(57)【要約】  ＰＳ標的化抗体で治療可能な癌患者を特定および治療するための、特にバビツキシマブおよびバビツキシマブ併用療法を使用して癌患者を特定および治療するための、驚くべき新たな方法およびキットが開示される。本方法およびキットは、β２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）、特に機能性β２ＧＰＩの定義された範囲の治療前血中濃度が、より良好な治療結果を有する患者を正確に予測する指標として作用するという驚くべき発見に基づく。【選択図】図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において癌を治療する方法における使用のためのバビツキシマブであって、機能性β２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）が、前記患者の血液試料中に２００μｇ／ｍｌ以上の濃度で存在し、前記機能性β２ＧＰＩが、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびバビツキシマブの両方に結合し、バビツキシマブが、第１の抗癌剤であり、前記方法が、少なくとも第２の抗癌剤を投与することをさらに含む、方法。
【請求項２】
前記方法が、
（ａ）前記患者の血液試料中の前記機能性β２ＧＰＩの濃度を特定することと、
（ｂ）機能性β２ＧＰＩの血中濃度が２００μｇ／ｍｌ以上である場合、バビツキシマブおよび少なくとも第２の抗癌剤を前記患者に投与することと、を含む、請求項１に記載の使用のためのバビツキシマブ。
【請求項３】
前記患者が、卵巣癌、胃癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、乳癌、食道癌、悪性神経膠腫、膠芽腫、前立腺癌、黒色腫、頭頸部癌、腎細胞癌、膀胱癌、膵臓癌、または肺癌を有する、請求項１または２に記載の使用のためのバビツキシマブ。
【請求項４】
前記患者が、膵臓癌または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する、請求項１または２に記載の使用のためのバビツキシマブ。
【請求項５】
前記少なくとも第２の抗癌剤が、化学療法剤または免疫チェックポイント抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのバビツキシマブ。
【請求項６】
前記化学療法剤が、ソラフェニブ、パクリタキセル、カルボプラチン、ゲムシタビン、またはドセタキセルである、請求項５に記載の使用のためのバビツキシマブ。
【請求項７】
前記免疫チェックポイント抗体が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＰＤ−Ｌ１に結合する遮断抗体である、請求項５に記載の使用のためのバビツキシマブ。
【請求項８】
前記免疫チェックポイント抗体が、トレメリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ、またはアテゾリズマブである、請求項５に記載の使用のためのバビツキシマブ。
【請求項９】
前記方法が、第３の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のためのバビツキシマブ。
【請求項１０】
機能性β２ＧＰＩの血中濃度が、２００μｇ／ｍｌ〜２９０μｇ／ｍｌである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのバビツキシマブ。
【請求項１１】
前記機能性β２ＧＰＩが、
（ａ）ＥＬＩＳＡプレートをホスファチジルセリン（ＰＳ）でコーティングして、ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートを調製することと、
（ｂ）バビツキシマブおよび前記血液試料を、前記血液試料中のβ２ＧＰＩを前記バビツキシマブおよび前記ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートの両方に結合させるのに有効な条件下で、前記ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートに添加することと、
（ｃ）前記ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートへのバビツキシマブおよびβ２ＧＰＩの前記結合を検出し、それによって前記血液試料中の前記機能性β２ＧＰＩを測定することと、を含む、アッセイにおいて測定される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのバビツキシマブ。
【請求項１２】
前記血液試料が、血漿試料である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のためのバビツキシマブ。
【請求項１３】
前記血液試料が、血清試料である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のためのバビツキシマブ。
【請求項１４】
第１の抗癌剤および少なくとも第２の抗癌剤で治療可能な癌患者を診断する方法であって、前記第１の抗癌剤が、バビツキシマブであり、前記方法が、前記患者の血液試料中の機能性β２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）の濃度を測定することを含み、前記機能性β２ＧＰＩの血中濃度が２００μｇ／ｍｌ以上である場合、前記患者がバビツキシマブおよび前記少なくとも第２の抗癌剤で治療可能であると決定され、前記機能性β２ＧＰＩが、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびバビツキシマブの両方に結合する、方法。
【請求項１５】
前記患者が、前記第１ならびに少なくとも第２および第３の抗癌剤で治療可能である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヒト患者において癌を治療するための方法であって、第１および少なくとも第２の抗癌剤を前記患者に投与することを含み、前記第１の抗癌剤が、バビツキシマブであり、前記患者が、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）の治療前血中濃度を有し、前記機能性β２ＧＰＩが、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびバビツキシマブの両方に結合する、方法。
【請求項１７】
ヒト患者において癌を治療するための方法であって、
（ａ）前記患者から得られた治療前血液試料中の機能性β２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）の濃度を測定することであって、前記機能性β２ＧＰＩが、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびバビツキシマブの両方に結合する、測定することと、
（ｂ）２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前血中濃度を有する前記患者に、第１および少なくとも第２の抗癌剤を投与することであって、前記第１の抗癌剤が、バビツキシマブである、投与することと、を含む、方法。
【請求項１８】
ヒト患者において癌を治療するための方法であって、
（ａ）前記患者から治療前血液試料を得ることと、
（ｂ）前記治療前血液試料中の機能性β２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）の濃度を測定することであって、前記機能性β２ＧＰＩが、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびバビツキシマブの両方に結合する、測定することと、
（ｃ）２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前血中濃度を有する前記患者に、第１および少なくとも第２の抗癌剤を投与することであって、前記第１の抗癌剤が、バビツキシマブである、投与することと、を含む、方法。
【請求項１９】
第１および少なくとも第２の抗癌剤で治療可能なヒト癌患者を特定するための方法であって、前記第１の抗癌剤が、バビツキシマブであり、前記患者を治療することが、
（ａ）前記患者から得られた治療前血液試料中の機能性β２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）の濃度を測定することであって、前記機能性β２ＧＰＩが、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびバビツキシマブの両方に結合する、測定することと、
（ｂ）前記治療前血液試料中の機能性β２ＧＰＩの濃度が２００μｇ／ｍｌ以上である場合、前記患者をバビツキシマブおよび前記少なくとも第２の抗癌剤で治療可能であると特定することと、
（ｃ）２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前血中濃度を有する前記患者に、バビツキシマブおよび前記少なくとも第２の抗癌剤を投与することと、を含む、方法。
【請求項２０】
第１および少なくとも第２の抗癌剤で治療可能なヒト癌患者を特定するための方法であって、前記第１の抗癌剤が、バビツキシマブであり、前記患者を治療することが、
（ａ）前記患者から治療前血液試料を得ることと、
（ｂ）前記治療前血液試料中の機能性β２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）の濃度を測定することであって、前記機能性β２ＧＰＩが、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびバビツキシマブの両方に結合する、測定することと、
（ｃ）前記治療前血液試料中の機能性β２ＧＰＩの濃度が２００μｇ／ｍｌ以上である場合、前記患者をバビツキシマブおよび前記少なくとも第２の抗癌剤で治療可能であると特定することと、
（ｄ）２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前血中濃度を有する前記患者に、バビツキシマブおよび前記少なくとも第２の抗癌剤を投与することと、を含む、方法。
【請求項２１】
前記バビツキシマブが、前記患者に３ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１６〜０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも第２および第３の抗癌剤を前記患者に投与することをさらに含む、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者が、卵巣癌、胃癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、乳癌、食道癌、悪性神経膠腫、膠芽腫、前立腺癌、黒色腫、頭頸部癌、腎細胞癌、膀胱癌、膵臓癌、または肺癌を有する、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者が、膵臓癌または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が、非扁平上皮非小細胞肺癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも第２の抗癌剤が、化学療法剤または免疫チェックポイント抗体である、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記化学療法剤が、ソラフェニブ、パクリタキセル、カルボプラチン、ゲムシタビン、またはドセタキセルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫チェックポイント抗体が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＰＤ−Ｌ１に結合する遮断抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫チェックポイント抗体が、トレメリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ、またはアテゾリズマブである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
機能性β２ＧＰＩの血中濃度が２００μｇ／ｍｌ〜２９０μｇ／ｍｌである場合、前記患者がバビツキシマブおよび少なくとも第２の抗癌剤で治療可能であると決定される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項３１】
前記患者が、２００μｇ／ｍｌ〜２９０μｇ／ｍｌの機能性β２ＧＰＩの治療前血中濃度を有する、請求項１６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記血液試料が、血漿試料である、請求項１４、１５、または１７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記血液試料が、血清試料である、請求項１４、１５、または１７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記機能性β２ＧＰＩが、
（ａ）ＥＬＩＳＡプレートをホスファチジルセリン（ＰＳ）でコーティングして、ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートを調製することと、
（ｂ）バビツキシマブおよび前記血液試料を、前記血液試料中のβ２ＧＰＩを前記バビツキシマブおよび前記ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートの両方に結合させるのに有効な条件下で、前記ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートに添加することと、
（ｃ）前記ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートへのバビツキシマブおよびβ２ＧＰＩの前記結合を検出し、それによって前記血液試料中の前記機能性β２ＧＰＩを測定することと、を含む、アッセイにおいて測定される、請求項１４、１５、または１７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
機能性β２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）を測定する方法であって、前記機能性β２ＧＰＩが、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびバビツキシマブの両方に結合し、前記方法が、
（ａ）ＥＬＩＳＡプレートをホスファチジルセリン（ＰＳ）でコーティングして、ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートを調製することと、
（ｂ）バビツキシマブ、およびβ２ＧＰＩを含有することが疑われる生物学的試料を、前記試料中のβ２ＧＰＩを前記バビツキシマブおよび前記ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートの両方に結合させるのに有効な条件下で、前記ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートに添加することと、
（ｃ）前記ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートへのバビツキシマブおよびβ２ＧＰＩの前記結合を検出し、それによって前記試料中の前記機能性β２ＧＰＩを測定することと、を含む、前記方法。
【請求項３６】
前記生物学的試料が、血液試料である、請求項０に記載の方法。
【請求項３７】
前記血液試料が、血漿試料である、請求項３４または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記血液試料が、血清試料である、請求項３４または３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記バビツキシマブが、検出可能なシグナルを生成する検出可能な物質に結合しており、前記ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートへのバビツキシマブおよびβ２ＧＰＩの結合が、前記検出可能なシグナルの検出および測定によって検出および測定される、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
β２ＧＰＩを含有する前記試料の添加前に、前記バビツキシマブが前記ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートに添加される、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月１７日に出願された同時係属中の仮出願第６２／５０７，５８０号、２０１７年４月３日に出願された仮出願第６２／４８０，９９４号、２０１６年１０月１１日（２０１６年１０月１０日は米国における連邦休日）に出願された仮出願第６２／４０６，７２７号、および２０１６年９月２７日に出願された仮出願第６２／４００，５８９号に対する優先権を主張し、これらの出願の明細書、特許請求の範囲、図面、および順序全体が、権利放棄することなく参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、バイオマーカーの分野に関し、特に、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を使用する治療法に対する奏効の成功を予測するための指標としての、治療前レベルβ２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）、特に機能性β２ＧＰＩの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌およびウイルス感染症を含む全ての疾患と戦う上で、機能的な免疫系は、治療奏効の重要な一部分である。したがって、現在癌を治療するための戦略として認識されている、免疫腫瘍学（ＩＯ）の分野を含む免疫療法に対して、重要な研究がなされてきた。近年、免疫応答を操作する新たな標的および化合物が、研究者および臨床医によって研究されてきた。例えば、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）およびプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）を標的化するＩＯ剤が、既に一部の進行性悪性腫瘍の治療薬として承認を受けている一方で、他のＩＯ標的と相互作用する化合物は、現在開発中である。
【０００４】
それにも関わらず、これらの新たな免疫療法でさえ、特定の患者にしか有効ではない。したがって、旧来の治療法および新たな免疫治療法の両方に対する奏効の可変性、ならびに臨床的利益を最大化するという願望を考慮して、ＩＯ療法を含む治療結果を予測することができるバイオマーカーが、依然として必要とされている。一部の研究者が、個別化された予測アプローチを開発するための治療標的の利用に焦点を合わせている一方で、他の研究者は、結合および下流シグナル伝達分子の測定を利用することによる患者選択および識別の代替手段を模索している。
【０００５】
近年、膜リン脂質、ホスファチジルセリン（ＰＳ）が、宿主の免疫応答を調節する上流免疫チェックポイントとして作用する、特有かつ高度に免疫抑制性の分子として特定されている。これは、ＰＳが癌およびウイルス感染を含む様々な疾患において重要な役割を果たし、ＰＳを遮断するＰＳ標的化抗体の形態で免疫療法の新たな分野を切り拓くことを意味する。
【０００６】
主要なＰＳ標的化抗体は、３Ｇ４と呼ばれるマウスｍＡｂに由来するマウス−ヒトキメラモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、バビツキシマブである（Ｒａｎら、２００５；Ｈｕａｎｇら、２００５；米国特許第７，２４７，３０３号）。３Ｇ４およびバビツキシマブは、β２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）に依存した様式でＰＳを標的化する、マウス、キメラ、および完全ヒト抗体のファミリーの一部分である。すなわち、バビツキシマブおよび関連ＰＳ標的化抗体は、それらが高親和性抗体−β２ＧＰＩ−ＰＳ複合体を形成するように、β２ＧＰＩの存在下でＰＳに結合する（Ｌｕｓｔｅｒら、２００６）。治療法に対する奏効の測定および予測（Ｇｏｎｇら、２０１３；Ｓｔａｆｆｏｒｄら、２０１３）を含む、多数の撮像研究（Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎら、２００８；Ｍａｒｃｏｎｅｓｃｕ＆Ｔｈｏｒｐｅ、２００８；Ｓａｈａら、２０１０；Ｓｔａｆｆｏｒｄ＆Ｔｈｏｒｐｅ、  ２０１１；Ｚｈａｏら、２０１１；Ｚｈａｎｇら、２０１４；およびＺｈｏｕら、２０１４；米国特許第７，７９０，８６０号）によって特に示されているように、操作上、これらのβ２ＧＰＩ依存性ＰＳ標的化抗体は、インビボでＰＳに特異的である。
【０００７】
バビツキシマブは、ＰＳがマーカーである広範囲の疾患、特に癌およびウイルス感染症に対する活性だけでなく、寄生原虫であるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓなどの細胞内寄生体（Ｗａｎｄｅｒｌｅｙら、２０１３）、ならびにそれぞれペストおよび野兎病を引き起こすＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓなどの細胞内細菌病原体（Ｌｏｎｓｄａｌｅら、２０１１）の感染症に対する活性もまた実証している。ウイルス感染症に関して、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、ウイルス複製を阻害し、器官内のウイルス量を減少させ、生存率を増加させることが示されている（Ｓｏａｒｅｓら、２００８；Ｍｏｏｄｙら、２０１０；米国特許第７，９０６，１１５号）。バビツキシマブおよび関連ＰＳ標的化抗体の抗癌活性は、広範な数の前臨床研究および臨床試験において実証されており、これらにおいて、効果は、腫瘍血管に対してかつＰＳの免疫抑制シグナル伝達を遮断することによって媒介される（Ｒａｎら、２００５；米国特許第７，５７２，４４８号；ＤｅＲｏｓｅら、２０１１）。
【０００８】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体の抗腫瘍効果は、例えば、放射線の使用および／または化学療法の同時投与によって、これらの抗体を腫瘍微小環境内でのＰＳの曝露を増加させる薬剤または条件と併用する場合に、増強される（米国特許第７，４２２，７３８号；米国特許第８，４８６，３９１号；米国特許第７，５７２，４４８号）。例えば、ＰＳ標的化抗体のバビツキシマブファミリーを、ドセタキセルと併用して乳腺腫瘍を治療する場合（Ｈｕａｎｇら、２００５）、ゲムシタビンと併用して膵臓腫瘍を治療する場合（Ｂｅｃｋら、２００６）、放射線と併用して肺癌（Ｈｅら、２００７）および脳癌、神経膠芽腫（Ｈｅら、２００９）を治療する場合、ドセタキセルと併用して前立腺癌を治療し、抗腫瘍免疫を再活性化する場合（Ｙｉｎら、２０１３）、およびソラフェニブと併用して肝細胞癌を治療する場合（Ｃｈｅｎｇら、２０１６）、抗腫瘍効果の改善が前臨床的に実証されている。ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１に対する抗体の形態のチェックポイント阻害剤と併用して黒色腫（Ｆｒｅｉｍａｒｋら、２０１６）および三種陰性乳癌（Ｇｒａｙら、２０１６ａ）を治療した場合について、前臨床的に示されているように、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を他のＩＯ剤との併用療法で使用した場合にも、抗腫瘍効果の増強がもたらされる。
【０００９】
バビツキシマブはまた、８００人を超える患者において臨床研究でも評価されており、そのほとんどが、併用療法で治療されていた。これらの臨床試験には、慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのウイルス感染症を有する患者、ならびに肺、乳房、肝臓（肝細胞癌、ＨＣＣ）、膵臓、結腸直腸、および腎臓（腎細胞癌、ＲＣＣ）を含むいくつかの腫瘍型を有する患者が含まれていた。バビツキシマブを、ＨＥＲ２陰性転移性乳癌を有する患者においてパクリタキセルと併用（Ｃｈａｌａｓａｎｉら、２０１５）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）においてパクリタキセル−カルボプラチンと併用（Ｄｉｇｕｍａｒｔｉら、２０１４）、肝細胞癌においてソラフェニブと併用（Ｃｈｅｎｇら、２０１６）、および治療歴のある進行性非扁平上皮ＮＳＣＬＣにおいてドセタキセルと併用（Ｇｅｒｂｅｒら、２０１６）した臨床試験から、有望な抗腫瘍効果が報告されている。
【００１０】
全体として、第Ｉ相および第ＩＩ相臨床研究の結果は、バビツキシマブの臨床的に有意義な治療効果を実証した。それにも関わらず、バビツキシマブ療法に関連するバイオマーカーは未だ存在していないため、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体による治療を最適化するための効果的な方法が依然として必要とされている。関連バイオマーカーデータの欠如に対処する試みは、バビツキシマブ抗体およびその生理学的／病理学的標的であるＰＳの特有の性質によって妨げられてきた。したがって、治療の最適化を可能にするための患者スクリーニング方法の改善が必要とされている。バビツキシマブ治療のための１つ以上の循環バイオマーカーを特定することは特に重要な進歩であり、これは患者を選択し、治療結果を改善するための低侵襲試験を提供するだろう。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体および同様の抗体、例えば、１Ｎ１１での治療を最適化するための新たなバイオマーカー方法、組成物、キット、およびアッセイを提供することによって、先行技術の前述および他の必要性に対処する。本発明は特に、バビツキシマブを使用する治療法に対する奏効を予測するための指標または「バイオマーカー」としての、治療前レベルのβ２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）、最も好ましくは機能性β２ＧＰＩの使用に関する。
【００１２】
これらの驚くべき新たな方法、組成物、キット、およびアッセイは、β２ＧＰＩ依存性ＰＳ標的化抗体で治療可能な患者、特にバビツキシマブ含有治療レジメンまたは併用療法による治療のための癌患者の特定および治療、最も好ましくは、バビツキシマブ（第１の抗癌剤）および少なくとも第２または第３の抗癌剤を使用する、癌を有する患者の特定および治療を提供し、これらは全て、機能性β２ＧＰＩの定義された範囲の治療前血中濃度を有する患者を選択することによって行われる。「機能性」β２ＧＰＩは、ＰＳと、β２ＧＰＩ依存性ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブとの両方に結合するβ２ＧＰＩである。
【００１３】
最も好ましい実施形態において、本発明は、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルに基づく患者の選択、特定、診断、および好ましくは治療に関する。
【００１４】
本発明は、ヒト患者においてＰＳがマーカーである疾患（特に癌）を治療するための方法であって、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブを患者に投与することを含む、方法を提供し、患者は、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前血中濃度を有する。好ましくは、本明細書で「第１の治療剤」および「第１の抗癌剤」と呼ばれる、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、少なくとも第２の治療剤または抗癌剤と共に患者に投与される。
【００１５】
本発明はまた、ヒトの患者においてＰＳがマーカーである疾患（特に癌）を治療するための方法であって、
（ａ）患者から得られた治療前血液試料中の機能性β２ＧＰＩの濃度を測定するステップと、
（ｂ）２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前血中濃度を有する患者に、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブを投与するステップと、を含む、方法も提供する。好ましくは、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、少なくとも第２の治療剤または抗癌剤と共に患者に投与される。
【００１６】
本発明は、ヒト患者においてＰＳがマーカーである疾患（特に癌）を治療するための方法であって、
（ａ）患者から治療前血液試料を得るステップと、
（ｂ）治療前血液試料中の機能性β２ＧＰＩの濃度を測定するステップと、
（ｃ）２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前血中濃度を有する患者に、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブを投与するステップと、を含む、方法をさらに提供する。好ましくは、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、少なくとも第２の治療剤または抗癌剤と共に患者に投与される。
【００１７】
ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブで治療可能なヒト患者、好ましくはヒト癌患者を特定するための方法であって、
（ａ）患者から得られた治療前血液試料中の機能性β２ＧＰＩの濃度を測定するステップと、
（ｂ）治療前血液試料中の機能性β２ＧＰＩの濃度が２００μｇ／ｍｌ以上である場合、患者をＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブで治療可能であると特定するステップと、
（ｃ）２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前血中濃度を有する患者に、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブを投与するステップと、を含む、方法もまた、本発明によって提供される。好ましくは、（ｂ）患者は、バビツキシマブおよび少なくとも第２の治療剤または抗癌剤で治療可能であると特定され、（ｃ）バビツキシマブおよび少なくとも第２の治療剤または抗癌剤が、患者に投与される。
【００１８】
ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブで治療可能なヒト患者、好ましくはヒト癌患者を特定し、その患者を治療するための方法であって、
（ａ）患者から治療前血液試料を得るステップと、
（ｂ）治療前血液試料中の機能性β２ＧＰＩの濃度を測定するステップと、
（ｃ）治療前血液試料中の機能性β２ＧＰＩの濃度が２００μｇ／ｍｌ以上である場合、患者をＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブで治療可能であると特定するステップと、
（ｄ）２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前血中濃度を有する患者に、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブを投与するステップと、を含む、方法が、さらに提供される。好ましくは、（ｃ）患者は、バビツキシマブおよび少なくとも第２の治療剤または抗癌剤で治療可能であると特定され、（ｄ）バビツキシマブおよび少なくとも第２の治療剤または抗癌剤が、患者に投与される。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブで治療可能な患者、好ましくは癌患者を診断する方法であり、該方法は、患者の血液試料中の機能性β２ＧＰＩの濃度を測定することを含み、機能性β２ＧＰＩの血中濃度が２００μｇ／ｍｌ以上である場合、患者は、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブで治療可能であると決定される。好ましくは、機能性β２ＧＰＩの血中濃度が２００μｇ／ｍｌ以上である場合、患者は、バビツキシマブおよび少なくとも第２の治療剤または抗癌剤で治療可能であると診断される。
【００２０】
本発明の更なる一実施形態は、患者を治療する方法、好ましくは患者において癌を治療する方法における使用のためのＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブであり、機能性β２ＧＰＩは、患者の血液試料中に２００μｇ／ｍｌ以上の濃度で存在する。好ましくは、これは、少なくとも第２の抗癌剤を投与することをさらに含む、そのような癌の治療方法における使用のためのバビツキシマブに関する。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態は、ＰＳがマーカーである疾患（好ましくは癌）を治療する方法における使用のためのＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブであり、この方法は、
（ａ）患者、好ましくは癌患者の血液試料中の機能性β２ＧＰＩの濃度を特定するステップと、
（ｂ）機能性β２ＧＰＩの血中濃度が２００μｇ／ｍｌ以上である場合、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブを患者に投与するステップと、を含む。好ましくは、癌を治療する方法における使用のためのバビツキシマブおよび少なくとも第２の治療剤または抗癌剤が提供される。
【００２２】
２００μｇ／ｍｌ以上のβ２ＧＰＩの最も好ましいレベルに加えて、特定の好ましい実施形態において、本発明は、２００〜２９０μｇ／ｍｌの範囲内の治療前の機能性β２ＧＰＩに基づく患者の選択に関する。これらのレベル内の全ての数値および範囲が、２００または２１０μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルに基づく患者の選択、特定、診断、および好ましくは治療などの前述の方法および使用の各々に含まれ、β２ＧＰＩは、低い数として２００または２１０μｇ／ｍｌのうちのいずれか一方から、高い数として２７０、２８０、２９０、３００、３１０、または３２０μｇ／ｍｌのうちのいずれか１つまでの範囲内（２００〜２７０、２００〜２８０、２００〜２９０、２００〜３００、２００〜３１０、２００〜３２０、２１０〜２７０、２１０〜２８０、２１０〜２９０、２１０〜３００、２１０〜３１０、および２１０〜３２０μｇ／ｍｌなどを含む）にあり、２１０〜２７０、２１０〜２８０、２１０〜２９０、２００〜２８０および２００〜２９０が現在好ましい。
【００２３】
ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブを患者、好ましくはヒト癌患者に投与する上で、抗体は、約１〜１０、１〜６、３〜６、または１〜３ｍｇ／ｋｇの用量、最も好ましくは約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００２４】
前述の方法および使用の各々において、本発明は、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブを、ソラフェニブ、パクリタキセル、カルボプラチン、ゲムシタビン、またはドセタキセルなどの化学療法剤である第２または第３の抗癌剤と共に使用して、卵巣癌、胃癌、肝臓癌、結腸直腸癌、乳癌、食道癌、脳癌（例えば、神経膠腫、神経膠芽腫）、前立腺癌、皮膚癌（黒色腫）、頭頸部癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、または肺癌などの固形腫瘍、好ましくは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（非扁平上皮ＮＳＣＬＣを含む）の治療に適用することができる。機能性β２ＧＰＩとＰＳとの複合体におけるバビツキシマブ結合の機構、および全体的なバビツキシマブの免疫活性化機構は、全てのバビツキシマブ療法に共通している。したがって、本発明は、特に化学療法剤、好ましくは免疫腫瘍（ＩＯ）薬剤などとの併用療法において、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体、または同様の抗体（例えば、１Ｎ１１）を使用する任意の治療法のための患者の選択に適用される。
【００２５】
好適なＩＯ剤は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、および／またはＧＩＴＲなどの活性化免疫チェックポイント、受容体、または分子に結合するアゴニスト（活性化）抗体を含む、免疫チェックポイント抗体、ならびに好ましくはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、および／またはＬＡＧ−３などの阻害性免疫チェックポイント、受容体、または分子に結合する拮抗（遮断）抗体である。阻害性免疫チェックポイント、受容体、または分子に結合する拮抗（遮断）抗体はまた、本明細書において「免疫チェックポイント阻害剤」または「ＩＣＩ」と呼ばれる。免疫チェックポイント抗体（または免疫チェックポイント阻害剤）の好ましい例は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ、およびアテゾリズマブなどのＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＰＤ−Ｌ１に対する遮断抗体である。
【００２６】
本発明は特に、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、ならびに第２および第３の治療剤または抗癌剤による患者の選択、診断、および治療を企図する。例えば、化学療法剤および免疫チェックポイント抗体、またはＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブでの治療を含む２つの免疫チェックポイント抗体では、化学療法剤での治療後に免疫チェックポイント抗体での治療が続く。
【００２７】
このβ２ＧＰＩバイオマーカー技術に関連して、かつ他の研究および臨床用途を有するものとして、本発明はまた、機能性β２ＧＰＩの検出および定量化に特に適合した新たなアッセイ方法、組成物、およびキットも提供する。したがって、前述の方法および使用の点の両方で、かつ新たなアッセイとして、本発明は、機能性β２ＧＰＩを測定する方法であって、
（ａ）任意で、ＥＬＩＳＡプレートなどの固体支持体をＰＳでコーティングして、ＰＳコーティング固体支持体またはＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートを調製するステップ（または事前調製したＰＳコーティング固体支持体またはＥＬＩＳＡプレートを使用してもよい）と、
（ｂ）ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、およびβ２ＧＰＩを含有することが疑われる生物学的試料をＰＳコーティング固体支持体に添加し、それによって試料中のβ２ＧＰＩをＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、およびＰＳコーティング固体支持体の両方に結合させるのに有効な条件下で抗体および試料を同時インキュベートするステップと、
（ｃ）ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、およびβ２ＧＰＩのＰＳコーティング固体支持体への結合を検出し、それによって試料中の機能性β２ＧＰＩを測定するステップと、を含む、方法をさらに提供する。
【００２８】
β２ＧＰＩを含有することが疑われる生物学的試料は、血漿試料または血清試料などの血液試料であり得る。細胞上清などを含む、β２ＧＰＩを含有することが疑われる他の生物学的流体試料が使用されてもよい。
【００２９】
本明細書に開示され、当業者にとって既知である、多くの結合形式のアッセイを用いることができる。好ましい実施形態において、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブは、それ自体が検出可能なシグナルを生成する検出可能な物質に結合することで、ＰＳコーティング固体支持体に対する抗体およびβ２ＧＰＩの結合が、検出可能なシグナルを検出および測定することによって検出および測定されるようになる。他の好ましい実施形態において、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブは、β２ＧＰＩを含有することが疑われる試料（血液試料など）の添加前に、ＰＳコーティング固体支持体に添加される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
以下の図面は、本明細書の一部分を構成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれている。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによってより良好に理解され得る。米国特許または出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含有し得る。カラーの図面（複数可）を有するこの米国特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な手数料の支払いをもって、特許局により提供される。
【００３１】
【図１】見た目が均質になるまで精製した、３Ｇ４抗体で処理したマウスにおける腫瘍成長の阻害。図１Ａ、ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪パッド内で成長する、確立された（直径０．６〜０．７ｃｍ、体積１４０ｍｍ３）ヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌；図１Ｂ、ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪パッド内で成長する、確立された（直径０．５〜０．７ｃｍ、体積１１０ｍｍ３）ヒトＭＤＡＭＢ−２３１乳癌；図１Ｃ、同系のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて皮下で成長する、小型メタＡ線維肉腫；および図１Ｄ、ＳＣＩＤマウスにおいて皮下で成長する、大型（直径０．８〜１ｃｍ、体積３７０ｍｍ３）ヒトＬ５４０ホジキン腫瘍。矢印で示した日から開始して、８〜１０匹のマウスの群に、１００μｇの３Ｇ４抗体（○、白丸）または対照のＢＢＧ３抗体（●、黒丸）を腹腔内注射した。その後、１週間に３回治療を続けた。
【図２】ＰＳコーティングマイクロタイタープレートに結合する３Ｇ４抗体は、血清依存性である。図２Ａ、３Ｇ４抗体を、ウシ血清含有培地（▲、ＳＣＭ）または無血清培地（■、ＳＦＭ）中で成長させた細胞から精製した。マイクロタイタープレートをＰＳでコーティングし、１％の鶏卵白由来の卵白アルブミン（ＯＶＡ）中で遮断した。３Ｇ４の段階希釈を、１０％のウシ胎児血清（実線、ＦＢＳ）または１％の鶏卵白由来の卵白アルブミン（破線、ＯＶＡ）中で実行した。図２Ｂ、マイクロタイタープレートをＰＳでコーティングし、１％のＯＶＡ中で遮断した。ＳＦＭ中の３Ｇ４の段階希釈を、示されるように、マウス（◆）、ラット（■）、ヒト（●）、およびウシ（▲）の種由来の１０％の血清中で実行した。
【図３】３Ｇ４抗体は、血漿タンパク質β２ＧＰＩに結合する。マイクロタイタープレートをヒト血漿から精製したヒトβ２ＧＰＩ（ｈβ２ＧＰＩ）でコーティングし、１％のＯＶＡ中で遮断した。市販のマウス抗ヒトβ２ＧＰＩ（◆、α−β２ＧＰＩ）、ＳＦＭ由来の３Ｇ４抗体（■、３Ｇ４）、および対照マウスＩｇＧ（▲、対照ｍＩｇＧ）の段階希釈を、１％のＯＶＡ中で実行した。
【図４】３Ｇ４抗体はドメインＩＩでβ２ＧＰＩと結合する。マイクロタイタープレートのウェルを、組み換え完全長ｈβ２ＧＰＩ（◆、ドメインＩ−Ｖ）、またはドメインＩを有しない（−Ｘ−、ドメインＩＩ−Ｖ）、ドメインＩおよびＩＩを有しない（■、ドメイン  ＩＩＩ−Ｖ）、ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを有しない（▲、ドメインＩＶ−Ｖ）、ならびにドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを有しない（●、ドメインＶ）ｈβ２ＧＰＩペプチドでコーティングした。プレートを１％のＯＶＡ中で遮断し、ＳＦＭ由来の３Ｇ４抗体の段階希釈を１％のＯＶＡ中で実行した。
【図５】ｃｈ３Ｇ４抗体およびβ２ＧＰＩは共に、曝露されたＰＳを有する細胞に結合する。成体ウシ大動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％の正常マウス血清（ＭＳ）中２００μＭのリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）に加えて、（ｉ）ｃｈ３Ｇ４のみ、（ｉｉ）ｃｈ３Ｇ４＋ｈβ２ＧＰＩ同時、または（ｉｉｉ）精製したｈβ２ＧＰＩのみと共に、３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、（ｉ）緩衝液のみ、（ｉｉ）緩衝液のみ、または（ｉｉｉ）ｃｈ３Ｇ４と共に、それぞれ３０分間インキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、固定し、蛍光マーカーで染色して、ｃｈ３Ｇ４の結合を検出した。ｃｈ３Ｇ４およびｈβ２ＧＰＩは、２μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ｃｈ３Ｇ４結合のピクセル面積を、ＭｅｔａＶｕｅソフトウェアを使用して定量化した。値は、条件（ｉ）下でのｃｈ３Ｇ４の結合に対するものであり、これを１に設定した。
【図６】β２ＧＰＩの脂質結合領域は、曝露されたＰＳを有する細胞へのｃｈ３Ｇ４抗体の結合を媒介する。図６Ａ、ＡＢＡＥ細胞を、ｃｈ３Ｇ４抗体に加えて、（ｉ）非脂質結合形態のβ２ＧＰＩ（ニック入りｈβ２ＧＰＩ）または（ｉｉ）インタクトなｈβ２ＧＰＩ（「ｈβ２ＧＰＩ」）と共にインキュベートした。インキュベーションは、ＤＭＥＭ＋１０％のＭＳ中２００μＭのＬＰＣの存在下または不在下で３０分間実行した。その後、細胞を洗浄し、固定し、蛍光マーカーで染色して、ｃｈ３Ｇ４の結合を検出した。ｃｈ３Ｇ４抗体、インタクトなｈβ２ＧＰＩ、およびニック入りｈβ２ＧＰＩを、２μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ｃｈ３Ｇ４結合のピクセル面積を、ＭｅｔａＶｕｅソフトウェアを使用して定量化した。値は、条件（ｉ）ＬＰＣなしの下でのｃｈ３Ｇ４の結合に対するものであり、これを１に設定した。図６Ｂ、マイクロタイタープレートのウェルを、インタクトなｈβ２ＧＰＩ（三角、ｈβ２ＧＰＩ）またはニック入りｈβ２ＧＰＩ（四角、ニック入り）でコーティングし、１％のＯＶＡ中で遮断した。ｃｈ３Ｇ４抗体（黒）または対照ｍＩｇＧ（白）の段階希釈を、１％のＯＶＡ中で実行した。
【図７】β２ＧＰＩ媒介３Ｇ４抗体が、曝露されたＰＳを有する細胞に結合するには、二価性が必要とされる。図７Ａ、ＡＢＡＥ細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中２００μＭのＬＰＣの存在下で、２０ｎＭの３Ｇ４、３Ｇ４Ｆ（ａｂ’）２、または３Ｇ４  Ｆａｂ’モノマーと共に３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、固定し、蛍光マーカーで染色して、３Ｇ４抗体または抗体断片の結合を検出した（３Ｇ４Ｆ（ａｂ’）２および３Ｇ４Ｆａｂ’を図７Ａに示す）。抗体結合のピクセル面積を、ＭｅｔａＶｕｅソフトウェアを使用して定量化した。値は、ＬＰＣの不在下での３Ｇ４の結合に対するものであり、これを１に設定した。図７Ｂ、ＡＢＡＥ細胞を、２００μＭのＬＰＣ、４０ｎＭの精製したｈβ２ＧＰＩ、２０ｎＭのｃｈ３Ｇ４、およびＤＭＥＭ＋１０％のＭＳ中ある力価の３Ｇ４Ｆａｂ’モノマーと共に３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、固定し、蛍光マーカーで染色して、ｃｈ３Ｇ４の結合を検出した。ｃｈ３Ｇ４結合のピクセル面積を、ＭｅｔａＶｕｅソフトウェアを使用して定量化した。値は、競合３Ｇ４Ｆａｂ’を有しないｃｈ３Ｇ４の結合に対するものであり、これを１００に設定した。
【図８】３Ｇ４およびバビツキシマブ抗体ファミリーは、β２ＧＰＩに依存した様式でＰＳに結合する。３Ｇ４、バビツキシマブ、および関連治療ＰＳ標的化抗体は（ドメインＩＩで）β２ＧＰＩに結合し、転じて、ドメインＶを介してＰＳに結合する。通常、β２ＧＰＩはモノマーであり、ＰＳには弱くしか結合せず、急速に解離する。３Ｇ４またはバビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体の存在下で、曝露されたＰＳを有する表面が存在する場合、β２ＧＰＩの２つの分子がＰＳに結合し、二価抗体によって架橋され得ることで、安定した複合体が形成される。抗体−β２ＧＰＩ複合体は、曝露されたＰＳを有する細胞から（ＰＳ標的化抗体の不在下で）モノマーβ２ＧＰＩよりも１，０００倍超緩徐に解離する。
【図９】低レベルのβ２ＧＰＩは、インビボでの３Ｇ４抗体の前臨床抗腫瘍活性を支持する。図９Ａ、雑種細胞から産生されたときの３Ｇ４抗体の純度が９０％であると仮定すると、３Ｇ４抗体で治療したマウスは、０．１２のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比で、２μｇ／ｍｌのウシβ２ＧＰＩを含有する。図９Ｂ、純度８０％の出発点において、３Ｇ４抗体で治療したマウスは、０．２５のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比で、４μｇ／ｍｌのウシβ２ＧＰＩを含有する。
【図１０】低レベルのβ２ＧＰＩは、インビボでの曝露されたＰＳを有する細胞へのバビツキシマブの結合を支持する。ＡＢＡＥ細胞を、ＰＳ曝露を誘導するための２００μＭのＬＰＣ、４０ｎＭの精製したｈβ２ＧＰＩ、およびＤＭＥＭ＋１０％のマウス血清中増加濃度のｃｈ３Ｇ４抗体（バビツキシマブ）と共に３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、固定し、蛍光マーカーで染色して、ｃｈ３Ｇ４の結合を検出した。ｃｈ３Ｇ４結合のピクセル面積を、ＭｅｔａＶｕｅソフトウェアを使用して定量化した。値は、３２０ｐＭのｃｈ３Ｇ４の結合に対するものであり、これを１に設定した。
【図１１】低レベルのβ２ＧＰＩは、インビトロでプレート上のＰＳに結合する２ａＧ４抗体を支持する。マイクロタイタープレートを、ＰＳでコーティングした。一定量の２ａＧ４抗体を含有する溶液を、（卵白アルブミン中）増加量のヒトβ２ＧＰＩの存在下で、ＰＳへの結合について試験した。ＴＭＢを基質として、ＨＲＰ共役抗ヒトＩｇＧを二次抗体として使用して、結合した抗体を検出し、吸光度を４５０ｎｍの波長で読み取った。
【図１２】様々なヒト血清中、インビトロでＰＳに結合するバビツキシマブ。マイクロタイタープレートを、ＰＳでコーティングした。６つの異なる個々のヒト血清試料を得、名目上番号３（◆）、番号４（■）、番号９（▲）、番号１１（−ｘ−）、番号１３（−ｘ−）、および番号１９（●）と呼び、ＰＢＳ中で希釈して、０．１％までの様々な％のヒト血清を得た。２μｇ／ｍｌのバビツキシマブ−ＨＲＰを、各％のヒト血清溶液に添加した。ヒト血清中のバビツキシマブ−ＨＲＰのそれらの混合物を、ＰＳプレートに添加し、結合させた。プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質を添加し、吸光度を４５０ｎｍの波長で読み取った。
【図１３】難治性進行性癌を有する患者への投与後の、平均血清バビツキシマブ濃度。バビツキシマブを、０、２８、３５、および４２日目に０．１ｍｇ／ｋｇ（○、白丸）または０．３ｍｇ／ｋｇ（□、白四角）で静脈内投与し、バビツキシマブを、０、７、１４、および２８日目に１ｍｇ／ｋｇ（●、黒丸）または３ｍｇ／ｋｇ（■、黒四角）で投与した。投与後の示された日に、平均血清バビツキシマブ濃度を決定した。定量化の下限は、０．１μｇ／ｍｌであった。
【図１４】バビツキシマブ投与後の患者におけるβ２ＧＰＩレベル。ＨＣＶに感染した患者に、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および６ｍｇ／ｋｇの量で、（太字の黒矢印↓で示した日に）反復用量のバビツキシマブを投与した。各用量（１ｍｇ／ｋｇ、▲、上（破）線；３ｍｇ／ｋｇ、■、中央線；６ｍｇ／ｋｇ、◆、下線）について、治療後の示した日に血清β２ＧＰＩレベルを決定し、治療前β２ＧＰＩレベルと比較した。
【図１５】１Ｎ１１（ＰＧＮ６３５）抗体は、血清に依存した様式でＰＳに結合する。プレーティングしたＰＳ、およびホスファチジルコリン（ＰＣ）とスフィンゴミエリン（ＳＭ）との混合物（ＰＣ／ＳＭ）に対するｓｃＦｖ形態の１Ｎ１１の結合を、ＥＬＩＳＡによって試験した。ポリスチレンプレートを、１０μｇ／ｍｌのＰＳまたは同量のＰＣ／ＳＭの混合物（各々ヘキサン中に溶解したもの）でコーティングした。ヘキサンが蒸発した後、ＰＢＳ中の１０％のヒト血清（＋１０％の血清）または１％の卵白アルブミン（＋１％のＯＶ）を添加し、１時間インキュベートした。２０μｇ／ｍｌの精製１Ｎ１１  ｓｃＦｖを、各抗原について６つのウェルのうちの第１のウェルに、１０％のヒト血清（＋１０％の血清）または１％の卵白アルブミン（＋１％のＯＶ）のいずれかで添加し、３倍希釈で滴定した。残りの結合したｓｃＦｖを、ＨＲＰ共役抗ｃ−ｍｙｃタグマウスモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって検出した。
【図１６】機能性β２ＧＰＩの標準曲線。既知量の機能性β２ＧＰＩの試料を、実施例ＸＶＩに記載される機能性β２ＧＰＩアッセイで試験し、プロットして、標準曲線を得た。標準曲線から、試験試料、特に希釈した血漿または血清試験試料中の機能性β２ＧＰＩの量を決定することができる。
【図１７】非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療するためのバビツキシマブおよびドセタキセルの第ＩＩＩ相試験に参加した患者における、治療前の機能性β２ＧＰＩレベル（μｇ／ｍｌ）の分布。図１７Ａ、全５９２人の評価可能な患者の機能性β２ＧＰＩの分布；図１７Ｂ、同じ患者からのβ２ＧＰＩのボックスプロット；図１７Ｃ、バビツキシマブおよびドセタキセルで治療した患者（２９４人の評価可能な患者）の機能性β２ＧＰＩの分布；ならびに図１７Ｄ、プラセボおよびドセタキセルで治療した患者（２９８人の評価可能な患者）の機能性β２ＧＰＩの分布。
【図１８】２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩレベルを有するＮＳＣＬＣ患者が、バビツキシマブで治療したときに生存期間が延長（ｍＯＳ）する傾向があることを示す、第ＩＩＩ相試験のカプランマイヤー生存曲線。図１８Ａ、バビツキシマブで治療した患者において、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者（「バビツキシマブ：Ｂ２ＧＰ１≧２００」、実線で青色の上線）は、２００μｇ／ｍｌ未満のβ２ＧＰＩを有する患者（「バビツキシマブ：Ｂ２ＧＰ１＜２００」、破線で青色の下線）とは対照的に、生存期間が延長する傾向がある。図１８Ｂ、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者において、バビツキシマブおよびドセタキセルで治療した患者（「バビツキシマブ」、青色の上線）は、プラセボおよびドセタキセル（「プラセボ」、緑色の下線）で治療した同じβ２ＧＰＩレベル（２００μｇ／ｍｌ以上）を有する患者とは対照的に、生存期間が延長する傾向がある。
【図１９】前臨床研究における３Ｇ４抗体のＰＳに結合する機能的活性および抗腫瘍活性を支持するβ２ＧＰＩレベルと、第ＩＩＩ相試験および他の臨床試験の患者におけるβ２ＧＰＩレベルとの比較。第ＩＩＩ相試験における５９２人の評価可能な患者の治療前の機能性β２ＧＰＩレベルの分布は、図１７Ａに明記されるものと同じである。２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩレベル（濃い橙色と明るい橙色の棒を合わせて）は、第ＩＩＩ相試験においてバビツキシマブで治療したＮＳＣＬＣ患者（図１８Ａおよび図１８Ｂ）（ならびに実施例ＸＶＩＩＩおよび実施例ＸＸにおけるように、バビツキシマブで治療した他のＮＳＣＬＣおよび膵臓癌患者についても）が、生存期間が延長する傾向を提供する。２００μｇ／ｍｌ〜２９０μｇ／ｍｌ（濃い橙色）の範囲内の機能性β２ＧＰＩレベルは、第ＩＩＩ相試験においてバビツキシマブで治療したＮＳＣＬＣ患者について、統計的に有意なより良好なｍＯＳを提供する（表１４Ａ）。約１０μｇ／ｍｌ以上（→、長い緑色の矢印）または約６０μｇ／ｍｌ以上（＞、短い緑色の矢印）の機能性β２ＧＰＩレベルは、前臨床研究におけるバビツキシマブのＰＳに結合する機能的活性および抗腫瘍活性に十分である（実施例Ｖ）。
【図２０】実施例ＸＶＩＩＩのＡに報告される、実施例ＸＩＩＩのＮＳＣＬＣを治療するためのバビツキシマブおよびドセタキセルの第ＩＩ相試験の患者における治療前の機能性β２ＧＰＩレベル（μｇ／ｍｌ）の分布。図２０Ａ、全１１９人の評価可能な患者の機能性β２ＧＰＩの分布；図２０Ｂ、３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブおよびドセタキセルで治療した患者（４０人の評価可能な患者）の機能性β２ＧＰＩの分布；ならびに図２０Ｃ、プールされた対照群の患者（プラセボまたは１ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ）（７９人の評価可能な患者）の機能性β２ＧＰＩの分布。
【図２１】２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩレベルを有するＮＳＣＬＣ患者が、バビツキシマブで治療したときに生存期間が延長する傾向を示す、実施例ＸＩＩＩの第ＩＩ相試験からのカプランマイヤー生存曲線。図２１Ａ、３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブで治療した患者において、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者（「バビツキシマブ：Ｂ２ＧＰ１≧２００」、青色の上線）は、２００μｇ／ｍｌ未満のβ２ＧＰＩを有する患者（「バビツキシマブ：Ｂ２ＧＰ１＜２００」、黄色の下線）とは対照的に生存期間が延長する傾向がある。図２１Ｂ、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者において、３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ（「バビツキシマブ」、青色の上線）で治療した患者は、併用対照群の患者（「バビツキシマブ」、緑色の下線）とは対照的に生存期間が延長する傾向がある。図２１Ｃ、併用対照群の患者において、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者（「プラセボ：Ｂ２ＧＰ１≧２００」、青色の線）は、２００μｇ／ｍｌ未満のβ２ＧＰＩを有する患者（「プラセボ：Ｂ２ＧＰ１＜２００」、黄色の線）と類似した生存期間を有する。
【図２２】実施例ＸＶＩＩＩのＢに報告される、実施例ＸＩＩの膵臓癌を治療するためのゲムシタビンおよびバビツキシマブの第ＩＩ相試験の患者における、治療前の機能性β２ＧＰＩレベル（μｇ／ｍｌ）の分布。３１人全ての評価可能な患者の機能性β２ＧＰＩの分布を示す。
【図２３】ゲムシタビンおよびバビツキシマブで治療した膵臓癌患者が、２００μｇ／ｍｌ未満の機能性β２ＧＰＩレベル（「Ｂ２ＧＰ１＜２００」、黄色の下線）とは対照的に、機能性β２ＧＰＩが２００μｇ／ｍｌ以上のレベル（「Ｂ２ＧＰ１≧２００」、青色の上線）で存在するときに生存期間が延長する傾向を示す、実施例ＸＩＩの第ＩＩ相試験からのカプランマイヤー生存曲線。
【図２４】実施例ＸＶＩＩＩのＣに報告される、ＮＳＣＬＣを治療するためのバビツキシマブおよびパクリタキセル／カルボプラチンの第ＩＩ相試験の患者における、治療前の機能性β２ＧＰＩレベル（μｇ／ｍｌ）の分布。図２４Ａ、全８４人の評価可能な患者の機能性β２ＧＰＩの分布；図２４Ｂ、バビツキシマブおよびパクリタキセル／カルボプラチンで治療した患者（４４人の評価可能な患者）の機能性β２ＧＰＩの分布；ならびに図２４Ｃ、パクリタキセル／カルボプラチン対照群の患者（４０人の評価可能な患者）の機能性β２ＧＰＩの分布。
【図２５】２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩレベルを有するＮＳＣＬＣ患者が、バビツキシマブで治療したときに生存期間が延長する傾向を示す、実施例ＸＶＩＩＩのＣに報告される第ＩＩ相試験からのカプランマイヤー生存曲線。図２５Ａ、バビツキシマブで治療した患者において、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩ（「Ｃ／Ｐ＋バビツキシマブ：Ｂ２ＧＰ１≧２００」、青色の上線）を有する患者は、２００μｇ／ｍｌ未満のβ２ＧＰＩを有する患者（「Ｃ／Ｐ＋バビツキシマブ：Ｂ２ＧＰ１＜２００」、黄色の下線）とは対照的に生存期間が延長する傾向がある。図２５Ｂ、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者において、バビツキシマブで治療した患者（「Ｃ／Ｐ＋バビツキシマブ」、青色の上線）は、対照群の患者（「Ｃ／Ｐ」、緑色の下線）とは対照的に生存期間が延長する傾向がある。図２５Ｃ、対照群の患者において、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者（「Ｃ／Ｐ：Ｂ２ＧＰ１≧２００」、青色の線）は、２００μｇ／ｍｌ未満のβ２ＧＰＩを有する患者（「Ｃ／Ｐ：Ｂ２ＧＰ１＜２００」、黄色の線）と比較して生存期間が低減する傾向がある。
【図２６】バビツキシマブおよびドセタキセル、その後に後続免疫療法（「ＳＡＣＴ−ＩＯ」）で治療した患者（青色の上線）が、ドセタキセル単独、その後に後続免疫療法で治療した患者（緑色の下線）とは対照的に、統計的に有意なより良好なｍＯＳを有することを示す、カプランマイヤー生存曲線。治療群、ｍＯＳ、および統計的分析を、これらの生存曲線について表１６に作表する（実施例ＸＩＸ）。
【図２７】２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩレベルを有するＮＳＣＬＣ患者が、バビツキシマブ、その後に後続免疫療法（「ＳＡＣＴ−ＩＯ」）で治療したときに統計的に有意なより良好なｍＯＳを有することを示す、カプランマイヤー生存曲線。２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者において、バビツキシマブで治療した患者（「ドセタキセル＋バビツキシマブ」、青色の線）は、ＳＡＣＴ−ＩＯを受ける患者（「ＳＡＣＴ  ＩＯあり」、実線）およびＳＡＣＴ−ＩＯを受けない患者（「ＳＡＣＴ  ＩＯなし」、破線）を含む対照患者（「ドセタキセル＋プラセボ」、緑色の線）とは対照的に、生存期間が延長する傾向がある。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
現代では、患者の疾患リスクおよび／または予測される奏効などの要因に基づいて、個々の患者に合わせて治療を調整することにますます重点が置かれている。この概念は一般に、「個別化医療」として説明することができる。特定の治療法の有効性に寄与する異なる構成要素についてのより深い理解は、患者を層別化するための基礎を提供し、それによって連続した患者集団について治療結果を改善することができる。本発明は、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を使用する免疫療法を最適化するための新たなバイオマーカーを提供することによる、そのような線に沿った進歩となる。
【００３３】
Ａ．治療標的としてのホスファチジルセリン
ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、上流免疫チェックポイントとして機能し、宿主の免疫応答を調節する、高度に免疫抑制性の分子である。したがって、ＰＳは、癌およびウイルス感染症を含む様々な疾患に関与している。したがって、ＰＳ標的化抗体の形態にある免疫療法剤は、癌を含むこれらの疾患に対する新たな治療の選択肢を提供する。
【００３４】
より詳細には、正常細胞において、ＰＳは、原形質膜の内側リーフレットに分離されるが、様々な病態において、特に癌およびウイルス感染症において、罹患した異常細胞内で原形質膜の外側リーフレットに対して外在化される。癌の文脈において、ＰＳの外在化を引き起こす環境ストレス要因のいくつかは、低酸素／再酸素負荷、酸化ストレス、および特定のサイトカインへの曝露である。ＰＳの外在化はまた、細胞死および免疫食細胞クリアランスの条件下でも生じる（Ｂｉｒｇｅら、２０１６）。その後、ＰＳが、免疫細胞上のＰＳ受容体（例えば、ＴＩＭ３およびＴＩＭ４、ＢＡＩ１、スタビリン（ｓｔａｂｉｌｉｎ）２、ならびにＲＡＧＥ）によって、任意でいくつかの架橋タンパク質のうちの１つ以上を介して認識および結合されることで、ＰＳは、免疫抑制を誘導および維持する。腫瘍微小環境内では、ＰＳは、腫瘍血管内皮細胞、腫瘍細胞、および腫瘍由来のエキソソームの表面上に曝露され、免疫抑制のプロセスが重複しているため、抗腫瘍および炎症反応の発生が予防されている。
【００３５】
曝露されたＰＳは、瀕死の細胞の認識およびクリアランスを促進し、免疫抑制性サイトカイン（例えば、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０）の放出を引き起こし、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２）の産生を阻害する、食作用シグナルである。ＰＳはまた、マクロファージを免疫抑制性Ｍ２表現型に偏らせ、樹状細胞（ＤＣ）の成熟およびＤＣが抗原を提示する能力を阻害する一方で、ＤＣを刺激して、Ｔ細胞耐性を促進する免疫抑制性メディエーターを分泌させる。要約すると、ＰＳは、免疫抑制された腫瘍微小環境の誘導および維持における中心的要因である。
【００３６】
Ｂ．ＰＳ標的化抗体
腫瘍微小環境内でＰＳ曝露が腫瘍進行を促進する傾向のために、ＰＳ標的化抗体を使用して、免疫細胞上の特定の受容体へのＰＳの結合を遮断することによって、効果的な癌療法を提供することができる（Ｙｉｎら、２０１３）。下記に例証されるように、いくつかのそのようなＰＳ標的化抗体が、治療薬として開発されている。「ＰＳ標的化抗体」の群には、抗体がＰＳに直接結合するか、またはＰＳと強固な結合複合体を形成するのに血清タンパク質を必要とするかどうかに関わらず、インビトロでＰＳに操作可能に結合し、インビボで病態時に曝露されるＰＳ（特に腫瘍細胞上および腫瘍血管上のＰＳ）を特異的に局在化させ、それに結合する、全ての抗体が含まれる。そのような「直接的」および「間接的」ＰＳ標的化抗体は、以下により詳細に記載される。
【００３７】
Ｂ１．バビツキシマブ
ＰＳ標的化抗体の前臨床潜在性を評価するために生成された初期のモノクローナル抗体は、３Ｇ４、ＩｇＧ３  ｍＡｂと呼ばれる抗体である（実施例Ｉ；Ｒａｎら、２００５；Ｈｕａｎｇら、２００５）。３Ｇ４抗体を分泌する雑種細胞株の試料をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託し、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ４５４５を与えた。寄託した雑種細胞の入手可能性は、いかなる政府の権限の下でもその特許法に従って付与された権利に違反して本発明を実施するための認可として解釈されるべきではない。
【００３８】
バビツキシマブは、マウス可変（抗原結合）領域がヒト抗体定常領域に操作可能に結合している、３Ｇ４マウス抗体のヒトキメラバージョンである（実施例ＩＩＩ、Ｃ）。バビツキシマブファミリーの抗体は、多数の米国特許、例えば、米国特許第７，２４７，３０３号および米国特許第７，５７２，４４８号に詳細に記載されており、バビツキシマブは、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ４５４５として寄託された抗体のヒトキメラ形態を調製することによって再構築することができる。抗体のかなりの部分がヒト起源のものであるため、バビツキシマブは、患者に投与したときの免疫原性が低い。
【００３９】
３Ｇ４およびバビツキシマブ抗体は、血清の存在下で、アニオン性リン脂質、特にＰＳに強く結合するが、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、およびカルジオリピン（ＣＬ）にも強く結合する（Ｒａｎら、２００５）。これらのアニオン性リン脂質のうち、ＰＳは、生理学的および病理学的に最も関連性がある。３Ｇ４およびバビツキシマブは、血清の存在に関わらず、中性リン脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、またはホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）に対して検出可能な結合を呈さない。
【００４０】
当初、３Ｇ４およびバビツキシマブ抗体は、ＰＳに直接結合すると考えられていたが、ＰＳ結合は、β２−糖タンパク質１（β２ＧＰＩ）として特定される血清タンパク質によって媒介されることが後に決定された（実施例ＩＶ；Ｌｕｓｔｅｒら、２００６）。実際に、精製β２ＧＰＩ、およびＥＬＩＳＡに典型的に使用される１０％の血清中に単に存在することによって提供されるβ２ＧＰＩを含む、β２ＧＰＩの存在下で実行される酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において、３Ｇ４およびバビツキシマブはＰＳに強く結合する。
【００４１】
アポリポタンパク質Ｈとしても知られるβ２ＧＰＩは、５つのドメイン、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶ（１、２、３、４、および５）を有し、ドメイン構造は、哺乳動物にわたって保存されている。β２ＧＰＩは、三次構造としてそれら５つの識別可能なドメイン内に折り畳まれ、閉じた円形構造または開いたＪ字形もしくはフック構造を有し得る。β２ＧＰＩは、酵素プラスミンでの切断などによって、Ｌｙｓ３１７／Ｔｈｒ３１８切断部位で、ドメインＶが「ニック」されていない限り（これは、ＰＳ結合を破壊する）、そのＣ末端ドメインであるドメインＶ内の正電荷領域を通して、アニオン性リン脂質、特にＰＳに結合する（Ｈｕｎｔら、１９９３；Ｈｕｎｔ＆Ｋｒｉｌｉｓ、１９９４）。３Ｇ４およびバビツキシマブ抗体は、β２ＧＰＩのドメインＩＩに結合する。これは、治療抗体としての３Ｇ４およびバビツキシマブの安全性を強化するが、これは、β２ＧＰＩに結合する特定の他の抗体が病理学に関連付けられているが、それらの抗体はβ２ＧＰＩのドメインＩに結合するためである。
【００４２】
ＰＳへの３Ｇ４およびバビツキシマブ抗体の高親和性結合は、抗体とβ２ＧＰＩとの二価相互作用を必要とする（実施例ＩＶ、図８）。そのような抗体が不在である場合、β２ＧＰＩは、アニオン性リン脂質、特にＰＳに低い親和性をもってしか結合しない。これは、３Ｇ４およびバビツキシマブが、高親和性複合体としてβ２ＧＰＩの存在下でＰＳに結合し、ＰＳへのβ２ＧＰＩの結合を１μＭから１  ｎＭへと調節することを示す研究において定量化されている。
【００４３】
ＰＳへの３Ｇ４およびバビツキシマブ抗体のβ２ＧＰＩ依存性結合を、図８に描写する。バビツキシマブファミリーの抗体は、β２ＧＰＩのドメインＩＩに結合する。述べた通り、バビツキシマブはβ２ＧＰＩのドメインＩＩに結合するため、それは、β２ＧＰＩのドメインＩに結合する抗体が存在する抗リン脂質抗体症候群に関連するものなどの副作用とは無関係である（ｄｅ  Ｌａａｔら、２００５；ｄｅ  Ｌａａｔら、２００６；Ｉｏａｎｎｏｕら、２００７）。抗体とβ２ＧＰＩとの高親和性二価相互作用は、ＰＳが細胞表面上および細胞膜上で外在化される場合を含む、ＰＳへの結果として生じる高親和性結合を調和させる。
【００４４】
３Ｇ４およびバビツキシマブ抗体は、β２ＧＰＩに結合するが、それらは、インビボで病態時に曝露されるＰＳを特異的に局在化させ、それに結合するため、「ＰＳ標的化抗体」と呼ばれる。ＰＳは、健康な正常細胞の内側で維持され、病態時にのみ細胞表面上に曝露されるため、インビボでの抗体局在化は、ＰＳに特異的であるだけでなく、ＰＳがマーカーである疾患、特に癌、ならびにウイルス感染症および特定の他の病理学にも特異的である。
【００４５】
図８はまた、ＰＳに結合するβ２ＧＰＩ依存性抗体が、インビトロでもインビボと同じであるため、ＥＬＩＳＡが治療法の正確なモデルであることも示す。特に、プレートがＰＳでコーティングされ、ＥＬＩＳＡが血清の存在下で実行されるＥＬＩＳＡにおいて、３Ｇ４、バビツキシマブなどの抗体は、ＰＳと安定した結合複合体を形成することができる。したがって、ＥＬＩＳＡアッセイは、治療中のインビボの状態を模倣し、ここで、ＰＳは、腫瘍微小環境内の細胞またはウイルス感染細胞などの疾患環境内の細胞上にのみ特有に曝露される。ＥＬＩＳＡと同様に、３Ｇ４およびバビツキシマブ抗体が曝露されたＰＳに遭遇するとき、それらは血液中に存在するβ２ＧＰＩと安定した結合複合体を形成することができる。ＰＳがＥＬＩＳＡウェル上にあるか、または罹患した細胞上にあるかに関わらず、抗体−β２ＧＰＩ複合体は、モノマーβ２ＧＰＩ、すなわち、ＰＳ標的化抗体を有しないβ２ＧＰＩに対するよりも、ＰＳに対して１，０００倍超高い親和性を有する。
【００４６】
Ｂ２．１１．３１などの直接ＰＳ結合抗体
バビツキシマブなどの間接ＰＳ結合抗体またはＰＳ標的化抗体に加えて、ＰＳ標的化抗体のファミリー全体は、ＰＳに直接結合する抗体、すなわち、直接ＰＳ結合抗体または直接ＰＳ標的化抗体を含む。そのような「直接ＰＳ結合抗体」（または「直接ＰＳ標的化抗体」）は、ＰＳに対して機能的に特異的であるだけでなく、（間接結合抗体と同様に）インビトロおよびインビボでＰＳを標的化し、それに結合もする抗体であるが、インビトロ結合アッセイにおいてすら、ＰＳと強固な結合複合体を形成するのにβ２ＧＰＩなどの血清タンパク質は必要としない抗体である。
【００４７】
そのような直接ＰＳ結合抗体の特定の一例は、９Ｄ２と呼ばれるマウスモノクローナル抗体である（Ｒａｎら、２００２）。９Ｄ２抗体は、腫瘍血管を局在化させ、インビボで抗腫瘍効果を発揮することが示されている（Ｒａｎら、２００２）。直接ＰＳ結合抗体の別の例は、１１．３１と呼ばれる完全ヒト抗体（ＰＧＮ６３２）である。１１．３１抗体もまた、インビボで（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌異種移植片を保有するマウスにおいて）抗腫瘍効果を発揮することが示されており、印象的な抗ウイルス効果を示す（Ｍｏｏｄｙら、２０１０；米国特許第７，４５５，８３３号）。
【００４８】
したがって、直接ＰＳ結合抗体は、ＰＳがマーカーである様々な疾患、特に癌およびウイルス感染症を治療する上で有用である。しかしながら、そのような直接結合ＰＳ標的化抗体での治療を最適化するためのバイオマーカーは、典型的には、本発明におけるようにβ２ＧＰＩなどの血清タンパク質には依存せず、他の要因に依存するであろう。直接結合抗体の有用なバイオマーカーは、ＰＳ標的化抗体の免疫バイオマーカーを含む。
【００４９】
Ｂ３．１Ｎ１１などの他のβ２ＧＰＩ依存性ＰＳ標的化抗体
本発明の好ましい実施形態は、ＰＳ標的化抗体ファミリーの他の部分、つまり間接ＰＳ結合抗体に関する。本明細書で使用される場合、「間接ＰＳ結合抗体」または「間接ＰＳ標的化抗体」は、ＰＳに対して機能的に特異的であり、インビトロでＰＳに操作可能に結合し、インビボでＰＳを標的化し、それに結合する抗体であるが、ＰＳと強固な結合複合体を形成するのに血清タンパク質を必要とする抗体である。本発明は、特に、間接ＰＳ結合抗体または間接ＰＳ標的化抗体、すなわち、β２ＧＰＩ依存性ＰＳ結合抗体またはβ２ＧＰＩ依存性ＰＳ標的化抗体のサブセットに関する。本明細書で使用される場合、「β２ＧＰＩ依存性ＰＳ結合抗体」または「β２ＧＰＩ依存性ＰＳ標的化抗体」は、ＰＳに対して機能的に特異的であり、インビトロでＰＳに操作可能に結合し、インビボでＰＳを標的化する、すなわち、β２ＧＰＩを含有する血清または精製された血清の存在下で実行されるアッセイにおいてインビトロでＰＳに結合する抗体であるが、ＰＳと強固な結合複合体を形成するのに血清タンパク質β２ＧＰＩを必要とする抗体である。上記のように、そのような抗体の例には、マウス抗体３Ｇ４およびキメラ抗体バビツキシマブが含まれる。
【００５０】
β２ＧＰＩ依存性ＰＳ標的化抗体の他の現在好ましい例は、１Ｎ１１（ＰＧＮ６３５）および１Ｇ１５と呼ばれる完全ヒト抗体、好ましくは１Ｎ１１抗体である。撮像および治療法を含む、１Ｎ１１抗体、およびそのマウスキメラバージョンを使用するいくつかの研究が記載されている（Ｇｏｎｇら、２０１３；Ｆｒｅｉｍａｒｋら、２０１６；Ｇｒａｙら、２０１６ａ）。１Ｎ１１抗体のＰＳ結合特性を、図１５に示す。１Ｎ１１をファージ提示法によって生成し、血清の存在下でのみ（またはβ２ＧＰ１の存在下でのみ）ＰＳへの結合についてのアッセイを使用して選択した。図１５に示されるように、当業者は、そのような研究を通例的に実行して、更なるＰＳ標的化抗体およびβ２ＧＰＩ依存性ＰＳ標的化抗体を調製し、単離することができる。
【００５１】
Ｃ．広範な治療経験
上記に考察されるＰＳ生物学から予測されるように、ＰＳからのシグナルは、免疫細胞が腫瘍を認識し、それと戦う能力を阻害する。バビツキシマブおよび関連抗体は、ＰＳとその受容体との関与を遮断することによって、および代替免疫活性化シグナルを送ることによって、このＰＳ媒介免疫抑制シグナル伝達を無効化する。したがって、ＰＳ標的化抗体は、腫瘍内での免疫細胞の機能を転換させ、免疫活性化および抗腫瘍免疫応答の複数の徴候をもたらすことが示されている。
【００５２】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、腫瘍微小環境内の免疫細胞を多局所的に再プログラミングして、免疫活性化を支持することによって、ＰＳ媒介免疫抑制のこの遮断を達成する（Ｙｉｎら、２０１３）。したがって、バビツキシマブおよび関連抗体は、腫瘍微小環境内の免疫耐性を破壊する。抗体媒介ＰＳ遮断は、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦβ）、およびインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）のレベルを低減させ、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）、およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）などの炎症誘発性サイトカインのレベルを増加させる。このＰＳ遮断はまた、ＭＤＳＣおよび腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を優勢なＭ２から優勢なＭ１表現型へと再び偏らせ、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を促進し、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化し、強力な適応抗腫瘍Ｔ細胞免疫を誘導する（Ｙｉｎら、２０１３）。
【００５３】
バビツキシマブおよび関連抗体はまた、自然免疫、すなわち、ＮＫ細胞およびＭ１マクロファージも活性化する。重要なことに、これらの抗体はまた、ＰＳを特有に曝露する既存の腫瘍血管の選択的停止も引き起こし（Ｒａｎら、２００５；米国特許第７，５７２，４４８）、この活性は、腫瘍浸潤性Ｍ１マクロファージおよびＮＫ細胞によって媒介される抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含む。このような腫瘍血管の破壊は、腫瘍細胞の破壊をもたらす。免疫療法および血管標的化のこれらの二重機構、特にＡＤＣＣ作用は、バビツキシマブが免疫活性化または従来の抗増殖化学療法に耐性のある腫瘍に対して有効であり得ることを意味する。
【００５４】
他の免疫療法と同様に、ＰＳ標的化抗体の抗腫瘍効果は、併用療法で使用される場合に増加する。バビツキシマブおよび関連抗体と共に使用するための薬剤の一群は、放射線および／または化学療法剤などの、腫瘍微小環境内でのＰＳの曝露を増加させる薬剤および／または条件である（米国特許第７，４２２，７３８号、米国特許第８，４８６，３９１号、米国特許第７，５７２，４４８号）。したがって、抗腫瘍効果の増強は、ドセタキセルとの併用での乳腺腫瘍（Ｈｕａｎｇら、２００５）および前立腺癌（Ｙｉｎら、２０１３）の治療、ゲムシタビンとの併用での膵臓腫瘍の治療（Ｂｅｃｋら、２００６）、放射線との併用での肺癌（Ｈｅら、２００７）および神経膠芽腫（Ｈｅら、２００９）の治療、変異腫瘍抑制因子ｐ５３を再活性化するＰＲＩＭＡ−１との併用での進行性乳腺腫瘍の治療（Ｌｉａｎｇら、２０１１）、アデノウイルスとの併用でのアデノウイルスの腫瘍脈管構造への再標的化（Ｈｏｇｇら、２０１１）、シスプラチンとの併用での手術後の肺癌再発の治療（Ｊｕｄｙら、２０１２）、ならびにソラフェニブとの併用での肝細胞癌の治療（Ｃｈｅｎｇら、２０１６）において前臨床的に実証されている。
【００５５】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体と共に使用するための別の薬剤の群は、他のＩＯ剤である。ＰＳは上流免疫チェックポイントであるため、バビツキシマブの作用機構は利用可能な治療剤に対して相補的である。したがって、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、およびＰＤ−Ｌ１に対する抗体の形態の他のチェックポイント阻害剤との併用において、バビツキシマブファミリーの抗体について、印象的な併用療法が前臨床的に示されている（Ｆｒｅｉｍａｒｋら、２０１６；Ｇｒａｙら、２０１６ａ）。生存期間の増加を含むそのような抗腫瘍活性は、ＰＤ−１遮断単独との比較での、腫瘍内活性化ＣＤ８Ｔ細胞の増加、ＰＤ−Ｌ１発現に関連したＭ２マクロファージおよびＭＤＳＣの低減、ならびに脾臓内の腫瘍反応性Ｔ細胞の増加に関連付けられた。
【００５６】
したがって、これらのような前臨床結果は、バビツキシマブファミリーのＰＳ標的化抗体がＰＳ媒介免疫抑制を逆転させ、治療的に有効な適応抗腫瘍免疫を開始することを確認する。したがって、下流免疫チェックポイントの遮断と併用したバビツキシマブでの治療は、奏効の結果、期間、およびレベルを有意に改善する、頑強かつ長期にわたる抗腫瘍免疫をもたらす（Ｆｒｅｉｍａｒｋら、２０１６；Ｇｒａｙら、２０１６ａ）。
【００５７】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体の有利な安全性プロファイルを考慮して、これらの抗体はまた、放射線、化学療法剤（「化学放射線療法」）、および／または免疫療法との三種併用、ならび２つの免疫療法剤との三種併用を含む、三種併用療法において効果的に併用することができる。近年、ＰＳ、ＰＤ−１、およびＬＡＧ−３を標的化する抗体を使用する三種併用について、印象的な結果が示された（Ｇｒａｙら、２０１６ｂ）。
【００５８】
そのような前臨床データに立脚して、バビツキシマブは、主に他の適応症に承認された治療薬と併用して、８００人超の患者を対象とした臨床研究において評価されている。様々な抗ウイルス研究および抗腫瘍研究が、治療活性を示している。広範な前臨床試験およびヒトにおける薬物動態プロファイル（実施例ＶＩ；Ｇｅｒｂｅｒら、２０１１；Ｄｉｇｕｍａｒｔｉら、２０１４も参照されたい）に基づいて、静脈内（ＩＶ）投与した３ｍｇ／ｋｇの用量のバビツキシマブが、肺癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、および腎臓癌を有する患者を含む腫瘍学のほとんどの臨床研究において決定され、選択された。現在、バビツキシマブについて、ＨＥＲ２陰性転移性乳癌を有する患者におけるパクリタキセル（Ｃｈａｌａｓａｎｉら、２０１５）、進行性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるパクリタキセル−カルボプラチン（Ｄｉｇｕｍａｒｔｉら、２０１４）、肝細胞癌におけるソラフェニブ（Ｃｈｅｎｇら、２０１６）、および以前に治療された進行性非扁平上皮ＮＳＣＬＣにおけるドセタキセル（Ｇｅｒｂｅｒら、２０１６）との併用で、有望な臨床的抗腫瘍結果が発表されている。
【００５９】
要約すると、第Ｉ相および第ＩＩ相臨床研究からの結果は、バビツキシマブの臨床的に有意義な治療効果を実証した。今では、ＰＳ標的化抗体を使用して様々な疾患の治療に成功したことを示すかなりの量の研究があるが、現在まで、そのような治療法のための既知のバイオマーカーは存在しない。ＰＳ標的化抗体を用いた臨床経験は主に、バビツキシマブなどのβ２ＧＰＩ依存性ＰＳ標的化抗体に基づいている。治療を最適化するためのバイオマーカーが最も必要とされているのは、それらの抗体である。そのようなバイオマーカー（複数可）を定量化するための高感度かつ迅速な方法と共に、バビツキシマブ治療のための１つ以上の循環バイオマーカーを特定することができれば、これは重要な発展であり、患者選択を促進して、治療結果を改善するための低侵襲試験（複数可）を提供する。
【００６０】
Ｄ．ＰＳ標的化抗体のためのバイオマーカー
癌治療薬の分野において、バイオマーカーは、治療に対する奏効に影響を与える特定の患者の特徴を特定する上でますます重要な役割を果たしている。これは、標的化癌治療、ならびにより近年ではＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１阻害剤を含むチェックポイント阻害剤について歴史的に見られてきた。
【００６１】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体での治療に重要なバイオマーカーが、分析されている。本明細書で使用される場合、「バビツキシマブバイオマーカー」は、治療法の少なくとも一部分として、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブを含む治療法での治療による臨床的利益を改善するために、患者または患者集団を選択する上で、単独で、または２つ以上もしくは複数のバイオマーカーのうちの１つとして使用するためのバイオマーカーである。したがって、β２ＧＰＩを含むそのようなバビツキシマブバイオマーカーは、治療前に、患者、患者集団、または亜集団が、ＰＳ標的化抗体（好ましくはバビツキシマブ）を含む併用療法を含む、ＰＳ標的化抗体（好ましくはバビツキシマブ）を含む治療から恩恵を受ける可能性があるかどうかを予測するための方法において使用することができる。
【００６２】
バビツキシマブ含有治療レジメンによる臨床的利益を改善するために、最も適切な患者集団を特定するための多重マーカー符号もまた考慮されている。これらの分析において特定された第１のバイオマーカーは、β２ＧＰＩである（節Ｅ、節Ｆ）。全体として、特定されたバイオマーカーのパターンは、臨床開発および治療を誘導するためのバビツキシマブ「符号」である。
【００６３】
バビツキシマブバイオマーカーの一部分として、バビツキシマブ免疫バイオマーカーが分析されている。そのようなデータは、免疫系を「プライミング」する、すなわち、抗腫瘍免疫応答を増幅するためのバビツキシマブの使用を支持する。これに関して、腫瘍がＴ細胞および他の免疫細胞によってどれほど深く浸潤されているかに応じて、腫瘍を「熱」から「冷」までの尺度に配置することができることが現在既知である。免疫浸潤のレベル（「熱」）は、免疫系が腫瘍を認識し、それに関与しているかどうかを反映する。「熱」である腫瘍を有する患者はより良好な予後を有し、「冷」の腫瘍では、再発の可能性がはるかに高くなる。重要なことに、バビツキシマブは、冷の腫瘍に正の影響を与え、それらを（他のチェックポイント阻害剤を含むものを用いて）より治療しやすくすることができることが決定されている。したがって、バビツキシマブ免疫バイオマーカーは、バビツキシマブ療法のために患者を選択することだけでなく、バビツキシマブおよび併用療法のための知的に選択された薬剤での治療のために患者を特定することにおいても、追加の用途を有する。
【００６４】
Ｄ１．試料
β２ＧＰＩ以外のバイオマーカー（節Ｅ）について、本発明を使用して、バイオマーカーのうちの１つ以上を含有するか、または含有することが疑われる任意の生物学的試料（糞便を含む、動物、対象、または患者由来の任意の組織試料または生検を含む）を試験することができる。生物学的組織試料由来の清澄化された溶解物が使用されてもよい。しかしながら、本発明は、好ましくは天然の体液と共に使用され、したがって、「液体生検」とも呼ばれる低侵襲または非侵襲技術を使用して得られた生物学的試料に対して実行され得る試験を提供する。これは、典型的には結果を得るのに時間がかかり、それら自体に健康上のリスクを引き起こし得る、生検などのより厳密な技術よりも有利である。
【００６５】
１つ以上のバイオマーカーを含有するか、または含有することが疑われる体液（生体液）の例には、血液、尿、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、脳および脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、鼻汁、骨髄吸引液、関節液または滑液、眼房水、羊水、卵胞液、耳垢、母乳（初乳を含む）、気管支肺胞洗浄液、精液、精漿（前立腺液を含む）、カウパー液または射精前液、腟液（ｆｅｍａｌｅ  ｅｊａｃｕｌａｔｅ）、汗、涙、嚢胞液、胸水および腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）または洗浄液、心膜液、リンパ液、粥状液、胆汁、肝臓灌流液、間質液、月経、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水様便（ｓｔｏｏｌ  ｗａｔｅｒ）、糞便液（ｆａｅｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）、膵液、副鼻腔からの洗浄液、体腔、気管支肺吸引液、または他の洗浄液が含まれる。生物学的試料にはまた、胎児または母体起源のものであり得る、胚盤胞腔（ｂｌａｓｔｏｃｙｌ  ｃａｖｉｔｙ）、臍帯血、または母体循環も含まれ得る。
【００６６】
試験するのに好ましい体液の例は、血液、尿、および腹水、特に卵巣癌を有するか、またはそれを有することが疑われる動物、対象、または患者由来の腹水である。尿試料が使用される場合、それは好ましくは、例えば、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、精巣癌、尿道癌、および陰茎癌などの泌尿器系、泌尿生殖器系、および生殖器系の癌に関連して使用される。β２ＧＰＩと同様に、他のバイオマーカーのうちの１つ以上の検出および定量化は、好ましくは末梢血試料、好ましくは血漿、および最も好ましくは血清から実行される。
【００６７】
Ｄ２．ＰＳ陽性エキソソーム
近年、エキソソームは癌に関連して注目を集めている。エキソソームは、インビボおよびインビトロで全ての細胞によって恒常的に放出される、４０〜５０から１００ナノメートル（ｎｍ）のサイズの膜由来小胞である。エキソソームは、細胞間の情報交換において重要な役割を果たし、多くの生理学的および病理学的プロセスに影響を与える、生物学的に活性な分子シャトルである。癌において、エキソソーム機能は、癌細胞と、転移拡散のためのいわゆる「転移ニッチ」をプライミングする腫瘍間質との間の癌遺伝子の伝達を含む（Ａｎら、２０１５）。
【００６８】
エキソソーム形成に関与する複数の細胞内融合事象のために、細胞外に放出されたエキソソームの管腔内容物およびプロテオミクスプロファイルは、起源細胞のものに酷似している。したがって、腫瘍由来エキソソーム（「腫瘍エキソソーム」）は、それらが由来する癌細胞を反映するプロファイルを有する。実際に、起源細胞由来のサイトゾル（特に核酸）および原形質膜構成成分の存在は、循環エキソソームがバイオマーカー分析のための親細胞の特性を反映する容易に入手可能な代用物であることを意味する。
【００６９】
正常細胞由来のエキソソームとは対照的に、腫瘍エキソソームは、それらの表面上にＰＳを有することを特徴とする。したがって、ＰＳ陽性腫瘍エキソソームを、癌の診断に使用することができる。固相アッセイを使用して、体液試料中のＰＳ陽性腫瘍エキソソームを検出および定量化することによって癌を診断するための、新たな改善された方法、組成物、およびキットが近年報告された。そのような技術は、各々２０１６年６月９日に出願された米国特許出願第１５／１７７，７４７号およびＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／０３６６２９号に記載されている。
【００７０】
ＰＳは高度に免疫抑制性であるため、ＰＳ陽性腫瘍エキソソームの放出は、腫瘍が免疫抑制環境を促進する別の手段である。したがって、治療前のＰＳ陽性腫瘍エキソソームのレベルは、任意の癌治療のための治療法に対する奏効の予測マーカーとして使用することが提案されている。明らかに、ＰＳ標的化抗体は、疾患微小環境内でＰＳに結合する必要がある。したがって、治療前のＰＳ陽性腫瘍エキソソームのレベルの測定は、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を使用する治療法に対する奏効の予測バイオマーカーとしての使用に特に説得力がある。
【００７１】
したがって、米国第１５／１７７，７４７号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／０３６６２９号にあるものなどの方法は、本発明のバイオマーカー試験の一部分として使用することができる。β２ＧＰＩの現在の定量化および／または他のバビツキシマブバイオマーカーとのそれらの併用は、例えば、予測分析全体の感度を増強するために、特定の実施形態において好ましくあり得る。
【００７２】
Ｅ．バイオマーカーとしてのβ２ＧＰＩ
それを否定する広範なデータ（例えば、実施例Ｖ）にも関わらず、本発明者らは、治療前のレベルのβ２ＧＰＩを、バイオマーカーとして、またはバイオマーカーのパネルの一部分として使用して、バビツキシマブおよび関連抗体を使用する治療法の治療結果を予測することができるかどうかを調査することを決定した。
【００７３】
β２ＧＰＩは、遊離のものとリポタンパク質に関連するものとの両方が見出される、豊富な血漿（血清）糖タンパク質である。マウス、ラット、イヌ、ウシ、チンパンジー、およびヒトを含む、様々な哺乳動物種由来のβ２ＧＰＩのＤＮＡおよびアミノ酸配列が既知である（Ｓｔｅｉｎｋａｓｓｅｒｅｒら、１９９１）。例示的な参考までに、ヒトβ２ＧＰＩアミノ酸配列は、受入番号１Ｃ１ＺＡとして提供されている。β２ＧＰＩはグリコシル化されており、５０ｋＤａのタンパク質として通例的に報告されている（実施例ＩＶ、Ａ４、Ｂ３；ＭｃＮｅｉｌら、１９９０の図３；Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、１９９８の図１；Ｌｕｓｔｅｒら、２００６の図１Ｄもまた参照されたい）。β２ＧＰＩは数十年間研究されているものの、β２ＧＰＩの正確な生理学的役割は未知のままである（Ｐｒａｋａｓａｍ＆Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ、２０１２）。実際に、β２ＧＰＩを欠損したノックアウトマウスの見かけ上健康な生活は、その役割が重要ではないことを示している（Ｓｈｅｎｇら、２０１１）。
【００７４】
驚くべきことに、治療前のβ２ＧＰＩ、特に機能性β２ＧＰＩの血中濃度が、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を使用する治療法に対する奏功を予測するためのバイオマーカーとして有効であることが決定された。実際に、ＰＳと、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体との両方に結合するβ２ＧＰＩを意味する「機能性」β２ＧＰＩのレベルは、バビツキシマブに対する応答のためのバイオマーカーとして単独で有用である。
【００７５】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体に対する応答のバイオマーカーとして治療前のβ２ＧＰＩレベルを単独で使用する本発明の実施形態において、それらのβ２ＧＰＩレベルは共に数値的に定義され、本明細書に定義される「機能性」β２ＧＰＩを検出できるアッセイにおいて測定される。しかしながら、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体に対する応答の２つ以上または複数のバイオマーカーのうちの１つとして治療前のβ２ＧＰＩレベルを使用する本発明の実施形態において、β２ＧＰＩレベルはそれほど厳密に数値的に定義される必要はなく、機能性β２ＧＰＩのアッセイにおいて単独で測定される必要はない。
【００７６】
したがって、バビツキシマブ含有療法のための二重または多重マーカー符号の一部分としてのβ２ＧＰＩレベルは、「β２ＧＰＩ高」対「β２ＧＰＩ低」であり得、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ（登録商標）良好（ＶＳ良好）およびＶＳ不良、ならびに「熱」または「冷」腫瘍などの説明と同様である。バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体での治療には、「β２ＧＰＩ高」を有する患者が選択されるべきである。この文脈において、「β２ＧＰＩ高」であるβ２ＧＰＩのレベルは、約１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、または２６０μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約２００μｇ／ｍｌ以上のβ２ＧＰＩ（全β２ＧＰＩ、または好ましくは機能性β２ＧＰＩのいずれか）の治療前レベルである。したがって、「β２ＧＰＩ高」は、約１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、または３２０μｇ／ｍｌに等しいβ２ＧＰＩ、（全β２ＧＰＩ、または好ましくは機能性β２ＧＰＩのいずれか）の治療前レベルを含む。
【００７７】
本発明はまた、機能性β２ＧＰＩを検出することができるアッセイにおいて測定される、特定の数値的に定義された量および範囲の機能性β２ＧＰＩに関するバイオマーカーも提供する。最も好ましい実施形態において、本発明は、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルに基づく患者の選択および治療に関する（実施例ＸＶＩＩ、図１８Ａおよび図１８Ｂ、実施例ＸＶＩＩＩ、実施例ＸＸ）。これは、約２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、または３２０μｇ／ｍｌに等しい治療前レベルの機能性β２ＧＰＩを含み得る。
【００７８】
実施例ＸＶＩＩ、実施例ＸＶＩＩＩ、および実施例ＸＸのデータによって例証されるように、β２ＧＰＩデータが利用可能である全ての臨床試験において、バビツキシマブは、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者で全生存期間を改善した。結果を表Ａに要約し、表中、治療欄は、引用された薬剤を併用した、列挙された適応症のバビツキシマブ治療を指す。加えて、バビツキシマブおよび後続ＩＯで治療したＮＳＣＬＣ患者（実施例ＸＸ）では、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩがプラセボよりもバビツキシマブの生存期間にとって有利であることが示された（バビツキシマブではｍＯＳに到達しなかったのに対して、プラセボでは１２．３ヶ月；ｐ＝０．００２、図２７）が、２００以上のβ２ＧＰＩ群および２００未満のβ２ＧＰＩ群におけるバビツキシマブ治療患者間の比較は、ｍＯＳがいずれの群についてもまだ到達されていないため、未だ行うことができない。
【表１】
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【００７９】
２００μｇ／ｍｌ以上の広く適用可能なレベルのβ２ＧＰＩと同様に、本発明の特定の現在好ましい実施形態は、特にＮＳＣＬＣを治療するための、２００〜２９０μｇ／ｍｌの範囲内の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルに基づく患者の選択および治療に関する（実施例ＸＶＩＩ、表１４Ａおよび表１４Ｂを比較されたい）。これはまた、２００〜２７０、２００〜２８０、２００〜２９０、２００〜３００、２００〜３１０、２００〜３２０、２１０〜２７０、２１０〜２８０、２１０〜２９０、２１０〜３００、２１０〜３１０、および２１０〜３２０μｇ／ｍｌなどの範囲内の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルも含み、２１０〜２７０、２１０〜２８０、２１０〜２９０、２００〜２８０、および２００〜２９０が現在好ましい。
【００８０】
更なる実施形態において、本発明は、低い数として約１９０、２００、２１０、または２２０μｇ／ｍｌのうちのいずれか１つから、高い数として約２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、または３２０μｇ／ｍｌのうちのいずれか１つまでの範囲内の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルに基づく患者の選択および治療に関する。これらの範囲には以下、
約１９０〜２６０、１９０〜２７０、１９０〜２８０、１９０〜２９０、１９０〜３００、１９０〜３１０、および１９０〜３２０；
約２００〜２６０、２００〜２７０、２００〜２８０、２００〜２９０、２００〜３００、２００〜３１０、および２００〜３２０；
約２１０〜２６０、２１０〜２７０、２１０〜２８０、２１０〜２９０、２１０〜３００、２１０〜３１０、および２１０〜３２０；
約２２０〜２６０、２２０〜２７０、２２０〜２８０、２２０〜２９０、２２０〜３２０、２２０〜３１０、および２２０〜３２０の全てが含まれ、その中でも約２１０〜２７０、２１０〜２８０、２１０〜２９０、２００〜２８０、および２００〜２９０μｇ／ｍｌの範囲が好ましい。
【００８１】
２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルに基づく、患者の最も好ましくかつ一般的に適用可能な選択および治療に加えて、任意の特定の治療または併用治療のために上記の数または範囲のうちのいずれか１つ以上のどれが選択されようと、治療前レベルのβ２ＧＰＩ、好ましくは機能性β２ＧＰＩのバイオマーカーとしての、またはバイオマーカーのパネルの一部分としての使用は、ＰＳがマーカーである広範囲の疾患（特に癌およびウイルス感染症であるが、細胞内寄生体の感染症でもある）を有する患者の選択、ならびに単独で、または好ましくは任意の併用療法でのいずれかで、ＰＳ標的化抗体を使用するそれらの治療に適用される。
【００８２】
Ｆ．β２ＧＰＩのアッセイ
β２ＧＰＩの治療前レベルは、バビツキシマブおよび関連抗体のバイオマーカーであるため、β２ＧＰＩのアッセイに関して以下の指針が提供される。本発明はまた、機能性β２ＧＰＩを定量化するための特定の好ましいアッセイも提供する（節Ｇ）。
【００８３】
Ｆ１．β２ＧＰＩ試料
血清タンパク質として、β２ＧＰＩは、下記のように末梢血（血漿、血清）試料中での検出に理想的である。しかしながら、ＰＳが関与する様々な病態生理学的条件下で、β２ＧＰＩはインビボで内皮細胞に局在化することが研究により示唆されている（Ａｇｏｓｔｉｎｉｓら、２０１１）。したがって、全範囲の生物学的試料（節Ｄ１）が潜在的にはβ２ＧＰＩ検出に使用され得る。
【００８４】
それにも関わらず、末梢血、血漿、および血清試料が、全β２ＧＰＩであるか機能性β２ＧＰＩであるかに関わらず、β２ＧＰＩの検出および定量化に特に好ましい（節Ｇ）。全血が使用されてもよい（赤血球、白血球、血小板、タンパク質、および血漿）。好ましくは、赤血球および白血球の沈殿後に残る液体である血漿が使用される。血漿は、フィブリノーゲンおよび他の凝固因子を含有するため、放置すると凝固する傾向がある。凝固しにくい血漿が入手可能であり、これが好ましく、また無血小板血漿が使用されてもよい。最も好ましくは、血清が、β２ＧＰＩの検出および定量に使用される。血清は凝固因子を有せず、主にフィブリノーゲンを有しない血漿であるため、血清は放置しても凝固しない。動物およびヒトの血清が診断目的で通例的に使用されており、調製技術は広く知られている。β２ＧＰＩ試験用の血清試料を調製するための例示的な方法を本明細書に示す（実施例ＸＶ、Ａ）。
【００８５】
本発明の利点は、試験を、生物学的試料、好ましくは血液、血漿、または血清に対して直接実行することができることである。感度のために、β２ＧＰＩは、いかなる事前の富化または濃縮もせずに（しかし、これは排除されない）容易に検出することができる。試験試料、好ましくは血清試料は、新鮮なものでも、事前に凍結され、その後解凍されたものでもよい。実施例ＸＶ、実施例ＸＶＩ、実施例ＸＶＩＩ、および実施例ＸＶＩＩＩは、β２ＧＰＩが−７０℃での長期保存に対して安定であることを示す。低音貯蔵管もしくはバイアルおよび／または全体的なタンパク質分解を制限するためのプロテアーゼ阻害剤の使用などの、凍結、保存、および／または解凍の業界標準の技術を使用するのが好ましい。
【００８６】
Ｆ２．β２ＧＰＩアッセイの範囲
それが「機能性」β２ＧＰＩであるかどうかに関係なく、β２ＧＰＩを測定するためのアッセイ（すなわち、「全」β２ＧＰＩのためのアッセイ）の幅は、治療前β２ＧＰＩレベルがバビツキシマブの２つ以上のバイオマーカーのうちの唯一のものとして使用される本発明の実施形態との使用に適用可能である。β２ＧＰＩのレベルがバビツキシマブのバイオマーカーとして単独で使用される場合、節Ｇに記載されるように、「機能性」β２ＧＰＩアッセイが使用されるべきである。
【００８７】
全β２ＧＰＩレベルは、当該技術分野において既知である多くのインビトロ結合アッセイおよびキットのうちの任意の１つ以上を使用して検出および好ましくは定量化することができる。好適な結合アッセイとしては、例えば、免疫ブロット、ウエスタンブロット、ドットブロット、ＲＩＡ、免疫組織化学、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、免疫沈降、親和性クロマトグラフィーなどが挙げられる。典型的には固相結合アッセイが好ましいが、β２ＧＰＩを検出するための様々な他の方法が文献に記載されており、それらのいずれを使用してもよい。例えば、β２ＧＰＩレベルは、放射状免疫拡散によって正確に決定することができる。実際に、放射状免疫拡散は、１９６０年代後半からより現代までβ２ＧＰＩの定量化に使用されてきた（例えば、Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、１９９８）。ウエスタンブロット、免疫電気泳動、およびオクタロニー二重免疫拡散（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、２０００）と同様に、等電点電気泳動（ＩＥＦ）およびそれに続く免疫ブロットもまた、β２ＧＰＩの定量化に使用することができる（Ｋａｍｂｏｈら、１９８８）。
【００８８】
Ｆ３．固相β２ＧＰＩ結合アッセイ
β２ＧＰＩの多数の高感度固相結合アッセイが当該技術分野において既知であり、全β２ＧＰＩは、好ましくはそのようなアッセイのうちの１つ以上を使用して検出および定量される。そのようなアッセイの好ましい一例は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）としてのものである。修飾捕捉ＥＬＩＳＡ（例えば、Ｍｅｈｄｉら、１９９９）および競合ＥＬＩＳＡ（例えば、Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、１９９８）を含む、全β２ＧＰＩに特異的な様々なＥＬＩＳＡが文献に報告されている。診断用ラベルに添付されているものを含む、市販の抗β２ＧＰＩ抗体と同様に、全β２ＧＰＩをアッセイするための多数の市販のキットが利用可能である。任意のそのようなキットまたは抗体を使用して、全β２ＧＰＩを検出および定量することができる。例えば、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌの抗β２ＧＰＩ抗体が、本明細書において比較アッセイで使用される（実施例ＸＶＩ、Ａ１０、Ｂ２）。
【００８９】
一般論として、全β２ＧＰＩのためのＥＬＩＳＡは、１つ以上の抗β２ＧＰＩ抗体を使用する。抗体技術は非常に進歩しているが、市販のキットおよび市販の抗β２ＧＰＩ抗体はしばしばポリクローナル抗β２ＧＰＩ抗体を使用し、それらはそのような実施形態における使用に完全に好適である。全β２ＧＰＩのための例示的なアッセイにおいて、抗β２ＧＰＩ抗体は９６ウェルプラスチックプレートなどの固体表面に吸着され、β２ＧＰＩ（この場合「抗原」）を含有することが疑われる生物学的試料と共にインキュベートされる。結合したβ２ＧＰＩ（抗原）は、検出可能な物質、すなわち、検出および定量化可能である色または蛍光などの検出可能なシグナルを生成する物質で直接的または間接的に標識された二次結合剤を使用して検出される。好ましくは、二次結合剤は、検出可能な物質で標識されている抗β２ＧＰＩ抗体である。
【００９０】
全β２ＧＰＩのためのそのようなＥＬＩＳＡは、実施例ＸＶＩ、Ａ１０、Ｂ２に例証され、固体支持体および検出可能な物質などの多くの一般的な構成要素およびステップもまた、本発明の機能性β２ＧＰＩアッセイに関して以下により完全に記載される（節Ｇ）。したがって、特定の試薬またはステップが機能性β２ＧＰＩアッセイでの使用にのみ適用されることが明らかでない限り、全β２ＧＰＩを検出するためのアッセイでのそれらの適用が本明細書において企図される。
【００９１】
Ｇ．機能性β２ＧＰＩのための好ましいＥＬＩＳＡ
より良い結果を予測するためのバイオマーカーの臨床試験結果を分析するための様々な市販のアッセイおよび研究ツールが利用可能であるが、いずれもバビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体に特有に適用可能であることは知られていなかった。低レベルおよび／または変動するレベルの血清β２ＧＰＩがバビツキシマブの治療結果に有意な影響を及ぼさない（実施例Ｖ、図１９）ことを示す、広範な前臨床モデル化および有意な先行臨床経験にも関わらず、第ＩＩＩ相試験の患者におけるβ２ＧＰＩ濃度の分析（実施例ＸＩＶ）が模索された。
【００９２】
しかしながら、全β２ＧＰＩとは対照的に、ＰＳに結合し得るβ２ＧＰＩを特異的に検出するための信頼できる定量的なβ２ＧＰＩアッセイは、入手することができなかった。そのようなアッセイは、特にβ２ＧＰＩの一部分（「全」β２ＧＰＩ）がニック入りβ２ＧＰＩとして存在し、それがＰＳに結合できず、したがって疾患部位で抗体結合を媒介できないことが周知であるため、バイオマーカーに適用される最も正確な測定に必要である。さらに、ＰＳにだけでなく、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体にも結合し得るβ２ＧＰＩを特異的に検出するためのいかなるアッセイも著しく欠如していた。これは、例えば、他の有意義な変化（特に、ドメインＩＩにおける、またはそれに影響を与える突然変異および／またはニックもしくは切断）を有するβ２ＧＰＩが検出されていた可能性を除外するための最高の忠実度のバイオマーカー測定にとって特に重要であるが、これは、いかなるそのようなβ２ＧＰＩ変化も、治療活性に必要とされる抗体：β２ＧＰＩ：ＰＳ複合体の形成を減少または無効化するためである。
【００９３】
したがって、第ＩＩＩ相試験（実施例ＸＩＶ）の患者を含む、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体で治療した（または治療される予定の）患者においてβ２ＧＰＩ濃度の最適な分析を実行するには、まず新たなアッセイを発明する必要があった。本出願は、血漿および血清などのヒト血液試料中の機能性（活性）β２ＧＰＩの量を検出および定量化する目的に特有に適合した、そのような有利なアッセイを開示し、このアッセイは、ＰＳと、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体との両方に結合し得るβ２ＧＰＩのレベルを決定することができる。
【００９４】
機能性β２ＧＰＩのためのそのようなアッセイを使用することによって、本発明は、バビツキシマブおよび関連ＰＳ標的化抗体での治療に対する奏効の単一のバイオマーカーとして使用するための定義されたレベルの治療前β２ＧＰＩを提供する。特に、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩ（実施例ＸＶＩＩ、図１８Ａおよび図１８Ｂ、実施例ＸＶＩＩＩ、実施例ＸＸ）は、２００〜２９０μｇ／ｍｌの範囲内の機能性β２ＧＰＩによって例証されるように、バビツキシマブでの治療に対する奏効を広く予測する（実施例ＸＶＩＩ、表１４Ａおよび表１４Ｂを比較されたい）。本発明によって提供される機能性β２ＧＰＩのための好ましいＥＬＩＳＡは、実施例ＸＶＩの詳細な教示によって例証され、また以下により完全に記載される。
【００９５】
Ｇ１．アッセイ方法
一般論として、機能性β２ＧＰＩのためのＥＬＩＳＡなどの固相アッセイは、ＰＳと、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体との両方を使用し、それらのうちの少なくとも一方は、固体支持体に操作可能に関連付けられている、かつ／またはそれらのうちの少なくとも一方は、検出可能な物質で直接的もしくは間接的に標識されている。全ての結合形式が使用され得る。例えば、ＰＳ標的化抗体を固体支持体に吸着させ、ＰＳを検出可能な物質で標識してもよい。検出可能な物質で標識されるＰＳなどの多くの脂質が当該技術分野において既知であり、それらのいずれが使用されてもよい。しかしながら、簡略化のために、現在好ましい実施形態は、ＰＳが９６ウェルプラスチックプレートなどの固体表面に吸着されているものである。これは、バビツキシマブまたは１Ｎ１１などのＰＳ標的化抗体が、好ましくは抗体に結合した直接標識である検出可能な物質で標識され得ることを意味する。
【００９６】
これらのアッセイにおいて、ＥＬＩＳＡプレート（またはそのウェル）などのＰＳコーティング固体支持体は、バビツキシマブまたは１Ｎ１１などのＰＳ標的化抗体、およびβ２ＧＰＩを含有することが疑われる生物学的試料と共にインキュベートされる。概念的には、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、およびβ２ＧＰＩ試料が、ＰＳコーティング固体支持体またはプレート上で「同時インキュベート」されることが重要である。科学的には、β２ＧＰＩが（インタクトな）ドメインＶを介してＰＳに結合し、その後にプレートに結合したβ２ＧＰＩのドメインＩＩに結合するバビツキシマブが続くか、またはバビツキシマブが溶液中でβ２ＧＰＩのドメインＩＩに結合し、その後にプレート上のＰＳに結合する（インタクトなドメインＶを有する）複合体化したバビツキシマブ／β２ＧＰＩが続くかのいずれかであり得る。両方の結合事象はインキュベーション時間中に生じるため、同時インキュベーションは全てのそのような結合機構を包含する。
【００９７】
ＰＳコーティング支持体上でＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、およびβ２ＧＰＩ試料を「同時インキュベートすること」は、「有効な結合条件」下、すなわち、「β２ＧＰＩが、試料中のＰＳ標的化抗体およびＰＳコーティング支持体の両方に結合するのを可能にするのに有効な条件下および時間」で一緒にインキュベートすることを意味する。「結合」は、「特異的結合」、すなわち、通常の洗浄によっては除去されない結合を可能にするのに有効な条件下かつ時間を意味する。したがって、バビツキシマブを使用する場合、有効な結合条件は、ＰＳのβ２ＧＰＩのインタクトな（ニックのない）ドメインＶへの結合およびバビツキシマブのβ２ＧＰＩのドメインＩＩへの結合を可能にする。バビツキシマブ以外のＰＳ標的化抗体を使用する場合、有効な結合条件は、ＰＳのβ２ＧＰＩのインタクトな（ニックのない）ドメインＶへの結合、およびＰＳ標的化抗体のβ２ＧＰＩへのドメインＶ以外のドメインでの結合（好ましくはドメインＩおよびＩＩを接合するヒンジ領域への、ならびに最も好ましくはβ２ＧＰＩのドメインＩＩへの結合）を可能にする。
【００９８】
ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、およびβ２ＧＰＩ試料がＰＳコーティング固体支持体またはプレート上で同時インキュベートされる限り、本発明のアッセイはいくつかの異なる形式を含む。例えば、ＰＳ標的化抗体、およびβ２ＧＰＩを含有することが疑われる試料は、実質的に同時にＰＳコーティング支持体に添加されてもよい。好ましくは、ＰＳ標的化抗体、およびβ２ＧＰＩを含有することが疑われる試料は、連続的に、すなわち、時間間隔を置いてＰＳコーティング支持体に添加される。
【００９９】
連続アッセイ結合ステップを実施する上で、ＥＬＩＳＡウェルなどのＰＳコーティング固体支持体は、まずβ２ＧＰＩを含有することが疑われる生物学的試料と共にインキュベートされ、その後、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブと共に同時インキュベートされてもよい。上記のアッセイは、事前調製されたＰＳコーティング支持体を利用することができ、その場合、アッセイは、以下（または以下のステップ）、
（ａ）β２ＧＰＩのインタクトなドメインＶを介して生物学的試料中のβ２ＧＰＩをＰＳコーティング支持体に結合させるのに有効な条件下で、β２ＧＰＩを含有することが疑われる生物学的試料をＰＳコーティング支持体に添加し、それによってＰＳおよびβ２ＧＰＩコーティング支持体を調製するステップと、
（ｂ）ドメインＶ以外のβ２ＧＰＩドメインへの抗体結合によってＰＳ標的化抗体をＰＳおよびβ２ＧＰＩコーティング支持体に結合させるのに、好ましくはβ２ＧＰＩドメインＩＩへの抗体結合によってバビツキシマブをＰＳおよびβ２ＧＰＩコーティング支持体に結合させるのに有効な条件下で、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブをＰＳおよびβ２ＧＰＩコーティング支持体に添加するステップと、
（ｃ）ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブのＰＳおよびβ２ＧＰＩコーティング支持体への結合を検出し、それによって生物学的試料中の機能性β２ＧＰＩを測定するステップと、を含む。
【０１００】
しかしながら、連続アッセイ結合ステップを実行する上で、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、および最も好ましくは検出可能に標識されたバビツキシマブは、最初にＰＳコーティング固体支持体に適用され、その後β２ＧＰＩを含有することが疑われる生物学的試料と共に同時インキュベートされる。そのようなアッセイまたは一連のステップは、技術的な理由で、例えば、ピペッティング中の相互汚染を回避するために好ましい。そのような好ましいアッセイは、以下（または以下のステップ）、
（ａ）固体支持体をＰＳでコーティングして、ＰＳコーティング支持体を調製するステップと、
（ｂ）ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、および最も好ましくは検出可能に標識されたバビツキシマブを、ＰＳコーティング支持体に添加して、抗体で覆われたＰＳコーティング支持体を調製するステップと、
（ｃ）生物学的試料中のβ２ＧＰＩを抗体で覆われたＰＳコーティング支持体に結合させるのに有効な条件下で、すなわち、β２ＧＰＩのインタクトなドメインＶを介したβ２ＧＰＩのＰＳコーティング支持体への結合によって、およびドメインＶ以外のβ２ＧＰＩドメインを介したβ２ＧＰＩのＰＳ標的化抗体への結合によって、好ましくはβ２ＧＰＩドメインＩＩを介したβ２ＧＰＩのバビツキシマブへの結合によって、本質的に洗浄することなく、β２ＧＰＩを含有することが疑われる生物学的試料を抗体で覆われたＰＳコーティング支持体に添加するステップと、
（ｄ）ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ（最も好ましくは検出可能に標識されたバビツキシマブ）、およびβ２ＧＰＩのＰＳコーティング支持体への結合を検出し、それによって生物学的試料中の機能性β２ＧＰＩを測定するステップと、を含む。
【０１０１】
このアッセイはまた、事前調製されたＰＳコーティング支持体を利用してもよく、その場合、アッセイは以下（または以下のステップ）、
（ａ）ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、および最も好ましくは検出可能に標識されたバビツキシマブをＰＳコーティング支持体に添加して、抗体で覆われたＰＳコーティング支持体を調製するステップと、
（ｂ）生物学的試料中のβ２ＧＰＩを抗体で覆われたＰＳコーティング支持体に結合させるのに有効な条件下で、すなわち、β２ＧＰＩのインタクトなドメインＶを介したβ２ＧＰＩのＰＳコーティング支持体への結合によって、およびドメインＶ以外のβ２ＧＰＩドメインを介したβ２ＧＰＩのＰＳ標的化抗体への結合によって、好ましくはβ２ＧＰＩドメインＩＩを介したβ２ＧＰＩのバビツキシマブへの結合によって、本質的に洗浄することなく、β２ＧＰＩを含有することが疑われる生物学的試料を抗体で覆われたＰＳコーティング支持体に添加するステップと、
（ｃ）ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ（最も好ましくは検出可能に標識されたバビツキシマブ）、およびβ２ＧＰＩのＰＳコーティング支持体への結合を検出し、それによって生物学的試料中の機能性β２ＧＰＩを測定するステップと、を含む。
【０１０２】
ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、および最も好ましくは検出可能に標識されたバビツキシマブが、最初にＰＳコーティング固体支持体に適用され、その後β２ＧＰＩを含有することが疑われる生物学的試料と共に同時インキュベートされる連続結合ステップを有する好ましいアッセイは、簡潔には、以下（または以下のステップ）、
（ａ）固体支持体をＰＳでコーティングして、ＰＳコーティング支持体を調製するステップと、
（ｂ）試料中のβ２ＧＰＩをＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブと、ＰＳコーティング支持体との両方に結合させるのに有効な条件下で、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、および最も好ましくは検出可能に標識されたバビツキシマブ、ならびにβ２ＧＰＩを含有することが疑われる生物学的試料を、ＰＳコーティング支持体に添加するステップであって、好ましくは、ＰＳ標的化抗体がβ２ＧＰＩを含有する試料の添加前にＰＳコーティング支持体に添加され、それらが一緒に同時インキュベートされる、ステップと、
（ｃ）ＰＳ標的化抗体およびβ２ＧＰＩのＰＳコーティング支持体への結合を検出し、それによって試料中の機能性β２ＧＰＩを測定するステップと、を含む。
【０１０３】
繰り返すが、アッセイは事前調製されたＰＳコーティング支持体を利用してもよく、その場合、アッセイは、以下（または以下のステップ）、
（ａ）試料中のβ２ＧＰＩをＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブと、ＰＳコーティング支持体との両方に結合させるのに有効な条件下で、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブ、および最も好ましくは検出可能に標識されたバビツキシマブ、ならびにβ２ＧＰＩを含有することが疑われる生物学的試料を、ＰＳコーティング支持体に添加するステップであって、好ましくは、ＰＳ標的化抗体がβ２ＧＰＩを含有する試料の添加前にＰＳコーティング支持体に添加され、それらが一緒に同時インキュベートされる、ステップと、
（ｂ）ＰＳ標的化抗体およびβ２ＧＰＩのＰＳコーティング支持体への結合を検出し、それによって試料中の機能性β２ＧＰＩを測定するステップと、を含む。
【０１０４】
結合したＰＳ標的化抗体およびβ２ＧＰＩ（抗原）は、少なくともＰＳ標的化抗体の形態、好ましくはバビツキシマブまたは１Ｎ１１の形態の少なくとも１つの二次結合剤を使用して検出され、これは、検出可能な物質で直接的または間接的に標識される。非標識ＰＳ標的化抗体は、ＰＳ標的化抗体に結合し、かつ検出可能な物質で直接標識されている三次結合剤、好ましくは別の抗体との関連で使用され得る。そのような三次結合抗体は当該技術分野において周知であり、例えば、ＰＳ標的化抗体のＦｃ部分に特異的に結合する。
【０１０５】
簡略化のために、現在好ましい実施形態は、ＰＳ標的化抗体、好ましくはバビツキシマブが、それ自体検出可能な物質に直接結合しているものである。検出可能な物質は、色または蛍光などの検出および測定または定量化され得る検出可能なシグナルを生成する物質である。例示的な検出可能な物質は、酵素の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり、ＨＲＰは、基質３，３’５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を切断して、４５０ｎｍで検出および測定される色付きシグナルを生成する。典型的には、シグナルから測定される結合材料の量は、標準曲線などの「基準シグナル」のレベルと比較される。必要に応じて、標準曲線は、全てのアッセイにおいて複製されてもよい。
【０１０６】
これらのアッセイの全ての形式において、最終的に検出される唯一のβ２ＧＰＩは、ＰＳおよびＰＳ標的化抗体の両方に結合することができるβ２ＧＰＩ、すなわち、通例的な洗浄によって全体的には除去されないβ２ＧＰＩである。したがって、これらのアッセイは、臨床治療に最も関連する形態の治療前β２ＧＰＩ、すなわち、投与された抗体、好ましくはバビツキシマブ、および好ましくは腫瘍の微小環境内の疾患部位に曝露されたＰＳと結合複合体を形成するように「機能する」β２ＧＰＩの検出に特有に適している。したがって、これらのアッセイの使用は、バビツキシマブ療法での改善された治療結果のための患者の選択において有利である。
【０１０７】
本発明によって提供される機能性β２ＧＰＩアッセイはまた、単純で再現性があり、高感度で費用効果が高く、かつ低侵襲技術によって得られる生物学的試料、特に血液（血清および血漿）試料と共に使用するのに理想的である。アッセイの迅速な性質は、バイオマーカー試験を素早く実行し、治療決定を適時に行い、実施することができるという重要な利点を提供する。しかしながら、本発明によって提供される機能性β２ＧＰＩを定量化するための新たなアッセイは、単にバビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を使用する治療法でバイオマーカーとして使用するためのβ２ＧＰＩの測定における使用のみに限定されない。β２ＧＰＩは、基礎的および指向的前臨床研究および臨床研究において重要な分子であるため、これらのアッセイは、任意の１つ以上のそのような実施形態において（例えば、ノックアウトマウス、またはヒトにおける抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）に関連する実施形態など）機能性β２ＧＰＩを測定するために使用することができる。
【０１０８】
Ｇ２．固体支持体
本発明の固相結合アッセイは、典型的には、結合構築物を（コーティングまたは結合のための少なくとも１つの表面を有する）固体支持体または基質と操作可能に会合させることを必要とする。本明細書で使用される場合、「結合構築物」は、バイオマーカーの検出に有用な構成成分に結合する構築物を含む。β２ＧＰＩバイオマーカーに関連して、結合構築物は、抗β２ＧＰＩ抗体、ＰＳ、およびバビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を含む。
【０１０９】
そのような固体支持体または基質としては、例えば、プレート、ビーズ、および繊維が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、固体支持体または基質は、標準的な９６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートである。固体支持体または基質は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ラテックス、ガラス、ポリスチレン、ポリビニル、ニトロセルロース、シリコン、シリカ、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの任意の好適な材料から製造することができる。結合構築物は、支持体または基質の少なくとも１つの表面を結合構築物と効率的に接触させることによって、固体支持体または基質と操作可能に会合されている。好ましくは、結合構築物は、固体支持体または基質の少なくとも１つの表面に固定化される。結合構築物はまた、コーティングされたスライドガラス上に印刷され、バイオマーカーアレイまたはマイクロアレイにおいて使用されてもよい。非接触印刷および接触印刷の両方を使用して、そのようなマイクロアレイを調製することができ、接触印刷が好ましい。
【０１１０】
Ｇ３．検出可能な物質
好適な検出可能な物質としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、およびウレアーゼなどの酵素が挙げられる。西洋ワサビペルオキシダーゼ検出系は、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と共に使用することができ、これは、過酸化水素の存在下、４５０ｎｍで検出可能な可溶性生成物をもたらす。他の好都合な酵素結合系としては、例えば、アルカリホスファターゼ検出系が挙げられ、これを発色基質ｐ−ニトロフェニルリン酸と共に使用して、４０５ｎｍで容易に検出可能な可溶性生成物を得ることができる。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出系を発色基質Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）と共に使用して、４１０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を得ることができ、またはウレアーゼ検出系をウレア−ブロモクレゾールパープルなどの基質と共に使用することができる。
【０１１１】
検出可能な物質の更なる例としては、化学発光標識および蛍光検出用の標識が挙げられる。有用な蛍光色素としては、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、フルオレセイン、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５Ｓ、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、およびリサミンが挙げられる。フルオレセインもしくはローダミン標識抗体もしくはアネキシン、および／またはフルオレセインもしくはローダミン標識二次抗体が使用されてもよい。同位体もまた検出方法において有用であり得、その部分およびアッセイは当該技術分野において周知である。
【０１１２】
検出可能な物質は検出可能なシグナルを生成し、その後、これは検出および好ましくは定量化される。検出可能なシグナルは、例えば、発色基質から色を検出するための分光光度計、放射線を検出するための放射線計数器（１２５Ｉ検出用ガンマ計数器など）、または特定の波長の光の存在下で蛍光を検出するための蛍光光度計を使用して分析することができる。酵素結合アッセイを使用する場合、検出可能なシグナルの定量分析は、分光光度計を使用して実行することができる。
【０１１３】
Ｇ４．キット
本発明はまた、診断的、予後的、および予測的治療キットを含む一連のバイオマーカーに基づくキットを提供する。バイオマーカーキットは、典型的には、本明細書に教示されるバイオマーカーの検出に有用な結合構築物のうちの１つ以上を含むだろう。β２ＧＰＩバイオマーカーに関連するキットは一般に、抗β２ＧＰＩ抗体、ＰＳ、およびＰＳ標的化抗体（バビツキシマブなど）などの少なくとも第１のβ２ＧＰＩ結合構築物を含むだろう。
【０１１４】
他のキットは、バイオマーカー検出のための結合構築物と、選択された患者の治療に使用するための少なくとも第１の治療剤、例えば、バビツキシマブもしくは１Ｎ１１などのＰＳ標的化抗体、またはその免疫複合体との両方を含む。そのようなキットは、ＰＳ標的化抗体との併用治療に使用するための少なくとも第２または第３の異なる治療剤をさらに含み得る。例えば、１つ以上の化学療法剤、放射線療法剤、抗血管新生剤、免疫療法剤、および／または抗ウイルス剤である。
【０１１５】
一般に、キットは、少なくとも第１の好適な容器（または容器手段）内に述べられる構成成分を含有するだろう。容器は一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、または他の容器もしくは容器手段を含み、その中に所望の薬剤を入れ、好ましくは好適にアリコートする。キットはまた、典型的には、個々のバイアル瓶などを送達のために厳重に閉じ込めて収容するための手段、例えば、所望のバイアル瓶および他の装置を入れて保持する射出または吹込成形プラスチック容器を含む。
【０１１６】
キットの構成成分は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかに含有され得る。試薬または構成成分が乾燥粉末として提供されるとき、粉末は、好適な溶媒の添加によって再構成され得る。溶媒はまた、キット内の別の容器内に提供されてもよい。任意の治療構成成分は、好ましくは薬学的に許容される製剤中にあるか、またはそのまま再構成する準備ができている。キットはまた、動物または患者に治療剤を投与するための手段、例えば、１つ以上の針もしくはシリンジ、または点眼器、ピペット、または動物に製剤を注入するか、もしくは身体の患部に適用することができる他の同様の装置を含有し得る。
【０１１７】
キットは、好ましくは所望の各構成成分または薬剤、特にバイオマーカー検出および診断用構成成分のための異なる容器を有するだろう。しかしながら、併用療法での使用のために、キットは、モル当量の組み合わせで、または他の構成成分を超える１つの構成成分と共に、事前混合された２つ以上の治療薬を含有する１つの容器を含み得る。キットは、完全に共役した形態の事前標識された抗体、またはキットの使用者によって共役される別々の標識部分を、好ましくは結合についての説明書と共に含み得る。免疫検出のために、ＰＳなどの１つ以上の構成成分が、既にマイクロタイタープレートのウェルなどの固体支持体に結合されていてもよい。
【０１１８】
キットはまた、好ましくは、例えば、併用療法における使用を含む、定量化、前臨床的、臨床的、および／または獣医学的実施形態における使用のための書面上または電子的な説明書も含むだろう。バイオマーカーに基づくため、キットは、好ましくは、検出アッセイのための標準曲線を準備するために使用され得るように、標識の有無に関わらず、好適にアリコートされた生物学的組成物などの制御剤をさらに含むだろう。
【０１１９】
Ｇ５．チップおよびナノアッセイ形式
全β２ＧＰＩおよび／または機能性β２ＧＰＩを含む固相およびＥＬＩＳＡ型バイオマーカーアッセイは、必要に応じて自動化またはロボットで実行することができ、複数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。本発明の文脈ではないが、一般にバイオマーカーを検出および定量化するために、そのような様々なアッセイ形式が使用されてきた。例えば、「チップ」と呼ばれるナノプラズモンセンサーおよびマイクロ流体デバイスが記載され、癌患者の循環バイオマーカーのオンチップ単離、定量化、および特徴付けに使用されている。したがって、本発明の特異性を依然として維持しながら、本アッセイは、そのようなマイクロ流体、チップ、ナノ技術、および他の合理化かつ自動化されたアッセイを使用して達成することができる。
【０１２０】
予測方法およびバイオマーカー誘導治療法に加えて、本発明はまた、コンピュータに基づくハードウェアおよび試験も提供する。本発明のそのようなコンピュータに基づく実施形態は、全β２ＧＰＩおよび／または機能性β２ＧＰＩのものを含む１つ以上の実験室バイオマーカー試験を読み取るように構成されたインターフェース、ならびにそのようなバイオマーカー試験からのデータを分析し、好ましくは分析されたデータを確立されたデータセット（試験データセットおよび対照データセットを含む）と比較するコンピュータを含む。本発明のコンピュータで実装される実施形態は、好ましくは、メモリストレージ、出力機能、および出力に基づいて治療法を誘導するように構成された命令を含む。
【０１２１】
Ｈ．疾患の治療
本発明は、動物およびヒトを選択し、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体での治療を最適化するためのバイオマーカー方法、組成物、およびキットを提供するため、動物、対象、および患者（ヒト患者を含む）に関する以下の指針が、バイオマーカー検出および選択された集団の治療に適用される。
【０１２２】
Ｈ１．動物、対象、および患者
本発明は、ヒト対象および患者に最も直接的に適用可能であるため、ヒトの選択および治療が最も好ましい実施形態である。それにも関わらず、種を超えたバイオマーカーの共通性および保存は、本発明がヒト以外の動物にも適用可能であることを意味する。動物の中では、哺乳動物が好ましく、最も好ましくは、家庭用ペット、競走馬、および人間が消費するための食物を直接的（例えば、肉）または間接的（例えば、牛乳）に生産する動物などの価値ある貴重な動物であるが、実験動物もまた含まれる。したがって、本発明は、臨床的、獣医学的、および研究的用途を含む。したがって、ヒトに加えて、本発明は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、バイソン、ラマ、シカ、ヘラジカ、および他の大型動物、ならびに子牛および子羊を含むそれらの幼若動物に適用され、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、霊長類（サルなど）、および他の実験動物に適用される。
【０１２３】
Ｈ２．抗体用量
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体の「治療有効」量または用量は、そのような治療を必要とする動物、好ましくはヒト患者に投与したとき（併用療法の一部分として投与したときを含む）に有益な治療効果を発揮する量または用量である。例えば、治療的に有効な抗癌投与量は、癌を有する動物、好ましくはヒト患者に投与したとき（併用癌療法の一部分として投与したときを含む）に有益な抗癌効果を発揮する量または用量である。治療的に有効な抗ウイルス用量は、ウイルス感染症または疾患を有する動物、好ましくはヒト患者に投与したとき（併用ウイルス療法の一部分として投与したときを含む）に有益な抗ウイルス効果を発揮する量または用量である。
【０１２４】
「有益な抗癌効果」は、腫瘍脈管構造血栓症および／または破壊、腫瘍壊死、腫瘍退縮、および腫瘍寛解（治癒までを含む）を含む、任意の一貫して検出可能な抗腫瘍および抗癌効果を含む。有益な抗癌効果の臨床的尺度としては、例えば、完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、およびＣＲ＋ＰＲを含む全奏効率（ＯＲＲ）の改善；腫瘍進行までの時間（ＴＴＰ）；奏効期間（ＤＯＲまたはＤＲ）；ならびに該当する場合、個々の患者、患者集団、および亜集団における無増悪生存期間（ＰＦＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）、および全生存期間（ＯＳ）（全生存期間の中央値（ｍＯＳ）を含む）の改善または拡大が挙げられる。
【０１２５】
「有益な抗ウイルス効果」は、ウイルス感染、複製、成熟、繁殖、および放出、ならびに／または更なる細胞（宿主細胞）もしくは組織の進行中の感染またはそれらへの拡散の阻害を含む、任意の一貫して検出可能な抗ウイルス効果を含む。有益な抗ウイルス効果の臨床的尺度としては、例えば、早期のウイルス学的応答、ウイルス量の低減およびウイルスのクリアランス、ならびにウイルス感染症によって引き起こされる症状の改善が挙げられる。
【０１２６】
有益な治療効果、特に抗癌効果は、特に中期または長期的には治療的ではない可能性があるが、それは治療の有用性を無効化するものではないことが理解される。これに関して、しかしまた一般に、「有益な」治療効果、抗癌効果、および抗ウイルス効果はまた、比較的および／または適度の治療効果も含むが、いずれか１つ以上の安全性の尺度における改善を伴う。「有益な」治療効果についての別の考慮事項は、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体が、疾患または腫瘍をさらに治療処置しやすくし得るために、その後の治療が全体的に改善された効果をもたらし得るという事実である。
【０１２７】
バビツキシマブまたは１Ｎ１１などのＰＳ標的化抗体の治療有効用量は、動物モデルからのデータを含む広範囲のデータを試用して現在容易に決定可能であるが、特に、本明細書に詳述され、文献に公開されるものなどの臨床研究に基づく。一般に、静脈内（ＩＶ）投与され、ｍｇ／ｋｇで引用されるバビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体の有効用量範囲は、約０．１から約１３〜１５、好ましくは約０．１から約６〜１０、好ましくは、約０．３〜約６、より好ましくは、約０．５〜約６、より好ましくは、約１〜約６、より好ましくは、約０．５〜約３、または約３〜約６、より好ましくは、約１〜約３である。静脈内投与され、ｍｇ／ｋｇで引用されるバビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体の例示的な有効用量は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および約１５、好ましくは約０．１、０．３、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、および約６、より好ましくは約２または３、ならびに最も好ましくは約３ｍｇ／ｋｇである。
【０１２８】
臨床治療のために、特に全ての腫瘍学的適応症のために静脈内（ＩＶ）投与される３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブの現在好ましい用量は、広範な安全性データと共に、広範な前臨床および臨床データ、ならびに特にヒトにおける薬物動態プロファイル（実施例ＶＩ）に基づいて推奨される。それにも関わらず、０．３ｍｇ／ｋｇでの臨床的抗ウイルス活性を含む、一連の用量が有効であることが示されている（実施例ＶＩ）。加えて、バビツキシマブは、ラットおよびサルに１０ｍｇ／ｋｇ超、最大１００ｍｇ／ｋｇまでの用量で安全に投与されている。サルにおける１００ｍｇ／ｋｇ用量レベルでは、バビツキシマブは、体循環中のβ２ＧＰＩを一過的に減少させたため、そのような超高用量は推奨されない。
【０１２９】
したがって、幅広いデータから、３ｍｇ／ｋｇの投与量が、好ましくはあるが本発明を限定しないことは明らかである。したがって、本明細書に提示されるパラメータおよび詳細な指針を考慮して、活性または最適用量範囲および用量における更なる変形が本発明に包含されることが理解される。したがって、特定の薬剤との併用ではより低い用量がより適切であり得ること、および特に通常致命的な疾患を治療する場合には高用量が依然として許容され得ることが理解される。
【０１３０】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を投与する上で、（無菌性、発熱性、純度、および一般的安全性のＦＤＡ標準に従って）薬学的に許容される組成物が動物または患者に全身投与される。静脈内注射が一般に好ましく、数時間にわたる連続注入が最も好ましい。
【０１３１】
用量自体を変えることに加えて、投与レジメンもまた、当業者に周知のように、治療戦略を最適化するように適合させることができる。治療されている対象の病態に応じて、投薬量および治療レジメンにおけるいくらかの変動が必要となり得る。担当医師（複数可）は、本開示を考慮して、個々の対象にとって適切な治療を決定することができるだろう。そのような最適化および調整は、当該技術分野において慣例的に実行されており、決して過度の量の実験を反映していない。
【０１３２】
Ｈ３．β２ＧＰＩでの補足治療
単独で、または多重バイオマーカー選択の一部分としてのいずれかで、治療前β２ＧＰＩレベルをＰＳ標的化抗体（バビツキシマブなど）に対する応答のバイオマーカーとして使用する上で、全β２ＧＰＩまたは機能性β２ＧＰＩが測定されるかどうかに関わらず、本方法は治療のために患者のサブセットのみを選択する。
【０１３３】
したがって、本出願の別の実施形態は、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体と共にβ２ＧＰＩをそれらの患者に同時投与することによって、任意の非選択患者を治療適格性に回復させることである。このようにして、集団全体がＰＳ標的化抗体で治療可能になる。例えば、２００μｇ／ｍｌ以上の治療前レベルの機能性β２ＧＰＩに基づいて、治療のための患者を選択する上で、β２ＧＰＩレベルを少なくとも約２００μｇ／ｍｌに回復させるのに十分な機能性β２ＧＰＩとの併用でバビツキシマブを同時投与することによって、１５０μｇ／ｍｌの治療前レベルの機能性β２ＧＰＩを有する患者を治療可能な群に戻すことができる。試料は、バイオマーカー分析に使用されるいずれの治療前レベルのβ２ＧＰＩにも適用される。
【０１３４】
Ｉ．ＰＳがマーカーである疾患の治療
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、ＰＳを特異的に標的化するため、治療の第１の（および最も重要な）適応症は癌（節Ｋ）、特に固形腫瘍およびそれらの転移であるが、液性腫瘍（白血病など）およびホジキンリンパ腫もまた適応症である。
【０１３５】
正常で健康な細胞では、ＰＳは細胞膜の内側に維持されており、結合に利用することはできない。疾患細胞のみが細胞膜の外側に曝露されたＰＳを有し、これらは特に腫瘍微小環境内にある細胞であるが、瀕死の細胞、異常細胞、不適切に活性化された細胞、感染した細胞、および病原性生物自体でもある。癌において、腫瘍微小環境内でのＰＳ曝露は「免疫抑制」であり、これは身体が癌と適切に戦うことができないことを意味する。ＰＳを遮断することによって、バビツキシマブはＰＳ媒介免疫抑制を無効化し、身体が腫瘍を攻撃するのを助ける。
【０１３６】
腫瘍微小環境内にある細胞、特に腫瘍内（およびウイルスに感染した細胞およびウイルス内）の血管を覆う細胞において、ＰＳは比較的安定したマーカーであり、これはそれが治療の理想的な標的であることを意味する。多くの細胞死が存在する疾患において、ＰＳはまた細胞の外側にも曝露され、これは、バビツキシマブが、増加した細胞死または不適切な細胞死が生じる様々な疾患（そのような病態は、例えば、癌および心臓発作を含む）の診断において、ならびに特に「撮像」（すなわち、インビボ診断）のためにも使用され得ることを意味する（撮像については下記を参照されたい）。
【０１３７】
宿主細胞にＰＳを外在化させる主な病原体は、ウイルスである（節Ｊ）。実際に、エンベロープウイルスの侵入および感染の増強剤としてのＰＳおよびＰＳ受容体の役割は現在十分に立証されており、広範囲のウイルスに適用される。さらに、ＰＳとウイルスとの関係は、エンベロープウイルスに限定されず、非エンベロープウイルスにも及ぶ。特に、ウイルスに感染した細胞から放出される「ＰＳ脂質小胞」が、エンテロウイルスの効率的な一括感染を可能にすることが既知である（Ｃｈｅｎら、２０１５）。
【０１３８】
癌およびウイルス感染症に加えて、広範囲の疾患および病原性感染症は、ＰＳを健康な細胞内のその内部位置から弾き出して、細胞の外側に曝露させ、これは、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体がそれらの細胞および病原体に局所化し、有益な効果を発揮し得ることを意味する。まとめると、これらは「ＰＳがマーカーである疾患および障害」である。
【０１３９】
癌、ウイルス性および病原性感染症以外で、ＰＳがマーカーである顕著な疾患および障害としては、（凝固しやすい）血栓形成促進性血管を有する疾患および障害、ならびに異常な血管新生に関与するものを含む、異常な脈管構造（血管）に関与する疾患を含む。血管新生は、既存の血管から新たな血管が形成されるプロセスであり、新たな血管の発達は、ＰＳを必要とする内皮細胞芽の形成から始まる（Ｗｅｉｈｕａら、２００５）。異常な血管新生は、多くの疾患、特に癌に関与している。それらの異常な脈管構造を考慮して、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）などの（悪性とは対照的に）良性腫瘍、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコーマ、肉芽腫（化膿性肉芽腫およびサルコイドーシス（サルコイド）を含む）、髄膜腫、アンジオーマ、血管腫、ならびに全身型血管腫である血管腫症を治療することができる。
【０１４０】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体で治療することができる異常な脈管構造に直接関連する病態としては、血管形成術後の再狭窄、静脈閉塞、動脈閉塞、および閉塞性頸動脈または閉塞性疾患を含む血管再狭窄（血管の狭小化）；ベーチェット病（眼疾患でもある）、結節性多発動脈炎（結節性汎動脈炎またはＰＡＮ）、およびウェゲナー肉芽腫症（ＷＧ）またはサルコイドーシス（多発性血管炎を伴う肉芽腫症、ＧＰＡ）を含む血管炎（炎症によって血管が破壊される障害）；動静脈奇形（ＡＶＭ）および動静脈瘻；鼻出血（鼻血）；血管癒着；ならびに過粘稠度症候群が挙げられる。
【０１４１】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、異常な脈管構造とのそれらの関連のために、関節リウマチおよび変形性関節症などの関節疾患、滑膜炎、血友病性関節、およびパジェット病；乾癬、皮膚炎、強皮症（全身性硬化症またはＣＲＥＳＴ症候群）、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ、Ｇｒｏｎｂｌａｄ−Ｓｔｒａｎｄｂｅｒｇ症候群として知られる）、酒さ、スティーブンス−ジョンソン症候群またはスティーブンス−ジョンソン病（ＰＸＥ、酒さ、およびスティーブンス−ジョンソン症候群はまた眼疾患でもある）類天疱瘡、肥厚性瘢痕、およびケロイドなどの皮膚疾患；オスラー−ウェーバー（またはオスラー−ランデュ−ウェーバー）症候群またはオスラー−ウェーバー（またはオスラー−ランデュ−ウェーバー）病（遺伝性出血性末梢血管拡張症、ＨＨＴとしても知られる）を含む臨床的に重要な疾患を治療することができる。
【０１４２】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体で治療される異常な脈管構造に関与する疾患の特に重要な例は、眼の血管新生疾患である。これらの疾患は、網膜、脈絡膜、および／または角膜などの眼の構造への新たな血管の浸潤を特徴とする。それらは失明の最も一般的な原因であり、約２０の眼疾患に関与している。最も一般的な眼の血管新生疾患は、（増殖性）糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を含む黄斑変性症、未熟児網膜症（ＲＯＰまたはテリー症候群、以前は後水晶体線維増殖症ＲＬＦとして知られていた）、血管新生緑内障、角膜移植血管新生、および角膜移植後拒絶反応である。脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）は、進行性ＡＭＤを有する患者における重度の視力喪失の症例の９０％を占め、直接および間接ＰＳ標的化抗体の両方を含むＰＳ標的化抗体で効果的に治療されている（Ｌｉら、２０１５）。
【０１４３】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体で治療することができる網膜／脈絡膜血管新生に関連する他の疾患には、梅毒性眼感染症、マイコバクテリア性眼感染、および／または網膜炎もしくは脈絡膜炎を引き起こす他の眼感染症；硝子体炎および周辺部ぶどう膜炎を含むぶどう膜炎（虹彩毛様体炎）；エールス病、推定眼ヒストプラスマ症候群（ＰＯＨＳ）、ベスト病（卵黄様黄斑変性症）、シュタルガルト病、眼の外傷、およびレーザー後合併症が含まれる。
【０１４４】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体で治療することができる角膜血管新生に特に関連する更なる疾患としては、アトピー性角膜炎、上輪部角結膜炎、乾燥翼状片角膜炎、および辺縁性表皮剥離どの、角膜炎（角膜のみが炎症する）および結膜炎（結膜のみが炎症する）を含むあらゆる形態の角結膜炎；フィレクテヌローシス（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）；モーレン潰瘍；化学熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、ヘルペス感染症、ならびに眼の外傷およびコンタクトレンズの過剰装着が挙げられる。
【０１４５】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体で治療することができる他の眼疾患としては、強膜炎、ルベオーシス（虹彩の血管新生）、隅角血管新生（ＮＶＡ）、および糖尿病に関連するかどうかに関わらず、線維血管または線維組織の異常増殖によって引き起こされる疾患（全ての形態の増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）を含む）が挙げられる。
【０１４６】
内皮細胞芽の形成にはＰＳが必要であるため、新たな血管の発達にもまたＰＳが必要である（Ｗｅｉｈｕａら、２００５）。このプロセスはまた、特定の正常な生理学的事象、特に創傷治癒および再生にも関与し、排卵および受精後の胞胚の着床において重要である。したがって、バビツキシマブを使用するこのプロセスの予防は、無月経を誘発する（生殖年齢の女性における月経期間の不在）、排卵を遮断する、かつ／または胞胚による着床を防止する、すなわち避妊薬として使用することができる。創傷治癒において、過剰な修復または線維増殖は、外科手順の有害な副作用である可能性があり、癒着は、手術の頻繁な合併症であり、これは小腸閉塞などの問題をもたらし得る。これらもまた、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体によって治療することができる。
【０１４７】
慢性炎症もまた、異常かつ病理学的な脈管構造に関与する。特に、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの慢性炎症性疾患の状態は、炎症組織への新たな血管の内部成長と共に組織学的変化を示す。したがって、それらの疾患もまた、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体によって治療することができる。
【０１４８】
宿主細胞がＰＳを曝露する、ならびに／またはＰＳ陽性細胞外微小胞およびエキソソームが立証されている、いくつかの他の疾患および障害が既知である。例えば、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血とも呼ばれる）および鎌状赤血球クリーゼでは、赤血球の３０〜４０％が時期尚早に老化し、ＰＳ陽性（「鎌状赤血球」）であるのに対して、健康な人々ではこれは約１％に過ぎない。ＰＳ陽性鎌状赤血球は循環したままであり、内皮に付着し、それらの曝露されたＰＳは凝血塊増殖の原因となる凝固カスケードの開始のためのプラットフォームとして作用する（Ｋｅｎｎｅｄｙら、２０１５）。
【０１４９】
ＰＳはまたアテローム動脈硬化症においても発現され、ＰＳ陽性細胞外微小胞はアテローム硬化性プラークから放出される（Ｍａｌｌａｔら、１９９９）。ＰＳ陽性である血管内腔内に形成されたプラークもまた、血管新生刺激活性を有することが示されている。ヒト冠状動脈アテローム性硬化症の進行における、および閉塞性冠状動脈疾患における再開通プロセスにおける、ＶＥＧＦなどの血管新生マーカーの病態生理学的有意性についての特別な証拠が存在する。したがって、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、アテローム性動脈硬化症および閉塞性冠状動脈疾患のための効果的な治療を提供する。
【０１５０】
１型および２型糖尿病患者はいずれも、アネキシンＶ陽性であることによって示されるように、ＰＳ陽性の細胞外微小胞を有する（Ｓａｂａｔｉｅｒら、２００２）。アルツハイマー病において、脳のエキソソームは、ＰＳと、この疾患の病原体であるアミロイドβ−ペプチド（Ａβ）とを含有する（Ｙｕｙａｍａら、２０１２）。ＰＳおよびＰＳ陽性細胞外微小胞もまた敗血症（敗血症性ショック）に関与しており、それらは敗血症誘導微小血管機能不全および免疫抑制のマーカーおよびメディエーターである（Ｓｏｕｚａら、２０１５）。
【０１５１】
身体自身のリン脂質に対して抗体が産生される自己免疫性障害である、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたはループス）は、流産および血小板減少症（低血小板数）などの凝固障害に関連付けられている。したがって、これらの患者における抗リン脂質抗体は、血栓症を引き起こす病原性抗体である。しかしながら、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、いかなるそのような副作用も呈することなくＰＳを標的化する。したがって、バビツキシマブはまた、抗リン脂質抗体症候群、関連疾患、およびその合併症も治療することができる。特に、バビツキシマブは、ＡＰＳ患者において病原性抗体と拮抗または競合する可能性があり、したがって病原性抗体を体内のそれらのリン脂質−タンパク質標的から退ける。
【０１５２】
病原性感染症に関して、例えば、リーシュマニア症を引き起こす寄生原虫であるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ（Ｚａｎｄｂｅｒｇｅｎら、２００６；Ｗａｎｄｅｒｌｅｙら、２００９；Ｗａｎｄｅｒｌｅｙら、２０１３）、マラリアを引き起こすＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｅｄａ＆Ｓｈｅｒｍａｎ、２００２；Ｐａｔｔａｎａｐａｎｙａｓａｔら、２０１０）、およびトリパノソーマ症を引き起こす寄生原虫であるＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ（ＤａＭａｔｔａら、２００７）などの細胞内寄生体は全て、ＰＳ曝露をもたらす。同様に、トキソプラズマ症を引き起こすＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ（Ｓｅａｂｒａら、２００４）と同様に、住血吸虫症を引き起こす寄生扁形動物であるＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａもまたＰＳを曝露する（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｌｅｉｊら、２００２）。
【０１５３】
ＰＳ曝露はまた、それぞれペストおよび野兎病を引き起こすＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓなどの細胞内細菌性病原体による感染後の細胞外表面上でも示されている（Ｌｏｎｓｄａｌｅら、２０１１）。リステリア症を引き起こすＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓもまた、感染した宿主細胞からの細胞外表面のＰＳを有する膜由来小胞の放出を促進する（Ｃｚｕｃｚｍａｎら、２０１４）。同様に、髄膜炎を引き起こす病原体であるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに感染した内皮細胞は、細胞表面へのＰＳ転位を呈する（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ−Ｕｎｋｍｅｉｒら、２００７）。マクロファージにおいて細胞内複製し、結核（ＴＢ）を引き起こすＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓへの感染は、結核病変の好中球におけるＰＳ外在化と関連付けられている（Ｆｒａｎｃｉｓら、２０１４）。同様に、レジオネラ症を引き起こす通性的な細胞内寄生体であるＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａは、ヒト単球においてＰＳ外在化を誘導する（Ｈａｇｅｌｅら、１９９８）。
【０１５４】
したがって、上記に詳述した通性的な細胞内寄生体に共通するＰＳ外在化は、それぞれブルセラ症、ならびに腸チフス、パラチフス、および食中毒などの疾病などを引き起こす、ＢｒｕｃｅｌｌａおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａなどの他のそのような病原体について生じる可能性がある。これはまた、性感染性クラミジア感染症を引き起こすＣｈｌａｍｙｄｉａ菌種などの偏性的な細胞内寄生体による感染症についても立証されており、ＰＳ外在化は病態形成にとって重要であり、感染した上皮細胞、内皮細胞、顆粒球細胞、および単球細胞上で示されている（Ｇｏｔｈ＆Ｓｔｅｐｈｅｎｓ、２００１）。トラコーマを引き起こすＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓもまた治療することができる（上記も参照されたい）。
【０１５５】
実際に、宿主細胞上のＰＳ外在化は、現在、様々な細菌および病原体への感染に応答する一般に認識されている現象である（Ｗａｎｄｌｅｒら、２０１０）。これは、胃上皮細胞に侵入し（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ＆Ｋｒｏｇｆｅｌｔ、２００３）、胃潰瘍を引き起こすＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉをさらに含む。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉが胃上皮細胞と直接接触を持つと、それは宿主の原形質膜の外小葉へのＰＳ外面化を誘導する（Ｍｕｒａｔａ−Ｋａｍｉｙａら、２０１０）。ＰＳはまた、梅毒を引き起こすＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍにも存在する。南アメリカで見られる細菌性感染症であるバルトネラ症は、バビツキシマブで治療することができるが、これは、特にバルトネラ症が血管内皮細胞の増殖を特徴とする慢性期をもたらし、癌治療において明らかに示されるバビツキシマブの作用機構のうちの１つが血管内皮細胞を破壊することであるためである。
【０１５６】
インビボ診断に関して、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を使用して、前述の疾患、障害、および感染症のいずれかを撮像すること、最も好ましくは血管新生化腫瘍を撮像することができる（Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎら、２００８；Ｍａｒｃｏｎｅｓｃｕ＆Ｔｈｏｒｐｅ、２００８；Ｓａｈａら、２０１０；Ｓｔａｆｆｏｒｄ＆Ｔｈｏｒｐｅ、２０１１；Ｇｏｎｇら、２０１３；Ｓｔａｆｆｏｒｄら、２０１３；米国特許第７，７９０，８６０号）。バビツキシマブはまた、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、心房細動、人工心臓血管材料の問題、脳卒中（脳血管障害（ＣＶＡ）または脳血管発作（ＣＶＩ）などの、特に心臓内また心臓付近の血管血栓症の撮像にも使用することができる。バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体はまた、例えば、膿瘍、再狭窄、関節炎などの病態にある、ならびに動脈血栓症、冠動脈血栓、静脈血栓症、および脳血栓症などの止血障害にある、活性化血小板の撮像にも使用することができる。
【０１５７】
したがって、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、ＰＳが立証されたマーカーである上記全ての疾患および障害を治療および／または診断するのに好適である。
【０１５８】
Ｊ．ウイルス感染症の治療
宿主細胞にＰＳを外在化させる主な病原体は、ウイルスである。ＰＳの存在は、ウイルスおよびウイルスに感染した細胞の表面上で実証されており、かつ／またはＡｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅを含む広範囲のウイルスファミリーによる感染症にとって重要であることが示されている（各々２０１５年２月２７日に出願された米国特許出願第１４／６３４，６０７号ならびにＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／１８１８３号の表２Ａおよび表２Ｂもまた参照されたい）。加えて、ウイルスおよびウイルスに感染した細胞上でのそのようなＰＳ曝露は単に偶発的なものではなく、ウイルス感染症において重要な役割を有することを実証するデータが提示されている（米国特許出願第１４／６３４，６０７号の表２Ｃおよび表２Ｄ、米国特許第７，９０６，１１５号、ＷＯ２０１５／１３１１５３Ａ１もまた参照されたい）。これは、インビトロおよびインビボの両方で、多様なウイルスファミリーによる感染症を阻害するためのＰＳ標的化抗体の使用によって示されている。
【０１５９】
ＰＳとウイルス感染症との間の関係もまた、現在文献に詳しく立証されている（例えば、米国特許第７，９０６，１１５号；Ｓｏａｒｅｓら、２００８；Ｍｅｒｃｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎｉｕｓ、２００８；Ｍｏｏｄｙら、２０１０；Ｍｏｒｉｚｏｎｏら、２０１１；Ｍｅｅｒｔｅｎｓら、２０１２；Ｂｅｓｔ、２０１３；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａら、２０１３；Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙら、２０１３；Ｍｏｌｌｅｒ−Ｔａｎｋ＆Ｍａｕｒｙ、２０１４；Ｂｉｒｇｅら、２０１６）。これは、エンベロープウイルスの侵入および感染の増強剤としてのＰＳおよびＰＳ受容体の役割を含む（例えば、Ｍｏｌｌｅｒ−Ｔａｎｋ＆Ｍａｕｒｙ、２０１４の表１を参照されたい）。ＰＳと、ウイルス感染症と、エキソソームなどの細胞外微小胞との関係もまた近年ますます明らかになってきており（Ｍｅｃｋｅｓ＆Ｒａａｂ−Ｔｒａｕｂ、２０１１；Ｓｉｍｓら、２０１４）、また広範囲のウイルスに適用されている（例えば、Ｗａｌｋｅｒら、２００９；Ｍｅｃｋｅｓら、２０１０；Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｕｓｅｒｏｓら、２０１０；Ｍｅｃｋｅｓ＆Ｒａａｂ−Ｔｒａｕｂ、２０１１）。
【０１６０】
さらに、ＰＳとウイルスとの関係は、エンベロープウイルスに限定されず、非エンベロープウイルスにも及ぶ（Ｃｌａｙｓｏｎら、１９８９；Ｃｈｅｎら、２０１５）。特に、「ＰＳ脂質小胞」（本質的にはエキソソーム）を示し、ＰＳ小胞がエンテロウイルスの効率的な一括感染を可能にすることを示すデータを添付する、Ｃｈｅｎら、２０１５によるＣｅｌｌ論文の表紙の図を参照されたい。特定の機構によって拘束されるものではないが、以下の理論的根拠は、ＰＳがエンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスの両方による感染症に関与していることを説明する。
【０１６１】
全てのウイルスは、宿主細胞からの成熟ビリオンの時間を計った排出を調整して、新たな宿主細胞の感染の成功を確実にする。エンベロープウイルスは、宿主細胞原形質膜を利用して、子孫ビリオンの次の宿主細胞への効率的な侵入を媒介するウイルスタンパク質を埋め込む。ＰＳは、ウイルス放出前にウイルスに感染した細胞の外側に見られ、エンベロープウイルスは、宿主細胞からの排出時にＰＳをウイルスエンベロープに組み込む。
【０１６２】
エンベロープをそれらの成熟ビリオンに組み込まないウイルスは、他の機構によって宿主細胞を離れる。非エンベロープウイルスが細胞から新たなビリオンを放出するために使用するいくつかの戦略には、細胞溶解が含まれ、これは感染した細胞（Ｔ細胞またはマクロファージ）に対する宿主免疫応答によって直接的に、または宿主細胞タンパク質合成または細胞構造に対する直接的なウイルスの活性のために引き起こされ得る。細胞構造を変化させて細胞溶解を誘導するウイルスの一例は、アデノウイルスである。アデノウイルスは、感染中後半に、フィラメントネットワークおよびタンパク質合成を破壊することによって細胞の構造的統合性を変化させるいくつかのタンパク質を発現する。いくつかの非エンベロープウイルスは、いかなる細胞変性効果もなく、非破壊的機構を介してそれらの子孫ウイルスを放出することができる。ポリオウイルスは急速に（約８時間）細胞溶解を誘導するが、それはまた、新たな宿主細胞を感染させることができるＰＳ脂質小胞内の細胞からも放出される。ＰＳ小胞内のポリオウイルス粒子は、ＨｅＬａ細胞および初代マクロファージを感染させる上でＰＳ小胞から除去されるウイルス粒子よりも効率的であり、アネキシンＶによる小胞の遮断は、用量に依存した様式で感染した細胞からの小胞を阻害し、これは、ＰＳ脂質がポリオウイルス感染症の補助因子であることを示唆している。ポリオウイルスに加えて、コクサッキーウイルスＢ３およびライノウイルス粒子もまたＰＳ脂質小胞内に放出され（Ｃｈｅｎら、２０１５）、これは、細胞を溶解することなく成熟粒子を選択的に放出するためにエンテロウイルスによって利用される共通の機構を示している。
【０１６３】
ＳＶ４０に関して、ＳＶ４０もまた上記の種類のＰＳ−脂質小胞内の細胞から放出される可能性がある。例えば、細胞変性効果の誘導前にＳＶ４０粒子の細胞からの放出が見られ得ることが報告されている（Ｃｌａｙｓｏｎら、１９８９）。また、ＳＶ４０ビリオンは、感染の４８時間後に平滑な細胞質小胞内で観察され、ＳＶ４０粒子の放出は、脂質膜にわたるカチオン輸送を遮断することによって細胞内タンパク質輸送を遮断するナトリウムイオン透過孔である、モネンシンによって阻害された。
【０１６４】
また、多くのウイルスは、効率的に複製するための環境を作り出すために宿主細胞の活性化を誘導する必要がある。ウイルス活性化剤または非ウイルス活性化剤のいずれかによる細胞活性化は、ＰＳ転位を活性化する細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）の上昇をもたらす。したがって、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体の潜在的な作用機構としては、細胞活性化に必要とされるタンパク質またはウイルス放出を媒介するそれらの能力との干渉、ＰＳ媒介免疫抑制の逆転、および免疫クリアランス機構による感染した細胞またはウイルスのクリアランスが挙げられる。
【０１６５】
インビボウイルスモデルは、ＰＳ標的化抗体で治療したウイルスに感染した動物の生存期間の増加を実証する。バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体がそのような抗ウイルス特性を発揮することが示されている潜在的な機構には、１）ウイルス粒子への結合、２）感染した細胞への結合、３）ウイルス複製の阻害、および４）ＰＳに結合する免疫抑制細胞受容体を遮断することによる免疫応答の増強が含まれる。ＨＩＶ−１モデルにおけるデータは、ウイルスに感染したマクロファージによって産生されたビリオンが、マクロファージのＨＩＶ−１感染の補助因子としての役割を果たす、上昇したレベルのＰＳを有することを実証する。ＰＳ標的化抗体でＨＩＶ−１上のＰＳを遮断することは、細胞間相互作用を予防し、ウイルス標的細胞融合を遮断し得る。結果はまた、バビツキシマブがピチンデウイルス粒子に結合し、ピチンデウイルスに感染したモルモットの治療が抗ピチンデ抗体および細胞応答の両方の発生を増強することも示している。
【０１６６】
全体として、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を使用するエンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスを含む全てのウイルス感染症の治療は、そのような治療に関して本開示を補足する米国特許第７，６１１，７０４号および米国特許第７，９０６，１１５号に教示されている。特に、これら特許の表Ｈ、表Ｊ、および表Ｇは、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体との併用療法において使用することができる一般的な抗ウイルス薬（表Ｇ）と共に、動物およびヒトにおけるウイルス感染症および関連疾患の治療（表Ｈ、表Ｊ）を例証している。
【０１６７】
Ｋ．癌の治療
本出願の広範な節は、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を使用して腫瘍および癌を治療することに関する。聴神経腫、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫およびＢＰＨなどの良性腫瘍の治療が含まれる。悪性腫瘍の治療が好ましい。本明細書で使用される場合、「腫瘍（複数可）および癌（複数可）」は、別段明確に述べられない限り、悪性腫瘍を示すことが意図される。
【０１６８】
白血病およびリンパ腫などの血液由来腫瘍、ならびに骨髄の様々な急性または慢性新生物疾患の治療が包含される。好ましくは、治療される腫瘍は、血管新生が活性である腫瘍および血栓形成促進性血管を有する腫瘍を含む、固形腫瘍または血管新生化腫瘍である。「固形」および「血管新生化」腫瘍は、血管構成成分を有する、すなわち、腫瘍細胞への酸素および栄養素の提供に腫瘍血管を必要とする腫瘍である。
【０１６９】
原発性または転移性であるかに関わらず、乳癌、卵巣癌、胸部癌、肺癌、肝臓癌（肝細胞癌、ＨＣＣ）、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、脳癌（神経膠腫および神経膠芽腫）、子宮頸癌、子宮癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、耳下腺癌、食道癌、喉頭癌、甲状腺癌、胃腸癌、胃癌、腎臓癌（腎細胞癌、ＲＣＣ）、胆道癌、膀胱癌、精巣癌、ならびに黒色腫、メルケル細胞癌、および血液悪性腫瘍だけでなく、細胞腫（扁平上皮癌および非扁平上皮癌、小細胞癌および非小細胞癌）、腺癌、および神経芽腫も含む他の癌によって例証される、全ての癌が含まれる。特定の実施形態において、本発明は特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、あるいは乳癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、直腸癌、もしくは卵巣癌、または黒色腫に適用される。特に、本発明は、非扁平上皮ＮＳＣＬＣなどのＮＳＣＬＣに適用される。
【０１７０】
公開された文献に加えて、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を使用する全ての癌の治療がいくつかの米国特許に教示されている。例えば、米国特許第６，４０６，６９３号、同第７，４２２，７３８号、同第８，４８６，３９１号、同第７，２４７，３０３号、および同第７，５７２，４４８号であり、これらは全てそのような治療に関して本開示を補足する。治療的に有効な抗癌量に関する上記の考察もまた参照されたい（節Ｈ２）。バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体の作用機序は、全ての固形腫瘍において実質的にまたは完全に同じであるため、本発明は、腫瘍細胞自体の特定の表現型または遺伝子型に関わらず、全ての固形腫瘍の治療に広く適用可能であることが理解される。
【０１７１】
Ｌ．併用療法
本出願の多くの節、公開された文献、およびいくつかの米国特許もまた、併用療法においてバビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を使用して癌を治療することに関する（例えば、米国特許第７，４２２，７３８号、米国特許第８，４８６，３９１号、米国特許第７，５７２，４４８号）。
【０１７２】
したがって、バイオマーカーおよび治療方法は、動物または患者が呈する特定の疾患または障害、特に癌およびウイルス感染症ならびにウイルス疾患の治療において一般に用いられる任意の他の方法と併用することができる。所与の治療アプローチ自体が患者の病態に有害であることが既知ではなく、ＰＳ標的化抗体療法に有意に反作用しない限り、それと本発明との併用が企図される。非悪性疾患のための併用療法もまた企図される。
【０１７３】
癌治療に関して、本発明は、外科手術、化学療法、放射線療法、サイトカイン療法、抗血管新生などのような古典的なアプローチ、および免疫腫瘍（ＩＯ）剤などのより新しいアプローチと併用して使用することができる。したがって、本発明は、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体が手術もしくは放射線治療と同時に、その前に、もしくはその後に使用されるか、または従来の化学療法剤もしくは放射線療法剤、サイトカイン、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤、標的化療法、ＩＯ剤などと共に、その前に、もしくはその後に患者に投与される、バイオマーカーおよび併用療法を提供する。
【０１７４】
手術に関して、任意の外科介入が本発明との併用で実施され得る。放射線療法に関連して、γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、およびさらには電子放出などの、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導するための任意の機構が企図される。腫瘍細胞への放射性同位体の指向的送達もまた企図され、これは標的化抗体または他の標的化手段との関連で使用され得る。
【０１７５】
癌治療における物質の併用の一般的な使用法は、周知である。１つ以上の薬剤を、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体と併用して使用する場合、併用した結果が、各治療を別々に実行したときに観察される効果の相加である必要はない。少なくとも相加効果が一般には望ましいが、単一療法のうちの１つを超える任意の治療効果または利益の増加（例えば、副作用の低減）は価値があるだろう。また、併用治療が相乗効果を呈する特別な必要はないが、これは可能かつ有利である。
【０１７６】
本明細書で使用される場合、本発明で使用される「一次治療剤」または「第１の抗癌剤」は、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体である。本明細書で使用される場合、「二次もしくは三次治療剤」または「少なくとも第２もしくは第３の抗癌剤」は、第２または第３の異なる治療剤、抗癌剤、または抗ウイルス剤、すなわち、一次治療剤「以外の」治療剤、抗癌剤、または抗ウイルス剤である。本発明の併用療法において、任意の二次または三次治療剤を使用することができる。また、二次または三次治療剤、「第２もしくは第３の抗癌剤」、または「第２もしくは第３の抗ウイルス剤」は、本開示の指針および当業者の知識に従って、相加効果、相加効果を超える効果、および潜在的には相乗効果を達成する目的で選択され得る。
【０１７７】
併用療法、抗腫瘍療法、または抗ウイルス療法を実施するためには、動物または患者に、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を、動物または患者内でそれらの併用治療作用、抗癌作用、または抗ウイルス作用をもたらすのに有効な様式で、別のもの、すなわち、第２または第３の異なる治療剤、抗癌剤、または抗ウイルス剤と併用して投与するだけでよい。したがって、薬剤は、疾患部位（例えば、腫瘍、腫瘍環境、もしくは腫瘍微小環境）内でのそれらの組み合わせでの存在をもたらすのに、かつ／または動物もしくは患者内でそれらの併用治療作用を発揮するのに、好ましくは動物もしくは患者の免疫系に対するそれらの併用治療作用を発揮するのに有効な量および有効な期間で提供される。この目的を達成するために、一次治療剤および第２または第３の異なる治療剤は、単一の組成物で、または異なる投与経路を使用して２つもしくは３つの異なる組成物として、実質的に同時に投与され得る。
【０１７８】
あるいは、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、例えば、数分から数週間または数ヶ月の範囲の間隔だけ、第２または第３の異なる治療剤、抗癌剤、または抗ウイルス剤に先行しても、後続してもよい。一次治療剤および第２または第３の異なる治療剤が動物または患者に別々に適用される特定の実施形態において、各薬剤が依然として有利な併用効果を発揮することができるように、各送達時の間に不動作期間が存在しないことを確実にする。バビツキシマブによる今日までの臨床経験を含む標準的な実施から、１週間または２週間は、バビツキシマブの投与と第２または第３の異なる治療剤の投与との間の不動作期間ではない。実際に、約１週間の間隔が好ましくあり得る。
【０１７９】
さらに、１つの好ましい併用腫瘍療法は、動物または患者に、実質的に同時にまたは好ましくは数週間の間隔で、第２の異なる抗癌剤と併用してバビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を投与し、その後、後続する時間に第３の異なる抗癌剤を投与し、後続する有効な時間（数ヶ月など）にわたって第３の異なる抗癌剤の定期的投与を続けることに関する。
【０１８０】
別々に時間を計った併用療法のための二次または三次治療剤が、本明細書で考察され、当該技術分野において既知であるものを含む特定の基準に基づいて選択され得る。しかしながら、前後の投与のために１つ以上の第２または第３の異なる治療剤を選択することが好ましくても、これは必要に応じて、実質的な同時投与におけるそれらの使用を排除しない。
【０１８１】
癌に関して、一次治療剤の「前に」投与するために選択され、増加した効果および潜在的には相乗効果を達成するように設計される第２または第３の異なる抗癌剤は、腫瘍微小環境内でＰＳの発現を誘導する薬剤を含む。例えば、局在化したカルシウム産生を刺激する、ＰＳを原形質膜の外表面に移動させる膜輸送体を活性化させる、腫瘍内皮を損傷させる、アポトーシス前変化を引き起こす、かつ／または腫瘍内皮または腫瘍細胞内のアポトーシスを誘導する薬剤は一般に、ＰＳ発現の増加をもたらすだろう。そのような薬剤の例は、ドセタキセルおよびパクリタキセルである。その後、ＰＳは、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体を使用して標的化され得、それにより全体的な治療効果を増幅し、また宿主エフェクター（補体、ＡＤＣＣ、抗体媒介食作用、ＣＤＣ）を介した攻撃を増加させる。
【０１８２】
腫瘍血管内には存在するが、正常な静止血管内には存在しないような、血管新生、リモデリング、または活性化内皮細胞に対する選択性を有する薬物もまた、腫瘍微小環境内でのＰＳの曝露を選択的に引き起こすために使用することができる。そのような薬剤の例は、コンブレタスタチンおよびドセタキセルである。これもまた、抗体結合の増加および宿主エフェクター機構の開始の増強をもたらすだろう。
【０１８３】
一次治療剤に「後続して」投与するために選択され、増加した効果および潜在的には相乗効果を達成するように設計される、第２または第３の異なる抗癌剤は、一次治療剤の効果から利益を得る薬剤を含む。バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、腫瘍壊死を引き起こす。したがって、後続投与に有効な第２または第３の異なる抗癌剤には、転移を阻害する抗血管新生剤、壊死腫瘍細胞を標的化する薬剤（インビボで悪性細胞から利用可能になる細胞内抗原に特異的な抗体など）（米国特許第５，０１９，３６８号、同第５，８８２，６２６号）、末梢で生存し得るあらゆる腫瘍細胞を攻撃する化学療法剤および抗腫瘍細胞免疫複合体が含まれる。下記のように、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体に後続して投与するための現在最も好ましい第２または第３の異なる抗癌剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。
【０１８４】
状態によっては、治療期間を大幅に延長することが望ましい場合があり、数日間（２、３、４、５、６、もしくは７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７、もしくは８）、または数ヶ月間（１、２、３、４、５、６、７、もしくは８）がそれぞれの投与間に経過する。これは、ある治療が腫瘍を実質的に破壊することを意図し、別の治療が微小転移もしくは腫瘍の再成長の予防および／または腫瘍に対する宿主応答の刺激もしくは補助（抗血管新生剤もしくは免疫チェックポイント阻害剤）を意図する状況において有利である。しかしながら、効果的な創傷治癒を可能にするために、抗血管新生剤は手術後の慎重な時期に投与されるべきである。その後、抗血管新生剤は、患者の生涯にわたって投与され得る。
【０１８５】
一次治療剤または第２もしくは第３の異なる治療剤のいずれかの複数回投与を利用することもまた、想定される。一次治療剤および第２もしくは第３の異なる治療剤は、１日置きもしくは１週間置きに互換的に投与されてもよく、または一連の１つの薬剤治療が与えられ、その後に一連の他の治療（複数可）が与えられてもよい。いずれにしても、併用療法を使用して治療効果を達成するためには、投与時間に関わらず、治療効果を発揮するのに有効な併用量で２つ以上の薬剤を送達することが必要である。
【０１８６】
Ｌ１．化学療法
実質的に同時に投与されようと、連続的に投与されようと、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、１つ以上の化学療法剤または化学療法薬と併用して投与することができる。化学療法薬は、増殖中の腫瘍細胞を死滅させ、治療全体によって生じる壊死領域を増強することができる。したがって、薬物は、本発明の一次治療剤の作用を増強することができる。
【０１８７】
ほとんどの癌化学療法薬は、分裂中の酸素化細胞に対して選択的である。それらは併用療法において利点を有するが、これは化学療法薬が一次治療剤とは異なる標的に作用し、より完全な抗腫瘍効果をもたらすためである。例えば、化学療法薬は、腫瘍末梢において急速に分裂する酸素化腫瘍細胞に対して選択的に活性である。腫瘍末梢における高酸素化血管新生血管に選択的である抗血管新生薬もまた、併用に有効だろう。
【０１８８】
腫瘍血管内で血栓の形成を誘導することによって、本発明の一次治療剤はまた、腫瘍内に薬物を保持または捕捉することにより化学療法薬の作用を増強することができる。したがって、化学療法剤は腫瘍内に保持される一方で、残りの薬物は身体から除去される。したがって、腫瘍細胞はより長期間にわたってより高濃度の薬物に曝露される。腫瘍内への薬物のこの閉じ込めは薬物の用量の低減を可能にし、治療をより安全かつより効果的にする。
【０１８９】
本発明において併用するための更なる薬物は、一次治療剤の作用によって薬物に対して「感作」された細胞に作用するものであるため、その抗腫瘍効果を達成するのに必要とされる第２の薬物の用量は低減される。例えば、これは、第２の薬物の作用の腫瘍構成成分が腫瘍血管に発揮され、本発明の抗体または薬剤が細胞を薬物に対して感作する場合に生じ得る。これは、本発明の一次治療剤が、直接的にまたはサイトカイン放出の刺激を通して、腫瘍細胞を第２の薬物に対して感作する場合にも同様である。
【０１９０】
併用療法に好適な他の第２または第３の抗癌剤は、例えば、免疫系の免疫抑制構成成分の活性を選択的に阻害することによって、宿主エフェクター細胞の活性を増強するものである。そのような薬剤は、それらの機構の一部分としてエフェクター細胞による攻撃を刺激する本発明の一次治療剤を、より積極的に機能させることができる。そのような薬剤の例は、ドセタキセルおよび免疫チェックポイント阻害剤である。
【０１９１】
一次治療剤の正確な作用機構（複数可）についての理解は、本発明の治療の実施に必要ではないが、そのような機構に関するデータおよび道理にかなった推論を使用して、本発明において併用するための特定の第２または第３の抗癌剤を選択することができる。転じて、選択された併用療法の有効性は、元のデータおよび提案された作用機構を支持し、また併用療法を実施するための第２または第３の抗癌剤の好ましいカテゴリーをもたらす。
【０１９２】
アポトーシスを誘導する薬物が、併用療法に使用されてもよい。例えば、ドセタキセルは、微小管への結合および細胞有糸分裂の破壊によってアポトーシスを誘導し、したがってＰＳ曝露を誘導する（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓら、２００２）。腫瘍血管を覆う内皮細胞および腫瘍細胞の、無症状濃度のドセタキセルによる治療は、細胞表面でのＰＳ発現を誘導することが既知である。
【０１９３】
バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体の抗腫瘍効果には、ＡＤＣＣ、ＣＤＣなどの免疫エフェクター機能のＦｃドメイン媒介増大、サイトカイン産生の刺激、およびそのような機構の組み合わせが含まれる。これはまたドセタキセルにも関連するが、それは、他の研究が、乳癌患者のドセタキセルでの治療が血清ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、およびＧＭ−ＣＳＦサイトカインレベルの増加をもたらし、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）細胞の活性を増強することによってこれらの患者における抗腫瘍免疫応答を増大することを示しているためである。
【０１９４】
したがって、ドセタキセルは、投与された抗体のＰＳ発現および結合の両方を誘導し、また抗腫瘍効果を媒介する免疫エフェクターの活性も増強する。前述の考慮事項に基づいて、抗体とドセタキセルとの併用は、下記のように、免疫チェックポイント阻害剤とも併用されるか、または免疫チェックポイント阻害剤による治療が続く場合に特に好ましい実施形態である。
【０１９５】
したがって、ドセタキセルおよびアポトーシスを誘導する他の化学療法剤は、本発明の併用療法に使用するための特定の好ましい薬剤である。ドセタキセルなどのアポトーシスを誘導する化学療法薬との併用は、腫瘍脈管構造内皮細胞および腫瘍細胞区画を相乗的に攻撃し、治療効力の有意な増強だけでなく、毒性の低下ももたらす。これらの併用は、乳癌治療、特にドセタキセルを使用するメトロノーム化学療法とＰＳ標的化抗体との併用での使用が企図される。
【０１９６】
併用療法のための例示的な化学療法剤は、米国特許第７，５７２，４４８号および米国特許第９，４２１，２５６号に記載されており（例えば、米国特許第７，５７２，４４８号の表Ｄおよび米国特許第９，４２１，２５６号の表Ｃに列挙されるもの）、例えば、ペメトレキセド、テモゾロミド、タモキシフェン、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、パクリタキセル、カルボプラチン、ゲムシタビン、およびドセタキセルなどである。例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、およびベバシズマブなどの他の治療抗体もまた使用することができる。当該技術分野において既知であるそれらの化学療法剤、抗体、および他の薬物の各々は例示的であり、限定的ではない。治療される病態に応じて、投薬量の変動が生じ得る。治療する医師は、個々の対象にとって適切な用量を決定することができるだろう。特定の好ましい実施形態において、ドセタキセルは、６０ｍｇ／ｍ２の出発用量で投与されるドセタキセル、または７５ｍｇ／ｍ２の量で患者に投与されるドセタキセルとして使用される。
【０１９７】
Ｍ．免疫療法（ＩＯ）の併用
効果的な免疫療法に対する課題は、自然または適応免疫活性化を阻害する複数の経路を克服することである。ＰＤ−１免疫チェックポイントは、主要な免疫抑制経路として特定されており、化学療法よりも毒性が少ない癌免疫療法のための有望な標的として浮上している。それは、活性化した腫瘍特異的Ｔ細胞を消耗させ、それらの殺腫瘍活性を弱めるように機能する。ＰＤ−１は、ナイーブＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＤＣ、および単球には不在であるが、それらの活性化対応物には高度に発現される。特に、腫瘍および関連骨髄細胞は、ＰＤ−１経路を利用して、ＰＤ−Ｌ１発現の上方制御を通して自然および適応免疫耐性を生成する。機構的研究は、これらの免疫チェックポイントの遮断が、新規または既存の抗腫瘍免疫応答が存在するときに最も有効であることを示している。残念なことに、腫瘍微小環境を支配するＰＳおよび他の免疫抑制因子の曝露のために、既存の腫瘍特異的免疫活性は癌患者において限定的である。
【０１９８】
複数の癌型において、ＰＤ−１シグナル伝達を遮断する薬剤による持続的な抗腫瘍免疫応答が観察されているが、あるサブセットの患者のみが応答しており、結果的に満たされない重要な医学的必要性が残っている。特に、腫瘍微小環境内で低レベルのＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１（免疫抑制およびＴ細胞活性化の欠如のバイオマーカー）を発現する患者は、チェックポイント遮断療法に対する応答性が低いようである。免疫活性化の観察は、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体が、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１および他のチェックポイント療法から利益を得ることができる患者の割合を増加させ得ることを示している。
【０１９９】
本明細書に提示されるのは、バビツキシマブおよび免疫療法で治療したヒト患者が、有意義な生存優位性を有することを初めて示す臨床データである。特に、実施例ＸＩＸの結果は、バビツキシマブ（およびドセタキセル）、その後に後続免疫療法（「ＳＡＣＴ−ＩＯ」）で治療した患者が、プラセボ（ドセタキセル単独）、その後に免疫療法で治療した患者と比較して、統計的に有意でより良好な全生存期間を有することを実証する。後続ＩＯを受けるバビツキシマブ患者のｍＯＳはまだ到達されていないため、生存期間の延長は統計的に有意であり（ｐ＝０．００６）、さらにより印象的であった（実施例ＸＩＸ、図２６、表１６）。したがって、バビツキシマブは実際に、ヒト患者において免疫療法剤の活性を増強する。
【０２００】
したがって、実施例ＸＩＸのデータによって例証されるように、本発明の重要な実施形態は、免疫療法剤または免疫腫瘍（ＩＯ）剤との併用での、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体による癌患者の治療である。併用療法のための例示的な免疫療法剤は、２０１６年１０月１１日に出願された仮出願第６２／４０６，７２７号の表Ｃ、ならびに２０１７年４月３日に出願された仮出願第６２／４８０，９９４号、および２０１７年５月１７日に出願された仮出願第６２／５０７，５８０号の各々の表Ｄに列挙されており、このうちＮＫ細胞療法およびＣＡＲ−Ｔ療法との併用が現在好ましい。
【０２０１】
ＩＯ剤の特定の好ましい例は、２０１７年４月３日に出願された仮出願第６２／４８０，９９４号および２０１７年５月１７日に出願された仮出願第６２／５０７，５８０号の各々の表Ｅに記載されているものなどの、臨床治療またはヒト臨床試験、好ましくは後期臨床試験において承認されているものである。２０１７年４月３日に出願された仮出願第６２／４８０，９９４号および２０１７年５月１７日に出願された仮出願第６２／５０７，５８０号の各々の表Ｅの詳細によって例証されるように、使用のための用量および治療のための適応症は当業者に周知である。例えば、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、古典的ホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ）リンパ腫、頭頸部の扁平上皮癌（頭頸部癌）、膀胱癌、小細胞肺癌、脳癌（悪性神経膠腫、未分化星状細胞腫（ＡＡ）、および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）など）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、食道癌、胃癌、中皮腫、および骨髄腫の治療には２週間毎に２４０ｍｇまたは３ｍｇ／ｋｇのニボルマブ；黒色腫、ＮＳＣＬＣ、古典的ホジキンリンパ腫、頭頸部癌、胃癌、乳癌、膀胱癌、全固形腫瘍、結腸直腸癌、ＲＣＣ、多発性骨髄腫、食道癌、およびＨＣＣの治療には３週間毎に２００ｍｇまたは２ｍｇ／ｋｇのペムブロリズマブ；膀胱癌、ＮＳＣＬＣ、ＲＣＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、黒色腫、乳癌、卵巣癌、および小細胞肺癌の治療には３週間毎に１２００ｍｇのアテゾリズマブ；転移性メルケル細胞癌、ＮＳＣＬＣ、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、ＲＣＣ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、非ホジキンリンパ腫、および頭頸部癌の治療には２週間毎に１０ｍｇのアベルマブ；ならびにＮＳＣＬＣ、頭頸部癌、膀胱癌、および小細胞肺癌の治療には２週間毎に１０ｍｇ／ｋｇのデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）である。
【０２０２】
他の好適なＩＯ剤は、切除不能または転移性黒色腫の治療には３週間毎に３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのイピリムマブ；黒色腫の治療には３ヶ月毎に１５ｍｇ／ｋｇのトレメリムマブ；ＮＳＣＬＣの治療にはＲＥＧＮ２８１０；黒色腫の治療にはＰＤＲ００１；ＮＳＣＬＣの治療にはラコツモマブ；進行性固形腫瘍の治療にはＭＥＤＩ０５６２およびＧＳＫ３１７４９９８；黒色腫の治療にはウレルマブ；ＤＬＢＣＬの治療にはウトミルマブ；ならびに固形腫瘍の治療にはＢＭＳ−９８６０１６、ＬＡＧ５２５、ＪＮＪ−６１６１０５８８、ＴＳＲ−０２２、ＭＢＧ４５３、ＭＥＤＩ１８７３、およびＩＮＣＡＧＮ０１８７６の各々である。
【０２０３】
実施例ＸＩＸのデータによって直接支持されるように、バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体との併用療法に特に好ましいＩＯ剤は、本明細書において「免疫チェックポイント抗体」とも呼ばれる「チェックポイント阻害剤」である。好適な「免疫チェックポイント抗体」としては、ＣＤ２８、ＯＸ４０、および／またはＧＩＴＲなどの活性化免疫チェックポイント、受容体、または分子に結合するアゴニスト（活性化）抗体、ならびにＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、および／またはＬＡＧ−３などの阻害免疫チェックポイント、受容体、または分子に結合する拮抗（遮断）抗体が挙げられる。そのような遮断抗体は慣例的に「免疫チェックポイント阻害剤」と呼ばれ、これもまた本明細書で使用される。いくつかのそのような抗体はまた、臨床治療または後期臨床試験に承認されているものとして、２０１７年４月３日に出願された仮出願第６２／４８０，９９４号および２０１７年５月１７日に出願された仮出願第６２／５０７，５８０号の各々の表Ｅにも記載されている。
【０２０４】
免疫チェックポイント抗体（免疫チェックポイント阻害剤）の現在最も好ましい例は、「ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＰＤ−Ｌ１に結合する遮断抗体」である。ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＰＤ−Ｌ１に結合するいくつかのそのような遮断抗体、ならびにそれらの選択、調製、および使用のための機能アッセイを含む方法は、表Ｂに記載されるように、当業者に周知である。これらには、イピリムマブおよびトレメリムマブなどのＣＴＬＡ−４に対する遮断抗体；ニボルマブ（Ｂｒａｈｍｅｒら、２０１５）、ＲＥＧＮ２８１０、およびペンブロリズマブ（Ｇａｒｏｎら、２０１５）などのＰＤ−１に対する遮断抗体；デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）およびアテゾリズマブ（Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒら、２０１６）などのＰＤ−Ｌ１に対する遮断抗体；ならびに「ＩＯダブレット」として知られる、そのような抗体のうちのいずれか１つ以上の組み合わせが含まれる。これらのうち、トレメリムマブ、ニボルマブ、デュルバルマブ、およびアテゾリズマブが現在好ましい。トレメリムマブ、ニボルマブ、デュルバルマブ、およびアテゾリズマブの主な米国特許はそれぞれ、米国特許第６，６８２，７３６号、米国特許第８，００８，４４９号、米国特許第８，７７９，１０８号、および米国特許第８，２１７，１４９号である。
【０２０５】
表Ｂに加えて、抗ＣＴＬＡ−４抗体の他の好適な例は、米国特許第６，２０７，１５６号に記載されているものであり、この特許は特に、寄託された雑種細胞に由来する定義された抗体から選択されるＣＤＲ（ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ１）を含む、抗ＣＴＬＡ−４抗体に関する。
【０２０６】
表Ｂに加えて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の他の好適な例は、米国特許第８，１６８，１７９号に記載されているもの（この特許は特に、化学療法の併用を含む、ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−Ｌ１過剰発現癌の治療に関する）、米国特許第９，４０２，８９９号（この特許は特に、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体を含む、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体による腫瘍の治療に関する）に記載されているもの、米国特許第９，４３９，９６２号に記載されているもの（この特許は特に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および化学療法による癌の治療に関する）である。これらの抗ＰＤ−Ｌ１抗体組成物および方法は、Ｏｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよび共同研究者らによって開発中のものを含む。
【０２０７】
ＰＤ−Ｌ１に対する更なる好適な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号、同第９，５８０，５０５号、および同第９，５８０，５０７号のもの、それらのキット（米国特許第９，５８０，５０７号）、ならびにそれらの抗体をコードする核酸（米国特許第８，３８３，７９６号）である。そのような抗体はＰＤ−Ｌ１に結合し、結合について基準抗体と競合するか、ＶＨおよびＶＬ遺伝子によって定義されるか、あるいは定義された配列の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３（米国特許第７，９４３，７４３号）もしくは重鎖ＣＤＲ３（米国特許第８，３８３，７９６号）またはそれらの保存的修飾によって定義されるか、あるいは基準抗体に対して９０％または９５％の配列同一性を有する。これらの抗ＰＤ−Ｌ１抗体はまた、定義された定量的（結合親和性を含む）特性および定性的特性を有するもの、免疫複合体、ならびに二重特異性抗体を含む。免疫応答を増強する上で、そのような抗体、ならびに定義された定量的（結合親和性を含む）特性および定性的特性を有するもの（単鎖形式の抗体および単離されたＣＤＲの抗体にある抗体を含む）を使用する方法がさらに含まれる（米国特許第９，１０２，７２５号）。米国特許第９，１０２，７２５号にあるように、免疫応答の増強を使用して、癌または感染症（ウイルス、細菌、真菌、または寄生体による病原性感染症など）を治療することができる。これらの抗ＰＤ−Ｌ１抗体組成物および方法は、ＢＭＳ９３６５５９の製品を含む。
【０２０８】
ＰＤ−Ｌ１に対する更なる好適な抗体は、米国特許出願第２０１６／０００９８０５号にあるものであり、この特許は、定義されたＣＤＲ配列の抗体および競合抗体を含む、ＰＤ−Ｌ１上の特定のエピトープに対する抗体；核酸、ベクター、宿主細胞、免疫複合体；検出、診断、予後、およびバイオマーカー方法；ならびに治療方法に関する。
【表２−１】
2019537619.tif 000004
【表２−２】
2019537619.tif 000005
【表２−３】
2019537619.tif 000006
＊      ＊      ＊
【０２０９】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技術は、本発明の実施において十分に機能することが発明者によって発見された技術を表しており、したがってその実施のための好ましい様式を構成すると見なされ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更を行い、依然として同様または類似の結果を得ることができることを理解するべきである。
【０２１０】
実施例Ｉ
３Ｇ４抗体の生成
本実施例は、３Ｇ４と呼ばれるマウスＰＳ標的化抗体の免疫化プロトコル、生成、および初期特徴付けを記載する。
【０２１１】
アニオン性リン脂質、主にＰＳをより強い免疫原として免疫系に提示するために、それらを細胞の文脈において、特にＰＳ陽性細胞として製剤化した。他の膜構成成分によって囲まれた、膜に曝露されたＰＳは、抗体を産生させるためのより良好な立体構造を有する。その意図は、ＰＳを発現する自己細胞で免疫適格動物を免疫化することであり、ここで動物は全ての自己表面抗原に対する抗体を産生するのではなく、外的要素として膜に曝露されたＰＳを認識する。
【０２１２】
マウス内皮腫細胞ｂＥｎｄ．３（不死化マウス（ＢＡＬＢ／ｃ株）内皮細胞）を、１０％のＣＯ２のインキュベーター内、９ｍｌ／５００ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液を有する１０％のＤＭＥＭ中で培養した。所望の数の細胞が得られるまで、ｂＥｎｄ．３細胞をＴ１７５  ＴＣフラスコ内で増殖させた。典型的には、約７０〜８０％の培養密度の各フラスコは、約３×１０６個の細胞を有し、各マウスは、１×１０６〜２０×１０６個の細胞、最大で１×１０７個の細胞を受ける。
【０２１３】
ｂＥｎｄ．３細胞を３７℃で１または２時間、５０μＭ〜２００μＭの過酸化水素で処理して、免疫化前にアニオン性リン脂質、特にＰＳを曝露させた。Ｈ２Ｏ２のストックは、［９．８Ｍ］、３０体積％であった。これを１：１０００に希釈し、その後、０．４ｍｌを４０ｍｌの培地を有するＴ１７５  ＴＣフラスコに添加して、Ｈ２Ｏ２の最終濃度を１００μＭとした。細胞を３７℃で１時間維持した。採取するために、培地中の全てのＢＳＡまたは血清タンパク質を除去する目的で、細胞を温かいリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）＋１０ｍＭのＥＤＴＡで３回洗浄した。細胞を穏やかなトリプシン処理で除去し、洗浄し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞を添加剤なしで適切な体積になるようにＤＭＥＭ中に再懸濁し（各マウスは２００μｌ中約１×１０７個の細胞を受けた）、氷上に維持した。
【０２１４】
このようにして処理した細胞を、１ｍｌのシリンジおよび２３ゲージの針を使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射した（２００μｌの細胞懸濁液）。まず、マウスを３〜４週間の間隔で３〜７回免疫化した。２回目の追加免疫から始めて、各追加免疫の１０日後にマウスを出血させることによって、免疫血清を収集した。ＰＳ抗体の血清力価をＥＬＩＳＡによって試験した。
【０２１５】
自己ＰＳ陽性細胞によるこれらの免疫化は、自己抗体の非制限的な産生はもたらさず、ＰＳと反応性の抗体の産生、主に他のアニオン性リン脂質との併用でＰＳと反応性の抗体の産生に限定されていた。ＰＳなどのアニオン性リン脂質と反応性の抗体の力価が非常に高いマウスを得た。マウスは、いかなる毒性の徴候も示さなかった。
【０２１６】
更なる免疫化において、様々なマウスを過酸化水素処理したｂＥｎｄ．３細胞で３回免疫化し、血清を初回免疫の５４日後に試験した。血清中のＰＳと反応性のＩｇＧ抗体を、抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ特異的二次抗体で検出した（血清中のＩｇＭ抗体を、抗マウスＩｇＧ  ｍｕ特異的二次抗体で検出した）。この免疫化プロトコルを使用して、ＰＳと反応性のＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を有するいくつかの有効な抗血清を得、そのうちＩｇＧ抗体を有する抗血清が一般により有効であった。
【０２１７】
典型的には、ＰＳに対する所望の抗血清のＩｇＧ力価が２００，０００超に達しているが、ＰＣ力価が５０，０００未満であったときに融合を実行して、モノクローナル抗体を生成した。免疫化した動物の脾細胞を骨髄腫パートナーＰ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）と融合させることによって、雑種細胞を得た。
【０２１８】
腫瘍治療に有用なモノクローナル抗体を調製するためのこの技術の重要な一態様は、アニオン性リン脂質に結合するが、中性リン脂質には結合しない抗体を選択するためのスクリーニングに関与する選択戦略であった。別の重要な態様は、血清の不在下でも血清の存在下と同様に強くＰＳコーティングプレートに結合する抗体を選択することであった。これは、ＰＳとβ２ＧＰＩとの複合体などの、ＰＳと血清タンパク質との複合体を認識する抗体を排除する目的で実行した。
【０２１９】
ＰＳと反応性のモノクローナル抗体を単離するための戦略は、抗マウスＩｇＧ、Ｆｃガンマ特異的二次抗体を使用して、ＰＳコーティングプレート上の雑種細胞上清をスクリーニングすることに関与した。まず、４つのリン脂質（ＰＳ、ホスファチジルセリン；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン；ＣＬ、カルジオリピン；およびＰＣ、ホスファチジルコリン）、ならびにｂＥｎｄ３細胞に対してスクリーニングを実行した。中性リン脂質であるＰＣと反応性のクローンを廃棄し、ｂＥｎｄ３細胞と非反応性のクローンも同様に廃棄した。ＰＳに対して高い結合を有するクローンを選択した。第１に、ＰＳのみの反応性またはＰＳに対する強い選択性を有するウェルをサブクローニングし、第２に、他のアニオン性リン脂質への結合と組み合わせてＰＳ反応性を呈するウェルをサブクローニングした。
【０２２０】
選択された各雑種細胞のアイソタイプを決定した。ＩｇＧクラスの抗体は、典型的により高い親和性、インビボでのより低いクリアランス速度、ならびに精製、修飾、および取り扱いの単純さを含む、ＩｇＭよりも多数の利点を有するため、それらの生成が特に所望された。均質なＩｇＧアイソタイプを有するウェルに焦点を合わせるために、ＩｇＭまたは異なるＩｇの混合物を含有するウェルを廃棄するか、または再クローニングした。高度に陽性のクローンのサブクローニングを、３〜４回反復した。
【０２２１】
最初に「Ｆ３−Ｇ４」と呼ばれ、３Ｇ４として再度命名された、有利なマウスＩｇＧ抗体（ＩｇＧ３κ）を選択した。３Ｇ４抗体を、血清の存在下および不在下でＥＬＩＳＡにおいてＰＳへの結合について試験し、最初に「血清非依存性」、すなわち、血清の不在下でＰＳに結合する抗体として特徴付けた。
【０２２２】
ＰＳまたは他のリン脂質への結合を試験するために使用した以下の「標準ＥＬＩＳＡ」を使用して、３Ｇ４抗体を研究した。リン脂質抗原（ＰＳ抗原、２．５ｍｌの瓶中Ｐ−６６４１が２５ｍｇ  １０ｍｇ／ｍｌ（溶媒は９５：５のクロロホルム：ＭｅＯＨ））原液をアリコートし、−３０℃で気密容器内に保存する。好ましい９６ウェルプレートは、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｕ  ｂｏｔｔｏｍ  Ｉｍｍｕｌｏｎ１（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｓより、カタログ番号０１１−０１０−３５５０）である。
【０２２３】
使用した標準遮断緩衝液は、ＰＢＳ中に溶解した１０％のウシ血清であった。一次抗体は、試験試料であった。二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰであった。発色溶液は、１０ｍｌの０．２ＭのＮａ２ＰＯ４、１０ｍｌの０．１Ｍのクエン酸、１個の１０ｍｇのＯＰＤ錠剤、および１０μＬの過酸化水素であった。停止溶液は、０．１８ＭのＨ２ＳＯ４であった。
【０２２４】
プロトコルは、以下のようにＰＳで９６ウェルプレートをコーティングすることを伴った：ＰＳ原液を、ｎ−ヘキサン中に１０μｇ／ｍｌになるまで希釈し、よく混合した。５０μｌを各ウェルに添加し、１時間蒸発させた。２００μｌの１０％の血清を（遮断緩衝液として）各ウェルに添加し、覆いをし、室温で２時間または４℃で一晩維持した。プレートをＰＢＳで３回洗浄した。一次抗体（遮断緩衝液中に希釈）を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した。１ウェル当たり１００μｌの二次抗体（典型的にはヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した。ウェルの各々に１００μｌの発色溶液を添加することによってＥＬＩＳＡを発色させ、１０分間発色させ、その後、各プレートに１００μｌの停止溶液を添加し、光学濃度を４９０ｎｍで読み取った。
【０２２５】
３Ｇ４抗体が、従来の抗体と比較して改善されたＰＳに対する相対的親和性を有すること、ならびに３Ｇ４抗体が、ＰＳ、ＣＬ、ＰＩ（ホスファチジルイノシトール）、ＰＡ（ホスファチジン酸）、およびＰＧ（ホスファチジルグリセロール）に結合することを決定した。腫瘍内で差次的に発現されるＰＳを標的化するためのモデルと一致して、３Ｇ４抗体は、中性リン脂質、ＰＣ、およびＳＭとは反応しなかった。
【０２２６】
標準的なタンパク質Ａ手順を使用して、３Ｇ４抗体を、培養した雑種の上清から見た目が均質になるまで精製した。簡潔には、生理学的ｐＨの３Ｇ４抗体を含有する試料を、タンパク質Ａカラムに適用し、ＩｇＧが固定化タンパク質Ａに結合するように緩徐に通過させた。カラムを洗浄緩衝液で洗浄して、非結合血清構成成分を除去した。３Ｇ４抗体を、酸性溶出緩衝液（約ｐＨ２．８）を使用してカラムから溶出させ、その後、溶出した抗体を含有する画分を中和または透析して、生理学的ｐＨに戻した。血清の不在下で実行されたＥＬＩＳＡにおいてＰＳへの結合について、この高度に精製された３Ｇ４抗体を試験する上で、依然として、３Ｇ４はＰＳに直接、すなわち、血清または血清タンパク質なしで結合すると考えられた。
【０２２７】
実施例ＩＩ
３Ｇ４抗体の前臨床抗腫瘍効果
この実施例において、同系および異種腫瘍モデルにおける３Ｇ４抗体の抗腫瘍効果のいくつかを示す初期前臨床経験を例証するためのデータを提供する。
【０２２８】
動物腫瘍研究のためのプロトコル
３Ｇ４の効果を、まず同系および異種腫瘍モデルにおいて検査した。動物腫瘍治療研究のための一般的なプロトコルは、以下の通りである。
【０２２９】
動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。マウスは、生後４〜５週間の雌のＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤまたはＦｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤマウスであった。マウスは、無菌取り扱いによって、オートクレーブケージ内に収容し、無菌の食物および水を与えた。全ての手順は、層流フード内で実行した。マウスを１週間順応させ、その後、耳にタグ付けし、尾静脈から血液試料（約７５〜１００μｌ）を採取して、ＥＬＩＳＡによって漏出を確認した。漏出ＥＬＩＳＡ試験に不合格であったマウスは、試験手順には使用しなかった。耳のタグ付けおよび血液試料除去の２〜３日後に、腫瘍細胞をマウスの乳房脂肪パッド（ＭＦＰ）に同所注射するか、または右側腹部に皮下注射した。
【０２３０】
同所モデルでは、０．１ｍｌのＤＭＥＭ中、１×１０７個の細胞を、典型的には麻酔したマウスのＭＦＰに注射した。０．０７５ｍｌのマウスカクテルを腹腔内注射して、マウスを麻酔した。マウスカクテルは、５ｍｌのケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）、２．５ｍｌのキシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）、１ｍｌのアセプロマジン（１０ｍｇ／ｍｌ）、１１ｍｌの無菌水である。投薬量は、３０分間にわたり腹腔内経路を介して、体重２０〜３０グラム当たり０．１ｍｌであった。
【０２３１】
マウスに麻酔をかけた後（趾／足をつまんでも応答がないことによって測定される）、マウスをその左側を下にして置き、頭のすぐ後ろおよび右前腕の周り／背中の領域を７０％のエタノールで拭いた。右前腕（側方胸部）のすぐ後ろに２〜３ｍｍの切開を入れたところ、皮弁を上げたときに白っぽい脂肪パッドが現れた。１ｍｌのシリンジおよび２７ゲージの針を使用して、０．１ｍｌの細胞を脂肪パッドに注射したところ、脂肪パッド内に小疱が生じた。切開部を、９ｍｍの無菌創傷クリップを使用して閉じた。マウスをそのケージに戻し、それが麻酔から目覚め、動けるようになるまで観察した。手術後の健康状態を決定し、何らかの苦痛の徴候が観察された場合には、動物に飲料水中のアセトアミノフェン（０．２４ｍｇ／ｍｌ）＋コデイン（０．０２４ｍｇ／ｍｌ）を与えた。１週間後に創傷クリップを除去した。この方法は、細胞が皮下領域ではなく選択された部位に正確に配置されるように使用した。腫瘍は１４〜１５日間で約２００μｌの体積（長さ×幅×重量）であり、生着率は本質的に１００％であった。
【０２３２】
皮下モデルでは、マウスに典型的には０．２ｍｌ中１×１０７個の細胞を注射した。マウスには麻酔をかけなかったが、マウスの皮膚をしっかりと握って拘束し、右側腹部を曝露させた。２３ゲージの針を有する１ｍｌのシリンジを使用して、マウスの皮膚のすぐ下に２００μｌ中１×１０７個の細胞を注射したところ、小疱が見られた。注射部位からの少量の漏出を観察することは珍しくはなかった。この漏出を低減するために、皮下注射から針を引き抜くときにねじり運動を使用した。腫瘍体積を、長さ×幅×高さによって測定した。
【０２３３】
灌流プロトコルでは、マウスに０．２ｍｌの生理食塩水中１０００Ｕのヘパリンを静脈内注射した。その後、マウスに０．１ｍｌのマウスカクテルを腹腔内注射することによって、マウスを鎮静させた。マウスが十分に鎮静した後（趾／足をつまんでも反射がないことによって測定される）、胸腔を開いて、心臓および肺を曝露させる。管および灌流ポンプに取り付けた３０ゲージの針を、左心室に挿入した。血液が滴り落ちるように、右心室を切り取った。生理食塩水を、毎分１ｍｌの速度で１２分間ポンピングした。灌流の終了時に、針および管を取り除いた。免疫組織化学または病理学のいずれかの更なる研究のために、組織を取り除いた。
【０２３４】
ノンパラメトリック検定（マン−ホイットニーの順位和検定）を使用して、腫瘍成長速度の差を統計的有意性について試験した。
【０２３５】
Ｂ．腫瘍治療結果
同系モデルでは、Ｍｅｔｈ  Ａマウスの線維肉腫腫瘍細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスと共に使用した。異種モデルでは、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞をＳＣＩＤマウスの乳房脂肪パッドに播種した。別の異種モデルでは、細胞を注入し、治療前に腫瘍を５００ｍｍ３超のサイズまで成長させることによって、大型ヒトホジキンリンパ腫Ｌ５４０異種移植片を確立した。対照抗体（ＢＢＧ３と呼ばれる、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ抗原に対するマウスＩｇＧ３κ抗体、ＡＴＣＣから２３．８．３４．２４として得られる雑種細胞から分泌；ＨＢ−１０１１３）とは対照的に、腫瘍保有マウス（１群当たり８〜１０匹の動物）には見た目が均質になるまで精製した１００μｇの３Ｇ４抗体を腹腔内注射した。治療を１週間に３回反復した。腫瘍測定のために、動物を１週間に２回または３回監視した。
【０２３６】
同系腫瘍および異種腫瘍の両方の成長は、３Ｇ４抗体での治療によって効果的に阻害された（Ｐ＜０．０５）。研究終了時に、対照マウスとは対照的に、３Ｇ４治療マウスにおける腫瘍成長の平均低減は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５では６５％（図１Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では７５％（図１Ｂ）、Ｍｅｔｈ  Ａでは９０％（図１Ｃ）、およびＬ５４０では５０％（図１Ｄ）であった。アイソタイプが一致した対照抗体であるＢＢＧ３で治療した対照マウスでは、腫瘍成長の遅延は生じなかった。同系Ｍｅｔｈ  Ａ腫瘍細胞の治療は特に成功した。壊死に耐性があることが既知である大型Ｌ５４０腫瘍を保有するマウスにおいてさえ、３Ｇ４抗体治療は対照と比較して腫瘍成長を阻害した。３Ｇ４抗体で治療したマウスでは、毒性は観察されなかった。
【０２３７】
したがって、要約すると、３Ｇ４抗体は、毒性の証拠なしに、腫瘍血管損傷、局在性血栓症、腫瘍壊死、および腫瘍成長の遅延を引き起こした。
【０２３８】
実施例ＩＩＩ
キメラ３Ｇ４抗体バビツキシマブの生成
本実施例は、合わせて６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む３Ｇ４抗体の重鎖および軽鎖可変領域の全配列を提供し、現在バビツキシマブと呼ばれているマウス−ヒトキメラ抗体（ｃｈ３Ｇ４）を含む３Ｇ４抗体のキメラバージョンの生成を記載する。
【０２３９】
Ａ．３Ｇ４抗体の配列
３Ｇ４抗体可変領域の元の配列を、３Ｇ４抗体を産生する雑種細胞からＲＡＣＥによって得、その配列を検証した。３Ｇ４抗体の重鎖可変領域（Ｖｈ）の核酸配列およびアミノ酸配列は、米国特許第７，５７２，４４８号の図１８Ａに示される。重鎖可変領域の配列は、Ｋａｂａｔによって予測可能な位置にＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を包含する（Ｋａｂａｔら、１９９１）。核酸配列内のＢｓｔＥＩＩ部位を好都合な部位として使用して、例えば、ヒト定常領域への移植に使用するための機能性マウス可変領域を調製することができる。
【０２４０】
実際に、３Ｇ４−２ＢＶＨ配列は、Ｌｏｎｚａ  ｐＥＥベクターを使用してＢｓｔＥＩＩ部位のヒトγ１定常領域に移植されている。結果として生じる生成物はマウスリーダー配列を含有し、そのＶＨは米国特許第７，５７２，４４８号の図１８Ａに示される様式でヒトＣＨ１配列に接合される。
【０２４１】
３Ｇ４抗体の軽鎖可変領域（Ｖκ）の核酸配列およびアミノ酸配列は、米国特許第７，５７２，４４８号の図１８Ｂに示される。軽鎖可変領域配列は、Ｋａｂａｔによって予測可能な位置にＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を包含する（Ｋａｂａｔら、１９９１）。核酸配列内のＢｂｓＩ部位を好都合な部位として使用して、例えば、ヒト定常領域への移植に使用するための機能性マウス可変領域を調製することができる。
【０２４２】
実際に、３Ｇ４−２ＢＶＬ配列は、Ｌｏｎｚａ  ｐＥＥベクターを使用してＢｂｓＩ部位のヒトκ定常領域に移植されている。結果として生じる生成物はマウスリーダー配列を含有し、そのＶＬは米国特許第７，５７２，４４８号の図１８Ｂに示される様式でヒトＣＬ１配列内に接合される。
【０２４３】
Ｂ．マウスキメラ抗体２ａＧ４の生成
直下に記載のように、マウス３Ｇ４抗体のヒトキメラ（ｃｈ３Ｇ４）は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ（ｈＩｇＧ１）である。ｃｈ３Ｇ４のマウスＩｇＧホモログは、ＩｇＧ２ａアイソタイプ（ｍＩｇＧ２ａ）に対応する。この構築物を作製し、試験したところ、元のマウスＩｇＧ３抗体と本質的に同じように挙動することが示された。
【０２４４】
簡潔には、３Ｇ４軽鎖コード配列を、３Ｇ４雑種細胞の細胞株から単離した全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ＲＴ−ＰＣＲプライマーは、Ｌｏｎｚａ発現ベクターであるｐＥＥ１２．４ベクターへのクローニングのために、増幅断片が増幅産物の両端にＸｍａＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含有するように設計した。３Ｇ４重鎖可変領域を、３Ｇ４雑種細胞の細胞株から単離した全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。プライマーは、Ｌｏｎｚａ発現ベクターであるｐＥＥ６．４ベクターへのクローニングのために、増幅断片が増幅産物の両端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｍａＩ制限酵素部位を含有するように設計した。
【０２４５】
マウスＩｇＧ２ａ定常領域を、プラスミドベクターからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲプライマーは、ｐＥＥ６．４＋３Ｇ４ＶＨベクターへのクローニングのために、増幅産物の両端にＢｓｔＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を有するように設計した。ＢｓｔＥＩＩ部位は、上流の３Ｇ４のＶＨ可変領域配列とインフレームになるように設計した。重鎖および軽鎖構築物を、両方のベクターをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで切断することによって単一の二重遺伝子ベクター（１２．４  ３Ｇ４  ＩｇＧ２ａ）に組み合わせた。重鎖および軽鎖コード領域を、配列決定によって検証した。
【０２４６】
１２．４  ３Ｇ４  ＩｇＧ２ａベクターを、電気穿孔によってＮＳ０細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＮＳ０細胞を希釈し、グルタミンを欠如する培地中で９６ウェルプレートにプレーティングした。（陽性選択のためのグルタミンシンターゼ遺伝子を含有する）構築物でトランスフェクトした細胞のみが、グルタミンの不在下で成長することができる。実施例Ｉの標準的なＥＬＩＳＡを使用して、トランスフェクタントを特定し、抗体分泌についてスクリーニングし、最高量の抗体を分泌するそれらのトランスフェクタントを大型培養物中で成長させて、精製抗体を生成した。
【０２４７】
結果として生じる２ａＧ４抗体を見た目が均質になるまで精製し、３Ｇ４抗体と本質的に同じ親和性および結合プロファイルを有することが示された。
【０２４８】
Ｃ．ヒトキメラ抗体ｃｈ３Ｇ４（バビツキシマブ）の生成
マウス可変領域およびヒト定常領域を含有するキメラ構築物を生成し（ｃｈ３Ｇ４）、元のマウス抗体と本質的に同じ特徴を有することが示された。
【０２４９】
マウス３Ｇ４抗体を、ヒト−マウスキメラ抗体に変換した。マウスＶＨをクローニングし、Ｌｏｎｚａ  ２ＢＶＨベクターのＢｓｔＥＩＩ部位のヒトγ１定常領域上に移植した。マウスＶＫをクローニングし、Ｌｏｎｚａ  ２ＢＶＬベクターのＢｂｓＩ部位のヒトＫ定常領域上に移植した。配列を検証した。全構築物をＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現させ、抗体を精製した。これは、現在バビツキシマブと呼ばれる抗体である。
【０２５０】
実施例Ｉの標準的なＥＬＩＳＡを使用して、結果として生じるｃｈ３Ｇ４は、少なくともマウス３Ｇ４と同程度にリン脂質コーティングＥＬＩＳＡプレートに結合した。キメラ３Ｇ４の、リン脂質ＰＳ、ＰＡ、ＣＬ、ＰＩ、およびＰＧへのインビトロ結合プロファイルは、３Ｇ４と同じであることが示された。無関係な特異性の対照抗体では結合は観察されなかったため、結合は抗原特異的であった。インビボでは、ｃｈ３Ｇ４は腫瘍血管内皮に局在化すること、ならびに広範囲の研究において抗腫瘍効果および抗ウイルス効果を発揮することもまた示された。
【０２５１】
しかしながら、キメラ３Ｇ４構築物を無血清条件下でＣＨＯ細胞内に発現させ、精製抗体を血清の不在下でＥＬＩＳＡにおいてＰＳへの結合について試験した場合、ＰＳへの結合は失われた。
【０２５２】
実施例ＩＶ
３Ｇ４抗体およびバビツキシマブは、β２ＧＰＩに依存した様式でＰＳを標的化する
この実施例は、元の雑種細胞由来の３Ｇ４抗体と、ＣＨＯ細胞内で発現されたキメラ抗体とのＰＳ結合プロファイルにおける見かけ上の矛盾を解決するためのデータを提供する。そうすることで、本実施例は、３Ｇ４抗体とＰＳとの間の相互作用が血漿タンパク質β２−糖タンパク質Ｉ（β２ＧＰＩ）に依存することを実証する。
【０２５３】
Ａ．材料および方法
１．材料
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびトリプシン／ＥＤＴＡは、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）から得た。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、正常ヒト血清、正常ラット血清、および正常マウス血清は、Ｂｉｏｍｅｄａ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から得た。新鮮なヒト血漿は、Ｃａｒｔｅｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｒｅ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から得た。無血清雑種細胞培地、Ｓｙｎｔｈｅｃｈｏｌ  ＮＳ０補助剤、Ｌ−α−ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および鶏卵白由来の卵白アルブミン（ＯＶＡ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。ＤＥＡＥセルロース、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、およびＨｙｂｏｎｄ−Ｐ膜は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から得た。１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン［リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）］は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から得た。９６ウェルのＩｍｍｕｌｏｎ−１ＢおよびＩｍｍｕｌｏｎ−２ＨＢマイクロタイタープレートは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）から得た。トリス−ＨＣｌ勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＯｐｔｉ−４ＣＮ基質キットは、Ｂｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から得た。８ウェルガラスチャンバースライドは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から得た。
【０２５４】
２．抗体
アニオン性リン脂質ＰＳに結合するように生成された３Ｇ４マウスモノクローナル抗体は、実施例Ｉに記載されている抗体である。３Ｇ４を最初に雑種細胞上清中で産生させた（実施例Ｉ、実施例ＩＩ）。３Ｇ４をマウスＩｇＧ２ａアイソタイプにも変換し（実施例ＩＩＩ、Ｂ）、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞株内でも産生させた。ＮＳ０細胞を、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中またはＳｙｎｔｈｅｃｈｏｌ  ＮＳ０補助剤を有する無血清雑種細胞培地中で培養した。３Ｇ４のヒトキメラバージョン（ｃｈ３Ｇ４、バビツキシマブ）を生成し（実施例ＩＩＩ、Ｃ）、無血清条件下でＣＨＯ細胞から抗体を産生させた。
【０２５５】
マウス抗ヒトβ２ＧＰＩ（抗β２ＧＰＩまたはα−β２ＧＰＩ）ｍＡｂは、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）から得た。Ｃ４４を分泌する雑種細胞、コルヒチン特異的マウスＩｇＧ２ａ  ｍＡｂは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得、３Ｇ４および抗β２ＧＰＩの対照として使用した。リツキシマブ（ヒトＩｇＧ１キメラｍＡｂ）を、ｃｈ３Ｇ４の対照として使用した。全ての二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から得た。
【０２５６】
３．抗体断片の調製
３Ｇ４  Ｆ（ａｂ’）２は、プロテアーゼペプシンと共にインキュベートすることによって生成した。３Ｇ４  Ｆａｂおよび対照Ｆａｂ  ７Ｈ１１（抗アデノウイルス）は、プロテアーゼパパインと共にインキュベートすることによって生成した。全ての抗体切断生成物をＦＰＬＣによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検証した。
【０２５７】
４．ヒト血漿からのβ２ＧＰＩの精製
本実施例において使用するためのヒトβ２ＧＰＩ（ｈβ２ＧＰＩ）は、本質的に以前に記載されているように（Ｐｏｌｚら、１９８０；Ｗｕｒｍら、１９８４）ヒト血漿から精製した。簡潔には、過塩素酸（７０％）を、１．５７体積％の最終濃度になるまでプールした血漿に添加した。沈殿物を廃棄し、上清を飽和Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ７．５に調整し、その後に５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）に対する広範な透析を続けた。この材料を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに適用して、混入物を除去した。その後、ＤＥＡＥカラム通過画分を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）で平衡化したヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ親和性カラムに適用し、結合したタンパク質を、１．０ＭのＮａＣｌを使用して溶出させた。最後に、β２ＧＰＩ調製物をＰＢＳに対して透析し、タンパク質Ａ／Ｇによってさらに精製して、混入ＩｇＧを除去した。最終調製物は、非還元ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色によって示されるように、５０ｋＤａで均質なバンドを含有した。
【０２５８】
５．β２ＧＰＩおよびβ２ＧＰＩドメインの構築および発現
純粋な組み換え完全長および欠失型のβ２ＧＰＩを生成するために、酵母シャトル発現ベクターｐＰＩＣ６αＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および宿主株Ｍｕｔ＋Ｘ−３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。発現ベクターは、アルコール（メタノール）オキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）の５’プロモーター配列および３’転写終結配列を含有する。このベクターはまた、ＡＯＸ１プロモーターの下流に酵母α接合因子シグナル配列も有し、これに外的ｃＤＮＡを融合させて、組み換え異種タンパク質を培地に分泌させることができる。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現は、哺乳動物細胞内のものに類似したグリコシル化およびジスルフィド結合形成を提供する。
【０２５９】
発現構築物を生成するために、Ｌｕｓｔｅｒら、２００６および米国特許第８，９５６，６１６号に記載されるように、ヒトβ２ＧＰＩ  ｃＤＮＡを使用して以下の５つの発現構築物、その同族シグナルペプチドを有しないβ２ＧＰＩ  ｃＤＮＡの全コード領域（ドメインＩ−Ｖ）；ドメインＩ欠失（ドメインＩＩ−Ｖ）；ドメインＩおよびＩＩ欠失（ドメインＩＩＩ−Ｖ）；ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ欠失（ドメインＩＶ−Ｖ）；ならびにドメインＶのみ（ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ欠失）を作製した。共通の３’プライマーを、全ての断片のＰＣＲに使用した。
【０２６０】
ＰＣＲ増幅断片を、α接合因子シグナル配列のすぐ下流のｐＰＩＣαＡのＥｃｏＲ１制限部位とＸｂａＩ制限部位との間にインフレームで挿入した。各断片の末端に停止コドンを導入して、組み換えタンパク質がｃ−ｍｙｃエピトープまたはＣ末端のＨｉｓタグに融合するのを予防した。プラスミド構築物を、１００μｇ／ｍｌのブラスチシジンの存在下、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増殖させ、制限分析およびヌクレオチド配列決定によって検証した。上記の５つの構築物によって発現された組み換えタンパク質は、グリコシル化前にそれぞれ約３６、２９、２４、１６、および９ｋＤａのタンパク質をコードしていた。
【０２６１】
発現クローンの形質転換およびスクリーニングのために、組み換えプラスミド構築物を制限酵素ＳａｃＩで直線化し、精製し、１０μｇを使用して、スフェロプラスト法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって宿主株Ｘ−３３を形質転換した。４００μｇ／ｍｌのブラスチシジンを含有するＹＰＤ（酵母抽出物ペプトンデキストロース培地）プレート上で、これらの構築物の各々の形質転換体を４日間選択した。これらの構築物の各々のいくつかのクローンを、４００μｇ／ｍｌのブラスチシジンを有するＹＰＤプレート上に再度画線付けして、真の組み込み体を決定した。その後、各構築物の１０のクローンを、最小デキストロース（ＭＤ）プレートおよび最小メタノール（ＭＭ）プレート上に画線付けした。その後、ＭＤプレートおよびＭＭプレート上の両方で同様に良好に成長する各構築物の５つのクローンを、２４、４８、７２、９６、および１２０時間、液体ＭＤ培地およびＭＭ培地中で成長させた。各時点での各クローンの上清およびペレットを、抗ヒトβ２ＧＰＩポリクローナル抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。上清中で最高のタンパク質発現を示したクローンを、大規模な調製にさらに使用した。
【０２６２】
組み換えタンパク質の大規模な精製のために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって推奨されている培養条件を使用して組み換えタンパク質を生成した。各クローンの出発培養物を、３０℃で激しく振盪しながら５ｍｌの緩衝最小グリセロール複合体培地（ＢＭＧＹ）中で一晩培養した。細胞を収集し、２５ｍｌのＢＭＧＹを播種するのに使用し、２日間成長させた。その後、２５ｍｌの培養物に由来する細胞を使用して、１Ｌの緩衝最小メタノール複合体（ＢＭＭＹ）培地（１．０％のメタノール）に播種した。３０℃で激しく振盪しながら４日間培養を続け、１００％のメタノールを２４時間毎に添加して（１．０％の最終濃度）、タンパク質発現を維持した。培地を遠心分離（４０００×ｇ、１５分間）によって清澄化し、上清を５０ｍＭのトリス緩衝液中、４℃で２日間透析してから、５０ｍＭのトリス緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムに適用した。通過画分溶液を収集し、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに適用した。β２ＧＰＩを、１ＭのＮａＣｌでヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから溶出させ、５０ｍＭのトリス緩衝液に対して透析し、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器を使用して濃縮し、ウエスタンブロットによって分析した。各タンパク質のＮ末端を配列決定して、α因子リーダー配列の切断を確認した。タンパク質収量は、１０ｍｇ／Ｌ（完全長β２ＧＰＩ）から２５ｍｇ／Ｌ（β２ＧＰＩドメインＶ）まで変動した。
【０２６３】
６．「ニック入り」ｈβ２ＧＰＩの調製
本実施例において上記のように、ヒト血漿から精製したインタクトなｈβ２ＧＰＩからニック入りｈβ２ＧＰＩを調製した。ｈβ２ＧＰＩをプラスミンコーティングビーズと共に３７℃で１７時間インキュベートした。ビーズを遠心分離によって除去し、切断されたタンパク質を含有する上清を回収した。精製された生成物のウエスタンブロットは、ニック入りβ２ＧＰＩ調製物がプラスミンを含まず、プラスミン自己タンパク質分解産物を含有しない（抗プラスミン抗体または抗アンジオスタチン抗体との反応性がない）ことを示した。Ｎ末端配列分析により、β２ＧＰＩのＮ末端に対応する２つのＮ末端、およびＬｙｓ３１７／Ｔｈｒ３１８切断部位で生成された１つの新たな配列が明らかになった。
【０２６４】
７．ＰＳ  ＥＬＩＳＡ
実施例Ｉの標準的なＥＬＩＳＡを、以下の変更を加えて適合させた。ＰＳコーティングＩｍｍｕｎｌｏｎ  １Ｂマイクロタイタープレートを、１重量体積％のＯＶＡ中で一晩遮断した。翌日、血清含有上清または無血清上清から精製した３Ｇ４の段階２倍希釈液を、１３．３３ｎＭの初期濃度から調製した。希釈は、１％のＯＶＡまたはウシ、ヒト、ラット、またはマウス由来の１０％の非加熱不活性化血清中で実行した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、３Ｇ４の結合を検出した。全てのＥＬＩＳＡ研究を、少なくとも３回実行した。
【０２６５】
８．抗ｈβ２ＧＰＩ  ＥＬＩＳＡ
以下の変更を加えて、上記のようにアッセイを実行した。ｈβ２ＧＰＩ、ニック入りｈβ２ＧＰＩ、または組み換えｈβ２ＧＰＩペプチドを、１０μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルのＩｍｍｕｎｌｏｎ  ２ＨＢマイクロタイタープレート上に一晩コーティングした。その後、１％のＯＶＡ中、室温でプレートを１時間遮断した。３Ｇ４、ｃｈ３Ｇ４、または抗β２ＧＰＩを、１％のＯＶＡ中で１３．３３ｎＭの初期濃度まで希釈し、段階２倍希釈液を調製した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、抗体結合を検出した。全てのＥＬＩＳＡ研究を、少なくとも３回実行した。
【０２６６】
９．ウエスタンブロット
タンパク質試料を、非還元ＳＤＳ試料緩衝液中で９５℃まで５分間加熱した。その後、試料をトリス−ＨＣｌの４〜１５％の勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に充填し、Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ装置（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して分離した。分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、３重量体積％のＢＳＡ中で一晩遮断した。膜を、３％のＢＳＡ中１μｇ／ｍｌに希釈した抗β２ＧＰＩ、３Ｇ４、または対照マウスＩｇＧで探索し、徹底的に洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共にインキュベートした。膜を、Ｏｐｔｉ−４ＣＮ基質キットを使用して発色させた。
【０２６７】
１０．内皮細胞上のＰＳ曝露の誘導および検出
成体ウシ大動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞を、１０％のＦＢＳおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で維持した。ＡＢＡＥ細胞を、０．２５％のトリプシン／０．０２％のＥＤＴＡへの短時間の曝露によって亜集密培養物から除去し、８ウェルチャンバースライドに１ウェル当たり２×１０４個の細胞で播種した。一晩培養した後、細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄し、２００μＭのリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）で処理して、ＰＳ曝露を誘導した。ＬＰＣ処理は、１０％のＦＢＳ中または１０％の正常マウス血清（ＭＳ）中のいずれかで、３７℃で３０分間、３Ｇ４、ｃｈ３Ｇ４、または対照ＩｇＧの存在下で実行した。ＬＰＣ処理を１０％のＭＳで実行した場合、３Ｇ４／ｃｈ３Ｇ４はＭＳ中ではＰＳに結合することができないため、ｈβ２ＧＰＩを補助因子として添加した（本実施例の以下の結果を参照されたい）。
【０２６８】
免疫蛍光染色によって、ＰＳ曝露を決定した。細胞をＰＢＳ中で徹底的に洗浄し、４重量体積％のパラホルムアルデヒド中に固定し、ビオチン共役抗マウス二次抗体と共にインキュベートした。次に、細胞をＦＩＴＣ共役ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベートして、抗体結合を検出した。その後、細胞をＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過処理し、テキサスレッド共役ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で対比染色した。Ｎｉｋｏｎ顕微鏡に取り付けたＣｏｏｌｓｎａｐデジタルカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を使用して画像をキャプチャし、ＭｅｔａＶｕｅソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ，ＰＡ）で処理した。
【０２６９】
１１．ＡＢＡＥ細胞への抗体結合の定量化
画像中の点灯ピクセル数を定量化することができるＭｅｔａＶｕｅ画像分析ソフトウェアを使用して、抗体結合の面積を決定した。ＦＩＴＣ蛍光の画像を使用して、抗体結合を定量化した。対応するＤＡＰＩ蛍光画像を使用して、視野内に存在する細胞数についてＦＩＴＣ画像を正規化した。小さいＦＩＴＣ／ＤＡＰＩ比は小さい抗体結合面積を示す一方で、大きいＦＩＴＣ／ＤＡＰＩ比は大きい結合面積を示す。ＦＩＴＣ／ＤＡＰＩ比を使用して、選択された条件下での抗体結合の基礎量に対する抗体結合面積の増加または減少を決定した。各分析には、２００倍の倍率の５枚の画像を使用した。データを、標準偏差との平均相対ＦＩＴＣ／ＤＡＰＩ比として分析する。
【０２７０】
Ｂ．結果
全体として、以下のデータは、３Ｇ４（およびバビツキシマブ）抗体とＰＳとの間の相互作用が、血漿タンパク質β２ＧＰＩに依存することを実証している。３Ｇ４は、一般にβ２ＧＰＩドメインＩを認識する、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）を有する患者から単離された病原性抗体とは関連しないドメインＩＩでβ２ＧＰＩに結合することが示されている。このデータは、ＰＳ陽性細胞への結合を含むＰＳ結合の増強に二価３Ｇ４／β２ＧＰＩ複合体が必要とされ、これは３Ｇ４Ｆａｂ’断片がこの活性を有しないためであることを示している。
【０２７１】
１．３Ｇ４は、ＰＳコーティングマイクロタイタープレートへの結合に血清因子を必要とする
血清含有培地（ＳＣＭ）または無血清培地（ＳＦＭ）から精製した３Ｇ４抗体は、１０％のＦＢＳ中で段階希釈を実行すると、ＰＳコーティングマイクロタイタープレートに結合する（図２Ａ、実線）。対照的に、（ウシ血清タンパク質を欠如する）１％のＯＶＡ中で段階希釈を実行すると、ＳＦＭから精製した３Ｇ４は、もはやＰＳには結合しない（図２Ａ、破線、■）。この発見は、ウシ血清中に存在する因子が３Ｇ４とＰＳの間の相互作用を媒介することを示している。
【０２７２】
興味深いことに、１％のＯＶＡ中で段階希釈を実行すると、ＳＣＭから精製した３Ｇ４は依然としてＰＳに結合する（図２Ａ、破線、▲）。明らかに、血清含有培地由来の血清タンパク質は３Ｇ４とＰＳとの間の相互作用を媒介している。これは、ＳＣＭ中で成長させた３Ｇ４を精製したとしても、精製抗体中に存在し得る低レベルの血清タンパク質が依然としてＰＳ結合を支持するのに十分であることを示している。
【０２７３】
これらの発見を考慮して、ＳＦＭから精製した３Ｇ４を使用して下記の研究を実行した。
【０２７４】
２．異なる種由来の血清中のＰＳへの３Ｇ４の結合
他の哺乳動物種由来の血清が３Ｇ４抗体とＰＳとの間の相互作用を媒介し得るかどうかを決定するために、１０％のマウス、ラット、ヒト、または他の血清中で３Ｇ４の段階希釈を実行した。３Ｇ４抗体は、ウシ血清の存在下でとほぼ同様に、ラットおよびヒト血清の存在下でＰＳに結合した（図２Ｂ）。しかしながら、３Ｇ４は、マウス血清の存在下ではＰＳに結合しなかった（図２Ｂ）。関連研究において、３Ｇ４は、ハムスター、フェレット、モルモット、ウサギ、およびサル血清の存在下でＰＳに結合した。したがって、３Ｇ４によって認識される血清タンパク質エピトープは、マウスを除いて試験した全ての哺乳動物種の間で保存されている。
【０２７５】
３．３Ｇ４は、血清糖タンパク質β２ＧＰＩに結合する
１９９０年代初期には、多くのいわゆる抗リン脂質（ａＰＬ）抗体がリン脂質を直接認識せず、代わりに血清タンパク質に結合し、それが転じてリン脂質に対する親和性を有することが示された（Ｇａｌｌｉら、１９９０；ＭｃＮｅｉｌら、１９９０）。したがって、アニオン性リン脂質と相互作用することが既知であるヒト血清タンパク質のパネルを、３Ｇ４抗体との反応性についてスクリーニングした。
【０２７６】
例えば、ヒトβ２ＧＰＩ（ｈβ２ＧＰＩ）をマイクロタイタープレート上にコーティングし、マウス抗ヒトβ２ＧＰＩ抗体（抗β２ＧＰＩ）、３Ｇ４抗体、または無関係の特異性を有する対照マウスＩｇＧ２ａ（対照ｍＩｇＧ）と共にインキュベートした。予想通り、抗β２ＧＰＩはｈβ２ＧＰＩに結合したが、対照ｍＩｇＧは結合しなかった（図３）。３Ｇ４抗体もまた、ｈβ２ＧＰＩコーティングプレートに強く結合した（図３）。
【０２７７】
β２ＧＰＩが３Ｇ４抗体によって認識される唯一の血清タンパク質であるかどうかを決定するために、精製ｈβ２ＧＰＩおよび１０％のヒト血清をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流し、免疫ブロット用の膜支持体に移した。３Ｇ４は、ヒト血清中で５０ｋＤａの精製ｈβ２ＧＰＩおよび類似サイズの単一のバンドを検出した。重要なことに、３Ｇ４免疫ブロットは、抗β２ＧＰＩ抗体を使用して生成したブロットと実質的に同一であった。対照ｍＩｇＧ抗体は、いかなるタンパク質も検出しなかった。
【０２７８】
アニオン性リン脂質と相互作用することが既知である他のヒト血清タンパク質を試験して、ＥＬＩＳＡにおいて３Ｇ４抗体との反応性の欠如を確認した。等量の特定のタンパク質をマイクロタイタープレート上にコーティングし、１％のＯＶＡ中で遮断し、３Ｇ４抗体の段階希釈物と共にインキュベートした。プレートを徹底的に洗浄し、抗体結合をペルオキシダーゼ標識二次検出抗体で検出した。全ての研究は、予想通りに機能した陽性および陰性対照抗体を含んだ。免疫ブロットおよびＥＬＩＳＡ研究の結果は、陽性がβ２ＧＰＩ、陰性がアネキシンＶ、第ＸＩＩ因子、キニノーゲン（低または高分子量）、酸化ＬＤＬ、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、プロトロンビン、および組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）である。まとめると、これらのデータは、３Ｇ４抗体が血清タンパク質β２ＧＰＩに結合することを示している。
【０２７９】
４．３Ｇ４は、ドメインＩＩでβ２ＧＰＩに結合する
β２ＧＰＩは５つのドメインを有し、そのうち第５のドメインはＰＳなどのアニオン性リン脂質への結合に関与している。β２ＧＰＩのどのドメインが３Ｇ４抗体によって認識されるかを決定するために、異なるドメイン構造を有する組み換えヒトβ２ＧＰＩ構築物を生成し、組み換え完全長ｈβ２ＧＰＩと共に試験した。これらのドメイン構築物は、Ｎ末端からの連続短縮化によって作製されたため、転じて、以下のようにＮ末端ドメインの各々を欠如している。組み換え完全長ｈβ２ＧＰＩはドメインＩ−Ｖを含有し、ドメインＩが欠失しているｈβ２ＧＰＩはドメインＩＩ−Ｖを含有し、ドメインＩおよびＩＩが欠失しているｈβ２ＧＰＩはドメインＩＩＩ−Ｖを含有し、ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩが欠失しているｈβ２ＧＰＩはドメインＩＶ−Ｖを含有し、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶが欠失しているｈβ２ＧＰＩはドメインＶのみを含有する。
【０２８０】
等量の完全長ｈβ２ＧＰＩおよび上記のｈβ２ＧＰＩドメイン構築物の各々を、マイクロタイタープレート上にコーティングし、３Ｇ４抗体の段階希釈物と共にインキュベートした。この研究は、β２ＧＰＩのドメインＩＩを含有するｈβ２ＧＰＩ構築物（ドメインＩ−ＶおよびドメインＩＩ−Ｖ）のみが３Ｇ４によって検出されることを示した（図４）。ドメインＩが欠失すると、３Ｇ４はドメインＩＩ−Ｖに同様に良好に結合した（図４）。したがって、３Ｇ４抗体はドメインＩＩでβ２ＧＰＩに結合する。
【０２８１】
ＡＰＳ患者から単離した病原性抗体について既知である情報を考慮すると、３Ｇ４抗体がドメインＩＩでβ２ＧＰＩに結合するという発見は重要である。ＡＰＳ患者から単離した病原性抗β２ＧＰＩ抗体は一般に、β２ＧＰＩのドメインＩを認識する（ｄｅ  Ｌａａｔら、２００５）。ドメインＩＩを認識するＡＰＳ患者由来の抗β２ＧＰＩ抗体は、しばしば病原性ではない。このことは、様々な動物モデルにおいて、および広範な臨床経験において実行される毒性学的研究（本明細書に記載されているものなど）後の３Ｇ４に関連する毒性の欠如を説明する可能性が高い。
【０２８２】
５．曝露されたＰＳを有する細胞への３Ｇ４およびβ２ＧＰＩの共結合
より生理学的な条件下で上記の発見を検証するために、生細胞結合アッセイを開発した。このアッセイは、膜破壊剤リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）で処理して、ＰＳ破壊を誘発した後の細胞膜表面への抗体結合を検出および測定する。
【０２８３】
このアッセイでは、ＡＢＡＥ細胞を、２００μＭのＬＰＣの存在下または不在下で、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中の３Ｇ４抗体または対照ｍＩｇＧと共に３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、固定し、蛍光マーカーで染色して、細胞表面への抗体の結合を視覚化した。３Ｇ４またｍＩｇＧ結合のピクセル面積は、ＭｅｔａＶｕｅソフトウェアを使用して定量化した。全ての値は、ＬＰＣ処理されていない細胞への３Ｇ４の結合に対するものであり、これを１に設定した。
【０２８４】
３Ｇ４抗体を通常の条件下でＡＢＡＥ細胞培地に添加した場合、細胞への結合は観察されなかった。しかしながら、ＡＢＡＥ細胞をＬＰＣの存在下で３Ｇ４と共にインキュベートした場合、３Ｇ４抗体結合の多数のピンポイントが容易に検出可能である。ＬＰＣは、一時的な膜の歪みを誘導することが既知であり（Ｋｏｇｕｒｅら、２００３）、これは膜の非対称性の喪失およびＰＳの曝露を引き起こす可能性が高い。
【０２８５】
定量化は、３Ｇ４抗体結合の面積がＬＰＣ処理時に５００倍超増加する一方で、対照ｍＩｇＧの結合は検出不能なままであることを示した。類似した結果が以前に得られており、その時には３Ｇ４およびＰＳ結合分子アネキシンＶが、Ｈ２Ｏ２でのＰＳ曝露の誘導後に内皮細胞に結合することが示された（Ｒａｎら、２００５；米国特許第８，４８６，３９１号）。ＬＰＣ処理したＡＢＡＥ細胞は、膜不透過性色素であるヨウ化プロピジウムまたはＤＡＰＩによって染色されず、これは、３Ｇ４が原形質膜の内小葉ではなく細胞膜上のＰＳと結合することを示した。
【０２８６】
３Ｇ４抗体が曝露されたＰＳを有する細胞に結合するのに、β２ＧＰＩが必要であることを確認するために、１０％のＦＢＳではなく１０％のマウス血清を含有する培地中で生細胞結合アッセイを実行して、ウシβ２ＧＰＩからの干渉を予防した。上記に実証されるように、３Ｇ４抗体は、マウス血清の存在下ではＰＳに結合しない。さらに、３Ｇ４抗体は、免疫ブロットによって１０％のマウス血清中のいかなるタンパク質も検出せず、これは、３Ｇ４がマウスβ２ＧＰＩを認識しないことを示した。
【０２８７】
この研究のために、ヒトキメラ３Ｇ４抗体（ｃｈ３Ｇ４）を使用して、マウス血清中に存在するマウスＩｇＧの検出によって引き起こされるバックグラウンドを予防した。ＡＢＡＥ細胞を、１０％のマウス血清およびＬＰＣの存在下でｃｈ３Ｇ４と共にインキュベートした場合、抗体結合は検出されなかった（図５）。対照的に、結合反応への精製ｈβ２ＧＰＩの添加はｃｈ３Ｇ４の広範な結合を支持し（図５）、これは、ｃｈ３Ｇ４抗体結合がｈβ２ＧＰＩに依存することを実証した。全ての状況において、ｃｈ３Ｇ４結合はＬＰＣ処理に依存し、無関係な特異性の対照ヒトＩｇＧを使用した場合、結合は検出されなかった。
【０２８８】
興味深いことに、ＡＢＡＥ細胞を１０％のマウス血清およびＬＰＣの存在下でｈβ２ＧＰＩと共にインキュベートし、徹底的に洗浄し、その後ｃｈ３Ｇ４抗体と共にインキュベートして、ｈβ２ＧＰＩの結合を検出した場合、非常に少ないｃｈ３Ｇ４結合が検出された（図５）。この発見は、ｈβ２ＧＰＩがｃｈ３Ｇ４抗体の不在下では曝露されたＰＳを有する細胞に結合しないことを示し、これは、β２ＧＰＩが生理学的条件下でＰＳ膜表面に対して低い親和性を有するという報告と一貫している（Ｗｉｌｌｅｍｓら、１９９６；Ｂｅｖｅｒｓら、２００４；Ｂｅｖｅｒｓら、２００５）。まとめると、これらのデータは、曝露されたＰＳを有するＡＢＡＥ細胞に結合するには、ｃｈ３Ｇ４抗体およびｈβ２ＧＰＩが同時に存在しなければならないことを示し、これは、ｃｈ３Ｇ４抗体がＰＳに対するβ２ＧＰＩの親和性を増強することを示唆する。
【０２８９】
６．β２ＧＰＩの脂質結合領域が、３Ｇ４の共結合に必要とされる
β２ＧＰＩの脂質結合領域が、曝露されたＰＳを有する細胞へのβ２ＧＰＩならびに３Ｇ４抗体およびｃｈ３Ｇ４抗体の共結合に必要であることを確認するために、「ニック入り」ｈβ２ＧＰＩを使用して生細胞結合アッセイを実行した。ニック入りｈβ２ＧＰＩは、ドメインＶの脂質結合領域内のプラスミン媒介切断のために、ＰＳに結合することができない（Ｈｕｎｔら、１９９３；Ｈｕｎｔ＆Ｋｒｉｌｉｓ、１９９４）。
【０２９０】
ＬＰＣの不在下でＡＢＡＥ細胞をｃｈ３Ｇ４抗体およびｈβ２ＧＰＩまたはニック入りｈβ２ＧＰＩと共にインキュベートした場合、ｃｈ３Ｇ４結合は検出されない（図６Ａ）。ＬＰＣの存在下では、ｈβ２ＧＰＩは曝露されたＰＳを有するＡＢＡＥ細胞へのｃｈ３Ｇ４の結合を媒介することができるが、ニック入りｈβ２ＧＰＩは結合を媒介することができない（図６Ａ）。等量のタンパク質がマイクロタイタープレート上にコーティングされている場合には、ｃｈ３Ｇ４はニック入りｈβ２ＧＰＩおよびｈβ２ＧＰＩに結合するため、生細胞アッセイにおける結合の欠如は、ｃｈ３Ｇ４抗体がニック入りｈβ２ＧＰＩに結合できないことによるものではない（図６Ｂ）。これらの発見は、ｃｈ３Ｇ４／ｈβ２ＧＰＩ複合体が、ｈβ２ＧＰＩドメインＶの脂質結合領域を通してＡＢＡＥ細胞上に曝露されたＰＳを検出することを実証する。
【０２９１】
７．抗体二価性が、β２ＧＰＩの共結合に必要とされる
上記に提示されたデータは、３Ｇ４抗体が、アニオン性リン脂質に対するβ２ＧＰＩの結合活性を増強することによってＰＳを検出することを示唆する。曝露されたＰＳを有する細胞への３Ｇ４／β２ＧＰＩの結合に、二価性が必要とされるかどうかを決定するために、３Ｇ４  Ｆ（ａｂ’）２および３Ｇ４  Ｆａｂ’モノマーを生成し、インタクトな３Ｇ４抗体による生細胞結合アッセイに使用した。予想通り、インタクトな３Ｇ４抗体は、ＬＰＣ処理したＡＢＡＥ細胞に結合したが、未処理の細胞には結合しなかった。等濃度の３Ｇ４  Ｆ（ａｂ’）２もまた、ＬＰＣ処理したＡＢＡＥ細胞に結合した（図７Ａ）が、３Ｇ４  Ｆａｂ’の結合は無視できるものであった（図７Ａ）。３Ｇ４と比較して、３Ｇ４  Ｆ（ａｂ’）２の結合の明らかな減少が検出されたが、これは、３Ｇ４  Ｆ（ａｂ’）２上に欠損しているＦｃエピトープに対するポリクローナル二次抗体の結合の喪失によるものである可能性が高い。マイクロタイタープレート上にコーティングされたβ２ＧＰＩに結合するのに必要とされる濃度よりも１，０００倍高い２μＭの濃度ですら、３Ｇ４  Ｆａｂ’の結合はＡＢＡＥ細胞上では検出できなかった。
【０２９２】
さらに、３Ｇ４  Ｆａｂ’は濃度に依存した様式でＬＰＣ処理したＡＢＡＥ細胞へのｃｈ３Ｇ４／β２ＧＰＩの結合を阻害したが（図７Ｂ）、無関係な特異性の対照Ｆａｂ’は阻害しなかった。３Ｇ４  Ｆａｂ’がｃｈ３Ｇ４結合を阻害する能力は、３Ｇ４  Ｆａｂ’がβ２ＧＰＩに結合することができること、およびモノマー３Ｇ４  Ｆａｂ’／β２ＧＰＩ複合体が曝露されたＰＳを有する細胞に結合することができないことを確認する。これらのデータは、二価の３Ｇ４／β２ＧＰＩ複合体が、細胞表面上に曝露されたＰＳに結合するのに必要とされることを示す。
【０２９３】
要約すると、図４に示されるように、３Ｇ４抗体はドメインＩＩでβ２ＧＰＩに結合し、図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、β２ＧＰＩドメインＶの脂質結合領域が、細胞上に曝露されたＰＳへの３Ｇ４（およびｃｈ３Ｇ４）ならびにβ２ＧＰＩの共結合に必要とされる。加えて、図７Ａおよび図７Ｂに実証されるように、抗体二価性が、曝露されたＰＳへの３Ｇ４（およびｃｈ３Ｇ４）ならびにβ２ＧＰＩのそのような共結合に必要とされる。したがって、活性化内皮細胞、腫瘍血管内皮細胞および腫瘍細胞、ならびにウイルス感染細胞で生じるものなどの、膜の外面上に曝露されたＰＳへの抗体およびβ２ＧＰＩの共結合のモデルを提示する（図８）。
【０２９４】
実施例Ｖ
バビツキシマブとβ２ＧＰＩとの間の相互作用の前臨床モデリング
本実施例は、バビツキシマブファミリーの抗体β２ＧＰＩとＰＳ間との相互作用に関する前臨床データを提供する。全体として、データは、ヒト集団における典型的な量を著しく下回る比較的低レベルのβ２ＧＰＩが、ＰＳへのバビツキシマブの有効な結合に十分であることを示している。
【０２９５】
Ａ．低β２ＧＰＩはマウスにおける抗腫瘍効果を支持する
マウス３Ｇ４抗体の初期の開発では、標準的なタンパク質Ａ手順を使用して、培養雑種細胞の上清から抗体を見た目が均質になるまで精製した（実施例Ｉ）。マウスにおける初期の研究において、この精製抗体は、いくつかのモデルにおいて抗腫瘍効果を発揮することが示された（実施例ＩＩ）。
【０２９６】
３Ｇ４抗体がＰＳ結合にβ２ＧＰＩを必要とすること（実施例ＩＶ）、およびマウスを除いて全ての種のβ２ＧＰＩがＰＳ結合を支持すること（図２Ｂ）を決定した後、実施例ＩＩの抗腫瘍効果が３Ｇ４抗体の効力の過小評価であると推論した。すなわち、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄにおける３Ｇ４抗体の抗腫瘍効果は、タンパク質Ａカラムを通して３Ｇ４抗体と共精製された可能性がある低レベルのウシβ２ＧＰＩによってのみ支持される。基本的に、送達されるタンパク質の大部分は純粋な３Ｇ４抗体であったが、低レベルのウシβ２ＧＰＩがマウスに同時投与されたはずである（雑種細胞の培養に使用された１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）に由来）。したがって、これらの初期データは、３Ｇ４抗体がインビボで腫瘍成長を阻害するには、高レベルのβ２ＧＰＩが必要ではないことを示唆している。
【０２９７】
ＩｇＧに対する親和性に基づいて抗体を精製するタンパク質Ａカラムを使用して、３Ｇ４抗体を見た目が均質になるまで精製した。培養培地由来のβ２ＧＰＩが、精製中に３Ｇ４抗体から分離した更なる理由が存在する。第一に、３Ｇ４抗体に対するβ２ＧＰＩの親和性は低い（かつタンパク質Ａと３Ｇ４との間の親和性よりも小さい）ため、β２ＧＰＩは充填および洗浄の間に３Ｇ４から分離した可能性がある。第二に、（タンパク質Ａから３Ｇ４抗体を分離するための）低ｐＨ溶出ステップは、３Ｇ４に複合体化したβ２ＧＰＩを除去した可能性がある。また、主要抗体ピークにおける溶出したタンパク質の収集時に、より小さいβ２ＧＰＩタンパク質が収集されなかった可能性がある。それにも関わらず、図９Ａおよび図９Ｂに示されるように、マウスに送達された見かけ上純粋な３Ｇ４抗体のうちの１０〜２０％が、実際には３Ｇ４−β２ＧＰＩ複合体の形態にあったという仮説的な立場を取ったとしても、そのようなレベルのウシβ２ＧＰＩは、絶対的にも抗体との比較でも、依然として非常に低い。
【０２９８】
より詳細には、３Ｇ４抗体を１０％のＦＢＳ中の雑種細胞から産生した。１リットル体積は、典型的には１０ｍｇ／Ｌの３Ｇ４抗体を産生するだろう。ＦＢＳが２００μｇ／ｍｌのウシβ２ＧＰＩ（ヒト血清中のヒトβ２ＧＰＩのレベルと同様）を含有すると仮定すると、１０％のＦＢＳは２０μｇ／ｍｌのウシβ２ＧＰＩを含む。収集時に、１リットルの雑種細胞上清は、１０ｍｇの３Ｇ４抗体および最大２０ｍｇのウシβ２ＧＰＩ（２０μｇ／ｍｌ×１０００＝２０ｍｇ）を含有するだろう。タンパク質Ａでの精製時、得られた材料は１０ｍｇのタンパク質を含有するだろう。３Ｇ４純度を８０〜９０％と仮定すると、残りの１０〜２０％は３Ｇ４：β２ＧＰＩ「複合体」であり、ここで１つの抗体は２つのβ２ＧＰＩに結合している（３Ｇ４−２×β２ＧＰＩ）。
【０２９９】
マウスにそのようなタンパク質を１００μｇ投与した。９０％の純度では、投与された１００μｇのタンパク質のうち９０μｇが純粋な３Ｇ４であり、１０μｇの３Ｇ４−２×β２ＧＰＩ複合体を有する。抗体の分子量（ＭＷ）を１４５ｋＤとし、β２ＧＰＩのＭＷを５０ｋＤとすると（実施例ＩＶ、Ａ４、Ｂ３；ＭｃＮｅｉｌら、１９９０；Ｌｕｓｔｅｒら、２００６）、複合体中の各抗体について２つのβ２ＧＰＩでは、重量比は約３：２である（正確には５９．２％の抗体および４０．８％の抗体）。したがって、１０μｇの複合体のうち、約６μｇが３Ｇ４であり、４μｇがβ２ＧＰＩである（正確には５．９２μｇの３Ｇ４、４．０８μｇがβ２ＧＰＩである）。
【０３００】
マウスの血液の体積は、２ｍｌである。純粋な３Ｇ４抗体は、マウス１匹当たり９０μｇ、または４５μｇ／ｍｌで存在する。約３：２の比で、マウス１匹当たり１０μｇの複合体は、約６μｇの３Ｇ４および約４μｇのβ２ＧＰＩ（３μｇ／ｍｌの３Ｇ４および２μｇ／ｍｌのβ２ＧＰＩ）を含有する。抗体結合が可能な２μｇ／ｍｌのβ２ＧＰＩでは、これはヒト血清中の平均β２ＧＰＩレベルの約１％であり、依然として抗腫瘍活性を支持した（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄ）。
【０３０１】
マウスにおける２μｇ／ｍｌのβ２ＧＰＩは、０．０４μＭに相当する。３Ｇ４に関しては、投与された３Ｇ４−２×β２ＧＰＩ複合体由来の３μｇ／ｍｌの３Ｇ４を４５μｇ／ｍｌの純粋な３Ｇ４に添加し、４８μｇ／ｍｌの３Ｇ４抗体が存在する。これは、０．３３μＭの抗体に相当する。９０％の純度の出発点で、０．０４μＭのβ２ＧＰＩおよび０．３３μＭの３Ｇ４抗体では、これは０．１２のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比である（図９Ａ）。８０％の純度の出発点でさえ、同じ計算は、β２ＧＰＩのインビボ濃度が４μｇ／ｍｌ（０．０８μＭ）であることを示し、インビボ抗体濃度は４６μｇ／ｍｌ（０．３２μＭ）である。これは、依然としてわずか０．２５のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比である（図９Ｂ）。抗体調製物の高感度ウエスタンブロット（その後ゲル上のβ２ＧＰＩバンドを特定することができる）を含む後続研究は、３Ｇ４抗体が常に少なくとも８０〜９０％の純度であることを確認した。したがって、０．１２〜０．２５のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比のこれらの計算は、３Ｇ４抗体を使用する初期のマウスデータが高レベルのβ２ＧＰＩが抗腫瘍活性には必要ないことを示すという当初の説明に定量的視点を加える。
【０３０２】
Ｂ．低β２ＧＰＩは細胞結合を支持する
細胞上のＰＳへの３Ｇ４−β２ＧＰＩ複合体の結合に必要とされるβ２ＧＰＩレベルを分析するための第１の研究において、ＡＢＡＥ細胞をＬＰＣで処理して、ＰＳ曝露を誘導し（実施例ＩＶ）、その後４０ｎＭの精製ヒトβ２ＧＰＩおよび様々な濃度のｃｈ３Ｇ４抗体（バビツキシマブ）と共にインキュベートした。相対ｃｈ３Ｇ４結合は、３２０ｐＭから８０ｎＭのｃｈ３Ｇ４の見かけ上のピークまで濃度に依存した様式で増加し、これは２：１の抗体対β２ＧＰＩ比である（図１０）。表１に示されるように（抗体のＭＷ、１４５ｋＤ；ヒトβ２ＧＰＩのＭＷ、５０ｋＤ）、この研究における見かけ上のピーク結合は、０．５のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比に対応する。
【表３】
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【０３０３】
ｃｈ３Ｇ４の濃度と曝露されたＰＳを有する細胞への結合との間の釣鐘形の関係（図１０）は、膜表面上の二価のｃｈ３Ｇ４２×β２ＧＰＩ複合体の形成をさらに支持し、一価のｃｈ３Ｇ４−β２ＧＰＩ複合体が非常に高い抗体濃度で形成されることを示唆する。そのような濃度では、一価（非結合）複合体と二価（結合）複合体との間の競合が、細胞に結合したｃｈ３Ｇ４２×β２ＧＰＩ複合体の量の減少を引き起こした（「フック効果」としても知られる）と考えられる。
【０３０４】
この研究における最大の相対結合は、８０ｎＭの抗体濃度で生じ、これはわずか０．５のβ２ＧＰＩ対抗体比である（図１０、表１）。これは、図８に示される二価相互作用の予測よりも低い比であるが、雑種細胞から精製された３Ｇ４抗体によるマウスの治療について上記に報告された比と一般に一致する。しかしながら、この研究において、細胞上のＰＳの正確な密度は既知ではない。より重要なことに、試験したｃｈ３Ｇ４濃度において、飽和結合（プラトー）は観察されず、２０〜８０ｎＭおよび８０〜３２０ｎＭのｃｈ３Ｇ４濃度での更なる試験が有益であるだろう。それでもなお、そのような中間試験がなくても、０．１２５、０．５、および２の間のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比で、最適な抗体結合が生じると結論付けることができる。これらのインビトロ数は、β２ＧＰＩ対抗体のモル比が抗体純度に応じて０．１２〜０．２５であった、雑種細胞精製３Ｇ４抗体を使用するインビボ治療について上記に報告したものと良好に一致する。したがって、この第１のインビトロ研究はまた、低レベルのβ２ＧＰＩが、曝露されたＰＳを有する細胞へのバビツキシマブの結合を効果的に支持することも示す。
【０３０５】
低β２ＧＰＩはＰＳ結合を支持する
以後の研究において、ＰＳへの２ａＧ４抗体の結合（実施例ＩＩＩ）を、様々な濃度のヒトβ２ＧＰＩの存在下でＥＬＩＳＡにおいて試験した。
【０３０６】
一定量の２ａＧ４抗体および増加量のヒトβ２ＧＰＩを含有する溶液を調製した。簡潔には、６２．５ｎｇ／ｍｌ（０．４ｎＭ）の２ａＧ４を、卵白アルブミンの０．００３２、０．０１６、０．０８、０．４、２、１０、または５０ｎＭのヒトβ２ＧＰＩに添加した。異なる２ａＧ４−β２ＧＰＩ混合物をＰＳマイクロタイタープレートに添加し、分子を３７℃で１〜２時間結合させた。未結合分子は、ＰＢＳで洗浄することによって除去した。二次抗体は、結合緩衝液中のＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧであった。プレートを３７℃で１時間放置してから、ＰＢＳで５回洗浄することによって未結合抗体を除去した。ＴＭＢ基質を１００μｌの体積で各ウェルに添加し、室温で１５分間放置して、比色反応を生じさせた。１００μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって、反応を停止させた。停止溶液を添加してから３０分以内に、吸光度（光学密度、ＯＤ）を４５０ｎｍの波長でプレート分光計によって読み取り、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した（β２ＧＰＩを有しない対照の平均ＯＤを、試験試料の平均ＯＤから減算することを含む）。
【０３０７】
この研究は、ＰＳへの２ａＧ４抗体の結合が、約１のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比でプラトーになり始め、ここでは両方の分子が約０．４ｎＭで存在することを示した（図１１）。より正確には、表２に示されるように（抗体のＭＷ、１４５ｋＤ；ヒトβ２ＧＰＩのＭＷ、５０ｋＤ）、０．９３のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比は、ＰＳでコーティングされたプレートへの抗体結合を支持するのに有効である。
【表４】
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【０３０８】
上記の第１のインビトロ研究の観察を延長し、この研究は、ＰＳへの抗体結合が、低いβ２ＧＰＩ対抗体のモル比で既に飽和に到達し、その後プラトーに到達することを示した（５０ｎＭのβ２ＧＰＩ  でＰＳ結合のわずかな喪失が観察され（図１１）、これはＥＬＩＳＡアッセイ形式において一般的に検出される典型的な飽和効果に関連する可能性が高い）。本研究では、β２ＧＰＩ対抗体の有効モル比は、約１（０．９３）であった。β２ＧＰＩ対抗体の比を５超に増加させても、結合の改善はもたらされなかった（図１１、表２）。
【０３０９】
卵白アルブミン中、様々な濃度のヒトβ２ＧＰＩの存在下で、ＥＬＩＳＡにおいてバビツキシマブのＰＳへの結合を試験する一連の関連研究を実行した。バビツキシマブ滴定およびβ２ＧＰＩ滴定の両方を実行した。これらの研究もまた、０．５μｇ／ｍｌまでの濃度を含む低レベルのβ２ＧＰＩが、ＰＳでコーティングされたプレートに結合する上での様々な抗体濃度を支持するのに有効であることを示した。
【０３１０】
Ｄ．希釈ヒト血清中での抗体結合および活性
別の一連の研究を実行して、様々な希釈度のヒト血清中でのＰＳに対するバビツキシマブの結合および機能を試験した。これらには、ＥＬＩＳＡにおけるＰＳへの結合、ＰＳ陽性細胞を使用するＦＡＣＳ分析、およびＮＦＡＴ代替ＡＤＣＣバイオアッセイの形式の機能アッセイが含まれた。
【０３１１】
１．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを実行して、様々なパーセンテージの６つの異なる個々のヒト血清試料中でのＰＳへのバビツキシマブの結合を試験した。異なるヒト血清（ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａより）をＰＢＳ中に希釈して、０．１％までの様々な範囲の％のヒト血清を調製した。２μｇ／ｍｌのバビツキシマブ−ＨＲＰ（実施例ＸＶＩ、Ａ３）を、各％のヒト血清溶液に添加した。異なるバビツキシマブ−ＨＲＰ混合物をＰＳマイクロタイタープレートに添加し、３７℃で１〜２時間結合させた。プレートをＰＢＳで洗浄した。ＴＭＢ基質を１００μｌの体積で各ウェルに添加し、室温で１５分間放置して、比色反応を生じさせた。１００μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって、反応を停止させた。停止溶液を添加してから３０分以内に、吸光度を４５０ｎｍの波長でプレート分光計によって読み取り、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した。
【０３１２】
２．ＦＡＣＳ
ＰＳ陽性細胞（エトポシド処理したＨＴ１０８０細胞）へのバビツキシマブの結合を、ウシβ２ＧＰＩの供給源として異なるパーセンテージのＦＢＳを使用して試験し、フローサイトメトリーとしても知られる蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定した。
【０３１３】
ＰＢＳ溶液中の異なるパーセンテージのＦＢＳを作製し、１０μｇ／ｍｌのバビツキシマブを各溶液に添加した。細胞表面へのＰＳ曝露を誘導するために、ＨＴ１０８０細胞を５０μＭのエトポシドで１８時間処理した。その後、細胞を異なるバビツキシマブのパーセンテージのＦＢＳ溶液と共にインキュベートし、続いてバビツキシマブに対する二次抗体と共にインキュベートして、フローサイトメトリーを介して細胞に結合した抗体を可視化した。陰性対照には、ＰＳを表面上に曝露させないエトポシドで処理していない細胞、およびＦＢＳを欠如するＰＢＳ溶液が含まれた。
【０３１４】
３．ＮＦＡＴ
活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）は、免疫応答において重要であることが示されている転写因子のファミリーに適用される一般名である。ＮＦＡＴシグナル伝達経路およびＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ−ＲＥ）が、培養細胞内のＮＦＡＴシグナル伝達経路を監視するためのアッセイおよび市販のキットの開発に使用されてきた。
【０３１５】
バビツキシマブ抗体ファミリーと共に使用するためのＮＦＡＴバイオアッセイが、開発されている（Ｌａｒｓｏｎら、２０１３）。細胞表面上にＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８受容体を発現するように操作されたジャーカット細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）もまた、複数のＮＦＡＴ−ＲＥを含有する最小のＴＡＴＡプロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有する遺伝要素でトランスフェクトされていた。これらは、ＰＳ陽性標的細胞と共培養されるＮＦＡＴエフェクター細胞である。バビツキシマブなどのＰＳ標的化抗体は、標的細胞の表面上のＰＳに結合する。その後、ＰＳ標的化抗体のＦｃ領域は、ＮＦＡＴエフェクター細胞上のＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８受容体に結合し、ＮＦＡＴ経路を通したシグナル伝達が引き起こされる。ＮＦＡＴはＮＦＡＴ−ＲＥに結合し、定量化できるルシフェラーゼ発現を活性化する。したがって、このＮＦＡＴアッセイは、バビツキシマブおよび他のＰＳ標的化抗体の代替ＡＤＣＣバイオアッセイである。
【０３１６】
４．結果
上記のＥＬＩＳＡアッセイの例示的な結果を図１２に提示し、これもまた、低レベルのβ２ＧＰＩを有する希釈ヒト血清が抗体結合を効果的に支持することを示す。精製β２ＧＰＩを使用する上記ＰＳ  ＥＬＩＳＡ（図１１）と同様に、５０％および１００％のヒト血清でＰＳ結合のいくらかの喪失が存在し、これは、特に未希釈の血清を使用する場合に、ＥＬＩＳＡアッセイ形式において一般的に検出される典型的な飽和効果に関連する。そのような効果はＦＡＣＳアッセイでは観察されず、曝露されたＰＳを有する細胞へのバビツキシマブの結合は、５０％、７５％、および１００％のウシ胎児血清中で本質的に同じであることが示された。
【０３１７】
図１２から、ＥＬＩＳＡにおけるＰＳへのバビツキシマブの結合は、約１％のヒト血清でプラトーになり始めたことが理解され得る。正常なヒト血清は、平均して２００μｇ／ｍｌのβ２ＧＰＩを含有する（Ｓｔｅｉｎｋａｓｓｅｒｅｒら、１９９１；Ｍｅｈｄｉら、１９９９；Ｍｉｙａｋｉｓら、２００４）ため、１％のヒト血清は、約２μｇ／ｍｌまたは０．０４μＭのβ２ＧＰＩを含有する。図１２は、ＰＳへのバビツキシマブの結合が、この濃度のβ２ＧＰＩで既に飽和状態にあることを示す。表３に示されるように（抗体のＭＷ、１４５ｋＤ；β２ＧＰＩのＭＷ、５０ｋＤ）、ＥＬＩＳＡにおける１％のヒト血清は、２．８６のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比に対応する。これは一般に、細胞表面上でＰＳと安定した複合体を形成するために、バビツキシマブの各分子が、β２ＧＰＩの２つの分子に結合する必要があるという理論的根拠と一致する（図８）。
【表５】
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【０３１８】
図１２に示されるように、０．５％のヒト血清でさえ、ＰＳへのバビツキシマブの結合は特に血清試料１３番についてプラトーに接近しており、これは１．４３のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比に対応する（表３）。ＮＦＡＴ代替ＡＤＣＣバイオアッセイの結果はまた、この一般的な範囲内のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比が、バビツキシマブ機能を支持するのに効果的であることも示した。例えば、この研究は、バビツキシマブ活性の最適比を特定するようには設計されていないが、１．９の（ウシ）β２ＧＰＩ対抗体のモル比は、ＮＦＡＴアッセイにおいてバビツキシマブ活性を効果的に支持することが示された。
【０３１９】
要約すると、本実施例は、０．１２〜２．８６ほど低いβ２ＧＰＩ対抗体のモル比が、ＰＳおよびＰＳ陽性細胞への抗体結合を支持し、機能アッセイにおける活性を促進し、マウスの腫瘍の効果的な治療を可能にすることを示す。上記の全てのデータを考慮し、予防的アプローチを採ると、バビツキシマブの結合および機能を最大化するためには、β２ＧＰＩ対抗体のモル比は約２．８６であるべきだが（表３）、それは約３より高い必要はないことが推定された。
【０３２０】
実施例ＶＩ
臨床研究におけるバビツキシマブの薬物動態
この実施例は、ＰＳがマーカーである疾患、特に癌およびウイルス感染症を有するヒト対象に投与したときのバビツキシマブの薬物動態に関する。臨床経験は、上記のように、前臨床モデリングと一致することが示されている。
【０３２１】
Ａ．初期第Ｉ相研究
第Ｉ相多施設非盲検用量漸増研究を実行して、難治性進行性固形腫瘍を有する２６人の患者に静脈内投与（バビツキシマブ単独療法）した場合のバビツキシマブの安全性、耐容性、および薬物動態（ＰＫ）を評価した。２つの投薬スケジュールで、４つの連続的な用量漸増コホート（毎週０．１、０．３、１、または３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ）に患者を登録した。０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのコホートでは、患者は０、２８、３５、および４２日目にバビツキシマブを受け、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのコホートでは、０、７、１４、および２１日目に患者にバビツキシマブを投与した。
【０３２２】
前臨床モデル（実施例Ｖ）および他の患者集団における経験に基づいて、１週間に３ｍｇ／ｋｇの上限用量を選択した。実施例ＩＩの研究に続く広範な動物モデル研究において、１週間に３回の０．５ｍｇ／ｋｇの抗体用量で最大有効性が達成され、治療の過程を通じて、４８時間の半減期および２μｇ／ｍｌの模擬平均血液濃度で５．５μｇ／ｍｌのＣｍａｘがもたらされた。そのような用量を超えると、ＰＳ陽性細胞へのバビツキシマブの結合がインビトロで飽和する濃度の観察に基づいて、バビツキシマブによるＰＳ結合は飽和することが推定された（実施例Ｖ）。
【０３２３】
研究前、０、１、２、４、７、１０、１４日目、および２１〜７０日目までの７日毎に、０．１および０．３ｍｇ／ｋｇの用量コホートの患者から試料を収集した。研究前、０、１、２、４、７、１４、２１、２２、２３、２５日目、および２８〜５６日目までの７日毎に、１および３ｍｇ／ｋｇの用量コホートの患者から、試料を収集した。バビツキシマブ血中レベルを、有効なＥＬＩＳＡによって決定した。
【０３２４】
表４は、最大濃度（Ｃｍａｘ）、クリアランス（ＣＬ）、半減期（ｔ１／２）、およびゼロから無限までの血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ）を含む、この第Ｉ相試験における単回投与（０日目）および複数回投与（２１日目）後のバビツキシマブの平均（変動係数、ＣＶ）ＰＫパラメータの要約を提示する。
【表６】
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【０３２５】
表４に示されるように、単回投与後、バビツキシマブの平均半減期は３７．２〜４３．９時間の範囲であることが決定された。０日目に、最大血清濃度（Ｔｍａｘ）に到達したときの投与後の時間の中央値で、平均最大血清濃度（Ｃｍａｘ）は、２．１１〜５６．４μｇ／ｍｌ（用量依存）の範囲であった（値は２．０４〜３．７３時間の範囲）。３ｍｇ／ｋｇで投与したバビツキシマブでは、最大血清濃度は５６．４μｇ／ｍｌであった。研究全体では、バビツキシマブ半減期は３７〜４７時間の範囲であった。この研究では、最大許容用量には到達しなかった。
【０３２６】
バビツキシマブは、直線的な単回用量（０日目）および複数回用量（２１または４２日目）のＰＫ特徴を呈した（図１３）。バビツキシマブは、複数回用量投与後に明らかな蓄積または時間依存的なＰＫの差は呈さなかった。要約すると、この研究は、バビツキシマブが１週間に最大３ｍｇ／ｋｇまでの範囲の用量で良好に許容され、薬物動態が毎週の投薬レジメンを支持することを示した。特に、１ｍｇ／ｋｇの用量では、バビツキシマブ濃度は６日間、前臨床モデルに基づいて予測される治療閾値である２μｇ／ｍｌを超えたままであり、３ｍｇ／ｋｇの用量では、バビツキシマブ濃度は７日間、この２μｇ／ｍｌを超えたままであることが決定された（図１３）。したがって、１週間に３ｍｇ／ｋｇの用量を腫瘍学における将来の使用のために選択した。
【０３２７】
Ｂ．更なる薬物動態学的研究
上記の第Ｉ相試験に加えて、ここでは、単回投与、１週間１回または１週間に２回の注入（６０〜９０分間）として投与されるバビツキシマブのＰＫを、癌またはウイルス感染症を有する患者におけるいくつかの他の臨床研究にわたって、１２０人超の患者で評価した。バビツキシマブは、０．１〜６ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で直線的な単回用量および複数回用量のＰＫ特徴を呈することが確認され、バビツキシマブの明らかな蓄積または時間依存的なＰＫの差の証拠はなかった。中央値Ｔｍａｘは、注入終了後の最初の２〜３時間以内に生じることが示された。血清バビツキシマブ濃度は、見かけ上、単一指数関数的または双指数関数的な一次様式で低下する。観察された場合、より急速な分布相は本質的に６時間以内に完了し、最終排出半減期は約１〜２日（２１．９〜４６．８時間）である。
【０３２８】
１．ウイルス感染症におけるＰＫ
バビツキシマブのＰＫ特徴は、ＨＩＶの有無に関わらず、ＨＣＶに慢性的に感染した患者において試験されたように、癌および慢性ウイルス感染症を有する患者において一般に類似している。
【０３２９】
第Ｉ相非盲検単一施設用量漸増研究は、ＨＣＶに慢性的に感染した患者におけるバビツキシマブの単回静脈内注入を評価した（実施例ＶＩＩ、Ａ）。表５に示されるように、観察されたバビツキシマブ濃度は、ＰＫモデリングデータの予測値と非常に一貫していることが見出された。
【表７】
2019537619.tif 000011
【０３３０】
慢性ＨＣＶ患者における対応する第Ｉｂ相多施設非盲検非無作為化漸増反復用量研究において、ＰＫデータの分析は、全ての用量レベルにおいて、０日目に直線的な単回用量ＰＫ特徴を、および１０日目に直線的な複数回用量特徴を示し、２週間の投薬後、バビツキシマブの蓄積または時間依存的なＰＫの差の証拠はなかった。
【０３３１】
慢性ＨＣＶおよびＨＩＶに同時感染した患者における第Ｉｂ相研究（実施例ＶＩＩ、Ｃ）において、バビツキシマブは、０．３〜６ｍｇ／ｋｇの範囲の用量での１週間に１回の投与後、０日目に直線的な単回用量ＰＫ特徴を、および４９日目に直線的な複数回用量ＰＫ特徴を呈した。バビツキシマブは、８週間にわたる１週間に１回の複数回投与後、時間依存的なＰＫの差または蓄積は呈さなかった。
【０３３２】
２．併用療法におけるＰＫ
重要なことに、バビツキシマブおよび他の薬物（特に化学療法剤）を併用して投与した場合、いずれの薬物にも臨床的に関連する薬物動態学的相互作用は見られなかった。これには、バビツキシマブおよびドセタキセルを併用して投与した場合も含まれる。
【０３３３】
これに関して、第Ｉｂ相多施設非盲検非無作為化研究はまず、難治性進行性固形腫瘍を有する患者において、ゲムシタビン、パクリタキセル＋カルボプラチン、またはドセタキセルと併用した場合の３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブの１週間に１回の静脈内投与の安全性、耐容性、およびＰＫを評価した。単回用量（０日目）または複数回用量のバビツキシマブ投与（２１日目）後に、３つの治療群間のいかなる測定可能なパラメータにも有意差は存在しないことが決定された。ＣｍａｘおよびＡＵＣの評価は、８週間にわたって１週間に１回の複数回用量投与後に、バビツキシマブの蓄積がないことを示した。
【０３３４】
治療歴を有する局所進行性または転移性の非扁平上皮ＮＳＣＬＣ患者においてバビツキシマブ＋ドセタキセルを評価する、第ＩＩ相無作為化二重盲検プラセボ対照研究（実施例ＸＩＩＩ）において、全研究集団のサブセット（１群当たり６人の患者）はまた、バビツキシマブとドセタキセルとの間の薬物間相互作用を調査するためのＰＫ下位研究にも参加した。周期１および２の指定された時点で、これらの患者に対して追加の採血を実行した。ドセタキセルありのバビツキシマブについて、臨床的に関連する薬物動態学的な薬物間相互作用は観察されなかった。加えて、ドセタキセルは、バビツキシマブの投与の有無に関わらず、類似した薬物動態学的特徴を呈した。したがって、これらの患者において、ドセタキセルありのバビツキシマブについて、臨床的に関連する薬物動態学的な薬物間相互作用は観察されなかった。
【０３３５】
実施例ＶＩＩ
バビツキシマブを使用する、患者におけるウイルス感染症の治療
この例では、リバビリンとの併用でのバビツキシマブを含む、ビツキシマブを使用する、患者におけるウイルス感染症の治療における臨床経験のいくつかを例証するためのデータが提示されている。選択された臨床用量では、バビツキシマブの投与が、ヒト対象のβ２ＧＰＩレベルを認識できるほどには低減させないことを示すためのデータもまた提示されている。
【０３３６】
Ａ．ＨＣＶ患者における第Ｉ相研究
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に慢性的に感染した患者における、第Ｉ相非盲検用量漸増研究および第Ｉｂ相非盲検漸増反復用量研究で、まずバビツキシマブを評価した。これらの研究は、バビツキシマブの安全性、耐容性、ＰＫプロファイル、ウイルス動態、最大許容用量（ＭＴＤ）、および最大有効量（ＭＥＤ）に関するものであった。０．１、０．３、１、３、および６ｍｇ／ｋｇの用量を第Ｉ相（３０人の患者、６人の患者の連続コホート）において投与し、０．３、１、３、および６ｍｇ／ｋｇの用量を第Ｉｂ相（２４人の患者、６人の患者の４つのコホート）において投与した。
【０３３７】
ＨＣＶ患者における第Ｉ相および第Ｉｂ相の研究では、全ての用量レベルのバビツキシマブが良好に許容された。第Ｉ相では、抗ウイルス活性を示唆するウイルス量の一過的な低減が、全ての用量レベルで観察された。第Ｉｂ相では、０．３、１、および６ｍｇ／ｋｇの用量のバビツキシマブによる治療後にウイルス量がわずかに減少し、これらの減少はしばしば一過的なものであったが、各コホートの少なくとも１人の患者において、ウイルス量の持続的な減少があった。特に、３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブの用量では、ＨＣＶの一貫した減少が研究治療および経過観察を通して実証された。
【０３３８】
Ｂ．バビツキシマブはβ２ＧＰＩを枯渇させない
上記の第Ｉｂ相研究はまた、患者におけるβ２ＧＰＩのレベルを測定して、バビツキシマブの投与がこれらのヒト対象におけるβ２ＧＰＩレベルを変化させたかどうかを決定した。結果を図１４に描写する。１ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブを受けている患者において、β２ＧＰＩレベルは実質的に変化がなかった。３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブを受けている患者において、β２ＧＰＩの血清レベルの一過的な低減（２０〜２５％）が観察された。しかしながら、そのような低減は、用量前レベルから統計的に有意には変化していなかった（図１４）。実際に、３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ用量では、β２ＧＰＩレベルは正常範囲内に留まり、２４時間以内に治療前レベルに戻った。対照的に、６ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブを受けている患者において、β２ＧＰＩは有意に低減した（ｐ＜０．０２）（図１４）。６ｍｇ／ｋｇの用量では、β２ＧＰＩレベルは治療前レベルと比較して、ほぼ正常範囲の下限まで４０％低下した。それにも関わらず、６ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブで治療したヒト対象においてさえ、β２ＧＰＩは３日以内にベースラインレベルに回復した。
【０３３９】
したがって、これらのデータは、ヒトにおける使用のための３ｍｇ／ｋｇ用量のバビツキシマブの選択を確認した。この用量は、バビツキシマブおよびβ２ＧＰＩが、血漿β２ＧＰＩレベルを枯渇させることなく、バビツキシマブ−β２ＧＰＩ複合体が形成され、疾患部位の細胞上に曝露されたＰＳに結合するのを可能にするのに有効な濃度で共に存在する、最大用量であることが決定された。しかしながら、このデータはまた、バビツキシマブ治療中のいかなるβ２ＧＰＩの低減も一過的なものに過ぎないこと、およびβ２ＧＰＩレベルが３日以内に回復することも示している。
【０３４０】
Ｃ．ＨＣＶ−ＨＩＶ患者における第Ｉ相研究
別個の第Ｉｂ相多施設非盲検無作為化用量漸増反復用量研究を実行して、慢性ＨＣＶ（ＨＣＶ遺伝子型１の大部分）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に同時感染した患者においてバビツキシマブを評価した。主な目的は、安全性、耐容性、ＰＫプロファイル、ウイルス動態、ＭＴＤ、および／またはＭＥＤを決定することであった。この研究は、約１６週間にわたって１６回の訪問予定を伴った。バビツキシマブを、以下の用量、０．３ｍｇ／ｋｇ（６人の患者）、１ｍｇ／ｋｇ（６人の患者）、３ｍｇ／ｋｇ（９人の患者）、および６ｍｇ／ｋｇ（６人の患者）で患者の連続コホートに投与した。患者は、８週間にわたって毎週静脈内にバビツキシマブを受けた。コホート内の全ての患者が、重篤有害事象（ＳＡＥ）として分類される血栓の事象なく最初の４週間の投薬を完了した後に、用量漸増を進めた。
【０３４１】
ベースラインＨＣＶウイルス量の中央値は６．７６ｌｏｇ１０であり、ＨＩＶのベースライン中央値は３．９９ｌｏｇ１０であった。研究中の特定の時点で、ＨＣＶおよびＨＩＶの血漿ウイルス量を測定した。全ての用量レベルにおいてバビツキシマブで治療した場合、各治療群の何人かの患者は、一過的な抗ウイルス活性を呈した（ベースラインから０．５ｌｏｇ１０以上のＨＣＶおよび／またはＨＩＶウイルス量の最大低減）。
【０３４２】
Ｄ．ＨＣＶ患者における第ＩＩ相研究
第ＩＩ相多施設無作為化活性対照研究を実行して、慢性ＨＣＶ（遺伝子型１）感染症の初期治療のための、リバビリンとの併用でのバビツキシマブを評価した。主要評価項目は、研究１２週目に早期ウイルス学的応答（ＥＶＲ）を示した患者の割合であり、ＥＶＲは、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルの２−ｌｏｇ１０国際単位（ＩＵ）以上の低減と定義された。安全性は、副次的評価項目に含まれた。
【０３４３】
患者は、最長２８日間のスクリーニング／洗い流し期間、その後（１：１：１の比の）ランダム化を受けて、全て１日２回の経口リバビリン１０００ｍｇ（体重７５ｋｇ未満）または１２００ｍｇ（体重７５ｋｇ以上）と共に、１週間に０．３または３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ注入または１２週間のペグ化インターフェロンアルファ−２ａ（ペグ化インターフェロン、ＰＥＧ−ＩＦＮα−２ａとも称される）の皮下注射を受けた。１２週間後にＥＶＲを示した患者は、最大４８週間経過までペグ化インターフェロン＋リバビリンでの研究外治療を受けた。
【０３４４】
平均年齢３９．１歳の合計６６人の患者（男性３８人、女性２８人）をこの研究に登録した。２２人の患者は各々、０．３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ、３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ、およびペグ化インターフェロンを受けた。受けた０．３および３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ用量の中央値は各々１２回の用量であり、平均治療期間はそれぞれ７８および７５日間であった。
【０３４５】
この研究では、バビツキシマブ＋リバビリンで治療した一部の患者で、１２週間にわたって徐々にウイルス低減が見られた。興味深いことに、より高い用量の３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブとは対照的に、より低い用量のバビツキシマブ（０．３ｍｇ／ｋｇ）で治療した患者において、２倍の人数の患者でＥＶＲが見られた。（１８％対９％）。いずれの用量でも、ペグ化インターフェロンを受けた患者ではＥＶＲ率はバビツキシマブを受けた患者よりも高かったが、バビツキシマブはより好ましい安全性プロファイルを示し、いずれのバビツキシマブ含有群と比較しても、ペグ化インターフェロン群のほぼ２倍の患者がＡＥを報告した。
【０３４６】
実施例ＶＩＩＩ
バビツキシマブおよびパクリタキセルによる乳癌患者の治療
臨床癌治療に目を向けると、本実施例は、タキサン、パクリタキセルと併用してバビツキシマブを使用する、ＨＥＲ２陰性転移性乳癌を有する患者の治療からのデータを提供する。
【０３４７】
単一施設研究者主導研究では、１４人のＨＥＲ２陰性転移性乳癌を有する患者が、４週間周期で１、８、および１５日目に投与されるパクリタキセル（８０ｍｇ／ｍ２）との併用で１週間に１回３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブを受けた。骨痛、疲労、頭痛、および好中球減少が、最も一般的な有害事象（ＡＥ）であった。対処可能な注入関連反応が、バビツキシマブに関連する最も一般的なＡＥであった。バビツキシマブは、血栓形成性の増加の証拠は示さなかった。治療は８５％の全奏効率（ＯＲＲ）をもたらし、２人の患者が完全奏効を示し、無増悪生存期間（ＰＦＳ）中央値は７．３ヶ月（９５％のＣＩ：２．８、１０．８）であった。
【０３４８】
要約すると、この研究は、パクリタキセルと併用したバビツキシマブが、転移性乳癌を有する患者の治療に良好に許容され、臨床奏効率（ＲＲ）およびＰＦＳに関して有望な結果が観察されることを示した。
【０３４９】
実施例ＩＸ
バビツキシマブおよびパクリタキセル−カルボプラチンによる乳癌患者の治療
この例は、ホルモンまたはＨＥＲ２の状態に制限されない、局所進行性または転移性乳癌を有する患者における、バビツキシマブ＋パクリタキセルおよびカルボプラチンの安全性および有効性を評価する、第ＩＩ相非盲検単一群研究の結果を報告する。
【０３５０】
この第ＩＩ相研究は、Ｓｉｍｏｎの２段階設計を利用した。１５人の患者を段階Ａに登録し、試験を段階Ｂにおいてさらに３１人の患者に拡大し、合計４６人の患者とした。主な目的は、完全奏効（ＣＲ）＋部分奏効（ＰＲ）、つまりＣＲ＋ＰＲとして定義される全奏効率（ＯＲＲ）を決定することであった。副次的目的には、腫瘍進行までの時間、奏効期間（ＤＯＲまたはＤＲ）、全生存期間（ＯＳ）、および安全性が含まれた。
【０３５１】
最大６周期まで、２８日間周期の１、８、および、１５日目にカルボプラチン（ＡＵＣ＝２の用量）およびパクリタキセル１００ｍｇ／ｍ２と併用して、疾患進行まで１週間に１回バビツキシマブ（３ｍｇ／ｋｇ）を与えた。４６人の患者のうち１６人（３４．８％）が、治療未経験者であった。
【０３５２】
最も一般的なグレード４の治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）は、好中球減少（１２人の患者、２６．１％）であり、これはこの研究で使用される化学療法で治療した患者において予想される発生率である。最も一般的なグレード３  のＴＥＡＥは、白血球減少（１１人の患者、２３．９％）、好中球減少（９人の患者、１９．６％）、および貧血（５人の患者、１０．９％）であった。これらもまた、この研究で使用される化学療法で治療した患者において予想される発生率である。
【０３５３】
固形腫瘍効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）に従う客観的奏効は、４６人中３４人の患者（７３．９％）において生じ、４６人中５人の患者（１０．９％）はＣＲが有し、２９人の患者（６３．０％）がＰＲを有した。平均奏効期間（ＤＯＲ）は３．７ヶ月（９５％の信頼区間  ［ＣＩ］：３．１、５．８）であり、ＰＦＳ中央値は６．９ヶ月（９５％のＣＩ：５．６、７．７）であった。研究終了時に、ＯＳ中央値は２３．２ヶ月であることが決定された（９５のＣＩ：「決定せず」まで５５３日）。これらの結果は、特に併用療法において、現在進行中のバビツキシマブの開発にとって非常に有望である。
【０３５４】
実施例Ｘ
バビツキシマブおよびドセタキセルによる乳癌患者の治療
本実施例は、今度は局所進行性または転移性乳癌を有する患者におけるドセタキセルとの併用での、バビツキシマブの安全性および有効性を評価する、別の第ＩＩ相非盲検単一群研究の結果を報告する。
【０３５５】
この試験はまた、Ｓｉｍｏｎの２段階設計を利用する第ＩＩ相多施設試験でもあった。１５人の患者を段階Ａに登録し、試験を段階Ｂにおいてさらに３１人の患者に拡大し、合計４６人の患者とした。主な目的は、ＯＲＲ（ＣＲ＋ＰＲ）を決定することであった。副次的目的には、腫瘍進行までの時間、ＤＯＲ、ＯＳ、および安全性が含まれた。
【０３５６】
最大６周期まで、４週間の計画周期の１、８、および、１５日目に与えられるドセタキセル（３５ｍｇ／ｍ２）と併用して、進行まで１週間に１回バビツキシマブ（３ｍｇ／ｋｇ）を与えた。全ての患者は、１つの事前化学療法レジメンを受けた。報告された最も一般的なＴＥＡＥのうち、疲労、頭痛、腰痛、および高血圧のみがグレード３以上であった。
【０３５７】
この研究では、４６人の患者のうち２８人（６０．９％）に客観的奏効が生じることが決定され、４６人の患者のうち５人（１０．９％）がＣＲを有し、４６人の患者のうち２３人（５０．０％）がＰＲを有した。ＤＯＲ中央値は６．１ヶ月（９５％のＣＩ：５．７、７．５）であり、ＰＦＳ中央値は７．４ヶ月（９５％のＣＩ：６．１、９．１）であった。最終分析時点で、ＯＳ中央値は約２０．７ヶ月であった（９５％のＣＩ：「決定せず」まで１６．１ヶ月）。これらのデータは、ドセタキセルとの併用療法を含む、バビツキシマブの更なる開発に対する強力な支持を提供する。
【０３５８】
実施例ＸＩ
バビツキシマブおよびソラフェニブによる肝癌患者の治療
この実施例では、ソラフェニブと併用してバビツキシマブを使用する、進行肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する患者の治療からのデータを提示する。
【０３５９】
進行肝細胞癌（ＨＣＣ）におけるバビツキシマブおよびソラフェニブの第ＩＩ相単一施設研究を実行した。患者は、放射線学的進行まで、１週間に１回３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブを静脈内（ＩＶ）に、および４００ｍｇのソラフェニブを経口で１日に２回（ＰＯ  ＢＩＤ）受けた。副次的評価項目には、全生存期間（ＯＳ）、疾患特異的生存期間、４ヶ月無増悪生存期間、安全性、および奏効率が含まれた。この研究には、３８人の患者を集めた。
【０３６０】
本研究の６人の患者からの関連橋渡しデータでは、複数の前臨床癌モデルにおいて関連ＰＳ標的化抗体について示されたものと類似して、評価した患者の半数が、１周期のバビツキシマブ治療後に抗腫瘍免疫細胞の増加を有することが決定された。加えて、免疫応答の増加はより長期間にわたって研究治療を続けた患者に関連付けられ、これは臨床的に有意義な抗腫瘍免疫応答を示唆した。評価した６人の患者のうち３人は腫瘍微小環境内への活性化抗腫瘍Ｔ細胞（ＣＤ８）の浸潤の増加を有し、これは疾患進行までの期間の延長と相関していた。加えて、これらの応答する患者は、治療開始前により低レベルのＰＤ−１陽性細胞（Ｔ細胞活性化および疾患成績の確立されたマーカーである）を最初に示し、続いてバビツキシマブ治療後に測定可能な上昇を示した。
【０３６１】
臨床的には、グレード４または５の有害事象は記録されなかった。最も一般的な全グレードの事象は、下痢（３２％）、疲労（２６％）、および食欲不振（２４％）であった。ＯＳ中央値（ｍＯＳ）は６．２ヶ月であった。２人の患者が部分奏効を達成し、４ヶ月ＰＦＳは６１％であった。
【０３６２】
これらの結果は、他のチェックポイント免疫療法で見られた自己免疫有害事象の徴候なく、進行ＨＣＣを有する患者においてバビツキシマブおよびソラフェニブが良好に許容されることを実証した。進行までの時間、疾患制御率、および４ヶ月無増悪生存期間の臨床成績は、高い大血管浸潤率を含む彼らの好ましくない疾患生物学のために、非常に不良な予後を有する多数の前治療歴を有するこの患者コホートにおいて特に有望である。
【０３６３】
実施例ＸＩＩ
バビツキシマブおよびゲムシタビンによる膵臓癌患者の治療
本実施例では、バビツキシマブと併用してゲムシタビンを使用する、治療歴のないＩＶ期膵臓癌を有する患者の治療のデータを提示する。
【０３６４】
この研究（ＰＰＨＭ１００２）は、治療歴のないＩＶ期膵臓癌を有する患者において、バビツキシマブと併用して、または併用せずに投与した時のゲビシタビンを評価するための第ＩＩ相無作為化非盲検研究である。主な目的は、治療群間での患者のＯＳを比較することであった。副次的目的には、ＰＦＳ、ＯＲＲ、ＤＲ、および安全性を比較することが含まれた。
【０３６５】
登録された患者を１：１の比で無作為化して、ゲムシタビン単独、または１週間に１回の３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブとの併用でのゲムシタビンの研究治療を受けさせた。ゲムシタビン（１０００ｍｇ／ｍ２）を、疾患進行または許容できない毒性があるまで、各２８日周期（４週間）の１、８、および１５日目に与えた。合計７０人の患者をこの研究に登録した。一般に、患者集団は非常に広範な疾患負荷量を有しており、これが両治療群において奏効を低減させている可能性がある。
【０３６６】
バビツキシマブ＋ゲムシタビン治療群の最も一般的なＴＥＡＥは、悪心（４４．１％）、貧血（３５．３％）、ならびに疲労、便秘、および食欲不振（各々患者の３２．４％に発生）であった。ゲムシタビンのみに無作為化した３人（９．１％）の患者は、グレード５（致命的）の事象（突然死［１人］、肝膿瘍［１人］、および心停止［１人］）を有した。ゲムシタビン＋バビツキシマブ群では、グレード５（致命的）の事象は発生しなかった。
【０３６７】
ほとんどの有効性評価項目は治療群間で同等であったが、バビツキシマブおよびゲムシタビン群では、１年時点で数値的に高い奏効率および生存確率が存在した。研究終了時、全生存期間中央値（９５％のＣＩ）は、ゲムシタビン単独治療群で５．２（４．０〜６．３）ヶ月、バビツキシマブ＋ゲムシタビン治療群で５．６（４．７〜７．０）ヶ月であった。バビツキシマブの追加に対するこれらの結果は、非常に広範な疾患負荷量を有するこの患者集団において特に有望である。
【０３６８】
実施例ＸＩＶの第ＩＩＩ相試験、および機能性β２ＧＰＩレベルが治療結果と相関することを示す実施例ＸＶＩＩの機能性β２ＧＰＩ分析後、本第ＩＩ相試験からの保存試料もまた、機能性β２ＧＰＩについて試験した。実施例ＸＶＩＩＩに報告されるように、これらの分析の結果は、機能性β２ＧＰＩのレベルがバビツキシマブ治療の成功のためのバイオマーカーであるという発見を強化する。
【０３６９】
実施例ＸＩＩＩ
ＮＳＣＬＣ患者におけるバビツキシマブおよびドセタキセルの第ＩＩ相試験
第Ｉ相および単一群第ＩＩ相実験を基にして、本実施例は、治療歴を有するＩＩＩｂ／ＩＶ期非扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者においてバビツキシマブ＋ドセタキセルを試験する、第ＩＩ相試験に関する。
【０３７０】
この研究（ＰＰＨＭ０９０２）は、治療歴を有する局所進行性または転移性の非扁平上皮ＮＳＣＬＣを有する患者においてバビツキシマブ＋ドセタキセルを評価する、第ＩＩ相無作為化二重盲検プラセボ対照試験である。この研究の主な目的は、治療群間のＯＲＲ（ＣＲ＋ＰＲ）を比較することであった。副次的目的には、ＰＦＳ、ＤＲ、ＯＳ、安全性、およびＰＫを比較することが含まれた。
【０３７１】
患者を１：１：１の比で無作為化して、ドセタキセル＋プラセボ、ドセタキセル＋１ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ、またはドセタキセル＋３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブを受けさせた。ドセタキセル７５ｍｇ／ｍ２を、最大６周期まで各２１日周期の１日目に与え、プラセボまたは割り当てられた用量のバビツキシマブを１週間に１回投与した。進行または毒性があるまで、患者は、１週間に１回割り当てられた盲検治療（プラセボ、１ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ、または３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ）を受け続けた。
【０３７２】
全研究集団のサブセット（１群当たり６人の患者）が、バビツキシマブとドセタキセルとの間の薬物間相互作用を調査するためのＰＫ下位研究に参加した。周期１および２の特定の時点で、これらの患者に対して追加の採血を実行した。
【０３７３】
平均年齢６０．０歳の合計１２１人の患者（男性７６人および女性４５人）をこの研究に登録した。独立データモニタリング委員会（ＩＤＭＣ）では、ＯＲＲの主要評価項目に到達したため、研究治療の非盲検化が推奨されることが決定され、この会議後に研究治療を非盲検化した。加えて、安全性の懸念または問題は、ＩＤＭＣによって特定されなかった。
【０３７４】
研究の非盲検化後、プラセボ群および１ｍｇ／ｋｇ群に関与する、包装および標識業者による標識の誤りが発見された。調査要約を食品医薬品局（ＦＤＡ）に提出し、プラセボまたは１ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブを投薬した患者のデータをプールして、探索分析および３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ群に対する比較のための複合対照群を形成した。
【０３７５】
全体として、毒性グレードによる治療群間のＡＥの発生率に有意差は観察されなかった。治療群間でＳＡＥに顕著な差は観察されなかった。複合対照群の３人の患者（３．８％）およびドセタキセルありの３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ群の２人の患者（５．０％）は、グレード５（致命的）の事象を有した。致命的事象を有する複合対照患者には、１人の敗血症を有する患者、１人の脳血管発作を有する患者、および１人の肺炎および偽敗血症の両方を経験する患者が含まれた。３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ＋ドセタキセル群では、１人の患者がバビツキシマブとは無関係の致命的な敗血症を有し、１人の患者が同様にバビツキシマブとは無関係の老衰事象を有した。
【０３７６】
有効性評価項目の要約を表６に提示し、この中で分析は治療意図（ＩＴＴ）集団および中央判定データに基づいている。全ての評価項目（ＯＲＲ、ＰＦＳ、およびＯＳ）は、複合対照群（プラセボまたは１ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ）と比較して、３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブが優位に向かう傾向を実証した。複合群と比較して、３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブのＯＲＲは約５０％高かった。ＰＦＳ中央値は、複合群と３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ群との間で類似していたが、３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブを受けた患者のＯＳ中央値は約６０％長かった。特に、複合群の患者のｍＯＳがわずか７．３ヶ月であるのに対して、３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ＋ドセタキセルで治療した患者は１１．７ヶ月のｍＯＳを有した（ＨＲ＝０．６６）。
【表８】
2019537619.tif 000012
【０３７７】
実施例ＸＩＶの第ＩＩＩ相試験、および機能性β２ＧＰＩレベルが治療結果と相関することを示した実施例ＸＶＩＩにおける機能性β２ＧＰＩの分析に続いて、本第ＩＩ相試験からの保存試料もまた、機能性β２ＧＰＩについて試験した。実施例ＸＶＩＩＩに記載されているこれらの分析の結果は、機能性β２ＧＰＩのレベルがバビツキシマブ治療の成功のためのバイオマーカーであることをさらに確認する。
【０３７８】
実施例ＸＩＶ
ＮＳＣＬＣ患者におけるバビツキシマブおよびドセタキセルの第ＩＩＩ相試験
前の実施例において報告されるように、第Ｉ相および第ＩＩ相研究の全体的な結果は、バビツキシマブの臨床的に有意義な治療効果を実証した。そのような結果、特に上記の二重盲検第ＩＩ相試験に基づいて、第ＩＩＩ相試験を行い、本実施例は第ＩＩＩ相試験および得られたデータを記載する。
【０３７９】
第ＩＩＩ相試験（ＰＰＨＭ１２０２）は、治療歴を有するＩＩＩｂ／ＩＶ期非扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者における、バビツキシマブ＋ドセタキセルの無作為化二重盲検プラセボ対照多施設試験であった。この世界的な二重盲検第ＩＩＩ相試験は、２０１２年に開始された。選択基準は、プラチナ−ダブレット化学療法を進行した（既知のＥＧＦＲまたはＡＬＫ突然変異の場合、適切な標的化療法を進行したはずである）ＩＩＩｂ／ＩＶ期の非扁平上皮ＮＳＣＬＣを有する患者のものである（ＥＣＯＧ  ＰＳ０−１および以前の免疫療法を許容）。この試験には、５９７人のそのような患者を１：１の比で集めて、進行または毒性があるまで、最大６周期の２１日周期のドセタキセル（７５ｍｇ／ｍ２）を毎週３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ（バビツキシマブ＋ドセタキセル）またはプラセボ（ドセタキセル単独）と併用して受けさせた。主要評価項目は、全生存期間（ＯＳ）であり、副次的評価項目は、客観的奏効率（独立中央判定、ＩＣＲ）、無増悪生存期間（ＩＣＲ）、安全性、ＰＫ、生活の質（ＬＣＳＳ）、および免疫相関を含む探索バイオマーカーである。選択された患者のベースライン特徴を表７に示し、表中の「プラセボ」欄はドセタキセル単独で治療した患者を指し、「バビツキシマブ」欄はバビツキシマブ＋ドセタキセルで治療した患者を指す。
【表９】
2019537619.tif 000013
【０３８０】
Ａ．安全性
標的とするＯＳ事象の７０％に到達したため、ＯＳ中央値（ｍＯＳ）を評価した（下記を参照されたい）。研究全体を通して、安全性プロファイルは群間で一般に類似していることが決定された。治療および安全性の要約が近年発表されている（Ｐａｌｍｅｒｏら、２０１７）。その中で報告されているように、バビツキシマブおよびドセタキセルの併用の安全性プロファイルは、プラセボ＋ドセタキセルの併用に類似している。グレード３以上の有害事象は、バビツキシマブ＋ドセタキセル群の患者のうち６８％に、およびドセタキセル単独群の患者の６０％に発生した。１５％超の患者において報告される治療関連ＡＥが近年報告された（Ｐａｌｍｅｒｏら、２０１７）。加えて、治療関連グレード３／４の発熱性好中球減少症は、ドセタキセル単独（５％）よりもバビツキシマブ＋ドセタキセル（８％）でわずかに高かった。表７のベースライン特徴におけるドセタキセル単独（プラセボ、ｎ＝  ３００）で治療した患者数は、ＩＴＴ集団に基づいていること、すなわち、全ての無作為化患者を含む一方で、Ｐａｌｍｅｒｏら、２０１７において発表されるドセタキセル単独（プラセボ、ｎ＝２９９）で治療した患者数は、安全性集団に基づいていること、すなわち、治療を受けた全ての無作為化患者を含むことに留意されたい。
【０３８１】
Ｂ．有効性
標的とするＯＳ事象の７０％に到達したため、バビツキシマブ＋ドセタキセル群の２９７人の患者におけるｍＯＳは１０．７ヶ月（９５％の信頼区間［ＣＩ］、８．６〜１１．５）であり、ドセタキセル単独群の３００人の患者におけるｍＯＳは１０．８ヶ月（９５％のＣＩ、９．２〜１２．６）であった（死亡ハザード比（ＨＲ）、１．１０（０．８９、１．３７））。無増悪生存期間（ＰＦＳ）もまた、標的とするＯＳ事象の７０％に到達した時点で２群において類似しており、ＰＦＳ中央値はバビツキシマブ＋ドセタキセル群で４．１ヶ月、ドセタキセル単独群で３．９ヶ月であった。その後の免疫療法は、本研究の患者のうち約１５％が受け、バビツキシマブ＋ドセタキセル群とドセタキセル単独群との間で均等に分布していた（実施例ＸＩＸを参照されたい）。
【０３８２】
最後の患者を無作為化してから１２ヶ月間の経過観察が経過し、かつ標的とするＯＳ事象の約８５％に到達し、ＯＳ中央値は、バビツキシマブ＋ドセタキセル群の２９７人の患者で１０．５ヶ月（９５％の信頼区間［ＣＩ］、８．４〜１１．９）、およびドセタキセル単独群の３００人の患者で１０．９ヶ月（９５％のＣＩ、９．２〜１２．１）であった（ＨＲ、１．０６；Ｐ＝０．５３３）。この段階でのＰＦＳは、バビツキシマブ＋ドセタキセル群で４．２ヶ月（９５％のＣＩ、３．９〜４．６）、およびドセタキセル単独群で４．１ヶ月（９５％のＣＩ、３．２〜４．８）であった（ＨＲ、１．０２；Ｐ＝０．８７６）。この段階でのＯＲＲは、バビツキシマブ＋ドセタキセル群で１５％であったのに対し、ドセタキセル単独群では１１％であった（オッズ比０．７、Ｐ＝０．１５）。
【０３８３】
この段階での有効性分析（ＩＴＴ）を表８に列挙し、ここで、Ｐ値は両側層別コクラン−マンテル−ヘンツェル厳密法に基づく。層別因子には、病期（ＩＩＩＢ対ＩＶ）、地理上の地域（北米、欧州、その他の地域）、以前の維持療法および／または標的化療法（あり対なし）が含まれる。
【表１０】
2019537619.tif 000014
【０３８４】
ＯＳ中央値のこれらの結果は、実施例ＸＩＩＩに上記の第ＩＩ相データおよび研究の検出力に使用した仮定ｍＯＳとは予想外に異なり、これらのうち後者は、バビツキシマブ＋ドセタキセルでは９．１ヶ月のｍＯＳであり、ドセタキセル単独では７．０ヶ月のｍＯＳであった（９．１対７．０ヶ月のｍＯＳを仮定して、８０％の検出力および片側２．５％の有意水準を提供する４７３のＯＳ事象；ＨＲ  ０．７７）。
【０３８５】
後ろ向きＶｅｒｉＳｔｒａｔ（登録商標）プロテオミクス試験は、バビツキシマブ＋ドセタキセル群の８０％およびドセタキセル単独群の８４％においてＶＳ良好サインを実証した（実施例ＸＶ）。治療歴を有する非扁平上皮ＮＳＣＬＣを有する患者におけるこの第ＩＩＩ相試験は、バビツキシマブ＋ドセタキセル群における優れたＯＳという主な目的は満たさなかったが、この結果は、特にドセタキセル単独群において、全体的に予想よりも高い割合のＶＳ良好サインによって影響された可能性がある。
【０３８６】
実施例ＸＶ
バビツキシマブの第ＩＩＩ相試験の初期バイオマーカー分析
上記の第ＩＩＩ相試験に関連して、バビツキシマブ含有治療レジメンから最大の利益を得る患者について、１つ以上のバイオマーカー、またはバイオマーカーのパターン（バビツキシマブの「符号」）を特定する目的で、バイオマーカー分析を実行した。本実施例は、後の研究に適用される試料収集技術に関し、最初のプロテオミクス符号分析を記載する。
【０３８７】
Ａ．試料収集
第ＩＩＩ相試験を設計し、患者の血液試料の収集のためにインフォームドコンセントを得た。患者の血液検体は、適切な静脈切開技術を使用して得た。止血帯を静脈穿刺部位の７〜１０ｃｍ上に置いたが、予備的な静脈選択のための止血帯の適用は１分を超えないようにした。患者に自らの拳を握らずに閉じさせ、中心から周辺への円運動を使用して、７０％のイソプロピルアルコールパッドで静脈穿刺部位を洗浄し、風乾させた。
【０３８８】
２１ゲージの針を使用して、患者の血液を５．０ｍｌの金蓋血清分離管（ＳＳＴ）に収集した。血液が流れ始めた後できるだけ早く止血帯を取り外し、管を完全に充填させた。収集後直ちに管を５回反転させ、少なくとも３０分間凝固させた。血清を分離するために、収集後３０〜６０分以内に管を１，０００〜１，３００ｇで１５分間遠心分離した。ピペットを使用して、約１．２５ｍｌの血清を３．６ｍｌのクリオバイアル管２本に移し、それらの試料を凍結した。
【０３８９】
凍結したバイアルを検体袋に入れ、しっかりと密封した。ドライアイス輸送箱の底部にドライアイスを層状に重ね、この箱に検体袋を入れた。箱が一杯になるまでドライアイスを添加し、蓋を所定の位置に固定し、試料を−７０℃で保存するために中央実験室に輸送した。
【０３９０】
中央実験室は、試料を解凍することによって部分アリコートのためのバイアルを準備した。ピペットを使用して、血清の少なくとも２５０μｌを２ｍｌの自然蓋クリオバイアル管４本に移し、−７０℃で再凍結した。同じ輸送指示を反復し、部分アリコートした試料を、試験用バイオマーカーのためにドライアイス上で凍結した状態で試験室に輸送した。
【０３９１】
Ｂ．ＶｅｒｉＳｔｒａｔ（登録商標）分析
癌の多次元特徴を理解することは、患者選択および治療計画にとって重要である。ＶｅｒｉＳｔｒａｔ（登録商標）試験は、進行ＮＳＣＬＣを有する患者のための、血液に基づく市販の予測的および予後的プロテオミクス試験である。予後的であることに加えて、ＶｅｒｉＳｔｒａｔは、単剤治療の選択肢から選択する場合の差次的な治療利益を予測する。ＶｅｒｉＳｔｒａｔは、第ＩＩＩ相試験の患者試料に対して後ろ向きに実行した。
【０３９２】
より侵襲性の疾患と相関するＶｅｒｉＳｔｒａｔ（ＶＳ）不良（ＶＳ−Ｐ）、またはより好ましい予後と相関するＶＳ良好（ＶＳ−Ｇ）として患者を分類する質量分析を使用して、第ＩＩＩ相試験の患者の治療前血清試料をタンパク質発現について試験した。カプランマイヤー統計法を使用して、ＯＳをＶｅｒｉＳｔｒａｔサブグループによって分析した。
【０３９３】
ＶｅｒｉＳｔｒａｔ分類は、５９７人の無作為化患者のうち５６９人の患者について入手可能であった。バビツキシマブ＋ドセタキセル群では、８０％がＶＳ良好、２０％がＶＳ不良であった。ドセタキセル単独群では、８４％がＶＳ良好、１６％がＶＳ不良であった。したがって、第ＩＩＩ相試験では、ＶｅｒｉＳｔｒａｔの良好／不良サインは治療群間でほぼ均衡が取れていた。
【０３９４】
全生存期間中央値（ｍＯＳ）は、全ＶＳ良好では１１．５ヶ月（９５％の信頼区間［ＣＩ］、１０．６〜１２．９）であり、全ＶＳ不良では５．７ヶ月（９５％のＣＩ、４．２〜７．２）であった（ｐ＜０．０００１）。ＨＲ  ＯＳ（ＶＳ良好対ＶＳ不良）０．４９（９５％のＣＩ  ０．３７〜０．６４）；ｐ＜０．００１。これらのＶｅｒｉＳｔｒａｔ結果は、ＰＲＯＳＥ試験（Ｇｒｅｇｏｒｃら、２０１４）ならびにＰＦＳおよびＯＳの全体的な予後と一致している。
【０３９５】
ＶＳ良好患者のうち、バビツキシマブ＋ドセタキセル群のｍＯＳは１１．２ヶ月（９５％のＣＩ、１０．２〜１２．８）であり、ドセタキセル単独群では１１．８ヶ月（９５％のＣＩ、１０．４〜１３．５）である（ｐ＝０．３８）。ＶＳ不良患者のうち、バビツキシマブ＋ドセタキセル群のｍＯＳは５．８ヶ月（９５％のＣＩ、５．０〜１１．３）であり、ドセタキセル単独群では４．７ヶ月（９５％のＣＩ、３．４〜７．２）である（ｐ＝０．２７）。この群の患者に対する治療選択肢が限定されていることを考慮すると、バビツキシマブがＶＳ不良患者においてＯＳを改善する能力は重要である。
【０３９６】
結論として、第ＩＩＩ相試験のＶｅｒｉＳｔｒａｔ結果は、ＰＦＳおよびＯＳについて全体的な予後であるが、バビツキシマブ治療応答の予測はできない。ドセタキセル群での予想外のＯＳ結果は、ＶｅｒｉＳｔｒａｔ良好患者の比較的高い全体的割合によって影響を受けた可能性がある。特に、この第ＩＩＩ相試験におけるＶｅｒｉＳｔｒａｔ良好患者のパーセンテージ（８０％超）は以前に報告されたもの（約６７％）よりも高く、これは患者が全体的に良好な予後を有したことを示し、したがって、ドセタキセル群の予想よりも良好な性能を部分的に説明する。
【０３９７】
前述のＶｅｒｉｓｔｒａｔ分析とは別に、特にバビツキシマブについて別個のプロテオミクスアプローチもまた探求した。広範な質量分析および相関分析を実行して、バビツキシマブの追加から利益を得る患者のサブグループを特定することができる可能性のある試験を調査したが、そのような遺伝子セットの富化分析は、臨床的利益に関連するいかなるマーカーの特定ももたらさなかったため、更なる研究および可能性のある新たなアプローチに対する必要性を強調した。
【０３９８】
実施例ＸＶＩ
機能性β２ＧＰＩのアッセイ
本実施例は、流体試料中の機能性（活性）β２ＧＰＩの検出のために明確に設計されたβ２ＧＰＩアッセイの開発に関する。この試験方法は、機能性β２ＧＰＩ（ＰＳおよびバビツキシマブの両方に結合することができるβ２ＧＰＩを意味する）を検出および定量化するように特有に適合している。したがって、本実施例は、バビツキシマブ治療に関連して更なる有意義なバイオマーカー分析に必要とされる、以前は利用できなかった手段を提供する。
【０３９９】
Ａ．材料および方法
１．材料および装置
以下の特定の材料および装置をアッセイにおいて使用して、本実施例の節Ｂ１およびＢ２に提示される結果を生成した。材料：９６ウェルの培地結合平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ、カタログ番号６５５００１）、９６ウェルの非結合丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６０５）、ヘキサン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３２２９３）、ＰＳ抗原（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ６６４１）、卵白アルブミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ５５０３）、発色基質、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＫＰＬ、カタログ番号５０−７６−００）、２ＭのＨ２ＳＯ４（Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＳＡ８１８−４）、プレートカバー（Ｆｉｓｈｅｒ  ０１５−０２７−１１）、接着プレート密封機（ＶＷＲ２３２７０１）、試薬リザーバー（ＶｉｓｔａＬａｂカタログ番号３０５４−１０００）。１．５ｍｌの微量遠心管、５０ｍｌの円錐管、および１５ｍｌの円錐管もまた利用した。
【０４００】
装置：ボルテックス（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、タイマー（ＶＷＲ６２３４４−６４）、１０〜１０００μｌのピペッター（Ｒａｉｎｉｎ）、１００〜３００μｌの多チャネルピペッター（Ｒａｉｎｉｎ）、４５０および６５０ｎｍのプレートリーダー（ＥＮ１８３５）。秤、撹拌棒、および３７℃のインキュベーターもまた利用した。このアッセイにはＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェアを使用した。
【０４０１】
２．緩衝液および技術
洗浄緩衝液は１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であり、遮断緩衝液は１×ＰＢＳ中２％の卵白アルブミンである。
【０４０２】
アッセイ全体を通して、大量（例えば、５００μｌ以上）で作業するときは、減法ピペッティングを利用した。全量の希釈剤を最初にピペッティングした。追加の試薬を添加する前に、等量の希釈剤を除去した。潜在的に危険な蒸気は全て、ドラフト内で取り扱った。
【０４０３】
３．バビツキシマブ−ＨＲＰ
バビツキシマブ抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共役させて、アッセイに使用するためのバビツキシマブ−ＨＲＰ検出剤を調製した。ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｐｌｕｓ活性化ペルオキシダーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１４８７）を使用し、その後ｐＨ７．２で活性化ペルオキシダーゼを抗体に共役させるための手順（製造者により提供）を続けて、共役を実行した。簡潔には、１ｍｇのバビツキシマブをＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。これを１ｍｇの凍結乾燥ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓ活性化ペルオキシダーゼに添加して、再構成した。再構成直後に、１０μｌの５Ｍのシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を反応物に添加し、室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの完了後、２０μｌの反応停止緩衝液を添加し、室温で１５分間インキュベートした。共役バビツキシマブ−ＨＲＰ（１ｍｇ／ｍｌ）を４℃で最大４週間保存した。
【０４０４】
４．コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを以下のようにＰＳ抗原でコーティングした。５μｇ／ｍｌのＰＳ抗原を調製し、送風機がオフの状態のドラフト内で６ｍｌのヘキサン中に希釈した。１２チャンネルピペットを使用して、５０μｌのＰＳ溶液を各ウェルに添加した。ドラフトの送風機を再びオンにし、ヘキサンを３０〜４５分間、典型的には３０分間蒸発させた。
【０４０５】
５．遮断
ＰＳコーティングＥＬＩＳＡプレートを以下のように遮断した。１プレート当たり１００ｍｌの遮断緩衝液（１×ＰＢＳ中２％の卵白アルブミン）を調製した。１２チャンネルピペットを使用して、２００μｌの遮断緩衝液を各ウェルに添加した。遮断されたＥＬＩＳＡプレートを、３７℃で１２０分間（±１０分間、これによるアッセイ性能の変化はなかった）インキュベートした。
【０４０６】
６．試料調製
アッセイ用の標準物、陽性対照、および試料調製を下記のように実行した。
【０４０７】
陽性対照のためのβ２ＧＰＩ標準物は、０．２Ｍのグリシン、０．１５ＭのＮａＣｌの緩衝液（ｐＨ７．４）中、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＨＴＩ、カタログ番号Ｂ２Ｇｌ−０００１−Ｃ、１．０ｍｇ／ｍｌ）から得た。β２ＧＰＩのバイアルを解凍し、標準物および陽性対照調製を以下のように実行した。
１０μｇ／ｍｌのβ２ＧＰＩサブストックＡを１ｍｌ、遮断緩衝液中で調製し、
サブストックＡから１００μｌを減法ピペッティングすることによって、１，０００ｎｇ／ｍｌのβ２ＧＰＩサブストックＢを１ｍｌ、遮断緩衝液中で調製し、
サブストックＢから２５０μｌを減法ピペッティングすることによって、２５０ｎｇ／ｍｌのβ２ＧＰＩ標準物を１ｍｌ、遮断緩衝液中で調製し、
減法ピペッティングを使用して、表９に従って１０００ｎｇ／ｍｌのサブストックから２００ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、および５ｎｇ／ｍｌの対照試料を調製した。
【表１１】
2019537619.tif 000015
【０４０８】
未知試料を試験のために以下のように調製した。１：４０００および１：８０００の最終希釈度で未知試料を遮断緩衝液中で調製し、１：１００の希釈度の未知試料を最初に調製し、１：４０の希釈度を１：１００の希釈度から調製して１：４０００の希釈度を達成し、１：８０の希釈度を１：１００の希釈度から調製して１：８０００の希釈度を達成した。
【０４０９】
非結合プレートの調製を以下のように実行した。７５μｌの遮断緩衝液を行Ｂ〜Ｈの列１〜３に添加し、２５０ｎｇ／ｍｌの標準物１５０μｌを列１〜３、行Ａに添加し、多チャネルピペットを使用して、列１〜３の７５μｌを列Ａから列Ｇまで段階希釈し、７５μｌの陽性対照および試料を指定のウェルに添加し、７５μｌの遮断緩衝液を全ての空のウェルに添加した。プレート設定を表１０に示す。
【表１２】
2019537619.tif 000016
【０４１０】
７．検出
遮断終了前に、３００ｎｇ／ｍｌのバビツキシマブ−ＨＲＰを６ｍｌ、遮断緩衝液中で調製した。２５０μｌを各ウェルにピペッティングすることによって、アッセイプレートを１×ＰＢＳで洗浄し、これをさらに２回反復した。プレート洗浄機を使用してもよく、その場合、プレートを１×ＰＢＳで１回洗浄する。プレートができるだけ乾燥していることを確実にした。
【０４１１】
３００ｎｇ／ｍｌのバビツキシマブ−ＨＲＰを５０μｌ、アッセイプレートの全ウェルに添加した。非結合プレートの対応する各ウェルから、５０μｌを添加した。アッセイプレートおよび非結合プレートをこのように使用することは、非結合プレートからβ２ＧＰＩを含有する試料を添加する前に、検出可能に標識されたバビツキシマブを最初にＰＳコーティングアッセイプレートに添加することを意味する。この順序は、ピペッティング中の交差汚染を回避する。バビツキシマブ−ＨＲＰおよびβ２ＧＰＩを含有する試料をプレート上で共にインキュベートし、インキュベーションを３７℃で９０分間実行した。
【０４１２】
８．発色
ＴＭＢペルオキシダーゼ基質およびＴＭＢペルオキシダーゼ溶液Ｂを、使用の少なくとも１時間前に冷蔵庫から取り出した。２５０μｌを各ウェルにピペッティングすることによって、アッセイプレートを１×ＰＢＳで洗浄し、これをさらに２回反復した。プレート洗浄機を使用してもよく、その場合、プレートを１×ＰＢＳで１回洗浄する。プレートができるだけ乾燥していることを確実にした。
【０４１３】
６ｍｌのＴＭＢペルオキシダーゼ基質を６ｍｌのＴＭＢ溶液Ｂと混合することによって、１２ｍｌのＴＭＢ混合物を調製した。１００μｌのＴＭＢ溶液をアッセイプレートの各ウェルに添加し、５〜６分間発色させた。アッセイプレートの各ウェルに２ＭのＨ２ＳＯ４を１００μｌ添加することによって、発色を停止させた。アッセイプレートを読み取り、反応停止後３０分以内に４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を決定した。アッセイデータの印刷物を提供するＳｏｆｔＭａｘＰｒｏプレートデータおよび分析テンプレートと併用して、マイクロプレートリーダーを使用した。
【０４１４】
９．ニック入りβ２ＧＰＩの調製
ヒト血漿および組み換えヒトβ２ＧＰＩから精製したβ２ＧＰＩの試料を両方ともプラスミンで処理（酵素加水分解）して、ニック入りβ２ＧＰＩの大部分を含有する試料を調製した。ニック入りβ２ＧＰＩは、初期研究では均質になるまで精製しなかったが、ニック入りβ２ＧＰＩは、ニックのない、すなわち「インタクトな」β２ＧＰＩを超えて存在することが決定された。
【０４１５】
１０．全β２ＧＰＩのためのアッセイ
使用した抗体に関する製造者の仕様に基づいて、全β２ＧＰＩを検出するアッセイを設計した。これは、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから市販されている抗体を使用するアッセイであり、このアッセイでは、プレートをβ２ＧＰＩに対する捕捉抗体でコーティングし、検出抗体として抗β２ＧＰＩ  −ＨＲＰ共役体を使用して、全ての結合β２ＧＰＩを検出する。抗体カタログ番号は、捕捉抗体、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  番号Ａ２２９９−８１Ａ、親和性精製抗β２ＧＰＩおよび検出抗体、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ番号Ａ２２９９−８１Ｂ、ペルオキシダーゼ共役抗β２ＧＰＩである。
【０４１６】
捕捉抗体の１：１００の希釈物を、炭酸塩緩衝液（５０ｍＭの重炭酸ナトリウム）中にｐＨ９．６で調製した。１００μｌをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、室温でインキュベートした。Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳ緩衝液でプレートを洗浄し、その後１％のＢＳＡを含有する１ウェル当たり２００μｌのアッセイ希釈剤で遮断し、３７℃でインキュベートした。精製β２ＧＰＩを使用して、アッセイ希釈剤中５００ｎｇ／ｍｌから始まる２倍希釈標準曲線を準備した。試料をアッセイ希釈剤中で希釈して、標準曲線の直線領域内の濃度を達成した。遮断インキュベーション後、プレートを洗浄し、続いて１ウェル当たり１００μｌの標準曲線および試料を２連または３連で添加した。標準曲線および試料の添加後、プレートを３７℃でインキュベートした。検出抗体を、アッセイ希釈剤で１：４００に希釈した。試料および標準曲線のインキュベート後、プレートを洗浄し、続いて１ウェル当たり１００μｌの検出抗体を添加した。プレートを３７℃でインキュベートした。二次抗体のインキュベーション後、プレートを洗浄し、その後ＴＭＢで発色させた。４５０ｎｍでプレートをプレートリーダーで読み取り、試料濃度を標準曲線から決定した。
【０４１７】
Ｂ．結果
１．機能性β２ＧＰＩとニック入りβ２ＧＰＩとの区別
ヒト血漿から精製したβ２ＧＰＩ（「ヒト」）または組み換え発現後のβ２ＧＰＩ（「組み換え」）をプラスミンで処理して、ＰＳに結合しない、プラスミン切断された（ニック入り）β２ＧＰＩの大部分を含有するβ２ＧＰＩ試験試料を調製した。本アッセイ（表１１Ｂ）において、かつ市販の捕捉抗体および検出抗体を使用して全β２ＧＰＩを検出するように設計したアッセイ（表１１Ａ）を使用して、これらの試料を、無プラスミン（インタクトな）β２ＧＰＩ、および各々の５０：５０混合物と共に試験した。結果を以下に示す。
【表１３】
2019537619.tif 000017
【表１４】
2019537619.tif 000018
【０４１８】
市販の抗体を使用するいわゆる「全β２ＧＰＩアッセイ」（表１１Ａ）および本発明の「機能性β２ＧＰＩアッセイ」（表１１Ｂ）は両方とも、類似した濃度のβ２ＧＰＩ（１４１ｎｇ／ｍｌおよび１３６ｎｇ／ｍｌ）が読み取られることがまず理解され得る。全β２ＧＰＩアッセイを使用しても、プラスミン処理した組み換えβ２ＧＰＩを検出する上で本質的な違いはなく、ヒト血漿からのプラスミン処理したβ２ＧＰＩの量が増加するにつれて、中程度の検出の低減のみが存在した（１４１から１０４ｎｇ／ｍｌ）。対照的に、機能性β２ＧＰＩアッセイを使用すると、組み換えまたは血漿由来のプラスミン処理したβ２ＧＰＩの量の増加は、有意な結合の低減をもたらす（１３６から３３ｎｇ／ｍｌ）。
【０４１９】
したがって、アッセイの設計と一貫して、これらの結果は、本アッセイが、ニック入りβ２ＧＰＩとは対照的に、機能性β２ＧＰＩ（すなわち、ＰＳおよびバビツキシマブの両方に結合するβ２ＧＰＩ）を効果的に検出することができることを示す。これにより、本発明の機能性β２ＧＰＩアッセイは、ＰＳに結合するβ２ＧＰＩと一緒に（ＰＳに結合しない）ニック入りβ２ＧＰＩも検出する市販のアッセイキット（および市販の抗β２ＧＰＩ抗体を使用するアッセイ）から区別される。
【０４２０】
２．機能性β２ＧＰＩの定量化
アッセイは、流体試料中の機能性β２ＧＰＩ（ＰＳおよびバビツキシマブの両方に結合するβ２ＧＰＩである）の量を決定に成功することができる。このアッセイは現在、再現性があるβ２ＧＰＩ標準曲線を準備するために慣例的に実行されている。これに関して、４パラメータロジスティック適合が使用され、これは非線形回帰分析に使用される統計的等式である。４パラメータ適合式は、
【数１】
2019537619.tif 000019
であり、式中、
Ａは、Ｘ軸の低い値に対する漸近線（すなわち、曲線の平坦部分）に対応するＹ値であり、
Ｂは、曲線の中心にある漸近線から、曲線がいかに素早く推移するかを説明する係数であり、一般に勾配係数と呼ばれ、
Ｃは、ＡとＤとの中間点に対応するＸ値であり、一般にＥＣ５０と呼ばれ、
Ｄは、Ｘ軸の高い値に対する漸近線に対応するＹ値である。
【０４２１】
機能性β２ＧＰＩの標準曲線の代表例を、図１６に示す。そのような標準曲線から、血漿または血清試料などのヒト血液試料中の機能性β２ＧＰＩの濃度を決定することができる。主に正確さのためではあるが、また試料調製の経済性のためにも、標準曲線はｎｇ／ｍｌ（ナノグラム／ｍｌ）で準備される。正常なヒト集団におけるβ２ＧＰＩの平均レベルは約２００μｇ／ｍｌ（マイクログラム／ｍｌ）であるため（Ｍｅｈｄｉら、１９９９；Ｍｉｙａｋｉｓら、２００４）、標準曲線は試験試料がアッセイでの分析前に希釈されるという期待の下で準備される。希釈した血漿または血清試験試料をアッセイにかけ、その後、希釈係数を調整することによって患者のβ２ＧＰＩ濃度を計算することができる。
【０４２２】
このアッセイは現在、上記の第ＩＩＩ相試験の患者における機能性β２ＧＰＩのレベルを決定するために使用されており、その結果を、以下の実施例ＸＶＩＩ、ならびに実施例ＸＶＩＩＩおよび実施例ＸＸに提示する。
【０４２３】
３．代替的な同等のアッセイ構成要素およびステップ
本実施例の節Ａ１〜Ａ８に記載される特定の材料、装置、およびアッセイステップに加えて、機能性β２ＧＰＩを検出および定量化するためのアッセイの概念から逸脱することなく、構成要素および方法ステップにおける変形がなされ、実行され得る。以下の結果は、関連薬剤が節Ａ１〜Ａ８に記載される薬剤に取って代わり得ること、および本質的に同じ結果が達成されることを示す。
【０４２４】
特定の好ましいＥＬＩＳＡプレートは、脂質吸着に最適化されたものであり、これは上記の節Ａ１のＥＬＩＳＡプレートに取って代わるように使用することができる。脂質吸着に最適化されたＥＬＩＳＡプレートが既知であり、それはより良好な脂質（ＰＳ）結合を提供する表面化学を有する。１つのそのようなＥＬＩＳＡプレートは、新たなアッセイ形式で使用されているＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＰｏｌｙＳｏｒｐ（登録商標）プレートである。
【０４２５】
上記の節Ａ４のヘキサンに基づくＰＳコーティング方法には、好ましくは、（ヘキサンの使用を回避することによって）ユーザに特定の安全性利益を提供することができるイソプロパノールに基づくＰＳコーティング方法が取って代わってもよい。新たなアッセイ形式において、コーティング緩衝液としてイソプロパノールを使用する際には、イソプロパノール中に希釈した１０μｇ／ｍｌのＰＳ抗原を使用してＥＬＩＳＡプレートをＰＳ抗原でコーティングし、インキュベーション時間は９０分間である。
【０４２６】
有効なβ２ＧＰＩ較正曲線を生成するために、β２ＧＰＩを得る任意の既知の方法を用いることができる。例えば、ＨＴＩ（上記の節Ａ６）などの商業販売会社から購入されるものである。明確で再現性のある較正制御のために、代替的なβ２ＧＰＩ調製物もまた開発され得る。１つのそのような好ましい方法は、ＣＨＯ細胞内でβ２ＧＰＩを発現させ、発現されたβ２ＧＰＩを精製することである。
【０４２７】
ＣＨＯ細胞由来のβ２ＧＰＩの好ましい精製は、混入物を除去し、清澄化された採取物が０．２μｍのフィルタを通過することを可能にする、採取物の清澄化、クロマチン抽出ステップ；清澄化された採取物を緩衝液交換し、体積を増加させずに、その伝導率を低下させるための、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）システムの使用；更なる混入物を除去するための、アニオン流スルーモードにおけるＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅステップ；凝集物および他の混入物を除去し、溶出液を濃縮し、任意の緩衝液交換を促進するための、Ｎｕｖｉａ（商標）Ｓを使用する強カチオンステップ；ならびに任意で、精製β２ＧＰＩを緩衝液交換し、濃縮するための、ＴＦＦシステムの使用を含む。β２ＧＰＩはこのように発現および精製され、新たなアッセイ形式において使用されている。
【０４２８】
上記の節Ａ３に加えて、特定の好ましいバビツキシマブ−ＨＲＰ検出剤は、２つの一般に使用されている非専売の架橋剤であるＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）またはＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート）のいずれかを使用して架橋された共役体である。他の好ましいバビツキシマブ−ＨＲＰ検出剤は、ＨＲＰの数がバビツキシマブ抗体の数を超える共役体、特に２：１または３：１のＨＲＰ：バビツキシマブ比をもたらし、本質的に遊離（非共役）抗体を有しないものである。そのようなコンジュゲートは、Ｓ−３００サイズ分類カラムによって精製されて、未反応の反応構成成分が除去される。これらの成分および特性の各々を有するバビツキシマブ−ＨＲＰ検出剤は、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、４９８５  Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ  Ｂｌｖｄ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２１７０３から得られ、新たなアッセイ形式において６００ｎｇ／ｍｌで使用されている。
【０４２９】
特に技術的な理由から、上記の代替的な構成要素およびアッセイステップのうちの１つ以上が好ましいが、全てのそのような代替物の併用でさえも、本実施例（すなわち、節Ａ１〜Ａ８）において最初に記載したアッセイと本質的に同じ結果をもたらす機能性β２ＧＰＩが提供される。そのような比較結果を以下の表１２に示し、この表は、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから得た４つの無作為ヒト試料（ドナー）を使用して、２つの異なるアッセイ形式で測定される機能性β２ＧＰＩレベルを提示する。
【表１５】
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【０４３０】
実施例ＸＶＩＩ
バビツキシマブ第ＩＩＩ相試験におけるβ２ＧＰＩバイオマーカー分析
上記の機能性β２ＧＰＩアッセイを利用して、本実施例は、実施例ＸＩＶの第ＩＩＩ相試験の患者における治療前の機能性β２ＧＰＩのレベルを報告する。機能性β２ＧＰＩのレベルを治療結果と相関させることによって、本実施例はまた、バビツキシマブおよびドセタキセルならびに他の併用療法で治療したＮＳＣＬＣ患者におけるものなどの、バビツキシマブ治療の成功のためのバイオマーカーとしての機能性β２ＧＰＩにも関する。
【０４３１】
Ａ．患者における機能性β２ＧＰＩレベル
上記の第ＩＩＩ相試験には５９７人の患者を集めた。第ＩＩＩ相試験における患者の血液試料の収集は、実施例ＸＶ、Ａに記載されている。本分析の時点で、機能性β２ＧＰＩが評価可能な５９２の患者試料が存在した。これらの５９２人の患者の血液試料の部分アリコートを、直前の実施例に記載されるアッセイを使用して機能性β２ＧＰＩについて試験した。
【０４３２】
μｇ／ｍｌでの治療前の機能性β２ＧＰＩのレベルおよび統計の要約を表１３に示し、表中、「バビツキシマブ」列はバビツキシマブ＋ドセタキセルで治療した患者を指し、「プラセボ」列はドセタキセル単独で治療した患者を指す。
【表１６】
2019537619.tif 000021
【０４３３】
治療前の機能性β２ＧＰＩのレベルは０．５〜４０２μｇ／ｍｌの範囲であり、全ての患者の機能性β２ＧＰＩの分布を図１７Ａおよび図１７Ｂに示す。バビツキシマブ＋ドセタキセルで治療した患者において、機能性β２ＧＰＩは、図１７Ｃに示されるように、２２〜３６５μｇ／ｍｌの範囲であった。ドセタキセル単独で治療した患者における機能性β２ＧＰＩの分布を図１７Ｄに示し、これはこの研究の全範囲を網羅する（０．５〜４０２μｇ／ｍｌ）。
【０４３４】
各治療群（２０２および１９５μｇ／ｍｌ）について、ならびに研究全体（１９８μｇ／ｍｌ）について、治療前の機能性β２ＧＰＩのレベルは文献に報告されている２００μｇ／ｍｌの平均と一貫している（２０ｍｇ／ｄｌはＭｅｈｄｉら、１９９９によって、および２００ｍｇ／ｌはＭｉｙａｋｉｓら、２００４によって）。
【０４３５】
２００μｇ／ｍｌ以上の治療前の機能性β２ＧＰＩレベルを有する患者のパーセンテージは、バビツキシマブ＋ドセタキセルで治療した患者では５６％、およびドセタキセル単独で治療した患者では４９％であることが決定された。
【０４３６】
Ｂ．単一カットオフのβ２ＧＰＩバイオマーカー分析
バビツキシマブ＋ドセタキセル療法を受けている患者における応答の予測因子としての機能性β２ＧＰＩを評価するために実行したサブグループ分析は、生存期間の延長に対する強い傾向を実証した。
【０４３７】
まず単一カットオフ法を使用して、患者のβ２ＧＰＩデータを評価した。このように最適なカットオフを探索する上で、ステップ１は、バビツキシマブ＋ドセタキセル群の患者について、高β２ＧＰＩ群対低β２ＧＰＩ群のＯＳ分離または有意なＯＳ分離を探索することであり、ステップ２は、それらの高β２ＧＰＩ患者について、バビツキシマブ＋ドセタキセル群対ドセタキセル単独群（プラセボ）のＯＳ分離または有意なＯＳ分離を探索することである。
【０４３８】
評価可能な５７８人の患者に単一カットオフ法を適用することによる、可能性のあるバイオマーカーとしての機能性β２ＧＰＩの初期分析は、驚くべきことに、高β２ＧＰＩを有する患者において、バビツキシマブ＋ドセタキセル群の１６７人の患者ではｍＯＳが１１．９ヶ月（９５％のＣＩ、９．０〜１４．７）であり、ドセタキセル単独群の１４１人の患者では９．４ヶ月（９５％のＣＩ、７．７〜１１．７）（死亡ＨＲ、０．７７；Ｐ＝０．１）であることを示した。これらの初期分析において、「高β２ＧＰＩ」は、２００μｇ／ｍｌ以上（≧２００μｇ／ｍｌ）の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルと定義される。これらの分析は単一カットオフに基づいているため、「高β２ＧＰＩ」を有しない患者は、２００μｇ／ｍｌ未満（＜２００μｇ／ｍｌ）の機能性β２ＧＰＩを有する。
【０４３９】
その後、単一カットオフ分析を評価可能な５９２人の患者に拡大した。統計的に有意ではないが、これらの分析もまた、患者が２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルを有するときに、バビツキシマブ＋ドセタキセル群において生存期間が延長する驚くべき傾向を実証した。これらの結果は、図１８Ａおよび図１８Ｂにおいて、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩについて、カプランマイヤー生存曲線によって表される。評価可能な５９２人の患者のうち、図１８Ａは、バビツキシマブで治療した患者について、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する者（１６７人の患者）が１１．４ヶ月のｍＯＳを有したのに対し、２００μｇ／ｍｌ未満の「低β２ＧＰＩ」を有する１２７人の患者ではｍＯＳが９．８ヶ月に過ぎなかったことを示す（死亡ＨＲ、０．７６；Ｐ＝０．０５４、ＣＩ（０．５８、１．０１））。図１８Ｂに示されるように、無作為化患者のうちの約５２％となる２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルを有する患者において、バビツキシマブ＋ドセタキセル群の１６７人の患者におけるｍＯＳは１１．４ヶ月（９５％のＣＩ、８．４〜１６．６）であり、ドセタキセル単独群の１４６人の患者におけるｍＯＳは１０．２ヶ月（９５％のＣＩ、８．５〜１１．９）であった（死亡ＨＲ、０．８２；Ｐ＝０．１３４、ＣＩ（０．６３、１．０６））。
【０４４０】
Ｃ．２カットオフのβ２ＧＰＩバイオマーカー分析
上記の単一カットオフ分析後に、２カットオフ法を使用して、５９２人の評価可能な患者におけるデータをさらに分析した（Ｋｌｅｉｎ＆Ｍｏｅｓｃｈｂｅｒｇｅｒ、２００３）。２カットオフ法において、ステップ１は、バビツキシマブ（＋ドセタキセル）で治療した患者の「範囲内」対「範囲外」のＯＳの有意な分離を検索することであり、ステップ２は、「範囲内」の患者のバビツキシマブ群対プラセボ群の有意なＯＳ分離を探索することである。
【０４４１】
５９２人の評価可能な患者における２カットオフ法を使用するこれらのサブグループ分析は、各々が２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩで始まるバビツキシマブの生存利益を示す、いくつかの統計的に有意な範囲の機能性β２ＧＰＩを生成し、したがって、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルがバビツキシマブでの治療に有益であるという初期の驚くべき発見を確認した。特に、２カットオフ法は、２１０〜２７０、２１０〜２８０、２１０〜２９０、２００〜２８０、および２００〜２９０μｇ／ｍｌの範囲の各々にある機能性β２ＧＰＩの治療前レベルが、ドセタキセル単独で治療した患者に対して、バビツキシマブ＋ドセタキセルで治療した患者の全生存期間における利益の統計的に有意な予測因子であることを示した。２１０〜２７０、２１０〜２８０、２１０〜２９０、２００〜２８０、および２００〜２９０μｇ／ｍｌの機能性β２ＧＰＩ範囲についてのこれらの結果を、表１４Ａおよび表１４Ｂに示す。
【表１７】
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【表１８】
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【０４４２】
表１４Ａの結果をまとめると、２１０〜２７０、２１０〜２８０、２１０〜２９０、２００〜２８０、および２００〜２９０μｇ／ｍｌの機能性β２ＧＰＩの範囲の各々は、１未満のハザード比および生存期間の改善を表す統計的に有意なＰ値を有する。表１４Ｂは、当然、それらの述べられる範囲外の機能性β２ＧＰＩを有する患者が、１超のハザード比および生存期間の悪化（または死亡率の増加）を表す統計的に有意なＰ値を有するという点において反対を示す。例えば、無作為化患者の約４９％となる治療前のβ２ＧＰＩレベルが２００〜２９０μｇ／ｍｌの患者は、バビツキシマブ（＋ドセタキセル）で治療した場合に１１．４ヶ月のｍＯＳを有したのに対して、同じ範囲のβ２ＧＰＩレベルを有する対照群の患者では、１０．１ヶ月であった。１０．１ヶ月に対する１１．４ヶ月のこの増加は、ｍＯＳの統計的に有意な改善を反映している（ＨＲ０．７６、Ｐ＝０．０４９）。
【０４４３】
２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルが、バビツキシマブ治療時に生存期間が延長する傾向を示すという示唆は文献には存在せず、２１０〜２７０、２１０〜２８０、２１０〜２９０、２００〜２８０、および２００〜２９０μｇ／ｍｌの機能性β２ＧＰＩの治療前レベルが、バビツキシマブで治療した患者の全生存期間における利益を予測するという示唆も存在しない。実際に、バビツキシマブの有意な以前の臨床経験には、そのような結果を示唆するものは何もない。さらに、そのような発見は、広範な前臨床モデリングからのデータと非常に矛盾しており、これは、様々なレベルの血清β２ＧＰＩがバビツキシマブの治療結果に有意な影響を及ぼさないことを示した。特に、臨床前の経験は、むしろ約１０〜２０から５０〜６０μｇ／ｍｌ程度などの非常に低いレベルの血清β２ＧＰＩが、バビツキシマブの結合および活性を支持するのに十分であることを示した（実施例Ｖ）。
【０４４４】
特に、異なるアッセイを使用して、実施例Ｖは、０．１２〜０．２５（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄと共に、図９Ａおよび図９Ｂ）、０．１２５、０．５〜２（図１０）、０．９３（図１１）、ならびに１．４３〜２．８６（図１２）のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比が、ＰＳへのバビツキシマブの結合を支持する上で有効であることを示す。バビツキシマブが約２．８６のβ２ＧＰＩ対抗体のモル比で有効であることを示す前臨床データ（表３）を含む、いくつかの異なる結合および機能試験システムを考慮すると、β２ＧＰＩ対抗体のモル比は３を超える必要はない。本第ＩＩＩ相試験において３ｍｇ／ｋｇの用量のバビツキシマブを使用すると、そのような比は６０μｇ／ｍｌ未満のβ２ＧＰＩレベルで達成される（図１９）。参考のために、第ＩＩＩ相試験のβ２ＧＰＩの量、抗体の量、および相当するβ２ＧＰＩ−抗体比を表１５に示し、表中、Ｎ＝定義された各増分内の機能性β２ＧＰＩレベルを有する患者数（５９２人の評価可能な患者から）である。
【表１９】
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【０４４５】
表１５および図１７Ａをモデリングに使用したデータ（表１、表２、および表３）と比較すると、第ＩＩＩ相試験の大多数の患者は、バビツキシマブがその最大血中濃度である（５６．４μｇ／ｍｌのＣｍａｘ；実施例ＶＩ；Ｇｅｒｂｅｒら、２０１１）場合ですら、バビツキシマブ結合を飽和させるのに十分過ぎるほどである（２．８６以上）、すなわち、６０μｇ／ｍｌまたは１．２μＭ（表１５、図１９）から始まる、β２ＧＰＩ対抗体モル比に一致する機能性β２ＧＰＩのレベルを有していたことが理解され得る。実際に、５９２人の評価可能な患者のうち４人（０．６８％）が、６０μｇ／ｍｌ未満の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルを有していた。さらに、機能性β２ＧＰＩのレベルが増加する（これは試験における大多数の患者に当てはまる）場合、β２ＧＰＩ対バビツキシマブのモル比は２または３よりはるかに高く、２００μｇ／ｍｌで１０を超える。以前の前臨床モデリングまたは臨床経験では、そのようなβ２ＧＰＩレベルまたは比がバビツキシマブ療法に有益であることを指摘するものは何もなかった。むしろ、図１９に示されるように、前臨床データは、約１０μｇ／ｍｌ以下から始まる低レベルの血清β２ＧＰＩ（５μｇ／ｍｌのβ２ＧＰＩは０．２５７のβ２ＧＰＩ：抗体モル比を有する）、および約６０μｇ／ｍｌでも簡単に、バビツキシマブの結合および活性を支持するのに十分であることを示した（実施例Ｖ）。
【０４４６】
予想外ではあったが、バビツキシマブの成績についての可能性のあるバイオマーカーとしての、機能性β２ＧＰＩの治療前レベルについてのこれらの詳細な分析は、非常に有望である。したがって、患者における機能性β２ＧＰＩの治療前濃度を測定することは、バビツキシマブ療法に対する応答を予測するための、すなわち、バビツキシマブでの治療から利益を得る可能性がより高いか、または最も可能性が高い患者を選択するための戦略を提供する。これは、特にＮＳＣＬＣにおいて、ドセタキセルと共にバビツキシマブを使用した場合に最初に観察された。しかしながら、機能性β２ＧＰＩおよびＰＳを有する複合体中でのバビツキシマブ結合の機構、および全体的なバビツキシマブの免疫活性化機構は、全てのバビツキシマブ療法に共通しているため、したがって、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルに基づく患者の選択は、これが治療結果を改善するという根拠の十分な期待の下でバビツキシマブを使用する全ての将来の試験および治療法に含めることができる。実際に、これを支持する更なる証拠が実施例ＸＶＩＩＩおよび実施例ＸＸに提供されている。
【０４４７】
実施例ＸＶＩＩＩ
更なるバビツキシマブ臨床試験におけるβ２ＧＰＩバイオマーカー分析
実施例ＸＶＩＩにおけるバビツキシマブ治療の成功のバイオマーカーとしての機能性β２ＧＰＩの特定に続いて、本実施例は、機能性β２ＧＰＩアッセイの使用を、より初期のバビツキシマブ臨床試験の試料に拡大する。以下の結果は、同じレベルの機能性β２ＧＰＩがバビツキシマブの成功した治療結果とも相関することを示し、したがって、機能性β２ＧＰＩがバビツキシマブのバイオマーカーとして確認される。
【０４４８】
Ａ．実施例ＸＩＩＩの第ＩＩ相試験
実施例ＸＩＩＩのＮＳＣＬＣ第ＩＩ相試験（ＰＰＨＭ０９０２）の試料を、実施例ＸＶＩの機能性β２ＧＰＩアッセイを使用して試験した。機能性β２ＧＰＩの治療前レベルが評価可能な１１９人の患者の試料があり、そのうち４０人の患者がバビツキシマブ３ｍｇ／ｋｇ群におり、７９人の患者が複合対照群（プラセボまたは１ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブ）にいた。
【０４４９】
機能性β２ＧＰＩの治療前レベルは、全患者について０．５〜２６６μｇ／ｍｌの範囲であった（図２０Ａ）。バビツキシマブ３ｍｇ／ｋｇ＋ドセタキセルで治療した患者では、機能性β２ＧＰＩは０．５〜２６６μｇ／ｍｌの範囲であった（図２０Ｂ）。複合対照群の患者における機能性β２ＧＰＩの分布は０．５〜２５７．４μｇ／ｍｌであった（図２０Ｃ）。各治療群（バビツキシマブ３ｍｇ／ｋｇでは１６９．４μｇ／ｍｌ、および複合対照群では１７１．８μｇ／ｍｌ）について、ならびに研究全体（１７１．０μｇ／ｍｌ）について、機能性β２ＧＰＩの治療前レベルは文献に報告されている平均と一貫している。
【０４５０】
２００μｇ／ｍｌ以上（≧２００μｇ／ｍｌ）の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルとして定義される、「高β２ＧＰＩ」のカットオフを使用して、バビツキシマブ  ３ｍｇ／ｋｇ群では、２００μｇ／ｍｌ以上のβ２ＧＰＩが全生存期間の増加と共に増加する傾向がある（図２１Ａおよび図２１Ｂ）が、他方の群ではそのような傾向はない（図２１Ｃ）と決定した。例えば、３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブで治療した患者について、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する者は１６．８ヶ月のｍＯＳを有したのに対して、２００μｇ／ｍｌ未満の「低β２ＧＰＩ」ではわずか９．４ヶ月であった（図２１Ａ）。また、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者において、３ｍｇ／ｋｇのバビツキシマブで治療した患者の１６．８ヶ月のｍＯＳは、複合対照群の患者のわずか８．７ヶ月のｍＯＳを超えていた（図２１Ｂ）。図２１Ａおよび図２１Ｂの各々における曲線の明確な分離を、図２１Ｃの上重ね曲線と対比されたい（複合対照群の２００μｇ／ｍｌ以上のβ２ＧＰＩを２００μｇ／ｍｌ未満のβ２ＧＰＩと比較）。
【０４５１】
Ｂ．実施例ＸＩＩの第ＩＩ相試験
実施例ＸＩＩの第ＩＩ相膵臓癌試験の試料（ＰＰＨＭ１００２）を、実施例ＸＶＩの機能性β２ＧＰＩアッセイを使用して試験した。機能性β２ＧＰＩの治療前レベルが評価可能な３１の患者試料があった。機能性β２ＧＰＩの治療前レベルは、全患者について８２．５〜３４３．２μｇ／ｍｌの範囲であった（図２２）。これら３１人の患者について、治療前の機能性β２ＧＰＩの平均レベル（２１９．２μｇ／ｍｌ）は文献に報告されている平均と一貫していた。
【０４５２】
試料サイズが小さく、かつ疾患が非常に侵襲性はであるが、２００μｇ／ｍｌ以上（≧２００μｇ／ｍｌ）の機能性β２ＧＰＩの「高β２ＧＰＩ」のカットオフを使用して、バビツキシマブについて、２００μｇ／ｍｌ以上のβ２ＧＰＩが全生存期間の増加と共に増加する傾向があることを決定した。２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有するバビツキシマブで治療した患者は、７．４ヶ月のｍＯＳを有したのに対して、２００μｇ／ｍｌ未満の「低β２ＧＰＩ」では５．３ヶ月であった（図２３）。
【０４５３】
Ｃ．ＮＳＣＬＣにおけるバビツキシマブおよびパクリタキセル／カルボプラチンの第ＩＩ相試験
バビツキシマブ併用または非併用のパクリタキセル／カルボプラチンの無作為化非盲検第ＩＩ相試験（ＰＰＨＭ１００１）を、治療歴のない局所進行または転移性非扁平上皮ＮＳＣＬＣを有する患者において実行した。この試験の試料を、実施例ＸＶＩの機能性β２ＧＰＩアッセイを使用して試験した。機能性β２ＧＰＩの治療前レベルが評価可能な８４の患者試料があり、そのうち４４人の患者がバビツキシマブ群に、４０人の患者がパクリタキセル／カルボプラチン群にいた。
【０４５４】
機能性β２ＧＰＩの治療前レベルは、全患者について０．５〜３２６μｇ／ｍｌの範囲であった（図２４Ａ）。バビツキシマブで治療した患者内では、機能性β２ＧＰＩは０．５〜３２６μｇ／ｍｌの範囲であった（図２４Ｂ）。パクリタキセル／カルボプラチン群の患者における機能性β２ＧＰＩは、８８．８〜２９２．７μｇ／ｍｌの範囲であった（図２４Ｃ）。各治療群（バビツキシマブでは１８７．９μｇ／ｍｌ、パクリタキセル／カルボプラチン群では１８６．４μｇ／ｍｌ）について、および研究全体（１８７．２μｇ／ｍｌ）について、機能性β２ＧＰＩの治療前レベルは、ここでもまた文献に報告されている平均と一貫している。
【０４５５】
２００μｇ／ｍｌ以上（≧２００μｇ／ｍｌ）の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルであるものと同じ「高β２ＧＰＩ」のカットオフを使用して、２００μｇ／ｍｌ以上のβ２ＧＰＩは、ここでもまたバビツキシマブ群においては全生存期間の増加と共に増加する傾向があるが、対照（パクリタキセル／カルボプラチン）群ではそのような傾向はないと決定した。例えば、バビツキシマブで治療した患者では、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者は１７．０ヶ月のｍＯＳを有したのに対して、２００μｇ／ｍｌ未満の「低β２ＧＰＩ」では１４．２ヶ月であった（図２５Ａ）。また、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者では、バビツキシマブで治療した患者の１７．０ヶ月のｍＯＳは、対照群の患者のわずか１３．２ヶ月のｍＯＳを超えた（図２５Ｂ）。図２５Ａおよび図２５Ｂ、特に図２５Ａにおける曲線の分離を、対照群の患者についてβ２ＧＰＩが２００μｇ／ｍｌ未満の場合により長期間生存する傾向が存在する図２５Ｃと対比されたい。
【０４５６】
結論として、４つの別個の臨床試験からの実施例ＸＶＩＩおよび実施例ＸＶＩＩＩのデータは、機能性β２ＧＰＩレベルが治療結果と相関し、したがって機能性β２ＧＰＩレベルをバビツキシマブ治療の成功のバイオマーカーとして確認することを一貫して示している。
【０４５７】
実施例ＸＩＸ
後続免疫療法との併用におけるバビツキシマブの生存期間
実施例ＸＩＶの第ＩＩＩ相試験の初期の分析は、ドセタキセル単独群と比較して、バビツキシマブ＋ドセタキセル群において優れたＯＳを示さなかったが、バビツキシマブ治療に対する治療的利益の他の可能性のある指標を特定する目的で、進行中の研究を実行した。本実施例は、バビツキシマブおよびドセタキセル、その後に後続免疫療法（ＳＡＣＴ−ＩＯ）で治療した患者は、ドセタキセル単独、その後に免疫療法で治療した患者とは対照的に、統計的に有意なより良好なｍＯＳを有することを示す。
【０４５８】
バビツキシマブおよびドセタキセル、またはドセタキセル単独のいずれかによる治療の後、患者の約１５％（５９７人中９３人）が、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を使用する後続免疫腫（ＩＯ）療法（ＳＡＣＴ−ＩＯ）の形態で後続抗癌療法（ＳＡＣＴ）を受けた。これらの９３人の患者は、治療群間で等しく均衡が取れており、４６人の患者がバビツキシマブおよびドセタキセルによる前治療を受け、４７人の患者がドセタキセル単独による前治療を受けた。
【０４５９】
驚くべきことに、後続ＩＯで治療した場合、プラセボとは対照的に、バビツキシマブでの前治療を受ける患者では、ｍＯＳの劇的な増加が存在することが決定された（図２６）。特に、後続ＩＯを受ける患者について、バビツキシマブおよびドセタキセル群では依然としてｍＯＳには到達していない（９５％のＣＩ、１５．２〜該当せず）一方で、ドセタキセル単独群では１２．６ヶ月（９５％のＣＩ、１０．４〜１７．８）  ；  ＨＲ＝０．４６およびｐ＝０．００６であった（図２６、表１６）。後続ＩＯを受けなかった患者では、ｍＯＳは、バビツキシマブおよびドセタキセル群で９．２ヶ月、ならびにドセタキセル単独群で１０．２ヶ月；ＨＲ＝１．１６およびｐ＝０．１７２であった。
【表２０】
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【０４６０】
後続ＩＯ群において、「第１の後続ＩＯ」の特定の免疫療法剤もまた特定した。バビツキシマブ（およびドセタキセル）ならびに後続ＩＯで治療した４６人の患者において、免疫療法剤を表１７に示し、それらは全て、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＰＤ−Ｌ１に結合する遮断抗体の形態のチェックポイント阻害剤抗体（免疫チェックポイント阻害剤）である。特に、使用した遮断抗体は、ＣＴＬＡ−４に結合する遮断抗体であるトレメリムマブ、ＰＤ−１に結合する遮断抗体であるニボルマブ、およびＰＤ−Ｌ１に結合する遮断抗体であるデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）であった。要約すると、４６人中４２人のバビツキシマブ患者は後続してニボルマブを受け、２人はデュルバルマブ単独療法を受け、２人はトレメリムマブ＋デュルバルマブを受けた（表１７）。
【表２１】
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【０４６１】
４人の患者が２回以上のＩＯ剤を受けたこと、すなわち、彼らの「第１の後続ＩＯ」療法自体が「ＩＯ併用」、すなわち、第１および第２のチェックポイント阻害剤抗体であったことに留意されたい。したがって、「ＩＴＴ」（治療意図）分析では、バビツキシマブで治療した４６人の患者が第１の後続ＩＯを受けたが、表１７では４８の後続ＩＯ剤が存在する。これは、２人の患者が「ＩＯダブレット」を受けたためである。全体として、４人の患者が２回以上の後続ＩＯを受け、これらの各々がＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）およびトレメリムマブのダブレットを受けた。これら４人の対象のうち、２人はバビツキシマブ群であり、２人はプラセボ群であった。
【０４６２】
後続ＩＯを受ける９３人の患者において、ドセタキセル単独（プラセボ）の治療歴のある患者もまた、トレメリムマブ、ニボルマブ、またはデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）を受けた。加えて、プラセボ群の２人の患者がペムブロリズマブ（以前のＭＫ−３４７５）を受け、プラセボ群の１人の患者がＲＥＧＮ２８１０を受け、これらはどちらもＰＤ−１に結合する遮断抗体である。全体として、プラセボ群の４７人の患者における第１の後続ＩＯは、トレメリムマブ（３人）、ニボルマブ（４０人）、デュルバルマブ（３人）、ペンブロリズマブ（２人）、およびＲＥＧＮ２８１０（１人）であり、これは４７人の患者において合計４９の薬剤であり、２人の患者がデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）−トレメリムマブのＩＯダブレットを受けた。すなわち、対照群の４７人中４０人の患者が後続してニボルマブを受け、  １人がデュルバルマブ単独療法を受け、１人がトレメリムマブ単独療法を受け、２人がトレメリムマブ＋デュルバルマブを受け、２人がペンブロリズマブを受け、１人がＲＥＧＮ２８１０を受けた。
【０４６３】
図２６は、無作為化からの時間に関して、後続ＩＯ前のバビツキシマブによる初期治療の生存利益を示す。後続ＩＯ前の初期バビツキシマブ治療の生存利益は、第１の後続ＩＯ治療からの時間として測定したときにさらにより顕著である。この文脈において、後続ＩＯを受ける患者について、バビツキシマブおよびドセタキセル群（９５％のＣＩ、１０．２〜該当せず）ではｍＯＳには依然として到達していない一方で、ドセタキセル単独群ではわずか６．２ヶ月（９５％のＣＩ、３．９〜８．７）；ＨＲ＝０．４２およびｐ＝０．００２であった。
【０４６４】
結論として、本実施例のデータは初めて、バビツキシマブがヒト患者において免疫療法剤の活性を増強することを示している。したがって、これらの結果は、免疫療法剤、特に免疫チェックポイント阻害剤との併用でのバビツキシマブによる癌患者の進行中および将来の治療を強く支持する。
【０４６５】
実施例ＸＸ
バビツキシマブおよび後続免疫療法のβ２ＧＰＩバイオマーカー分析
実施例ＸＩＸに示されるように、バビツキシマブ（＋ドセタキセル）および後続ＩＯで治療した患者は、ドセタキセル単独および後続ＩＯで治療した患者よりも著しく良好なｍＯＳを有する。本実施例は、バビツキシマブバイオマーカーとしての機能性β２ＧＰＩの使用をさらに確認し、これは、同じレベルの機能性β２ＧＰＩが免疫療法との併用でのバビツキシマブによる治療の成功とも相関することを示す。
【０４６６】
実施例ＸＶＩのアッセイを使用すると、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩレベルは、第ＩＩＩ相試験を含むバビツキシマブ治療の成功と相関することが示される（実施例ＸＶＩＩ）。２００μｇ／ｍｌ以上（≧２００μｇ／ｍｌ）の機能性β２ＧＰＩの治療前レベルであるものと同じ「高β２ＧＰＩ」のカットオフに基づいて、２００μｇ／ｍｌ以上のβ２ＧＰＩは、バビツキシマブおよび後続ＩＯで治療した患者では全生存期間の増加と相関するが、後続ＩＯを受けた対照患者では相関しないことを再度決定した。
【０４６７】
特に、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩを有する患者について、バビツキシマブおよび後続ＩＯで治療した患者ではｍＯＳには未だ到達していない一方で、ドセタキセルおよび後続ＩＯで治療した患者ではｍＯＳは１２．３ヶ月（１０．２〜１７．６）であった（図２７、ｐ＝０．００２）。実施例ＸＶＩＩのデータによって予測されるように、後続ＩＯなしの患者では、対照（９．２ヶ月）と比較して、バビツキシマブで治療した患者（１０．５ヶ月）において２００μｇ／ｍｌ以上のβ２ＧＰＩは依然として全生存期間の増加と共に増加する傾向があったが、曲線の分離は、後続ＩＯ患者について観察されたほどは顕著ではない（図２７）。バビツキシマブ治療とは対照的に、後続ＩＯありの患者および後続ＩＯなしの患者の両方について、対照群の患者では、β２ＧＰＩが２００μｇ／ｍｌ未満であるときに生存期間がより長くなる傾向がある。β２ＧＰＩが２００μｇ／ｍｌ未満である群のデータの詳細な分析は、β２ＧＰＩが２００μｇ／ｍｌ未満である群においてバビツキシマブ（ｎ＝１２）およびプラセボ（ｎ＝１９）ならびに後続ＩＯで治療した患者が比較的少数であることによって妨害される。
【０４６８】
したがって、これらの臨床データは、２００μｇ／ｍｌ以上の機能性β２ＧＰＩが、免疫療法との併用での、特にトレメリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ、およびアテゾリズマブなどの免疫チェックポイント阻害剤との併用での、バビツキシマブによる治療の成功のバイオマーカーであることを示す。
＊      ＊      ＊
【０４６９】
本明細書に開示および主張される組成物および方法の全ては、本開示を考慮して、過度の実験をすることなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を、好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく、本組成物および方法、ならびに本明細書に記載の方法のステップまたはステップの順序に変更を適用することができることは、当業者に明らかだろう。より具体的には、同じまたは類似の結果を達成しながら、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤が本明細書に記載の薬剤に取って代わってもよいことは明らかだろう。当業者に明らかであるそのような類似の代替および変更は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲、および概念の範囲内にあると見なされる。
【０４７０】
参考文献
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Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｕｇｍｅｎｔ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ”，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８（１）：５０，ＤＯＩ  １０．１１８６／ｓ１３０５８−０１６−０７０８−２，２０１６ａ．
Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，”ＬＡＧ３  ｉｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｗｈｏｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｐｏｓｔｅｒ  Ｂ０１９，ＣＲＩ−ＣＩＭＴ−ＥＡＴＩ−ＡＡＣＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２５−２８，２０１６ｂ．
Ｇｒｅｇｏｒｃ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｅｃｏｎｄ−ｌｉｎｅ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｏｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（ＰＲＯＳＥ）：ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ−ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｐｈａｓｅ  ３  ｔｒｉａｌ”，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１５（７）：７１３−７２１，２０１４．
Ｈａｇｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ｋｉｌｌｓ  ｈｕｍａｎ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｐｒｏｔｏｚｏａｎ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ”，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６９（１）：５１−５８，１９９８．
Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ”，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３（１７）：５２１１−５２１８，２００７．
Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｄａｍａｇｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ”，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１５（２２）：６８７１−８０，２００９．
Ｈｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｔｕｍｏｒｓ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：２７５−２８７，２０１１．
Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｄｏｃｅｔａｘｅｌ（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｒｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  ｃｅｎｔｅｒ”，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，１（１３）：１１９１−２００，２００２．
Ｈｕａｎｇ，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｔｈｏｒｐｅ，”Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｏｃｅｔａｘｅｌ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６５（１０）：４４０８−４４１６，２００５．
Ｈｕｎｔ，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｋｒｉｌｉｓ，”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  β２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔｉｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２１４１−２１４５，１９９３．
Ｈｕｎｔ  ａｎｄ  Ｋｒｉｌｉｓ，”Ｔｈｅ  ｆｉｆｔｈ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  β２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ（Ｃｙｓ２８１−Ｃｙｓ２８８）  ａｎｄ  ａ  ｒｅｇｉｏｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：６５３−６５９，１９９４．
Ｉｏａｎｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  Ｉ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  β２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ：ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｒ３９  ｔｏ  Ｒ４３”，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，５６（１）：２８０−９０，２００７．
Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｕｓｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，”ＨＩＶ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：Ｔｒｏｊａｎ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｒｉｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔｒｏｊａｎ  ｈｏｒｓｅ？”，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ，６（３）：ｅ１０００７４０，２０１０．
Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  Ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ａｒｓｅｎｉｃ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  Ｂｉｎｄｓ  Ｅｘｐｏｓｅｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ”，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１４（５）：１３７７−１３８５，２００８．
Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，”ＴＩＭ−Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｖｉｒｉｏｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ”，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，９（３）：ｅ１００３２３２；  ２０１３．
Ｊｕｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｌａｐｓｅｓ  ａｆｔｅｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ”，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，１４：３５２−３５９，２０１２．
Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１，ｐｐ  ６４７−６６９  ｉｎ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ．
Ｋａｍｂｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＩＶ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈ（β２−Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ）”，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４２：４５２−４５７，１９８８．
Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ  ａ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｒｉｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ”，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｅｈｙ．２０１５．０１．０３７，２０１５．
Ｋｌｅｉｎ  ＆  Ｍｏｅｓｃｈｂｅｒｇｅｒ，”Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｎｓｏｒｅｄ  ａｎｄ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｄａｔａ”，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３（ＩＳＢＮ−１０：０３８７９５３９９Ｘ；  ＩＳＢＮ−１３：９７８−０３８７９５３９９１）．
Ｋｏｇｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｅｍｐｏｒａｒｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ，ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ”，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ，１２６：２９−３８，２００３．
Ｌａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｕｓｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）  Ｂｉｏａｓｓａｙ”，ＩＢＣ’ｓ  ２３ｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓａｙｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｙ  １４−１６，２０１３；  Ｐｏｓｔｅｒ  Ｂｏａｒｄ  ＃７．
Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ（ＰＳ）  ｉｓ  Ｅｘｐｏｓｅｄ  ｉｎ  Ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：ＰＳ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ”，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，５６：７１３７−７１４５，２０１５．
Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｐ５３  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ：Ａｎ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｔｕｍｏｒｓ”，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，１２５：４０７−４２０，２０１１．
Ｌｏｎｓｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ａｓ  ａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ａｎｄ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，２０１１  Ｌａｓ  Ｖｅｇａｓ，ＮＶ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｗ１５−０４８．
Ｌｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  β２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ３Ｇ４  ａｎｄ  Ａｎｉｏｎｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｏｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１（４０）：２９８６３−２９８７１，２００６．
Ｍａｌｌａｔ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｓｈｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  Ｐｌａｑｕｅｓ”，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９９：３４８−３５３，１９９９．
Ｍａｒｃｏｎｅｓｃｕ  ＆  Ｔｈｏｒｐｅ，”Ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｈｓｏｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ａｎｄ  Ａｎｉｏｎｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１７７８（１０）：２２１７−２２２４，２００８．
ＭｃＮｅｉｌ，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｃｈｅｓｔｅｒｍａｎ，Ｋｒｉｌｉｓ，”Ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｈａｔ  ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ａ  ｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ：β２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈ）”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（１１）：４１２０−４１２４，１９９０．
Ｍｅｃｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｕｔｉｌｉｚｅｓ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０７（４７）：２０３７０−２０３７５，２０１０．
Ｍｅｃｋｅｓ  ａｎｄ  Ｒａａｂ−Ｔｒａｕｂ，”Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８５（２４）：１２８４４−１２８５４，２０１１．
Ｍｅｈｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈ（β２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ）  ｇｅｎｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｐｌａｓｍａ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ”，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０５：６３７１，１９９９．
Ｍｅｅｒｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  ＴＩＭ  ａｎｄ  ＴＡＭ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ”，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ，１２（４）：５４４−５５７，２０１２．
Ｍｅｒｃｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，”Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｕｓｅｓ  ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｍｉｍｉｃｒｙ  ｔｏ  ｅｎｔｅｒ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：５３１−５３５，２００８．
Ｍｉｙａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，”β２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ  −  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１１４：３３５−３４６，２００４．
Ｍｏｌｌｅｒ−Ｔａｎｋ  ＆  Ｍａｕｒｙ，”Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ｏｆ  ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４６８−４７０（２０１４）  ５６５−５８０，２０１４．
Ｍｏｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＣＣＲ５−ｔｒｏｐｉｃ  ＨＩＶ−１  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  β−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ”，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０７（４）：７６３−７７６，２０１０．
Ｍｏｒｉｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇａｓ６  ｂｒｉｄｇｅｓ  ｖｉｒｉｏｎ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  Ｃ２５４  ｔｏ  ｔｈｅ  ＴＡＭ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ａｘｌ  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｖｉｒａｌ  ｅｎｔｒｙ”，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ，９：２８６−２９８．２０１１．
Ｍｕｒａｔａ−Ｋａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  Ｅｘｐｌｏｉｔｓ  Ｈｏｓｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣａｇＡ  Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ，７：３９９−４１１，２０１０．
Ｐａｌｍｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｆｉｎａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ＳＵＮＲＩＳＥ：Ａ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ，Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，Ｄｏｕｂｌｅ−Ｂｌｉｎｄ，Ｐｌａｃｅｂｏ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ  Ｐｌｕｓ  Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｓｔａｇｅ  ＩＩＩｂ／ＩＶ  Ｎｏｎｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ”，Ａｎｎａｌｓ  Ｏｎｃｏｌ．，２８（Ｓｕｐｐｌ．５）：４８７，Ａｂｓｔｒａｃｔ  １３６４Ｐ，２０１７．
Ｐａｔｔａｎａｐａｎｙａｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｆｅｂｒｉｌｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐａｒａｓｉｔｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ”，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｐａｒｔ  Ａ，７７Ａ：５１５−５２３，２０１０．
Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＆  Ｋｒｏｇｆｅｌｔ，”Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ：ａｎ  ｉｎｖａｄｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ？Ａ  ｒｅｖｉｅｗ”，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：１１７−１２６，２００３．
Ｐｏｌｚ，Ｗｕｒｍ，Ｋｏｓｔｎｅｒ，”Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  β２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ｉ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  −  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１：２６５−２７０，１９８０．
Ｐｒａｋａｓａｍ  ａｎｄ  Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ，”β２−Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ  −  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，Ｉｎ  Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｅｄ．Ａｌｅｎａ  Ｂｕｌｉｋｏｖａ，ＩＳＢＮ：９７８−９５３−５１−０５２６−８，ＩｎＴｅｃｈ，Ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋｓ／ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−ｓｙｎｄｒｏｍｅ／ｂｅｔａ２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｉ−ｉｎ−ｓｅａｒｃｈ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２０１２．
Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ”，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１１：１５５１−１５６２，２００５．
Ｓａｂａｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｙｐｅ  １  Ａｎｄ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１：２８４０−２８４５，２００２．
Ｓａｈａ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎ  Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  Ｌｕｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｅ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｍｉｃｒｏｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒａｔｓ”，Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．，１７４：６２−７１，２０１０．
Ｓｃｈｕｂｅｒｔ−Ｕｎｋｍｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ”，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７５（２）：８９９−９１４，２００７．
Ｓｅａｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ  ｅｘｐｏｓｅｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ１  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｉｎｇ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｅｖａｓｉｏｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，３２４（２）：７４４−７５２，２００４．
Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  β２−Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ  Ｎｕｌｌ  Ｍｉｃｅ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（１７）：１３８１７−１３８２１，２０１１．
Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｖｉｒａｌ  ｅｎｔｒｙ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，９：４８９３−４８９７，２０１４．
Ｓｏａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｖｉｒａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４（１２）：１３５７−１３６２，２００８．
Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ＡＫＩ”，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｋｉ．２０１５．２６，２０１５．
Ｓｔａｆｆｏｒｄ  ＆  Ｔｈｏｒｐｅ，”Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ”，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，１３：２９９−３０８，２０１１．
Ｓｔａｆｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＥＴ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２４−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｔｈａｔ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ”，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，８（１２）：ｅ８４８６４，２０１３．
Ｓｔｅｉｎｋａｓｓｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  β２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７７：３８７−３９１，１９９１．
Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ２  ｓｉｂｌｉｎｇｓ  ｗｉｔｈ  β２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ”，Ｂｌｏｏｄ，９６：１５９４−１５９５，２０００．
米国特許出願第ＵＳ２０１６／０００９８０５号。
米国特許第５，０１９，３６８号
米国特許第５，８８２，６２６号
米国特許第７，２４７，３０３号
米国特許第７，４２２，７３８号
米国特許第７，４５５，８３３号
米国特許第７，５７２，４４８号
米国特許第７，６１１，７０４号
米国特許第７，７９０，８６０号
米国特許第７，９０６，１１５号
米国特許第８，４８６，３９１号
米国特許第８，９５６，６１６号
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｌｅｉｊ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｏｓｔ−Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ：ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｌ  ｌｙｓｏ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（５０）：４８１２２−４８１２９，２００２．
Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＣＤ４＋  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ”’Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８２（３）：１５４８−１５５９，２００９．
Ｗａｎｄｅｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｖｉａｂｌｅ  ｍｅｔａｃｙｃｌｉｃｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ”，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，４（５）：ｅ５７３３，２００９．
Ｗａｎｄｅｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ  ａｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３５：１０９−１１９，２０１３．
Ｗａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  Ｇｒｅａｓｙ  Ｆｏｏｔｈｏｌｄ  ｆｏｒ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ”，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ，７：３３８−３３９，２０１０．
Ｗｅｉｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｉｔｉａｔｅ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ  ｖｉａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６５（２４）：１１５２９−１１５３５，２００５．
Ｗｉｌｌｅｍｓ，Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｐｅｌｓｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｖａｌｅｎｃｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−β２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｔｏ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：１３８３３−１３８４２，１９９６．
Ｗｕｒｍ，”β２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ｉ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈ）  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６：５１１−１５，１９８４．
Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｍ１  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，１（４）：２５６−２６８，２０１３．
Ｙｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  Ａｍｙｌｏｉｄ−β  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７（１４）：１０９７７−１０９８９，２０１２．
Ｚａｎｄｂｅｒｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｔ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．，１０３（３７）：１３８３７−１３８４２，２００６．
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｂｉｍｏｄａｌ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ”，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１８３：１１４−１２３，２０１４．
Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｘｐｏｓｅｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｌｉｏｍａ  Ｍｏｄｅｌ”，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４：３５５−３６４，２０１１．
Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｂｙ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ”，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：１−１０，２０１４．
【図１】
2019537619.tif 000027
【図２Ａ】
2019537619.tif 000028
【図２Ｂ】
2019537619.tif 000029
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2019537619.tif 000033
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2019537619.tif 000035
【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
2019537619.tif 000040
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
2019537619.tif 000049
【図１７Ｄ】
2019537619.tif 000050
【図１８Ａ】
2019537619.tif 000051
【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
2019537619.tif 000054
【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
2019537619.tif 000056
【図２１Ａ】
2019537619.tif 000057
【図２１Ｂ】
2019537619.tif 000058
【図２１Ｃ】
2019537619.tif 000059
【図２２】
2019537619.tif 000060
【図２３】
2019537619.tif 000061
【図２４Ａ】
2019537619.tif 000062
【図２４Ｂ】
2019537619.tif 000063
【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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