(57)【要約】  本発明は、血液凝固診断の分野に関し、Ｃｌａｕｓｓ法に従ってヒト血漿試料中のフィブリノゲン濃度を決定する動力学的方法に関する。
2019502094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｌａｕｓｓ法に従って血漿試料中のフィブリノゲン濃度を決定する方法であって：
血漿試料とトロンビンを含む反応混合物を提供する工程と、
反応混合物の吸光度値を経時的に測定する工程と、
経時的に測定された吸光度値から反応曲線を作成する工程と、
回帰法によって、最大吸光度変化を確定する工程と、
既知のフィブリノゲン濃度および最大吸光度変化の割り当てから作成された較正曲線を用いてフィブリノゲン濃度を決定する工程と
を含む、前記方法。
【請求項２】
回帰法は：
反応曲線の第１の仮最大吸光度変化が、予め決められた第１の回帰間隔を用いて決定される、第１の工程と、
第２の回帰間隔が、決定された第１の仮最大吸光度変化に基づいて、かつ予め決められたパラメータに基づいて決定される、第２の工程と、
第２の回帰間隔を用いて、最大吸光度変化が決定される、第３の工程と
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血漿試料とトロンビンを含む反応混合物を提供することは、血漿試料にトロンビンを加えることを含み、血漿試料にトロンビンを加えたときから反応混合物の吸光度値の測定の開始までの間に、０．５〜５秒、好ましくは３〜４秒の期間がある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
自動分析装置（１０）であって、
少なくとも１つのピペット分注デバイス（２１、２７）と、
光度または比濁測定ステーション（３０）と、
データ処理ユニットとを含み、
Ｃｌａｕｓｓ法に従って血漿試料中のフィブリノゲン濃度を決定する方法を制御するように構成された制御装置をさらに含み、該方法は：
血漿試料とトロンビンを含む反応混合物を提供する工程と、
反応混合物の吸光度値を経時的に測定する工程と、
経時的に測定された吸光度値から反応曲線を作成する工程と、
回帰法によって、最大吸光度変化を確定する工程と、
既知のフィブリノゲン濃度および最大吸光度変化の割り当てから作成された較正曲線を用いてフィブリノゲン濃度を決定する工程と
を含むことを特徴とする、前記自動分析装置。
【請求項５】
反応混合物を提供することを目的とする、反応容器のための第１の受け入れ位置（２２）と、
測定ステーション（３０）に割り当てられる、反応容器のための第２の受け入れ位置（３２）と、
第１の受け入れ位置から第２の受け入れ位置へと反応容器を輸送するデバイスと
をさらに含み、ここで、制御装置は、さらに：
第１の受け入れ位置（２２）において、反応容器内にある血漿試料にトロンビンを加えることによる反応混合物を含む反応容器を提供する工程、
反応容器を第１の受け入れ位置から第２の受け入れ位置（３２）へと輸送する工程、および、次いで
測定ステーション（３０）において反応混合物の吸光度値を経時的に測定する工程をさらに制御するように構成され、
血漿試料にトロンビンを加えたときから反応混合物の吸光度値の測定の開始までの間に、０．５〜５秒、好ましくは３〜４秒の期間がある、
請求項４に記載の自動分析装置（１０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固診断の分野に関し、Ｃｌａｕｓｓ法（Ｃｌａｕｓｓ  ｍｅｔｈｏｄ）に従ってヒト血漿試料中のフィブリノゲン濃度を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリノゲンは、傷を閉じるためのマトリックスを形成するフィブリンの水溶性前駆体である。凝固プロテアーゼトロンビン（因子ＩＩａ）は、フィブリノゲンを開裂し、このようにして、フィブリンの形成、すなわち凝血塊形成を起動する。フィブリノゲンレベルの低下は、出血に関する感受性に関連付けられる。フィブリノゲンレベルの急激な上昇は、術後の炎症および他の状況においてしばしばみられる。フィブリノゲンレベルの長期にわたる上昇は、血栓性疾患の危険を示すものと考えられる。
【０００３】
従来技術において、多種多様なフィブリノゲン濃度決定方法が知られている。
【０００４】
特許文献１には、トロンビンタイムの測定に基づいたフィブリノゲンの決定方法が記載されている。トロンビンタイムからは、フィブリノゲン濃度の正確な決定はできないことが分かっている。なぜなら、フィブリノゲンに加えて、たとえば、ヘパリンまたは直接的トロンビン阻害剤などの抗血液凝固剤、またはフィブリン開裂産物（ｐｒｏｄｕｃｔ）もしくはフィブリノゲン開裂産物の存在などの他の因子が、トロンビンタイムに影響を及ぼすことがあるからである。トロンビンタイムは、一般に、激しいフィブリノゲン欠損の場合にしか機能しない。トロンビンタイムを用いた方法では、通常、未希釈血漿試料が比較的少量のトロンビンと混合され、フィブリンの形成、すなわち反応混合物の吸光度変化が光度分析で測定され、その後、凝固時間が決定される。しかし、特許文献１によれば、凝固時間は、決定されず；その代わりに決定されるのは、反応曲線の一次導関数の最大値、換言すると、反応曲線の最大吸光度変化である。最大吸光度変化は、直接、フィブリノゲン濃度に相関することが分かっている。つまり、フィブリノゲン濃度は、既知のフィブリノゲン濃度と最大吸光度変化の割り当てから得られる較正曲線を使って決定することができる。
【０００５】
実質的により正確でありよく使用されるフィブリノゲン濃度の決定法は、Ｃｌａｕｓｓ法（非特許文献１）と称される。試験は、血漿試料がトロンビンと混合され凝固時間が決定される、トロンビンタイムの変形形態（ｖａｒｉａｎｔ）である。Ｃｌａｕｓｓ法では、反応混合物において比較的低濃度のフィブリノゲンが比較的高い標準的な濃度のトロンビンと混ぜ合わされ、その結果、事実上排他的に、フィブリン形成速度は、フィブリノゲン濃度に相関することになる。反応混合物における比較的低濃度のフィブリノゲンは、通常、希釈前の血漿試料の使用により作成される。
【０００６】
次いで、反応混合物において、フィブリンの形成、すなわち凝血塊形成が、光度分析で決定される。フィブリンの形成により、反応混合物は、濁りを増し、つまりフィブリンの形成は吸光度測定によって定量的に測定することができることを意味する。
【０００７】
次いで、通常は、試料の凝固時間が決定される。試料の凝固時間は、フィブリノゲンの量に対して比例的に推移する。試料の凝固時間は、試料にトロンビンを加えたときから、識別可能なフィブリンの形成、すなわち反応混合物の濁りの測定のときまでの時間である。これに関連して、「識別可能なフィブリンの形成」は、それが超えられたときに凝固時間を示す、試験固有および機器固有の閾値として定めることができる。あるいは、凝固反応の開始前と完了後のシグナルの差から生じる「識別可能なフィブリンの形成」は、それに到達したときに凝固時間を示す、試験固有および機器固有のシグナル差の値のパーセンテージ（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｓｉｇｎａｌ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｖａｌｕｅ）として定めることができる。Ｃｌａｕｓｓ試験におけるフィブリン形成の反応速度論（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は、トロンビンタイム試験におけるフィブリン形成の反応速度論とは著しく異なる。Ｃｌａｕｓｓ試験の場合、フィブリンの形成は、トロンビン試薬を加えてから早ければ３秒後のフィブリノゲン濃度に応じて、すなわち、フィブリンの形成が最も早くて１０秒後に始まるトロンビンタイム試験の場合よりも実質的に早くに始まる。さらに、Ｃｌａｕｓｓ試験の場合におけるフィブリンの形成速度は、少なくとも比較的高濃度の試料では、トロンビンタイム試験の場合よりも速い。したがって、Ｃｌａｕｓｓ試験の場合における高フィブリノゲン濃度の試料についての反応曲線は、トロンビンタイム試験と比較すると、短い遅滞期、急激上昇、および比較的迅速に到達されるプラトー期（ｐｌａｔｅａｕ  ｐｈａｓｅ）により区別される。Ｃｌａｕｓｓ試験の場合、低フィブリノゲン濃度の試料についての反応曲線は、同様に、トロンビンタイム試験の場合と比較すると、短い遅滞期、緩やかな上昇、および通常は測定完了後しか出現しないほど遅いプラトー期を示す。それとは対照的に、トロンビンタイムの場合、プラトー期は、明らかにより弱く示され、または完全に抜けてしまうこともある。
【０００８】
問題は、Ｃｌａｕｓｓ試験において、比較的高希釈の血漿試料が原因で、比較的低いシグナル強度しか達成されず、それによって光学システムにおける低いシグナル対ノイズの比の結果、および、たとえば冷却された試薬の使用によって起こることがある反応混合物中の気泡などの単なる軽微な障害の結果として、不正確な測定結果に至ることがある、という点である。
【０００９】
これらの問題を回避するため、従来技術では、非冷却の試薬を使用する、および／または、シグナルをブーストする（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）追加試薬としてカオリンが加えられる。
【００１０】
冷却されていない試薬の使用には、試薬の安定性が低減し、可能な限り迅速に使い切らなければならないという欠点がある。さらに、試薬コンテナの冷却収納位置は、排他的に、多くの場合において、最新の分析装置に設けられており、つまり非冷却の試薬を容易に提供することは不可能であることを意味する。同様に、シグナルをブーストする追加試薬の使用は、第一に、経済的な理由から、第二に、追加的に必要なピペット分注工程により試験の実行が延びることから、望ましくない。さらに、形成される凝血塊は、特に、低い血漿フィブリノゲンレベルの場合、凝集し、「フィブリン−カオリン泡」として反応混合物中を浮遊することがある。
【００１１】
さらなる問題には、Ｃｌａｕｓｓ試験において試料の凝固時間を決定する場合、測定は、理想的には、試料へのトロンビンの添加直後に開始されるべきである、ということがある。しかし、実際は、処理が分析装置において自動で行われる場合、反応容器にトロンビン試薬を加えてから、測定位置におけるその反応容器の配置までの間に短い期間が（数秒）経過する。しかし、非常に高い血漿フィブリノゲンレベルの場合、この短時間の間にすでに反応は開始しており、したがってシグナルが上昇する可能性がある。この場合、従来の凝固時間の決定は困難である。なぜなら、試験固有および機器固有の閾値か、あるいは凝固反応の開始および完了に基づいたシグナル差パーセンテージかのどちらかにより、「識別可能なフィブリンの形成」のために、開始値が分からなければならないからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＣＡ１０６２５０１
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃｌａｕｓｓ，Ａ．，Ｇｅｒｉｎｎｕｎｇｓｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ  Ｓｃｈｎｅｌｌｍｅｔｈｏｄｅ  ｚｕｒ  Ｂｅｓｔｉｍｍｕｎｇ  ｄｅｓ  Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ  ［Ｒａｐｉｄ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ−ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ］、１９５７年、Ａｃｔａｈａｅｍｔ．１７：２３７−２４６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の目的は、高い精度で自動的に行うことができ、非冷却試薬の使用、および、たとえばカオリンのようなシグナルをブーストする添加試薬の使用を省くことができるように、ヒト血漿試料中のフィブリノゲン濃度を決定するようにＣｌａｕｓｓ法を修正することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的は、もはや今までの通例の試料の凝固時間を決定する必要がなく、フィブリンの形成の反応速度論を測定し、フィブリノゲン濃度を決定するために反応速度を用いることによって、達成される。
【００１６】
したがって、本出願は、Ｃｌａｕｓｓ法に従ってヒト血漿試料中のフィブリノゲン濃度を決定する方法であって：
・血漿試料とトロンビンを含む反応混合物を提供する工程と、
・反応混合物の吸光度値を経時的に測定する工程と、
・経時的に測定された吸光度値から反応曲線を作成する工程と、
・回帰法によって、最大吸光度変化を確定する工程と、
・既知のフィブリノゲン濃度および最大吸光度変化の割り当てから作成された較正曲線を用いてフィブリノゲン濃度を決定する工程と
を含む、方法を提供する。
【００１７】
Ｃｌａｕｓｓ法による反応混合物、すなわち、（試料からの）比較的低濃度のフィブリノゲンと比較的高濃度のトロンビンの化合物を提供するための血漿試料とトロンビン単位の混合比、したがってその結果のフィブリン形成速度は、フィブリノゲン濃度に事実上排他的に相関することは、当業者には十分に知られている（Ｔｈｏｍａｓ，Ｌ．，Ｌａｂｏｒ  ｕｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｅ「Ｌａｂｏｒｙ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｅ」、第７版、ＴＨ−Ｂｏｏｋｓ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ、フランクフルト／マイン、２００８年、第１６．１５．２章参照）。
【００１８】
好ましくは、この目的で、反応混合物は、約０．０３〜０．４ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンと、約２５〜４０ＩＵ／ｍＬのトロンビンを含む。これらの濃度は、たとえば、緩衝液による被検血漿試料の約１：１０希釈液と、約１００ＩＵ／ｍＬトロンビンの濃度を有する緩衝トロンビン試薬を２：１の比率で混合することによって得ることができる。これは、約０．５ｇ／Ｌ〜６．０ｇ／Ｌのフィブリノゲン濃度を決定することができることを意味する。試料の前希釈を変えることによって、ヒトの血漿中のフィブリノゲンの生理学的に起こり得る範囲全体を測定することができる。
【００１９】
反応混合物の吸光度値の経時的な測定は、光度分析、すなわち、反応混合物を透過した光線の光減衰の測定によって、または比濁分析、すなわち、反応混合物を透過した光ビームの散乱光部分を測定することによって行うことができる。測定は、トロンビンを試料に加えた直後に開始され、吸光度値の測定は、フィブリンの形成が完了するまで連続的に行われることが理想である。しかし、実際には、手順が分析装置において自動的に行われる場合、トロンビン試薬を反応容器に加えて混ぜてから、測定位置に反応容器を配置するまでに、短い期間（数秒）経過する。
【００２０】
本発明による方法は、たとえば反応混合物がまず測定ステーションに輸送されなければならないことから吸光度値の即時の測定が不可能な試験プロトコルに特に適していることが判明した。反応混合物の提供が血漿試料にトロンビンを加えることを含む特定の一実施形態では、血漿試料にトロンビンを加えたときから反応混合物の吸光度値の測定の開始までの間に、０．５〜５秒、好ましくは３〜４秒の期間がある。
【００２１】
最大吸光度変化を確定するために使用される回帰法は、当業者に知られている動力学的評価法であり、第１の評価工程において大まかに確定される反応曲線の勾配に応じて、第２の評価工程において、最大反応速度、すなわち最大吸光度変化の算出のために、個々の最適化された回帰間隔（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）が決定される。
【００２２】
好ましくは、回帰法は：
・反応曲線の第１の仮最大吸光度変化が、予め決められた第１の回帰間隔を用いて決定される、第１の工程と、
・第２の回帰間隔が、決定された第１の仮最大吸光度変化に基づいて、かつ予め決められたパラメータに基づいて決定される、第２の工程と、
・第２の回帰間隔を用いて、最大吸光度変化が決定される、第３の工程と
を含む。
【００２３】
したがって、好ましくは、（可能な限りトロンビン添加時に近い）第１の測定値から始まる、所定の試験固有かつ機器固有の評価範囲内で、まず、勾配（＝反応速度または吸光度変化）が、最小二乗法に従った回帰によって試験固有かつ機器固有の回帰間隔にわたって計算される。この計算は、回帰間隔の開始点として、第２の測定値、第３の測定値、第４の測定値などを用いて何度も繰り返される。
【００２４】
こうして確定された仮の最大勾配（大まかな勾配）は、実証的に予め決められたパラメータである係数および指数を用いてべき関数によって最終回帰間隔を計算することに用いられる。負の指数によって、勾配が大きくなるにつれて回帰間隔がより短くなるという所望の効果が達成される。しかし、原理上は、最終回帰間隔の計算は、異なる方程式によって行う、またはソフトウェアに入っている表から集めることもできる。
【００２５】
計算により得られた最終回帰間隔を用いて、すでに上記で述べたように、再度、第１の測定値から始まる最小二乗法に従った回帰により、最終最大勾配が確定される。この計算は、回帰間隔の開始点として、第２の測定値、第３の測定値、第４の測定値などを用いて何度も繰り返される。
【００２６】
Ｃｌａｕｓｓ試験反応速度論の最大勾配を確定するためにこの２つの工程からなる回帰法を使用することによって、たとえば、実際の測定シグナルにオーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）し、したがって「誤った」最大勾配を含むことになる、反応混合物中の気泡などの反応速度論における障害があっても、高フィブリノゲン濃度の試料中のフィブリノゲン濃度、ならびに低フィブリノゲン濃度の試料中のフィブリノゲン濃度を正確に決定することが可能になることが判明した。
【００２７】
次いで、試料中のフィブリノゲン濃度の決定は、既知のフィブリノゲン濃度および最大勾配（＝最大吸光度変化）の割り当てから作成される較正曲線を使って行われる。
【００２８】
本発明は、さらに、自動分析装置であって、少なくとも１つのピペット分注デバイスと、光度または比濁測定ステーションと、データ処理ユニットとを含み、Ｃｌａｕｓｓ法に従って血漿試料中のフィブリノゲン濃度を決定する方法を制御するように構成された制御装置をさらに含み、該方法は：
・血漿試料とトロンビンを含む反応混合物を提供する工程と、
・反応混合物の吸光度値を経時的に測定する工程と、
・経時的に測定された吸光度値から反応曲線を作成する工程と、
・回帰法によって、最大吸光度変化を確定する工程と、
・既知のフィブリノゲン濃度および最大吸光度変化の割り当てから作成された較正曲線を用いてフィブリノゲン濃度を決定する工程とを含むことを特徴とする、自動分析装置を提供する。
【００２９】
そうした自動分析装置は、通常、非常に多くの試験法において、迅速、正確かつ再現可能に非常に多くの試料を分析するために、分析化学、法医学、微生物学および臨床診断に使用される。
【００３０】
上述した動力学的評価とあわせてＣｌａｕｓｓ試験の実行を制御するように構成される制御装置を含む本発明による分析装置は、前記分析装置が、フィブリノゲンの正確な決定を実行することを可能にし、したがって、反応混合物を提供するために使用される試薬、特にトロンビン試薬のための非冷却収納位置を提供する必要がない、という利点を有する。
【００３１】
自動分析装置において血漿試料とトロンビンを含む反応混合物を提供することは、典型的には、１つまたはそれ以上の自動ピペット分注デバイスを使って行われる。
【００３２】
反応混合物の吸光度値の経時的な測定は、典型的には、光度または比濁測定ステーションで行われる。
【００３３】
「光度測定ステーション」は、少なくとも１つの光源と、少なくとも１つの光検出器とを含み、試料における特定の波長の光の吸収度の測定を可能にするように設計される測定ユニットを意味すると理解されたい。典型的には、光源から発せられる光の波長は、この場合フィブリンである、試料中の検出予定の物質によって減衰（吸収、反射または散乱）されるような波長に選択される。
【００３４】
「比濁測定ステーション」は、少なくとも１つの光源と、少なくとも１つの光検出器とを含み、試料における光の吸収度の測定を可能にするように設計される測定ユニットを意味すると理解されたい。典型的には、光源および光検出器の配置は、たとえば分析物依存反応（ａｎａｌｙｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）の結果として反応混合物中に生じる粒子凝集体、またはこの場合フィブリンである、試料中の検出予定の高分子によって散乱される散乱光を測定することができるように選択される。
【００３５】
較正曲線を使ってフィブリノゲン濃度を決定するため、既知のフィブリノゲン濃度と最大吸光度変化の対応する割り当てが、データ処理ユニットに記憶されることが好ましい。次いで、データ処理ユニットにおいて、フィブリノゲン濃度が、反応混合物の確定された最大吸光度変化に対応するフィブリノゲン濃度の読み取りによって確定される。
【００３６】
本発明による自動分析装置の一実施形態は、反応混合物を提供することを目的とする、反応容器のための第１の受け入れ位置と、測定ステーションに割り当てられる、反応容器のための第２の受け入れ位置と、第１の受け入れ位置から第２の受け入れ位置へと反応容器を輸送するデバイスとをさらに含み、ここで、制御装置は、さらに：
・反応容器のための第１の受け入れ位置において、反応容器内にある血漿試料にトロンビンを加えることによる反応混合物を含む反応容器を提供する工程、
・反応容器を第１の受け入れ位置から第２の受け入れ位置へと輸送する工程、および、次いで
・反応混合物の吸光度値を経時的に測定する工程
をさらに制御するように構成され、
血漿試料にトロンビンを加えたときから反応混合物の吸光度値の測定の開始までの間に、０．５〜５秒、好ましくは３〜４秒の期間がある。
【００３７】
反応容器は、好ましくは、プラスチックまたはガラスから作られた透明な管状キュベットである。
【００３８】
反応容器のための「受け入れ位置」は、反応容器を配置するための場所を意味する。これは、しばしば、液体コンテナを安定して収納することを可能にする構造的に適用された受け入れデバイスであり、たとえば、具体的に設計された反応容器が形状嵌めによりそこに挿入されるアダプタなどである。受け入れ位置は、しばしば、たとえば、非常に多くの受け入れ位置を有する回転可能キュベットプレートまたはリングなどの可動受け入れ装置上に配置される。測定ステーションに割り当てられる受け入れ位置は、反応容器内にある反応混合物の測定がそこで可能なように設計され配置される。
【００３９】
水平および垂直に可動の移送アームに取り付けられるグリッパは、しばしば、空間的に隔てられた受け入れ装置に配置される２つの受け入れ位置である、たとえばピペット分注デバイスがアクセスを有し反応混合物を提供し培養することができる第１の受け入れ位置と、反応混合物の測定が行われる第２の受け入れ位置との間で、反応容器を輸送するために提供される。
【００４０】
図面を参照して、以下において本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明による自動分析装置の図である。
【図２】Ｃｌａｕｓｓフィブリノゲン法における高フィブリノゲン濃度の血漿試料の反応速度論の図である。
【図３】Ｃｌａｕｓｓフィブリノゲン法における低フィブリノゲン濃度の血漿試料の反応速度論の図である。
【図４】Ｃｌａｕｓｓフィブリノゲン法についての本発明による較正曲線の図である。
【図５】Ｃｌａｕｓｓフィブリノゲン法についての凝固時間による従来技術による較正曲線の図である。
【図６】Ｃｌａｕｓｓフィブリノゲン法についての凝固時間による従来技術による較正曲線の図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
図１は、内部にある構成要素のうちのいくつかが示されている、自動分析装置１０の概略線図である。図面には、自動分析装置１０の基本的な機能を示すために、非常に簡素化されたかたちで最も重要な構成要素しか示されておらず、各構成要素の個々の部材は詳細には示されていない。
【００４３】
自動分析装置１０は、血液または他の体液の広範にわたる様々な分析を完全に自動化して、こうした分析のための使用者による活動を必要とせずに実施するように設計されている。一方、使用者に求められる介入は、たとえば、キュベットの補充の必要がある場合、または液体コンテナの交換が必要な場合である、保守または修理、およびタンクの補充に限られる。
【００４４】
患者の試料は、自動分析装置１０の、詳細には図示されない搬送台の送出しトラック２０を介して一次試料容器内に送られる。各試料における実行予定の分析に関する情報は、たとえば、試料容器に貼付され、自動分析装置１０で読み取られるバーコードによって転送することができる。第１のピペット分注デバイス２１を用い、ピペット分注針によって、試料アリコートが試料容器から抜き取られる。
【００４５】
試料アリコートは、さらに、温度３７℃に調節された回転可能培養装置２３の受け入れ位置２２に配置されている、同様に図示されないキュベットに送られる。キュベットは、キュベットリザーバ２４から取り出される。たとえばトロンビン試薬液など様々な試薬液を収容する試薬容器２６は、約８〜１０℃に冷却された試薬容器リザーバ２５内に収納されている。試薬液は、第２のピペット分注デバイス２７のピペット分注針によって、試薬容器２６から抜き取られ、反応混合物を提供するために、たとえば血漿試料である試料アリコートをすでに含むキュベットへと送達される。反応混合物を含むキュベットは、クランピンググリッパ２９を含む移送アーム２８によって培養装置２３の受け入れ位置２２から取り出され、反応混合物を混合するために、振とう装置３１へと移送される。混合プロセスの完了後、キュベットは、さらに、光度測定ステーション３０のための回転可能受け入れ装置３３の受け入れ位置３２へと移送され、そこで反応混合物の吸光度が測定される。
【００４６】
プロセス全体は、自動分析装置１０およびその構成要素の多数のさらなる電子回路およびマイクロプロセッサによって支援される、たとえばデータケーブルを介して接続されるコンピュータなどの中央制御ユニット４０によって制御される。電子回路およびマイクロプロセッサは、詳細には図示されない。
【００４７】
以下の実施例は、制限的でなく、本発明の例示とみなされるべきである。
【００４８】
実施例
Ｃｌａｕｓｓフィブリノゲン法の実施
Ｏｗｒｅｎのベロナール緩衝液により、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌのフィブリノゲン濃度範囲のヒト血漿試料の１：１２．５希釈液を作成した。これらの希釈した試料１００μＬを、＋３７℃に温度調節し、５０μＬの温度調節済みトロンビン試薬（約１００ＩＵ／ｍＬ）を加えた。反応混合物を混合し、約８０秒間、波長４０５ｎｍの光で吸光度を光度分析により測定した。反応混合物の提供および吸光度の測定は、自動分析装置で行った。
【００４９】
本発明による反応速度論評価
反応速度論、すなわち経時的に測定した吸光度値の評価は、本発明に従って、回帰法により反応速度論の最大吸光度変化を確定することによって行った。
【００５０】
較正曲線は、既知のフィブリノゲン濃度の血漿試料を使用して、本発明により確定された関連の最大吸光度変化を使用して、同じように作成した。
【００５１】
図２は、高フィブリノゲン濃度（約５ｇ／Ｌ）の血漿試料の、吸光度値（ｍＡＵ）、すなわち反応速度論（１）の経時変化を示している。反応、すなわちフィブリンの形成は、測定チャネルへの反応容器の挿入中（試薬を加えてから約３〜４秒）にすでに始まった。ここでは、すでに、開始シグナルが不明なので、従来からのシグナル差による方法を用いた凝固時間の従来の決定はもはや不可能である。本発明による、適用回帰間隔による最大反応速度の決定が、ここで選択される方法である。ここでは、適用回帰間隔は、非常に短い（２秒）。直線（２）は、最大反応速度（吸光度変化）の直線である。
【００５２】
図３は、低フィブリノゲン濃度（約１ｇ／Ｌ）の血漿試料の、吸光度値（ｍＡＵ）、すなわち反応速度論（１）の経時変化を示している。ここでは、フィブリノゲンのフィブリンへの変換は非常にゆっくりと、時には、最終プラトーが明確に断言されずに起きた。この場合、反応速度の決定は、同じく選択される方法である。ここでは、適用回帰間隔は延ばされた（９秒）。直線（２）は、最大反応速度（吸光度変化）の直線である。
【００５３】
図４は、本発明による、フィブリノゲン濃度の決定のための較正曲線を示している。０．５〜６．０ｇ／Ｌの既知のフィブリノゲン濃度の１０個の血漿試料を、それぞれにおいて、本発明による方法を用いて分析し、最大吸光度変化（ｍＡＵ／ｓ）を決定した。すべての間隔において、データポイントの中に良好な分散がある。たとえば１．０ｇ／Ｌ未満のフィブリノゲン濃度を有する試料の１：４．２の希釈、または６．０ｇ／Ｌを上回るフィブリノゲン濃度を有する試料の１：２５の希釈など、試料の希釈を変えることによって、それに従って、測定可能なフィブリノゲン濃度範囲を拡大する（ｅｘｔｅｎｄ）ことが可能となる。
【００５４】
比較のために、図５および図６は、閾値（図５）またはシグナル差パーセンテージ（図６）による凝固時間の評価についてのこれまで通例のＣｌａｕｓｓフィブリノゲン決定方法についての較正曲線を示している。どちらの場合も、約４ｇ／Ｌよりも上の較正曲線のプロファイルは、未加工値の有意な評価が事実上もはや可能でないほど、すでに平坦である。したがって、４ｇ／Ｌを上回るフィブリノゲン濃度を有する試料は、すでにさらに希釈し、再度測定しなければならない。非常に平坦な理由は、とりわけ、第１の測定値の記録のときにすでに反応が始まっているからである。
【００５５】
さらに、閾値法を用いて決定される凝固時間の評価は、シグナルが最小閾値に達しないので、０．５ｇ／Ｌ濃度では不可能である。可能な解決策としての閾値の低減は、（たとえば、気泡による）反応曲線におけるオーバーレイによる誤った評価の危険を伴う。
【符号の説明】
【００５６】
１  反応速度論
２  直線
１０  分析装置
２０  送出しトラック
２１  ピペット分注デバイス
２２  受け入れ位置
２３  培養装置
２４  キュベットリザーバ
２５  試薬容器リザーバ
２６  試薬容器
２７  ピペット分注デバイス
２８  移送アーム
２９  クランピンググリッパ
３０  測定ステーション
３１  振とう装置
３２  受け入れ位置
３３  受け入れデバイス
４０  制御ユニット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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