(57)【要約】これらに限定されないが、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの動物における肝臓に関する疾患の治療、予防または改善において使用するための方法および組成物が記載される。本発明の化合物は、ガンマ−ケトアルデヒドスカベンジャーである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝疾患を有するかまたはそのリスクがある動物の肝疾患の治療、予防または改善によって肝疾患を抑制または治療するための方法であって、以下の式の化合物：
【化１】
2019526598.tif 000014
（式中：
Ｒは、ＮまたはＣであり；
Ｒ２は、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３およびＲ４で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ３は、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ５は、結合、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ４と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよい）
ならびにその立体異性体および類似体によって表される構造を有する化合物の有効量を該動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、式：
【化２】
2019526598.tif 000015
（式中：
Ｒは、ＮまたはＣであり；
Ｒ２は、独立して、Ｈ、置換または非置換のアルキルであり；
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシル、ニトロであり；
Ｒ４は、Ｈ、置換または非置換のアルキル、カルボキシルである）
およびその医薬的に許容される塩から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、サリチルアミン（２−ヒドロキシベンジルアミンまたは２−ＨＯＢＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、式：
【化３】
2019526598.tif 000016
またはその医薬的に許容される塩から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、式：
【化４】
2019526598.tif 000017
またはその医薬的に許容される塩から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が、式：
【化５】
2019526598.tif 000018
またはその医薬的に許容される塩から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、式：
【化６】
2019526598.tif 000019
またはその医薬的に許容される塩から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が、式：
【化７】
2019526598.tif 000020
またはその医薬的に許容される塩から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
医薬的に許容される担体、および以下の式：
【化８】
2019526598.tif 000021
（式中：
Ｒは、ＮまたはＣであり；
Ｒ２は、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３およびＲ４で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ３は、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ５は、結合、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ４と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよい）
の化合物、ならびにその立体異性体および類似体を含む栄養組成物、および肝疾患を有するかまたはそのリスクがある動物の肝疾患の治療、予防または改善によって肝疾患を抑制または治療するための方法における薬剤としてのその使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、２０１６年９月６日付けで出願された米国特許出願第６２／３８３，８９５号および２０１６年１０月１９日付けで出願された米国特許出願第６２／４１０，１３３号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
１．分野
本発明は、γ−ケトアルデヒド（γ−ＫＡ）を捕捉する化合物、例えば２−ヒドロキシベンジルアミン（２−ＨＯＢＡ）を含む組成物に関し、さらに、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／またはアルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、および／または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの肝臓に関する疾患または状態の治療、予防または改善のためのγ−ＫＡスカベンジャーを投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景
アルコールに起因する慢性肝疾患は、上昇し続ける罹患率と死亡率の主な原因である。ウイルス性肝炎に次いで、慢性的なエタノールの過剰摂取が、肝臓がんおよび硬変症によって引き起こされる全死亡数の２５％の原因となっている。慢性的なアルコール摂取は、肝臓の疾患およびがんと高頻度で併存する。アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）にとっての健康管理の負担は重く、そのコストは米国単独でも年間２７０億ドルに達すると推測される。節制することがＡＬＤの最良の療法であるが、常習性が主要なリスクであり、再発率は年間通じて６７％〜８１％の範囲である。
【０００４】
ＡＬＤは、脂肪肝（脂肪症）、肝炎および硬変症／線維症などの様々な肝臓の兆候を包含し、特定の個体ではこれらの兆候が同時に出現する場合もある。ＡＬＤの範囲は、単純な脂肪症からアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）や硬変症に至るまで様々であり、肥満症によって悪化する。アルコールが肝臓傷害を誘発する多くのメカニズムがあるが、炎症がＡＬＤ進行の基礎となっている。エタノール代謝は、抗酸化物質の枯渇を促進し、アセトアルデヒド、酢酸塩、活性酸素種（ＲＯＳ）、および炎症性応答を誘発する脂質の過酸化物などの有害な物質の形成を引き起こす。加えて、アルコールおよびその代謝産物は、消化管の漏れを促進すること、および免疫細胞を刺激すること（いわゆる適応免疫応答）、および／または補体などの自然免疫経路を活性化することによって炎症を刺激する。自然免疫の構成要素の活性化は、アルコールによる肝臓傷害を開始させるが、肝細胞の損傷を低減する肝保護的な、再生性の、および抗炎症性の応答をも引き起こす。
【０００５】
慢性肝疾患、特にＡＬＤの炎症および病因において、脂質の過酸化および酸化的ストレスがかなりの役割を果たすことが周知である。アルデヒド、例えばマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）および４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）は、正常なタンパク質の機能を妨害する共有結合のタンパク質付加物を形成する。ＭＤＡや４−ＨＮＥより数桁高い反応性を有するものは、非環式γ−ＫＡ（イソレブグランジンまたはイソケタールとしても公知）と称されるアラキドン酸の過酸化生成物であり、これらは炎症の主要な媒介物質である（図１）。γ−ＫＡは、迅速に共有結合によってタンパク質およびＤＮＡに付加し、正常な分子の機能を妨害し、タンパク質−タンパク質架橋（イソケタール）を形成する。γ−ＫＡは、Ｆ２−イソプロスタン（Ｆ２−イソＰ）経路によって生産される。γ−ＫＡは、様々な病態生理学的状態において、フリーラジカルが媒介するアラキドン酸の過酸化によって非酵素的に形成される非典型的なエイコサノイドであるイソプロスタン（イソＰ）およびイソフラン（イソＦ）を介して蓄積することが示されている。イソフランはイソプロスタンと類似しているが、置換テトラヒドロフラン環を含有する。ＡＬＤを有するヒト対象の血清における抗γ−ＫＡの抗体力価が、ＡＬＤを有さない対象に比べて上昇することが実証されている（図２）。
【０００６】
ＡＬＤは、脂肪症、炎症、肝細胞の壊死およびアポトーシスの進行、それに伴う偶発的な線維症および硬変症の発症を特徴とする。また、過剰なアルコール摂取が肝臓への酸化性傷害の原因となることも十分に確立されている。Ｆ２−イソＰは、インビボにおける酸化的ストレスの最も正確な予測変数であることが示されており、アルコール性肝疾患や慢性肝炎である場合、それらのレベルが増加する。ＫＡの過剰生産は、数々の慢性炎症性疾患の病因に関与する。つい最近になって、マウスへのエタノール給餌は、容易にタンパク質と結合して安定な付加物を形成する肝臓のγ−ＫＡ形成を誘発することが示されている。これらのγ−ＫＡ−タンパク質付加物は、炎症促進性応答または付加物特異的な免疫応答を惹起することによるエタノール誘発性の肝臓傷害に寄与する可能性が高い。
【０００７】
炎症過程を阻害すること、およびＡＬＤに関連する免疫原性経路を妨害することを目的とする適切な治療的介入を突き止めることに多大な関心が寄せられている。２−ヒドロキシベンジルアミン（２−ＨＯＢＡ）、すなわちソバの繊維が、γ−ＫＡ−リシル−タンパク質付加物の形成速度より９８０倍速くγ−ＫＡを捕捉するγ−ＫＡの有力なスカベンジャーであることが見出された。このことから、重要なことに、このγ−ＫＡスカベンジャーはシクロオキシゲナーゼ酵素を阻害しないことが示された。酸化剤が媒介する細胞死のモデルにおいて（図３）、２−ＨＯＢＡはほぼ完全にｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔＢＨＰ）により誘発された細胞死を防いだ。加えて、２−ＨＯＢＡは、様々な濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に曝露されたＨｅｐＧ２細胞において酸化剤が媒介する細胞死に対する保護的作用を有することが実証された。
【０００８】
ＡＬＤの深刻な経済的および健康上の影響にもかかわらず、この重度の臨床症状を有する患者の管理における進歩はほとんどなされなかった。節制が治療の土台となるものであるが、ＡＬＤに関する他の治療的介入および治療を突き止めることに多大な関心が寄せられている。現在のＡＬＤ治療の様式としては、コルチコステロイドおよびペントキシフィリンが挙げられる。コルチコステロイドは、アルコール性肝炎の重度の形態における短期間の生存を改善するが、高頻度の使用は禁忌である。ペントキシフィリンは、競合的な非選択的なホスホジエステラーゼ阻害剤であり、重症の急性アルコール性肝炎における短期間の生存を改善し、プレドニゾンと比較して改善されたリスク−ベネフィットプロファイルを実証したが、プレドニゾンと併用しても相加的な利益を付与しなかった。これらの治療はどちらも炎症性応答を弱めるが、基礎となる炎症性シグナルを標的としない。２−ＨＯＢＡによる毒性の酸化脂質のトラップは、炎症を持続させ肝臓の損傷を駆り立てる悪化原因となるタンパク質付加物の形成を少なくするという点で新規である。本発明は、ＡＬＤを予防し、さらにアルコール性肝疾患の蔓延も減弱する２−ＨＯＢＡの使用を包含する。
【０００９】
疫学的なデータから、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、西側諸国において慢性肝疾患の最も普及している形態であることが示されている。ＮＡＦＬＤの範囲は、単純な脂肪症から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）や硬変症に至るまで様々であり、肥満症、脂質異常症およびインスリン耐性の状況において頻繁に起こる。ＮＡＳＨは、患者１０〜１５％において硬変症や肝不全を引き起こす可能性がある。脂肪症をＮＡＳＨから区別するメカニズムは、まだ十分理解されていない。炎症ならびにその結果としての活性酸素種（ＲＯＳ）および反応性脂質種（ＲＬＳ）の生産がＮＡＳＨの病因における重要な要因であることが明らかになりつつある。肝臓において、炎症性および免疫応答における変化は、ＲＯＳおよび炎症促進性サイトカインの生産を激化させ、ＮＡＳＨの悪化を引き起こす。
【００１０】
さらに、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨを有する患者は、一般的な集団と比較してより高い死亡率および病的状態を有する。ＮＡＦＬＤは、高い心臓血管系の死亡率を示し、ＮＡＳＨは、より高い肝臓関連の死亡率を示す。近年の観察から、ＮＡＳＨは、米国で現在のところ３番目に一般的な肝臓移植の適応症であることが結論付けられており、次の１０年の間に最も一般的な肝臓移植の適応症になると予想される。ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤの炎症性の形態であり、過剰な肝臓脂肪、炎症、および肝細胞の風船化を特徴とし、線維症が併存することもあればそうではない場合もある。ＮＡＳＨは、末期の肝疾患、または硬変症への進行が最も懸念される。ＮＡＳＨを支持するメカニズムおよび条件は組織学的に明確ではないが、アルコール性脂肪性肝炎との類似性がある。ＮＡＳＨを含む慢性肝疾患の病因において、脂質の過酸化および酸化的ストレスが重要な役割があることは周知である。活性酸素種（ＲＯＳ）は、脂質過酸化物の形成を促進し、炎症の主要な媒介物質である二機能性の求電子物質（ＢＦＥ）の生成を引き起こす。これらのＢＦＥのなかでも、４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）、アクロレイン、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）およびレブグランジン（ＬＧ）は、脂質、タンパク質およびＤＮＡを共有結合で改変することによって酸化傷害を媒介することがわかっている。ＢＦＥは、極めて反応性が高い化合物であり、これは、共有結合によりタンパク質およびＤＮＡと付加物を形成して、正常な分子機能を妨害し、タンパク質、ホスホエタノールアミンおよびＤＮＡとの架橋を形成する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、肝臓における脂肪の蓄積によって引き起こされる肝臓の炎症および損傷である。ＮＡＳＨはＡＬＤと似ているが、アルコールをほとんど摂取しない人で起こる。米国人の２〜５パーセントがＮＡＳＨに罹患しており、それらはほとんどの場合、中年で過体重であるかまたは肥満の人である。本発明は、ＮＡＳＨを予防および／または治療するための２−ＨＯＢＡの使用を包含する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、毒性の酸化脂質（ケトアルデヒド）を捕捉して、炎症性プログラムを効果的にレギュレートし、炎症に伴う肝臓の傷害を元に戻すための、２−ＨＯＢＡの使用を包含する。
【００１３】
本発明は、γ−ＫＡを標的化して、アルコール性肝疾患における脂質の過酸化とその結果生じるγ−ＫＡ特異的な免疫応答を予防するための、２−ＨＯＢＡの使用を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、どのようにγ−ＫＡがリシンまたは他の第一アミンと反応して可逆的なシッフ塩基付加物を形成するかを描写する図である。
【図２】図２は、アルコール性肝疾患を有するおよび有さない入院ＩＣＵ患者における血清γ−ＫＡ抗体力価を描写するグラフである。
【図３】図３は、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドを増加させた場合のマウス肝細胞における酸化剤が媒介する細胞死に対する２−ＨＯＢＡの保護的作用を描写するグラフである。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、エタノール用量を増加させた場合のＨｅｐａＲＧにおけるＲＯＳ、およびエタノール濃度を増加させた場合の２−ＨＯＢＡの保護的作用を描写する。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、異なるレベルの２−ＨＯＢＡで前処置したＨｅｐａＲＧ細胞の培地におけるＡＬＴおよびＡＳＴレベルを描写する。
【図６】図６は、エタノールが媒介するγ−ＫＡ形成に対する２−ＨＯＢＡの前処置の作用を示す。
【図７】図７は、マウス肺におけるγ−ＫＡによって改変されたヒストン−Ｈ３および−Ｈ４の同定を示す。
【図８】図８は、肝臓および腎臓のイソプロスタン（イソＰ）およびイソフラン（イソＦ）を描写するグラフである。
【図９】図９は、ヒトＮＡＦＬＤ肝臓におけるイソＬＧの形成に関する証拠を描写する。
【図１０】図１０は、ＮＡＳＨにおけるＭＰＯ陽性細胞の増加を描写する。
【図１１−１】図１１Ａ〜図１１Ｅは、ＳＴＡＭマウスにおけるＮＡＦＬＤの発達を描写する。
【図１１−２】図１１Ｆ〜図１１Ｉは、ＳＴＡＭマウスにおけるＮＡＦＬＤの発達を描写する。
【図１２−１】図１２Ａ〜図１２Ｔは、ＳＴＡＭマウスへの２−ＨＯＢＡの作用を記載する。
【図１２−２】図１２Ａ〜図１２Ｔは、ＳＴＡＭマウスへの２−ＨＯＢＡの作用を記載する。
【図１２−３】図１２Ａ〜図１２Ｔは、ＳＴＡＭマウスへの２−ＨＯＢＡの作用を記載する。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｆは、ＳＴＡＭ（商標）マウスにおけるインスリンシグナル伝達および肝臓のインフラマソームを示す。
【図１４−１】図１４Ａ〜図１４Ｇは、ＤＩＡＭＯＮＤ（商標）マウスにおけるＮＡＦＬＤの発達を描写する。
【図１４−２】図１４Ａ〜図１４Ｇは、ＤＩＡＭＯＮＤ（商標）マウスにおけるＮＡＦＬＤの発達を描写する。
【図１５−１】図１５は、ＤＩＡＭＯＮＤ（商標）マウスの試験の結果を要約する。
【図１５−２】図１５は、ＤＩＡＭＯＮＤ（商標）マウスの試験の結果を要約する。
【図１６−１】図１６は、ＤＩＡＭＯＮＤ（商標）マウスの試験の結果を要約する。
【図１６−２】図１６は、ＤＩＡＭＯＮＤ（商標）マウスの試験の結果を要約する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、γ−ＫＡ−タンパク質付加物の形成、ならびに自然および適応免疫応答への差次的な作用を予防することによって肝臓の傷害を低減すると予想される新規の栄養療法を包含する。この栄養療法は、これらに限定されないが、ＮＡＦＬＤ、ＡＬＤおよびＮＡＳＨなどの肝臓に関する状態または疾患の治療、予防または改善に使用することができる。栄養療法は、全体的な肝臓の健康状態を改善し、健康な肝機能を維持するのに使用することができる。
【００１６】
本発明は、二機能性の求電子物質（ＢＦＥ）「スカベンジャー」分子のクラスを使用して肝臓におけるγ−ＫＡ付加物の形成を特異的に予防するための手段を含む。一連のピリドキサミンを包含するフェノール系アミンおよびその水溶性誘導体であるソバの実の天然産物の２−ヒドロキシベンジルアミン（２−ＨＯＢＡ）は、好ましい実施態様を構成する。２−ＨＯＢＡは特に、γ−ＫＡと、リシンとの反応より９８０倍速く反応して、インビトロおよびインビボでのタンパク質および脂質との付加物形成を予防する。
【００１７】
本発明の組成物および方法は、ヒトおよび非ヒト動物を含む動物を対象とする。動物は、健康であってもよいし、または疾患または状態に罹っていてもよい。
【００１８】
投与すること、または投与という用語は、哺乳動物に組成物を提供すること、組成物を摂取すること、およびそれらの組合せを包含する。
【００１９】
本発明は、２−ＨＯＢＡを使用するための組成物および方法を包含し、ここで２−ＨＯＢＡは、サリチルアミン、ＳＡＭ、２−ヒドロキシベンジルアミン、およびペンチルピリドキサミン（ＰＰＭ）とも称される。
【００２０】
本発明の実施態様は、以下の式：
【化１】
2019526598.tif 000002
（式中、
Ｒは、ＮまたはＣであり；
Ｒ２は、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３およびＲ４で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ３は、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ５は、結合、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ４と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよい）
の化合物、ならびにその立体異性体および類似体を包含し、さらに、ＮＡＦＬＤ、ＡＬＤおよびＮＡＳＨなどの肝臓の状態または疾患を有するまたはそのリスクがある対象におけるＮＡＦＬＤ、ＡＬＤおよびＮＡＳＨなどの肝臓の状態または疾患を治療し、予防し、または改善し、それによってそのような肝臓の状態または疾患を抑制または治療するための方法における薬剤としてのその使用を包含する。
【００２１】
別の本発明の実施態様は、以下の式：
【化２】
2019526598.tif 000003
（式中、
Ｒは、ＮまたはＣであり；
Ｒ２は、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３およびＲ４で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ３は、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ５は、結合、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ４と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよい）
の化合物、ならびにその立体異性体および類似体を包含し、さらに、ＮＡＦＬＤ、ＡＬＤおよびＮＡＳＨなどの肝臓の状態を有するまたはそのリスクがある対象におけるそのような肝臓の状態または疾患の治療、予防または改善のための方法におけるその使用を包含する。
【００２２】
ある特定の実施態様において、本化合物は、本明細書で開示された化合物から選択することができる。好ましい実施態様において、本化合物は、サリチルアミンであり得る。
【００２３】
本発明の別の実施態様は、ＮＡＦＬＤ、ＡＬＤおよびＮＡＳＨなどの肝臓の状態または疾患を有するまたはそのリスクがある対象におけるＮＡＦＬＤ、ＡＬＤおよびＮＡＳＨなどの肝臓の状態または疾患を治療し、予防し、または改善し、それによってそのような肝臓の状態を抑制または治療するための方法であって、対象に、哺乳動物における機能異常を治療するのに有効な投薬法および量で、少なくとも１種の化合物を、ＮＡＦＬＤ、ＡＬＤおよびＮＡＳＨなどの肝臓の状態または疾患の治療、予防または改善の公知の副作用を有する薬物と共に投与する工程を含み、この化合物は、以下の式：
【化３】
2019526598.tif 000004
（式中、
Ｒは、ＮまたはＣであり；
Ｒ２は、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３およびＲ４で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ３は、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ５と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよく；
Ｒ５は、結合、Ｈ、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、ＣＦ３、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜１０シクロアルキル、１つまたはそれより多くのＲ４、Ｒ２およびＲ３で任意選択で置換されていてもよいＣ、Ｏ、ＳまたはＮを含有するＣ３〜８員環であり、１つまたはそれより多くのＲ２、Ｒ３、またはＲ４と共に環化されて、Ｃ、Ｏ、ＳまたはＮを含有する任意選択で置換されていてもよいＣ３〜８員環を形成してもよい）
の化合物、ならびにその立体異性体および類似体によって代表される構造を有する。
【００２４】
本明細書で開示された方法と共に使用することができる化合物の例としては、これらに限定されないが、式：
【化４】
2019526598.tif 000005
（式中、
Ｒは、ＮまたはＣであり；
Ｒ２は、独立して、Ｈ、置換または非置換のアルキルであり；
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシル、ニトロであり；
Ｒ４は、Ｈ、置換または非置換のアルキル、カルボキシルである）
から選択される化合物およびその医薬的に許容される塩が挙げられる。
【００２５】
好ましい実施態様において、本化合物は、サリチルアミン（２−ヒドロキシベンジルアミンまたは２−ＨＯＢＡ）である。
【００２６】
本化合物は、下記またはそれらの医薬的に許容される塩から選ぶことができる。
【化５】
2019526598.tif 000006
【００２７】
本化合物はまた、下記またはその医薬的に許容される塩からも選ぶことができる。
【化６】
2019526598.tif 000007
【００２８】
本化合物または類似体はまた、下記またはその医薬的に許容される塩からも選ぶことができる。
【化７】
2019526598.tif 000008
【００２９】
本化合物はまた、下記またはその医薬的に許容される塩からも選ぶことができる。
【化８】
2019526598.tif 000009
【００３０】
本化合物はまた、下記またはその医薬的に許容される塩からも選ぶことができる。
【化９】
2019526598.tif 000010
【００３１】
本発明の化合物は、あらゆる方法によって投与することができ、このような方法は当業者周知であり、そのようなものとしては、これらに限定されないが、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、膣内投与、眼への投与、耳内投与、大脳内投与、直腸内投与、ならびに非経口投与、例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与および皮下投与などの注射による投与などが挙げられる。本化合物は、すでに罹っている疾患または状態を治療するために治療的に投与してもよいし、または疾患または状態の予防のために予防的に投与してもよい。
【００３２】
本組成物を含むあらゆる好適な医薬用媒体が本発明の範囲内で利用できるが、好ましくは、本組成物は、好適な製剤用担体、例えばデキストロースまたはスクロースと組み合わされる。
【００３３】
本組成物が投与される頻度を計算方法は、当業界において周知であり、あらゆる好適な投与頻度（例えば、１回の６ｇ用量／日または２回の３ｇ用量／日）があらゆる好適な期間にわたり本発明の範囲内で使用することができる（例えば、単回用量を５分間または１時間にわたり投与してもよいし、または代替として、複数回用量を長期間にわたり投与してもよい）。本発明の組成物は、長期間にわたり、例えば数週間、数か月または数年にわたり投与してもよい。本組成物は、１日または２４時間で投与される組成物の総量を含む１日分の一食分（serving）が作製されるように、１日当たり１回分の用量を含む個別の一食分で、または１回分より多くの用量を含む個別の一食分（複数の個別の一食分）で投与することができる。
【００３４】
本発明の組成物のあらゆる好適な用量が本発明の範囲内で使用することができる。適した用量を計算する方法は当業界において周知である。
【００３５】
「治療」または「治療すること」は、疾患、病的状態、または障害の治癒、改善、安定化、または予防を意図した患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的治療、すなわち具体的に疾患、病的状態、または障害の改善を目的とした治療を包含し、さらに、原因治療、すなわち関連する疾患、病的状態、または障害の原因を取り除くことを目的とした治療も包含する。加えて、この用語は、緩和治療、すなわち疾患、病的状態、または障害の治癒というよりも症状が緩和されるように設計された治療；予防的治療、すなわち関連する疾患、病的状態、または障害の発生を最小化すること、または部分的もしくは完全に抑制することを目的とした治療；および支持療法、すなわち関連する疾患、病的状態、または障害の改善を目的とする別の具体的な療法を補うために用いられる治療を包含する。
【実施例】
【００３６】
実施例１
完全に分化した２１日目のＨｅｐａＲＧ肝細胞（バイオ−プレディクトインターナショナル（Bio-Predict International））は、容易に蛍光性のＭＲＰ２基質であるＣＤＦＤＡを代謝する多数の毛細胆管を含有する肝細胞の群体を包囲する透明な上皮細胞を提示する。ＨｅｐａＲＧ細胞は、ヒト肝臓の吸収、分布、代謝、および排出に高い忠実度を有する固有の十分に確立されたヒト肝細胞培養系である。２−ＨＯＢＡの作用の公知のメカニズムと一致して、ＨｅｐａＲＧ細胞を２−ＨＯＢＡ（０、２５０、５００および１０００μＭ）で２４時間前処置し、それに続いて濃度を増加させたエタノール（０〜２００ｍＭ；２４時間）で前処置したが、活性酸素種の形成に影響はなかった（図４Ａ）。しかしながら、２−ＨＯＢＡは、エタノールによる細胞死をほぼ完全に防いだ（図４Ｂ）。同様に、ＨｅｐａＲＧ細胞を２−ＨＯＢＡ（０、２５０、５００および１０００μＭ）で２４時間前処置し、それに続いて濃度を増加させたエタノール（０〜２００ｍＭ；２４時間）で前処置したところ、ＨｅｐａＲＧ肝細胞から採取した培養培地中のＡＬＴ（図５Ａ）およびＡＳＴ（図５Ｂ）レベルがほぼ標準化された。現在、γ−ＫＡ改変を受けやすいタンパク質の同一性に関する知見はほとんどない。本発明者らは、先に２−ＨＯＢＡの前処置（０、２５０または５００μＭ、２４時間）を行ってまたは行わないでエタノールに曝露されたＨｅｐａＲＧ肝細胞培養物を使用して、内因的に付加物を形成するタンパク質の同一性を調査した。細胞を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって総タンパク質を分析し、次いでよく特徴付けられた単鎖抗体である、γ−ＫＡ異性体によって改変されたペプチドおよびタンパク質を認識するＤ１１ＳＣＦｖで探索した（図６）。γ−ＫＡ改変を受けやすいタンパク質の「プール」があるという理論と一致して、全ての治療において類似のレベルの「バックグラウンド」抗Ｄ１１交差反応性が示された。しかしながら、エタノールで処置されたが２−ＨＯＢＡで保護されていない肝細胞において、約１８ｋＤにおける単一のバンド（矢印）の交差反応性のロバストな増加がみられた。対照的に、このバンドの強度は、２−ＨＯＢＡの前処置（２５０または５００μＭの２−ＨＯＢＡ）によって、未処置対照で観察されたレベルに回復した。興味深いことに、このバンドは、近年肺線維症のマウスモデルにおいてγ−ＫＡとの付加物および抗Ｄ１１抗体として同定されたものと同じ分子量を有する（図７）。これらのデータは、ＥＴＯＨは、γ−ＫＡと付加物を形成するタンパク質の形成を促進し、この形成は２−ＨＯＢＡでブロックできることを意味する。
【００３７】
総合すると、これらの発見から、γ−ＫＡが、脂質の過酸化によって引き起こされる肝臓傷害の主要な媒介物質であること、および２−ＨＯＢＡの使用が、このような酸化剤またはエタノールへの曝露により誘発される細胞死から保護することが実証される。γ−ＫＡの標的化は、アルコール性肝疾患における脂質の過酸化とその結果生じるγ−ＫＡ特異的な免疫応答を予防するための方法として使用することができる。
【００３８】
実施例２
Ｃ５７／ＢＬ６Ｊマウスに２−ＨＯＢＡおよびエタノールを同時に投与して、エタノールが媒介する肝臓機能異常（ＡＳＴおよびＡＬＴの増加）を和らげること、γ−ＫＡ形成を低減すること、免疫応答を有利に変更すること、および有益な細胞内シグナル伝達経路を刺激することにおける２−ＨＯＢＡの効能を確立した。結果から、２−ＨＯＢＡ（１．０ｍｇ／ｍｌ）での前処置が、エタノールに曝露されると活性化される肝臓の傷害（γ−ＫＡおよび肝機能酵素の上昇）を有意に低減することが示される。
【００３９】
１４日間のエタノール処置の前に２−ＨＯＢＡ（０．５ｇ／Ｌ、Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉの液状食物、ＬＤＬＤ中）をマウスに投与して、肝臓の傷害を和らげることにおける２−ＨＯＢＡの効能を検査した。ＮＩＡＡＡモデル（ＬＤＬＤ＋耽溺での１０日間のエタノール）を使用してエタノール（５％ｖ／ｖ）を投与した。食物摂取および体重は、ＬＤＬＤへの０．５ｇ／Ｌの２−ＨＯＢＡの添加による有意な影響を受けなかった（データ示さず）。エタノールを用いた場合、マルトデキストリン供給と比べて、白血球およびリンパ球の数は低減したが、好酸球および好塩基球の数は増加した（表１）。これは、アルコール性肝臓傷害の他の報告と一致していた。これらの研究において、このような応答は、２−ＨＯＢＡの存在下で観察されなかった。０．５ｇ／Ｌでの２−ＨＯＢＡは、血清ＡＳＴまたはＡＬＴの増加を減じられなかった（表２）。
【化１０】
2019526598.tif 000011
【化１１】
2019526598.tif 000012
【００４０】
ＮＩＡＡＡモデルを使用したエタノールの投与の前に、マウスの追加のコホートに２−ＨＯＢＡ（１．０ｇ／Ｌ）による１４日の前処置を施した。エタノールが投与されたマウスの食物摂取はより少なく、その結果として、研究終了時に、体重がマルトデキストリンが供給された対照より約２．５ｇ少なかった。
【００４１】
【化１２】
2019526598.tif 000013
【００４２】
肝臓のトリグリセリド含量は、２−ＨＯＢＡ（１．０ｇ／Ｌ）で前処置されたＥＴＯＨ刺激マウスにおいてより低いという傾向であった。血清ＡＬＴの変化で示される肝臓の傷害は、対照＋ＥＴＯＨマウス（２５３．０±６２．９Ｕ／Ｌ）に比べて２−ＨＯＢＡの前処置（１６４．４±２０．８Ｕ／Ｌ）でより低い傾向であったが、これらは統計的有意性には至らなかった。ＡＳＴは、対照（９０６．１±１８６．１Ｕ／Ｌ）と比較して２−ＨＯＢＡ＋ＥＴＯＨ（６７６．６±８６．７Ｕ／Ｌ）で前処置したマウスにおいてより低かったが、これらは統計的有意性には至らなかった。これらの変化は、図８で示されるように、肝臓のイソプロスタン（イソＰ）およびイソフラン（イソＦ）における有意な低減を伴っており、腎臓のイソプロスタンレベルにおける有意な低減ももたらした（対照＋ＥＴＯＨにおける２．０±０．３ｎｇ／ｇに対して１．３±０．１ｎｇ／ｇ；Ｐ＜０．０５）。
【００４３】
ＮＩＡＡＡモデルにおける１．０ｇ／Ｌの２−ＨＯＢＡによる１４日間の前処置は、肝臓の傷害を低減し、ＥＴＯＨ曝露で観察された肝臓のイソプロスタンおよびイソフラン含量における有意な増加を緩和し、加えて腎臓のイソプロスタン形成を減少させた。
【００４４】
実施例３−ＮＡＳＨ
Ｆ２−イソプロスタン（Ｆ２−イソＰ）は、インビボでフリーラジカルにより開始されるアラキドン酸の過酸化を含む非酵素的なメカニズムを介して形成されるプロスタグランジン様化合物であり、インビボにおける酸化的ストレスの最も正確な予測変数であることが示されている。血漿または尿のＦ２−イソＰのレベル上昇は、アルコール性肝疾患患者において、さらにはＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨを有する動物において報告されており、さらに肝臓のＦ２−イソＰの増加も、ＮＡＳＨを有するヒトおよび動物で報告されている。Ｆ２−イソＰ値はまた、慢性肝炎でも増加する。予備的なデータから示されるように、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨであることが証明されたマウスおよびヒト肝臓組織から得られた肝臓は、対照と比べてイソＬＧタンパク質付加物レベルの劇的な増加を示す（図９）。これらの観察と同時に、生検で証明されたＮＡＳＨの特徴である試料中のミエロペルオキシダーゼ陽性好中球の染色が増加したことから（図１０）、炎症の増強が示唆される。数々の薬剤が、炎症過程の増強に関連するようである。
【００４５】
ＮＡＳＨ患者の血漿中における血漿リポ多糖（ＬＰＳ）および遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の増加は、肝臓のＴＬＲ４−Ｍｙｄ８８とは独立したシグナル伝達の増加に関連することが実証された。また、培養されたＨｅｐａＲＧ細胞において、パルミチン酸塩およびＬＰＳが、化学的な、または短鎖干渉ＲＮＡが媒介するＴＬＲ４阻害をブロックできるＮＦ−ｋＢ活性を誘発することも実証された。Ｌｉａｎｇらは、近年、代替の代謝リガンド（コレステロールおよび炭水化物）も、インフラマソーム媒介メカニズムを介した、脂肪症、肝細胞の肥大、および混成型（好中球および単核細胞）の炎症の増強を開始させる可能性があることを実証した。
【００４６】
インフラマソームは、ＰＡＭＰ（病原体関連分子パターン）またはＤＡＭＰ（損傷関連分子パターン）の結合時に、直接的にかまたはアダプター分子ＡＳＣを介するかのいずれかで、カスパーゼ１を活性化する自然免疫系の多量体タンパク質複合体である。カスパーゼ１は順に下流のシグナル伝達経路を活性化し、その結果生じた生物学的機能の変化は、細胞型および開始のリガンドに応じてきわめて多様である。インフラマソームは、（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）ファミリー（ＮＬＲＰ１−３、ＮＬＲＰ６−７、ＮＬＲＰ１２、ＮＬＲＣ４）、ＮＡＩＰおよびＡｉｍ２のメンバーによって活性化される。ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は、カスパーゼ−１による、不活性なプロＩＬ−１β、プロＩＬ−１８およびプロＩＬ−３３のそれらの活性型への切断を引き起こす。公知のＮＬＲＰ３−インフラマソーム活性化剤としては、なかでも特に、脂肪酸、コレステロール、およびタンパク質凝集体が挙げられる。すでに述べられているＮＡＳＨインフラマソームの分子トリガーとしては、ＤＮＡ、飽和脂肪酸およびＬＰＳ、ＮＬＲＰ−１が挙げられる。これは、イソＬＧは、まだ十分に詳述されていないメカニズムを介した追加の有力なインフラマソーム活性化剤でもあることを示唆する。実際に、イソＬＧリガンドによる欠陥のあるＮＬＲＰ１およびＮＬＲＰ３シグナル伝達／活性化は、変更された肝臓の免疫代謝、宿主消化管のマイクロバイオーム適合、およびＮＡＦＬからＮＡＳＨへの推移の特徴である欠陥のあるＮＬＲＰ−インフラマソームの感知の基礎となる可能性がある。
【００４７】
２−ヒドロキシベンジルアミン（２−ＨＯＢＡ）は、リシンより９８０倍高いγＫＡとの反応性を有し、重要なことに、シクロオキシゲナーゼ酵素を阻害しない。酸化剤が媒介する細胞死のモデルにおいて、２−ＨＯＢＡはほぼ完全にｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔＢＨＰ）により誘発された肝細胞死を防いだ。これは、酸化傷害の病因が極めて複雑であり多面的であるという事実を考慮すれば驚くべき発見である。加えて、２−ＨＯＢＡは、様々な濃度のＨ２Ｏ２に曝露されたＨｅｐＧ２細胞において酸化剤が媒介する細胞死に対する保護的作用を有することが実証された。総合すると、これらの発見から、γＫＡが、脂質の過酸化によって引き起こされる肝臓の傷害の主要な媒介物質である可能性があること、さらに、２−ＨＯＢＡの使用により、肝臓においてこのような酸化剤により誘発された細胞死からの保護がもたらされる可能性があることを示唆される。明らかに、２−ＨＯＢＡの効能は、標的組織におけるその蓄積に依存しており、これは近年、インビボのマウスモデルにおける薬物動態研究によって裏付けられた。７日間にわたる１、３、および１０ｇ／Ｌの２−ＨＯＢＡの投与は、血漿および肝臓の２−ＨＯＢＡレベルの用量依存性の増加と関連していた。肝臓におけるレベルは血漿中より約１０倍高った。
【００４８】
ＮＡＳＨ、硬変症およびＨＣＣの病因の研究で使用された１つのモデルは、ＳＴＡＭモデル（ステリック社（Stelic Inc.）、日本東京）である。ＳＴＡＭモデルは、組織学および生理学の両方においてヒトＮＡＳＨに強力な忠実度を有することから（高い空腹時血糖、肝臓の生化学的特徴、肝臓内の脂質、脂質異常症；図１１）、これまでＮＡＦＬＤの遺伝学的なノックアウトまたは食事モデルにおいて達成が困難であった特徴を発展させる。本発明者らは、２−ＨＯＢＡは、ＳＴＡＭマウスにおいてＮＡＦＬＤの重症度を低減できることを実証した（図１２）。
【００４９】
ＳＴＡＭ（商標）モデルにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、生後の２日目に２００μｇのストレプトゾトシン（ＳＴＸ）溶液を単回で皮下注射し、４週齢で高脂肪食の供給を始めることによってＮＡＳＨを誘発する。３週齢で、ＳＴＺ注射を受けた１２匹のマウスを、２つのグループ：１）２−ＨＯＢＡ（ｎ＝６）、および２）ビヒクル対照（ｎ＝６）に分割した。２−ＨＯＢＡグループのマウスは、飲用水中の２−ＨＯＢＡ（水１Ｌ中１ｇ）が与えられ、一方でビヒクル対照グループは、２−ＨＯＢＡ非含有の普通の水が与えられた。４週齢で、全てのマウスを高脂肪食物を自由に摂取できる状況に置いた。全てのマウスにおいて高脂肪食物を続け、研究プロトコールの間中、それらのグループ割り当てに基づき２−ＨＯＢＡを補充した水または普通の水を与えた。体重および食物／水の摂取を毎週モニターした。９週齢で動物を致死させ（６週間の２−ＨＯＢＡまたはビヒクル処置）、分析のために組織および血清を収集した。
【００５０】
肝臓の切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（脂肪症、肝細胞の風船化、および炎症のスコア付けのため）、シリウスレッド（線維症の評価のため）で染色し、さらにＦ４／８０＋マクロファージに関して染色した。スコア付けを、脂肪症、風船化、炎症、および壊死に関して盲検方式で、以下の基準：脂肪症（０〜４）：０＝＜５％；１＝５〜２５％；２＝２５〜５０％；３＝５０〜７５％；４＝７５〜１００％を使用して実行した。風船化（０〜３）：０＝なし；１＝軽度（３個未満の肝細胞を含む病巣）；２＝中程度（３個より多くの肝細胞を含む病巣または多病巣性）；３＝やや重度（３個またはそれより多くの肝細胞の３個より多くの病巣を有する多病巣性）。炎症（０〜４）：０＝なし；１＝最小（２０個の領域当たり０から１個の病巣）；２＝軽度（２個の病巣）；３＝中程度（３個の病巣）；４＝重度（４個またはそれより多くの病巣）。グルコース、インスリン、アラニントランスアミナーゼ、アスパルテートトランスアミナーゼ、トリグリセリド、コレステロール、およびＦ２−イソプロスタンの血清レベルを測定した。以下の炎症性マーカー：ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦαの血清および組織レベルを、多重アッセイ（ルミネックス（Luminex）、ミリポア（Millipore）、マサチューセッツ州ビレリカ）によって測定した。肝臓の２−ＨＯＢＡ、Ｆ２−イソプロスタン、およびイソフランレベルを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法によって決定した。肝臓のｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ｑＰＣＲによって、以下の遺伝子：Ｇｃｋ、Ｐｃｋ１、Ｐｄｋ４、Ｉｒｓ１、Ｉｒｓ２、Ｐｇｃ１ａ、Ｃｐｔ１ａ、Ｇｙｋ、Ｓｒｅｐｂ１ｃ、Ａｃｃ１、Ｆｘｒ、Ｃｏｘ１、Ｃｏｘ２、Ｎｏｘ４、カタラーゼ、Ｇｐｘ１、Ｇｐ４１ｐｈｘ、およびｐ２２ｐｈｏｘに関して評価した。肝臓のタンパク質含量およびリン酸化の状態を、Ａｋｔ、ＧＳＫ３β、ｍＴＯＲ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ＦＯＸＯ１、およびＮＡＬＰに関して決定した。独立したサンプルの両側ｔ検定を使用して、２−ＨＯＢＡで処置されたグループとビヒクルで処置されたグループとで評価項目を比較した。有意性をα＝０．０５に設定した。
【００５１】
生存率、臨床徴候および挙動を毎日モニターした。平均の体重および食物摂取はグループ間で類似していたが、肝臓の重量、および肝臓と体重との比率は有意に低減された（図１２）。血清グルコースレベルはグループ間で類似していたが、インスリン、ＡＬＴおよび脂質は全て低減する傾向を示した。重要なことに、血清イソプロスタン（ＢＦＥ形成およびイソＬＧ付加物形成のマーカー）および組織学的なＮＡＳＨの重症度は、２−ＨＯＢＡ処置により有意に低減された。
【００５２】
図１３に記載される肝機能および表現型の改善のための基準をよりよく理解するために、ＳＴＡＭマウスからの肝臓を免疫ブロット分析に供した。２−ＨＯＢＡ処置は、ｍＴＯＲ、ＥＲＫまたはＦＯＸＯ１を介したシグナル伝達を有意に変更することなく、ＡＫＴおよびＧＳＫ３βのリン酸化を劇的に増加させた。加えて、このデータから、ミトコンドリアの燃料代謝のレギュレーションにおける主要なタンパク質であるピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ４（ｐｄｋ４）の発現が有意に減少したことが示され、これは、２−ＨＯＢＡ処置による、肝臓の重量における低減、ＮＡＳＨの重症度における改善、および血清イソプロスタンにおける低減は、ミトコンドリアの機能に影響を及ぼすγＫＡ媒介メカニズムによって媒介される可能性があることを示唆している。さらに、このデータから、２ＨＯＢＡ処置によるＮＡＬＰ１の減少が示される。近年、ミトコンドリアの機能のレギュレートにおけるＮＲＬＰ３−インフラマソームの役割が説明された。
【００５３】
ＳＴＡＭモデルにおけるこれらのデータは、イソＬＧ−タンパク質付加物が肝臓への傷害の原因であること、さらに、２−ＨＯＢＡがＮＡＳＨの重症度を強く低減し、肝臓のインスリン感受性のマーカーを回復させていることを意味する。重要なことに、このデータから、このモデルにおけるＮＬＲＰ１−インフラマソームの活性化は、２−ＨＯＢＡの経口投与でブロックされることが示され、これは、イソＬＧ媒介インフラマソームＮＡＳＨ応答のブロックにおいて２−ＨＯＢＡが役割を有することを示唆する。
【００５４】
実施例４
ＤＩＡＭＯＮＤ（非アルコール性脂肪性肝疾患の食物によって誘発された動物モデル）は、特許化された同系マウス株であって、高脂肪の糖分が多い食物に応答して、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、線維症、および肝細胞癌を逐次的に発症させる。ＤＩＡＭＯＮＤマウスにおける疾患の進行は、組織病理学的特徴も含めてヒトの疾患の進行と極めて類似している。ＤＩＡＭＯＮＤマウスモデルは、肝臓の病的状態を誘発する遺伝子のノックアウトまたは毒素によるのではなく単に西洋的な食物（高脂肪、砂糖水）の結果としてＮＡＳＨを発症させるＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの唯一のマウスモデルであるという点で独特である（図１４）。
【００５５】
１２匹の８週齢の雄ＤＩＡＭＯＮＤマウスを、高脂肪食物（Ｈａｒｌａｎ−ＥＮＶＩＧＯＴＤ．８８３１７）およびグルコース（１８．９％ｗ／ｖ）およびフルクトース（２３．１％ｗ／ｖ）を含有する水を自由に摂取できる状況に置いた。研究プロトコールの間中、全てのマウスがこの食物を続けた。１２週齢で、マウスを、２つのグループ：１）２−ＨＯＢＡ（ｎ＝６）、および２）ビヒクル対照（ｎ＝６）に分割した。２−ＨＯＢＡグループの動物は、飲用水中の２−ＨＯＢＡ（グルコースおよびフルクトースを含む水１Ｌ中１ｇ）が与えられた。ビヒクル対照グループは、２−ＨＯＢＡ非含有の水（グルコースおよびフルクトースを含む）が与えられた。体重および食物摂取を毎週測定した。約２３週齢で、肝臓の脂肪を評価するために、全ての動物がグルコース負荷試験（ＧＴＴ）およびＭＲＩイメージングを受けた。ＧＴＴのために、動物を１２時間絶食させ、次いでグルコース（滅菌水中１００ｍｇ／ｍＬグルコースを２ｇ／ｋｇ体重で）を経口胃管栄養法によって投与した。グルコース投与の０、１５、３０、４５、６０、９０、および１２０分後に血液をサンプリングし、濃度曲線下面積を計算した。２４週齢で動物を致死させた（１２週間の２−ＨＯＢＡまたはビヒクル処置）。分析のために、組織および血清を収集した。
【００５６】
肝臓の切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（脂肪症、肝細胞の風船化、および炎症のスコア付けのため）およびシリウスレッド（線維症の評価のため）で染色した。スコア付けを、脂肪症、風船化、炎症、および壊死に関して盲検方式で、以下の基準：脂肪症（０〜４）：０＝＜５％；１＝５〜２５％；２＝２５〜５０％；３＝５０〜７５％；４＝７５〜１００％を使用して実行した。風船化（０〜３）：０＝なし；１＝軽度（３個未満の肝細胞を含む病巣）；２＝中程度（３個より多くの肝細胞を含む病巣または多病巣性）；３＝やや重度（３個またはそれより多くの肝細胞の３個より多くの病巣を有する多病巣性）。炎症（０〜４）：０＝なし；１＝最小（２０個の領域当たり０から１個の病巣）；２＝軽度（２個の病巣）；３＝中程度（３個の病巣）；４＝重度（４個またはそれより多くの病巣）。グルコース、アラニントランスアミナーゼ、およびアスパルテートトランスアミナーゼの血清レベルを測定した。肝臓のｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ｑＰＣＲによって、以下の遺伝子：Ｔｎｆａ、Ｎｌｒｐ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ１８、Ｔｉｍｐ１、Ｃｏｌ１ａ１、ＰｒｏＣａｒｄ、Ｎｌｒｐ３、Ｃａｓｐ１、ＰｒｏＩｌ１ｂ、Ｔｇｆｂ１、Ｂａｍｂｉ、Ｐｄｋ４、およびＧａｐｄｈに関して評価した。独立したサンプルの両側ｔ検定を使用して、２−ＨＯＢＡで処置されたグループとビヒクルで処置されたグループとで評価項目を比較した。有意性をα＝０．０５に設定した。
【００５７】
図１５〜１６に、ＤＩＡＭＯＮＤマウスの試験の結果を要約する。これらのデータから、２ＨＯＢＡ補充の場合、肝臓の重量が低減し、それに伴い肝臓の酵素であるＡＬＴおよびＡＳＴが有意に低減する傾向が実証される。これらの発見は、ＮＡＳＨの発症を予防するかまたはその重症度を弱める２−ＨＯＢＡの効能を裏付ける。
【００５８】
文献リスト
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４−１】
2019526598.tif 000038
【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【国際調査報告】
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