(57)【要約】本発明は細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製する新規の方法を提供する。該方法は、イオン強度が高い緩衝溶液の存在下で４〜９の間のｐＨにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含み、その際、細胞結合剤は、アミン反応基を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物との共有結合を形成するリシンε−ＮＨ２基を含む。本明細書に記載されている方法に従って調製される細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートも本発明に含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製する方法であって、イオン強度が高い緩衝溶液の存在下で４〜９の間のｐＨにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と前記細胞結合剤を反応させる工程を含み、前記細胞結合剤はアミン反応基を有する前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物との共有結合を形成するリシンε−ＮＨ２基を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ｐＨが７．３〜８．７の間である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐＨが７．３〜８．４の間である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨが７．６〜８．４の間である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐＨが７．７〜８．３の間である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｐＨが７．８〜８．２の間である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐＨが７．９〜８．１の間である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｐＨが８．０である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｐＨが８．５〜８．９の間である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｐＨが８．６〜８．８の間である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐＨが８．７である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記緩衝溶液が２０ｍＭ〜５００ｍＭのイオン強度を有する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝溶液が５０ｍＭ〜１００ｍＭのイオン強度を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記緩衝溶液が６０ｍＭ〜９０ｍＭのイオン強度を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記緩衝溶液が７０ｍＭ〜８０ｍＭのイオン強度を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記緩衝溶液が７５ｍＭのイオン強度を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記緩衝溶液が１００ｎＭ〜２００ｍＭのイオン強度を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記緩衝溶液が１００ｎＭ〜１６０ｎＭのイオン強度を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記緩衝溶液が１２０ｎＭ〜１４０ｎＭのイオン強度を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記緩衝溶液が１３０ｎＭのイオン強度を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記緩衝溶液が７．８〜８．９の間のｐＨ及び５０ｍＭ〜２００ｍＭの間のイオン強度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記緩衝溶液が７．８〜８．２の間のｐＨ及び７０ｍＭ〜８０ｍＭの間のイオン強度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記緩衝溶液が８．０のｐＨ及び７５ｍＭのイオン強度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記緩衝溶液が８．５〜８．９の間のｐＨ及び１２０ｍＭ〜１４０ｍＭの間のイオン強度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記緩衝溶液が８．７のｐＨ及び１３０ｍＭのイオン強度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記緩衝溶液が、ＭＥＳ（（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸））緩衝液、ビス−トリスメタン（２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール）緩衝液、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸）緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ−−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳＯ（β−ヒドロキシ−４−モルフォリンプロパンスルホン酸）緩衝液、ビス−トリスプロパン（１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）緩衝液、ＤＩＰＳＯ、（３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸またはＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＯＢＳ（４−（Ｎ−モルフォリノ）ブタンスルホン酸）緩衝液、ＴＡＰＳＯ（３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸）緩衝液、トリズマ（トリスまたは２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））緩衝液、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）緩衝液、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）緩衝液、トリシン（Ｎ−（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン）緩衝液、ｇｌｙ−ｇｌｙ、ビシン（２−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸）緩衝液、ＨＥＰＢＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸））緩衝液、ＴＡＰＳ（３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］プロパン−１−スルホン酸）緩衝液、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）緩衝液、ＴＡＢＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸）緩衝液、ＡＭＰＳＯ（Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記緩衝溶液がＥＰＰＳ緩衝液である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記緩衝溶液が、７．８〜８．９の間のｐＨを有する５０ｍＭ〜２００ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記緩衝溶液が、７．８〜８．２の間のｐＨを有する７０ｍＭ〜８０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記緩衝溶液が、８．０のｐＨを有する７５ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記緩衝溶液が、８．５〜８．９の間のｐＨを有する１２０ｍＭ〜１４０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記緩衝溶液が、８．７のｐＨを有する１３０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製する方法であって、７．３〜９．０のｐＨを有する緩衝溶液にて細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含み、前記細胞結合剤はアミン反応基を有する前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物との共有結合を形成するリシンε−ＮＨ２基を含む、前記方法。
【請求項３４】
前記緩衝溶液の前記ｐＨが７．３〜８．４の間である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｐＨが７．６〜８．４の間である請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ｐＨが７．７〜８．３の間である請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｐＨが７．８〜８．２の間である請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｐＨが７．９〜８．１の間である請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｐＨが８．０である請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｐＨが８．５〜８．９の間である請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｐＨが８．６〜８．８の間である請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｐＨが８．７である請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製する方法であって、高濃度の緩衝溶液の存在下で４〜９のｐＨにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と前記細胞結合剤を反応させる工程を含み、前記細胞結合剤はアミン反応基を有する前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物との共有結合を形成するリシンε−ＮＨ２基を含む、前記方法。
【請求項４４】
前記緩衝溶液の前記濃度が、２０ｍＭ〜７５０ｍＭの間、２０ｍＭ〜５００ｍＭの間、２０ｍＭ〜２００ｍＭ、２５ｍＭ〜１５０ｍＭの間、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの間、５０ｍＭ〜１００ｍＭの間、１００ｍＭ〜２００ｍＭの間、または１００ｍＭ〜１５０ｍＭの間である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｐＨが、７．３〜８．９の間、７．３〜８．４、７．６〜８．４の間、７．７〜８．３の間、７．８〜８．２の間、８．５〜８．９、または８．６〜８．８の間である請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記緩衝溶液が、２０ｍＭ〜２００ｍＭの間の濃度及び７．１〜８．５の間のｐＨを有する請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記緩衝溶液が、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの間の濃度及び７．６〜８．４の間のｐＨを有する請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記緩衝溶液が、５０ｍＭ〜１００ｍＭの間の濃度及び７．７〜８．３の間のｐＨを有する請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記緩衝溶液が、６０ｍＭ〜９０ｍＭの間の濃度及び７．８〜８．２の間のｐＨを有する請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記緩衝溶液が、７０ｍＭ〜８０ｍＭの間の濃度及び７．９〜８．１の間のｐＨを有する請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記緩衝溶液が、５０ｍＭ〜２００ｍＭの間の濃度及び７．８〜８．９の間のｐＨを有する請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記緩衝溶液が、１１０ｍＭ〜１５０ｍＭの間の濃度及び８．５〜８．９の間のｐＨを有する請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記緩衝溶液が、１２０ｍＭ〜１４０ｍＭの間の濃度及び８．６〜８．８の間のｐＨを有する請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
前記緩衝溶液が、ＭＥＳ（（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸））緩衝液、ビス−トリスメタン（２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール）緩衝液、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸）緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ−−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳＯ（β−ヒドロキシ−４−モルフォリンプロパンスルホン酸）緩衝液、ビス−トリスプロパン（１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）緩衝液、ＤＩＰＳＯ、（３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸またはＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＯＢＳ（４−（Ｎ−モルフォリノ）ブタンスルホン酸）緩衝液、ＴＡＰＳＯ（３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸）緩衝液、トリズマ（トリスまたは２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））緩衝液、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）緩衝液、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）緩衝液、トリシン（Ｎ−（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン）緩衝液、ｇｌｙ−ｇｌｙ、ビシン（２−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸）緩衝液、ＨＥＰＢＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸））緩衝液、ＴＡＰＳ（３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］プロパン−１−スルホン酸）緩衝液、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）緩衝液、ＴＡＢＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸）緩衝液、ＡＭＰＳＯ（Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項３３〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記緩衝溶液がＥＰＰＳ緩衝液である請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記緩衝溶液が７５ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記緩衝溶液が１３０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
さらに、前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物の前記細胞結合剤との反応の後、イオン強度が高い反応停止溶液を混合する工程を含む、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記反応停止溶液が、２００ｍＭ〜３０００ｍＭの間、２００ｍＭ〜２０００ｍＭの間、２００ｍＭ〜１０００ｍＭの間、５００ｍＭ〜１０００ｍＭの間、５５０ｍＭ〜１０００ｍＭの間、または６００ｍＭ〜１０００ｍＭの間のイオン強度を有する請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記反応停止溶液が７００ｍＭ〜１０００ｍＭの間のイオン強度を有する請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記反応停止溶液がＥＰＰＳを含む請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記反応停止溶液がＥＰＰＳとヒスチジン塩酸塩とを含む請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
さらに、前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物の前記細胞結合剤との反応の後で高濃度緩衝液を含む反応停止溶液を混合する工程を含む請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記反応停止溶液における前記緩衝液の前記濃度が、２００ｍＭ〜３０００ｍＭの間、２００ｎＭ〜２０００ｍＭの間、２００ｍＭ〜１０００ｍＭの間、５００ｍＭ〜１０００ｍＭの間、５５０ｍＭ〜１０００ｍＭの間、または６００ｍＭ〜１０００ｍＭの間である請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記混合に続いて、前記緩衝液の前記最終濃度が、１５０ｍＭ〜７５０ｍＭの間、１５０ｍＭ〜６００ｍＭの間、２００ｍＭ〜５００ｎＭの間、２００ｍＭ〜４００ｎＭの間、または２５０ｍＭ〜３５０ｍＭの間である請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記反応停止溶液が５〜９の間のｐＨを有する請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記反応停止溶液が５〜７の間のｐＨを有する請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記反応停止溶液が５〜６の間のｐＨを有する請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記反応停止溶液が５．５のｐＨを有する請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記反応停止溶液が７５０ｍＭのＥＰＰＳ及び１５０ｍＭのヒスチジン塩酸塩を含む請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記反応停止緩衝液の前記添加が高分子量種の前記量を低下させる請求項５８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が以下の構造式：
【化１】
2019510741.tif 000050
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表され、式中、
Ｌは、以下の式：
−ＮＲ５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）Ｅ       （Ａ１）；または 
−ＮＲ５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｍ−Ｓ−Ｚｓ１  （Ａ３）；によって表され、
その際、
Ｒ５は−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐは２〜２０の間のアミノ酸残基を含有するアミノ酸残基またはペプチドであり；
Ｒａ及びＲｂは各存在について、それぞれ独立して−Ｈ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、または荷電した置換基またはイオン化できる基Ｑであり；
ｍは１〜６の整数であり；
Ｚｓ１は以下の式：
【化２】
2019510741.tif 000051
のいずれか１つから選択され；
ｑは１〜５の整数であり；
Ｍは−Ｈまたはカチオンであり；
−Ｃ（＝Ｏ）Ｅは反応性エステル基を表す、請求項１〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
Ｒａ及びＲｂが双方ともＨであり、Ｒ５がＨまたはＭｅである請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
Ｐが２〜５のアミノ酸残基を含有するペプチドである請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
Ｐがプロテアーゼによって切断できるペプチドである請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
Ｐが腫瘍組織で発現されるプロテアーゼによって切断できるペプチドである請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
Ｐが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２１）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２２）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号２３）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、及びＭｅｔ−Ａｌａから選択される請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
Ｐが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、またはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
Ｑが−ＳＯ３Ｍである請求項７２〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が以下の式：
【化３】
2019510741.tif 000052
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される請求項７２に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が以下の構造式：
【化４】
2019510741.tif 000053
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
前記反応性エステル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニル（たとえば、２または４−ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（たとえば、２，４−ジニトロフェニル）エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル（たとえば、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）エステル、及びペンタフルオロフェニルエステルから選択される請求項７２〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記反応性エステル基が、以下の式：
【化５】
2019510741.tif 000054
によって表され、式中、ＵがＨまたは−ＳＯ３Ｍである請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記反応性エステル基が、以下の式：
【化６】
2019510741.tif 000055
によって表される請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞毒性剤が以下の構造式：
【化７】
2019510741.tif 000056
または薬学上許容できるその塩によって表される請求項７２に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞毒性剤が以下の構造式：
【化８】
2019510741.tif 000057
または薬学上許容できるその塩によって表される請求項７２に記載の方法。
【請求項８７】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、構造式（ＩＩ）の前記化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される構造式（Ｉ）によって表される請求項７２〜７９及び８２〜８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８８】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、以下の構造式：
【化９】
2019510741.tif 000058
の１つによって表される化合物または薬学上許容できるその塩をスルホン化試薬と反応させることによって調製される請求項８０及び８２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記細胞毒性剤が、以下の式：
【化１０】
2019510741.tif 000059
の１つによって表される化合物または薬学上許容できるその塩をスルホン化試薬と反応させることによって調製される請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が構造式（ＩＩ）によって表され、前記方法がさらに前記細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートをスルホン化試薬と反応させることを含む請求項７２〜７９及び８２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が構造式（ＩＩ）によって表され、前記方法が、スルホン化試薬の存在下で構造式（ＩＩ）によって表される前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物と前記細胞結合剤を反応させることを含む請求項７２〜７９及び８２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記方法がさらに、前記細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートをスルホン化試薬と反応させることを含む請求項８１〜８４及び８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記方法が、スルホン化試薬の存在下で前記細胞結合剤を前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物と反応させることを含む、請求項８１〜８４及び８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が以下の構造式：
【化１１】
2019510741.tif 000060
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表され、式中、
Ｒｘ１及びＲｘ２は独立して（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒｅ１は、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒｅ２は−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは２〜６の整数であり；
Ｒｋは−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｚｓ１は以下の式：
【化１２】
2019510741.tif 000061
のいずれか１つから選択され；その際、
ｑは１〜５の整数であり；
Ｍは−Ｈまたはカチオンであり；
−Ｃ（＝Ｏ）Ｅは反応性エステル基を表す請求項１〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
Ｒｅ１がＨまたはＭｅであり；Ｒｘ１及びＲｘ２が独立して−（ＣＨ２）ｐ−（ＣＲｆＲｇ）−であり、その際、Ｒｆ及びＲｇはそれぞれ独立して−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；ｐは０、１、２または３である請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
Ｒｆ及びＲｇが同一であり、または異なり、且つ−Ｈ及び−Ｍｅから選択される請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、以下の式：
【化１３】
2019510741.tif 000062
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、以下の式：
【化１４】
2019510741.tif 000063
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記反応性エステル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニル（たとえば、２または４−ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（たとえば、２，４−ジニトロフェニル）エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル（たとえば、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）エステル、及びペンタフルオロフェニルエステルから選択される請求項９４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記反応性エステル基が、以下の式：
【化１５】
2019510741.tif 000064
によって表され、式中、ＵがＨまたは−ＳＯ３Ｍである請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記反応性エステル基が、以下の式：
【化１６】
2019510741.tif 000065
によって表される請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が以下の構造式：
【化１７】
2019510741.tif 000066
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される請求項９４に記載の方法。
【請求項１０３】
前記細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物が以下の構造式：
【化１８】
2019510741.tif 000067
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される請求項９４に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、構造式（ＩＶ）の前記化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される構造式（ＩＩＩ）によって表される請求項９４〜９６及び９９〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、構造式（ＶＩ）の前記化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される構造式（Ｖ）によって表される請求項９４〜９６及び９９〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、以下の構造式：
【化１９】
2019510741.tif 000068
の１つによって表される化合物または薬学上許容できるその塩をスルホン化試薬と反応させることによって調製される請求項９７及び９９〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、以下の構造式：
【化２０】
2019510741.tif 000069
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される細胞毒性剤を以下の構造式：
【化２１】
2019510741.tif 000070
の１つによって表されるリンカー化合物と反応させることによって調製される請求項９７及び９９〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、以下の構造式：
【化２２】
2019510741.tif 000071
の１つによって表される化合物または薬学上許容できるその塩をスルホン化試薬と反応させることによって調製される請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０９】
前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、以下の構造式：
【化２３】
2019510741.tif 000072
または薬学上許容できるその塩によって表される細胞毒性剤を以下の構造式：
【化２４】
2019510741.tif 000073
のリンカー化合物と反応させることによって調製される請求項１０２に記載の方法。
【請求項１１０】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、構造式（ＩＶ）または（ＶＩ）によって表され、前記方法がさらに、前記細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートをスルホン化試薬と反応させることを含む請求項９４〜９６及び９９〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、構造式（ＩＶ）または（ＶＩ）によって表され、前記方法が、スルホン化試薬の存在下で構造式（ＩＶ）または（ＶＩ）によって表される前記化合物を反応させることを含む請求項９４〜９６及び９９〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記方法がさらに、前記細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートをスルホン化試薬と反応させることを含む請求項９８〜１０１及び１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記方法が、スルホン化試薬の存在下で前記細胞結合剤を前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物と反応させることを含む請求項９８〜１０１及び１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記スルホン化試薬がＮａＨＳＯ３である請求項８７〜９３及び１０４〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
Ｍが−Ｈ、Ｎａ＋またはＫ＋である請求項７２〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
ＭがＮａ＋である請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記細胞結合剤が抗体である請求項１〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である請求項１１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、図面、式、明細書及びクレームすべてを含むそのそれぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１６年２月５日に出願された米国仮特許出願番号６２／２９２，０１８の米国特許法第１１９条（ｅ）のもとでの出願日の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
インドリノベンゾジアゼピン二量体化合物の抗体・薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は生体内で高い効能及び／または高い治療指標（最大耐性用量の最小有効用量に対する比）を有することが示されている。インドリノベンゾジアゼピン二量体化合物は一般に疎水性であり、コンジュゲート反応の間での抗体の安定性に影響を及ぼし得る。特定の状況下で、コンジュゲート反応は非常に少ない反応収率を有し、それはＡＤＣの大規模製造にとって望ましくない。
【０００３】
前述のことを考慮して、大規模製造に好適である細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための効率的なプロセスを開発する満たされないニーズがある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための新規で且つ効率的な方法を提供する。
【０００５】
一実施形態では、本発明の方法は、イオン強度が高い緩衝溶液の存在下で４〜９の間のｐＨにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基（たとえば、アミン反応基）を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含む。
【０００６】
別の実施形態では、本発明の方法は、７．３〜８．４のｐＨを有する緩衝溶液にて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基（たとえば、アミン反応基）を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含む。
【０００７】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、高濃度の緩衝溶液の存在下で４〜９の間のｐＨにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基（たとえば、アミン反応基）を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含む。
【０００８】
驚くべきことに、インドリノベンゾジアゼピン二量体化合物と抗体とのコンジュゲート反応は７．３〜８．４の間のｐＨでのイオン強度の高い緩衝溶液にて行われ、コンジュゲート反応がさらに高いｐＨで低いイオン強度を有する緩衝溶液で行われる場合に比べてコンジュゲート反応が有意にさらに効率的であることが見いだされている。本発明の方法は、高い純度及び／または安定性を伴う細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを提供する。
【０００９】
本発明はまた本明細書に記載されている方法を用いて調製される細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートも対象とする。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製する新規の方法を提供する。
【００１１】
第１の実施形態では、本発明の方法は、イオン強度が高い緩衝溶液の存在下で４〜９の間のｐＨにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基（たとえば、アミン反応基）を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含む。
【００１２】
本明細書で使用されるとき、溶液の「イオン強度」は溶液におけるイオンの濃度である。それは溶液に存在するイオンすべての濃度の関数である。イオン強度（Ｉ）は以下の方程式：
【数１】
2019510741.tif 000002
を用いて算出することができ、Ｃｉは溶液に存在するイオンｉのモル濃度であり、ｚｉはその電荷数であり、合計は溶液におけるイオンすべてについて計算される。溶液のカチオン及びアニオンがそれぞれ＋１及び−１の電荷を運ぶ場合、イオン強度は溶液の濃度に等しい。
【００１３】
一実施形態では、緩衝溶液のイオン強度は２０ｍＭ〜５００ｍＭの間、好ましくは２０ｍＭ〜２００ｍＭの間、２５ｍＭ〜１５０ｍＭの間、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの間、５０ｍＭ〜１００ｍＭの間、または１００ｍＭ〜２００ｍＭの間である。別の実施形態では、緩衝溶液のイオン強度は６０ｍＭ〜９０ｍＭの間、または７０ｍＭ〜８０ｍＭの間である。さらに別の実施形態では、緩衝溶液のイオン強度は７５ｍＭである。別の実施形態では、緩衝溶液のイオン強度は１００ｍＭ〜１６０ｍＭまたは１２０ｍＭ〜１４０ｍＭの間である。さらに別の実施形態では、緩衝溶液のイオン強度は１３０ｍＭである。
【００１４】
別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは７．１〜８．７の間、好ましくは７．３〜８．７の間、７．１〜８．５の間、７．３〜８．４の間、７．６〜８．４の間、７．７〜８．３の間、７．８〜８．２の間である。一実施形態では、緩衝溶液のｐＨは７．９〜８．１の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは８．０である。一実施形態では、緩衝溶液のｐＨは８．５〜８．９の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは８．６〜８．８の間である。さらに別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは８．７である。
【００１５】
第２の実施形態では、本発明の方法は、７．３〜９．０のｐＨを有する緩衝溶液にて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基（たとえば、アミン反応基）を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含む。
【００１６】
一実施形態では、緩衝溶液のｐＨは７．３〜８．４の間、７．６〜８．４の間、７．７〜８．３の間、または７．８〜８．２の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは７．９〜８．１の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは８．０である。一実施形態では、緩衝溶液のｐＨは８．５〜８．９の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは８．６〜８．８の間である。さらに別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは８．７である。
【００１７】
第１の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は２０ｍＭ〜２００ｍＭの間のイオン強度及び７．１〜８．５の間のｐＨを有する。
【００１８】
第２の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は５０ｍＭ〜１５０ｍＭの間のイオン強度及び７．６〜８．４の間のｐＨを有する。
【００１９】
第３の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は５０ｍＭ〜１００ｍＭの間のイオン強度及び７．７〜８．３の間のｐＨを有する。
【００２０】
第４の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は６０ｍＭ〜９０ｍＭの間のイオン強度及び７．８〜８．２の間のｐＨを有する。
【００２１】
第５の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は７０ｍＭ〜８０ｍＭの間のイオン強度及び７．９〜８．１の間のｐＨを有する。
【００２２】
第６の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は７５ｍＭのイオン強度及び８．０のｐＨを有する。
【００２３】
第７の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は５０ｍＭ〜２００ｍＭの間のイオン強度及び７．８〜８．９の間のｐＨを有する。
【００２４】
第８の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は１１０ｍＭ〜１５０ｍＭの間のイオン強度及び８．５〜８．９の間のｐＨを有する。
【００２５】
第９の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は１２０ｍＭ〜１４０ｍＭの間のイオン強度及び８．６〜８．８の間のｐＨを有する。
【００２６】
第１０の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は１３０ｍＭのイオン強度及び８．７のｐＨを有する。
【００２７】
当該技術で既知の好適な緩衝溶液を本発明の方法で使用することができる。好適な緩衝溶液には、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液及びリン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
第１１の具体的な実施形態では、第１もしくは第２の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９もしくは第１０の具体的な実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は、ＭＥＳ（（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸））緩衝液、ビス−トリスメタン（２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール）緩衝液、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸）緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ−−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳＯ（β−ヒドロキシ−４−モルフォリンプロパンスルホン酸）緩衝液、ビス−トリスプロパン（１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）緩衝液、ＤＩＰＳＯ、（３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸またはＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＯＢＳ（４−（Ｎ−モルフォリノ）ブタンスルホン酸）緩衝液、ＴＡＰＳＯ（３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸）緩衝液、トリズマ（トリスまたは２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））緩衝液、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）緩衝液、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）緩衝液、トリシン（Ｎ−（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン）緩衝液、ｇｌｙ−ｇｌｙ、ビシン（２−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸）緩衝液、ＨＥＰＢＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸））緩衝液、ＴＡＰＳ（３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］プロパン−１−スルホン酸）緩衝液、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）緩衝液、ＴＡＢＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸）緩衝液、ＡＭＰＳＯ（Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。一実施形態では、緩衝液は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））緩衝液、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸���緩衝液、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）緩衝液、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸）緩衝液、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００２９】
第１２の具体的な実施形態では、第１もしくは第２の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９もしくは第１０の具体的な実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液はＥＰＰＳ緩衝液である。好まれる実施形態では、緩衝溶液は７５ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である。
【００３０】
第１３の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は７．８〜８．９の間のｐＨを有する５０ｍＭ〜２００ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である。
【００３１】
第１４の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は７．８〜８．２の間のｐＨを有する６０ｍＭ〜９０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である。
【００３２】
第１５の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は７．９〜８．１の間のｐＨを有する７０ｍＭ〜８０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である。
【００３３】
第１６の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は８．０のｐＨを有する７５ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である。
【００３４】
第１７の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は８．５〜８．９の間のｐＨを有する１１０ｍＭ〜１５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である。
【００３５】
第１８の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は８．6〜８．８の間のｐＨを有する１２０ｍＭ〜１４０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である。
【００３６】
第１９の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は８．７のｐＨを有する１３０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液である。
【００３７】
第３の実施形態では、本発明の方法は、高濃度の緩衝液の存在下で４〜９の間のｐＨにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基（たとえば、アミン反応基）を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含む。
【００３８】
一実施形態では、緩衝液の濃度は２０ｍＭ〜７５０ｍＭの間である。別の実施形態では、緩衝液の濃度は２０ｍＭ〜５００ｍＭの間、２０ｍＭ〜２００ｍＭの間、２５ｍＭ〜１５０ｍＭの間、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの間、５０ｍＭ〜１００ｍＭの間、１００ｍＭ〜２００ｍＭの間、または１００ｍＭ〜１５０ｍＭの間である。
【００３９】
一実施形態では、緩衝溶液のｐＨは、７．３〜８．９の間、７．３〜８．４の間、７．６〜８．４の間、７．７〜８．３の間、または７．８〜８．２の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは７．９〜８．１の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは８．０である。一実施形態では、緩衝溶液のｐＨは８．５〜８．９の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは８．６〜８．８の間である。さらに別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは８．７である。
【００４０】
第２０の具体的な実施形態では、第３の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は２０ｍＭ〜２００ｍＭの間の濃度及び７．１〜８．５の間のｐＨを有する。
【００４１】
第２１の具体的な実施形態では、第３の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は５０ｍＭ〜１５０ｍＭの間の濃度及び７．６〜８．４の間のｐＨを有する。
【００４２】
第２２の具体的な実施形態では、第１または第２の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は５０ｍＭ〜１００ｍＭの間の濃度及び７．７〜８．３の間のｐＨを有する。
【００４３】
第２３の具体的な実施形態では、第３の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は６０ｍＭ〜９０ｍＭの間の濃度及び７．８〜８．２の間のｐＨを有する。
【００４４】
第２４の具体的な実施形態では、第３の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は７０ｍＭ〜８０ｍＭの間の濃度及び７．９〜８．１の間のｐＨを有する。
【００４５】
第２５の具体的な実施形態では、第３の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は７５ｍＭの濃度及び８．０のｐＨを有する。
【００４６】
第２６の具体的な実施形態では、第３の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は５０ｍＭ〜２００ｍＭの間の濃度及び７．８〜８．９の間のｐＨを有する。
【００４７】
第２７の具体的な実施形態では、第３の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は１１０ｍＭ〜１５０ｍＭの間の濃度及び８．５〜８．９の間のｐＨを有する。
【００４８】
第２８の具体的な実施形態では、第３の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は１２０ｍＭ〜１４０ｍＭの間の濃度及び８．６〜８．８の間のｐＨを有する。
【００４９】
第２９の具体的な実施形態では、第３の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は１３０ｍＭの濃度及び８．７のｐＨを有する。
【００５０】
一実施形態では、本発明の方法で使用される緩衝溶液はさらに不活性の塩を含んで緩衝液のイオン強度を維持してもよい。一実施形態では、緩衝溶液はさらに塩化ナトリウムを含む。
【００５１】
一実施形態では、上記に記載されている本発明の方法については、細胞結合剤と細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物との間の反応は少量の有機溶媒の存在下で実施される。さらに具体的には、有機溶媒はジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）である。有機溶媒（たとえば、ＤＭＡ）は緩衝溶液と有機溶媒の総体積の１体積％〜２０体積％、１〜１５体積％、２〜１５体積％、５〜１５体積％、８〜１２体積％または１０〜２０体積％の量で存在することができる。一実施形態では、有機溶媒（たとえば、ＤＭＡ）は緩衝溶液と有機溶媒の総体積の１０体積％の量で存在する。別の実施形態では、有機溶媒（たとえば、ＤＭＡ）は緩衝溶液と有機溶媒の総体積の１５体積％の量で存在する。
【００５２】
一実施形態では、上記に記載されている本発明の方法については、反応を、２分間〜１週間、１時間〜４８時間、１時間〜３６時間、１時間〜２４時間、１時間〜１２時間、１時間〜８時間、５時間〜１５時間、６時間〜１４時間、４時間〜８時間、５時間〜７時間、１時間〜５時間、１時間〜４時間、１時間〜２時間、３０分間〜２時間、５分間〜３０分間、または２時間〜５時間進行させる。一実施形態では、反応を２時間〜６時間または３時間〜５時間進行させる。一実施形態では、反応を１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間
、１３時間、１４時間、１５時間、等進行させる。別の実施形態では、反応を４時間進行させる。
【００５３】
細胞結合剤と細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物との間の反応は好適な温度で実施することができる。一実施形態では、反応は１０℃〜５０℃、１０℃〜４０℃または１０℃〜３０℃の温度で実施することができる。別の実施形態では、反応は、１５℃〜３０℃、２０℃〜３０℃、１５℃〜２５℃、１６℃〜２４℃、１７℃〜２３℃、１８℃〜２２℃または１９℃〜２１℃の温度で実施することができる。別の実施形態では、反応は１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃で実施することができる。
【００５４】
細胞結合剤と細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物との間のコンジュゲート反応から形成されるコンジュゲートは、保存の際、またはコンジュゲート反応の完了と精製工程の間の時間中に、高分子量種を形成する傾向を有してもよい。高分子量種の形成を軽減するには、コンジュゲート反応の後に反応停止溶液を加えてコンジュゲートを安定化してもよい。
【００５５】
第３０の具体的な実施形態では、第１、第２または第３の上記実施形態に（たとえば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９の具体的な実施形態に）記載されている方法はさらに、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物の細胞結合剤との反応の後、イオン強度の高い反応停止溶液を添加する工程を含む。
【００５６】
別途第３０の具体的な実施形態で提供されるように、方法はさらに細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物の細胞結合剤との反応の後、高い濃度の緩衝液を含む反応停止溶液を添加する工程を含む。
【００５７】
一実施形態では、反応停止溶液は、２００ｍＭ〜３０００ｍＭの間、２００ｍＭ〜２０００ｍＭの間、２００ｍＭ〜１０００ｍＭの間、５００ｍＭ〜１０００ｍＭ、５５０ｍＭ〜１０００ｍＭの間、または６００ｍＭ〜１０００ｍＭの間のイオン強度を有する。別の実施形態では、反応停止溶液は７００ｍＭ〜１０００ｍＭの間のイオン強度を有する。別の実施形態では、反応停止溶液は９００ｍＭのイオン強度を有する。
【００５８】
別の実施形態では、反応停止溶液は、２００ｍＭ〜３０００ｍＭの間、２００ｍＭ〜２０００ｍＭの間、２００ｍＭ〜１０００ｍＭの間、５００ｍＭ〜１０００ｍＭ、５５０ｍＭ〜１０００ｍＭの間、または６００ｍＭ〜１０００ｍＭの間の濃度の緩衝液を含む。別の実施形態では、反応停止溶液は７００ｍＭ〜１０００ｍＭの間の濃度の緩衝液を有する。別の実施形態では、反応停止溶液は７５０ｍＭの濃度の緩衝液を有する。
【００５９】
別の実施形態では、反応停止溶液は細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物の細胞結合剤との反応の後、反応混合物と混合されたが、混合に続いて、緩衝液の最終濃度は１５０ｍＭ〜７５０ｍＭの間、１５０ｍＭ〜６００ｍＭの間、２００ｍＭ〜５００ｎＭの間、２００ｍＭ〜４００ｎＭの間、２５０ｍＭ〜３５０ｍＭの間である。
【００６０】
一部の実施形態では、反応停止溶液における緩衝液は、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物の細胞結合剤とのコンジュゲート反応で使用される緩衝液と同一である。
【００６１】
本明細書に記載されている反応停止溶液は緩衝液、塩またはそれらの組み合わせを含むことができる。任意の好適な緩衝液または塩を使用することができる。例となる緩衝液には、ＭＥＳ（（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸））緩衝液、ビス−トリスメタン（２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール）緩衝液、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸）緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ−−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳＯ（β−ヒドロキシ−４−モルフォリンプロパンスルホン酸）緩衝液、ビス−トリスプロパン（１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）緩衝液、ＤＩＰＳＯ、（３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸またはＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＯＢＳ（４−（Ｎ−モルフォリノ）ブタンスルホン酸）緩衝液、ＴＡＰＳＯ（３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸）緩衝液、トリズマ（トリスまたは２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））緩衝液、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）緩衝液、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）緩衝液、トリシン（Ｎ−（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン）緩衝液、ｇｌｙ−ｇｌｙ、ビシン（２−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸）緩衝液、ＨＥＰＢＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸））緩衝液、ＴＡＰＳ（３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］プロパン−１−スルホン酸）緩衝液、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）緩衝液、ＴＡＢＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸）緩衝液、ＡＭＰＳＯ（Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝液、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、緩衝液は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））緩衝液、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）緩衝液、ＥＰＰＳ（���−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）緩衝液、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸）緩衝液、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。例となる塩には、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びヒスチジン塩酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、反応停止溶液はＥＰＰＳを含む。別の実施形態では、反応停止溶液はＥＰＰＳ及びヒスチジン塩酸塩を含む。
【００６２】
一実施形態では、反応停止溶液は５〜９の間、５〜７の間または５〜６の間のｐＨを有する。別の実施形態では、反応停止溶液は５．５のｐＨを有する。
【００６３】
一実施形態では、反応混合物と混合する前の反応停止溶液は７５０ｍＭのＥＰＰＳ及び１５０ｍＭのヒスチジン塩酸塩を含む。
【００６４】
一実施形態では、反応停止溶液はＥＰＰＳ及びヒスチジン塩酸塩を含み、反応停止溶液を反応混合物と混合することに続いて、得られる混合物は２００ｍＭ〜４００ｍＭのＥＰＰＳ及び４０〜６０ｍＭのヒスチジン塩酸塩を含む。一実施形態では、得られる混合物は２５０ｍＭ〜３５０ｍＭのＥＰＰＳ及び４０〜６０ｍＭのヒスチジン塩酸塩を含む。さらに別の実施形態では、得られる混合物は３００ｍＭ〜３５０ｍＭのＥＰＰＳ及び４５ｍＭ〜５５ｍＭのヒスチジン塩酸塩を含む。
【００６５】
一実施形態では、本発明の方法に従って調製される細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートは精製工程に供される。この点で、細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートは、膜に基づく接線流濾過プロセスである接線流濾過（ＴＦＦ）、非吸着性クロマトグラフィ、吸着性クロマトグラフィ、吸着性濾過、選択性沈殿、または他の好適な精製プロセス、と同様にそれらの組み合わせを用いて混合物（たとえば、遊離の細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物及び反応副生成物）の他の成分から精製することができる。
【００６６】
本発明の一実施形態では、細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートは単一の精製工程（たとえば、ＴＦＦ）を用いて精製される。好ましくはコンジュゲートは単一の精製工程（たとえば、ＴＦＦ）を用いて精製され、適当な製剤に交換される。本発明の別の実施形態では、２つの連続精製工程を用いて細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートは精製される。たとえば、コンジュゲートは先ず、選択性沈殿、吸着性濾過、吸着性クロマトグラフィまたは非吸着性クロマトグラフィによって精製し、その後、ＴＦＦによって精製することができる。当業者は細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートの精製が細胞毒性剤に化学的に結合した細胞結合剤を含む安定したコンジュゲートの単離を可能にすることを十分に理解する。
【００６７】
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ型システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓ．）、Ｓａｒｔｏｃｏｎカセットシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、Ｎ．Ｙ．）、ＴａｎｇｅｎＸカセット（ＴａｎｇｅｎＸ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ、ＭＡ）及びＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ型システム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、Ｎ．Ｙ．）を含む任意の好適なＴＦＦシステムが精製に利用されてもよい。
【００６８】
任意の好適な吸着性クロマトグラフィ樹脂が精製に利用されてもよく、その際、樹脂は細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを保持し、且つ不純物の溶出を可能にしてもよく、または不純物を保持し、且つ樹脂は細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートの溶出を可能にしてもよい。好まれる吸着性クロマトグラフィ樹脂には、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性電荷誘導クロマトグラフィ（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィ、混合モードイオン交換クロマトグラフィ、不動化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適なヒドロキシアパタイト樹脂の例には、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴタイプＩ及びタイプＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）、ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌヒドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、Ｎ．Ｙ．）及びセラミックフルオロアパタイト（ＣＦＴタイプＩ及びタイプＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。好適なＨＣＩＣの例はＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，Ｎ．Ｙ．）である。好適なＨＩＣ樹脂の例には、ブチル−セファロース、ヘキシル−セファロース、フェニル−セファロース、及びオクチルセファロース樹脂（すべてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．に由来する）、と同様にＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐメチル及びＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｔ−ブチル樹脂（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。好適なイオン交換樹脂の例には、ＳＰ−セファロース、ＣＭ−セファロース、及びＱ−セファロース樹脂（すべてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．に由来する）、ならびにウノスフェアＳ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。好適な混合モードイオン交換体の例には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢｘ樹脂（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。好適なＩＭＡＣ樹脂の例には、キレートセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）及びＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。好適な色素リガンド樹脂の例には、ブルーセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）及びＡｆｆｉ−ゲルブルー樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。好適なアフィニティ樹脂の例には、細胞結合剤が抗体であるプロテインＡセファロース樹脂（たとえば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、及び細胞結合剤が適当なレクチン結合部位を持つレクチンアフィニティ樹脂、たとえば、Ｌｅｎｔｉｌレクチンセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。或いは、細胞結合剤に特異的な抗体が使用されてもよい。そのような抗体は、たとえば、セファロース４ファストフロー樹脂 （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）に不動化することができる。好適な逆相樹脂の例にはＣ４、Ｃ８及びＣ１８樹脂（Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【００６９】
任意の好適な非吸着性クロマトグラフィ樹脂が精製に利用されてもよい。好適な非吸着性クロマトグラフィ樹脂の例には、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂（たとえば、Ｓ−２００及びＳ−３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂（たとえば、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５及びＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００）、ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂（たとえば、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−３０、Ｐ−６０、及びＰ−１００）、及び当業者に既知のその他が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書に記載されている方法によって調製されるコンジュゲートは好適な製剤化緩衝液にて製剤化することができる。
【００７１】
本発明のプロセスによって調製される細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートは実質的に高い純度及び安定性を有する。本発明の態様の１つでは、実質的に高い純度の細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートは、以下の特徴：（ａ）抗体断片化の２５％未満、２０％未満、１５％未満（たとえば、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満またはそれに等しい）、（ｂ）９０％を超える（たとえば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を超えるまたはそれに等しい）、好ましくは９５％を超えるコンジュゲート種が単量体である、（ｃ）コンジュゲート調製物における未コンジュゲートのリンカーのレベルが約１０％未満である（たとえば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０％未満またはそれに等しい）（総リンカーに対して）、（ｄ）コンジュゲート種の１０％未満が架橋される（たとえば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０％未満またはそれに等しい）、（ｅ）コンジュゲート調製物における遊離の細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物のレベルが約２％未満（たとえば、約１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、または０％未満またはそれに等しい）（細胞毒性剤の合計に対するモル／モル）である、（ｆ）高分子量種の約１０％未満、約５％未満（約４％、３％、２％、１％または０％未満またはそれに等しい）、及び／または（ｇ）保存の際（たとえば、約１週間後、約２週間後、約３週間後、約１ヵ月後、約２ヵ月後、約３ヵ月後、約４ヵ月後、約５ヵ月後、約６ヵ月後、約１年後、約２年後、約３年後、約４年後、または約５年後）遊離の細胞毒性剤のレベルの実質的な上昇がない、の１以上を有する。遊離の細胞毒性剤のレベルの「実質的な上昇」は、特定の保存時間（たとえば、約１週間、約２週間、３週間、約１ヵ月間、約２ヵ月間、約３ヵ月間、約４ヵ月間、約５ヵ月間、約６ヵ月間、約１年、約２年、約３年、約４年、または約５年）の後、遊離の細胞毒性剤のレベルの上昇が約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．２％、約２．５％、約２．７％、約３．０％、約３．２％、約３．５％、約３．７％、または約４．０％未満であることを意味する。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、用語「未コンジュゲートのリンカー」は二官能性の架橋試薬に共有結合している細胞結合剤を指し、その際、細胞結合剤は二官能性の架橋試薬のリンカーを介して細胞毒性剤に共有結合しない（すなわち、「未コンジュゲートのリンカー」はＣＢＡ−Ｌによって表すことができ、ＣＢＡは細胞結合剤を表し、Ｌは二官能性の架橋試薬を表す。それに対して、細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートはＣＢＡ−Ｌ−Ｄによって表すことができ、Ｄは細胞毒性剤を表す）。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、用語「高分子量種」または「ＨＭＷ」は、分子量が高い抗体含有種またはコンジュゲート含有種を指す。高分子量種は抗体またはコンジュゲートまたはそれらの組み合わせの集合によって形成される二量体、三量体、他の高次オリゴマーであることができる。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって高分子量種を特定することができ、その量を決定することができる。
【００７４】
一実施形態では、細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートにおける細胞毒性剤の細胞結合剤に対する平均モル比（すなわち、ＤＡＲ）は１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１．５〜５、２〜７、または３〜５である。別の実施形態では、ＤＡＲは１．５〜３．５、２〜３、２．１〜２．９、２．２〜２．８、２．３〜２．７、または２．４〜２．６である。別の実施形態では、本発明の方法によって調製されるコンジュゲートについてのＤＡＲは２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．５、２．７、２．８、２．９または３．０である。一実施形態では、ＤＡＲは２．５である。別の実施形態では、ＤＡＲは２．７である。
【００７５】
ＤＡＲ値は当該技術で既知の方法によって決定することができる。一実施形態では、ＤＡＲ値は、それぞれ抗体及び細胞毒性剤についての波長での吸光度の値を用いたＵＶ／Ｖｉｓ分光法によって決定することができる。或いは、ＤＡＲ値は質量分光分析及び／またはＨＰＬＣによって決定することができる。
【００７６】
細胞結合剤
本発明の方法における使用については、細胞結合剤は細胞、通常、及び好ましくは動物細胞（たとえば、ヒト細胞）に結合する任意の好適な作用物質であることができる。細胞結合剤は好ましくはペプチドまたはポリペプチドである。好適な細胞結合剤には、たとえば、抗体（たとえば、モノクローナル抗体及びその断片）、インターフェロン（たとえば、アルファ、ベータ、ガンマ）、リンホカイン（たとえば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６）、ホルモン（たとえば、インスリン、ＴＲＨ（サイロトロピン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、ステロイドホルモン、たとえば、アンドロゲン及びエストロゲン）、増殖因子及びコロニー刺激因子、たとえば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、５：１５５−１５８（１９８４））、栄養輸送分子（たとえば、トランスフェリン）、ビタミン（たとえば、葉酸塩）及び細胞の表面における標的分子を特異的に結合する他の作用物質または分子が挙げられる。
【００７７】
細胞結合剤が抗体である場合、それはポリペプチドまたはグリコトープであり、且つ膜貫通分子（たとえば、受容体）または増殖因子のようなリガンドであってもよい抗原に結合する。例となる抗原には、レニンのような分子；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−アンチトリプシン；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；ｖｍｃ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、及びヴォン・ヴィレブランド因子のような凝固因子；プロテインＣのような抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼまたはヒトの尿型もしくは組織型のプラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）のようなプラスミノーゲン活性化因子；ボムベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化制御で、正常Ｔ細胞で発現、分泌される）；ヒトのマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン；ミュラー管阻害物質；レラキシンＡ−鎖；レラキシンＢ−鎖；プロレラキシン；マウス性腺刺激ホルモン−関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼのような微生物タンパク質；ＤＮＡ分解酵素；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４のような細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子のための受容体；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；たとえば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養因子−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、またはＮＧＦ−ベータのような神経成長因子のような神経栄養因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦのような線維芽細胞増殖因子；表皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−．ベータ．１、ＴＧＦ−．ベータ．２、ＴＧＦ−．ベータ．３、ＴＧＦ−．ベータ．４、またはＴＧＦ−．ベータ．５を含むＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータのような形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＥｐＣＡＭ；ＧＤ３；ＦＬＴ３；ＰＳＭＡ；ＰＳＣＡ；ＭＵＣ１；ＭＵＣ１６；ＳＴＥＡＰ；ＣＥＡ；ＴＥＮＢ２；ＥｐｈＡ受容体；ＥｐｈＢ受容体；葉酸受容体；ＦＯＬＲ１；メソテリン；クリプト；αｖβ６；インテグリン；ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ；ＥＧＦＲ；線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）（たとえば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４）；トランスフェリン受容体；ＩＲＴＡ１；ＩＲＴＡ２；ＩＲＴＡ３；ＩＲＴＡ４；ＩＲＴＡ５；たとえば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８��、ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１５２のようなＣＤタンパク質、グアニリルサイクラーゼＣ（ＧＣＣ）、または参照によってその全体が組み入れられる米国特許出願公開番号２００８／０１７１０４０もしくは米国特許出願公開番号２００８／０３０５０４４にて開示された１以上の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体に結合する抗体；エリスロポイエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマのようなインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、たとえば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、たとえば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；活性酸素分解酵素；Ｔ−細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、たとえば、ＨＩＶエンベロープの部分；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節性タンパク質；インテグリン、たとえば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、たとえば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体；エンドグリン；ｃ−Ｍｅｔ；ＩＧＦ１Ｒ；前立腺抗原、たとえば、ＰＣＡ３、ＰＳＡ、ＰＳＧＲ、ＮＧＥＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＴＭＥＦＦ２、及びＳＴＥＡＰ１；ＬＧＲ５；Ｂ７Ｈ４；ならびに上記でリストにしたポリペプチドのいずれかの断片が挙げられる。一実施形態では、抗原はＧＣＣではない。
【００７８】
さらに、骨髄系細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦは、急性骨髄性白血病に由来する病んだ細胞に対する細胞結合剤として使用することができる。活性化Ｔ細胞に結合するＩＬ−２は、移植の移植片拒絶の防止、移植片対宿主病の治療及び予防、及び急性Ｔ細胞白血病の治療に使用することができる。メラニン細胞に結合するＭＳＨは、黒色腫を対象とする抗体のように黒色腫の治療に使用することができる。葉酸を使用して卵巣癌及び他の腫瘍で発現される葉酸受容体を標的とすることができる。表皮増殖因子を用いて、肺癌及び頭頚部癌のような扁平上皮癌を標的とすることができる。ソマトスタチンを使用して神経芽細胞腫及び他の腫瘍型を標的とすることができる。
【００７９】
乳腺及び精巣の癌は、細胞結合剤としてそれぞれエストロゲン（またはエストロゲン類似体）またはアンドロゲン（またはアンドロゲン類似体）によって上手く標的化することができる。
【００８０】
用語「抗体」は本明細書で使用されるとき、任意の免疫グロブリン、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、プロボディのような任意の免疫グロブリン断片（Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２８９５−２９０２（１９８３）；Ｓｐｒｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１３：４７０−４７８（１９７４）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０−２４４（１９６０），Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，７：２４８６−２４９７（２００８），Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｓ．，６：３４３−３５７（２００６），米国特許第８，３９９，２１９号）、または細胞の表面上の抗原に結合することができる免疫グロブリンキメラ（たとえば、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する）を指す。任意の好適な抗体は細胞結合剤として使用することができる。当業者は適当な抗体の選択は標的とされる細胞集団に左右されることを十分に理解する。この点で、特定の細胞集団（通常及び好ましくは病んだ細胞集団）で選択的に発現される細胞表面分子（すなわち、抗原）の種類及び数は本発明の組成物での使用のための適当な抗体の選択を支配する。細胞表面の発現プロファイルは、腫瘍細胞型を含む多種多様な細胞型で知られており、またはもし未知であれば、日常の分子生物学及び組織化学の技法を用いて決定することができる。
【００８１】
抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであることができるが、最も好ましくはモノクローナル抗体である。本明細書で使用されるとき、「ポリクローナル」抗体は、免疫された動物の血清に通常含有される抗体分子の不均一の集団を指す。「モノクローナル」抗体は特定の抗原に対して特異的である抗体分子の均一な集団を指す。モノクローナル抗体は通常、Ｂリンパ球（「Ｂ細胞」）の単一クローンによって産生される。モノクローナル抗体は、標準のハイブリドーマ技術を含む当業者に既知の種々の技法を用いて得られてもよい（たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：５１１−５１９（１９７６），Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８），ならびにＣ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００１）を参照のこと）。手短には、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ法には通常、好適な動物、通常及び好ましくはマウスに抗原（すなわち、「免疫原」）を注射することが関与する。続いて動物を屠殺し、その脾臓から単離したＢ細胞をヒト骨髄腫細胞と融合させる。試験管内で無制限に増殖し、所望の特異性を持つ高い力価の抗体を連続的に分泌するハイブリッド細胞（すなわち、「ハイブリドーマ」）が作出される。当該技術で既知の適当な方法を用いて所望の特異性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定することができる。そのような方法には、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット解析及び放射線免疫アッセイが挙げられる。ハイブリドーマの集団をスクリーニングしてそのそれぞれが抗原に対する単一の抗体種を分泌する個々のクローンを単離する。各ハイブリドーマは単一のＢ細胞との融合に由来するクローンなので、それが産生する抗体分子はすべて、その抗原結合部位及びアイソタイプを含めて構造は同一である。モノクローナル抗体はＥＢＶ・ハイブリドーマ技術（たとえば、Ｈａｓｋａｒｄ及びＡｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２）：３６１−６７（１９８４），ならびにＲｏｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：１４０−６７（１９８６）を参照のこと）、バクテリオファージベクター発現系（たとえば、Ｈｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−８１（１９８９）を参照のこと）、またはＦａｂ及びｓｃＦｖ（単鎖可変領域）のような抗体断片を含むファージディスプレイライブラリ（たとえば、米国特許第５，８８５，７９３号及び同第５，９６９，１０８号ならびに国際特許出願公開番号ＷＯ９２／０１０４７及びＷＯ９９／０６５８７を参照のこと）を含む他の好適な技法を用いて生成されてもよい。
【００８２】
モノクローナル抗体は、好適な動物から単離され、または好適な動物で産生されることができるが、好ましくは哺乳類にて、さらに好ましくはマウスまたはヒトにて、及び最も好ましくはヒトにて産生される。マウスにて抗体を産生させる方法は当業者に周知であり、本明細書に記載されている。ヒト抗体に関して、当業者は、適当な抗原でワクチン接種されたまたは免疫されたヒト対象の血清からポリクローナル抗体を単離することができることを十分に理解する。或いは、ヒト抗体はマウスのような非ヒト動物でヒト抗体を作出する既知の技法を適応させることによって生成することができる（たとえば、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号及び同第５，７１４，３５２号、ならびに米国特許出願公開番号２００２／０１９７２６６Ａ１を参照のこと）。
【００８３】
ヒトにおける治療応用のための理想的な選択である一方で、ヒト抗体、特にヒトモノクローナル抗体は通常、マウスモノクローナル抗体よりも生成するのが難しい。しかしながら、マウスモノクローナル抗体はヒトに投与すると短時間で宿主抗体反応を誘導し、それは抗体・細胞毒性剤コンジュゲートの治療的または診断的潜在性を低下させ得る。これらの複雑な事態を回避するために、モノクローナル抗体は好ましくはヒト免疫系によって「異物」として認識されない。
【００８４】
この目的で、ファージディスプレイを用いて抗体を生成することができる。この点で、標準の分子生物学及び組換えＤＮＡ法（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３．ｓｕｐ．ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）を参照のこと）を用いて抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリを生成することができる。所望の特異性を持つ可変領域をコードするファージを所望の抗原に対する特異的な結合について選択し、選択された可変ドメインを含む完全なヒト抗体を再構成する。再構成された抗体をコードする核酸配列をハイブリドーマ作出に使用される骨髄腫細胞のような好適な細胞株に導入するので、モノクローナル抗体の特徴を有するヒト抗体がその細胞によって分泌される（たとえば、Ｊａｎｅｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．，上記，Ｈｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，上記，及び米国特許第６，２６５，１５０号を参照のこと）。或いは、モノクローナル抗体は特定のヒト重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるマウスから生成することができる。そのような方法は当該技術で既知であり、たとえば、米国特許第５，５４５，８０６号及び同第５，５６９，８２５号，ならびにＪａｎｅｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．，上記に記載されている。
【００８５】
最も好ましくは、抗体はヒト化抗体である。本明細書で使用されるとき、「ヒト化」抗体は、抗体の抗原結合ループを形成するマウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体分子のフレームワークに移植されるものである。マウス及びヒトの抗体のフレームワークの類似性のおかげで、このアプローチが、ヒト抗体と抗原性で同一であるが、ＣＤＲ配列が由来するマウスモノクローナル抗体と同じ抗原を結合するモノクローナル抗体を作出することは当該技術で一般に受け入れられている。ヒト化抗体を生成する方法は当該技術で周知であり、たとえば、Ｊａｎｅｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．，上記，米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号及び同第５，６９３，７６１号，欧州特許第０２３９４００号Ｂ１，ならびに英国特許第２１８８６３８号にて詳細に記載されている。ヒト化抗体は米国特許第５，６３９，６４１号及びＰｅｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５：９５９−９７３（１９９４）に記載された抗体再表面化法を用いても生成することができる。本発明の組成物のコンジュゲートで採用される抗体は最も好ましくはヒト化モノクローナル抗体である一方で、上記で記載されているようなヒトモノクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体も本発明の範囲の中にある。
【００８６】
少なくとも１つの抗原結合部位を有するので標的細胞の表面に存在する少なくとも１つの抗原または受容体を認識し、それに結合する抗体断片も本発明の範囲の中にある。この点で、インタクトの抗体分子のタンパク質分解切断は抗原を認識し、結合する能力を保持する種々の抗体断片を作出することができる。たとえば、プロテアーゼであるパパインによる抗体分子の限定された消化は通常、３つの断片を生じ、そのうちの２つは同一であり、それらが親抗体分子の抗原結合活性を保持しているのでＦａｂ断片と呼ばれる。酵素ペプシンによる抗体分子の切断は普通、２つの抗体断片を生じ、そのうちの１つは抗体分子の双方の抗原結合アームを保持するので、Ｆ（ａｂ’）２断片と呼ばれる。Ｆ（ａｂ’）２断片のジチオスレイトールまたはメルカプトエチルアミンによる還元はＦａｂ’断片と呼ばれる断片を生じる。合成ペプチドを介して抗体軽鎖のＶドメインに連結される抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインを含む切り詰めたＦａｂ断片から成る単鎖可変領域断片（ｓＦｖ）抗体断片は日常の組換えＤＮＡ技術の技法（たとえば、Ｊａｎｅｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．上記を参照のこと）を用いて生成することができる。同様に、ジスルフィドで安定化した可変領域断片（ｄｓＦｖ）は組換えＤＮＡ技術（たとえば、Ｒｅｉｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７−７０４（１９９４）を参照のこと）によって調製することができる。しかしながら、本発明の文脈における抗体断片は抗体断片のこれらの例となる種類には限定されない。所望の細胞表面の受容体または抗原を認識し、且つそれに結合する任意の好適な抗体断片を採用することができる。抗体断片は、たとえば、Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２８９５−２９０２（１９８３），Ｓｐｒｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１３：４７０−４７８（１９７４），及びＮｉｓｏｎｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０−２４４（１９６０）にてさらに記載されている。抗体・抗原結合は、たとえば、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降、及び競合阻害アッセイのような当該技術で既知の好適な方法を用いてアッセイすることができる（たとえば、Ｊａｎｅｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．，上記，及び米国特許出願公開番号２００２／０１９７２６６  Ａ１を参照のこと）。
【００８７】
加えて、抗体はキメラ抗体またはその抗原結合断片であることができる。「キメラ」によって、抗体が少なくとも２つの異なる種から得られるまたはそれに由来する少なくとも２つの免疫グロブリンまたはそれらの断片（たとえば、マウスの免疫グロブリン可変領域と組み合わせたヒトの免疫グロブリン定常領域のような２つの異なる免疫グロブリン）を含むことを意味する。抗体はまた、たとえば、ラクダ抗体（たとえば、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：７５２，（１９９６）を参照のこと）またはサメ抗体、たとえば、新しい抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）（たとえば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４：１６８（１９９５），及びＳｔａｎｆｉｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５：１７７０−１７７３（２００４）を参照のこと）のようなドメイン抗体（ｄＡｂ）またはその抗原結合断片であることもできる。
【００８８】
本発明の文脈では任意の好適な抗体を使用することができる。たとえば、モノクローナル抗体Ｊ５は、急性リンパ芽球性白血病共通抗原（ＣＡＬＬＡ）に特異的であるマウスＩｇＧ２ａ抗体であり（Ｒｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８３：５８３−５８５（１９８０））、ＣＡＬＬＡを発現している細胞（たとえば、急性リンパ芽球性白血病細胞）を標的とするのに使用することができる。モノクローナル抗体ＭＹ９は、ＣＤ３３抗原に特異的に結合するマウスＩｇＧ１抗体であり（Ｇｒｉｆｆｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓ．，８：５２１（１９８４））、ＣＤ３３を発現している細胞（たとえば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞）を標的とするのに使用することができる。特定の実施形態では、ＭＹ９抗体は取り除かれたＮ末端またはＣ末端の残基を有する。
【００８９】
同様に、モノクローナル抗体である抗Ｂ４（Ｂ４とも呼ばれる）はＢ細胞上のＣＤ１９抗原に結合するマウスＩｇＧ１抗体であり（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２４４−２５０（１９８３））、ＣＤ１９を発現しているＢ細胞または病んだ細胞（たとえば、非ホジキンリンパ腫細胞及び慢性リンパ芽球性白血病細胞）を標的とするのに使用することができる。Ｎ９０１は、小細胞肺癌を含む神経内分泌起源の細胞で見いだされたＣＤ５６（神経細胞接着分子）抗原に結合するマウスモノクローナル抗体であり、それは神経内分泌起源の細胞に薬剤を標的化するためのコンジュゲートで使用することができる。Ｊ５抗体、ＭＹ９抗体及びＢ４抗体は、コンジュゲートの一部として使用されるのに先立って好ましくは再表面化される、またはヒト化される。抗体の再表面化またはヒト化は、たとえば、Ｒｏｇｕｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９６９−７３（１９９４）に記載されている。
【００９０】
加えて、モノクローナル抗体Ｃ２４２はＣａｎＡｇ抗原（たとえば、米国特許第５，５５２，２９３号を参照のこと）に結合し、たとえば、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌及び胃癌のようなＣａｎＡｇを発現している腫瘍にコンジュゲートを標的化するのに使用することができる。ＨｕＣ２４２はモノクローナル抗体Ｃ２４２のヒト化形態である（たとえば、米国特許第５，５５２，２９３号を参照のこと）。ＨｕＣ２４２が産生されるハイブリドーマはＥＣＡＣＣ特定番号９００１２６０１で寄託されている。ＨｕＣ２４２はＣＤＲ移植法（たとえば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号及び同第５，６９３，７６２号を参照のこと）または再表面化技術（たとえば、米国特許第５，６３９，６４１号を参照のこと）を用いて調製することができる。ＨｕＣ２４２を用いて、たとえば、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌及び胃癌の細胞のようなＣａｎＡｇを発現している腫瘍細胞にコンジュゲートを標的化することができる。
【００９１】
卵巣癌及び前立腺癌の細胞を標的化するには、抗ＭＵＣ１抗体をコンジュゲートにおける細胞結合剤として使用することができる。抗ＭＵＣ１抗体には、たとえば、抗−ＨＭＦＧ−２（たとえば、Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２８：１７−２１（１９８１）を参照のこと），ｈＣＴＭＯ１（たとえば、ｖａｎ  Ｈ  ｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：５１７９−５１８５（１９９６）を参照のこと）、及びＤＳ６が挙げられる。前立腺癌細胞も、たとえば、Ｊ５９１のような抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を細胞結合剤として使用することによりコンジュゲートによって標的化することができる（たとえば、Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：３６２９−３６３４（１９９７）を参照のこと）。さらに、たとえば、乳癌、前立腺癌及び卵巣癌のような、Ｈｅｒ２抗原を発現している癌細胞は、抗Ｈｅｒ２抗体、たとえば、トラスツズマブを細胞結合剤として使用することによりコンジュゲートによって標的化することができる。表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）及びたとえば、ＩＩＩ型欠失変異体であるＥＧＦＲｖＩＩＩのようなその変異体を発現している細胞は、抗ＥＧＦＲ抗体を使用することによりコンジュゲートによって標的化することができる。抗ＥＧＦＲ抗体は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８，３８５及びＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８，３７８に記載されている。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は米国特許第７，７３６，６４４号及び同第７，６２８，９８６号及び米国特許出願公開２０１０／０１１１９７９、２００９／０２４００３８、２００９／０１７５８８７、２００９／０１５６７９０、及び２００９／０１５５２８２に記載されている。たとえば、米国特許第７，９８２，０２４号に記載されたもののような、インスリン様増殖因子受容体に結合する抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体もコンジュゲートで使用することができる。ＣＤ２７Ｌ、クリプト、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＥｐｈＡ２、インテグリン、ＣＤ３７、葉酸塩、ＣＤ２０、ＰＳＧＲ、ＮＧＥＰ、ＰＳＣＡ、ＴＭＥＦＦ２、ＳＴＥＡＰ１、エンドグリン、及びＨｅｒ３に結合する抗体もコンジュゲートで使用することができる。
【００９２】
一実施形態では、抗体は、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、抗ＨＥＲ２抗体（たとえば、トラスツズマブ）、ビバツズマブ、シブロツズマブ、リツキシマブ、ｈｕＤＳ６、国際特許出願公開ＷＯ２０１０／１２４７９７に記載された抗メソテリン抗体（たとえば、ＭＦ−Ｔ）、米国特許出願公開２０１０／００９３９８０に記載された抗クリプト抗体（たとえば、ｈｕＢ３Ｆ６）、米国特許出願公開２００７／０１８３９７１に記載された抗ＣＤ１３８（たとえば、ｈｕＢ−Ｂ４）、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８，３８５及びＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８，３７８に記載された抗ＥＧＦＲ抗体（たとえば、ＥＧＦＲ−７）、米国特許第７，７３６，６４４号及び同第７，６２８，９８６号及び米国特許出願公開２０１０／０１１１９７９、２００９／０２４００３８、２００９／０１７５８８７、２００９／０１５６７９０及び２００９／０１５５２８２に記載された抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、国際特許出願公開ＷＯ２０１１／０３９７２１及びＷＯ２０１１／０３９７２４に記載されたヒト化ＥｐｈＡ２抗体（たとえば、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４）；国際特許出願公開ＷＯ２００８／０４７２４２に記載された抗ＣＤ３８抗体（たとえば、ｈｕ３８ＳＢ１９），国際特許出願公開ＷＯ２０１１／１０６５２８及び米国特許出願公開２０１２／０００９１８１に記載された抗葉酸抗体（たとえば、ｈｕＭｏｖ１９）；米国特許第５，９５８，８７２号、同第６，５９６，７４３号、及び同第７，９８２，０２４号に記載された抗ＩＧＦ１Ｒ抗体；米国特許出願公開２０１１／０２５６１５３に記載された抗ＣＤ３７抗体（たとえば、ｈｕＣＤ３７−３）；米国出願公開２００６／０１２７４０７に記載された抗インテグリンαｖβ６抗体（たとえば、ＣＮＴＯ９５）；ならびに国際特許出願公開ＷＯ２０１２／０１９０２４に記載された抗Ｈｅｒ３抗体から成る群から選択される。一実施形態では、細胞結合剤はＥＧＦＲ２に結合する抗体またはその抗原結合断片（たとえば、その教示全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２０１４／０３０８２０に記載されたもの）である。別の実施形態では、細胞結合剤は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ４に結合する抗体またはその抗原結合断片（たとえば、その教示全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２０１４／３０１９４６に記載されたもの）である。
【００９３】
特に好まれる抗体は本明細書に記載されているヒト化モノクローナル抗体である。例には、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、ヒト化モノクローナル抗−Ｈｅｒ２抗体（たとえば、トラスツズマブ）、ビバツズマブ、シブロツズマブ、ＣＮＴＯ９５、ｈｕＤＳ６、及びリツキシマブ（たとえば、米国特許第５，６３９，６４１号及び同第５，６６５，３５７号、米国仮特許出願番号６０／４２４，３３２（米国特許第７，５５７，１８９号に関連する）、国際（ＰＣＴ）特許出願公開ＷＯ０２／１６４０１、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，上記，Ｒｏｇｕｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．，上記，Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，上記，Ｎａｄｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，上記，Ｃｏｌｏｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．，１９：４９−５６（２００１），Ｈｅｉｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１Ａ：２３８５−２３９１（１９９５），Ｗｅｌｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２：１１９３−１２０３（１９９４），ならびにＭａｌｏｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９０：２１８８−２１９５（１９９７）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。他のヒト化モノクローナル抗体は当該技術で既知であり、本発明と併せて使用することができる。
【００９４】
一実施形態では、細胞結合剤はｈｕＭｙ９−６、または米国特許第７，３４２，１１０号及び同第７，５５７，１８９号（参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されている他の関連する抗体である。
【００９５】
別の実施形態では、細胞結合剤は、米国特許第８，５５７，９６６号及び同第９，１３３，２７５号に記載された抗葉酸受容体抗体である。これら特許のそれぞれの教示はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【００９６】
別の実施形態では、細胞結合剤はヒト化抗葉酸抗体、またはヒト葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）を特異的に結合するその抗原結合断片であり、その際、抗体は、（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＸａａ１ＦＸａａ２Ｘａａ３（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２；及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３と、（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１；ＲＡＳＮＬＥＡ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びＱＱＳＲＥＹＰＹＴ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み；その際、Ｘａａ１はＫ、Ｑ、Ｈ及びＲから選択され、Ｘａａ２はＱ、Ｈ、Ｎ及びＲから選択され、Ｘａａ３はＧ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、Ａ及びＶから選択される。好ましくは重鎖ＣＤＲ２配列はＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号７）を含む。
【００９７】
別の実施形態では、抗葉酸抗体は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＦＭＮＷＶＫＱＳＰＧＱＳＬＥＷＩＧＲ  ＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＮＴＡＨＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＦＡＶＹＹＣＴＲＹＤ  ＧＳＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ  ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩ  ＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ  ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ  ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ  ＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ  ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８）のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、ヒト葉酸受容体１を特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
【００９８】
別の実施形態では、抗葉酸抗体は、２０１０年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０７７２及びＰＴＡ−１０７７３または１０７７４を有するプラスミドＤＮＡによってコードされるヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
【００９９】
別の実施形態では、抗葉酸抗体は、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＦＭＮＷＶＫＱＳＰＧＱＳＬＥＷＩＧＲＩＨＰＹＤＧ  ＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＮＴＡＨＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＦＡＶＹＹＣＴＲＹＤＧＳＲＡＭＤＹＷＧＱＧ  ＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２４）に対して少なくとも約９０％、９５％、９９％または１００％同一である重鎖可変ドメインと、
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＡＶＳＬＧＱＰＡＩＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＨＱＫＰＧＱＱＰＲＬ  ＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＫＴＤＦＴＬＮＩＳＰＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＹ  ＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号９）；または
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＡＶＳＬＧＱＰＡＩＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＨＱＫＰＧＱＱＰＲＬ  ＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＫＴＤＦＴＬＴＩＳＰＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＹ  ＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号１０）に対して少なくとも約９０％、９５％、９９％または１００％同一である軽鎖可変ドメインとを含むヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
【０１００】
一実施形態では、細胞結合剤はＧＣＣに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は配列番号１１〜１６のＣＤＲ配列を含む。一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体はそれぞれ配列番号１７及び配列番号１８に対して少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬの配列を有する。別の実施形態では、抗ＧＣＣ抗体はそれぞれ配列番号１７及び配列番号１８であるＶＨ及びＶＬの配列を有する。さらに別の実施形態では、抗ＧＣＣ抗体は配列番号１９の重鎖アミノ酸配列と配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列とを含む。一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体は、ＩｇＧ１の重鎖（配列番号１９）においてＦｃγＲＩＩＩｂを結合するのに重要であるＥＬＬＧをＰＶＡで置き換える重鎖アミノ酸配列と配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列とを含む。
【表１】
2019510741.tif 000003
【０１０１】
一実施形態では、細胞結合剤は抗ＧＣＣ抗体またはその抗原結合断片ではない。
【０１０２】
細胞結合剤は好ましくは抗体である一方で、細胞結合剤は非抗体分子であることもできる。好適な非抗体分子には、たとえば、インターフェロン（たとえば、アルファ、ベータ、またはガンマインターフェロン）、リンホカイン（たとえば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、またはＩＬ−６）、ホルモン（たとえば、インスリン）、増殖因子（たとえば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦ）、コロニー刺激因子（たとえば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、及びＧＭ−ＣＳＦ（たとえば、Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、５：１５５−１５８（１９８４）を参照のこと）、ソマトスタチン、及びトランスフェリン（たとえば、Ｏ’Ｋｅｅｆｅ，ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：９３２−９３７（１９８５）を参照のこと）が挙げられる。たとえば、骨髄系細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦを細胞結合剤として用いて急性骨髄性白血病細胞を標的とすることができる。加えて、活性化Ｔ細胞に結合するＩＬ−２を移植の移植片拒絶の防止、移植片対宿主病の治療及び予防、及び急性Ｔ細胞白血病の治療に使用することができる。表皮増殖因子（ＥＧＦ）を用いて肺癌及び頭頚部癌のような扁平上皮癌を標的化することができる。ソマトスタチンを用いて神経芽細胞腫の細胞及び他の腫瘍細胞型を標的とすることができる。
【０１０３】
特定の実施形態では、本発明の方法で使用することができる細胞結合剤（たとえば、抗体）は、アミン反応基を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と共有結合を形成することができる遊離のアミン−ＮＨ２基（たとえば、１以上のリシン残基におけるイプシロンアミノ基）を含む。
【０１０４】
細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物
「細胞毒性剤」は本明細書で使用されるとき、細胞の死を結果的に生じる、細胞死を誘導するまたは細胞の生存率を低下させる任意の化合物を指す。一実施形態では、細胞毒性剤はベンゾジアゼピン二量体化合物である。別の実施形態では、細胞毒性剤はインドリノベンゾジアゼピン二量体化合物である。好ましくは、インドリノベンゾジアゼピン二量体化合物は細胞結合剤におけるアミン基（たとえば、リシンのアミン基）と共有結合を形成することができるアミン反応基を有する。
【０１０５】
特定の実施形態では、細胞毒性剤はアミン反応基を有するリンカーと反応してそれに連結されたアミン反応基を有する細胞毒性剤・リンカー化合物を形成することができる。得られる細胞毒性剤・リンカー化合物は次いで細胞結合剤と反応して細胞結合剤・細胞結合剤コンジュゲートを形成することができる。
【０１０６】
本明細書で使用されるとき、「アミン反応基」はアミン基と容易に反応して共有結合を形成することができる官能基を指す。一実施形態では、アミン反応基は反応性エステル基である。反応性エステル基の例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニル（たとえば、２または４−ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（たとえば、２，４−ジニトロフェニル）エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル（たとえば、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）エステル、及びペンタフルオロフェニルエステルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、反応性エステル基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルである。
【０１０７】
第３１の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９または第３０の具体的な実施形態に記載されている方法）については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は、以下の構造式：
【化１】
2019510741.tif 000004
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表され、式中、
Ｌは、以下の式
−ＮＲ５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）Ｅ（Ａ１）；または
−ＮＲ５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｍ−Ｓ−Ｚｓ１  （Ａ３）によって表され、
その際、
Ｒ５は−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、
Ｐは２〜２０のアミノ酸残基を含有するアミノ酸残基またはペプチドであり、
Ｒａ及びＲｂはそれぞれの存在についてそれぞれ独立して−Ｈ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルまたは荷電した置換基またはイオン化できる基Ｑ（好ましくはＱは−ＳＯ３Ｍである）であり、
ｍは１〜６の整数であり、
Ｚｓ１は以下の式：
【化２】
2019510741.tif 000005
のいずれか１つから選択され、
その際、
ｑは１〜５の整数であり、
Ｍは−Ｈまたはカチオンであり、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｅは反応性エステル基を表す。
【０１０８】
第３２の具体的な実施形態では、上記に記載されている式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物について、Ｒａ及びＲｂは双方ともＨであり、Ｒ５はＨまたはＭｅであり、残りの可変記号は第３１の具体的な実施形態にて記載されたとおりである。
【０１０９】
第３３の具体的な実施形態では、上記に記載されている式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物について、Ｐは２〜５のアミノ酸を含有するペプチドであり；残りの可変記号は第３１及び第３２の具体的な実施形態にて記載されたとおりである。一実施形態では、ペプチドはプロテアーゼによって切断可能であり、好ましくは腫瘍組織で発現されているプロテアーゼによって切断可能である。別の実施形態では、Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２１）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２２）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号２３）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、及びＭｅｔ−Ａｌａから選択される。好ましくは、Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、またはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである。
【０１１０】
第３４の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９または第３０の具体的な実施形態に記載されている方法）については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の構造式：
【化３】
2019510741.tif 000006
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される。
【０１１１】
第３５の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９または第３０の具体的な実施形態に記載されている方法）については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の構造式：
【化４】
2019510741.tif 000007
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される。
【０１１２】
一実施形態では、本明細書に記載されている化合物（第３１、第３２、第３３、第３４、または第３５の具体的な実施形態に記載されている化合物）については、−Ｃ（＝Ｏ）Ｅによって表される反応性エステル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニル（たとえば、２または４−ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（たとえば、２，４−ジニトロフェニル）エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル（たとえば、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）エステル、及びペンタフルオロフェニルエステルから選択される。さらに具体的には、反応性エステル基は以下の式：
【化５】
2019510741.tif 000008
によって表され、式中、ＵはＨまたは−ＳＯ３Ｍである。一層さらに具体的には、反応性エステル基は以下の式：
【化６】
2019510741.tif 000009
によって表される。
【０１１３】
第３６の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９または第３０の具体的な実施形態に記載されている方法）については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の構造式：
【化７】
2019510741.tif 000010
または薬学上許容できるその塩によって表される。
【０１１４】
一実施形態では、第３６の実施形態に記載されている方法については、構造式（Ｉｅ）の化合物は（ＩＩｅ）の化合物をスルホン化剤と反応させることによって調製される。具体的な実施形態では、スルホン化剤はＮａＨＳＯ３またはＫＨＳＯ３である。別の具体的な実施形態では、第３６の実施形態に記載されている方法については、構造式（Ｉｅ）の化合物は、構造式（Ｉｅ）の化合物を細胞結合剤と反応させる前に精製することなくその場で（ＩＩｅ）の化合物をスルホン化剤と反応させることによって調製される。一実施形態では、式（ＩＩｅ）の化合物とスルホン化剤（たとえば、ＮａＨＳＯ３またはＫＨＳＯ３）の間のスルホン化反応は、１．９〜５．０、２．９〜４．０、２．９〜３．７、３．１〜３．５、３．２〜３．４のｐＨでの水溶液にて実施される。具体的な実施形態では、スルホン化反応はｐＨ３．３の水溶液にて実施される。一実施形態では、スルホン化反応はジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）と水にて実施される。
【０１１５】
第３７の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９または第３０の具体的な実施形態に記載されている方法）については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の構造式：
【化８】
2019510741.tif 000011
または薬学上許容できるその塩によって表される。
【０１１６】
第３８の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９または第３０の具体的な実施形態に記載されている方法）については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の構造式：
【化９】
2019510741.tif 000012
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表され、式中、
Ｒｘ１及びＲｘ２は独立して（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒｅ１は−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒｅ２は−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは２〜６の整数であり；
Ｒｋは−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｚｓ１は以下の式：
【化１０】
2019510741.tif 000013
のいずれか１つから選択され、その際、
ｑは１〜５の整数であり；
Ｍは−Ｈまたはカチオンであり；
−Ｃ（＝Ｏ）Ｅは反応性エステル基を表す。
【０１１７】
第３９の具体的な実施形態では、構造式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）によって表される化合物については、Ｒｅ１はＨまたはＭｅであり；Ｒｘ１及びＲｘ２は独立して−（ＣＨ２）ｐ−（ＣＲｆＲｇ）−であり、その際、Ｒｆ及びＲｇはそれぞれ独立して−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；ｐは０、１、２または３であり；残りの可変記号は第３８の具体的な実施形態にて上記に記載されたとおりである。好ましくは、Ｒｆ及びＲｇは同一であり、または異なり、−Ｈ及び−Ｍｅから選択される。
【０１１８】
第４０の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９または第３０の具体的な実施形態に記載されている方法）については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の式：
【化１１】
2019510741.tif 000014
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される。
【０１１９】
第４１の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９または第３０の具体的な実施形態に記載されている方法）については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の式：
【化１２】
2019510741.tif 000015
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される。
【０１２０】
第４２の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９または第３０の具体的な実施形態に記載されている方法）については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の式：
【化１３】
2019510741.tif 000016
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される。
【０１２１】
第４３の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９または第３０の具体的な実施形態に記載されている方法）については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の式：
【化１４】
2019510741.tif 000017
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表される。
【０１２２】
特定の実施形態では、上記に記載されている構造式（Ｉ）、（ＩＩＩ）または（Ｖ）によって表される化合物は、それぞれ上記に記載されている構造式（ＩＩ）、（ＩＶ）または（ＶＩ）の化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される。
【０１２３】
本明細書で使用されるとき、「スルホン化試薬」は以下の変換を達成することができる試薬である。
【化１５】
2019510741.tif 000018
一実施形態では、スルホン化試薬はＮａＨＳＯ３である。
【０１２４】
特定の実施形態では、構造式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）または（Ｉｅ）によって表される化合物はそれぞれ、構造式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）及び（ＩＩｅ）によって表される化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される。
【０１２５】
特定の実施形態では、構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、または（ＩＩＩｃ）によって表される化合物はそれぞれ、構造式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、または（ＩＶｃ）によって表される化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される。
【０１２６】
特定の実施形態では、構造式（Ｖａ）、（Ｖｂ）、または（Ｖｃ）によって表される化合物はそれぞれ、構造式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、または（ＶＩｃ）によって表される化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される。
【０１２７】
特定の実施形態では、上記に記載されている本発明の方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３７、第３８、第３９、第４０、第４１、または第４３、の具体的な実施形態に記載されている方法）については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は、構造式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）または（ＶＩｃ）によって表され、方法はさらに細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートをスルホン化試薬と反応させることを含む。一実施形態では、スルホン化試薬はＮａＨＳＯ３またはＫＨＳＯ３である。
【０１２８】
特定の実施形態では、上記に記載されている本発明の方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３７、第３８、第３９、第４０、第４１、または第４３の具体的な実施形態に記載されている方法）については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は、構造式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）または（ＶＩｃ）によって表され、方法はさらに、スルホン化試薬の存在下で構造式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）または（ＶＩｃ）によって表される細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させることを含む。一実施形態では、スルホン化試薬はＮａＨＳＯ３またはＫＨＳＯ３である。
【０１２９】
特定の実施形態では、構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（Ｖａ）または（Ｖｂ）によって表される化合物は、以下の構造式：
【化１６】
2019510741.tif 000019
の１つによって表される化合物または薬学上許容できるその塩を、以下の構造式：
【化１７】
2019510741.tif 000020
の１つによって表されるリンカー化合物と反応させることによって調製される。
【０１３０】
特定の実施形態では、構造式（ＩＩＩｃ）または（Ｖｃ）の化合物は、以下の構造式：
【化１８】
2019510741.tif 000021
によって表される化合物または薬学上許容できるその塩を、以下の構造式：
【化１９】
2019510741.tif 000022
のリンカー化合物と反応させることによって調製される。
【０１３１】
一実施形態では、本明細書に記載されている化合物（たとえば、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（Ｖｃ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、または（ＶＩｃ）の化合物）については、Ｍは、−Ｈ、Ｎａ＋またはＫ＋である。一実施形態では、ＭはＮａ＋またはＫ＋である。別の実施形態では、ＭはＮａ＋である。さらに別の実施形態では、ＭはＫ＋である。
【０１３２】
他の好適な細胞毒性剤には、たとえば、マイタンシノイド及びコンジュゲート可能なアンサマイトシン（たとえば、２０１１年１１月３日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／５９１３１、及び米国特許第９，０９０，６２９号を参照のこと）、タキソイド、ＣＣ−１０６５及びＣＣ−１０６５類似体、及びドラスタチン及びドラスタチン類似体が挙げられる。本発明の具体的な実施形態では、細胞毒性剤はマイタンシノール及びマイタンシノール類似体を含むマイタンシノイドである。マイタンシノイドは微小管形成を阻害し、哺乳類細胞に対して高度に毒性である化合物である。好適なマイタンシノール類似体の例には、修飾された芳香環を有するもの及び他の位置で修飾を有するものが挙げられる。そのようなマイタンシノイドは、たとえば、米国特許第４，２５６，７４６号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６２，６６３号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，３７１，５３３号、同第４，４５０，２５４号、同第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、及び同第６，３３３，４１０号に記載されている。
【０１３３】
修飾された芳香環を有するマイタンシノール類似体の例には、（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ還元によって調製される）、（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号及び同第４，３０７，０１６号）（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓもしくはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓを用いた脱メチル化またはＬＡＨを用いた脱塩素化によって調製される）、及び（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化によって調製される）が挙げられる。
【０１３４】
芳香環以外の位置の修飾を有するマイタンシノール類似体の例には、（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（Ｈ２ＳまたはＰ２Ｓ５によるマイタンシノールの還元によって調製される）、（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（Ｎｏｃａｒｄｉａから調製される）、（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓによるマイタンシノールの変換によって調製される）、（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号及び同第４，３１５，９２９号）（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｉｆｌｏｒａから単離される）、（６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号及び同第４，３２２，３４８号）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓによるマイタンシノールの脱メチル化によって調製される）、及び（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（マイタンシノール三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製される）が挙げられる。
【０１３５】
本発明の具体的な実施形態では、本発明のプロセスで使用することができる細胞毒性剤は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシンとしても知られるチオール含有のマイタンシノイドＤＭ１である。ＤＭ１の構造を以下に示す。
【化２０】
2019510741.tif 000023
【０１３６】
本発明の別の具体的な実施形態では、本発明のプロセスで使用することができる細胞毒性剤は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシンとしても知られるチオール含有のマイタンシノイドＤＭ４である。ＤＭ４の構造を以下に示す。
【化２１】
2019510741.tif 000024
【０１３７】
たとえば、イオウ原子を持つ炭素原子上でモノアルキル置換またはジアルキル置換を持つチオール及びジスルフィドを含有するマイタンシノイドを含む他のマイタンシノイドが本発明の文脈で使用されてもよい。特に好まれるのは、Ｃ−３位にて（ａ）Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシまたはＣ−２０デメチル官能性を有し、且つ（ｂ）ヒンダードスルフヒドリル基を持つアシル基を伴ったアシル化されたアミノ酸側鎖を有するマイタンシノイドであり、その際、チオール官能性を持つアシル基の炭素原子は１または２の置換基を有し、前記置換基は、１〜１０の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキルまたはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する環状のアルキルまたはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環芳香族ラジカルまたはヘテロシクロアルキルラジカルであり、さらに、置換基の１つはＨであることができ、アシル基はカルボニル官能基とイオウ原子の間で少なくとも炭素原子３つの直鎖長を有する。
【０１３８】
本明細書に記載されている本発明がさらに完全に理解されるために、以下の実施例が示される。これらの実施例は説明目的だけのためのものであり、どんな方法でも本発明を限定するようには解釈されるべきではないことが理解されるべきである。
【０１３９】
本発明に含まれるのはまた、本明細書に記載されている方法（たとえば、第１、第２または第３の実施形態、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３７、第３８、第３９、第４０、第４１、第４２、第４３の具体的な実施形態に記載されている方法）によって調製される細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートである。
【０１４０】
一実施形態では、本発明の方法によって調製されるコンジュゲートは以下の構造式：
【化２２】
2019510741.tif 000025
【化２３】
2019510741.tif 000026
【化２４】
2019510741.tif 000027
の１つまたは薬学上許容できるその塩によって表され、式中、ＣＢＡ−ＮＨ２は細胞結合剤であり；Ｍは、−ＨまたはＮａ＋もしくはＫ＋のような薬学上許容できるカチオンであり；ｒは１〜１０の整数である。
【実施例】
【０１４１】
実施例１
【化２５】
2019510741.tif 000028
化合物１ａ
（５−アミノ−１，３−フェニレン）ジメタノール（１．０１ｇ，６．５９ミリモル）の無水ジメチルホルムアミド（１６．４８ｍＬ）と無水テトラヒドロフラン（１６．４８ｍｌ）における撹拌された溶液に、４−メチル−４−（メチルジスルファニル）ペンタン酸（１．２８１ｇ，６．５９ミリモル）と、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（２．５３ｇ，１３．１９ミリモル）と、４−ジメチルアミノピリジン（０．０８１ｇ，０．６５９ミリモル）を加えた。得られた混合物を室温で１８時間撹拌した。この反応は、飽和塩化アンモニウム溶液で反応を止め、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を水及びブラインで洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を濾過し、真空で濃縮し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して白色固形物（０．７０ｇ、収率３２％）として化合物１ａを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６：δ９．９０（ｓ，１Ｈ），７．４３（ｓ，２Ｈ），６．９３（ｓ，１Ｈ），５．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），４．４４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．４３（ｓ，３Ｈ），２．４１−２．３８（ｍ，２Ｈ），１．９２−１．８８（ｍ，２Ｈ），１．２９（ｓ，６Ｈ）．ＭＳ（ｍ／ｚ），分析値３３０．０（Ｍ＋１）＋。
【０１４２】
【化２６】
2019510741.tif 000029
化合物１ｂ
化合物１ａ（２１９ｍｇ，０．６６５ミリモル）の冷却した（−１０℃）無水ジクロロメタン（６．６５ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（４６３μｌ，３．３２ミリモル）を加え、その後、無水メタンスルホン酸（２９８ｍｇ，１．６６２ミリモル）を一滴ずつ加えた。混合物を−１０℃で２時間撹拌し、次いで氷水で混合物の反応を止め、冷却した酢酸エチル（２×３０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を氷水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗精製のジメシレートを得た。
【０１４３】
粗精製のジメシレート（２２７ｍｇ，０．４６７ミリモル）及びＩＧＮ単量体Ａ（３０３ｍｇ，１．０２８ミリモル）を無水ＤＭＦ（３．１１ｍＬ）に溶解した。炭酸カリウム（１６１ｍｇ，１．１６９ミリモル）を加え、混合物を室温で１８時間撹拌した。脱イオン水を加え、得られた沈殿物を濾過し、水ですすいだ。固形物をジクロロメタンに再溶解し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗精製の残留物をシリカゲルクロマトグラフィ（メタノール／ジクロロメタン）によって精製して化合物１ｂ（２２７ｍｇ、収率３６％）を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ），分析値８８２．５（Ｍ＋１）＋。
【０１４４】
【化２７】
2019510741.tif 000030
化合物１ｃ
化合物１ｂ（２２７ｍｇ，０．１６７ミリモル）の無水１，２−ジクロロエタン（３．３４６ｍＬ）懸濁液にトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３７．３ｍｇ，０．１６７ミリモル）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、飽和塩化アンモニウム溶液で反応を止めた。混合物をジクロロメタンで抽出し、ブラインで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗精製の残留物をＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水／アセトニトリル）によって精製した。所望の生成物を含有する分画をジクロロメタンで抽出し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して化合物１ｃ（３５ｍｇ、収率１９％）を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ），分析値８８４．３（Ｍ＋１）＋。
【０１４５】
【化２８】
2019510741.tif 000031
化合物１ｄ
化合物１ｃ（１８ｍｇ，０．０１７ミリモル）のアセトニトリル（９２１μＬ）とメタノール（６５８μＬ）の溶液にリン酸ナトリウム緩衝液中の（１３２μＬ，０．７５Ｍ，ｐＨ６．５）中のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（１７．５１ｍｇ，０．０６０ミリモル）（飽和重炭酸ナトリウム溶液（０．２ｍＬ）で中和した）を加えた。混合物を室温で３.５時間撹拌し、次いでジクロロメタンと脱イオン水で希釈した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗精製のチオールを得た。ＭＳ（ｍ／ｚ），分析値８３８．３（Ｍ＋１）＋。
【０１４６】
工程５に由来する粗精製のチオール(１５．５ｍｇ，０．０１８ミリモル)を２−プロパノール（１．２３ｍＬ)に溶解した。脱イオン水（６１７μＬ）及び重亜硫酸ナトリウム（５．７７ｍｇ，０．０５５ミリモル）を混合物に加え、室温で混合物を５時間撹拌した。反応物をアセトン／ドライアイス槽にて凍結し、凍結乾燥し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、脱イオン水／アセトニトリル）によって精製した。所望の生成物を含有する分画を凍結し、凍結乾燥して化合物（１２Ｓ，１２ａＳ）−９−（（３−（４−メルカプト−４−メチルペンタンアミド）−５−（（（（Ｒ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）ベンジル）オキシ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−１２−スルホン酸（化合物１ｄ）（６．６ｍｇ、収率３９％）を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）、分析値９１８．２（Ｍ−１）−。
【０１４７】
実施例２
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ６−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｒ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−６−オキソヘキサノエート、化合物９０の合成。
【化２９】
2019510741.tif 000032
工程１
（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（５ｇ，２２．４０ミリモル）及び（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−アミノプロパノエート塩酸塩（４．４８ｇ，２４．６４ミリモル）を無水ＤＭＦ（４４．８ｍＬ）に溶解した。ＥＤＣ・ＨＣｌ（４．７２ｇ，２４．６４ミリモル）とＨＯＢｔ（３．４３ｇ，２２．４０ミリモル）とＤＩＰＥＡ（９．７５ｍＬ，５６．０ミリモル）とを加えた。反応物をアルゴンのもと室温にて一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、次いで飽和塩化アンモニウム、飽和重炭酸ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。粗精製の油をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル）を介して精製して化合物２ａを得た（６．７ｇ、収率８５％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３８−７．３１（ｍ，５Ｈ），６．５３−６．４２（ｍ，１Ｈ），５．４２−５．３３（ｍ，１Ｈ），５．１４（ｓ，２Ｈ），４．４８−４．４１（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．２０（ｍ，１Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ），１．４２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．３８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）。
【０１４８】
【化３０】
2019510741.tif 000033
工程２
化合物２ａ（６．７ｇ，１９．１２ミリモル）をメタノール（６０．７ｍＬ）と水（３．０３ｍＬ）に溶解した。溶液をアルゴンで５分間パージした。炭素上のパラジウム（湿った，１０％）（１．０１７ｇ，０．９５６ミリモル）をゆっくり加えた。反応物を水素の雰囲気下で一晩撹拌した。セライトを介して溶液を濾過し、メタノールですすぎ、濃縮した。それをメタノール及びアセトニトリルと共に共沸し、得られた油を高真空に直接置いて化合物２ｂ（４．０２ｇ、収率９７％）を得た。これは次の工程で直接使用される。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．７８−７．６３（ｍ，１Ｈ），４．４９−４．４２（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．５０（ｍ，１Ｈ），１．７３（ｓ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），１．３９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．３６（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
【０１４９】
【化３１】
2019510741.tif 000034
工程３
化合物２ｂ（４．０２ｇ，１８．５９ミリモル）及びモノメチルアジペート（３．０３ｍＬ，２０．４５ミリモル）を無水ＤＭＦ（６２．０ｍＬ）に溶解した。ＥＤＣ・ＨＣｌ（３．９２ｇ，２０．４５ミリモル）とＨＯＢｔ（２．８５ｇ，１８．５９ミリモル）とＤＩＰＥＡ（６．４９ｍＬ，３７．２ミリモル）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。反応物をジクロロメタン／メタノール（１５０ｍＬ、５：１）で希釈し、飽和塩化アンモニウム、飽和重炭酸ナトリウム及びブラインで洗浄した。それを硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、揮散させた。化合物をアセトニトリル（５×）と共に共沸し、次いで３５℃にて高真空に送り込み、化合物２ｃを得た（６．６６ｇ、収率１００％）。精製することなく粗精製物質を次の工程で利用した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），６．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．５２−４．４４（ｍ，１Ｈ），４．４３−４．３６（ｍ，１Ｈ），３．６５（ｓ，３Ｈ），２．３５−２．２９（ｍ，２Ｈ），２．２５−２．１８（ｍ，２Ｈ），１．７１−１．６０（ｍ，４Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．３６（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）。
【０１５０】
【化３２】
2019510741.tif 000035
工程４
化合物２ｃ（５．９１ｇ，１６．５ミリモル）をＴＦＡ（２８．６ｍＬ，３７２ミリモル）及び脱イオン水（１．５ｍＬ）にて室温で３時間撹拌した。反応混合物をアセトニトリルで濃縮し、高真空に置いて粘着性固形物（５．８８ｇ、収率１００％）として粗精製の化合物２ｄを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），６．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．６９−４．６０（ｍ，１Ｈ），４．５９−４．５１（ｍ，１Ｈ），３．６９（ｓ，３Ｈ），２．４０−２．３３（ｍ，２Ｈ），２．３１−２．２４（ｍ，２Ｈ），１．７２−１．６３（ｍ，４Ｈ），１．５１−１．４５（ｍ，３Ｈ），１．４２−１．３７（ｍ，３Ｈ）。
【０１５１】
【化３３】
2019510741.tif 000036
工程５
化合物２ｄ（５．６ｇ，１８．５２ミリモル）を無水ジクロロメタン（１１８ｍＬ）と無水メタノール（５８．８ｍＬ）に溶解した。（５−アミノ−１，３−フェニレン）ジメタノール（２．７０ｇ，１７．６４ミリモル）とＥＥＤＱ（８．７２ｇ，３５．３ミリモル）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。溶媒を揮散させ、酢酸エチルを加えた。得られたスラリーを濾過し、酢酸エチルで洗浄し、真空／Ｎ２下で乾燥させて化合物２ｅ（２．７９ｇ、収率３６％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．８２（ｓ，１Ｈ），８．０５，（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），８．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．４６（ｓ，２Ｈ），６．９５（３，１Ｈ），５．２１−５．１２（ｍ，２Ｈ），４．４７−４．４２（ｍ，４Ｈ），４．４０−４．３３（ｍ，１Ｈ），４．３３−４．２４（ｍ，１Ｈ），３．５８（ｓ，３Ｈ），２．３３−２．２６（ｍ，２Ｈ），２．１６−２．０９（ｍ，２Ｈ），１．５４−１．４６（ｍ，４Ｈ），１．３０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．２２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ）。
【０１５２】
【化３４】
2019510741.tif 000037
工程６
化合物２ｅ（０．５２ｇ，１．１８９ミリモル）と四臭化炭素（１．１８３ｇ，３．５７ミリモル）を無水ＤＭＦ（１１．８９ｍＬ）に溶解した。トリフェニルホスフィン（０．９３５ｇ，３．５７ミリモル）を加え、アルゴンのもとで反応物を４時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１）で希釈し、水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗精製物質をシリカゲルクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によって精製して化合物２ｆ（２６２ｍｇ、収率３９％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．０１（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．６７（ｓ，２Ｈ），７．２１（ｓ，１Ｈ），４．７０−４．６４（ｍ，４Ｈ），４．４０−４．３２（ｍ，１Ｈ），４．３１−４．２３（ｍ，１Ｈ），３．５８（ｓ，３Ｈ），２．３４−２．２６（ｍ，２Ｈ），２．１８−２．１０（ｍ，２Ｈ），１．５５−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．３１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．２１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）。
【０１５３】
【化３５】
2019510741.tif 000038
工程７
二臭化化合物２ｆとＩＧＮ単量体化合物ＡをＤＭＦに溶解した。炭酸カリウムを加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物に水を加え、生成物を沈殿させた。室温でスラリーを撹拌し、ついで濾過し、真空／Ｎ２下で乾燥させた。粗精製物質をシリカゲルクロマトグラフィ（ジクロロメタン／メタノール）によって精製して化合物２ｇ（３３６ｍｇ、収率７４％）を得た。ＬＣＭＳ＝５．９１分（１５分法）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：９９０．６（Ｍ＋１）＋。
【０１５４】
【化３６】
2019510741.tif 000039
工程８
ジイミン化合物２ｇを１，２−ジクロロエタンに溶解した。ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（ＳＴＡＢ）を反応混合物に加え、室温にて１時間撹拌した。反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液で反応を止めた。層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。ＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム，アセトニトリル／水）を介して粗精製物質を精製し、化合物２ｈ（８５．５ｍｇ、収率２５％）を得た。ＬＣＭＳ＝６．６４分（１５分法）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：９９２．６（Ｍ＋１）＋。
【０１５５】
【化３７】
2019510741.tif 000040
工程９
化合物２ｈを１，２−ジクロロエタンに溶解した。トリメチルスタンナノールを反応混合物に加え、８０℃で一晩加熱した。次いで反応混合物をＲＴに冷却し、水で希釈した。水性層を１ＭのＨＣｌでｐＨ約４に酸性化した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。シリカのプラグに粗精製物質を通して化合物２ｉ（４８．８ｍｇ、収率８０％）を得た。ＬＣＭＳ＝５．８９分（１５分法）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：９７８．６（Ｍ＋１）＋。
【０１５６】
【化３８】
2019510741.tif 000041
工程１０
酸化合物２ｉとＮ−ヒドロキシスクシンアミドのＣＨ２Ｃｌ２における撹拌した溶液にＲＴでＥＤＣ・ＨＣｌを加えた。反応混合物を２時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。ＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム，アセトニトリル／水）を介して粗精製物質を精製し、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ６−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｒ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−６−オキソヘキサノエート、化合物２ｊ（８．２ｍｇ，収率３０％）を得た。ＬＣＭＳ＝６．６４分（１５分法）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０７５．４（Ｍ＋１）＋
【０１５７】
実施例３
コンジュゲート：以前のプロトコール
ＡｂＸ、ヒト抗ＧＣＣ抗体、５Ｆ９（配列番号１９の重鎖アミノ酸配列と配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列を有する）をコンジュゲートに先立って１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５に緩衝液交換した。次いで化合物（ＩＩｅ）のスルホン化形態を用いてＡｂＸ−（Ｉｅ）コンジュゲートを調製した。９０／１０の有機溶液：水溶液にて５倍モル過剰の重亜硫酸ナトリウム及び５０ｍＭのコハク酸塩（ｐＨ５．０）と共に化合物（ＩＩｅ）を室温で３時間インキュベートし、その後４℃で一晩インキュベートすることによって化合物（Ｉｅ）を先ずスルホン化した。次いで、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５における２．０ｍｇ／ｍＬのＡｂＸ抗体と、抗体に基づいた特定のモル過剰での化合物（Ｉｅ）の添加を用いてコンジュゲート反応を行った（代表的なコンジュゲートについては表１を参照のこと）。コンジュゲート反応物は最終的な９０／１０の１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５とＤＭＡの水性：有機の組成を有し、製剤化緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭの塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭの重亜硫酸ナトリウム、ｐＨ６．２）への精製に先立って、２５℃の水槽にて４時間インキュベートした。
【表２】
2019510741.tif 000042
【０１５８】
コンジュゲート：最適化されたプロトコール
化合物（Ｉｅ）の等張強度、伝導性、ｐＨ、反応濃度及びモル当量を含む種々のパラメータを調べて所望のＡｂＸ−（Ｉｅ）コンジュゲートの収率を最適化した。７５ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０緩衝液を利用する最適化されたプロトコールはこれらの研究から明らかになった。標準の基盤プロトコールに類似して、ＡｂＸ−（Ｉｅ）コンジュゲートは化合物（ＩＩｅ）のスルホン化形態（前のセクションで記載されているように調製される）である化合物（Ｉｅ）を用いて作製された。最適化されたコンジュゲート反応は、７５ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０における２．０ｍｇ／ｍＬのＡｂＸ抗体と、抗体に基づく特定のモル過剰での化合物（Ｉｅ）の添加とを用いて実施された（代表的なコンジュゲートについては表２を参照のこと）。コンジュゲート反応物は最終的な９０／１０の７５ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０とＤＭＡの水性：有機の組成を有し、製剤化緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭの塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭの重亜硫酸ナトリウム、ｐＨ６．２）への精製に先立って、２５℃の水槽にて４時間インキュベートした。
【表３】
2019510741.tif 000043
【０１５９】
表２に示すように、コンジュゲートの収率は、ｐＨ８．５でのイオン強度が低い緩衝液を使用する前のプロトコールに比べてｐＨ８．０でのイオン強度が高い緩衝液の使用が関与するプロトコールによって２４％から６４％に上昇し、約２倍の上昇だった。
【０１６０】
精製
２０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭの塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭの重亜硫酸ナトリウム、ｐＨ６．２によって平衡化したセファデックスＧ−２５ＮＡＰカラムを用いてＡｂＸ−（Ｉｅ）コンジュゲートの反応混合物を精製した。０．２２μｍのＰＶＤＦ注射器フィルターを用いて、精製されたコンジュゲートを濾過し、４℃にて新しい製剤化緩衝液に対して一晩透析し、その後、新しい製剤化緩衝液を用いて常温にて４時間透析した。分析前に０．２２μｍのＰＶＤＦ注射器フィルターを用いて、コンジュゲートを再濾過した。
【０１６１】
分析方法
精製したコンジュゲート試料における抗体及び細胞毒性剤（Ｄ）の濃度は２８０ｎｍ及び３３０ｎｍでの吸光度の値を用いるＵＶ／Ｖｉｓによって決定した。抗体及び細胞毒性剤は双方とも２８０ｎｍで吸収するので、各部分に起因する総シグナルの一部を検討するには２項方程式が必要とされた。細胞毒性剤であるインドリノベンゾジアゼピン（ＩＧＮ）のみが３３０ｎｍで吸収するので、その波長での濃度は細胞毒性剤にのみ起因し得る。コンジュゲートした部分の吸光係数の値を表３でリストにする。
【０１６２】
各波長での各構成成分の寄与を説明する以下の代数的表現を用いて抗体及び細胞毒性剤の成分を定量した。
ＣＤ＝Ａ３３０／ε３３０ｎｍＩＧＮ
ＣＡｂ＝（Ａ２８０−（ε２８０ｎｍＩＧＮ／ε３３０ｎｍＩＧＮ）×Ａ３３０）／ε２８０ｎｍＡｂ
【０１６３】
ＡｘはＸｎｍの波長での吸光度の値であり、ＣＡｂは抗体（すなわち、ＡｂＸ）のモル濃度であり、ＣＤは細胞毒性剤のモル濃度である。細胞毒性剤：Ａｂの比（ＤＡＲ）は上記のモル濃度の比として算出された。ＡｂＸ及び細胞毒性剤のｍｇ／ｍＬ（ｇ／Ｌ）濃度は表３でリストにした分子量を用いて算出された。
【表４】
2019510741.tif 000044
【０１６４】
単量体コンジュゲートの割合を決定すること
精製したＡｂＸ−細胞毒性剤試料における単量体コンジュゲートの比率を、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いたＨＰＬＣ解析を介して決定した。ＳＥＣカラム（ＴＳＫ  ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷ×ｌ  ５μｍ，７．８ｍｍ×３０ｃｍ，部品番号０８５４１；推奨ガードカラムＴＳＫ  ＧＥＬ，４ｃｍ，部品番号０８５４３，ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を備え、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウムと５０ｍＭのリン酸ナトリウムと５％のイソプロパノールとの定組成移動相と共に０．５ｍＬ／分で測定するＨＰＬＣ機器におよそ１０〜１００μｇのＡｂＸ−細胞毒性剤コンジュゲートを注入した。２８０ｎＭ及び３３０ｎｍの波長で吸光度シグナルを３０分間収集した。
【０１６５】
ＡｂＸ抗体単量体は通常約１７分で溶出した一方で、ＡｂＸ−細胞毒性剤コンジュゲート単量体は約１７分と約１９分でのピークを持つダブレットとして溶出することが多かった。高分子量種（ＨＭＷ、たとえば、二量体、集合体）及び低分子量種（ＬＭＷ、断片）は通常それぞれ約１２分及び約２４分で溶出した。
【０１６６】
％単量体抗体（またはコンジュゲート）は１７分ピーク（または１７／１９ダブレット）の２８０ｎｍピーク面積から算出し、合わせたタンパク質ピークすべての面積と比較した。
【０１６７】
単量体ピークにおけるＤＡＲも、上記セクションで示したＣＤ及びＣＡｂの方程式にて２８０ｎｍ及び３３０ｎｍでのシグナルのピーク面積をＡ２８０及びＡ３３０の空欄に代入し、次いでＣＤ／ＣＡｂを分けることによって決定される。
【０１６８】
未コンジュゲートの細胞毒性剤の割合を決定すること
精製したコンジュゲート試料に存在する未コンジュゲートの細胞毒性剤（「遊離の薬剤」）の量は、直列ＳＥＣカラム及びＣ−１８逆相カラム（「二重カラム」）を用いたＵＰＬＣ解析を介して決定した。２つのＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣタンパク質ＢＥＨ  ＳＥＣカラム（１．７μｍ，４．６×３０ｍｍ，部品番号１８６００５７９３，Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を順次接続してインタクトのコンジュゲートを遊離の薬剤から分離し、次いでそれをＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｔｅｃｓ  ＵＰＬＣ  Ｃ−１８カラム（２．１×５０ｍｍ，部品番号１８６００７０９３）に導いて遊離のＣＤＡ種を分離し、定量した。アセトニトリル（ＡＣＮ）で２０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮに希釈することによってコンジュゲートを調製し、カラムシリーズに注入し（２５μＬ）、表４でリストにした勾配に従って流した。
【表５】
2019510741.tif 000045
【０１６９】
カラムは２．２分でインラインＳＥＣからＣ−１８に変え、１４．０分でインラインＳＥＣに戻した。シグナルは２６５ｎｍで収集した。化合物（Ｉｅ）に由来する標準曲線を用い、以下の式：
ｎｇ遊離＝（ＡＵＣ２６５ｎｍ＋１１８０５）／４８８８
％遊離ＣＤＡ＝ｎｇ遊離／ｎｇ注入
を用いて、２．２〜１４．０分のウインドウで見いだされたピークから試料に存在する遊離の薬剤の量を算出した。
【０１７０】
実施例４
ヒト化抗体Ａｂ１及びマウス抗体、マウスＭｙ９−６の化合物（Ｉｅ）とのコンジュゲートを実施例３に記載されているプロトコールに従って調製した。結果を表５に示す。
【表６】
2019510741.tif 000046
【０１７１】
表５に示すように、ｐＨ８でのイオン強度の高い緩衝液を用いたコンジュゲートはｐＨ８．５でのイオン強度の低い緩衝液を用いたコンジュゲートに比べて反応収率の有意な上昇を生じる。
【０１７２】
実施例５
実施例３に記載されている、７５ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０の緩衝液を利用するプロトコールを用いて５Ｆ９−ＰＶＡｄＧ−（Ｉｅ）コンジュゲートを調製した。５Ｆ９−ＰＶＡｄＧ抗体は、ＩｇＧ１の重鎖（配列番号９）にてＦｃγＲＩＩＩｂを結合するのに重要であるＥＬＬＧを類似の位置にてＩｇＧ２で高度に保存されたアミノ酸であるＰＶＡで置き換えるアミノ酸置換を含有する（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ａｎｄ  ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５（５２０）：１−１７（２０１４））。
【０１７３】
コンジュゲート反応は、抗体に基づいた特定のモル過剰での化合物（ＩＩｅ）のスルホン化形態の添加と共に、７５ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０における２．０ｍｇ／ｍＬでの５Ｆ９−ＰＶＡｄＧ抗体を用いて実施した（代表的なコンジュゲートについては表６を参照のこと）。コンジュゲート反応は最終的な９０／１０の７５ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０とＤＭＡの水性：有機の組成を有し、製剤化緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭの塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭの重亜硫酸ナトリウム、ｐＨ６．２）への精製に先立って、２５℃の水槽にて４時間インキュベートした。
【０１７４】
１０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭの塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭの重亜硫酸ナトリウム、ｐＨ６．２によって平衡化したセファデックスＧ−２５ＨｉＰｒｅｐカラムを用いて５Ｆ９−ＰＶＡｄＧ−（Ｉｅ）コンジュゲートの反応混合物を精製した。解析の前に０．２２μｍのＰＶＤＦ注射器フィルターを用いて、精製したコンジュゲートを濾過した。
【表７】
2019510741.tif 000047
【０１７５】
実施例６
最適化したスルホン化
化合物（ＩＩｅ）を以下のようにスルホン化して化合物（Ｉｅ）を生成した。３．７５ｍＬの５０ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ３．３溶液に６．１１ｍＬ量のＤＭＡを加えた。水槽にて混合し、１０℃に平衡化した後、ＤＭＡ中２１．５ｍＭの化合物（ＩＩｅ）ストック１．３９ｍＬ（３０．０マイクロモルの化合物（ＩＩｅ））を加え、混合した。この添加に続いて、２０ｍＭの重炭酸ナトリウム水溶液３．７５ｍＬ（２．５当量、７５マイクロモル）を反応物に導入した。混合した後、反応を１０℃で１５．５時間進め、精製することなく直ちに次の工程で使用した。反応混合物の液体クロマトグラフィ（逆相）解析は２．４％の残りの未反応化合物（ＩＩｅ）を伴って９２．４％の化合物（Ｉｅ）への変換を示した。
【０１７６】
コンジュゲート後の反応停止
コンジュゲート後のイオン強度の上昇が高分子量（ＨＭＷ）種の形成の低下を生じる条件を決定するために、以下の最適化を行った。５Ｆ９抗体（2ｍｇ／ｍＬ）を２２℃にて８０〜９０分間、３．８モル当量の化合物（Ｉｅ）にコンジュゲートさせた。コンジュゲート反応物の最終組成は体積で１５％のＤＭＡを伴った１３０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．７で構成された。コンジュゲート反応が完了次第直ちに、表７で詳述されているような指示された体積の反応停止溶液でアリコートを希釈した。２２℃で保持して指示された時間、パーセントＨＭＷ種の変化をモニターした。この知見に基づいて、３００、５００または７００ｍＭのＥＰＰＳ反応停止溶液を用いた２倍希釈、７５０ｍＭのＥＰＰＳを用いた１．４〜１．６倍希釈、及び７５０ｍＭのＥＰＰＳ／１５０ｍＭのヒスチジン塩酸塩を用いた１．４〜１．６倍希釈を選択した。以下のコンジュゲート例では、７５０ｍＭのＥＰＰＳ／１５０ｍＭのヒスチジン塩酸塩を用いた１．５倍希釈を用いた。表７は粗精製の５Ｆ９−（Ｉｅ）コンジュゲートの安定性に対する反応停止溶液の影響を示す。粗精製の５Ｆ９−（Ｉｅ）コンジュゲートを特定の時間量の間、様々な反応停止溶液と共にインキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィによってパーセント分子量種における変化を測定した。
【表８−１】
2019510741.tif 000048
【表８−２】
2019510741.tif 000049
【０１７７】
最適化したコンジュゲート及び精製
１３０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．７を３２５ｍＬ含有する頂部撹拌機を備えた１Ｌのジャケット付きガラス反応器に６８．６ｍＬのＤＭＡを加えた。溶液の混合及び２２℃への平衡化に続いて、１３０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．７中１０．０ｍｇ／ｍＬの５Ｆ９抗体の溶液１００ｍＬを反応器に導入し、１５分間混合した。その後、２ｍＭの化合物（Ｉｅ）の溶液１２．８ｍＬ（２５．５マイクロモル、５Ｆ９抗体の３．７当量；以前記載された最適化されたスルホン化プロトコールを用いて調製された）を反応溶液に導入した。２２℃で６０分間撹拌した後、１５０ｍＭのヒスチジン塩酸塩及び７５０ｍＭのＥＰＰＳを含有する水溶液２５０ｍＬを反応容器に移した。十分に混合することに続いて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｓｃａｌｅ  ４７  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  ０．５／０．２μＭのフィルターを介してこの物質を濾過した。次いでＴａｎｇｅｎＸ  ０．０２ｍ２  ＨｙＳｔｒｅａｍ  ３０  ｋＤ  Ｓｉｕｓ  ＬＳＮ  ＴＦＦカセットによる限外濾過によって粗精製の反応混合物を２．５ｍｇ／ｍＬの計算されたバルクタンパク質の濃度に濃縮した。濃縮工程に続いて、５０ｍＭヒスチジン、６．７ｗ／ｖ（重量／体積）％のスクロース、０．１ｖ／ｖ（体積／体積）％のポリソルベート８０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウム、ｐＨ５．５の緩衝液４．８Ｌに対して溶液を透析濾過した。透析濾過の後、０．１ｖ／ｖ（体積／体積）％のポリソルベート８０の最終濃度でポリソルベート８０を保持液溶液に加え、得られた溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｓｃａｌｅ  ４７  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  ０．５／０．２μＭのフィルターで濾過した。２℃〜８℃での２日間の保存に続いて、追加の５０ｍＭヒスチジン、６．７ｗ／ｖ％のスクロース、０．１ｖ／ｖ％のポリソルベート８０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウム、ｐＨ５．５の緩衝液の必要容量の添加によって溶液を１．０ｍｇ／ｍＬのコンジュゲートに希釈した。次いでＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｓｃａｌｅ  ４７  Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ０．２２μＭフィルターを介してこの溶液を濾過し、１．０ｍｇ／ｍＬのコンジュゲート８１８ｍＬを得た。最終的なコンジュゲートの測定されたＤＡＲは９７．４％の単量体によるＵＶ／Ｖｉｓ及びＳＥＣによる２．５％ＨＭＷによって２．６である。生成物の最終的な収率は８２％だった。
【０１７８】
分析
精製したコンジュゲートにおける抗体及び細胞毒性剤（Ｉｅ）の濃度は２８０ｎｍ及び３３０ｎｍでの吸光度の値を用いたＵＶ／Ｖｉｓによって決定した。抗体及び細胞毒性剤は双方とも２８０ｎｍで吸収するので、各部分に起因する総シグナルの一部を検討するには２項方程式が必要とされた。細胞毒性剤であるインドリノベンゾジアゼピン（ＩＧＮ）のみが３３０ｎｍで吸収するので、その波長での濃度は細胞毒性剤にのみ起因し得る。この実施例で使用したコンジュゲートした部分の吸光係数の値はそれぞれ、２８０ｎｍ及び３３０ｎｍで３４１５０及び１６２７０Ｍ−１ｃｍ−１である。
【０１７９】
各波長での各構成成分の寄与を説明する以下の代数的表現を用いて抗体及び細胞毒性剤の成分を定量した。
ＣＤ＝Ａ３３０／ε３３０ｎｍＩＧＮ
ＣＡｂ＝（Ａ２８０−（ε２８０ｎｍＩＧＮ／ε３３０ｎｍＩＧＮ）×Ａ３３０）／ε２８０ｎｍＡｂ
【０１８０】
ＡｘはＸｎｍの波長での吸光度の値であり、ＣＡｂは抗体（すなわち、ＡｂＸ）のモル濃度であり、ＣＤは細胞毒性剤のモル濃度である。細胞毒性剤：Ａｂの比（ＤＡＲ）は上記のモル濃度の比とし算出した。ＡｂＸのｍｇ／ｍＬ（ｇ／Ｌ）濃度は１４４８８７ｇ／モルの分子量を用いて算出した。
【配列表】
2019510741000001.app
【国際調査報告】
2019510741.tif 000074
2019510741.tif 000075
2019510741.tif 000076
2019510741.tif 000077
2019510741.tif 000078
2019510741.tif 000079