(57)【要約】  本発明は、自然免疫を調節することによる諸疾患の予防または治療に関する。本発明は、患者の諸疾患の予防または治療に使用するためのＣｂｌファミリー阻害剤（ここでＣｂｌファミリー阻害剤は、Ｓｙｋの結合ペプチドと、細胞送達部分と、ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドとを含み、ここでＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、Ｃｂｌファミリータンパク質のＴＫＢドメインに結合する）、キットおよびこれらの利用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞送達部分と、ｃａｓｉｔａｓ  Ｂ系列リンパ腫ファミリー（Ｃｂｌファミリー）チロシンキナーゼ結合（ＴＫＢ）ドメイン結合ペプチドを含む融合ペプチド。
【請求項２】
前記細胞送達部分が膜透過ペプチドである、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項３】
前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）のペプチド断片である、請求項１または２に記載の融合ペプチド。
【請求項４】
前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドがＣｂｌ−ｂ結合ペプチドであり、好ましくはＣｂｌ−ｂのＴＫＢドメインの結合ペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項５】
前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、配列モチーフＮ／ＤＸｐＹ、好ましくはＮ／ＤＸ１ｐＹＸ２Ｐを有し（ここで、Ｘ、Ｘ１およびＸ２は任意のアミノ酸から選択され、Ｎ／Ｄはアスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）であり、ｐＹはホスホチロシンである）、前記配列モチーフが、場合によってはＤ型またはレトロ−インベルソ型のアミノ酸を１個以上含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項６】
前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、以下のコンセンサス配列：
ＳＦＮＰＹＥＰＸ１Ｘ２Ｘ３
を含み（ここでＸ１〜Ｘ３は、独立に、任意のアミノ酸から選択される）、好ましくは前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドはＳｙｋのペプチド断片であり、より好ましくは前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、配列ＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧ、ＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧ、ＳＦＮＰＹＥＰＥＶＡ、またはＳＦＮＰＹＥＰＥＬＡを含み、これら配列のいずれかは、場合によってはＤ型またはレトロ−インベルソ型の１個以上のアミノ酸を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項７】
前記配列中のチロシンがリン酸化されている、請求項６に記載の融合ペプチド。
【請求項８】
前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、ＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドであって、前記ペプチドは自然免疫の調節因子であり、好ましくは自然抗寄生虫免疫、または自然抗真菌免疫、または自然抗腫瘍免疫の調節因子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと、前記ペプチドの細胞取り込みを促進する、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物であって、好ましくは医薬として許容可能な前記担体は、小胞、ミセル、リポソームおよびミクロソームから選択され、より好ましくは前記医薬組成物は、非経口投与用、特に静脈内投与用、動脈内投与用、筋肉内投与用、髄腔内投与用、皮下投与用、腹腔内投与用、または局所投与用いずれかに調製されており、好ましくは皮膚浸透促進剤をさらに含む医薬組成物。
【請求項１０】
治療に利用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合ペプチドまたは医薬組成物であって、前記ペプチドまたは組成物は患者に投与されるものであり、好ましくは前記ペプチドはＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドである、融合ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１１】
患者で、腫瘍、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症（特に細胞内寄生虫感染症）、もしくは薬剤性免疫抑制の予防または治療に利用するための、請求項１０に記載の融合ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１２】
患者の治療においてワクチンアジュバントとして利用するためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤であって、好ましくはＣｂｌファミリータンパク質阻害剤はＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドであり、より好ましくはＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドである、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤。
【請求項１３】
患者の真菌感染症の予防または治療に利用するためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤であって、前記真菌感染症が、酵母感染症、好ましくはカンジダ症またはクリプトコッカス症である、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤。
【請求項１４】
患者の真菌感染症の予防または治療に利用するためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤であって、前記Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤が、ＳｙｋのＣｂｌファミリー結合ペプチドを含む、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤。
【請求項１５】
前記真菌感染症が酵母感染症であり、好ましくはカンジダ症（特にカンジダ・アルビカンス感染症、カンジダ・グラブラタ感染症、カンジダ・クルセイ感染症またはカンジダ・ドゥブリニエンシス感染症）、皮膚糸状菌感染症、またはアスペルギルス感染症である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の利用のためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤またはペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１６】
アジュバントとしてＣｂｌファミリータンパク質阻害剤を含むワクチンであって、好ましくは前記Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤が、ＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと、少なくとも１つの抗原を含み、好ましくは前記Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤が、請求項１〜８および請求項１０〜１５のいずれか１項に定義されるものある、ワクチン。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のペプチドと、医薬として許容可能な賦形剤、好ましくは患者の細胞内投与に適していることが好ましい賦形剤とを含むキット。
【請求項１８】
インビトロまたはインビボで免疫細胞を刺激または活性化する方法であって、前記免疫細胞を、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと接触させる、または処理することを含み、好ましくはサイトカインが産生され、より好ましくは前記サイトカインがＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３およびＴＮＦから選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＣｂｌファミリータンパク質阻害剤に関するとともに、Ｃｂｌファミリーメンバーを抑制して免疫系の活性を調節し、特に真菌感染症（特にカンジダ症）またはがんを予防または治療することに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｅ３ユビキチンリガーゼのＣｂｌファミリーは、メンバーとして３種類のタンパク質、すなわちＣｂｌ（ｃ−Ｃｂｌとしても知られる）、Ｃｂｌ−ｂ、Ｃｂｌ−ｃ（Ｃｂｌ−３としても知られる）を含んでいる。Ｃｂｌ−ｂ（ｃａｓｉｔａｓ  ｂ系列リンパ腫ｂ）は、元々は適応免疫応答の負の調節因子として報告された。極めて重要なシグナル伝達分子がＣｂｌ−ｂを媒介としてユビキチン化されることにより、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のシグナル伝達とＢ細胞受容体（ＢＣＲ）のシグナル伝達の両方が変化する。その帰結として、Ｃｂｌ−ｂは、いくつかの疾患（特にがん）の治療において免疫療法の標的となってきた（アメリカ合衆国特許出願公開第２０１０／０２６０８０８  Ａ号）。アメリカ合衆国特許第８，１６８，１７６  Ｂ２号には、Ｃｂｌ−ｂの投与によって内毒素を媒介とした病気（敗血症を含む）を治療する方法が記載されている。Ｃｂｌ−ｂの別の役割は、ＮＫ細胞を媒介とした抗腫瘍免疫（アメリカ合衆国特許出願公開第２０１４／００１０７８１  Ａ号）、マスト細胞におけるＦｃεＲシグナル伝達、インテグリンのシグナル伝達、ＤＣ機能におけるものであり、Ｃｂｌ−ｂの機能が自然免疫系の細胞へと拡張される。Ｃｂｌ−ｂが標的とするシグナル伝達分子は特定の経路に特異的ではないことがしばしばあるため、多数のシグナル伝達モジュールによって使用され得る。
【０００３】
Ｋａｗａｉ（２０１５年）は、アテロコラーゲン（ＡＴＣＯＬ）をベースとした送達方法を利用してペンタペプチドをＣｂｌ−ｂ阻害剤として細胞に送達することによる骨格筋萎縮の予防に関する。
【０００４】
Ｋｕｍａｒ（２０１２年）は、Ｃｂｌ（ＴＫＢ）（ｃ−Ｃｂｌとしても知られる）阻害剤の同定に関する。
【０００５】
Ｒｕｚｚａ（２００９年）は、治療薬としてのＳｙｋ阻害剤の見通しに関する。Ｓｙｋ阻害剤は、Ｓｙｋの効果を増進するＣｂｌ阻害剤とは反対の効果を有する。
【０００６】
真菌は、重病の患者における主要な病原体であるとますます認識されてきており（Ｅｎｏｃｈ他、２００６年）、真菌感染症は毎年１５０万人の生命を奪っていると推定されている。カンジダ種とクリプトコッカス種は、臨床において最も高頻度で単離される酵母である。カンジダ・アルビカンスは、先進国において重篤な真菌感染症を患っている患者から最も高頻度で単離される真菌病原体である（Ｋｕｌｌｂｅｒｇ他、２０１５年）。アスペルギルス種は、最も一般的に単離される侵襲性カビである（Ｄｅｎｎｉｎｇ、１９９８年）。抗悪性腫瘍剤と免疫抑制剤、広域抗生物質、人工装具とグラフト、より侵襲的な手術を利用することが理由で、侵襲性真菌感染症が増加している。火傷や膵炎の患者も真菌感染症になりやすい（Ｅｎｏｃｈ他、２００６年）。免疫状態が損なわれた患者は、ＨＩＶ感染（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ−Ｊａｍｅｓ他、２０１４年；Ｂｒｏｗｎ他、２０１４年；Ｐａｒｋ他、２００９年）や、免疫抑制（Ｒａｖｉｋｕｍａｒ他、２０１５年）や、ある種の原発性免疫不全（Ｌａｎｔｅｒｎｉｅｒ他、２０１３年；Ｌｏｒｔｈｏｌａｒｙ他、１９９７年）で観察されるように、深刻な真菌感染症が進行する大きなリスクを抱えている。
【０００７】
酵母、カビ、二形性菌が、ヒトで疾患を引き起こすことが知られている３種類の真菌である（Ｊａｉｎ他、２０１０年）。真菌感染症は３つのグループに分類される。すなわち１）皮膚、毛髪、爪に存在する表面的／皮膚感染症、２）皮膚の下の組織に存在する皮下感染症、３）全身性感染症である。
【０００８】
いくつかの抗真菌剤が異なる種類の真菌感染症の治療に用いられている。アムホテリシンＢは、大半の酵母とカビに対して有効な非常に広域の活性を有するポリエンであり、抗真菌剤のクラスに属していて局所または全身に投与することができる。しかし副作用が５０〜９０％のケースで発生しており、それは通常は腎毒性または輸注関連である。発熱、寒気、吐き気、嘔吐、低血圧が、それ以外の副作用である。フルコナゾールはアゾール系抗真菌剤に属しており、経口投与または静脈内投与される。欠点には、いくつかのカンジダ株の抵抗性と、頭痛、吐き気、嘔吐、肝臓酵素の上昇といった副作用が含まれる。
【０００９】
さらに、Ｃｂｌタンパク質にはさまざまな機能があること、そしてＣｂｌタンパク質が、がんの進行と、がんに対する免疫応答の調節の両方において役割を果たしていることから、多面的な治療機会が提供される。したがってＣｂｌタンパク質によって調節される経路を標的とすることで、がんを治療する魅力的な機会が提供される可能性がある。
【００１０】
まとめると、既知の抗真菌剤または抗がん剤の有効性および／または安全性は多くの場合にまだ不十分であるため、新しい抗真菌剤と抗がん剤が大いに必要とされている。真菌感染症および／またはがんを予防または治療するための新規な化合物と方法を提供することが、本発明の目的の１つである。
【発明の概要】
【００１１】
本発明により、ｃａｓｉｔａｓ  ｂ系列リンパ腫ファミリー（Ｃｂｌファミリー）活性を抑制する方法と手段が提供され、この方法と手段により、特に真菌感染症に感染したとき、またはがんに罹患したときに患者の健康を顕著に改善することができて、真菌感染症で罹患率（例えば図１ａ参照）と死亡率（図１ｂ）を顕著に低下させることと、がんで腫瘍の成長を顕著に低下させること（図１５ａ）が可能であることが非常に際立っている。したがって本発明により、患者で真菌感染症および／またはがんの予防または治療に用いるためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤が提供される。真菌感染症は酵母感染症であることが好ましく、日和見酵母感染症であることがより好ましい。より一層好ましいのは、真菌感染症がカンジダ症またはクリプトコッカス症であることである。一実施態様では、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤は、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の結合ペプチドを含んでいる。
【００１２】
本発明の別の１つの側面では、細胞送達部分とＣｂｌファミリータンパク質結合ペプチドを含んでいて、そのＣｂｌファミリータンパク質結合ペプチドがＣｂｌファミリーのメンバーのチロシンキナーゼ結合（ＴＫＢ）ドメインに結合する融合ペプチドが提供される（したがってこのペプチドは、ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドとも呼ばれる）。注目すべきことに、この融合ペプチドは、致死的真菌感染症（図１２ｂ）とがん（図１５ａ）からの保護に非常に有効であることがわかったが、任意の用途または利用でＣｂｌファミリータンパク質阻害剤として使用することができ、その中には治療での利用が含まれる。
【００１３】
さらに本発明は、細胞送達部分とＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドを含んでいて、そのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドがイントラマーまたはアプタマーであってＣｂｌファミリーのタンパク質を抑制する融合ペプチドに関する。このＣｂｌファミリー結合ペプチドは、Ｃｂｌファミリーのメンバー（Ｃｂｌ−ｂが好ましい）のＴＫＢドメインに結合することが好ましい。
【００１４】
本発明はさらに、患者でワクチンアジュバントとして用いるためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤に関するものであり、そのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤は、ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドである。Ｃｂｌファミリー結合ペプチドは、Ｃｂｌファミリータンパク質のＴＫＢドメインに結合することが好ましい。特に好ましいのは、Ｓｙｋのペプチド（断片）、またはＳｙｋに由来するペプチド（断片）である。
【００１５】
本発明は、上記の融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと、細胞へのそのペプチドの取り込みを促進する、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物にも関する。
【００１６】
それに加えてさらに、本発明により、アジュバントとしてＣｂｌファミリータンパク質阻害剤を含むワクチンが提供される。Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤は、ＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと、少なくとも１つの抗原であることが好ましい。
【００１７】
別の１つの側面では、本発明は、上記のペプチドと医薬として許容可能な賦形剤を含むキットにも関する。医薬として許容可能な賦形剤は、患者で細胞内投与するのに適していることが好ましい。
【００１８】
本発明は、自然免疫を調節する方法にも関係しており、この方法は、Ｃｂｌファミリータンパク質を抑制することを含んでいる。上記の融合ペプチドまたはＣｂｌファミリータンパク質阻害剤を患者に投与することが好ましい。
【００１９】
さらに、別の１つの側面では、本発明は、インビトロまたはインビボで免疫細胞を刺激または活性化する方法に関するものであり、この方法は、その細胞を上記の融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと接触させること、またはその細胞を上記の融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドで処理することを含んでいる。
【００２０】
本発明のすべての側面と実施態様は、Ｃｂｌファミリータンパク質結合ペプチドを用いたＣｂｌファミリータンパク質の抑制に関する。明示的に述べられている場合は除き、本明細書に提示するより詳細なすべての一般的な記述と具体的な記述は、好ましい実施態様を含め、本発明のあらゆる側面と利用に同様に関係する。例えばペプチドまたはそのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合部分の好ましい任意の定義を本発明のあらゆる側面または方法で用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１−１】図１：Ｃｂｌ−１が抗真菌免疫を調節する。（ａ、ｂ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウス、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウス、Ｃｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａマウスの静脈内にカンジダ・アルビカンスを感染させ（体重２１．５ｇに１０５ＣＦＵ）、示されている期間モニタした。グラフに示されているのは、（ａ）開始時の体重と比較した感染後の体重減少の経時変化（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）、または（ｂ）感染後の生存率の経時変化（Ｐ値はログ・ランク検定で評価）である。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａマウスではｎ＝６、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスではｎ＝７。（ｃ）感染後７日目の、示されている臓器内の真菌カンジダ・アルビカンス負荷であり、臓器の重量１ｇ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）で示してある。各点は個々のマウスを表わす。（ｄ、ｅ）カンジダ・アルビカンスを全身に感染させてから７日後のマウスからの代表的な腎臓切片を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色（ｄ）。挿入写真は、四角で囲んだ領域からの腎炎領域を大きな倍率で示している。（ｅ）腎臓免疫細胞浸潤、炎症、組織破壊の程度に基づく総合炎症スコア。（ｆ、ｇ）カンジダ・アルビカンスを感染させてから７日後のマウスからの代表的な腎臓切片をゴモリメテナミン銀（ＧＭＳ）で染色（ｆ）。挿入写真は、四角で囲んだ領域からの真菌増殖領域を大きな倍率で示している。黄色の矢印頭部は真菌菌糸を示す。（ｇ）グラフには、病巣内の真菌負荷を、ＧＭＳ染色した腎臓切片の病理組織学的評価によって点数化して示してある。（ｈ、ｉ）好中球マーカーＬｙ−６Ｇに関して染色した代表的な腎臓切片（ｈ）。挿入写真は、四角で囲んだ領域からの好中球浸潤領域を示している。（ｉ）グラフは、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウエアを用いてＬｙ−６Ｇに関して陽性である腎臓領域の割合を示している。図（ｄ〜ｇ）に関し、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスではｎ＝４、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスではｎ＝５であり、図（ｈ、ｉ）に関し、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスではｎ＝４、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスではｎ＝４であり、図（ｄ〜ｉ）に関し、マウス１匹につき４つの切片を分析した。図（ｃ、ｅ、ｇ、ｉ）に関し、データは平均値±標準偏差で示してある。すべての実験について、３〜６回独立に繰り返した中の１つの代表的な実験を示してある。特に断わらない限り、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図１−２】図１：Ｃｂｌ−１が抗真菌免疫を調節する。（ａ、ｂ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウス、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウス、Ｃｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａマウスの静脈内にカンジダ・アルビカンスを感染させ（体重２１．５ｇに１０５ＣＦＵ）、示されている期間モニタした。グラフに示されているのは、（ａ）開始時の体重と比較した感染後の体重減少の経時変化（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）、または（ｂ）感染後の生存率の経時変化（Ｐ値はログ・ランク検定で評価）である。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａマウスではｎ＝６、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスではｎ＝７。（ｃ）感染後７日目の、示されている臓器内の真菌カンジダ・アルビカンス負荷であり、臓器の重量１ｇ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）で示してある。各点は個々のマウスを表わす。（ｄ、ｅ）カンジダ・アルビカンスを全身に感染させてから７日後のマウスからの代表的な腎臓切片を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色（ｄ）。挿入写真は、四角で囲んだ領域からの腎炎領域を大きな倍率で示している。（ｅ）腎臓免疫細胞浸潤、炎症、組織破壊の程度に基づく総合炎症スコア。（ｆ、ｇ）カンジダ・アルビカンスを感染させてから７日後のマウスからの代表的な腎臓切片をゴモリメテナミン銀（ＧＭＳ）で染色（ｆ）。挿入写真は、四角で囲んだ領域からの真菌増殖領域を大きな倍率で示している。黄色の矢印頭部は真菌菌糸を示す。（ｇ）グラフには、病巣内の真菌負荷を、ＧＭＳ染色した腎臓切片の病理組織学的評価によって点数化して示してある。（ｈ、ｉ）好中球マーカーＬｙ−６Ｇに関して染色した代表的な腎臓切片（ｈ）。挿入写真は、四角で囲んだ領域からの好中球浸潤領域を示している。（ｉ）グラフは、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウエアを用いてＬｙ−６Ｇに関して陽性である腎臓領域の割合を示している。図（ｄ〜ｇ）に関し、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスではｎ＝４、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスではｎ＝５であり、図（ｈ、ｉ）に関し、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスではｎ＝４、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスではｎ＝４であり、図（ｄ〜ｉ）に関し、マウス１匹につき４つの切片を分析した。図（ｃ、ｅ、ｇ、ｉ）に関し、データは平均値±標準偏差で示してある。すべての実験について、３〜６回独立に繰り返した中の１つの代表的な実験を示してある。特に断わらない限り、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図２−１】図２：カンジダ種とリステリア・モノサイトゲネスの感染。（ａ）示されている遺伝子型のマウスの腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）または脾臓から調製したライセートに含まれるＣｂｌ−ｂのタンパク質レベルをウエスタンブロッティングで評価。β−アクチンを負荷対照として示してある。（ｂ）図１ｈからのＬｙ−６Ｇで染色した腎臓切片の代表的なＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウエア分析。（ｃ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの静脈内にカンジダ・ドゥブリニエンシスを感染させ（１０６ＣＦＵ）、示されている期間モニタした。グラフに示されているのは、感染後の生存率の経時変化である（Ｐ値はログ・ランク検定で評価）。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋コホートではｎ＝５、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δコホートではｎ＝６。（ｄ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの静脈内にリステリア・モノサイトゲネスを感染させ（１０５ＣＦＵ）、示されている期間モニタした。グラフに示されているのは、感染後の生存率の経時変化である。（ｅ、ｆ）示されている遺伝子型のマウスの（ｅ）大腿骨または（ｆ）脾臓について、示されている自然免疫細胞系の頻度と全免疫細胞のカウント数をフローサイトメトリーによって評価。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋同腹マウスではｎ＝８、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ同腹マウスではｎ＝１１。データは平均値±標準偏差で示してある。図（ａ、ｂ、ｄ、ｅ、ｆ）に関しては３つの独立な実験のうちの１つの代表、図（ｃ）に関しては２つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。特に断わらない限り、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図２−２】図２：カンジダ種とリステリア・モノサイトゲネスの感染。（ａ）示されている遺伝子型のマウスの腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）または脾臓から調製したライセートに含まれるＣｂｌ−ｂのタンパク質レベルをウエスタンブロッティングで評価。β−アクチンを負荷対照として示してある。（ｂ）図１ｈからのＬｙ−６Ｇで染色した腎臓切片の代表的なＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウエア分析。（ｃ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの静脈内にカンジダ・ドゥブリニエンシスを感染させ（１０６ＣＦＵ）、示されている期間モニタした。グラフに示されているのは、感染後の生存率の経時変化である（Ｐ値はログ・ランク検定で評価）。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋コホートではｎ＝５、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δコホートではｎ＝６。（ｄ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの静脈内にリステリア・モノサイトゲネスを感染させ（１０５ＣＦＵ）、示されている期間モニタした。グラフに示されているのは、感染後の生存率の経時変化である。（ｅ、ｆ）示されている遺伝子型のマウスの（ｅ）大腿骨または（ｆ）脾臓について、示されている自然免疫細胞系の頻度と全免疫細胞のカウント数をフローサイトメトリーによって評価。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋同腹マウスではｎ＝８、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ同腹マウスではｎ＝１１。データは平均値±標準偏差で示してある。図（ａ、ｂ、ｄ、ｅ、ｆ）に関しては３つの独立な実験のうちの１つの代表、図（ｃ）に関しては２つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。特に断わらない限り、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図３】図３：免疫細胞内のＣｂｌ−ｂが真菌による病変から保護する。（ａ、ｂ）病巣に致死線量を照射した後のＣｂｌ−ｂ＋／＋マウス、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウス、Ｃｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａマウスいずれかからの骨髄を用いてＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスを再構成した。再構成してから８週間後、マウスの静脈内にカンジダ・アルビカンスを感染させ（体重２１．５ｇに１０５ＣＦＵ）、示されている期間モニタした。グラフに示されているのは、（ａ）開始時の体重と比較した感染後の体重減少の経時変化（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）、または（ｂ）感染後の生存率の経時変化（Ｐ値はログ・ランク検定で評価）である。すべてのコホートでｎ＝６。（ｃ、ｄ）（ａ）におけるようにしてＣｂｌ−ｂ＋／＋／Ｒａｇ２Δ／ΔマウスまたはＣｂｌ−ｂΔ／Δ／Ｒａｇ２Δ／Δマウスに感染させて（ｃ）体重減少と（ｄ）死亡率を数値化した。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋／Ｒａｇ２Δ／Δマウスではｎ＝７、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ／Ｒａｇ２Δ／Δマウスではｎ＝６。（ｅ、ｆ）病巣に致死線量を照射した後のＣｂｌ−ｂ＋／＋／Ｒａｇ２Δ／ΔマウスまたはＣｂｌ−ｂΔ／Δ／Ｒａｇ２Δ／Δマウスからの骨髄を用いてＲａｇ２Δ／Δマウスを再構成した。再構成してから８週間後、（ａ）におけるようにしてマウスに感染させて（ｅ）体重減少と（ｆ）死亡率を数値化した。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋／Ｒａｇ２Δ／ΔマウスからＲａｇ２Δ／Δマウスへはｎ＝６、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ／Ｒａｇ２Δ／ΔマウスからＲａｇ２Δ／Δマウスへはｎ＝５。（ｇ、ｈ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウス、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウス、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋／Ｒａｇ２Δ／Δマウス、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ／Ｒａｇ２Δ／Δマウスの剃毛した背中に２×１０８ＣＦＵのカンジダ・アルビカンスを感染させた。グラフは、感染してから３日後の皮膚での真菌負荷を示しており、ＣＦＵ／感染した全皮膚面積としてプロットしてある。点は個々のマウスを表わす。図（ａ、ｂ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ）に関しては３つの独立な実験のうちの１つの代表、図（ｃ、ｄ）に関しては４つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。特に断わらない限り、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図４−１】図４：免疫浸潤、ＣＬＲ発現、初期真菌負荷。（ａ、ｂ、ｃ）カンジダ・アルビカンス（体重２１．５ｇに１０５ＣＦＵ）を感染させてから２４時間後のＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの腎臓（ａ）、肺（ｂ）、肝臓（ｃ）への、示されている免疫細胞系の細胞のリクルート。グラフは、臓器ごとに、ＣＤ４５＋造血細胞の割合（左図）またはリクルートされた細胞の合計数（右図）を示している。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスに関してはｎ＝５、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスに関してはｎ＝６。（ｄ、ｅ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスから単離された末梢血の単球と好中球でのデクチン−１タンパク質の発現をフローサイトメトリーによって評価。（ｄ）代表的な染色と（ｅ）デクチン−１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示してある。（ｅ）の中の点は個々のマウスを表わす。（ｆ、ｇ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの（ｆ）骨髄細胞と（ｇ）脾臓細胞の中の示されているＣ型レクチン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを定量ＰＣＲによって評価。実験はトリプリケートで実施した。（ｈ）感染させてから２４時間後の、示されている臓器内のカンジダ・アルビカンス真菌負荷を臓器の重量１ｇ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）としてプロットしてある。各点は個々のマウスを表わす。図（ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ）ではデータを平均値±標準偏差で示してある。図（ａ、ｂ、ｃ、ｆ、ｇ）に関しては３つの独立な実験のうちの１つの代表、図（ｄ、ｅ）に関しては５つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図４−２】図４：免疫浸潤、ＣＬＲ発現、初期真菌負荷。（ａ、ｂ、ｃ）カンジダ・アルビカンス（体重２１．５ｇに１０５ＣＦＵ）を感染させてから２４時間後のＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの腎臓（ａ）、肺（ｂ）、肝臓（ｃ）への、示されている免疫細胞系の細胞のリクルート。グラフは、臓器ごとに、ＣＤ４５＋造血細胞の割合（左図）またはリクルートされた細胞の合計数（右図）を示している。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスに関してはｎ＝５、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスに関してはｎ＝６。（ｄ、ｅ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスから単離された末梢血の単球と好中球でのデクチン−１タンパク質の発現をフローサイトメトリーによって評価。（ｄ）代表的な染色と（ｅ）デクチン−１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示してある。（ｅ）の中の点は個々のマウスを表わす。（ｆ、ｇ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの（ｆ）骨髄細胞と（ｇ）脾臓細胞の中の示されているＣ型レクチン受容体のｍＲＮＡ発現レベルを定量ＰＣＲによって評価。実験はトリプリケートで実施した。（ｈ）感染させてから２４時間後の、示されている臓器内のカンジダ・アルビカンス真菌負荷を臓器の重量１ｇ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）としてプロットしてある。各点は個々のマウスを表わす。図（ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ）ではデータを平均値±標準偏差で示してある。図（ａ、ｂ、ｃ、ｆ、ｇ）に関しては３つの独立な実験のうちの１つの代表、図（ｄ、ｅ）に関しては５つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図５−１】図５：Ｃｂｌ−ｂが樹状細胞とマクロファージの抗真菌活性を制御する。（ａ〜ｅ）ＢＭ−好中球（ａ）、ＢＭ−Ｍ（ｂ）、ＢＭ−ＤＣ（ｃ）、ＢＭ−単球（ｄ）、脾臓ＤＣ（ｅ）の殺菌能力を、カンジダ・アルビカンスとともに培養することによって評価。アッセイはクワドゥルプリケートで実施した。（ｆ、ｇ）（ｆ）ファゴサイトーシス阻害剤Ｄｙｎａｓｏｒｅまたは抗デクチン−１抗体の存在下、または（ｇ）Ｓｙｋ阻害剤Ｒ４０６の存在下でのＢＭ−ＤＣの殺菌能力。（ｈ、ｉ）カンジダ・アルビカンス（体重２１．５ｇに５×１０６ＣＦＵ）を腹腔内に感染させてから２４時間後のＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの腹腔内免疫浸潤物によるＲＯＳ生成。グラフは、（ｈ）再刺激なし、または（ｉ）カンジダ・アルビカンスで再刺激した後の免疫浸潤物によるＲＯＳ生成を示している。実験はトリプリケートで実施した。（ｊ）（ｈ、ｉ）からの免疫浸潤物の殺菌能力。（ｋ、ｌ）（ｈ、ｉ）での浸潤物からＦＡＣＳでソーティングされた（ｋ）単球／マクロファージまたは（ｌ）好中球のＲＯＳ生成。（ｍ、ｎ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスまたはＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの静脈内にカンジダ・アルビカンス（体重２１．５ｇに１０５ＣＦＵ）を感染させる２４時間前と感染させた２４時間後にＰＢＳリポソームまたはクロドロン酸リポソームを注射し、（ｍ）開始時の体重と比較した体重減少（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）、または（ｎ）生存率（Ｐ値はログ・ランク検定で評価）をモニタした。ＰＢＳリポソームで処理したコホートに関してはｎ＝５、クロドロン酸リポソームで処理したコホートに関してはｎ＝８。図（ａ〜ｇ、ｊ、ｍ）ではデータを平均値±標準偏差で示してある。図（ａ〜ｆ）に関しては５つの独立な実験のうちの１つの代表、図（ｇ〜ｎ）に関しては３つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。特に断わらない限り、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図５−２】図５：Ｃｂｌ−ｂが樹状細胞とマクロファージの抗真菌活性を制御する。（ａ〜ｅ）ＢＭ−好中球（ａ）、ＢＭ−Ｍ（ｂ）、ＢＭ−ＤＣ（ｃ）、ＢＭ−単球（ｄ）、脾臓ＤＣ（ｅ）の殺菌能力を、カンジダ・アルビカンスとともに培養することによって評価。アッセイはクワドゥルプリケートで実施した。（ｆ、ｇ）（ｆ）ファゴサイトーシス阻害剤Ｄｙｎａｓｏｒｅまたは抗デクチン−１抗体の存在下、または（ｇ）Ｓｙｋ阻害剤Ｒ４０６の存在下でのＢＭ−ＤＣの殺菌能力。（ｈ、ｉ）カンジダ・アルビカンス（体重２１．５ｇに５×１０６ＣＦＵ）を腹腔内に感染させてから２４時間後のＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの腹腔内免疫浸潤物によるＲＯＳ生成。グラフは、（ｈ）再刺激なし、または（ｉ）カンジダ・アルビカンスで再刺激した後の免疫浸潤物によるＲＯＳ生成を示している。実験はトリプリケートで実施した。（ｊ）（ｈ、ｉ）からの免疫浸潤物の殺菌能力。（ｋ、ｌ）（ｈ、ｉ）での浸潤物からＦＡＣＳでソーティングされた（ｋ）単球／マクロファージまたは（ｌ）好中球のＲＯＳ生成。（ｍ、ｎ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスまたはＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの静脈内にカンジダ・アルビカンス（体重２１．５ｇに１０５ＣＦＵ）を感染させる２４時間前と感染させた２４時間後にＰＢＳリポソームまたはクロドロン酸リポソームを注射し、（ｍ）開始時の体重と比較した体重減少（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）、または（ｎ）生存率（Ｐ値はログ・ランク検定で評価）をモニタした。ＰＢＳリポソームで処理したコホートに関してはｎ＝５、クロドロン酸リポソームで処理したコホートに関してはｎ＝８。図（ａ〜ｇ、ｊ、ｍ）ではデータを平均値±標準偏差で示してある。図（ａ〜ｆ）に関しては５つの独立な実験のうちの１つの代表、図（ｇ〜ｎ）に関しては３つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。特に断わらない限り、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図６−１】図６：真菌刺激に応答したファゴサイトーシスとＲＯＳ生成。（ａ、ｂ）カンジダ・アルビカンスとともに培養した、示されている遺伝子型の（ａ）ＢＭ−Ｍまたは（ｂ）ＢＭ−ＤＣによるファゴサイトーシスの割合。（ｃ）カンジダ・アルビカンスによって刺激したまたは刺激していないＣｂｌ−ｂ＋／＋マウス由来のＢＭ−ＤＣ、ＢＭ−Ｍ、骨髄好中球から調製したライセートからのＣｂｌ−ｂタンパク質発現をウエスタンブロッティングによって評価。β−アクチンのブロットを負荷対照として示してある。（ｄ〜ｈ）カンジダ・アルビカンスとともに培養した（ｄ）骨髄好中球、（ｅ）ＢＭ−Ｍ、（ｆ）ＢＭ−ＤＣ、（ｇ）骨髄単球、（ｈ）脾臓ＤＣいずれかによる活性酸素種（ＲＯＳ）生成を、示されている期間にわたってルミノールアッセイを利用してリアルタイムでモニタした。実験はトリプリケートで実施した。数値は、細胞１，０００個当たりの相対的光単位として表示してある。（ｉ〜ｋ）（ｉ）カンジダ・グラブラタ、（ｊ）カンジダ・クルセイ、（ｋ）カンジダ・ドゥブリニエンシスのいずれかで刺激した、示されている遺伝子型のＢＭ−ＤＣによるＲＯＳ生成を（ｄ〜ｈ）のようにしてモニタし、分析した。図（ａ、ｂ）におけるデータは平均値±標準偏差で示してある。Ｐ値は、図（ａ、ｂ）に関してはスチューデントのｔ検定で計算し、図（ｄ〜ｋ）に関しては二元配置分散分析で計算した。すべての実験について３つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６−２】図６：真菌刺激に応答したファゴサイトーシスとＲＯＳ生成。（ａ、ｂ）カンジダ・アルビカンスとともに培養した、示されている遺伝子型の（ａ）ＢＭ−Ｍまたは（ｂ）ＢＭ−ＤＣによるファゴサイトーシスの割合。（ｃ）カンジダ・アルビカンスによって刺激したまたは刺激していないＣｂｌ−ｂ＋／＋マウス由来のＢＭ−ＤＣ、ＢＭ−Ｍ、骨髄好中球から調製したライセートからのＣｂｌ−ｂタンパク質発現をウエスタンブロッティングによって評価。β−アクチンのブロットを負荷対照として示してある。（ｄ〜ｈ）カンジダ・アルビカンスとともに培養した（ｄ）骨髄好中球、（ｅ）ＢＭ−Ｍ、（ｆ）ＢＭ−ＤＣ、（ｇ）骨髄単球、（ｈ）脾臓ＤＣいずれかによる活性酸素種（ＲＯＳ）生成を、示されている期間にわたってルミノールアッセイを利用してリアルタイムでモニタした。実験はトリプリケートで実施した。数値は、細胞１，０００個当たりの相対的光単位として表示してある。（ｉ〜ｋ）（ｉ）カンジダ・グラブラタ、（ｊ）カンジダ・クルセイ、（ｋ）カンジダ・ドゥブリニエンシスのいずれかで刺激した、示されている遺伝子型のＢＭ−ＤＣによるＲＯＳ生成を（ｄ〜ｈ）のようにしてモニタし、分析した。図（ａ、ｂ）におけるデータは平均値±標準偏差で示してある。Ｐ値は、図（ａ、ｂ）に関してはスチューデントのｔ検定で計算し、図（ｄ〜ｋ）に関しては二元配置分散分析で計算した。すべての実験について３つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７−１】図７：真菌刺激に応答したサイトカインの放出。（ａ）示されている遺伝子型のＢＭ−ＤＣをカンジダ・アルビカンスで刺激した後、そのＢＭ−ＤＣにおけるカスパーゼ−８の活性化を、ＣａｓｐＧＬＯＷアッセイを利用して、示されている時点でモニタした（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）。（ｂ、ｃ）示されている遺伝子型のＢＭ−ＤＣを（ｂ）抗デクチン−１またはアイソタイプ対照抗体の存在下、または（ｃ）ＳＹＫ阻害剤Ｒ４０６またはＤＭＳＯの存在下で１８時間にわたってカンジダ・アルビカンスで刺激した後のそのＢＭ−ＤＣによるＩｌ−１βの分泌をＥＬＩＳＡによって評価。（ｄ）カンジダ・アルビカンスとともに１８時間培養したときのＢＭ−ＭによるＩｌ−１βの分泌をＥＬＩＳＡで評価。（ｅ）示されている遺伝子型のＢＭ−ＤＣをカンジダ・アルビカンスで２時間にわたって刺激し、そのＢＭ−ＤＣにおけるサイトカインＲＮＡの発現誘導を定量ＰＣＲによって評価。実験はトリプリケートで実施した。（ｆ〜ｉ）（ｆ、ｇ）抗デクチン−１またはアイソタイプ対照抗体の存在下、または（ｈ、ｉ）ＳＹＫ阻害剤Ｒ４０６またはＤＭＳＯの存在下でカンジダ・アルビカンスとともに１８時間培養したときのＢＭ−Ｍによる示されているサイトカインの分泌をＥＬＩＳＡで評価。（ｊ〜ｎ）示されている遺伝子型の（ｊ、ｋ、ｎ）ＢＭ−ＤＣまたは（ｌ、ｍ）ＢＭ−Ｍをカンジダ・アルビカンスとともに１８時間培養したときの示されているサイトカインの分泌をＥＬＩＳＡで評価。すべての図でデータは平均値±標準偏差で示してある。すべての図について、Ｐ値は、（ａ）以外はスチューデントのｔ検定で計算し、図（ａ）は二元配置分散分析で計算した。図（ａ〜ｄ、ｆ〜ｎ）に関しては４つの独立な実験のうちの１つの代表例を、図（ｅ）に関しては５つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７−２】図７：真菌刺激に応答したサイトカインの放出。（ａ）示されている遺伝子型のＢＭ−ＤＣをカンジダ・アルビカンスで刺激した後、そのＢＭ−ＤＣにおけるカスパーゼ−８の活性化を、ＣａｓｐＧＬＯＷアッセイを利用して、示されている時点でモニタした（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）。（ｂ、ｃ）示されている遺伝子型のＢＭ−ＤＣを（ｂ）抗デクチン−１またはアイソタイプ対照抗体の存在下、または（ｃ）ＳＹＫ阻害剤Ｒ４０６またはＤＭＳＯの存在下で１８時間にわたってカンジダ・アルビカンスで刺激した後のそのＢＭ−ＤＣによるＩｌ−１βの分泌をＥＬＩＳＡによって評価。（ｄ）カンジダ・アルビカンスとともに１８時間培養したときのＢＭ−ＭによるＩｌ−１βの分泌をＥＬＩＳＡで評価。（ｅ）示されている遺伝子型のＢＭ−ＤＣをカンジダ・アルビカンスで２時間にわたって刺激し、そのＢＭ−ＤＣにおけるサイトカインＲＮＡの発現誘導を定量ＰＣＲによって評価。実験はトリプリケートで実施した。（ｆ〜ｉ）（ｆ、ｇ）抗デクチン−１またはアイソタイプ対照抗体の存在下、または（ｈ、ｉ）ＳＹＫ阻害剤Ｒ４０６またはＤＭＳＯの存在下でカンジダ・アルビカンスとともに１８時間培養したときのＢＭ−Ｍによる示されているサイトカインの分泌をＥＬＩＳＡで評価。（ｊ〜ｎ）示されている遺伝子型の（ｊ、ｋ、ｎ）ＢＭ−ＤＣまたは（ｌ、ｍ）ＢＭ−Ｍをカンジダ・アルビカンスとともに１８時間培養したときの示されているサイトカインの分泌をＥＬＩＳＡで評価。すべての図でデータは平均値±標準偏差で示してある。すべての図について、Ｐ値は、（ａ）以外はスチューデントのｔ検定で計算し、図（ａ）は二元配置分散分析で計算した。図（ａ〜ｄ、ｆ〜ｎ）に関しては４つの独立な実験のうちの１つの代表例を、図（ｅ）に関しては５つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８−１】図８：ザイモサン、カードラン、ＬＰＳ、ＣｐＧ、カンジダ・アルビカンスが、ＢＭ−ＤＣと腹腔内炎症浸潤物によるサイトカインの放出を開始させた。（ａ〜ｆ）（ａ〜ｃ）ザイモサンまたは（ｄ〜ｆ）カードランの用量を増やしながら１８時間刺激したＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣ、Ｃｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ  ＢＭ−ＤＣ、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣが、示されているサイトカインを分泌するのをＥＬＩＳＡで評価。（ｇ〜ｊ）示されている用量のＬＰＳ（ｇ、ｈ）またはＣｐＧ（ｉ、ｊ）で１８時間刺激したＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣまたはＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣが、示されているサイトカインを分泌するのをＥＬＩＳＡで評価。（ｋ）図５ｈ〜図５ｉにおけるように腹腔内にカンジダ・アルビカンスを感染させてから２４時間後のＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスまたはＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの腹腔内洗浄液中の示されているサイトカインの発現をＥＬＩＳＡによって評価。データは、すべての図で、平均値±標準偏差で示してある。Ｐ値は、（ａ〜ｆ）二元配置分散分析で計算するか、（ｋ）スチューデントのｔ検定で計算した。すべての図で、３つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図８−２】図８：ザイモサン、カードラン、ＬＰＳ、ＣｐＧ、カンジダ・アルビカンスが、ＢＭ−ＤＣと腹腔内炎症浸潤物によるサイトカインの放出を開始させた。（ａ〜ｆ）（ａ〜ｃ）ザイモサンまたは（ｄ〜ｆ）カードランの用量を増やしながら１８時間刺激したＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣ、Ｃｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ  ＢＭ−ＤＣ、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣが、示されているサイトカインを分泌するのをＥＬＩＳＡで評価。（ｇ〜ｊ）示されている用量のＬＰＳ（ｇ、ｈ）またはＣｐＧ（ｉ、ｊ）で１８時間刺激したＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣまたはＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣが、示されているサイトカインを分泌するのをＥＬＩＳＡで評価。（ｋ）図５ｈ〜図５ｉにおけるように腹腔内にカンジダ・アルビカンスを感染させてから２４時間後のＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスまたはＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの腹腔内洗浄液中の示されているサイトカインの発現をＥＬＩＳＡによって評価。データは、すべての図で、平均値±標準偏差で示してある。Ｐ値は、（ａ〜ｆ）二元配置分散分析で計算するか、（ｋ）スチューデントのｔ検定で計算した。すべての図で、３つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図９−１】図９：Ｃｂｌ−ｂの不在下での、ＣＬＲを媒介としたシグナル伝達の増加。（ａ）示されている期間にわたってＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣ、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣ、Ｃｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ  ＢＭ−ＤＣをカンジダ・アルビカンスで刺激し、ウエスタンブロッティングによってリン酸化チロシンのレベルを分析した。（ｂ）示されている遺伝子型のＢＭ−ＤＣを（ａ）におけるようにして刺激し、示されているシグナル伝達分子のリン酸化または全量を分析した。（ｃ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣをトレハロース−６，６−ジミコレート（ＴＤＭ）で９０分間刺激し、熱でカンジダ・アルビカンス（ＨＫ）またはカンジダ・アルビカンス菌糸（Ｈｙｐｈ）を殺し、ライセート中のリン酸化Ｓｒｃ、リン酸化Ｓｈｐ−２、リン酸化Ｓｙｃのレベルをウエスタンブロッティングによって分析した。β−アクチンを負荷対照として示してある。（ｄ）示されている遺伝子型のＢＭ−ＤＣを（ａ）におけるようにして刺激し、示されている分子のリン酸化または全量を分析した。（ｅ、ｆ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣまたはＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣをカンジダ・アルビカンスで９０分間刺激するか、刺激せずに放置し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、（ｅ）リン酸化Ｓｈｐ−２または（ｆ）リン酸化Ｓｙｃを探すために染色し、共焦点顕微鏡によって分析した。各遺伝子型と各時点の代表的な画像を示してある。矢印頭部は、ファゴソームが局在している（ｅ）リン酸化Ｓｈｐ−２または（ｆ）リン酸化Ｓｙｃを示す。細胞をＤＡＰＩで対比染色した（青色）。すべての図で、４つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。
【図９−２】図９：Ｃｂｌ−ｂの不在下での、ＣＬＲを媒介としたシグナル伝達の増加。（ａ）示されている期間にわたってＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣ、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣ、Ｃｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ  ＢＭ−ＤＣをカンジダ・アルビカンスで刺激し、ウエスタンブロッティングによってリン酸化チロシンのレベルを分析した。（ｂ）示されている遺伝子型のＢＭ−ＤＣを（ａ）におけるようにして刺激し、示されているシグナル伝達分子のリン酸化または全量を分析した。（ｃ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣをトレハロース−６，６−ジミコレート（ＴＤＭ）で９０分間刺激し、熱でカンジダ・アルビカンス（ＨＫ）またはカンジダ・アルビカンス菌糸（Ｈｙｐｈ）を殺し、ライセート中のリン酸化Ｓｒｃ、リン酸化Ｓｈｐ−２、リン酸化Ｓｙｃのレベルをウエスタンブロッティングによって分析した。β−アクチンを負荷対照として示してある。（ｄ）示されている遺伝子型のＢＭ−ＤＣを（ａ）におけるようにして刺激し、示されている分子のリン酸化または全量を分析した。（ｅ、ｆ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣまたはＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣをカンジダ・アルビカンスで９０分間刺激するか、刺激せずに放置し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、（ｅ）リン酸化Ｓｈｐ−２または（ｆ）リン酸化Ｓｙｃを探すために染色し、共焦点顕微鏡によって分析した。各遺伝子型と各時点の代表的な画像を示してある。矢印頭部は、ファゴソームが局在している（ｅ）リン酸化Ｓｈｐ−２または（ｆ）リン酸化Ｓｙｃを示す。細胞をＤＡＰＩで対比染色した（青色）。すべての図で、４つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。
【図１０−１】図１０：ＳＹＫ、デクチン−１、デクチン−２のユビキチン化とＣＢＬ−Ｂ抑制ペプチド処理。（ａ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣの中の示されているＣ型レクチン受容体のｍＲＮＡ発現レベルをｑＰＣＲによって評価。実験はトリプリケートで実施した。（ｂ）ＣＢＬ−Ｂによるインビトロでのユビキチン化で生成したユビキチン鎖の質量スペクトル測定分析。図１１ａに示したサンプルと並行して同じ処理をしたサンプルを用い、Ｋ４８が連結したユビキチン鎖に由来するペプチドに関して取得された代表的なＭＳ／ＭＳスペクトルを示してある。選択されたペプチドのβ型イオン（赤色）とγ型イオン（青色）の両方を示してある。（ｃ、ｄ）（ｃ）カンジダ・アルビカンスまたは（ｄ）カンジダ・アルビカンス菌糸を感染させたときのＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣにおける（ｃ）デクチン−１タンパク質と（ｄ）デクチン−２タンパク質の発現をそれぞれ抗デクチン−１抗体または抗デクチン−２抗体を用いて調べたイムノブロット分析。β−アクチンを負荷対照として示してある。（ｅ、ｆ）それぞれ抗デクチン−１抗体または抗デクチン−２抗体を抗ユビキチン抗体とともに用いて免疫沈降させた後の、Ｅ６４で前処理したＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣにおける（ｅ）デクチン−１と（ｆ）デクチン−２のイムノブロット分析。デクチン−１とデクチン−２のイムノブロットを対照として示してある。（ｇ）示された濃度のＴＫＢ結合ペプチドの存在下でカンジダ・アルビカンスとともに培養したＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣによるＲＯＳ生成。グラフは、示されたペプチド濃度での７５分間にわたる累積ＲＯＳ生成を示す。実験はトリプリケートで実施した。数値は、細胞１，０００個当たりの相対的光単位として表示してある。（ｈ、ｉ）Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスの静脈内にカンジダ・アルビカンスを感染させ（体重２１．５ｇに１０５ＣＦＵ）、感染後０日目と２日目に（ｈ）１００μｇまたは（ｉ）２０μｇのＴＫＢ結合ペプチドを腹腔内に注入し、開始時の体重と比較した体重減少の経時変化をモニタした（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）。処理したコホートと処理していないコホートでｎ＝５。（ｊ、ｋ）図１２ｇにおけるようにして処理して（ｊ）ゴモリメテナミン銀（ＧＭＳ）または（ｋ）好中球マーカーＬｙ−６Ｇで染色したＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスからの代表的な腎臓切片。（ｊ）の中の黄色の矢印頭部は、真菌菌糸を示す。処理したコホートと処理していないコホートでｎ＝３。マウス１匹につき４つの腎臓切片を分析した。（ａ、ｇ）のデータは平均値±標準偏差で示してある。図（ａ、ｂ）に関しては４つの独立な実験のうちの１つの代表例を、図（ｃ〜ｋ）に関しては３つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊＊＊Ｐ＜０．００１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図１０−２】図１０：ＳＹＫ、デクチン−１、デクチン−２のユビキチン化とＣＢＬ−Ｂ抑制ペプチド処理。（ａ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣの中の示されているＣ型レクチン受容体のｍＲＮＡ発現レベルをｑＰＣＲによって評価。実験はトリプリケートで実施した。（ｂ）ＣＢＬ−Ｂによるインビトロでのユビキチン化で生成したユビキチン鎖の質量スペクトル測定分析。図１１ａに示したサンプルと並行して同じ処理をしたサンプルを用い、Ｋ４８が連結したユビキチン鎖に由来するペプチドに関して取得された代表的なＭＳ／ＭＳスペクトルを示してある。選択されたペプチドのβ型イオン（赤色）とγ型イオン（青色）の両方を示してある。（ｃ、ｄ）（ｃ）カンジダ・アルビカンスまたは（ｄ）カンジダ・アルビカンス菌糸を感染させたときのＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣにおける（ｃ）デクチン−１タンパク質と（ｄ）デクチン−２タンパク質の発現をそれぞれ抗デクチン−１抗体または抗デクチン−２抗体を用いて調べたイムノブロット分析。β−アクチンを負荷対照として示してある。（ｅ、ｆ）それぞれ抗デクチン−１抗体または抗デクチン−２抗体を抗ユビキチン抗体とともに用いて免疫沈降させた後の、Ｅ６４で前処理したＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣにおける（ｅ）デクチン−１と（ｆ）デクチン−２のイムノブロット分析。デクチン−１とデクチン−２のイムノブロットを対照として示してある。（ｇ）示された濃度のＴＫＢ結合ペプチドの存在下でカンジダ・アルビカンスとともに培養したＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣによるＲＯＳ生成。グラフは、示されたペプチド濃度での７５分間にわたる累積ＲＯＳ生成を示す。実験はトリプリケートで実施した。数値は、細胞１，０００個当たりの相対的光単位として表示してある。（ｈ、ｉ）Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスの静脈内にカンジダ・アルビカンスを感染させ（体重２１．５ｇに１０５ＣＦＵ）、感染後０日目と２日目に（ｈ）１００μｇまたは（ｉ）２０μｇのＴＫＢ結合ペプチドを腹腔内に注入し、開始時の体重と比較した体重減少の経時変化をモニタした（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）。処理したコホートと処理していないコホートでｎ＝５。（ｊ、ｋ）図１２ｇにおけるようにして処理して（ｊ）ゴモリメテナミン銀（ＧＭＳ）または（ｋ）好中球マーカーＬｙ−６Ｇで染色したＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスからの代表的な腎臓切片。（ｊ）の中の黄色の矢印頭部は、真菌菌糸を示す。処理したコホートと処理していないコホートでｎ＝３。マウス１匹につき４つの腎臓切片を分析した。（ａ、ｇ）のデータは平均値±標準偏差で示してある。図（ａ、ｂ）に関しては４つの独立な実験のうちの１つの代表例を、図（ｃ〜ｋ）に関しては３つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊＊＊Ｐ＜０．００１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図１１−１】図１１：Ｃｂｌ−ｂはＳｙｋをユビキチン化する。（ａ）組み換えたＣｂｌ−ｂ、Ｃｂｌ−ｂ２９−４８３、Ｃ３７３Ａ  Ｃｂｌ−ｂ２９−４８３による活性なＳＹＫのインビトロでのユビキチン化。Ｓｙｋ（上図）またはユビキチン（下図）についてアッセイをウエスタンブロッティングによって分析した。Ｃｂｌ−ｂは、基質でないものが付着したポリユビキチン鎖を形成することに注意されたい。＊は、非特異的なバンドを示す。（ｂ）不活性なＳｙｋ（Ｓｙｋ−ＧＳＴ）または活性なＳｙｋのＣｂｌ−ｂ２９−４８３によるインビトロでのユビキチン化。対照、ＡＴＰなし。アッセイは（ａ）におけるようにして分析した。（ｃ）カンジダ・アルビカンスで刺激し、抗Ｃｂｌ−ｂ抗体またはＩｇＧ対照を用いて免疫沈降させたＢＭ−ＤＣからのライセート。沈降物でＣｂｌ−ｂとＳｙｋを調べた。負荷対照としてアリコートをＣｂｌ−ｂとＳｙｋに関してブロットした。（ｄ）ＭＧ１３２（１０μＭ）の存在下または不在下でＢＭ−ＤＣをカンジダ・アルビカンスで刺激し、ウエスタンブロッティングによって分析した。（ｅ）ＴＫＢ結合ペプチドの配列。アンテナペディアのホモドメインに由来する配列と、Ｓｙｋに由来する配列を示してある。チロシン３１７を赤色で示してあり、黒丸のｐは、チロシン３１７のリン酸化を象徴している。（ｆ）１００μＭのＴＫＢ結合ペプチドの存在下または不在下でのＣｂｌ−ｂ２９−４８３による活性な組み換えＳｙｋのインビトロでのユビキチン化。対照、ＡＴＰなし。アッセイをＳｙｋ（上図）またはユビキチン（下図）に関してウエスタンブロッティングによって分析した。（ｇ）示された遺伝子型のＢＭ−ＤＣを１００μＭのＴＫＢ結合ペプチドの不在下または存在下でカンジダ・アルビカンスを用いて刺激し、ルミノールアッセイを利用してＲＯＳの生成をリアルタイムでモニタした。実験はトリプリケートで実施した。数値は、細胞１，０００個当たりの相対的光単位として表示してある（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）。（ｈ）示された遺伝子型のＢＭ−ＤＣの殺菌能力を、１００μＭのＴＫＢ結合ペプチドの存在下または不在下でカンジダ・アルビカンスとともに２４時間培養することによって評価。アッセイはクワドゥルプリケートで実施した。データは平均値±標準偏差で示してある。Ｐ値はスチューデントのｔ検定で計算した。すべての図に関して３つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１１−２】図１１：Ｃｂｌ−ｂはＳｙｋをユビキチン化する。（ａ）組み換えたＣｂｌ−ｂ、Ｃｂｌ−ｂ２９−４８３、Ｃ３７３Ａ  Ｃｂｌ−ｂ２９−４８３による活性なＳＹＫのインビトロでのユビキチン化。Ｓｙｋ（上図）またはユビキチン（下図）についてアッセイをウエスタンブロッティングによって分析した。Ｃｂｌ−ｂは、基質でないものが付着したポリユビキチン鎖を形成することに注意されたい。＊は、非特異的なバンドを示す。（ｂ）不活性なＳｙｋ（Ｓｙｋ−ＧＳＴ）または活性なＳｙｋのＣｂｌ−ｂ２９−４８３によるインビトロでのユビキチン化。対照、ＡＴＰなし。アッセイは（ａ）におけるようにして分析した。（ｃ）カンジダ・アルビカンスで刺激し、抗Ｃｂｌ−ｂ抗体またはＩｇＧ対照を用いて免疫沈降させたＢＭ−ＤＣからのライセート。沈降物でＣｂｌ−ｂとＳｙｋを調べた。負荷対照としてアリコートをＣｂｌ−ｂとＳｙｋに関してブロットした。（ｄ）ＭＧ１３２（１０μＭ）の存在下または不在下でＢＭ−ＤＣをカンジダ・アルビカンスで刺激し、ウエスタンブロッティングによって分析した。（ｅ）ＴＫＢ結合ペプチドの配列。アンテナペディアのホモドメインに由来する配列と、Ｓｙｋに由来する配列を示してある。チロシン３１７を赤色で示してあり、黒丸のｐは、チロシン３１７のリン酸化を象徴している。（ｆ）１００μＭのＴＫＢ結合ペプチドの存在下または不在下でのＣｂｌ−ｂ２９−４８３による活性な組み換えＳｙｋのインビトロでのユビキチン化。対照、ＡＴＰなし。アッセイをＳｙｋ（上図）またはユビキチン（下図）に関してウエスタンブロッティングによって分析した。（ｇ）示された遺伝子型のＢＭ−ＤＣを１００μＭのＴＫＢ結合ペプチドの不在下または存在下でカンジダ・アルビカンスを用いて刺激し、ルミノールアッセイを利用してＲＯＳの生成をリアルタイムでモニタした。実験はトリプリケートで実施した。数値は、細胞１，０００個当たりの相対的光単位として表示してある（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）。（ｈ）示された遺伝子型のＢＭ−ＤＣの殺菌能力を、１００μＭのＴＫＢ結合ペプチドの存在下または不在下でカンジダ・アルビカンスとともに２４時間培養することによって評価。アッセイはクワドゥルプリケートで実施した。データは平均値±標準偏差で示してある。Ｐ値はスチューデントのｔ検定で計算した。すべての図に関して３つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１２−１】図１２：Ｃｂｌ−ｂ抑制によって抗真菌免疫が増進する。（ａ、ｂ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスの静脈内にカンジダ・アルビカンス（体重２１．５ｇに１０５ＣＦＵ）を感染させ、腹腔内に１００μｇのＴＨＢ結合ペプチドを２回注射した。グラフに示されているのは、（ａ）体重減少（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）と、（ｂ）生存率（Ｐ値はログ・ランク検定で評価）である。（ｃ）感染させてから７日後の血中尿素濃度。すべてのコホートでｎ＝５。（ｃ、ｄ、ｅ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスを（ａ〜ｃ）におけるようにして２０μｇのペプチドで処理した。グラフに示されているのは、（ｄ）体重減少（Ｐ値は二元配置分散分析で評価；全コホートでｎ＝５）、感染してから７日後の（ｅ）血中尿素濃度、（ｆ）腎臓真菌負荷である。（ｇ、ｈ、ｉ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスに（ａ〜ｃ）におけるようにして感染させ、腹腔内に１００μｇのペプチドを２回注入した。グラフに示されているのは、（ｇ）体重減少（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）、（ｈ）２回目のペプチド処理から４８時間後の腎臓真菌負荷、（ｉ）生存率（Ｐ値はログ・ランク検定で評価）である。（ａ、ｄ、ｇ）青色の矢印は、ペプチド処理の時点を示す。（ｊ）（ｇ）におけるようにして処理し、２回目のペプチド処理の２日後に安楽死させたマウスからのＰＡＳ染色した腎臓切片。四角の領域を大きな倍率で示してある。（ｋ）（ｊ）からの感染した腎臓の炎症スコア。両方のコホートでｎ＝３。マウス１匹につき４つの切片を分析した。（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ）データは平均値±標準偏差で示してある。点は個々のマウスを表わす。図（ａ〜ｃ）に関しては５つの独立な実験のうちの１つの代表例を、図（ｃ〜ｊ）に関しては３つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図１２−２】図１２：Ｃｂｌ−ｂ抑制によって抗真菌免疫が増進する。（ａ、ｂ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスの静脈内にカンジダ・アルビカンス（体重２１．５ｇに１０５ＣＦＵ）を感染させ、腹腔内に１００μｇのＴＨＢ結合ペプチドを２回注射した。グラフに示されているのは、（ａ）体重減少（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）と、（ｂ）生存率（Ｐ値はログ・ランク検定で評価）である。（ｃ）感染させてから７日後の血中尿素濃度。すべてのコホートでｎ＝５。（ｃ、ｄ、ｅ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスを（ａ〜ｃ）におけるようにして２０μｇのペプチドで処理した。グラフに示されているのは、（ｄ）体重減少（Ｐ値は二元配置分散分析で評価；全コホートでｎ＝５）、感染してから７日後の（ｅ）血中尿素濃度、（ｆ）腎臓真菌負荷である。（ｇ、ｈ、ｉ）Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスに（ａ〜ｃ）におけるようにして感染させ、腹腔内に１００μｇのペプチドを２回注入した。グラフに示されているのは、（ｇ）体重減少（Ｐ値は二元配置分散分析で評価）、（ｈ）２回目のペプチド処理から４８時間後の腎臓真菌負荷、（ｉ）生存率（Ｐ値はログ・ランク検定で評価）である。（ａ、ｄ、ｇ）青色の矢印は、ペプチド処理の時点を示す。（ｊ）（ｇ）におけるようにして処理し、２回目のペプチド処理の２日後に安楽死させたマウスからのＰＡＳ染色した腎臓切片。四角の領域を大きな倍率で示してある。（ｋ）（ｊ）からの感染した腎臓の炎症スコア。両方のコホートでｎ＝３。マウス１匹につき４つの切片を分析した。（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ）データは平均値±標準偏差で示してある。点は個々のマウスを表わす。図（ａ〜ｃ）に関しては５つの独立な実験のうちの１つの代表例を、図（ｃ〜ｊ）に関しては３つの独立な実験のうちの１つの代表例を示してある。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図１３】図１３：Ｃｂｌ−ｂファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、マウスＤＣにおいてＣＢＬ−ＢとＣＢＬの両方を抑制する。（ａ）カンジダ・アルビカンスを感染させた後、１００μＭのＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン含有ペプチド（Ｍ１）の存在下または不在下で、示されているｓｈＲＮＡを安定に発現する示されている遺伝子型の樹状細胞（ＤＣ）が生成する活性酸素種（ＲＯＳ）。グラフは、感染後９０分間にわたるＲＯＳ生成の累積値を示す。実験はクワドゥルプリケートで実施した。数値は、細胞１，０００個当たりの累積相対的光単位（ＲＬＵ）として表示してある。データは平均値±標準偏差で示してある。＊＊＊Ｐ＜０．００１をスチューデントのｔ検定で計算した。
【図１４】図１４：Ｃｂｌ−ｂファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドで処理すると、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖反応が増進する。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウス（ａ、ｂ）またはＣｂｌ−ｂΔ／Δマウス（ｃ、ｄ）のプールした脾臓とリンパ節から精製したＣＤ４＋Ｔ細胞ＭＡＣＳに細胞増殖染料で標識し、示されている濃度のＣｂｌ−ｂファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチド（Ｍ３）（ａ、ｃ）、またはスクランブルド対照ペプチド（Ｍ４）（ｂ、ｄ）の不在下または存在下にて、プレートに結合した示されている濃度のＣＤ３抗体と可溶性ＣＤ２８抗体で、またはプレートに結合した示されている濃度のＣＤ３抗体だけで３日間刺激した。ヒストグラムの重ね図は、示された濃度のペプチドの存在下または不在下でのＴ細胞受容体刺激に応答して、刺激の３日後に細胞増殖染料が増殖に依存して希釈されることを示している。
【図１５】図１５：Ｃｂｌ−ｂファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドで処理すると、メラノーマモデルにおいて生体内抗腫瘍免疫反応が増進する。（ａ、ｂ）３つのコホートのＣ５７ＢＬ／６マウス（各コホートでｎ＝１０）に同時に１０６個のＢ１６−ＳＩＹ腫瘍細胞を皮下に接種し、ビヒクル、ペプチドＭ１、ペプチドＭ２のいずれかで２日ごとに処理し、腫瘍の体積（ａ）と体重（ｂ）の経時変化をモニタした。青色の矢印は、ペプチド処理の時点を示す。データは平均値±標準偏差で示してある。統計的有意性はスチューデントのｔ検定を利用して評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１６】図１６：ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドで処理すると、ヒトＴ細胞の増殖、サイトカイン産生、活性化が増大する。ヒトのＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから精製し、細胞増殖染料ＣＦＳＥで標識し、プレートに結合したＣＤ３／ＣＤ２８抗体で３日間刺激した。（ａ、ｂ）グラフは、示されている濃度のペプチドＨ１またはＨ２の存在下でのＣＤ３／ＣＤ２８刺激に対するＣＤ４＋Ｔ細胞（ａ）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（ｂ）の増殖反応を、ＣＦＳＥ含量が希釈された細胞の割合を定量することによって評価した結果を示している。（ｃ）（ａ、ｂ）におけるようにして処理した細胞からの上清でＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによって調べた。（ｄ）（ａ、ｂ）におけるようにして処理した細胞を活性化マーカーＣＤ６９に関して染色した。グラフは、ＣＤ６９＋細胞の割合を全ＣＤ４＋細胞に対する割合として示している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
Ｅ３ユビキチンリガーゼのＣｂｌファミリーは、多彩な細胞系においてシグナル伝達の調節に重要な役割を果たしている（Ｓｏｈｎ他、２００３年）。Ｃｂｌタンパク質のアミノ末端ドメインは、チロシンキナーゼ結合（ＴＫＢ）ドメインとＲＩＮＧフィンガードメインで構成されており、その両方が、シグナル伝達とタンパク質分解を調節している（Ｏｈｎｏ他、２０１６年；Ｐｅｓｃｈａｒｄ他、２００４年）。Ｃｂｌファミリーのメンバー（例えばＣｂｌ−ｂ）による基質の認識には主にそのＴＫＢドメインが関与していて、ＴＫＢドメインが、標的分子（例えばＺＡＰ−７０、Ｓｙｋ、Ｓｒｃ）上のホスホチロシンと、ＲＴＫ（例えばＥＧＦＲ受容体、Ｍｅｔ受容体、ＣＳＦ−１受容体）内に位置する残基を認識する（Ｍａｎｃｉｎｉ他、２００２年；Ｐｅｓｃｈａｒｄ他、２００１年；Ｐｅｓｃｈａｒｄ他、２００４年；Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ他、２００１年）。Ｃｂｌ−ｂは、元々は適応免疫応答の負の調節因子として特徴づけられた（Ｂａｃｈｍａｉｅｒ他、２０００年；Ｃｈｉａｎｇ他、２０００年）。極めて重要なシグナル伝達分子がＣｂｌ−ｂを媒介としてユビキチン化されることにより、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のシグナル伝達とＢ細胞受容体（ＢＣＲ）のシグナル伝達の両方が変化する（Ｌｏｅｓｅｒ他、Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ２００７年；Ｋｉｔａｕｒａ他、２００７年）。例えばＣｂｌ−ｂの遺伝子除去（Ｂａｃｈｍａｉｅｒ他、２０００年；Ｃｈｉａｎｇ他、２０００年）または触媒的に不活性なＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａバリアントのノックイン（Ｐａｏｌｉｎｏ他、２０１１年）が、特に抗原チャレンジの後に広い自己免疫症状を引き起こすことが報告されている。最近の観察から、Ｃｂｌ−ｂの別の役割が、ＮＫ細胞を媒介とした抗腫瘍免疫（Ｐａｏｌｉｎｏ他、２０１４年）、マスト細胞におけるＦｃεＲシグナル伝達（Ｇｕｓｔｉｎ他、２００６年；Ｑｕ他、２００４年）、インテグリンのシグナル伝達（Ｈａｎ他、２０１０年）、ＤＣ機能（Ｗａｌｌｎｅｒ他、２０１３年）において発見されていて、Ｃｂｌ−ｂの機能が自然免疫系の細胞へと拡張される。Ｃｂｌ−ｂが標的とするシグナル伝達分子は特定の経路に特異的ではないことがしばしばあるため、多数のシグナル伝達モジュールが使用することができる。
【００２３】
脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）は、Ｃｂｌファミリーのタンパク質（特にＣｂｌ−ｂ）が標的とするシグナル伝達タンパク質である。特にＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）であるデクチン−１、デクチン−２、デクチン−３によって誘導される古典的シグナル伝達は、Ｓｙｋの活性化に決定的に依存する（Ｇｒｏｓｓ他、２００９年；Ｍｏｃｓａｉ他、２０１０年）。Ｓｙｋはデクチン−１、デクチン−２／３、Ｍｉｎｃｌｅ受容体複合体にリクルートされた後、Ｓｒｃファミリーのキナーゼを通じたリン酸化と自己リン酸化の両方によって活性化される（Ｄｅｎｇ他、２０１５年）。すると活性化されたＳｙｋは、インフラマソーム（Ｇｒｏｓｓ他、２００９；  Ｇｒｉｎｇｈｕｉｓ他、２０１２年；Ｚｗｏｌａｎｅｋ他、２０１４年）、古典的ＮＦ−κＢシグナル伝達（ＬｅｉｂｕｎｄＧｕｔ−Ｌａｎｄｍａｎｎ他、２００７年；Ｒｕｌａｎｄ、２００８年）、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞（ＤＣ）における活性酸素種（ＲＯＳ）の産生（Ｍｏｃｓａｉ他、２０１０年）を開始させる。これらが合わさってＣＬＲによりＳｙｋが活性化されて殺真菌経路がただちに活性化されるとともに、細胞の種類に特異的な転写の変化が局所的または全身性の真菌感染症の根絶に向けて誘導される。Ｓｙｋシグナル伝達は、がんにおいてもある役割を果たしている。
【００２４】
本発明によれば、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤（特にＣｂｌ−ｂ阻害剤）の投与により、最も優勢な酵母病原体であるカンジダ・アルビカンスの感染と、それに似た真菌病原体の感染によって誘発される罹患と死亡から保護されることが見いだされた。Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤（特にＣｂｌ−ｂ阻害剤）の投与により、腫瘍の成長が顕著に低下することも見いだされた。したがって第１の側面では、本発明により、患者で真菌感染症またはがんの予防または治療に用いるためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤（例えばＣｂｌ−ｂ阻害剤）が提供される。ただしその真菌感染症は酵母感染症である。患者は、例えば疾患の症状を有するか予後不良であり、治療を必要としている可能性がある。
【００２５】
Ｃｂｌファミリーの遺伝子とその遺伝子産物はこれまでに詳しく記述されている（例えばＣｂｌ−ｂに関しては、ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｉｄ．Ｍｍ．３２８２０６とＨｓ．４３０５８９も参照されたい）。Ｃｂｌファミリーのタンパク質配列は、例えばＣｂｌ−ｂについてはＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録番号ＮＰ＿００１０２８４１０．１（マウス）とＮＰ＿７３３７６２．２（ホモサピエンス）で公開されている。Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤は先行技術で知られている。Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤として適した抗Ｃｂｌファミリータンパク質抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス阻害剤が市販されている。具体的には、Ｃｂｌファミリーのタンパク質の発現を低下させるか抑制し、したがってＣｂｌファミリーの機能を低下させるか抑制するのにも適したｓｉＲＮＡが、例えばアメリカ合衆国特許出願公開第２００７／００５４３５５  Ａ１号、第２０１０／０２６０８０８  Ａ号、第２０１４／００１０７８１  Ａ号に開示されている（これらのすべてが、参照によって本明細書に組み込まれている）。Ｃｂｌファミリーのメンバーを抑制するペプチドは、Ｋａｗａｉ（２０１５年）、Ｋｕｍａｒ（２０１２年）、Ｂｅｃｈａｒａ（２０１３年）に開示されている。
【００２６】
任意のＣｂｌファミリータンパク質阻害剤（例えばＣｂｌ−ｂ阻害剤）を本発明で用いることができる。一実施態様では、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤は、Ｃｂｌファミリーのタンパク質（例えばＣｂｌ−ｂ）を標的とする核酸（例えばＣｂｌファミリーの遺伝子発現を抑制する核酸であるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）から選択される。
【００２７】
Ｃｂｌファミリーは、ｃ−Ｃｂｌ（またはＣｂｌ）、Ｃｂｌ−ｂ、Ｃｂｌ−ｃ（またはＣｂｌ−３）というメンバーを含んでいる。Ｃｂｌ−ｂ、すなわちＣｂｌファミリー結合ペプチドの標的が抑制されることが好ましい。さらに別の実施態様では、ｃ−ＣｂｌとＣｂｌ−ｃのいずれか一方、すなわちＣｂｌファミリー結合ペプチドの標的が抑制される。Ｃｂｌファミリーのメンバーを本明細書では「Ｃｂｌ−ファミリー−リガーゼ」、「Ｃｂｌファミリーリガーゼ」、「Ｃｂｌタンパク質」、「Ｃｂｌ−ファミリータンパク質」、「Ｃｂｌ−ファミリーメンバー」と呼ぶ。いくつかの実施態様では、阻害剤は、ファミリーの２つ以上のメンバー（例えばｃ−ＣｂｌとＣｂｌ−ｂ）と結合すること、またはファミリーの２つ以上のメンバーを抑制することができる。Ｃｂｌ−ｂが最も好ましい標的であるため、本発明の任意の側面と好ましい実施態様はＣｂｌ−ｂの抑制として読まれ、本発明のあらゆる側面と実施態様において、例えばＣｂｌファミリータンパク質阻害剤としてはＣｂｌ−ｂ阻害剤が可能であり、ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドとしては（Ｃｂｌ−ｂのＴＫＢドメインに結合する）Ｃｂｌ−ｂ結合ペプチドが可能である。
【００２８】
臨床的に重要なサッカロミケス科のいくつかの酵母の感染症（例えばカンジダ感染症）に対する免疫応答は、Ｃｂｌファミリーのメンバーによって調節されることが示されている。したがって好ましい一実施態様では、酵母感染症は、サッカロミケス科の酵母の感染症であり、より好ましいのはそれがカンジダ症またはクリプトコッカス症であることである。さらに好ましいのは、真菌感染症が、カンジダ・アルビカンス感染症、カンジダ・グラブラタ感染症、カンジダ・クルセイ感染症、カンジダ・ドゥブリニエンシス感染症のいずれかであることである。
【００２９】
本発明は、患者でがんおよび／または真菌感染症の予防または治療に用いるためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤にも関するものであり、そのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤は、ＳｙｋのＣｂｌファミリータンパク質結合ペプチドであり、特に好ましいのはＳｙｋのＣｂｌ−ｂ結合ペプチドである。Ｓｙｋ遺伝子とその遺伝子産物は先行技術において周知である（ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｉｄ．Ｍｍ．３７５０３１、Ｒｎ．８７４０７、Ｍｍｕ．３２２９４、Ｈｓ．３７１７２０）。Ｓｙｋ配列は例えばＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録番号ＮＰ＿００１１８５９０６．２（マウス）、ＮＰ＿０３６８９０．１（ラット）、ＮＭ＿００１２６１０３５．１（アカゲザル）、ＮＰ＿００３１６８．２（ホモサピエンス）で公開されている。Ｃｂｌファミリーのメンバーに結合する上で重要な配列を含有するＳｙｋの断片は、治療でＣｂｌファミリータンパク質を抑制するための特に有効な治療剤であることが示されている。特にＣｂｌファミリータンパク質結合ペプチドは、ＣｂｌファミリーのメンバーのＴＫＢドメインに結合する（ＴＢＫ（ドメイン）結合ペプチド）。
【００３０】
好ましい一実施態様では、Ｃｂｌファミリータンパク質結合ペプチドは、Ｓｙｋのホスホチロシンと周囲の隣接領域を含んでいる（マウスＳｙｋペプチドを示す図１１ｅの右側部分）。本発明の一実施態様では、ＴＫＢドメイン結合ペプチドは、以下のコンセンサス配列：ＳＦＮＰＹＥＰＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１）を有する。ただしＸ１、Ｘ２、Ｘ３は、独立に、任意のアミノ酸から選択される。アミノ酸は、タンパク質構成アミノ酸から選択されることが好ましく、例えばこのペプチドは、少なくとも５０％のタンパク質構成アミノ酸を含むことができる。やはり好ましいのは、特に生体内でペプチドの安定性および／または薬力学を変化させるため、１個以上の非タンパク質構成アミノ酸を含むことである。この配列内のＹ（チロシン）はリン酸化されていることが好ましい。マウスでは、相同配列は、マウスＳｙｋのアミノ酸３１３〜３２２（Ｓｙｋ３１３−３２２）を有するＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧ（配列番号２）である。ラットでは、相同配列は、Ｓｙｋの３１３〜３２２（Ｓｙｋ３１３−３２２）に位置するＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧ（配列番号２）である。アカゲザルでは、相同配列は、Ｓｙｋの３１９〜３２８（Ｓｙｋ３１９−３２８）に位置するＳＦＮＰＹＥＰＥＶＡ（配列番号３）である。ヒトでは、相同配列は、Ｓｙｋの２９６〜３０５（Ｓｙｋ２９６−３０５）に位置するＳＦＮＰＹＥＰＥＬＡ（配列番号４）である。したがって特に好ましい一実施態様では、Ｃｂｌファミリータンパク質結合ペプチドは、配列ＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧ（配列番号２）、ＳＦＮＰＹＥＰＥＶＡ（配列番号３）、ＳＦＮＰＹＥＰＥＬＡ（配列番号４）のいずれかを含んでいる。Ｘ１はＴまたはＥであることが好ましい。Ｘ２は、Ｇ、Ｌ、Ｖのいずれかであることが好ましい。Ｘ３は、ＧまたはＡであることが好ましい。これら配列のバリアントも可能であるため、本発明は、ＳＦＮＰＹＥＰＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１）、ＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧ（配列番号２）、ＳＦＮＰＹＥＰＥＶＡ（配列番号３）、ＳＦＮＰＹＥＰＥＬＡ（配列番号４）から選択された配列で任意の位置に１個または２個のアミノ酸の欠失または置換を有するものを含むペプチドを提供または利用することにも関する。
【００３１】
本発明の特に好ましい一実施態様では、Ｃｂｌファミリータンパク質結合ペプチドは、以下のコンセンサス配列：ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＷＸ５（配列番号５）を含んでいる。ただしＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５は、独立に、任意のアミノ酸から選択され、上記のようにタンパク質構成アミノ酸および／または非タンパク質構成アミノ酸を含むことが好ましい。マウスでは、相同配列は、Ｓｙｋの３１０〜３２５（Ｓｙｋ３１０−３２５）に位置するＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧＰＷＧ（配列番号６）である。ラットでは、相同配列は、Ｓｙｋの３１０〜３２５（Ｓｙｋ３１０−３２５）に位置するＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧＡＷＧ（配列番号７）である。アカゲザルでは、相同配列は、Ｓｙｋの３１６〜３３１（Ｓｙｋ３１６−３３１）に位置するＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＥＶＡＰＷＡ（配列番号８）である。ヒトでは、相同配列は、Ｓｙｋの２９３〜３０８（Ｓｙｋ２９３−３０８）に位置するＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＥＬＡＰＷＡ（配列番号９）である。したがって関連する一実施態様では、Ｃｂｌファミリータンパク質結合ペプチドは、配列ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧＰＷＧ（配列番号６）、ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧＡＷＧ（配列番号７）、ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＥＶＡＰＷＡ（配列番号８）、ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＥＬＡＰＷＡ（配列番号９）のいずれかを含んでいる、好ましくはその配列からなる。特に、開示されている配列中に示されている配列部分−ＰＹＥ−の中のチロシン（Ｙ）はリン酸化されている。Ｘ１はＴまたはＥであることが好ましい。Ｘ２は、Ｇ、Ｌ、Ｖのいずれかであることが好ましい。Ｘ３は、ＧまたはＡであることが好ましい。Ｘ４は、ＰまたはＡであることが好ましい。Ｘ５は、ＧまたはＡであることが好ましい。また、これら配列のバリアントも可能であるため、本発明は、ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＷＸ５（配列番号５）、ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧＰＷＧ（配列番号６）、ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧＡＷＧ（配列番号７）、ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＥＶＡＰＷＡ（配列番号８）、ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＥＬＡＰＷＡ（配列番号９）から選択された配列で任意の位置に１個または２個または３個のアミノ酸の欠失または置換を有するものを含むペプチドを提供または利用することにも関する。
【００３２】
Ｃｂｌファミリータンパク質結合ペプチド（または融合ペプチドに含まれているその一部）は、アミノ酸の長さが５〜１００個の短いペプチドであることが好ましく、アミノ酸の長さは８〜８０個、または１２〜６０個が好ましい。
【００３３】
どの実施態様でも、融合ペプチド全体として、長さがアミノ酸１５〜５００個のペプチドが可能であり、アミノ酸の長さは１５〜２００個が好ましく、アミノ酸の長さは１８〜１００個がより一層好ましい。
【００３４】
ＣｂｌファミリーのメンバーのＴＫＢドメインに結合し、そのことによってその活性を抑制するＣｂｌファミリータンパク質結合ペプチドは、任意の形態、または複合体、または組成物にして細胞に投与することができる。投与のためのこの形態、複合体、組成物により、Ｃｂｌファミリータンパク質結合ペプチドは、生きている細胞の中に入ることが可能になり、そのことによって細胞膜を通過する。好ましいのは、細胞送達部分または膜透過部分との複合体（例えば膜透過ペプチドとの融合ペプチド）である。複合体と融合ペプチドは、リンカー部分またはリンカーペプチドによって接続することができる。そのようなリンカーは通常は小さく、例えば１０ｋＤａ未満、または５ｋＤａ未満、または長さがアミノ酸０個または１個から２０個である。細胞に投与するための他の形態に含まれるのは、小胞、ミセル、リポソーム、ミクロソームである。
【００３５】
興味深いことに、Ｃｂｌ−ｂのＴＫＢドメインに結合する融合ペプチド（図１１ｅ）は、カンジダ・アルビカンスの刺激（図１１ｇ、図１１ｈ；図１２ｂ）とがん（図１５ａ）に応答して免疫機能を顕著に改善する。さらなる効果が、Ｃｂｌ−ｂとｃ−Ｃｂｌの両方で、腫瘍抗原に対するＴ細胞応答の活性化において示された。したがって別の１つの側面では、本発明は、細胞送達部分と、Ｃｂｌファミリーのメンバー（Ｃｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌが好ましい）のＴＫＢドメインに結合する（特に上記の）Ｃｂｌ−ｂ結合ペプチドとを含む融合ペプチドに関する。特に融合ペプチドは、細胞送達部分と、ＣｂｌファミリーのメンバーのＴＫＢドメインに結合するＣｂｌファミリータンパク質結合ペプチドを含むか、細胞送達部分と、ＣｂｌファミリーのメンバーのＴＫＢドメインに結合するＣｂｌファミリータンパク質結合ペプチドからなる（したがってこのペプチドは、ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドとも呼ばれる）。細胞送達部分として膜透過ペプチドが可能である。細胞への送達で可能な経路は、小胞などと細胞膜の融合であり、脂質二重層、移行、エンドサイトーシスのいずれかを通じて侵入する。
【００３６】
膜透過ペプチド（ＣＰＰ）は、通常はカチオン性または両親媒性の短いペプチドであり、多彩な生物学的積荷（ｃａｒｇｏ）の細胞内送達を媒介する（Ｂｅｃｈａｒａ他、２０１３年；Ｊｏｎｅｓ他、２００５年、ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ＿ｐｅｐｔｉｄｅ、これらはすべて、参照によって本明細書に組み込まれている）。タンパク質に由来するペプチドと、キメラペプチドと、合成ＣＰＰが、ＣＰＰの識別可能な主要な３つのクラスである（Ｂｅｃｈａｒａ他、２０１３年）。ＣＰＰは低い毒性などの重要な利点を有するため、インビトロと生体内において、生物学的に活性なペプチドを細胞間で輸送するための一般的なバイオテクノロジーの技術になっている（Ｊｏｎｅｓ他、２００５年；Ｌｉｎｄｓａｙ他、２００２年）。したがって好ましい一実施態様では、融合ペプチドの細胞送達部分は膜透過ペプチドである。ＣＰＰの重要な代表例は、アンテナペディア、Ｔａｔ、トランスポータン、ｄＮＰ１、ｄＮＰ２（Ｌｉｍ他、２０１５年）、ポリアルギニンである。アンテナペディアは、取り込みの多さと細胞毒性の両方を考慮すると、インビトロでのペプチド送達にとって特に有用であることが示されている（Ｊｏｎｅｓ他、２００５年）。特に有効なのは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはそれ以上のカチオン（特にカチオン性アミノ酸残基であるＨ、Ｋ、Ｒであり、ＫとＲから選択することが好ましい）を含むＣＰＰである。ＣＰＰの選択は、ＤＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１０）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１１）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１２）、（ＫＫＤＫＫＤＥＲＲＸＡＫ）ｍ（配列番号１３）（ただし１≦ｍ≦５であり、ＸＡは、ＫとＲから選択される）、（ＫＩＫＫＸＢＫＫＫＧＲＫ）ｍ（配列番号１４）（ただし１≦ｍ≦５であり、ＸＢは、Ｖ、Ｉ、Ｔ、（Ｒ）ｎから選択され、６≦ｎ≦１２である）からなされることが好ましい。これらのＣＰＰ配列は繰り返すこと、例えば二重にすることができる。好ましいＣＰＰは、ＫＩＫＫＴＫＫＫＧＲＫＫＩＫＫＴＫＫＫＧＲＫ（配列番号４３のアミノ酸１〜２２）である。ＣＰＰ（または融合タンパク質に含まれている）は長さがアミノ酸８〜１００個であり、長さがアミノ酸１０〜８０個または１２〜６０個であることが好ましい。
【００３７】
別の好ましい一実施態様では、融合ペプチドのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、上記のようにＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドであるか、Ｓｙｋに由来する。ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、ＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドであるとともに、自然免疫の調節因子であることが好ましい。このペプチドは、自然抗寄生虫免疫または自然抗真菌免疫または自然抗がん免疫の調節因子であることが好ましい。
【００３８】
ＣｂｌファミリーのメンバーのＴＫＢドメインに結合する別のタンパク質またはペプチド（例えば、骨格筋成長のカギとなる中間体であってインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）によって調節されるインスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）（Ｎａｋａｏ他、２００９年；Ｏｈｎｏ他、２０１６年）、またはＴ細胞発達とリンパ球活性化においてある役割を果たす７０ｋＤａのゼータ関連タンパク質（Ｚａｐ−７０）のタンパク質またはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチド）を用いることができる。それに加え、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）（例えばＣｂｌファミリーのメンバーのＴＫＢドメインと相互作用するＥＧＦＲ、Ｍｅｔ受容体、ＣＳＦ１受容体）の中に位置する残基を用いることができる（Ｍａｎｃｉｎｉ他、２００２年；Ｎａｋａｏ他、２００９年；Ｏｈｎｏ他、２０１６年；Ｐｅｓｃｈａｒｄ他、２００１年；Ｐｅｓｃｈａｒｄ他、２００４年；Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ他、２００１年）。Ｃｂｌ−ｂのＴＫＢ結合部位のいくつかは、ホスホチロシンを含む配列モチーフを共有している。例えばＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、配列モチーフＮ／ＤＸｐＹを有することが好ましい。ただしＸは任意のアミノ酸から選択され、上記のようにタンパク質生成および／または非タンパク質構成アミノ酸を含有することが好ましい。Ｎ／Ｄはアスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）であり、ｐＹはホスホチロシンである。より好ましいのは、ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが配列モチーフＮ／ＤＸ１ｐＹＸ２Ｐ（配列番号１５）を持つことである。ただしＸ１とＸ２は任意のアミノ酸から選択され、上記のようにタンパク質生成および／または非タンパク質構成アミノ酸を含有することが好ましい。Ｎ／Ｄはアスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）であり、ｐＹはホスホチロシンである。より一層好ましいのは、ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、アミノ酸５〜２０個の長さの配列を持つこと、および／またはＳｙｋとの配列一致が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％であることである。さらなる一実施態様では、ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、Ｚａｐ−７０またはＩＲＳ−１の断片である。マウスとヒトのＺａｐ−７０では、配列モチーフＮ／ＤＸ１ｐＹＸ２Ｐ（配列番号１５）の相同配列は、マウスの２８８〜２９２の位置（マウスＺａｐ−７０２８８−２９２）、ヒトの２９０〜２９４の位置（ヒトＺａｐ−７０２９０−２９４）にあるＤＧｐＹＴＰ（配列番号１６）である。マウスとヒトのＩＲＳ−１では、配列モチーフＮ／ＤＸ１ｐＹＸ２Ｐの相同配列は、マウスの６０６〜６１０の位置（マウスＩＲＳ−１６０６−６１０）、ヒトの６１０〜６１４の位置（ヒトＩＲＳ−１６１０−６１４）にあるＤＧｐＹＭＰ（配列番号１７）である。したがってさらに別の好ましい一実施態様では、ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、ＤＧｐＹＴＰまたはＤＧｐＹＭＰを含むか、ＤＧｐＹＴＰまたはＤＧｐＹＭＰからなる。
【００３９】
ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドがチロシンを含んでいて、そのチロシンがリン酸化されていることが好ましい。チロシンをリン酸化するとＣｂｌファミリーのメンバー（特にＣｂｌ−ｂ）との相互作用が増加するため、チロシンのリン酸化は、本発明のあらゆる側面における好ましい一実施態様である。
【００４０】
これらペプチドの任意のものをレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチドとして用いることができる。レトロ−インベルソペプチドは、配列が逆転している。すなわち左から右に向かって書かれる配列をＮ末端からＣ末端へと読むのではなく、配列をＣ末端からＮ末端へと読む。レトロ−インベルソペプチドの１つの利点は、増大した安定性である。レトロ−インベルソ配列になったどのペプチドもＬ型ではなくてＤ型である（Ｂｒｕｇｉｄｏｕ他、１９９５年；Ｓｎｙｄｅｒ他、２００４年；Ｔｕｇｙｉ他、２００５年；Ｗａｎｇ他、２０１７年を参照されたい）。例えば配列番号１のコンセンサス配列（ＳＦＮＰＹＥＰＸ１Ｘ２Ｘ３）は、ｄＸ３ｄＸ２ｄＸ１ｄＰｄＥｄＹｄＰｄＮｄＦｄＳ（ただし「ｄ」はＤ型アミノ酸を表わす）になる（レトロ−インベルソＳＦＮＰＹＥＰＸ１Ｘ２Ｘ３とも呼ばれる）。あるいは配列番号１０（ＤＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）の膜透過ペプチドは、ｄＫｄＫｄＷｄＫｄＭｄＲｄＲｄＮｄＱｄＦｄＷｄＩｄＫｄＩｄＱｄＲｄＤになる（レトロ−インベルソＤＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫとも呼ばれる）。他の特性は以前のままである。すなわちチロシンはリン酸化されていることが好ましく、他のペプチド（正常なペプチドとさらに別のレトロ−インベルソペプチドの両方）に含まれるか、他のペプチドに結合するか、他のペプチドと融合することができる。ペプチドの安定性増大を実現するのに所与のペプチド配列の配列全体をレトロ−インベルソ型にする必要はなく、１個または数個のアミノ酸で十分である。例えばＣｂｌファミリー結合ペプチドと膜透過ペプチドの一方または両方が、１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上のレトロ−インベルソアミノ酸を含有しており、ＣＰＰは、レトロ−インベルソアミノ酸またはレトロ−インベルソ配列を含有することが好ましい。便宜上の理由で、Ｄ−アミノ酸がさらに隣接していない１個のＤ−アミノ酸が含まれる場合には、このアミノ酸を、配列逆転が起こっていないため単純にＤ型と呼ぶ。２個以上のＤ−アミノ酸が連続している場合には、連続したこれらＤ−アミノ酸の配列を逆転させ、この部分をレトロ−インベルソ型と呼ぶ。
【００４１】
本発明はさらに、融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。担体は、細胞へのそのペプチドの取り込みを促進することができる。
【００４２】
好ましい一実施態様では、医薬として許容可能な担体は、小胞、ミセル、リポソーム、ミクロソームから選択される。これらは、細胞へのペプチドの取り込みを、治療に利用するために、または治療以外に利用するためにも、増大させることができる。医薬組成物は、医薬として許容可能な塩、緩衝液、等張剤、医薬として許容可能な担体を含むことができる。医薬用担体は組成物の適合性を向上させ、活性成分の可溶性改善と生物学的利用能改善を可能にする。その例は、乳化剤、増粘剤、レドックス成分、デンプン、アルコール溶液、ポリエチレングリコール、脂質である。別の好ましい一実施態様では、医薬組成物は、非経口投与（特に静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、髄腔内投与、皮下投与、腹腔内投与）用に調製されるか、非経口投与で使用される。別の好ましい一実施態様では、医薬組成物は、局所投与用に調製されるか、局所投与で使用され、皮膚浸透増進剤をさらに含むことが好ましい。適切な皮膚浸透増進剤の選択は、安息香酸Ｃ１２−Ｃ１５アルキル、ペンチレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシジグリコール、ジメチルスルホキシド、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート（モノラウリン酸ポリエチレンソルビタン）、レシチンと、これらの混合物を含むグループからなされる。別の好ましい一実施態様では、医薬組成物は、腫瘍内投与用および／または腫瘍周辺投与用に調製されるか、腫瘍内投与および／または腫瘍周辺投与で使用される。
【００４３】
本発明のペプチドまたは医薬組成物は治療用であることが好ましく、そのペプチドまたは組成物が患者に投与される。より好ましいのは、そのペプチドまたは医薬組成物が、患者の真菌感染症および／またはがんの予防用または治療用であることである。
【００４４】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）とＣＬＲは、侵入する病原体（病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる）の保存されている構造を認識し、したがって免疫応答を誘導することが示されている（ＫａｗａｉとＡｋｉｒａ、２０１０年；ＫａｗａｉとＡｋｉｒａ、２０１１年）。Ｃｈｉｂａら（２０１４年）は、ＣＬＲデクチン−１が腫瘍細胞を認識し、その帰結として抗腫瘍応答のために自然免疫細胞を活性化することを証明した。デクチン−１は、腫瘍細胞が特異的に発現する糖エピトープのための受容体として機能する。近位デクチン−１シグナル伝達の負の調節におけるＣｂｌ−ｂの機能が原因で、ＴＫＢ結合ペプチドはデクチン−１のシグナル伝達を増大させて自然免疫系による腫瘍細胞の免疫認識に影響を与える。Ｃｂｌ−ｂを本発明で抑制することによる免疫系の活性化増大に加え、この機構が、自然免疫系によって駆動される抗腫瘍免疫をさらに増進する。したがって本発明のさらに好ましい一実施態様では、本発明のペプチドまたは医薬組成物は、腫瘍、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫（特に細胞内寄生虫）感染症、真菌症、薬剤性免疫抑制の予防または治療に使用される。特に好ましいのは、腫瘍とがんの治療である。本明細書では、本発明のＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが腫瘍の成長を低下させ、免疫系の抗腫瘍反応性を増大させることが示された。治療するさらに別の疾患または病気は、先天性または後天性の免疫不全（例えばエイズ）、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、薬剤性免疫抑制、がんと、場合によっては疾患特異的抗原の選択によって特徴づけられる。固形腫瘍を含むがんの治療が特に好ましい。
【００４５】
腫瘍細胞ではＮ−グリカン構造が大いに発現している。本発明の別の好ましい一実施態様では、本発明のペプチドまたは医薬組成物は、Ｎ−グリカンを大量に発現しているそのような腫瘍の予防または治療に用いるためのものである。特定のタイプの細胞内の高レベルのＮ−グリカン量（モル）は、腫瘍でないそのタイプの細胞で見られるＮ−グリカンの少なくとも１．５倍である。腫瘍でないそのタイプの細胞は、例えばメラノサイト、上皮細胞、リンパ球、間葉細胞、肺細胞、血液細胞、肝細胞である。本発明の好ましい実施態様によれば、本発明に従って治療すべきがん疾患または腫瘍疾患の選択は、卵巣がん、精巣がん、前立腺がん、乳がん；消化管のがん疾患（特に胃がん、大腸がん、直腸がん、膵臓がん、食道がん、肝臓がん）；腎臓がん、皮膚がん（特にメラノーマ）、基底細胞癌、扁平細胞癌；神経芽細胞腫、膠芽腫、肺がん、甲状腺がん、肉腫、頭部と首のがん、扁平細胞癌、リンパ腫、白血病からなされる（ただし「がん」、「腫瘍」、「癌」などは、本明細書では常に交換可能に使用され、悪性疾患を意味する）。
【００４６】
使用するペプチドまたは医薬組成物は、融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドを１ｍｇ〜５００ｍｇ含むものを、好ましくは７日間、１４日間、２１日間、２８日間までのいずれか、および／または毎日、患者に腹腔内注射によって投与することが好ましい。５ｍｇ〜２００ｍｇと１０ｍｇ〜１００ｍｇも、好ましい用量である。
【００４７】
Ｃｂｌ−ｂは、自然免疫系と獲得免疫系の負の調節因子である（図３）。したがって本明細書に規定したＣｂｌ−ｂ結合ペプチドは、ワクチンアジュバントとして投与するとき、自然免疫反応と獲得免疫反応の両方を正方向に刺激することができる。具体的には、本明細書に規定したＣｂｌ−ｂ結合ペプチドは、ワクチン接種の間にチェックポイント阻害を取り除くことができる。したがって本発明によって患者でワクチンアジュバントとして用いるためのＣｂｌ−ｂ阻害剤または他の任意のＣｂｌファミリータンパク質阻害剤も提供され、そのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤は、本明細書に規定したＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドである。一実施態様では、ワクチン接種は、腫瘍、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症のいずれかに対するものである。関連する一実施態様では、本発明により、アジュバントとしてＣｂｌファミリータンパク質阻害剤を含むワクチンが提供される。Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤は、ＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと、少なくとも１つの抗原であることが好ましい。
【００４８】
本明細書では、「ワクチン接種」は、絶対的な意味、すなわち免疫系による絶対的な保護につながる免疫原の投与と理解するのではなく、免疫系による保護を増大させるため、および／または免疫系、特にワクチン抗原に対する免疫系の細胞を活性化させるための免疫学的投与と理解するべきである。本発明のＣｂｌファミリータンパク質阻害剤、特に本発明のペプチドは、患者でワクチン抗原に対する免疫反応性を増大させる、および／または患者で免疫反応性そのものを増大させる。
【００４９】
好ましい一実施態様では、治療する患者は哺乳動物である。さらに好ましい一実施態様では、患者はヒトである。別の一実施態様では、ワクチンアジュバントとして用いるＣｂｌファミリータンパク質阻害剤は、抗原を含むワクチンとともに患者に投与されて、その抗原に対する免疫反応がＣｂｌファミリータンパク質抑制によって増大することになる。代わりの一実施態様では、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤は、ワクチンを投与する前および／または後に患者に投与される。
【００５０】
本発明により、Ｃｂｌファミリータンパク質の抑制が全身性真菌感染症と皮膚真菌感染症（カンジダ症が好ましい）の治療に有効であることが示された（例えば実施例３、図５ｈ）。皮膚真菌感染症としてさらに皮膚糸状菌症が可能であり、全身性真菌感染症としてアスペルギルス症も可能である。皮膚真菌感染症は局所療法によって治療することができる。局所抗真菌投与剤形に含まれるのは、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、粉末、溶液、スプレーである。本発明では、本明細書に記載した融合ペプチドを用いた治療が、すでに罹患している真菌性敗血症の治療において有効であることがさらに証明された（実施例６、図１０ｊ、図１０ｋ、図１２ｇ〜図１２ｋ）。真菌性敗血症は増加しつつあり、かなりの罹患率と死亡率に関係していると報告されている（ＬｅｐａｋとＡｎｄｅｓ、２０１１年）。好ましい一実施態様では、本発明のＣｂｌファミリータンパク質阻害剤、ペプチド、組成物のいずれかを用いて治療する真菌感染症は、皮膚糸状菌感染症またはアスペルギルス感染症である。真菌感染症は、急性、全身性、皮膚性のいずれかであることが好ましい。
【００５１】
患者は、敗血症（特に真菌感染症が原因の敗血症（「真菌性敗血症」））に罹患しているか、敗血症になるリスクがあることが好ましい。免疫刺激、特に病原体に対する免疫反応を本発明で増大させることにより、敗血症のリスクを阻止するか低下させることができる。急性敗血症では、免疫クリアランスを早めることができる。
【００５２】
治療する疾患または病気は、急性でも慢性でもよい。慢性状態は、少なくとも９０日間と定義される。急性の治療は、その疾患または病気になってから０日目〜８９日目、好ましくは４日目〜３０日目に開始することができる。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様では、Ｃｂｌファミリーのメンバーの機能低下または機能抑制は一過性である。すなわち機能は一時的に低下するだけであるため、例えば阻害剤の消費または分解によって再び回復することができる。インビトロまたは患者の体内での免疫細胞内のＣｂｌファミリーの一時的低減を、例えば治療が成功するまで繰り返して実施することもできる。
【００５４】
本発明のさらに好ましい一実施態様では、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤またはペプチドまたは医薬組成物は、患者の静脈内、動脈内、筋肉内、血管内、皮下、腹腔内のいずれかに投与される。より好ましいのは、治療すべき患者が哺乳動物であることである。より一層好ましいのは、患者がヒトであることである。
【００５５】
別の好ましい一実施態様では、使用するＣｂｌファミリータンパク質阻害剤またはペプチドは、医薬として許容可能な担体（特に小胞、ミセル、リポソーム、ミクロソーム）を用いて患者に投与される。
【００５６】
したがって本発明は、自然免疫を調節する（特に増大させる）方法にも関係しており、この方法は、例えば上述のように患者の体内の少なくとも免疫細胞内でＣｂｌファミリータンパク質を抑制することを含んでいる。本明細書に開示した融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドを患者に投与することが好ましい。より好ましいのは、自然免疫が、自然抗寄生虫免疫、自然抗真菌免疫、自然抗腫瘍免疫であることである。
【００５７】
本発明の治療が標的とする免疫細胞、または本発明の治療による影響を受ける免疫細胞は、抗原提示細胞、および／またはＰＢＭＣ（末梢血単球細胞）、および／またはＴリンパ球、および／またはＢリンパ球、および／または単球、および／またはマクロファージ、および／または樹状細胞であることが好ましく、特に、Ｔリンパ球、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球、特にＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞であることが好ましい。
【００５８】
本発明はさらに、ペプチドと、医薬として許容可能な賦形剤とを含むキットに関する。このキットは、患者で細胞内投与に適していることが好ましい。上記のように患者への任意の投与経路を選択することができる。キットは、化合物（例えば本発明のペプチドまたはＣｂｌファミリータンパク質阻害剤）と、細胞を処理するための医薬組成物または他の試薬の補助物質とを収容する容器を含むことができ、このキットを本発明の任意の方法または任意の利用で用いることができる。容器および／またはキットは、刺激をさらに大きくするため、（本発明のペプチドとは別に）さらなる免疫刺激物質（サイトカイン、または他の受容体（例えばＴＬＲ）のリガンドが好ましい）、または表面分子（ＣＤ３および／またはＣＤ２８が好ましい）に対する抗体も含むことができる。同様に、キットまたは容器は、安定化させる成分、媒体、緩衝液も含むことができる。
【００５９】
キットでは、または患者または細胞の併用療法では、インビトロまたはインビボで、本発明のＣｂｌファミリータンパク質阻害剤を別の免疫刺激化合物と組み合わせることができる。免疫刺激化合物は免疫細胞刺激サイトカインなどであり、そのサイトカインの選択は、例えば一般的なγ鎖サイトカイン（特に、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１）；適応免疫系と自然免疫系両方の細胞を刺激するサイトカイン（特にＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７）；エフェクタ細胞サイトカイン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８）；インターフェロン、（特にインターフェロンα）；インターフェロン刺激因子；抗体（特に腫瘍細胞表面分子、ＴＬＲリガンド、ＰＡＭＰ受容体リガンドを認識する抗体であり、特にＴＬＲ−１、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＴＬＲ−９のアゴニストが好ましい）からなされる。本発明による免疫細胞刺激サイトカイン、適応免疫系と自然免疫系両方のサイトカイン、エフェクタ細胞サイトカイン、インターフェロン刺激因子の選択は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−１７ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−λ、ＴＮＦ（以前はＴＮＦα）、リンホトキシンα（以前はＴＮＦβ）を含むグループからなされることが好ましい。本発明の物質を投与する文脈で用いられる「同時に」または「とともに」または「との組み合わせで」または「と組み合わせて」という表現は、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤以外の少なくとも１つの免疫刺激化合物を投与することを意味する。投与が複数の異なる医薬組成物を用いてなされる場合には、組み合わせ投与は、同時に、または順番に実施することができる。
【００６０】
Ｃｂｌファミリーのタンパク質（例えばＣｂｌ−ｂ）は、インビトロで自然免疫細胞（特にマクロファージと樹状細胞）において機能し、Ｃｂｌ−ｂの抑制によって免疫細胞の免疫応答または活性が増大した。したがって本発明は、免疫細胞の活性化に関する。免疫細胞として、抗原提示細胞、および／またはＰＢＭＣ（末梢血単球細胞）、および／またはＴリンパ球、および／またはＢリンパ球、および／または単球、および／またはマクロファージ、および／または樹状細胞が可能であり、特に、Ｔリンパ球、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球、特にＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞が可能である。このような細胞は、本発明のＣｂｌファミリータンパク質阻害剤で処理して刺激することもできる。したがって本発明により、免疫細胞を刺激または活性化するインビトロの方法として、その細胞を、本明細書に開示した融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと接触させること、またはそのペプチドで処理することを含む方法が提供される。この方法は、活性化または刺激された免疫細胞によるサイトカインの産生を含むことが好ましい。例えば産生されるサイトカインは、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３、ＴＮＦから選択される。
【００６１】
本明細書では、「治療する」または「治療」という用語は、すでに存在する疾患状態または病気を治癒させること、または疾患状態または病気からの回復の可能性を大きくすることを意味する。治療するには、抑制すること、すなわち疾患状態または病気の進行を停止させることと、改善させること、すなわち疾患の後退を引き起こすことも含むことができる。治療は、患者の治癒に至らなくても疾患の症状を改善することでもよい。
【００６２】
本明細書では、「予防する」または「予防」という用語は、患者または対象で疾患状態または病気が起こるのを完全に止めることを意味するのではなく、疾患状態または病気が進行するリスクを減らすことを意味する。
【００６３】
好ましい一実施態様では、本発明の医薬組成物は、医薬として許容可能な非経口投与用の１種類以上の賦形剤をさらに含むことができる。適切な賦形剤は当業者に知られており、例えば水（特に注射用の水）、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、緩衝液、ハンク溶液、小胞形成化合物（例えば脂質）、不揮発性油、オレイン酸エチル、生理食塩水中の５％デキストロース、等張性と化学的安定性を増大させる物質、緩衝液、保存剤が挙げられる。この医薬組成物は、それを必要とする患者（すなわち本明細書で言及した疾患または病気に罹患している患者、または本明細書で言及した疾患または病気が進行するリスクを有する患者）に（薬として）当業者に知られた適切な手続きで投与することができる。この医薬組成物の好ましい投与経路は、非経口投与、特に静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、髄腔内投与、皮下投与、腹腔内投与、局所投与である。非経口投与のためには、本発明の医薬組成物は、医薬として許容可能な上記の担体とともに製剤にされて、注射可能な単位剤形で、例えば溶液、懸濁液、乳液として提供される。しかし用量と投与方法は、治療する個々の患者によって異なる。この医薬組成物は、他のペプチド投与計画から知られている適切な任意の用量で、または所与の個人のために特別に評価されて最適化された用量で投与することができる。例えば活性剤（すなわち本発明の融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチド）は、医薬組成物の中に１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは５０ｍｇ〜２ｇ、特に１００ｍｇ〜１ｇの量で存在することができる。通常の用量は、患者の体重（ｋｇ）をもとにして決定することもでき、例えば好ましい用量は、（投与セッションごとに）体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、特に体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲である。投与は、例えば１日１回、２日に１回、１週間に１回、２週間に１回が可能である。本発明の医薬組成物の好ましい投与様式は非経口投与であるため、液体であること、または液体（例えば減菌水、脱イオン水、蒸留水、減菌等張リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））に容易に溶けることが好ましい。このような組成物１０００μｇ（乾燥重量）は、本発明の活性剤を０．１〜９９０μｇ（好ましくは１〜９００μｇ、より好ましくは１０〜２００μｇ）と、（好ましくは最終体積の中に等張緩衝液を生じさせるため）場合によっては１〜５００μｇ（好ましくは１〜１００μｇ、より好ましくは５〜１５μｇ）の（緩衝）塩と、場合によっては０．１〜９９９．９μｇ（好ましくは１００〜９９９．９μｇ、より好ましくは２００〜９９９μｇ）の他の賦形剤を含むことが好ましい。このような乾燥組成物１００ｍｇを減菌脱イオン水／蒸留水、または減菌等張リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶かして最終体積を０．１〜１００ｍｌ（好ましくは０．５〜２０ｍｌ、より好ましくは１〜１０ｍｌ）にすることが好ましい。
【００６４】
本明細書では、「結合している」または「結合する」という用語は、分子Ａ（例えばＣｂｌファミリータンパク質に結合する分子であるＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドなど）が、分子Ｂ（Ｃｂｌファミリータンパク質様Ｃｂｌ−ｂ、特にそのＴＫＢドメイン）に対して１０００ｎＭ（好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは５０ｎＭ未満、より一層好ましくは１０ｎＭ未満、特に５ｎＭ未満）よりも小さい（すなわち「より強い」）解離定数（「親和性」とも呼ばれる）を有することを要求する。
【００６５】
予防または治療する患者は哺乳動物であることが好ましく、特にヒトであることが好ましい。典型的には、（本明細書に規定した真菌感染症に罹患していることが好ましく、特に本明細書に規定した真菌感染症と診断されている）患者は、本発明の治療を必要としている。真菌感染症を予防するための本発明の処置の文脈では、患者として、真菌感染症に罹患していないが、真菌感染症が進行するリスクがある患者（例えば免疫不全患者）が可能である。別の一実施態様では、（本明細書に規定したがんに罹患していることが好ましく、特に本明細書に規定したがんと診断されている）患者は、本発明の治療を必要としている。がんを予防するための本発明の処置の文脈では、患者として、がんに罹患していないが、がんが進行するリスクがある患者が可能である。
【００６６】
本明細書では、「ＴＫＢ結合ペプチド」という用語は、Ｃｂｌファミリー結合タンパク質（例えばＣｂｌファミリーのメンバー（例えばＣｂｌ−ｂ）のＴＫＢドメインに結合するＣｂｌ−ｂ結合ペプチド）を意味する。
【００６７】
「含む」は、個数制限のない用語として用いられており、他の要素も存在していてよいことを意味する。「からなる」は、個数制限のある用語として用いられているため、記載されている本発明の１つの要素または要素群は、記載されている要素だけからなる。ある１つの要素または要素群を含むと記載されている本発明の一実施態様は、そうでないと述べられているのでなければ、その要素または要素群だけからなることも可能である。
【００６８】
「１つの」という単語の使用は、請求項および／または明細書の中で「含む」という用語とともに用いるときには「１つ」を意味することができるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、「２つ以上」の意味とも合致している。
【００６９】
以下の実施態様で本発明をさらに規定する。
【００７０】
１．細胞送達部分と、ｃａｓｉｔａｓ  Ｂ系列リンパ腫ファミリー（Ｃｂｌファミリー）ＴＫＢドメイン結合ペプチドとを含む融合ペプチド。そのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、Ｃｂｌファミリータンパク質のチロシンキナーゼ結合（ＴＫＢ）ドメインに結合する。あらゆる実施態様と本発明のさらなる定義２〜４７では、Ｃｂｌファミリータンパク質はＣｂｌ−ｂであることが好ましく、ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、Ｃｂｌ−ｂのＴＫＢドメインに結合するＣｂｌ−ｂ結合ペプチドである。
【００７１】
２．前記細胞送達部分が膜透過ペプチドである、項１に記載の融合ペプチド。
【００７２】
３．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）のペプチド断片である、項１または２に記載の融合ペプチド。
【００７３】
４．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが配列モチーフＮ／ＤＸｐＹを有する（ただしＸは任意のアミノ酸から選択され、Ｎ／Ｄはアスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）であり、ｐＹはホスホチロシンである）、項１〜３のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【００７４】
５．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが配列モチーフＮ／ＤＸ１ｐＹＸ２Ｐを有する（ただしＸ１とＸ２は任意のアミノ酸から選択され、上記のタンパク質構成アミノ酸および／または非タンパク質構成アミノ酸を含むことが好ましく、Ｎ／Ｄはアスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）であり、ｐＹはホスホチロシンである）、項１〜４のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【００７５】
６．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、７０ｋＤａのゼータ関連タンパク質（Ｚａｐ−７０）またはインスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）のペプチド断片である、項１、２、４、５のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【００７６】
７．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドがＣｂｌファミリーのメンバーに結合し、チロシンを含んでいて、そのチロシンがリン酸化されている、項１〜６のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【００７７】
８．以下のコンセンサス配列：
ＳＦＮＰＹＥＰＸ１Ｘ２Ｘ３
を含み（ただしＸ１〜Ｘ３は、独立に、任意のアミノ酸から選択され、上記のタンパク質構成アミノ酸および／または非タンパク質構成アミノ酸を含むことが好ましい）、より好ましくは前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドがＳｙｋのペプチド断片である、項１〜７のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【００７８】
９．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが配列ＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧを含む、項８に記載の融合ペプチド。
【００７９】
１０．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが配列ＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧを含む、項８に記載の融合ペプチド。
【００８０】
１１．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが配列ＳＦＮＰＹＥＰＥＶＡを含む、項８に記載の融合ペプチド。
【００８１】
１２．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが配列ＳＦＮＰＹＥＰＥＬＡを含む、項８に記載の融合ペプチド。
【００８２】
１３．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドがＳｙｋに由来していて以下のコンセンサス配列：
ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＷＸ５
（ただしＸ１〜Ｘ５は、独立に、任意のアミノ酸から選択され、上記のタンパク質構成アミノ酸および／または非タンパク質構成アミノ酸を含むことが好ましい）を含み、好ましくはこのコンセンサス配列からなり、より好ましくは前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドがＳｙｋのペプチド断片である、項１〜１２のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【００８３】
１４．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが配列ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧＰＷＧを含み、好ましくはこの配列からなる、項１３に記載の融合ペプチド。
【００８４】
１５．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが配列ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧＡＷＧを含み、好ましくはこの配列からなる、項１３に記載の融合ペプチド。
【００８５】
１６．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが配列ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＥＶＡＰＷＡを含み、好ましくはこの配列からなる、項１３に記載の融合ペプチド。
【００８６】
１７．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが配列ＳＴＶＳＦＮＰＹＥＰＥＬＡＰＷＡを含み、好ましくはこの配列からなる、項１３に記載の融合ペプチド。
【００８７】
１８．前記配列中のチロシンがリン酸化されている、項８〜１７のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【００８８】
１９．前記膜透過ペプチドが、ＤＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、（ＫＫＤＫＫＤＥＲＲＸＡＫ）ｍ（ただし１≦ｍ≦５である）から選択され、ＸＡがＫ、Ｒ、（ＫＩＫＫＸＢＫＫＫＧＲＫ）ｍ（ただし１≦ｍ≦５である）から選択され、ＸＢがＶ、Ｉ、Ｔ、（Ｒ）ｎ（ただし６≦ｎ≦１２である）から選択される、項２〜１８のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【００８９】
２０．項１〜１９のいずれか１項に規定した細胞送達部分と、ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドを含んでいて、そのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドがイントラマーまたはアプタマーであって、Ｃｂｌ−ｂなどのＣｂｌファミリータンパク質を抑制し、好ましくはＣｂｌファミリータンパク質のＴＫＢドメインに結合する、融合タンパク質。
【００９０】
２１．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドがＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドであり、そのペプチドが自然免疫の調節因子である、項１〜２０のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【００９１】
２２．前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドがＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドであり、そのペプチドが、自然抗寄生虫免疫、または自然抗真菌免疫、または自然抗腫瘍免疫の調節因子である、項１〜２１のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【００９２】
２３．項１〜２２のいずれか１項に記載の融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと、細胞へのそのペプチドの取り込みを促進する、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【００９３】
２４．医薬として許容可能な前記担体が、小胞、ミセル、リポソーム、ミクロソームから選択される、項２３に記載の医薬組成物。
【００９４】
２５．非経口投与用、特に静脈内投与用、動脈内投与用、筋肉内投与用、髄腔内投与用、皮下投与用、腹腔内投与用、局所投与用いずれかに調製されている、項２３または２４に記載の医薬組成物。
【００９５】
２６．局所投与用に調製されており、好ましくは皮膚浸透促進剤をさらに含む、項２３または２４に記載の医薬組成物。
【００９６】
２７．治療用であり、患者に投与される、項１〜２６のいずれか１項に記載のペプチドまたは医薬組成物。
【００９７】
２８．患者で真菌感染症の予防または治療に用いるための、項２７に従って使用するためのペプチドまたは医薬組成物。
【００９８】
２９．ＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドである、項２７または２８に従って使用するためのペプチドまたは医薬組成物。
【００９９】
３０．腫瘍、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症（特に細胞内寄生虫感染症）、薬剤性免疫抑制いずれかの予防または治療に用いるための、項２７〜２９のいずれか１項に従って使用するためのペプチドまたは医薬組成物。
【０１００】
３１．項２７〜３０のいずれか１項に記載のペプチドまたは医薬組成物であって、そのペプチドが、患者に、前記融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドを１ｍｇ〜５００ｍｇの用量にして、好ましくは７日間、１４日間、２１日間、２８日間までのいずれか、および／または毎日投与される、ペプチドまたは医薬組成物。
【０１０１】
３２．患者でワクチンアジュバントとして治療に用いるためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤、好ましくはＣｂｌ−ｂ阻害剤であって、好ましくはそのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤がＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドであり、より好ましくはＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドである、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤。
【０１０２】
３３．患者で真菌感染症の予防または治療に用いるためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤であって、その真菌感染症が酵母感染症であり、好ましくはカンジダ症またはクリプトコッカス症である、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤。
【０１０３】
３４．患者で真菌感染症の予防または治療に用いるためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤であって、そのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤が、ＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドを含む、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤。
【０１０４】
３５．前記真菌感染症が酵母感染症であり、好ましくはカンジダ症であり、特にカンジダ・アルビカンス感染症、カンジダ・グラブラタ感染症、カンジダ・クルセイ感染症、またはカンジダ・ドゥブリニエンシス感染症である、項２７〜３４のいずれか１項に従って使用するためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤、またはペプチド、または医薬組成物。
【０１０５】
３６．前記真菌感染症が皮膚糸状菌感染症またはアスペルギルス感染症である、項２７〜３４のいずれか１項に従って使用するためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤、またはペプチド、または医薬組成物。
【０１０６】
３７．前記真菌感染症が、急性、または全身性、または皮膚性である、項２７〜３６のいずれか１項に従って使用するためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤、またはペプチド、または医薬組成物。
【０１０７】
３８．前記患者が真菌性敗血症に罹患しているか、真菌性敗血症が進行するリスクを有する、項２７〜３７のいずれか１項に従って使用するためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤、またはペプチド、または医薬組成物。
【０１０８】
３９．前記患者に静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、血管内投与、皮下投与、腹腔内投与、髄腔内投与のいずれかで投与される、項２７〜３８のいずれか１項に従って使用するためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤、またはペプチド、または医薬組成物。
【０１０９】
４０．前記患者が哺乳動物であり、好ましくはヒトである、項２７〜３９のいずれか１項に従って使用するためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤、またはペプチド、または医薬組成物。
【０１１０】
４１．医薬として許容可能な担体、特に小胞、ミセル、リポソーム、ミクロソームのいずれかを用いて前記患者に投与される、項２７〜４０のいずれか１項に従って使用するためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤またはペプチド。
【０１１１】
４２．Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤をアジュバントとして含むワクチンであって、好ましくはそのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤が、ＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと、少なくとも１つの抗原を含み、好ましくはそのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤が、項１〜２２と項２７〜４０のいずれか１項に記載のものである、ワクチン。
【０１１２】
４３．好ましくは項１〜２２と項２７〜４０のいずれか１項に記載の融合ペプチドまたはＣｂｌファミリータンパク質阻害剤を患者に投与することによってＣｂｌファミリータンパク質を抑制することを含む、自然免疫を調節するための、特に自然免疫を増進するための方法。
【０１１３】
４４．前記自然免疫が、抗寄生虫免疫、抗真菌免疫、抗腫瘍免疫のいずれかである、項４３に記載の方法。
【０１１４】
４５．項１〜３１のいずれか１項に記載のペプチドと、医薬として許容可能な賦形剤、好ましくは患者の細胞内投与に適した賦形剤とを含むキット。
【０１１５】
４６．インビトロまたはインビボで免疫細胞を刺激または活性化する方法であって、その細胞を、項１〜２２のいずれか１項に記載の融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと接触させるか、そのペプチドで処理することを含む方法。
【０１１６】
４７．サイトカインが産生され、好ましくはそのサイトカインがＩｌ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦから選択される、項４６に記載のインビトロまたはインビボで免疫細胞を刺激または活性化する方法。
【０１１７】
本発明はさらに、以下の図面と実施例によって説明されるが、本発明がそれらに限定されることはない。
【実施例】
【０１１８】
実施例１  −  材料と方法
【０１１９】
マウス：Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウス、Ｃｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａマウス、Ｒａｇ２Δ／Δ欠損マウスは以前に報告されており、それらのマウスをＣ５７ＢＩ／６バックグラウンドで飼育した。マウスの遺伝子型をＰＣＲによって評価した。注目すべきことに、それぞれ出産の同腹マウスから年齢と性別だけがマッチしたマウスを実験で使用した。オーストリアの現行法に合致した倫理的動物ライセンスプロトコルに従ってすべてのマウスを飼育して維持した。
【０１２０】
骨髄キメラマウスの作製：骨髄キメラマウスを作製するため、８週齢の野生型またはＲａｇ２Δ／Δ欠損のＣ５７ＢＩ／６マウスに放射線量を分割して照射し（２×６Ｇｙ）、２回目の照射の１８時間後に３００万個のドナー細胞を静脈内に注入することによってマウスを再構成した。実験は、完全な再構成が可能になるよう８週間後に実施した。再構成の８週間後、適用した条件下での再構成の効率を、同時出産のＣＤ４５．１レシピエントマウスを用い、脾臓細胞を染色してＣＤ４５．１（レシピエント由来）とＣＤ４５．２（ドナー由来）を探すことによって調べると、常に９８％超であった。
【０１２１】
好中球、単球、樹状細胞の単離と分化：好中球は、Ｌｙ−６Ｇ標識の後、マウスの頸骨と大腿骨から、以前に報告されている（Ｂｏｘｉｏ他、２００４年）ようにしてＰｅｒｃｏｌｌ勾配（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を利用して単離するか、ＭＡＣＳ技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を利用して精製した。骨髄単球は、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ−６Ｇ、Ｌｙ−６Ｃに対して特異的な抗体を用いて標識した後、ＦＡＣＳソーティングによって精製した。脾臓樹状細胞は、ＣＤ１９、ＴＣＲβ、Ｌｙ−６Ｇ、ＣＤ１１ｃに対する抗体を用いて標識した後にＦＡＣＳソーティングした。精製した好中球、単球、脾臓樹状細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（ＰＡＡ社）の中で培養した。骨髄前駆細胞からの分化によってＢＭ−ＤＣまたはＢＭ−Ｍが得られた。末梢血の単球または好中球を顎下瀉血によって取得し、カリウムＥＤＴＡ試験管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社、ドイツ国）の中に回収した。塩化アンモニウムカリウム（ＡＣＫ）緩衝液を用いて赤血球細胞を溶解させた。
【０１２２】
フローサイトメトリー：Ｆｃ受容体をブロックした後、氷の上のＦＡＣＳ染色緩衝液（２％ＦＢＳと２ｍＭ  ＥＤＴＡを補足したＰＢＳ）の中で３０分間かけて白血球を抗体で標識した。Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて細胞の生存を評価した。臓器をコラゲナーゼ４（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）／ＤＮＡアーゼ（Ｒｏｃｈｅ社）で消化させ、生存性染色し、Ｆｃをブロックし、抗体染色し、フローサイトメトリーによって免疫細胞のリクルートを評価した。サンプルはＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメータを用いて取得し、データはＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）を用いて分析した。
【０１２３】
サイトカイン放出、ＲＯＳ生成、カスパーゼ−８活性の測定：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（ＩＬ−１β、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３）またはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ＩＬ−１Ｒａ）から購入したＥＬＩＳＡキットを製造者の指示に従って用い、細胞培養物の上清によるサイトカイン分泌、または腹腔洗浄液の中のサイトカイン分泌を評価した。以前に報告されている（Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ他、２００９年）ようにして、プローブとしてルミノールを用いたアッセイで活性酸素種（ＲＯＳ）をリアルタイムで９０分間にわたって測定した。ＣａｓｐＧＬＯＷアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を製造者の指示に従って利用してカスパーゼ−８活性を評価した。
【０１２４】
ファゴサイトーシスアッセイ：ファゴサイトーシスアッセイのため、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）の中でカンジダ・アルビカンス（株ＳＣ５３１４）をＡｌｅｘａ  ４８８で標識した。ＢＭ−ＤＣまたはＢＭ−Ｍを標識したカンジダ・アルビカンスとともに３７℃で４５分間培養した。食細胞に接着しているが食細胞によるファゴサイトーシスは受けない真菌細胞による蛍光をトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）でクエンチし、ファゴサイトーシスの割合をフローサイトメトリーによって評価した。
【０１２５】
殺菌アッセイ：殺真菌活性を評価するため、指定された免疫細胞を９６ウエルのプレートに１×１０５細胞／ウエルの密度で播種した。細胞をカンジダ・アルビカンスとともに１：５００の感染多重度で２４時間培養した。インキュベーションの後、最終濃度４％のパラホルムアルデヒドを添加して食細胞を固定した。その後、カンジダ・アルビカンスをＣｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｓｉｇｍａ社）で染色し、食細胞ありのウエルと食細胞なしのウエルでのコロニー数を比較することによって殺菌を評価した。
【０１２６】
マウスの感染症とクロドロン酸リポソーム処理：８〜１０週齢のマウスの静脈内に１０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）のカンジダ・アルビカンス（株ＳＣ５３１４）、１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）のカンジダ・ドゥブリニエンシス、１０５ＣＦＵのリステリア・モノサイトゲネス（株ＥＧＤ）のいずれかを感染させた。カンジダ・アルビカンスのＣＦＵは、報告されている（Ｗｉｒｎｓｂｅｒｇｅｒ他、２０１４年）ようにしてさまざまな臓器から評価した。クロドロン酸リポソームまたはＰＢＳリポソームで処理する実験では、カンジダ・アルビカンスを静脈内に感染させる２４時間前と２４時間後の両方に、マウスに、マウスの体重１０ｇ当たり１００μｌのリポソームを腹腔内注射した。クロドロン酸またはＰＢＳの対照リポソームはｃｌｏｄｒｏｎａｔｅｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．ｏｒｇから取得し、製造者の指示に従って取り扱った。すべてのマウス感染実験が、ウイーン医科大学の倫理委員会によって評価され、科学・研究局（ウイーン、オーストリア国）によって承認された。
【０１２７】
ＢＭ−ＭとＢＭ−ＤＣの刺激実験：ＢＭ−ＭとＢＭ−ＤＣを、カンジダ・アルビカンス（株ＳＣ５３１４）、ザイモサン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）、カードラン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）、ＴＤＭ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）、ＣｐＧ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）、ＬＰＳ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）、カンジダ・アルビカンス菌糸のいずれかで刺激した。抑制実験では、細胞を刺激する３０分前にＳｙｋ阻害剤Ｒ４０６（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社）、抗デクチン−１抗体（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）、ＭＧ１３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、Ｄｙｎａｓｏｒｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）のいずれかで処理した（ＭＯＩ：免疫細胞：カンジダ・アルビカンス＝１：２）。カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ドゥブリニエンシスの真菌単離体は、親切にもＡｌｌｇｅｍｅｉｎｅｓ  Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓ  Ｖｉｅｎｎａ（ＡＫＨ）から提供された。真菌単離体をＰＣＲによって調べ、それぞれの種を確認した。
【０１２８】
定量ＰＣＲ：ＳＶ−Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）またはＲｎｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてｍＲＮＡを単離し、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）またはｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて逆転写した。ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｐｅｑｌａｂ社）を用いてｑＰＣＲを実施した。
【０１２９】
ウエスタンブロッティングと免疫沈降：ウエスタンブロッティングを標準的なプロトコルに従って実施した。リン酸化されたエピトープを探すため、１×ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０の中の５％ウシ血清アルブミン、または１×ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０の中の４％ＢＳＡでブロットを１時間ブロックした後、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。その後、ブロットを１×ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０の中で１５分間ずつ３回洗浄した後、ＨＲＰ共役二次抗体（１：２５００；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、＃ＮＡ９３４０Ｖ）とともに室温で４５分間インキュベートし、１×ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０の中で１５分間ずつ３回洗浄し、増強化学発光（ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ、Ｐｉｅｒｃｅ社）を利用して可視化した。抗β−アクチンｍＡｂを用いてタンパク質負荷を制御した。Ｃｂｌ−ｂ免疫沈降実験のため、細胞をカンジダ・アルビカンスで刺激し、ホスファターゼ阻害剤とプロテイナーゼ阻害剤（Ｈａｌｔ  プロテアーゼ／ホスファターゼ混合型阻害剤；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）の中で溶解させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ  Ｐｌｕｓ  Ａｇａｒｏｓｅビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）でプレクリアし、抗Ｃｂｌ−ｂ抗体とともに一晩インキュベートした。示されている抗体を用いて沈降物をウエスタンブロッティングによって分析した。デクチン−１とデクチン−２の免疫沈降物に関しては、示されている遺伝子型のＢＭ−ＭをＥ−６４（１０μＭ）で３０分間前処理し、カンジダ・アルビカンス酵母、またはカンジダ・アルビカンス菌糸を示されている期間にわたって感染させ、氷の上の２％ＳＤＳを含有するＲＩＰＡ緩衝液の中で３０分間溶解させ、ＳＤＳなしのＲＩＰＡ緩衝液で希釈して最終ＳＤＳ濃度を０．４％にした。短時間の超音波処理の後、抗デクチン−１抗体または抗デクチン−２抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で用いてライセートを免疫沈降させた。示されている抗体を用いて沈降物をウエスタンブロッティングによって分析した。
【０１３０】
インビトロでのユビキチン化アッセイ：インビトロでのユビキチン化アッセイのための反応混合物は、１００ｎｍのＵｂｅ１（自家精製）、５００ｎＭのＵｂｃＨ５ｂ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１５０ｎＭの完全長ヒトＣｂｌ−ｂ（Ａｂｎｏｖａ社）またはヒトＣｂｌ−ｂ２９−４８３、触媒不活性なヒトＣ３７３Ａ  Ｃｂｌ−ｂ２９−４８３変異体のいずれかと、１００ｍＭのユビキチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｉｃｈ社）に加え、３００ｎＭの基質を、反応緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）の中に含有していた。基質は、活性な（リン酸化された）ヒトＳｙｋ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）と、不活性な（リン酸化されていない）ヒトＳｙｋ−ＧＳＴ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）であった。１ｍＭのＡＴＰを添加して反応を開始させ、３７℃で３０分間インキュベートした。ＴＫＢ結合ペプチドを媒介としたＣｂｌ−ｂ抑制に関しては、Ｃｂｌ−ｂを濃度１００μＭのＴＫＢ結合ペプチドとともに２４℃で２０分間プレインキュベートした後、反応混合物に添加した。アッセイをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に移し、抗ユビキチン抗体または抗Ｓｙｋ抗体を用いてブロットした。
【０１３１】
組み換えＣｂｌ−ｂ２９−４８３と組み換えＣ３７３Ａ  Ｃｂｌ−ｂ２９−４８３の作製：Ｃｂｌ−ｂ２９−４８３コード配列とＣ３７３Ａ  Ｃｂｌ−ｂ２９−４８３コード配列をｐＧＥＸ−２ＴＫベクターにクローニングしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を得た。Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地中でＯＤ６００を１にして０．３ｍＭのイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシドを用い、２０℃で一晩インキュベートすることにより、大腸菌ＢＬ２１の中での発現を誘導した。細胞を溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のトリトンＸ−１００）の中で溶解させ、３回軽く超音波処理し、グルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）とともに４℃で一晩インキュベートした。その後、セファロースビーズを溶解緩衝液で５回洗浄し、結合したタンパク質を溶離緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭの還元されたグルタチオン）で溶離させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングを利用して溶離液のサイズと純度を調べた。
【０１３２】
組織病理学：組織病理学的分析のため、腎臓を１０％中性緩衝化ホルマリンの中で固定し、標準的な手続きに従って処理し、パラフィンの中に包埋し、切片にした。厚さ２μｍの切片をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）、抗Ｌｙ−６Ｇ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社；クローン１Ａ８）のいずれかで染色した。抗原賦活化（ＢＯＮＤ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌキット、Ｌｅｉｃａ社）の後、ＤＡＢ増感と、１：１００の一次抗体希釈液を用いた免疫組織化学を実施した。４μｍの切片をゴモリメテナミン銀（ＧＭＳ；Ｍｅｒｃｋ社）で染色した。染色されたスライドをＰａｎｎｏｒａｍｉｃスライドスキャナ（３Ｄ  Ｈｉｓｔｅｃｈ社）で走査し、炎症の重篤度と病巣内真菌負荷を以下の基準に基づいて評価した。
【０１３３】
【表１】
2019527674.tif 000002
【０１３４】
Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｔｕｄｉｏ（商標）ソフトウエアを適用し、冒された腎臓内のＬｙ−６Ｇ＋細胞による浸潤の程度を評価した。スライドの代表的な領域内の興味ある領域と細胞を手作業で分類してソフトウエアのアルゴリズムを訓練することで、Ｌｙ−６Ｇ陽性標的対象を同定し、非標的対象を排除した。標的対象は、形態と陽性免疫組織学的染色に基づいて同定した。その後、最適化されたアルゴリズムを適用して全スライドを自動的に分析した。分析の有効性は、両方の群からの代表的なスライドの組織病理学的検証によって確認した。
【０１３５】
ペプチドの合成：ＡＢＩ  ４３３ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でＴＫＢ結合ペプチドを合成するため固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法を利用した。ペプチドをＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＲＰ−ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で精製し、４８００  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ分析装置（ＡＢＳｃｉｅｘ社）で分析した。凍結乾燥させたペプチドをＰＢＳに溶かし、−８０℃で保管した。
【０１３６】
免疫蛍光：カンジダ・アルビカンスを感染させる２４時間前にＢＭ−ＣＤをμ−スライド（ＩＢＩＤＩ社）の上に播種した。感染後、細胞を氷上の４％ＰＦＡの中で２０分間固定し、室温で１０分間浸透させ（０．２％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ）、室温で１時間ブロックした（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）。その後、細胞を３％ＢＳＡの中でＳｙｋ（１：１００）またはＳｈｐ−２（１：１００）に対する一次抗体とともに一晩インキュベートした。次に細胞をＰＢＳの中で洗浄し、３％ＢＳＡの中で室温にて抗ウサギＡｌｅｘａ５５５抗体（１：５００）とともに１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳの中で洗浄した後、ＤＡＰＩで対比染色し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡で直接画像を取得した。
【０１３７】
ＮａｎｏＬＣ−ＭＳ分析：本研究で使用したナノＨＰＬＣシステムは、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に接続されていてＰｒｏｘｅｏｎナノスプレー源（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を備えるＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣ  ＲＳＬＣナノシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）であった。ペプチドは、０．１％ＴＦＡを移動相として用いてトラップカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、アムステルダム、オランダ国、ＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８、５ｍｍ×３００μｍ  ＩＤ、５μｍの粒子、孔径１００Å）に流速２５μｌ／分で装填した。１０分後、トラップカラムを分析カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、アムステルダム、オランダ国、ＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８、５００ｍｍ×７５μｍ  ＩＤ、２μｍの粒子、１００Å）に合わせて切り換えた。２３０ｎｌ／分の流速とバイナリ２ｈ勾配を利用して１６５分間にわたってペプチドを溶離させた。３０℃で平衡させるため、勾配は、９８％水／ギ酸（９９．９／０．１；ｖ／ｖ）と２％水／アセトニトリル／ギ酸（１９．９２／８０／０．０８；ｖ／ｖ／ｖ）から開始し、１２０分間かけて３５％水／ギ酸（９９．９／０．１；ｖ／ｖ）と６５％水／アセトニトリル／ギ酸（１９．９２／８０／０．０８；ｖ／ｖ／ｖ）まで増加させた後、勾配を５分間かけて１０％水／ギ酸（９９．９／０．１；ｖ／ｖ）と９０％水／アセトニトリル／ギ酸（１９．９２／８０／０．０８；ｖ／ｖ／ｖ）にし、この比率を５分間維持し、その後、２分間かけて９８％水／ギ酸（９９．９／０．１；ｖ／ｖ）と２％水／アセトニトリル／ギ酸（１９．９２／８０／０．０８；ｖ／ｖ／ｖ）に戻した。Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析器をデータ依存モードで作動させ、フル走査（ｍ／ｚの範囲３７０〜１６５０、公称解像度７０，０００、標的値３×１０６）の後、１２種類の最も豊富なイオンのＭＳ／ＭＳ走査を利用した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、正規化された衝突エネルギー２７％、分離幅２、標的値１×１０５を利用して取得した。断片化のために選択した前駆イオン（帯電状態２以上）を１０秒間ダイナミック排除リストに載せた。アンダーフィル比を強度閾値が４×１０４になる２０％に設定した。ペプチド一致機能と同位体排除機能を作動させた。
【０１３８】
質量分析データの分析：ペプチドを同定するため、生ファイルをＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（バージョン１．４．０．２８８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にロードした。検索エンジンノードＭＳＡｍａｎｄａ（Ｄｏｒｆｅｒ他、２０１４年）を利用し、生成したすべてのＭＳ／ＭＳスペクトルをＦｌｙＢａｓｅ配列データベース（２２，２５６個の配列；２０，２２２，８５０個の残基）と、Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｈｕｍａｎを用いたＳｗｉｓｓｐｒｏｔ配列データベース（２０，１７０個の配列、１１，３１８，２１３個の残基）で検索した。以下の検索パラメータを用いた：システインのβ−メチルチオ化を固定された修飾として設定し、メチオニンの酸化、リシンのアセチル化、セリン、トレオニン、チロシンのリン酸化、アスパラギンとグルタミンの脱アミド化、リシンのユビキチン化を可変修飾として設定した。トリプシンペプチドに関してタンパク質の質量に制限なしの中でモノアイソトピック質量を検索した。ペプチドの質量の許容誤差は±５ｐｐｍに設定し、断片の質量の許容誤差は±０．０３Ｄａに設定した。消化不備（ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ）の最大数は２に設定した。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒに組み込んだＰｅｒｃｏｌａｔｏｒアルゴリズムを用いて結果をフィルタして１％ＦＤＲにした。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒに組み込まれていてホスホＲＳに基づくツールｐｔｍＲＳ（Ｔａｕｓ他、２０１１年）でペプチド内の可変修飾の部位を特定した。
【０１３９】
データ分析と統計：特に断わらない限り、本明細書の中のすべての数値を平均値±標準偏差で与える。すべてのインビトロ実験を３〜５回独立に繰り返した。生体内実験は２〜６回繰り返した。図面と統計的分析は、ＰｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を利用して生成させた。分析で除外したマウスはおらず、Ｄｅｆｉｎｉｅｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｓｔｕｄｉｏソフトウエアを用いて組織病理学的分析をブラインドで実施した。マウスは遺伝子型に基づいて実験群に割り当て、性別と年齢が一致した群の中でランダム化した。マウスは近交系で性別と年齢が一致しているため、実験コホート間で似た分散になると仮定した。先験的なサンプルサイズ評価は実施しなかった。群の大きさは、使用したモデル系またはアッセイについて経験的に評価した変動性に基づいており、群は、第一種過誤と第二種過誤を最小にするためできるだけ多くのマウスを含んでいた。データは、示してあるように、対応のないスチューデントの両側ｔ検定または二元配置分散分析を利用して分析した。生存率分析ではログ・ランク検定を実施した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとした。
【０１４０】
以下の抗体を本研究では使用した。
【０１４１】
【表２】
2019527674.tif 000003
【０１４２】
以下のＰＣＲプライマーを本研究では使用した。
【０１４３】
【表３】
2019527674.tif 000004
【０１４４】
ヒトＴ細胞アッセイ：ヒトの血液からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）ＰＢＭＣ単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を製造者の指示に従って用いて末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を精製した。ＣＤ４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓまたはＣＤ８  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）をそれぞれ用いるとともにＭＡＣＳ技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を利用してヒトのＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞をＰＢＭＣから精製した。増殖アッセイのため、ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、０．１μｇ／ｍｌ）とＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、０．１μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳで平底９６ウエルプレートを３７℃にて２時間にわたって被覆した。増殖による拡張をモニタするため、カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で標識したＴ細胞を用いてアッセイを実施した。Ｔ細胞をＸ−ＶＩＶＯ  １５という化学的に規定された無血清造血細胞培地（Ｌｏｎｚａ社）の中で、示されている濃度のペプチドまたはビヒクル対照とともに培養した。７２時間後、細胞にＣＤ４に対する抗体（ＲＰＡ−Ｔ４、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ５１０で標識、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）またはＣＤ８に対する抗体（ＲＰＡ−Ｔ８、ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ  ７８０  ｌａｂｅｌｅｄ，  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）と、ＣＤ６９に対する抗体（ＦＮ５０、ＰＥ／Ｃｙ７で標識、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で標識し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメータで分析した。データはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｋａｌｕｚａソフトウエアを用いて分析した。増幅アッセイの細胞培地の上清へのＩＦＮ−γの分泌は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を製造者（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の指示に従って用いて調べた。
【０１４５】
マウスＴ細胞アッセイ：ＭＡＣＳ技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を利用し、プールした脾臓とリンパ節からマウスＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。増幅アッセイのため、ＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）とＣＤ２８抗体（３７．５１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を含むＰＢＳで平底９６ウエルプレートを３７℃にて２時間にわたって被覆した。精製したＴ細胞を細胞増殖染料ｅＦｌｕｏｒ  ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で標識し、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ社）、Ｌ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）、ペニシリンとストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を補足したＩＭＤＭ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ社）の中で、５ｎｇ／ｍｌの組み換えＩＬ−２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）と示された濃度のペプチドの存在下にて培養した。３日後、細胞を固定可能な生存染料ｅＦｌｕｏｒ  ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）で染色し、ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ７１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で染色した。細胞をＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ＩＩフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で分析し、データをＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０．０．８ソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社）を用いて分析した。
【０１４６】
Ｂ１６−ＳＩＹ生体内腫瘍モデル：（Ｓｐｒａｎｇｅｒ、２０１４年）に記載されているＢ１６−ＳＩＹ腫瘍細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ社）、Ｌ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）、ペニシリンとストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を補足したＤＭＥＭ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ社）の中で培養した。１０６個の腫瘍細胞を皮内に移植してＣ５７Ｂｌ／６マウスの中に入れた。腫瘍細胞を接種して２４時間後からマウスの腹腔内に１００μｇの示されたペプチドまたはビヒクル対照を２日に１回注射した。その後、示された時点で体重と腫瘍の体積を測定した。
【０１４７】
マウスＨｏｘｂ８−造血前駆細胞の作製と、ｓｈＲＮＡを媒介としたｃｂｌノックダウン：以前に報告されている（Ｒｅｄｅｃｋｅ、２０１３年）ようにして、全ｃｂｌｂ＋／＋骨髄細胞または全ｃｂｌｂΔ／Δ骨髄細胞からＦｌｔ３−Ｈｏｘｂ８−造血前駆細胞を作製し、培養し、ＧＭ−ＣＳＦ樹状細胞（ＤＣ）へと分化させた。ｃｂｌまたはウミホタルルシフェラーゼを標的とする安定なＨｏｘｂ８−造血前駆細胞ｓｈＲＮＡ系を生成させるためのＭｉＲ−Ｅ骨格を含有するレンチウイルスベクターが以前に報告されている（Ｆｅｌｌｍａｎｎ、２０１３年）。ｃｂｌまたはウミホタルルシフェラーゼを標的とするｓｈＲＮＡを、ＰＣＲ増幅により、９７ｍｅｒオリゴヌクレオチド（ｃｂｌ：５’−ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＡＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３’）（配列番号３７）；ウミホタルのルシフェラーゼ：５’−ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴＴＡＴＣＴＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＧＡＴＡＡＧＣＡＴＴＡＴＡＡＴＴＣＣＴＡＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３’（配列番号３８）；ＩＤＴ）から、以前に報告されているｍｉｒ−Ｅ順プライマー（５’−ＡＧＡＡＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣ−３’（配列番号３９）またはｍｉｒ−Ｅ逆プライマー（５’−ＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧＧ−３’（配列番号４０）））（Ｆｅｌｌｍａｎｎ、２０１３年）を用い、これらレンチウイルスベクターにクローニングした。ｃｂｌまたは対照ｓｈＲＮＡを安定に発現する細胞系は、ｅＧＦＰレポータ遺伝子の発現に基づき、感染した細胞系のレンチウイルス形質導入とＦＡＣＳソーティングによって取得した。ＧＭ−ＣＳＦの存在下でｓｈＲＮＡ発現細胞系を樹状細胞（ＤＣ）へと分化させ、上記のようにしてＲＯＳ生成を調べた。
【０１４８】
【表４】
2019527674.tif 000005
【０１４９】
上記の表には、本研究で使用した追加のペプチドが掲載されている。第１列は、一文字のアミノ酸コードで表わしたＳＹＫ由来のペプチド配列の名称と種（Ｍはマウス、Ｈはヒト）を示している。第２列の太字の配列は、膜透過ペプチド（ＣＰＰ）のアミノ酸配列を一文字コードで示している。第２列の中に星印（＊）で示してあるのは、ＳＹＫ由来のペプチド配列またはスクランブルドペプチド配列のリン酸化された中心チロシンである。スクランブルドペプチドは、マウスまたはヒトのＳＹＫに由来する配列のアミノ酸配列を中心ホスホチロシンのまわりにスクランブルするが、ＣＰＰ部分はそのまま残すことによって得られた。
【０１５０】
実施例２  −  Ｃｂｌ−ｂまたはＣｂｌ−ｂ触媒活性の欠損が真菌症の病状を改善する
【０１５１】
抗真菌免疫におけるＣｂｌ−ｂの潜在的な役割を調べるため、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ同腹子と対照Ｃｂｌ−ｂ＋／＋同腹子の全身に致死量のカンジダ・アルビカンスを感染させた。それに加え、触媒的に不活性なＣｂｌ−ｂを有するＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａマウス（Ｐａｏｌｉｎｏ他、２０１１年）にカンジダ・アルビカンスを感染させた。Ｃｂｌ−ｂタンパク質の欠損（図２ａ）またはＣｂｌ−ｂ触媒機能の欠損によって真菌症の病状が顕著に改善されたことは、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋同腹子と比べたときの感染後の体重減少の低下（図１ａ）と顕著な死亡遅延（図１ｂ）に示されている。これらの結果に合致して、対照Ｃｂｌ−ｂ＋／＋同腹子と比較したとき、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスの腎臓、脾臓、肝臓、肺における真菌負荷の顕著な低下も観察することができた（図１ｃ）。全身感染の７日後の冒された腎臓の組織病理学的分析から、これらの結果が確認された；Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスは、ヨウ素酸シッフ染色による評価で腎炎の減少を示し（図１ｄ、図１ｅ）、ゴモリメテナミン銀（ＧＭＳ）染色による評価でカンジダ・アルビカンス酵母と菌糸の数の減少を示した（図１ｆ、図１ｇ）。真菌負荷の減少に合致して、感染したＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの腎臓切片に関する好中球特異的マーカーＬｙ−６Ｇでの染色による評価で、対照Ｃｂｌ−ｂ＋／＋同腹子と比較したときに好中球浸潤の顕著な減少が検出された（図１ｈ、図１ｉ）。Ｃｂｌ−ｂ欠損の保護効果は、カンジダ・アルビカンスの感染に限定されていなかった。というのも、カンジダ・ドゥブリニエンシスの臨床単離体の致死量を全身感染させると、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスを対照Ｃｂｌ−ｂ＋／＋同腹子と比較したとき、死亡率とキネティクスに関して同様の結果になったからである（図２ｃ）。重度の真菌感染症におけるＣｂｌ−ｂ欠損の保護効果が、自然免疫機能が広範囲で制御を外れた結果であるかどうかを評価するため、Ｃｂｌ−ｂ欠損マウスと同腹子対照マウスにグラム陽性菌リステリア・モノサイトゲネスを感染させた。Ｃｂｌ−ｂの欠損がリステリア・モノサイトゲネスに感染したマウスの死亡率に影響を与えることはなかった（図２ｄ）。この結果は、Ｃｂｌ−ｂの欠損が、カンジダ・アルビカンスとカンジダ・ドゥブリニエンシスの全身感染に対して顕著な抵抗力を有することを示している。
【０１５２】
観察された保護効果の細胞的基礎の見通しを得るため、Ｃ５７Ｂｌ／６レシピエントマウスに致死線量を照射し、同一遺伝子型のＣｂｌ−ｂΔ／Δ同腹マウス、Ｃｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ同腹マウス、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋同腹マウスいずれかからの骨髄を用いて再構成することによって骨髄キメラ動物を作製した。再構成の後、コホートに致死量のカンジダ・アルビカンスを感染させた。放射線感受性造血区画におけるＣｂｌ−ｂ欠損は、全身のＣｂｌ−ｂ欠損に反映された（図３ａ、図３ｂ）。適応免疫においてＣｂｌ−ｂが役割を果たしているという理由で、次に、観察された抗真菌活性に対する適応免疫細胞の潜在的な寄与を調べた。その目的で、適応免疫系が欠けたＣｂｌ−ｂ＋／＋／Ｒａｇ２Δ／Δ二重欠損マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δ／Ｒａｇ２Δ／Δ二重欠損マウスを作製した。重要なことだが、自然免疫系におけるＣｂｌ−ｂ欠損と、適応免疫の不在下におけるＣｂｌ−ｂ欠損は、致死量のカンジダ・アルビカンスを感染させたとき、全身ノックアウト表現型に非常によく似ていた（図３ｃ、図３ｄ）。それに加え、自然免疫系に対するＣｂｌ−ｂ欠損の潜在的な効果を制限するため、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δレシピエントマウスに致死線量を照射し、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ／Ｒａｇ２Δ／Δ骨髄グラフトまたはＣｂｌ−ｂ＋／＋／Ｒａｇ２Δ／Δ骨髄グラフトで再構成することによって骨髄キメラマウスを作製した。再び、Ｃｂｌ−ｂ欠損がカンジダ・アルビカンスの全身感染に対して保護効果を与えることを観察できた（図３ｅ、図３ｆ）。これは、Ｃｂｌ−ｂが自然抗真菌免疫を制御していることを示す。
【０１５３】
抗真菌防御にとって重要な自然免疫細胞の発達または維持に対するＣｂｌ−ｂ欠損の潜在的な効果を調べるため、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ同腹マウスとＣｂｌ−ｂ＋／＋同腹マウスの骨髄と脾臓の中の主要な自然免疫系列の細胞密度と細胞組成を評価した。骨髄と脾臓両方のＬｙ−６Ｇ＋好中球と脾臓ＮＫ細胞でわずかなレベル上昇を観察することができた（図２ｅ、図２ｆ）。これが単球または好中球の浸潤に影響を与える可能性があるかどうかを調べるため、カンジダ・アルビカンスの全身チャレンジに対する単球または好中球のリクルートを感染してから２４時間後に定量した。感染後のこの早期の時点で、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスの腎臓、肺、肝臓への免疫浸潤が同等であるか、わずかに低下さえしていることを観察できた（図４ａ、図４ｂ、図４ｃ）。ＣＬＲファミリーのメンバーであるデクチン−１によるカンジダ・アルビカンスの細胞壁のβ−グルカンの認識が、抗真菌免疫反応において決定的に重要であることが示されている（Ｂｒｏｗｎ他、２００１年）。Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ同腹マウスと対照Ｃｂｌ−ｂ＋／＋同腹マウスの末梢血の単球と好中球でのデクチン−１の発現が同等であることが検出された（図４ｄ、図４ｅ）。さらに、デクチン−１（Ｃｌｅｃ７ａ）とデクチン−２（Ｃｌｅｃ４ｎ）、デクチン−３（Ｃｌｅｃ４ｄ）とＭｉｎｃｌｅ（Ｃｌｅｃ４ｅ）のｍＲＮＡ発現は、ｑＰＣＲによって評価すると、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔマウスとＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスの脾臓細胞と骨髄細胞において同等であった（図４ｆ、図４ｇ）。重要なことだが、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔマウスとＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスは、カンジダ・アルビカンスの全身チャレンジに応答して同等な初期細胞リクルートパターンを示したにもかかわらず、冒された臓器内の真菌負荷は感染後２４時間ですでに顕著に低下した（図４ｈ）。これは、Ｃｂｌ−ｂ欠損により自然免疫細胞の殺真菌活性が増大するという考え方を支持している。
【０１５４】
実施例３  −  Ｃｂｌ−ｂの欠損は、全身真菌感染と皮膚真菌感染の両方に対する抵抗力を与える
【０１５５】
Ｃｂｌ−ｂ欠損の保護効果を他の感染経路に拡張できるかどうかを調べるため、皮膚カンジダ・アルビカンス感染のモデルを使用した（Ｉｇｙａｒｔｏ他、２０１１年）。このモデルでは、真菌負荷の顕著な低下によって証明されるように、カンジダ・アルビカンスによる皮膚コロニー形成に対するＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの抵抗力が同腹対照マウスと比較して増大することが再び観察された（図３ｇ）。カンジダ・アルビカンスの皮膚感染に対する免疫反応は、適応免疫細胞と自然免疫細胞の間のクロストークによって特徴づけられる（Ｉｇｙａｒｔｏ他、２０１１年；Ｋａｓｈｅｍ他、２０１５年）ため、カンジダ・アルビカンス皮膚感染をＲａｇ２欠損バックグラウンドで実現した。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋／Ｒａｇ２Δ／Δ欠損マウスは、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋／Ｒａｇ２＋／＋マウスと比べて真菌負荷がわずかに増加していたが、統計的有意には達していなかった。重要なことだが、適応免疫系の不在下でのＣｂｌ−ｂ欠損は、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ／Ｒａｇ２Δ／Δマウスの皮膚における真菌負荷の低下によって証明されるように、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋／Ｒａｇ２Δ／Δ同腹対照マウスと比べて真菌コロニー形成に対する保護効果を持つことが再び観察された（図３ｈ）。したがって自然免疫細胞におけるＣｂｌ−ｂ欠損は、全身と皮膚のカンジダ・アルビカンス感染に対する抵抗力を与える。
【０１５６】
実施例４  −  Ｃｂｌ−ｂは、樹状細胞とマクロファージの抗真菌活性を制御する
【０１５７】
自然免疫系の中での殺真菌活性は、主に好中球、マクロファージ、ＤＣに起因する（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ他、２０１５年）。Ｃｂｌ−ｂ欠損がこれらのタイプの細胞の抗真菌活性に及ぼす効果を直接調べるため、感染していないマウスからの骨髄好中球、感染していないマウスの骨髄から単離した骨髄由来のマクロファージ（ＢＭ−Ｍ）、骨髄由来の樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ）、骨髄単球、脾臓から単離した脾臓ＤＣをカンジダ・アルビカンスとともに培養することによってインビトロ殺菌アッセイを実施した。Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ骨髄好中球、Ｃｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ骨髄好中球、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋骨髄好中球を比較したとき、殺真菌活性の有意差を観察することはできなかった（図５ａ）。しかしＢＭ−ＭとＢＭ−ＤＣ、骨髄単球と脾臓ＤＣ（両方とも感染していないマウスから単離）は、Ｃｂｌ−ｂまたはＣｂｌ−ｂリガーゼ機能の不在下でカンジダ・アルビカンスを殺す効力が増大した（図５ｂ、図５ｃ、図５ｄ、図５ｅ）。注目すべきことに、ファゴサイトーシスの割合は、３つの遺伝子型すべてのＢＭ−ＭまたはＢＭ−ＤＣの間で同等であった（図６ａ、図６ｂ）。ＤＣとマクロファージによる抗真菌応答におけるＣｂｌ−ｂのより顕著な役割に合致して、カンジダ・アルビカンスで刺激した細胞からのライセートと感染していない細胞からのライセートの両方で、ＢＭ−ＤＣとＢＭ−Ｍの中のＣｂｌ−ｂタンパク質が、骨髄好中球と比べてより高レベルであることが観察された（図６ｃ）。したがってＣｂｌ−ｂは、ＢＭ−ＭとＢＭ−ＤＣの両方の殺真菌活性と、単離された骨髄由来の単球と脾臓ＤＣの殺真菌活性を制御する。
【０１５８】
以前の観察に合致して、Ｄｙｎａｓｏｒｅを用いてファゴサイトーシスを薬理学的に抑制することによってＢＭ−ＤＣを媒介とした殺菌が阻止される。同様に、抗体を媒介としてデクチン−１をブロックすることによりカンジダ・アルビカンスの殺菌が顕著に減少し、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ  ＢＭ−ＤＣの両方における真菌殺菌の増加が、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋細胞で観察されるレベルまで低下した（図５ｆ）。それに加え、Ｒ４０６を用いてＳｙｋを薬理学的に抑制することにより、カンジダ・アルビカンスの殺菌がほぼ完全に阻止された（図５ｇ）。次に、Ｃｂｌ−ｂ欠損または欠陥のあるＣｂｌ−ｂリガーゼ機能が、ＢＭ−Ｍ、ＢＭ−ＤＣ、骨髄由来の単球、脾臓ＤＣがＲＯＳを生成する能力に影響を与えるかどうかを測定した。Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ骨髄好中球またはＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ骨髄好中球は、カンジダ・アルビカンスに応答したＲＯＳ生成のキネティクスと量の両方に関し、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋骨髄好中球と有意に異なってはいなかった（図６ｄ）。しかしＣｂｌ−ｂΔ／ΔまたはＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３ＡのＢＭ−Ｍ、ＢＭ−ＤＣ、骨髄単球、脾臓ＤＣの殺真菌活性の増加は、カンジダ・アルビカンスによって誘導されるＲＯＳ生成が、Ｃｂｌ−ｂが十分な細胞と比べて増加していることと相関していた（図６ｅ〜図６ｈ）。真菌チャレンジに対するこの異常な細胞応答がカンジダ・アルビカンスを用いた刺激に特異的であるかどうかを調べるため、ＢＭ−ＤＣを、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ドゥブリニエンシスの臨床単離体で刺激した。Ｃｂｌ−ｂが欠損していることで、これらの異なる真菌を用いた刺激に応答してＲＯＳ生成が顕著に増加することが再び観察された（図６ｉ〜図６ｋ）。したがってＣｂｌ−ｂ欠損により、臨床的に重要ないくつかの真菌病原体に対する免疫応答が増加する。
【０１５９】
カンジダ・アルビカンスを媒介としたＢＭ−ＤＣの活性化も、Ｓｙｋに依存したインフラマソームの活性化を開始させ、そのことによってカスパーゼ−８によるプロ−インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の分断が可能になる（Ｇｒｉｎｇｈｕｉｓ他、２０１２年；Ｚｗｏｌａｎｅｋ他、２０１４年）。カンジダ・アルビカンスで刺激したＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣまたはＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ  ＢＭ−ＤＣにおけるカスパーゼ−８の活性の顕著な増加（図７ａ）と成熟ＩＬ−１βの放出が対照Ｃｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣと比べて増加することが実際に観察されたが、それは、デクチン−１ブロッキング抗体によって減少させることができた（図７ｂ）。Ｓｙｋを薬理学的に抑制することによっても、３つの遺伝子型すべてのＢＭ−ＤＣからのＩＬ−１β分泌がほぼ完全に阻止された（図７ｃ）。同様に、カンジダ・アルビカンスで刺激したＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣまたはＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ  ＢＭ−ＤＣからの成熟ＩＬ−１βの産生と放出がＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣと比べて増加することが見いだされた（図７ｄ）。
【０１６０】
カンジダ・アルビカンスの感染に対する転写応答をモニタするため、炎症促進性サイトカインのｍＲＮＡのレベルを評価した。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣと比べたとき、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ  ＢＭ−ＤＣではＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２の転写産物のレベルが有意に増加することが観察された（図７ｅ）。サイトカインのｍＲＮＡ発現のこの増加は、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ  ＢＭ−ＤＣによる炎症促進性サイトカインＩＬ−６とＴＮＦの分泌がＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣと比べて顕著に増加することと相関していた（図７ｆ、図７ｇ）。デクチン−１をブロックすると３つの遺伝子型すべてでＩＬ−６とＴＮＦの放出が減少し、重要なことに、Ｃｂｌ−ｂ欠損ＢＭ−ＤＣにおけるサイトカイン放出の増加も減少した（図７ｆ、図７ｇ）。再度、Ｓｙｋを薬理学的に抑制することにより、カンジダ・アルビカンスで刺激した３つの遺伝子型すべてのＢＭ−ＤＣによるＩＬ−６とＴＮＦの放出がほぼ完全に阻止された（図７ｈ、図７ｉ）。Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ細胞とＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ細胞をＣｂｌ−ｂ＋／＋対照細胞と比べると、カンジダ・アルビカンスで刺激することで、ＢＭ−ＤＣによるＩＬ−２３とＩＬ−１２の放出も実質的に増加し（図７ｊ、図７ｋ）、ＢＭ−ＭによるＩＬ−６とＴＮＦの放出も増加した（図７ｌ、図７ｍ）。それに加え、カンジダ・アルビカンスで刺激したＢＭ−ＤＣによる抗炎症メディエータＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）の分泌を調べた。Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂ＋／＋ＢＭ−ＤＣを比較したとき、ＩＬ−１Ｒａの分泌の有意な増加が観察された（図７ｎ）。
【０１６１】
デクチン−１の寄与をさらに調べるため、用量を増やしていくザイモサン（カンジダ・アルビカンスの細胞壁ホモジェネート）またはカードラン（精製したβ−グルカン）に応答した３つの遺伝子型すべてのＢＭ−ＤＣによるサイトカイン分泌を比較した。ザイモサンと、デクチン−１アゴニストであるカードランを用いて刺激することで、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ  ＢＭ−ＤＣによるＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦの放出が増加した（図８ａ〜図８ｆ）。Ｃｂｌ−ｂ欠損は致死的なリステリア・モノサイトゲネス感染症で死亡率に影響を与えなかった（図２ｄ参照）ため、ＴＬＲ４アゴニストであるリポ多糖（ＬＰＳ）またはＴＬＲ９アゴニストであるＣｐＧを用いた刺激に対するＢＭ−ＤＣの応答におけるＣｂｌ−ｂの潜在的な役割を調べた。ＴＬＲ４とＴＬＲ９の両方とも、リステリア・モノサイトゲネス感染症に関与する重要な病原体関連分子パターン受容体である。重要なことだが、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂ＋／＋ＢＭ−ＤＣを比較したとき、高用量または低用量のＬＰＳまたはＣｐＧを用いた刺激に応答した炎症促進性サイトカインＩＬ−６とＴＮＦの分泌に有意差は観察されなかった（図８ｇ〜８ｊ）。したがってＣｂｌ−ｂは、カンジダ・アルビカンス感染に対してＢＭ−ＤＣとＢＭ−Ｍがデクチン−１／Ｓｙｋを媒介として応答する際のカギとなる調節因子である。
【０１６２】
これまでのデータは、Ｃｂｌ−ｂ欠損、またはＣｂｌ−ｂ活性の欠如が、インビトロでの抗真菌免疫応答の深刻な異常につながることを示していた。観察された違いを炎症部位にリクルートされた免疫細胞で再現できるかどうか調べるため、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔマウスとＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスの腹腔内にカンジダ・アルビカンスを感染させるチャレンジを行ない、２４時間後にその抗真菌活性を評価した。Ｃｂｌ−ｂ欠損により免疫細胞が腹膜腔に全面的に浸潤することでＲＯＳ応答が増加した。Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスでは、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスと比べてＲＯＳ生成の増加がすでに観察され、カンジダ・アルビカンスでさらに再刺激しなくても細胞が浸潤した（図５ｈ、図５ｉ）。同様に、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ免疫浸潤物の殺真菌活性は、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋同腹対照マウスからの免疫細胞浸潤物と比べて増大した（図５ｊ）。カンジダ・アルビカンスを腹腔内に感染させると炎症性の単球／マクロファージと好中球の両方がリクルートされる。どのタイプの細胞が観察されたこの違いに寄与しているかを調べるため、好中球と単球／マクロファージを全浸潤免疫細胞からＦＡＣＳで精製し、カンジダ・アルビカンスを用いた再刺激後にそれらの細胞がＲＯＳを生成させる能力を調べた。腹腔にリクルートされたＣｂｌ−ｂΔ／Δ単球／マクロファージによってＲＯＳの生成がＣｂｌ−ｂ＋／＋細胞と比べて増加することが観察されたが、腹腔にリクルートされた好中球では観察されなかった（図５ｋ、図５ｌ）。それに加え、腹腔内洗浄液で炎症性サイトカインＩＬ−６とＴＮＦのほか、ＩＬ−１Ｒａを調べた。インビトロ実験に見られるように、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔマウスとＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスからの腹腔内洗浄液を比較したとき、ＩＬ−６とＴＮＦの両方とＩＬ−１Ｒａで増加が観察された（図８ｋ）。
【０１６３】
データは、真菌チャレンジに対するＣｂｌ−ｂ欠損の保護効果が、好中球ではなくて、組織に常在しているかリクルートされた貪食免疫細胞によって媒介されることを示していた。好中球に固有の効果を調べるため、クロドロン酸リポソームを用いて生体内で貪食免疫細胞を欠乏させた。クロドロン酸リポソームは、マクロファージ、単球のサブポピュレーション、ＤＣサブセットを欠乏させる一方で、好中球には影響を与えないことが報告されている（Ｂｕｉｔｉｎｇ他、１９９４年；Ｂｕｉｔｉｎｇ他、１９９６年；Ｑｉａｎ他、１９９４年；Ｓｕｎｄｅｒｋｏｔｔｅｒ他、２００４年；ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎ他、１９９２年）。貪食細胞を２４時間前に欠乏させ、２４時間後にカンジダ・アルビカンスを全身感染させ、体重減少と生存率の経時変化をモニタした。貪食細胞を欠乏させると、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスの両方で、対照ＰＢＳリポソームで処理したコホートと比べて体重減少が有意に増加した（Ｑｉａｎ他、１９９４年）（図５ｍ）。重要なことだが、クロドロン酸リポソームで処理したＣｂｌ−ｂΔ／ΔマウスとＣｂｌ−ｂ＋／＋マウスの間に有意差はなかった（図５ｍ）。同様に、ＰＢＳリポソームで処理したＣｂｌ−ｂΔ／ΔコホートとＣｂｌ−ｂ＋／＋コホートを比較すると、Ｃｂｌ−ｂ欠損によって生存期間が延長したが、クロドロン酸リポソームによる貪食細胞の欠乏により、Ｃｂｌ−ｂ欠損が原因で生存延長のあらゆる恩恵が完全に消失した（図５ｎ）。これらのデータは、貪食細胞におけるＣｂｌ−ｂ欠損が、カンジダ・アルビカンス全身感染に対して観察される有利な効果にとって極めて重要であることを示している。
【０１６４】
実施例５  −  Ｃｂｌ−ｂの欠損が、カンジダ・アルビカンスに応答した、ＣＬＲを媒介としたシグナル伝達を増進する
【０１６５】
Ｃｂｌ−ｂ欠損、またはＣｂｌ−ｂリガーゼ機能の欠損が、ＢＭ−ＤＣによるシグナル伝達応答の大きさを変えるかどうかを調べるため、カンジダ・アルビカンスを用いた刺激の３０分後、６０分後、９０分後にチロシンリン酸化を分析した。Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ  ＢＭ−ＤＣから調製したライセートでは、対照Ｃｂｌ−ｂ＋／＋ＢＭ−ＤＣと比較して、カンジダ・アルビカンス刺激に応答してチロシンリン酸化が大きく増加することが、調べたすべての刺激時点で観察された（図９ａ）。ＣＬＲによる古典的シグナル伝達には、ＳｒｋキナーゼとＳｈｐ−２の近位活性化が関与していて、その近位活性化によってその後Ｓｙｋが活性化される（Ｄｅｎｇ、２０１５年）。カンジダ・アルビカンスを用いてＢＭ−ＤＣを刺激した後に同等なＳｒｃチロシンリン酸化が観察されたが、リン酸化されたＳｈｐ−２とＳｙｋのレベルは上昇していた（図９ｂ）。Ｓｙｋを抑制することで抗真菌効果がデクチン−１をブロックすることと比べて増加するため、デクチン−１、デクチン−２／３、Ｍｉｎｃｌｅのシグナル伝達におけるＣｂｌ−ｂ欠損の役割をさらに調べた。これら表面受容体は、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂ＋／＋ＢＭ−ＤＣにおいて同等のレベルで発現した（図１０ａ）とはいえ、Ｃｂｌ−ｂの不在下では、熱で殺したカンジダ・アルビカンス（ＨＫ；デクチン−１を活性化させるため）、カンジダ・アルビカンス菌糸（Ｈｙｐｈ；デクチン−２／３を活性化させるため）、トレハロース−６，６−ジミコレート（ＴＤＭ；Ｍｉｎｃｌｅを活性化させるため）に応答してＳｙｋとＳｈｐ−２のリン酸化の増加が観察された（図９ｃ）。それに加え、カンジダ・アルビカンスで刺激したＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣとＣｂｌ−ｂＣ３７３Ａ／Ｃ３７３Ａ  ＢＭ−ＤＣにおいて遠位ＣＬＲシグナル伝達分子ＰＬＣγ２とｐ６５  ＮＦ−κＢのリン酸化の増加が観察された（図９ｄ）。イムノブロットに合致するように、Ｃｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣは、共焦点顕微鏡によって分析すると、カンジダ・アルビカンスで刺激した後に、リン酸化されたＳｈｐ−２（図９ｅ）とリン酸化されたＳｙｋ（図９ｆ）の両方のレベルが上昇した。これらのデータは、カンジダ・アルビカンス感染に応答した近位ＣＬＲシグナル伝達の調節においてＣｂｌ−ｂが中心的な機能を有することを明らかにしている。
【０１６６】
実施例６  −  Ｃｂｌ−ｂは、Ｓｙｋ、デクチン−１、デクチン−２をユビキチン化の標的とする
【０１６７】
Ｅ３リガーゼＣｂｌ−ｂが近位ＣＬＲシグナル伝達にとって極めて重要な分子をポリユビキチン化できるかどうかを調べるため、組み換えタンパク質を用いてユビキチン化アッセイを実施した。これらのアッセイでは、組み換えＳｈｐ−２のポリユビキチン化は検出されなかったが、活性な組み換えＳｙｋのロバストなポリユビキチン化が観察された（図１１ａ）。Ｃｂｌ−ｂによって形成される鎖連結のタイプを質量分析によって分析すると、Ｋ４８連結ユビキチン鎖だけに由来する独自のペプチド（ＦＡＧＫＱＬＥＤ）（配列番号３６）が同定された（図１０ｂ）。Ｃｂｌ−ｂ基質の特異性には、アミノ末端チロシンキナーゼ結合（ＴＫＢ）ドメインが主に関与している。この考え方に合致するように、カルボキシ末端ユビキチン関連（ＵＢＡ）ドメインを欠いているがＴＫＢドメインとＲＩＮＧフィンガードメインは含有する頭部切断Ｃｂｌ−ｂタンパク質（Ｃｂｌ−ｂ２９−４８３）は、相変わらずＳｙｋに対するユビキチン化活性を示した（図１１ａ）。予想されるように、Ｃｂｌ−ｂ２９−４８３のＣ３７３Ａ変異体は、Ｓｙｋポリユビキチン化活性を示さなかった（図１１ａ）。重要なことだが、非リン酸化組み換えＳｙｋは、Ｃｂｌ−ｂ２９−４８３によるポリユビキチン化が大きく減少した（図１１ｂ）。これは、Ｃｂｌ−ｂが、活性化されたＳｙｋを標的とすることと合致している。ＳｙｋとＣｂｌ−ｂの間の相互作用を調べるため、同時免疫沈降実験を実施した。カンジダ・アルビカンスを用いてＢＭ−ＤＣを刺激した後にＳｙｋとＣｂｌ−ｂの同時免疫沈降が増加することを観察できた（図１１ｃ）。プロテアソームブロッカーＭＧ１３２で処理すると、すべてのＳｙｋではなくてリン酸化されたＳｙｋの増加が、カンジダ・アルビカンスで刺激したＣｂｌ−ｂ＋／＋ＢＭ−ＤＣからのライセートで観察された。重要なことだが、カンジダ・アルビカンスで刺激したＣｂｌ−ｂΔ／ΔＢＭ−ＤＣをＭＧ１３２で処理したとき、リン酸化されたＳｙｋのレベルは変化しなかった（図１１ｄ）。これは、Ｃｂｌ−ｂが、プロテアソームターゲティングを通じてその効果を媒介することを示している。これらの結果は、Ｃｂｌ−ｂが、活性なＳｙｋをユビキチン化できることを示している。
【０１６８】
Ｃｂｌ−ｂ欠損がＣＬＲ刺激によって開始される近位シグナル伝達に及ぼす潜在的な追加の効果を調べるため、ＣＬＲファミリーのメンバーであるデクチン−１とデクチン−２がＣｂｌ−ｂを媒介とした分解の標的としても機能する可能性があるかという疑問を提起した。そこでＢＭ−Ｍをカンジダ・アルビカンスまたはカンジダ・アルビカンス菌糸で刺激し、デクチン−１とデクチン−２それぞれのタンパク質レベルを、刺激後のさまざまな時点で調べた。デクチン−１とデクチン−２のレベルは対照細胞の中で時間経過とともに低下したが、その発現レベルはＣｂｌ−ｂの不在下で一定に留まった（図１０ｃ、図１０ｄ）。デクチン−１とデクチン−２が真菌刺激に応答してユビキチン化するかどうかを調べ、そうなる場合にはユビキチン化が、Ｃｂｌ−ｂ細胞、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ細胞、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋細胞が刺激されたことに依存するかどうかを調べるため、デクチン−１またはデクチン−２を免疫沈降させ、ユビキチンをブロットした。カンジダ・アルビカンスまたはカンジダ・アルビカンス菌糸を用いた刺激に応答したデクチン−１とデクチン−２それぞれのユビキチン化を観察した。このユビキチン化は、Ｃｂｌ−ｂの不在下で減少した（図１０ｅ、図１０ｆ）。これらのデータは、Ｃｂｌ−ｂが、デクチン−１とデクチン−２のタンパク質レベルを調節するとともに近位シグナル伝達分子Ｓｙｋを調節することによってＣＬＲのシグナル伝達を調節していることを示している。
【０１６９】
実施例７  −  Ｃｂｌ−ｂを抑制することによってインビトロと生体内での抗真菌免疫が増進する
【０１７０】
遺伝子データと生化学的データに基づき、ＣｂｌファミリーのＴＫＢが媒介する基質認識が阻止されることで、ＣＬＲ刺激の下流でＳｙｋの活性化が異常になっている可能性があると推測された。この仮説を検証するため、ショウジョウバエのアンテナペディアのホメオドメイン由来の膜透過ペプチド（Ｍａｙ他、２０００年）と、Ｓｙｋに由来する長さがアミノ酸１６個のリン酸化されたペプチドでチロシン３１７（Ｙ３１７）を含むもの（Ｃｂｌファミリーリガーゼを媒介としたＳｙｋターゲティングに必要であることが報告されている（Ｓｏｈｎ他、２００３年；Ｙａｎｋｅｅ他、１９９９年；Ｚｏｕ他、２００９年））と、周囲の隣接領域からなる融合ペプチドを設計した（図１１ｅ）。アンテナペディアのペプチドを付着させると、付着したペプチドを細胞質に効率的に送達できることが報告されている（Ｊｏｎｅｓ他、２００５年）。組み換えＣｂｌ−ｂをこのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドとともにプレインキュベートすると、活性なＳｙｋのインビトロでのユビキチン化が完全に阻止される（図１１ｆ）。真菌刺激に応答したＢＭ−ＤＣにおけるＲＯＳ生成の活性化はＳｙｋに依存するため、新規なＣｂｌ−ｂ−ＴＫＢドメイン結合ペプチドの存在下でのＲＯＳ生成をモニタした。興味深いことに、ペプチド干渉により、カンジダ・アルビカンス刺激に応答してＢＭ−ＤＣによるＲＯＳ生成が大きく増加した（図１１ｇ）。観察された効果は、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ細胞におけるＲＯＳ生成の増加をはるかに超えていた。このペプチド干渉戦略は、あらゆるＣｂｌファミリーのリガーゼ（ｃ−Ｃｂｌ、Ｃｂｌ−ｂ、Ｃｂｌ−３）がＴＫＢを媒介として基質タンパク質を標的とすることを潜在的に抑制するため、Ｃｂｌファミリーのリガーゼは少なくとも冗長に作用できるように思われる。そのシナリオに沿うように、Ｃｂｌ−ｂ欠損ＢＭ−ＤＣでは、Ｃｂｌ−ｂが十分な細胞と比べてペプチド干渉に対する感度の顕著な増大が観察された（図１０ｇ）。非常に重要なことだが、ＣｂｌファミリーＴＫＢ結合ペプチドも、インビトロでのカンジダ・アルビカンス感染時にＢＭ−ＤＣの殺真菌活性を増大させた（図１１ｈ）。注目すべきことに、アンテナペディアのペプチドだけを添加しても、リン酸化されたスクランブルドペプチドを添加しても、ＲＯＳ生成や、ＢＭ−ＤＣの殺真菌活性に影響はなかった。
【０１７１】
抑制性ペプチドで観察されたインビトロの効率が理由で、Ｃｂｌファミリーのリガーゼを抑制することが、生体内で真菌性敗血症に対する免疫応答性と免疫機能を向上させるための新規な１つの戦略となる可能性があるかどうかを調べた。そこでＣｂｌ−ｂΔ／Δ同腹マウスとＣｂｌ−ｂ＋／＋同腹対照マウスに致死量のカンジダ・アルビカンスを感染させ、高用量の抑制性ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチド（１００μｇ、腹腔内、０日目と２日目）で２回処理するか、処理なしで放置した。驚くべきことに、２回だけ処理したマウスは、処理していない対照コホートと比較した体重減少の減少と遅延した死亡によって証明されるように、野生型Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスで顕著な保護効果を示した（図１２ａ、図１２ｂ）。それに加え、ペプチド処理によって血中尿素窒素のレベルが減少した（図１２ｃ）。これは、腎臓損傷が減ったことを示している。ペプチド処理によってＣｂｌ−ｂΔ／Δマウスに対する保護効果が与えられることはなかった（図１０ｈ）。ＴＫＢ結合阻害剤の濃度が１／５（１回の注射で２０μｇ）に低下しても、同等な結果が得られた（図１２ｄ、図１２ｅ；図１０ｉ）。低用量ペプチド処理で観察された罹患率の低下に合致するように、ペプチドで処理したマウスの腎臓で真菌負荷の有意な低下が検出された（図１２ｆ）。マウスをアンテナペディアのペプチドまたはスクランブルドリン酸化対照ペプチドで処理しても、処理なしの対照コホートと比べて罹患率または死亡率に影響はなかった。Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスではペプチド処理に保護機能があることが理由で、すでに罹患している真菌性敗血症におけるＴＫＢ結合ペプチドの治療薬としての可能性を最終的に調べた。そこでマウスに致死量のカンジダ・アルビカンスを感染させた後、２日目と３日目に処理した（１回の腹腔内注射で１００μｇ）。驚くべきことに、この処理計画により、２回目のペプチド処理の２日後にさらなる体重減少が完全に阻止され、腎臓の真菌負荷が有意に減少し、マウスが死亡から保護されさえした（図１２ｇ、図１２ｈ、図１２ｉ）。組織病理学的分析から、腎炎（図１２ｊ、図１２ｋ）、真菌負荷（図１０ｊ）、好中球浸潤（図１０ｋ）の有意な減少を示すこれらの知見が確認された。したがってＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、抗真菌免疫を増進し、致死的なカンジダ・アルビカンス敗血症から保護することができる。
【０１７２】
実施例８  −  ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、マウスＤＣにおいてＣＢＬ−ＢとＣＢＬの両方を抑制する
【０１７３】
活性なＳＹＫは、活性化されたＢ細胞の中のＣＢＬ−ＢとＣＢＬの両方により、プロテアソーム分解の標的にされる（Ｋｉｔａｕｒａ、２００７年；Ｓｏｈｎ、２００３年）。ＣＬＢ−Ｂ  ＴＫＢドメイン結合ペプチドはＳＹＫに由来するため、ＣＢＬ−ＢとＣＢＬの両方に結合してそれらを抑制するペプチドとして機能することができた。図５ｇに見られるように、ＣＬＢ−Ｂ  ＴＫＢ結合ペプチド（Ｍ１）の存在下でＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＢＭ−ＤＣをカンジダ・アルビカンスで刺激すると、このペプチドで処理していない対照と比べてＲＯＳ生成が有意に低下した。ＲＯＳ生成の増加は、ペプチド（Ｍ１）で処理した細胞内のＣｂｌ−ｂΔ／Δ  ＢＭ−ＤＣでは、処理なしの対照細胞と比べて相変わらず検出可能であった。ペプチド処理がＣｂｌ−ｂΔ／Δ細胞におけるＲＯＳ生成に及ぼす追加の効果がＣＢＬの抑制によるかどうかを調べるため、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋マウスとＣｂｌ−ｂΔ／ΔマウスからＨｏｘｂ８造血前駆体（Ｒｅｄｅｃｋｅ、２０１３年）を導出し、Ｃｂｌを標的とするｓｈＲＮＡ、またはウミホタルのルシフェラーゼを標的とする陰性対照としてのｓｈＲＮＡに導入した。ＣＢＬ−Ｂが十分なＨｏｘｂ８造血前駆体、ＣＢＬ−Ｂが欠けたＨｏｘｂ８造血前駆体、ＣＢＬとＣＢＬ−Ｂの両方が欠けたＨｏｘｂ８造血前駆体を樹状細胞（ＤＣ）に分化させた後、ＣＬＢ−Ｂ  ＴＫＢドメイン結合ペプチド（Ｍ１）の存在下または不在下でカンジダ・アルビカンスに感染させたときのＲＯＳ生成を調べた。Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ  ＤＣでは、カンジダ・アルビカンスに感染させたときのＲＯＳ生成がＣｂｌ−ｂ＋／＋細胞と比べて増加した。ＣＢＬとＣＢＬ−Ｂ両方の欠失により、ＤＣによるＲＯＳ生成は、ＣＢＬ−Ｂだけが欠けた細胞と比べてさらに増加した。重要なことだが、ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチド（Ｍ１）で処理すると、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋  ＤＣとＣｂｌ−ｂΔ／Δ  ＤＣではＲＯＳの生成が増加する一方で、ＣＢＬとＣＢＬ−Ｂの両方が欠けた細胞ではＲＯＳ生成がさらに増加することはなかった（図１３ａ）。これらの結果は、カンジダ・アルビカンス感染に応答してＳＹＫを媒介としてＲＯＳが生成する際の調節においてＣＢＬ−ＢとＣＢＬが少なくとも部分的に冗長な機能を有することを示している。さらに、ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチド（Ｍ１）は、ＣＢＬ−ＢとＣＢＬの両方に作用するように見える。というのも、ＣＢＬ−ＢとＣＢＬの両方が欠けた細胞をカンジダ・アルビカンスに感染させてペプチドで処理しても、ペプチドで処理していない対照と比べてＲＯＳ生成のさらなる上方調節がなかったからである。したがってペプチド処理により、ＤＣでのＳＹＫを媒介としたＲＯＳ生成においてＣＢＬ／ＣＢＬ−Ｂ二重欠損が表現型模写される。
【０１７４】
実施例９  −  ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドで処理すると、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答が増大する
【０１７５】
骨髄免疫細胞で観察された抗真菌免疫反応以外の細胞応答を調節するのにＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドを応用できることを調べるため、Ｔ細胞増殖アッセイを実施した。なぜなら、Ｔ細胞の増殖は、マウスＴ細胞の中のＣＢＬ−Ｂによって調節されることが以前に報告されている（Ｂａｃｈｍａｉｅｒ、２０００年；Ｃｈｉａｎｇ、２０００年）からである。ＣＢＬファミリーＴＫＢ結合ペプチド（Ｍ３；図１４ａ）の存在下では、プレートに結合したＣＤ３抗体、またはプレートに結合したＣＤ３抗体と可溶性ＣＤ２８抗体での刺激に応答してマウスＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖応答が、ペプチド処理のないＣｂｌ−ｂ＋／＋  ＣＤ４＋細胞と比べて用量に依存して増加することが観察された。ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドのスクランブルドバリアント（Ｍ４）（同じアミノ酸組成で、中心のホスホチロシンが、変化していないアンテナペディアのペプチドに融合したもの）を対照として使用すると、Ｃｂｌ−ｂ＋／＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖が、ペプチドで処理していない細胞と比べてほんのわずかに増加した（図１４ｂ）。ペプチド（Ｍ３）を媒介としたＣＢＬ−Ｂ活性の抑制は、最適ではない刺激条件（すなわち低濃度のＣＤ３）下において、ＣＤ２８を媒介とした同時刺激シグナルの存在下と不在下の両方でより顕著な効果を示した（図１４ａ、図１４ｂ）。
【０１７６】
ＣｂｌファミリーのメンバーによってＢ細胞受容体が開始する応答の部分的に冗長な調節（Ｋｉｔａｕｒａ、２００７年）と同様、マウスＴ細胞におけるＣＢＬ−ＢとＣＢＬ両方の欠損は、Ｔ細胞受容体刺激に応答したＴ細胞増殖をさらに増進させる（Ｎａｒａｍｕｒａ、２００２年）。これらのデータと、ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドの二重機能に合致するように、ＣＢＬ−ＢとＣＢＬの両方を抑制し、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δマウスに由来するＣＤ４＋  Ｔ細胞を刺激すると、ＴＫＢドメイン結合ペプチド（Ｍ３）の存在下では、処理していない対照細胞と比べて増殖応答が顕著に増加した（図１４ｃ）。スクランブルド対照ペプチドで細胞を処理すると、ここでもＣｂｌ−ｂΔ／Δ  Ｔ細胞の増殖応答は、処理していない対照細胞と比べてほんのわずかだが増加した（図１４ｄ）。まとめると、ＳＹＫに由来するＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、ＤＣによるＣ型レクチン受容体を媒介としたＲＯＳ生成と、マウスＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体を媒介とした細胞増殖の両方において、ＣＢＬ−ＢとＣＢＬの阻害剤として機能する。
【０１７７】
実施例１０  −  ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドで処理すると、メラノーマモデルにおける生体内抗腫瘍免疫応答が増大する
【０１７８】
Ｃｂｌ−ｂは、抗腫瘍免疫応答のチェックポイント調節因子であり、Ｃｂｌ−ｂΔ／Δ  Ｔ細胞は、さまざまな動物の腫瘍モデルにおいて腫瘍に対して免疫応答を増大させることが示されている（Ｌｏｅｓｅｒ，ＪＥＭ、２００７年；Ｃｈｉａｎｇ、２００７年）。ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが媒介する免疫調節の効率をがん免疫応答において調べるため、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの皮下に１０６個のＢ１６−ＳＩＹメラノーマ細胞を接種し、腫瘍を移植されたマウスを、ビヒクル、１００μｇのスクランブルドペプチド（Ｍ２）、１００μｇのＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチド（Ｍ１）のいずれかで２日ごとに処理し、腫瘍の体積と体重の経時変化を記録した。ペプチド処理が観察期間中に体重増加に影響を与えることはなかったが、ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチド（Ｍ１）で処理したマウスでは、ビヒクルで処理した対照コホートと比べて腫瘍体積の顕著な減少が観察された（図１５ａ、図１５ｂ）。これらの結果は、ＴＫＢドメイン結合ペプチドでの処理が、抗真菌免疫応答だけでなく、抗腫瘍免疫の調節においても有効であることの証拠を提供する。
【０１７９】
実施例１１  −  ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドで処理すると、ヒトＴ細胞の増殖と活性化が増進する
【０１８０】
ヒト細胞におけるＣＢＬ−Ｂサイレンシング実験から、マウスとヒトのＴ細胞でＣＢＬ−Ｂが同様の免疫調節機能を持つことが示されている（Ｐｅｄｒａｚａ−Ａｌｖａ、２０１１年；Ｓｔｒｏｍｎｅｓ、２０１０年）ため、ＣＢＬ−Ｂは、ヒトのがんにおけるチェックポイント阻止を抑制するための標的として有望である。ヒトＴ細胞においてＣＢＬ−Ｂがペプチドを媒介として抑制される効率を調べるため、マウスアッセイで使用するＣＢＬ−Ｂ  ＴＫＢドメイン結合ペプチドのヒト化バリアント（ペプチドＨ１）を作製した。マウスＴ細胞で得られた結果に合致するように、ヒトのＣＤ４＋  Ｔ細胞とＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖応答は、プレートに結合したＣＤ３／ＣＤ２８抗体を用いた刺激に応答して、ペプチド（Ｈ１）の用量に依存して顕著に増加することが観察された（図１６ａ、図１６ｂ）。同様に、ヒトＣＢＬ−Ｂ  ＴＫＢ結合ペプチド（Ｈ１）の存在下では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞による炎症促進性サイトカインＩＦＮ−γの産生が有意に増加した（図１６ｃ）。ペプチド処理がＴ細胞受容体刺激を変化させることと合致するように、ヒト化ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチド（Ｈ１）で処理すると、Ｔ細胞上のマーカーＣＤ６９の活性化が、処理していない対照細胞と比べて用量に依存して上方調節されることがさらに観察された（図１６ｄ）。スクランブルド対照ペプチド（Ｈ２）のわずかな効果が記録されたが、ヒト化ＣＢＬファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドで処理した細胞で観察された効果よりも実質的に小さかった。
【０１８１】
参考文献
【表５−１】
2019527674.tif 000006
【表５−２】
2019527674.tif 000007
【表５−３】
2019527674.tif 000008
【０１８２】
本明細書中に引用された全ての文献は、その全体が参照によって本明細書中に援用される。
【図１−１】
2019527674.tif 000009
【図１−２】
2019527674.tif 000010
【図２−１】
2019527674.tif 000011
【図２−２】
2019527674.tif 000012
【図３】
2019527674.tif 000013
【図４−１】
2019527674.tif 000014
【図４−２】
2019527674.tif 000015
【図５−１】
2019527674.tif 000016
【図５−２】
2019527674.tif 000017
【図６−１】
2019527674.tif 000018
【図６−２】
2019527674.tif 000019
【図７−１】
2019527674.tif 000020
【図７−２】
2019527674.tif 000021
【図８−１】
2019527674.tif 000022
【図８−２】
2019527674.tif 000023
【図９−１】
2019527674.tif 000024
【図９−２】
2019527674.tif 000025
【図１０−１】
2019527674.tif 000026
【図１０−２】
2019527674.tif 000027
【図１１−１】
2019527674.tif 000028
【図１１−２】
2019527674.tif 000029
【図１２−１】
2019527674.tif 000030
【図１２−２】
2019527674.tif 000031
【図１３】
2019527674.tif 000032
【図１４】
2019527674.tif 000033
【図１５】
2019527674.tif 000034
【図１６】
2019527674.tif 000035
【配列表】
2019527674000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月23日(2018.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞送達部分と、ｃａｓｉｔａｓ  Ｂ系列リンパ腫ファミリー（Ｃｂｌファミリー）チロシンキナーゼ結合（ＴＫＢ）ドメイン結合ペプチドを含む融合ペプチドであって、
ここで前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、以下のコンセンサス配列：
ＳＦＮＰＹＥＰＸ１Ｘ２Ｘ３
を含み、ここでＸ１〜Ｘ３は、独立に、任意のアミノ酸から選択されるものであり、場合によっては任意の位置に１または２個のアミノ酸の欠失もしくは置換を有し、場合によってはここで１個以上のアミノ酸がＤ型またはレトロ−インベルソ型であり、そして、
ここで前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、２０個のアミノ酸までの配列の長さを有し、Ｓｙｋと少なくとも８０％の配列同一性を有する、融合ペプチド。
【請求項２】
前記細胞送達部分が膜透過ペプチドである、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項３】
前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）のペプチド断片である、請求項１または２に記載の融合ペプチド。
【請求項４】
前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドがＣｂｌ−ｂ結合ペプチドであり、好ましくはＣｂｌ−ｂのＴＫＢドメインの結合ペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項５】
前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、配列モチーフＮ／ＤＸｐＹ、好ましくはＮ／ＤＸ１ｐＹＸ２Ｐを有し（ここで、Ｘ、Ｘ１およびＸ２は任意のアミノ酸から選択され、Ｎ／Ｄはアスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）であり、ｐＹはホスホチロシンである）、前記配列モチーフが、場合によってはＤ型またはレトロ−インベルソ型のアミノ酸を１個以上含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項６】
前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、以下のコンセンサス配列：
ＳＦＮＰＹＥＰＸ１Ｘ２Ｘ３
を含み（ここでＸ１〜Ｘ３は、独立に、任意のアミノ酸から選択される）、好ましくは前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドはＳｙｋのペプチド断片であり、より好ましくは前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドは、配列ＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧ、ＳＦＮＰＹＥＰＴＧＧ、ＳＦＮＰＹＥＰＥＶＡ、またはＳＦＮＰＹＥＰＥＬＡを含み、これら配列のいずれかは、場合によってはＤ型またはレトロ−インベルソ型の１個以上のアミノ酸を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項７】
前記配列中のチロシンがリン酸化されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項８】
前記ＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドが、ＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドであって、前記ペプチドは自然免疫の調節因子であり、好ましくは自然抗寄生虫免疫、または自然抗真菌免疫、または自然抗腫瘍免疫の調節因子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合ペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと、前記ペプチドの細胞取り込みを促進する、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物であって、好ましくは医薬として許容可能な前記担体は、小胞、ミセル、リポソームおよびミクロソームから選択され、より好ましくは前記医薬組成物は、非経口投与用、特に静脈内投与用、動脈内投与用、筋肉内投与用、髄腔内投与用、皮下投与用、腹腔内投与用、または局所投与用いずれかに調製されており、好ましくは皮膚浸透促進剤をさらに含む医薬組成物。
【請求項１０】
治療に利用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合ペプチドまたは医薬組成物であって、前記ペプチドまたは組成物は患者に投与されるものであり、好ましくは前記ペプチドはＳｙｋのＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドである、融合ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１１】
患者で、腫瘍、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症（特に細胞内寄生虫感染症）、もしくは薬剤性免疫抑制の予防または治療に利用するための、請求項１０に記載の融合ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１２】
患者の治療においてワクチンアジュバントとして利用するためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤であって、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤は請求項１〜８のいずれか１項に定義されるものである、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤。
【請求項１３】
患者の真菌感染症の予防または治療に利用するためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤であって、前記Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤が、請求項１〜８のいずれか１項に定義されるものである、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤。
【請求項１４】
前記真菌感染症が、酵母感染症、好ましくはカンジダ症またはクリプトコッカス症である、請求項１３に記載の利用のための、Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤。
【請求項１５】
前記真菌感染症がカンジダ症（特にカンジダ・アルビカンス感染症、カンジダ・グラブラタ感染症、カンジダ・クルセイ感染症またはカンジダ・ドゥブリニエンシス感染症）、皮膚糸状菌感染症、またはアスペルギルス感染症である、請求項１４に記載の利用のためのＣｂｌファミリータンパク質阻害剤またはペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１６】
アジュバントとしてＣｂｌファミリータンパク質阻害剤と、少なくとも１つの抗原とを含むワクチンであって、前記Ｃｂｌファミリータンパク質阻害剤が、請求項１〜８のいずれか１項に定義されるものである、ワクチン。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のペプチドと、医薬として許容可能な賦形剤、好ましくは患者の細胞内投与に適していることが好ましい賦形剤とを含むキット。
【請求項１８】
インビトロまたはインビボで免疫細胞を刺激または活性化する方法であって、前記免疫細胞を、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合ペプチドまたはＣｂｌファミリーＴＫＢドメイン結合ペプチドと接触させる、または処理することを含み、好ましくはサイトカインが産生され、より好ましくは前記サイトカインがＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３およびＴＮＦから選択される、方法。
【国際調査報告】
2019527674.tif 000036
2019527674.tif 000037