(57)【要約】  本発明は、細胞傷害性細胞及び幹細胞の効果を強化するためのＲＩＧ−Ｉアゴニストを有する。ＲＩＧ−Ｉアゴニストは、養子細胞移入のために細胞を強化するために、小分子治療薬としてインビボで又はインビトロで使用することができる。用途は、癌治療、免疫系強化、慢性ウイルス感染及びウイルス誘発炎症の治療及びウイルスに基づく治療の強化を含む。
2019510035.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中心ヘアピン及び内部ループを有するＲＮＡ分子を有することを特徴とするＲＩＧ−Ｉアゴニスト。
【請求項２】
前記ループと前記ヘアピンとの間に７〜８０塩基が存在することを特徴とする請求項１に記載のＲＩＧ−Ｉアゴニスト。
【請求項３】
前記ループの各側に少なくとも１つのＧＣ相補塩基対が存在することを特徴とする請求項１に記載のＲＩＧ−Ｉアゴニスト。
【請求項４】
前記相補的ＧＣ塩基対が、前記ループの各側の２〜５塩基対以内にあることを特徴とする請求項３に記載のＲＩＧ−Ｉアゴニスト。
【請求項５】
前記ループはＡＵ相補塩基対を有することを特徴とする請求項１に記載のＲＩＧ−Ｉアゴニスト。
【請求項６】
配列ＩＤ番号１のＲＮＡ分子。
【請求項７】
細胞傷害性細胞にＲＩＧ−Ｉアゴニストを投与することを有することを特徴とする、細胞傷害性細胞におけるグランザイムＢのレベルを増加させる方法。
【請求項８】
前記ＲＩＧ−ＩアゴニストがＩＬ２と共に投与されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＲＩＧ−Ｉアゴニストは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２又は配列ＩＤ番号３から選択されるＲＮＡ分子の少なくとも１つであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記グランザイムＢのレベルは、未処理細胞のレベルの８００〜１１００倍の因子によって増加されることを特徴とする請求項８に記載のグランザイムＢのレベルを増加させる方法。
【請求項１１】
前記ＲＩＧ−ＩアゴニストはＩＬ２と共に投与されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＩＧ−Ｉアゴニストは配列ＩＤ番号１であることを特徴とする請求項１０〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞傷害性細胞はナチュラルキラー細胞であることを特徴とする請求項１０〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ナチュラルキラー細胞はＮＫ９２細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞傷害性細胞はＣＤ８細胞であることを特徴とする請求項１０〜１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞傷害性細胞はリンパ球であることを特徴とする請求項１０〜１２に記載の方法。
【請求項１７】
細胞傷害性細胞にＲＩＧ−Ｉアゴニストを投与することを有することを特徴とする、細胞傷害性細胞におけるパーフォリンのレベルを増加させる方法。
【請求項１８】
前記ＲＩＧ−Ｉアゴニストは、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２又は配列ＩＤ番号３のＲＮＡ分子の少なくとも１つから選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＲＩＧ−Ｉアゴニストは配列ＩＤ番号１であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＩＧ−ＩアゴニストはＩＬ２と共に投与されることを特徴とする請求項１７〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記パーフォリンのレベルは、未処理細胞のレベルの１６００〜２０００倍の因子によって増加されることを特徴とする請求項１７〜２０に記載のパーフォリンレベルを増加させる方法。
【請求項２２】
前記細胞傷害性細胞はナチュラルキラー細胞であることを特徴とする請求項１７〜２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ナチュラルキラー細胞はＮＫ９２細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞傷害性細胞はＣＤ８細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞傷害性細胞はリンパ球であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
細胞傷害性細胞に、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２又は配列ＩＤ番号３から選択される少なくとも１つのＲＮＡ分子を投与することを有することを特徴とする、細胞傷害性細胞におけるパーフォリン及びグランザイムＢのレベルを増加させる方法。
【請求項２７】
前記ＲＩＧ−ＩアゴニストはＩＬ２と共に投与されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＩＧ−Ｉアゴニストは配列ＩＤ番号１であることを特徴とする請求項２６〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞傷害性細胞はナチュラルキラー細胞であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ナチュラルキラー細胞はＮＫ９２細胞であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞傷害性細胞はＣＤ８細胞であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞傷害性細胞はリンパ球であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜６に記載の少なくとも１つのＲＮＡ分子の有効量を、それを必要とする患者に投与することを有することを特徴とする、癌を治療する方法。
【請求項３４】
前記ＲＮＡ分子は配列ＩＤ番号１を有することを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜６に記載の少なくとも１つのＲＮＡ分子の有効量を、それを必要とする患者に投与することを有することを特徴とする、慢性ウイルス感染を有するウイルス感染を治療する方法。
【請求項３６】
前記ＲＮＡ分子は配列ＩＤ番号１を有することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜６又は配列ＩＤ番号２又は配列ＩＤ番号３のＲＮＡ分子から選択される少なくとも１つのＲＮＡ分子を有することを特徴とする細胞傷害性細胞。
【請求項３８】
配列ＩＤ番号１を有することを特徴とする細胞傷害性細胞。
【請求項３９】
請求項１〜６又は配列ＩＤ番号２又は配列ＩＤ番号３のＲＮＡ分子から選択される少なくとも１つのＲＮＡ分子の投与を有することを特徴とする、癌又は慢性感染症を有する患者を治療する方法。
【請求項４０】
前記ＲＮＡは配列ＩＤ番号１であることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞内防御機構を阻害する際に有効なＲＩＧ−Ｉアゴニストで処置された細胞の患者への投与を有することを特徴とする、養子細胞移入で治療可能な疾患を有する患者を治療する方法。
【請求項４２】
前記患者はＩＬ２も受けることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＲＩＧ−Ｉアゴニストは、請求項１〜６又は配列ＩＤ番号２又は配列ＩＤ番号３のＲＮＡ分子から選択される少なくとも１つのＲＮＡ分子から選択されることを特徴とする請求項４１〜４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＲＮＡは配列ＩＤ番号１であることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項３７〜３８に記載の細胞傷害性細胞の投与を有することを特徴とする、癌又は慢性感染症を有する患者を治療する方法。
【請求項４６】
幹細胞を請求項１〜６、配列ＩＤ番号２又は配列ＩＤ番号３のＲＮＡ構築物に接触させることを有することを特徴とする、幹細胞の生存性又は生着を増加させる及び／又は幹細胞の増殖、送達又は治療効果を強化する方法。
【請求項４７】
ＩＬ２の同時投与を更に有することを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＲＮＡは配列ＩＤ番号１であることを特徴とする請求項４６〜４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＲＩＧ−Ｉアゴニストによって処置された細胞傷害性細胞から単離された細胞外小胞の投与を有することを特徴とする、癌を有する哺乳動物の生存時間を延長する方法。
【請求項５０】
前記哺乳動物はＩＬ２も受けることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＲＩＧ−Ｉアゴニストは、請求項１〜６又は配列ＩＤ番号２又は配列ＩＤ番号３から選択されることを特徴とする請求項４９〜５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＲＮＡは配列番号１であることを特徴とする請求項４９−５１の方法。
【請求項５３】
前記細胞はＨＥＫ２９３細胞であることを特徴とする請求項４９〜５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞はナチュラルキラー細胞であることを特徴とする請求項４９〜５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記ナチュラルキラー細胞はＮＫ９２細胞であることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞傷害性細胞はＣＤ８細胞であることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞傷害性細胞はリンパ球であることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
バイスペシフィックキラーセルエンゲージャ（ＢＩＫＥ）、トライスペシフィックキラーセルエンゲージャ（ＴＲＩＫＥ）又はモノクローナル抗体の少なくとも１つと共にＲＩＧ−Ｉアゴニストを投与することを有することを特徴とする、細胞傷害性細胞の活性化を高める方法。
【請求項５９】
前記ＲＩＧ−Ｉアゴニストは、請求項１〜６、配列ＩＤ番号２又は配列ＩＤ番号３から選択されることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＲＮＡは配列ＩＤ番号１であることを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞はＨＥＫ２９３細胞であることを特徴とする請求項５８〜６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞傷害性細胞はナチュラルキラー細胞であることを特徴とする請求項５８〜６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ナチュラルキラー細胞はＮＫ９２細胞であることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞傷害性細胞はＣＤ８細胞であることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞傷害性細胞はリンパ球であることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
ＲＩＧ−Ｉアゴニストによってトランスフェクトされた細胞由来の標的腫瘍溶解性ウイルス、ウイルスベクター、モノクローナル抗体又は運搬及び／又は細胞浸透ペプチド又は細胞外小胞を使用して、ＲＩＧ−Ｉアゴニストの送達を有することを特徴とする、腫瘍微小環境における免疫応答増加方法。
【請求項６７】
前記ＲＩＧ−Ｉアゴニストは、請求項１〜６、配列ＩＤ番号２又は配列ＩＤ番号３から選択されることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＲＮＡは配列ＩＤ番号１であることを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞傷害性細胞はナチュラルキラー細胞であることを特徴とする請求項６６〜６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記ナチュラルキラー細胞はＮＫ９２細胞であることを特徴とする請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞傷害性細胞はＣＤ８陽性細胞であることを特徴とする請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＣＤ８細胞はＴＡＬＬ細胞であることを特徴とする請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞傷害性細胞はリンパ球であることを特徴とする請求項６１〜６３に記載の方法。
【請求項７４】
ＲＩＧ−Ｉアゴニストの投与を有することを特徴とする、細胞におけるＣＤ９０発現を増加させる方法。
【請求項７５】
前記ＲＩＧ−Ｉアゴニストは、請求項１〜６、配列ＩＤ番号２又は配列ＩＤ番号３から選択されることを特徴とする請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＲＩＧ−Ｉアゴニストは配列ＩＤ番号１であることを特徴とする請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞は間葉系間質細胞であることを特徴とする請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞は造血幹細胞であることを特徴とする請求項７４〜７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権と参照による結合）
本出願は、２０１６年４月１日に提出された米国仮特許出願６２／３１６，６７９号に対する優先権を主張し、その内容は参考として援用される。本明細書に引用される全ての参考文献は、参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＤ８細胞」）を用いる治療の有効性は、該細胞傷害性細胞におけるグランザイムＢ及び／又はパーフォリンの相対量（「ロード」）によって影響される。ＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞はまとめて「細胞傷害性細胞」と呼ばれる。養子細胞、腫瘍浸潤リンパ球細胞（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変細胞、及び幹細胞（ここではまとめて養子細胞移入と呼ばれる）と呼ばれるものを含む細胞傷害性細胞は、現在、様々な臨床試験において試験されている多数の癌の種類に対する治療処置として使用することができる。養子細胞移入による治療処置の成功のための重要な因子の１つは、ＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞におけるグランザイムＢ及びパーフォリンのロードである。
【０００３】
細胞傷害性細胞は、悪性形質転換細胞への早期自然応答において重要な役割を果たす。細胞傷害性細胞は、細胞表面で様々な活性化受容体を通じて又は腫瘍細胞上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の非存在下で活性化される（非特許文献８、１０）。
【０００４】
ＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の細胞傷害性は、グランザイムＢ及びパーフォリンの放出、又はＦａｓＬ及びＴＮＦ関連アポトーシスリガンド（ＴＲＡＩＬ）等の死受容体リガンドの発現によって媒介される。活性化すると、溶解性顆粒は、エフェクター及び標的細胞によって主に形成される細胞内接合に送達される（非特許文献６）。ＴＩＬ及びＣＡＲ遺伝子改変細胞傷害性細胞を含む養子細胞移入の標準実務は、現在、養子移入前にインビトロでサイトカイン曝露で細胞を活性化することである。しかし、制限因子は、パーフォリン及びグランザイムＢの全ロードに大きく依存する、各細胞傷害性細胞による十分な連続死滅を得ることである。更に、トランスフェクション処理及び／又はインビボでウイルスに対する細胞耐性又は耐性欠如は、重要な要因である。
【０００５】
細胞溶解性顆粒のロードに対する中心ステップは、ＭＤＡ−５（メラノーマ分化因子５）及びＲＩＧ−Ｉ（レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ）等の細胞内ＲＮＡ認識部位の活性化であり、活性化細胞の直接的な応答をもたらす。
【０００６】
５’−トリホスフェート末端（５’ｐｐｐ）及び１００ヌクレオチド未満のサイズを有するウイルスＲＮＡ又は合成ｄｓＲＮＡ分子は、ＲＩＧ−１を誘導することが分かっている（非特許文献４、７）。更に、５’末端でペアリングするブラント末端塩基及び最小２０ヌクレオチドの長さは、ＲＩＧ−Ｉの最適結合及び活性化のために重要であった（非特許文献４、７）。活性ＲＩＧ−Ｉは、そのＣＡＲＤドメインを介してミトコンドリアアダプタータンパク質ＭＡＶＳと相互作用する。ＭＡＶＳの活性化は、結果的にＩＲＦ−３及びＩＲＦ−７をリン酸化し、ＮＦ−κＢ経路を活性化するＩＫＫ関連キナーゼＴＢＫ１及びΚΚβの活性化をもたらす。更に、これは、ＩＦＮ刺激遺伝子１５（ＩＳＧ１５）及び他のＩＳＧ（非特許文献５、９、１１、１３）等の炎症性サイトカイン及び選択された抗ウイルス遺伝子の転写及び分泌と同様に、タイプＩ  ＩＦＮ（ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−α）免疫応答を直接誘導する（非特許文献５、９、１１、１３）
ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞においてパーフォリン及びグランザイムＢのロードを増加させるであろうＲＩＧ−１に対して特に特異的であるＲＮＡ構築物が当該技術分野では必要であり、それによりＮＫ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の養子細胞移入の障害の１つを克服する。
【０００７】
ＲＩＧ−Ｉは、幹細胞における生存性及び生存期間において重要な役割を果たすことも知られている。ＲＩＧ−Ｉの活性化は、早期幹細胞死をもたらす処理をダウンレギュレートすると考えられている。生存性を改善し、幹細胞の生着能力を増加させるＲＩＧ−Ｉアゴニストが当該技術分野で必要とされている。
【０００８】
当該技術分野では、改善された腫瘍溶解性ウイルス癌治療の必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｅｌｊａｎｓｋｉ  Ｖ，  Ｃｈｉａｎｇ  Ｃ，  Ｋｉｒｃｈｅｎｂａｕｍ  ＧＡ，  Ｏｌａｇｎｉｅｒ  Ｄ，  Ｂｌｏｏｍ  ＣＥ，  Ｗｏｎｇ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＲＩＧ−Ｉ  Ａｇｏｎｉｓｔ  ａｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８９（２０）：  １０６１２−１０６２４．
【非特許文献２】Ｂｈａｔ  Ｒ，  Ｗａｔｚｌ  Ｃ  （２００７）．  Ｓｅｒｉａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ−−ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２（３）：  ｅ３２６．
【非特許文献３】Ｃｈｉａｎｇ  Ｃ，  Ｂｅｌｊａｎｓｋｉ  Ｖ，  Ｙｉｎ  Ｋ，  Ｏｌａｇｎｉｅｒ  Ｄ，  Ｂｅｎ  Ｙｅｂｄｒｉ  Ｆ，  Ｓｔｅｅｌ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  Ｂｒｏａｄ−Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ＲＩＧ−Ｉ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８９（１５）：  ８０１１−８０２５
【非特許文献４】Ｇｏｕｂａｕ  Ｄ，  Ｓｃｈｌｅｅ  Ｍ，  Ｄｅｄｄｏｕｃｈｅ  Ｓ，  Ｐｒｕｉｊｓｓｅｒｓ  ＡＪ，  Ｚｉｌｌｉｎｇｅｒ  Ｔ，  Ｇｏｌｄｅｃｋ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）．  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｖｉａ  ＲＩＧ−Ｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｂｅａｒｉｎｇ  ５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５１４（７５２２）：  ３７２−３７５．
【非特許文献５】Ｇｒａｎｄｖａｕｘ  Ｎ，  Ｓｅｒｖａｎｔ  ＭＪ，  ｔｅｎＯｅｖｅｒ  Ｂ，  Ｓｅｎ  ＧＣ，  Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ  Ｓ，  Ｂａｒｂｅｒ  ＧＮ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ３  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ：  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６（１１）：  ５５３２−５５３９．
【非特許文献６】Ｈｅｎｋａｒｔ  ＰＡ  （１９８５）．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：  ３１−５８．
【非特許文献７】Ｈｏｒｎｕｎｇ  Ｖ，  Ｅｌｌｅｇａｓｔ  Ｊ，  Ｋｉｍ  Ｓ，  Ｂｒｚｏｚｋａ  Ｋ，  Ｊｕｎｇ  Ａ，  Ｋａｔｏ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）．  ５’−Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ＲＩＧ−Ｉ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４（５８０１）：  ９９４−９９７．
【非特許文献８】Ｋａｒｒｅ  Ｋ，  Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ  ＨＧ，  Ｐｉｏｎｔｅｋ  Ｇ，  Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ  Ｒ  （１９８６）．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈ−２−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｅｎｃｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３１９（６０５５）：  ６７５−６７８．
【非特許文献９】Ｋａｗａｉ  Ｔ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  Ｓａｔｏ  Ｓ，  Ｃｏｂａｎ  Ｃ，  Ｋｕｍａｒ  Ｈ，  Ｋａｔｏ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）．  ＩＰＳ−１，  ａｎ  ａｄａｐｔｏｒ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ＲＩＧ−Ｉ−  ａｎｄ  Ｍｄａ５−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：  ９８１−９８８．
【非特許文献１０】Ｌａｎｉｅｒ  ＬＬ  （２００１）．  Ｏｎ  ｇｕａｒｄ−−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２（１）：  ２３−２７．
【非特許文献１１】Ｌｉｕ  ＳＹ，  Ｓａｎｃｈｅｚ  ＤＪ，  Ｃｈｅｎｇ  Ｇ  （２０１１）．  Ｎｅｗ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３（１）：  ５７−６４．
【非特許文献１２】Ｓｈｕ  Ｄ，  Ｓｈｕ  Ｙ，  Ｈａｑｕｅ  Ｆ，  Ａｂｄｅｌｍａｗｌａ  Ｓ，  Ｇｕｏ  Ｐ  （２０１１）．  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ＲＮＡ  ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：  ６５８−６６７．
【非特許文献１３】Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ，  Ａｋｉｒａ  Ｓ  （２０１０）．  Ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  １４０（６）：  ８０５−８２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、細胞傷害性細胞中のパーフォリンの量を増加させるＲＮＡ分子を提供することである。
【００１１】
本発明の目的は、細胞傷害性細胞中のグランザイムＢの量を増加させるＲＮＡ分子を提供することである。
【００１２】
本発明の目的は、小分子を投与することによって細胞傷害性細胞中のパーフォリンの量を増加させることである。
【００１３】
本発明の目的は、エクスビボ処理（即ち、自己又は同種細胞が体外にある間）においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）技術を含む養子細胞治療を強化するために、細胞傷害性細胞及び／又は幹細胞を含む細胞にＲＮＡ分子を投与することである。
【００１４】
本発明の目的は、インビボ処理（即ち、細胞が体内に残っている間）を介して、細胞傷害性細胞及び／又は幹細胞を含む常在細胞にＲＮＡ分子を投与することである。
【００１５】
本発明の目的は、小分子を投与することによって細胞傷害性細胞中のグランザイムＢの量を増加させることである。
【００１６】
本発明の目的は、幹細胞をトランスフェクトする能力を改善することである。
【００１７】
本発明の目的は、ＲＩＧ−Ｉに結合するＲＮＡ分子を投与することによって幹細胞の生存性及び生着率を上げることである。
【００１８】
本発明の目的は、エクスビボトランスフェクション処理においてウイルスに曝露された場合に細胞傷害性細胞の生存性を増加させることである。
【００１９】
本発明の目的は、インビボでウイルスに曝露された場合に細胞傷害性細胞の生存性を増加させることである。
【００２０】
本発明の目的は、細胞傷害性細胞の連続死滅能力を増加させることである。
【００２１】
本発明の目的は、慢性ウイルス感染を含むウイルス感染を治療することである。
【００２２】
本発明の目的は癌を治療することである。
【００２３】
本発明の目的は、肝臓癌を治療することである。
【００２４】
本発明の目的は、多発性骨髄腫を治療することである。
【００２５】
本発明の目的は、Ｃ型肝炎を治療することである。
【００２６】
本発明の目的は、ＨＩＶを治療することである。
【００２７】
本発明の目的は、ウイルスリザーバとして作用する細胞を除去することである。
【００２８】
本発明の目的は、ＲＮＡ小分子を投与して細胞系ＮＫ−９２においてグランザイムＢ及びパーフォリンを増加させることである。
【００２９】
本発明の目的は、ＲＮＡ小分子を投与して細胞系ＴＡＬＬ−１０４においてグランザイムＢ及びパーフォリンを増加させることである。
【００３０】
本発明の目的は、ナチュラルキラー細胞及びＴ細胞等の初代ヒト細胞傷害性リンパ球におけるグランザイムＢ及びパーフォリンを増加させるために、ＲＮＡ小分子を投与することである。
【００３１】
本発明の目的は、ＲＩＧ−ＩアゴニストＡによって処理されたＨＥＫ２９３細胞又はＮＫ細胞から単離された細胞外小胞を用いて癌を有する哺乳動物の生存時間を延ばすことである。
【００３２】
本発明の目的は、新規ＲＮＡ  ＲＩＧ−Ｉアゴニストをインビボ又はインビトロで、ＲＮＡウイルスベクターにそれをコードすること又は腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスを使用することによって、投与することである。
【００３３】
本発明の目的は、細胞の活性化を上げるために、バイスペシフィックキラーセルエンゲージャ（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ：ＢＩＫＥｓ）、トライスペシフィックキラーセルエンゲージャ（Ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ：ＴＲＩＫＥｓ）及びモノクローナル抗体と相乗する新規ＲＮＡ  ＲＩＧ−Ｉアゴニストを投与することである。
【００３４】
本発明の目的は、標的ナノ粒子、リポソーム、腫瘍溶解性ウイルス、ウイルスベクター、モノクローナル抗体又は運搬及び／又は細胞浸透性ペプチドを用いてＲＩＧ−ＩアゴニストＡを送達することによって腫瘍微小環境における免疫応答を増加させることである。
【００３５】
本発明の目的は、本発明のＲＩＧ−Ｉアゴニストを、抗ＫＩＲ抗体、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＴＥＭ３、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ−１、及び／又は抗ＣＴＬＡ４等のチェックポイント阻害剤と組み合わせることである。
【００３６】
本発明の目的は、診断ツールとしてのエフェクター細胞のアネルギーを理解するために、本発明のＲＩＧ−Ｉアゴニストを使用することである。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
我々は、「ＲＩＧ−ＩアゴニストＡ」（「ＲＩＡＡ」）とここで同定された５６のＲＮＡサブユニットを含むＲＮＡ構築物を作製した。ＲＩＡＡはＲＩＧ−Ｉに非常に特異的であり、細胞傷害性細胞におけるパーフォリン及びグランザイムＢのロードを増加させる。これは、細胞傷害性細胞の生存性、死滅力及び有効性を増加させ、ＮＫ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞及び幹細胞の養子細胞移入の様々な障害を克服する。
【００３８】
ＲＩＡＡは、患者に細胞を投与する前に、ＮＫ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞及び幹細胞を含む細胞をインビトロでトランスフェクトするために使用可能なＲＮＡ小分子である。細胞は、自己又は同種細胞であってもよい。ＲＩＡＡは、患者の内在性細胞を治療するためにインビボで投与することもできる。更に、ＲＩＡＡは、養子細胞のインビトロ処理を必要とせずに、治療用小分子として患者に投与することができ、更に、ＲＩＡＡを単剤療法及び／又は併用療法として投与することができる。
【００３９】
本発明の用途は、悪性黒色腫、卵巣癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肝臓癌、子宮頸癌、頭頸部癌、ＥＧＦＲ＋腫瘍、ＨＥＲ１＋腫瘍、ＨＥＲ２＋腫瘍、膵癌、扁平上皮癌、サルコーマ、非小細胞性肺癌、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、多形膠芽腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、形質細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、ＣＤ−２０陽性Ｂ細胞悪性腫瘍、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫及び肝臓、慢性ウイルス及び／又はＣ型肝炎及びＨＩＶを含むがこれらに限定されない感染、移植後リンパ増殖性疾患を含むがこれらに限定されない固形腫瘍及び血液癌の成人及び小児治療及び幹細胞を用いる任意の治療を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】実験プロトコルの概略図である。
【図２】ＲＩＧ−ＩアゴニストＡの投与後のＮＫ細胞のパーフォリン及びグランザイムＢロードの増加を示す一対の棒グラフである。
【図３】ＲＩＡＡによる刺激後のＮＫ細胞の連続的な細胞傷害能力を示す折れ線グラフである。
【図４】ＲＩＡＡ及び他のＲＩＧ−Ｉアゴニストを、シンジェニック免疫適格腫瘍担持マウスへの皮下投与を示す折れ線グラフである。
【図５】既知のＲＩＧ−Ｉ刺激剤Ｍ５及びＭ８と比較されたＲＩＡＡの二次ＲＮＡ構造の概略図である。
【図６】Ｍ５、Ｍ８及びＲＩＧ−ＩアゴニストＡの配列比較である。
【図７】ＲＩＧ−ＩアゴニストＡ処理がある場合とない場合の間葉系間質細胞におけるドナーあたりのＣＤ９０受容体密度の変化を示す折れ線グラフである。
【図８】ＲＩＧ−ＩアゴニストＡの投与後のＣＤ９０細胞の増加を示す棒グラフである。
【図９】ＲＩＧ−ＩアゴニストＡ処理を用いたＴ細胞におけるパーフォリン及びグランザイムＢの増加を示す棒グラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
我々は、ＮＫ細胞及び幹細胞のトランスフェクションを改善する際に有用であるＲＮＡ  ＲＩＧ−Ｉアゴニストの新しいファミリーを発見した。これらのアゴニストは、ヘアピン及びループを含む二次構造を生成するそれ自体に結合するＲＮＡの一本鎖を含む。我々は、ヘアピンとループ（「結合領域」）の間の分子に沿った距離がＲＩＧ−Ｉ結合及び活性化に重要であることを発見した。
【００４２】
結合領域内で、ヘアピンとループの距離は７〜８０塩基の間でなければならない。７塩基未満では、構造がＲＩＧ−Ｉの結合溝に収まるように折り畳むことができないと考えられる。結合領域が８０塩基を超えると、分子は折り畳まれてＲＩＧ−Ｉ結合部位に収まるかもしれないが、大分子は、実際にＲＩＧ−Ｉの活性化を減少させるだろうと考えられる。ヘアピンとループの結合領域は、ループ構造を安定にするために、ループの各側の２〜５塩基距離内にＧＣ相補塩基対を含む必要がある。また、ループ領域に少なくとも１つのＡＵ相補対が存在することにより、ループの形成が容易になる。
【００４３】
このＲＮＡ小分子ファミリーの代表は、ＲＩＡＡ（配列ＩＤ番号１）として同定された新規なＲＮＡ構築物である。ＲＩＡＡは、ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞におけるパーフォリン及びグランザイムＢの大幅に増加したロードをもたらすＲＩＧ−Ｉに対して非常に特異的である。
【００４４】
ＲＩＡＡは、患者に細胞を投与する前に、ＮＫ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞及び幹細胞を含む細胞をインビトロでトランスフェクトするために使用可能なＲＮＡ小分子である。細胞は、自己又は同種であってもよい。インビボで内在性細胞を治療するために、インビボでＲＩＡＡを投与することもできる。更に、ＲＩＡＡは、養子細胞のインビトロ処理を必要とせずに小分子治療薬として患者に投与することができる。
【００４５】
本発明の構築物及び方法を用いて活性化された細胞傷害性細胞は、殺傷機能が強化された細胞傷害性細胞が望まれる任意の用途に有用である。本発明の用途は、多発性骨髄腫及び肝臓を含むがこれらに限定されない任意の癌ならびにＣ型肝炎及びＨＩＶ等の慢性ウイルス感染を含み、これらに限定されないウイルス感染の治療を含む。
【実施例１】
【００４６】
（細胞を強化するためのＲＩＧ−Ｉアゴニストのエクスビボの使用）
材料及び方法
細胞培養
ヒトナチュラルキラー細胞株ＮＫ−９２は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス、カタログ番号ＣＲＬ−２４０７ＴＭ）から購入した。細胞を、２０％熱不活性ＦＢＳ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）及び１０００Ｕ／ｍｌ  Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（ノバルティス、バーゼル・スイス）を含む幹細胞培地（ＣｅｌｌＧｒｏ；ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、フライブルグ・ドイツ）で最初に解凍した。
【００４７】
ヒトＴ細胞株ＴＡＬＬ―１０４は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス、カタログ番号ＣＲＬ−２４０７ＴＭ）から購入した。細胞を、２０％熱不活性ＦＢＳ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）及び１０００Ｕ／ｍｌ  Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（ノバルティス、バーゼル・スイス）を含むＩＭＤＭで最初に解凍した。
【００４８】
ＮＫ細胞活性を評価するために、慢性骨髄性白血病患者Ｋ５６２（ＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ／ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）由来のヒト赤芽球細胞株をＣＲ５１放出及び脱顆粒分析の標的として使用した。Ｋ５６２細胞をＲＰＭＩ、ＧｌｕｔａＭＡＸ１６４０（インビトロジェン）と共に培養し、１０％ＦＢＳで補充した。
【００４９】
細胞を３７℃、５％ＣＯ２、湿度９５％でインキュベートし、トリパンブルー染色及びＣｏｕｎｔｅｓｓ細胞カウンター（インビトロジェン）により２日毎に細胞数を決定した。
【００５０】
ＮＫ−９２細胞を０．５〜１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で培養し、ＩＬ−２で毎日補充した。
【００５１】
全細胞培養は、厳密な抗生物質不使用条件下でＢＳＬ２環境で行われた。
【００５２】
ＴＡＬＬ−１０４細胞株は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が補充されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＦＭＤＭ）で、０．０５〜０．１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で使用された。細胞を組換え５００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２で補充された。
【００５３】
ＲＮＡ構築物
以前に報告されたＲＩＧ−Ｉアゴニスト（Ｍ５及びＭ８）は、ジョン・ヒスコット（Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｆｏｎｄａｚｉｏｎｅ  Ｃｅｎｃｉ  Ｂｏｌｏｇｎｅｔｔｉ、ローマ・イタリア）によって親切に共有された。残念なことに、移入されたＭ５配列ＩＤ番号２及びＭ８（配列ＩＤ番号３）組成物は非常に汚染されており、活性がＭ５又はＭ８分子に由来するかどうか、又は活性が未知の汚染物質に由来するかどうかは不明であった。（Ｍ５及びＭ８分子は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０１１３２４に記載されていると考える）。従って、ＲＩＧ−ＩアゴニストＡ、Ｍ５及びＭ８構築物は合成され、ＲＩＧ−ＩアゴニストＡ）精製され、品質管理された（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（ＧＥヘルスケア））。Ｍ５、Ｍ８及びＲＩＡＡを図５に示す。
【００５４】
ＲＩＡＡ配列ＩＤ番号１：
ＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＡＣＡＡＡＣＣＡＧＡＵＡＡＡＡＡＵＡＡＵＵＵＵＵＡＵＣＵＧＧＵＵＧＵＵＵＧＵＣＵＵＣＧＵＣ
Ｍ５配列ＩＤ番号２：
ＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＴＴＣＧＴＣＣ
Ｍ８配列ＩＤ番号３
ＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＴＴＣＧＴＣ
ＲＩＧ−１アゴニストによるＨＥＫ２９３細胞株のトランスフェクション
ヒト胎児腎細胞株２９３（ＨＥＫ２９３）は、当該技術分野で周知の細胞株である。トランスフェクションは、ＨＥＫ２９３に対して１ｍｌのＩＭＤＭ／ウェルで約２×１０５細胞／ウェルを使用して、１２ウェルプレートの懸濁液の新しくトリプシン処理された細胞で行われた。各トランスフェクションに対して、１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン）及び５０ｎｇのｍＲＮＡが使用された。細胞懸濁液に添加される前に、ｍＲＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００は１００μｌＯＰＴＩ−ＭＥＭブランド最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）で３０分間インキュベートした。細胞及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００−ｍＲＮＡ複合混合物を、余分な５０μｌ／ウェルＦＭＤＭが添加される前に、ＨＥＫ２９３に対して５×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに直ちに分け、３７℃、５時間インキュベートした。トランスフェクション後、細胞はＯＰＴＩ−ＭＥＭのＴ−１５０フラスコにプールされた。上清が１６、２４、４０、４８時間で集められ、−２０℃でエクソソーム精製のために凍結された。
【００５５】
ＲＩＧ−ＩアゴニストによるＢＭＭＳＣの培養及びトランスフェクション
トランスフェクションは上記のように行われた。簡潔には、骨髄間葉間質細胞（「ＢＭＭＳＣ」）を３人の健康なドナーから入手した。Ｆｉｃｏｌｌ分離骨髄を、２ｍｌのＡｌｐｈａ−ＭＥＭ（インビトロジェン）の６ウェルプレートに播種した。次いで、細胞を、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で５日間インキュベートした。位相差顕微鏡で３日目の紡錘形細胞の出現と７０〜９０％のコンフルエントを確認した後で、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．２５％ＧＭＰグレードＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＴＳ（サーモフィッシャー、マサチューセッツ州ウォルサム）２．５ｍＬで、３７℃、２分間ダイジェストした後、７．５ｍＬの完全最小必須培地アルファ（「α−ＭＥＭ培地」）で中和した。その後、１ｘ１０６細胞を、フローサイトメトリーを用いた表現型ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１４６、ＳＳＥＡ−１及びＳＳＥＡ−４であることを確認するのに使用し、これらの細胞がＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性であることを確認した。パネルを以下の表１に記載する。残りの細胞を隔日継代し、継代５−７の間にトランスフェクトした。次いで、細胞をトランスフェクションのために５×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。トランスフェクションプロトコルは上記のように行われた。フローサイトメトリーを用いてトランスフェクション後２４時間に細胞を特徴付け、上清ＴＧＦ−ＢレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。
【００５６】
【表１】
2019510035.tif 000003
【００５７】
造血幹細胞（「ＨＳＣ」）のトランスフェクション
満期正常分娩（３７〜４１週）から採取した臍帯血試料を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）で１：１に希釈した。続いて、４００ｇで４０分間Ｆｉｃｏｌｌの遠心分離により単核細胞を単離した。単核細胞を集め、２回洗浄し、０．５％ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）を添加してＰＢＳに再懸濁した。
【００５８】
製造業者の推奨に従って、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク）及びＣＤ３４ダイレクト・アイソレーション・キット（ミルテニーバイオテク）を使用して、ＣＤ３４＋画分を免疫磁気単離した。つまり、ＦｃＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔを加えた後で、細胞をＭＡＣＳ  ＣＤ３４  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓで６〜１２℃で３０分間標識した。続いて、細胞懸濁液を磁界に置かれたカラムを通すことにより、標識細胞を濃縮された。カラムを磁界から取り出した後、陽性選択細胞をカラムから洗い出して集めた。ＣＤ３４＋細胞集団の純度は、単離直後にフローサイトメトリーによって決定された。
【００５９】
幹細胞因子（ＳＣＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）（５０ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ）及び胎児肝チロシンキナーゼ−３リガンドＦｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）（５０ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ）の成長因子で補充された造血幹細胞及び前駆細胞（ＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）に対して、細胞を、無血清培地に１ｘ１０５／ｍｌの細胞濃度、２５ｃｍ２フラスコで培養した。５％ＣＯ２の加湿雰囲気、３７℃で４８時間インキュベートした後で、細胞を、２０％ＨＳＡで補充されたＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ培地に１ｘ１０５／ｍｌで再懸濁した。
【００６０】
ＣＤ３４濃縮細胞を、等しいサイズのアリコート（アリコート当たり２〜５×１０５の細胞）に分け、トランスフェクトなし、ＲＮＡなしでトランスフェクトした（モック）、又はＲＩＧ−Ｉアゴニストでトランスフェクトした、のいずれかとした。トランスフェクションキュベットを１ｍｌのＩＭＤＭで２回リンスすることにより、トランスフェクトされた細胞を１５ｍｌのプラスチックチューブに移し、総量１０ｍｌのＥＶＩＤＭで洗浄した。ペレット化した細胞を、加湿雰囲気、３７℃、５％ＣＯ２で１５分間インキュベートした後、早期作用性サイトカイン（胎児肝チロシンキナーゼ−３リガンドＦｌｔ−３リガンド［Ｆｌｔ−３Ｌ］、幹細胞因子［ＳＣＦ］、トロンボポエチン［ＴＰＯ］、各々１０ｎｇ／ｍｌ最終濃度で［全てＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、ニュージャージー州ロッキーヒル］）で補充された１ｍｌのＭｙｌｅｏｃｕｌｔ  Ｈ５１００培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー・カナダ）に再懸濁された。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で、一般的なカスパーゼ阻害剤Ｚ−Ｖ  ＡＤ−ＦＭＫ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルグ・ドイツ）の存在下で、１×１０５細胞／ｍｌの密度で培養した。
【００６１】
我々は、製造業者Ｌｏｎｚａ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｌｏｎｚａ．ｃｏｍ／ｆｉｌｅａｄｍｉｎ／ｇｒｏｕｐｓ／ｍａｒｋｅｔｉｎｇ／Ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ／Ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ｄ＿Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＿７１．ｐｄｆ）からのトランスフェクションインストラクションを使用し、ヌクレオフェクションプログラムＵ０８を使用し、５×１０５以上のＣＤ３４濃縮細胞を使用した。上記のようにＲＮＡをトランスフェクトした。次いで、表２のパネルを用いて詳細なフローサイトメトリーにより細胞を特徴付けた。
【００６２】
【表２】
2019510035.tif 000004
【００６３】
ＲＮＡナノ粒子及び細胞外小胞の構築
ナノ粒子は、以前に報告されたプロトコル（非特許文献１２）に従って、ＲＮＡフラグメント（Ｔｒｉｌｉｎｋ）から合成された。ＲＮＡナノ粒子は、インビボでＲＮａｓｅ分解に耐性をもたせるために、２−Ｆ  Ｕ及びＣヌクレオチドを含んだ。次いで、ＲＮＡ複合物を、個々の鎖をＰＢＳ緩衝液に室温（ＲＴ）、化学量論比で混合することによって組み立てた。
【００６４】
（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙにより測定された）１２μｇの全タンパク質濃度でＮＫ９２又はＨＥＫ２９３由来のエクソソーム及び１６μｇのＲＮＡを４００μｌのエレクトロポレーション緩衝液（１．１５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．２，２５ｍＭ塩化カリウム、２１％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）で混合され、４ｍｍキュベットで電気穿孔した。インビボ実験のために、エレクトロポレーションを４００μｌで行い、その後プールした。
【００６５】
エクソソームは、５０ｍｌの条件培地（４８時間、ＯｐｔｉＭｅｍにＮＫ細胞Ｓ７２）を３００ｇ、５分間回転させて細胞デブリを除去し、０．２μｍの滅菌フィルターを通して濾過し、次いで１１０，０００ｇで９０分間超遠心分離した。ペレットを全容量３００μｌのＰＢＳに再懸濁した。Ｌｉｇｕｎｉら、ＪＩ２０１２、ヒトＮＫ細胞由来エクソソームの免疫サーベイランス特性を参照のこと。
【００６６】
マウス
雌雄Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウスをＨａｒｌａｎ  ＣＰＢ（ホルスト・オランダ）から購入した。Ｃ５７Ｂ１／６、Ｃ５７Ｂ１／６  ＣＤ１−／−、Ｃ５７Ｂ１／６  ＣＯ４−／−、Ｃ５７Ｂ１／６  ＣＤ８−／−、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＡＣＴｂＥＧＦＰ）１Ｏｓｂ／Ｊ及びＲａｇ２−／−ｃγ−／−マウスは、カロリンスカ研究所微生物学及び腫瘍生物学センターから供給された。全ての動物は、水道水及び標準飼料の自由アクセスを含む従来条件下で、カロリンスカ研究所フッディンゲ大学病院臨床研究センターで動物施設に収容された。全マウスは、各実験の開始時に８−１０週齢であった。本研究で行われた実験は、スウェーデン南ストックホルム地方倫理委員会によって承認された。
【００６７】
ＭＭ細胞注入及び多発性骨髄腫の誘導
Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウス群に、マウス１匹あたり全量１００μｌ滅菌ＰＢＳに懸濁された１０５個のｅＧＦＰ−５Ｔ３３  ＭＭ及び／又は非形質導入５Ｔ３３  ＭＭ細胞で静注した。コントロールマウスには等量のＰＢＳで静注された。動物は対麻痺の進展のために一日２回検査された。週間隔かつ疾患進行時に、マウスをＣＯ２吸入により安楽死させ、脾臓、肝臓、胸腺及びリンパ節を切除し、単細胞懸濁液の調製処理までＰＢＳに保持した。大腿骨及び脛骨からの骨髄は、ＰＢＳを骨の空洞に流すことによって得られた。
【００６８】
腫瘍細胞の照射及び接種
腫瘍細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１３７Ｃｓ  Ｇａｍｍａｃｅｌｌ２０００デバイス（Ｍｏｌｓｇａａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ、ヘルスホルム・デンマーク）に６０Ｇｙでガンマ線を照射した。照射直後に、それらを皮下注射又は更なるインビトロ分析のために培養した。Ｃ５７Ｂｌ／６及びＣ５７Ｂｌ／ＫａＬｗＲｉｊに、標準プロトコルに従って免疫性を与えた。簡潔には、注射前に、洗浄、計数し、最終濃度、ＰＢＳ（０．２ｍｌ）に腫瘍細胞を再懸濁した。２７ゲージ針を備えた１ｃｃツベルクリン注射器を用いて３週間隔で３回腫瘍細胞を注入し、マウスを週に２回腫瘍の存在も検査した。
【００６９】
エフェクター細胞の調製
脾臓断片に穏やかな圧力をかけるためホモジナイザーを用いて懸濁液をメッシュを通して濾過してことにより、マウスからの脾臓単細胞の懸濁液を無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地にプールした。赤血球を、塩化アンモニウム溶液［０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍｍｏｌ／Ｌエデト酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．２］で溶解した。得られた細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地［１０％不活性ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、１ｍｍｏｌピルビン酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／ＬのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１００ｋＵ／ＬのペニシリンＧ及び１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン］で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地とＴｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ａ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社、バージニア州ハーンドン）に再懸濁した。新鮮な完全ＲＰＭＩ培地のＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（ｒＩＬ−２）を０日目及び１日おきに添加した。細胞を１×１０６細胞／ｍｌの濃度で培養し、細胞密度を毎日測定した。
【００７０】
エフェクター細胞のエクスビボ分離
単細胞懸濁後で、マウス細胞を、製造者の指示に従って、ＣＤ８マウスマイクロビーズキット（ミルテニーバイオテク、ベルギッシュ・グラードバッハ・ドイツ）を使用して分離した。簡潔には、異なる器官からの単細胞懸濁液を上記のように調製し、細胞数を決定した。３００ｇで１０分間の細胞遠心分離後、上清を完全に除去した。細胞ペレットを９０μｌのすすぎ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。細胞を、１０７の全細胞あたり１０μｌのＣＤ８マイクロビーズと混合し、４℃で１５分間インキュベートした。磁気分離前に、細胞を１０７の細胞あたり２ｍｌのすすぎ緩衝液で洗浄し、３００ｇで１０分間遠心分離して上清を除去し、５００μｌのすすぎ緩衝液に再懸濁した。一方、磁気カラムを適切なＭＡＣＳセパレータの磁界に置き、３ｍｌのすすぎ緩衝液で３回すすぐことによって選別のために調製した。最後に、細胞懸濁液をカラムに適用し、３ｍｌのすすぎ緩衝液で３回リンスした。全ての非標識（陰性）細胞をすすぎ洗いし、１５ｍｌのファルコンチューブに集めた。標識エフェクター細胞を集めるために、カラムを磁界から除去し、５ｍｌのすすぎ緩衝液をカラムに適用し、プランジャーを用いて陽性細胞画分を清浄な１５ｍｌのファルコンチューブに洗い流した。
【００７１】
陰性画分を、２４ウェルプレート（ＢＤ）中の５０ユニット／ｍｌ  ＪＬ−２との１：１エフェクト対標的（Ｅ：Ｔ）比でインビトロで刺激した。インビトロ刺激の５日後、細胞を採取し、５１Ｃｒ放出分析に使用した。
【００７２】
脱顆粒及び細胞傷害性分析
Ｋ細胞の脱顆粒する能力を分析するために、細胞を９６ウェルプレートで１×１０６細胞／ｍｌの密度で培養し、単独又はＫ５６２と１：１の比又はＰＭＡ及びＩｏｎｏ（０．５μｇ／ｍｌ、会社、場所）で４−６時間インキュベートした。インキュベーションの１時間後、ゴルジストップ（ＢＤ）を培養液に添加して、タンパク質輸送を阻害した。続いて、細胞をＣＤ５６及びＣＤ１０７ａに対して４℃で３０分間染色した。
【００７３】
細胞傷害性機能は、１８時間の５１Ｃｒ放出分析で３回測定した。簡潔には、１×１０６個の標的細胞を１００μｌ５１Ｃｒ（１ｍＣｉ／ｍｌの比活性）で標識し、３７℃で１時間インキュベートした。５Ｔ３３及びＬＰＳ  Ｂｌａｓｔを標的として使用した。ＣＴＬ細胞を、最大Ｅ：Ｔ比１００：１を有する３組調製した標的細胞連続希釈液と共にインキュベートした。ＲＰＭＩ培地をネガティブコントロールとして使用し、ポジティブコントロールのために細胞を１％ＴｒｉｔｏｎＸと共にインキュベートした。Ｖ底型９６ウェルプレートで３７℃、１８時間インキュベートした後、上清７０μｌを各ウェルから吸引し、パッカード・コブラ・オートガンマ５０００シリーズ計数システム（アメリカ合衆国コネチカット州メリデン）を用いて数えた。自発放出パーセンテージを次式から計算した：％比５１Ｃｒ放出＝（試料放出−自発放出）／（最大放出−自然放出）×１００。
【００７４】
マウスＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のインビボ枯渇
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、尾静脈又は皮下を介して１０６の５Ｔ３３ＭＭ細胞でそれらを接種することによって腫瘍誘発を行った。インビボでＣＤ４細胞を枯渇させるために、マウスを、免疫化の２日前から抗ＣＤ４ｍＡｂの２００μｇの腹腔内注射し、その後５日毎に、実験終了まで抗ＣＤ４ｍＡｂの２００μｇの腹腔内注射した。コントロールマウスには、同量（０．２ｍｌ）及び同用量のマウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）をアイソタイプコントロールとして注射した。エンドポイントで脾臓細胞のフローサイトメトリー分析により、ＣＤ４＋細胞の枯渇の有効性をモニターした。脾臓において１．０％未満のＣＤ４＋細胞を示す動物を研究から除外した（ｎ＝２）。
【００７５】
並行して、精製抗ＣＤ８ＭＡｂ（クローン２．４３）を用いてＣＴＬのインビボ枯渇を実施し、腫瘍確立中に枯渇するとき、エンドポイントまで−２日目から５日毎にマウス１匹当たり０．５ｍｇの抗体を腹腔内注射した。
【００７６】
マウスを対麻痺又は皮下腫瘍の発生についてモニターし、それらの生存動態を比較した。
【００７７】
フローサイトメトリー
ＣＤ２（ＲＰＡ−２．１０）、ＣＤ１１ｂ（ＩＣＲＦ４４）ＣＤ５７（ＮＫ−１）ＤＮＡＭ１（ＤＸ１１）、Ｋｐ４４（ｐ４４−８．１）Ｋｐ４６（９Ｅ２）、ＮＫｐ３０（ｐ３０−１５）、ＣＤ１０７ａ（Ｈ４Ａ３）、ＮＫＧ２Ｄ（１Ｄ１１）（ＢＤ、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）、ＮＫＧ２Ｃ（１３４５９１）（Ｒ＆Ｄシステムズ、英国アビングドン）、ＣＤ５６（ＨＣＤ５６）、ＮＫｐ８０（５ｄ１２）、ＣＤ１６１（ＨＰ−３Ｇ１０）、ＣＤ３１９（１６２．１）、ＣＤ３５２（ＮＴ−７）、（バイオレジェンド、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＣＤ２４４（Ｃ１．７）（ベックマンコールター、カリフォルニア州ブレア）、Ｓｉｇｌｅｃ７（ＲＥＡ２１４）（ミルテニー、ベルギッシュ・グラードバッハ・ドイツ）に対する蛍光色素結合抗体を用いて、表現型を分析し、製造手順に従って処理した。パーフォリン（ｄＧ９）、グランザイムＢ（ＧＢ１１）（ＢＤ）の細胞内染色のために、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いでＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ）で固定・透過化し、＋４℃で２０分間インキュベートした。固定・透過化の後で、細胞を洗浄し、製造プロトコルに従って、Ｐｅｒｍｗａｓｈで染色した。
【００７８】
Ｐａｒｔｅｃ  Ｃｙｆｌｏｗ  ＭＬ又はＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ）のいずれかによって全細胞を獲得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ社、オレゴン州アシュランド）を用いて分析した。
【００７９】
統計
非パラメトリックＫｒｕｓｋａｌ  Ｗａｌｌｉｓ検定を用いて、全培養液の絶対細胞数、ＮＫ細胞パーセンテージ及び細胞傷害性を比較した。生存曲線の統計的有意性（ｐ＜０．０５）を分析するために、ＭａｃＯＳＸのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６（グラフ・パッド・ソフトウェア、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてログランク検定を行った。
【００８０】
結果
パーフォリン及びグランザイムＢ含量
ＲＩＡＡ、Ｍ５又はＭ８で別々に処理したＮＫ細胞の３つのバッチのトランスフェクションの４時間後、我々は上記のようにフローサイトメトリーを用いてＮＫ細胞のグランザイムＢ及びパーフォリンロードを分析した。ＲＩＡＡで処理したＩＬ２刺激ＮＫ細胞では、ＩＬ２刺激Ｍ５及びＭ８コントロールと比較して、パーフォリン含量が１６００〜２０００倍増加し、グランザイムＢ含量が８００〜１１００倍増加した（図２）。Ｍ５は、未処理細胞よりもパーフォリン含量が１４１〜９２１倍増加し、Ｍ８は、未処理細胞よりもパーフォリン含量が１１０〜７８３倍増加していた。Ｍ５は、未処理細胞よりもグランザイムＢ含量が７０〜４６０倍増加し、Ｍ８は、未処理細胞よりもパーフォリン含量が５５〜３９１倍増加したことを示した。図２のデータを以下の表３及び表４に更に示す。
【００８１】
【表３】
2019510035.tif 000005
【００８２】
【表４】
2019510035.tif 000006
【００８３】
ＲＩＡＡ及びＭ８のいずれかを用いたＴＡＬＬ−１０４細胞株のトランスフェクションの２時間後、４時間後、及び６時間後に、このガンマ−デルタＴ細胞株のグランザイムＢ及びパーフォリンロードを上記と同じパネルを用いて評価した。我々は、同様の方法で、ＲＩＡＡで処置したアームでグランザイムＢ及びパーフォリン（図９）のアップレギュレーションを観察した。ＲＩＡＡで処置された細胞は、パーフォリンの２７０−１７２２からの増加を示した。Ｍ８は、未処理細胞よりもパーフォリン含量が１９０〜３８１倍の増加を示した。Ｍ８は、未処理細胞よりもパーフォリン含量が２２４−３６５倍の増加を示した。このデータも以下の表５及び表６に示す。
【００８４】
【表５】
2019510035.tif 000007
【００８５】
【表６】
2019510035.tif 000008
【００８６】
連続細胞傷害性分析
Ｋ５６２標的に対するＮＫ細胞の連続細胞傷害性能力を、上述したように実施した（非特許文献２）。ＲＩＡＡ運搬ナノ粒子と同様に、Ｍ５及びＭ８アゴニストをＩＬ−２によって活性化されたＮＫ細胞に一夜越しインキュベーションでトランスフェクトした。その後、細胞傷害性分析を行った。Ｍ５及びＭ８によってトランスフェクトされたＮＫ細胞は、連続死滅能力に有意差がなかった。しかし、ＲＩＡＡによってトランスフェクトされた細胞は、連続細胞傷害性活性の有意な増加を有した（図３及び４）。
【００８７】
インビボ腫瘍拒絶分析
５Ｔ３３ＭＭ腫瘍は、上記のように確立された。ＲＮＡ運搬ナノ粒子を腫瘍細胞注射後５日目に投与した。粒子は２時間毎に６回（１μｇ／ｇ；５００μｌのＰＢＳ）注射した。比較腫瘍生着は、ＲＩＡＡ粒子を投与したマウスはＭＭ生着が遅れていることを示した（図４）。更なる研究は、ＨＥＫ２９３由来ＥＶの皮下投与が同一実験モデルにおいて用量依存的に生存を遅延させることを示した（図９）。
【００８８】
議論
本研究では、我々はナチュラルキラー細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球等の細胞傷害性リンパ球におけるパーフォリン及びグランザイムＢ産生の最適誘導因子を同定することを目的とした。ＲＩＧ−Ｉ依存性誘導を誘導しようとする際に、我々は、以前に発表されたＲＩＧ−１アゴニスト（Ｍ５及びＭ８）を用いることにより、より良好なパーフォリン及びグランザイムＢ発現を導くＲＩＧ−Ｉ誘導の仮説を最初に試験した。以前に報告したようにＩ型インターフェロン分泌の増加を観察することもできるが、細胞傷害性顆粒のいずれかの有意な増加は観察されなかった。これに対応するために、以前に定義された構築物とははるかに短く構造的に異なる新しい構築物を試験した。トランスフェクション又はＥＶ媒介送達を用いてナチュラルキラー細胞及びＴ細胞にこの構築物を導入すると、パーフォリン及びグランザイムＢの発現が有意かつ迅速に増加した。我々が知る限り、これは、ＲＮＡ構築物の最初の報告であり、このような細胞傷害性リンパ球のプロテオームプロファイルの劇的な差異をもたらす。
【００８９】
その後、我々は、活性ＮＫ細胞が用量依存的にＭＭ拒絶に重要であることを示した以前に報告された同種免疫実験的多発性骨髄腫（ＭＭ）モデルに、このＲＮＡ構築物を投与した。この場合、ＮＫ細胞の養子移入はなく、最小限の残存疾患の確立直後に比較的短期間のＲＮＡ投与のみであった。構築物は、他の全ての試験処置と比較して、腫瘍発生の有意な遅延をもたらした。我々は、この現象が、細胞の連続細胞傷害能力の増加に起因する可能性があると考えている。オフターゲット効果や重篤な有害事象は観察されていない。しかし、我々は、ＲＮＡ分子のインビボ送達は次善で、最適な抗腫瘍活性の最良のプラットフォーム及び送達方法を解明するために更なる研究が必要である。
【００９０】
サイトゾルＲＮＡ認識受容体ＲＩＧ−１及びＭＤＡ−５の刺激及び活性化は、活性細胞の免疫応答を高めるために大変魅力的である。活性化は、免疫細胞のプライミング、増殖及び極性の重要な役割を果たす広範囲な抗ウイルスエフェクター、サイトカイン及びケモカインの合成を刺激する（非特許文献１）。５’ｐｐｐＲＮＡを用いたＲＩＧ−Ｉの活性化は、炎症誘発性及び抗ウイルス性遺伝子の強固な発現をもたらすことが以前に示されている（非特許文献３）。他のところで議論されているように、構築物の長さが抗ウイルス応答の強さに重大な効果を及ぼすようであり、構築物が５９ヌクレオチド〜９９ヌクレオチドの間であれば、抗ウイルス応答はより短い構築物に比べて高められた（非特許文献３）。また、Ｋ５６２の大幅に増加した連続死滅はインビボで示され（図２及び３）、腫瘍拒絶分析（図４）によってインビトロで確認することもできた。この大幅に増加した細胞傷害活性は、高められたパーフォリン及びグランザイムＢレベルの直接的効果である。
【００９１】
ＲＩＡＡのＲＮＡ配列及び二次構造は、以前に発表されたＲＩＧ−１アゴニストＭ５及びＭ８とは完全に異なる。ＲＩＡＡは他のＲＮＡ分子の両方よりも有意に短く、有意な配列相同性を持たない（図６）。Ｍ５は片側にヘアピンを有する線状分子であり、Ｍ８は１つのヘアピンを有する両側ｄｓＲＮＡ鎖である。対照的に、ＲＩＡＡ構造は、ヘアピン及びループ構造を有するものである（図５）。これらの構造的相違は、他の既知のＲＩＧ−ＩアゴニストよりもＲＩＡＡの活性が大きく増加した原因となっている。
【００９２】
要約すると、我々は、ＲＩＡＡ  ＲＮＡ構築物が、インビトロ及びインビボの両方でより高い連続選択的細胞傷害性能力をもたらす、増加されたパーフォリン及びグランザイムＢ発現を誘導することを実証した。この分子群の潜在的応用は、養子移入又は直接投与前に細胞の単純なエクスビボ処置であり得る。これらの構築物の安全性及び有効性プロフィールを理解するための更なる研究が必要である。
【実施例２】
【００９３】
（インビボの使用）
本発明のＲＮＡ構築物は、構築物を発現する細胞を移入／投与することによって又は小分子として患者に投与可能である。そのような細胞又は小分子は、患者に注射するか、従来の経路を介して投与することができるだろう。次いで、ＲＮＡ構築物を受ける細胞は、細胞の連続死滅能力を改善するために、グランザイムＢ及び／又はパーフォリンの産生及び貯蔵を増加させるであろう。
【００９４】
本発明のＲＮＡ構築物は、当該技術分野で既知の技術を用いて、注射、経口、経鼻又は粘膜送達によって投与することができる。潜在的治療用途には、癌、肝臓遺伝子治療、単一遺伝子障害、記憶障害及び腫瘍再標的化遺伝子が含まれる。
【００９５】
本発明で治療可能な癌は、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、及び芽細胞腫、即ち、急性リンパ芽球性白血病（全て）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、エイズ関連癌、肛門癌、星細胞腫、基底細胞癌、肝外胆管癌（胆管癌）、膀胱癌、骨腫瘍、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳癌、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫、乳癌、気管支腺腫/カルチノイド、バーキットリンパ腫、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、軟骨肉腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚ｔ−細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭蓋外、性腺外又は卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹のグリオーマ、小児大脳星細胞腫神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、急性リンパ芽球性白血病（急性リンパ性白血病とも呼ばれる）、急性骨髄芽球性白血病（急性骨髄性白血病）、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病（慢性骨髄性白血病とも呼ばれる）、ヘアリーセル白血病、口唇及び口腔癌、脂肪肉腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、マクログロブリン血症、ワルデンストローム、男性の乳癌、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽細胞腫、メラノーマ、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮頸部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄性白血病、多発性骨髄腫（骨髄癌）、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、乏突起膠腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、上皮性卵巣癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体芽細胞腫、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、腎盂尿管移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、メラノーマ及び非メラノーマ皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明扁平上皮頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫及びセザリー症候群）、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂移行上皮癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視経路グリオーマ及び視床下部神経膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍（腎臓癌）を含む。
【００９６】
本発明は、２１−ヒドロキシラーゼ欠損症、軟骨無形成症、急性間欠性ポルフィリン症、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アラジール症候群、アレクサンダー病、アルストレーム症候群、遺伝性エナメル質形成不全症、ビオチニダーゼ欠損症、ＣＧＤ慢性肉芽腫性疾患、ディジョージ症候群、ファンコニ貧血、Ｇ６ＰＤ欠損、リポ蛋白リパーゼ欠損症、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型、シデリアスＸ連鎖性精神遅滞症候群（ＰＨＦ８遺伝子の変異によって引き起こされる）、X連鎖重症複合免疫不全（Ｘ−ＳＣＩＤ）、X連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）等の遺伝性疾患の治療にも有効である。
【００９７】
本発明で治療可能な代謝性疾患は、ニーマン・ピック病、テイ・サックス病、ゴーシェ病、ファブリー病を含む。
【実施例３】
【００９８】
（慢性ウイルス感染を含むウイルス感染設定での使用）
ＲＩＧ−Ｉアゴニストがトランスフェクトされた本発明の細胞の強化された死滅能力は、高いウイルスロードを有する感染細胞を除去する強化された能力をそれに与えるだろう。このように、本発明は、これらの感染細胞の他の細胞を感染又はそれらの含有を放出する能力を排除するウイルスリザーバの除去を可能にする。本発明のＲＮＡ構築物は、構築物を発現する細胞を移入／投与することによって、又は小分子として患者に投与することができる。そのような細胞又は小分子は、患者に注射又は従来の経路を介して投与することができた。ＲＮＡ構築物を受ける細胞は、細胞の連続死滅能力を改善するために、グランザイムＢ及び／又はパーフォリンの産生及び貯蔵を増加させるであろう。
【実施例４】
【００９９】
（幹細胞でのＲＩＡＡの使用）
本発明のＲＮＡ構築物は、幹細胞の寿命を延ばすために使用可能である。ＲＩＧ−Ｉは、幹細胞におけるＤＮＡ修復機構を媒介することが知られている。本発明の投与は、ＲＩＧ−Ｉ活性を強化すること、そのため本発明で処理された幹細胞の生存性を延長することが期待される。
【０１００】
進行中の実験では、整形外科手術を受けている１０人の健康なヒトドナーからｃｄ９０骨髄サンプルを得た。各試料をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で希釈し、７０μｍ細胞フィルターを通した。
【０１０１】
単細胞懸濁液を、予め滴定された抗体混合物ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１４（全てＢＤバイオサイエンシーズ）でインキュベートし、室温で２０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を２０×１０６／ｍｌの濃度でＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞を、４０５、４８８、５６１及び６３３レーザーを備えたＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤバイオサイエンシーズ）で選別した。細胞を回収し、ＤＭＥＭ２０％ＦＣＳでコンフルエンスまで成長させた。
【０１０２】
ＲＩＡＡは、フラスコにそれらを播種した後で、ＭＳＣＳに播種してから２４時間トランスフェクトした。それらは、定義されるように２９３システムのエクソソームによって産生された。
【０１０３】
インビボ創傷モデルにおける間葉系幹細胞（「ＭＳＣ」）の治癒能力を評価する。継代８で、ＲＩＡＡ処理が有る場合と無い場合の選択されたＭＳＣ株をポリビニルアルコールスポンジにロードし、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスに移入される（Ｄｅｓｋｉｎｓ  ＤＬ、Ａｒｄｅｓｔａｎｉ  Ｓ、Ｙｏｕｎｇ  ＰＰ、ポリビニルアルコールスポンジモデル移入。Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１２；（６２）：３８８５．）。簡単に言えば、スポンジは食塩水で水和、滅菌される。ＭＳＣ細胞株あたり３つのスポンジには、２５μｌのリン酸緩衝生理食塩水に７．５×１０６の細胞がロードされる。各マウスは３つのスポンジにはめ込まれ、各スポンジは異なるＭＳＣ株を含む。全てのスポンジは移植の２１日後に除去され、半分に切断されてから、１０％緩衝ホルマリンで２４時間保存される。ホルマリン浸漬後、スポンジは、パラフィンに切り口を下にして埋め込まれ、染色のために切片にされる。
【０１０４】
図７及び図８を参照すると、ＲＩＡＡで処置されたＭＳＣ株はコントロールよりも有意に大きな成長を示すと考えられる。これらの細胞におけるＣＤ９０のアップレギュレーションは、腫瘍抑制においてＲＩＡＡで処理された細胞の直接又は代理的役割を示唆している（非特許文献１）。Ａｂｅｙｓｉｎｇｈｅ  ＨＲ、Ｃａｏ  Ｑ、Ｘｕ  Ｊ、Ｐｏｌｌｏｃｋ  Ｓ、Ｖｅｙｂｅｒｍａｎ  Ｙ、Ｇｕｃｋｅｒｔ  Ｌ、Ｋｅｎｇ  Ｐ、Ｗａｎｇ  Ｎ（２００３）。「ＴＨＹ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ」。Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．１４３（２）：１２５−３２．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１６５−４６０８（０２）００８５５−５。ＰＭＩＤ１２７８１４４６。また重要なのは、ＣＤ９０が細胞の接着、溢出及びホーミングの増加に明らかに関係しているため、ＲＩＡＡ刺激によるＭＳＣ及びＨＳＣの生着及び接着の増加の可能性である。Ｒｅｇｅ  ＴＡ、Ｈａｇｏｏｄ  ＪＳ（２００６）、「Ｔｈｙ−１  ａｓ  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｍａｔｒｉｘ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｘｏｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，  ａｄｈｅｓｉｏｎ，  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，  ｃａｎｃｅｒ，  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ」、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０（８）：１０４５−５４、ｄｏｉ：１０．１０９６／ｆｊ．０５−５４６０ｒｅｖ。ＰＭＩＤ１６７７０００３。Ｗｅｔｚｅｌ  Ａ、Ｃｈａｖａｋｉｓ  Ｔ、Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ  ＫＴ、Ｓｔｉｃｈｅｒｌｉｎｇ  Ｍ、Ｈａｕｓｔｅｉｎ  ＵＦ、Ａｎｄｅｒｅｇｇ  Ｕ、Ｓａａｌｂａｃｈ  Ａ（２００４）。「Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙ−１  （ＣＤ９０）  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ａ  ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｍａｃ−１  （ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）」（要約の頁）。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７２（６）：３８５０−９。ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１７２．６．３８５０。ＰＭＩＤ１５００４１９２。
【実施例５】
【０１０５】
（養子細胞移入）
最も好ましい使用では、患者への養子細胞移入前に細胞を処置するためにＲＩＧ−Ｉアゴニストが使用される。上記プロトコルを使用して、ＲＩＡＡは、エクスビボ操作中に任意の時点で使用することができる。培養範囲におけるＲＩＧ−Ｉアゴニストの好ましい濃度は、約０．４ｍＭから約１０ｍＭである。最も好ましくは、０．５ｍＭから６ｍＭである。これらの細胞は、それにより、当該技術分野で周知のプロトコルを使用して、後の注入時間点で直ちに注入又は凍結することができる。ＲＩＧ−Ｉアゴニスト投与は、インビボ及びエクスビボの両方で、単回用量として、又はインヒビターの血清濃度が０．４〜６μＭの間、好ましくはより低い用量であり得る用量ウィンドウを繰り返し使用して行うことができる。上記実施例３に記載の条件を治療するために、そのような養子細胞移入を使用することができる。
【実施例６】
【０１０６】
（ウイルス性炎症の治療）
本発明は、筋炎、心筋炎、ウイルス性関節炎、ウイルス性脳炎及び髄膜炎等のウイルス感染によって引き起こされる炎症を患っている患者を治療するために使用することもできる。このような疾患において、免疫系によるウイルスの認識を低減又は停止し、それによって炎症を軽減、予防又は排除するために、ＲＩＧ−Ｉアゴニストを抗ウイルス療法と同時投与することができる。これは、免疫応答に依存しない又は完全に利用しない抗ウイルス療法と共に使用可能である。そのような抗ウイルス剤は、アマンダチン及びリマンチジン等のアダマンタン抗ウイルス剤、リトナビル及びコビシスタット等の抗ウイルスブースター、マラビロク等のケモカイン受容体アンタゴニスト、マラビロク、ドルテグラビル及びエルビテグラビル等のインテグラーゼ鎖転移阻害剤、ソホスブビル、エンフビルチド、ホスカルネット、ホミビルセン等のその他の抗ウイルス剤、ペルミビル、オセルタミビル及びザナミビル等のノイラミニダーゼ阻害剤、ネビラピン、デラビルジン、エトラビリン及びリルピビリン等の非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ダクラタビル等のＮＳ５ａ阻害剤、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン及びエンテカビル等のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＲＴＩＳ）、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホサンプレナビル、チプラナビル及びダルナビル等のプロテアーゼ阻害剤、リバビリンバラシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル及びシドフォビル等のプリンヌクレオシドを含む。これらの薬物の単独又は組み合わせの用量指示は、当該技術分野において周知である。
【実施例７】
【０１０７】
（ＲＮＡウィルス療法のインビボ有効性の増加）
ＲＩＧ−Ｉアゴニストは、インビボ投与されると、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、セネカウイルス、ＥＣＨＯウイルス、例えば、膀胱癌、脳腫瘍、婦人科腫瘍、肝細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、前立腺癌、軟部組織肉腫及び固形腫瘍のような適応症のためのＲＩＧＶＩＲ等のＲＮＡウイルスベースの腫瘍溶解性ウイルス療法のインビボ有効性を増加させるのにも有用である。ＲＩＧ−Ｉアゴニストは、細胞内抗ウイルス防御メカニズムを阻害し、腫瘍内の腫瘍溶解性ウイルスの分布有効性を高めるのに役立つであろう。ＲＩＧ−Ｉアゴニストのインビボ投与のための標的血清レベルは、０．２乃至６ｍＭである。
【０１０８】
このように、本発明の好ましい実施形態であると現在考えられていることが記載されているが、当業者であれば、本発明の精神から逸脱することなく、他のそして更なる実施形態が可能であり、本明細書に記載された特許請求の範囲の真の範囲内にあるそのような更なる改変及び変更の全てを含む。
【図１】
2019510035.tif 000009
【図２】
2019510035.tif 000010
【図３】
2019510035.tif 000011
【図４】
2019510035.tif 000012
【図５】
2019510035.tif 000013
【図６】
2019510035.tif 000014
【図７】
2019510035.tif 000015
【図８】
2019510035.tif 000016
【図９】
2019510035.tif 000017
【配列表】
2019510035000001.app
【国際調査報告】
2019510035.tif 000018
2019510035.tif 000019
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