(57)【要約】本明細書で提供する実施形態は、たとえばデジタル流体デバイスのためのパターン化されたフローセルまたはパターン化された表面を含むシーケンシング用途のためのパターン化された表面を調製する自己組織化方法を対象としている。方法は、フォトリソグラフィーを利用して、疎水性間隙領域によって分離された複数のマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭でパターン化された表面を作り出し、フォトリソグラフィープロセスの間の酸素プラズマ処理を必要としない。さらに、方法では、輪郭にゲル材料を堆積させた後の任意の化学的または機械的研磨ステップの使用が避けられる。
2019523640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体を含むゲルコーティングされた輪郭を有するパターン化された表面であって、前記固体支持体が、
表面であって、前記表面が連続的疎水性コーティング層を含む、表面と、
前記固体支持体の前記疎水性コーティング層上のフォトレジスト層であって、前記フォトレジスト層がマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭を含む、フォトレジスト層と、
前記マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭の内側のゲル材料の層であって、前記ゲル材料がオリゴヌクレオチドに共有結合することができる、ゲル材料の層と
を含む、パターン化された表面。
【請求項２】
前記輪郭が疎水性間隙領域によって分離され、少なくとも前記輪郭の一部および前記疎水性間隙領域の一部を覆うシランの層をさらに含む、請求項１に記載のパターン化された表面。
【請求項３】
前記マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭の少なくとも一部が前記疎水性コーティングを有しない、請求項１から２のいずれか一項に記載のパターン化された表面。
【請求項４】
前記輪郭がウェルを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のパターン化された表面。
【請求項５】
前記疎水性コーティング層が、フッ素化ポリマー、全フッ素化ポリマーもしくはケイ素ポリマー、またはそれらの混合物を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のパターン化された表面。
【請求項６】
前記疎水性コーティング層が、非晶質フルオロポリマー、ＣＹＴＯＰ−Ｍ、ＣＹＴＯＰ−Ｓ、ＣＹＴＯＰ−Ａ、ポリテトラフルオロエチレン、テフロン（登録商標）、パリレン、フッ素化炭化水素、フルオロアクリルコポリマー、Ｃｙｔｏｎｉｘ  Ｆｌｕｏｒｏｐｅｌ、フルオロシラン、プラズマ堆積フルオロカーボン、ケイ素ポリマー、ポリジメチルシロキサンもしくはシロキサン、またはそれらの混合物を含む、請求項５に記載のパターン化された表面。
【請求項７】
前記疎水性コーティング層が全フッ素化ポリマーを含む、請求項６に記載のパターン化された表面。
【請求項８】
前記疎水性コーティング層が、ＣＹＴＯＰ−Ｍ、ＣＹＴＯＰ−ＳもしくはＣＹＴＯＰ−Ａ、またはそれらの混合物を含む、請求項５に記載のパターン化された表面。
【請求項９】
前記疎水性コーティング層がＣＹＴＯＰ−Ｓを含む、請求項７に記載のパターン化された表面。
【請求項１０】
前記疎水性コーティング層がＣＹＴＯＰ−Ｍを含む、請求項７に記載のパターン化された表面。
【請求項１１】
前記疎水性コーティング層がＣＹＴＯＰ−ＳおよびＣＹＴＯＰ−Ａを含む、請求項７に記載のパターン化された表面。
【請求項１２】
前記疎水性コーティング層が前記表面と直接接触している、請求項１から１１のいずれか一項に記載のパターン化された表面。
【請求項１３】
前記疎水性コーティング層が、第１の接着促進層を介して前記表面と接触している、請求項１から１１のいずれか一項に記載のパターン化された表面。
【請求項１４】
前記第１の接着促進層が、ＣＹＴＯＰ−Ａ、ＡＰＴＭＳもしくはＡＰＴＥＳ、またはそれらの組合せを含む、請求項１３に記載のパターン化された表面。
【請求項１５】
前記フォトレジストが、前記固体支持体の前記疎水性コーティング層と直接接触している、請求項１から１４のいずれか一項に記載のパターン化された表面。
【請求項１６】
前記フォトレジストが、第２の接着促進層を介して前記固体支持体の前記疎水性コーティング層と接触している、請求項１から１４のいずれか一項に記載のパターン化された表面。
【請求項１７】
前記第２の接着促進層がフッ素化界面活性剤を含む、請求項１６に記載のパターン化された表面。
【請求項１８】
前記フッ素化界面活性剤が、Ｓｕｒｆｌｏｎ  Ｓ−６５１、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３０、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３２、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３４、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−５２１０、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮ−１００、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳ−３００、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳ−５００、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−１０、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−３０、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６０、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６１、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６３、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６４もしくはＣａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６５、またはそれらの組合せである、請求項１７に記載のパターン化された表面。
【請求項１９】
前記フォトレジストが、Ｓｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８００ＴＭシリーズのフォトレジストである、請求項１から１８のいずれか一項に記載のパターン化された表面。
【請求項２０】
前記フォトレジストが、Ｓｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８１８（ＭＩＣＲＯＰＯＳＩＴＴＭ  Ｓ１８１８ＴＭ）およびＳｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８０５（ＭＩＣＲＯＰＯＳＩＴＴＭ  Ｓ１８０５ＴＭ）から選択される、請求項１９に記載のパターン化された表面。
【請求項２１】
前記ゲル材料がＰＡＺＡＭを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のパターン化された表面。
【請求項２２】
前記ゲル材料が、核酸に付着したＰＡＺＡＭを含む、請求項２１に記載のパターン化された表面。
【請求項２３】
前記パターン化された表面が（ａ）結合材料層または（ｂ）シラン層をさらに含み、前記結合材料層またはシラン層が任意選択でノルボルネン誘導体化シランを含み、前記結合材料層またはシラン層が少なくとも前記輪郭の一部および前記疎水性間隙領域の一部を覆っている、請求項１から２２のいずれか一項に記載のパターン化された表面。
【請求項２４】
ゲルコーティングされた輪郭を有するパターン化された表面を調製する方法であって、
表面を含む固体支持体を提供するステップであって、前記表面が連続的疎水性コーティング層を含むステップと、
前記固体支持体の前記疎水性コーティング層上にフォトレジスト層を配置するステップと、
前記フォトレジスト層をパターン化して前記表面上にマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭を形成するステップと、
ゲル材料の層を前記マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭の内側に堆積させるステップであって、前記ゲル材料がオリゴヌクレオチドに共有結合することができる、ステップと
を含む方法。
【請求項２５】
分析用途のためのパターン化された表面を調製する方法であって、
表面を含む固体支持体を提供するステップであって、前記表面が連続的疎水性コーティング層を含むステップと、
前記固体支持体の前記疎水性コーティング層上にフォトレジスト層を配置するステップと、
前記フォトレジスト層をパターン化して疎水性間隙領域によって分離された前記表面上にマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭を形成するステップと、
前記フォトレジストを除去するステップと、
（ａ）結合材料層または（ｂ）シラン層を前記表面に適用して、少なくとも前記輪郭の一部および前記疎水性間隙領域の一部を覆うステップと
を含む方法。
【請求項２６】
分析用途のためのパターン化された表面を調製するための方法であって、
表面を含む固体支持体を提供するステップであって、前記表面が連続的疎水性コーティング層を含むステップと、
前記固体支持体の前記疎水性コーティング層上にフォトレジスト層を配置するステップと、
前記フォトレジスト層をパターン化して疎水性間隙領域によって分離された前記表面上にマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭を形成するステップと、
（ａ）結合材料層または（ｂ）シラン層を前記表面に適用して、少なくとも前記輪郭の一部および前記疎水性間隙領域の一部を覆うステップと、
ゲル材料を前記結合材料層またはシラン層に共有結合的に付着させるステップと
を含む方法。
【請求項２７】
前記疎水性コーティング層が、フッ素化ポリマー、全フッ素化ポリマーもしくはケイ素ポリマー、またはそれらの混合物を含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記疎水性コーティング層が、非晶質フルオロポリマー、ＣＹＴＯＰ−Ｍ、ＣＹＴＯＰ−Ｓ、ＣＹＴＯＰ−Ａ、ポリテトラフルオロエチレン、テフロン（登録商標）、パリレン、フッ素化炭化水素、フルオロアクリルコポリマー、Ｃｙｔｏｎｉｘ  Ｆｌｕｏｒｏｐｅｌ、フルオロシラン、プラズマ堆積フルオロカーボン、ケイ素ポリマー、ポリジメチルシロキサンもしくはシロキサン、またはそれらの混合物を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記疎水性コーティング層が全フッ素化ポリマーを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記疎水性コーティング層が、ＣＹＴＯＰ−Ｍ、ＣＹＴＯＰ−ＳもしくはＣＹＴＯＰ−Ａ、またはそれらの混合物を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記疎水性コーティング層がＣＹＴＯＰ−Ｓを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記疎水性コーティング層がＣＹＴＯＰ−Ｍを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記疎水性コーティング層がＣＹＴＯＰ−ＳおよびＣＹＴＯＰ−Ａを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭が、前記疎水性コーティング層の一部をエッチングして除去することによって形成される、請求項２４から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭が、前記疎水性コーティング層を含む疎水性間隙領域によって互いに分離されている、請求項２４から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記結合材料層またはシラン層がノルボルネン誘導体化シランを含む、請求項２５から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ゲル材料がＰＡＺＡＭを含む、請求項２４または２６から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ゲル材料が、核酸に付着したＰＡＺＡＭを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ゲル材料を硬化させるステップをさらに含む、請求項２４または２６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記フォトレジストを除去するステップをさらに含む、請求項２４から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記フォトレジストがアセトンによって除去される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記フォトレジストを除去した後で、前記疎水性間隙領域が前記ゲル材料を実質的に含まない、請求項２４または２６から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭の少なくとも一部が、前記疎水性コーティングを有しない、請求項２４から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、前記フォトレジストを配置する前の前記表面のプラズマデスカム処理を必要としない、請求項２４から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記疎水性コーティング層が前記表面と直接接触している、請求項２４から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記疎水性コーティング層が、第１の接着促進層を介して前記表面と接触している、請求項２４から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１の接着促進層が、ＣＹＴＯＰ−Ａ、ＡＰＴＭＳもしくはＡＰＴＥＳ、またはそれらの組合せを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記フォトレジストが、前記固体支持体の前記疎水性コーティング層と直接接触している、請求項２４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記フォトレジストが、第２の接着促進層を介して前記固体支持体の前記疎水性コーティング層と接触している、請求項２４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２の接着促進層がフッ素化界面活性剤を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記フッ素化界面活性剤が、Ｓｕｒｆｌｏｎ  Ｓ−６５１、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３０、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３２、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３４、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−５２１０、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮ−１００、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳ−３００、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳ−５００、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−１０、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−３０、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６０、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６１、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６３、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６４もしくはＣａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６５、またはそれらの組合せから選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記フォトレジストが、Ｓｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８００ＴＭシリーズのフォトレジストから選択される、請求項２４から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記フォトレジストが、Ｓｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８１８（ＭＩＣＲＯＰＯＳＩＴＴＭ  Ｓ１８１８ＴＭ）およびＳｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８０５（ＭＩＣＲＯＰＯＳＩＴＴＭ  Ｓ１８０５ＴＭ）から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記結合材料層またはシラン層にゲル材料を共有結合的に付着させるステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項５５】
過剰のゲル材料を、前記疎水性間隙領域が前記ゲル材料を実質的に含まなくなるように除去するステップをさらに含む、請求項２５から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ポリヌクレオチドのアレイを調製する方法であって、
オリゴヌクレオチドに共有結合することができるゲル材料でコーティングされたマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭を含むパターン化された表面を含む固体支持体を提供するステップであって、前記パターン化された表面が請求項２４から５５のいずれか一項に記載の方法によって調製される、ステップと、
複数の第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第２のオリゴヌクレオチドを前記ゲル材料に共有結合的に付着させるステップと
を含む、方法。
【請求項５７】
前記ポリマーコーティングに付着した前記複数の第１のオリゴヌクレオチドを増幅すべき鋳型と接触させるステップであって、各鋳型が前記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズできる配列を３’末端に、その相補体が前記第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズできる配列を５’末端に含む、ステップをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドを使用して前記鋳型を増幅し、それによりポリヌクレオチドのクラスター化されたアレイを生成するステップをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
本開示は、一般にポリヌクレオチドのシーケンシング用途のためのマイクロまたはナノパターン化された表面を作り出すためのフォトリソグラフィーパターニングプロセスの分野に関する。より具体的には、本出願は、フローセルまたはデジタル流体デバイスのためのパターン化された表面を調製する自己組織化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
概要
フローセルは、流体が、基材内のチャネルまたはウェルを通って流れることを可能にするデバイスである。核酸分析法において有用なパターン化されたフローセルには、不活性な間隙領域の内側の活性表面を有する別個のウェルが含まれる。フローセルの表面は通常、以下のステップを使用して加工される：（１）ウェルを最初にエッチングして均一な基材とする；（２）ウェルおよび間隙領域をシランおよびゲル材料で機能化する；（３）間隙領域を覆っている過剰のゲル材料を研磨プロセスによって除去する；ならびに（４）次いで、ウェル中のゲル材料に一本鎖プライマーＤＮＡをグラフトして下流のシーケンシング用途のためのフローセル表面を提供する。この場合、加工ワークフローの研磨ステップにおいてゲル材料の一部が無駄になる。さらに、間隙領域の表面エネルギーは主として出発基材に依存する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
実施形態はシーケンシング用途のためのパターン化された表面を調製する自己組織化方法に関する。パターン化された表面には、たとえば、デジタル流体デバイスのためのパターン化されたフローセルまたはパターン化された表面が含まれ得る。一部の実施形態では、方法は、フォトリソグラフィーを利用して、疎水性間隙領域によって分離された複数のマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭でパターン化された表面を生成するが、フォトレジストを堆積させる前の酸素プラズマ表面または他の処理の必要性を排除する。さらに、一部の実施形態では、輪郭の上にゲル材料を堆積させた後の化学的または機械的研磨ステップの使用が避けられる。
【０００４】
本明細書に記載した一部の実施形態は、表面を含む固体支持体を提供するステップであって、該表面が連続的疎水性コーティング層を含むステップと、固体支持体の疎水性コーティング層上にフォトレジストを配置して疎水性コーティング層を覆うステップと、フォトリソグラフィー（または当技術分野で公知であるおよび／または本明細書に記載した他の好適な方法）によってフォトレジスト層をパターン化して表面上にマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭を形成するステップと、ゲル材料の層をマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭の内側に堆積させるステップであって、ゲル材料がオリゴヌクレオチドに共有結合することができる、ステップとによって、ゲルコーティングされた輪郭を有するパターン化された表面を調製する方法に関する。一部の実施形態では、マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭は、疎水性コーティング層の一部をエッチングして除去することによって形成される。一部の実施形態では、マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭は、疎水性コーティング層を含む疎水性間隙領域によって互いに分離されている。一部の実施形態では、マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭の少なくとも一部は疎水性コーティングを有しない。一部の実施形態では、方法は、フォトレジストを配置する前の表面のプラズマ表面改質処理（たとえば、デスカムもしくは酸素プラズマ処理、コロナ処理、加熱、化学的もしくは液体活性化、または表面エネルギーを増大させ、結合特性を改善するために使用される他の処理）を必要としない。ある特定の実施形態では、輪郭はウェルである。
【０００５】
本明細書に記載した一部の実施形態は、分析用途のためのパターン化された表面を調製する方法に関し、該方法は、表面を含む固体支持体を提供するステップであって、該表面が連続的疎水性コーティング層を含むステップと、固体支持体の疎水性コーティング層上にフォトレジストを配置して疎水性コーティング層を覆うステップと、フォトリソグラフィー（または他の好適な方法）によってフォトレジスト層をパターン化して疎水性間隙領域によって分離された表面上にマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭を形成するステップと、フォトレジストを除去するステップと、シラン層などの結合材料の層を表面に適用して、少なくとも輪郭の一部および疎水性間隙領域の一部を覆うステップとを含む。一部の実施形態では、方法は、ゲル材料をシランなどの結合材料の層に共有結合的に付着させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドをゲル材料に共有結合的に付着させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ゲル材料をシランなどの結合材料の層に非共有結合的に付着させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ゲル材料の層を結合材料層またはシランの層に適用するステップを含む。
【０００６】
本明細書に記載した一部の実施形態は、分析用途のためのパターン化された表面を調製する方法に関し、該方法は、表面を含む固体支持体を提供するステップであって、該表面が連続的疎水性コーティング層を含むステップと、固体支持体の疎水性コーティング層上にフォトレジストを配置して疎水性コーティング層を覆うステップと、フォトリソグラフィー（または他の好適な方法）によってフォトレジスト層をパターン化して疎水性間隙領域によって分離された表面上にマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭を形成するステップと、シランの層を表面に適用して、少なくとも輪郭の一部および疎水性間隙領域の一部を覆うステップと、ゲル材料を結合材料層またはシランの層に共有結合的に付着させるステップとを含む。一部の実施形態では、方法は、フォトレジストを除去して疎水性間隙領域中の疎水性層を露出させるステップをさらに含む。
【０００７】
一部の実施形態では、結合材料は、共有結合的または非共有結合的にゲル材料を疎水性コーティング層および／または固体支持体に固定化する。一部の実施形態では、ゲル材料は、結合材料、たとえばシランに共有結合する。
【０００８】
本明細書に記載した一部の実施形態は、ポリヌクレオチドのアレイを調製する方法に関し、該方法は、パターン化された表面を含む固体支持体を提供するステップであって、該表面がオリゴヌクレオチドに共有結合することができるゲル材料でコーティングされたマイクロスケールおよび／またはナノスケールの輪郭を含み、該表面が本明細書に記載した方法のいずれかによって調製される、ステップと、複数の第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第２のオリゴヌクレオチドをゲル材料に共有結合的に付着させるステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、基材のパターン化された表面上に疎水性間隙領域を作り出すために使用され得る３種の全フッ素化ポリマー（ＣＹＴＯＰ−Ａ、ＣＹＴＯＰ−ＭおよびＣＹＴＯＰ−Ｓ）を示す概略図である。
【００１０】
【図２Ａ】図２Ａは、複数のウェルおよび疎水性間隙領域を含むガラス基材のパターン化された表面の部分断面図である。
【００１１】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ガラススライドの最上部の３層の材料を示す図２Ａの拡大図である。
【００１２】
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｔｙｐｈｏｏｎ装置からの３種のグラフト化ガラス表面の蛍光画像である。
【００１３】
【図３】図３は、化学処理の前後で対照表面と比較した、ＣＹＴＯＰ−ＭおよびＣＹＴＯＰ−Ｓで処理したガラス表面の接触角を示す。
【００１４】
【図４】図４は、パターン化された表面を作り出すための典型的なワークフローの断面図を示す。
【００１５】
【図５】図５は、パターン化された表面を作り出すための改善されたワークフローの一実施形態を示す。
【００１６】
【図６−１】図６Ａおよび６Ｂは、１４μｍのマイクロウェルを有するパターン化されたデバイス表面の蛍光画像である。
【００１７】
【図６−２】図６Ｃは、直径７００ｎｍのマイクロウェルにおけるパターン化されたＤＮＡクラスターの蛍光画像である。
【００１８】
【図７】図７は、パターン化された表面を作り出すための改善された直接パターニングワークフローの一実施形態を示す。
【００１９】
【図８Ａ】図８Ａは、リフトオフ法を使用してパターン化された表面を作り出すための改善されたパターニングワークフローの一実施形態を示す。
【００２０】
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａで例示したリフトオフワークフローを使用した直径１４μｍのマイクロウェル構造におけるパターン化されたＰＡＺＡＭおよびＤＮＡクラスターの蛍光画像を示す。
【００２１】
【図９Ａ】図９Ａは、液相リフロープロセスの例を示す。
【００２２】
【図９Ｂ】図９Ｂは、蒸気相リフロープロセスの例を示す。
【００２３】
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｏ２プラズマ処理後のＰＡＺＡＭコーティングされたＣＹＴＯＰ−Ｓナノウェル（直径７００ｎｍ〜１．１μｍ）の光学顕微鏡画像である。
【００２４】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、液相溶媒リフロー後の図１０ＡのＰＡＺＡＭコーティングされたＣＹＴＯＰ−Ｓナノウェルの光学顕微鏡画像である。
【００２５】
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、蛍光染料を含む水滴によるウェッティング／デウェッティングの後の図１０ＢのＰＡＺＡＭコーティングされたＣＹＴＯＰ−Ｓナノウェルの蛍光画像である。
【００２６】
【図１１Ａ】図１１Ａは、サブミクロンサイズのウェルにおけるＤＮＡクラスターパターニングを示す。明るい点は、蛍光染料で標識されたＤＮＡクラスターである。「ｔ」字状のエリアでは、材料はパターン化されていないＳｉＯ２であり、クラスターはランダムに分布している。画像は、図１１Ｂに示すトポロジーを使用して生じさせた。
【００２７】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、パターン化された基材の断面説明図を示す。ウェルの直径は０．７ミクロンであり、１．７５ミクロンのピッチで配列されている。
【００２８】
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、バイオ試薬の交換を容易にするためのＭｉＳｅｑ（登録商標）フローセルフォーマットにおけるパターン化された基材アセンブリーを示す。絵図は、図１１Ｂに示すトポロジーを使用して生じさせた。
【００２９】
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＤＮＡクラスターのサイズおよび強度が異なるウェルのサイズで調節可能であることを示す。図１２Ａは、図１１Ｂに示す表面層を有する直径０．７ミクロンでピッチ１．７５ミクロンのウェルの中で成長したＳＹＴＯＸ（登録商標）染色クラスターを示す。図１２Ｂは、直径０．９ミクロンでピッチ１．７５ミクロンのウェルの中で成長したＳＹＴＯＸ（登録商標）染色クラスターを示す。
【００３０】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＣＹＴＯＰパターン化された表面（ウェル直径０．７ミクロン、ピッチ１．７５ミクロン）からのシーケンシング結果を示す。図１３Ａは、研磨なしのパターニング法を使用して得られた、ＣＹＴＯＰナノウェルの内側の重ね合わせたＣチャネルおよびＴチャネルならびにクラスターの環状基準指示パターニングを示す第１のベース画像である。図１３Ｂは、この操作の各１５０サイクルの読み１および読み２についてのミスマッチ率（エラー率）を示す。達成したエラー率は、ＭｉＳｅｑ操作から予想されるエラー率（１５０サイクルの終わりで約２％）と同様である。この図は、ペアードエンドターンアラウンドが研磨なしのパターニング法と両立できることも示している。図１３Ｃは、ベースアウトプットの品質の尺度を提供すると同時に、操作のサイクルの関数としての読みのｑスコア（品質スコア）を示す。ＣＹＴＯＰパターニングは、シーケンシング化学と両立できることが示され、強固であり、２×１５０ｂｐｓのシーケンシングを終了するために数千回の流れ交換を遅らせる。これらの実験の詳細は、実施例３に記載する。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＣＹＴＯＰパターン化された表面（ウェル直径０．７ミクロン、ピッチ１．７５ミクロン）からのシーケンシング結果を示す。図１３Ａは、研磨なしのパターニング法を使用して得られた、ＣＹＴＯＰナノウェルの内側の重ね合わせたＣチャネルおよびＴチャネルならびにクラスターの環状基準指示パターニングを示す第１のベース画像である。図１３Ｂは、この操作の各１５０サイクルの読み１および読み２についてのミスマッチ率（エラー率）を示す。達成したエラー率は、ＭｉＳｅｑ操作から予想されるエラー率（１５０サイクルの終わりで約２％）と同様である。この図は、ペアードエンドターンアラウンドが研磨なしのパターニング法と両立できることも示している。図１３Ｃは、ベースアウトプットの品質の尺度を提供すると同時に、操作のサイクルの関数としての読みのｑスコア（品質スコア）を示す。ＣＹＴＯＰパターニングは、シーケンシング化学と両立できることが示され、強固であり、２×１５０ｂｐｓのシーケンシングを終了するために数千回の流れ交換を遅らせる。これらの実験の詳細は、実施例３に記載する。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＣＹＴＯＰパターン化された表面（ウェル直径０．７ミクロン、ピッチ１．７５ミクロン）からのシーケンシング結果を示す。図１３Ａは、研磨なしのパターニング法を使用して得られた、ＣＹＴＯＰナノウェルの内側の重ね合わせたＣチャネルおよびＴチャネルならびにクラスターの環状基準指示パターニングを示す第１のベース画像である。図１３Ｂは、この操作の各１５０サイクルの読み１および読み２についてのミスマッチ率（エラー率）を示す。達成したエラー率は、ＭｉＳｅｑ操作から予想されるエラー率（１５０サイクルの終わりで約２％）と同様である。この図は、ペアードエンドターンアラウンドが研磨なしのパターニング法と両立できることも示している。図１３Ｃは、ベースアウトプットの品質の尺度を提供すると同時に、操作のサイクルの関数としての読みのｑスコア（品質スコア）を示す。ＣＹＴＯＰパターニングは、シーケンシング化学と両立できることが示され、強固であり、２×１５０ｂｐｓのシーケンシングを終了するために数千回の流れ交換を遅らせる。これらの実験の詳細は、実施例３に記載する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
実施形態は、これだけに限らないが、細胞、細胞内成分、および分子を含む生物学的成分などの目的の分析物の分析および合成において使用され得るパターン化された表面を調製する方法に関する。例示的な生物学的分子には、これだけに限らないが、核酸、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、アミノ酸、ぺプチド、タンパク質、多糖、糖、代謝物、および酵素補因子などが含まれる。パターン化された表面を使用することができる特に有用な分析プロセスには、たとえば核酸シーケンシング用途が含まれる。一実施形態では、パターン化された表面は、フローセルまたはエレクトロウェッティング流体デバイスの一部である。一部の実施形態では、疎水性間隙領域によって分離された複数のマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭でパターン化された表面を作り出すために、フォトエッチング、フォトエングレービングもしくはフォトリソグラフィー、または電子線リソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィー、ナノスタンピングもしくは直接アブレーションなどの他のパターニング法などのナノ加工手法が使用される。本明細書でパターニング手法としてフォトリソグラフィーを述べる場合、表面をパターニングするためにこれらの他の方法も使用することができる。パターン化された表面は、フォトリソグラフィーの前の基材表面の酸素プラズマ処理を必要とせずに製造することができる。ゲル材料を表面上に堆積させることができ、表面上の輪郭および間隙領域の差異的疎水性／親水性特性を利用して、ゲル材料を所望の特徴部分に保持しながら表面の一部の領域からゲル材料を便利に除去することができる。たとえば、ゲル材料をシラン化ウェルに保持し、ウェルの周囲の疎水性間隙領域から除去することができる。そのような実施形態は、ゲル材料を表面の上に堆積させた後の、ゲル材料を間隙領域から除去するために苛酷な化学的または機械的研磨ステップの使用を避けることによって、特に有利であり得る。一部の実施形態では、疎水性間隙領域には、ＣＹＴＯＰ−Ｓなどの全フッ素化ポリマーが含まれる。
【００３２】
本明細書で使用されるセクション見出しは、構成の目的のためのみであり、記載する主題を制限すると解釈すべきではない。
表面の調製
【００３３】
本明細書に記載した一部の実施形態は、核酸分子などの分析物を所定の位置に結合させるために構成されたパターン化された表面を調製する方法に関し、またパターン化された表面に関する。たとえば、パターン化された表面は差異的疎水性および親水性特性を有する領域または輪郭を有してよい。これにより、表面に表面化学を差次的に適用することが可能となり得る。たとえば、表面上に形成された輪郭、ウェル、または他の特徴部分を処理して、輪郭、ウェル、または他の特徴部分を互いに分離する間隙領域には存在しない反応性シランおよび／またはゲル材料を含有するようにすることができる。一実施形態では、輪郭またはウェルは、核酸分子などの分析物に結合することができるか、または結合しているゲルまたは同様のポリマー材料でコーティングされる。この実施形態では、連続的疎水性コーティング層を有する表面を含む固体支持体から出発することによって、パターン化された表面を作り出すことができる。次いで、固体支持体の疎水性コーティング層上にフォトレジストの層を堆積させて疎水性コーティング層を覆うことができる。次いで、フォトレジスト層を、複数のマイクロスケールおよび／またはナノスケールのパターンを含むフォトマスクを使用するフォトリソグラフィーによって、マイクロスケールまたはナノスケールのパターンを表面に転写して疎水性コーティング層上にマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭を形成するようにパターン化することができる。次いで、マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭の内側にゲル材料の層を堆積させることができ、ここで、ゲル材料はオリゴヌクレオチドに共有結合することができる。
【００３４】
フォトリソグラフィーの間、フォトレジストは、パターン化されたフォトマスクを使用することによってあるパターンの光（たとえばＵＶ光）に露光される。露光によって化学変化が引き起こされ、それにより、露光されたフォトレジストの一部が現像液によって除去されて、下にある疎水性コーティング層のパッチを露出することが可能となる。フォトレジストが（たとえば、プロセスにおいて使用される特定のフォトレジスト製品についての標準的処方に従って）現像された後、表面上の露出された疎水性コーティング層の一部をエッチングして除去することによって、マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭が形成される。一部の実施形態では、マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭は、疎水性コーティング層を含む疎水性間隙領域によって互いに分離されている。一部の実施形態では、マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭の少なくとも一部は、疎水性コーティングを有しない。一部の実施形態では、輪郭は、チャネルまたはウェル（たとえばマイクロウェルまたはナノウェル）などの凹部を含む。別の実施形態では、輪郭はリッジ、ポスト、またはコーン（たとえばナノポストまたはナノコーン）などの凸部を含む。
【００３５】
本明細書に記載した方法の一部の実施形態では、疎水性コーティング層はフッ素化ポリマー、全フッ素化ポリマーもしくはケイ素ポリマー、またはそれらの混合物を含む。ポリマー骨格は、炭素もしくはケイ素、またはそれらの組合せでよい。一部の実施形態では、フッ素化ポリマーは、たとえば、非晶質フルオロポリマー（任意選択で、カルボキシル、シリル化アミド、またはトリフルオロメチル末端などのペンダント官能基を任意選択で有する２，３−連結全フッ素化ＴＨＦモノマー、たとえばＣＹＴＯＰ−Ｍ、ＣＹＴＯＰ−Ｓ、ＣＹＴＯＰ−Ａ、図１参照）、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標）など）、パリレン（parylen）（たとえば、グレードＡ、Ｆ、ＨＴ）、フッ素化炭化水素、フルオロアクリルコポリマー（Ｃｙｔｏｎｉｘ  Ｆｌｕｏｒｏｐｅｌなど）、フルオロシラン、またはプラズマ堆積フルオロカーボンである。一部の実施形態では、ケイ素ポリマーは、ポリジメチルシロキサンまたはシロキサンである。一部の実施形態では、疎水性コーティング層は、全フッ素化ポリマーを含む。一部の特定の実施形態では、全フッ素化ポリマーは、ＣＹＴＯＰ−Ｍ、ＣＹＴＯＰ−Ｓ、またはＣＹＴＯＰ−Ａから選択される。一実施形態では、全フッ素化ポリマーは、ＣＹＴＯＰ−Ｓを含むか、ＣＹＴＯＰ−Ｓである。別の実施形態では、全フッ素化ポリマーはＣＹＴＯＰ−Ｍを含む。別の実施形態では、全フッ素化ポリマーは、ＣＹＴＯＰ−ＳとＣＹＴＯＰ−Ａの混合物である。一部の実施形態では、疎水性コーティング層は、表面と直接接触している。直接接触は、共有結合によるものであっても、非共有結合によるものであってもよい。他の一部の実施形態では、疎水性コーティング層は、第１の接着促進層を介して表面と接触している。一つの例では、第１の接着促進層は、官能化シランまたは接着促進剤を含み、例示的な第１の接着層は、ＣＹＴＯＰ−Ａ、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）もしくは（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（triethyoxysilane）（ＡＰＴＥＳ）、またはそれらの組合せを含む。
【００３６】
フォトリソグラフィーのためにフォトレジストを疎水性コーティング層上に配置するには、疎水性コーティング層とその上に堆積させるフォトレジスト層との間に表面エネルギーのある程度の一致が必要なことが多い。一部の実施形態では、フォトレジスト適用のために酸素プラズマ処理を使用して疎水性コーティング層が調製される。一部の例では、（デスカム処理などの）酸素プラズマ処理によって疎水性コーティング層の化学構造が損傷を受けることがある。本方法は、２つの代替プロセスを提案することによって、フォトレジストを配置する前の表面の前処理の必要性を除去または低減する。
【００３７】
１つの選択肢では、フォトレジストは、酸素プラズマ前処理なしに疎水性コーティング層と直接接触するように使用することができる。一部の実施形態では、フォトレジストはポジ型フォトレジストである。他の実施形態では、フォトレジストはネガ型フォトレジストである。一部の実施形態では、フォトレジストは、Ｓｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８００ＴＭシリーズのフォトレジスト、たとえば、Ｓｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８１８（ＭＩＣＲＯＰＯＳＩＴＴＭ  Ｓ１８１８ＴＭ）およびＳｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８０５（ＭＩＣＲＯＰＯＳＩＴＴＭ  Ｓ１８０５ＴＭ）から選択される。
【００３８】
別の選択肢では、疎水性コーティング層とフォトレジスト層との間の表面エネルギーの不一致を低減するために接着促進層が使用され得る。一部の実施形態では、接着促進層はフッ素化界面活性剤を含む。一部のそのような実施形態では、フッ素化界面活性剤は、Ｓｕｒｆｌｏｎ  Ｓ−６５１、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３０、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３２、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３４、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−５２１０、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮ−１００、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳ−３００、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳ−５００、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−１０、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−３０、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６０、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６１、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６３、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６４もしくはＣａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６５、またはそれらの組合せから選択される。一実施形態では、フッ素化界面活性剤はＳｕｒｆｌｏｎ  Ｓ−６５１を含む。
直接ゲルパターニング
【００３９】
本明細書に記載した一部の実施形態は、分析用途のためのパターン化された表面を直接ゲルパターニング法によって調製する方法に関する。直接ゲルパターニング法では、表面を有する固体支持体には連続的疎水性コーティング層が備わっている。フォトレジストは、疎水性コーティング層上に配置される。次いで、複数のマイクロスケールまたはナノスケールのパターンを含むフォトマスクを使用するフォトリソグラフィーによってフォトレジスト層がパターン化され、それによりマイクロスケールまたはナノスケールのパターンが表面に転写されて、疎水性間隙領域によって分離された表面上にマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭が形成される。一部の実施形態では、疎水性コーティング層の一部をエッチングして除去することによってマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭が形成され、マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭は、疎水性コーティング層を含む疎水性間隙領域によって互いに分離されている。次いで、フォトレジストが除去され、少なくとも輪郭の一部および疎水性間隙領域の一部を覆うようにシランの層が表面に適用される。次いで、表面にゲルが添加される。ゲルを表面に付着させる前、後、またはその間に、核酸をゲルに付着させることができる。これらの方法は、直接パターニング法としても公知である。
【００４０】
本明細書に記載した直接パターニング法では、露光されていない残存フォトレジストは何らかの化学変化を受ける必要がなく、現像プロセスの後に疎水性間隙領域に残ってもよい。残存フォトレジストは、使用するフォトレジストの種類に応じた種々の試薬によって除去することができる。たとえば、フォトレジストリフトオフレジスト（ＬＯＲ）は、ＭＩＣＲＯＣＨＥＭのＲｅｍｏｖｅｒ  ＰＧによって除去することができる。一部の実施形態では、残存フォトレジストは、アセトンにより、たとえば、アセトン溶液中での超音波処理によって除去される。第２の接着促進層は、フォトレジストとともに同時に除去され得る。あるいは、第２の接着促進層は、異なる除去試薬を使用してフォトレジストの後で除去される。疎水性間隙領域を覆う残存フォトレジストを除去した後、露出した疎水性コーティング層を、その後のシラン堆積に供することができる。
【００４１】
一部の実施形態では、ゲル材料は、シランの層に共有結合的に付着している。一部の実施形態では、方法は、ゲル材料を硬化させるステップをさらに含む。当業者には理解されるように、硬化プロセスは、使用するゲル材料の種類に応じて種々の条件で行われ得る。一部の実施形態では、硬化は、シラン層上に堆積したゲル材料をオーブン中でインキュベートすることによって行われる。さらなる一部の実施形態では、方法は、過剰のゲル材料を、疎水性間隙領域がゲル材料を実質的に含まなくなるように除去するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ゲル材料の除去は、単純に水ですすぐことによって行うことができる。
【００４２】
一部の実施形態では、本明細書に記載した方法は、ゲル材料を堆積させた後の化学的または機械的研磨の必要性も排除する。
【００４３】
一部の実施形態では、方法は、核酸（たとえばオリゴヌクレオチド）をゲル材料に共有結合的に付着させるステップをさらに含む。
リフトオフゲルパターニング
【００４４】
本明細書に記載したさらなる一部の実施形態は、リフトオフゲルパターニング法によってパターン化された表面を調製する方法に関する。この方法は、連続的疎水性コーティング層を有する固体支持体を使用して、疎水性コーティング層上にフォトレジスト層を配置するステップを含み得る。次いで、フォトレジストを、複数のマイクロスケールまたはナノスケールのパターンを含むフォトマスクを使用するフォトリソグラフィーによって、マイクロスケールまたはナノスケールのパターンを表面に転写して疎水性間隙領域によって分離された表面上にマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭を形成するようにパターン化することができる。一部の実施形態では、疎水性コーティング層の一部をエッチングして除去することによってマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭が形成される。次いで、少なくとも輪郭の一部および疎水性間隙領域の一部を覆うようにシランの層を表面に適用することができ、ゲル材料をシランの層に共有結合的に付着させることができる。これらの方法は、リフトオフ法としても公知である。
【００４５】
記載するリフトオフ法では、直接パターニングプロセスで記載したようにパターン転写の直後にフォトレジストを除去するのではなく、該方法は、フォトレジストの存在下、シランの層を表面に直接適用して、少なくとも輪郭の一部および疎水性間隙領域の一部を覆うことができる。次いで、ゲル材料をシランの層に共有結合的に付着させることができる。一部の実施形態では、方法は、ゲル材料を硬化させるステップをさらに含む。当業者には理解されるように、硬化プロセスは、使用するゲル材料の種類に応じて種々の条件で行われ得る。一部の実施形態では、硬化は、シラン層上に堆積したゲル材料をオーブン中でインキュベートすることによって行われる。
【００４６】
ゲル材料がシラン層上に固定化された後、次いで、間隙領域中の残存フォトレジストは除去または「リフトオフ」し、それにより下の疎水性コーティング層を露出させることができる。残存フォトレジストは、使用するフォトレジストの種類に応じた種々の試薬によって除去することができる。たとえば、フォトレジストＬＯＲは、ＭＩＣＲＯＣＨＥＭのＲｅｍｏｖｅｒ  ＰＧによって除去することができる。一部の実施形態では、残存フォトレジストは、アセトンにより、たとえば、アセトン溶液中での超音波処理によって除去される。第２の接着促進層は、フォトレジストとともに同時に除去され得る。あるいは、第２の接着促進層は、異なる除去試薬を使用してフォトレジストの後で除去される。一実施形態では、フォトレジストと第２の接着促進層は、アセトンによって両方とも除去される。
【００４７】
一部の実施形態では、方法は、シラン層に固定化されていない過剰のゲル材料を除去するステップをさらに含む。
【００４８】
一部の実施形態では、方法は、核酸（たとえばオリゴヌクレオチド）をゲル材料に共有結合的に付着させるステップをさらに含む。
【００４９】
本明細書で説明した方法または組成物（たとえば表面調製、直接パターニング、およびリフトオフ法）では、本明細書で使用するシランは、ゲル材料と共有結合を形成するための官能基を含んでよい。シランにおける官能基の非限定的な例には、ビニル、アクリロイル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニル、ニトレン、アルデヒド、ヒドラジニル、グリシジルエーテル、エポキシ、カルベン、イソシアネートもしくはマレイミド、または任意選択で置換されているそれらのバリアントもしくは組合せが含まれる。たとえば、本明細書で使用するシランは、アミノ基（ＡＰＴＥＳまたはＡＰＴＭＳなど）を含んでよい。一部の好ましい実施形態では、本明細書で使用するシランは、ノルボルネン誘導体化シランを含む。一実施形態では、シランは、［（５−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エニル）エチル］トリメトキシシランを含む。シランを、固体支持体の表面上に化学蒸着により堆積させてよい。
【００５０】
本明細書で説明した方法または組成物（たとえば表面調製、直接パターニング、およびリフトオフ法）では、使用され得るゲル材料には、これだけに限らないが、ヒドロゲルまたはポリマーが含まれる。有用なヒドロゲルには、これだけに限らないが、シランを含まないアクリルアミド（ＳＦＡ）ポリマー、ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ）、たとえば、ＷＯ００／３１１４８（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているアクリルアミドおよびアクリル酸またはビニル基を含有するアクリル酸から形成されたポリアクリルアミドポリマー；たとえば、ＷＯ０１／０１１４３またはＷＯ０３／０１４３９２（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている［２＋２］光環化付加反応を形成するモノマーから形成されたポリアクリルアミドポリマー；あるいは米国特許第６，４６５，１７８号、ＷＯ０１／６２９８２またはＷＯ００／５３８１２（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているポリアクリルアミドコポリマーが含まれる。対応する反応性基を有するオリゴヌクレオチドと反応することができる反応性部位を有するヒドロゲルなどの、これらのゲル材料の化学的に処理されたバリアントも有用である（たとえば、ＰＡＺＡＭは、５’−または３’−アルキニル変性オリゴヌクレオチドと反応することができる）。他の有用なゲルは、液体からゲル状への状態の温度依存性変化によって形成されるゲルである。例には、これだけに限らないが、寒天、アガロース、またはゼラチンが含まれる。一部の実施形態では、ゲル材料を、シラン層に共有結合的に付着させる。
【００５１】
一部の実施形態では、使用されるゲル材料は、反応性部位を含む。本明細書で使用する用語「反応性部位」は、化学反応または分子相互作用によって、１つもしくはそれより多くの分子をゲル材料に付着させ、そして／またはゲル材料を表面に付着させるために使用することができる、本明細書に記載したゲル上の部位を意味する。反応性部位の非限定的な例には、アジド、任意選択で置換されているアミノ、Ｂｏｃ保護アミノ、ヒドロキシ、チオール、アルキニル、アルケニル、ハロ、エポキシ、テトラジニル、またはアルデヒドが含まれる。一部の実施形態では、ゲル材料は、反応性部位としてアジド官能基を有するポリマーを含む。特定の実施形態では、ゲル材料はＰＡＺＡＭを含む。ＰＡＺＡＭは、触媒を含まない歪み促進型環化付加によってノルボルネン誘導体化シランと反応して共有結合を形成することができる。一部の実施形態では、ゲル材料の反応性部位は、プライマーグラフティングの目的で、官能化オリゴヌクレオチドと共有結合を形成することもできる。一部の代替実施形態では、ゲル材料は、シラン層と反応する前にプライマーとプレグラフトされる。
【００５２】
他の一部の実施形態では、ゲル形成（たとえば重合可能な）材料を液体状態で表面上に提供し、続いてゲルに変換することができる。重合可能な材料の例には、限定することなくアクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−ビニルピロリジノン（pyrolidinone）、またはそれらの誘導体が含まれる。そのような材料は、ヒドロゲルを調製するために有用である。一部の実施形態では、重合可能な材料は、コポリマーを形成する異なる２種またはそれより多種の化合物を含み得る。たとえば、異なる２種またはそれより多種のアクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−ビニルピロリジノン、またはそれらの誘導体は、重合してコポリマーヒドロゲルを形成するコモノマーとして機能し得る。
パターン化された表面および固体支持体
【００５３】
本明細書において、固体支持体を含むゲルコーティングされた輪郭を有するパターン化された表面であって、
連続的疎水性コーティング層を含む表面と、
固体支持体の疎水性コーティング層上のフォトレジスト層であって、フォトレジスト層がマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭を含む、フォトレジスト層と、
マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭の内側のゲル材料の層であって、ゲル材料がオリゴヌクレオチドに共有結合することができる、ゲル材料の層と
を含む、パターン化された表面が記載される。
【００５４】
一部の実施形態では、輪郭は、疎水性間隙領域によって分離されており、少なくとも輪郭の一部および疎水性間隙領域の一部を覆う（シランの層などの）結合材料の層をさらに含む。一部の実施形態では、マイクロスケールまたはナノスケールの輪郭の少なくとも一部は、疎水性コーティングを有しない。一部の実施形態では、輪郭はウェルを含む。一部の実施形態では、表面は、疎水性コーティング層と、固体支持体の疎水性コーティング層上のフォトレジスト層であって、フォトレジスト層がマイクロスケールまたはナノスケールの輪郭を含む、フォトレジスト層と、輪郭の少なくとも一部および疎水性間隙領域の少なくとも一部を覆う結合材料またはシランの層とを含む。
【００５５】
一部の実施形態では、疎水性コーティング層は、フッ素化ポリマー、全フッ素化ポリマーもしくはケイ素ポリマー、またはこれらの混合物を含む。一部の実施形態では、疎水性コーティング層は、非晶質フルオロポリマー、ＣＹＴＯＰ−Ｍ、ＣＹＴＯＰ−Ｓ、ＣＹＴＯＰ−Ａ、ポリテトラフルオロエチレン、テフロン（登録商標）、パリレン、フッ素化炭化水素、フルオロアクリルコポリマー、Ｃｙｔｏｎｉｘ  Ｆｌｕｏｒｏｐｅｌ、フルオロシラン、プラズマ堆積フルオロカーボン、ケイ素ポリマー、ポリジメチルシロキサンもしくはシロキサン、またはそれらの混合物を含む。他の実施形態では、疎水性コーティング層は、全フッ素化ポリマーを含む。他の実施形態では、疎水性コーティング層は、ＣＹＴＯＰ−Ｍ、ＣＹＴＯＰ−ＳもしくはＣＹＴＯＰ−Ａ、またはそれらの混合物を含む。他の実施形態では、疎水性コーティング層はＣＹＴＯＰ−Ｓを含む。他の実施形態では、疎水性コーティング層はＣＹＴＯＰ−Ｍを含む。他の実施形態では、疎水性コーティング層はＣＹＴＯＰ−ＳおよびＣＹＴＯＰ−Ａを含む。
【００５６】
一部の実施形態では、疎水性コーティング層は、表面と直接接触している。他の実施形態では、疎水性コーティング層は、第１の接着促進層を介して表面と接触している。一部の実施形態では、第１の接着促進層は、ＣＹＴＯＰ−Ａ、ＡＰＴＭＳもしくはＡＰＴＥＳ、またはそれらの組合せを含む。
【００５７】
一部の実施形態では、フォトレジストは、固体支持体の疎水性コーティング層と直接接触している。他の実施形態では、フォトレジストは、第２の接着促進層を介して固体支持体の疎水性コーティング層と接触している。一部の実施形態では、第２の接着促進層はフッ素化界面活性剤を含む。一部の実施形態では、フッ素化界面活性剤は、Ｓｕｒｆｌｏｎ  Ｓ−６５１、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３０、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３２、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３４、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−５２１０、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮ−１００、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳ−３００、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳ−５００、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−１０、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−３０、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６０、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６１、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６３、Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６４もしくはＣａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−６５、またはそれらの組合せである。
【００５８】
一部の実施形態では、フォトレジストはＳｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８００ＴＭシリーズのフォトレジストである。一部の実施形態では、フォトレジストは、Ｓｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８１８（ＭＩＣＲＯＰＯＳＩＴＴＭ  Ｓ１８１８ＴＭ）およびＳｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８０５（ＭＩＣＲＯＰＯＳＩＴＴＭ  Ｓ１８０５ＴＭ）から選択される。
【００５９】
一部の実施形態では、ゲル材料はＰＡＺＡＭを含む。一部の実施形態では、ゲル材料は、核酸に付着したＰＡＺＡＭを含む。
【００６０】
一部の実施形態では、表面は（ａ）結合材料層または（ｂ）シラン層をさらに含み、ここで、結合材料層またはシラン層は任意選択でノルボルネン誘導体化シランを含み、結合材料層またはシラン層は、少なくとも輪郭の一部および疎水性間隙領域の一部を覆っている。
【００６１】
そのようなパターン化された表面を調製する方法も本明細書に記載する。
定義
【００６２】
他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に当業者に理解される意味と同じ意味を有する。用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形の使用は非限定的である。用語「有している（ｈａｖｉｎｇ）」ならびに「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」および「有した（ｈａｄ）」などの他の形の使用は非限定的である。本明細書で使用する場合、移行句の中であろうと、請求項の本文中であろうと、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」はオープンエンドの意味を有すると解釈すべきである。即ち、上記の用語は、語句「少なくとも〜を有している」または「少なくとも〜を含んでいる」と同義に解釈すべきである。たとえば、プロセスに関連して使用される場合、用語「含んでいる」は、プロセスが、言及したステップを少なくとも含むが、追加のステップを含んでもよいことを意味する。化合物、組成物、またはデバイスに関連して使用される場合、用語「含んでいる」は、化合物、組成物、またはデバイスが、言及した特徴または構成要素を少なくとも含むが、追加の特徴または構成要素も含んでよいことを意味する。
【００６３】
本明細書で使用する場合、共通の略語を以下に定義する。
ＡＰＴＳ  アミノプロピルシラン
ＡＰＴＥＳ  （３−アミノプロピル）トリエトキシシラン
ＡＰＴＭＳ  （３−アミノプロピル）トリメトキシシラン
ａｑ．  水性
Ａｚａｐａ  Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド
℃  摂氏度での温度
ＣＡ  接触角
ＣＶＤ  化学蒸着
ｄＡＴＰ  デオキシアデノシントリホスフェート
ｄＣＴＰ  デオキシシチジントリホスフェート
ｄＧＴＰ  デオキシグアノシントリホスフェート
ｄＴＴＰ  デオキシチミジントリホスフェート
ｇ  グラム
ｈまたはｈｒ  時間
ＩＰＡ  イソプロピルアルコール
ｍまたはｍｉｎ  分
ｍＬ  ミリリットル
ＰＡＺＡＭ  任意のアクリルアミド対Ａｚａｐａ比のポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド）
ｒｔ  室温
ＳＦＡ  米国特許公開第２０１１／００５９８６５号で定義されたシランを含まないアクリルアミド
ＳＢＳ  シーケンシングバイシンセシス
ＳＨＰ  半疎水性
ｓｓＤＮＡ  一本鎖ＤＮＡ
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「付着した（attached）」は、２つの物が相互に接合した、結び付けられた、接着した、接続した、または結合した状態を指す。たとえば、核酸などの分析物は、共有結合または非共有結合によってゲルまたは固体支持体などの材料に付着させることができる。共有結合は、原子間の電子対の共有によって特徴付けられる。非共有結合は、電子対の共有を含まない化学結合であり、たとえば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用および疎水性相互作用が含まれ得る。
【００６５】
本明細書で使用する場合、用語「アレイ」は、異なるプローブ（たとえばプローブ分子）の集団であって、異なるプローブが相対的場所によって互いに区別できるように異なるプローブの集団が１つまたは複数の基材に付着している、異なるプローブの集団を指す。アレイは、基材上の異なる処理可能な場所にそれぞれが位置している異なるプローブを含み得る。あるいはまたはさらに、アレイは、異なるプローブをそれぞれが担持している別々の基材を含み得、ここで、異なるプローブは、基材が付着している表面上の基材の場所によって、または液体中の基材の場所によって同定され得る。別々の基材が表面上に位置している例示的なアレイには、限定することなく、たとえば、米国特許第６，３５５，４３１Ｂ１号、ＵＳ２００２／０１０２５７８、およびＰＣＴ公開ＷＯ００／６３４３７に記載されているウェル中のビーズを含むものが含まれる。たとえば蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）などのマイクロ流体デバイスを使用して液体アレイ中のビーズを区別するための本発明で使用することができる例示的なフォーマットは、たとえば米国特許第６，５２４，７９３号に記載されている。本発明で使用することができるアレイのさらなる例には、限定することなく、米国特許第５，４２９，８０７号、同第５，４３６，３２７号、同第５，５６１，０７１号、同第５，５８３，２１１号、同第５，６５８，７３４号、同第５，８３７，８５８号、同第５，８７４，２１９号、同第５，９１９，５２３号、同第６，１３６，２６９号、同第６，２８７，７６８号、同第６，２８７，７７６号、同第６，２８８，２２０号、同第６，２９７，００６号、同第６，２９１，１９３号、同第６，３４６，４１３号、同第６，４１６，９４９号、同第６，４８２，５９１号、同第６，５１４，７５１号および同第６，６１０，４８２号、ＷＯ９３／１７１２６、ＷＯ９５／１１９９５、ＷＯ９５／３５５０５、ＥＰ７４２２８７ならびにＥＰ７９９８９７に記載されたものが含まれる。
【００６６】
本明細書で使用する場合、用語「共有結合的に付着した」または「共有結合した」は、原子間の電子対の共有によって特徴付けられる化学結合の形成を指す。たとえば、共有結合的に付着したヒドロゲルは、他の手段、たとえば接着または静電的相互作用による表面への付着と比較した場合、基材の官能化された表面と化学結合を形成するヒドロゲルを指す。表面に共有結合的に付着しているポリマーは、共有結合的付着に加えて、ある手段によっても結合できることが理解される。
【００６７】
本明細書で使用する場合、用語「コーティングする」は、動詞として使用する場合、表面上に層または被覆を提供することを意味することが意図されている。表面の少なくとも一部は、層またはカバーを提供され得る。一部の場合では、表面全体は、層またはカバーを提供され得る。代替の場合では、表面の一部のみが、層または被覆を提供される。表面と材料との関係を記載するために使用する場合、用語「コーティングする」は、材料が表面上の層またはカバーとして存在することを意味することが意図されている。材料は、表面をシールして、たとえば液体または気体が表面と接触することを防止することができる。しかし、材料はシールを形成する必要はない。たとえば、材料は、液体、気体、または液体もしくは気体の中で運搬される１つもしくは複数の成分に対して多孔質であってよい。表面をコーティングできる例示的な材料には、これだけに限らないが、ゲル、ポリマー、有機ポリマー、液体、金属、第２の表面、プラスチック、シリカ、または気体が含まれる。
【００６８】
本明細書で使用する場合、用語「分析物」は、検出、特徴付け、変性、または合成などがされる種々の分析物のいずれかを含むことが意図されている。例示的な分析物には、これだけに限らないが、核酸（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体）、タンパク質、多糖、細胞、核、細胞小器官、抗体、エピトープ、受容体、リガンド、酵素（たとえばキナーゼ、ホスファターゼまたはポリメラーゼ）、ペプチド、または小分子薬物候補などが含まれる。アレイは、分析物のライブラリーからの複数の異なる種を含み得る。たとえば、種は、抗体ライブラリーからの異なる抗体、核酸のライブラリーからの異なる配列を有する核酸、タンパク質のライブラリーからの異なる構造および／または機能を有するタンパク質、小分子のコンビナトリアルライブラリーからの薬物候補などであってよい。
【００６９】
本明細書で使用する場合、用語「輪郭」は、表面の形状における局所化された変化を意味することが意図されている。例示的な輪郭には、これだけに限らないが、ウェル、ピット、チャネル、ポスト、ピラー、およびリッジが含まれる。輪郭は、種々の表面の凹部または表面からの凸部のいずれかとして生じ得る。輪郭の全てまたは一部は、アレイの特徴部分として役立ち得る。たとえば、固体支持体の特定の平面に生じる輪郭の一部は、その特定の平面における特徴部分として役立ち得る。一部の実施形態では、輪郭は、表面上の規則的または繰り返しパターンにおいて提供される。
【００７０】
ある材料が輪郭の「内側に」存在する場合、それは輪郭の空間の中に位置している。たとえば、ウェルについては、材料はウェルの内側にあり、ピラーまたはポストについては、材料は表面の平面の上に延在する輪郭を覆っている。
【００７１】
一部の実施形態では、第２の層が第１の層を「覆っている」という場合、第２の層は第１の層の最上部上の薄いフィルムの形態である。
【００７２】
本明細書で使用する場合、用語「異なる」は、核酸に関して使用する場合、核酸が互いに同じでないヌクレオチド配列を有することを意味する。２つまたはそれより多くの核酸は、その全長にわたって異なるヌクレオチド配列を有し得る。あるいは、２つまたはそれより多くの核酸は、その長さの実質的な部分にわたって異なるヌクレオチド配列を有し得る。たとえば、２つまたはそれより多くの核酸は、２つまたはそれより多くの分子について異なる標的ヌクレオチド配列部分を有し得る一方、２つまたはそれより多くの分子において同じ普遍的な配列部分をも有し得る。用語は、アミノ酸配列の相違に基づいて互いに異なる区別可能なタンパク質にも同様に適用できる。
【００７３】
本明細書で使用する場合、用語「それぞれ」は、項目の集合に関して使用する場合、集合内の個別の項目を同定することが意図されているが、必ずしも集合内の全ての項目を指すわけではない。そうでないことが明白な開示または文脈によって明らかに指示される場合には、例外もあり得る。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「特徴部分」は、特定の分析物を付着させるように構成されたアレイ中の場所を意味する。たとえば、特徴部分は、表面上の輪郭の全てであっても一部であってもよい。特徴部分は単一の分析物のみを含有し得るか、またはいくつかの分析物の集団を含有し得、任意選択でいくつかの分析物は同種であり得る。一部の実施形態では、特徴部分は、分析物を付着させる前に固体支持体上に存在する。他の実施形態では、特徴部分は、固体支持体への分析物の付着によって作り出される。
【００７５】
本明細書で使用する場合、用語「フローセル」は、反応を行うことができるチャンバー、試薬をチャンバーに送達するための入口、および試薬をチャンバーから除去するための出口を有する容器を意味することが意図されている。一部の実施形態では、チャンバーは、チャンバー内で（たとえば、チャンバーと流体接触している表面上で）起こる反応の検出のために構成される。たとえば、チャンバーは、チャンバー内のアレイ、または光学標識された分子などの光学検出を可能にする１つまたは複数の透明な表面を含んでよい。例示的なフローセルには、これだけに限らないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により市販されているＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）もしくはＨｉＳｅｑ（登録商標）プラットフォーム用、またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により市販されているＳＯＬｉＤＴＭもしくはＩｏｎ  ＴｏｒｒｅｎｔＴＭシーケンシングプラットフォーム用のフローセルなどの、核酸シーケンシング装置に使用されるものが含まれる。例示的なフローセルならびにその製造および使用のための方法は、たとえばＷＯ２０１４／１４２８４１Ａ１、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８Ａ１号および米国特許第８，９５１，７８１号にも記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００７６】
本明細書で使用する場合、用語「ゲル材料」は、液体および気体を透過可能な半硬質材料を意味することが意図されている。典型的には、ゲル材料は、液体を吸収すると膨潤することができ、液体がたとえば乾燥によって除去されると収縮することができる。例示的なゲルには、これだけに限らないが、アガロースなどのコロイド構造；ゼラチンなどのポリマーメッシュ構造；またはポリアクリルアミド、シランを含まないアクリルアミド（たとえば米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５Ａ１号を参照）、ＰＡＺＡＭ（たとえば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，０１２，０２２号を参照）、および米国特許公開第２０１５／０００５４４７号および米国出願第１４／９２７，２５２号（これらの全ては、その全体が参照により組み込まれる）に記載されているポリマーなどの架橋ポリマー構造を有するものが含まれる。特に有用なゲル材料は、それが存在するウェルまたは他の輪郭の形状に合致する。一部の有用なゲル材料は、（ａ）それが存在するウェルまたは他の輪郭の形状に合致し、かつ（ｂ）それが存在するウェルまたは輪郭の体積を実質的に超えない体積を有し得る。一部の特定の実施形態では、ゲル材料はポリマーヒドロゲルである。
【００７７】
本明細書で使用する場合、用語「間隙領域」は、基材または表面の他のエリアを分離する基材内または表面上のエリアを指す。たとえば、間隙領域は、１つの輪郭または特徴部分を表面上の別の輪郭または特徴部分から分離することができる。互いに分離された２つの領域は、別個である可能性があり、互いの接触がない可能性がある。多くの実施形態では、間隙領域は連続している一方、輪郭または特徴部分は、たとえば他では連続的な表面におけるウェルのアレイの場合のように、別個である。間隙領域によって提供される分離は部分的分離であっても完全分離であってもよい。間隙領域は、典型的には表面上の輪郭または特徴部分の表面材料とは異なる表面材料を有する。たとえば、アレイの輪郭は、間隙領域に存在する量または濃度を超える、ゲル材料または分析物の量または濃度を有し得る。一部の実施形態では、ゲル材料または分析物は間隙領域に存在しなくてもよい。
【００７８】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」および「ヌクレオチド」は、当技術分野におけるその使用と一致すること、および天然産生種またはその機能的類似体を含むことが意図されている。核酸の特に有用な機能的類似体は、配列特異的な様式で核酸とハイブリダイズすることができ、または特定のヌクレオチド配列の複製のための鋳型として使用することができる。天然産生の核酸は、一般にホスホジエステル結合を含有する骨格を有する。類似構造は、当技術分野で公知の種々の骨格リンケージのいずれかを含む代替の骨格リンケージを有し得る。天然産生の核酸は、一般に（たとえばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）で見られる）デオキシリボース糖または（たとえばリボ核酸（ＲＮＡ）で見られる）リボース糖を有する。核酸は、当技術分野で公知のこれらの糖部分の種々の類似体のいずれかを有するヌクレオチドを含有してよい。核酸は、天然または非天然のヌクレオチドを含んでよい。これに関し、天然のデオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニンからなる群から選択される１つまたは複数の塩基を有してよく、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシンまたはグアニンからなる群から選択される１つまたは複数の塩基を有してよい。核酸またはヌクレオチドに含まれ得る有用な非天然塩基は、当技術分野で公知である。用語「プローブ」または「標的」は、核酸に関して使用する場合、本明細書で説明した方法または組成物に関連する核酸の意味的識別語であることが意図されており、他に明示的に指示されたものを除いて、核酸の構造または機能を必ずしも限定するものではない。用語「プローブ」および「標的」は、タンパク質、小分子、または細胞などの他の分析物に同様に適用され得る。
【００７９】
本明細書で使用する場合、用語「フッ素化」は、少なくとも１つのフッ素原子を含有する分子を指す。本明細書で使用する場合、用語「全フッ素化」は、２つまたはそれより多くのフッ素原子を含有する分子を指す。一部の実施形態では、全フッ素化分子は、ｓｐ３混成炭素上の水素原子がフッ素原子で置き換えられた炭化水素含有分子である。たとえば、本明細書に記載したある特定の全フッ素化ポリマーは、パーフルオロアルキル基またはパーフルオロアルキレン部分を含有する。
【００８０】
本明細書で使用する場合、用語「フォトレジスト」およびその誘導体は、表面上にパターン化されたコーティングを形成するためのフォトリソグラフィー、フォトエッチング、またはフォトエングレービングなどのプロセスで使用される光感受性材料を指す。フォトレジスト材料は、ある特定の波長の光に露光された場合、現像液に関する溶解性が変化する。フォトレジスト層は、ポジ型（露光された領域が可溶性になる）またはネガ型（露光された領域が不溶性になる）フォトレジスト材料から構成されていてよい。
【００８１】
本明細書で使用する場合、用語「ピッチ」は、表面上の輪郭または特徴部分に関して使用する場合、隣接する特徴部分の中心間間隔を指すことが意図されている。特徴部分のパターンは、平均ピッチの観点で特徴付けることができる。パターンは、平均ピッチを中心にした変動係数が小さくなるように配列することができ、またはパターンは、変動係数が比較的大きくてもよい場合にはランダムであり得る。いずれの場合でも、平均ピッチは、たとえば、少なくとも約１０ｎｍ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、１００μｍもしくはそれより大きい、または２つの先行する値のいずれかによって定義される範囲（たとえば１０〜１００ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、３００〜５００ｎｍ）であってよい。あるいはまたはさらに、平均ピッチは、たとえば、大きくとも約１００μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．１μｍもしくはそれ未満、または２つの先行する値のいずれかによって定義される範囲であってよい。もちろん、特徴部分の特定のパターンについての平均ピッチは、上記の範囲から選択されるより低い値の１つとより高い値の１つの間であってよい。
【００８２】
本明細書で使用する場合、用語「繰り返しパターン」は、特徴部分に関して使用する場合、対象物の１つの領域における特徴部分または輪郭のサブセットの相対的な場所が対象物の少なくとも１つの他の領域における特徴部分または輪郭のサブセットの相対的な場所と同じであることを意味することが意図されている。一般に、繰り返しはｘおよびｙ次元で起こる。１つの領域は、典型的にはパターン中の他の領域に隣接している。繰り返しパターンの１つの領域における特徴部分の相対的な場所は、一般に、繰り返しパターンの別の領域における輪郭の相対的な場所から予測できる。測定に使用するサブセットは、一般に少なくとも２つの特徴部分を含むが、少なくとも３、４、５、６、１０個またはそれより多くの特徴部分を含んでもよい。あるいはまたはさらに、測定に使用するサブセットは、２、３、４、５、６、または１０個以下の特徴部分を含んでよい。例示的な繰り返しパターンには、正方格子、矩形格子、斜方格子、六方格子および斜交格子が含まれる。繰り返しパターンはサブパターンの多重反復を含んでもよい。
【００８３】
本明細書で使用する場合、用語「隔離する」は、２つの輪郭上の（または２つの別々の特徴部分における）ゲル材料に関して使用する場合、輪郭の一方の上の（または特徴部分の一方における）ゲル材料を他方の輪郭上の（または他方の特徴部分における）ゲル材料から分離または単離することを意味する。したがって、第１の輪郭上の（または第１の特徴部分における）ゲル材料は、他のウェルの中の（または他の特徴部分における）ゲル材料と直接接触しない。一部の実施形態では、用語「隔離する」は、２つのウェルの中のゲル材料に関して使用され、ウェルの一方の中のゲル材料を他方のウェルの中のゲル材料から分離または単離することを意味する。一部の実施形態では、２つのウェルの中の（または２つの特徴部分における）ゲル材料は、たとえば２つのウェル（または特徴部分）と接触する溶液を介して間接的に接触している。あるいは、２つのウェルの中の（または２つの特徴部分における）ゲル材料は、間接接触さえもしていない。表面上の間隙領域は、ゲル材料を有していないことによって２つのウェルの中の（または２つの特徴部分における）ゲル材料を隔離することができる。特定の実施形態では、ゲル材料は表面上で不連続である可能性があり、ウェルなどの特徴部分には存在するが、特徴部分間の間隙領域には存在しない可能性がある。
【００８４】
本明細書で使用する場合、用語「表面」は、固体支持体またはゲル材料の外側部分または外層を意味することが意図されている。表面は、気体、液体、ゲル、ポリマー、有機ポリマー、同様のもしくは異なる材料の第２の表面、金属、またはコートなどの別の材料と接触してよい。表面、またはその領域は、実質的に平坦であっても平面状であってもよい。表面は、ウェル、ピット、チャネル、リッジ、隆起領域、ペグ、またはポストなどの表面輪郭を有し得る。
【００８５】
本明細書で使用する場合、用語「固体支持体」は、水性液体に不溶の硬質基材を指す。基材は非多孔質であっても多孔質であってもよい。基材は、任意選択で（たとえば多孔性によって）液体を吸収できてもよいが、典型的には、液体を吸収したときに基材が実質的に膨潤せず、乾燥によって液体が除去されたときに実質的に収縮しない程度に十分に硬質である。非多孔質固体支持体は、一般に液体または気体を透過しない。例示的な固体支持体には、これだけに限らないが、ガラスおよび改質もしくは機能化ガラス、プラスチック（たとえばアクリル、ポリスチレンならびにスチレンおよび他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロンＴＭ（登録商標）、環状オレフィン、ポリイミドなど）、ナイロン、セラミック、樹脂、Ｚｅｏｎｏｒ、ケイ素および改質ケイ素を含むシリカまたはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、光学繊維束、ならびにポリマーが含まれる。一部の実施形態に特に有用な固体支持体は、フローセルの構成要素であるか、フローセル装置の内部に位置している。
【００８６】
本明細書で使用する場合、用語「ウェル」は、表面の間隙領域に完全に包囲された表面開口部を有する固体支持体における別個の輪郭を指す。ウェルは、表面におけるその開口部に、円形、楕円形、四角形、多角形、（任意の数の頂点を有する）星形などを含むがこれらに限定されない、種々の形状のいずれかを有し得る。表面と直角に取ったウェルの断面は曲線、四角形、多角形、双曲線、円錐形、角張った形などであってよい。一部の実施形態では、ウェルはマイクロウェルまたはナノウェルである。
【００８７】
本明細書で説明し、特許請求の範囲で言及する実施形態は、上記の定義を考慮して理解され得る。
【００８８】
図１は、基材のパターン化された表面の疎水性間隙領域を作り出すために使用され得る３種のフルオロポリマーを示す。ＣＹＴＯＰ−Ａ、ＣＹＴＯＰ−Ｍ、およびＣＹＴＯＰ−Ｓは、市販の非晶質全フッ素化ポリマーであり、それぞれが、以下の骨格構造：
【化１】
2019523640.tif 000003
およびポリマー鎖の両端に異なる官能基を有する。ＣＹＴＯＰ−Ａは−Ｃ（Ｏ）ＯＨ末端官能基を有する。ＣＹＴＯＰ−Ｍは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｓｉ（ＯＲ）ｎ官能基を有する。ＣＹＴＯＰ−Ｓは−ＣＦ３官能基を有する。図１は、各種類のＣＹＴＯＰポリマーと表面との間の可能な相互作用の種類も示す。これは、ＣＹＴＯＰ−Ｓが、−ＣＦ３官能基の不活性に起因して、金属表面、シラン仕上げ表面、またはＳｉ／ＳｉＮ表面との化学的相互作用を有しないことを示している。
【００８９】
図２Ａは、ガラス基材１０のパターン化された表面の概略断面部分図である。示されるように、ガラス基材１０は、最上部表面１５および底表面２０を有する。最上部表面１５は、最上部表面１５に形成された複数のウェル２５ａ〜２５ｄを有する。ウェル２５ａ〜２５ｄのそれぞれは、ウェルの内壁を覆うポリマー材料またはゲル３０ａ〜３０ｄを有する。ウェル２５ａ〜２５ｄのそれぞれの間に位置する最上部表面１５上に、一連の疎水性間隙領域３５ａ〜３５ｅが示されている。示されるように、ポリマー材料またはゲル３０ａ〜３０ｄは、ウェル２５ａ〜２５ｄの底上に堆積しており、ＤＮＡクラスター４０ａ〜４０ｄは、ゲル材料３０ａ〜３０ｄに共有結合的に付着している。
【００９０】
図２Ｂは、本明細書に記載した表面のより詳細な概略例である。図示したように、表面はガラススライドの最上部上に３層の材料を含む。底のＣＹＴＯＰ層は、底のガラス表面と直接接触している。ＣＹＴＯＰ材料の最上部上にはノルボルネン誘導体化シラン層が堆積している。ノルボルネン層の最上部上にはＰＡＺＡＭを含む最上層がある。フルオロフォアＴＥＴＴＭが付着した１組のグラフト化Ｐ５／Ｐ７オリゴヌクレオチドプライマーが、材料のＰＡＺＡＭ層に結合している。Ｐ５およびＰ７プライマーの配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９６９，２５８号で説明されている。
【００９１】
図２Ｃは、３種のグラフト化ガラス表面の蛍光画像である。化学的不活性試験はＣＹＴＯＰ−ＳおよびＣＹＴＯＰ−Ｍについて行った。左側の表面は対照として使用し、いずれのＣＹＴＯＰポリマーでもコーティングしなかった。中央の表面はＣＹＴＯＰ−Ｍでコーティングし、右側の表面はＣＹＴＯＰ−Ｓでコーティングした。次いで、各表面をノルボルネン誘導体化シランで処理し、続いてＰＡＺＡＭカップリング、ならびにＰ５およびＰ７オリゴヌクレオチドをＰＡＺＡＭへグラフトした。ＰＡＺＡＭが付着したオリゴヌクレオチドの存在または非存在を、蛍光標識したＴＥＴオリゴヌクレオチド（Ｐ５およびＰ７に相補的）のハイブリダイゼーションおよびＴｙｐｈｏｏｎ蛍光イメージャーにおける検出によって評価した。ＣＹＴＯＰ−Ｓで処理した表面においてＴＥＴオリゴの強度がないことは、オリゴヌクレオチドをグラフトしたＰＡＺＡＭがＣＹＴＯＰ−Ｓ処理した表面に固定化されなかったことを示している。
【００９２】
図３は、化学処理の前後で対照表面と比較したＣＹＴＯＰ−ＭおよびＣＹＴＯＰ−Ｓで処理したガラス表面の接触角を示す。ＣＹＴＯＰで処理したガラス表面は、ＣＹＴＯＰ−Ｍで約１２０°、ＣＹＴＯＰ−Ｓで約１２３°の接触角を示した。ノルボルネンシラン層の堆積の後、接触角は、ＣＹＴＯＰ−Ｍで１１６°、ＣＹＴＯＰ−Ｓで１２０°に低下した。ＰＡＺＡＭカップリングおよびオリゴグラフティングの後、接触角はＣＹＴＯＰ−Ｍ表面について実質的に５１°に低下し、このことは、ＤＮＡクラスターおよび親水性ＰＡＺＡＭポリマーが表面に結合し、表面が親水性になったことを示している。対照的に、ＣＹＴＯＰ−Ｓ表面は接触角が僅かに低下したのみで、その疎水性を保持していた。その化学的不活性および疎水性特性に起因して、ＣＹＴＯＰ−Ｓは、（たとえば、分析物担持特徴部分間の間隙領域を形成するための）表面パターニングの良好な候補であることが確認される。
【００９３】
ＣＹＴＯＰ−Ｓを疎水性コーティングとして使用してパターン化された表面を調製するための典型的なワークフローを図４に示す。最初に、表面をＣＹＴＯＰ−Ｓで処理した。ＣＹＴＯＰ−Ｓにはガラスまたはケイ素表面にカップリングするための反応性官能基がないので、表面へのＣＹＴＯＰ−Ｓのコーティングを容易にするために接着促進層が使用されてもよい。この例では、ＣＹＴＯＰ−Ａの薄い層を最初にガラス表面にコーティングした。次いで、ＣＹＴＯＰ−Ｓを均一に表面にコーティングした。その後の硬化の後、２つのＣＹＴＯＰ層中の全フッ素化ポリマーはさらに絡み合ってより強固な接着を形成する。ガラスまたはケイ素表面への接着促進層として使用され得る材料の非限定的な例には、ＡＰＴＭＳ、ＡＰＴＥＳなどのアミノ系シランカップリング剤も含まれる。
【００９４】
この標準的なワークフローでは、フォトリソグラフィー用の標準的なフォトレジストを堆積させるためにＣＹＴＯＰ−Ｓ表面を酸素プラズマで処理した。プラズマ処理によって、ＣＹＴＯＰ−Ｓはより親水性になり、それにより、その最上部上にフォトレジストをコーティングすることができる。この表面改質により、標準的なフォトレジストは、表面からデウェットされる（dewet）傾向にある。プロセスの間に、ＣＹＴＯＰ−Ｓ表面は酸素プラズマ処理の後でその疎水性および化学的不活性を失った。ＣＹＴＯＰ−Ｓ表面の疎水性はＣＹＴＯＰ−Ｓ溶液を使用する１８０℃での高温リフローステップによって回復したが、表面の化学的不活性は回復せず、間隙ＣＹＴＯＰ−Ｓ表面へのＰＡＺＡＭの非特異的結合が観察された。
リフロープロセス
【００９５】
本明細書に記載した方法の任意の実施形態では、方法は、パターニングの間の表面への損傷を回復するためのリフロープロセスをさらに含んでよい。たとえば、パターニングプロセスの間にＣＹＴＯＰ−Ｓ表面が損傷（不活性または疎水性性質の喪失など）を受けた場合、ＣＹＴＯＰ−Ｓ表面の性質は、ＣＹＴＯＰ−Ｓを含有する溶媒を使用するリフロープロセスによって修復することができる。溶媒リフローは、図９Ａに例示した液相プロセスとして、または図９Ｂに例示した蒸気相プロセスとして行うことができる。液相リフローの非限定的な例には、高温（たとえば１８０℃）での表面上へのＣＹＴＯＰ−Ｓ溶媒の堆積または表面上への直接スピンコーティング、その後の低温（たとえば５０℃）での硬化が含まれる。蒸気相リフローでは、ある量のＣＹＴＯＰ−Ｓ含有溶媒、たとえば２ｍＬの全フッ素化フルオロカーボン溶媒（ＣＴ−ＳＯＬＶ１００Ｅなど）が中に入っている真空封止されたデシケーターに、基材を入れる。リフロープロセスで使用され得る溶媒には、これだけに限らないが、ＣＴ−ＳＯＬＶ１８０またはＣＴ−ＳＯＬＶ１００Ｅが含まれる。選択される他の溶媒には、ＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔＴＭＦＣ−４０、ＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔＴＭＦＣ−７７０が含まれ、これらはそれぞれ全フッ素化ポリマーを溶解することができる。
【００９６】
別の実施形態では、パターン化されたＣＹＴＯＰ−Ｓ表面は、表面の性質の損傷を修復するためにヒドロゲルコーティングの後でリフロープロセスに供してもよい。リフロープロセスは、シーケンシングのためのヒドロゲルの品質に影響しない。図１０Ａは、Ｏ２プラズマ処理後のＰＡＺＡＭコーティングされたＣＹＴＯＰ−Ｓナノウェル（７００ｎｍ〜１．１μｍ）の光学顕微鏡画像である。図１０Ｂは、液相溶媒リフロー後の図１０ＡのＰＡＺＡＭコーティングされたＣＹＴＯＰ−Ｓナノウェルの光学顕微鏡画像である。図１０Ｃは、蛍光染料を含む水滴によるウェッティング／デウェッティングの後の図１０ＢのＰＡＺＡＭコーティングされたＣＹＴＯＰ−Ｓナノウェルの蛍光画像であり、これは、ＰＡＺＡＭがまだ利用可能であることを示している。
固体支持体
【００９７】
本開示の装置または方法に有用な固体支持体は、一般に平坦な表面（たとえばチップまたはスライド）であってもよく、曲がった表面（たとえば円筒またはドラム）を有してもよい。これはまた、二次元あっても三次元であってもよい。有用な材料には、ガラス、水晶、プラスチック（ポリスチレン（低架橋および高架橋ポリスチレン）、ポリカーボネート、ポリプロピレンまたはポリ（メチルメタクリレート）など）、アクリルコポリマー、ポリアミド、ケイ素、金属（たとえばアルカンチオレート誘導体化金）、セルロース、ナイロン、ラテックス、デキストラン、ゲルマトリックス（たとえばシリカゲル）、ポリアクロレイン、またはコンポジットが含まれる。一部の実施形態では、固体支持体はガラスを含む。
特徴部分
【００９８】
アレイの特徴部分は種々の形状のいずれを有してもよい。一部の実施形態では、用語「特徴部分」は、輪郭の全てがアレイ中の特徴部分として役立つ場合、パターン化された表面上の「輪郭」も指す。たとえば、アレイの表面上などの二次元平面で観察した場合、特徴部分は、円形、環状、長円形、矩形、四角形、対称、非対称、三角形、または多角形などのように見えてよい。特徴部分は、たとえば正方格子、矩形格子、斜方格子、六方格子または斜交格子などを含む規則的な繰り返しパターンで配置することができる。パターンは、所望の充填レベルを達成するように選択することができる。たとえば、円形の特徴部分は六角形の配置で最適に充填できる。もちろん、円形の特徴部分のために他の充填配置を使用することもでき、逆も可能である。
【００９９】
アレイ上の特徴部分（または本明細書の方法またはシステムで使用される他の対象物）の大きさは、特定の用途に適合するように選択することができる。たとえば、一部の実施形態では、アレイの特徴部分は単一の核酸分子のみを収容する大きさを有してよい。この大きさの範囲の複数の特徴部分を有する表面は、単一分子の分解能で検出するための分子のアレイを構築するのに有用である。この大きさの範囲の特徴部分は、核酸分子のコロニーをそれぞれが含有する特徴部分を有するアレイにおける使用にも有用である。したがって、アレイの特徴部分はそれぞれ、約１ｍｍ２より大きくない、約５００μｍ２より大きくない、または約１００μｍ２より大きくない、約１０μｍ２より大きくない、約１μｍ２より大きくない、約５００ｎｍ２より大きくない、約１００ｎｍ２より大きくない、約１０ｎｍ２より大きくない、約５ｎｍ２より大きくない、または約１ｎｍ２より大きくない面積を有し得る。あるいはまたはさらに、アレイの特徴部分は、約１ｍｍ２より小さくない、約５００μｍ２より小さくない、約１００μｍ２より小さくない、約１０μｍ２より小さくない、約１μｍ２より小さくない、約５００ｎｍ２より小さくない、約１００ｎｍ２より小さくない、約１０ｎｍ２より小さくない、約５ｎｍ２より小さくない、または約１ｎｍ２より小さくない。まさに、特徴部分は、上で例示した大きさから選択される上限および下限の間の範囲の大きさを有し得る。表面の特徴部分についてのいくつかの大きさの範囲を、核酸に関しておよび核酸のスケールについて例示したが、これらの大きさの範囲の特徴部分は核酸を含まない用途に使用され得ることが理解される。特徴部分の大きさは、必ずしも核酸用途に使用されるスケールに限る必要はないこともさらに理解される。
【０１００】
アレイはピッチに関しても特徴付けられる。たとえば、特徴部分の大きさおよび／または特徴部分のピッチは、アレイが所望の密度を有し得るように変わってよい。たとえば、平均特徴部分ピッチは、大きくとも１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．４μｍ、０．３μｍ、０．２μｍ、０．１μｍまたはそれ未満であってよい。あるいはまたはさらに、平均特徴部分ピッチは、少なくとも０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、５０μｍ、１００μｍまたはそれより大きくてよい。同様に、最大の特徴部分ピッチは、大きくとも１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．４μｍ、０．３μｍ、０．２μｍ、０．１μｍもしくはそれ未満であってよく、そして／または最小の特徴部分ピッチは、少なくとも０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、５０μｍ、１００μｍもしくはそれより大きくてよい。上記の範囲は、特徴部分間の平均、最大、または最小のピッチに適用できる。
【０１０１】
アレイ中の特徴部分の密度は、単位面積あたりに存在する特徴部分の数に関して理解することもできる。たとえば、アレイの特徴部分の平均密度は、少なくとも約１×１０３特徴部分／ｍｍ２、１×１０４特徴部分／ｍｍ２、１×１０５特徴部分／ｍｍ２、１×１０６特徴部分／ｍｍ２、１×１０７特徴部分／ｍｍ２、１×１０８特徴部分／ｍｍ２もしくは１×１０９特徴部分／ｍｍ２、またはそれより高くてよい。あるいはまたはさらに、アレイの特徴部分の平均密度は、高くとも約１×１０９特徴部分／ｍｍ２、１×１０８特徴部分／ｍｍ２、１×１０７特徴部分／ｍｍ２、１×１０６特徴部分／ｍｍ２、１×１０５特徴部分／ｍｍ２、１×１０４特徴部分／ｍｍ２もしくは１×１０３特徴部分／ｍｍ２、またはそれ未満であってよい。
【０１０２】
特徴部分の規則的なパターンを有するアレイは、特徴部分の相対的な場所に関して整列させることができるが、各特徴部分の他の１つまたは複数の特性に関してはランダムであり得る。たとえば、核酸アレイの場合には、核酸の特徴部分はその相対的な場所に関して整列させることができるが、任意の特定の特徴部分に存在する核酸種の配列の知識に関してはランダムであり得る。より具体的な例として、特徴部分の繰り返しパターンを鋳型核酸とともに播種し、各特徴部分において鋳型を増幅して（たとえばクラスター増幅またはブリッジ増幅によって）特徴部分における鋳型のコピーを形成することによって形成された核酸アレイは、特徴部分を形成する輪郭の位置によって決定される場合、核酸の特徴部分の規則的なパターンを有するが、アレイを横切る核酸の配列の分布に関してはランダムである。したがって、一般にアレイ上の核酸材料の存在の検出によって特徴部分の繰り返しパターンを得ることができる一方、配列特異的な検出によって、アレイを横切るシグナルの非繰り返し分布を得ることができる。
【０１０３】
一部の実施形態では、本明細書に記載した方法は、単一の繰り返しパターンを有する輪郭を形成する。他の一部の実施形態では、本明細書に記載した方法は、多重繰り返しパターンを有する輪郭を形成し、少なくとも特徴部分の第１の繰り返しパターンと特徴部分の第２の繰り返しパターンを有するアレイを提供する。そのような一部の実施形態では、第１および第２のパターンは、外表面に沿って交互配置のパターンを形成し、第１の繰り返しパターンの特徴部分は第１の高さで現われ、第２の繰り返しパターンの特徴部分は第２の高さで現われ、特徴部分は分析物の付着点を含み、それにより、第１の繰り返しパターンの特徴部分は第２の繰り返しパターンの特徴部分に付着した分析物に対して異なる高さで分析物に付着するように構成されている。本明細書で説明した方法または組成物において作製されまたは使用され得る多重繰り返しパターンを有する輪郭を有する基材の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年３月２８日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２４５７８、表題「Multi-Plane  Microarrays」に記載されている。
分析応用
【０１０４】
一部の実施形態は、本明細書に記載した方法によって調製したパターン化された表面を有する基材を使用して分析物を検出する方法を対象としている。一部の実施形態では、分析物は、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質、抗体、抗体へのエピトープ、酵素、細胞、核、細胞小器官、または小分子薬物から選択される。一実施形態では、分析物はポリヌクレオチドである。一実施形態では、検出することは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップを含む。
【０１０５】
本明細書に記載した一部の実施形態は、ポリヌクレオチドのアレイを調製する方法に関し、該方法は、パターン化された表面を含む固体支持体を提供するステップであって、該表面がオリゴヌクレオチドに共有結合することができるゲル材料でコーティングされたマイクロスケールおよび／またはナノスケールの輪郭を含み、該表面が本明細書に記載した方法のいずれかによって調製される、ステップと、複数の第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第２のオリゴヌクレオチドをゲル材料に共有結合的に付着させるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、ポリマーコーティングに付着した複数の第１のオリゴヌクレオチドを増幅すべき鋳型と接触させるステップであって、各鋳型が第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズできる配列を３’末端に、その相補体が第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズできる配列を５’末端に含む、ステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを使用して鋳型を増幅し、それによりポリヌクレオチドのクラスター化されたアレイを生成するステップをさらに含む。
【０１０６】
核酸を使用する一部の実施形態は、基材上で核酸を増幅するステップを含み得る。本明細書に記載した基材と併せて、多くの異なるＤＮＡ増幅手法を使用することができる。使用することができる例示的な手法には、これだけに限らないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、またはランダムプライム増幅（ＲＰＡ）が含まれる。特定の実施形態では、増幅に使用する１つまたは複数のプライマーを（たとえばゲルまたはポリマーコーティングによって）基材に付着させることができる。ＰＣＲ実施形態では、増幅に使用する一方または両方のプライマーを基材に付着させることができる。２つの付着させたプライマーを利用するフォーマットは、しばしばブリッジ増幅と称される。それは、二重鎖アンプリコンが、コピーされた鋳型配列の横に存在する２つの付着させたプライマーの間に橋のような構造を形成するからである。ブリッジ増幅に使用することができる例示的な試薬および条件は、たとえば、参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる米国特許第５，６４１，６５８号、米国特許公開第２００２／００５５１００号、米国特許第７，１１５，４００号、米国特許公開第２００４／００９６８５３号、米国特許公開第２００４／０００２０９０号、米国特許公開第２００７／０１２８６２４号および米国特許公開第２００８／０００９４２０号に記載されている。
【０１０７】
ＰＣＲ増幅は、基材に付着した１つの増幅プライマーおよび溶液中の第２のプライマーを用いて行うこともできる。１つの付着したプライマーと可溶性プライマーの組合せを使用する例示的なフォーマットは、たとえば、参照により本明細書にそれぞれ組み込まれるDressmanら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、１００巻：８８１７〜８８２２頁（２００３年）、ＷＯ０５／０１０１４５、または米国特許公開第２００５／０１３０１７３号もしくは同第２００５／００６４４６０号に記載されているエマルジョンＰＣＲである。エマルジョンＰＣＲはフォーマットの例であり、本明細書で説明した方法の目的上、エマルジョンの使用は任意選択であって、まさに一部の実施形態ではエマルジョンは使用されないことが理解される。さらに、プライマーはｅＰＣＲ参照文献で説明されているように基材または固体支持体に直接付着する必要はなく、その代わり本明細書で説明したようにゲルまたはポリマーコーティングに付着していてもよい。
【０１０８】
ＲＣＡ手法は、本開示の方法における使用のために変更することができる。ＲＣＡ反応で使用することができる例示的な成分、およびＲＣＡがアンプリコンを生成する原理は、たとえば、参照により本明細書にそれぞれ組み込まれるLizardiら、Nat.  Genet.、１９巻：２２５〜２３２頁（１９９８年）およびＵＳ２００７／００９９２０８Ａ１に記載されている。ＲＣＡに使用するプライマーは溶液中にあってもよく、ゲルもしくはポリマーコーティングに付着していてもよい。
【０１０９】
ＭＤＡ手法は、本開示の方法における使用のために変更することができる。ＭＤＡのための一部の基礎的原理および有用な条件は、たとえば、参照により本明細書にそれぞれ組み込まれるDeanら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９９巻：５２６１〜６６頁（２００２年）；Lageら、Genome  Research、１３巻：２９４〜３０７頁（２００３年）；Walkerら、Molecular  Methods  for  Virus  Detection、Academic  Press,  Inc.、１９９５年；Walkerら、Nucl.  Acids  Res.、２０巻：１６９１〜９６頁（１９９２年）；ＵＳ５，４５５，１６６、ＵＳ５，１３０，２３８号、およびＵＳ６，２１４，５８７に記載されている。ＭＤＡに使用するプライマーは溶液中にあってもよく、ゲルもしくはポリマーコーティングに付着していてもよい。
【０１１０】
特定の実施形態では、上で例示した増幅手法の組合せを使用することができる。たとえば、ＲＣＡとＭＤＡを組み合わせて使用することができ、ＲＣＡは（たとえば溶液相プライマーを使用して）溶液中でコンカタマーアンプリコンを生成するために使用される。次いで、アンプリコンは（たとえばゲルまたはポリマーコーティングによって）基材に付着させたプライマーを使用するＭＤＡに鋳型として使用することができる。この例では、ＲＣＡとＭＤＡを組み合わせたステップの後で産生されるアンプリコンを基材に付着させる。
【０１１１】
核酸アレイを含有する本開示の基材は、種々の目的のいずれにも使用することができる。核酸の特に望ましい使用は、相補的配列を有する標的核酸にハイブリダイズするキャプチャープローブとして役立つことである。いったんキャプチャープローブにハイブリダイズした標的核酸は、たとえばキャプチャープローブに採用した標識を介して検出することができる。キャプチャープローブへのハイブリダイゼーションを介して標的核酸を検出するための方法は、当技術分野で公知であり、たとえば、参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる米国特許第７，５８２，４２０号、同第６，８９０，７４１号、同第６，９１３，８８４号もしくは同第６，３５５，４３１号または米国特許公開第２００５／００５３９８０Ａ１号、同第２００９／０１８６３４９Ａ１号もしくは同第２００５／０１８１４４０Ａ１号に記載されたものが含まれる。たとえば、標識を担持する標的プローブにキャプチャープローブをハイブリダイズするために、キャプチャープローブに標識を採用することができる。別の例では、標的プローブをキャプチャープローブにハイブリダイズすることによってキャプチャープローブに標識を採用することができ、それにより（たとえばリガーゼ活性による）標識されたオリゴヌクレオチドへのライゲーションによって、または（たとえばポリメラーゼ活性による）標識されたヌクレオチドの付加によって、キャプチャープローブを延長することができる。
【０１１２】
一部の実施形態では、本明細書に記載した基材を、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するために使用することができる。そのような実施形態では、方法は、（ａ）ポリヌクレオチドポリメラーゼを（たとえば本明細書に記載したポリマーまたはゲルコーティングの任意の１つを介して）基材の表面に付着させたポリヌクレオチドクラスターと接触させるステップと、（ｂ）ヌクレオチドを基材の表面に提供して、それにより１つまたは複数のヌクレオチドがポリヌクレオチドポリメラーゼによって利用されるときに検出可能なシグナルが生成されるステップと、（ｃ）１つまたは複数の付着したポリヌクレオチド（または付着したポリヌクレオチドから産生された１つまたは複数のクラスター）におけるシグナルを検出するステップと、（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）を繰り返して、それにより基材付着ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップを含むことができる。
【０１１３】
核酸シーケンシングは、当技術分野で公知の種々のプロセスによってポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するために使用することができる。好ましい方法では、（たとえば本明細書に記載したポリマーコーティングの任意の１つを介して）基材の表面に付着させたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためにシーケンシングバイシンセシス（ＳＢＳ）が利用される。そのようなプロセスでは、ポリヌクレオチドポリメラーゼに関連する鋳型ポリヌクレオチドに１つまたは複数のヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドポリメラーゼによって１つまたは複数のヌクレオチドがポリヌクレオチド鋳型に相補的な新たに合成された核酸鎖の中に組み込まれる。合成は、鋳型ポリヌクレオチドの一部または鋳型ポリヌクレオチドの１つの末端に共有結合している普遍的なもしくは非可変の核酸の一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーから開始される。ヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドに組み込まれるとともに、検出可能なシグナルが生成され、それによりシーケンシングプロセスの各ステップの最中にどのヌクレオチドが組み込まれたかの決定が可能になる。このようにして、鋳型ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的な核酸の配列が生成され得、それにより鋳型ポリヌクレオチドの少なくとも一部のヌクレオチド配列の決定を可能にし得る。
【０１１４】
フローセルは、本開示の方法によって産生され、シーケンシングバイシンセシス（ＳＢＳ）またはサイクル中の試薬の繰り返し送達を含む他の検出手法に供されるアレイを収容するための便利なフォーマットを提供する。たとえば、第１のＳＢＳサイクルを開始するために、１つまたは複数の標識されたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、本明細書で説明した方法によって作製された核酸アレイを収容するフローセルの中に／を通って流すことができる。標識されたヌクレオチドがプライマー延長によって組み込まれるアレイの部位を検出することができる。ヌクレオチドは任意選択で、いったんヌクレオチドがプライマーに添加されるとさらなるプライマーの延長を停止する可逆的停止性質をさらに含んでもよい。たとえば、可逆的停止剤部分を有するヌクレオチド類似体は、デブロッキング剤を送達して部分を除去するまでその後の延長が起こり得ないように、プライマーに添加されてよい。したがって、可逆的停止を使用する実施形態では、（検出が起こる前または後に）デブロッキング試薬をフローセルに送達することができる。種々の送達ステップの間に洗浄を行うことができる。次いで、サイクルをｎ回繰り返してプライマーをｎヌクレオチドだけ延長し、それにより長さｎの配列を検出することができる。本開示の方法によって産生されるアレイとともに使用するために容易に適応できる例示的なＳＢＳ手順、流体システム、および検出プラットフォームは、たとえば、参照により本明細書にそれぞれ全体が組み込まれるBentleyら、Nature、４５６巻：５３〜５９頁（２００８年）、ＷＯ０４／０１８４９７、ＵＳ７，０５７，０２６、ＷＯ９１／０６６７８、ＷＯ０７／１２３７４４、ＵＳ７，３２９，４９２、ＵＳ７，２１１，４１４、ＵＳ７，３１５，０１９、ＵＳ７，４０５，２８１、およびＵＳ２００８／０１０８０８２に記載されている。
【０１１５】
フローセルを用いる上述の方法の一部の実施形態では、単一のフローステップの間に１種類のみのヌクレオチドがフローセル中に存在する。そのような実施形態では、ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびそれらの類似体からなる群から選択することができる。フローセルを用いる上述の方法の他の実施形態では、単一のフローステップの間に複数の異なる種類のヌクレオチドがフローセル中に存在する。そのような方法では、ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびそれらの類似体から選択することができる。
【０１１６】
フローセル中に存在する基材の表面上のポリマーコーティングに付着したポリヌクレオチドの１つまたは複数について各フローステップの最中に組み込まれたヌクレオチド（単数または複数）の決定は、ポリヌクレオチド鋳型においてまたはその近くで産生されたシグナルを検出することによって達成される。上述の方法の一部の実施形態では、検出可能なシグナルは光学シグナルを含む。他の実施形態では、検出可能なシグナルは非光学シグナルを含む。そのような実施形態では、非光学シグナルは、ポリヌクレオチド鋳型の１つまたは複数におけるまたはその近くのｐＨの変化を含む。
【０１１７】
本開示の基材の応用および使用を、本明細書において核酸に関して例示した。しかし、本明細書で説明した基材に他の分析物を付着させ、分析することができることが理解される。本開示の基材の中または該基材上に１つまたは複数の分析物が存在することができる。本開示の基材は、分析物の検出に、または分析物との合成反応の実施に、特に有用である。したがって、検出、特徴付け、変性、または合成などがされる種々の分析物のいずれも、本明細書で説明した基材の中または該基材上に存在することができる。例示的な分析物には、これだけに限らないが、核酸（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体）、タンパク質、多糖、細胞、抗体、エピトープ、受容体、リガンド、酵素（たとえばキナーゼ、ホスファターゼまたはポリメラーゼ）、または小分子薬物候補などが含まれる。基材には、分析物のライブラリーからの複数の異なる種が含まれ得る。たとえば、種は、抗体ライブラリーからの異なる抗体、核酸のライブラリーからの異なる配列を有する核酸、タンパク質のライブラリーからの異なる構造および／または機能を有するタンパク質、小分子のコンビナトリアルライブラリーからの薬物候補などであってよい。
【０１１８】
一部の実施形態では、分析物が個別に溶解可能となるように、分析物を基材上の特徴部分に分配してもよい。たとえば、各分析物の単一分子は、各特徴部分に存在してよい。あるいは、分析物は、コロニーまたは集団として存在してもよく、それにより個別の分子は必ずしも溶解しない。コロニーまたは集団は、（複数のコピーの中であっても）単一種の分析物のみを含有することに関して均質であってよい。核酸を例にとると、基材上の各特徴部分は核酸のコロニーまたは集団を含んでよく、コロニーまたは集団中の全ての核酸は同じヌクレオチド配列（一本鎖または二本鎖のいずれか）を有してよい。そのようなコロニーは、本明細書で前に説明したようにクラスター増幅またはブリッジ増幅によって作り出すことができる。ローリングサークル増幅手順を使用して作り出されたコンカタマーのような標的配列の多重繰り返しが単一核酸分子の中に存在してもよい。したがって、基材上の特徴部分は、単一種の分析物の多重コピーを含有してよい。あるいは、特徴部分にある分析物のコロニーまたは集団は、２つまたはそれより多くの異なる種を含んでよい。たとえば、基材上の１つまたは複数のウェルはそれぞれ、２つまたはそれより多くの異なる核酸種（即ち、異なる配列を有する核酸分子）を有する混合コロニーを含有してよい。混合コロニー中の２つまたはそれより多くの核酸種は、無視できない量、たとえば、混合コロニー中で１つ超の核酸を検出することを可能にする量で存在してよい。
【実施例】
【０１１９】
以下の実施例においてさらなる実施形態をさらに詳細に開示するが、これらが、いかなる意味でも特許請求の範囲を限定することは意図されていない。
実施例１
【０１２０】
図５は、実施したＣＹＴＯＰ−Ｓを使用してパターン化された表面を調製するための例示プロセスのワークフロー図である。上述のように、ＣＹＴＯＰ−Ｓ表面の酸素プラズマ処理によって、ＣＹＴＯＰ層の疎水性および化学的不活性が喪失したことがわかった。Ｓｈｉｐｌｅｙ１８シリーズのフォトレジストなどのある特定のフォトレジストは、酸素プラズマ処理を何ら必要とせずにＣＹＴＯＰ−Ｓコーティングされた表面上で直接スピンできることが見出された。
【０１２１】
表面の調製：  最初に、基材（ガラス基材または二酸化ケイ素でコーティングされたＳｉ基材）をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、脱イオン水（ＤＩ）で清浄化し、次いで窒素ガスを吹き付けて乾燥した。次いで、ＡＰＴＭＳによるシラン化のために、基材を６０℃の真空デシケーターに１２時間入れた。次いで、０．５％のＣＹＴＯＰ−Ａコーティング溶液を、基材表面上に２０００ｒｐｍで２０秒間スピンコートした。コーティングした基材を、５０℃で３０分間ソフトベークした。続いて、５％のＣＹＴＯＰ−Ｓコーティング溶液を、ＣＹＴＯＰ−Ａ層上に１０００ｒｐｍで３０秒間スピンコートした。ＣＹＴＯＰ−ＡおよびＣＹＴＯＰ−Ｓの溶液を調製するために、ＡＧＣからのＣＴ−ＳＯＬＶ１８０などのフルオロカーボン系溶媒を使用した。基材を室温で３０分間乾燥し、次いで５０℃で３０分間、その後８０℃で３０分間ベークして、最後に２５０℃で３０分間ベークした。ＣＹＴＯＰ−Ａ／Ｓコーティングが完了し、基材はフォトリソグラフィーの準備ができた。
【０１２２】
フォトリソグラフィー：  Ｓｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８００フォトレジストを基材表面のＣＹＴＯＰ層の上に直接スピンコートした（Ｓｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８０５を０．５μｍの厚みでコーティングするため、たとえば３０００ｒｐｍで３０秒間）。基材を１１５℃で６０秒間、ソフトベークした。露光エネルギー約１２０ｍＪ／ｃｍ２でのフォトリソグラフィーのためにＧ線ＵＶを用いる接触アライナーまたはステッパーを使用してよい。現像プロセスは、基材をＭｉｃｒｏｐｏｓｉｔ  ＭＦ−３２１現像剤中に６０秒間入れ、次いで脱イオン水ですすぎ、その後窒素ガスを吹き付けて乾燥することによって行った。次いで、Ｓｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８フォトレジストでパターン化した基材を１２０℃のオーブン中で３０分間ハードベークした。ウェルエリア内のＣＹＴＯＰをエッチング除去して下にあるＳｉＯ２表面を露出させるために、基材をＯ２プラズマ（Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｅｔｃｈｅｒ、１００ｓｃｃｍ  Ｏ２フラックス、１５０Ｗ、１８０秒ドライエッチ）で処理した。得られた基材の表面は、ＣＹＴＯＰ−Ｓで覆われた間隙領域によって分離された、パターン化され露出したＳｉＯ２表面を含んでおり、ヒドロゲルパターニングステップの準備ができた。
【０１２３】
ヒドロゲルパターニング：  基材の処理された表面上にシランカップリング剤を堆積させ、露出したＳｉＯ２表面とＣＹＴＯＰ−Ｓで覆われた間隙領域の両方を覆った。次いで、シランカップリング剤の上にヒドロゲルをスピンコートして共有結合を形成し、それによりヒドロゲルを表面上に固定化した。硬化の後、過剰のヒドロゲルをすすぎ落とした。ヒドロゲルでパターン化された表面は研磨することなくオリゴグラフティングに直接使用することができる。
【０１２４】
図６Ａおよび６Ｂは、クラスタリングおよび１４サイクルのシーケンシングの前後の、２８μｍのピッチを有する１４μｍのマイクロウェルを含有するパターン化されたデバイス表面の蛍光画像である。デバイス表面は、一体としたＣＹＴＯＰ−ＡおよびＣＹＴＯＰ−Ｓ層の全厚みが３７０ｎｍである、Ｓｈｉｐｌｅｙ  Ｓ１８０５を使用して、図５に記載したＳｈｉｐｌｅｙフォトレジストワークフローに従って調製した。図６Ａは、ＴＥＴ染料で標識したオリゴプライマーをグラフトしたＰＡＺＡＭでパターン化された表面の画像を示す。図６Ｂは、ＳＹＴＯＸ（登録商標）インターカレーティング染料で標識したマイクロウェル中のＤＮＡクラスターの成長を示す。これらの画像から、マイクロウェル間の疎水性ＣＹＴＯＰ−Ｓ間隙領域におけるプライマーまたはＤＮＡクラスターの非特異的結合の兆候がないことは明らかである。
【０１２５】
図５に記載した同じＳｈｉｐｌｅｙ１８フォトレジストワークフローを使用して加工した１．８μｍのピッチを有する７００ｎｍのマイクロウェルを含有するデバイスについてプロセスを反復した。図６Ｃは、ＳＹＴＯＸ（登録商標）インターカレーター染料によって可視化した７００ｎｍのマイクロウェルにおけるパターン化されたＤＮＡクラスターの蛍光画像である。再び、画像は非常に清浄なＣＹＴＯＰ−Ｓ間隙領域を示した。
実施例２
【０１２６】
本実施例では、フォトリソグラフィーの前に表面の酸素プラズマ処理を必要としない標準的なフォトレジストを使用してパターン化された表面を作り出す２つのプロセス−直接パターニングプロセスおよびリフトオフプロセス−を行った。
【０１２７】
図７は、パターン化された表面を作り出すための直接パターニングワークフローを示す。
【０１２８】
表面の調製：  最初に、実施例１に記載した手順と同じ手順に従って固体支持体の表面上にＣＹＴＯＰ−ＡおよびＣＹＴＯＰ−Ｓをコーティングした。次いで、フルオロ界面活性剤Ｓｕｆｌｏｎ−Ｓ６５１をイソプロパノール（ＩＰＡ）と混合して１％溶液を形成し、ＣＹＴＯＰ−Ｓ表面の上に５００ｒｐｍで５秒間、次いで４０００ｒｐｍで５０秒間スピンコートした。このステップにより、ＣＹＴＯＰ層とその上に堆積させるフォトレジスト層との間の表面エネルギーの不一致が低減された。続いて、酸素プラズマ処理を何ら必要とせずに、ＭＩＣＲＯＣＨＥＭからのＬＯＲレジストを、処理された表面の上に直接スピンした。このアプローチによってプロセスワークフローが拡大し、Ｓｈｉｐｌｅｙ１８フォトレジストの他に、加工設備で使用される多種のフォトレジストの使用が可能になる。このワークフローにおける以後のステップには、所与のフォトレジスト製品に適したフォトレジストコーティング、ソフトベーキング、ＵＶアラインメント／露光、および現像が含まれる。ウェル領域中のＣＹＴＯＰポリマーをエッチング除去して下にあるＳｉＯ２エリアを露出させるために、基材をＯ２プラズマ（Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｅｔｃｈｅｒ、１００ｓｃｃｍ  Ｏ２フラックス、１５０Ｗ、１８０秒ドライエッチ）で処理した。基材の得られた表面は、疎水性間隙領域によって分離された、パターン化され露出したＳｉＯ２表面を含んでおり、ヒドロゲルパターニングステップの準備ができた。
【０１２９】
直接パターニング：  最初に、基材表面上に残存しているフォトレジストを、基材をアセトン中で１０分間超音波処理し、その後ＩＰＡですすぎ、水ですすぎ、次いで空気を吹き付けて乾燥することによって除去した。あるいは、ＭＩＣＲＯＣＨＥＭのＲｅｍｏｖｅｒ  ＰＧによってフォトレジストＬＯＲをストリッピングしてよく、次いでアセトンによってＳｕｆｌｏｎ−Ｓ６５１をストリッピングしてもよい。フォトレジストおよびフルオロ界面活性剤を除去することにより、下にある間隙領域としてのＣＹＴＯＰ−Ｓコーティングが露出した。続いて、ノルボルネンシラン化のために基材を６０℃の真空デシケーターに１２時間入れた。シラン化が完了した後、次いで、基材をＰＡＺＡＭでコーティングし、６０℃のオーブン中で１時間インキュベートした。過剰のヒドロゲルをＤＩ水ですすぎ落とした。次いで、基材をＤＩ水中４５℃で３０分間超音波処理して、表面上に、共有結合することなく緩く残存している過剰のヒドロゲルを除去した。得られた基材は、ウェルエリアにコーティングされたヒドロゲルおよびヒドロゲルを含まない清浄なＣＹＴＯＰ間隙エリアを有する。基材は、その後のプライマーグラフティングならびにＤＮＡ播種およびシーケンシングの準備ができている。
【０１３０】
図８Ａは、パターン化された表面を作り出すためのリフトオフパターニングワークフローを示す。基材の加工プロセスは、図７に例示したワークフローにおける上述のものと同じであった。ＣＹＴＯＰおよびＳｕｒｆｌｏｎによるコーティングならびにフォトリソグラフィーの後、パターン化された表面をエッチングして、下にあるウェル中のＳｉＯ２を露出した。次いで、表面上にフォトレジスト層が残存しているパターン化された基材を、ノルボルネンシラン化のために、６０℃の真空デシケーターに１２時間、直接入れた。次いで、基材をＰＡＺＡＭでコーティングし、６０℃のオーブン中で１時間インキュベートした。過剰のヒドロゲルをＤＩ水ですすぎ落とした。次いで、基材をＤＩ水中４５℃で３０分間超音波処理して、表面上に、共有結合することなく緩く残存しているヒドロゲルを除去した。続いて、基材をアセトン中、４５℃で３０分間超音波処理して、間隙領域のフォトレジスト層を除去した。フォトレジスト層の最上部上に堆積したヒドロゲルも同時に除去した。間隙領域の清浄なＣＹＴＯＰ表面が露出した。得られた基材は、ウェルエリアに固定化されたヒドロゲルと、ヒドロゲルを含まない清浄なＣＹＴＯＰ間隙領域とを有する。基材は、その後のプライマーグラフティングならびにＤＮＡ播種およびシーケンシングの準備ができている。
【０１３１】
図８Ｂは、図８Ａに例示したリフトオフワークフローを使用した１４μｍマイクロウェル構造におけるパターン化されたＰＡＺＡＭおよびＤＮＡクラスターの蛍光画像を示す。ＤＮＡクラスターは、ＳＹＴＯＸ（登録商標）インターカレーター染料で染色した。画像は、ヒドロゲルパターニングの結果が図７の直接パターニングワークフローで達成された結果と同程度であることを示唆している。
【０１３２】
さらに、ＣＹＴＯＰ−Ｓ表面は、直接プロセスとリフトオフプロセスの両方でヒドロゲルパターニングの後に表面疎水性を取り戻しており、リフトオフ法の方が直接パターニング法に比べて良好な表面疎水性を保持していた。
実施例３
【０１３３】
ＣＹＴＯＰ−Ａ表面および種々のウェルパターンを有するパターン化されたフローセルを本明細書に記載したように調製した。ＤＮＡ配列の増幅は、ＥｘＡｍｐ増幅法を使用して２×１５０サイクルの操作で実施した。インキュベーションは１分間行い、デブロッキングは１５秒間行い、反応は６５μＬの体積で行った。以下の結果が得られ、結果を図１３Ａ〜１３Ｃに示す。
【表１】
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【０１３４】
結果は、ＣＹＴＯＰパターニングがＩｌｌｕｍｉｎａ  ＳＢＳ化学と両立すること、ならびに表面が強固で２×１５０ｂｐｓのシーケンシング操作を完了するための数千回の流れ交換が可能であることを立証している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【国際調査報告】
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