(57)【要約】  本発明は、セルロース分解酵素またはヘミセルロース分解酵素を生産するための方法に関し、  −  ２５〜３０℃の温度および４〜５．５のｐＨにおいて、１０および９０ｇ／Ｌの間の濃度の少なくとも１つの炭素質増殖基質の存在下における閉鎖型反応器内でのセルロース分解微生物の増殖段階ａ）  −  ２５〜２７℃の温度および４〜５のｐＨにおいて少なくとも１つの誘導物質性炭素質基質が添加される酵素生産段階ｂ）  を含み、  この方法において、前記誘導物質性基質は、リグノセルロース系材料の前処理プロセスから得られる前処理された搾汁残渣であり、これは酵素的加水分解を受けておらずかつ流加または連続モードで添加され、これは具体的な特徴：試験において８０％を超える加水分解収率と試験において測定される１０ｓ−１のせん断速度での１Ｐａ．ｓ未満の見かけ粘度とを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース分解酵素またはヘミセルロース分解酵素を生産するための方法であって：
−  ２５〜３０℃の温度および４〜５．５のｐＨにおいて、１０および９０ｇ／ｌの間の濃度の少なくとも１つの炭素質増殖基質の存在下における閉鎖型反応器内でのセルロース分解微生物の増殖段階ａ）、
−  ２５〜２７℃の温度および４〜５のｐＨにおいて少なくとも１つの誘導物質性炭素質基質が導入される酵素生産段階ｂ）、
を含み、
この方法において、
−  前記誘導物質性基質はリグノセルロース系材料の前処理プロセスから得られる前処理された搾汁残渣であり、前記搾汁残渣は酵素的加水分解を受けておらず、流加または連続モードで導入され、
−  前記搾汁残渣は、前記搾汁残渣に対して、５０℃およびｐＨ４．８において１５ｗｔ．％の乾燥物重量（ＤＭ）で、ＤＭのグラムあたり１０ｍｇのＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＣＴＥＣ２酵素によって行われる酵素的加水分解においては、９６ｈ後に少なくとも８０％の酵素的加水分解収率を有するものであり、前記収率は、前処理からもたらされる全てのセルロース、ヘミセルロース、およびオリゴマーが加水分解された場合に得られるであろう理論上の最大質量によって除算された、酵素的加水分解によって遊離した単純な糖の質量の比率であり、
−  室温において１０ｗｔ．％のＤＭで懸濁された前記前処理された搾汁残渣は、１０ｓ−１のせん断速度において１Ｐａ．ｓ未満、好ましくは０．１５Ｐａ．ｓ未満の見かけ粘度を有し、
−  前記搾汁残渣は、連続モードでは培地のリットルあたりかつ時間あたり０．３および０．８グラムの間のＤＭの速度で導入され；流加モードでは、ｆ時間毎に添加される搾汁残渣の量は培地のリットルあたり０．３ｆおよび０．８ｆグラムの間の乾燥物重量であり、ｆは０．５ｈおよび４８ｈの間である、
セルロース分解酵素またはヘミセルロース分解酵素を生産するための方法。
【請求項２】
ステップｂ）の培地の見かけ粘度が１０ｓ−１のせん断速度において１０Ｐａ．ｓ未満、好ましくは１Ｐａ・ｓ未満のままである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記搾汁残渣は導入される前に洗浄されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記搾汁残渣は導入される前に洗浄されていない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記セルロース分解微生物がTrichoderma reesei種の菌類である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記前処理が酸性条件下における蒸煮爆砕である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
段階ｂ）において、添加される糖の非存在下において操作される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記前処理された搾汁残渣が唯一の誘導物質性基質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記前処理された搾汁残渣が液体および固体の形を成し、前記固体が２０〜７０％の乾燥物重量を含有し、その２０〜５０％がリグニンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記前処理された搾汁残渣が液体および固体の形を成し、かつ、前記前処理された搾汁残渣の固体が３０〜６０ｗｔ．％のセルロースと１〜１０ｗｔ．％のミネラル化合物およびヘミセルロースとを含有し、前記液体が３０〜８０ｗｔ．％の糖を含有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記搾汁残渣が添加される段階において、大気圧下の培地中の酸素飽和における溶存酸素の濃度ｐＯ２が３０％超に維持される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記前処理された搾汁残渣が、リグノセルロース系バイオマス前処理ステップからもたらされる前処理された搾汁残渣の一部であり、前処理された搾汁残渣の別の一部は、前記酵素生産段階によって得られた酵素の存在下に行われる酵素的加水分解ステップに導入され、得られた加水分解物はエタノール発酵ステップに渡され、得られた流出液はエタノールを分離するために蒸留される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前処理された搾汁残渣の前記一部が直接的に段階ｂ）に用いられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前処理された搾汁残渣の前記一部中に含有される液体の一部または全てが分離され、得られた搾汁残渣が段階ｂ）に導入される、請求項１２または１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース分解酵素およびヘミセルロース分解酵素を生産するためのプロセスに関する。
【０００２】
酵素は、具体的にはバイオ燃料がエタノールであるときに、第２世代バイオ燃料を（すなわちリグノセルロース系バイオマスから）生産するためのプロセスにおいて特に用いられる。一般的に、本発明に従うプロセスは、バイオマス、具体的にはリグノセルロース系バイオマスの酵素的加水分解を包含する全てのプロセスに用いられ得る。これは具体的には糸状菌による酵素の生産に用いられ得る。
【背景技術】
【０００３】
４５年超に渡って、成分多糖から発酵可能な糖への加水分解後において、リグノセルロース系材料からエタノールへの変換はいくつもの研究の対象である。
【０００４】
リグノセルロース系材料はセルロース系材料であり、つまり９０重量％超のセルロースおよび／またはリグノセルロースからなる（リグノセルロースは本質的にセルロース、ヘミセルロース、およびリグニンを含む）。セルロースおよびヘミセルロースは本質的にペントースおよびヘキソースからなる多糖である。リグニンはフェノール性化合物ベースの複雑な構造および高い分子量の高分子である。
【０００５】
木、わら、およびトウモロコシ穂軸は最も広く用いられるリグノセルロース系材料であるが、他の資源、例えば専用林地収穫物、アルコール−木質系植物の残材、糖含有植物および糖含有穀類、パルプ・紙工業からのリグノセルロース系残材、ならびにリグノセルロース系材料の変換からの生成物もまた用いられ得る。これらは概ね約３５から５０％のセルロース、２０から３０％のヘミセルロース、および１５から２５％のリグニンを含む。
【０００６】
リグノセルロース系材料からエタノールへの生化学的変換のためのプロセスは、物理化学的前処理ステップ、次に、糖を生産するための酵素カクテルを用いる酵素的加水分解ステップ、遊離した糖のエタノール発酵のステップ、およびエタノール精製ステップを包含し、エタノール発酵および酵素的加水分解は同時に行われ得る（ＳＳＦプロセス）。
【０００７】
酵素カクテルはセルロース分解酵素（セルラーゼともまた呼ばれる）および／またはヘミセルロース分解酵素（多くの場合にキシラナーゼと呼ばれる）の混合物である。セルロース分解酵素は活性の３つの主な型：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、およびセロビアーゼを有し、最後のものはβ−グルコシダーゼともまた呼ばれる。ヘミセルロース分解酵素は具体的にはキシラナーゼ活性を有する。
【０００８】
酵素的加水分解は効率的であり、穏やかな条件下において行われ得る。
【０００９】
酵素のコストは非常に高いままであり、リグノセルロース系材料をエタノールに変換するコストの２０から５０％を占める。結果として、このコストを減少するために：先ず第１に、高生産微生物をセレクションすることと前記酵素を生産するためのプロセスを改善することとによって酵素の生産を最適化することについて、それから、前処理ステップを最適化することとそれらの酵素の特異的活性を改善することと酵素的加水分解ステップの実行を最適化することとによって加水分解の際の酵素の量を減少することについて、沢山の研究が行われてきた。
【００１０】
過去十年に渡って、多くの研究は酵素カクテルの作用の機序および発現の機序を理解することに集中して来た。狙いは、微生物を改変することによってリグノセルロース系材料の加水分解のための最も好適なカクテルを分泌することである。
【００１１】
酵素カクテルの工業生産に最も用いられるセルロース分解微生物は菌類Trichoderma reeseiである。これは、誘導物質性炭素質基質、例えばセルロースの存在下において、酵素カクテルを非常に高い濃度（最大で１００ｇ／ｌ）で分泌する能力を有する。リグノセルロース系材料の加水分解に不可欠な特性を持つ他の蛋白質、例えばキシラナーゼもまたTrichoderma reeseiによって生産される。誘導物質性炭素質基質の存在はセルロース分解酵素および／またはヘミセルロース分解酵素の発現にとって必須である。炭素質基質の種類は酵素カクテルの組成に強い影響を及ぼす。これはキシロースに当てはまり、これは、セルロースまたはラクトースなどの誘導物質性炭素質基質では、前記キシラナーゼの活性が有意に改善されることを可能にする。
【００１２】
ラクトースは酵素カクテルの工業生産のためのプロセスにおける最も好適な基質の１つのままである；しかしながら、そのコストはかなりばらつき、酵素のコスト価格のおよそ３分の１から３分の２に相当する。炭素基質としてのラクトースの使用のケースでは、酵素カクテル生産プロセスは外部の炭素源に依存する。結果として、リグノセルロース系材料の生化学的変換プロセスから得られる炭素基質の使用は進むべき重要な道である。
【００１３】
用いられ得る別の誘導物質性基質はセルロースである。しかしながら、これはラクトースよりもさらに高価である。
【００１４】
米国特許出願公開２０１１／２６２９９７号明細書（特許文献１）は、セルラーゼの生産のための従来プロセスに用いられるセルロースを、具体的には酸性条件下における蒸煮爆砕によって前処理された、前処理されたバイオマスによって代替しており、バイオマスは任意に洗浄されている。前処理されたバイオマスは誘導物質としてのみ用いられ、微生物の増殖は炭素基質としてのグルコースによって得られている。回分操作されるプロセスの実施例においては、前処理（酸蒸煮）および洗浄された搾汁残渣は実験の始めにまとめて追加され、グルコースと抑泡剤との溶液が追加される。
【００１５】
一方で、このプロセスは、使用前に前処理された搾汁残渣の除毒を要求するという欠点を有する。洗浄はこれのための推奨されるオプションである。このプロセスが工業スケールで適用される場合には、各種洗浄の実行はプロセスのコストを大いに増大させるであろう。
【００１６】
他方で、全ての前処理された搾汁残渣が実験の始めに追加されるという事実は、培地の粘度を大いに増大させ、これは高い散逸仕事率の適用を要求する。培地を撹拌するために要求されるモーターの仕事率（ｋＷ／ｍ３）が「散逸仕事率」と呼ばれる。粘度のこの増大は、十分な酸素移動を許すための非常に高い通気速度をもまた要求する。
【００１７】
別の国際特許出願公開ＷＯ−１３／１９００６４号明細書（特許文献２）もまた、前処理されたリグノセルロース系バイオマス（第１の前処理されたバイオマスと呼ばれる）の酵素的加水分解のための酵素の生産に関する。この生産は、追加される糖（例えばグルコース）の非存在下においてだが、複雑な糖とリグニンとを含む固体の存在下において行われる。この固体は好ましくは異なるバイオマス処理プロセスから得られ、これは前記固体の酵素的加水分解、それから分離を含み、プロセスは第２の前処理されたバイオマスから始まる。酵素を生産するためのこのプロセスにおいては、前記固体の複雑な糖対リグニンの比率が前記第２のバイオマスの複雑な糖対リグニンの比率未満であるということが必須である。この基準は、加水分解物から水および可溶性糖の少なくとも５０％を除去することを要求する。これはプロセスのコストを増大させる。さらにその上、この固体は非常に高いパーセンテージのリグニンを有し、これは酵素の生産をより効率的でなくする。事実、リグニンのフェノール性化合物は酵素に対して阻害効果を有するということが公知である。
【００１８】
国際特許出願公開ＷＯ−１３／０５３９２４号明細書（特許文献３）は同じ型のプロセスによって操作され、その中では、単純な糖（グルコース）の追加なしに（または少々の追加によって）、前処理されたバイオマスが増殖基質の役割をもまた果たす。その上、培養はビタミンおよび／またはミネラルおよび／または酵素生産誘導物質の追加なしに行われる。このプロセスもまた搾汁残渣の除毒を要求する（特に、用いられる前処理が酸性である場合）。
【００１９】
国際特許出願公開ＷＯ２０１１／０２８５５４号明細書（特許文献４）は、Trichoderma reeseiによるセルラーゼの生産のために、ヘミセルロースの加水分解から得られる固体残渣の使用を教示しており、その中で、残渣はリグニン抽出ステップにおいてそのリグニン画分をストリッピングされている。生産は糖（グルコース）の追加の存在下において行われる。得られる酵素はヘミセルロースの加水分解ではなくセルロースの加水分解に用いられる。脱リグニン処理された固体残渣は微生物の増殖段階の始めに用いられ、これは操作上の困難を引き起こす。
【００２０】
本発明の目的は、リグノセルロース系材料の加水分解にとって好適である酵素カクテルが生産されることを可能にする、生産プロセスから得られる誘導性炭素源を提案することである。
【００２１】
セルラーゼ生産プロセスは、好ましくは前もって除毒されていない前処理された搾汁残渣を用いる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】米国特許出願公開２０１１／２６２９９７号明細書
【特許文献２】国際特許出願公開ＷＯ−１３／１９００６４号明細書
【特許文献３】国際特許出願公開ＷＯ−１３／０５３９２４号明細書
【特許文献４】国際特許出願公開ＷＯ２０１１／０２８５５４号明細書
【発明の概要】
【００２３】
本発明は、前処理された搾汁残渣(pomace)を用いるセルロース分解微生物によって液体培養において酵素カクテルを生産するためのプロセスに関する。
【００２４】
「前処理された搾汁残渣」は、前処理ステップ、好ましくは酸性媒体中での蒸煮爆砕(steam explosion)を受けたリグノセルロース系材料に由来する基質(substrate)を言う。バイオマスは好ましい材料の１つの型であり；文中において、用語バイオマスおよびリグノセルロース系材料は多くの場合に交換可能に用いられる。
【００２５】
一般的には、リグノセルロース系材料からアルコール（具体的にはエタノール）への生化学的変換のためのプロセスは、前処理された搾汁残渣を生産する物理化学的前処理ステップ（好ましくは、酸性媒体中での蒸煮爆砕）、次に糖を生産する酵素カクテルを用いる酵素的加水分解ステップ、それから前記糖のエタノール発酵ステップ、および最後にエタノールの精製ステップを含み、エタノール発酵および酵素的加水分解は同時に（ＳＳＦプロセス）または別々に（ＳＨＦプロセス）行われ得る。
【００２６】
本発明は多くの利点を有する：
−  リグノセルロース系材料の生化学的変換のための前記プロセスへの外部起源の炭素質基質の供給を減少またはさらには除外する。
【００２７】
−  生化学的変換プロセスにおける前処理されたリグノセルロース系材料の酵素的加水分解に特に適合した酵素カクテルを生産する。
【００２８】
−  用いられる前処理された搾汁残渣を除毒（例えば、洗浄）せずに済むことを可能にするプロセスを行うためのプロセスを提案する。これは、排出前に再処理されなくてはならない洗浄の間に生ずる流出液の量が減少されることを可能にする。
【００２９】
−  培地の粘度が低い値に維持され、これが酸素要求量を限定するプロセスを提案し、このようにして、工業スケールにスケールアップされ得るプロセスを提供する。
【００３０】
プロセスは連続または流加モードで操作され得る。
【００３１】
流加モードでは、プロセスを行う特に有利なやり方は、反応培地のｐＨおよび放出ガス中の％ＣＯ２の変化に応じて、逐次的な様式で搾汁残渣の追加を行うことである。
【００３２】
この操作モードは、除毒されていない前処理された搾汁残渣（未洗浄の搾汁残渣）の使用を許容する。
【００３３】
このプロセスの利点は、特に上記の操作モードでは、培地の低い粘度を維持することである。これは、酸素移動に影響しないために、かつ工業スケールにスケールアップされ得るプロセスを有するために、重要である。
【００３４】
本発明は、より具体的には、２つの段階を含む酵素生産プロセスに関する：
−  閉鎖型反応器内での少なくとも１つの炭素質増殖基質の存在下における前記微生物の増殖段階ａ）。前記増殖段階は１０および９０ｇ／ｌの間の炭素質増殖基質の濃度において行われる。前処理された搾汁残渣はこの段階では導入されない。このようにして前記微生物の培養物が得られる。
【００３５】
−  酵素（単数または複数）カクテルを生産するための段階ｂ）。その中では、少なくとも１つの誘導物質性炭素質基質が流加的または連続的に追加され、前記誘導物質性炭素質基質は前記前処理された搾汁残渣の一部であり、前記生産段階は搾汁残渣の連続的または非連続的追加（流加）によって行われる。
【００３６】
より具体的には、本発明は、セルロース分解酵素またはヘミセルロース分解酵素を生産するためのプロセスに関し：
−  ２５〜３０℃の間の温度および４から５．５のｐＨにおける１０および９０ｇ／ｌの間の濃度の少なくとも１つの炭素質増殖基質の存在下での、閉鎖型反応器内におけるセルロース分解微生物の増殖段階ａ）、
−  少なくとも１つの誘導物質性炭素質基質が２５〜２７℃の温度および４〜５のｐＨにおいて導入される酵素生産段階ｂ）、
を含み、
このプロセスにおいて、
−  前記誘導物質性基質はリグノセルロース系材料の前処理プロセスから得られる前処理された搾汁残渣であり、前記搾汁残渣は酵素的加水分解を受けておらず、流加または連続モードで導入され、
−  前記搾汁残渣は９６ｈ後に少なくとも８０％の酵素的加水分解収率を示し、前記加水分解は、前記搾汁残渣に対して、５０℃およびｐＨ４．８において１５ｗｔ．％の乾燥物重量（ＤＭ）でＤＭのグラムあたり１０ｍｇのＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＣＴＥＣ２酵素によって実施され、前記収率は、前処理からもたらされる全てのセルロース、ヘミセルロース、およびオリゴマーが加水分解された場合に得られるであろう理論上の最大質量によって除算された、酵素的加水分解によって遊離した単純な糖の質量の比率であり、
−  室温において１０ｗｔ．％のＤＭで懸濁された前記前処理された搾汁残渣は、１０ｓ−１のせん断速度において１Ｐａ．ｓ未満、好ましくは０．１５Ｐａ．ｓ未満の見かけ粘度を有し、
−  前記搾汁残渣は、連続モードでは培地のリットルあたりかつ時間あたり０．３および０．８グラムの間のＤＭの速度で導入され；流加モードでは、ｆ時間毎に追加される搾汁残渣の量は培地のリットルあたり０．３ｆおよび０．８ｆグラムの間の乾燥物重量であり、ｆは０．５ｈおよび４８ｈの間である。
【００３７】
好ましくは、ステップｂ）の培地の見かけ粘度は１０ｓ−１のせん断速度において１０Ｐａ．ｓ未満、好ましくは１Ｐａ．ｓ未満のままである。
【００３８】
搾汁残渣は段階ｂ）に導入される前に除毒（洗浄）され得るか、または除毒（洗浄）されずにあり得る。段階ｂ）は、一般的には、追加される糖の非存在下において操作される。このようにして、非常に有利には, 前記前処理された搾汁残渣が唯一の誘導物質性基質である。
【００３９】
下で詳細に説明されるように、前処理された搾汁残渣は液体および固体の形を成し、その中の固体は２０〜７０％の乾燥物重量を含有し、その２０〜５０％はリグニンである。前記前処理された搾汁残渣の固体は３０〜６０ｗｔ．％のセルロースと１〜１０ｗｔ．％のミネラル化合物およびヘミセルロースとをもまた含有し、液体は３０〜８０ｗｔ．％の糖を含有する。
【００４０】
好ましくは、前処理は酸性条件下における蒸煮爆砕である。
段階ａ）
本発明に従って酵素カクテルを生産するためのプロセスに用いられる微生物は、Trichoderma、Aspergillus、Penicillium、またはSchizophyllum属に属する菌類の株であり、好ましくはTrichoderma reesei種に属する。最も有効な工業株は例えば株ＣＬ８４７（仏国特許ＦＲ−２５５５８０３）などのTrichoderma reesei種に属する株であり、酵素カクテルを改善するように変異−選択プロセスによって改変されている。遺伝子組み換え技術によって改善された株もまた用いられ得る。それらの株は、それらの増殖および酵素の生産と適合性の条件下において通気撹拌反応器内で培養される。いくつもの改善された株、例えばＭＣＧ７７（Gallo−米国特許４２７５１６７）、ＭＣＧ８０（Allen, AL and Andreotti, RE, Biotechnol-Bioengi 1982 12, 451-459 1982）、ＲＵＴ Ｃ３０（Montenecourt, BS and Eveleigh, DE, Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782）、およびＣＬ８４７（Durand et al, 1984 Proc.SFM Symposium "Genetics of Industrial Microorganisms", Paris, HESLOT H. Ed, pp 39-50）が公知である。
【００４１】
前記段階ａ）に用いられる前記微生物の炭素質増殖基質は、有利には可溶性工業糖から選ばれ、好ましくは、グルコース、ラクトース、キシロース、リグノセルロース系材料の酵素的加水分解物の単量体糖のエタノール発酵後に得られる液体残渣（ビナス(仏vinasse):蒸留残渣）、および前処理されたリグノセルロース系基質（例えば、前処理レベルにおいて分離された液体）から得られる単量体の形態のヘミセルロース系画分の抽出物（Ｃ５化合物）から選ばれ、単独でまたは混合物として用いられる。その種類に応じて、前記炭素基質は滅菌前に閉鎖型反応器内に導入されるか、または別々に滅菌され、最後のものの滅菌後に閉鎖型反応器内に導入される。
【００４２】
この炭素質増殖基質は、反応体積のリットルあたり１０および９０ｇの間の炭素質基質の初期濃度で前記段階ａ）に用いられる。
【００４３】
好ましくは、前記増殖段階ａ）は、３０および７０時間の間の、好ましくは３０および４０時間の間の継続時間に渡って行われる。
【００４４】
好ましくは、前記増殖段階ａ）は、４および５．５の間のｐＨ、好ましくは４．８、かつ２５および３０℃の間の温度、好ましくは２７℃において操作される。
段階ｂ）
本発明に従うと、前記生産段階ｂ）に用いられる前記誘導物質性炭素質基質は有利には前処理された搾汁残渣である。
【００４５】
リグノセルロース系材料の前処理ステップは、酵素的加水分解に対するセルロース系画分の感度が改善されることを可能にする。
【００４６】
好ましくは、前処理ステップは酸性媒体中において行われる。これは好ましくは酸加水分解、酸蒸煮、または蒸煮爆砕である。好ましくは、前処理ステップは蒸煮爆砕である。有利には、蒸煮爆砕は、好ましくは硫酸の水溶液である酸溶液を前記リグノセルロース系材料に含浸させるステップによって先行される。そこで、これは酸性条件下における蒸煮爆砕と呼ばれる（材料は酸を含有する）。
【００４７】
前処理の終わりに、前処理された搾汁残渣が得られ、この搾汁残渣の一部は酵素の生産のために取られ、別の一部は酵素的加水分解に送られ、それからアルコールの生産のための発酵に送られる。
【００４８】
搾汁残渣の前記一部はそのまま用いられ得（全搾汁残渣）、または好ましくはその固体分であり得るかもしくは有利には液体の何らかの有意な分離後に得られる部分でもまたあり得る。
【００４９】
用いられる前処理に応じて、搾汁残渣は幾分かの水分を有するが液体相なしの固体形態であるか、または固体相および液体相を含有する。後者のケースでは、液体相は完全にまたは部分的に分離され得る。
【００５０】
用いられる前処理プロセスに応じて、固体分は前処理された搾汁残渣の重量の２０および７０％の間に相当する。酵素の生産に用いられる搾汁残渣は、１０〜８５％、最も多くの場合には２０〜７０％、非常に好ましくは４０％〜６０％の乾燥物重量率を有する（これは、多くの場合に、前処理後に固体形態の搾汁残渣を得ることに対応する）。
【００５１】
前記固体分は、リグニン、ミネラル化合物、セルロース、および加水分解されていない残留ヘミセルロースからなる。前記固体分中のセルロースの割合は３０から６０ｗｔ．％である。前記固体分中のリグニンの割合は２０から５０ｗｔ．％である。前記固体分中のミネラル化合物およびヘミセルロースの割合は１から１０ｗｔ．％である。
【００５２】
前記前処理された搾汁残渣の液体部分はキシロース、キシロオリゴ糖、マンノース、およびアラビノースを３０および８０％の間の割合で含有する。
【００５３】
好ましい実施形態において、搾汁残渣は直接的に、つまり化学的または生化学的処理を受けることなしに用いられる。このようにして、本発明は、酵素的加水分解をも受けた前処理された搾汁残渣を用いない。１つ以上の物理的処理が可能である（液体の分離、加熱、濃縮手段など）。
【００５４】
好ましいモードにおいては、搾汁残渣は未洗浄である。いくつかのケースでは、これはそれを除毒するために好ましくは最小限の量の水を用いて洗浄され得る。
【００５５】
好ましくは、前記生産段階ｂ）は、７０および２００時間の間、好ましくは１００および１５０時間の間の継続時間に渡って行われる。
【００５６】
好ましくは、前記生産段階ｂ）は、４および５の間のｐＨおよび２５から２７℃の温度において操作される。
【００５７】
前処理ステップの終わりに、前処理された搾汁残渣は、本発明に従う酵素カクテルの生産段階ｂ）に、誘導物質性炭素質基質として、直接的にか否かに関わらず、用いられる。
【００５８】
生産段階ｂ）は、連続モードでは培地のリットルあたりかつ時間あたり０．３および０．８グラムの間の乾燥物重量（好ましくは０．４から０．６ｇ／Ｌ／ｈ、最も多くの場合には０．５ｇ／Ｌ／ｈ）の速度における搾汁残渣の連続的添加によって、または流加モードではｆ時間毎の搾汁残渣の逐次的な添加によって、どちらでも行われ、ｆは０．５時間および４８時間の間であり、添加される搾汁残渣の量は培地のリットルあたり０．３ｆおよび０．８ｆグラムの間の乾燥物重量である。
【００５９】
これは、例えば添加が１２ｈ毎になされる場合には、添加される搾汁残渣の量は培地のリットルあたり３．６（すなわち０．３×１２）および９．６（すなわち０．８×１２）ｇの間の乾燥物重量、好ましくは培地のリットルあたり４．８および８．４ｇの間の乾燥物重量であろうということを意味する。
【００６０】
流加の実施の好ましいモードに従うと、前処理された搾汁残渣の添加は、放出ガス中のＣＯ２ｍｏｌ．％のシグナルと培地のｐＨ測定値とに応じて行われる。ＣＯ２％±０．０２％（０．５ｍｉｎ−１のｖｖｍで）の安定化は、０．０５単位のｐＨ増大または少なくとも５％のｐＯ２の増大と対を成しており、搾汁残渣の逐次的な添加の引き金となる。
【００６１】
事実、添加の次には、放出ガス中の％ＣＯ２の増大があり、これは、前処理された搾汁残渣中に存在する可溶性糖（本質的にキシロースおよびグルコース）の消費に対応する。それから、酵素はセルラーゼの生産を誘導するであろうセルロースを攻撃し、％ＣＯ２は減少する。
【００６２】
添加は、放出ガス中の％ＣＯ２の減少および０．０５単位超のｐＨ増大が観察されたときに行われる。
【００６３】
ｐＯ２シグナル（飽和における溶存酸素の濃度）は一般的に高く（大気圧における液体培地中の酸素飽和濃度の３０％よりも上に）維持される。
【００６４】
プロセスを行うときには、有利には、培地の見かけ粘度が１０ｓ−１のせん断速度において１０Ｐａ．ｓよりも下、好ましくは１Ｐａ．ｓよりも下のままであるということが保証されるであろう。
【００６５】
事実、粘度は酸素の移動に悪影響する。そこで、散逸仕事率および／または通気速度を大いに増大させて移動を保証することが必要であり、これは大いにエネルギー支出を増大させ、プロセスを工業スケールまでスケールアップすることを困難にし得る。
【００６６】
本発明に従うプロセスに用いられ得る前処理された搾汁残渣は次の特徴を有する：
−  １５％の乾燥物重量（ＤＭ）になされた前記搾汁残渣のサンプルによって、ＤＭのグラムあたり１０ｍｇのＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＣＴＥＣ２酵素（ノボザイムズによって市販されている）によって５０℃およびｐＨ４．８で行われる酵素的加水分解試験においては、９６時間後に、加水分解収率は８０％を超える。加水分解収率は、前処理からもたらされる全てのセルロース、ヘミセルロース、およびオリゴマーが加水分解された場合に得られるであろう理論上の最大質量によって除算された、酵素的加水分解によって遊離した単純な糖（例えばグルコース、キシロース）の質量の比率であり、
−  粘度試験においては、１０％ＤＭを有する懸濁液中において、前処理された搾汁残渣は１０ｓ−１のせん断速度では１Ｐａ．ｓ未満、好ましくは０．１５Ｐａ．ｓ未満の見かけ粘度を有する。測定は、ＴＡインスツルメントからのＡＲ２０００レオメーターによって、螺旋帯型の幾何学によって、記事"Experimental guidelines to optimize two crucial steps of lignocellulosic bioethanol production: a rheological approach" by Henault et al. 2014に記載されているように行われる。
【００６７】
前処理された搾汁残渣のソースとしてのバイオマスの種類は、酵素の生産に影響を及ぼし、リグノセルロース系バイオマスを処理するための生化学的プロセスの酵素的加水分解成績にもまた影響を及ぼす。実施例はススキがわらよりも反応性であるということを示しており、それでも後者は本発明に従うプロセスにおいて高いレベルの成績を生ずる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例1による、酸性条件下での前処理されたリグノセルロース系バイオマスによる回分モードにおける蛋白質濃度の経過を示すグラフである。
【図２】実施例2による、搾汁残渣によって行われた種々の実験の蛋白質濃度の経過を示すグラフである。
【図３】流加モードにおける挙動を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６９】
実施例では、実施のモードと用いられる搾汁残渣の型とがプロセスの成績に影響を及ぼすということを実証する。
実施例１：回分モードによる前処理された搾汁残渣の使用：全ての搾汁残渣は実験の始めに添加する。
【００７０】
菌類の前培養を機械撹拌発酵器によって行う。ミネラル培地は次の組成を有する：ＫＯＨ；１．６６ｇ／Ｌ、８５％のＨ３ＰＯ４；２ｍＬ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４；２．８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２；０．６ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４；３．２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；２．８ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２；４．０ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１０ｍｇ／Ｌ、コーンスティープ；１．２ｇ／Ｌ、消泡剤；０．５ｍＬ／Ｌ、およびｐＨを緩衝するための５ｇ／Ｌの濃度でのフタル酸カリウムの添加。
【００７１】
ミネラル培地を含有する発酵器を１２０℃で２０分間滅菌する。
【００７２】
発酵器にTrichoderma reeseiのＣＬ８４７の株を植菌する。
【００７３】
前培養における菌類の増殖は、炭素基質としてグルコースを３０ｇＬ−１の濃度で用いて行う。植菌物の増殖は２〜３日間続き、インキュベーターシェーカー内で２８℃において行われる。
【００７４】
残留グルコース濃度が１５ｇ／Ｌ未満であるときに、セルラーゼ生産発酵器への移動を行う。
【００７５】
４つの実験を行って、酸条件下における蒸煮爆砕によって前処理されたススキを用いて酵素を生産した：
−  ２つの実験を１０％ＤＭで行った
−  ２つの実験を２０％ＤＭで行った
セルラーゼの生産を機械振盪発酵器内で行う。ミネラル培地は次の組成を有する：ＫＯＨ；１．６６ｇ／Ｌ、８５％のＨ３ＰＯ４；２ｍＬ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４；２．８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２；０．６ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４；３．２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；２．８ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２；４．０ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１０ｍｇ／Ｌ、コーンスティープ；１．２ｇ／Ｌ、消泡剤；０．５ｍＬ／Ｌ。
【００７６】
ミネラル培地を含有する発酵器を１２０℃で２０分間滅菌する。
【００７７】
発酵器にTrichoderma reeseiのＣＬ８４７の株の液体前培養物を１０％（ｖ／ｖ）の濃度で植菌する。ｐＨを５．５に調節する。
【００７８】
２０％ＤＭで行った実験は不首尾であった：セルラーゼの生産はなかった。培地はあまりに粘性であり、および／またはあまりに多くの阻害物質を含有していた。
【００７９】
１０％ＤＭで行った実験は、１５０時間後に１５ｇ／Ｌの蛋白質を生産すること、すなわち０．１ｇ／Ｌ／ｈの生産力を可能にした。
【００８０】
酸性条件下での前処理されたリグノセルロース系バイオマスによる回分モードにおける蛋白質濃度の経過を図１に例示する。
実施例２：流加モードによる実験
５つの実験を行った（実験１から５）。
【００８１】
菌類Trichoderma reeseiのＣＬ８４７の前培養を、実施例１のように、ただし１５ｇ／Ｌのグルコースを唯一の炭素基質として行う。セルラーゼ生産は、前処理された搾汁残渣を流加モードで添加することによって、つまり、
−  １２時間毎に培地のリットルあたり６ｇの搾汁残渣乾燥物重量（実験３、実験４、実験５）、
−  または同じ頻度によるリットルあたり１２ｇの乾燥物重量（実験１および実験２）
を添加することによって、２４時間後に始まる。
【００８２】
５つの実験は、酸性条件下における蒸煮爆砕によって前処理されそのまま得られた３つの異なるリグノセルロース系基質を用いて行った（液体分離なし）：
−  ススキ１は加水分解試験および粘度試験に合致する（１０ｓ−１における見かけ粘度は０．０９Ｐａ．ｓに等しい）（実験１および実験５）
−  ススキ２は加水分解試験試験に合致しない（収率＜７０％）（実験２および実験３）
−  麦わら１は加水分解試験および粘度試験に合致する（１０ｓ−１における見かけ粘度は１．１Ｐａ．ｓに等しい）（実験４）
加水分解試験および粘度試験は上に記載されているものである。
【００８３】
図１は、前記搾汁残渣によって行われた種々の実験の蛋白質濃度の経過を示している：
実験１：  搾汁残渣ススキ１  −  最適手順に２倍優る量の搾汁残渣による手順
実験２：  搾汁残渣ススキ２  −  最適手順に２倍優る量の搾汁残渣による手順
実験３：  搾汁残渣ススキ２  −  いわゆる最適手順
実験４：  搾汁残渣麦わら１  −  いわゆる最適手順
実験５：  搾汁残渣ススキ１  −  いわゆる最適手順
実験３、４、または５に用いたセルラーゼの生産のためのいわゆる最適手順プロトコールは次の通りである：
１５ｇ／Ｌのグルコースによる回分モードでの２４時間の増殖段階後に、ススキ搾汁残渣の添加が、約１２時間毎に培地のリットルあたり６ｇの乾燥物重量の添加によってなされた。１２０ｈ後に、添加の頻度をＣＯ２シグナルに応じて調節した。
【００８４】
事実、添加の次には、放出ガス中の％ＣＯ２の増大が認められ（図３）、これは前処理された搾汁残渣中に存在する可溶性糖（主にキシロースおよびグルコース）の消費に対応する。それから、酵素はセルラーゼの生産を誘導するであろうセルロースを攻撃し（図２）、％ＣＯ２が減少する。
【００８５】
添加は、放出ガス中の％ＣＯ２の減少および０．０５単位超のｐＨ増大が観察されたときに行う。
【００８６】
ｐＯ２シグナル（飽和における溶存酸素の濃度）は、低い散逸仕事率（１ｋＷ／ｍ３未満）によって実験の間は高く（３０％よりも上に）維持される。
【００８７】
図１では、ｐＨが上昇し、ＣＯ２が落ちることを止めたときに、添加あたり、リットルあたり６ｇの乾燥物重量の速度で搾汁残渣が添加されている。矢印は搾汁残渣が添加される時間に対応する。
【００８８】
結果は図２にプロットされており、プロセスの成績について、手順モードと用いられる搾汁残渣の型との両方の重要性を示している。
【００８９】
事実、最適プロセス（図２の実験５）は、３５ｇ／Ｌというセルラーゼの終濃度が２１０ｈで達成されること、すなわち０．１７ｇ／Ｌ／ｈの生産力を可能にする。
【００９０】
ゆえに、これは実施例１に示されている回分モードで得られるものよりも７０％良好である。
【００９１】
同じ流加速度（最適手順）による、ただし前処理されたわら１（試験に合致する）（実験４）またはススキ２（試験に合致しない）（実験３）を用いる他の実験は、実験５のものよりもそれぞれ３２％および２５％低い生産力をもたらした。
【００９２】
最適速度の２倍である流加速度による実験は、試験に合致する前処理されたススキ１によって（実験１）または試験に合致しない前処理されたススキ２によって（実験２）どちらでも不良な生産成績をもたらした。
【００９３】
これらの実験では、ｐＯ２が１０％よりも下に落ちるということが見出された。用いられた前処理されたわらは、ススキのものを約１２倍超える懸濁液中における材料の見かけ粘度を有し、これはｐＯ２の減少を説明し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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