(57)【要約】  Ｌ−グルホシネート（ホスフィノトリシンまたは（Ｓ）−２−アミノ−４−（ヒドロキシ（メチル）ホスホノイル）ブタン酸としても公知である）の生産方法が提供される。その方法は、２工程のプロセスを含む。第１の工程は、Ｄ−グルホシネートの、ＰＰＯ（２−オキソ−４−（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）への酸化的脱アミノ化を含む。第２の工程は、１つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用した、ＰＰＯの、Ｌ−グルホシネートへの特異的アミノ化を含む。これらの２つの反応を組み合わせることによって、Ｌ−グルホシネートおよびＤ−グルホシネートの混合物中のＬ−グルホシネートの比率を実質的に増加させることができる。
2019509734.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルホシネートを作製する方法であって、
Ｄ−グルホシネートを、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素と反応させて、ＰＰＯ（２−オキソ−４−（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）を形成する工程と、
１つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用して、トランスアミナーゼ（ＴＡ）酵素によって、ＰＰＯをＬ−グルホシネートにアミノ化する工程と
を含み、Ｄ−グルホシネートの少なくとも７０％が、Ｌ−グルホシネートに変換される方法。
【請求項２】
アミン供与体が、グルタメート、Ｌ−グルタメート、アラニン、ｓｅｃ−ブチルアミン、フェニルエチルアミン、グリシン、リジン、バリン、セリン、グルタミン、イソプロピルアミン、エタノールアミン、２−アミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸または任意の第二級アミンもしくはアミノ酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｄ−グルホシネートが、ＤおよびＬ−グルホシネートまたはそれらの塩のラセミ混合物中に元々存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＡＡＯ酵素が、Rhodosporidium toruloides（UniProt P80324）、Trigonopsis variabilis（UniProt Q99042）、Neolentinus lepideus（KZT28066.1）、Trichoderma reesei（XP_006968548.1）、またはTrichosporon oleaginosus（KLT40252.1）由来の酵素から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＤＡＡＯ酵素が、変異型ＤＡＡＯである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
変異型ＤＡＡＯが、Rhodosporidium toruloides由来の配列に基づく変異型ＤＡＡＯである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
変異型ＤＡＡＯが、５４位、５６位、５８位、２１３位、および２３８位で１つまたは複数の変異を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
５４位での変異が、Ｎ５４Ｃ、Ｎ５４Ｌ、Ｎ５４Ｔ、およびＮ５４Ｖからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
５６位での変異が、Ｔ５６Ｍである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
５８位での変異が、Ｆ５８Ａ、Ｆ５８Ｇ、Ｆ５８Ｈ、Ｆ５８Ｋ、Ｆ５８Ｎ、Ｆ５８Ｑ、Ｆ５８Ｒ、Ｆ５８Ｓ、およびＦ５８Ｔからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
２１３位での変異が、Ｍ２１３Ｓである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
変異型ＤＡＡＯが、変異Ｆ５８ＫおよびＭ２１３Ｓを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
変異型ＤＡＡＯが、５４位および５６位での変異を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
変異型ＤＡＡＯが、変異Ｎ５４ＴおよびＴ５６Ｍを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
変異型ＤＡＡＯが、変異Ｆ５８ＱまたはＦ５８Ｈを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
変異型ＤＡＡＯが、変異Ｎ５４ＶおよびＦ５８Ｑを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
変異型ＤＡＡＯが、変異Ｎ５４Ｖ、Ｆ５８Ｑ、およびＭ２１３Ｓを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
ＴＡ酵素が、Escherichia coli（UniProt P22256）由来のgabTトランスアミナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ＴＡ酵素が、配列番号１によってコードされる酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
反応させる工程およびアミノ化する工程が、単一容器中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
全ての試薬が、反応の開始時に実質的に添加される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
反応させる工程用の試薬およびアミノ化する工程用の試薬が、異なる時期に単一容器に添加される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
反応させる工程およびアミノ化する工程が、別々の容器中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｄ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＬ−グルホシネートを含む組成物。
【請求項２５】
Ｌ−グルホシネートの量が、Ｄ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＬ−グルホシネートの総量に基づいて、９０％以上である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組成物を有する固体が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
除草活性を有する配合物における使用のためのＬ−グルホシネートの溶液が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
配合物の１０〜３０重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、
配合物の１０〜４０重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の０．５〜２重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の４〜１８重量％の量のジプロピレングリコール、および配合物の４〜２０重量％の量のアルキルポリサッカライドからなる群から選択される１つまたは複数のさらなる構成成分、ならびに
配合物の残余としての水
を含む配合物。
【請求項２９】
配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、
配合物の３１．６重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、
配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、
配合物の８．６重量％の量のジプロピレングリコール、
配合物の９．８重量％の量のアルキルポリサッカライド、および
配合物の３６．７５重量％の量の水
を含む、請求項２８に記載の配合物。
【請求項３０】
配合物の２４．５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、
配合物の３１．６重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、
配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、
配合物の８．６重量％の量のジプロピレングリコール、
配合物の９．８重量％の量のアルキルポリサッカライド、および
配合物の２４．５重量％の量の水
を含む、請求項２８に記載の配合物。
【請求項３１】
配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、
配合物の１５．８重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、
配合物の０．５重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、
配合物の４．３重量％の量のジプロピレングリコール、
配合物の４．９重量％の量のアルキルポリサッカライド、および
配合物の６２．２５重量％の量の水
を含む、請求項２８に記載の配合物。
【請求項３２】
配合物の１０〜３０重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、
配合物の１０〜４０重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の０．５〜２重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、および配合物の３〜１０重量％の量のアルキルポリサッカライドからなる群から選択される１つまたは複数のさらなる構成成分、ならびに
配合物の残余としての水
を含む配合物。
【請求項３３】
配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、
配合物の２２．１重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、
配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、
配合物の６．２重量％の量のアルキルポリサッカライド、および
配合物の５８．４５重量％の量の水
を含む、請求項３２に記載の配合物。
【請求項３４】
配合物の２４．５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、
配合物の２２．１重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、
配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、
配合物の６．２重量％の量のアルキルポリサッカライド、および
配合物の４６．２重量％の量の水
を含む、請求項３２に記載の配合物。
【請求項３５】
配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、
配合物の１１．０５重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、
配合物の０．５重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、
配合物の３．１重量％の量のアルキルポリサッカライド、および
配合物の７３．１重量％の量の水
を含む、請求項３２に記載の配合物。
【請求項３６】
区域において雑草を選択的に防除する方法であって、
Ｄ−グルホシネートに対して９０％を超える鏡像体過剰率でのＬ−グルホシネートを含む有効量の組成物を区域に施用する工程
を含む方法。
【請求項３７】
１ヘクタール当たりＬ−グルホシネートおよびＤ−グルホシネートの合計４００グラム未満の組成物の量が施用される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
区域において雑草を選択的に防除する方法であって、
Ｄ−グルホシネートに対して９０％を超える鏡像体過剰率でのＬ−グルホシネートおよび０．０１％を上回るが、１０％未満であるＰＰＯを含む有効量の組成物を区域に施用する工程
を含む方法。
【請求項３９】
１ヘクタール当たりＬ−グルホシネート、Ｄ−グルホシネートおよびＰＰＯの合計４００グラム未満の組成物の量が施用される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
グルホシネートに対して耐性である植栽種子の１つまたは複数の作物を含有する区域において雑草を選択的に防除する方法であって、
Ｄ−グルホシネートに対して９０％を超える鏡像体過剰率でのＬ−グルホシネートおよび０．０１％を上回るが、１０％未満であるＰＰＯを含む有効量の組成物を圃場に施用する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先出願に対するクロスリファレンス
本出願は、2016年3月2日に出願された米国仮出願第62/302,421号、2016年5月16日に出願された米国仮出願第62/336,989号、および2016年10月26日に出願された米国仮出願第62/413,240号に対する優先権を主張するものであり、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
グルホシネートの単一立体異性体を生産する方法、特にＬ−グルホシネートを生産する方法が本明細書中に記載される。
【背景技術】
【０００３】
除草剤グルホシネートは、毒物学的または環境的観点から最も安全な除草剤の1つであると考えられている、非選択的に葉面に（foliarly）施用する除草剤である。グルホシネートに関する現在の商業的な化学合成方法は、ＬおよびＤ−グルホシネートのラセミ混合物を生じる（Duke et al. 2010 Toxins 2:1943-1962）。しかしながら、Ｌ−グルホシネート（ホスフィノトリシンまたは（Ｓ）−２−アミノ−４−（ヒドロキシ（メチル）ホスホノイル）ブタン酸としても公知である）は、Ｄ−グルホシネートよりもはるかに強力である（Ruhland et al. (2002) Environ. Biosafety Res. 1:29-37）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、活性Ｌ−グルホシネート形態のみ、または、主に活性Ｌ−グルホシネート形態が生産されるような方法が必要とされている。これまで、純粋なＬ−グルホシネート、または、Ｌ−グルホシネートに富んだＤおよびＬ−グルホシネートの混合物を生成する、費用対効果の高い方法は利用できなかった。本明細書では、Ｌ−グルホシネートの生産に関する新たな費用対効果の高い方法を記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
Ｌ−グルホシネートを作製するための組成物および方法が提供される。プロセスの第１の工程は、ＰＰＯ（２−オキソ−４−（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）へのＤ−グルホシネートの酸化的脱アミノ化を含む。第２の工程は、１つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用した、Ｌ−グルホシネートへのＰＰＯの特異的アミノ化を含む。いくつかの実施形態では、その方法は、Ｄ−グルホシネートを、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素と反応させて、ＰＰＯ（２−オキソ−４−（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）を形成し、続いて、１つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用して、トランスアミナーゼ（ＴＡ）酵素によって、ＰＰＯをＬ−グルホシネートにアミノ化し、これによりＤ−グルホシネートの少なくとも７０％が排除され、および／または、Ｌ−グルホシネートの収率がインプットラセミグルホシネートの少なくとも８５％であるか、またはＤ−グルホシネートの少なくとも７０〜８５％がＬ−グルホシネートに変換される工程を含む。いくつかの実施形態では、１つの反応で未反応であったアミン供与体は、さらなる段階の反応で再利用することができる。任意で、Ｄ−グルホシネートは、ＤおよびＬ−グルホシネートのラセミ混合物中に元々（つまり反応の段階から）存在している。
【０００６】
ＤＡＡＯ酵素は、反応を促進するために、活性を約３μｍｏｌ／分＊ｍｇまたはそれを超える増加された活性を有さなくてはならない。ＤＡＡＯ酵素は、当該技術分野で利用可能であり、プロセスを促進するのに必要な必須増加活性を有するように修飾されたり、変異を有することができる。このように、Rhodosporidium toruloides（UniProt P80324）、Trigonopsis variabilis（UniProt Q99042）、Neolentinus lepideus（GenBank KZT28066.1）、Trichoderma reesei（GenBank XP_006968548.1）、またはTrichosporon oleaginosus（KLT40252.1）由来の変異体、または修飾を有する酵素を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＤＡＡＯ酵素は、Rhodosporidium toruloides由来の配列に基づく変異型ＤＡＡＯである。数多くの変異体が作製され、活性上の効果に対する試験をすることができる一方で、いくつかの実施形態では、変異型ＤＡＡＯは、５４位、５６位、５８位、２１３位、および／または２３８位の変異を含んでもよい。例えば、変異型ＤＡＡＯは、５４位にある以下の変異：Ｎ５４Ｃ、Ｎ５４Ｌ、Ｎ５４Ｔ、またはＮ５４Ｖの１つまたは複数を含むことができる。変異型ＤＡＡＯは、任意で、５６位にある以下の変異：Ｔ５６Ｍを含むことができる。任意で、変異型ＤＡＡＯは、５８位にある以下の変異：Ｆ５８Ａ、Ｆ５８Ｇ、Ｆ５８Ｈ、Ｆ５８Ｋ、Ｆ５８Ｎ、Ｆ５８Ｑ、Ｆ５８Ｒ、Ｆ５８Ｓ、またはＦ５８Ｔの１つまたは複数を含むことができる。任意で、変異型ＤＡＡＯは、２１３位にある以下の変異：Ｍ２１３Ｓを含むことができる。いくつかの実施形態では、変異型ＤＡＡＯは、以下の変異の組合せ：Ｆ５８ＫとＭ２１３Ｓ、Ｎ５４ＴとＴ５６Ｍ、Ｎ５４ＶとＦ５８Ｑおよび／またはＮ５４Ｖ、Ｆ５８Ｑ、Ｍ２１３Ｓの１つまたは複数を含むことができる。それぞれの場合において、酵素は、約３μｍｏｌ／分＊ｍｇに等しいか、もしくはそれを超える、約４μｍｏｌ／分＊ｍｇを超える、またはそれよりも高い活性を有する必要がある。野生型酵素は、酵素が上記のような活性レベルを有する限りは、本発明の方法において使用することができる。
【０００７】
ＴＡ酵素は、Escherichia coli（UniProt P22256）由来のgabTトランスアミナーゼであってもよい。あるいは、ＴＡ酵素は、配列番号１として同定される配列を有するトランスアミナーゼであってもよい。ＴＡ酵素はまた、配列番号１に対する配列類似性に基づいて選択されてよく、および／または所望の反応においてその活性を改善するように変異されてもよい。したがって、アラインメントのＢＬＡＳＴＰ法に基づいて、配列番号１に対して８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える配列同一性を有し、かつ、トランスアミナーゼ活性を保持する配列は、本発明によって包含される。配列番号1の酵素配列をコードする任意のＤＮＡ配列、またはその変異体も同様に、本発明に包含される。
【０００８】
反応工程およびアミノ化工程は、単一容器中、または、別々の容器中で実施することができる。一実施形態では、全ての試薬が、反応の開始時に実質的に添加される。あるいは、反応工程用の試薬およびアミノ化工程用の試薬は、単一容器で、異なるタイミングに添加される。
【０００９】
また、本明細書では、グルホシネートに対して任意で耐性であり得る植栽種子の１つまたは複数の作物を含有する圃場において、雑草を選択的に防除する方法であって、Ｄ−グルホシネートに対して９０％を超える鏡像体過剰率でのＬ−グルホシネートを含む有効量の組成物を圃場に施用する工程を含む方法が、本明細書中に記載される。また、本明細書では、圃場において雑草を選択的に防除し、圃場ではない区域において雑草を防除し、植物または作物を落葉させ、および／または収穫前に作物を乾燥させる方法であって、Ｄ−グルホシネートに対して９０％を超える鏡像体過剰率でのＬ−グルホシネート、および０．０１％を上回るが、１５％未満であるＰＰＯを含む有効量の組成物を圃場に施用する工程を含む方法が、本明細書中に記載される。
【００１０】
１つまたは複数の実施形態の詳細は、図面および以下の説明に記載される。他の特徴、目的および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【００１１】
本発明のいくつかの組成物は、Ｄ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＬ−グルホシネートを含む。かかる組成物において、Ｌ−グルホシネートは、Ｄ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＬ−グルホシネートの総重量に基づき、組成物の８０重量％に等しいか、それを超える、９０重量％を超える、９５重量％を超える、９６重量％を超える、９７重量％を超える、９８重量％を超える、または９９重量％を超える濃度で存在する。他の組成物は、本反応混合物からのＬ−グルホシネートの単離後に８０％に等しいか、またはそれを超える濃度でＬ−グルホシネートを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｄ−グルホシネートの、Ｌ−グルホシネートへの典型的な変換の模式図である。アミン供与体およびケト酸生成物は例であり、限定することを意図するものではない。
【００１３】
【図２】Rhodosporidium toruloides ＤＡＡＯのＮ５４Ｔ、Ｔ５６Ｍ、Ｆ５８Ｋ、およびＭ２１３Ｓの変異体およびE. coli gabTトランスアミナーゼによる１工程での脱ラセミ化中のＬ−グルホシネート（丸）、Ｄ−グルホシネート（三角）、およびＰＰＯ（四角）の濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
Ｌ−グルホシネート（ホスフィノトリシンまたは（Ｓ）−２−アミノ−４−（ヒドロキシ（メチル）ホスホノイル）ブタン酸としても公知である）の生産に関する組成物および方法が提供される。その方法は、２工程のプロセスを含み、そのプロセスは、任意で単一の器中でほぼ同時に行ってもよい。第１の工程は、Ｄ−グルホシネートの、ＰＰＯ（２−オキソ−４−（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）への酸化的脱アミノ化に関する。第２の工程は、１つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用した、ＰＰＯの、Ｌ−グルホシネートへの特異的アミノ化に関する。これら２つの反応を組み合わせることによって、Ｌ−グルホシネートの比率を、ラセミグルホシネート混合物において実質的に増加させることができる。したがって、本明細書では、実質的にはＬ−グルホシネートで構成される組成物を得る方法を提供する。Ｌ−グルホシネートは、Ｄ−グルホシネートよりも強力であるため、除草剤として効果を示すのに必要とされる組成物の量は、より少量になる。
【００１５】
本明細書中の一実施形態では、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの混合物を含む組成物が記載されており、ここで、Ｌ−グルホシネートは、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの混合物を含む組成物の中で、優勢な化合物である。かかる組成物は、ＰＰＯが、除草活性に寄与することができる（EP0030424）ため、除草剤として直接使用することができる。他の実施形態では、Ｌ−グルホシネートは、精製されるか、または実質的に精製され、除草剤として使用することができる。
【００１６】
Ｌ−グルホシネートの組成物は、Ｄ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＬ−グルホシネートを含んでもよい。任意で、Ｌ−グルホシネートの量は、Ｄ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＬ−グルホシネートの総重量に基づいて、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または約９５％以上、９７％以上、９８％以上である。任意で、Ｄ−グルホシネートの量は、Ｄ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＬ−グルホシネートの総重量に基づいて、１０％以下、５％以下、２．５％以下、または１％以下である。任意で、ＰＰＯの量は、Ｄ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＬ−グルホシネートの重量に基づいて、１％を上回るが、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満である。これらの組成物を、任意に、乾燥粉末として存在させるか、または水性もしくは非水性担体中に溶解させることができ、任意でさらなる化学種を追加して存在させることができる。任意に、組成物は、ｅｘ  ｖｉｖｏ環境下で調製および使用される。
【００１７】
また、Ｌ−グルホシネートは、さらに単離され、除草剤として配合物中で使用できることも理解される。
【００１８】
また、配合物も本明細書中に記載される。配合物は、配合物の１０〜３０重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の１０〜４０重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の０．５〜２重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の４〜１８重量％の量のジプロピレングリコール、および配合物の４〜２０重量％の量のアルキルポリサッカライドからなる群から選択される１つまたは複数のさらなる構成成分、ならびに配合物の残余としての水を含む。任意で、配合物は、配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の３１．６重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の８．６重量％の量のジプロピレングリコール、配合物の９．８重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の３６．７５重量％の量の水を含む。任意で、配合物は、配合物の２４．５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の３１．６重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の８．６重量％の量のジプロピレングリコール、配合物の９．８重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の２４．５重量％の量の水を含む。任意で、配合物は、配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の１５．８重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の０．５重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の４．３重量％の量のジプロピレングリコール、配合物の４．９重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の６２．２５重量％の量の水を含む。任意で、配合物は、配合物の２４．５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の２２．１重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム塩、配合物の１．０重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の６．２重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の４６．２重量％の量の水を含む。
【００１９】
その方法は、実質的に精製されたＬ−グルホシネートをバッチ反応で生産するのに使用することができる一方で、連続プロセスを使用することができることが理解される。
【００２０】
I.合成方法
Ｄ−グルホシネートの、Ｌ−グルホシネートへの変換方法が提供される。本明細書中に記載する方法は、低コストのＤおよびＬ−グルホシネートのラセミ混合物の原料を、Ｌ−グルホシネートに富んだより価値のある生成物に変換する手段を提供する。変換方法は、２工程を含み、それらは、１つまたは複数の別々の容器で行うことができる。第１工程は、Ｄ−グルホシネート（ＤおよびＬ−グルホシネートのラセミ混合物中に存在し得る）の、ＰＰＯ（２−オキソ−４−（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）への酸化的脱アミノ化である。この工程は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＤＡＡＤ）酵素、または化学変換によって、触媒反応を進めることができる。第２の工程は、１つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用した、ＰＰＯの、Ｌ−グルホシネートへの特異的アミノ化である。かかるアミン供与体は、グルタメート、Ｌ−グルタメート、リジン、アラニン、イソプロピルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、フェニルエチルアミン等から選択することができる。この工程は、トランスアミナーゼ（ＴＡ）酵素、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素、または化学変換によって、触媒反応を進めることができる。本明細書中に記載する方法を使用して、実質的に精製されたＬ−グルホシネートの組成物を得ることができる。
【００２１】
図１に、Ｄ−グルホシネートをＬ−グルホシネートへ変換する例を記載している。上述するように、その方法は、２工程のプロセスを含む。図のように、第１工程は、Ｄ−グルホシネートの、ＰＰＯへの酸化的脱アミノ化であり、第２工程は、ＰＰＯの、Ｌ−グルホシネートへのアミノ化である。
【００２２】
第１工程、すなわち、Ｄ−グルホシネートの、ＰＰＯへの酸化的脱アミノ化は、いくつかの種類の酵素が触媒することができるか、または、酵素によらずに行うことができる。かかる酵素には、ＤＡＡＯ、ＤＡＡＤ、およびＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００２３】
一実施形態では、ＤＡＡＯ酵素は、Ｄ−グルホシネートの、ＰＰＯへの変換の触媒に使用される。かかる反応は、下記化学量論を有する：
Ｄ−グルホシネート＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ  ⇒  Ｈ２Ｏ２＋ＮＨ３＋ＰＰＯ。
【００２４】
一般的に、水性反応緩衝液中の酸素の溶解度はグルホシネートの溶解度と比較して低いため、プロセスを効率的に進めるためには、ＤＡＡＯ反応の期間全体にわたって、酸素を導入しなくてはならない。これは、例えば、米国特許第7,723,576号、同第7,939,709号、同第8,642,836号、および同第8,946,507号に記載される、反応を密封器中で行ったＨａｗｋｅｓ反応とは対照的である。まず、Ｄ−グルホシネートは、３０ｇ／Ｌを超え、最大で１４０ｇ／Ｌ程度まで存在する。初期酸素レベルは、一般的に、反応温度によって影響されるが、通常、最初は、およそ８ｍｇ／Ｌで存在し、速やかな反応を続けるのに十分な酸素を供給するために、反応全体にわたって添加される。水は通常、５００ｇ／Ｌを超えて存在するが、必須ではない。
【００２５】
いくつかのＤＡＡＯ酵素は、当該技術分野で公知であり、それらが、Ｄ−グルホシネートを基質として受容でき、反応を進めるのに十分なレベルの活性を提供する限りは、本明細書中に記載する方法で使用することができる。本発明の方法において有用なＤＡＡＯ酵素は、約３μｍｏｌ／分＊ｍｇに等しいか、もしくはそれを超えるか、約４μｍｏｌ／分＊ｍｇを超えるか、またはそれよりも高い活性を有する。野生型酵素は、酵素が上記のような活性レベルを有する限りは、本発明の方法で使用することができる。その方法で使用することができるかかるＤＡＡＯ酵素は、活性を増加するように修飾された、Rhodosporidium toruloides、Trigonopsis variabilis、Fusarium sp、Candida sp、Schizosasaccharomyces sp、Verticillium sp、Neolentinus lepideus、Trichoderma reesei、Trichosporon oleaginosus等由来のものが挙げられる。Swissprotの受託番号P80324、Q99042、P00371、およびP24552またはSPTREMBL番号Q9HGY3およびQ9Y7N4またはGenBank番号KZT28066.1、XP_006968548.1、およびKLT40252.1に対応する配列を有するものを含む任意のＤＡＡＯ酵素は、出発酵素として使用することができる。ＤＡＡＯをコードするＤＮＡ配列は、EMBLの受託A56901、RGU60066、Z50019、SSDA04、D00809、AB042032、RCDAAOX、A81420、およびSPCC1450に記載される配列から選択されてもよく、または選択される発現宿主（複数可）における発現を最適化するために、上記で示したタンパク質配列からコドンを最適化してもよい。米国特許第8,227,228号には、Candida intermedia由来のＤＡＡＯ酵素について記載されている。かかる配列は、参照により本明細書に組み入れられる。これらの酵素は、活性の増加のために修飾され、本発明の方法において使用することができる。
【００２６】
さらなるＤＡＡＯ酵素は、配列類似性および機能性スクリーニングを含む様々な方法において同定することができる。ＤＡＡＯ酵素は、基質としてＤ−グルホシネートを受容できる変異型ＤＡＡＯ酵素でもあってもよい。上記のＨａｗｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．では、Rhodosporidium toruloides由来の配列に基づく変異型ＤＡＡＯ（Ｆ５８ＫおよびＭ２１３Ｓの変異で構成される）は、基質としてＤ−グルホシネートを受容することが示されている（Hawkes et al. (2011) Plant Biotechnol J. 9(3):301-14）。同様に、他のＤＡＡＯ酵素は、Ｄ−グルホシネートを受容して、より大きな活性、すなわち、本発明の方法を進めるのに必要とされる活性を有するように修飾されることができる。同様に、公知のＤＡＡＯ酵素は、変異誘発によって改良されてもよく、および／または新規ＤＡＡＯ酵素を同定することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載する方法で変異型酵素を作製および試験することができる。変異型ＤＡＡＯ酵素（例えば、Rhodotorula gracilis由来）は、野生型配列と比較したときに、変異型配列のある位置において、１個の変異、２個の変異、３個の変異、または３個よりも多い変異（例えば、４個の変異、５個の変異、６個の変異、７個の変異、８個の変異、９個の変異、もしくは１０個の変異、またはそれよりも多く）を含むことができる。変異型ＤＡＡＯは、任意に、５４位、５６位、５８位、２１３位、および／または２３８位における変異を含むことができる。いくつかの実施形態では、かかる変異体は、野生型配列と比較したときに、５４位および５６位におけるアミノ酸置換を含むことができる。他の実施形態では、かかる変異体は、野生型配列と比較したときに、５４位および５８位におけるアミノ酸置換を含むことができる。他の実施形態では、かかる変異体は、野生型配列と比較したときに、５４位、２１３位、および２３８位におけるアミノ酸置換を含むことができる。
【００２８】
任意で、野生型アスパラギンは、５４位を、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、または、より好ましくは、ＴｈｒもしくはＶａｌに置き換えられてもよい。例えば、変異型ＤＡＡＯは、５４位における下記変異:Ｎ５４Ｃ、Ｎ５４Ｌ、Ｎ５４Ｔ、またはＮ５４Ｖのうちの１つを含むことができる。
【００２９】
任意で、野生型スレオニンは、５６位を、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、またはＶａｌに置き換えることができる。参照により本明細書で援用される米国特許第7,939,709号を参照されたい。例えば、変異型ＤＡＡＯは、Ｔ５６Ｍ変異を含むことができる。
【００３０】
さらに、野生型Ｐｈｅは、５８位を、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、またはＨｉｓに置き換えることができる。変異型ＤＡＡＯは、任意で、５８位における下記変異: Ｆ５８Ａ、Ｆ５８Ｇ、Ｆ５８Ｈ、Ｆ５８Ｋ、Ｆ５８Ｎ、Ｆ５８Ｑ、Ｆ５８Ｒ、Ｆ５８Ｓ、またはＦ５８Ｔのうちの1つを含むことができる。いくつかの実施形態においては、変異型ＤＡＡＯは、５８位での変異を含まない。
【００３１】
任意で、野生型メチオニンの２１３位は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、またはＡｌａによって置き換えられる。いくつかの例においては、変異型ＤＡＡＯは、Ｍ２１３Ｓ変異を含むことができる。
【００３２】
任意で、野生型チロシンの２３８位は、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｇｙｓ、Ａｓｎ、またはＡｌａによって置き換えられる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、変異型ＤＡＡＯは、下記の変異の組合せ:Ｆ５８ＫおよびＭ２１３Ｓ、Ｎ５４ＴおよびＴ５６Ｍ、Ｎ５４ＶおよびＦ５８Ｑ、Ｎ５４ＣおよびＦ５８Ｈ、Ｎ５４ＴおよびＦ５８Ｔ、Ｎ５４ＴおよびＦ５８Ｇ、Ｎ５４ＴおよびＦ５８Ｑ、Ｎ５４ＴおよびＦ５８Ａ、Ｎ５４ＬおよびＦ５８Ｒ、Ｎ５４ＶおよびＦ５８Ｒ、Ｎ５４ＶおよびＦ５８Ｎ、ならびに／またはＮ５４Ｖ、Ｆ５８ＱおよびＭ２１３Ｓの1つまたは複数を含みことができる。
【００３４】
一実施形態では、変異型ＤＡＡＯは、Rhodosporidium toruloidesのＤＡＡＯまたはTrigonopsis variabilis のＤＡＡＯの５４位、５６位、５８位、２１３位、および／または２３８位に相当する位置に変異を有する他のＤＡＡＯ酵素における変異を含む。
【００３５】
他の適切なＤアミノ酸オキシダーゼは、好ましくは真菌を供給源として得てもよい。かかるＤＡＡＯ酵素を、本発明の方法に使用するために同定し、試験することができる。酵素が、基質としてＤ−グルホシネートを受容するかどうかを決定するために、酸素電極アッセイ（上記のHawkes, 2011）、比色分析アッセイ（Berneman A, Alves-Ferreira M, Coatnoan N, Chamond N, Minoprio P (2010) Medium/High Throughput D-Amino Acid Oxidase Colorimetric Method for Determination of D-Amino Acids. Application for Amino Acid Racemases. J Microbial Biochem Technol 2: 139-146）、および／または生成物形成の直接的な測定（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、または同様のものを介して）を用いることができる。
【００３６】
ＤＡＡＯ酵素によって触媒される反応は、酸素を要する。いくつかの実施形態では、酸素、酸素富化空気、酸素富化ガス流、または空気は、上部の空間において、またはガスを反応器に通して散在させることによって、断続的に、または連続的に反応に導入されて反応速度を上げる。さらに、他の実施形態では、任意で、ガスを反応器に通して散在させることと組み合わせて、加圧反応器を使用してもよい。すなわち、反応器を密封してＯ２を消費してもよい。密封チャンバーを使用することで、蒸気の放出は制限されるであろう。
【００３７】
ＤＡＡＯ酵素が、Ｄ−グルホシネートの、ＰＰＯへの変換を触媒するとき、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が発生する。これは、酵素および他の生体内変換の構成成分（例えば、生成物および／または基質）に損傷を与え得る。したがって、一実施形態では、ＤＡＡＯ酵素に加えて、例えばカタラーゼなどの酵素を、過酸化水素を除去するための触媒反応に使用することができる。カタラーゼは、下記の化学量論で、過酸化水素の分解を触媒する:
２Ｈ２Ｏ２  ⇒  ２Ｈ２Ｏ＋Ｏ２。
【００３８】
いくつかの実施形態では、過酸化水素は、触媒および非触媒分解反応を使用して除去することができる。例えば、過酸化水素は、熱および／またはｐＨの上昇を使用して、非触媒分解反応によって除去することができる。過酸化水素はまた、例えば、遷移金属およびヨウ化カリウムなどの他の物質を使用して、触媒分解反応によって除去することができる。過酸化水素を除去することに加えて、カタラーゼを使用するとまた、酸素（Ｏ２）が発生する。ＤＡＡＯが機能するには酸素を必要とするため、カタラーゼによって酸素が作られると、ＤＡＡＯ酵素を使ったＤ−グルホシネートのＰＰＯへの変換の促進を補助することができる。
【００３９】
他の酵素は、Ｄ−グルホシネートの、ＰＰＯへの変換の触媒に使用することができる。例えば、基質としてＤ−グルホシネートを受容するＤＡＡＤ酵素は、下記の化学量論で使用することができる:
Ｄ−グルホシネート＋Ｈ２Ｏ＋受容体  ⇒  ＮＨ３＋還元受容体＋ＰＰＯ。
【００４０】
ＤＡＡＤを使用する方法において、ＤＡＡＤ触媒反応が酸化還元補因子の再利用を含むことができることが理解される。このことは、より多くの電子をＤ−グルホシネートから受容できるように還元型受容体を酸化することを含む。
【００４１】
一実施形態では、中間体α−ケト酸が親アミノ酸から生産される化学的酸化的脱アミノ化は、本明細書に記載する方法において、Ｄ−グルホシネートをＬ−グルホシネートに変換するのに使用することができる。化学的酸化的脱アミノ化は、約４〜約１０の範囲のｐＨで、室温と溶液の沸点の間の温度の水溶液中で、一般的に銅またはコバルトのような金属イオンを使用して、同時的なアンモニアの放出を伴う、アミン基の、ケト基への変換を含む。例えば、参照により本明細書で援用されるIkawa and Snell (1954) J. Am. Chem. Soc. 76 (19): 4900-4902を参照されたい。
【００４２】
Ｄ−グルホシネートの、ＰＰＯへの実質的に完全な（７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、または９５％を超える）変換は、２４時間以内、１８時間以内、１２時間以内、８時間以内またはそれ以下の時間で起こることができる。
【００４３】
本明細書に記載する方法の第２の工程は、トランスアミナーゼ（ＴＡ）酵素、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＬＡＡＤ）酵素を使用するか、または化学的変換によるＰＰＯの、Ｌ−グルホシネートへの変換を含む。一実施形態では、その方法は、ＴＡによって触媒される反応である。ＰＰＯを基質として受容するのに必要とされる立体特異性を有するＴＡは、下記化学量論を用いて、ＰＰＯの、Ｌ−グルホシネートへのアミノ化を触媒する:
ＰＰＯ＋アミン供与体  ⇒  Ｌ−グルホシネート＋ケト酸。
【００４４】
Ｄ−スルホネートが、アミン供与体および／またはトランスアミナーゼの非存在下でＰＰＯに実質的に変換される２段階プロセスとして反応が行われる場合、第２の段階におけるＰＰＯの出発量は、通常、１０ｇ／Ｌ〜１４０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ〜１４０ｇ／Ｌ、または３０ｇ／Ｌ〜１４０ｇ／Ｌの範囲である。反応が、単一段階プロセスで行われる場合、ＰＰＯの出発量は通常、１ｇ／Ｌ未満であり、反応中のＰＰＯの最高レベルは通常、２５ｇ／Ｌ未満である。アミン供与体は、最初は、ラセミグルホシネートの出発量よりも１〜５０倍モル過剰で存在する。
【００４５】
本明細書中に記載する方法において有用なＴＡとして、Escherichia coli（UniProt P22256）由来のgabTトランスアミナーゼが含まれており、それは、基質としてのＰＰＯと所望の反応を触媒することが示されている（Bartsch et al. (1990) Appl Environ Microbiol. 56(1):7-12）。別の酵素は、イソプロピルアミンをアミン供与体として使用して、より速い速度で所望の反応を触媒するように進化している（Bhatia et al. (2004) Peptide Revolution: Genomics, Proteomics & Therapeutics, Proceedings of the Eighteenth American Peptide Symposium, Ed. Michael Chorev and Tomi K. Sawyer, July 19-23, 2003, pp. 47-48）。アミノ酸の配列番号１を有するトランスアミナーゼもまた、ＰＰＯおよびイソプロピルアミンを基質として用いた所望の反応を触媒する（実施例１１）。さらに、Streptomyces hygroscopicus、Streptomyces viridochromogenes、Candida albicans等、その他の多数の微生物由来のＴＡ酵素は、本明細書中に記載する方法の実施において使用することができる。例えば、参照により本明細書で援用される欧州特許第0249188号、および米国特許第5,162,212号を特に参照されたい。必要に応じて、酵素は、それらの活性を増加するような変異誘発性によって進化できる。変異型ＴＡ酵素は、Schulz et al., Appl Environ Microbiol. (1990) Jan. 56(1):1-6に概略が述べられているアッセイ、および／またはＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ、もしくは類似の製品による生成物の直接的な測定による所望の活性に関して選択することができる。
【００４６】
その方法における使用のためのさらなるＴＡ酵素は、Prozomix Limited社（Northumberland、英国）、SyncoZymes社（上海、中国）、Evocatal社（Monheim am Rhein、ドイツ）、Codexis社（Redwood City、CA）、またはAbcam社（Cambridge、英国）によって販売されるＴＡ種を、所望の活性に関してスクリーニングすることによって同定することができる。あるいは、配列類似性を使用して、新規ＴＡ酵素を同定することができる。最終的に、ＴＡ酵素はまた、所望の反応を触媒することが可能な生物からも同定できる。
【００４７】
適切なアミン供与体の選択は、Ｄ−グルホシネートの、Ｌ−グルホシネートへの変換にとって経済的に重要である。供与体のコスト、平衡熱力学、供与体の回収可能性、所望のＬ−グルホシネート由来のケト酸生成物の分離等、その他を含め、様々な課題が考えられ得る。その結果として、Ｌ−アスパルテートまたはラセミアスパルテート、Ｌ−グルタメートまたはラセミグルタメート、Ｌ−アラニンまたはラセミアラニン、Ｌ−フェニルエチルアミンまたはラセミフェニルアラニン、Ｌ−グリシンまたはラセミグリシン、Ｌ−リジンまたはラセミリジン、Ｌ−バリンまたはラセミバリン、Ｌ−セリンまたはラセミセリン、Ｌ−グルタミンまたはラセミグルタミン、イソプロピルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、エタノールアミン、２−アミノ酪酸、およびジアミノプロピオン酸のような低コストアミン供与体を含むいくつかの異なるアミン供与体を受容するＴＡ酵素を使用することができる。いくつかの実施形態では、アミン供与体は、アスパルテートまたはアスパラギン酸（例えば、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、またはラセミＤ，Ｌ−アスパラギン酸）ではない。
【００４８】
アミノ供与体がグルタメートである実施形態では、アミノ基転移反応に起因するケト酸の副産物は、α−ケトグルタレート（これは、α−ケトグルタル酸またはα−ＫＧとも称される）である。α−ケトグルタレートは、欧州特許第0073711号、中国特許第10519873号、中国特許第105177065号、中国特許第104529755号、およびZhan et al., Shipin Yu Shengwu Jishu Xuebao, 32(10): 1043-1048 (2013)におけるような当業者に公知の方法を使用して、単離および／または精製することができ、それらはそれぞれ、それらの全体が、参照により本明細書に援用される。生産および単離されたα−ケトグルタレートは、医薬品、食品添加物、および生体材料の合成を含む様々な用途で使用することができる。任意で、α−ケトグルタレートは、任意で反応における再利用のために、ラセミグルタメートまたはＬ−グルタメートのいずれかに化学的に変換することができる。
【００４９】
化学的還元的アミノ化は、通常、有機溶液中での適切なアミンによるケト化合物の処理によって、イミン化合物を介した、ケト基のアミン基への変換を含む。適切なアミンとして、例えば、メチルアミンまたはアンモニアが挙げられる。有機溶液における使用に適した有機溶媒として、テトラヒドロフラン、エタノール、またはジクロロメタン（ＤＣＭ）が挙げられる。還元的アミノ化は、室温と溶液の沸点の間の温度で実施できる。続いて、生産されたイミンは、有機溶液中で還元剤を使用して還元することができる。適切な還元剤として、例えば、ＮａＢＨ４、ＮａＨＢ（ＯＡｃ）３、またはＮａ（ＣＮ）ＢＨ３が挙げられる。有機溶液中における使用に適した有機溶媒として、テトラヒドロフラン、エタノール、またはＤＣＭが挙げられる。還元反応は、０℃と溶液の沸点の間の温度で実施することができる。当業者は、プロセスが、「ワンポット」で、または複数容器中、すなわち、別々に変換できることを理解するであろう。さらに、当業者は、記載する手順が、可能であればラセミアミノ材料を供給することを理解している。ＲｕＣｌ２［（Ｓ）−ＢＩＮＡＰ］などのキラル還元剤および水素ガスもしくは水素ガスの潜在性供給源、または１：１〜１：０．０５の比での（Ｓ）または（Ｒ）−ＶＡＰＯＬのようなキラルリガンドの存在下でのアキラル水素化物ベースの還元剤の使用は、鏡像異性体的に純粋な、および／または富化されたアミノ材料を生産することができる。例えば、Mignonac (1921) Compt. Rend. 172:223 and G. Li, Y. Liang, J. C. Antilla (2007) J. Am. Chem. Soc., 129:5830-5831を参照されたい。
【００５０】
所望のアミン供与体を受容する野生型ＴＡを同定することができるか、または一般的に所望のアミン供与体を受容しないＴＡを、所望の基質を受容するように進化させることができる。任意で、トランスアミナーゼは、アスパラギン酸トランスアミナーゼではない。任意で、トランスアミナーゼは、４−アミノ−酪酸:２−ケトグルタル酸トランスアミナーゼではない。いくつかの実施形態では、トランスアミナーゼは、ＰＰＴ特異的なトランスアミナーゼおよびグルタミン酸:オキサロ酢酸トランスアミナーゼを含む複合酵素系ではない。
【００５１】
ＰＰＯの、Ｌ−グルホシネートへの変換を触媒するために使用される他の酵素として、ＰＰＯを基質として受容するＬＡＡＤ酵素またはイミン還元酵素が挙げられる。かかるＬＡＡＤ酵素は、下記化学量論を使用する:
ＮＨ３＋還元受容体＋ＰＰＯ  ⇒  Ｌ−グルホシネート＋Ｈ２Ｏ＋受容体。
【００５２】
ＬＡＡＤが触媒した反応は、酸化還元補因子再循環を含むことができ、酸化還元補因子再循環は、より多くの電子をＰＰＯに供与することができるように、酸化された受容体を還元することを含む。
【００５３】
アミノ基が親ケト化合物から生産される化学的還元的アミノ化はまた、キラル還元体もしくはリガンドが使用されない場合にはグルホシネートを、またはキラル還元体もしくはリガンドが使用される場合にはＬ−グルホシネートを生産するのに使用することができる。化学的還元的アミノ化は、上記のように影響され得る。
【００５４】
ＰＰＯの、Ｌ−グルホシネートへの実質的に完全な変換は、２４時間以内、１８時間以内、１２時間以内、８時間以内、または４時間以内に起きてもよい。この文脈で、実質的に完全は、ＰＰＯの、Ｌ−グルホシネートへの変換が、約７０％を超える、約７５％を超える、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９８％を超える、または約９９％を超えることを意味する。
【００５５】
反応が、単一の容器または器で起こる場合、ＴＡ酵素は、ＤＡＡＯ酵素と一緒に添加することができるか、または後に、例えば、ＤＡＡＯ酵素が、幾らかまたは実質的に全ての酸化的脱アミノ化を触媒できた後に添加することができる。
【００５６】
酵素は、多くの方法によって反応に添加することができる。アプローチの1つは、E. coli、S. cerevisiae、P. pastoris等、その他の微生物（複数可）において酵素（複数可）を発現して、細胞全体を生体触媒とした細胞全部を反応に添加することである。別のアプローチは、酵素（複数可）を発現し、微生物を溶解し、その細胞可溶化液を添加することである。さらに別のアプローチは、酵素（複数可）を可溶化液から精製または部分的に精製して、純粋なまたは部分的に純粋な酵素（複数可）を反応に添加することである。複数の酵素が反応に必要とされる場合、酵素は、単一微生物内で全ての酵素を発現することを含めて、１つまたはいくつかの微生物において発現させることができる。
【００５７】
上記アプローチと組み合わせることができるさらなるアプローチは、酵素を支持体に固定化することである（代表的な方針の概略は、Datta et al. (2013) 3 Biotech. Feb; 3(1): 1-9にあり）。限定することを意図するわけではないが、Datta et alにおいて概略が述べられているように、酵素は、単独でまたは組み合わせて、例えば、酵素（複数可）自体の凝集体を含む、自然もしくは合成のポリマーまたは無機支持体に吸着され得るか、またはそれらに共有結合的にもしくは非共有結合的に結合され得るか、またはそれらの内部に捕捉され得る。いったん固定化されると、酵素（複数可）および支持体は、バルク溶液に分散することができるか、または土台、カラム、もしくは酵素を有する反応溶液と相互作用させるための任意の数の類似手段のものに充填することができる。通気は、ここで想定されるＤＡＡＯ反応にとって重要であるため、気泡カラムまたは類似のものを、酵素固定化に使用してもよい。例として、反応混合物を、固定化酵素のカラムに通して流してもよく（フロー反応）、固定化酵素の固定土台もしくはカラムに添加して反応させ、反応器の底もしくは上部のいずれかから除去してもよく（栓流）、または分散させた固定化酵素に添加し、反応させた後、固定化酵素を、濾過、遠心分離、もしくは類似のものによって除去することができる（バッチ）。したがって、本発明の方法においては、酵素の固定化に関する任意の方法が用いられ得る。
【００５８】
ＤＡＡＯ、ＴＡ、および／または他の反応は、緩衝液中で起こり得る。生体内変換反応において一般的に使用される例示的な緩衝液として、トリス、ホスフェート、または２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、β−ヒドロキシ−４−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、塩化クロラミン、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−２−ヒドロキシプロパンー１−スルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、アセトアミドグリシン、３−（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ（−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、トリシン、グリシンアミド、ビシン、または３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］プロパン−１−スルホン酸（ＴＡＰＳ）などのグッドバッファーのいずれかが挙げられる。さらなる例示的な緩衝液の製法は、Whittall, J. and Sutton, P. W. (eds) (2012) Front Matter, in Practical Methods for Biocatalysis and Biotransformations 2, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UKに見出すことができる。いくつかの実施形態では、アンモニウムは、緩衝液として作用し得る。１つまたは複数の有機溶媒もまた、反応に添加することができる。
【００５９】
驚くべきことに、ＤＡＡＯ、ＴＡ、および／または他の反応は、緩衝液を添加せずに、または低レベル（１ｍＭ未満）の緩衝液（任意でラセミグルホシネートアンモニウムの添加に起因して存在し得るアンモニウム以外）の添加で起こり得る。特に、固定化ＤＡＡＯおよびＴＡは、１ｍＭ未満のリン酸緩衝液の存在下、および、ラセミグルホシネートアンモニウムの添加に起因して存在する任意のアンモニウムを除く他の緩衝液がなくても安定かつ活性であり得る。
【００６０】
ラセミグルホシネート出発材料は、多くの形態で供給され得る。アンモニウムおよびハイドロクロライド、または両性イオンなどのラセミグルホシネートの各種塩を使用することができる。ラセミグルホシネートは、固体粉末（純度８０％、８５％、９０％、または９５％を超える粉末などの）または水溶液（ラセミグルホシネートのおよそ５０％溶液などの）の形態で存在してもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態では、反応は、規定のｐＨ範囲内で行われ、それは、ｐＨ４〜ｐＨ１０（例えば、ｐＨ６〜ｐＨ９、例えばおよそｐＨ７．５〜ｐＨ８）であることができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、反応は、規定の温度で行われる。温度は、室温と溶媒の沸点の間、最も一般的には室温と５０℃の間のある温度で保持することができる。
【００６３】
示されているように、本明細書中に記載する方法によって、実質的に純粋なＬ−グルホシネートの組成物（Ｌ−グルホシネートおよびＤ−グルホシネートのラセミ混合物ではない）が供給される。実質的に純粋なＬ−グルホシネートは、約７０％を超える、約７５％を超える、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９６％を超える、約９７％を超える、約９８％を超える、または約９９％を超えるＤ−グルホシネートが、Ｌ−グルホシネートに変換されて、組成物中に存在するＤ−グルホシネートおよびＬ−グルホシネートの合計と比較して、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９６％を超える、約９７％を超える、約９８％を超える、または約９９％を超えるＬ−グルホシネートを有する組成物を生じることを意味する。
【００６４】
一実施形態では、Ｌ−グルホシネートは、生体内変換混合物から単離されず、Ｄ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＬ−グルホシネートを含む組成物が得られる。この組成物は、Ｌ−グルホシネート、Ｄ−グルホシネート、およびＰＰＯの合計の少なくとも８０重量％のＬ−グルホシネート、構成成分の合計の少なくとも９０重量％のＬ−グルホシネートを含有する。この組成物は、除草組成物として直接、または除草剤配合製品における一成分として使用してもよい。
【００６５】
あるいは、Ｌ−グルホシネート以外のいくつかまたは全ての構成成分を、生体内変換混合物から除去して、混合物を任意で濃縮して、続いて混合物を、雑草の防止または防除に直接（および／または各種補助剤の添加を伴って）使用することができる。場合によっては、生体内変換混合物を直接（および／または各種補助剤の添加を伴って）雑草の防止または防除に使用することができる。
【００６６】
Ｌ−グルホシネートをさらに精製するためのさらなる工程を追加することができる。かかるさらなる精製および単離方法として、イオン交換、抽出、塩生成、結晶化および濾過が含まれ、それぞれを、複数回、または適切な組合せで使用してもよい。酵素は、固定されている場合には単純な濾過によって、または溶液中で遊離している場合には限外濾過の使用、セライト、セルロースもしくは炭素のような吸着剤の使用、または当業者に公知の様々な技術を介した変性によって除去することができる。
【００６７】
イオン交換プロセスは、この目的で選択された樹脂上への溶質の選択的吸着による分離をもたらす。生成物および不純物は、吸着より前に単一溶液中に溶解されなくてはならないため、単離より前の蒸発または蒸留による精製生成物流の濃縮が通常必要とされる。精製のためのイオン交換の使用例は、Schultz et al.、および欧州特許第0249188(A2)号によって記載される。
【００６８】
精製は、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸等を含む適切な酸の添加によるＬ−グルホシネートの不溶性塩の形成によって成されてもよい。同様に、精製は、不溶性塩を形成するための適切な塩基の添加によって成されてもよい。有用な塩基として、アルカリ金属の水酸化物、カーボネート、サルフェートおよびホスフェート、またはアルカリ土類金属の水酸化物、カーボネート、サルフェートおよびホスフェートが挙げられる。アンモニア、ヒドロキシルアミン、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、２−ピコリン、３−ピコリン、４−ピコリン、２，４−ルチジン、２，６−ルチジン、モルホリン、Ｎ−メチルモルホリン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、およびジメチルエタノールアミンを含む窒素を含有する他の塩基を使用してもよい。混合物を濃縮するか、または溶媒を添加して（またはその両方）、収率を最大限にして、所望の塩の純度を最適化することは好適であり得る。この目的に適した溶媒として、所望の塩の溶解度が非常に低いものが挙げられる（かかる溶媒は多くの場合、「非溶媒」と呼ばれる）。Ｌ−グルホシネートの塩は、当業者に公知の標準的な方法によって、配合物に適したグルホシネートに形質転換することができる。あるいは、Ｌ−グルホシネートは、両性イオンとして単離することができる。
【００６９】
米国特許第9,255,115 B2号は、Ｌ−グルホシネートの塩酸の塩がどのようにして、水酸化ナトリウムまたはナトリウムメトキシドなどの塩基を用いて両性イオンに形態に変換され、続いて比較的高純度でＬ−グルホシネートを作り出すために水性アルコール溶媒から結晶化され得るかについて記載している。この方法は、吸湿性ではない結晶性Ｌ−グルホシネートを生産するという利点を有しており、したがって、経時的に湿気に曝露される場合に非晶質Ｌ−グルホシネートと比較してより高い純度を維持する。
【００７０】
Ｌ−グルホシネートの他の塩は当該技術分野で公知である。米国特許第5,767,309号および米国特許第5,869,668号は、ラセミグルホシネートとジアステレオマー塩を形成するためのキラルアルカロイド塩基の使用を教示している。Ｌ−グルホシネートの塩は、Ｄ−グルホシネートで相当する塩よりもはるかに大量に溶液から沈殿するので、精製は達成される。したがって、所望する場合には、高い鏡像異性体過剰を有するＬ−グルホシネートを得るために、本発明とともにこの方法を使用することができる。
【００７１】
任意で、これまでに記載されているように、まず１つまたは複数の不純物を結晶化すること、不純物を濾過によって除去すること、続いて、塩を形成することによって得られた濾液からＬ−グルホシネートをさらに精製することによって、精製は達成されてもよい。これは、未反応のアミン供与体が、部分的にまたは完全に単離され、続く反応において使用され得る場合に好適である。同様に、部分的または完全に単離される未反応のＰＰＯは、続く反応における使用のために再利用してもよい。
【００７２】
抽出を使用して、生成物を精製してもよい。独国特許第3920570 C2号は、過剰なグルタミン酸（アミン供与体として使用）が、硫酸を用いて溶液のｐＨを３．７〜４．２に調節することによって沈殿するプロセスについて記載している。グルタミン酸を濾過した後、濾液のｐＨが１〜２に下がるとすぐに、他の不純物は溶媒中に抽出される。抽出および濃縮後、ｐＨ５〜７になるようにアンモニアを水溶液に添加するとすぐに、硫酸アンモニウムが沈殿する。硫酸アンモニウムは、濾過によって除去され、得られた濾液を濃縮して、Ｌ−グルホシネートのアンモニウム塩を得る。
【００７３】
Ｌ−グルホシネートまたはその塩の単離は、例えば、固体を配合または使用の場所に輸送するために望ましい場合がある。一般的な単離の産業的方法、例えば、濾過、遠心分離等を使用してもよい。単離生成物は多くの場合、水、揮発性不純物および溶媒（存在する場合）の除去を要し、一般的な産業用乾燥装置をこの目的で使用してもよい。かかる装置の例として、炉、回転式ドラム乾燥機、攪拌乾燥機等が挙げられる。いくつかの場合においては、噴霧乾燥機を使用することが好適となり得る。
【００７４】
精製後に固体生成物を生産することは必須ではない。このことは、Ｌ−グルホシネートの形成が、Ｌ−グルホシネートの生産で使用されるのと同じ部位で行われるべき場合に好適であり得る。Ｌ−グルホシネートおよびその塩の多くが、水中に容易に溶解し、水は、生成物を配合するために使用するのに都合の良い液体である。例えば、アミン供与体は、濾過によって単離されて、得られた濾液は、蒸留によって濃縮される。濾液のｐＨは、望ましい値に調節されてもよく、得られた溶液は、そのままで使用され得るか、または配合成分と混合されてもよい。別の例では、Ｌ−グルホシネートまたはその塩の１つのスラリーは、上述するように調製されて、濾過によって単離してもよい。Ｌ−グルホシネートの溶液を得るために、固体に水または適切な溶媒をフィルター上で直接添加して溶解させることができる。
【００７５】
II.組成物
また、上述する反応生成物を含む組成物が、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に、Ｌ−グルホシネートおよびハイドロクロライド、アンモニウムもしくはイソプロピルアンモニウム塩などの許容可能な陽イオン性または陰イオン性の塩形態を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの混合物を含む。
【００７６】
任意で、Ｌ−グルホシネートは、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの中でも優勢な化合物である。例えば、Ｌ−グルホシネートは、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの合計の少なくとも８０重量％、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの合計の少なくとも８５重量％、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの合計の少なくとも９０重量％、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの合計の少なくとも９５重量％、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの合計の少なくとも９６重量％、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの合計の少なくとも９７重量％、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの合計の少なくとも９８重量％、またはＬ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの合計の少なくとも９９重量％の量で、組成物中に存在することができる。
【００７７】
組成物は、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの合計の最大２０重量％の量でＰＰＯを含み得る。任意で、組成物は、０．００１％〜２０％のＰＰＯ（例えば、０．０５％〜１５％、または０．０１％超〜５％未満のＰＰＯ）を含む。例えば、組成物は、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの質量の合計の２０重量％未満、１９重量％未満、１８重量％未満、１７重量％未満、１６重量％未満、１５重量％未満、１４重量％未満、１３重量％未満、１２重量％未満、１１重量％未満、１０重量％未満、９重量％未満、８重量％未満、７重量％未満、６重量％未満、５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満、または０．０１重量％未満の量でＰＰＯを含むことができる。
【００７８】
Ｄ−グルホシネートは、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの合計の１５重量％以下の量で、組成物中に存在できる。例えば、Ｄ−グルホシネートは、Ｌ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＤ−グルホシネートの合計の１４重量％以下、１３重量％以下、１２重量％以下、１１重量％以下、１０重量％以下、９重量％以下、８重量％以下、７重量％以下、６重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下、または０．５重量％以下の量で存在できる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、組成物は、少量（例えば、組成物の約１０重量％以下、約８重量％以下、約５重量％以下、約２重量％以下、または約１重量％以下）のＤ−グルホシネートを含有することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、少量（例えば、組成物の約１５重量％以下、約１０重量％以下、約８重量％以下、約５重量％以下、約２重量％以下、または約１重量％以下）のＰＰＯを含有することができる。
【００８０】
本明細書中に記載する組成物は、雑草の防止または防除のための作物植物の圃場への施用に有用である。組成物は、圃場上で噴霧するための液体として配合されてもよい。Ｌ−グルホシネートは、有効量で組成物中に供給される。本明細書中で使用されているように、有効量は、１ヘクタール当たり約１０グラムの有効成分〜１ヘクタール当たり約１，５００グラムの有効成分、例えば、約５０グラム〜約４００グラム、または約１００グラム〜約３５０グラムを意味する。いくつかの実施形態では、有効成分は、Ｌ−グルホシネートである。例えば、組成物中のＬ−グルホシネートの量は、１ヘクタール当たり約１０グラム、約５０グラム、約１００グラム、約１５０グラム、約２００グラム、約２５０グラム、約３００グラム、約３５０グラム、約４００グラム、約５００グラム、約５５０グラム、約６００グラム、約６５０グラム、約７００グラム、約７５０グラム、約８００グラム、約８５０グラム、約９００グラム、約９５０グラム、約１，０００グラム、約１，０５０グラム、約１，１００グラム、約１，１５０グラム、約１，２００グラム、約１，２５０グラム、約１，３００グラム、約１，３５０グラム、約１，４００グラム、約１，４５０グラム、または約１，５００グラムのＬ−グルホシネートとすることができる。
【００８１】
本明細書中に記載する除草性組成物（植物への施用に先立って希釈を要する濃縮物を含む）は、液体または固体形態で、Ｌ−グルホシネート（すなわち、有効成分）、任意で、幾らかの残留Ｄ−グルホシネートおよび／またはＰＰＯ、ならびに１つまたは複数の補助剤構成成分を含有する。
【００８２】
組成物は、微粉微粒子固体、ペレット、溶液、分散液または乳剤の形態で組成物を供給するために、有効成分を希釈剤、拡張剤、担体、界面活性剤、有機溶媒、保水剤、または調整剤などの１つまたは複数の補助剤と混合することによって調製される。したがって、有効成分は、微粉固体、有機物起源の液体、水、湿潤剤、分散剤、乳化剤、またはこれらの任意の適切な組合せなどの補助剤とともに使用することができる。経済的および利便性の観点から、水は、好ましい希釈剤である。しかしながら、全ての化合物が、加水分解に耐性であるとは限らず、当業者によって理解されるように、場合によっては、これにより、非水性溶剤溶媒の使用を決定してもよい。
【００８３】
任意で、配合除草組成物を生産するために、１つまたは複数のさらなる構成成分を組成物に添加することができる。かかる配合組成物は、Ｌ−グルホシネート、担体（例えば、希釈剤および／または溶媒）、および他の構成成分を含むことができる。配合組成物は、有効量のＬ−グルホシネートを含む。任意で、Ｌ−グルホシネートは、Ｌ−グルホシネートアンモニウムの形態で存在できる。Ｌ−グルホシネートアンモニウムは、配合組成物の１０重量％〜３０重量％の範囲の量で存在できる。例えば、Ｌ−グルホシネートアンモニウムは、配合組成物の１０重量％、１２重量％、１４重量％、１６重量％、１８重量％、２０重量％、２２重量％、２４重量％、２６重量％、２８重量％、または３０重量％の量で存在できる。任意で、Ｌ−グルホシネートアンモニウムは、１２．２５％または２４．５％の量で存在する。
【００８４】
いくつかの例において、配合組成物は、１つまたは複数の界面活性剤を含みことができる。配合組成物における使用に適した界面活性剤として、アルキルエーテル硫酸ナトリウムが挙げられる。界面活性剤は、配合組成物の１０重量％〜４０重量％の量で存在できる。例えば、界面活性剤は、配合組成物の１０重量％、１２重量％、１４重量％、１６重量％、１８重量％、２０重量％、２２重量％、２４重量％、２６重量％、２８重量％、３０重量％、３２重量％、３４重量％、３６重量％、３８重量％または４０重量％の量で存在できる。任意で、アルキルエーテル硫酸ナトリウムは、１１．０５％、１５．８％、２２．１％、または３１．６％の量で存在する。
【００８５】
配合組成物は、任意で１つまたは複数の溶媒（例えば、有機溶媒）を含むことができる。任意で、溶媒は、１−メトキシ−２−プロパノール、ジプロピレングリコール、エチレングリコール、およびそれらの混合物であることができる。１つまたは複数の溶媒は、配合組成物の０．５重量％〜２０重量％の範囲の量で存在できる。例えば、組成物中の溶媒の総量は、配合組成物の０．５重量％〜１８重量％、５重量％〜１５重量％、または７．５重量％〜１０重量％の量で存在できる。
【００８６】
任意で、溶媒は、２つの溶媒の組合せを含む。例えば、配合物中の溶媒は、１−メトキシ−２−プロパノールおよびジプロピレングリコールを含むことができる。１−メトキシ−２−プロパノールは、例えば、配合組成物の０．５重量％〜２重量％の量で存在できる。例えば、１−メトキシ−２−プロパノールは、配合組成物の０．５重量％、０．６重量％、０．７重量％、０．８重量％、０．９重量％、１．０重量％、１．１重量％、１．２重量％、１．３重量％、１．４重量％、１．５重量％、１．６重量％、１．７重量％、１．８重量％、１．９重量％、または２．０重量％の量で存在できる。任意で、１−メトキシ−２−プロパノールは、配合組成物の０．５重量％または１．０重量％の量で存在する。ジプロピレングリコールは、配合組成物の４重量％〜１８重量％の量で存在できる。例えば、ジプロピレングリコールは、配合組成物の４重量％、６重量％、８重量％、１０重量％、１２重量％、１４重量％、１６重量％、または１８重量％の量で存在できる。任意で、ジプロピレングリコールは、配合組成物の４．３重量％または８．６重量％の量で存在する。
【００８７】
配合組成物はまた、１つまたは複数のポリサッカライド保水剤を含むことができる。適切なポリサッカライド保水剤の例として、例えば、アルキルポリサッカライド、ペントース、異性化糖、ソルビトールおよび糖蜜を含む。アルキルポリサッカライドなどのポリサッカライド保水剤は、配合組成物の４重量％〜２０重量％の範囲の量で、配合組成物中に存在できる。例えば、組成物中のポリサッカライド保水剤の総量は、配合組成物の４重量％〜１８重量％、４．５重量％〜１５重量％、または５重量％〜１０重量％の量で存在できる。いくつかの例において、配合組成物中に存在するアルキルポリサッカライドなどのポリサッカライド保水剤の総量は、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、または１８％であることができる。任意で、アルキルポリサッカライドは、３．２％、４．９％、６．２％、または９．８％の量で存在できる。
【００８８】
希釈剤もまた、配合組成物中に含まれることができる。適切な希釈剤として、水および他の水性構成成分が挙げられる。任意で、希釈剤は、包装または使用の準備用組成物を生産するのに必要な量で存在する。
【００８９】
一例では、配合組成物は、配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の３１．６重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の８．６重量％の量のジプロピレングリコール、配合物の９．８重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の３６．７５重量％の量の水を含む。
【００９０】
別の例では、配合組成物は、配合物の２４．５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の３１．６重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の８．６重量％の量のジプロピレングリコール、配合物の９．８重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の３６．７５重量％の量の水を含む。
【００９１】
別の例では、配合組成物は、配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の１５．８重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の０．５重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の４．３重量％の量のジプロピレングリコール、配合物の４．９重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の６２．２５重量％の量の水を含む。
【００９２】
別の例では、配合組成物は、配合物の２４．５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の２２．１重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の６．２重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の４６．２重量％の量の水を含む。
【００９３】
別の例では、配合組成物は、配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の２２．１重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の６．２重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の５８．４５重量％の量の水を含む。
【００９４】
別の例では、配合組成物は、配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の１１．０５重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の０．５重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の３．１重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の７３．１重量％の量の水を含む。
【００９５】
本明細書で提供する配合組成物における使用に適したさらなる構成成分は、米国特許第4,692,181号および同第5,258,358号に記載されており、それらはともに、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【００９６】
本明細書中に記載する除草組成物、特に液体および可溶性粉末は、さらなる補助剤構成成分として、所定の組成物を、水中または油中に容易に分散可能にさせるのに十分な量で、１つまたは複数の界面活性剤を含有できる。組成物への界面活性剤の組込みは、それらの有効性を大いに高める。界面活性剤は、本明細書中で使用する場合、湿潤剤、分散剤、懸濁剤を含み、乳化剤は、その中に含まれる。陰イオン、陽イオンおよび非イオン剤は、同等の設備で使用することができる。
【００９７】
適切な湿潤剤として、アルキルベンゼンおよびアルキルナフタレンスルホネート、硫酸化脂肪アルコール、アミンまたは酸アミド、ナトリウムイセチオネートの長鎖酸エステル、ナトリウムスルホサクシネートのエステル、硫酸化またはスルホン化脂肪酸エステル石油スルホネート、スルホン化植物油、ジターシャリーアセチレングリコール、アルキルフェノール（特にイソオクチルフェノールおよびノニルフェノール）のポリオキシエチレン誘導体、およびヘキシトール無水物（例えば、ソルビタン）のモノ高級脂肪酸エステルのポリオキシエチレン誘導体が挙げられる。例示的な分散剤として、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ナトリウムリグニンスルホネート、高分子アルキルナフタレンスルホネート、ナトリウムナフタレンスルホネート、ポリメチレンビスナフタレンスルホネート、およびナトリウムＮ−メチル−Ｎ−（長鎖酸）ラウレートが挙げられる。
【００９８】
１つまたは複数の有効成分、不活性固体増量剤、ならびに１つまたは複数の湿潤および分散剤を含有する水分散性粉末組成物を作製することができる。不活性固体増量剤は通常、天然粘土、珪藻土、およびシリカ等に由来する合成鉱物などの鉱物が起源である。かかる増量剤の例として、カオリナイト、アタパルジャイトクレイ、および合成ケイ酸マグネシウムが挙げられる。本明細書中に記載する水分散性粉末は、任意で、約５〜約９５重量部の有効成分（例えば、約１５〜３０重量部の有効成分）、約０．２５〜２５重量部の湿潤剤、約０．２５〜２５重量部の分散剤、および４．５〜約９４．５重量部の不活性固体増量剤を含有することができ、全ての部は、総組成物の重量に基づく。必要であれば、約０．１〜２．０重量部の固体不活性増量剤は、腐食防止剤もしくは消泡剤またはその両方で置き換えることができる。
【００９９】
水性懸濁液は、溶解によって、または超微細粒子の濃縮スラリーを得るための分散剤の存在下で水不溶性有効成分の水性スラリーを一緒に混合し、粉砕することによって調製することができる。得られた濃縮水性懸濁液は、その極めて小さな粒径を特徴とし、その結果、希釈および噴霧される場合に、適用範囲が非常に一様である。
【０１００】
乳化可能な油は通常、界面活性剤を伴う水非混和性または部分的に水非混和性の溶媒中の有効成分の溶液である。本明細書中に記載する有効成分に適した溶媒として、炭化水素および水非混和性エーテル、エステルまたはケトンが挙げられる。乳化可能な油の組成は概して、約５〜９５重量部の有効成分、約１〜５０重量部の界面活性剤、および約４〜９４重量部の溶媒を含有し、全ての重量部は、乳化可能な油の総重量に基づく。
【０１０１】
本明細書中に記載する組成物はまた、補助剤として使用される他の添加物、例えば、肥料、植物に有害な物質、および植物成長調節剤、殺虫剤等、または、上記補助剤の組み合わせを含有することができる。本明細書中に記載する組成物はまた、他の材料、例えば、肥料、他の植物に有害な物質等と混合させることができ、また単一の施用で施用することができる。
【０１０２】
本明細書中に記載する配合型、例えば液体および固体配合それぞれの型において、有効成分の濃度は同じである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、組成物は、主要構成成分として、α−ケトグルタル酸を含むことができる。α−ケトグルタル酸は、重要なジカルボン酸であり、トリカルボン酸回路およびアミノ酸代謝における重要な中間体の１つである。α−ケトグルタル酸は、参照により本明細書で援用される仏国特許第07199号に記載されるものなどの方法によって、反応混合物から単離することができる。α−ケトグルタル酸組成物は、医薬賦形剤および担体、食品添加物、または生体材料を形成するのに使用される構成成分とともに配合することができる。α−ケトグルタル酸組成物は、Li et al., Bioprocess Biosyst Eng, 39:967-976 (2016)に記載されるように、医薬品、食品添加物、および生体材料を合成することを含む様々な用途で使用することができる。
【０１０４】
除草組成物は、他の除草剤と組み合わせて使用することができることが理解される。本発明の除草組成物は、多くの場合、より様々な望ましくない植生を防除するために１つまたは複数の他の除草剤と組み合わせて施用される。他の除草剤と併用される場合、本明細書で特許請求される化合物は、他の１つまたは複数の除草剤とともに配合するか、他の１つまたは複数の除草剤とタンク混合するか、または他の１つまたは複数の除草剤とともに順次施用することができる。本発明の化合物と併用して用いることができる除草剤のいくつかとして、アリドクロール、ベフルブタミド、ベンザドックス、ベンジプラム、ブロモブチド、カフェンストロール、ＣＤＥＡ、クロルチアミド、シプラゾール、ジメテナミド、ジメテナミド−Ｐ、ジフェナミド、エプロナズ、エトニプロミド、フェントラザミド、フルポキサム、ホメサフェン、ハロサフェン、イソカルバミド、イソキサベン、ナプロパミド、ナプタラム、ペトキサミド、プロピザミド、キノナミドおよびテブタムなどのアミド除草剤;クロラノクリル、シスアニリド、クロメプロップ、シプロミド、ジフロフェニカン、エトベンザニド、フェナスラム、フルフェナセト、フルフェニカン、メフェナセト、メフルイジド、メタミホップ、モナリド、ナプロアニリド、ペンタノクロール、ピコリナフェンおよびプロパニルなどのアニリド除草剤;ベンゾイルプロップ、フラムプロップおよびフラムプロップ−Ｍなどのアリールアラニン除草剤;アセトクロール、アラクロール、ブタクロール、ブテナクロール、デラクロール、ジエタチル、ジメタクロール、メタザクロール、メトラクロール、Ｓ−メトラクロール、プレチラクロール、プロパクロール、プロピソクロール、プリナクロール、テルブクロール、テニルクロールおよびキシラクロールなどのクロールアセトアニリド除草剤;ベンゾフルオール、パーフルイドン、ピリミスルファンおよびプロフルアゾールなどのスルホンアニリド除草剤;アシュラム、カルバシュラム、フェナシュラムおよびオリザリンなどのスルホンアミド除草剤;ビラナホスなどの抗生物質除草剤;クロラムベン、ジカムバ、２，３，６−ＴＢＡおよびトリカムバなどの安息香酸除草剤;ビスピリバックおよびピリミノバックなどのピリミジニルオキシ安息香酸除草剤;ピリチオバックなどのピリミジニルチオ安息香酸除草剤;クロルタールなどのフタル酸除草剤;アミノピラリド、クロピラリドおよびピクロラムなどのピコリン酸除草剤;キンクロラックおよびキンメラックなどのキノリンカルボン酸除草剤;カコジル酸、ＣＭＡ、ＤＳＭＡ、ヘキサフルレート、ＭＡＡ、ＭＡＭＡ、ＭＳＭＡ、メタ亜ヒ酸カリウムおよびメタ亜ヒ酸ナトリウムなどのヒ素除草剤;メソトリオン、スルコトリオン、テフリルトリオンおよびテムボトリオンなどのベンゾイルシクロヘキサンジオン除草剤;ベンフレセートおよびエトフメセートなどのベンゾフラニルアルキルスルホネート除草剤;アシュラム、カルボキサゾール  クロルプロカルブ、ジクロルメート、フェナシュラム、カルブチレートおよびテルブカルブなどのカルバメート除草剤;バルバン、ＢＣＰＣ、カルバシュラム、カルベタミド、ＣＥＰＣ、クロルブファム、クロルプロファム、ＣＰＰＣ、デスメジファム、フェニソファ��、フェンメジファム、フェンメジファム−エチル、プロファムおよびスェップなどのカルバニレート除草剤;アロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、クロプロキシジム、シクロキシジム、プロホキシジム、セトキシジム、テプラロキシジムおよびトラルコキシジムなどのシクロヘキサンオキシム除草剤;イソキサクロルトールおよびイソキサフルトールなどのシクロプロピルイソキサゾール除草剤;ベンズフェンジゾン、シニドン−エチル、フルメジン、フルミクロラック、フルミオキサジンおよびフルミプロピンなどのジカルボキシイミド除草剤;ベンフルラリン、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、フルクロラリン、イソプロパリン、メタルプロパリン、ニトラリン、オリザリン、ペンジメタリン、プロジアミン、プロフルラリンおよびトリフルラリンなどのジニトロアニリン除草剤;ジノフェネート、ジノプロップ、ジノサム、ジノセブ、ジノテルブ、ＤＮＯＣ、エチノフェンおよびメジノテルブなどのジニトロフェノール除草剤;エトキシフェンなどのジフェニルエーテル除草剤;アシフルオルフェン、アクロニフェン、ビフェノックス、クロメトキシフェン、クロミトロフェン、エトニプロミド、フルオロジフェン、フルオログリコフェン、フルオロニトロフェン、ホメサフェン、フリルオキシフェン、ハロサフェン、ラクトフェン、ニトロフェン、ニトロフルオルフェンおよびオキシフルオルフェンなどのニトロフェニルエーテル除草剤;ダゾメットおよびメタムなどのジチオカルバメート除草剤;アロラック、クロロポン、ダラポン、フルプロパネート、ヘキサクロロアセトン、ヨードメタン、臭化メチル、モノクロロ酢酸、ＳＭＡおよびＴＣＡなどのハロゲン化脂肪族除草剤;イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキンおよびイマゼタピルなどのイミダゾリノン除草剤;スルファミン酸アンモニウム、ボラックス、塩素酸カルシウム、硫酸銅、硫酸第一鉄、アジ化カリウム、シアン酸カリウム、アジ化ナトリウム、塩素酸ナトリウムおよび硫酸などの無機除草剤;ブロモボニル、ブロモキシニル、クロロキシニル、ジクロロベニル、ヨードボニル、アイオキシニルおよびピラクロニルなどのニトリル除草剤;アミプロホス−メチル、アニロホス、ベンスリド、ビラナホス、ブタミホス、２，４−ＤＥＰ、ＤＭＰＡ、ＥＢＥＰ、ホサミン、グリホセートおよびピペロホスなどの有機リン除草剤;ブロモフェノキシム、クロメプロップ、２，４−ＤＥＢ、２，４−ＤＥＰ、ジフェノペンテン、ジスル、エルボン、エトニプロミド、フェンテラコールおよびトリホプシムなどのフェノキシ除草剤;４−ＣＰＡ、２，４−Ｄ、３，４−ＤＡ、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＡ−チオエチルおよび２，４，５−Ｔなどのフェノキシ酢酸除草剤;４−ＣＰＢ、２，４−ＤＢ、３，４−ＤＢ、ＭＣＰＢおよび２，４，５−ＴＢなどのフェノキシ酪酸除草剤;クロプロップ、４−ＣＰＰ、ジクロルプロップ、ジクロルプロップ−Ｐ、３，４−ＤＰ、フェノプロップ、メコプロップおよびメコプロップ−Ｐなどのフェノキシプロピオン酸除草剤;クロラジホップ、クロジナホップ、クロホップ、シハロホップ、ジクロホップ、フェノキサプロップ、フェノキサプロップ−Ｐ、フェンチアプロップ、フルアジホップ、フル��ジホップ−Ｐ、ハロキシホップ、ハロキシホップ−Ｐ、イソキサピリホップ、メタミホップ、プロパキザホップ、キザロホップ、キザロホップ−Ｐおよびトリホップなどのアリールオキシフェノキシプロピオン酸除草剤;ジニトラミンおよびプロジアミンなどのフェニレンジアミン除草剤;ベンゾフェナップ、ピラゾリネート、ピラスルホトール、ピラゾキシフェン、ピロキサスルホンおよびトプラメゾンなどのピラゾリル除草剤;フルアゾレートおよびピラフルフェンなどのピラゾリルフェニル除草剤;クレダジン、ピリダホルおよびピリデートなどのピリダジン除草剤;ブロムピラゾン、クロリダゾン、ジミダゾン、フルフェンピル、メトフルラゾン、ノルフルラゾン、オキサピラゾンおよびピダノンなどのピリダジノン除草剤;アミノピラリド、クリオジネート、クロピラリド、ジチオピル、フルロキシピル、ハロキシジン、ピクロラム、ピコリナフェン、ピリクロール、チアゾピルおよびトリクロピルなどのピリジン除草剤;イピリミダムおよびチオクロリムなどのピリミンジアミン除草剤;シペルクアット、ジエタムクアット、ジフェンザクアット、ジクアット、モルファムクアットおよびパラクアットなどの第四級アンモニウム除草剤;ブチレート、シクロエート、ジアレート、ＥＰＴＣ、エスプロカルブ、エチオレート、イソポリネート、メチオベンカルブ、モリネート、オルベンカルブ、ペブレート、プロスルホカルブ、ピリブチカルブ、スルファレート、チオベンカルブ、チオカルバジル、トリアレートおよびベモレートなどのチオカルバメート除草剤;ジメキサノ、ＥＸＤおよびプロキサンなどのチオカーボネート除草剤;メチウロンなどのチオ尿素除草剤;ジプロペトリン、トリアジフラムおよびトリヒドロキシトリアジンなどのトリアジン除草剤;アトラジン、クロラジン、シアナジン、シプラジン、エグリナジン、イパジン、メソプラジン、プロシアジン、プログリナジン、プロパジン、セブチラジン、シマジン、テルブチラジンおよびトリエタジンなどのクロロトリアジン除草剤;アトラトン、メトメトン、プロメトン、セクブメトン、シメトンおよびテルブメトンなどのメトキシトリアジン除草剤;アメトリン、アジプロトリン、シアナトリン、デスメトリン、ジメタメトリン、メトプロトリン、プロメトリン、シメトリンおよびテルブトリンなどのメチルチオトリアジン除草剤;アメトリジオン、アミブジン、ヘキサジノン、イソメチオジン、メタミトロンおよびメトリブジンなどのトリアジノン除草剤;アミトロール、カフェンストロール、エプロナズおよびフルポキサムなどのトリアゾール除草剤;アミカルバゾン、ベンカルバゾン、カルフェントラゾン、フルカルバゾン、プロポキシカルバゾン、スルフェントラゾンおよびチエンカルバゾン−メチルなどのトリアゾロン除草剤;クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメトスラム、メトスラム、ペノキススラムおよびピロキススラムなどのトリアゾロピリミジン除草剤;ブタフェナシル、ブロマシル、フルプロパシル、イソシル、レナシルおよびテルバシルなどのウラシル除草剤;３−フェニルウラシル;ベンズチアズロン、クミルロン、シクルロン、ジクロラル尿素、ジフルフェンゾピル、イソノルロン、イソウロン、メタベンズチアズロン、モニソウロン���よびノルロンなどの尿素除草剤;アニスロン、ブツロン、クロルブロムロン、クロレツロン、クロロトルロン、クロロクスロン、ダイムロン、ジフェノクスロン、ジメフロン、ジウロン、フェヌロン、フルオメツロン、フルオチウロン、イソプロツロン、リヌロン、メチウロン、メチルジムロン、メトベンズロン、メトブロムロン、メトクスロン、モノリヌロン、モヌロン、ネブロン、パラフルロン、フェノベンズロン、シデュロン、テトラフルロンおよびチジアズロンなどのフェニル尿素除草剤;アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、シクロフルファムロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルセトスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、メソスルフロン、ニコスルフロン、オルトスルファムロン、オキサスルフロン、ピリミスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロンおよびトリフロキシスルフロンなどのピリミジニルスルホニル尿素除草剤;クロルスルフロン、シノスルフロン、エタメツルフロン、ヨードスルフロン、メツルフロン、プロスルフロン、トリフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルスルフロンおよびトリトスルフロンなどのトリアジニリルスルホニル尿素除草剤;ブチウロン、エチジムロン、テブチウロン、チアザフルロンおよびチジアズロンなどのチアジアゾリル尿素除草剤;ならびにアクロレイン、アリルアルコール、アミノシクロピラクロール、アザフェニジン、ベナゾリン、ベンタゾン、ベンゾビシクロン、ブチダゾール、カルシウムシアナミド、カムベンジクロール、クロルフェナック、クロルフェンプロップ、クロルフルラゾール、クロルフルレノール、シンメチリン、クロマゾン、ＣＰＭＦ、クレゾール、オルト−ジクロロベンゼン、ジメピペレート、エンドタール、フルオロミジン、フルリドン、フルロクロリドン、フルルタモン、フルチアセット、インダノファン、メタゾール、メチルイソチオシアネート、ニピラクロフェン、ＯＣＨ、オキサジアルギル、オキサジアゾン、オキサジクロメホン、ペンタクロロフェノール、ペントキサゾン、酢酸フェニル水銀、ピノキサデン、プロスルファリン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド、キノクラミン、ローデタニル、スルグリカピン、チジアジミン、トリジファン、トリメツロン、トリプロピンダンおよび
トリタックなどのアミド系除草剤が挙げられる。本発明の除草組成物はさらに、グリホセート耐性または２，４−Ｄ耐性作物に対して、グリホセートまたは２，４−Ｄと併用して使用することができる。一般的に、本発明の組成物は、処理される作物に関して選択的で、かつ、用いられる施用率でこれらの組成物によって防除される雑草の範囲を補完する除草剤と組み合わせて使用することが好ましい。さらに一般的には、本発明の組成物および他の補完的な除草剤を、複合配合物として、またはタンクミックスとして同時に施用することが好ましい。
【０１０５】
III.Ｌ−グルホシネート組成物の使用方法
本明細書中に記載する組成物は、圃場または、例えば、鉄道、芝生、ゴルフコース、および雑草の防除が望ましい他の場所を含む任意の他の区域において、雑草を選択的に防除する方法において使用することができる。任意で、圃場または他の区域は、グルホシネートに対して耐性である植栽種子の１つまたは複数の作物を含有できる。その方法は、本明細書中に記載するようなＬ−グルホシネートを含む有効量の組成物を圃場に施用する工程を含むことができる。
【０１０６】
本明細書中に記載する組成物は、雑草の防止または防除のための作物植物の圃場への施用に有用である。組成物は、圃場上で噴霧するための液体として配合されてもよい。Ｌ−グルホシネートは、有効量で組成物中に供給される。本明細書中で使用する場合、有効量は、１ヘクタール当たり約１０グラムの有効成分〜１ヘクタール当たり約１，５００グラムの有効成分、例えば、約５０グラム〜約４００グラム、または約１００グラム〜約３５０グラムを意味する。いくつかの実施形態では、有効成分は、Ｌ−グルホシネートである。例えば、組成物中のＬ−グルホシネートの量は、１ヘクタール当たり約１０グラム、約５０グラム、約１００グラム、約１５０グラム、約２００グラム、約２５０グラム、約３００グラム、約３５０グラム、約４００グラム、約５００グラム、約５５０グラム、約６００グラム、約６５０グラム、約７００グラム、約７５０グラム、約８００グラム、約８５０グラム、約９００グラム、約９５０グラム、約１，０００グラム、約１，０５０グラム、約１，１００グラム、約１，１５０グラム、約１，２００グラム、約１，２５０グラム、約１，３００グラム、約１，３５０グラム、約１，４００グラム、約１，４５０グラム、または約１，５００グラムのＬ−グルホシネートであり得る。
【０１０７】
IV.例示的な実施形態
非限定的な実質形態は、下記を含む:
【０１０８】
１.  Ｌ−グルホシネートを作製する方法であって、
Ｄ−グルホシネートを、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）酵素と反応させて、ＰＰＯ（２−オキソ−４−（ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル）酪酸）を形成する工程と、
１つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用して、トランスアミナーゼ（ＴＡ）酵素によって、ＰＰＯをＬ−グルホシネートにアミノ化する工程と
を含み、Ｄ−グルホシネートの少なくとも７０％が、Ｌ−グルホシネートに変換される方法。
【０１０９】
２.  アミン供与体が、グルタメート、Ｌ−グルタメート、アラニン、ｓｅｃ−ブチルアミン、フェニルエチルアミン、グリシン、リジン、バリン、セリン、グルタミン、イソプロピルアミン、エタノールアミン、２−アミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸または任意の第二級アミンもしくはアミノ酸からなる群から選択される、実施形態１の方法。
【０１１０】
３.  Ｄ−グルホシネートが、ＤおよびＬ−グルホシネートまたはそれらの塩のラセミ混合物中に元々存在する、実施形態１の方法。
【０１１１】
４.  ＤＡＡＯ酵素が、Rhodosporidium toruloidesまたはTrigonopsis variabilis、Neolentinus lepideus、Trichoderma reesei、またはTrichosporon oleaginosus由来の酵素から選択される、実施形態１の方法。ある実施形態では、Rhodosporidium toruloides ＤＡＡＯ酵素は、UniProt P80324である。ある実施形態では、Trigonopsis variabilis ＤＡＡＯ酵素は、UniProt Q99042である。ある実施形態では、Neolentinus lepideus ＤＡＡＯ酵素は、KZT28066.1である。ある実施形態では、Trichoderma reesei ＤＡＡＯ酵素は、XP_006968548.1である。ある実施形態では、Trichosporon oleaginosus ＤＡＡＯ酵素は、KLT40252.1である。
【０１１２】
５.  ＤＡＡＯ酵素が、変異型ＤＡＡＯである、実施形態１の方法。
【０１１３】
６.  変異型ＤＡＡＯが、Rhodosporidium toruloides由来の配列に基づく変異型ＤＡＡＯである、実施形態５の方法。
【０１１４】
７.  変異型ＤＡＡＯが、５４位、５６位、５８位、２１３位、および２３８位で１つまたは複数の変異を含む、実施形態５の方法。
【０１１５】
８.  ５４位での変異が、Ｎ５４Ｃ、Ｎ５４Ｌ、Ｎ５４Ｔ、およびＮ５４Ｖからなる群から選択される、実施形態７の方法。
【０１１６】
９.  ５６位での変異が、Ｔ５６Ｍである、実施形態７の方法。
【０１１７】
１０.  ５８位での変異が、Ｆ５８Ａ、Ｆ５８Ｇ、Ｆ５８Ｈ、Ｆ５８Ｋ、Ｆ５８Ｎ、Ｆ５８Ｑ、Ｆ５８Ｒ、Ｆ５８Ｓ、およびＦ５８Ｔからなる群から選択される、実施形態７の方法。
【０１１８】
１１.  ２１３位での変異が、Ｍ２１３Ｓである、実施形態７の方法。
【０１１９】
１２.  変異型ＤＡＡＯが、変異Ｆ５８ＫおよびＭ２１３Ｓを含む、実施形態５の方法。
【０１２０】
１３.  変異型ＤＡＡＯが、５４位および５６位での変異を含む、実施形態５の方法。
【０１２１】
１４.  変異型ＤＡＡＯが、変異Ｎ５４ＴおよびＴ５６Ｍを含む、実施形態５の方法。
【０１２２】
１５.  変異型ＤＡＡＯが、変異Ｆ５８ＱまたはＦ５８Ｈを含む、実施形態５の方法。
【０１２３】
１６.  変異型ＤＡＡＯが、変異Ｎ５４ＶおよびＦ５８Ｑを含む、実施形態５の方法。
【０１２４】
１７.  変異型ＤＡＡＯが、変異Ｎ５４Ｖ、Ｆ５８Ｑ、およびＭ２１３Ｓを含む、実施形態５の方法。
【０１２５】
１８.  ＴＡ酵素が、Escherichia coli由来のgabTトランスアミナーゼである、実施形態１の方法。ある実施形態では、Escherichia coli gabTトランスアミナーゼは、UniProt P22256である。
【０１２６】
１９.  ＴＡ酵素が、配列番号１によってコードされる、実施形態１の方法。
【０１２７】
２０.  反応させる工程およびアミノ化する工程が、単一容器中で実施される、実施形態１の方法。
【０１２８】
２１.  全ての試薬が、反応の開始時に実質的に添加される、実施形態２０の方法。
【０１２９】
２２.  反応させる工程用の試薬およびアミノ化する工程用の試薬が、異なる時期に単一容器に添加される、実施形態２０の方法。
【０１３０】
２３.  反応させる工程およびアミノ化する工程が、別々の容器中で実施される、実施形態１の方法。
【０１３１】
２４.  Ｄ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＬ−グルホシネートを含む組成物。
【０１３２】
２５.  Ｌ−グルホシネートの量が、Ｄ−グルホシネート、ＰＰＯ、およびＬ−グルホシネートの総量に基づいて、９０％以上である、実施形態２４の組成物。
【０１３３】
２６.  実施形態２５の組成物を有する固体が得られる、実施形態１の方法。
【０１３４】
２７.  除草活性を有する配合物における使用のためのＬ−グルホシネートの溶液が得られる、実施形態１の方法。
【０１３５】
２８.  配合物の１０〜３０重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の１０〜４０重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の０．５〜２重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の４〜１８重量％の量のジプロピレングリコール、および配合物の４〜２０重量％の量のアルキルポリサッカライドからなる群から選択される１つまたは複数のさらなる構成成分、ならびに配合物の残余としての水を含む配合物。
【０１３６】
２９.  配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の３１．６重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の８．６重量％の量のジプロピレングリコール、配合物の９．８重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の３６．７５重量％の量の水を含む、実施形態２８の組成物。
【０１３７】
３０.  配合物の２４．５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の３１．６重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の８．６重量％の量のジプロピレングリコール、配合物の９．８重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の２４．５重量%の量の水を含む、実施形態２８の組成物。
【０１３８】
３１.  配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の１５．８重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の０．５重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の４．３重量％の量のジプロピレングリコール、配合物の４．９重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の６２．２５重量％の量の水を含む、実施形態２８の組成物。
【０１３９】
３２.  配合物の１０〜３０重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の１０〜４０重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の０．５〜２重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、および配合物の３〜１０重量％の量のアルキルポリサッカライドからなる群から選択される１つまたは複数のさらなる構成成分、ならびに配合物の残余としての水を含む配合物。
【０１４０】
３３.  配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の２２．１重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の６．２重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の５８．４５重量％の量の水を含む、実施形態３２の組成物。
【０１４１】
３４.  配合物の２４．５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の２２．１重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の１重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の６．２重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の４６．２重量％の量の水を含む、実施形態３２の組成物。
【０１４２】
３５.  配合物の１２．２５重量％の量のＬ−グルホシネートアンモニウム、配合物の１１．０５重量％の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の０．５重量％の量の１−メトキシ−２−プロパノール、配合物の３．１重量％の量のアルキルポリサッカライド、および配合物の７３．１重量％の量の水を含む、実施形態３２の組成物。
【０１４３】
３６.  区域において雑草を選択的に防除する方法であって、
Ｄ−グルホシネートに対して９０％を超える鏡像体過剰率でのＬ−グルホシネートを含む有効量の組成物を区域に施用する工程
を含む方法。
【０１４４】
３７.  １ヘクタール当たりＬ−グルホシネートおよびＤ−グルホシネートの合計４００グラム未満の量の組成物が施用される、実施形態３６の方法。
【０１４５】
３８.  区域において雑草を選択的に防除する方法であって、
Ｄ−グルホシネートに対して９０％を超える鏡像体過剰率でのＬ−グルホシネートおよび０．０１％を上回るが、１０％未満であるＰＰＯを含む有効量の組成物を区域に施用する工程
を含む方法。
【０１４６】
３９.  １ヘクタール当たりＬ−グルホシネート、Ｄ−グルホシネートおよびＰＰＯの合計４００グラム未満の組成物の量が施用される、実施形態３８の方法。
【０１４７】
４０.  グルホシネートに対して耐性である植栽種子の１つまたは複数の作物を含有する区域において雑草を選択的に防除する方法であって、
Ｄ−グルホシネートに対して９０％を超える鏡像体過剰率でのＬ−グルホシネートおよび０．０１％を上回るが、１０％未満であるＰＰＯを含む有効量の組成物を圃場に施用する工程
を含む方法。
【０１４８】
下記実施例は、説明の目的で提示されるものであって、限定の目的で提示されるものではない。
【実施例】
【０１４９】
実施例１:ＤＡＡＯ酵素精製
Rhodosporidium toruloides由来の変異型ＤＡＡＯのコード配列（例えば、MMARIRLリーダー配列ならびにＦ５８ＫおよびＭ２１３Ｓの変異で構成される）をｐＥＴ１４ｂベクターへクローニングして、Ｎ末端で６×Ｈｉｓをタグ付けしたタンパク質の発現を可能にした。このpET14b-RgDAAOプラスミドで、BL21（BE3）trxB PLysS細胞を形質転換した。本明細書に記載する番号付け全てに対応するRhodosporidium toruloides由来の野生型ＤＡＡＯの配列は、下記である:
MHSQKRVVVLGSGVIGLSSALILARKGYSVHILARDLPEDVSSQTFASPWAGANWTPFMTLTDGPRQAKWEESTFKKWVELVPTGHAMWLKGTRRFAQNEDGLLGHWYKDITPNYRPLPSSECPPGAIGVTYDTLSVHAPKYCQYLARELQKLGATFERRTVTSLEQAFDGADLVVNATGLGAKSIAGIDDQAAEPIRGQTVLVKSPCKRCTMDSSDPASPAYIIPRPGGEVICGGTYGVGDWDLSVNPETVQRILKHCLRLDPTISSDGTIEGIEVLRHNVGLRPARRGGPRVEAERIVLPLDRTKSPLSLGRGSARAAKEKEVTLVHAYGFSSAGYQQSWGAAEDVAQLVDEAFQRYHGAARESKL（配列番号２）
【０１５０】
ＤＡＡＯ酵素を精製するために、細胞を、自己誘導性培地（微量元素を有するＬＢブロスベース、Formedium社製）４００ｍＬ中で、３０℃で２０〜２４時間増殖させた。細胞を、予め冷却した遠心機およびバケットで回収して、冷水で洗浄して、再び遠心分離して、精製するまで−８０℃で保管した。
【０１５１】
次に、細胞ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０、２０ｍＭイミダゾールおよび１％Sigma社製プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩＣ）ｗ／ｏＥＤＴＡ）中で、細胞ペレット１ｇにつき溶解緩衝液５ｍＬの容量で解凍した。氷上では、細胞を振幅１０で３０秒間を４回の超音波処理をした。細胞可溶化物を遠心分離によって清澄化して、続いて、総容積の４倍量のコバルト樹脂（HisPur Cobalt、ThermoScientific社製）に添加した。細胞可溶化物を、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。樹脂をカラムに添加して、総容積の５倍量量の洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｋｐｉ、ｐＨ８．０、２０ｍＭイミダゾール）で２回洗浄した。総容積の１倍量の溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｋｐｉ、２００ｍＭイミダゾール）で４回、溶出を実施した。
【０１５２】
実施例２:ＤＡＡＯ活性の比色定量
ＤＡＡＯ活性は、Berneman et alと同様に決定した。簡潔に述べると、基質およびＨＲＰ（５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８中に０．１ｍｇ／ｍＬのＨＲＰ、Sigma社 P8375、および所望量のＤ−グルホシネートまたはラセミＤ／Ｌ−グルホシネート）１００μＬを、Brand社  製のＵＶマイクロキュベットに添加した。そこに、５０μＬの色素（５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８中に６０μｇ／ｍＬのＴＢＨＢＡ、Sigma社 439533、および１ｍｇ／ｍＬの４−アミノアンチピリン、Sigma社 A4382）を添加し、続いて５０μＬの酵素ミックス（１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８中に所望であるようなＤＡＡＯ濃度）を添加した。反応は、分光光度計で５１０ｎｍにて適切な時間にわたってモニタリングして、酵素動態を決定した。フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）は、ＤＡＡＯの精製または反応に添加されなかったが、この試薬は任意に含むことができる。実施例１のように精製したRhodosporidium toruloides のＤＡＡＯの２つの例示的な変異体であるＡＣ２０１（Ｆ５８ＫおよびＭ２１３Ｓを含有する）およびＡＣ２６３（Ｎ５４Ｔ、Ｔ５６Ｍ、Ｆ５８Ｋ、およびＭ２１３Ｓを含有する）は、このアッセイを使用して検査され、過酸化水素を生産することが示され、Ｄ−グルホシネートを酸化する際にはそれらの活性があることを実証していた。ＡＣ２０１およびＡＣ２６３は、類似したＶｍａｘを有するが、ＡＣ２６３は、より低いＫＭを有する。
【０１５３】
実施例３:トランスアミナーゼの精製
例えば、Escherichia coli gabTトランスアミナーゼ（http://www.uniprot.org/uniprot/P22256）を精製するために、遺伝子をE. coli K12株ER2925から増幅させて、pET-14bでクローニングされ、Ｎ末端で６×Ｈｉｓをタグ付けした型を生成した。次に、誘導のため、このプラスミドでBL21（DE3）細胞を形質転換した。自己誘導性培地中での誘導後、細胞を超音波処理によって溶解させて、６×Ｈｉｓタグ付き酵素を実施例１に記載しているように精製した。
【０１５４】
実施例４:トランスアミナーゼ活性の実証
非限定的な例において、トランスアミノ化アッセイに関するＰＰＯの供給源は、ＤＡＡＯによってＰＰＯに変換されたＤ−グルホシネートまたはラセミＤ／Ｌ−グルホシネートであり得る。第1の工程では、３９ｍＭラセミＤ／Ｌ−グルホシネートを、０．５ｍｇ／ｍｌの精製した、Ｆ５８Ｋ、Ｍ２１３ＳであるRhodosporidium toruloides のＤＡＡＯおよび１０μｇ／ｍＬのカタラーゼとともに、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８の緩衝液中で、３０℃で２０時間インキュベートした。これにより、Ｄ−グルホシネートの大部分はＰＰＯに変換された。続いて、精製したE. coli gabTを２０μｇ／ｍＬで添加して、Ｌ−グルタメートをアミン供与体として、５０ｍＭで添加した。適切な時点で試料を１０分間沸騰し、続く等量のアセトニトリルによる沈殿によって停止させた。個々の化学種は、Chirobiotic T2カラムを用いたＨＰＬＣで分解され、真正標準物質との比較によって定量化された。
【０１５５】
ＤＡＡＯの変異体およびトランスアミナーゼの組合せは、Ｄ−グルホシネートに対するＬ−グルホシネートに関して０％（すなわち、Ｄ−グルホシネートおよびＬ−グルホシネートの表現は等しい）で出発した鏡像異性体富化を、９２％の鏡像異性体富化に改善した。これらの結果により、E. coli gabTがトランスアミナーゼ活性を有することが実証され、このアッセイを使用して、任意数の野生型および／または潜在的変異型トランスアミナーゼの活性を決定することができる。
【０１５６】
実施例５:単一器中でのラセミＤ／Ｌ−グルホシネートの脱ラセミ化
反応は、実施例４と同様に設定した。系（５．４５ｍＬ、３０℃）は、ｐＨ７．３のリン酸緩衝液にて実行した。ｐＨ８．０での５０ｍＭリン酸緩衝液は、アミノ酸添加を緩衝するには不十分であること、およびこの系におけるアミノ酸添加後の未調節ｐＨは、ｐＨ６．４であることが観察された。ｐＨは、容量５．４５ｍＬになるように１Ｍの塩基の塩Ｋ２ＨＰＯ４を使用して調節されていたため、添加による実際の初期基質濃度は２７５ｍＭになることを意味していた。反応の開始時に基本的に同時に下記試薬を添加した:Ｄ，Ｌ−グルホシネート２７１ｍｇ、グルタメート４２０ｍｇ、ＡＣ２６３  ＤＡＡＯ  １５ｍｇ、カタラーゼ  ５０μｇ、およびE. coli gabTトランスアミナーゼ１．０ｍｇ。図２は、全ての試薬を添加すると、ほんのわずかのＰＰＯの蓄積を伴って、Ｄ−ＰＰＴ（Ｄ−グルホシネート）の量は、減少したことを示している。この結果は、RgＤＡＡＯ／EcgabT酵素対によるＤ／Ｌ−グルホシネートの、Ｌ−グルホシネートへの効率的な脱ラセミ化を示している。
【０１５７】
実施例６:ＤＡＡＯ酵素の改善の実証
上記で概略が述べられているタンパク質の変異誘発戦略を使用して、改良した変異体ＤＡＡＯ酵素を同定した。酵素は、以下に記載する手順に従ってアッセイされた。
【０１５８】
ストック溶液:
下記色素ストック溶液を調製した:２０ｍｇ／ｍＬの２，４，６−トリブロモ−３−ヒドロキシ安息香酸（ＴＢＨＢＡ）のＤＭＳＯでのストック溶液、および１００ｍｇ／ｍＬの４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）の水でのストック溶液。下記酵素ストック溶液を調製した:ｐＨ８．０のリン酸カリウム緩衝液中の１ｍｇ／ｍＬのホースラディッシペルオキシド（ＨＲＰ）６型ストック溶液。下記基質ストック溶液を調製した:ｐＨ８．０のリン酸カリウム緩衝液中の様々な濃度のＤまたはＤＬアミノ酸。
【０１５９】
反応ミックス:
下記の反応混合物を調製した:
混合物Ａは、基質およびＨＲＰ酵素の組合せである。溶液は、反応緩衝液を使用してアッセイされるべき各基質濃度に関して調製された。溶液は、最終的な基質濃度の２倍であり、ＨＲＰ溶液に関しては０．２ｍｇ／ｍＬであった。
混合物Ｂは、乾燥混合物である。反応緩衝液５ｍＬに、ＴＢＨＢＡ溶液１２０μＬおよび４−ＡＡＰ溶液４００μＬを添加した。
混合物Ｃは、酵素混合物である。反応緩衝液中でＤＡＡＯの０．１ｍｇ／ｍＬ溶液となるように調製した。最終反応濃度は、２５μｇ／ｍＬであった。
【０１６０】
プロトコール:
分光光度計は、４−ＡＡＰ／ＴＢＨＢＡに関して最大吸光度に相当し、吸光係数が２９４００Ｍ−１ｃｍ−１である点である波長５１０ｎｍで使用した。アッセイを実施するための温度は３０℃であった。反応動態は、１５分間ごとに測定することによって得られた。測定の間に、標準的な強度での２０秒の軌道振とうを行い、続いて定着時間を１０秒とした。
【０１６１】
９６ウェルプレートを使用して、下記混合物（反復を伴う）を、マルチチャネルを使用して下記の順序で添加した:混合物Ａ  １００μｌ、混合物Ｂ  ５０μｌ、および混合物Ｃ  ５０μｌ。測定は、酵素添加後、即座に開始した。
【０１６２】
酵素動態を上記のように測定して、ミカエリスメンテングラフ上にプロットして、ＶｍａｘおよびＫＭを算出するのに使用した。変異体Ａｃ３０２（５４Ｖ、５８Ｑ、２１３Ｓ）に関して、Ｖｍａｘは、４．２μｍｏｌ／分＊ｍｇであった。
【０１６３】
上記のように多くの変異体ＤＡＡＯ酵素に関してこの分析を完了させたが、但し、混合物Ｃのストックは、ＤＡＡＯの０．２ｍｇ／ｍＬ溶液であり、ＤＡＡＯのこの最終反応濃度は、５０μｇ／ｍＬであった。
【０１６４】
表１で以下に示すように、変異体ＤＡＡＯ酵素は、幅広い活性を示した:
【０１６５】
【表１】
2019509734.tif 000003
【０１６６】
実施例７:５Ｌの反応サイズでのラセミＤ／Ｌ−グルホシネートの脱ラセミ化
当業者に既知のアプローチを使用して、脱ラセミ化のスケールを増加させる。試薬およびそれらの相対比は、実施例５と実質的に同様であるが、量は、有意に多い。振とう機におけるチューブではなく、反応は、任意でブロスもしくはヘッドスペースの空気または酸素スパージングを含む攪拌型ジャケット付反応器中で実施する。これらの反応器は、１０ｍＬ未満の反応から何万または何十万リットルまでサイズが多様である。攪拌速度は、電力消費およびせん断を最低限に抑えながら、反応混合および速度を増加するように選択される。
【０１６７】
一例では、反応は、５Ｌスケールで実行された。系（５Ｌ、３０℃）は、攪拌型ジャケット付反応器においてｐＨ８．０の２００ｍＭリン酸緩衝液中で実行された。下記試薬は、反応の開始時に本質的に同時に添加した:３００ｍＭのＤ，Ｌ−グルホシネート、９００ｍＭグルタメート、ＡＣ３０２  ＤＡＡＯ  ７．５ｇ、カタラーゼ０．２ｇ、およびE.coli gabTトランスアミナーゼ１．０ｇ。さらに、イソプロパノール５００ｍＬを添加して、気泡を制御した。反応の経過中に、空気を０．３ＶＶＭ（１分当たりの反応混合物の容量ごとの空気の容量）で導入した。
【０１６８】
反応物のＨＰＬＣ分析により、９９％を超えるＤ−グルホシネートに対するＬ−グルホシネートの鏡像異性体過剰およびＬ−グルホシネート対ＰＰＯが９０％対１０％の割合で、８時間以内に平衡に達することが実証された。この結果は、より大きなスケールでのＲｇＤＡＡＯ／ＥｃgabT酵素対によるＤ／Ｌ−グルホシネートの、Ｌ−グルホシネートへの効率的な脱ラセミ化を示している。
【０１６９】
実施例８:反応速度に対する酸素の影響
攪拌型ジャケット付反応器または固定化カラムは通常、幾らかの酸素移動を可能にするが、受動通気によって提供される酸素取込みの速度は、効率的なプロセスにとって十分ではない。一例では、反応は、実施例７と同じ器中で実質的に同じ条件下ではあるが、低減された（０．０１ＶＶＭ）状態で、容量に基づくと２倍のＡＣ３０２  ＤＡＡＯ（１．５ｇ／Ｌに対して３ｇ／Ｌ）で、イソプロパノールを用いずに実行された。この場合、反応は、平衡に達するのに６０時間を超えてかかり、効率的な反応のためには通気が極めて重要であることを実証した。
【０１７０】
実施例９:ＤＡＡＯおよびＴＡの共固定
ＤＡＡＯおよびＴＡ酵素を、ＥｚｉＧ制御孔ガラスビーズ（EnginZyme社）上に共固定した。ＥｚｉＧ  ３型ビーズ１００ｍｇを、５０ｍｌのFalconチューブにおいてｐＨ７．５、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール中に精製したＡＣ３０２  ＤＡＡＯ  １６ｍｇおよび精製したgabT  １．６ｍｇを含有する溶液３ｍｌとともに室温で振とうした。３０分後、ビーズを遠心沈降させて、固定化用溶液を除去して、ビーズを、１０ｍｌのｐＨ７．５、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液で３回洗浄した。
【０１７１】
反応は、他の全ての構成成分を、洗浄したビーズに添加することによって開始された。反応混合物は、２．５ｍＬ中に３００ｍＭのＤ／Ｌ−グルホシネート、９００ｍＭのＬ−グルタミン酸、５０μｇのカタラーゼ、１９８ｍＭのリン酸カリウムを含有した。反応は、ガス交換用に開けられた孔を有するパラフィルムで覆った５０ｍＬのチューブ中で、３０℃にて振とう（２５０ｒｐｍ）しながらインキュベートされた。
【０１７２】
１時間後、Ｄ−グルホシネートの枯渇およびＬ−グルホシネートの形成をＨＰＬＣによって決定し、これらの割合を算出した。６時間後、ビーズを遠心沈降させて、反応混合物を除去して、ビーズを、１０ｍｌのｐＨ７．５、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液で３回洗浄した。続いて、ビーズを４℃で１８〜７２時間保管した後、反応を総計１５回繰り返し、その後に保持された活性は、初期活性の５０％を超えた。
【０１７３】
実施例１０:反応における緩衝液の影響
可溶性ＡＣ３０２  ＤＡＡＯおよびE. coli gabT ＴＡ酵素を使用する場合、５０ｍＭを上回るリン酸緩衝液が、完全活性に必要とされる。１００ｍＬの反応液を、パラフィルムで覆った５００ｍＬのフラスコ中で、３０℃で振とう（２５０ｒｐｍ）しながらインキュベートした。最初の５時間は、空気ポンプを使用して、空気を反応物に通してバブリングした。空気ポンプは、一晩のインキュベーションに関しては取り外すため、反応は泡立たず、空気孔を有する新たなパラフィルムをガス交換用に使用した。反応混合物は、３００ｍＭのＤ／Ｌ−グルホシネート、９０５ｍＭのＬ−グルタミン酸、ＡＣ３０２  ＤＡＡＯ（０．８ｍｇ／ｍＬ）８０ｍｇ、gabT １４．５ｍｇ（０．１４５ｍｇ／ｍＬ）、カタラーゼ２ｍｇ、および消泡試薬としてイソプロパノール（初期濃度１０％のイソプロパノールは、２時間後（２ｍＬ）、３時間後（１ｍＬ）、３．５時間後（１ｍＬ）、および４時間後（２ｍＬ）にさらに添加した）を含有した。５００μＬの１Ｎ  ＮａＯＨ  を使用（酵素の前に添加）して、ｐＨを約６から約７に調節した。ｐＨは、さらに調節することなく、反応全体に関して約７のままであった。ストック酵素緩衝液中のリン酸カリウムに起因して、最終的な混合物は、４５ｍＭリン酸緩衝液であった。２００ｍＭリン酸緩衝液を用いた場合の同様の反応と比較して、反応速度は、２００ｍＭ緩衝液を用いた反応の５０〜６０％であった。
【０１７４】
固定化したＡＣ３０２  ＤＯＯＡおよびE. coli gabT ＴＡ酵素を使用する場合、１ｍＭ未満のリン酸緩衝液は、完全活性にとって十分である。固定化タンパク質を調製し、「緩衝された」反応に関して実施例９と同様に反応を実施した。さらに、固定化タンパク質を調製して、「ｐＨ７」反応に関して実施例９と同様に反応を実施したが、但し、反応のｐＨをｐＨ７に調節するのには水酸化ナトリウムを使用し、リン緩衝液は添加しなかった（酵素保管緩衝液由来の残留リン酸緩衝液は、１ｍＭ未満である）。この研究により、ＤＡＡＯおよび複合ＤＡＡＯの両方の反応、ならびにgabT反応に関する初期反応速度は、固定化酵素を使用する場合には、リン酸緩衝液を添加するとき、および添加しないとき、非常に類似していることが実証された。
【０１７５】
実施例１１:アミン供与体としてのイソプロピルアミン
イソプロピルアミンは、適切なＴＡを使用したＰＰＯの、Ｌ−グルホシネートへの変換用のアミン供与体として使用することができる。ＰＰＯは、下記構成成分を用いた反応において、Ｌ−グルホシネートに変換された:
・０．２５ｍｇ／ｍＬの配列番号１によってコードされるＴＡ
・２５ｍＭのＰＰＯ
・０．２ｍＭリン酸ピリドキサール
・２５０ｍＭイソプロピルアミン（Ｈ３ＰＯ４を用いて８へｐＨ調整）
・１００ｍＭのＫｐｈｏｓ緩衝液ｐＨ８．０
【０１７６】
反応物は、穏やかに振とう（２５０ｒｐｍ）しながら、２５〜３０℃で３０時間、インキュベートされた。０時間では、ＨＰＬＣによって測定される場合のＬ−グルホシネートの量は０ｍＭであり、２０時間では、それは１４ｍＭであり、３０時間では、それは１８ｍＭであった。これにより、配列番号1によってコードされる酵素が、ＰＰＯをＬ−グルホシネートに変換することができることが実証される。
【０１７７】
実施例１２:アミン供与体としてのリジン
リジンは、適切なＴＡを使用したＰＰＯの、Ｌ−グルホシネートへの変換用のアミン供与体として使用することができる。ＰＰＯは、下記構成成分を用いた反応において、Ｌ−グルホシネートに変換された:
・０．４ｍｇ／ｍＬのgabT（実施例３のように精製される）
・２５ｍＭのＰＰＯ（ＮａＯＨを用いて８へｐＨ調整）
・０．２ｍＭリン酸ピリドキサール
・７５ｍＭのＬ−リジンジヒドロクロリド（ＮａＯＨを用いて８へｐＨ調整）
・１００ｍＭのＫｐｈｏｓ緩衝液ｐＨ８．０
【０１７８】
反応物は、振とう（２５０ｒｐｍ）しながら、３０℃で２０時間、インキュベートされた。Ｌ−グルホシネートは、２０時間にわたって０．４ｍＭ／時間の速度で形成された。これにより、Ｌ−リジンは、ＰＰＯをＬ−グルホシネートに変換するのに使用することができることが実証される。
【０１７９】
実施例１３:Ｌ−グルホシネートの精製および単離
実施例９に記載する手順に従って、いくつかのバッチを調製したが、より大きなスケールで生成された。ビーズを除去した後、各バッチを少なくとも１０分間９０℃へ加熱して、２０〜２５℃に冷却した後、濾過して、少量の固体を除去した。個々のバッチに、３７％ＨＣｌが滴下により添加され、グルタミン酸の沈殿をもたらした。添加した３７％ＨＣｌの量は、バッチのおよそ１０％の容量であった。得られた白色固体を濾過によって除去した。バッチを合わせて、真空下で油状物質になるまで濃縮し、油状物質は、およそ１５３グラムのＬ−グルホシネートを含有していた。油状物質は、５倍容量の水で希釈され、３７％ＨＣｌを添加して、溶液をｐＨ１に調節された。溶液を、それぞれが予め洗浄した各分のDOWEX 50WX8陽イオン交換樹脂がおよそ３．０ｋｇとなるようにして、２回の処理を順次行った。各処理において、溶液を樹脂と３０分間混合した後、樹脂をフィルター上で単離した。各分の両方の樹脂を合わせて、まずは水で洗浄し、続いて４Ｍ  ＮＨ４ＯＨで溶出した。溶離液を真空下で油状物質になるまで濃縮し、ＰＰＯおよび２−オキソグルタレートは、油状物質で存在しなかった。油状物質およそ１００グラムを水で希釈して、ｐＨがおよそ９になるまで、水酸化アンモニウム水を添加した。バッチに、予め洗浄したDOWEX Monosphere（水酸化物形態）陰イオン交換樹脂１．０ｋｇを添加して、混合物をおよそ４０分間攪拌した。等量の予め洗浄したDOWEX Monosphere樹脂をガラスカラムに充填した。水中のDOWEX樹脂のスラリーを、予め洗浄した樹脂の最上部でカラムに添加した。水８００ｍＬをカラムに充填した後、０．１Ｎ酢酸を充填し、全てのグルタミン酸が溶出されるまで、ＨＰＬＣで測定しながらカラムに通して流し続けた。全てのＬ−グルホシネートがカラムから溶出されるまで、ＨＰＬＣで測定しながら、４Ｎ酢酸をカラムに供給した。Ｌ−グルホシネートの溶液を真空下で濃縮した。得られた油状物質を水で希釈して、最小容量の２倍になるまで真空下で濃縮した。透明な溶液が得られるまで、メタノールを添加して、等容量のヘプタンを添加した。最小容量になるまで、混合物を真空下で濃縮し、その手順を繰り返した。陽イオン交換処理から回収した油状物質の残りの１６８グラムを、同様の様式で処理して、総計１０８グラムの粗製Ｌ−グルホシネートを得た。Ｌ−グルホシネート対グルタミン酸の比は、ＮＭＲによる測定で、９９：１を超えた。得られた固体を水酸化アンモニウム水と混合して乾固するまで濃縮し、Ｌ−グルホシネートアンモニウム１１１グラムが得られた。メタノールも酢酸も、生成物のＮＭＲ分析によって検出されなかった。
【０１８０】
本明細書中で使用する専門用語は、特定の実施形態のみを記載する目的であり、専門用語は、限定的する意図で用いられるのではないことが理解される。本発明の範囲は、併記の特許請求の範囲によってのみ限定される。他に定義されない限りは、本明細書中で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同義を有する。様々な値が提供される場合、文脈が明らかに他の状況で指示しない限りは、その範囲の上限および下限と、その規定範囲における任意の他の規定または介在値との間にある下限の単位の１０分の１に至る各介在値は、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して、より小さな範囲中に含まれてもよく、規定範囲において任意に具体的に排除される限界に従い、本発明内にも包含される。規定範囲が、限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方または両方を排除する範囲もまた、本発明に含まれる。ある特定の範囲は、先行する数値とともに「約」という用語によって本明細書中で提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数、ならびにその用語が先行する数に近いか、またはほぼその数である数と同様である文字通りの補助を提供するために、本明細書中で使用される。数が、具体的に列挙する数に近いか、またはほぼその数であるかどうかを決定する際に、近いか、または近似する列挙されていない数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙する数の実質的同等物を提供する数であってもよい。
【０１８１】
本明細書中で引用する刊行物、特許および特許出願は全て、個々の刊行物、特許または特許出願が、参照により援用されるように具体的にかつ個々に示されるのと同程度にまで、参照により本明細書で援用される。さらに、引用された刊行物、特許または特許出願はそれぞれ、関連して引用される刊行物の主題を開示および記載する形で、参照により本明細書で援用される。任意の刊行物の引用は、出願日に先立つその開示に関するものであるが、本明細書中に記載する本発明が、先行発明のためにかかる刊行物に先行する権利がないということを認めているものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される出版の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、それは、個々に確認する必要があり得る。
【０１８２】
特許請求の範囲は、任意の要素を除くように作成され得ることに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の要素の列挙と関連して、「単独で」、「唯一」等のような排他的な用語、または「否定的な」限定を使用するための前提として役割を果たすことが意図されている。本開示を読んでいる当業者に明らかであるように、本明細書中に記載および図示する個々の実施形態それぞれが、本発明の範囲または趣旨を逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に分離され得るか、またはその特徴と組み合わされ得る別個の構成成分および特徴を有する。任意の引用方法は、列挙される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実行してもよい。本明細書中に記載するものに類似するか、または等しい任意の方法および材料もまた、本発明の実施または実験において使用してもよいが、ここには代表的な例示的方法および材料を記載する。
【０１８３】
配列
配列番号１:
MNIAAQSWERREATSFFHTFTDLPSLKTDGPVIIDHGEGPYIIDTVGRRYFEGNSGLWNMTLGFSERRLSDAALKQYQEFPGYHTFFGRNSKPTVELAERMLKLAPAPMSRVFFTNSGSEANESIVKLLWMMWAAEGRPERRKLLTRKNAYHGATVMASALTGKDYVKAFGLPGPEIVTLDCPHAWRFALPGEGDDEFAARLAANLETRILQEGPETIAGMFAEPVMGAGGVIVPPATYFAKIQPVLQRYGIPLIADEVICGFGRTGSLWGTLAVGQQPDIIVASKSMSAGYFPMGAVMLSADIDKRATAASEVWEEFPHGFTTGGHPVGCAISLEAIRIITEEGVFENVKSVSETFQSGLRALADHPMIGEARGMGLMGALETVADKKTKQSFSGDLRIGERISKEARDRGFIIRPLGSSVVLAPPFISTHGQIEELLAVLKEVLDVVYGTVKGEVA
【０１８４】
配列番号２:
MHSQKRVVVLGSGVIGLSSALILARKGYSVHILARDLPEDVSSQTFASPWAGANWTPFMTLTDGPRQAKWEESTFKKWVELVPTGHAMWLKGTRRFAQNEDGLLGHWYKDITPNYRPLPSSECPPGAIGVTYDTLSVHAPKYCQYLARELQKLGATFERRTVTSLEQAFDGADLVVNATGLGAKSIAGIDDQAAEPIRGQTVLVKSPCKRCTMDSSDPASPAYIIPRPGGEVICGGTYGVGDWDLSVNPETVQRILKHCLRLDPTISSDGTIEGIEVLRHNVGLRPARRGGPRVEAERIVLPLDRTKSPLSLGRGSARAAKEKEVTLVHAYGFSSAGYQQSWGAAEDVAQLVDEAFQRYHGAARESKL
【図１】
2019509734.tif 000004
【図２】
2019509734.tif 000005
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019509734.tif 000008
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