(57)【要約】  本発明は、リンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物を１以上使用して、癌を処置する方法に関する。より具体的に、ここに記載する発明は、骨髄由来サプレッサー細胞を標的化するために、リンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物を１以上使用して、癌を処置する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む、葉酸受容体陰性癌を処置する方法であって、ここで、骨髄由来サプレッサー細胞が阻害されまたは枯渇されるものである、方法。
【請求項２】
骨髄由来サプレッサー細胞を枯渇させまたは阻害するために宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む、葉酸受容体陰性癌を処置する方法。
【請求項３】
骨髄由来サプレッサー細胞が癌にあるときの宿主動物における葉酸受容体陰性癌を処置する方法であって、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与し、骨髄由来サプレッサー細胞を有する癌を処置することを含む、方法。
【請求項４】
宿主動物の癌において骨髄由来サプレッサー細胞の存在を確認し、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む、癌を処置する方法。
【請求項５】
宿主動物における癌を処置する方法であって、骨髄由来サプレッサー細胞を阻害または枯渇させるために、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項６】
宿主動物における骨髄由来サプレッサー細胞をターゲティングする方法であって、骨髄由来サプレッサー細胞を標的とするために、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療または診断有効量を投与することを含む、方法。
【請求項７】
癌が葉酸受容体陰性である、請求項４〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
癌が葉酸受容体陽性である、請求項４〜６の何れかに記載の方法。
【請求項９】
葉酸受容体結合リガンドが葉酸受容体βに特異的であり、葉酸受容体結合リガンドが骨髄由来サプレッサー細胞上の葉酸受容体βに結合する、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
骨髄由来サプレッサー細胞がＣＤ１１ｂマーカーを有する、請求項１〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
骨髄由来サプレッサー細胞がＧｒ１マーカーを有する、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
癌が非小細胞肺癌、頭頸部癌、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、子宮内膜癌および腎臓癌から選択される、請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
薬物がＣＩ３０７、ＢＥＺ２３５、ワートマニン、ＡＭＴ、ＰＦ−０４６９１５０２、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＢＬＺ９４５、レナリドマイド、ＮＬＧ９１９、５,１５−ＤＰＰ、ピロロベンゾジアゼピン、メトトレキサート、エベロリムス、ツブリシン、ＧＤＣ−０９８０、ＡＳ１５１７４９９、ＢＩＲＢ７９６、ｎ−アセチル−５−ヒドロキシトリプタミンおよび２,４−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミジンから選択される、請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
薬物が微小管阻害剤である、請求項１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
薬物が骨髄由来サプレッサー細胞を死滅させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
薬物がＰＩ３Ｋ阻害剤、ＳＴＡＴ６阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ｉＮＯＳ阻害剤および抗炎症剤から選択される、請求項１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
薬物が骨髄由来サプレッサー細胞を不活化する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
薬物がＴＬＲアゴニストである、請求項１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
ＴＬＲアゴニストがＴＬＲ７アゴニストおよびＴＬＲ９アゴニストから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
薬物が骨髄由来サプレッサー細胞を初期化(reprogram)する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
薬物がツブリシンである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２２】
薬物がＰＩ３Ｋ阻害剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
薬物がＧＤＣ−０９８０、ワートマニンおよびＰＦ−０４６９１５０２から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
薬物がＳＴＡＴ６阻害剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
薬物がＡＳ１５１７４９９である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
薬物がＭＡＰＫ阻害剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
薬物がＢＩＲＢ７９６である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
薬物がｉＮＯＳ阻害剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
薬物がＡＭＴである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
薬物が抗炎症剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
薬物がメトトレキサートである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
薬物がＣＩ３０７、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＴＬＲ７Ａから選択される、請求項１８〜２０の何れかに記載の方法。
【請求項３３】
１を超える化合物が投与され、化合物が異なる薬物を含む、請求項１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
異なる薬物がＴＬＲ７アゴニストおよびＰＩ３Ｋ阻害剤である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
１以上の化合物が投与され、非コンジュゲート薬物も投与される、請求項１〜３２の何れかに記載の方法。
【請求項３６】
化合物における薬物がＴＬＲ７アゴニストであり、非コンジュゲート薬物がＰＩ３Ｋ阻害剤である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
化合物が式
【化１】
2019519524.tif 000038
で表される、請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項３８】
化合物が式
【化２】
2019519524.tif 000039
で表される、請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項３９】
化合物が式
【化３】
2019519524.tif 000040
で表される、請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項４０】
化合物が式
【化４】
2019519524.tif 000041
で表される、請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項４１】
１以上の化合物または１以上の化合物の何れかの薬学的に許容される塩が宿主動物に投与される、請求項１〜４０の何れかに記載の方法。
【請求項４２】
投与が非経腸投与形態である、請求項１〜４１の何れかに記載の方法。
【請求項４３】
非経腸投与剤形が皮内投与剤形、皮下投与剤形、筋肉内投与剤形、腹腔内投与剤形、静脈内投与剤形および髄腔内投与剤形から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
治療有効量または診断有効量が約０.５mg／ｍ２〜約６.０mg／ｍ２である、請求項１〜４３の何れかに記載の方法。
【請求項４５】
治療有効量または診断有効量が約０.５mg／ｍ２〜約４.０mg／ｍ２である、請求項１〜４４の何れかに記載の方法。
【請求項４６】
治療有効量または診断有効量が約０.５mg／ｍ２〜約２.０mg／ｍ２である、請求項１〜４５の何れかに記載の方法。
【請求項４７】
癌が葉酸受容体陰性であり、癌が結腸癌、肺癌、前立腺癌および乳癌から選択される、請求項１〜７または９〜４６の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月２５日出願の米国仮出願６２／３４１,５８７に基づく優先権を、35 U.S.C. § 119(e)の下に主張し、それを全体として引用により本明細書に包含させる。
【０００２】
発明の分野
ここに記載する発明は、リンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物を１以上使用して、癌を処置する方法に関する。より具体的に、ここに記載する発明は、骨髄由来サプレッサー細胞を標的とするようにリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物を１以上使用して、癌を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景および要約
放射線療法、化学療法およびホルモン療法などの抗癌テクノロジーの顕著な進歩にもかかわらず、米国で癌はなお心疾患に続く死亡原因の第２位のままである。ほとんどの場合、癌は、マイトマイシン、パクリタキセルおよびカンプトテシンなどの高度に強力な薬物を利用する化学療法で処置される。多くの場合、これらの化学療法剤は用量反応性効果を示し、腫瘍阻害は薬物用量に比例する。それ故に、積極的投与レジメンが新生物処置に使用されているが、高用量化学療法は癌細胞に対する乏しい選択性および正常細胞への毒性により妨げられる。腫瘍特異性の欠如は、化学療法が乗り越える必要がある多くの障害の１つである。
【０００４】
現在の化学療法の限界の１つの解決は、極めて高い特異性を有する抗癌剤の有効な濃度での送達である。この目標に到達するために、相当な努力が抗癌薬物をホルモン、抗体およびビタミンにコンジュゲートすることによる、腫瘍選択的薬物の開発に向かっている。例えば、低分子量ビタミン、葉酸および他の葉酸受容体結合リガンドは、葉酸受容体陽性癌へのターゲティング剤として特に有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
葉酸は、ビタミンＢ群のメンバーであり、核酸およびアミノ酸の生合成に参加することにより、細胞生存に必須の役割を有する。この必須ビタミンはまた葉酸受容体陽性癌細胞にターゲティングすることにより、コンジュゲート抗癌薬物の特異性を増強する、高親和性リガンドでもある。葉酸受容体(ＦＲ)が、９０％を超える非粘液性卵巣癌で上方制御されていることが判明している。葉酸受容体はまた腎臓、脳、肺および乳房の癌でも高〜中程度レベルで見られている。対照的に、葉酸受容体は大部分の正常組織に低レベルで存在し、癌細胞を選択的にターゲティングする機構をもたらすことが報告されている。葉酸受容体は極めて高い特異性で薬剤を腫瘍組織に送達するのに使用できるが、葉酸受容体を全く発現しないか、所望の特異性を提供するには不十分な数で発現する多数の癌がある。それ故に、このような葉酸受容体陰性癌の処置のための治療剤の開発の必要性がある。
【０００６】
骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)は腫瘍と関連し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＤＣマクロファージおよびＮＫＴ細胞などの細胞の抑制により、腫瘍環境において免疫抑制を増強し得る。それ故に、ＭＤＳＣは腫瘍増殖、血管形成および転移を促進し得る。腫瘍環境におけるこれらの細胞の豊富さが、癌患者生存と負に相関する。それ故に、ＭＤＳＣを枯渇させる治療剤は有用である。
【０００７】
出願人らは、葉酸受容体を発現するまたは十分な数で葉酸受容体を発現しないまたは全く発現しない腫瘍が、ＭＤＳＣが葉酸受容体βを発現するため、薬物をＭＤＳＣにターゲティングすることにより処置し得ることを発見した。それ故に、リンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを使用してＭＤＳＣをターゲティングすることにより癌を処置する方法がここに記載される。ＭＤＳＣは、癌が葉酸受容体を発現しているか否かに関わりなく、ＭＤＳＣを枯渇させまたは阻害するためおよび癌を有する宿主動物を処置するために、薬物をＭＤＳＣに送達するためのターゲティングリガンドとして葉酸を使用することにより、標的化され得る。従って、ここに記載する方法を使用して、葉酸受容体を発現しない癌および葉酸受容体を発現する癌が処置され得ることが理解される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ある実施態様において、葉酸受容体陰性癌を処置するための方法が提供される。該方法は、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含み、ここで、骨髄由来サプレッサー細胞を阻害しまたは枯渇させる。
【０００９】
他の実施態様において、葉酸受容体陰性癌を処置するための方法が提供される。該方法は、宿主動物に、骨髄由来サプレッサー細胞を枯渇させまたは阻害するためのリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む。
【００１０】
さらに他の実施態様において、骨髄由来サプレッサー細胞が癌にあるときの、宿主動物における葉酸受容体陰性癌を処置するための方法が提供され、該方法は、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与し、骨髄由来サプレッサー細胞を有する癌を処置することを含む。
【００１１】
なお他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、宿主動物の癌における骨髄由来サプレッサー細胞の存在を確認し、該宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む。
【００１２】
他の説明的実施態様において、宿主動物における癌を処置する方法が提供される。該方法は、宿主動物に、骨髄由来サプレッサー細胞を阻害または枯渇させるためのリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む。
【００１３】
他の実施態様において、宿主動物における骨髄由来サプレッサー細胞をターゲティングする方法が提供される。該方法は、宿主動物に、骨髄由来サプレッサー細胞を標的とするためのリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療または診断有効量を投与することを含む。
【００１４】
本発明のさらなる説明的および非限定的実施態様を、次の番号付けした条項に記載する。次の条項の組み合わせの全てが、ここに記載する発明のさらなる実施態様と解釈される。これらの実施態様と、本明細書の説明的実施態様の詳細な記載の章に記載する実施態様の全ての適用可能な組み合わせも、本発明の実施態様である。
【００１５】
１. 宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む、葉酸受容体陰性癌を処置する方法であって、ここで、骨髄由来サプレッサー細胞を阻害または枯渇させる、方法。
【００１６】
２. 骨髄由来サプレッサー細胞を枯渇させまたは阻害するために宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む、葉酸受容体陰性癌を処置する方法。
【００１７】
３. 骨髄由来サプレッサー細胞が癌にあるときの宿主動物における葉酸受容体陰性癌を処置する方法であって、宿主動物に、リンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与し、骨髄由来サプレッサー細胞を有する癌を処置することを含む、方法。
【００１８】
４. 宿主動物の癌において骨髄由来サプレッサー細胞の存在を確認し、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む、癌を処置する方法。
【００１９】
５. 宿主動物における癌を処置する方法であって、宿主動物に、骨髄由来サプレッサー細胞を阻害または枯渇させるためのリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む、方法。
【００２０】
６. 宿主動物における骨髄由来サプレッサー細胞をターゲティングする方法であって、宿主動物に、骨髄由来サプレッサー細胞を標的とするためのリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療または診断有効量を投与することを含む、方法。
【００２１】
７. 癌が葉酸受容体陰性である、項４〜６の何れかに記載の方法。
【００２２】
８. 癌が葉酸受容体陽性である、項４〜６の何れかに記載の方法。
【００２３】
９. 葉酸受容体結合リガンドが葉酸受容体βに特異的であり、葉酸受容体結合リガンドが骨髄由来サプレッサー細胞上の葉酸受容体βに結合する、項１〜８の何れかに記載の方法。
【００２４】
１０. 骨髄由来サプレッサー細胞がＣＤ１１ｂマーカーを有する、項１〜９の何れかに記載の方法。
【００２５】
１１. 骨髄由来サプレッサー細胞がＧｒ１マーカーを有する、項１〜１０の何れかに記載の方法。
【００２６】
１２. 癌が非小細胞肺癌、頭頸部癌、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、子宮内膜癌および腎臓癌から選択される、項１〜１１の何れかに記載の方法。
【００２７】
１３. 薬物がＣＩ３０７、ＢＥＺ２３５、ワートマニン、ＡＭＴ、ＰＦ−０４６９１５０２、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＢＬＺ９４５、レナリドマイド、ＮＬＧ９１９、５,１５−ＤＰＰ、ピロロベンゾジアゼピン、メトトレキサート、エベロリムス、ツブリシン、ＧＤＣ−０９８０、ＡＳ１５１７４９９、ＢＩＲＢ７９６、ｎ−アセチル−５−ヒドロキシトリプタミンおよび２,４−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミジンから選択される、項１〜１２の何れかに記載の方法。
【００２８】
１４. 薬物が微小管阻害剤である、項１〜１３の何れかに記載の方法。
【００２９】
１５. 薬物が骨髄由来サプレッサー細胞を死滅させる、項１４に記載の方法。
【００３０】
１６. 薬物がＰＩ３Ｋ阻害剤、ＳＴＡＴ６阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ｉＮＯＳ阻害剤および抗炎症剤から選択される、項１〜１３の何れかに記載の方法。
【００３１】
１７. 薬物が骨髄由来サプレッサー細胞を不活化する、項１６に記載の方法。
【００３２】
１８. 薬物がＴＬＲアゴニストである、項１〜１３の何れかに記載の方法。
【００３３】
１９. ＴＬＲアゴニストがＴＬＲ７アゴニストおよびＴＬＲ９アゴニストから選択される、項１８に記載の方法。
【００３４】
２０. 薬物が骨髄由来サプレッサー細胞を初期化(reprogram)する、項１８または１９に記載の方法。
【００３５】
２１. 薬物がツブリシンである、項１４または１５に記載の方法。
【００３６】
２２. 薬物がＰＩ３Ｋ阻害剤である、項１６に記載の方法。
【００３７】
２３. 薬物がＧＤＣ−０９８０、ワートマニンおよびＰＦ−０４６９１５０２から選択される、項２２に記載の方法。
【００３８】
２４. 薬物がＳＴＡＴ６阻害剤である、項１６に記載の方法。
【００３９】
２５. 薬物がＡＳ１５１７４９９である、項２４に記載の方法。
【００４０】
２６. 薬物がＭＡＰＫ阻害剤である、項１６に記載の方法。
【００４１】
２７. 薬物がＢＩＲＢ７９６である、項２６に記載の方法。
【００４２】
２８. 薬物がｉＮＯＳ阻害剤である、項１６に記載の方法。
【００４３】
２９. 薬物がＡＭＴである、項２８に記載の方法。
【００４４】
３０. 薬物が抗炎症剤である、項１６に記載の方法。
【００４５】
３１. 薬物がメトトレキサートである、項３０に記載の方法。
【００４６】
３２. 薬物がＣＩ３０７、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＴＬＲ７Ａから選択される、項１８〜２０の何れかに記載の方法。
【００４７】
３３. １を超える化合物が投与され、化合物が異なる薬物を含む、項１〜１３の何れかに記載の方法。
【００４８】
３４. 異なる薬物がＴＬＲ７アゴニストおよびＰＩ３Ｋ阻害剤である、項３３に記載の方法。
【００４９】
３５. １以上の化合物が投与され、非コンジュゲート薬物も投与される、項１〜３２の何れかに記載の方法。
【００５０】
３６. 化合物における薬物がＴＬＲ７アゴニストであり、非コンジュゲート薬物がＰＩ３Ｋ阻害剤である、項３５に記載の方法。
【００５１】
３７. 化合物が式
【化１】
2019519524.tif 000003
で表される、項１〜１２の何れかに記載の方法。
【００５２】
３８. 化合物が式
【化２】
2019519524.tif 000004
で表される、項１〜１２の何れかに記載の方法。
【００５３】
３９. 化合物が式
【化３】
2019519524.tif 000005
で表される、項１〜１２の何れかに記載の方法。
【００５４】
４０. 化合物が式
【化４】
2019519524.tif 000006
で表される、項１〜１２の何れかに記載の方法。
【００５５】
４１. １以上の化合物または１以上の化合物の何れかの薬学的に許容される塩が宿主動物に投与される、項１〜４０の何れかに記載の方法。
【００５６】
４２. 投与が非経腸投与剤形で行われる、項１〜４１の何れかに記載の方法。
【００５７】
４３. 非経腸投与剤形が皮内投与剤形、皮下投与剤形、筋肉内投与剤形、腹腔内投与剤形、静脈内投与剤形および髄腔内投与剤形から選択される、項４２に記載の方法。
【００５８】
４４. 治療有効量または診断有効量が約０.５mg／ｍ２〜約６.０mg／ｍ２である、項１〜４３の何れかに記載の方法。
【００５９】
４５. 治療有効量または診断有効量が約０.５mg／ｍ２〜約４.０mg／ｍ２である、項１〜４４の何れかに記載の方法。
【００６０】
４６. 治療有効量または診断有効量が約０.５mg／ｍ２〜約２.０mg／ｍ２である、項１〜４５の何れかに記載の方法。
【００６１】
４７. 癌が葉酸受容体陰性であり、癌が結腸癌、肺癌、前立腺癌および乳癌から選択される、項１〜７または９〜４６の何れかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、種々のヒト腫瘍におけるＦＲ−α発現のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す：肝臓癌(図１ａ)；頭頸部癌(図１ｂ)；胸腺腫(図１ｃ)。
【００６３】
【図２】図２は、種々のヒト腫瘍におけるＦＲ−β発現のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す：肝臓癌(図２ａ)；頭頸部癌(図２ｂ)；胸腺腫(図２ｃ)。
【００６４】
【図３】図３は、種々のヒト腫瘍におけるＦＲ−β発現のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す：膀胱癌(図３ａ)；脳の癌(図３ｂ)；肝臓癌(図３ｃ)。
【００６５】
【図４】図４は、種々のヒト腫瘍におけるＦＲ−β発現のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す：腎臓癌(図４ａ)；皮膚癌(図４ｂ)；胸腺癌(図４ｃ)。
【００６６】
【図５】図５は、マウスＭＤＳＣ(ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋)におけるＦＲ−β発現を示す。図５ａ：生存細胞でゲーティングしたＭＤＳＣ集団；図５ｂ：ゲーティングしたＭＤＳＣ集団のＦＲ−β発現。
【００６７】
【図６】図６は、マウスＴＡＭ(ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０)におけるＦＲ−β発現を示す。図６ａ：生存細胞でゲーティングしたＴＡＭ集団；図６ｂ：ゲーティングしたＴＡＭ集団のＦＲ−β発現。
【００６８】
【図７】図７は、種々の薬物と共培養後のＴＡＭ／ＭＤＳＣによるインビトロアルギナーゼ産生を示す。図７ａ：(●)ＣＬ３０７；(■)ＢＥＺ２３５；(▲)ワートマニン；(▼)ＡＭＴ。図７ｂ：(◆)ＣｐＧ；(○)ＢＩＺ９４５；(□)レナリドマイド；(△)ＮＬＧ９１９。図７ｃ：(▽)Ｎ−アセチル−５−ヒドロキシプタミン；(◇)２,４−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミジン；(■)５,１５−ＤＰＰ；(×)メトトレキサート。図７ｄ：(＋)エベロリムス；
【表１】
2019519524.tif 000007
【００６９】
【図８】図８は、種々の薬物と共培養後のＴＡＭ／ＭＤＳＣによるインビトロＩＬ−１０産生を示す。図８ａ：(■)ＢＥＺ２３５；(▲)ワートマニン；(▼)ＡＭＴ。図８ｂ：(○)ＢＩＺ９４５；(□)レナリドマイド；(△)ＮＬＧ９１９。図８ｃ：(▽)Ｎ−アセチル−５−ヒドロキシプタミン；(◇)２,４−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミジン；(■)５,１５−ＤＰＰ；(×)メトトレキサート。図８ｄ：
【表２】
2019519524.tif 000008
【００７０】
【図９】図９は、種々の薬物と共培養後のＴＡＭ／ＭＤＳＣによるインビトロ一酸化窒素産生を示す。図９ａ：(■)ＢＥＺ２３５；(▲)ワートマニン；(▼)ＡＭＴ。図９ｂ：(○)ＢＩＺ９４５；(□)レナリドマイド；(△)ＮＬＧ９１９。図９ｃ：(▽)Ｎ−アセチル−５−ヒドロキシプタミン；(◇)２,４−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミジン；(■)５,１５−ＤＰＰ；(×)メトトレキサート。図９ｄ：
【表３】
2019519524.tif 000009
【００７１】
【図１０】図１０は、図１０ａにおいて、種々の濃度で、２種のＴＬＲアゴニスト、(●)ＣｐＧ(ＴＬＲ９アゴニスト)および(◆)ＣＬ３０７(ＴＬＲ７アゴニスト)と共培養後のＴＡＭ／ＭＤＳＣによる一酸化窒素産生を示す。点線は、未処置対照からの一酸化窒素レベル；図１０ｂ、種々のＴＬＲアゴニスト：レシキモド(ＴＬＲ７／８アゴニスト)、ＣｐＧ  ＯＤＮ(ＴＬＲ９アゴニスト)、ポリＩＣ(ＴＬＲ３アゴニスト)、ザイモサン(ＴＬＲ２アゴニスト)と共培養後のフローサイトメトリーにより測定したＭＤＳＣのＣＤ８６発現を示す。
【００７２】
【図１１】図１１は、２種のＴＬＲ７アゴニスト、(■)ＣＬ３０７および(●)ＴＬＲ７Ａによる、ＴＡＭ／ＭＤＳＣを種々の濃度のこれら２薬物と共培養することによりインビトロで試験したアルギナーゼ(図１１ａ)および一酸化窒素(図１１ｂ)産生を示す。図１１ａの点線は、未処置対照のアルギナーゼレベルを示す。図１１ａの実線は、背景アルギナーゼレベルを示す。
【００７３】
【図１２】図１２は、ＴＡＭ／ＭＤＳＣ機能を効率的に抑制するためのＰＩ３Ｋ阻害剤活性を特定するための、３種のＰＩ３Ｋ阻害剤(ＢＥＺ２３５、ＰＦ−０４６９１５０２およびＧＤＣ−０９８０)と共培養後のＴＡＭ／ＭＤＳＣによるアルギナーゼ産生を示す。
【００７４】
【図１３】図１３は、ＴＡＭ／ＭＤＳＣ機能を効率的に抑制するためのＰＩ３Ｋ阻害剤活性を特定するための、３種のＰＩ３Ｋ阻害剤(ＢＥＺ２３５、ＰＦ−０４６９１５０２およびＧＤＣ−０９８０)と共培養後のＴＡＭ／ＭＤＳＣによるＩＬ−１０産生を示す。
【００７５】
【図１４】図１４は、ＴＡＭ／ＭＤＳＣ機能を効率的に抑制するためのＰＩ３Ｋ阻害剤活性を特定するための、３種のＰＩ３Ｋ阻害剤(ＢＥＺ２３５、ＰＦ−０４６９１５０２およびＧＤＣ−０９８０)と共培養後のＴＡＭ／ＭＤＳＣによる一酸化窒素産生を示す。
【００７６】
【図１５】図１５は、ＴＬＲ７アゴニスト(ＣＬ３０７)およびＰＩ３Ｋ阻害剤(ＢＥＺ２３５)でのＴＡＭ／ＭＤＳＣのインビトロ組み合わせ処置による、アルギナーゼ産生の相乗的曲線を示す；(■)単剤処置、(●)組み合わせ処置。
【００７７】
【図１６】図１６は、４Ｔ１固形腫瘍モデルにおけるＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト(ＦＡ−ＴＬＲ７Ａ)の用量試験を示す。図１６ａは、未処置対照(●)、２nmol処置(■)および５nmol(▲)処置の群からの腫瘍増殖を示す。図１６ｂは、未処置対照(●)、１０nmol(▼)処置および２０nmol(◆)処置の群からの腫瘍増殖を示す。
【００７８】
【図１７】図１７は、図１６に示す４Ｔ１固形腫瘍モデルにおける用量試験の種々の群の動物体重を示す。体重を処置６日目から開始して、連日測定した。図１７ａは、未処置対照(●)、２nmol処置(■)および５nmol(▲)処置の群からの体重を示す。図１７ｂは、未処置対照(●)、１０nmol(▼)処置および２０nmol(◆)処置の群からの体重を示す。
【００７９】
【図１８】図１８は、４Ｔ１固形腫瘍モデルにおけるＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストのインビボ治療試験を示す。図１８ａは、処置開始後連日測定した腫瘍増殖を示し、(●)未処置対照、(■)ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト、(○)競合ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストである。図１８ｂは、処置開始後連日測定した動物体重を示し、(●)未処置対照、(■)ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト、(○)競合ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストである。
【００８０】
【図１９】図１９は、４Ｔ１固形腫瘍モデルにおけるＦＡ−ツブリシンのインビボ治療試験を示す。図１９ａは処置開始後連日測定した腫瘍増殖を示し、(●)未処置対照、(▲)ＦＡ−ツブリシン、(□)競合ＦＡ−ツブリシンである。図１９ｂは処置開始後連日測定した動物体重を示し、(●)未処置対照、(▲)ＦＡ−ツブリシン、(□)競合ＦＡ−ツブリシンである。
【００８１】
【図２０】図２０は、４Ｔ１固形腫瘍モデルにおけるＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤のインビボ治療試験を示す。図２０ａは、処置開始後連日測定した腫瘍増殖を示し、(●)未処置対照、(▼)ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤、(△)競合ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤である。図２０ｂは、処置開始後連日測定した動物体重を示し、(●)未処置対照、(▼)ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤、(△)競合ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤である。
【００８２】
【図２１】図２１は、４Ｔ１固形腫瘍モデルにおけるＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストと非標的化ＰＩ３Ｋ阻害剤(ＢＥＺ２３５)の組み合わせ処置のインビボ治療試験を示す。図２１ａは処置開始後連日測定した腫瘍増殖を示し、(●)未処置対照、(◆)組み合わせ、(▽)競合組み合わせである。図２１ｂは処置開始後連日測定した動物体重を示し、(●)未処置対照、(◆)組み合わせ、(▽)競合組み合わせである。
【００８３】
【図２２】図２２は、４Ｔ１固形腫瘍モデルにおけるＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストおよび非標的化ＰＩ３Ｋ阻害剤(ＢＥＺ２３５)のインビボ治療試験を示す。図２２ａは処置開始後連日測定した腫瘍増殖を示し、(●)未処置対照、(■)ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト、(◇)ＰＩ３Ｋ阻害剤である。図２２ｂは処置開始後連日測定した動物体重を示し、(●)未処置対照、(■)ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト、(◇)ＰＩ３Ｋ阻害剤である。
【００８４】
【図２３】図２３は、未処置対照、ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト、ＦＡ−ツブリシン、ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストと非標的化ＰＩ３Ｋ阻害剤(ＢＥＺ２３５)の組み合わせの各々の治療群の処置最終日での平均腫瘍体積を示す。＊および＊＊＊は、統計的に有意な結果を示す。
【００８５】
【図２４】図２４は、未処置対照、ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト(図２４ａ)、ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤(図２４ｃ)、ＦＡ−ツブリシン(図２４ｂ)および組み合わせ(図２４ｄ)の群ならびに競合群で試験した、Ｆ４／８０＋マクロファージ上のアルギナーゼの細胞内染色を示す。＊は、統計的に有意な結果を示し、ｎｓは、統計的に有意ではない結果を示す。
【００８６】
【図２５】図２５は、未処置対照、ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト(図２５ａ)、ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤(図２５ｃ)、ＦＡ−ツブリシン(図２５ｂ)および組み合わせ(図２５ｄ)の群ならびに競合群で試験した、Ｍ１対Ｍ２マクロファージ比(Ｆ４／８０＋ＣＤ８６＋：Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋)を示す。＊は、統計的に有意な結果を示し、ｎｓは、統計的に有意ではない結果を示す。
【００８７】
【図２６】図２６は、未処置対照、ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト(図２６ａ)、ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤(図２６ｃ)、ＦＡ−ツブリシン(図２６ｂ)および組み合わせ(図２６ｄ)の群ならびに競合群で試験した、ＭＤＳＣ集団(ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋)を示す。＊は、統計的に有意な結果を示し、ｎｓは、統計的に有意ではない結果を示す。
【００８８】
【図２７】図２７は、未処置対照、ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト、ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＦＡ−ツブリシンの群および組み合わせ群における４Ｔ１固形腫瘍から単離した生存細胞で試験した、ＣＤ４(図２７ａ)およびＣＤ８(図２７ｂ)Ｔ細胞集団のパーセンテージを示す。
【００８９】
【図２８】図２８は、ＩＬ−１０産生減少による、選択薬物に応答したインビトロ誘発ヒトＭＤＳＣを示す。(●)ビンブラスチン；(■)ＧＤＣ０９８０；(▼)ＢＥＺ２３５；(◆)ツブリシン。
【００９０】
【図２９】図２９Ａ〜Ｂは、３群の薬物で処置した後のＭＤＳＣによる、ヒトＴ細胞抑制の阻害を示す。図２９Ａは、０.１μMの薬物で処置後の結果を示す；図２９Ｂは、１.０μMの薬物で処置後の結果を示す。
【００９１】
【図３０】図３０Ａ〜Ｃは、３群の薬物に対する４Ｔ１細胞の耐性を示す。４Ｔ１細胞を、３薬物と３６時間培養した。細胞毒性をＬＤＨアッセイにより評価した。図３０Ａは、種々の濃度でのＴＬＲアゴニストの結果を示す；図３０Ｂは、種々の濃度でのＰＩ３Ｋ阻害剤の結果を示す；図３０Ｃは、種々の濃度でのツブリシンの結果を示す。
【００９２】
【図３１】図３１Ａ〜Ｃは、３群のＦＡ−コンジュゲートに対する４Ｔ１細胞の耐性を示す。４Ｔ１細胞を、ＦＡ−コンジュゲートと３時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、３６時間培地で培養した。図３１Ａは、種々の濃度でのＴＬＲアゴニストコンジュゲートの結果を示す；図３１Ｂは、種々の濃度でのＰＩ３Ｋ阻害剤コンジュゲートの結果を示す；図３１Ｃは、種々の濃度でのツブリシンコンジュゲートの結果を示す。
【００９３】
【図３２】図３２は、ＦＡ−コンジュゲートで２週間の連続処置による、４Ｔ１の腫瘍増殖を示す。(●)対照マウス１；(■)対照マウス２；(▲)対照マウス３；(○)ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤コンジュゲートマウス１；(□)ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤コンジュゲートマウス２；(△)ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤コンジュゲートマウス３；
【表４】
2019519524.tif 000010
【００９４】
【図３３】図３３は、葉酸薬物コンジュゲートで２週間連続処置後の４Ｔ１腫瘍からのＭＤＳＣおよびＴＡＭにおいて測定したアルギナーゼレベルである。
【表５】
2019519524.tif 000011
【００９５】
【図３４】図３４は、２週間(７日／週)３群のＦＡ−コンジュゲートで処置した４Ｔ１固形腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおける肺転移評価を示す。肺を試験の最後に摘出し、転移を実施例１５に記載する標準法により評価した。
【００９６】
【図３５】図３５は、ＭＤＳＣ／ＴＡＭターゲティングによる４Ｔ１腫瘍モデルにおける肺転移の概要を示す。
【００９７】
【図３６】図３６は、腫瘍増殖生存試験のモニタリングを示す：腫瘍体積を、５日目に腫瘍を外科的に摘出するまで３種の葉酸−薬物コンジュゲートの生存試験で４Ｔ１においてモニターした。(●)対照；(○)ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストコンジュゲート；(△)ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤コンジュゲート；(□)ＦＡ−ツブリシンコンジュゲート。
【００９８】
【図３７】図３７は、４Ｔ１固形腫瘍を有するマウスの生存曲線を示す(ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストについてｎ＝２、ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤および疾患対照についてｎ＝３、ＦＡ−ツブリシンについてｎ＝４)。(■)対照；(△)ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストコンジュゲート；(○)ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤コンジュゲート；(□)ＦＡ−ツブリシンコンジュゲート。４１日時点で、１００％は対照以外の全記号を含む。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
説明的実施態様の詳細な記載
ここに記載する発明の各実施態様は、適用可能であれば、任意の他のここに記載する実施態様と組み合わせ得ることが理解される。例えば、概要および／またはここに記載する番号付けした条項における実施態様の何れかまたは任意の適用可能なそれらの組み合わせを、本特許明細書の説明的実施態様の詳細な記載の章において記載する実施態様の何れかと組み合わせ得る。
【０１００】
ここで記載する用語“骨髄由来サプレッサー細胞”(ＭＤＳＣ)は、癌、例えば、腫瘍の微小環境に存在し、免疫抑制性であり、マーカーＣＤ１１ｂおよびＧｒ１の１以上を有する細胞をいう。ＭＤＳＣは、当分野で知られる方法により、例えば、ＣＤ１１ｂおよびＧｒ１などのＭＤＳＣに特異的なマーカーを使用するフローサイトメトリーにより、同定され得る。
【０１０１】
ここで使用する語句“ここで、骨髄由来サプレッサー細胞は癌にある”は、一般に癌(例えば、腫瘍)の微小環境に存在するまたは、例えば、癌性組織(例えば、腫瘍組織)に見られる、ＭＤＳＣをいう。
【０１０２】
ここで記載する用語“投与”は、一般に、経口(ｐｏ)、静脈内(ｉｖ)、筋肉内(ｉｍ)、皮下(ｓｃ)、経皮、吸入、バッカル、眼、舌下、膣、直腸および類似投与経路を含むが、これらに限定されない、ここに記載する化合物の宿主動物への導入のための任意かつ全ての手段をいう。ここに記載する化合物を、１以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤、添加物および／または媒体およびそれらの組み合わせを含む、単位投与剤形および／または組成物で投与し得る。
【０１０３】
ここで記載する用語“組成物”は、一般にここに記載する化合物を含む、１を超える成分を含む、任意の製品をいう。ここに記載する組成物は、ここに記載する単離化合物または塩、溶液、水和物、溶媒和物およびここに記載する化合物の他の形態から製造され得ることが理解される。ヒドロキシ、アミノおよび類似基などのある官能基は水および／または種々の溶媒と、化合物の種々の物理的形態で複合体を形成し得ることが認識される。組成物が、ここに記載する化合物の種々の非晶質、非非晶質、部分結晶、結晶および／または他の物理的形態から製造され得ることも理解される。組成物がここに記載する化合物の種々の水和物および／または溶媒和物から製造され得ることも理解される。従って、ここに記載する化合物に言及するこのような医薬組成物は、ここに記載する化合物の種々の物理的形態および／または溶媒和物または水和物形態の各々または任意の組み合わせまたは個々の形態を含むことが理解される。
【０１０４】
出願人らは、葉酸受容体を発現するまたは葉酸受容体を十分な数で発現しないもしくは全く発現しない腫瘍が、ＭＤＳＣが葉酸受容体βを発現するため、ＭＤＳＣに薬物をターゲティングすることにより処置し得ることを発見した。それ故に、リンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを使用してＭＤＳＣをターゲティングすることにより癌を処置する方法がここに記載される。癌が葉酸受容体を発現するか否かに関わらず、ＭＤＳＣを枯渇させまたは阻害するためおよび癌を有する宿主動物を処置するために、薬物をＭＤＳＣに送達するためのターゲティングリガンドとして葉酸を使用することにより、ＭＤＳＣが標的化され得る。従って、ここに記載する方法が葉酸受容体を発現しない癌、ならびに葉酸受容体を発現する癌の処置に使用され得ることが理解される。
【０１０５】
ある実施態様において、葉酸受容体陰性癌を処置するための方法が提供される。該方法は、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含み、ここで、骨髄由来サプレッサー細胞を阻害または枯渇させる。
【０１０６】
他の実施態様において、葉酸受容体陰性癌を処置するための方法が提供される。該方法は、骨髄由来サプレッサー細胞を枯渇させまたは阻害するために、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む。
【０１０７】
さらに他の実施態様において、骨髄由来サプレッサー細胞が癌にあるときの、宿主動物における葉酸受容体陰性癌を処置するための方法が提供され、該方法は、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与し、該骨髄由来サプレッサー細胞を有する葉酸受容体陰性癌を処置することを含む。
【０１０８】
なお他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、宿主動物の癌における骨髄由来サプレッサー細胞の存在を確認し、該宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む。
【０１０９】
他の説明的実施態様において、宿主動物における癌を処置する方法が提供される。該方法は、骨髄由来サプレッサー細胞を阻害または枯渇させるために、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む。
【０１１０】
他の実施態様において、宿主動物における骨髄由来サプレッサー細胞をターゲティングする方法が提供される。該方法は、宿主動物に、骨髄由来サプレッサー細胞を標的とするためのリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療または診断有効量を投与することを含む。
【０１１１】
本発明のさらなる説明的および非限定的実施態様を、次の番号付けした条項に記載する。
１. 宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む、葉酸受容体陰性癌を処置する方法であって、ここで、骨髄由来サプレッサー細胞を阻害または枯渇させる、方法。
【０１１２】
２. 骨髄由来サプレッサー細胞を枯渇させまたは阻害するために宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む、葉酸受容体陰性癌を処置する方法。
【０１１３】
３. 骨髄由来サプレッサー細胞が癌にあるときの宿主動物における葉酸受容体陰性癌を処置する方法であって、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与し、骨髄由来サプレッサー細胞を有する癌を処置することを含む、方法。
【０１１４】
４. 宿主動物の癌において骨髄由来サプレッサー細胞の存在を確認し、宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む、癌を処置する方法。
【０１１５】
５. 宿主動物における癌を処置する方法であって、宿主動物に、骨髄由来サプレッサー細胞を阻害または枯渇させるためのリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療有効量を投与することを含む、方法。
【０１１６】
６. 宿主動物における骨髄由来サプレッサー細胞をターゲティングする方法であって、宿主動物に、骨髄由来サプレッサー細胞を標的とするためのリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の１以上の治療または診断有効量を投与することを含む、方法。
【０１１７】
７. 癌が葉酸受容体陰性である、項４〜６の何れかに記載の方法。
【０１１８】
８. 癌が葉酸受容体陽性である、項４〜６の何れかに記載の方法。
【０１１９】
９. 葉酸受容体結合リガンドが葉酸受容体βに特異的であり、葉酸受容体結合リガンドが骨髄由来サプレッサー細胞上の葉酸受容体βに結合する、項１〜８の何れかに記載の方法。
【０１２０】
１０. 骨髄由来サプレッサー細胞がＣＤ１１ｂマーカーを有する、項１〜９の何れかに記載の方法。
【０１２１】
１１. 骨髄由来サプレッサー細胞がＧｒ１マーカーを有する、項１〜１０の何れかに記載の方法。
【０１２２】
１２. 癌が非小細胞性肺癌、頭頸部癌、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、子宮内膜癌および腎臓癌から選択される、項１〜１１の何れかに記載の方法。
【０１２３】
１３. 薬物がＣＩ３０７、ＢＥＺ２３５、ワートマニン、ＡＭＴ、ＰＦ−０４６９１５０２、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＢＬＺ９４５、レナリドマイド、ＮＬＧ９１９、５,１５−ＤＰＰ、ピロロベンゾジアゼピン、メトトレキサート、エベロリムス、ツブリシン、ＧＤＣ−０９８０、ＡＳ１５１７４９９、ＢＩＲＢ７９６、ｎ−アセチル−５−ヒドロキシトリプタミンおよび２,４−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミジンから選択される、項１〜１２の何れかに記載の方法。
【０１２４】
１４. 薬物が微小管阻害剤である、項１〜１３の何れかに記載の方法。
【０１２５】
１５. 薬物が骨髄由来サプレッサー細胞を死滅させる、項１４に記載の方法。
【０１２６】
１６. 薬物がＰＩ３Ｋ阻害剤、ＳＴＡＴ６阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ｉＮＯＳ阻害剤および抗炎症剤から選択される、項１〜１３の何れかに記載の方法。
【０１２７】
１７. 薬物が骨髄由来サプレッサー細胞を不活化する、項１６に記載の方法。
【０１２８】
１８. 薬物がＴＬＲアゴニストである、項１〜１３の何れかに記載の方法。
【０１２９】
１９. ＴＬＲアゴニストがＴＬＲ７アゴニストおよびＴＬＲ９アゴニストから選択される、項１８に記載の方法。
【０１３０】
２０. 薬物が骨髄由来サプレッサー細胞を初期化する、項１８または１９に記載の方法。
【０１３１】
２１. 薬物がツブリシンである、項１４または１５に記載の方法。
【０１３２】
２２. 薬物がＰＩ３Ｋ阻害剤である、項１６に記載の方法。
【０１３３】
２３. 薬物がＧＤＣ−０９８０、ワートマニンおよびＰＦ−０４６９１５０２から選択される、項２２に記載の方法。
【０１３４】
２４. 薬物がＳＴＡＴ６阻害剤である、項１６に記載の方法。
【０１３５】
２５. 薬物がＡＳ１５１７４９９である、項２４に記載の方法。
【０１３６】
２６. 薬物がＭＡＰＫ阻害剤である、項１６に記載の方法。
【０１３７】
２７. 薬物がＢＩＲＢ７９６である、項２６に記載の方法。
【０１３８】
２８. 薬物がｉＮＯＳ阻害剤である、項１６に記載の方法。
【０１３９】
２９. 薬物がＡＭＴである、項２８に記載の方法。
【０１４０】
３０. 薬物が抗炎症剤である、項１６に記載の方法。
【０１４１】
３１. 薬物がメトトレキサートである、項３０に記載の方法。
【０１４２】
３２. 薬物がＣＩ３０７、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＴＬＲ７Ａから選択される、項１８〜２０の何れかに記載の方法。
【０１４３】
３３. １を超える化合物が投与され、化合物が異なる薬物を含む、項１〜１３の何れかに記載の方法。
【０１４４】
３４. 異なる薬物がＴＬＲ７アゴニストおよびＰＩ３Ｋ阻害剤である、請求項３３に記載の方法。
【０１４５】
３５. １以上の化合物が投与され、非コンジュゲート薬物も投与される、項１〜３２の何れかに記載の方法。
【０１４６】
３６. 化合物における薬物がＴＬＲ７アゴニストであり、非コンジュゲート薬物がＰＩ３Ｋ阻害剤である、項３５に記載の方法。
【０１４７】
３７. 化合物が式
【化５】
2019519524.tif 000012
で表される、項１〜１２の何れかに記載の方法。
【０１４８】
３８. 化合物が式
【化６】
2019519524.tif 000013
で表される、項１〜１２の何れかに記載の方法。
【０１４９】
３９. 化合物が式
【化７】
2019519524.tif 000014
で表される、項１〜１２の何れかに記載の方法。
【０１５０】
４０. 化合物が式
【化８】
2019519524.tif 000015
で表される、項１〜１２の何れかに記載の方法。
【０１５１】
４１. １以上の化合物または１以上の化合物の何れかの薬学的に許容される塩が宿主動物に投与される、項１〜４０の何れかに記載の方法。
【０１５２】
４２. 投与が非経腸投与剤形である、項１〜４１の何れかに記載の方法。
【０１５３】
４３. 非経腸投与剤形が皮内投与剤形、皮下投与剤形、筋肉内投与剤形、腹腔内投与剤形、静脈内投与剤形および髄腔内投与形態から選択される、項４２に記載の方法。
【０１５４】
４４. 治療有効量または診断有効量が約０.５mg／ｍ２〜約６.０mg／ｍ２である、項１〜４３の何れかに記載の方法。
【０１５５】
４５. 治療有効量または診断有効量が約０.５mg／ｍ２〜約４.０mg／ｍ２である、項１〜４４の何れかに記載の方法。
【０１５６】
４６. 治療有効量または診断有効量が約０.５mg／ｍ２〜約２.０mg／ｍ２である、項１〜４５の何れかに記載の方法。
【０１５７】
４７. 癌が葉酸受容体陰性であり、癌が結腸癌、肺癌、前立腺癌および乳癌から選択される、項１〜７または９〜４６の何れかに記載の方法。
【０１５８】
ある実施態様において、ＭＤＳＣの活性を枯渇させまたは阻害するためのＭＤＳＣのターゲティングは、腫瘍増殖の阻害、腫瘍の完全なまたは部分的排除、疾患安定、腫瘍細胞の死滅等の治療効果を宿主動物にもたらし得る。ここで使用するＭＤＳＣの“枯渇”または“阻害”は、ＭＤＳＣの集団の一部または全ての死滅、ＭＤＳＣの活性の阻害または喪失(例えば、ＭＤＳＣが腫瘍組織において血管形成を刺激する能力の低減または喪失)、ＭＤＳＣが腫瘍生存を支持ではなく阻害するようなＭＤＳＣの初期化、ＭＤＳＣ数の増加またはＭＤＳＣ数の減少の阻止または宿主動物に抗癌治療効果をもたらす他の何らかの効果をＭＤＳＣにもたらすことを意味する。
【０１５９】
ここに記載する方法は、このような処置を必要とする癌を有する“宿主動物”の処置に使用する。ある実施態様において、ここに記載する方法を、ヒト臨床医学または獣医学適用のために使用し得る。それ故に、“宿主動物”は、ここに記載する１以上の化合物または葉酸造影剤コンジュゲート(下記)を投与され得て、宿主動物はヒト(例えばヒト患者)でありまたは、獣医学適用の場合、実験動物、農業用動物、家庭用動物または野生動物であり得る。ある態様において、宿主動物はヒト、齧歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスターなど)、ウサギ、サル、チンパンジーなどの実験動物、イヌ、ネコおよびウサギなどの家庭用動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの農業用動物ならびにクマ、パンダ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカおよびクジラなどの捕獲された野生動物であり得る。
【０１６０】
種々の実施態様において、ここに記載する癌は、良性腫瘍および悪性腫瘍を含む腫瘍原性である癌であってよくまたは癌は非腫瘍原性であり得る。ある実施態様において、癌は自然発生的にまたは宿主動物の生殖系列に存在する変異などの過程または体細胞変異により生じ得てまたは癌は化学物質、ウイルスもしくは放射線で誘発され得る。他の実施態様において、ここに記載する発明に適用可能な癌は、癌腫、肉腫、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、鼻咽頭癌、白血病、腺癌および骨髄腫を含むが、これらに限定されない。
【０１６１】
ある態様において、癌は、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫子宮癌、卵巣癌、子宮内膜癌、直腸癌、胃癌、結腸癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵管癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、非小細胞肺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、前立腺癌、胸腺腫、胸腺癌、白血病、リンパ腫、胸膜中皮腫、膀胱癌、バーキットリンパ腫、輸尿管癌、腎臓癌、中枢神経系新生物、脳の癌、下垂体腺腫または食道胃接合部腺癌であり得る。
【０１６２】
ある態様において、癌は、非小細胞肺癌、未分化甲状腺癌、膵管腺癌、頭頸部癌、上皮細胞増殖因子受容体陰性乳癌、中皮腫、成人古典的ホジキンリンパ腫、ぶどう膜黒色腫、神経膠芽腫、腎臓癌、平滑筋肉腫および色素性絨毛結節性滑膜炎からなる群から選択され得る。
【０１６３】
他の実施態様において、癌が非小細胞肺癌、頭頸部癌、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、子宮内膜癌および腎臓癌から選択される。
【０１６４】
他の実施態様において、癌が葉酸受容体陰性であり、癌が結腸癌、肺癌、前立腺癌および乳癌から選択される。関連したＭＤＳＣを有するあらゆる癌を、ここに記載する方法により処置し得る。
【０１６５】
葉酸受容体結合リガンドの一部である“葉酸”の説明的実施態様は、葉酸およびフォリン酸、プテロイルポリグルタミン酸、プテロイル−Ｄ−グルタミン酸ならびにテトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸およびそれらのデアザおよびジデアザ類似体などの葉酸受容体結合プテリジンなどの葉酸の類似体および誘導体を含む。用語“デアザ”および“ジデアザ”類似体は、天然に存在する葉酸構造における１個または２個の窒素原子に置き換った炭素原子を有する、当分野で認識される類似体またはその類似体もしくは誘導体をいう。例えば、デアザ類似体は、葉酸、フォリン酸、プテロイルポリグルタミン酸およびテトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸およびテトラヒドロ葉酸などの葉酸受容体結合プテリジンの１−デアザ、３−デアザ、５−デアザ、８−デアザおよび１０−デアザ類似体を含む。ジデアザ類似体は、例えば、葉酸、フォリン酸、プテロイルポリグルタミン酸およびテトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸およびテトラヒドロ葉酸などの葉酸受容体結合プテリジンの１,５−ジデアザ、５,１０−ジデアザ、８,１０−ジデアザおよび５,８−ジデアザ類似体を含む。本発明のための複合体形成リガンドとして有用な他の葉酸は、葉酸受容体結合類似体アミノプテリン、アメトプテリン(メトトレキサートとしても知られる)、Ｎ１０−メチル葉酸、２−デアミノ−ヒドロキシ葉酸、１−デアザメトプテリンまたは３−デアザメトプテリンなどのデアザ類似体および３’,５’−ジクロロ−４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−メチルプテロイルグルタミン酸(ジクロロメトトレキサート)である。葉酸受容体に結合するさらなる葉酸(例えば、葉酸類似体)が、米国特許出願公開２００５／０２２７９８５および２００４／０２４２５８２に記載され、これらの開示を引用により本明細書に包含させる。葉酸および前記類似体および／または誘導体は、葉酸受容体に結合する能力を考慮して、“ある葉酸”、“該葉酸”または“葉酸群”とも称し、このようなリガンドは、外来分子とコンジュゲートしたとき、葉酸介在エンドサイトーシスを経るなどの膜貫通輸送の増強に有効である。前記はまたここに記載する葉酸受容体結合リガンドにおいて使用し得る。
【０１６６】
ある実施態様において、ここに記載する葉酸受容体結合リガンドを、該化合物をここに記載する方法において使用するために、リンカーを介して薬物に結合させ得る。ＭＤＳＣの枯渇または阻害に適するあらゆる薬物が、ここに記載する方法により使用され得る。ある実施態様において、薬物はＣＩ３０７、ビンブラスチン、ＧＤＣ０９８０、ＢＥＺ２３５、ワートマニン、ＡＭＴ、ＰＦ−０４６９１５０２、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＢＬＺ９４５、レナリドマイド、ＮＬＧ９１９、５,１５−ＤＰＰ、ピロロベンゾジアゼピン、メトトレキサート、エベロリムス、ツブリシン、ＧＤＣ−０９８０、ＡＳ１５１７４９９、ＢＩＲＢ７９６、ｎ−アセチル−５−ヒドロキシトリプタミンおよび２,４−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミジンから選択される。
【０１６７】
ある態様において、薬物は微小管阻害剤であり得る。本実施態様において、薬物は骨髄由来サプレッサー細胞を死滅させることができ、薬物はツブリシンであり得る。
【０１６８】
他の実施態様において、薬物がＰＩ３Ｋ阻害剤、ＳＴＡＴ６阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ｉＮＯＳ阻害剤および抗炎症剤から選択される。本実施態様において、薬物は骨髄由来サプレッサー細胞を不活性化できる。本実施態様において、薬物は、ＧＤＣ−０９８０、ワートマニンおよびＰＦ−０４６９１５０２から選択されるＰＩ３Ｋ阻害剤、ＳＴＡＴ６阻害剤(例えば、ＡＳ１５１７４９９)、ＭＡＰＫ阻害剤(例えば、ＢＩＲＢ７９６)、ｉＮＯＳ阻害剤(例えば、ＡＭＴ)または抗炎症剤(例えば、メトトレキサート)であり得る。
【０１６９】
さらに他の実施態様において、薬物は、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ３アゴニスト(例えば、ポリＩＣ)またはＴＬＲ７／８アゴニスト(例えば、イミキモド)などのＴＬＲアゴニストであり得る。ＴＬＲアゴニストは、例えば、ＣＩ３０７、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびＴＬＲ７Ａから選択され得る。本実施態様において、薬物は、骨髄由来サプレッサー細胞を初期化し得る。
【０１７０】
なお他の実施態様において、薬物は、ＤＮＡアルキル化剤またはＤＮＡ挿入剤(例えばＰＢＤ、プロＰＢＤまたはHoechst染色)、トラベクテジン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ビスホスホネート(例えば、遊離またはリポソーム中の形態)およびアポトーシス促進性ペプチドからなる群から選択され得る。さらに他の実施態様において、薬物は、モノホスホリルリピドＡ(例えば、解毒ＬＰＳ)、ｍＴＯＲ阻害剤(例えば、エベロリムスまたはラパマイシン)、ＰＰＡＲγアゴニストおよびＰＰＡＲδアゴニストからなる群から選択され得る。
【０１７１】
他の態様において、薬物はシリビニン、ｓｒｃキナーゼ阻害剤、ＭｅｒＴＫ阻害剤およびＳｔａｔ３阻害剤からなる群から選択され得る。本実施態様において、薬物は、ｓｒｃキナーゼ阻害剤(例えば、ダサチニブ)であり得る。他の実施態様において、薬物は、ＭｅｒＴＫ阻害剤(例えば、ＵＮＣ１０６２)であり得る。さらに他の実施態様において、薬物は、Ｓｔａｔ３阻害剤(例えば、スニチニブおよびソラフェニブから選択される)であり得る。
【０１７２】
ここに記載する薬物の類似体または誘導体も、ここに記載する化合物において使用し得ることは理解される。薬物はまたリンカーを介して葉酸受容体結合リガンドに結合する造影剤であり得る。
【０１７３】
他の態様において、１を超える化合物を投与でき、化合物は異なる薬物を含み得る。ある実施態様において、異なる薬物は、例えば、ＴＬＲ７アゴニストおよびＰＩ３Ｋ阻害剤から選択され得る。さらに他の実施態様において、１以上の化合物を、１以上の非コンジュゲート薬物(すなわち、葉酸受容体結合リガンドに結合していない)と共に投与し得る。組み合わせ治療実施態様について、任意のここに記載する化合物および薬物を使用できまたはＭＤＳＣを枯渇させまたは阻害する他の薬物を、ここに記載する方法において使用し得る。組み合わせ治療実施態様について、ここに記載するとおり、相乗作用が生じ得る。
【０１７４】
ある実施態様において、宿主動物をＭＤＳＣを枯渇させまたは阻害するためにここに記載する方法で処置する前に、米国出願公開２０１４０１４０９２５(引用により本明細書に包含させる)に記載のとおり、宿主動物を、宿主動物の葉酸受容体状態を決定するために宿主動物に葉酸−造影剤コンジュゲートを投与することにより処置し得る。本実施態様において、宿主動物の葉酸受容体状態を、陽性または陰性であるとして決定でき、葉酸受容体状態を使用して、宿主動物に投与すべき化合物を決定できる。
【０１７５】
ここに記載する方法のさらなる態様において、１以上の化合物における葉酸は、葉酸受容体−α特異的葉酸および葉酸受容体−β特異的葉酸から選択される。この態様において、一方の化合物の葉酸は葉酸受容体−α特異的葉酸であり、他方の化合物の葉酸は葉酸受容体−βに特異的である、少なくとも２種の化合物を投与し得る。この説明的態様において、葉酸受容体陽性癌を、該化合物の腫瘍への結合による腫瘍の直接的処置によりおよび他の化合物のＭＤＳＣへのＭＤＳＣを阻害または枯渇させるための結合による腫瘍の間接的処置により、処置し得る。
【０１７６】
他の実施態様において、化合物は、式
【化９】
2019519524.tif 000016
(ここではＦＡ−ＴＬＲ７とも称する)で表されるかまたはその薬学的に許容される塩である。
【０１７７】
他の実施態様において、化合物は、式
【化１０】
2019519524.tif 000017
(ここではＦＡ−ＰＩ３Ｋとも称する)で表されるかまたはその薬学的に許容される塩である。
【０１７８】
他の実施態様において、化合物は、式
【化１１】
2019519524.tif 000018
(ここではＦＡ−ツブリシンとも称する)で表されるかまたはその薬学的に許容される塩である。
【０１７９】
他の実施態様において、化合物は、式
【化１２】
2019519524.tif 000019
(ここではＦＡ−ＰＢＤとも称する)で表されるかまたはその薬学的に許容される塩である。
【０１８０】
ここで記載する用語“薬学的に許容される塩”は、医薬において使用し得るカウンターイオンとの塩をいう。このような塩は、(１)遊離塩基の親化合物と塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、(Ｄ)または(Ｌ)リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸などの有機酸の反応により得られ得る酸付加塩；または(２)親化合物に酸性プロトンが存在するとき、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンまたはアルミニウムイオンにより置き換えられることにより形成される塩；またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基との配位化合物を含む。薬学的に許容される塩は当業者に周知であり、任意のこのような薬学的に許容される塩が、ここに記載する実施態様と関連して企図され得る。
【０１８１】
適当な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸と形成される。説明的例は、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、炭酸水素塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／クロライド、臭化水素酸塩／ブロマイド、ヨウ化水素酸塩／アイオダイド、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩、２−ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロト酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、糖酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トシル酸およびトリフルオロ酢酸塩を含む。
【０１８２】
ここに記載する化合物の適当な塩基塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成される。説明的例は、アルギニン塩、ベンザチン塩、カルシウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、ジオールアミン塩、グリシン塩、リシン塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、オールアミン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トロメタミン塩および亜鉛塩を含む。酸および塩基のヘミ塩、例えば、ヘミ硫酸塩およびヘミカルシウム塩も形成され得る。
【０１８３】
ある態様において、ここに記載する化合物を、血流に直接、筋肉にまたは内部臓器に投与し得る。このような非経腸投与の適当な経路は、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、側脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、腫瘍内、筋肉内および皮下送達を含む。非経腸投与の適当な手段は、有針(マイクロニードルを含む)注射器、無針注射器および点滴技法を含む。
【０１８４】
ある説明的態様において、非経腸組成物は一般に水溶液であり、これは、塩、炭水化物および緩衝剤(好ましくはｐＨ３〜９で)などの担体または添加物を含み得るが、ある適用について、それらは、無菌非水溶液または無菌、発熱物質除去水またはリン酸緩衝化食塩水などの適当な媒体と組み合わせて使用する乾燥形態としてより適切に製剤され得る。他の実施態様において、ここに記載する化合物を含む組成物の何れも、ここに記載する化合物の非経腸投与に適応させ得る。例えば、無菌条件下の凍結乾燥による、無菌条件下の非経腸組成物の製造は、当業者に周知の標準的製剤化技術を使用して容易に達成し得る。ある実施態様において、非経腸組成物の製造に使用する化合物の溶解度を、溶解度増強剤の包含などの適切な製剤技法の使用により増加させ得る。
【０１８５】
化合物の用量は、宿主動物の状態、処置する癌、化合物の投与経路および組織分布および放射線療法または組み合わせ治療におけるさらなる薬物などの他の治療的処置の併用の可能性により、相当変わり得る。宿主動物に投与する治療有効量(すなわち、化合物)または診断有効量(例えば、米国出願公開２０１４０１４０９２５(引用により本明細書に包含させる)に記載の葉酸造影剤コンジュゲート)は、体表面積、腫瘤および宿主動物の状態の医師による評価に基づく。治療有効量または診断有効量は、例えば、約０.０５mg／患者体重kg〜約３０.０mg／患者体重kgまたは約０.０１mg／患者体重kg〜約５.０mg／患者体重kgの範囲であり、０.０１mg／kg、０.０２mg／kg、０.０３mg／kg、０.０４mg／kg、０.０５mg／kg、０.１mg／kg、０.２mg／kg、０.３mg／kg、０.４mg／kg、０.５mg／kg、１.０mg／kg、１.５mg／kg、２.０mg／kg、２.５mg／kg、３.０mg／kg、３.５mg／kg、４.０mg／kg、４.５mg／kgおよび５.０mg／kgを含むが、これらに限定されず、またこれらは全て患者体重kg当たりの重量である。化合物の総治療有効量または診断有効量を単回または分割用量で投与し得て、医師の裁量により、ここに記載する典型的な範囲の外もあり得る。
【０１８６】
他の実施態様において、化合物または葉酸造影剤コンジュゲートを、約０.５μg／ｍ２〜約５００mg／ｍ２、約０.５μg／ｍ２〜約３００mg／ｍ２または約１００μg／ｍ２〜約２００mg／ｍ２の治療有効量または診断有効量で投与し得る。他の実施態様において、量は、約０.５mg／ｍ２〜約５００mg／ｍ２、約０.５mg／ｍ２〜約３００mg／ｍ２、約０.５mg／ｍ２〜約２００mg／ｍ２、約０.５mg／ｍ２〜約１００mg／ｍ２、約０.５mg／ｍ２〜約５０mg／ｍ２、約０.５mg／ｍ２〜約６００mg／ｍ２、約０.５mg／ｍ２〜約６.０mg／ｍ２、約０.５mg／ｍ２〜約４.０mg／ｍ２または約０.５mg／ｍ２〜約２.０mg／ｍ２であり得る。総量を、単回または分割投与で投与でき、医師の裁量により、ここに記載する典型的な範囲の外もあり得る。これらの量は、体表面積ｍ２に基づく。
【０１８７】
ここに記載する化合物は、１以上のキラル中心を含み得る他、複数の立体異性体として存在し得る。ある実施態様において、ここに記載する発明は、如何なる特定の立体化学要件にも拘束されず、化合物は光学的に純粋であり得るかまたは、ラセミおよび他のエナンチオマー混合物、他のジアステレオマー混合物などを含む、多様な立体異性混合物の何れかであり得ることは理解される。このような立体異性体混合物は、１以上のキラル中心で単一立体化学配置を含み、同時に１以上の他のキラル中心で立体化学配置の混合物を含み得ることも理解される。
【０１８８】
同様に、ここに記載する化合物は、ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ、ＥおよびＺ二重結合などの幾何中心を含み得る。他の実施態様において、ここに記載する発明は特定の幾何異性体要件に拘束されず、化合物は純粋であり得るかまたは多様な幾何異性体混合物の何れかであり得ることは理解される。このような幾何異性体混合物は、１以上の二重結合で単一配置を含み、同時に１以上の他の二重結合で幾何異性配置の混合を含み得ることも理解される。
【０１８９】
ここで記載する用語“リンカー”は、分子の２以上の機能的部分を連結して、本発明の化合物を形成する、原子の鎖を含む。実例として、原子の鎖はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳｉおよびＰまたはＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される。原子の鎖は、葉酸と薬物などの化合物の異なる機能的能力を共有結合的に連結する。リンカーは、連続主鎖に約２〜約１００原子の範囲のような広範な長さを有し得る。
【０１９０】
ここで記載する用語“遊離可能リンカー”または“遊離可能であるリンカー”は、ｐＨ不安定、酸不安定、塩基不安定、酸化的不安定、代謝的不安定、生化学的不安定または酵素不安定結合などの、生理的条件下で破壊され得る少なくとも１結合を含むリンカーをいう。結合破壊をもたらすこのような生理的条件は、必ずしも生物学的または代謝過程を含まず、代わりに、例えば、生理学的ｐＨでのまたは細胞質ｐＨより低いｐＨを有するエンドソームなどの細胞小器官への区画化の結果としての加水分解反応などの標準的化学反応を含み得る。
【０１９１】
切断可能結合は、遊離可能リンカーの何れかの端または両端で、ここに記載するとおり、遊離可能リンカー内の２つの隣接原子を連結するおよび／または他のリンカー部分または葉酸および／または薬物を連結することができる。切断可能結合が遊離可能リンカー内の２つの隣接原子を連結するとき、結合の切断後、遊離可能リンカーは２以上のフラグメントに破壊される。あるいは、切断可能結合が遊離可能リンカーと他の部分の間であるとき、結合の切断後、遊離可能リンカーは他の部分から離される。
【０１９２】
他の実施態様において、化合物の投与用組成物は、少なくとも約９０％または約９５％または約９６％または約９７％または約９８％または約９９％または約９９.５％の純度を有する化合物から製造される。他の実施態様において、化合物の投与用組成物は、少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９６％または少なくとも９７％または少なくとも９８％または少なくとも９９％または少なくとも９９.５％の純度を有する化合物から製造される。
【実施例】
【０１９３】
化学物質および試薬：
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕはAAPPTEC Inc.から購入した。４−クロロ−３−ニトロキノリンはMatrix Scientific Inc.から購入した。Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３,６−ジオキサオクタン酸はPolyPeptide Inc.から購入した。Ｎ１０−(トリフルオロアセチル)プテロイン酸、ツブリシンはEndocyte Inc.から購入した。固相合成モニターキットはANASPEC Inc.から購入した。２,２−ジメチルオキシラン、水酸化アンモニウム、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、トリフルオロ酢酸、トルエン、２−プロパノール、メタノール、Ｐｄ／Ｃ、１,２−ジアミノエタントリチル(ポリマー結合樹脂)、トリエチルアミン、塩化バレリル、酢酸エチル、ヘキサン、Ｎａ２ＳＯ４、酸化カルシウム、ジクロロメタン、３−クロロペルオキシ安息香酸、イソシアン酸ベンゾイル、Ｈ−ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−２−クロロトリチル樹脂、ナトリウムメトキシド、ジメチルアミノピリジン、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、４−クロロ−３−ニトロ−ａ,ａ,ａ−トリフルオロトルエン、ヒドラジン水和物、エタノール、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、濃ＨＣｌ、エーテル、トリクロロメチルクロロホルメート、塩化スルフリル、２−メルカプトピリジン、２−メルカプトエタノール、ＤＭＦ、ＰｙＢＯＰ、ＤＩＰＥＡ、エタンジチオール、トリイソプロピルシラン、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液、４−クロロ−３−ニトロ−ａ,ａ,ａ−トリフルオロトルエン、ヒドラジン水和物、５,１５−ＤＰＰ、レシキモド、２,４−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミジン、Ｎ−アセチル−５−ヒドロキシトリプタミン、メトトレキサート、エベロリムス、ザイモサン、ＭｎＣｌ２、Ｌ−アルギニン、ダルベッコリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)、クロストリジウム・ヒストリチカム(clostridium histolyticum)からのコラゲナーゼ、ウシ膵臓からのデオキシリボヌクレアーゼＩ、ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、グリシン、ナトリウムアジド、ＯＰＤ基質はSigmaから購入した。水素、アルゴン、窒素の圧縮ガスは、Indiana Oxygen Companyから購入した。ＢＥＺ２３５、ＰＦ−０４６９１５０２、ＧＤＣ−０９８０、ワートマニン、ＢＬＺ９４５、レナリドマイド、ＮＬＧ９１９、ＡＳ１５１７４９９およびＢＩＲＢ７９６はSelleckchemから購入した。ＡＭＴはTocris Bioscienceから購入した。ＣＬ３０７、ＣｐＧおよびポリＩＣはInvivoGen Inc.から購入した。グリース試薬はLifetechnology Inc.から購入した。１０％Triton X-100はPierce Inc.から購入した。プロテアーゼ阻害剤はResearch Products Internationalから購入した。QuantiChromTM尿素アッセイキットはBioAssay Systemsから購入した。マウスＩＬ−１０培地および抗マウスＦＩＴＣアルギナーゼはR&D Systemsから購入した。ＲＰＭＩ  １６４０培地、葉酸欠損ＲＰＭＩ  １６４０培地はGibco Inc.から購入した。ペニシリンストレプトマイシン溶液(５０×)、Ｌ−グルタミン(２００mM)、２.２１mM  ＥＤＴＡ含有０.２５％トリプシン(１×)はCorning Inc.から購入した。胎児ウシ血清(ＦＢＳ)はＡAtlanta biologicals Inc.から購入した。動物用葉酸欠損餌はEnvigo Inc.から購入した。マウス葉酸受容体−β抗体(Ｆ３ＩｇＧ２ａ)は、ＮＩＨのディミトロフ博士から恵与された。マウスＦｃブロッカー(ＣＤ１６／ＣＤ３２)、抗マウスＦＩＴＣ−ＣＤ１１ｂ、抗マウスＰＥ−Ｆ４／８０、抗マウスＰＥ−Ｇｒ１、抗マウス���Ｅ−ＣＤ４、抗マウスＦＩＴＣ−ＣＤ８、７−ＡＡＤ生存能染色溶液、赤血球溶解緩衝液(１０×)はBiolegend Inc.から購入した。固定可能生存能色素eFluor(登録商標)660はeBioscience, Inc.から購入した。PierceTM１６％ホルムアルデヒド(ｗ／ｖ)(無メタノール)はThermo Fischer Scientificから購入した。イソフルランはVetOne Inc.から購入した。Andy FluorTM647 NHSエステル(スクシンイミジルエステル)はApplied Bioprobesから購入した。マウスＧＭ−ＣＳＦはMiltenyi Biotec Inc.から購入した。葉酸−ツブリシンは、文献法により製造した(例えばＷＯ２０１４／０６２６９７に記載の方法参照)。抗ヒトＡＰＣ−ＣＤ３３抗体はBiolegend Inc.から購入した。ヒトＴ細胞培養培地(ＴｅｘＭＡＣＳ培地)、ヒトＩＬ−２はMiltenyi Biotechから購入した。ヒトＴ細胞単離キット(ヒトＴ細胞富化キット)はSTEMMCELLから購入した。Ficoll-PaqueTM PlusはGE Healthcareから購入した。６−チオグアニンおよびメチレンブルーはSigmaから購入した。
【０１９４】
生物学実施例
実施例１：細胞培養および動物飼育
葉酸受容体を発現しない４Ｔ１細胞は、Endocyte Inc.から提供された。細胞を完全ＲＰＭＩ  １６４０培地(１０％胎児ウシ血清、１％ペニシリンストレプトマイシンおよび２mM  Ｌ−グルタミン添加ＲＰＭＩ  １６４０培地)で、３７℃で加湿９５％空気、５％ＣＯ２雰囲気下培養した。細胞培地に３〜４日毎に２.２１mM  ＥＤＴＡ含有０.２５％トリプシンを添加した。６〜８週齢の雌ｂａｌｂ／ｃマウスをEnvigo Inc.から得た。動物を、通常の齧歯類餌または葉酸欠損餌で飼育し、試験期間中標準１２時間明暗サイクルの無菌環境に置いた。全ての動物処理は、ＮＩＨガイドラインに従ってパーデュー動物飼育利用委員会(Purdue Animal Care and Use Committee)により承認された。
【０１９５】
実施例２：腫瘍モデル
４Ｔ１固形腫瘍モデル：６〜８週齢の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、２週間葉酸欠損餌で飼育した。腫瘍移植前、マウスの左体側を電動トリマーで除毛した。５０μL完全ＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁した５万４Ｔ１細胞を、乳房脂肪体近くに皮下にインプラントした。処置を、腫瘍体積が約２０〜５０mm３に達した６日目に開始した。ＦＲ＋  ＴＡＭ／ＭＤＳＣの特徴付けのために、腫瘍を、３００〜５００mm３の体積になったとき、消化させた。細胞表面タンパク質への損傷を最小にする腫瘍消化が開発された。消化カクテルは、１０mL無血清葉酸欠損ＲＰＭＩ  １６４０培地中１mg／mL  コラゲナーゼIV、０.１mg／mL  ウシ精子由来ヒアルロニダーゼおよび０.２mg／mL  デオキシリボヌクレアーゼＩからなった。穏やかに振盪させながら１時間、３７℃で消化後、消化反応を１０％熱不活性化ＦＢＳ含有葉酸欠損ＲＰＭＩ  １６４０培地の添加により停止させ、破壊された腫瘍を４０μmセルストレーナーを通して、個々の細胞を取得した。単離細胞を遠沈させて消化カクテルを除き、氷上で、５分、５〜１０mL  赤血球溶解緩衝液(１×)に再懸濁させた。３０〜４０mLのＰＢＳを添加して、細胞溶解反応を停止させた。細胞を遠沈して上清を除去し、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳであった流動染色(flow staining)培地に再懸濁した。細胞を計数し、次いでフローサイトメトリー染色に備えた。
【０１９６】
４Ｔ１腹膜モデル：６〜８週齢の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、通常の齧歯類餌で飼育した。３００μL  ＰＢＳ中１０００万４Ｔ１細胞を腹腔に注射した。腹水を、腹膜灌流により７〜１０日目に取得した。細胞を遠沈して上清を除去し、氷上で、５分、５〜１０mL  赤血球溶解緩衝液(１×)に再懸濁させた。３０〜４０mLのＰＢＳを添加して、細胞溶解反応を停止させた。細胞を遠沈して上清を除去し、１０ng／mL  マウスＧＭ−ＣＳＦ添加完全ＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁した。細胞を計数し、フローサイトメトリー染色およびインビトロスクリーニングに備えた。
【０１９７】
ＲＭ１固形腫瘍モデル：６〜８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２週間葉酸欠損餌で飼育した。腫瘍移植前、マウス頸部を電動トリマーで除毛した。５０μL完全ＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁した２００万ＲＭ１細胞を皮下にインプラントした。動物を、腫瘍インプラント後、隔日でモニターした。腫瘍サイズが約５００mm３に達したとき、マウスを屠殺した。腫瘍を、４Ｔ１腫瘍モデルに類するカクテルを使用して消化させた。穏やかに振盪させながら１時間、３７℃で消化後、消化反応を１０％熱不活性化ＦＢＳ含有葉酸欠損ＲＰＭＩ  １６４０培地の添加により停止させ、破壊された腫瘍を４０μmセルストレーナーを通して、個々の細胞を取得した。単離細胞を遠沈させて消化カクテルを除き、氷上で、５分、５〜１０mL  赤血球溶解緩衝液(１×)に再懸濁させた。３０〜４０mLのＰＢＳを添加して、細胞溶解反応を停止させた。細胞を遠沈して上清を除去し、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳであった流動染色培地に再懸濁した。細胞を計数し、次いでフローサイトメトリー染色に備えた。
【０１９８】
ＣＴ２６固形腫瘍モデル：６〜８週齢の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、２週間葉酸欠損餌で飼育した。腫瘍移植前、マウス頸部を電動トリマーで除毛した。５０μL完全ＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁した２００万ＣＴ２６細胞を皮下にインプラントした。動物を、腫瘍インプラント後、隔日でモニターした。腫瘍サイズが約５００mm３に達したとき、マウスを屠殺した。腫瘍を、４Ｔ１腫瘍モデルに類するカクテルを使用して消化させた。穏やかに振盪させながら１時間、３７℃で消化後、消化反応を１０％熱不活性化ＦＢＳ含有葉酸欠損ＲＰＭＩ  １６４０培地の添加により停止させ、破壊された腫瘍を４０μmセルストレーナーを通して、個々の細胞を取得した。単離細胞を遠沈させて消化カクテルを除き、氷上で、５分、５〜１０mL  赤血球溶解緩衝液(１×)に再懸濁させた。３０〜４０mLのＰＢＳを添加して、細胞溶解反応を停止させた。次いで細胞を遠沈して上清を除去し、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳであった流動染色培地に再懸濁した。細胞を計数し、次いでフローサイトメトリー染色に備えた。
【０１９９】
ＥＭＴ６固形腫瘍モデル：６〜８週齢の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、２週間葉酸欠損餌で飼育した。腫瘍移植前、マウス頸部を電動トリマーで除毛した。５０μL完全ＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁した２００万ＥＭＴ６細胞を皮下にインプラントした。動物を、腫瘍インプラント後、隔日でモニターした。腫瘍サイズが約５００mm３に達したとき、マウスを屠殺した。腫瘍を、４Ｔ１腫瘍モデルに類するカクテルを使用して消化させた。穏やかに振盪させながら１時間、３７℃で消化後、消化反応を１０％熱不活性化ＦＢＳ含有葉酸欠損ＲＰＭＩ  １６４０培地の添加により停止させ、破壊された腫瘍を４０μmセルストレーナーを通して、個々の細胞を取得した。単離細胞を遠沈させて消化カクテルを除き、氷上で、５分、５〜１０mL  赤血球溶解緩衝液(１×)に再懸濁させた。３０〜４０mLのＰＢＳを添加して、細胞溶解反応を停止させた。次いで細胞を遠沈して上清を除去し、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳであった流動染色培地に再懸濁した。細胞を計数し、次いでフローサイトメトリー染色に備えた。
【０２００】
実施例３：フローサイトメトリー分析
細胞表面マーカー染色：固形腫瘍モデルまたは腹膜腫瘍モデルから得た単一細胞懸濁液を、先に記載のとおり調製した。１００μL流動染色培地中の１００万細胞を、５分、氷上で０.７μL  マウスＦｃブロッカーとインキュベートした。ＭＤＳＣ(ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１)、ＴＡＭ(ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０)および葉酸受容体−β(Ｆ３ＩｇＧ２ａ)の表面マーカーを、Ｆｃブロッカーとインキュベーション後に添加した。表１および２は、表面マーカー染色に使用した抗体の体積を記載した。１時間時間、氷上でインキュベーション後、細胞を５００μL  ＰＢＳで洗浄し、２００μL流動染色培地に再懸濁した。死／生存細胞マーカー(３μLの７−ＡＡＤまたは１μLのＢＶ４２１死／生存)を各サンプルに添加し、暗所で室温でインキュベートした。１５分後、細胞を、洗浄せずに、BD Accuri C6TMフローサイトメーターを使用して分析した(表１染色)。１回洗浄を表２の染色について行い、細胞をBD Forteassaフローサイトメーターを使用して分析した。結果を図５および図６に示す。図５および図６に示すとおり、固形４Ｔ１腫瘍におけるマウスＭＤＳＣおよびＴＡＭ集団は、それぞれＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋およびＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋マーカーにより確認できる。これらの２集団の細胞をゲーティング後、ＦＲ−β発現は、これら２集団の大部分で観察できた(ＭＤＳＣで６１.２％およびＴＡＭで９５％)。
【表６】
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【０２０１】
細胞内アルギナーゼ染色：ＴＡＭ／ＭＤＳＣについての細胞表面マーカーを、先に記載した方法に従いラベルした。０.１μL  固定可能生存能色素eFluor(登録商標)６６０を、抗体カクテルと共に添加した。ＰＢＳで洗浄後、細胞を、５００μLのＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドで１５分、４℃で固定した。細胞を遠沈して、固定溶液を除去した。細胞を０.１Ｍ  グリシンおよび０.０５％ナトリウムアジド含有５００μL洗浄緩衝液で２回洗浄した。最後に遠沈させた後、細胞に０.１Ｍ  グリシン、０.０５％ナトリウムアジドおよび０.１％triton-100含有１mL透過化溶液を添加した。透過化を、室温で５分行った。透過化細胞を１５００rpmで１分遠沈し、細胞を０.０５Ｍ  グリシン、０.０５％ナトリウムアジドおよび０.２％ゼラチン含有１mL遮断緩衝液で洗浄した。次いで細胞を１mL遮断緩衝液で４℃中、一夜再懸濁し、非特異的細胞内結合を遮断した。次いで細胞を１５００rpmで１分遠沈して上清を除去し、さらに１μL  ＦＩＴＣアルギナーゼ含有１００μL遮断緩衝液を添加した。細胞を、４℃で一夜暗所に維持した。１５００rpmで１分遠沈後、細胞を１mL遮断緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリー分析(BD Accuri C6ＴＭフローサイトメーター)に備えた。
【０２０２】
実施例４：インビトロＴＡＭ／ＭＤＳＣスクリーニング
腹膜モデルから単離した細胞を１０ng／mL  マウスＧＭ−ＣＳＦ添加完全ＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。表２に挙げる種々の濃度のスクリーニング薬物を同培地に溶解し、３００μL培地中５０万の細胞を含む各ウェルに添加した。薬物を添加しない３００μL培地中５０万細胞を含むウェルを未処置対照として維持した。３つのさらなるウェルに、細胞および薬物を含まない３００μL培地を入れ、背景対照として維持した。次いで、細胞を３７℃で加湿９５％空気、５％ＣＯ２雰囲気で２４時間〜４８時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、上清をＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡおよび一酸化窒素アッセイのために取得した。細胞を３００μL  ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、アルギナーゼアッセイに備えた。
【表７】
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【０２０３】
実施例５：アルギナーゼアッセイ
アルギナーゼ活性を、I.M. Corraliza, M.L. Campo, G. Soler, M. Modolell, ‘Determination of arginase activity in macrophages: a micromethod', Journal of Immunological Methods 174 (1994) 231-235に記載のとおり、細胞可溶化物から測定した。すなわち、９６ウェルプレートで単離ＴＡＭ／ＭＤＳＣを種々の薬物とインビトロインキュベーションした後、細胞を３００μL  ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を３０分、室温でプロテアーゼ阻害剤(１×)含有１００μLの０.１％Triton X-100で溶解させた。続いて、５０μLの可溶化物溶液を新しいＶ型９６ウェルプレートに移した。５０μLのアルギナーゼ活性化溶液(１０mM  ＭｎＣｌ２／５０mM  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ(ｐＨ７.５)を細胞可溶化物に添加した。１０分、５６℃での加熱により、酵素を活性化した。アルギニン加水分解を、２５μLの活性化溶液を、２５μLのアルギナーゼ基質溶液(０.５Ｍ  Ｌ−アルギニン(ｐＨ９.７))と３７℃で６０分、穏やかに振盪しながらインキュベートすることにより実施した。室温に冷却後、次いで１０μLの反応溶液を９０μLのＰＢＳで希釈した。１０μLのこの希釈溶液を、９６ウェル平底透明プレートに移した。２００μLの尿素試薬を各ウェルに添加した。室温暗所で１０分インキュベーション後、尿素濃度を、プレートリーダーにより５２０nmで測定した。結果を図７、図１１、図１２、図１５および図２４に示す。
【０２０４】
図７に示すとおり、ＣＬ３０７、ＢＥＺ２３５、ワートマニン、ＣｐＧ、ツブリシン、ＡＳ１５１７４９９およびＢＩＲＢ７９６を含む数種の薬物が、インビトロでＴＡＭ／ＭＤＳＣによるアルギナーゼ産生を効率的に減少させることが判明した。アルギナーゼ濃度は、５２０nmの吸光度に比例した。各図の点線は、未処置対照のアルギナーゼレベルを示した。実線は、背景のアルギナーゼレベルを示した。全サンプルについての５２０nmの吸光度を、０.１μM〜１００μMの試験薬物の濃度に対して、プロットした。
【０２０５】
図１１に示すとおり、ＴＡＭ／ＭＤＳＣによるアルギナーゼ産生への影響について、新たに合成したＴＬＲ７アゴニスト(ＴＬＲ７Ａ)の効力を試験するために、ＴＬＲ７ＡおよびＣｌ３０７を、種々の濃度でＴＡＭ／ＭＤＳＣと共培養した。図１１から、ＴＬＲ７Ａが、市販のＴＬＲ７アゴニスト(Ｃｌ３０７)よりアルギナーゼに効果的であることが判明した。
【０２０６】
図１２に示すとおり、インビトロでＴＡＭ／ＭＤＳＣによるアルギナーゼ産生減少について３種のＰＩ３Ｋ阻害剤の効果を比較することにより、ＧＤＣ−０９８０が、ＴＡＭ／ＭＤＳＣにより産生されるアルギナーゼを効率的に減少できる最良の候補であることが判明した。
【０２０７】
図１５に示すとおり、４Ｔ１腹膜腫瘍モデルから得たＴＡＭ／ＭＤＳＣを、種々の濃度のＴＬＲ７アゴニスト(Ｃｌ３０７)、ＰＩ３Ｋ阻害剤(ＢＥＺ２３５)および／または２種の薬物の組み合わせと培養した。全組み合わせのＥＣ５０を、図１５に示すとおり２薬物間でプロットした。四角は、Ｃｌ３０７またはＢＥＺ２３５での単剤処置のＥＣ５０を示す。アルギナーゼ産生に個々に作用し得る２種の異なる薬物を組み合わせて、相乗効果が観察され、ＴＡＭ／ＭＤＳＣによるアルギナーゼ産生をさらに減少できることが判明した。
【０２０８】
図２４に示すとおり、Ｆ４／８０＋マクロファージ上のアルギナーゼの細胞内染色を、未処置対照、ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト、ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＦＡ−ツブリシンおよび組み合わせの群ならびに競合群で試験した。先の方法の部分に記載するとおり、治療試験の最後の腫瘍消化後、単離細胞を、マクロファージ表面マーカー(Ｆ４／８０)およびＭ２マクロファージ機能的マーカー(アルギナーゼ)で染色して、Ｆ４／８０＋マクロファージ上のアルギナーゼ発現レベルを試験した。アルギナーゼ上方制御が、アルギナーゼによるＬ−アルギニン枯渇が細胞毒性Ｔ細胞増殖を阻害し得るため、ＴＡＭ／ＭＤＳＣについての重要な抑制マーカーであることが確立されている。処置および競合群からの生存細胞におけるアルギナーゼ＋Ｆ４／８０＋細胞集団を、未処置群の同集団と比較した。図２４に示すとおり、処置群からのアルギナーゼ＋Ｆ４／８０＋細胞集団は未処置対照と比較して劇的に減少し、この効果は、競合剤(ＦＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２)のさらなる添加により競合された。それ故に、４Ｔ１固形腫瘍におけるＦＲ＋  ＴＡＭ／ＭＤＳＣのターゲティングにより、３群のＦＡ−コンジュゲートＳＭＤＣが、ＴＡＭ／ＭＤＳＣの免疫抑制に影響し得ると結論付けされた。
【０２０９】
実施例６：ＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡアッセイ
種々の化合物とのインビトロインキュベーション後のＴＡＭ／ＭＤＳＣによるＩＬ−１０産生を、R&D SystemsによるマウスＩＬ−１０培地ＥＬＩＳＡに添付のプロトコールに従うＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。簡潔には、高親和性９６ウェルプレートをウェルあたり１００μLの希釈捕捉抗体で、ＰＢＳ中作業濃度４μg／mLで担体タンパク質非存在下に被覆した。プレートを密閉し、一夜、室温でインキュベートした。各ウェルを吸引し、噴出ボトルを使用して、４００μLの洗浄緩衝液(ＰＢＳ中０.０５％Ｔｗｅｅｎ(登録商標)２０、ｐＨ７.２〜７.４)で３回洗浄した。最後の洗浄後、残った洗浄緩衝液を、プレートを裏返し、清潔なペーパータオルに軽打することにより除いた。プレートを３００μLの試薬希釈剤(ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、ｐＨ７.２〜７.４)を各ウェルに添加することにより遮断し、室温で１時間インキュベートした。吸引／洗浄を先に記載したのと同じ方法で３回繰り返した。プレートを、サンプル添加に備えた。ＴＡＭ／ＭＤＳＣインビトロスクリーニングからの１００μLのサンプル上清を各ウェルに添加した。プレートをアドヒシブストリップで覆い、２時間、室温でインキュベートした。先に記載した吸引／洗浄方法を３回繰り返した。試薬希釈剤中３００ng／mL濃度の１００μLの検出抗体を各ウェルに添加した。プレートを新たなアドヒシブストリップで覆い、２時間、室温でインキュベートした。先に記載した吸引／洗浄方法を３回繰り返した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ(試薬希釈剤中１〜４０希釈)の１００μLの作業希釈を、各ウェルに添加した。プレートを覆い、２０分、室温暗所でインキュベートした。先に記載した吸引／洗浄方法を３回繰り返した。２００μLの基質溶液(２０mLのＤＩ水中ＯＰＤの銀および金錠剤の１バッグ)を、各ウェルに添加した。プレートを２０分、室温で暗所でインキュベートした。５０μLの停止溶液(３Ｍ  ＨＣｌ)を、各ウェルに添加した。プレートを穏やかに軽打して、徹底的な混合を確実にした。ＩＬ−１０濃度は、４９２nmでマイクロプレートリーダーにより決定した光学密度に比例する。結果を図８および図１３に示す。
【０２１０】
図８に示すとおり、ＢＥＺ２３５、ワートマニン、ツブリシン、レナリドマイド、ＡＳ１５１７４９９およびＢＩＲＢ７９６を含む数薬物が、インビトロでのＴＡＭ／ＭＤＳＣによるＩＬ−１０産生を効率的に減少できることが判明した。ＩＬ−１０の濃度は、４９２nmの吸光度に比例した。各図の点線は、未処置対照のＩＬ−１０レベルを示した。実線は、背景のＩＬ−１０レベルを示した。全サンプルについての４９２nmの吸光度を、０.１μM〜１００μMの試験薬物の濃度に対して、プロットした。
【０２１１】
図１３に示すとおり、インビトロでのＴＡＭ／ＭＤＳＣによるＩＬ−１０産生減少に対する３種のＰＩ３Ｋ阻害剤の効果を比較することにより、ＧＤＣ−０９８０が、ＴＡＭ／ＭＤＳＣにより産生されるＩＬ−１０を効率的に減少できる最良の候補であることが判明した。
【０２１２】
実施例７：一酸化窒素アッセイ
一酸化窒素産生を、グリース試薬を用いて、Je-In Youn, Srinivas Nagaraj, Michelle Collazo, and Dmitry I. Gabrilovich, ‘Subsets of Myeloid-Derived Suppressor Cells in Tumor Bearing Mice', J Immunol. 2008 Oct 15; 181(8): 5791-5802に記載のとおり測定した。簡潔には、種々の薬物とのＴＡＭ／ＭＤＳＣのインビトロインキュベーション後、各ウェルからの５０μLの上清を９６ウェル平底透明プレートに移した。２０μLのグリース試薬および３０μLのＤＩ水を、５０μLの上清の各ウェルに添加した。反応溶液を暗所で室温で３０分維持し、その後プレートリーダー測定した。５４８nmの吸光度は、ＴＡＭ／ＭＤＳＣにより産生される一酸化窒素濃度に相関する。結果を図９、図１０、図１１および図１４に示す。
【０２１３】
図９に示すとおり、ＢＥＺ２３５、ワートマニン、ＡＭＴ、メトトレキサート、ツブリシン、ＡＳ１５１７４９９、エベロリムスおよびＢＩＲＢ７９６を含む数薬物が、インビトロでのＴＡＭ／ＭＤＳＣによる一酸化窒素産生を効率的に減少できることが判明した。一酸化窒素の濃度は、５４８nmの吸光度に比例した。各図の点線は、未処置対照の一酸化窒素レベルを示した。実線は、背景の一酸化窒素レベルを示した。全サンプルについての５４８nmの吸光度を、０.１μM〜１００μMの試験薬物の濃度に対して、プロットした。
【０２１４】
図１０に示すとおり、インビトロでの種々のＴＬＲアゴニストとＴＡＭ／ＭＤＳＣの共培養後、一酸化窒素産生の劇的増加およびＣＤ８６の上方制御を示し、ＴＡＭ／ＭＤＳＣの抗腫瘍機能を有するＭ１マクロファージへの初期化を示す。
【０２１５】
図１１に示すとおり、ＴＡＭ／ＭＤＳＣによる一酸化窒素産生への影響についての新たに合成したＴＬＲ７アゴニスト(ＴＬＲ７Ａ)の効力を試験するために、ＴＬＲ７ＡおよびＣｌ３０７を、種々の濃度でＴＡＭ／ＭＤＳＣと共培養した。図１１から、ＴＬＲ７Ａが、市販のＴＬＲ７アゴニスト(Ｃｌ３０７)より一酸化窒素増加に効果的であることが判明した。
【０２１６】
図１４に示すとおり、インビトロでＴＡＭ／ＭＤＳＣによる一酸化窒素の産生減少で３種のＰＩ３Ｋ阻害剤の効果を比較することにより、ＧＤＣ−０９８０が、ＴＡＭ／ＭＤＳＣによる一酸化窒素を効率的に減少できる最良の候補であることが判明した。
【０２１７】
実施例８：統計分析
値間の統計的有意を、スチューデントのｔ検定で試験した。全データは平均±ＳＤとして示した。ｐ≦０.０５の確率値を有意と見なした。
【０２１８】
実施例９：Ｍ１対Ｍ２マクロファージ比
Ｍ１対Ｍ２マクロファージ比(Ｆ４／８０＋ＣＤ８６＋：Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋)を、未処置対照、ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト、ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＦＡ−ツブリシンおよび組み合わせの群ならびに競合群で試験した。
【０２１９】
先の方法の部分に記載するとおり、治療試験の最後の腫瘍消化後、単離細胞をＦ４／８０マクロファージマーカーおよびＭ１(ＣＤ８６)、Ｍ２(ＣＤ２０６)マーカーで染色した。４Ｔ１固形腫瘍におけるＭ１対Ｍ２マクロファージ比を試験しており、図２５に要約する。腫瘍環境におけるマクロファージは、主にＭ２マクロファージ機能として考えられ、これは腫瘍増殖を支持し、免疫応答を抑制する。他方で、Ｍ１マクロファージは、腫瘍細胞を排除し、抗癌免疫応答を刺激することができると考えられている。それ故に、Ｍ１対Ｍ２マクロファージ比試験は、ＦＲ−β陽性ＴＡＭ／ＭＤＳＣターゲティングに重要である。図２５に示すとおり、処置および競合群からのＭ１対Ｍ２マクロファージ比(Ｆ４／８０＋ＣＤ８６＋細胞集団対Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋細胞集団)を、未処置対照からの比と比較した。結果として、３処置群(ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト、ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤および組み合わせ)の比は、未処置対照と比較して劇的に増加し、この効果は、競合剤(ＦＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２)のさらなる添加により競合された。それ故に、４Ｔ１固形腫瘍におけるＦＲ＋  ＴＡＭ／ＭＤＳＣのターゲティングにより、３群のＦＡ−コンジュゲートＭＤＳＣが免疫抑制Ｍ２マクロファージ環境を抗癌Ｍ１マクロファージ環境に変換することができ、これが腫瘍の増殖遅延に寄与していると結論できた。
【０２２０】
実施例１０：ＭＤＳＣ集団
ＭＤＳＣ集団(ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋)を、未処置対照、ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト、ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＦＡ−ツブリシンおよび組み合わせの群ならびに競合群で試験した。
【０２２１】
先の方法の部分に記載するとおり、治療試験の最後の腫瘍消化後、単離細胞をＭＤＳＣマーカーＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋で染色した(図２６参照)。ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストおよび組み合わせ群のみが、ＭＤＳＣ集団の劇的減少を示した。ＦＡ−ツブリシンおよびＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤の処置群におけるＭＤＳＣ集団は、未処置対照および競合群と比較して、差異はなかった。ＴＬＲ７アゴニスト処置(ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストおよび組み合わせ群)におけるＭＤＳＣ集団減少は、腫瘍生存阻害の機能のためのＭＤＳＣの初期化によるものであり、これがＭＤＳＣの表現型変化を引き起こすはずである。インビトロデータは、ＴＡＭ／ＭＤＳＣに対するツブリシン毒性を示すが、インビボ腫瘍環境は、腫瘍細胞が毒性ツブリシン存在下でのＭＤＳＣ生存を支持し得る増殖因子およびサイトカインを放出できるはずであるため、死滅機能を抑制できるはずである。結果として、ＦＡ−ツブリシン処置についてのＭＤＳＣ集団は変化がなかった。しかしながら、図２４、２５および２６を組み合わせることにより、ＦＡ−ツブリシンおよびＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤群におけるＴＡＭ／ＭＤＳＣ(アルギナーゼレベル)および腫瘍環境(Ｍ１対Ｍ２マクロファージ比)の機能は、ＭＤＳＣの表現型の変化がなくても修飾されていることを示す。
【０２２２】
実施例１１：ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞集団のパーセンテージ
ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞集団のパーセンテージを、未処置対照、ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニスト、ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＦＡ−ツブリシン、組み合わせの群ならびに競合群において４Ｔ１固形腫瘍から単離した生存細胞で試験した(図２７参照)。
【０２２３】
葉酸ＳＭＤＣ処置は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増加よりＣＤ４＋Ｔ細胞集団増加により顕著な効果を有する。ＰＩ３ＫがＴ細胞増殖および活性化に重要であるため、組み合わせ群におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両方が、未処置対照と比較して、差がないか減少した集団を示したことは言及すべきである。
【０２２４】
実施例１２：インビボ試験
ＦＡ−ＴＬＲ７Ａの用量試験を、４Ｔ１固形腫瘍モデルで、２マウス／群で実施した。種々の用量のＦＡ−ＴＬＲ７Ａを、週５日、腫瘍インプラント(皮下、５万細胞／マウス)６日目から開始して、ｉ.ｖ.注射することにより処置を実施した。処置を２週間続けた。腫瘍体積を毎日測定した。この試験から、葉酸受容体−βを介してＴＬＲ７アゴニストでＴＡＭ／ＭＤＳＣをターゲティングすることにより、腫瘍増殖が、特に５nmol、１０nmolおよび２０nmolの群で遅延したことが見られる。結果を図１６および１７に示す。
【０２２５】
ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストの治療試験を、４Ｔ１固形腫瘍モデルで３マウス／群で実施した。ＰＢＳ中１００μLの１０nmol  ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストを、週５日、腫瘍インプラント(皮下、５万細胞／マウス)６日目から開始して、ｉ.ｖ.注射することにより処置を実施した。処置を２週間続けた。競合群を、２００倍以上の競合剤(ＦＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２)と１０nmolのＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストの共注射により、同じスケジュールで実施した。総注射体積は１００μLであった。腫瘍体積を毎日測定した。この試験から、葉酸受容体−βを介してＴＬＲ７アゴニストをＴＡＭ／ＭＤＳＣにターゲティングすることにより、腫瘍増殖が遅延したことが見られた。そして、この効果は、さらなるＦＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２の添加により競合することができ、ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストの抗癌活性にＦＲ−βが介在することが確認された。結果は図１８に示す。
【０２２６】
ＦＡ−ツブリシンの治療試験を、４Ｔ１固形腫瘍モデルで３マウス／群で実施した。ＰＢＳ中１００μLの３０nmol  ＦＡ−ツブリシンを、週５日、腫瘍インプラント(皮下、５万細胞／マウス)６日目から開始して、ｉ.ｖ.注射することにより処置を実施した。処置を２週間続けた。競合群を、２００倍以上の競合剤(ＦＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２)と３０nmolのＦＡ−ツブリシンの共注射により、同じスケジュールで実施した。総注射体積は１００μLであった。腫瘍体積を毎日測定した。この試験から、葉酸受容体−βを介してツブリシンをＴＡＭ／ＭＤＳＣにターゲティングすることにより、腫瘍増殖が遅延したことが見られた。そして、この効果は、さらなるＦＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２の添加により競合することができ、ＦＡ−ツブリシンの抗癌活性にＦＲ−βが介在することが確認された。結果は図１９に示す。
【０２２７】
ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤の治療試験を、４Ｔ１固形腫瘍モデルで３マウス／群で実施した。ＰＢＳ中の１００μLの１０nmol  ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤を、週５日、腫瘍インプラント(皮下、５万細胞／マウス)６日目から開始して、ｉ.ｖ.注射することにより処置を実施した。処置を２週間続けた。競合群を、２００倍以上の競合剤(ＦＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２)と１０nmolのＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤の共注射により、同じスケジュールで実施した。総注射体積は１００μLであった。腫瘍体積を毎日測定した。この試験から、葉酸受容体−βを介してＰＩ３Ｋ阻害剤をＴＡＭ／ＭＤＳＣにターゲティングすることにより、腫瘍増殖が遅延したことが見られた。そして、この抗癌効果は、さらなるＦＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２の添加により競合することができ、ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤の抗癌活性にＦＲ−βが介在することが確認された。結果は図２０に示す。
【０２２８】
ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストと非標的化ＰＩ３Ｋ阻害剤(ＢＥＺ２３５)の組み合わせ治療試験を、４Ｔ１固形腫瘍モデルで３マウス／群で実施した。マウスあたり０.２７mgのＢＥＺ２３５の経口投与と組み合わせて、ＰＢＳ中の１００μLの１０nmol  ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストを、週５日、腫瘍インプラント(皮下、５万細胞／マウス)６日目から開始して、ｉ.ｖ.注射することにより処置を実施した。処置を２週間続けた。競合群を、２００倍以上の競合剤(ＦＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２)とマウスあたり０.２７mgのＢＥＺ２３５の経口投与と組み合わせた１０nmolのＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストの共注射により、同じスケジュールで実施した。総注射体積は１００μLであった。腫瘍体積を毎日測定した。この試験から、ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストと非標的化ＰＩ３Ｋ阻害剤の組み合わせにより、腫瘍増殖が顕著に遅延したことが見られた。そして、この抗癌効果は、効果は、さらなるＦＡ−ＰＥＧ−ＮＨ２の添加により競合することができ、組み合わせ処置の抗癌活性にＦＲ−βが介在することが確認された。しかしながら、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＢＥＺ２３５の導入により、動物体重の減少として、ある毒性が初期投与で観察された。結果は図２１に示す。
【０２２９】
ＦＡ−ＴＬＲ７アゴニストのインビボ治療試験を先に記載のとおり実施した。ＰＩ３Ｋ阻害剤(ＢＥＺ２３５)の非標的化治療を、週５日の０.２７mg／マウスの経口投与により、類似の投与スケジュールで実施した。試験を２週間続けた。図２１および２２の比較により、腫瘍増殖遅延に対する相乗効果が組み合わせ処置で見られ、これは、ＴＡＭ／ＭＤＳＣとＴＬＲ７アゴニストおよびＰＩ３Ｋ阻害剤の共培養によるアルギナーゼ産生に対する相乗効果の先のインビトロ試験を確認した。結果は図２２に示す。
図２３は、治療群の処置最終日の平均腫瘍体積を示す。
【０２３０】
実施例１３：ＰＢＭＣからのヒトＭＤＳＣのインビトロ誘発
健常ドナーからのヒトＰＢＭＣを次の標準法に従う密度勾配遠心分離により単離した。
血液をＰＢＳ(１：２希釈)で希釈した。１５mlのFicollを５０mlチューブに移した。３５mlの希釈血液をFicoll培地に注意深く載せた。チューブを、４００ｇで３０分、２４℃でブレーキをかけずに遠心分離した。遠心分離器停止後、チューブを、層を壊すことなく、遠心分離器から注意深く出した。ＰＢＭＣをチューブから注意深く取り、新しい５０mLコニカルチューブに移した。単離ＰＢＭＣをＰＢＳで洗浄し、３００ｇで１０分遠心分離した。上清を傾捨した。ペレットをもう一回ＰＢＳで洗浄し、２００ｇで１５分遠心分離した。単離ＰＢＭＣを血球計数板で計数した。
【０２３１】
単離ＰＢＭＣを、さらに、無血清培地で４時間、３７℃で、３×１０６細胞／ml密度で付着させることにより精製した。懸濁液細胞除去後、付着ＰＢＭＣを１０ng／mlのＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦ添加完全ＲＰＭＩ−１６４０で７日間培養した。次いでＣＤ３３＋細胞のフローとしてソートした。正常ヒトマクロファージを、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で７日間ＰＢＭＣと共培養することにより分化させた。
【０２３２】
ヒトＭＤＳＣを、選択薬物と２日間培養した。ＭＤＳＣによるＩＬ−１０産生を測定し、薬物濃度に対してプロットした。ヒトＭＤＳＣは、ＩＬ−１０減少により、これら薬物に対して同等の応答をし、これがＭＤＳＣの免疫抑制阻害に寄与しているはずである。結果は図２８に示す。
【０２３３】
実施例１４：ヒトＴ細胞のインビトロ活性化およびＴ細胞抑制阻害
ヒトＰＢＭＣを、実施例１３に記載のとおり密度勾配遠心分離により単離した。単離ＰＢＭＣを、５×１０７細胞／ml濃度で、１５mlチューブ中、２％ＦＢＳおよび１mM  ＥＤＴＡを含む１mlのＰＢＳに差異懸濁した。ヒトＴ細胞富化キットの５０μLのカクテル溶液を懸濁液に添加した。細胞を、１０分、ＲＴでインキュベートした。５０μLの磁気ビーズ(ヒトＴ細胞富化キット)を添加し、５分、ＲＴでインキュベートした。Ｔ細胞および磁気ビーズ含有チューブを、５分、ＲＴで磁気内に入れた。上清は負に選択されたヒトＴ細胞を含み、これを集め、計数した。単離Ｔ細胞を５０Ｕ／mlのＩＬ−２と、１×１０６細胞／ml密度で３日間培養した。次いで細胞溶液をピペットで十分混合し、次に磁石の隣に５分置いて、ビーズを除いた。懸濁液を取得し、これは抑制アッセイ用活性化ヒトＴ細胞を含んだ。
【０２３４】
０.１μMまたは１μM濃度の３群の薬物と２日間共培養したヒトＭＤＳＣを、活性化ヒトＴ細胞と８：１比で１８時間混合した。ＩＦＮ−γの賛成をＴ細胞活性化マーカーとして測定した。マクロファージと比較して、ＭＤＳＣはＴ細胞活性化の５０％阻害を示した。薬物濃度０.１μMについて、Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ産生の有意な変化はなかった。しかしながら、１μM濃度で、ＴＬＲ７アゴニスト処置ＭＤＳＣは、Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの劇的な増加を示し、ＭＤＳＣの抑制機能がインビトロでＴＬＲ７アゴニスト刺激により阻害または逆転されるはずであることを示す。結果は図２９に示す。
【０２３５】
実施例１５：肺転移アッセイ
４Ｔ１細胞を移植したＢａｌｂ／ｃマウスを、腫瘍サイズが５０mm３に達したとき、２週間(７日／週)、３群のＦＡ−コンジュゲートで処置した。２週間処置後、動物を屠殺し、肺を５mlのコラゲナーゼIV  ＰＢＳ溶液(１mg／ml)で２時間、３７℃で消化させた。懸濁液を７０μmセルストレイナーを通して、単一細胞懸濁液を得た。細胞を６０μMの６−チオグアニンを含む１０mlの完全ＲＰＭＩ−１６４０培地と、１０〜１４日間共培養した。培地を培養の最後に除去した。細胞を５mlのメタノールで５分、室温で固定し、ＤＩ水で１回洗浄した。５mlのメチレンブルー(０.０３％、ｖ／ｖ)を添加して、細胞を５分、室温で染色した。水で洗浄後、細胞を転移評価のために、空気乾燥した。
【０２３６】
４Ｔ１細胞は、ＦＡ−コンジュゲートおよび遊離薬物両方に抵抗性を示した。それ故に、ＦＡ−コンジュゲートのインビボ抗癌活性は、免疫抑制機能の阻害または初期化によるＦＲ−β陽性骨髄細胞のターゲティングにより寄与されるはずであると考えられた。結果は図３０および図３１に示す。
【０２３７】
ＦＡ−コンジュゲートの投与を、治療効果が改善されるか否かを見るために、週５日から週７日に変えた。４Ｔ１固形腫瘍へのＦＡ−コンジュゲートの連続的投与は、腫瘍増殖を減少させ得る。結果は図３２に示す。
【０２３８】
ＭＤＳＣ／ＴＡＭのターゲティングにより、アルギナーゼレベルは３処置群で劇的に減少し、これは、Ｔ細胞抑制の排除に起因しているはずである。結果は図３３に示す。
【０２３９】
ＭＤＳＣは、前転移ニッチェの形成、血管形成および腫瘍細胞侵襲促進に関与することにより、腫瘍転移の促進と直接関連付けられる。我々の仮説は、ＭＤＳＣ／ＴＡＭの除去が、癌転移を予防するはずであるとのことである。先の試験は、ＴＬＲ７刺激／ＰＩ３Ｋ阻害がＭＤＳＣ集団を減少させるかまたは免疫抑制ＭＤＳＣ／ＴＡＭをＭ１様マクロファージに変換させるまたはアルギナーゼおよびＩＬ−１０などの免疫抑制機能阻害の何れか行い得ることを示した。結果として、Ｔ細胞活性化は促進され、全身免疫が改善されるはずである。転移データは、未処置疾患対照と比較して、処置群の肺転移減少を示した。結果は図３４および３５に示す。
【０２４０】
実施例１６：生存試験
Ｂａｌｂ／ｃマウスに５×１０４細胞ｓ.ｑ.でインプラントした。ＦＡ−コンジュゲートによる処置を、腫瘍サイズが約５０mm３に達したときに開始し、２週間、７日／週で続けた。腫瘍を、サイズが１５０〜２００mm３に達したとき、外科的に摘出した。動物生存をモニターした。
【０２４１】
４Ｔ１固形腫瘍担持マウスを、腫瘍サイズが５０mm３に達したときにＭＤＳＣ／ＴＡＭを標的化するために、ＦＡ−コンジュゲートで処置した。腫瘍を、サイズが１５０〜２００mm３に達したとき、外科的に摘出した。処置を計２週間(７日／週)続けた。マウス生存をモニターした。ＭＤＳＣ／ＴＡＭの免疫抑制機能排除後、動物生存の有意な増加が見られた。この試験は動物生存および血液血清サイトカインのモニターのために、現在も継続中である。結果を図３６および図３７に示す。
【０２４２】
化学実施例
実施例１：ＴＬＲ７アゴニスト(ＴＬＲ７Ａ)の合成
ＴＬＲ７アゴニスト(ＴＬＲ７Ａ)を、Nikunj M. Shukla, Cole A. Mutz, Subbalakshmi S. Malladi, Hemamali J. Warshakoon, Rajalakshmi Balakrishna, and Sunil A. David, ‘Regioisomerism-dependent TLR7 agonism and antagonism in an imidazoquinoline; Structure-Activity Relationships in Human Toll-Like Receptor 7-Active Imidazoquinoline Analogues', J Med Chem. 2012 Feb 9; 55(3): 1106-1116により報告されたスキーム１の方法により合成した。
【化１３】
2019519524.tif 000022
【０２４３】
段階１：１−アミノ−２−メチルプロパン−２−オール(化合物１’)の合成
２,２−ジメチルオキシラン(０.１ｇ、１.３８８mmol)を、水酸化アンモニウムの２０mL氷冷溶液に滴下した。反応混合物を１２時間、室温で撹拌した。溶媒を減圧下除去し、残留物をメタノールに溶解した。二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル(０.７５ｇ、３.４７mmol)を反応混合物に添加し、４時間撹拌した。混合物をカラムクロマトグラフィー(２４％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)を使用して精製して、ｔｅｒｔ−ブチル２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルカルバメートを得た。純粋ｔｅｒｔ−ブチル２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルカルバメートを５mLのトリフルオロ酢酸に溶解し、３５分撹拌した。溶媒を減圧下除去して、１−アミノ−２−メチルプロパン−２−オールをトリフルオロ酢酸塩１’として得た。1H NMR 500 MHz (500 MHz, CDCl3, δ in ppm): δ 8.62 (s, 2H), 3.02 (d, 2H), 2.06-2.04 (m, 2H), 1.37-1.34 (s, 6H)
【０２４４】
段階２：２−メチル−１−(３−ニトロキノリン−４−イルアミノ)プロパン−２−オール(化合物２)の合成
１−アミノ−２−メチルプロパン−２−オールのトリフルオロ酢酸塩(化合物１’)(４５０mg、２.４mmol)を４−クロロ−３−ニトロキノリン(化合物１)(２５０mg、１.２mmol)およびＥｔ３Ｎ(０.５ml、３mmol)のトルエンおよび２−プロパノールの４：１混合物中の溶液に添加した。混合物を７０℃で半時間、固体が沈殿を始めるまで加熱した。次いで反応混合物を冷却し、濾過し、トルエン／２−プロパノール(７：３)、エーテルおよび冷水で洗浄した。残留物を８０℃で乾燥させて、２−メチル−１−(３−ニトロキノリン−４−イルアミノ)プロパン−２−オール(化合物２)を得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 261
【０２４５】
段階３：１−(３−アミノキノリン−４−イルアミノ)−２−メチルプロパン−２−オール(化合物３)の合成
２−メチル−１−(３−ニトロキノリン−４−イルアミノ)プロパン−２−オール(化合物２)(４５０mg、１.７２mmol)をメタノールに溶解し、水素バルーンで触媒としてのＰｄ／Ｃを用いて、４時間水素化した。次いで溶液をセライトを使用して濾過し、溶媒を減圧下蒸発させて、１−(３−アミノキノリン−４−イルアミノ)−２−エチルプロパン−２−オール(化合物３)を得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 231. 1H NMR 500 MHz (CDCl3, δ in ppm): δ 8.12 (s, 1H), 7.61-7.58 (m, 1H), 7.48-7.40 (m, 2H), 4.90 (s, 2H), 3.47 (2H), 1.35-1.21 (s, 6H)
【０２４６】
段階４：１−(４−アミノ−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル)−２−メチルプロパン−２−オール(化合物５、ＴＬＲ７Ａ)の合成
化合物３(１００mg、０.４３mmol)の無水ＴＨＦ溶液に、トリエチルアミン(６６mg、０.６５mmol)および塩化バレリル(６２mg、０.５２mmol)を添加した。次いで反応混合物を６〜８時間撹拌し、減圧下溶媒を除去した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、水および塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、中間体アミド化合物を得た。これをＭｅＯＨに溶解し、酸化カルシウムを添加し、マイクロ波で１１０℃で１時間加熱した。次いで溶媒を除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー(９％ＭｅＯＨ／ジクロロメタン)を使用して精製して、化合物４(５８mg)を得た。化合物４のＭｅＯＨ：ジクロロメタン：クロロホルム(０.１：１：１)の溶媒混合物中の溶液に、３−クロロペルオキシ安息香酸(８４mg、０.４９mmol)を添加し、溶液を４５〜５０℃で４０分還流した。次いで溶媒を除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー(２０％ＭｅＯＨ／ジクロロメタン)を使用して精製して、オキシド誘導体(５５mg)を得た。次いでこれを無水ジクロロメタンに溶解し、イソシアン酸ベンゾイル(３９mg、０.２６mmol)を添加し、４５℃で１５分加熱した。次いで溶媒を減圧下除去し、残留物を無水ＭｅＯＨに溶解し、過剰のナトリウムメトキシドを添加した。次いで反応混合物を８０℃で１時間加熱した。溶媒を減圧下除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー(１１％ＭｅＯＨ／ジクロロメタン)を使用して精製して、化合物５を得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 312. 1H NMR 500 MHz (CDCl3, δ in ppm): δ 8.16-8.15 (d, 1H), 7.77-7.46 (d, 1H), 7.46-7.43 (m, 1H), 7.33-7.26 (m, 1H), 3.00-2.97 (m, 2H), 1.84-1.78 (m, 2H), 1.47-1.41 (m, 2H), 1.36 (s, 6H), 0.98-0.95 (m, 3H)
【０２４７】
実施例２：ヘテロ二機能性ジスルフィドリンカー(化合物７)の合成
ヘテロ二機能性ジスルフィドリンカー(化合物７)を、Satyam A., ‘Design and synthesis of releasable folate-drug conjugates using a novel heterobifunctional disulfide-containing linker', Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008 Jun 1;18(11):3196-9により記載された方法に従い、スキーム２に示すとおり、合成した。
【化１４】
2019519524.tif 000023
【０２４８】
段階１：ヘテロ二機能性ジスルフィドリンカー(化合物７)の合成
塩化スルフリル(２５mLの塩化メチレン中１Ｍ溶液)を、撹拌中の２−メルカプトピリジン(２.５ｇ、２２.５mmol)の２５mLの乾燥塩化メチレン溶液に、窒素雰囲気下、０〜５℃で２０分かけて添加した。黄色固体が析出した。混合物を室温で２時間撹拌し、回転蒸発により濃縮し、こうして得た顆粒状固体を５０mLの乾燥塩化メチレンに溶解し、氷浴で冷却した。この撹拌中の懸濁液に、０〜５℃で、窒素雰囲気下、２−メルカプトエタノール(１.７mL、２４.２mmol)の３０mLの乾燥塩化メチレン溶液を５分かけて添加した。最初に、懸濁液は溶解して、透明溶液を形成した。しかしながら、１５〜２０分以内に、淡黄色顆粒状固体が沈殿し初めた。混合物を室温で一夜撹拌した。沈殿を濾過し、ＨＰＬＣグレード塩化メチレンで洗浄し、真空デシケーターで数時間乾燥させた。化合物(化合物６)の遊離塩基は、その塩酸塩の塩化メチレン中の懸濁液と、わずかに当モル量を超えるジメチルアミノピリジンを混合し、混合物を、短シリカゲルカラムおよび溶離剤として５％メタノールの塩化メチレンを使用して取得することができる。化合物６(遊離塩基、１ｇ、５.４mmolの１０mLのアセトニトリル溶液を、２分かけて、撹拌中のＢＴＢＣ(２.５ｇ、５.７mmol)の５０mLのアセトニトリル溶液に、室温で添加した。得られた混合物を室温で３８時間撹拌した。混合物を減圧下濃縮し、残留物を酢酸エチル(５０mL)および１Ｎ  ＮａＨＣＯ３(２５mL)に分配した。有機層を分離し、１Ｎ  ＮａＨＣＯ３(１０mL)でさらに洗浄し、乾燥させ(無水Ｎａ２ＳＯ４)、濾過し、減圧下濃縮して、化合物７を得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 416. 1H NMR 500 MHz (CDCl3, δ in ppm): δ 8.38-8.32 (m, 3H), 8.09-8.07 (m, 1H), 7.77-7.75 (m, 1H), 7.70-7.69 (m, 1H), 7.14-7.13 (m, 1H), 4.81-4.78 (m, 2H), 3.33-3.31 (m, 2H)
【０２４９】
実施例３：ＢＴＢＣ(化合物８)の合成
ＢＴＢＣを、Takeda, K.; Tsuboyama, K.; Hoshino, M.; Kishino, M.; Ogura, H. ‘A Synthesis of a New Type of Alkoxycarbonylating Reagents from 1,1-Bis[6-(trifluoromethyl)benzotriazolyl] Carbonate (BTBC) and Their Reactions', Synthesis, 1987, 557-560に記載の方法に従い、スキーム３に示すとおり、合成した。
【化１５】
2019519524.tif 000024
【０２５０】
４−クロロ−３−ニトロ−ａ,ａ,ａ−トリフルオロトルエン(２.５ｇ、０.０１１mol)およびヒドラジン水和物(１.６５ｇ、０.０３３mol)の９９％エタノール(２０mL)中の混合物を２４時間還流した。溶媒を減圧下除去後、残留物を１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液に溶解した。溶液をエーテルで洗浄して出発物質を除去し、濃ＨＣｌで酸性化して、生成物を沈殿させ、これを水で洗浄し、乾燥させて、１−ヒドロキシ−６−(トリフルオロメチル)ベンゾトリアゾールを得た。この撹拌中の１−ヒドロキシ−６−(トリフルオロメチル)ベンゾトリアゾール(１ｇ、５mmol)の乾燥エーテル(５０mL)溶液に、トリクロロメチルクロロホルメート(０.２６ｇ、１.２３mmol)を室温で添加した。１０分後、さらなる量のトリクロロメチルクロロホルメート(０.２６ｇ、１.２３mmol)を混合物に添加し、１時間穏やかに還流し、形成した沈殿を取得し、乾燥エーテルで洗浄した。ＢＴＢＣのほぼ純粋な結晶が得られる。LCMS: [M+H]+ m/z = 432
【０２５１】
実施例４：固相合成による葉酸−システイン(化合物９)の合成
Ｈ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−２−クロロトリチル樹脂(１００mg)を１２mLのジクロロメタンに分配し、アルゴンで１０分バブリングした。ジクロロメタン除去後、１０mLのＤＭＦ  １０mLを添加し、５分バブリングした。５mLの２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を、各１０分で３回添加した。樹脂を各１０mLのＤＭＦで５分、３回洗浄した。１０mLのイソプロパノールを添加して、樹脂を各５分、３回洗浄した。数分空気乾燥後、遊離アミンを、青色ビーズがアミンの完全な脱保護を示す固体合成モニターキットで試験した。ＤＭＦに溶解したＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ(６４mg、０.１５mol)、ＤＩＰＥＡ(０.１０５mL、０.６mol)、ＰｙＢＯＰ(７９mg、０.１５molをＤＭＦ溶液中のビーズに添加した。５〜６時間反応後、ＤＭＦ／ＩＰＡでの３回の反復洗浄を行った。アミンの脱保護が、５mLの２０％ピペリジンＤＭＦ溶液の３回の添加により行った。３回ＤＭＦで洗浄後、２mLのＤＭＦ溶液とＮ１０−(トリフルオロアセチル)プテロイン酸(６２mg、０.１５mol)、ＤＩＰＥＡ(０.１０５ml、０.６mol)、ＰｙＢＯＰ(７９mg、０.１５mol)をＤＭＦ溶液中のビーズに添加した。反応をアルゴン下５〜６時間続けた。８mLの体積比９６.２５／１.２５／１.２５／１.２５のＴＦＡ／エタンジチオール／トリイソプロピルシラン／Ｈ２Ｏ混合溶液を、各３０分で３回添加して、化合物を樹脂から開裂させた。トリフルオロアセチル保護化合物８をＨＰＬＣで精製した。化合物８を、トリフルオロアセチル基をアンモニウム溶液(５ml、０.５Ｍ)で２時間、室温で脱保護後得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 544
【化１６】
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【０２５２】
実施例５：ＴＬＲ７アゴニストの葉酸コンジュゲート(ＴＬＲ７Ａ)の合成
ＴＬＲ７アゴニストの葉酸コンジュゲート(ＴＬＲ７Ａ)をスキーム５に示すとおり合成した。
【化１７】
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【０２５３】
ヘテロ二機能性リンカー７(８８mg、０.２１３mmol)を、化合物５(３３mg、０.１０６mmol)およびジメチルアミノピリジン(３９mg、０.３１９mmol)の４mLの塩化メチレン溶液に、室温で窒素雰囲気下添加し、混合物を還流温度で７時間撹拌し、この時点で、混合物のＴＬＣ分析は＞８０％変換を示した。混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィーで、１０％アセトニトリルの塩化メチレン溶液を溶離剤として使用して精製した。純粋生成物化合物９を淡黄色固体として得た。化合物８(１当量)のＤＭＳＯ溶液を、２０分間隔で３回に分けて、ジメチルアミノピリジン(１当量)を含む薬物−リンカー中間体化合物９(１.０〜１.５当量)のＤＭＳＯ溶液に添加した。ＲＴでアルゴン下、１〜２時間の撹拌後、混合物のＬＣＭＳ分析は、所望の葉酸−薬物コンジュゲート(化合物１０)の主生成物としての形成を示した。混合物を分取ＨＰＬＣで精製した。LCMS: [M+H]+ m/z = 959
【０２５４】
実施例６：ＦＡ−ＰＩ３Ｋ阻害剤(化合物１２)の合成
ＰＩ３Ｋ阻害剤の葉酸コンジュゲート(ＧＤＣ−０９８０)を、スキーム６に示すとおり、合成した。
【化１８】
2019519524.tif 000027
【０２５５】
ヘテロ二機能性リンカー７(５０mg、０.１２mmol)を、ＧＤＣ−０９８０(５mg、０.０１mmol)およびジメチルアミノピリジン(５mg、０.０３mmol)の４mLの塩化メチレン溶液に、ＲＴで窒素雰囲気下添加し、混合物を還流温度で７時間撹拌し、その時点で、混合物のＴＬＣ分析は＞８０％変換を示した。混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィーで、１０％アセトニトリルの塩化メチレン溶液を溶離剤として使用して精製した。純粋生成物化合物９を淡黄色固体として得た。化合物８(１当量)のＤＭＳＯ溶液を、２０分間隔で３回に分けて、ジメチルアミノピリジン(１当量)を含む薬物−リンカー中間体化合物１１(１.０−１.５当量)のＤＭＳＯ溶液に添加した。１〜２時間、アルゴン下、室温で撹拌後、混合物のＬＣＭＳ分析は所望の葉酸−薬物コンジュゲート化合物１２の主生成物としての形成を示した。混合物を分取ＨＰＬＣで精製した。LCMS: [M+H]+ m/z = 1145
【０２５６】
実施例７：ＦＡ−ＰＢＤ阻害剤(化合物２５)の合成
【化１９】
2019519524.tif 000028
フェノール化合物(２.２０ｇ、１２.１mmol)をアセトン(Ｎａ２ＳＯ４パッドで乾燥、４８.４mL)に溶解し、この溶液に１,５−ジブロモペンタン(４９.４mL、３６.３mmol)およびＫ２ＣＯ３(６.６９ｇ、４８.４mmol)を添加した。反応物を、Ａｒ下、６時間加熱還流した。反応物をＲＴに冷却し、固体を濾去した。濾液を濃縮し、CombiFlashで０〜３０％ＥｔＯＡｃ／ｐ−エーテルで精製して、化合物１３(３.３８９３ｇ、収率８４.５％)を固体として得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 331. 1H NMR(CDCl3, δ in ppm): 7.65 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 8.50 Hz, 1H), 4.08 (t, J = 6.50 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.44 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.95 (m, 4H), 1.65 (m, 2H)
【０２５７】
化合物１３(３.３８９３ｇ、１０.２３mmol)のＡｃ２Ｏ(５２mL)溶液を０℃に冷却し、Ｃｕ(ＮＯ３)・３Ｈ２Ｏ(２.９６７ｇ、１２.２８mmol)のゆっくりした添加により処理した。反応物を０℃で１時間、次いでＲＴで２時間撹拌した。反応完了後、反応混合物を氷水に注加し、１時間撹拌した。得られた沈殿を濾取した。生成物を水(３×)で洗浄し、空気乾燥させて、化合物１４(３.７０９７ｇ、収率９６％)を得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 376. 1H NMR(CDCl3, δ in ppm): 7.41 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 4.08 (t, J = 6.50 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.42 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.93 (m, 4H), 1.63 (m, 2H)
【０２５８】
化合物１４(３７.６mg、０.１mmol)およびＨｏｃｈｅｓｔ色素(５３.３mg、０.１mmol)のＤＭＦ(１.５mL)溶液を、Ａｒ下、Ｋ２ＣＯ３でｒｔで処理した。反応物を６０℃に加熱し、一夜維持した。次いで反応物をｒｔに冷却し、固体を濾別した。残留固体を分取ＨＰＬＣ(移動相Ａ：５０mM  ＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ７.０；Ｂ＝ＡＣＮ。方法：１０〜１００  Ｂ％を３０分)で精製して、化合物１５(１３.１mg、収率１８％)を得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 720.71
【０２５９】
化合物１５(１３.１mg、０.０１８２mmol)をＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ(３／１／１、０.２mL)に溶解し、ＬｉＯＨ水溶液(１Ｍ、３６μL)で４時間、ｒｔでＡｒ下処理した。大部分の溶媒を減圧下除去し、水相を濃ＨＣｌでｐＨ２〜３まで酸性化し、沈殿を濾過により固体として取得した(化合物１６、１２.８mg、精製せず)。次工程のために、濾液を水(３×)で洗浄し、空気乾燥させた。LCMS: [M+H]+ m/z = 706
【０２６０】
化合物１６(１５.７mg、０.０２２mmol)のＭｅＯＨ(１０mL)を、２時間、パールシェーカー(１０％湿Ｐｄ／Ｃ、５％ｗｔ、７.８５mg、Ｈ２  ４１PSI)中の水素化に付した。生成物をセライトパッドでの濾過により単離した。溶媒を減圧下除去して、粗製化合物１７を得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 676.79
【０２６１】
【化２０】
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Ｖａｌ−Ａｌａ−ＯＨ(１ｇ、５.３１mM)の水(４０ml)溶液に、Ｎａ２ＣＯ３(１.４２ｇ、１３.２８mM)を添加し、０℃で冷却し、ジオキサン(４０mL)を添加した。Ｆｍｏｃ−Ｃｌ(１.４４ｇ、５.５８mM)のジオキサン(４０mL)溶液を、１０分かけて、０℃で添加した。反応混合物を０℃で２時間撹拌し、次いでＲＴで１６時間撹拌した。ジオキサンを減圧下除去し、反応混合物を水(４５０mL)で希釈し、１Ｎ  ＨＣｌを使用してｐＨを２に調節し、ＥｔＯＡｃ(３×２５０mL)で抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮し、乾燥させて、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＯＨを得た。この生成物を乾燥ＤＣＭ(２５ml)に懸濁し、ＰＡＢＡ(０.７８５ｇ、６.３８mM)およびＥＥＤＱ(１.９７１ｇ、７.９７mM)を添加し、得られた混合物をアルゴン下メタノールで透明溶液が得られるまで処理した。反応物を一夜撹拌し、濾過した。濾液をジエチルエーテル(４×)で洗浄し、高真空下乾燥させて、化合物１８(１.８５ｇ、６８％)を得た。1H NMR (500 MHz, CD3OD): δ 7.79 (d, J1 = 8.0 Hz, 2H), 7.65 (t, J1 = 7.0 Hz, J2 = 7.5 Hz, 2H), 7.54 (d, J1 = 8.0 Hz, 2H), 7.38 (t, J1 = 7.5 Hz, J2 = 7.5 Hz, 2H), 7.33-7.24 (m, 4H), 4.54 (s, 2H), 4.48 (q, J1 = 14.0 Hz, J2 = 7.0 Hz, 1H), 4.42-4.32 (m, 2H), 4.22 (t, J1 = 7.0 Hz, J2 = 6.5 Hz, 1H), 3.94 (d, J1 = 7.0 Hz, 1H), 2.07 (m, 1H), 1.43 (d, J1 = 7.5 Hz, 3H), 0.97 (d, J1 = 7.0 Hz, 3H), 0.95 (d, J1 = 7.0 Hz, 3H); LCMS (ESI):(M + H)+ = C30H33N3O5の計算値, 516.24;実測値516.24
【０２６２】
【化２１】
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化合物１９。(Ｓ)−１−ｔｅｒｔ−ブチル２−メチル４−オキソピロリジン−１,２−ジカルボキシレートを、ウィッティヒ反応により化合物１９に変換した。Ｐｈ３ＰＣＨ３Ｂｒ(９１７.８mg、２.５７mmol)のＴＨＦ(３０mL)溶液をＫＯｔＢｕ(ＴＨＦ中１Ｍ、２.５７μL、２.５７mmol)で０℃で滴下により処理した。反応物を環境温度に２時間維持した。撹拌中の溶液に、ケトン(２５０mg、１.０２８mmol)のＴＨＦ(２０mL)溶液を０〜１０℃で添加した。次いで反応物を環境温度で一夜撹拌した。Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＡｃ(１：１、４０mL)で反応停止させ、大部分のＴＨＦを減圧下除去した。水相をＥｔＯＡｃ(２０mL、３×)で抽出し、有機相をＨ２Ｏおよび塩水で連続的に洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物をCombiFlashで、０〜５０％ＥｔＯＡｃ／石油エーテル中で精製して、化合物１９(７７.２mg、３１％)を得た。LCMS: [M-Boc+H]+ m/z = 142
【０２６３】
化合物２０。(Ｓ)−１−ｔｅｒｔ−ブチル２−メチル４−メチレンピロリジン−１,２−ジカルボキシレート(３５３.２mg、１.４６mmol)のＤＣＭ／トルエン(１：３、９.８mL)溶液を、ＤＩＢＡＬ(トルエン中１Ｍ、２当量、２.９２mmol)の−７８℃でアルゴン下の滴下により処理した。反応物を−７８℃で約４時間撹拌した。次いで、６０μLのＭｅＯＨの−７８℃での添加、続く５％ＨＣｌ(０.５mL)およびＥｔＯＡｃ(１８mL)添加により反応停止させた。冷却浴を除き、反応物を３０分撹拌した。ＥｔＯＡｃ層を分離し、塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、化合物２０を得た。
【０２６４】
【化２２】
2019519524.tif 000031
【０２６５】
化合物２０(５５０mg、２.６mmol)をＤＣＭ(１０mL)に溶解し、ＭｇＳＯ４(３ｇ)を添加して、エタノールアミン(０.１６mL、２.６mmol)のＤＣＭ(１０mL)を滴下した。反応物をｒｔで１時間撹拌した。減圧下の濾過および濃縮により、オキサゾリン中間体を得た。他のフラスコで、化合物１８(５１６mg、１.０mmol)をＴＨＦ(４０mL)に溶解し、ピリジン(０.８mL、１０mmol)を添加した。溶液を−７８℃に冷却し、ジホスゲン(０.１６mL、１.５mmol)を添加した。反応物を−７８℃で１時間撹拌し、ＤＣＭ(２０mL)およびオキサゾリジン中間体溶液を滴下した。反応混合物を数時間で−２０℃に温めた。ＬＣ−ＭＳおよびＴＬＣは生成物形成を示した。反応混合物をシリカゲルと共に濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー(１２０金Redisepカラム、０〜１００％ＥｔＯＡｃの石油エーテル溶液)で精製して、化合物２１(０.５９ｇ、７４％)を得た。LCMS (ESI):(M + H)+ = C44H53N5O9計算値, 796.38;実測値796.74
【０２６６】
【化２３】
2019519524.tif 000032
【０２６７】
化合物２１(１０１.０mg、０.１２７mmol)をＴＦＡ／ＤＣＭ(各０.５mL)中、ｒｔで３０分撹拌した。ＬＣ−ＭＳはＢｏｃ基の完全除去を示した。反応混合物を高真空下濃縮してＴＦＡおよびＤＣＭを除去し、ＤＭＦ(１.０mL)に再溶解し、ヒューニッヒ塩基(０.３mL)添加によりｐＨを８〜９に調節した。化合物１７(８６.０mg、０.１２７mmol)、ＰｙＢｏＰ(８４mg、０.１６mmol)を添加し、反応物をｒｔで２時間撹拌した。９０分のＬＣ−ＭＳ主要ピークが所望の生成物を有することを示した。反応混合物をシリカゲルカートリッジに載せ、フラッシュクロマトグラフィー(１２ｇ金、０〜３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ)で精製して、所望の生成物、化合物２２(１４０mg、８１％)を得た。LCMS (ESI):(M + H)+ = C77H84N12O11計算値, 1353.64;実測値1354.18
【０２６８】
【化２４】
2019519524.tif 000033
【０２６９】
化合物２２(１４０mg、０.１０mmol)をＤＥＡ／ＤＣＭ(１２／１８mL)に溶解し、ｒｔで３０分撹拌した。ＬＣ−ＭＳはＦｍｏｃ基の完全除去を示した。反応混合物を高真空下で濃縮して過剰のジエチルアミンを除去し、ＤＣＭ(５mL)に再溶解した。市販α−マレイミドプロピオニル−ω−スクシンイミジル−４−(エチレングリコール)(Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ)(６２mg、０.１２mmol)を添加し、反応物をｒｔで１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＤＭＳＯに再溶解し、ＨＰＬＣカラムに直接充填して、分取ＨＰＬＣ(Ｃ１８カラム、５〜８０％ＡＣＮ／ｐＨ７緩衝液)で精製して、所望の生成物化合物２３(５５.８mg、３６％)を得た。LCMS: [M+2H]2+ m/z = C80H100N14O17計算値, 765.37;実測値765.74
【０２７０】
Ｎ１０−ＴＦＡ保護化合物２４。Ｎ１０−ＴＦＡ保護化合物２４を次の方法により製造した。
【化２５】
2019519524.tif 000034
【０２７１】
化合物２４をＷＯ２０１４／０６２６７９に記載のとおり製造した。化合物２４を次の方法により製造した。
【化２６】
2019519524.tif 000035
【０２７２】
【化２７】
2019519524.tif 000036
化合物２４(９.８５mg、０.００６mmol)をＤＭＳＯ(２mL)中、溶解するまで撹拌した。ＤＩＰＥＡ(５０μL)、化合物２３(６.２４mg、０.００４mmol)のＤＭＳＯ(２mL)溶液を添加した。反応物をＲＴで５０分撹拌した。１０分のＬＣ−ＭＳ分析は、完全な変換を示した。反応混合物を直接分取ＨＰＬＣカラムに載せ、精製して(１０〜１００％ＭｅＣＮ／重炭酸アンモニウム、ｐＨ７緩衝液)、所望の生成物実施例２５(５.５mg、４２％)を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-D6 + D2O)(選択データ): δ 8.60 (s, 1H), 8.44-8.08 (m*, 1H), 8.07 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.06-7.84 (m*, 2H), 7.80-7.57 (m*, 2H), 7.57 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 7.44 (m*, 1H), 7.22 (m*, 2H), 7.08 (d, J = 8 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.33 (s, 1H), 4.95 (m*, 4H), 4.45 (m*, 3H); LCMS: [M+4H]4+ m/z = C145H198N30O51S計算値, 803.34;実測値803.80
【０２７３】
比較実施例１：
【化２８】
2019519524.tif 000037
(ここでは競合剤または競合ともいう)
【図１】
2019519524.tif 000042
【図２】
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【図３】
2019519524.tif 000044
【図４】
2019519524.tif 000045
【図５】
2019519524.tif 000046
【図６】
2019519524.tif 000047
【図７−１】
2019519524.tif 000048
【図７−２】
2019519524.tif 000049
【図８−１】
2019519524.tif 000050
【図８−２】
2019519524.tif 000051
【図９−１】
2019519524.tif 000052
【図９−２】
2019519524.tif 000053
【図１０】
2019519524.tif 000054
【図１１】
2019519524.tif 000055
【図１２】
2019519524.tif 000056
【図１３】
2019519524.tif 000057
【図１４】
2019519524.tif 000058
【図１５】
2019519524.tif 000059
【図１６】
2019519524.tif 000060
【図１７】
2019519524.tif 000061
【図１８】
2019519524.tif 000062
【図１９】
2019519524.tif 000063
【図２０】
2019519524.tif 000064
【図２１】
2019519524.tif 000065
【図２２】
2019519524.tif 000066
【図２３】
2019519524.tif 000067
【図２４】
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【図２５】
2019519524.tif 000069
【図２６】
2019519524.tif 000070
【図２７】
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【図２８】
2019519524.tif 000072
【図２９】
2019519524.tif 000073
【図３０−１】
2019519524.tif 000074
【図３０−２】
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【図３１−１】
2019519524.tif 000076
【図３１−２】
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【図３２】
2019519524.tif 000078
【図３３】
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【図３４】
2019519524.tif 000080
【図３５】
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【図３６】
2019519524.tif 000082
【図３７】
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【国際調査報告】
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