(57)【要約】  本発明は、生理活性核酸を細胞内に導入できる新しい構造の核酸複合体、それを含む疾病の治療および診断用組成物、並びにそれを用いた標的遺伝子の発現調節方法に関し、より詳細には、生理活性核酸と、全体的に陽電荷を有するように改変されたキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とが相補的に結合された核酸複合体、それを含む疾病の治療および診断用組成物、並びにそれを用いた標的遺伝子の発現調節方法に関する。
2019526624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）の構造を有する核酸複合体:
［構造式（１）］
［Ａ≡Ｃ（＋）］
前記構造式（１）中、
Ａは、標的とする遺伝子と結合可能な配列、または標的とする遺伝子配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生理活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
「≡」は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との相補的な結合を意味し、
Ａで表される生理活性核酸は、全体的に陰電荷または中性を有し、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を有することを意味し
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を帯びるように改変されたペプチド核酸単量体を１つ以上含む。
【請求項２】
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、各々２個〜５０個の核酸単量体を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項３】
前記生理活性核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡおよび改変されたペプチド核酸で構成された群から選択された核酸単量体からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項４】
全体的に陽電荷を有すること特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項５】
前記キャリアペプチド核酸は、前記生理活性核酸と一部もしくは全部が相補的な配列で構成されることを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項６】
前記一部が相補的な配列で構成されるキャリアペプチド核酸は、１つ以上のユニバーサル塩基を含むことを特徴とする請求項５に記載の核酸複合体。
【請求項７】
前記キャリアペプチド核酸は、全体的に陽電荷を有するように１個以上のガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項８】
前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、電気的陽性を有するようにリジン（Ｌｙｓｉｎｅ，  Ｌｙｓ，  Ｋ），  アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，  Ａｒｇ，  Ｒ），  ヒスチジン  （Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，  Ｈｉｓ，  Ｈ），  ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ，  ＤＡＢ），  オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ，  Ｏｒｎ）およびアミノ酸類似体で構成された群から選択される１つ以上の陽電荷を有するアミノ酸をバックボーンに含むことを特徴とする請求項７に記載の核酸複合体。
【請求項９】
前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、陰電荷を有するアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ，Ｇｌｕ，Ｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ，Ａｓｐ，Ｄ）またはアミノ酸類似体をバックボーンに含むことを特徴とする請求項８に記載の核酸複合体。
【請求項１０】
前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、陽電荷のアミノ酸を有する単量体が、陰電荷のアミノ酸を有する単量体に比べてより多く含まれ、全体的にキャリアペプチド核酸の電荷が陽性となることを特徴とする請求項８に記載の核酸複合体。
【請求項１１】
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の結合は、それぞれの５´−方向性と３´−方向性に基づいて、平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）または逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）の結合であることを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項１２】
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）は、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項１３】
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）または部分的特異的結合（Ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）により互いに結合することによって、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）が、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする請求項１２に記載の核酸複合体。
【請求項１４】
前記キャリアペプチド核酸は、リンカー、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）、および生理活性核酸の対応する塩基と相補的ではないペプチド核酸塩基から選択される１つ以上のペプチド核酸塩基を有することにより、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）が、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする請求項１２に記載の核酸複合体。
【請求項１５】
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力を調節することで、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の分離時点および生理活性核酸と生理活性核酸の標的遺伝子との結合時点が調節されることを特徴とする請求項１２に記載の核酸複合体。
【請求項１６】
前記ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）およびウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）などの天然塩基、並びに、イノシンＰＮＡ（ｉｎｏｓｉｎｅ  ＰＮＡ）、インドールＰＮＡ（ｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、ニトロインドールＰＮＡ（ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、および無塩基（ａｂａｓｉｃ）といった、選択性なしに結合し、相補的な結合力より低い結合力を有する塩基からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１４に記載の核酸複合体。
【請求項１７】
疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光剤、蛍光マーカーおよび発光マーカーからなる群から選択される１つ以上の物質が、生理活性核酸および／またはキャリアペプチド核酸に結合されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項１８】
前記疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光剤、蛍光マーカーおよび発光マーカーからなる群から選択される１つ以上の物質と、生理活性核酸および／またはキャリアペプチド核酸との結合は、単純共有結合またはリンカー媒介性の共有結合であることを特徴とする請求項１７に記載の核酸複合体。
【請求項１９】
前記核酸複合体は、５ｎｍ〜３００ｎｍの粒子サイズを有することを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項２０】
前記核酸複合体の粒子サイズは、核酸複合体の電荷平衡を調節することで調節されることを特徴とする請求項１９に記載の核酸複合体。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む、標的遺伝子の発現調節用組成物。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む疾病の予防または治療用組成物。
【請求項２３】
前記疾病は、癌、炎症性疾患、老人性黄斑変性、希少疾患および重症疾患、心血管疾患、代謝性疾患または皮膚疾患であることを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＶＥＧＦ、アンドロゲンレセプター（Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＫＲＡＳ、クラスタリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）、ＴＧＦβＲ２、ＥＲＢＢ３、トランスグルタミナーゼ  ２（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ２）、ＡＢＣＢ１、Ｈｓｐ２７、ＳＴＡＴ３およびＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＶＥＧＦであることを特徴とする請求項２３に記載組成物。
【請求項２６】
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＩＦＩ１６、ＴＬＲ６およびＴＩＥＧ１からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記皮膚疾患は、乾癬、色素沈着関連皮膚疾患、およびアトピー疾患から選択されることを特徴とする請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
水性溶液、クリーム、ゲル、ペースト、ローションおよび軟膏から選択されるいずれか一つの剤型を有することを特徴とする請求項２７に記載の治療用組成物。
【請求項２９】
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＰＤＥ４ＢおよびＰｅｌｌｉｎｏ−１からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＳＭＮ２、ＡｐｏＢ−１００、ＩＣＡＭ−１、ＡｐｏＣＩＩＩ、ＴＴＲ、ＨＴＴ、ＧＨｒ、ＳＯＤ１、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＫＫ、ｍｉＲ−２１、ＴＭＰＲＳＳ６、ＦＭＲ１およびＣｏｎｎｅｘｉｎ  ２６からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項２３に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の核酸複合体を含む疾病の診断用組成物。
【請求項３２】
請求項１〜２０のいずれかに記載の核酸複合体を用いることを含む、標的遺伝子の発現調節方法。
【請求項３３】
構造式（１）の核酸複合体の電荷平衡を調節することを含む、前記核酸複合体の粒子サイズ調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性核酸を細胞内に導入できる新しい構造の核酸複合体、それを含む疾病の治療および診断用組成物、並びにそれを用いた標的遺伝子の発現調節方法に関し、より詳細には、生理活性核酸と、全体的に陽電荷を有するように改変されたキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とが相補的に結合された核酸複合体、それを含む疾病の治療および診断用組成物、およびそれを用いた標的遺伝子の発現調節方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的に、新しい薬剤を探索するに際し、コンピュータ研究による種々の化合物をスクリーニングすることを基本とし、スクリーニングされた化合物の大多数はタンパク質を標的とする。
【０００３】
伝統的な薬剤と異なって、核酸薬剤は標的特異的伝令ＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）の発現を抑制するため、タンパク質を標的とする既存の薬剤では治療が不可能であった研究領域を扱うことが可能となった（Ｋｏｌｅ  Ｒ．など、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１２；１１；１２５−１４０．，Ｗｉｌｓｏｎ  Ｃ．など、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏ．２００６；１０：６０７−６１４．）。
【０００４】
オリゴ核酸（Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）に基づく遺伝子発現調節の高い効果および多様な用途にもかかわらず、核酸に基づく治療剤を開発するためには、克服すべき妨害物が多数存在する。例えば、オリゴ核酸は核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）などによる損傷の危険性を有し、オリゴ核酸の電気的性質（電荷）とサイズにより、受動拡散（ｐａｓｓｉｖｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）による細胞膜透過が不可能であるという点などがある。上記の問題を解消するために、核酸を改変することで生物学的安定性を確保しようとする努力が続けられており、改変された人工核酸（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）の場合、生物学的な活性が損失することなく標的核酸との親和性を高めることが可能となっている。
【０００５】
改変された人工核酸の一種であるペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、ＰＮＡ）は、（２−アミノエチル）−グリシンペプチドバックボーン（（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｇｌｙｃｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）が導入された人工核酸であって、相補的な塩基配列を有するＲＮＡおよびＤＮＡに強く結合する性質を有している。特に、前記ペプチド核酸は、核酸分解酵素に対して抵抗性を有し、生物学的安定性が高いため、種々のオリゴ核酸に基づく治療剤に関する研究が行われている。しかしながら、前記ペプチド核酸は、電気的中性を有する特性により、細胞内への導入が困難であるという欠点を有している（Ｊｏｅｒｇｅｎｓｅｎ  Ｍ．  など、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ２０１１，  ２１；  ２９−３７．）。
【０００６】
薬剤としての核酸の性能および利点により、核酸を用いた様々な臨床試験が行われており、核酸ベースの治療剤の用途が増加しているにもかかわらず、細胞内への導入のための運搬体の使用は極めて制限的である。例えば、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、カチオン性リポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、およびポリマーナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を用いるオリゴ核酸に基づく薬剤の細胞または組織内への運搬戦略（方法）を使用した臨床試験が行われているが、殆どの場合、運搬システムを含まず、非経口的な方法である筋肉注射、眼球（ｏｃｕｌａｒ）投与、皮下注射などの投与経路（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｒｏｕｔｅ）により、核酸を直ちに導入することが主となっている。
【０００７】
また、オリゴ核酸自体の細胞膜透過能力は非常に低く、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡは陰電荷を帯びていることから、細胞の疎水性リン脂質二重膜を通過することができないため、単純拡散による細胞内への伝達が困難である。レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）もしくはＡＡＶ（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）などのウイルス運搬体の使用は、オリゴ核酸の細胞内への導入を可能とするが、不意の免疫活性と発癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の組換え可能性などの危険性がある（Ｃｏｕｔｏ  Ｌ．  Ｂ．  など、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０１０，  ５；  ５３４−５４２．）。
【０００８】
このような理由から、細胞毒性が少なく、免疫活性が低い非−ウイルス性オリゴ核酸に基づく核酸運搬体の開発の重要性がさらに大きくなっており、その結果として、カチオン性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、安定した核酸脂質粒子（ｓｔａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＳＮＡＬＰ）、ポリマー、および細胞−透過ペプチド（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を用いた細胞導入技法が開発されている（Ｚｈｉ  Ｄ．  など、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１３，  ２４；  ４８７−５１９．，  Ｂｕｙｅｎｓ  Ｋ．  など、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１２，  １５８；  ３６２−７０．，  ＲＯＳＳＩ，  Ｊ．  Ｊ．  など、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００６，  １３：  ５８３−５８４．，  Ｙｏｕｓｅｆｉ  Ａ．  など、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１３，  １７０；  ２０９−１８．，  Ｔｒａｂｕｌｏ  Ｓ．  など、Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ．  ２０１３，  １９；  ２８９５−９２３．）。
【０００９】
かかる核酸伝達技法は、機能性残基を直接的な結合により有しており、複合体の形成のためのステップを含み、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）構造のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）効率および生体毒性などの問題を有しているため、オリゴ核酸導入機能の向上と、製造プロセスおよび副作用に係る問題の解消が必要である。
【００１０】
このような技術的背景下で、本発明者らは、細胞毒性が低く、生理活性核酸の細胞透過性および遺伝子発現調節能力が向上した新しい構造体を開発するために鋭意努力した結果、生理活性核酸と、全体的に陽電荷を有するように改変されたキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とが相補的に結合された核酸複合体が、細胞透過性（ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）が驚くべきに向上し、それを用いて標的遺伝子の発現を非常に効率的に調節することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明で解決しようとする課題は、生理活性核酸と、全体的に陽電荷を有するように改変されたキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とが相補的に結合された核酸複合体、それを含む疾病の治療および診断用組成物、およびそれを用いた標的遺伝子の発現調節方法を提供するころにある。
【００１２】
また、本発明で解決しようとする他の課題は、本発明による核酸複合体および／またはそれを含む薬学的組成物を、治療を要する患者に投与することを含む疾病の治療方法を提供するころにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、下記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を提供する:
【００１４】
［構造式（１）］
［Ａ≡Ｃ（＋）］
【００１５】
前記構造式（１）中、
Ａは、標的とする遺伝子と結合可能な配列、または標的とする遺伝子配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生理活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
「≡」は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との相補的な結合を意味し、
Ａで表される生理活性核酸は、全体的に陰電荷または中性を有し、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を有することを意味し
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を帯びるように改変されたペプチド核酸単量体を１つ以上含む。
【００１６】
前記構造式（１）の核酸複合体の粒子サイズは、生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸の電荷平衡（ｃｈａｒｇｅ  ｂａｌａｎｃｅ）を適宜調節することで調節可能である。
【００１７】
具体的には、キャリアペプチド核酸の陽電荷が増加すると核酸複合体の粒子サイズが小さくなるが、キャリアペプチド核酸の陽電荷が所定程度以上となると、核酸複合体の粒子サイズが大きくなる特徴を有する。また、粒子サイズを決定する他の重要な要素として、複合体を成す生理活性ペプチド核酸の電荷による全体的な生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸との適切な電荷平衡によって、核酸複合体の粒子サイズが決定される。
【００１８】
本発明によるキャリアペプチド核酸の陽電荷は１個〜７個（陽電荷を有する単量体が２個〜５個含まれることを意味する）であり、好ましくは２個〜５個、最も好ましくは２個〜３個であり、電荷平衡のための生理活性核酸の正味の電荷（ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅ）は、０個〜５個、好ましくは０個〜３個である。
【００１９】
本発明による核酸複合体は、５ｎｍ〜３００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜８０ｎｍ、最も好ましくは１５ｎｍ〜７０ｎｍの粒子サイズを有する。
【００２０】
これにより、本発明は、前記構造式（１）の核酸複合体の電荷平衡を調節することを含む、核酸複合体の粒子サイズ調節方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、前記構造式（１）の核酸複合体を含む疾病の予防および治療用組成物、疾病の診断用組成物、および標的とする遺伝子の発現調節用組成物を提供する。
【００２２】
本発明は、また、前記構造式（１）の核酸複合体を含む疾病の診断用キットを提供する。
【００２３】
本発明は、また、（ａ）生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とキャリアペプチド核酸を結合させて複合体を形成するステップと、（ｂ）前記複合体を細胞、細菌、カビ、寄生虫などに接触させて細胞内に導入させるステップと、を含む、前記複合体を用いた標的遺伝子発現の調節方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、本発明による核酸複合体および／またはそれを含む薬学的組成物を、治療を要する患者に投与することを含む、疾病の治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】１本鎖からなる生理活性核酸と、構造式（１）の核酸複合体において、生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸が平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）により構成された核酸複合体の粒子サイズを比較して示した図である。  （Ａ）生理活性核酸の単独  （Ｂ）生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が平行結合により結合された核酸複合体
【図２ａ】構造式（１）の核酸複合体の生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸が有する電気的性質による、複合体粒子の形態およびサイズの変化をＳＥＭ写真により観察した結果を示した図である。
【図２ｂ】構造式（１）の核酸複合体の生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸が有する電気的性質による、複合体粒子の形態およびサイズの変化をＳＥＭ写真により観察した結果を示した図である。  （Ａ）ＰＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ１（生理活性ペプチド核酸（配列番号６）とキャリアペプチド核酸（配列番号３２）の複合体）  （Ｂ）ＰＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ２（生理活性ペプチド核酸（配列番号５）とキャリアペプチド核酸（配列番号３２）の複合体）  （Ｃ）ＰＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ３（生理活性ペプチド核酸（配列番号１）とキャリアペプチド核酸（配列番号３７）の複合体）  （Ｄ）ＰＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ４（生理活性ペプチド核酸（配列番号１）とキャリアペプチド核酸（配列番号２３）の複合体）
【図３ａ】生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸の結合および電気的性質による、本発明による核酸複合体の細胞透過率を分析するための共焦点顕微鏡で撮影された写真を示した図である。
【図３ｂ】生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸の結合および電気的性質による、本発明による核酸複合体の細胞透過率を分析するための共焦点顕微鏡で撮影された写真を示した図である。
【図３ｃ】生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸の結合および電気的性質による、本発明による核酸複合体の細胞透過率を分析するための共焦点顕微鏡で撮影された写真を示した図である。    （ａ）電荷を有さない生理活性ペプチド核酸（配列番号１３）とキャリアペプチド核酸（配列番号３８）からなる複合体を使用した場合    （ｂ）電荷を有する生理活性ペプチド核酸（配列番号１３）とキャリアペプチド核酸（配列番号４０）からなる複合体を使用した場合    （ｃ）種々の電荷を有する生理活性ペプチド核酸と陽電荷３個を使用したキャリアペプチド核酸（配列番号４０）からなる複合体を使用した場合        （１）生理活性ペプチド核酸（配列番号１５）とキャリアペプチド核酸（配列番号４０）からなる複合体を使用した場合        （２）生理活性ペプチド核酸（配列番号１６）とキャリアペプチド核酸（配列番号４０）からなる複合体を使用した場合        （３）生理活性ペプチド核酸（配列番号１４）とキャリアペプチド核酸（配列番号４０）からなる複合体を使用した場合        （４）生理活性ペプチド核酸（配列番号１７）とキャリアペプチド核酸（配列番号４０）からなる複合体を使用した場合
【図４】構造式（１）の核酸複合体において、キャリアペプチド核酸としてＰＮＡを使用した場合の、時間経過による生理活性ペプチド核酸複合体の細胞内存在有無を確認した図である。
【図５ａ】構造式（１）による生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸からなる複合体の、時間経過による細胞内における複合体の分離有無を確認した結果を示した図である。
【図５ｂ】構造式（１）による生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸からなる複合体の、時間経過による細胞内における複合体の分離有無を確認した結果を示した図である。
【図５ｃ】構造式（１）による生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸からなる複合体の、時間経過による細胞内における複合体の分離有無を確認した結果を示した図である。
【図５ｄ】構造式（１）による生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸からなる複合体の、時間経過による細胞内における複合体の分離有無を確認した結果を示した図である。
【図５ｅ】構造式（１）による生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸からなる複合体の、時間経過による細胞内における複合体の分離有無を確認した結果を示した図である。
【図５ｆ】構造式（１）による生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸からなる複合体の、時間経過による細胞内における複合体の分離有無を確認した結果を示した図である。    （ａ）複合体の対照群    （ｂ）生理活性ペプチド核酸（配列番号１４）とキャリアペプチド核酸（配列番号３９）からなる複合体が、２４ｈ後に細胞内で複合体を成す様子    （ｃ）生理活性ペプチド核酸（配列番号１４）とキャリアペプチド核酸（配列番号３９）からなる複合体の、４８ｈ後の細胞内での複合体の様子であり、キャリアペプチド核酸が複合体を成すか分離される様子    （ｄ）生理活性ペプチド核酸（配列番号１４）とキャリアペプチド核酸（配列番号３９）からなる複合体の７２ｈ後の細胞内での複合体の様子であり、キャリアペプチド核酸と生理活性核酸が分離される様子    （ｅ）生理活性ペプチド核酸（配列番号１４）とキャリアペプチド核酸（配列番号３９）からなる複合体の９６ｈ後の細胞内での複合体の様子であり、キャリアペプチド核酸と生理活性核酸が分離される様子    （ｆ）生理活性ペプチド核酸（配列番号１３）とキャリアペプチド核酸（配列番号３９）からなる複合体の１２０ｈ後の細胞内での複合体の様子であり、キャリアペプチド核酸と生理活性核酸が分離された後、細胞内に残っている生理活性核酸の様子
【図６ａ】ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉＲＮＡを単独で使用した場合の、細胞内への透過効率を共焦点燎微鏡で確認した結果を示した図である。
【図６ｂ】構造式（１）の核酸複合体において、ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉＲＮＡとキャリアペプチド核酸（配列番号３９）としてＰＮＡを使用した場合の、細胞内への透過効率を共焦点燎微鏡で確認した結果を示した図である。
【図６ｃ】構造式（１）の核酸複合体において、ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉＲＮＡとキャリアペプチド核酸（配列番号３９）としてＰＮＡを使用した場合の、細胞内への透過効率を共焦点燎微鏡で確認した結果を示した図である。
【図６ｄ】構造式（１）の核酸複合体において、ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉＲＮＡとキャリアペプチド核酸（配列番号３９）としてＰＮＡを使用した場合の、細胞内への透過効率を共焦点燎微鏡で確認した結果を示した図である。
【図６ｅ】構造式（１）の核酸複合体において、ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉＲＮＡとキャリアペプチド核酸（配列番号３９）としてＰＮＡを使用した場合の、細胞内への透過効率を共焦点燎微鏡で確認した結果を示した図である。
【図６ｆ】構造式（１）の核酸複合体において、ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉＲＮＡとキャリアペプチド核酸（配列番号３９）としてＰＮＡを使用した場合の、細胞内への透過効率を共焦点燎微鏡で確認した結果を示した図である。
【図６ｇ】構造式（１）の核酸複合体において、ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉＲＮＡとキャリアペプチド核酸（配列番号３９）としてＰＮＡを使用した場合の、細胞内への透過効率を共焦点燎微鏡で確認した結果を示した図である。    （ａ）ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉＲＮＡを使用した場合    （ｂ）〜（ｇ）ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉＲＮＡとキャリアペプチド核酸（配列番号３９）からなる複合体を使用した場合
【図７】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、種々の癌細胞株でサバイビンおよび下位経路タンパク質の発現が抑制されることを確認した図である。  （Ａ）ＨｅＬａ細胞株を使用した実験結果  （Ｂ）ＳＷ４８０細胞株を使用した実験結果  （Ｃ）ＳＫ−ＢＲ−３細胞株を使用した実験結果
【図８ａ】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、種々の癌細胞株でサバイビンおよび下位経路タンパク質の発現が抑制されることを確認した図である。
【図８ｂ】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、種々の癌細胞株でサバイビンおよび下位経路タンパク質の発現が抑制されることを確認した図である。
【図８ｃ】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、種々の癌細胞株でサバイビンおよび下位経路タンパク質の発現が抑制されることを確認した図である。
【図８ｄ】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、種々の癌細胞株でサバイビンおよび下位経路タンパク質の発現が抑制されることを確認した図である。
【図８ｅ】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、種々の癌細胞株でサバイビンおよび下位経路タンパク質の発現が抑制されることを確認した図である。  （ａ）ＳＷ４８０細胞株を使用した電荷を有さない生理活性ペプチド核酸（配列番号１）と様々な電荷を有するペプチド核酸を用いた複合体を使用した実験結果。  （ｂ）ＳＷ４８０細胞株を使用した生理活性ペプチド核酸（配列番号２）と様々な電荷を有するペプチド核酸を含む複合体を使用した実験結果。  （ｃ）ＳＷ４８０細胞株を使用した生理活性ペプチド核酸（配列番号６）と様々な電荷を有するペプチド核酸を含む複合体を使用した実験結果  （ｄ）ＳＷ４８０細胞株を使用した生理活性ペプチド核酸（配列番号１２）と様々な電荷を有するペプチド核酸を含む複合体を使用した実験結果  （ｅ）ＳＫ−ＢＲ−３細胞株を使用した生理活性ペプチド核酸（配列番号１２）と様々な電荷を有するペプチド核酸を含む複合体を使用した実験結果
【図９ａ】構造式（１）の核酸複合体での生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸の長さによる細胞生存率の変化を示した図である。
【図９ｂ】構造式（１）の核酸複合体での生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸の長さによる細胞生存率の変化を示した図である。  （ａ）キャリアペプチド核酸の長さの変化による細胞生存率の変化  （ｂ）生理活性ペプチド核酸の長さ変化による細胞生存率の変化
【図１０ａ】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト大膓癌細胞株の細胞生存率の変化およびサバイビンとその下位経路タンパク質の発現が抑制されることを確認した図である。
【図１０ｂ】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト大膓癌細胞株の細胞生存率の変化およびサバイビンとその下位経路タンパク質の発現が抑制されることを確認した図である。  （ａ）細胞生存率の変化  （ｂ）サバイビンおよび下位経路タンパク質の発現変化
【図１１ａ】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト大膓癌細胞株が移植されたマウスでの腫瘍成長抑制効能を立証した結果を示した図である。
【図１１ｂ】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト大膓癌細胞株が移植されたマウスでの腫瘍成長抑制効能を立証した結果を示した図である。
【図１１ｃ】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト大膓癌細胞株が移植されたマウスでの腫瘍成長抑制効能を立証した結果を示した図である。
【図１１ｄ】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト大膓癌細胞株が移植されたマウスでの腫瘍成長抑制効能を立証した結果を示した図である。
【図１１ｅ】サバイビン特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト大膓癌細胞株が移植されたマウスでの腫瘍成長抑制効能を立証した結果を示した図である。  （ａ）マウスの体重変化  （ｂ）腫瘍体積の変化  （ｃ）腫瘍重量の変化  （ｄ）腫瘍外観の変化  （ｅ）肝毒性指標の変化
【図１２ａ】ＶＥＧＦ特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト乳癌細胞株と肺癌細胞株の細胞生存率の変化を確認した図である。
【図１２ｂ】ＶＥＧＦ特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト乳癌細胞株と肺癌細胞株のＶＥＧＦとその下位経路タンパク質の発現抑制を確認した図である。
【図１２ｃ】ＶＥＧＦ特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト乳癌細胞株と肺癌細胞株の細胞死滅誘導を確認した図である。  を示す。  （ａ）細胞生存率の変化  （ｂ）ＶＥＧＦおよび下位経路タンパク質の発現変化  （ｃ）ＶＥＧＦの抑制による細胞死滅誘導分析
【図１３】ＶＥＧＦ特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ゼブラフィッシュをモデルとして用いた坑癌薬理効果の評価結果を示した図である。
【図１４ａ】ＶＥＧＦ特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト由来の網膜色素上皮細胞での細胞生存率の抑制を確認した結果を示した図である。
【図１４ｂ】ＶＥＧＦ特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト由来の網膜色素上皮細胞でのＶＥＧＦとその下位経路タンパク質の発現抑制効能を確認した結果を示した図である。  （ａ）細胞生存率の変化  （ｂ）ＶＥＧＦおよび下位経路タンパク質の発現変化
【図１５ａ】ＩＦＩ１６特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト来由の表皮角化細胞株での細胞生存率の抑制を確認した結果を示した図である。
【図１５ｂ】ＩＦＩ１６特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト来由の表皮角化細胞株でのＩＦＩ１６とその下位経路タンパク質の抑制効能を確認した結果を示した図である。  （ａ）細胞生存率の変化  （ｂ）ＩＦＩ１６および下位経路タンパク質の発現変化
【図１６ａ】ＩＦＩ１６特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、乾癬が誘導されたマウスモデルでの効能を確認した結果を示した図である。
【図１６ｂ】ＩＦＩ１６特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、乾癬が誘導されたマウスモデルでの効能を確認した結果を示した図である。
【図１６ｃ】ＩＦＩ１６特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、乾癬が誘導されたマウスモデルでの効能を確認した結果を示した図である。  （ａ）耳の厚さ変化を示す写真および厚さ測定結果  （ｂ）ＩＦＩ１６およびその下位タンパク質の発現変化  （ｃ）バイオプシーによる、耳組織での表皮角化細胞の変化
【図１７】ＰＤ−Ｌ１特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、ヒト由来の乳癌細胞株でのＰＤ−Ｌ１とその下位経路タンパク質の抑制効能を確認した結果を示した図である。
【図１８】ａｃｐＰ特異的生理活性ペプチド核酸を含む構造式（１）の核酸複合体を用いて、細菌の増殖を抑制した実験結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００２７】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００２８】
本発明は、下記構造式（１）の構造を有する核酸複合体に関する：
【００２９】
［構造式（１）］
［Ａ≡Ｃ（＋）］
【００３０】
前記構造式（１）中、
Ａは、標的とする遺伝子と結合可能な配列、または標的とする遺伝子配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生理活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
「≡」は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との相補的な結合を意味し、
Ａで表される生理活性核酸は、全体的に陰電荷または中性を有し、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を有することを意味し
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を帯びるように改変されたペプチド核酸単量体を１つ以上含む。
【００３１】
本発明において、「生理活性核酸」は、発現を減少させようとする標的の標的遺伝子と結合可能な相補的な配列、特に、その標的遺伝子のｍＲＮＡに結合可能な相補的な配列を有するか、発現させようとする標的遺伝子の発現を促進する配列を含む核酸であって、該遺伝子の発現を抑制または促進するなどの遺伝子発現調節に関与する核酸を意味し、発現を減少または増加させようとする標的遺伝子に相補的な配列を有する核酸であるか、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの１本鎖ＲＮＡ配列に相補的な配列の核酸であってもよい
【００３２】
特に、本発明における「生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）」は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で標的遺伝子、およびそれを含む塩基配列と結合し、該遺伝子の固有機能（例えば、転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の発現またはタンパク質の発現）を活性化または阻害し、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を調節（例えば、エキソンスキッピング（ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ））するなどの機能を果たし、前記塩基配列は、遺伝子調節部位（ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または遺伝子部位（ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはスプライシング調節部位（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であることを特徴とする。前記遺伝子調節部位は、プロモーター、転写エンハンサー、５´非翻訳領域、３´非翻訳領域、ウイルスパッケージング配列、および選択マーカーから選択されることを特徴とする。前記遺伝子部位はエキソンまたはイントロンであってもよく、前記遺伝子部位は、遺伝子の転写開始部位の１０、５、３、または１ｋｂもしくは５００、３００、または２００ｂｐ内に、例えば、開始部位の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）または下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にあってもよい。また、前記スプライシング調節部位は、ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ、ｃｒｙｐｔｉｃ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ、ｐｓｅｕｄｏ−ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ｉｎｔｒｏｎ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ、ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ関連配列を含んでもよい。
【００３３】
本発明において、「キャリアペプチド核酸」は、生理活性核酸と一部もしくは全部の塩基が相補的に結合して機能性を付与する核酸を意味し、本発明で用いられるキャリアペプチド核酸としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）だけでなく、これと類似の改変された核酸を用いてもよく、ペプチド核酸が好ましいが、これに限定される意味ではない。
【００３４】
本発明において、前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、それぞれ２個〜５０個、好ましくは５個〜３０個、さらに好ましくは１０個〜２５個、最も好ましくは１５個〜１７個の核酸単量体を含んでもよい。
【００３５】
また、前記生理活性核酸は、天然（ｎａｔｕｒａｌ）の核酸塩基および／または改変された核酸単量体からなっていることを特徴とし、前記キャリアペプチド核酸は、前記生理活性核酸と一部もしくは全部が相補的な塩基配列を有することを特徴とする。
【００３６】
特に、キャリアペプチド核酸は、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）を１つ以上含んでもよく、キャリアペプチド核酸の全てがユニバーサル塩基からなってもよい。
【００３７】
本発明において、前記生理活性核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび改変された核酸であるＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＭＯ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ），  ＧＮＡ（ｇｌｙｃｏｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）およびＴＮＡ（ｔｈｒｅｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ），ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）およびＤＮＡｚｙｍで構成された群から選択されてもよく、好ましくは、前記生理活性核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび改変された核酸であるＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＭＯ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＧＮＡ（ｇｌｙｃｏｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）およびＴＮＡ（ｔｈｒｅｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）で構成された群から選択されてもよい。
【００３８】
本発明において、生理活性核酸に用いられた単量体がＰＮＡである場合、前記生理活性核酸は生理活性ペプチド核酸と称し、他の単量体が用いられた場合にも前記生理活性核酸は同様の方式と称する。
【００３９】
本発明において、前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、ホスホジエステル  （ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）、２’０−  メチル  （２’０−ｍｅｔｈｙｌ）、２’  メトキシ−エチル（２’  ｍｅｔｈｏｘｙ−ｅｔｈｙｌ）、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メチルホスホネート  （ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）およびホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で構成された群から選択される１つ以上の官能基をさらに含んでもよい。
【００４０】
本発明において、前記生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸のそれぞれは、電気的特性が全体的に、陽電荷（陽性）、陰電荷（陰性）、または中性電荷を有することを特徴とする複合体であってもよい。
【００４１】
前記電気的特性の表現において、「全体的に」ということは、個別塩基の電気的特性ではなく、全体的な生理活性核酸またはキャリアペプチド核酸のそれぞれの電荷の、外部から見た時の全体的な電気的特性を意味する。
【００４２】
例えば、生理活性核酸内の一部の単量体が陽性を有するとしても、陰性を有する単量体の個数がより多く存在する場合には、生理活性核酸は、電気的特性が「全体的に」陰電荷を有する。
【００４３】
キャリアペプチド核酸内の一部の塩基および／またはバックボーンが陰性を有するとしても、陽性を有する塩基および／またはバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）の個数がより多く存在する場合には、キャリアペプチド核酸は、電気的特性が「全体的に」陽電荷を有することになるのである。
【００４４】
このような観点から、本発明の構造式（１）の核酸複合体において、前記生理活性核酸は、電気的特性が全体的に、陰電荷または中性の特性を有することが好ましく、キャリアペプチド核酸は、電気的特性が全体的に、陽電荷特性を有することが好ましい。
【００４５】
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の電気的特性を付与するために、改変されたペプチド核酸単量体を用いることができる。改変されたペプチド核酸単量体は、陽電荷を有するキャリアペプチド核酸としてリジン（Ｌｙｓｉｎｅ，  Ｌｙｓ，  Ｋ），  アルギニン  （Ａｒｇｉｎｉｎｅ，  Ａｒｇ，  Ｒ），  ヒスチジン  （Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，  Ｈｉｓ，  Ｈ），  ジアミノ  酪酸  （Ｄｉａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ，  ＤＡＢ），  オルニチン  （Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ，  Ｏｒｎ）  およびアミノ酸類似体で構成された群から選択される１つ以上の陽電荷のアミノ酸を含み、陰電荷を有するキャリアペプチド核酸として陰電荷のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ，  Ｇｌｕ，  Ｅ）およびアミノ酸類似体で構成された群から選択される１つ以上の陰電荷のアミノ酸を含んでもよい。
【００４６】
好ましくは、前記キャリアペプチド核酸は全体的に陽電荷を有するように、１個以上のガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とする。特に、前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、電気的陽性を有するようにリジン（Ｌｙｓｉｎｅ、Ｌｙｓ、Ｋ），アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ａｒｇ、Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｈｉｓ、Ｈ）、ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ、ＤＡＢ）、オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ、Ｏｒｎ）およびアミノ酸類似体で構成された群から選択される１つ以上の陽電荷を有するアミノ酸をバックボーンに含んでもよい。
【００４７】
電荷を付与するためのペプチド核酸単量体の改変は、前記バックボーン改変の他にも、核酸塩基か改変されたペプチド核酸単量体を用いてもよい。
【００４８】
好ましくは、前記キャリアペプチド核酸は、電気的陽性を有するように、アミン（ａｍｉｎｅ）、トリアゾール（ｔｒｉａｚｏｌｅ）またはイミダゾール残基（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｍｏｉｅｔｙ）を核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）に含むか、電気的陰性を有するように、カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を塩基に含んでもよい。
【００４９】
また、キャリアペプチド核酸の改変ペプチド核酸単量体は、陰電荷をバックボーンもしくは核酸塩基にさらに含んでもよいが、改変ペプチド核酸単量体は、陽電荷を有する単量体が、陰電荷を有する単量体に比べてより多く含まれ、全体的にキャリアペプチド核酸の電荷が陽性となることが好ましい。
【００５０】
好ましくは、本発明による前記構造式（１）の核酸複合体は、全体的に陽電荷を有すること特徴とする。
【００５１】
本発明による前記構造式（１）の核酸複合体において、疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光剤および蛍光／発光マーカーなどからなる群から選択される１つ以上の物質が、生理活性核酸および／またはキャリアペプチド核酸に結合されていることを特徴とする。好ましくは、前記疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、およびイメージングのための蛍光／発光マーカーなどからなる群から選択される１つ以上の物質は、前記キャリアペプチド核酸に結合されてもよい。
【００５２】
本発明において、前記疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光剤、蛍光マーカーおよび発光マーカーからなる群から選択される１つ以上の物質と、生理活性核酸および／またはキャリアペプチド核酸との結合は、単純共有結合またはリンカー媒介性の共有結合であってもよいが、これに限定されるものではない(表１参照)。好ましくは、前記核酸運搬体に結合された、細胞透過、溶解度、安定性、運搬、およびイメージング関連物質（例えば、疎水性残基など）は、標的遺伝子の発現を調節する生理活性核酸と独立して存在することになる。
【００５３】
本発明において、前記核酸の相補的な結合形態は、大別して、逆平行結合（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）と平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）の形態を有することを特徴とし、前記核酸の相補的な結合形態は、生理活性核酸の標的配列（生理活性核酸と相補的な配列）の存在下で分離される構造を有する。
【００５４】
逆平行結合と平行結合は、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＰＮＡの結合方式において、５´−方向性と３´−方向性によって決定される。逆平行結合は、一般のＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＰＮＡの結合方式であって、本発明による構造式（１）の核酸複合体を例として説明すると、生理活性核酸は５´から３´の方向に、キャリアペプチド核酸は３´から５´の方向に互いに結合される形態を意味する。平行結合は、逆平行結合よりは結合力がやや低い形態であって、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸が両方とも５´から３´の方向または３´から５´の方向に互いに結合される形態を意味する。
【００５５】
好ましくは、本発明による構造式（１）の核酸複合体において、前記生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）は、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子、特に、標的遺伝子のｍＲＮＡとの結合力よりも低いことを特徴とすることが好ましい。
【００５６】
上記のように、前記生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）が、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子、特に、標的遺伝子のｍＲＮＡとの結合力よりも低くなるための具体的な方法の例として、前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）または部分的特異的結合(Ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）  により互いに結合することによって、生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）を、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子、特に、標的遺伝子のｍＲＮＡとの結合力よりも低くしてもよいが、これに限定されるものではない。
【００５７】
また、他の例として、前記キャリアペプチド核酸は、リンカー、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）、および生理活性核酸の対応する塩基と相補的ではないペプチド核酸塩基から選択される１つ以上のペプチド核酸塩基を有することにより、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）を、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子、特に、標的遺伝子のｍＲＮＡとの間の結合力よりも低くしてもよい(表１参照)。
【００５８】
前記ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）およびウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）などの天然塩基、並びに、イノシンＰＮＡ（ｉｎｏｓｉｎｅ  ＰＮＡ）、インドールＰＮＡ（ｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、ニトロインドールＰＮＡ（ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、および無塩基（ａｂａｓｉｃ）といった、選択性なしに結合し、相補的な結合力より低い結合力を有する塩基からなる群から選択される１つ以上を用いてもよく、好ましくは、イノシンＰＮＡを用いてもよい。
【００５９】
【表１】
2019526624.tif 000003
【００６０】
前記表１中、Ｎは核酸の塩基（ＡＴＧＣ）であり、＊はアンチセンス核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）配列と相補的ではない配列、＄はユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）であって、＝はリンカーであり、５´−、３´−は核酸（塩基）の方向性を示す。
【００６１】
本発明において、前記核酸複合体の機能を調節するための核酸の結合形態と電気的性質の組み合わせを提供し、前記核酸の結合形態と電気的性質の組み合わせにより粒子サイズおよび作用時点を調節することで、細胞透過性、溶解度、および特異度を向上させることを特徴とする。
【００６２】
特に、核酸複合体の粒子サイズは、生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸の電荷を調節することで達成可能であり、キャリアペプチド核酸の陽電荷の適切な数と生理活性ペプチド核酸が有する電荷による好適な電荷平衡により、核酸複合体の粒子サイズを小さくすることができる。
【００６３】
一方、キャリアペプチド核酸と生理活性ペプチド核酸の結合力を調節することで、標的遺伝子の存在下で、生理活性ペプチド核酸が標的配列と結合される時点（生理活性核酸の標的配列への置換時点、標的特異的分離および結合時点）などの調節が可能である。
【００６４】
すなわち、本発明による構造式（１）の核酸複合体において、生理活性核酸の標的遺伝子への置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）時点、標的特異的分離および結合（ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｂｉｎｄ）時点の調節は、複合体の非特異結合のためのキャリアペプチド核酸の非特異塩基、およびユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）、およびリンカーの有無、および個数、および位置によって調節が可能であることを特徴とし、複合体の相補的な結合形態である平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）または逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）形態の結合などと、前記条件の組み合わせによって調節が可能であることを特徴とする。
【００６５】
本発明による構造式（１）の核酸複合体は、前記生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を適切な条件でハイブリダイズすることによって製造することができる。
【００６６】
本発明における「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズ」は、相補的な１本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリダイズは、２本の核酸鎖間の相補性が完全な場合（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）に行われるか、または一部に不整合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても行われることができる。ハイブリダイズに必要な相補性の程度は、ハイブリダイズ条件によって変わり得て、特に、結合温度によって調節可能である。
【００６７】
本発明による前記生理活性核酸またはキャリアペプチド核酸は、両末端にリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とリポーター蛍光を消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）することができる消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合し得る。前記リポーターは、  ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ＨＥＸ（２’、４’、５’、７’、−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙ−４，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）  、及びＣｙ５で構成される群から選択される一つ以上であってもよく、好ましくは  Ｃｙ５を使用する。前記消光剤は、ＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）  、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２及びＤａｂｃｙｌで構成される群から選択される一つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６８】
本発明において、前記キャリアペプチド核酸は、生理活性核酸と相補的に水素結合して前記核酸を細胞内に運ぶことができ、前記生理活性核酸は標的遺伝子と結合して標的遺伝子の発現を調節することを特徴とする。
【００６９】
本発明の「標的遺伝子」は、活性、抑制、または標識しようとする核酸配列（塩基配列）を意味し、用語「標的核酸」と違いがなく、本明細書で混用される。
【００７０】
前記標的遺伝子を含む標的核酸（塩基配列）が生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で前記複合体と接触（結合）すると、キャリアペプチド核酸から生理活性核酸が分離されて生物学的活性を示すことになる。
【００７１】
さらに他の観点において、本発明は、構造式（１）の核酸複合体を含む標的遺伝子の発現調節用組成物、疾病の予防および治療用組成物、および疾病の診断用組成物を提供する。
【００７２】
また、本発明は、前記構造式（１）の核酸複合体を予防または治療を要する患者に投与することを含む、疾病の予防または治療方法を提供する。
【００７３】
本発明は、前記構造式（１）の核酸複合体を用いることを含む、標的遺伝子の発現調節方法を提供する。
【００７４】
本発明による構造式（１）の核酸複合体を用いて予防、治療、または診断可能な疾病は、構造式（１）の核酸複合体中の生理活性核酸が結合する標的遺伝子によって決定され、好ましくは癌または腫瘍であるが、これに限定されるものではない。
【００７５】
用語「治療用組成物」は、「医薬(薬剤学的、薬剤学的)組成物」と混用することができ、本発明の生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）および前記核酸と結合するキャリアペプチド核酸を含む核酸複合体を有効性分として含む。
【００７６】
本発明の治療用組成物は、標準医薬実施に従って、経口または非経口投与剤型の形態に剤型化してもよい。これらの剤形は、前記有効成分以外に薬学的に許容可能な担体、賦形剤、補助剤または希釈剤などの添加物を含有してもよい。
【００７７】
用語「薬学的に許容可能な（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、化合物の生物学的活性と物性を損傷させない特性を意味する。
【００７８】
用語「担体（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、細胞または組織内への複合体の付加を容易にする化合物として定義される。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生物体の細胞または組織内への多くの有機化合物の投入を容易にする通常使用される担体である。
【００７９】
用語「希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）」は、対象化合物の生物学的活性形態を安定化させるだけでなく、化合物を溶解させる水で希釈される化合物と定義される。バッファー溶液に溶解されている塩は、当該分野で希釈剤として用いられる。通常用いられるバッファー溶液はリン酸バッファー食塩水であり、これは、ヒト溶液の塩状態を模倣しているためである。バッファー塩は、低い濃度で溶液のｐＨを制御することができるため、バッファー希釈剤が化合物の生物学的活性を改変することは殆どない。
【００８０】
ここで用いられた複合体を含有する化合物は、ヒト患者に、その自体で、または、併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）のように他の活性成分とともに、または適切な担体や賦形剤とともに混合された医薬組成物として、投与可能である。
【００８１】
本発明において使用するに適した医薬組成物には、活性成分が、その意図された目的を達成するに有効な量で含有されている組成物が含まれる。より具体的に、治療的有効量は、治療されるべき固体の生存を延長するか、疾患の症状を防止、軽減、もしくは緩和させるに有効な化合物の量を意味する。治療学的有効量の決定は、特に、ここで提供された詳細な開示内容の側面で、通常の技術者の能力範囲内にいる。
【００８２】
本発明で用いられる用語「予防」は、前記複合体、またはその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物の投与（または塗布）により、坑癌活性を示し、癌の増殖を抑制させるか、癌の発症を遅延させる全ての行為を意味する。また、本発明で用いられる用語「治療」は、前記複合体、またはその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物の投与（または塗布）により、癌疾患の症状が好転または完治される全ての行為を意味する。
【００８３】
本発明による核酸複合体を含む組成物で予防または治療可能な疾病は特に制限されないが、好ましくは、腫瘍または癌、炎症性疾患、老人性黄斑変性、難聴、皮膚疾患などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８４】
本発明による核酸複合体を含む治療用組成物で治療可能な疾患は、核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子によって決定され、核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子の例として、癌治療のための標的遺伝子としては、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＶＥＧＦ、アンドロゲンレセプター（Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＫＲＡＳ、クラスタリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）、ＴＧＦβＲ２、ＥＲＢＢ３、トランスグルタミナーゼ  ２（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ２）、ＡＢＣＢ１、Ｈｓｐ２７、ＳＴＡＴ３、ＰＤ−Ｌ１などが挙げられる。
【００８５】
炎症疾患を標的とする遺伝子としてはＰＤＥ４Ｂ、Ｐｅｌｌｉｎｏ−１が挙げられ、希少疾患および重症疾患を標的とする遺伝子としてはＳＭＮ２、ＡｐｏＢ−１００、ＩＣＡＭ−１、ＡｐｏＣＩＩＩ、ＴＴＲ、ＨＴＴ、ＧＨｒ、ＳＯＤ１、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＫＫ、ｍｉＲ−２１、ＴＭＰＲＳＳ６、ＦＭＲ１、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ２６が挙げられ、心血管疾患を標的とする遺伝子としてはＦａｃｔｏｒ  ＸＩ、Ａｐｏ（ａ）、ＡｐｏＣＩＩＩ、ＡＧＴが挙げられ、代謝性疾患を標的とする遺伝子としてはＧＣＧＲ、ＡＮＧＰＴＬ３、ｍｉＲ−１０３／１０７、ＤＧＡＴ２が挙げられ、皮膚疾患を標的とする遺伝子としてはＩＦＩ１６、ＴＬＲ６、ＴＩＥＧ１が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８６】
本発明の治療用組成物は、それらのみで、もしくは後述のような適切な薬学的に許容される担体または賦形剤とともに、公知の方法により非経口または経口投与用剤型に製剤化してもよい。このような剤型の具体的な例としては、注射剤、軟質カプセル剤、硬質カプセル剤、錠剤、シロップ剤などの経口剤または外用剤が挙げられる。
【００８７】
好ましくは、本発明による核酸複合体を含む治療用組成物は、非経口投与用剤型で製造されて用いられることができる。適切な非経口投与用剤型としては、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸腔内注射用などに適切な注射液または凍結乾燥剤形が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８８】
さらに他の観点において、本発明による核酸複合体は、皮膚伝達（ｓｋｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）経路を介して投与されてもよい。皮膚伝達のための剤型は、水性溶液、クリーム、および軟膏などから選択されてもよいが、これに限定されるものではなく、皮膚伝達のために当該技術分野に公知の全ての形態の剤型が利用可能である。
【００８９】
非経口投与用剤型に製剤化するために、本発明による核酸複合体を含む治療用組成物は、本発明による複合体を含み、食塩水、滅菌数、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち一つの成分または二つ以上の成分を混合して使用でき、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形で製剤化することができる。特に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）された形態の剤形で製剤化して提供することが好ましい。凍結乾剤形燥製造のために本発明が属する技術分野で通常知られている方法が使用でき、凍結乾燥のための安定化剤が追加されてもよい。さらには、当分野の適正な方法でまたはレミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を利用して、各疾病に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００９０】
また、本発明による治療用組成物は、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などのような経口投与剤型に剤型化してもよく、この際、薬学的に許容される１つ以上の賦形剤が添加されてもよい。
【００９１】
さらに他の観点において、本発明は、本発明による核酸複合体を含む癌の治療用組成物を提供する。本発明による組成物で治療可能な腫瘍または癌は特に限定されず、固形癌と血液癌を全て含む。好ましくは、標的遺伝子（例えば、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ：  ａ  ｎｅｗ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ．  ３５（７）：５５３−６２，  ２００９）が発現するすべての癌を含み、さらに好ましくは、前記癌は、肝癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、子宮頚癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、皮膚癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎臓癌、食道癌、胆道癌、精巣癌、直腸癌、頭頸部癌、頸椎癌、尿管癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、および神経膠腫からなる群から選択される。
【００９２】
好ましくは、本発明による癌治療のための核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＶＥＧＦ、アンドロゲンレセプター（Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＫＲＡＳ、クラスタリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）、ＴＧＦβＲ２、ＥＲＢＢ３、トランスグルタミナーゼ  ２（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ２）、ＡＢＣＢ１、Ｈｓｐ２７、ＳＴＡＴ３およびＰＤ−Ｌ１で構成された群から選択されたいずれか一つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００９３】
好ましくは、本発明による癌治療用組成物には、配列番号１〜１８の何れか１つの配列を有するサバイビン特異的生理活性ペプチド核酸およびそれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号１９〜４０から選択される何れか１つの配列を有してもよく、前記配列のうち一部がユニバーサル塩基で置換されて用いられてもよい。
【００９４】
また、本発明による癌治療用組成物には、好ましくは、配列番号４１で表されるＶＥＧＦ特異的生理活性ペプチド核酸または配列番号４９で表されるＰＤ−Ｌ１特異的生理活性ペプチド核酸、およびこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号４２、４３(ＶＥＧＦ)または配列番号５０(ＰＤ−Ｌ１)の配列を有してもよく、前記配列のうち一部がユニバーサル塩基で置換されて用いられてもよい。
【００９５】
さらに他の観点において、本発明は、本発明による核酸複合体を含む老人性黄斑変性（Ａｇｅｄ  Ｍａｃｕｌａｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）  治療用組成物を提供する。本発明による老人性黄斑変性のための核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＶＥＧＦであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００９６】
好ましくは、本発明による老人性黄斑変性治療用組成物には、配列番号４１で表されるＶＥＧＦ特異的生理活性ペプチド核酸、およびこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号４２、４３の配列を有してもよく、前記配列のうち一部がユニバーサル塩基で置換されて用いられてもよい。
他の観点において、本発明は、本発明による核酸複合体を含む皮膚疾患の予防または治療用組成物を提供する。前記皮膚疾患としては、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、色素沈着関連皮膚疾患、およびアトピー疾患などが挙げられるが、これに限定されない。本発明による皮膚疾患治療のための核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＩＦＩ１６、ＴＬＲ６およびＴＩＥＧ１で構成された群から選択されたいずれか一つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００９７】
好ましくは、本発明は、乾癬治療用組成物を提供する。本発明による乾癬治療用組成物には、配列番号４４〜４７の何れか１つの配列を有するＩＦＩ１６特異的生理活性ペプチド核酸およびそれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号４８の配列を有してもよく、前記配列のうち一部がユニバーサル塩基で置換されて用いられてもよい。
【００９８】
前記皮膚疾患の予防または治療用組成物は、水性溶液、クリーム、ゲル、ペースト、ローションおよび軟膏などの剤型で製造されてもよいが、これに限定されるものではない。
【００９９】
さらに他の観点において、本発明は、本発明による核酸複合体を含む炎症性疾患の治療用組成物を提供する。本発明による炎症性疾患治療のための核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＰＤＥ４ＢおよびＰｅｌｌｉｎｏ−１で構成された群から選択されたいずれか一つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
【０１００】
さらに他の観点において、本発明は、本発明による核酸複合体を含む希少疾患および重症疾患の治療用組成物を提供する。本発明による希少疾患および重症疾患治療のための核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＳＭＮ２、ＡｐｏＢ−１００、ＩＣＡＭ−１、ＡｐｏＣＩＩＩ、ＴＴＲ、ＨＴＴ、ＧＨｒ、ＳＯＤ１、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＫＫ、ｍｉＲ−２１、ＴＭＰＲＳＳ６、ＦＭＲ１およびＣｏｎｎｅｘｉｎ  ２６で構成された群から選択されたいずれか一つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
【０１０１】
好ましくは、本発明による核酸複合体を含む希少疾患および重症疾患は、難聴であり、核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ２６であってもよい。
【０１０２】
本発明の複合体は、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの伝達体を用いて投与（または塗布）してもよい。前記リポソームは、リンパ組織のような特定組織に対して前記複合体を標的化するか、感染細胞に対して選択的に標的化することを助け、また、前記複合体が含まれた組成物の半減期を増加させることを助けることができる。リポソームとしては、エマルション、フォーム（ｆｏａｍ）、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、不溶性断層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層（ｌａｍｅｌｌａｒ  ｌａｙｅｒ）などが挙げられる。このような製剤において、送逹される前記複合体は、単独で、または特定細胞を対象として、ＣＤ４５抗原に結合されるモノクローナル抗体のようなリンパ細胞のうち優勢な受容体に結合する分子とともに、またはその他の治療組成物とともに、リポソームの一部として混入させる。したがって、本発明の所定複合体で充填または塗布されて（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）前記複合体組成物を送逹するリポソームは、リンパ細胞の前記部位に指向されることができる。
【０１０３】
本発明で用いるためのリポソームは、通常、中性および陰電荷リン脂質、およびコレステロールなどのステロールを始めとする標準ベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）−形成脂質から形成される。通常、例えば、血流中におけるリポソームの安定性、酸不安定性（ａｃｉｄ  ｌａｂｉｌｉｔｙ）、およびリポソームのサイズなどを考慮して脂質を選択する。リポソームの製造には、様々な方法を用いることができる。例えば、文献［Ｓｚｏｋａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ９：４６７，  １９８０），  および米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号および第５，０１９，３６９号］  に開示されたような方法を利用することができる。
【０１０４】
本発明は、一態様において、複合体、または複合体を含む組成物を個体に投与(または塗布)して疾病を治療して、抑制(または緩和)する方法を提供する。
【０１０５】
本発明による複合体を用いて治療可能な疾患は、用いられる生理活性核酸の特性により決定され、特に制限されない。
【０１０６】
好ましい本発明による複合体を用いて治療可能な疾患の例としては、癌、黄斑変性などの異常血管増殖疾患、皮膚疾患、炎症疾患、自己免疫疾患などが挙げられるが、これに制限されない。
【０１０７】
本発明による複合体を含む組成物は、癌疾患を治療するために、または癌疾患の症状を抑制（または緩和）するために、医薬的に効果的な量で投与（または塗布）されてもよい。本発明による薬学的組成物の投与量／塗布量は、色素沈着関連皮膚疾患の種類、患者の年齢、体重、症状の特性および程度、現在治療法の種類、治療回数、投与（塗布）形態、および経路などの様々な要因によって変わり得て、該当分野の専門家によって容易に決定されることができる。本発明の組成物は、上述の薬理学的または生理学的成分をともに投与（塗布）するか、順に投与（塗布）してもよく、また、追加の従来の治療剤と併用して投与（塗布）してもよく、従来の治療剤とは順にもしくは同時に投与（塗布）してもよい。このような投与（塗布）は、単一または多重投与（塗布）であってもよい。
【０１０８】
本発明において、「個体」は、本発明による複合体を投与（塗布）して軽減、抑制、または治療可能な状態または疾患を患っているか、その危険を有している哺乳動物を意味し、好ましくはヒトを意味する。
【０１０９】
また、本発明の化合物の人体への投与量（塗布量）は、患者の年齢、体重、性別、投与（塗布）形態、健康状態、および疾患の程度によって変わり得て、体重が７０ｋｇである成人患者を基準としたときに、一般に、０．００１〜１，０００ｍｇ／日であり、好ましくは０．０１〜５００ｍｇ／日であって、医者または薬剤師の判断によって、一定時間間隔で１日１回〜数回に分割投与（塗布）してもよい。
【０１１０】
本発明の方法で用いられる任意の複合体、またはそれを含む混合物の治療学的有効量は、細胞培養分析から初期に測定されることができる。例えば、線量（ｄｏｓｅ）は、細胞培養で決定されたＩＣ５０（ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）またはＥＣ５０（ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を含む循環濃度範囲を得るために動物モデルで計算されることができる。このような情報は、ヒトでの有用な線量をより正確に決定するのに用いられることができる。
【０１１１】
ここで記載されている複合体、またはそれを含む混合物の毒性と治療効率性は、例えば、ＬＤ５０（群集の５０％に対する致死量）、ＥＤ５０（群集の５０％に対して治療効果を有する線量）、ＩＣ５０（群集の５０％に対して治療抑制効果を有する線量）を決定するために、細胞培養または実験動物での標準製薬過程によって算定されることができる。毒性と治療効果との線量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０とＥＤ５０（または、ＩＣ５０）との比率で表現されることができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養分析により得られたデータは、ヒトに用いる線量の範囲を算定するのに用いられることができる。このような化合物の投与量（ｄｏｓａｇｅ）または塗布量は、好ましくは、毒性がないか殆どない状態でＥＤ５０（または、ＩＣ５０）を含む循環濃度の範囲内にある。
【０１１２】
さらに他の観点において、本発明は、前記複合体を含む癌または腫瘍診断用キットに関する。
【０１１３】
本発明において、癌または腫瘍診断のための検体試料は、ヒトを含む動物の特定組織または器官から由来することができる。組織の代表的な例としては、結合、皮膚、筋肉または神経組織が含まれる。器官の代表的な例としては、目、脳、肺、肝、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、すい臓、腎臓、胆嚢、胃、小腸、睾丸、卵巣、子宮、直腸、神経系、腺及び内部血管が含まれる。
【０１１４】
前記検体試料は、生物学的根源から出てきたいかなる細胞、組織、流体液（ｆｌｕｉｄ）、または本発明によって良好に分析できるいかなる他の媒質（ｍｅｄｉｕｍ）も含み、これはヒト、動物、ヒトまたは動物の消費のために製造された食べ物から得た試料が含まれる。また、試料は、体液試料を含み、これは喀痰、血液、血清、血しょう、リンパ、母乳、小便、糞便、眼球流液、唾液、精液、脳抽出物（例えば、脳粉砕物）、脊髄液、虫垂、脾臓及び扁桃腺組織抽出物が含まれるか、これらに限定されない。
【０１１５】
本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ補因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのような標的核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ反応）を実施するのに必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に、前記キットは、様々なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、バッファー及び試薬、及びＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する抗体を含むことができる。また、前記キットで、特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書に開示事項を習得した当業者によって容易に決定され得る。典型的に、前記キットは、先述した構成成分を含む別途の包装またはコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）で製作され得る。
【０１１６】
本発明の実施例では、前記核酸複合体の結合による粒子サイズを分析した。その結果、図１に示されたように、核酸複合体の粒子サイズが、１本鎖核酸に比べて数十ｎｍに小さくなることが確認された（実施例２参照）。
【０１１７】
本発明の他の実施例では、前記核酸複合体を用いて細胞透過性を分析した。その結果、図２ａおよび図２ｂに示されたように、電荷を有する核酸複合体の細胞内への導入により、細胞内Ｃｙ３蛍光（マーカー）が最も高く現れ、電荷を有さない生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸が対（ｄｕｐｌｅｘ）を成さない複合体の場合、複合体の細胞内への透過率が低いことが確認された（実施例３参照）。
【０１１８】
本発明のさらに他の実施例では、前記核酸複合体を用いて、腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。その結果、図３ａ〜図３ｃに示されたように、タンパク質および下位経路遺伝子の発現パターンを分析した時に、前記核酸複合体で処理した実験群で、サバイビンおよび下位経路タンパク質の発現が抑制されることを確認した（実施例４参照）。
【０１１９】
本発明のさらに他の実施例では、前記核酸複合体の結合力を調節することで標的遺伝子であるサバイビンタンパク質の発現抑制時点が調節され、サバイビンおよびＶＥＧＦ特異的生理活性核酸を含む核酸複合体および腫瘍細胞株を用いた実験により、坑癌効能を示すことを確認した（実施例５〜実施例８など参照）。
【０１２０】
本発明のさらに他の実施例では、前記複合体構造を用いて、細菌およびカビの増殖が抑制可能であることを確認した（実施例１２参照）。
【０１２１】
本発明によるキャリアペプチド核酸（すなわち、改変されたキャリアペプチド核酸）は、改変されていない従来のネーキッドペプチド核酸（ｎａｋｅｄ−ＰＮＡ）の自己凝集（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）性質などによる沈澱問題を解消し、細胞透過性、溶解度の増加、および細胞内拡散効果を増進させることができる。
【０１２２】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、（ａ）生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とキャリアペプチド核酸を結合させて複合体を形成するステップと、（ｂ）前記複合体を標的細胞に接触させて細胞内に導入させるステップと、を含む、前記複合体を用いた標的遺伝子発現の調節方法に関する。
【０１２３】
本発明において、前記標的細胞は、上述の癌または腫瘍来由の細胞であってもよいが、これに限定されない。本発明において、前記（ｂ）ステップにおいて、複合体が細胞内に導入されて移動した後、生理活性核酸は、相補的な塩基配列を有する標的核酸と結合し、キャリアペプチド核酸から分離されることを特徴とし、前記生理活性核酸は標的遺伝子と結合して標的遺伝子の発現を調節することを特徴とする。
【０１２４】
本発明によると、前記複合体は、標的核酸（標的配列）が存在しない場合には、生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸が相補的な結合を維持するのに対し、生理活性核酸の塩基配列と相補性を成す標的核酸が存在する場合には、「生理活性核酸の標的配列への置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」、「標的特異的分離および結合（ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｂｉｎｄ）」方法により、生理活性核酸がキャリアペプチド核酸から分離されて標的核酸と結合する。前記分離および結合の時点は、生理活性核酸のキャリアペプチド核酸と標的核酸の塩基配列の相補性によるそれぞれの核酸（塩基）間の水素結合力の調節により調節可能であることを特徴とする。
【０１２５】
したがって、本発明の好ましい具現例によると、標的特異的分離および結合方法は、ｉ）相補的な結合のうち一部が異なる配列（ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有するキャリアペプチド核酸構造として「一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）」もしくは「生理活性核酸よりも短い配列」を有するように製作したり、ｉｉ）キャリアペプチド核酸の一部配列をユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）で交替したり、ｉｉｉ）キャリアペプチド核酸の一部配列をリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）で代替し、ｖｉ）生理活性核酸に平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）に結合するキャリアペプチド核酸構造を有するようにすることで、標的核酸と生理活性核酸の結合力に比べてキャリアペプチド核酸と生理活性核酸の結合力が相対的に低いように製作される方式により実現されてもよく、前記方法を２つ以上組み合わせで使用可能であって、平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）方式を用いることが好ましい。
【０１２６】
前記ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）、ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）などの天然塩基と、選択性なしに結合し、相補的な結合力より低い結合力を有する塩基としてイノシンＰＮＡ（ｉｎｏｓｉｎｅ  ＰＮＡ）、インドールＰＮＡ（ｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、ニトロインドールＰＮＡ（ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、および無塩基（ａｂａｓｉｃ）からなる群から選択される１つ以上を用いてもよく、好ましくは、イノシンＰＮＡを用いてもよい。
【０１２７】
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の結合力を調節することで、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の分離時点および生理活性核酸と生理活性核酸の標的遺伝子との結合時点の調節が可能であるという利点がある。
【０１２８】
［実施例］
以下、本発明を、実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【０１２９】
実施例１：生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）およびキャリアペプチド核酸、並びにそれらを用いた複合体の製造
本発明による構造式（１）の核酸複合体の効能を検証するために、標的遺伝子としてサバイビンを使用した。サバイビンは、今まで先行された殆どの新生腫瘍や形質変異された細胞株で共通して発現されるタンパク質であって、坑癌治療において重要な標的となるのであろうと予測されている（ｓｕｒｖｉｖｉｎ：  ａ  ｎｅｗ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ．  ３５（７）：５５３−６２，  ２００９）。
【０１３０】
サバイビンを抑制するために、サバイビンに対する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）としてアンチセンスペプチド核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＰＮＡ）およびＲＮＡを使用した。
【０１３１】
本発明のサバイビンに対する生理活性核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＰＮＡおよびＲＮＡ）は、配列番号１番〜１８番と記載される配列で構成されている。本実施例で用いられたペプチド核酸ベースの生理活性核酸は、イメージングのための蛍光（Ｃｙ３）を３´末端に結合し、塩基配列、単量体の改変および構造は表２のとおりである。
【０１３２】
本発明で使用したペプチド核酸は、何れもパナジーン（ＰＡＮＡＧＥＮＥ、韓国）でＨＰＬＣ精製方法により合成した。
【０１３３】
本発明のサバイビンを標的遺伝子とする生理活性核酸を細胞内に伝達するためのキャリアペプチド核酸は、配列番号１９番〜４０番と記載される配列で構成されている。本実施例で用いられたキャリアペプチド核酸の塩基配列、単量体の改変および構造は、表２のとおりである。
【０１３４】
複合体の粒子サイズの分析、細胞透過率の分析、および標的遺伝子の発現阻害効率の分析のために、表２の生理活性核酸とキャリアペプチド核酸を組み合わせて複合体の製造に使用した。
【０１３５】
【表２】
2019526624.tif 000004
2019526624.tif 000005
【０１３６】
単量体の改変では、電気的な性質を付与するために、電気的陽性を有するようにリシン（Ｌｙｓｉｎｅ、Ｌｙｓ、Ｋ、（＋）で表記）を、電気的陰性を有するようにグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ、Ｇｌｕ、Ｅ、（−）で表記）をペプチド核酸のバックボーンに含むように、改変されたペプチドバックボーンを有するように製作した。
【０１３７】
それぞれの生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の組み合わせはＤＭＳＯ下でハイブリダイズされ、その結果、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸で構成された複合体が製作された。
【０１３８】
実施例２：生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の結合、および電気的性質による複合体の粒子サイズの分析
実施例１で表２の構造を有するように製造された生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて、粒子のサイズを分析しようとした。
【０１３９】
実施例２−１．走査型電子顕微鏡（Ｆｉｅｌｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＦＥ−ＳＥＭ）分析
実施例１で製造された複合体の粒子サイズを分析するために、走査型電子顕微鏡（Ｆｉｅｌｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて粒子サイズを分析した。走査型電子顕微鏡分析のために、キャリアペプチド核酸と生理活性核酸２５０ｎＭをハイブリダイズすることで用意された複合体３ｕｌをシリコンウェハに落とした後、−７０℃で１時間冷凍させた後、２０分間凍結乾燥させた。乾燥した複合体をオスミウム（ｏｓｍｉｕｍ）に１０分間コーティングした後、５ｋＶから１０ｋＶの走査型電子顕微鏡で分析した。
【０１４０】
実施例２−２．様々な電気的性質による複合体構造の走査型電子顕微鏡（Ｆｉｅｌｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＦＥ−ＳＥＭ）分析
実施例１の方法により、様々な電気的性質を有する複合体を製造し、粒子サイズを分析するために実施例２−１の方法で分析した。
【０１４１】
その結果、図１に示されたように、互いに異なる電気的性質を有する生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸が平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）により構成された複合体の粒子サイズが、１本鎖からなる生理活性核酸の粒子サイズより小さいことを確認した。また、図２ａおよび図２ｂのように、ＰＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ  １は生理活性ペプチド核酸（配列番号６）とキャリアペプチド核酸（配列番号３２）、ＰＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ  ２は生理活性ペプチド核酸（配列番号５）と３個の陽電荷を有するキャリアペプチド核酸（配列番号３２）、ＰＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ  ３は生理活性ペプチド核酸（配列番号１）とキャリアペプチド核酸（配列番号３７）、ＰＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ  ４は電荷を有さない生理活性ペプチド核酸（配列番号１）とキャリアペプチド核酸（配列番号２３）を用いて複合体の粒子サイズを確認した。キャリアペプチド核酸の陽電荷が２個から３個に増加すると、粒子サイズが小さくなるが、５個以上となると、粒子のサイズが大きくなる特徴がある。また、粒子サイズを決定する他の要素として、複合体を成す生理活性ペプチド核酸の電荷による全体的な複合体の生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が有する適切な電気的性質によって、複合体の粒子サイズが異なることを確認した。
【０１４２】
実施例３：キャリアペプチド核酸の特性による細胞透過率の分析
実施例１で表２の構造を有するように製造された生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて、細胞透過性を分析しようとした。
【０１４３】
実施例３−１．細胞培養
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手したヒト子宮癌細胞（ＨｅＬａ）をＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１４４】
実施例３−２．生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内への導入
実施例３−１で培養されたＨｅＬａ細胞株（５ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）を同一の培養条件で８−ウェルプレートで２４時間培養した後、実施例１で製作された生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体を５００ｎＭの濃度で処理し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で、２４、４８、７２および９６時間の間隔で培養してから、複合体の細胞内への導入を測定した。
【０１４５】
実施例３−３．生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内への透過率の分析
生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の細胞内への導入程度を確認するために、共焦点燎微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した。核はＤＡＰＩ染色で確認し、生物学的活性を有するペプチド核酸は、Ｃｙ３を標識して細胞内への導入有無を確認した。
【０１４６】
実施例３−４．生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の、細胞内標的遺伝子存在時における分離有無の分析
生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が細胞内に導入されて標的遺伝子と会合した時に、その結合が分離されるかを確認するために、Ｃｙ３で標識した生理活性核酸と、Ａｌｅｘａ４８８で標識したキャリアペプチド核酸との重畳シグナルの有無を共焦点燎微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した。
【０１４７】
実施例３−５．キャリアペプチド核酸を用いた単一生理活性小干渉リボ核酸（ｓｉｎｇｌｅ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｓｉＲＮＡ）の細胞内への透過率の分析
生物学的活性を有する単一生理活性小干渉リボ核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の細胞内への導入程度を確認するために、共焦点燎微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した。核はＤＡＰＩ染色により確認し、生物学的活性を有する単一生理活性小干渉リボ核酸はＣｙ３で標識して細胞内への導入有無を確認した。
【０１４８】
その結果、図３ａ〜図３ｃに示されたように、電荷を有する生理活性ペプチド核酸（配列番号１４）とキャリアペプチド核酸（配列番号３２）の複合体の細胞内への導入により、細胞内でＣｙ３蛍光が最も高く現れ、生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸が対（ｄｕｐｌｅｘ）を成さないか、複合体の電荷が存在しない場合には、生理活性ペプチド核酸（配列番号１）とキャリアペプチド核酸（配列番号１９）の複合体の細胞内への透過率が低いことが確認された。また、複合体は、どのような電気的性質および形態で構成されたかによって細胞内への透過率が変わることが確認された。図４から確認されるように、生物学的安定性を示すペプチド核酸で構成された生理活性ペプチド核酸（配列番号１４）とキャリアペプチド核酸（配列番号３２）の複合体は、細胞内への透過率が高いだけでなく、長期間にわたって細胞内に存在することが確認された。同一の電荷を有する生理活性ペプチド核酸（配列番号１４）とキャリアペプチド核酸（配列番号３９）の複合体は、細胞内部に導入されると、複合体が結合された状態で存在していて、４８時間後には分離されることが、図５ａ〜図５ｆのように確認された。図６ａ〜図６ｇにおける結果では、表２に示された生理活性核酸と同一の配列を有するｓｉｎｇｌｅ  ｓｉＲＮＡは、それ自体のみでは、細胞内に透過されないことが確認されたが、キャリアペプチド核酸（配列番号３９）とｓｉｎｇｌｅ  ｓｉＲＮＡが複合体をなすと、高い効率で細胞内に透過されることが確認された。
【０１４９】
実施例４：生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いた腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制
実施例１で表２の構造を有するように製造された生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて、腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制効率を分析しようとした。
【０１５０】
実施例４−１．細胞培養
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手したヒト由来大膓癌細胞（ＳＷ４８０）およびヒト由来乳癌細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）をＲＰＭＩ１６４０培養培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  、ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１５１】
実施例４−２．細胞培養、および生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内への導入
ヒト由来の癌細胞株の培養条件、および生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の処理方法は、実施例３と同様であった。但し、６−ウェルプレートにウェル当り１ｘ１０５ｃｅｌｌｓを培養し、複合体で処理した後、７２、９６時間の間隔で培養してから、標的遺伝子の発現抑制有無を確認した。
【０１５２】
実施例４−３．ウエスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
実施例４−２の条件で処理された細胞株から総タンパク質を抽出し、ＢＣＡ定量法（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙ）によりタンパク質を定量した。タンパク質を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上でタンパク質のサイズ毎に分離し、分離されたゲル状のタンパク質をメンブレンに移した後、抗−サバイビン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  米国）、抗−ＣｙｃｌｉｎＤ  １（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，  米国）  ウサギ由来抗体を１次反応させ、２次反応として抗−ウサギ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，  米国）を用いて反応させてから、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ，  米国）溶液で処理した。抗体処理および洗浄過程済みの前記メンブレンは、ＬＡＳ下で、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）および下位経路（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）遺伝子であるＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１のタンパク質の発現様相を確認した。
【０１５３】
その結果、図７に示されたように、ＰＮＡ１と２は、表２に示されたような同一の配列を有するが、互いに異なる電気的性質を有する生理活性ペプチド核酸と、同一の電気的性質を有するキャリアペプチド核酸との複合体を成したものである。ＰＮＡ１は生理活性ペプチド核酸（配列番号３）、ＰＮＡ２は生理活性ペプチド核酸（配列番号６）とキャリアペプチド核酸（配列番号３２）の複合体である。互いに異なる電気的性質を有する複合体は、タンパク質および下位経路遺伝子の発現パターンを分析した時に、前記複合体で処理した実験群で、複合体の電気的性質によって時間差はあるが、サバイビンおよび下位経路タンパク質の発現が抑制されることを確認した。
【０１５４】
実施例５：生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の調節を用いた腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制
実施例１で表２の構造を有するように製造された様々な電気的性質を有する生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の調節を用いて、腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制効率を分析しようとした。
【０１５５】
実施例５−１．細胞培養、および生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内への導入
ＳＷ４８０とＳＫ-ＢＲ-３細胞株の培養条件、および生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の処理方法は、実施例２と同様であった。但し、６−ウェルプレートにウェル当り１ｘ１０５ｃｅｌｌｓを培養し、複合体で処理した後、２４、４８、７２および９６時間の間隔で培養してから、標的遺伝子の発現抑制有無を確認した。
【０１５６】
実施例５−２．ウエスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）による遺伝子発現の分析
実施例４−１の条件で実験を行い、生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の調節を用いて腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
【０１５７】
その結果、図８に示されたように、表２に示された同一の配列を有する生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸を使用したが、それぞれの複合体を成す陽電荷を有するキャリアペプチド核酸は同一であるが、複合体を成す生理活性ペプチド核酸は、互いに異なる多様な電気的性質を有する。Ａは生理活性ペプチド核酸（配列番号１）からなる複合体であり、Ｂは生理活性ペプチド核酸（配列番号２）からなる複合体であり、ＣとＤは生理活性ペプチド核酸（配列番号１２）からなる複合体であって、これらに対して、互いに異なる癌細胞でのサバイビンタンパク質および下位経路遺伝子の発現パターンを分析した。様々な電気的性質を有する複合体を用いて、生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸の複合体の電気的性質の違いによる複合体の構造によって、サバイビンおよび下位経路タンパク質の発現抑制時点が変わることを確認した。
【０１５８】
実施例６：様々な長さ毎の生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸の複合体を用いた腫瘍細胞株での細胞生存率の分析
実施例１で表２の構造を有するように製造された様々な電気的性質を有するが、異なる長さによる生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の調節を用いて、腫瘍細胞株で細胞生存率の抑制効率を分析しようとした。
【０１５９】
実施例６−１．細胞培養、および生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内への導入
ＳＷ４８０細胞株の培養条件、および生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の処理方法は、実施例２と同様であった。但し、培養された細胞を９６−ウェルプレートにウェル当り６ｘ１０３ｃｅｌｌｓ培養し、複合体で処理後、２４、４８、７２および９６時間の間隔で培養してから、処理時間経過後に細胞生存率を確認した。
【０１６０】
実施例６−２．ＭＴＴ（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）により腫瘍細胞株での細胞生存率の分析
実施例６−１の条件で処理された細胞株に、ＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液を１ＸＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように製造し、ウェル当り２０μＬで処理して４時間培養した後、ＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）をスペクトロフォトメータ（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定して分析した。
【０１６１】
その結果、図９ａおよび図９ｂのように、生理活性ペプチド核酸（配列番号６〜１１）およびキャリアペプチド核酸（配列番号２３〜３６）が結合されている複合体の長さ毎の効率による細胞生存率の差が確認された。
【０１６２】
実施例７：サバイビンを標的遺伝子とする生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む候補物質複合体を用いた坑癌薬剤の評価
実施例１で表２の構造を有するように製造された、サバイビンを標的遺伝子とする生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む候補物質複合体を用いて、腫瘍細胞株および腫瘍細胞を移植した動物モデルで標的遺伝子の発現抑制による腫瘍の抑制を分析しようとした。
【０１６３】
実施例７−１．細胞培養、および生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内への導入
ＳＷ４８０細胞株の培養条件、および生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の処理方法および実験内容は、実施例４および５と同様であった。
【０１６４】
実施例７−２．ＭＴＴ（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）により腫瘍細胞株での細胞生存率の分析
実施例６−１の条件で処理された細胞株に、ＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液を１ＸＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように製造し、ウェル当り２０μＬで処理して４時間培養した後、ＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）をスペクトロフォトメータ（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定して分析した。
【０１６５】
実施例７−３．ウエスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）による遺伝子発現の分析
実施例４−１の条件で処理された細胞株に対して、実施例４−３の実験条件でタンパク質の発現様相を確認した。
【０１６６】
実施例７−４．ヒト由来大膓癌細胞株（ＳＷ４８０）が移植されたマウスでの、生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む候補物質複合体の尾静脈投与による坑癌薬効の評価
坑癌薬効の評価のために、特定病原体不在（ＳＰＦ）ＢＡＬＢ／Ｃ系および雌ヌードマウス（Ｎａｒａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ、韓国）を用いてヒト由来大膓癌細胞を培養し、５週齢のヌードマウスに移植するために、培養されたＳＷ４８０細胞株を３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調節した後、調節された細胞培養液をマウス当り０．３ｍｌ（９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）ずつ右側の肩胛部と胸壁との間の腋窩部の皮下に注入した。生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸の候補物質複合体を、陰性対照物質（１、２ｍｇ／ｋｇ）と物質１、２、３（１、２ｍｇ／ｋｇ）として調製されたものをマウス当り０．１ｍｌずつ２回／週（ｄａｙｓ０、３、７、１０、１４、１７）で尾静脈投与した。全ての動物に対して、注射開始時および試験期間中に、投与直前の一般症状の観察および体重測定を行った。癌細胞移植後、群毎の平均腫瘍サイズが４４．１ｍｍ３に達したときから１８日目まで総９回、個体毎にＶｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒを用いて３方向を測定した後、長さ（ｌｅｎｇｔｈ）×幅（ｗｉｄｔｈ）×高さ（ｈｅｉｇｈｔ）／２の計算式により計算した。薬物投与開始１８日目に、眼窩静脈からヘパリンチューブを用いて採血（５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離、上清である血漿のみを分離しｖｉａｌに分注して−７０℃で保管）した後、ＣＯ２ガスでマウスを安楽死させてから、腫瘍を分離して化学天秤（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂａｌａｎｃｅ）で重量を測定し、腫瘍組織の写真を撮影した。
【０１６７】
実施例７−５．ヒト由来大膓癌細胞株（ＳＷ４８０）が移植されたマウスでの血液を用いた肝毒性指標物質の分析
坑癌薬効の評価を行ったマウスからの採血により血液中の血漿を分離し、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）分析キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、米国）分析溶液に適切な希釈比率で希釈して、ウェル当り２０μＬとなるように入れ、また、血漿中のアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の量の定量を助ける標準物質もともに用意して入れた後、分析キット内の方法に従って反応溶液（分析溶液を含む酵素および染色試薬混合物）を製造してウェル当り総１００μＬとなるように入れてよく混ぜてから、５７０ｎｍでＯＤをスペクトロフォトメータで測定した。
【０１６８】
その結果、図１０ａおよび図１０ｂに示されたように、サバイビンを標的遺伝子とする生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸の候補物質複合体を用いて、先ず、ヒト由来大膓癌細胞での細胞生存率が抑制されることを確認し、標的遺伝子であるサバイビンおよび下位遺伝子のタンパク質の発現も抑制されることを確認した。図１１ａ〜図１１ｅの結果のように、ヒト由来大膓癌細胞株が移植されたマウスにおける尾静脈投与による動物実験において、投与翌日から最終日まで、陰性対照物質に比べて全ての物質投与群で、試験期間中に特異な一般症状および統計的に有意な体重減少は観察されなかった。また、腫瘍サイズの場合、最終日（ｄａｙ１８）の結果を見ると、陰性対照物質１ｍｇ／ｋｇ投与群に比べて、物質１、２、３の１ｍｇ／ｋｇ投与群では、それぞれ１８．９％（ｐ＜０．０１）、８．２％、８．９％、陰性対照物質２ｍｇ／ｋｇ投与群に比べて、物質１、２、３の２ｍｇ／ｋｇ投与群では、それぞれ４０．１％（ｐ＜０．００１）、２８．０％（ｐ＜０．００１）、３１．７％（ｐ＜０．００１）の腫瘍成長抑制効果が現れた。さらに、最終日の腫瘍重量の場合、薬物投与開始１８日目にＳＷ４８０腫瘍（ｔｕｍｏｒ）を切除してその重量を測定した結果、陰性対照物質１ｍｇ／ｋｇ投与群に比べて、物質１、２、３の１ｍｇ／ｋｇ投与群では、それぞれ１８．９％（ｐ＜０．０１）、８．９％、８．５％、陰性対照物質２ｍｇ／ｋｇ投与群に比べて、物質１、２、３の２ｍｇ／ｋｇ投与群では、それぞれ４０．７％（ｐ＜０．００１）、２８．９％（ｐ＜０．００１）、３２．７％（ｐ＜０．００１）の腫瘍重量の減少があったことを確認することができた。最後に、坑癌薬効評価で用いられたマウスから採血して肝毒性指標物質を比較した結果、全ての投与群で特異的に肝毒性が確認されなかった。
【０１６９】
実施例８：新規複合体を用いた、ヒト由来乳癌細胞および肺癌細胞での血管内皮成長因子の抑制による坑癌薬理効果の確認
多くの癌細胞で高い発現が確認されている血管内皮成長因子であるＶＥＧＦは、癌細胞で細胞血管増殖を誘導すると知られている。そのため、これに対する新規複合体を用いてＶＥＧＦを抑制し、坑癌薬理効果を確認しようとした。
【０１７０】
実施例８−１．細胞培養
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手したヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）とヒト肺癌細胞（Ａ５４９）を、ＤＭＥＭ培養バッジ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加して、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１７１】
実施例８−２．細胞培養、および生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内への導入
血管内皮成長因子を抑制するための新規複合体として、血管成長の必須遺伝子であるＶＥＧＦ  ｍＲＮＡと相補的な配列（配列番号４１）の生理活性ペプチド核酸を製作し、生理活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸（配列番号４２〜４３）を製作した後、同量をハイブリダイズして複合体を製作した（表３参照）。生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の処理方法は、実施例２と同様であった。
【０１７２】
【表３】
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【０１７３】
実施例８−３．ヒト由来乳癌細胞と肺癌細胞株での細胞生存率の分析
新規複合体の血管内皮成長因子の抑制程度を分析するために、実施例８−１で培養された細胞を９６−ウェルプレートにウェル当り６ｘ１０３ｃｅｌｌｓ培養し、複合体で処理後、２４、４８、７２および９６時間の間隔で培養した後、処理時間経過後に実施例６−２の実験条件で細胞生存率を確認した。
【０１７４】
実施例８−４．ウエスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）による遺伝子発現の分析
新規複合体の血管内皮成長因子の抑制程度を分析するために、実施例７−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当り１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ培養し、複合体で処理後、２４、４８、７２および９６時間の間隔で培養した後、処理時間経過後に実施例４−３の実験条件で抗−ＶＥＧＦ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，  米国）および抗−ｐ−Ａｋｔ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  米国）を用いてタンパク質の発現を分析した。
【０１７５】
実施例８−５．流細胞分析器（ＦＡＣＳ）による細胞死滅の分析
新規複合体の血管内皮成長因子の抑制による細胞死滅を分析するために、実施例７−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当り１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ培養し、複合体で処理後、７２時間培養した後、細胞を収集してからＦＩＴＣ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ、米国）のＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ５００μＬによく溶解した。その後、ＦＩＴＣ  Ａｎｎｅｘｉｎ  ＶとＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎをそれぞれ５μＬ処理した後、流細胞分析器専用のチューブに移してから用いて、処理時間経過後にＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ，米国）で分析した。
【０１７６】
実施例８−６．ゼブラフィッシュを用いた坑癌薬理の評価
２日間培養器で培養した後に得られたゼブラフィッシュの卵を用いた。具体的に、実施例８−１の方法によって培養されるヒト由来乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１をＣｅｌｌＴｒａｃＴＭ  ＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）を用いて緑色で３０分間染色してから収集し、ゼブラフィッシュ１匹当り１５０個の染色されたヒト由来乳癌細胞を微注入法によりゼブラフィッシュ幼虫に注入した。ヒト由来乳癌細胞が注入されたゼブラフィッシュを、新規複合体が含まれた水が入っている９６ウェルプレートに分注した後、４日間培養器で培養した。４日間培養した後には、０．０４％のトリカイン（ｔｒｉｃａｉｎｅ）を用いて麻酔した後、蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ、日本）で分析した。
【０１７７】
その結果、図１２ａ〜図１２ｃに示されたように、新規複合体による血管内皮成長因子の抑制によって細胞生存率が抑制されることが、ヒト由来乳癌細胞と肺癌細胞で確認された。また、血管内皮成長因子であるＶＥＧＦと下位遺伝子であるｐ−Ａｋｔ１のタンパク質の発現が抑制されることが確認された。また、血管内皮成長因子が抑制されて細胞死滅が誘導されることを確認するために、流細胞分析器で確認した結果、生理活性ペプチド核酸と結合するキャリアペプチド核酸の長さおよび電荷の性質が異なる複合体を分析したところ、それぞれ３．２％と２％の細胞死滅が誘導されることが確認された。最後に、坑癌薬理効果を確認するために動物モデルとして用いられるゼブラフィッシュにヒト由来乳癌細胞を移植した後確認した結果、図１３の結果のように、移植された乳癌細胞の成長が抑制される効果を確認することができた。
【０１７８】
実施例９：新規複合体を用いたヒト由来網膜色素上皮細胞での血管内皮成長因子の抑制の確認
老人性黄斑変性の原因と知られている黄斑における血管内皮成長因子であるＶＥＧＦに対する新規複合体を、ヒト由来網膜色素上皮細胞に処理して血管生成を抑制するかを確認した。
【０１７９】
実施例９−１．細胞培養
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手したヒト網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培養バッジ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ／  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２、Ｇｉｂｃｏ、米国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加して、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１８０】
実施例９−２．細胞培養、および生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内への導入  
血管内皮成長因子を抑制するための新規複合体は実施例７−２と同様に使用して、新規複合体の処理方法は実施例２と同様であった。
【０１８１】
実施例９−３．ヒト由来網膜色素上皮細胞株での細胞生存率の分析
新規複合体の血管内皮成長因子の抑制程度を分析するために、実施例９−１で培養された細胞を９６−ウェルプレートにウェル当り６ｘ１０３ｃｅｌｌｓ培養し、複合体で処理後、２４、４８、７２、９６および１２０時間の間隔で培養した後、処理時間経過後に実施例６−２の実験条件で細胞生存率を確認した。
【０１８２】
実施例９−４．ウエスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）による遺伝子発現の分析
新規複合体の血管内皮成長因子の抑制程度を分析するために、実施例９−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当り１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ培養し、複合体で処理後、２４、４８、７２、９６および１２０時間の間隔で培養した後、処理時間経過後に実施例４−３の実験条件で抗−ＶＥＧＦ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，米国）、抗−ｐ−Ａｋｔ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，米国）および  抗−ｐ−ＥＲＫ−１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，米国）を用いてタンパク質の発現を分析した。
【０１８３】
その結果、図１４ａおよび１４ｂに示されたように、新規複合体を処理することで、ヒト由来網膜色素上皮細胞での細胞生存率が抑制されることが確認され、同様に、ＶＥＧＦおよび下位遺伝子であるｐ−Ａｋｔ−１とｐ−ＥＲＫ−１のタンパク質の発現が抑制されることを確認することができた。
【０１８４】
実施例１０：新規複合体を用いた、乾癬に対する抗炎症薬理効果の確認
新規複合体を用いて皮膚疾患である乾癬に対する効能を検証するために、標的遺伝子であるＩＦＩ１６（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １６）を抑制して抗炎症薬理効果を確認しようとした。
【０１８５】
実施例１０−１．細胞培養
ＣＬＳ（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）  から入手したヒト由来表皮角化細胞（ＨａＣａＴ）を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培養バッジ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＷＥＬＧＥＮＥ、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加して、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１８６】
実施例１０−２．細胞培養、および生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内への導入
ＩＦＩ１６を抑制するための新規複合体として、ＩＦＩ１６  ｍＲＮＡと相補的な配列（配列番号４４〜４７）の生理活性ペプチド核酸を製作し、生理活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸（配列番号４８）を製作した後、同量をハイブリダイズして複合体を製作した（表４参照）。生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている複合体の処理方法は、実施例２と同様であった。
【０１８７】
【表４】
2019526624.tif 000007
【０１８８】
実施例１０−３．ヒト由来の表皮角化細胞株での細胞生存率の分析
ＩＦＩ１６の抑制程度を分析するために、実施例１０−１で培養された細胞を９６−ウェルプレートにウェル当り６ｘ１０３細胞を２４時間培養した後、生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体で処理し、ヒト表皮角化細胞の炎症反応を誘導するために、ＩＬ−１７Ａを２０ｎｇ／ｍＬで処理してから、７２、９６および１２０時間培養した後、実施例６−２の実験条件で細胞生存率を確認した。
【０１８９】
実施例１０−４．ウエスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）による遺伝子発現の分析
新規複合体のＩＦＩ１６の抑制程度を分析するために、実施例１０−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当り１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ培養し、複合体で処理後、７２、９６、１２０および１４４時間の間隔で培養した後、処理時間経過後に実施例４−３の実験条件で抗−ＩＦＩ１６抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，米国）および抗−ｐ−ＮＦ−ｋＢ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，米国）を用いてタンパク質の発現を分析した。
【０１９０】
実施例１０−５．イミキモドを用いたＢａｌｂ／Ｃマウス乾癬モデルの誘導、および生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いたイミキモド乾癬モデルでの表現型変化の分析
６週齢のＢａｌｂ／Ｃ雄マウスの右側耳に、毎日２０ｍｇのイミキモドを１２日間塗布することで乾癬を誘導したマウスモデルに、新規複合体を２日に１回ずつ総１２日間（６回）液状またはクリームで塗布し、右側耳の厚さを測定（マイクロメーター）し、乾癬誘導前の初期右側耳の厚さと、乾癬誘導後、対照群に対する新規複合体処理群の耳厚さの差を確認した。
【０１９１】
実施例１０−６．イミキモドを用いたＢａｌｂ／Ｃマウス乾癬誘導モデルでの新規複合体を用いた遺伝子発現の抑制
実施例１０−５と同様の条件で新規複合体を塗布した後、マウスの右側耳をバイオプシーして総タンパク質を抽出し、ＢＣＡ定量法（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙ）を用いてタンパク質を定量した。実施例１０−４の方法によりタンパク質の発現を確認した。
【０１９２】
実施例１０−７．イミキモドを用いたＢａｌｂ／Ｃマウス乾癬誘導モデルでの、生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いた組織内角化細胞の異常増殖の抑制
実施例１０−５と同様の条件で新規複合体を塗布した後、マウスの右側耳をバイオプシーして４％のホルムアルデヒド溶液で固定した後、パラフィン包埋して製作したパラフィンブロックをミクロトームで切片とし、脱パラフィンした組織をスライドガラスに載せてマウンティングして、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ）染色のための準備をした。
【０１９３】
その結果、図１５ａおよび図１５ｂに示されたように、ヒト由来の表皮角化細胞株は、ＩＦＩ１６を標的遺伝子とする新規複合体で処理した時に、細胞生存率が減少することが確認され、ＩＦＩ１６標的遺伝子および下位経路遺伝子であるｐ−ＮＦ−ｋＢのタンパク質の発現が減少することが確認された。乾癬に対する新規複合体の抗炎症薬理効果を確認するための動物実験を行った結果、図１６に示されたように、乾癬を誘導していない陰性対照群に比べて、イミキモドで乾癬を誘導した陽性対照群で、マウスの右側耳の厚さが増加しており、ＩＦＩ１６を標的とする新規複合体で処理した群で、陰性対照群と類似の程度で耳の厚さが減少することを確認した。また、実験動物でバイオプシーした組織を用いて標的遺伝子の発現が抑制されるかを確認した結果、ＩＦＩ１６の発現が増加された陽性対照群と異なって、新規複合体で処理した群では、ＩＦＩ１６の発現が減少することが確認された。最後に、実験で使用したマウスのバイオプシーによりＨ＆Ｅ染色を行った結果、陰性対照群に比べて、陽性対照群で表皮の角化細胞の増殖が増加することを確認し、新規複合体を塗布した群では、表皮の角化細胞増殖が減少することを確認した。
【０１９４】
実施例１１：新規複合体を用いたヒト由来乳癌細胞での免疫坑癌効果の確認
多くの癌細胞遺伝子の表面で発現されるＰＤ−Ｌ１により、Ｔ細胞のＰＤ−１と結合して免疫細胞による死滅が誘導されず、癌細胞の増殖を誘導し続けると知られている。そのため、高い発現を示すヒト由来乳癌細胞で、ＰＤ−Ｌ１を標的とする新規複合体を用いてＰＤ−Ｌ１を抑制して免疫坑癌効果を確認しようとした。
【０１９５】
実施例１１−１．細胞培養
実施例８−１と同様の方法で培養した。
【０１９６】
実施例１１−２．細胞培養、および生理活性ペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内への導入
ＰＤ−Ｌ１を抑制するための新規複合体として、癌細胞の表面に発現しているＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡと相補的な配列（配列番号４９）の生理活性ペプチド核酸を製作し、生理活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸（配列番号５０）を製作した後、同量をハイブリダイズして複合体を製作した（表５参照）。生物学的活性を有するペプチド核酸およびキャリアペプチド核酸が結合されている新規複合体の処理方法は、実施例２と同様であった。
【０１９７】
【表５】
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【０１９８】
実施例１１−３．ウエスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）による遺伝子発現の分析
新規複合体のＰＤ−Ｌ１の抑制程度を分析するために、実施例１１−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当り１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ培養し、複合体で処理後、９６、１２０および１４４時間の間隔で培養した後、処理時間経過後に実施例４−３の実験条件で抗−ＰＤ−Ｌ１抗体(Ａｂｃａｍ、英国)を用いてタンパク質の発現を分析した。
【０１９９】
その結果、図１７に示されたように、新規複合体で処理することで、ヒト由来乳癌細胞での標的遺伝子であるＰＤ−Ｌ１のタンパク質の発現が、陰性対照群に比べて抑制されることを確認することができた。
【０２００】
実施例１２：新規複合体を用いた細菌増殖の抑制
新規複合体を用いて、細菌の増殖に必須遺伝子と知られたａｃｐＰを標的遺伝子とし、複合体によって細菌増殖も抑制されるかを確認しようとした。
【０２０１】
実施例１２−１．細菌培養
細菌ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、韓国）をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ｂｒｏｔｈに接種した後、３０℃で１０５ＣＦＵとなるように培養した。
【０２０２】
実施例１２−２．細菌増殖抑制用新規複合体の製作
細菌増殖を抑制するための新規複合体として、細菌の必須遺伝子であるａｃｐＰ  ｍＲＮＡと相補的な配列（配列番号５１）の生理活性核酸を製作し、生理活性核酸と相補的なキャリアペプチド核酸（配列番号５２）を製作した後、同量をハイブリダイズして複合体を製作した（表６参照）。
【０２０３】
【表６】
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【０２０４】
実施例１２−３．複合体の細菌増殖抑制の分析
新規複合体の細菌増殖抑制程度を分析するために、実施例１２−１で培養された細菌に、実施例６−２で製作された複合体を１μＭの濃度で２４時間処理した後、段階希釈した培養液を固体培地に同量ずつ落としてから、１２、２４、４８時間観察した。その結果、図１８に示されたように、１本鎖からなる生理活性核酸のみで処理した実験区に比べて、複合体形態で処理した実験区の成長が阻害されることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０２０５】
本発明の構造式（１）による生理活性核酸およびキャリアペプチド核酸を含む核酸複合体は、生理活性核酸の安定性を高め、生理活性核酸の自己凝集（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）などによる沈澱などの損失を減少させることができ、細胞内への生理活性核酸の伝達効率を高め、標的遺伝子の発現を容易に調節することができる。
【０２０６】
特に、本発明による核酸複合体における生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の結合は、生理活性核酸の標的遺伝子の塩基配列の存在下でのみ分離されるため、前記生理活性核酸の単独の細胞内への導入に比べて、標的遺伝子に対する選択性および特異度が高く、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との様々な構造の組み合わせにより結合力を調節して複合体を製造することができるため、生理活性核酸の細胞内（または細胞外で）作用時点の調節が可能であるという利点がある。
【０２０７】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
2019526624.tif 000034
【図８ｅ】
2019526624.tif 000035
【図９ａ】
2019526624.tif 000036
【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
2019526624.tif 000040
【図１１ｂ】
2019526624.tif 000041
【図１１ｃ】
2019526624.tif 000042
【図１１ｄ】
2019526624.tif 000043
【図１１ｅ】
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【図１２ａ】
2019526624.tif 000045
【図１２ｂ】
2019526624.tif 000046
【図１２ｃ】
2019526624.tif 000047
【図１３】
2019526624.tif 000048
【図１４ａ】
2019526624.tif 000049
【図１４ｂ】
2019526624.tif 000050
【図１５ａ】
2019526624.tif 000051
【図１５ｂ】
2019526624.tif 000052
【図１６ａ】
2019526624.tif 000053
【図１６ｂ】
2019526624.tif 000054
【図１６ｃ】
2019526624.tif 000055
【図１７】
2019526624.tif 000056
【図１８】
2019526624.tif 000057
【配列表】
2019526624000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月27日(2019.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）の構造を有する核酸複合体:
［構造式（１）］
［Ａ≡Ｃ（＋）］
前記構造式（１）中、
Ａは、標的とする遺伝子と結合可能な配列、または標的とする遺伝子配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生理活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
「≡」は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との相補的な結合を意味し、
Ａで表される生理活性核酸は、全体的に陰電荷を有するペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ＰＡＮ）であり、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を有することを意味し
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を帯びるように改変されたペプチド核酸単量体を１つ以上含む。
【請求項２】
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、各々２個〜５０個の核酸単量体を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項３】
全体的に陽電荷を有すること特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項４】
前記キャリアペプチド核酸は、前記生理活性核酸と一部もしくは全部が相補的な配列で構成されることを特徴とし、前記一部が相補的な配列で構成されるキャリアペプチド核酸は、１つ以上のユニバーサル塩基を含む、請求項１に記載の核酸複合体。 
【請求項５】
前記キャリアペプチド核酸は、全体的に陽電荷を有するように１個以上のガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とし、前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、陽電荷のアミノ酸を有する単量体が、陰電荷のアミノ酸を有する単量体に比べてより多く含まれ、全体的にキャリアペプチド核酸の電荷が陽性となることを特徴とする、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項６】
前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、電気的陽性を有するようにリジン（Ｌｙｓｉｎｅ，  Ｌｙｓ，  Ｋ），  アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，  Ａｒｇ，  Ｒ），  ヒスチジン  （Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，  Ｈｉｓ，  Ｈ），  ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ，  ＤＡＢ），  オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ，  Ｏｒｎ）およびアミノ酸類似体で構成された群から選択される１つ以上の陽電荷を有するアミノ酸をバックボーンに含むことを特徴とする請求項５に記載の核酸複合体。
【請求項７】
前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、陰電荷を有するアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ，Ｇｌｕ，Ｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ，Ａｓｐ，Ｄ）またはアミノ酸類似体をバックボーンに含むことを特徴とする請求項６に記載の核酸複合体。
【請求項８】
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の結合は、それぞれの５´−方向性と３´−方向性に基づいて、平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）または逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）の結合であることを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項９】
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）は、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項１０】
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）または部分的特異的結合(Ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ)により互いに結合することによって、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）が、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする請求項９に記載の核酸複合体。
【請求項１１】
前記キャリアペプチド核酸は、リンカー、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）、および生理活性核酸の対応する塩基と相補的ではないペプチド核酸塩基から選択される１つ以上のペプチド核酸塩基を有することにより、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）が、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする請求項９に記載の核酸複合体。
【請求項１２】
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力を調節することで、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の分離時点および生理活性核酸と生理活性核酸の標的遺伝子との結合時点が調節されることを特徴とする請求項９に記載の核酸複合体。
【請求項１３】
前記ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）およびウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）などの天然塩基、並びに、イノシンＰＮＡ（ｉｎｏｓｉｎｅ  ＰＮＡ）、インドールＰＮＡ（ｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、ニトロインドールＰＮＡ（ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、および無塩基（ａｂａｓｉｃ）といった、選択性なしに結合し、相補的な結合力より低い結合力を有する塩基からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１１に記載の核酸複合体。
【請求項１４】
疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光剤、 蛍光マーカーおよび発光マーカーからなる群から選択される１つ以上の物質が、生理活性核酸および／またはキャリアペプチド核酸に結合されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項１５】
前記疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光剤、 蛍光マーカーおよび発光マーカーからなる群から選択される１つ以上の物質と、生理活性核酸および／またはキャリアペプチド核酸との結合は、単純共有結合またはリンカー媒介性の共有結合であることを特徴とする請求項１４に記載の核酸複合体。
【請求項１６】
前記核酸複合体は、５ｎｍ〜３００ｎｍの粒子サイズを有することを特徴とし、前記核酸複合体の粒子サイズは、核酸複合体の電荷平衡を調節することで調節されることを特徴とする請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項１７】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む、標的遺伝子の発現調節用組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む疾病の予防または治療用組成物であって、前記疾病は、癌、炎症性疾患、老人性黄斑変性、希少疾患および重症疾患、心血管疾患、代謝性疾患または皮膚疾患であることを特徴とする、前記治療用組成物。
【請求項１９】
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＶＥＧＦ、アンドロゲンレセプター（Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＫＲＡＳ、クラスタリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）、ＴＧＦβＲ２、ＥＲＢＢ３、トランスグルタミナーゼ  ２（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ２）、ＡＢＣＢ１、Ｈｓｐ２７、ＳＴＡＴ３およびＰＤ−Ｌ１、ＩＦＩ１６、ＴＬＲ６、ＴＩＥＧ１、ＰＤＥ４Ｂ、Ｐｅｌｌｉｎｏ−１、ＳＭＮ２、ＡｐｏＢ−１００、ＩＣＡＭ−１、ＡｐｏＣＩＩＩ、ＴＴＲ、ＨＴＴ、ＧＨｒ、ＳＯＤ１、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＫＫ、ｍｉＲ−２１、ＴＭＰＲＳＳ６、ＦＭＲ１およびＣｏｎｎｅｘｉｎ  ２６からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１８に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
また、本発明は、本発明による核酸複合体および／またはそれを含む薬学的組成物を、治療を要する患者に投与することを含む、疾病の治療方法を提供する。
また、本発明は、以下のものを提供する。
[項目１]
下記構造式（１）の構造を有する核酸複合体:
［構造式（１）］
［Ａ≡Ｃ（＋）］
前記構造式（１）中、
Ａは、標的とする遺伝子と結合可能な配列、または標的とする遺伝子配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生理活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
「≡」は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との相補的な結合を意味し、
Ａで表される生理活性核酸は、全体的に陰電荷または中性を有し、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を有することを意味し
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に陽電荷を帯びるように改変されたペプチド核酸単量体を１つ以上含む。
[項目２]
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、各々２個〜５０個の核酸単量体を含むことを特徴とする項目１に記載の核酸複合体。
[項目３]
前記生理活性核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡおよび改変されたペプチド核酸で構成された群から選択された核酸単量体からなることを特徴とする項目１に記載の核酸複合体。
[項目４]
全体的に陽電荷を有すること特徴とする項目１に記載の核酸複合体。
[項目５]
前記キャリアペプチド核酸は、前記生理活性核酸と一部もしくは全部が相補的な配列で構成されることを特徴とする項目１に記載の核酸複合体。 
[項目６]
前記一部が相補的な配列で構成されるキャリアペプチド核酸は、１つ以上のユニバーサル塩基を含むことを特徴とする項目５に記載の核酸複合体。
[項目７]
前記キャリアペプチド核酸は、全体的に陽電荷を有するように１個以上のガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とする項目１に記載の核酸複合体。
[項目８]
前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、電気的陽性を有するようにリジン（Ｌｙｓｉｎｅ，  Ｌｙｓ，  Ｋ），  アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，  Ａｒｇ，  Ｒ），  ヒスチジン  （Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，  Ｈｉｓ，  Ｈ），  ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ，  ＤＡＢ），  オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ，  Ｏｒｎ）およびアミノ酸類似体で構成された群から選択される１つ以上の陽電荷を有するアミノ酸をバックボーンに含むことを特徴とする項目７に記載の核酸複合体。
[項目９]
前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、陰電荷を有するアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ，Ｇｌｕ，Ｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ，Ａｓｐ，Ｄ）またはアミノ酸類似体をバックボーンに含むことを特徴とする項目８に記載の核酸複合体。
[項目１０]
前記ガンマ−またはアルファ−バックボーン改変ペプチド核酸単量体は、陽電荷のアミノ酸を有する単量体が、陰電荷のアミノ酸を有する単量体に比べてより多く含まれ、全体的にキャリアペプチド核酸の電荷が陽性となることを特徴とする項目８に記載の核酸複合体。
[項目１１]
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の結合は、それぞれの５´−方向性と３´−方向性に基づいて、平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）または逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）の結合であることを特徴とする項目１に記載の核酸複合体。
[項目１２]
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）は、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする項目１に記載の核酸複合体。
[項目１３]
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）または部分的特異的結合(Ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ)により互いに結合することによって、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）が、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする項目１２に記載の核酸複合体。
[項目１４]
前記キャリアペプチド核酸は、リンカー、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）、および生理活性核酸の対応する塩基と相補的ではないペプチド核酸塩基から選択される１つ以上のペプチド核酸塩基を有することにより、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）が、生理活性核酸と、生理活性核酸の標的遺伝子との間の結合力よりも低いことを特徴とする項目１２に記載の核酸複合体。
[項目１５]
前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との間の結合力を調節することで、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の分離時点および生理活性核酸と生理活性核酸の標的遺伝子との結合時点が調節されることを特徴とする項目１２に記載の核酸複合体。
[項目１６]
前記ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）およびウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）などの天然塩基、並びに、イノシンＰＮＡ（ｉｎｏｓｉｎｅ  ＰＮＡ）、インドールＰＮＡ（ｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、ニトロインドールＰＮＡ（ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、および無塩基（ａｂａｓｉｃ）といった、選択性なしに結合し、相補的な結合力より低い結合力を有する塩基からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする項目１４に記載の核酸複合体。
[項目１７]
疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光剤、 蛍光マーカーおよび発光マーカーからなる群から選択される１つ以上の物質が、生理活性核酸および／またはキャリアペプチド核酸に結合されていることを特徴とする項目１に記載の核酸複合体。
[項目１８]
前記疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光剤、 蛍光マーカーおよび発光マーカーからなる群から選択される１つ以上の物質と、生理活性核酸および／またはキャリアペプチド核酸との結合は、単純共有結合またはリンカー媒介性の共有結合であることを特徴とする項目１７に記載の核酸複合体。
[項目１９]
前記核酸複合体は、５ｎｍ〜３００ｎｍの粒子サイズを有することを特徴とする項目１に記載の核酸複合体。
[項目２０]
前記核酸複合体の粒子サイズは、核酸複合体の電荷平衡を調節することで調節されることを特徴とする項目１９に記載の核酸複合体。 
[項目２１]
項目１〜２０のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む、標的遺伝子の発現調節用組成物。
[項目２２]
項目１〜２０のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む疾病の予防または治療用組成物。
[項目２３]
前記疾病は、癌、炎症性疾患、老人性黄斑変性、希少疾患および重症疾患、心血管疾患、代謝性疾患または皮膚疾患であることを特徴とする項目２２に記載の組成物。
[項目２４]
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＶＥＧＦ、アンドロゲンレセプター（Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＫＲＡＳ、クラスタリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）、ＴＧＦβＲ２、ＥＲＢＢ３、トランスグルタミナーゼ  ２（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ２）、ＡＢＣＢ１、Ｈｓｐ２７、ＳＴＡＴ３およびＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする項目２３に記載の組成物。
[項目２５]
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＶＥＧＦであることを特徴とする項目２３に記載組成物。
[項目２６]
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＩＦＩ１６、ＴＬＲ６およびＴＩＥＧ１からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする項目２３に記載の組成物。
[項目２７]
前記皮膚疾患は、乾癬、色素沈着関連皮膚疾患、およびアトピー疾患から選択されることを特徴とする項目２６に記載の組成物。
[項目２８]
水性溶液、クリーム、ゲル、ペースト、ローションおよび軟膏から選択されるいずれか一つの剤型を有することを特徴とする項目２７に記載の治療用組成物。
[項目２９]
前記核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＰＤＥ４ＢおよびＰｅｌｌｉｎｏ−１からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする項目２３に記載の組成物。
[項目３０]
核酸複合体中に含まれた生理活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＳＭＮ２、ＡｐｏＢ−１００、ＩＣＡＭ−１、ＡｐｏＣＩＩＩ、ＴＴＲ、ＨＴＴ、ＧＨｒ、ＳＯＤ１、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＫＫ、ｍｉＲ−２１、ＴＭＰＲＳＳ６、ＦＭＲ１およびＣｏｎｎｅｘｉｎ  ２６からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする項目２３に記載の組成物。
[項目３１]
項目１〜２０のいずれかに記載の核酸複合体を含む疾病の診断用組成物。
[項目３２]
項目１〜２０のいずれかに記載の核酸複合体を用いることを含む、標的遺伝子の発現調節方法。
[項目３３]
構造式（１）の核酸複合体の電荷平衡を調節することを含む、前記核酸複合体の粒子サイズ調節方法。
【国際調査報告】
2019526624.tif 000058
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2019526624.tif 000060
2019526624.tif 000061
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