(57)【要約】  ＲＯＲ１抗体組成物及び関連の方法。本開示は、ヒトＲＯＲ１を特異的に認識する抗体、抗体薬物複合体、抗体ベースのフラグメント又は抗体フラグメント（抗原結合フラグメント）、さらには、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、並びに関連組成物を提供する。また、本開示では、様々な診断及び治療用途でこうした抗体を使用する方法も提供される。
2019509021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）の細胞外ドメインに対し、第２抗体のものと同じ結合特異性で、特異的に結合する抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメントであって、前記第２抗体が、（１）配列番号１と配列番号１４；（２）配列番号２と配列番号１５；（３）配列番号３と配列番号１６；（４）配列番号４と配列番号１７；（５）配列番号５と配列番号１８；（６）配列番号６と配列番号１９；（７）配列番号７と配列番号２０；（８）配列番号８と配列番号２１；（９）配列番号９と配列番号２２；（１０）配列番号１０と配列番号２３；（１１）配列番号１１と配列番号２４；（１２）配列番号１２と配列番２５；（１３）配列番号１３と配列番号２６；（１４）配列番号１３０と配列番号１３６；（１５）配列番号１３１と配列番号１３７；（１６）配列番号１３２と配列番号１３８；（１７）配列番号１３３と配列番号１３９；（１８）配列番号１３４と配列番号１４０；若しくは（１９）配列番号１３５と配列番号１４１にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項２】
重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含み、その一方又は両方が、（１）配列番号１と配列番号１４；（２）配列番号２と配列番号１５；（３）配列番号３と配列番号１６；（４）配列番号４と配列番号１７；（５）配列番号５と配列番号１８；（６）配列番号６と配列番号１９；（７）配列番号７と配列番号２０；（８）配列番号８と配列番号２１；（９）配列番号９と配列番号２２；（１０）配列番号１０と配列番号２３；（１１）配列番号１１と配列番号２４；（１２）配列番号１２と配列番２５；（１３）配列番号１３と配列番号２６；（１４）配列番号１３０と配列番号１３６；（１５）配列番号１３１と配列番号１３７；（１６）配列番号１３２と配列番号１３８；（１７）配列番号１３３と配列番号１３９；（１８）配列番号１３４と配列番号１４０；若しくは（１９）配列番号１３５と配列番号１４１にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項３】
重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含み、その一方又は両方が、（１）配列番号１と配列番号１４；（２）配列番号２と配列番号１５；（３）配列番号３と配列番号１６；（４）配列番号４と配列番号１７；（５）配列番号５と配列番号１８；（６）配列番号６と配列番号１９；（７）配列番号７と配列番号２０；（８）配列番号８と配列番号２１；（９）配列番号９と配列番号２２；（１０）配列番号１０と配列番号２３；（１１）配列番号１１と配列番号２４；（１２）配列番号１２と配列番２５；（１３）配列番号１３と配列番号２６；（１４）配列番号１３０と配列番号１３６；（１５）配列番号１３１と配列番号１３７；（１６）配列番号１３２と配列番号１３８；（１７）配列番号１３３と配列番号１３９；（１８）配列番号１３４と配列番号１４０；若しくは（１９）配列番号１３５と配列番号１４１にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列と同一である、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項４】
（１）配列番号１と配列番号１４；（２）配列番号２と配列番号１５；（３）配列番号３と配列番号１６；（４）配列番号４と配列番号１７；（５）配列番号５と配列番号１８；（６）配列番号６と配列番号１９；（７）配列番号７と配列番号２０；（８）配列番号８と配列番号２１；（９）配列番号９と配列番号２２；（１０）配列番号１０と配列番号２３；（１１）配列番号１１と配列番号２４；（１２）配列番号１２と配列番２５；（１３）配列番号１３と配列番号２６；（１４）配列番号１３０と配列番号１３６；（１５）配列番号１３１と配列番号１３７；（１６）配列番号１３２と配列番号１３８；（１７）配列番号１３３と配列番号１３９；（１８）配列番号１３４と配列番号１４０；若しくは（１９）配列番号１３５と配列番号１４１にそれぞれ示される重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項５】
（１）配列番号２７〜２９と配列番号６６〜６８、（２）配列番号３０〜３２と配列番号６９〜７１、（３）配列番号３３〜３５と配列番号７２〜７４、（４）配列番号３６〜３８と配列番号７５〜７７、（５）配列番号３９〜４１と配列番号７８〜８０、（６）配列番号４２〜４４と配列番号８１〜８３、（７）配列番号４５〜４７と配列番号８４〜８６、（８）配列番号４８〜５０と配列番号８７〜８９、（９）配列番号５１〜５３と配列番号９０〜９２、（１０）配列番号５４〜５６と配列番号９３〜９５、（１１）配列番号５７〜５９と配列番号９６〜９８、（１２）配列番号６０〜６２と配列番号９９〜１０１、若しくは（１３）配列番号６３〜６５と配列番号１０２〜１０４と、それぞれ少なくとも９０％又は９５％同一である重鎖ＣＤＲ配列と軽鎖ＣＤＲ配列とを含む、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項６】
配列番号２７〜６５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項７】
配列番号６６〜１０４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列をさらに含む、請求項６に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項８】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、それらは配列番号２７〜２９、配列番号３０〜３２、配列番号３３〜３５、配列番号３６〜３８、配列番号３９〜４１、配列番号４２〜４４、配列番号４５〜４７、配列番号４８〜５０、配列番号５１〜５３、配列番号５４〜５６、配列番号５７〜５９、配列番号６０〜６２、若しくは配列番号６３〜６５とそれぞれ同一である、請求項６に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項９】
（１）配列番号２７〜２９と配列番号６６〜６８、（２）配列番号３０〜３２と配列番号６９〜７１、（３）配列番号３３〜３５と配列番号７２〜７４、（４）配列番号３６〜３８と配列番号７５〜７７、（５）配列番号３９〜４１と配列番号７８〜８０、（６）配列番号４２〜４４と配列番号８１〜８３、（７）配列番号４５〜４７と配列番号８４〜８６、（８）配列番号４８〜５０と配列番号８７〜８９、（９）配列番号５１〜５３と配列番号９０〜９２、（１０）配列番号５４〜５６と配列番号９３〜９５、（１１）配列番号５７〜５９と配列番号９６〜９８、（１２）配列番号６０〜６２と配列番号９９〜１０１、若しくは（１３）配列番号６３〜６５と配列番号１０２〜１０４にそれぞれ示される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列とを含む、請求項８に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項１０】
配列番号６６〜１０４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項１１】
配列番号２７〜６５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列をさらに含む、請求項１０に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項１２】
軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、それらは配列番号６６〜６８、配列番号６９〜７１、配列番号７２〜７４、配列番号７５〜７７、配列番号７８〜８０、配列番号８１〜８３、配列番号８４〜８６、配列番号８７〜８９、配列番号９０〜９２、配列番号９３〜９５、配列番号９６〜９８、配列番号９９〜１０１、又は配列番号１０２〜１０４とそれぞれ同一である、請求項１０に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項１３】
キメラ抗体又はヒト化抗体を含む、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項１４】
（１）配列番号１３０〜１３５から選択される配列と少なくとも９０％同一の免疫グロブリン重鎖可変領域配列及び／又は（２）配列番号１３６〜１４１から選択される配列と少なくとも９０％同一の免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項１５】
（１）配列番号１３０〜１３５から選択される配列と同一の免疫グロブリン重鎖可変領域配列及び／又は（２）配列番号１３６〜１４１から選択される配列と同一の免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む、請求項１４に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項１６】
（１）配列番号１３０と配列番号１３６；（２）配列番号１３１と配列番号１３７；（３）配列番号１３２と配列番号１３８；（４）配列番号１３３と配列番号１３９；（５）配列番号１３４と配列番号１４０；又は（６）配列番号１３５と配列番号１４１にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列と同一の記載の重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、請求項１４に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項１７】
以下：ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、合成ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、非枯渇ＩｇＧ、ダイアボディ、及び二価抗体である、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項１８】
合成分子に結合した、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項１９】
前記合成分子が、標識、細胞傷害剤、治療用放射性同位体、又はリポソームである、請求項１８に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項２０】
前記細胞傷害剤が、低分子量毒素、又はペプチド毒素、若しくはタンパク質毒素である、請求項１９に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメント。
【請求項２１】
請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントと、少なくとも１種の細胞傷害剤を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項２２】
前記細胞傷害剤が、低分子量毒素、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素である、請求項２１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２３】
前記抗体又は抗体フラグメントが、ソルターゼ酵素媒介抗体結合（ＳＭＡＣ）を介して前記細胞傷害剤に結合される、請求項２１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２４】
前記細胞傷害剤が、アントラサイクリン（ＰＮＵ）毒素誘導体Ｇｌｙ(n)−ＥＤＡ−ＰＮＵであり、ここで、ｎは、１〜２１の任意の数である、請求項２１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２５】
前記抗体又は抗体フラグメントが、キメラ又はヒト化されている、請求項２１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２６】
前記抗体又は抗体フラグメントが、以下：（１）配列番号２７〜２９と配列番号６６〜６８、（２）配列番号３９〜４１と配列番号７８〜８０、又は（３）配列番号６０〜６２と配列番号９９〜１０１にそれぞれ示される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列とを含む、請求項２１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２７】
前記抗体又は抗体フラグメントが、以下：（１）配列番号１３０と配列番号１３６；（２）配列番号１３１と配列番号１３７；（３）配列番号１３２と配列番号１３８；（４）配列番号１３３と配列番号１３９；（５）配列番号１３４と配列番号１４０；（６）配列番号１３５と配列番号１４１；（７）配列番号１と配列番号１４；（８）配列番号５と配列番号１８；又は（９）配列番号１２と配列番号２５にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２８】
膜貫通領域及び細胞内Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインと融合した、請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２９】
前記抗体又は抗体フラグメントが、キメラ又はヒト化されている、請求項２８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３０】
前記抗体又は抗体フラグメントが、以下：（１）配列番号２７〜２９と配列番号６６〜６８にそれぞれ示される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列とを含む、請求項２８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３１】
前記抗体又は抗体フラグメントが、以下：（１）配列番号１３０と配列番号１３６；（２）配列番号１３１と配列番号１３７；（３）配列番号１３２と配列番号１３８；（４）配列番号１３３と配列番号１３９；（５）配列番号１３４と配列番号１４０；（６）配列番号１３５と配列番号１４１；又は（７）配列番号１と配列番号１４にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３２】
以下：（１）治療有効量の（ａ）請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質若しくは抗体フラグメント又は（ｂ）請求項２１に記載の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）と、（２）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３３】
以下：（１）請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質若しくは抗体フラグメント又は（２）請求項２１に記載の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含むキット。
【請求項３４】
請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質若しくは抗体フラグメントの前記重鎖又は軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３５】
配列番号３４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３６】
被験者においてＲＯＲ１を発現する細胞を殺傷するか、又はその増殖を阻害する方法であって、それを必要とする被験者に請求項３２に記載の医薬組成物を投与し、それにより、前記被験者においてＲＯＲ１を発現する前記細胞を殺傷するか、又はその増殖を阻害するステップを含む方法。
【請求項３７】
前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記医薬組成物が、細胞傷害剤と結合した請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメントを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞傷害剤が、小分子量毒素、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
被験者においてＲＯＲ１の発現増大に関連する疾患又は状態を治療する方法であって、ＲＯＲ１の発現増大に関連する疾患又は障害を有する被験者に請求項３２に記載の医薬組成物を投与し、それによって、前記被験者におけるＲＯＲ１の発現増大に関連する前記疾患又は状態を治療するステップを含む方法。
【請求項４１】
前記疾患又は状態が、癌である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患又は状態が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌、肺癌、結腸癌、頭部及び頚部癌、及び黒色腫からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記医薬組成物が、細胞傷害剤と結合した請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメントを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞傷害剤が、小分子量毒素、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体又は抗体断片が、膜貫通領域及び細胞内Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインと融合して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／２８０，８４３号明細書（２０１６年１月２０日出願）に対する優先権の利益を主張する。優先出願の全開示内容は、全体として、及びあらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
癌は、主な死亡原因の１つである。これは、細胞の不死化を招く遺伝子変化、例えば、染色体転位、腫瘍抑制遺伝子、転写因子若しくは増殖因子受容体の突然変異などに起因する、正常細胞の悪性形質転換によって引き起こされる疾患の１クラスである。不死化が、過剰増殖と組み合わされると、不死化細胞は、転移を伴う、若しくは伴わない（固形腫瘍の場合）腫瘍、又は白血病及びリンパ腫（血液の癌）を発生する。アポトーシス、又はプログラム細胞死の欠損は、癌を引き起こす細胞の悪性形質転換にさらに寄与し得る。
【０００３】
受容体チロシンキナーゼオーファン受容体−１及び−２（ＲＯＲ１及びＲＯＲ２）から構成される膜結合性受容体チロシンキナーゼのファミリーは、特定の癌に特に関連するものとして記載されている（Ｒｅｂａｇａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．２（３４））が、ごくわずかな例外を除いて、正常組織上の発現にはほとんど存在しない（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８−０４３２）。ＲＯＲ発現が、腫瘍発生と機能的に関連しているか否かは依然として不明のままである。しかし、ＲＯＲファミリーメンバーの極めて腫瘍選択的な発現のために、これらは、標的癌療法にとって適切な標的を代表するものである。受容体チロシンキナーゼオーファン受容体−１（ＲＯＲ１）は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）とのそのほぼ１００％の関連（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｂｌｏｏｄ  １２８（２５），ｐ．２９３１）、並びに肺及び乳房などの特定の固形腫瘍にも発現されるという観察結果（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８−０４３２）によって、癌標的として特に関心を集めている。ＲＯＲファミリーのメンバーは、３つの個別の細胞外ドメイン、Ｉｇ、クリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）及びフリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ドメインと、それに続く膜貫通領域、並びに細胞内部分を含む１型膜貫通タンパク質である。細胞内部分内で、ＲＯＲ１は、チロシンキナーゼドメイン、２つのセリン／トレオニンリッチドメイン及びプロリンリッチドメインを有する。ＲＯＲは、様々なホモログによる胚のパターン形成及び神経発生に関して研究されている。これらの生理学的機能は、キナーゼドメインの要件に基づいて二分されている。ますます多くの文献が、例えば、ＲＯＲ１発現がほぼ１００％相関する慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、いくつかの急性リンパ芽球性リンパ腫（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、及びいくつか他の血液悪性疾患などの癌のマーカとしてＲＯＲ１を立証している。さらに、ＲＯＲ１は、いくつかの固形腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌、肺癌、結腸癌、頭部及び頚部癌、黒色腫、及びその他の癌などの進行に決定的に関与している。ＲＯＲ１は、アポトーシスを阻害し、ＥＧＦＲシグナル伝達を強化し、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導して、カベオラ形成に寄与する。重要なことには、ＲＯＲ１は、主に胚組織中で検出可能であり、概して、成体組織中に存在しないため、このタンパク質は癌療法にとって理想的な薬剤標的となる。従って、ＲＯＲ１は、以前からＲＯＲ１特異的抗体の開発のための標的として認識されている。しかし、様々な哺乳動物種間でのＲＯＲ１の高い相同性（ヒトとカニクイザルとの間のアミノ酸レベルで１００％保存され、ヒトとマウスの間で９６．７％相同であり、またヒトとウサギの間で９６．３％相同である）のために、動物の免疫のような標準的な技術ではこの標的に対する高親和性抗体を作製することは困難であった。
【０００４】
少数のマウス及びウサギ抗体が文献で論じられている。例えば、国際公開第２００７／０５１０７７号パンフレットは、ＣＬＬ、小リンパ球性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫などのリンパ腫に見いだされるネイティブＲＯＲ１に対するヒト化抗体をはじめとする、モノクローナル抗体を論じている。薬剤（ＲＯＲ１キナーゼ活性を阻害するＲＯＲ１結合抗体であってもよい）を用いて腫瘍細胞の増殖を阻害する方法は、国際公開第２００７／１４６９５７号パンフレットの主題である。国際公開第２０１１／０５４００７号パンフレットでは、特異的ＲＯＲ１ターゲティング抗体の投与による、ＲＯＲ１の細胞外ドメインが発現される癌の治療又は予防方法が論じられた。
【０００５】
さらに、国際公開第２０１０／１２４１８８号パンフレットは、抗ヒトＲＯＲ１抗体、特に２Ａ２の名称で呼ばれるモノクローナルマウス抗体について論じ、国際公開第２０１２／０７５１５８号パンフレットは、Ｒ１１及びＲ１２と呼ばれるモノクローナルウサギ抗体について述べる。特定のＲＯＲ１ターゲティング抗体は、国際公開第２０１６／０９４８７３号パンフレットにも記載されている。国際公開第２０１１／０７９９０２号パンフレット及び同第２０１２／０７６０６６号パンフレットのいずれも、選択された細胞外ＲＯＲ１ドメイン配列に結合する、細胞死を誘導することができるＲＯＲ１の生物学的誘導体について論じた。国際公開第２０１４／０３１１７４号パンフレットは、９９９６１と呼ばれる抗体と同じ結合特異性を有する抗ＲＯＲ１抗体について述べている。抗ＲＯＲ１抗体の結合エピトープについては、国際公開第２０１６／１８７２２０号パンフレットにさらに記述されている。国際公開第２０１１／１５９８４７号パンフレットは、ＲＯＲ１に結合する特定のｓｃＦｖ抗体フラグメントについて論じた。国際公開第２０１４／１６７０２２号パンフレット、同第２０１６／０５５５９２号パンフレット及び同第２０１６／０５５５９３号パンフレットは、二重特異性ＲＯＲ１ターゲティング抗体及びそれらの使用について論じ、国際公開第２０１５／１８４２０３号パンフレットは、三重特異性結合分子について論じた。ヒト化抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体を開示する特に新しい文献は、２Ａ２、Ｒ１１、Ｒ１２若しくはＤ１０などの独自に開示したマウス又はウサギ抗体に基づいている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
入手可能なＲＯＲ１特異的モノクローナル抗体の数が少ないために、当技術分野には、より高い親和性、又は既知の抗体クローンにはない他の機能的特性を有する優れた抗ＲＯＲ１抗体に対するニーズがある。さらに、例えば、ウエスタンブロッティング及び／又は免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＲＯＲ１関連の疾患状態においてＲＯＲ１発現を検出するための別の診断ツールに対するニーズも存在する。本発明は、これらの、及び他のニーズに取り組むことに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、ヒト受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ｈＲＯＲ１）の細胞外ドメインに特異的に結合し、且つ、哺乳動物細胞に発現されるヒトＲＯＲ１（ｈＲＯＲ１）細胞外ドメインをベイトとして用いて、非免疫ウサギの高度に多様なファージディスプレイライブラリーから選択された、ウサギ抗体の新規の高親和性結合ドメインを提供する。ウサギ抗体の可変領域は、組換えタンパク質として、また、哺乳動物宿主細胞の表面に過剰発現されるｈＲＯＲ１の結合に基づいて、ｈＲＯＲ１のＥＣＤに対する結合についてスクリーニングすることにより、選択されている。この戦略によって、これまでにない性質及び好都合な機能的特性の新規のｈＲＯＲ１抗体が同定されている。さらに、本発明は、ヒトＩｇＣ1抗体の定常領域ドメインに融合されたウサギ可変ドメインのキメラ完全長抗体を提供する。さらには、本発明は、可変イムノグロブリン重鎖及び軽鎖のフレームワークへの本明細書に開示するウサギ抗ＲＯＲ１抗体のＣＤＲ移植によって作製された新規の高親和性ヒト化抗体も提供する。こうしたヒト化抗体は、内在性の、完全ヒト型に対して相同性が高いことから、ヒト疾患の治療法に使用することができる。本発明の第２の態様では、超強力アントラサイクリン毒素を含むキメラウサギ−ヒト及びヒト化抗ヒトＲＯＲ１（ｈＲＯＲ１）抗体をベースとする部位特異的結合抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）が本発明により提供される。部位特異的結合は、国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレット（本明細書に参照により組み込まれる）実質的に開示されているように、ソルターゼ酵素を用いた酵素結合により達成される。様々なインビトロ及びインビボ腫瘍モデルにおいて前例のない効力を有する抗ｈＲＯＲ１  ＡＤＣをもたらす超強力アントラサイクリン毒素は、国際公開第２０１６１０２６７９号パンフレット（本明細書に参照により組み込まれる）に開示されている。
【０００８】
最後に、本発明は、インビトロで高い効果を示す前記抗ｈＲＯＲ１結合ドメインを使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びこれらのＣＡＲで作製されたＴ細胞、すなわち、いわゆるＣＡＲ−Ｔ細胞を提供する。
【０００９】
従って、本発明は、以下：（１）配列番号１と配列番号１４；（２）配列番号２と配列番号１５；（３）配列番号３と配列番号１６；（４）配列番号４と配列番号１７；（５）配列番号５と配列番号１８；（６）配列番号６と配列番号１９；（７）配列番号７と配列番号２０；（８）配列番号８と配列番号２１；（９）配列番号９と配列番号２２；（１０）配列番号１０と配列番号２３；（１１）配列番号１１と配列番号２４；（１２）配列番号１２と配列番２５；（１３）配列番号１３と配列番号２６；（１４）配列番号１３０と配列番号１３６；（１５）配列番号１３１と配列番号１３７；（１６）配列番号１３２と配列番号１３８；（１７）配列番号１３３と配列番号１３９；（１８）配列番号１３４と配列番号１４０；若しくは（１９）配列番号１３５と配列番号１４１にそれぞれ示される、免疫グロブリン重鎖可変領域配列と免疫グロブリン軽鎖可変領域配列とを含むｈＲＯＲ１特異的抗体のものと同じｈＲＯＲ１に対する結合特異性を有する、抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１０】
本発明は、さらに、以下：（１）配列番号２７〜２９と配列番号６６〜６８、（２）配列番号３０〜３２と配列番号６９〜７１、（３）配列番号３３〜３５と配列番号７２〜７４、（４）配列番号３６〜３８と配列番号７５〜７７、（５）配列番号３９〜４１と配列番号７８〜８０、（６）配列番号４２〜４４と配列番号８１〜８３、（７）配列番号４５〜４７と配列番号８４〜８６、（８）配列番号４８〜５０と配列番号８７〜８９、（９）配列番号５１〜５３と配列番号９０〜９２、（１０）配列番号５４〜５６と配列番号９３〜９５、（１１）配列番号５７〜５９と配列番号９６〜９８、（１２）配列番号６０〜６２と配列番号９９〜１０１、若しくは（１３）配列番号６３〜６５と配列番号１０２〜１０４に対して、それぞれ、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％、又は９５％超で、且つ１００％未満同一である、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ配列と免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ配列とを含む、抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１１】
本発明は、さらに、以下：（１）配列番号２７〜２９と配列番号６６〜６８、（２）配列番号３０〜３２と配列番号６９〜７１、（３）配列番号３３〜３５と配列番号７２〜７４、（４）配列番号３６〜３８と配列番号７５〜７７、（５）配列番号３９〜４１と配列番号７８〜８０、（６）配列番号４２〜４４と配列番号８１〜８３、（７）配列番号４５〜４７と配列番号８４〜８６、（８）配列番号４８〜５０と配列番号８７〜８９、（９）配列番号５１〜５３と配列番号９０〜９２、（１０）配列番号５４〜５６と配列番号９３〜９５、（１１）配列番号５７〜５９と配列番号９６〜９８、（１２）配列番号６０〜６２と配列番号９９〜１０１、若しくは（１３）配列番号６３〜６５と配列番号１０２〜１０４と、それぞれ同一である、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ配列と免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ配列とを含む、抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１２】
本発明は、さらに、以下：（１）配列番号１と配列番号１４；（２）配列番号２と配列番号１５；（３）配列番号３と配列番号１６；（４）配列番号４と配列番号１７；（５）配列番号５と配列番号１８；（６）配列番号６と配列番号１９；（７）配列番号７と配列番号２０；（８）配列番号８と配列番号２１；（９）配列番号９と配列番号２２；（１０）配列番号１０と配列番号２３；（１１）配列番号１１と配列番号２４；（１２）配列番号１２と配列番２５；若しくは（１３）配列番号１３と配列番号２６にそれぞれ示される、免疫グロブリン重鎖可変領域配列と免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に対して、アミノ酸レベルで、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％、又は９５％超で、且つ１００％未満の同一性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域配列又は免疫グロブリン軽鎖可変領域配列のいずれかを含む、抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１３】
本発明は、さらに、配列番号２７〜６５からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ配列を含む、抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。本発明は、さらに、配列番号６６〜１０４からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ配列を含む、抗ｈＲＯＲ１抗体、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。一部の実施形態では、ｈＲＯＲ１特異的抗体、抗体ベースの結合タンパク質、若しくはその抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲは、以下：配列番号２７〜２９、配列番号３０〜３２、配列番号３３〜３５、配列番号３６〜３８、配列番号３９〜４１、配列番号４２〜４４、配列番号４５〜４７、配列番号４８〜５０、配列番号５１〜５３、配列番号５４〜５６、配列番号５７〜５９、配列番号６０〜６２、若しくは配列番号６３〜６５とそれぞれ同一である、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。
【００１４】
本発明は、さらに、以下：（１）配列番号１と配列番号１４；（２）配列番号２と配列番号１５；（３）配列番号３と配列番号１６；（４）配列番号４と配列番号１７；（５）配列番号５と配列番号１８；（６）配列番号６と配列番号１９；（７）配列番号７と配列番号２０；（８）配列番号８と配列番号２１；（９）配列番号９と配列番号２２；（１０）配列番号１０と配列番号２３；（１１）配列番号１１と配列番号２４；（１２）配列番号１２と配列番２５；（１３）配列番号１３と配列番号２６；（１４）配列番号１３０と配列番号１３６；（１５）配列番号１３１と配列番号１３７；（１６）配列番号１３２と配列番号１３８；（１７）配列番号１３３と配列番号１３９；（１８）配列番号１３４と配列番号１４０；若しくは（１９）配列番号１３５と配列番号１４１と同一の免疫グロブリン重鎖可変領域配列又は免疫グロブリン軽鎖可変領域配列のいずれかを含む、抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１５】
本発明は、さらに、抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、あるいは、以下：（１）配列番号１と配列番号１４；（２）配列番号２と配列番号１５；（３）配列番号３と配列番号１６；（４）配列番号４と配列番号１７；（５）配列番号５と配列番号１８；（６）配列番号６と配列番号１９；（７）配列番号７と配列番号２０；（８）配列番号８と配列番号２１；（９）配列番号９と配列番号２２；（１０）配列番号１０と配列番号２３；（１１）配列番号１１と配列番号２４；（１２）配列番号１２と配列番２５；（１３）配列番号１３と配列番号２６；（１４）配列番号１３０と配列番号１３６；（１５）配列番号１３１と配列番号１３７；（１６）配列番号１３２と配列番号１３８；（１７）配列番号１３３と配列番号１３９；（１８）配列番号１３４と配列番号１４０；若しくは（１９）配列番号１３５と配列番号１４１とそれぞれ同一の、免疫グロブリン重鎖可変領域配列と免疫グロブリン軽鎖可変領域配列とを含有する、抗ｈＲＯＲ１特異的抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを含むＣＡＲに関する。
【００１６】
一部の実施形態では、抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲは、配列番号６６〜１０４からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ配列を含む。これらの分子のいくつかは、配列番号２７〜６５からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ配列をさらに含む。これらの分子のいくつかは、以下：配列番号６６〜６８、配列番号６９〜７１、配列番号７２〜７４、配列番号７５〜７７、配列番号７８〜８０、配列番号８１〜８３、配列番号８４〜８６、配列番号８７〜８９、配列番号９０〜９２、配列番号９３〜９５、配列番号９６〜９８、配列番号９９〜１０１、又は配列番号１０２〜１０４とそれぞれ同一である、免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。一部の実施形態では、抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲは、以下：（１）配列番号２７〜２９と配列番号６６〜６８、（２）配列番号３０〜３２と配列番号６９〜７１、（３）配列番号３３〜３５と配列番号７２〜７４、（４）配列番号３６〜３８と配列番号７５〜７７、（５）配列番号３９〜４１と配列番号７８〜８０、（６）配列番号４２〜４４と配列番号８１〜８３、（７）配列番号４５〜４７と配列番号８４〜８６、（８）配列番号４８〜５０と配列番号８７〜８９、（９）配列番号５１〜５３と配列番号９０〜９２、（１０）配列番号５４〜５６と配列番号９３〜９５、（１１）配列番号５７〜５９と配列番号９６〜９８、（１２）配列番号６０〜６２と配列番号９９〜１０１、若しくは（１３）配列番号６３〜６５と配列番号１０２〜１０４にそれぞれ示される、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と、免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列とを含む。
【００１７】
本発明は、さらに、以下：（１４）配列番号１３０と配列番号１３６；（１５）配列番号１３１と配列番号１３７；（１６）配列番号１３２と配列番号１３８；（１７）配列番号１３３と配列番号１３９；（１８）配列番号１３４と配列番号１４０；又は（１９）配列番号１３５と配列番号１４１に記載の免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖に対して、アミノ酸レベルで、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９５％で且つ１００％未満の相同性を有する、ｈＲＯＲ１特異的ヒト化抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１８】
また別の実施形態では、ｈＲＯＲ１特異的抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、以下：ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、若しくはＩｇＭアイソタイプ、又はそれらのＦ（ａｂ）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ2、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ2ＣＨ3、Ｆａｂ、ＶL、ＶH、ｓｃＦｖ4、ｓｃＦｖ3、ｓｃＦｖ2、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）2フラグメント、又は非枯渇ＩｇＧ、ダイアボディ若しくは二価抗体のいずれかである。これらの分子のいくつかは、天然に存在するＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4アイソタイプ、又は合成ＩｇＧからなる群から選択されるＩｇＧである。これらの分子のいくつかは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はｄｓＦｖである。一部の実施形態では、本発明のｈＲＯＲ１特異的抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、合成分子と結合している。合成分子は、例えば、標識、細胞傷害剤、放射性同位体、又はリポソームであってよい。細胞傷害剤は、例えば、低分子量毒素、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素であってよい。一部の実施形態では、ｈＲＯＲ１特異的抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、膜貫通領域及び細胞内Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインと結合して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する。
【００１９】
本発明は、さらに、ｈＲＯＲ１特異的細胞の効率的な殺傷をもたらす毒素ペイロードと一緒に、ｈＲＯＲ１特異的ヒト化若しくはキメラ抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。前記ＡＤＣにおいて、毒素ペイロードは、マレイミド官能基を有する古典的な化学リンカー、又はリシン若しくはシステインアミノ酸側鎖との結合を媒介することができる当技術分野で公知の他の化学物質を使用し、リシン若しくはシステインアミノ酸側鎖を介して、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメントと非部位特異的に結合することができる。前記ＡＤＣでは、低分子量ペイロードは、例えば、二官能価リンカー、ホルミル−グリシン形成酵素修飾抗体上でピクテ・スペングラー（Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ）化学を可能にするリンカー、グリカン−再モデル化抗体、又は細菌トランスグルタミナーゼ若しくはソルターゼ酵素のように、当技術分野で公知の化学、化学−酵素、若しくは酵素結合のいずれかによって、部位特異的に結合することもできる。
【００２０】
一部の関連態様では、本発明は、治療に有効な量の本明細書に記載の抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）と、薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物又はキットを提供する。本発明のいくつかのキットは、１つ又は複数の免疫アッセイバッファーをさらに含み得る。さらに、本明細書に開示する抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲの免疫グロブリン重鎖若しくは免疫グロブリン軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供される。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ｈＲＯＲ１を発現する細胞を殺傷するか、又はその増殖を阻害する方法を提供する。これらの方法は、治療有効量の本発明の抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲを、それが必要な被験者に投与するステップを含み、これにより、被験者において、ｈＲＯＲ１を発現する細胞を殺傷するか、又はその増殖を阻害することが可能になる。これらの方法の一部は、特に、腫瘍細胞を殺傷又は阻害することに関する。別の態様では、本発明は、被験者において、ｈＲＯＲ１の発現増大に関連する疾患又は状態を治療する方法を提供する。これらの方法は、治療有効量の本発明の抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、ＡＤＣ、又はＣＡＲを、ｈＲＯＲ１の発現増大に関連する疾患又は状態に罹患した被験者に投与するステップを含み、これにより、被験者において、ｈＲＯＲ１の発現増大に関連する疾患又は状態の治療が可能になる。これらの治療法の一部は、特に癌の治療に関する。例えば、これらの方法を用いて、例えば、ＣＬＬ、ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌、肺癌、結腸癌、頭部及び頚部癌、及び黒色腫を含む、多種多様な癌に罹患した被験者を治療することができる。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、被験者におけるＲＯＲ１レベルの変化を検出する方法を提供する。こうした方法は、以下：（ａ）被験者から生体サンプルを取得するステップ；（ｂ）サンプルを本発明の抗ｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントと接触させるステップ；（ｃ）生体サンプル中のＲＯＲ１のレベルを決定するステップ；並びに（ｄ）生体サンプル中のＲＯＲ１レベルとＲＯＲ１のコントロールレベルを比較することにより、生体サンプル中のＲＯＲ１レベルが、ＲＯＲ１のコントロールレベルに対して変化しているか否かを決定するステップを含む。これらの方法の一部では、コントロールレベルに対して、被験者のＲＯＲ１レベルの増加は、被験者におけるＲＯＲ１の発現増大に関連する疾患又は状態を示す。これらの方法に好適な具体的な疾患又は状態の例として、例えば、ＣＬＬ、ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌、肺癌、結腸癌、頭部及び頚部癌、又は黒色腫が挙げられる。
【００２３】
別の関連態様では、本発明は、被験者においてＲＯＲ１発現腫瘍を検出する方法を提供する。これらの方法は、（ａ）ＲＯＲ１発現腫瘍を有する、有することが疑われる、若しくは、それを発生するリスクがある被験者に、本発明のｈＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを投与するステップ；及び（ｂ）変化した結合標識密度若しくは濃度の領域について被験者をイメージするステップを含み、ここで、密度若しくは濃度は、（ｉ）近傍組織中のバックグラウンド又は（ｉｉ）被験者の同じ領域中で以前検出された密度若しくは濃度と比較され、その結果、変化した結合標識密度若しくは濃度の領域の存在は、被験者におけるＲＯＲ１発現腫瘍の存在の指標である。
【００２４】
本明細書の残りの部分及び請求項を参照にすることにより、本発明の性質及び利点はさらに理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】表示の通り、新規ウサギ抗ｈＲＯＲ１ｍＡｂの可変免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を示す。ウサギ可変ドメイン（Ｖκ、Ｖλ、及びＶH）のアミノ酸配列アラインメントは、Ｋａｂａｔ番号付けを用いて、フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）と一緒に示される。図には、ＸＢＲ１−４０２、ＥＲＲ１−３０１、ＥＲＲ１−３０６、ＥＲＲ１−３１６、ＥＲＲ１−３２４、ＥＲＲ１−４０３、ＥＲＲ１−４０９、ＥＲＲ１−ＴＯＰ４、ＥＲＲ１−ＴＯＰ１５、ＥＲＲ１−ＴＯＰ２２、ＥＲＲ１−ＴＯＰ４０、ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３、及びＥＲＲ１−ＴＯＰ５４と称される１３の抗体の重鎖可変ドメイン鎖配列（それぞれ、配列番号１〜１３）と軽鎖可変ドメイン配列（それぞれ、配列番号１４〜２６）が示される。図に示すように、クローンＸＢＲ１−４０２、ＥＲＲ１−３０１、ＥＲＲ１−３０６、ＥＲＲ１−３１６、ＥＲＲ１−４０３、ＥＲＲ１−４０９、ＥＲＲ１−ＴＯＰ４、ＥＲＲ１−ＴＯＰ１５、ＥＲＲ１−ＴＯＰ２２、ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３、及びＥＲＲ１−ＴＯＰ５４は、免疫グロブリンλ軽鎖の可変ドメインであり、ＥＲＲ１−３２４及びＥＲＲ１−ＴＯＰ４０は、免疫グロブリンκ軽鎖の可変ドメインである。
【図２】ｈＲＯＲ１及びｍＲＯＲ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）とヒトＩｇＧ１抗体のヒトＦｃドメインとの融合タンパク質として発現される、ヒトＲＯＲ１（ｈＲＯＲ１）及びマウスＲＯＲ１（ｍＲＯＲ１）に対するキメラウサギ／ヒトＦａｂの結合活性を示す。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ（ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１及びｈＦｃ−ｍＲＯＲ１）と融合したｈＲＯＲ１及びｍＲＯＲ１に対する各キメラウサギ／ヒトＦａｂの結合をＥＬＩＳＡによって分析した。ｈＦｃ−ＲＯＲ１又はｈＦｃ−ｍＲＯＲ１を、プレート上に固定化した抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ抗体によって捕捉した後、マウス抗Ｈｉｓタグを用いた検出を介してＨｉｓタグを含むｈＲＯＲ１特異的Ｆａｂと一緒にインキュベートした。コントロールとして、ｈＲＯＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）とヒトＩｇＧ１抗体（ｈＦｃ−ｈＲＯＲ２）のヒトＦｃドメインとの融合タンパク質を用いることにより、Ｆａｂの特異性を確認した。
【図３】マウス前駆Ｂ細胞株６３−１２の細胞表面上に発現されたネイティブヒトＲＯＲ１タンパク質に対するキメラウサギ／ヒトＦａｂの結合活性を示す（実施例１を参照）。マウス前駆Ｂ細胞（６３−１２）表面上に異所的に発現されたヒトＲＯＲ１に対する各キメラウサギ／ヒトＦａｂの結合をフローサイトメトリーにより分析した。ＥＲＲ２−ＴＯＰ３５は、アイソタイプ適合コントロールとして使用したｈＲＯＲ２に対するｍＡｂである。
【図４】ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインの様々な部分を含む６つの異なる固定化ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質：ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１−Ｉｇ（ｈＲＯＲ１の免疫グロブリンドメインを含む）、ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１−Ｆｒ（ｈＲＯＲ１のフリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ドメインを含む）、ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１−Ｋｒ（ｈＲＯＲ１のクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメインを含む）、ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１−Ｉｇ−Ｆｒ（ｈＲＯＲ１の免疫グロブリン及びフリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ドメインを含む）、ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１−Ｆｒ−Ｋｉ（ｈＲＯＲ１のフリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）及びクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメインを含む）並びにｈＦｃ−ｈＲＯＲ１（ｈＲＯＲ１の全細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む）に対するキメラウサギ／ヒトＦａｂのエピトープマッピング試験を示す。
【図５】表面プラズモン共鳴により実施されるエピトープ結合試験を示す。ＣＭ５チップ上に固定化された抗ヒトＦｃγ抗体によって捕捉されたｈＦｃ−ｈＲＯＲ１に対する様々なＦａｂの結合について得られたＳＰＲセンソグラムを示す。独立の、且つオーバーラップするエピトープを同定するために、様々な順序でＦａｂを注射した。以前注射したＦａｂについて観測された値を上回る共鳴ユニット（ＲＵ、ｙ軸）の増大は、これらが同時結合を可能にすることから、独立のエピトープを示した。例えば、ＦａｂＲ１１の結合について観測された増大は、ＸＢＲ１−４０２単独で観測された値を上回ったが、これは、Ｆａｂ  Ｒ１１とＸＢＲ１−４０２が、ヒトＲＯＲ１に同時に結合することができることを示している。対照的に、Ｆａｂ  ＸＢＲ１−４０２のエピトープは、ＥＲＲ１−３０１、ＥＲＲ１−４０３及びＲ１２（左側グラフ）のエピトープとオーバーラップし；Ｆａｂ  ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３のエピトープは、ＥＲＲ１−３０６、ＸＢＲ１−４０２及びＥＲＲ１−ＴＯＰ４０のエピトープとオーバーラップする。ｘ軸は、秒単位（ｓ）の時間を表す。
【図６】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、ｈＲＯＲ１  ＥＣＤに対する抗ｈＲＯＲ１特異的Ｆａｂの親和性測定を示す。（Ａ）即時バックグラウンド除去後のＣＭ５チップに固定化された抗ヒトＦｃγ抗体によって捕捉されたｈＦｃ−ｈＲＯＲ１に対する各Ｆａｂの結合について得られたＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００センソグラムを示す。５つの様々な濃度でＦａｂを注射したが、その最高濃度を表（Ｂ）に示し、５つの濃度の１つを２回反復して試験した。（Ｂ）表には、各Ｆａｂの一価親和性が示される。平衡解離定数（Ｋd）は、ｋoff／ｋon（ｋon、会合速度定数；ｋoff、解離速度定数）から算出した。
【図７】実施例９に記載する通り、抗ヒトＲＯＲ１抗体２Ａ２を含む様々なヒト癌細胞株に対する、ＦＡＣＳによるｈＲＯＲ１の細胞染色を示す。分析した細胞株には、６９７（ヒト急性リンパ性白血病、ＡＬＬ）、Ｋａｓｕｍｉ−２（ヒト前駆Ｂ急性リンパ性白血病）、ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＨＳ−５７８Ｔ、並びにヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄが含まれる。Ｔ４７Ｄヒト乳癌細胞株を除いて、評価した細胞の全てが、ｈＲＯＲ１発現に対して陽性であった。
【図８】蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により測定した乳癌細胞に発現された内在性ｈＲＯＲ１に対する、選択したキメラウサギ／ヒトＩｇＧ１の結合活性を示す。ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ｈＲＯＲ１を発現することがわかっており、ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄは、ｈＲＯＲ１について陰性であることがわかっている。対照的に、Ｔ４７Ｄは、ＲＯＲ２陽性であることがわかっており、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＲＯＲ２発現については陰性であることがわかっている。ＥＲＲ１−Ｔｏｐ５４、ＥＲＲ１−Ｔｏｐ４３、ＥＲＲ１−３２４、ＸＢＲ１−４０２は、選択された抗ｈＲＯＲ１特異的ｍＡｂであり、ＸＢＲ２−４０１は、特異性コントロールとして用いられるｈＲＯＲ２特異的ｍＡｂであった。（Ａ）乳癌細胞上の内在性ｈＲＯＲ及びｈＲＯＲ２の発現は、それぞれ、市販のヤギ抗ヒトＲＯＲ１及びヤギ抗ヒトＲＯＲ２ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）2ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いたフローサイトメトリーにより検出した。コントロール染色は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）2ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体単独で実施した。（Ｂ）ＲＯＲ１発現ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＲＯＲ２発現ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄに対する、選択したクローンＥＲＲ１−ＴＯＰ５４、ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３、ＥＲＲ１−３２４、ＸＢＲ１−４０２（全て、ｈＲＯＲ１特異的）及びＸＢＲ２−４０１（ｈＲＯＲ２特異的）のキメラウサギ／ヒトＩｇＧ１の結合を、一次抗体としてキメラウサギ／ヒトＩｇＧ１を、二次抗体としてＡＰＣ標識ヤギ抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって分析した。
【図９】ウエスタンブロット実験における変性ｈＲＯＲ１に対するキメラウサギ／ヒトＩｇＧ１  ＸＢＲ１−４０２及びＥＲＲ１−ＴＯＰ４３（いずれもｈＲＯＲ１特異的）の結合活性を示す。細胞表面Ｋ５６２上に発現されるｈＲＯＲ１又は精製済タンパク質を変性させて、ウエスタンブロッティングにより検出した。ウエスタンブロットは、表示のように、下記のサンプルを含んだ：レーン１：完全長のｈＲＯＲ１を異所発現するＫ５６２細胞。レーン２：トランスフェクトされていないＫ６２細胞。レーン３：ｈＲＯＲ１の精製済細胞外ドメイン。レーン４：ｈＲＯＲ２の精製済細胞外ドメイン。
【図１０】ＥＬＩＳＡにより分析した、組換え、精製ｈＲＯＲ１に対する（パネルＡ）及びネガティブコントロールとしての組換え、精製ｈＲＯＲ２に対する（パネルＢ）、選択したクローンＥＲＲ１−３０１、ＸＢＲ１−４０２、ＥＲＲ１−３０６、ＥＲＲ１−３２４、ＥＲＲ１−４０３及びＥＲＲ１−Ｔｏｐ４３の選択したｈＲＯＲ１特異的ウサギ−ヒト−Ｆｃキメラ抗体の結合を示す。
【図１１】本発明に開示する部位特異的結合ＡＤＣがどのようにして作製されるかを概略的に示す。（Ａ）国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレットに開示されているように、ソルターゼ酵素媒介抗体結合（ＳＭＡＣ−技術）の機構を概略的に示す。部位特異的結合ＡＤＣを作製するために、組換え抗体は、Ｃ末端ペンタペプチドモチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１４４）と一緒に発現する必要があり、このモチーフは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼ酵素Ａ（ＳｒｔＡ）の認識部位として役立つ。グリシン修飾毒素基質を、抗体及びソルターゼＡ酵素を含有するペンタペプチドモチーフＬＰＸＴＧと一緒にインキュベートすると、ソルターゼＡ酵素は、グリシン修飾毒素が、ＬＰＸＴＧモチーフのＣ末端グリシンに取って代わり、残るＬＰＸＴ（配列番号１４７）のトレオニンと共有結合する。このようにして、Ｃ末端毒素結合ＡＤＣを高効率で作製することができる。（Ｂ）は、国際公開第２０１６１０２６９７号パンフレットに開示されているように、好ましい毒素の構造、すなわち、アントラサイクリン構造のＣ１３におけるカルボニル基に５×グリシン区間をつなげるエチレン−ジアミノ（ＥＤＡ）リンカーを含むＰＮＵ−１５９６８２誘導体を示す。
【図１２】既知のｈＲＯＲ１ターゲティングＡＤＣ（２Ａ２−Ｇ５−ＰＮＵ、Ｒ１２−Ｇ５−ＰＮＵ）及び本発明で提供される新規のＡＤＣ（ＥＲＲ１−Ｔｏｐ４３−Ｇ５−ＰＮＵ）を用いて、固定化ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に対して（パネルＡ）、並びに既知のｈＲＯＲ１ターゲティングＡＤＣ（２Ａ２−Ｇ５−ＰＮＵ、Ｒ１２−Ｇ５−ＰＮＵ）及び本発明で提供される新規のＡＤＣ（ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ及びＥＲＲ１−Ｔｏｐ４３−Ｇ５−ＰＮＵ）を用いて、固定化ヒト乳癌細胞株ＨＳ５７８Ｔに対して（パネルＢ）実施したインビトロ細胞殺傷アッセイについての効果を示す。ＡＤＣ  Ａｃ１０−Ｇ５−ＰＮＵをターゲティングするＣＤ３０は、いずれのパネルにおいてもアイソタイプ適合コントロールＡＤＣとして使用した。
【図１３】抗体クローン２Ａ２、Ｒ１１及びＲ１２をベースとするＡＤＣ、並びに本発明に開示される抗ＲＯＲ１抗体クローンＸＢＲ１−４０２をベースとするＡＤＣを含む、４つの抗ＲＯＲ１−ＰＮＵ  ＡＤＣを用いた、ＲＯＲ１陽性急性リンパ性白血病細胞株６９７の細胞殺傷についてのインビトロ効力を示す。全ての抗体が、ウサギ−ヒト（Ｒ１１、Ｒ１２、ＸＢＲ−４０２）又はマウス−ヒト（２Ａ２）キメラＩｇＧ1として発現された。（Ａ）ＡＤＣの各々を有する毒素ペイロードＧｌｙ5−ＥＤＡ−ＰＮＵ（Ｇ５−ＰＮＵと略）に部位特異的に結合したＡＤＣの濃度範囲にわたって細胞殺傷を示す。（Ｂ）抗ＲＯＲ１ＡＤＣの各々についての（Ａ）の曲線から算出した細胞殺傷の数値ＩＣ50値を示す。
【図１４】Ｇｌｙ5−ＥＤＡ−ＰＮＵ毒素ペイロード（Ｇ５−ＰＮＵと略）に部位特異的に結合した、選択抗ｈＲＯＲ１  ＡＤＣによる、ＲＯＲ１陽性ＡＬＬ細胞株Ｋａｓｕｍｉ−２（Ａ）及び６９７（Ｂ）のインビトロ細胞殺傷を示す。ＡＤＣは、表示の通り、抗ＲＯＲ１抗体クローン２Ａ２及びＲ１２、並びに抗ＲＯＲ１クローンＸＢＲ１−４０２をベースとする。Ｇｌｙ5−ＥＤＡ−ＰＮＵ毒素ペイロードに部位特異的に結合したＨＥＲ−２特異的トラスツズマブは、アイソタイプ適合コントロールＡＤＣとして用いた。パネルＣ及びＤは、アイソタイプ適合コントロール抗体に対し、一次抗体として抗体２Ａ２を用いたＦＡＣＳによって分析される通り、Ｋａｓｕｍｉ−２及び６９７の細胞表面上で測定したＲＯＲ１の発現レベルを示す。
【図１５】（Ａ）ＥＤＡ−Ｇｌｙ5−ＰＮＵ  ＡＤＣを用いたＲＯＲ１陽性６９７の播種性マウスモデルにおけるＡＤＣのインビトロ効果を示す。マウス（８匹ずつのグループ）に、１０6個の６９７ヒトＡＬＬ細胞を静脈内移植し、７日及び１４日後に、各々１ｍｇ／ｋｇの抗体２Ａ２及び新規抗体ＸＢＲ１−４０２をベースとするＰＮＵ−ＡＤＣ、又はネガティブコントロールとして、ＨＥＲ−２特異的抗体トラスツズマブをベースとするＰＮＵ−ＡＤＣで処置した。マウスグループ内の生存率を時間に対してプロットした。（Ｂ）１ｍｇ／ｋｇを受けたマウスにおいて測定されたＡＤＣの血漿濃度を示し、これは、１２日及び１９日後に、抗ヒトＦｃｇ試薬による捕捉、並びに抗体濃度については抗κ軽鎖検出抗体、及びＡＤＣ濃度については抗ＰＮＵ検出抗体のいずれかによる検出を用いた免疫をベースとするＥＬＩＳＡアッセイにより測定された。
【図１６】パネル（Ａ）は、いずれも、キメラヒトＩｇＧ１抗体として発現される、抗ＲＯＲ１抗体Ｒ１２及び新規の抗体ＸＢＲ１−４０２をベースとする部位特異的結合ＰＮＵ−ＡＤＣを用いたｈＲＯＲ１トランスフェクトマウス乳癌細胞株ＥＭＴ６−クローン１４（ＥＭＴ６−ｃ１１４と略）のインビトロ細胞殺傷を示す。ＨＥＲ−２特異的なトラスツズマブ−Ｇ５−ＰＮＵ  ＡＤＣは、アイソタイプ適合コントロールＡＤＣとして用いた。（Ｂ）別のコントロールとして、同じＡＤＣを用いた同じ細胞殺傷実験を、非トランスフェクト（及びＲＯＲ１陰性）ＥＭＴ６親細胞に対しても実施した。パネル（Ｃ）は、ＲＯＲ１特異的抗体２Ａ２を用いたＦＡＣＳにより検出した、非トランスフェクトＥＭＴ６細胞に対する、ｈＲＯＲ１トランスフェクトＥＭＴ６細胞におけるｈＲＯＲ１の相対発現を示す。
【図１７】抗ＲＯＲ１抗体ｍｓ９６１及び新規の抗体ＸＢＲ１−４０２及びＥＲＲ１−３２４をベースとする部位特異的結合ＰＮＵ−ＡＤＣ（各々、キメラヒトＩｇＧ１抗体として発現される）を用いた、ｈＲＯＲ１トランスフェクトマウス乳癌細胞株ＥＭＴ６−クローン１４（ＥＭＴ６−ｃｌ．１４と略）のインビトロ細胞殺傷を示す。ＨＥＲ−２に特異的なトラスツズマブ−Ｇ５−ＰＮＵは、アイソタイプ適合コントロールＡＤＣとして用いた。
【図１８】（Ａ）は、Ｂａｌｂ／ｃ野生型マウスの乳房脂肪体に移植されたｈＲＯＲ１トランスフェクトＥＭＴ６マウス乳癌細胞株を用いた、同所性マウス乳癌モデルについてのインビボ効果試験の結果を示す。上のパネルは、コントロールＡＤＣトラスツズマブ−Ｇ５−ＰＮＵで２回処置したマウスの生存曲線を示す。中央のパネルは、抗ＲＯＲ１抗体Ｒ１２をベースとするＰＮＵ−ＡＤＣで処置したマウスの生存曲線を示し、下のパネルは、新規抗ＲＯＲ１抗体ＸＢＲ１−４０２をベースとするＰＮＵ−ＡＤＣで処置したマウスの生存曲線を示す。ｘ軸下方の小さな三角は、腫瘍の移植後１４日目及び２１日目に１ｍｇ／ｋｇの各ＡＤＣでそれぞれ実施した２回の処置を示す。（Ｂ）は、パネル（Ａ）に示した３回の実験のカプラン・マイヤープロット（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔ）を示す。
【図１９】全抗体（実線）又はインタクトなＡＤＣ（点線）のいずれかを検出する免疫をベースとするＥＬＩＳＡアッセイにより分析された、ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス血清（パネルＡ）及びヒト血清（パネルＢ）におけるＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ  ＡＤＣのインビトロ安定性を示す。
【図２０】雌ＣＤ−１マウスにおいて評価された新規のネイキッド抗ＲＯＲ１抗体ＸＢＲ１−４０２、並びにＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ  ＡＤＣのインビボ血漿安定性を示す。ヒトＦｃ検出試薬で検出された全ＩｇＧ、並びにＰＮＵ特異的検出試薬で検出されたインタクトなＡＤＣの免疫をベースとするＥＬＩＳＡアッセイにより測定した血漿安定性が示される。
【図２１】２つのコントロール細胞株Ｋａｓｕｍｉ−２（ヒトＡＬＬ細胞株）とＡ５４９（ヒト肺癌細胞株）からの溶解物を含むウエスタンブロット分析によるｈＲＯＲ１タンパク質発現についての様々な患者由来腫瘍溶解物の分析を示す。患者由来腫瘍溶解物は、下記の名称及び起源のものである：ＰＸＦ１１１８：胸膜中皮腫、ＲＸＦ４８６：副腎腫、ＰＸＦ５４１、胸膜中皮腫、ＳＸＦＳ１４０７：神経線維肉腫、ＣＸＦ５３３：腺癌。
【図２２】ＣＸＦ５３３、ＲＸＦ４８６、ＰＸＦ１１１８、ＳＸＦＳ１４０７及びＰＸＦ５４１患者由来腫瘍材料を移植した雌ＮＭＲ１ヌードマウスに樹立された様々な患者由来腫瘍モデル（ＰＤＸモデル）において、ビヒクルコントロールで処置したマウスと比較したＸＢＲ１−４０２抗ＲＯＲ１  ＡＤＣの部位特異的結合ＰＮＵ−ＡＤＣの効果を示す。
【図２３】新規の抗ＲＯＲ１抗体ＸＢＲ１−４０２に由来するヒト化抗体クローンのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。ヒト化可変ドメイン（Ｖλ及びＶH）のアミノ酸配列アラインメントは、Ｋａｂａｔ番号付けを用いて、フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）と一緒に示される。図には、ＨｕＸＢＲ１−４０２（３）、ＨｕＸＢＲ１−４０２（８）、ＨｕＸＢＲ１−４０２（１５）、ＨｕＸＢＲ１−４０２（１７）、ＨｕＸＢＲ１−４０２（１９）、及びＨｕＸＢＲ１−４０２（２６）と称される６つの抗体の重鎖可変ドメイン配列（それぞれ、配列番号１３０〜１３５）及び軽鎖可変ドメイン配列（それぞれ、配列番号１３６〜１４１）が示される。
【図２４】表示されるｋon及びｋoffデータをはじめとする、親ｍＡｂＸＢＲ１−４０２の新規のヒト化クローンについての親和性測定のデータを提供する。
【図２５】（パネルＡ）ｈＲＯＲ１ターゲティング親ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ、並びにヒト化抗体をベースとするＡＤＣ：ｈｕＸＢＲ１−４０２−３−Ｇ５−ＰＮＵ、ｈｕＸＢＲ１−４０２−８−Ｇ５−ＰＮＵ、ｈｕＸＢＲ１−４０２−１５−Ｇ５−ＰＮＵ、ｈｕＸＢＲ１−４０２−１７−Ｇ５−ＰＮＵ、ｈｕＸＢＲ１−４０２−１９−Ｇ５−ＰＮＵ及びｈｕＸＢＲ１−４０２−２６−Ｇ５−ＰＮＵを用いて、ヒト６９７ＡＬＬ癌細胞に対して実施したインビトロ細胞殺傷アッセイの用量−応答曲線を示す。ＨＥＲ２ターゲティング抗体トラスツズマブをベースとするＰＮＵ−ＡＤＣは、アイソタイプコントロールＡＤＣ（Ｔｒａｓ−Ｇ５−ＰＮＵ）として使用した。パネルＢは、インビトロ細胞殺傷効果の定量化（ＩＣ50）を示す。
【図２６】ＲＯＲ１ターゲティングＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔ及びＲ１２  ＣＡＲ−Ｔのインビトロ活性の比較を示す。
【図２７】短いスペーサ及び長いスペーサを有するＲＯＲ１ターゲティングＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔのインビトロ活性の比較を示す。
【図２８】Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを用いた、キメラウサギ／ヒト抗ヒトＲＯＲ１  ＩｇＧ１  ＸＢＲ１−４０２及びコントロールとしてのキメラウサギ／ヒト抗ヒトＲＯＲ２  ＩｇＧ１  ＸＢＲ２−４０１の特異性分析の概略を示す。
【図２９】Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを用いた、キメラウサギ／ヒト抗ヒトＲＯＲ１  ＩｇＧ１  ＸＢＲ１−４０２及びコントロールとしてのキメラウサギ／ヒト抗ヒトＲＯＲ２  ＩｇＧ１  ＸＢＲ２−４０１の特異性分析を示す。４，３３６のヒト血漿膜タンパク質を含む大型スクリーンからの一次結合ヒット（図２８を参照）を単一スライド上で合わせ、キメラウサギ／ヒト抗ヒトＲＯＲ１  ＩｇＧ１  ＸＢＲ１−４０２、並びにコントロールとしてのキメラウサギ／ヒト抗ヒトＲＯＲ２  ＩｇＧ１  ＸＢＲ２−４０１及びリツキシマブバイオシミラーで染色した。左側のＺｓＧｒｅｅｎ１シグナルは、様々なヒト膜タンパク質の発現レベルを示す。それらのそれぞれの抗原（ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、及びＣＤ２０）以外に、ＩｇＧ１フォーマットの試験抗体は、予想された通り、Ｆｃγ受容体ＦＣＧＲ３Ｂ（ＣＤ１６Ｂ）、ＦＣＧＲ１Ａ（ＣＤ６４Ａ）、及びＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２Ａ）にも結合する。二次抗体単独での染色では、予想された通り、ヒトＩｇＧ３重鎖（ＩＧＨＧ３）が検出される。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
１．概説
本発明は、一部が、本発明者らによる大きなナイーブキメラウサギ／ヒトＦａｂライブラリーの作製及びファージディスプレイを介したヒトＲＯＲ１に対する結合物質の選択に基づく。受容体チロシンキナーゼオーファン受容体−１及び−２、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２は、全体的な構造設計及びいくつかの機能的類似性に基づき、新たな受容体チロシンキナーゼファミリーを定義するただ２つのファミリーメンバーである。ＲＯＲ１及びＲＯＲ２タンパク質のいずれも、免疫グロブリンドメイン、システインリッチフリズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ドメイン及びクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメインから構成される細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を有するＩ型１回膜貫通型受容体である。これらの３つの細胞外ドメインに、キナーゼドメインを含むタンパク質の細胞内部分にＥＣＤを結合する膜貫通ドメインが続く（Ｒａｂａｇａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  Ｏｎｃｏｌ．２：１−８）。ヒトＲＯＲ１及びＲＯＲ２タンパク質は、互いに５８％相同であるが、ＲＯＲタンパク質の各々は、種の間で高度に保存されている。最も保存されているのは、実際に、９３７ａａ長タンパク質であるＲＯＲ１タンパク質であり、これは、ヒトと全ての配列決定された非ヒト霊長類との間で９８．５％超同一であり、ヒトとマウス及びウサギＲＯＲ１との間でもそれぞれ９６．７及び９６．３％相同である（Ｂｏｒｃｈｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ  ５：４９６−５０２）。そのため、マウス又はウサギ免疫によって高品質の抗ＲＯＲ１抗体を作製することは課題であり、許容可能な親和性を有する抗体はほんのわずかしか知られていない。例えば、国際公開第２０１０／１２４１８８号パンフレット（マウスモノクローナル抗体２Ａ２）、国際公開第２０１２／０７５１５８号パンフレット（ウサギ抗体Ｒ１１及びＲ１２）、国際公開第２０１２／０９７３１３号パンフレット（マウスモノクローナル抗体Ｄ１０）及び国際公開第２０１４／０３１１７４号パンフレット（マウスｍＡｂ９９９６１のヒト化バージョンで、ｍＡｂＤ１０が結合するのと同じエピトープに結合する）を参照されたい。
【００２７】
マウス／ウサギＲＯＲ１とヒトＲＯＲ１との間に最大のダイバージャンスを有するエピトープに抗体を向かわせるマウス／ウサギの従来の免疫／スクリーニングによる抗ＲＯＲ１抗体の作製（ｍＡｂ２Ａ２、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｄ１０及び９９９６１の同定と同様に）を繰り返さないために、本発明者らは、ファージにより展示された極めて高複雑度のナイーブウサギ抗体Ｆａｂライブラリーを作製し、ＲＯＲ１のネイティブ哺乳動物組換えＥＣＤ、及び細胞表面発現ヒトＲＯＲ１に対する結合についてこのライブラリーをスクリーニングすることにより、ネイティブヒトＲＯＲ１タンパク質と反応性で、最も機能性且つ多様な抗体クローンを選択した。この戦略を選んだのは、得ようとする抗体レパトアが、依然として天然のウサギＢリンパ球に由来し、従って、免疫系の予め選択された抗体重鎖及び軽鎖について選択されるためである。しかし、ネイティブ組換え及び細胞発現ヒトＲＯＲ１を含む適用スクリーニング戦略によって、優れた発展性及び機能性品質を有し、しかも、特定のＲＯＲ１陽性癌のように、ＲＯＲ１発現と関連するヒトの疾患の治療法に特に有用なｈＲＯＲ１特異的抗体が同定されることが期待された。
【００２８】
選んだ戦略の結果、多様なＣＤＲ１、２及び３クローン型（図１）を有し、且つヒトＲＯＲ１に対しては高い結合選択性を有するが、その最も関連する「姉妹分子」であるヒトＲＯＲ２については結合選択性を示さない（図２、３及び１０）いくつかの新たなウサギ高親和性抗ヒトＲＯＲ１抗体が同定された。ｈＲＯＲ１特異的抗体の一部は、ｈＲＯＲ１標的に対して高い親和性（一桁のｎＭ親和性）を示した（図６）。本明細書に詳述するように、異なる重鎖及び軽鎖配列を有するキメラウサギ／ヒトＦａｂフォーマットで１３のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が得られた。これらのｍＡｂは、暫定的に「ＸＢＲ１−４０２」、「ＥＲＲ１−３０１」、「ＥＲＲ１−３０６」、「ＥＲＲ１−３１６」、「ＥＲＲ１−３２４」、「ＥＲＲ１−４０３」、「ＥＲＲ１−４０９」、「ＥＲＲ１−ＴＯＰ４」、「ＥＲＲ１−ＴＯＰ１５」、「ＥＲＲ１−ＴＯＰ２２」、「ＥＲＲ１−ＴＯＰ４０」、「ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３」、及び「ＥＲＲ１−ＴＯＰ５４」と称される。１３の抗体は全て、ＥＬＩＳＡにより分析される通り、精製済ヒトＲＯＲ１に、また、フローサイトメトリーにより分析される通り、細胞表面ヒトＲＯＲ１に結合する。ＲＯＲ１の最も近縁であり、ＲＯＲ１と５８％アミノ酸配列同一性を有するＲＯＲ２に結合するものはなかった。２つのｍＡｂ（「ＥＲＲ１−３０６」と「ＥＲＲ１−ＴＯＰ２２」）は、ヒト及びマウスＲＯＲ１の両方に結合するが、残る１１のｍＡｂは、ヒトＲＯＲ１にしか結合しない。
【００２９】
バイオレイヤー干渉法及び表面プラズモン共鳴によって、全１３のｍＡｂの親和性を決定した。さらに、７つのｍＡｂ（「ＥＲＲ−３０１」、（「ＥＲＲ−３０６」、「ＥＲＲ−４０３」、「ＸＢＲ１−４０２」、「ＥＲＲ１−３２４」、「ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３」、及び「ＥＲＲ１−ＴＯＰ５４」）は、哺乳動物細胞に発現されるキメラウサギ／ヒトＩｇＧ１フォーマットに変換した後、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。特に、更なる評価で最も高いアフィニティクローンＸＢＲ１−４０２及びＥＲＲ１−ＴＯＰ４３は、ヒトＲＯＲ１を過剰発現する哺乳動物細胞（図３）及び天然にｈＲＯＲ１を発現する哺乳動物細胞（図８）を用いたＦＡＣＳによって最も高い染色活性を示した。２つの上位結合クローンＸＢＲ１−４０２及びＥＲＲ１−ＴＯＰ４３は、ウエスタンブロッティングにより変性ＲＯＲ１タンパク質を検出することもでき（図９）、これによって、ＲＯＲ１発現癌のコンパニオン診断の開発のためにこれらのクローンの使用が可能になる。
【００３０】
これに加えて、数個のｍＡｂが、Ｃ末端ソルターゼ認識タグを有するキメラウサギ／ヒトＩｇＧ１として発現され、これによって、国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレットに実質的に記載されているように、ソルターゼ酵素媒介抗体結合技術（ＳＭＡＣ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標））による抗体Ｃ末端へのペイロードの部位特異的結合が可能になる。これらの抗ｈＲＯＲ１抗体は、国際公開第２０１６１０２６７９号パンフレット（本明細書に参照により組み込まれ、その本文は、本出願に付録として組み込まれる）に実質的に開示されているように、非常に強力な抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製するために、非常に強力なアントラサイクリンベースのＰＮＵ１５９６８２毒素誘導体、Ｇｌｙ5−ＥＤＡ−ＰＮＵに部位特異的に結合された（図１１Ｂ）。これらのＡＤＣは、既知の抗ｈＲＯＲ１抗体に基づいて作製されたＡＤＣに対する様々なインビトロ及びインビボ腫瘍モデルにおいて機能的に評価されている。ＸＢＲ１−４０２と呼ばれる１つの特定のリードクローンは、様々な既知抗体（例えば、２Ａ２（国際公開第２０１０／１２４１８８号パンフレットから）、Ｒ１１、Ｒ１２（いずれも、国際公開第２０１２／０７５１５８号パンフレットから）、又はｍｓ９６（国際公開第２０１４／０３１１７４号パンフレットから）と比較して、最も高い効力及び効果を示すことが観察され、これは、現在のところ、ＣＬＬの臨床試験において、ネイキッドＩｇＧ１  ｍＡｂとして、ヒト化抗ｈＲＯＲ１  ｍＡｂシルムツズマブの基礎を形成する。
【００３１】
ＡＤＣとして腫瘍細胞殺傷に対する機能性に関してベストインクラス（ｂｅｓｔ−ｉｎ−ｃｌａｓｓ）特性に基づいて、リードクローンＸＢＲ１−４０２がヒト化され、これは、ｈＲＯＲ１に対してさらに増大した親和性を有する数個のヒト化クローンを生成し、これらは、「ｈｕＸＢＲ１−４０２−３」、「ｈｕＸＢＲ１−４０２−８」、「ｈｕＸＢＲ１−４０２−１５」、「ｈｕＸＢＲ１−４０２−１７」、「ｈｕＸＢＲ１−４０２−１９」及び「ｈｕＸＢＲ１−４０２−２６」と呼ばれる。これらのリードクローンＸＢＲ１−４０２のヒト化バージョンは、部位特異的に結合したＰＮＵ−ＡＤＣとしても評価され、これらの各々は、インビトロｈＲＯＲ１腫瘍モデルにおいてさらに向上した腫瘍殺傷を示した。
【００３２】
ＲＯＲ１ターゲティングｍＡｂの治療有用性をさらに調べるために、既知のＲＯＲ１ターゲティングｍＡｂ  Ｒ１１及びＲ１２についてこれまでに記載されている方法（Ｈｕｄｅｃｅｋ，Ｍ．，Ｌｕｐｏ−Ｓｔａｎｇｈｅｌｌｉｎｉ，Ｍ．Ｔ．，Ｋｏｓａｓｉｈ，Ｐ．Ｌ．，Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ，Ｄ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｒａｄｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．Ｒ．（２０１３）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＯＲ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９，３１５３−３１６４）を用いて、ＸＢＲ１−４０２をベースとするＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した。手短には、エクスビボで拡大した正常ドナーＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞に、レンチウイルスにより、ｓｃＦｖフォーマット中にＸＢＲ１−４０２を含有するＥＦ１αプロモータ駆動の発現カセット、続いて短い若しくは長いスペーサ、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン、並びに切断型リガンド結合及びチロシンキナーゼドメインを含むＴ２Ａ分断膜貫通ＥＧＦＲフラグメントを形質導入した。ＥＧＦＲ＋形質導入Ｔ細胞のＦＡＣＳ単離によって、＞９０％のＣＡＲ−Ｔ細胞における頑健な抗ＲＯＲ１認識が明らかにされた。短いスペーサを有するＲＯＲ１ターゲティングＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔの活性を乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＲＯＲ１＋ＲＯＲ２−）及びＴ４７Ｄ（ＲＯＲ１−ＲＯＲ２＋）に対して試験した。ＲＯＲ１−ＲＯＲ２＋標的細胞ではなく、ＲＯＲ１＋ＲＯＲ２−の存在下で、ＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔは、急速に増殖し、大量にＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌し、標的細胞をインビトロで強力に殺傷した（図２６）。特に、直接比較すると、ＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔは、同じ短いスペーサ及びシグナル伝達ドメインを有する臨床試験されたＲ１２  ＣＡＲ−Ｔと同等又はそれよりも強力であることが判明した。
【００３３】
さらに、本発明者らは、Ｔ細胞と標的細胞との間の最適距離が、膜から遠いエピトープをターゲティングするＣＡＲ−Ｔ細胞に、より短いスペーサを備え付ける、及びその逆によって達成されると仮定した。この仮定に基づき、Ｒ１２を含むオーバーラップエピトープを有するＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔは、長いスペーサと比較して、短いスペーサを備えている場合、より活性となることが予測される。実際に、ＲＯＲ１＋ＲＯＲ２−標的細胞の存在下で、短いリンカーを有するＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔは、長いスペーサを有するＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔよりも速く増殖し（図２７）、また、有意に多量のＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌することが判明した。しかしながら、インビトロ細胞傷害性は、同等に強力であることがわかった（図２７）。
【００３４】
これらの試験に従って、本発明は、ＲＯＲ１を特異的に認識する新規のモノクローナルウサギ及びヒト化抗体、並びに関連抗体をベースとする結合タンパク質及びその抗体フラグメント、さらには、インビトロ及びインビボで腫瘍モデルを発現するｈＲＯＲ１中に特異的抗腫瘍活性を有する抗体薬物複合体及びＣＡＲを提供する。さらに、異常若しくは増大したＲＯＲ１発現に関連する疾患及び状態、例えば、癌の治療及び診断用途において、これらの抗体薬剤を使用する方法も本発明に提供される。
【００３５】
本発明の抗体及び関連組成物は、他の驚くほど有利な特性を明らかにしている。様々なインビトロ及びインビボモデルを使用した、高度に強力なＰＮＵアントラサイクリンペイロードを有する部位特異的結合ＡＤＣとしての新規クローンの機能評価によって、特に、新規のクローンＸＢＲ１−４０２が、既知の抗体のいずれよりも優れた性能を示すことが判明した。例えば、Ｒ１１ベースのＡＤＣは、インビトロ腫瘍モデルにおいて限定的な効力を有した（図１３）。また、抗体クローン９９９６１（ｍｓ９６１）、２Ａ２及びＲ１２と比較して、本明細書に記載される新規のＸＢＲ１−４０２は、インビトロでの腫瘍モデルにおいて一貫して優れた性能を示し（図１３、１４、１７）、これは、インビボでの腫瘍モデルにおいてさらに明らかであった（図１５及び１８）。４，３３６のヒト血漿膜タンパク質に対して試験した際の、その高度に特異的な認識に関するＸＢＲ１−４０２クローンの好ましい特性（図２９）と、マウス血漿及び他の血清中で評価されたＡＤＣの好ましい安定性（図１５Ｂ、１９及び２０）とを組み合わせれば、ＸＢＲ１−４０２ベースのＡＤＣは、ＡＤＣ療法について高い潜在能力を備えたベストインクラス抗ＲＯＲ１ターゲティング製剤の可能性を有すると思われる。
【００３６】
さらに、多くの場合、非ヒト型抗体のヒト化の工程中に親和性が低下しているため、抗ＲＯＲ１  ｍＡｂ  ＸＢＲ１−４０２のヒト化バージョンは、意外にも、親ウサギクローンＸＢＲ１−４０２よりも高い親和性を示した（図２４）（Ｍａｒｇｒｅｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２９：２６６−２７５）。親和性の増大は、ＡＤＣとしての抗腫瘍活性について評価したとき、これらのヒト化ｍＡｂの効力の向上とも相関した（図２５）。これらのデータは、ヒトの疾患の治療法のためのヒト化ＸＢＲ１−４０２抗体に基づき、評価された抗ＲＯＲ１  ＡＤＣの高い効力を証明するものである。ＸＢＲ１−４０２及び／又はヒト化ＸＢＲ１−４０２に基づくＰＮＵ−ＡＤＣの有効な腫瘍治療法についてのこのような高い潜在能力は、ｈＲＯＲ１を発現する患者に由来する多様な異種移植片モデルにおけるＸＢＲ１−４０２ベースのＡＤＣの高い効果（図２２）によって支持される。
【００３７】
本明細書に記載される高度に機能性の抗ｈＲＯＲ１抗体及び関連組成物は、ＲＯＲ１発現に関連するヒト癌の治療法での治療薬として使用する上で極めて優れた機能性を呈示した。こうしたものとして、本明細書に例示した特定の抗体（例えば、ＸＢＲ１−４０２）により示されるものと同じ若しくはほぼ同じ結合特性を有する、本明細書に記載の様々なｈＲＯＲ１抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲが挙げられる。このように、本明細書に例示した抗体によって示される好ましい特性及び高い治療有効性は、本明細書に開示する可変重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ配列の一部若しくは全部、あるいは、本明細書に開示する可変重鎖及び／又は軽鎖のほぼ同様のＣＤＲ配列を含む、同種抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ、ＣＡＲにまで広げることができる。さらに、好ましい特性及び／又は高い治療有効性は、開示される抗体の２つの免疫グロブリン鎖の一方（すなわち、重鎖若しくは軽鎖のいずれか）、又は例示した抗体と相同性である２つの免疫グロブリン鎖の一方（すなわち、重鎖若しくは軽鎖のいずれか）のみを含む、抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ、ＣＡＲにまで広げることもできる。
【００３８】
ＩＩ．定義
別に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の通常の技術者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。下記の参照文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ  ｅｄ．，  １９９２）；  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（Ｅｄ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （３ｒｄ  ｅｄ．，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（Ｅｄ．），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ  （Ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ａｎａｎｄａｎｄ（Ｅｄｓ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；及びａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈ  ｅｄ．，２０００）。これに加えて、本発明の実施に際して読者を補助するために、以下の定義が提供される。
【００３９】
用語「抗体」は、同義語として「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも呼ばれ、又は「抗原結合フラグメント」は、所与の抗原、エピトープ若しくは複数のエピトープに対する強力な一価、二価若しくは多価結合を示すポリペプチド鎖を指す。別に注記されていない限り、本発明で使用される抗体又は抗原結合フラグメントは、任意の脊椎動物種に由来する配列を有することができる。これらは、例えば、ハイブリドーマ技術、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、遺伝子シャッフリングライブラリー、半合成若しくは完全な合成ライブラリー又はこれらの組み合わせなどの任意の好適な技術を用いて作製することができる。別に注記されていない限り、本発明で使用される「抗原」という用語は、インタクトな抗体、抗原結合ポリペプチドフラグメント及び以下に記載されるか、又は当技術分野で公知の他のデザイナー抗体（例えば、Ｓｅｒａｆｉｎｉ，Ｊ  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：５３３−６，１９９３を参照）を含む。
【００４０】
インタクトな「抗体」は、典型的に、ジスルフィド結合により互いに結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖（約５０〜７０ｋＤ）と２つの軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤ）とを含む。認識されている抗体鎖コード免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、Δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに多種多様な免疫グロブリン可変領域遺伝子がある。軽鎖は、κ又はλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、Δ、又はεとして分類され、これらは、それぞれ、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを定義する。
【００４１】
抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（ＶH）と重鎖定常領域から成る。大部分のＩｇＧアイソタイプ（サブクラス）の重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣH1、ＣH2及びＣH3から成り、ＩｇＭ又はＩｇＥなどの一部のＩｇＧアイソタイプは、第４の定常領域ドメイン、ＣH4を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶL）と軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣLから成る。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）などの宿主組織又は因子との結合を媒介し得る。
【００４２】
抗体のＶH及びＶL領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができ、これらの領域の間には、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が点在している。各ＶH及びＶLは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成され、次の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシ末端まで配置されている。ＣＤＲとＦＲ領域の配置及び番号付け方法は、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、米国政府印刷局（Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ）（１９８７及び１９９１）により定義されている。
【００４３】
本明細書で使用される「抗体ベースの結合タンパク質」は、他の非免疫グロブリン、又は非抗体由来成分に関して、少なくとも１つの抗体由来ＶH、ＶL、又はＣH免疫グロブリンドメインを含有する任意のタンパク質を表し得る。こうした抗体ベースのタンパク質として、限定されないが、（ｉ）免疫グロブリンＣHドメインの全部若しくは一部を有する受容体又は受容体成分を含む、結合タンパク質のＦc−融合タンパク質、（ｉｉ）ＶH及び／若しくはＶLドメインが、別の分子スカフォールドに連結されている結合タンパク質、又は（ｉｉｉ）免疫グロブリンＶH、及び／若しくはＶL、並びに／又はＣHドメインが、天然に存在する抗体若しくは抗体フラグメントに通常見いだされない様式で組み合わされている、及び／又はアセンブルされている分子が挙げられる。
【００４４】
「結合親和性」は、一般に、平衡会合又は解離定数（それぞれ、ＫA又はＫD）に関して表現され、これらは、解離及び会合速度定数（それぞれ、ｋoff及びｋon）の反比となる。従って、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性は、異なる速度定数と一致し得る。抗体の結合親和性は、通常、抗体の一価フラグメント（例えば、Ｆabフラグメント）のＫDとして表され、一桁のナノモル範囲以下の（サブナノモル又はピコモル）ＫD値は、非常に高く、治療及び診断的に重要であるとみなされる。
【００４５】
本明細書で使用される用語「結合特異性」は、抗体と抗原（又はエピトープ若しくはその抗原決定基）、受容体とリガンド、酵素と基質の結合のような、ある分子の別の分子に対する選択的親和性を指す。従って、ある実体の特定の抗原決定基（例えば、ＲＯＲ１又はＲＯＲ２の特定のエピトープ）に結合する全てのモノクローナル抗体は、その実体に対する同じ結合特異性を有するとみなされる。
【００４６】
用語「抗体薬物複合体」、又は「ＡＤＣ」は、治療活性物質又は活性医薬成分（ＡＰＩ）を抗体の結合標的にターゲティングして、薬理作用を発揮することができるように、治療活性物質又は活性医薬成分（ＡＰＩ）が共有結合されている抗体を指す。治療活性物質又は活性医薬成分は、ＡＤＣによりターゲティングされる細胞、好ましくは悪性若しくは癌細胞の殺傷をもたらすことができる細胞毒素であってよい。治療活性物質、活性医薬成分又は細胞毒素の共有結合は、ペイロードをリシン若しくはシステイン残基に結合する標準的化学リンカーを用いて非部位特異的様式で実施してもよいし、あるいは、好ましくは、結合部位、並びに作製しようとするＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）の十分な制御を可能にする部位特異的様式で実施する。
【００４７】
用語「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一若しくはほぼ同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は、核酸が、アミノ酸配列をコードしない場合には、ほぼ同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が、いずれか所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。従って、コドンによりアラニンが指定される全ての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを改変することなく、対応する記載のコドンのいずれかに改変することができる。こうした核酸変異は、保存的修飾変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書に記載の全ての核酸配列も核酸のあらゆる可能なサイレント変異を表している。当業者は、機能的に同一の分子を取得するために、核酸中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾することができることは認識されよう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載される配列の各々に内在している。
【００４８】
ポリペプチド配列の場合、「保存的修飾変異体」は、保存的アミノ酸置換、すなわち、電荷が類似した側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換されたアミノ酸残基を有する変異体を指す。電荷が類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００４９】
用語「接触（させること）」は、その通常の意味を有し、２つ以上の物質（例えば、ポリペプチド若しくはファージ）を合わせる、物質と細胞を合わせる、又は異なる細胞の２つの集団を合わせることを指す。接触は、例えば、試験管若しくは増殖培地中で、抗体と細胞を混合する、又は抗体の集団を細胞の集団と混合するなど、インビトロで実施することができる。接触はまた、例えば、細胞における２つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの同時発現により、細胞内で、又は細胞溶解物中で、２つのポリペプチドを接触させるなど、細胞内又はインサイチュで実施することもできる。さらに、接触は、例えば、薬剤を標的細胞に送達するために、被験者に薬剤を投与することにより、被験者においてインビボで実施することもできる。
【００５０】
「ヒト化抗体」は、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，ｐｐ．５５により定義されているように、８０を超えるＴ２０スコアを有するヒトＶH若しくはＶL抗体フレームワーク配列に対する相同性を有する抗体ＶH若しくはＶLドメインを含む抗体若しくは抗体フラグメント、抗原結合フラグメント、又は抗体ベースの結合タンパク質である。
【００５１】
用語「同一」又は「同一性」パーセントは、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、同じである２つ以上の配列若しくはサブ配列を指す。２つの配列は、２つの配列が、比較窓にわたり、あるいは、下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は手動アラインメント及び視覚検査により測定される指定領域にわたって、最大一致について比較したとき、明示されたパーセンテージの同じ（すなわち、明示された領域にわたって、又は明示されていない場合、配列全体にわたって、６０％同一、任意選択で６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一の）アミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有していれば、「実質的に同一である」。任意選択で、同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチド（若しくは１０アミノ酸）の領域にわたって、又は好ましくは長さが１００〜５００又は１０００ヌクレオチド以上（若しくは２０、５０、２００以上のアミノ酸）の領域にわたって存在する。
【００５２】
比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、スミス−ウォーターマンの局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃ，１９７０）により；ニードルマン−ウンシュの相同性アライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）により；ピアーソン−リップマンの類似性検索方法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８）により；これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により；又は手動アラインメント及び視覚検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ  ｅｄ．，  ２００３）を参照）によって実施することができる。配列同一性及び配列類似性の割合を決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０にそれぞれ記載されている。
【００５３】
用語「被験者」は、ヒト及び非ヒト動物（特に、非ヒト哺乳動物）を指す。本明細書で使用される用語「被験者」は、例えば、治療及び診断方法に関して、ヒト又は動物被験者を指す。動物被験者として、限定されないが、ＣＬＬ、ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌、肺癌、結腸癌、頭部及び頚部癌、黒色腫及びその他の癌などのＲＯＲ１発現増大に関連する状態又は障害の哺乳動物モデルのような動物モデルが挙げられる。非ヒト被験者の他の具体的な例として、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルが挙げられる。
【００５４】
人工Ｔ細胞受容体（キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）若しくはＴボディとしても知られる）は、免疫エフェクター細胞に任意の特異性をグラフトする、改変受容体である。典型的には、これらの受容体を用いて、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞にグラフトし；それらのコード配列の転移が、レトロウイルス若しくはレンチウイルスベクター又はトランスポゾンによって促進される。ＣＡＲ操作Ｔ細胞（また、ＣＡＲ−Ｔ細胞と略される）は、その細胞外認識単位が、抗体由来の認識ドメインから成り、その細胞内領域が、１つ又は複数のリンパ球刺激部分に由来するキメラ受容体を備える、遺伝子改変Ｔ細胞である。プロトタイプＣＡＲの構造は、モジュラー型であり、様々な機能性ドメインを収容し、これによって、Ｔ細胞の特異性の選択及び制御された活性化を可能にするように設計されている。好ましい抗体由来の認識単位は、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の特異性及び結合残基を兼ね備える単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。最も一般的なリンパ球活性化部分は、Ｔ細胞トリガー（例えば、ＣＤ３ζ）部分とタンデムのＴ細胞共刺激（例えば、ＣＤ２８）ドメインを含む。エフェクターリンパ球（例えば、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞）にこうしたキメラ受容体を付与することによって、改変細胞は、非ＨＬＡ限定様式で、予定された特異性により、任意の所望される標的抗原に向け直される。レトロウイルス若しくはレンチウイルスベクター又はトランスポゾンを用いて、所与の患者の末梢リンパ球からのＴ細胞に、ＣＡＲ構築物をエクスビボで導入する。得られたＣＡＲ改変Ｔ細胞を注入により患者に戻した後、それらは、移動し、その標的部位に到達し、その標的細胞若しくは組織と相互作用した後、活性化を受けて、予定のエフェクター機能を実施する。ＣＡＲアプローチの治療標的としては、癌及びＨＩＶ感染細胞、又は自己免疫エフェクター細胞が挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用される用語「治療する」、「治療する（こと）」、「治療」、及び「治療に有効な」は、必ずしも１００％又は完全な治療を意味しない。そうではなく、当業者により、潜在的な利益又は治療効果を有するものとして認識される様々な程度の治療がある。これに関して、本発明の方法は、任意の量の任意のレベルの治療を提供し得る。さらには、本発明の方法により提供される治療は、治療対象の疾患の１つ又は複数の状態若しくは症状の治療を含むことができる。
【００５６】
「ベクター」は、プラスミド、ファージ若しくはコスミドなどのレプリコンであり、それに、別のポリヌクレオチドセグメントが結合して、結合したセグメントの複製をもたらし得る。１つ又は複数のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を指令することができるベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。
【００５７】
ＩＩＩ．ＲＯＲ１及び関連誘導体化合物に特異的に結合する、抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲ
一態様では、本発明は、本明細書に例示する抗ＲＯＲ１抗体と同じ結合特異性で、ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する、新規の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、ＡＤＣ又はＣＡＲに関する（図１及び２３）。本発明の抗体としては、同種抗原であるＲＯＲ１に結合する能力を保持するインタクトな抗体の抗原結合部分を含有する、インタクトな抗体（例えば、本明細書に例示するＩｇＧ１抗体）、抗体フラグメント若しくは抗原結合フラグメント（例えば、本明細書に例示するＦａｂフラグメント）、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ及びＣＡＲが挙げられる。こうした抗体フラグメントの例としては、以下のものが挙げられる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶL、ＶH、ＣL及びＣH1ドメインから構成される一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶH及びＣH1ドメインから構成されるＦｄフラグメント；（ｉｖ）インタクトな抗体の単一アームのＶL及びＶHドメインから構成されるＦｖフラグメント；（ｖ）構造的に保存されたフレームワーク領域の間で操作された鎖間ジスルフィド結合を有するジスルフィド安定化Ｆｖｓ（ｄｓＦｖｓ）；（ｖｉ）ＶH又はＶLドメインから構成される単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えば、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９を参照）；並びに（ｖｉｉ）直鎖ペプチド又は環状ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。抗体ベースの結合タンパク質の例は、抗体の結合ドメインが、他のポリペプチド若しくはポリペプチドドメイン、例えば、別の分子スカフォールド、Ｆｃ−領域、他のポリペプチド若しくは抗体の他の機能若しくは結合ドメインと組み合わされて、追加結合特性を有する分子、例えば、二重若しくは多重特異性タンパク質又は抗体をもたらすポリペプチドである。こうしたポリペプチドは、天然に存在する抗体若しくは抗体フラグメントには通常見いだされない結合又は機能ドメインの配列を形成することができる。
【００５８】
本発明の抗体は、単鎖抗体のような抗体フラグメント（又は「抗原結合フラグメント」）も包含する。用語「単鎖抗体」は、ポリペプチド結合中に、一般にスペーサペプチドを介して連結された、ＶH及びＶLドメインを含むポリペプチドを指し、これは、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端に追加ドメイン若しくはアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、単鎖抗体は、コードポリヌクレオチドへの連結のためのテザーセグメントを含んでもよい。一例として、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）は、単鎖抗体である。個別の遺伝子によりコードされるＦｖフラグメントのＶL及びＶHドメインと比較して、ｓｃＦｖは、合成リンカーを介して（例えば、組換え方法により）連結された２つのドメインを有する。これにより、ＶL及びＶH領域が対合して、一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてこれらを作製することが可能になる。
【００５９】
本発明の抗体はまた、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）スカフォールドを有する、単一ドメイン抗原結合単位も包含する。ラクダ科の動物には、ラクダ、ラマ、及びアルパカが含まれる。ラクダ科は、軽鎖が欠失した機能抗体を産生する。重鎖可変（ＶH）ドメインは、自律的にフォールドし、抗原結合単位として独立に機能する。その結合表面は、古典的抗原結合分子（Ｆａｂ）又は単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の６つのＣＤＲと比較して、３つのＣＤＲしか含まない。ラクダ科抗体は、一般的抗体の結合親和性と同等の結合親和性を獲得することができる。
【００６０】
本明細書に記載される様々な抗体、抗体ベースの結合タンパク質、及びその抗体フラグメントは、インタクトな抗体の酵素若しくは化学的修飾により生成するか、又は組換えＤＮＡ方法を用いて新たに合成することもでき、あるいは、ファージディスプレイライブラリーを用いて同定することもできる。これらの抗体、抗体ベースの結合タンパク質、及びその抗体フラグメントを作製する方法は全て、当技術分野で公知である。例えば、単鎖抗体は、ファージディスプレイライブラリー又はリボソームディスプレイライブラリー、遺伝子シャッフルライブラリー（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４，１９９０；及び米国特許第４，９４６，７７８号明細書）を用いて同定することができる。特に、ｓｃＦｖ抗体は、例えば、以下：Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８に記載される方法を用いて取得することができる。Ｆｖ抗体フラグメントは、Ｓｋｅｒｒａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−４１，１９８８に記載されているように作製することができる。ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）は、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７：１１３−２３，１９９６に記載されている方法を用いて作製することができる。同様に、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、例えば、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９；及びＣａｉ  ａｎｄ  Ｇａｒｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６２８０−８５，１９９６に記載されている多様な方法を用いて生成することができる。ラクダ科単一ドメイン抗体は、当技術分野で公知の方法、例えば、Ｄｕｍｏｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１：５００−５１５，２００２；Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４：５２１−５２６，１９９７；及びＢｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：６４３−５５，２００３に記載の方法を用いて生成することができる。他のタイプの抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はＦｄフラグメント）も、日常的に実施されている免疫学方法を用いて容易に生成することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８を参照されたい。
【００６１】
本発明の抗体は、好ましくは、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，ｐｐ．５５によって定義されるように、８０超のＴ２０スコアで、げっ歯類ＶH若しくはＶLドメインよりも、ヒト抗体ＶH若しくはＶLドメインに対してアミノ酸レベルで高い相同性のヒト化抗体ＶH若しくはＶLドメインを有するヒト化抗体をさらに含む。
【００６２】
一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、図１又は図２３に示される抗体と実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列並びに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を有する。例示した抗体の軽鎖及び重鎖ＣＤＲ配列を全て図面に表示する。これらの実施形態の一部では、抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、以下を有する：（１）配列番号２７〜２９とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号６６〜６８とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（２）配列番号３０〜３２とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号６９〜７１とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（３）配列番号３３〜３５とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号７２〜７４とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（４）配列番号３６〜３８とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号７５〜７７とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（５）配列番号３９〜４１とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号７８〜８０とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（６）配列番号４２〜４４とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号８１〜８３とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（７）配列番号４５〜４７とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号８４〜８６とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（８）配列番号４８〜５０とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号８７〜８９とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（９）配列番号５１〜５３とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号９０〜９２とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（１０）配列番号５４〜５６とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号９３〜９５とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（１１）配列番号５７〜５９とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号９６〜９８とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（１２）配列番号６０〜６２とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号９９〜１０１とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；又は（１３）配列番号６３〜６５とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号１０２〜１０４とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列。
【００６３】
一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、以下に示される配列と同一である重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列とを含む：（１）配列番号２７〜２９と配列番号６６〜６８（抗体ＸＢＲ１−４０２）、（２）配列番号３０〜３２と配列番号６９〜７１（抗体ＥＲＲ１−３０１）、（３）配列番号３３〜３５と配列番号７２〜７４（抗体ＥＲＲ１−３０６）、（４）配列番号３６〜３８と配列番号７５〜７７（抗体ＥＲＲ１−３１６）、（５）配列番号３９〜４１と配列番号７８〜８０（抗体ＥＲＲ１−３２４）、（６）配列番号４２〜４４と配列番号８１〜８３（抗体ＥＲＲ１−４０３）、（７）配列番号４５〜４７と配列番号８４〜８６（抗体ＥＲＲ１−４０９）、（８）配列番号４８〜５０と配列番号８７〜８９（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ４）、（９）配列番号５１〜５３と配列番号９０〜９２（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ１５）、（１０）配列番号５４〜５６と配列番号９３〜９５（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ２２）、（１１）配列番号５７〜５９と配列番号９６〜９８（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ４０）、（１２）配列番号６０〜６２と配列番号９９〜１０１（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３）、若しくは（１３）配列番号６３〜６５と配列番号１０２〜１０４（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ５４）。
【００６４】
他の実施形態では、ヒトＲＯＲ１と特異的に結合する本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、以下を含む：（ａ）配列番号１４〜２６若しくは１３６〜１４１のいずれか１つと実質的に同一の配列を有する軽鎖可変ドメイン、（ｂ）配列番号１〜１３若しくは１３０〜１３５のいずれか１つと実質的に同一の配列を有する重鎖可変ドメイン、又は（ｃ）（ａ）の軽鎖と（ｂ）の重鎖の両方。一部の実施形態では、抗体は、（ａ）の軽鎖と（ｂ）の重鎖の両方を含む。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、以下を含む：（ａ）配列番号１４〜２６若しくは１３６〜１４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン、（ｂ）配列番号１〜１３若しくは１３０〜１３５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン、又は（ｃ）（ａ）の軽鎖と（ｂ）の重鎖の両方。一部の実施形態では、同一性の割合は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、あるいは１００％であってよい。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１４〜２６又は１３６〜１４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１４〜２６又は１３６〜１４１のいずれか１つに対して１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、配列番号１〜１３又は１３０〜１３５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。他の実施形態では、同一性の割合は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、あるいは１００％であってよい。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１〜１３又は１３０〜１３５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１〜１３又は１３０〜１３５のいずれか１つに対して１００％の同一性を有する。
【００６５】
一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、本明細書に例示するものなどのいずれか好適な軽鎖と組み合わせて、本明細書に記載するいずれかの重鎖（例えば、図１及び２３に示す重鎖）を含み得る。同様に、抗体は、本明細書に例示するものなどのいずれか好適な重鎖と組み合わせて、前述した軽鎖（例えば、図１及び２３に示す軽鎖）のいずれかを含み得る。例えば、好ましい実施形態では、抗体は、配列番号１４に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖と、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（抗体ＸＢＲ１−４０２）、配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖と、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（抗体ＥＲＲ１−３２４）、配列番号２５に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖と、配列番号１２に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３）、又は配列番号２６に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖と、配列番号１３に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ５４）を含む。一部の実施形態では、抗体は、以下にそれぞれ示す軽鎖と重鎖とを含み得る：（１）配列番号１４と配列番号１、（２）配列番号１８と配列番号５、（３）配列番号２５と配列番号１２、又は（４）配列番号２６と配列番号１３。様々な実施形態において、ペプチド配列の同一性（％）は、例えば、１００×［（同一の位置）／ｍｉｎ（ＴＧＡ，ＴＧＢ）］（式中、ＴＧＡ及びＴＧＢは、ＴＧＡ及びＴＧＢを最小にするアラインメント中のペプチド配列Ａ及びＢにおける残基の数と、内部ギャップ位置の数の総和である。例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４４：３３２−３５０（１９９４）を参照されたい）で計算される。
【００６６】
本発明の抗体は、ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識するか、又はこれと結合する完全長抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質をはじめとする、いずれの抗体であってもよい。例えば、抗体、抗体フラグメント又は抗体ベースの結合タンパク質は、ポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ、又はヒト化抗体であってよい。さらに、抗体は、限定されないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭなどのいずれのアイソタイプのものであってもよい。このように、例えば、抗体は、ＩｇＡ１若しくはＩｇＡ２などのいずれのＩｇＡ、又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、若しくは合成ＩｇＧなどのいずれのＩｇＡであってもよい。抗体は、ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに対する特異性を有するいずれかの抗体フラグメント又は抗体ベースの結合タンパク質、例えば、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、二価、二重特異性、又は多重特異性抗体であってもよい。抗体は、限定されないが、非枯渇ＩｇＧ抗体、ＣＡＲ、又は抗体の他のＦｃ若しくはＦａｂ変異体であってもよい。
【００６７】
前述した重鎖に加えて、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、連続的なナイーブ鎖シャッフリングを用いて、Ｆａｂライブラリーから選択した軽鎖をさらに含み得る。同様に、前述した軽鎖に加えて、本発明の抗体は、連続的なナイーブ鎖シャッフリングを用いて、Ｆａｂライブラリーから選択した重鎖をさらに含み得る。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に例示する抗ＲＯＲ１抗体の保存的修飾変異体である、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを提供する。典型的に、これらの変異体の可変領域は、１又は複数のアミノ酸残基における保存的置換を除いて、これらの例示した配列の１つと同一のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、ヒトＲＯＲ１に特異的に結合し、且つ、配列番号２７〜１０４からなる群から選択される１配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む。本発明はまた、前述のＣＤＲ配列又は実質的に同一のＣＤＲ配列の１つ又は複数の変異体を含む、ＲＯＲ１に対する特異性を有する単離された抗体も提供する。これらの抗体における変異型ＣＤＲ配列は、配列番号２７〜１０４からなる群から選択される１配列に１、２、若しくは３つの置換、挿入、欠失、又はそれらの組み合わせを含み得る。例えば、組換えキメラ若しくはヒト化抗体（又はそのフラグメント）は、前述したＣＤＲ配列の１、２、３、４、５、若しくは６つを含み得る。しかしながら、一部の実施形態では、組換えキメラ若しくはヒト化抗体（又はそのフラグメント）は、同じ軽鎖若しくは重鎖、例えば、配列番号６６〜６８、配列番号７８〜８０、配列番号９９〜１０１、又は配列番号１０２〜１０４に示される軽鎖ＣＤＲ；及び配列番号２７〜２９、配列番号３９〜４１、配列番号６０〜６２、又は配列番号６３〜６５に示される重鎖ＣＤＲの３つＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態では、組換えキメラ若しくはヒト化抗体（又はそのフラグメント）は、同じ抗体の６つのＣＤＲ配列、例えば、（ａ）配列番号６６〜６８と配列番号２７〜２９（抗体ＸＢＲ１−４０２）；（ｂ）配列番号７８〜８０と配列番号３９〜４１（抗体ＥＲＲ１−３２４）；（ｃ）配列番号９９〜１０１と配列番号６０〜６２（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３）、又は（ｄ）配列番号１０２〜１０４と配列番号６３〜６５（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ５４）を含む。
【００６８】
一部の実施形態では、本発明は、約１０μＭ以下、５μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、又は２００ｎＭ以下のＲＯＲ１に対する結合活性を有する抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを提供する。一部の実施形態では、抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、又は約５ｎＭ以下の結合活性で、ＲＯＲ１に結合する。一部の実施形態では、抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、約１ｎＭ以下、約８００ｐＭ以下、約７００ｐＭ以下、約６００ｐＭ以下、約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、又は約１００ｐＭ以下の結合活性で、ＲＯＲ１に結合する。結合活性は、ＥＬＩＳＡ、バイオレイヤー干渉法、又は表面プラズモン共鳴などの当技術分野で公知の技術を用いて測定することができる。
【００６９】
本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、いずれか好適な技術により、例えば、いずれか好適な真核又は非真核生物発現系を用いて、生成することができる。特定の実施形態では、哺乳動物発現系を用いて、抗体を生成する。本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを生成するいくつかの具体的な技術を本明細書に例示する。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、細菌発現系などの好適な非真核生物発現系を用いて、生成することができる。細菌発現系を用いて、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、及びダイアボディなどのフラグメントを生成することができる。こうしたフラグメントを生成するためにＤＮＡコード配列を改変する技術は、当技術分野において公知である。
【００７０】
本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、いずれか好適なタイプの結合を用いて、合成分子に結合させることができる。組換え操作及び組み込みセレノシステイン（例えば、２０１４年１２月２３日に発行された米国特許第８，９１６，１５９号明細書に記載されているような）を用いて、合成分子に結合させることができる。他の結合方法は、ネイティブ若しくは操作リシン側鎖アミン又はシステイン側鎖チオールとの共有結合を含み得る。例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３：１  １３７−１  １４６（２００５）を参照されたい。
【００７１】
好ましい実施形態では、合成分子と結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント（毒素である合成分子との抗体薬物複合体の場合、「ＡＤＣ」と呼ばれる）は、部位特異的ソルターゼ酵素媒介抗体結合を用いて取得される。国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレットに開示されているように、ソルターゼ（ソルターゼトランスペプチダーゼとも呼ばれる）は、特定のペプチドモチーフ（「ソルターゼ認識タグ」又は「ソルターゼタグ」と呼ばれる）を認識して、切断することにより、表面タンパク質を修飾する一群の原核生物酵素を形成する。通常、所与のソルターゼ酵素は、１つ又は複数のソルターゼ認識タグを認識する。ソルターゼ酵素は、天然に存在するものであってもよいし、又は遺伝子操作に付したものであってもよい（Ｄｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２０１４；１１１，１３３４３−８）。
【００７２】
好ましい実施形態では、複合体は、以下：（ａ）１つ又は複数のソルターゼ認識タグを担持する本明細書に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントと、（ｂ）グリシン若しくはオリゴグリシンタグ、Ｇｌｙ(n)を担持する１つ又は複数の合成分子の部位特異的ソルターゼ酵素媒介結合によって得られる。
【００７３】
好ましくは、ソルターゼ認識タグを抗体の少なくとも１つのサブドメインのＣ末端に融合又は結合させる。前記ソルターゼ認識タグは、以下：ＬＰＸＳＧ（配列番号１４２）、ＬＰＸＡＧ（配列番号１４３）、ＬＰＸＴＧ（配列番号１４４）、ＬＡＸＴＧ（配列番号１４５）、及びＮＰＱＴＧ（配列番号１４６）からなる群から選択するのが好ましい。
【００７４】
好ましくは、オリゴグリシンタグ、Ｇｌｙ(n)は、長さ１〜２１グリシン残基を有し、ここで、ｎは、１〜２１の任意の数であり）、長さ３〜５アミノ酸を有するのが好ましい（ｎは３〜５、すなわち、Ｇｌｙ(3)、Ｇｌｙ(4)、又はＧｌｙ(5)）。
【００７５】
合成分子は、腫瘍をターゲティングするものなどの任意の分子であってよい。一部の実施形態では、抗体と結合させる合成分子は、タンパク質（例えば、抗体）又はＲＮＡ若しくはＤＮＡアプタマーである。
【００７６】
一実施形態では、合成分子と結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、一般式Ａ−（Ｌ−Ｐ）nを有し、式中、Ａは、本明細書に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントであり、Ｌは、１つ又は複数のリンカーであり、Ｐは、標識及び細胞傷害性若しくは細胞静止剤からなる群から選択される１つ又は複数のペイロードであり、ここで、ｎは、≧１〜≦１０の範囲の整数である。
【００７７】
この実施形態では、リンカーは、好ましくは、以下：オリゴペプチドリンカー（開裂可能及び開裂不可能なオリゴペプチドリンカーを含む）、ヒドラジンリンカー、チオ尿素、自壊的（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）リンカー、スクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、マレイミドリンカー、ジスルフィドリンカー、チオエーテルリンカー、及び／又はマレイミドリンカーからなる群から選択される少なくとも１つを含むか、又はそれから構成される。
【００７８】
当業者は、別のリンカーも好適となり得ることを理解されよう。こうしたリンカーは、開裂不可能であってもよいし、又はｐＨ、酸化還元電位若しくは特定の細胞内酵素により開裂可能であってもよい。開裂可能なオリゴペプチドリンカーとしては、プロテアーゼ−又はマトリックスメタロプロテアーゼ−開裂可能リンカーがある。リンカーが、上記の組み合わせを含んでもよいことは理解されよう。例えば、リンカーは、バリン−シトルリンＰＡＢリンカーであってもよい。
【００７９】
好ましい実施形態では、リンカーは、ペンタペプチドモチーフ：ＬＰＸＳＧ（配列番号１４２）、ＬＰＸＡＧ（配列番号１４３）、ＬＰＸＴＧ（配列番号１４４）、ＬＡＸＴＧ（配列番号１４５）、及びＮＰＱＴＧ（配列番号１４６）を含む配列を有するオリゴペプチド（Ｘは、任意のアミノ酸である）、続いてオリゴ−グリシン区間、Ｇｌｙ(n)（ｎは、≧１〜≦２１の整数である）を含む。好ましい実施形態では、リンカーは、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントの少なくとも１つのサブドメインのＣ末端に結合される。
【００８０】
様々な実施形態では、抗体と結合させる好適な合成分子（「ペイロード」）としては、例えば、細胞傷害性薬剤、細胞静止剤、又は血管新生阻害剤、放射性同位体、及びリポソームが挙げられる。細胞傷害性薬剤は、植物、真菌、又は細菌分子であってよい。一部の実施形態では、本発明の抗体と結合させる細胞傷害性薬剤は、低分子量毒素（ＭＷ＜２’０００ダルトン、好ましくは、ＭＷ＜１’０００ダルトン）、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素である。これらの毒素の多くの具体的な例が当技術分野で公知である。例えば、Ｄｙｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１０：２３１１−３４，２００４；Ｋｕｙｕｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：１６４５−５８，２０１４；Ｂｅｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．１０：３２２−４２，２０１１；及びＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８：１９９−２２１，１９８４を参照されたい。一部の実施形態では、治療薬を抗体と結合させる。例えば、治療薬は、メイタンシノイド（例えば、メイタンシノール若しくはＤＭ１メイタンシノイド）、タキサン、カリケアミシン、セマドチン、モノメチルラウリスタチン（例えば、モノメチルラウリスタチンＥ若しくはモノメチルラウリスタチンＦ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）又は、好ましくは、アントラサイクリン、より好ましくは極めて強力なアントラサイクリンＰＮＵ−１５９６８２の誘導体であってよい。極めて強力なアントラサイクリンＰＮＵ−１５９６８２の特に好ましい誘導体は、国際公開第２０１６１０２６７９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。治療薬はまた、ビンクリスチン及びプレドニゾンを含んでもよい。様々な実施形態では、本発明で使用することができる治療薬は、抗代謝物質（例えば、メトトレキサートなどの抗葉酸剤、５−フルオロウラシルなどのフルオロピリミジン、システインアラビノシド、又はプリン若しくはアデノシンのアナログ）；挿入剤（例えば、ドキソルビシン、ネモルビシン、又は好ましくはＰＮＵ−１５９６８２の誘導体などのアントラサイクリン）、ダウノマイシン、エピラビシン、イダルビシン、ミトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、若しくはミトラマイシン、又はピロロベンゾジアゼピンなどの他の挿入剤；カリケアミシン、チアンシマイシン、及びその他のエンジインなどのＤＮＡ反応剤；白金誘導体（例えば、シスプラチン若しくはカルボプラチン）；アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミドニトロウレア若しくはチオテパ）；α−アマニチンなどのＲＮＡポリメラーゼ阻害剤；有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド、又はパクリタキセル若しくはドセタキセルなどのタキソイド）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、トポテカン）；細胞周期阻害剤（例えば、フラボピリドール）；又は微小管剤（例えば、エポチロン、チューブリシン、プレ−チューブリシン、ジスコデルモリドアナログ、若しくはエリュテロビンアナログ）であってよい。治療薬は、ボルテゾミブ、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、若しくはドキソルビシンなどのプロテアソーム阻害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤であってよい。治療用放射性同位体としては、ヨウ素（131Ｉ）、イットリウム（90Ｙ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、アクチニウム（225Ａｃ）、プラセオジム、アスタチン（Ａｔ）、レニウム（Ｒｅ），ビスマス（Ｂｉ若しくはＢｉ）、及びロジウム（Ｒｈ）が挙げられる。血管新生阻害剤としては、リモミド、ベバクジマブ、アンギオスタチン、及びラゾキサンが挙げられる。
【００８１】
好ましい実施形態では、合成毒素分子は、Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）に記載されているようなＰＮＵ−１５９６８２及びその誘導体（以下の式（ｉ）を参照）、メイタンシン、モノメチルアウリスタチンＭＭＡＥ、及びモノメチルアウリスタチンＭＭＡＦから選択される。好ましい実施形態では、リンカーと、その波線（ｗａｖｙ  ｌｉｎｅ）で連結する毒素は、国際公開第２０１６１０２６７９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような式（ｉ）のものである：
【化１】
2019509021.tif 000003
【００８２】
合成分子が、式（ｉ）のものである実施形態では、アミノ結合を形成するために、リンカーは、１つのアミノ基が、式（ｉ）の波線に直接連結されるように、形態ＮＨ2−（ＣＨ2）m−ＮＨ2（ｍ≧１且つ≦１１、好ましくはｍ＝２）のアルキルジアミノ基を含むのが好ましい。第２のアミノ基がオリゴペプチドリンカーに連結しているのがさらに好ましい。第２アミノ基は、オリゴペプチドリンカーと連結されるのがさらに好ましく、このリンカーは、より好ましくは、オリゴグリシンＧｌｙ(n)であり、ここで、ｎは、≧１且つ≦２１である。最も好ましいペイロードを図１１（Ｂ）に示す。
【００８３】
一部の実施形態では、合成分子は、任意の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、又は抗体フラグメントに結合させることができる。一部の実施形態では、合成分子は、標識である。標識は、診断用途で有用となり得、例えば、造影剤を含み得る。造影剤は、ヨウ素（131Ｉ若しくは125Ｉ）、インジウム（111Ｉｎ）、テクネチウム（99Ｔｃ）、リン（32Ｐ）、炭素（14Ｃ）、トリチウム（3Ｈ）などの放射性同位体標識、その他の放射性同位体標識（例えば、放射性イオン）、又は上に挙げた治療用放射性同位体の１つなどの治療用放射性同位体標識であってよい。加えて、造影剤は、Ｘ線不透過物質、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）剤、超音波イメージング剤、及び動物の身体をイメージングする装置による検出に好適ないずれか他の造影剤を含み得る。さらに、合成分子は、蛍光標識、生物活性酵素標識、発光性標識、又は発色団標識であってもよい。
【００８４】
一部の実施形態では、合成分子は、Ｂｅｎｄａｓ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，１５：２１５−２２４，２００１に記載されているように、リポソームであってよい。こうした実施形態では、抗体は、コロイド粒子、例えば、リポソームに結合させて、疾患細胞への薬剤の制御送達に用いることができる。リポソーム、例えば、免疫リポソームと結合した抗体を作製する場合、化学療法薬などの薬剤又はその他の薬物を、標的細胞への送達のためにリポソームに封入することができる。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、ＲＯＲ１以外に、１つ又は複数の抗原に対する特異性を有してもよい。例えば、本発明の抗体は、ＲＯＲ１と別の腫瘍抗原、例えば、神経芽細胞腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、結腸癌（例えば、結腸腺癌）、又は乳癌（例えば、乳腺癌）に関連する抗原に対する特異性を有するように、操作する（例えば、二価ダイアボディ、又は結合したＦａｂ二量体若しくは三量体として）ことができる。抗体は、ＲＯＲ１と、細胞傷害性エフェクター細胞の活性化又はターゲティングを促進する抗原とを有するように、操作することができる。
【００８５】
ＩＶ．ＲＯＲ１抗体を生成するためのポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントのセグメント若しくはドメインを含むポリペプチドをコードする配列と同一又は相補的である、実質的に精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）を提供する。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、図１及び２３に示す重鎖又は軽鎖ドメイン配列をコードする。適切な発明ベクターから発現されると、これらのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、ＲＯＲ１抗原結合能力を呈示することができる。さらに、本発明には、本明細書に記載の抗体の重鎖若しくは軽鎖からの少なくとも１つのＣＤＲ領域、通常、３つのＣＤＲ領域全てをコードするポリヌクレオチドも提供される。いくつかの他のポリヌクレオチドは、例示した抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域配列の全部若しくは実質的に全部をコードする。例えば、これらのポリヌクレオチドの一部は、配列番号１〜１３又は１３０〜１３５のいずれか１つに示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び／又は配列番号１４〜２６又は１３６〜１４１のいずれか１つに示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする。コードの縮重のために、様々な核酸配列が、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードすることになる。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドは、例示した抗体の可変領域配列だけをコードすることができる。これらはまた、抗体の可変領域及び定常領域の両方をコードすることもできる。本発明のポリヌクレオチド配列の一部は、配列番号１〜１３又は１３０〜１３５のいずれか１つに示される成熟重鎖可変領域配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％若しくは９９％）同一の成熟重鎖可変領域配列をコードする。本発明のポリヌクレオチド配列の一部は、配列番号１４〜２６又は１３６〜１４１のいずれか１つに示される成熟軽鎖可変領域配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％若しくは９９％）同一の成熟軽鎖可変領域配列をコードする。ポリヌクレオチド配列の一部は、例示した抗体のうちの１抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域を含むポリペプチドをコードする。一部の他のポリヌクレオチドは、例示した抗体のうちの１抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一である２つのポリペプチドセグメントをコードする。
【００８７】
ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成により、又は例示した機能抗体をコードする既存の配列（例えば、以下の実施例に記載する配列）のＰＣＲ突然変異によって、生成することができる。核酸の直接の化学合成は、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０，１９７９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９，１９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９，１９８１のジエチルホスホロアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号明細書に記載の固体支持体法などの当技術分野で公知の方法によって達成することができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入は、例えば、下記の文献に記載されているように実施することができる：ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（Ｅｄ．），Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１；及びＥｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７，１９９１。
【００８８】
さらに、本明細書に記載の機能抗体を生成するための発現ベクター及び宿主細胞も本発明に提供される。抗体を発現するためのプラスミド及びトランスポゾンベースのベクターの具体的な例は、以下の実施例に記載されている。機能抗体鎖又は結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現するために、様々な他の発現ベクターを使用することもできる。ウイルスベース及び非ウイルス発現ベクターを用いて、哺乳動物宿主細胞において抗体を生成することができる。非ウイルスベクター及び系としては、プラスミド、典型的にはタンパク質若しくはＲＮＡを発現するための発現カセットを備えるエピソーマルベクター、ヒト人工染色体が挙げられる（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５，１９９７を参照）が挙げられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞における抗体ポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターには、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ４、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ，Ｂ＆Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ，Ｂ＆Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、並びに他のタンパク質を発現するための当技術分野において知られている多数の他のベクターがある。他の有用な非ウイルスベクターには、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃｋ及びその他のトランスポゾン系によって動員することができる発現カセットを含むベクターがある。有用なウイルスベクターとしては、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ）又はその他のレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）をベースとするベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＢＰ  エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）ベクター及びセムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＶ）をベースとするベクターが挙げられる。Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，前掲；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３，１９９２を参照されたい。
【００８９】
発現ベクターの選択は、ベクターを発現させることが意図される宿主細胞に左右される。典型的には、発現ベクターは、機能抗体鎖又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモータ及び他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含む。一部の実施形態では、誘導性プロモータを使用して、誘導条件下を除き、挿入配列の発現を阻止する。誘導性プロモータとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモータ又はヒートショックプロモータが挙げられる。その発現産物が宿主細胞による耐容性が優れたコード配列について集団を偏らせることなく、形質転換生物の培養物を非誘導条件下で拡大することができる。プロモータに加えて、機能抗体鎖又はフラグメントの効率的な発現のために他の調節エレメントが必要となる、又は望ましい場合もある。これらのエレメントは、典型的に、ＡＴＧ開始コドン及び隣接リボソーム結合部位（コザック共通配列）又はその他の配列を含む。さらに、発現の効率は、使用する細胞系に適したエンハンサーの含有によって増強される（例えば、Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４；及びＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７を参照）。例えば、哺乳動物宿主細胞での発現を増大するために、ＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーを使用することができる。
【００９０】
発現ベクターはまた、挿入された機能抗体配列によってコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も賦与し得る。大抵の場合、挿入された機能抗体配列は、ベクターへの導入の前に、シグナル配列に連結される。また、機能抗体軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする配列を受けるために用いられるベクターも、それらの定常領域若しくは部分をコードすることがある。こうしたベクターは、定常領域を有する融合タンパク質と同様に、可変領域の発現を可能にし、これにより、インタクトな抗体又はそのフラグメントの生成をもたらす。典型的に、こうした定常領域は、ヒト型であり、好ましくはヒトＩｇＧ１抗体のものである。
【００９１】
機能抗体鎖を含有し、これを発現させる宿主細胞は、原核又は真核細胞のいずれであってもよい。一部の好ましい実施形態では、哺乳動物宿主細胞を用いて、本発明の抗体ポリペプチドを発現すると共に、これを生成する。例えば、宿主細胞は、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株又は外性発現ベクターを含有する哺乳動物細胞株のいずれであってもよい。これらは、任意の正常な可死又は正常若しくは異常な不死動物細胞若しくはヒト細胞を含む。本明細書に例示する細胞株以外に、インタクトな免疫グロブリンを分泌することができるいくつかの他の好適な宿主細胞株も当技術分野で知られている。こうした細胞株として、例えば、ＣＨＯ細胞株、各種ＨＥＫ２９３細胞株、各種Ｃｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞及びハイブリドーマが挙げられる。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養物の使用は、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７に概要が論じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモータ、及びエンハンサーなどの発現制御配列、並びにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列などの必要なプロセシング情報部位を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子由来又は哺乳動物ウイルス由来のプロモータを含有する。好適なプロモータは、構成性、細胞型特異的、発生期特異的、及び／又はモジュレート可能若しくは調節可能なものであってよい。有用なプロモータとして、限定されないが、本明細書に例示するＥＦ１α及びヒトＵｂＣプロモータ、メタロチオネインプロモータ、構成性アデノウイルス後期プロモータ、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＭＲＰ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータ、構成性ＭＰＳＶプロモータ、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモータ（ヒト最初期ＣＭＶプロモータなど）、構成性ＣＭＶプロモータ、及び当技術分野で公知のプロモータ−エンハンサー複合体が挙げられる。
【００９２】
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類によって変わる。例えば、原核細胞の場合には、一般に塩化ナトリウム形質転換が使用されるが、他の細胞宿主の場合には、リン酸ナトリウム処理又はエレクトロポレーションが用いられ得る（概要については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲を参照）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、注射及びマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３，１９９７）、薬剤によるＤＮＡの取り込み強化、並びにエクスビボ形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期、高収率生成のためには、多くの場合、安定した発現が望ましい。例えば、ウイルス複製起点又は内在性発現エレメント及び選択マーカ遺伝子を含有する本発明の発現ベクターを用いて、抗体鎖又は結合断片を安定して発現する細胞株を調製することができる。ベクターの導入後、選択培地に移す前に、細胞を濃縮培地中で１〜２日間増殖させてもよい。選択マーカの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在によって、選択培地中で導入配列を好適に発現する細胞の増殖が可能になる。耐性の、安定にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。
【００９３】
本発明は、さらに、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを生成するように組換えにより操作された真核又は非真核細胞（例えば、Ｔリンパ球）も提供する。真核又は非真核細胞は、本発明の抗体を生成するための発現系として使用することができる。一部の実施形態では、本発明は、本発明のＲＯＲ１特異的抗体を組換えにより発現するように操作されたＲＯＲ１標的免疫細胞を提供する。例えば、本発明は、本発明の抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、若しくは（ｓｃＦｖ）２）を発現するように操作されたＴ細胞を提供し、これは、下記ドメイン：スペーサ又はヒンジ領域（例えば、ＣＤ２８配列若しくはＩｇＧ４ヒンジ−Ｆｃ配列）、膜貫通領域（例えば、膜貫通規定ドメイン）、及び細胞内Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインの１つ又は複数を含む合成分子と連結しており、これによって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴボディを形成する。ＣＡＲ（又はＴボディ）内に含有させることができる細胞内ＴＣＲシグナル伝達ドメインとして、限定されないが、ＣＤ３ζ、ＦｃＲ−γ、及びＳｙｋ−ＰＴシグナル伝達ドメイン並びにＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ１３４同時シグナル伝達ドメインが挙げられる。ＣＡＲ（又はＴボディ）を発現するＴ細胞を構築するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｍａｒｃｕ−Ｍａｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．５（２００９年４月１６日にインターネットで公開）を参照されたい。
【００９４】
Ｖ．治療及び診断用途
本明細書に開示するＲＯＲ１抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、ＡＤＣ及びＣＡＲは、様々な治療及び診断用途に使用することができる。ＲＯＲ１は、様々な腫瘍の発生時に発現され、それに関与している。例えば、Ｒｅｂａｇａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．２，３４，２０１２；Ｓｈａｂａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ  １９，９４１−９５５，２０１５を参照されたい。例えば、ＲＯＲ１は、ＣＬＬ、ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌、肺癌、結腸癌、頭部及び頚部癌、黒色腫、及びその他の癌における腫瘍細胞表面上に発現される。重要なことには、ＲＯＲ１は、胚形成に発現されるが、ほとんどが誕生後停止される。ごくわずかな成体正常組織及び細胞が、ＲＯＲ１を発現する。これと一致して、抗ＲＯＲ１  ＣＡＲ操作Ｔ細胞は、非ヒト霊長類において安全且つ活性であることがわかっており、これによって、ＲＯＲ１は、癌の治療標的として認められた（Ｂｅｒｇｅｒ  （２０１５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．３（２），ｐａｇｅ  ２０１６）。従って、ＲＯＲ１に対するｍＡｂは、癌において高い治療及び診断有用性を有する。
【００９５】
一部の実施形態では、本発明は、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、ＡＤＣ又はＣＡＲと細胞を接触させることにより、ＲＯＲ１を発現する細胞（ＲＯＲ１細胞）を阻害する方法を提供する。抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、ネイキッド（非結合）分子、又は合成分子、例えば、細胞傷害剤、細胞静止剤、又は血管新生阻害剤、放射性同位体、あるいはリポソームに結合した抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントであってよい。好ましくは、結合した細胞傷害性分子を含むＡＤＣと細胞を接触させる。この方法を用いて、インビトロで又は被験者において（すなわち、インビボで）ＲＯＲ１細胞を阻害することができる。接触させるＲＯＲ１細胞は、例えば、ＲＯＲ１のレベル増大に関連する障害の細胞培養物又は動物モデルに存在するものであってよい。この方法は、例えば、特定のＲＯＲ１細胞型の抗体の阻害活性を測定及び／又はランク付け（別の抗体に対して）する上で有用である。ＲＯＲ１細胞の阻害は、ＲＯＲ１細胞の活性若しくは増殖を阻止又は低減することを含む。阻害はまた、ＲＯＲ１細胞の殺傷も含み得る。この方法は、特定の作用機構に何ら拘束又は制限されるものではないが、阻害活性は、ＲＯＲ１媒介性シグナル伝達を阻止することにより、又はＲＯＲ１関連受容体のシグナル伝達を阻止することによって、媒介することができる。阻害活性はまた、ＲＯＲ１細胞を攻撃する免疫系エフェクターの動員により、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体系の成分を活性化することによって、媒介することもできる。
【００９６】
一部の関連実施形態では、本発明は、ＲＯＲ１の発現に関連する障害を有する、有することが疑われる、又はそうした障害を発生するリスクがある被験者を治療する方法を提供する。一般に、本方法は、治療有効量の本発明の単離された抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、ＡＤＣ又はＣＡＲを被験者に投与するステップを含む。抗体は、本明細書に記載する本発明の抗ＲＯＲ１抗体、抗ＲＯＲ１抗体フラグメント、抗ＲＯＲ１抗体ベース結合タンパク質のいずれであってもよい。従って、抗体は、キメラ、ヒト化、合成、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、又は（ｓｃＦｖ）２であってよい。一部の実施形態では、本方法は、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、又は二価抗体を投与するステップを含む。投与される抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントは、前述した合成分子、例えば、細胞傷害剤、細胞静止剤、若しくは血管新生阻害剤、治療用放射性同位体、又はリボソームと結合させることができる。例示的な細胞傷害剤は、緑膿菌外毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ）Ａ（ＰＥ３８）である。治療することができる障害としては、ＣＬＬ、ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌、肺癌、結腸癌、頭部及び頚部癌、黒色腫、及びＲＯＲ１のレベル増大に関連するその他の障害が挙げられる。
【００９７】
一部の実施形態では、本発明は、遺伝子操作された本明細書に記載のＴ細胞の養子移入によって、ＲＯＲ１のレベル増大に関連する障害を有する、有することが疑われる、又はそうした障害を発生するリスクがある被験者を治療する方法を提供し、ここで、Ｔ細胞は、ＲＯＲ１と選択的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを発現する。組換え技術を用いて、治療しようとする被験者からのいずれか好適なＴ細胞、例えば、セントラルメモリＴ細胞にＣＡＲコード遺伝子材料を導入することができる。遺伝子材料を担持するＴ細胞を拡大することができる（例えば、サイトカインの存在下で）。遺伝子操作されたＴ細胞は、典型的に、注入によって、患者に移入する。その後、移入された本発明のＴ細胞は、被験者においてＲＯＲ１発現細胞に対する免疫応答を高めることができる。養子移入法を用いて、例えば、ＣＬＬ、ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌、肺癌、結腸癌、頭部及び頚部癌、黒色腫、及びその他の癌を含む、ＲＯＲ１に関連する癌のいずれかを有するか、又は有することが疑われる被験者を治療することができる。一部の実施形態では、前述の治療方法は、さらに、ＲＯＲ１のレベル増大に関連する障害を治療するための第２の治療薬を同時投与するステップも含み得る。例えば、治療しようとする障害が、ＲＯＲ１を発現する癌を含むとき、本方法は、癌を治療するのに好適な、細胞傷害剤、細胞静止剤、若しくは血管新生阻害剤、又は免疫刺激剤（例えば、免疫チェックポイント阻害抗体、例えば、限定されないが、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＴＩＭ３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３などに結合するもの）の同時投与をさらに含み得る。癌が、Ｂ細胞悪性疾患である場合、本方法は、例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、又はＣＨＯＰ化学療法薬レジメンの同時投与をさらに含み得る。
【００９８】
一部の他の実施形態では、本発明は、ＦＡＣＳ、免疫組織化学（ＩＨＣ）又はウエスタンブロッティングのいずれかにより、例えばコントロールに比べて、変化したレベルのＲＯＲ１（例えば、細胞表面ＲＯＲ１）を生体サンプル中で検出する方法を提供する。一般に、本方法は、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントと生体サンプルを接触させるステップと、サンプル中で材料（例えば、細胞）に選択的に結合する抗体の量を決定することにより、生体サンプル中のＲＯＲ１のレベルを決定するステップを含む。生体サンプルは、細胞培養物又は試験被験者由来のものでよく、例えば、ＲＯＲ１のレベル増大に関連する疾患又は状態を有する、有することが疑われる、又はそうした疾患又は状態を発生するリスクがある被験者からの血漿若しくは組織サンプルであってよい。コントロールレベルは、１つ又は複数のコントロール培養物若しくは疾患のない被験者からの対応するサンプル中の同じ抗体を用いて検出されたＲＯＲ１レベルと一致するのが望ましい。本発明の抗体を用いてＲＯＲ１レベルを決定する方法は、イムノ−（ウエスタン）ブロッティング、酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）及びフローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析などの任意の免疫アッセイを含み得る。
【００９９】
検出方法を用いて、ＲＯＲ１増大に関連する障害の存在をスクリーニングすることができる。本方法は、スクリーニングを必要とする試験被験者、例えば、ＲＯＲ１増大に関連する障害を有する、有することが疑われる、又はそうした障害を発生するリスクがある被験者から、サンプルを取得するステップを含む。本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを用いて、サンプル中のＲＯＲ１のレベル（例えば、量又は濃度）を測定し、サンプル中のレベルをＲＯＲ１のコントロールレベルと比較する。コントロールレベルは、例えば、ＲＯＲ１増大に関連する障害のない１又は好ましくは複数のコントロールグループ被験者からのサンプル中の平均レベル（例えば、量又は濃度）を表す。あるいは、コントロールレベルは、試験被験者が、ＲＯＲ１増大に関連する状態がなかった、又はそれを呈示していなかったときなど、以前の１又は複数の時点に、試験被験者から採取された１つ又は複数のサンプル中のＲＯＲ１のレベル若しくは平均レベルと一致してもよい。コントロールレベルに比べて、生体サンプル中の有意に高いＲＯＲ１のレベルは、被験者におけるＲＯＲ１増大に関連する障害を示している。細胞表面ＲＯＲ１発現が主に胚形成に限定されるヒトなどの被験者の場合、ＲＯＲ１のコントロールレベルは、ゼロ又は無であってよい。このように、本発明が提供する検出方法の一部の実施形態では、生体サンプル中のＲＯＲ１のどんな有意且つ検出可能な量も、被験者におけるＲＯＲ１増大に関連する障害を示す可能性がある。
【０１００】
さらに、検出方法を用いて、ＲＯＲ１増大に関連する障害の進行をモニターすることができる。本方法は、スクリーニングを必要とする被験者、例えば、ＲＯＲ１増大に関連する障害を有すると診断されたか、又は有することが疑われる被験者からサンプルを取得するステップを含む。本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを用いて、サンプル中のＲＯＲ１のレベルを測定し、サンプル中のレベルを、以前の１又は複数の時点で試験被験者から採取された１つ又は複数のサンプル中のＲＯＲ１のレベル若しくは平均レベルに一致するコントロールレベルと比較する。コントロールに比べて、有意に増大又は低下したＲＯＲ１のレベルは、被験者の障害が、それぞれ、悪化又は改善していることを示している。前述の検出方法を用いて、例えば、ＣＬＬ、ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌、肺癌、結腸癌、頭部及び頚部癌、黒色腫、及びその他の癌を含む障害の存在をスクリーニングする、又はその進行をモニターすることができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、本発明は、変化したレベルのＲＯＲ１について被験者をスクリーニングする方法を提供する。一般に、本方法は、標識（例えば、造影剤）と結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを被験者に投与するステップ、標識を検出するのに好適な様式で被験者をイメージングするステップ、及び被験者における１領域が、近傍の組織中の標識のバックグラウンドレベルと比較して、変化した密度若しくは濃度の標識を有するか否かを決定するステップを含む。あるいは、本方法は、被験者の同じ領域中で以前検出された標識の密度若しくは濃度と比較して、領域中の標識の密度若しくは濃度に変化があるか否を決定するステップを含む。被験者をイメージングする方法としては、抗体に結合した標識を検出する上で適した、Ｘ線イメージング、Ｘ線コンピュータ断層イメージング（例えば、ＣＴ血管造影（ＣＴＡ）イメージング）、磁気共鳴（ＭＲ）イメージング、磁気共鳴血管造影（ＭＲＡ）、核医学、超音波（ＵＳ）イメージング、最適イメージング、エラストグラフィ、赤外線イメージング、マイクロ波イメージングなどが挙げられる。好ましい実施形態では、被験者は、例えば、ＣＬＬ、ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌、肺癌、結腸癌、頭部及び頚部癌、黒色腫、及びその他の癌などのＲＯＲ１発現腫瘍を有する、有することが疑われる、又はそれを発生するリスクがあり、本方法を用いて、腫瘍の存在をスクリーニング又は検出する。別の実施形態では、本方法を用いて、時間経過による、例えば、治療期間中のＲＯＲ１発現腫瘍サイズ又は密度をモニターすることができる。
【０１０２】
ＶＩ．医薬組成物及び併用
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、又はＡＤＣと、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、本明細書に記載の抗体のいずれかから調製することができる。例示的な組成物として、配列番号１４（軽鎖）及び／又は配列番号１（重鎖）を有するキメラ抗体、配列番号１８（軽鎖）及び／又は配列番号５（重鎖）を有するキメラ抗体、配列番号２５（軽鎖）及び／又は配列番号１２（重鎖）を有するキメラ抗体、並びに配列番号２６（軽鎖）及び／又は配列番号１３（重鎖）を有するキメラ抗体が挙げられる。本発明の医薬組成物に好適な他の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、又はＡＤＣとしては、配列番号１４〜２６若しくは１３６〜１４１に示される軽鎖配列及び／又は配列番号１〜１３若しくは１３０〜１３５に示される重鎖配列を有するものが挙げられる。本発明の他の例示的な組成物は、配列番号１３０〜１４１に例示されるものと同様に、配列番号２７〜１０４からなる群から選択される１、２、３、４、５、若しくは６つのＣＤＲを有するヒト化抗体を含有することができる。一部の実施形態では、抗体は、図１に示される例示軽鎖又は重鎖の３つのＣＤＲ配列を含む。これらは、以下：（１）配列番号２７〜２９と配列番号６６〜６８（抗体ＸＢＲ１−４０２）、（２）配列番号３０〜３２と配列番号６９〜７１（抗体ＥＲＲ１−３０１）、（３）配列番号３３〜３５と配列番号７２〜７４（抗体ＥＲＲ１−３０６）、（４）配列番号３６〜３８と配列番号７５〜７７（抗体ＥＲＲ１−３１６）、（５）配列番号３９〜４１と配列番号７８〜８０（抗体ＥＲＲ１−３２４）、（６）配列番号４２〜４４と配列番号８１〜８３（抗体ＥＲＲ１−４０３）、（７）配列番号４５〜４７と配列番号８４〜８６（抗体ＥＲＲ１−４０９）、（８）配列番号４８〜５０と配列番号８７〜８９（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ４）、（９）配列番号５１〜５３と配列番号９０〜９２（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ１５）、（１０）配列番号５４〜５６と配列番号９３〜９５（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ２２）、（１１）配列番号５７〜５９と配列番号９６〜９８（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ４０）、（１２）配列番号６０〜６２と配列番号９９〜１０１（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３）、又は（１３）配列番号６３〜６５と配列番号１０２〜１０４（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ５４）にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列とを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、図１に例示される同じ抗体の６つのＣＤＲ配列、例えば、（ａ）配列番号６６〜６８と配列番号２７〜２９（抗体ＸＢＲ１−４０２）；（ｂ）配列番号７８〜８０と配列番号３９〜４１（抗体ＥＲＲ１−３２４）；（ｃ）配列番号９９〜１０１と配列番号６０〜６２（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３）、又は（ｄ）配列番号１０２〜１０４と配列番号６３〜６５（抗体ＥＲＲ１−ＴＯＰ５４）を有する抗体を含む。また別の例示的な医薬組成物は、ｄｓＦｖフラグメントを含み、これは、必要に応じて、また当業者には理解されるように、アミノ酸配列に１つ又は複数の修飾を含んでもよい。
【０１０３】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質又はＡＤＣのための担体、望ましくは薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、任意の好適な薬学的に許容される担体であってよい。これは、ヒト若しくは動物患者への投与に適した１種又は複数種の適合性固体若しくは液体充填材、希釈剤、他の賦形剤、又は封入物質（例えば、生理学的に許容される担体又は薬理学的に許容される担体）であってよい。用語「担体」は、活性成分の使用、例えば、被験者への活性成分の投与を容易にするために活性成分と併用される有機若しくは無機成分（天然若しくは合成）を意味する。薬学的に許容される担体は、所望の薬効を実質的に損なわないように、１種若しくは複数種の活性成分、例えば、ハイブリッド分子と混合することができ、また、組成物中に２種以上の薬学的に許容される担体が存在する場合には、互いに混合することができる。薬学的に許容される材料は、典型的に、吐気、めまい、発疹、若しくは急性胃蠕動などの有意な望ましくない生理学的作用を生じることなく、被験者、例えば、患者への投与を可能にする。例えば、治療目的のためにヒト患者に投与される場合、薬学的に許容される担体を含む組成物は免疫原性ではないことが望ましい。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は、さらに、例えば、塩の形態の酢酸、塩の形態のクエン酸、塩の形態のホウ酸、及び塩の形態のリン酸などの好適な緩衝剤を含有することができる。組成物は、さらに、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、及びチメロサールなどの好適な防腐剤を任意選択的に含有することもできる。本発明の医薬組成物は、単位剤形で提供することができ、また、いずれか好適な方法で調製することができ、その多くは、製剤分野で公知である。こうした方法は、本発明の抗体を、１若しくは複数の補助成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般に、組成物は、活性剤を液体担体、微粉化した固体担体、又はその両方と均一且つ入念に会合させた後、必要であれば、生成物を造形することにより調製される。
【０１０５】
非経口投与に好適な組成物は、本発明の組成物の滅菌水性調製物を含むのが好都合であり、これは、好ましくはレシピエントの血液と等張性である。この水性調製物は、好適な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、公知の方法に従い製剤化することができる。滅菌注射調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤若しくは溶媒中の滅菌注射液若しくは懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であってよい。使用することができる許容されるビヒクル及び溶媒として、水、リンガー溶液、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、溶媒又は懸濁媒として、滅菌、不揮発性油が一般に使用される。この目的のために、いずれの無刺激の不揮発性油を使用してもよく、例えば、合成モノ−若しくはジ−グリセリドがある。加えて、オレイン酸などの脂肪酸を注射液の調製に使用することもできる。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に好適な担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見いだすことができる。
【０１０６】
本発明の医薬組成物の調製及びそれらの様々な投与経路は、当技術分野で公知の方法に従って実施することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，２０th  ｅｄ．，２０００；及びＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。本発明に関して有用な送達系は、本発明の組成物の送達が、治療しようとする部位の感作を引き起こす前に、並びにそれを引き起こすのに十分な時間で、実施されるように、定時放出、遅延放出、及び持続的放出を含む。本発明の組成物は、他の治療薬又は療法と一緒に使用することができる。このような系は、本発明の組成物の反復投与を回避して、被験者及び医師に対する便宜を高めることができ、しかも、本発明の組成物にとって特に好適となり得る。
【０１０７】
多くのタイプの放出送達系が入手可能であり、当業者には周知である。好適な送達系としては、ポリ（ラクチド−グリコシド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ無水物が挙げられる。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号明細書に記載されている。送達系はまた、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロール、脂肪酸又はモノ−ジ−及びトリグリセリドなどの中性脂肪を含む脂質である非ポリマー系；ハイドロゲル放出系；シラスティック系；ペプチドベース系；ワックスコーティング；通常の結合剤及び賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分的に融合したインプラントなどを含んでもよい。具体的な例として、限定されないが、以下のものが挙げられる：（ａ）活性組成物が、米国特許第４，４５２，７７５号明細書、同第４，６６７，０１４号明細書、同第４，７４８，０３４号明細書、及び同第５，２３９，６６０号明細書に記載されるものなどのマトリックス内の形態で含有されるエロージョン系、並びに（ｂ）米国特許第３，８３２，２５３号明細書及び同第３，８５４，４８０号明細書に記載されているようなポリマーから制御された速度で活性成分が透過する分散系。さらに、ポンプを用いたハードウエア送達系を使用することができ、そのいくつかは、移植のために改変されている。
【０１０８】
本発明はまた、本発明の方法を実施する上で好適なキットも提供する。典型的には、キットは、本発明の治療及び診断方法を実施するために必要な２種以上の構成要素を含む。キット構成要素としては、限定されないが、本発明の１種又は複数種の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、若しくはＡＤＣ、適切な試薬、及び／又は装置が挙げられる。一部の実施形態では、キットは、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、及びＲＯＲ１を検出する上で好適な免疫アッセイバッファー（例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、磁気選別、又はＦＡＣＳによる）を含み得る。キットは、さらに、１若しくは複数のマイクロタイタープレート、標準、アッセイ希釈剤、洗浄バッファー、接着プレートカバー、磁気ビーズ、磁石、及び／又はキットを使用する本発明の方法を実施するための指示書を含んでもよい。キットスキャンは、基質（例えば、マルチウェルプレート若しくはチップ）に結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを含み、これは、好適にパッケージングされ、ＲＯＲ１を検出する上で有用である。一部の実施形態では、キットは、蛍光標識、生体活性酵素標識、発光性標識、若しくは発色団標識などの標識に結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを含む。キットは、さらに、結合した抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、例えば、酵素の基質を視覚化するための試薬も含み得る。一部の実施形態では、キットは、造影剤に結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、並びに任意選択で、被験者における抗体をイメージングする上で有用な１種若しくは複数種の試薬又は装置の構成要素を含む。
【０１０９】
一般に、キット内の本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントは、例えば、バイアル、ポーチ、アンプル、及び／又は治療若しくは検出方法に適した任意の容器内に好適にパッケージされる。キット構成要素は、濃縮物（凍結乾燥組成物を含む）として提供することができ、これは、使用前に希釈してもよいし、又は使用濃度で提供することができる。インビボでの本発明の抗体の使用のために、所望の量及び濃度の構成要素を有する滅菌容器内に単一用量を供給してもよい。
【実施例】
【０１１０】
本発明をさらに説明するために以下に実施例を記載するが、本発明の範囲を制限することは意図しない。本発明の他の変形は、当業者には容易に理解され、それらは、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０１１１】
実施例１．細胞株
細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＭＤＡ−ＭＢ−４６９，６９７，Ｋａｓｕｍｉ−２、Ｔ４７Ｄ、ＨＳ５７８Ｔ、６３−１２及び６３−１２／ｈＲＯＲ１及び６３−１２／ｈＲＯＲ２トランスフェクタント、Ｋ５６２及びＫ５６２／ｈＲＯＲ１トランスフェクタント、ＥＭＴ−６及びＥＭＴ−６／ＲＯＲ１トランスフェクタントを、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養した。ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、接着培養を支持するために１％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ中に維持するか、又は懸濁培養の場合には、ＦＢＳなしで、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ中に維持した。
【０１１２】
完全長ｈＲＯＲ１及びｈＲＯＲ１哺乳動物発現ベクターのクローニング：合成した、又は配列確認した市販のベクターから得られたフランキング制限部位を有するモジュラー部分から転移可能なベクターバックボーン（ｐＰＢ−Ｐｕｒｏ）をアセンブルしたが、これらについては、国際公開第２０１４０１３０２６Ａ１号パンフレットに詳しく記載されている。これらの元の転移可能なベクターバックボーンは、元のベクター中のプロマイシン耐性遺伝子のＩＲＥＳ駆動発現を個別のホスホグリセリン酸キナーゼプロモータ（ＰＧＫ）駆動発現と交換することによって修飾した。これは、ＩＲＥＳ配列を、多回クローニング部位の３’側に位置するＳＶ４０−ｐＡ配列で置換した後、プロマイシン耐性遺伝子の５’側にＰＧＫプロモータ配列を導入することによって実施した。フランキング制限部位（５’ＮｏｔＩ／３’ＢｓｔＢＩ）を用いた全遺伝子合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）によって完全長ＲＯＲ１／２オープンリーディングフレームを合成し、次に、これらを、それぞれの制限酵素を用いて転移可能なベクターの多回クローニング部位にクローニングした。
【０１１３】
６３−１２マウスＡ−ＭｕＬＶ−形質転換前駆Ｂ細胞株におけるｈＲＯＲ１又はｈＲＯＲ２の異所性発現のための細胞株の操作：マウスエーベルマン（Ａｂｅｌｓｏｎ）マウス前駆Ｂ細胞株６３−１２（Ｓｈｉｎｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：８５５−６７）を、２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ａｍｉｍｅｄ，４−０２Ｆ００−Ｈ）、２００ｍＭのＬ−グルタミン（Ａｍｉｍｅｄ，５−１０Ｋ００−Ｈ）及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Ａｍｒｅｓｃｏ，０４８２）で補充した培地（１７．７ｇ／ＬのＧｉｂｃｏ（登録商標）ＩＭＤＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，４２２００−０３０）、３．０２４ｇ／ＬのＮａＨＣＯ3（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｐ．ａ．，＞９９．７％）、１０ｍＬ／Ｌの１００×非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１１４００３５）、５ｍＬｇ／Ｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉ−５５００）、Ｈ2Ｏ中３ｍＬ／Ｌの１０％プリマトンＲＬ／ＵＦ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＨ2Ｏ中１ｍＬ／Ｌの５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍ−３１４８））において、３７℃及び７．５％ＣＯ2で培養した。細胞は、下記の通り、転位によってｈＲＯＲ１及びｈＲＯＲ２を過剰発現するように操作した：細胞を遠心分離（６分、１２００ｒｐｍ、４℃）し、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に再懸濁させた（５×１０6細胞／ｍＬ）。次に、１０μｇの転移性ベクターｐＰＢ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１（完全長ＲＯＲ１（ＮＰ＿００５００３．２）及びプロマイシン耐性遺伝子の同時発現を指令する）、又は１０μｇの転移性ベクターｐＰＢ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ−ＲＯＲ２（完全長ＲＯＲ２（ＮＰ＿００４５５１．２）及びプロマイシン耐性遺伝子の同時発現を指令する）を含有する４００μＬのＲＰＭＩに、４００μＬの細胞懸濁物を、１０μｇのトランスポザーゼ含有ベクターｐＣＤＮＡ３．１＿ｈｙ＿ｍＰＢと一緒に添加した。ＤＮＡ／６３−１２細胞混合物をエレクトロポレーションキュベット（０．４ｃｍ−ギャップ、１６５−２０８８，ＢｉｏＲａｄ，Ｃｒｅｓｓｉｅｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移し、３００Ｖ及び９５０μＦのキャパシタンスエクステンダー（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ）を備えたＢｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを用いて、エレクトロポレーションした。次に、細胞を室温で５〜１０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１２００ｒｐｍで６分間（４℃）遠心分離し、１回洗浄した後、２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ａｍｉｍｅｄ，４−０２Ｆ００−Ｈ）、２００ｍＭのＬ−グルタミン（Ａｍｉｍｅｄ，５−１０Ｋ００−Ｈ）及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Ａｍｒｅｓｃｏ，０４８２）で補充した水性培地（１７．７ｇ／ＬのＧｉｂｃｏ（登録商標）ＩＭＤＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，４２２００−０３０）、３．０２４ｇ／ＬのＮａＨＣＯ3（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｐ．ａ．，＞９９．７％）、１０ｍＬ／Ｌの１００×非必須アミノ酸（Ｌｉ��ｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１１４００３５）、５ｍＬｇ／Ｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉ−５５００）、Ｈ2Ｏ中３ｍＬ／Ｌの１０％プリマトンＲＬ／ＵＦ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＨ2Ｏ中１ｍＬ／Ｌの５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍ−３１４８）Ｈ2Ｏ中）中に再懸濁させた。５％ＣＯ2雰囲気下、加湿したインキュベータ内の３７℃で２日のインキュベーション後、２μｇ／ｍＬプロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ８８３３）を添加することによって、ｈＲＯＲ１又はｈＲＯＲ２を安定して発現する細胞プールを選択した。
【０１１４】
４〜５日後、操作細胞上でのｈＲＯＲ１又はｈＲＯＲ２発現をフローサイトメトリーにより確認した。手短には、トリプシン処理後、１０6個の細胞をＦＡＣＳチューブ内で遠心分離し；得られたペレットをバッファー（２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＰＢＳ）中に再懸濁させた。ｈＲＯＲ１操作細胞の場合、続いて、細胞を２Ａ２（ＲＯＲ１をターゲティングするｍＡｂ０６６抗体、最終濃度２μｇ／ｍＬ）と一緒に３０分間、４℃でインキュベートした後、遠心分離及び洗浄した。細胞を前述のように再懸濁させ、１：１００希釈率で、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃγ特異的）ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ，１２−４９９８−８２）と一緒に暗所で（３０分、４℃）インキュベートし、バッファーで１回洗浄してから、ＦＡＣＳソーティングまで氷上で維持した。ｈＲＯＲ２操作６３−１２細胞の場合、同じプロトコルを実施するが、一次抗体としてＥＰＲ３７７９（ＲＯＲ２をターゲティングするＡｂｃａｍ抗体；１：１００希釈）及び二次抗体としてアロフィコシアニンと結合したＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，１１１−１３６−１４４）を使用した。
【０１１５】
ｈＲＯＲ１操作６３−１２細胞の場合、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩを用いて、ウェル当たり２００μＬの補充培地を含有する９６ウェル平底プレート中に細胞をシングルセルソーティングした。プレートを３７℃でインキュベートし、分析前にクローンを６ウェルプレートに拡大した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ計器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いたフローサイトメトリーにより、標的発現を確認した。
【０１１６】
ＥＭＴ−６マウス乳癌細胞株におけるｈＲＯＲ１の異所性発現のための細胞株操作：マウスＥＭＴ−６乳癌細胞（バーゼル大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．ｍｅｄ．Ａｌｆｒｅｄ  Ｚｉｐｐｅｌｉｕｓからの親切な寄贈品）を、完全ＤＭＥＭ（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ及び２ｍＭのＬ−グルタミン（全て、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（４．５ｇ／ｌ））において、３７℃及び５％ＣＯ2で培養した。細胞は、下記の通り、転位によってＲＯＲ１を過剰発現するように操作した：細胞を遠心分離（６分、１２００ｒｐｍ、４℃）し、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に再懸濁させた（５×１０6細胞／ｍＬ）。次に、１３．３μｇの転移性ベクターｐＰＢ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１（完全長ＲＯＲ１（ＮＰ＿００５００３．２）及びプロマイシン耐性遺伝子の同時発現を指令する）と、６．６μｇのトランスポザーゼ含有ベクターｐＣＤＮＡ３．１＿ｈｙ＿ｍＰＢを含有する４００μＬのＲＰＭＩに、４００μＬの上記細胞懸濁物を添加した。ＤＮＡ／ＥＭＴ−６細胞混合物をエレクトロポレーションキュベット（０．４ｃｍ−ギャップ，１６５−２０８８，ＢｉｏＲａｄ，Ｃｒｅｓｓｉｅｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移し、３００Ｖ及び９５０μＦのキャパシタンスエクステンダーを備えたＢｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを用いて、エレクトロポレーションした。次に、細胞を室温で５〜１０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１２００ｒｐｍで６分間遠心分離し、１回洗浄してから、続いて完全ＤＭＥＭ中に再懸濁させた後、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃にて、加湿したインキュベータ内でのインキュベーションに付した。エレクトロポレーションから１日後、３μｇ／ｍＬのプロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ８８３３）を添加することによって、ヒトＲＯＲ１を安定に発現する細胞プールを選択した。
【０１１７】
選択したＥＭＴ−６−ＲＯＲ１細胞上でのＲＯＲ１発現をフローサイトメトリーにより確認した。手短には、トリプシン処理後、１０6個の細胞をＦＡＣＳチューブ内で遠心分離し；得られたペレットをバッファー（２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＰＢＳ）中に再懸濁させた。次に、細胞を２Ａ２（ｍＡｂ０６６）；３０分、４℃、最終濃度２μｇ／ｍＬ）と一緒にインキュベートした後、遠心分離及び洗浄した。続いて、細胞を前述のように再懸濁させ、１：２５０希釈率で、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃγ特異的）ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ，１２−４９９８−８２）と一緒に暗所で（３０分、４℃）インキュベートし、バッファーで１回洗浄してから、ＦＡＣＳソーティングまで氷上で維持した。
【０１１８】
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩを用いて、ウェル当たり２００μＬの完全ＤＭＥＭを含有する９６ウェル平底プレート中に細胞をシングルセルソーティングした。このプレートを３７℃でインキュベートし、クローンを６ウェルプレートに拡大した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ計器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて、上に概説したフローサイトメトリーによるＲＯＲ１発現の分析を行った。
【０１１９】
図１６Ｃは、抗ＲＯＲ１抗体２Ａ２（ｍＡｂ０６６）を用いて検出された、クローン１４（高ＲＯＲ１発現）及びＷＴ（ＲＯＲ１陰性）ＥＭＴ−６のＦＡＣＳ分析データを示す。
【０１２０】
実施例２．高複雑度ウサギＦａｂライブラリーの作製及びスクリーニング用の試薬
組換えヒトＲＯＲ１タンパク質の構築、発現、及び精製：ヒトＲＯＲ１又はマウスＲＯＲ１の様々なドメインを含有するｈＦｃ融合タンパク質の構築、発現、精製及びビオチン化が記載されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２１０１８，２０１１）。ｈＲＯＲ１−ＡＶＩ−６ＸＨＩＳ融合タンパク質の場合、ヒトＲＯＲ１（２４−４０３）の細胞外ドメインを、プライマーｐＣＥＰ４−ｈＲＯＲ１−Ｆ及びｐＣＥＰ４−ｈＲＯＲ１−Ａｖｉタグ−Ｒ（ＡＶＩタグは、プライマーｐＣＥＰ４−ｈＲＯＲ１−Ａｖｉタグ−Ｒにより、ＲＯＲ１のＣ末端に導入されたことに留意されたい）を用いてＰＣＲ増幅した後、プライマーｐＣＥＰ４−シグナル−Ｆ−ＫｐｎＩ及びｐＣＥＰ４−６ＨＩＳ−Ｒ−ＸｈｏＩを用いた伸長ＰＣＲにより、Ｎ及びＣ末端にシグナルペプチド及び６ＸＨＩＳタグを個別に付加した後、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩを介したｐＣＥＰ４へのクローニングを実施した。次に、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、この構築物をＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクトし、Ｋｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｅｒ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６：Ｕｎｉｔ  ６  １０，２００９に記載されているように、１−ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙによりタンパク質を精製した。精製したｈＲＯＲ１−ＡＶＩ−６ＸＨＩＳの品質及び量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡ280吸光度によりそれぞれ分析した。これに続いて、プロトコルに従ってＡｖｉｄｉｔｙ（Ａｕｒｏｒａ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）製のＢｉｒＡ酵素キットにより融合タンパク質をビオチン化した。手短には、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中４０μＭで２ｍｇのＲＯＲ１−ＡＶＩ−６ＸＨＩＳを、３７℃で３０分のインキュベーション後、１０μｇのＢｉｒＡを用いてビオチンの存在下、ビオチン化し、続いて、前述のように１ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて再度精製した。ｐＣＥＰ４−ｈＲＯＲ１−Ｆ：５’−ａｔｃｃｔｇｔｔｔｃｔｃｇｔａｇｃｔｇｃｔｇｃａａｃｔｇｇａｇｃａｃａｃｔｃｃｇｃｃｃｇｇｇｇｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃｃａｇ−３’（配列番号１０５）；ｐＣＥＰ４−ｈＲＯＲ１−Ａｖｉ−ｔａｇ−Ｒ：５’−ｃｃａｃｔｃｇａｔｃｔｔｃｔｇｇｇｃｃｔｃｇａａｇａｔｇｔｃｇｔｔｃａｇｇｃｃｃｔｃｃａｔｃｔｔｇｔｔｃｔｔｃｔｃｃｔｔ−３’（配列番号１０６）；ｐＣＥＰ４−シグナル−Ｆ−ＫｐｎＩ：５’ｇｃｔｇｇｇｔａｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃｔｇｇａｃｔｔｇｇａｇａａｔｃｃｔｇｔｔｔｃｔｃｇｔａｇｃｔｇｃｔ−３’（配列番号１０７）；ｐＣＥＰ４−６ＨＩＳ−Ｒ−ＸｈｏＩ：５’−ｇｃｃｇｇｃｃｔｃｇａｇｔｃａｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃｇｔｇｃｃａｃｔｃｇａｔｃｔｔｃｔｇｇｇｃｃｔｃ−３’（配列番号１０８）。
【０１２１】
組換えヒトＲＯＲ１（ｈＲＯＲ１−Ｈｉｓ）及びヒトＲＯＲ２（ｈＲＯＲ２−Ｈｉｓ）タンパク質の構築、発現、及び精製：テンプレートとしてｐＣＥＰ４−ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２１０１８，２０１１）を用いて、プライマーＳＰ−ｈＲＯＲ１＿Ｆ（５’  ｇｃｔｇｇｇｔａｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃｔｇｇａｃｔｔｇｇａｇａａｔｃｃｔｇｔｔｔｃｔｃｇｔａｇｃｔｇｃｔｇｃａａｃｔｇｇａｇｃａｃａｃｔｃｃｇｃｃｃｇｇｇｇｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃｃａｇ  ３’）（配列番号１０９）及びｈＲＯＲ１−Ｈｉｓ＿Ｒ（５’ｃｇｇｃｃｔｃｇａｇｔｃａｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃｃａｔｃｔｔｇｔｔｃｔｔｃｔｃｃｔｔ  ３’）（配列番号１１０）でｈＲＯＲ１−ＨｉｓをＰＣＲ増幅し、またテンプレートとしてｐＣＥＰ４−ｈＦｃ−ｈＲＯＲ２を用いて、プライマーＳＰ−ｈＲＯＲ２＿Ｆ（ｇｃｔｇｇｇｔａｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃｔｇｇａｃｔｔｇｇａｇａａｔｃｃｔｇｔｔｔｃｔｃｇｔａｇｃｔｇｃｔｇｃａａｃｔｇｇａｇｃａｃａｃｔｃｃｇａａｇｔｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇａｔｃｃｇ）（配列番号１１１）及びｈＲＯＲ２−Ｈｉｓ＿Ｒ（ｃｇｇｃｃｔｃｇａｇｔｃａｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｇｃｃｃｃａｔｃｔｔｇｃｔｇｃｔｇｔｃｔｃｇ）（配列番号１１２）でＰＣＲ増幅した。次に、これらを、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩを介して個別にｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。続いて、これらの構築物を、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に個別且つ一過性にトランスフェクトし、Ｋｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｅｒ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６：Ｕｎｉｔ  ６  １０，２００９に記載されているように、１−ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙにより、対応するタンパク質を精製した。精製したｈＲＯＲ１−Ｈｉｓ及びｈＲＯＲ２−Ｈｉｓの品質及び量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡ280吸光度によりそれぞれ分析した。
【０１２２】
ナイーブキメラウサギ／ヒトＦａｂライブラリーの作製及び選択：ウサギの取り扱いは全て、Ｐｏｃｏｎｏ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｆａｒｍ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ，ＰＡ）又はＲ＆Ｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔａｎｗｏｏｄ，ＷＡ）の家畜担当職員により実施された。計９匹のウサギ（月齢３〜４ヵ月）を使用した。これらのウサギの５匹は、ニュージーランドホワイト（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ）（ＮＺＷ）系統であり、そのうち３匹は、Ｐｏｃｏｎｏ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｆａｒｍ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ，ＰＡ）から取得し、２匹は、Ｒ＆Ｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔａｎｗｏｏｄ，ＷＡ）から取得した。４匹のｂ９野生型ウサギは、米国立アレルギー・感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）（ＮＩＡＩＤ）（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ−Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ８１：１７９４−１７９８，１９８４；及びＰｏｐｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２５：３２５−３３５，２００３で開発され、特性決定された純種を起源とする個別のＲ＆Ｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから得られた。各ウサギからの脾臓及び骨髄を収集し、確立されたプロトコル（Ｒａｄｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５２５：１０１−１２８，ｘｉｖ，  ２００９を用いて、全ＲＮＡ作製並びにウサギＶκ、Ｖλ、及びＶHコード配列のＲＴ−ＰＣＲ増幅のために処理した。ウサギ（ｒｂ）Ｖκ／ヒト（ｈｕ）Ｃκ／ｒｂＶH及びｒｂＶλ／ｈｕＣλ／ｒｂＶHセグメントは、それぞれ、３フラグメントオーバーラップ発現ＰＣＲに基づく１融合ステップでアセンブルした。ｂ９ウサギに由来するＶLも、ＮＺＷウサギ由来のＶHを用いてアセンブルしたことに留意されたい。ＦａｂコードフラグメントをＳｆｉＩで消化し、ＳｆｉＩ処理ファージディスプレイベクターｐＣ３Ｃ（Ｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ３１８：７５−８７，２００７）と１６℃で２４時間連結した。続いて、３０回の個別のエレクトロポレーション（各々、５０μｌのエレクトロコンピテントセル中０．５μｇのＤＮＡを用いる）により、１５μｇの精製ｐＣ３Ｃ−ｒｂＶκ／ｈＣκ／ｒｂＶH連結産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＳＲ３２０（トロント大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏ，  Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）Ｄｒ．Ｓａｃｈｄｅｖ  Ｓ．Ｓｉｄｈｕからの親切な寄贈品）に形質転換し、ライブラリーκについて７．５×１０9個の独立した形質転換体を取得した。ライブラリーλの場合、同じ手順を用いて、４．８×１０9個の独立した形質転換体が得られた。ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、ファージミドライブラリーをファージライブラリーに変換し、−８０℃で保存した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又はＥＲ２７３８（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を用いて、ファージライブラリーκ及びライブラリーλを再度増幅し、同様に混合した後、ビオチン化ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１又はｈＲＯＲ１−ＡＶＩ−６ＨＩＳに対する４ラウンドのパ���ングに付した。パニングの間、５μｇ／ｍＬの抗原をストレプトアビジンコート磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に３７℃で３０分間プレインキュベートした後、ｈＦｃ−ＲＯＲ１を用いた場合、１ｍｇ／ｍＬの非特異的ポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下で、ファージライブラリーからの結合物質を捕捉した。第３ラウンドのパニングから、空のビーズを用いたインキュベーションにより、インプットファージをネガティブディプリーションした後、抗原負荷ビーズに対する選択に付した。選択の後、ＩＰＴＧ誘導細菌クローンの上清をＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーにより分析した。ＡｌｕＩを用いたＤＮＡ指紋法により反復クローンを同定し、ユニークなクローンのＶL及びＶH配列をＤＮＡシーケンシングにより決定した（図１）。
【０１２３】
実施例３．キメラウサギ／ヒトＦａｂ及び完全長ＩｇＧ１抗体の発現及び精製
キメラウサギ／ヒトＦａｂ及びＩｇＧ１の構築、発現及び精製：キメラウサギ／ヒトＦａｂフォーマットのＭＡｂ  ＸＢＲ１−４０２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミドｐＣ３Ｃ−Ｈｉｓにクローニングして、発現さ、Ｋｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｅｒ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６：Ｕｎｉｔ  ６  １０，２００９に記載されているように精製した。キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１フォーマットのｍＡｂ  ＸＢＲ１−４０２の発現のために、以前記載されているベクターＰＩＧＧ−Ｒ１１を使用した（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２１０１８，２０１１）。Ｆａｂ  ＸＢＲ１−４０２のＶHコード配列を、プライマー４−２＿ＶＨ＿Ｆ及び４−２＿ＶＨ＿Ｒを用いてＰＣＲ増幅し、ＡｐａＩ／ＳａｃＩを介してＰＩＧＧ−Ｒ１１にクローニングした。次に、ＸＢＲ１−４０２の軽鎖コード配列を、プライマー４−２＿λ＿Ｆ及びＬＥＡＤ−Ｂを用いてＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩを介して、対応する重鎖コード配列を有するＰＩＧＧ−Ｒ１１にクローニングした。Ｆａｂ  ＸＢＲ１−４０２のＶHコード配列のＦＲ４の内部ＡｐａＩ部位は、プライマー４−２＿ＶＨ＿Ｒにおけるサイレント突然変異によって除去されたことに留意されたい。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおける選択の間に抑制されていたＴＡＧ停止コドンは、プライマー４−２＿ＶＨ＿Ｆを用いて、ネイティブＶHの第１アミノ酸をコードするＣＡＧ（グルタミン）に変更した（図１）。得られたＰＩＧＧ−ＸＢＲ１−４０２プラスミドは、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性トランスフェクトし、記載されているように（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２１０１８，２０１１；及びＹａｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９０１：２０９−２３２，２０１２）、１ｍＬ組換えＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、タンパク質を精製した。精製したＩｇＧ１の品質及び量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡ280吸光度によりそれぞれ分析した。
【０１２４】
キメラウサギ／ヒトＦａｂフォーマット中の他の全てのｍＡｂを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミドｐＥＴ１１ａにクローニングして、発現させ、記載されているように（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２１０１８，２０１１）精製した。キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１フォーマットのｍＡｂ  ＥＲＲ１−３２４，ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３及びＥＲＲ１−ＴＯＰ５４の発現のために、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、重鎖及び軽鎖を個別にクローニングした。重鎖の場合、重鎖シグナルペプチドコード配列、ＥＲＲ２−３０２（ｈＲＯＲ２に対するｍＡｂ）のＶH及びヒトＩｇＧ１のＣＨ１（１〜４９）をＩＤＴ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）により合成し、プライマーＫｐｎＩ／ＡｓｃＩ−シグナル及びＣＨ１−内部／オーバーラップ−Ｒを用いて増幅して、プライマーＣＨ１−内部／オーバーラップ−Ｆ及びＨＣ−ＣＨ３−Ｒ−ＸｈｏＩを用いてＰＩＧＧから増幅されたＣＨ１（５０〜８８）−ＣＨ２−ＣＨ３と、プライマーＫｐｎＩ／ＡｓｃＩ−シグナル及びＨＣ−ＣＨ３−Ｒ−ＸｈｏＩを用いたオーバーラップ伸長ＰＣＲにより融合した後、ＡｓｃＩ／ＸｈｏＩによりｐＣＥＰ４にクローニングした。ｇＢｌｏｃｋを合成したとき、ＥｈｅＩ部位は、同義突然変異によってＡｌａ12のＣＨ１に導入されたことに留意されたい。その結果、この構築物は、ＡｓｃＩ／ＥｈｅＩを用いてＶHを置換することにより、他のｍＡｂの重鎖をクローニングするためのベクターとして役立ち：ＥＲＲ１−３２４、ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３及びＥＲＲ１−ＴＯＰ５４のＶHを、フォワードプライマーＥＲＲ１−３２４  ＨＣ−Ｆ、ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３  ＨＣ−Ｆ及びＥＲＲ１−ＴＯＰ５４  ＨＣ−Ｆ並びにリバースプライマーＶＨ−ＣＨ１−Ｒ−ＥｈｅＩで個別に増幅した後、伸長ＰＣＲにより、プライマーＫｐｎＩ／ＡｓｃＩ−シグナル及びＶＨ−ＣＨ１−Ｒ−ＥｈｅＩを含むシグナルペプチドを付加した。次に、ＡｓｃＩ／ＥｈｅＩにより、各ＶHをベクターに挿入した。軽鎖のクローニングのために、ＥＲＲ１−ＴＯＰ４３及びＥＲＲ１−ＴＯＰ５４のλ軽鎖は、ＬＣ−Ｒ−Ｘｈｏｌと個別に組み合わせたプライマーＥＲＲ１−ＴＯＰ４３  ＬＣ−Ｆ及びＥＲＲ１−ＴＯＰ５４  ＬＣ−Ｆで増幅し、ＥＲＲ１−３２４のκ軽鎖は、プライマーＥＲＲ１−３２４  ＫＣ−Ｆ及びＫＣ−Ｒ−ＸｈｏＩで増幅した。次に、フォワードプライマーＫｐｎＩ／ＡｓｃＩ−シグナル及びリバースプライマーＬＣ−Ｒ−ＸｈｏＩ又はＫＣ−Ｒ−ＸｈｏＩを用いた伸長ＰＣＲにより、シグナルペプチドコード配列を付加した。続いて、各軽鎖ＰＣＲ産物をＡｓｃＩ／ＸｈｏＩによりｐＣＥＰ４にクローニングした。各ＩｇＧについて重鎖又は軽鎖を含む、得られた構築物は、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性同時トランスフェクトし、記載されているように（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２１０１８，２０１１；及びＹａｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９０１：２０９−２３２，２０１２）、１ｍＬ組換えＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，��Ｊ）を用いて、対応するタンパク質を精製した。精製したＩｇＧ１の品質及び量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡ280吸光度によりそれぞれ分析した。
【０１２５】
【表１】
2019509021.tif 000004
【０１２６】
実施例４．抗体結合活性の試験
ＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡ（図２）のために、９６ウェルＣｏｓｔａｒ３６９０プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を２５μＬのコーティングバッファー（０．１  Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．６）中１００ｎｇの抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃで、３７℃にて１時間コーティングした。１５０μＬの３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＴＢＳで、３７℃にて１時間遮断してから、１００ｎｇ／５０μＬで、３７℃にて１時間のインキュベーションの後、ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１又はｈＦｃ−ｍＲＯＲ１を捕捉した。次に、１００ｎｇ／５０μＬのＦａｂを３７℃の各ウェル内に塗布した。２時間後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＴＢＳ中のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に結合させたマウス抗体ＨｉｓタグｍＡｂの１：１０００希釈物５０μＬを用いて、Ｆａｂを検出した。エピトープ（図４）を決定するために、ｈＲＯＲ１の様々なドメインを含有するｈＦｃ融合タンパク質を直接コーティングし、続いて、Ｆａｂと一緒にインキュベートした後、ＨＲＰに結合したマウス抗ＨｉｓタグｍＡｂによる検出を行った。ＰＢＳによる洗浄を繰り返してから、基質として２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、製造者の指示に従い、比色検出を実施した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）及びＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
【０１２７】
フローサイトメトリー：標準的なフローサイトメトリー方法を用いて、細胞を染色した。手短には、精製済の抗ＲＯＲ１  Ｆａｂ（図３）の場合、０．１〜１×１０6個の細胞を氷上の１０００ｎｇ／１００μＬのＦａｂで１時間かけて染色した。氷冷フローサイトメトリーバッファー（１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）で２回洗浄した後、氷上の１００μＬフローサイトメトリーバッファー中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｑｉａｇｅｎ）と結合したマウス抗ＨｉｓタグｍＡｂの１：１０００希釈物と一緒に、細胞を３０分間インキュベートした。精製済の抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ１（図８）の場合、０．１〜１×１０6個の細胞を４％ヤギ血清により室温で１５分間遮断した後、１００ｎｇ／１００μＬのＩｇＧと一緒に氷上で１時間インキュベートした。氷冷フローサイトメトリーバッファーで２回洗浄した後、氷上の１００μＬフローサイトメトリーバッファー中のＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＦｃγＡｂの１：５００希釈物で、３０分かけて細胞を染色した。市販のヤギ抗ヒトＲＯＲ１ポリクローナル抗体（図８）の場合、０．１〜１×１０6個の細胞を氷上の２００ｎｇ／１００μＬのＡｂで１時間かけて染色した。氷冷フローサイトメトリーバッファー（１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）で２回洗浄した後、氷上の１００μＬフローサイトメトリーバッファー中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７と結合したＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）2ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）の１：１０００希釈物と一緒に、細胞を３０分間インキュベートした。最後に、分析から死滅細胞を排除するために、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍＬまで添加した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ計器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて、細胞を分析した。
【０１２８】
表面プラズモン共鳴：ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１に対する全Ｆａｂの親和性の測定及びエピトープマッピング試験のために表面プラズモン共鳴を、Ｂｉａｃｏｒｅ試薬及びソフトウエアを用いたＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００計器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で実施した。Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の指示に従い、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体をＣＭ５センサーチップ上に固定化した。次に、ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１融合タンパク質を特定の密度（図５及び図６に示す）で捕捉した。センサーチップは、即座のバックグラウンド除去のために空のフローセルを含んだ。全結合アッセイは、１×ＨＢＳ−ＥＰ＋泳動バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）、及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）及び流量３０ｍＬ／分を用いた。親和性測定のために、全てのＦａｂを５つの異なる濃度（希釈係数は２）で注射し、最も低い濃度は２回反復して試験した（各Ｆａｂの最も高い濃度は図６Ｂに示す）。センサーチップは、結合能力を一切喪失することなく、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔから３ＭｇＣｌ2を用いて再生した。会合（ｋon）及び解離（ｋoff）速度定数の計算は、１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルに基づいて行った。平衡解離定数（Ｋd）をｋoff／ｋonから算出した。エピトープマッピング試験のために、図５に示す順で、各Ｆａｂを１×ＨＢＳ−ＥＰ＋泳動バッファー中５００ｎＭの単独で調製し、次に注射した。
【０１２９】
ウエスタンブロッティング：１×サンプルバッファー（１％β−メルカプトエタノールを含有）により、細胞又はタンパク質を溶解させ、ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上での泳動の前に煮沸した。膜転写及び５％ミルクによる遮断の後、ＸＢＲ１−４０２若しくはＥＲＲ１−ＴＯＰ４３の２μｇ／ｍＬのキメラウサギ／ヒトＩｇＧ１を塗布して、変性タンパク質を検出し、続いて、ＨＲＰに結合した１／１０００抗ヒトＦｃγとのインキュベーションの後、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて展開させた（図９）。
【０１３０】
実施例５．精製、組換えストレップタグ付き（ｓｔｒｅｐ−ｔａｇｇｅｄ）ヒトＲＯＲ１及びヒトツインストレップタグ付き（ｓｔｒｅｐ−ｔａｇｇｅｄ）ヒトＲＯＲ２の発現
ストレップＩＩタグ付きヒトＲＯＲ１−細胞外ドメインを次のように生成した：ヒトＲＯＲ１（ＮＰ＿００５００３．２）をコードするヌクレオチド配列を、シグナル配列（ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣ）とＮ末端に融合させ、ストレップＩＩタグ（ＧＷＳＨＰＱＦＥＫ）をコードする配列とＣ末端に融合させた。全遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）により、フランキングする５’ＮｏｔＩ及び３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する全ヌクレオチド配列を生成し、Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により、独自の哺乳動物発現ベクターｐＥｖｉ５中にアセンブルして、ＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【０１３１】
タンパク質の発現は、Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により、懸濁液改変ＣＨＯ  Ｋ１細胞において実施した。トランスフェクトしたＣＨＯ  Ｋ１細胞のプールからの上清を遠心分離により回収し、滅菌濾過（０．２μｍ）した後、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎカラム（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＦＰＬＣ−ベースのアフィニティ精製に付した。
【０１３２】
組換えヒトツインストレップタグ付きＲＯＲ２（ＮＰ＿００４５５１．２）を下記のプロトコルに従って発現させ、実験室内で精製した：ＴｗｉｎＳｔｅｐタグでＣ末端がタグ付けされた、ＥＢＮＡ発現ベクターｐＣＢ１４ｂ−ＲＯＲ２−ＥＣＤ−ＴｗｉｎＳｔｒｅｐ（ＲＯＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の発現を指令する）を、ＰＬＵＳ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔと共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１５３８８１００）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクトした。１日のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ2、増殖培地：１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全て、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（４．５ｇ／ｌ））の後、細胞を選択条件（２μｇ／ｍＬのプロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、２ｍｇ／ｍＬのＰ８８３３−２５ｍｇストック））下で拡大した。細胞を分割して、さらに拡大し（３７℃、５％ＣＯ2）；一旦密集に達したら、組織培養皿を２０μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ１５２４）で、３７℃にて２時間コーティングし、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄した後、ポリ−Ｌ−リシンコーティングプレート上に１：３に分割した。再度、密集に達した後、細胞をＰＢＳで洗浄してから、１μｇ／ｍＬのプロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８８３３）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、４−０２Ｆ００−Ｈ）、１６１μｇ／ｍＬのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ８１９９）及び１０μｇ／ｍＬのＬ−グルタチオン還元型（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ６５２９）で補充した生成培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２，Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，３１３３０−０３）を用いて培地の取替えを行った。上清を隔週で回収し、濾過する（０．２２μｍ）ことにより細胞を除去して、精製まで４℃で保存した。精製のために、濾過した上清をＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（登録商標）高容量カートリッジ（ＩＢＡ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２−１２３８−００１）カラムにロードし；ＡＥＫＴＡ  ｐｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、製造者のプロトコルに従い、精製及び溶離を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質純度及び完全性について画分を分析した。タンパク質含有画分を混合し、Ａｍｉｃｏｎ濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＰＢＳ中≧１：１００の希釈率に達するまでバッファー交換に付した後、ローリテンションフィルタ（０．２０μｍ，Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ＰＡ４９．１）を用いて滅菌濾過した。
【０１３３】
実施例６．精製、組換えヒト化抗ヒトＲＯＲ１及びアイソタイプコントロール抗体の発現
発現ベクター：リーダ配列としてＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣを用いた全遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）によって抗体可変領域コード領域を生成し、発現ベクターｐＣＢ１４において、ヒトＩｇＨ−γ１及びＩｇＬ−κ又は、適用できる場合には、ＩｇＬ−λ定常領域とアセンブルした。このベクター、エピソーム哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体は、ＥＢＶ複製起点を担持し、染色体外複製を可能にするためにＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ−１）をコードし、元のヒグロマイシンＢ耐性遺伝子の代わりにプロマイシン選択マーカを含有する。
【０１３４】
実験室内発現及び精製：ＰＬＵＳ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｉｎａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，１５３８８１００）と共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、ｐＣＢ１４ベースの発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。１日のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ2、増殖培地：１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全て、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（４．５ｇ／ｌ））の後、細胞を選択条件（２μｇ／ｍＬのプロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｕｃｈｓ  ＳＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、２ｍｇ／ｍＬのＰ８８３３−２５ｍｇストック））下で拡大した。細胞を分割し、さらに拡大した（３７℃、５％ＣＯ2）；一旦密集に達したら、組織培養皿を２０μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ１５２４）で、３７℃にて２時間コーティングし、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞をトリプシン処理し、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたプレート上に１：３に分割した。再度、密集に達した後、細胞をＰＢＳで洗浄してから、１μｇ／ｍＬのプロマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８８３３）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）、１６１μｇ／ｍＬのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ８１９９）及び１０μｇ／ｍＬのＬ−グルタチオン還元型（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ６５２９）で補充した生成培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２，Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，３１３３０−０３）への培地の取替えを行った。上清を隔週で回収し、濾過する（０．２２μｍ）ことにより細胞を除去して、精製まで４℃で保存した。
【０１３５】
精製のために、濾過した上清をＰＢＳ平衡Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１７−０４０５−０１）又はＪＳＲ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＪＳＲ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ，ＪＷＴ２０３ＣＥ）にロードし、ＰＢＳで洗浄し；ＡＥＫＴＡ  ｐｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を用いて、溶離を実施した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で画分を直ちに中和してから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質純度及び完全性について分析した。タンパク質含有画分を混合し、Ａｍｉｃｏｎ濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ＵＦＣ９０１００８）を用いて、表２に列記するバッファー中で１：１００の希釈率に達するまでバッファー交換に付した後、ローリテンションフィルタ（０．２０μｍ，Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ＰＡ４９．１）を用いて滅菌濾過した。
【０１３６】
当技術分野で公知の方法により、抗体をＣＨＯ細胞において一過性発現させ、当技術分野で公知の通り、ＣＨＯ細胞上清から標準的プロテインＡ精製により組換え抗体を精製した。組換え抗体の純度及び完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１３７】
表２は、最終濃度及びバッファーと共に、後の実施例で使用した抗体を列記する。
【０１３８】
【表２】
2019509021.tif 000005
2019509021.tif 000006
【０１３９】
Ｍｓ９６１は、国際公開第２０１４／０３１１７４号パンフレットの配列番号１の重鎖と配列番号３の軽鎖とを有する抗ＲＯＲ１抗体に相当する。２Ａ２は、国際公開第２０１０／１２４１８８号パンフレットに記載の抗ＲＯＲ１抗体を指し、ｈｕ２Ａ２は、未公開ＰＣＴ／欧州特許第２０１６／０７６２４４号明細書に記載のヒト化２Ａ２を指す。Ｒ１１及びＲ１２は、国際公開第２０１２／０７５１５８号パンフレットに記載の抗ＲＯＲ１抗体である。アイソタイプコントロール抗体トラスツズマブ及びＡｃ１０は、ＨＥＲ−２及びＣＤ３０をそれぞれターゲティングする。ヒトＣＤ３０標的に特異的なモノクローナル抗体ブレンツキシマブ（クローン  ｃＡｃ１０）の重鎖及び軽鎖可変領域配列は、米国特許第２００８２１３２８９Ａ１号明細書から取得し、市販の抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）に含まれるヒトＨＥＲ−２特異的トラスツズマブ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域配列、又はそれに由来するＡＤＣ  Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）は、オンラインＩＭＧＴデータベースから取得した（ＶＨ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝７６３７＆Ｐａｒｔ＝Ｃｈａｉｎ＆Ｃｈａｉｎ＝７６３７Ｈ及びＶＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝７６３７＆Ｐａｒｔ＝Ｃｈａｉｎ＆Ｃｈａｉｎ＝７６３７Ｌ）。
【０１４０】
実施例７．ｍＡｂ  ＲＯＲ１及びＲＯＲ２結合−ＥＬＩＳＡによる特性決定
９６ウェルプレートの各ウェルを、０．１Ｍ重炭酸塩コーティングバッファー（ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍＬのストレップタグ付きヒトＲＯＲ１（実施例５から）１００μＬでコーティングした後、４℃で１２時間インキュベートした。第２の９６ウェルプレートも、ツイン−ストレップタグ付きヒトＲＯＲ２（実施例５から）を用いて同様に調製した。
【０１４１】
３７℃にて、１５０μＬの３％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳで１時間遮断してから、下記の抗体を０．５μｇ／ｍＬの濃度で各プレートのウェルに添加し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＴＢＳで連続的に希釈（希釈率４）した後、３７℃で１時間のインキュベーションに付した：ＥＲＲ１−３０１（ｍＡｂ０２７）、ＸＢＲ１−４０２（ｍＡｂ０３１）、ＥＲＲ１−３０６（ｍＡｂ０３３）、ＥＲＲ１−３２４（ｍＡｂ０３４）、ＥＲＲ１−４０３（ｍＡｂ０３５）及びＥＲＲ１−Ｔｏｐ４３（ｍＡｂ０３６）。次に、ＨＲＰに結合したＦ（ａｂ’）2抗ヒトＦＣ−γ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，１０９−０３６−００８）を１：２０’０００の希釈率で、ウェル当たり１００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、Ｓｐａｒｋ  １０Ｍプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ）を用いた検出に付した。図１０に示すように、抗ヒトＲＯＲ１抗体は、ヒトＲＯＲ１に結合し（パネルＡ）、ヒトＲＯＲ２とは交差反応性ではない（パネルＢ）。
【０１４２】
実施例８．抗ｈＲＯＲ１特異的抗体ＸＢＲ１−４０２のヒト化
ヒト化可変領域配列（７つのｈｕ４−２ＶＨ変異体及び４つのｈｕ４−２ＶＬ変異体）を融合抗体（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（Ｂｅｌｆａｓｔ，Ｉｒｅｌａｎｄ）により設計した。手短には、ウサギ可変領域内のフレームワークをヒトフレームワーク領域と交換する（独自のアルゴリズムに基づくインシリコ支援（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ  ａｓｓｉｓｔｅｄ）ＣＤＲ−グラフトアプローチに従って）ことによって、２８の考えられる重鎖／軽鎖対を形成した。
【０１４３】
全２８の考えられる重鎖／軽鎖対を呈示する抗体の発現は、ｐＣＢ１４ベースの発現構築物をＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞に一過性トランスフェクトして、細胞上清を回収することにより達成した。
【０１４４】
一過性抗体発現のために、Ａｖａｎｔｉ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｉ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＵＳＡ）を用いて、細胞を２４ウェルプレート内でトランスフェクトした。ウェル当たり０．５μｇの全ＤＮＡをトランスフェクトし、新鮮な増殖培地を翌日添加して、４日間順化させた。上清を滅菌濾過し、分析まで−２０℃で保存した。
【０１４５】
次に、親和性スクリーニングを実施して、最良の結合物質を選択した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００計器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて親和性を決定し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｔ２００  Ｖ２．０ソフトウエアを用いてデータを評価した。ｍＡｂを捕捉するために、ヤギα−ヒトＦｃ−γ−特異的ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，♯１０９−００５−０９８）をＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，♯ＢＲ−１００５−３０）上に共有結合によって固定化した。
【０１４６】
手短には、ＨＥＫ２９３Ｔ上清を捕捉するために、希釈されていない上清を３０μｌ／分の流量で１２０秒間捕捉した。ＲＯＲ１−ストレップを泳動バッファー（ＨＢＳ−ＥＰ＋ｐＨ７．４（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で、２０ｎＭまで希釈した。３０μｌ／分の流量で１２０秒にわたり会合を測定した後、３０μｌ／分の流量で２００秒にわたり解離を測定した。捕捉レベルは、３１．８ＲＵ〜５９．４ＲＵの範囲であった。
【０１４７】
選択した抗体を発現させ、実施例６により、以下の表３の条件に従って精製した。
【０１４８】
【表３】
2019509021.tif 000007
【０１４９】
実施例９．ｈＲＯＲ１発現のための細胞のＦＡＣＳ染色
ウェル当たり５×１０5個の各細胞型を９６ウェルプレートに添加した。バッファー（２％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを添加したＰＢＳ）中の再懸濁物と一緒に、プレートを遠心分離（３分、１３００ｒｐｍ）した。２μｇ／ｍＬの濃度に達するまで、２Ａ２（ｍＡｂ０６６）を各ウェルに添加した。次に、プレートを氷上で３０分間インキュベートし、２００μＬのバッファーで洗浄してから、１：２５０の希釈率で抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃγ特異的）ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２−４９９８−８２）で補充した２００μＬのバッファー中に再懸濁させた。氷上で３０分のインキュベーション及び１回の洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ計器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いてデータを分析した。
【０１５０】
図７は、ＲＯＲ１陽性ヒトＡＬＬ細胞株６９７及びＫａｓｕｍｉ−２、ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＨＳ−５７８Ｔ、並びにネガティブコントロールとしてのＲＯＲ１陰性ヒト乳癌細胞株Ｔ４７ＤのＦＡＣＳ分析データを示す。
【０１５１】
実施例１０．ＳＭＡＣ技術を用いた部位特異的結合ＡＤＣの作製
ソルターゼＡ酵素。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の組換え及びアフィニティ精製ソルターゼＡ酵素は、国際公開第２０１４１４０３１７Ａ１号パンフレットに開示されているように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から生成した。
【０１５２】
グリシン修飾毒素の作製。ペンタグリシン修飾ＰＮＵ−１５９６８２誘導体を含むＳＭＡＣ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）結合ＡＤＣを作製するために、国際公開第２０１６１０２６９７号パンフレットに開示されているように、Ｇｌｙ5−ＥＤＡ−ＰＮＵ（図１１Ｂ）を製造した。質量分析法及びＨＰＬＣによって、ペンタグリシン修飾ＰＮＵ毒素のアイデンティティ及び純度を確認した。Ｇｌｙ5−修飾毒素は、ＨＰＬＣクロマトグラムにおける単一ピークによって決定される通り、＞９５％の純度を示した。
【０１５３】
ソルターゼ媒介性抗体結合。列記した結合バッファー中のグリシン修飾毒素［２００μＭ］及び３μＭソルターゼＡと一緒に、ＬＰＥＴＧタグ付きｍＡｂ［１０μＭ］を２５℃で３．５時間インキュベートすることによって、前述の毒素を表３に従い抗ＲＯＲ１抗体に結合させた。これを、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＢｉｏＲａｄ）に通過させることによって、反応を停止した。５カラム体積の溶出バッファー（０．１ＭグリシンｐＨ２．５、５０ｎＭ  ＮａＣｌ）で、結合したコンジュゲートを溶離し、１カラム体積画分を、酸を中和するために２５％ｖ／ｖ  １Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８を含有するチューブに収集した。タンパク質含有画分をプールし、ＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩カラムを用いて表７の製剤化バッファー中で製剤化した。
【０１５４】
ＡＤＣ解析学。Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ  ＰＬＲＰ  ２．１ｍｍ×５ｃｍ、０．０５〜０．１％のＴＦＡ／Ｈ2Ｏと０．０４〜０．１％のＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮとの間の２５分の線形勾配を用いた１ｍＬ／分／８０℃の５μｍカラムランで実施した逆相クロマトグラフィーにより、ＤＡＲを評価した。まず、ｐＨ８．０のＤＴＴとの３７℃、１５分間のインキュベーションによりサンプルを還元した。逆相クロマトグラフィーにより決定されるＤＡＲを以下の表４にまとめる。
【０１５５】
【表４】
2019509021.tif 000008
2019509021.tif 000009
2019509021.tif 000010
【０１５６】
これらの分析から、ＳＭＡＣ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）結合が、高い効率で進行し、それによって、ＩｇＧ−フォーマット抗ＲＯＲ１抗体−毒素の組み合わせについて約３．５〜４．０の範囲の総平均ＤＡＲが得られた。
【０１５７】
実施例１１．ＲＯＲ１ターゲティングＡＤＣ  ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵのインビトロ血清安定性
ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵのインビトロ血清安定性を、ＥＬＩＳＡによる血清安定性アッセイで評価した。手短には、ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス（バーゼル大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．ｍｅｄ．Ａｌｆｒｅｄ  Ｚｉｐｐｅｌｉｕｓからの親切な寄贈品）及びヒト血清（ＳＲＫ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｎａｔｉｏｎ  ｃｅｎｔｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから；男性：女性血液の５０：５０混合物を２０００ｇで１５分間遠心分離して、血清を取得）中１００μｇ／ｍＬの濃度までＡＤＣを希釈し、３７℃でインキュベートした。サンプルを０、３、７及び１４日目に液体窒素で瞬間凍結し、ＥＬＩＳＡ分析まで−８０℃で保存した。マウス血清の場合には、ＡＤＣと結合させるために、２μｇ／ｍｌの実験室内作製マウス抗ＰＮＵ  ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ−ＰＮＵコンジュゲートでマウスを免疫し、ＢＳＡ−ＰＮＵコンジュゲートを用いてスクリーニングすることにより作製）で、又は全ＩｇＧと結合させるために、ヤギ抗ヒトＦｃ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，１０９−００６−０９８）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で、ＡＤＣ血清サンプルの希釈系列（希釈係数３．５、５〜０．０００８μｇ／ｍｌ）を捕捉し、ＨＲＰ結合ロバ抗ヒトＩｇＧの１：２５００希釈物（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，７０９−０３５−１４９）で検出した。ヒト血清の場合には、２μｇ／ｍｌの組換えヒトＲＯＲ１（ストレップタグ付き、実施例５）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングした後、ＨＲＰ結合ロバ抗ヒトＩｇＧの１：２５００希釈物（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，７０９−０３５−１４９）又は２μｇ／ｍｌのマウス抗ＰＮＵ  ＩｇＧ（実験室内で作製）、続いて、１：５０００希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＦｃγ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，１１５−０３６−０７１）を、全ＩｇＧ及びＡＤＣの検出のためにそれぞれ使用した。ＡＤＣ及び全ＩｇＧの血清濃度は、既知濃度の同じＡＤＣのサンプルとの比較により、サンプル力価測定の最大半数値から算出した。図１９に示すように、ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵは、いずれの血清中においても実質的に安定性を維持する。
【０１５８】
実施例１２．野生型ＥＭＴ−６及びＲＯＲ１過剰発現ＥＭＴ−６乳癌細胞に対する抗ＲＯＲ１抗体ベースのＡＤＣのインビトロ細胞傷害性アッセイ
抗ＲＯＲ１  ＡＤＣ  ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２６２）の細胞傷害性を、野生型（ＷＴ）ＥＭＴ−６及びヒトＲＯＲ１を過剰発現するように操作されたＥＭＴ−６細胞（実施例２から）を用いて調べた。アイソタイプコントロールとして、Ｔｒａｓ−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２８６）を含んだ。
【０１５９】
このために、ウェル当たり１×１０3個のＷＴ  ＥＭＴ−６及びｈＲＯＲ１過剰発現ＥＭＴ−６細胞を、１０体積％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補充した７５μＬのＤＭＥＭを含む９６ウェルプレート上に平板培養し（水を含有するエッジウェルを除く）、３７℃、７．５％ＣＯ2雰囲気下の加湿したインキュベータ内で増殖させた。１日のインキュベーションの後、増殖培地中３．５倍連続希釈物を２５μＬの量で含むそれぞれのウェルに、各ＡＤＣを添加した（これにより、２０μｇ／ｍＬ〜０．８８ｎｇ／ｍｌの最終ＡＤＣ濃度が得られた）。さらに４日後、プレートをインキュベータから取り出し、室温に平衡させた。約３０分後、各ウェルから５０μＬを取り出し、次に５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ９２４３）を各ウェルに添加した。４５０ｒｐｍで５分間のプレートの振盪に続いて、振盪なしで１０分のインキュベーションの後、ウェル当たり２５０ｍｓの積分時間を用いたＴｅｃａｎ  Ｓｐａｒｋ  １０Ｍプレートリーダで発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ＡＤＣ濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対する発光の曲線を当てはめた。Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅの組み込み「ログ（阻害剤）対応答−可変傾き（４つのパラメータ）」ＩＣ50決定関数を用いて決定したＩＣ５０値を表５に報告する。
【０１６０】
【表５】
2019509021.tif 000011
【０１６１】
図１６は、表５のＡＤＣを用いたＷＴ及びｈＲＯＲ１過剰発現ＥＭＴ６細胞に対するインビトロ細胞殺傷アッセイの用量−応答曲線を示す。上の表及び図１６によれば、ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵは、ＲＯＲ１発現状態に依存的な特異的殺傷を達成する。
【０１６２】
実施例１３．ＲＯＲ１過剰発現ＥＭＴ−６細胞に対する新規及び既知抗ＲＯＲ１抗体ベースのＡＤＣのインビトロ細胞傷害性アッセイ
抗ＲＯＲ１  ＡＤＣ  ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ４０９）の細胞傷害性を、ヒトＲＯＲ１を過剰発現するように操作されたヒトＥＭＴ−６細胞（実施例２から）を用いて調べ、抗体Ｍｓ９６１ベースの抗ＲＯＲ１  ＡＤＣ（ａｄｃ３９６）と比較した。アイソタイプコントロールとして、Ｔｒａｓ−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ３９４）を含んだ。
【０１６３】
このために、ウェル当たり１×１０3個のｈＲＯＲ１過剰発現ＥＭＴ−６細胞を、１０体積％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補充した７５μＬのＤＭＥＭを含む９６ウェルプレート上に平板培養し（水を含有するエッジウェルを除く）、３７℃、７．５％ＣＯ2雰囲気下の加湿したインキュベータ内で増殖させた。１日のインキュベーションの後、増殖培地中３．５倍連続希釈物を２５μＬの量で含むそれぞれのウェルに、各ＡＤＣを添加した（これにより、２０μｇ／ｍＬ〜０．８８ｎｇ／ｍｌの最終ＡＤＣ濃度が得られた）。さらに４日後、プレートをインキュベータから取り出し、室温に平衡させた。約３０分後、各ウェルから５０μＬを取り出し、次に５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ９２４３）を各ウェルに添加した。４５０ｒｐｍで５分間のプレートの振盪に続いて、振盪なしで１０分のインキュベーションの後、ウェル当たり２５０ｍｓの積分時間を用い、Ｔｅｃａｎ  Ｓｐａｒｋ  １０Ｍプレートリーダで発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ＡＤＣ濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対する発光の曲線を当てはめた。Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅの組み込み「ログ（阻害剤）対応答−可変傾き（４つのパラメータ）」ＩＣ50決定関数を用いて決定したＩＣ５０値を表６に報告する。
【０１６４】
【表６】
2019509021.tif 000012
【０１６５】
図１７は、表６のＡＤＣを用いたｈＲＯＲ１過剰発現ＥＭＴ６細胞に対するインビトロ細胞殺傷アッセイの用量−応答曲線を示す。上の表及び図１７によれば、ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵは、抗体Ｍｓ９６１をベースとする同等のＡＤＣよりも強力な殺傷を達成する。
【０１６６】
実施例１４．ヒト６９７及びＫａｓｕｍｉ−２ＡＬＬ細胞に対する新規及び既知抗ＲＯＲ１抗体ベースのＡＤＣのインビトロ細胞傷害性アッセイ
抗ＲＯＲ１  ＡＤＣ  ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２６２）の細胞傷害性を、ヒト細胞株６９７を用いて調べ、既知抗体２Ａ２、Ｒ１１及びＲ１２ベースの抗ＲＯＲ１  ＡＤＣと比較する（図１３）か、又は２Ａ２及びＲ１２に対する６９７及びＫａｓｕｍｉ−２ＡＬＬ細胞を再度用いた個別の実験により調べた。
【０１６７】
このために、ウェル当たり２．５×１０3個の６９７又はＫａｓｕｍｉ−２細胞を、１０体積％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補充した７５μＬのＲＰＭＩを含む９６ウェルプレート上に平板培養し（水を含有するエッジウェルを除く）、３７℃、７．５％ＣＯ2雰囲気下の加湿したインキュベータ内で増殖させた。１日のインキュベーションの後、増殖培地中３．５倍連続希釈物を２５μＬの量で含むそれぞれのウェルに、各ＡＤＣを添加した（これにより、２０μｇ／ｍＬ〜０．８８ｎｇ／ｍｌの最終ＡＤＣ濃度が得られた）。さらに４日後、プレートをインキュベータから取り出し、室温に平衡させた。約３０分後、各ウェルから５０μＬを取り出し、次に５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７０）を各ウェルに添加した。７５０ｒｐｍで５分間のプレートの振盪に続いて、振盪なしで２０分のインキュベーションの後、ウェル当たり１秒の積分時間を用いて、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｆ２００プレートリーダで発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ＡＤＣ濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対する発光の曲線を当てはめた。Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅの組み込み「ログ（阻害剤）対応答−可変傾き（４つのパラメータ）」ＩＣ50決定関数を用いて決定されたＩＣ50値を表７に報告する。
【０１６８】
【表７】
2019509021.tif 000013
【０１６９】
図１３は、表７のＡＤＣを用いた６９７細胞に対するインビトロ細胞殺傷アッセイの用量−応答曲線を示す。上の表及び図１３によれば、本発明のＡＤＣは、既知の抗ＲＯＲ１抗体ベースのＡＤＣよりも優れた、ヒト６９７前駆Ｂ細胞白血病細胞の殺傷を達成する。
【０１７０】
実施例１５．乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＨＳ５７８Ｔ細胞に対する抗ＲＯＲ１抗体ベースのＡＤＣのインビトロ細胞傷害性アッセイ
ヒト細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＳ５７８Ｔを用いて、抗ＲＯＲ１  ＡＤＣ  ２Ａ２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ１６５）、ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ１３５）、Ｒ１２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２９２）、ＥＲＲ１−Ｔｏｐ４３−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２０４）、並びにＥＲＲ１−３２４−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２０２）と２Ａ２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ１６５）、ＥＲＲ１−３２４−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２０２）とＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ１３５）、ＥＲＲ１−３２４−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２０２）とＲ１２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２９２）、及びＥＲＲ１−３２４−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２０２）とＥＲＲ１−Ｔｏｐ４３−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２０４）の５０：５０重量比混合物の細胞傷害性を調べた。アイソタイプコントロールとして、Ａｃ１０−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ１５９）を含んだ。
【０１７１】
このために、ウェル毎に下記の細胞を９６ウェルプレート上に平板培養し（水を含有するエッジウェルを除く）、３７℃、７．５％ＣＯ2雰囲気下の加湿したインキュベータ内の増殖培地（１０体積％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補充したＤＭＥＭ）中で増殖させた。
【０１７２】
【表８】
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【０１７３】
１日のインキュベーションの後、増殖培地中３．５倍連続希釈物を２５μＬの量で含むそれぞれのウェルに、各ＡＤＣを添加した（これにより、２０μｇ／ｍＬ〜０．８８ｎｇ／ｍｌの最終ＡＤＣ濃度が得られた）。さらに４日後、プレートをインキュベータから取り出し、室温に平衡させた。約３０分後、各ウェルから５０μＬを取り出し、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ９２４３）を各ウェルに添加した。７５０ｒｐｍで５分間のプレートの振盪に続いて、振盪なしで２０分のインキュベーションの後、ウェル当たり１秒の積分時間を用い、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｆ２００プレートリーダで発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ＡＤＣ濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対する発光の曲線を当てはめた。Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅの組み込み「ログ（阻害剤）対応答−可変傾き（４つのパラメータ）」ＩＣ50決定関数を用いて決定されたＩＣ50値を表９に報告する。
【０１７４】
【表９】
2019509021.tif 000015
【０１７５】
図１２は、表９のＡＤＣを用いたＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＨＳ５７８Ｔ細胞に対するインビトロ細胞殺傷アッセイの用量−応答曲線を示す。上の表及び図１２によれば、本発明のＡＤＣは、既知の抗ＲＯＲ１抗体２Ａ２及びＲ１２よりも優れた、特定のヒト癌細胞の殺傷を達成する。
【０１７６】
実施例１６．６７９細胞に対するヒト化抗ＲＯＲ１抗体ベースのＡＤＣのインビトロ細胞傷害性アッセイ
ヒト６９７細胞を用いて、ヒト化抗ＲＯＲ１  ＡＤＣ：ｈｕＸＢＲ１−４０２−３−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ４５６）、ｈｕＸＢＲ１−４０２−８−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ４５７）、ｈｕＸＢＲ１−４０２−１５−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ４５８）、ｈｕＸＢＲ１−４０２−１７−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ４５９）、ｈｕＸＢＲ１−４０２−１９−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ４６０）及びｈｕＸＢＲ１−４０２−２６−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ４６１）の細胞傷害性を調べた。アイソタイプコントロールとして、Ｔｒａｓ−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２８６）を含んだ。
【０１７７】
このために、ウェル当たり５×１０4個の６９７細胞を、１０体積％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補充した７５μＬのＲＰＭＩを含む９６ウェルプレート上に平板培養し（水を含有するエッジウェルを除く）、３７℃、７．５％ＣＯ2雰囲気下の加湿したインキュベータ内で増殖させた。１日のインキュベーションの後、増殖培地中３．５倍連続希釈物を２５μＬの量で含むそれぞれのウェルに、各ＡＤＣを添加した（これにより、２０μｇ／ｍＬ〜０．８８ｎｇ／ｍｌの最終ＡＤＣ濃度が得られた）。さらに４日後、プレートをインキュベータから取り出し、室温に平衡させた。約３０分後、各ウェルから５０μＬを取り出し、次に５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ９２４３）を各ウェルに添加した。４５０ｒｐｍで５分間のプレートの振盪に続いて、振盪なしで１０分のインキュベーションの後、ウェル当たり２５０ｍｓの積分時間を用いて、Ｔｅｃａｎ  Ｓｐａｒｋ  １０Ｍプレートリーダで発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ＡＤＣ濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対する発光の曲線を当てはめた。Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅの組み込み「ログ（阻害剤）対応答−可変傾き（４つのパラメータ）」ＩＣ50決定関数を用いて決定されたＩＣ50値を表１０に報告する。
【０１７８】
【表１０】
2019509021.tif 000016
【０１７９】
図２５は、表１０のヒト化ＡＤＣを用いた６９７細胞に対するインビトロ細胞殺傷アッセイの用量−応答曲線を示す。上の表及び図２５によれば、ヒト化ＡＤＣは、親、非ヒト化ｍＡｂを用いて製造されたＡＤＣと比較して、強力である。
【０１８０】
実施例１７．ＣＤ−１野生型マウス株における抗ＲＯＲ１  ＸＢＲ１−４０２−抗体及びＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ  ＡＤＣのインビトロ薬物動態試験
下記の試験をＡＢＰＲＯ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）で実施した。ケージ当たり最大５匹の動物からなるグループ毎に収容された雌ＣＤ−１マウス（試験開始時に少なくとも６週齢、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ，ＵＳＡから）を体重別に各々９匹ずつの２グループにランダムに分けた。１グループは、静脈内投与により、単一用量の１ｍｇ／ｋｇのＸＢＲ１−４０２（ｍＡｂ２０２）を受け、第２グループは、単一用量の１ｍｇ／ｋｇのＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ４０９）を受けた。投与後の血液サンプルを表１１のプロトコルに従って各々３匹から成るサブグループから採取した。採血は、顎下静脈のランセット穿刺により実施した（約２００μＬを採取）が、但し、２１日目の採血は例外で、心臓穿刺により実施した（約６００μＬを採取）。サブグループからのサンプルを各時点についてプールした。１’５００ｇで１０分間の血液遠心分離により血漿を単離し、ＥＬＩＳＡによる実験室内分析まで滅菌クライオバイアル内に−８０℃で保存した。
【０１８１】
【表１１】
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【０１８２】
１５００ｇで１０分間の遠心分離により血液から血漿を単離し、滅菌クライオバイアルに移し、ＥＬＩＳＡによる分析まで−８０℃で保存した。ｍＡｂ  ＸＢＲ１−４０２及びＡＤＣ  ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵのインビボ安定性をＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。ＡＤＣと結合させるために、２μｇ／ｍｌのマウス抗ＰＮＵ  ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ−ＰＮＵコンジュゲートでマウスを免疫し、ＢＳＡ−ＰＮＵコンジュゲートを用いてスクリーニングすることにより実験室内で作製）で、又は全ＩｇＧと結合させるために、抗ヒトＦｃ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で、ＡＤＣ血清サンプルの希釈系列を捕捉し、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の１：２５００希釈物で検出した。ＡＤＣ及び全ＩｇＧの血清濃度は、既知濃度の同じＡＤＣのサンプルとの比較により、サンプル力価測定の最大半数値から算出した。
【０１８３】
図２０のデータは、本発明のＡＤＣの高い安定性を示している。
【０１８４】
実施例１８．ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるヒト急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞株６９７の播種性異種移植モデルでのＡＤＣのインビボ効力の評価
以下の試験をＰｉｐｅｌｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｔｒｉｇｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で実施した。ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２８８）及びヒト化ｈｕ２Ａ２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２８７；未公開ＰＣＴ／欧州特許第２０１６／０７６２４４号明細書に基づく）の効力を、ｈＲＯＲ１陽性６９７ＡＬＬ細胞を注射した雌ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおける播種性異種移植モデルにおいて比較した。ＨＥＲ−２特異的抗体トラスツズマブ、Ｔｒａｓ−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２８６）ベースのＡＤＣは、負のアイソタイプ適合コントロールＡＤＣとして使用した。
【０１８５】
各々体重が少なくとも２０ｇの９週齢マウスに、試験０日目で、６９７腫瘍細胞（２００μＬ  ＰＢＳ中５×１０6細胞／匹）を接種した。ＰＢＳ中に製剤化した各ＡＤＣを、７日目、１４日目及び２１日目に１．０ｍｇ／ｋｇで６匹のマウスのグループに投与（静脈内）したが、各ＡＤＣの投与の２０時間前に、マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，０１５−０００−００３）、３０ｍｇ／ｋｇ）の投与を行った。実験動物に関する欧州及びデンマークの法律に従い、中等度の痛み、中等度の苦痛の臨床的徴候、あらゆる等度の苦しみ、又は人道的エンドポイントの限界を超える試験に特有のあらゆる臨床的徴候を示した動物は全て、安楽死させた。１２及び１９日目に、血液（ＥＤＴＡバイアル内に９０μＬ）を各動物の尾静脈から採取した。標準的手順に従う血液遠心分離により、血漿を単離した。処置グループからのサンプルを各時点についてプールした。
【０１８６】
ＡＤＣと結合させるために、２μｇ／ｍｌのマウス抗ＰＮＵ  ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ−ＰＮＵコンジュゲートでマウスを免疫し、ＢＳＡ−ＰＮＵコンジュゲートを用いてスクリーニングすることにより実験室内で作製）で、又は全ＩｇＧと結合させるために、抗ヒトＦｃ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００６−０９８）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で、ＡＤＣ血漿サンプルの希釈系列を捕捉し、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、７０９−０３５−１４９）の１：２５００希釈物で検出した。ＡＤＣ及び全ＩｇＧの血清濃度は、既知濃度の同じＡＤＣのサンプルとの比較により、サンプル力価測定の最大半数値から算出した。
【０１８７】
ソフトウエアＰＲＩＳＭを用いて、データ分析を実施した。本発明のＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ  ＡＤＣで処置したマウスは、同等のＲＯＲ１ターゲティングｈｕ２Ａ２−Ｇ５−ＰＮＵ  ＡＤＣ、又はアイソタイプコントロールＡＤＣで処置したものと比較して、長期の生存を示した（図１５、パネルＡ）。さらに、ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ  ＡＤＣの濃度は、既知又はアイソタイプコントロールＡＤＣよりも血漿中で高いままである（図１５、パネルＢ）。
【０１８８】
実施例１９．ｈＲＯＲ１過剰発現ＥＭＴ−６細胞で樹立された同所性乳癌モデルにおける抗ＲＯＲ１  ＡＤＣのインビボ効果の評価
表１３の試験プロトコルに従い、下記のマウスモデルにおいて、新規の抗ＲＯＲ１抗体ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵベースのＡＤＣ（ａｄｃ２６２）をＲ１２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ３２７）、及び既知抗体Ｒ１２ベースのＡＤＣ及びアイソタイプコントロールＴｒａｓ−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ２８６）ＡＤＣと比較した。
【０１８９】
【表１２】
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【０１９０】
【表１３】
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【０１９１】
図１８は、６匹の個別のマウス各々において、試験の間に変化する腫瘍体積を示す。高度のｈＲＯＲ１発現を有する乳癌細胞で樹立された同所性乳癌モデルは、ＲＯＲ１陰性ＷＴ  ＥＭＴ−６モデルの無応答とは反対に、本発明のＡＤＣによる処置に有意に応答する。さらに、本発明のＡＤＣの顕著な応答は、既知Ｒ１２  ＲＯＲ１ターゲティング抗体ベースの同等ＡＤＣに対する有意な改善を立証している。
【０１９２】
実施例２０．ウエスタンブロットによるヒト患者由来腫瘍溶解物におけるｈＲＯＲ１発現の分析
ヒト患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデル（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の腫瘍溶解物及びコントロールとしての高度にＲＯＲ１陽性の不死化細胞株（Ｋａｓｕｍｉ−２）の溶解物、並びに不死化Ａ５４９癌細胞からの溶解物をウエスタンブロットによるｈＲＯＲ１タンパク質発現についてプローブした。このために、溶解物を５×ＳＤＳ−ＰＡＧＥロードバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、５％μ−メルカプトエタノール）と混合し、９９℃で５分間加熱することによって、溶解物を変性させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離の後、ｅｂｌｏｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用いて、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。次に、１０％ウマ血清（Ａｍｉｍｅｄ，Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有するＴＢＳＴ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に１：２００希釈した市販のポリクローナルウサギ抗ＲＯＲ１抗体４１０２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）と一緒に、膜を４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで２回洗浄した後、ＨＲＰ結合抗ウサギ二次抗体（ＷｅｓｔｅｒｎＳｕｒｅ  ＨＲＰ  ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＬｉＣｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＵＳＡ）と一緒に、膜を室温で１時間インキュベートした。発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ（３４０９４，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で膜をインキュベートし、ｃＤｉｇｉｔ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ｒｅａｄｅｒ（ＬｉＣｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＵＳＡ）を用いたイメージングにより、シグナルを明らかにした。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの検出は、ローディングコントロールとして使用した。
【０１９３】
【表１４】
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【０１９４】
図２１は、ヒト腫瘍溶解物、並びに不死化癌細胞からの溶解物のウエスタンブロット分析を示す。
【０１９５】
実施例２１．患者由来の腫瘍異種移植モデルにおけるＡＤＣ  ＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵのインビボ効果の分析
下記の試験をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｏｎｃｏｔｅｓｔ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において実施した。
【０１９６】
【表１５】
2019509021.tif 000021
【０１９７】
エンドトキシンを含有しないことが以前確認されたＸＢＲ１−４０２−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ４０９）ＡＤＣを下記の試験プロトコルに従い、各モデルにおいて調べた。
【０１９８】
【表１６】
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【０１９９】
ＰＤＸ材料（いずれか片側（ＰＸＦ１１１、ＲＸＦ４８６、ＣＸ５３３）又は両側（ＳＸＦＳ１４０７、ＰＸＦ５４１）をマウスに皮下移植した。腫瘍が１００ｃｍ3のサイズに達したらマウスをランダム化し、１ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ又はビヒクルで計３回処置した。腫瘍体積をカリパス測定により決定し、体重を週２回記録した。２０００ｍｍ3（片側）若しくは１７００ｍｍ3（両側）の腫瘍負荷に達するか、又は有意な体重減少（全体で３０％超、又は２日で２０％超）の場合には、マウスを安楽死させた。
【０２００】
図２２は、試験の間の腫瘍体積の変化を示す。高度のｈＲＯＲ１発現を有する患者由来の腫瘍材料で樹立した腫瘍異種移植は、本発明のＡＤＣによる処置に有意に応答する。
【０２０１】
実施例２２．ＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔのインビトロ活性
ＲＯＲ１ターゲティングｍＡｂ  Ｒ１１及びＲ１２について以前記載されている方法（Ｈｕｄｅｃｅｋ，Ｍ．，Ｌｕｐｏ−Ｓｔａｎｇｈｅｌｌｉｎｉ，Ｍ．Ｔ．，Ｋｏｓａｓｉｈ，Ｐ．Ｌ．，Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ，Ｄ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｒａｄｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．Ｒ．（２０１３）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＯＲ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９，３１５３−３１６４）を用いて、ＸＢＲ１−４０２ベースのＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した。エクスビボ拡大一次ヒトＣＤ８+ＣＤ６２Ｌ+Ｔ細胞に、レンチウイルスにより、ＣＤ３ζ及び４−１ＢＢシグナル伝達ドメインと短いスペーサとを含むＸＢＲ１−４０２又はＲ１２由来のＣＡＲを形質導入した。形質導入したＴ細胞をＦＡＣＳによりｔＥＧＦＲを介して精製し、機能性アッセイの前日にその表現型を評価した。ＣＤ８＋純度は、９７％〜９９％の間で変動し、ｔＥＧＦＲ発現は、９５％〜９９％の間で変動した。ＲＯＲ１陽性又はＲＯＲ１陰性ヒト乳癌細胞との７２時間の同時培養後、ＣＦＳＥ染色ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞をフローサイトメトリーにより分析したところ、ＸＢＲ１−４０２及びＲ１２  ＣＡＲ−Ｔの標的依存性増殖が判明した（図２６；上方左側パネル）。２４時間の同時培養後に採取した上清中のＩＦＮγ及びＩＬ２濃度をＥＬＩＳＡにより測定した（図２６；上方右側パネル）。ＲＯＲ１陽性及びＲＯＲ１陰性細胞との１１時間の同時培養後、ルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイを用いて、選択性障害性を測定した（図２６；下方パネル）。
【０２０２】
同じ実験を反復して、短いスペーサを有するＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔと、長いスペーサを有するＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔを比較した。ＲＯＲ１陽性又はＲＯＲ１陰性ヒト乳癌細胞との７２時間の同時培養後、ＣＦＳＥ染色ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞をフローサイトメトリーにより分析したところ、短いスペーサを有するＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔのより強い増殖が判明した（図２７；上方パネル）。ＲＯＲ１陽性及びＲＯＲ１陰性細胞との１１時間の同時培養後のルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイによる選択性障害性から、短いスペーサ及び長いスペーサを有するＸＢＲ１−４０２  ＣＡＲ−Ｔの両方について選択性障害性が判明した（図２７；下方パネル）。
【０２０３】
実施例２３．ＸＢＲ１−４０２の特異性分析
図２８は、Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍの外観を示す。一次スクリーン：精製済キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１  ＸＢＲ１−４０２及び精製済キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１  ＸＢＲ１−４０１を各々２μｇ／ｍＬの濃度までプールした。４，３３６のヒト血漿膜タンパク質を個別に発現する固定ＨＥＫ２９３細胞／スライドに対する結合について、プールをスクリーニングした（１３スライドセット；ｎ＝２スライド／スライドセット）。トランスフェクション効率は全て、最小閾値を超えた。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ検出抗体を使用した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔで蛍光（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７及びＺｓＧｒｅｅｎ１）を分析することによって、一次ヒット（重複スポット）を同定した。全ヒットをコードするベクターをシーケンシングすることにより、それらの正しいアイデンティティを確認した。確認スクリーン：全ヒットをコードするベクター、並びにコントロールベクターを新しいスライドに重複してスポットし、これらを用いて、以前と同様に、ヒトＨＥＫ２９３細胞をリバーストランスフェクトした。トランスフェクション効率は全て、最小閾値を超えた。同一の固定スライドを２つの試験抗体（ＸＢＲ１−４０２及びＸＢＲ２−４０１）の各々で個別に処理し、さらにポジティブ及びネガティブコントロール（ｎ＝２スライド／処理）でも処理した。スライドを前述と同様に分析した（図２９）。
【０２０４】
以上において本発明を明瞭な理解のために例示及び実施例によってある程度詳しく説明してきたが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付の請求項の精神又は範囲を逸脱することなく、本発明にいくつかの変更及び修正が加えられ得ることは容易に理解されよう。
【０２０５】
本明細書で引用した刊行物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許、及び特許出願の全ては、その各々が、あたかも明示的且つ個別に、参照により組み込まれていると示されているのと同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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