(57)【要約】  疾患の臨床発症の前にアルツハイマー病のサインを検出する方法、例えば、軽度認知障害（ＭＣＩ）を診断し、ＭＣＩの進行をモニタリングし、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測する方法が開示される。この方法は、ＡＤ指数、形態測定画像化およびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択される１つ以上のバイオマーカーのアウトプットシグナルに対応するバイオマーカー重症度スコアを使用する。ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防に有益な化合物のスクリーニング方法、ならびに、ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防のための薬剤の治療的有益性の評価またはモニタリングの方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において軽度認知障害（ＭＣＩ）を診断する方法であって、
（ａ）前記対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）前記対象からの前記１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、前記診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；ならびに
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定される前記アウトプットシグナルを、年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）細胞およびＡＤ細胞の前記診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｂ）で決定される前記アウトプットシグナルは前記ＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、前記ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合に前記対象でＭＣＩが示されること
を含む方法。
【請求項２】
（１）前記ＡＤ細胞の前記診断バイオマーカーの前記アウトプットシグナルをそれらのＡＤ期間の関数としてプロットすることであって、各ＡＤ期間は、ＡＤの臨床発症時のＡＤ対象の年齢と前記診断バイオマーカーの前記アウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＤ対象の年齢の間の年齢差であること；
（２）工程（１）のプロットされた前記アウトプットシグナルに関数をあてはめること；および
（３）工程（ｃ）でＭＣＩが示される場合、工程（ｂ）で決定される前記診断バイオマーカーの前記アウトプットシグナルをあてはめ関数にインプットし、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を決定することによって、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測すること
を含む、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記あてはめ関数が線形関数である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（１）前記ＡＤ細胞の前記診断バイオマーカーの前記アウトプットシグナルをそれらのＡＤ期間の関数としてプロットすることであって、各ＡＤ期間は、ＡＤの臨床発症時のＡＤ対象の年齢と前記診断バイオマーカーの前記アウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＤ対象の年齢の間の年齢差であること；
（２）前記ＡＣ細胞の前記診断バイオマーカーの前記アウトプットシグナルをそれらの年齢差の関数としてプロットすることであって、各年齢差は、前記診断バイオマーカーの前記アウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＣ対象の年齢と、前記診断バイオマーカーの前記アウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点で最高齢のＡＣ対象の年齢の間の差であること；
（３）工程（１）および（２）のプロットされた前記アウトプットシグナルに関数をあてはめること；ならびに
（４）工程（ｃ）でＭＣＩが示される場合、工程（ｂ）で決定される前記診断バイオマーカーの前記アウトプットシグナルをあてはめ関数にインプットし、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を決定することによって、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測すること
を含む、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記あてはめ関数がロジスティック関数である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１つ以上の以降の時点で工程（ａ）から（ｃ）を反復することを含む、ＭＣＩの進行をモニタリングすることをさらに含み、上の工程（ｂ）で決定される前記アウトプットシグナルが経時的に増加した場合は前記対象がＡＤ認知症の臨床発症の方向に進行している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）におけるＡＣ細胞およびＡＤ細胞の前記診断バイオマーカーの前記アウトプットシグナルが平均アウトプットシグナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の細胞が末梢細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記末梢細胞が皮膚線維芽細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象がＡＤの表現型症状を提示しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防に有益な化合物のスクリーニングの方法であって、
（ａ）対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）前記対象からの前記１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、前記診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定される前記アウトプットシグナルを、ＡＣ細胞およびＡＤ細胞の前記診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｂ）で決定される前記アウトプットシグナルは前記ＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、前記ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合に前記対象でＭＣＩが示されること；
（ｄ）工程（ｃ）でＭＣＩが示される場合、前記対象からの細胞を化合物と初期の時間および／または継続する時間接触させた後に、工程（ｂ）の前記診断バイオマーカーの前記アウトプットシグナルを決定すること；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）で決定される前記アウトプットシグナルを工程（ｂ）で決定される前記アウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｄ）で決定される前記アウトプットシグナルが工程（ｂ）で決定される前記アウトプットシグナル未満である場合、ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防に試験化合物が有益であると示されること
を含む方法。
【請求項１２】
対象でのＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防のための薬剤の治療的有益性の評価またはモニタリングの方法であって、
（ａ）対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）前記対象からの前記１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、前記診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定される前記アウトプットシグナルを、ＡＣ細胞およびＡＤ細胞の前記診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｂ）で決定される前記アウトプットシグナルは前記ＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、前記ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合に前記対象でＭＣＩが示されること；
（ｄ）工程（ｃ）でＭＣＩが示される場合、薬剤による処置の初期、継続中および／または中止の後に前記対象からの１つ以上の細胞を使用して、工程（ｂ）の前記診断バイオマーカーの前記アウトプットシグナルを決定すること；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）で決定される前記アウトプットシグナルを工程（ｂ）で決定される前記アウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｄ）で決定される前記アウトプットシグナルが工程（ｂ）で決定される前記アウトプットシグナルと同等以下である場合、前記対象でのＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防のために治療的有益性を前記薬剤が提供すると示されること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
[001]本出願は、その全内容は参照によりここに組み込まれる、２０１６年２月２２日に出願の米国特許仮出願第６２／２９８，１８２号への優先権を主張する。
【０００２】
[002]アルツハイマー病（ＡＤ）は、精神機能の進行性の減退によって一般的に特徴付けられる、神経変性障害である。より具体的には、ＡＤは、重大な精神荒廃に徐々につながり、究極的に死につながる、記憶、認知、推理、判断および情緒的安定の進行性の喪失によって臨床的に特徴付けられる。ＡＤの可能な機構に関する多くの仮説があるが、１つの中心的な理論は、毒性のβ−アミロイド（Ａβ）ペプチドの過剰な形成および蓄積が直接的にまたは間接的に様々な細胞事象に影響し、神経細胞傷害および細胞死につながるということである。
【０００３】
[003]ＡＤは、臨床症状の発症と死亡の間におよそ８〜１５年の平均期間がある進行性の障害である。米国において、ＡＤは７番目に最も一般的な医学的死因であると考えられ、約５，０００，０００人がＡＤに冒される。
【０００４】
[004]診断バイオマーカーの値は、疾患の進行および緩解をモニタリングするそれらの能力、ならびに疾患の発症前のそれらの予測精度に由来する。発症すらしないうちにＡＤが検出されるなら、予防および／または治療戦略の計画のための重要な機会が提供され得る。例えば、軽度認知障害は、個体の年齢および教育水準で予想されるレベルよりも大きいが、日常生活の活動を目立つほどには妨害しない認知減退として特徴付けられている。それは、正常な加齢の予想される認知変化と認知症の最も初期の臨床症状の間の中間の段階を表す。ＭＣＩは、アルツハイマー病を起こすリスクを増加させる。しかし、ＡＤの初期の段階では、認知症の発症から４年以内に、臨床診断が当たる率は限られている。さらに、認知症の発症前の臨床診断の精度はこれまで検証されていない。したがって、ＡＤのための改善された診断および予測能力を発展させる必要性がある。特に、臨床上の認知症発症の前にＡＤのサインを検出するための方法を開発する必要性がある。
【０００５】
[005]本開示の方法は、ＭＣＩの診断、ＭＣＩの進行のモニタリング、およびＡＤ認知症の臨床発症までの時間の予測の方法を提供することによって、これらの必要性に対処する。本開示は、ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防に有益な化合物のスクリーニング方法、ならびに、ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防のための薬剤の治療的有益性の評価またはモニタリングの方法にも関する。
【０００６】
[006]本開示の１つの側面では、対象においてＭＣＩを診断する方法は、以下を含む：
（ａ）対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）対象からの１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルを、年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）細胞およびＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルはＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合に対象でＭＣＩが示されること。
【０００７】
[007]別の側面では、対象でＭＣＩの進行をモニタリングする方法は、以下を含む：
（ａ）対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）対象からの１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；
（ｃ）工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルを、ＡＣ細胞およびＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルはＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合に対象でＭＣＩが示されること；ならびに
（ｄ）以降の１つ以上の時点で工程（ａ）から（ｃ）を反復することであって、ここで、工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルが経時的に増加した場合は、対象がＡＤ認知症の臨床発症の方向に進行している。
【０００８】
[008]別の側面では、対象でＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測する方法は、以下を含む：
（ａ）対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）対象からの１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；
（ｃ）工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルを、ＡＣ対象の群からのＡＣ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと、およびＡＤ対象の群からのＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルはＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合に対象でＭＣＩが示されること；
（ｄ）ＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルをそれらのＡＤ期間の関数としてプロットすることであって、各ＡＤ期間は、ＡＤの臨床発症時のＡＤ対象の年齢と診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＤ対象の年齢の間の年齢差であること；
（ｅ）工程（ｄ）のプロットされたアウトプットシグナルに関数をあてはめること；ならびに
（ｆ）工程（ｃ）でＭＣＩが示される場合、工程（ｂ）で決定される診断バイオマーカーのアウトプットシグナルをあてはめ関数にインプットし、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を決定することによって、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測すること。
【０００９】
[009]別の側面では、対象でＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測する方法は、以下を含む：
（ａ）対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）対象からの１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；
（ｃ）工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルを、ＡＣ対象の群からのＡＣ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと、およびＡＤ対象の群からのＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルはＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合に対象でＭＣＩが示されること；
（ｄ）ＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルをそれらのＡＤ期間の関数としてプロットすることであって、各ＡＤ期間は、ＡＤの臨床発症時のＡＤ対象の年齢と診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＤ対象の年齢の間の年齢差であること；
（ｅ）ＡＣ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルをそれらの年齢差の関数としてプロットすることであって、各年齢差は、診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＣ対象の年齢と、診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点で最高齢のＡＣ対象の年齢の間の差であること；
（ｆ）工程（ｄ）および（ｅ）のプロットされたアウトプットシグナルに関数をあてはめること；ならびに
（ｇ）工程（ｃ）でＭＣＩが示される場合、工程（ｂ）で決定される診断バイオマーカーのアウトプットシグナルをあてはめ関数にインプットし、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を決定することによって、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測すること。
【００１０】
[010]別の側面では、ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防に有益な化合物のスクリーニング方法は、以下を含む：
（ａ）対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）対象からの１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルを、ＡＣ細胞およびＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルはＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合に対象でＭＣＩが示されること；
（ｄ）工程（ｃ）でＭＣＩが示される場合、対象からの細胞を化合物と初期の時間および／または継続する時間接触させた後に、工程（ｂ）の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定すること；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）で決定されるアウトプットシグナルを工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｄ）で決定されるアウトプットシグナルが工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナル未満である場合、ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防に試験化合物が有益であると示されること。
【００１１】
[011]別の側面では、対象でのＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防のための薬剤の治療的有益性の評価またはモニタリングの方法は、以下を含む：
（ａ）対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）対象からの１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルを、ＡＣ細胞およびＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルはＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合に対象でＭＣＩが示されること；
（ｄ）工程（ｃ）でＭＣＩが示される場合、薬剤による処置の初期、継続中および／または中止の後に対象からの１つ以上の細胞を使用して、工程（ｂ）の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定すること；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）で決定されるアウトプットシグナルを工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｄ）で決定されるアウトプットシグナルが工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルと同等以下である場合、対象でのＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防のために治療的有益性を薬剤が提供すると示されること。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】[012]図１Ａおよび１Ｂは、３つの集団、年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）、ＭＣＩ患者およびＡＤ患者の、海馬歯状回の外側分子層におけるシナプスの総数の平均および平均ＭＭＳＥスコアに基づく、ＭＣＩ患者におけるシナプスの喪失とミニ精神状態検査（ＭＭＳＥ）スコアの間の相関を示す。特に、図１Ａは、海馬歯状回の外側分子層におけるシナプスの総数×１０10（閉三角形および左ｙスケール）およびＭＭＳＥスコア（開三角形および右ｙスケール）を示す。図１Ｂは図１Ａにおけるのと同じ値を使用し、シナプスの総数およびＭＭＳＥスコアの重症度スコアを示す０〜１００でそれらをスケーリングする。曲線は、最良適合ロジスティック関数である。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、３つの集団、年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）、ＭＣＩ患者およびＡＤ患者の、海馬歯状回の外側分子層におけるシナプスの総数の平均および平均ＭＭＳＥスコアに基づく、ＭＣＩ患者におけるシナプスの喪失とミニ精神状態検査（ＭＭＳＥ）スコアの間の相関を示す。特に、図１Ａは、海馬歯状回の外側分子層におけるシナプスの総数×１０10（閉三角形および左ｙスケール）およびＭＭＳＥスコア（開三角形および右ｙスケール）を示す。図１Ｂは図１Ａにおけるのと同じ値を使用し、シナプスの総数およびＭＭＳＥスコアの重症度スコアを示す０〜１００でそれらをスケーリングする。曲線は、最良適合ロジスティック関数である。
【図２Ａ】[013]図２Ａは、ＡＣ細胞（四角）およびＡＤ細胞（円）についてのＭＭＳＥスコアへのＡＤ指数バイオマーカーの線形依存性を示す。図２Ｂは、ＡＤ細胞のためのＡＤ期間およびＡＣ細胞のための年齢差の関数としてのＡＣ（四角）およびＡＤ（円）細胞の正規化されたアウトプットシグナルを示す。ＡＤ細胞のＡＤ期間は、ＡＤの臨床発症時のＡＤ対象の年齢と診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＤ対象の年齢の間の年齢差であった。ＡＣ細胞の年齢差は、診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＣ対象の年齢と、ＡＣ群の最高齢のＡＣ対象の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点の年齢の間の差であった。ＡＣ群の年齢差は、負の年齢差としてＡＤ発症の左側にプロットした。
【図２Ｂ】図２Ａは、ＡＣ細胞（四角）およびＡＤ細胞（円）についてのＭＭＳＥスコアへのＡＤ指数バイオマーカーの線形依存性を示す。図２Ｂは、ＡＤ細胞のためのＡＤ期間およびＡＣ細胞のための年齢差の関数としてのＡＣ（四角）およびＡＤ（円）細胞の正規化されたアウトプットシグナルを示す。ＡＤ細胞のＡＤ期間は、ＡＤの臨床発症時のＡＤ対象の年齢と診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＤ対象の年齢の間の年齢差であった。ＡＣ細胞の年齢差は、診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＣ対象の年齢と、ＡＣ群の最高齢のＡＣ対象の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点の年齢の間の差であった。ＡＣ群の年齢差は、負の年齢差としてＡＤ発症の左側にプロットした。
【図３Ａ】[014]図３Ａおよび３Ｂは、ＡＤ期間の関数としての形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーの重症度スコアを示す。図３Ａは、ＡＤ期間の関数としての形態測定画像化バイオマーカーのアウトプットシグナルをプロットし（Ｌｎ（Ａ／Ｎ）の最小値および最大値を０〜１００でスケーリングした）、図３Ｂは、ＡＤ期間の関数としてのＰＫＣイプシロンバイオマーカーのアウトプットシグナルをプロットする（Ｓ／Ｉの最小および最大値を０〜１００でコールした）。各プロットは、線形あてはめ線を含む。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、ＡＤ期間の関数としての形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーの重症度スコアを示す。図３Ａは、ＡＤ期間の関数としての形態測定画像化バイオマーカーのアウトプットシグナルをプロットし（Ｌｎ（Ａ／Ｎ）の最小値および最大値を０〜１００でスケーリングした）、図３Ｂは、ＡＤ期間の関数としてのＰＫＣイプシロンバイオマーカーのアウトプットシグナルをプロットする（Ｓ／Ｉの最小および最大値を０〜１００でコールした）。各プロットは、線形あてはめ線を含む。
【図４Ａ】[015]図４Ａは、ＡＤ細胞のためのＡＤ期間およびＡＣ細胞のための年齢差の関数としての形態測定画像化バイオマーカーの正規化されたアウトプットシグナルを示す。図４Ｂは、ＡＤ細胞のためのＡＤ期間およびＡＣ細胞のための年齢差の関数としてのＰＫＣイプシロンバイオマーカーの正規化されたアウトプットシグナルを示す。ＡＣ群の年齢差は、両図のＡＤ発症線の左側にプロットした。エラーバーは、平均値の標準誤差である。縦の矢印は、ＡＣ群とＡＤ群の間のギャップを示す。このギャップの範囲内の重症度スコアを有する患者は、ＭＣＩ患者である。
【図４Ｂ】図４Ａは、ＡＤ細胞のためのＡＤ期間およびＡＣ細胞のための年齢差の関数としての形態測定画像化バイオマーカーの正規化されたアウトプットシグナルを示す。図４Ｂは、ＡＤ細胞のためのＡＤ期間およびＡＣ細胞のための年齢差の関数としてのＰＫＣイプシロンバイオマーカーの正規化されたアウトプットシグナルを示す。ＡＣ群の年齢差は、両図のＡＤ発症線の左側にプロットした。エラーバーは、平均値の標準誤差である。縦の矢印は、ＡＣ群とＡＤ群の間のギャップを示す。このギャップの範囲内の重症度スコアを有する患者は、ＭＣＩ患者である。
【図５Ａ】[016]図５Ａは図４Ａに類似しているが、ＡＤ群の線形依存性を適用した、形態測定画像化バイオマーカーの予測値をさらに図示する。図５Ｂは図４Ｂに類似しているが、ＡＤ群の線形依存性に続いて、ＰＫＣイプシロンバイオマーカーの予測値をさらに図示する。
【図５Ｂ】図５Ａは図４Ａに類似しているが、ＡＤ群の線形依存性を適用した、形態測定画像化バイオマーカーの予測値をさらに図示する。図５Ｂは図４Ｂに類似しているが、ＡＤ群の線形依存性に続いて、ＰＫＣイプシロンバイオマーカーの予測値をさらに図示する。
【図６Ａ】[017]図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、線形でなくロジスティックあてはめ関数を適用した、形態測定、ＰＫＣイプシロンおよびＡＤ指数バイオマーカーの予測値をそれぞれ図示する。
【図６Ｂ】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、線形でなくロジスティックあてはめ関数を適用した、形態測定、ＰＫＣイプシロンおよびＡＤ指数バイオマーカーの予測値をそれぞれ図示する。
【図６Ｃ】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、線形でなくロジスティックあてはめ関数を適用した、形態測定、ＰＫＣイプシロンおよびＡＤ指数バイオマーカーの予測値をそれぞれ図示する。
【図７Ａ】[018]図７Ａは、３つのバイオマーカーの重症度スコアにおけるかなりの重複を示す。図７Ｂは、３つの集団、ＡＣ、ＭＣＩおよびＡＤの、海馬歯状回の外側分子層におけるシナプスの総数の平均および平均ＭＭＳＥスコアのかなりの重複を示す。
【図７Ｂ】図７Ａは、３つのバイオマーカーの重症度スコアにおけるかなりの重複を示す。図７Ｂは、３つの集団、ＡＣ、ＭＣＩおよびＡＤの、海馬歯状回の外側分子層におけるシナプスの総数の平均および平均ＭＭＳＥスコアのかなりの重複を示す。
【図８Ａ】[019]図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、形態測定画像化、ＰＫＣイプシロンおよびＡＤ指数バイオマーカーのランク付けしたアウトプットシグナルのロジスティックあてはめ曲線をそれぞれ示す。ＭＣＩ患者は、水平矢印および太線で示すＡＣとＡＤ群の患者の間のギャップに位置する。図８Ｄは、図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃを要約する（形態測定画像化−赤色；ＰＫＣイプシロン−緑色；ＡＤ指数−青色）。
【図８Ｂ】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、形態測定画像化、ＰＫＣイプシロンおよびＡＤ指数バイオマーカーのランク付けしたアウトプットシグナルのロジスティックあてはめ曲線をそれぞれ示す。ＭＣＩ患者は、水平矢印および太線で示すＡＣとＡＤ群の患者の間のギャップに位置する。図８Ｄは、図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃを要約する（形態測定画像化−赤色；ＰＫＣイプシロン−緑色；ＡＤ指数−青色）。
【図８Ｃ】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、形態測定画像化、ＰＫＣイプシロンおよびＡＤ指数バイオマーカーのランク付けしたアウトプットシグナルのロジスティックあてはめ曲線をそれぞれ示す。ＭＣＩ患者は、水平矢印および太線で示すＡＣとＡＤ群の患者の間のギャップに位置する。図８Ｄは、図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃを要約する（形態測定画像化−赤色；ＰＫＣイプシロン−緑色；ＡＤ指数−青色）。
【図８Ｄ】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、形態測定画像化、ＰＫＣイプシロンおよびＡＤ指数バイオマーカーのランク付けしたアウトプットシグナルのロジスティックあてはめ曲線をそれぞれ示す。ＭＣＩ患者は、水平矢印および太線で示すＡＣとＡＤ群の患者の間のギャップに位置する。図８Ｄは、図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃを要約する（形態測定画像化−赤色；ＰＫＣイプシロン−緑色；ＡＤ指数−青色）。
【説明】
【００１３】
[020]ここで用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数形を含む。
【００１４】
[021]ここで用いるように、「タンパク質キナーゼＣ活性化剤」または「ＰＫＣ活性化剤」は、ＰＫＣによって触媒される反応の速度を増加させる物質を指す。ＰＫＣ活性化剤は、非特異的または特異的活性化剤であり得る。特異的活性化剤は、１つのＰＫＣアイソフォーム、例えばＰＫＣ−ε（イプシロン）を、別のＰＫＣアイソフォームより高い検出可能な程度に活性化する。
【００１５】
[022]ここで用いられる用語「対象」または「対象（複数）」は、非限定的である。それはヒトを指すが、他の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、サルおよび類人猿を含むこともできる。
【００１６】
[023]認知障害の程度と緊密に相関している剖検ＡＤ脳の唯一の病理学的特質は、シナプスの喪失である。Ｓｃｈｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ”，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２７（１０）：１３７２−８４（２００６）；Ｍａｓｌｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｓｙｎａｐｓｅ  ｌｏｓｓ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｏｆ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ．”Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｏｃｔ；３０（４）：５７２−８０（１９９１）。アミロイドプラークは、認知欠損の程度と緊密に相関していない。しかし、シナプスの総数は、生活における認知能と緊密に相関している。同書。認知症の臨床診断のために必要とされるレベルに到達していない多くの認知障害患者は、軽度認知障害を有すると分類されている。Ｓｃｈｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２７（１０）：１３７２−８４。ＭＣＩ患者のかなりの割合（概ね６０％）が、ＡＤの診断に進行する。多くのＭＣＩ患者はプラークを有しないが、認知欠損と緊密に相関するシナプスのかなりの喪失を示す（図１Ａおよび１Ｂを参照）。同書。さらに、年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）、ＭＣＩ患者およびＡＤ患者の全３つの集団は、シナプスの総数と、認知スクリーニングのための広く使用されるツールであるＭＭＳＥの結果の間の相関を示す（図１Ａおよび１Ｂを参照）。同書。これらの臨床的および病理的所見の集合は、ＡＤと関連するシナプスの喪失がＡＤ認知症の発症前に既に始まっていることを示唆する。
【００１７】
[024]アルツハイマー病のシナプス喪失の１つの原因は、シナプス原性ＰＫＣεアイソザイムおよびそれらの下流のシナプス原性基質、例えば脳由来神経栄養因子の病理学的低減である。Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“ＰＫＣε  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｌｏｓｓ，Ａβ  Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３１（２）：６３０−６４３（２０１１）；Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“ＰＫＣε  Ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｂｒａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１５；４３（２）：４９１−５０９。ＰＫＣαおよびεの低減は、可溶性βアミロイドタンパク質（Ａβ）の上昇に付随して、しかし、アミロイドプラークの出現または神経細胞喪失の前に起こる。同書。
【００１８】
[025]ＡＤの３つのバイオマーカー、ＰＫＣεバイオマーカー、ＡＤ指数バイオマーカー、および形態測定画像化バイオマーカーは、シナプスの形成に関連し、ＡＤの進行に伴って異常が増加することが見出された。Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１５；４３（２）：４９１−５０９。全３つのバイオマーカーは、ＡＤ病理学的診断を同定する剖検での脳変化と相関することも見出された。本発明者らは、年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）およびＡＤ患者のそれぞれのバイオマーカーのアウトプットシグナルに対応するバイオマーカー重症度スコアを開発した。アウトプットシグナルは、正規化すること、例えば０〜１００％にスケーリングすることができるが、その必要はない。一態様では、バイオマーカー重症度スコアは、それぞれのバイオマーカーのアウトプットシグナルの正規化された値（０〜１００％）への連続的ロジスティックあてはめ関数として表される。本発明者らは、バイオマーカー重症度スコアを使用することによって、これらのバイオマーカーが認知症の臨床発症の前、例えば臨床発症の数年前に、ＡＤのサインを検出することができること、および、ＭＣＩを診断し、ＭＣＩの進行をモニタリングし、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測するために使用することができることを発見した。バイオマーカー重症度スコアを使用して、発明者らは、ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防に有益な化合物のスクリーニング方法、ならびに、ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防のための薬剤の治療的有益性の評価またはモニタリングの方法も発見した。
【００１９】
[026]１つの側面では、対象においてＭＣＩを診断する方法は、以下を含む：
（ａ）対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）対象からの１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルを、ＡＣ対象の群からのＡＣ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと、およびＡＤ対象の群からのＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルはＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合に対象でＭＣＩが示されること。
【００２０】
[027]本方法は、以下を含む、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測することをさらに含んでもよい：
（１）ＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルをそれらのＡＤ期間の関数としてプロットすることであって、各ＡＤ期間は、ＡＤの臨床発症時のＡＤ対象の年齢と診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＤ対象の年齢の間の年齢差であること；
（２）工程（１）のプロットされたアウトプットシグナルに関数をあてはめること；ならびに
（３）工程（ｃ）でＭＣＩが示される場合、工程（ｂ）で決定される診断バイオマーカーのアウトプットシグナルをあてはめ関数にインプットし、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を決定することによって、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測すること。
図５Ａおよび５Ｂは、仮定のＭＣＩ対象のためのＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測する例を示す。一部の態様では、あてはめ関数は、線形関数である。
【００２１】
[028]あるいは、本方法は、以下を含む、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測することをさらに含んでもよい：
（１）ＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルをそれらのＡＤ期間の関数としてプロットすることであって、各ＡＤ期間は、ＡＤの臨床発症時のＡＤ対象の年齢と診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＤ対象の年齢の間の年齢差であること；
（２）ＡＣ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルをそれらの年齢差の関数としてプロットすることであって、各年齢差は、診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点のＡＣ対象の年齢と、診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを生成するために１つ以上の細胞を収集する時点で最高齢のＡＣ対象の年齢の間の差であること；
（３）工程（１）および（２）のプロットされたアウトプットシグナルに関数をあてはめること；ならびに
（４）工程（ｃ）でＭＣＩが示される場合、工程（ｂ）で決定される診断バイオマーカーのアウトプットシグナルをあてはめ関数にインプットし、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を決定することによって、ＡＤ認知症の臨床発症までの時間を予測すること。一部の態様では、あてはめ関数は、ロジスティック関数である（図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃを参照）。
【００２２】
[029]別の側面では、ＭＣＩの進行をモニタリングする方法は、１つ以上の以降の時点で上の工程（ａ）から（ｃ）を反復することを含み、ここで、上の工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルが経時的に増加した場合は、対象がＡＤ認知症の臨床発症の方向に進行している。
【００２３】
[030]さらなる側面では、ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防に有益な化合物のスクリーニング方法は、以下を含む：
（ａ）対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）対象からの１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルを、ＡＣ細胞およびＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルはＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合に対象でＭＣＩが示されること；
（ｄ）工程（ｃ）でＭＣＩが示される場合、対象からの細胞を化合物と初期の時間および／または継続する時間接触させた後に、工程（ｂ）の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定すること；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）で決定されるアウトプットシグナルを工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｄ）で決定されるアウトプットシグナルが工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナル未満である場合、ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防に試験化合物が有益であると示されること。
【００２４】
[031]本開示は、ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防に有益な化合物のスクリーニング方法であって、以下を含む方法も含む：
（ａ）非ＡＤ、非認知症、非ＭＣＩ対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）１つ以上の細胞をＡβペプチドと接触させること；
（ｃ）Ａβペプチドと接触させた１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；
（ｄ）ステップ（ｃ）で決定されるアウトプットシグナルを、ＡＣ細胞およびＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｃ）で決定されるアウトプットシグナルはＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合には、工程（ｂ）によって対象でＭＣＩが誘発されること；
（ｅ）工程（ｄ）でＭＣＩが示される場合、対象からの細胞を化合物と初期の時間および／または継続する時間接触させた後に、工程（ｃ）で診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定すること；ならびに
（ｆ）工程（ｅ）で決定されるアウトプットシグナルを工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｄ）で決定されるアウトプットシグナルが工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナル未満である場合、ＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防に試験化合物が有益であると示されること。
【００２５】
[032]別の側面では、対象でのＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防のための薬剤の治療的有益性の評価またはモニタリングの方法は、以下を含む：
（ａ）対象から１つ以上の細胞を得ること；
（ｂ）対象からの１つ以上の細胞を使用して１つ以上の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することであって、診断バイオマーカーは、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーから選択されること；
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルを、ＡＣ細胞およびＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルはＡＤ細胞の最も低いアウトプットシグナル未満であるが、ＡＣ細胞の最も高いアウトプットシグナルより大きい場合に対象でＭＣＩが示されること；
（ｄ）工程（ｃ）でＭＣＩが示される場合、薬剤による処置の初期、継続中および／または中止の後に対象からの１つ以上の細胞を使用して、工程（ｂ）の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定すること；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）で決定されるアウトプットシグナルを工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルと比較することであって、工程（ｄ）で決定されるアウトプットシグナルが工程（ｂ）で決定されるアウトプットシグナルと同等以下である場合、対象でのＭＣＩの処置またはＡＤ認知症の臨床発症の予防のために治療的有益性を薬剤が提供すると示されること。
【００２６】
[033]ここに記載されるＡＣ細胞およびＡＤ細胞のアウトプットシグナルは、対象のアウトプットシグナルを決定するのとほぼ同じ時間に決定してもよく、または、ＡＣ細胞およびＡＤ細胞のアウトプットシグナルは、例えば事前に決定してもよく、所与の対象のために決定されるアウトプットシグナルとの比較のためにデータベースに維持してもよい。
【００２７】
[034]ここに記載されるＡＣ細胞は、年齢をマッチさせた非ＡＤ、非ＭＣＩ細胞であるべきであり、すなわち、年齢をマッチさせた非ＡＤ、非ＭＣＩ集団から得るべきである。一部の態様では、ＡＣ細胞は、年齢をマッチさせた非ＡＤ、非認知症、非ＭＣＩ細胞であり、すなわち、年齢をマッチさせた非ＡＤ、非認知症、非ＭＣＩ集団から得るべきである。
【００２８】
[035]一部の態様では、ここに記載される方法は、ＡＤの表現型症状を提示しない対象、例えばＡＤの表現型症状を提示しないが、ＡＤを起こす１つ以上の危険因子を有する対象を使用して実行される。
【００２９】
[036]対象のアウトプットシグナルと比較されるＡＣ細胞およびＡＤ細胞の診断バイオマーカーのアウトプットシグナルは、平均アウトプットシグナルであり得る。例えば、アウトプットシグナルならびにここに記載される年齢差およびＡＤ期間は、５年の年齢区間の中で平均して、５年の年齢区間ごとの平均アウトプットシグナルおよび平均年齢差をもたらしてもよい。他の区間を適用してもよいことは、当業者には明らかとなる。
【００３０】
[037]一部の態様では、ここに記載されるバイオマーカーのアウトプットシグナルを決定するために使用される細胞は、線維芽細胞または血液細胞を限定されずに含む、末梢細胞（すなわち、非ＣＮＳ組織から得た細胞）であってもよい。一部の態様では、細胞は皮膚線維芽細胞である。他の態様では、細胞は血液リンパ球細胞である。
【００３１】
ＡＤ指数バイオマーカー
[038]「ＡＤ指数バイオマーカー」は、細胞がプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤である薬剤で処理されるときの、リン酸化された第１のＭＡＰキナーゼタンパク質とリン酸化された第２のＭＡＰキナーゼタンパク質との比における変化を測定するアッセイを指す。ここで用いるように、ＡＤ指数バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することは、以下を含む
（ｉ）対象からの１つ以上の細胞をＰＫＣ活性化剤である薬剤と接触させること；
（ｉｉ）リン酸化された第１のＭＡＰキナーゼタンパク質対リン酸化された第２のＭＡＰキナーゼタンパク質の比を測定することであって、リン酸化された第１および第２のＭＡＰキナーゼタンパク質は工程（ｉ）の接触の後に細胞から得られること；
（ｉｉｉ）工程（ｉ）で使用されるＰＫＣ活性化剤である薬剤と接触していない対象からの１つ以上の細胞において、リン酸化された第１のＭＡＰキナーゼタンパク質対リン酸化された第２のＭＡＰキナーゼタンパク質の比を測定すること；ならびに
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られる比を工程（ｉｉ）で得られる比から引き算すること。
【００３２】
[039]リン酸化されたＭＡＰキナーゼタンパク質は、互いに配列変異体であってもよく、タンパク質の同じファミリーに属していてもよい。一部の態様では、リン酸化された第１のＭＡＰキナーゼタンパク質はリン酸化されたＥｒｋ１であり、リン酸化された第２のＭＡＰキナーゼタンパク質はリン酸化されたＥｒｋ２である。
【００３３】
[040]ＡＤ指数アッセイは、いかなる特定のＰＫＣ活性化剤の使用にも限定されない。一部の態様では、ＰＫＣ活性化剤は、ブラジキニン、ブリオスタチン、ブリオログ、ネリスタチン、８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰＬＡ）およびＤＣＰＬＡのエステルから選択される。例えば、ブリオスタチンは、ブリオスタチン−１、ブリオスタチン−２、ブリオスタチン−３、ブリオスタチン−４、ブリオスタチン−５、ブリオスタチン−６、ブリオスタチン−７、ブリオスタチン−８、ブリオスタチン−９、ブリオスタチン−１０、ブリオスタチン−１１、ブリオスタチン−１２、ブリオスタチン−１３、ブリオスタチン−１４、ブリオスタチン−１５、ブリオスタチン−１６、ブリオスタチン−１７またはブリオスタチン−１８から選択してもよい。適するＰＫＣ活性化剤の例は米国特許出願公開第２０１４／０３１５９９０号に開示され、それは参照によりここに組み込まれる。
【００３４】
[041]米国特許第７，５９５，１６７号および米国特許出願公開第２０１４／００３１２４５号は、ＡＤ指数アッセイを実行するための技術を開示し、参照によりここに組み込まれる。したがって、ＡＤ指数アッセイは、それらの刊行物に記載されている通りに実行してもよい。例えば、ある特定の態様では、ＰＫＣ活性化剤はブラジキニンであり、第１および第２のＭＡＰキナーゼタンパク質はそれぞれＥｒｋ１およびＥｒｋ２である。
【００３５】
形態測定画像化バイオマーカー
[042]「形態測定画像化バイオマーカー」は、細胞凝集を測定するためのアッセイを指す。ここで用いるように、形態測定画像化バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することは、（ｉ）対象からの１つ以上の細胞を細胞凝集を達成するのに十分な時間培養すること；（ｉｉ）細胞凝集体の平均面積（Ａ）を決定し、平均面積を凝集体の数（Ｎ）によって割り算して凝集体数あたりの平均面積（Ａ／Ｎ）を得ること；および（ｉｉｉ）（Ａ／Ｎ）の自然対数を計算することを含む。
【００３６】
[043]１つ以上の細胞は、増殖のための細胞培地、例えばタンパク質混合物において培養してもよい。一部の態様では、タンパク質混合物は、ゲル状タンパク質混合物である。非限定的な例示的ゲル状タンパク質混合物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、エンゲルブレス−ホルム−スウォーム（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞によって分泌されるゲル状タンパク質混合物の商標名であり、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって市販されている。この混合物は多くの組織で見出される複雑な細胞外環境に類似し、細胞生物学者によって細胞培養のための基質として使用される。
【００３７】
[044]細胞を培養し、凝集体の面積および数を決定するためのこれらおよび他の技術は、米国特許第８，６５８，１３４号および国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１０３４９５号に記載され、これらは参照によりここに組み込まれる。
【００３８】
ＰＫＣイプシロンバイオマーカー
[045]「ＰＫＣイプシロンバイオマーカー」は、細胞がＡβペプチドで処理されるときのＰＫＣεにおける変化を測定するアッセイを指す。ここで用いるように、ＰＫＣイプシロンバイオマーカーのアウトプットシグナルを決定することは、（ｉ）対象からの１つ以上の細胞でＰＫＣεレベルを決定すること；（ｉｉ）１つ以上の細胞をＡβペプチドと接触させること；（ｉｉｉ）接触工程の後に工程（ｉｉ）の１つ以上の細胞でＰＫＣイプシロンレベルを決定すること；および（ｉｖ）Ａβペプチド濃度の関数としてのＰＫＣεレベルの変化の勾配（Ｓ）と切片（Ｉ）との比（Ｓ／Ｉ）としてアウトプットシグナルを計算することを含む。米国特許出願公開第２０１４／００３８１８６号は、Ａβペプチド、Ａβペプチドと細胞を接触させること、およびＰＫＣεレベルを決定することを開示し、参照によりここに組み込まれる。
【００３９】
[046]以下の例は、本発明のある特定の好ましい態様をさらに記載するために例示として提供され、本開示を限定するものではない。
【００４０】
［実施例］
[047]バイオマーカー重症度スコアの予測値は、ＡＤ指数バイオマーカー、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーを使用して調査した。形態測定画像化バイオマーカー、ＰＫＣイプシロンバイオマーカーおよびＡＤ指数バイオマーカーそれぞれのための３つのバイオマーカー、Ｌｎ（Ａ／Ｎ）、Ｓ／Ｉおよび（ｐＥＲＫ1／ｐＥＲＫ2）BK+−（ｐＥＲＫ1／ｐＥＲＫ2）BK-のアウトプットシグナルは、２つの患者集団、ＡＤおよびＡＣのために正規化した。バイオマーカーの正規化されたアウトプットシグナルは、年齢差の関数として示された。ＡＤ群については、年齢差は皮膚生検のための採収の年齢と、疾患の臨床発症の間であって、それは疾患期間の尺度であった。ＡＣ群については、現在の年齢をＡＣ群の最高年齢から引き算し、ＡＤ発症の左側にプロットした（図４Ａおよび４Ｂの縦の点線）。ＰＫＣεおよび形態測定画像化バイオマーカーのアウトプットシグナル、ならびにここに記載される年齢差は、５年の年齢区間の中で平均して、５年の年齢区間ごとの平均アウトプットシグナルおよび平均年齢差をもたらした。ＡＤ指数バイオマーカーについては、患者データが豊富であったため、この平均は必要でなかった。ＡＣ細胞のアウトプットシグナルは、疾患発症の左側にプロットした（図４Ａおよび４Ｂの縦の点線）。
【００４１】
[048]発明者らは、ＡＣ細胞で重症度スコアが一定であって、バイオマーカーのベースラインを表していることを見出した。例えば、図４Ａおよび４Ｂを参照。重症度スコアはまたＡＣおよびＡＤ細胞のアウトプットを有意に分離し、ＭＣＩ患者のバイオマーカー重症度スコアが入るだろうギャップ（４０％を超える）を残し、バイオマーカーの各々が認知症発症の数年前にＡＤのサインを検出することができ、ＡＤ認知症への進行の予測リスクを提供することを示す。例えば、図４Ａおよび４Ｂを参照。特に、結果は、分離「ギャップ」の中の重症度スコアで測定された患者は、ＡＤ認知症の段階およびその関連する病理学的特質に進行するシナプス喪失およびＭＣＩを有するという強力な証拠を提供した。バイオマーカー重症度スコアがＡＤ認知症発症の時まで次第に増加すること（例えば、図２Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ〜６Ｃ、７Ｂおよび８Ａ〜８Ｄを参照）、および、重症度スコアが認知症発症時にベースラインより有意に上にとどまったこと（例えば、図２Ａおよび２Ｂを参照）も見出された。
【００４２】
[049]３つのバイオマーカーのうちの２つは、ＡＤ群について年齢差（疾患期間）と線形のアウトプットシグナルの増加を示した（図３Ａおよび３Ｂの線形あてはめ線）。ＡＤの最も低い重症度スコアは、形態測定画像化バイオマーカーおよびＰＫＣイプシロンバイオマーカーの場合約１２％であった（図３Ａおよび３Ｂの線形あてはめ線とｙ軸との交点）。重症度スコアの約１２％のこの非ゼロの値は、両バイオマーカーが認知症の発症の前に患者を検出することができることを示唆する。この可能性を評価するために、バイオマーカーのアウトプットシグナルの最も低い値にアクセスするために、ＡＣ細胞の重症度スコアが含められた（図４Ａ、４Ｂ、５Ａおよび５Ｂ）。図３Ａおよび３Ｂの正規化手順のために、調査した年齢差の最大シグナルは１００％であった。しかし、ＡＤ群の年齢差（疾患期間）への重症度スコアの依存は、大きな年齢差を飽和させることが予想された。したがって、ＡＤ群における線形依存性は第１の近似としてだけ考えられ、大きな年齢差を飽和させたＳ字形／ロジスティック関数として潜在的に改善された近似を行った（図６Ａ〜６Ｃ）。
【００４３】
[050]その方法は参照によりここに組み込まれる、Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｅｒｋ１  ａｎｄ  Ｅｒｋ２  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ  ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２９；１０３（３５），１３２０３−７（２００６）、およびＫｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅａｒｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｕｔｏｐｓｙ−ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ，”Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ，３１（６），８８９−９００（２０１０）に記載されているように、ＡＤ指数バイオマーカーのアウトプットシグナルは、皮膚線維芽細胞をブラジキニン（ＢＫ＋）で処理したときのリン酸化されたＥＲＫ1とＥＲＫ2との比における変化として決定され、差（ｐＥＲＫ1／ｐＥＲＫ2）BK+−（ｐＥＲＫ1／ｐＥＲＫ2）BK-によって数量化した。図２Ａおよび２Ｂも参照。
【００４４】
[051]その方法は参照によりここに組み込まれる、Ｃｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  Ｓｃｒｅｅｎｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３３，１６５−１７６（２０１３）、およびＣｈｉｒｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｓ  ｗｉｔｈ  ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４２，１２７９−９４（２０１４）に記載されているように、Ｍａｔｒｉｇｅｌの厚い（１．８ｍｍ）基質の上で細胞を４８時間培養し、（Ａ／Ｎ）を決定するために画像分析ソフトウェアを使用することによって、形態測定画像化バイオマーカーのアウトプットシグナルを決定した。図３Ａも参照。
【００４５】
[052]その方法は参照によりここに組み込まれる、Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“ＰＫＣε  Ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｂｒａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１５；４３（２）：４９１−５０９に記載されているように、ＰＫＣイプシロンバイオマーカーのアウトプットシグナルは、細胞をβ−アミロイドアミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）の球状凝集体で処理したときのＰＫＣεの変化を測定することによって決定し、勾配（Ｓ）と切片（Ｉ）との比Ｓ／Ｉによって数量化した。図３Ｂも参照。
【００４６】
[053]図４Ａおよび４Ｂに示すように、形態測定画像化バイオマーカー（図４Ａ）とＰＫＣイプシロンバイオマーカー（図４Ｂ）の両方は、ＡＣ群の年齢差に伴うわずかな変化、ならびにＡＣとＡＤアウトプットの間の＞４０％の有意なギャップを示した。形態測定画像化バイオマーカーは、年齢差に伴うわずかな増加を示したが、ＰＫＣイプシロンはＡＣ群でわずかな低下を示した（図４Ａおよび４ＢのＡＣあてはめ線）。ＡＣ群の両バイオマーカーの重症度スコアは１５％未満であって、調べた年齢差でほとんど平らであった。年齢差がより負になるのに伴う下限の方への飽和も、ＡＣ群で予想された。したがって、線形近似は第１の近似であるだけであり、潜在的に改善された近似は下限を飽和させたＳ字形／ロジスティック関数であった。
【００４７】
[054]ＡＣとＡＤ群の間に有意なシグナルギャップがあったが、これらは、重症度スコアの正規化された形において、ＰＫＣイプシロンバイオマーカー（図４Ｂ）の場合約５０％のシグナルギャップおよび形態測定画像化バイオマーカー（図４Ａ）の場合約４０％のシグナルギャップであった）。このギャップは臨床試験でＭＣＩ患者と同定された集団の存在を示し（図１Ａおよび１Ｂを参照）、これらの２つのバイオマーカーが予測値を有することを示す。特に、ＭＣＩ患者は、シグナルが１５％を超え、５５％未満である、ＡＣとＡＤ群の間のギャップを埋めるはずである（図４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂおよび８Ａ〜８Ｄ）。
【００４８】
[055]第１の近似では、ＭＣＩ患者は、ＡＤ患者と同じ、年齢差に伴う線形傾向に従うだろうと仮定された（図５Ａおよび５Ｂの延長されたＡＤ線形あてはめ線）。だとすると、ＭＣＩ患者は、ＡＤ認知症発症（縦の線）の左側のＡＤとＡＣ集団の間のギャップを埋めるだろう（図５Ａおよび５Ｂを参照）。延長されたＡＤ線形あてはめ線と約１５％の重症度スコアとの交点から、どのくらいの時間だけ臨床発症の前に、これらの２つのバイオマーカーがＭＣＩ患者を検出することができるのかについての予測が得られた（図５Ａおよび５Ｂの下の水平矢印）。このアプローチの下で、形態測定画像化バイオマーカーは、臨床発症の約１０年前にＭＣＩ患者を検出したが、ＰＫＣεバイオマーカーは、臨床発症の＞２７年前に患者を検出した。形態測定画像化およびＰＫＣεバイオマーカーのための仮定のＭＣＩ患者（三角形）およびＡＤ発症までの予測された時間（上の水平矢印）は、図５Ａおよび５Ｂにそれぞれ示す。
【００４９】
[056]ＭＣＩ患者群の位置のための潜在的に改善された近似は、ロジスティック関数に従うと仮定された（図６Ａ〜６Ｃ）。ロジスティック関数と約１５％の重症度スコアとの交点から、どのくらいの時間だけ臨床発症よりも前に、バイオマーカーがＭＣＩ患者を検出することができるのかについての予測が得られた（図６Ａ〜６Ｃの水平矢印）。この近似では、形態測定画像化バイオマーカーは、臨床発症の約４年前にＭＣＩ患者を検出したが（図６Ａ）、ＰＫＣイプシロンバイオマーカーは臨床発症の約５年前にＭＣＩ患者を検出した（図６Ｂ）。さらに、ロジスティックあてはめ曲線とＡＤ発症垂直線との交点として決定されたカットオフ線は、それらのバイオマーカーの両方で同じ、すなわち約４５％であった。
【００５０】
[057]ＭＣＩ患者の位置は、ＡＣとＡＤ患者の間のギャップにあり、おそらくロジスティック型の曲線に従った。しかし、ＡＣ群は、ＡＤ発症垂直線から左側に若干の距離だけ離れているはずである。さらに、ＡＤ群は上限を、したがってシグナルの飽和を示すはずである。これらの考慮点は、これらの２つのバイオマーカーの予測値が、２つの適用された近似の間にあるはずであることを示す。したがって、形態測定画像化バイオマーカーは４年から１０年の間にＭＣＩ患者を検出することができるはずであり、ＰＫＣイプシロンバイオマーカーは５年から２５年の間にＭＣＩ患者を検出することができるはずであることが判明した。
【００５１】
[058]正規化された重症度スコアの形におけるバイオマーカーの顕著な重複は、図７Ａでロジスティックあてはめ関数によって表される。ＡＤ発症線とロジスティック曲線の間の交点として決定された屈折点は、形態測定画像化およびＰＫＣイプシロンバイオマーカーで事実上同じであった。図７Ｂは、３つの集団、ＡＣ、ＭＣＩおよびＡＤの、海馬歯状回の外側分子層におけるシナプスの総数の平均および平均ＭＭＳＥスコアのかなりの重複も示す。図７Ａおよび７Ｂは、３つのバイオマーカーがシナプスの喪失をなぞる（ｔｒａｃｋ）ことを示す。
【００５２】
[059]３つのバイオマーカーのアウトプットシグナルは、ノイズフリーでなかった。ノイズは、測定方法、機器または人為操作から生じ得る。図８Ａ〜８Ｄに示すように、ＡＣおよびＡＤ群のバイオマーカーのアウトプットシグナルをランク付けすることは、ノイズを軽減し、「年齢差」アプローチと類似の結果を生成した。３つのバイオマーカーのアウトプットシグナルのランク付けは、ＭＣＩ患者のＡＤとＡＣ群の間で同じギャップを示し、ロジスティック的な依存性はこの図でより明白だった（図８Ａ〜８Ｄ）。
【００５３】
[060]本開示で指摘する参考文献、特許および印刷刊行物の全ては、ここに参照により本出願に完全に組み込まれる。前述の態様は本開示の例であり、添付の請求項に示すように本発明の精神および範囲を逸脱しない範囲で修正または変更をその中に加えてもよいことを理解すべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【国際調査報告】
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