(57)【要約】治療用タンパク質、抗体、ベクター、並びにウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを産生することができる細胞及び細胞株が開示される。細胞及び／又は細胞株は、内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ−／−）又はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ−／−）遺伝子の一方又は両方のいずれかに、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳの発現又は機能が実質的に低下するか又は排除されるような突然変異又は欠失を有し得る。【選択図】  図２
2019509748.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的な内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及び／又はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を発現しないヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞。
【請求項２】
機能的な内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及び／又はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を発現しないヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株。
【請求項３】
第１の異種核酸配列で安定に又は一過性にトランスフェクトされ、任意選択で、第２の異種核酸配列で安定に又は一過性にトランスフェクトされた、請求項１又は２に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項４】
第１の異種核酸配列及び第１の選択可能なマーカーで安定に又は一過性にトランスフェクトされ、任意選択で、第２の異種核酸配列及び第２の選択可能なマーカーで安定に又は一過性にトランスフェクトされた、請求項１又は２に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項５】
前記第１の異種核酸配列が、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードし、任意選択の第２の異種核酸配列が、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする、請求項３又は４に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項６】
前記第１の異種核酸配列によりコードされた前記治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列と、前記任意選択の第２の異種核酸配列によりコードされた前記治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列とが、同じであるか又は異なる、請求項４に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項７】
前記第１の又は第２の選択可能なマーカーが、抗生物質に対する耐性を提供しない、請求項４に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項８】
前記第１の又は第２の選択可能なマーカーが、前記第１の及び／又は第２の異種核酸配列を増幅する手段を提供する、請求項４に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項９】
前記第１の又は第２の選択可能なマーカーが、ＤＨＦＲ機能を有するタンパク質をコードする核酸を含む、請求項４に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項１０】
前記第１の又は第２の選択可能なマーカーが、ＧＳ機能を有するタンパク質をコードする核酸を含む、請求項４に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項１１】
前記第１の選択可能なマーカーが、ＤＨＦＲ機能を有するタンパク質をコードする核酸を含み、前記第２の選択可能なマーカーが、ＧＳ機能を有するタンパク質をコードする核酸を含む、請求項４に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項１２】
前記第１の異種核酸配列が第１のベクターを含み、前記任意選択の第２の異種核酸配列が第２のベクターを含む、請求項３〜１１のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項１３】
前記第１のベクターと任意選択の第２のベクターとが、同じであるか又は異なる、請求項１１又は１２に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項１４】
前記第１のベクター及び任意選択の第２のベクターが、ＤＨＦＲ機能を有するタンパク質をコードする核酸又はＧＳ機能を有するタンパク質をコードする核酸を含む選択可能なマーカーを各々含む、請求項１１又は１２に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項１５】
前記第１のベクターが第１のウイルスベクターを含み、任意選択の第２のベクターが第２のウイルスベクターを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項１６】
前記第１の又は第２のウイルスベクターが、ＡＡＶベクターゲノムを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項１７】
ＡＡＶベクターゲノムを各々含む、第１の及び第２のウイルスベクターを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項１８】
前記ＡＡＶベクターゲノムが、前記異種核酸配列の５’及び／又は３’末端に隣接する１つ又は２つのＡＡＶのＩＴＲを含む、請求項１７に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項１９】
前記ＨＥＫ細胞又は細胞株中における前記異種核酸配列及び／又はベクター及び／又はウイルスベクター及び／又はＡＡＶベクターゲノムのコピー数が、細胞１つ当たり１〜５コピー、細胞１つ当たり５〜１０コピー、１０〜５０コピー／細胞、細胞１つ当たり５０〜１００コピー、細胞１つ当たり１００〜２５０コピー、細胞１つ当たり２５０〜５００コピー、細胞１つ当たり５００〜１，０００コピー、細胞１つ当たり１，０００〜２，０００コピー、又は細胞１つ当たり約２，０００、３，０００、４，０００若しくは５，０００コピーであるか若しくはそれよりも多い、任意選択で、コピー数は、多くの継代、例えば、少なくとも５又はそれを超えて、１０、１５又はそれを超える継代にわたって安定であると思われる、請求項４〜１８のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項２０】
前記ＨＥＫ細胞又は細胞株中における前記ＡＡＶベクターゲノムのコピー数が、細胞１つ当たり少なくとも１，０００コピーであり、前記ｒＡＡＶベクター粒子の収率が、ＨＥＫ細胞又は前記ＨＥＫ細胞株のローラーボトルから、任意選択で少なくとも１×１０８ｖｇ／ｍｌ、又は少なくとも１×１０９ｖｇ／ｍｌ、又は少なくとも１×１０１０ｖｇ／ｍｌ、又は少なくとも１×１０１１ｖｇ／ｍｌ又は少なくとも２×１０１１ｖｇ／ｍｌである、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項２１】
ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ配列をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項２２】
前記ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ配列が、一過性に又は安定にのいずれかで前記ＨＥＫ細胞又は細胞株にトランスフェクトされたプラスミドにより提供される、請求項２０に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項２３】
ＡＡＶヘルパー機能配列をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項２４】
ＨＥＫ２９３である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項２５】
培養培地又は成長培地中の、又は長期貯蔵に適当な培地中の、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項２６】
メトトレキセート（ＭＴＸ）及び／又はメチオニンスルホキサミン（ＭＳＸ）を含む培養培地又は成長中の、請求項９〜２５のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項２７】
前記異種核酸配列をパッケージングされたｒＡＡＶベクター粒子を産生する、請求項６〜２６のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項２８】
前記ｒＡＡＶベクター粒子が、機能的な内因性ＤＨＦＲ及び／又はＧＳを発現し、前記異種核酸配列を有するＡＡＶベクターゲノムで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞により産生される量を超える量で、産生される、請求項２７に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項２９】
産生された前記ＡＡＶベクター粒子が、ＡＡＶの空のカプシド及び／又は機能的な内因性ＤＨＦＲ及び／又はＧＳを発現しており、前記異種核酸配列を有するｒＡＡＶベクターゲノムで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞により産生された混入ＤＮＡをパッケージングしているｒＡＡＶ粒子の量よりも少ない量のｒＡＡＶの空のカプシド、及び／又はそれよりも少ない量の混入ＤＮＡをパッケージングしているｒＡＡＶ粒子を含有する、請求項２７に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項３０】
前記異種核酸配列が、治療用タンパク質又は阻害性核酸配列をコードする、請求項３〜２９のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項３１】
前記治療用タンパク質が、血液凝固因子又は免疫グロブリン配列を含む、請求項３０に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項３２】
前記阻害性核酸配列が、小さい若しくは短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小さい若しくは短い干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、ｔｒａｎｓ−スプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡを含む、請求項３０に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項３３】
前記第１の異種核酸配列を安定にトランスフェクトされた、請求項３〜３２のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項３４】
前記第１の及び前記第２の異種核酸配列を安定にトランスフェクトされた、請求項３〜３２のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株。
【請求項３５】
請求項１５〜３４のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株から単離された又は精製されたウイルス粒子又はｒＡＡＶベクター粒子。
【請求項３６】
請求項５〜３４のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株から単離された又は精製された治療用タンパク質。
【請求項３７】
治療用タンパク質、ウイルスベクター又はｒＡＡＶベクター粒子を製造する方法であって、請求項５〜３４のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株を、前記治療用タンパク質、ウイルスベクター又はｒＡＡＶベクター粒子の産生及び／又は分泌を可能にする条件下で培養して、前記治療用タンパク質、ウイルスベクター又はｒＡＡＶベクター粒子を、前記細胞培養物、培養培地、又は細胞培養物及び培養培地から単離又は精製するステップを含む、方法。
【請求項３８】
ｒＡＡＶベクター粒子を製造する方法であって、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞又は細胞株を、前記ｒＡＡＶベクター粒子の産生及び／又は分泌を可能にする条件下で培養して、前記ｒＡＡＶベクター粒子を、前記細胞培養物、培養培地、又は細胞培養物及び培養培地から単離又は精製するステップを含み、前記ＨＥＫ細胞又は細胞株が、細胞１つ当たり少なくとも１，０００コピーのＡＡＶベクターゲノムを有する場合、前記ｒＡＡＶベクター粒子の収率は、ＨＥＫ細胞又は前記ＨＥＫ細胞株の少なくとも２×１０１１ｖｇ／ローラーボトルである、方法。
【請求項３９】
前記第１の及び／又は第２の異種核酸配列が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３及びＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン−１及びネトリン−２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子生成物をコードする、請求項３〜３８のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞若しくは細胞株又は方法。
【請求項４０】
前記ｒＡＡＶベクター粒子が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３及びＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン−１及びネトリン−２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子生成物をコードする前記第１の及び／又は前記第２の異種核酸配列を含む、請求項２３〜２９、３７又は３８のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞若しくは細胞株又は方法。
【請求項４１】
前記第１の及び／又は第２の異種核酸配列が、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１〜ＩＬ−１７）、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ分子からなる群から選択される遺伝子生成物をコードする、請求項３〜３８のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞若しくは細胞株又は方法。
【請求項４２】
前記ｒＡＡＶベクター粒子が、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１〜ＩＬ−１７）、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ分子からなる群から選択される遺伝子生成物をコードする前記第１の及び／又は前記第２の異種核酸配列を含む、請求項２３〜２９、３７又は３８のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞若しくは細胞株又は方法。
【請求項４３】
前記第１の及び／又は第２の異種核酸配列が、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータ−シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、ＲＰＥ６５、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィンｃＤＮＡ配列からなる群から選択される、先天性のエラーの修正に有用なタンパク質をコードする、請求項３〜３８のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞若しくは細胞株又は方法。
【請求項４４】
前記ｒＡＡＶベクター粒子が、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータ−シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、ＲＰＥ６５、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィンｃＤＮＡ配列からなる群から選択される、先天性のエラーの修正に有用なタンパク質をコードする前記第１の及び／又は前記第２の異種核酸配列を含む、請求項２３〜２９、３７又は３８のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞若しくは細胞株又は方法。
【請求項４５】
機能的な内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を発現しないヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株を製造する方法であって、前記内因性ＤＨＦＲ遺伝子を突然変異させるか又はノックアウトするステップを含む、方法。
【請求項４６】
機能的な内因性グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を発現しないヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株を製造する方法であって、前記内因性ＧＳ遺伝子を突然変異させるか又はノックアウトするステップを含む、方法。
【請求項４７】
機能的な内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を発現しないヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株を製造する方法であって、前記内因性ＤＨＦＲ遺伝子及びＧＳ遺伝子を突然変異させるか又はノックアウトするステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0002]グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）は、アミノ酸Ｌ−グルタミンの合成における酵素である。それゆえに、ＧＳ陰性の細胞株はＬ−グルタミンのために栄養要求性である。ＧＳは、組換えタンパク質発現系に基づくＣＨＯ細胞における選択マーカー遺伝子として報告されている（Ｗｕｒｍら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：１３９３〜１３９８）。ＧＳ遺伝子を含有する発現カセットは、カセットがＧＳ陰性のＣＨＯ株に導入されたときに、ＧＳ阻害剤のメチオニンスルホキシミンを使用して選択することができる。
【０００２】
[0003]ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、５，６，７，８−テトラヒドロフォレート：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ）は、真核細胞及び原核細胞の両方における酵素であり、ジヒドロフォレートのテトラヒドロフォレート（チミジレート、プリンヌクレオチド、グリシン及びメチル化合物の生合成における一炭素単位の必須担体）へのＮＡＤＰＨ依存性の還元を触媒する。ＤＨＦＲ欠損細胞は、フォレート代謝に関与するある種の因子が補完された培地でのみ、又はＤＨＦＲが細胞に、例えば、導入遺伝子として提供された場合、成長する。
【発明の概要】
【０００３】
[0004]治療用タンパク質、抗体、ベクター、並びにウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを産生することができる細胞及び細胞株が、本明細書で開示される。細胞及び／又は細胞株は、内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ−／−）又はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ−／−）遺伝子の一方又は両方のいずれかに、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳの発現又は機能が実質的に低下するか又は排除されるような突然変異又は欠失を有し得る。
【０００４】
[0005]低下は、例えば、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳの遺伝子のうちの単一の対立遺伝子のノックアウトにより達成され得る。低下は、対応するタンパク質の機能又は活性を低下させる、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳ遺伝子における突然変異（例えば、置換又は欠失）により達成され得る。排除は、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳ遺伝子の二対立遺伝子のノックアウトにより達成され得る。
【０００５】
[0006]特定の実施形態では、本発明の細胞及び／又は細胞株は、ＨＥＫ２９３などのヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞若しくは細胞株に基づくか又はそれらに由来する。ＨＥＫ２９３などのヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又は細胞株は、本明細書で開示されるように、内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ−／−）又はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ−／−）遺伝子の一方又は両方のいずれかに、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質の発現及び／又は機能が実質的に低下するか又は排除されるような突然変異又は欠失を有する。
【０００６】
[0007]特定の実施形態では、発明の細胞及び／又は細胞株は、ヒト腺癌肺胞の基底上皮細胞若しくは細胞株に基づくか又はそれらに由来する。ヒトＡ４５９細胞又は細胞株は、本明細書で開示されるように、内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ−／−）又はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ−／−）遺伝子の一方又は両方のいずれかにＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質の発現及び／又は機能が実質的に低下するか又は排除されるような突然変異又は欠失を有する。
【０００７】
[0008]特定の実施形態では、発明の細胞及び／又は細胞株は、アフリカミドリザルの腎臓に基づくか又はそれらに由来する。ベロ細胞又は細胞株は、本明細書で開示されるように、内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ−／−）又はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ−／−）遺伝子の一方又は両方のいずれかに、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質の発現及び／又は機能が実質的に低下するか又は排除されるような突然変異又は欠失を有する。
【０００８】
[0009]細胞株は、個々の細胞から選択され得る（クローン）。クローンが、拡大されて、順送りで、内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ−／−）又はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ−／−）遺伝子の一方又は両方のいずれかにＤＨＦＲ及び／又はＧＳの発現及び／又は機能が実質的に低下するか又は排除されるような突然変異又は欠失を有するＨＥＫ細胞、例えば、ＨＥＫ２９３、ヒトＡ４５９細胞及び／又はベロ細胞の安定な細胞株を提供することができる。
【０００９】
[0010]本明細書において、幾つかの態様では、機能的な内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及び／又はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を発現しないヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、ヒトＡ４５９細胞及びベロ細胞が開示される。本明細書において、ある態様では、機能的な内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及び／又はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を発現しないヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株、ヒトＡ４５９細胞株及びベロ細胞株が提示される。
【００１０】
[0011]幾つかの実施形態では、ＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株は、第１の異種核酸配列で安定に又は一過性にトランスフェクトされ、任意選択で、第２の異種核酸配列で安定に又は一過性にトランスフェクトされる。幾つかの実施形態では、ＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株は、第１の異種核酸配列及び第１の選択可能なマーカーで安定に又は一過性にトランスフェクトされ、任意選択で第２の異種核酸配列及び第２の選択可能なマーカーで安定に又は一過性にトランスフェクトされる。ある実施形態では、第１の異種核酸配列は、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードし、ある実施形態では、第２の異種核酸配列が、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする。第１の異種核酸配列によりコードされる治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列と、任意選択の第２の異種核酸配列によりコードされる治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列とは、同じであっても異なっていてもよい。幾つかの実施形態では、第１の及び／又は第２の選択可能なマーカーは、抗生物質に対する耐性を示さない。ある実施形態では、第１の及び／又は第２の選択可能なマーカーは、第１の及び／又は第２の異種核酸配列を増幅する手段を提供する。幾つかの態様では、第１の及び／又は第２の選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ機能を有するタンパク質をコードする核酸を含む。幾つかの態様では、第１の及び／又は第２の選択可能なマーカーは、ＧＳ機能を有するタンパク質をコードする核酸を含む。幾つかの実施形態では、第１の選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ機能を有するタンパク質をコードする核酸を含み、第２の選択可能なマーカーは、ＧＳ機能を有するタンパク質をコードする核酸を含む。
【００１１】
[0012]本明細書に記載されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株の幾つかの態様では、第１の異種核酸配列は第１のベクターを含み、幾つかの実施形態では、任意選択の第２の異種核酸配列は、第２のベクターを含む。第１のベクターと任意選択の第２のベクターとは、同じであっても異なっていてもよい。幾つかの実施形態では、第１のベクター及び任意選択の第２のベクターは、各々、ＤＨＦＲ機能を有するタンパク質をコードする核酸、又はＧＳ機能を有するタンパク質をコードする核酸を含む選択可能なマーカーを含む。ある実施形態では、第１のベクターは第１のウイルスベクターを含み、任意選択の第２のベクターは第２のウイルスベクターを含む。幾つかの実施形態では、第１の及び／又は第２のウイルスベクターは、ＡＡＶベクターゲノムを含む。ＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株が、第１の及び第２のウイルスベクターを含む幾つかの実施形態では、ウイルスベクターの各々は、ＡＡＶベクターゲノム、又はその一部を含む。ある実施形態では、ＡＡＶベクターゲノムは、異種核酸配列の５’及び／又は３’末端に隣接する１つ又は２つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む。
【００１２】
[0013]ある態様では、ＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株中における異種核酸配列及び／又はベクター及び／又はウイルスベクター及び／又はＡＡＶベクターゲノムのコピー数は、細胞１つ当たり１０〜５０００コピーの間である。幾つかの実施形態では、ＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株中における異種核酸配列及び／又はベクター及び／又はウイルスベクター及び／又はＡＡＶベクターゲノムのコピー数は、細胞１つ当たり１〜５コピー、細胞１つ当たり５〜１０コピー、１０〜５０コピー／細胞、細胞１つ当たり５０〜１００コピー、細胞１つ当たり１００〜２５０コピー、細胞１つ当たり２５０〜５００コピー、細胞１つ当たり５００〜１，０００コピー、細胞１つ当たり１，０００〜２，０００コピーの間であり、又は細胞１つ当たり約２，０００、３，０００、４，０００若しくは５，０００コピーであるか若しくはそれよりも多い。ある実施形態では、ＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株中におけるＡＡＶベクターゲノムのコピー数は、細胞１つ当たり少なくとも１，０００コピーであり、ｒＡＡＶベクター粒子の収率は、ＨＥＫ細胞若しくはＨＥＫ細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株のローラーボトルから、少なくとも１×１０８ｖｇ／ｍｌ、少なくとも１×１０９ｖｇ／ｍｌ、少なくとも１×１０１０ｖｇ／ｍｌ、少なくとも１×１０１１ｖｇ／ｍｌ又は少なくとも２×１０１１ｖｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態では、コピー数は、多くの継代、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、又はより多くの継代にわたって安定であると思われ、ＡＡＶベクターの産生は安定で、例えば、任意のより少ない細胞継代から産生される量の約１０〜３０％以内で一貫している。
【００１３】
[0014]幾つかの態様では、本明細書で提示されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株は、ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ配列をさらに含む。幾つかの実施形態では、ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐの配列は、ＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株に一過性に又は安定にのいずれかでトランスフェクトされたプラスミドにより提供される。幾つかの実施形態では、本明細書で提示されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株は、ＡＡＶのヘルパー機能配列をさらに含む。
【００１４】
[0015]ある態様では、本明細書で提示されたＨＥＫ細胞又はＨＥＫ細胞株はＨＥＫ２９３である。
【００１５】
[0016]幾つかの実施形態では、本明細書で提示されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株は、培養又は成長培地中に又は長期貯蔵のために適した培地中にある。幾つかの実施形態では、培養培地又は成長は、メトトレキセート（ＭＴＸ）及び／又はメチオニンスルホキサミン（ＭＳＸ）を含む。
【００１６】
[0017]ある態様では、本明細書で提示されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株は、１種又は複数の異種核酸配列（例えば、本明細書に記載された第１の及び／又は第２の異種核酸）をパッケージングしているｒＡＡＶベクター粒子を産生する。幾つかの実施形態では、ｒＡＡＶベクター粒子は、機能的な内因性ＤＨＦＲ及び／又はＧＳを発現している、異種核酸配列を有するＡＡＶベクターゲノムで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞により産生される量よりも大量に産生される。ある実施形態では、産生されたＡＡＶベクター粒子は、ｒＡＡＶの空のカプシド並びに／又は機能的な内因性ＤＨＦＲ及び／若しくはＧＳを発現しており、異種核酸配列を有するｒＡＡＶベクターゲノムで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞により産生された混入ＤＮＡをパッケージングしているｒＡＡＶ粒子の量よりも少ない量（例えば、少なくとも１％、少なくとも１０％未満又は少なくとも２分の１未満）のｒＡＡＶの空のカプシド、及び／又はそれよりも少ない量（例えば、少なくとも１％、少なくとも１０％未満又は少なくとも２分の１未満）の混入ＤＮＡをパッケージングしているｒＡＡＶ粒子を含有する。
【００１７】
[0018]ある態様では、異種核酸配列は、１種又は複数の治療用タンパク質をコードする。ある態様では、異種核酸配列は、１種又は複数の阻害因子をコードする。幾つかの実施形態では、異種核酸配列は、１種又は複数の阻害性核酸配列を含む。幾つかの実施形態では、異種核酸配列は、治療用タンパク質をコードする、及び／又は阻害性核酸配列を含む。ある実施形態では、治療用タンパク質は、血液凝固因子を含む。ある実施形態では、治療用タンパク質は、免疫グロブリン配列（例えば、免疫グロブリンのアミノ酸配列）を含む。幾つかの実施形態では、阻害性核酸配列は、小さい若しくは短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小さい若しくは短い干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、ｔｒａｎｓ−スプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡを含む。
【００１８】
[0019]ある態様では、本明細書に記載されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株は、第１の異種核酸配列で安定にトランスフェクトされる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株は、第１の及び／又は第２の異種核酸配列で安定にトランスフェクトされる。
【００１９】
[0020]幾つかの態様では、本明細書に記載されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株から単離及び／又は精製されたウイルスの又はｒＡＡＶベクター粒子が、本明細書で提示される。
【００２０】
[0021]幾つかの態様では、本明細書に記載されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株から単離及び／又は精製された治療用タンパク質が、本明細書で提示される。
【００２１】
[0022]幾つかの態様では、治療用タンパク質、ウイルスベクター及び／又はｒＡＡＶベクター粒子を製造する方法であって、本明細書に記載されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株を、本明細書に記載された治療用タンパク質、ウイルスベクター又はｒＡＡＶベクター粒子の産生及び／又は分泌を可能にする条件下で培養するステップと、細胞培養物、培養培地、又は細胞培養物及び培養培地（例えば、細胞培養物、培養培地、又はＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／若しくはベロ細胞若しくは細胞株を含む細胞培養物及び培養培地）から、治療用タンパク質、ウイルスベクター又はｒＡＡＶベクター粒子を単離又は精製するステップとを含む方法が、本明細書で提示される。
【００２２】
[0023]幾つかの態様では、本明細書に記載されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株を、ｒＡＡＶベクター粒子の産生及び／又は分泌を可能にする条件下で培養するステップと、細胞培養物、培養培地、又は細胞培養物及び培養培地からｒＡＡＶベクター粒子を単離又は精製するステップとを含むｒＡＡＶベクター粒子を製造する方法であって、ＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株が、ＡＡＶベクターゲノムの細胞１つ当たり少なくとも１，０００コピーを有し、ｒＡＡＶベクター粒子収率が、ＨＥＫ細胞若しくはＨＥＫ細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株のローラーボトルから、少なくとも１×１０８ｖｇ／ｍｌ、又は少なくとも１×１０９ｖｇ／ｍｌ、又は少なくとも１×１０１０ｖｇ／ｍｌ、又は少なくとも１×１０１１ｖｇ／ｍｌ又は少なくとも２×１０１１ｖｇ／ｍｌである、方法が、本明細書で提示される。
【００２３】
[0024]幾つかの態様では、本明細書に記載された第１の及び／又は第２の異種核酸配列は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３及びＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン−１及びネトリン−２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子生成物をコードする。
【００２４】
[0025]ある態様では、本明細書に記載されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株、或いは、ｒＡＡＶベクター粒子が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３及びＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン−１及びネトリン−２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子生成物をコードする第１の及び／又は第２の異種核酸配列を含む、本明細書に記載された方法が、本明細書で提示される。
【００２５】
[0026]ある態様では、本明細書に記載されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株、或いは第１の及び／又は第２の異種核酸配列が、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１〜ＩＬ−１７）、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ分子からなる群から選択される遺伝子生成物をコードする、本明細書に記載された方法が、本明細書で提示される。
【００２６】
[0027]ある態様では、本明細書に記載されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株、或いはｒＡＡＶベクター粒子が、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１〜ＩＬ−１７）、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ分子からなる群から選択される遺伝子生成物をコードする第１の及び／又は第２の異種核酸配列を含む、本明細書に記載された方法が、本明細書で提示される。
【００２７】
[0028]ある態様では、本明細書に記載されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株、或いは第１の及び／又は第２の異種核酸配列が、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータ−シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、ＲＰＥ６５、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィンｃＤＮＡ配列からなる群から選択される、先天性のエラーの修正のために有用なタンパク質をコードする、本明細書に記載された方法が、本明細書で提示される。
【００２８】
[0029]ある態様では、本明細書に記載されたＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株、或いはｒＡＡＶベクター粒子が、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータ−シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、ＲＰＥ６５、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィンｃＤＮＡ配列からなる群から選択される、先天性のエラーの修正のために有用なタンパク質をコードする第１の及び／又は第２の異種核酸配列を含む、本明細書に記載された方法が、本明細書で提示される。
【００２９】
[0030]幾つかの実施形態では、機能的な内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を発現しないヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株、ヒトＡ４５９細胞株及びベロ細胞株を製造する方法であって、内因性ＤＨＦＲ遺伝子を突然変異させるか又はノックアウトするステップを含む方法が、本明細書で提示される。
【００３０】
[0031]幾つかの実施形態では、機能的な内因性グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を発現しないヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株、ヒトＡ４５９細胞株及びベロ細胞株を製造する方法であって、内因性ＧＳ遺伝子を突然変異させるか又はノックアウトするステップを含む方法が、本明細書で提示される。
【００３１】
[0032]幾つかの実施形態では、機能的な内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を発現しないヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株、ヒトＡ４５９細胞株及びベロ細胞株を製造する方法であって、内因性ＤＨＦＲ遺伝子及びＧＳ遺伝子を突然変異させるか又はノックアウトするステップを含む方法が、本明細書で提示される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＨＥＫ２９３などのヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又は細胞株の創出、並びに組換えタンパク質及びＡＡＶなどのウイルスベクターを製造するための使用の概要を示す図である。
【図２】本発明の例示的なＨＥＫ２９３クローン（安定細胞株）により産生されるｒＡＡＶベクターの量を示す図である。Ｙ軸は、ローラーボトル中で各ＨＥＫ２９３クローンにより産生されるＡＡＶベクター（ベクターゲノム、ｖｇ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
[0035]ＨＥＫ２９３細胞などのＨＥＫ細胞の、そのような遺伝子が改変されたか又は遺伝子がノックアウトされた細胞のクローンは、ＤＨＦＲ−／−及び／又はＧＳ−／−ゲノムのバックグラウンドを有するヒト細胞の第１のクローンである。これらの細胞及び細胞株は、多くの異なる組換え生体材料、例えば組換えタンパク質（例えば、モノクローナル抗体などの抗体）及びウイルスベクターを製造するために使用することができる。製造された組換えタンパク質及びウイルスベクターは、疾患の治療のために使用することができる。特定の用途では、製造されたウイルスベクター（例えば、レンチ又はＡＡＶ）は、ノックイン（例えば、異常な又は消失している機能的タンパク質を導入する）遺伝子療法の適用のために使用することができる。特定の用途では、製造されたウイルスベクター（例えば、レンチ又はＡＡＶ）は、ノックアウト（例えば、発現又は機能が異常な又は望ましくない内因性タンパク質、例えば、病状又は疾患の原因となるか又は関連する突然変異体タンパク質を標的とするアンチセンスなどの阻害配列を導入する）遺伝子療法の適用のために使用することができる。
【００３４】
[0036]本発明は、生物学的製剤、例えば、タンパク質、並びに組換えタンパク質、抗体、ＡＡＶ、レンチ及び他のウイルスを含むウイルスベクターを含む他の生体材料の、十分にキャラクタライズされたヒト細胞株における遺伝子増幅系による製造に利益を提供する。追加の利益は、折りたたみ、改変（翻訳後）及び機能のためにヒトの細胞内環境を必要とするタンパク質の製造に関するものである。
【００３５】
[0037]本発明は、十分にキャラクタライズされたヒト細胞又は細胞株を使用する新しい製造系を創出する。細胞株を産生するｒＡＡＶを確立するために選択された親クローンが、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳ遺伝子の単一の又は二重のノックアウトなどのＤＨＦＲ及び／又はＧＳ遺伝子が実質的に低下したか又は排除されたＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞、ヒトＡ４５９細胞又はベロ細胞から作り変えられる。ＤＨＦＲ及び／又はＧＳ遺伝子が実質的に低下したか又は排除されたヒトＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）、ヒトＡ４５９及び／又はベロ細胞若しくは細胞株、例えば、本発明のＤＨＦＲ及び／又はＧＳ遺伝子の単一の又は二重のノックアウトは、ヒトにおけるその天然改変により近い生物学的産生物の翻訳後の改変を可能にして、それゆえに、生物学的産生物の安全性及び生物活性を改善するであろう。
【００３６】
[0038]ＤＨＦＲ及びＧＳ遺伝子の一方又は両方を排除する（例えば、ノックアウトする）ことにより、ＨＥＫ２９３細胞、ヒトＡ４５９細胞及び／又はベロ細胞のための１つ又は２つの選択マーカーが創出される。ＤＨＦＲの選択可能なマーカーが安定に組み込まれている発明のＨＥＫ細胞及び細胞株、ヒトＡ４５９細胞及び細胞株並びに／又はベロ細胞及び細胞株は、細胞を培養培地で培養することにより選択され得る。その上、ＤＨＦＲの選択可能なマーカーとは別の異種核酸配列（例えば、２種の別々のプラスミド）が、又は単一のポリヌクレオチド配列として（例えば、ＡＡＶベクタープラスミドなどの同じプラスミドにおいて）、１つの細胞中に導入される場合、両方とも組み込まれ得る。したがって、ＤＨＦＲ導入遺伝子が、異種核酸配列（例えば、目的のタンパク質又は核酸をコードする）を加えているか又は含む場合、ＤＨＦＲ及び目的のタンパク質又は核酸の両方を発現している細胞が選択され得る。
【００３７】
[0039]ＧＳの選択可能なマーカーが安定に組み込まれている発明のＨＥＫ細胞及び細胞株、ヒトＡ４５９細胞及び細胞株並びに／又はベロ細胞及び細胞株は、細胞を培養培地で培養することにより選択され得る。ＧＳの選択可能なマーカーとは別の異種核酸配列（例えば、２種の別々のプラスミド）が、又は単一のポリヌクレオチド配列として（例えば、ＡＡＶベクタープラスミドなどの同じプラスミドにおいて）、１つの細胞中に導入される場合、両方とも組み込まれ得る。したがって、ＧＳ導入遺伝子が、異種核酸配列（例えば、目的のタンパク質又は核酸をコードする）を加えている又は含む場合、ＧＳ及び目的のタンパク質又は核酸の両方を発現している細胞が選択され得る。
【００３８】
[0040]メトトレキセート（ＭＴＸ）などの阻害剤に応答して、ＤＨＦＲ遺伝子のコピー数、及びそれゆえに、ＤＨＦＲ遺伝子に隣接して組み込まれた異種核酸配列は、発明のＨＥＫ細胞及び細胞株、ヒトＡ４５９細胞及び細胞株並びに／又はベロ細胞及び細胞株で増幅され得る。メチオニンスルホキシミン（ＭＳ）などの阻害剤に応答して、ＧＳ遺伝子のコピー数、及びそれゆえに、ＧＳ遺伝子に隣接して組み込まれた異種核酸配列は、発明のＨＥＫ細胞及び細胞株、ヒトＡ４５９細胞及び細胞株並びに／又はベロ細胞及び細胞株で増幅され得る。
【００３９】
[0041]したがって、外来性ＤＨＦＲ及び／又はＧＳに隣接して組み込まれたか又は外来性ＤＨＦＲ及び／又はＧＳ共に組み込まれた目的のタンパク質又は核酸をコードする配列は、細胞を、濃度が増大するＭＴＸ及び／又はＭＳに徐々に曝露することにより増幅させることが可能で、コードされた目的のタンパク質又は核酸の増大した発現を生ずる。
【００４０】
[0042]本明細書で開示される研究により、ｒＡＡＶゲノムの高いコピー数を有するＨＥＫ２９３クローンが得られたことが示される。特定の例では、ｒＡＡＶゲノムは、治療用のヒトＦＩＸ、報告されている最も安定な細胞株よりも大幅に高い一千コピーを超えるレベルに達したｒＡＡＶゲノムのコピーをコードする。ｒＡＡＶゲノムの高いコピー数は、高いｒＡＡＶ−ｈＦｉｘ産生をもたらした。高いコピー数は、多くの継代、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、又はそれを超える継代にわたって安定であるように思われる。
【００４１】
[0043]高いｒＡＡＶ産生に加えて、ＨＥＫ２９３  ｒＡＡＶベクターを産生する細胞株から製造されるｒＡＡＶ調製物の品質も評価した。ＨＥＫ２９３の安定クローン中における高いｒＡＡＶゲノムのコピーは、ｒＡＡＶ粒子中にパッケージングされたＤＮＡ不純物をさらに減少させて、ゲノムがパッケージングされたベクターに対する空の粒子の比を低下させることができるように思われる。
【００４２】
[0044]安定な産生をするＨＥＫ２９３クローンにおけるｒＡＡＶゲノムの高いコピーに加えて、本発明のＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞及び細胞株、ヒトＡ４５９細胞及び細胞株並びに／又はベロ細胞及び細胞株も、ＭＴＸ及び／又はＭＳＸの誘導を通して遺伝子の増幅を可能にして、それは、ＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞及び細胞株、ヒトＡ４５９細胞及び細胞株並びに／又はベロ細胞及び細胞株において、ｒＡＡＶゲノムをさらに増幅するであろう。増幅は、順送りでｒＡＡＶゲノムの数を増大させて、それにより作り変えられたＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞及び細胞株、ヒトＡ４５９細胞及び細胞株並びに／又はベロ細胞及び細胞株によるｒＡＡＶ産生を増大させる。
【００４３】
[0045]発明のＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞及び細胞株並びに／又はベロ細胞及び細胞株、例えば、ＨＥＫ細胞のノックインクローン（ＨＥＫ２９３の単一のＤＦＨＲ−／−又はＧＳ−／−、又は二重ＤＦＨＲ−／−／ＧＳ−／−）は、任意のＡＡＶ血清型のｒＡＡＶベクターを産生するために使用することができる。例えば、発明のＨＥＫ細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株、例えば、ウイルス（例えばＡＡＶ）のベクターのＨＥＫ２９３のｒＡＡＶ−ｈＦｉｘ  ＤＦＨＲ−／−／ＧＳ−／−のノックインクローンは、任意のＡＡＶ血清型のｒＡＡＶ−ｈＦｉｘベクターを産生するために使用することができ、ベクター産生は、遺伝子療法による血友病Ｂの治療のために使用することができる。
【００４４】
[0046]本発明のＨＥＫ細胞又は細胞株をウイルス（例えばＡＡＶ）のベクターを製造するために使用することができる特定の非限定的な方法は、米国特許出願公開第２０１３／００７２５４８号（米国特許出願第１３／５６１，７５３号）；米国特許出願公開第２０１４／０３４９４０３号（米国特許出願第１４／３６４，６２３号）；及び米国特許出願公開第２０１４／０３２３５５６号（米国特許出願第１４／２１６，７７８号）に記載されている。
【００４５】
[0047]「選択可能なマーカー」とは、適当な選択的培養条件下で導入されて、細胞により発現されたときに、前記選択可能なマーカーを発現する細胞の選択を可能にするポリヌクレオチド又は遺伝子を指す。選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳ、特に、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳの機能又は活性を有するタンパク質、例えば、発明のＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞及び細胞株、ヒトＡ４５９細胞及び細胞株並びに／又はベロ細胞及び細胞株により又はそれらの中で発現されるＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子であることができる。
【００４６】
[0048]ＤＨＦＲタンパク質及びＧＳタンパク質並びにコード核酸の全ての哺乳動物及び非哺乳動物の形態は明らかに含まれる。適当なＤＨＦＲタンパク質及びＧＳタンパク質、したがって当業者に公知の遺伝子が使用され得る。ＤＨＦＲ及びＧＳタンパク質は、発明のＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞及び細胞株、ヒトＡ４５９細胞及び細胞株並びに／又はベロ細胞及び細胞株において少なくとも部分的機能又は活性を保持する限り、任意の種から誘導され得る。ＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質は、天然に生ずる多形体を含む。
【００４７】
[0049]ＤＨＦＲ及び／又はＧＳは、野生型ＤＨＦＲ及び／若しくはＧＳ又はそれらの機能的変異体又は誘導体であってもよい。用語「変異体」又は「誘導体」は、それぞれのＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質を含む融合タンパク質、又はそれらの機能的フラグメントのアミノ酸配列に関して、１つ又は複数のアミノ酸配列の交換（例えば、欠失、置換又は付加）を有するＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質（この用語は、そのようなタンパク質をコードする核酸配列を指す場合もある）を含む。変異体は、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質の少なくとも部分的機能又は活性を保持するＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質を含む。
【００４８】
[0050]改変され、追加の構造及び／又は機能を提供するＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質の変異体及び誘導体、並びにＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質の少なくとも１つの機能を依然として有する前述の機能的フラグメント。例えば、ＤＨＦＲ及び／又はＧＳタンパク質は、例えば、野生型ＤＨＦＲ若しくはＧＳそれぞれのタンパク質、及び／又はＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞、ヒトＡ４５９細胞及び／若しくはベロ細胞により内因性で発現されるＤＨＦＲ若しくはＧＳタンパク質よりも、ＭＴＸなどの抗葉酸薬に対して多かれ少なかれ感受性の、又はＭＳに対して多かれ少なかれ感受性の選択可能なマーカーとして使用することもできる。
【００４９】
[0051]例えば、ＤＨＦＲタンパク質は、ＭＴＸなどのＤＨＦＲ阻害剤に対して、発明のＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞及び細胞株、ヒトＡ４５９細胞及び細胞株並びに／又はベロ細胞及び細胞株で発現される内因性ＤＨＦＲ酵素よりも、感受性の高い選択可能なマーカーとして使用される。そのようなＤＨＦＲは、順送りで、ＤＨＦＲの選択可能なマーカーの、及び順送りで異種核酸／ベクター配列の強力な増幅のための手段を提供する。
【００５０】
[0052]用語「ベクター」とは、小さい担体核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）、又は核酸の挿入若しくは組み込みにより操作され得る他のビヒクルを指す。ベクターは、ポリヌクレオチドを細胞中に導入／移動するために、及び挿入されたポリヌクレオチドを細胞中で転写又は翻訳するために、遺伝子操作（即ち、「ベクターをクローニング」）するために使用することができる。「発現ベクター」は、宿主細胞における発現のために必要な調節領域を有する遺伝子又は核酸配列を含有するベクターである。ベクター核酸配列は、少なくとも、細胞中における増殖のための複製の起点及び任意選択で追加の要素、例えば、異種核酸配列、発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、逆位末端反復（ＩＴＲ）、任意選択の選択可能なマーカー（例えば、ＤＨＦＲ、ＧＳなど）、ポリアデニル化シグナルを一般的に含有する。
【００５１】
[0053]ウイルスベクターは、ウイルスのゲノムを含む１種又は複数の核酸要素から誘導される又はそれらに基づく。特定のウイルスベクターは、レンチウイルス、偽型レンチウイルス及びパルボ−ウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。ＡＡＶを含むパルボウイルスは、細胞に侵入して、核酸／遺伝子材料を導入することができて、その結果、核酸／遺伝子材料が細胞中で安定に維持され得るので、遺伝子療法ベクターとして有用である。加えて、これらのウイルスは、核酸／遺伝子材料を、特定の部位、例えば第１９染色体における特定の部位などに導入することができる。ＡＡＶは、ヒトにおける病原性疾患と関連しないので、ＡＡＶベクターは、異種核酸配列（例えば、治療用タンパク質及び作用物質）をヒトの患者に、実質的なＡＡＶ病原性又は疾患を引き起こすことなく送達することができる。
【００５２】
[0054]ベクターの変更遺伝子、例えば、組換えウイルスの、例えば、レンチ又はパルボ−ウイルス（例えばｒＡＡＶ）ベクター、並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの配列の変更遺伝子としての用語「組換え」は、一般的に天然では起こらない様式で、組成が操作された（即ち、作り変えられた）ことを意味する。組換えベクターの特定の例、例えばＡＡＶベクターは、野生型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）のゲノム中に通常存在しないポリヌクレオチドがウイルスのゲノム内に挿入された場合であろう。組換えベクターの例は、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）が、ベクター中に、遺伝子がウイルス（例えばＡＡＶ）のゲノム内で通常関連する５’、３’及び／又はイントロン領域とともに又はそれなしでクローニングされる場合であろう。本明細書では、用語「組換え」が、ベクター、例えばウイルス及びＡＡＶのベクター、並びにポリヌクレオチドなどの配列に関して使用されるとは限らないが、ポリヌクレオチドを含む組換え形態は、任意のそのような省略にも拘わらず、明らかに含まれる。
【００５３】
[0055]組換えウイルスの「ベクター」又は「ｒＡＡＶベクター」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）から野生型ゲノムを除去して、非天然の（異種）核酸、例えば、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする核酸で置き換える分子法を使用することにより、ＡＡＶなどのウイルスの野生型ゲノムから誘導される。典型的には、ＡＡＶについて、ＡＡＶゲノムの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列がｒＡＡＶベクター中に保持される。「組換え」ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）は、ウイルスのゲノムの全て又は一部が、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）のゲノムの核酸に関して、非天然の配列、例えば、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする異種核酸で置き換えられているので、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）のゲノムと明白に区別される。それゆえに、非天然の配列の組み込みは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を「組換え」ベクターと定義し、ＡＡＶの場合、「ｒＡＡＶベクター」と称することができる。
【００５４】
[0056]組換えベクター（例えば、レンチ、パルボ−、ＡＡＶ）の配列は、パッケージングすることができて、エックスビボ、インビトロ又はインビボにおける細胞のその後の感染（形質導入）について、本明細書では「粒子」と称する。組換えベクター配列が、ＡＡＶ粒子中にカプシド形成されているか又はパッケージングされている場合、粒子は、「ｒＡＡＶ」と称することもできる。そのようなｒＡＡＶ粒子は、ベクターゲノムをカプシド形成するか又はパッケージングするタンパク質を含む。特定の例には、ウイルスのエンベロープタンパク質、及びＡＡＶの場合には、カプシドタンパク質が含まれる。
【００５５】
[0057]ベクター「ゲノム」とは、最終的にパッケージングされるか又はカプシド形成されてウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）粒子を形成する組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えプラスミドが組換えベクターを構築するか又は製造するために使用される場合に、ベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。この組換えプラスミドの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」と称され、プラスミド骨格は、プラスミドのクローニング及び増幅、増殖及び組換えウイルス産生のために必要なプロセスのために重要であるが、それ自体はウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）粒子中にパッケージング又はカプシド形成されない。したがって、ベクター「ゲノム」とは、ウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）によりパッケージングされているか又はカプシド形成された核酸を指す。
【００５６】
[0058]本明細書において使用する用語「血清型」は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に区別されるカプシドを有するＡＡＶを指して使用される区別である。血清学的特殊性は、あるＡＡＶを別のＡＡＶと比較して抗体間の交差反応性の欠如を根拠に決定される。交差反応性の差は、カプシドタンパク質の配列／抗原決定基における差に通常起因する（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列のＡＡＶ血清型の差に起因する）。
【００５７】
[0059]従来の定義に基づき、血清型は、目的ウイルスが、全ての既存の及びキャラクタライズされた血清型に対して特異的な血清に対して、中和活性について試験されて、目的ウイルスを中和する抗体が見出されなかったことを意味する。より多くの天然に生ずるウイルス単離体が発見されて及び／又はカプシド突然変異体が発生するので、現在存在する血清型のいずれかと血清学的差があることもあり、ないこともある。したがって、新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）が血清学的差を有しない場合、この新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、対応する血清型のサブグループ又は変異体である。多くの場合、カプシド配列が改変された突然変異体ウイルスについて、血清型の従来の定義による別の血清型のものであるかどうかを決定するために、中和活性についての血清学試験が、さらに実施されなければならない。したがって、便宜上及び繰り返しを避けるために、用語「血清型」とは、血清学的に区別されるウイルス（例えばＡＡＶ）並びに所与の血清型のサブグループ又は変異体の内であり得て血清学的に区別されないウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を広く指す。
【００５８】
[0060]組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）は、任意のウイルス株又は血清型を含む。非限定的な例として、組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）のプラスミド又はベクター（例えば、ＡＡＶ）のゲノム又は粒子（カプシド）は、任意のＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１などに基づき得る。そのようなベクターは、同じ株又は血清型（又はサブグループ若しくは変異体）に基づき得るか、又は互いに異なることもできる。非限定的な例として、１つの血清型のゲノムに基づく組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）のプラスミド又はベクター（例えば、ＡＡＶ）のゲノム又は粒子（カプシド）は、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質の１種又は複数と同一であることができる。加えて、組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）のプラスミド又はベクター（例えば、ＡＡＶ）のゲノムは、ベクターゲノムをパッケージングするカプシドタンパク質の１種又は複数と区別されるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）血清型ゲノムに基づき得、その場合、３種のカプシドタンパク質のうちの少なくとも１種が、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、又はそれらの変異体であることができる。ＡＡＶベクターは、それゆえに、特定の血清型、並びに混合血清型に対して特徴的な遺伝子／タンパク質配列と同一の遺伝子／タンパク質配列を含む。
【００５９】
[0061]種々の例示的な実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、１種又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１のカプシドタンパク質と少なくとも７０％以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等）同一の配列を含むか又はそれらからなる。種々の例示的な実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、１種又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１のＩＴＲと少なくとも７０％以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等）同一の配列を含むか又はそれらからなる。
【００６０】
[0062]組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１他、並びに変異体、ハイブリッド及びキメラ配列は、当業者に公知の組換え技法を使用して、１種又は複数の機能的ＡＡＶのＩＴＲ配列に隣接する１種又は複数の異種ポリヌクレオチド配列（導入遺伝子）を含むように構築することができる。そのようなベクターは、全部又は一部、例えば、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が欠失しているが、ｒＡＡＶベクター粒子中に組換えベクターをレスキュー、複製、及びパッケージングするために必要な少なくとも１つの機能的な隣接するＩＴＲ配列を保持する野生型のＡＡＶ遺伝子の１種又は複数を有する。ｒＡＡＶベクターゲノムは、それゆえに、複製及びパッケージングのために必要な配列（例えば、機能的ＩＴＲ配列）を、ｃｉｓの形態で含む。
【００６１】
[0063]用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む核酸、オリゴヌクレオチドの全て形態を指して互換的に使用される。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、及びスプライスされた又はスプライスされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び阻害ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、小さい若しくは短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小さい若しくは短い干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、ｔｒａｎｓ−スプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）を含む。核酸は、天然に生ずる、合成の、及び意図的に改変された又は変えられたポリヌクレオチドを含む。核酸は、一重、二重、又は三重、直鎖状又は環状であることができ、任意の長さのものであることができる。核酸を論ずる際に、本明細書では、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’方向で配列を提供する慣行に従って記載されることがある。
【００６２】
[0064]「異種」核酸配列とは、ベクターに媒介される、ポリヌクレオチドの細胞中への移動／送達を目的として、ベクター（例えば、ＡＡＶ）に挿入されたポリヌクレオチドを指す。異種核酸配列は、典型的にはベクター（例えば、ＡＡＶ）の核酸と区別される、即ち、ウイルス（例えばＡＡＶ）の核酸に関して非天然である。細胞中に移動／送達されると、ベクター内に含有される異種核酸配列が、発現され得る（例えば、適当ならば、転写されて翻訳される）。或いは、細胞中の移動／送達されたベクター内に含有される異種ポリヌクレオチドは、発現されなくてもよい。用語「異種」は、本明細書では、核酸配列及びポリヌクレオチドの言及に使用されるとは限らないが、核酸配列又はポリヌクレオチドに対する言及は、「異種」変更遺伝子の非存在下でさえ、省略にも拘わらず、異種核酸配列及びポリヌクレオチドを含むことが意図される。
【００６３】
[0065]「核酸配列」によりコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、結果として、改変された形態又は変異体が天然の全長タンパク質のある程度の機能性を保持する限り、天然に生ずるタンパク質、並びに機能的部分配列、改変された形態又は配列変異体と同様に、天然の全長配列を含む。核酸配列によりコードされるそのようなポリペプチド、タンパク質及びペプチドは、処置される哺乳類で欠陥のある、又は発現が不十分若しくは不完全である内因性タンパク質と同一であることができるが、そうである必要はない。
【００６４】
[0066]「導入遺伝子」は、本明細書では、細胞又は生物体に意図されるか又は導入されている核酸（例えば異種）を指して便利に使用される。導入遺伝子は、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする異種核酸などの任意の核酸を含む。
【００６５】
[0067]導入遺伝子を有する細胞では、導入遺伝子は、プラスミド又はベクター、例えばＡＡＶ、細胞の「形質導入」又は「トランスフェクション」により、導入／移動されている。用語「形質導入」及び「トランスフェクト」とは、核酸などの分子の細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）又は宿主生物体への導入を指す。導入遺伝子は、受容細胞のゲノム核酸中に組み込まれてもよく組み込まれなくてもよい。導入された核酸が受容細胞又は生物体の核酸（ゲノムＤＮＡ）中に組み込まれれば、導入された核酸は、その細胞又は生物体中で安定に維持されることができ、受容細胞又は生物体の子孫細胞又は生物体にさらに受け渡され、又はそれらにより継承される。
【００６６】
[0068]「形質導入された細胞」は、導入遺伝子が導入されている細胞である。したがって、「形質導入された」細胞は、外来性分子、例えば、核酸（例えば、導入遺伝子）の細胞中への組み込み後の細胞における遺伝的変化を意味する。したがって、「形質導入された」細胞は、外来性核酸が導入されている細胞又はその子孫である。細胞は、増殖する（培養する）ことができ、細胞により、導入されたタンパク質が発現され若しくは核酸が転写され、又はｒＡＡＶなどのベクターが産生される。遺伝子療法の使用及び方法のために、形質導入された細胞は対象に存在し得る。
【００６７】
[0069]細胞に関して、本明細書において使用する用語「安定」、又は「安定に組み込まれた」は、選択可能なマーカー若しくは異種核酸配列などの核酸配列、又はプラスミド若しくはベクターが、染色体に挿入されているか（例えば、相同性組換え、非相同性末端結合、トランスフェクション等により）、又は受容細胞若しくは宿主生物体の染色体外で維持され、及び染色体中にとどまるか、又はある期間、染色体外で維持されることを意味する。培養細胞の場合、染色体中に挿入された選択可能なマーカー若しくは異種核酸配列などの核酸配列、又はプラスミド若しくはベクターは、複数の細胞継代の過程にわたり維持され得る。
【００６８】
[0070]「発現制御要素」とは、作動可能に連結した核酸の発現に影響する核酸配列を指す。制御要素は、本明細書で説明されるプロモーター及びエンハンサーなどの発現制御要素を含む。ｒＡＡＶベクターを含むベクター配列は、１種又は複数の「発現制御要素」を含むことができる。典型的には、そのような要素が含まれて、適当な異種ポリヌクレオチドの転写及び適当ならば翻訳を容易にする（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのフレーム内翻訳を可能にする遺伝子の正確な読み取りフレームの維持、及び停止コドン等）。そのような要素は、典型的には、ｃｉｓの形態で作用して、「ｃｉｓ作用性」要素と称されるが、ｔｒａｎｓの形態で作用することもある。
【００６９】
[0071]発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージの安定性等のレベルで影響され得る。典型的には、転写を調整する発現制御要素は、転写される核酸の５’末端付近（即ち、「上流」）に並置される。発現制御要素は、転写される配列の３’末端（即ち、「下流」）に又は転写物内（例えば、イントロン中）に配置することもできる。発現制御要素は、転写される配列に隣接して、又は距離をおいて（例えば、ポリヌクレオチドから１〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜５００、又はそれを超えるヌクレオチド）、かなりの距離でも配置され得る。それにも拘わらず、あるベクター、例えばｒＡＡＶベクターの長さの制限があるので、発現制御要素は、典型的には、転写される核酸から１〜１０００ヌクレオチド以内である。
【００７０】
[0072]機能的に、作動可能に連結した核酸の発現は、要素（例えば、プロモーター）により少なくとも部分的に制御可能であり、その結果、要素が核酸の転写及び、適当な場合には、転写物の翻訳を調整する。発現制御要素の具体的な例は、プロモーターであり、プロモーターは転写される配列の５’に通常位置する。プロモーターは、典型的には、作動可能に連結した核酸から発現される量を、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して増大させる。
【００７１】
[0073]本明細書において使用する「エンハンサー」は、選択可能なマーカーなどの核酸配列又は異種核酸配列に隣接して位置する配列を指すことができる。エンハンサー要素は、典型的には、プロモーター要素の上流に位置するが、機能しもする、そして配列の下流又は配列内部に位置することもできる。それゆえに、エンハンサー要素は、上流でも下流でも、例えば、選択可能なマーカー、及び／又は治療用タンパク質若しくはポリヌクレオチド配列をコードする異種核酸の１００塩基対、２００塩基対、又は３００以上の塩基対以内に位置することができる。エンハンサー要素は、典型的には、作動可能に連結した核酸の発現を、プロモーター要素により生ずる発現を超えて増大させる。
【００７２】
[0074]用語「作動可能に連結した」は、核酸配列の発現に必要な調節配列が、核酸配列の発現に効果をもたらすように、配列に対して適当な位置に置かれることを意味する。この同じ定義が、時には、発現ベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターにおける核酸配列及び転写制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び停止要素）の配置に適用される。
【００７３】
[0075]核酸と作動可能に連結している発現制御要素の例では、関係は、制御要素が核酸の発現を調整するようになっている。より詳細には、例えば、作動可能に連結した２つのＤＮＡ配列は、２つのＤＮＡがＤＮＡ配列の少なくとも１つが他の配列に対して生理学的効果を及ぼすことができる、そのような関係で配置されている（ｃｉｓ又はｔｒａｎｓ）ことを意味する。
【００７４】
[0076]したがって、ベクターのための追加要素は、ＡＡＶのＩＴＲ配列、又はイントロンの１つ又は複数のコピーなどの配列に隣接して存在する、発現制御要素（例えば、プロモーター／エンハンサー）、転写停止シグナル又は停止コドン、５’又は３’の非翻訳領域（例えば、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列）を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
[0077]さらなる要素は、例えば、パッケージングを改善し、混入核酸の存在を減少させるための、例えば、フィラー又はスタッファーのポリヌクレオチド配列を含む。ＡＡＶベクターは、典型的には、一般的に約４ｋｂ〜約５．２ｋｂ、又は僅かにそれを超えるサイズ範囲を有するＤＮＡの挿入を受け入れる。したがって、より短い配列に対して、ｒＡＡＶ粒子中へのベクターのパッケージングのために許容されるウイルスゲノム配列の正常サイズ近くに又は正常サイズに、長さを調節するために、スタッファー又はフィラーが含まれる。種々の実施形態では、フィラー／スタッファーの核酸配列は、核酸の非翻訳（非タンパク質コード）セグメントである。４．７Ｋｂ未満の核酸配列に対して、フィラー又はスタッファーのポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わされたときに（例えば、ベクター中に挿入）、約３．０〜５．５Ｋｂの間、又は約４．０〜５．０Ｋｂの間、又は約４．３〜４．８Ｋｂの間の全長を有する長さを有する。
【００７６】
[0078]「治療用タンパク質」は、一実施形態では、細胞又は対象におけるタンパク質の不十分な量、不在又は欠陥から生ずる症状を緩和するか又は軽減することができるペプチド又はタンパク質である。導入遺伝子によりコードされる「治療用」タンパク質は、対象に恩恵を与える、例えば、遺伝的欠陥を修正する、遺伝子の（発現又は機能的）欠損等を修正することができる。
【００７７】
[0079]本発明により有用な遺伝子生成物（例えば、治療用タンパク質）をコードする異種核酸の非限定的な例は、「鬱血」又は血液凝固障害、例えば、血友病Ａ、阻害抗体を有する血友病Ａ患者、血友病Ｂ、凝固因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸ、ＸＩ、Ｖ、ＸＩＩ、ＩＩ、フォンウィレブラント因子の欠損、組み合わされたＦＶ／ＦＶＩＩＩ欠損、地中海貧血、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠損、ガンマ−カルボキシラーゼ欠損；貧血、外傷、傷害、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝血異常、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）と関連する出血；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖、ワーファリン、低分子抗血栓薬（即ち、ＦＸａ阻害剤）に関連する過抗凝固；並びに血小板障害、例えば、ベルナールスリエ症候群、グランツマン血小板無力症、及び貯蔵プール欠乏症を含むが、これらに限定されない疾患又は障害の治療で使用され得るものを含む。
【００７８】
[0080]核酸分子、ベクター、例えば、クローニングベクター、発現ベクター（例えば、ベクターゲノム）及びプラスミドは、組換えＤＮＡ技法を使用して調製することができる。ヌクレオチドの配列情報が入手できることは、種々の手段による核酸分子の調製を可能にする。例えば、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）をコードする核酸は、種々の標準的クローニング、組換えＤＮＡ技術を使用して、細胞発現又はインビトロ翻訳及び化学合成技法により作製することができる。ポリヌクレオチドの純度は、配列決定、ゲル電気泳動等により決定することができる。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーション又はコンピューターに基づくデータベーススクリーニング技法を使用して単離することができる。そのような技法は、（１）相同性ヌクレオチド配列を検出するプローブを用いるゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション；（２）例えば、発現ライブラリーを使用して、共有される構造的特徴を有するポリペプチドを検出する抗体スクリーニング；（３）目的の核酸配列とアニーリングすることができるプライマーを使用するゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡにおけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；（４）関連する配列についての配列データベースのコンピューター検索；及び（５）差し引かれた核酸ライブラリーの示差的スクリーニングを含むが、これらに限定されない。
【００７９】
[0081]本明細書で開示されるように、組換えウイルスベクター、例えば本発明によりｒＡＡＶベクターを産生する方法は、発明のＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株中の治療用タンパク質又はポリヌクレオチドをコードする異種核酸を発現させることである。細胞又は細胞株は、ウイルス（例えばＡＡＶ）のベクターをパッケージングするためのヘルパー機能を提供し、適当な培養条件下でｒＡＡＶを産生する。したがって、本発明は、ｒＡＡＶベクターなどの組換えウイルスベクターを産生するＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞及び細胞株、ヒトＡ４５９細胞及び細胞株並びに／又はベロ細胞及び細胞株、並びにｒＡＡＶベクターなどの組換えウイルスベクターを製造する方法を提供する。本発明のＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株は、異種核酸の発現を含み、同時にウイルス（例えばＡＡＶ）のベクターをパッケージングするためのヘルパー機能を提供する。方法は、ウイルス（例えばＡＡＶ）のベクターをパッケージングするためのヘルパー機能を提供する発明のＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株における異種核酸の発現を含む。
【００８０】
[0082]本明細書でも開示されるように、本発明により組換えタンパク質を産生する方法は、発明のＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株においてそのようなタンパク質をコードする核酸を発現させることである。したがって、本発明は、組換えタンパク質を産生する細胞並びに組換えタンパク質を作製する方法も提供する。本発明のＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株は、組換えタンパク質をコードする核酸の発現を含む。方法は、発明のＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞若しくは細胞株、ヒトＡ４５９細胞若しくは細胞株及び／又はベロ細胞若しくは細胞株において組換えタンパク質をコードする核酸の発現を含む。
【００８１】
[0083]用語「単離された」は、組成物の変更遺伝子として使用される場合、組成物がヒトの手により作製されるか、又は完全に若しくは少なくとも部分的に、天然に生ずるものからインビボ環境で分離されることを意味する。一般的に、単離された組成物は、通常天然に伴う１種又は複数の材料、例えば、１種又は複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。
【００８２】
[0084]タンパク質に関して、用語「単離されたタンパク質」又は「単離され精製されたタンパク質」は、時に、本明細書で使用される。この用語は、核酸分子の発現により産生するタンパク質を主として指す。或いは、この用語は、天然で伴われる他のタンパク質から十分に分離されて、その結果「実質的に純粋」な形態で存在するタンパク質を指すこともある。
【００８３】
[0085]用語「単離された」は、ヒトの手によって製造した組合せ、例えば、組換えベクター配列、又はベクターゲノム（例えば、ｒＡＡＶ）をパッケージング又はカプシド形成するウイルス粒子及び薬学的製剤を除外しない。用語「単離された」は、組成物の代替的物理的形態、例えば、ハイブリッド／キメラ、多量体／オリゴマー、改変（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質修飾）若しくは誘導体化された形態、又はヒト手により製造した宿主細胞中で発現された形態も除外しない。
【００８４】
[0086]「から本質的になる」というフレーズは、特定のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を指す場合、所与の配列の性質を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用される場合、フレーズは、配列それ自体及び配列の基本的及び新規特性に影響しない分子改変を含む。
【００８５】
[0087]特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解される同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様な又は等価の方法及び材料が、本発明の実行又は試験で使用され得るが、適当な方法及び材料が本明細書に記載されている。
【００８６】
[0088]本明細書に挙げた全ての特許出願、出版物、特許及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋの引用及びＡＴＣＣの引用は、参照によりそれらの全体で組み込まれる。相容れない場合には、定義を含む本明細書が優先する。
【００８７】
[0089]本明細書で開示された特徴の全ては、任意の組合せで組み合わされてもよい。本明細書で開示された各特徴は、同じ、等価の、又は同様な目的に役立つ代替的特徴により置き換えることもできる。したがって、別段明確に述べられていない限り、開示された特徴（例えば、核酸配列、ベクター、ウイルスベクター、ｒＡＡＶベクター等）は、等価の又は同様な特徴の部類の例である。
【００８８】
[0090]本明細書において使用する、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上別段明確に示されていない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ある核酸配列（ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、又は「選択可能なマーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ）」への言及は、複数のそのような核酸配列及び選択可能なマーカーを含み、「あるベクター（ａ  ｖｅｃｔｏｒ）」への言及は、ｒＡＡＶベクターなどの複数のそのようなベクターを含む。
【００８９】
[0091]本明細書において使用する、全て数値又は数の範囲は、前後関係で他のように明確に示されない限り、そのような範囲内の整数及び範囲内の値の端数又は整数を含む。したがって、例示すると、８０％以上の同一性への言及は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％等、並びに８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％等、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％等を含む。
【００９０】
[0092]超又は未満を伴う整数への言及は、言及された数を超えるか又は未満の任意の数をそれぞれ含む。したがって、例えば、１００未満への言及は、９９、９８、９７等、ずっと下がって数１までの全てを含み；１０未満は、９、８、７等、ずっと下がって数１までの全てを含む。
【００９１】
[0093]本明細書において使用する、全て数値又は範囲は包括的である。さらに、全ての数値又は範囲は、文脈上別段明確に示されていない限り、そのような範囲内の値の端数及び整数、並びにそのような範囲内の整数の端数を含む。したがって、例示すると、１〜１０などの数の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等を含む。それゆえに、１〜５０の範囲への言及は、５０を含め５０までを含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５等（以下同様）を含む。
【００９２】
[0094]一連の範囲への言及は、その一連の範囲内の異なる範囲の境界の値を組み合わせる範囲を含む。したがって、例示すると、一連の範囲、例えば、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００、５，５００〜６，０００、６，０００〜７，０００、７，０００〜８，０００、又は８，０００〜９，０００への言及は、１０〜５０、５０〜１００、１００〜１，０００、１，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００等の範囲を含む。
【００９３】
[0095]本発明は、本明細書で肯定的言語を使用して一般的に開示され、多数の実施形態及び態様が説明されている。本発明は、物質若しくは材料、方法ステップ及び条件、プロトコール、又は手順などの特定の対象事物が全部又は一部除外される実施形態も特定して含む。例えば、本発明のある実施形態又は態様では、材料及び／又は方法ステップが除外される。したがって、本発明が含まないことに関して、たとえ本発明が本明細書で一般的に表現されていなくても、それにも拘わらず、本発明で明白に除外されていない態様が、本明細書で開示されている。
【００９４】
[0096]本発明の幾つかの実施形態が記載されている。それにも拘わらず、当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変更及び改変を行って、本発明を種々の用途及び条件に適合させることができる。したがって、以下の例は、例示することを意図するが、特許請求された本発明の範囲を限定することは意図しない。
【実施例】
【００９５】
実施例１
この実施例は、発明のＨＥＫ細胞及び細胞株の製造、並びにそれに続くウイルスゲノムの移動及びウイルス（ＡＡＶ）ベクターの製造を記載する。
【００９６】
[0097]発明のＨＥＫ細胞及び細胞株は、種々の方法で、細胞の内因性ＤＨＦＲ遺伝子及び／又はＧＳ遺伝子をノックアウトすることにより製造することができる。例えば、ある非限定的な方法は、標的とされた開裂及び遺伝子不活性化のためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む（例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；第２００５０２０８４８９号；第２００５００２６１５７号；第２００５００６４４７４号；第２００６０１８８９８７号；第２００６００６３２３１号；第２００８／００１５１６４号；及び国際公開第０７／０１４２７５号を参照されたい）。ＺＦＮは、選ばれたゲノムの位置における二本鎖ＤＮＡの破断（ＤＳＢ）の場所を定める能力を提供する。この部位特異的ＤＳＢの除去は、供与体ＤＮＡが提供される場合、相同組換え修復プロセスを通して、又は非相同性末端接合（ＮＨＥＪ）により、細胞自体のＤＮＡ修復機構により実施される。例えば、Ｕｒｎｏｖら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６〜６５１（２００５）；Ｍｏｅｈｌｅら（２００７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４：３０５５〜３０６０（２００７）；Ｂｉｂｉｋｏｖａら（２００１）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：２８９〜２９７；Ｂｉｂｉｋｏｖａら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：７６４；Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：９６７〜９７３；Ｌｏｍｂａｒｄｏら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１２９８〜１３０６；Ｐｅｒｅｚら（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：８０８〜８１６；Ｂｉｂｉｋｏｖａら（２００２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１：１１６９〜１１７５；Ｌｌｏｙｄら（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：２２３２〜２２３７；Ｍｏｒｔｏｎら（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１６３７０〜１６３７５を参照されたい。
【００９７】
[0098]ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集は、内因性ＤＨＦＲ及び／若しくはＧＳの発現の低下した、又は内因性ＤＨＦＲ遺伝子及び／若しくはＧＳ遺伝子がノックアウトされた発明のＨＥＫ、ヒトＡ４５９及び／又はベロ細胞、細胞株並びに細胞クローンを製造するために使用することができる別の方法である。標的とされた遺伝子の改変／欠失のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、詳しく記載されている（例えば、Ｑｉ  ＬＳらＣｅｌｌ．１５２（５）、１１７３〜１１８３（２０１３）；Ｃｏｎｇ  Ｌ．らＳｃｉｅｎｃｅ．３３９（６１２１）、８１９〜８２３（２０１３）；Ｈｓｕ  ＰＤらＣｅｌｌ．１５７（６）、１２６２〜１２７８（２０１４）；Ｈｓｕ  ＰＤらＮａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（９）、８２７〜８３２（２０１３）；及びＤｏｕｄｎａ  ＪＡ、Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４６（６２１３）、１２５８０９６（２０１４）を参照されたい）。
【００９８】
[0099]ＤＨＦＲ遺伝子発現カセット又はＧＳ発現カセットのいずれかと関連するｒＡＡＶ−ｈＦｉｘの構築物を構築して、ＨＥＫ２９３  ＤＨＦＲ−／−／ＧＳ−／−細胞株にトランスフェクトした。安定なクローンを、ＭＴＸ又はＭＳＸを選択マーカーとして使用して単離した。高いコピー数のｒＡＡＶ−ｈＦｉＸゲノムを含有し、より多くのｒＡＡＶベクターを産生するクローンを、さらにキャラクタリゼーションするために維持した。幾つかの単離された細胞クローンは、安定で高いＡＡＶ産生を示した（図２）。
【００９９】
実施例２
この実施例は、発明のＨＥＫ細胞及び細胞株のある非限定的な特徴を説明する。
【０１００】
[0100]例えば、一般的に、
Ａ．  安定なプロデューサーのクローン。
Ｂ．  ＤＨＦＲ及び／又はＧＳ遺伝子がノックアウトされたヒト哺乳動物の製造細胞クローンは、ＤＨＦＲ又はＧＳ遺伝子（又は両方）を選択マーカーとして使用して、目的の遺伝子を発現する安定なクローンの選択を可能にし、クローンは、任意の目的の遺伝子、又はウイルスベクターを創出することができること。
Ｃ．  高い生産性を提供する遺伝子増幅機能を有する生物学的産生物を産生するために適当なヒト細胞株のより安定な産生。
Ｄ．  創出された細胞株のＤＨＦＲ及び／又はＧＳ陰性のゲノムのバックグラウンドが、目的の遺伝子の遺伝子増幅を可能にし、そのために高い特異的生産性に結びつくこと。
Ｅ．  混入のないゲノムバックグラウンド、陽性のプロデューサークローンを選択するための抗生物質マーカーを導入する必要がないこと、そのために、組換えタンパク質、ｒＡＡＶベクターなどのウイルスベクターを製造する、より安定なクローン。
Ｆ．  大幅に低下した労働コスト及び材料コスト。
【０１０１】
[0101]例えば、ｒＡＡＶ産生について、
Ａ．  向上したｒＡＡＶ収率
Ｂ．  大量の産生／大規模のｒＡＡＶ産生のための規模拡大の容易さ。
Ｃ．  ヘルパーウイルスの関与する産生系、例えばアデノウイルスをヘルパーとして使用する産生系、又はバキュロウイルスに基づく産生系と比較してより安定な産生系。
Ｄ．  空の粒子を減少させてｒＡＡＶベクター中にパッケージングされたＤＮＡ不純物を減少させることにより、空のカプシドの量が少ないｒＡＡＶベクターを産生すること。
Ｅ．  ある細胞クローン、同定された高いｒＡＡＶｈＦｉｘプロデューサークローンについて達成されたｒＡＡＶゲノムの高いコピー数。
Ｆ．  ｒＡＡＶｈＦｉｘゲノムを用いるＤＨＦＲ／ＧＳの二重ノックインがｒＡＡＶｈＦｉｘゲノムの実質的増幅を可能にし、そのために高いｒＡＡＶ産生に結びつくこと。
【０１０２】
[0102]例えば、タンパク質産生について、
Ａ．  ＨＥＫ、ヒトＡ４５９及び／又はベロ細胞及び細胞株は、生物学的産生物を、ヒトで産生させるときに、その自然のままの状態にさらに近く折りたたんで改変することができて、そのために、ＨＥＫ、ヒトＡ４５９及び／又はベロ細胞及び細胞株からの生成物の産生は、より安定で、より強くなること。
Ｂ．  ＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）及びＡ５４９細胞はヒト細胞株であり、別の非ヒト種のものではないので、ＨＥＫ（例えば、創出されたＨＥＫ２９３ＤＨＦＲ−／−／ＧＳ−／−細胞のクローン）、及び／又はヒトＡ４５９から産生した生物学的産生物は、人体からのその天然生成物にさらに近い翻訳後の改変を可能にすること。
【０１０３】
［関連出願］
[0001]本出願は、２０１６年３月３０日出願の米国特許仮出願第６２／３１５，４８０号に対する優先権を主張する。前述の出願の全内容は、本文、表、配列表及び図面の全てを含めて参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019509748.tif 000003
【図２】
2019509748.tif 000004
【国際調査報告】
2019509748.tif 000005
2019509748.tif 000006