(57)【要約】本明細書の実施形態は、蚊細胞及び蚊ベクターによる伝達の複製が不可能な生弱毒化アルファウイルスに関する。他の実施形態は、生弱毒化アルファウイルス、その構築物の生成方法、及び免疫原性組成物におけるこれらの生弱毒化アルファウイルスの使用に関する。他の実施形態は、生弱毒化アルファウイルスを含む医薬組成物、及びこれら生弱毒化ウイルスを製造するための方法に関する。さらに別の実施形態は、アルファウイルス感染に対するワクチンなどの携帯用の適用のためのキットにおけるこれらの組成物の使用、及びその方法に関する。
2019509750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生弱毒化組換えアルファウイルスであって、
（ｉ）不活性化されたサブゲノムプロモーター、及び
（ｉｉ）非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の末端の１つと前記アルファウイルスのサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の挿入を有するアルファウイルス核酸を含み、
少なくとも１つのウイルスＩＲＥＳは、生存可能な弱毒化アルファウイルスを産生することができるＩ型またはＩＩ型ピコルナウイルスＩＲＥＳまたは他のＩＲＥＳ配列を含む前記生弱毒化組換えアルファウイルス。
【請求項２】
前記ＩＲＥＳ配列は、エンテロウイルスＩＲＥＳ、エンテロウイルス７１  ＩＲＥＳ（ＥＶ７１  ＩＲＥＳ）、ライノウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルスＩＲＥＳ（ＨＲＶ  ＩＲＥＳ）、アフトウイルスＩＲＥＳ、アフトウイルス：サブタイプ：口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳ）、テロウイルスＩＲＥＳ（ＴＭＥＶ  ＩＲＥＳ）、及びフラビウイルスＩＲＥＳ、フラビウイルスサブタイプ：ヘパシウイルス（ＨＣＶ  ＩＲＥＳ）からなる群から選択され、
前記アルファウイルスは弱毒化される、請求項１に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項３】
前記サブゲノムプロモーターは、前記非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の末端とサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間の前記サブゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲの欠失により不活性化される、請求項１または２に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項４】
前記サブゲノムプロモーターは、前記アルファウイルスの非構造タンパク質４の前記カルボキシ末端に位置するクラスター化点突然変異によって不活性化される、請求項１または２に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項５】
前記生アルファウイルスは、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、またはコロナウイルス科及びトガウイルス科の他のアルファウイルス、ベバールウイルス、マヤロウイルス、サブタイプ：ウナウイルス、オニョンニョンウイルス：サブタイプ：イボ−オラウイルス（Ｉｇｂｏ−Ｏｒａ  ｖｉｒｕｓ）、ロスリバーウイルス：サブタイプ：ベバールウイルス、サブタイプ：ゲッタウイルス；サブタイプ：サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルス：サブタイプ：Ｍｅ  Ｔｒｉウイルスを含むセムリキ森林ウイルス複合体、及びそれらの組み合わせの１つ以上を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項６】
前記クラスター化点突然変異は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の７４７４、７４７７、７４８０、７４８１、７４８３、７４８６、７４８９、７４９２、７４９５、７４９８、７５０１、７５０２、及び７５０３の位置に２つ以上の点突然変異を含む同義の点突然変異である請求項４に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項７】
前記サブゲノムプロモーターの前記突然変異は、非構造タンパク質４の前記カルボキシ末端の前記アミノ酸配列を改変しない、請求項３、４または６に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項８】
前記アルファウイルスの前記非構造タンパク質のいずれか１つに適応変異をさらに含み、
前記適応変異は、ウイルス複製、放出、及びウイルス力価の増加のために選択され得る請求項１〜７のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項９】
前記ＩＲＥＳは、エンテロウイルス７１ＩＲＥＳ（ＥＶ７１  ＩＲＥＳ）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１０】
前記ＩＲＥＳは、ヒトライノウイルスＩＲＥＳ（ＨＲＶ  ＩＲＥＳ）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１１】
前記ＩＲＥＳは、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ（ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳ）を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１２】
前記ＩＲＥＳは、テロウイルスＩＲＥＳ（ＴＭＥＶ  ＩＲＥＳ）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１３】
前記ＩＲＥＳは、ヘパシウイルスＩＲＥＳ（ＨＣＶ  ＩＲＥＳ）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１４】
前記アルファウイルスは、チクングニヤウイルスである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１５】
前記アルファウイルスは、東部ウマ脳炎ウイルスである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１６】
前記アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１７】
前記アルファウイルスは、西洋ウマ脳炎ウイルスである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１８】
前記アルファウイルスは、蚊及び蚊細胞において複製することができない請求項１〜１７のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の生弱毒化アルファウイルスをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の前記ベクターを含み、発現する宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の弱毒化組換えアルファウイルス、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２２】
前記アルファウイルスへの曝露から前記アルファウイルスへの感染の発症を減少させるために、対象において免疫応答を誘導するための、請求項２１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
前記対象は、ヒト、家畜、または他の飼育動物またはペットである請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
蚊に感染することができない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の生弱毒化組換えアルファウイルスを製造する方法であって、
非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の一端と前記アルファウイルスのサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間に、
エンテロウイルスＩＲＥＳ、ライノウイルスＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、アフトウイルス：ＩＲＥＳ、及びフラビウイルスＩＲＥＳからなる群から選択される内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をクローニングすることを含む方法。
【請求項２５】
前記アルファウイルスは、前記サブゲノムプロモーターを不活性化することによりさらに弱毒化される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＩＲＥＳは、ＥＶ７１  ＩＲＥＳを含む請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＲＥＳは、ＨＲＶ  ＩＲＥＳを含む請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＩＲＥＳは、ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳを含む請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＩＲＥＳは、ＴＭＥＶ  ＩＲＥＳを含む請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＩＲＥＳは、ＨＣＶ  ＩＲＥＳを含む請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記生弱毒化組換えアルファウイルスは、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、またはコロナウイルス科及びトガウイルス科の他のアルファウイルス、ベバールウイルス、マヤロウイルス、サブタイプ：ウナウイルス、オニョンニョンウイルス：サブタイプ：イボ−オラウイルス、ロスリバーウイルス：サブタイプ：ベバールウイルス、サブタイプ：ゲッタウイルス；サブタイプ：サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルス：サブタイプ：Ｍｅ  Ｔｒｉウイルスを含むセムリキ森林ウイルス複合体、及びそれらの組み合わせの１つ以上を含む請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項３２】
対象においてアルファウイルスに対する免疫応答を誘導するための方法であって、
請求項２１に記載の弱毒化組換えアルファウイルス組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項３３】
前記対象は、ヒト、家畜、ペットまたは他の動物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記生弱毒化組換えアルファウイルスは、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、またはコロナウイルス科及びトガウイルス科の他のアルファウイルス、ベバールウイルス、マヤロウイルス、サブタイプ：ウナウイルス、オニョンニョンウイルス：サブタイプ：イボ−オラウイルス、ロスリバーウイルス：サブタイプ：ベバールウイルス、サブタイプ：ゲッタウイルス；サブタイプ：サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルス：サブタイプ：Ｍｅ  Ｔｒｉウイルスを含むセムリキ森林ウイルス複合体、及びそれらの組み合わせの１つ以上を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
キットであって、
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの生弱毒化組換えアルファウイルス、及び
少なくとも１つの容器を含む前記キット。
【請求項３６】
１つ以上の安定剤を含む組成物をさらに含み、
前記組成物は、生弱毒化組換えアルファウイルスの不活性化を減少させる、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
生弱毒化組換えアルファウイルスであって、
ａ）エンベロープ糖タンパク質遺伝子の下流にあり、前記アルファウイルスの前記３’ＵＴＲの上流に配置されたキャプシド遺伝子、
ｂ）前記エンベロープ糖タンパク質遺伝子の３’末端と前記配置されたキャプシド遺伝子との間に導入された、少なくとも１つのＩＲＥＳで、前記遺伝子は、エンベロープ糖タンパク質遺伝子、挿入ＩＲＥＳ、配置されたキャプシド遺伝子、及び３’ＵＴＲとして、５’から３’に位置し、また、
ｃ）前記ＩＲＥＳの上流に位置する前記エンベロープ糖タンパク質遺伝子は、ＩＲＥＳ非依存的な様式で翻訳され、一方、前記配置されたキャプシドはＩＲＥＳ依存的に翻訳され、
前記少なくとも１つのウイルスＩＲＥＳは、生存可能な生弱毒化アルファウイルスを産生することができるＩ型またはＩＩ型ピコルナウイルスＩＲＥＳまたは他のＩＲＥＳ配列である、生弱毒化組換えアルファウイルス。
【請求項３８】
前記ＩＲＥＳ配列は、エンテロウイルスＩＲＥＳ、ライノウイルスＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、タイロウイルスＩＲＥＳ、及びフラビウイルスＩＲＥＳからなる群より選択され、前記アルファウイルスは、弱毒化されている、請求項１に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項３９】
前記ＩＲＥＳは、エンテロウイルス７１ＩＲＥＳ（ＥＶ７１  ＩＲＥＳ）を含む請求項３７または３８に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項４０】
前記ＩＲＥＳは、ヒトライノウイルスＩＲＥＳ（ＨＲＶ  ＩＲＥＳ）を含む、請求項３７または３８に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項４１】
前記ＩＲＥＳは、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ（ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳ）を含む、請求項３７または３８に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項４２】
請求項３７または３８に記載の弱毒化アルファウイルスであって、
前記ＩＲＥＳは、タイロウイルスＩＲＥＳ（ＴＭＥＶ  ＩＲＥＳ）を含む弱毒化アルファウイルス。
【請求項４３】
前記ＩＲＥＳは、ヘパシウイルスＩＲＥＳ（ＨＣＶ  ＩＲＥＳ）を含む、請求項３７または３８に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項４４】
前記生弱毒化組換えアルファウイルスは、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、またはコロナウイルス科及びトガウイルス科の他のアルファウイルス、ベバールウイルス、マヤロウイルス、サブタイプ：ウナウイルス、オニョンニョンウイルス：サブタイプ：イボ−オラウイルス、ロスリバーウイルス：サブタイプ：ベバールウイルス、サブタイプ：ゲッタウイルス；サブタイプ：サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルス：サブタイプ：Ｍｅ  Ｔｒｉウイルスを含むセムリキ森林ウイルス複合体、及びそれらの組み合わせの１つ以上を含む、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【請求項４５】
前記生弱毒化アルファウイルスは、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）である請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の弱毒化アルファウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本ＰＣＴ出願は、２０１６年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１６，２６４号の利益を米国特許法第１１９条（ｅ）下に請求するものであり、その全体は参照することによって本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本明細書の実施形態は、蚊細胞において複製することができず、蚊ベクターにより伝達することができない生弱毒化アルファウイルスに関する。他の実施形態は、生弱毒化アルファウイルス及びその構築物を作製する方法に関する。さらに他の実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化アルファウイルスは、前記アルファウイルスによる感染に対して、免疫原性組成物を作製するために使用され得る。他の実施形態は、生弱毒化アルファウイルスを含む医薬組成物、及びこれら生弱毒化ウイルスの製造方法に関する。いくつかの実施形態は、アルファウイルス感染に対する免疫原性組成物などの携帯用の適用のためのキットにおけるこれらの組成物の使用、及びその方法に関する。本明細書に開示される特定の実施形態は、組換えアルファウイルス構築物に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
病原性ウイルス感染から防御するためのワクチンは、ヒトの疾患の発生を減少させるために効果的に使用されてきた。ウイルスワクチンに使用される最も成功した技術の１つは、弱体化または弱毒化されたウイルス株（「生弱毒化ウイルス」）を動物またはヒトに免疫することである。免疫後の制限された複製のために、前記弱毒化株は、それが改変されているため、宿主または他の対象において疾患を引き起こさない。しかしながら、この限定されたウイルス複製は、ウイルス抗原の完全なレパートリーを発現するのに十分であり、このようなワクチンを受ける対象において、前記ウイルスに対して強力かつ長続きする免疫応答を生成し得る。従って、前記ウイルスの病原性株へのその後の曝露時に、前記免疫された個体は、前記ウイルスによって引き起こされる疾患から保護され得る。これらの生きた弱毒化ウイルスワクチンは、公衆衛生において使用される最も成功したワクチンの一つである。
【０００４】
Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科のＡｌｐｈａｖｉｒｕｓ属は、多数の重要なヒト及び動物の病原体を含む。これらのウイルスは、南極地域を除くすべての大陸に広く分布しており、重大な公衆衛生上の脅威になっている。アルファウイルスの大部分は、蚊によって伝達され、それらが前記宿主において生涯にわたる感染を引き起こす可能性がある。それらの血液の食事の間に蚊に感染した脊椎動物において、アルファウイルスは、新しい蚊の感染の前提条件であるウイルス血症、及び自然においてその継続的な循環に特徴付けられる、急性感染を引き起こす可能性がある。これらのウイルスに対するワクチンは限られている。
【０００５】
ワクチンにおける遺伝子組換えウイルスの使用は、蚊ベクターによって媒介される自然循環に導入され得て、蚊または脊椎動物宿主におけるウイルス血症発生の間のいずれかにおいて、長期間の複製の間にさらなる進化を示し得るという健康上の懸念がある。従って、ワクチンにおいて使用の生存するウイルス株の新世代を設計するには、蚊などのベクターによって広がることができない弱毒化ウイルスを作製することが重要である。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書の実施形態は、蚊細胞において複製することができず、蚊ベクターによって伝達することができない生弱毒化アルファウイルスに関する。他の実施形態は、生弱毒化アルファウイルスの作製方法、その構築物、及び免疫原性組成物におけるこれらの生弱毒化アルファウイルスの使用に関する。他の実施形態は、本明細書に開示される前記生弱毒化アルファウイルスを含み得る医薬組成物、及びこれらの医薬組成物の製造方法に関する。さらに他の実施形態は、携帯用の適用のためのキットにおけるアルファウイルスに対するこれらの免疫原性組成物の使用、及び方法に関する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、生弱毒化組換えアルファウイルスは、非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の一端と前記アルファウイルスのサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間に、少なくとも１つのウイルスの内部リボソーム侵入部位の挿入を有するアルファウイルス核酸を含み得る。これらの実施形態によれば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列は、哺乳動物細胞における遺伝子の転写／発現を可能にする、前記アルファウイルスのゲノムに挿入される異なるＩＲＥＳ配列を含み得る。これらのＩＲＥＳ配列は、対照的に、本質的に昆虫細胞における発現が不可能である。特定の実施形態において、異なるＩＲＥＳ配列は、Ｉ型（例えば、エンテロウイルス：サブタイプ、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、及びサブタイプ、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ））というピコルナウイルス由来の１以上のＩＲＥＳ配列、及び／またはＩＩ型ＩＲＥＳ配列（例えば、カルジオウイルス：サブタイプ、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ以外のタイロウイルス（ＴＭＥＶ）、及びアフロウイルス：サブタイプ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ））というピコルナウイルス由来の１以上のＩＲＥＳ配列が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、ＩＲＥＳ配列は、フラビウイルス（例えば、サブタイプ、ヘパシウイルス（ＨＣＶ））に由来するかまたは見出される１つ以上のＩＲＥＳ配列を含み得る。
【０００８】
別の実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスは、上記に開示したようなＩＲＥＳ配列の挿入に加えて、不活性化されたサブゲノムプロモーターを含み得る。これらの実施形態によれば、不活性化されたサブゲノムプロモーターは、突然変異誘発、点突然変異、欠失、及び挿入（例えば、フレームシフトをもたらさないか、または翻訳領域が保存される）などの当技術分野で公知の任意の方法によって不活性化され得る。他の実施形態において、アルファウイルスサブゲノムプロモーターは、非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の末端とサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間のサブゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲの欠失により、不活性化され得る。他の実施形態において、生弱毒化組換えアルファウイルスのアルファウイルスサブゲノムプロモーターは、前記サブゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲに位置する前記アルファウイルス核酸におけるクラスター化された点突然変異により、不活性化され得る。他の実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスは、前記変異が非構造タンパク質４のカルボキシ末端のアミノ酸配列を改変しない、前記サブゲノムプロモーターにおいて、１つ以上の変異を含み得る。さらに他の実施形態において、前記生弱毒化組換えアルファウイルスは、前記アルファウイルスの非構造タンパク質のいずれか１つに適応突然変異を含み、前記適応突然変異は、ウイルス複製、放出、及びウイルス力価を増加させる。他の実施形態において、前記生弱毒化ウイルスは、前記生弱毒化ウイルスの翻訳を最適化するために、コドンの最適化についての操作を含み得る。
【０００９】
特定の実施形態において、本発明の生弱毒化組換えアルファウイルスは、蚊及び蚊細胞において複製することができない生弱毒化組換えアルファウイルスを含み得る。これらの実施形態によれば、前記生弱毒化組換えアルファウイルスは、哺乳動物及び哺乳動物細胞において発現し得る。
【００１０】
他の実施形態において、生弱毒化アルファウイルス及びアルファウイルス構築物は、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルスなどのアルファウイルスまたはコロナウイルス科及びトガウイルス科の他のアルファウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。他のセムリキ森林ウイルス複合体は、ベバールウイルス、マヤロウイルス、サブタイプ：ウナウイルス、オニョンニョンウイルス：サブタイプ：イボ−オラウイルス（Ｉｇｂｏ−Ｏｒａ  ｖｉｒｕｓ）、ロスリバーウイルス：サブタイプ：ベバールウイルス、サブタイプ：ゲッタウイルス；サブタイプ：サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルス：サブタイプ：Ｍｅ  Ｔｒｉウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、前記生弱毒化アルファウイルス及び／またはアルファウイルス構築物は、生弱毒化チクングニヤウイルスであり得る。
【００１１】
特定の実施形態において、ベクターは、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスをコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態は、前記生弱毒化組換えアルファウイルスをコードするヌクレオチド配列を有するベクターを発現し得る宿主細胞を含み得る。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている生弱毒化組換えアルファウイルスまたはアルファウイルス構築物は、医薬組成物の一部であってもよく、製薬上許容される担体を含んでいてもよい。これらの実施形態において、前記生弱毒化組換えアルファウイルスまたはアルファウイルス構築物に対する免疫応答を誘導するために、医薬組成物の一部として、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスまたは構築物は、対象に投与され得る。特定の実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、１つ以上の用量で対象に投与するための使用のワクチン組成物の一部であり得る。これらの実施形態によれば、対象は、ヒト対象（例えば、成人または子供または乳児）またはウマ、ウシ、ラクダ、アルパカなどの家畜、または飼育動物またはペットであり得る。
【００１３】
特定の実施形態において、本明細書に開示される免疫原性のアルファウイルス組成物は、アルファウイルスのポリペプチド及びポリヌクレオチドの混合物であり得る。これらの実施形態によれば、免疫原性のアルファウイルス組成物は、ポリヌクレオチドによってコードされる種々のポリペプチドを含むかまたは含まない、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含み得る。他の実施形態において、本明細書に開示される方法は、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、経皮的、経口的、吸入、膣内、局所、鼻腔内または直腸内または他の公知の適用を含む任意の許容可能な方法で、１つ以上の用量の薬学的に許容される免疫原性組成物の生弱毒化アルファウイルスを対象に投与することを含み得る。これらの実施形態によれば、免疫原性製剤は、対象に単回用量または２回以上の用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、免疫原性製剤は、相互に約３６５日（１年）以内に、相互に約１２０日以内に、相互に約９０日以内に、相互に約６０日以内に、相互に約３０日以内に、互いに約３０日以内に投与され得る。他の実施形態において、２つ以上の用量が、同一または異なる解剖学的位置で、同じ日に対象に提供され得る。さらに他の実施形態において、生弱毒化アルファウイルス構築物は、単回または複数回の投与量で、対象に投与するのに適合する他のワクチンと混合され得て、例えば、病原性ウイルスを運ぶことができる蚊が蔓延している風土病領域に入る旅行者に投与される。
【００１４】
他の実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルス、構築物及び組成物は、本明細書に開示される少なくとも１つの生弱毒化組換えアルファウイルスまたは構築物、及び少なくとも１つの容器を含むキットの一部であり得るが、これらに限定されない。さらに他の実施形態において、キットは、１つまたは複数の安定化剤、生理食塩水もしくは緩衝液、及び／または送達デバイスをさらに含み得るが、これらに限定されない。上記の参照された実施形態のいずれかは、本出願人による目標を達成するために組み合わせることができることに留意されたい。
【００１５】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書の特定の実施形態の特定の態様をさらに示すために含まれる。前記実施形態は、本明細書に提示される詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することにより、よりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明のいくつかの実施形態の生弱毒化組換えアルファウイルスを生成する概略的方法を示す。
【図２】図２は、本発明のいくつかの実施形態の生弱毒化組換えアルファウイルスを生成する代替の概略的方法を示す。
【図３】図３は、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールと比較した、哺乳動物細胞で増殖させた本発明のいくつかの実施形態の特定の生弱毒化アルファウイルスのグラフ図を表す。
【図４】図４は、昆虫細胞で増殖させた本発明のいくつかの実施形態の特定の生弱毒化アルファウイルスのグラフ図を表す。
【図５】図５は、ポジティブコントロールと比較した場合の、本発明のいくつかの実施形態の特定の生弱毒化アルファウイルスのプラーク形態を示す。
【図６】図６は、治験ワクチン及びポジティブコントロールの生弱毒化アルファウイルスと比較した、本発明のいくつかの実施形態の特定の生弱毒化アルファウイルスについての中和力価を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ポジティブコントロールの生弱毒化アルファウイルス及び治験ワクチンと比較した、本発明のいくつかの実施形態の特定の生弱毒化アルファウイルスの中和力価の範囲を示す表である。
【図８】図８は、ポジティブコントロールのアルファウイルス構築物と比較した、本発明のいくつかの実施形態の様々な生弱毒化アルファウイルス構築物の医薬組成物の投与後、野生型のアルファウイルスを用いたチャレンジ後の期待中和力価の範囲を示す表である。
【図９】図９は、ＩＲＥＳ挿入を有するいくつかのアルファウイルスの典型的なアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＣＨＩＫＶ−ＥＶ７１  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号２は、ＣＨＩＫＶ−ＨＲＶ２  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号３は、ＣＨＩＫＶ−ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号４は、ＣＨＩＫＶ−ＴＭＥＶ  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号５は、ＣＨＩＫＶ−ＨＣＶ  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号６は、ＥＶ７１  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号７は、ＨＲＶ２  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号８は、ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号９は、ＴＭＥＶ  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号１０は、ＨＣＶ  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号１１は、ＣＨＩＫＶ−ＨＡＶ  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号１２は、ＣＨＩＫＶ−ＦＧＦ１  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号１３は、ＨＡＶ  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号１４は、ＦＧＦ１  ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例であり、配列番号１５は、本明細書に開示される特定の実施形態において使用されるプライマーのＤＮＡ配列の例であり、配列番号１６は、本明細書に開示される特定の実施形態において使用されるプライマーのＤＮＡ配列の例であり、配列番号１７は、本明細書に開示される特定の実施形態において使用されるプローブのＤＮＡ配列の一例であり、配列番号１８は、ＣＨＩＫ−ＩＲＥＳのいくつかの構造ポリペプチドを表し、配列番号１９は、ＣＨＩＫ−ＩＲＥＳ非構造ポリペプチドの非構造ポリペプチドを表し、また、配列番号２０は、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳのポリヌクレオチド配列の例である。
【００１８】
例示的な実施形態の説明
定義
本明細書で使用される場合、「１つ」は、１つまたは複数のアイテムを意味し得る。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「約」は、プラスまたはマイナス５パーセントまでを意味し、例えば、約１００は、９５及び１０５までを意味し得る。
本明細書で使用される場合、「弱毒化ウイルス」は、動物に投与された場合、疾患の臨床的徴候の減少を示すか、または全く示さないウイルスを意味し得る。
【００２０】
詳細な説明
以下のセクションでは、様々な実施形態を詳述するために、様々な例示的な組成物及び方法を説明する。様々な実施形態を実施することは、本明細書に概説された特定の詳細のすべてまたは一部を使用する必要はなく、むしろ濃度、時間、及び他の特定の詳細を日常的な実験によって変更することができることは当業者には明らかである。場合によっては、よく知られている方法または構成要素は、前記説明に含まれていないことがある。
【００２１】
本明細書に開示される実施形態によれば、当業者の範囲内の従来の分子生物学、タンパク質化学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は、前記文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）を参照のこと。
【００２２】
本明細書に開示される特定の実施形態は、生弱毒化アルファウイルスの新規構築物に関する。これらの実施形態によれば、これらの生弱毒化アルファウイルスは、脊椎動物細胞において効率的に複製することができるが、昆虫細胞では発現が無くなるまで減少している。いくつかの実施形態において、生弱毒化組換えアルファウイルスは、非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の一端と前記アルファウイルスのサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧとの間に、少なくとも１つのウイルスの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の挿入を有するアルファウイルス核酸を含み得る。これらの実施形態によれば、ＩＲＥＳ配列は、哺乳動物細胞における遺伝子の発現を駆動する構築物を作製し得る異なるＩＲＥＳ配列を含み得る。特定の実施形態において、異なるＩＲＥＳ配列には、Ｉ型（例えば、エンテロウイルス：サブタイプ、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）及びサブタイプ、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ））というピコーマウイルス由来の１以上のＩＲＥＳ配列、及び／またはＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ以外のＩＩ型ＩＲＥＳ配列（例えば、カルジオウイルス：サブタイプ、タイロウイルス（ＴＭＥＶ）及びアフラトキシン：サブタイプ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ））というピコルナウイルス由来の１以上のＩＲＥＳ配列が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、ＩＲＥＳ配列は、フラビウイルス（例えば、サブタイプ、ヘパシウイルス（ＨＣＶ））に由来するかまたは見出される１つ以上のＩＲＥＳ配列を含み得る。本明細書に開示される構築物は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ挿入を有さないことに留意されたい。
【００２３】
他の実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスは、不活性化サブゲノムプロモーターを含み得る。これらの実施形態によれば、生弱毒化組換えアルファウイルスは、本明細書に詳述されるようなＩＲＥＳ挿入を含み、対象のアルファウイルス（例えば、ＣＨＩＫ）の変異または他の不活性化形態により、不活性化サブゲノムプロモーターをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスは、生存可能であり得て、また、高度に弱毒化された表現型として特徴付けられ得るが、例えば、対象におけるアルファウイルス感染を低減または予防するために投与される場合、前記対象におけるアルファウイルスに対する免疫応答を複製及び誘発し得る。これらの実施形態によれば、不活性化されたサブゲノムプロモーターは、突然変異誘発、点突然変異、欠失、挿入（例えば、フレームシフトをもたらさないか、またはある翻訳領域が保存される）などの当該分野で公知の任意の方法によって不活性化され得る。他の実施形態において、前記生弱毒化組換えアルファウイルスの前記サブゲノムプロモーターは、前記サブゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲに位置するアルファウイルス核酸におけるクラスター化点突然変異によって不活性化され得る。他の実施形態において、本明細書中に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスは、非構造タンパク質４のカルボキシ末端のアミノ酸配列を改変しないサブゲノムプロモーターに、１つ以上の変異を含み得る。さらに他の実施形態において、前記生弱毒化組換えアルファウイルスは、前記アルファウイルスの前記非構造タンパク質のいずれか１つに適応する突然変異をさらに含み得て、前記適応する突然変異は、例えば、製造目的のために、ウイルス複製、ウイルス放出、及び／またはウイルス力価を増加させ得る。
【００２４】
特定の実施形態において、組織培養または胚における継代によるアルファウイルスの減弱は、前記アルファウイルスの構造遺伝子及び非構造遺伝子、ならびにウイルスゲノムのｃｉｓ作用エレメントにおける点突然変異をもたらし得る。さらに、突然変異は、化学的な突然変異誘発によって増加させ得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ＋ウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの配列を改変することによる遺伝子操作は、ウイルスゲノム（例えば、欠失、挿入、逆位、突然変異）の安定した有意な改変を作製するために使用され得て、野生型または他の昆虫感染性ゲノム配列、または前記変異体の免疫原性を増強する可能性のあるさらなる遺伝物質に戻ることを、非常に困難または不可能にするであろう。特定の実施形態において、本発明の生弱毒化組換えアルファウイルスは、蚊及び蚊細胞において複製することができない生弱毒化組換えアルファウイルスを含み得る。これらの実施形態によれば、前記生弱毒化組換えアルファウイルスは、哺乳動物及び哺乳動物細胞において発現することができる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、生弱毒化アルファウイルス及びアルファウイルス構築物は、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルスなどのアルファウイルスウイルス、またはコロナウイルス科及びトガウイルス科の他のアルファウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。他のセムリキ森林ウイルス複合体は、ベバールウイルス、マヤロウイルス、サブタイプ：ウナウイルス、オニョンニョンウイルス：サブタイプ：イボ−オラウイルス、ロスリバーウイルス：サブタイプ：ベバールウイルス、サブタイプ：ゲッタウイルス。サブタイプ：サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルス：サブタイプ：Ｍｅ  Ｔｒｉウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、前記生弱毒化アルファウイルス及び／またはアルファウイルス構築物は、チクングニヤウイルスである。他の実施形態において、病原性アルファウイルスに対する医薬組成物は、対象への投与について、適合性の組合せ医薬組成物において、複数の生弱毒化アルファウイルスまたは他の生弱毒化もしくは死滅ウイルスを含み得る。
【００２６】
アルファウイルスは、家畜の病気を含むかなりの数のヒト及び動物の病気に関与する、小さく球状のエンベロープを持つポジティブセンスＲＮＡウイルスである。例えば、チクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ  Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）は、アルボウイルス病原体であり、最近、アフリカやアジアなど、世界中の何百万人もの人々を巻き込む爆発的な都市での大発生を引き起こしている。これらのウイルスに対する生アルボウイルスワクチン株は、節足動物宿主間の循環が病原性の増大、及び少なくとも他の宿主への感染の可能性を含む予期せぬ変化につながる可能性があるので、節足動物ベクターによって伝染してはならない。前者のリスクは、１９７１年にルイジアナ州で収集された蚊のベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）ＴＣ−８３ワクチン株の検出によって明らかにされ、これはテキサス州に限られた流行病／流行の外の領域である。このワクチン株ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３は、ワクチン接種後に蚊細胞及び感染する蚊に複製することができ、従って、蚊によるその伝達は可能性のままである。
【００２７】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるヌクレオチド配列を発現するベクターは、本明細書に開示される生弱毒化アルファウイルスまたは構築物を生成するための使用が意図される。他の実施形態において、ベクターは、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスまたはアルファウイルス構築物をコードするヌクレオチド配列を発現させるために使用され得る。いくつかの実施形態は、生弱毒化組換えアルファウイルスをコードするヌクレオチド配列を有するベクターを発現することができる宿主細胞を含み得る。これらの構築物を発現することができる任意のベクターは、本明細書に開示される方法に使用され得ることが企図される。
【００２８】
他の実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスまたは１つ以上のアルファウイルス構築物は、医薬組成物の一部であり得、薬学的に許容される担体を含み得る。これらの実施形態によれば、生弱毒化組換えアルファウイルスまたは本明細書に開示された医薬組成物の一部を構成する構築物は、生弱毒化組換えアルファウイルスまたはアルファウイルス構築物に対する免疫応答を誘導するために、対象に投与され得る。特定の実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、１つ以上の用量で、対象に投与するための使用のワクチン組成物の一部であり得る。これらの実施形態によれば、対象は、ヒト対象（例えば、成人または子供または乳児）、家畜、またはウマ、ウシ、ラクダ、アルパカ、動物園、または野生動物または飼育動物またはペットなどの他の動物であり得る。
【００２９】
特定の実施形態において、本明細書に開示される免疫原性アルファウイルス組成物は、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの混合物であり得る。これらの実施形態によれば、免疫原性アルファウイルス組成物は、ポリヌクレオチドによってコードされる種々のポリペプチドを含むかまたは含まない本明細書に記載のポリヌクレオチドを含み得る。他の実施形態において、方法は、１つ以上の用量の本明細書に開示される薬学的に許容される免疫原性組成物を任意の既知の様式によって対象に投与することを含み得る。これらの実施形態によれば、投与様式は、対象に前記組成物を皮下、筋肉内、静脈内、皮内、経皮、経口、吸入、膣内、局所、鼻腔内、または直腸投与することが挙げられるが、これらに限定されない。これらの実施形態によれば、免疫原性製剤は、対象に単回用量または２回以上の用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、免疫原性製剤は、ブースターとして、相互に約３６５日（１年）以内に、相互に約１２０日以内に、相互に約９０日以内に、相互に約６０日以内に、相互に約３０日以内に、互いに約３０日以内に投与され得る。特定の実施形態において、対象は、成人、子供または乳児または動物であり得る。他の実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、対象に１日で皮下または皮内または鼻腔内に投与され、続いて、第１の用量の３０日以内または６ヶ月〜１年までに、別の日に第２の用量を追加投与した。
【００３０】
現在、チクングニヤに対するワクチンや治療薬がほとんどないため、これらのウイルスの流行は、人々を蚊の媒介にさらすことを防ぎ、病気の症状を治療することによってのみ制御され得る。１９８０年代、ウォルターリードアーミー研究所の科学者は、１８１／クローン２５（以下、１８１−２５という。）という試験用ワクチンを製造した。この生弱毒化株は、野生型ＣＨＩＫＶ株の連続的なプラークからプラークへの継代によって生成された。前記ウイルスは、げっ歯類及び非ヒト霊長類の両方において弱毒化され、ヒトにおいて高度な免疫原性である。しかしながら、この１８１−２５株は、軽度で一過性の関節痛を引き起こし、第２相試験の間、天然の蚊ベクターＡｅ．Ａｅｇｙｐｔｕｓにより、実験的に伝達されることが判明した。さらに、ホルマリン不活性化ワクチンは、高価で非効率である。これらのワクチンは、複数の反復ワクチン接種を必要とすることもある。従って、ＣＨＩＫＶに対する改善された免疫原性薬剤の必要性が存在する。
【００３１】
アルファウイルスに特有の資源が限られている国に効果的で、流行と戦うために、理想的なアルファウイルスワクチンは、単回投与後に迅速かつ長命な免疫を誘導し、反応原性及び病原性への復帰のリスクが低く、安価である。アルボウイルスの疾患に対する免疫原性組成物は、ウイルス血症が起こった場合、特に、非風土病領域で使用される場合、蚊を介して免疫化された人からの伝染のリスクが低くなければならい。安全性を重視する複製が欠損している免疫原性候補が記載されているが、単回投与後に、迅速または長期生存免疫を誘導することは示されておらず、産生するのに費用がかかるものもあり得る。
【００３２】
本明細書の特定の実施形態は、蚊及び蚊細胞において複製することができないが、哺乳動物細胞において複製することができる、生弱毒化組換えアルファウイルスを含む。これらの実施形態によれば、これらの構築物は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列以外の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を使用して生成され得る。いくつかの配列が所望の表現型を達成することができなかったので、すべてのＩＲＥＳ配列がＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの代わりになるわけではないことに留意されたい。本開示の生弱毒化アルファウイルスは、様々な外来種の特定のＩＲＥＳ配列の制御下で、特定のＩＲＥＳ配列を慎重に選択し、アルファウイルス複製の翻訳制御を置くことにより達成された。これらの実施形態によれば、外因性ＩＲＥＳ配列は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを排除するが、限定されないがフラビウイルス、ピコノウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レトロウイルス、ヘパドナウイルス、ペスチウイルス、カリシウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及び／またはポックスウイルスのＩＲＥＳ配列が挙げられる。米国特許第８，４２６，１８８号を参照されたく、これらの開示は、本明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、その全体が参照により組み込まれる。
【００３３】
ピコルナウイルス（ピコルナウイルス科）は、多くの既知のヒト及び／または動物の疾患を引き起こす、正十二面体キャプシドを有する非エンベロープのプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ピコーマウイルスは、他のウイルスよりも頻繁にヒトに感染するライノウイルス、長年にかけて何百万人もの人々が麻痺したり死亡したりしたポリオウイルス）、及び口蹄疫ウイルスを含むいくつかの注目すべきメンバーを含み、それらは、世界中の専門機関の生産につながった。
【００３４】
ピコルナウイルスは、キャップ依存性の翻訳が損なわれた場合、ｍＲＮＡにおけるキャップ非依存性の翻訳開始を制御する能力と組み合わせた、ｃｉｓ作用のＲＮＡ調節配列である内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含む。前記ピコーマウイルスのＩＲＥＳ配列は、その一次構造及び二次構造に基づいて、３つのタイプに分類される。Ｉ型ＩＲＥＳ配列を有するピコウイルスは、エンテロウイルス：サブタイプ、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、ヒトエンテロウイルスＡ（ＨＥＶ）、コクサッキーウイルスＢ（ＣＶＢ）（ヒトエンテロウイルスＢ）、ポリオウイルス（ＰＶ）（ヒトエンテロウイルスＣ）、ウシエンテロウイルス（ＢＥＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＩ型ＩＲＥＳ配列を有するピコーマウイルスは、アフロウイルス：サブタイプ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、及びウシ鼻炎Ｂウイルス（ＢＲＢＶ）；が挙げられるが、これらに限定されない。カーディオウイルス：サブタイプ、タイロウイルス（ＴＭＥＶ）、及び脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）；エルボウイルス：サブタイプ、ウマ鼻炎Ｂウイルス（ＥＲＢＶ）；パレコウイルス：サブタイプ、ヒトパレコウイルス（ＨＰｅＶ）；コウウィルス：サブタイプ、アイチウイルス（ＡｉＶ）；アビシウイルス、コサウイルス、及びハンニウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。これらのＩＲＥＳの型は、宿主タンパク質の要件、及び前記エントリー部位に関する前記開始コドンの位置が異なる。Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）のＩＲＥＳは、他のピコルナウイルスとは異なり、グループ（ＩＩＩ型）を単独で構成する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、Ｉ型またはＩＩ型ピコルナウイルスのＩＲＥＳ配列は、生弱毒化組換えアルファウイルスに挿入され得る。他の実施形態において、生弱毒化組換えアルファウイルスは、非ピコルナウイルス由来のＩＲＥＳ配列を含み得る。これらの非ピコルナウイルスのＩＲＥＳ配列は、フラビウイルス：サブタイプ、ハパシウイルス（ＨＣＶ）、ペスチウイルス、ジシストロウイルス、及びレトロウイルス由来のＩＲＥＳ配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのＩＲＥＳ配列のいくつかは、本明細書に開示される免疫原性組成物に使用するアルファウイルス構築物を作製するために、首尾よく使用された。
【００３６】
特定の実施形態において、生弱毒化アルファウイルス及びアルファウイルス構築物は、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルスなどのアルファウイルス、またはコロナウイルス科及びトガウイルス科の他のアルファウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。他のセムリキ森林ウイルス複合体は、ベバールウイルス、マヤロウイルス、サブタイプ：ウナウイルス、オニョンニョンウイルス：サブタイプ：イボ−オラウイルス、ロスリバーウイルス：サブタイプ：ベバールウイルス、サブタイプ：ゲッタウイルス；サブタイプ：サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルス：サブタイプ：Ｍｅ  Ｔｒｉウイルス、もしくはそれらの組み合わせ、または他の生弱毒化ウイルス製剤との組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、蚊または他の昆虫細胞において複製することができない生弱毒化組換えアルファウイルスを含み得る。特定の実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスのサブゲノムプロモーターは、非構造タンパク質４（ｎｓＰ４）コード配列の末端とサブゲノムＲＮＡコード配列の開始ＡＵＧと間のサブゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲの欠失により不活性化され得る。別の実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスのサブゲノムプロモーターは、前記サブゲノムプロモーター内のクラスター化点突然変異により不活性化され得る。これらの実施形態によれば、前記アルファウイルスサブゲノムプロモーターは、前記サブゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲに位置する核酸のクラスター化点突然変異を含み得る。他の実施形態において、アルファウイルスサブゲノムプロモーターは、前記非構造タンパク質の野生型アミノ酸を保存しながら、同義変異を用いて不活性化され得る。一例において、前記アルファウイルス、チクングニヤウイルス、サブゲノムプロモーターは、クラスター化点突然変異により不活性化され得る。同様のクラスター化点突然変異は、他のアルファウイルスのサブゲノムプロモーターを不活性化するために使用され得る。これらの実施形態によれば、クラスター化点突然変異は、ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の７４７４，７４７７，７４８０，７４８１，７４８３，７４８６，７４８９，７４９２，７４９５，７４９８及び／または７５０１−７５０３の位置に、２つ以上の突然変異の同義の点突然変異を含み得て、前記ポリペプチドは、１つ以上の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５を含み得る。前記サブゲノムプロモーターを不活性化するためのクラスター化点突然変異の使用は、上記の突然変異の２つ以上、４つ以上、６つ以上、または前記アルファウイルスのターゲットの前記サブゲノムプロモーターにおいて１２までの突然変異のような、逆転を低減または防止するのに十分な数である。本明細書に開示される特定の実施形態におけるアルファウイルスは、遺伝的に類似している（例えば、図９、いくつかのアルファウイルスのアラインメントを参照のこと）。
【００３８】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、蚊及び蚊細胞において複製することができず、一方、哺乳動物細胞で発現することができる生弱毒化組換えアルファウイルスの製造方法を含む。これらの実施形態によれば、これらの生弱毒化組換えアルファウイルスは、前記アルファウイルスゲノムに突然変異を導入し、前記アルファウイルスの構造タンパク質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（または構造タンパク質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ））のキャップ依存性の翻訳を不活性化し、前記構造遺伝子の上流のアルファウイルスゲノムへの脊椎動物由来細胞の翻訳を選択的に開始するＩＲＥＳをクローニングすることにより作製され得る。
【００３９】
他の実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスは、ａ）エンベロープ糖タンパク質遺伝子の下流に位置し、前記アルファウイルスの３’ＵＴＲの上流に位置するキャプシド遺伝子、ｂ）前記エンベロープ糖タンパク質遺伝子の３’末端と前記配置されたキャプシド遺伝子との間に導入され、前記遺伝子は、エンベロープ糖タンパク質遺伝子として５’から３’に位置する少なくとも１つのＩＲＥＳ、挿入されたＩＲＥＳ、配置されたカプシド遺伝子、及び３’ＵＴＲ、ならびにｃ）前記ＩＲＥＳの上流に位置する前記エンベロープ糖タンパク質遺伝子は、ＩＲＥＳ非依存的な様式で翻訳され、一方、前記配置されたキャプシドは、ＩＲＥＳ依存的な様式で翻訳されることを含み得る。
【００４０】
図１を参照すると、アルファウイルスのゲノムが示され、前記模式図で表されるアルファウイルスは、４つの非構造タンパク質（ｎｓＰｌ−４）、及び３つの主要構造タンパク質（Ｃａｐｓｉｄ、Ｅ１及びＥ２エンベロープ糖タンパク質）をコードする。複製中に、２つの異なるＲＮＡ、すなわちゲノムＲＮＡ及びサブゲノムＲＮＡが生成される。前記サブゲノムＲＮＡは、感染の間に、前記ｎｓＰ４遺伝子の３’末端に見出され得るサブゲノムプロモーター（ＳＧプロモーター）から遅れて転写される。いくつかの実施形態は、外因性ウイルスまたはヒト／哺乳動物ＩＲＥＳ（例えば、ピコーマウイルス及び／またはフラビウイルス）のＩＲＥＳ配列を、アルファウイルスｃＤＮＡクローンのＳＧプロモーターの下流に直接挿入することにより、蚊細胞において複製することができない生弱毒化組換えアルファウイルスを生成する方法を含む（図１；中央図）。本明細書に開示される他の実施形態はまた、不活性化されたＳＧプロモーターを有する生弱毒化組換えアルファウイルスを含み得る。例えば、前記サブゲノムプロモーターは、不活性化され得る（例えば、１つ以上の点突然変異、図１の下）。不活性ＳＧプロモーターを有するこれらの生弱毒化組換えアルファウイルスは、蚊の要素依存性の翻訳に戻ることができないという点で安定である。このような逆転は、前記ＩＲＥＳの欠失だけでなく、機能しているサブゲノムプロモーターの修復も、これを非常に起こりそうにない出来事としている。
【００４１】
ここで図２を参照すると、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、前記３’ＵＴＲのすぐ上流の前記サブゲノム領域の前記３’末端に前記キャプシド遺伝子を有する、前記エンベロープ糖タンパク質遺伝子の下流にＩＲＥＳ配列を配置することにより、生弱毒化組換えアルファウイルスを生成する方法を含み得る（図２；バージョン２）。この戦略によって生成されたこれらの生弱毒化組換えアルファウイルスは、活性サブゲノムプロモーターを保持し得る。これらの実施例において、キャップ依存的に翻訳されたエンベロープタンパク質遺伝子、及びＩＲＥＳ依存的な要式で翻訳されたカプシドタンパク質を用いて、サブゲノムメッセージが作製され得る。本明細書に開示される他の実施形態は、不活性ＳＧプロモーターを有する生弱毒化組換えアルファウイルスを含み得る。本明細書に記載の１つの弱毒化戦略に基づいて、遺伝子発現を変化させ、前記アルファウイルスを弱毒化させるために、前記脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳを使用する、生弱毒化チクングンヤウイルスが以前に設計された。１つの生弱毒化アルファウイルス、ＩＲＥＳ挿入を有するチクングンヤにおいて、クラスター化点突然変異は、前記サブゲノムプロモーターを不活性化するために使用され、また、前記ＩＲＥＳは、前記構造タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流の遺伝子間領域に挿入された。第２のバージョンのＣＨＩＫＶ／ＩＲＥＳｖ２は、野生型サブゲノムプロモーターを保持したが、前記キャプシドタンパク質遺伝子を前記エンベロープタンパク質遺伝子の下流、及び前記ＩＲＥＳの後ろに配置した。いくつかの実施形態において、本明細書に示される生弱毒化組換えアルファウイルスは、記載されるような弱毒化戦略を用いて、生弱毒化ウイルスのこれらのバージョンを用いて生成され得る。例えば、米国特許第８，４２６，１８８号を参照されたく、これらの開示は、本明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、その全体が参照により組み込まれる。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列を用いたこれらの従来の構築物を考慮すると、驚くべきことに、すべてのＩＲＥＳ配列が以前に設計された構築物に使用され得るとは限らないことが判明した。さらに、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳがメンバーであるピコルナウイルス由来のＩＲＥＳ配列のすべてが、本明細書に開示された生弱毒化組換えアルファウイルスの適切な代替物であるとは限らない。生存率を維持しながら前記アルファウイルスを弱毒化するために、特異的なＩＲＥＳ配列のみが生弱毒化アルファウイルスにおいて機能することが発見された。驚くべきことに、試験したＩ型及びＩＩ型ピコルナウイルスのＩＲＥＳ配列の一部のみが機能的な構築物を生成し、ＩＩＩ型ピコルナウイルスのＩＲＥＳ（ＨＡＶ、Ａ型肝炎）配列は機能しなかった。さらに、細胞性ＦＧＦ（例えば、哺乳動物）のＩＲＥＳ配列はまた、本明細書に開示された構築物に挿入された場合、生存可能なアルファウイルスを産生しなかった。
【００４２】
ＩＲＥＳ配列は、前記ＲＮＡにおいて生成される二次構造の広範なステム−ループ／ヘアピン配列を含む。これらの構造は、すべてのＩＲＥＳタイプで共有されているわけではなく、実際には、３つのタイプ（Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型）の間でかなり異なる。しかしながら、ＩＩＩ型は、Ｉ型及びＩＩ型への二次構造においてより劇的に異なる。これは、どの翻訳因子が前記ＩＲＥＳ構造に結合し、これらのプロモーターからポリペプチド産生を開始することができるかに影響を及ぼす可能性がある（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｉｃｏｍａｖｉｍｓ  ＩＲＥＳ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ：ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｉｍｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２０６，ｐｐ．６２−７３，２０１５に記載されており、これらの開示は、本明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、その全体が参照により本明細書に援用される）。さらに、３種のピコーマウイルスのＩＲＥＳ配列内の他の構造的相違が、本明細書に開示される免疫原性組成物における使用のアルファウイルス構成成分を生成する際に異なる効果に寄与し得ることが明らかである。
【００４３】
医薬組成物
本明細書の実施形態は、生物学的に適合する形態で、必要とする対象に投与するための生弱毒化アルファウイルス構築物を作製及び使用するための方法を提供する。インビボでの投与について、生物学的適合性のある適切な形態は、前記活性剤の治療上の利点により、有害な影響を上回って投与される活性剤の形態（例えば、特定の実施形態の生弱毒化アルファウイルスの組成物）であり得る。治療的に有効な量の治療用組成物の投与は、所望の結果を達成するのに必要な投与量及び時間で、効果的な量とみなされ得る、例えば、治療的に活性な化合物の量は、前記個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに前記個体において所望の応答を誘発するための製剤の能力のような要因に従って変化し得る。投薬計画は、最適な治療応答を提供するように調整され得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物（例えば、いくつかの実施形態の医薬免疫原性組成物）は、そのような組成物で作用することが知られている任意の様式で投与され得て、皮下、静脈内、経口投与、吸入、経皮適用、皮内適用、膣内適用、局所適用、鼻腔内または直腸投与が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、本明細書に開示される組成物は、皮下投与で投与され得る。さらに別の実施形態において、本明細書に開示される組成物は、皮下もしくは筋肉内、または皮内もしくは鼻腔内投与により、または初回用量及び追加投与レジメンとしての組み合わせにより、投与され得る。
【００４５】
免疫原性組成物は、前記組成物と同時投与される適切な担体または希釈剤において、対象に投与され得る。本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」は、生理食塩水及び水性緩衝液などの希釈剤を含むことを意味する。本明細書に開示される生弱毒化アルファウイルス構築物はまた、非経口的にまたは腹腔内に投与され得る。分散液は、ＨＥＰＥＳ緩衝液及び他の適切な薬剤などの適切な緩衝液において調製され得る。保存及び使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有し得る。
【００４６】
投与に適した医薬組成物は、当該分野で公知の任意の手段によって投与され得る。例えば、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のために、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末または凍結乾燥／凍結乾燥ケーキが使用され得る。すべての場合において、前記組成物は、無菌であり得て、容易な注射可能性が存在する程度に流動性であり得る。それは、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して、さらに保存され得る。前記薬学的に許容される担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒、安定化組成物、または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用により維持され得る。
【００４７】
滅菌注射溶液は、活性化合物を、必要に応じて、適切な溶媒または上記に列挙した成分の１つまたは組合せと共に組み入れ、その後、滅菌することにより調製され得る。
処方されると、溶液は、投薬製剤と適合する様式で、治療的に有効な量で投与され得る。治療有効量は、患者の健康または幸せに、単一または累積的に有益な効果を有する生物活性化合物の量である。前記製剤は、上記の注射可能な溶液のタイプのような、様々な剤形で容易に投与される。徐放性カプセル、徐放性微粒子なども、本明細書の組成物を投与するために使用され得ると考えられる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。
【００４８】
生弱毒化ウイルスワクチンが効果的であるためには、それらは免疫後に複製可能でなければならない。前記ウイルスを不活性化する要因は、前記生弱毒化アルファウイルスを傷つける可能性がある。一般に使用されるワクチンの中には、極端な温度に敏感なものもある。過度の熱または偶発的な凍結は、前記ワクチンを不活性化する可能性がある。流通を通じてこの「コールドチェーン」を維持することは、アルファウイルスがよく発生する資源が限られている国では、特に困難である。特定の実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスは、これらのアルファウイルスの劣化または不活性化を低減または防止するために、液体もしくは水性製剤、または凍結もしくは凍結乾燥形態で保存され得る。他の実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルスは、室温（例えば、約２０℃〜約２５℃、さらには４０℃もの高温）または冷蔵温度（例えば、約０℃〜約１０℃）で、長期間安定性を維持するために、様々な添加剤を用いて配合され得る。生弱毒化組換えアルファウイルスの劣化または不活性化を減少させる添加剤は、炭水化物及び／またはアミノ酸、またはＰＢＳ緩衝液、または他の適切な緩衝液を用いたＨＥＰＥＳ（例えば、約１０．０〜約２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、限定されるものではないが、タンパク質剤は、ゼラチン、または本質的に不活性な低減させたアレルギー反応または免疫原性応答を有する他の薬剤を含み得る製剤に添加され得る。本明細書中のさらに別の実施形態は、低温（例えば、冷蔵保存または凍結保存）の必要性を減少させること、ならびに水性及び／または再構成された生弱毒化組換えアルファウイルスの貯蔵寿命を延長させることに指向されており、前記生弱毒化アルファウイルスを保存するための前記処方物の使用は、ＨＥＰＥＳバッファーまたは他の適切なバッファーを含み得る。
【００４９】
前記活性治療剤は、用量当たり標的アルファウイルスに対して免疫応答を誘導する（例えば、中和抗体を産生する）プラーク形成単位（ＰＦＵ）により、測定された生弱毒化アルファウイルスを含み得る混合物中に処方され得る。単回投与または複数回投与も、所定の状況のための適切なスケジュールで投与され得る。いくつかの実施形態において、用量は、本明細書で企図されるウイルスへの曝露の前、曝露中及び／または曝露の後に投与され得る。他の実施形態において、対数ＰＦＵは、前記組成物を投与された対象に依存して変化し得る。１用量あたりのＰＦＵの範囲は、２Ｌｏｇ１０〜８Ｌｏｇ１０の間であり得る。特定の実施形態において、用量範囲は、対象に前記アルファウイルスに対する免疫応答を誘発するために前記対象に投与される場合、３Ｌｏｇ１０〜６Ｌｏｇ１０であり得るか、または医療従事者によって適切であると判明した他の用量であり得る。
【００５０】
特定の実施形態において、本明細書で使用する生弱毒化アルファウイルス免疫原性組成物は、医薬組成物の一部であってよく、ポリヌクレオチドにより代表される生弱毒化アルファウイルス、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドとポリペプチドの両方の混合物を含み得る。これらの実施形態によれば、本明細書に開示される組成物は、そのような治療を必要とする対象を治療するため、またはアルファウイルスへの曝露に起因する障害または感染の発症の予防のために使用され得る。
【００５１】
キット
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される生弱毒化組換えアルファウイルス、構築物及び組成物は、本明細書に開示される少なくとも１つの生弱毒化組換えアルファウイルス、または構築物、及び少なくとも１つの容器を含むキットの一部であり得るが、これらに限定されない。さらに他の実施形態において、キットは、１つまたは複数の安定化剤、緩衝液、及び／または送達デバイスをさらに含み得るが、これらに限定されない。キットはまた、本明細書に開示される前記組成物と共に送達されるのに適した１つ以上の追加の薬剤を含み得る。
【００５２】
前記キットは、それを必要とする対象において、適切に分取された組成物の使用をさらに含み得る。さらに、本明細書の組成物は、部分的にまたは完全に脱水されていても、または水性であってもよい。本明細書で企図されるキットは、特定の製剤に依存して、本明細書に開示される室温または冷蔵温度で保存され得る。
【００５３】
前記キットの容器手段は、組成物がその中に置かれ、好ましくは適切に分取される、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を一般に含む。追加の成分が提供される場合、前記キットは、一般に、この薬剤または成分が配置され得る１つまたは複数の追加の容器も含む。本明細書のキットはまた、典型的には、前記薬剤、組成物、及び他の試薬容器を商業的販売のために密閉して収容するための手段を含む。そのような容器は、所望のバイアルが保持される注入またはブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例は、本明細書に提示される特定の実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本明細書に開示される実施において良好に機能することが判明した技術を表し、従って、その実施のための好ましい態様を構成すると考えられ得ることは、当業者には理解されるはずである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本明細書の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、同様のまたは類似の結果を得ることを認識すべきである。
【００５５】
実施例１
プラスミドの生産及び配列決定
１つの例示的な方法では、不活性化突然変異（ＣＨＩＫＶ／ＩＲＥＳ＝ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを含有するポジティブコントロールのウイルス）を用いて、サブゲノムプロモーターをアブレーションしたＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを含むＣＨＩＫＶ  ｃＤＮＡクローンを、標準組換えＤＮＡ技術を用いて作製し、そこにおいて、先に記載したＬａ  Ｒｅｕｎｉｏｎ株（ＬＲ）の感染クローンを鋳型、及び以下に開示する他の構築物に対するポジティブコントロールとして使用した。前記サブゲノムプロモーターの不活性化は、部位特異的突然変異誘発を用いて行った。前記サブゲノムプロモーターを介して、ｎｓＰ４遺伝子の３’末端をコードする中間構築物を、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）の高忠実度Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲを使用して作製した。得られたアンプリコンをシャトルベクターｐｒＳ２にクローニングし、ＢｉｇＤｙｅキット（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列決定した。前記ＬＲ株由来のキャプシド遺伝子の５’末端を、前記ＩＲＥＳ配列に相補的なオーバーハングを有するＰＣＲを用いて増幅した。次いで、ＩＲＥＳ含有及びキャプシドフラグメントを融合ＰＣＲを用いて結合させ、このフラグメントを前記シャトルベクターにクローン化して再配列させた。前記ＩＲＥＳ／キャプシドフラグメント、及び前記突然変異したサブゲノムフラグメントを、両方のフラグメントに導入されたＳｐｅＩ部位を介して最終的に連結した。次いで、完成した挿入物をＬＲ骨格にクローニングし、この最終構築物を完全に配列決定した。
【００５６】
さらに、不活性化突然変異（例えば、ＥＶ７１及びＨＲＶ）を用いて不活性化されたサブゲノムプロモーターを有するＩ型ピコルナウイルスのＩＲＥＳ配列を含有するＣＨＩＫＶ  ｃＤＮＡクローン、不活性化突然変異（例えばＦＭＤＶ及びＴＭＥＶ）を用いて不活性化されたサブゲノムプロモーターを有するＩＩ型ピコルナウイルスのＩＲＥＳ配列を含有するＣＨＩＫＶ  ｃＤＮＡクローン、不活性化突然変異（例えば、ＨＡＶ）を用いて不活性化されたサブゲノムプロモーターを有するＩＩＩ型ピコルナウイルスのＩＲＥＳ配列を含有するＣＨＩＫＶ  ｃＤＮＡクローン、不活化突然変異（例えば、ＨＣＶ）を用いてアブレーションされたサブゲノムプロモーターを有する非ピコルナウイルスのＩＲＥＳ配列を含有するＣＨＩＫＶ  ｃＤＮＡクローン、及び不活性化突然変異（例えば、ＦＧＦ１）を用いて不活性化されたサブゲノムプロモーターを有する非ウイルス性の哺乳動物のＩＲＥＳを含有するＣＨＩＫＶ  ｃＤＮＡクローンを、上記の標準組換えＤＮＡ技術を用いて作製した。
【００５７】
実施例２
ＲＮＡ転写、トランスフェクション、及びウイルス産生
陰イオン交換カラムを用いて、大規模プラスミド精製を行った。次いで、精製した前記ＤＮＡをＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて線状化し、１．２％アガロースゲルで小さなサンプルを解析して線状化を確認した。Ａｍｂｉｏｎ  ＳＰ６インビトロ転写キットを用いて、残りの前記ＤＮＡを転写した。前記ＲＮＡを定量し、ＢＴＸ  ＥＣＭ  ８３０エレクトロポレーターを用いて、ベロ細胞をエレクトロポレーションした。簡潔には、９０％コンフルエントのベロ細胞を含有する２つのＴ−１５０フラスコをトリプシン処理し、ＲＮＡ分解酵素がないＤＰＢＳで３回洗浄した。前記細胞を７００μＬのＤＰＢＳに再懸濁し、１０μｇのＲＮＡを添加した。前記溶液を４ｍｍのキュベットに入れ、２５０ｖで１０秒間、１秒間隔で２回パルスした。次いで、前記細胞を室温で１０分間放置した後、Ｔ−７５フラスコに播種した。前記ウイルスは、エレクトロポレーションの４８時間後に、または明らかなＣＰＥが観察され、７７１×ｇで遠心分離するまで採取された。上清を回収し、ベロ細胞上のＴＣＩＤ５０アッセイにより、力価測定した。
【００５８】
細胞培養
一例では、ベロアフリカミドリザルの腎臓細胞が得られた（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）由来）。前記細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、３７℃で維持した。Ｃ６／３６  Ａｅ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ細胞も２８℃で１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにおいて維持した。
【００５９】
細胞培養増殖曲線
試験された各ウイルスについて、二連でＴ−２５フラスコ中で複製の動態を測定した。前記フラスコをベロ細胞またはＣ６／３６細胞を用いて、９５％のコンフルエントに播種した。培地を除去し、ＭＯＩ  ０．００１で１時間感染させた。次いで、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ  ５ｍＬを添加した。０時点を直ちに除去した（３００μＬ）。１〜６日目の残りの各時点で、３００μＬを除去した。前記サンプルをＴＣＩＤ５０アッセイにより、力価測定した。
【００６０】
実施例３
ウイルス及び抗体力価
他の典型的な実験において、封じ込めの要件及び感度の必要性に応じて、アルファウイルスのストック及び実験サンプルをプラークアッセイまたはＴＣＩＤ５０により力価測定し、ウイルスの希釈を用いた定量的リアルタイムＰＣＲを使用して推定し、（プラーク形成単位）ＰＦＵ力価を外挿することができる標準曲線を作成した。この特定のアッセイにおいて、プライマーは、例えば、（５’−ＧＡＹＣＣＣＧＡＣＴＣＡＡＣＣＡＴＣＣＴ−３’−配列番号１５）、及び（５’−ＣＡＴＭＧＧＧＣＡＲＡＣＧＣＡＣＴＧＧＴＡ−３’−配列番号１６）、ならびに典型的な色素ＦＡＭを含有する前記プローブ（５’−ＡＧＹＧＣＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＫＧＡＴＧＴ−３’−配列番号１７）を用いた。Ａｂ力価は、５０％低減した終点を有するプラーク減少中和試験を用いて測定した。
【００６１】
実施例４
ウイルスレスキュー
特定の例示的な方法において、サブゲノムプロモーターに複数の突然変異を有する組換えアルファウイルス構築物を、上記のＩＲＥＳに基づく弱毒化戦略を用いた標準組換えＤＮＡ技術を使用して、ｃＤＮＡ中に作製した。インビトロで転写されたＲＮＡのベロ細胞へのエレクトロポレーションによりレスキューされた、すべての得られたウイルス（例えば、ＦＭＤＶ、ＨＣＶ、ＥＶ７１、ＴＭＥＶ、及びＨＲＶ由来のＩＲＥＳ）は、非機能性のサブゲノムプロモーターを含んでいた。ＦＧＦ１及びＨＡＶ  ＩＲＥＳ構築物は、いずれのＣＰＥも示さなかった。さらに、ＦＧＦ１及びＨＡＶのＩＲＥＳ配列を有する構築物は、ベロ細胞に回収されたが、ウイルス活性は示さなかった。
【００６２】
実施例５
ベロ細胞の増殖速度
ベロ細胞における生存率を評価するために、前記エレクトロポレーションに由来するウイルスを、ＣＨＩＫＶ（チクングニヤウイルス）感染後に比較した。ここで、図３を参照すると、ＣＨＩＫ−ＩＲＥＳ及び他の生弱毒化アルファウイルスを、試験ワクチンであるチクングニヤ１８１−２５株と比較して、ベロ細胞における生存能力、及び増殖における弱毒化について試験した。同様に、ＦＭＤＶ、ＥＶ７１、ＨＣＶ、ＴＭＥＶ、及びＨＲＶのＩＲＥＳ配列を含有する組換えアルファウイルス構築物は、ベロ細胞で生存可能であることが見出され、古典的に弱毒化（細胞培養の継代後）された１８１−２５株と比較して、増殖においてＣＨＩＫ−ＩＲＥＳと類似の弱毒化レベルを示した。ＨＣＶ及びＦＭＤＶは、ＣＨＩＫ−ＩＲＥＳと比較して、増殖において弱毒化を示した。しかしながら、ＦＧＦ１及びＨＡＶ  ＩＲＥＳ構築物は、生存可能なウイルスを生成しなかった。
【００６３】
Ｃ６／３６蚊細胞の増殖速度
蚊細胞の生存率を評価するために、Ｃ６／３６蚊細胞の感染後に、エレクトロポレーションに由来するウイルスを比較した。ここで、図４を参照すると、１８１−２５株は、Ｃ６／３６蚊細胞で生存可能な唯一の株であった。本明細書で試験したすべての組換えアルファウイルス構築物は、生存可能ではなく、Ｃ６／３６蚊細胞で増殖を示さなかった。
【００６４】
実施例６
プラークアッセイ
チクングニヤ１８１−２５株、及びＣＨＩＫ−ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ポジティブコントロール）は、ベロ細胞上にプラークを生成した。ここで図５を参照すると、いくつかの組換えアルファウイルス構築物（例えば、ＥＶ７１、ＨＣＶ、ＴＭＥＶ、及びＨＲＶ由来のＩＲＥＳ）は、ベロ細胞上にプラークを生成したが、異なるサイズのプラークを示した。例えば、ＥＶ７１  ＩＲＥＳ配列の挿入物を有する構築物は、コントロールのＣＨＩＫ−ＩＲＥＳより一貫してより大きなプラークを生成したが、一方で、ＨＣＶ、ＨＲＶ、及びＴＭＥＶ由来のＩＲＥＳ配列を有する構築物のような、他の組換えアルファウイルス構築物は、ＥＶ７１  ＩＲＥＳ配列を挿入した構築物ＣＨＩＫ−ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ、ポジティブコントロールの構築物）、及び１８１−２５株よりも小さい疫病を生じた。ＦＭＤＶは、プラークの生成に失敗した。プラークのサイズは、ウイルスの適応性の指標であり、各構築物は、独特のプラークの表現型を有しており、−さらに、ＩＲＥＳ挿入のすべてが、この弱毒化生成方法において、同等に機能するとは限らないことを支持する。
【００６５】
実施例７
中和力価
チクングニヤウイルスである１８１−２５に対して産生された中和ウサギポリクローナル抗体は、公に入手可能である。この抗体を、これらのＩＲＥＳ構築物の各々がこの試薬に対して中和される能力について、ＴＣＩＤ５０中和アッセイで試験した。各生弱毒化アルファウイルス株を、中和ポリクローナル抗体（ｎＰａｂ）を中和するその能力について試験した。この抗体は、インビボで免疫原性及び中和抗体応答を誘導する能力を有するウイルス上のエピトープに結合することが理解される。一定量のウイルス（１×１０４  ＴＣＩＤ５０）を２倍希釈系列の抗体に添加した。投入ウイルスの５０％が中和された希釈液を、各々の生弱毒化アルファウイルス株間で比較する。
【００６６】
ここで、図６を参照すると、このヒストグラムのプロットに示すように、コントロールの抗チクングンヤウサギ血清プールを１：４から１：８１９２まで連続的に希釈した。５つの組換えアルファウイルス構築物、チクングニヤ−ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（ＩＲＥＳ  ＣＯＮＴＲＯＬ，ＣＨＩＫ／ＩＲＥＳ）、及び１８１−２５の集団チクングニヤワクチン株をＴＣＩＤ５０／ｍＬ  ２０００の同等のウイルス力価に希釈した。等量の各抗体希釈液及び各ウイルスサンプルを合わせ、３７℃で１．５時間インキュベートした。９６ウェルのベロ細胞プレートの１ウェルあたり、各ウイルス抗体試料１００μＬを蒔いた。５日後、前記細胞層中にＣＰＥが存在しないことによって示されるように、前記ウイルスが完全に中和された抗体の最も高い希釈物が記録された。前記図の値は、２つの異なる機会に、３回の反復の幾何平均である。前記グラフの縦線で示されるように、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳのコントロールは、３２−１６１のＧＭＴ値をもたらした。
【００６７】
ここで、図７を参照すると、コントロールの抗チクングンヤウサギ血清プールを１：４から１：８１９２まで連続的に希釈した。試験した前記ＩＲＥＳアルファウイルス構築物、前記チクングンヤＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ（ＩＲＥＳのコントロール）、及び古典的に弱毒化した生１８１／２５の集団チクングンヤワクチン株を、ＴＣＩＤ５０／ｍＬ  ２０００の同等のウイルス力価に希釈した。等量の各抗体希釈液、及び各ウイルスサンプルを合わせ、３７℃で１．５時間インキュベートした。９６ウェルのベロ細胞プレートの１ウェルあたり、各ウイルス抗体試料１００μＬを蒔いた。５日後、前記細胞層中にＣＰＥが存在しないことによって示されるように、前記ウイルスが完全に中和された抗体の最も高い希釈物が記録された。前記図の値は、２つの異なる実験における３回の反復の幾何平均である。生存可能なアルファウイルス構築物の各々は、前記中和抗体によって中和され得る。前記ＧＭＴは、ワクチンの遺伝子型に渡って同等ではなかったが、前記力価範囲は、１または２希釈以内であり、強固な中和を示した。
【００６８】
実施例８
動物試験
予備動物試験でマウスを使用し得る。例えば、Ａ１２９マウスを入手して、コントロールの構築物であるＥＭＣＶ−ＩＲＥＳアルファウイルス構築物の以前の試験と同様のマウス試験に使用し得る。３〜１０週齢の動物は、約１×１０４  ＰＦＵの選択された構築物、または他の適切な投与量を、左後足の足蹠に皮内感染させ得る。足蹠の測定は、予防接種の４８時間後に、前記ボールで後足の垂直高さとして、キャリパーを用いて行い得る。前記動物を１５〜４５日（または、約３８日）維持し、２１日目と３５日目に出血させ得る。次いで、これらの動物に、約１００  ＰＦＵ、またはアルファウイルス（例えば、天然に存在し、感染症の症状、罹患率、及び死亡についてモニタリングされたＣＨＩＫＶ）の他の適切なチャレンジでチャレンジし得る。これらのチャレンジに対する反応は、ＣＨＩＫＶまたは他の標的アルファウイルスによる感染の減少及び感染に対する防御について観察し得る。
【００６９】
予備的データに基づいて、５つの構築物のいずれかで免疫したマウス（図７または８参照）は、ウイルス感染及びウイルス感染後の条件に対する防御を有するＣＨＩＫ野生型チャレンジに応答するであろう。これらの組み合わされたデータに基づいて、マウスは、ＧＭＴで測定した、図８に見られる表に示される中和力価傾向を生じる。ＥＶ７１  ＩＲＥＳアルファウイルス構築物は、ＥＭＣＶ  ＣＨＩＫ−ＩＲＥＳを含む、試験された他の構築物よりも一貫して大きなプラークを生成する能力に部分的に基づいて、コントロールのＥＭＣＶ  ＣＨＩＫ−ＩＲＥＳよりも優れていないとしても、同様に機能するであろう。図８に示されるすべての試験構築物は、標的アルファウイルスに曝露された場合、前記対象における標的アルファウイルスの感染を減少させるのに適したそのような構築物を受けている対象において、中和力価を生成する可能性が高い。
【００７０】
第１相試験のデザイン
別の例では、遺伝的に改変された生弱毒化チクングニヤワクチンの候補を用いたフェーズＩ、非盲検、プラセボ対照用量漸増初回ヒト単回中心試験が記載されており、１８〜４９歳の４４人の健常な男性及び女性の成人がこの試験で評価される。インフォームドコンセント手続、試験参加についての適格性評価、及びワクチン接種前の血液採取（ベースラインのルーチン検査パラメーターについて、ＨＩＶ／慢性肝炎を排除するため、及びベースラインのチクングニヤ抗体力価について）は、１日目のＣＨＩＫＶワクチン候補の単回投与と共に、ワクチン接種の２８日前までと０日目に行われる。ワクチン接種の７、１４、２８、１８２及び３６４日後に、安全性、忍容性及び免疫原性を評価する。図８及び図９に示された各試験構築物について、上記で議論された予備試験のために、前記構築物の投与後の対象において、すべての構築物がＣＨＩＫに対する中和抗体を産生する可能性が高い。
【００７１】
【表１】
2019509750.tif 000003
【００７２】
実施例９
蚊の感染
蚊由来のＡｅ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓのコロニーを回収し、これらの実験に使用し得る。これらの昆虫は、前記ＬＲ  ＣＨＩＫＶ株（及び他のアルファウイルス）に対して非常に感受性が高いため、この種が選択され得る。羽化３〜４日後に採取した成虫の蚊を、冷蔵テーブル（Ｂｉｏｑｕｉｐ、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ）を用いて麻酔し得て、胸腔内に約１０４のベロＰＦＵ／ｍＬウイルスのストック１．０μＬを注射し得る。前記蚊を、自由摂取で提供された１０％ショ糖と共に、２７℃で７日間インキュベートし得る。前記蚊を、例えば、２％ＦＢＳ及び殺菌剤を含むＭＥＭのような培地において、凍結及び磨砕し得る。１０，０００×Ｇで１０分間遠心分離した後、９６ウェルプレートを用いて、ベロ細胞上に前記上清をプレーティングし得る。前記細胞を３７℃で１時間感染させ、次いで、２％ＦＢＳを含むＭＥＭで覆い、ＣＰＥを測定するために４８時間インキュベートする。次いで、前記構築物による昆虫細胞の感染性を評価するために、標的構築物の存在について、前記細胞を評価する。上記の予備的な証拠に基づいて、図８及び図９に示された試験構築物のいずれも、前記昆虫細胞において有意なレベルの生弱毒化アルファウイルスを産生するが、実証されるように、前記構築物は哺乳動物細胞で増殖し得る。
【００７３】
本明細書に開示され特許請求されている組成物及び方法のすべては、本開示に照らして過度の実験をすることなく、作製及び実行され得る。前記組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、前記組成物及び方法、ならびに本明細書に記載された方法のステップの順序で変形が適用され得ることは、当業者には明らかである。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤と置き換えて、同じまたは類似の結果を達成し得る。当業者に明らかなそのような類似の置換及び修飾はすべて、添付の特許請求の範囲により規定される精神、範囲、及び概念の範囲内であるとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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