(57)【要約】  ｉｎ  ｖｉｖｏで癌を治療する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）に少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドを導入することと、ｈＭＳＣが腫瘍組織の第１の合胞体癌細胞とともにギャップジャンクションチャネルを形成することを可能にする条件下で、ｉｎ  ｖｉｖｏで合胞体癌細胞の腫瘍組織をｈＭＳＣと接触させることとを含む。結果として、少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドは、ギャップジャンクションチャネルを横切ることによって第１の合胞体癌細胞に送達され、および少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドは、第１の合胞体癌細胞と第２の合胞体癌細胞との間のギャップジャンクションチャネルを横切ることによって腫瘍組織の第２の合胞体癌細胞に送達される。【選択図】図１９Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｖｏで癌を治療する方法であって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複数のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）に少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドを導入することと、
ｂ）前記複数のｈＭＳＣの１つのｈＭＳＣが腫瘍組織の第１の合胞体癌細胞とともにギャップジャンクションチャネルを形成することを可能にする条件下で、複数の合胞体癌細胞を含む前記腫瘍組織をｉｎ  ｖｉｖｏで前記複数のｈＭＳＣと接触させることとを含み、
それによって前記少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドが前記ギャップジャンクションチャネルを横切ることで前記第１の合胞体癌細胞内に送達され、および前記少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドが前記第１の合胞体癌細胞と第２の合胞体癌細胞との間のギャップジャンクションチャネルを横切ることで前記腫瘍組織の前記第２の合胞体癌細胞内に送達される方法。
【請求項２】
前記ｈＭＳＣが前記少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドを前記第１の合胞体癌細胞に送達することができる前に、前記少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドが前記ｈＭＳＣを死滅させない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数のｈＭＳＣが約１０５ｈＭＳＣを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドがｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６を模倣するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ−３４ａを模倣するｓｉＲＮＡ、コルタクチンの翻訳を妨害するｓｉＲＮＡ、Ａｋｔの翻訳を妨害するｓｉＲＮＡ、ゲルゾリンの翻訳を妨害するｓｉＲＮＡ、ａ−チュ−ブリンの翻訳を妨害するｓｉＲＮＡ、ＧＡＰＤＨの翻訳を妨害するｓｉＲＮＡ、およびＫｒａｓＧＡＴの翻訳を妨害するｓｉＲＮＡを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記腫瘍組織が子宮頚癌組織、結腸直腸癌組織、メラノーマ組織、膵癌組織、前立腺癌組織、非小細胞肺癌およびラット神経膠腫を含む群のメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍組織が前立腺癌組織であり、および前記少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドがｍｉＲ−１６を模倣するｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記複数のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）内に少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドを導入することが、前記少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドをコードする前記少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドの２０ナノモル溶液中で前記複数のｈＭＳＣを培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記複数のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）内に少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドを導入することが、前記少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドをコードする前記少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドおよびトランスフェクション試薬の溶液中で複数のｈＭＳＣを培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条の下で２０１６年３月２３日に出願された米国仮出願第６２／３２１，２３０号の利益を主張し、その内容全体は本明細書に完全に記載されているかのように参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本出願は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４２５０４号として、２００４年１２月１７日出願の米国特許出願第１０／５８３，３６９号（２０１０年１１月３０日に米国特許第７，８４２，６７３号として発行される）、および２０１０年１０月２２日出願の米国継続出願第１２／９１０，３４６号（２０１２年５月２９日に米国特許第８，１８８，０６２号として発行される）に関する。
【０００３】
ＥＦＳ−ＷＥＢ経由で提出された配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子出願され、電子提出されたテキストファイル形式の配列表を含む。テキストファイルは２０１７年３月２３日に作成された、表題「２０１７０３２３＿１５００３０８７ＰＣ０＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、２ＫＢサイズの配列表を含んでいる。このテキストファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体を参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００４】
政府の権利についての声明
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された認可番号ＧＭ０５５２６３の下、政府の援助で行われた。連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
本出願全体を通して種々の刊行物が脚注内または括弧内のテキストに参照されている。これらの刊行物のそれぞれその全体は、本発明が関連する最新の技術をより完全に説明するために、本明細書で用いたものと一致しない専門用語をのぞいて、参照によって本出願に組み込まれている。これらの参照のための完全な書誌引用は、特許請求の範囲に先立つ、本明細書の末尾に見いだすことができる。
【０００６】
同一出願人による先願、２００３年１月１５日出願の米国特許出願第１０／３４２，５０６号ならびにＰｌｏｔｎｉｋｏｖら，２００３およびＶａｌｉｕｎａｓら，２００２に記載されているように、幹細胞は標的組織とギャップジャンクションを形成するために使用されている。そのような幹細胞は、遺伝子産物または小分子を送達することによって、標的組織の活性に影響することができる。
【０００７】
米国特許第７，８４２，６７３号および第８，１８８，０６２号に記載のように、ドナー細胞への蛍光標識オリゴヌクレオチドの単一電極送達によって示されるように、一本鎖もしくは二本鎖のいずれか、または両方のオリゴヌクレオチドは、ＨｅＬａ細胞対においてコネキシンタンパク質Ｃｘ４３またはコネキシンタンパク質Ｃｘ４０によって形成されたギャップジャンクションを通り抜けることができ、およびギャップジャンクションを介した情報伝達により標的細胞への該オリゴヌクレオチドの移動を決定する。このように、それらの特許は、ギャップジャンクションを形成する任意のドナー細胞を使用して、標的細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を提案している。
【０００８】
しかし、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの形のヌクレオチドは、種々の癌の腫瘍細胞で構成される標的細胞にヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）によって送達されると、腫瘍増殖を減少させるのに効果的であることは示されていない。これの１つの理由は、観察されている腫瘍細胞とともに増殖するｈＭＳＣが腫瘍増殖の速度を上昇させる血管系を促進することである。例えば、Ｔｉａｎら，２０１１は、こう述べている。「腫瘍増殖でのｈＭＳＣの促進的役割は腫瘍血管形成の増加に関連することが判明した。ｈＭＳＣがｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏとの間で腫瘍細胞増殖に対して矛盾した効果を及ぼしており、したがって新たな治療戦略においてｈＭＳＣを利用することは悪性条件下で注意する必要があることを我々の現在の研究は示唆している。」
【発明の概要】
【０００９】
本明細書に記載のように、阻害性オリゴヌクレオチドはｈＭＳＣから腫瘍組織までギャップジャンクションを通り抜けることができ、驚くべきことにその量は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の増殖を遅らせるのに効果的であり、したがって治療効果がある。ｈＭＳＣは、阻害性オリゴヌクレオチドを腫瘍細胞に効果的に導入することばかりでなく、腫瘍の外側の細胞を阻害性オリゴヌクレオチドに曝すことを軽減することにも役立つ。これは、阻害性オリゴヌクレオチドが全身的に導入されるのではなく、それよりも腫瘍内部の接触部位に局所的に導入されるからである。
【００１０】
実施形態の第１の組によれば、ｉｎ  ｖｉｖｏで癌を治療する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）に少なくとも１種類の阻害性オリゴヌクレオチドを導入することと、合胞体癌細胞を含む腫瘍組織をｉｎ  ｖｉｖｏで、ｈＭＳＣが腫瘍細胞の第１の合胞体癌細胞とともにギャップジャンクションチャネルを形成することを可能にする条件下でｈＭＳＣと接触させることとを含む。結果として、阻害性オリゴヌクレオチドはギャップジャンクションチャネルを横切ることによって第１の合胞体癌細胞に送達され、次いで阻害性オリゴヌクレオチドは第１の合胞体癌細胞と第２の合胞体癌細胞の間のギャップジャンクションチャネルを横切ることによって腫瘍組織の第２の合胞体癌細胞に送達される。
【００１１】
実施形態は、特定の阻害性オリゴヌクレオチドによって引き起こされる特定の腫瘍における遺伝子活性の減少がｈＭＳＣの存在下で通常観察される加速する腫瘍の増殖を克服するのに十分である有用な治療法を提示する。
【００１２】
標的細胞へのＲＮＡまたはアンチセンスの送達が裸のプラスミドまたは間質液によって行われる従来の方法と比較すると、種々の実施形態において送達は、ギャップジャンクションを通して標的組織の細胞の細胞質にｈＭＳＣによって直接的に行われ、そのトランスフェクション速度は非常に高いことが予想される。さらに、標的腫瘍細胞において、１つの腫瘍細胞に送達された阻害性オリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の増殖を遅らせるのに十分な速度で同様にギャップジャンクションから隣接する腫瘍細胞にトランスフェクトされる。このように、種々の実施形態は、特定の種々の癌についての治療法を提供する。
【００１３】
本発明のさらに別の態様、特徴および利点は、本発明を実施するために考えられる最良の態様を含むいくつかの特定の実施形態および実現例を単純に例示することによって、以下の発明を実施するための形態から容易に明らかになる。本発明は、別の異なる実施形態も可能であり、そのいくつかの細部は、種々の明白な点に関して、本発明の趣旨および範囲からすべて逸脱することなく修正されることができる。したがって、図面および説明は、本来、例示的であると見なされるべきであり、限定的であると見なされるべきではない。
【００１４】
同一の参照番号が同様の要素を指す添付の図面の図において、本発明は例として示され、限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】一実施形態による、コネキシン４３で構成されるギャップジャンクションチャネルを通り抜ける１２メンバー一本鎖オリゴヌクレオチドの一例を示す。
【図１Ｂ】一実施形態による、コネキシン４３で構成されるギャップジャンクションチャネルを通り抜ける１６メンバー一本鎖オリゴヌクレオチドの一例を示す。
【図１Ｃ】一実施形態による、コネキシン４３で構成されるギャップジャンクションチャネルを通り抜ける２４メンバー一本鎖オリゴヌクレオチドの一例を示す。
【図１Ｄ】一実施形態による、コネキシン４３で構成されるギャップジャンクションチャネルを通り抜けるハイブリダイズした１２メンバー二本鎖オリゴヌクレオチドの一例を示す。
【図２Ａ】一実施形態による、ソース細胞へのオリゴヌクレオチドの送達から１２分後の例のデータのサマリーをグラフで示す。グラフにおいてｘ軸はオリゴヌクレオチドの長さであり、ｙ軸は受容細胞（図１Ａ〜図１Ｄのすべての例において左側の細胞）における蛍光タグの相対強度である。
【図２Ｂ】一実施形態による、ジャンクションコンダクタンス例をｘ軸に、蛍光タグの相対強度をｙ軸に示すグラフである。
【図３Ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を用いて処置したときの、腫瘍増殖速度の上昇の例を示すグラフである。
【図３Ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を用いて処置したときの、腫瘍増殖速度の上昇の例を示すグラフである。
【図４】種々の細胞プロセス経路を妨害するマイクロＲＮＡを示すダイアグラムであり、したがって、一実施形態による、腫瘍増殖を遅らせるための潜在的作用物質を表す。
【図５Ａ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質による、種々の合胞体癌の腫瘍増殖に対する相対的な効果を示すプロットであり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図５Ｂ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質による、種々の合胞体癌の腫瘍増殖に対する相対的な効果を示すプロットであり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図５Ｃ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質による、種々の合胞体癌の腫瘍増殖に対する相対的な効果を示すプロットであり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図６】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質、例えばｍｉＲ−１６によるメラノーマ腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示すプロットであり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図７Ａ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質、例えばマイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１６のｓｉＲＮＡミミックによる、前立腺腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示すプロットであり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図７Ｂ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質、例えばマイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１６のｓｉＲＮＡミミックによる、前立腺腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示すプロットであり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図７Ｃ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質、例えばマイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１６のｓｉＲＮＡミミックによる、前立腺腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示すプロットであり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図８Ａ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質、例えばｍｉＲ−１６ミミックおよびＫｒａｓＧＡＴＳｉＲＮＡによる膵臓腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示す画像とプロットであり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図８Ｂ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質、例えばｍｉＲ−１６ミミックおよびＫｒａｓＧＡＴＳｉＲＮＡによる膵臓腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示す画像とプロットであり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図８Ｃ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質、例えばｍｉＲ−１６ミミックおよびＫｒａｓＧＡＴＳｉＲＮＡによる膵臓腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示す画像とプロットであり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図８Ｄ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質、例えばｍｉＲ−１６ミミックおよびＫｒａｓＧＡＴＳｉＲＮＡによる膵臓腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示す画像とプロットであり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図９Ａ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質、例えばｍｉＲ−１６ミミックによる異なる細胞株の膵臓腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示す画像であり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図９Ｂ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質、例えばｍｉＲ−１６ミミックによる異なる細胞株の膵臓腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示すプロットであり、したがってｈＭＳＣによる導入のための候補作用物質を示す。
【図１０Ａ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣに直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質のロードを示す画像およびプロットである。
【図１０Ｂ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣに直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質のロードを示す画像およびプロットである。
【図１０Ｃ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣに直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質のロードを示す画像およびプロットである。
【図１０Ｄ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣに直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質のロードを示す画像およびプロットである。
【図１０Ｅ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣに直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質のロードを示す画像およびプロットである。
【図１０Ｆ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣに直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質のロードを示す画像およびプロットである。
【図１１】種々の実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣに直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質をロードするための種々の方法を示す一連のプロットである。
【図１２Ａ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣに直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質によるロード後、ｈＭＳＣの残存を示すプロットである。
【図１２Ｂ】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣに直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質によるロード後、ｈＭＳＣの残存を示すプロットである。
【図１３Ａ】一実施形態による、ｈＭＳＣと、合胞体癌細胞との間のギャップジャンクションの形成を示すプロットである。
【図１３Ｂ】一実施形態による、ｈＭＳＣと、合胞体癌細胞との間のギャップジャンクションの形成を示すプロットである。
【図１４Ａ】一実施形態による、合胞体癌腫瘍の複数の細胞を介して阻害性オリゴヌクレオチドの増殖で用いる２つの合胞体癌細胞間のギャップジャンクションの形成例を示す。
【図１４Ｂ】一実施形態による、合胞体癌腫瘍の複数の細胞を介して阻害性オリゴヌクレオチドの増殖で用いる２つの合胞体癌細胞間のギャップジャンクションの形成例を示す。
【図１４Ｃ】種々の実施形態で用いる、ギャップジャンクションコネキシンが様々な結腸直腸癌細胞株で見出されることを示す電気泳動ゲルの画像である。
【図１４Ｄ】種々の実施形態で用いる、ギャップジャンクションコネキシンが様々な結腸直腸癌細胞株で見出されることを示す電気泳動ゲルの画像である。
【図１４Ｅ】種々の実施形態で用いる、いくつかの構造タンパク質または機能タンパク質の産生を妨害するＲＮＡが癌細胞間でトランスフェクトされることができることを示す電気泳動ゲルの画像である。
【図１４Ｆ】種々の実施形態で用いる、いくつかの構造タンパク質または機能タンパク質の産生を妨害するＲＮＡが癌細胞間でトランスフェクトされることができることを示す電気泳動ゲルの画像である。
【図１５Ａ】一実施形態による、合胞体癌腫瘍の複数の細胞中でｓｉＲＮＡの増殖を示す画像およびプロットである。
【図１５Ｂ】一実施形態による、合胞体癌腫瘍の複数の細胞中でｓｉＲＮＡの増殖を示す画像およびプロットである。
【図１５Ｃ】一実施形態による、合胞体癌腫瘍の複数の細胞中でｓｉＲＮＡの増殖を示す画像およびプロットである。
【図１６】一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣとの共培養による結腸直腸腫瘍増殖に対する相対的な効果を示すプロットである。
【図１７】種々の残りのプロットを比較するために腫瘍重量と腫瘍体積との間の直接的な関係を示すプロットである。
【図１８Ａ】一実施形態による、ｍｉＲ−１６またはｍｉＲ−１６のｓｉＲＮＡミミックをロードしたｈＭＳＣとのｉｎ  ｖｉｒｏでの共培養による前立腺腫瘍増殖に対する相対的な効果を示すプロットである。
【図１８Ｂ】一実施形態による、ｍｉＲ−１６またはｍｉＲ−１６のｓｉＲＮＡミミックをロードしたｈＭＳＣとのｉｎ  ｖｉｒｏでの共培養による前立腺腫瘍増殖に対する相対的な効果を示すプロットである。
【図１９Ａ】一実施形態による、ｍｉＲ−１６のｓｉＲＮＡミミックをロードしたｈＭＳＣによるｉｎ  ｖｉｖｏでの処置により前立腺腫瘍増殖に対する効果の一例を示すプロットである。
【図１９Ｂ】一実施形態による、ｍｉＲ−１６のｓｉＲＮＡミミックをロードしたｈＭＳＣによるｉｎ  ｖｉｖｏでの処置により前立腺腫瘍増殖に対する効果の一例を示すプロットである。
【図１９Ｃ】一実施形態による、ｍｉＲ−１６のｓｉＲＮＡミミックをロードしたｈＭＳＣによるｉｎ  ｖｉｖｏでの処置により前立腺腫瘍増殖に対する効果の一例を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．定義
以下の例で明確かつ明白に修正されない限り、またはその意味の適用がいかなる解釈も無意味にするもしくは本質的に無意味にする場合、以下の定義および説明は、いかなる今後の解釈も規制することを意味し、意図される。用語の解釈がそれを無意味にするまたは本質的に無意味にする場合、その定義はＷｅｂｓｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，第３版、または当業者に既知の辞書、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（編集Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，２００４）から取らなければならない。
【００１７】
本明細書で用いる用語は、特定の実施形態だけを説明する目的であり、限定することを意図しない。本明細書で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形も同様に含むように意図される。さらに、「包含している」、「包含する」、「有している」、「有する」、「とともに」という用語またはその変形が発明を実施するための形態および／または特許請求の範囲のいずれかで用いられる限りにおいて、そのような用語は「含んでいる」という用語と同様の様式で包括的であるように意図される。
【００１８】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定された特定の値についての許容される誤差範囲を意味し、これは、値がどのように測定または決定されたか、例えば測定システムの限界に部分的に依存する。例えば「約」は、当技術分野における実施につき１または１より大きい標準偏差を意味することができる。あるいは、「約」は、基準値±１０％の範囲、または０以外の最小数によって示される精度を意味することができる。
【００１９】
本明細書で用いる場合、「ＤＮＡ」または「デオキシリボ核酸」という用語は、いくつかの核酸塩基からなる分子を意味する。ＤＮＡは、すべての既知の生物および多くのウイルスの発達、機能および生殖で使用される大部分の遺伝的指令を保有することができる。ＤＮＡは核酸であり、タンパク質と糖質が並んでおり、核酸は生命のすべての既知の生物に必須の３つの主要な高分子を構成する。大部分のＤＮＡ分子は、二重らせんを形成するために互いに巻きついた２本のバイオポリマー鎖からなる。２本のＤＮＡ鎖は、核酸塩基、あるいはより簡単にヌクレオチドと呼ばれる単純な単位からなっているので、ポリヌクレオチドとして知られている。各ヌクレオチドは、窒素含有核酸塩基（シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）のいずれか）、ならびにデオキシリボースと呼ばれる単糖およびリン酸基からなる。ヌクレオチドは、１ヌクレオチドの糖と、次のヌクレオチドのリン酸塩との間が共有結合によって１本の鎖で互いに結合し、糖−リン酸が交互に連結した骨格になる。塩基対合則（ＡとＴ、およびＣとＧ）によって、水素結合により、２本の別々のポリヌクレオチド鎖の窒素塩基が結合して、二本鎖ＤＮＡを作る。
【００２０】
本明細書で用いる場合、「ＲＮＡ」または「リボ核酸」という用語は、遺伝子のコーディング、デコーディング、調節および発現において種々の生物学的役割に関係づけられることが多い、高分子を意味する。ＤＮＡの様にＲＮＡは核酸である。ＲＮＡは、リボヌクレオチド塩基と呼ばれている４種類の小分子、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびＤＮＡで見られるチミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）からなる線状分子である。
【００２１】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の調節に関与するコード領域の前後の領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００２２】
本明細書で用いる場合、「アンチセンス」という用語は、コード配列に相補的であり、したがってコード配列に結合することができるヌクレオチド配列を意味し、転写を受けるＤＮＡ二重らせん鎖のもの、またはメッセンジャーＲＮＡ分子のもののいずれかであり得る。アンチセンスＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡのコード鎖と相補的な非コード鎖である。アンチセンス鎖は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）合成のための鋳型として役立つ。
【００２３】
「核酸」および「核酸分子」という用語は、本開示全体を通じて同じ意味で用いられることができる。この用語は、例えば、ＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）など）、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、胎児または胎盤によって高度に発現されるＲＮＡなど）、および／またはＤＮＡ類似体もしくはＲＮＡ類似体（例えば、塩基類似体、糖類似体および／または非天然骨格などを含有する）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドおよびポリアミド核酸（ＰＮＡ）からの任意の組成の核酸を指し、そのすべてが一本鎖または二本鎖の形態でありえ、他に限定がない限り、天然起源ヌクレオチドと同じように機能することができる天然のヌクレオチドの公知の類似体を包含することができる。特定の実施形態において、核酸は、プラスミド、ファージ、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、染色体、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、あるいは宿主細胞、細胞、細胞核もしくは細胞の細胞質において複製できる、もしくは複製されることができる他の核酸であり得る、またはこれらに由来し得る。特に明記しない限り、特定の核酸配列は、その保守的に修飾された変異体（例えば、縮退コドン置換）、対立遺伝子、相同分子種、一塩基多型（ＳＮＰ）および相補配列、ならびに明確に示されている配列も暗黙に包含する。核酸という用語は、遺伝子によってコードされる遺伝子座、遺伝子、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡと同じ意味で用いられる。この用語は、ヌクレオチド類似体、一本鎖ポリヌクレオチド（「センス」鎖もしくは「アンチセンス」鎖、「プラス」鎖もしくは「マイナス」鎖、「順方向」読み枠もしくは「逆方向」読み枠）および二本鎖ポリヌクレオチドから合成されたＲＮＡまたはＤＮＡの均等物、誘導体、変異体および類似体も含み得る。
【００２４】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、１または複数のヌクレオチドにおいて相補的ヌクレオシド塩基間またはヌクレオチド塩基間の水素結合を意味し、ワトソン・クリック水素結合、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る。
【００２５】
「合成核酸」という用語は、核酸が天然起源の核酸の化学構造または配列を持たないことを意味する。合成ヌクレオチドは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子などの遺伝子操作された核酸を含む。しかし、細胞に加えられる合成核酸は、その構造または配列が非合成核酸もしくは天然起源核酸、例えば成熟ｍｉＲＮＡ配列と同じになるように、続いて、修飾され得るまたは変えられ得ることも考えられる。例えば、合成核酸は前駆体ｍｉＲＮＡの配列と異なる配列を有し得るが、その配列は内在性のプロセッシングされたｍｉＲＮＡと同じになるように細胞内で一度変えることができる。したがって、「合成ｍｉＲＮＡ」という用語は、天然起源ｍｉＲＮＡとして細胞内で、または生理的条件下で機能する「合成核酸」を指すことが理解されよう。
【００２６】
本明細書で用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は短鎖ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を意味する。オリゴヌクレオチドは、配列特異的様式で、それらのそれぞれの相補的オリゴヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡに容易に結合して二本鎖を形成する。
【００２７】
本明細書で用いる場合、「単離されたヌクレオチド」という用語は、人間の介入によって自然の状態から変えられた、または取り出されたヌクレオチドを意味する。
【００２８】
本明細書で用いる場合、「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」という用語は、翻訳を介してタンパク質合成のための鋳型を意味し、ＤＮＡからリボソームへ遺伝子情報を伝え、遺伝子発現のタンパク質産物のアミノ酸配列を特定するＲＮＡ分子の大きなファミリーである。
【００２９】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）という用語は、時には短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られる二本鎖ＲＮＡ分子の種類で、長さが２０〜２５塩基対である。種々のｓｉＲＮＡは多くの役割を果たしているが、最も注目すべきはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路においてである。ｓｉＲＮＡは相補的な塩基配列によって特定の遺伝子の発現を妨害する。ｓｉＲＮＡは、転写後、ｍＲＮＡを破壊させることによって機能し、タンパク質への翻訳をもたらさない。特定のタンパク質に対して翻訳を阻止するｓｉＲＮＡは、タンパク質名に用語ｓｉＲＮＡを結びつけることによって示される。したがって、重要なキナーゼＡｋｔに対して翻訳を阻止するｓｉＲＮＡは、表記「Ａｋｔ  ｓｉＲＮＡ」によって示される。一般的に、種々の実施形態においてｓｉＲＮＡは、２本のヌクレオチド鎖を含む二本鎖核酸分子であり、各鎖は約１９〜約２８のヌクレオチド（すなわち、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８のヌクレオチド）を有する。
【００３０】
マイクロＲＮＡ（略称ｍｉＲＮＡ）という用語は、植物、動物および一部のウイルスに見られる小さい非コードＲＮＡ分子（約２２ヌクレオチドを含む）であり、ＲＮＡサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後調節において機能する。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と似ているが、ただし、ｍｉＲＮＡはそれ自体が折り曲がって短いヘアピンを形成するＲＮＡ転写物の領域に由来し、一方ｓｉＲＮＡは二本鎖ＲＮＡの長い領域に由来することを除く。標準命名方式下で、名称は実験的に確立されたｍｉＲＮＡに割り当てられる。接頭辞「ｍｉＲ」の後にダッシュと番号が続く。後者の番号は命名順を示すことが多い。「ＭＩＲ」は、対応するｍｉＲＮＡをコードする遺伝子を指す。１、２個のヌクレオチド以外はほとんどの同一の配列を有する異なるｍｉＲＮＡは、小文字を追加した注釈を付ける。
【００３１】
本明細書で用いる場合、ｍｉＲＮＡミミックという用語は、細胞に導入されると内在性の成熟ｍｉＲＮＡを模倣するようにデザインされた、ｓｉＲＮＡなどの小さい、二本鎖ＲＮＡ分子を指す。一部の図面において、ｍｉＲ−１６ミミックはＭｉｒ−１６ミミックと称される。
【００３２】
「阻害性オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、リボソームにおいてｍＲＮＡをタンパク質に翻訳することを妨害することによってタンパク質の産生または発現を減少させる、あるいは１または複数の標的遺伝子もしくはｍＲＮＡに特異的に結合し（ハイブリダイズし）、それによって標的タンパク質の発現または生物活性を減少させる１または複数の標的タンパク質をコードする遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに対して十分に相補的である任意のオリゴヌクレオチドを指す。阻害性オリゴヌクレオチドとしては、中でも、単離されたもしくは合成のｓｈＲＮＡまたはｓｈＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスＤＮＡまたはキメラアンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡミミックが挙げられる。
【００３３】
本明細書で用いる場合、「コネキシン」という用語は、細胞間情報伝達およびイオンと小さいシグナル伝達分子の移動を可能にし、ギャップジャンクションを形成するために集合する膜貫通タンパク質の大きなファミリーを意味する。コネキシンは、ＣとＮの両細胞質末端、細胞質ループ（ＣＬ）および２つの細胞外ループ（ＥＬ−１）と（ＥＬ−２）を有する４回膜貫通型の膜貫通タンパク質である。コネキシンは、６つのグループで集合して、半チャネル、すなわちコネクソンを形成し、次いで２つの半チャネル（各細胞に１つ）が結合して２つの細胞間にギャップジャンクションを形成する。コネキシン遺伝子ファミリーは多様であり、配列決定されたヒトゲノムにおいて２１の同定されたメンバーと、マウスにおいて２０のメンバー（そのうちの１９は、オルソロガス対である）を有する。これらのメンバーは、通常２６〜６０キロダルトン（ｋＤａ）の分子量であり、平均で３８０アミノ酸長を有する。種々のコネキシンは、ホモマーギャップジャンクション（両方とも同じコネキシン）およびヘテロマーギャップジャンクション（２つの異なるコネキシン）に結合することが観察されており、それぞれは、ポアコンダクタンス、サイズ選択性、電荷選択性、電圧ゲーティングおよび化学ゲーティングを含む様々な機能特性を示すことができる。コネキシンという用語は、Ｃｘと略され、それをコードする遺伝子はＣＸと略される。最近の文献において、コネキシンは、それらの分子量によって一般に命名されている。例えば、Ｃｘ２６は２６ｋＤａのコネキシンタンパク質であり、他の種においてオルソロガスタンパク質の番号付けのためにヒトタンパク質の分子量を用いている。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「ギャップジャンクション」という用語は、多数の動物の細胞型間の特殊な細胞間結合を意味する。ギャップジャンクションは、２つの細胞の細胞質を直接結合し、それにより種々の分子、イオンおよび電気インパルスが細胞間の調節されたゲートを直接通過することが可能になる。
【００３５】
合胞体という用語は、ギャップジャンクションによる特殊な膜によって相互連結され、それにより活動電位において電気的に同期する細胞からなる合胞体組織を指す。合胞体細胞として、心筋細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、結合組織細胞または合胞体癌細胞が挙げられる。
【００３６】
本明細書で用いる場合、「送達している」または「送達された」という用語は、細胞膜内部に分子を導入することを意味する。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「ドナー細胞」という用語は、標的細胞と呼ばれる異なる細胞に送達されるように分子をロードした細胞を意味する。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「標的細胞」という用語は、ドナー細胞またはドナー細胞によって保有される内容物などの特定の作用物質によって選択的に影響を受ける細胞を意味する。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「ヒト間葉系幹細胞」（略称ｈＭＳＣ）という用語は、例えば、ヒト造骨細胞（骨細胞）、ヒト軟骨細胞（軟骨細胞）、ヒト筋細胞（筋細胞）およびヒト脂肪細胞（脂肪細胞）の種々の細胞型に分化することができるヒト多能性間質細胞を意味する。
【００４０】
「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」という用語は、本明細書では同じ意味で用いられ、診断、治療または療法を望む、いずれの哺乳動物対象、特にヒトを指す。
【００４１】
「治療」、「治療すること」などという用語を本明細書で用いて、望ましい薬理学効果および／または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾患またはその症状を完全に、もしくは部分的に防止することに関しては予防効果でありえ、および／または疾患および／もしくはその疾患に起因する有害作用の部分的治療もしくは完全治療に関しては治療効果であり得る。本明細書で用いる場合、「治療」は、哺乳動物における疾患のいずれの治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、まだ疾患を有すると診断されていない対象において、疾患の発症を防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その進展を阻止すること、または（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患を退行させることを含む。治療薬は、疾患または損傷の発症前、発症中、または発症後に、投与されてよい。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定させる、または軽減する場合、進行中の疾患のその治療は、特に有益である。そのような治療は、患部組織において機能が完全に喪失する前に、行われることが望ましい。疾患の症候性段階の間、および場合によっては、疾患の症候性段階の後に、主題の療法が施されるのが望ましい。
【００４２】
分子性化学および細胞生化学における一般的な方法は標準テキストブック、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版  （Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  ＨａＲＢｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇら，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （Ｗａｇｎｅｒら編，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）；  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ  ＆  Ｌｏｅｗｙ編，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．  Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ編，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；およびＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）に見いだすことが可能であり、それらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。本開示に記載の遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、商用ベンダー、例えばＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＣｌｏｎＴｅｃｈから入手可能である。
【００４３】
２．概要
我々自身の初期の研究によれば、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを発現するプラスミドを標的細胞に送達する方法は、オリゴヌクレオチドをドナー細胞に導入することと、ドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成することを可能にする条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させこととを含み、それによってオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチチドの生成物がドナー細胞から標的細胞に送達される。
【００４４】
一部の新しい実施形態によれば、ドナー細胞はヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）であり、阻害性オリゴヌクレオチドはギャップジャンクションを通過することができる阻害性オリゴヌクレオチドであり、および標的細胞は合胞体癌組織の細胞である。本明細書では、合胞体癌組織は、合胞体癌腫瘍とも呼ばれる。本明細書では、標的細胞は合胞体癌細胞または腫瘍細胞とも呼ばれる。本方法は、合胞体癌腫瘍の増殖を遅らせることに効果的であることが示されている。過去の研究ではｈＭＳＣは癌腫瘍増殖を強化することを示したので、これは驚くべきことである。阻害性オリゴヌクレオチドがドナー細胞に損傷を与えることなくドナー細胞にロードされ得ることはこれまで知られていなく、損傷によりドナー細胞が阻害性オリゴヌクレオチドを効果的に送達することを可能にするのに十分に長く生存できなかったので、これも驚くべきことである。
【００４５】
種々の実施態様において、オリゴヌクレオチドはギャップジャンクションを横切ることができる阻害性オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡミミックをコードするプラスミドであり得る。オリゴヌクレオチドは、ギャップジャンクションを横切ることができる阻害性オリゴヌクレオチドを生成するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡであり得る。オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡのｓｉＲＮＡミミックを生成し、ギャップジャンクションを横切ることができるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡをコードするプラスミドである。オリゴヌクレオチドは、１２〜２８以上のメンバーを含み得る。
【００４６】
ギャップジャンクションチャネルは、合胞体癌組織に存在する他のコネキシンの中でも、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、コネキシン４０（Ｃｘ４０）、コネキシン４５（Ｃｘ４５）、コネキシン３２（Ｃｘ３２）、およびコネキシン３７（Ｃｘ３７）のうちの１つまた複数で構成され得る。一部の実施形態において、Ｃｘ３２はｓｉＲＮＡを通過するのに用いられない。
【００４７】
種々の実施形態において治療される合胞体腫瘍としては、子宮頸癌、結腸直腸癌、メラノーマ、膵癌および前立腺癌の腫瘍が挙げられる。
【００４８】
本出願者らの以前の研究では、ギャップジャンクションチャネルを介してオリゴヌクレオチド（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡフラグメント）を通過する方法を提供している。これは、コネキシン４３（Ｃｘ４３）で構成されるギャップジャンクションチャネルを子宮頸癌のためのＨｅＬａ細胞株で用いた実験で示された。
【００４９】
実験は、規定された長さのＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列などのオリゴ複合体がギャップジャンクションチャネルを通り抜けることができることを確定した。ＤＮＡまたはＲＮＡは、溶液中で０．９〜１．０ｎｍの小径のαヘリックスを形成する。１２〜２４のヌクレオチドまたはヌクレオチド対のサイズ範囲のオリゴヌクレオチドは、特に興味深い。種々の実験において、小さいフラグメント（モルホリノと呼ばれている）に分解されることができないＤＮＡのユニーク配列に、オリゴ配列の製造を専門とするＧＥＮＥ  ＴＯＯＬＳ，  ＬＬＣ（商標）（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，Ｏｒｅｇｏｎ）からの蛍光プローブを付け加えた。Ｈｅｋ２９３親細胞は、３５ｍｍの培養皿内に配置された１８ｘ１８ｍｍ無菌のカバーガラスの上で増殖させた。それぞれの培地に播種してから約２４時間後、２４量体モルホリノ（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ）およびＥｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ）を添加した２ｍＬの新鮮な完全培地（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ）と交換した。モルホリノの最終濃度は、１．２５μＭであり、Ｅｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒの最終濃度は、約６μＭであった。モルホリノは、最大送達で細胞上に残存し、洗浄しなかった。対照培養皿にはＥｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒのみの完全培地を投与した。種々の時点でカバーガラスを３．７％ホルムアルデヒドで固定した。カバーガラスにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を載せ、６３×油浸対物レンズを用いて、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ１０００共焦点顕微鏡上で画像をキャプチャした。蛍光強度プロファイルは、Ｏｌｙｍｐｕｓラインシリーズ分析ソフトウェアツールを用いて作成した。
【００５０】
実験の第１のセットは、オリゴヌクレオチド１２メンバー、オリゴヌクレオチド１６メンバーおよびオリゴヌクレオチド２４メンバーを用いて行った。結果は、３つの一本鎖形態すべてがＣｘ４３で構成されるギャップジャンクションチャネルを通り抜けることを示した（図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃ）。さらに、２つの１２メンバーの相補体をハイブリダイズさせて二本鎖形態を生成し、その通過を測定した（図１Ｄ）。二本鎖形態は、その小径がわずかに増大しただけである。図２Ａは、Ｘ軸がオリゴヌクレオチドの長さであるデータの概要を示す。ハイブリダイズした１２メンバーのオリゴヌクレオチドは、Ｘ軸上に順不同でプロットされている。Ｙ軸は、ソース細胞へのオリゴヌクレオチドの送達から１２分後の、受容細胞（図１Ａ〜図１Ｄのすべての例において左側の細胞）内の蛍光タグの相対強度である。各オリゴヌクレオチドに関して、個々の実験から得られた値は、各オリゴヌクレオチドについての平均値および標準偏差とともに示される。いくつかの実験では、蛍光標識したオリゴヌクレオチドのジャンクションコンダクタンスおよび移動を同時にモニターした。図２Ｂは、Ｘ軸上のジャンクションコンダクタンスとＹ軸上の蛍光タグの相対強度の関係を示すグラフである。比較のために、Ｃｘ４３ギャップジャンクションチャネルを通過するＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗのコンダクタンス−強度の関係を示す（Ｖａｌｉｕｎａｓら，２００２）（２）。すべての場合において、１つの細胞から別の細胞への移動速度を表す相対強度は、受容細胞におけるＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ蛍光強度の５〜１０分の１である。この低い移動速度は、その小径が１．０ナノメートル（ｎｍ）であり、溶液中でＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗよりも移動が少ない、オリゴヌクレオチドのロッド様の大きさおよび分子量と整合する。
【００５１】
これらの所見は、ギャップジャンクションチャネルが、例えばサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子または同様の大きさの任意の他の分子のための実行可能な送達ポートであることを示している。ｈＭＳＣが互いにおよび標的細胞とギャップジャンクションを形成することを本出願者らはこれまでに示した。また、電気穿孔法によって幹細胞にプラスミドをロードすることができることも示した。本結果は、別の標的細胞型（これには潜在的ドナー細胞または標的細胞としてｈＭＳＣを含む）とともにギャップジャンクションを形成するいずれのドナー細胞型をビヒクルとして用いて、ＲＮＡまたはＤＮＡを送達することができることを示している。
【００５２】
説明を目的とする以下の記述では、本発明の十分な理解を提供するために具体的な詳細を多数記載する。しかし、本発明がこれらの具体的な詳細なしで実施可能であることを当業者には明らかであろう。他の例において、本発明を不必要に不明瞭にしないように、周知の構造および装置は、ブロック図の形式で示す。
【００５３】
実施形態例において、オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのｓｉＲＮＡミミック（以下、便宜上「ｍｉＲＮＡミミック」と呼ぶ）、例えばそのようなｓｉＲＮＡをコードし、腫瘍増殖を妨害する、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６ミミック、ｍｉＲ−３４ａミミック、コルタクチンｓｉＲＮＡ、ゲルゾリンｓｉＲＮＡ、Ａｋｔ  ｓｉＲＮＡ、α−チューブリンｓｉＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ、ＫｒａｓＧＡＴｓｉＲＮＡまたはＤＮＡのうちの１または複数である。これらの阻害性オリゴヌクレオチドは、必須細胞構造もしくはプロセスもしくはアポトーシス（細胞死）に影響を及ぼす既知のそれらの特性のために、最初は選択された。これらのうち、特定の阻害性オリゴヌクレオチドは以下の実験実施形態において有利と確認された。
【００５４】
例えば、一部の実施形態において、ｍｉＲ−１６はＧｅｎｅ  ＩＤ：４０６９５０−ＭＩＲ１６−１  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  １６−１であり、その対応するｍｉＲ−１６ミミックは、ＣＣＡＧＵＡＵＵＡＡＣＵＧＵＧＣＵＧＣＵＧＡ（ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−１、配列番号１）である。他の実施形態において、ｍｉｒＲ−３４ａはＧｅｎｅ  ＩＤ：４０７０４０−ＭＩＲ３４Ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ３４ａであり、その対応するｍｉＲ−３４ａミミックは、ＵＧＧＣＡＧＵＧＵＣＵＵＡＧＣＵＧＧＵＵＧＵ（ｈｓａ−ｍｉｒ−３４ａ、配列番号２）である。
【００５５】
３．実験実施形態
以下の実験は、特定の阻害性オリゴヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合胞体癌腫瘍増殖を遅らせることができ、ｈＭＳＣの残存を妨げることなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣにロードされることができ、ギャップジャンクションを介してｈＭＳＣと、合胞体癌細胞との間を通り抜けることができ、腫瘍内の細胞間のギャップジャンクションを介して増殖することができ、およびｈＭＳＣにロードされ、そのような腫瘍と接触すると、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を効果的かつ治療的に遅らせる、または減少させることができることを示す。これらの理由から、種々の実施形態は、合胞体癌腫瘍に対して効果的な治療を提供することが予測される。
【００５６】
以下に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの種々の直接的なトランスフェクション実験において、ｈＭＳＣまたは他の細胞にｓｉＲＮＡを直接トランスフェクトして、ロードした細胞を生成する。別段の定めがない限り、これらの実験は、当技術分野で周知の無菌条件下で同じ細胞培地を含有するペトリ皿で行った。トランスフェクションは、阻害性オリゴヌクレオチドの溶液、一般的には１００ナノモル（ｎＭ）と、トランスフェクション作用物質（リポフェクタミン）とを用い、約２０％〜約３０％の細胞密度で、２４時間のトランスフェクション時間にわたり生じた。細胞増殖を経時的に得るために、２４時間の終わりに、細胞を培地ですすぎ、ｈＭＳＣまたは他の細胞集団を間接的なトランスフェクション実験に導入し、任意のラベルの吸光度または蛍光強度を含む任意の細胞計数法を用いて、以下に記述し、または経時的に記録した。
【００５７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの種々の間接的なトランスフェクション実験において、ロードまたはアンロードしたｈＭＳＣまたは他の細胞を標的細胞集団とともに共培養した。ロードする場合、ｈＭＳＣは上記のように直接トランスフェクトした。別段の定めがない限り、これらの実験は、ペトリ皿にロードした、またはアンロードしたｈＭＳＣを標的細胞とともに約２０％〜３０％のコンフルエンスで播種することによって行った。次いで、共播種した細胞を培地ですすいだ。次いで、標的細胞増殖を経時的に得るために、任意のラベルの吸光度または蛍光強度を含む任意の細胞計数法を用いて、標的細胞集団を経時的に記録した。
【００５８】
３．１  ｈＭＳＣとともにｉｎ  ｖｉｖｏでの処置は腫瘍増殖を増強することができる
図３Ａおよび図３Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）と接触させたときの、腫瘍増殖速度の上昇の例を示すグラフである。図３Ａは、マウスにおいて（ｉｎ  ｖｉｖｏで）単独で増殖させた（対照）腫瘍細胞および特定の阻害性オリゴヌクレオチドをロードさせてないｈＭＳＣの存在下の腫瘍細胞の増殖した腫瘍体積を示すグラフである。横軸は経過時間を日単位で示し、縦軸は正規化された腫瘍体積を示す。腫瘍は前立腺癌研究で使われるヒト前立腺癌のＰＣ−３細胞株である。これらの細胞は、進行した前立腺癌細胞において、および治療法に対するそれらの反応を評価することにおいて生化学変化を研究することに役立つ。さらに、これらの細胞を用いて、生物という面に関して腫瘍環境のｉｎ  ｖｉｖｏでのモデルを研究するために、マウスにおける皮下腫瘍を生じさせることができる。
【００５９】
白丸は、平均５匹の異なるヌードマウスへの導入から２０日目と５０日目との間の種々の時点での対照についてのＰＣ−３腫瘍体積を示す。黒丸は、別の平均５匹の異なるヌードマウスへの導入から２０日目と５０日目との間の種々の時点でのｈＭＳＣによる腫瘍増殖のＰＣ−３腫瘍体積を示す。この実験では、ＰＣ−３細胞には、同数のｈＭＳＣを注射した。グラフは、４８日目に対照値に対して正規化されている。注射されたｈＭＳＣの圧倒的大部分は、約３〜４日間以上腫瘍部位にとどまっている可能性が低い。結果の標準偏差は縦線で示す。ｈＭＳＣによる腫瘍増殖は、一貫して対照よりも大きい体積が測定された。
【００６０】
実験終了後、動物を犠牲にし、腫瘍を秤量した。図３Ｂは、単独で増殖させた（対照）腫瘍細胞および特定の阻害性オリゴヌクレオチドをロードさせてないｈＭＳＣの存在下の腫瘍細胞の腫瘍重量を示す棒グラフである。横軸は群を示し、縦軸は重量をグラムで示す。図３Ｂにおける腫瘍重量は、腫瘍細胞が発現した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の画像化によって得られた腫瘍体積から推定される。白色棒は対照群の平均重量を示し、黒色棒はｈＭＳＣによって増殖した群の平均重量を示し、縦線は標準偏差を示す。阻害性オリゴヌクレオチドをロードさせてないｈＭＳＣによる処置に伴い腫瘍増殖がかなり増大している。
【００６１】
３．２  特定のｓｉＲＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの直接曝露によって腫瘍増殖を遅らせることができる
実験的試験用の阻害性オリゴヌクレオチドの候補を発見するために研究を行い、次いでｉｎ  ｖｉｔｒｏで実験を行って、ｉｎ  ｖｉｖｏでｈＭＳＣを介して対応する腫瘍への導入に適した最も有効な阻害性オリゴヌクレオチドを発見した。阻害性オリゴヌクレオチドの候補としては、細胞構造および主要機能において役割を果たすゲルゾリン、ＧＡＰＤＨ、α−チューブリン、コルタクチンおよびＡｋｔに対するｓｉＲＮＡが挙げられる。そのような構造タンパク質または主要機能が標的細胞で限定される場合、影響を受けた細胞が適切に機能することができなく、ゆっくりと増殖することが予想された。図示した実施形態において上記のタンパク質標的が特定されるが、種々の他の実施形態において、他の細胞タンパク質は阻害性オリゴヌクレオチドによって標的にされる。
【００６２】
当技術分野で周知のように、ゲルゾリンは重要なアクチン調節因子であり、細胞運動をもたらし、浸潤性癌細胞などの多くの異なる特殊な細胞において示されるポドゾーム形成（Ａｒｐ３、コルタクチンおよびＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅとともに）において役割を果たす。ゲルゾリンも、ミトコンドリアを安定させることによって、アポトーシス（細胞死）を阻害する。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨと略される）は、解糖の６段階を触媒するサイズが約３７ｋＤａの酵素であり、したがってエネルギーおよび炭素分子のためにグルコースを分解するのに役立つ。α−チューブリンおよびβ−チューブリンの両方は、真核生物の細胞骨格の主成分である微小管に重合する。微小管は、有糸分裂を含む多くの不可欠な細胞プロセスにおいて機能する。コルタクチンは、すべての細胞型に存在し、アクチン細胞骨格、特に細胞周辺部のアクチン皮質の重合および再編成を促進する外部刺激によって活性化されることができる細胞の細胞質に位置する単量体タンパク質である。プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）としても知られているＡｋｔは、複数の細胞プロセス、例えば、グルコース代謝、アポトーシス、細胞増殖、転写および細胞移動において重要な役割を果たすセリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼである。
【００６３】
他の阻害性オリゴヌクレオチドの候補は、種々の重要な細胞プロセス経路に影響を及ぼすことが知られているマイクロＲＮＡのなかから選択された。図４は、種々の細胞プロセス経路を妨害するマイクロＲＮＡを示すダイアグラムであり、したがって、一実施形態による、腫瘍増殖を遅らせるための潜在的作用物質を表す。例えば、ｍｉＲ−１６およびｍｉＲ−３４ａが種々のタンパク質の翻訳を妨害することは、知られている。上記のｍｉＲＮＡおよびそれらのｓｉＲＮＡミミックは、図示した実施形態において同定されたが、種々の別の実施形態において、他のｍｉＲＮＡおよびそれらのｓｉＲＮＡミミックは阻害性オリゴヌクレオチドとして用いられる。図４に示すように、ｍｉＲ−１６はタンパク質ＣＤＫ１、ＣＤＫ２およびＣＤＣ２の翻訳を妨害し、ｍｉＲ−３４ａはタンパク質ＣＤＣ２およびＣＤＫ４の翻訳を妨害する。これらのタンパク質は細胞の増殖と分裂周期において役割を果たしており、したがってそのような妨害は細胞周期停止を潜在的にもたらし得る。同様に、ｍｉＲ−１６はタンパク質ＦＧＦ−２、ＣＣＮＤ１およびＦＧＦＲ−１の翻訳を妨害し、ｍｉＲ−３４ａはタンパク質ＣＤＫ５、Ｅ２Ｆ３およびＥ２Ｆ５の翻訳を妨害する。これらのタンパク質は細胞の増殖（数の増加）および移動において役割を果たし、したがって、そのような妨害は潜在的に増殖および移動の阻害をもたらし得る。図４にも示すように、ｍｉＲ−１６はタンパク質ＢＣＬ２、ＰＤＣ６ＩＰ、ＭＣＬ１およびＷＮＴ３Ａの翻訳を妨害し、ｍｉＲ−３４ａはタンパク質ＣＣＮＤ１、ＢＣＬ２およびＳＩＲＴ１の翻訳を妨害する。これらのタンパク質はアポトーシス（細胞死）および老化（細胞老化）を遅らせることにおいて役割を果たし、したがって、そのような妨害は潜在的に老化またはアポトーシスを誘導し、それによって腫瘍増殖の阻害をもたらし得る。
【００６４】
図５Ａ〜図５Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせる潜在的作用物質による種々の合胞体癌または細胞の腫瘍増殖に対する相対的な効果を示し、したがって、一実施形態によるｈＭＳＣを介する導入のための候補作用物質を示すプロットである。図５Ａは、正常なヒト胎児腎細胞２９３（本明細書ではＨｅＫ２９３とも呼ぶ）の増殖に対する２種類の阻害性オリゴヌクレオチドの効果を示す。ＨｅＫ２９３細胞は、最初は組織培養で増殖させたヒト胎児腎細胞由来の特定の非癌細胞株である。ＨＥＫ２９３細胞は増殖させるのが極めて容易で、非常に容易にトランスフェクトし、細胞生物学研究で広く使われてきた。直接のトランスフェクション実験プロトコルは、２４時間のトランスフェクション期間で使用された。横軸は、実験開始後の時間を示す。縦軸は、１万の細胞単位中の細胞の数を示す。縦線は、ラベルを適用する実験（ｎ＝６）にわたる標準偏差を示す。トレースラベル「対照」は、通常のＨｅＫ２９３の増殖曲線である。トレースラベル「コルタクチン」は、コルタクチンを妨害するｓｉＲＮＡ、すなわちコルタクチンｓｉＲＮＡに４８時間曝した後の細胞増殖を指す。トレースラベル「ｍｉｒ−１６」は、ｍｉＲ−１６を模倣するｓｉＲＮＡ、すなわちｍｉＲ−１６ミミックに４８時間曝した後の細胞増殖を指す。明らかに、コルタクチンｓｉＲＮＡはＨｅＫ２９３において細胞増殖を減少させるのに効果的であり、コルタクチンｓｉＲＮＡが他の細胞型、例えば癌細胞にトランスフェクトされると、増殖を制御するのに効果的であり得ることを示している。以下に示すように、癌細胞にトランスフェクトされると、ｍｉＲ−１６ミミックは、図５Ａに示す通常のＨｅＫ細胞に対するよりも効果的である。
【００６５】
図５Ｂは、ＵＡＣＣ−６２細胞株（本明細書ではＵＡＣＣ６２細胞とも呼ぶ）によって表されるヒトメラノーマの増殖に対する３種類の阻害性オリゴヌクレオチドの効果を示す。直接トランスフェクション実験プロトコルを各トレースのために実験（ｎ＝６）で用いた。横軸は実験開始後の時間を示す。縦軸は１万の細胞単位中の細胞の数を示す。トレースラベル「対照（ＵＡＣＣ６２）」は、阻害性オリゴヌクレオチドによるローディングなしのＵＡＣＣ−６２細胞の増殖曲線である。トレースラベル「コルタクチンｓｉＲＮＡ、ゲルゾリンｓｉＲＮＡ、Ａｋｔ  ｓｉＲＮＡ」は、コルタクチン、ゲルゾリンおよびＡｋｔを妨害するｓｉＲＮＡへの曝露開始０時間からの細胞増殖をそれぞれ指す。明らかに、コルタクチンｓｉＲＮＡ、ゲルゾリンｓｉＲＮＡ、Ａｋｔ  ｓｉＲＮはすべて、増殖速度を低下させ、すべてがメラノーマ腫瘍の増殖を制御するのに効果的であり得ることを示している。
【００６６】
図５Ｃは、ＰＣ−３細胞株（本明細書ではＰＣ３細胞とも呼ぶ）によって表されるヒト前立腺癌の増殖に対する３種類の阻害性オリゴヌクレオチドの効果を示す。直接トランスフェクション実験プロトコルを各トレースのために実験（ｎ＝６）で用いた。横軸は実験開始後の時間を示す。縦軸は１万の細胞単位中の細胞の数を示す。縦線は、ラベル型の異なる６種類の実験の標準偏差を示す。トレースラベル「対照（ＰＣ３）」は、阻害性オリゴヌクレオチドによるローディングなしのＰＣ−３細胞の増殖曲線である。トレースラベル「コルタクチンｓｉＲＮＡ、Ａｋｔ  ｓｉＲＮＡおよびＭｉｒ−１６ミミック」は、コルタクチンとＡｋｔおよびｍｉＲ−１６を模倣するＭｉｒ−１６ミミックを妨害するｓｉＲＮＡへの曝露開始０時間からの細胞増殖をそれぞれ指す。明らかに、コルタクチンｓｉＲＮＡおよびＡｋｔ  ｓｉＲＮＡの両方は、増殖速度を低下させ、前立腺腫瘍の増殖を制御するのに効果的であり得ることを示している。ｍｉＲ−１６ミミックが前立腺癌に対してさらにいっそう効果的であることも明らかである。これはｍｉＲ−１６ミミックがメラノーマを含む他の癌型に対して、Ａｋｔ  ｓｉＲＮＡまたはコルタクチンｓｉＲＮＡのいずれよりもさらに効果的あり得ることを示唆する。
【００６７】
図６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるために、ｍｉＲ−１６を含む潜在的作用物質によるメラノーマ腫瘍増殖に対する相対的な効果を示すプロットであり、したがって一実施形態による、ｈＭＳＣを介する導入のための候補作用物質を示す。直接トランスフェクション実験プロトコルを各トレースのために実験（ｎ＝６）で用いた。横軸は実験開始後の時間を示す。縦軸は、細胞の数に関連する、光ビ−ムの吸光度を示す。トレースラベル「陰性対照」は、阻害性オリゴヌクレオチドによるローディングなしのＵＡＣＣ−６２細胞の増殖曲線を示す。トレースラベル「コルタクチン、ゲルゾリン」は、コルタクチンおよびゲルゾリンを妨害するｓｉＲＮＡへの直接曝露後の細胞増殖をそれぞれ指す。トレースラベル「ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−３４」は、ｍｉＲ−１６を模倣するｓｉＲＮＡおよびｍｉＲ−３４ａを模倣するｓｉＲＮＡへの直接曝露後の細胞増殖をそれぞれ指す。各トレースの各点の値は平均値を示し、各点での縦線は各ラベル型の６回の実験にわたる標準偏差を示す。ゲルゾリンｓｉＲＮＡおよびｍｉＲ−３４ａミミックは、このメラノーマ細胞株の増殖を減少させるのに有用でないように思われる。これは、図５ＢにおいてコルタクチンｓｉＲＮＡが約５０％の推定減少率で、効果的であるように思われる結果を確証している。これはさらに、ｍｉＲ−１６を模倣するｓｉＲＮＡがメラノーマ増殖率を減少させることにおいて、少なくともこの細胞株に対してコルタクチンｓｉＲＮＡよりも実際に効果的であり、良好な約８０％の推定減少率を示している。
【００６８】
図７Ａ〜図７Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるために、ｍｉＲ−１６またはそのミミックを含む、潜在的作用物質による前立腺腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示し、したがって、一実施形態による、ｈＭＳＣを介する導入のための候補作用物質を示すプロットである。直接トランスフェクション実験プロトコルを各トレースのために実験（ｎ＝６）で用いた。図７Ａにおいて、横軸は実験開始後の時間を示す。縦軸は細胞の数に関連する、光ビ−ムの吸光度を示す。トレースラベル「陰性対照」は、阻害性オリゴヌクレオチドによるローディングなしのＰＣ−３細胞の増殖曲線を示す。トレースラベル「コルタクチン、ゲルゾリン」は、コルタクチンおよびゲルゾリンを妨害するｓｉＲＮＡに対する直接曝露後の細胞増殖をそれぞれ指す。トレースラベル「ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−３４」は、ｍｉＲ−３４を模倣するｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲ−１６を模倣するｓｉＲＮＡに直接曝露後の細胞増殖をそれぞれ指す。各トレースの各点での値は平均値を示し、各点での縦線は標識型の６回の実験にわたる標準偏差を示す。すべてのｓｉＲＮＡは細胞増殖に対して何らかの効果があり、ゲルゾリンｓｉＲＮＡの効果が最も小さい。コルタクチンｓｉＲＮＡは、推定減少率が約６０％、コルタクチンｓｉＲＮＡよりもｍｉＲ−３４は若干低い効果で模倣し、ｍｉＲ−１６はさらにいっそう効果的に模倣し、効果的であると思われる。
【００６９】
図７Ｂにおいて、横軸は図７Ａにおけるのと同じであるが、縦軸は相対単位中の腫瘍の細胞の数を示す。トレースラベル「対照」は、阻害性オリゴヌクレオチドによるローディングなしのＰＣ−３細胞の増殖曲線を示す。トレースラベル「Ａｋｔ  ｓｉＲＮＡ」は、Ａｋｔを妨害するｓｉＲＮＡへの直接曝露後の細胞増殖を指す。トレースラベル「ＳｉＲＮＡミミックｍｉｒ−１６、ＳｉＲＮＡミミックｍｉＲ−３４」は、ｍｉＲ−３４を模倣するｓｉＲＮＡおよびｍｉＲ−１６を模倣するｓｉＲＮＡへの直接曝露後の細胞増殖をそれぞれ指す。各トレースの各点での値は平均値を示し、各点での縦線は各ラベル型の数回の実験にわたる標準偏差を示す。すべてのｓｉＲＮＡは細胞増殖の減少に対して何らかの効果があり、ｍｉＲ−１６ミミックが最も効果的である。
【００７０】
図７Ｃは、図７Ｂの阻害性オリゴヌクレオチドのトランスフェクション後、単独（対照）で増殖されたＰＣ−３腫瘍細胞に対してアポトーシスを経験する細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。横軸は群を示し、ラベルＡｋｔ、ｍｉＲ−１６およびｍｉＲ−３４ａが、ｍｉＲ−１６に対してＡｋｔ  ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡミミックをトランスフェクトされ、ｍｉＲ−３４ａに対してｓｉＲＮＡミミックをトランスフェクトされた群をそれぞれ示す。縦軸は、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって検出されるアポトーシスを細胞のパーセンテージで示す。ＴＵＮＥＬアッセイは、核酸の末端を標識することによってＤＮＡ断片化を検出する方法であり、アポトーシスシグナル伝達カスケードから生じるＤＮＡ断片化を検出する一般的な方法である。ｍｉＲ−１６およびｍｉＲ−３４ａに対してＳｉＲＮＡミミックの直接トランスフェクションに関連するアポトーシスが大幅に増加し、ｍｉＲ−１６についてのミミックが最も効果的である。１２０時間の実験終了時に、試料をＴＵＮＥＬアッセイにかけた。
【００７１】
上記の実験のすべてにおいて、ｍｉＲ−１６ミミックは、細胞増殖を減少させるのに最も効果的であることが判明し、そのため、残りの実験の大部分および後述のセクションに示すｉｎ  ｖｉｖｏ実験で最初に用いた。
【００７２】
図８Ａ〜８Ｄは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるために、ｍｉＲ−１６およびＫｒａｓＧＡＴＳｉＲＮＡを含む、潜在的作用物質による膵腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示し、したがって、一実施形態による、ｈＭＳＣを介する導入のための候補作用物質を示す画像およびプロットである。非内分泌性膵癌を、ヒト膵臓類上皮癌腫のためにＰＡＮＣ−１細胞株を使用してモデル化する。直接トランスフェクション実験プロトコルを各トレースのために実験（ｎ＝４）で用いた。図８Ａは、４つの画像を示す。左側の２つの画像は、実験開始から２４時間後および９６時間後の培養中のヒトＰＡＮＣ−１細胞の顕微鏡写真である。右側の２つの画像は、ｍｉＲ−１６を模倣するｓｉＲＮＡの１００ナノモル（ｎＭ）溶液中で直接トランスフェクションにかけた実験の開始から２４時間後および９６時間後の培養中のヒトＰＡＮＣ−１細胞の顕微鏡写真である。９６時間での２つの画像を比較すると分かるように、ｍｉＲ−１６ミミックに曝された培養中のＰＡＮＣ−１細胞の増殖が明らかに減少している。
【００７３】
この結果は、図８Ｂに定量化されており、時間に対するＰＡＮＣ−１細胞集団成長（増殖）を示している。横軸は時間を時単位で示し、縦軸は２４時間で対照集団によって正規化された集団を示す。対照トレースは、阻害性オリゴヌクレオチドに曝されてないＰＡＮＣ−１細胞に対する集団の大きさを示す。ｍｉＲ−１６トレースは、ｍｉＲ−１６を模倣するｓｉＲＮＡの１００ｎＭ溶液に曝されたＰＡＮＣ−１細胞に対する集団の大きさを示す。２４時間の集団の約１．３倍のｍｉＲ−１６ミミックに曝された集団は、２４時間集団の約５．７倍の対照集団から９６時間でほぼ８０％減少している。この同じ減少は、さらに低い濃度のｍｉＲ−１６ミミックへの曝露でも達成できる。
【００７４】
図８Ｃは、異なる濃度のｍｉＲ−１６ミミックに対して９６時間でのＰＡＮＣ−１細胞株集団の減少例を示し、したがってｍｉＲ−１６への曝露に対する用量反応をプロットするグラフである。対数表示の横軸は、ナノモル（ｎＭ）単位でのｍｉＲ−１６ミミックの濃度を示し、縦軸は図８Ｂと同じである。対照トレースは白丸でプロットされ、ｍｉＲ−１６ミミック溶液への曝露についてのトレースは黒丸でプロットされる。図８Ｂにおけるトレースは、１００ｎＭのｍｉＲ−１６ミミック濃度についてプロットされている。図８Ｃにおいて１００ｎＭで、同じ結果をみることができ、ｍｉＲ−１６ミミックに曝された集団は約１．３で、約５．７の対照集団からほぼ８０％減少している。この差は、１００ｎＭより若干多いｎＭで、および約２０ｎＭでほぼ同じである。わずか４ｎＭの濃度でも、ｍｉＲ−１６ミミックに曝された細胞の集団は、約５．５での対照集団と比較して、約２．７でかなり減少し、ほぼ５０％の減少である。２０ｎＭ溶液と比較してより高い濃度の１００ｎＭ溶液を使用する利点がないようである。
【００７５】
図８Ｄは、ＰＡＮＣ−１細胞株に対する他のｓｉＲＮＡの効果を示すプロットである。ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦは、細胞増殖、分化およびアポトーシスを制御する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達経路に関与する癌遺伝子である。ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦの癌遺伝子における変異は、ヒト合胞体癌、例えば結腸直腸癌および非小細胞肺癌に頻繁に見られる。しかし、非小細胞肺癌は、コネキシン発現を減少させるので、ｓｉＲＮＡのギャップジャンクション送達を含む提案される治療の理想的な候補ではない。一部の癌において、コドン１２の遺伝子変異が観察されており、ＧＡＴ変異体と呼ばれる。したがって、タンパク質（本明細書ではＫｒａｓＧＡＴと呼ぶ）の翻訳を妨害し、この変異によってコードされるｓｉＲＮＡ（本明細書ではＫｒａｓＧＡＴｓｉＲＮＡと呼ぶ）は、そのような癌の拡散との戦いにおいて有益な効果を有し得る。横軸は時間を時単位で示し、縦軸は２４時間で対照集団によって正規化された集団を示す。対照トレースは白丸を用い、阻害性オリゴヌクレオチドに曝されていないＰＡＮＣ−１細胞の集団の大きさを示す。ＫｒａｓＧＡＴトレースは黒丸を用い、ＫｒａｓＧＡＴｓｉＲＮＡの１５０ｎＭ溶液に曝されたＰＡＮＣ−１細胞の集団の大きさを示す。対照ｓｉＲＮＡトレースは平行斜線で塗りつぶした丸を用い、いずれの主要な経路または構造を妨害しないｓｉＲＮＡの１５０ｎＭ溶液に曝されたＰＡＮＣ−１細胞の集団の大きさを示す。対照ｓｉＲＮＡはＫｒａｓＧＡＴｓｉＲＮＡと同じ長さだが、対照ｓｉＲＮＡはいずれの遺伝子もコードしなく、ナンセンスｓｉＲＮＡと呼ばれる。トランスフェクションは、両方集団とも０時間で開始した。このプロットは、ナンセンスｓｉＲＮＡを超えるＫｒａｓＧＡＴｓｉＲＮＡによって中等度効果があることを示す。
【００７６】
図９Ａは画像であり、図９Ｂはプロットである。両方ともｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるために、ｍｉＲ−１６ミミックを含む、潜在的作用物質による異なる細胞株の膵臓腫瘍の増殖に対する相対的な効果を示し、したがって、一実施形態による、ｈＭＳＣを介する導入のための候補作用物質を示す。直接トランスフェクション実験プロトコルを各トレースのために実験（ｎ＝６）で用いた。ＣＦＰＡＣ−１と称する細胞株は、嚢胞性線維症の患者由来のヒト膵臓腺癌細胞株である。図９Ａは、４つの画像を示す。左側の２つの画像は、トランスフェクション開始から２４時間後および９６時間後の、培養中のヒトＣＦＰＡＣ−１細胞の顕微鏡写真である。右側の２つの画像は、ｍｉＲ−１６を模倣するｓｉＲＮＡの１００ｎＭ溶液中での直接トランスフェクションの開始から２４時間後および９６時間後の、培養中のヒトＣＦＰＡＣ−１細胞の顕微鏡写真である。９６時間での２つの画像を比較すると分かるように、ｍｉＲ−１６ミミックに曝された培養中のＣＦＰＡＣ−１細胞の増殖が明らかに減少している。
【００７７】
図８Ａおよび図８Ｂと同様に、図９Ａの結果は、図９Ｂに定量化されており、時間に対するＣＦＰＡＣ−１細胞集団成長（増殖）を示している。横軸は時間を時単位で示し、縦軸は２４時間で対照集団によって正規化された集団を示す。対照トレースは、阻害性オリゴヌクレオチドに曝されてないＣＦＰＡＣ−１細胞の集団の大きさを示す。ｍｉＲ−１６トレースは、ｍｉＲ−１６を模倣するｓｉＲＮＡの１００ｎＭ溶液に曝されたＣＦＰＡＣ−１細胞に対する集団の大きさを示す。２４時間の集団の約１．５倍のｍｉＲ−１６ミミックに曝された集団は、２４時間集団の約８．３倍の対照集団から９６時間で８０％以上減少している。
【００７８】
同様にこれらの実験において、ｍｉＲ−１６のｓｉＲＮＡミミックは、細胞増殖を減少させることに最も効果的であることが判明した。
【００７９】
３．３  ｈＭＳＣ細胞質は、腫瘍増殖を遅らせるｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏでロードすることができる
ドナー細胞から標的細胞まで阻害性オリゴヌクレオチドなどの作用物質をトランスフェクトすることに効果的であるギャップジャンクションのために、作用物質はドナー細胞の細胞質中、したがって、しばしばギャップジャンクションの近傍に豊富にある必要がある。一部のトランスフェクションプロセスの間、作用物質はエンドサイトーシスを経て周囲の液体から細胞内にロードされる。エンドサイトーシスは細胞が分子（核酸およびタンパク質など）をのみ込むことによって細胞にそれらを輸送し、小胞を形成する能動輸送の形態である。これは、エネルギーを使用するプロセスである。エンドサイトーシスおよびその相対物であるエキソサイトーシスはすべての細胞によって用いられる。細胞にとって重要なほとんどの化学物質は大きな極性分子であり、受動的手段によって疎水性細胞質または細胞膜を通過することができないからである。ギャップジャンクションを通してトランスフェクションに利用できるエンドサイトーシスによってロードされた作用物質の場合、小胞壁を分解させ、細胞質内に作用物質を放出する必要がある。次の実験は、ｈＭＳＣの細胞質へのｓｉＲＮＡの効果的な移動を示す。
【００８０】
図１０Ａ〜図１０Ｆは、一実施形態により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣに直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質のローディングを示す画像とプロットである。これらの実施形態において、フルオロフォアを標識したｓｉＲＮＡは、培養中のｈＭＳＣにロードされる。標識したｓｉＲＮＡの長さは、約５００ミクロン（１ミクロン＝１マイクロメートル、μｍ＝１０−６メートル）である。Ｈｅｋ２９３親細胞は、３５ｍｍの培養皿内に配置された１８ｘ１８ｍｍ無菌のカバーガラスの上で増殖させた。それぞれの培地に播種してから約２４時間後、２４量体モルホリノ（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ）およびＥｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ）を添加した２ｍＬの新鮮な完全培地（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ）と交換した。モルホリノの最終濃度は、１．２５μＭであり、Ｅｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒの最終濃度は、約６μＭであった。モルホリノは、最大送達で細胞上に残存し、洗浄しなかった。対照培養皿にはＥｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒのみの完全培地を投与した。種々の時点でカバーガラスを３．７％ホルムアルデヒドで固定した。カバーガラスにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を載せ、６３×油浸対物レンズを用いて、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ１０００共焦点顕微鏡上で画像をキャプチャした。蛍光強度プロファイルは、Ｏｌｙｍｐｕｓラインシリーズ分析ソフトウェアツールを用いて作成した。
【００８１】
ｈＭＳＣ中の自然起源の背景蛍光から、ロードしたｓｉＲＮＡによって蛍光を識別するために、蛍光は、まず、ローディングを受けてない対照ｈＭＳＣについて測定する。図１０Ａは、対照ｈＭＳＣからの蛍光強度の顕微鏡写真の一例を示す画像である。画像の卵型のｈＭＳＣにおいていくぶんさらに明るいのは背景蛍光である。図１０Ａにおいて長さ約７００ミクロンの白線部分に沿った蛍光強度のプロファイルをプロットして図１０Ｂに示す。横軸は白線部分に沿った距離を示す。ｈＭＳＣ細胞境界は、約１００ミクロンと６００ミクロン、約５００ミクロンの長さである。縦軸は任意単位での蛍光強度を示す。ｈＭＳＣの右側境界近くの蛍光強度において、平均勾配より大きいピークがある。
【００８２】
図１０Ｃは、フルオロフォアタグ付きｓｉＲＮＡによるローディングへの３時間の曝露後、異なるｈＭＳＣからの蛍光強度の顕微鏡写真の一例を示す画像である。画像の卵型ｈＭＳＣの左右両端の背景より明らかに明るい蛍光がある。両端で、蛍光が非常に明るい数ピクセルにわたる小胞は、明瞭である。図１０Ｃにおいて長さ約７００ミクロンの白線部分に沿った蛍光強度のプロファイルをプロットして図１０Ｄに示す。横軸は白線部分に沿った距離を示す。ｈＭＳＣ細胞境界は、約１００ミクロンと５００ミクロン、約４００ミクロンの長さである。縦軸は任意単位での蛍光強度を示す。ｈＭＳＣの左右両端の境界近くの蛍光強度において２つの明白なピークがある。蛍光は、依然として細胞境界近くの小胞に限られており、細胞質全体にわたり明るくないように見える。
【００８３】
この記述は、４８時間の曝露によって変化する。図１０Ｅは、フルオロフォアタグ付きｓｉＲＮＡによるローディングへの４８時間の曝露後、異なるｈＭＳＣからの蛍光強度の顕微鏡写真の一例を示す画像である。背景蛍光が存在するが、三角形のｈＭＳＣは背景より明らかにはるかに明るい。数ピクセルにわたる小胞は、依然として明瞭であり、その蛍光は特別に明るい。しかし、蛍光は細胞質全体にわたり明るい。図１０Ｅにおいて、長さ約８００ミクロンの線部分（この場合明るい細胞質上で見えるようにするために黒色にした）に沿った蛍光強度のプロファイルをプロットして図１０Ｆに示す。横軸は黒線部分に沿った距離を示す。ｈＭＳＣ細胞境界は、約２００ミクロンと７００ミクロン、約５００ミクロンの長さである。縦軸は任意単位での蛍光強度を示す。ｈＭＳＣの左右両端の境界近くの蛍光強度において２つの明白なピークがあるが、細胞の中央にはさらに幅が広く、強力なピークがある。蛍光は、ｈＭＳＣ全体にわたって明るい。これは、ギャップジャンクションを通ってトランスフェクションのためのｓｉＲＮＡが良好に分布されている。
【００８４】
図１１は、種々の実施形態による、ｈＭＳＣおよび他の細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質をロードする種々の方法を示す、一連のプロットである。２種のトランスフェクション試薬を使用し、トランスフェクション試薬なしの対照と比較した。トランスフェクションを試験したｓｉＲＮＡは、Ｃｙａｎｉｎｅ  ３（以降Ｃｙ３と呼ぶ。プロットではＣｙ３ＰＥ−Ａと称する）を用いて蛍光を作成するＭｉｓｓｉｏｎ  ｓｉＲＮＡであった。細胞を識別する上で補助のために、フルオレセインでも染色した（プロットでは６ＦＡＭ  ＦＩＴＣ−Ａと称する）。図１１において９のプロットのそれぞれには、Ｃｙ３からの蛍光の強度を示す対数表示の縦軸と、フルオレセインからの蛍光強度を示す対数表示の横軸がある。以下で明らかになるので、これらの軸の目盛を読み取る必要はない。各プロットは、一群の細胞内部のＣｙ３およびフルオレセインの分布の分散図である。
【００８５】
図１１の下段のｈＭＳＣと、中段のＰＡＮＣ−１および上段のＣＦＰＡＣ−１の２種の膵癌細胞株との３種の細胞型を比較した。左列には３種の細胞型の対照、すなわち、トランスフェクション試薬を含まない、Ｃｙ３タグ付きＭｉｓｓｉｏｎ  ｓｉＲＮＡの１００ｎＭ溶液に浸したときのＣｙ３とフルオレセインの分布を示す。ほとんどの細胞は、Ｃｙ３およびフルオレセインについて値が低く、各プロット上にマークした四分割の左下部Ｑ３に明確に示す。左列の対照例についての３つのプロットの比較から明らかなように、四分割の左下部は各細胞型によって異なる。
【００８６】
中央列は、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬を使用したときのＣｙ３タグ付きＭｉｓｓｉｏｎ  ｓｉＲＮＡの１００ｎＭ溶液に細胞を浸した効果を示す。フルオレセイン強度は低いままであるが、細胞内部のＣｙ３強度は四分割Ｑ３から四分割Ｑ１に飛び出ている。これは、下段のｈＭＳＣを含む３種の細胞型すべてにＭｉｓｓｉｏｎ  ｓｉＲＮＡが効果的にトランスフェクションされたことを示す。３種類の細胞型のすべてについて右列に示すように、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧｅｎｅ  ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，  ＮＪから入手可能）を使用したとき、同様の結果が生じる。
【００８７】
図１１は、ｉｎ  ｖｉｖｏでドナー細胞として使用するために、ｓｉＲＮＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣに容易にロードされることを示す。２４ウェルプレートの単一ウェルからの平均細胞収率は、ｓｉＲＮＡをロードした１．９×１０５ｈＭＳＣ細胞である。妨害するｓｉＲＮＡをロードした１０５ｈＭＳＣ細胞を導入することは、ｉｎ  ｖｉｖｏで合胞体癌細胞の腫瘍と接触したとき、治療効果があると予想される。
【００８８】
別の実施形態において、他の機構、これらに限定されないが、例えば、リン酸カルシウムもしくは電気穿孔法もしくは細胞スクイージングを用いて、または細胞膜と融合し、それらのカーゴを単独で、またはいくつかの組み合わせで内部に堆積させるリポソームを生成するために、カチオン性脂質を材料と混合することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｓｉＲＮＡをｈＭＳＣにトランスフェクトする。
【００８９】
３．４  ｈＭＳＣは腫瘍増殖を遅らせる特定のｓｉＲＮＡをロードして残存することができる
図１２Ａおよび図１２Ｂは、一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＭＳＣに直接トランスフェクトされた腫瘍の増殖を遅らせるための潜在的作用物質によるロード後、ｈＭＳＣの残存を示すプロットである。直接トランスフェクション実験プロトコルを各トレースのために実験（ｎ＝４）で用いた。図１２Ａは、少なくとも一部の癌細胞の増殖を減少させるために上記の阻害性オリゴヌクレオチドをロードしたｈＭＳＣの残存の例を示すグラフである。横軸はトランスフェクション後の時間を時単位で示し、縦軸は０時間での初期集団が５０，０００細胞である各トレースの何万もの細胞中の細胞数を示す。トレースラベル「ｈＭＳＣ−対照」は４８時間までの集団変化を示すが、初期集団から約１０％以上逸脱しない。トレースは、それぞれＡｋｔ  ｓｉＲＮＡ、ゲルゾリンｓｉＲＮＡおよびコルタクチンｓｉＲＮＡをロードしたｈＭＳＣも示す。すべては７２時間にわたり若干変化するが、すべてｈＭＳＣの初期集団の約４０％以内に終わり、隣接細胞と相当数のギャップジャンクションを形成するのに十分な量である。
【００９０】
図１２Ｂは、検査されたすべての癌細胞の増殖を減少させる最も効果的な作用物質であることを上記で示しているｍｉＲ−１６のためにｓｉＲＮＡミミックをロードしたとき、ｈＭＳＣ残存例を示すグラフである。横軸はローディング後の時間を時単位で示し、縦軸は任意単位での細胞数を示す。トレースラベル「対照」は、ｍｉＲ−１６のためにＳｉＲＮＡミミックをロードしてないｈＭＳＣについて９６時間まで増殖する集団を示す。トレースは、それぞれ１００ｎＭ、２００ｎＭおよび３００ｎＭの異なる濃度レベルで、およびしたがってラベルを付けて、溶液中でｍｉＲ−１６のためのｓｉＲＮＡミミックをロードしたｈＭＳＣについても示す。各点は、４回の実験の平均値であり、縦線で表す標準偏差は、記号の大きさの桁であり、そのため容易に観察されない。ｍｉＲ−１６ミミックをロードしたｈＭＳＣのすべてのトレースは、対照トレースをわずかに下回る増殖を示し、３種類の非対照トレース間にほとんど差がない。
【００９１】
したがって、ｍｉＲ−１６ミミックをロードしたｈＭＳＣは、標的細胞とギャップジャンクションを形成し、それらのｍｉＲ−１６ミミックのロードを標的細胞に送達するのに十分に長く残存するはずである。
【００９２】
３．５  ｈＭＳＣは合胞体癌細胞と機能的ギャップジャンクションを形成し、したがって、腫瘍増殖を遅らせる特定のｓｉＲＮＡを、ギャップジャンクションを介して合胞体癌細胞にトランスフェクトすることができる
図１３Ａおよび図１３Ｂは、一実施形態による、ｈＭＳＣと、合胞体癌細胞との間のギャップジャンクションの形成を示すプロットである。この場合、合胞体癌細胞は、ＬｏＶｏ（ヒトの結腸腺癌）細胞株のメンバーである。図１３Ａは、二重全細胞パッチクランプから生じているデータを表す。横軸は時間であり、縦軸の目盛は２種あり、下の目盛は適用電圧を示し、上の目盛は派生電流を示す。０時間での適用電圧はゼロであり、電流はゼロである。電圧は−１１０ミリボルト（ｍＶ、１ｍＶ＝１０−３ボルト）まで直ちに下げられ、白線トレースによって与えられた電流は６００ピコアンペア（ｐＡ、１ｐＡ＝１０−１２アンペア）を超えるまでジャップし、次いでわずかに減衰する。５秒後に、電圧は＋１１０ｍＶに切り換わり、電流は−６００ｐＡ以下まで逆転し、次いで次第に減衰する。１０秒後に、電圧はゼロまで戻り、電流も同様に戻る。加えて、他のトレースを生成するために、０と１１０ｍＶの間の電圧を１０ｍＶ単位で試験した。ｈＭＳＣに適用された電流は、ＬｏＶｏ細胞で検出された。そのような反応は、測定電流を運ぶために細胞間でイオンを通過させるギャップジャンクションが形成されたことを示す。図１３Ｂは、ＬｏＶＯ癌細胞に適用される電圧の機能として、ｈＭＳＣ細胞中のジャンクション電流を示す電圧電流応答曲線を示すグラフである。電流が破線中で水平になる所で、カップリングは依存性を検出するには高すぎる。実線トレースは測定値であり、破線トレースは、細胞間のコンダクタンスが低い（すなわち、コンダクタンスの電圧依存性が観察されることができた）場合、予想されるものである。
【００９３】
３．６  合胞体癌細胞は、互いに機能的ギャップジャンクションを形成し、したがって、腫瘍増殖を遅らせる特定のｓｉＲＮＡを、ギャップジャンクションを介してトランスフェクトすることができる
図１４Ａおよび図１４Ｂは、一実施形態による、合胞体癌腫瘍の複数の細胞を介して阻害性オリゴヌクレオチドの増殖で用いる２つの合胞体癌細胞間のギャップジャンクションの形成例を示す。図１４Ａは、外膜中のアクチンを赤色フルオロフォアで強調するため、細胞核中のＤＮＡを青色ＤＡＰＩフルオロフォアで強調するため、および細胞質中のゲルゾリンを緑色フルオロフォアで強調するために、蛍光標識された２つのＵＡＣＣ−６２メラノーマ細胞の顕微鏡写真である。図１４Ｂは、二重全細胞パッチクランプから生じるデータを示す。一細胞に適用された電流は、他で検出された。
【００９４】
図１４Ｃおよび図１４Ｄは、種々の実施形態で用いるために、ギャップジャンクションコネキシンが種々の結腸直腸癌細胞株で見つかることを示す電気泳動ゲルの画像である。２回の異なる実験で、Ｃｘ４３は対照としてのＨｅｋ２９３中に見いだされ、およびＬｏＶｏ、ヒト結腸直腸癌細胞株ＨＣＴ１１６および結腸腺癌ＳＷ４８０を含む４種類の結腸直腸細胞株のうちの３種類で見いだされた。ヒト結腸直腸腺癌細胞株ＨＴ２９だけは、Ｃｘ４３を発現しなかった。Ｃｘ４３の一般的な存在は、ｈＭＳＣｓと同様に細胞株の他のメンバーとともにギャップジャンクションを形成するのに役立つ。
【００９５】
３．７  合胞体癌細胞は、互いに特定のｓｉＲＮＡをトランスフェクトする
図１４Ｅおよび図１４Ｆは、癌細胞間でトランスフェクトされるいくつかの構造タンパク質または機能タンパク質の生成を妨害し、したがって、一実施形態による、腫瘍増殖を遅らせるための潜在的作用物質を表すＲＮＡを示す電気泳動ゲル（ウエスタンブロット）の画像である。図１４Ｅは、ゲルの５つのカラムを示す。第１のカラムは、５５ｋＤａ、７２ｋＤａ、９５ｋＤａ、１３０ｋＤａおよび１７０ｋＤａを含む既知のサイズのマーカー分子を含む。カラム２〜５は、ＵＡＣＣ−６２（悪性メラノーマ）、Ｈｅｌａ  ＣＸ４３Ｈ１０（子宮頚癌）、対照としてＨｅＫ２９３、およびＣ６（ラット神経膠腫）の細胞株の細胞にそれぞれ効率よくトランスフェクトされたそれらの抗体（９０ｋＤａで抗ゲルゾリン、３６ｋＤａで抗ＧＡＰＤＨ）によって検出されたタンパク質の存在を示す。図１４Ｆは図１４Ｅの画像とサイズで整列させたゲルの３つのカラムを表す。図１４Ｆにおいて、第３のカラムは、既知のサイズ、例えば４０ｋＤａ、５０ｋＤａおよび６０ｋＤａのマーカー分子を含む。カラム１および２は、ＵＡＣＣ−６２細胞に効率よくトランスフェクトされたｓｉＲＮＡによって減少させたそれらの抗体（９０ｋＤａで抗ゲルゾリン、５５ｋＤａで抗α−チューブリン）によって検出されたタンパク質の存在を示す。ノックダウンされたタンパク質は、右側（ゲルゾリン）のウエスタンブロットにおいて低密度であることを示している。ゲルゾリンのためのｓｉＲＮＡはトランスフェクトされ、タンパク質のレベルは低下した。これらのプロットは、そのようなｓｉＲＮＡが結合された腫瘍細胞の間でトランスフェクトされることができ、したがって種々の実施形態においてそのような細胞株によって表される腫瘍に対して少なくとも使われ得ることを示している。
【００９６】
３．８  合胞体癌組織はｉｎ  ｖｉｔｒｏで合胞体癌細胞の複数の細胞幅を通してｓｉＲＮＡを送達する
ギャップジャンクションを介して一癌細胞から別の癌細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションの判定は、スクレープローディングを用いて行う。スクレープローディングにおいて、接着細胞の単一層は、ギャップジャンクション透過性トレーサーの存在下で単一線に沿ってスクレープされる、またはスクラッチされ、これによっておそらく何らかの膜の機械的な混乱の結果、スクレープに沿って細胞によって取り込まれる。正常な膜透過性が再確立されると、トレーサーは細胞質内に捕捉され、時間とともにロードされた細胞から、コネキシンチャネルでできた機能的ギャップジャンクションで結合された隣接している細胞へ移動することができる。一定期間中、蛍光染料がスクレープ線から離れて拡散する距離は、ギャップジャンクションの細胞間情報伝達を意味している。
【００９７】
図１５Ａ〜図１５Ｃは、一実施形態による、合胞体癌腫瘍の複数の細胞を介するｓｉＲＮＡの増殖を示す画像およびプロットである。図１５Ａにおいて、各トランスフェクションから２４時間後のＨｅＬａ子宮頸癌細胞株細胞にロードされたフルオロフォアタグ付きｓｉＲＮＡの量を、溶液中のタグ付きｓｉＲＮＡの４つの異なる濃度（それぞれ０ｎＭ、０．０５ｎＭ、５ｎＭおよび１５０ｎＭで）について４枚の画像で示す。より高い濃度で、より多くの細胞は、蛍光タグ付きｓｉＲＮＡの明るいドットをトランスフェクトされる。
【００９８】
図１５Ｂは、スクレープロードのイベントから２２時間後のＨｅＬａ子宮頸癌単一層を上部中央から右下隅へ斜めに切った画像を示す。上部は、下部画像の一部の２倍倍率の画像である。スクレープ線に沿った細胞はタグ付きｓｉＲＮＡによって明るいが、ギャップジャンクションの移動のため、多少のタグ付きｓｉＲＮＡを示す。両方向矢印線部分はスクレープ方向に対して垂直な方向を示す。このデータは図１５Ｃにプロットする。
【００９９】
図１５Ｃは、スクレープロード線からの距離とともに低下する蛍光強度を示すグラフである。横軸は距離をミクロンで示し、縦軸は任意単位での蛍光強度を示す。蛍光染料は各細胞の核に集中し、ピークを形成する。この標識されたｓｉＲＮＡが輸送される細胞幅の数は、ピークを計数することによって決定することができる。蛍光強度は、約１１細胞幅に相当する、約１７５ミクロンの範囲でスクレープ線値の約５％まで低下する。したがって、タグ付きｓｉＲＮＡを示している最後の細胞に達するために、タグ付きｓｉＲＮＡは、１０の介在細胞を介してギャップジャンクションによって増殖された。拡散曲線の適合は、毎秒約５ｘ１０−９平方センチメートルの拡散定数（ＤＣ）を生成する。
【０１００】
これは、阻害性オリゴヌクレオチドがロードしたｈＭＳＣによって導入されると、一癌細胞から別の癌細胞までギャップジャンクションを介して増殖し、通常癌細胞より劣勢であるｈＭＳＣの効果を増加させることが予想され得ることを示す。
【０１０１】
３．９  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでロードしたｈＭＳＣとの共培養は、腫瘍増殖を遅らせる
適当な阻害性オリゴヌクレオチドがロードされると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで癌細胞と共培養されるｈＭＳＣは腫瘍増殖の減少をもたらすことが発見されている。これは、阻害性オリゴヌクレオチドがｈＭＳＣにロードされないとき、得られる結果（例えば、図３Ａおよび図３Ｂに示す）とまったく対照的である。上記の実験に基づいて、この結果は、ｈＭＳＣから隣接する癌細胞に、およびそれらの隣接する癌細胞から連続してさらに遠くの癌細胞にギャップジャンクションを介する阻害性オリゴヌクレオチドのトランスフェクションによると思われる。
【０１０２】
図１６は、一実施形態による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｈＭＳＣとの共培養によって結腸直腸腫瘍増殖に対する相対的な効果を示すプロットである。この実験は、ＬｏＶｏ結腸直腸細胞株を使用した。間接トランスフェクション実験プロトコルを各トレースのために実験（ｎ＝１５）で用いた。横軸は時間を日単位で示し、縦軸は任意単位での細胞集団を示す。単独で培養されたＬｏＶｏ細胞、および阻害性オリゴヌクレオチドをロードしなかったｈＭＳＣとともに培養したＬｏＶｏ細胞についてのトレースを示す。トレースは、Ａｋｔ  ｓｉＲＮＡをロードされたｈＭＳＣ（ラベル「ＬｏＶｏ＋ｈＭＳＣ＋Ａｋｔ」）と共培養されたＬｏＶｏ細胞についても示す。トレースは、スクランブルｓｉＲＮＡをロードされたｈＭＳＣ（ラベル「ＬｏＶｏ＋ｈＭＳＣ＋スクランブル」）と共培養されたＬｏＶｏ細胞についても示す。スクランブルｓｉＲＮＡは、その配列がいずれの既知の遺伝子配列と相補的でないｓｉＲＮＡであり、したがってナンセンスｓｉＲＮＡを表す。各トレースは、縦線部分によって示される標準偏差とともに１５培養物の平均値をプロットする。３日目、ＬｏＶｏ＋ｈＭＳＣ＋Ａｋｔは他の３つの群すべてよりも有意に良好だった（ｐ＜０．００１）。ＬｏＶｏ＋ｈＭＳＣ＋Ｓｃｒａｍｂｌｅｄは、ＬｏＶｏ単独およびＬｏＶｏ＋ｈＭＳＣよりも有意に良好だった（ｐ＜０．０５）。
【０１０３】
図１７は、種々の残りのプロットを比較するために腫瘍重量と腫瘍体積との間の直接的な関係を示すプロットである。横軸は重量をグラムで示し、縦軸は体積を立方センチメートル（ｃｍ３）で示す。データは、対照腫瘍と、重量を計った小さい腫瘍のためのｍｉＲ−１６ミミックをトランスフェクトした腫瘍との両方に基づく。関係は、約０．１グラム〜約１．６グラムの重量に対して線形であり、Ｒ２＝０．８１である。
【０１０４】
図１８Ａおよび図１８Ｂは、一実施形態による、ｍｉＲ−１６またはｍｉＲ−１６のｓｉＲＮＡミミックをロードしたｈＭＳＣとのｉｎ  ｖｉｒｏで共培養による前立腺腫瘍増殖に対する相対的な効果を示すプロットである。間接トランスフェクション実験プロトコルを各トレースのために実験（ｎ＝４）で用いた。図１８Ａは、実験の一連の実験例からのデータを示すグラフである。横軸は時間を時単位で示し、縦軸は何万もの細胞の細胞数を示す。対照トレースは、阻害性オリゴヌクレオチドをロードしてないｈＭＳＣとともにＰＣ−３前立腺細胞株を共培養する効果を示す。他のトレースは、ｍｉＲ−１６ミミックをロードしたｈＭＳＣとともにＰＣ−３前立腺細胞株を共培養する効果を示す。各トレースは４の培養物の平均値をプロットし、標準偏差は縦線部分によって示されている。腫瘍増殖速度において減少は約２５％であるが、ｍｉＲ−１６ミミックの直接トランスフェクションほど劇的ではない。培養時間が長くなれば、ギャップジャンクションの数が増加し、ｍｉＲ−１６ミミックがさらにＰＣ−３細胞に送達されるので、より多くの減少を示すことが予想される。
【０１０５】
図１８Ｂは、実験を１日延長し、９６時間まで及ぶ別の一連の実験例からのデータを示すグラフである。横軸は時間を時単位で示し、縦軸は吸光度の単位での腫瘍細胞数を示す。対照トレースは、各型の細胞の均等混合（１：１）において阻害性オリゴヌクレオチドをロードしてないｈＭＳＣとともにＰＣ−３前立腺細胞株を共培養する効果を示す。他のトレースは、これも１：１の混合において、ｍｉＲ−１６ミミックをロードしたｈＭＳＣとともにＰＣ−３前立腺細胞株を共培養する効果を示す。ｈＭＳＣは、１５０ｎＭ  ｍｉＲ−１６ミミック溶液中でロードされた。各トレースは６培養物の平均値をプロットし、標準偏差は縦線部分によって示されている。腫瘍増殖速度において減少は約３０％〜４０％であり、本例示の７２時間で、および図１８Ａでの７２時間で得られたよりもいくぶん良好であった。
【０１０６】
３．１０  ロードしたｈＭＳＣによるｉｎ  ｖｉｖｏでの処置は腫瘍増殖を遅らせる
このセクションでは、阻害性オリゴヌクレオチドをロードしたｈＭＳＣがｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を減少させ、阻害性オリゴヌクレオチドをロードしてないｈＭＳＣについての図３Ａおよび図３Ｂに示す結果とまったく対照的であることを示す。
【０１０７】
図１９Ａ〜図１９Ｃは、一実施形態による、ｍｉＲ−１６ミミックをロードしたｈＭＳＣによるｉｎ  ｖｉｖｏでの処置による前立腺腫瘍増殖に対する効果を示すプロットである。図１９Ａは、ｍｉＲ−１６ミミックをロードしたｈＭＳＣをｉｎ  ｖｉｖｏで用いる腫瘍増殖の減少例を示すグラフである。横軸は時間を日単位で４０日まで示し、縦軸は腫瘍体積を立方センチメートル（ｃｍ３）で示す。０日目、前立腺癌ＰＣ−３細胞株の１００万の細胞を２群のヌードマウス（各群ｎ＝４マウス）それぞれのヌードマウスに注射した。１０日目、ｍｉＲ−１６ミミックをロードしたｈＭＳＣの１００ｎＭ溶液を１群のそれぞれのヌードマウスの腫瘍に注射した。対照トレースは、ｍｉＲ−１６ミミックをロードしたｈＭＳＣを投与されてない無処置群のヌードマウスの平均腫瘍体積を示し、標準偏差を縦軸部分に示す。処置トレースは、ｍｉＲ−１６ミミックをロードしたｈＭＳＣを投与された処置群のヌードマウスの平均腫瘍体積を示し、ここでも標準偏差を縦軸部分に示す。３５日目、処置群の腫瘍体積は、無処置の対照群の腫瘍体積の約５０％である。差は統計的に有意であり、治療的に重要である。
【０１０８】
３５日目に図１９Ａに示した実験由来の動物を犠牲にし、単独で増殖させた腫瘍細胞（対照）の腫瘍体積と、ｍｉＲ−１６を模倣するｓｉＲＮＡがロードされているｈＭＳＣの存在下の腫瘍細胞の腫瘍体積を図１９Ｂに棒グラフで示す。横軸は群を示し、縦軸は重量をグラムで示す。第１の棒は対照群の４種類の腫瘍の平均重量を示し、黒色棒はｈＭＳＣとともに増殖させた群の４種類の腫瘍の平均重量を示し、縦線部分は平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。ｍｉＲ−１６ミミックがロードされているｈＭＳＣによる処置に関連した腫瘍増殖において有意な減少がある。この結果は、図３Ｂに示す結果と比較する必要がある。
【０１０９】
図１９Ｃは、ｍｉＲ−１６ミミックをロードしたｈＭＳＣをｉｎ  ｖｉｖｏで用いた腫瘍増殖の減少例を腫瘍サイズ（幅および高さ）について示すグラフである。横軸は時間を日単位で３６日まで示し、縦軸は腫瘍サイズをベースラインサイズの％で示す。０日目、前立腺癌ＰＣ−３細胞株の１００万の細胞を２群のヌードマウス（各群において６匹のマウス）それぞれのヌードマウスに注射した。１４日目、ｍｉＲ−１６ミミックとして用いられるｓｉＲＮＡをロードした１００万のｈＭＳＣを１群のそれぞれのヌードマウスの腫瘍に注射した。対照トレースは、ｍｉＲ−１６ミミックをロードしたｈＭＳＣを投与されてない無処置群のヌードマウスの平均腫瘍サイズを示し、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を縦線部分で示す。処置トレースは、ｍｉＲ−１６ミミックをロードしたｈＭＳＣを投与された処置群のヌードマウスの平均腫瘍サイズを示し、ここでも平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を縦線部分で示す。３６日目、処置群腫瘍サイズは、無処置対照群の腫瘍サイズの約６０％である。差は統計的に有意であり、治療的に重要である。
【０１１０】
一癌細胞株についての実験結果、およびコネキシン発現、ギャップジャンクション形成、他の合胞体癌細胞株のためのｍｉＲ−ミミックへの応答で観察された類似点に基づいて、他の癌、例えば、本明細書に示した癌（子宮頸癌、結腸直腸癌、メラノーマ、膵癌、前立腺、非小細胞肺癌とラット神経膠腫）に対して、阻害性オリゴヌクレオチド、中でもｍｉＲ−１６ミミック、コルタクチンｓｉＲＮＡ、ゲルゾリンｓｉＲＮＡ、Ａｋｔ  ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲ−３４ａミミックなどをロードしたｈＭＳＣを注射することによって、またはさもなければ腫瘍と接触させることによって、腫瘍増殖において同様の著しい、治療効果のある減少を得ることができると予想される。
【０１１１】
４．代替物および修正
前述の明細書において、本発明はその具体的な実施形態に関連して記述されている。しかし、さまざまな修正および変化が本発明の広範な趣旨および範囲から逸脱することなく、それになされ得ることは明白である。したがって、本明細書および図面は、限定的な意味ではなくむしろ例示的な意味でみなされる。本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、単語「含む」およびその変化形、例えば「含んでいる」、「含むこと」は、明言された項目、要素もしくはステップまたは項目、要素もしくはステップの群の包含を意味するが、いずれの他の項目、要素もしくはステップ、または項目、要素もしくはステップの群の排除を意味しないと理解されよう。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、その冠詞によって修飾される品目、要素もしくはステップの１つまたは複数を示すことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、その冠詞によって修飾される品目、要素もしくはステップの１つまたは複数を示すことを意味する。
【０１１２】
参考文献
Ｔｉａｎら，２０１１，“Ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｌａｙ  ａ  ｄｕａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，”  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｖ２２６（＃７），ｐｐ１８６０−７，２０１１，  ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｃｐ．２２５１１．
Ｐｌｏｔｎｉｋｏｖら，２００３，“Ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＣＮ２  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｉｎｅ  ｈｅａｒｔ，”  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ｖ１０８：ＩＶ−５４７．
Ｖａｌｉｕｎａｓら，２００２，“Ｃａｒｄｉａｃ  ｇａｐ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｓｈｏｗ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．”  Ｃｉｒ．  Ｒｅｓ．，  ｖ９１，ｐｐ１０４−１１１．
【図１】
2019509297.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2019509297.tif 000033
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
2019509297.tif 000039
【図１５Ｃ】
2019509297.tif 000040
【図１６】
2019509297.tif 000041
【図１７】
2019509297.tif 000042
【図１８Ａ】
2019509297.tif 000043
【図１８Ｂ】
2019509297.tif 000044
【図１９Ａ】
2019509297.tif 000045
【図１９Ｂ】
2019509297.tif 000046
【図１９Ｃ】
2019509297.tif 000047
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月4日(2018.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019509297000001.app
【国際調査報告】
2019509297.tif 000048