(57)【要約】本明細書では、心血管疾患（ＣＶＤ）または他のＨＤＬ関連疾患に罹患している対象、または罹患が疑われる対象由来の試料から１種以上のＨＤＬ関連タンパク質（例えば、ＡｐｏＣ３；ＡｐｏＣ３及びＡｐｏＡ１；ＡｐｏＣ３及びＳＡＡ１／２；またはバイオマーカーパネル１〜３０のタンパク質）を検出するための方法、システム、及び組成物を提供する。ある特定の実施形態では、そのような方法、システム、及び組成物を使用して、対象でのＣＶＤ（または他の疾患）の概算リスク、及び／または試料の概算コレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）を決定する。
2019523431.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象由来の試料中の少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルを検出することを含む方法であって、前記少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質がＡｐｏＣ３を含み、前記対象は心血管疾患に罹患しているかまたは罹患の疑いがある、前記方法。
【請求項２】
前記試料が精製された高密度リポタンパク質試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、血清試料、血漿試料、及び血液試料からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質の前記レベルを総計のＨＤＬ粒子、またはＡｐｏＡ１、またはＨＤＬコレステロールの前記概算レベルで正規化して、少なくとも１種のＨＤＬタンパク質の正規化値を生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料中の総計のＨＤＬ粒子、またはＡｐｏＡ１、またはＨＤＬコレステロールの概算レベルの前記決定に、前記試料に添加された内部標準物質のレベルを決定することを含み、前記内部標準物質に標識ＨＤＬタンパク質を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１種のＨＤＬタンパク質のレベルの前記検出に、前記試料に試薬を添加することを含み、前記試薬は前記試料中のＨＤＬタンパク質を消化する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの前記検出に、ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片を検出するアッセイを、前記試料の少なくとも一部に対して実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アッセイが質量分析アッセイまたはイムノアッセイである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質がアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種のＨＤＬタンパク質のレベルの前記検出に、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、及びｉｉ）ＡｐｏＡ１またはＡｐｏＡ１断片を検出するアッセイを実施することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質がアポリポタンパク質Ｃ１（ＡｐｏＣ１）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの前記検出に、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、及びｉｉ）ＡｐｏＣ１またはＡｐｏＣ１断片を検出するアッセイを実施することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質がアポリポタンパク質Ｃ２（ＡｐｏＣ２）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの前記検出に、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、及びｉｉ）ＡｐｏＣ２またはＡｐｏＣ２断片を検出するアッセイを実施することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）心血管疾患に罹患している対象、または罹患が疑われる対象由来の試料と、
ｂ）第１の成分と、を含み、前記第１の成分が
ｉ）アポリポタンパク質Ｃ３（ＡｐｏＣ３）結合剤、及び／または
ｉｉ）ＡｐｏＣ３質量分析標準物質を含む、システムまたは組成物。
【請求項１６】
ｃ）前記試料中のシグナルを、前記試料中に存在する総計のＨＤＬ粒子、ＡｐｏＡ１、またはＨＤＬコレステロールの概算レベルで正規化するための較正物質として機能し得る検出可能な標識ＨＤＬタンパク質を含んでいる組成物を含む第２の成分をさらに含む、請求項１５に記載のシステムまたは組成物。
【請求項１７】
前記試料が、血清試料、血漿試料、血液試料、及び精製された高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）試料からなる群から選択される、請求項１５に記載のシステムまたは組成物。
【請求項１８】
ｃ）ｉ）アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＡ１質量分析標準物質を含む、第２の成分をさらに含む、請求項１５に記載のシステムまたは組成物。
【請求項１９】
ｃ）ｉ）アポリポタンパク質Ｃ１（ＡｐｏＣ１）結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＣ１質量分析標準物質を含む、第２の成分をさらに含む、請求項１５に記載のシステムまたは組成物。
【請求項２０】
ｃ）ｉ）アポリポタンパク質Ｃ２（ＡｐｏＣ２）結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＣ２質量分析標準物質を含む、第２の成分をさらに含む、請求項１５に記載のシステムまたは組成物。
【請求項２１】
心血管疾患の概算リスク及び／または概算のコレステロール逆転送能を決定する方法であって、
ａ）対象由来の試料において、バイオマーカーパネル１７、１８、及び／または１９
（前記バイオマーカーパネル１７は、タンパク質ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、及びＡｐｏＣ３を含み、
前記バイオマーカーパネル１８は、タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、及びＡｐｏＣ４を含み、
前記バイオマーカーパネルは、タンパク質ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＤ、及びＳＡＡ１／２を含む）
のＨＤＬ関連タンパク質それぞれのレベルを検出することと；
ｂ）前記対象での心血管疾患（ＣＶＤ）の概算リスク及び／または前記試料の前記概算コレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）を決定することを含む、前記方法。
【請求項２２】
前記試料が、血清試料、血漿試料、血液試料、及び精製された高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）試料からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記決定に、第１のアルゴリズムを用いて、心血管疾患（ＣＶＤ）リスクスコアまたはコレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）スコアを生成することを含み、前記第１のアルゴリズムが、ｉ）各ＨＤＬ関連タンパク質レベルに所定の係数を乗じて乗算値を生成することと、ｉｉ）前記乗算値を合計してパネル固有の定数値を加算することを含む演算を実行し、それによって前記ＣＶＤリスクスコアまたは前記ＣＥＣスコアを生成する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ｃ）前記ＣＶＤリスクスコア及び／または前記ＣＥＣスコアを示すレポートを生成することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年７月２１日出願の米国仮出願第６２／３６５，１７５号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本明細書では、心血管疾患（ＣＶＤ）または他のＨＤＬ関連疾患に罹患している対象、または罹患が疑われる対象由来の試料から１種以上のＨＤＬ関連タンパク質（例えば、ＡｐｏＣ３；ＡｐｏＣ３及びＡｐｏＡ１；ＡｐｏＣ３及びＳＡＡ１／２；またはバイオマーカーパネル１〜３０のタンパク質）を検出するための方法、システム、及び組成物を提供する。ある特定の実施形態では、そのような方法、システム、及び組成物を使用して、対象でのＣＶＤ（または他の疾患）の概算リスク、及び／または試料の概算コレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）を決定する。特定の実施形態では、システム及び組成物は、ＣＶＤに罹患している対象または罹患が疑われる対象由来の試料、及びＨＤＬ関連結合剤または質量分析標準物質で構成される。
【背景技術】
【０００３】
近年、心血管疾患の病態生理学に関する理解と、アテローム性プラークの画像化技術のいずれもが進歩しているにもかかわらず、安定期の心臓病患者におけるリスクを正確に決定することは依然として困難である。積極的なリスク因子の改善を受けておらず、重大な心臓の有害事象を経験している臨床的に未確認の高リスク患者は重大な問題である。同様に、有限なヘルスケア資源を最も効果がありそうな人々へ再集中するには、リスクの低い対象をより正確に識別することが必要である。現在の臨床的リスク評価ツールは、大半が、未処置の一次予防集団の疫学に基づく研究から開発されたアルゴリズムに関連するものであり、高リスク及び投薬中の心臓病外来患者の場合に適用が限定されている。関心は高いものの、心臓リスク層別化を改善するためのより網羅的なアレイベースのフェノタイピング技術（例えば、ゲノムアレイ、プロテオームアレイ、メタボロームアレイ、発現アレイ）を取り入れる努力はまだ始まったばかりであり、臨床診療に要求される高速性に対応できる効率的かつ確実なプラットフォームにはまだ至っていない。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書では、心血管疾患（ＣＶＤ）または他のＨＤＬ関連疾患に罹患している対象、または罹患が疑われる対象由来の試料から１種以上のＨＤＬ関連タンパク質（例えば、ＡｐｏＣ３；ＡｐｏＣ３及びＡｐｏＡ１；ＡｐｏＣ３及びＳＡＡ１／２；またはバイオマーカーパネル１〜３０のタンパク質）を検出するための方法、システム、及び組成物を提供する。ある特定の実施形態では、そのような方法、システム、及び組成物を使用して、対象でのＣＶＤ（または他の疾患）の概算リスク、及び／または試料の概算コレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）を決定する。特定の実施形態では、システム及び組成物は、ＣＶＤに罹患している対象または罹患が疑われる対象由来の試料、及びＨＤＬ関連結合剤または質量分析標準物質で構成される。
【０００５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法には、対象由来の試料中の少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルを検出することを含み、その場合、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質はＡｐｏＣ３を含み、対象は心血管疾患に罹患しているかまたは罹患の疑いがある。ある特定の実施形態では、試料は精製された高密度リポタンパク質試料である。他の実施形態では、試料は、血清試料、血漿試料、及び血液試料からなる群から選択される。追加の実施形態では、本方法は、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルを総計のＨＤＬ粒子、またはＡｐｏＡ１、またはＨＤＬコレステロールの概算レベルで正規化して、少なくとも１種のＨＤＬタンパク質の正規化値を生成することをさらに含む。
【０００６】
特定の実施形態では、試料中の総計のＨＤＬ粒子、またはＡｐｏＡ１、またはＨＤＬコレステロールの概算レベルの決定には、試料に添加された内部標準物質のレベルを決定することを含み、その場合、内部標準物質には標識ＨＤＬタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬタンパク質のレベルの検出には、試料に試薬を添加することを含み、その場合、試薬は試料中のＨＤＬタンパク質を消化する（例えば、Ｌｙｃ−Ｃ、ペプシン、トリプシンなど）。他の実施形態では、ＨＤＬ関連タンパク質は事前に消化せずに検出される（例えば、インタクトなＨＤＬ関連タンパク質を検出する）。
【０００７】
他の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片を検出するアッセイを、試料の少なくとも一部に対して実施することを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、標識または非標識のＡｐｏＣ３タンパク質またはタンパク質断片標準物質を試料に添加すること、及びＡｐｏＣ３標準物質を検出することをさらに含む。さらなる実施形態では、ＡｐｏＣ３標準物質は、配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、アッセイは質量分析アッセイまたはイムノアッセイである。
【０００８】
特定の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質は血清アミロイドＡ１または２（ＳＡＡ１及び／またはＳＡＡ２、本明細書で「ＳＡＡ１／２」と称する）をさらに含む。さらなる実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬタンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、及びｉｉ）ＳＡＡ１／２またはＳＡＡ１／２断片を検出するアッセイを実施することを含む。追加の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、標識または非標識のＳＡＡ１／２タンパク質またはタンパク質断片標準物質を試料に添加すること、及びＳＡＡ１／２標準物質を検出することをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＳＡＡ１／２標準物質は、配列番号３５に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【０００９】
さらなる実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質はアポリポタンパク質１（ＡｐｏＡ１）をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、及びｉｉ）ＡｐｏＡ１またはＡｐｏＡ１断片を検出するアッセイを実施することを含む。他の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、ｉｉ）ＳＡＡ１／２またはＳＡＡ１／２断片、及びｉｉｉ）ＡｐｏＡ１またはＡｐｏＡ１断片を検出するアッセイを実施することを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、標識または非標識のＡｐｏＡ１タンパク質またはタンパク質断片標準物質を試料に添加すること、及びＡｐｏＡ１標準物質を検出することをさらに含む。他の実施形態では、ＡｐｏＡ１標準物質は、配列番号１または２に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００１０】
さらなる実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質はアポリポタンパク質Ｃ１（ＡｐｏＣ１）をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、及びｉｉ）ＡｐｏＣ１またはＡｐｏＣ１断片を検出するアッセイを実施することを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質はアポリポタンパク質Ｃ１（ＡｐｏＣ２）をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、及びｉｉ）ＡｐｏＣ１またはＡｐｏＣ２断片を検出するアッセイを実施することを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質はアポリポタンパク質Ｃ４（ＡｐｏＣ４）をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、及びｉｉ）ＡｐｏＣ１またはＡｐｏＣ４断片を検出するアッセイを実施することを含む。特定の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、ｉｉ）ＡｐｏＡ１またはＡｐｏＡ１断片、及びｉｉｉ）ＡｐｏＣ１またはＡｐｏＣ１断片を検出するアッセイを実施することを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、ｉｉ）ＡｐｏＡ１またはＡｐｏＡ１断片、及びｉｉｉ）ＡｐｏＣ２またはＡｐｏＣ２断片を検出するアッセイを実施することを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質はアポリポタンパク質Ｌ１（ＡｐｏＬ１）及びリン脂質輸送タンパク質（ＰＬＴＰ）をさらに含む。他の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、ｉｉ）ＳＡＡ１／２またはＳＡＡ１／２断片、ｉｉｉ）ＡｐｏＬ１またはＡｐｏＬ１断片、及びｉｖ）ＰＬＴＰまたはＰＬＴＰ断片を検出するアッセイを実施することを含む。他の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、標識もしくは非標識のＡｐｏＬ１タンパク質もしくはタンパク質断片標準物質及び／または標識もしくは非標識のＰＬＴＰタンパク質もしくはタンパク質断片標準物質を試料に添加すること、ならびにＡｐｏＬ１標準物質及び／またはＰＬＴＰ標準物質を検出することをさらに含む。追加の実施形態では、ＡｐｏＬ１標準物質は、配列番号１８または１９に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＰＬＴＰ標準物質は配列番号３１または３２を含むかまたはそれからなる。
【００１２】
他の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質はアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、ｉｉ）ＳＡＡ１／２またはＳＡＡ１／２断片、ｉｉｉ）ＡｐｏＬ１またはＡｐｏＬ１断片、ｉｖ）ＰＬＴＰまたはＰＬＴＰ断片、及びｖ）ＡｐｏＥまたはＡｐｏＥ断片を検出するアッセイを実施することを含む。他の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、標識または非標識のＡｐｏＥタンパク質またはタンパク質断片標準物質を試料に添加すること、及びＡｐｏＥ標準物質を検出することをさらに含む。さらなる実施形態では、ＡｐｏＥ標準物質は、配列番号１５または１６に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００１３】
ある特定の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質はアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）及びアポリポタンパク質Ｄ（ＡｐｏＤ）をさらに含む。さらなる実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、ｉｉ）ＳＡＡ１／２またはＳＡＡ１／２断片、ｉｉｉ）ＡｐｏＬ１またはＡｐｏＬ１断片、ｉｖ）ＰＬＴＰまたはＰＬＴＰ断片、ｖ）ＡｐｏＥまたはＡｐｏＥ断片、ｖｉ）ＡｐｏＡ１またはＡｐｏＡ１断片、及びｖｉｉ）ＡｐｏＤまたはＡｐｏＤ断片を検出するアッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、標識または非標識のＡｐｏＤタンパク質またはタンパク質断片標準物質を試料に添加すること、及びＡｐｏＤ標準物質を検出することをさらに含む。特定の実施形態では、ＡｐｏＤ標準物質は、配列番号１３または１４に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、標識または非標識のＡｐｏＡ１タンパク質またはタンパク質断片標準物質を試料に添加すること、及びＡｐｏＡ１標準物質を検出することをさらに含む。
【００１４】
他の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質はアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）及びリン脂質輸送タンパク質（ＰＬＴＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、ｉｉ）ＳＡＡ１／２またはＳＡＡ１／２断片、ｉｉｉ）ＡｐｏＭまたはＡｐｏＭ断片、及びｉｖ）ＰＬＴＰまたはＰＬＴＰ断片を検出するアッセイを実施することを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、標識もしくは非標識のＡｐｏＭタンパク質もしくはタンパク質断片標準物質及び／または標識もしくは非標識のＰＬＴＰタンパク質もしくはタンパク質断片標準物質を試料に添加すること、ならびにＡｐｏＭ及び／またはＰＬＴＰ標準物質を検出することをさらに含む。追加の実施形態では、ＡｐｏＭ標準物質は、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＰＬＴＰ標準物質は配列番号３１または３２に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００１５】
追加の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質はアポリポタンパク質Ｃ１（ＡｐｏＣ１）をさらに含む。さらなる実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、ｉｉ）ＳＡＡ１／２またはＳＡＡ１／２断片、及びｉｉｉ）ＡｐｏＣ１またはＡｐｏＣ１断片を検出するアッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、標識または非標識のＡｐｏＣ１タンパク質またはタンパク質断片標準物質を試料に添加すること、及びＡｐｏＣ１標準物質を検出することをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ１標準物質は、配列番号７または８に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００１６】
追加の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質はアポリポタンパク質Ｄ（ＡｐｏＤ）をさらに含む。さらなる実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、ｉｉ）ＳＡＡ１／２またはＳＡＡ１／２断片、及びｉｉｉ）ＡｐｏＤまたはＡｐｏＤ断片を検出するアッセイを実施することを含む。他の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、標識または非標識のＡｐｏＤタンパク質またはタンパク質断片標準物質を試料に添加すること、及びＡｐｏＤ標準物質を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＤ標準物質は、配列番号１３または１４に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質は、少なくともＣＬＵ、ＡｐｏＥ、ＣＥＴＰ、ＰＯＮ１、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＭ、ＰＬＴＰ、及びＡｐｏＬ１からなる群から選択される追加タンパク質をさらに含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、ｉｉ）ＳＡＡ１／２またはＳＡＡ１／２断片、及びｉｉｉ）少なくとも１つの追加タンパク質またはその断片を検出するアッセイを実施することを含む。特定の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、少なくとも１つの追加タンパク質に対応する、標識または非標識のタンパク質またはタンパク質断片標準物質を添加すること、及び対応する標準物質を検出することをさらに含む。さらなる実施形態では、対応する標準物質は、配列番号２３、２４、１５、１６、２１、２２、３３、３４、７、８、３、４、９、１０、２０、３１、３２、１８、及び１９に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００１８】
ある特定の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質はＡｐｏＣ１及びＡｐｏＣ２をさらに含む。他の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、ｉｉ）ＡｐｏＣ１またはＡｐｏＣ１断片、及びｉｉｉ）ＡｐｏＣ２またはＡｐｏＣ２断片を検出するアッセイを実施することを含む。追加の実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、標識もしくは非標識のＡｐｏＣ１タンパク質もしくはタンパク質断片標準物質を試料に添加すること、及び／または標識もしくは非標識のＡｐｏＣ２タンパク質もしくはタンパク質断片標準物質を試料に添加すること、ならびにＡｐｏＣ１及び／またはＡｐｏＣ２標準物質を検出することをさらに含む。さらなる実施形態では、ＡｐｏＣ１標準物質は、配列番号７または８に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ＡｐｏＣ２標準物質は配列番号９または１０に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。さらなる実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質には、アポリポタンパク質Ｃ１（ＡｐｏＣ１）と、ＡｐｏＭ、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ４、ＣＬＵ、ＳＡＡ４、ＡｐｏＬ１、ＨＰ、Ｃ３、及びＰＬＴＰからなる群から選択される少なくとも１つの追加タンパク質とをさらに含む。さらなる実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、ｉ）ＡｐｏＣ３またはＡｐｏＣ３断片、ｉｉ）ＳＡＡ１／２またはＳＡＡ１／２断片、ｉｉｉ）ＡｐｏＣ１またはＡｐｏＣ１断片、及びｉｖ）少なくとも１つの追加タンパク質またはその断片を検出するアッセイを実施することを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルの検出には、標識もしくは非標識のＡｐｏＣ１タンパク質もしくはタンパク質断片標準物質及び／または標識もしくは非標識の追加タンパク質もしくはタンパク質断片標準物質を添加すること、ならびにＡｐｏＣ１標準物質及び／または追加タンパク質標準物質を検出することをさらに含む。他の実施形態では、ＡｐｏＣ１標準物質は、配列番号７または８に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、追加タンパク質標準物質は配列番号２３、２４、９、１０、２０、３１、３２、１８、１９、１、２、１２、３６、３７、２７、２８、２５、または２６に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００１９】
さらなる実施形態では、本明細書で提供する方法は、対象由来の試料において、バイオマーカーパネル１〜３０のうちの少なくとも１つの、ＨＤＬ関連タンパク質それぞれのレベルを検出することを含む。バイオマーカーパネル１〜２６は表２に示し、バイオマーカーパネル２７〜３０は表５４に示す。ある特定の実施形態では、対象はヒト（例えば、ヒト男性またはヒト女性）である。ある特定の実施形態では、ヒトは心血管疾患に罹患していると診断されている。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるシステム及び組成物は、ａ）心血管疾患に罹患している対象、または罹患が疑われる対象由来の試料と、ｂ）第１の成分とを含み、第１の成分が、ｉ）アポリポタンパク質Ｃ３（ＡｐｏＣ３）結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＣ３質量分析標準物質を含む。
【００２１】
ある特定の実施形態では、システム及び組成物は、ｃ）試料中のシグナルを、試料中に存在する総計のＨＤＬ粒子、ＡｐｏＡ１、またはＨＤＬコレステロールの概算レベルで正規化するための較正物質として機能し得る検出可能な標識ＨＤＬタンパク質を含んでいる組成物を含む第２の成分をさらに含む。他の実施形態では、検出可能な標識ＨＤＬタンパク質は、標識（例えば、同位体標識）ＡｐｏＡ１タンパク質またはその断片を含む。ある特定の実施形態では、試料は、血清試料、血漿試料、血液試料、及び精製された高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）試料からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３結合剤には、抗ＡｐｏＣ３抗体もしくはその結合部分、または抗ＡｐｏＣ３核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含む。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３質量分析標準物質には、同位体標識または非標識のＡｐｏＣ３タンパク質またはタンパク質断片を含む。さらなる実施形態では、このタンパク質断片は、配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００２２】
他の実施形態では、システムまたは組成物は、ｃ）ｉ）血清アミロイドＡ１／２（ＳＡＡ１／２）結合剤、及び／またはｉｉ）ＳＡＡ１／２質量分析標準物質を含む、第２の成分をさらに含む。特定の実施形態では、ＳＡＡ１／２結合剤には、抗ＳＡＡ１／２抗体もしくはその結合部分、または抗ＳＡＡ１／２核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＡ１／２質量分析標準物質には、標識（例えば、同位体標識）または非標識のＳＡＡ１／２タンパク質またはタンパク質断片を含む。さらなる実施形態では、このタンパク質断片は、配列番号３５に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００２３】
追加の実施形態では、システムまたは組成物は、ｄ）ｉ）アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＡ１質量分析標準物質を含む、第３の成分をさらに含む。さらなる実施形態では、ＡｐｏＡ１結合剤には、抗ＡｐｏＡ１抗体もしくはその結合部分、または抗ＡｐｏＡ１核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含む。さらなる実施形態では、ＡｐｏＡ１質量分析標準物質には、同位体標識または非標識のＡｐｏＡ１タンパク質またはタンパク質断片を含む。ある特定の実施形態では、このタンパク質断片は、配列番号１または２に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００２４】
追加の実施形態では、システムまたは組成物は、ｄ）ｉ）アポリポタンパク質Ｌ１（ＡｐｏＬ１）結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＬ１質量分析標準物質を含む第３の成分と、ｅ）ｉ）リン脂質輸送タンパク質（ＰＬＴＰ）結合剤、及び／またはｉｉ）ＰＬＴＰ質量分析標準物質とを含む第４の成分とをさらに含む。さらなる実施形態では、ＡｐｏＬ１結合剤には、抗ＡｐｏＡ１抗体もしくはその結合部分、または抗ＡｐｏＬ１核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含み、ＰＬＴＰ結合剤には、抗ＰＬＴＰ抗体もしくはその結合部分、または抗ＰＬＴＰ核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含む。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＬ１質量分析標準物質には、同位体標識もしくは非標識のＡｐｏＬ１タンパク質もしくはタンパク質断片を含み、及び／またはＰＬＴＰ質量分析標準物質には、同位体標識もしくは非標識のＰＬＴＰタンパク質もしくはタンパク質断片を含む。さらなる実施形態では、ＡｐｏＬ１タンパク質断片は、配列番号１８もしくは１９に示すアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、及び／またはＰＬＴＰタンパク質断片は配列番号３１もしくは３２に示すアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、システムまたは組成物は、ｉ）アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＥ質量分析標準物質を含む、第５の成分をさらに含む。他の実施形態では、ＡｐｏＥ結合剤には、抗ＡｐｏＥ抗体もしくはその結合部分、または抗ＡｐｏＥ核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含む。追加の実施形態では、ＡｐｏＥ質量分析標準物質には、同位体標識または非標識のＡｐｏＥタンパク質またはタンパク質断片を含む。他の実施形態では、ＡｐｏＥタンパク質断片は、配列番号１５または１６に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００２６】
ある特定の実施形態では、システム及び組成物は、ｉ）アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＡ１質量分析標準物質を含む、第６の成分をさらに含む。他の実施形態では、システムは、ｄ）ｉ）アポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＭ質量分析標準物質を含む第３の成分と、ｅ）ｉ）リン脂質輸送タンパク質（ＰＬＴＰ）結合剤、及び／またはｉｉ）ＰＬＴＰ質量分析標準物質を含む第４の成分とをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＭ結合剤には、抗ＡｐｏＭ抗体もしくはその結合部分、または抗ＡｐｏＭ核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含む。特定の実施形態では、ＡｐｏＭ質量分析標準物質には、同位体標識または非標識のＡｐｏＭタンパク質またはタンパク質断片を含む。他の実施形態では、ＡｐｏＭタンパク質断片は、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００２７】
追加の実施形態では、システム及び組成物は、ｄ）ｉ）アポリポタンパク質Ｃ１（ＡｐｏＣ１）結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＣ１質量分析標準物質を含む第３の成分をさらに含む。追加の実施形態では、ＡｐｏＣ１結合剤には、抗ＡｐｏＣ１抗体もしくはその結合部分、または抗ＡｐｏＣ１核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含む。他の実施形態では、ＡｐｏＣ１質量分析標準物質には、標識（例えば、同位体標識）または非標識のＡｐｏＣ１タンパク質またはタンパク質断片を含む。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ１タンパク質断片は、配列番号７または８に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００２８】
他の実施形態では、システム及び組成物は、ｄ）ｉ）アポリポタンパク質Ｄ（ＡｐｏＤ）結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＤ質量分析標準物質を含む第３の成分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＤ結合剤には、抗ＡｐｏＤ抗体もしくはその結合部分、または抗ＡｐｏＤ核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含む。さらなる実施形態では、ＡｐｏＤ質量分析標準物質には、標識（例えば、同位体標識）または非標識のＡｐｏＤタンパク質またはタンパク質断片を含む。さらなる実施形態では、ＡｐｏＤタンパク質断片は、配列番号１３または１４に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００２９】
ある特定の実施形態では、システム及び組成物は、ｄ）ｉ）追加タンパク質結合剤、及び／またはｉｉ）追加タンパク質の質量分析標準物質を含む第４の成分をさらに含み、その場合、追加タンパク質は、ＣＬＵ、ＡｐｏＥ、ＣＥＴＰ、ＰＯＮ１、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＭ、ＰＬＴＰ、及びＡｐｏＬ１からなる群から選択される。さらなる実施形態では、追加タンパク質結合剤には、抗追加タンパク質抗体もしくはその結合部分、または抗追加タンパク質の核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含む。他の実施形態では、追加タンパク質の質量分析標準物質には、同位体標識または非標識の追加タンパク質またはタンパク質断片を含む。他の実施形態では、追加タンパク質断片は、配列番号２３、２４、１５、１６、２１、２２、３３、３４、７、８、３、４、９、１０、２０、３１、３２、１８、及び１９に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、システム及び組成物は、ｃ）ｉ）ＡｐｏＣ１結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＣ１質量分析標準物質を含む第２の成分と、ｄ）ｉ）ＡｐｏＣ２結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＣ２質量分析標準物質を含む第３の成分とをさらに含む。さらなる実施形態では、ＡｐｏＣ１結合剤には、抗ＡｐｏＣ１抗体もしくはその結合部分、または抗ＡｐｏＣ１核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含み、ＡｐｏＣ２結合剤には、抗ＡｐｏＣ２抗体もしくはその結合部分、または抗ＡｐｏＣ２核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含む。他の実施形態では、ＡｐｏＣ１質量分析標準物質には、同位体標識または非標識のＡｐｏＣ１タンパク質またはタンパク質断片を含み、ＡｐｏＣ２質量分析標準物質には、同位体標識または非標識のＡｐｏＣ２タンパク質またはタンパク質断片を含む。
【００３１】
特定の実施形態では、システム及び組成物は、ｄ）ｉ）アポリポタンパク質Ｃ１（ＡｐｏＣ１）結合剤、及び／またはｉｉ）ＡｐｏＣ１質量分析標準物質を含む第３の成分と、ｅ）ｉ）追加タンパク質結合剤、及び／またはｉｉ）追加タンパク質の質量分析標準物質を含む第４の成分とをさらに含み、その場合、追加タンパク質は、ＡｐｏＭ、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ４、ＣＬＵ、ＳＡＡ４、ＡｐｏＬ１、ＨＰ、Ｃ３、及びＰＬＴＰからなる群から選択される。他の実施形態では、ＡｐｏＣ１結合剤には、抗ＡｐｏＣ１抗体もしくはその結合部分、または抗ＡｐｏＣ１核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含み、追加タンパク質結合剤には、抗追加タンパク質抗体もしくはその結合部分、または抗追加タンパク質核酸もしくはタンパク質アプタマーもしくはそれらの結合部分を含む。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＣ１質量分析標準物質には、同位体標識または非標識のＡｐｏＣ１タンパク質またはタンパク質断片を含み、追加タンパク質の質量分析標準物質には、同位体標識または非標識の追加タンパク質またはタンパク質断片を含む。さらなる実施形態では、ＡｐｏＣ１タンパク質断片は、配列番号７または８に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、追加タンパク質断片は、配列番号２３、２４、９、１０、２０、３１、３２、１８、１９、１、２、１２、３６、３７、２７、２８、２５、または２６に示すアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、ヒトは心血管疾患に罹患していると診断されている。
【００３２】
いくつかの実施形態では、心血管疾患（例えば、ＣＡＤ、動脈硬化性疾患など）の概算リスク及び／または概算のコレステロール逆転送能を決定する方法を本明細書で提供し、これには、ａ）対象由来の試料において、バイオマーカーパネル１〜３０（バイオマーカーパネル１〜２６は表２に示し、バイオマーカーパネル２７〜３０は表５４に示す）のうちの少なくとも１つの、ＨＤＬ関連タンパク質それぞれのレベルを検出することと；ｂ）対象での心血管疾患（ＣＶＤ）の概算リスク、及び／または試料の概算コレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）を決定することを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、試料は、血清試料、血漿試料、血液試料、及び精製された高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）試料からなる群から選択される。さらなる実施形態では、決定には、第１のアルゴリズムを用いて、心血管疾患（ＣＶＤ）リスクスコアまたはコレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）スコアを生成することを含み、その場合の第１のアルゴリズムは、ｉ）各ＨＤＬ関連タンパク質レベルに所定の係数を乗じて乗算値を生成することと、ｉｉ）乗算値を合計してパネル固有の定数値を加算することを含む演算を実行し、それによってＣＶＤリスクスコアまたはＣＥＣスコアを生成する。他の実施形態では、この方法には、ｃ）ＣＶＤリスクスコア及び／またはＣＥＣスコアを示すレポートを生成することをさらに含む。ある特定の実施形態では、このレポートは、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルをさらに含む。他の実施形態では、決定は、第２のアルゴリズムを用いて、ＣＶＤの確率を生成することをさらに含み、その場合の第２のアルゴリズムは、ＣＶＤリスクスコアを以下の式：ＣＶＤ確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））または類似式に適用する。他の実施形態では、この方法には、ｃ）ＣＶＤ（例えば、ＣＡＤ）の確率を示すレポートを生成することをさらに含む。さらなる実施形態では、このレポートは、少なくとも１種のＨＤＬ関連タンパク質のレベルをさらに含む。
【００３４】
ある特定の実施形態では、バイオマーカーパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、及びＡｐｏＣ４で構成されるバイオマーカーパネル番号１８である。他の実施形態では、バイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＤ、及びＳＡＡ１／２で構成されるバイオマーカーパネル番号１９である。他の実施形態では、バイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ２、及びＡｐｏＣ３で構成されるバイオマーカーパネル番号５である。追加の実施形態では、バイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ３、ＣＬＵ、ＰＬＴＰ、及びＳＡＡ４で構成されるバイオマーカーパネル番号４である。他の実施形態では、バイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＣ４、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＭ、Ｃ３、ＣＬＵ、ＨＰ、ＳＡＡ１／２、及びＳＡＡ４で構成されるバイオマーカーパネル番号２８である。さらなる実施形態では、バイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＣ４、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＭ、Ｃ３、ＨＰ、ＰＬＴＰ、ＰＯＮ１、及びＳＡＡ１／２で構成されるバイオマーカーパネル番号３０である。いくつかの実施形態では、ＣＶＤは冠動脈疾患（ＣＡＤ）である。さらなる実施形態では、ＣＥＣは全体的なＣＥＣである。さらなる実施形態では、ＣＥＣはＡＢＣＡ１のＣＥＣである。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本方法は、工程ａ）の後だが、工程ｂ）の前に、少なくとも１つのバイオマーカーパネルのＨＤＬ関連タンパク質それぞれのレベルを正規化する工程をさらに含み、その場合、正規化とは、試料中の総計のＨＤＬ粒子、またはＡｐｏＡ１、またはＨＤＬコレステロールの概算レベルで正規化して、ＨＤＬタンパク質の正規化値を生成することである。追加の実施形態では、本方法は、試料中の総計のＨＤＬ粒子、またはＡｐｏＡ１、またはＨＤＬコレステロールの概算レベルを決定することをさらに含む。さらなる実施形態では、試料中の総計のＨＤＬ粒子、またはＡｐｏＡ１、またはＨＤＬコレステロールの概算レベルの決定には、試料に添加された内部標準物質のレベルを決定することを含み、その場合の内部標準物質には標識ＨＤＬタンパク質を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルのＨＤＬ関連タンパク質それぞれのレベルの検出には、バイオマーカーパネルのＨＤＬ関連タンパク質またはその断片のそれぞれを検出するアッセイを、試料の少なくとも一部に対して実施することを含む。特定の実施形態では、アッセイは質量分析アッセイまたはイムノアッセイである。さらなる実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルのＨＤＬ関連タンパク質それぞれのレベルの検出には、検出されるＨＤＬ関連タンパク質の少なくとも１つに対応する試料に、標識または非標識のタンパク質断片標準物質を添加すること、及び標準物質を検出することをさらに含む。他の実施形態では、対象はヒトである。さらなる実施形態では、ヒトは心血管疾患に罹患していると診断されている。
【００３７】
他の実施形態では、本明細書で提供されるシステム及び組成物は、ａ）心血管疾患に罹患している対象、または罹患が疑われる対象由来の試料と、ｂ）以下のうち少なくとも１つとを含む：ｉ）バイオマーカーパネル１〜３０（バイオマーカーパネル１〜２６は表２に示し、バイオマーカーパネル２７〜３０は表５４に示す）のうちの少なくとも１つの、ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する結合剤；及び／またはｉｉ）バイオマーカーパネル１〜３０のうちの少なくとも１つの、ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する質量分析標準タンパク質。
【００３８】
特定の実施形態では、システムは、ｃ）少なくとも１つのバイオマーカーパネルについての、試料中のＨＤＬ関連タンパク質の未加工レベルまたは正規化レベルを示すレポートをさらに含む。さらなる実施形態では、システムは、ｃ）少なくとも１つのバイオマーカーパネルについての、試料中のＨＤＬ関連タンパク質のレベルに基づいた、対象のＣＶＤリスクスコア及び／またはコレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）を示すレポートをさらに含む。他の実施形態では、このシステムには、ｃ）対象でのＣＶＤの確率リスクを示すレポートをさらに含む。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００３９】
いくつかの実施形態では、対象でのＣＶＤリスクスコアまたはコレステロール引き抜き能スコアを報告する方法を本明細書で提供し、これには、ａ）バイオマーカーパネル１〜３０（バイオマーカーパネル１〜２６は表２に示し、バイオマーカーパネル２７〜３０は表５４に示す）のうちの少なくとも１つの、ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する対象の値を取得することと、ｂ）処理システムで対象値を処理することによって、対象でのＣＶＤリスクスコア及び／またはコレステロール引き抜き能スコアを決定することを含み、該処理システムは、ｉ）コンピュータープロセッサと、ｉｉ）１つ以上のコンピュータープログラム及びデータベースを含む非一過性のコンピューターメモリとを含み、１つ以上のコンピュータープログラムはバイオマーカーパネルモデルアルゴリズムを含み、データベースは、ｉ）少なくとも１つのバイオマーカーパネルのＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する所定の係数と、ｉｉ）少なくとも１つのバイオマーカーパネルについてのパネル固有の定数値とを含み、１つ以上のコンピュータープログラムは、コンピュータープロセッサと連携して、バイオマーカーパネルモデルのアルゴリズムを適用し、ｉ）少なくとも１つのバイオマーカーパネルのＨＤＬ関連タンパク質それぞれのレベルに、対応する所定の係数を乗じて乗算値を生成し、ｉｉ）乗算値を合計して、パネル固有の定数値を加算し、それによって対象でのＣＶＤリスクスコアまたはコレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）スコアを生成するように構成されている。
【００４０】
ある特定の実施形態では、この方法には、ｃ）処理システムによって決定された、対象でのＣＶＤリスクスコア及び／またはＣＥＣスコアを報告することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＶＤリスクスコアは、対象でのＣＶＤリスクの確率を決定するために使用される。さらなる実施形態では、方法には、ｄ）以下の１つ以上の処置を行うことをさらに含む：ｉ）ＣＶＤリスクの確率が高いことを根拠に、対象に対して冠状動脈カテーテル挿入を実施すること、ｉｉ）ＣＶＤリスクの確率が高いかまたは中程度であることを根拠に、心血管疾患（ＣＶＤ）治療薬（例えば、スタチン、ＡＣＥ阻害薬、アルドステロン阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、ベータ遮断薬、カルシウム拮抗薬、コレステロール低下薬、ジゴキシン、利尿薬、カリウム、マグネシウム、血管拡張薬、またはワルファリン）で対象を治療すること、ｉｉｉ）ＣＶＤリスクの確率が高いかまたは中程度であることを根拠に、ＣＶＤ治療薬を対象に処方すること、ｉｖ）ＣＶＤリスクの確率が中程度であるかまたは高いことを根拠に、対象に対して少なくとも１つの追加診断試験を実施すること、ｖ）ＣＶＤリスクの確率が高いことを根拠に、対象を入院させる及び／または入院を指示すること、ｖｉ）ＣＶＤリスクの確率が中程度であるかまたは高いことを根拠に、バイオマーカーパネル以外の１つ以上のＣＶＤリスクアッセイを用いて対象由来の試料を試験すること、ｖｉｉ）ＣＶＤリスクの確率が低いことを根拠に、対象を治療施設から退院させること、ならびにｖｉｉｉ）ＣＶＤリスクの確率が中程度であるかまたは高いことを根拠に、対象に対してストレス試験を実施すること。
【００４１】
ある特定の実施形態では、方法には、ｄ）以下の１つ以上の処置を行うことをさらに含む：ｉ）対象でのＣＶＤリスクの確率をユーザーに伝えること、ｉｉ）対象でのＣＶＤリスクの確率を表示すること、ｉｉｉ）対象でのＣＶＤリスクの確率を示すレポートを生成すること、ならびにｉｖ）対象でのＣＶＤリスクの確率を示すレポートを作成及び／または送信すること。他の実施形態では、対象値の取得には、試験室から、対象から、分析試験システムから、及び／またはハンドヘルドもしくはポイントオブケア検査装置から対象値を受信することを含む。いくつかの実施形態では、処理システムは、分析試験システム及び／またはハンドヘルドもしくはポイントオブケア検査装置をさらに含む。
【００４２】
特定の実施形態では、対象値の取得には、対象値を電子的に受信することを含む。他の実施形態では、対象値の取得には、検出アッセイを用いて対象由来の試料を試験することを含む。さらなる実施形態では、検出アッセイはイムノアッセイまたは質量分析アッセイを含む。追加の実施形態では、処理システムはグラフィカルユーザーインターフェースをさらに含み、この方法はグラフィカルユーザーインターフェース経由で対象値を入力することをさらに含む。ある特定の実施形態では、グラフィカルユーザーインターフェースは、デスクトップコンピューター、ノートブックコンピューター、タブレットコンピューター、スマートフォン、及びポイントオブケア分析装置から選択される装置の一部である。
【００４３】
追加の実施形態では、処理システムは試料分析器をさらに含む。さらなる実施形態では、コンピューターメモリの少なくとも一部は試料分析器の内部に配置されている。さらなる実施形態では、処理システムはラボラトリインターフェースシステム（ＬＩＭ）をさらに含む。他の実施形態では、コンピューターメモリの少なくとも一部はＬＩＭの一部である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、処理システムは、デスクトップコンピューター、ノートブックコンピューター、タブレットコンピューター、スマートフォン、及びポイントオブケア分析装置からなる群から選択される処理装置をさらに含む。追加の実施形態では、コンピューターメモリの少なくとも一部は処理装置の内部に配置されている。
【００４５】
他の実施形態では、１つ以上のコンピュータープログラムがＣＶＤ確率アルゴリズムをさらに含み、該１つ以上のコンピュータープログラムは、コンピュータープロセッサと連携して、ＣＶＤ確率アルゴリズムアルゴリズムを利用し、ｉｉｉ）ＣＶＤリスクスコアを以下の式：ＣＶＤ確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−ＣＶＤリスクスコア）に適用するようにさらに構成されている。特定の実施形態では、ＣＶＤは冠動脈疾患（ＣＡＤ）である。他の実施形態では、ＣＥＣは全体的なＣＥＣである。いくつかの実施形態では、ＣＥＣはＡＢＣＡ１のＣＥＣである。
【００４６】
追加の実施形態では、ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する対象値は、正規化レベルである（例えば、試料中の総計のＨＤＬ粒子、もしくはＡｐｏＡ１、もしくはＨＤＬコレステロールの概算レベル、または試料中の他の何らかのタンパク質、例えばＨＳＡの概算レベルに対する）。さらなる実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、及びＡｐｏＣ４で構成されるバイオマーカーパネル番号１８である。他の実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＤ、及びＳＡＡ１／２で構成されるバイオマーカーパネル番号１９である。追加の実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ２、及びＡｐｏＣ３で構成されるバイオマーカーパネル番号５である。他の実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ３、ＣＬＵ、ＰＬＴＰ、及びＳＡＡ４で構成されるバイオマーカーパネル番号４である。さらなる実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＣ４、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＭ、Ｃ３、ＣＬＵ、ＨＰ、ＳＡＡ１／２、及びＳＡＡ４で構成されるバイオマーカーパネル番号２８である。他の実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＣ４、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＭ、Ｃ３、ＨＰ、ＰＬＴＰ、ＰＯＮ１、及びＳＡＡ１／２で構成されるバイオマーカーパネル番号３０である。さらなる実施形態では、対象はヒトである。他の実施形態では、ヒトは心血管疾患に罹患していると診断されている。
【００４７】
さらなる実施形態では、本明細書で提供される処理システムは、ａ）コンピュータープロセッサと、ｂ）１つ以上のコンピュータープログラム及びデータベースを含む非一過性のコンピューターメモリとを含み、１つ以上のコンピュータープログラムはバイオマーカーパネルモデルアルゴリズムを含み、データベースは、ｉ）バイオマーカーパネル１〜３０（バイオマーカーパネル１〜２６は表２に示し、バイオマーカーパネル２７〜３０は表５４に示す）のうちの少なくとも１つの、ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する対象値と、ｉｉ）バイオマーカーパネル１〜３０のうちの少なくとも１つの、ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対するパネル固有の所定の係数と、ｉｉｉ）少なくとも１つのバイオマーカーパネルについてのパネル固有の定数値とを含み、１つ以上のコンピュータープログラムは、コンピュータープロセッサと連携して、バイオマーカーパネルモデルのアルゴリズムを適用し、ｉ）ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する対象値に、対応するパネル固有の所定の係数を乗じて乗算値を生成し、ｉｉ）乗算値を合計して、パネル固有の定数値を加算し、それによって対象でのＣＶＤリスクスコアまたはコレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）スコアを生成するように構成されている。
【００４８】
ある特定の実施形態では、１つ以上のコンピュータープログラムがＣＶＤ確率アルゴリズムをさらに含み、該１つ以上のコンピュータープログラムは、コンピュータープロセッサと連携して、ＣＶＤ確率アルゴリズムを利用し、ｉｉｉ）ＣＶＤリスクスコアを以下の式：ＣＶＤ確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−ＣＶＤリスクスコア）に適用するようにさらに構成されている。いくつかの実施形態では、ＣＶＤは冠動脈疾患（ＣＡＤ）である。さらなる実施形態では、ＣＥＣは全体的なＣＥＣである。他の実施形態では、ＣＥＣはＡＢＣＡ１のＣＥＣである。
【００４９】
ある特定の実施形態では、ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する対象値は、試料中の総計のＨＤＬ粒子、またはＡｐｏＡ１、またはＨＤＬコレステロールに対する正規化レベルである。他の実施形態では、システムは、ｃ）ＨＤＬ関連タンパク質分析試験システム及び／またはハンドヘルドもしくはポイントオブケアＨＤＬ関連タンパク質ポイントオブケア検査装置をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＤＬ関連タンパク質分析試験システムは質量分析計または光学検出器を含む。他の実施形態では、システムは、ｃ）ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する対象値をコンピューターメモリに入力するためのグラフィカルユーザーインターフェースをさらに含む。他の実施形態では、グラフィカルユーザーインターフェースは、デスクトップコンピューター、ノートブックコンピューター、タブレットコンピューター、スマートフォン、及びポイントオブケア分析装置から選択される装置の一部である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、システムは試料分析器をさらに含み、コンピューターメモリの少なくとも一部は試料分析器の内部に配置されている。特定の実施形態では、システムは、ラボラトリインターフェースシステム（ＬＩＭ）の少なくとも一部をさらに含む。他の実施形態では、コンピューターメモリの少なくとも一部はＬＩＭの一部である。他の実施形態では、システムは、ｃ）デスクトップコンピューター、ノートブックコンピューター、タブレットコンピューター、スマートフォン、及びポイントオブケア分析装置からなる群から選択される処理装置をさらに含む。他の実施形態では、コンピューターメモリの少なくとも一部は処理装置の内部に配置されている。追加の実施形態では、システムは、患者のＣＶＤリスクスコアまたはＣＥＣスコアを表示するように構成されたディスプレイコンポーネントをさらに含む。他の実施形態では、ディスプレイコンポーネントは、コンピューターモニター、タブレットコンピューター画面、スマートフォン画面、及びポイントオブケア分析装置画面から選択される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、及びＡｐｏＣ４で構成されるバイオマーカーパネル番号１８である。さらなる実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＤ、及びＳＡＡ１／２で構成されるバイオマーカーパネル番号１９である。他の実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ２、及びＡｐｏＣ３で構成されるバイオマーカーパネル番号５である。さらなる実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ３、ＣＬＵ、ＰＬＴＰ、及びＳＡＡ４で構成されるバイオマーカーパネル番号４である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＣ４、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＭ、Ｃ３、ＣＬＵ、ＨＰ、ＳＡＡ１／２、及びＳＡＡ４で構成されるバイオマーカーパネル番号２８である。特定の実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーパネルは、ＨＤＬ関連タンパク質ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＣ４、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＭ、Ｃ３、ＨＰ、ＰＬＴＰ、ＰＯＮ１、及びＳＡＡ１／２で構成されるバイオマーカーパネル番号３０である。他の実施形態では、対象はヒトである。追加の実施形態では、ヒトは心血管疾患に罹患していると診断されている。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される非一過性のコンピューターメモリ構成要素は、データベースにアクセスするように構成された１つ以上のコンピュータープログラムを含み、１つ以上のコンピュータープログラムはバイオマーカーパネルモデルアルゴリズムを含み、データベースは、ｉ）バイオマーカーパネル１〜３０（バイオマーカーパネル１〜２６は表２に示し、バイオマーカーパネル２７〜３０は表５４に示す）のうちの少なくとも１つの、ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する対象値と、ｉｉ）バイオマーカーパネル１〜３０のうちの少なくとも１つの、ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する所定の係数と、ｉｉｉ）少なくとも１つのバイオマーカーパネルについてのパネル固有の定数値とを含み、１つ以上のコンピュータープログラムは、コンピュータープロセッサと連携して、バイオマーカーパネルモデルのアルゴリズムを適用し、ｉ）ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する対象値に、対応する所定の係数を乗じて乗算値を生成し、ｉｉ）乗算値を合計して、パネル固有の定数値を加算し、それによって対象でのＣＶＤリスクスコアまたはコレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）スコアを生成するように構成されている。
【００５３】
さらなる実施形態では、ＨＤＬ関連タンパク質のアッセイは、質量分析法（ＭＳ）、クロマトグラフィー、ＬＣ−ＭＳ、プラズモン共鳴、ならびにポリビニルスルホン酸（ＰＶＳ）及びポリエチレングリコールメチルエーテル（ＰＥＧＭＥ）の使用を含むアッセイからなる群から選択される技術を用いて実施される。ある特定の実施形態では、検出は、精製されたＨＤＬ試料を、クロマトグラフィーと質量分析の両方を実行する装置に注入することによって行われる。いくつかの実施形態では、装置は液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）装置である。
【００５４】
ある特定の実施形態では、ＨＤＬ値は正規化値である。特定の実施形態では、正規化は総計のＨＤＬコレステロール、またはＡｐｏＡ１タンパク質、またはＨＤＬ粒子に対するものである。総ＨＤＬの決定は、ＨＤＬコレステロールを測定することによって実施することができる。一般的に、実施の際には、特定の順序で添加される選択試薬を使用する「ホモジニアス」アッセイを用いて、リポタンパク質ＡｐｏＢを含有するＬＤＬコレステロール粒子の血清試料を「除去する」。その後、従来的な酵素結合アッセイを用いてＨＤＬコレステロールを化学的に決定する。総ＨＤＬの測定はまた、ＨＤＬ粒子を単離する物理的方法、通常は超遠心分離を利用して実施することができる（例えば、Ｗａｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００１  ｖｏｌ．４７  ｎｏ．９  １５７９−１５９６、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ＨＤＬ関連タンパク質の測定量を最初の試料中の天然ＡｐｏＡ１の総量と比較して、正規化した比を決定してもよい。ＡｐｏＡ１は、各ＨＤＬ粒子の主たるリポタンパク質成分である。ＡｐｏＡ１ではなくＨＤＬコレステロールの測定が心血管リスク評価の主流であったが、ＡｐｏＡ１の測定が無症候性アテローム性動脈硬化症の同定に有用であることから、この見解は変わりつつある（Ｆｌｏｒｖａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ：ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ  ２００６，Ｖｏｌ．６１Ａ，Ｎｏ．１２，１２６２−１２６６、参照により本明細書に組み込まれる）。総ＡｐｏＡ１は通常、広く利用されているイムノアッセイプラットフォームアッセイを用いて測定される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法には、対象由来の試料中の少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質（例えば、表２及び表５４に列挙されたものから選択される）のレベルを検出することを含み、その場合、対象は心血管疾患に罹患しているかまたは罹患の疑いがある。特定の実施形態では、試料は精製された高密度リポタンパク質試料である。
【００５６】
ある特定の実施形態では、心血管疾患の概算リスク及び／または概算のコレステロール逆転送能を決定する方法を本明細書で提供し、これには、ａ）対象由来の試料中の少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質（例えば、表２及び表５４に列挙されたものから選択される）のレベルを検出することと、ｂ）対象での心血管疾患（ＣＶＤ）の概算リスク、及び／または試料の概算コレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）を決定することを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるシステムは、ａ）心血管疾患に罹患している対象、または罹患が疑われる対象由来の試料と、ｂ）以下のうち少なくとも１つとを含む：ｉ）少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質（例えば、表２及び表５４に列挙されたものから選択される）のそれぞれに対する結合剤；及び／またはｉｉ）少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する質量分析標準タンパク質。
【００５８】
他の実施形態では、対象でのＣＶＤリスクスコアまたはコレステロール引き抜き能スコアを報告する方法を本明細書で提供し、これには、ａ）少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質（例えば、表２及び表５４に列挙されたものから選択される）のそれぞれに対する対象値を取得することと；ｂ）処理システムで対象値を処理することによって、対象でのＣＶＤリスクスコア及び／またはコレステロール引き抜き能スコアを決定することを含み、該処理システムは、ｉ）コンピュータープロセッサと、ｉｉ）１つ以上のコンピュータープログラム及びデータベースを含む非一過性のコンピューターメモリと、を含み、１つ以上のコンピュータープログラムはバイオマーカーのアルゴリズムを含み、データベースは、ｉ）少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する所定の係数と、ｉｉ）少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質の組み合わせに対するパネル固有の定数値とを含み、１つ以上のコンピュータープログラムは、コンピュータープロセッサと連携して、バイオマーカーのアルゴリズムを適用し、ｉ）少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質それぞれのレベルに、対応する所定の係数を乗じて乗算値を生成し、ｉｉ）乗算値を合計して、パネル固有の定数値を加算し、それによって対象でのＣＶＤリスクスコアまたはコレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）スコアを生成するように構成されている。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される処理システムは、ａ）コンピュータープロセッサと、ｂ）１つ以上のコンピュータープログラム及びデータベースを含む非一過性のコンピューターメモリとを含み、１つ以上のコンピュータープログラムはバイオマーカーアルゴリズムを含み、データベースは、ｉ）少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質（例えば、表２及び表５４に列挙されたものから選択される）のそれぞれに対する対象値と、ｉｉ）少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対するパネル固有の所定の係数と、ｉｉｉ）少なくとも３種のＨＤＬ関連タンパク質の組み合わせに対するパネル固有の定数値とを含み、１つ以上のコンピュータープログラムは、コンピュータープロセッサと連携して、バイオマーカーのアルゴリズムを適用し、ｉ）少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する対象値に、対応するパネル固有の所定の係数を乗じて乗算値を生成し、ｉｉ）乗算値を合計して、パネル固有の定数値を加算し、それによって対象でのＣＶＤリスクスコアまたはコレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）スコアを生成するように構成されている。
【００６０】
特定の実施形態では、本明細書で提供される非一過性のコンピューターメモリ構成要素は、データベースにアクセスするように構成された１つ以上のコンピュータープログラムを含み、１つ以上のコンピュータープログラムはバイオマーカーアルゴリズムを含み、データベースは、ｉ）少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質（例えば、表２及び表５４に列挙されたものから選択される）のそれぞれに対する対象値と、ｉｉ）ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する所定の係数と、ｉｉｉ）少なくとも３種（または少なくとも２種）のＨＤＬ関連タンパク質の組み合わせに対するパネル固有の定数値と、を含み、１つ以上のコンピュータープログラムは、コンピュータープロセッサと連携して、バイオマーカーのアルゴリズムを適用し、ｉ）ＨＤＬ関連タンパク質それぞれに対する対象値に、対応する所定の係数を乗じて乗算値を生成し、ｉｉ）乗算値を合計して、パネル固有の定数値を加算し、それによって対象でのＣＶＤリスクスコアまたはコレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）スコアを生成するように構成されている。
【００６１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のバイオマーカーパネルは、心血管疾患、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、紅斑性狼瘡、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、及びアルツハイマー病から選択されるＨＤＬ関連疾患のリスクを診断するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】パネル１に関して以下の実施例１に記載する工程に対応する例示的ワークフローを示す。
【図２】ＡｐｏＡ−Ｉ関連血清画分の単離−血清をＨｉｓ６ＡｐｏＡ−Ｉとインキュベートし、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いてＨｉｓタグを標的とすることにより、ＡｐｏＡ−Ｉ関連タンパク質を単離する概要模式図。
【図３】ＡｐｏＡ−Ｉ関連プロテオームとＨＤＬプロテオームの重複−ＨＤＬ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｗａｔｃｈリストの枠内で、ＡｐｏＡ−Ｉアフィニティー精製によって同定されたタンパク質と、勾配超遠心分離によって調製されたＨＤＬとの重複を示すベン図。
【図４】細胞系のコレステロール引き抜きアッセイとの関連−ｃＡＭＰ刺激されたＪ７７４マクロファージからの実測のコレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）と、（Ａ）ＡｐｏＡ−Ｉ関連血清タンパク質の標的分析に基づく、タンパク質６種のパネルを用いた予測ＣＥＣ、ならびに（Ｂ）ＡｐｏＡ−Ｉ、（Ｃ）ＨＤＬ、及び（Ｄ）ｈｓＣＲＰの血清濃度との相関関係。
【図５】予測ＣＥＣとＣＡＤとの逆相関−標的ＨＤＬプロテオーム分析によって予測されたＣＥＣの分布。全対照及びＣＡＤ患者集団（ＭＡＣＥあり、またはなし）の比較。
【図６】ＡｐｏＡ−Ｉ関連タンパク質の標的ＭＲＭ測定において観察された内因性ＡｐｏＡ−Ｉと、委託臨床研究所内で免疫比濁分析によって測定された血清ＡｐｏＡ−Ｉレベルとの相関関係。
【図７】試料３０個（対照がｎ＝１５、ＣＡＤがｎ＝１５）の標的ＨＤＬプロテオーム分析から予測されるＣＥＣと、ｃＡＭＰ刺激されたＪ７７４マクロファージにおける同試料セットの細胞系アッセイによる実測の細胞コレステロール引き抜きとの比較。
【図８】コホート間の予測コレステロール引き抜き値を比較し、対照コホートと比較してＣＡＤコホートのコレステロール引き抜きの方が全体的に低いことを明らかにしている実施例４の結果を示す。
【図９】実施例４の転帰最適化モデルの適用結果が、ＣＡＤと診断されるリスクと相関するバイオマーカースコア尺度で患者を層別化していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
定義
本明細書で使用される場合、「高密度リポタンパク質」すなわち「ＨＤＬ」は、血中を流れる、両親媒性タンパク質の非共有結合複合体であり、コレステロール及びトリグリセリドなどの脂質を水性の血流内で輸送できるようにする。ＨＤＬは、約５０質量％が、遊離コレステロール（約４％）の埋め込まれたリン脂質一重層（約２５％）と、トリグリセリド（約３％）及びコレステロールエステル（約１２％）のコアとで構成される、脂質エマルジョンを安定化させる両親媒性タンパク質で構成されている。ＨＤＬのサブクラスとして、ＨＤＬ２及びＨＤＬ３が挙げられる。ＨＤＬ２粒子の方が大きくて脂質含有量が多く、対するＨＤＬ３粒子は小さくて脂質含有量が少ない。それ以外のサブクラスとして、最大粒子から最小粒子の順に、ＨＤＬ２ｂ、ＨＤＬ２ａ、ＨＤＬ３ａ、ＨＤＬ３ｂ、及びＨＤＬ３ｃが挙げられる。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「リポタンパク質」とは、１つ以上の脂質分子と結合するかまたは結合することができるタンパク質の種類を指す。場合によって、リポタンパク質は、結合しているリン脂質が４分子以下である「脂質欠乏リポタンパク質」であり得る。本明細書で使用される場合、リポタンパク質は、脂質が結合していないがＨＤＬ粒子中に交換可能であるタンパク質（例えばアポリポタンパク質）を含む。
【００６５】
本明細書で使用される場合、語句「コレステロール逆転送」とは、血漿を介してコレステロールを末梢組織から肝臓に戻す実移動をもたらす多段階の過程を指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、試料の「コレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）」という語句は、試料中のＨＤＬが、脂質を含んだマクロファージからコレステロールを受け取ることによってコレステロール逆転送を促進する能力を指す。ＣＥＣの測定方法としては、限定されないが、ｄｅ  ｌａ  Ｌｌｅｒａ−Ｍｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ａｐｒ；３０（４）：７９６−８０１；Ｓａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｄｅｃ；５２（１２）：２３３２−４０；及びＫｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＥＪＭ，３６４；２，２０１１に記載のものが挙げられ、これらはすべて、そこに開示されるアッセイを含め、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＡＢＣＡ１のＣＥＣは特に、ＡＢＣＡ１トランスポーターによって特異的に誘導されるコレステロール逆転送を指す。例えばこれは、試薬処理（例えば、ｃＡＭＰ処理）したマクロファージと試薬未処理のマクロファージとの間のＣＥＣの差を差し引くことによって測定することができる。この場合、マクロファージは、処理試薬の存在下でＡＢＣＡ１発現が直ちに増加するように変性される。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「血液試料」とは、全血試料、またはそれに由来する血漿もしくは血清画分を指す。ある特定の実施形態では、血液試料は、全血試料、またはそれに由来する血漿もしくは血清画分などのヒト血液試料を指す。いくつかの実施形態では、血液試料は、全血試料、またはそれに由来する血漿もしくは血清画分などの非ヒト哺乳動物（「動物」）の血液試料を指す。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「全血」とは、分画されておらず、細胞成分と流体成分の両方を含有する血液試料を指す。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「血漿」とは、全血のうち流体性の非細胞成分を指す。使用する分離方法に応じて、血漿は細胞成分を全く含まなくてもよく、または様々な量の血小板及び／または少量の他の細胞成分を含んでいてもよい。血漿はフィブリノーゲンなどの種々の凝固因子を含むため、用語「血漿」は以下に記載する「血清」とは区別される。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「血清」とは、哺乳動物の全血清、例えば、ヒト全血清、試験動物由来の全血清、ペット由来の全血清、家畜由来の全血清などを指す。さらに、本明細書で使用される場合、「血清」とは、凝固因子（例えば、フィブリノーゲン）が除去された血漿を指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、語句「精製された高密度リポタンパク質試料」とは、血液試料（例えば、血清、または血漿、または全血試料）を（例えば、以下に記載される超遠心分離法またはＡｐｏＡ１の交換法によって）精製して得られる、精製試料中の全タンパク質の少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％…９４％…９８％…９９％…または少なくとも９９．９％）がＨＤＬリポタンパク質である精製試料を指す。いくつかの実施形態では、精製された試料中の全タンパク質の１０％未満が非ＨＤＬリポタンパク質である（例えば、１０％…５％…１％…０．２％未満）。ある特定の実施形態では、非ＨＤＬリポタンパク質は、主としてまたはすべてが血清アルブミンである。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「心血管疾患」（ＣＶＤ）または「心血管障害」とは、身体の心臓、心臓弁、及び血管系（例えば、静脈及び動脈）に影響を及ぼす多数の病態を分類するために使用される用語であり、これに包含される疾患及び病態には、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、急性冠症候群、狭心症、鬱血性心不全、大動脈瘤、大動脈解離、腸骨動脈瘤または大腿動脈瘤、肺塞栓症、原発性高血圧、心房細動、脳卒中、一過性虚血発作、収縮機能不全、拡張機能不全、心筋炎、心房頻拍、心室細動、心内膜炎、動脈症、血管炎、アテローム性プラーク、脆弱性プラーク、急性冠症候群、急性虚血性発作、心臓突然死、末梢血管疾患、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、及び脳血管疾患を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
本明細書で使用される場合、語句「ＣＶＤの罹患が疑われる」とは、ＣＶＤに関連した少なくとも１つの徴候または症状、例えば、極度の疲労、常時のめまいまたはふらつき、速い心拍数（例えば、安静時に毎分１００回超の拍動）、新たな不規則な心拍、休息すると消える活動時の胸痛または不快感、通常の活動時及び安静時の呼吸困難、悪化する呼吸器感染症または咳、不安感または混乱、睡眠パターンの変化、ならびに食欲不振または吐き気がある患者を指す。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「動脈硬化性心血管疾患」または「動脈硬化性心血管障害」とは、アテローム性動脈硬化症を要素として含む心血管疾患の一部、または特定の種類の心血管疾患の前兆を指し、ＣＡＤ、ＰＡＤ、脳血管疾患を含むがこれらに限定されない。アテローム性動脈硬化症は、動脈血管壁に起こる慢性的な炎症反応である。これはアテローム性プラークの形成を伴い、それによって動脈の狭小化（「狭窄」）を招き、最終的に動脈開口部の部分的または完全な閉鎖及び／またはプラークの破裂に至るおそれがある。したがって、動脈硬化性疾患または障害には、アテローム性プラークの形成及び破裂の結果を含み、これには、動脈の狭窄または狭小化、心不全、大動脈瘤を含む動脈瘤の形成、大動脈解離、ならびに心筋梗塞及び脳卒中などの虚血性イベントを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法、組成物、及びシステムは、動脈硬化性ＣＶＤを少なくとも部分的に診断するために使用される。
【００７５】
用語「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」は、本明細書で同義に使用され、一般に、類人猿及びヒトを含む霊長類、ウマ科動物（例えばウマ）、イヌ科動物（例えばイヌ）、ネコ科動物、様々な家畜（例えば、ブタ類、ブタ、ヤギ、ヒツジなどの有蹄動物）、ならびに家庭で飼育されるペット及び動物園で管理されている動物を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は特にヒト対象である。
【００７６】
発明の詳細
本明細書では、心血管疾患（ＣＶＤ）または他のＨＤＬ関連疾患に罹患している対象、または罹患が疑われる対象由来の試料から１種以上のＨＤＬ関連タンパク質（例えば、ＡｐｏＣ３；ＡｐｏＣ３及びＡｐｏＡ１；ＡｐｏＣ３及びＳＡＡ１／２；またはバイオマーカーパネル１〜３０のタンパク質）を検出するための方法、システム、及び組成物を提供する。ある特定の実施形態では、そのような方法、システム、及び組成物を使用して、対象でのＣＶＤ（または他の疾患）の概算リスク、及び／または試料の概算コレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）を決定する。特定の実施形態では、システム及び組成物は、ＣＶＤに罹患している対象または罹患が疑われる対象由来の試料、及びＨＤＬ関連結合剤または質量分析標準物質で構成される。
【００７７】
本明細書では、以下の表２及び５４に示すパネルのうちの１つ以上におけるタンパク質レベルの測定に基づいて、予測される心血管疾患及び／またはコレステロール引き抜きを決定するための方法、組成物、及びキットを提供する。本開示の実施形態の開発中に実施した研究から、単独のタンパク質のレベル（例えば、パネル１０であるＡｐｏＣ３）または複数のタンパク質の組み合わせ（例えば、パネル１〜９及び１１〜３０）のいずれもＣＶＤ及びコレステロール引き抜き能の決定に使用できることを見出した。以下に記載するのは、心血管疾患に罹患している対象、または罹患が疑われる対象由来の試料にバイオマーカーパネルを使用する際に用いられる、例示的、非限定的な方法及びシステムである。
【００７８】
いくつかの実施形態では、最初に、心血管疾患の症状（例えば、胸痛）を有する対象から、病院、診療所、または他の医療施設で血液を採取する。この血液試料を処理して血清試料を生成する。次に、この血清試料を、超遠心分離またはタグ付きＨＤＬ結合粒子の精製など、試料中のＨＤＬを精製する方法で処理する。さらに、この精製された血清試料を、精製試料中に存在するＨＤＬ関連タンパク質を消化する酵素（例えば、Ｌｙｓ−Ｃなど）で処理する。次に、この消化した試料を１つ以上の検出アッセイ（例えば、質量分析、免疫学的アッセイ、アプタマー結合アッセイ）にかけて、バイオマーカーパネル１〜３０のうちの１つ以上に存在するＨＤＬ関連タンパク質レベルを検出する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、質量分析法を用いる場合、検出プロトコールは以下の通りであり得る。消化したＨＤＬ精製試料の一部を希釈し、ＬＣカラムに充填する。次に、ペプチドをトリプル四重極質量分析計（例えば、ダイナミックＭＲＭモードで動作）を使用して検出する。インタクトペプチドの質量に対する所定のｍ／ｚ値（機器のＱ１でフィルタリング）、インタクトペプチドが機器のｑ２で受ける衝突エネルギー、及びペプチド断片に対するフラグメント（ｍ／ｚ）値（Ｑ３でフィルタリング）で構成される所定の「トランジション」で、ペプチドを標的化する。トランジションは、試料内の標的とするペプチド固有であるように選択される。２つのトランジション（後半の定量化に使用される「クオンティファイア」と、品質管理に使用される「クオリファイア」）をペプチドごとにモニタリングし、タンパク質あたり最大２つのペプチドを標的化する。ペプチド標的及びそのトランジションの詳細な一覧を、以下実施例１の表１に示す。
【００８０】
ペプチドシグナル強度は、各ペプチドの「クオンティファイア」トランジションのクロマトグラフピークを積分することによって得られる。タンパク質強度は、タンパク質の標的ペプチドそれぞれのクオンティファイアのピーク面積を合計し、１つ以上のＨＤＬ関連タンパク質の強度で正規化することによって決定される。
【００８１】
さらに、選択したバイオマーカーパネルのＨＤＬ関連タンパク質のレベルを多変量アルゴリズムで処理してコレステロール引き抜きまたはＣＶＤリスクスコアを決定する。このアルゴリズムは、各パネル固有の（及びＣＶＤリスクスコアまたは全体的な引き抜きもしくはＡＢＣＡ１引き抜きに固有の）定数（ｉ）、ならびに検出された固有のタンパク質レベルで乗算されるタンパク質及びパネル固有の係数（ｃ）を含む。アルゴリズムは以下の通りである：
ＣＶＤリスクスコア／予測される全体的なコレステロール引き抜き＝ｃ１＊ｐ１＋ｃ２＊ｐ２…ｃｎ＊ｐｎ＋ｉ
ここで、引き抜きまたはＣＶＤリスクは、係数（ｃ）を所与のタンパク質のタンパク質レベル（ｐ）（例えば、正規化されたピーク面積）で乗算したものの加算合計に定数（ｉ）を加えることで決定される。以下の実施例１は、質量分析により決定されるタンパク質値及びモルタンパク質値の両方について、各パネルの各タンパク質に対する係数及び定数を示している。実施例１はさらに、これらの数値のそれぞれに対する９５％信頼区間を示している。例えば、ＣＶＤリスクスコア及び／またはコレステロール引き抜き値を計算するとき、（ｃ）または（ｐ）の値に、この範囲内の任意の値を使用することができる。
【００８２】
上記のアルゴリズム及び以下の実施例１の値を使用して決定されるＣＶＤリスクスコアを、以下の式を使用して確率（ＣＶＤのリスク率）に変換することができる：
確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
さらに、この確率値に１００を掛け、ＣＶＤのリスク率を求めることができる。ＣＶＤのリスクスコアまたは確率またはリスク率は、医療従事者が、心臓疾患が疑われる患者の治療を決定する際の一助として、または治療もしくは監視を必要とするような患者を除外するために用いることができる。例えば、一般に、ＣＡＤのリスク率が１０％未満である患者は通常、低リスクとみなされ（例えば、心臓疾患の治療または監視を必要としない患者とみなすことができる）、ＣＡＤのリスク率が１０〜２０％のリスクである患者は通常、中間リスクとみなされ（例えば、患者に心臓疾患の追加徴候がないか監視することができる）、ＣＡＤのリスク率が２０％を超える患者は通常、高リスクとみなされる（例えば、治療的または手術的介入により処置することができる）。
【００８３】
ある特定の実施形態では、精製された高密度リポタンパク質試料中に、パネル１〜３０の一部として検出されるタンパク質が１種または複数種検出される。精製されたＨＤＬ試料は、超遠心分離法またはＨＤＬ結合ペプチド法を含む任意の好適な方法によって得ることができる。
【００８４】
超遠心分離法の場合、例えば、密度１．００６ｋｇ／Ｌの血清の、１８℃、１８時間の超遠心分離（１０５，０００ｘｇ）を用いて、マンガンとヘパリンによる低密度リポタンパク質の沈降を妨げる超低密度リポタンパク質を除去することができる。塩化マンガン及びヘパリンを、最終濃度０．０４５６モルのＭｎ２＋及び１８３ＵＰＳ  ｋＵ／Ｌのヘパリンを得るのに十分な量で下層画分に添加すると、非ＨＤＬ−Ｃリポタンパク質が沈降する。４℃、１５００ｘｇで３０分間遠心分離した後、得られた上清をさらに臭化カリウムを用いて１．２１ｋｇ／Ｌ以上の密度に調整する。次に、密度調整した溶液を再度、２４時間遠心分離する（約１０５，０００ｘｇ）。遠心分離後、最上層を注意深く除去すると、ＨＤＬの濃縮画分を得ることができる。
【００８５】
ある特定の実施形態では、ＨＤＬは、アフィニティータグを付けたＨＤＬ結合ペプチド（例えば、ＡｐｏＡ１）を使用して精製される。そのような精製方法は、２０１５年５月１５日出願の米国出願番号第１４／７１３，０４６号に記載されており、これは本明細書に完全に記載されているものとして、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。簡潔には、アフィニティータグを付けたＨＤＬ結合ペプチド（例えば、ＡｐｏＡ１）を試料に添加する。ＨＤＬ粒子は結合粒子の一部を取り込む。次に、そのようなＨＤＬ粒子を、アフィニティータグを利用して精製し、それによって精製されたＨＤＬ試料を得る。
【００８６】
本発明は、対象試料からＨＤＬ関連ペプチド（例えば、ＡｐｏＣ３、ＳＡＡ１／２、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１など）を検出するために使用される方法に限定されない。
【００８７】
ある特定の実施形態では、ＨＤＬ関連タンパク質は、以下から選択される検出方法を用いて検出される：イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、活性アッセイ、共免疫沈降アッセイ、質量分析、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、干渉法、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、二重偏光干渉法（「ＤＰＩ」）、偏光解析法、及び水晶振動子マイクロバランス。
【実施例】
【００８８】
実施例１
本実施例では、全体的なコレステロール引き抜き及び冠動脈疾患リスクに関する種々のアルゴリズムを使用し、単一及び複数のＨＤＬタンパク質からなる２６のパネルによって全体的なコレステロール引き抜き及び心血管疾患リスクを予測する能力を試験することについて説明する。ＨＤＬタンパク質は質量分析法によって測定した。
【００８９】
ＨＤＬの精製
ＨＤＬの精製には以下のプロトコールを使用した。１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で、１５Ｎ標識Ｈｉｓタグ付きアポリポタンパク質Ａ−Ｉの０．５ｍｇ／ｍＬ溶液２５μＬとヒト血清１２μＬを混合する。血清とＡｐｏＡ−Ｉの混合物を３７℃で１５分間インキュベートする間にＨｉｓタグ付きＡｐｏＡ−Ｉが血清試料中のＨＤＬ粒子に取り込まれる。次に、ハイスループット自動液体処理プラットフォームに適するピペットチップ形式の固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、混合物からＨＤＬを精製する。簡潔には、１６４μＬの結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）を添加して、血清とＡｐｏＡ−Ｉの混合物を２００μＬに希釈する。アフィニティーカラムチップを４００μＬの結合緩衝液で平衡化する。次いでアフィニティーカラムを用いて、１８０μＬの血清／ＡｐｏＡ−Ｉ混合物を流速２００μＬ／分で６回吸引し、カラムベッド上に分注する。次に、結合緩衝液２００μＬを吸引して分注することによりカラムベッドを１回洗浄し、続いて強洗浄緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）２００μＬで２回目の洗浄を行う。その後、結合したＨＤＬ粒子を、溶出緩衝液（３００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５％メタノール、ｐＨ９．０）９０μＬを吸引して分注することにより溶出する。
【００９０】
ＨＤＬの消化
次に、１００ｍＭジチオスレイトール５μＬ及び５０ｎｇ／μＬエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ１０μＬを、溶出したＨＤＬに加え、３７℃で４時間インキュベートする。Ｌｙｓ−Ｃが、配列中のリジンアミノ酸残基のＣ末端側でＨＤＬ関連タンパク質を切断し、ＬＣ−ＭＳ分析及び定量化で予測可能な標的ペプチドを産生する。
【００９１】
ＨＤＬプロテオーム標的ペプチドのＬＣ−ＭＳ分析
２５％メタノールを含有する溶出緩衝液中の、Ｌｙｓ−Ｃで消化したＨＤＬ２５μＬを、ミキシングティーを使用してインラインで注入及び５倍希釈した後、ＬＣカラムに直接装填する。希釈及び充填は、０．１％ギ酸水溶液をミキシングティーへ１５０μＬ／分で送液する試料充填ポンプ、及び９９％移動相Ａ（０．１％ギ酸水溶液）、１％移動相Ｂ（０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）をティーへ６００μＬ／分で送液するバイナリポンプを使用して行う。充填後、バイナリポンプをカラムと同一直線上に切り換え、５００μＬ／分で１％から６５％までの移動相Ｂの直線勾配で５分間ペプチドを溶出させる。ダイナミックＭＲＭモードで動作するＡｇｉｌｅｎｔ  ６４９０トリプル四重極質量分析計を使用してペプチドを検出する。ダイナミックＭＲＭは、スケジュール設定した保持時間枠内でペプチド標的の標的化検出及び定量化を可能にする。インタクトペプチドの質量に対する所定のｍ／ｚ値（機器のＱ１でフィルタリング）、インタクトペプチドが機器のｑ２で受ける衝突エネルギー、及びペプチド断片に対するフラグメント（ｍ／ｚ）値（Ｑ３でフィルタリング）で構成される所定の「トランジション」で、ペプチドを標的化する。トランジションは、試料内の標的とするペプチド固有であるように選択される。２つのトランジション（後半の定量化に使用される「クオンティファイア」と、品質管理に使用される「クオリファイア」）をペプチドごとにモニタリングし、タンパク質あたり最大２つのペプチドを標的化する。ペプチド標的及びそのトランジションの詳細な一覧を表１に示す。なお、質量分析測定を行う際、列挙したペプチド配列以外の他の部分を使用することができる。
【００９２】
【表１】
2019523431.tif 000003
2019523431.tif 000004
2019523431.tif 000005
【００９３】
２６のＨＤＬタンパク質パネル
表２に示しているのは、ＨＤＬの全体的なコレステロール引き抜きの測定において良好な結果が得られたタンパク質の組み合わせを示す２６のパネルである。
【００９４】
【表２】
2019523431.tif 000006
【００９５】
ペプチド及びタンパク質の定量化及び正規化
ペプチドシグナル強度は、各ペプチドの「クオンティファイア」トランジションのクロマトグラフピークを積分することによって得られる。タンパク質強度は、タンパク質の標的ペプチドそれぞれのクオンティファイアのピーク面積を合計し、１つ以上のＨＤＬ関連タンパク質の強度で正規化することによって決定される。
【００９６】
引き抜き能及びＣＡＤリスクのアルゴリズム
測定されたタンパク質から正規化した強度に基づいて、引き抜き能（探索コホート、及び新鮮時と凍結時の比較）及びＣＡＤリスク（総計、イベントの有無を問わない）の多変量アルゴリズムを開発し、これを利用して、元の血清試料のコレステロール引き抜き能またはＣＡＤリスクに関連する値を得た。モデル１は、探索試料の全体的なコレステロール引き抜きであり、モデル２は、新鮮試料と凍結試料の全体的なコレステロール引き抜きであり、モデル３は総計の冠動脈疾患（ＣＡＤ）リスクであり、モデル４はイベントありＣＡＤリスクであり、モデル５はイベントなしＣＡＤリスクである。これらのモデルの一般式を以下に示す：
モデル１及び２−予測される全体的なコレステロール引き抜き＝ｃ１＊ｐ１＋ｃ２＊ｐ２…ｃｎｐｎ＋ｉ
モデル３〜５−ＣＡＤ（イベントあり／なし）リスクスコア＝ｃ１ｐ１＋ｃ２ｐ２…ｃｎｐｎ＋ｉ
ここで、引き抜きは、係数（ｃ）をいくつかのタンパク質の正規化されたピーク面積（ｐ）で乗算したものの加算合計に定数（ｉ）を加えることで決定される。
【００９７】
統計解析
各パネルに関するデータの統計解析は、Ｒ（「ｗｗｗ．」の後に「ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ」）及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（「ｗｗｗ．」の後に「ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ」）を使用して実施した。データは、１５Ｎ  ＡｐｏＡ１タンパク質の総強度で正規化した。ＭＲＭで測定した２つのペプチドをもつタンパク質に関して、分析した試料の大半で最高強度を示すペプチドを基準にタンパク質のレベルを算出した。ロバスト線形回帰を用いて、各タンパク質と全体的なコレステロール引き抜きとの相関関係を算出した。最小絶対収縮選択演算子（ＬＡＳＳＯ：Ｌｅａｓｔ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｓｈｒｉｎｋａｇｅ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｐｅｒａｔｏｒ）をすべてのタンパク質に適用し、係数が０にならない特徴を選択した。７０の探索試料で測定して選択された特徴に段階的ロバスト線形回帰を適用した。各パネルについて、赤池情報量基準（ＡＩＣ）が最も低いモデルを選択した。
【００９８】
タンパク質の絶対モル量の決定
モル値を得るために、合成ペプチド標準物質を使用したＬＣ−ＭＳにより、表１の各ペプチドに関する測定シグナルの範囲を包含する５点外部検量線を作成し、モニターした。検量線を線形フィットし、１／Ｘ（Ｘはペプチド濃度）の重み付けを行った。その後、算出したモル値を用いてモル量係数を計算した。
【００９９】
パネル１
パネル１の全体的なコレステロール引き抜きを予測するために、モデル１及び２を作成した。このモデルを以下に示す。
モデル１及び２−予測される全体的なコレステロール引き抜き＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ２）＊ＡｐｏＥ＋（ｃ３）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ４）＊ＰＬＴＰ＋（ｃ５）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表３Ａに示す。一例として、モデル１は以下の値になる：
モデル１−予測される全体的なコレステロール引き抜き＝９．２５＋（１６５．７５）ＡｐｏＣ３＋（−８３４．８）ＡｐｏＥ＋（−１４４．２６）ＡｐｏＬ１＋（−１１５４８．３３）ＰＬＴＰ＋（−１６０．５８）ＳＡＡ１／２。
【０１００】
【表３】
2019523431.tif 000007
【０１０１】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７８であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）は上（表２）に示したものであり、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５２であった。一例として、モデル２は以下の値になる：
モデル２−予測される全体的なコレステロール引き抜き＝５．２７＋（２３０．５３）＊ＡｐｏＣ３＋（４７８６．５２）＊ＡｐｏＥ＋（４１．７１）＊ＡｐｏＬ１＋（１４３６８．８９）＊ＰＬＴＰ＋（−９３．３７）＊ＳＡＡ１／２。
【０１０２】
次に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデル（モデル３）は、５分割交差検証に基づくと、０．６２に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデル（モデル４）は、５分割交差検証に基づくと、０．６４に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデル（モデル５）は、５分割交差検証に基づくと、０．６６に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を上記の表３Ａに示し、式を以下に示す。
ＣＡＤ（イベントあり／なし）リスクスコア＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ２）＊ＡｐｏＥ＋（ｃ３）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ４）＊ＰＬＴＰ＋（ｃ５）＊ＳＡＡ１／２
モデル３−総ＣＡＤリスクスコア＝２．４９＋（１１．４４）＊ＡｐｏＣ３＋（−１４３４．４８）＊ＡｐｏＥ＋（１７．７４）＊ＡｐｏＬ１＋（−９１４１．２３）＊ＰＬＴＰ＋（１６．４５）＊ＳＡＡ１／２。
モデル４−イベントありＣＡＤのリスクスコア＝２．４２＋（７．８）＊ＡｐｏＣ３＋（−１５９７．９５）＊ＡｐｏＥ＋（−２８）＊ＡｐｏＬ１＋（−９５８４．４７）＊ＰＬＴＰ＋（１２．０３）＊ＳＡＡ１／２。
モデル５−イベントなしＣＡＤのリスクスコア＝１．０８＋（１３．１）＊ＡｐｏＣ３＋（−１２２１．３３）＊ＡｐｏＥ＋（７３．５８）＊ＡｐｏＬ１＋（−８５０９．０５）＊ＰＬＴＰ＋（２４．５９）＊ＳＡＡ１／２。
なお、表３Ａの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１０３】
その後、これらの式と値を使用して３人の患者（Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３）の最終値を算出した。結果を以下の表３Ｂに示す。
【０１０４】
【表４】
2019523431.tif 000008
【０１０５】
次の式に基づいて、表３Ｂのリスクスコア結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。さらに、この値に１００を掛け、リスク率を求めることができる。
【０１０６】
例えば、患者Ｐ１の場合、表３Ａのモデル３のリスクスコア結果は−１．１６である。これを式に代入すると、次のようになる：１／（１＋ｅｘｐ（−（−１．１６）））＝０．２３８６６７３。結果に１００を掛けると、患者Ｐ１のＣＡＤのリスク確率は２３．８％になる。表３Ｂのモデル及び患者のすべて、ならびに本実施例及び以下の実施例２の他のパネルについて以下で報告する結果に対しても、この同じ式を使用することができる。
【０１０７】
リスクスコアは、医療従事者が、心臓疾患が疑われる患者の治療を決定する際の一助として、または治療もしくは監視を必要とするような患者を除外するために用いることができる。例えば、一般に、ＣＡＤのリスク率が１０％未満である患者は通常、低リスクとみなされ（例えば、心臓疾患の治療または監視を必要としない患者とみなすことができる）、ＣＡＤのリスク率が１０〜２０％のリスクである患者は通常、中間リスクとみなされ（例えば、患者に心臓疾患の追加徴候がないか監視することができる）、ＣＡＤのリスク率が２０％を超える患者は通常、高リスクとみなされる（例えば、治療的または手術的介入により直ちに処置することができる）。
【０１０８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表３Ｃの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０１０９】
【表５】
2019523431.tif 000009
【０１１０】
なお、表３Ｃの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。例えば、ＡｐｏＣ３の値は正確に１５０．３５ではなく、１０９．９１〜１９０．８の間のいずれの値でもよく、これをモデルに使用できる。
【０１１１】
パネル２
パネル２の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル２のモデル１〜５を以下に示す：
パネル２のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ２＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ３）＊ＡｐｏＥ＋（ｃ４）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ５）＊ＣＬＵ＋（ｃ６）＊ＰＬＴＰ
モデル１〜５の値を以下の表４に示す。
【０１１２】
【表６】
2019523431.tif 000010
【０１１３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７７であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）の値を上記の表４に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．６であった。
【０１１４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６１に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．５９に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を表４に示す。なお、表４の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１１５】
５つのモデル及び３人の患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表５Ａに示す。
【０１１６】
【表７】
2019523431.tif 000011
【０１１７】
次の式に基づいて、表５Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０１１８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表５ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０１１９】
【表８】
2019523431.tif 000012
【０１２０】
なお、表５Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１２１】
パネル３
パネル３の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル３のモデル１〜５を以下に示す：
パネル３のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ２＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ３）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ４）＊ＰＬＴＰ
モデル１〜５の値を以下の表６に示す。
【０１２２】
【表９】
2019523431.tif 000013
【０１２３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７３であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表６に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５であった。
【０１２４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６１に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６１に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのＣＡＤモデルを表６に示す。なお、表６の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１２５】
５つのモデル及び３人の患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表７Ａに示す。
【０１２６】
【表１０】
2019523431.tif 000014
【０１２７】
次の式に基づいて、表７Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０１２８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表７ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０１２９】
【表１１】
2019523431.tif 000015
【０１３０】
なお、表７Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１３１】
パネル４
パネル４の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル４のモデル１〜５を以下に示す：
パネル４のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ３）＊ＣＬＵ＋（ｃ４）＊ＰＬＴＰ＋（ｃ５）＊ＳＡＡ４
モデル１〜５の値を以下の表８に示す。
【０１３２】
【表１２】
2019523431.tif 000016
【０１３３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７８であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデルの値を上記の表８に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．６８であった。
【０１３４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７２に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６６に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を上記の表８に示す。なお、表４の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１３５】
５つのモデル及び３人の患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを表９Ａに示す。
【０１３６】
【表１３】
2019523431.tif 000017
【０１３７】
次の式に基づいて、表９Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０１３８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表９ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０１３９】
【表１４】
2019523431.tif 000018
【０１４０】
なお、表９Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１４１】
パネル５
パネル５の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル５のモデル１〜５を以下に示す：
パネル５のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＡ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ１＋（ｃ３）＊ＡｐｏＣ３
モデル１〜５の値を以下の表１０に示す。
【０１４２】
【表１５】
2019523431.tif 000019
【０１４３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．８５であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を上記の表１０に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５３であった。
【０１４４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７５に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．８１に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのＣＡＤモデルの値を表１０に示す。なお、表１０の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１４５】
５つのモデル及び３人の患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表１１Ａに示す。
【０１４６】
【表１６】
2019523431.tif 000020
【０１４７】
次の式に基づいて、表１１Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０１４８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表１１ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０１４９】
【表１７】
2019523431.tif 000021
【０１５０】
なお、表１１Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１５１】
パネル６
パネル６の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル６のモデル１〜５を以下に示す：
パネル６のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ２）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ３）＊ＰＬＴＰ＋（ｃ４）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表１２に示す。
【０１５２】
【表１８】
2019523431.tif 000022
【０１５３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７４であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表１２に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．４９であった。
【０１５４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６３に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６４に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。ＣＡＤリスクに関する３つのモデル（モデル３〜５）の値を表１２に示す。なお、表１２の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１５５】
５つのモデル及び３人の患者に基づく予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表１３Ａに示す。
【０１５６】
【表１９】
2019523431.tif 000023
【０１５７】
次の式に基づいて、表１３Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０１５８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表１３ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０１５９】
【表２０】
2019523431.tif 000024
【０１６０】
なお、表１３Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１６１】
パネル７
パネル７の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル７のモデル１〜５を以下に示す：
パネル７のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ３）＊ＡｐｏＭ
モデル１〜５の値を以下の表１４に示す。
【０１６２】
【表２１】
2019523431.tif 000025
【０１６３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．８４であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表１４に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５４であった。
【０１６４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７５に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．８２に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７３に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を上記の表１４に示す。なお、表１４の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１６５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表１５Ａに示す。
【０１６６】
【表２２】
2019523431.tif 000026
【０１６７】
次の式に基づいて、表１５Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０１６８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表１５ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０１６９】
【表２３】
2019523431.tif 000027
【０１７０】
なお、表１５Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１７１】
パネル８
パネル８の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル８のモデル１〜５を以下に示す：
パネル８のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ２）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表１６に示す。
【０１７２】
【表２４】
2019523431.tif 000028
【０１７３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．８であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質に線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表１６に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．４８であった。
【０１７４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．５８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．５４に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．５３に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を上記の表１６に示す。なお、表１６の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１７５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表１７Ａに示す。
【０１７６】
【表２５】
2019523431.tif 000029
【０１７７】
次の式に基づいて、表１７Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０１７８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表１７ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０１７９】
【表２６】
2019523431.tif 000030
【０１８０】
なお、表１７Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１８１】
パネル９
パネル９の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル９のモデル１〜５を以下に示す：
パネル９のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ３
モデル１〜５の値を以下の表１８に示す。
【０１８２】
【表２７】
2019523431.tif 000031
【０１８３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．８５であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質に線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表１８に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５４であった。
【０１８４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７７に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、０．６８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を上記の表１８に示す。なお、表１８の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１８５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表１９Ａに示す。
【０１８６】
【表２８】
2019523431.tif 000032
【０１８７】
次の式に基づいて、表１９Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０１８８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表１９ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０１８９】
【表２９】
2019523431.tif 000033
【０１９０】
なお、表１９Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１９１】
パネル１０
パネル１０の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル１０のモデル１〜５を以下に示す：
パネル１０のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ３
モデル１〜５の値を以下の表２０に示す。
【０１９２】
【表３０】
2019523431.tif 000034
【０１９３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．８であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質に線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表２０に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．４８であった。
【０１９４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．５６に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．５８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．４９に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を上記の表２０に示す。なお、表２０の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０１９５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表２１Ａに示す。
【０１９６】
【表３１】
2019523431.tif 000035
【０１９７】
次の式に基づいて、表２１Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。この値に１００を掛け、ＣＡＤのリスク率を求めることができる。
【０１９８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表２１ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０１９９】
【表３２】
2019523431.tif 000036
【０２００】
なお、表２１Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２０１】
パネル１１
パネル１１の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル１１のモデル１〜５を以下に示す：
パネル１１のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ２）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ３）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表２２に示す。
【０２０２】
【表３３】
2019523431.tif 000037
【０２０３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．８であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表２２に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．４８であった。
【０２０４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．５４に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．５３に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．４８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を上記の表２２に示す。なお、表２２の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２０５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表２３Ａに示す。
【０２０６】
【表３４】
2019523431.tif 000038
【０２０７】
次の式に基づいて、表２３Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０２０８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表２３ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０２０９】
【表３５】
2019523431.tif 000039
【０２１０】
なお、表２３Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２１１】
パネル１２
パネル１２の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル１２のモデル１〜５を以下に示す：
パネル１２のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＡ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ１＋（ｃ３）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ４）＊ＣＬＵ
モデル１〜５の値を以下の表２４に示す。
【０２１２】
【表３６】
2019523431.tif 000040
【０２１３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．８６であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表２４に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．６１であった。
【０２１４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５倍交差検証に基づくと、０．７５に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５倍交差検証に基づくと、０．８２に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５倍交差検証に基づくと、０．６３に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を上記の表２４に示す。なお、表２４の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２１５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表２５Ａに示す。
【０２１６】
【表３７】
2019523431.tif 000041
【０２１７】
次の式に基づいて、表２５Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０２１８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表２５ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０２１９】
【表３８】
2019523431.tif 000042
【０２２０】
なお、表２５Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２２１】
パネル１３
パネル１３の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル１３のモデル１〜５を以下に示す：
パネル１３のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ３）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ４）＊ＨＰ＋（ｃ５）＊ＰＬＴＰ
モデル１〜５の値を以下の表２６に示す。
【０２２２】
【表３９】
2019523431.tif 000043
【０２２３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７４であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表２６に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５４であった。
【０２２４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７９に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を上記の表１４に示す。なお、表２６の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２２５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表２７Ａに示す。
【０２２６】
【表４０】
2019523431.tif 000044
【０２２７】
次の式に基づいて、表２７Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０２２８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表２７ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０２２９】
【表４１】
2019523431.tif 000045
【０２３０】
なお、表２７Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２３１】
パネル１４
パネル１４の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル１４のモデル１〜５を以下に示す：
パネル１４のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ２）＊ＡｐｏＤ＋（ｃ３）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表２８に示す。
【０２３２】
【表４２】
2019523431.tif 000046
【０２３３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．８であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質に線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表２８に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．４８であった。
【０２３４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７１に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６５に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を上記の表２８に示す。なお、表２８の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２３５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表２９Ａに示す。
【０２３６】
【表４３】
2019523431.tif 000047
【０２３７】
次の式に基づいて、表２９Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０２３８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表２９ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０２３９】
【表４４】
2019523431.tif 000048
【０２４０】
なお、表２９Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２４１】
パネル１５
パネル１５の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル１５のモデル１〜５を以下に示す：
パネル１５のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＡ２＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ２＋（ｃ３）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ４）＊ＡｐｏＤ＋（ｃ５）＊ＣＬＵ＋（ｃ６）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表３０に示す。
【０２４２】
【表４５】
2019523431.tif 000049
【０２４３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７３であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質に部分線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表２０に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５７であった。
【０２４４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６１に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を上記の表３０に示す。なお、表３０の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２４５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表３１Ａに示す。
【０２４６】
【表４６】
2019523431.tif 000050
【０２４７】
次の式に基づいて、表３１Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０２４８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表３１ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０２４９】
【表４７】
2019523431.tif 000051
【０２５０】
なお、表３１Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２５１】
パネル１６
パネル１６の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル１６のモデル１〜５を以下に示す：
パネル１６のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＡ２＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ２＋（ｃ３）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ４）＊ＡｐｏＤ＋（ｃ５）＊ＡｐｏＭ＋（ｃ６）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表３２に示す。
【０２５２】
【表４８】
2019523431.tif 000052
【０２５３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．６５であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質に部分線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表３２に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５１であった。
【０２５４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６５に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７４に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６５に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのＣＡＤモデルの値を上記の表３２に示す。なお、表３２の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２５５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表３３Ａに示す。
【０２５６】
【表４９】
2019523431.tif 000053
【０２５７】
次の式に基づいて、表３３Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０２５８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表３３ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０２５９】
【表５０】
2019523431.tif 000054
【０２６０】
なお、表３３Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２６１】
パネル１７
パネル１７の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル１７のモデル１〜５を以下に示す：
パネル１７のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ２＋（ｃ３）＊ＡｐｏＣ３
モデル１〜５の値を以下の表３４に示す。
【０２６２】
【表５１】
2019523431.tif 000055
【０２６３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．８１であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にｅｌａｓｔｉｃ  ｎｅｔモデルを適用した。このモデル（モデル２）を上記の表３４に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５３であった。
【０２６４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７４に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７２に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのモデルの値を上記の表３４に示す。なお、表３４の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２６５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表３５Ａに示す。
【０２６６】
【表５２】
2019523431.tif 000056
【０２６７】
次の式に基づいて、表３５Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０２６８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表３５Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０２６９】
【表５３】
2019523431.tif 000057
【０２７０】
なお、表３５Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２７１】
パネル１８
パネル１８の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル１８のモデル１〜５を以下に示す：
パネル１８のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＡ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ１＋（ｃ３）＊ＡｐｏＣ２＋（ｃ４）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ５）＊ＡｐｏＣ４
モデル１〜５の値を以下の表３６に示す。
【０２７２】
【表５４】
2019523431.tif 000058
【０２７３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．８６であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質に線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表３６に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５５であった。
【０２７４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７７に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．８１に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７２に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのＣＡＤモデルの値を上記の表３６に示す。なお、表３６の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２７５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表３７Ａに示す。
【０２７６】
【表５５】
2019523431.tif 000059
【０２７７】
次の式に基づいて、表３７Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０２７８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表３７Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０２７９】
【表５６】
2019523431.tif 000060
【０２８０】
なお、表３７Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２８１】
パネル１９
パネル１９の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル１９のモデル１〜５を以下に示す：
パネル１９のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＡ２＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ１＋（ｃ３）＊ＡｐｏＣ２＋（ｃ４）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ５）＊ＡｐｏＤ＋（ｃ６）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表３８に示す。
【０２８２】
【表５７】
2019523431.tif 000061
【０２８３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７１であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質に部分線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）の値を表３８に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５１であった。
【０２８４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７４に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７９に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７３に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのＣＡＤモデルの値を上記の表３８に示す。なお、表３８の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２８５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表３９Ａに示す。
【０２８６】
【表５８】
2019523431.tif 000062
【０２８７】
次の式に基づいて、表３９Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０２８８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表３９Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０２８９】
【表５９】
2019523431.tif 000063
【０２９０】
なお、表３９Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２９１】
パネル２０
パネル２０の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル２０のモデル１〜５を以下に示す：
パネル２０のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＡ２＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ３）＊ＡｐｏＤ＋（ｃ４）＊ＡｐｏＥ＋（ｃ５）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ６）＊ＰＬＴＰ＋（ｃ７）＊ＳＡＡ１／２
パネル２０のモデル１〜５の値を以下の表４０に示す。
【０２９２】
【表６０】
2019523431.tif 000064
【０２９３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．８であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にｅｌａｓｔｉｃ  ｎｅｔモデルを適用した。このモデル（モデル２）を上記の表４０に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５２であった。
【０２９４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６４に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６６に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのＣＡＤモデルの値を上記の表４０に示す。なお、表４０の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０２９５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表４１に示す。
【０２９６】
【表６１】
2019523431.tif 000065
【０２９７】
次の式に基づいて、表４１Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０２９８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表４１Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０２９９】
【表６２】
2019523431.tif 000066
【０３００】
なお、表４１Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３０１】
パネル２１
パネル２１の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル２１のモデル１〜５を以下に示す：
パネル２１のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ２）＊ＡｐｏＭ＋（ｃ３）＊ＰＬＴＰ＋（ｃ４）＊ＳＡＡ１／２
パネル２１のモデル１〜５の値を以下の表４２に示す。
【０３０２】
【表６３】
2019523431.tif 000067
【０３０３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７６であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を上記の表４２に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５であった。
【０３０４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６５に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７１に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのＣＡＤモデルの値を上記の表４２に示す。なお、表４２の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３０５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表４３Ａに示す。
【０３０６】
【表６４】
2019523431.tif 000068
【０３０７】
次の式に基づいて、表４３Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０３０８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表４３Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０３０９】
【表６５】
2019523431.tif 000069
【０３１０】
なお、表４３Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３１１】
パネル２２
パネル２２の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル２２のモデル１〜５を以下に示す：
パネル２２のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ２）＊ＡｐｏＤ＋（ｃ３）＊ＰＬＴＰ＋（ｃ４）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表４４に示す。
【０３１２】
【表６６】
2019523431.tif 000070
【０３１３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７９であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を上記の表４４に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５であった。
【０３１４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６５に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７１に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６６に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのＣＡＤモデルの値を上記の表４４に示す。なお、表４４の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３１５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表４５Ａに示す。
【０３１６】
【表６７】
2019523431.tif 000071
【０３１７】
次の式に基づいて、表４５Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０３１８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表４５Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０３１９】
【表６８】
2019523431.tif 000072
【０３２０】
なお、表４５Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３２１】
パネル２３
パネル２３の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル２３のモデル１〜５を以下に示す：
パネル２３のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＡ２＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ３）＊ＡｐｏＤ＋（ｃ４）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ５）＊ＡｐｏＭ＋（ｃ６）＊ＰＬＴＰ＋（ｃ７）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表４６に示す。
【０３２２】
【表６９】
2019523431.tif 000073
【０３２３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７９であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にｅｌａｓｔｉｃ  ｎｅｔモデルを適用した。このモデル（モデル２）を上記の表４６に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５であった。
【０３２４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６５に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６７に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのＣＡＤモデルの値を上記の表４６に示す。なお、表４６の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３２５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表４７Ａに示す。
【０３２６】
【表７０】
2019523431.tif 000074
【０３２７】
次の式に基づいて、表４７Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０３２８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表４７Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０３２９】
【表７１】
2019523431.tif 000075
【０３３０】
なお、表４７Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３３１】
パネル２４
パネル２４の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル２４のモデル１〜５を以下に示す：
パネル２４のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ３）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表４８に示す。
【０３３２】
【表７２】
2019523431.tif 000076
【０３３３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．８５であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質に線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を上記の表４８に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５３であった。
【０３３４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７５に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６７に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのＣＡＤモデルの値を上記の表４８に示す。なお、表４８の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３３５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表４９Ａに示す。
【０３３６】
【表７３】
2019523431.tif 000077
【０３３７】
次の式に基づいて、表４９Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０３３８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表４９Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０３３９】
【表７４】
2019523431.tif 000078
【０３４０】
なお、表４９Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３４１】
パネル２５
パネル２５の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル２５のモデル１〜５を以下に示す：
パネル２５のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ３）＊Ｃ３＋（ｃ４）＊ＰＬＴＰ
モデル１〜５の値を以下の表５０に示す。
【０３４２】
【表７５】
2019523431.tif 000079
【０３４３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７９であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロバスト線形回帰を適用した。このモデル（モデル２）を表５０に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．５６であった。
【０３４４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７４に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．８に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのＣＡＤモデルの値を上記の表５０に示す。なお、表５０の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３４５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表５１Ａに示す。
【０３４６】
【表７６】
2019523431.tif 000080
【０３４７】
次の式に基づいて、表５１Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０３４８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表５１Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０３４９】
【表７７】
2019523431.tif 000081
【０３５０】
なお、表５１Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３５１】
パネル２６
パネル２６の全体的なコレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル２６のモデル１〜５を以下に示す：
パネル２６のモデル１〜５＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＡ２＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ２＋（ｃ３）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ４）＊ＡｐｏＤ＋（ｃ５）＊ＡｐｏＥ＋（ｃ６）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ７）＊ＡｐｏＭ＋（ｃ８）＊ＣＥＴＰ＋（ｃ９）＊ＣＬＵ＋（ｃ１０）＊ＰＬＴＰ＋（ｃ１１）＊ＰＯＮ１＋（ｃ１２）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表５２に示す。
【０３５２】
【表７８】
2019523431.tif 000082
2019523431.tif 000083
【０３５３】
次に、このモデルを３５の複製試料で試験した。実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．７８であった。次に、７６の新鮮試料及び凍結試料（４０が新鮮試料及び３６が凍結試料）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にｅｌａｓｔｉｃ  ｎｅｔモデルを適用した。このモデル（モデル２）を上記の表５２に示しており、実験室で測定したコレステロール引き抜きと予測コレステロール引き抜きとの相関は０．６２であった。
【０３５４】
最後に、７４の健常対照及び１５７のＣＡＤ患者（８３がイベントあり、７４がイベントなし）で構成される試料の別のコホートにおいて、このパネルのタンパク質にロジスティック回帰を適用した。健常対照とＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６３に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントありＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．７１に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。健常対照とイベントなしＣＡＤ患者の比較に適合させたモデルは、５分割交差検証に基づくと、０．６に等しいＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。３つのＣＡＤモデルの値を上記の表５２に示す。なお、表５２の値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３５５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表５３Ａに示す。
【０３５６】
【表７９】
2019523431.tif 000084
【０３５７】
次の式に基づいて、表５３Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０３５８】
上記のように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表５３Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０３５９】
【表８０】
2019523431.tif 000085
【０３６０】
なお、表５３Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３６１】
実施例２
本実施例では、ＡＢＣＡ１のコレステロール引き抜き及び冠動脈疾患リスクに関する種々のアルゴリズムを使用し、単一及び複数のＨＤＬタンパク質からなる５つのパネルによって全体的なＡＢＣＡ１コレステロール引き抜き（全体的なコレステロール引き抜きではない）及び心血管疾患リスクを予測する能力を試験することについて説明する。上記５つのパネルについて、上記の実施例１と同様に同じアッセイ及び試料を測定した。以下の表５４に示すように、５つのパネルはパネル２７〜３０及びパネル１０である。
【０３６２】
【表８１】
2019523431.tif 000086
【０３６３】
パネル２７
パネル２７のＡＢＣＡ１コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル２７のモデル１〜５を以下に示す：
パネル２７のモデル１〜５＝予測されるＡＢＣＡ１コレステロール引き抜き＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ２）＊ＡｐｏＥ＋（ｃ３）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ４）＊ＨＰ＋（ｃ５）＊ＰＬＴＰ
モデル１〜５の値を以下の表５５に示す。
【０３６４】
【表８２】
2019523431.tif 000087
【０３６５】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表５６Ａに示す。
【０３６６】
【表８３】
2019523431.tif 000088
【０３６７】
次の式に基づいて、表５６Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０３６８】
実施例１に上述したように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表５６Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０３６９】
【表８４】
2019523431.tif 000089
【０３７０】
なお、表５６Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３７１】
パネル２８
パネル２８のＡＢＣＡ１コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル２８のモデル１〜５を以下に示す：
パネル２８のモデル１〜５＝予測されるＡＢＣＡ１コレステロール引き抜き＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＡ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＡ２＋（ｃ３）＊ＡｐｏＣ１＋（ｃ４）＊ＡｐｏＣ２＋（ｃ５）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ６）＊ＡｐｏＣ４＋（ｃ７）＊ＡｐｏＤ＋（ｃ８）＊ＡｐｏＥ＋（ｃ９）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ１０）＊ＡｐｏＭ＋（ｃ１１）＊Ｃ３＋（ｃ１２）＊ＣＬＵ＋（ｃ１３）＊ＨＰ＋（ｃ１４）＊ＳＡＡ１／２＋（ｃ１５）＊ＳＡＡ４
モデル１〜５の値を以下の表５７に示す。
【０３７２】
【表８５】
2019523431.tif 000090
2019523431.tif 000091
【０３７３】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表５８Ａに示す。
【０３７４】
【表８６】
2019523431.tif 000092
【０３７５】
次の式に基づいて、表５８Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０３７６】
実施例１に上述したように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表５８Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０３７７】
【表８７】
2019523431.tif 000093
2019523431.tif 000094
【０３７８】
なお、表５８Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３７９】
パネル２９
パネル２９のＡＢＣＡ１コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル２９のモデル１〜５を以下に示す：
パネル２９のモデル１〜５＝予測されるＡＢＣＡ１コレステロール引き抜き＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＡ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ３）＊ＡｐｏＤ＋（ｃ４）＊ＡｐｏＥ＋（ｃ５）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ６）＊ＡｐｏＭ＋（ｃ７）＊ＨＰ＋（ｃ８）＊ＰＬＴＰ＋（ｃ９）＊ＰＯＮ１＋（ｃ１０）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表５９に示す。
【０３８０】
【表８８】
2019523431.tif 000095
【０３８１】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表６０Ａに示す。
【０３８２】
【表８９】
2019523431.tif 000096
【０３８３】
次の式に基づいて、表６０Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０３８４】
実施例１に上述したように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表６０Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０３８５】
【表９０】
2019523431.tif 000097
【０３８６】
なお、表６０Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３８７】
パネル３０
パネル３０のＡＢＣＡ１コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル３０のモデル１〜５を以下に示す：
パネル３０のモデル１〜５＝予測されるＡＢＣＡ１コレステロール引き抜き＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＡ１＋（ｃ２）＊ＡｐｏＡ２＋（ｃ３）＊ＡｐｏＣ３＋（ｃ４）＊ＡｐｏＣ４＋（ｃ５）＊ＡｐｏＤ＋（ｃ６）＊ＡｐｏＥ＋（ｃ７）＊ＡｐｏＬ１＋（ｃ８）＊ＡｐｏＭ＋（ｃ９）＊Ｃ３＋（ｃ１０）＊ＨＰ＋（ｃ１１）＊ＰＬＴＰ＋（ｃ１２）＊ＰＯＮ１＋（ｃ１３）＊ＳＡＡ１／２
モデル１〜５の値を以下の表６１に示す。
【０３８８】
【表９１】
2019523431.tif 000098
2019523431.tif 000099
【０３８９】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表６２Ａに示す。
【０３９０】
【表９２】
2019523431.tif 000100
【０３９１】
次の式に基づいて、表６２Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０３９２】
実施例１に上述したように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表６２Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０３９３】
【表９３】
2019523431.tif 000101
2019523431.tif 000102
【０３９４】
なお、表６２Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０３９５】
パネル１０
パネル１０のＡＢＣＡ１コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを予測するために、モデル１〜５を作成した。パネル１０のモデル１〜５を以下に示す：
パネル１０のモデル１〜５−予測されるＡＢＣＡ１コレステロール引き抜き＝（ｉ）＋（ｃ１）＊ＡｐｏＣ３
モデル１〜５の値を以下の表６３に示す。
【０３９６】
【表９４】
2019523431.tif 000103
【０３９７】
５つのモデル及び３人の特異的患者に基づいて算出した予測コレステロール引き抜き及びＣＡＤリスクを以下の表６４Ａに示す。
【０３９８】
【表９５】
2019523431.tif 000104
【０３９９】
次の式に基づいて、表６４Ａの結果を使用してＣＡＤの確率を得ることができる：確率＝１／（１＋ｅｘｐ（−リスクスコア））。
【０４００】
実施例１に上述したように、各タンパク質の絶対モル量は、内部標準物質の絶対量を用いて決定した。次に、これらのモル量を用い、モデル１、３、４、及び５に関して表６４Ｂの係数を決定した。これらの係数はモル量単位であるため、どの種類の検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析など）でタンパク質値が決定されるモデルでも使用することができる。
【０４０１】
【表９６】
2019523431.tif 000105
【０４０２】
なお、表６４Ｂの値は、９５％信頼区間の範囲の数も含む。式（モデル）の各値に関して、この範囲の数を式に代入することができる。
【０４０３】
実施例３
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ関連プロテオームはコレステロール引き抜き能及び冠動脈疾患と関連する
本実施例では、コレステロール引き抜きと関連した、ＡｐｏＡ−Ｉ関連血清プロテオーム及びそのＨＤＬ機能との関係について考察した。さらに、本研究ではコレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）の予測方法の構築を試みた。Ｈｉｓタグ付き組換えＡｐｏＡ−Ｉに関連する血清タンパク質画分をデータ依存型プロテオーム解析にかけ、コレステロール逆転送及び／または冠動脈疾患（ＣＡＤ）に関連する２１種のタンパク質に関する標的定量プロテオーム法を開発した。この標的化方法を細胞系のＣＥＣ測定値（Ｎ＝１０５）と比較して、プロテオーム予測アルゴリズムを導出し、このアルゴリズムを、健常検体（Ｎ＝７４）ならびに主要有害心血管イベントありＣＡＤ検体（Ｎ＝８３）、及び主要有害心血管イベントなしＣＡＤ検体（Ｎ＝７４）の症例／対照研究において評価した。ＡｐｏＡ−Ｉ関連血清プロテオームと、ＨＤＬに観察されるタンパク質との間に有意な共通点がみられた。ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、及び血清アミロイドＡ（パネル１９）で構成されるプロテオーム予測アルゴリズムは、細胞系のＣＥＣアッセイ結果と強く相関した（Ｒ＝０．７７）。症例／対照コホートにおけるプロテオーム予測したＣＥＣ測定値は、ＣＥＣとＣＡＤ診断との間に有意な逆相関を示し（Ｐ＝０．００３２）、対照とＭＡＣＥなしＣＡＤ検体との間には有意なＣＥＣの低下が観察され（Ｐ＝０．０４）、ＭＡＣＥありＣＡＤ検体に観察されたＣＥＣはさらに減少した。
【０４０４】
材料及び方法
試験方法はすべて、必要に応じて現地の治験審査委員会による承認を得た。特に明記しない限り、試薬はすべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手可能な最高等級品を購入した。この試験で使用した検体は、プールされた血清試料を供給するＧｏｌｄｅｎ  Ｗｅｓｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手した。免疫親和性除去によって調製されたリポタンパク質非含有血清は、ＧｅｎｗａｙＢｉｏ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。加えて、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＨｅａｒｔＬａｂから入手したレムナント試料を使用した。冠動脈疾患の症例を呈する臨床検体及び対照は、Ｆａｉｒｂａｎｋｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓから入手した。
【０４０５】
ＡｐｏＡ−Ｉ関連血清画分の濃縮
組換え発現及び精製した０．５ｍｇ／ｍＬの１５Ｎ標識Ｈｉｓ６タグ付きアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（１５Ｎ−Ｈｉｓ６ＡｐｏＡ−Ｉ）（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液２４μＬを、１２μＬのヒト血清に加えた。１５Ｎ−Ｈｉｓ６ＡｐｏＡ−Ｉ／血清混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、製造業者のプロトコールに従って、５ｍｍイミダゾール、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で総容積２００μＬに試料を希釈した後、Ｎｉ−ＮＴＡ  ＨｉｓＢｉｎｄ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ固定相５μＬを充填した、ＰｈｙＴｉｐ（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）搭載Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｅｖｏ自動液体ハンドラー（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して精製した。簡潔には、希釈した試料を、反復ピペットサイクルを用いて２５０μＬ／分でＰｈｙｔｉｐカラムにゆっくりと結合させ、続いて３００μＬの２０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で引き続き洗浄した。次に、結合したＨｉｓ６−ＡｐｏＡ−Ｉ及び関連種を３００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、２５％メタノールで溶出した。溶出後、試料は直ちに次の分析に使用するか、または必要になるまで−８０℃で保存した。
【０４０６】
ナノＬＣ−ＭＳによるデータ依存型プロテオーム解析
５００ｎｇのエンドプロテイナーゼＬｙｓＣ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）に加えて、ジチオスレイトールを最終濃度５ｍＭの濃縮ＡｐｏＡ−Ｉ関連血清画分に添加した。試料をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＰＣＲサーマルサイクラーにて、３７℃で４時間消化した後、４℃に保ち、エンドプロテイナーゼ活性を停止させた。得られたペプチド混合物を、Ｗａｔｅｒｓ  ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ超高圧ＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して分離した。全ペプチド材料５００ｎｇを含む１０μＬ容積を逆相Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８捕捉カラム（１８０μｍ内径×２０ｍｍ、５μｍ粒子）（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ）に、移動相Ａ（０．１％ギ酸、２％アセトニトリル水溶液）を用いて、１０μＬ／分で４分間、注入して捕捉し、洗浄した。次に、１．７μｍのＢＥＨ１３０  Ｃ１８固定相を充填したｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹカラム（７５μｍ内径×２５０ｍｍ）で、３００ｎＬ／分でペプチドを溶出した。その際、移動相Ｂ（０．１％ギ酸、２％アセトニトリル水溶液）を２％〜５０％の勾配で２１０分間、その後移動相Ｂを１００％に増加して１５分間用い、続いて２％の移動相Ｂで１５分間再平衡化した。分解能１２０，０００のオービトラップ内でのｍ／ｚ３５０〜１８００のプリカーサーイオンスキャンを使用し、続いて衝突誘起解離を用いてイオントラップして２５のデータ依存型ＭＳ／ＭＳイベントを行う、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でペプチドを検出した。プリカーサーは選択幅２．５ｍ／ｚで分離し、２０ｍｓの間、３５％正規化衝突エネルギーで断片化した。モノアイソトピックなプリカーサーの選択が可能であり、１＋及び空電荷状態を有するプリカーサーはＭＳ／ＭＳの選択から除外された。プラスまたはマイナス１０ｐｐｍの質量を除外枠とするプリカーサーの動的除外を６０秒間利用した。イオントラップとオービトラップの自動利得制御限界をそれぞれ１×１０４と１×１０６に設定した。ＲＡＷ形式の質量分析データファイルを、統合型Ａｎｄｒｏｍｅｄａ検索アルゴリズム１５を使用して、ＭａｘＱｕａｎｔ（バージョン１．４．１．２）１４で処理し、タンパク質を同定した。一般汚染物質データベースに加えて、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（２０１３年１０月１４日にＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからダウンロード、８８，３０４エントリからなる）に対して検索を行った。プリカーサー質量許容値±７ｐｐｍ及びフラグメント質量許容値０．６Ｄａで検索を実施した。ＬｙｓＣを切断酵素に設定し、少なくとも６個のアミノ酸を含み、切断エラーが２つまでのペプチドを分析対象とした。メチオニン酸化は可変修飾として許容した。タンパク質及びペプチドの偽陽性率は１％に設定した。タンパク質の同定をさらに高精度化し、少なくとも２つのペプチドが同定されるようにした。
【０４０７】
標的プロテオーム解析
還元剤（１００ｍＭジチオスレイトール５μＬ）及びプロテアーゼ（５０ｎｇ／μＬエンドプロテイナーゼＬｙｓＣ（Ｗａｋｏ）１０μＬ）を、濃縮されたＡｐｏＡ−Ｉ関連血清画分８５μＬに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。その時点の温度は４℃に低下していた。１３Ｃ６、１５Ｎ２−リジン標識内部標準ペプチドの規定混合物５μＬをタンパク質消化物７５μＬに添加し、続いて２５μＬを注入して液体クロマトグラフィー多重反応モニタリング質量分析（ＬＣ−ＭＲＭ）により分析した。注入試料を１．２５分間カラムに充填して洗浄した後、移動相Ｂの直線勾配により５００μＬ／分で溶出した。スケジュール設定した保持時間枠内でペプチド標的の標的化検出が可能である、ダイナミックＭＲＭモードで動作するＡｇｉｌｅｎｔ  ６４９０トリプル四重極質量分析計を使用してペプチドを検出した。トランジションは、試料内の標的とするペプチド固有であるように選択、最適化して、決定される。２つのトランジションをペプチドごとに、かつタンパク質あたり最大２つのペプチドをモニタリングした。ペプチド標的及びそのトランジションの詳細な一覧を上記の表１に記載しており、パネル１９については以下の表６７に記載している。
【０４０８】
【表９７】
2019523431.tif 000106
【０４０９】
ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、クオンティファイアトランジションに対するクロマトグラフピークを積分することにより、ペプチドシグナル強度を得た。クオリファイアイオン比及び内部標準ピークを使用して、すべてのピークを手作業でレビューした。
【０４１０】
超遠心分離によるＨＤＬの単離
プールされた血清由来のＨＤＬ（１．０６３ｇ／ｍＬ＜ｐ＜１．２１ｇ／ｍＬ）を、Ｂｒｅｗｅｒの方法に多少の変更を加えて用い単離した１６。
【０４１１】
コレステロール引き抜き能の細胞系による評価
ヒト血清試料をＬＤＬ除去し、Ｊ７７４マクロファージからの３Ｈ標識コレステロールの引き抜きを測定する細胞系のアッセイを、ｄｅ  ｌａ  Ｌｌｅｒａ−Ｍｏｙａ１７によって記載された方法を用いてＶａｓｃｕｌａｒ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）に外部委託して実施した。測定値はすべて、引き抜き値を正規化して報告した。
【０４１２】
ＣＥＣアルゴリズム開発用検体
引き抜き相関モデルを開発するための血清試料は、訓練用と試験用のセットをそれぞれ用意するために、６週間空けて２つのバッチで回収されたＣＨＬの未同定のレムナント検体から採取した。各セットに対する候補試料の選択指針として、ＬＤＬ−ｃ、ＨＤＬ−ｃ、ＡｐｏＡ、ＡｐｏＢ、トリグリセリド、及び高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）の定量分析を用い、最終的に好適合の検体セットを得た（表６５）。
【０４１３】
【表９８】
2019523431.tif 000107
【０４１４】
定量的ＡｐｏＡ−Ｉ関連プロテオーム分析及びＣＥＣ測定値を、品質管理用物質として高度に特性決定された血清プールとともに１０５の検体について収集した。
【０４１５】
臨床確認用の検体
検体はＦａｉｒｂａｎｋｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓバイオバンクから選択した。これは、２２〜８７歳の男女１５００人から得た血清試料からなり、内訳は、冠動脈造影によるＣＡＤ所見（≧５０％閉塞）７５０人、ＣＡＤ、陽性ストレス試験、糖尿病、高血圧症、または脂質異常（ＬＤＬ−Ｃ≧１３０ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ−Ｃ≦４０ｍｇ／ｄＬ、総コレステロール≧２４０ｍｇ／ｄＬ、またはトリグリセリド≧２００ｍｇ／ｄＬ）に関して陽性所見のない対照対象７５０人であった。空腹時の血液試料を試験ＳＯＰに従って採取した後、−８０℃で保存した。ＣＡＤと診断された対象を評価して、症例とイベントあり症例の２群を決定した。全ＣＡＤ患者を、主要有害心血管イベント（ＭＡＣＥ）を規定するＩＣＤ−９コードに従って、心筋梗塞（４１０）、冠動脈バイパス術もしくは血管形成術（３６．１、４５．８２）、または脳卒中（４３４．９１）に分類した。ＩＣＤ９分類により心筋梗塞と確認された場合、記録を調査し、虚血性疼痛の履歴、異常なＥＣＧ、異常なトロポニンの３つのうち２つを有する患者を選択した。合計で、イベントなしＣＡＤ対象７４人と、ＭＡＣＥイベントありＣＡＤ対象８３人を選択した（表６６）。
【０４１６】
【表９９】
2019523431.tif 000108
【０４１７】
７４人の適合対照群も選択した。
【０４１８】
標的アルゴリズムの開発
コンピューター解析の前に、各標的ペプチドのピーク面積存在量を、濃縮過程で使用した１５Ｎ−Ｈｉｓ６ＡｐｏＡ−Ｉの強度で正規化した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した２種以上のペプチドを有するタンパク質に関して、分析した試料の大半で最高強度を示すペプチドを用いてタンパク質の相対量を確定した。タンパク質レベルのデータを統計分析に使用した。特性選択のための一連の逐次工程を包含する分析パイプラインを正規化タンパク質レベルデータに適用して、ＣＥＣに関連するタンパク質を探索した１８。一変量分析では、ロバスト線形回帰を各タンパク質に適用し、７０個の訓練試料に対するＣＥＣを予測し、ｐ値＜０．１を有するタンパク質を選択した。ｅｌａｓｔｉｃ  ｎｅｔモデルを用いてさらなるフィルタリングを適用した。多変量解析では、部分最小二乗回帰を用いてフィルタリングしたタンパク質でバイオマーカーパネルを構築した。バイオマーカーパネルの性能を評価するために、予測ＣＥＣと測定ＣＥＣとの間のスピアマン相関及び中央絶対偏差（ｃｏｓｔ）を計算した。最初に、未較正のＬＣ−ＭＳピーク強度を用いてバイオマーカーパネルを作成した。プロテオーム法は較正後の絶対モル量が得られるように後に改良し、パネル係数は部分最小二乗回帰を用いて較正後のＭＲＭデータで高精度化した。最後に、パネルを３５個の検証試料で試験した。ＣＥＣ予測バイオマーカーパネルがＣＡＤの有無によって対象を区別できるかどうかを評価するために、７４人の健常対照と１５７人のＣＡＤ患者のバイオマーカータンパク質を試験した。データの統計分析は、Ｒバージョン３．２．３を使用して実施した（Ｒ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ  （２０１３）．Ｒ：Ａ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）。患者コホート累積分布の比較は、コルモゴロフ−スミルノフ（Ｋ−Ｓ）検定を用いて実施した。
【０４１９】
結果：
ＡｐｏＡ−Ｉアフィニティープールの迅速な調製
質量分析に基づくプロテオミクスを用いた、無脂質ＡｐｏＡ−Ｉ関連タンパク質の正確かつハイスループットな分析を容易にするために、迅速なアフィニティー濃縮のための戦略を考案した。この戦略では、Ｈｉｓタグ付きＡｐｏＡ−Ｉと固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを使用した（図２）。Ｎ末端ポリヒスチジンタグを有する組換え型の無脂質ＡｐｏＡ−Ｉ（Ｈｉｓ６ＡｐｏＡ−Ｉ）をヒト血清に添加し、３７℃でインキュベートした。次に、試料をニッケル−ＮＴＡ固定相に通して、Ｈｉｓ６ＡｐｏＡ−Ｉ及び関連タンパク質と結合させた。低濃度のイミダゾールで固定相を洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を抑制した後、複合体化タンパク質及び過剰なＨｉｓ６ＡｐｏＡ−Ｉを、高濃度イミダゾールを含む望ましい回収緩衝液に溶出する。次に、最終的に液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）で分析するため、標準的な酵素消化ワークフローを、溶出した試料に施した。分析対象の検体に属する内因性タンパク質と区別するため、外因性ＡｐｏＡ−Ｉの特異的測定が可能である１５Ｎ標識Ｈｉｓ６ＡｐｏＡ−Ｉ（１５Ｎ−Ｈｉｓ６ＡｐｏＡ−Ｉ）を使用した。
【０４２０】
無脂質ＡｐｏＡ−Ｉアフィニティープールのデータ依存型プロテオーム解析
初期のデータ依存型実験で明らかになったように、無脂質ＡｐｏＡ−Ｉの親和性画分で同定されたタンパク質の大半がＨＤＬ関連であることがわかっている。従来の超遠心分離を用いて単離したＨＤＬと、４００人の男性ドナーの市販血清プールを用いたＡｐｏＡ−Ｉ関連血清画分との定性的プロテオーム比較により、この観察結果のさらなる明確化を試みた。各濃縮技術あたり３回の繰り返し工程を実施した。総じて、９１種のタンパク質が超遠心分離によって精製されたＨＤＬ中で同定され、１６２種のタンパク質が無脂質ＡｐｏＡ−Ｉアフィニティープールで同定され、そのうち７８種のタンパク質は両方の調製方法に共通していた（図３を参照）。
【０４２１】
我々の実験で同定されたタンパク質を、１７の公開されているＨＤＬプロテオーム試験の結果をまとめたＨＤＬ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｗａｔｃｈリストと比較した。このリストには２２９種のタンパク質が含まれており、うち９５種のタンパク質が３つ以上の研究で同定されているか、または他の分子生物学的手法で検証されている。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｗａｔｃｈリストの全２２９種のタンパク質のうち、８０種は超遠心分離で調製したＨＤＬで同定され、８６種は我々のアフィニティー精製プールで同定され、７２種（ケラチンなどの一般的な夾雑物を除く）は両方の調製方法で共通していた（７７％が共通）（図３）。
【０４２２】
多重反応モニタリング質量分析による標的定量
ＡｐｏＡ−Ｉアフィニティープールとコレステロール引き抜き能（ＣＥＣ）との関係を調べるため、液体クロマトグラフィー多重反応モニタリング（ＬＣ−ＭＲＭ）に基づく正確な定量方法の使用を試みた。文献検索及び我々のデータ依存型ＬＣ−ＭＳ結果に基づいて、脂質輸送、コレステロール逆転送及び／または心血管疾患との関連が知られている２１種のタンパク質を開発対象として選択した（脂質代謝（アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｃ−ＩＶ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｊ、Ｌ−Ｉ、Ｍ）、酵素（リン脂質輸送タンパク質−ＰＬＴＰ、コレステリルエステル転送タンパク質−ＣＥＴＰ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ−ＬＣＡＴ、パラオキソナーゼ１−ＰＯＮ１）、ならびに急性期反応タンパク質（補体Ｃ３、ハプトグロビン、血清アミロイドＡ１及び２−ＳＡＡ１／２、ならびにＳＡＡ４））。アッセイ開発対象とする各タンパク質由来の２つのペプチド（可能な場合）を同定し、ワークフロー全体を最適化した。４時間以内に全タンパク質について安定なペプチド存在量が産生される消化条件を得た。血清原液からの天然ＡｐｏＡ−Ｉの回収率は、約５５％であると推定され、これは、イムノアッセイによって決定された血清中のＡｐｏＡ−Ｉレベルと強く相関していた（ピアソンｒ＝０．８４、補足図６）。比較すると、無脂質の１５Ｎ−Ｈｉｓ６ＡｐｏＡ−Ｉの平均回収率はＰＢＳ緩衝液からは８５％であり、溶媒除去した血清からは７２％であった。
【０４２３】
ＣＥＣ予測のための多変量アルゴリズムの開発及び検証
無脂質のＡｐｏＡ−Ｉアフィニティー濃縮技術を使用して、一連の血清試料を分析し、アフィニティー濃縮タンパク質とＣＥＣとの間に関連性が存在するかどうかを調べた。７０の訓練試験試料及び３５の独立した試験試料（表６５）のセットは、どの疾患診断かは問わずに無作為に選択したが、リポタンパク質測定との一致に関しては慎重を期した。各検体について、２１種のタンパク質の補体の正規化ＣＥＣ及び正規化質量分析データを決定した。一変量統計法及び多変量統計法を含む多段階インフォマティクスパイプラインを実施して、相対タンパク質存在量が細胞系のＣＥＣ１８と相関するバイオマーカーパネルを開発した。一変量解析の後、ｐ値＜０．１を有する９種のタンパク質（アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｃ−ＩＶ、Ｄ、ＣＥＴＰ、及びＳＡＡ）をロバスト線形回帰によって同定した。それに続くｅｌａｓｔｉｃ  ｎｅｔ回帰で、６種のタンパク質（ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、及びＳＡＡ）を選択して、それに部分線形回帰を適用し、最終予測モデルを確定した。
【０４２４】
予測パネルは、ＣＥＣ測定値の測定誤差を考慮すると十分に機能した（訓練セット、スピアマンｒ＝０．６３、ｐ＜０．００１；検証セット、スピアマンｒ＝０．７０、Ｐ＜０．００１）。全開発試料セット内でのプロテオーム予測ＣＥＣアルゴリズムの性能を図４Ａに示す（ピアソンｒ＝０．７７）。細胞系のアッセイ及びプロテオーム推定及び他の臨床測定値（総コレステロール、ＨＤＬ−ｃ、ＬＤＬ−ｃ、非ＨＤＬ−ｃ、トリグリセリド、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＢ、及びｈｓＣＲＰ）によって決定されたＣＥＣ間の関連性を調べた。細胞系のＣＥＣと最も有意な関連性があるのは、以前の報告１１、１２と同様、ＡｐｏＡ−Ｉ（ピアソンｒ＝０．５７、図４Ｂ）及びＨＤＬ−ｃ（ピアソンｒ＝０．４５、図４Ｃ）であった。また、ＣＥＣとｈｓＣＲＰとの間には有意な負の相関がみられた（ピアソンｒ＝−０．２３、図４Ｄ）。予測ＣＥＣは総コレステロールに対しても同様に挙動したが、ＡｐｏＡ−Ｉ及びＨＤＬ−ｃとの関係については、プロテオームパネルにＡｐｏＡ−Ｉが含まれているため、計算しなかった。
【０４２５】
予測ＣＥＣはＣＡＤと逆相関する
予測ＣＥＣは、細胞系のＣＥＣ測定に関する報告と同様に心血管疾患と逆相関するはずであると仮定し、本発明者らの多変量パネルを使用して、１５７人のＣＡＤ患者（主要有害心血管イベント（ＭＡＣＥ）なし７４人、ＭＡＣＥあり８３人）、ならびに年齢及び性別が一致する外見は健常な対照７４人に関してＣＥＣを予測した（表６６）。
【０４２６】
これらコホート間での予測ＣＥＣの分布を図５Ａに示す。ＣＡＤ患者の予測ＣＥＣ中央値が低いことがわかった（９．５４％引き抜き／４時間；対照９．９８％引き抜き／４時間；ｐ＝０．００３２）。ＣＡＤ症例をＭＡＣＥのない症例と特定の有害事象を伴わない症例に分けた場合、ＭＡＣＥのないＣＡＤ患者に、対照と比較して有意に低い予測ＣＥＣが観察される（Ｐ＝０．０４）。血管再生術を受けたＣＡＤ患者（ｎ＝２９）は、ＭＡＣＥのないＣＡＤ患者よりも低い予測ＣＥＣを示した（Ｐ＝０．０２７、対照との比較Ｐ＝０．０００３）。心筋梗塞（ｎ＝３８）または脳卒中（ｎ＝１６）を経験したＣＡＤ患者は、低い予測ＣＥＣ中央値を示したが、ＭＡＣＥのないＣＡＤ患者との有意差はなかった。年齢及び性別が一致する対照とＣＡＤ試料との比較を６週間後に繰り返し、初回の分析で観察された傾向を裏付けることを実証した。また、臨床転帰を伴う少数の選択試料において、予測ＣＥＣと細胞系のＣＥＣ測定との性能の比較を実施した。対照及びＣＡＤコホートにおいて、それぞれ１５の最高及び最低予測ＣＥＣ値を同定した後、細胞系のＣＥＣ測定値を取得した。補足図７に示すように、ＣＡＤ検体のサブセットは、プロテオーム予測と細胞系のＣＥＣ測定のいずれによって決定した場合にもＣＥＣが有意に低かった（Ｐ値＜０．００１）。さらに、転帰が同じサブセットで、予測値と細胞系の測定値とを比較した場合、明らかな有意差はなかった（対照ではＰ＝０．３９、ＣＡＤではＰ＝０．０８）。
【０４２７】
細胞系アッセイによるＣＥＣの決定がコレステロール代謝の調査に効果的であることは明白であり、血清系のＣＥＣ測定値が心血管リスクの独立した予測因子であることを示す研究が増えている。残念ながら、この方法は、労働集約的でワークフローが複雑であり、相対的に不正確なため、規模、スループット、精度、較正、そして最終的には分析検証の実現が求められる臨床検査に、この技術を転用するには支障がある。
【０４２８】
プロテオーム予測ＣＥＣの性能
試験セットでのプロテオーム予測ＣＥＣの性能（ｒ＝０．７１）は有望であり、コレステロール引き抜きの調節にＡｐｏＡ−Ｉ以外のタンパク質が果たす重要な役割を示唆している。蛍光標識コレステロールを用いた修飾細胞系のアッセイを実施する最近のＣＥＣの臨床研究によると、前提となる放射性同位体アッセイを用いた正規化引き抜きとやや一致する有意な予測値がみられた（Ｒ＝０．５４）１２。それ以外にも引き抜きとの相関が確認されている。予測された通り、多くの研究において、ｒ＝０．２２〜０．６４（本研究ではｒ＝０．５７）の範囲でＡｐｏＡ−Ｉとの正の一変量相関が報告されている１１、１９。高ＨＤＬ−Ｃ（＞６８ｍｇ／ｄＬ）検体では、スフィンゴミエリン／ホスホルエタノールアミン比が引き抜きと有意に関連している（ｒ＝０．６４）が、正常なＨＤＬ−Ｃレベルでは関連していないことが実証された。引き抜きはまた、ＨＤＬサブクラスに依存することが知られており、これは一連の構造的及び機能的相互作用の複雑さをさらに示唆している２０。これらの多様性は完全には解明されないままであるが、追加の生化学的及び生物物理学的データをモデルに統合し、ＣＥＣ予測を改善できる可能性がある。
【０４２９】
ＣＥＣ予測パネルタンパク質の機構的考察
本発明者らの研究で得たＣＥＣのプロテオーム予測因子は、コレステロール輸送と機械的に関連するタンパク質（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｄ、及びＳＡＡ；パネル１９）で構成される。引き抜きと正の相関を有するタンパク質では、ＡｐｏＡ−Ｉ及びＡｐｏＡ−ＩＩが細胞コレステロールの一次受容体として機能している１、２１。同様にＡｐｏＣ−Ｉは、重要ではないが効率的なコレステロール受容体であり、ＨＤＬの成熟に役割を果たすレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼＬＣＡＴも活性化する２２。ＡｐｏＣ−ＩＩ及びＡｐｏＣ−ＩＩＩは、ＨＤＬリモデリングに関与するリポタンパク質リパーゼを調節し、ＡｐｏＤは、ｐｒｅ−β３−ＨＤＬ、すなわちＨＤＬの強力な細胞コレステロール受容形態の形成に役割を果たす２２、２３。血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）は急性期反応タンパク質であり、ＨＤＬからのＡｐｏＡ−Ｉの変位によりコレステロール引き抜き能に負の影響を与えることが広く特性決定されている２４、２５。本発明者らはまた、引き抜きの調節にＳＡＡが果たす機能的役割が、引き抜きとｈｓＣＲＰとの間の負の相関に反映されることにも注目した。ｈｓＣＲＰは、全身性炎症の測定によく用いられる別のバイオマーカーである（ただし、本研究ではＡｐｏＡ−Ｉの関連性は同定していない）。興味深いことに、プロテオーム解析によって解明された無脂質ＡｐｏＡ−Ｉと血清タンパク質との相互作用は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｗａｔｃｈリストに分類されている標準的なＨＤＬプロテオームと高度の重複を示す。
本実施例の参考文献：
１．Ｋｏｎｔｕｓｈ  Ａ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＭＪ．Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；２０１２．
２．Ｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＮＯ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２００４；１０１（１８）：６９９９−７００４．
３．Ａｎｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ／Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｂｅｔｔｅｒ  Ｔｈａｎ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  Ａｒｅ  Ｆａｖｏｒａｂｌｙ  Ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００３；１０８（２２）：２７５１−２７５６．
４．Ｇａｉｄｕｋｏｖ  Ｌ，Ｔａｗｆｉｋ  ＤＳ．Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ，Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  Ｌａｃｔｏｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ  ＰＯＮ１  Ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｏｎ  ＨＤＬ  ｗｉｔｈ  ＡｐｏＡ−Ｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５；４４（３５）：１１８４３−１１８５４．
５．Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ−１，ａｎｄ  ＨＤＬ  ｆｏｒｍ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３；１２３（９）：３８１５−３８２８．
６．Ｃａｖｉｇｉｏｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｉ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｌｉｐｉｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ−ｆｒｅｅ  ｓｔａｔｅｓ：  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１０；２８５（２４）：１８８４７−１８８５７．
７．Ｆｒｅｄｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１６；１３（１）：８３−９８．
８．Ｇａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２００２；４１５（６８６８）：１４１−１４７．
９．Ｇｕｎｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｂｕｍｉｎ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｌｂｕｍｉｎｏｍｅ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ−Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ．２００７；１（１）：７３−８８．
１０．Ｐｏｕｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（ＳＡＰ）Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｌｅｖｅｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１７；５６（６）：８９６−９０２．
１１．Ｋｈｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｃａｐａｃｉｔｙ，ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１１；３６４（２）：１２７−１３５．
１２．Ｒｏｈａｔｇｉ  ｅｔ  ａｌ．ＨＤＬ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１４；３１７（２５）：２３８３−２３９３．
１３．Ｍｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｙｏｎｄ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｆａｍｉｌｙ  Ｈｉｓｔｏｒｙ，ａｎｄ  Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１６；６７（２１）：２４８０−２４８７．
１４．Ｃｏｘ  Ｊ，Ｍａｎｎ  Ｍ．ＭａｘＱｕａｎｔ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｈｉｇｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ  ｐ．ｐ．ｂ．−ｒａｎｇｅ  ｍａｓｓ  ａｃｃｕｒａｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；２６（１２）：１３６７−１３７２．
１５．Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｅｎｇｉｎｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ＭａｘＱｕａｎｔ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１１；１０（４）：１７９４−１８０５．
１６．Ｄｕｖｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ  ｍａｊｏｒ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｉ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３；３２（４６）：１２３７２−１２３７９．
１７．ｄｅ  ｌａ  Ｌｌｅｒａ−Ｍｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｌｕｘ  ｖｉａ  ＡＢＣＡ１  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｔｏ  ｒｅｍｏｖｅ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｆｒｏｍ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２０１０；３０（４）：７９６−８０１．
１８．Ｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｆｒｏｍ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２０１５；１９２（１０）：１１６２−１１７０．
１９．Ｓａｌｅｈｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＤＬ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ：  ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ＆  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１５；３（７）：５０７−５１３．
２０．Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．ＨＤＬ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ＡＢＣＡ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｘｐｏｒｔ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２０１５；１１６（７）：１１３３−１１４２．
２１．Ｒｏｔｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＩＩ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ  Ｄｏｅｓ  Ｎｏｔ  Ｉｍｐａｉｒ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２００５；２５（９）．
２２．ｖｏｎ  Ｅｃｋａｒｄｓｔｅｉｎ  Ａ，Ｎｏｆｅｒ  Ｊ−Ｒ，Ａｓｓｍａｎｎ  Ｇ．Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｆｆｌｕｘ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２００１；２１（１）：１３−２７．
２３．Ｆｒａｎｃｏｎｅ  ＯＬ，Ｆｉｅｌｄｉｎｇ  ＣＪ．Ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｔｅｐｓ  ｉｎ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ−ｌｉｖｅｄ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｃｃｅｐｔｏｒｓ．Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．１９９０；１１（ｓｕｐｐｌ  Ｅ）．
２４．Ｖａｉｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＤＬ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｃａｐａｃｉｔｙ．Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２０１５；５６（８）：１５１９−１５３０．
２５．Ｂａｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ（ＳＡＡ）：  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ＨＤＬ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ．Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．１９９５；３６（５）：１０５８−１０６５．
実施例４
本実施例では、パネル１８（ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ１、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＣ３、及びＡｐｏＣ４）をＦａｉｒｂａｎｋｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｔｉｅｓの試料及びＡｂｃｏｄｉａ  Ｂｉｏｂａｎｋのサブセットに適用した。
【０４３０】
Ｆａｉｒｂａｎｋｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（Ｆａｉｒｂａｎｋｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、仮説駆動型研究のための広範なアノテーション付き生物検体リポジトリを作成している。これらの生体試料は、全州的な電子臨床データリポジトリであるＩｎｄｉａｎａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｃａｒｅ（ＩＮＰＣ）から抽出した縦断的な臨床的及び疾患特異的な健康記録情報とリンクされている。使用されたＦａｉｒｂａｎｋｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣＡＤコレクションには、冠動脈疾患と診断された個人に加え、一致する対照由来の血清及び血漿を含む。この試料セットを用いて、質量分析法で測定したモルタンパク質量に基づくコレステロール引き抜き予測モデル（表３７Ｂ、モデル１）を、健常だった（対照）患者（ｎ＝７４）または冠動脈疾患（ＣＡＤ）と診断されたことがある患者（ｎ＝１５７）で構成される試料セットに適用した。図８に示すように、各コホート間で予測コレステロール引き抜き値を比較すると、対照コホートと比較してＣＡＤコホートのコレステロール引き抜きの方が全体的に低いことが明らかである（Ｐ＝０．０３、マンホイットニー検定による）。臨床転帰の分岐（対照対ＣＡＤ）を最適化するためにパネル１８のタンパク質成分に対してロジスティック回帰を実行すると、表３７、モデル３のパラメーターになる。本発明者らは、Ｆａｉｒｂａｎｋｓの臨床セットに適用した場合、転帰に基づく患者コホートの層別化が改善されることを確認している。図９に示すように、転帰最適化モデルの適用は、ＣＡＤと診断されるリスクと相関するバイオマーカースコア尺度で患者を層別化する。ここでは、ＣＡＤコホートは、対照群と比較して有意に高いバイオマーカースコアを示している（Ｐ＜０．０００１、マンホイットニー検定による）。
【０４３１】
本発明者らはまた、パネル１８のモデルをＡｂｃｏｄｉａ  Ｂｉｏｂａｎｋのサブセットにも適用した。このサブセットは、５０〜７４歳の閉経後女性の２０万人で構成され、そのうち５万人を数年間にわたり縦断的にサンプリングした。本試験では、対照患者は、非致命的な心筋梗塞が確認された症例とサンプリング場所、年齢、及びサンプリング日時が一致していた。モデル１とモデル３（表３７Ｂ）はいずれも、これらのコホート間で、イベント発生前の０〜８年の範囲にわたり、持続的かつ統計的に有意な分岐を示している。
【０４３２】
【表１００】
2019523431.tif 000109
【０４３３】
本出願で言及された全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲及び趣旨から逸脱しない、記載された本発明の方法及び組成物の種々の変更及び変形例が当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明されているが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないものと理解されるべきである。実際には、関連分野の当業者には明らかである、記載された本発明の実施形態の様々の変更が、添付の特許請求の範囲内であることが意図されている。
【図１】
2019523431.tif 000110
【図２】
2019523431.tif 000111
【図３】
2019523431.tif 000112
【図４−１】
2019523431.tif 000113
【図４−２】
2019523431.tif 000114
【図５】
2019523431.tif 000115
【図６】
2019523431.tif 000116
【図７】
2019523431.tif 000117
【図８】
2019523431.tif 000118
【図９】
2019523431.tif 000119
【配列表】
2019523431000001.app
【国際調査報告】
2019523431.tif 000120
2019523431.tif 000121