(57)【要約】  二官能性ポリマーは、一方の末端が、対象の生体分子をコンジュゲートするアズラクトン末端基で官能化されており、他方の末端が、ポリマーを基材に結合させるアジドアンカー基で官能化されている。また、二官能性ポリマーの製造方法も提供される。被覆基材は、基材の表面上に二官能化ポリマーを含む。また、被覆基材の製造方法も提供される。マイクロアレイは、複数の個別領域を含み、各個別領域は、被覆基材を含む。
2019527246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二官能性ポリマーであって、
（ａ）アジド、カルボン酸、チオール、アミン、ヒドロキシル、ヒドラジン、シリル、ホスホネート、アルキン、カテコール、およびリジンからなる群から選択されるアンカー基；
（ｂ）ポリエチレングリコールまたは多糖を含む１つ以上の第１のポリマーを含む、ポリマーブロック；
（ｃ）フェニル、ビニル、ベンジル、およびアルキルからなる群から選択されるリンカー基；および
（ｄ）Ｒ１およびＲ２を有し、ここで、Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、水素、アルキル、およびアリールからなる群から選択されるアズラクトン末端基
を含む、前記二官能性ポリマー。
【請求項２】
前記１つ以上の第１のポリマーは、ポリリジン、ポリオキサゾリン、ポリメチルメタクリレート、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリドーパミン、ポリアルカン、およびＮ−置換グリシンポリマーからなる群から選択される第２のポリマーとのコポリマーである、請求項１記載の二官能性ポリマー。
【請求項３】
被覆基材であって、
（ａ）基材；および
（ｂ）１つ以上の第１のポリマーと、前記１つ以上の第１のポリマーのそれぞれの第１の末端に結合された１つ以上のアズラクトン官能基と、前記１つ以上の第１のポリマーのそれぞれの第２の末端に結合された１つ以上のアジド基とを含む、ポリマー層、ここで、前記１つ以上のアジド基は、前記ポリマー層を前記基材に結合させる
を含む、前記被覆基材。
【請求項４】
前記基材は、ガラス、シリカ、プラスチック、炭素、金属、および金属酸化物からなる群から選択される、請求項３記載の被覆基材。
【請求項５】
前記ポリマー層は、線状ポリマー、マルチアームポリマー、ブラシポリマー、またはナノ粒子を含む、請求項３記載の被覆基材。
【請求項６】
前記１つ以上の第１のポリマーは、ポリエチレングリコールまたは多糖を含む、請求項３記載の被覆基材。
【請求項７】
前記１つ以上の第１のポリマーは、ポリリジン、ポリオキサゾリン、ポリメチルメタクリレート、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリドーパミン、ポリアルカン、およびＮ−置換グリシンポリマーからなる群から選択される第２のポリマーとのコポリマーである、請求項６記載の被覆基材。
【請求項８】
複数の個別領域を含み、前記個別領域がそれぞれ被覆基材を有するマイクロアレイであって、前記被覆基材は、
（ａ）基材；および
（ｂ）１つ以上のポリマーと、前記１つ以上のポリマーのそれぞれの第１の末端に結合された１つ以上のアズラクトン官能基と、前記１つ以上のポリマーのそれぞれの第２の末端に結合された１つ以上のアジド基とを含むポリマー層、ここで、前記１つ以上のアジド基は、前記ポリマー層を前記基材に結合させる
を含む、前記マイクロアレイ。
【請求項９】
二官能性ポリマーの製造方法であって、
（ａ）ポリマーを準備すること、ここで、前記ポリマーは、前記ポリマーの第１の末端に結合された１つ以上のカルボン酸基または活性化エステル基と、前記ポリマーの第２の末端に結合された１つ以上のアジド基とを有する；
（ｂ）少なくとも１つのカルボン酸基または活性化エステル基を、ハロゲン化アリール基またはハロゲン化ビニル基に変換すること；および
（ｃ）ビニルジアルキルアズラクトンを、前記ハロゲン化アリール基またはハロゲン化ビニル基に結合すること
を含む、二官能性ポリマーの製造方法。
【請求項１０】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコールである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ビニルジアルキルアズラクトンを、パラジウム触媒、１種以上の溶媒、および塩基を用いてカップリング反応によって結合させる、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記パラジウム触媒は、パラジウム（ＩＩ）キノリン−８−カルボキシレート、パラジウム（ＩＩ）クロリド、パラジウム（ＩＩ）ブロミド、パラジウム（ＩＩ）アセテート、パラジウム（ＩＩ）アセトアセテート、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、パラジウム（ＩＩ）トリフルオロアセテート、アリルパラジウム（ＩＩ）クロリドダイマー、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド、ジクロロビス（トリシクロヘキシルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）、および［１，１’−ビス（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記１種以上の溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、アセトニトリル、およびアルコールからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記塩基は、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、およびナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシドからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
二官能性ポリマーを基材に結合させる方法であって、
（ａ）アルキン官能基を含む基材を準備すること；
（ｂ）前記二官能性ポリマー、１種以上の溶媒、触媒、塩基、および還元剤を含む混合物を準備すること；および
（ｃ）前記基材を前記混合物と接触させること
を含み、
ここで、前記二官能性ポリマーは、ポリマー、前記ポリマーの第１の末端に結合された１つ以上のアズラクトン官能基、および前記ポリマーの第２の末端に結合された１つ以上のアジド基を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記ポリマーは、ポリエチレングリコールである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記１種以上の溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、および水からなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記触媒は、銅（ＩＩ）塩または銅（Ｉ）塩を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記触媒は、硫酸銅、臭化銅、およびヨウ化銅からなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記触媒は、ルテニウム触媒を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記触媒は、ペンタメチルシクロペンタジエニルビス（トリフェニルホスフィン）ルテニウム（ＩＩ）クロリド、ペンタメチルシクロペンタジエニル（シクロオクタジエニル）ルテニウム（ＩＩ）クロリド、およびペンタメチルシクロペンタジエニル（ノルボルナジエン）ルテニウム（ＩＩ）クロリドからなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記塩基は、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、キノロン、フェナントロリン、およびイミダゾールからなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
前記還元剤は、アスコルビン酸ナトリウム、トリス（トリアゾール）アミン、およびヒドロキノン類からなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
対象の生体分子を単離する方法であって、
（ａ）基材と、１つ以上のポリマーと、前記１つ以上のポリマーのそれぞれの第１の末端に結合された１つ以上のアズラクトン基と、前記１つ以上のポリマーのそれぞれの第２の末端に結合された１つ以上のアジド基とを含む官能化基材を準備すること、ここで、前記１つ以上のアジド基は、前記１つ以上のポリマーのそれぞれを前記基材に結合させる；
（ｂ）水溶液を準備すること、ここで、前記水溶液は、前記対象の生体分子を含有する；ならびに
（ｃ）前記官能化基材を前記水溶液と期間にわたって接触させ、ここで、前記期間の間に、前記対象の生体分子を前記アズラクトン基に結合させること
を含む、前記方法。
【請求項２５】
前記水溶液は、さらに添加剤を含み、前記添加剤は、グリセロール、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、界面活性剤、ポリビニルアルコール、糖、有機溶媒、および無機塩からなる群から選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記水溶液のｐＨレベルは、約２〜約１０の範囲にある、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記官能化基材と前記水溶液との前記接触は、ジェット印刷、ピン印刷、クイル印刷、バイオロジカルレーザー印刷、キャピラリーに基づくフルイディクス、または浸漬によって達成される、請求項２４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の態様は、二官能性ポリマーおよび該二官能性ポリマーの製造方法に関し、ここで、該二官能性ポリマーは、一方の末端が、対象の生体分子をコンジュゲートするアズラクトン基で官能化されており、他方の末端が、該ポリマーを基材に結合させるアジドアンカー基で官能化されているため、アズラクトン官能性は、アジド基が反応性である条件下でそのままである。本発明の態様はまた、基材の表面上にこのような二官能化ポリマーを含む被覆基材、および該被覆基材の製造方法に関する。本発明の態様はまた、複数の個別スポットを含むマイクロアレイに関し、各スポットは、該マイクロアレイの表面上に該被覆基材を含む。
【０００２】
背景
タンパク質および抗体マイクロアレイなどの測定アッセイまたはプラットフォームでは、標的分子の高い忠実度（例えば、感度および特異性）を達成することは、非常に重要である。アッセイにおけるサンプルは、核酸、タンパク質、生物学的細胞および小分子などの生体分子、血液、血清、唾液および尿などの他のヒト体液に加えて、さらにはミルク、ベビーフードまたは水などの消耗品であり得る。サンプルとは無関係に、アッセイの基材への標的分子の効率的なコンジュゲーションは、これらのアッセイにおいてより高い忠実度を達成するのに役立ち得る。
【０００３】
活性化エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、マレイミド、フルオロフェニル）、カルバメート、カーボネート、エポキシドおよびアルデヒドは、生体分子をコンジュゲートするためにアッセイにおいてよく使用される官能基である。しかしながら、これらの官能基は、低い加水分解安定性が欠点である。低い加水分解安定性は、競合する加水分解反応のために、生体分子の最適以下のコンジュゲーション効率につながり得るので、結果的に、コンジュゲートした生体分子の量の低下、およびコンジュゲートした生体分子の不均一性をもたらす。
【０００４】
アズラクトン基は、中性ｐＨで水加水分解に対して良好な耐性を示しながら、開環付加反応によって、第一級アミン、アルコールおよびチオールなどの強い求核試薬と反応することが知られている（Carter, H.E., 第5章: ”Azlactones,” Organic Reactions, John Wiley & Sons, 3: 198〜239頁（1946年）を参照のこと）。アズラクトン官能化表面は、より高い安定性に加えて、周囲条件下でより長期に保存され得るが、活性化エステル、エポキシドおよびアルデヒドを含有する表面は、水分のない条件（真空密封包装、冷凍庫）で保存され、かつ周囲条件に曝された直後に使用されなければならない。
【０００５】
「アズラクトン」は、６員環：
【化１】
2019527246.tif 000003
［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、１〜１４個の炭素原子を有するアルキル基、３〜１４個の炭素原子を有するシクロアルキル基、５〜１２個の環原子を有するアリール基、６〜２６個の炭素原子および０〜３個の硫黄、窒素、および非過酸化酸素（nonperoxidic oxygen）のヘテロ原子を有するアレーニル基であるか、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している炭素と一緒になって、４〜１２個の環原子を有する炭素環を形成することができ、かつｎは０または１の整数である］
によって表され得る。
【０００６】
ｎが０である場合、このアズラクトンは、５員環：
【化２】
2019527246.tif 000004
［式中、Ｒ１およびＲ２は上記のように定義される］
によって表され得る。
【０００７】
それらの有利でかつユニークな特性のために、タンパク質のコンジュゲーションに使用するためのアズラクトン官能化ポリマーの製造方法が知られている。米国特許第５３２１０９５号明細書には、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを製造するための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むアズラクトン活性化ポリアルキレンオキシドの製造方法が開示されている。また、米国特許第４４８５２３６号明細書および米国特許第５０１３７９５号明細書には、ラジカルプロセスを介したアズラクトン含有ポリマーの製造方法およびタンパク質コンジュゲーションのためのそれらの使用が開示されている。
【０００８】
アズラクトン基は、クロマトグラフィーにおいて利用されている。Rasmussenら、“Crosslinked, hydrophilic, azlactone-functional polymeric beads: A two-step approach”, Reactive Polymers, 16(2): 199〜212頁（1991年）には、クロマトグラフィーのためのアズラクトン官能化ポリマービーズの適用が開示されており、その際、アクリルアミド系ポリマービーズは、ラジカル重合により製造され、かつアズラクトン基は、無水酢酸を用いるペンダントアシルアミノ酸基の脱水環化により導入される。Colemanら、“Immobilization of Protein A at High Density on Azlactone-functional Polymeric Beads and Their Use in Affinity Chromatography”, Journal of Chromatography, 512：345〜63頁（1990年）には、表面上にタンパク質が固定され、高度に架橋したコポリマービーズが開示されており、該コポリマービーズは、メチレン−ビス−アクリルアミドおよびビニルジメチルアズラクトンから逆相重合法により製造され、アフィニティークロマトグラフィーで使用される。
【０００９】
アズラクトン基は、細胞および酵素固定基材にも利用されている。Buckら、“Chemical Modification of Reactive Multilayered Films Fabricated from Poly(2-alkenyl azlactone)s: Design of Surfaces That Prevent or Promote Mammalian Cell Adhesion and Bacterial Biofilm Growth”, Biomacromolecules, 10(6): 1564〜74頁（2009年）には、反応性ポリマーフィルムが開示されており、このポリマーフィルムを官能化することで、細胞の付着および成長を、ポリアミンおよびポリ（２−ビニル−４，４’−ジメチルアズラクトン）（ＰＶＤＭＡ）の交互積層法を介して防止または促進することができる。ポリアミンのアミノ基とＰＶＤＭＡのアズラクトン官能基との反応により、フィルムは、共有結合的に架橋される。ＰＶＤＭＡの未反応アズラクトン基は、親水性部分または疎水性部分を結合させるためにさらに利用されており、したがって、表面からの細胞の付着または細胞の反発のいずれかを促進させる。Cullenら、”Surface-Anchored Poly(2-vinyl-4,4-dimethyl azlactone) Brushes as Templates for Enzyme Immobilization”, Langmuir, 24(23): 13701〜09頁（2008年）には、原子移動ラジカル重合によってガラスの表面に固定された開始剤からＰＶＤＭＡブラシを成長させることが開示されている。
【００１０】
アズラクトン基は、医療用インプラントにも利用されている。米国特許第５２９２５１４号明細書には、ポリマーおよびオリゴマーのビニルジメチルアズラクトンのラジカル重合による製造ならびにビニルジメチルアズラクトンの、哺乳類の体内インプラントのコーティングとしての使用が開示されている。
【００１１】
米国特許第４９８１９３３号明細書には、不飽和重合性アズラクトンポリマー（例えば、ビニルアズラクトン）およびビニルベンジルハライドからのアズラクトンコポリマーの製造が開示されており、該アズラクトンコポリマーは、したがって、これらの２つの部分のそれぞれの反応官能基を有する。
【００１２】
米国特許第５３４４７０１号明細書には、生物試薬のカップリングのための既存の支持体上にアズラクトン官能基を導入するいくつかの方法が開示されている。これらの方法は、高エネルギー放射線を暴露してフリーラジカルを発生させ、続いてビニル−アズラクトンと反応させること、アズラクトンモノマーの化学的架橋によりフィルムを表面上に形成すること、および分散重合して支持体の細孔内に機能性粒子を生成することを含む。
【００１３】
発明の概要
本発明の特定の例示的な実施形態の概要を以下に記載する。これらの態様は、これらの特定の実施形態の簡単な概要を読者に提供するために提示されているにすぎず、これらの態様は、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。実際に、本発明は、以下に記載されていない様々な態様を包含し得る。
【００１４】
測定プラットフォームまたはアッセイにおけるアズラクトン官能化表面は、優れた輝度および均一性を有するスポットを生成し得る可能性がある。水加水分解に対するアズラクトン官能化表面のより高い安定性のために、スポッティングの再現性も同様に改善され得る可能性がある。しかしながら、測定プラットフォームまたはアッセイにおいてアズラクトン基を利用するためには、アズラクトン官能化ポリマーは、アズラクトン基の官能性を妨害することなく、表面または基材に固定化されるべきである。換言すれば、第２の官能基は、アズラクトン官能化ポリマーを表面または基材に結合しなければならないが、対象の生体分子をコンジュゲートするアズラクトン基の能力を妨げるべきではない。
【００１５】
したがって、本発明の例示的な実施形態では、生体分子をコンジュゲートするアズラクトン基とアズラクトン官能化ポリマーを基材上に固定して生体適合性表面を作り出す結合基との双方で官能化されたポリマーが提供されており、ここで、アズラクトン官能性は、結合基を反応性にする条件下でそのままである。例示的な実施形態によれば、ＰＥＧは、生体分子のコンジュゲーションのためのアズラクトン基および基材への結合のためのアジド基で官能化されている。アジド基とアズラクトン基は、化学的に直交性（オルソゴナル）であるので、アズラクトン官能性は、アジド基を反応性にする条件下でそのままであろう。また、本発明の例示的な実施形態では、このような生体適合性表面を作製し、かかる生体適合性表面を、タンパク質および抗体マイクロアレイなどの測定プラットフォームに基材として組み込む方法も提供されている。
【００１６】
本発明の例示的な実施形態では、表面または基材に固定され得るアズラクトン官能化ポリマーが提供されており、その際、得られたアズラクトン官能化表面または基材は、生体分子のより効率的なコンジュゲーションのために、タンパク質および抗体マイクロアレイなどの測定アッセイで使用され得る。このような官能化表面は、米国特許出願番号１４／７９２，５５３、１４／７９２，５７６、１４／７９２，５４１、１４／７９２，５６９、および１４／７９２，５３０号に記載されているような、バイオセンサーシステムにおいて使用され得るものであり、これらの米国出願は、これによってその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１７】
例示的な実施形態によれば、二官能性ポリマーは以下のものを含む：（ａ）アジド、カルボン酸、チオール、アミン、ヒドロキシル、ヒドラジン、シリル、ホスホネート、アルキン、カテコール、およびリジンからなる群から選択されるアンカー基；（ｂ）１つ以上の第１のポリマーを含むポリマーブロック、該１つ以上の第１のポリマーは、ＰＥＧまたは多糖を含む；（ｃ）フェニル、ビニル、ベンジル、およびアルキルからなる群から選択されるリンカー基；ならびに（ｄ）Ｒ１およびＲ２を含み、ここでＲ１およびＲ２が、それぞれ独立して、水素、アルキル、およびアリールからなる群から選択されるアズラクトン末端基。
【００１８】
一部の例示的な実施形態では、１つ以上の第１のポリマーは、第２のポリマーとのコポリマーであり、ここで、該第２のポリマーは、ポリリジン、ポリオキサゾリン、ポリメチルメタクリレート、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリドーパミン、ポリアルカン、およびＮ−置換グリシンポリマーからなる群から選択される。
【００１９】
例示的な実施形態によれば、被覆基材は、（ａ）基材；および（ｂ）該基材に結合したポリマー層を含み、ここで、該ポリマー層は、１つ以上の第１のポリマーと、該１つ以上の第１のポリマーのそれぞれの第１の末端に結合された１つ以上のアズラクトン官能基と、該１つ以上の第１のポリマーのそれぞれの第２の末端に結合された１つ以上のアジド基とを含み、該１つ以上のアジド基は、該ポリマー層を該基材に結合させる。
【００２０】
一部の例示的な実施形態では、該基材は、ガラス、シリカ、プラスチック、炭素、金属、および金属酸化物からなる群から選択される。
【００２１】
一部の例示的な実施形態では、ポリマー層は、線状ポリマー、マルチアームポリマー、ブラシポリマー、またはナノ粒子である。
【００２２】
一部の例示的な実施形態では、１つ以上の第１のポリマーは、ＰＥＧまたは多糖である。
【００２３】
一部の例示的な実施形態では、１つ以上の第１のポリマーは、第２のポリマーとのコポリマーであり、ここで、該第２のポリマーは、ポリリジン、ポリオキサゾリン、ポリメチルメタクリレート、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリドーパミン、ポリアルカン、およびＮ−置換グリシンポリマーからなる群から選択される。
【００２４】
例示的な実施形態によれば、マイクロアレイは、複数の個別領域を含み、ここで、各個別領域は、被覆基材を含み、該被覆基材は、（ａ）基材；および（ｂ）該基材に結合されたポリマー層を含み、該ポリマー層は、１つ以上のポリマーと、該１つ以上のポリマーのそれぞれの第１の末端に結合された１つ以上のアズラクトン官能基と、該１つ以上のポリマーのそれぞれの第２の末端に結合された１つ以上のアジド基とを含み、ここで、該１つ以上のアジド基は、該ポリマー層を該基材に結合させる。
【００２５】
例示的な実施形態によれば、二官能性ポリマーの製造方法は、（ａ）ポリマーの第１の末端に結合された１つ以上のカルボン酸基または活性化エステル基と、該ポリマーの第２の末端に結合された１つ以上のアジド基とを有するポリマーを準備すること；（ｂ）少なくとも１つのカルボン酸基または活性化エステル基を、ハロゲン化アリール基またはハロゲン化ビニル基に変換すること；および（ｃ）ビニルジアルキルアズラクトンを、該ハロゲン化アリール基またはハロゲン化ビニル基に結合することを含む。
【００２６】
一部の例示的な実施形態では、該ポリマーはＰＥＧである。
【００２７】
一部の例示的な実施形態では、該ビニルジアルキルアズラクトンは、パラジウム触媒、１種以上の溶媒、および塩基を用いるカップリング反応によって結合される。
【００２８】
一部の例示的な実施形態では、パラジウム触媒は、パラジウム（ＩＩ）キノリン−８−カルボキシレート、パラジウム（ＩＩ）クロリド、パラジウム（ＩＩ）ブロミド、パラジウム（ＩＩ）アセテート、パラジウム（ＩＩ）アセトアセテート、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、パラジウム（ＩＩ）トリフルオロアセテート、アリルパラジウム（ＩＩ）クロリドダイマー、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド、ジクロロビス（トリシクロヘキシルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）、および［１，１’−ビス（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【００２９】
一部の例示的な実施形態では、１種以上の溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、アセトニトリル、およびアルコールからなる群から選択される。
【００３０】
一部の例示的な実施形態では、塩基は、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、およびナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシドからなる群から選択される。
【００３１】
例示的な実施形態によれば、二官能性ポリマーを基材に結合させる方法であって、該二官能性ポリマーは、ポリマー、該ポリマーの第１の末端に結合された１つ以上のアズラクトン官能基、および該ポリマーの第２の末端に結合された１つ以上のアジド基を含み、該方法が、（ａ）アルキン官能基を有する基材を準備すること；（ｂ）該二官能性ポリマー、１種以上の溶媒、触媒、塩基および還元剤を含む混合物を準備すること；ならびに（ｃ）該基材と該混合物とを接触させることを含む方法が提供される。
【００３２】
一部の例示的な実施形態では、該ポリマーはＰＥＧである。
【００３３】
一部の例示的な実施形態では、１種以上の溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、および水からなる群から選択される。
【００３４】
一部の例示的な実施形態では、触媒は、銅（ＩＩ）塩または銅（Ｉ）塩である。
【００３５】
一部の例示的な実施形態では、触媒は、硫酸銅、臭化銅、およびヨウ化銅からなる群から選択される。
【００３６】
一部の例示的な実施形態では、触媒は、ルテニウム触媒である。
【００３７】
一部の例示的な実施形態では、触媒は、ペンタメチルシクロペンタジエニルビス（トリフェニルホスフィン）ルテニウム（ＩＩ）クロリド、ペンタメチルシクロペンタジエニル（シクロオクタジエニル）ルテニウム（ＩＩ）クロリド、およびペンタメチルシクロペンタジエニル（ノルボルナジエン）ルテニウム（ＩＩ）クロリドからなる群から選択される。
【００３８】
一部の例示的な実施形態では、塩基は、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、キノロン、フェナントロリン、およびイミダゾールからなる群から選択される。
【００３９】
一部の例示的な実施形態では、還元剤は、アスコルビン酸ナトリウム、トリス（トリアゾール）アミン、およびヒドロキノン類からなる群から選択される。
【００４０】
例示的な実施形態によれば、対象の生体分子の単離方法は、（ａ）官能化された基材を準備すること、ここで、該官能化された基材は、基材と、１つ以上のポリマーと、該１つ以上のポリマーのそれぞれの第１の末端に結合された１つ以上のアズラクトン基と、該１つ以上のポリマーのそれぞれの第２の末端に結合された１つ以上のアジド基とを含み、該１つ以上のアジド基は、それによって該１つ以上のポリマーのそれぞれを該基材に結合させる；（ｂ）水溶液を準備すること、ここで、前記水溶液は、対象の生体分子を含有する；および（ｃ）該官能化された基材を該水溶液にある期間にわたって接触させ、該期間の間に、対象の生体分子を、該基材のアズラクトン基に結合させることを含む。
【００４１】
一部の例示的な実施形態では、該水溶液は、添加剤を含み、ここで、該添加剤は、グリセロール、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、界面活性剤、ポリビニルアルコール、糖、有機溶媒、および無機塩からなる群から選択される。
【００４２】
一部の例示的な実施形態では、該水溶液のｐＨレベルは、約２〜約１０の範囲にある。
【００４３】
一部の例示的な実施形態では、該基材と該水溶液との接触は、ジェット印刷、ピン印刷、クイル印刷、バイオロジカルレーザー印刷、キャピラリーに基づくフルイディクス、または浸漬によって達成される。
【００４４】
本発明のこれらのおよび他の特徴、態様、ならびに利点は、特定の例示的な実施形態の以下の詳細な説明を、添付図面を参照して読む際に、よりよく理解されることになり、図面において類似の文字は、図面全体を通して類似の部分を表す。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の例示的な実施形態による二官能性ポリマーを図示する。
【図２】本発明の例示的な実施形態による被覆基材を図示する。
【図３】本発明の例示的な実施形態によるマイクロアレイを図示する。
【図４】ＮＨＳ官能化基材およびアズラクトン官能化基材上の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）スポットの蛍光強度（スポット１０個の平均）を比較する。
【図５Ａ】ＮＨＳ官能化基材上で得られたＧＦＰスポットモルホロジーの代表例を図示する。
【図５Ｂ】アズラクトン官能化基材上で得られたＧＦＰスポットモルホロジーの代表例を図示する。
【図６】アズラクトン基で官能化されたＰＥＧ被覆スライドおよびＮＨＳ基で官能化されたＰＥＧ被覆スライドの表面上にコンジュゲートした免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の蛍光強度を比較する。
【図７】ＮＨＳ官能化表面のアズラクトン官能化表面への変換を図示する。
【図８】アルデヒド官能化表面のアズラクトン官能化表面への変換を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明の例示的な実施形態では、一方の末端が、対象の生体分子をコンジュゲートさせるアズラクトン末端基で官能化され、かつ他方の末端が、ポリマーを基材に結合させるアジドアンカー基で官能化されている、二官能性のＰＥＧなどのポリマーが提供される。アジド基およびアズラクトンなどの化学的に直交性である２つの基でポリマーを官能化することにより、ポリマーを基材に結合させるためにアジド基が反応性である条件下で、生体分子をコンジュゲートするためのアズラクトン官能性をそのままにすることができる。本発明の例示的な実施形態では、このような二官能化ポリマーを基材の表面上に組み込む被覆基材が提供されており、ここでアジド基は、ポリマーを基材に結合させ、アズラクトン基は、生体分子をコンジュゲートするために遊離かつ活性なままにする。本発明の例示的な実施形態では、このような被覆基材をマイクロアレイの表面上に組み込むマイクロアレイが提供されており、ここでマイクロアレイは、複数の個別スポットを含み、各スポットは二官能化ポリマーを含む。
【００４７】
図１は、例示的な実施形態による二官能性ポリマーを示し、該二官能性ポリマーは、アジド、カルボン酸、チオール、アミン、ヒドロキシル、ヒドラジン、シリル、ホスホネート、アルキン、カテコール、およびリジンからなる群から選択されるアンカー基１１０；ＰＥＧまたは多糖であり得る、１つ以上の第１のポリマーを含むポリマーブロック１０６；フェニル、ビニル、ベンジル、およびアルキルからなる群から選択されるリンカー基１１２；ならびにＲ１およびＲ２を含み、ここで、Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して水素、アルキル、およびアリールからなる群から選択されるアズラクトン末端基１０８を含む。別の例示的な実施形態では、１つ以上の第１のポリマーは、第２のポリマーとのコポリマーであることができ、ここで、第２のポリマーは、ポリリジン、ポリオキサゾリン、ポリメチルメタクリレート、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリドーパミン、ポリアルカン、およびＮ−置換グリシンポリマーからなる群から選択される。
【００４８】
図２は、例示的な実施形態による被覆基材２００を示し、被覆基材２００は、基材２０２および基材２０２に結合したポリマー層２０４を含み、ここで、ポリマー層２０４は、１つ以上の第１のポリマー２０６、１つ以上の第１のポリマー２０６のそれぞれの第１の末端にリンカー基２１２を介して結合した１つ以上のアズラクトン官能基２０８、および１つ以上の第１のポリマー２０６のそれぞれの第２の末端に結合した１つ以上のアジド基２１０を含み、ここで、１つ以上のアジド基２１０は、ポリマー層２０４を基材２０２に結合させる。
【００４９】
例示的な実施形態では、基材２０２は、ガラス、シリカ、プラスチック、炭素、金属、または金属酸化物であり得る。図２に示すように、ポリマー層２０４は、線状ポリマーで作製され得るが、他の実施形態では、ポリマー層２０４は、マルチアームポリマー、ブラシポリマー、またはナノ粒子で作製され得る。一部の例示的な実施形態では、１つ以上の第１のポリマー２０６は、ＰＥＧまたは多糖であり得るものであり、他の実施形態では、１つ以上の第１のポリマー２０６は、第２のポリマーとのコポリマーであり得るものであり、ここで、第２のポリマーは、ポリリジン、ポリオキサゾリン、ポリメチルメタクリレート、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリドーパミン、ポリアルカン、またはＮ−置換グリシンポリマーであり得る。
【００５０】
図３は、例示的な実施形態によるマイクロアレイ３００を示し、該マイクロアレイ３００は、複数の個別領域３１４を含み、各個別領域３１４は、基材３０２および基材３０２に結合されたポリマー層３０４を含む被覆基材を含み、ここで、ポリマー層３０４は、１つ以上のポリマー３０６、１つ以上のポリマー３０６のそれぞれの第１の末端にリンカー基３１２を介して結合した１つ以上のアズラクトン官能基３０８、および１つ以上のポリマー３０６のそれぞれの第２の末端に結合した１つ以上のアジド基３１０を含み、ここで、１つ以上のアジド基３１０は、ポリマー層３０４を基材３０２に結合させる。
【００５１】
本発明の例示的な実施形態では、さらに、ＰＥＧなどのポリマーをアズラクトン基およびアジド基で官能化する、二官能性ポリマーの製造方法も提供される。
【００５２】
本発明の例示的な実施形態によれば、例えば、以下の実施例１および２に関して記載されるように、二官能性ポリマーの製造方法は、（ａ）ポリマーを準備すること、ここで、該ポリマーは、該ポリマーの第１の末端に結合された１つ以上のカルボン酸基または活性化エステル基と、該ポリマーの第２の末端に結合された１つ以上のアジド基とを有する；（ｂ）少なくとも１つのカルボン酸基または活性化エステル基を、ハロゲン化アリール基またはハロゲン化ビニル基に変換すること；および（ｃ）ビニルジアルキルアズラクトンを、該ハロゲン化アリール基またはハロゲン化ビニル基に結合することを含む。該ポリマーは、ＰＥＧであり得る。ビニルジアルキルアズラクトンは、パラジウム触媒、１種以上の溶媒および塩基を用いるカップリング反応によって、該ハロゲン化アリール基またはハロゲン化ビニル基に結合され得る。パラジウム触媒は、パラジウム（ＩＩ）キノリン−８−カルボキシレート、パラジウム（ＩＩ）クロリド、パラジウム（ＩＩ）ブロミド、パラジウム（ＩＩ）アセテート、パラジウム（ＩＩ）アセトアセテート、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、パラジウム（ＩＩ）トリフルオロアセテート、アリルパラジウム（ＩＩ）クロリドダイマー、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド、ジクロロビス（トリシクロヘキシルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）、および［１，１’−ビス（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）からなる群から選択され得る。１種以上の溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、アセトニトリル、およびアルコールからなる群から選択され得る。塩基は、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、およびナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシドからなる群から選択され得る。
【００５３】
本発明の例示的な実施形態では、さらに、アズラクトン官能化ポリマー、例えばＰＥＧで表面を官能化する方法も提供される。本発明の例示的な実施形態によれば、例えば、以下の実施例３に関して記載されるように、ポリマーと、該ポリマーの第１の末端に結合した１つ以上のアズラクトン官能基と、該ポリマーの第２の末端に結合した１つ以上のアジド基とを含む二官能性ポリマーを基材に結合する「トップダウン」方法であって、該方法が、（ａ）アルキン官能基を含む基材を準備すること；（ｂ）該二官能性ポリマーと、１種以上の溶媒と、触媒と、塩基と、還元剤とを含む混合物を準備すること；および（ｃ）該基材を該混合物と接触させることを含む方法が提供される。
【００５４】
トップダウン手法では、まず、アズラクトン基およびアジド基をポリマー鎖の末端に導入し、次に、ポリマーを「クリック」反応によってアルキン基を含む表面に結合させる。このトップダウン手法によって、官能化度をより良く制御することが可能となり、各ポリマー鎖が、アズラクトン官能基を有することを保証する。基材は、金属、金属酸化物、シリカ、ガラス、炭素、またはプラスチックであり得る。このような表面上にアルキン官能基を導入する方法は公知である。例えば、Achatzら、“Colloidal silica nanoparticles for use in click chemistry-based conjugations and fluorescent affinity assays,” Sensors and Actuators B: Chemistry, 150 (1): 211〜19頁（2010年）には、シリカナノ粒子を、Ｏ−（プロパルギル）−Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）カルバメートで修飾する方法が開示されている。該ポリマーは、ＰＥＧまたは多糖であり得る。１種以上の溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、および水からなる群から選択され得る。触媒は、銅（ＩＩ）塩もしくは銅（Ｉ）塩（硫酸銅、臭化銅、およびヨウ化銅を含む）またはルテニウム触媒（ペンタメチルシクロペンタジエニルビス（トリフェニルホスフィン）ルテニウム（ＩＩ）クロリド、ペンタメチルシクロペンタジエニル（シクロオクタジエニル）ルテニウム（ＩＩ）クロリド、およびペンタメチルシクロペンタジエニル（ノルボルナジエン）ルテニウム（ＩＩ）クロリドを含む）のいずれかであり得る。塩基は、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、キノロン、フェナントロリン、およびイミダゾールからなる群から選択され得る。還元剤は、アスコルビン酸ナトリウム、トリス（トリアゾール）アミン、およびヒドロキノン類からなる群から選択され得る。基材を混合物と接触させることは、室温または高められた温度で、例えば約２３℃〜１５０℃で、行うことができ、基材を混合物と接触させるのに許容される反応時間量は、得られるＰＥＧコーティング密度と相関する。
【００５５】
本発明の選択的な、例示的な実施形態によれば、表面をアズラクトンで官能化する「ボトムアップ」方法は、ポリマーを準備すること、ここで、該ポリマーは、該ポリマーの第１の末端に結合した１つ以上のカルボン酸基および該ポリマーの第２の末端に結合した１つ以上の結合基を有する；該結合基を介して該ポリマーを該表面に結合させること；次いで、該カルボン酸基をアズラクトンに変換することを含む。該ポリマーは、ＰＥＧであり得る。このボトムアップ手法により、該ポリマーを表面に結合させるためにより多くの代替化学物質を使用することができる。なぜなら、この表面結合は、もはやアズラクトンに対して化学的に直交性である必要がないからである。ボトムアップ手法では、ポリマーの結合基は、アジド、ホスホン酸、カルボン酸、シラン、チオール、アミン、ヒドラジン、アルキン、またはカテコールであり得る。
【００５６】
本発明の例示的な実施形態によれば、図７に示すように、ＮＨＳ官能化表面（１６）は、固相合成によりアズラクトン官能化表面（１８）に変換される。ＮＨＳ官能化表面は、塩基（例えば、トリメチルアミン（ＴＥＡ））および溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））の存在下で２−メチルアラニンと反応し、中間構造（１７）をもたらす。中間構造（１７）は、カップリング試薬（例えば、カルボジイミド、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ））および溶媒（例えば、ジクロロメタン（ＤＣＭ））の存在下で環化反応を受け、アズラクトン官能化表面（１８）をもたらす。
【００５７】
本発明の別の例示的な実施形態によれば、図８に示すように、アルデヒド官能化表面（１９）は、固相合成によりアズラクトン官能化表面（２０）に変換される。アルデヒド官能化表面（１９）は、触媒（例えば、３−ベンジル−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウムクロリド）、塩基（例えば、ＴＥＡ）、および溶媒（例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ））の存在下でビニルジアルキルアズラクトンと反応し、アズラクトン官能化表面（２０）をもたらす。
【００５８】
アズラクトン官能基を有する基材は、基材に適合性の反応条件の範囲がより広いことを含む、いくつかの利点をもたらす。アズラクトン基の加水分解安定性のために、基材は、様々な緩衝液、ｐＨレベルおよび他の環境条件（温度および湿度を含む）を許容することとなり、したがって、生体分子の結合化学を最適化し、かつシグナル強度および均一性を改善することが使用者にとってより容易になる。
【００５９】
例えば、スポッティング法を用いて固体基材上にタンパク質アレイを作成する場合、１滴のタンパク質溶液を基材上に分注して乾燥させる。乾燥プロセスは、シグナル強度および均一性に影響を及ぼし、その際、よりゆっくりとした乾燥プロセスは、コンジュゲーション効率を改善する（反応が起こるより多く時間があるため）だけでなく、さらに、円形の外周に中心よりも高い濃度のタンパク質が含まれるコーヒーリング効果を最小限にするであろう。しかしながら、ＮＨＳ、活性化エステル、エポキシドおよびアルデヒドなどの基では、水加水分解は、コンジュゲーション反応と競合するので、より良い強度および均一性を犠牲にしても、より速い乾燥が好ましい。水溶液中のアズラクトン基の堅牢性によって、より遅い乾燥プロセスが可能となり、最適なシグナル強度および均一性の双方が達成される。
【００６０】
別の例として、連続フローマイクロプリンティングは、タンパク質アレイを作成する別の方法である。連続フローマイクロプリンティングは、乾燥することなくタンパク質溶液と官能性基材とのより長い接触をもたらし、かつその能力が、基材の表面に加水分解安定な官能基がある場合、最大限に利用され得る。
【００６１】
本発明の例示的な実施形態では、さらに、アズラクトン官能化基材を使用して対象の生体分子をコンジュゲートする方法も提供される。
【００６２】
本発明の例示的な実施形態によれば、対象の生体分子を単離する方法は、（ａ）基材と、１つ以上のポリマーと、該１つ以上のポリマーのそれぞれの第１の末端に結合された１つ以上のアズラクトン基と、該１つ以上のポリマーのそれぞれの第２の末端に結合された１つ以上のアジド基とを含む官能化基材を準備すること、ここで、該１つ以上のアジド基は、該１つ以上のポリマーのそれぞれを該基材に結合させる；（ｂ）対象の生体分子を含有する水溶液を準備すること；ならびに（ｃ）該官能化基材と該水溶液とをある期間にわたって接触させ、ここで、該期間の間に、対象の生体分子をアズラクトン基に結合させることを含む。水溶液は、添加剤（例えば、グリセロール、オリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、界面活性剤、ポリビニルアルコール、糖、有機溶媒、および無機塩）を含み得るものであり、かつ約２〜約１０の範囲のｐＨレベルを有し得る。官能化基材と水溶液との接触は、ジェット印刷、ピン印刷、クイル印刷、バイオロジカルレーザー印刷、キャピラリーに基づくフルイディクス、または浸漬によって達成され得る。該期間は、数秒から数時間であり得る。さらに、生体分子は、インビトロ転写および翻訳技術を用いてインサイチュにて基材上で発現および捕捉され得る。
【００６３】
上記の説明は、例示であり、限定するものではない。当業者であれば、上記の説明から、本発明を様々な形態で実施することができ、様々な実施形態を単独でまたは組み合わせて実施できることを理解することができる。したがって、本発明の実施形態をその特定の例に関連して説明してきたが、その他の変更は、図面、明細書、および以下の実施例および特許請求の範囲を検討する際に当業者に明らかになるので、本発明の実施形態および／または方法の真の範囲は、そのように限定されるべきではない。
【００６４】
以下は、いかなる方法でも限定することを意図することなく、具体的な方法を示す例である。これらの例は、一般的な知識から理解されるように、詳細な説明の範囲内で変更され得る。
【実施例】
【００６５】
実施例１  −  アジド−ＰＥＧ−アズラクトンの合成、カルボン酸基のハロゲン化アリール基への変換
乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の、Ｎ３−ＰＥＧ１Ｋ−ＣＯ２Ｈ（２００ｍｇ、０．２０ミリモル、１．０当量）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（３７ｍｇ、０．２４ミリモル、１．２当量）およびヨードアニリン（５２ｍｇ、０．２４ミリモル、１．２当量）の混合物を、アルゴン下にて室温で１２時間撹拌した。反応を水でクエンチし、有機層を分離した。水層をＤＣＭで３回抽出し、かつ合わせた有機部分を硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥させた。溶液を減圧下で濃縮して粗油状物を得て、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０〜１０％のメタノール／ＤＣＭ）で精製すると、柔らかい白色固体（２２５ｍｇ、８２％）が得られた。
【化３】
2019527246.tif 000005
【００６６】
得られた生成物の構造を、プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を用いて決定し、ここで、以下のＮＭＲスペクトルが得られた：
2019527246.tif 000006
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）における生成物の保持係数（Ｒｆ）は、以下の通りである：ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．５（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）。
【００６７】
実施例２  −  アジド−ＰＥＧ−アズラクトンの合成、ビニルジアルキルアズラクトンのハロゲン化アリール基への結合
パラジウム触媒「Ｑｕｉｎ２Ｐｄ」を、Cuiら、”Pd(quinoline-8-carboxylate)2 as a Low-Priced, Phosphine-Free Catalyst for Heck and Suzuki Reactions”, Journal of Organic Chemistry, 72:9342（2007年）に記載されているような手順に従って合成した。
【００６８】
１０ｍＬのフレームドライしたシュレンクフラスコに、Ｎ３−ＰＥＧ１ｋ−ヨードアニリド（２００ｍｇ、０．１５２ミリモル、１．０当量）およびＱｕｉｎ−Ｐｄ（３．２ｍｇ、０．００７２ミリモル、０．０５当量）を装入し、アルゴンでパージした。乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０．２Ｍ、０．８ｍＬ）、トリエチルアミン（１００μＬ、０．０７６ミリモル、５．０当量、乾燥、ＣａＨ２で蒸留したてのもの）、およびビニルアズラクトン（５８μＬ、０．４５６ミリモル、３．０当量）を添加し、このシステムを密封した。反応混合物を１３０℃で３時間加熱すると、暗褐色に変化した。次に、これを室温に冷却し、減圧下で濃縮した。粗残留物をＤＣＭに溶解し、セライト上にドライローディングし、これをシリカカラムに適用した。カラムクロマトグラフィー（０〜２０％のメタノール／ＤＣＭ）で精製すると、収量は１５６ｍｇであった。
【化４】
2019527246.tif 000007
【００６９】
得られた生成物の構造を、プロトンＮＭＲ分光法を用いて決定し、ここで、以下のＮＭＲスペクトルが得られた：
2019527246.tif 000008
薄層クロマトグラフィーにおける生成物の保持係数は、以下の通りである：ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．４（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）。
【００７０】
実施例３  −  アジド−ＰＥＧ−アズラクトンの、アルキン官能化表面への「クリック」反応による結合
５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および５ｍＬの脱イオン（ＤＩ）水中のアジド−ＰＥＧ−アズラクトンの溶液（３ｍｇ／ｍＬ）に、０．５２ｍＬの１．０ｍＭのクリックケミストリーのストック溶液（１．５ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、６ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム、４μＬのトリエチルアミン、３ｍＬのＤＭＳＯ、および３ｍＬのＤＩ水）を添加した。アルキン基で官能化されたスライドを、この溶液中に、室温で１２時間穏やかに振とうしながら浸漬した。ＰＥＧ化スライドをＤＩ水ですすぎ、スピン乾燥させた。
【００７１】
選択的に、表面をアジド基で予め官能化し、次にその表面を、アルキン−ＰＥＧ−アズラクトンと「クリック」反応によってカップリングさせることにより、ＰＥＧ−アズラクトンを表面上に導入した。
【化５】
2019527246.tif 000009
【００７２】
実施例４  −  アズラクトンおよびアジド官能基で修飾された多糖の合成
以下に図示するように、多糖を酸化して、アズラクトンとのさらなる官能化に適したカルボン酸基を生成した。多糖鎖（構造７）上の第一級アルコールの一部を、白金上の酸素を用いて、または触媒としてＴＥＭＰＯ（（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イル）オキシルもしくは（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イル）オキシダニル）および塩基性ｐＨの次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）を用いてのいずれかで、カルボン酸基に変換すると、構造（８）が得られた（Cumpstey, I., ISRN Organic Chemistry, Article ID 417672（2013年）を参照）。次に、カルボン酸基を、ハロゲン化（臭化またはヨウ化）アリールまたはビニル官能基に変換し、構造９を得て、続いてビニルジアルキルアズラクトンを、パラジウム触媒カップリングによって結合させると、所望のアズラクトン官能化材料（構造１０）が生成した。
【化６】
2019527246.tif 000010
【００７３】
選択的に、以下に図示するように、過ヨウ素酸塩を使用して、多糖鎖（構造７）の１，２ジオールの開裂を達成し、カルボン酸官能基をポリマー鎖に導入すると、構造１１が得られた。次に、構造１１をヨードアニリンと反応させ、構造１２を得て、次いで、これをビニルジアルキルアズラクトンと反応させると、所望のアズラクトン官能化材料（構造１３）が生成した。
【化７】
2019527246.tif 000011
【００７４】
以下に図示するように、多糖鎖の第一級アルコールの一部を、臭化物に変換する（例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）およびトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ）を使用する）か、またはトシル基を変換して（塩化トシル（ＴｓＣｌ）と反応させることによる）構造１４を得て、続いてアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）と反応させて、構造１５を生成することによってアジド官能基を多糖鎖（構造７）に導入した（Cumpsteyを参照のこと）。この方法を、アズラクトン官能化多糖を合成する前の２つの方法のいずれかと組み合わせることで、アズラクトン基とアジド基との双方を有する多糖鎖を得ることができる。多糖鎖上の第一級アルコールのほんの一部しかアズラクトンへと修飾されていないので、他のアルコールをアジドへの変換に利用することができる。
【化８】
2019527246.tif 000012
【００７５】
実施例５  −  ピン印刷によるアジド−ＰＥＧ−アズラクトンで被覆された基材へのタンパク質の結合
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に０．１％のポリビニルアルコールを含有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の２００ｍｇ／ｍＬ溶液を、室温および相対湿度５５％でピン印刷法を用いて基材上にスポットした。スポットをデシケーター中で１２時間乾燥させ、次いでスライドをＰＢＳ−ＴｗｅｅｎおよびＰＢＳですすぎ、結合していないタンパク質を除去した。基材に共有結合したＧＦＰの相対量を、表面上のタンパク質の蛍光強度を測定することによって求めた。アズラクトン官能化スライドの蛍光強度は、ＮＨＳエステル官能化スライドと比較して２．５倍高かった（図４を参照）。蛍光強度でスポット全体を見ることにより、スライドのモルホロジーを比較した。アズラクトン官能化表面上のタンパク質のスポットは均一である（図５Ｂ）のに対し、ＮＨＳ官能化表面上のスポットは特徴的なコーヒーリングモルホロジーを示した（図５Ａを参照）。
【００７６】
実施例６  −  浸漬によるタンパク質のコンジュゲーション
表面上に同じ密度の官能基を含むアジド−ＰＥＧ−アズラクトンおよびアジド−ＰＥＧ−ＮＨＳで官能化されたガラス基材を、ｐＨ７．４でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の溶液に最大６時間曝した。この溶液を除去し、ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎおよびＰＢＳでスライドをすすいだ後、これらの基材に共有結合したＩｇＧの相対量を、表面上のタンパク質の蛍光強度を測定することによって求めた。６時間のインキュベーション後、アズラクトン官能化スライドの蛍光強度は、ＮＨＳエステル官能化スライドの蛍光強度と比較して５倍高かった（図６を参照のこと）。
【符号の説明】
【００７７】
１０６  ポリマーブロック、  １０８  アズラクトン末端基、  １１０  アンカー基、  １１２  リンカー基、
２００  被覆基材、  ２０２  基材、  ２０４  ポリマー層、  ２０６  第１のポリマー、  ２０８  アズラクトン官能基、  ２１０  アジド基、  ２１２  リンカー基、
３００  マイクロアレイ、  ３０２  基材、  ３０４  ポリマー層、  ３０６  １つ以上のポリマー、  ３０８  アズラクトン官能基、  ３１０  アジド基、  ３１２  リンカー基、  ３１４  個別領域、
１６  ＮＨＳ官能化表面、  １７  中間構造、  １８  アズラクトン官能化表面、
１９  アルデヒド官能化表面、  ２０  アズラクトン官能化表面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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