(57)【要約】  本発明は、式Ｉまたは式ＩＩＩの化合物、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはかかるエステルもしくはアミドの塩、またはかかるエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物に関する。2019519491.tif 0000992019519491.tif 000100  式中、Ｒ１〜Ｒ１３およびＬ１〜Ｌ４の定義は、明細書に記載のとおりであり、式中、Ｒ１４はペプチドである。式Ｉの化合物に、リンカを介してペプチドを共有結合させて式ＩＩＩの化合物を調製し、それにより治療化合物の半減期が延長される。本発明はまた、開示された化合物の医薬組成物、ならびに疾患の診断または治療におけるそれらの使用に関する。
2019519491.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはかかるエステルもしくはアミドの塩、またはかかるエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物。
【化１】
2019519491.tif 000066
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシ基から独立に選択され、
Ｒ１２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６ハロアルキル基であり、
Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｍ−であって、ｍは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｌ３は、−（ＣＨ２）ｐ−であって、ｐは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｒ１３は、キレート基である。）
【請求項２】
Ｌ１が、−ＮＨ（ＣＯ）−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｌ２が、−（ＣＨ２）４−ＮＨ（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｌ３が、−ＮＨ（ＣＯ）ＣＨ２−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ４が独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシ基から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１が、各々水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１およびＲ４が、独立してＣ１−Ｃ６アルキル基から選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１およびＲ４が、各々メチル基である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１２が、水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１３が、
【化２】
2019519491.tif 000067
【化３】
2019519491.tif 000068
【化４】
2019519491.tif 000069
【化５】
2019519491.tif 000070
【化６】
2019519491.tif 000071
、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
式Ｉの化合物が、式ＩＩの化合物である、請求項１に記載の化合物。
【化７】
2019519491.tif 000072
式ＩＩ
（式中、Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｒ１３は、キレート基である。）
【請求項１２】
Ｌ２が、−（ＣＨ２）４−ＮＨ（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−であり、
Ｒ１３が、
【化８】
2019519491.tif 000073
【化９】
2019519491.tif 000074
【化１０】
2019519491.tif 000075
【化１１】
2019519491.tif 000076
【化１２】
2019519491.tif 000077
、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
式ＩＩＩの化合物、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはかかるエステルもしくはアミドの塩、またはかかるエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物。
【化１３】
2019519491.tif 000078
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシ基から独立に選択され、
Ｒ１２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６ハロアルキル基であり、
Ｒ１４は、ペプチドであり、
Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｍ−であって、ｍは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｌ３は、−（ＣＨ２）ｐ−であって、ｐは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｑ−であって、ｑは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｒ１３は、キレート基である。）
【請求項１４】
Ｌ１が、−ＮＨ（ＣＯ）−であり、Ｒ１およびＲ４が、各々メチル基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２が、各々水素である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ１４が、治療用ペプチドである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ１４が、標的細胞または組織に対して結合できるペプチドである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１４が、腫瘍に結合できる、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１４が、インターフェロンα、顆粒球コロニー刺激因子、オクトレオテート、ボンベシン、ＲＧＤ、α−ＭＳＨ、ＣＴＴ１２９８またはアプタマから選択される、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ１４が、環状ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１４が、
【化１４】
2019519491.tif 000079
である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ１４が、更に放射性核種を含む、請求項１６に記載の化合物。
【請求項２２】
前記放射性核種が、１８Ｆ、７６Ｂｒ、１２４Ｉ、１２５Ｉまたは１３１Ｉである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１４が、
【化１５】
2019519491.tif 000080
である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ１３が、
【化１６】
2019519491.tif 000081
【化１７】
2019519491.tif 000082
【化１８】
2019519491.tif 000083
【化１９】
2019519491.tif 000084
【化２０】
2019519491.tif 000085
、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される、請求項１３に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ１３が、更に放射性核種を含む、請求項１３に記載の化合物。
【請求項２６】
前記放射性核種が、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、８６Ｙ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８９Ｚｒ、９９Ｔｃ、１５３Ｓｍ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃまたは２２３Ｒａである、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
前記放射性核種が、６４Ｃｕまたは９０Ｙである、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２８】
式ＩＩＩの化合物が、式ＩＶの化合物である、請求項１に記載の化合物。
【化２１】
2019519491.tif 000086
（式中、Ｒ１４は、ペプチドであり、
Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｑ−であって、ｑは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｒ１３は、キレート基である。）
【請求項２９】
Ｒ１４が、標的細胞または組織に対して結合できるペプチドである、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ１４が、腫瘍に結合できる、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｒ１４が、環状ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓである、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ１４が、
【化２２】
2019519491.tif 000087
である、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｌ２が、-（ＣＨ２）４−ＮＨ（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−であり、
Ｌ４−Ｒ１４が、
【化２３】
2019519491.tif 000088
である、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ１４が、更に放射性核種を含む、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３５】
前記放射性核種が、１８Ｆ、７６Ｂｒ、１２４Ｉ、１２５Ｉまたは１３１Ｉである、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ１４が、
【化２４】
2019519491.tif 000089
である、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｒ１３が、
【化２５】
2019519491.tif 000090
【化２６】
2019519491.tif 000091
【化２７】
2019519491.tif 000092
【化２８】
2019519491.tif 000093
【化２９】
2019519491.tif 000094
、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｒ１３が、更に放射性核種を含む、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３９】
前記放射性核種が、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、８６Ｙ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８９Ｚｒ、９９Ｔｃ、１５３Ｓｍ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃまたは２２３Ｒａである、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
前記放射性核種が、６４Ｃｕまたは９０Ｙである、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４１】
請求項２１，２５，３４または３８のいずれか１つの化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項４２】
前記薬学的に許容される担体が、結合剤、緩衝剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、フレーバー、滑沢剤、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、錠剤化用剤、湿潤剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
哺乳動物における癌の治療または診断方法であって、前記哺乳動物に、治療的有効量の請求項２１，２５，３４または３８のいずれか１つの化合物を、任意に１つ以上のさらなる活性成分との組合せで投与することを含む方法。
【請求項４４】
前記１つ以上のさらなる活性成分が、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カンプトセシン、テモゾロマイド、アバスチン、ハーセプチン、エルビタックス、およびそれらの組合せから選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ｒ１４が、
【化３０】
2019519491.tif 000095
である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項４６】
Ｒ１４が、
【化３１】
2019519491.tif 000096
である、請求項２８に記載の化合物。
【請求項４７】
Ｒ１４が、
【化３２】
2019519491.tif 000097
である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項４８】
Ｒ１４が、
【化３３】
2019519491.tif 000098
である、請求項２８に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許商標庁において２０１７年５月９日に出願の米国仮特許出願第６２／３３３，４２７号の優先権、および米国特許法１１９条に基づき生じる全ての利益を主張し、その全開示内容を参照により本願明細書に組み込む。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
本発明は、米国国立衛生研究所からの政府支援により一部なされたものである。米国政府は、本発明に関し一定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、エバンスブルー色素の官能化誘導体に関し、具体的には、放射線治療剤およびイメージング剤として有用なエバンスブルー色素の官能化誘導体に関する。
【背景技術】
【０００４】
医薬の効果は、薬物動態に大きく依存する。医薬用の化合物は、特に、患者に対して所期の効果を発揮させるために充分な半減期がなければならない。身体における医薬品化合物の半減期を増加させるため、各種のアプローチがこれまで用いられた。半減期を増加させる１つの方法は、身体から薬剤のクリアランスの速度を低下させることであり、それは、薬剤の直接の修飾によるか、またはクリアランス経路に作用する他の薬剤の添加による、クリアランス機構の抑制により可能となる。特にタンパク質製剤の場合、それらはプロテアーゼによる分解に対し非常に感受性が高いため、クリアランスの低下が特に求められる。
【０００５】
一般に、腎臓は６０ｋＤａ未満の分子をろ過するため、クリアランス速度を低下させるための１つの方法は、例えば、タンパク質の融合、グリコシル化またはポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）の添加により、タンパク質薬剤の分子のサイズを増加させることである。しかしながら、これらのアプローチのいくつかには、短所が存在する。例えば、医薬品の薬物動態を改善する１つの一般的なストラテジーは、治療化合物にポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分を結合させることであり、これはＰＥＧ化として公知の方法である。しかしながら、薬剤または治療的タンパク質に対してＰＥＧを共有結合させることにより、宿主の免疫系から薬剤をマスキングすることで免疫原性および抗原性を低下させ、また薬剤の流体力学的サイズを増加させることで腎臓クリアランスを低下させる結果その循環時間を長期化させることが生じうる。またＰＥＧ化により、疎水性の薬剤およびタンパク質に水溶性を付与することも可能となる。しかしながら、ＰＥＧ鎖のかさ高いサイズのため、生物学的活性は、ＰＥＧ化の後、不可避的に損なわれる。
【０００６】
小分子またはタンパク質薬剤を、アルブミンまたは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインなどの巨大タンパク質と融合させることにより、薬剤の分子サイズの増加、およびそれによる腎臓クリアランスの低下による薬剤半減期の増加が可能となる。アルブミンまたはＩｇＧ  Ｆｃドメインとの融合は、サイズを増加させることに加え、融合後の複合体に官能性を付与し、また、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用を生じさせることで、結合したリガンドを細胞内の異化作用からサルベージし、それらが循環系中で再利用されるのを可能にする。このＦｃＲｎとの相互作用は、ヒトにおける、アルブミンおよびＩｇＧの２１日にもわたる非常に長い血清中半減期をもたらす。したがって、アルブミンまたは血清中ＩｇＧと相互作用するタンパク質または小分子薬剤を創出することは、腎臓クリアランスおよび細胞内の異化作用を低減することにより半減期を著しく増加させることにつながると考えられる。これらの方法により、治療薬によるインビボ曝露を延長させることができる。
【０００７】
血漿中において最も豊富な（約５０ｍｇ／ｍＬ）タンパク質としての、６６．５ｋＤａの分子量を有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、血液における主要なキャリアータンパク質である。それは、長鎖脂肪酸の主要な可溶化剤、ビリルビンとの結合によるタンパク質の解毒および血液中における重金属イオンの輸送ビヒクルとして作用する。１９９０年代半ばから、アルブミンは、炎症性または悪性組織に対する薬剤のターゲティング、またはそれらの半減期の延長のためのキャリアータンパク質として研究されてきた。２つの主要なアルブミンベースの技術が、治療的使用のために開発されている。１つの方法は、高圧下で親油性薬剤およびＨＳＡをジェット噴射し、アルブミン−薬剤ナノ粒子を形成させる方法である。もう１つの方法は、静脈内注射の後、循環アルブミンに共有結合または非共有結合によりインサイチューで結合するアルブミン結合ペプチドまたはプロドラッグを開発することである。
【０００８】
アルブミンは、循環血液中に非常に豊富に存在するため、薬剤担体として、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に勝る効果を発揮する。薬剤放出を考慮に入れると、アルブミン結合能と該結合からの効果的な薬剤放出との間でバランスをとる必要があるため、物理的な結合が、共有結合よりも好ましい。システイン３４のフリーのチオール基が、細胞外タンパク質の独特の特徴であり、血漿中におけるチオール濃度のほぼ９０％を占めるため、プロドラッグをアルブミンと共有結合させるためには、通常、アルブミンの３４位のシステインが用いられる。例えば、この種のプロドラッグの第１の、かつ最も進歩したプロトタイプは、ドキソルビシンの（６−マレイミドカプロイル）ヒドラゾン誘導体（ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ）であり、それは静脈内投与後、内因性のアルブミンのシステイン３４位に迅速に、かつ選択的に密接に結合する、ドキソルビシンの酸感受性プロドラッグである。アルドキソルビシンは、腫瘍細胞によるアルブミンコンジュゲートの細胞内取り込み後に、腫瘍組織において通常みられる弱酸性環境において細胞外に、または、酸性のエンドソームもしくはリソソーム区画において細胞内に、ドキソルビシンが放出されることを可能にする酸感受性ヒドラゾンリンカを含む。
【０００９】
アルブミンとの物理的相互作用の１つの例は、レベミル（Ｌｅｖｅｍｉｒ）（登録商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社）という、ミリスチン酸（テトラデカン酸）が位置Ｂ２９でリジンアミノ酸に結合している、糖尿病治療用のインスリンアナログの開発である。レベミル上に存在し、血清アルブミンに結合する脂肪酸は、インスリンを長時間作用性の形態にする。インスリン投与の他に、糖尿病におけるグルコースレベル制御のための他の選択肢は、インスリン分泌を刺激することである。ペプチドホルモンＧＬＰ−１−（７−３７）は、プログルカゴン分子の選択的な切断から生じ、膵細胞におけるインスリン分泌を増加させるが、遍在する酵素による分解により１．５〜２分間の半減期に留まる。レベミル（登録商標）と同様、ＧＬＰ−１−（７−３７）は、ＧＬＰ−１ペプチド配列におけるグルタミン酸のＮ末端部位に導入されたリジンのε−アミノ部位に対する脂肪酸（例えばパルミチン酸）により誘導体化する。得られる新薬リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）（Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標））は、アルブミンとの結合により代謝性の分解に対する安定性を有する、ＧＬＰ−１のアルブミン結合誘導体であり、皮下投与後１１〜１５時間の血漿中半減期を有する。より良好な薬剤様特性のために修飾される抗糖尿病性ペプチドの更なる例は、非特許文献１に開示されている。
【００１０】
アルブミンベースの薬物送達システムは、糖尿病などの代謝異常に対する治療オプションとして重要であるのみならず、癌治療に対しても有用である。薬剤担体としてアルブミンを使用することで、固形腫瘍へのドラッグデリバリにおいていくつかの特有の効果が得られる。第１に、アルブミンベースの薬剤担体は、受動的な腫瘍ターゲティングと比較し、強化された浸透性および高分子保持能を提供する（ＥＰＲ効果）。さらに、２つのアルブミン結合タンパク質が、腫瘍内皮上のｇｐ６０受容体およびＳＰＡＲＣ（腫瘍間質に存在する、アルブミンに対する高い結合能を有する分泌糖タンパク質）などの腫瘍特有の環境において過剰発現することが解っている。ＥＰＲ効果の他に、２つのアルブミン結合タンパク質の相互作用が、腫瘍におけるアルブミンの取り込みおよび保持を促進する。
【００１１】
エバンスブルー（ＥＢ）は、血清アルブミンに対し高い親和性を有するアゾ色素である。それは血液量の測定において多用されるが、高分子の透過性を示す目的でも使用できる。ＥＢはアルブミンと強く結合するため、それは大型のアルブミン分子が局在化する部位のマーカーとして利用でき、ゆえに、例えば脳血液関門（ＢＢＢ）などのバリアの透過性の評価に使用できる。アルブミンはＢＢＢを通過できず、また実質的にすべてのＥＢがアルブミンに結合するため、ＥＢがＣＮＳに取り込まれるときは、ＢＢＢが危険に曝された場合のみとなる。また、アルブミンに結合したＥＢは、健常細胞ではなく損傷した細胞または死細胞に取り込まれるため、ＥＢは生存率アッセイにも用いられている。
【００１２】
エバンスブルー色素の誘導体は、従来技術において周知である。例えば、Ｚｈａｎｇらの特許文献１は、アルブミンと結合するＥＢの短縮バージョンが、放射性核種または他の標識と結合できる大環状のキレート基（ＮＯＴＡ、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸）と結合しているイメージング剤を開示する。大環状のキレート基により形成されるかかる誘導体は、有用な血液プールのイメージング剤の提供につながる。同様に、Ｋａｔａｙａｍａらの特許文献２は、アルブミンと結合するＥＢの短縮バージョンが、放射性核種と結合する直鎖状キレート基に結合している、剥離した血管内皮部位に対する有用なイメージング剤を開示する。ＥＢ−ＮＯＴＡの合成および使用は、非特許文献２にも開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】中国特許第１０３２４２２５５号明細書
【特許文献２】国際公開第２００４／０７５９２５号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｋａｓｐａｒら、“Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，１８（１７）：ｐｐ．８０７−８１７（２０１３）
【非特許文献２】Ｎｉｕら、“Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｏｒ  ＰＥＴ”，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．５５：ｐｐ．１１５０−１１５６（２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記の薬剤−アルブミンコンジュゲートは、結合した薬剤の半減期を増加させることができるが、それらの組織がアルブミンと結合しない限り、組織特異的なターゲティングの改善が得られなかった。特定の細胞または組織を特異的にターゲッティングする能力は、コンジュゲートの治療効果を高めると考えられる。
【００１６】
アルブミンベースの治療法への可能性を高めるため、改良された薬剤−アルブミンコンジュゲートに対するニーズが存在する。本発明は、かかるニーズに応えるものと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一態様において、本発明は、式Ｉの化合物、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはかかるエステルもしくはアミドの塩、またはかかるエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物に関し、
【化１】
2019519491.tif 000003
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシ基から独立に選択され、
Ｒ１２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６ハロアルキル基であり、
Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｍ−であって、ｍは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｌ３は、−（ＣＨ２）ｐ−であって、ｐは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｒ１３は、キレート基である。
【００１８】
他の態様において、本発明は、式ＩＩＩの化合物、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはかかるエステルもしくはアミドの塩、またはかかるエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物に関し、
【化２】
2019519491.tif 000004
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシ基から独立に選択され、
Ｒ１２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６ハロアルキル基であり、
Ｒ１４は、ペプチドであり、
Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｍ−であって、ｍは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｌ３は、−（ＣＨ２）ｐ−であって、ｐは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｑ−であって、ｑは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されず、
Ｒ１３は、キレート基である。
【００１９】
更なる態様において、本発明は、薬学的に許容される担体と共に、更に放射性核種を含む上記の化合物の１つを含む医薬組成物に関する。
【００２０】
更なる態様において、本発明は、哺乳動物における癌を治療または診断する方法であって、前記哺乳動物に、治療的有効量の上記の化合物の１つを、任意に１つ以上の更なる活性成分と組合せて投与することを含む前記方法に関する。
【００２１】
これらの態様、また他の態様は、以下の発明の詳細な説明の記載から明らかになるであろう。
【００２２】
以下の発明の詳細な説明は、以下に係る図面を参照することにより、深く理解することができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】一実施態様に係る、治療剤またはイメージング剤として有用な化合物を示す図である。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、競合物のない場合の、インテグリンαｖβ３への化合物の（図２Ａ）、６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）と競合する場合の、インテグリンαｖβ３への化合物の（図２Ｂ）、および化合物のアルブミンへの（図２Ｃ）、最大結合量（％）対濃度（Ｌｏｇモル濃度、Ｌｏｇ［Ｍ］）のプロットである。図２Ｄおよび２Ｅは、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取り込み（図２Ｄ）および内在化（図２Ｅ）を示す、総量に対する％対時間（分）のプロットである。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、列挙された化合物のインテグリンαｖβ３との結合に関する、最大結合量（％）対濃度（Ｌｏｇモル濃度、Ｌｏｇ［Ｍ］）のプロットである。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、列挙された細胞タイプのうち、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ−２９細胞における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取り込み（図４Ａ）、ならびにＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞における内在化（図４Ｂ）、に関する、総量に対する％対時間（分）のプロットである。
【図５】ＨＴ−２９細胞における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの内在化に関する、総量に対する％対時間（分）のプロットである。
【図６】ヒト腫瘍組織に結合した６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの一組のマイクロＰＥＴイメージである。
【図７】マウス腫瘍異種移植における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの一組のマイクロＰＥＴイメージである。
【図８】マウス腫瘍異種移植における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取り込みに関する、グラム当たりの注入された投与量（％）（％ＩＤ／ｇ）対時間（時間）のプロットである。
【図９】血液および腫瘍における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取り込みに関する、グラム当たりの注入された投与量（％）（％ＩＤ／ｇ）対時間（時間）の一組のプロットである。
【図１０】各種タイプの組織における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取り込みに関する、グラム当たりの注入された投与量（％）（％ＩＤ／ｇ）のプロットである。
【図１１】マウス腫瘍異種移植における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの一組のマイクロＰＥＴイメージである。
【図１２】マウス腫瘍異種移植における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取り込みに関する、グラム当たりの注入された投与量（％）（％ＩＤ／ｇ）対時間（時間）のプロットである。
【図１３】異なるタイプの組織によるマウス腫瘍異種移植における、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取り込みに関する、グラム当たりの注入された投与量（％）（％ＩＤ／ｇ）のプロットである。
【図１４】マウス腫瘍異種移植における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢの取り込みに関する、グラム当たりの注入された投与量（％）（％ＩＤ／ｇ）対時間（時間）のプロットである。
【図１５】腫瘍体積（ミリメータ、ｍｍ）対各種の処理アームにおける処理日のプロットである。
【図１６】体重（開始日に対する重量（％））対各種の処理アームにおける処理日のプロットである。
【図１７】生存率（％）対各種の処理アームにおける処理日のプロットである。
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、腫瘍体積（図１８Ａ、ミリメータ、ｍｍ）および体重（図１８Ｂ、開始日に対する重量（％））対各種の処理アームにおける処理日のプロットである。
【図１９】注入後３日における、各種の処理アームの腫瘍異種移植に関する、一組のマイクロＰＥＴイメージ、およびグラム当たりの注入された投与量（％）（％ＩＤ／ｇ）の一組のプロットである。
【図２０】注入後１０日における、各種の処理アームの腫瘍異種移植に関する、一組のマイクロＰＥＴイメージ、およびグラム当たりの注入された投与量（％）（％ＩＤ／ｇ）の一組のプロットである。
【図２１】各種の処理アームにおける、処理後の異なるタイプの染色された細胞の一組のイメージである。
【図２２】６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤによる注入後の３人の健常なヒトボランティアの一組のＰＥＴイメージである。
【図２３】６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤによる注入後のヒト患者におけるグリア芽細胞腫の一組のＰＥＴイメージである。
【図２４】６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤによる注入後のヒト患者におけるグリア芽細胞腫の標準取り込み値（ＳＵＶ）対時間（時間）のプロットである。
【図２５】（ｉ）短縮型エバンスブルー（ＥＢ）色素分子、（ｉｉ）金属キレート、および（ｉｉｉ）マレイミドを特徴とする付加分子の設計を示す。
【図２６】短縮型ＥＢの誘導体の合成を示す。
【図２７】ＴＡＴＥ−ＳＨの合成、およびそれを含む反応混合物のＨＰＬＣ分析を示す。
【図２８】ＥＢ−ＴＡＴＥの合成を示す。
【図２９】ＥＢ−ＴＡＴＥおよびＴＡＴＥの構造を示す。
【図３０】ＡＲ４２Ｊラット膵臓神経内分泌腫瘍異種移植のモデルにおける６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥの評価を示す一組のＰＥＴイメージである。
【図３１】ＡＲ４２Ｊラット膵臓神経内分泌腫瘍異種移植のモデルにおける６４Ｃｕ−ＴＡＴＥの評価を示す一組のＰＥＴイメージである。
【図３２】図３２Ａおよび３２Ｂは、血液および腫瘍による６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥ対６４Ｃｕ−ＴＡＴＥの時間依存的な取り込みを示す図である。
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂは、血液および腫瘍による６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥ対６４Ｃｕ−ＴＡＴＥ（平均対最大）の時間依存的取り込みを示す図である。
【図３４】図３４Ａ、３４Ｂおよび３４Ｃは、膀胱、肝臓および腎臓による６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥ対６４Ｃｕ−ＴＡＴＥの時間依存的な取り込みを示す図である。
【図３５】図３５Ａおよび３５Ｂは、ＨＣＴ１１６  ＳＳＴＲ２陽性／陰性細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。
【図３６】ＨＣＴ１１６陽性細胞の免疫蛍光染色の結果を示す画像である。
【図３７】ＨＣＴ１１６陰性細胞の免疫蛍光染色の結果を示す画像である。
【図３８】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃおよび３８Ｄは、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥの細胞取り込み／内在化試験の結果を示す図である。
【図３９】図３９Ａおよび３９Ｂは、ＨＣＴ１１６  ＳＳＴＲ２＋／−細胞における８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥ細胞取り込み／内在化試験の結果を示す図である。
【図４０】図４０Ａおよび４０Ｂは、ＨＣＴ１１６  ＳＳＴＲ２＋／−細胞における８６Ｙ−ＴＡＴＥ細胞取り込み／内在化試験の結果を示す図である。
【図４１】結合動態、ＥＢ−ＴＡＴＥ−ＢＳＡの会合／解離定数を示すプロット図である。
【図４２】ＨＣＴ１１６＋異種移植における８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの評価を示す一組のＰＥＴイメージである。
【図４３】ＨＣＴ１１６＋／−異種移植における８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの評価を示す一組のＰＥＴイメージである。
【図４４】図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃおよび４４Ｄは、８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥおよび８６Ｙ−ＴＡＴＥの腫瘍および血液におけるＴＡＣを示す図である。
【図４５】図４５Ａ、４５Ｂおよび４５Ｃは、肝臓、腎臓および８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥおよび８６Ｙ−ＴＡＴＥの膀胱におけるＴＡＣを示す図である。
【図４６】注射後４８時間のＨＣＴ１１６＋異種移植（ＳＳＴＲ２陽性腫瘍）における８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥ対８６Ｙ−ＴＡＴＥの体内分布を示す図である。
【図４７】注射後４８時間のＨＣＴ１１６＋異種移植（ＳＳＴＲ２陽性腫瘍）における８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥ  Ｅの体内分布を示す図である。
【図４８】ＡＲ４２Ｊ異種移植における８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの評価を示す一組のＰＥＴイメージである。
【図４９】注射後４８時間のＡＲ４２Ｊ異種移植における８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの評価を示す一組のＰＥＴイメージである。
【図５０】図５０Ａおよび５０Ｂは、ＡＲ４２Ｊ腫瘍モデルにおける８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥ  ＴＡＣを示す図である。
【図５１】注射後４８時間のＡＲ４２Ｊ異種移植における８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの体内分布を示す図である。
【図５２】ＨＣＴ１１６  ＳＳＴＲ２＋腫瘍の免疫蛍光染色の結果を示す画像である。
【図５３】ＨＣＴ１１６  ＳＳＴＲ２−腫瘍の免疫蛍光染色の結果を示す画像である。
【図５４】図５４Ａ、５４Ｂ、５４Ｃ、５４Ｄ、５４Ｅおよび５４Ｆは、ＨＣＴ１１６異種移植の腫瘍増殖曲線における９０Ｙ放射線治療を示す図である。
【図５５】ＨＣＴ１１６異種移植の腫瘍増殖曲線における９０Ｙ放射線治療を示すプロットである。
【図５６】ＨＣＴ１１６異種移植の生存曲線における９０Ｙ放射線治療を示すプロットである。
【図５７】ＨＣＴ１１６異種移植の体重曲線における９０Ｙ放射線治療を示すプロットである。
【図５８】図５８Ａ、５８Ｂ、５８Ｃ、５８Ｄ、５８Ｅおよび５８Ｆは、ＨＣＴ１１６異種移植の腫瘍増殖曲線における９０Ｙ放射線治療を示す図である。
【図５９】ＨＣＴ１１６異種移植における９０Ｙ放射線治療としての、ＨＣＴ１１６  ＳＳＴＲ２−腫瘍の免疫蛍光染色の結果を示す一組の画像である。
【図６０】ＨＣＴ１１６異種移植における、９０Ｙ放射線治療としてのＳＳＴＲ２による免疫蛍光染色の結果を示す一組のイメージである。
【図６１】６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥイメージングを用いた処理の前後の、ＨＣＴ１１６  ＳＳＴＲ２＋腫瘍におけるＳＳＴＲ２の発現を示す一組のＰＥＴイメージである。
【図６２】図６２Ａ、６２Ｂ、６２Ｃおよび６２Ｄは、ＡＲ４２Ｊ異種移植における、９０Ｙ放射線治療による腫瘍成長曲線を示す図である。
【図６３】ＨＣＴ１１６異種移植における、９０Ｙ放射線治療による腫瘍成長曲線を示すプロットである。
【図６４】ＨＣＴ１１６異種移植における、９０Ｙ放射線治療による生存曲線を示すプロットである。
【図６５】ＨＣＴ１１６異種移植における、９０Ｙ放射線治療による体重曲線を示すプロットである。
【図６６】Ｋｉ６７およびＴＵＮＥＬ  ＨＣＴ１１６異種移植の染色実験の結果を示す一組のイメージである。
【図６７】Ｈ＆Ｅで染色したＨＣＴ１１６異種移植の結果を示す一組のイメージである。
【図６８】ＤＭＥＢ−ＣＴＴの構造を示す図である。
【図６９】膜関連タンパク質のみを染色した後のＰＳＭＡ発現レベルを示す図である。
【図７０】図７０Ａ、７０Ｂ、７０Ｃおよび７０Ｄは、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＣＴＴの細胞内取り込み／内在化の結果を示す図である。
【図７１】ＰＣ３−ＰＩＰ異種移植における６４Ｃｕ−ＥＢ−ＣＴＴの評価を示す一組のＰＥＴイメージである。
【図７２】図７２Ａおよび７２Ｂは、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＣＴＴの腫瘍および血液におけるＴＡＣを示す図である。
【図７３】異なる異種移植における６４Ｃｕ−ＥＢ−ＣＴＴの腫瘍内取り込みを示す図である。
【図７４】ＰＣ３−ＰＩＰ異種移植における６４Ｃｕ−ＥＢ−ＣＴＴの生体内分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
［用語］
化合物は、標準的な化合物名を用いて記載される。特に定義されない限り、本願明細書において用いられるすべての専門および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同様の意味を有する。
【００２５】
用語「ａ」および「ａｎ」は、量の限定を意味せず、むしろ参照された項目の少なくとも１つの存在を意味する。用語「または」は、「および／または」を意味する。用語「含む」、「有する」、「包含する」および「含有する」は、非限定的な用語として解釈される（すなわち「含むが、これに限定されない」ことを意味する）ものとする。
【００２６】
数値範囲の記載は、本願明細書において明示されない限り、個々に該範囲内に含まれる各値に関連する単なる簡便な記載方法として用いられることを目的とするに過ぎず、各値は、あたかも本願明細書において個々に記載されるかのようにそこに組み込まれる。すべての範囲の上限および下限値は、該範囲に含まれ、それぞれに組合せ可能である。
【００２７】
本願明細書に記載のすべての方法は、本願明細書において特に明記しない限り、または文脈から明らかに否定されうる場合を除き、適切な順序にて実施できる。すべての例または例示的用語（例えば「〜など」）の使用は、特許請求されない限り、単に本発明を適切に例示することを目的とするに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。明細書において用いられない用語は、本明細書で用いられる本発明の実施に必要な要素であって特許請求の範囲に記載されない要素を排除するものとして解釈されるべきではない。特に明記しない限り、本願明細書において用いられる技術的および科学的用語は、本開示の当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２８】
さらに、本開示は、すべての変形、組合せおよび配列を包含し、その際、列記される一つ以上の請求項に由来する一つ以上の限定、要素、節および説明的用語は、他の請求項にも導入される。例えば、他の請求項に従属するいかなる請求項も、同じ引用元の請求項に従属するその他のいずれかの請求項に存在する一つ以上の限定を含む態様に変更されうる。要素がリストとして、例えばマーカッシュ形式で示される場合、要素の各サブグループも開示されるものとし、またいずれかの要素を要素群から除外することもできる。
【００２９】
すべての化合物は、該化合物に存在する原子のすべての考えられる同位元素を含みうると理解される。同位元素には、質量数が異なることを除き、同じ原子番号を有する原子が含まれるものとし、重元素および放射性同位元素が包含される。一般的な例としては、限定されないが、水素の同位元素にはトリチウムおよび重水素が含まれ、炭素の同位元素には１１Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃが含まれる。したがって、本願明細書に開示される化合物は、化合物の構造中に、またはそれに結合する置換基として、重元素または放射性同位元素を含みうる。有用な重元素または放射性同位元素の例には、１８Ｆ、１５Ｎ、１８Ｏ、７６Ｂｒ、１２５Ｉおよび１３１Ｉが含まれる。
【００３０】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶには、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶのすべての薬学的に許容される塩が含まれる。
【００３１】
オープンエンドな用語「含む」には、「〜から本質的になる」や「〜からなる」などの中間的およびクローズエンドな用語が含まれる。
【００３２】
用語「置換される」は、指定される原子または基上の一つ以上のいずれかの水素原子が、示されるいずれかの基で置き換えられることを意味するが、指定される原子の原子価が通常の価数を上回ることはない。置換基および／または可変要素の組合せは、かかる組合せが安定な化合物、または有用な合成中間体をもたらす場合にのみ許容できる。安定な化合物または安定な構造とは、該化合物が、反応混合物からの単離、およびその後の有効な治療薬への製剤化を可能にする程度の強度を有することを意味するものとする。
【００３３】
２つの文字または記号の間のもの以外のダッシュ（「−」）は、置換基の結合する位置を示すために用いるものとする。
【００３４】
「アルキル」には、指定された炭素原子数、一般に１〜約８個の炭素原子を有する、分岐状および直鎖状の脂肪族飽和炭化水素基が含まれる。本明細書で用いられる用語Ｃ１−Ｃ６アルキルは、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルキル基を示す。他の実施態様には、１から８個の炭素原子、１〜４個の炭素原子または１もしくは２個の炭素原子を有するアルキル基（例えばＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ１−Ｃ２アルキル基）が含まれる。例えば−Ｃ０−Ｃ２アルキル（フェニル）など、Ｃ０−Ｃｎアルキルが本願明細書において他の基との組合せで用いられるときは、示される基（この場合フェニル基）が単結合（Ｃ０アルキル）によって直接結合されるか、または、指定された炭素原子数（この場合１、２、３または４個の炭素原子）を有するアルキル鎖により結合されることを指す。アルキル基は、例えば−Ｏ−Ｃ０−Ｃ４アルキル（Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル）のように、ヘテロ原子などの他の基を経て結合されてもよい。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、３−メチルブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、およびｓｅｃ−ペンチル基が含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
「アルコキシ」は、示される炭素原子数を有する上記のアルキル基が、酸素架橋（−Ｏ−）により、それが置換する基に共有結合した基である。アルコキシ基の例には、メトキシ、エトオキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、２−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、２−ヘキソキシ、３−ヘキソキシおよび３−メチルペントキシ基が含まれるが、これらに限定されない。同様に、「アルキルチオ」または「チオアルキル」基は、示される炭素原子数を有する上記のアルキル基が、硫黄架橋（−Ｓ−）により、それが置換する基に共有結合した基である。同様に、各例において、「アルケニルオキシ」、「アルキニルオキシ」および「シクロアルキルオキシ」基は、アルケニル、アルキニルおよびシクロアルキル基が、酸素架橋（−Ｏ−）により、それが置換する基に共有結合した基を指す。
【００３６】
「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味し、また重元素および放射性同位元素などのすべての同位元素を含むものとして本願明細書において定義される。有用なハロ同位元素の例には、１８Ｆ、７６Ｂｒおよび１３１Ｉが含まれる。さらなる同位元素も、当業者により容易に認識される。
【００３７】
「ハロアルキル」は、指定された炭素原子数を有し、１個以上のハロゲン原子により、通常、最大許容数のハロゲン原子により置換された分岐状および直鎖状アルキル基を意味する。ハロアルキル基の例には、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、２−フルオロエチルおよびペンタフルオロエチル基が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
「ハロアルコキシ」基は、酸素架橋（アルコールラジカルの酸素）により結合した、上記のハロアルキル基である。
【００３９】
「ペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合とも呼ばれる）を介して相互に結合したアミノ酸の鎖状分子を意味する。
【００４０】
「医薬組成物」は、少なくとも一つの活性薬剤（例えば式ＩＩの化合物またはその塩）と、少なくとも一つの他の物質（例えば担体）と、を含む組成物を意味する。医薬組成物は、ヒトの、または、ヒト以外の薬剤に関する米国ＦＤＡのＧＭＰ基準（適正製造基準）を満たす。
【００４１】
「担体」は、活性体の投与において併用される希釈剤、賦形剤またはビヒクルを意味する。「薬学的に許容される担体」は、医薬組成物の調製において有用であり、一般に安全、無毒性で、また生物学的に望ましくない性質を有さない物質（例えば、賦形剤、希釈剤またはビヒクル）を意味し、獣医学的使用およびヒトの製薬用への使用に対して許容できる担体が含まれる。「薬学的に許容される担体」は、かかる担体を１つまたは１つ以上含む。
【００４２】
「患者」は、医療的処理を必要とするヒトまたはヒト以外の動物を意味する。医療的処理には、既存の症状（例えば疾患または障害）の治療または診断的処理が含まれうる。いくつかの実施態様において、前記患者はヒト患者である。
【００４３】
「提供する」とは、与えること、投与すること、販売すること、配布すること、移転すること（利益の有無を問わない）、製造すること、調合することまたは分注すること、を意味する。
【００４４】
「治療」または「治療すること」とは、何らかの疾患・徴候を顕著に低減し、疾患の進行を遅延させ、または疾患の退縮を引き起こすのに十分な量で患者に活性化合物を提供することを意味する。特定の実施態様において、疾患の治療は、患者が疾患の症状を示す前に開始してもよい。
【００４５】
医薬組成物の「治療上有効量」とは、患者に投与したときに、治療的利益（例えば症状の改良）を提供し、疾患の進行を低減し、または疾患の退縮をもたらすのに有効な量を意味する。
【００４６】
「治療化合物」とは、疾患の診断または治療に用いられうる化合物を意味する。該化合物は、小分子、ペプチド、タンパク質または他の種類の分子であってもよい。
【００４７】
有意な変化とは、統計的有意差に関する標準的なパラメトリック検定、統計的に有意（例えばＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定でｐ＜０．０５）であるいかなる検出可能な変化であってもよい。
【００４８】
［化学構造に関する説明］
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの化合物は、一つ以上の非対称要素（例えば立体中心、対称軸等（例えば不斉炭素原子））を含んでもよく、その結果、該化合物は異なる立体異性体の形態で存在しうる。これらの化合物は、例えば、ラセミ体または光学活性体であってもよい。二つ以上の非対称要素を有する化合物の場合、これらの化合物はさらにジアステレオマ混合物である場合もある。不斉中心を有する化合物の場合、純粋形態の光学異性体、およびそれらの混合物がすべて包含される。これらの状況において、単一のエナンチオマ（すなわち光学活性形態）は、不斉合成によって得ることが可能であり、その合成は光学的に純粋な前駆体からの合成、またはラセミ体の分割によって行う。ラセミ体の分割は、また分割剤の存在下における結晶化またはクロマトグラフィ（例えばキラルＨＰＬＣカラム）などの従来技術により実施できる。それらを得るために用いる方法に関係なく、すべての形態が本願明細書において包含される。
【００４９】
活性薬剤のすべての形態（例えば溶媒和物、光学異性体、鏡像異性的形、多形、フリー体化合物および塩）が、単独または組合せで使用できる。
【００５０】
用語「キラル」とは、鏡像パートナを重ね合わせることができない分子を指す。
【００５１】
「立体異性体」とは、同一の化学構造を有するが、空間的に原子または基の配列に関して異なる化合物である。
【００５２】
「ジアステレオマ」とは、二つ以上のキラル中心を有し、分子が互いに鏡像関係ではない立体異性体である。ジアステレオマは、融点、沸点、分光特性および反応性などの物性が異なる。ジアステレオマ混合物は、電気泳動、分割剤の存在下での結晶化またはクロマトグラフィ（例えばキラルＨＰＬＣカラム）などの高分解能解析手段を用いて分離できる。
【００５３】
「エナンチオマ」とは、相互に重ね合わせることができない鏡像関係にある、２つの化合物の立体異性体を指す。エナンチオマの５０：５０の混合物は、ラセミ混合物またはラセミ体と呼ばれ、化学的反応またはプロセスにおいて立体選択性または立体特異性がない場合に生じうる。
【００５４】
本願明細書において用いられる立体化学的な定義および慣例は、通常Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、および、Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９９４）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに従う。多くの有機化合物は、光学活性形態において存在し、すなわち、それらは平面偏光面を回転させる能力を有する。光学活性化合物を記載する場合、接頭辞ＤおよびＬ、またはＲおよびＳを用いて、そのキラル中心に対する分子の絶対配置を定義する。接頭辞ｄおよびｌ、または（＋）および（−）は、化合物による平面偏光の回転方向を示すために用い、（−）またはｌは、該化合物が左旋性であることを意味する。（＋）またはｄの接頭辞の化合物は右旋性である。
【００５５】
「ラセミ混合物」または「ラセミ体」とは、２つの鏡像異性種の等モル（または５０：５０）混合物であって、光学活性を有さないものである。化学的反応またはプロセスにおいて立体選択性または立体特異性がない場合にラセミ混合物が生じうる。
【００５６】
「キレート基」または「キレータ」とは、一個の中心原子に２以上の別々の配位結合を形成できるリガンド基であり、それは通常金属イオンである。本願明細書において開示されるキレート基は、複数のＮ、ＯまたはＳヘテロ原子を有する有機基であり、二つ以上のヘテロ原子による同じ金属イオンへの結合形成を可能にする構造を有する。
【００５７】
「薬学的に許容される塩」には、開示される化合物の誘導体であって、親化合物が、無機および有機の、無毒性の、酸または塩基付加塩となることにより修飾されたものが含まれる。本発明の化合物の塩は、従来の化学的方法により、塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成できる。通常、かかる塩は、これらの化合物のフリー体の酸と適切な化学両論量の塩基（例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカリウムの水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）との反応により、または、これらの化合物のフリー体の塩基と適切な化学両論量の酸との反応により、調製できる。かかる反応は、水もしくは有機溶媒中で、または、典型的にはこれら２つの混合液中で実施される。通常、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルなどの非水性溶媒を用いるのが実際的である。本発明の化合物の塩には更に、該化合物および該化合物の塩の溶媒和物が含まれる。
【００５８】
薬学的に許容される塩には、アミンなどの塩基性残基の無機塩または有機酸塩、酸性残基（例えばカルボン酸）のアルカリまたは有機塩などが含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩には、親化合物の、無毒性の無機または有機酸などから形成される従来公知の無毒性塩および第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、従来公知の無毒性の酸塩には、塩酸、臭素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等の無機酸に由来するもの、ならびにプロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、メシル酸、エシル酸、ベシル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタン硫酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、ｎが０〜４であるＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ等の有機酸から調製される塩が含まれる。更なる適切な塩のリストは、例えば、Ｇ．Ｓｔｅｆｆｅｎ  Ｐａｕｌｅｋｕｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００７，５０，６６６５、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２に記載されている。
【００５９】
上記のように、一態様において、本発明は、以下に示す式Ｉの化合物を有するエバンスブルー色素の化学的コンジュゲート、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはかかるエステルもしくはアミドの塩、またはかかるエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物を包含するものである。
【化３】
2019519491.tif 000005
【００６０】
式Ｉ中、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシ基から独立に選択され、Ｒ１２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６ハロアルキル基であり、Ｒ１３は、キレート基である。いくつかの実施態様において、キレート基は、大環状部分（例えばＮＯＴＡ基（ｇｒｏｕｐ）、ＤＯＴＡ基（ｇｒｏｕｐ）、メルカプトアセチルトリグリシン（ＭＡＧ３）、ジピコリラミンエタン酸（ＤＰＡ）、シクロデキストリン、クラウンエーテルまたはポルフィリンなど）でもよく、または直鎖状部分（例えば１，４，７−トリアザヘプタン−１，４，７，７−テトラ酢酸基（1,4,7-triazaheptane-1,4,7,7-tetracetic acid group））であってもよい。これらの化合物のいくつかの化学構造を以下に示す。
【化４】
2019519491.tif 000006
【化５】
2019519491.tif 000007
【化６】
2019519491.tif 000008
【化７】
2019519491.tif 000009
【化８】
2019519491.tif 000010
【００６１】
式Ｉは、−（ＣＨ２）ｍ−である連結基Ｌ１（式中、ｍは０から１２の整数である。）、−（ＣＨ２）ｎ−である連結基Ｌ２（式中、ｎは０から１２の整数である。）、および−（ＣＨ２）ｐ−である連結基Ｌ３（式中、ｐは０から１２の整数である。）を含んでもよい。各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４において、各ＣＨ２は−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で個々に置換されてもよいが、但し２つの隣接するＣＨ２基が置換されることはない。
【００６２】
いくつかの実施態様において、連結基Ｌ１〜Ｌ３は、ポリエチレングリコール部分−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−を含む。
【００６３】
式Ｉの一実施態様において、Ｌ１は−ＮＨ（ＣＯ）である。式Ｉの他の実施態様において、Ｌ２は−（ＣＨ２）４−ＮＨ（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−である。式Ｉのさらに他の実施態様において、Ｌ３は−ＮＨ（ＣＯ）ＣＨ２−である。
【００６４】
式Ｉのさらに他の実施態様において、Ｒ１およびＲ４は独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシ基から選択される。
【００６５】
式Ｉのさらに他の実施態様において、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、各々水素である。
【００６６】
式Ｉのさらに他の実施態様において、Ｒ１およびＲ４は独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキル基から選択される。
【００６７】
式Ｉのさらに他の実施態様において、Ｒ１およびＲ４は各々メチル基である。
【００６８】
式Ｉのさらに他の実施態様において、Ｒ１２は水素である。
【００６９】
式Ｉのさらに他の実施態様において、Ｒ１３は、
【化９】
2019519491.tif 000011
【化１０】
2019519491.tif 000012
【化１１】
2019519491.tif 000013
【化１２】
2019519491.tif 000014
【化１３】
2019519491.tif 000015
、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される。
【００７０】
式Ｉのさらに他の実施態様において、Ｒ１３は、
【化１４】
2019519491.tif 000016
または
【化１５】
2019519491.tif 000017
である。
【００７１】
他の態様において、本発明は、以下に示す式ＩＩの化合物を有するエバンスブルー色素の化学的コンジュゲート、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはかかるエステルもしくはアミドの塩、またはかかるエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物を包含するものである。
【化１６】
2019519491.tif 000018
【００７２】
式ＩＩにおいて、連結基Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は個々に−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で置換されてもよいが、ただし２つの隣接するＣＨ２基は置換されない。式ＩＩにおいて、Ｒ１３は、キレート基である。
【００７３】
式ＩＩのいくつかの実施態様において、Ｒ１３は、
【化１７】
2019519491.tif 000019
【化１８】
2019519491.tif 000020
【化１９】
2019519491.tif 000021
【化２０】
2019519491.tif 000022
【化２１】
2019519491.tif 000023
、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される。
【００７４】
式ＩＩのさらに他の実施態様において、Ｒ１３は、
【化２２】
2019519491.tif 000024
または
【化２３】
2019519491.tif 000025
である。
【００７５】
式ＩＩの他の実施態様において、Ｌ２は−（ＣＨ２）４−ＮＨ（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−である。
【００７６】
他の態様において、本発明は、以下に示す式ＩＩＩの化合物を有するエバンスブルー色素の化学的コンジュゲート、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはかかるエステルもしくはアミドの塩、またはかかるエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物を包含するものである。
【化２４】
2019519491.tif 000026
【００７７】
式ＩＩＩにおいて、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシ基から選択され、Ｒ１２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６ハロアルキル基であり、Ｒ１４は、ペプチドである。
【００７８】
式ＩＩＩは、−（ＣＨ２）ｍ−である連結基Ｌ１（式中、ｍは０から１２の整数である。）、−（ＣＨ２）ｎ−である連結基Ｌ２（式中、ｎは０から１２の整数である。）、−（ＣＨ２）ｐ−である連結基Ｌ３（式中、ｐは０から１２の整数である。）、および−（ＣＨ２）ｑ−である連結基Ｌ４（式中、ｑは０から１２の整数である。）を含んでもよい。各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４において、各ＣＨ２は−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で個々に置換されてもよいが、但し２つの隣接するＣＨ２基が置換されることはない。式ＩＩＩにおいて、Ｒ１３は、キレート基である。
【００７９】
式ＩＩＩの一実施態様において、Ｌ１は−ＮＨ（ＣＯ）−であり、Ｒ１およびＲ４は各々メチル基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は各々水素である。
【００８０】
Ｒ１４のペプチドは、治療用ペプチド（例えば疾患を治療できるペプチドまたは疾患の診断に使用できるペプチド）であってもよい。Ｒ１４のペプチドには、インターフェロンα、顆粒球コロニー刺激因子、オクトレオテート、ボンベシン、ＲＧＤ、α−ＭＳＨ、ＣＴＴ１２９８またはアプタマなどのペプチドが含まれうる。前記ペプチドは、未だ式ＩＩＩの一部として結合されたまま生物活性を示すものであってもよく、または、前記ペプチドは例えばペプチダーゼ酵素により式ＩＩＩから分離されるものであってもよい。前記ペプチドは、標的細胞または組織に結合できるペプチドであってもよく、例えば前記ペプチドは腫瘍に結合ができるものであってもよい。前記結合は、共有結合性または非共有結合によるものであってもよい。
【００８１】
例えば、Ｒ１４のペプチドは、環状ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓであってもよい。Ｒ１４のペプチドは、以下のものであってもよい。
【化２５】
2019519491.tif 000027
【００８２】
他の実施態様において、Ｒ１４のペプチドは、以下のものであってもよい。
【化２６】
2019519491.tif 000028
【００８３】
さらに他の実施形態において、Ｒ１４のペプチドは、以下のものであってもよい。
【化２７】
2019519491.tif 000029
【００８４】
いくつかの実施態様において、Ｒ１４は、治療化合物である。前記治療化合物は、治療的な特性を有するいかなる化合物でもあってもよく、治療的小分子、ペプチド薬剤またはタンパク質ベースの治療剤が含まれうる。式ＩＩＩにおいて有用な、適切な治療的小分子の例には、ドキソルビシン、パクリタキセル、ゲムシタビン、カンプトセシン、テモゾロマイドなどが含まれるが、これらに限定されない。式ＩＩＩにおいて有用な、適切なペプチド薬剤の例には、インスリン、ＧＬＰ−１、エキセンディン−４、オクトレオチド、ボンベシン、ＲＧＤペプチド（アルギニルグリシルアスパラギン酸）またはそれらの治療的断片などが含まれるが、これらに限定されない。式ＩＩＩにおいて有用な、適切な治療的タンパク質の例には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼなど、またはそれらの治療的断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、式ＩＩＩの治療化合物Ｒは、哺乳類、好ましくはヒトにおける疾患または症状の治療または診断に使用できる。例えば、一例において、癌または糖尿病を治療または診断する能力を有するＲが選択される。
【００８５】
Ｒ１４が、天然の治療的分子または治療的活性を有するその断片であってもよいことを理解すべきである。好ましくは、Ｒ１４は、それと式Ｉのマレイミド部分との間のコンジュゲーションまたは架橋による式ＩＩＩの複合体形成を可能にするスルフヒドリル部分を含む。治療化合物上の活性型スルフヒドリル部分は、天然由来（例えばエキセンディン−４におけるシステイン−４０）であってもよく、または公知の方法（例えばアミノ酸置換または化学修飾）により治療化合物またはその断片に人工的に付与してもよい。
【００８６】
いくつかの実施態様において、Ｒ１４は更に、放射性核種（例えば１８Ｆ、７６Ｂｒ、１２４Ｉ、１２５Ｉまたは１３１Ｉ）を含む。放射性核種を含むＲ１４の有用な置換基の例は、以下のとおりである。
【化２８】
2019519491.tif 000030
【００８７】
いくつかの実施態様において、Ｒ１３は、
【化２９】
2019519491.tif 000031
【化３０】
2019519491.tif 000032
【化３１】
2019519491.tif 000033
【化３２】
2019519491.tif 000034
【化３３】
2019519491.tif 000035
、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される。
【００８８】
いくつかの実施態様において、Ｒ１３は、
【化３４】
2019519491.tif 000036
または
【化３５】
2019519491.tif 000037
である。
【００８９】
いくつかの実施態様において、式ＩＩＩにおけるＲ１３基は更に、放射性核種（例えば６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、８６Ｙ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８９Ｚｒ、９９Ｔｃ、１５３Ｓｍ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａまたはその他）を含む。いくつかの実施態様において、Ｒ１３に含まれる放射性核種は、６４Ｃｕまたは９０Ｙである。前記放射性核種は、キレート化または化学分野において公知の従来の共有結合またはイオン結合などの他の手段により、Ｒ１３に結合されうる。前記放射性核種は、例えばイメージングまたはスキャニング、例えばＰＥＴイメージングなどの適切な目的で使用でき、それにより式ＩＩＩの化合物はＰＥＴイメージング剤となりうる。前記放射性核種は、患者の治療（例えば放射線治療）に適するものであってもよく、それにより式ＩＩＩの化合物は癌の治療剤となりうる。
【００９０】
他の態様において、本発明は、以下に示す式ＩＶの化合物を有するエバンスブルー色素の化学的コンジュゲート、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはかかるエステルもしくはアミドの塩、またはかかるエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物を包含するものである。
【化３６】
2019519491.tif 000038
【００９１】
式ＩＶにおいて、Ｒ１４はペプチドであり、Ｒ１３はキレート基である。
【００９２】
式ＩＶは、−（ＣＨ２）ｎ−である連結基Ｌ２（式中、ｎは０から１２の整数である。）、および−（ＣＨ２）ｑ−である連結基Ｌ４（式中、ｑは０から１２の整数である。）を含んでもよい。各Ｌ２およびＬ４において、各ＣＨ２は−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−で個々に置換されてもよいが、但し２つの隣接するＣＨ２基が置換されることはない。
【００９３】
いくつかの実施態様において、連結基Ｌ１〜Ｌ４は、ポリエチレングリコール部分−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−を含む。
【００９４】
一実施態様において、Ｌ２は−（ＣＨ２）４−ＮＨ（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−であり、Ｌ４−Ｒ１４は以下のとおりである。
【化３７】
2019519491.tif 000039
【００９５】
他の実施態様において、Ｒ１３は、
【化３８】
2019519491.tif 000040
【化３９】
2019519491.tif 000041
【化４０】
2019519491.tif 000042
【化４１】
2019519491.tif 000043
【化４２】
2019519491.tif 000044
、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される。
【００９６】
いくつかの実施態様において、Ｒ１３は、
【化４３】
2019519491.tif 000045
または
【化４４】
2019519491.tif 000046
である。
【００９７】
式ＩＩＩの化合物に関して行ったＲ１４の実施態様の説明は、式ＩＶの化合物にも適用される。また、式ＩＶのＲ１３および／またはＲ１４は上記の放射性核種を更に含んでもよく、式ＩＩＩの化合物に関して行った放射性核種の実施態様の説明は、式ＩＶの化合物にも適用される。
【００９８】
いくつかの実施態様において、本開示における新規な分子は、アルブミン結合モチーフとしての短縮型エバンスブルードメイン、放射性核種による標識のためのキレータ、スペーサ、リンカとしてのマレイミド由来残基、および生体分子結合モチーフを含む（図１）。
【００９９】
［医薬調製物］
ある式への参照はすべての下位概念に係る式への参照を含み、例えば式ＩＩＩは式ＩＶの化合物を含む。本願明細書において開示される化合物は、純粋な化学薬品として投与されることもできるが、好ましくは医薬組成物として投与される。したがって、本発明は、少なくとも一つの薬学的に許容される担体と共に、式ＩＩＩの化合物などの化合物または該化合物の薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を包含する。前記医薬組成物は、唯一の活性薬剤として式ＩＩＩの化合物または塩を含んでもよいが、好ましくは少なくとも更に一つの活性薬剤を含む。特定の実施態様において、前記医薬組成物は、約０．１ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇ、または約２００ｍｇ〜約６００ｍｇの式ＩＩＩの化合物と、任意に、約０．１ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇ、または約２００ｍｇ〜約６００ｍｇの更なる活性薬剤と、を含む単位投与形態の投与形態である。前記医薬組成物は、式ＩＩＩの化合物などの化合物と、更なる活性薬剤とを、所定のモル比で含んでもよい。例えば、前記医薬組成物は、式ＩＩＩの化合物と更なる活性薬剤とを、約０．５：１、約１：１、約２：１、約３：１または約１．５：１〜約４：１のモル比で含んでもよい。
【０１００】
本願明細書において開示される化合物は、従来公知の薬学的に許容される担体を含む単位投与製剤として、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入または噴霧により、舌下的に、経皮的に、口腔的に、直腸内に、点眼剤として、または他の手段により投与されうる。前記医薬組成物は、例えばエアゾール、クリーム、ゲル、ピル、カプセル、錠剤、シロップ、経皮パッチまたは点眼剤としてなど、いかなる薬学的に有用な形状に調製化されてもよい。投与形態によっては（例えば錠剤およびカプセルの場合）、適切な量（例えば所望の目的を達成するための有効量）の活性成分を含む適切なサイズにデザインされた投与単位に更に分割される。
【０１０１】
担体は、賦形剤および希釈剤を含み、また治療を受ける患者への投与に適するだけの十分な純度を有し、また十分な毒性の低さを有しなければならない。担体は不活性であってもよく、またはそれ自体が医薬的有効性を有していてもよい。化合物と共に用いられる担体の量は、化合物の投与単位の実際量を提供するのに十分な量である。
【０１０２】
担体の種類としては、結合剤、緩衝剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、フレーバ、滑沢剤、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、錠剤化用剤および湿潤剤が挙げられるが、これらに限定されない。一つ超の種類のいくつかの担体を列挙しうるが、例えば植物油は、いくつかの製剤においては潤滑剤として、他の場合には希釈剤として使用可能である。薬学的に許容される担体の例としては、砂糖、デンプン、セルロース、トラガント粉末、モルト、ゼラチン、タルクおよび植物油が挙げられる。本発明の化合物の活性を実質的に妨害しない、任意の活性薬剤を、前記医薬組成物に含有させてもよい。
【０１０３】
医薬用組成物／配合剤は、経口投与用に製剤化されてもよい。これらの組成物は、式ＩＩＩの化合物を０．１〜９９重量％（ｗｔ％）、通常では式ＩＩＩの化合物を少なくとも約５重量％含む。いくつかの実施態様では、式ＩＩＩの化合物を約２５重量％〜約５０重量％、または約５重量％〜約７５重量％含む。
【０１０４】
［治療方法］
式ＩＩＩの化合物、ならびに該化合物を含む医薬組成物は、糖尿病または癌などの疾患の診断または治療に有用である。本発明において、糖尿病の治療方法は、かかる治療を必要とする患者に式ＩＩＩの化合物を治療的有効量で投与することを含む。一実施態様において、前記患者は、哺乳動物、より具体的にはヒトである。当業者に理解できるように、本発明はまた、ヒト以外の患者、例えばネコ、イヌおよび家畜などのコンパニオンアニマルの治療方法を包含する。
【０１０５】
医薬組成物の治療的有効量とは、好ましくは、疾患または症状の状態を軽減または改善するのに十分な量である。例えば糖尿病の場合、治療的有効量は、高血糖を軽減または改善するのに十分な量でありうる。本願明細書に記載される化合物または医薬組成物の治療的有効量は、患者に投与されるとき、式ＩＩＩの化合物の十分な濃度が提供される。十分な濃度とは、好ましくは、障害を予防し、または戦うのに必要な、患者の身体における化合物の濃度である。かかる量は、例えば化合物の血中濃度のアッセイにより、または理論的に生物学的利用能を算出することにより、実験的に確認されうる。
【０１０６】
本発明によると、本願明細書において開示される治療方法は、特定の投与量の式ＩＩＩの化合物を患者に提供することを含む。約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇ／ｋｇ体重／日の各化合物の投与量は、上記で示した症状の治療において有用である（１患者あたり１日約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。単一投与形態の製造のために担体物質と組合せることができる化合物の量は、治療される患者や特定の投与形態に依存し変動するであろう。単位投与形態は通常、活性成分を約１ｍｇ〜約５００ｍｇの間で含有することになろう。特定の実施態様において、２５ｍｇ〜５００ｍｇ、または２５ｍｇ〜２００ｍｇの式Ｉの化合物が患者に毎日投与される。投与頻度は、使用する化合物および治療される特定の疾患に応じて変化しうる。しかしながら、ほとんどの疾患および障害の治療において、投与計画は１日４回以下が採用され、特定の実施態様において、１日１または２回の投与計画が採用される。
【０１０７】
しかしながら、特定の患者に対する具体的な投与量は、使用される具体的な化合物の活性、患者の年齢、体重、総体的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、併用する薬剤、および治療中の具体的な疾患の重篤度などのさまざまな要因に依存することが理解されるべきである。
【０１０８】
式ＩＩＩの化合物は、糖尿病などの疾患および症状の治療または予防のために単独で（すなわち投与計画における唯一の治療薬として）投与されてもよく、または他の活性薬剤との組合せで投与されてもよい。１つ以上の式ＩＩＩの化合物は、１つ以上の他の活性薬剤（例えば抗癌細胞毒性剤）の投与計画との連携において投与されてもよい。一実施態様において、哺乳動物における癌の治療または診断方法は、前記哺乳動物に、治療的有効量の式ＩＩＩの化合物を、任意に１つ以上のさらなる活性成分との組合せで投与することを含む。
【０１０９】
当業者により理解されるように、本願明細書において提供される治療方法は、ヒト以外の哺乳動物の治療にも有用であり、ウマおよび家畜（例えばウシ、ヒツジ、乳牛、ヤギ、ブタ等）、ならびにペット（例えばイヌおよびネコ等のコンパニオンアニマル）などの治療に係る獣医学的用途にも有用である。
【０１１０】
診断または研究用途では、齧歯動物（例えばマウス、ラット、ハムスタ）、ウサギ、霊長類およびブタ（例えば近交系のブタ等）を含む多様な哺乳動物が、適切な被験体である。さらに、インビトロ用途（例えばインビトロの診断および調査用途）では、上記の被験体の体液（例えば血液、血漿、血清、細胞組織液、唾液、排泄物および尿）ならびに細胞および組織サンプルが使用に適する。
【０１１１】
一実施態様において、本発明は、糖尿病の障害を治療する方法であって、かかる治療が必要であると同定された患者、有効量の式ＩＩＩの化合物を投与することを含む方法を提供する。本願明細書において提供される式ＩＩＩの化合物は、単独で投与されてもよく、または１つ以上の他の活性薬剤との組合せで投与されてもよい。
【０１１２】
他の実施態様において、前記糖尿病の治療方法は、１つ以上のさらなる化合物との組合せで式ＩＩＩの化合物を投与することをさらに含んでもよく、該さらなる化合物の少なくとも１つは、かかる治療を必要とする患者に活性な薬剤である。１つ以上のさらなる化合物には、抗癌治療化合物（例えばドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カンプトセシン、テモゾロマイド、アバスチン、ハーセプチン、エルビタックス）などのさらなる治療化合物が含まれうる。
【０１１３】
本発明の組成物は、多くの小分子および生物学的製剤が、１ステップで、高収率および高純度で容易に修飾できるという利点を提供する。ＥＢ部分のアルブミンとの比較的強い結合性のため、インビボでの体内分布は、ＥＢ部分およびリンカの数の調整により容易に制御することができる。さらに、ＥＢ部分が相対的に小型であることにより、小分子または生物学的物質の生物学的機能に対するいかなる干渉の可能性も減少する。キレータ（例えばＥＢ部分に結合されるＮＯＴＡまたはＤＯＴＡ）の付加により、放射性核種のような更なる基の安易な付加を可能にし、それにより、本発明の分子がイメージング剤および／または放射性治療剤として機能しうる。したがって、本発明は、高い有効性を有する、持続性および長時間作用性の治療剤およびイメージング剤を開発するための効率的なシステムを提供する。
【実施例】
【０１１４】
以下の実施例により本発明を更に詳述する。特に明記しない限り、部およびパーセンテージはすべて重量により、温度はすべて℃により表す。
【０１１５】
［略語］
Ｂｏｃ  ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
ＣＴ  コンピュータ断層撮影
ＤＩＰＥＡ  ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＤＯＴＡ  １，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸
ＨＡＴＵ  １−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィ
ＨＲＭＳ  高分解能質量分析
ＬＣ／ＭＳ  液体クロマトグラフィ／質量分析
ＮＯＴＡ  １，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸
ＰＢＳ  リン酸緩衝食塩水
ＰＥＴ  ポジトロン放出断層撮影
ＲＴ  室温
ＳＡＴＡ  Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
【０１１６】
［一般的方法］
Ｂｏｃ−リジン−Ｆｍｏｃアミノ酸は、Ｂａｃｈｅｍ社から購入した。ＮＯＴＡ−ビス（ｔ−Ｂｕエステル）およびＤＯＴＡ−トリス（ｔ−Ｂｕエステル）は、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社から購入した。Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）およびＰＥＧ４ビオチン化試薬は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。アビジン−セファロースビーズはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから得た。Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドは、Ｃ．Ｓ．Ｂｉｏ社から購入した。他の全ての溶媒および化学薬品は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。
【０１１７】
分析的高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）は、以下の２つのグラジェントシステムを有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ８カラム（５μｍ、４．６０×１５０ｍｍ）で行った：
システム１：８０％の溶媒Ａ（５０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ）および２０％の溶媒Ｂ（ＣＨ３ＣＮ）から開始し、２分間、および１ｍＬ／分の流速で１５分間に溶媒Ｂが９０％となるまで増加させるグラジェント
システム２：９５％の溶媒Ａおよび５％の溶媒Ｂから開始し、１ｍＬ／分の流速で３５分間に６５％の溶媒Ｂとするグラジェント
紫外線（ＵＶ）吸光度を２５４および６００ｎｍでモニタした。化合物は、Ｂｉｏｔａｇｅ精製システム（Ｃ−１８、２１０×２５ｍｍ）またはＨｉｇｇｉｎｓカラム（Ｃ−１８、５μｍ、２５０×２０ｍｍ）において、グラジェントシステム２およびそれぞれ２５または１２ｍＬ／分の流速により、溶媒の変更［溶媒Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ、溶媒Ｂ：０．１％のＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ］を除きシステム２と同様のグラジェントを用い、精製した。ＬＣ−ＭＳ分析は、文献記載の手順（１）と同様に行った。６４ＣｕＣｌ２は、ＮＩＨ  Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから得た。放射性ＴＬＣは、ｉＴＬＣプレートおよび発色溶媒として０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ５）を用い、ＡＲ−２０００  Ｂｉｏｓｃａｎスキャナにおいて実施した。１８Ｆ−ＦＧＤは、Ｃａｒｄｉｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ社から購入した。１８Ｆ−ＦＬＴは、文献記載の手順（２）に従い合成した。
【０１１８】
＜実施例１：エバンスブルーアミン（ＥＢ−ＮＨ２）の調製＞
２−トリジン（2-tolidine）（４．３ｇ）およびジクロロメタン（４０ｍＬ）を含む１００ｍＬの丸底フラスコに、ジ−ｔ−ブチルジカルボネート（４．４ｇ）を添加した。得られる混合物を室温で一晩攪拌した。反応液を濃縮し、残余物をシリカゲルクロマトグラフィにより精製し、３．２ｇのＮ−Ｂｏｃ−２−トリジン（N-Boc-2-tolidine）を得た。ＬＣ−ＭＳ：［ＭＨ］＋＝３１３．４１３５（ｍ／ｚ）（計算値）：３１２．１８３８。
【化４５】
2019519491.tif 000047
【０１１９】
Ｎ−Ｂｏｃ−２−トリジン（N-Boc-2-tolidine）（０．４６ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を、ガラスバイアル中のアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却し、塩酸（０．３Ｍ、１５ｍＬ）を添加した。冷却した亜硝酸ナトリウム溶液（５ｍＬの水中、０．３１ｇ）を滴下して添加し、２０分間撹拌し、溶液は明るい黄色に変化した。この溶液を、０℃で水（２０ｍＬ）において、１−アミノ−８−ナフトール−２，４−ジスルホン酸一ナトリウム塩（０．５９ｇ）および重炭酸ナトリウム（０．４９ｇ）を含む他のガラスバイアルに滴下した。ＬＣ／ＭＳにより反応の完了を確認し、反応液を更なる精製なしで凍結乾燥し、Ｂｏｃ−ＥＢ生成物を得た。［Ｍ−Ｈ］−＝５４１．４４２５、計算値：５４２．０９３０。
【化４６】
2019519491.tif 000048
【０１２０】
Ｂｏｃ  ＥＢ生成物を８０％のＴＦＡ、１０％の１，２−エタンジチオールおよび１０％のチオアニソールの溶液に添加し、反応が完了するまで撹拌した。混合液を水（１００ｍＬ）で希釈し、Ｃ−１８クロマトグラフィカートリッジ（３×１５ｃｍ）にロードした。カラムを水で洗浄し、次に８０％エタノールにより所望の生成物を溶出させた。溶出液中の溶媒を蒸発させた後、８０％純度の生成物ＥＢ−ＮＨ２を０．６ｇ得た。少量の生成物をＨＰＬＣにより更に精製した。ＬＣ−ＭＳ：［Ｍ−Ｈ］−＝５４１．４４２５、計算値：５４２．０９３０。
【化４７】
2019519491.tif 000049
【０１２１】
＜実施例２：ＥＢ−ＬＹＳ−ＢＯＣの合成＞
【化４８】
2019519491.tif 000050
無水のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２〜３ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｌｙｓ−Ｆｍｏｃ（３．６当量）の溶液に、アルゴン雰囲気下で（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート）（ＨＡＴＵ、４．２当量）を添加した。溶液を室温（ＲＴ）で１０分間撹拌した。次に、１０当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加し、続いて５〜７ｍＬのＤＭＦ中のＥＢ−ＮＨ２を添加した。反応液をＲＴで一晩撹拌した。ＥＢ−ＮＨ２の、被保護Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＢｏｃとのＥＢコンジュゲートへの変換を、分析的ＨＰＬＣ（システム１）を用いてモニタした。ガス滞留時間は、ＥＢ−ＮＨ２では７．７分、コンジュゲート型ＥＢ−保護Ｌｙｓでは１１分とした。変換完了後、２０％ピペリジン（ｖ／ｖ）を添加し、反応液を更に１時間撹拌した。ＤＭＦを高真空オイルポンプにより除去し、反応液をメタノール／Ｈ２Ｏ（２：１）中に再度溶解させ、Ｂｉｏｔａｇｅシステムで精製した。回収したＨＰＬＣフラクションを、分析的ＨＰＬＣに再注入した結果、純度が９０％超であり、それを更に凍結乾燥した。ＥＢ−Ｌｙｓ−Ｂｏｃのガス滞留時間（ｒ．ｔ．）は、８．３分（システム１）または２３．２分（システム２）とした。ＬＣ−ＭＳ分析の結果、７６９［ＭＨ］−の質量であった。
【０１２２】
＜実施例３：ＮＯＴＡ−ＥＢ−ＬＹＳ−ＢＯＣの合成＞
【化４９】
2019519491.tif 000051
ＥＢ−Ｌｙｓ−ＢｏｃとＮＯＴＡ−ビス（ｔ−Ｂｕエステル）との間の反応は、上記と同様の条件で行った。分析的ＨＰＬＣ（システム２）による分析の結果、２９．３分のｒ．ｔ．で純度＞９０％、および１１６７［ＭＨ］−の質量であった。
【０１２３】
＜実施例４：ＮＯＴＡ−ＥＢ−ＬＹＳの合成＞
【化５０】
2019519491.tif 000052
チオアニソール：１，２−エタンジチオール：アニソール：ＴＦＡ（５：３：２：９０）を用い、ＲＴで脱保護した。脱保護の完了を、ＨＰＬＣ（１７．１分のｒ．ｔ．）によりモニタした。精製前に、アルゴン流によりＴＦＡを除去した。ＮＯＴＡ−ＥＢ−Ｌｙｓを、Ｂｉｏｔａｇｅシステムで精製した。ＬＣ−ＭＳ分析の結果、９５４［ＭＨ］−の質量であった。
【０１２４】
＜実施例５：ＮＯＴＡ−マレイミド−ＥＢ（ＮＭＥＢ）の合成＞
【化５１】
2019519491.tif 000053
ＮＯＴＡ−ＥＢ−Ｌｙｓを０．５ｍＬのＤＭＦ中に溶解させた。次に、１．２６当量のトリメチルアミンを添加し、続いて０．２ｍＬのＤＭＦ中の１．２６当量の３−（マレイミド）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加した。反応液をＲＴで２時間撹拌した。Ｈｉｇｇｉｎｓカラムで精製を行った。分析的ＨＰＬＣへの注入（システム２）の結果、１７．４分のｒ．ｔ．における純度＞９０％、および１１０５［ＭＨ］−の質量であった。
【０１２５】
＜実施例６：ＲＧＤ−ＳＨの合成＞
【化５２】
2019519491.tif 000054
２０〜３０ｍｇのｃ（ＲＧＤｆｋ）を、１．５ｍＬのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中に溶解させた。１．３当量のＳＡＴＡを、ジメチルスルホキシド中に溶解させ、ペプチドに添加した。ＨＰＬＣがコンジュゲート型ペプチドへの完全な変換を示すまで、溶液を１〜１．５時間撹拌した。一晩凍結乾燥し、溶媒を除去した。ＲＴで１時間、０．１Ｍのホウ酸バッファ（ｐＨ８．６）およびＨ２Ｏ（１：１）中の７０ｍｇのヒドロキシルアミンおよび２０ｍｇのエチレンジアミン四酢酸を用い、アセチル基を脱保護した。ＨｉｇｇｉｎｓカラムでＲＧＤ−ＳＨの精製を行った。分析的ＨＰＬＣへの純粋なペプチドの再注入の結果、１７．３分のｒ．ｔ．における純度は９０％超であり、ＬＣ−ＭＳ分析の結果、６７６の［ＭＨ］−の質量であった。
【０１２６】
＜実施例７：ＮＭＥＢ−ＲＧＤの合成＞
【化５３】
2019519491.tif 000055
脱気された０．３ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．１％のアスコルビン酸ナトリウム（Na ascorbate）（ｗ／ｖ）溶液に、ＮＭＥＢを溶解させた。ＲＧＤ−ＳＨ（１．１当量）を５０μＬのＤＭＦ中に溶解させ、ＮＭＥＢ溶液に添加した。この反応液を室温にて２時間撹拌した。Ｈｉｇｇｉｎｓシステムにより精製した。ＮＭＥＢ−ＲＧＤのｒ．ｔ．は１７．５４分、化学純度は＞９０％、および１７８３［ＭＨ］−の質量であった。
【０１２７】
＜実施例８：ＤＯＴＡ−マレイミド−ＥＢ−ＲＧＤ（ＤＥＢ−ＲＧＤ）の合成＞
【化５４】
2019519491.tif 000056
キレータとしてＤＯＴＡ−トリス（ｔ−Ｂｕエステル）を用いた以外は、実施例７と同様の方法で、チオール化ＲＧＤにコンジュゲートしたＤＯＴＡ−マレイミド−ＥＢを合成し、ＨＰＬＣの結果、１７．８分のｒ．ｔ．および１８８３．９［ＭＨ］−の質量であった。
【０１２８】
＜実施例９：チオール化オクトレオテートにコンジュゲートしたＤＯＴＡ−マレイミド−ＥＢ（ＥＢ−ＴＡＴＥ）の合成＞
【化５５】
2019519491.tif 000057
【化５６】
2019519491.tif 000058
キレータとしてＤＯＴＡ−トリス（ｔ−Ｂｕエステル）を用いた以外は、実施例７と同様の方法で、チオール化オクトレオテートにコンジュゲートしたＤＯＴＡ−マレイミド−ＥＢを合成し、ＨＰＬＣの結果、３．３５分のｒ．ｔ．および１８６２．５８［ＭＨ］−の質量であった。
【０１２９】
＜実施例１０：ＣＴＴ１２９８にコンジュゲートしたＤＯＴＡ−マレイミド−ＥＢ（ＤＭＥＢ−ＣＴＴ）の合成＞
【化５７】
2019519491.tif 000059
キレータとしてＤＯＴＡ−トリス（ｔ−Ｂｕエステル）を用いた以外は、実施例７と同様の方法で、ＣＴＴ１２９８（前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）リガンド）にコンジュゲートしたＤＯＴＡ−マレイミド−ＥＢを合成し、ＨＰＬＣの結果、２．３２分のｒ．ｔ．および１８６５．３８［ＭＨ］−の質量であった。
【０１３０】
＜実施例９：比較化合物＞
【化５８】
2019519491.tif 000060
【化５９】
2019519491.tif 000061
【化６０】
2019519491.tif 000062
【化６１】
2019519491.tif 000063
上記の構造を有する化合物ＮＭＥＢ−ＲＡＤ、ＤＯＴＡ−ＲＧＤ、ＮＯＴＡ−ＲＧＤおよびＮＥＢを、実施例２〜８と同様の方法により合成した。
【０１３１】
＜実施例１０：化合物の標識＞
１０μＬの６４ＣｕＣＬ２（１．５〜２．２ＧＢｑ、４２〜６０ｍＣｉ）を、０．５ｍＬの０．４Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．６）で希釈した。次に、０．３７〜０．７４ＧＢｑ（１０〜２０ｍＣｉ）を、ペプチド（１００μｇ）を含むバイアルに移した。反応液を３７℃で３０分間混合し、分析的ＨＰＬＣ（システム１、ｒ．ｔ．６．３７）、およびｉＴＬＣプレートと発色溶媒（ｐＨ５）としての０．１Ｍのクエン酸とを用いた放射性ＴＬＣ（ＡＲ−２０００  Ｂｉｏｓｃａｎスキャナ）のいずれかにより、純度を試験した。フリーの６４ＣｕのＲｆは〜０．９であり、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤのＲｆは〜０．１であった。６４Ｃｕ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥおよび６４Ｃｕ−ＤＭＥＢ−ＣＴＴの標識は、同様の方法で行った。Ｙ−９０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）の標識は、３７０−４４４ｍＢｑ（１０−１２ｍＣｉ）の６４Ｃｕを用いて上記の条件と同様に行った。
【０１３２】
＜実施例１１：マウス血清における安定性試験＞
７．４〜１１．１ＭＢｑ（０．２〜０．３ｍＣｉ）の６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤを、３７℃で１、４、８および２４時間、０．５ｍＬのマウス血清とインキュベートした。各時点でサンプルを分取し、ｉＴＬＣプレート上にロードし、放射性ＴＬＣ測定において発色させた。
【０１３３】
＜実施例１２：細胞の培養＞
Ｕ８７ＭＧヒト神経膠芽腫、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト黒色腫およびＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌の細胞株をＡＴＣＣから購入し、それぞれ、最小限培地、リーボビッツＬ−１５培地およびマッコイ５Ａ培地において増殖させた。すべての細胞において、１０％のウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンで補充した。３７℃、５％のＣＯ２の加湿雰囲気下で細胞を増殖させた。
【０１３４】
＜実施例１３：細胞によるＮＭＥＢ−ＲＧＤおよびＦＴＩＣ−アルブミンの取り込み＞
１０５個の細胞を三組、一定量のＦＩＴＣ−アルブミンおよび漸増量のＮＭＥＢ−ＲＧＤと共に２時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメータを用いて取得した。細胞蛍光を平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。
【０１３５】
＜実施例１４：組織病理染色＞
内皮細胞の視覚化のために、腫瘍血管および腫瘍細胞の両方、ＣＤ３１、ＣＤ６１（マウスインテグリンβ３）またはヒトインテグリンαｖβ３、におけるインテグリン発現に関する免疫蛍光染色を採用した。本発明で使用したマウス抗ヒトインテグリンαｖβ３抗体は、ヒトインテグリンαｖβ３を認識するだけであり、腫瘍細胞のマウスインテグリンαｖβ３とは交差反応しない。簡潔には、凍結組織切片（５μｍ）を冷却したアセトンで固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＲＴで１時間、１％のウシ血清アルブミン溶液でブロッキングした。スライドを室温で一晩、ラット抗マウスＣＤ３１、ハムスタ抗ラットＣＤ６１またはマウス抗ヒトインテグリンαｖβ３モノクローナル抗体の１：１００の希釈液と共にインキュベートし、次に、それぞれ、１：２００のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識ロバ抗ラット、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗ハムスタおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗マウス二次抗体とインキュベートした。核の染色のためにサンプルをＤＡＰＩと共に装着した。蛍光イメージは、落射蛍光顕微鏡（２００Ｘ、オリンパス、Ｘ８１）により得た。イメージは同じ条件で取得し、同じスケールで表示した。
【０１３６】
＜実施例１５：標的特異的放射線治療後の組織病理染色＞
動物を安楽死させた後、群Ａ〜ＦからＵ８７ＭＧ腫瘍サンプルを回収し、切片を調製した。ＣＤ３１の染色手順は、前述と同様に行った。Ｋｉ−６７染色の際、凍結させた腫瘍切片を２０分間、冷却したアセトンで固定し、室温で３０分間空気乾燥させた。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）による３０分間のブロッキングの後、スライドを、Ｋｉ−６７特異的モノクローナル抗体（１：１０００、Ａｂｃａｍ社）で染色し、次にＣｙ−３複合ロバ抗ウサギ二次抗体（１：２００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と共にインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、サンプルを、核の染色のためにＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ社）と共に装着した。蛍光イメージは、落射蛍光顕微鏡（２００Ｘ、オリンパス、Ｘ８１）により得た。
【０１３７】
市販のキット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用い、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介ビオチン−ｄＵＴＰ免疫蛍光標識（ＴＵＮＥＬ）による分析を行った。製造業者の説明書に従い、サンプルを１０％のホルマリンで固定し、氷上で２分間、０．１％トリトンとのインキュベートにより浸透させた。固定化および浸透処理の後、ＴＵＮＥＬ反応混合液５０μＬをサンプルに添加した。次に、スライドを、暗所、３７℃で６０分間、加湿雰囲気下でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ社）と共に装着した後、ＧＦＰチャネルを用い、落射顕微鏡下でサンプルを観察した。ｓｃ−７３１２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたＨ＆Ｅ染色によるヒト組織の染色は、Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ社にて行い、またマウス組織の染色もＨｉｓｔｏｓｅｒｖ社にて行った。
【０１３８】
＜実施例１６：ＦＶＢマウスにおける安定性アッセイ＞
ＦＶＢマウスに、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤを３．７ＭＢｑ（１００μＣｉ）注射した。１および４時間後、マウス（ｎ＝２）を安楽死させ、血液を心臓から採取した。遠心分離（５分間の３５００ｒｐｍ）を用い、血漿から赤血球を分離した。その後、血漿０．２ｍＬを採取し、冷却メタノールで希釈し（１：１）、３０秒間ボルテックスし、１０，６００ｇで５分間遠心分離した。抽出されたスープを採取し、０．４５μｍフィルターで濾過し、分析的ＨＰＬＣ（システム１）に注入した。
【０１３９】
６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤは、最大２４時間、マウス血清中で安定であり、顕著な脱金属は観察されなかった。インビボにおいて、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤは血液中で４時間まで安定であり、極性の高い成分の出現はごくわずかであった。抽出された放射能の９０％以上は、血液タンパク質フラクションに結合した。インビボでの安定性評価は、２４時間目にはアルブミン／血液から抽出される６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの量が、ＨＰＬＣ分析にはあまりに低かったため、４時間に制限した。
【０１４０】
＜実施例１７：腫瘍モデル＞
雌の無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、病原体フリーの条件の実験動物施設に収容した。５〜６週齢の雌の無胸腺ヌードマウスに、５×１０６細胞を右肩へ注入し、腫瘍モデルを増殖させた。腫瘍体積が３００ｍｍ３になったとき（接種後１４〜２０日）、マウスを小動物ＰＥＴ試験に供し、また腫瘍体積が１５０ｍｍ３になったとき（接種後１０〜１４日）、９０Ｙ放射性核種治療に供した。
【０１４１】
＜実施例１８：生体内分布＞
６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤを注入したＵ８７ＭＧ腫瘍異種移植個体を、ＰＥＴイメージングの２４時間後に安楽死させた。血液、筋肉、骨、肝臓、腎臓、脾臓、腸、心臓および腫瘍を採取し、湿重量を測定した。６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤを注入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ−２９腫瘍異種移植を有するマウスでは、血液、腫瘍および心臓を採取した。放射線量をγ−カウンタで測定した。結果を％ＩＤ／ｇで表した。
【０１４２】
＜実施例１９：ＮＭＥＢ−ＲＧＤのインビトロ解析＞
Ｕ８７ＭＧ細胞を用いた競合アッセイにおいて、インテグリンαｖβ３に対するＮＭＥＢ−ＲＧＤの結合能を、ｃ（ＲＧＤｆＫ）と比較した。ＮＭＥＧ−ＲＧＤおよびｃ（ＲＧＤｆＫ）のためのＩＣ５０値は、１８Ｆ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）と競合させた場合、１時間後で、それぞれ５９．８８±１３．９５ｎＭおよび４６．６１±１８．７７ｎＭであり（図２Ａ）、６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）と競合させた場合、４時間後で、それぞれ７４．０７±２８．２４ｎＭおよび８５．２１±１３．９９ｎＭであった（図２Ｂ）。両トレーサの比活性は同様であり（６．６６ＧＢｑ／μｍｏｌ）、両トレーサの結合の違いが受容体の飽和によるものではなかったと仮定できるものであった。
【０１４３】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下、ＮＭＥＢ−ＲＧＤの結合能は、１時間のインキュベート時間において低かった（数値が高かった）（４１２．０３±３７１．３８ｎＭ、図２Ｂ）。対称的に、ＮＭＥＢ−ＲＧＤのアルブミンに対するＮＭＥＢ−ＲＧＤ結合能は、インテグリンαｖβ３より３９倍低かった（数値が高かった）（２．３４±１．３８μＭ、図２Ｃ）。アルブミンに対するこの低親和性は、報告されているエバンスブルー（ＥＢ）のアルブミンへの結合能（〜２．５μＭ）と同等であった。アルブミン存在下におけるインテグリンαｖβ３に対するＮＭＥＢ−ＲＧＤの低い結合能が、バッファ中の低い遊離ＮＭＥＢ−ＲＧＤ濃度またはＥＢ−ＲＧＤ−アルブミン複合体の顕著に遅い会合速度に依るものか否かを試験するため、インテグリンαｖβ３に対するＮＭＥＢ−ＲＧＤの結合を、４時間にわたり、アルブミンの存在下で評価した。これらの条件における、競合物質としての６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）との競合により、２２１．１３±７７．０２ｎＭまでＩＣ５０が減少した（図２Ｂ）。
【０１４４】
ｃ（ＲＧＤｆｋ）およびＥＢ−ＲＧＤ誘導体の場合、ＮＯＴＡからＤＯＴＡへのキレータの置換は、４時間のインキュベートの後、インテグリンαｖβ３への結合能を変化させなかった（ＩＣ５０は、ＨＳＡを添加しない場合、ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の場合６７．７９±３３．６３ｎＭ、対してＤＭＥＢ−ＲＧＤの場合７６．６１±３１ｎＭ、また１％ＨＳＡの存在下では１８５．２３±１２１．２８ｎＭ）（図３Ａ）。ＲＧＤペプチドにおけるグリシン残基のアラニンへの置換により、受容体の結合能が失われた（図３Ｂ）。
【０１４５】
＜実施例２０：細胞による取り込みおよび内在化＞
６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ細胞取り込みおよび内在化は、インテグリンαｖβ３の発現レベルが異なる（高、中および低）、それぞれ公知の３種の細胞株（Ｕ８７ＭＧ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ２９）を用いて試験および評価した。すべての時点の６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取り込みは、培地中にアルブミンが存在しないとき、顕著に高かった（図２Ｄ）。Ｕ８７ＭＧ細胞（インテグリンαｖβ３の発現レベルが最も高い）による６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取り込みは、インキュベート時間に比例して増加し、４時間目における総流入が１．８６±０．２２％に達した。ＨＴ２９細胞（インテグリン発現レベルが最も低い）の場合、取り込みは顕著に低かった（０．７６±０．０３％、図４Ａ）。インテグリンαｖβ３に対する６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの特異性について、過剰量のｃ（ＲＧＤｆｋ）またはＮＭＥＢ−ＲＧＤ（図２Ｄ）との同時インキュベートにより試験した。５分後、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取り込みは内在化によるものではなかったが、しかしながら、後の時点では、取り込まれたほとんどの６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤは内在化した（図２Ｅ）。この現象はＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ２９細胞株（図４Ａ〜Ｂ、図５）においても観察された。ＮＭＥＢ−ＲＧＤの内在化が、ＮＭＥＢ−ＲＧＤに結合したアルブミンも内在化するか否かを試験するため、Ｕ８７ＭＧ細胞を、漸増濃度のＮＭＥＢ−ＲＧＤと共に蛍光標識したアルブミンとインキュベートし、そして、細胞全体の蛍光を測定した。いずれのＥＢ−ＲＤＧ濃度でも、ｆｉｔｃ−アルブミン単独では、ベースラインを上回る細胞蛍光の増加が観察されなかった。漸増量のＮＭＥＢ−ＲＧＤでは細胞の蛍光がしなかったため、ＮＭＥＢ−ＲＧＤがアルブミンの内在化を誘導しないことが示唆され、またそれは、インテグリンαｖβ３への結合より前にアルブミンから遊離すると考えられる。
【０１４６】
＜実施例２１：６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤによる腫瘍異種移植のマイクロＰＥＴイメージング＞
Ｕ８７ＭＧ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ２９腫瘍組織における、腫瘍血管形成およびインテグリンαｖβ３発現レベルを、ＣＤ３１、ＣＤ６１（マウスインテグリンβ３）およびヒトインテグリンαｖβ３に対する蛍光抗体を用いて視覚化した。Ｕ８７ＭＧおよびＨＴ２９腫瘍はいずれも高いＣＤ３１染色により示される高い血管形成を示した一方、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍では比較的より染色が弱かった（図６）。Ｕ８７ＭＧ腫瘍組織は、最も高いヒトインテグリンαｖβ３発現を示した（図６）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ではインテグリン発現は低かったが、ＨＴ２９よりは高かった（図６）。マウスインテグリンβ３（ＣＤ６１）の発現レベルは、ＣＤ３１染色と同様、Ｕ８７ＭＧ＞ＨＴ２９＞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の順であった（図６）。
【０１４７】
４つのすべての放射性トレーサを用い、最初に、Ｕ８７ＭＧ異種移植（高インテグリンαｖβ３および高血管形成）において評価した。６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤは、すべての時点で、すべてのトレーサよりも顕著に高い取り込みであった（注射後（ｐ．ｉ．）、それぞれ１、４および２４時間において、９．８７±１．４０、１４．０９±１．６２および１６．６４±１．９９％ＩＤ／ｇ）（図７）。％ＩＤ／ｇ平均値と最大値との比較の結果、４および２４時間のｐ．ｉ．で、２７〜３０％ＩＤ／ｇに達する腫瘍における高い蓄積が見られ、それは６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の取り込みより１５倍高かった（図８）。血液における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取り込みは、１時間のｐ．ｉ．において比較的高かったが（９．５８±０．８４％ＩＤ／ｇ）、４および２４時間のｐ．ｉ．で、それぞれ、５．７３±０．６７および２．４６±０．２５％ＩＤ／ｇにまで著しく低下し、腫瘍対バックグラウンドの高い比率となった（図７および９）。インテグリンαｖβ３に対する６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの結合特異性を、ｃ（ＲＧＤｆｋ）または非標識ＮＭＥＢ−ＲＧＤの同時注入により試験した。過剰量の単量体が同時注入されたとき、腫瘍による取り込みは、ブロッキングがない場合の取り込みの約２５％まで、１時間のｐ．ｉ．で著しく低下した（５．７７±０．０８％ＩＤ／ｇ、Ｐ＝０．０１７）。４時間のｐ．ｉ．で、腫瘍による取り込みは１１．１±０．０５％ＩＤ／ｇに増加し、この取り込みは、２４時間のｐ．ｉ．で、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤと同程度の値まで徐々に増加した（図７）。過剰量の非標識ＮＭＥＢ−ＲＧＤを用いた同時注入により、すべての時点で腫瘍による取り込みを５５〜６５％ブロックした（図７および９）。更に、ＰＥＴ定量化の妥当性を確認するため、２４時間のｐ．ｉ．におけるＰＥＴイメージングの直後に生体内分布試験を実施し、腫瘍における高い６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取り込みを確認した（図１０）。
【０１４８】
６４Ｃｕ−ＮＯＴＡｃ（ＲＧＤｆｋ）は、尿路を通じて血液から急速にクリアランスされ、腫瘍における低い蓄積を示した（１、４および２４時間のｐ．ｉ．で、１．２９±０．１７、１．１５±０．０７、１．０６±０．０３％ＩＤ／ｇ、図７および９に対応）。非特異的トレーサである６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＡＤは、すべての時点で低い腫瘍蓄積を示した（約６％のＩＤ／ｇ）。血液におけるその取り込みは、すべての時点で、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤより著しく高かった（４時間のｐ．ｉ．で１０〜１２％ＩＤ／ｇ、および２４時間のｐ．ｉ．で３．７±０．３％ＩＤ／ｇ、図７および９）。６４Ｃｕ−ＮＥＢはすべての時点で血液における最も高い蓄積を示し、一方、腫瘍における取り込みは、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＡＤを僅かに超えるものであった（４時間のｐ．ｉ．までに６〜７％ＩＤ／ｇ、および２４時間のｐ．ｉ．で約８％ＩＤ／ｇ、図７および９）。
【０１４９】
Ｕ８７ＭＧ異種移植における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取り込みを、異なるインテグリンおよび血管形成度合いを有するＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ２９異種移植と比較した（図１１〜１２）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ２９異種移植における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取り込みはいずれも、すべての時点でＵ８７ＭＧより著しく低かった（図１１〜１２）。血液および心臓への取り込みは、３つのモデル全てで同等であった（図１３）。腫瘍により取り込みが主に特定の受容体への結合によるものであり、血管形成や透過性および保持性の強化（ＥＰＲ）効果によるものではないことを確認するため、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ２９異種移植に、血液プールイメージングトレーサ（６４Ｃｕ−ＮＥＢ）を注入した。６４Ｃｕ−ＮＥＢ取り込みは、ＣＤ３１およびＣＤ６１染色と相関しており、Ｕ８７ＭＧ＞ＨＴ２９＞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５の順であった（図１４）。
【０１５０】
＜実施例２２：放射線治療＞
ＮＭＥＢ−ＲＧＤを、インテグリンαｖβ３標的特異的な放射線治療に適用した。ＮＭＥＢを基に、ＤＯＴＡを含み、放射線治療的同位元素９０Ｙをキレート化できるものに変換した（以下ＤＭＥＢと称する）。Ｕ８７ＭＧ腫瘍を有するマウス（１５０〜２００ｍｍ３の初期腫瘍サイズ）における、腫瘍増殖に対する放射線治療の有効性を、以下の通り評価した：
群Ａ：生理食塩水を注入、
群Ｂ：７．４ＭＢｑ（２００μＣｉ）の９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤで処理、
群Ｃ：３．７ＭＢｑ（１００μＣｉ）の９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤで処理、
群Ｄ：１．７５ＭＢｑ（５０μＣｉ）の９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤで処理、
群Ｅ：７．４ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）で処理、および
群Ｆ：１．７５ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）で処理（図１５〜１７）。
【０１５１】
最初の注入日を０日目とする。処理後６日目に、群間の有意差が顕著に表れた（図１５）。生理食塩水を注入した群Ａと比較し、すべての９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤ処理マウス（群Ｂ〜Ｄ）の腫瘍体積は著しく低かった（ｐ＜０．０１）（図１５）。さらに、処理後８日目から、腫瘍体積における有意差が、９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤおよび群Ｅ〜Ｆの全３群の間で観察された（図１５）。これらの差は時間とともに増加し、７．４ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤを注入したマウスの腫瘍は、８日目で体積の減少を示した（群Ｂ、図１５）。９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤの更なる注入が腫瘍を排除するか否かを試験するため、群Ｂ〜Ｄそれぞれに、７．４、３．７または１．７５ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）を、最初の処理後１４日目に再注入した。７．４ＭＢｑの線量による９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤの２回目の注入は、著しく腫瘍体積を縮小し（２０日目にＰ＝０．０１であり、２２日目には０．０００３まで縮小（図１５））、腫瘍は最初の処理から３０日目にはほとんど消失した。軽微な腫瘍縮小が、群Ｃ（３．７ＭＢｑ線量）において検出され、それは２回目の注入の後数日間持続し、その後腫瘍体積が再度増加した（図１５）。腫瘍体積に対する効果は、群Ｄ（１．７５ＭＢｑの受容線量）においては観測されなかった。放射線治療の全身毒性を、動物の体重のモニタにより評価した。群Ｂのみが、微量ではあるが（５％）、２日目に統計学的に有意な体重減少を示し、４日目にはそれらの体重は回復された（図１６）。他の全ての群の動物の体重は、処理後に増加し続けた（図１６）。同様のパターンが、２回目の注入後に観察された。放射線治療のエンドポイント（生存率分析に使用）を、腫瘍体積が１６００ｍｍ３となった時、腫瘍が潰瘍となったとき、またはマウスが死亡したとき、とした。生存率分析により、群Ａ、ＥおよびＦと比較した群Ｂ〜Ｄの有意差（ｐ＜０．０１）が示された。群Ｂの場合、最初の処理の後３０日目まで生存率は１００％あり、群Ｂ、ＣおよびＤでは生存率（％）は用量依存的であった（図１７）。
【０１５２】
インテグリンαｖβ３に対する９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤ放射線治療の特異性を試験するため、ヒトインテグリンの発現レベルは低いが、マウスインテグリンを適度に発現するＨＴ２９における、７．４ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤの有効性を試験した（図６）。この腫瘍異種移植は、高い血管形成度合いにもかかわらず、Ｕ８７ＭＧモデルよりも非常に増殖が遅い。ＨＴ２９腫瘍を有するマウスへの７．４ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤの注入を、生理食塩水を注入した同じモデルとの間で比較した（図１８Ａ）。処理群とコントロールとの間の腫瘍体積は、処理後８日目までは同様であり、その後、処理された腫瘍は、コントロールと比較し、より遅い速度で増殖し始めた。その結果、９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤによる標的特異的な放射線治療は、Ｕ８７ＭＧで示される腫瘍収縮よりもむしろ、ＨＴ−２９腫瘍異種移植における腫瘍増殖の遅延をもたらした（図１６および１８Ａ）。ＨＴ−２９処理を受けたマウスの体重は、対照群と比較し大幅に変化しなかった（図１８Ｂ）。腫瘍潰瘍化のため、ＨＴ−２９処理および未処理のマウスは注入後２６日目に安楽死させた。
【０１５３】
９０Ｙの注入後３日目における１８Ｆ−ＦＤＧによるＰＥＴイメージングは、９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤを注入した群の場合でのみ、代謝の低下を示した（図１９）。しかしながら、処理後１０日目にこのスキャンを繰り返したところ、群Ｂにおいてのみ、顕著な代謝の低下が示された（図２０）。１８Ｆ−ＦＬＴによるＰＥＴイメージングを、最初の処理から５および１２日目に行い、その結果、群Ｂでは１８Ｆ−ＦＬＴの取り込みが顕著に低く、これらのマウスの腫瘍における増殖の低さを示唆するものである。この取り込みは、５〜１２日目の間に低下した（図２０）。
【０１５４】
＜実施例２３：９０Ｙ放射線治療後の腫瘍の生物学的解析＞
腫瘍血管系を評価するＣＤ３１染色、腫瘍増殖を評価するＫｉ−６７染色およびＤＮＡ損傷を決定するＴＵＮＥＬ染色を、全６群（Ａ〜Ｆ）に対して行った。大きい壊死面積を有する群Ａ、ＥおよびＦでは、染色は、腫瘍細胞が生存していた腫瘍の端部に集中していた。図２１に示すとおり、群Ｂ（７．４ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤを注入）における腫瘍血管系は、他の群におけるそれより小さかった。１８Ｆ−ＦＬＴによるＰＥＴイメージングと同様、群Ａおよび群Ｃ〜Ｆでは比較的高いパーセンテージで、Ｋｉ−６７に関して細胞がポジティブに染色され、一方、群Ｂでは細胞増殖の顕著な低下が観察された（図２１）。他の５群と比較し、群Ｂは、ＴＵＮＥＬ染色により示されるように、かなり高い細胞アポプトーシスを示した（図２１）。ヘマトキシリン−エオジン染色により、群Ｂのほとんどの腫瘍領域が、９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤ治療における２回の投与後にすでに壊死していたが、他の５群の腫瘍はほぼ完全に生存していたことが示された（図２１）。
【０１５５】
＜実施例２４：ヒト被験者における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの評価＞
３人の健常なボランティアに、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤを１４８〜２９６ＭＢｑ（４−８ｍＣｉ）注射し、注射後１、８および２４時間目にＰＥＴ／ＣＴスキャンを行った（図２２）。注射後１時間における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取り込みが、血液プール、腎臓において観察され、膀胱を通って分泌され、健常な器官への望ましくない蓄積がなかった。表１に線量測定の算出結果を示すが、８ｍＣｉを注入した被験者における、健常な器官への低い蓄積、０．０３１５ｍＳｖ／ＭＢｑ（０．１１６６Ｒｅｍ／ｍＣｉ）の有効量、および０．９３３Ｒｅｍの曝露は、１８Ｆ−ＦＤＧによるＰＥＴスキャンと非常に類似している。
【０１５６】
【表１】
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【０１５７】
ＷＨＯのステージＩＶグリア芽細胞腫患者への６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの注入により、腫瘍における高い蓄積が示され、それは時間とともに増加し、１２時間のｐ．ｉ．で、最大６．２５のＳＵＶに達し（図２３）、また２４時間目でわずかな減少を示した（図２４および表２）。腫瘍／非腫瘍比率もまた、時間とともに増加し、最大７３．４に達した（図２４および表２）。腫瘍生検では、インテグリンαｖβ３の適度な発現が示された。
【０１５８】
【表２】
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【０１５９】
＜実施例２５：ヒト被験者における６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥの評価＞
担体分子としてアルブミンを用いた薬剤の、血液中半減期を延長するため、（ｉ）短縮型エバンスブルー（ＥＢ）色素分子、（ｉｉ）金属キレート、および（ｉｉｉ）マレイミドを「付加」した分子を作製した（図２５）。「付加」分子は、遊離のチオール基を含む標的分子に容易にコンジュゲートでき、アルブミンへのＥＢの適度な結合により血液中の半減期を延長し、イメージングおよび放射線治療のための放射性標識を可能にする。短縮型ＥＢ誘導体の合成は、図２６および過去の報告（Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２０１７  Ａｐｒ；５８（４）：５９０−５９７）に記載されている。オクトレオテート（ＴＡＴＥ）（ソマトスタチン受容体結合ペプチド）にそれをコンジュゲートさせるためには、フェニルアラニン残基のαアミン上にフリーのチオール基を導入する必要がある。ＴＡＴＥ−ＳＨの合成を図２７Ａ〜Ｂに記載する。
【０１６０】
短縮型ＥＢをＤＯＴＡキレータとコンジュゲートさせ、その後、ＴＡＴＥ−ＳＨに結合させ、ＥＢ−ＴＡＴＥを得た（図２８）。比較のため、ＴＡＴＥをＥＢ部分のないＤＯＴＡにコンジュゲートさせ、ＴＡＴＥを得た（図２９）。ＴＡＴＥおよびＥＢ−ＴＡＴＥは、イメージングまたは放射線治療のため、それぞれＣｕ−６４、Ｙ−８６またはＹ−９０により放射性同位元素標識し、マウス異種移植モデルにおいて比較した。
【０１６１】
本分野における安定的なモデルで、ＳＳＴＲ２を高発現することが報告されている、ＡＲ４２Ｊラット膵臓神経内分泌腫瘍異種移植モデルにおいて、上記２つの化合物を最初に評価した（図３０および３１）。ＥＢ−ＴＡＴＥおよびＴＡＴＥを、最初にＣｕ−６４で標識し、同一の放射線量の注入後（ｐ．ｉ．）、異なる時点で、マウスをＰＥＴスキャンに供した。６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥは、すべての時点で顕著に高い腫瘍への取り込み能を示し、２４時間のｐ．ｉ．では高い腫瘍対バックグラウンド比率であった（図３０〜３１、３２Ａ〜Ｂおよび３３Ａ〜Ｂ）。予想されるように、オクトレオテートへのＥＢ部分の付加は、膀胱によるその排出を著しく低下させた（図３４Ａ〜Ｃ）。次に、ＳＳＴＲ２でトランスフェクションしたヒトＨＣＴ１１６直腸異種移植におけるこれらの２つのトレーサを評価した。ＨＣＴ１１６およびＳＳＴＲ２−ＨＣＴ１１６によりトランスフェクトした細胞間でのＳＳＴＲ２発現の相違を測定するため、ＦＡＣＳ分析および免疫蛍光染色を実施した（図３５Ａ〜Ｂおよび３６〜３７）。陽性および陰性のＨＣＴ１１６  ＳＳＴＲ２細胞における６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥおよび６４Ｃｕ−ＴＡＴＥの細胞取り込み／内在化に関する試験も行った。６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥの細胞取り込みは、すべての時点で顕著に高く、大部分の取り込みは内在化に関連するものであった（図３８Ａ〜Ｄ）。さらに、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥの細胞取り込みおよび内在化は、非標識ＥＢ−ＴＡＴＥの添加によりブロックされることから、ＳＳＴＲ２に対するその特異性を示唆するものである（図３８Ａ〜Ｄ）。
【０１６２】
ＥＢ−ＴＡＴＥの将来の潜在的用途は、Ｙ−９０を用いた放射線治療である。９０Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの分布に関するより詳細な理解および様々な器官における蓄積を可能にするために、ＥＢ−ＴＡＴＥを、ＰＥＴ同位元素Ｙ−８６で標識した。さらに、Ｙ−８６はＤＯＴＡによって良好にキレート化される同位元素であり、ゆえに、イメージング同位元素としてＹ−８６を用いることにより、トランスキレーションまたは特にＥＢ−ＴＡＴＥと関連がない他の現象による放射能の蓄積を減少させると考えられる。
【０１６３】
細胞／内在化試験を繰り返し、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥおよび６４Ｃｕ−ＴＡＴＥ誘導体に関する適切な結果が得られた（図３９Ａ〜Ｂおよび４０Ａ〜Ｂ）。非標識ＥＢ−ＴＡＴＥおよびウシ血清アルブミンの結合動態試験も実施した。ＥＢ−ＴＡＴＥは、エバンスブルー−アルブミンの親和性と同様、μＭ  Ｋｄの親和性による高いＫｏｎおよび低いＫｏｆｆを有する（図４１）。
【０１６４】
得られた放射性同位元素識別されたコンジュゲートは、長期にわたる循環半減期を示し、ソマトスタチン受容体陽性腫瘍における腫瘍内蓄積を促進した（図４２〜４３、４４Ａ〜Ｄ、４５Ａ〜Ｃ、４６および４７Ａ〜Ｂ）。腫瘍内取り込みは、「アドオン」のないペプチドと比較し、著しく増加した（図４２〜４３、４４Ａ〜Ｄ、４５Ａ〜Ｃ、４６および４７Ａ〜Ｂ）。ＡＲ４２Ｊ異種移植における８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥを評価したところ、高いＳＳＴＲ２レベルを示し、また非常に高い腫瘍内取り込み値を示した（図４８〜４９、５０Ａ〜Ｂおよび５１）。ＳＳＴＲ２陽性腫瘍において８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥをブロックする試みにも成功した（図４９、５０Ａ〜Ｂおよび５１）。
【０１６５】
腫瘍の凍結切片に対する免疫蛍光解析から、受容体の発現が示された（図５２〜５３）。
【０１６６】
９０Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥを用いたマウスにおける腫瘍放射線治療試験は大いに成功を収め（図５５〜５７、５８Ａ〜Ｆ、５９〜６１、６２Ａ〜Ｄおよび６３〜６５）、１〜２回の９０Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの投与により受容体陽性の腫瘍が除去された（図５５〜５７、５８Ａ〜Ｆ、５９〜６１、６２Ａ〜Ｄおよび６３〜６５）。放射線治療実験では、７．４ＭＢｑによる３匹のマウス、および３．７ＭＢｑによる１匹のマウスは、図５８において、僅かに腫瘍の再増殖を示した。６８Ｇａ−ＴＡＴＥを用いたＰＥＴイメージングおよび免疫蛍光染色の結果、腫瘍再増殖がＳＳＴＲ２から独立していることが確認された（図５９〜６１）。９０Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥ処理した群では、生理食塩水および９０Ｙ−ＴＡＴＥ群と比較し、低い増殖および高いアポプトーシスが観察された（Ｋｉ６７、ＴＵＮＥＬおよびＨ＆Ｅ染色、図６６〜６７）。
【０１６７】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）リガンドの小分子であるＣＴＴ１２９８へのコンジュゲートによるＥＢ部分の実施可能性を評価した（図６８）。この分子は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＴＴ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｔａｒｇｅｔｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｃｏｍ／ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．ｈｔｍＬ）から得た。４種の細胞株およびＰＣ３−ＰＩＰ（トランスフェクション細胞、高いＰＳＭＡ発現を示す）におけるＰＳＭＡ発現を試験した。ＬＮＣａＰは中程度のＰＳＭＡ発現を示し、ＰＣ３およびＣＷ２２Ｒｖ１は低いＰＳＭＡ発現を示した（図６９）。細胞内取り込み／内在化について、４種の細胞株の中で、ＰＣ３−ＰＩＰがすべての時点において最も高い取り込みを示し、またそのほとんどが内在化されることが示された（図７０Ａ〜Ｄ）。ＰＥＴ試験ではまた、ＰＣ３およびＣｗ２２ＲＶ１異種移植と比較し、ＰＣ３−ＰＩＰでは高い腫瘍蓄積が示された（図７１、７２Ａ〜Ｂおよび７３〜７４）。ＬＮＣａＰ異種移植は、同様に評価される必要がある。
【０１６８】
結論として、ＴＡＴＥペプチドおよびＣＴＴ１２９８小分子への、本発明に係る新規な「付加」分子のコンジュゲートは、これらの薬剤によりイメージングおよび放射線治療を大幅に改善した。これらの結果は、本発明の「アドオン」が、血液中半減期および腫瘍内取り込みを改善し、薬剤をセラノスティックな物質に変換できることを示す。
【０１６９】
本発明の概念を、例示的な原則および実施態様に関して記載したが、当業者であれば、請求項で定義される開示の範囲および趣旨を逸脱しない範囲内において変更を加え、記載されたものの一部を置換した均等物を得ることが可能であることを理解するであろう。
【図１】
2019519491.tif 000101
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【国際調査報告】
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