(57)【要約】本発明は、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドであって、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて、強化された中和特性、ヒト肝組織もしくは肝細胞（すなわちヒト肝細胞）またはその両方における向上した形質導入及び／または向性を呈する、当該変異型カプシドポリペプチドに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性を呈する、前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項２】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する、先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項３】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞における形質導入または向性をさらに呈する、先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項４】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した形質導入を呈する、請求項３に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項５】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した向性を呈する、請求項３に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項６】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織または非肝細胞性ヒト細胞における形質導入または向性をさらに呈する、先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項７】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した生体内でのヒト肝組織または肝細胞の形質導入を呈する、先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項８】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内でのヒト肝組織または肝細胞の形質導入を呈する、先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項９】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内での三次元培養物中のヒト肝オルガノイドの形質導入を呈する、先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項１０】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが機能性ＡＡＶカプシドの一部であり、前記機能性ＡＡＶカプシドが、非コードＲＮＡ、タンパク質コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子指向性カセット、及び治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列をパッケージングする、先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項１１】
前記核酸配列がＡＡＶベクター内に含まれている、請求項１０に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項１２】
前記発現カセットがＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現システムである、請求項１０に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項１３】
前記治療用発現カセットが治療タンパク質または治療抗体をコードする、請求項１０に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項１４】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された核酸発現を可能にする、請求項１０に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項１５】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列が、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）、ＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）及びＡＡＶ−ＮＰ３０（配列番号８）からなる群から選択される、先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項１６】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列が、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）及びＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）からなる群から選択される、先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項１７】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列が、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）及びＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）からなる群から選択される、先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項１８】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列がＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）である、先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項１９】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列がＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）である、先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項２０】
治療処置計画またはワクチンにおいて先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用する方法。
【請求項２１】
対象に投与される核酸の総量を減らすために先行請求項のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用する方法であって、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用して前記核酸を形質導入するときに、同程度の治療効果を得るために非変異型親カプシドポリペプチドを使用して前記核酸を形質導入する場合に前記対象に投与される核酸の量に比べてより少ない総量の核酸を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞における形質導入または向性を呈する、前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項２３】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した形質導入を呈する、請求項２２に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項２４】
非変異型親カプシドに比べて向上した向性を呈する、請求項２２に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項２５】
非変異型親カプシドに比べて強化された中和特性をさらに呈する、請求項２２〜２４のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項２６】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する、請求項２５に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項２７】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織または非肝細胞性ヒト細胞における形質導入または向性をさらに呈する、請求項２２〜２６のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項２８】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した生体内でのヒト肝組織または肝細胞の形質導入を呈する、請求項２２〜２７のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項２９】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内でのヒト肝組織または肝細胞の形質導入を呈する、請求項２２〜２８のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項３０】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内での三次元培養物中のヒト肝オルガノイドの形質導入を呈する、請求項２２〜２９のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項３１】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが機能性ＡＡＶカプシドの一部であり、前記機能性ＡＡＶカプシドが、非コードＲＮＡ、タンパク質コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子指向性カセット、及び治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列をパッケージングする、請求項２２〜３０のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項３２】
前記核酸配列がＡＡＶベクター内に含まれている、請求項３１に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項３３】
前記発現カセットがＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現システムである、請求項３１に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項３４】
前記治療用発現カセットが治療タンパク質または治療抗体をコードする、請求項３１に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項３５】
非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された核酸発現を可能にする、請求項３１に記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項３６】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列が、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）、ＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）及びＡＡＶ−ＮＰ３０（配列番号８）からなる群から選択される、請求項２２〜３５のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項３７】
治療処置計画またはワクチンにおいて請求項２２〜３６のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用する方法。
【請求項３８】
対象に投与される核酸の総量を減らすために請求項２２〜３６のいずれかに記載の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用する方法であって、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用して前記核酸を形質導入するときに、同程度の治療効果を得るために非変異型親カプシドポリペプチドを使用して前記核酸を形質導入する場合に前記対象に投与される核酸の量に比べてより少ない総量の核酸を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３９】
変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターであって、前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性を呈する、前記ＡＡＶベクター。
【請求項４０】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する、請求項３９に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４１】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、ヒト肝組織または肝細胞における向上した形質導入または向性を呈する、請求項３９〜４０のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項４２】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した形質導入を呈する、請求項４１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４３】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した向性を呈する、請求項４１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４４】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドがさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織または非肝細胞性ヒト細胞における形質導入または向性を呈する、請求項３９〜４３のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項４５】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した生体内でのヒト肝組織または肝細胞の形質導入を呈する、請求項３９〜４４のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項４６】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内でのヒト肝組織または肝細胞の形質導入を呈する、請求項３９〜４５のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項４７】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内での三次元培養物中のヒト肝オルガノイドの形質導入を呈する、請求項３９〜４６のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項４８】
前記ベクターがさらに、非コードＲＮＡ、コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子指向性カセット、及び治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列を含む、請求項３９〜４７のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項４９】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された核酸発現を可能にする、請求項４８に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５０】
前記発現カセットがＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現システムである、請求項４８に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５１】
前記治療用発現カセットが治療タンパク質または治療抗体をコードする、請求項４８に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５２】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列が、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）、ＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）及びＡＡＶ−ＮＰ３０（配列番号８）からなる群から選択される、請求項３９〜５１のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項５３】
治療処置計画またはワクチンにおいて請求項３９〜５２のいずれかに記載のＡＡＶベクターを使用する方法。
【請求項５４】
変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターであって、前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞における形質導入または向性を呈する、前記ＡＡＶベクター。
【請求項５５】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した形質導入を呈する、請求項５４に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５６】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドに比べて向上した向性を呈する、請求項５４に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５７】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドがさらに、非変異型親カプシドに比べて強化された中和特性を呈する、請求項５４〜５６のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項５８】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する、請求項５７に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５９】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドがさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織または非肝細胞性ヒト細胞における形質導入または向性を呈する、請求項５４〜５８のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項６０】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した生体内でのヒト肝組織または肝細胞の形質導入を呈する、請求項５４〜５９のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項６１】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内でのヒト肝組織または肝細胞の形質導入を呈する、請求項５４〜６０のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項６２】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内での三次元培養物中のヒト肝オルガノイドの形質導入を呈する、請求項５４〜６１のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項６３】
前記ベクターがさらに、非コードＲＮＡ、コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子指向性カセット、及び治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列を含む、請求項５４〜６２のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項６４】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された核酸発現を可能にする、請求項６３に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６５】
前記発現カセットがＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現システムである、請求項６３に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６６】
前記治療用発現カセットが治療タンパク質または治療抗体をコードする、請求項６３に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６７】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列が、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）、ＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）及びＡＡＶ−ＮＰ３０（配列番号８）からなる群から選択される、請求項５４〜６６のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項６８】
治療処置計画またはワクチンにおいて請求項５４〜６７のいずれかに記載のＡＡＶベクターを使用する方法。
【請求項６９】
対象に投与されるＡＡＶベクターの総量を減らすために請求項５４〜６７のいずれかに記載のＡＡＶベクターを使用する方法であって、前記ＡＡＶベクターを変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドによって形質導入するときに、同程度の治療効果を得るために前記ＡＡＶベクターを非変異型親カプシドポリペプチドによって形質導入する場合に前記対象に投与されるＡＡＶベクターの量に比べてより少ない総量のＡＡＶベクターを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項７０】
変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを生成する方法であって、前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性と向上したヒト肝組織または肝細胞における形質導入または向性とを両方とも呈するものであり、前記方法が、
ａ）変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドのライブラリーを生成することを含み、前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、２つ以上の非変異型親カプシドポリペプチドからの複数の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列を含むものであり；
ｂ）前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドライブラリーをＡＡＶベクターにクローニングすることによってＡＡＶベクターライブラリーを生成することを含み、前記ＡＡＶベクターが複製能のあるＡＡＶベクターであり；
ｃ）非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性と向上したヒト肝組織または肝細胞における形質導入または向性との両方に関してｂ）からの前記ＡＡＶベクターライブラリーから変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドをスクリーニングすることを含み；さらに、
ｄ）ｃ）からの前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを選抜することを含む、前記方法。
【請求項７１】
ｅ）ｄ）からの前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドの配列を決定することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する、請求項７０〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した形質導入を呈する、請求項７０〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した向性を呈する、請求項７０〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドがさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織または非肝細胞性ヒト細胞における形質導入または向性を呈する、請求項７０〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した生体内でのヒト肝組織または肝細胞の形質導入を呈する、請求項７０〜７５のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内でのヒト肝組織または肝細胞の形質導入を呈する、請求項７０〜７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内での三次元培養物中のヒト肝オルガノイドの形質導入を呈する、請求項７０〜７７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２９６，０４６号の利益を主張するものであり、その全てを参照により全体として本明細書に明示的に援用する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の下でなされた発明の権利に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって認められた契約ＨＬ０９２０９６、ＡＩ１１６６９８、ＯＤ０１０５８０及びＨＬ１１９０５９の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、変異体ＡＡＶカプシドポリペプチドであって、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて、強化された中和特性を呈し、ヒト肝組織もしくは肝細胞（すなわちヒト肝細胞）またはその両方における向上した形質導入及び／または向性を呈する、当該変異型カプシドポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
望ましい遺伝子の欠損（機能喪失）もしくは欠如、または望ましくないかもしくは不完全な遺伝子の発現（機能獲得）によって引き起こされる、遺伝子疾患は、様々な疾患を招く。現在のところ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、生体内への遺伝子の送達において最高の安全性及び有効性を有することから、治療用途に選択される遺伝子移入ベクターとして認識されている。これまでに単離されているＡＡＶ血清型のうちＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６及びＡＡＶ８は、重度の血友病Ｂに罹患したヒトの肝臓を標的化するために使用されてきた。ＡＡＶ８の事例では、治療用導入遺伝子の長期発現が確認された。近年のヒトからのデータは、ＡＡＶを使用して肝臓を標的化することによって治療レベルのＦＩＸ導入遺伝子の長期発現を達成できることを示した。さらに、α１アンチトリプシン欠乏症の治療のための様々なＡＡＶ血清型を使用するいくつかの第１相及び第２相の治験が報告された（Ｍ．Ｌ．Ｂｒａｎｔｌｙ，Ｊ．Ｄ．Ｃｈｕｌａｙ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｌ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｆ．Ｒｏｕｈａｎｉ，Ｔ．Ｊ．Ｃｏｎｌｏｎ，Ｒ．Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｍ．Ｒ．Ｂｅｔｔｓ，Ｃ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｂ．Ｊ．Ｂｙｒｎｅ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ，Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｓｐｉｔｅ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｒＡＡＶｌ−ＡＡＴ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０６，１６３６３−１６３６８（２００９）、Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ，Ｂ．Ｃ．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｍ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｂ．Ｃａｒｅｙ，Ｒ．Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｆ．Ｒｏｕｈａｎｉ，Ｍ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ａ．Ｔ．Ｙａｃｈｎｉｓ，Ｒ．Ａ．Ｓａｎｄｈａｕｓ，Ｎ．Ｇ．ＭｃＥｌｖａｎｅｙ，Ｃ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｂｒａｎｔｌｙ，Ｄ．Ｒ．Ｋｎｏｐ，Ｇ．Ｊ．Ｙｅ，Ｊ．Ｄ．Ｃｈｕｌａｙ，Ｐｈａｓｅ  ２  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｌｐｈａｌ−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ：ｉｎｔｅｒｉｍ  ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２２，１２３９−１２４７（２０１１）、Ｃ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｄ．Ｃｈｕｌａｙ，Ｂ．Ｃ．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｍ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｂ．Ｃａｒｅｙ，Ｒ．Ａ．Ｓａｎｄｈａｕｓ，Ｎ．Ｇ．ＭｃＥｌｖａｎｅｙ，Ｌ．Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｑ．Ｔａｎｇ，Ｆ．Ｎ．Ｒｏｕｈａｎｉ，Ｍ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ａ．Ｄ．Ｆｕ，Ａ．Ｙａｃｈｎｉｓ，Ｄ．Ｒ．Ｋｎｏｐ，Ｇ．Ｊ．Ｙｅ，Ｍ．Ｂｒａｎｔｌｙ，Ｒ．Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｓ．Ｓｏｍａｎａｔｈａｎ，Ｌ．Ｐ．Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｒ．Ｈ．Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，Ｍ．Ａ．Ｈｕｌｍｅ，Ｔ．Ｍ．Ｂｒｕｓｋｏ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ，���ｕｍａｎ  Ｔｒｅｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｌｌｏｗ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２３，５３１０−５３１８（２０１３））。さらに、世界中で数多くの試験が進行中であり、それには例えば、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）のためのＡＡＶ５を使用する試験ＥＳ−００２０（第Ｉ相）、ｈＡＡＴ（α１アンチトリプシン）のためのＡＡＶ１を使用するＩＥ−０００１（第ＩＩ相）、血友病ＢのためのＡＡＶ５を使用するＮＬ−００３７（第Ｉ相）、血友病ＢのためのＡＡＶ２を使用するＵＫ−０１３７（第Ｉ相）、血友病ＢのためのＡＡＶ２を使用するＵＳ−０８６４（第Ｉ相）、血友病ＢのためのＡＡＶ８を使用するＵＳ−１４４１（第Ｉ／ＩＩ相）、血友病ＢのためのＡＡＶ８を使用するＵＳ−１３５５（第Ｉ／ＩＩ相）、高コレステロール血症のためのＡＡＶ８を使用するＵＳ−１１４４（第Ｉ相）、血友病ＢのためのＡＡＶｒｈ１０を使用するＵＳ−１３９８（第Ｉ／ＩＩ相）、血友病ＢのためのＡＡＶ２／ＡＡＶ６を使用するＵＳ−１４４６（第Ｉ相）、及び遅発型オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症のためのＡＡＶ８を使用するＵＳ−１５２０（第Ｉ／ＩＩ相）が含まれる。ａｂｅｄｉａ．ｃｏｍ／ｗｉｌｅｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブを参照されたい。
【０００５】
パルボウイルス科のメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロ塩基（ｋｂ）の一本鎖線状ＤＮＡゲノムを有する無エンベロープ二十面体ウイルスである。ＡＡＶは、精製アデノウイルス株中の混入物として発見されたため、ディペンドウイルス属に帰属される（Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｆｉｅｌｄ’ｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｅｄ．Ｓｉｘｔｈ，２０１３）。ＡＡＶは、その野生型状態では、複製に必要なタンパク質因子を提供するヘルパーウイルス―典型的にはアデノウイルス―に依存する、というのも、ＡＡＶは天然には複製能欠損性であるからである。ＡＡＶの４．７ｋｂのゲノムの両側には、複製にとって重要なヘアピン形状に折りたたまれる２つの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が位置している。ＡＡＶは、天然には複製能欠損性でありなおかつ人体のほぼ全ての細胞型に形質導入することができるため、遺伝子治療またはワクチン送達における治療的使用に理想的なベクターに相当する。野生型状態でのＡＡＶの生活環は、感染後にＡＡＶゲノムが部位特異的に宿主染色体中に組み込まれる潜伏期と、アデノウイルスか単純ヘルペスウイルスかのどちらかによる感染の後、組み込まれたゲノムが救出、複製及びパッケージングされて感染性ウイルスになる感染期とを含む。ベクター化させる場合、ＡＡＶのウイルス性Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子を取り出してウイルス産生中にトランスで供給し、結果的にＩＴＲを残存する唯一のウイルスＤＮＡにする（Ａ．Ｖａｓｉｌｅｖａ，Ｒ．Ｊｅｓｓｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３，８３７−８４７（２００５））。そうして遺伝子追加または遺伝子標的化を行う一連のふさわしい移入用ベクター配置でＲｅｐ及びＣａｐを置き換える。これらのベクター化組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、分裂細胞にも非分裂細胞にも形質導入し、静止している組織において堅牢で安定した発現を示す。様々な遺伝性または後天性の疾患の処置が完了したかまたは進行中であるｒＡＡＶ遺伝子治療治験の数は、ｒＡＡＶに基づいた療法の評判が高まるにつれて劇的に増えている。同様に、臨床用ワクチンの分野では、ヒト／類人猿の免疫不全ウイルス（ＨＩＶ／ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ヘニパウイルス及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のために受動ワクチン手法で抗体発現カセットを送達するベクターとしてｒＡＡＶを使用する数多くの前臨床研究及び一つの進行中の治験が行われてきた（Ｐ．Ｒ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ｃ．Ｓｃｈｎｅｐｐ，Ｊ．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｊ．Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｙｕｓｔｅ，Ｒ．Ｃ．Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，Ｋ．Ｒ．Ｃｌａｒｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５，９０１−９０６（２００９）、Ａ．Ｂ．Ｂａｌａｚｓ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｍ．Ｈｏｎｇ，Ｄ．Ｓ．Ｒａｏ，Ｌ．Ｙａｎｇ，Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ４８１，８１−８４（２０１２）、Ａ．Ｂ．Ｂａｌａｚｓ，Ｙ．Ｏｕｙａｎｇ，Ｃ．Ｍ．Ｈｏｎｇ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｍ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｓ．Ｒａｏ，Ｄ．Ｓ．Ａｎ，Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｎａｔｕ��ｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０，２９６−３００（２０１４）、Ａ．Ｂ．Ｂａｌａｚｓ，Ｊ．Ｄ．Ｂｌｏｏｍ，Ｃ．Ｍ．Ｈｏｎｇ，Ｄ．Ｓ．Ｒａｏ，Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，６４７−６５２（２０１３）、Ｍ．Ｐ．Ｌｉｍｂｅｒｉｓ，Ｖ．Ｓ．Ａｄａｍ，Ｇ．Ｗｏｎｇ，Ｊ．Ｇｒｅｎ，Ｄ．Ｋｏｂａｓａ，Ｔ．Ｍ．Ｒｏｓｓ，Ｇ．Ｐ．Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｔｒｅｔｉａｋｏｖａ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，１８７ｒａｌ７２（２０１３）、Ｍ．Ｐ．Ｌｉｍｂｅｒｉｓ，Ｔ．Ｒａｃｉｎｅ，Ｄ．Ｋｏｂａｓａ，Ｙ．Ｌｉ，Ｇ．Ｆ．Ｇａｏ，Ｇ．Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＦＩ６  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｉｒｗａｙ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｎｅｗ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ，Ｈ７Ｎ９．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ＣＶＩ  ２０，１８３６−１８３７（２０１３）、Ｊ．Ｌｉｎ，Ｒ．Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｌ．Ｈ．Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｐ．Ｂｅｌｌ，Ｓ．Ｓｏｍａｎａｔｈａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３，１２７３８−１２７５０（２００９）、Ｉ．Ｓｉｐｏ，Ｍ．Ｋｎａｕｆ，Ｈ．Ｆｅｃｈｎｅｒ，Ｗ．Ｐｏｌｌｅｒ，Ｏ．Ｐｌａｎｚ，Ｒ．Ｋｕｒｔｈ，Ｓ．Ｎｏｒｌｅｙ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９，１６９０−１６９９（２０１１）、Ａ．Ｐｌｏｑｕｉｎ，Ｊ．Ｓｚｅｃｓｉ，Ｃ．Ｍａｔｈｉｅｕ，Ｖ．Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ，Ｖ．Ｂａｒａｔｅａｕ，Ｋ．Ｃ．Ｏｎｇ，Ｋ．Ｔ．Ｗｏｎｇ，Ｆ．Ｌ．Ｃｏｓｓｅｔ，Ｂ．Ｈｏｒｖａｔ，Ａ．Ｓａｌｖｅｔｔｉ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２０７，４６９−４７８（２０１３）、Ｄ．Ｋｕｃｋ，Ｔ．Ｌａｕ，Ｂ．Ｌｅｕｃｈｓ，Ａ．Ｋｅｒｎ，Ｍ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｌ．Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８０，２６２１−２６３０（２００６）、Ｋ．Ｎｉｅｔｏ，Ａ．Ｋｅｒｎ，Ｂ．Ｌｅｕｃｈｓ，Ｌ．Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  １４，１１２５−１１３７（２００９）、Ｋ．Ｎｉｅｔｏ，Ｃ．Ｓｔａｈｌ−Ｈｅｎｎｉｇ，Ｂ．Ｌｅｕｃｈｓ，Ｍ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｌ．Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２３，７３３−７４１（２０１２）、及びＬ．Ｚｈｏｕ，Ｔ．Ｚｈｕ，Ｘ．Ｙｅ，Ｌ．Ｙａｎｇ，Ｂ．Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｌｉａｎｇ，Ｌ．Ｌｕ，Ｙ．Ｐ．Ｔｓａｏ，Ｓ．Ｌ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｌｉ，Ｘ．Ｘｉａｏ，Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２１，１０９−１１９（２０１０）を参照のこと）。非病原性、非分裂細胞を含めた広い感染宿主範囲、及び潜在的な部位特異的染色体組込みの特性はＡＡＶを遺伝子移入の魅力的なツールにする。
【０００６】
西洋諸国で認可された最初のｒＡＡＶに基づく遺伝子治療（２０１２年に欧州連合で使用が認可されたリポタンパク質リパーゼ欠損症のためのグリベラ（登録商標））は、ｒＡＡＶ療法を臨床へと世界的に動かす現実の可能性に向けて遺伝子治療界、発明者及び規制機関を刺激した。しかし、様々な組織型及び細胞型に形質導入するｒＡＡＶの素晴らしい能力にもかかわらず、ヒト肝組織は歴史的に、送達された導入遺伝子産物を治療レベルで持続的に発現させるのに十分高いレベルで形質導入するのが困難な組織であった。これはおそらく、標的組織に形質導入するのに最良のカプシド血清型を決定するためのｒＡＡＶを使用する前臨床モデリングが動物モデル―典型的にはマウス―で行われ、それが必ずしも、各ｒＡＡＶが有する組織向性及び細胞向性をヒトにおいて再現するものでも、処置時の形質導入能を再現するものでも、またヒトに存在する免疫学的障壁を再現するものでもない、という事実に起因している。
【０００７】
米国特許公開第２０１５／０１７６０２７号、第２０１５／００２３９２４号、第２０１４／０３４８７９４号、第２０１４／０２４２０３１号及び第２０１２／０１６４１０６号（それらの全てを参照により全体的に本明細書に援用する）を含めた種々の公開済みの米国特許出願にはＡＡＶベクター及びビリオンについての記載がある。
【０００８】
しかしながら、遺伝子治療試験には高レベルの形質導入が必要とされる。変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、強化された中和特性を呈しかつ／またはヒト肝組織もしくは肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における向上した形質導入もしくは向性を呈したならば、より低い用量及びより少ない回数の注射が必要とされるようになり、治療上の妥当性を獲得するであろう。同様に、ワクチン送達ツールとして使用する場合、血中循環抗体の治療レベルに達すべく、ＡＡＶにコードされている抗体の堅牢な分泌を成し遂げるためには、高効率の形質導入及び安定性が必要とされる。
【０００９】
したがって、強化された中和特性を呈し、ヒト肝組織もしくは肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における向上した形質導入もしくは向性を呈する変異型ＡＡＶカプシド、または両方とも呈する変異型ＡＡＶカプシドが、当該技術分野においてなおも必要とされ続けている。本発明は、強化された中和特性、ヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における向上した形質導入または向性を実証する変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド、及び両方の特性を呈する変異型ＡＡＶカプシドを提供することによってこの必要性を満たす。本発明は、ＤＮＡ遺伝子シャッフリングによる指向的進化を利用して、強化された中和特性、ヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における向上した形質導入または向性を有するそのような変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド、及び両方の特性を呈する変異型ＡＡＶカプシドを評価及びスクリーニングする。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性を呈する、当該変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した形質導入を呈する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した向性を呈する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織または非肝細胞性ヒト細胞における形質導入または向性を呈する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した生体内でのヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の形質導入を呈する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内でのヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の形質導入を呈する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内での三次元培養物中のヒト肝オルガノイドの形質導入を呈する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは機能性ＡＡＶカプシドの一部であり、上記機能性ＡＡＶカプシドは、非コードＲＮＡ、タンパク質コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子指向性カセット、及び治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列をパッケージングする。
【００２０】
いくつかの実施形態では、核酸配列はＡＡＶベクター内に含まれている。
【００２１】
いくつかの実施形態では、発現カセットがＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現システムである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、治療用発現カセットは治療タンパク質または治療抗体をコードする。
【００２３】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された核酸発現を可能にする。
【００２４】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列は、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）、ＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）及びＡＡＶ−ＮＰ３０（配列番号８）からなる群から選択される。
【００２５】
本発明はさらに、治療処置計画またはワクチンにおいて変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用する方法を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用する方法は、対象に投与される核酸の総量の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用して核酸を形質導入するときに、同程度の治療効果を得るために非変異型親カプシドポリペプチドを使用して核酸を形質導入する場合に対象に投与される核酸の量に比べてより少ない総量の核酸を対象に投与することを含む。
【００２７】
本発明はさらに、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈する、当該変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを提供する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した形質導入を呈する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した向性を呈する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性を呈する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織または非肝細胞性ヒト細胞における形質導入または向性を呈する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した生体内でのヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の形質導入を呈する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内でのヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の形質導入を呈する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内での三次元培養物中のヒト肝オルガノイドの形質導入を呈する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは機能性ＡＡＶカプシドの一部であり、上記機能性ＡＡＶカプシドは、非コードＲＮＡ、タンパク質コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子指向性カセット、及び治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列をパッケージングする。
【００３７】
いくつかの実施形態では、核酸配列はＡＡＶベクター内に含まれている。
【００３８】
いくつかの実施形態では、発現カセットはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現システムである。
【００３９】
いくつかの実施形態では、治療用発現カセットは治療タンパク質または治療抗体をコードする。
【００４０】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された核酸発現を可能にする。
【００４１】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列は、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）、ＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）及びＡＡＶ−ＮＰ３０（配列番号８）からなる群から選択される。
【００４２】
本発明はさらに、治療処置計画またはワクチンにおいて変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用する方法を提供する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用する方法は、対象に投与される核酸の総量の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用して核酸を形質導入するときに、同程度の治療効果を得るために非変異型親カプシドポリペプチドを使用して核酸を形質導入する場合に対象に投与される核酸の量に比べてより少ない総量の核酸を対象に投与することを含む。
【００４４】
本発明はさらに、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターであって、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性を呈する、当該ＡＡＶベクターを提供する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における向上した形質導入または向性を呈する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した形質導入を呈する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した向性を呈する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織または非肝細胞性ヒト細胞における形質導入または向性を呈する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した生体内でのヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の形質導入を呈する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内でのヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の形質導入を呈する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内での三次元培養物中のヒト肝オルガノイドの形質導入を呈する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ベクターはさらに、非コードＲＮＡ、コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子指向性カセット、及び治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された核酸発現を可能にする。
【００５５】
いくつかの実施形態では、発現カセットはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現システムである。
【００５６】
いくつかの実施形態では、治療用発現カセットは治療タンパク質または治療抗体をコードする。
【００５７】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列は、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）、ＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）及びＡＡＶ−ＮＰ３０（配列番号８）からなる群から選択される。
【００５８】
本発明はさらに、治療処置計画またはワクチンにおいて変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用する方法を提供する。
【００５９】
本発明はさらに、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターであって、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈する、当該ＡＡＶベクターを提供する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した形質導入を呈する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドに比べて向上した向性を呈する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドに比べて強化された中和特性を呈する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織または非肝細胞性ヒト細胞における形質導入または向性を呈する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した生体内でのヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の形質導入を呈する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内でのヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の形質導入を呈する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内での三次元培養物中のヒト肝オルガノイドの形質導入を呈する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ベクターはさらに、非コードＲＮＡ、コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子指向性カセット、及び治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された核酸発現を可能にする。
【００７０】
いくつかの実施形態では、上記発現カセットはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現システムである。
【００７１】
いくつかの実施形態では、上記治療用発現カセットは治療タンパク質または治療抗体をコードする。
【００７２】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列は、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）、ＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）及びＡＡＶ−ＮＰ３０（配列番号８）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）及びＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）及びＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）である。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）である。
【００７３】
本発明はさらに、治療処置計画またはワクチンにおいて変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを使用する方法を提供する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶベクターを使用する方法は、対象に投与されるＡＡＶベクターの総量の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、上記ＡＡＶベクターを変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドによって形質導入する場合に、同程度の治療効果を得るために上記ＡＡＶベクターを非変異型親カプシドポリペプチドによって形質導入する場合に上記対象に投与されるＡＡＶベクターの量に比べてより少ない総量のＡＡＶベクターを、上記対象に投与することを含む。
【００７５】
本発明はさらに、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを生成する方法であって、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性と向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性とを両方とも呈するものである、当該方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、
ａ）変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドのライブラリーを生成することを含み、上記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、２つ以上の非変異型親カプシドポリペプチドからの複数の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列を含むものであり；
ｂ）上記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドライブラリーをＡＡＶベクターにクローニングすることによってＡＡＶベクターライブラリーを生成することを含み、上記ＡＡＶベクターが複製能のあるＡＡＶベクターであり；
ｃ）非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性と向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性との両方に関してｂ）からの上記ＡＡＶベクターライブラリーから変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドをスクリーニングすることを含み；さらに、
ｄ）ｃ）からの上記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを選抜することを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、方法はさらに、ｅ）ｄ）からの上記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドの配列を決定することを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した形質導入を呈する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した向性を呈する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織または非肝細胞性ヒト細胞における形質導入または向性を呈する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した生体内でのヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の形質導入を呈する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内でのヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の形質導入を呈する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した試験管内での三次元培養物中のヒト肝オルガノイドの形質導入を呈する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）による異種移植術を受けたキメラマウスにおいてヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の選択的な形質導入を呈する。
【００８５】
本発明のその他の目的、利点及び実施形態は以下の詳細な説明から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】マウス肝細胞及びヒト肝細胞に対するＡＡＶ血清型ＤＪ及びＬＫ０３の種選好性をそれぞれ際立たせている共焦点免疫蛍光（ＩＦ）染色を示す。
【図２】ＤＮＡシャッフリング及び、ヒト化肝臓マウスにおけるプールされたヒト免疫グロブリンに対する多重逐次スクリーニングによる、アデノ随伴ウイルスカプシドの指向的進化に関する図解を示す。（Ａ）１０個の親血清型（１、２、３ｂ、４、５、６、８、９＿ｈｕ１４、鳥類、及びウシ）からのＡＡＶカプシド遺伝子をＰＣＲ増幅し、ＤＮａｓｅＩ消化により断片化し、その後、セルフプライミングＰＣＲによってランダムに再構成させた。結果として生じたシャッフリング済みＣａｐ遺伝子を複製能のあるＡＡＶ産生プラスミドの中へと、ＡＡＶ２  Ｒｅｐの下流で両側に位置するＳｗａＩ／ＮｓｉＩ部位を介して再クローニングした。結果として産生したライブラリーのプラスミドは、ＡＡＶ２  ＩＴＲと、改変されたＡＡＶ２  ３’ＵＴＲとを含有していた。ＡＡＶライブラリーは標準的な生産プロトコールを用いてパッケージングさせ、ドットブロット力価測定を行い、選抜のために使用した。（Ｂ）ヒト化肝臓マウスでの選抜のためにＮＴＢＣ選抜によってヒト化肝臓ＦＲＧマウスを作る手順を示す図である。（Ｃ）（Ｂ）からのヒト化肝臓マウスにおける（Ａ）からの複製性ＡＡＶカプシドライブラリーでの最初の５回選抜スクリーニングを示す図である。（Ｄ）プールされたヒト免疫グロブリンに対して、ヒト肝細胞向性に関して既にスクリーニングされた進化ＡＡＶライブラリーを使用する、後に続く２回の副スクリーニングを示す図である。プールされたヒト免疫グロブリンに結合しなかったカプシドを将来の特性評価において採用した。
【図３】ヒト肝臓向性及び低減されたヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）結合性に関する多重逐次ＡＡＶカプシドスクリーニングを示した図解を示す。
【図４】プールされたヒトＩｇＧによる体液性中和の軽減に関して５回目に選抜されたＡＡＶカプシドに対する逐次副スクリーニングを示した図解を示す。
【図５】選抜された１００種の変異型の系統発生を示した図を示し、逐次スクリーニングによって進化した関連カプシドの「ファミリー」を示す。
【図６】密接に関連しているＡＡＶキメラのプールに対するＩＶＩＧ結合アッセイに関するデータを示す。
【図７】プールＡからの４つの変異型（ＡＡＶ−ＮＰ５９、ＡＡＶ−ＮＰ８４、ＡＡＶ−ＮＰ４０及びＡＡＶ−ＮＰ３０）のカプシド充実スコアに関するデータを示す。
【図８】ライブラリースクリーニングからのプールＡ変異型のキメラカプシド組成に対する親寄与を示した図を示す。
【図９】ヒト肝細胞を移植したキメラマウスのヒト肝細胞の生体内での共焦点免疫蛍光（ＩＦ）染色を示す。第１列：ヘキスト染色した核（青色）。第２列：ヒトＦＡＨタンパク質のヒト肝細胞染色（赤色）。第３列：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現しているＡＡＶ形質導入細胞（緑色）。第４列：第１列、第２列及び第３列の重ね合わせ。
【図１０】漸増濃度のプールされたヒト免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の存在下で各ＡＡＶを使用するヒトＨＥＫ２９３細胞及びヒトＨｕｈ７細胞での中和アッセイに関するデータを示す（ＡＡＶ−ＮＰ５９、ＡＡＶ−ＮＰ８４、ＡＡＶ−ＮＰ４０及びＡＡＶ−ＮＰ３０）。ＩＶＩＧ中和アッセイには、以前に記載のあるいくつかの方法（Ｇｒｉｍｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２（１２）：５８８７−５９１１（２００８）；Ａｒｂｅｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（２４）：１５２３８−１５２４５（２００５））を改変して取り入れた。Ｇａｍｍａｇａｒｄ  ＩＶＩＧ液［１００ｍｇ／ｍＬ］（Ｂａｘｔｅｒ、製品コード番号ＬＥ１５００１９０、ロット番号ＬＥ１２Ｐ１８０ＡＢ）を０〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲（０、０．１、１、２．５、５、１０、２５、５０ｍｇ／ｍＬ）で使用した。ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰを移入ベクターとして使用した。各変異型の同数のゲノム含有ベクター粒子（ＭＯＩ７５，０００）を漸増濃度のＩＶＩＧと共に３７℃で１時間インキュベートした。この時間中に、両方の細胞種での細胞培養の培地を、いかなる血清または抗生物質／抗真菌薬も含有しない培地で交換した。８０，０００個の細胞（ＨＥＫ２９３かＨｕｈ７かのどちらか）をＩＶＩＧ／ＡＡＶ混合物で形質導入し、培養物を６時間後に洗浄し、ＡＡＶ輸送、脱殻及びＧＦＰ発現を可能にするために７２時間培養した。その後、細胞を採集し、ＧＦＰ発現に関してＦＡＣＳによって分析した。各血清型は、それ自体の「０ｍｇ／ｍＬ  ＩＶＩＧ」対照試料に対して標準化し、信号を５０％減少させるのに必要なＩＶＩＧの濃度を決定した（グラフのＸ軸とＹ軸とを０％ではなく５０％で交差させているのはこのためである）。１０，０００個の細胞を各条件で使用して計数／統計を決定した。
【図１１】４つのＡＡＶカプシド：Ａ）ＡＡＶ−ＮＰ８４、Ｂ）ＡＡＶ−ＮＰ５９、Ｃ）ＡＡＶ−ＮＰ４０及びＤ）ＡＡＶ−ＮＰ３０の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。
【図１２】各スクリーニングの進行中における各アミノ酸位置での親保存性パーセントを示す。ＰａｃＢｉｏ単分子配列決定及び生命情報科学的解析を用いて位置充実評価を行って、親血清型（ＡＡＶ１、２、３ｂ、４、５、６、８、９＿ｈｕ１４）からのアミノ酸における保存性パーセントまたは、スクリーニング中の肝要な回（生体内での投入時、１回目及び５回目、ならびに未結合の７回目）にある全カプシドにおける各アミノ酸のｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異を計算した。ウシ及び鳥類のものはプロットから外した、というのも、それら２つの血清型からの何らかの明らかな寄与を示した変異型はほとんどなかったからである。四角形の大きさが最大であることは変異型の１００％が、その親に由来するそのアミノ酸をその位置で共有していることを指し示す。四角形のその他あらゆる大きさは、その親に由来するそのアミノ酸をその位置で有する変異型の０〜１００％のパーセントに比例する。各親は凡例に示されているとおりに色付けし（同じ色体系を図３Ａ、図３Ｂで使用している）、スクリーニング中に発生したｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異は黒で示されている。参考のためにＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＡＡＰ  ＯＲＦが下側に図示されている。
【図１３】新規なシャッフリング済みヒト肝臓向性ＡＡＶカプシド変異型の配列的及び構造的な構成を示す。（Ａ）ライブラリーに使用した親ＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、２、３ｂ、４、５、６、８、９＿ｈｕ１４）からのベクター化変異型におけるカプシド断片交差の交差マッピングである。円の大きさが最大であることは、その親に由来するそのアミノ酸とのその位置での１００％の一致を指し示す。円のその他あらゆる大きさは、その位置でそのアミノ酸がその親と一致する尤度パーセントに比例する。各キメラにおいて黒の実線は、各交差にわたって同定された最も可能性の高い親血清型一致を表す。交差同士の間にある薄い平行線は、等しい確率での多重親一致を指し示す。垂直の杭状のものは親配列空間内からの突然変異を指し示し、他方、上部のアスタリスクは、どの親もその位置でそのアミノ酸を有していない、発生したｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異を指し示す。参考のためにＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＡＡＰ  ＯＲＦが下側に図示されている。（Ｂ）シャッフリング済み変異型をＡＡＶ２の結晶構造に対して３Ｄ擬似カラーマッピングした。色分けは、（Ａ）の場合と同じ色を使用した親寄与を指し示す。
【図１４】ヒト化肝臓マウスにおける生体内でのヒト肝細胞形質導入の検証及び比較定量を示す。（Ａ）様々なカプシド血清型を使用して２Ｅ１１ｖｇのｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰの静脈注射によって形質導入されたオレゴン健康科学大学（ＯＨＳＵ）からの処置済みヒト化肝臓マウスからの代表的な免疫組織化学的画像である。肝臓断面のヒト特異的ＦＡＨ（紫色）、ウイルスＧＦＰ（緑色）、ヘキスト（青色）である。目盛＝１００μＭ。（Ｂ）様々なカプシド血清型を使用して２Ｅ１１ｖｇのｓｓＡＡＶ−ＬＳＰ１−ＧＦＰの静脈注射によって形質導入された小児医療研究所（ＣＭＲＩ）からの処置済みヒト化肝臓マウスからの代表的な免疫組織化学的画像である。肝臓断面のヒト特異的アルブミン（赤色）、ウイルスＧＦＰ（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）である。目盛＝１００μＭ。（Ｃ）形質導入された異種移植マウスの分析のまとめである。形質導入されたヒト肝細胞の割合は、以前に記載４がなされているようにＧＦＰ蛍光の画像及びヒトＦＡＨ免疫染色から細胞計数を個々に解析及び比較することによって決定した。
【図１５】肝要な患者群及び非ヒト霊長類における免疫学的アッセイを示す。（Ａ）５０名の米国成人からの正常ヒト血清中の抗ＡＡＶ抗体の存在についての血清反応性ＥＬＩＳＡアッセイである。各患者について技術的三重反復でのアッセイを行い、データ点は、平均値からバックグラウンドを差し引いたものを表した。赤線は平均を表す。記号は、比較を可能にすべく各患者の処置を通して一貫している。（Ｂ）６頭のアカゲザルからの血清中の抗ＡＡＶ抗体の存在についての血清反応性ＥＬＩＳＡアッセイである。各ドットは１頭のアカゲザルである。赤線は平均を表す。（Ｃ）ヒト２Ｖ６．１１  ＡＡＶ許容細胞を使用して、２１名の欧州個人の患者血清の存在下でｒＡＡＶ中和を評価した。データは、５０％を上回る形質導入阻害が認められたときの希釈倍率の逆数を示す。赤線は平均を表す。（Ｄ）血友病Ｂを有する２１名の成人男性からのヒト血清中の抗ＡＡＶ抗体の存在についての血清反応性ＥＬＩＳＡアッセイである。赤線は平均を表す。
【図１６】比較のためのＡＡＶによる生体外ヒト肝臓オルガノイド形質導入を示す。（Ａ）既知の肝臓向性ＡＡＶ対照血清型２、８、ＤＪ及びＬＫ０３と比較したときの、初代ヒト肝臓オルガノイド培養物におけるベクター化変異型のＧＦＰ発現による形質導入評価である。各血清型を技術的二重反復での１４日間にわたって評価した。１１日目のものが示されている。目盛＝１００μＭ。オルガノイド培養物からの培地をＥＬＩＳＡによってヒトアルブミンの存在に関して試験した（ヒトアルブミン＝５８．３ｎｇ／ｍＬ）。（Ｂ）１４日目の研究終了時の（Ａ）からの１００，０００個の解離オルガノイド細胞に対するＧＦＰ  ＦＡＣＳ定量データである。
【図１７】ＡＡＶ−ＤＪによる機能的ヒト肝細胞形質導入の欠如に関するデータを示す。（Ａ）２Ｅ１１ｖｇのｓｓＡＡＶ−ＤＪ−ＣＡＧ−ＧＦＰが静脈内投与された異種移植ＦＲＧ肝臓の代表的な染色である。切片をヘキスト（青色）、ウイルスＧＦＰ（緑色）及びヒト特異的ＦＡＨ（紫色）で染色した。目盛＝１００μＭ。（Ｂ）形質導入された異種移植マウスの分析のまとめである。（Ｃ）（Ａ）からの切片でのＧＦＰ  ＲＮＡ  ＦＩＳＨとＧＦＰタンパク質ＩＦとの重ね合わせである。ヒト及びマウスの肝細胞をＤＡＰＩ標識（マウス核＝大きい水色の異色斑点（緑色矢印）；ヒト核＝小さいぼやけた青（白色矢印））によって差別化した。ＧＦＰ  ＲＮＡ  ＦＩＳＨによってＡＡＶ−ＧＦＰゲノム（赤色）を探した。その後、緑色ＧＦＰタンパク質免疫蛍光をＧＦＰ  ＲＮＡプローブの上に重ね、画像座標を記録した。いくつかのヒト肝細胞はＤＪ−ＧＦＰ  ＲＮＡを示したが、付随するＧＦＰタンパク質発現を示したものはなかった。多くのマウス肝細胞はＤＪ−ＧＦＰ  ＲＮＡを示し、ＧＦＰタンパク質発現も有していた。目盛＝１０μＭ。（Ｄ）（ｂ）からの肝臓切片に対するＲＮＡ  ＦＩＳＨの後に続くＧＦＰ  ＤＮＡ  ＦＩＳＨ（赤色）である。稀に、ＡＡＶ  ｄｓＤＮＡの核質鎖状体を示すヒト肝細胞があった（赤色斑点、桃色矢印）。これは、ＡＡＶ脱殻の成功、ｄｓＤＮＡ変換の成功、そして場合によってＲＮＡへの転写の成功さえも、累加的に示したが、それらのゲノムのＧＦＰタンパク質への翻訳は遮断された。（ｅ）それに比べて、ＡＡＶ−ＬＫ０３−ＧＦＰ陽性対照ＲＮＡ  ＦＩＳＨは豊富な細胞質及び核小体のＧＦＰ  ＲＮＡを示した（赤色）。ＲＮＡｓｅ  Ａによる処置に続いてＧＦＰ  ＲＮＡ  ＦＩＳＨは、ＲＮＡ  ＦＩＳＨ単独で見受けられた信号がないことを示した。ＲＮＡｓｅ  Ａ及びＲＮＡ  ＦＩＳＨの後に行った逐次ＧＦＰ  ＤＮＡ  ＦＩＳＨは、明るい核質ＧＦＰ  ＤＮＡ信号の存在を示し、ＲＮＡ  ＦＩＳＨからの信号がｓｓＲＮＡであって、誤探知されたｓｓＤＮＡ  ＡＡＶゲノム信号ではないということを裏付けた。
【図１８】ライブラリークローニング用プラスミド内の改変されたＡＡＶ２  ＶＰ１  ３’ＵＴＲ配列を示す。ＡＡＶ２由来の改変された３’−ＵＴＲ配列は、レシピエントライブラリープラスミドのクローニングの間、ＡＡＶゲノムの適切な発現及び複製を確保するために維持した。
【図１９】ＰａｃＢｉｏ完全長カプシド配列決定を利用したスクリーニング進行の系統図を示す。（Ａ）ライブラリー及び全てのライブラリー変異型の中の親血清型におけるアミノ酸レベルでの遺伝的関連性を示す、比較のための系統発生である。未選抜ＡＡＶライブラリーから５回の生体内選抜及びビーズ上での２回のＩｇＧ選抜を経るにつれて多様性が低下し、充実度が高くなることが示される。（Ｂ）（ａ）を生成するために使用した未処理及びフィルタリング済みの読取りＣＣＳ計数を示す。
【図２０】スクリーニング完了からの上位の変異型の系統発生及び充実スコアを示す。（Ａ）ライブラリーの中の親血清型（ＡＡＶ１、２、３ｂ、４、５、６、８、９＿ｈｕ１４）におけるアミノ酸レベルでの遺伝的関連性を示す系統樹及び、未結合のＡＡＶ画分の免疫回避に関する２つ目のスクリーニングの最終回からの１００個の選抜変異型である。（Ｂ）最尤度に基づいて親血清型由来の配列と比較することによって各キメラの配列内の核アミノ酸位置についての充実スコアを算出した。ライブラリー親は、示された異なる色で描写されている。
【図２１】非ヒト化マウスにおける短時間の生体内形質導入の経時変化を示す。（Ａ）尾静脈内投与（２Ｅ１１ｖｇ／マウス）後にｓｓＡＡＶ−ＥＦ１α−ＦＬｕｃを発現している、ＰＢＳ、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＮＰ３０、ＡＡＶ−ＮＰ４０、ＡＡＶ−ＮＰ５９またはＡＡＶ−ＮＰ８４で処置された未移植の野生型Ｂａｌｂ／ｃＪマウスにおけるＦＬｕｃ形質導入のライブイメージング経時変化。共通する同じ尺度で撮像した全てのマウスと共に平均放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）が示されている。全てのマウスの背側（ｄ）及び腹側（ｖ）を撮像した。（Ｂ）（Ａ）からのマウスの１４日目の背側及び腹側の定量放射輝度である。
【図２２】性別ごとに分けた血清反応性ＥＬＩＳＡプロファイリングを示す。図５ａからのヒト血清反応性の分解である。記号は、比較を可能にすべく各患者の処置を通して一貫している。（Ａ）男性患者。（Ｂ）女性患者。線は平均を表す。
【図２３】最も高性能なシャッフリング済みカプシド変異型のアミノ酸配列を示す。
【図２４】用量５×１０１０ｖｇの４つのベクター（ＮＰ５９、ＮＰ４０、ＮＰ８４及びＬＫ０３）の各々によるヒト化マウスにおけるヒト肝細胞の形質導入に関するデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
序論
強化された中和特性を呈することができる遺伝子治療ベクターならびに、ヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における向上した形質導入及び／または向性を有しその結果としてより高い治療レベルの核酸発現を成し遂げることができる遺伝子治療用のベクターが当該技術分野においてなおも必要とされ続けている。本発明は、この必要性を満たして、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性を呈する変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを提供する。本発明はさらに、この必要性を満たして、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈する変異型ＡＡＶカプシドを提供する。本発明はさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性と、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入及び／または向性とを両方とも呈する変異型ＡＡＶカプシドを提供することによってこの必要性を満たす。
【００８８】
詳細な説明
様々な実施形態において本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド（すなわち変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド）であって、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性を呈する、当該変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈する。
【００８９】
様々な実施形態において本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈する、当該変異型カプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを変異型組換えＡＡＶカプシドポリペプチドまたは変異型ｒＡＡＶカプシドポリペプチドと呼ぶ。
【００９１】
他の様々な実施形態において本発明は、変異型カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターであって、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性を呈する、当該ＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターを組換えＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶベクターと呼ぶ。
【００９２】
他の様々な実施形態において本発明は、変異型カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターであって、変異型カプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈する、当該ＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターを組換えＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶベクターと呼ぶ。
【００９３】
他の様々な実施形態において本発明は、変異型カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターであって、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性と、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性とを両方とも呈する、当該ＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターを組換えＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶベクターと呼ぶ。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＡＶベクターであって、ａ）変異型ＡＡＶカプシドタンパク質を含み、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、実質的に同一の非変異型親ＡＡＶカプシドタンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、変異型カプシドタンパク質が、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて強化された中和特性を呈する、当該ＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドポリペプチドは、天然に存在するＡＡＶカプシドポリペプチドに存在しているアミノ酸配列を含んでいない。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＡＶベクターであって、ａ）変異型ＡＡＶカプシドタンパク質を含み、その変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、実質的に同一の非変異型親ＡＡＶカプシドタンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、変異型カプシドタンパク質が、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上した肝組織または肝細胞における形質導入または向性を呈する、当該ＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドポリペプチドは、天然に存在するＡＡＶカプシドポリペプチドに存在しているアミノ酸配列を含んでいない。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＡＶベクターであって、ａ）変異型ＡＡＶカプシドタンパク質を含み、その変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、実質的に同一の非変異型親ＡＡＶカプシドタンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、変異型カプシドタンパク質が、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性と、非変異型カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて強化された中和特性とを両方とも呈する、当該ＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドポリペプチドは、天然に存在するＡＡＶカプシドポリペプチドに存在しているアミノ酸配列を含んでいない。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドであって、実質的に同一の非変異型親ＡＡＶカプシドポリペプチドに関して少なくとも１つのアミノ酸差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、かつ非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて強化された中和特性を呈する、当該変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、天然に存在するＡＡＶカプシドポリペプチドに存在しているアミノ酸配列を含んでいない。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドであって、実質的に同一の非変異型親ＡＡＶカプシドタンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、かつ非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈する、当該変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、天然に存在するＡＡＶカプシドポリペプチドに存在しているアミノ酸配列を含んでいない。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドであって、実質的に同一の非変異型親ＡＡＶカプシドポリペプチドに対して少なくとも１つのアミノ酸差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、かつ非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて強化された中和特性と非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性とを両方とも呈する、当該変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、天然に存在するＡＡＶカプシドポリペプチドに存在しているアミノ酸配列を含んでいない。
【０１００】
本発明をさらにいっそう詳しく説明する前に、本発明が本明細書に記載の特定の実施形態に限定されないことを理解されたい、というのも、そのような実施形態は変化し得るものであるからである。また、本明細書中で使用する術語は単に特定の実施形態を説明するためのものであるに過ぎず、術語は限定を意図したものでない、ということも理解されたい。本発明の範囲は、別記の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる。別段の定めがない限り、本明細書中で使用する全ての科学技術用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。値の範囲が示されている場合には、文脈が明らかに別の指示をしていない限り下限の一位の数の１０分の１までの、その範囲の上限と下限との間にある各値及び、示されたその範囲内の、示されているかまたは間にある他の任意の値は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は独立して、そのより小さい範囲の中に含まれ得、さらに、示された範囲において具体的に排除された任意の限界の条件下で本発明に包含される。示された範囲が片方または両方の限界を含む場合には、含まれたそれらの限界の片方または両方を除いた範囲も本発明に含まれる。本明細書において特定の範囲は、先行する「約」を伴った数値で提示される。「約」という用語は、本明細書において、それに先行される厳密な数及び、その用語が先行している数に近いかまたはその近似である数に対して、文字上の支持を提供するために使用される。ある数が、具体的に列挙された数に近いかまたはその近似であるか否かの判断において、列挙されていない近いかまたは近似である数は、提示された文脈において、具体的に列挙された数と実質的に等価な数であり得る。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願を参照により援用することを具体的かつ個別に示したのと同じ程度に、参照により本明細書に援用される。さらに、引用された各々の刊行物、特許または特許出願は、刊行物の引用と関連付けられる主題を開示及び記載するために、参照により本明細書に援用される。いかなる刊行物の引用も、出願日前のその開示に関するものであり、先行発明の効力によって本明細書に記載の本発明がそのような刊行物に先行する権利を有さないことを認めるものと解釈されるべきでない。さらに、提供される公開日は実際の公開日とは異なっている場合があり、それは独立して確認される必要があり得る。
【０１０１】
特許請求の範囲はいかなる任意選択要素も排除して書かれている場合があることに留意されたい。したがって、この記載は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「もっぱら」、「単に」などのような排他的術語の使用または「消極的な」限定の使用に先立つ基準としての役割を果たすことが意図されている。本開示を読めば当業者には明らかとなろうことであるが、本明細書において記載及び例示されている個々の実施形態は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴とは容易に分離及び結合される別個の要素及び特徴を有する。列挙されるどの方法も、列挙されている事象の順序または、論理的に可能なその他の任意の順序で行われ得る。本明細書に記載の方法及び材料に類似するかまたはそれと等価ないかなる方法及び材料を本発明の実施または試験において使用してもよいが、実例となる代表的な方法及び材料をこれより説明する。
【０１０２】
本発明において記載する際に次の用語を使用することとし、それらは以下に示すとおりに定義される。
【０１０３】
略語
「ＡＡＶ」は、アデノ関連ウイルスの略語であり、ウイルス自体またはその派生物を指すために使用され得る。当該用語は、別に定めがある場合を除いて、全てのサブタイプならびに天然に存在する形態及び組換え形態を包含する。「ｒＡＡＶ」という略語は、組換えアデノ関連ウイルスを指し、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる。
【０１０４】
定義
「ＡＡＶ」という用語は、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３）、３ｂ型ＡＡＶ（ＡＡＶ３ｂ）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ９＿ｈｕ１４、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染することができるＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は、非霊長類哺乳動物に感染することができるＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」は、ウシ  哺乳動物などに感染することができるＡＡＶを指す。
【０１０５】
本明細書中で使用する場合での「ＡＡＶベクター」は、様々な核酸配列をコードするＡＡＶベクター核酸配列を指し、いくつかの実施形態においては変異型カプシドポリペプチドを含む（つまり、ＡＡＶベクターは、変異型カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む）。変異型カプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて、強化された中和特性、ヒト肝組織もしくは肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における向上した形質導入もしくは向性を呈するかまたは、いくつかの実施形態においてそれらを両方とも呈する。ＡＡＶベクターは、核酸インサートの一部として、ＡＡＶ起源でない異種核酸配列を含むこともできる。この異種核酸配列は、典型的には、細胞の遺伝形質転換のための対象配列を含む。一般に、異種核酸配列の横には少なくとも１つ、一般的には２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が配置されている。
【０１０６】
「非変異型親カプシドポリペプチド」という用語は、天然に存在するＡＡＶカプシドポリペプチド及び／または任意のＡＡＶ野生型カプシドポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、非変異型親カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９＿ｈｕ１４、ウシＡＡＶ及び／または鳥類ＡＡＶのカプシドポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、非変異型親カプシドポリペプチドはまた、本明細書に記載され当該技術分野において既知であるような、限定されないが例えばＬＫ０３及び／またはＤＪを含めた対照カプシドポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、対照カプシドポリペプチドはＬＫ０３である。いくつかの実施形態では、対照カプシドポリペプチドはＤＪである。
【０１０７】
「実質的に同一」という用語は、変異型カプシドポリペプチド及び非変異型親カプシドポリペプチドとの関連において、１つ以上のアミノ酸変化を有する配列を指す。いくつかの実施形態では、これらの変化はカプシドポリペプチドのパッケージング機能に影響を与えない。いくつかの実施形態では、実質的に同一であることは、非変異型親カプシドポリペプチドと約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％または約９０％同一である変異型カプシドポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、変異型カプシドポリペプチドの部分領域にわたって、例えば、全ポリペプチド配列長の約２５％、約５０％、約７５％または約９０％にわたって、非変異型親カプシドポリペプチドと実質的に同一であることができる。
【０１０８】
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つの（変異型カプシドポリペプチドと非変異型親カプシドポリペプチドとの両方を含めた）ＡＡＶカプシドポリペプチドと、カプシド中に封入されたポリヌクレオチドＡＡＶ移入ベクターとからなるウイルス粒子を指す。粒子が異種核酸（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子）を含む場合、それは「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ＡＡＶビリオンまたはＡＡＶ粒子の生産はＡＡＶベクターの生産を必ず含む、というのも、そのようなベクターはＡＡＶビリオン中またはＡＡＶ粒子中に入っているからである。
【０１０９】
「パッケージング」は、核酸配列及び／またはその他の治療分子をカプシドで包んでいるＡＡＶビリオンまたはＡＡＶ粒子の組立てをもたらす一連の細胞内事象を指す。パッケージングは、本明細書に記載の変異型カプシドポリペプチドを含むカプシドの中に核酸配列及び／またはその他の治療分子を封入することを指し得る。
【０１１０】
本明細書中で使用する「治療分子」という語句は、核酸（例えばベクターを含む）、ポリペプチド（例えば抗体を含む）及びワクチンならびに、本発明の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドによってパッケージングされ得るその他の任意の治療分子を含み得る。
【０１１１】
ＡＡＶの「ｒｅｐ」遺伝子及び「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の複製タンパク質及びカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。本明細書ではＡＡＶのＲｅｐ（複製）及びＣａｐ（カプシド）をＡＡＶの「パッケージング遺伝子」と呼ぶ。
【０１１２】
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、哺乳動物細胞によってＡＡＶ（例えば野生型ＡＡＶ）が複製及びパッケージングされるのを可能にするウイルスを指す。ＡＡＶの種々のそのようなヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクチニアなどのポックスウイルスを含めて、当該技術分野において既知である。アデノウイルスは、数々の異なるサブグループを包含するが、サブグループＣの５型アデノウイルスが最も一般的にヘルパーウイルスとして使用されている。ヒト、非ヒト哺乳動物及び鳥類を起源とする数多くのアデノウイルスが既知であり、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられ、それらもＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。
【０１１３】
「ヘルパーウイルス機能（複数可）」は、ヘルパーウイルスゲノムにコードされている、ＡＡＶの複製及びパッケージングを（本明細書に記載の複製及びパッケージングのその他の要件との関連において）可能にする機能（複数可）を指す。本明細書に記載されているように、「ヘルパーウイルス機能」は、数々の方法で、例えば、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば必須機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列を産生細胞にトランスで提供することによって、もたらされ得る。
【０１１４】
「感染性」のビリオン、ウイルスまたはウイルス粒子とは、ウイルス種の指向先である細胞の中へと送達されることができるポリヌクレオチド成分を含むもののことである。その用語は必ずしもウイルスの何らかの複製能力を含意しているわけではない。本明細書中で使用する場合、「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子とは、標的細胞に接近した際に標的細胞に感染することができ、かつ標的細胞内で異種核酸を発現することができるもののことである。したがって、「感染性」は、標的細胞に接近し、標的細胞に感染し、標的細胞内で異種核酸を発現する、ウイルス粒子の能力を指す。感染性は、試験管内での感染性または生体内での感染性を指し得る。感染性ウイルス粒子の数を数えるための検査は本開示において他の所に記載されており、当該技術分野において既知である。ウイルス感染性は、全ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比率として表すことができる。全ウイルス粒子は、ウイルスゲノム複製物の数として表すことができる。細胞内で異種核酸を発現するウイルス粒子の能力は、「形質導入」と呼ぶことができる。細胞内で異種核酸を発現するウイルス粒子の能力は、（例えばＧＦＰをコードするヌクレオチド配列をウイルスが含む場合に）ＧＦＰをウイルス粒子に感染した細胞において産生させ、検出し、かつ／もしくは測定するものである緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）検査などのマーカー遺伝子の評価、または例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）もしくは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による産生したタンパク質の測定を含めた、数々の技術を用いて検査することができる。
【０１１５】
「複製能のある」ビリオンまたはウイルス（例えば、複製能のあるＡＡＶ）は、感染性を有し表現型が野生型であり、なおかつ感染細胞内で（つまり、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製可能である、ウイルスを指す。ＡＡＶの場合、複製能力は大抵において機能性ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子を欠き、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）において複製不能である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターはいかなるＡＡＶパッケージング遺伝子配列も欠き、ＡＡＶパッケージング遺伝子と入ってくるＡＡＶベクターとの間での組換えによって複製能のあるＡＡＶを生成する可能性を最低限に抑える。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶベクター製剤は、複製能力を有するＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ。ＲＣＡとも呼ぶ）を含有するとしてもわずか（例えば、１０２個のＡＡＶ粒子あたり約１個未満のｒｃＡＡＶ、１０４個のＡＡＶ粒子あたり約１個未満のｒｃＡＡＶ、１０８個のＡＡＶ粒子あたり約１個未満のｒｃＡＡＶ、１０１２個のＡＡＶ粒子あたり約１個未満のｒｃＡＡＶ、または全く存在しないｒｃＡＡＶ）である。
【０１１６】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含めたあらゆる形態の核酸、オリゴヌクレオチドを指すために本明細書において互換的に使用される。ポリヌクレオチドとしては、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡならびに、スプライス済みまたはスプライス済みでないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡアンタゴミール、ならびに阻害性のＤＮＡまたはＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子ヘアピンもしくは短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマー、低分子干渉もしくは短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）が挙げられる。ポリヌクレオチドにはさらに、限定されないが例えばＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡアンタゴミール及びアプタマーを含めた非コードＲＮＡ、ならびに当業者において知られているその他の任意の非コードＲＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド及び、意図的に改変または修飾されたポリヌクレオチド、ならびに類縁体及び誘導体を含む。「ポリヌクレオチド」という用語はさらに、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはその類縁体を含めた任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、核酸配列と同義である。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類縁体を含んでいてもよく、非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。ヌクレオチド構造に対する修飾は、それが存在する場合、ポリマーの組立ての前に与えられてもよいし、後に与えられてもよい。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書中で使用する場合、二本鎖及び一本鎖の分子を互換的に指す。特に指定または要求していない限り、ポリヌクレオチドを含んでいる本明細書に記載のいかなる実施形態も、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが既知であるかまたは予測される２つの相補的一本鎖形態の各々とを両方とも包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖または三本鎖、線形または円形であり得、いかなる長さでもあり得る。ポリヌクレオチドについて述べる場合、特定のポリヌクレオチドの配列または構造は本明細書において、５’から３’への方向に配列を提供する慣例に従って記載され得る。
【０１１７】
「遺伝子」は、転写及び翻訳された後に特定のタンパク質またはポリペプチドをコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有しているポリヌクレオチドを指す。
【０１１８】
「低分子干渉ＲＮＡ」または「短鎖干渉ＲＮＡ」すなわちｓｉＲＮＡは、遺伝子対象物（「標的遺伝子」）を標的とするヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖である。「ＲＮＡ二本鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域同士が相補的に対合することによって形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡは遺伝子を「標的とする」ものであり、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列は、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列と相補的である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖の長さは３０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、二本鎖の長さは２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、二本鎖の長さは、１９〜２５ヌクレオチドの長さである。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二本鎖部分はヘアピン構造の一部であり得る。ヘアピン構造は、二本鎖部分の他に、二本鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分を含有し得る。ループの長さは様々であってよい。いくつかの実施形態では、ループの長さは５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ヌクレオチドである。ヘアピン構造はさらに、３’または５’突出部分を含有していてもよい。いくつかの実施形態では、突出部は、長さが０、１、２、３、４または５ヌクレオチドである３’または５’突出部である。
【０１１９】
本明細書中で使用する場合、「マイクロＲＮＡ」という用語は、限定されないが内在性マイクロＲＮＡ及び人工マイクロＲＮＡ（例えば合成ｍｉＲＮＡ）を含めた任意の種類の干渉ＲＮＡを指す。内在性マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することができる、ゲノム中に天然にコードされた低分子ＲＮＡである。人工マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの活性を調節することができる、内在性マイクロＲＮＡ以外のいかなる類のＲＮＡ配列でもあり得る。マイクロＲＮＡ配列は、これらの配列のうちの任意の１つ以上からなるＲＮＡ分子であり得る。マイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）配列については、Ｌｉｍ，ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７，９９１−１００８、Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９，１５４０、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ａｍｂｒｏｓｅ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２、Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，８５８−８６１、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７３５−７３９、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５３−８５７、及びＬａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００３，ＲＮＡ，９，１７５−１７９などの刊行物に記載されている。マイクロＲＮＡの例としては、より大きいＲＮＡの任意のＲＮＡ断片、またはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｃＲＮＡ、ｔｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ、ｓｎＲＮＡもしくはその他の低分子非コードＲＮＡが挙げられる。例えば、米国特許出願２００５０２７２９２３、２００５０２６６５５２、２００５０１４２５８１及び２００５００７５４９２を参照されたい。「マイクロＲＮＡ前駆体」（すなわち「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」）は、マイクロＲＮＡ配列が中に組み込まれたステムループ構造を有する核酸を指す。「成熟マイクロＲＮＡ」（すなわち「成熟ｍｉＲＮＡ」）は、マイクロＲＮＡ前駆体（「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」）から切断されたかまたは、合成された（例えば、無細胞合成によって実験室で合成された）、約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドの長さのマイクロＲＮＡを含み、例えば、成熟マイクロＲＮＡは１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔまたは２７ｎｔの長さを有することができる。成熟マイクロＲＮＡは標的ｍＲＮＡに結合すること及び標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。
【０１２０】
ポリヌクレオチドに対して適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限ステップまたはライゲーションステップ、ならびに天然にみられるポリヌクレオチドとは別個でありかつ／または異なる構築物をもたらすその他の手順の様々な組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリペプチドをカプシドで包んでいるウイルス粒子である。当該用語は、元のポリペプチド構築物の複製物及び元のウイルス構築物の子孫をそれぞれ含む。
【０１２１】
「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、複写、転写、スプライシング、翻訳または分解を含めたポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度または特異性に影響を与え得るものであり、本質的に増強性または阻害性のものであり得る。当該技術分野において知られている制御エレメントとしては、例えば、プロモーター及びエンハンサーなどの転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、特定条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合して、大抵プロモーターの下流（３’方向）に位置しているコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。
【０１２２】
「機能的に繋げられ」または「機能可能に繋げられ」は、遺伝エレメントが並置されており、当該エレメントが、予期された仕方でそれらが機能することを可能にする関係性にある、ということを指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始に役立つ場合、プロモーターはコード領域に機能的に繋げられている。この機能的関係性が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に位置する残基が存在していてもよい。
【０１２３】
「異種」は、比較されている残りの実在物とは遺伝子型が異なっている実在物に由来することを意味する。例えば、異なる種に由来するプラスミドまたはベクターの中に遺伝子操作技術によって導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。生来のコード配列から取り出されて天然にみられないコード配列に機能的に繋げられたプロモーターは、異種プロモーターに関連付けられる。例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含んでいるＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶに通常含まれていない核酸を含んだＡＡＶであり、コードされる異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶによって通常コードされない遺伝子産物である。変異型カプシドポリペプチドをコードする核酸を含んでいるＡＡＶは、異種核酸配列を含んでいる。一旦宿主細胞内に移され／送達されると、ビリオンの中に入っている異種ポリヌクレオチドは発現（例えば適宜転写及び翻訳）されることができる。あるいは、宿主細胞内に移され／送達された、ビリオンの中に入った異種ポリヌクレオチドは、発現される必要がない。「異種」という用語は本明細書において常にポリヌクレオチドとの関連において使用されるわけではないが、たとえ「異種」という修飾語が存在しなくてもポリヌクレオチドに対する言及は、省略があるにもかかわらず異種ポリヌクレオチドを含むことが意図されている。
【０１２４】
「遺伝子変化」及び「遺伝子改変」という用語（及びその文法的変化形）は、本明細書において互換的に、有糸分裂または減数分裂を除く他のことによって遺伝エレメント（例えばポリヌクレオチド）を細胞内に導入するプロセスを指すために使用される。エレメントは細胞にとって異種であってもよいし、細胞内に既に存在するエレメントの追加コピーまたは改良型であってもよい。遺伝子変化は、例えば、組換えプラスミドまたはその他のポリヌクレオチドを当該技術分野において知られている任意のプロセス、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウムトランスフェクション、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体との接触によって細胞にトランスフェクトすることによってもたらされ得る。遺伝子変化はまた、例えば、ＤＮＡウイルスもしくはウイルスベクターまたはＲＮＡウイルスもしくはウイルスベクターによる形質導入または感染によってももたらされ得る。一般に、遺伝エレメントは細胞内の染色体中またはミニ染色体中に導入されるが、細胞及びその子孫の表現型及び／または遺伝子型を変更するいかなる変化もこの用語に含まれる。
【０１２５】
細胞は、試験管内での細胞の長期培養中に遺伝子配列がその機能を行うことが可能である場合に、当該遺伝子配列による「安定的な」変化、形質導入、遺伝的改変または形質転換がなされていると言われる。そのような細胞は一般的には、遺伝子変化が、変化した細胞の子孫に対して導入され遺伝可能である、という点において「遺伝可能に」変化している（遺伝的に改変されている）。
【０１２６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は本明細書において互換的に、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために使用される。「ポリヌクレオチド配列」によってコードされる「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、天然に存在するタンパク質に関する完全長の生来の配列を含むだけでなく、機能性配列、修飾形態または配列変異型も、配列、修飾形態または変異型が生来の完全長タンパク質の機能性をある程度保っている限りにおいて含む。本明細書に記載の方法及び使用において、ポリヌクレオチド配列によってコードされるそのようなポリペプチド、タンパク質及びペプチドは、必ずというわけではないが、不完全な内因性タンパク質または、その発現が処置哺乳動物において不十分もしくは不完全である内因性タンパク質と同一であり得る。その用語はさらに、修飾アミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、メチル化、カルボキシル化、脱アミド、アセチル化、または標識化合物との複合化も包含する。抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチドなどといったポリペプチドは、哺乳動物対象に遺伝子産物を送達すること及びそのための構成物との関連において述べられている場合、それぞれの完全なポリペプチドまたは、完全なタンパク質の所望の生化学的機能を保っているその任意の断片もしくは遺伝子操作された派生物を指す。
【０１２７】
本明細書中で使用しているように、本開示の方法において使用される遺伝的にコードされるＬ−エナンチオマーアミノ酸の略号は慣習的なものであり、以下の表１に示すとおりである。
【表１】
2019509032.tif 000003
【０１２８】
「親水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の標準化共通疎水性尺度に従って零未満の疎水性を呈するアミノ酸を指す。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸としては、例えば、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）及びＡｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
【０１２９】
「酸性アミノ酸」は、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの逸失のために生理的ｐＨにおいて負に帯電している側鎖を有する。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸としては、例えばＧｌｕ（Ｅ）及びＡｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【０１３０】
「塩基性アミノ酸」は、７より大きい側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、水素イオンとの会合のために生理的ｐＨにおいて正に帯電している側鎖を有する。遺伝的にコードされる塩基性アミノ酸としては、例えば、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）及びＬｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【０１３１】
「極性アミノ酸」は、生理的ｐＨにおいて電荷を帯びていない側鎖ではあるがしかし２つの原子によって共有された電子対を片方の原子がより近くに保持している少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する、親水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされる極性アミノ酸としては、例えば、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）及びＴｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【０１３２】
「疎水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の標準化共通疎水性尺度に従って零より大きい疎水性を呈するアミノ酸を意味する。典型的な疎水性アミノ酸としては、例えば、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｒｏ（Ｐ）及びプロリン類縁体が挙げられる。
【０１３３】
「芳香族アミノ酸」は、少なくとも１つの芳香環または複素芳香環を有する側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。芳香環または複素芳香環は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなどの１つ以上の置換基を含み得、ここで、各Ｒは独立して、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ２１））アリール、置換（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ２６）アルキアリール、置換（Ｃ６−Ｃ２６）アルキアリール、５〜２０員環ヘテロアリール、置換５〜２０員環ヘテロアリール、６〜２６員環アルキヘテロアリールまたは置換６〜２６員環アルキヘテロアリールである。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸としては、例えば、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）及びＴｒｐ（Ｗ）が挙げられる。
【０１３４】
「非極性アミノ酸」は、生理的ｐＨにおいて電荷を帯びていない側鎖であって２つの原子によって共有された電子対が２つの原子の各々によって概して等しく保持されている結合を有する（すなわち側鎖が極性でない）側鎖を有する、疎水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされる無極性アミノ酸としては、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）及びＡｌａ（Ａ）が挙げられる。
【０１３５】
「脂肪族アミノ酸」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされる脂肪族性アミノ酸としては、例えば、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）が挙げられる。
【０１３６】
アミノ酸に関する「非天然」という用語は、上表１に列挙する２０種のアミノ酸のうちの１つとして含まれてはいない任意のアミノ酸及び、当業者に知られている任意の改変または誘導体化されたアミノ酸を含み得る。非天然のアミノ酸としては、限定されないが例えば、β−アラニン、α−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、γ−（アミノフェニル）酪酸、α−アミノイソ酪酸、ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、β−アスパラギン酸、アミノ安息香酸、アミノフェニル酢酸、アミノフェニル酪酸、γ−グルタミン酸、システイン（ＡＣＭ）、ε−リジン、メチオニンスルホン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、ｄ−オルニチン、ｐ−ニトロ−フェニルアラニン、ヒドロキシプロリン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、及びチオプロリンを挙げることができる。
【０１３７】
カプシドポリペプチドなどのポリペプチドに関する「ｖａｒｉａｎｔ（変異型）」または「ｖａｒｉａｎｔｓ（変異型）」という用語は、非変異型ポリペプチド配列とも呼ばれる（非変異型親ポリペプチドとも呼ばれる）親ポリペプチド配列とは少なくとも１つのアミノ酸が異なっているポリペプチド配列を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはカプシドポリペプチドであり、変異型は、少なくとも１つのアミノ酸置換によって異なっている。アミノ酸も、天然に存在するアミノ酸及び非天然のアミノ酸ならびにそれらの誘導体を含む。アミノ酸はＤ体もＬ体も含む。
【０１３８】
「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞またはその他の物質は、物質または類似物質が天然に存在するかまたはそこから最初に調製された場合に存在している少なくとも１つの他成分を欠く、物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、供給源となる混合物からそれを濃縮する精製技術を用いて調製され得る。濃縮具合は、絶対的な基準、例えば溶液の体積当たりの重量で測ることができ、または、供給源となる混合物の中に存在する第２の潜在的干渉物質に関して濃縮具合を測ることができる。本発明の実施形態の濃縮具合を高めることは、ますます多くを単離することである。いくつかの実施形態では、単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞またはその他の物質は、約８０％〜約９０％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、もしくは少なくとも９９％純粋、またはそれよりもさらに純粋となるように精製される。
【０１３９】
「高度に保存された」という用語は、少なくとも約８０％の同一性、好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは約９７％を上回る同一性が保存されていることを意味する。同一性は、当業者に知られているアルゴリズム及びコンピュータプログラムを利用することにより、当業者によって容易に決定される。
【０１４０】
核酸配列との関連において「配列同一性パーセント」または「同一」という用語は、一致率を最大にして整列させた場合に同一である、２つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの完全長もしくは、遺伝子コード配列の完全長に及んでいてもよく、または少なくとも５００〜５０００ヌクレオチドの断片が望ましい。しかしながら、より小さい断片、例えば少なくとも１つ以上のヌクレオチドの同一性も望ましい。同様に、アミノ酸配列の「配列同一性パーセント」は、タンパク質の完全長またはその断片にわたって容易に決定され得る。好適には、断片の長さは少なくとも８アミノ酸であり、最長でアミノ酸でのタンパク質の長さであり得る。
【０１４１】
本明細書中で使用する場合、「処置」、「処置する」などの用語は、所望の薬理学的及び／または生理学的作用を得ることを指す。作用は、疾患もしくはその症候を完全もしくは部分的に防止することに関して予防的なものであってもよく、かつ／または疾患及び／もしくは疾患に起因し得る有害作用の部分的もしくは完全な治癒に関して治療的であってもよい。本明細書中で使用する場合での「処置」は、哺乳動物、特にヒトの疾患のいかなる処置も包含し、また、（ａ）疾患の素因を有するかまたは疾患を患う恐れがあるが、疾患があると診断されていない対象において疾患が起こるのを防止すること、（ｂ）疾患を抑制すること、つまりその発症を阻止すること、ならびに（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち疾患の退行を引き起こすことを含む。
【０１４２】
「個体」、「対象」及び「患者」という用語は本明細書において互換的に使用され、哺乳動物、限定されないが例えば、サル及びヒトを含めたヒト及び非ヒト霊長類；娯楽用哺乳動物（例えばウマ）；家畜用哺乳動物（例えば、ヒツジ、ヤギなど）；ペット用哺乳動物（イヌ、ネコなど）；ならびに齧歯動物（例えば、マウス、ラットなど）を指す。
【０１４３】
「薬学的に許容できる」及び「生理学的に許容できる」という用語は、１つ以上の投与経路、生体内送達または接触に適した、生物学的に許容できる気体状、液状もしくは固形の製剤またはそれらの混合物を意味する。「薬学的に許容できる」及び「生理学的に許容できる」組成物は、生物学またはその他に関して望ましくないものではない物質であり、当該物質は例えば、望ましくない生物学的作用を大幅に引き起こすことなく対象に投与され得るものである。したがって、そのような医薬組成物は、例えば、本明細書において開示される変異型ＡＡＶカプシド、ＡＡＶベクターもしくはＡＡＶビリオン、またはＡＡＶで形質転換された細胞を対象に投与する場合に使用され得る。
【０１４４】
本明細書中で使用する場合での「単位剤形」という表現は、処置される対象のための単位用量として適する物理的に不連続な単位を指し、各単位は、医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクルまたは増量剤）を場合により伴って所定量を含有するものであり、それは１回分以上で用量が投与された場合に所望の作用（例えば、予防的または治療的効果）をもたらす。いくつかの実施形態では、単位剤形は、液体組成物を含んで例えばアンプル及びバイアルの中に入ったものであってもよいし、フリーズドライまたは凍結乾燥のなされた状態の組成物であってもよく、生体内への投与または送達の前に例えば滅菌液体担体が添加されることができる。個々の単位剤形は、多回投薬キットまたは容器の中に入っていてもよい。変異型ＡＡＶカプシド、ＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオン、及びその医薬組成物は、投与の簡単さ及び投薬の一様性のために単回分または多回分の単位用量で包装されることができる。
【０１４５】
「治療上有効な量」は、実験及び／または治験によって決定することができる比較的広い範囲に該当するであろう。例えば、生体内注射、例えば対象の組織内または脈管構造内（例えば肝組織内または静脈内）への直接的な注射の場合、治療上有効な用量は、約１０６個〜約１０１５個程度のＡＡＶビリオン、例えば１０８〜１０１２個のＡＡＶビリオンであろう。その他の効果的な用量は用量応答曲線を生成する慣例的試験によって当業者によって容易に打ち立てられることができる。
【０１４６】
「有効な量」または「十分な量」は、単独で、または１つ以上の他の組成物（治療剤、例えば薬物）、処置、プロトコールもしくは治療計画剤（例えばワクチン投薬計画を含む）と組み合わせて、単回用量または多回用量で、検出可能な応答を任意の持続時間（長期または短期）にわたって提供するか、予測もしくは所望される対象の転帰または対象にとっての恩恵を測定可能または検出可能な任意の度合いで、または任意の持続時間（例えば、数分、数時間、数日間、数ヶ月間、数年間または治癒するまで）にわたって提供する、量を指す。
【０１４７】
処置のために（例えば、改善するため、または治療の恩恵もしくは改善をもたらすために）「有効な量」または「十分な量」の用量は、典型的には、疾患の１つ、多くまたは全ての有害な症候、事象または合併症、例えば疾患によって引き起こされるかまたは疾患に関連する１つ以上の有害な症候、障害、病気、病状または合併症に対する応答を、測定可能な程度にもたらすのに有効である。但し、疾患の進行または悪化を軽減、縮減、阻害、抑制、制限または制御することも満足な転帰である。
【０１４８】
「予防」及びその文法上の変化形は、対象に対する接触、投与または生体内送達を疾患に先立って行う方法を意味する。対象に対する投与または生体内送達は、疾患によって引き起こされるかまたは疾患に関連する有害な症候、症状、合併症などの発症に先立って行われ得る。例えば、記載の方法及び使用のための候補としてそのような対象を同定するために（例えば遺伝子の）スクリーニングを用いることができるが、対象には疾患が現れていなくてもよい。したがって、そのような対象は、機能性遺伝子産物（タンパク質）の不十分な量もしくは欠乏に関して陽性でスクリーニングされた対象または、疾患を招く部分的に機能的であるかもしくは非機能的である異常な遺伝子産物（タンパク質）を産生する対象；及び疾患を招く異常または不完全な（突然変異）遺伝子産物（タンパク質）に関して陽性でスクリーニングされた対象を、たとえそのような対象に疾患の症候が現れていなくとも含む。
【０１４９】
「強化された中和特性」という表現は、対象において中和抗体結合からよりよく逃れるＡＡＶベクターまたはビリオンの能力を指す。ある場合には、より少ない中和抗体がＡＡＶ感染に備え、形質導入がより高いレベルで可能となり、本発明の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド、ＡＡＶベクター及びＡＡＶビリオンは遺伝子治療目的のためによりよく適したものになる。
【０１５０】
「向性」及び「形質導入」という表現は、相互に関連しているものの、違いがある。本明細書中で使用する場合での「向性」という用語は、１つ以上の特定細胞種に感染するＡＡＶベクターまたはビリオンの能力を指すが、１つ以上の特定細胞種において細胞に形質導入するためにベクターがどの程度機能するかをも包含し得る。つまり、向性は、特定の細胞種（複数可）もしくは組織種（複数可）の中へのＡＡＶベクターもしくはビリオンの優先的進入及び／または、特定の細胞種または組織種の中への進入を促進する細胞表面との優先的相互作用を指しており、場合によってその後には、好ましくは、ＡＡＶベクターまたはビリオンによって細胞内に運ばれた配列の発現（例えば転写及び、場合によって翻訳）、例えば、組換えウイルスの場合での異種ヌクレオチド配列（複数可）の発現が続く。本明細書中で使用する場合、「形質導入」という用語は、１つ以上の特定細胞種に感染するＡＡＶベクターまたはビリオンの能力を指す。つまり、形質導入は、ベクターゲノムからの発現を獲得するための、細胞内へのＡＡＶベクターまたはビリオンの進入及び、ＡＡＶベクターまたはビリオンの中に含まれている遺伝物質の細胞内への移入を指す。全てではないがいくつかの場合には、形質導入と向性は相関し得る。
【０１５１】
「向性特性」という用語は、１つ以上の標的細胞、組織及び／または器官への形質導入の様式を指す。例えば、あるシャッフリング済みＡＡＶカプシド（変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド）はヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の効率的な形質導入をもたらす。反対に、あるシャッフリング済みＡＡＶカプシドは、骨格筋（例えば四頭筋）、横隔膜筋及び／または心筋組織、生殖腺及び／または生殖細胞の形質導入のレベルが非常に低い。本明細書において開示される変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）の効率的かつ／または強化された形質導入をもたらすものである。
【０１５２】
特に指示していない限り、「効率的な形質導入」もしくは「効率的な向性」または同様の用語は、適切な対照（例えば、それぞれ対照の形質導入または向性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２５％、１５０％、１７５％または２００％以上）を基準として判定され得る。適切な対照は、所望の向性特性を含めた様々な因子に依存するであろう。同様に、カプシド及び／またはウイルスが標的組織に対して「効率的に形質導入しない」か否か、もしくは「効率的な向性を有しない」か否か、または同様の用語は、適切な対照を基準として判定することができる。
【０１５３】
本明細書中及び別記の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から別段の規定が明らかでない限り、複数形の意味を含む。したがって、例えば、「ＡＡＶビリオン」に対する言及は複数のそのようなビリオンを含み、「宿主細胞」に対する言及は、１つ以上の宿主細胞及び当業者に知られているその均等物に対する言及を含む、などである。さらに、特許請求の範囲はいかなる任意選択要素も排除して書かれている場合があることに留意されたい。したがって、この記載は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「もっぱら」、「単に」などのような排他的術語の使用または「消極的な」限定の使用に先立つ基準としての役割を果たすことが意図されている。
【０１５４】
本発明をさらに説明する前に、本発明が記載の特定の実施形態に限定されないことを理解されたい、というのも、そのようなものは当然変化し得るものであるからである。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書中で使用する術語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであるに過ぎず、限定を意図したものでない、ということも理解されたい。
【０１５５】
ＡＡＶカプシド及びベクターの特徴
本発明のＡＡＶベクターは数多くの特徴を有する。いくつかの実施形態では、ベクターは、変異型カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。そのようなＡＡＶベクター及びその特徴について以下に詳しく説明する。
【０１５６】
本発明の典型的なＡＡＶベクターは、アミノ酸配列が野生型または非変異型の親カプシドタンパク質とは少なくとも１つのアミノ酸だけ異なった変異型ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸を含む。アミノ酸差異（複数可）はカプシドの溶媒到達可能部位（例えば、溶媒到達可能ループ）または内腔（例えば、ＡＡＶカプシドの内部空間）に位置し得る。いくつかの実施形態では、内腔はＡＡＶカプシドの内部空間を含む。例えば、アミノ酸置換（複数可）がＡＡＶカプシドポリペプチドのＧＨループに位置し得る。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９＿ｈｕ１４のカプシドポリペプチドにおいてアミノ酸置換を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質が、非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含むものでありかつ、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて強化された中和特性を呈するものである、当該単離核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９＿ｈｕ１４のカプシドポリペプチドなどの親非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、変異型カプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて強化された中和特性を呈する、単離核酸を提供する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ血清型１、２、３ｂ及び６（すなわちＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ及びＡＡＶ６）に由来する非変異型親カプシドポリペプチド配列からの１つ以上の領域または小部分を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、上記に係る変異型カプシドポリペプチドを提供する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質が、非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含むものでありかつ、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈するものである、当該単離核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９＿ｈｕ１４のカプシドポリペプチドなどの親非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、変異型カプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈する、単離核酸を提供する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ血清型１、２、３ｂ及び６（すなわちＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ及びＡＡＶ６）に由来する非変異型親カプシドポリペプチド配列からの１つ以上の領域または小部分を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、上記に係る変異型カプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドに最も寄与した親血清型は、順にＡＡＶ２、３ｂ、１及び６であった。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ４、５、８、９＿ｈｕ１４、ウシＡＡＶまたは鳥類ＡＡＶに由来する１つ以上の領域または小部分を含まない。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ８由来の１つ以上の領域または小部分を含まない。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質が、非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含むものでありかつ、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて強化された中和特性と向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性とを両方とも呈するものである、当該単離核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９＿ｈｕ１４のカプシドポリペプチドなどの親非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、変異型カプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性と向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性とを両方とも呈する、単離核酸を提供する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ血清型１、２、３ｂ及び６（すなわちＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ及びＡＡＶ６）に由来する非変異型親カプシドポリペプチド配列からの１つ以上の領域または小部分を含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドに最も寄与した親血清型は、順にＡＡＶ２、３ｂ、１及び６であった。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ４、５、８、９＿ｈｕ１４、ウシＡＡＶまたは鳥類ＡＡＶに由来する１つ以上の領域または小部分を含まない。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ８由来の１つ以上の領域または小部分を含まない。いくつかの実施形態では、本発明は、上記に係る変異型カプシドポリペプチドを提供する。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、主題ＡＡＶベクターは、非変異型親カプシドポリペプチドまたは非変異型親カプシドポリペプチドの小部分に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％であるアミノ酸配列を有する変異型カプシドポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、当該技術分野において知られている他のベクター／プラスミドによってコードされる。いくつかの実施形態では、本発明は、上記に係る変異型カプシドポリペプチドを提供する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、かつ非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性を呈する、当該変異型ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９＿ｈｕ１４のカプシドポリペプチドなどの親非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、かつ非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性を呈する、当該変異型ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ血清型１、２、３ｂ及び６（すなわちＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ及びＡＡＶ６）に由来する非変異型親カプシドポリペプチド配列からの１つ以上の領域または小部分を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、かつ非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈する、当該変異型ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９＿ｈｕ１４のカプシドポリペプチドなどの親非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、かつ非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈する、当該変異型ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ血清型１、２、３ｂ及び６（すなわちＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ及びＡＡＶ６）に由来する非変異型親カプシドポリペプチド配列からの１つ以上の領域または小部分を含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドに最も寄与した親血清型は、順にＡＡＶ２、３ｂ、１及び６であった。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ４、５、８、９＿ｈｕ１４、ウシＡＡＶまたは鳥類ＡＡＶに由来する１つ以上の領域または小部分を含まない。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ８由来の１つ以上の領域または小部分を含まない。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、かつ非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性と向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性とを両方とも呈する、当該変異型ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９＿ｈｕ１４のカプシドポリペプチドなどの親非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、かつ非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性と向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性とを両方とも呈する、当該変異型ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ血清型１、２、３ｂ及び６（すなわちＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ及びＡＡＶ６）に由来する非変異型親カプシドポリペプチド配列からの１つ以上の領域または小部分を含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドに最も寄与した親血清型は、順にＡＡＶ２、３ｂ、１及び６であった。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ４、５、８、９＿ｈｕ１４、ウシＡＡＶまたは鳥類ＡＡＶに由来する１つ以上の領域または小部分を含まない。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ８由来の１つ以上の領域または小部分を含まない。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドが実質的な相同性または「実質的な類似性」を呈することは、アミノ酸またはその断片に言及する場合、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴って最適に別のアミノ酸（またはその相補鎖）と整列させた場合に整列した配列の少なくとも約９５％〜約９９％においてアミノ酸同一性が存在することを指し示す。いくつかの実施形態では、相同性は、完全長配列もしくはそのポリペプチド、例えばカプシドタンパク質、または長さが少なくとも８アミノ酸、より望ましくは少なくとも約１５アミノ酸であり非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分を含むその断片に及ぶ。例えば、変異型カプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドまたは非変異型親カプシドポリペプチドの小部分に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９＿ｈｕ１４のカプシドポリペプチドなどの親非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、当該変異型カプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性を呈する。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９＿ｈｕ１４のカプシドポリペプチドなどの親非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、当該変異型カプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて強化された中和特性を呈する。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９＿ｈｕ１４のカプシドポリペプチドなどの親非変異型カプシドアミノ酸配列または非変異型親カプシドポリペプチド配列の小部分の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、当該変異型カプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて強化された中和特性と、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性とを両方とも呈する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ血清型１、２、３ｂ及び６（すなわちＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ及びＡＡＶ６）に由来する非変異型親カプシドポリペプチド配列からの１つ以上の領域または小部分を含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドに最も寄与した親血清型は、順にＡＡＶ２、３ｂ、１及び６であった。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ４、５、８、９＿ｈｕ１４、ウシＡＡＶまたは鳥類ＡＡＶに由来する１つ以上の領域または小部分を含まない。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ８由来の１つ以上の領域または小部分を含まない。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチド配列は、以下の表２に示す配列番号２、４、６または８を含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチド配列は、以下の表２に示す配列番号１、３、５または７によってコードされる。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）及びＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）及びＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）である。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）である。
【表２−１】
2019509032.tif 000004
【表２−２】
2019509032.tif 000005
【表２−３】
2019509032.tif 000006
【表２−４】
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【表２−５】
2019509032.tif 000008
【表２−６】
2019509032.tif 000009
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入を呈する。いくつかの実施形態では、形質導入は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％向上する。いくつかの実施形態では、形質導入は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％向上する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドに比べて向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における向性を呈する。いくつかの実施形態では、向性は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％向上する。いくつかの実施形態では、向性は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％向上する。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性を呈する。いくつかの実施形態では、本発明の変異型カプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された、プールされたヒト免疫グロブリンに対する中和特性を呈する。いくつかの実施形態では、中和特性は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％強化される。いくつかの実施形態では、中和特性は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％強化される。いくつかの実施形態では、強化された中和特性は、宿主細胞における中和抗体の生成の減少によって判定される。いくつかの実施形態では、中和抗体の生成の減少は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％の減少である。いくつかの実施形態では、中和抗体の生成の減少は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％または約４０％〜約５０％の減少である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、強化された中和特性は、プールされたヒト免疫グロブリン（すなわち、ＩｇＧまたは、Ｇａｍｍａｇａｒｄ  ＩＶＩＧとして市販されているＩＶＩＧ）に対するものである。いくつかの実施形態では、ＩＶＩＧに結合した変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドの比率は、強化された中和特性の指標として決定され、中和特性を決定する方法は当該技術分野において既知である（例えば、Ｇｒｉｍｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２（１２）：５８８７−５９１１（２００８）、Ａｒｂｅｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（２４）：１５２３８−１５２４５（２００５）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ＩＶＩＧに結合していない変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドに対するＩＶＩＧに結合した変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドの比率が低いことは、強化された中和特性を指し示す（例えば図６を参照のこと）。いくつかの実施形態では、強化された中和特性は、変異型ＡＡＶカプシドで形質導入された細胞から生じる信号を対照試料信号に比べて約５０％減少させるのに必要なＩＶＩＧの濃度を決定することによって、判定される。いくつかの実施形態では、対照試料信号は、変異型ＡＡＶカプシドで形質導入された細胞からＩＶＩＧの非存在下で生じる信号である。いくつかの実施形態では、濃度は、変異型ＡＡＶカプシドで形質導入された細胞から生じる信号を対照試料信号に比べて少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％減少させるのに足りるＩＶＩＧの濃度である。いくつかの実施形態では、濃度は、当該信号を対照試料信号に比べて少なくとも約５０％減少させるのに足りるＩＶＩＧの濃度である。いくつかの実施形態では、濃度は、変異型ＡＡＶカプシドで形質導入された細胞から生じる信号を対照試料信号に比べて少なくとも約４０％〜少なくとも約９５％減少させるのに足りるＩＶＩＧの濃度である。いくつかの実施形態では、濃度は、変異型ＡＡＶカプシドで形質導入された細胞から生じる信号を対照試料信号に比べて少なくとも約５０％〜少なくとも約９０％減少させるのに足りるＩＶＩＧの濃度である。いくつかの実施形態では、濃度は、変異型ＡＡＶカプシドで形質導入された細胞から生じる信号を対照試料信号に比べて少なくとも約５０％〜少なくとも約８５％減少させるのに足りるＩＶＩＧの濃度である。いくつかの実施形態では、濃度は、変異型ＡＡＶカプシドで形質導入された細胞から生じる信号を対照試料信号に比べて少なくとも約５０％〜少なくとも約８０％減少させるのに足りるＩＶＩＧの濃度である。いくつかの実施形態では、濃度は、変異型ＡＡＶカプシドで形質導入された細胞から生じる信号を対照試料信号に比べて少なくとも約５５％〜少なくとも約７５％減少させるのに足りるＩＶＩＧの濃度である。いくつかの実施形態では、濃度は、変異型ＡＡＶカプシドで形質導入された細胞から生じる信号を対照試料信号に比べて少なくとも約５０％〜少なくとも約７０％減少させるのに足りるＩＶＩＧの濃度である。いくつかの実施形態では、濃度は、変異型ＡＡＶカプシドで形質導入された細胞から生じる信号を対照試料信号に比べて少なくとも約５０％〜少なくとも約６５％減少させるのに足りるＩＶＩＧの濃度である。いくつかの実施形態では、濃度は、変異型ＡＡＶカプシドで形質導入された細胞から生じる信号を対照試料信号に比べて少なくとも約５０％〜少なくとも約６０％減少させるのに足りるＩＶＩＧの濃度である。いくつかの実施形態では、濃度は、変異型ＡＡＶカプシドで形質導入された細胞から生じる信号を対照試料信号に比べて少なくとも約５０％〜少なくとも約５５％減少させるのに足りるＩＶＩＧの濃度である。いくつかの実施形態では、生じる信号は、検出可能な任意の信号である。いくつかの実施形態では、生じる信号は、蛍光信号である。いくつかの実施形態では、生じる信号は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）及びＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）からのものである。いくつかの実施形態では、生じる信号は、生物発光信号である。いくつかの実施形態では、生じる信号は、ルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼ）からのものである。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト幹細胞種における形質導入または向性を呈する。いくつかの実施形態では、ヒト幹細胞種としては、限定されないが例えば、胚性幹細胞、成体組織幹細胞（すなわち体性幹細胞）、骨髄、前駆細胞、人工多能性幹細胞及び初期化幹細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、成体幹細胞として例えばオルガノイド幹細胞（すなわち、体内の対象となる任意の器官または器官系に由来する幹細胞）を挙げることができる。身体の器官としては、限定されないが例えば、皮膚、毛髪、爪、感覚受容体、汗腺、皮脂腺、骨、筋肉、脳、脊髄、神経、下垂体、松果腺、視床下部、甲状腺、副甲状腺、胸腺、副腎、膵臓（膵島組織）、心臓、血管、リンパ節、リンパ管、胸腺、脾臓、扁桃腺、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、口、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門管、歯、唾液腺、舌、肝臓、胆嚢、膵臓、盲腸、腎臓、尿管、膀胱、尿道、精巣、（輸）精管、尿道、前立腺、陰茎、陰嚢、卵巣、子宮、卵管（ファローピウス管）、膣、外陰部及び乳腺（乳房）が挙げられる。身体の器官系としては、限定されないが例えば、外皮系、骨格系、筋肉系、神経系、内分泌系、心血管系、リンパ系、呼吸器系、消化器系、泌尿器系及び生殖器系が挙げられる。いくつかの実施形態では、形質導入及び／または向性は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％向上する。いくつかの実施形態では、形質導入及び／または向性は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、または約３０％〜約６０％向上する。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織における形質導入または向性を呈する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織における形質導入を呈する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織における向性を呈する。いくつかの実施形態では、形質導入及び／または向性は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％向上する。いくつかの実施形態では、形質導入及び／または向性は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、または約３０％〜約６０％向上する。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織における形質導入または向性を呈する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織における形質導入を呈する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドをコードするベクターに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織における向性を呈する。いくつかの実施形態では、形質導入及び／または向性は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％向上する。いくつかの実施形態では、形質導入及び／または向性は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、または約３０％〜約６０％向上する。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９＿ｈｕ１４を含むＶＰ１を含有する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ２を含むＶＰ２を含有する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ２に由来するＶＰ２の固有領域を含有する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ及びＡＡＶ６を含むＶＰ３を含有する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ２を含むＶＰ１を含有する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ２を含むＶＰ２を含有する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ及びＡＡＶ６を含むＶＰ３を含有する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはＮＰ−４０（配列番号６）である。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはＮＰ−５９（配列番号４）である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ３ｂの位置３２６〜４２６
（ＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨ（配列番号１３））
からの保存された寄与が存在する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ３ｂからの３２４〜４２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ３ｂからの３２４〜４２６のアミノ酸配列を含み、かつ強化されたヒト肝臓形質導入を呈する。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、（ＡＡＶ２からの）シリンダーを含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、（ＡＡＶ３ｂからの）キャニオンを含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、Ｋ５５５Ｅ、Ｎ６２２Ｄ及びＲ６１１Ｇからなる群から選択される１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはＫ５５５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはＮ６２２Ｄを含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはＲ６１１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはＫ５５５Ｅ及びＲ６１１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは上記特徴のうちの１つ以上の任意の組み合わせを含む。
【０１７３】
本発明の変異型カプシドポリペプチドの典型的実施形態として、ＮＰ４０は３つのうちで最もシャッフリングされており、ＡＡＶ１／３ｂ／６／８／９からのＶＰ１の固有領域を有し、ＡＡＶ２に由来するＶＰ２の固有領域を有し、そして最後にＡＡＶ２及び３ｂからの寄与によるＶＰ３を有し、それに加えて、１つのｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異（Ｋ５５５Ｅ）を有する。ＮＰ４０は、位置３２６〜４２６においてＡＡＶ３ｂからの保存された寄与を呈する。いくつかの実施形態では、これは、強化されたヒト肝臓形質導入のためのＡＡＶ３ｂからの最小限の構造領域である。本発明の変異型カプシドポリペプチドのもう１つの典型的実施形態として、ＮＰ５９は、ＮＰ４０と類似しているが多様なＶＰ１寄与は欠けており、代わりにその配列範囲がＡＡＶ２からなる。ＮＰ５９は、１つのｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異（Ｎ６２２Ｄ）を別とすればＮＰ４０と同じＶＰ２寄与及びＶＰ３寄与を有する。本発明の変異型カプシドポリペプチドのもう１つの典型的実施形態として、ＮＰ８４は、ＶＰ１及びＶＰ２の固有領域がＮＰ５９と共通しているが、ＶＰ３においてＡＡＶ３ｂからの寄与がはるかに大きくかつＡＡＶ２からの寄与がより小さく、それに加えて、２つのｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異（Ｋ５５５Ｅ及びＲ６１１Ｇ）を有する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチド配列は、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）、ＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）及びＡＡＶ−ＮＰ３０（配列番号８）からなる群から選択される。ＮＰ８４の場合、ＶＰ１の固有領域はＡＡＶ２からなり、ＶＰ２の固有領域はＡＡＶ２からなり、ＶＰ３はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６及びいくつかのｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異からなる。ＮＰ５９の場合、ＶＰ１の固有領域はＡＡＶ２からなり、ＶＰ２の固有領域はＡＡＶ２からなり、ＶＰ３はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６及びいくつかのｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異からなる。ＮＰ４０の場合、ＶＰ１の固有領域は、等しい確率でＡＡＶ１、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８及び／またはＡＡＶ９からなり、ＶＰ２の固有領域はＡＡＶ２からなり、ＶＰ３はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６及びいくつかのｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異からなる。ＮＰ３０の場合、ＶＰ１の固有領域はＡＡＶ２からなり、ＶＰ２の固有領域はＡＡＶ２からなり、ＶＰ３はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６及びいくつかのｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異からなる。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、Ｋ５５５Ｅ、Ｎ６２２Ｄ及びＲ６１１Ｇからなる群から選択される１つ以上の置換（すなわちｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異）を含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはＫ５５５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはＮ６２２Ｄを含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはＲ６１１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドはＫ５５５Ｅ及びＲ６１１Ｇを含む。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは上記の特徴及び／または置換（すなわちｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異）のうちの１つ以上の任意の組み合わせを含む。
【０１７５】
本発明はさらに、ＡＡＶ−ＮＰ８４（配列番号２）、ＡＡＶ−ＮＰ５９（配列番号４）、ＡＡＶ−ＮＰ４０（配列番号６）及びＡＡＶ−ＮＰ３０（配列番号８）などの変異型カプシドポリペプチドを生成することを提供する。これらの方法は、既知のライブラリー生成技術を採用するが、しかしながら、複製能のあるＡＡＶベクターを変異型カプシドポリペプチド生成（すなわち、変異型カプシドポリペプチドの選抜及び進化）の間に採用するという点において方法は新規なものである。本発明は、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを生成する方法であって、変異型カプシドポリペプチドが、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性と向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性とを両方とも呈するものであり、上記方法が、
ａ）変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドのライブラリーを生成することを含み、上記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドが、２つ以上の非変異型親カプシドポリペプチドからの複数の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド配列を含むものであり；
ｂ）上記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドライブラリーをＡＡＶベクターにクローニングすることによってＡＡＶベクターライブラリーを生成することを含み、上記ＡＡＶベクターが複製能のあるＡＡＶベクターであり；
ｃ）非変異型親カプシドポリペプチドに比べて強化された中和特性と向上したヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）における形質導入または向性との両方に関してｂ）からの上記ＡＡＶベクターライブラリーから変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドをスクリーニングすることを含み；さらに、
ｄ）ｃ）からの上記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドを選抜することを含む、当該方法を提供する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、方法はさらに、ｅ）ｄ）からの上記変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドの配列を決定することを含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本発明のスクリーニング方法によって生成した変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上したヒト肝組織における形質導入を呈する。いくつかの実施形態では、形質導入は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％向上する。いくつかの実施形態では、形質導入は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％向上する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本発明のスクリーニング方法によって生成した変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドに比べて向上したヒト肝組織における向性を呈する。いくつかの実施形態では、向性は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％向上する。いくつかの実施形態では、向性は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％向上する。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本発明のスクリーニング方法によって生成した変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドペプチドに比べて強化された中和特性を呈する。いくつかの実施形態では、中和特性は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％強化される。いくつかの実施形態では、中和特性は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％強化される。いくつかの実施形態では、強化された中和特性は、新しいＡＡＶカプシド実施形態と交差反応する宿主内の既存の中和抗体の減少によって判定される。いくつかの実施形態では、既存の中和抗体の交差反応性の低下は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％である。いくつかの実施形態では、中和抗体の生成の減少は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％の減少である。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本発明のスクリーニング方法によって生成した変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織における形質導入または向性を呈する。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織における形質導入を呈する。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、非変異型親カプシドポリペプチドに比べて向上した１つ以上の非肝性ヒト組織における向性を呈する。いくつかの実施形態では、形質導入及び／または向性は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％向上する。いくつかの実施形態では、形質導入及び／または向性は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、または約３０％〜約６０％向上する。
【０１８１】
形質導入は、当該技術分野において知られている技術、例えば、以下の実施例１に記載されているものを含めた免疫組織化学的分析、及び当該技術分野において知られているその他の方法によって測定することができる。試験管内での形質導入分析は、ヒト肝組織細胞または肝細胞において、形質導入を決定すべく例えばＧＦＰ発現（または別のマーカー遺伝子）を測定することによって行うことができる。生体内または生体外での形質導入分析は、例えばホタルルシフェラーゼに基づくアッセイを含めた当該技術分野において知られている技術によって、例えば、形質導入を決定すべくルシフェラーゼ発現（または別のマーカー遺伝子）を測定することによって、測定することができる。いくつかの実施形態では、形質導入効率を比較するために、変異型カプシドポリペプチドによってパッケージングされたＡＡＶベクターからのマーカー発現を、非変異型親カプシドポリペプチドによってパッケージングされたＡＡＶベクターからのマーカー発現と比較する。いくつかの実施形態では、向性を決定するために、異なる細胞種において形質導入を比較する。つまり、特定細胞種における向性（向性プロファイルと呼ばれることがある）を決定するために、変異型カプシドポリペプチドによってパッケージングされたＡＡＶベクターによる形質導入と、非変異型カプシドポリペプチドによってパッケージングされたＡＡＶによる形質導入とを少なくとも２つの異なる細胞種において比較する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞種はヒト肝組織細胞またはヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞種はヒト肝組織細胞である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞種はヒト肝細胞である。
【０１８２】
変異型カプシドポリペプチドを生成するそのような方法は、一連または複数のＡＡＶ擬似種（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９＿ｈｕ１４、ウシＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ）からのカプシド遺伝子のファミリーから始めるカプシドタンパク質のＤＮＡシャッフリングを含み、それらは酵素的にシャッフリングされることでカプシド遺伝子の多様なライブラリーを作り出し、当該ライブラリーは、ＡＡＶシャトルプラスミドの中にクローニングし戻されることができ、生きた複製性ウイルスライブラリー（例えば図２を参照のこと）を生成するために利用されることができる。シャッフリング済みカプシド（すなわち変異型カプシドポリペプチド）をヒト肝組織または肝細胞（すなわちヒト肝細胞）に機能的に形質導入できる尤度を―典型的には前臨床評価のために使用されるモデル生物の肝組織または肝細胞に比べて―最大限にするために、本発明は、ヒト化肝臓マウスにおいてスクリーニングを行うことを企図している（例えば図３を参照のこと）。シャッフリング済みカプシド（すなわち変異型カプシドポリペプチド）が強化された中和特性を呈する尤度を最大限にするために、本発明は、プールされたヒト免疫グロブリンにおいてスクリーニングを行うことを企図している（例えば図４を参照のこと）。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、どちらのスクリーニングの完了時にも、完全サンガー配列決定及び親血清型（すなわち親非変異型カプシドポリペプチド配列）との系統学的比較のために各スクリーニングから変異型ＡＡＶカプシドを選出する。いくつかの実施形態では、親非変異型カプシドポリペプチド配列は、初期ライブラリーの中に含まれた配列である。スクリーニングから最も好結果に選抜された変異型（例えば、ヒト肝組織またはヒト肝細胞における形質導入及び／または向性の最も高い向上ならびに強化された中和特性を呈する変異型）を単離し、発現用構築物によってベクター化し、場合によっては後に続く検証実験で使用する。いくつかの実施形態では、各スクリーニングから選抜された進化カプシド（すなわち変異型カプシドポリペプチド）に対する各親ＡＡＶ血清型（すなわち非変異型親カプシドポリペプチド）の遺伝的寄与を評価するために交差マッピングを行うことができる（例えば図５を参照のこと）。どちらの方法論も、進化カプシド変異型の高度にシャッフリングされた特質を実証し、選抜されたカプシドに存在している固有ドメインと共通ドメインとを両方とも際立たせた。いくつかの実施形態では、進化させた変異型に最も寄与している親カプシド（すなわち非変異型親カプシドポリペプチド）には、ＡＡＶ２及びＡＡＶ３ｂが含まれる。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９＿ｈｕ１４からの領域ならびにｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ウシＡＡＶまたは鳥類ＡＡＶに由来するカプシド断片領域を有する変異型（すなわち変異型カプシドポリペプチド）はない。いくつかの実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含めたＣａｐの長さに沿って多様なシャッフリングが成し遂げられ、かつ維持された。
【０１８４】
対照血清型（すなわち非変異型親カプシドポリペプチド）と比較したときの変異型カプシドポリペプチドによる形質導入の著しい向上を様々な肝臓由来細胞系統において実証するために試験管内での特性評価を用いる。
【０１８５】
そのような分析のために、ＡＡＶベクター化変異型（変異型カプシドポリペプチドからなるＡＡＶベクター）の大規模な超純粋生産を行うことができ、実際の臨床用途に十分な高力価を生むことができるもの（例えば、変異型ＡＡＶ−ＮＰ８４、ＡＡＶ−ＮＰ５９、ＡＡＶ−ＮＰ４０及びＡＡＶ−ＮＰ３０）をさらに検証のために考慮に入れることができる。いくつかの実施形態では、ヒト肝臓細胞またはヒト肝細胞において、著しく向上した機能的形質導入を呈しているシャッフリング済み変異型（すなわち変異型カプシドポリペプチド）を本発明によって選抜することができる。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドはさらに、マウス肝細胞において生体内で向上した形質導入または向性を呈する。
【０１８６】
ＡＡＶベクターエレメント
核酸インサート（異種ヌクレオチド配列とも呼ぶ）は、その転写または発現を生体内でヌクレオチド配列において誘導する制御エレメントに機能可能に繋げられ得る。そのような制御エレメントは、選抜遺伝子に正常に関連付けられた制御配列を含み得る（例えば内在性細胞制御エレメント）。あるいは、異種制御配列を採用することもできる。有用な異種制御配列は大抵、哺乳動物遺伝子またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来する配列を含む。例としては、限定されないが、ＳＶ４０早期プロモーター、マウス乳癌ウイルス長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス後期主要プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、対象遺伝子にとって異種である内在性細胞プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ即時早期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子に由来する配列を使用することもできる。そのようなプロモーター配列は例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、異種遺伝子産物をコードする核酸インサート（異種ヌクレオチド配列とも呼ぶ）に細胞種特異的または組織特異的なプロモーターを機能可能に繋げて、特定の細胞種（複数可）または組織（複数可）において遺伝子産物を選択的または優先的に産生することを可能にすることができる。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを異種核酸に機能可能に繋げることができる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、核酸は、本発明の変異型カプシドポリペプチドによってパッケージングされる。いくつかの実施形態では、核酸インサート、またはパッケージングされた核酸は、少なくとも３０００核酸〜少なくとも５０００核酸である。いくつかの実施形態では、核酸インサート、またはパッケージングされた核酸は、少なくとも３５００核酸〜少なくとも４５００核酸である。いくつかの実施形態では、核酸インサート、またはパッケージングされた核酸は、少なくとも４０００核酸〜少なくとも５０００核酸である。いくつかの実施形態では、核酸インサート、またはパッケージングされた核酸は、少なくとも４２００核酸〜少なくとも４９００核酸である。いくつかの実施形態では、核酸インサート、またはパッケージングされた核酸は、少なくとも４４００核酸〜少なくとも４８００核酸である。いくつかの実施形態では、核酸インサート、またはパッケージングされた核酸は、少なくとも４７００核酸である。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドによってパッケージングされたＡＡＶベクターは、全長が少なくとも約２０００核酸であり、かつ全長が約５０００核酸以下である。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドによってパッケージングされたＡＡＶベクターは約２０００核酸、約２４００核酸、約２８００核酸、約３０００核酸、約３２００核酸、約３４００核酸、約３６００核酸、約３８００核酸、約４０００核酸、約４２００核酸、約４４００核酸、約４６００核酸、約４７００核酸または約４８００核酸である。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドによってパッケージングされたＡＡＶベクターは約２０００核酸（２ｋｂ）〜約５０００核酸（５ｋｂ）である。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドによってパッケージングされたＡＡＶベクターは約２４００核酸（２．４ｋｂ）〜約４８００核酸（４．８ｋｂ）である。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドによってパッケージングされたＡＡＶベクターは約３０００核酸（３ｋｂ）〜約５０００核酸（５ｋｂ）である。いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドによってパッケージングされたＡＡＶベクターは約３０００核酸（３ｋｂ）〜約４０００核酸（４ｋｂ）である。
【０１９０】
本明細書において開示されるＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオンはさらに、本発明に従って生産されたＡＡＶベクターでトランスフェクトされたかまたはＡＡＶビリオンに感染した細胞における転写、翻訳及び／または発現を可能にするように核酸インサート（異種ヌクレオチド配列とも呼ぶ）に機能可能に繋げられた従来の制御エレメントを含むこともできる。本明細書中で使用する場合、「機能的に繋げられた」配列は、対象遺伝子と接している発現制御配列を含むだけでなく、トランスで、つまり離れて作用して対象遺伝子を制御する発現制御配列も含む。
【０１９１】
発現制御配列は、適切な転写開始配列、終止配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列；効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングシグナル及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル；細胞質内ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザック共通配列）；タンパク質安定性を強化する配列；ならびに所望によってはコードされた産物の分泌を強化する配列を含む。ネイティブプロモーター、恒常的プロモーター、誘導性プロモーター及び／または組織特異的プロモーターから選択されるプロモーターを含めた非常に多くの発現制御配列が当該技術分野において既知であり、利用され得る。
【０１９２】
恒常的プロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によってＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によってＣＭＶエンハンサーを伴う）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照のこと）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＥＦ１プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にするものであり、外から供給される化合物、温度などの環境要因または、特異な生理学的状態（例えば、急性期や、細胞の、または複製性細胞のみにおける特定の分化状態）の存在によって調節され得る。誘導性プロモーター及び誘導系は、限定されないがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ及びＡｒｉａｄを含めた様々な商業的供給元から入手可能である。その他多くの系は記載がなされており、当業者が容易に選択することができる。外から供給される化合物によって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１）、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１）、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９、さらにＨａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ，２：５１２−５１８も参照のこと）、ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：２３９−２４３、及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１）、及びラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２）が挙げられる。これに関連して有用なその他のタイプの誘導性プロモーターは、特異な生理学的状態、例えば、温度や、急性期や、細胞の、または複製性細胞のみにおける特定の分化状態によって調節される、プロモーターである。
【０１９３】
別の実施形態では、核酸インサート（異種ヌクレオチド配列とも呼ぶ）のネイティブプロモーターが使用されよう。ネイティブプロモーターは、核酸インサート（異種ヌクレオチド配列とも呼ぶ）の発現が生来の発現を模倣すべきであることが望まれる場合に好まれ得る。ネイティブプロモーターは、核酸インサート（異種ヌクレオチド配列とも呼ぶ）の発現を一時的もしくは発展的に、または組織特異的に、または特異な転写刺激に応答して調節せねばならない場合に使用され得る。さらなる実施形態では、生来の発現を模倣するために他のネイティブ発現制御エレメント、例えば、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはコザック共通配列が使用され得る。
【０１９４】
核酸インサート（異種ヌクレオチド配列とも呼ぶ）の別の実施形態は、組織特異的プロモーターに機能可能に繋げられた遺伝子を含む。例えば、肝組織での発現が望まれる場合には、肝組織において活性であるプロモーターを使用すべきである。組織特異的であるプロモーターの例としては、数ある中でも、肝臓に関するもの（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７１：５１２４−３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９；アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４）、骨オステオカルシンに関するもの（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｍｏ  Ｉ  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６）；骨シアロタンパク質に関するもの（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４）、リンパ球に関するもの（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１：１０６３−８；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、ニューロンに関するもの、例えば神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９３）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，１３：５０３−１５）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子に関するもの（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５）、及びニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子に関するもの（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４）が知られている。
【０１９５】
様々な実施形態において、１つ以上の治療上有用な核酸インサート（異種ヌクレオチド配列とも呼ぶ）を保有するＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオンはさらに、選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子、例えば、数ある中でも、ジェネテシン、ヒグロマイシンまたはピューロマイシン耐性をコードする配列を含む。選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子は、例えばアンピシリン耐性を調べることを含めて、細菌細胞内のプラスミド／ベクターの存在を知らせるために使用することができる。プラスミドのその他の構成要素は複製起点を含んでもよい。これら及びその他のプロモーター及びベクターエレメントの選択は一般的であり、多くのそのような配列が使用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．及びその中で引用されている参考文献を参照のこと）。
【０１９６】
宿主細胞及びパッケージング
宿主細胞は、感染性ＡＡＶベクターを生成するため、及び開示のＡＡＶベクターに基づいたＡＡＶビリオンを生成するために必要である。したがって、本発明は、本発明のＡＡＶベクターに基づいたＡＡＶビリオンの生成及びパッケージングのための宿主細胞を提供する。様々な宿主細胞が当該技術分野において既知であり、本発明の方法において使用される。本明細書において記載されているかまたは当該技術分野において既知であるいかなる宿主細胞も、本明細書に記載の組成物及び方法に関して採用することができる。
【０１９７】
本発明は、主題核酸を含む宿主細胞、例えば単離（遺伝子改変）宿主細胞を提供する。主題宿主細胞は、単離細胞、例えば、試験管内培養物中の細胞であり得る。主題宿主細胞は、以下に記載する主題のＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオンを生成するために有用である。主題宿主細胞は、主題ＡＡＶビリオンを作るために使用される場合、「パッケージング細胞」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、主題宿主細胞は、主題ＡＡＶベクターで安定的に遺伝子改変される。他の実施形態では、主題宿主細胞は主題ＡＡＶベクターで一過的に遺伝子改変される。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、主題核酸は、確立された技術、限定されないが例えば、電気穿孔、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、バキュロウイルス感染などを用いて宿主細胞内に安定的または一過的に導入される。安定した形質転換のためには、主題核酸は大抵、選択可能なマーカー、例えば、いくつかのよく知られた選択可能なマーカーのうちのいずれか、例えばネオマイシン耐性などをさらに含むことになろう。
【０１９９】
総じて本発明に係るＡＡＶベクターをトランスフェクションによって送達する場合、ＡＡＶベクターは、約５μｇ〜約１００μｇＤＮＡ、約１０〜約５０μｇＤＮＡ、約１×１０４細胞〜約１×１０１３細胞、または約１×１０５細胞の量で送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法及び選択された宿主細胞などの要因を考慮に入れて調節してもよく、そのような調節は当業者の水準内である。
【０２００】
いくつかの実施形態では、感染性ビリオンの生成に使用される宿主細胞は、原核生物（例えば細菌）細胞ならびに、昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を含む真核生物細胞を含めた任意の生物から選択することができる。主題宿主細胞は、多様な細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばマウス細胞及び霊長類細胞（例えばヒト細胞）のいずれかの中に主題核酸（すなわちＡＡＶベクター）を導入することによって生成する。特に望ましい宿主細胞は任意の哺乳動物種の中から選択され、限定されないが例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ及びハムスターを含めた哺乳動物に由来するＡ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ  １、ＢＳＣ  ４０、ＢＭＴ  １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、２９３、Ｖｅｒｏ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｈｕｈ−７  Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、ＲＡＴ１、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）、ヒト胚性幹細胞、ヒト成体組織幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、初期化幹細胞、オルガノイド幹細胞、骨髄幹細胞、ＨＬＨｅｐＧ２、ＨｅｐＧ２及び初代線維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞が挙げられる。細胞を提供する哺乳動物種の選択も、哺乳動物細胞の種類、すなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などの選択も、本発明においては限定されない。使用する細胞の要件は、ＡＡＶベクターによる感染またはトランスフェクションが可能なことである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細胞において安定的にトランスフェクトされるＲｅｐ及びＣａｐを有する細胞であり、いくつかの実施形態においては本明細書に記載の変異型カプシドポリペプチドを含むものである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本発明の変異型カプシドポリペプチドまたは本明細書に記載のＡＡＶベクターの一部、例えばＡＡＶベクター内に入っている異種核酸配列を発現する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本発明に係る宿主細胞の作製には、選択されたＤＮＡ配列の組立てなどの技術を伴う。この組立ては、一般的技術を利用して成し遂げられ得る。そのような技術は、上に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている周知のｃＤＮＡ及びゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、合成方法、ならびに所望のヌクレオチド配列をもたらすその他の任意の好適な方法と組み合わせてアデノウイルス及びＡＡＶゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列を使用することを含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、宿主細胞内へのＡＡＶベクターの導入は、当業者に知られている技術及び本明細書全体を通して記述されている技術を用いて成し遂げられ得る。好ましい実施形態では、標準的なトランスフェクション技術、例えば、ＣａＰＯ４トランスフェクションもしくは電気穿孔及び／または、ヒト胎児腎細胞系統ＨＥＫ２９３（トランスで作用するＥ１タンパク質をもたらす機能性アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するヒト腎細胞系統）などの細胞系統に対するハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによる感染を用いる。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、主題遺伝子改変宿主細胞は、上記のような変異型ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の他に、１つ以上のＡＡＶ  Ｒｅｐ（複製）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸も含む。他の実施形態では、主題宿主細胞はさらにＡＡＶベクターを含む。ＡＡＶビリオンは、主題宿主細胞を用いて生成させることができる。ＡＡＶビリオンを生成させる方法は、例えば米国特許公開第２００５／００５３９２２号及び米国特許公開第２００９／０２０２４９０号に記載されている。
【０２０４】
典型的な実施形態では、宿主細胞はＡＡＶベクターの他に、宿主細胞におけるＡＡＶカプシドポリペプチド（変異型カプシドポリペプチド及び非変異型親カプシドポリペプチドを含む）の発現及び、核酸インサート（異種ヌクレオチド配列とも呼ぶ）に見受けられるＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と同じ血清型であるかまたは交差相補血清型であるＲｅｐ（複製）配列の発現を推進する配列を含有する。ＡＡＶカプシド及びＲｅｐ（複製）配列は、独立してＡＡＶ源から得ることができ、当業者に知られているかまたは本明細書において記載されているいかなる方法で宿主細胞内に導入されてもよい。さらに、ＡＡＶベクターを例えばＡＡＶ８カプシド内に偽型化する場合には、必須な各Ｒｅｐ（複製）タンパク質をコードする配列がＡＡＶ８によって供給されてもよいし、Ｒｅｐ（複製）タンパク質をコードする配列が別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７及び／またはＡＡＶ９）によって供給されてもよい。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、適切なプロモーターの制御下でカプシドタンパク質（例えば本発明の変異型カプシドポリペプチドを含む）、例えば上に記載したものを安定的に含有する。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は誘導性プロモーターの制御下で発現する。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、トランスで宿主細胞へ供給される。カプシドタンパク質は、トランスで宿主細胞へ送達される場合、選択されたカプシドタンパク質の宿主細胞における発現を誘導するのに必要な配列を含有するプラスミドによって送達され得る。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質（例えば本発明の変異型カプシドポリペプチドを含む）をコードするベクターは、トランスで宿主細胞へ送達される場合、ＡＡＶをパッケージングするのに必要な他の配列、例えばＲｅｐ（複製）配列をさらに保有する。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、適切なプロモーターの制御下でＲｅｐ（複製）配列、例えば上に記載したものを含有する。いくつかの実施形態では、必須なＲｅｐタンパク質を誘導性プロモーターの制御下で発現させる。別の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質をトランスで宿主細胞へ供給する。Ｒｅｐタンパク質は、トランスで宿主細胞へ送達される場合、選択されたＲｅｐタンパク質の宿主細胞における発現を誘導するのに必要な配列を含有するプラスミドによって送達され得る。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質（例えば本発明の変異型カプシドポリペプチドを含む）をコードするベクターは、トランスで宿主細胞へ送達される場合、ＡＡＶベクターをパッケージングするのに必要な他の配列、例えばＲｅｐ配列をさらに保有する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ及びカプシド配列は、単一の核酸分子で宿主細胞内へトランスフェクトされ得、融合されないエピソームとして細胞内に安定的に存在し得る。別の実施形態では、Ｒｅｐ及びカプシド配列は細胞の染色体中に安定的に組み込まれる。別の実施形態は、宿主細胞内で一過的に発現したＲｅｐ及びカプシド配列を有する。例えば、そのようなトランスフェクションに有用な核酸分子は、５’から３’へ向かって、プロモーター、プロモーターとＲｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に配置される任意選択のスペーサー、ＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子配列、及びＡＡＶカプシド遺伝子配列を含む。
【０２０８】
Ｒｅｐ及びカプシドをもたらす分子（複数可）は一過的に（つまりトランスフェクションによって）宿主細胞内に存在することができるが、いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ及びカプシドタンパク質ならびにそれらの発現を制御しているプロモーター（複数可）のうちの片方または両方を、エピソームとして、または宿主細胞の染色体中への組込みによって、宿主細胞内で安定的に発現させることができる。本発明の実施形態を構築するために採用される方法は、上記の参考文献において記載されているような一般的な遺伝子操作または組換え操作の技術である。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、パッケージング用の宿主細胞は、本発明のＡＡＶベクターをＡＡＶビリオンとしてパッケージングするためにヘルパー機能を必要とし得る。いくつかの実施形態では、これらの機能はヘルペスウイルスによって提供され得る。いくつかの実施形態では、必要とされる各ヘルパー機能は、ヒトまたは非ヒト霊長類アデノウイルス源から供給され、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．（ＵＳ）を含めた様々な供給元から入手可能である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｅ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物及び／またはＥ４  ＯＲＦ６遺伝子産物を供給されかつ／または含有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＶＡＩ  ＲＮＡなどの、他のアデノウイルス遺伝子を含有し得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞には他のアデノウイルス遺伝子または遺伝子機能が存在しない。
【０２１０】
異種の核酸、核酸遺伝子産物及びポリペプチド遺伝子産物
様々な実施形態において、本発明は、核酸及びポリペプチドを含めた様々な治療分子をパッケージングすることができるカプシドの形成が可能である変異型カプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、治療分子はワクチンである。様々な実施形態において、本発明は、例えば導入遺伝子インサートまたはその他の核酸インサートを含めた核酸インサートを収容することができるＡＡＶベクターを提供する。これは、ポリペプチドを発現することができるベクターを可能にする。そのような核酸は、異種の核酸、核酸遺伝子産物及びポリペプチド遺伝子産物を含むことができる。核酸インサートの特徴を以下に記載する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶベクターは核酸インサートを含有する。いくつかの実施形態では、核酸インサートは、限定されないが、非コードＲＮＡ、タンパク質コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子指向性カセット、及び治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列を含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、発現カセットはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現システムである。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、核酸インサートは、異種遺伝子産物、例えば核酸遺伝子産物またはポリペプチド遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物はアプタマーである。遺伝子産物は自己相補型核酸であってもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子産物はポリペプチドである。
【０２１４】
適する異種遺伝子産物としては、例えば、干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びアプタマーが挙げられる。遺伝子産物が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である場合、適するＲＮＡｉとしては、例えば、細胞内の標的ポリペプチドのレベルを低下させるＲＮＡｉが挙げられる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、典型的なポリペプチド、核酸またはその他の治療分子として、例えば肝臓の疾患及び障害を処置するのに有用なものが挙げられる。肝臓の疾患及び障害としては、限定されないが例えば、肝臓が適切に機能することを阻止するかまたはそれが十分に機能すること（つまり、正常レベルで機能すること）を妨げる任意の症状が挙げられる。肝臓の疾患及び障害の症候としては、限定されないが例えば、腹痛、皮膚または眼の黄染（黄疸）、肝機能試験の異常な結果、肝臓の肥大（例えば不均衡な肥大を含む）、及び肝硬変を挙げることができる。肝臓の疾患及び障害としてはさらに、限定されないが例えば、アメーバ性肝膿瘍、自己免疫性の肝疾患及び肝障害（例えば、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性硬変症（ＰＢＣ）及び原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）を含む）、胆道閉鎖症、硬変症、コクシジオイデス症、デルタ因子（Ｄ型肝炎）、薬物性胆汁鬱滞、ヘモクロマトーシス、ウイルス性肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎を含む）、新生児肝炎、肝細胞癌（ＨＣＣ及びその他の肝臓癌）、線維層状型肝細胞癌、アルコールに起因する肝疾患、化膿性肝膿瘍、ライ症候群、硬化性胆管炎、ウィルソン病、急性肝不全（例えば薬物、毒素及びその他の様々な疾患によって引き起こされるもの）、アルコール性肝疾患、自己免疫関連疾患、バッド・キアリ症候群、凝固亢進疾患、寄生虫感染症、慢性胆管閉塞症（例えば、腫瘍、胆石、炎症及び外傷によるものを含む）、ヘモクロマトーシス、α１アンチトリプシン（Ａ１Ａ）欠乏症、ウィルソン病、アラジール症候群、嚢胞性肝疾患、ガラクトース血症、ジルベール症候群、ヘモクロマトーシス、妊娠時の肝疾患、リソソーム酸性リパーゼ欠損症（ＬＡＬＤ）、ポルフィリン症、サルコイドーシス、１型グリコーゲン蓄積病、チロシン血症、多包虫症、細菌性肝紫斑病、先天性肝線維症、鬱血性肝障害、胃前庭部毛細血管拡張症、肝性脳症、肝内結石症、肝肺症候群、肝腎症候群、肝脾腫、肝毒性、インド小児肝硬変、ラエンネック型肝硬変、リングスタダス症候群、肝紫斑病、進行性家族性肝内胆汁鬱滞症、ツァーン梗塞、ジーヴ症候群、ならびに非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が挙げられる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、典型的なポリペプチド、核酸またはその他の治療分子として、例えば、ドゥシェンヌ型筋ジストロフィーや肢帯型筋疾患のような稀なサルコグリカン異常症及びジストロフィン異常症、ならびに脊髄性筋萎縮症、ならびにその他の筋肉組織関連疾患を処置するのに有用なものが挙げられる。典型的な筋組織関連疾患としては、限定されないが例えば、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アンダーセン・タウィル症候群、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ベッカー型先天性ミオトニー、ベスレムミオパチー、延髄脊髄性筋萎縮症（球脊髄性筋萎縮症）、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症（ＣＰＴ欠損症）、セントラルコア病（ＣＣＤ）、中心核ミオパチー、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、先天性筋無力症（ＣＭＳ）、先天性筋硬直性ジストロフィー、コーリ病（脱分枝酵素欠損症）、脱分枝酵素欠損症、デジェリン・ソッタス病（ＤＳＤ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（筋強直性ジストロフィー）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、内分泌性ミオパチー、オイレンブルグ病（先天性パラミオトニア）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）、フィンランド人（頸骨筋）遠位ミオパチー、フォーブス病（脱分枝酵素欠損症）、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、福山型先天性筋ジストロフィー、１０型糖原病、１１型糖原病、２型糖原病、３型糖原病、５型糖原病、７型糖原病、９型糖原病、Ｇｏｗｅｒｓ−Ｌａｉｎｇ遠位型ミオパチー、Ｈａｕｐｔｍａｎｎ−Ｔｈａｎｈｅｕｓｅｒ  ＭＤ（エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー）、遺伝性封入体筋炎、遺伝性運動感覚ニューロパチー（シャルコー・マリー・トゥース病）、甲状腺機能亢進性ミオパチー、甲状腺機能低下性ミオパチー、封入体筋炎（ＩＢＭ）、遺伝性ミオパチー、インテグリン欠損型先天性筋ジストロフィー、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症）、クーゲルベルグ・ウェランダー病（脊髄性筋萎縮症）、乳酸脱水素酵素欠損症、ランバート・イートン筋無力症候群（ＬＥＭＳ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、ルー・ゲーリック病（筋萎縮性側索硬化症）、マッカードル病（ホスホリラーゼ欠損症）、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、筋肉の代謝性疾患、ミトコンドリアミオパチー、三好型遠位型ミオパチー、運動ニューロン疾患、筋・眼・脳病、重症筋無力症（ＭＧ）、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、筋原線維性ミオパチー、筋型ホスホリラーゼ欠損症、先天性ミオトニー（ＭＣ）、筋強直性ジストロフィー（ＭＭＤ）、筋細管ミオパチー（ＭＴＭまたはＭＭ）、ネマリンミオパチー、埜中型遠位型ミオパチー、眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、先天性パラミオトニア、ピアソン症候群、周期性麻痺、腓骨筋萎縮症（シャルコー・マリー・トゥース病）、ホスホフルクトキナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症、ホスホリラーゼ欠損症、ホスホリラーゼ欠損症、多発性筋炎（Ｐ���）、ポンペ病（酸性マルターゼ欠損症）、進行性外眼筋麻痺（ＰＥＯ）、桿体病（ネマリンミオパチー）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、スタイナート病（筋強直性ジストロフィー）、垂井病（ホスホフルクトキナーゼ欠損症）、トムセン病（先天性ミオトニー）、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー、ウォーカー・ワールブルグ症候群（先天性筋ジストロフィー）、ウェランダー型遠位型ミオパチー、ウェルドニッヒ・ホフマン病（脊髄性筋萎縮症）、及びＺＡＳＰ関連ミオパチーが挙げられる。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、典型的なポリペプチドとして、例えば神経保護ポリペプチド及び抗血管新生ポリペプチドが挙げられる。適するポリペプチドとしては、限定されないが例えば、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ；例えば神経成長因子β）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、ニューロトロフィン６（ＮＴ−６）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、Ｗｎｔポリペプチド、可溶性Ｆｌｔ−１、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦ抗体、可溶性ＶＥＧＦＲ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、及びヘッジホッグファミリーのメンバー（ソニック・ヘッジホッグ、インディアン・ヘッジホッグ、及びデザート・ヘッジホッグなど）が挙げられる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、異種核酸配列によってコードされる有用な治療用産物として、例えばホルモンならびに成長及び分化因子、限定されないが例えば、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＧＥＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、トランスフォーミング増殖因子アルファスーパーファミリー（ＴＧＦαを含む）のなかのいずれか１つ、アクチビン、インヒビン、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１〜１５のうちのいずれか、成長因子のヘレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのうちのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３及びＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのうちのいずれか１つ、ネトリン−１及びネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニック・ヘッジホッグ、ならびにチロシン水酸化酵素が挙げられる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、有用な異種核酸配列産物として、免疫系を調節するタンパク質、限定されないが例えば、サイトカイン及びリンフォカイン、例えば、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１〜ＩＬ−２５（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８を含む）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドが挙げられる。免疫系によって産生される遺伝子産物も本発明において有用である。これらとしては、限定されないが例えば、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩ  ＭＨＣ分子ならびに、操作された免疫グロブリン及びＭＨＣ分子が挙げられる。有用な遺伝子産物としてはさらに、補体調節タンパク質、例えば、補体調節タンパク質、膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２及びＣＤ５９も挙げられる。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、有用な異種核酸配列産物には、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンフォカイン、調節タンパク質及び免疫系タンパク質の受容体のうちのいずれか１つを含む。有用な異種核酸配列にはさらに、コレステロール制御及び／または調節のための受容体、例えば、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体及びスカベンジャー受容体も含む。本発明はさらに、グルココルチコイド受容体及びエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体ならびにその他の核内受容体を含めたステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーなどの遺伝子産物の使用を包含する。さらに、有用な遺伝子産物には、転写因子、例えば、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ及びｍｙｏｇｅｎｉｎ、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ−ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＳＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、ならびに翼状らせんタンパク質のフォークヘッドファミリーを含む。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、有用な異種核酸配列産物として、例えば、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸合成酵素、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニン水酸化酵素、α１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素、シスタチオンβ−合成酵素、分枝状鎖ケト酸脱炭酸酵素、アルブミン、イソ吉草酸ｃｏＡ脱水素酵素、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシン脱炭酸酵素、Ｈタンパク質、Ｔタンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィンｃＤＮＡ配列が挙げられる。さらなる他の有用な遺伝子産物としては、例えば、酵素の不十分な活性によって生じる様々な症状に有用な、酵素補充療法に有用な酵素が挙げられる。例えば、マンノース−６−リン酸を含有する酵素は、リソソーム蓄積症（例えば適する遺伝子はβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードするものを包含する）の治療において利用され得る。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、有用な異種核酸配列産物として、例えば、血友病Ｂ（第ＩＸ因子を含む）及び血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子ならびにその変異型、例えば、ヘテロ二量体の軽鎖及び重鎖ならびにＢ欠失ドメインを含む；米国特許第６，２００，５６０号及び米国特許第６，２２１，３４９号）を含めた血友病の処置に使用されるものが挙げられる。第ＶＩＩＩ因子遺伝子は２３５１個のアミノ酸をコードし、当該タンパク質は６つのドメインを有し、アミノから末端のカルボキシ末端までＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と呼称される（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３３０；Ｖｅｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３３７、及びＴｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３４２：３３７）。ヒト第ＶＩＩＩ因子は細胞内でプロセシングされて、Ａ１、Ａ２及びＢドメインを含有する重鎖と、Ａ３、Ｃ１及びＣ２ドメインを含有する軽鎖とを主として含むヘテロ二量体を生じる。一本鎖ポリペプチド及びヘテロ二量体はどちらも、Ａ２ドメインとＢドメインとの間でのトロンビン切断によって活性化されてＢドメインを遊離させるとともにＡ１及びＡ２ドメインからなる重鎖を生じさせるまでは、不活性前駆体として血漿中を循環する。Ｂドメインは、タンパク質の活性化凝血促進物質形態では欠失している。さらに、生来のタンパク質では、Ｂドメインの両隣に位置する２本のポリペプチド鎖（「ａ」及び「ｂ」）に二価カルシウムカチオンが結合している。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、有用な遺伝子産物として、例えば天然に存在しないポリペプチド、例えば、挿入、欠失またはアミノ酸置換を含有する天然に存在しないアミノ酸配列を有するキメラまたはハイブリッドポリペプチドが挙げられる。例えば、操作された一本鎖免疫グロブリンは特定の免疫不全患者に有用となり得る。天然に存在しない他のタイプの遺伝子配列としては、例えば、標的の過剰発現を低減するために使用されるアンチセンス分子及び触媒性核酸、例えばリボザイムが挙げられる。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、幹細胞障害、例えば、骨髄幹細胞または成体組織幹細胞（すなわち体性幹細胞）のどちらかにおける障害を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、成体幹細胞として、例えばオルガノイド幹細胞（すなわち、体内の対象となる任意の器官または器官系に由来する幹細胞）を挙げることができる。身体の器官としては、限定されないが例えば、皮膚、毛髪、爪、感覚受容体、汗腺、皮脂腺、骨、筋肉、脳、脊髄、神経、下垂体、松果腺、視床下部、甲状腺、副甲状腺、胸腺、副腎、膵臓（膵島組織）、心臓、血管、リンパ節、リンパ管、胸腺、脾臓、扁桃腺、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、口、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門管、歯、唾液腺、舌、肝臓、胆嚢、膵臓、盲腸、腎臓、尿管、膀胱、尿道、精巣、（輸）精管、尿道、前立腺、陰茎、陰嚢、卵巣、子宮、卵管（ファローピウス管）、膣、外陰部及び乳腺（乳房）が挙げられる。身体の器官系としては、限定されないが例えば、外皮系、骨格系、筋肉系、神経系、内分泌系、心血管系、リンパ系、呼吸器系、消化器系、泌尿器系及び生殖器系が挙げられる。いくつかの実施形態では、処置のための障害は、任意の１つ以上のオルガノイド幹細胞（すなわち、体内の対象となる任意の器官または器官系に由来する幹細胞）における障害である。いくつかの実施形態では、処置は、生体内での処置である（例えば、変異型カプシドポリペプチドの投与を対象に対して直接行う）。いくつかの実施形態では、処置は、生体外での処置である（例えば、変異型カプシドポリペプチドの投与を、対象から単離された幹細胞に対して行い、その後、処置済みの幹細胞を対象へ戻す）。
【０２２５】
異種核酸配列の発現の低減及び／または調節は、過剰増殖細胞によって特徴付けられる過剰増殖状態、例えば癌及び乾癬の処置において特に望ましい。標的ポリペプチドには、過剰増殖細胞において排他的に、または正常細胞と比べてより高いレベルで生成される、ポリペプチドを含む。標的抗原としては、例えば、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎなどの癌遺伝子ならびに転座遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ及びＥＧＲＦによってコードされるポリペプチドが挙げられる。標的抗原としての癌遺伝子産物の他に、抗癌処置及び保護的養生のための標的ポリペプチドには、Ｂ細胞リンパ腫によって作られた抗体の可変領域、及びＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域が含まれ、それらは、いくつかの実施形態では自己免疫疾患の標的抗原として使用される。その他の腫瘍関連ポリペプチドは、標的ポリペプチド、例えば腫瘍細胞においてより高いレベルで見受けられるポリペプチド、例えばモノクローナル抗体１７−１Ａによって認識されるポリペプチド及び葉酸結合ポリペプチドとして使用することができる。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、適する治療用ポリペプチド及びタンパク質には、自己免疫性に関連する標的、例えば細胞受容体及び「自己」指向性抗体を産生する細胞に対して幅広い保護的免疫応答を付与することによって自己免疫疾患及び障害を患う個体を処置するために有用なものが含まれる。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ウェゲナー肉芽腫症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。これらの疾患はどれも、内因性抗原に結合して自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを起こすＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって特徴付けられる。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、他の病原体、例えば細菌、ウイルス、真菌、ヒト及び非ヒト脊椎動物に感染する寄生性微生物もしくは多細胞寄生虫、または癌細胞もしくは腫瘍細胞に対する免疫をヒトまたは非ヒト動物に付与するのに有用な免疫源をコードする。細菌性病原体の例としては、病原性グラム陽性球菌、例えば、肺炎球菌、ブドウ球菌（及びそれによって産生される毒素、例えば、エンテロトキシンＢ）、及び連鎖球菌が挙げられる。病原性グラム陰性球菌としては、例えば、髄膜炎菌、淋菌が挙げられる。病原性グラム陰性腸内桿菌としては、例えば、腸内細菌；シュードモナス、アシネトバクテリア及びエイケネラ；メリオイドーシス；サルモネラ；シゲラ；インフルエンザ菌；モラキセラ；Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ（軟性下疳を引き起こす）；ｂｒｕｃｅｌｌａ属菌（ブルセラ症）；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病を引き起こす）；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）及びその他のＹｅｒｓｉｎｉａ（パスツレラ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ及びスピリルム；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含めたグラム陽性桿菌；Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ジフテリアを引き起こす）；コレラ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ａｎｔｈｒａｃｉａ（炭疽病を引き起こす）；ドノヴァン症（鼠径肉芽腫；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓによって引き起こされる）；ならびにバルトネラ症が挙げられる。病原性嫌気性細菌によって引き起こされる疾患としては、例えば、破傷風；ボツリヌス中毒症（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ及びその毒素）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ及びそのイプシロン毒素；その他のクロストリジウム菌；結核；らい病；及びその他のマイコバクテリアが挙げられる。病原性スピロヘータ病としては、例えば、梅毒；トレポネーマ症：フランベジア、ピンタ及び風土性梅毒；ならびにレプトスピラ症が挙げられる。高等な病原性細菌及び病原性真菌によって引き起こされる他の感染症としては、例えば、鼻疽（Ｂｕｒｋｈｏｌａｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）；放線菌症；ノカルジア症；クリプトコッカス症、分芽菌症、ヒストプラズマ症及びコクシジオイデス症；カンジダ症、アスペルギルス症及びムコール症；スポロトリクム症；パラコクシジオイデス症、ペトリエリジウム症（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫及び黒色真菌症；ならびに皮膚糸状菌症が挙げられる。リケッチア感染症としては、例えば、発疹チフス；ロッキー山紅斑熱；Ｑ熱（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ）；及びリケッチア痘瘡が挙げられる。マイコプラズマ感染症及びクラミジア感染症の例としては、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｒｎｏｎｉａｅ、鼠径リンパ肉芽腫症（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによって引き起こされる）、オウム病及び周産期クラミジア感染症が挙げられる。病原性原生動物及び寄生蠕虫を含めた病原性真核生物、ならびにそれらによってもたらされる感染症としては、例えば、アメーバ症（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ��ｉｓｔｏｌｙｔｉｃａによって引き起こされる）；マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍによって引き起こされる）；リーシュマニア症（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａによって引き起こされる）；トリパノソーマ症（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａによって引き起こされる）；トキソプラズマ症（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉによって引き起こされる）；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ；バベシア症（Ｂａｂｅｓｉａによって引き起こされる）；ジアルジア症（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａによって引き起こされる）；旋毛虫症（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ属の線虫によって引き起こされる）；フィラリア症（Ｆｉｌａｒｉｏｉｄｅａの線虫によって引き起こされる）；住血吸虫症（寄生虫Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａの５つの種のうちの１つに感染した淡水産巻貝が保有している）；線虫（Ｎｅｍａｔｏｄａ）；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅ）すなわち吸虫（ｆｌｕｋｅ）（Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）；及び条虫（Ｃｅｓｔｏｉｄｅａ；サナダムシ）の感染症が挙げられる。ウイルスの例としては、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ；例えばＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）、インフルエンザ（例えばインフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びインフルエンザＣ）、パラインフルエンザ肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎及びＥ型肝炎）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ；ＨＨＶ；例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２としても知られる単純ヘルペスウイルス１型及び２型を含めて、ヘルペスウイルス１型、２型、３型、４型、５型、６Ａ型、６Ｂ型、７型及び８型）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＨＨＶ−３）、エプスタイン・バーウイルス（ＨＨＶ−４）、ロゼオロウイルス（ＨＨＶ−６Ａ及びＨＨＶ−６Ｂ）；ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＨＨＶ−５）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ、ＨＨＶ−８）、パポーバウイルス（ｐａｐｏｖｉｒｕｓ）（例えば、ヒトパピローマウイルス；ＨＰＶ；ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−２、ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８）、パルボウイルス（例えばパルボウイルスＢ１９）、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルス、レスピロウイルス、ルブラウイルス、フェルラウイルス、ニューモウイルス及びメタニューモウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、口蹄疫ウイルス、アクアマウイルスＡ、脳心筋炎ウイルス、タイロウイルス、コサウイルスベクターＡ、カディシウイルス（ｃａｄｉｃｉｖｉｒｕｓ）Ａ、エンテロウイルスＡ、エンテロウイルスＢ、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＥ、エンテロウイルスＦ、エンテロウイルスＧ、エンテロウイルスＨ、エンテロウイルスＪ、ライノウイルスＡ、ライノウイルスＢ、ライノウイルスＣ、アイチウイルスＡ、アイチウイルスＢ、アイチウイルスＣ、メレグリウイルス（ｍｅｌｅｇｒｉｖｉｒｕｓ）Ａ、ヒトパレコウイルス、ユンガンウイルス及びサリウイルスＡ）、トガウイルス（例えば、フラビウイルス、アルファウイルス及びルビウイルス）、牛痘ウイルス、馬痘ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、デングウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトエンテロウイ��ス６８、ヒトエンテロウイルス７０、非ＨＩＶ型レトロウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、ヒトスプーマレトロウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、イスファハンウイルス、日本脳炎ウイルス、ラッサウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、メンゴ脳心筋炎、サル痘ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ノーウォークウイルス、ピチンデウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス（例えば、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ及びロタウイルスＣ）、風疹ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、トスカーナウイルス、ウークニエミウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、西部馬脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス及びエボラ、ならびに当業者に知られているその他任意のウイルスが挙げられる。
【０２２８】
ＡＡＶビリオンを生成する方法
様々な実施形態において、本発明は、本発明のＡＡＶビリオンを生成する方法を提供する。ＡＡＶビリオンを生成する様々な方法は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載のＡＡＶベクターを含むＡＡＶビリオンを生成するために用いることができる。概して、方法は、ＡＡＶベクターをＡＡＶビリオンの中にパッケージングする能力のある宿主細胞の中へ本発明のＡＡＶベクターを挿入または形質導入することを伴った。典型的な方法は以下に記載及び言及しているが、当業者に知られている任意の方法を採用して本発明のＡＡＶビリオンを生成することができる。
【０２２９】
異種核酸を含んでおりかつＡＡＶビリオンを生成するために使用されるＡＡＶベクターは、当該技術分野においてよく知られている方法を用いて構築することができる。例えば、Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１７：２０８８；Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６：１７０３−１７０９；ならびに米国特許第７，４３９，０６５号、第６，９５１，７５８号及び第６，４９１，９０７号を参照されたい。例えば、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）が取り払われたＡＡＶゲノムの中に、異種配列（複数可）を直接挿入することができる。複製機能及びパッケージング機能を可能にするのに十分なＩＴＲの部分が残存する限り、ＡＡＶゲノムの他の部分を欠失させることもできる。そのような構築物は、当該技術分野においてよく知られている技術を用いて設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号及び第５，１３９，９４１号；国際公開第９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日公開）及び第９３／０３７６９号（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照されたい。
【０２３０】
ＡＡＶビリオンを作るためには、既知の技術、例えばトランスフェクションを用いてＡＡＶベクターを適した宿主細胞内へ導入する。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野において一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照されたい。特に適したトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム共沈法（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６−４６７）、培養細胞内への直接的マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８）、電気穿孔法（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１）、リポソーム媒介遺伝子移入（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０）、脂質媒介形質導入（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）、及び高速微粒子を使用する核酸送達（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３）が挙げられる。
【０２３１】
ＡＡＶビリオンを作るのに適した宿主細胞としては、例えば、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用することができるかまたは使用されたことのある、微生物、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞が挙げられる。当該用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書中で使用する「宿主細胞」は総じて、外来ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。安定したヒト細胞株２９３（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから受託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３のもとに容易に入手することができる）からの細胞を使用することができる。例えば、ヒト細胞株２９３は、５型アデノウイルスＤＮＡ断片で形質転換されたヒト胚性腎細胞株であり（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）、アデノウイルスのＥｌａ及びＥｌｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９４：４６０）。２９３細胞株は簡単にトランスフェクトされ、ＡＡＶビリオンを作るための簡便な基盤を提供する。
【０２３２】
昆虫細胞においてＡＡＶビリオンを作る方法は、当該技術分野において既知であり、主題ＡＡＶビリオンを作るために用いることができる。例えば、米国特許公開第２００９／０２０３０７１号、米国特許公開第７，２７１，００２号、及びＣｈｅｎ（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：９２４を参照されたい。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶビリオンまたはＡＡＶベクターは、本明細書において記載されているかまたは当該技術分野において知られているいずれかの方法によって感染性のビリオンまたはウイルス粒子の中にパッケージングされる。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドと比較して同様なパッケージングを可能とする。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドでパッケージングされたＡＡＶベクターは、非変異型親カプシドポリペプチドでパッケージングされたベクターよりも良好に、生体内で細胞内へ形質導入される。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドでパッケージングされたＡＡＶベクターは、非変異型親カプシドポリペプチドでパッケージングされたベクターよりも良好に、試験管内で細胞内へ形質導入される。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、変異型カプシドポリペプチドは、非変異型親カプシドポリペプチドでパッケージングされた核酸よりも高い核酸発現をもたらす。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、上記変異型カプシドポリペプチドでパッケージングされたＡＡＶベクターは、非変異型親カプシドポリペプチドでパッケージングされた導入遺伝子よりも良好な導入遺伝子発現をもたらす。
【０２３９】
医薬組成物及び投薬
本発明は、本明細書に記載の本発明の方法に従って対象を処置するのに有用な医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、記載の医薬組成物を投与するための投薬計画を提供する。本発明は、ａ）本明細書に記載の変異型ポリペプチドを含むカプシドによってパッケージングされた、つまりその中にパッケージングされた、本明細書に記載の主題ＡＡＶベクターまたは主題ＡＡＶビリオン、及び治療分子、ならびにｂ）薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤または緩衝剤を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤または緩衝剤は、ヒトでの使用に適している。
【０２４０】
そのような賦形剤、担体、希釈剤及び緩衝剤には、過度の毒性を伴わずに投与されることができるいかなる医薬品も含まれる。薬学的に許容できる賦形剤としては、限定されないが例えば、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体が挙げられる。その中に、薬学的に許容できる塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などといった無機酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などといった有機酸の塩を含ませることができる。さらに、湿潤剤または乳化剤などの補助物質、ｐＨ緩衝物質などがそのようなビヒクル中に存在していてもよい。薬学的に許容できる多種多様な賦形剤は当該技術分野において既知であり、本明細書中で詳細に述べる必要はない。薬学的に許容できる賦形剤は、様々な刊行物、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ  ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．において十分に記載されている。
【０２４１】
主題組成物は、本発明の主題変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドまたは変異型カプシドポリペプチドを含んでいるＡＡＶビリオンが溶解状態、懸濁状態またはその両方で含まれている液体を含み得る。本明細書中で使用する場合、液体組成物にはゲルを含む。いくつかの実施形態では、液体組成物は水性である。いくつかの実施形態では、組成物は系中でゲル化することができる水性組成物、例えば、系中でゲル化することができる水溶液である。水性組成物は、眼用に適合したｐＨ及びオスモル濃度を有する。
【０２４２】
そのような組成物としては、例えば、薬学的投与または生体内での接触もしくは送達に適合した溶媒（水性または非水性）、液剤（水性または非水性）、エマルジョン（例えば水中油または油中水）、懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤、分散媒及び懸濁媒、コーティング、等張化剤ならびに、吸収促進剤または吸収遅延剤が挙げられる。水性及び非水性の溶媒、溶液及び懸濁液は懸濁化剤及び増粘剤を含み得る。そのような薬学的に許容できる担体としては、例えば、（コーティングされているかまたはされていない）錠剤、（硬質または軟質の）カプセル剤、マイクロビーズ、散剤、顆粒剤及び結晶が挙げられる。補助的な活性化合物（例えば、保存剤、抗菌剤、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）を組成物中に組み込むこともできる。
【０２４３】
医薬組成物は、本明細書において明記されているかまたは当業者に既知である特定の投与経路または送達経路に適合するように製剤化することができる。したがって、医薬組成物には、様々な経路での投与に適した担体、希釈剤または賦形剤が含まれる。
【０２４４】
非経口投与に適した組成物は、活性化合物の水性及び非水性の溶液、懸濁液またはエマルジョンを含む。製剤は典型的には滅菌されており、意図するレシピエントの血液と等張であり得る。非限定的な実例としては、水、生理食塩水、デキストロース、果糖、エタノール、動物油、植物油または合成油が挙げられる。
【０２４５】
経粘膜または経皮投与（例えば局所接触）のためには、医薬組成物に浸透剤が含まれ得る。浸透剤は当該技術分野において既知であり、例えば経粘膜投与の場合には洗浄剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経皮投与のためには、活性成分を当該技術分野において知られているエアゾール剤、スプレー剤、軟膏剤、膏薬、ゲル剤またはクリーム剤として製剤化することができる。皮膚との接触のためには、医薬組成物には典型的に、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ペースト剤、ゲル剤、スプレー剤、エアゾール剤または油剤が含まれる。有用な担体としては、例えば、ワセリン（登録商標）、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮吸収増強剤及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２４６】
共溶媒及び佐薬を製剤に添加してもよい。共溶媒の非限定的な例には、ヒドロキシル基またはその他の極性基、例えば、イソプロピルアルコールなどのアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテルなどのグリコール；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコール及びポリオキシエチレン脂肪酸エステルが含まれる。佐薬としては、例えば、大豆レシチン及びオレイン酸などの界面活性剤；ソルビタントリオレエートなどのソルビタンエステル；ならびにポリビニルピロリドンが挙げられる。
【０２４７】
ＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオンに適した医薬組成物及び送達システムならびにその方法及び使用は当該技術分野において既知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３）２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（１９９３），Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．、Ａｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｌｏｓａ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）１１ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．、及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９８０），Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２５３−３１５を参照されたい。）
【０２４８】
用量は様々であり得、処置が予防的なものであるかそれとも治療的なものであるか、治療が向けられる疾患の種類、徴候、頻度、継続期間または蓋然性、望ましい臨床上の到達目標、以前の処置または同時的処置、対象の全身的健康状態、年齢、性別、人種または免疫能力、及び当業者によって認識されるであろうその他の要因に依存し得る。投薬の量、回数、頻度または継続期間は、処置または療法の何らかの有害副作用、合併症またはその他の危険因子、及び対象の状態によって必要とされるとおりに比例的に増減してもよい。当業者であれば、治療上または予防上の恩恵をもたらすのに十分な量を提供するために要求される用量及びタイミングに影響を与え得る要因を認識するであろう。
【０２４９】
本明細書において開示される本発明の方法及び使用は、対象が処置標的の疾患を有すると同定されたか、疾患の１つ以上の症候を有しているか、または対象が疾患の１つ以上の症候をたとえ有していなくともスクリーニングされて本明細書に明記のとおりに陽性と同定される時から約１時間以内〜約２時間以内、約２時間以内〜約４時間以内、約４時間以内〜約１２時間以内、約１２時間以内〜約２４時間以内、または約２４時間以内〜約７２時間以内に実践することができる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される本発明は、約１時間以内、約２時間以内、約３時間以内、約４時間以内、約５時間以内、約６時間以内、約７時間以内、約８時間以内、約９時間以内、約１０時間以内、約１１時間以内、約１２時間以内、約２４時間以内、約３６時間以内、約４８時間以内または、約７２時間以内もしくはそれ以上において実践することができる。勿論、本発明の方法及び使用は、対象が処置標的の疾患を有すると同定されたか、疾患の１つ以上の症候を有しているか、または対象が疾患の１つ以上の症候をたとえ有していなくともスクリーニングされて本明細書に明記のとおりに陽性であると同定される時から約１日後〜約７日後、約７日後〜約１４日後、約１４日後〜約２１日後、約２１日後〜約４８日後以上、数ヶ月後、または数年後に実践することができる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される本発明は、約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内、約１０日以内、約１１日以内、約１２日以内、約１４日以内、約２１日以内、約３６日以内、または約４８日以内、またはそれ以上において実践することができる。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、本発明は、包装材とその中に入った１つ以上の構成要素とを含んだキットを提供する。キットは、典型的には、構成要素についての記載またはその中に入った構成要素を試験管内、生体内もしくは生体外で使用するための説明書きを含んだラベルまたは添付文書を含む。キットは、そのような構成要素の収集物、例えば、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド、ＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオン、及び任意での第２活性（例えば別の）化合物、薬剤、薬物または組成物を収容し得る。
【０２５１】
キットは、キットの１つ以上の構成要素を収容している物理的構造体を指す。包装材は、構成要素を滅菌状態に維持することができ、そのような目的のために一般的に使用される材料（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、箔、アンプル、バイアル、チューブなど）で作られることができる。
【０２５２】
ラベルまたは添付文書は、中に入った１つ以上の構成要素、投薬量、活性成分（複数可）の臨床薬理学、例えば作用機序、薬物動態及び薬力学についての識別情報を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、製造元、ロット番号、製造元所在地及び日付ならびに消費期限を識別する情報を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、製造元情報を識別する情報、ロット番号、製造元所在地及び日付を含むことができる。ラベルまたは折込みは、キット構成要素が使用され得る疾患についての情報を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、方法、使用もしくは処置プロトコールまたは治療計画においてキット構成要素のうちの１つ以上を使用するための臨床医または対象へ向けた説明を含むことができる。使用説明書は、投薬の量、頻度または継続期間、及び本明細書に記載の方法、使用、処置プロトコールまたは予防計画もしくは治療計画を実践するための説明を含むことができる。
【０２５３】
ラベルまたは添付文書は、構成要素が提供し得る何らかの恩恵、例えば予防的または治療的な恩恵についての情報を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、潜在的な有害副作用、合併症または反応についての情報、例えば特定の組成物を使用することが適切とならない状況に関して、対象または臨床医に対する警告を含むことができる。有害副作用または合併症は、組成物に適合しない可能性がある１つ以上の医薬を対象が服用したかもしくは服用するつもりであるかもしくは現在服用している場合または、適合しない別の処置プロトコールまたは治療計画を対象が受けたかもしくは受けるつもりであるかもしくは現在受けている場合にも起こる可能性があり、このため、使用説明はそのような不適合性に関する情報を含み得る。
【０２５４】
ラベルまたは添付文書は、別個になっているかまたは、構成要素、キットもしくは包装材（例えば箱）に添付されているか、またはキット構成要素を収容しているアンプル、チューブもしくはバイアルに貼付されている、「印刷物」、例えば紙または厚紙を含む。ラベルまたは添付文書はさらに、コンピュータ可読媒体、例えばバーコード印刷ラベル、ディスク、光ディスク、例えばＣＤ−もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、または電子記憶媒体、例えばＲＡＭ及びＲＯＭもしくはこれらのハイブリッド、例えば磁気／光記憶媒体、フラッシュメディアもしくはメモリ型カードを含むことができる。
【０２５５】
疾患を処置する方法
本発明はさらに、本発明のＡＡＶベクター及び／または核酸を投与することによって対象の疾患を処置する方法を提供し、ここで、本明細書に記載のＡＡＶベクター及び／または核酸は機能的ＡＡＶカプシド内にパッケージングされており、機能的ＡＡＶカプシドは本発明の１つ以上の変異型カプシドポリペプチドを含む。典型的な実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与して対象の疾患を処置する方法を提供する。様々な実施形態において、対象は他の形で本発明の組成物の投与を必要としない。いくつかの実施形態では、本発明は、ワクチン投与方法を提供する。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、例えば治療タンパク質または治療ワクチンなどの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含んでいる異種核酸を含む治療用発現カセットをパッケージングする。いくつかの実施形態では、ＡＡＶビリオンまたはＡＡＶベクターは、例えば治療タンパク質または治療ワクチンなどの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含んでいる異種核酸を含む治療用発現カセットを含む。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型カプシドポリペプチドはワクチン送達の一環として採用される。ワクチン送達は、本明細書に記載のいずれかの治療タンパク質及び核酸の送達を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の変異型カプシドポリペプチドは、ワクチン投薬計画の一環として採用され、本明細書に記載の方法に従って投薬される。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド、ＡＡＶビリオンまたはＡＡＶベクターを治療処置計画において使用する。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド、ＡＡＶビリオンまたはＡＡＶベクターを治療ポリペプチド産生に使用する。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、主題変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドまたはＡＡＶベクターは、対象の細胞内に導入された場合に、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドによってパッケージングされるかまたはＡＡＶによってコードされる異種遺伝子産物の高レベルでの産生をもたらす。例えば、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドによってパッケージングされるかまたはＡＡＶによってコードされる異種ポリペプチドは約１μｇ〜約５０μｇ以上のレベルで産生され得る。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、主題変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド、ＡＡＶビリオンまたはＡＡＶベクターは、対象の中に導入された場合に標的細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％超において、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドによってパッケージングされるかまたはＡＡＶによってコードされる異種遺伝子産物の産生をもたらす。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、本発明は、疾患を処置する方法であって、それを必要とする個体に、上記の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドまたは主題ＡＡＶビリオンによってパッケージングされた治療分子を有効量投与することを含む、方法を提供する。
【０２６３】
変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドまたは主題ＡＡＶビリオンは、全身的、局部的もしくは局所的に、または任意の経路、例えば、注射、点滴、経口（例えば摂取または吸入）または局所適用（例えば経皮）によって、投与することができる。そのような送達及び投与としては、例えば、静脈内、粘膜内、腹腔内、皮内、皮下、腔内、頭蓋内、経皮（局所適用）、非経口、例えば経粘膜、または直腸内が挙げられる。典型的な投与及び送達の経路としては、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、筋肉内、非経口、皮下、胸腔内、局所適用、皮膚、皮内、経皮、非経口、例えば経粘膜、頭蓋内、髄腔内、経口（消化器によるもの）、経粘膜、吸入、鼻腔内、挿管、肺内、肺内点滴注入、頬側、舌下、血管内、クモ膜下腔内、腔内、イオン導入、眼内、経眼、腺内、臓器内、及びリンパ管内が挙げられる。
【０２６４】
ある場合には、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドまたは主題ＡＡＶビリオンによってパッケージングされた治療分子の治療上有効な量は、個体に単回以上投与したときに個体における疾患または障害の進行を遅らせるのに有効であるかまたは症候を改善するのに有効である量である。例えば、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドまたは主題ＡＡＶビリオンによってパッケージングされた治療分子の治療上有効な量は、個体に単回以上投与したときに疾患の進行を、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドまたはＡＡＶビリオンによってパッケージングされた治療分子による処置の不在下での疾患の進行に比べて少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％よりも大きく遅らせるのに有効な量とすることができる。
【０２６５】
したがって、処置の治療的または恩恵的効果は、特定の対象に対してもたらされる客観的または主観的に測定可能または検出可能な任意の改善または恩恵である。治療的または恩恵的効果は、必ずというわけではないが、全てまたは何らかの特定の有害な症候、障害、病気、または疾患の合併症の完全な除去であり得る。したがって、臨床上の満足な到達目標は、有害な症候、障害、病気もしくは、疾患によって引き起こされるかもしくは疾患に関連のある合併症の、漸増的改善もしくは部分的軽減または、１つ以上の有害な症候、障害、病気もしくは、疾患によって引き起こされるかもしくは疾患に関連する合併症の、悪化もしくは進行の抑制、減少、軽減、抑止、防止、制限もしくは制御が、短持続期間または長持続期間（数時間、数日、数週間、数ヶ月間など）にわたって存在する場合に達成される。
【０２６６】
臨床症候の改善は、当該技術分野において知られている１つ以上の方法によって追跡評価することもでき、治療の有効性の指標として用いることができる。臨床症候はまた、当業者に知られている任意の手段、例えば肝臓有効性基準、限定されないが例えば、肝臓酵素試験、ＭＲＩ、胆汁酸プロファイリングまたは、肝機能及び／または肝機能の不良を検査及び／または判定するのに有用であることが知られているその他の任意の試験によって追跡評価してもよい。肝臓酵素試験（肝機能試験またはＬＦＴと呼ばれることがある）としては、限定されないが例えば、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴまたはＳＧＯＴ）、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴまたはＳＧＰＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、５’ヌクレオチダーゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、ビリルビン、アルブミン及びα１アンチトリプシン（Ａ１Ａ）のレベルについての血液試験が挙げられる。凝固因子産生に肝臓が関与していることから、プロトロンビン時間（ＰＴ；凝固時間；国際標準比（ＩＮＲ）として表されることが多い）を測定することもできる。ビリルビンレベルを尿において肝機能の試験として測定することもできる。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド、主題ＡＡＶビリオンまたはＡＡＶウイルスによってパッケージングされた治療分子（例えばワクチンを含む）は、対象の中に導入された場合に約２日〜約６ヶ月、例えば、約２日〜約７日、約１週間〜約４週間、約１ヶ月〜約２ヶ月、または約２ヶ月〜約６ヶ月の期間にわたって異種遺伝子産物の産生をもたらす。いくつかの実施形態では、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド、主題ＡＡＶビリオンまたはウイルスによってパッケージングされた治療分子（例えばワクチンを含む）は、対象の中に導入された場合に６ヶ月超、例えば約６ヶ月〜２０年以上、または１年超、例えば、約６ヶ月〜約１年、約１年〜約２年、約２年〜約５年間、約５年〜約１０年、約１０年〜約１５年、約１５年〜約２０年、または２０年超の期間にわたって、コードされた異種遺伝子産物の産生をもたらす。いくつかの実施形態では、投与計画はワクチン投薬計画の一部である。
【０２６８】
主題ＡＡＶビリオンの多回投薬を、それを必要とする個体に施すことができる。多回投薬を一定期間にわたって施す場合、活性剤は一定期間にわたって月１回〜およそ年１回、およそ年１回〜年２回、およそ２年に１回〜５年に１回、またはおよそ５年に１回〜およそ１０年に１回投与する。例えば、主題ＡＡＶビリオンを約３ヶ月〜約２年、約２年〜約５年、約５年〜約１０年、約１０年〜約２０年、または２０年超の期間にわたって投与する。投与の実際の頻度及び処置の実際の継続期間は様々な要因に依存する。いくつかの実施形態では、投与計画はワクチン投薬計画の一部である。
【０２６９】
治療効果を獲得するための用量、例えば、ベクターゲノム／キログラム体重（ｖｇ／ｋｇ）は、様々な要因、限定されないが例えば、投与経路、治療効果を獲得するために要求される異種ポリヌクレオチド発現レベル、処置される特定の疾患、ウイルスベクターに対する何らかの宿主免疫応答、異種ポリヌクレオチドまたは発現産物（タンパク質）に対する宿主免疫応答、及び発現したタンパク質の安定性に基づいて変化するであろう。当業者であれば、上記要因及びその他の要因に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を処置するためのビリオン用量範囲を容易に決定することができる。大抵の場合、治療効果を獲得するための用量は、対象の体重１キログラム当たりのベクターゲノム数（ｖｇ／ｋｇ）表示で例えば少なくとも約１×１０９、少なくとも約１×１０１０、少なくとも約１×１０１１、少なくとも約１×１０１２、少なくとも約１×１０１３、または少なくとも約１×１０１４、またはそれ以上に及ぶであろう。いくつかの実施形態では、処置を５×１０１０ｖｇ／ｋｇの用量で施す。いくつかの実施形態では、本発明の変異型ＡＡＶポリペプチドは、対象に投与されるＡＡＶベクターまたはその他の治療分子の総量を減らすために採用することができ、この場合、変異型カプシドポリペプチドを使用して上記ＡＡＶベクターまたはその他の治療分子を形質導入するときに、同程度の治療効果を得る（つまり、どちらの用量も同様の治療効果または区別できない治療効果をもたらす）ように非変異型親カプシドポリペプチドを使用してＡＡＶベクターまたはその他の治療分子を形質導入する場合に対象に投与されるＡＡＶベクターまたはその他の治療分子の量に比べてより少ない総量のＡＡＶベクターまたはその他の治療分子を対象に投与する。いくつかの実施形態では、対象に投与されるベクターまたはその他の治療分子の総量は、変異型カプシドポリペプチドを使用してＡＡＶベクターまたはその他の治療分子を形質導入するときに、同程度の治療効果を得る（つまり、どちらの用量も同様の治療効果または区別できない治療効果をもたらす）ように非変異型親カプシドポリペプチドを使用してＡＡＶベクターまたはその他の治療分子を形質導入する場合に比べて約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％またはそれ以上少ない。いくつかの実施形態では、対象に投与するＡＡＶベクターまたはその他の治療分子の総量は、変異型カプシドポリペプチドを使用してＡＡＶベクターまたはその他の治療分子を形質導入するときに、同程度の治療効果を得る（つまり、どちらの用量も同様の治療効果または区別できない治療効果をもたらす）ように非変異型親カプシドポリペプチドを使用してＡＡＶベクターまたはその他の治療分子を形質導入する場合に比べて約５％〜約８０％、約１０％〜約７５％、約１５％〜約６５％、約２０％〜約６０％、または約１０％〜約５０％少ない。
【０２７０】
有効量または十分量は、必ずというわけではないが単回投与で提供することができ、多回投与を必要とすることもあり、必ずというわけではないが単独で、または別の組成物（例えば薬剤）、処置、プロトコールもしくは治療計画と組み合わせて投与することができる。例えば、当該量は、対象の要求、処置される疾患の種類、状況及び重症度または処置の副作用（あれば）によって必要とされるとおりに比例的に増量してもよい。さらに、有効量または十分量は、第２の組成物（例えば別の薬物または薬剤）、処置、プロトコールまたは治療計画を伴わずに単回用量または多回用量で与えられる場合に有効または十分である必要はない、というのも、所与の対象において有効または十分とみなされるためにはそのような用量を上回るかもしくは超える追加の用量、量もしくは継続期間、または追加の組成物（例えば薬物または薬剤）、処置、プロトコールもしくは治療計画が含められることがあるからである。有効とみなされる量はまた、別の処置、治療計画またはプロトコールの利用、例えば凝固障害（例えば血友病ＡまたはＢ）の処置のための組換え凝固因子タンパク質の投与の軽減をもたらす量も含む。
【０２７１】
有効量または十分量は、所与の群内または集団内のあらゆる処置対象または大半の処置対象において有効である必要はない。有効量または十分量は、群または全体的集団ではなく特定の対象における有効性または十分性を意味する。そのような方法においては典型的であるように、ある対象は、所与の処置方法または用途に対してより大きい応答またはより小さい応答を呈するかまたは全く応答を呈しないであろう。このように、適する量は、処置される症状、望ましい治療効果及び個々の対象（例えば、対象における生物学的利用能、性別、年齢など）に依存するであろう。
【０２７２】
疾患もしくはその症候、または根底にある細胞応答に関して、検出可能または測定可能な改善としては、例えば、主観的または客観的な、疾患もしくは疾患によって引き起こされるかもしくは疾患に関連する合併症の発生、頻度、重症度、進行もしくは持続期間の減少、低減、抑制、抑止、制限もしくは制御、または疾患の症候もしくは根底にある原因もしくは成り行きの改善、または疾患の逆転が挙げられる。
【０２７３】
したがって、好結果な処置転帰は、対象における疾患または疾患の１つ以上の有害症候もしくは根底にある原因もしくは成り行きの発生、頻度、重症度、進行または持続期間の減少、軽減、抑制、抑止、制限、制御または防止という「治療効果」または「恩恵」につながり得る。したがって、疾患または有害症候の根底にある１つ以上の原因に影響を与える処置方法及び用途は有益であるとみなされる。悪化の減少または軽減、例えば、疾患またはその有害症候が安定することも、好結果な処置転帰である。
【０２７４】
したがって、治療上の恩恵または改善は、疾患または、疾患に関連するいずれか１つもしくは大半もしくは全ての有害症候、合併症、成り行きもしくは根底にある原因の完全な除去である必要はない。それゆえ、満足な到達目標は、対象の疾患の漸増的改善または、疾患の発生、頻度、重症度、進行もしくは持続期間の部分的な減少、低減、抑制、抑止、制限、制御もしくは防止、もしくは疾患の抑制もしくは逆転（例えば、１つ以上の症候または合併症が安定すること）が、短持続期間または長持続期間（数時間、数日、数週間、数ヶ月など）にわたって存在する場合に達成される。方法または用途、例えば、疾患の潜在的な治療上の恩恵または改善をもたらす処置の有効性は、様々な方法によって確認することができる。
【０２７５】
開示されている方法及び用途は、所望の治療的、恩恵的、追加的、相乗的または相補的な活性または作用を有するいかなる化合物、薬剤、薬物、処置またはその他の治療計画もしくはプロトコールと組み合わせることもできる。典型的な併用組成物及び併用処置としては、例えば、第２の活性物質、例えば、生物製剤（タンパク質）、薬剤及び薬物が挙げられる。そのような生物製剤（タンパク質）、薬剤、薬物、処置及び療法は、他の任意の本発明の方法または用途、例えば対象の肝疾患を処置する治療方法の前に、または実質的にそれと並行して、またはその後に、施すかまたは行うことができる。
【０２７６】
当該化合物、薬剤、薬物、処置またはその他の治療計画またはプロトコールは、併用組成物として、または別々に、例えば、本明細書に記載のＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオンの送達または投与と並行して、または連続的もしくは逐次的に（その前または後に）施すことができる。したがって、本発明は、本発明の方法または用途と、本明細書において明示されているかまたは当業者に知られている任意の化合物、薬剤、薬物、治療計画、処置プロトコール、プロセス、治療または組成物とを併用する組み合わせを提供する。化合物、薬剤、薬物、治療計画、処置プロトコール、プロセス、治療または組成物は、本明細書に記載のＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオンの投与の前に、またはそれと実質的に並行して、またはその後に対象に施すかまたは行うことができる。したがって、併用実施形態の具体的かつ非限定的な例には、上記またはその他の化合物、薬剤、薬物、治療計画、処置プロトコール、プロセス、治療または組成物を含む。
【０２７７】
本発明の方法及び用途はさらに、数ある中でも、別の化合物、薬剤、薬物、治療計画、処置プロトコール、プロセスまたは治療の必要性または利用の低減をもたらす方法及び用途を含む。例えば、患者が肝臓からの血液凝固性分泌の不良を有する血液凝固疾患に関して、対象の肝臓からの内因性凝固因子の不十分または不完全な（異常な、または突然変異による）分泌を補うための組換え凝固因子タンパク質の投与が所与の対象においてより少ない頻度またはより少ない用量となるかまたは排除される場合、本発明の方法または用途は治療上の恩恵を有する。したがって、本発明によれば、別の処置または療法の必要性または利用を低減する方法及び用途が提供される。
【０２７８】
本発明は、獣医学的医療用途を含めて動物に有用である。したがって、好適な対象としては、例えば、ヒトなどの哺乳動物、及び非ヒト動物が挙げられる。いくつかの実施形態では、ヒトは男性である。いくつかの実施形態では、ヒトは女性である。「対象」という用語は、動物、典型的には哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（類人猿、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、飼育動物（イヌ及びネコ）、家畜動物（家禽、例えば、ニワトリ及びアヒル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、及びその他の鳥類（トリとしては、限定されないが例えば、オウム、（小型及び大型の）パラキート、ペンギン、オカメインコ、パロットレット、ローリー、ロリキート、ピオヌスインコ、Ｐｏｉｃｅｐｈａｌｕｓ、カナリア、フィンチ、コカトゥー、コンゴウインコ、カラス、ｄｏｖｅｓ（ハト）、ｐｉｇｅｏｎｓ（ハト）、マイナ及びオオハシが挙げられる）を指す。ヒト対象としては、例えば、胎児、新生児、幼児、年少者及び成人の対象が挙げられる。対象には、動物疾患モデル、例えば、血液凝固疾患のマウスモデル及びその他の動物モデル、ならびに当業者に知られているその他のモデルが含まれる。
【０２７９】
肝臓の疾患及び障害の非限定的な特定例としては、限定されないが、肝臓が適切に機能することを阻むかまたはそれが十分に機能すること（正常レベルで機能すること）を妨害する任意の症状が挙げられる。肝臓の疾患及び障害の症候としては、例えば、腹痛、皮膚または眼の黄染（黄疸）、肝機能試験の異常な結果、肝臓の肥大（例えば不均衡な肥大を含む）、及び肝硬変が挙げられる。肝臓の疾患及び障害としてはさらに、限定されないが例えば、アメーバ性肝膿瘍、自己免疫性の肝疾患及び肝障害（例えば、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性硬変症（ＰＢＣ）及び原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）を含む）、胆道閉鎖症、硬変症、コクシジオイデス症、デルタ因子（Ｄ型肝炎）、薬物性胆汁鬱滞、ヘモクロマトーシス、ウイルス性肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎を含む）、新生児肝炎、肝細胞癌（ＨＣＣ及びその他の肝臓癌）、線維層状型肝細胞癌、アルコールに起因する肝疾患、化膿性肝膿瘍、ライ症候群、硬化性胆管炎、ウィルソン病、急性肝不全（例えば薬物、毒素及びその他の様々な疾患によって引き起こされるもの）、アルコール性肝疾患、自己免疫関連疾患、バッド・キアリ症候群、凝固亢進疾患、寄生虫感染症、慢性胆管閉塞症（例えば、腫瘍、胆石、炎症及び外傷によるものを含む）、ヘモクロマトーシス、α１アンチトリプシン（Ａ１Ａ）欠乏症、ウィルソン病、アラジール症候群、嚢胞性肝疾患、ガラクトース血症、ジルベール症候群、ヘモクロマトーシス、妊娠時の肝疾患、リソソーム酸性リパーゼ欠損症（ＬＡＬＤ）、ポルフィリン症、サルコイドーシス、１型グリコーゲン蓄積病、チロシン血症、多包虫症、細菌性肝紫斑病、先天性肝線維症、鬱血性肝障害、胃前庭部毛細血管拡張症、肝性脳症、肝内結石症、肝肺症候群、肝腎症候群、肝脾腫、肝毒性、肝紫斑病、インド小児肝硬変、ラエンネック型肝硬変、リングスタダス症候群、進行性家族性肝内胆汁鬱滞症、ツァーン梗塞、ジーヴ症候群、ならびに非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が挙げられる。
【０２８０】
本発明に従って処置することができる疾患の非限定的な特定例としては、例えば、本明細書において明記したもの及び、肺疾患（例えば嚢胞性線維症）、凝固障害または出血性障害（例えば阻害剤を伴うかまたは伴わない血友病Ａまたは血友病Ｂ）、サラセミア、血液障害（例えば貧血）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、リソソーム蓄積症、銅または鉄の蓄積症（例えば、ウィルソン病またはメンケス病）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、神経障害または神経変性疾患、がん、１型または２型糖尿病、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝不全（例えばグリコーゲン蓄積病）、網膜変性疾患（例えば、ＲＰＥ６５の欠損症または不全、コロイデレミア、及びその他の眼疾患）、及び固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患、ならびに筋疾患、限定されないが例えば、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アンダーセン・タウィル症候群、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ベッカー型先天性ミオトニー、ベスレムミオパチー、延髄脊髄性筋萎縮症（球脊髄性筋萎縮症）、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症（ＣＰＴ欠損症）、セントラルコア病（ＣＣＤ）、中心核ミオパチー、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、先天性筋無力症（ＣＭＳ）、先天性筋硬直性ジストロフィー、コーリ病（脱分枝酵素欠損症）、脱分枝酵素欠損症、デジェリン・ソッタス病（ＤＳＤ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（筋強直性ジストロフィー）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、内分泌性ミオパチー、オイレンブルグ病（先天性パラミオトニア）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）、フィンランド人（頸骨筋）遠位ミオパチー、フォーブス病（脱分枝酵素欠損症）、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、福山型先天性筋ジストロフィー、１０型糖原病、１１型糖原病、２型糖原病、３型糖原病、５型糖原病、７型糖原病、９型糖原病、Ｇｏｗｅｒｓ−Ｌａｉｎｇ遠位型ミオパチー、Ｈａｕｐｔｍａｎｎ−Ｔｈａｎｈｅｕｓｅｒ  ＭＤ（エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー）、遺伝性封入体筋炎、遺伝性運動感覚ニューロパチー（シャルコー・マリー・トゥース病）、甲状腺機能亢進性ミオパチー、甲状腺機能低下性ミオパチー、封入体筋炎（ＩＢＭ）、遺伝性ミオパチー、インテグリン欠損型先天性筋ジストロフィー、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症）、クーゲルベルグ・ウェランダー病（脊髄性筋萎縮症）、乳酸脱水素酵素欠損症、ランバート・イートン筋無力症候群（ＬＥＭＳ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、ルー・ゲーリック病（筋萎縮性側索硬化症）、マッカードル病（ホスホリラーゼ欠損症）、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、筋肉の代謝性疾患、ミトコンドリアミオパチー、三好型遠位型ミオパチー、運動ニューロン疾患、筋・眼・脳病、重症筋無力症（ＭＧ）、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、筋原線維性ミオパチー、筋型ホスホ���ラーゼ欠損症、先天性ミオトニー（ＭＣ）、筋強直性ジストロフィー（ＭＭＤ）、筋細管ミオパチー（ＭＴＭまたはＭＭ）、ネマリンミオパチー、埜中型遠位型ミオパチー、眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、先天性パラミオトニア、ピアソン症候群、周期性麻痺、腓骨筋萎縮症（シャルコー・マリー・トゥース病）、ホスホフルクトキナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症、ホスホリラーゼ欠損症、ホスホリラーゼ欠損症、多発性筋炎（ＰＭ）、ポンペ病（酸性マルターゼ欠損症）、進行性外眼筋麻痺（ＰＥＯ）、桿体病（ネマリンミオパチー）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、スタイナート病（筋強直性ジストロフィー）、垂井病（ホスホフルクトキナーゼ欠損症）、トムセン病（先天性ミオトニー）、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー、ウォーカー・ワールブルグ症候群（先天性筋ジストロフィー）、ウェランダー型遠位型ミオパチー、ウェルドニッヒ・ホフマン病（脊髄性筋萎縮症）、及びＺＡＳＰ関連ミオパチーが挙げられる。
【０２８１】
主題方法を用いて処置または防止することができる眼疾患としては、限定されないが例えば、急性黄斑神経網膜症；黄斑部毛細血管拡張症；ベーチェット病；脈絡膜血管新生；糖尿病ぶどう膜炎；ヒストプラズマ症；黄斑変性症、例えば、急性黄斑変性症、Ｓｃｏｒｓｂｙ’ｓ黄斑ジストロフィー、初期もしくは中悪性度の（乾燥型）黄斑変性症、または進行黄斑変性症の一形態、例えば滲出型黄斑変性症もしくは地図状萎縮；浮腫、例えば、黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫及び糖尿病黄斑浮腫；多病巣性脈絡膜炎；後眼部または後眼部位を冒す眼球外傷；眼腫瘍；網膜障害、例えば、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病網膜症（増殖性及び非増殖性糖尿病網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜炎性網膜疾患；交換性眼炎；フォークト小柳・原田（ＶＫＨ）症候群；ぶどう膜滲出（ｕｖｅａｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）；眼球レーザー処置によって引き起こされるかまたは影響を受ける後眼部症状；光線力学療法、光凝固術、放射線網膜症によって引き起こされるかまたは影響を受ける後眼部症状；網膜上膜障害；網膜中心静脈閉塞症または網膜静脈分岐閉塞症；前部虚血性視神経症、非網膜症型糖尿病性網膜機能障害；色素性網膜炎；網膜分離症；ならびに緑内障から選択される。
【０２８２】
一実施形態において、本発明の方法または用途は、（ａ）本明細書に記載のとおりに調製された変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドがカプシドによって含まれているＡＡＶビリオンを提供することを含み、ＡＡＶビリオンが異種核酸配列を含むものであり、異種核酸配列が、上記核酸配列の転写をもたらす発現制御エレメントに機能可能に繋げられており；さらに、（ｂ）上記異種核酸が対象において発現するようにＡＡＶビリオンを対象に一定量投与することを含む。
【０２８３】
一実施形態において、本発明の方法または用途は、（ａ）本明細書に記載のとおりに調製された変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドによってパッケージングされた治療分子（例えばワクチンを含む）を提供することを含み、治療分子が異種核酸配列を含むものであり、異種核酸配列が、上記核酸配列の転写をもたらす発現制御エレメントに機能可能に繋げられており；さらに、（ｂ）上記異種核酸が哺乳動物において発現するように、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドによってパッケージングされた治療分子（例えばワクチンを含む）を哺乳動物に一定量投与することを含む。
【０２８４】
別の実施形態において、本発明の方法または用途は、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドによってパッケージングされた異種ポリヌクレオチド、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドによってパッケージングされた複数の異種ポリヌクレオチド、本明細書に記載のとおりに調製されたＡＡＶビリオン、または異種核酸配列を含んでいる複数のＡＡＶビリオンを哺乳動物または哺乳動物の細胞に投与し、それによって哺乳動物または哺乳動物の細胞の中に異種ポリヌクレオチド配列を送達するかまたは移入させることによって、哺乳動物または哺乳動物の細胞の中に異種ポリヌクレオチド配列を送達するかまたは移入させることを含む。いくつかの実施形態では、異種核酸配列が、哺乳動物において発現するタンパク質をコードするか、または異種核酸配列が、哺乳動物における内因性タンパク質の発現を低減する抑制性の配列もしくはタンパク質をコードする。
【０２８５】
例として、血友病に関して治療効果を得るためには、肝臓は、重度の疾患表現型を中等度のものへと変化させるべく、循環血液凝固因子のレベルを正常な個体において認められる因子濃度の１％よりも高い濃度まで分泌せねばならないと考えられている。重度の表現型は、関節損傷、及び生命を脅かす出血によって特徴付けられる。中等度の疾患表現型を軽度なものへと変えるには、循環血液凝固因子濃度が正常濃度の約５％よりも高いことが必要であると考えられている。そのような血友病対象を処置することに関して、所望の治療効果を得るためには、典型的な用量は、少なくとも１×１０１０ＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）／キログラム（ｖｇ／ｋｇ）対象体重、または約１×１０１０〜約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ対象体重、または約１×１０１１〜約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ対象体重、または約１×１０１２〜約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ対象体重である。いくつかの実施形態では、５×１０１０ｖｇ／ｋｇの用量で処置を施す。
【実施例】
【０２８６】
実施例１：既存のヒト中和抗体に対して耐性である新規組換えアデノ随伴ウイルスカプシド
目的：
ヒト細胞に形質導入する能力と、患者の既存の抗カプシド抗体による中和を回避する能力とを併せ持つ新規組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）カプシドを進化させる。既存の抗体の力価による中和からの回復力のあるｒＡＡＶベクターの作出及び同定は、これらのベクターが核酸送達のための臨床試験において使用されるので、ヒト遺伝子治療において大いに役立つであろう。意図した疾患を処置するための遺伝子移入の成功を妨げるであろう既存抗ＡＡＶ抗体を有する人口の割合は高い（２５〜７５％の間で変動）。そういったことから、予めスクリーニングされた患者を治験から排除せざるを得ないかまたは治療処置に供するわけにいかないことがよくある。
【０２８７】
技術的説明（概要）：
１０個の異なる親ＡＡＶカプシド（ＡＡＶ１、２、３ｂ、４、５、６、８、９＿ｈｕ１４、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ）のＤＮＡシャッフリングによる１０ｅ５（すなわち１０５）個の変異型の野生型複製性ＡＡＶライブラリーを利用した。ＡＡＶカプシドライブラリーは、野生型アデノウイルス５型と同時投与された場合にヒト細胞において選択的に複製し、キメラヒト化肝臓マウスを、ヒト肝臓への向性を有するカプシドの選抜を可能にするための優れたツールにする。スクリーニングは、異種移植を施されたヒト化肝臓マウスにおいて５回の選抜にわたって行い、そして、スクリーニングが完了するのを待たずに、中和抗体回避に関する後のスクリーニングで使用するためにライブラリー多様性を多少残したままでスクリーニングを終了した。５回のヒト肝臓スクリーニングからの全ての変異型を先に進め、ＩｇＧ免疫捕捉アッセイにおいて、プールされたヒト免疫グロブリンとの結合に耐えるそれらの能力に関してさらに２回スクリーニングした。好成績に選抜された上位１００位までの変異型を配列決定し、アミノ酸レベルでのカプシド関連性に基づいて７つのプールのＣＡＧプロモーター駆動型ＧＦＰ製剤としてベクター化した。次に各プールを、追加で、プールされたヒト免疫グロブリンによるスクリーニングに再び供し、最良のプールを選出した。このプールからの上位７位までの候補を対照血清型と共に試験した結果、体液性中和に関して極度：最も強い中和（ＡＡＶ−２）、最も弱い中和（ＡＡＶ−ＤＪ）を表し、ＬＫ０３はそれらの中間であった。これらのプールからの、臨床用途に最も妥当な変異型は、ＡＡＶ−ＮＰ８４、ＡＡＶ−ＮＰ４０及びＡＡＶ−ＮＰ５９であることが同定された。ＡＡＶ−ＮＰ８４は、ＡＡＶ−ＤＪに比肩する中和特性を有し、後に続くヒト化肝臓マウスにおける生体内での形質導入試験では、ヒト肝細胞に対する高い向性及び特異性がＡＡＶ−ＮＰ８４によって実証された。それに比べ、ＡＡＶ−ＮＰ４０は若干の中和特性を有するが、生体内でヒト肝細胞への高い向性及び特異性も示す。最後に、ＡＡＶ−ＮＰ５９も若干の中和特性を呈するが、ヒト肝細胞とマウス肝細胞との両方に形質導入することができる。これは、ＡＡＶ−ＮＰ５９がマウスでの前臨床研究のモデル構築に使用され得るだけでなく臨床的にヒトにおいても使用され得ることから、非常に有用となる可能性がある。
【０２８８】
そのような変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドには、ヒト遺伝子治療での用途がある。
【０２８９】
ＡＡＶベクター：
今日において肝細胞に対する優れた向性を有するＡＡＶカプシドとしては、例えば、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−ＤＪ、及びＡＡＶ−ＬＫ０３が挙げられる。しかしながら、ＡＡＶ−８もＡＡＶ−ＤＪも概してマウス肝細胞にのみ形質導入し、ヒト肝細胞には形質導入しない。ＡＡＶ−ＬＫ０３は、ヒト化マウスにおいて生体内でヒト肝細胞に良好に形質導入するが、潜在的患者の約１／３はそれに対する既存の抗体を有し、これらの患者において有用となるその能力には限界がある。新規ＡＡＶカプシドＡＡＶ−ＮＰ８４、ＡＡＶ−ＮＰ４０及びＡＡＶ−ＮＰ５９は、ヒト化マウスにおいて生体内での堅牢なヒト肝細胞形質導入を示す。ＡＡＶ−ＮＰ８４も、好ましいと見受けられる抗体中和特性を示す。
【０２９０】
カプシド配列の変化は、中和特性をさらにいっそう強化する可能性があり、ヒト組織の形質導入を強化する可能性があり、かつ／または治療介入にとっての良好な標的である様々なヒト細胞種の形質転換を拡充する可能性がある。
【０２９１】
カプシド配列ＡＡＶ−ＮＰ８４、ＡＡＶ−ＮＰ４０及びＡＡＶ−ＮＰ５９の他にもＡＡＶ−ＮＰ３０が本発明において同定された。
【０２９２】
ヒト肝細胞向性とヒト免疫回避との両方の能力を呈する新規変異型ＡＡＶカプシドが本発明において提供される。
【０２９３】
実施例２：生物工学によって作られた、生体内での高いヒト肝臓形質導入と固有の体液性血清反応性とを併せ持つＡＡＶカプシド
概要：
ヒト肝疾患の生体内での遺伝子治療処置剤を送達するための既存の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）血清型は、高レベルのヒト肝細胞形質導入と好ましい体液性中和属性との両立をもたらさなかった。しかし、これらの特性の両立は治療有効性にとって重要である。固有の血清反応性特性を呈すると同時に治療上妥当なレベルでヒト肝細胞に機能的に形質導入するカプシドを生物工学によって作るために、多様なカプシドライブラリーを、初代ヒト肝細胞において生体内で使用するのみならず、数千人の患者に由来するプールされたヒト血清と共に使用して、多重逐次指向的進化スクリーニングを行った。ヒト化肝臓を有するマウスにおいてＡＡＶライブラリーを５回の生体内選抜に供して充実ヒト肝指向性ライブラリーを単離し、次いでそれを、プールされたヒト免疫グロブリンに対するビーズ上での逐次スクリーニングへの投入材料として使用した。進化させた変異型をベクター化し、既存の肝指向性血清型に対して検証した。進化ＡＡＶ血清型のうちの２つ―ＮＰ４０及びＮＰ５９―は、キメラヒト化肝臓マウスにおける生体内での向上した機能的ヒト肝細胞形質導入と、好ましいヒト血清反応性特性とを両方とも呈した。これらの新規カプシドは、将来のヒト肝臓遺伝子治療用途のための強化されたベクター送達システムに相当する。
【０２９４】
序論：
数十年間の肝臓遺伝子治療研究にもかかわらず、ｒＡＡＶ遺伝子移入によって処置された肝障害でこれまでに治療レベルでなく治癒レベルに到達したものはない。血友病Ｂにおいてヒト第ＩＸ因子を発現するｒＡＡＶベクターで患者を処置することにはかなりの進歩があったが１、２、形質導入は少なく、形質導入された少数の肝細胞からの超生理学的な発現レベルによって補われるにすぎなかった３、４。分泌因子の恩恵がある血友病Ｂのような非細胞自立性疾患では、これらの低い形質導入レベルは、高発現のために最適化された移入ベクターと組み合わせられるのであれば十分であり得る。しかしながら、より要求の大きい細胞自立性表現型を有する肝疾患では、そのような形質導入レベルは最適未満であろう。長期機能的ヒト肝臓形質導入を改良するには、機能的肝細胞形質導入の総レベルの向上、ｒＡＡＶカプシドに対する既存の中和抗体（ｎＡｂ）、及び形質導入肝細胞上に提示されるカプシドペプチドに対する細胞性免疫応答を含めた数多くのハードルが残っている。これまでの最適未満の形質導入はおそらく、ヒトにおける肝細胞向性も発現の到達可能な動態及び強度も再現しない動物モデルにおいて前臨床ｒＡＡＶ選抜及び検証が歴史的に行われてきたという事実に端を発している１、５。血流中でのｒＡＡＶの体液性中和は、患者を自然界で親血清型に曝露することによって起こる６−１１。免疫によって媒介される形質導入肝細胞の破壊は、ｒＡＡＶカプシド成分に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答によるものであるが１２、これは大抵、コルチコステロイド投与１及び用量低減によって管理されることができる。したがって、高レベルで機能的なヒト肝細胞形質導入及び、体液性中和の回避は、今日において真に有効な臨床肝臓遺伝子治療にとって主要な障壁であり続けている。
【０２９５】
重要なことに、多様なカプシドライブラリーの指向的進化を通じて親血清型では不可能な形質導入及び中和潜在性を達成すべく生物工学によってｒＡＡＶベクターを作ることができる１３−１５。この技術は、選抜及び進化のプロセス全体を通じてＡＡＶを複製させることを利用する。受容体結合性及び取込みに関してのみ選抜する非複製型スクリーニング１６、１７とは対照的に、複製性ＡＡＶを使用する手法は、侵入後の機能的形質導入効率に対してどれも大きな影響を与え得るものである肝細胞内での輸送及び発現のカスケードの全ステップにおいて選抜を行う５、１８−２０。カプシドの単一のアミノ酸の突然変異でさえ、侵入後及び脱殻後の機能的形質転換に影響を与えることが示されている２１。総合すれば、これらのデータは、可能な限り複製型ＡＡＶスクリーニングを用いることを支持している。
【０２９６】
本発明では、これらの重要パラメータ：単なる肝細胞受容体結合性及び侵入にとどまらない選抜を可能にする複製性ＡＡＶライブラリーを使用すること、マウスではなくヒトの肝細胞において生体内でヒト肝細胞向性を進化させること、数千人の患者に由来するヒト免疫グロブリンのプールに対する体液性回避についてのスクリーニングをすること、ならびに臨床的に有意な方法論を用いて形質導入を評価すること、の各々を結合させた。結果として、以前に特徴付けられた血清型に比べて優れたヒト肝臓形質導入及び固有の体液性中和を有する一まとまりの新規ｒＡＡＶ変異型が得られた。
【０２９７】
結果：
ヒトにおける理想的な肝臓送達に必要な基準を全て満たす既存のｒＡＡＶ血清型はない
遺伝子治療分野において、高い機能的ヒト肝細胞形質導入と低い中和潜在性との併合的必要性を満たす理想的なｒＡＡＶベクター候補は存在しない。いくつかの候補は、治験または異種移植モデルにおいて検出可能なヒト肝細胞形質導入を実証した一方でどれも好ましい中和特性を呈さず、またその逆も同様である（下表３参照）。ヒト肝臓試験またはヒト化肝臓マウスのどちらかで試験されたことのないいかなるｒＡＡＶもこの一覧表から除外した、というのも、細胞株のみ（ｒＡＡＶ−Ｆ系列２２）または非ヒト化マウスのみ（ｒＡＡＶ１２３、２４）におけるヒト肝細胞形質導入の評価はヒト肝臓形質導入との相関が乏しいことが示されているからである１、５。最も好ましい極度を有する２つの候補は、高いヒト肝細胞形質導入を有する４がしかし実質的なｎＡｂレベルも誘発９するｒＡＡＶ−ＬＫ０３と、低いｎＡｂレベルを誘発する１３がしかしヒト肝細胞形質導入に関する評価が未だなされていないｒＡＡＶ−ＤＪである。これに対処するために、６匹のヒト化ＦＲＧ２５マウスをｓｓＡＡＶ−ＤＪ−ＣＡＧ−ＧＦＰで処置し、マウス及びヒト肝細胞における形質導入を測定した。ヒトＦＡＨ及びウイルスＧＦＰについての肝臓免疫組織化学は、全ての処置マウスにおいて低レベルの機能的ヒト肝細胞形質導入（＜５％）を実証した（図１７ａ、図１７ｂ参照）。処置済みの肝臓切片に対するＧＦＰ  ＲＮＡ  ＦＩＳＨに続く逐次的なＧＦＰ  ＤＮＡ  ＦＩＳＨの結果は、機能的ヒト形質導入の遮断が脱殻後に起こったことを実証した（図１７ｃ〜ｅ参照）。強い核内ＧＦＰ  ＤＮＡと、核内及び細胞質内ＧＦＰ  ＲＮＡとの両方が検出されたが、ＧＦＰタンパク質は存在せず、機能的発現に対する翻訳遮断を指し示していた。
【表３】
2019509032.tif 000010
【０２９８】
表３は、既存の肝臓指向性ＡＡＶ血清型を使用した機能的肝細胞形質導入及びヒトの既存の中和抗体レベルの文献比較を示す。異なる状況において生体内で肝細胞に機能的に形質導入する能力を比較した。第１列は、治験から推定されたヒト肝細胞機能的形質導入パーセントを示す。全ての値は推定値である、というのも、処置後の機能的形質転換（ベクター複製数ではなくタンパク質発現）を評価する生検が行われていないからである。注目すべきことに、ＡＡＶ８からの発現レベルは数名の患者においては治療的（正常ヒトＦＩＸレベルの５〜７％を維持）であったが、形質導入された肝細胞による超生理学的発現を示す以前のデータは、患者の肝細胞の１０％未満が形質導入されたことを示唆している。第２列は、処置された異種移植肝臓マウスから測定した生体内での実際のヒト肝細胞機能的形質導入パーセントを示す。第３列は、様々な遺伝子型及び系統背景を有する非異種移植マウスからの生体内での実際のマウス肝細胞機能的形質導入パーセントを示す。第４列は、中和アッセイにおいてヒト血清から測定された既存の中和抗体（ｎＡｂ）のレベルを示す。ＮＤ＝不検出。＊＝予測（研究終了よりも前の査読されていない出版物公開から取得したデータ）。３つの形質導入の列は、肝細胞の、低＝０〜１０％、中＝１０〜５０％、高＝５０〜１００％である。中和の列は、そのＡＡＶカプシドに対する中和を血清が示した患者の、低＝０〜１０％、中＝１０〜５０％、高＝５０〜１００％である。
【０２９９】
生体内での初代ヒト肝臓異種移植片における多様なＡＡＶカプシドライブラリーのスクリーニング
ヒトにおける肝臓指向性遺伝子治療に理想的なｒＡＡＶカプシドは、高い機能的肝臓形質導入と免疫回避とを併せ持ったものであろう。そのような変異型を進化させるために、遺伝的及び機能的に多様な数多くの親ＡＡＶからの血清型カプシド遺伝子のＤＮＡシャッフリングを通じて多様なカプシドを生物工学によって作る指向性進化手法を採用した。酵素的断片化に続いてシャッフリング済み完全長カプシド遺伝子の組立てを用いて、多様なカプシドライブラリーを生み出した。次にそれらをＡＡＶシャトルベクターの中にクローニングし、生きた複製性ＡＡＶライブラリーを作るために利用した（図２ａ、図１８参照）。ライブラリーは、異なる１０種の親カプシド血清型（１、２、３ｂ、４、５、６、８、９＿ｈｕ１４、鳥類及びウシ）から作った。シャッフリング済みカプシドが体液性中和を回避できるだけでなく機能的にヒト肝細胞に形質導入することもできる尤度を最大限にするために、初代ヒト組織を使用して多重逐次スクリーニングを行った。まず、初代ヒト手術肝臓検体を消化及び精製して、ＦＲＧマウスに移植するための肝細胞集団を単離した（図２ｂ参照）。異種移植マウスの静脈内に、ＡＡＶライブラリーの５Ｅ１０ベクターゲノム（ｖｇ）を投与し（図２ｃ参照）、次いでその２４時間後に生きたアデノウイルス−５（Ａｄ−５）を投与した。成功裏に肝臓へ輸送された複製ＡＡＶ変異型をＡｄ５投与の２日後に単離し、最低限の精製及び再度の力価測定を行い、新しい異種移植マウスの中に再び５Ｅ１０ｖｇ／マウスで注射した。この生体内スクリーニングサイクルを５回の選抜にわたって行った。サンガー配列決定による多様性追跡評価は、３回目から始めて、ヒト肝臓形質導入のための十分な圧を選択するがライブラリー多様性を多少残す５回目まで毎回行った。その後、この充実ヒト肝臓指向性ＡＡＶライブラリーを、数千人の患者に由来するプールされたヒト免疫グロブリンに対するビーズ上での一連の逐次スクリーニングへの投入材料として使用して、低減された体液性中和潜在性を有する変異型を集団全体にわたって選抜した（図２ｄ参照）。２回の結合性選抜の後に、結合せずに残った変異体を潜在的臨床実用性についての厳密な特性評価に供した。
【０３００】
構造及び比較に基づくコンピュータモデリングによる機能上重要な残基の同定
２つ目の逐次スクリーニングが完了した時点で、投入ライブラリー及び数回の選抜から増幅させたカプシド配列に対してＰａｃＢｉｏ単分子配列決定を用いるディープシーケンスを行った。数千個のカプシドからの何回もの位置解析によって、肝要な残基の選択物が同定された（図１２参照）。この手法は、最も近い完全長親配列に根差した古典的系統樹よりも示唆に富んでおり、機能的に重要な残基を効果的に完全長カプシド関連性の内にマスキングした（図１９参照）。興味深いことに、ｒＡＡＶ２がヒト肝細胞の機能的形質導入を不得意としていることが知られているにもかかわらず、ＡＡＶ２由来のいくつかの構造断片、とりわけＶＰ３のＣ末端にある残基が、最初のスクリーニングにおいて初め頃の回のスクリーニング中に好成績で選抜された。他方、代わりにＡＡＶ８残基が選択されていた、ＶＰ１の固有領域及びＶＰ２の固有領域の一部（アラインメントされた残基６７〜１４６）；ＡＡＶ３ｂ残基が選択されていた、ＶＰ３の広い範囲（アラインメントされた残基３２１〜４２３）；ならびにライブラリー生成に使用したいずれの親血清型にも存在しない様々なアミノ酸を含んでいた、いくつかの高頻度ｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異多発部位（アラインメントされた残基４２、１５８、１６５、１８１、２９０、５１５及び５５５）を含めたそれらに対して、ＡＡＶ２配列の多くが強固に選択された。体液性回避が可能なカプシド変異型を選抜する２つ目のスクリーニングへと実験が推移するにつれて、ＩｇＧ結合ＡＡＶ変異型及びＩｇＧ未結合ＡＡＶ変異型は構造的平均類似性を高度に呈した。向上したＩｇＧ回避を並立的に成し遂げるために必要となる可能性のあるほんの数個の肝要な領域だけが、それらの間で異なっていた。この場合、完全長カプシド配列を集合としてではなく個々に使用した方が全体的な差異がより簡単にＰａｃＢｉｏ単分子配列決定から分かった（図１９ａ参照）。
【０３０１】
進化させた変異型をさらに精査するために、最終スクリーニング後に得られた最も好成績で選抜されたカプシド変異型のうちのいくつかを選び出し（図２０ａ参照）、後に続く検証実験のためにＧＦＰまたはホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）発現用構築物でベクター化した。進化カプシド断片に対する各親ＡＡＶ血清型の遺伝的寄与を判定するために、交差マッピング（図１３ａ参照）、構造的カプシドマッピング（図１３ｂ参照）及び予測的断片保存性解析（図２０ｂ参照）を行った。これらの相補的方法論は、特定の残基の選抜を実証し、固有ドメインと共有ドメインとを両方とも際立たせた。シャッフリングは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＡＡＰを含むＣａｐの長さに沿って成し遂げられた。進化させた変異型に最も寄与した親血清型は順にＡＡＶ２、３ｂ、１及び６であった。選抜されたどの変異型も、ＡＡＶ４、５、８、９＿ｈｕ１４、ウシＡＡＶまたは鳥類ＡＡＶからの明らかな寄与を有していなかった。興味深いことに、ヒト肝細胞に形質導入する能力に関して選抜された変異型は、マウス肝細胞とは対照的に、固有のＡＡＶ８配列がほぼ完全に欠けている。これは、ｒＡＡＶ８が生体内でのヒト肝細胞の機能的形質導入を不得意としておりマウス形質導入研究にはるかによく適している、という数名の発明者ら４及びその他の当該分野の発明者ら３の知見を支持する。
【０３０２】
シャッフリング済みＮＰ４０、ＮＰ５９及びＮＰ８４のカプシド配列（図１３ａ、図２３参照）は、既知の肝臓向性を有する親血清型からの多くの断片を含んでおり、これらの変異型は、ヒト化肝臓異種移植片で最初の生体内スクリーニングにおいて選抜された。これら３つのシャッフリング済みカプシドは、それらの非常に類似しているカプシド配列を考慮すれば互いに類似した比較構造を有することが予測されよう（図１３ａ、図１３ｂ参照）。ＮＰ４０は、３つのうちで最もシャッフリングされており、ＡＡＶ１／３ｂ／６／８／９からのＶＰ１の固有領域を有し、ＡＡＶ２に由来するＶＰ２の固有領域を有し、そして最後にＡＡＶ２及び３ｂからの寄与によるＶＰ３を有し、それと同時に、１つのｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異（Ｋ５５５Ｅ）を有する。残りの変異型カプシドに関しては、強化されたヒト肝臓形質導入に必要とされるＡＡＶ３ｂからの最小限の構造領域であることを示唆しているＡＡＶ３ｂからの保存された寄与が位置３２６〜４２６において認められた。ＮＰ５９は、ＮＰ４０と類似しているが多様なＶＰ１寄与は欠けており、代わりにその配列範囲がＡＡＶ２からなる。ＮＰ５９は、１つのｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異（Ｎ６２２Ｄ）を別とすればＮＰ４０と同じＶＰ２寄与及びＶＰ３寄与を有する。ＮＰ８４は、ＶＰ１及びＶＰ２の固有領域がＮＰ５９と共通しているが、ＶＰ３においてＡＡＶ３ｂからの寄与がはるかに大きくかつＡＡＶ２からの寄与がより小さく、それに加えて、２つのｄｅ  ｎｏｖｏ突然変異（Ｋ５５５Ｅ及びＲ６１１Ｇ）を有する。３つ全ての変異型カプシドを全体的に見ると構造マッピングは、超可変領域の軽微な構造異質性を際立たせたが、シリンダー（ＡＡＶ２由来）、キャニオン（ＡＡＶ３ｂ由来）及び様々な対称軸などの肝要な構造ドメイン内での巨視的な保存性も際立たせた。
【０３０３】
肝臓異種移植片はヒト肝臓形質導入を評価するための精密な代替である
シャッフリング済みカプシドの機能的ヒト肝臓形質導入能を適切な生体内環境において綿密に評価するために、ヒト化ＦＲＧ異種移植マウスに形質導入した。バイアスを減らし、厳密性を最大限にするために、異種移植肝臓マウスのコホートを２つの異なる研究所で作り、ＧＦＰを発現する変異型（ＮＰ４０、ＮＰ５９及びＮＰ８４）または対照（ＬＫ０３及びＤＪ）のｒＡＡＶカプシドを投与した。２つの場所の各々にいるヒト化マウスにｒＡＡＶを同じ用量（２Ｅ１１／マウス）で同じ送達方法（外側尾静脈注射）によって投与し、ＡＡＶ投与後１４日目にＧＦＰ免疫組織化学によって形質導入を評価した（図１４ａ、図１４ｂ参照）。異なるプロモーターが使用されたものの、ＣＡＧもＬＳＰ１も肝細胞内で等価なレベルで発現することが示された２６。形質導入に対する再増殖率の潜在的影響を評価するために、１つのコホートを高い再増殖レベルで形質導入し、残りは低い再増殖レベルで形質導入した。２つの盲検研究所から得られた独立した結果は、シャッフリング済み変異型ＮＰ４０及びＮＰ５９（及び、高い再増殖のコホートではＮＰ８４も）では機能的ヒト肝細胞形質導入が対照血清型ＬＫ０３及びＤＪよりも著しく向上したことを実証した（図１４ｃ、図１７ａ、図１７ｂ参照）。変異型による形質導入が対照よりも向上する傾向は、再増殖の度合いを問わず保たれたものの、平均形質導入レベルは、ヒト肝細胞の利用能、及び限定性であるｒＡＡＶビリオンに応じて変化した。形質導入は、導入遺伝子産物の代謝活性ならびに推測される発現及び分泌の勾配が存在している肝小葉にわたって見受けられた。新規シャッフリング済み変異型は、ヒト肝細胞の形質導入に対する特異性が高い。シャッフリング済み変異型は、非ヒト化Ｂａｌｂ−ＣＪマウスにＩＶ注射された場合、肝臓への機能的形質導入が非常に弱かったかまたは全くなかった（図２１ａ、図２１ｂ）。これは、機能的マウス肝臓形質導入においてｒＡＡＶ８さえも凌駕したｒＡＡＶ−ＤＪとは実に対照的である。
【０３０４】
進化させた肝臓向性ＡＡＶ変異型の免疫学的特性
患者における既存の潜在的に交差反応性の抗ＡＡＶカプシド抗体によるｒＡＡＶ中和の尤度を予測するために、様々な患者群及び非ヒト霊長類からの血清を使用して血清反応性アッセイと形質導入中和アッセイとの両方を行った。まず、５０名の健常米国人男女（下表４参照）からの個々のヒト血清試料をシャッフリング済みカプシド変異型及び対照の血清に対するそれらの血清反応性に関して評価した（図１５ａ、図２２ａ、図２２ｂ、下表５参照）。シャッフリング済み変異型ＮＰ４０、ＮＰ５９、ＮＰ８４、及びＤＪはどれも、高いヒト中和頻度を有すること９、１０、２７、２８が知られているｒＡＡＶ８及びＬＫ０３に比べて著しく低下した血清反応性を有していた（Ｐ＜０．００１〜０．０００１）。血清反応性を性別ごとに評価することによって、異なるカプシドに対する血清反応性の統計的に有意な差が男性及び女性において実証されたが、試料数が少なかったため注意して解釈されねばならない（表５参照）。男性も女性も、全てのシャッフリング済み変異型に対してｒＡＡＶ８よりも顕著に向上した血清反応性を示したが、ＬＫ０３に比べて顕著な向上は男性のみが有していた（ｎ＝３３）。女性患者は、患者数が少なかったが（ｎ＝１７）、ＬＫ０３と３つの新規な変異型カプシド（ＮＰ４０、ＮＰ５９及びＮＰ８４）の各々とで血清反応性の顕著な差を実証しなかった。
【表４−１】
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【表４−２】
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【０３０５】
表４は、正常ヒトオフクロット血清試料の詳細を示す。図１５Ａからの５０名の米国血清ドナーについての採血日（ＤＯＳ）、提供時の年齢、性別、人種、喫煙状況及びＡＢＯ血液型を含めた詳細である。全てのドナーはＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＩＶについて陰性であった（データ示さず）。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【０３０６】
表５は、ヒト血清反応性統計を示す。全患者（図１５Ａ）、分けた男性患者（図２２Ａ）、及び分けた女性患者（図２２Ｂ）についての比較統計データである。
【０３０７】
将来の非ヒト霊長類における前臨床試験を支持するために、６頭のアカゲザルの小コホート（下表６参照）からの血清の、同じパネルのＡＡＶ（図１５ｂ参照）に対する血清反応性を評価した。小コホートの大きさを考慮すると、ＤＪに対する血清反応性がＡＡＶ８よりも低かった（Ｐ＜０．０１）ことを別とすれば試験カプシド間で平均血清反応性の統計的有意差はみられなかった（下表７参照）。欧州からの２１名の健常ヒトドナーからなる限られたコホートからの血清を使用する試験管内でのヒト２Ｖ６．１１許容細胞における中和アッセイからは、全血清型にわたる平均類似性が見出された（図１５ｃ、下表８参照）。シャッフリング済み変異型はどれも中和の平均レベルがＬＫ０３よりも低く、ｒＡＡＶ８のみがこの小さいコホート（ｎ＝２１）において統計的有意性（Ｐ＜０．００１）に達した。これらのカプシドの１つの重要な潜在的用途は、血友病Ｂ試験に関するものである。それゆえ、血友病Ｂを有する２１名の成人男性（下表９参照）からの血清を使用する血清反応性アッセイを行った。試料に限りがあったため、主要候補であるＬＫ０３のみに対して変異型を比較した。結果は、６６％の患者においてＮＰ５９がＬＫ０３に比べてより好ましい平均血清反応性を有しており、その一方でＮＰ８４及びＮＰ４０はどちらも、この小さいコホートでは統計的有意性に達しなかったものの、５３％の患者においてより好ましかった、ということを示した（図１５ｄ、表９参照）。これらの知見は、とりわけ血清陽性率及び抗体媒介中和に関して、変異型カプシドＮＰ４０、ＮＰ５９、ＮＰ８４、及びＤＪの固有の免疫学的特徴を重複的に際立たせる。
【表６】
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【０３０８】
表６は、健常成体Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓアカゲザルからの非ヒト霊長類血清試料の詳細を示す。サルＩＤ、採血時の月齢、出生日（月／日／年）、性別、原産国及び提供元が示されている。
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【０３０９】
表７は、図１６からの追加の統計を示す。６頭の成体アカゲザルからの血清反応性の比較統計データ（図１５Ｂ）、欧州からの２１名の健常成人からの中和（図１５Ｃ）、及び２１名の成人血友病Ｂ患者からの血清反応性（図１５Ｄ）である。
【表８】
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【０３１０】
表８は、中和研究に使用した欧州からの２１名の健常ドナーからのヒト血清試料の詳細を示す。対象ＩＤ、出身国、性別及び提供時の年齢（歳）が示されている。
【表９】
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【０３１１】
表９は、確定した血友病Ｂを有する２１名のドナーからのヒト血清試料の詳細を示す。患者ＩＤ、提供時の年齢及び性別が示されている。
【０３１２】
比較ヒト肝臓オルガノイド形質導入アッセイは分化形質導入を支持する
肝疾患を生体内でｒＡＡＶの静脈内送達によって処置することに加えて、移植可能なヒト肝臓オルガノイドでの生体外での遺伝子送達または遺伝子修正の研究は、いくつかの肝疾患のための潜在的な将来の療法と関連がある。進化肝臓変異型を生体外においても使用することができるか否かについての確証を得るために、初期ヒト肝臓オルガノイドにおけるＧＦＰ形質導入評価を行った。１４日間にわたる２重オルガノイド形質導入経時変化評価（図１６ａ、図１６ｂ）では、シャッフリング済み変異型ＮＰ４０は、機能的ヒト肝臓オルガノイド形質導入がｒＡＡＶ２及びｒＡＡＶ８よりも顕著に多いことがＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）イメージングによって示され、既知の強力な試験管内形質導入材料であるＬＫ０３及びＤＪによって成し遂げられる高レベルの形質導入で見受けられるのと等価なＭＦＩを有していた。ＮＰ５９は、形質導入レベルがｒＡＡＶ２と同程度であり、ＭＦＩがｒＡＡＶ８よりもはるかに大きかった。ＮＰ８４は生体外でのヒト肝臓オルガノイドの強力な形質導入材料ではなかった。
【０３１３】
考察
近年、最適なヒト肝臓送達のための最良のｒＡＡＶ血清型の選出は、実験構成、データ解釈及び再現性の差異に端を発してますます複雑で物議を醸すものとなってきた３、４、２９、３０。異なるグループによる実験設計において改変された変数の数を考えればこのことはおそらく驚くべきことではない。２つの研究が等しく実施されたことはなく、このため比較は煩雑なものであったし、煩雑なものであり続けるであろう。評価のための異なるモデル系の使用は、最も単純な場合であっても困難なものであった。試験管内培養系でのｒＡＡＶ形質導入は生体内での形質導入レベルと相関しないことはよく知られており、そのため、機能的な生体内形質導入を確立することを目的として他の支持データなしでこれらの系列で試験することは断念せねばならない。生体内での形質導入の測定に関してさえ、ヒト異種移植（マウス）なしでの異なる種の使用はヒトにおける形質導入転帰を再現しないことが示されており１、５、そのような結果は注意して解釈されねばならない。ヒト肝臓を完全に再現するモデル生物はないが、現在における証拠は、初代ヒト肝細胞を移植された異種移植肝臓モデルでの機能的形質転換の評価が既存の患者データを最も良く再現したこと３、４、及び当該集団モデルを先へと進めるべきであることを実証している。同様に、ベクター複製数による機能的形質転換の定量は大変不正確である、というのも、それは機能性に関係なく侵入後の全てのゲノムを測定するものであるからである。定量上、これは極めて重要なことである、というのも、ほとんどのＡＡＶゲノムは治療妥当性に必要とされる細胞内輸送及び発現カスケード３１、３２を完遂せず、そのために形質導入は過剰に大きく推定されてしまうからである。
【０３１４】
本研究では、ｒＡＡＶビリオンが限定性である場合、ヒト肝細胞に対するマウス肝細胞の相対比がおそらく全体としての形質導入効率に極めて重要であるため、ヒト化マウスにおいて再増殖レベルを制御及び報告することが潜在的に重要であることが実証された。今日まで、方法の報告が不十分であること及び処置される対象の数が少ないことゆえに、当該分野において公開された研究の再現を試みることさえ難題であった。将来の研究同士を比較するのを容易にするためには、詳細なマウス維持条件、マウスモデルまたはその他の動物モデルの系統背景、ヒト肝細胞ドナーの特徴（年齢、性別、疾患状態、地域）、注射方法、採用されるＡＡＶ生産及び精製の方法、移入ベクターについての詳細な説明（プロモーター、導入遺伝子、エンハンサー、ポリＡ、ゲノム型などを含む）、力価測定方法、最終の再懸濁液、ベクター形質導入を定量する方法、及び行われる任意の標準化を含めた付加的変数を厳密に制御する必要もある。
【０３１５】
処置される患者に高レベルで既に存在している、親血清型に対するｎＡｂは、今日まで、前スクリーニングを将来のあらゆる試験のための要件としてきた。ｎＡｂの保有率は、患者の地理、健康状態、性別、年齢、及びおそらくその他多くの変数によって変動する３３。既知の肝臓向性血清型のなかでも、限りあるこれまでのヒト研究は、ｒＡＡＶ２９、１０、２７、２８、３４、ｒＡＡＶ５１０、２８、３４、３５、ｒＡＡＶ８１０、２８、２７及びｒＡＡＶ３ｂ９、２８、ならびに関連性の高いｒＡＡＶ−ＬＫ０３カプシド９に対して最も高いｎＡｂレベルを示した。最大の患者参加数で肝臓遺伝子治療試験を将来可能にするためには、異なる起源を有し中和に対する感受性が低減された新規カプシドが必要とされる。親血清型またはシャッフリング済み変異型に関して特性評価された抗原性エピトープは少なく、このため、カプシドライブラリー多様性を最大限にする合理的な設計の試みは阻まれている。前臨床検証において将来のカプシド変異型を患者抗体のプールに対してスクリーニングすることは、臨床へと進められる変異型の最終的な有用性を向上させるための、バイアスのない手法を意味する。
【０３１６】
そのような高レベルでヒト肝臓に形質導入する新規カプシド変異型の素晴らしい可能性は、患者用量を減らしながらも所望の発現レベルをなおも可能にすることであろう。これによって、ｒＡＡＶが将来の肝臓遺伝子治療試験に有効なベクターとなるためのいくつかのハードルを回避することができるであろう：ａ）循環して存在しているカプシドがより少ないために中和の確率が低くなり、ｂ）生産費用が減って、患者一人あたり１００万ドルに達し得る驚くほどの処置費用３６、３７が相殺され、ｃ）形質導入された肝細胞に対するカプシド特異的Ｔ細胞応答の確率が低くなる３８。同様に、クリグラー・ナジャー症候群及び血友病などといった単純な非細胞自立性肝疾患を処置することから、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、及び臨床有効性のために少なくとも２０〜５０％のヒト肝細胞に機能的に形質導入することを必要とするであろうその他の尿素回路障害などといった細胞自立性疾患を処置することへと、当業者がまとまって転向するにつれて、高レベルの機能的形質導入は当該分野において肝要となるであろう。
【０３１７】
方法
シャッフリング済みＡＡＶカプシドプラスミドライブラリーの生成。シャッフリング済みＡＡＶカプシドライブラリーは、以下に記載する改変を加えつつも、以前に記載４がなされているとおりに生成した。高忠実度ポリメラーゼを使用して血清型（１、２、３ｂ、４、５、６、８、９＿ｈｕ１４、鳥類及びウシ）に由来するＡＡＶカプシド遺伝子をＰＣＲ増幅させ、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号Ｋ２８００）を使用してクローニングし、その後、個々のクローンのサンガー配列決定を行った。１〜３０分の様々な間隔でＤＮａｓｅＩを使用して、カプシド遺伝子を切り出し、１：１の比で混合し、消化した。プールされたこれらの反応を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離させ、１，０００ｂｐ未満の断片を切り出してプライマーなしでのＰＣＲ再構成ステップに使用し、その後、カプシド遺伝子の外側に結合するプライマー：
順方向：５’−ＧＴＣＴＧＡＧＴＧＡＣＴＡＧＣＡＴＴＣＧ−３’
逆方向：５’−ＧＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧ−３’
を使用する２回目のＰＣＲを行った。
【０３１８】
ＣＡＰ挿入部位の両側に位置するＳｗａＩ／ＮｓｉＩ制限部位と、ＡＡＶ２  ＶＰ１  ３’ＵＴＲの改変部分とを有している改変されたｐＡＡＶ２宿主プラスミド（ＩＴＲ−Ｒｅｐ２−Ｃａｐクローニング部位−ＡＡＶ２  ３’ＵＴＲ配列−ＩＴＲ）の中に、完全長のシャッフリング済みカプシド遺伝子をクローニングした（図１８参照）。ライゲーションさせたものを、等分された数多くの独立したエレクトロコンピテント細胞アリコートに形質導入し、最小限の増殖のために低量のアンピシリン（５０ｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培養液で１：４０に希釈した。アリコートを播種し、１００個のクローンを取り出し、サンガー配列決定を行ってライブラリー多様性を検証した。ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ  カタログ番号１２３８１１）を使用してライブラリープラスミドのプールを精製し、複製能のあるＡＡＶビリオンのライブラリーを生成するために使用した。
【０３１９】
ＡＡＶライブラリー産生、ベクター産生及び力価測定。ＡＡＶライブラリー産生物は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  カタログ番号ＣＲＬ−３２１６）においてＣａ３（ＰＯ４）２トランスフェクションプロトコール（ｗｔＡＡＶライブラリープラスミドプール及びｐＡｄ５ヘルパー）を用った後、２層塩化セシウム密度勾配精製を行い、以前に記載３９がなされているとおりに透析を行うことによってもたらされ、それを、５％のソルビトール（ｗ／ｖ）と０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（ｖ／ｖ）とを含有するｄＰＢＳ中に再懸濁させた。下記プライマー／プローブ組：
順方向：５’−ＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧ−３’
逆方向：５’−ＧＴＣＣＧＴＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＡＴＴ−３’
プローブ：５’／ＦＡＭ／ＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡ／ＢＨＱ−１／−３’
を使用してＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲによってＡＡＶライブラリーをＲｅｐに関して力価測定した。
【０３２０】
組換えＡＡＶベクター産生物は、ｐＡｄ５ヘルパーと、ＡＡＶ移入ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃３７８２５からのｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ＳＶ４０ｐＡ；自社でクローニングされたｓｓＡＡＶ−ＥＦ１ａ−Ｆｌｕｃ−ＷＰＲＥ−ＨｇＨｐＡ；Ｉａｎ  ＡｌｅｘａｎｄｅｒからのｓｓＡＡＶ−ＬＳＰ１−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ＢｇＨｐ４０）と、各対象カプシドのための偽型化プラスミドとを使用する３重のトランスフェクション（ＰＥＩまたはＣａ３（ＰＯ４）２）を行ったこと以外は上記と同様にしてもたらされた。下記プライマー／プローブ組：
順方向：５’−ＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴ−３’
逆方向：５’−ＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣ−３’
プローブ：５’／ＦＡＭ／ＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧ／ＢＨＱ−１／−３’
を使用してＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲによってＡＡＶ−ＧＦＰベクターをＧＦＰで力価測定した。
【０３２１】
ＡＡＶ−ＦＬｕｃベクターは、下記プライマー／プローブ組：
順方向：５’−ＣＡＣＡＴＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＴＡＣ−３’
逆方向：５’−ＴＧＧＴＴＴＧＴＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＴＡＧ−３’
プローブ：５’／ＦＡＭ／ＡＣＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡＧＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧ／ＢＨＱ−１／−３’
を使用してＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲによって力価測定した。
【０３２２】
マウス。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有するＦａｈ／Ｒａｇ２／Ｉｌ２ｒｇｃ（ＦＲＧ）欠損マウス２５と、ＮＯＤ系統バックグラウンドを有するＦＲＧマウス（ＦＲＧＮ）とを、オレゴン健康科学大学（米国）か、スタンフォード大学（米国）か、小児医療研究所（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（オーストラリア）かのいずれかの特定病原体除去バリア施設内に収容及び維持した。ＦＲＧ／Ｎマウスは、チロシン経路への流れを減らすために放射線照射済みのマウス用高脂肪低タンパク質餌（米国：Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ  カタログ番号Ｐｉｃｏｌａｂ−５ＬＪ５；オーストラリア：Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ  Ｆｅｅｄｓ  カタログ番号Ｓ４１５−０２４）で自由に養った。米国のＦＲＧ／Ｎマウスは、移植の日から数えて１週間は細菌増殖を防止するために酸性水で養い、一方、オーストラリアのマウスには、２５ｍｇ／ｍＬのバイトリル抗生物質を補充した酸性水を与えた。その次の週に、米国のマウスは１週間の８ｍｇ／Ｌ  ＳＭＸ−ＴＭＰ抗生物質水（嗜好性のために０．７モル／Ｌのデキストロースを補充）に切り替え、一方、オーストラリアのマウスは１ｍｇ／ＬのＮＴＢＣ水に切り替えた。それ以降は各場所のＦＲＧ／Ｎマウスに対して記載の１ｍｇ／ＬのＮＴＢＣ水を有りと無しとのサイクルで使用した２５、４１。イメージング研究のために成体Ｂａｌｂ／ｃＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｔ番号００６５１）から購入した。スタンフォード大学、オレゴン健康科学大学及び小児医療研究所の動物実験委員会は全てのマウス手順を認可した。
【０３２３】
肝細胞移植。移植研究用のドナーヒト肝細胞は、米国での研究のために１７歳の白人女性よりＣｅｌｓｉｓ（カタログ番号Ｆ００９９５、ロット番号ＬＴＳ）から入手したか、オーストラリアでの研究のために白人男性よりＬｏｎｚａ（カタログ番号ＣＣ−２５９１Ｓ、ロット番号９Ｆ３０９７）から入手したかのどちらかであった。離乳ＦＲＧ／Ｎマウスに対して、移植の２４時間前に組換えヒトアデノウイルス発現ウロキナーゼ（オーストラリアでは尾静脈に１．２５Ｅ９  ＰＦＵ、また、米国では眼窩後方に５Ｅ１０  ＰＦＵ）を投与することによる前処理を施して、ヒト細胞生着を促進した。麻酔したレシピエントＦＲＧ／Ｎマウスに５Ｅ５〜１Ｅ６個のヒト肝細胞を脾臓内注射し、ＮＴＢＣを有り／無しのサイクルで使用してヒト肝細胞の生着及び増殖を促進した２５。広域抗生物質（米国ではセフチオフルを４ｍｇ／ｋｇ；オーストラリアではバイトリルを５．６ｍｇ／ｋｇ）を手術直前及び手術後２日間にわたって腹腔内注射によって与えた。移植から数週間後に、循環ヒトアルブミンレベルを用いてヒト移植片生着パーセントを数マイクロリットルのマウス末梢血から見積もった。
【０３２４】
ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ。キメラマウスにおけるヒト移植片生着パーセントを見積もるために、Ｂｅｔｈｙｌ定量的ヒトアルブミンＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｅ８８−１２９）を製造業者のプロトコールに従って使用し、数マイクロリットルの末梢血を使用してヒトアルブミンを測定した。これと同じキットを使用して、分泌されたヒトアルブミンの培地上清中レベルをヒト肝臓オルガノイド分化中に分化成功のマーカーとして検出した。
【０３２５】
複製能のあるＡＡＶライブラリーのヒト化ＦＲＧマウスにおける選抜
ヒト化が確認された雌のＦＲＧマウスに、５Ｅ１０ｖｇ／マウスのＡＡＶライブラリーを尾静脈内投与によって形質導入した。２４時間後に、複製能のある５Ｅ９  ＰＦＵの野生型ヒトアデノウイルス５（ｈＡｄ５）（ＡＴＣＣ  カタログ番号ＶＲ−５）を体積２０μｌで眼窩後方静脈注射によって投与した。形質導入されたヒト化肝臓を、ｈＡｄ５投与から４８時間後に採取した。肝臓を細かく刻み、３回の凍結解凍サイクル及びさらなる均質化に供して残存肝細胞を確実に完全溶解させた。その後、肝臓溶解物を３０分間６５℃に供してｈＡｄ５を熱不活性化し、４℃で１４，０００ＲＰＭの遠心分離にかけてウイルス含有上清を細胞残屑から分離した。合計５回の生体内選別の間、毎回の後にウイルス性の上清のドットブロット力価測定を行って、５Ｅ１０ｖｇ／マウスが次の回で確実に連続投与されるようにした。
【０３２６】
プールされたヒト免疫グロブリンに対する進化ヒト肝臓ライブラリーの逐次副スクリーニング。ＰｕｒｅＰｒｏｔｅｏｍｅプロテインＧ磁気ビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  カタログ番号ＬＳＫＭＡＧＧ０２）に対して、プールされたヒト免疫グロブリン（Ｂａｘｅｒ  Ｇａｍｍａｇａｒｄ  ＩＶＩＧ  Ｌｉｑｕｉｄ（商標）、カタログ番号ＬＥ１５００１９０、ロット番号ＬＥ１２Ｊ３３８ＡＢ）を４℃で６０分間、直接免疫沈降プロトコールについての製造業者の指示に従って前負荷した。５回目の生体内スクリーニングからのＡＡＶライブラリーを、回転しているＩｇＧ負荷ビーズに４℃で１２時間付着させた。結合画分及び未結合画分を製造業者の指示に従ってそのまま溶離させ、真のＩｇＧ結合ＡＡＶ及びＩｇＧ未結合ＡＡＶの母集団を充実させるために新しいＩｇＧ負荷ビーズの上に流した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎキット（Ｑｕｉａｇｅｎ  カタログ番号５７７０４）を使用して各画分からウイルスｇＤＮＡを抽出し、その後、
順方向：５’−ＴＧＧＡＴＧＡＣＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡ−３’
逆方向：５’−ＴＧＣＴＴＡＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＡＧＴＣＡＧＧＴＡＴＣＴＧ−３’
を使用してＰＣＲ増幅を行った。
【０３２７】
ＩｇＧ回避に関する副スクリーニングの２回目からのＡＡＶカプシドＯＲＦを、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯキットを使用してクローニングし、プライマー：
順方向−１：５’−ＴＧＧＡＴＧＡＣＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡ−３’
順方向−２：５’−ＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＣＣ−３’
逆方向−１：５’−ＡＴＧＧＡＡＡＣＴＡＧＡＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡ−３’
を使用して１００個のクローンを完全サンガー配列決定に供して多様性を評価した。
【０３２８】
進化ＡＡＶカプシドのベクター化及び配列寄与解析。Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  Ｒ７  ｖ７．１．９ソフトウェアを使用してコンティグを組み立て、そして、
順方向：５’−ＡＡＡＴＣＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＡＴＧ−３’
逆方向：５’−ＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＧＡＡＡＣＴＡＧＡＴＡＡＧＡＡＡＧ−３’
を使用して、ベクター化のために選抜されたクローンを増幅させた。
【０３２９】
ＳｗａＩ及びＸｍａｌ制限部位を使用して、ＩＴＲなしでＡＡＶ２  Ｒｅｐを含有する前消化済みレシピエントｐＣａｐパッケージングプラスミドの中に、ＰＣＲアンプリコンをＲｅｐの下流でインフレームクローニングした。ＡＡＶカプシド遺伝子の配列確認を行い、結果として生じたコンティグは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）を使用して多重配列アラインメントを評価する特別注文のＰｅｒｌパイプラインを使用して解析し、最尤度に基づくＤＮＡ及びアミノ酸配列と親ＡＡＶ血清型との比較によってシャッフリング済みＡＡＶの全体的な血清型組成を得た。Ｘｏｖｅｒ  ３．０  ＤＮＡ／タンパク質シャッフリングパターン解析ソフトウェアを使用して、シャッフリング済み変異型の親断片交差マップを生成した４２。各親血清型を下記のとおりに色分けした：ＡＡＶ１：赤色；ＡＡＶ２：深緑色；ＡＡＶ３ｂ：マリンブルー；ＡＡＶ４：マゼンタ；ＡＡＶ５：ツバルブルー（ｔｖ  ｂｌｕｅ）；ＡＡＶ６：青緑色；ＡＡＶ８：橙色；ＡＡＶ９：薄緑色；鳥類ＡＡＶ：紫色；ウシＡＡＶ：深紅色。
【０３３０】
ＰａｃＢｉｏライブラリー調製及び完全長単分子カプシド配列決定。ＰａｃＢｉｏからの「手順及びチェックリスト−２ｋｂ鋳型調製及び配列決定」プロトコールに従って、ＳＭＲＴｂｅｌｌ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｖ１．０（ＰａｃＢｉｏ  カタログ番号１００−２５９−１００）を使用してＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ）ＳＭＲＴｂｅｌｌライブラリーを調製した。ＰａｃＢｉｏ「結合及びアニーリング」計算機を使用してＳＭＲＴｂｅｌｌライブラリーのアニーリング及び結合に適した濃度を決定した。ＤＮＡ／ポリメラーゼ結合キットＰ６  ｖ２．０（ＰａｃＢｉｏ  カタログ番号１００−３７２−７００）を使用して配列決定のためにＳＭＲＴｂｅｌｌライブラリーをＰ６  ＤＮＡポリメラーゼに対してアニーリング及び結合させた。標準的なＭａｇＢｅａｄプロトコール及びＭａｇＢｅａｄ緩衝液キットｖ２．０（ＰａｃＢｉｏ  カタログ番号１００−６４２−８００）を使用して、結合したＳＭＲＴｂｅｌｌライブラリーをＳＭＲＴ細胞に対して負荷した。ＤＮＡ配列決定キット４．０  ｖ２（ＰａｃＢｉｏ  カタログ番号１００−６１２−４００、Ｐ６／Ｃ４化学系としても知られる）に関しては標準的なＭａｇＢｅａｄ配列決定プロトコールに従った。「Ｓｔａｇｅ  Ｓｔａｒｔ」を有効にしない状態で６時間の動画時間にわたって配列決定データを収集した。フィルタリングを最小完全通過＝３及び最小予測精度＝９５％に定めてＰａｃＢｉｏ  ＳＭＲＴ  ｐｏｒｔａｌ及びＲＳ＿ＲｅａｄｓＯｆＩｎｓｅｒｔ．１プロトコールを用いて、読取り環状共通配列（ＣＣＳ）を生じさせた。
【０３３１】
読取りＰａｃＢｉｏ配列の生命情報科学的評価。配列長２，３００〜２，３５０ヌクレオチドの読取りＣＣＳを下流における生命情報科学解析に組み入れた。読取りＣＣＳ中の挿入欠失の修正は、修正対象の挿入欠失を決定するために比較される正しい親ヌクレオチド配列を決定すべく最初に親ヌクレオチド配列を評価するものである社内アルゴリズムを使用して行った。挿入欠失を引き起こさない単一ヌクレオチド多型を維持した。その後、ＦＡＳＴＡ形式の修正配列をＭＵＳＣＬＥと整列させた４３。ＲＡｘＭＬにおいて最尤度法を用いて系統樹解析を行った４４。シャッフリング済みライブラリーの各アラインメント位置での各親の割合を同定する社内アルゴリズムを使用して親保存性パーセントを決定した。四角形の大きさが最大であることは変異型の１００％が、その親に由来するそのアミノ酸をその位置で共有していることを指し示す。四角形のその他あらゆる大きさは、その親に由来するそのアミノ酸をその位置で有する変異型の０〜１００％のパーセントに比例する。
【０３３２】
形質導入マウス実験。全てのマウスを、種々のカプシド血清型で偽型化された２Ｅ１１ｖｇ／マウスのｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰまたはｓｓＡＡＶ−ＬＳＰ１−ＧＦＰの正常動態静脈内外側尾静脈注射に供した。処置マウスを１４日間追跡観察し、吸入イソフルラン麻酔下で肝臓を採取した。肝組織をいくつかの葉から切り取っていくつかの２×５ｍｍ程度の切片にし、遮光して２５℃で５時間、１０倍体積の４％ＰＦＡ中に固定した。固定した組織をＰＢＳ中で１回洗浄し、一連のスクロース凍結保護及び再水和に供した（１０％ｗ／ｖのスクロースに２５℃で２時間、２０％ｗ／ｖのスクロースに４℃で一晩、３０％ｗ／ｖのスクロースに２５℃で４時間）。肝臓切片をＰＢＳ中で洗浄し、吸い取り乾燥させ、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  カタログ番号４５８３）を使用して凍結型（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  カタログ番号４５５７）の中に固定し、液体窒素で冷却したイソペンタン浴中で凍結させた。薄片にするときまで凍結型を−８０℃の所に置いた。
【０３３３】
肝臓免疫組織化学。軽微な改変を加えつつも、確立されたプロトコール４５に従って、肝臓切片のヒトＦＡＨのための蛍光染色を行った。改変には、薄片を室温のアセトン中ではなく氷冷メタノール中に１０分間固定すること；ｄＰＢＳ中５％ではなく１０％のロバ血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−２０４４）で１０分間、加湿チャンバ内にて室温でブロッキングすること；一次抗体溶液が、モノクローナルウサギ抗ヒトＦＡＨ  ＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＨＰＡ−０４１３７）を１０％ロバ血清中に１：１００（オーストラリア）または１：５００（米国）で存在させて４℃で一晩（米国）または室温で２時間（オーストラリア）インキュベートした１００μｌであったこと；二次抗体溶液が、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７  ＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ３１５７３）をＰＢＳＴ中に１：５００で存在させると共にヘキスト３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｈ−３５７９）を１：１，０００で存在させて室温で１時間暗条件下に置いた１００μｌであった（米国）か、または、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４  ＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ２１２０７）をＰＢＳ中に１：５００で存在させて室温で１時間暗条件下に置いた後にＤＡＰＩをＰＢＳ中８０ｎｇ／ｍＬで存在させた１００μｌであったこと；薄片の上に３滴のＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｐ３６９３４）（米国）またはＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｐ３６９６１）（オーストラリア）を載せたことを含んでいた。抗体効力対照は、二次のみの染色ならびに、陽性対照凍結ヒト肝臓組織切片（Ｚｙａｇｅｎ、カタログ番号ＨＦ−３１４）及び陰性対照凍結未処理マウス肝臓切片での実証を含んでいた。米国での共焦点イメージングは、２０Ｘの油含浸対物レンズを使用してＬｅｉｃａ  ＴＳＣ  ＳＰ８−Ｘ  ＷＬＬ倒立共焦点顕微鏡で行い、Ｌｅｉｃａ  ＡＦソフトウェア  ｖ３．３．０．１０１３４で撮像した一方、オーストラリアでの共焦点イメージングは２０Ｘの対物レンズを使用して倒立Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏで行い、Ｚｅｎ  Ｐｒｏソフトウェアで撮像した。Ｚ−ｓｔａｃｋは、ＩｍａｇｅＪ  ｖ２．０．０を使用して圧縮し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ６  ｖ１３．０で重ね合わた。マウス肝細胞またはヒト肝細胞とＡＡＶ−ＧＦＰ信号との信号共局在化は、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ  ｖ６．３ソフトウェアを使用して行い、切片の小部分に対する肉眼での計数によって再検証した。
【０３３４】
肝臓の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）。処置されたヒト化マウスからのＯＣＴ包埋凍結肝臓切片に対して逐次的なＲＮＡ及びＤＮＡのＦＩＳＨを記載４６にあるとおりに行った。ＲＮＡ  ＦＩＳＨ信号を局在させるために、多重の３Ｄ画像を取得すること、撮像された視野全ての座標を記録すること、及びＥＤＦ（拡張焦点深度）機能を使用して各視野からのペインを結合させて各撮像視野についての一連の単一焦点画像にすることによって薄片を分析した。続いて、ＤＮＡ  ＦＩＳＨを記載４６にあるとおりに完遂し、先に撮像した視野を同じ方法で再び撮像した。画像組を比較することによって、ＲＮＡ信号及びＤＮＡ信号の相対位置を決定することが可能になる。ＧＦＰ免疫染色を追加することで、ＡＡＶ移入ベクターＤＮＡの転写と翻訳との関係性が示された。画像は、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｃｏｏｌｓｎａｐ  ＥＳカメラ及びＮｉｋｏｎ  ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア  ｖ４．２を使用してＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００広視野顕微鏡（１．４のＮＡを有する６０Ｘ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズ）で撮影した。
【０３３５】
ヒト肝臓オルガノイド培養物の機能検証。２３歳男性からのヒト肝臓非実質細胞を、軽微な改変（ガストリンを省き、ＡＬＫ５阻害剤ＳＢ４３１５４２を添加した）を加えつつも記載４７、４８にあるとおりに培養した。オルガノイドの肝臓起源を機能的に実証するために、オルガノイド培養物からの培地をヒトアルブミンの存在に関してＥＬＩＳＡによって試験した（ヒトアルブミン＝５８．３ｎｇ／ｍＬ）。
【０３３６】
ＡＡＶによるヒト肝臓オルガノイド形質導入。開始した肝臓オルガノイド培養物を、２４ウェル懸濁用プレートにおいて２週間の増殖の後に１：４の比で標準オルガノイド条件（９５％超のマトリゲル中に埋め込み、その後に液体培地を添加する）へと継代させた。５回目のオルガノイド継代の後に、各血清型のｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰ製剤をＭＯＩ  ５００Ｋで各ウェルに添加した。培地は、３日間のインキュベーションの後及びその後毎日交換し、ＧＦＰ発現の出現を蛍光顕微鏡観察及び明視野撮像によって毎日追跡観察した。ＥＶＯＳ  Ｆ１イメージングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ番号ＡＭＦ４３００）で１４日間撮像した後、単一の肝細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１７９７９４５）でオルガノイドから解離させ、１００Ｋ個の解離した細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ）によってＧＦＰ陽性に関して分析した。
【０３３７】
ヒト血清中の抗ＡＡＶ抗体に関する血清反応性間接ＥＬＩＳＡアッセイ。５０名の健常米国成人（表４参照）の末梢血から採取したオフクロット血清を間接ＥＬＩＳＡにおいて一次抗体として使用した。数千人のドナーからのプールされたヒトＩｇＧ（Ｂａｘｔｅｒ、カタログ番号ＬＥ１５００１９０、ロット番号ＬＥ１２Ｐ１８０ＡＢ）を使用して検量線を作製した（ブロッキング用緩衝液中１００ｍｇ／ｍｌのＩＶＩＧ原液の１６種の２倍希釈液）。シャッフリング済みＡＡＶカプシド及び親ＡＡＶカプシドは抗原としての役割を果たした（５Ｅ８ベクターゲノム／ウェル）。ヒトＩｇＧ標準を６回反復的に評価し、全てのＡＡＶ試料を三重に評価した。ＩｇＧ標準及びＡＡＶ試料を５０μｌのコーティング溶液（水中１３ｍＭのＮａ２ＣＯ３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で９６ウェルイムノプレートのウェルに固定し、プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、ブロッキング用緩衝液（ＰＢＳ、６％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１時間、２５℃でブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで２回洗浄した。５０個のヒト血清試料の各々をブロッキング用緩衝液で希釈し（１：１００〜１：２，０００）、５０μｌを実験用ウェルに加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで２回洗浄した。ポリクローナルヒツジ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号ＮＡ９３３Ｖ）を洗浄用緩衝液で１：５００に希釈し、１００μｌを各ウェルに加えてヒト血清中の結合抗体を検出した。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで２回洗浄した。ＯＰＤ基質（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｐ４６６４）を１００μｌ／ウェルで０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液に添加し、プレートを２５℃で正確に１０分間インキュベートした。５０μＬ／ウェルの３Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４９０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で決定した。一連のブランクウェルを使用して、イムノプレートに対する抗体の非特異的結合によるバックグラウンドを差し引いた。４パラメータロジスティック曲線近似を用いて標準をプロットし、Ｐｒｉｓｍ  ｖ６．０ソフトウェアを使用して、希釈系列の線形範囲内及び検出限界内に入る試料濃度を決定した。血友病を有する２１名の成人男性（表９参照）に対して同じアッセイを行った。
【０３３８】
正常アカゲザル血清中の抗ＡＡＶ抗体に関する血清反応性間接ＥＬＩＳＡアッセイ。血清反応性ＥＬＩＳＡは、１Ｅ９ｖｐ／ウェルでコーティングされたプレートを使用して、以前に記載４９がなされているとおりに行った。オフクロット血清を６頭のアカゲザル（表６参照）からの末梢血から採取した。
【０３３９】
個々のヒト血清試料に関する発光に基づくＡＡＶ中和アッセイ。中和アッセイを、以前に記載５０がなされているとおりに行った。オフクロット血清を２１名の健常な欧州個人（表８参照）の末梢血から採取した。ｓｓＡＡＶ−ＣＭＶ−ＦＬｕｃベクターを２００のＭＯＩで移入ベクターとして使用した。
【０３４０】
擬似カラー構造カプシドマッピング。Ｐｙｍｏｌ  ｖ１．７．６．０を使用してキメラカプシドをＡＡＶ２カプシド構造１ＬＰ３５１に対して偽色マッピングした。マッピングされた色は、親断片交差マップにおいて使用する親血清型の色に対応する。外側のカプシド図は、示されている全ての鎖を有する一方、横断面図は、除去されてカプシド内腔を露出させた５回対称軸の所でシリンダーを囲んでいる鎖を有する。
【０３４１】
統計。統計解析は、Ｐｒｉｓｍ  ｖ６及びエクセル  ｖ１４．５．８ソフトウェアを使用して行った。図１５中の各パネルの実験値は、トゥーキーの多重比較検定を用いて二元配置ＡＮＯＶＡによって評価する前にｌｏｇ＋１変換された。Ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であるとみなされる。さらなる実験誤差は、等しい分散を仮定したスチューデントのｕｎｐａｉｒｅｄ両側ｔ検定を用いて評価した。
参考文献
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５  Ｎａｔｈｗａｎｉ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６５，２３５７−２３６５，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａｌ１０８０４６（２０１１）。
６  Ｌｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｅｘａｍｉｎｅｄ  
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７  Ｅｒｌｅｓ，Ｋ．，Ｓｅｂｏｋｏｖａ，Ｐ．＆Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （ＩｇＧ  ａｎｄ  ＩｇＭ）  ｔｏ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  （ＡＡＶ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５９，４０６−４１１（１９９９）。
８  Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｎｅｗｂｏｒｎｓ，ｃｈｉｌｄｒｅｎ，ａｎｄ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ＣＶＩ  １８，１５８６−１５８８，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＣＶＩ．０５１０７−１１（２０１１）。
９  Ｌｉｎｇ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｉｖｅｒ−ｔｒｏｐｉｃ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  １００  ｈｅａｌｔｈｙ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｏｄｙ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３，３４１−３４６，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ２０９５−４９６４（１５）６０２００−Ｘ（２０１５）。
１０  Ｌｉｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＡＡＶ２，ＡＡＶ５  ａｎｄ  ＡＡＶ８  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｎｄ  ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２１，７３２−７３８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．４７（２０１４）。
１１  Ｌｉｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＡＡＶ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  １  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＡＡＶ１  ｖｅｃｔｏｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８５，１５５０−１５５６，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｍｖ．２３６４７（２０１３）。
１２  Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．ＣＤ８（＋）Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３，４１９−４２２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ１５４９（２００７）。
１３  Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎｔｅｒｂｒｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２，５８８７−５９１１，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００２５４−０８（２００８）。
１４  Ｌｉ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｕｆｆｌｅｄ  ＡＡＶ  ｇｅｎｏｍｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １６，１２５２−１２６０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２００８．１００（２００８）。
１５  Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．＆Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｄ．Ｖ．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５，４４５−４５１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ３７４２（２０１４）。
１６  Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｃｒｏｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｉｚｕｒｅ−ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ（ＢＢＢ）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８，５７０−５７８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２００９．２９２（２０１０）。
１７  Ｊａｎｇ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖａｒｉａｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９，６６７−６７５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２８７（２０１１）。
１８  Ｄａｖｉｄｏｆｆ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２，  ５，ａｎｄ  ８  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１，８７５−８８８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２００４．１２．０２２（２００５）。
１９  Ｎａｔｈｗａｎｉ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ａｆｔｅｒ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｖｅｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｓｔａｂｌｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＦＩＸ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０９，１４１４−１４２１，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００６−０３−０１０１８１（２００７）。
２０  Ｎａｔｈｗａｎｉ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｉｖｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｅｎａｂｌｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｌｉｖｅｒ．Ｂｌｏｏｄ  １０７，２６５３−２６６１，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００５−１０−４０３５（２００６）。
２１  Ｓａｌｇａｎｉｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｍａｙ  ｐｌａｙ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８８，１０７１−１０７９，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２０９３−１３（２０１４）。
２２  Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｓ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．＆Ｗｏｎｇ，Ｋ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ．Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｐａｔｅｎｔ（２０１５）。
２３  Ｘｉａｏ，Ｗ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３，３９９４−４００３（１９９９）。
２４  Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ，Ｃ．，  Ｓｏｌｔｙｓ，Ｓ．，  Ｒｅｎｇｏ，Ｇ．＆Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＡＶ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  １−９  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １６，１０７３−１０８０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２００８．７６（２００８）。
２５  Ａｚｕｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｂｕｓｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，９０３−９１０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１３２６（２００７）。
２６  Ｔｕｒｕｎｅｎ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＬＤＬＲ  ａｎｄ  ＶＬＤＬＲ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２４，６２０−６３５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１５．２２１（２０１６）。
２７  Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，  Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｌ．  Ｈ．，  Ｇａｏ，Ｇ．，  Ｌｉｎ，Ｊ．＆Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９９，３８１−３９０，ｄｏｉ：１０．１０８６／５９５８３０（２００９）。
２８  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａｒｅｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  １７，２４３６−２４４２，ｄｏｉ：１０．１００２／ｉｂｄ．２１６７３（２０１１）。
２９  Ｗａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｗｉｔｈ  ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＡＡＶ  Ｃａｐｓｉｄｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３，１８７７−１８８７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１５．１７９（２０１５）。
３０  Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｅｓｔ  ＡＡＶ  Ｃａｐｓｉｄ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３，１８００−１８０１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１５．２０６（２０１５）。
３１  Ｚｅｎ，Ｚ．，  Ｅｓｐｉｎｏｚａ，Ｙ．，  Ｂｌｅｕ，Ｔ．，  Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．＆Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｔｉｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｅｖｅｎｔｓ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １５，７０９−７１５，ｄｏｉ：１０．１０８９／１０４３０３４０４１３６１２６２（２００４）。
３２  Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＡＶ−２  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｖｉａ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｐｓｉｄ  ＥＬＩＳＡ：ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｃａｎ  ｌｉｍｉｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＡＶ−２．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ６，１３２２−１３３０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｇｔ．３３００９４６（１９９９）。
３３  Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．＆Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＡＡＶ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４，３４１，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００３４１（２０１３）。
３４  Ｂｏｕｔｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｔｙｐｅｓ  １，  ２，  ５，  ６，  ８，ａｎｄ  ９  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２１，７０４−７１２，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２００９．１８２（２０１０）。
３５  Ｈａｌｂｅｒｔ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｔｙｐｅｓ  ２，  ５，ａｎｄ  ６  ｉｎ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １７，４４０−４４７，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２００６．１７．４４０（２００６）。
３６  Ｈａｎ，Ｘ．＆Ｎｉ，Ｗ．Ｃｏｓｔ−Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｂｅｒａ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｐａｓｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｖａｌｕｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８，Ａ７５６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖａｌ．２０１５．０９．２４６１（２０１５）。
３７  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｃ．＄１−ｍｉｌｌｉｏｎ  ｐｒｉｃｅ  ｔａｇ  ｓｅｔ  ｆｏｒ  Ｇｌｙｂｅｒａ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３，２１７−２１８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ０３１５−２１７（２０１５）。
３８  Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．＆Ｈｉｇｈ，Ｋ．Ａ．Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｔｏ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ  １２２，２３−３６，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１３−０１−３０６６４７（２０１３）。
３９  Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８，１４６−１５７（２００２）。
４０  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｓ．Ｃ．，  Ｄａｎｅ，Ａ．Ｐ．，  Ｓｐｉｎｏｕｌａｓ，Ａ．，  Ｌｏｇａｎ，Ｇ．Ｊ．＆Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｉ．Ｅ．  Ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ＡＡＶ２／８  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １６，１０８１−１０８８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２００８．７２（２００８）。
４１  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ＦＲＧＮ  ｍｉｃｅ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３，４０４−４１２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｃｒ．２０１４．０８．００６（２０１４）。
４２  Ｈｕａｎｇ，Ｗ．，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｗ．Ａ．，  Ｂｏｄｅｎ，Ｍ．＆Ｇｉｌｌａｍ，Ｅ．Ｍ．  ＲｅＸ：Ａ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ，ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６０，９１−９４，ｄｏｉ：１０．２１４４／０００１１４３８１  （２０１６）。
４３  Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．ＭＵＳＣＬＥ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２，１７９２−１７９７，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ３４０（２００４）。
４４  Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ，Ａ．，  Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．＆Ｍｅｉｅｒ，Ｈ．  ＲＡｘＭＬ−ＩＩＩ：ａ  ｆａｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒｅｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１，４５６−４６３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｉ１９１（２００５）。
４５  Ｂａｒｚｅｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１７，３６０−３６４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３８６４（２０１５）。
４６  Ｎａｍｅｋａｗａ，Ｓ．Ｈ．，  Ｐａｙｅｒ，Ｂ．，  Ｈｕｙｎｈ，Ｋ．Ｄ．，  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．＆Ｌｅｅ，Ｊ．Ｔ．  Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｘ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｒｅｐｅａｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｇｅｎｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３０，３１８７−３２０５，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＭＣＢ．００２２７−１０（２０１０）。
４７  Ｈｕｃｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  Ｌｇｒ５＋  ｌｉｖｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｗｎｔ−ｄｒｉｖｅｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９４，２４７−２５０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１８２６（２０１３）。
４８  Ｄｏｒｒｅｌｌ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｏｒｇａｎｏｉｄ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ａｒｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｉｍｉｌａｒ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３，２７５−２８３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｃｒ．２０１４．０７．００６（２０１４）。
４９  Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２０，４１７−４２４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１２．５５（２０１３）。
５０  Ｍｅｌｉａｎｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｉｔｅｒ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６，４５−５３，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１５．０３７（２０１５）。
５１  Ｘｉｅ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ａｔｏｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ−２），ａ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９，１０４０５−１０４１０，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．ｌ６２２５０８９９（２００２）。
５２  Ｄａｎｅ，Ａ．Ｐ．，  Ｗｏｗｒｏ，Ｓ．Ｊ．，  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｓ．Ｃ．＆Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｉ．Ｅ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ  ＡＡＶ  ｐｓｅｕｄｏ−ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２０，４６０−４６４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１２．６７（２０１３）。
５３  Ｌｉ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｗｉｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＡＡＶ３Ｂ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３，１８６７−１８７６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１５．１７４（２０１５）。
５４  Ｄ’Ａｖｏｌａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ  ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  ｐｏｒｐｈｙｒｉａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ６５，７７６−７８３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｈｅｐ．２０１６．０５．０１２（２０１６）。
５５  ｕｎｉＱｕｒｅ．Ｐｒｅｓｓ  ｒｅｌｅａｓｅ：ｕｎｉＱｕｒｅ  ａｎｎｏｕｎｃｅｓ  ｆｉｒｓｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  ｓｅｃｏｎｄ  ｄｏｓｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｏｆ  ＡＭＴ−０６０  ｉｎ  ｏｎｇｏｉｎｇ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ．（２０１６）。
５６  Ｐａｎｅｄａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｇｅｎｄｅｒｓ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２０，９０８−９１７，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２００９．０３１（２００９）。
５７  Ｎａｋａｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ８  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９，２１４−２２４，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７９．１．２１４−２２４．２００５（２００５）。
５８  Ｍａｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  −ＤＪ  ｃａｐｓｉｄ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．ＢＭＣ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６，１，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓｌ２８９６−０１５−０２３０−０（２０１６）。
【０３４２】
上に明記した例は、当業者に本発明の組成物、システム及び方法の実施形態をいかにして作りそして用いるかについての完全な開示及び説明を与えるために提供されているのであって、本発明者らが本発明とみなしているものの範囲を限定することを意図したものはない。当業者にとって自明な、本発明を実施するための上記の形態の改変は、以下の特許請求の範囲に含められることが意図される。本明細書中で言及した全ての特許及び刊行物は、本発明との関連がある技術分野において技量を有する者の技量レベルを示す。本開示において引用した全ての参考文献は、各参考文献を参照によりその全体を個別に援用したのと同じ程度に、参照により援用される。
【０３４３】
全ての見出し及び節題は、明確さ及び参照のために使用しているに過ぎず、決して限定しているとみなされるべきでない。例えば、当業者であれば、本明細書に記載の本発明の趣旨及び範囲に従って異なる見出し及び節からの様々な態様を適宜組み合わせることの有用性を認識するであろう。
【０３４４】
本明細書中で引用した全ての参考文献は、個々の刊行物または特許または特許出願を参照によりあらゆる目的のために全体として援用することを具体的かつ個別に示したのと同じ程度に、参照によってあらゆる目的のためにそれらの全体として本明細書に援用される。
【０３４５】
当業者には明らかなことであろうが、本願の趣旨及び範囲から逸脱することなく本願の多くの改変及び変更を行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態及び実施例は、例として示されているに過ぎず、本願は、別記の特許請求の範囲の語句、及び特許請求の範囲によって認められる均等物の全範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
2019509032.tif 000022
【図２】
2019509032.tif 000023
【図３】
2019509032.tif 000024
【図４】
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【図５】
2019509032.tif 000026
【図６】
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【図７】
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【図８】
2019509032.tif 000029
【図９】
2019509032.tif 000030
【図１０】
2019509032.tif 000031
【図１１Ａ】
2019509032.tif 000032
【図１１Ｂ】
2019509032.tif 000033
【図１１Ｃ】
2019509032.tif 000034
【図１１Ｄ】
2019509032.tif 000035
【図１２】
2019509032.tif 000036
【図１３】
2019509032.tif 000037
【図１４】
2019509032.tif 000038
【図１５】
2019509032.tif 000039
【図１６】
2019509032.tif 000040
【図１７】
2019509032.tif 000041
【図１８】
2019509032.tif 000042
【図１９】
2019509032.tif 000043
【図２０】
2019509032.tif 000044
【図２１】
2019509032.tif 000045
【図２２】
2019509032.tif 000046
【図２３】
2019509032.tif 000047
【図２４】
2019509032.tif 000048
【配列表】
2019509032000001.app
【国際調査報告】
2019509032.tif 000049
2019509032.tif 000050
2019509032.tif 000051
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2019509032.tif 000053
2019509032.tif 000054
2019509032.tif 000055