(57)【要約】  トロンビン抗体、抗原結合フラグメント及びその医薬用途が提供される。更に、トロンビン抗体CDR領域を含むキメラ抗体及びヒト化抗体、ならびにトロンビン抗体及びその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびにその抗凝固剤としての使用が提供される。特に、トロンビン媒介疾患又は状態を治療するための薬物の調製におけるヒト化トロンビン抗体の使用が提供される。【選択図】なし
2019510474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列から選択される1つ以上のCDR領域又は以下の配列と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列を含む抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
抗体重鎖可変領域のHCDR領域：配列番号:7、配列番号:8及び配列番号:21；
抗体軽鎖可変領域のLCDR領域：配列番号:10、配列番号:11及び配列番号:12；
ここで、配列番号:21の配列が式（I）で表される：
DHYX1G X2SYVFDX3                (I)
式中、X1がH、I、L及びMから成る群より選択され；X2がN及びAから選択され；X3がY、S、L及びTから成る群より選択される。
【請求項２】
抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:7、配列番号:8及び配列番号:21、又は配列番号:7、配列番号:8及び配列番号:21と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列でそれぞれ示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含む、請求項１に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
式（I）の配列が以下の配列から選択される、請求項１に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
DHYHGNSYVFDY          配列番号:9；
DHYIGASYVFDY          配列番号:23；
DHYLGNSYVFDS          配列番号:24；
DHYLGNSYVFDL          配列番号:25；又は
DHYMGNSYVFDT          配列番号:26。
【請求項４】
抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:10、配列番号:11及び配列番号:12、又は配列番号:10、配列番号:11及び配列番号:12と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列でそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む、請求項１に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、マウス抗体又はその機能的フラグメントである、請求項１に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、マウスκ鎖もしくはその変異体に由来する軽鎖FR領域又はマウスλ鎖もしくはその変異体に由来する軽鎖FR領域をさらに含む；及び／又は、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、マウスIgG1もしくはその変異体に由来する重鎖FR領域、マウスIgG2もしくはその変異体に由来する重鎖FR領域又はマウスIgG3もしくはその変異体に由来する重鎖FR領域をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:5の重鎖可変領域及び配列番号:6の軽鎖可変領域を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、マウスκ鎖もしくはその変異体に由来する軽鎖定常領域又はマウスλ鎖もしくはその変異体に由来する軽鎖定常領域をさらに含む；及び／又は、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、マウスIgG1もしくはその変異体に由来する重鎖定常領域、マウスIgG2もしくはその変異体に由来する重鎖定常領域又はマウスIgG3もしくはその変異体に由来する重鎖定常領域をさらに含む、請求項１〜７のいずれか1項に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、キメラ抗体又はその機能的フラグメントである、請求項１に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒト化抗体又はその機能的フラグメントである、請求項１に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記ヒト化抗体又はその機能的フラグメントの重鎖FR領域が、ヒト生殖系列重鎖IGHV3-23*04及びhjh6.1の組合せ配列又はその変異体配列に由来し；前記ヒト化抗体又はその機能的フラグメントが、ヒト生殖系列重鎖IGHV3-23*04由来のFR1、FR2、FR3領域及びヒト生殖系列重鎖hjh6.1由来のFR4領域又はそれらの変異体配列を含む、請求項１０に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記ヒト化抗体又はその機能的フラグメントが、配列番号:13の重鎖可変領域又は配列番号:13と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列：好ましくは配列番号:13と比較して1〜10個のアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記ヒト化抗体又はその機能的フラグメントが、1〜10個のアミノ酸逆突然変異を有する重鎖FR領域を含み、該逆突然変異が、好ましくはR87K、K98R、Q3K及びS49Aアミノ酸逆突然変異から成る群より選択される、請求項１１に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
前記ヒト化抗体又はその機能的フラグメントが、配列番号:22もしくは配列番号:15の重鎖可変領域、又は配列番号:22もしくは配列番号:15と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列を含み；
配列番号:22の配列が、式（II）で表される：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVSNINSDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDHYX1GX2SYVFDX3WGQGTTVTVSS             (II);
式中、X1がH、I、L及びMから成る群より選択され；X2がN及びAから選択され；X3がY、S、L及びTから成る群より選択される、請求項１１〜１３のいずれか1項に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
式（II）の配列が、配列番号:14、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29及び配列番号:30から成る群より選択される、請求項１４に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
前記ヒト化抗体又はその機能的フラグメントの軽鎖FR領域が、ヒト生殖系列軽鎖IGKV1-39*01及びhjk4.1の組合せ配列又はその変異体配列に由来し；前記ヒト化抗体又はその機能的フラグメントが、ヒト生殖系列軽鎖IGKV1-39*01由来のFR1、FR2、FR3領域及びhjk4.1由来のFR4領域又はその変異体配列を含む、請求項１０に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
前記ヒト化抗体又はその機能的フラグメントが、配列番号:16の軽鎖可変領域又は配列番号:16と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列を含み；好ましくは、配列番号:16と比較して1〜10個のアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
前記ヒト化抗体又はその機能的フラグメントが、1〜10個のアミノ酸逆突然変異を有する軽鎖FR領域を含み、該逆突然変異が、好ましくはY49S、T69K、K45R、L47I及びF71Yアミノ酸逆突然変異から成る群より選択される、請求項１６に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
前記ヒト化抗体又はその機能的フラグメントが、配列番号:17もしくは配列番号:18の軽鎖可変領域、又は配列番号:17もしくは配列番号:18と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列を含む、請求項１６〜１８のいずれか1項に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
前記ヒト化抗体又はその機能的フラグメントが、
a）重鎖可変領域の配列が、配列番号:13、配列番号:22及び配列番号:15、又は配列番号:13、配列番号:22及び配列番号:15と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列から成る群より選択される重鎖可変領域；及び/又は、
b）軽鎖可変領域の配列が、配列番号:16、配列番号:17及び配列番号:18、又は配列番号:16、配列番号:17及び配列番号:18と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列から成る群より選択され、配列番号:22は請求項14で定義される軽鎖可変領域、
を含む、請求項１０に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、さらに、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4又はそれらの変異体に由来する重鎖定常領域を含み、好ましくはヒトIgG4に由来する重鎖定常領域を含み、最も好ましくは配列番号:19の配列を有する重鎖定常領域を含み、
抗トロンビン抗体又は抗原結合フラグメントが、さらに、ヒトκ鎖、ヒトλ鎖又はそれらの変異体に由来する軽鎖定常領域を含み、最も好ましくは配列番号:20の軽鎖定常領域を含む、
請求項９〜２０のいずれか1項に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
抗原結合フラグメントが、Fab、Fab'、F(ab')2、単鎖抗体（scFv）、二量体化V領域（二重特異性抗体）、ジスルフィド安定化V領域（dsFv）及びCDRペプチドを含む抗原結合フラグメントから成る群より選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、トロンビンのR70、Y71、E72、R73、N74、I75及びY114から成る群より選択される１つ以上の残基に結合し；好ましくは、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、さらにトロンビンの9、24、60、62、64、66、69、78及び113位の残基に結合する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
トロンビンのR70、Y71、E72、R73、N74、I75及びY114から成る群より選択される１つ以上の残基に結合し、好ましくは、さらにトロンビンの9、24、60、62、64、66、69、78及び113位の残基に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの治療的有効量及び１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするDNA分子。
【請求項２７】
請求項２６に記載のDNA分子を含む発現ベクター。
【請求項２８】
宿主細胞が、原核細胞及び真核細胞から成る群より選択され、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞である、請求項２７に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項２９】
疾患又は症状が、好ましくは血栓性疾患であり；より好ましくは静脈血栓症及び肺塞栓症、動脈血栓症、血栓症誘発性脳卒中及び末梢動脈形成、アテローム性動脈硬化症、脳動脈疾患または末梢動脈疾患であり；最も好ましくは静脈血栓症、血栓症誘発性脳卒中及びアテローム性動脈硬化症である、トロンビン媒介性の疾患又は症状を治療するための医薬の製造における、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項２５に記載の医薬組成物又は請求項２６に記載のDNA分子の使用。
【請求項３０】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む薬剤であって、ヒトのトロンビンを検出又は測定するための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明はトロンビン抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。本発明は更にキメラ抗体、該トロンビン抗体のCDR領域を含むヒト化抗体に関する。本発明は更に該トロンビン抗体及びその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびに該抗体の抗凝固剤としての使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
血液凝固は損傷した血管が出血するのを防ぐ重要なプロセス（止血）である。しかし、血管を通って流れる血液を阻む血餅（血栓症）又は身体のどこか他の場所の血管に沈着する血餅（血栓塞栓症）は、健康に深刻な脅威となる可能性がある。血栓症（例えば、急性心筋梗塞（AMI）、静脈血栓塞栓症等）は人の健康と生命を危険にさらす深刻な心血管疾患である。世界保健機関の2008年の統計によると、心臓血管疾患の発生率と死亡率が第一位とランクされてしている。毎年世界で約1,732万人が心血管疾患で死亡し、これが死亡率全体の30％を占めている。中国には2億9000万人の心血管疾患患者がおり、毎年約350万人が死亡し、これが死亡率全体の41％を占めている。世界疾病研究（GBD）の2010年の統計によると、脳卒中は我が国の住民の第一死因である。そのため、心血管疾患の治療に有効な薬物及び方法に関する研究が近年ますます注目されている。病理学的な血液凝固を治療するため、現在いくつかの抗凝固療法を用いることができる。例えば、伝統的な薬物ヘパリン、小分子ヘパリン又はワルファリン、又はトロンビン阻害剤の直接使用及びダビガトラン（Dabigatran）等。これらの治療法の一般的な欠点は、出血の危険性の増大である。多くの抗凝固剤に関して、有効用量（血栓症を予防する）と安全用量（出血の危険性がない最高用量）との間には十分な広い幅がなく、個人差によっては更に狭くなる。トロンビンを標的とするトロンビン拮抗薬を用いて血栓の形成を阻害することは、血栓症の臨床治療法の1つである。
【０００３】
凝固反応は複雑なシグナルカスケードプロセスであり、トロンビンはこのプロセスにおいて中心的な役割を果たす。トロンビンは、循環器系のフィブリノーゲンをフィブリン単量体（凝固してフィブリン、血餅の繊維マトリックスを形成することができる）に分解し、細胞を直接制御する。セリンプロテアーゼとして、それは血小板を変形させ、ADP、血小板活性化因子、セロトニン及びトロンボキサンA2ならびにケモカイン及び成長因子を放出する。また、接着分子P-セレクチン及びCD40リガンドの血小板表面への移動を促進し、次いでインテグリンallb/b3を活性化する。後者はフィブリノーゲン及びフォンビルブラント因子（vWF）と結合し、次いで血小板凝集を媒介する。トロンビンはまた、血小板表面の凝血促進活性を刺激し、次にトロンビンの発現を促進する。トロンビンは、培養された内皮細胞において、vWFの放出、細胞膜におけるP-セレクチンの出現及びケモカインの生成を促進する。これらの反応は、内皮細胞の表面への血小板及び白血球の結合を引き起こすと考えられている。内皮細胞は直ちにそれらの形状を変化させ、内皮細胞層の透過性が増加する。これらの反応は、血漿タンパク質の局部的な滲出を促進し、浮腫を促進すると予想される。
非内皮組織では、トロンビンは平滑筋細胞に作用することによって血管収縮を誘導する。in vitroでの培養線維芽細胞又は血管平滑筋細胞において、トロンビンはサイトカインの生成を調節し、有糸分裂を促進する。Tリンパ球では、カルシウムシグナル及び他の反応を誘発する。これらの細胞反応では、トロンビンが止血過程、炎症反応、及び免疫反応を増強する体の調節さえも伴う組織損傷と関連することが示される。これらの細胞反応では、また組織損傷に加えて、内皮細胞及び他のタイプの細胞におけるトロンビンが、また白血球性エキソサイトーシス、血管リモデリング及び/又は血管新生において役割を果たす可能性が示唆される。従って、トロンビンは潜在的な抗凝固剤及び抗血栓性の標的となっている。
【０００４】
単離された抗トロンビン抗体は、出血を促進又は有意に促進することなく、即ち、抗体分子が血管損傷（止血）に対する正常な生理学的応答を阻害又は実質的に阻害しないで、in vivoでトロンビンを阻害することができる。例えば、止血は抗体分子によって抑制されないか、又は最小限に抑制される（即ち、患者の健康に影響を与えることなく、又は更なる介入を必要とせずに僅かに阻害される）。出血は抗体分子によって増加しないか、又は最小限に増加する。
【０００５】
抗トロンビン抗体に関する特許開示としては、例えばWO2013123591、WO2014153195、WO2014202992及びWO2014202993のようないくつかあるが、これまでに承認された医薬品又は臨床研究に利用可能な抗トロンビン抗体はない。関連する臨床研究及び応用のために、新たな抗トロンビン抗体を更に開発する必要がある。本発明は、血栓症に対する高い親和性及び顕著な阻害活性を有する新規なトロンビン抗体を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、以下の配列から選択される1つ以上のCDR領域又は以下の配列と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列を含むトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
抗体重鎖可変領域のHCDR領域：配列番号:7、配列番号:8及び配列番号:21;及び
抗体軽鎖可変領域のLCDR領域：配列番号:10、配列番号:11及び配列番号:12;
ここで、配列番号:21の配列が、式（I）で表される:
DHYX1G X2SYVFD X3                (I);
式中、X1がH、I、L及びMから成る群より選択され；X2がN及びAから選択され；X3がY、S、L及びTから成る群より選択される。
【０００７】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号:7、配列番号:8及び配列番号:21で示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3、又は配列番号:7、配列番号:8及び配列番号:21と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、式（I）の配列番号:21の配列は、以下の配列から選択される：
DHYHGNSYVFDY          配列番号:9;
DHYIGASYVFDY          配列番号:23;
DHYLGNSYVFDS          配列番号:24;
DHYLGNSYVFDL          配列番号:25;又は
DHYMGNSYVFDT          配列番号:26。
【０００９】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号:10、配列番号:11及び配列番号:12で示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3、又は配列番号:10、配列番号:11及び配列番号:12と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントは、マウス抗体又はその機能的フラグメントである。
【００１１】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントは、更にマウスκ鎖もしくはその変異体に由来する軽鎖FR領域を含み、又は更にマウスλ鎖もしくはその変異体に由来する軽鎖FR領域を含む;及び/又はトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントは、更にマウスIgG1もしくはその変異体に由来する重鎖FR領域を含み、又は更にマウスIgG2もしくはその変異体に由来する重鎖FR領域を含み、又は更にマウスIgG3もしくはその変異体に由来する重鎖FR領域を含む。
【００１２】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号:5の重鎖可変領域及び配列番号:6の軽鎖可変領域を含む。
【００１３】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントは、更にマウスκ鎖もしくはその変異体に由来する軽鎖定常領域、又はマウスλ鎖もしくはその変異体に由来する軽鎖定常領域を含む;及び/又はトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントは、更にマウスIgG1もしくはその変異体に由来する重鎖FR領域、又はマウスIgG2もしくはその変異体に由来する重鎖FR領域、又はマウスIgG3もしくはその変異体に由来する重鎖FR領域を含む。
【００１４】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ抗体又はその機能的フラグメントである。
【００１５】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体又はその機能的フラグメントである。
【００１６】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、ヒト化抗体又はその機能的フラグメントの重鎖FR領域は、ヒト生殖系列重鎖IGHV3-23*04及びhjh6.1の組合せ配列又はその変異体配列に由来し;該ヒト化抗体又はその機能的フラグメントが、ヒト生殖系列重鎖IGHV3-23*04由来のFR1、FR2、FR3領域及びヒト生殖系列重鎖hjh6.1由来のFR4領域、又はその変異体配列を含む。
【００１７】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、ヒト化抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号:13の重鎖可変領域、又は配列番号:13と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列;好ましくは配列番号:13に0〜10個のアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、ヒト化抗体又はその機能的フラグメントは、0〜10個のアミノ酸逆突然変異を有する重鎖FR領域を含み、該逆突然変異が、好ましくはR87K、K98R、Q3K及びS49Aアミノ酸逆突然変異から成る群より選択される。
【００１９】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、ヒト化抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号:22又は配列番号:15の重鎖可変領域、又は配列番号:22又は配列番号:15と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列を含み;
ここで、該配列番号:22の配列が式（II）で表される：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVSNINSDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDHYX1GX2SYVFDX3WGQGTTVTVSS             (II);
式中、X1がH、I、L及びMから成る群より選択され；X2がN及びAから選択され；X3がY、S、L及びTから成る群より選択される。
【００２０】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、式（II）の配列番号:22の配列は、配列番号:14、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29及び配列番号:30から成る群より選択される。
【００２１】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、ヒト化抗体又はその機能的フラグメントの軽鎖FR領域は、ヒト生殖系列軽鎖IGKV1-39*01及びhjk4.1の組合せ配列又はその変異体配列に由来し;該ヒト化抗体又はその機能的フラグメントが、ヒト生殖系列軽鎖IGKV1-39*01由来のFR1、FR2、FR3領域及びhjk4.1由来のFR4領域又はその変異体配列を含む。
【００２２】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、ヒト化抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号:16の軽鎖可変領域、又は配列番号:16と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列;好ましくは配列番号:16と比較して0〜10個のアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、ヒト化抗体又はその機能的フラグメントは、0〜10個のアミノ酸逆突然変異を有する軽鎖FR領域を含み、該逆突然変異が、好ましくはY49S、T69K、K45R、L47I及びF71Yアミノ酸逆突然変異から成る群より選択される。
【００２４】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、ヒト化抗体又はその機能的フラグメントは、配列番号:17又は配列番号:18の軽鎖可変領域、又は配列番号:17又は配列番号:18と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む。
【００２５】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、ヒト化抗体は、
a）重鎖可変領域（その配列が、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、及び配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列から成る群より選択される。）及び/又は
b）軽鎖可変領域（その配列が、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、及び配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18と少なくとも95％の同一性があるアミノ酸配列から成る群より選択される。）を含む。
【００２６】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4、もしくはその変異体に由来する重鎖定常領域を含み、好ましくはヒトIgG4に由来する重鎖定常領域を含み、最も好ましくは配列番号:19の定常領域を含む。
【００２７】
トロンビン抗体又は抗原結合フラグメントは、更にヒトκ鎖、ヒトλ鎖又はその変異体に由来する軽鎖定常領域を含み、最も好ましくは配列番号:20の軽鎖定常領域を含む。
【００２８】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、抗原結合フラグメントは、Fab、Fab'、F(ab')2、単鎖抗体（scFv）、二量体化V領域（二重特異性抗体）、ジスルフィド安定化V領域（dsFv）及びCDRペプチドを含む抗原結合フラグメントから成る群より選択される。
【００２９】
本発明のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの別の好ましい実施形態では、トロンビン抗体又は抗原結合フラグメントは、トロンビンのR70、Y71、E72、R73、N74、I75及びY114から成る群より選択される1つ以上の残基に結合し；好ましくは、トロンビン抗体又は抗原結合フラグメントは、更にトロンビンの9、24、60、62、64、66、69、78及び113位の残基に結合する。
【００３０】
本発明は、更にトロンビンのR70、Y71、E72、R73、N74、I75及びY114から成る群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又は7つの残基に結合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、該トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントが、更にトロンビンの9、24、60、62、64、66、69、78及び113位の残基に結合する。
【００３１】
本発明は、更に治療有効量の上記のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント、及び１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
本発明は、更に上記のトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするDNA分子を提供する。
【００３３】
本発明は、更に上記のDNA分子を含む発現ベクターを提供する。
【００３４】
本発明は、更に上記の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。該宿主細胞が、原核細胞及び真核細胞から成る群より選択され、好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞である。
【００３５】
本発明は、更にトロンビン媒介性の疾患又は状態を治療するための医薬の調製における、トロンビン抗体又はその抗原結合フラグメント又は上記の医薬組成物の使用を提供する。該疾患又は状態が、好ましくは血栓症及び血栓塞栓症を含む血栓性疾患であり;より好ましくは静脈血栓症及び肺塞栓症、動脈血栓症、血栓症誘発性脳卒中及び末梢動脈形成、アテローム性動脈硬化症、脳動脈疾患、又は末梢動脈疾患であり；最も好ましくは静脈血栓症、血栓症誘発性脳卒中及びアテローム性動脈硬化症である。
【００３６】
本発明による抗体で診断され得る典型的な疾患としては、静脈血栓症及び肺塞栓症、動脈血栓症、血栓症誘発性脳卒中及び末梢動脈形成、アテローム性動脈硬化症、脳動脈疾患、又は末梢動脈疾患から成る群より選択される１つ以上の疾患を含む血栓障害（血栓症及び血栓塞栓症を含む）が含まれる。
【００３７】
一態様では、本発明は、有効量の抗トロンビン抗体を個体に投与することを含む、高コレステロール血症及び/又は静脈血栓症、血栓症誘発性脳卒中及びアテローム性動脈硬化症から選択される少なくとも1つの症状を治療又は予防する方法を提供する。本発明は、また薬剤の調製における細胞外又は循環トロンビンに対する有効量のトロンビン抗体の使用を提供する。該薬剤が、個体における血栓症及び/又は肺塞栓症、血栓症誘発性脳卒中及びアテローム性動脈硬化症から選択される少なくとも1つの症状を治療又は予防するために使用される。
【００３８】
一態様では、本発明は、ヒトトロンビンを検出又は測定するための薬剤を提供する。該薬剤が、上記の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】抗トロンビン抗体CH-1601のヒトトロンビナーゼ活性に及ぼす影響;本データは、CH-1601のトロンビンとの結合が、基質S2228に対するトロンビンの酵素活性に影響しなかったことを示す。
【図２】本発明の抗トロンビン抗体のヒトトロンビナーゼ活性及ぼす影響;本データは、H1601-008のトロンビンとの結合が、基質S2228に対するトロンビンの酵素活性に影響しなかったことを示す。
【図３】各濃度のトロンビン抗体の正常人における血漿APTT値に及ぼす影響;本データで示されたように、抗体CH-1601及びh1601-008濃度の増加に伴って、正常人の血漿におけるAPTT値も上昇し、h1601-008の場合では、最高濃度3200 nMにおいてAPTT値も28.7秒のピークまで増加した。
【図４】H1601-008の静脈内注射のサルAV-シャントにおける静脈血栓症に及ぼす影響
【図５】本発明の抗体のサル血漿のAPTT値に及ぼす影響
【図６】パパインで精製抗体H1601-008を切断する。
【図７】LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR3がトロンビンに強く結合しているFabの結晶構造を示す図
【図８】トロンビンのR62、Y71、E72、R73及びY114残基は、それぞれFabの4つの環と水素結合の相互作用を有する。本発明の詳細な説明用語
【００４０】
本発明をより容易に理解するため、以下に特定の技術的及び科学的用語を具体的に定義する。本明細書中の他の箇所で特に定義されていない限り、ここで使用される他の全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【００４１】
ここで使用される場合、アミノ酸の一文字コード及び三文字コードは、J. Biol. Chem, 243, (1968) p.3558に記載された通りである。
【００４２】
ここで使用される場合、「抗体」とは、2つの同一重鎖と2つの同一軽鎖との間のジスルフィド結合によって一緒に連結された4ペプチド鎖構造の免疫グロブリンをいう。異なる免疫グロブリン重鎖定常領域は、異なるアミノ酸組成及び順位を示し、従って異なる種類の抗原性を示す。従って、免疫グロブリンは、免疫グロブリンアイソタイプと呼ばれる、即ち、IgM、IgD、IgG、IgA及びIgEの5つのカテゴリーに分けることができ、それらの対応する重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。ヒンジ領域のアミノ酸組成及び重鎖ジスルフィド結合の数及び位置によって、同じタイプのIgは異なるサブカテゴリに分けることができ、例えば、IgGはIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4に分けることができる。異なる定常領域を考慮し、軽鎖はκ又はλ鎖に分けることができる。それぞれ5つのIgはκ又はλ鎖を有することができる。
【００４３】
本発明において、ここに記載の抗体軽鎖は、更にヒト又はマウスκ、λ鎖もしくはその変異体から成る軽鎖定常領域を含む。
【００４４】
本発明において、ここに記載の抗体重鎖は、更にヒト又はマウスIgG1、IgG2、IgG3、IgG4もしくはその変異体から成る重鎖定常領域を含む。
【００４５】
抗体重鎖及び軽鎖のN末端配列の近くでは、約110個のアミノ酸が大きく変化し、これは可変領域(FV領域)として知られている。残りのC-末端付近のアミノ酸配列部分は相対的に安定であり、定常領域として知られている。可変領域は、3つの超可変領域(HVR)及び4つの比較的安定した配列フレームワーク領域(FR)を含む。3つの超可変領域は抗体の特異性を決定し、相補性決定領域(CDR)としても知られている。各軽鎖可変領域（LCVR）及び各重鎖可変領域（HCVR）は3つのCDR領域及び4つのFR領域から成り、アミノ末端からカルボキシル末端への配列順位は：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4である。3つの軽鎖CDRとは、LCDR1、LCDR2及びLCDR3をいい;3つの重鎖CDRとは、HCDR1、HCDR2及びHCDR3をいう。ここでの抗体又は抗原結合フラグメントのLCVR及びHCVR領域におけるCDR領域アミノ酸残基の数及び位置は、既知のKabat付番基準(LCDR1-3、HCDE2-3)に従い、又はKabat及びChothia付番基準(HCDR1)に従う。
【００４６】
本発明の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体、好ましくはヒト化抗体を含む。
【００４７】
本発明で使用される用語「マウス抗体」とは、当分野で知られている知識及び技術に従って調製された抗ヒトトロンビンモノクローナル抗体をいう。調製の際に被験者にトロンビン抗原を注射した後、所望の配列又は機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離した。本発明の好ましい実施形態において、マウストロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントは、更にマウスκ、λ鎖、もしくはその変異体の軽鎖定常領域を含み、又は更にマウスIgG1、IgG2、IgG3、もしくはその変異体の重鎖定常領域を含む。
【００４８】
用語「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合することによって形成される抗体であり、該キメラ抗体がマウス抗体誘発性の免疫反応を緩和することができる。キメラ抗体を樹立するために、特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを最初に樹立し、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし、次いで、ヒト抗体の定常領域遺伝子を所望に応じてクローニングし、マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子と連結して発現ベクターに挿入できるキメラ遺伝子を形成し、最後にキメラ抗体分子を真核又は原核系で発現させる。本発明の好ましい実施形態では、トロンビンキメラ抗体の軽鎖は、更にヒトκ、λ鎖もしくはその変異体の軽鎖定常領域を含む。トロンビンキメラ抗体の重鎖は、更にヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4もしくはその変異体の重鎖定常領域を含み、好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の重鎖定常領域を含み、又は好ましくはヒトIgG1、IgG2又はIgG4、又はアミノ酸変異を有するその変異体（例えばYTE変異）の重鎖定常領域を含む。
【００４９】
用語「ヒト化抗体」とは、CDR移植抗体としても知られており、マウスCDR配列をヒト抗体の可変領域フレームワーク、即ち、異なるタイプのヒト生殖系列抗体フレームワーク配列間で産生される抗体に移植することによって生成される抗体をいう。ヒト化抗体は、多量のマウスタンパク質成分を有するキメラ抗体によって誘導される異種反応を克服する。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を網羅する公的なDNAデータベース又は公開された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列DNA配列は、「VBase」ヒト生殖細胞系列配列データベース（ウェブwww.mrccpe.com.ac.uk/vbaseで入手可能）に発見でき、またKabat, EA et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.にも発見できる。免疫原性還元の間の活性低下を回避するため、ヒト抗体の可変領域フレーム配列は最小限の逆突然変異を受けて活性を維持する。本発明のヒト化抗体は、ファージディスプレイによりCDR親和性成熟化に更に供されるヒト化抗体も含む。本発明の好ましい実施形態では、ヒト化トロンビン抗体のマウスCDR配列は、配列番号:7、8、9、10、11及び12から成る群より選択される。抗体の重鎖可変領域の重鎖FR配列が、ヒト生殖系列重鎖IGKV1-39*01及びhjk4.1の組合せ配列に由来し；該抗体の軽鎖可変領域の軽鎖FR配列が、ヒト生殖細胞系列重鎖IGHV3-23*04及びhjh6.1の組合せ配列に由来するようにヒト抗体の可変領域フレームが設計され、選択される。免疫原性の低下によって引き起こされる活性の低下を回避するために、ここに記載のヒト抗体の可変領域は、抗体の活性を維持するために最小限の逆突然変異を受けることができる。
【００５０】
CDRの移植は、抗原と接触するフレームワーク残基の変化によって、抗原に対するトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの親和性の減少をもたらし得る。そのような相互作用は、高度な体細胞の突然変異の結果であり得る。従って、このようなドナーフレームワークアミノ酸をヒト化抗体のフレームワークに移植することが依然として必要であろう。非ヒトトロンビン抗体又はその抗原結合フラグメントの抗原結合に関与するアミノ酸残基は、マウスモノクローナル抗体の可変領域配列及び構造を調べることによって同定することができる。生殖系列とは異なるCDRドナーフレームワーク中の残基のそれぞれは、関連性があると考えられ得る。最も密接に関連する種を決定することができない場合、その配列は、類似性パーセンテージが高いサブタイプコンセンサス配列又はマウス配列のコンセンサス配列と比較することができる。希少なフレーム残基は、結合に重要な役割を果たす高度な体細胞の突然変異の結果であると考えられている。
【００５１】
用語、抗体の「抗原結合フラグメント」又は「機能的フラグメント」とは、特異的に抗原（例えば、トロンビンタンパク質）と結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントをいう。抗体の抗原結合機能は全長抗体のフラグメントによって行うことができることが示されている。用語、抗体の「抗原結合フラグメント」に包含される結合フラグメントの例としては、（i）VL、VH、CL及びCH1ドメインから成る一価フラグメントであるFabフラグメント;（ii）ヒンジ領域上にジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメントであるF(ab')2フラグメント;（iii）VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメント;（iv）抗体の単一アームのVL及びVHドメインから成るFvフラグメント;（v）VHドメインから成る単一ドメイン又はdAbフラグメント(Ward et al., (1989) Nature10 341:544-546);（vi）分離された相補性決定領域（CDR）又は（vii）合成リンカーによって連結された2つ以上の単独CDRの任意な組み合わせがある。更に、Fvフラグメントの2つのドメインであるVL及びVHは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を用いて、それらをVL及びVH領域が対になって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって結合させることができる(単鎖Fv（scFv）として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242：423-426;及びHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。そのような単鎖抗体は、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語にも包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、フラグメントの機能は無処置の抗体と同じ方法でスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えDNA技術によって、又は無処置の免疫グロブリンを酵素的もしくは化学的に切断することによって製作され得る。該抗体は異なるアイソフォームの抗体であってもよい。例えばIgG（例えばIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4サブタイプ）、IgA1、IgA2、IgD、IgE又はIgM抗体。
【００５２】
用語「単鎖抗体」、「単鎖Fv」又は「scFv」とは、リンカーによって接続される抗体重鎖可変ドメイン（又は領域;VL）及び抗体軽鎖可変ドメイン（又は領域;VL）を含む分子をいう。このようなscFv分子は、一般構造：NH2-VL-リンカー-VH-COOH又はNH2-VH-リンカー-VL-COOHを有することができる。先行技術における好適なリンカーは、反復性GGGGSアミノ酸配列もしくはその変異体から成り、例えば1-4反復の変異体である(Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448)。本発明において使用され得る他のリンカーは、Alfthan et al., Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immuno.13:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56及びRoovers et al. (2001), Cancer Immunolに記載されたものである。
【００５３】
用語「CDR」とは、主に抗原結合に寄与する抗体の可変ドメイン内の6つの超可変領域のうちの1つをいう。6つのCDRの中、最も一般的に使用される定義の1つとしては、Kabat E.A.らが1991年に免疫学的観点かたのタンパク質の配列(NIH Publication 91-3242)で提示されたものがある。ここで使用されるように、CDRのKabatの定義は、軽鎖可変ドメイン(CDR Ll、CDR L2、CDR L3又はLl、L2、L3)のCDR1、CDR2、及びCDR3、ならびに重鎖可変ドメイン（CDR H2、CDR H3又はH2、H3）のCDR2及びCDR3のみに適用される。
【００５４】
ここで使用される用語「抗体フレームワーク」とは、該可変ドメインの抗原結合ループ（CDR）のための足場として働く、可変ドメインの一部（VL又はVHのいずれか）をいう。これは、本質的にCDRを持たない可変ドメインである。
【００５５】
用語「エピトープ」又は「抗原決定基」とは、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部位（例えば、トロンビン分子上の特定の部位）をいう。エピトープは、典型的には、独特の立体配座で少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個の連続又は非連続なアミノ酸を含む。例えば、分子生物学の方法におけるエピトープマッピングのプロトコル, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996) を参照されたい。
【００５６】
用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」及び「特異的に結合する」とは、抗体が所定の抗原におけるエピトープに結合することをいう。典型的には、抗体は約10-7 M未満で、例えば10-8 M、10-9 M又は10-10 M未満、又は更に低い親和性である。
【００５７】
用語「KD」又は「Kd」とは、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数をいう。
典型的には、本発明の抗体が、トロンビンに結合する場合の解離平衡定数（KD）は、例えば、BIACORE装置における表面プラズモン共鳴（SPR）の技術を用いて測定されるように、約10-7 M未満で、例えば約10-8 M、10-9 M又は10-10 M、又は更に低いである。
【００５８】
ここで使用されるように、用語「核酸分子」とは、DNA分子及びRNA分子をいう。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖DNAである。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合には、「効果的に連結される」。例えば、転写開始配列又は転写促進因子は、それが配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列に効果的に連結される。
【００５９】
用語「ベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。一実施形態では、ベクターのタイプは、追加のDNAセグメントが連結され得る環状二本鎖DNAループを指す「プラスミド」である。別の実施形態では、ベクターのタイプは、追加のDNAセグメントをウイルスゲノムに連結できるウイルスベクターである。本発明では、ベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律的複製できる（例えば、複製の細菌起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）、又は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより宿主ゲノム（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）と共に複製される。
【００６０】
抗体及び抗原結合フラグメントの製作方法及び精製方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Cold Spring Harborの抗体実験技術ガイド、第5〜8及び15章に発見できる。例えば、マウスをヒトトロンビン又はそのフラグメントで免疫化することができ、次いで、得られた抗体を、当技術分野で周知の従来法を用いて再生、精製及び配列決定することができる。抗原結合フラグメントは、従来法でも調製することができる。本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、非ヒト由来CDRに１つ以上のヒトフレームワーク領域（FR）を導入するように遺伝子操作される。ヒトFR生殖系列配列は、ImMunoGeneTics (IMGT)から、そのウェブサイトhttp://imgt.cines.frを通じて、又はThe Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351から得られる。
【００６１】
用語「宿主細胞」とは、発現ベクターが導入された細胞をいう。宿主細胞は、細菌、微生物、植物又は動物細胞を含むことができる。形質転換されやすい細菌には、大腸菌又はサルモネラ菌の菌株のような腸内細菌科のメンバー、枯草菌のようなバチルス科、肺炎球菌;連鎖球菌及びヘモフィルスインフルエンザ菌が含まれる。適切な微生物には、出芽酵母及びピキア・パストリスが含まれる。適切な動物宿主細胞系には、CHO（チャイニーズハムスター卵巣系）及びNS0細胞が含まれる。
【００６２】
本発明の操作された抗体又は抗原結合フラグメントは、従来法を用いて調製及び精製され得る。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするcDNA配列をクローニングし、GS発現ベクターに組み換えてもよい。次いで、組換え免疫グロブリン発現ベクターは、CHO細胞を安定的に導入することができる。当技術分野で周知のより推奨される方法として、哺乳動物発現系は、典型的にはFc領域の高度に安定なN末端における糖鎖修飾をもたらすであろう。安定なクローンは、ヒトトロンビンに特異的に結合する抗体の発現によって得られる。陽性クローンは、バイオリアクターにおいて抗体を製作するために無血清培地中で増殖させることができる。抗体が分泌された培養培地は、従来の技術により精製できる。例えば、培地を好都合に互換性のある緩衝液で平衡化されたプロテインA又はGセファロースFFカラムに負荷できる。該カラムを洗浄して非特異的結合成分を除去する。結合した抗体をPHグラジェントにより溶出し、抗体フラグメントをSDS-PAGEにより検出した後、プールする。一般的な技術を用いて該抗体をろ過し、濃縮できる。サイズ排除又はイオン交換を含む一般的な技術により可溶性混合物及び凝集物を効果的に除去できる。得られた生成物は直ちに、例えば-70℃で凍結してもよく、又は凍結乾燥してもよい。
【００６３】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官又は生物学的流体に適用される「投与」及び「治療」とは、外因性の医薬品、治療剤、診断剤、又は組成物を該動物、ヒト、被験体細胞、組織、器官、又は生物学的液体と接触させることをいう。「投与」及び「治療」とは、例えば、治療的、薬物動態学的、診断的、研究的及び実験的方法をいうことができる。細胞の処理は、試薬を該細胞と接触させること、及び試薬を流体と接触させることを含み、ここで、該流体が該細胞と接触している。また、例えば、細胞の「投与」及び「治療」は、試薬、診断や結合化合物、又は別の細胞によるin vitro及びex vivoでの処理も意味する。ヒト、獣医、又は研究対象に適用される「治療」とは、研究及び診断用途への治療的処置、予防的又は防止的な措置をいう。
【００６４】
「治療する」とは、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物のような治療剤を、その薬剤が既知の治療活性を有する1つ以上の疾患症状を有する患者の内部又は外部に投与することを意味する。典型的には、そのような症状の臨床的に測定可能な程度への退行を誘導するか、又はその進行を阻害するかにかかわらず、該薬剤が、処置された患者又は集団における1つ以上の疾患の症状を緩和するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患の症状を緩和するのに有効な治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、疾患の状態、患者の年齢及び体重、ならびに該患者における所望の反応を誘発する薬剤の能力等の因子によって変化し得る。疾患の症状が緩和されたかどうかは、該症状の重篤度又は進行状況を評価するために医師又は他の熟練した医療従事者が典型的に用いる任意の臨床測定によって評価することができる。本発明の実施形態（例えば、治療法又は製造の被験物）は、全ての患者において関心のある疾患の症状を緩和するのに有効ではない可能性があるが、当該分野において、例えばStudent's t-検定、chi-square検定、Mann及びWhitneyによるU-検定、Kruskal-Wallis検定（H-検定）、Jonckheere-Terpstra-検定及びWilcoxon-検定として知られるような統計的検査により決定された統計学的に有意な数の患者における標的疾患の症状を緩和すべきである。
【００６５】
「保存的修飾」又は「保存的置換又は置換」とは、タンパク質の中で類似の特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性/親水性、骨格コンフォメーション及び剛性等）を有する他のアミノ酸とのアミノ酸置換をいう。タンパク質の生物学的活性を変えることなく、該変化を頻繁にさせることができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一なアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないとを考える（例えば、Watson et al. (1987), 遺伝子の分子生物学、The Benjamin / Cummings Pub. Co., 第224頁（第4版）を参照）。更に、構造的又は機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を妨害する可能性は低い。
【００６６】
「有効量」には、症状又は病状の兆候を改善又は予防するのに十分な量が含まれる。有効量はまた、診断を可能にするか又は容易にするのに十分な量を意味する。特定の患者又は獣医学的被験対象に対する有効量は、治療される状態、患者の全般的な健康状態、投与の経路及び用量及び副作用の重症度等の要因によって変化し得る。有効量は、有意な副作用又は毒性作用を回避する最大用量又は投薬プロトコルであり得る。
【００６７】
「外来性の」とは、状況に応じて生物体、細胞又は人体の外で製作された物質のことをいう。「内在性の」とは、状況に応じて細胞、生物体又は人体の中で製作された物質のことをいう。
【００６８】
「相同性」とは、2つのポリヌクレオチド配列間又は2つのポリペプチド間の配列類似性をいう。比較される2つの配列の両方の位置が同じ塩基又はアミノ酸単量体サブユニットに占領される場合、例えば、2つのDNA分子のいずれの位置がアデニンに占領されるなら、該分子は該位置では相同である。2つの配列間の相同性のパーセンテージは、2つの配列によって共有される一致する又は相同な位置の数を、比較される位置の数で割ってから100で乗じた関数である。例えば、2つの配列中の10の位置のうちの6つが、配列が最適に整列されている時に一致又は相同であれば、該2つの配列が60％相同である。2つの配列中の100の位置のうちの95が、配列が最適に整列されている時に一致又は相同であれば、該2つの配列が95％相同である。一般に、2つの配列が整列して相同性を最大にする時に該比較が行われる。
【００６９】
ここで用いられるように、表現「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」は互換的に使用され、そのような表記は全て後代を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という用語は、転移の数を考慮することなく、主要な対象細胞及びそこから誘導される培養物を含む。意図的又は偶然の突然変異によって、全ての後代がDNA含量において精確に同一ではないことも理解される。最初に形質転換された細胞でスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異の後代も含まれる。異なる名称が意図されている場合は、その文脈から明らかであろう。
【００７０】
ここで用いられるように、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「PCR」とは、例えば、米国特許第4,683,195号に記載されたように、核酸、RNA及び/又はDNAの特定の部分の微量が増幅される手順又は技術をいう。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計できるように、関心領域の端部又は端部からの配列情報を利用可能にする必要があり、これらのプライマーは、増幅されるべき鋳型の対応する鎖と同一の配列又は類似の配列である。2つのプライマーの5'末端ヌクレオチドは、増幅されるべき物質の末端と同一であり得る。PCRは、特定のRNA配列、全ゲノムDNAからの特異的DNA配列、及び全細胞RNA、バクテリオファージ又はプラスミド配列等から転写されたcDNAを増幅するために使用され得る。一般に、Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich編、(1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.を参照されたい。ここで用いられるように、PCRは、核酸試験サンプルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応方法の一例であり、唯一の例ではなく、既知の核酸をプライマーとして使用すること、及び該核酸の特定部分を増幅又は生成するために核酸ポリメラーゼを使用することを含む。
【００７１】
「任意の」又は「任意に」は、続く事象又は状況が必ずしも起こらない場合があることを意味し、その記載は、事象又は状況が起こる又は起こらない場合を含む。例えば、「1つ〜3つの抗体重鎖可変領域を任意に含む」とは、特定の配列を有する抗体重鎖可変領域が必ずしも存在する必要はないことを意味する。
【００７２】
「薬学的組成物」とは、本発明による1つ以上の化合物又はその生理学的/薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを、他の化学成分、ならびに生理学的/薬学的に許容される担体及び賦形剤のような追加成分と共に含むものをいう。該医薬組成物は、生物体への投与を促進し、活性成分の吸収を促進し、それにより生物学的効果を発揮することを目的とする。
実施例と試験
【００７３】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。特定の条件が記載されていない本発明の実施例では、実験は一般に、Cold Spring Harborの抗体技術ラボマニュアル及び分子クローニングマニュアルに記載されているような通常の条件下で、又は材料又は製品の製造業者が提案した条件下で行われる。試薬の供給源が特に示されていない場合、該試薬が市販の慣用試薬である。
【実施例１】
【００７４】
トロンビン抗原及び検出タンパク質の調製
1．関連トロンビン及びプロトロンビン配列
ヒトプロトロンビン（h-プロトロンビン）、マウスプロトロンビン（m-プロトロンビン）及びカニクイザルプロトロンビン（cyno-プロトロンビン）をコードする配列は、CRO上海Xu Guan生物科学技術開発株式会社で合成された（上記プロトロンビンタンパク質は全て本発明者らによって設計されている）。3'末端にHis又はFlagコード配列付ワンステップPCRの後、Hisタグ付ヒトプロトロンビン（h-プロトロンビン-his）、Flagタグ付ヒトプロトロンビン（h-プロトロンビン-フラグ）、Hisタグ付マウスプロトロンビン（m-プロトロンビン-his）及びHisタグ付カニクイザルプロトロンビン（cyno-プロトロンビン-his）をpTT5ベクター(Biovector, Cat No.:102762)にそれぞれクローン化し、次に293細胞で一過的に発現される。組換え発現により得られたプロトロンビンを精製し、in vitroで活性化してトロンビンを得た。更に精製して、免疫用のFlagタグ付トロンビン（h-トロンビン-フラッグ）を得た。Hisタグ付ヒトトロンビン（h-トロンビン-His）、Hisタグ付マウストロンビン（m-トロンビン-His）及びHisタグ付カニクイザルトロンビン（cyno-トロンビン-His）をin vitroでのスクリーニングに使用した。
配列番号:1
Flagタグ付ヒトプロトロンビン(DYKDDDDK)
MAHVRGLQLPGCLALAALCSLVHSQHVFLAPQQARSLLQRVRRANTFLEEVRKGNLERECVEETCSYEEAFEALESSTATDVFWAKYTACETARTPRDKLAACLEGNCAEGLGTNYRGHVNITRSGIECQLWRSRYPHKPEINSTTHPGADLQENFCRNPDSSTTGPWCYTTDPTVRRQECSIPVCGQDQVTVAMTPRSEGSSVNLSPPLEQCVPDRGQQYQGRLAVTTHGLPCLAWASAQAKALSKHQDFNSAVQLVENFCRNPDGDEEGVWCYVAGKPGDFGYCDLNYCEEAVEEETGDGLDEDSDRAIEGRTATSEYQTFFNPRTFGSGEADCGLRPLFEKKSLEDKTERELLESYIDGRIVEGSDAEIGMSPWQVMLFRKSPQELLCGASLISDRWVLTAAHCLLYPPWDKNFTENDLLVRIGKHSRTRYERNIEKISMLEKIYIHPRYNWRENLDRDIALMKLKKPVAFSDYIHPVCLPDRETAASLLQAGYKGRVTGWGNLKETWTANVGKGQPSVLQVVNLPIVERPVCKDSTRIRITDNMFCAGYKPDEGKRGDACEGDSGGPFVMKSPFNNRWYQMGIVSWGEGCDRDGKYGFYTHVFRLKKWIQKVIDQFGEDYKDDDDK
配列番号:2
Hisタグ付ヒトプロトロンビン(HHHHHH)
MAHVRGLQLPGCLALAALCSLVHSQHVFLAPQQARSLLQRVRRANTFLEEVRKGNLERECVEETCSYEEAFEALESSTATDVFWAKYTACETARTPRDKLAACLEGNCAEGLGTNYRGHVNITRSGIECQLWRSRYPHKPEINSTTHPGADLQENFCRNPDSSTTGPWCYTTDPTVRRQECSIPVCGQDQVTVAMTPRSEGSSVNLSPPLEQCVPDRGQQYQGRLAVTTHGLPCLAWASAQAKALSKHQDFNSAVQLVENFCRNPDGDEEGVWCYVAGKPGDFGYCDLNYCEEAVEEETGDGLDEDSDRAIEGRTATSEYQTFFNPRTFGSGEADCGLRPLFEKKSLEDKTERELLESYIDGRIVEGSDAEIGMSPWQVMLFRKSPQELLCGASLISDRWVLTAAHCLLYPPWDKNFTENDLLVRIGKHSRTRYERNIEKISMLEKIYIHPRYNWRENLDRDIALMKLKKPVAFSDYIHPVCLPDRETAASLLQAGYKGRVTGWGNLKETWTANVGKGQPSVLQVVNLPIVERPVCKDSTRIRITDNMFCAGYKPDEGKRGDACEGDSGGPFVMKSPFNNRWYQMGIVSWGEGCDRDGKYGFYTHVFRLKKWIQKVIDQFGEHHHHHH
配列番号:3
Hisタグ付カニクイザルプロトロンビン
MAHVRGLQLPGCLALAALCSLVHSQHVFLAPQQALSLLQRVRRASSGFLEEVFKGNLERECVEETCSYEEAFEALESSTATDAFWAKYTACETARTSRDTLAACLEGNCAEDLGTNYRGHVNITRSGIECQLWRSRYPHKPEINSTTHPGADLQENFCRNPDSSTTGPWCYTTDPTVRREECSIPVCGQDQVTVVMTPRSSVNLSLPSEECVPDRGRQYQGHLAVTTHGLPCLAWASAQAKALSKHQDFDSAVQLVENFCRNPDGDEEGVWCYVAGKPGDFEYCDLNYCEEAVDEETGDGLGEDPDRAIEGRTATSEYQTFFDPRTFGLGEADCGLRPLFEKKSLEDKTEGELLESYIDGRIVEGWDAEIGMSPWQVMLFRKSPQELLCGASLISDRWVLTAAHCLLYPPWDKNFTENDLLVRIGKHSRTRYERNIEKISMLEKIYIHPRYNWRENLDRDIALMKLKKPITFSDYIHPVCLPDRETAASLFQAGYKGRVTGWGNLKETWTTNVGKVQPSVLQVVNLPIVERSVCKDSTRIRITDNMFCAGYKPGEGKRGDACEGDSGGPFVMKNPLNKRWYQMGIVSWGEGCDRDGKYGFYTHVFRLKKWIQKVIDQFGDHHHHHH
配列番号:4
Hisタグ付マウスプロトロンビン
MSHVRGLGLPGCLALAALVSLVHSQHVFLAPQQALSLLQRVRRANSGFLEELRKGNLERECVEEQCSYEEAFEALESPQDTDVFWAKYTVCDSVRKPRETFMDCLEGRCAMDLGVNYLGTVNVTHTGIQCQLWRSRYPHKPEINSTTHPGADLKENFCRNPDSSTTGPWCYTTDPTVRREECSVPVCGQEGRTTVVMTPRSGGSKDNLSPPLGQCLTERGRLYQGNLAVTTLGSPCLPWNSLPAKTLSKYQDFDPEVKLVENFCRNPDWDEEGAWCYVAGQPGDFEYCNLNYCEEAVGEENYDVDESIAGRTTDAEFHTFFNEKTFGLGEADCGLRPLFEKKSLKDTTEKELLDSYIDGRIVEGWDAEKGIAPWQVMLFRKSPQELLCGASLISDRWVLTAAHCILYPPWDKNFTENDLLVRIGKHSRTRYERNVEKISMLEKIYVHPRYNWRENLDRDIALLKLKKPVPFSDYIHPVCLPDKQTVTSLLRAGYKGRVTGWGNLRETWTTNINEIQPSVLQVVNLPIVERPVCKASTRIRITDNMFCAGFKVNDTKRGDACEGDSGGPFVMKSPFNNRWYQMGIVSWGEGCDRKGKYGFYTHVFRLKRWIQKVIDQFGHHHHHH
注：配列の二重下線部分はトロンビン配列である。配列の単一下線部分は、対応するタグ配列である。
2．in vitroでのプロトロンビン関連組換えタンパク質の精製及び活性化、トロンビン関連組換えタンパク質、ハイブリドーマ抗体及び組換え抗体の精製
1). Hisタグ付ヒトプロトロンビン、Hisタグ付マウスプロトロンビン及びHisタグ付カニクイザルプロトロンビンの精製工程
細胞上清サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去した。その後、PBS緩衝液（pH7.4）でニッケルカラムを平衡化し、カラム容量の2〜5倍量で洗浄し、上清サンプルをある流速でNiセファロースエクセルカラムに負荷した。A280での測定値がベースラインまで低下するまでPBSでカラムを洗浄した。次いで、PBS+10 mMイミダゾールでカラムを洗浄し、非特異的に結合する不純なタンパク質を洗い流し、次いで流出液を回収した。最後に、300 mMイミダゾールを含有するPBS緩衝液で標的タンパク質を溶出し、溶出ピークを収集した。収集された溶出液を濃縮し、続いてin vitroでの活性化及び更なる精製のために、脱塩カラムを用いてサンプル緩衝液をPBS溶液で交換した。
2). Flagタグ付組換えヒトプロトロンビンタンパク質の精製工程：
サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、適切な容量に濃縮した。その後、0.5×PBS（pH7.4）でflag親和性カラムを平衡化し、カラム容量の2〜5倍量で洗浄した。不純物を除去した後、上清サンプルをカラムに負荷した。A280での測定値がベースラインまで低下するまで、0.5×PBSでカラムを洗浄した。その後、PBSでカラムを洗浄し、不純なタンパク質を洗い流して回収した。100 μg/mlの3×Flagポリペプチドを含有するTBS緩衝液で標的タンパク質を溶出し、in vitroで更に活性化及び精製するために収集した。
3). プロトロンビン関連組換えタンパク質のin vitroでの活性化及び活性化トロンビン関連タンパク質の更なる精製
予備親和性クロマトグラフィー（ニッケルカラム又はFlag親和性カラム）によりプロトロンビンを得、エカリン酵素と100：1の質量比で均一に混合し、室温で終夜インキュベートした。活性化したサンプルを高速で遠心分離し、沈殿物を除去し、イオン交換カラム及びサイズ排除クロマトグラフィーSECを用いて更に精製した。
3.1）イオン交換
陽イオン交換カラムSP HPカラムでHisタグ付ヒトトロンビン、Hisタグ付マウストロンビン及びHisタグ付カニクイザルを精製した。陰イオン交換カラムQ HPカラムを用いてFlagタグ付ヒトトロンビンを更に精製した。陽イオン交換緩衝液Aは10 mM PB(pH6.8)緩衝液であり、緩衝液Bは10 mM PB(pH6.8),1 M NaCl緩衝液であった。陰イオン交換の場合、緩衝液Aは10 mM Tris-HCl(pH8.5)緩衝液であり、緩衝液Bは10 mM Tris-HCl(pH8.5),1 M NaCl緩衝液であった。
カラム容量の5倍量の緩衝液Aでイオン交換カラムを予め平衡化した。緩衝液Aで交換した活性化トロンビンサンプルをある流速で負荷した。負荷終了時に、A280での測定値がベースラインに低下するまでに緩衝液AでカラムAを平衡化し。緩衝液Bを用いて、カラム容量の20倍量で0％〜80％のグラジェント溶出により溶出ピークを収集した。標的タンパク質の成分をSDS-PAGEにより同定し、更に質量分析及びペプチドマッピングにより確認した。
3.2）サイズ排除クロマトグラフィー
PBS(pH7.4)でSECカラム（superdex75）を予め平衡化した。サンプルを負荷し、移動相のPBSで溶出し、溶出したピークを収集した。標的タンパク質の成分をSDS-PAGEにより同定し、更に質量分析及びペプチドマッピングにより確認した。
3.3）ハイブリドーマ及び組換え抗体の精製
細胞上清サンプルを高速で遠心分離し、不純物を除去した。プロテインGカラムでハイブリドーマ発現上清を精製し、組換え抗体発現上清をプロテインAカラムで精製した。A280での測定値がベースラインに低下するまでにPBS(pH7.4)でカラムを洗浄した。100 mM酢酸(pH3.0)で標的タンパク質を溶出し、1 M Tris-HCl(pH8.0)で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮し、PBSで平衡化したゲルクロマトグラフィーSuperdex200(GE)を用いて更に精製し、凝集ピークを除き、単量体のピークを収集し、使用のため等分した。
【実施例２】
【００７５】
抗ヒトトロンビンモノクローナル抗体の調製
1. 免疫化
マウスを免疫化し、抗ヒトトロンビンモノクローナル抗体を作製した。実験用SJL白マウス、雌、6週齢（北京Weitong Lihua実験動物技術有限公司、動物生産許可番号：SCXK (Beijing) 2012-0001）。給餌環境：SPFレベル。マウスを購入した後、12/12-時間の明/暗サイクル、温度20〜25℃、湿度40〜60％の実験室に該動物を1週間保管した。該環境に順応したマウスを以下のスキームに従って免疫化した。免疫抗原はFlagタグ付ヒトトロンビン（配列番号:1の二重下線で示す）であった。
免疫化スキーム：TiterMax(登録商標) Gold Adjuvant (Sigma, Cat No.: T2684)及びThermo Imject(登録商標) Alum (Thremo, Cat No.: 77161)でマウスを交差免疫した。Adjuvant (TiterMax(登録商標) Gold Adjuvant)と抗原の比は1：1で、Adjuvant (Thermo Imject(登録商標) Alum)と抗原の比は3：1であった。投与量は50 μg/マウス（初回免疫）及び25 μg/マウス（追加免疫）であった。抗原を乳化した後、0、14、28、42及び56日目に該マウスに接種した。
0日目に、投与量50 μg/マウスで該マウスに乳化抗原を腹腔内注射（i.p.）した。14日目に、投与量25 μg/マウスで該マウスを複数の部位（通常は背中の6〜8部位）に皮下注射（s.c.）した。28日目及び42日目に、背部の塊及び腹部の腫脹状態に応じて、背部又は腹腔への抗原注射を選択した。脾臓細胞融合の3日前に、投与量50 μg/マウスで生理食塩水を配合した抗原溶液をi.p.注射し、追加免疫を実施した。
22、36、50及び64日目に血液サンプルを採取し、ELISAによりマウス血清中の抗体力価を測定した。免疫化を4回行った後に、抗体力価が比較的に高く、血清中にプラットホームする傾向のあるタイターを有するマウスを脾細胞融合のために選択した。
2．脾細胞融合
最適化されたPEG媒介融合手順に従って、脾臓リンパ球を骨髄腫Sp2/0細胞(ATCC(登録商標) CRL-8287TM)と融合させ、ハイブリドーマ細胞を得た。密度0.5〜1×106/mlのMC半固体完全培地（20％FBS、1×HAT、1×OPI及び2％メチルセルロースを含むRPMI-1640培地）に得られたハイブリドーマ細胞を再懸濁し、35 mmの細胞培養プレートの中で、37℃、5％CO2で7〜9日間インキュベートした。融合後7〜9日目に、単細胞クローンを、200 μl/ウェルのHT完全培地（20％FBS、1×HAT及び1×OPIを含有するRPMI-1640培地）を含有する96ウェル細胞培養プレートに採取し、5％CO2、37℃で3日間培養した後、ELISAアッセイにより検出した。
3．ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
ハイブリドーマ細胞の増殖密度に応じて、ハイブリドーマ培養上清をトロンビン結合ELISA（試験1を参照）により検出した。そして、上記の結合ELISAの間に陽性細胞についてプロトロンビン結合ELISA試験を行った（試験3を参照）。陽性細胞を増殖させ、随時に凍結保存し、単細胞クローンが得られるまで細胞を2〜3回サブクローニングした。
各サブクローニング工程の後、細胞をトロンビン結合ELISA及びプロトロンビン結合ELISAに供した。上記スクリーニング実験によりハイブリドーマクローンmAb-1601を得、更に無血清細胞培養法により抗体を調製し、そして、試験例に用いるために該抗体を精製例で精製した。
4．陽性ハイブリドーマクローンの配列決定
該陽性ハイブリドーマからのクローニング配列の方法は以下の通りである：対数増殖期でのハイブリドーマ細胞を回収し、キットの説明書に従い、Trizol (Invitrogen, Cat No. 15596-018)でRNAを抽出し、そして、PrimeScriptTM逆転写酵素キット(Takara, Cat No.: 2680A)を用いて逆転写を行った。マウスIg-プライマーセット(Novagen, TB326 Rev. B 0503)を用いて逆転写で得られたcDNAをPCRで増幅し、配列決定会社で配列決定を行った。
陽性クローンmAb-1601のDNA配列に対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:5及び配列番号:6に示す。
ハイブリドーマから得られた重鎖可変領域：
EVKLVESEGGLVQPGSSLKLSCTASGFTFSDYYMAWVRQVPEKGLEWVANINSDGSSTYYLDSLKSRFIISRDNAKNILYLQMSSLKSEDTATYYCARDHYHGNSYVFDYWGQGTTLTVSS
配列番号:5
ハイブリドーマから得られた軽鎖可変領域:
DIQMTQSSSSFSVSRGNRVTITCKASEDIYNRLAWYQQKPGNAPRLIISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVGTYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIK
配列番号:6
注：順序はFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4であり、イタリック配列はFR配列を表し、下線付き配列はCDR配列を表す。
【表１】
2019510474.tif 000003
実施例4で陽性クローンmAb-1601をクローン化し、発現させ、キメラ抗体CH-1601を得た。該抗体のヒトトロンビン及びプロトロンビンに対する結合活性を測定した（試験1及び試験2）。同時に、キメラ抗体CH-1601について、サル属のトロンビンとの交差結合活性（試験3を参照）、ヒトトロンビンとの親和性（試験6参照）及びヒトトロンビン活性への影響について試験した（試験例5を参照）。その試験結果を以下の表2及び図1に示す。
【表２】
2019510474.tif 000004
表2は、CH-1601がヒト及びサルトロンビンを含む異なる種のトロンビンと強い結合能力を有するが、マウストロンビンとは結合しないことを示す。図1は、トロンビンへのCH-1601の結合が基質S2228に対するその酵素活性に影響しないことを示す。
【実施例３】
【００７６】
マウス抗ヒトトロンビンモノクローナル抗体のヒト化
1．ハイブリドーマクローンmAb-1601をヒト化するためのフレームワークの選択
IMGTヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子データベース及びMOEソフトウェアでの比較から、mAb-1601と高い相同性を有する重鎖及び軽鎖の可変領域生殖系列遺伝子を鋳型として選択し、2つのマウス抗体に由来するCDRを、対応するヒト起源の鋳型に移植して、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順序で可変領域配列を形成した。この中、アミノ酸残基は、Kabat付番方法により同定・注解した。
マウス抗体mAb-1601をヒト化するための軽鎖鋳型はIGKV1-39*01及びhjk4.1であり、ヒト化のための重鎖鋳型はIGHV3-23*04及びhjh6.1であり、ヒト化可変領域の配列は以下の通りである：
> h1601-001 (CDR graft)、ヒト化重鎖可変領域
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVSNINSDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDHYHGNSYVFDYWGQGTTVTVSS
配列番号:13
> h1601-001 (CDR graft)ヒト化軽鎖可変領域
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLAWYQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYWSTPWTFGGGTKVEIK
配列番号:16
注：順序はFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4であり、イタリック配列はFR配列であり、下線はCDR配列である。
2．ハイブリドーマクローンCH-1601の逆突然変異設計は下記の表3を参照：
【表３】
2019510474.tif 000005
注：例えば、Kabat付番方法によると、Q3Kは位置3でQからKへの逆突然変異を示す。Graftedは、マウス抗体CDRがヒト生殖系列FR配列に移植されたことを示す。
該突然変異後の具体的な配列を以下に示す：
h1601_VH.1B:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVSNINSDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDHYHGNSYVFDYWGQGTTVTVSS
配列番号:14
h1601_VH.1D:
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINSDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDHYHGNSYVFDYWGQGTTVTVSS
配列番号:15
h1601_VL.1A:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLAWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYWSTPWTFGGGTKVEIK
配列番号:17
h1601_VL.1C:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLAWYQQKPGKAPRLIISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYWSTPWTFGGGTKVEIK
配列番号:18
逆突然変異後の軽鎖及び重鎖の可変領域は組み換えられ、得られた抗体に含まれる軽鎖及び重鎖可変領域の組み合わせは以下の通りである：
【表４】
2019510474.tif 000006
下記の実施例4の調製方法に従って上記可変領域をクローニング及び精製し、試験1のELISA法により抗体のヒトトロンビンタンパク質との結合活性を検出した。更にin vivo又はin vitroで活性を測定するため、該試験の結果に応じて抗体を選択した。
【実施例４】
【００７７】
キメラ抗体及びヒト化抗体の調製
ヒト重鎖IgG4/軽鎖κ由来の定常領域を各可変領域と組み合わせ、抗体を構築し、S228P変異をFcに作製し、IgG4抗体の安定性を高めた。その機能を高めるため、当該分野で知られている他の突然変異も使用できる。
重鎖定常領域:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号:19
軽鎖定常領域:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号:20
1. キメラ抗体の分子クローニング
ハイブリドーマスクリーニングから得られた候補抗体分子を配列決定し、可変領域コード配列を得た。得られた配列に応じてプライマーを設計し、配列決定遺伝子を鋳型とし、各種抗体VH/VK遺伝子フラグメントをPCRにより構築し、次いで、発現ベクターpHr（シグナルペプチド及びhIgG4定常領域（CH1-FC/CL）フラグメントを有する）で再構築し、組換え抗体用の全長発現プラスミドVH-CH1 -FC-pHr/VL-CL-pHrを構築した。
2 ヒト化抗体の分子クローニング
設計されたヒト化抗体配列の遺伝コード最適化の後、優先なヒト遺伝子コードのコード配列を生成した。プライマーを設計し、抗体のVH/VK遺伝子フラグメントをPCRにより構築し、発現ベクターpHr（シグナルペプチド及び定常領域（CH1-FC/CL）フラグメントを有する）で再構築し、ヒト化抗体用の全長発現プラスミドVH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHrを構築した。
3. キメラ抗体及びヒト化抗体の発現及び精製
抗体軽鎖及び重鎖の発現プラスミドを1：1.5の比でHEK293E細胞に同時導入した。6日後に発現上清を収集し、高速遠心分離により不純物を除去し、次いでプロテインAカラムで精製した。A280での測定値がベースラインまで低下するまで、PBSでカラムを洗浄した。100 mM酢酸(pH3.0)で標的タンパク質を溶出し、1M Tris-HCl(pH8.0)で中和した。溶出液を適切に濃縮し、PBSで平衡化したゲルクロマトグラフィーSuperdex200(GE)により更に精製した。凝集ピークを除外し、単量体のピークを収集した。次いで、収集したサンプルを使用のために等分した。
【実施例５】
【００７８】
抗原エピトープの決定
パパインで精製した抗体H1601-008を切断した（図6）。Fabフラグメントを分離し、ヒトPPACK-トロンビンと組み合わせた。該PPACKはApexBio社から購入されたトロンビン阻害剤である。トロンビンは本特許の配列番号:1の二重下線の配列である。ヒトPPACK-トロンビン-FAB複合体を結晶化し、構造解析に使用した。得られた構造的統計結果は次の通りである：解像度はRfactor = 23.4％、Rfree = 27.2％であり、非対称ユニットにRamachandran：favored = 93.5％及び異常値=0％の2つの錯体がある。結晶構造では、FabのLCDR1、LCDR2、LCDR3及びHCDR3がトロンビンに強く結合していることが示された（図7）。
具体的には、トロンビンのR62、Y71、E72、R73、Y114残基は、Fabの4つの環と水素結合の相互作用を有する（図8）。本実施例におけるトロンビン残基番号の付番規則は、本発明のトロンビンフラグメント配列のN末端からC末端までの配列付番に従う。
抗体-トロンビン結合PISAの分析では、複合体における隠された表面が合計で803Å2であると示された。重鎖における接触残基（Kabat付番方法）は全てCDR中100、102、103、104、105、107、109である。CDRL1-KASEDIYNRLA、CDRL2-GATSLET、CDRL3-QQYWSTPWT、CDRH3-DHYHGNSYVFDY（下線部分が接触残基である）。CDRLが抗体の隠れた表面の57.3％を提供し、より重要であることが分かった。軽鎖における接触残基は、30、31、32、46、49、50、53、55、91、92、96である。
トロンビンにおける接触残基は9、24、60、62、64、66、69、70、71、72、73、74、75、78、113、114である。隠れた表面への単独寄与の中、最も重要なものはペプチドR70-Y71-E72-R73-N74-175及びY114である。
【実施例６】
【００７９】
h1601-008選択活性の改良
h1601-008に対する親和性成熟を実施し、トロンビンの親和性を増加させながら、プロトロンビンに対する結合活性を可能な限り低減又は維持することにした。これにより、2つの分子間でh1601-008の選択性が増加する。
M13ファージディスプレイ技術を用いて選択性を高めた。コドンベースのプライマー（プライマーの合成において、単一コドンは野生型コドンとNNKを含む。）を採用して各CDRに突然変異を導入し、各CDRについて別々のファージディスプレイライブラリを構築した。CDRの長さに基づいて、NNKとライブラリーに必要なライブラリーサイズの比率を調整した。具体的な計画を表5に示す。
【表５】
2019510474.tif 000007
構築された6個のライブラリーを、パニングのためのファージにパッケージングした：液相の中で高濃度のプロトロンビンに予め結合させ、次にビオチン化トロンビンと結合し、ストレプトアビジンにより捕捉し、溶離し、溶出し、次いで、次のラウンドのパニングのために大腸菌に再感染させた。パニングの各ラウンドにおいてビオチン化トロンビンの濃度は2〜5倍減少した。パニングを3ラウンド行った後、配列決定を検証するために各ライブラリーから単一クローンを選別した。HCDR3のみでは明らかなアミノ酸増加が見られた。CDR領域におけるアミノ酸残基の増加程度に応じてTM-1、TM-2、TM-4、TM-7等のいくつかのクローンを選択し、哺乳類細胞における発現のための全長Igを構築した。
選択されたクローンはHCDR3のみでh1601-008と異なっていた。関連するHCDR3式及びその対応する重鎖可変領域を以下に記載する。
スクリーニングで得られたHCDR3配列の式は以下の通りである：
DHYX1G X2SYVFD X3                                         配列番号:21;
更に、以下のように関連の重鎖可変領域配列の一般式は得られた：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVSNINSDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDHYX1GX2SYVFDX3WGQGTTVTVSS      配列番号:22;
式中、X1がH、I、L、Mから成る群より選択され;X2がN、Aから選択され;X3がY、S、L、Tから選択される。
得られた具体的な関連配列は表6に記載するが、これらに限定されない。
【表６】
2019510474.tif 000008
クローン化タンパク質を精製した後、ビアコアを用いてトロンビン及びプロトロンビンに対する親和性を測定した。
その結果、aTM-1の選択性は1.8倍（18.2/9.9）増加し、トロンビンに対する親和性は有意に増加したが、プロトロンビンに対する親和性も増加した。本結果を表10に示す。
生化学的な試験方法で本発明の抗体の性能及び利点を以下のように確認する。
【試験１】
【００８０】
トロンビン抗体のヒトトロンビンタンパク質との結合のELISAアッセイ
抗トロンビン抗体の結合能は、該抗体及びHisタグ付ヒトトロンビンのELISAアッセイにより測定した。ビオチン標識キット(Dongren Chemicals, Cat No.: K03)で標識されたHisタグ付トロンビンタンパク質を96ウェルのマイクロタイタープレート上にコーティングされたストレプトアビジンに結合させ、それをマイクロタイタープレートに固定した。抗体添加後のシグナル強度を用いて該抗体のトロンビンとの結合活性を測定した。具体的な実験方法は以下の通りである。
PBS緩衝液(pH7.4)(Sigma, Cat No.: P4417-100TAB)でストレプトアビジン(Sigma, Cat No.: S4762-5MG)を5 μg/mlの濃度に希釈し、50 μl/ウェルの容量で96ウェルのプレートに添加した後、プレートを37℃のインキュベーターの中で2時間インキュベートした。液体を廃棄した後、200 μl/ウェルの5％スキムミルク（光明スキムミルク）を含有するPBS中のブロッキング溶液でプレートをブロックし、37℃のインキュベーターの中で2.5時間又は4℃で終夜（16〜18時間）インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング溶液を廃棄し、PBST緩衝液（0.05％tween-20を含有するPBS、pH7.4）でプレートを5回洗浄した。ビオチン-ラベリングで標識したHisタグ付ヒトトロンビンタンパク質（配列番号:2、二重下線で表示）をサンプル希釈液（1％BSAを含有するPBS、PH7.4）で50 μg/mlに希釈し、50 μl/ウェルで各ウェルに添加した。次いで、プレートを37℃のインキュベーターの中で2時間又は終夜インキュベートした。インキュベーションの後、プレート中のブロッキング溶液を廃棄し、PBSTでプレートを6回洗浄し、そして、サンプル希釈液で各種濃度に希釈した試験抗体を50 μl/ウェルで添加し、プレートを37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションの後、PBSTでプレートを5回洗浄し、HRPで標識されたヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson Immuno Research, Cat No.: 109-035-003)を100 μl/ウェルで添加し、サンプル希釈液に希釈し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。PBSTでプレートを5回洗浄した後、TMB発色基質(KPL, Cat No.: 52-00-03)を50 μl/ウェルで各ウェルに添加し、室温で10〜15分間インキュベートし、50 μl/ウェルの1 M H2SO4を各ウェルに添加し、反応を停止させた。NOVOStarマイクロプレートリーダーで波長450 nmにおけるOD値を読み取った後、トロンビン抗体のヒトトロンビンへの結合のEC50値を計算した。その結果を表7に示す。
【表７】
2019510474.tif 000009
本データでは、本発明のスクリーニング方法により得られた全てのヒト化抗体は優れたヒトトロンビンタンパク質との結合活性を示したことが示された。
【試験２】
【００８１】
トロンビン抗体のヒトプロトロンビンタンパク質との結合のELISAアッセイ
プロトロンビンはトロンビンの前駆体であり、プロトロンビンの酵素分解及び活性化によりトロンビンを製作する。ELISAにより抗トロンビン抗体のh-プロトロンビンとの結合能を検出した。具体的な実験方法は以下の通りである。
PBS緩衝液(pH 7.4)(Sigma, Cat No.: P4417-100TAB)でHisタグ付ヒトプロトロンビン(配列番号:2）を10 μg/mlの濃度に希釈し、100 μl/ウェルの容量で96ウェルのプレートに加えた後、プレートを4℃で終夜インキュベートした。液体を廃棄した後、200 μl/ウェルの5％スキムミルク（光明スキムミルク）を含有するPBS中のブロッキング溶液でプレートをブロックし、37℃のインキュベーターの中で2.5時間インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング溶液を廃棄し、PBST緩衝液（0.05％tween-20を含有するPBS、pH7.4）でプレートを5回洗浄した後、サンプル希釈液（1％BSAを含有するPBS、pH7.4）でグラジェント希釈された試験抗体を50 μl/ウェルで添加し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。インキュベーションの後、PBSTでプレートを5回洗浄し、HRPで標識されたヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson Immuno Research, Cat No.: 109-035-003)を100 μl/ウェルで添加し、サンプル希釈液に希釈し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。PBSTでプレートを5回洗浄した後、TMB発色基質(KPL, Cat No.: 52-00-03)を50 μl/ウェルで各ウェルに添加し、室温で10〜15分間インキュベートし、50 μl/ウェルの1 M H2SO4を各ウェルに添加し、反応を停止させた。NOVOStarマイクロプレートリーダーで波長450 nmにおけるOD値を読み取った後、トロンビン抗体のヒトプロトロンビンへの結合のEC50値を計算した。
【試験３】
【００８２】
異なる種のトロンビンに対するトロンビン抗体の結合のための交差結合アッセイ
サル由来のトロンビンに対するスクリーニングされたトロンビン抗体のin vitro結合能力を試験するために、カニクイザルトロンビンをin vitro結合アッセイに使用した。
PBS緩衝液(pH7.4)(Sigma, Cat No.: P4417-100TAB)でHisタグ抗体(GenScript, Cat No.: A00174)を0.5 μg/mlの濃度に希釈し、100 μl/ウェルの容量で96ウェルのプレートに加えた後、プレートを37℃のインキュベーターの中で2時間インキュベートした。液体を廃棄した後、200 μl/ウェルの5％スキムミルク（光明スキムミルク）を含有するPBS中のブロッキング溶液でプレートをブロックし、37℃のインキュベーターの中で2.5時間又は4℃で終夜（16〜18時間）インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング溶液を廃棄し、PBST緩衝液（0.05％tween-20を含有するPBS、pH7.4）でプレートを5回洗浄した。サンプル希釈液（1％BSAを含有するPBS、PH7.4）でHisタグ付カニクイザルトロンビンタンパク質（配列番号:3、二重下線で表示）を0.5 μg/mlまで希釈し、50 μl/ウェルで各ウェルに添加した。次いで、プレートを37℃のインキュベーター中で2時間又は終夜インキュベートした。インキュベーションの後、プレート中のブロッキング溶液を廃棄し、PBSTでプレートを6回洗浄し、そして、50 μlのサンプル希釈液で各種濃度に希釈した試験抗体を添加し、プレートを37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションの後、PBSTでプレートを5回洗浄し、HRPで標識されたヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson Immuno Research, Cat No.: 109-035-003)を100 μl/ウェルで添加し、サンプル希釈液に希釈し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。PBSTでプレートを5回洗浄した後、TMB発色基質(KPL, Cat No.: 52-00-03)を50 μl/ウェルで各ウェルに添加し、室温で10〜15分間インキュベートし、50 μl/ウェルの1 M H2SO4を各ウェルに添加し、反応を停止させた。NOVOStarマイクロプレートリーダーで波長450 nmにおけるOD値を読み取った後、トロンビン抗体のカニクイザルトロンビンへの結合のEC50値を計算した。その結果を表8に示す。
【表８】
2019510474.tif 000010
本データでは、本発明の抗体は優れたサルトロンビンとの結合活性を示したことが示された。
【試験４】
【００８３】
トロンビン抗体の親和性のビアコアアッセイ
試験抗体の親和性捕捉のために、抗ヒトトラッピングキット(Cat No.: BR-1008-39, GE)の記載方法に従って、抗ヒト捕捉抗体(Cat No.: BR-1008-39, GE)をCM5バイオチップに共有結合させた。次に、トロンビン抗体及びHisタグ付ヒトトロンビンをバイオチップの表面に流し、ビアコア装置を用いて反応シグナルをリアルタイムで検出し、結合及び解離曲線を得、フィッティングによって親和性の値を得た。実験で各解離サイクルが終了した後、バイオチップを洗浄し、抗ヒトキャプチャーキットに提供された再生溶液で再生した。その結果を表9に示す。
【表９】
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本結果では、本発明中の抗体h1601-008及びh1601-009は、CH-160と同等の優れた結合活性及びヒトトロンビンに対する親和性を有することが実証された。
ファージディスプレイ技術（実施例6）によりスクリーニングされた抗体について親和性試験を実施した。得られた結果を表10に示す。
【表１０】
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上記から分かるように、ファージディスプレイ技術によりスクリーニングされた新規抗体は、トロンビンに対する結合活性が大きく改善され、選択性も僅かに増加した。
【試験５】
【００８４】
トロンビン抗体のトロンビン活性に及ぼす影響
本実験では、トロンビン抗体のトロンビン酵素の活性に及ぼす影響を、トロンビンのその基質S2228に対する酵素活性を測定することによって試験した。
Hisタグ付ヒトトロンビンをPBS緩衝液(pH7.4)で100 nMの濃度までグラジェント希釈し、壁が黒色；底が透明の96ウェルのプレートに25 μl/ウェルの容量で加えた。PBSで本発明の試験トロンビン抗体を2000 nM〜62.5 nM（1：2グラジェント希釈）の濃度までグラジェント希釈し、25 μl/ウェルの容量でプレートに加えた。室温で30〜60分間インキュベートした後、PBSでS2228（トロンビン活性を検出するための基質、Gill Biochemistry (Shanghai) Co., Ltd.により合成）を4 mMの濃度に希釈し、50 μl/ウェルで前のステップのプレートに加えた。陰性対照については、トロンビン又はS2228のみを加えた。室温で30分間インキュベートした後、NOVOStarマイクロプレートリーダーで波長450 nmでのOD値を読み取った。その結果を図2に示すが、その中、トロンビン及びS2228は、陰性対照のウェルで測定したOD値を示し、0.625：1、1.25：1、2.5：1、5：1、10：1、20：1は、試験抗体及びトロンビンの異なるモル比で測定したOD値を示す。
図2中の結果では、h1601-008のトロンビンへの結合が基質S2228に対する酵素活性には影響しないことが示された。
トロンビン抗体の薬力学的実験
【試験６】
【００８５】
正常なヒト血漿のAPTT検査
本実験では、正常なヒト血漿をIgG及び異なる濃度のトロンビン抗体と共にインキュベートし、本発明の抗体のAPTT値（活性化部分トロンボプラスチン時間）に対する効果を試験した。
IgGは陰性対照であり、プロテインA精製等の従来の親和性クロマトグラフィー法を用いて得られたヒト免疫グロブリンである。h1601-008は、本発明による異なる濃度の試験抗体である。
その結果を図3に示す。本データでは、抗体CH-1601及びh1601-008の濃度の増加に伴って、正常なヒト血漿のAPTT値も増加し、3200 nMの最高濃度では、h1601-008はAPTT値を28.7秒のピークに増加させたことが示された（表11）。
【表１１】
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【試験７】
【００８６】
カニクイザルの誘導循環モデル
16匹の健康なカニクイザル（雄と雌は半数ずつ、Hainan Jingang Biotechnology Limited by Share Ltdより提供）を実験環境に2週間順応させ、体重を測定した。これらを体重に応じて4つの群に分け、各群はサル4匹ずつを有した。該動物をZoletilで麻酔した後、更にペントバルビタールで麻酔した。手術前に、各群に下肢静脈を介して本発明の抗体及び対照薬物をゆっくり注射した（薬物及び投薬量については表12を参照）。37℃の恒温手術台の上で以下のステップを行った。鼠径部の下で大腿動脈及び静脈を左側から右側の順に外科的に分離した。手術により動静脈カテーテルを行った。カニューレを固定した後、動脈鉗子を外し（投与15分後に左側の動脈鉗子を外し、投与25分後に右側を外した。）、同時に計数し、血流を15分間持続させた。カニューレの2つの端部を止血剤又は血管鉗子で固定し、塞栓の脱落を防止した。シリコーンチューブを取り出し、生理食塩水が入ったシャーレに入れた。次いで、外科用ハサミを使って血栓の付いた凝血原系統を除去した。両末端をペーパータオル上に置き、水を3秒間吸収し、次いで精密電子秤で秤量し、血栓の正味重量を計算した。
【表１２】
2019510474.tif 000014
本実験結果を図4に示すが、H1601-008は3 mg/kg及び6 mg/kgの投与量でカニクイザルにおける血栓症の形成を有意に阻害した。陰性抗体群（IgG-6 mg/kg）の平均血栓重量と比較して統計的に有意な差があった。
統計的方法は、One-way ANOVA及びStudent's t-検定であり、群IgG、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001と比較した。
【試験８】
【００８７】
CT2値の決定及びトリートメントウインドウの推定
本実験では、本発明の抗体のAPTT値に及ぼす影響を、正常なカニクイザルの血漿を異なる濃度のトロンビン抗体と共にインキュベートすることにより試験した（試験6を参照）。
その実験結果を図5に示す。抗体H1601-008の濃度の増加に伴い、正常なサル血漿のAPTT値は明らかに延長された。H1601-008が最高濃度25600 nMであった時に、APTT値は66.9秒のピークに達した（表13）。
【表１３】
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【試験９】
【００８８】
本発明のトロンビン抗体の薬物動態試験
試験動物としてカニクイザルを用い、投与後のカニクイザルの血清における薬物の濃度をELISA（試験4を参照）により測定し、Winnolinソフトウェア及びEXCELにより試験薬物のt1/2及び主要なパラメーターを算出した。カニクイザルにおける本発明の化合物の薬物動態特性を調査し、評価した。
実験的なカニクイザルは、一般級、雄、3〜5歳、3.5〜4.5 kg、成都Huaxi Hai医薬技術有限公司により飼育され、飼育環境：通常の部屋。該カニクイザルを12/12時間の明/暗サイクル、温度16〜26℃、相対湿度40〜60％の実験環境に3日以上適応させた。該カニクイザルを各群3匹ずつに群分した。実験の日に、カニクイザルにそれぞれ投与量3 mg/kg及び10 mg/kgで試験薬物を静脈注射した。静脈注射の容量は10 ml/kgで、投与速度は2〜4 ml/分であった。
血液の採取時点は、投与後0.25時間、2時間、4時間、8時間、1日、2日、3日、4日、7日、10日、14日、21日、28日、35日であった。各回では約1 mLの血液を採取し、抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを使用し、サンプルを氷の中に一時保存し、1800 g、2〜8℃で10分間遠心分離し、-70℃で保存した。
ELISAでカニクイザルの血清における薬物の濃度を測定し、Winnolinソフトウェア及びEXCELにより試験薬物のt1/2及び主要なパラメーターを算出した。その結果を以下に示す。
本発明の抗体の薬物動態パラメーターを以下の表14に示す。
【表１４】
2019510474.tif 000016
結論：本発明の抗体の薬物動態特性は良好である。
【図１】
2019510474.tif 000017
【図２】
2019510474.tif 000018
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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