部分を含む１または複数の荷電基で官能化されている；
−クロマトグラフィー法は、親和性捕捉クロマトグラフィー法であり、クロマトグラフィー媒体は、１または複数の金属陽イオンを含有する基で官能化されている；
−クロマトグラフィー法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー法であり、クロマトグラフィー媒体は、１または複数のプロピル基、ブチル基、フェニル基、またはオクチル基で官能化されている；あるいは
−クロマトグラフィー法は、混合モードクロマトグラフィー法であり、クロマトグラフィー媒体は、１または複数のＭＥＰ基、オクチルアミン基、Ｎ−ベンジルメチルエタノールアミン基またはＮ−ベンゾイル−ホモシステイン基で官能化されている。
【０１３９】
官能化されたクロマトグラフィー媒体の性質
官能化されたクロマトグラフィー媒体中の配位基の密度は、一般に１００〜１，５００μｍｏｌ／ｇの官能化されたクロマトグラフィー媒体である。密度は、好ましくは３００〜１，５００μｍｏｌ／ｇ、より好ましくは５００〜１２００μｍｏｌ／ｇ、さらにより好ましくは６００〜１０００μｍｏｌ／ｇ、さらにより好ましくは７００〜９００μｍｏｌ／ｇである。いくつかの実施形態では、密度は１００〜５００μｍｏｌ／ｇである。配位基が荷電基である場合、この図は材料の電荷密度を表す。
【０１４０】
密度は一般に、官能化された材料中の部分の数を決定する滴定法によって求められる。当業者は、官能化された材料の所与試料中に存在する特定の部分の量を決定するために使用するのに適した方法を認識しているであろう。
【０１４１】
塩化トリメチルアンモニウムによる官能化の状況では、密度は塩化トリメチルアンモニウム密度として求めることができ、それは以下のアッセイによって決定されてよい：
１）５０ｍｇの材料をブフナー濾過漏斗で１００ｍＬの０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液で、次にさらに１００ｍＬの０．０１Ｍ  ＨＣｌ溶液で洗浄する；
２）材料を７５℃の乾燥オーブンで一定質量になるまで乾燥させた後、細かくちぎって小片にし、小型の磁気撹拌子を装備した５０ｍＬ遠心管の中に入れる；
３）約１ｍＬのクロム酸カリウム溶液（乳首ピペットを介して添加）とともに１５ｍＬの脱イオン水を添加する、それにより混合物は色が黄色になる；
４）混合物を２０分間激しく撹拌した後、０．１Ｍ硝酸銀で滴定する。滴定のエンドポイントは透明な黄色から曇った褐色への色の変化によって確認される；
５）塩化トリメチルアンモニウム含量（μｍｏｌ／ｇ）を、エンドポイントに達するまで添加した硝酸銀のマイクロモル数／滴定で用いたナノファイバー材料のグラム数として計算する。
【０１４２】
スルホン酸（Ｓ）基による官能化の状況では、密度は、スルホン酸密度として求めることができ、それは以下のアッセイによって決定されてよい：
１）官能化された材料の乾燥試料を０．１Ｍ  ＨＣＬおよび０．０１Ｍ  ＨＣｌで洗浄する；
２）材料をオーブンで乾燥させ、秤量する；
３）ｐＨ７に達するために添加しなければならないＮａＯＨの量によって材料のモル濃度を求める；
４）スルホン酸（Ｓ）含量（μｍｏｌ／ｇ）を、ｐＨ７に達するために添加したＮａＯＨの量のマイクロモル数／滴定で用いたナノファイバー材料のグラム数として計算する。
【０１４３】
官能化されたクロマトグラフィー材料は、一般に、１０〜２１０ｍｇ／ｍＬ（１０％破過）、好ましくは２０〜１９５ｍｇ／ｍＬ（１０％破過）、３０〜１８０ｍｇ／ｍＬ（１０％破過）、４０〜１６５ｍｇ／ｍＬ（１０％破過）、または５０〜１５０ｍｇ／ｍＬ（１０％破過）の動的結合容量（ＤＢＣ）を有する。ある種の実施形態では、ＤＢＣは、最大５０ｍｇ／ｍＬ（１０％破過）、例として１０〜５０ｍｇ／ｍＬ（１０％破過）であってよい。陰イオン性の官能化されたクロマトグラフィー媒体には、ＤＢＣ（１０％破過）は、一般にＢＳＡについてのＤＢＣ（１０％破過）として計算される。陽イオン性の官能化されたクロマトグラフィー媒体には、ＤＢＣ（１０％破過）は、一般にリゾチームについてのＤＢＣ（１０％破過）として計算される。
【０１４４】
１０％破過のＤＢＣは、標準的な手段、例えばＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅシステムを使用することに従って求めることができる。
【０１４５】
１０％破過のＤＢＣは、一般に、以下のアッセイ法に従って求められる：
１）負荷材料（陰イオン交換材料には、負荷材料は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８中１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡであった。陽イオン交換材料には、負荷材料は、酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７、１０ｍＭ中１ｍｇ／ｍＬリゾチームであった。）を、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅシステム（ＧＥヘルスケア）上のホルダーの中に含有される官能化された材料に通す；
２）材料を、決定された膜容量／分の流量（ｍＶ／分）で、ホルダー出口後の濃度が、ＵＶフローセルによって決定されるその負荷の１０％を超えるまで負荷する；
３）システムおよびホルダー装置のデッドボリュームを考慮して、１０％破過でディスクに負荷されたタンパク質の総量を、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア（ＧＥヘルスケア）のクロマトグラムの分析によって決定した。
【０１４６】
一般に、官能化されたクロマトグラフィー材料は、塩不耐性材料である。塩不耐性材料は、結合溶出分離プロセスの溶出ステップにおいて低い塩濃度で生成物を溶出する能力のある材料である。ここで使用されるように、低い塩濃度は、１０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する溶液である。
【０１４７】
クロマトグラフィープロセス
本発明のプロセスは、クロマトグラフィー分離プロセスである。一般に、クロマトグラフィー分離は、結合−溶出クロマトグラフィー分離プロセスである。あるいは、クロマトグラフィー分離プロセスは、フロースルークロマトグラフィー分離プロセスである。官能化されたクロマトグラフィー媒体は、クロマトグラフィー分離プロセスにおいて固定相として使用される。
【０１４８】
本発明のプロセスは、本明細書に定義されるウイルス生成物を含む組成物および本明細書に定義される生成物関連不純物を本明細書に定義される官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む。あるいは、本発明のプロセスは、本明細書に定義されるウイルス生成物を含む組成物および本明細書に定義される非生成物関連不純物を本明細書に定義される官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む。
【０１４９】
官能化されたクロマトグラフィー媒体は、膜またはシートの形態であってよい。そのような膜およびシートは、膜クロマトグラフィー法での使用に適している。膜クロマトグラフィー法は、当業者に周知であり、その全文が参照により本明細書に援用される「Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ」ｅｄ．Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｃｈａｒｃｏｓｓｅｔ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１２に考察されている。
【０１５０】
官能化されたクロマトグラフィー媒体は、クロマトグラフィーカートリッジまたはホルダーに収容されてよい。カートリッジおよびホルダーという用語は、本明細書において同義的に使用される。カートリッジは、一般に本発明の１または複数の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む。カートリッジは一般に円筒形である。
【０１５１】
一般に、クロマトグラフィーカートリッジは、一般に円筒形ホルダーの内部に積み重ねられたかまたは巻かれた１または複数の本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む。クロマトグラフィーカートリッジは、軸方向流または半径方向流の下で動作するように設計されてよい。一実施形態では、カートリッジは、ホルダーの内部に巻かれた１または複数の本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含み、軸方向流下で動作するように設計されている。あるいは、カートリッジは、ホルダーの内部に積み重ねられた１または複数の本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含み、半径方向流下で動作するように設計されている。
【０１５２】
一般に、クロマトグラフィーカートリッジは、２以上の本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む。クロマトグラフィーカートリッジは、一般に、２０までの本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む。
【０１５３】
一般に、クロマトグラフィーカートリッジは、一般に円筒形のホルダーの内部に１または複数のフリットも含む。フリットは、当業者に周知であり、硬質多孔質構造、一般に硬質金属、ポリマーまたはセラミック、好ましくは硬質金属またはセラミックの多孔質構造をさす。フリットは、一般に、カートリッジを通る流量分布を改善するため、および／または１または複数の本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体を支持するためにクロマトグラフィーカートリッジに含められる。典型的なフリットの細孔の直径は、１〜１０００μｍ、好ましくは５〜５００μｍ、より好ましくは１０〜１５０μｍである。その他の適したフリット細孔径には、１〜２０μｍ、好ましくは５〜１０μｍ、より好ましくは３〜７μｍが含まれる。
【０１５４】
一般に、カートリッジは、２以上の本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体および１または複数のフリットを含み、フリットは官能化されたクロマトグラフィー媒体間に位置する。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、カートリッジは、フリットを含まない。
【０１５６】
カートリッジは、フリットの代わりに、またはフリットに加えて、代わりのスペーサー材料を含んでよい。典型的な代替スペーサー材料には不織布および織布材料が含まれる。
【０１５７】
不織布材料、例えば不織布ポリマー材料は当業者に公知である。そのような不織布材料は多孔質である、すなわち、一般に圧力を大幅に低下させずに液体を通過させる。一般に、不織布ポリマー材料はポリプロピレンである。一般に、不織布材料の面密度は４５〜１５０ｇｓｍである。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、カートリッジは、２以上の本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体および上に定義される１または複数の不織布ポリマー材料層を含み、１または複数の不織布ポリマー材料層は官能化されたクロマトグラフィー媒体間に位置する。
【０１５９】
織布材料は当業者に公知である。そのような織布材料は多孔質である、すなわち、一般に圧力を大幅に低下させずに液体を通過させる。一般に、織布材料は、織布ポリマー材料、好ましくは織布ポリプロピレンである。一般に、織布材料の厚さは１ｍｍ未満である。
【０１６０】
一般に、クロマトグラフィーカートリッジは、１または複数の入口流体分配手段および／または出口流体収集手段も含む。そのような手段は、当業者に周知である。
【０１６１】
本発明のプロセスは、本明細書に定義される組成物を、本明細書に定義される膜またはシートの形態であってよく、かつ／または本明細書に定義されるカートリッジに含有されていてよい、本明細書に定義される官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む。ウイルス生成物および生成物関連不純物は、官能化されたクロマトグラフィー媒体に様々な強度で結合すると考えられる。一般に、これはその後の溶出ステップにおけるそれらの分離を可能にする。これは、既知のクロマトグラフィー法の結合段階および溶出段階について公知の従来法に従って実行することができる。あるいは、ウイルス生成物と生成物関連不純物の結合強度が異なることにより、ウイルス生成物をフロースルーモードで生成物関連不純物から分離させることができる。すなわちウイルス生成物および生成物関連不純物を含む組成物を官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させ、生成物関連不純物が官能化されたクロマトグラフィー媒体に実質的に結合する間にウイルス生成物をカラムから溶出する。
【０１６２】
あるいは、またはそれに加えて、ウイルス生成物および非生成物関連不純物は、官能化されたクロマトグラフィー媒体に様々な強度で結合すると考えられる。一般に、これはその後の溶出ステップにおけるそれらの分離を可能にする。これは、既知のクロマトグラフィー法の結合段階および溶出段階について公知の従来法に従って実行することができる。あるいは、ウイルス生成物と非生成物関連不純物の結合強度が異なることにより、ウイルス生成物をフロースルーモードで非生成物関連不純物から分離させることができる。すなわちウイルス生成物および非生成物関連不純物を含む組成物を官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させ、非生成物関連不純物が官能化されたクロマトグラフィー媒体に実質的に結合する間にウイルス生成物をカラムから溶出する。
【０１６３】
組成物は、ウイルス生成物および本明細書に定義される生成物関連不純物を一般に移動相に含む。あるいは、組成物は、ウイルス生成物および本明細書に定義される非生成物関連不純物を一般に移動相に含む。移動相は、一般に水相、好ましくは緩衝液、例えば緩衝生理食塩水、またはトリス緩衝液である。組成物は一般にウイルス生成物を生成するために用いられるプロセスから、または緩衝液交換ステップの後に、例えばウイルスベクター生成プロセスから得られる。そのようなプロセスは、当業者に公知であり（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）（Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）（Ｍ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、その全文が参照により本明細書に援用される。
【０１６４】
組成物は一般にウイルス生成物を生成するために用いられるプロセスの付加的な副生成物も含む。付加的な副生成物としては、例えばバッファー、細胞片、細胞タンパク質、細胞ＤＮＡおよび細胞培地の成分が挙げられる。
【０１６５】
本発明に従って処理する前に、さらなる処理ステップ、例えば１または複数の遠心分離、ＤＮＡｓｅによる処理、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーを実行してよい。
【０１６６】
本発明は、ウイルス生成物を回収するためのプロセスを適宜に提供し、そのプロセスは、以下を含む：
（ｉ）本明細書に定義されるウイルス生成物および本明細書に定義される生成物関連不純物を含む本明細書に定義される組成物を準備するステップ
（ｉｉ）所望により、遠心分離、ＤＮＡｓｅによる処理、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーから選択される１または複数の処理ステップに組成物を付すステップ、および
（ｉｉｉ）得られる組成物を本明細書に定義される官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させるステップ。
【０１６７】
あるいは、本発明は、ウイルス生成物を回収するためのプロセスを適宜に提供し、そのプロセスは、以下を含む：
（ｉ）本明細書に定義されるウイルス生成物および本明細書に定義される非生成物関連不純物を含む本明細書に定義される組成物を準備するステップ
（ｉｉ）所望により、遠心分離、ＤＮＡｓｅによる処理、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーから選択される１または複数の処理ステップに組成物を付すステップ、および
（ｉｉｉ）得られる組成物を本明細書に定義される官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させるステップ。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、少なくともアフィニティークロマトグラフィーを含む。
【０１６９】
ステップ（ｉ）は一般にウイルスベクター生成プロセスを含み、それは他所に考察されるように公知の方法に従って実施されてよい。
【０１７０】
組成物は、一般に導電率が３０ｍＳ／ｃｍよりも低くなるように溶解塩濃度を有する。導電率は、好ましくは２５ｍＳ／ｃｍよりも低く、より好ましくは２０ｍＳ／ｃｍよりも低く、さらにより好ましくは１５ｍＳ／ｃｍよりも低く、さらにより好ましくは１０ｍＳ／ｃｍよりも低く、さらにより好ましくは９ｍＳ／ｃｍよりも低く、さらにより好ましくは８ｍＳ／ｃｍ以下である。当業者は導電率を決定するために使用することのできる適した方法をよく認識している。
【０１７１】
本発明のプロセスは、回分法で（すなわち組成物および媒体を容器に入れて）、または連続法で（すなわち官能化されたクロマトグラフィー媒体が膜またはシートの形態であり、１または複数の前記膜／シートおよび所望により本明細書に定義される１または複数のフリットまたはその他のスペーサー材料を含むホルダーまたはカートリッジに組成物を通過させて）組成物を官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させることを含み得る。一般に、そのような実施形態では、（ａ）前記１または複数の膜／シートを通る経路長が２ｍｍ未満であり、かつ／あるいは（ｂ）ホルダーに存在する膜、シート、フリットおよびその他のスペーサー材料を通る総経路長が５０ｍｍ未満であるように、組成物をホルダーに通過させる。
【０１７２】
実施形態（ａ）では、組成物は、膜／シートではないホルダー内のその他の材料も通過することがあり、２ｍｍ経路長はこれらのその他の材料を含まないことを理解されたい。実施形態（ｂ）では、５０ｍｍ経路長にはホルダー内のその他の材料を含まれる。疑義を避けるために明記すると、上述の経路長はいずれもホルダー内の材料の層間に少しの空隙も含まない。
【０１７３】
本発明のプロセスは、高い流速で操作することができる。したがって、一般に本発明のクロマトグラフィープロセスでは、組成物は、官能化されたクロマトグラフィー媒体と、１分以下、好ましくは５０秒以下、より好ましくは４０秒以下、さらにより好ましくは３０秒以下、さらにより好ましくは２０秒以下、さらには１５秒以下、１２秒以下、１０秒以下、８秒以下、６秒以下、４秒以下、２秒以下、１．５秒以下、さらには１秒以下の期間接触する。
【０１７４】
本発明のプロセスは、一般に、ウイルス生成物を官能化されたクロマトグラフィー媒体から回収するさらなるステップを含む。ウイルス生成物は、官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触すると、官能化されたクロマトグラフィー媒体に吸着される。このステップは、一般に、１以上の生体分子が吸着されている官能化されたクロマトグラフィー媒体を溶出緩衝液と接触させることによって達成することができる。一般に、これは時間に対してイオン強度が増加する液相と接触することを含む。これは、ウイルス生成物を選択的に溶出する。生成物関連不純物も官能化されたクロマトグラフィー媒体に吸着させることができる。非生成物関連不純物も官能化されたクロマトグラフィー媒体に吸着させることができる。ウイルス生成物は、溶出緩衝液のイオン強度を慎重に段階的に制御することによって、これらの不純物に優先して選択的に溶出させることができる。これは、そのようなクロマトグラフィー法の溶出段階について公知の従来法に従って実行することができる。したがって、本プロセスは、一般に結合−溶出クロマトグラフィー法である。
【０１７５】
結合ステップと溶出ステップの間に、本プロセスはウイルス生成物および／または生成物関連不純物および／または非生成物関連不純物を吸着した、官能化されたクロマトグラフィー媒体を洗浄するステップをさらに含んでよい。この洗浄ステップは、官能化されたクロマトグラフィー媒体またはクロマトグラフィーカートリッジに結合していない成分を除去するために実行される。これは、そのようなクロマトグラフィー法の洗浄段階について公知の従来法に従って実行することができる。この洗浄ステップは一般に、低イオン濃度の液相で洗浄することを含む。
【０１７６】
一般に、本発明のプロセスは、
（ｉ）本明細書に定義される組成物を本明細書に定義される官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させるステップ；
（ｉｉ）所望により官能化されたクロマトグラフィー媒体を低イオン濃度の液相で洗浄するステップ；および
（ｉｉｉ）官能化されたクロマトグラフィー媒体を増加するイオン強度の液相と接触させることによって、ウイルス生成物および生成物関連不純物を選択的に溶出するステップ
を含む。
【０１７７】
あるいは、本発明のプロセスは、
（ｉ）本明細書に定義される組成物を本明細書に定義される官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させるステップ；
（ｉｉ）所望により官能化されたクロマトグラフィー媒体を低イオン濃度の液相で洗浄するステップ；および
（ｉｉｉ）官能化されたクロマトグラフィー媒体を増加するイオン強度の液相と接触させることによって、ウイルス生成物および非生成物関連不純物を選択的に溶出するステップ
を含む。
【０１７８】
溶出ステップの後、本プロセスは、官能化されたクロマトグラフィー媒体を再生するステップをさらに含んでよい。一般に、これはウイルス生成物および／または生成物関連不純物が溶出された官能化されたクロマトグラフィー媒体を緩衝液と接触させることによって達成される。これは、そのようなクロマトグラフィー法の再生段階について公知の従来法に従って実行することができる。
【０１７９】
あるいは、ウイルス生成物は、官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触しても官能化されたクロマトグラフィー媒体に吸着されない。代わりに、生成物関連不純物は、官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触すると官能化されたクロマトグラフィー媒体に吸着されるようになることがある。したがって、生成物関連不純物はフロースルーステップの完了後に、官能化されたクロマトグラフィー媒体と実質的に結合したままであるので、ウイルス生成物および生成物関連不純物を含む組成物を含む溶液を、官能化されたクロマトグラフィー媒体を含むカートリッジに通して流すことによって、ウイルス生成物を生成物関連不純物に優先して選択的に回収することが可能である。
【０１８０】
あるいは、またはそれに加えて、非生成物関連不純物は、官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触すると官能化されたクロマトグラフィー媒体に吸着されるようになることがある。したがって、非生成物関連不純物はフロースルーステップの完了後に、官能化されたクロマトグラフィー媒体と実質的に結合したままであるので、ウイルス生成物および非生成物関連不純物を含む組成物を含む溶液を、官能化されたクロマトグラフィー媒体を含むカートリッジに通して流すことによって、ウイルス生成物を非生成物関連不純物に優先して選択的に収集することが可能である。
【０１８１】
したがって、本発明のプロセスは、あるいは、
（ｉ）本明細書に定義される組成物を含む溶液を本明細書に定義される官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させるステップ；および
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させた、ウイルス生成物を含む溶液を回収するステップ
を含む。
【０１８２】
一般に、本発明に従ってウイルス生成物を回収するプロセスは、１回の結合−溶出ステップまたは１回のフロースルーステップを含む。あるいは、本発明に従うプロセスは、連続した２以上の結合−溶出ステップ、例えば２、３、４、５以上の結合−溶出ステップを含んでよい。あるいは、本発明に従うプロセスは、連続した２以上のフロースルーステップ、例えば２、３、４、５以上のフロースルーステップを含んでよい。あるいは、本発明に従うプロセスは、連続した結合−溶出およびフロースルーステップの組合せ、例えば合計２、３、４、５以上のステップを含んでよい。
【０１８３】
一般に、ウイルス生成物は回収され、生成物関連不純物は廃棄される。一般に、非生成物関連不純物は廃棄される。しかし、特定の生成物関連不純物は、特定の用途に使用される可能性があるので、生成物関連不純物を二次生成物として回収することも想定される。
【０１８４】
本発明のプロセスは、ウイルス生成物を回収するためのものである。しかし、どんなクロマトグラフィープロセスもウイルス生成物を１００％の純度で提供することができないことを理解されたい。したがって、本発明は、ウイルス生成物および生成物関連不純物を含む組成物から、元の組成物と比較してウイルス生成物が濃縮された生成物画分を回収するための手段を提供する。したがって、一般に、生成物画分は、組成物中に存在していたよりも大量の、ウイルス生成物および生成物関連不純物の総量の百分率として表されるウイルス生成物を含有する。一般に、ウイルス生成物および生成物関連不純物の総量の百分率として表される生成物画分中のウイルス生成物の量は、組成物中の量よりも１０倍以上、好ましくは１００、１０００、１００００、１×１０＾５、１×１０＾６、１×１０＾７、１×１０＾８、１×１０＾９、１×１０＾１０、１×１０＾１１、１×１０＾１２、１×１０＾１３、または１×１０＾１４倍以上の倍率で大きい。
【０１８５】
したがって、一般に、ウイルス生成物および生成物関連不純物の総量の百分率として表される生成物画分中のウイルス生成物の量は、％ＰＦで表される。これは１００ＰＦＶＰ／（ＰＦＶＰ＋ＰＦＩ）で計算することができ、式中のＰＦＶＰは生成物画分中のウイルス生成物の量であり、ＰＦＩは生成物画分中の生成物関連不純物の量である。ウイルス生成物および生成物関連不純物の総量の百分率として表される元の組成物中のウイルス生成物の量は、％Ｃで表される。これは１００ＣＶＰ／（ＣＶＰ＋ＣＩ）として計算することができ、式中のＣＶＰは組成物中のウイルス生成物の量であり、ＣＩは、組成物中の生成物関連不純物の量である。
【０１８６】
本発明のプロセスは、一般に％ＰＦ≧１０％Ｃとなるように、組成物中の量に対して生成物画分中のウイルス生成物の量を濃縮する。好ましくは、％ＰＦは、１００％Ｃ、１０００％Ｃ、１００００％Ｃ、％Ｃ×１０＾５、％Ｃ×１０＾６、％Ｃ×１０＾７、％Ｃ×１０＾８、％Ｃ×１０＾９、％Ｃ×１０＾１０、％Ｃ×１０＾１１、％Ｃ×１０＾１２、％Ｃ×１０＾１３、または％Ｃ×１０＾１４よりも大きい。
【０１８７】
一般に、本発明のプロセスは、擬似または実際の移動床系を用いる。したがって一般に、本プロセスは、吸着剤として官能化されたクロマトグラフィー媒体を含有する複数の連結されたクロマトグラフィーカラムを有する、１または複数の擬似または実移動床クロマトグラフィー装置に組成物を導入することを含む。
【０１８８】
それが吸着剤として官能化されたクロマトグラフィー媒体を含むのであれば、クロマトグラフィープロセスを実行するためにどんな既知の擬似または実移動床装置を使用してもよい。
【０１８９】
擬似または実移動床クロマトグラフィーは、当業者のよく知る既知技法である。動作原理は、液体溶出相および固体吸着相の向流移動を含む。この動作は溶媒の使用を最小限にして、このプロセスを経済的に実行可能にする。そのような分離技術は、膜吸着剤を使用する生体分子の精製をはじめとする多様な分野に用途が見出されている。
【０１９０】
擬似移動床系は、直列に連結された、吸着剤を含有するいくつかの個々のカラムからなる。溶出剤は、第１の方向でカラムを通過する。原料および溶出剤の注入点、ならびに系の中の分離成分の回収点は、一連の弁によって周期的に変化する。全体的効果は、固体吸着剤の移動床を含有する１本のカラムの動作をシミュレーションすることである。したがって、擬似移動床系は、従来の固定床系と同様に、溶出剤が通過する固体吸着剤の固定床を含有するカラムで構成されるが、擬似移動床系では、動作は連続向流移動床をシミュレートするようなものである。
【０１９１】
実移動床系は、擬似移動床系と動作が類似している。しかし、供給混合物および溶出剤の注入点、および分離成分回収点を弁のシステムによって変化させるのではなく、代わりに一連の吸着ユニット（すなわちカラム）を供給点および排出点に対して物理的に移動させる。この場合もやはり、動作は連続向流移動床をシミュレートするようなものである。
【０１９２】
本発明者らは上に概説した官能化されたクロマトグラフィー媒体を使用することには、先行技術のウイルスベクター精製プロセスと比較していくつかの利点があることを見出した。
【０１９３】
１つの利点は、材料が比較的塩不耐性であることであり、そのため比較的低い塩濃度の溶出緩衝液を用いてウイルス生成物をクロマトグラフィー媒体から溶出することができることである。この低い塩濃度は、溶出緩衝液の導電率によって測定することができる。
【０１９４】
そのため、本発明は、本明細書に定義されるウイルス生成物を、前記生成物および本明細書に定義される生成物関連不純物を含む本明細書に定義される組成物から回収するためのプロセスも提供する。このプロセスは、組成物を塩不耐性のクロマトグラフィー媒体と接触させることを含み、塩不耐性のクロマトグラフィー媒体はウイルス生成物を１０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率で溶出することができる。
【０１９５】
あるいは、本発明は、本明細書に定義されるウイルス生成物を、前記生成物および本明細書に定義される非生成物関連不純物を含む本明細書に定義される組成物から回収するためのプロセスも提供する。このプロセスは、組成物を塩不耐性のクロマトグラフィー媒体と接触させることを含み、塩不耐性のクロマトグラフィー媒体はウイルス生成物を１０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率で溶出することができる。
【０１９６】
これらの実施形態では、塩不耐性のクロマトグラフィー媒体は、上に定義されるような塩不耐性材料である。
【０１９７】
塩不耐性のクロマトグラフィー媒体は、上に定義される官能化されたクロマトグラフィー媒体と多くの点で類似しているが、高分子ナノファイバーを含むクロマトグラフィー媒体に限定されない。しかし、塩不耐性のクロマトグラフィー媒体は、一般に、（高分子ナノファイバーについて）上に定義されるポリマーの１または複数で形成される高分子媒体である。塩不耐性のクロマトグラフィー媒体はまた、一般に、上に定義されるように１または複数の配位基で官能化された、官能化された媒体である。
【０１９８】
さらなる利点は、充填ベクターを非充填ベクターから分離するために少量のクロマトグラフィー材料しか必要としないことである。
【０１９９】
そのため、本発明は、本明細書に定義されるウイルス生成物を、前記生成物および本明細書に定義される生成物関連不純物を含む本明細書に定義される組成物から回収するためのプロセスも提供する。このプロセスは、組成物を膜またはシートの形態のクロマトグラフィー媒体と接触させること、ならびに、１または複数の前記膜またはシートおよび所望により１または複数のフリットまたはその他のスペーサー材料を含むホルダーに組成物を通過させることを含み、
該組成物は、（ａ）前記１または複数の膜またはシートを通る経路長が２ｍｍ未満であるか、または（ｂ）膜、シート、フリットおよびその他のスペーサー材料を通る総経路長が５０ｍｍ未満であるようにホルダーを通過する。
【０２００】
この実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、上に定義される官能化されたクロマトグラフィー媒体と多くの点で類似しているが、高分子ナノファイバーを含むクロマトグラフィー媒体に限定されない。しかし、クロマトグラフィー媒体は、一般に、（高分子ナノファイバーについて）上に定義されるポリマーの１または複数で形成される高分子媒体である。クロマトグラフィー媒体はまた、一般に、上に定義されるように１または複数の配位基で官能化された、官能化された媒体である。
【０２０１】
さらなる利点は、短い滞留時間が可能であることである。
【０２０２】
そのため、本発明は、本明細書に定義されるウイルス生成物を、前記生成物および本明細書に定義される生成物関連不純物を含む本明細書に定義される組成物から回収するためのプロセスも提供する。このプロセスは、組成物を膜またはシートの形態のクロマトグラフィー媒体と接触させること、ならびに、１または複数の前記膜またはシートおよび所望により１または複数のフリットまたはその他のスペーサー材料を含むホルダーに組成物を通過させることを含み、
該組成物は、１分以下の期間クロマトグラフィー媒体と接触する。
【０２０３】
この実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、上に定義される官能化されたクロマトグラフィー媒体と多くの点で類似しているが、高分子ナノファイバーを含むクロマトグラフィー媒体に限定されない。しかし、クロマトグラフィー媒体は、一般に、（高分子ナノファイバーについて）上に定義されるポリマーの１または複数で形成される高分子媒体である。クロマトグラフィー媒体はまた、一般に、上に定義されるように１または複数の配位基で官能化された、官能化された媒体である。
【０２０４】
好ましい滞留（接触）時間は、上に定義される通りである。
【０２０５】
さらなる利点は、本発明に従うプロセスが、代わりの精製プロセスを使用した場合よりも、クロマトグラフィー分離ステップの間に無傷のまま残っているウイルス粒子の割合が大きいことを確実にすると考えられる点である。したがって、本発明に従うプロセスを実行することは、先行技術で公知のウイルス精製プロセスを実行するよりも損傷するウイルス粒子が少ないと考えられる。
【０２０６】
ウイルス生成物、不純物、組成物および使用
本発明は、本発明のプロセスによって得られるかまたは得ることのできるウイルス生成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、本発明のプロセスによって得られるかまたは得ることのできるウイルスベクターを提供する。そのような生成物は、本発明の微生物治療、ワクチン接種および遺伝子治療法で有利に使用することができる。
【０２０７】
また、本発明のプロセスによって得ることができるかまたは得られる生成物関連不純物も提供される。そのような不純物は通常廃棄されることになるが、特定の実施形態では、それらは治療、例えばワクチン接種において有用であることがある。
【０２０８】
また、本明細書に定義されるウイルス生成物を製薬上許容される担体または希釈剤とともに含む組成物も提供される。そのような組成物は、本発明の微生物治療、ワクチン接種および遺伝子治療法で使用することができる。
【０２０９】
また、本明細書に定義される生成物関連不純物を製薬上許容される担体または希釈剤とともに含む組成物も提供される。
【０２１０】
好ましい組成物は、汚染微生物および発熱物質を含まない。
【０２１１】
本発明のウイルス生成物（および所望により生成物関連不純物）は、多様な剤形で投与されてよい。したがって、それらは経口的に、例えば水性または油性懸濁液として投与されることができる。それらはまた、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、胸骨内に、経皮的に、または注入技術によって投与されてもよい。それらは吸入器またはネブライザーによってエアロゾルの形態で吸入によって投与されてもよい。
【０２１２】
経口投与用の製剤は、例えば、有効成分とともに、可溶化剤、例えばシクロデキストリンまたは修飾シクロデキストリン；希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチまたはポテトスターチ；滑沢剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、および／またはポリエチレングリコール；結合剤；例えばデンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン；解凝集剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギン酸塩またはデンプングリコール酸ナトリウム；発泡混合物；色素；甘味料；湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリルサルフェートなど；ならびに、一般に、医薬製剤に使用される無毒で薬理学的に不活性な物質を含有してよい。
【０２１３】
経口投与用の分散液は、溶液、シロップ、乳濁液および懸濁液であってよい。溶液は、可溶化剤、例えばシクロデキストリンまたは修飾シクロデキストリンを含有してよい。シロップ剤は、担体として、例えば、サッカロースまたはグリセリンを含むサッカロースおよび／またはマンニトールおよび／またはソルビトールを含有してよい。
【０２１４】
懸濁液および乳濁液は、担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含有してよい。筋肉注射用の懸濁液または溶液は、活性化合物とともに、製薬上許容される担体、例えば滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えばプロピレングリコール；可溶化剤、例えばシクロデキストリンまたは修飾シクロデキストリン、および必要に応じて適量の塩酸リドカインを含有してよい。
【０２１５】
静脈内または輸液用の溶液は、担体として、例えば、滅菌水および可溶化剤、例えばシクロデキストリンまたは修飾シクロデキストリンを含有してよく、あるいは好ましくはそれらは滅菌された水性の等張性生理食塩水の形態であってよい。
【０２１６】
本発明のウイルス生成物は、例えば遺伝子治療または遺伝子ワクチン接種治療を実行する際に患者に治療用遺伝物質をインビボ送達するために有用であり、該ウイルス生成物には治療用遺伝物質が含まれる。用語「治療用遺伝物質」が、本明細書において、例えば治療上有用なタンパク質またはＲＮＡの発現による、治療効果を得るために投与されるあらゆる遺伝物質または核酸を示すために使用されていることは理解されるであろう。そのような方法は、特にワクチン接種の場合に、所望により１または複数の生成物関連不純物を患者に投与することも含み得る。
【０２１７】
遺伝子治療は、限定されるものではないが、癌の治療（直接注射に適した局所到達可能な腫瘍結節、ならびに全身治療を必要とする転移性癌を含む）、パーキンソン病、Ｘ−ＳＣＩＤ、鎌状赤血球症、レッシュ・ナイハン症状群、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ハンチントン舞踏病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病、嚢胞性線維症、リソソーム蓄積症、心血管疾患および糖尿病を含むヒト疾患の全分野にわたって適用される。
【０２１８】
本発明のウイルス生成物は、ウイルスワクチンの送達にも使用されてよい。ＨＩＶ、結核、マラリア、インフルエンザ、癌およびその他の疾患に対するワクチン接種が想定される。ワクチンは、プライム・ブースト法で（すなわち複数回投与によって）投与されてもよいし、アジュバントと組み合わせて投与されてもよい。
【０２１９】
本発明のウイルス生成物は、例えばウイルス療法をはじめとする微生物治療を実行する際に、治療薬を患者にインビボ送達するために有用である。
【０２２０】
ある種の実施形態では、本発明のウイルス生成物は、その他の薬物、例えば癌の治療に有効なその他の薬物と組み合わせて使用されることがある。
【０２２１】
ウイルス生成物は、ポリヌクレオチドを細胞に挿入するエクスビボ法で使用されてもよく、その方法は、エクスビボで細胞を本発明のウイルス生成物と接触させることを含む。そのようなエクスビボ法は、例えば、後に治療で使用するための細胞のエクスビボ操作を含むことがある。典型的な治療用途にはキメラ抗原受容体−Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）癌治療がある。あるいは、エクスビボ法は、研究目的に、あるいは例えば遺伝子編集（ＣＲＩＳＰＲを含む）、例としてバイオ燃料の製造のための遺伝子組換え作物または酵素の作製に使用されることがある。
【０２２２】
このエクスビボ法に従って改変された細胞は、その後、治療薬として患者に投与され得る。本発明は、本発明のエクスビボ法によって得られるかまたは得ることのできる細胞を提供する。そのため、本発明は、本発明のエクスビボ法に従って改変された１または複数の細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む治療方法も提供する。治療によって、例えば癌の治療において、ヒトまたは動物の体を治療する方法で使用するための、本発明のエクスビボ法に従って改変された１または複数の細胞も提供される。
【０２２３】
以下の実施例は本発明を説明する。
【０２２４】
実施例
材料および装置
特に断りのない限り、全ての化学生成物は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、シグマ−アルドリッチ、ＦｌｕｏｒｏＣｈｅｍ、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、およびＶＷＲなどの会社から入手されたかまたは入手可能である。
【０２２５】
洗浄プロトコール
洗浄プロトコールＡ
反応媒体を等量の脱イオン水と交換し、１時間循環させた。すすぎ手順をさらに１回繰り返した。最後に、材料を等量の水性エタノール（２：１−Ｈ２Ｏ：ＥｔＯＨ）で処理した後、反応器から取り出した。
【０２２６】
洗浄プロトコールＢ
反応媒体を等量の脱イオン水と交換し、１時間循環させた。この後、洗浄媒体を０．０１Ｍ  ＨＣｌと交換し、これを１時間循環させた後、それを０．００１Ｍ  ＨＣｌと交換して１時間循環させた。最後に、媒体をＨ２Ｏ：ＥｔＯＨの２：１混合物と交換し、それを１時間循環させた。次に、誘導体化したナノファイバーを反応器から取り出した。
【０２２７】
洗浄プロトコールＣ
反応媒体を等量の温（６０℃）脱イオン水：アセトンの１：１混合物と交換し、これを３０分間循環させた。洗浄手順をさらに２回繰り返した。最後に、媒体をＨ２Ｏ：ＥｔＯＨの２：１混合物と交換し、それを１時間循環させた。次に、誘導体化したナノファイバーを反応器から取り出した。
【０２２８】
洗浄プロトコールＤ
２Ｌの超純水をナノファイバー材料に送り出した。
【０２２９】
洗浄プロトコールＥ
反応媒体を等量の１：１−脱イオン水：ＥｔＯＨと交換し、１時間循環させた。洗浄手順をさらに２回繰り返した。最後に、媒体をＨ２Ｏ：ＥｔＯＨの２：１混合物と交換し、それを１時間循環させた。次に、誘導体化したナノファイバーを反応器から取り出した。最後に、媒体をＨ２Ｏ：ＥｔＯＨの２：１混合物と交換し、それを１時間循環させた。次に、誘導体化したナノファイバーを反応器から取り出した。
【０２３０】
洗浄プロトコールＦ
反応媒体を超高純度の脱イオン水と交換した。ナノファイバー材料を清浄水中で３０分間穏やかに撹拌した。この後、洗浄媒体を交換し、洗浄サイクルを繰り返した。
【０２３１】
洗浄プロトコールＧ
反応媒体を注ぎ出し、流出液のｐＨが中性または弱酸性になるまでビーカーに水を補充した。
【０２３２】
Ｉ  材料の調製
調製例１
相対分子量が２９，０００ｇ／ｍｏｌの酢酸セルロース溶液を、電界紡糸の前に一般的な溶媒に溶解して、３００〜６００ｎｍの間の範囲の直径をもつ繊維を製造した。ナノファイバー作製のための最適化された条件は、例えば、Ｏ．Ｈａｒｄｉｃｋ、ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．４６（２０１１）３８９０に見出すことができ、その全文は参照により本明細書に援用される。約２０ｇ／ｍ２材料のシートを積層し、加熱および加圧を組み合わせた処理を施した。
【０２３３】
参考例１−塩化トリメチルアンモニウムの官能基化
ナノファイバー材料を、以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
ステップ（ｉ）：酢酸セルロース（ＣＡ）の再生セルロース（ＲＣ）への鹸化
【０２３４】
【化１】
2019527058.tif 000002
調製例１の方法に従って得た酢酸セルロースシート（４４＊３２ｍｍ＊１５０ｍｍ）を、２：１−水：エタノール中０．０７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液５Ｌを含有する大型ビーカーの中に入れた。反応混合物を室温で４８時間循環させた。次に、洗浄プロトコールＡに従って材料を洗浄した。
【０２３５】
ステップ（ｉｉ）：塩化グリシジルトリメチルアンモニウムの誘導体化
【０２３６】
【化２】
2019527058.tif 000003
ステップ（ｉ）で得た材料を１Ｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨに懸濁した。反応媒体を１５分間循環させた後、塩化グリシジルトリメチルアンモニウム（２５ｍＬ、１００ｍＬ）を一度に添加した。反応媒体をさらに１６時間室温で循環させた。次に、洗浄プロトコールＢに従って材料を洗浄した。
【０２３７】
塩化トリメチルアンモニウムの含量を以下の方法によって決定した。５０ｍｇの材料をブフナー濾過漏斗で１００ｍＬの０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液で洗浄し、次にさらに１００ｍＬの０．０１Ｍ  ＨＣｌ溶液で洗浄した。次に、材料を７５℃の乾燥オーブンに入れ、一定質量になるまで乾燥させた後、細かくちぎって小片にした後、５０ｍＬ遠心管の中に入れた。次に、小型の磁気撹拌子および１５ｍＬの脱イオン水を約１ｍＬのクロム酸カリウム溶液（乳首ピペットを介して添加）とともに添加すると、混合物の色は黄色になった。混合物を２０分間激しく撹拌した後、０．１Ｍ硝酸銀で滴定した。滴定のエンドポイントは透明な黄色から曇った褐色への色の変化によって確認される。
【０２３８】
塩化トリメチルアンモニウム含量（μｍｏｌ／ｇ）を、エンドポイントに達するまで添加した硝酸銀のマイクロモル数／滴定で用いたナノファイバー材料のグラム数として計算した。
【０２３９】
２５ｍＬのＧＭＡＣで処理した試料の塩化トリメチルアンモニウム含量（μｍｏｌ／ｇ）は３０８であることが分かった。１００ｍＬのＧＭＡＣで処理した試料の塩化トリメチルアンモニウム含量（μｍｏｌ／ｇ）は７７５であることが分かった。
【０２４０】
調製例３−グリシドール／塩化トリメチルアンモニウムの官能基化
ナノファイバー材料を、以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
【０２４１】
【化３】
2019527058.tif 000004
ステップ（ｉ）：酢酸セルロース（ＣＡ）の再生セルロース（ＲＣ）への鹸化
【０２４２】
【化４】
2019527058.tif 000005
調製例１の方法に従って得た酢酸セルロースシート（４４＊３２ｍｍ＊１５０ｍｍ）を、２：１−水：エタノール中０．０７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液５Ｌを含有する大型ビーカーの中に入れた。反応混合物を室温で４８時間撹拌した。次に、洗浄プロトコールＡに従って材料を洗浄した。
【０２４３】
ステップ（ｉｉ）：グリシドール重合
【０２４４】
【化５】
2019527058.tif 000006
ステップ（ｉ）の材料を１Ｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨに懸濁した。反応媒体を１５分間循環させた後、グリシドール（１８０ｍＬ）を一度に注意深く添加した。反応媒体を室温で１６時間循環させ、続いて材料を洗浄プロトコールＢに従って洗浄した。
【０２４５】
ステップ（ｉｉｉ）：塩化グリシジルトリメチルアンモニウムの誘導体化
【０２４６】
【化６】
2019527058.tif 000007
ステップ（ｉｉ）で得た材料を一般に１Ｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨに懸濁した。反応媒体を１５分間循環させた後、塩化グリシジルトリメチルアンモニウム（５０ｍＬ、１００ｍＬ）を一度に添加した。反応媒体をさらに１６時間室温で循環させた。次に、洗浄プロトコールＣに従って材料を洗浄した。
【０２４７】
塩化トリメチルアンモニウムの含量を調製例２の方法を用いて決定した。
【０２４８】
５０ｍＬのＧＭＡＣで処理した試料の塩化トリメチルアンモニウム含量（μｍｏｌ／ｇ）は５２３であることが分かった。１００ｍＬのＧＭＡＣで処理した試料の塩化トリメチルアンモニウム含量（μｍｏｌ／ｇ）は７７５であることが分かった。
【０２４９】
調製例４−アデノウイルス（ＡＶ）ベクターの調製
アデノウイルスベクターは、既知方法と同様に調製した。
【０２５０】
このように、アデノウイルスベクターは、ＨＥＫ−２９３細胞培養で作製された。アデノウイルスベクターの作製方法は、Ｖｏｌｕｍｅ  １：Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ａｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ
Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｄ，Ａｎｎ  Ｅ．Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ  ＩＳＢＮ：９７８−１−５８８２９−５９８−９（印刷）９７８−１−５９７４５−１６６−６（オンライン）に論じられている。細胞を、凍結融解サイクルを用いて溶解し、得られる材料を遠心分離を用いて精製し、続いてＤＮＡｓｅ（ベンゾナーゼ）で処理した（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。得られる物質を１０ｍＭトリス緩衝液中に透析した。
【０２５１】
調製例５−アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの調製
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡの配列からなるペイロードを含有するアデノ随伴ウイルスベクターを、既知方法と同様に調製した。
【０２５２】
このように、アデノ随伴ウイルスベクターは、ＨＥＫ−２９３細胞培養で作製された（Ｍａｒｔｉｎ  Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。細胞を溶解し、得られる材料を濾過を用いて精製し、続いてＤＮＡｓｅ（ベンゾナーゼ）で処理した（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （２００５）１２，Ｓ５−Ｓ１７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｇｔ．３３０２６１１；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｇｔ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ１２／ｎ１ｓ／ｆｕｌｌ／３３０２６１１ａ．ｈｔｍｌ）。得られる材料を、Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｐａｎ  １０ｍＭ  ｐＨ８に透析した。
【０２５３】
調製例６−アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの代替調製
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡの配列からなるペイロードを含有するアデノ随伴ウイルスベクターを、上に考察されるように既知方法と同様に調製した。
【０２５４】
このように、アデノ随伴ウイルスベクターは、ＨＥＫ−２９３細胞培養で作製された。細胞を溶解し、得られる材料を、濾過（０．４５μｍ、０．２２μｍ）を用いて精製した。得られる材料を、Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｐａｎ  １０ｍＭ  ｐＨ８に透析した。
【０２５５】
ＩＩ  材料の分析
分析例１−クロマトグラフィー材料のＤＢＣ
負荷材料を、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅシステム（ＧＥヘルスケア）のホルダー内に含有される選択された官能化ナノファイバーディスクに通した。材料を、決定された膜容量／分の流量（ｍＶ／分）で、ホルダー出口後の濃度が、ＵＶフローセルによって決定されるその負荷の１０％を超えるまで負荷した。システムおよびホルダー装置のデッドボリュームを考慮して、１０％破過でディスクに負荷されたタンパク質の総量を、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア（ＧＥヘルスケア）のクロマトグラムの分析によって決定した。
【０２５６】
陰イオン交換材料には、負荷材料は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８中１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡであった。
【０２５７】
調製例２および３の様々な材料のＤＢＣを決定した。試験した材料は、下の表１の材料１〜４として示され、ＤＢＣは図１に示される。
【０２５８】
【表１】
2019527058.tif 000008
図１から、材料の電荷密度が上昇するとＢＳＡのＤＢＣが増加することが分かる。材料と共有結合したポリマーの量が増加してもＢＳＡのＤＢＣが増加する。ＢＳＡの最大容量は最少量の７．６倍である。
【０２５９】
ＩＩ  ウイルス材料の分離
実施例１−アデノウイルス材料（ＡＶ）の分離
調製例４で作製したアデノウイルス材料を、調製例２および３で作製した材料を用いて結合−溶出クロマトグラフィー分離プロセスに付した。
【０２６０】
以下のクロマトグラフィー法を分離に用いた。
【０２６１】
【表２】
2019527058.tif 000009
クロマトグラムの分析
材料１〜４について得られるクロマトグラムを図２〜４で比較する。
【０２６２】
図２は、材料１と２を比較する。これは、グラフトされていない材料の電荷密度の増加がクロマトグラムの形状を実質的に変えることを示す。材料２を使用したクロマトグラムには、第２の種も存在すると思われる。
【０２６３】
ポリマー鎖が共有結合している（グラフトされている）材料には、反対の関係が見られる。図３は、材料３と４を比較する。このことは、グラフトされた材料に関して、電荷密度および吸着剤の（ＢＳＡに対する）結合容量が増加すると、分離の見掛分解（ａｐｐａｒｅｎｔ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）が低下することを示す。
【０２６４】
同じ電荷密度のグラフトされた材料とグラフトされていない材料を比較すると、グラフトされていない材料についてより良好な分解が達成され、種の分解は電荷密度のより高い材料を使用すると改善されることが分かる。
【０２６５】
図４は、材料２と４を比較する。
【０２６６】
アデノウイルス容量データ
４つの異なるクロマトグラフィープロセス（材料１〜４を使用）についての総溶出面積を比較して材料の容量を決定した。結果を図５に示す。このことから、最大結合材料は最小結合材料の１．８倍多くのＡｄＶと結合することが分かる。
【０２６７】
意外にも、ＡｄＶ調製物に対する容量の差は、最も強い結合と最も弱い結合の差が７．６倍であったＢＳＡに対する同じ材料の容量の差と比較してもあまり顕著ではない。
【０２６８】
このことは、ＢＳＡ（６６ＫＤａ）などの高い結合容量の小分子に最適化された材料が、何桁も大きい大型のベクター材料（２０〜１１０ｎｍ）を結合および分離するのには適さない場合があることを示している。
【０２６９】
実施例２−アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）材料の分離
調製例５で作製したアデノウイルス材料を、８２０μｍｏｌ／ｇの電荷密度を有する調製例２の方法に従って作製した材料を使用して、結合−溶出クロマトグラフィー分離プロセスに付した。それは１２０ｍＬのＧＭＡＣを使用して、調製例２の方法を使用して調製された。
【０２７０】
以下のクロマトグラフィー法を分離に用いた。
【０２７１】
【表３】
2019527058.tif 000010
クロマトグラムの分析
得られるクロマトグラムを図６として示す。この図は２つの明白なピークを示し、これらは充填ベクター材料および非充填ベクター材料であると考えられた。既知技法（ウエスタンブロット法およびＰＣＲ）を使用してこれをさらに分析した。
【０２７２】
ウエスタンブロット解析
図６のピーク１および２を、既知方法を用いてウエスタンブロットによってＡＡＶベクターカプシドタンパク質について解析した（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｐｓ／ｐｄｆ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｗｂ−ｂｅｇｉｎｎｅｒ．ｐｄｆに考察される通り）。ウエスタンブロット法のトレースを図７として示す。この図から、負荷中に存在するカプシドタンパク質もピーク１と２の両方に存在することが分かる。
【０２７３】
ＰＣＲ分析
ＰＣＲ分析を図６のピーク１および２の画分に実行してＧＦＰ  ＤＮＡ配列を増幅した。これは既知方法を用いて実行した（Ｍａｒｔｉｎ  Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０２７４】
ＰＣＲ分析の結果を図８として示す。この図は、ＧＦＰ  ＤＮＡ配列を含有するのがピーク２であることを明らかに示す。これにより、活性充填ベクターを含有するのがピーク２であることが明らかである。しかしながらピーク１はＧＦＰ  ＤＮＡ配列を含有しない。
【０２７５】
図７および図８を総合すると、本発明のクロマトグラフィー分離プロセスは、充填材料と非充填ベクター材料の混合物をＤＮＡ含有充填ベクターとＤＮＡペイロードを含有しないベクターとに分離したことは明らかである。図６に戻って参照すると、充填ピークと非充填ピークの両方が６ｍＳ未満の導電率で溶出することが明らかである。
【０２７６】
実施例３−本発明のプロセスとＣｓＣｌ勾配遠心分離の比較
調製例６で作製したアデノウイルス材料を、上の実施例２と同じ材料および方法を使用して結合−溶出クロマトグラフィー分離プロセスに付した。
【０２７７】
２６０ｎｍと２８０ｎｍのシグナルとの特徴的な関係（図６に見られる通り）を用いて同定された充填ピークを収集し、ビス・トリスプロパン  １０ｍＭ  ｐＨ８中に透析した。
【０２７８】
同じアデノウイルス材料の別個の試料（調製例６で作製）も、既知方法（Ｍａｒｔｉｎ  Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を用いるＣｓＣｌ勾配遠心分離に付した。充填ウイルス材料と非充填ウイルス材料の両方がこの方法（ビス・トリスプロパン  １０ｍＭ  ｐＨ８中に透析）によって得られ、それぞれ、ＣｓＣｌ充填およびＣｓＣｌ非充填として同定された。次に、この材料を、本発明のプロセスを用いて分離した材料と比較した。
【０２７９】
本発明のクロマトグラフィー分離から得た精製された充填材料を、実施例２と同じ材料および方法を用いて分析した。基本的に、同じ材料および方法が使用されるが、調製クロマトグラフィーよりも分析的に使用される。クロマトグラムを作製して材料を特徴づけた。
【０２８０】
ＣｓＣｌ充填材料を同じ方法で分析した。クロマトグラムを作製して材料を特徴づけた。
【０２８１】
充填材料とＣｓＣｌ充填材料のクロマトグラムを重ねて図９として示す。この図から、２つのトレースの間には高いレベルの類似性があり、２つの方法の生成物が同等であることを示していることが分かる。
【０２８２】
ＣｓＣｌ法と本発明のプロセスをさらに比較するために、ＣｓＣｌ非充填材料を充填材料と混合し、得られる混合物を上記の充填材料およびＣｓＣｌ充填材料と同じ方法で分析した。
【０２８３】
クロマトグラムを生成した。充填ピークと汚染物質ピークの相対サイズを図１０で比較する。
【０２８４】
この図から、ＣｓＣｌ非充填材料のスパイクは、充填ピークのサイズに寄与しないことが分かる。このことは、充填ピーク（したがって本発明のプロセスを用いて得た充填画分）が非充填ベクターを含有しないことを示す。図１０から、ＣｓＣｌ非充填材料が汚染物質ピークに大きく寄与していることも分かる。このことは、本発明の方法を用いて作製された充填ピーク（それ故に画分）が高純度であることを示す。
【０２８５】
参考文献
本明細書に引用される全ての参考文献は参照により本明細書に援用される。
【０２８６】
Ｂｕｒｏｖａ，Ｅ．，＆Ｉｏｆｆｅ，Ｅ．（００００）．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１２（Ｓ１），Ｓ５−Ｓ１７．
Ｂｕｒｏｖａ，Ｅ．，＆Ｉｏｆｆｅ，Ｅ．（２００５）．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１２  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ５−１７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｇｔ．３３０２６１１
Ｄａｖｉｌａ，Ｍ．Ｌ．，Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｉ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｂａｒｔｉｄｏ，Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．，Ｃｕｒｒａｎ，Ｋ．，．．．Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｒ．（２０１４）．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  １９−２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｕｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６（２２４），２２４ｒａ２２５−２２４ｒａ２２５．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００８２２６
Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．，Ｆｅｉｇｉｎ，Ａ．，Ｔａｎｇ，Ｃ．，Ｆｉｔｚｓｉｍｏｎｓ，Ｈ．Ｌ．，Ｍａｔｔｉｓ，Ｐ．，Ｌａｗｌｏｒ，Ｐ．Ａ．，．．．Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｂｏｒｎｅ  ＧＡＤ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａｎ  ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３６９（９５７９），２０９７−２１０５．ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０１４０−６７３６（０７）６０９８２−９
Ｌｅｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｂ．Ｍ．，＆Ｓｅｏｌ，Ｄ．Ｗ．（２００９）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂｙ  ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，３７８（３），６４０−６４４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２００８．１１．０９６
Ｌｏｃｋ，Ｍ．，Ａｌｖｉｒａ，Ｍ．，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｌ．Ｈ．，Ｓａｍａｎｔａ，Ａ．，Ｔｏｅｌｅｎ，Ｊ．，Ｄｅｂｙｓｅｒ，Ｚ．，＆Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０１０）．Ｒａｐｉｄ，Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｔ  Ｓｃａｌｅ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２１（１０），１２５９−１２７１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１０．０５５
Ｌｏｃｋ，Ｍ．，Ａｌｖｉｒａ，Ｍ．Ｒ．，＆Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０１２）．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ８  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３（１），５６−６４．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１１．２１７
Ｎａｔｈｗａｎｉ，Ａ．Ｃ．，Ｒｅｉｓｓ，Ｕ．Ｍ．，Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ，Ｅ．Ｇ．Ｄ．，Ｒｏｓａｌｅｓ，Ｃ．，Ｃｈｏｗｄａｒｙ，Ｐ．，ＭｃＩｎｔｏｓｈ，Ｊ．，．．．Ｄａｖｉｄｏｆｆ，Ａ．Ｍ．（２０１４）．Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７１（２１），１９９４−２００４．ｄｏｉ：ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１４０７３０９
Ｑｕ，Ｇ．，Ｂａｈｒ−Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．，Ｐｒａｄｏ，Ｊ．，Ｔａｉ，Ａ．，Ｃａｔａｎｉａｇ，Ｆ．，ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．，．．．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．（２００７）．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２  ｅｍｐｔｙ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４０（１−２），１８３−１９２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２００６．１１．０１９
Ｕｒａｂｅ，Ｍ．，Ｘｉｎ，Ｋ．−Ｑ．，Ｏｂａｒａ，Ｙ．，Ｎａｋａｋｕｒａ，Ｔ．，Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈ．，Ｋｕｍｅ，Ａ．，．．．Ｏｚａｗａ，Ｋ．（２００６）．Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｅｍｐｔｙ  Ｃａｐｓｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｔｙｐｅ  １  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｔｏｃｋｓ  ｂｙ  Ａｎｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１３（４），８２３−８２８．
Ｖｅｌｌｅｋａｍｐ，Ｇ．，Ｐｏｒｔｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｓｕｔｊｉｐｔｏ，Ｓ．，Ｃｕｔｌｅｒ，Ｃ．，Ｂｏｎｄｏｃ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｙ．−Ｈ．，．．．Ｚｈｕａｎｇ，Ｓ．（２００１）．Ｅｍｐｔｙ  Ｃａｐｓｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ−Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１２（１５），１９２３−１９３６．ｄｏｉ：１０．１０８９／１０４３０３４０１７５３１５３９７４
Ｗｉｃｋｒａｍａｓｉｎｇｈｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｏ．，Ｔｅｓｋｅ，Ｃ．，Ｈｕｂｂｕｃｈ，Ｊ．，＆Ｕｌｂｒｉｃｈｔ，Ｍ．（２００６）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｄｓｏｒｂｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１（１−２），６０９−６１８．ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｅｍｓｃｉ．２００６．０４．０３２
Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｌｅ，Ｔ．，Ｐｒａｄｏ，Ｊ．，Ｂａｈｒ−Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｈ．，Ｚｈｅｎ，Ｚ．，．．．Ｑｕ，Ｇ．（２００５）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＡＶ２  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｉｔｓ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１２（１），１７１−１７８．
［実施態様１］
ウイルス生成物を前記生成物および生成物関連不純物を含む組成物から回収するためのプロセスであって、前記プロセスは、前記組成物を、１または複数の高分子ナノファイバーを含む、官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させるステップを含み、
前記ウイルス生成物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコア、またはプロウイルスを含み、その各々は１または複数のポリヌクレオチドを含有し、かつ
前記生成物関連不純物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスを含み、その各々はポリヌクレオチドを実質的に含まない、プロセス。
［実施態様２］
前記ウイルス生成物が、複数のウイルス、ウイルス粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコア、またはプロウイルスを含み、その各々が細胞を感染させる能力を有する、実施態様１に記載のプロセス。
［実施態様３］
前記ウイルス生成物が、複数のウイルスベクターを含み、その各々が１または複数のトランスジェニックポリヌクレオチドを含有する、実施態様１乃至２のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様４］
前記生成物関連不純物が、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスを含み、その各々が細胞を感染させることができない、実施態様１乃至３のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様５］
前記生成物関連不純物が、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルス様粒子  ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコアまたはプロウイルスを含み、その各々が完全なウイルスゲノムを欠く、実施態様１乃至４のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様６］
前記ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルスから選択される、実施態様１乃至５のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様７］
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルスから選択される、実施態様１乃至６のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様８］
前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、１または複数の不織布高分子ナノファイバーで形成されている、実施態様１乃至７のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様９］
前記１または複数の高分子ナノファイバーが、同じであっても異なっていてもよい１または複数の配位基で官能化されていて、それが、前記１または複数の配位基を含む前記高分子ナノファイバーをクロマトグラフィー媒体としての使用に適したものにする、実施態様１乃至８のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様１０］
同じであっても異なっていてもよい１または複数の配位基が、前記１または複数の高分子ナノファイバーに結合している、実施態様９に記載のプロセス。
［実施態様１１］
前記１または複数の高分子ナノファイバーが、同じであっても異なってもよく、それと共有結合している、１または複数のポリマー鎖を有する、実施態様１乃至１０のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様１２］
前記同じであっても異なっていてもよい１または複数のポリマー鎖が、同じであっても異なっていてもよく、それと結合していて、前記１または複数のポリマー鎖および１または複数の配位基を含む前記高分子ナノファイバーをクロマトグラフィー媒体としての使用に適したものにする、１または複数の配位基を有する、実施態様１１に記載のプロセス。
［実施態様１３］
前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、イオン交換、疎水性相互作用および混合モード法からなる群から選択されるクロマトグラフィー法での使用に適している、実施態様１乃至１２のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様１４］
前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、５０μｍｏｌ／ｇ〜１，５００μｍｏｌ／ｇの官能化されたクロマトグラフィー媒体中の配位基の密度を有する、実施態様１乃至１３のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様１５］
前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、最大５０ｍｇ／ｍＬ（１０％破過）の動的結合容量を有する、実施態様１乃至１４のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様１６］
前記組成物が、導電率が３０ｍＳ／ｃｍ未満となるような溶解塩濃度を有する、実施態様１乃至１５のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様１７］
前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、膜またはシートの形態である、実施態様１乃至１６のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様１８］
前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が膜またはシートの形態であり、前記組成物が１または複数の前記膜またはシートおよび所望により１または複数のフリットまたはその他のスペーサー材料を含むホルダーを通過する、実施態様１乃至１７のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様１９］
前記組成物が、（ａ）前記１または複数の膜／シートを通る前記経路長が２ｍｍ未満であり、または（ｂ）膜、シート、フリットおよびその他のスペーサー材料を通る前記総経路長が５０ｍｍ未満であるように、前記ホルダーを通過する、実施態様１８に記載のプロセス。
［実施態様２０］
前記組成物が官能化されたクロマトグラフィー媒体と１分以下の時間接触する、実施態様１乃至１９のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様２１］
（ｉ）前記組成物を前記官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させるステップと；
（ｉｉ）所望により前記官能化されたクロマトグラフィー媒体を低イオン濃度の液相で洗浄するステップと；
（ｉｉｉ）前記官能化されたクロマトグラフィー媒体を増加するイオン強度の液相と接触させることによって、前記ウイルス生成物および前記生成物関連不純物を選択的に溶出するステップと
を含む、実施態様１乃至２０のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様２２］
（ｉ）前記組成物を含む溶液を前記官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させるステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で前記官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させた、前記ウイルス生成物を含む前記溶液を回収するステップと
を含む、実施態様１乃至２０のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様２３］
前記高分子ナノファイバーがセルロースナノファイバーである、実施態様１乃至２２のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様２４］
前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が、１または複数の荷電基で官能化されている、実施態様１乃至２３のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様２５］
前記１または複数のポリヌクレオチドが、ＤＮＡおよびｓｉＲＮＡを含むＲＮＡから選択される１または複数の核酸である、実施態様１乃至２４のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様２６］
実施態様１乃至３、６および７のいずれか１項に記載のウイルス生成物を、実施態様１および４乃至７のいずれか１項に記載の前記生成物および生成物関連不純物を含む実施態様１および１６のいずれか１項に記載の組成物から回収するためのプロセスであって、前記プロセスは前記組成物を塩不耐性のクロマトグラフィー媒体と接触させることを含み、前記塩不耐性のクロマトグラフィー媒体は、前記ウイルス生成物を１０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率で溶出することができる、プロセス。
［実施態様２７］
実施態様１乃至３、６および７のいずれか１項に記載のウイルス生成物を、実施態様１および４乃至７のいずれか１項に記載の前記生成物および生成物関連不純物を含む実施態様１および１６のいずれか１項に記載の組成物から回収するためのプロセスであって、前記プロセスが、前記組成物を膜またはシートの形態のクロマトグラフィー媒体と接触させることを含み、前記組成物が１または複数の前記膜またはシートおよび所望により１または複数のフリットまたはその他のスペーサー材料を含むホルダーを通過し、
前記組成物が、（ａ）前記１または複数の膜／シートを通る前記経路長が２ｍｍ未満であり、または（ｂ）膜、シート、フリットおよびその他のスペーサー材料を通る前記総経路長が５０ｍｍ未満であるように前記ホルダーを通過する、プロセス。
［実施態様２８］
実施態様１乃至３、６および７のいずれか１項に記載のウイルス生成物を、実施態様１および４乃至７のいずれか１項に記載の前記生成物および生成物関連不純物を含む実施態様１および１６のいずれか１項に記載の組成物から回収するためのプロセスであって、前記プロセスが、前記組成物を膜またはシートの形態のクロマトグラフィー媒体と接触させることを含み、前記組成物が１または複数の前記膜またはシートおよび所望により１または複数のフリットまたはその他のスペーサー材料を含むホルダーを通過し、
前記組成物が１分以下の期間クロマトグラフィー媒体と接触する、プロセス。
［実施態様２９］
前記生成物関連不純物が二次生成物として回収される、実施態様１乃至２８のいずれか１項に記載のプロセス。
［実施態様３０］
ウイルス生成物を前記生成物および非生成物関連不純物を含む組成物から回収するためのプロセスであって、組成物を、１または複数の高分子ナノファイバーを含む官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させることを含み、
前記ウイルス生成物は、複数のウイルス、ウイルス粒子／ビリオン、ウイルスコア、膜が除去されたウイルス、１または複数の外膜が除去されかつ／またはカプシドが除去されたウイルスコア、またはプロウイルスを含み、その各々は１または複数のポリヌクレオチドを含有し、かつ
前記非生成物関連不純物は、細胞および／または細胞成分、例えば脂質、宿主細胞タンパク質および／または宿主細胞増殖培地のその他の構成要素、例えばタンパク質および／または糖などを含む、プロセス。
［実施態様３１］
実施態様１乃至３０のいずれか１項に記載のプロセスによって得ることができるかまたは得られるウイルス生成物。
［実施態様３２］
実施態様１乃至２９のいずれか１項に記載のプロセスによって得ることができるかまたは得られる生成物関連不純物。
［実施態様３３］
実施態様３１に記載のウイルス生成物を製薬上許容される担体または希釈剤とともに含む組成物。
［実施態様３４］
実施態様３２に記載の生成物関連不純物を製薬上許容される担体または希釈剤とともに含む組成物。
［実施態様３５］
微生物治療、ワクチン接種または遺伝子治療のプロセスであって、そのような治療を必要とする患者に有効量の実施態様３１に記載のウイルス生成物または実施態様３３に記載の組成物を投与することを含む方法。
［実施態様３６］
微生物治療、ワクチン接種または遺伝子治療の方法で使用するための、実施態様３１に記載のウイルス生成物または実施態様３３に記載の組成物。
［実施態様３７］
ポリヌクレオチドを細胞に挿入するエクスビボ法であって、前記細胞を実施態様３１に記載のウイルス生成物と接触させることを含む、方法。
［実施態様３８］
実施態様３７に記載の方法によって得られるかまたは得ることのできる細胞。
［実施態様３９］
実施態様３８に記載の１または複数の細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む治療方法。
［実施態様４０］
治療によってヒトまたは動物の体を治療する方法で使用するための、実施態様３８に記載の細胞。
［実施態様４１］
癌を治療する際に使用するための、実施態様３８に記載の細胞。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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