(57)【要約】分離デバイスは、マルトオリゴ糖（ＭＯＬ）の３つの異なるオリゴマーとともに同時注入される既知または未知のグリカンを受け取る。検出器は、移動時間の関数である強度ピークとして、分離されたグリカンおよび分離された３つの異なるオリゴマーを測定する。ＭＯＬの複数の他のオリゴマーの移動時間が、３つの異なるオリゴマーの移動時間から計算される。分離されたグリカンの強度ピークに対するグルコース単位（ＧＵ）値が、それらの移動時間をＭＯＬの複数の他のオリゴマーの計算された移動時間と比較することによって計算される。プロセッサは、分離されたグリカンの強度ピークの計算されたＧＵ値を既知のグリカン構造に対するＧＵ値のデータベースと比較することによって、グリカンの構造を識別する。
2019526798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリカンとともにマルトオリゴ糖（ＭＯＬ）の３つの異なるグルコースα１−４オリゴマーから構成された三重内部標準を同時注入することによって、前記グリカンの構造を識別するためのシステムであって、前記システムは、
ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーとともに同時注入される既知または未知のグリカンを受け取り、前記グリカンおよび前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーを経時的に分離する分離デバイスであって、ＭＯＬは、１〜最大数十に及ぶ重合度（ＤＰ）を有するオリゴマーを備え、ＭＯＬの２つの連続的オリゴマー間の移動時間の差異とＭＯＬの隣接する連続的オリゴマー間の移動時間の差異との比率は、ＭＯＬのＤＰ範囲の第１の領域内の第１の既知の定数値およびＭＯＬのＤＰ範囲の第２の領域内の第２の既知の定数値であり、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの２つは、前記第１の領域または前記第２の領域のうちの一方における移動時間を生じるように選択され、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの第３のものは、前記第１の領域または前記第２の領域のうちの他方における移動時間を生じるように選択される、分離デバイスと、
移動時間の関数である強度ピークとして、前記分離された既知または未知のグリカンおよび前記分離されたＭＯＬの３つの異なるオリゴマーを測定する検出器と、
プロセッサと
を備え、前記プロセッサは、
前記分離された既知または未知のグリカンおよび前記分離されたＭＯＬの３つの異なるオリゴマーの前記強度ピークを受信することと、
前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーの移動時間と前記第１の既知の定数値および前記第２の既知の定数値とからＭＯＬの複数の他のオリゴマーの移動時間を計算することと、
前記分離された既知または未知のグリカンの移動時間を前記ＭＯＬの複数の他のオリゴマーの前記計算された移動時間と比較することによって、前記分離された既知または未知のグリカンの前記強度ピークに対するグルコース単位（ＧＵ）値を計算することと、
前記分離された既知または未知のグリカンの前記強度ピークの前記計算されたＧＵ値を既知のグリカン構造に対するＧＵ値のデータベースと比較することによって、前記既知または未知のグリカンの前記構造を識別することと
を行う、システム。
【請求項２】
前記分離デバイスは、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）または多重キャピラリ電気泳動デバイスを備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記分離デバイスは、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）デバイスを備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記既知または未知のグリカンおよび前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーは、同時注入の前にレーザ誘起蛍光（ＬＩＦ）のために標識化され、前記検出器は、ＬＩＦ検出器を備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記検出器は、紫外線（ＵＶ）光検出器を備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記検出器は、質量分析計を備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーは、マルトース（下側ブラケティング標準）と、マルトトリオース（内部標準）と、マルトペンタデカオース（上側ブラケティング標準）とを備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記ＭＯＬのＤＰ範囲の第１の領域は、ＤＰ値≧ＤＰ２かつ≦ＤＰ７を備え、前記ＭＯＬのＤＰ範囲の第２の領域は、ＤＰ値≧ＤＰ７を備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの前記２つは、前記第１の領域内の移動時間を生じるように選択され、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの前記第３のものは、前記第２の領域内の移動時間を生じるように選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの前記２つは、前記第２の領域内の移動時間を生じるように選択され、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの前記第３のものは、前記第１の領域内の移動時間を生じるように選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
グリカンとともにマルトオリゴ糖（ＭＯＬ）の３つの異なるオリゴマーから構成された三重内部標準を同時注入することによって、前記グリカンの構造を識別する方法であって、前記方法は、
分離デバイスを使用して、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーとともに同時注入される既知または未知のグリカンを受け取り、前記グリカンおよび前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーを経時的に分離することであって、ＭＯＬは、１〜最大数十に及ぶ重合度（ＤＰ）を有するオリゴマーを備え、ＭＯＬの２つの連続的オリゴマー間の移動時間の差異とＭＯＬの隣接する連続的オリゴマー間の移動時間の差異との比率は、ＭＯＬのＤＰ範囲の第１の領域内の第１の既知の定数値およびＭＯＬのＤＰ範囲の第２の領域内の第２の既知の定数値であり、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの２つは、前記第１の領域または前記第２の領域のうちの一方における移動時間を生じるように選択され、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの第３のものは、前記第１の領域または前記第２の領域のうちの他方における移動時間を生じるように選択される、ことと、
検出器を使用して、移動時間の関数である強度ピークとして、前記分離された既知または未知のグリカンおよび前記分離されたＭＯＬの３つの異なるオリゴマーを測定することと、
プロセッサを使用して、前記分離された既知または未知のグリカンおよび前記分離されたＭＯＬの３つの異なるオリゴマーの強度ピークを受信することと、
前記プロセッサを使用して、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーの移動時間と前記第１の既知の定数値および前記第２の既知の定数値とからＭＯＬの複数の他のオリゴマーの移動時間を計算することと、
前記プロセッサを使用して、前記分離された既知または未知のグリカンの移動時間を前記ＭＯＬの複数の他のオリゴマーの前記計算された移動時間と比較することによって、前記分離された既知または未知のグリカンの前記強度ピークに対するグルコース単位（ＧＵ）値を計算することと、
前記プロセッサを使用して、前記分離された既知または未知のグリカンの前記強度ピークの前記計算されたＧＵ値を既知のグリカン構造に対するＧＵ値のデータベースと比較することによって、前記既知または未知のグリカンの前記構造を識別することと
を含む、方法。
【請求項１２】
前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーは、マルトースと、マルトトリオースと、マルトペンタデカオースとを備えている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの前記２つは、前記第１の領域内の移動時間を生じるように選択され、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの前記第３のものは、前記第２の領域内の移動時間を生じるように選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの前記２つは、前記第２の領域内の移動時間を生じるように選択され、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの前記第３のものは、前記第１の領域内の移動時間を生じるように選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
非一過性有形コンピュータ読み取り可能な記憶媒体を備えているコンピュータプログラム製品であって、前記記憶媒体のコンテンツは、グリカンとともにマルトオリゴ糖（ＭＯＬ）の３つの異なるオリゴマーから構成された三重内部標準を同時注入することによって前記グリカンの構造を識別する方法を実施するためのプロセッサ上で実行される命令を有するプログラムを含み、前記方法は、
システムを提供することであって、前記システムは、１つ以上の異なるソフトウェアモジュールを備え、前記異なるソフトウェアモジュールは、測定モジュールと、分析モジュールとを備えている、ことと、
前記測定モジュールを使用して、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーとともに同時注入される既知または未知のグリカンを受け取ることと、前記グリカンおよび前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーを経時的に分離することとを行うように分離デバイスに命令することであって、ＭＯＬは、１〜最大数十に及ぶ重合度（ＤＰ）を有するオリゴマーを備え、ＭＯＬの２つの連続的オリゴマー間の移動時間の差異とＭＯＬの隣接する連続的オリゴマー間の移動時間の差異との比率は、ＭＯＬのＤＰ範囲の第１の領域内の第１の既知の定数値およびＭＯＬのＤＰ範囲の第２の領域内の第２の既知の定数値であり、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの２つは、前記第１の領域または前記第２の領域のうちの一方における移動時間を生じるように選択され、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの第３のものは、前記第１の領域または前記第２の領域のうちの他方における移動時間を生じるように選択される、ことと、
前記測定モジュールを使用して、移動時間の関数である強度ピークとして、前記分離された既知または未知のグリカンおよび前記分離されたＭＯＬの３つの異なるオリゴマーを測定するように検出器に命令することと、
前記分析モジュールを使用して、前記分離された既知または未知のグリカンおよび前記分離されたＭＯＬの３つの異なるオリゴマーの強度ピークを受信することと、
前記分析モジュールを使用して、前記ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーの移動時間と前記第１の既知の定数値および前記第２の既知の定数値とから前記ＭＯＬの複数の他のオリゴマーの移動時間を計算することと、
前記分析モジュールを使用して、前記分離された既知または未知のグリカンの移動時間を前記ＭＯＬの複数の他のオリゴマーの計算された移動時間と比較することによって、前記分離された既知または未知のグリカンの前記強度ピークに対するグルコース単位（ＧＵ）値を計算することと、
前記分析モジュールを使用して、前記分離された既知または未知のグリカンの前記強度ピークの前記計算されたＧＵ値を既知のグリカン構造に対するＧＵ値のデータベースと比較することによって、前記既知または未知のグリカンの前記構造を識別することと
を含む、コンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国仮特許出願第６２／３８０，０６２号（２０１６年８月２６日出願）および米国仮特許出願第６２／５１８，１０４号（２０１７年６月１２日出願）の利益を主張し、両出願の内容は、その全体が参照により本明細書に引用される。
【０００２】
本明細書における教示は、キャピラリ電気泳動または液体クロマトグラフィ等の分離技法を使用して、サンプル中の炭水化物または任意のグリカンの構造を識別することに関する。より具体的には、本明細書における教示は、グルコース単位（ＧＵ）計算のための三重内部標準の同時注入を使用してグリカンの構造を識別するためのシステムおよび方法に関し、三重内部標準の同時注入は、計算のためのマルトオリゴ糖ラダーの付随する実行の必要性を緩和する。ブラケティング標準が、同時注入される一方、内部標準は、サンプルの一部である。本明細書におけるシステムおよび方法は、プロセッサ、コントローラ、または図１のコンピュータシステム等のコンピュータシステムと併せて実施されることができる。
【背景技術】
【０００３】
（グルコース単位（ＧＵ）計算）
炭水化物は、本質的に最も構造的に多様なバイオポリマーのうちの１つであり、したがって、有意な分析課題を提起する。可能なグリカン構造の極端に高い多様性は、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）、多重キャピラリ電気泳動、質量分析（ＭＳ）、および核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、またはそれらのいくつかの組み合わせの最も強力な生物学的分析技法を用いても、それらの構造解明を非常に困難にする。グリカンは、任意の多糖類またはオリゴ糖であり、特に、糖タンパク質もしくは糖脂質の一部となるものである（２０１７年３月２３日時点のｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｇｌｙｃａｎ）。炭水化物は、あるタイプのグリカンであるか、またはグリカンの一部であり得る糖類である（２０１７年３月２３日時点のｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）。
【０００４】
ＬＣおよびＣＥベースのグライコミクス方法が、通常、グリコ分析分野において使用される。両方の技法では、グルコース単位（ＧＵ）計算が、データベース検索ベースの構造割当のための一般的なアプローチである。グルコース単位アプローチは、構造解明を補助するための増加するサイズのオリゴ糖構造の混合物（通常、文献では「ラダー」と呼ばれる）との未知の分析物ピークの移動時間の直接比較に基づく。
【０００５】
ＣＥまたはＬＣでは、例えば、マルトオリゴ糖（ＭＯＬ）ラダーが、この目的のために使用される。ラダーは、グルコース単位（限定ではないが、α１−４、α１−６、β１−４、β１−６、β等の結合単位等）を備え、それらの重合度（ＤＰ）は、１〜最大数十に及ぶ。ＣＥは、著しく強力な分離技法であるが、エキソグリコシダーゼベースの分解アッセイまたは質量分析等の追加の分析次元の使用なしでは、それは、グリカン構造データベースに関してＧＵ計算を付随しない限り、直接構造情報を提供しない。
【０００６】
しかしながら、ＧＵ値計算の正確度は、溶出／移動時間測定値の精度に強く依存し、事実上全ての液相分離方法は、異なるオリゴ糖構造の溶出／移動時間シフトおよび可能な共溶出／移動に悩まされる。移動時間の相対的移動時間への変換が、精度を増加させることができる。加えて、サンプルについての先験的情報が、データ誤解釈を回避することに役立ち得る。ＧＵアプローチは、システム非依存性になり、糖鎖生物学において標準構造解明方法としての役割を果たすことを目標としている。クロマトグラフィ分野におけるその明確に確立された役割にもかかわらず、ＣＥベースのデータ処理および解釈は、依然として、その初期段階にある。
【０００７】
手動ＧＵ計算は、実践では、このタスクを実施するためのコンピュータプログラムのリリース前は時間がかかるプロセスであった。これらのコンピュータプログラムのうちのいくつかは、サンプル間移動時間シフトおよび電気泳動図の伸張／圧縮に対処する優れたマルチレーンＣＥ移動時間整合を提供するが、ＧＵ値計算および後続の構造割当に対処しない。
【０００８】
典型的なＣＥベースのＧＵアプローチ実験では、１つ以上のＭＯＬ標準サンプルが、各既知または未知のグリカンサンプルとともに調製される。ＭＯＬ標準サンプルが、ＣＥを使用して最初に分離される。オリゴマーの強度ピークが、ＣＥデバイスに接続される検出器を使用して検出される。検出器によって採用される検出の方法は、限定ではないが、蛍光検出、紫外線光検出、または質量分析を含むことができる。ＭＯＬ標準サンプルから検出されるオリゴマーの強度ピークは、移動時間の関数として測定される。
【０００９】
ＭＯＬ標準サンプルを分離した後、既知または未知のグリカンサンプルが、同じＣＥデバイスを使用して分離される。既知または未知のグリカンサンプルの強度ピークも、移動時間の関数として測定される。
【００１０】
図２は、相対的移動時間に基づいてピークの整合を実証する既知の８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）標識化ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｎ−グリカンおよびマルトオリゴ糖（ＭＯＬ）標準ラダーの強度ピークの比較を示す例示的プロットまたは電気泳動図２００である。既知のＩｇＧ  Ｎ−グリカンの強度ピーク２１０が、上側トレースにおいて示され、ＭＯＬ標準ラダーの強度ピーク２２０が、下側トレースにおいて示される。強度ピーク２１０および２２０は、比較目的のために同じプロット２００に示される。強度ピーク２１０および２２０は、同じＣＥデバイスを使用して、別個のＣＥ実験から取得された。
【００１１】
典型的なＣＥベースのＧＵ実験では、既知または未知のグリカンの強度ピークの移動時間は、グリカンを識別するために、ＭＯＬ標準の強度ピークの移動時間と比較される。特に、ピークは、既知または未知のグリカンのピークからＭＯＬ標準ラダーのピークもしくはα１−４結合グルコース単位までの時間における相対的距離を決定するために比較される。既知または未知のグリカンのピークとＭＯＬ標準ラダーのピークもしくはα１−４結合グルコース単位とのこの相対的対応は、１〜最大数十に及ぶ既知または未知のグリカンの重合度（ＤＰ）を決定する。ＧＵ値は、次いで、ＤＰの観点から表される。
【００１２】
例えば、既知のＩｇＧ  Ｎ−グリカンのピーク２１０の移動時間が、既知のＩｇＧ  Ｎ−グリカンのピーク２１０の各々に対する相対的ＧＵ値を決定するために、ＭＯＬ標準ラダーのピーク２２０と比較される。既知のＩｇＧ  Ｎ−グリカンのピーク２１０に対するＧＵ値が取得されると、これらのＧＵ値は、複数のグリカンに対する基準ＧＵ値を含むグリカン構造データベースと比較される。計算されたＧＵ値をグリカン構造データベースの基準ＧＵ値に合致させることから、既知のＩｇＧ  Ｎ−グリカンの構造が、確認される。
【００１３】
単一のスペクトル撮像検出システム上で最大精度を達成し、ドリフトする移動時間を回避するために、ＧＵ値計算は、各サンプルに対して付随するＭＯＬラダーの実行を要求し、それは、サンプル処理時間を２倍にする。ある場合、ＭＯＬ標準ラダー実験は、既知または未知のグリカンに対する実験の前および後に実施される。その結果、３つの別個の分離実験が、実施され、サンプル処理時間を３倍にする。
【００１４】
代替として、単一のＭＯＬラダーが、サンプルのバッチのために使用されることができる。しかしながら、このシナリオでは、一連の実行は、移動時間シフトをもたらす、わずかに異なる分離条件を有し得る。この改変は、毛細管壁被覆範囲の分散、すなわち、コーティング問題および／または吸着される分析物分子、バックグラウンド電解液成分、もしくは不純物によって引き起こされる可能性が最も高い。ＧＵ値に影響を及ぼさなかったわずかな移動時間シフトが、コーティングされていない毛細管とコーティングされた毛細管との間で観察されている。
【００１５】
単一色検出システムの場合サンプルとのＭＯＬラダーの同時注入は、ラダーおよびサンプルピークのうちのいくつかが重複し得るので、いかなる実践的妥当性も有していない。マルチスペクトル撮像（すなわち、異なるように標識化された種を同時に検出するために複数の波長を使用すること）では、ラダーの同時注入は、着目ピークに変位効果を引き起こし、したがって、データ評価を不明瞭にし得る。
【００１６】
少なくとも１つ、多くの場合、２つの別個のＭＯＬ標準ラダー分離実験が、各既知または未知のグリカン分離実験のために実施されるので、伝統的なＬＣまたはＣＥベースのＧＵ実験は、時間がかかり得る。加えて、３つもの数の実験サンプルが各既知または未知のグリカンのために生成および分析されなければならないので、これらの実験は、実験室材料および資源の観点から高価である。例えば、９６ウェルプレートの３分の２が、ＭＯＬ標準ラダーサンプルのみを含むために使用され得る。
【００１７】
加えて、伝統的なＬＣまたはＣＥベースのＧＵ実験は、同じデバイス上で実施される別個の実験間の比較を要求する。これらは、既知または未知のグリカン実験と１つまたは２つのＭＯＬ標準ラダー実験とからの結果間の比較である。その結果、追加の誤差が、異なる実験の設定および測定において導入され得る。
【００１８】
その結果、（１）これらの実験のために要求される時間の量を低減させ、（２）これらの実験のコストを減少させ、（３）これらの実験の正確度を改良し得るＬＣまたはＣＥベースのＧＵ実験を実施する改良された方法の必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
グリカンとともにマルトオリゴ糖（ＭＯＬ）の３つの異なるオリゴマーから構成された三重内部標準を同時注入することによって、グリカンの構造を識別するためのシステム、方法、およびコンピュータプログラム製品が、開示される。３つ全ての実施形態は、以下のステップを含む。
【００２０】
分離デバイスは、ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーとともに同時注入される既知または未知のグリカンを受け取る。好ましい実施形態では、ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーは、グルコースα１−４オリゴマーである。しかしながら、ＭＯＬのこれらのオリゴマーは、任意の他の糖またはほぼ同時に移動する任意の他の分子であり得る。ＭＯＬの３つのオリゴマーのうちの２つは、ブラケティング標準であり、一方は、ＭＯＬの他方のオリゴマーの計算のためにも使用される内部標識化標準であり、それは、オリゴマー移動時間の仮想ラダーを生成する。
【００２１】
分離デバイスは、グリカンおよび３つの異なるオリゴマーを経時的に分離する。検出器は、移動時間の関数である強度ピークとして、分離されたグリカンおよび分離された３つの異なるオリゴマーを測定する。
【００２２】
プロセッサは、分離されたグリカンおよび分離された３つの異なるオリゴマーの強度ピークを受信する。プロセッサは、３つの異なるオリゴマーの移動時間からＭＯＬの複数の他のオリゴマーの移動時間を計算する。プロセッサは、それらの移動時間をＭＯＬの複数の他のオリゴマーの計算された移動時間と比較することによって、分離されたグリカンの強度ピークに対するグルコース単位（ＧＵ）値を計算する。プロセッサは、分離されたグリカンの強度ピークの計算されたＧＵ値をデータベースと比較することによって、グリカンの構造を識別する。データベースは、既知のグリカン構造に対するＧＵ値を含む。グリカンの構造は、データベースの合致する構造から見出される。
【００２３】
出願者の教示のこれらおよび他の特徴が、本明細書に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
当業者は、下記に説明される図面が、例証目的のためにすぎないことを理解するであろう。図面は、本教示の範囲をいかようにも限定することを意図していない。
【００２５】
【図１】図１は、本教示の実施形態が実装され得るコンピュータシステムを図示するブロック図である。
【００２６】
【図２】図２は、相対的移動時間に基づいてピークの整合を実証する既知の８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）標識化ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｎ−グリカンおよびマルトオリゴ糖（ＭＯＬ）標準ラダーの強度ピークの比較を示す、例示的プロットまたは電気泳動図である。
【００２７】
【図３】図３は、例示的ＣＥシステムである。
【００２８】
【図４】図４は、種々の実施形態による連続的ＭＯＬ標準ラダーピークの移動時間差対連続的ＭＯＬ標準ラダーピーク差の例示的プロットである。
【００２９】
【図５】図５は、種々の実施形態によるグリカンとともにＭＯＬの３つの異なるオリゴマーから構成された三重内部標準を同時注入することによって、グリカンの構造を識別するためのシステムの概略図である。
【００３０】
【図６】図６は、種々の実施形態によるグリカンとともにＭＯＬの３つの異なるオリゴマーから構成された三重内部標準を同時注入することによって、グリカンの構造を識別する方法を示す、フローチャートである。
【００３１】
【図７】図７は、種々の実施形態によるグリカンとともにＭＯＬの３つの異なるオリゴマーから構成された三重内部標準を同時注入することによって、グリカンの構造を識別する方法を実施する１つ以上の異なるソフトウェアモジュールを含むシステムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本教示の１つ以上の実施形態が詳細に説明される前に、当業者は、本教示が、それらの用途において、以下の詳細な説明に記載される構造、構成要素の配列、およびステップの配列、または図面に図示されるそれらの詳細に限定されないことを理解するであろう。本明細書で使用される語句および専門用語が説明の目的のためであり、限定的と見なされるべきではないことも理解されたい。
【００３３】
（コンピュータ実装システム）
図１は、本教示の実施形態が実装され得るコンピュータシステム１００を図示するブロック図である。コンピュータシステム１００は、情報を通信するためのバス１０２または他の通信機構と、情報を処理するためにバス１０２と結合されたプロセッサ１０４とを含む。コンピュータシステム１００は、プロセッサ１０４によって実行されるべき命令を記憶するために、バス１０２に結合されるランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）または他の動的記憶デバイスであり得るメモリ１０６も含む。メモリ１０６は、プロセッサ１０４によって実行されるべき命令の実行中、一時的変数または他の中間情報を記憶するためにも使用され得る。コンピュータシステム１００は、プロセッサ１０４のための静的情報および命令を記憶するために、バス１０２に結合された読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）１０８または他の静的記憶デバイスをさらに含む。磁気ディスクまたは光学ディスク等の記憶デバイス１１０は、情報および命令を記憶するために提供され、バス１０２に結合される。
【００３４】
コンピュータシステム１００は、情報をコンピュータユーザに表示するために、バス１０２を介して、ブラウン管（ＣＲＴ）または液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のディスプレイ１１２に結合され得る。英数字および他のキーを含む入力デバイス１１４は、情報およびコマンド選択をプロセッサ１０４に通信するために、バス１０２に結合される。別のタイプのユーザ入力デバイスは、方向情報およびコマンド選択をプロセッサ１０４に通信し、ディスプレイ１１２上のカーソル移動を制御するためのマウス、トラックボール、またはカーソル方向キー等のカーソル制御１１６である。この入力デバイスは、典型的には、このデバイスが平面において位置を規定することを可能にする２つの軸、すなわち、第１の軸（すなわち、ｘ）および第２の軸（すなわち、ｙ）において、２自由度を有する。
【００３５】
コンピュータシステム１００は、本教示を実施することができる。本教示のある実装によると、結果は、メモリ１０６内に含まれる１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスをプロセッサ１０４が実行することに応答して、コンピュータシステム１００によって提供される。そのような命令は、記憶デバイス１１０等の別のコンピュータ読み取り可能な媒体から、メモリ１０６に読み込まれ得る。メモリ１０６内に含まれる命令のシーケンスの実行は、本明細書に説明されるプロセスをプロセッサ１０４に実施させる。代替として、有線回路が、本教示を実装するためのソフトウェア命令の代わりに、またはそれと組み合わせて使用され得る。したがって、本教示の実装は、ハードウェア回路およびソフトウェアの任意の特定の組み合わせに限定されない。
【００３６】
種々の実施形態では、コンピュータシステム１００は、ネットワーク化システムを形成するために、ネットワークを横断して、コンピュータシステム１００のような１つ以上の他のコンピュータシステムに接続されることができる。ネットワークは、プライベートネットワークまたはインターネット等のパブリックネットワークを含むことができる。ネットワーク化システムでは、１つ以上のコンピュータシステムは、データを記憶し、それを他のコンピュータシステムに提供することができる。データを記憶および提供する１つ以上のコンピュータシステムは、クラウドコンピューティングシナリオにおいて、サーバもしくはクラウドと称されることができる。１つ以上のコンピュータシステムは、例えば、１つ以上のウェブサーバを含むことができる。サーバまたはクラウドに、およびそれからデータを送信および受信する他のコンピュータシステムは、例えば、クライアントもしくはクラウドデバイスと称されることができる。
【００３７】
本明細書で使用されるような用語「コンピュータ読み取り可能な媒体」は、実行のために命令をプロセッサ１０４に提供することにおいて関与する任意の媒体を指す。そのような媒体は、限定ではないが、不揮発性媒体、揮発性媒体、および伝送媒体を含む多くの形態をとり得る。不揮発性媒体は、例えば、記憶デバイス１１０等の光学または磁気ディスクを含む。揮発性媒体は、メモリ１０６等の動的メモリを含む。伝送媒体は、バス１０２を備えているワイヤを含む同軸ケーブル、銅ワイヤ、および光ファイバを含む。
【００３８】
コンピュータ読み取り可能な媒体またはコンピュータプログラム製品の一般的形態は、例えば、フロッピディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、または任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、Ｂｌｕ−ｒａｙ（登録商標）  Ｄｉｓｃ、任意の他の光学媒体、サムドライブ、メモリカード、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、およびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップまたはカートリッジ、もしくはコンピュータが読み取り得る任意の他の有形媒体を含む。
【００３９】
コンピュータ読み取り可能な媒体の種々の形態は、実行のために１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスをプロセッサ１０４に搬送することに関与し得る。例えば、命令は、遠隔コンピュータの磁気ディスク上で最初に搬送され得る。遠隔コンピュータは、命令をその動的メモリ内にロードし、モデムを使用して、電話回線を経由して命令を送信することができる。コンピュータシステム１００にローカルなモデムは、データを電話回線上で受信し、赤外線送信機を使用し、データを赤外線信号に変換することができる。バス１０２に結合された赤外線検出器は、赤外線信号において搬送されるデータを受信し、データをバス１０２上に配置することができる。バス１０２は、データをメモリ１０６に搬送し、そこから、プロセッサ１０４は、命令を読み出し、実行する。メモリ１０６によって受信された命令は、随意に、プロセッサ１０４による実行の前または後のいずれかに、記憶デバイス１１０上に記憶され得る。
【００４０】
種々の実施形態によると、方法を実施するためにプロセッサによって実行されるように構成される命令は、コンピュータ読み取り可能な媒体上に記憶される。コンピュータ読み取り可能な媒体は、デジタル情報を記憶するデバイスであり得る。例えば、コンピュータ読み取り可能な媒体は、ソフトウェアを記憶するための当分野で公知であるようなコンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）を含む。コンピュータ読み取り可能な媒体は、実行されるように構成される命令を実行するために好適なプロセッサによってアクセスされる。
【００４１】
本教示の種々の実装の以下の説明は、例証および説明の目的ために提示されている。それは、包括的ではなく、本教示を開示される精密な形態に限定しない。修正および変形例が、上記の教示に照らして可能であるか、または本教示の実践から取得され得る。加えて、説明される実装は、ソフトウェアを含むが、本教示は、ハードウェアおよびソフトウェアの組み合わせとして、またはハードウェア単独において実装され得る。本教示は、オブジェクト指向および非オブジェクト指向両方のプログラミングシステムによって実装され得る。
【００４２】
（電気泳動システムおよび方法）
電気泳動方法が、標的分析物の検出を促進するために使用される。そのような方法は、溶液中の分子が固有電荷を有するという事実を活用する。したがって、電場の存在下、各分子種は、分子種の質量／電荷比に依存する特徴的な「電気泳動」移動度で移動する。この比率が存在する種々の種の間で異なるとき、それらは、相互から分離する。そのような場の影響下、全ての異型は、異型の電荷と反対の指定された電荷に向かって移動し、すなわち、より低い電気泳動移動度を有するそれらは、（相対的に）より高い電気泳動移動度を有するそれらよりも低速で移動し、したがって、それから分離されるであろう。
【００４３】
電気泳動は、混合物の分離および分析のために使用されている。電気泳動は、移動度の差異に基づく電場内の分子の移動および分離を伴う。フリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、および等速電気泳動を含む種々の形態の電気泳動が、公知である。別の形態のキャピラリ電気泳動（ＣＥ）が、遊離および結合標識の分離を対象とする。一般的に、ＣＥは、サンプルを毛細管、すなわち、約２ｐｍ〜約２，０００μｍの（好ましくは、約５０μｍ未満、最も好ましくは、約２５ｐｍまたはそれ未満）内径を有する管の中に導入し、電場を管に印加することを伴う（Ｃｈｅｎ，Ｆ−Ｔ．Ａ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５１６：６９＊７８（１９９１年）；Ｃｈｅｎ，Ｆ−Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１５：１１４３＊１１６１（１９９２年））。サンプル構成物の各々は、それ自体の個々の電気泳動移動度を有するので、より高い移動度を有するものは、より低い移動度を伴うものよりも速く毛細管を通して進行する。したがって、サンプルの構成物は、管を通したそれらの移動中に毛細管内の別々の区域に分解される。方法は、それが便利なオンライン注入、検出、およびリアルタイムデータ分析を提供するので、自動化に非常に好適である。
【００４４】
図３は、例示的ＣＥシステム３００である。ＣＥシステム３００は、ＣＥデバイス３１０と、検出器３２０とを含む。ＣＥデバイス３１０は、光学視認窓３１２を伴う溶融シリカ毛細管３１１と、制御可能高電圧電力供給源３１３と、２つの電極アセンブリ３１４と、２つのバッファリザーバ３１５とを含む。毛細管３１１の端部は、バッファリザーバ内に設置され、光学視認窓３１２は、検出器３２０が光学検出器であるとき、検出器３２０と整列させられる。バッファを用いて毛細管３１１を充填した後、サンプルは、毛細管３１１の中に注入されることができる。
【００４５】
電気泳動は、基本的に、印加電場内の荷電粒子の移動である。ＣＥでは、サンプルが、毛細管３１１の一方の端部に注入される。検出器３２０は、サンプルから遠隔の毛細管３１１の他方の端部において毛細管３１１に位置付けられるか、または取り付けられる。高電圧電力供給源３１３および２つの電極アセンブリ３１４によって提供される電圧が、毛細管３１１の長さに沿って印加される。
【００４６】
電位が印加された状態で、２つの別個の流動効果が生じる。これらの流動効果のうちの第１のものは、総サンプル流動効果である。サンプルは、集団として毛細管の中に移動する。これらの流動効果のうちの第２のものは、電気泳動流動である。これは、異なる電荷を有するサンプルの構成物に毛細管３１１内の流体の主流に対して移動させる。異なる電荷を有するサンプルの部分は、それによって、毛細管３１１内で分離される。
【００４７】
異なる検出器が、電気泳動分離が起こった後、サンプルを分析するために使用され得る。これらの検出器は、限定ではないが、紫外線（ＵＶ）検出器、レーザ誘起蛍光（ＬＩＦ）検出器、または質量分析計を含むことができる。例えば、ＵＶ検出器は、分離されたサンプルによって吸収されるＵＶ光の量を測定するために使用される。例えば、ＬＩＦ検出器は、標識化された分子種の高感度測定を提供するために使用される。
【００４８】
キャピラリ電気泳動をエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および質量分析（ＭＳ）と組み合わせるシステムでは、毛細管の出力は、エレクトロスプレーアセンブリに入力される。エレクトロスプレーイオン化は、質量分析計への毛細管入口に対して、分離毛細管の出力において高電位差をかけることによって遂行される。分離毛細管は、高電位差がその入口と出口との間にかけられることも要求する。サンプルの分離された部分は、それらが毛細管から退出するとき、エレクトロスプレーによって微細なエアロゾルに分散させられる。エアロゾルの液滴は、次いで、質量分析によって観察される。
【００４９】
初期開発器具と比較して、完全に自動化されたＣＥデバイスは、全ての動作のコンピュータ制御、圧力および動電学的注入、オートサンプラおよびフラクションコレクタ、自動化された方法開発、精密な温度制御、ならびに高度な熱放散システムを提供する。繰り返し可能な動作が精密な定量的分析のために要求されるので、自動化は、ＣＥに重要である。
【００５０】
（三重内部標準ＧＵ実験を実施するためのシステムおよび方法）
上で説明されるように、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）、および多重キャピラリ電気泳動ベースのグライコミクス方法が、グリカンの構造を決定するために、グリコ分析分野において通常使用される。両方の技法では、グルコース単位（ＧＵ）計算が、データベース検索ベースの構造割当のための一般的なアプローチである。グルコース単位アプローチは、ラダーと呼ばれる増加するサイズのオリゴ糖構造の混合物との未知の分析物ピークの移動時間の直接比較に基づく。ＣＥまたはＬＣでは、例えば、マルトオリゴ糖（ＭＯＬ）ラダーが、この目的のために使用される。
【００５１】
典型的なＣＥベースのＧＵアプローチ実験では、１つ以上のＭＯＬ標準サンプルが、各既知または未知のグリカンサンプルとともに調製される。ＭＯＬ標準サンプルが、ＣＥを使用して最初に分離される。オリゴマーの強度ピークが、ＣＥデバイスに接続される検出器を使用して検出される。ＭＯＬ標準サンプルから検出されるオリゴマーの強度ピークは、移動時間の関数として測定される。
【００５２】
ＭＯＬ標準サンプルを分離した後、既知または未知のグリカンサンプルが、同じＣＥデバイスを使用して分離される。既知または未知のグリカンサンプルの強度ピークも、移動時間の関数として測定される。
【００５３】
上で説明されるように、図２は、相対的移動時間に基づいてピークの整合を実証する既知の８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）標識化ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｎ−グリカンおよびマルトオリゴ糖（ＭＯＬ）標準ラダーの強度ピークの比較を示す。既知のＩｇＧ  Ｎ−グリカンの強度ピーク２１０が、上側トレースにおいて示され、ＭＯＬ標準ラダーの強度ピーク２２０が、下側トレースにおいて示される。
【００５４】
典型的なＣＥベースのＧＵ実験では、既知または未知のグリカンの強度ピークの移動時間は、グリカンを識別するために、ＭＯＬ標準の強度ピークの移動時間と比較される。図２を参照すると、既知のＩｇＧ  Ｎ−グリカンのピーク２１０の移動時間は、既知のＩｇＧ  Ｎ−グリカンのピーク２１０の各々に対する相対的ＧＵ値を決定するために、ＭＯＬ標準ラダーのピーク２２０と比較される。
【００５５】
例えば、既知のＩｇＧ  Ｎ−グリカンのピーク２１１のＧＵ値は、以下から計算されることができ、
ＧＵｘ＝Ｇｎ＋（ｔｘ−ｔｎ）／（ｔｎ＋１−ｔｎ）    （１）
式中、ＧＵｘは、未知のオリゴ糖のＧＵ値であり、Ｇｎは、先行するＭＯＬ標準ラダーピークの重合度（ＤＰ）であり、ｔｘは、未知のオリゴ糖の移動時間であり、ｔｎ＋１およびｔｎは、未知のオリゴ糖のピークに後続および先行するＭＯＬ標準ラダーピークの移動時間である。先行および後続するＭＯＬ標準ラダーピークのＤＰは、整数として表され、それは、ラダーの対応する段階を表す。
【００５６】
再び図２を参照すると、ピーク２１１の先行するＭＯＬ標準ラダーピークは、ピーク２２１である。ピーク２２１のＤＰは、ＤＰ１０であり、したがって、Ｇｎは、１０である。未知のオリゴ糖またはピーク２１１の相対的移動時間ｔｘは、０．６６である。先行するＭＯＬ標準ラダーピーク２２１の移動時間ｔｎは、０．６５である。後続するＭＯＬ標準ラダーピーク２２２の移動時間ｔｎ＋１は、０．７２である。その結果、ピーク２１１のＧＵ値ＧＵｘは、１０＋（０．６６−０．６５）／（０．７２−０．６５）、すなわち１０．１４３である。
【００５７】
既知のＩｇＧ  Ｎ−グリカンのピーク２１０に対するＧＵ値が取得されると、これらのＧＵ値は、複数のグリカンに対する基準ＧＵ値を含むグリカン構造データベースと比較される。例えば、ピーク２１１のＧＵ値１０．１４３が、グリカン構造データベース内の複数のグリカンに対するＧＵ値と比較される。計算されたＧＵ値をグリカン構造データベースの基準ＧＵ値に合致させることから、既知のＩｇＧ  Ｎ−グリカンの構造が、確認される。この場合、ＩｇＧ  Ｎ−グリカンは、既知であり、したがって、その構造が、確認される。グリカンが未知である場合、グリカン構造データベースからの合致する構造は、未知のグリカンの構造を識別する。
【００５８】
上で説明されるように、少なくとも１つ、多くの場合、２つの別個のＭＯＬ標準ラダー分離実験が、各既知または未知のグリカン分離実験に対して実施されるので、伝統的なＬＣまたはＣＥベースのＧＵ実験は、時間がかかり、実験室材料および資源の観点から高価であり得る。加えて、伝統的なＬＣまたはＣＥベースのＧＵ実験は、同じデバイス上で実施される別個の実験間の比較を要求し、それは、測定において追加の誤差を導入し得る。
【００５９】
その結果、（１）これらの実験のために要求される時間の量を低減させ、（２）これらの実験のコストを減少させ、（３）これらの実験の正確度を改良し得るＬＣまたはＣＥベースのＧＵ実験を実施する改良された方法の必要性がある。
【００６０】
（ＭＯＬ標準の３つのみのオリゴマーの同時注入）
種々の実施形態では、１回のみのＬＣまたはＣＥ分離実験において、ＭＯＬ標準の３つのみのオリゴマーが、ＧＵ計算のために必要とされる測定値を取得するために、既知もしくは未知のグリカンサンプルとともに同時注入される。例えば、３つのα１−４オリゴマーが、使用されることができる。しかしながら、３つのオリゴマーは、任意の他の糖、結合、またはさらには非糖分子であり得る。ＭＯＬ標準の３つのみのオリゴマーからの測定値を使用することは、上で説明された既知または未知のグリカンのピークとのラダーピークの重複もしくは干渉を防止する。加えて、ＭＯＬ標準の３つのみのオリゴマーから、ＭＯＬ標準ラダー全体が、既知または未知のグリカンに対するＧＵ計算において計算および使用されることができる。
【００６１】
１回のみの分離実験を使用するこの能力は、上で説明される伝統的方法に優って（１）ＧＵ実験のために要求される時間の量を低減させ、（２）実験のコストを減少させ、（３）実験の結果の正確度を改良する。
【００６２】
多数のＣＥ実行を分析すると、連続的ピークの移動時間増分の比率分布が、明白に一定であることが観察された。この観察は、改変された分離電圧、温度、毛細管タイプ（コーティングの有無別）、毛細管長、注入方法、ならびに日々の反復および器具依存性調査を伴う専用実験を含む５００＋測定データ点に基づいた。
【００６３】
より具体的には、２つのＭＯＬ標準ラダーピーク間の移動時間差と次の２つのＭＯＬ標準ラダーピーク間の移動時間差との比率は、定数であることが観察された。例えば、Δｔ２−３／Δｔ３−４の比率とΔｔ３−４／Δｔ４−５の比率とは、同じ定数に等しいことが観察され、式中、Δｔ２−３＝ｔ３−ｔ２は、ＤＰ２ピークとＤＰ３ピークと間の移動時間差であり、Δｔ３−４＝ｔ４−ｔ３は、ＤＰ３ピークとＤＰ４ピークと間の移動時間差であり、Δｔ４−５＝ｔ５−ｔ４は、ＤＰ４ピークとＤＰ５ピークと間の移動時間差である。この関係を説明する別の方法は、連続的ＭＯＬ標準ラダーピーク間の時間差が線形に変動するということである。
【００６４】
さらに、時間差の比率は、２つの別個であるが接続される領域において異なる定数であることが観察された。この関係を説明する別の方法は、連続的ＭＯＬ標準ラダーピーク間の時間差が、２つの別個であるが接続される領域において線形であるということである。糖オリゴマーがＤＰ＞７において完全な螺旋回転を形成するとき、移動挙動は変化するので、２つの別個であるが接続された線形領域が存在する。この変化は、ＤＰ＞７における計算された移動時間においてシフトをもたらす。
【００６５】
図４は、種々の実施形態による連続的ＭＯＬ標準ラダーピークの移動時間差対連続的ＭＯＬ標準ラダーピーク差の例示的プロット４００である。プロット４００は、線４１０と４２０とによって描写される本質的に２つの別個の線形領域を示す。ＭＯＬ標準ラダーピーク１−２間の移動時間差点４１１は、使用されない。これは、その構造がＭＯＬ標準の他のオリゴマーと同等ではないので、ＭＯＬ標準の第１のオリゴマーが使用されないためである。例えば、それは、リング構造ではない。
【００６６】
移動時間差点４１１を排除すると、したがって、２つの線形領域、すなわち、線４１０および４２０が存在する。各線形領域内の点は、２つの測定されたラダーピーク移動時間の間の差異および観察された比率から計算されることができる。その結果、２つの別個の線形領域の各々に対して、２つの測定されたラダーピーク移動時間が、必要とされる。言い換えると、合計４つの測定されたラダーピーク移動時間が、必要とされる。
【００６７】
しかしながら、この場合、２つの線形領域は、完全には別個ではない。それらは、ＤＰ７ピークを共有する。その結果、１つの領域内の２つの測定されたピーク移動時間は、ＤＰ７ピークの移動時間が計算されることを可能にする。ＤＰ７ピークの移動時間がすでに計算されていると、１つの他の移動時間のみが、他の領域内で測定される必要がある。その結果、合計３つのみの測定されたラダーピーク移動時間が、プロット４００の全ての点またはＭＯＬ標準ラダー全体の全ての移動時間を計算するために必要とされる。
【００６８】
好ましい実施形態では、例えば、ＭＯＬ標準のマルトース、マルトトリオース、およびマルトペンタデカオースが、既知または未知のグリカンとともに同時注入される。マルトース（下側ブラケティング標準）およびマルトトリオース（内部標準）は、ＭＯＬ標準の一方の線形領域に対する測定可能ピークを提供し、マルトペンタデカオース（上側ブラケティング標準）は、他方の線形領域に対する測定可能ピークを提供する。これらの３つの別個の標準は、それぞれ、ＭＯＬ標準ラダーのＤＰ２、ＤＰ３、およびＤＰ１５に対応する。
【００６９】
マルトース（ＤＰ２）およびマルトトリオース（ＤＰ３）は、例えば、それらが殆どの他の着目グリカンピークよりも早く移動し、マルトペンタデカオース（ＤＰ１５）が殆どの他の着目グリカンピークよりも後で移動するので、選定される。その結果、これらの３つの特定の標準を選定することは、上で説明される同時注入される着目グリカンのピークとの潜在的重複または干渉を回避する。
【００７０】
マルトース、マルトトリオース、およびマルトペンタデカオース（それぞれ、ＤＰ２、ＤＰ３、およびＤＰ１５）の測定されたピークから、ＭＯＬ標準ラダー全体の移動時間が、計算される。例えば、図４を参照すると、測定されたピークＤＰ２およびＤＰ３から、これらのピークの移動時間差Δｔ２−３＝ｔ３−ｔ２は、０．４２５分であることが見出される。これは、図４の点４１２として示される。Δｔ２−３／Δｔ３−４の観察された比率は、１．０９１であることが把握される。Δｔ２−３および１．０９１の観察された比率から、ピークＤＰ３およびＤＰ４の移動時間差Δｔ３−４は、０．３９０分であることが見出される。これは、図４の点４１３として示される。同様に、それは、Δｔ３−４／Δｔ４−５に関して繰り返される。この比率も、１．０９１である。その結果、Δｔ４−５が、Δｔ３−４／１．０９１から計算され、０．３５７であることが見出される。このように、図４の点４１２−４１６は、それぞれ、０．４２５、０．３９０、０．３５７、０．３２７、および０．３００分として計算される。
【００７１】
ラダーピークの個々の移動時間は、ピークＤＰ２およびＤＰ３の測定された移動時間と計算された移動時間差（点４１２−４１６）とから計算されることができる。例えば、ＤＰ２の測定された移動時間が４．３２３分であり、ＤＰ３が４．７４８である場合、ＤＰ４、ＤＰ５、ＤＰ６、およびＤＰ７の計算された移動時間は、それぞれ、５．１３８、５．４９５、５．８２２、および６．１２２分である。
【００７２】
同様に、ＤＰ７の計算された移動時間、ＤＰ１５の測定された移動時間、およびＭＯＬ標準ラダーの第２の領域内の移動時間差の観察された比率から、図４の残りの点とＭＯＬ標準ラダーの残りの移動時間とが、計算される。例えば、ＤＰ１５の移動時間は、８．３２２分であると測定され、ＤＰ７の移動時間は、６．１２２分であると計算され、ＭＯＬ標準ラダーの第２の領域内の移動時間差の観察された比率は、１．０００である。
【００７３】
ＤＰ１５およびＤＰ７の移動時間が、把握され、したがって、移動時間差Δｔ７−１５＝ｔ１５−ｔ７が、把握される。この差異は、以下のように表されることができる。
Δｔ７−１５＝Δｔ７−８＋Δｔ８−９＋Δｔ９−１０＋Δｔ１０−１１＋Δｔ１１−１２＋Δｔ１２−１３＋Δｔ１３−１４＋Δｔ１４−１５（２）
それは、以下でもあると把握され、
Δｔ７−８／Δｔ８−９＝Δｔ８−９／Δｔ９−１０＝Δｔ９−１０／Δｔ１０−１１＝Δｔ１０−１１／Δｔ１１−１２＝Δｔ１１−１２／Δｔ１２−１３＝Δｔ１２−１３／Δｔ１３−１４＝Δｔ１３−１４／Δｔ１４−１５＝Ｋｒａｔｉｏ（３）
式中、Ｋｒａｔｉｏは、既知の観察された比率１．０００である。これらの２つの式から、残りの未知の移動時間が全て、計算されることができる。例えば、式（２）は、式（３）を使用してΔｔ７−８の観点から表されることができる。次いで、式（２）は、以下になる。
Δｔ７−１５＝Δｔ７−８＋Δｔ７−８／Ｋｒａｔｉｏ＋Δｔ７−８／（Ｋｒａｔｉｏ）２＋Δｔ７−８／（Ｋｒａｔｉｏ）３＋Δｔ７−８／（Ｋｒａｔｉｏ）４＋Δｔ７−８／（Ｋｒａｔｉｏ）５＋Δｔ７−８／（Ｋｒａｔｉｏ）６＋Δｔ７−８／（Ｋｒａｔｉｏ）７（４）
式（４）では、ｔ７、ｔ１５、およびＫｒａｔｉｏは、全て既知であり、したがって、式は、ｔ８を解くために使用されることができる。ｔ８から、Δｔ７−８が、計算されることができ、式（３）を使用して、全ての他の移動時間および移動時間差が、見出されることができる。このように、図４の点４２１−４２８は、０．２７５として計算される。
【００７４】
ラダーピークの個々の移動時間は、ピークＤＰ７およびＤＰ８の計算された移動時間と計算された移動時間差（点４２２−４２８）とから計算されることができる。例えば、ＤＰ７の計算された移動時間が６．１２２分であり、ＤＰ８が６．３９７である場合、ＤＰ９−ＤＰ１４の計算された移動時間は、それぞれ、６．６７２、６．９４７、７．２２２、７．４９７、７．７７２、および８．０４７分である。
【００７５】
要約すれば、好ましい実施形態では、領域≧ＤＰ２かつ≦ＤＰ７からのマルトース（ＤＰ２）およびマルトトリオース（ＤＰ３）標準と、領域≧ＤＰ７からのマルトペンタデカオース（ＤＰ１５）標準とが、ＭＯＬ標準ラダー全体を計算するために、既知または未知のグリカンとともに同時注入される。種々の他の実施形態では、領域≧ＤＰ２かつ≦ＤＰ７からの任意の２つの標準と、領域≧ＤＰ７からのいずれか１つの標準とが、ＭＯＬ標準ラダー全体を計算するために、既知または未知のグリカンとともに同時注入されることができる。この場合、ＤＰ２およびＤＰ１５は、ブラケティング標準であり、ＤＰ３は、仮想ラダーの計算のためにも使用される内部標識化標準である。
【００７６】
種々の他の実施形態では、領域≧ＤＰ２かつ≦ＤＰ７からのいずれか１つの標準と、領域≧ＤＰ７からのいずれか２つの標準とが、ＭＯＬ標準ラダー全体を計算するために、既知または未知のグリカンとともに同時注入されることもできる。例えば、領域≧ＤＰ２かつ≦ＤＰ７からのマルトース（ＤＰ２）標準と、領域≧ＤＰ７からのマルトテトラデカオース（ＤＰ１４）およびマルトペンタデカオース（ＤＰ１５）標準とが、ＭＯＬ標準ラダー全体を計算するために、既知または未知のグリカンとともに同時注入される。
【００７７】
言い換えると、ＭＯＬ標準からの任意の３つのオリゴマー標準は、２つの標準がＭＯＬ標準ラダーの２つの領域のうちの一方においてピークを生じ、第３の標準が他方の領域においてピークを生じる限り、ＭＯＬ標準ラダー全体を計算するために使用されることができる。ＭＯＬ標準ラダーの２つの領域は、（１）領域≧ＤＰ２〜≦ＤＰ７、および、（２）領域≧ＤＰ７である。当然ながら、３つの標準は、既知または未知の着目グリカンとの重複もしくは干渉を回避するようにも選択されるべきである。
【００７８】
ＭＯＬ標準ラダーピークが３つの同時注入された標準の測定されたピークから計算されると、既知または未知のグリカンの構造は、既知または未知のグリカンの測定された強度ピークを、計算されたもしくは「仮想」ＭＯＬ標準ラダーピークと比較することによって見出される。この比較は、上で説明される方法に従う。
【００７９】
例えば、ＧＵ値が、上で示される式（１）を使用して、既知または未知のグリカンの各ピークに対して計算される。既知または未知のグリカンのピークに対するＧＵ値が取得されると、これらのＧＵ値は、複数のグリカンに対する基準ＧＵ値を含むグリカン構造データベースと比較される。計算されたＧＵ値をグリカン構造データベースの基準ＧＵ値に合致させることから、既知のグリカンの構造または未知のグリカンの構造が、それぞれ、確認され、または識別される。
【００８０】
（グリカンを識別するためのシステム）
図５は、種々の実施形態による、グリカンとともにＭＯＬの３つの異なるオリゴマーから構成された三重内部標準を同時注入することによって、グリカンの構造を識別するためのシステム５００の概略図である。システム５００は、分離デバイス５１０と、検出器５２０と、プロセッサ５３０とを含む。
【００８１】
分離デバイス５１０は、限定ではないが、ＣＥデバイスまたはＬＣデバイスであり得る。分離デバイス５１０は、ＭＯＬの３つの異なるオリゴマー５０２とともに同時注入される既知または未知のグリカン５０１を受け取る。分離デバイス５１０は、グリカン５０１および３つの異なるオリゴマー５０２を経時的に分離する。
【００８２】
好ましい実施形態では、ＭＯＬの３つの異なるオリゴマー５０２は、グルコースα１−４オリゴマーである。しかしながら、単糖類タイプ（例えば、ガラクトース、マンノース等）、結合タイプ（１−６、１−２等）、およびアノマー性（例えば、ベータ）にかかわらず、ＭＯＬの任意のオリゴマーまたは類似する移動時間を伴う任意の他の分子が、使用されることができる。
【００８３】
ＭＯＬは、１〜最大数十に及ぶ重合度（ＤＰ）を有するオリゴマーを含む。ＭＯＬの２つの連続的オリゴマー間の移動時間の差異とＭＯＬの隣接する連続的グルコース単位間の移動時間の差異との比率は、ＭＯＬのＤＰ範囲の第１の領域内の第１の既知の定数値およびＭＯＬのＤＰ範囲の第２の領域内の第２の既知の定数値である。３つの異なるオリゴマー５０２のうちの２つは、第１の領域または第２の領域のうちの一方における移動時間を生じるように選択される。３つの異なるオリゴマー５０２のうちの第３のものは、第１の領域または第２の領域のうちの他方における移動時間を生じるように選択される。
【００８４】
種々の実施形態では、ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーは、マルトース（下側ブラケティング標準）と、マルトトリオース（内部標準）と、マルトペンタデカオース（上側ブラケティング標準）とを含む。
【００８５】
種々の実施形態では、ＭＯＬのＤＰ範囲の第１の領域は、ＤＰ値≧ＤＰ２かつ≦ＤＰ７を備え、ＭＯＬのＤＰ範囲の第２の領域は、ＤＰ値≧ＤＰ７を備えている。
【００８６】
種々の実施形態では、３つの異なるオリゴマー５０２のうちの２つは、第１の領域内の移動時間を生じるように選択される。３つの異なるオリゴマー５０２のうちの第３のものは、第２の領域内の移動時間を生じるように選択される。代替実施形態では、この状況は、逆転される。３つの異なるオリゴマー５０２のうちの２つは、第２の領域内の移動時間を生じるように選択される。３つの異なるオリゴマー５０２のうちの第３のものは、第１の領域内の移動時間を生じるように選択される。
【００８７】
検出器５２０は、限定ではないが、ＬＩＦ検出器、ＵＶ光検出器、または質量分析計であり得る。検出器５２０がＬＩＦ検出器である場合、グリカン５０１および３つの異なるオリゴマー５０２は、同時注入の前にＬＩＦのために標識化される。
【００８８】
検出器５２０は、移動時間の関数である強度ピークとして、分離されたグリカン５０１および分離された３つの異なるオリゴマー５０２を測定する。これらの測定値は、例えば、プロット５２１に示される。
【００８９】
プロセッサ５３０は、限定ではないが、コンピュータ、マイクロコントローラ、マイクロプロセッサ、図１のコンピュータシステム、または制御信号およびデータを送信および受信し、データを処理することが可能な任意のデバイスであり得る。プロセッサ５３０は、分離デバイス５１０、検出器５２０、およびデータベース５４０と通信する。
【００９０】
プロセッサ５３０は、分離されたグリカン５０１および分離された３つの異なるオリゴマー５０２の強度ピークを受信する。プロセッサ５３０は、３つの異なるオリゴマー５０２の移動時間と第１の既知の定数値および第２の既知の定数値とからＭＯＬの複数の他のオリゴマーの移動時間を計算する。プロット５３１および５３２は、計算を描写する。
【００９１】
プロセッサ５３０は、分離されたグリカン５０１の強度ピークに対するＧＵ値を、それらの移動時間をＭＯＬの複数の他のオリゴマーの計算された移動時間と比較することによって、計算する。ボックス５３３は、計算において比較される移動時間を強調する。プロセッサ５３０は、分離されたグリカン５０１の強度ピークの計算されたＧＵ値をデータベース５４０と比較することによって、グリカン５０１の構造を識別する。データベース５４０は、既知のグリカン構造に対するＧＵ値を含む。グリカン５０１の構造は、データベース５４０の合致する構造から見出される。
【００９２】
（グリカンを識別する方法）
図６は、種々の実施形態によるグリカンとともにＭＯＬの３つの異なるオリゴマーから構成された三重内部標準を同時注入することによって、グリカンの構造を識別する方法６００を示すフローチャートである。
【００９３】
方法６００のステップ６１０において、既知または未知のグリカンおよびグリカンとともに同時注入されるＭＯＬの３つの異なるオリゴマーが、受け取られ、グリカンおよびＭＯＬの３つの異なるオリゴマーは、分離デバイスを使用して、経時的に分離される。ＭＯＬは、１〜最大数十に及ぶ重合度（ＤＰ）を有するオリゴマーを備えている。ＭＯＬの２つの連続的オリゴマー間の移動時間の差異とＭＯＬの隣接する連続的オリゴマー間の移動時間の差異との比率は、ＭＯＬのＤＰ範囲の第１の領域内の第１の既知の定数値およびＭＯＬのＤＰ範囲の第２の領域内の第２の既知の定数値である。ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの２つは、第１の領域または第２の領域のうちの一方における移動時間を生じるように選択される。ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの第３のものは、第１の領域または第２の領域のうちの他方における移動時間を生じるように選択される。
【００９４】
ステップ６２０において、分離された既知または未知のグリカンおよび分離されたＭＯＬの３つの異なるオリゴマーが、検出器を使用して移動時間の関数である強度ピークとして測定される。
【００９５】
ステップ６３０において、分離された既知または未知のグリカンおよび分離されたＭＯＬの３つの異なるオリゴマーの強度ピークが、プロセッサを使用して受信される。
【００９６】
ステップ６４０において、ＭＯＬの複数の他のオリゴマーの移動時間が、プロセッサを使用して、ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーの移動時間と第１の既知の定数値および第２の既知の定数値とから計算される。
【００９７】
ステップ６５０において、分離された既知または未知のグリカンの強度ピークに対するグルコース単位（ＧＵ）値が、プロセッサを使用して、それらの移動時間をＭＯＬの複数の他のオリゴマーの計算された移動時間と比較することによって計算される。
【００９８】
最後に、ステップ６６０において、既知または未知のグリカンの構造が、プロセッサを使用して、分離された既知または未知のグリカンの強度ピークの計算されたＧＵ値を既知のグリカン構造に対するＧＵ値のデータベースと比較することによって識別される。
【００９９】
（グリカンを識別するためのコンピュータプログラム製品）
種々の実施形態では、コンピュータプログラム製品は、そのコンテンツが、グリカンとともにＭＯＬの３つの異なるオリゴマーから構成された三重内部標準を同時注入することによってグリカンの構造を識別する方法を実施するためのプロセッサ上で実行される命令を伴うプログラムを含む有形コンピュータ読み取り可能な記憶媒体を含む。方法は、１つ以上の異なるソフトウェアモジュールを含むシステムによって実施される。
【０１００】
図７は、種々の実施形態によるグリカンとともにＭＯＬの３つの異なるオリゴマーから構成された三重内部標準を同時注入することによってグリカンの構造を識別する方法を実施する１つ以上の異なるソフトウェアモジュールを含むシステム７００の概略図である。システム７００は、測定モジュール７１０と、分析モジュール７２０とを含む。
【０１０１】
測定モジュール７１０は、ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーとともに同時注入される既知または未知のグリカンを受け取り、グリカンおよびＭＯＬの３つの異なるオリゴマーを経時的に分離するように分離デバイスに命令する。ＭＯＬは、１〜最大数十に及ぶ重合度（ＤＰ）を有するオリゴマーを含む。ＭＯＬの２つの連続的オリゴマー間の移動時間の差異とＭＯＬの隣接する連続的オリゴマー間の移動時間の差異との比率は、ＭＯＬのＤＰ範囲の第１の領域内の第１の既知の定数値およびＭＯＬのＤＰ範囲の第２の領域内の第２の既知の定数値である。ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの２つは、第１の領域または第２の領域のうちの一方における移動時間を生じるように選択される。ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーのうちの第３のものは、第１の領域または第２の領域のうちの他方における移動時間を生じるように選択される。
【０１０２】
測定モジュール７１０は、移動時間の関数である強度ピークとして分離された既知または未知のグリカンおよび分離されたＭＯＬの３つの異なるオリゴマーを測定するように検出器に命令する。
【０１０３】
分析モジュール７２０は、分離された既知または未知のグリカンおよび分離されたＭＯＬの３つの異なるオリゴマーの強度ピークを受信する。分析モジュール７２０は、ＭＯＬの３つの異なるオリゴマーの移動時間と第１の既知の定数値および第２の既知の定数値とからＭＯＬの複数の他のオリゴマーの移動時間を計算する。分析モジュール７２０は、分析モジュールを使用して、それらの移動時間をＭＯＬの複数の他のオリゴマーの計算された移動時間と比較することによって、分離された既知または未知のグリカンの強度ピークに対するグルコース単位（ＧＵ）値を計算する。最後に、分析モジュール７２０は、分離された既知または未知のグリカンの強度ピークの計算されたＧＵ値を既知のグリカン構造に対するＧＵ値のデータベースと比較することによって、既知または未知のグリカンの構造を識別する。
【０１０４】
本教示は、種々の実施形態と併せて説明されているが、本教示が、そのような実施形態に限定されることは意図されない。対照的に、本教示は、当業者によって理解されるであろうように、種々の代替物、修正、および均等物を包含する。
【０１０５】
さらに、種々の実施形態の説明する上で、本明細書は、ステップの特定のシーケンスとして方法および／またはプロセスを提示していることもある。しかしながら、方法またはプロセスが、本明細書に記載されるステップの特定の順序に依拠しない程度に、方法またはプロセスは、説明されるステップの特定のシーケンスに限定されるべきではない。当業者が理解するであろうように、ステップの他のシーケンスも、可能であり得る。したがって、本明細書に記載される特定の順序のステップは、請求項に関する限定として解釈されるべきではない。加えて、方法および／またはプロセスを対象とする請求項は、記載される順序におけるそれらのステップの実施に限定されるべきではなく、当業者は、シーケンスが変動され、依然として、種々の実施形態の精神および範囲内に留まり得ることを容易に理解することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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