(57)【要約】  本発明は、ヒトＲＯＲ２を特異的に認識する抗体、抗体フラグメント又は抗原結合フラグメント、並びに関連抗体薬物複合体（ＡＤＣ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。また、様々な診断及び治療用途でこうした抗体を使用する方法も本発明に提供される。
2019509023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２（ＲＯＲ２）の細胞外ドメインと特異的に対し、第２抗体のものと同じ結合特異性で結合する、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントであって、前記第２抗体が、（ｉ）配列番号１と配列番１３；（ｉｉ）配列番号２と配列番号１４；（ｉｉｉ）配列番号３と配列番号１５；（ｉｖ）配列番号４と配列番号１６；（ｖ）配列番号５と配列番号１７；（ｖｉ）配列番号６と配列番号１８；（ｖｉｉ）配列番号７と配列番号１９；（ｖｉｉｉ）配列番号８と配列番号２０；（ｉｘ）配列番号９と配列番号２１；（ｘ）配列番号１０と配列番号２２；（ｘｉ）配列番号１１と配列番号２３；若しくは（ｘｉｉ）配列番号１２と配列番２４にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項２】
重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含み、その一方又は両方が、（ｉ）配列番号１と配列番１３；（ｉｉ）配列番号２と配列番号１４；（ｉｉｉ）配列番号３と配列番号１５；（ｉｖ）配列番号４と配列番号１６；（ｖ）配列番号５と配列番号１７；（ｖｉ）配列番号６と配列番号１８；（ｖｉｉ）配列番号７と配列番号１９；（ｖｉｉｉ）配列番号８と配列番号２０；（ｉｘ）配列番号９と配列番号２１；（ｘ）配列番号１０と配列番号２２；（ｘｉ）配列番号１１と配列番号２３；若しくは（ｘｉｉ）配列番号１２と配列番２４にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列に対して、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項３】
重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含み、その一方又は両方が、（ｉ）配列番号１と配列番１３；（ｉｉ）配列番号２と配列番号１４；（ｉｉｉ）配列番号３と配列番号１５；（ｉｖ）配列番号４と配列番号１６；（ｖ）配列番号５と配列番号１７；（ｖｉ）配列番号６と配列番号１８；（ｖｉｉ）配列番号７と配列番号１９；（ｖｉｉｉ）配列番号８と配列番号２０；（ｉｘ）配列番号９と配列番号２１；（ｘ）配列番号１０と配列番号２２；（ｘｉ）配列番号１１と配列番号２３；若しくは（ｘｉｉ）配列番号１２と配列番２４にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列と同一である、重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項４】
（ｉ）配列番号１と配列番１３；（ｉｉ）配列番号２と配列番号１４；（ｉｉｉ）配列番号３と配列番号１５；（ｉｖ）配列番号４と配列番号１６；（ｖ）配列番号５と配列番号１７；（ｖｉ）配列番号６と配列番号１８；（ｖｉｉ）配列番号７と配列番号１９；（ｖｉｉｉ）配列番号８と配列番号２０；（ｉｘ）配列番号９と配列番号２１；（ｘ）配列番号１０と配列番号２２；（ｘｉ）配列番号１１と配列番号２３；若しくは（ｘｉｉ）配列番号１２と配列番２４にそれぞれ示される重鎖可変領域配列と免疫グロブリン軽鎖可変領域配列とを含む、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項５】
（ｉ）配列番号２５〜２７と配列番号６１〜６３、（ｉｉ）配列番号２８〜３０と配列番号６４〜６６、（ｉｉｉ）配列番号３１〜３３と配列番号６７〜６９、（ｉｖ）配列番号３４〜３６と配列番号７０〜７２、（ｖ）配列番号３７〜３９と配列番号７３〜７５、（ｖｉ）配列番号４０〜４２と配列番号７６〜７８、（ｖｉｉ）配列番号４３〜４５と配列番号７９〜８１、（ｖｉｉｉ）配列番号４６〜４８と配列番号８２〜８４、（ｉｘ）配列番号４９〜５１と配列番号８５〜８７、（ｘ）配列番号５２〜５４と配列番号８８〜９０、（ｘｉ）配列番号５５〜５７と配列番号９１〜９３、若しくは（ｘｉｉ）配列番号５８〜６０と配列番号９４〜９６に対して、それぞれ少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一である、重鎖ＣＤＲ１〜３配列と軽鎖ＣＤＲ１〜３配列とを含む、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項６】
配列番号２５〜６０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項７】
配列番号６１〜９６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列をさらに含む、請求項６に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項８】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、それらは配列番号２５〜２７、配列番号２８〜３０、配列番号３１〜３３、配列番号３４〜３６、配列番号３７〜３９、配列番号４０〜４２、配列番号４３〜４５、配列番号４６〜４８、配列番号４９〜５１、配列番号５２〜５４、配列番号５５〜５７、若しくは配列番号５８〜６０とそれぞれ同一である、請求項６に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項９】
（ｉ）配列番号２５〜２７と配列番号６１〜６３、（ｉｉ）配列番号２８〜３０と配列番号６４〜６６、（ｉｉｉ）配列番号３１〜３３と配列番号６７〜６９、（ｉｖ）配列番号３４〜３６と配列番号７０〜７２、（ｖ）配列番号３７〜３９と配列番号７３〜７５、（ｖｉ）配列番号４０〜４２と配列番号７６〜７８、（ｖｉｉ）配列番号４３〜４５と配列番号７９〜８１、（ｖｉｉ）配列番号４６〜４８と配列番号８２〜８４、（ｉｘ）配列番号４９〜５１と配列番号８５〜８７、（ｘ）配列番号５２〜５４と配列番号８８〜９０、（ｘｉ）配列番号５５〜５７と配列番号９１〜９３、若しくは（ｘｉｉ）配列番号５８〜６０と配列番号９４〜９６にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列とを含む、請求項８に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項１０】
配列番号６１〜９６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項１１】
配列番号２５〜６０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列をさらに含む、請求項１０に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項１２】
軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、それらは配列番号６１〜６３、配列番号６４〜６６、配列番号６７〜６９、配列番号７０〜７２、配列番号７３〜７５、配列番号７６〜７８、配列番号７９〜８１、配列番号８２〜８４、配列番号８５〜８７、配列番号８８〜９０、配列番号９１〜９３、若しくは配列番号９４〜９６とそれぞれ同一である、請求項１０に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体又は抗体フラグメントが、キメラであるか、又はヒト化されている、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項１４】
前記抗体又は抗体フラグメントが、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、合成ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、非枯渇ＩｇＧ、ダイアボディ、若しくは二価抗体である、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項１５】
合成分子と結合している、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項１６】
前記合成分子が、細胞傷害剤、標識、治療用放射性同位体、又はリポソームである、請求項１５に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
【請求項１７】
前記細胞傷害剤が、低分子量毒素、又はペプチド毒素、又はタンパク質毒素から選択される、請求項１６に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
請求項１に記載の抗体又はその抗体フラグメントと少なくとも１種の細胞傷害剤とを含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項１９】
前記細胞傷害剤が、低分子量毒素、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素である、請求項１８に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２０】
前記抗体又はその抗体フラグメントが、ソルターゼ酵素媒介抗体結合（ＳＭＡＣ）を介して細胞傷害剤と結合している、請求項１８に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２１】
前記細胞傷害剤が、アントラサイクリン（ＰＮＵ）毒素誘導体Ｇｌｙ(n)−ＥＤＡ−ＰＮＵであり、ここで、ｎは、１〜２１の任意の数である、請求項２０に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２２】
前記抗体又はその抗体フラグメントが、キメラであるか、又はヒト化されている、請求項１８に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２３】
前記抗体又はその抗体フラグメントが、以下：（１）配列番号２５〜２７と配列番号６１〜６３、（２）配列番号４３〜４５と配列番号７９〜８１、（３）配列番号４６〜４８と配列番号８２〜８４、（４）配列番号５２〜５４と配列番号８８〜９０、（５）配列番号３４〜３６と配列番号７０〜７２、若しくは（６）配列番号５８〜６０と配列番号９４〜９６にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列とを含む、請求項１８に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２４】
前記抗体又はその抗体フラグメントが、以下：（１）配列番号１と配列番１３；（２）配列番号７と配列番号１９；（３）配列番号８と配列番号２０；（４）配列番号１０と配列番号２２；（５）配列番号４と配列番号１６；若しくは（６）配列番号１２と配列番号２４にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、請求項１８に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２５】
膜貫通領域及び細胞内Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインと融合した請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２６】
前記抗体又はその抗体フラグメントが、キメラであるか、又はヒト化されている、請求項２５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２７】
前記抗体又はその抗体フラグメントが、配列番号２５〜２７及び配列番号６１〜６３にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列とを含む、請求項２５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２８】
前記抗体又はその抗体フラグメントが、配列番号１及び配列番号１３にそれぞれ示される重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２９】
（１）治療有効量の（ａ）請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質若しくはその抗体フラグメント又は（ｂ）請求項１８に記載の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）と、（２）薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３０】
（１）請求項１に記載の抗体若しくは抗原結合フラグメント又は（２）請求項１８に記載の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む、キット。
【請求項３１】
請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質若しくはその抗体フラグメントの重鎖又は軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３３】
対象においてＲＯＲ２を発現する細胞を殺傷するか、又はその増殖を阻害する方法であって、請求項２９に記載の医薬組成物を、それが必要な対象に投与し、これにより、前記対象においてＲＯＲ２を発現する前記細胞を殺傷するか、又はその増殖を阻害するステップを含む、方法。
【請求項３４】
前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記医薬組成物が、（１）請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質若しくはその抗体フラグメントと、（２）細胞傷害剤とを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞傷害剤が、低分子量毒素、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
対象においてＲＯＲ２の発現増大に関連する疾患又は状態を治療する方法であって、請求項２９に記載の医薬組成物を、ＲＯＲ２の発現増大に関連する疾患又は状態を有する対象に投与し、これにより、前記対象においてＲＯＲ２の発現増大に関連する前記疾患又は状態を治療するステップを含む方法。
【請求項３８】
前記疾患又は状態が、癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患又は状態が、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、又は多発性骨髄腫である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記医薬組成物が、（１）請求項１に記載の抗体又はその抗体フラグメントと、（２）細胞傷害剤とを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞傷害剤が、低分子量毒素、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体又は抗体フラグメントが、膜貫通領域及び細胞内Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインと融合して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／２８０，８３４号明細書（２０１６年１月２０日出願）に対する優先権の利益を主張する。優先出願の全開示内容は、全体として、及びあらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
癌は、主な死亡原因の１つである。これは、細胞の不死化を招く遺伝子変化、例えば、染色体転位、腫瘍抑制遺伝子、転写因子若しくは増殖因子受容体の突然変異などに起因する、正常細胞の悪性形質転換によって引き起こされる疾患の１クラスである。不死化が、過剰増殖と組み合わされると、不死化細胞は、転移を伴う、若しくは伴わない（固形腫瘍の場合）腫瘍、又は白血病及びリンパ腫（血液の癌）を発生する。アポトーシス、又はプログラム細胞死の欠損は、癌を引き起こす細胞の悪性形質転換にさらに寄与し得る。
【０００３】
受容体チロシンキナーゼオーファン受容体−１及び−２（ＲＯＲ１及びＲＯＲ２）から構成される膜結合性受容体チロシンキナーゼのファミリーは、特定の癌に特に関連するものとして記載されている（Ｒｅｂａｇａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．２（３４））が、少なくともＲＯＲ１の場合、ごくわずかな例外を除いて、正常組織上の発現にはほとんど存在しない（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８−０４３２）。ＲＯＲ発現が、腫瘍発生と機能的に関連しているか否かは依然として不明のままである。しかし、ＲＯＲファミリーメンバーの極めて腫瘍選択的な発現のために、これらは、標的癌療法にとって適切な標的を代表するものである。重要なことには、ＲＯＲ２は、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、多発性骨髄腫及びその他の癌において腫瘍細胞表面上に発現される。
【０００４】
正常生理学では、ＲＯＲ２は、胚発生中の骨及び軟骨成長の様々な状況の原因となる。誕生後、ＲＯＲ２の発現は下方制御されるため、ＲＯＲ２は、通常、成体組織において検出できないか、又は非常に低いレベルで発現される。ＲＯＲ２の弱い発現は、胃及び胸腺組織に報告されているに過ぎない（Ｍｏｒｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１００：１２２７−１２３３，２００９）。ＲＯＲ２は、以前からＲＯＲ２特異的抗体の開発のための標的として認識されている（国際公開第２０１３１０３６３７号パンプレット）。しかし、文献に記載される既知の配列を有するｈＲＯＲ２標的に対する抗体はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、ＲＯＲ２発現癌の抗体による標的療法の開発の基礎として用いることができる高品質の抗ＲＯＲ２結合抗体のニーズがある。さらには、例えば、ウエスタンブロッティング及び／又は免疫組織化学（ＩＨＣ）などの、ＲＯＲ２関連疾患状態におけるＲＯＲ２発現を検出するための追加的診断ツールに対するニーズも存在する。本発明は、これらの、及び他のニーズに取り組むことに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、ヒト受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２（ｈＲＯＲ２）の細胞外ドメインに特異的に結合し、且つ、哺乳動物細胞に発現されるヒトＲＯＲ２（ｈＲＯＲ２）細胞外ドメインをベイトとして用いて、非免疫ウサギの高度に多様なファージディスプレイライブラリーから選択された、ウサギ抗体の新規の高親和性結合ドメインを提供する。ウサギ抗体の可変領域は、組換えタンパク質として、また、哺乳動物宿主細胞の表面に過剰発現されるｈＲＯＲ２の結合に基づいて、ｈＲＯＲ２のＥＣＤに対する結合についてスクリーニングすることにより、選択されている。この戦略によって、高品質及び好都合な機能的特性の新規のｈＲＯＲ２抗体が同定されている。さらに、本発明は、ヒトＩｇＣ1抗体の定常領域ドメインに融合されたウサギ可変ドメインのキメラ完全長抗体を提供する。
【０００７】
本発明の第２の態様では、超強力アントラサイクリン毒素を含むキメラウサギ−ヒト抗ヒトＲＯＲ２（ｈＲＯＲ２）抗体に基づく部位特異的結合抗体薬物複合体（ＡＤＣ）が本発明によって提供される。部位特異的結合は、国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレットに実質的に開示されているように、ソルターゼ酵素を用いた酵素結合によって達成される。インビトロで高い効力を有する抗ｈＲＯＲ２  ＡＤＣをもたらす超強力アントラサイクリン毒素は、国際公開第２０１６１０２６７９号パンフレット（本明細書に参照により組み込まれる）に開示されている。
【０００８】
最後に、本発明は、インビトロで高い効果を示す前記抗ｈＲＯＲ２結合ドメインを使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びこれらのＣＡＲで作製されたＴ細胞、すなわち、いわゆるＣＡＲ−Ｔ細胞を提供する。
【０００９】
従って、本発明は、以下：（ｉ）配列番号１と配列番１３；（ｉｉ）配列番号２と配列番号１４；（ｉｉｉ）配列番号３と配列番号１５；（ｉｖ）配列番号４と配列番号１６；（ｖ）配列番号５と配列番号１７；（ｖｉ）配列番号６と配列番号１８；（ｖｉｉ）配列番号７と配列番号１９；（ｖｉｉ）配列番号８と配列番号２０；（ｉｘ）配列番号９と配列番号２１；（ｘ）配列番号１０と配列番号２２；（ｘｉ）配列番号１１と配列番号２３；若しくは（ｘｉｉ）配列番号１２と配列番２４にそれぞれ示される、免疫グロブリン重鎖可変領域配列と免疫グロブリン軽鎖可変領域配列とを含むｈＲＯＲ２特異的抗体のものと同じｈＲＯＲ２に対する結合特異性を有する、抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント（抗原結合フラグメント）、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１０】
本発明は、さらに、一方又は両方が、以下：（ｉ）配列番号１と配列番１３；（ｉｉ）配列番号２と配列番号１４；（ｉｉｉ）配列番号３と配列番号１５；（ｉｖ）配列番号４と配列番号１６；（ｖ）配列番号５と配列番号１７；（ｖｉ）配列番号６と配列番号１８；（ｖｉｉ）配列番号７と配列番号１９；（ｖｉｉｉ）配列番号８と配列番号２０；（ｉｘ）配列番号９と配列番号２１；（ｘ）配列番号１０と配列番号２２；（ｘｉ）配列番号１１と配列番号２３；若しくは（ｘｉｉ）配列番号１２と配列番２４にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列又は軽鎖可変領域配列に対して、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％、又は９５％超で、且つ１００％未満同一である、重鎖可変領域配列又は軽鎖可変領域配列を含む、抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１１】
本発明は、さらに、一方又は両方が、以下：（ｉ）配列番号１と配列番１３；（ｉｉ）配列番号２と配列番号１４；（ｉｉｉ）配列番号３と配列番号１５；（ｉｖ）配列番号４と配列番号１６；（ｖ）配列番号５と配列番号１７；（ｖｉ）配列番号６と配列番号１８；（ｖｉｉ）配列番号７と配列番号１９；（ｖｉｉｉ）配列番号８と配列番号２０；（ｉｘ）配列番号９と配列番号２１；（ｘ）配列番号１０と配列番号２２；（ｘｉ）配列番号１１と配列番号２３；若しくは（ｘｉｉ）配列番号１２と配列番２４にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列と同一である、重鎖可変領域配列又は軽鎖可変領域配列を含む、抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１２】
本発明は、さらに、以下：（ｉ）配列番号２５〜２７と配列番号６１〜６３、（ｉｉ）配列番号２８〜３０と配列番号６４〜６６、（ｉｉｉ）配列番号３１〜３３と配列番号６７〜６９、（ｉｖ）配列番号３４〜３６と配列番号７０〜７２、（ｖ）配列番号３７〜３９と配列番号７３〜７５、（ｖｉ）配列番号４０〜４２と配列番号７６〜７８、（ｖｉｉ）配列番号４３〜４５と配列番号７９〜８１、（ｖｉｉｉ）配列番号４６〜４８と配列番号８２〜８４、（ｉｘ）配列番号４９〜５１と配列番号８５〜８７、（ｘ）配列番号５２〜５４と配列番号８８〜９０、（ｘｉ）配列番号５５〜５７と配列番号９１〜９３、若しくは（ｘｉｉ）配列番号５８〜６０と配列番号９４〜９６に対して、それぞれ少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％、又は９５％超で、且つ１００％未満同一である、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ配列と免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ配列とを含む、抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１３】
本発明は、さらに、以下：（ｉ）配列番号２５〜２７と配列番号６１〜６３、（ｉｉ）配列番号２８〜３０と配列番号６４〜６６、（ｉｉｉ）配列番号３１〜３３と配列番号６７〜６９、（ｉｖ）配列番号３４〜３６と配列番号７０〜７２、（ｖ）配列番号３７〜３９と配列番号７３〜７５、（ｖｉ）配列番号４０〜４２と配列番号７６〜７８、（ｖｉｉ）配列番号４３〜４５と配列番号７９〜８１、（ｖｉｉｉ）配列番号４６〜４８と配列番号８２〜８４、（ｉｘ）配列番号４９〜５１と配列番号８５〜８７、（ｘ）配列番号５２〜５４と配列番号８８〜９０、（ｘｉ）配列番号５５〜５７と配列番号９１〜９３、若しくは（ｘｉｉ）配列番号５８〜６０と配列番号９４〜９６とそれぞれ同一である、重鎖ＣＤＲ１〜３配列と軽鎖ＣＤＲ１〜３配列とを含む、本発明の抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１４】
本発明は、さらに、以下：（ｉ）配列番号１と配列番１３；（ｉｉ）配列番号２と配列番号１４；（ｉｉｉ）配列番号３と配列番号１５；（ｉｖ）配列番号４と配列番号１６；（ｖ）配列番号５と配列番号１７；（ｖｉ）配列番号６と配列番号１８；（ｖｉｉ）配列番号７と配列番号１９；（ｖｉｉｉ）配列番号８と配列番号２０；（ｉｘ）配列番号９と配列番号２１；（ｘ）配列番号１０と配列番号２２；（ｘｉ）配列番号１１と配列番号２３；若しくは（ｘｉｉ）配列番号１２と配列番２４にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、本発明の抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１５】
本発明は、さらに、配列番号２５〜６０からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ配列を含む、本発明の抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。これらの分子の一部は、配列番号６１〜９６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列をさらに含む。
【００１６】
本発明は、さらに、以下：配列番号２５〜２７、配列番号２８〜３０、配列番号３１〜３３、配列番号３４〜３６、配列番号３７〜３９、配列番号４０〜４２、配列番号４３〜４５、配列番号４６〜４８、配列番号４９〜５１、配列番号５２〜５４、配列番号５５〜５７、若しくは配列番号５８〜６０とそれぞれ同一である、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む、抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１７】
本発明は、さらに、配列番号６１〜９６からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、本発明の抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。これらの分子の一部は、配列番号２５〜６０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列をさらに含む。
【００１８】
本発明は、さらに、以下：配列番号６１〜６３、配列番号６４〜６６、配列番号６７〜６９、配列番号７０〜７２、配列番号７３〜７５、配列番号７６〜７８、配列番号７９〜８１、配列番号８２〜８４、配列番号８５〜８７、配列番号８８〜９０、配列番号９１〜９３、若しくは配列番号９４〜９６とそれぞれ同一である、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む、抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００１９】
本発明は、さらに、以下：（ｉ）配列番号２５〜２７と配列番号６１〜６３、（ｉｉ）配列番号２８〜３０と配列番号６４〜６６、（ｉｉｉ）配列番号３１〜３３と配列番号６７〜６９、（ｉｖ）配列番号３４〜３６と配列番号７０〜７２、（ｖ）配列番号３７〜３９と配列番号７３〜７５、（ｖｉ）配列番号４０〜４２と配列番号７６〜７８、（ｖｉｉ）配列番号４３〜４５と配列番号７９〜８１、（ｖｉｉｉ）配列番号４６〜４８と配列番号８２〜８４、（ｉｘ）配列番号４９〜５１と配列番号８５〜８７、（ｘ）配列番号５２〜５４と配列番号８８〜９０、（ｘｉ）配列番号５５〜５７と配列番号９１〜９３、若しくは（ｘｉｉ）配列番号５８〜６０と配列番号９４〜９６にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列とを含む、抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲに関する。
【００２０】
様々な実施形態では、本発明の抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントは、以下：ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４若しくはＩｇＭアイソタイプ、又はそれらのＦ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２フラグメント、又は非枯渇ＩｇＧ、ダイアボディ、若しくは二価抗体のいずれかであってよい。一部の実施形態では、抗ｈＲＯＲ２抗体又は抗体ベースの結合タンパク質は、天然に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４アイソタイプ、又は合成ＩｇＧからなる群から選択されるＩｇＧである。一部の他の実施形態では、抗ｈＲＯＲ２抗体フラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はｄｓＦｖである。一部の実施形態では、抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントは、合成分子と結合している。これらの実施形態の一部では、抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントは、膜貫通領域及び細胞内Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインと結合して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する。
【００２１】
本発明は、さらに、ｈＲＯＲ２特異的細胞の殺傷をもたらす毒素ペイロードと一緒に、本発明のｈＲＯＲ２特異的抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。前記ＡＤＣにおいて、毒素ペイロードは、マレイミド官能基を有する古典的な化学リンカー、又はリシン若しくはシステインアミノ酸側鎖との結合を媒介することができる当技術分野で公知の他の化学物質を使用し、リシン若しくはシステインアミノ酸側鎖を介して、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメントと非部位特異的に結合することができる。前記ＡＤＣでは、低分子量ペイロードは、例えば、二官能価リンカー、ホルミル−グリシン形成酵素修飾抗体上でピクテ・スペングラー（Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ）化学を可能にするリンカー、グリカン−再モデル化抗体、又は細菌トランスグルタミナーゼ若しくはソルターゼ酵素のように、当技術分野で公知の化学、化学−酵素、若しくは酵素結合のいずれかによって、部位特異的に結合することもできる。
【００２２】
関連する一態様では、本発明は、治療に有効な量の本発明の抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）と、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物を提供する。また、本明細書に開示する抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント若しくは抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の少なくとも１つを含む医薬組成物又はキットも本発明に提供される。さらに、本明細書に開示する抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲの免疫グロブリン重鎖若しくは免疫グロブリン軽鎖の可変領域をコードする、単離された若しくは実質的に精製されたポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも本発明に提供される。
【００２３】
別の態様では、本発明は、対象においてｈＲＯＲ２を発現する細胞を殺傷するか、又はその増殖を阻害する方法を提供する。これらの方法は、本明細書に開示する治療有効量の抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲを、治療が必要な対象に投与するステップを含む。これにより、対象においてｈＲＯＲ２を発現する細胞を殺傷するか、又はその増殖を阻害することが可能になる。様々な実施形態では、ｈＲＯＲ２を発現する細胞は、腫瘍細胞である。関連する態様では、本発明は、対象において、ｈＲＯＲ２の発現増大に関連する疾患又は状態を治療する方法を提供する。これらの方法は、治療有効量の本発明の抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲを、ｈＲＯＲ２の発現増大に関連する疾患又は状態に罹患した対象に投与するステップを含む。これにより、対象において、疾患又は状態の治療が可能になる。これらの治療法の一部は、対象の癌の治療に関する。本発明の方法による治療に適した癌として、例えば、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌及び多発性骨髄腫が挙げられる。様々な実施形態では、投与される抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、又はそれらに基づく抗体薬物複合体（ＡＤＣ）若しくはＣＡＲは、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、（ｓｃＦｖ）２、又は合成ＩｇＧである。一部の方法では、投与される抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、合成分子と結合している。これらの実施形態の一部では、投与される抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントは、膜貫通領域及び細胞内Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインに結合されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、対象に投与しようとするＴ細胞上に存在する。一部の他の実施形態では、抗体は、細胞傷害剤、放射性同位体、又はリポソームに結合することができる。
【００２４】
別の態様では、本発明は、対象におけるＲＯＲ２レベルの変化を検出する方法を提供する。この方法は、以下：（ａ）対象から生体サンプルを取得するステップ；（ｂ）サンプルを、本明細書に開示する抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントと接触させるステップ；（ｃ）生体サンプル中のＲＯＲ２のレベルを決定するステップ；並びに（ｄ）生体サンプル中のＲＯＲ２のレベルとＲＯＲ２のコントロールレベルを比較するステップを含む。これにより、生体サンプル中のＲＯＲ２レベルが、ＲＯＲ２のコントロールレベルに対して変化しているか否かを決定することができる。これらの方法では、コントロールレベルに対して、対象のＲＯＲ２レベルの増加は、対象におけるＲＯＲ２の発現増大に関連する疾患又は状態を示す。例えば、ＲＯＲ２の発現増大の検出は、対象における神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、又は多発性骨髄腫の存在を示し得る。
【００２５】
また別の態様では、本発明は、対象においてＲＯＲ２発現腫瘍を検出する方法を提供する。これらの方法は、（ａ）ＲＯＲ２発現腫瘍を有する、有することが疑われる、若しくは、それを発生するリスクがある対象に、本発明の抗ｈＲＯＲ２抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを投与するステップ；及び（ｂ）変化した結合標識密度若しくは濃度の領域について対象をイメージするステップを含み、ここで、密度若しくは濃度は、（ｉ）近傍組織中のバックグラウンド又は（ｉｉ）対象の同じ領域中で以前検出された密度若しくは濃度と比較される。変化した結合標識密度若しくは濃度の領域の存在は、対象におけるＲＯＲ２発現腫瘍の存在の指標である。
【００２６】
本明細書の残りの部分及び請求項を参照にすることにより、本発明の性質及び利点はさらに理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】表示の通り、新規のウサギ抗ｈＲＯＲ２ｍＡｂの可変免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を示す。ウサギ可変ドメイン（Ｖκ、Ｖλ、及びＶH）クローンのアミノ酸配列アラインメントは、Ｋａｂａｔ番号付けを用いて、フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）と一緒に示される。図には、ＸＢＲ２−４０１、ＸＢＲ２−４１６、ＸＢＲ２−４３３、ＸＢＲ２−３２７、ＸＢＲ２−ＴＯＰ９、ＸＢＲ２−ＴＯ７２、ＥＲＲ２−３０２、ＥＲＲ２−３０８、ＥＲＲ２−３１６、ＥＲＲ２−３１７、ＥＲＲ２−ＴＯＰ２、及びＥＲＲ２−ＴＯＰ３５と称される１２の抗体の重鎖可変ドメイン鎖配列（それぞれ、配列番号１〜１２）と軽鎖可変ドメイン配列（それぞれ、配列番号１３〜２４）が示される。図に示すように、クローンＸＢＲ２−４０１、ＸＢＲ２−４１６、ＸＢＲ２−３２７、ＸＢＲ２−ＴＯＰ９、ＥＲＲ２−３０８、ＥＲＲ２−３１６、ＥＲＲ２−３１７、及びＥＲＲ２−ＴＯＰ２は、免疫グロブリンκ軽鎖の可変ドメインを含み、抗体ＸＢＲ２−４３３、ＸＢＲ２−ＴＯＰ７２、ＥＲＲ２−３０２、及びＥＲＲ２−ＴＯＰ３５は、免疫グロブリンλ軽鎖の可変ドメインを含む。
【図２】ＲＯＲ２に対するキメラウサギ／ヒトＦａｂの結合活性を示す。（Ａ）固定化されたヒトＲＯＲ２（ｈＦｃ−ｈＲＯＲ２）に対する各キメラウサギ／ヒトＦａｂの結合。ｈＲＯＲ２特異性のコントロールとして、哺乳動物細胞に発現されたＲＯＲ２の姉妹分子、ｈＲＯＲ１（ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１）及び非関連コントロールとしてのＢＳＡを用いたＥＬＩＳＡを、ｈＦｃ−ｈＲＯＲ２に対するファージディスプレイセレクションで同定された様々な新規の抗体と共に実施した。（Ｂ）このパネルは、マウスＢ前駆細胞（６３−１２）表面に異所性発現されたｈＲＯＲ２に対するキメラウサギ／ヒトＦａｂの結合を示し、これは、フローサイトメトリーにより分析される。
【図３】同定された新規抗体のエピトープマッピング試験のためにＨＥＫ２９３Ｆ細胞に展示された様々なｈＲＯＲ２ドメインタンパク質及びコントロールタンパク質の構造の概略図である。ヒトＲＯＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の様々な単離されたドメイン又はコントロールドメインを含む８つの構築物をクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に安定してトランスフェクトした。
【図４】組換えにより発現されたヒトＲＯＲ２（ｈＲＯＲ２）に対する様々な抗体の結合を示す。（Ａ）アミノ酸２４５位に異なるＳＮＰを有するｈＲＯＲ２及びマウスＲＯＲ２（ｍＲＯＲ２）のＨＥＫ２９３Ｆ細胞における異所性発現を、市販のビオチン化ラット抗ヘマグルチニン（ＨＡ）モノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ）、続いてフィコエリスリン（ＰＥ）結合ストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いたフローサイトメトリーにより検出した。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｆ細胞表面上に展示されたｈＲＯＲ２−Ｔ２４５、ｈＲＯＲ２−Ａ２４５及びｍＲＯＲに対する新規のキメラウサギ／ヒトＦａｂ各々の結合をフローサイトメトリーにより分析した。
【図５】フローサイトメトリーによるｍＡｂ  ＸＢＲ２−４０１についてのエピトープマッピング試験を示す。キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１  ＸＢＲ２−４０１のエピトープは、ｈＲＯＲ２−Ｔ２４５の３つの細胞外ドメイン（免疫グロブリン、フリズル（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）及びクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメイン、Ｉｇ、Ｆｒ及びＫｉと略）の異なる組成を展示するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いたフローサイトメトリーにより決定した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞上に発現したｈＲＯＲ２  Ｉｇ、Ｆｒ、Ｋｉ、Ｉｇ＋Ｆｒ、Ｆｒ＋Ｋｉ及び完全ＥＣＤ（細胞外ドメイン）に対する結合をフローサイトメトリーにより検出した。
【図６】フローサイトメトリーによるＸＢＲ２−４３３についてのエピトープマッピング試験を示す。キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１  ＸＢＲ２−４３３のエピトープは、ＲＯＲ２−Ｔ２４５の３つの細胞外ドメイン（免疫グロブリン、フリズル（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）及びクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメイン、Ｉｇ、Ｆｒ及びＫｉと略）の異なる組成を展示するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いたフローサイトメトリーにより決定した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞上に発現したｈＲＯＲ２  Ｉｇ、Ｆｒ、Ｋｉ、Ｉｇ＋Ｆｒ、Ｆｒ＋Ｋｉ及び完全ＥＣＤ（細胞外ドメイン）に対する結合をフローサイトメトリーにより検出した。
【図７】フローサイトメトリーによるＸＢＲ２−４１６についてのエピトープマッピング試験を示す。キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１  ＸＢＲ２−４１６のエピトープは、ｈＲＯＲ２−Ｔ２４５の３つの細胞外ドメイン（免疫グロブリン、フリズル（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）及びクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメイン、Ｉｇ、Ｆｒ及びＫｉと略）の異なる組成を展示するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いたフローサイトメトリーにより決定した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞上に発現したｈＲＯＲ２  Ｉｇ、Ｆｒ、Ｋｉ、Ｉｇ＋Ｆｒ、Ｆｒ＋Ｋｉ及び完全ＥＣＤ（細胞外ドメイン）に対する結合をフローサイトメトリーにより検出した。
【図８】フローサイトメトリーによる１０のキメラウサギ／ヒトＦａｂについてのエピトープマッピング試験を示す。各キメラウサギ／ヒトＦａｂのエピトープは、ｈＲＯＲ２−Ｔ２４５の３つの細胞外ドメイン（免疫グロブリン、フリズル（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）及びクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメイン、Ｉｇ、Ｆｒ及びＫｉと略）の異なる組成物を展示するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いたフローサイトメトリーにより決定した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞上に発現したｈＲＯＲ２  Ｉｇ、Ｆｒ、Ｋｉ、Ｉｇ＋Ｆｒ、Ｆｒ＋Ｋｉ及び完全ＥＣＤ（細胞外ドメイン）に対する結合をフローサイトメトリーにより検出した。
【図９】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により実施されるエピトープ結合試験を示す。ＣＭ５チップ上に固定化した抗ヒトＦｃγ抗体によって捕捉されたｈＦｃ−ｈＲＯＲ１に対する様々なＦａｂの結合について得られたＳＰＲセンソグラムを示す。独立の、且つオーバーラップするエピトープを同定するために、異なる順序及び混合物でＦａｂを注射した。これまでに存在したＦａｂについて観測された値を上回る共鳴ユニット（ＲＵ、ｙ軸）の増大は、これらが同時結合を可能にすることから、独立のエピトープを示した。例えば、Ｆａｂ  ＸＢＲ２−ＴＯＰ７２、ＸＢＲ２−３２７、ＥＲＲ２−ＴＯＰ２、ＸＢＲ２−４１６、及びＸＢＲ２−４０１の組合せについて観測されたＲＵ（右側グラフ）は、ＸＢＲ２−４０１のみ、又はＸＢＲ２−３２７、ＥＲＲ２−ＴＯＰ２、ＸＢＲ２−４１６、及びＸＢＲ２−４０１の組合せについて観測された値を上回ったが、これは、これら５つのＦａｂ全てが、ヒトＲＯＲ２に、従って、タンパク質の異なる領域に同時に結合することができることを示している。ｘ軸は、秒（ｓ）単位の時間を示す。
【図１０】表面プラズモン共鳴による、ｈＲＯＲ２  ＥＣＤに対する抗ｈＲＯＲ２特異的Ｆａｂの親和性測定を示す。（Ａ）即時バックグラウンド除去後のＣＭ５チップに固定化された抗ヒトＦｃγ抗体によって捕捉されたＦｃ−ｈＲＯＲ２に対する各Ｆａｂの結合について得られたＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００センソグラムを示す。５つの様々な濃度でＦａｂを注射したが、その最高濃度を表（Ｂ）に示し、５つの濃度の１つを２回反復して試験した。（Ｂ）表には、各Ｆａｂの一価親和性が示される。平衡解離定数（Ｋd）は、ｋoff／ｋon（ｋon、会合速度定数；ｋoff、解離速度定数）から算出した。
【図１１】フローサイトメトリーにより測定した、乳癌細胞株上に発現される内在性ｈＲＯＲ２に対する、選択したキメラウサギ／ヒトＩｇＧ１の結合活性を示す。ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄは、ｈＲＯＲ２を発現することがわかっており、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ｈＲＯＲ２について陰性であることがわかっている。対照的に、Ｔ４７Ｄは、ＲＯＲ１陰性であることがわかっており、また、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＲＯＲ１発現について陽性であることがわかっている。（Ａ）乳癌細胞株上での内在性ｈＲＯＲ２の発現は、市販のヤギ抗ヒトＲＯＲ２ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）2ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いたフローサイトメトリーにより検出した。（Ｂ）キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１とｈＲＯＲ２の結合を、ヒトＴ４７Ｄ乳癌細胞の細胞表面上で、フローサイトメトリーにより検出した。ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞は、ネガティブコントロール細胞株として使用した。
【図１２】非トランスフェクト６３−１２細胞（レーン２）、並びにｈＲＯＲ１（レーン１）又はｈＲＯＲ２（レーン３）を異所性発現する６３−１２細胞の溶解物を用いたウエスタンブロッティング実験における変性ｈＲＯＲ２に対するキメラウサギ／ヒトＩｇＧ１  ＸＢＲ２−４０１の結合活性を示す。さらに、ウエスタンブロッティングを用いて、ｈＲＯＲ２（レーン４）又はｈＲＯＲ１（レーン５）の精製済細胞外ドメインに対する結合を決定した。
【図１３】本発明に開示する部位特異的結合ＡＤＣがどのようにして作製されるかを概略的に示す。（Ａ）国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレットに開示されているように、ソルターゼ酵素媒介抗体結合（ＳＭＡＣ−技術）の機構を概略的に示す。部位特異的結合ＡＤＣを作製するために、組換え抗体は、Ｃ末端ペンタペプチドモチーフＬＰＸＴＧ（配列番号１３９）と一緒に発現する必要があり、このモチーフは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼ酵素Ａ（ＳｒｔＡ）の認識部位として役立つ。グリシン修飾毒素基質を、抗体及びソルターゼＡ酵素を含有するペンタペプチドモチーフＬＰＸＴＧと一緒にインキュベートすると、ソルターゼＡ酵素は、グリシン修飾毒素が、ＬＰＸＴＧモチーフのＣ末端グリシンに取って代わり、残るＬＰＸＴ（配列番号１４２）配列のトレオニンと共有結合することによりペプチド転移反応を触媒する。このようにして、部位特異的結合及びＣ末端毒素結合ＡＤＣを高効率で作製することができる。（Ｂ）は、国際公開第２０１６１０２６９７号パンフレットに開示されているように、好ましい毒素の構造、すなわち、アントラサイクリン構造のＣ１３におけるカルボニル基に５×グリシン区間を連結するグリシン（５×）−エチレン−ジアミノ（Ｇｌｙ(5)−ＥＤＡ）リンカーを含むＰＮＵ−１５９６８２誘導体を示す。
【図１４】ヒト及びマウスＲＯＲ２の組換えＥＣＤに対する完全長ＩｇＧ１抗体の結合を示す。パネル（Ａ）及び（Ｂ）は、ＥＬＩＳＡにより分析したヒト及びマウスＲＯＲ２の精製済組換えＥＣＤに対する完全長キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１抗体として発現される、選択した本発明のクローンの結合特異性を示す。パネル（Ｃ）及び（Ｄ）は、ＥＬＩＳＡにより分析したヒト及びカニクイザルＲＯＲ２の精製済組換えＥＣＤに対する完全長キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１抗体として発現される、本発明の選択クローンの結合特異性を示す。
【図１５】（Ｂ）マウス乳癌細胞株ＥＭＴ６、又は（Ａ）ヒトＲＯＲ２トランスフェクトＥＭＴ６細胞（クローン１４）に対する完全長キメラウサギ−ヒトＩｇＧ１として発現された本発明の選択クローンを用いて作製された部位特異的結合ＰＮＵ−ＡＤＣのインビトロ細胞殺傷活性を示す。無関係の特異性を有する非関連ＰＮＵ−ＡＤＣをアイソタイプ適合コントロールＡＤＣとして使用した。パネル（Ｃ）は、非トランスフェクトＥＭＴ６細胞に対する、ｈＲＯＲ２トランスフェクトＥＭＴ６クローン１４でのｈＲＯＲ２の相対発現を示し、これは、ｈＲＯＲ２特異的抗体を用いたフローサイトメトリーにより検出される。
【図１６】ＲＯＲ２陰性ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、並びに短い及び長いスペーサを有するＲＯＲ２陽性ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄに対するＲＯＲ２ターゲティングＸＢＲ２−４０１  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ活性の比較を示す。上のパネルは、ＲＯＲ２陰性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＲＯＲ２陽性Ｔ４７Ｄ細胞との同時培養時の、表示のように、ＣＡＲ（長い及び短いスペーサ）を含む、又は含まないＴ細胞の細胞増殖を示し、これは、ＣＦＳＥ染色により分析される。ＲＯＲ２陽性Ｔ４７Ｄ細胞だけが、長いスペーサのＲＯＲ２  ＣＡＲを含む操作Ｔ細胞の非常に強力な増殖を誘導する。下のパネルは、表示のように、様々なエフェクター：標的比のＣＡＲ  Ｔ細胞と乳癌標的細胞での対応する細胞殺傷活性を示す。また、このデータセットは、長いスペーサを有するＲＯＲ２  ＣＡＲを含むＴ細胞の最も強力な活性も示す。
【図１７】Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを用いた、キメラウサギ／ヒト抗ヒトＲＯＲ２  ＩｇＧ１  ＸＢＲ２−４０１及びコントロールとしてのキメラウサギ／ヒト抗ヒトＲＯＲ１  ＩｇＧ１  ＸＢＲ１−４０２の特異性分析方法の概略を示す。
【図１８】Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを用いた、キメラウサギ／ヒト抗ヒトＲＯＲ２  ＩｇＧ１  ＸＢＲ２−４０１及びコントロールとしてのキメラウサギ／ヒト抗ヒトＲＯＲ１  ＩｇＧ１  ＸＢＲ１−４０２の特異性分析を示す。４，３３６のヒト血漿膜タンパク質を含む大型スクリーンからの一次結合ヒット（図１７を参照）を単一スライド上で合わせ、キメラウサギ／ヒト抗ヒトＲＯＲ２  ＩｇＧ１  ＸＢＲ２−４０１、並びに、コントロールとしてのキメラウサギ／ヒト抗ヒトＲＯＲ１  ＩｇＧ１  ＸＢＲ１−４０２及びリツキシマブバイオシミラーで染色した。左側のＺｓＧｒｅｅｎ１シグナルは、様々なヒト膜タンパク質の発現レベルを示す。それらのそれぞれの同種抗原（ＲＯＲ２、ＲＯＲ１、及びＣＤ２０）以外に、ＩｇＧ１フォーマットのＲＯＲ１及びＲＯＲ２に対する試験抗体は、予想された通り、Ｆｃγ受容体ＦＣＧＲ３Ｂ（ＣＤ１６Ｂ）、ＦＣＧＲ１Ａ（ＣＤ６４Ａ）、及びＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２Ａ）にも結合する。二次抗体単独での染色では、予想通り、ヒトＩｇＧ３重鎖（ＩＧＨＧ３）が検出される。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
１．概説
受容体チロシンキナーゼオーファン受容体−１及び−２、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２は、全体的な構造設計及びいくつかの機能的類似性に基づき、新たな受容体チロシンキナーゼファミリーを定義するただ２つのファミリーメンバーである。ＲＯＲ１及びＲＯＲ２タンパク質のいずれも、免疫グロブリンドメイン、システインリッチフリズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ドメイン及びクリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメインから構成される細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を有するＩ型１回膜貫通型受容体である。これらの３つの細胞外ドメインに、キナーゼドメインを含むタンパク質の細胞内部分にＥＣＤを結合する膜貫通ドメインが続く（Ｒａｂａｇａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  Ｏｎｃｏｌ．２：１−８）。
【００２９】
ヒトＲＯＲ１及びＲＯＲ２タンパク質は、互いに５８％相同であるが、ＲＯＲタンパク質の各々は、種の間で高度に保存されている。これは、ヒトＲＯＲ２特異的モノクローナル抗体の作製にとって課題を呈し、そうした抗体はごくわずかしか知られておらず、抗ＲＯＲ２抗体の配列は文献に記載されていない。
【００３０】
抗ｈＲＯＲ２抗体を作製するために、本発明者らは、ファージにより展示された極めて高複雑度のナイーブウサギ抗体Ｆａｂライブラリーを作製し、ｈＲＯＲ２の哺乳動物細胞発現ＥＣＤ及び細胞表面発現ヒトＲＯＲ２に対する結合物質のライブラリーを選択することにより、ネイティブヒトＲＯＲ２タンパク質と反応性で、最も機能性且つ多様な抗体クローンを選択した。
【００３１】
この戦略を選んだのは、得ようとする抗体レパトアが、依然として天然のウサギＢリンパ球に由来し、従って、免疫系の予め選択された抗体重鎖及び軽鎖について選択されるためである。しかし、ネイティブ組換え及び細胞発現ヒトＲＯＲ２を含む適用スクリーニング戦略によって、特定のＲＯＲ２陽性癌のように、ＲＯＲ２発現と関連するヒトの疾患の治療法に特に有用である、高い機能性品質を有するｈＲＯＲ２特異的抗体が同定されることが期待された。
【００３２】
選んだ戦略の結果、多様なＣＤＲ１、２及び３配列（図１）を有し、且つヒトＲＯＲ２に対しては高い結合選択性を有するが、その最も関連する「姉妹分子」であるヒトＲＯＲ１については結合選択性を示さない（図２及び３）いくつかの新たなウサギ高親和性抗ヒトＲＯＲ２抗体が同定された。ｈＲＯＲ２特異的抗体の一部は、ｈＲＯＲ２標的に対して高い親和性（一桁のｎＭ親和性）を示した（図１０）。本発明は、本発明者らによる大きなナイーブキメラ／ヒトＦａｂライブラリーの作製及びヒトＲＯＲ２に対する結合物質の選択に一部が基づくものである。本明細書に詳述するように、本発明者らによっていくつかのモノクローナルキメラウサギ／ヒトＦａｂ抗体（ｍＡｂ）が得られた（図１を参照）。これらのｍＡｂは全て、ＥＬＩＳＡにより分析される通り、精製済ヒトＲＯＲ２に、また、フローサイトメトリーにより分析される通り、細胞表面ヒトＲＯＲ２に結合する。ＲＯＲ２の最も近縁であり、ＲＯＲ２と５８％のアミノ酸配列同一性を有するＲＯＲ１に結合するものはなかった。加えて、ｍＡｂの親和性及びそれらのエピトープ（これらは異なる）の位置が決定されている。さらに、いくつかのｍＡｂ（抗体クローンＸＢＲ２−４０１、ＸＢＲ２−４１６、ＸＢＲ２−４３３、ＥＲＲ２−３０２、ＥＲＲ２−３０８、ＥＲＲ２−３１７、ＸＢＲ２−３２７、及びＸＢＲ２−ＴＯＰ７２）も、キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１フォーマットに変換し、哺乳動物細胞において発現させた後、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。これらのＩｇＧ１抗体の結合活性も決定した。
【００３３】
これに加えて、数個のｍＡｂが、Ｃ末端ソルターゼ認識タグを有するキメラウサギ／ヒトＩｇＧ１として発現され、これによって、国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレットに実質的に記載されているように、ソルターゼ酵素媒介抗体結合技術（ＳＭＡＣ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標））による抗体Ｃ末端へのペイロードの部位特異的結合が可能になる。これらの抗ｈＲＯＲ２抗体は、国際公開第２０１６１０２６７９号パンフレット（本明細書に参照により組み込まれる）に実質的に開示されているように、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製するために、非常に強力なアントラサイクリンベースのＰＮＵ−１５９６８２毒素誘導体、Ｇｌｙ5−ＥＤＡ−ＰＮＵに部位特異的に結合された（図１３）。これらのＡＤＣは、機能的にインビトロで評価され、全て、ヒトＲＯＲ２を異所性発現するマウス乳癌細胞を効果的に殺傷することが明らかにされた。
【００３４】
ＲＯＲ２ターゲティングｍＡｂの治療有用性をさらに調べるために、これまでに記載されている方法（Ｈｕｄｅｃｅｋ，Ｍ．，Ｌｕｐｏ−Ｓｔａｎｇｈｅｌｌｉｎｉ，Ｍ．Ｔ．，Ｋｏｓａｓｉｈ，Ｐ．Ｌ．，Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ，Ｄ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｒａｄｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．Ｒ．（２０１３）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＯＲ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９，３１５３−３１６４）を用いて、ＸＢＲ２−４０１をベースとするＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した。手短には、エクスビボで拡大した正常ドナーＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞に、レンチウイルスにより、ｓｃＦｖフォーマット中にＸＢＲ２−４０１を含有するＥＦ１αプロモータ駆動の発現カセット、続いて短い若しくは長いスペーサ、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン、並びに切断型リガンド結合及びチロシンキナーゼドメインを含むＴ２Ａ分断膜貫通ＥＧＦＲフラグメントを形質導入した。ＥＧＦＲ＋形質導入Ｔ細胞のＦＡＣＳ単離によって、＞９０％のＣＡＲ−Ｔ細胞における頑健な抗ＲＯＲ２認識が明らかにされた。短い及び長いスペーサを有するＲＯＲ２ターゲティングＸＢＲ２−４０１  ＣＡＲ−Ｔの活性を乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ（ＲＯＲ２＋ＲＯＲ１−）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＲＯＲ２−ＲＯＲ１＋）に対して試験した。ＸＢＲ２−４０１は、ＲＯＲ２のＫｒドメイン内の膜近傍エピトープに結合することから、本発明者らは、ＸＢＲ２−４０１  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、短いスペーサよりも長いスペーサで、活性であると仮定した。これは、ＲＯＲ２＋ＲＯＲ１−標的細胞の存在下、増殖、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２分泌、並びに細胞傷害性に関して確認された（図１６）。
【００３５】
これらの試験に従って、本発明は、ｈＲＯＲ２を特異的に認識するモノクローナル抗体、並びに関連抗体をベースとする結合タンパク質及びその抗体フラグメント（抗原結合フラグメント）を提供する。本発明は、また、本明細書に記載するｈＲＯＲ２抗体から得られる抗体薬物複合体（ＡＤＣ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供する。さらに、ＲＯＲ２発現の異常若しくは増大に関連する疾患及び状態、例えば、癌の治療及び診断用途において、これらの抗体薬剤及び関連組成物を使用する方法も本発明に提供される。
【００３６】
ＩＩ．定義
別に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の通常の技術者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。下記の参照文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ  ｅｄ．，  １９９２）；  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（Ｅｄ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （３ｒｄ  ｅｄ．，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（Ｅｄ．），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ  （Ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ａｎａｎｄａｎｄ（Ｅｄｓ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；及びａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈ  ｅｄ．，２０００）。これに加えて、本発明の実施に際して読者を補助するために、以下の定義が提供される。
【００３７】
用語「抗体」は、同義語として「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも呼ばれ、又は「抗原結合フラグメント」は、所与の抗原、エピトープ若しくは複数のエピトープに対する強力な一価、二価若しくは多価結合を示すポリペプチド鎖を指す。別に注記されていない限り、本発明で使用される抗体又は抗原結合フラグメントは、任意の脊椎動物種に由来する配列を有することができる。これらは、例えば、ハイブリドーマ技術、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、遺伝子シャッフリングライブラリー、半合成若しくは完全な合成ライブラリー又はこれらの組み合わせなどの任意の好適な技術を用いて作製することができる。別に注記されていない限り、本発明で使用される「抗原」という用語は、インタクトな抗体、抗原結合ポリペプチドフラグメント及び以下に記載されるか、又は当技術分野で公知の他のデザイナー抗体（例えば、Ｓｅｒａｆｉｎｉ，Ｊ  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：５３３−６，１９９３を参照）を含む。
【００３８】
インタクトな「抗体」は、典型的に、ジスルフィド結合により互いに結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖（約５０〜７０ｋＤ）と２つの軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤ）とを含む。認識されている抗体鎖コード免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、Δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに多種多様な免疫グロブリン可変領域遺伝子がある。軽鎖は、κ又はλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、Δ、又はεとして分類され、これらは、それぞれ、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを定義する。
【００３９】
抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（ＶH）と重鎖定常領域から成る。大部分のＩｇＧアイソタイプ（サブクラス）の重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣH1、ＣH2及びＣH3から成り、ＩｇＭ又はＩｇＥなどの一部のＩｇＧアイソタイプは、第４の定常領域ドメイン、ＣH4を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶL）と軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣLから成る。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）などの宿主組織又は因子との結合を媒介し得る。
【００４０】
抗体のＶH及びＶL領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができ、これらの領域の間には、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が点在している。各ＶH及びＶLは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成され、次の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシ末端まで配置されている。ＣＤＲとＦＲ領域の配置及び番号付け方法は、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、米国政府印刷局（Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ）（１９８７及び１９９１）により定義されている。
【００４１】
本明細書で使用される「抗体ベースの結合タンパク質」は、他の非免疫グロブリン、又は非抗体由来成分に関して、少なくとも１つの抗体由来ＶH、ＶL、又はＣH免疫グロブリンドメインを含有する任意のタンパク質を表し得る。こうした抗体ベースのタンパク質として、限定されないが、（ｉ）免疫グロブリンＣHドメインの全部若しくは一部を有する受容体又は受容体成分を含む、結合タンパク質のＦc−融合タンパク質、（ｉｉ）ＶH及び／若しくはＶLドメインが、別の分子スカフォールドに連結されている結合タンパク質、又は（ｉｉｉ）免疫グロブリンＶH、及び／若しくはＶL、並びに／又はＣHドメインが、天然に存在する抗体若しくは抗体フラグメントに通常見いだされない様式で組み合わされている、及び／又はアセンブルされている分子が挙げられる（抗原結合フラグメント）。
【００４２】
「結合親和性」は、一般に、平衡会合又は解離定数（それぞれ、ＫA又はＫD）に関して表現され、これらは、解離及び会合速度定数（それぞれ、ｋoff及びｋon）の反比となる。従って、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性は、異なる速度定数と一致し得る。抗体の結合親和性は、通常、抗体の一価フラグメント（例えば、Ｆabフラグメント）のＫDとして表され、一桁のナノモル範囲以下の（サブナノモル又はピコモル）ＫD値は、非常に高く、治療及び診断的に重要であるとみなされる。
【００４３】
本明細書で使用される用語「結合特異性」は、抗体と抗原（又はエピトープ若しくはその抗原決定基）、受容体とリガンド、酵素と基質の結合のような、ある分子の別の分子に対する選択的親和性を指す。従って、ある実体の特定の抗原決定基（例えば、ＲＯＲ１又はＲＯＲ２の特定のエピトープ）に結合する全てのモノクローナル抗体は、その実体に対する同じ結合特異性を有するとみなされる。
【００４４】
用語「抗体薬物複合体」、又は「ＡＤＣ」は、治療活性物質又は活性医薬成分（ＡＰＩ）を抗体の結合標的にターゲティングして、薬理作用を発揮することができるように、治療活性物質又は活性医薬成分（ＡＰＩ）が共有結合されている抗体を指す。治療活性物質又は活性医薬成分は、ＡＤＣによりターゲティングされる細胞、好ましくは悪性若しくは癌細胞の殺傷をもたらすことができる細胞毒素であってよい。治療活性物質、活性医薬成分又は細胞毒素の共有結合は、ペイロードをリシン若しくはシステイン残基に結合する標準的化学リンカーを用いて非部位特異的様式で実施してもよいし、あるいは、好ましくは、結合部位、並びに作製しようとするＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）の十分な制御を可能にする部位特異的様式で実施する。
【００４５】
用語「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一若しくはほぼ同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は、核酸が、アミノ酸配列をコードしない場合には、ほぼ同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が、いずれか所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。従って、コドンによりアラニンが指定される全ての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを改変することなく、対応する記載のコドンのいずれかに改変することができる。こうした核酸変異は、保存的修飾変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書に記載の全ての核酸配列も核酸のあらゆる可能なサイレント変異を表している。当業者は、機能的に同一の分子を取得するために、核酸中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾することができることは認識されよう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載される配列の各々に内在している。
【００４６】
ポリペプチド配列の場合、「保存的修飾変異体」は、保存的アミノ酸置換、すなわち、電荷が類似した側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換されたアミノ酸残基を有する変異体を指す。電荷が類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００４７】
用語「接触（させること）」は、その通常の意味を有し、２つ以上の物質（例えば、ポリペプチド若しくはファージ）を合わせる、物質と細胞を合わせる、又は異なる細胞の２つの集団を合わせることを指す。接触は、例えば、試験管若しくは増殖培地中で、抗体と細胞を混合する、又は抗体の集団を細胞の集団と混合するなど、インビトロで実施することができる。接触はまた、例えば、細胞における２つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの同時発現により、細胞内で、又は細胞溶解物中で、２つのポリペプチドを接触させるなど、細胞内又はインサイチュで実施することもできる。さらに、接触は、例えば、薬剤を標的細胞に送達するために、対象に薬剤を投与することにより、対象においてインビボで実施することもできる。
【００４８】
用語「同一」又は「同一性」パーセントは、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、同じである２つ以上の配列若しくはサブ配列を指す。２つの配列は、２つの配列が、比較窓にわたり、あるいは、下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は手動アラインメント及び視覚検査により測定される指定領域にわたって、最大一致について比較したとき、明示されたパーセンテージの同じ（すなわち、明示された領域にわたって、又は明示されていない場合、配列全体にわたって、６０％同一、任意選択で６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一の）アミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有していれば、「実質的に同一である」。任意選択で、同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチド（若しくは１０アミノ酸）の領域にわたって、又は好ましくは長さが１００〜５００又は１０００ヌクレオチド以上（若しくは２０、５０、２００以上のアミノ酸）の領域にわたって存在する。
【００４９】
比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、スミス−ウォーターマンの局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃ，１９７０）により；ニードルマン−ウンシュの相同性アライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）により；ピアーソン−リップマンの類似性検索方法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８）により；これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により；又は手動アラインメント及び視覚検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ  ｅｄ．，  ２００３）を参照）によって実施することができる。配列同一性及び配列類似性の割合を決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０にそれぞれ記載されている。
【００５０】
用語「対象」は、ヒト及び非ヒト動物（特に、非ヒト哺乳動物）を指す。用語「対象」は、本明細書において、例えば、治療及び診断方法に関して、ヒト又は動物である対象を指す。動物である対象として、限定されないが、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、多発性骨髄腫及びその他の癌などのＲＯＲ２発現増大に関連する状態又は障害の哺乳動物モデルなどの動物モデルが挙げられる。非ヒト対象の他の具体的な例として、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルが挙げられる。
【００５１】
人工Ｔ細胞受容体（キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）若しくはＴボディとしても知られる）は、免疫エフェクター細胞に任意の特異性をグラフトする、改変受容体である。典型的には、これらの受容体を用いて、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞にグラフトし；それらのコード配列の転移が、レトロウイルス若しくはレンチウイルスベクター又はトランスポゾンによって促進される。ＣＡＲ操作Ｔ細胞（また、ＣＡＲ−Ｔ細胞と略される）は、その細胞外認識単位が、抗体由来の認識ドメインから成り、その細胞内領域が、１つ又は複数のリンパ球刺激部分に由来するキメラ受容体を備える、遺伝子改変Ｔ細胞である。プロトタイプＣＡＲの構造は、モジュラー型であり、様々な機能性ドメインを収容し、これによって、Ｔ細胞の特異性の選択及び制御された活性化を可能にするように設計されている。好ましい抗体由来の認識単位は、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の特異性及び結合残基を兼ね備える単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。最も一般的なリンパ球活性化部分は、Ｔ細胞トリガー（例えば、ＣＤ３ζ）部分とタンデムのＴ細胞共刺激（例えば、ＣＤ２８）ドメインを含む。エフェクターリンパ球（例えば、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞）にこうしたキメラ受容体を付与することによって、改変細胞は、非ＨＬＡ限定様式で、予定された特異性により、任意の所望される標的抗原に向け直される。レトロウイルス若しくはレンチウイルスベクター又はトランスポゾンを用いて、所与の患者の末梢リンパ球からのＴ細胞に、ＣＡＲ構築物をエクスビボで導入する。得られたＣＡＲ改変Ｔ細胞を注入により患者に戻した後、それらは、移動し、その標的部位に到達し、その標的細胞若しくは組織と相互作用した後、活性化を受けて、予定のエフェクター機能を実施する。ＣＡＲアプローチの治療標的としては、癌及びＨＩＶ感染細胞、又は自己免疫エフェクター細胞が挙げられる。
【００５２】
本明細書で使用される用語「治療する」、「治療する（こと）」、「治療」、及び「治療に有効な」は、必ずしも１００％又は完全な治療を意味しない。そうではなく、当業者により、潜在的な利益又は治療効果を有するものとして認識される様々な程度の治療がある。これに関して、本発明の方法は、任意の量の任意のレベルの治療を提供し得る。さらには、本発明の方法により提供される治療は、治療対象の疾患の１つ又は複数の状態若しくは症状の治療を含むことができる。
【００５３】
「ベクター」は、プラスミド、ファージ若しくはコスミドなどのレプリコンであり、それに、別のポリヌクレオチドセグメントが結合して、結合したセグメントの複製をもたらし得る。１つ又は複数のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を指令することができるベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。
【００５４】
ＩＩＩ．ＲＯＲ２及び関連誘導体化合物に特異的に結合する、抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、又はＣＡＲ
一態様では、本発明は、本明細書に例示する抗ＲＯＲ２抗体と同じ結合特異性で、ヒトＲＯＲ２に特異的に結合する、新規の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント（「抗原結合フラグメント」とも呼ばれる）、ＡＤＣ又はＣＡＲに提供する（図１）。本発明の抗体は、同種抗原であるＲＯＲ２に結合する能力を保持するインタクトな抗体の抗原結合部分を含有する、インタクトな抗体（例えば、本明細書に例示するＩｇＧ１抗体）、抗体フラグメント（例えば、本明細書に例示するＦａｂ抗体）、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、ＡＤＣ又はＣＡＲを含む。こうした抗体フラグメントの例としては、以下のものが挙げられる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶL、ＶH、ＣL及びＣH1ドメインから構成される一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶH及びＣH1ドメインから構成されるＦｄフラグメント；（ｉｖ）インタクトな抗体の単一アームのＶL及びＶHドメインから構成されるＦｖフラグメント；（ｖ）構造的に保存されたフレームワーク領域の間で操作された鎖間ジスルフィド結合を有するジスルフィド安定化Ｆｖｓ（ｄｓＦｖｓ）；（ｖｉ）ＶH又はＶLドメインから構成される単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えば、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９を参照）；並びに（ｖｉｉ）直鎖ペプチド又は環状ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。抗体ベースの結合タンパク質の例は、抗体の結合ドメインが、他のポリペプチド若しくはポリペプチドドメイン、例えば、別の分子スカフォールド、Ｆｃ−領域、他のポリペプチド若しくは抗体の他の機能若しくは結合ドメインと組み合わされて、追加結合特性を有する分子、例えば、二重若しくは多重特異性タンパク質又は抗体をもたらすポリペプチドである。こうしたポリペプチドは、天然に存在する抗体若しくは抗体フラグメントには通常見いだされない結合又は機能ドメインの配列を形成することができる。
【００５５】
本発明の抗体は、単鎖抗体のような抗体フラグメントも包含する。用語「単鎖抗体」は、ポリペプチド結合中に、一般にスペーサペプチドを介して連結された、ＶH及びＶLドメインを含むポリペプチドを指し、これは、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端に追加ドメイン若しくはアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、単鎖抗体は、コードポリヌクレオチドへの連結のためのテザーセグメントを含んでもよい。一例として、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）は、単鎖抗体である。個別の遺伝子によりコードされるＦｖフラグメントのＶL及びＶHドメインと比較して、ｓｃＦｖは、合成リンカーを介して（例えば、組換え方法により）連結された２つのドメインを有する。これにより、ＶL及びＶH領域が対合して、一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてこれらを作製することが可能になる。
【００５６】
本発明の抗体はまた、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）スカフォールドを有する、単一ドメイン抗原結合単位も包含する。ラクダ科の動物には、ラクダ、ラマ、及びアルパカが含まれる。ラクダ科は、軽鎖が欠失した機能抗体を産生する。重鎖可変（ＶH）ドメインは、自律的にフォールドし、抗原結合単位として独立に機能する。その結合表面は、古典的抗原結合分子（Ｆａｂ）又は単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の６つのＣＤＲと比較して、３つのＣＤＲしか含まない。ラクダ科抗体は、一般的抗体の結合親和性と同等の結合親和性を獲得することができる。
【００５７】
本明細書に記載される様々な抗体、抗体ベースの結合タンパク質、及びその抗体フラグメントは、インタクトな抗体の酵素若しくは化学的修飾により生成するか、又は組換えＤＮＡ方法を用いて新たに合成することもでき、あるいは、ファージディスプレイライブラリーを用いて同定することもできる。これらの抗体、抗体ベースの結合タンパク質、及びその抗体フラグメントを作製する方法は全て、当技術分野で公知である。例えば、単鎖抗体は、ファージディスプレイライブラリー又はリボソームディスプレイライブラリー、遺伝子シャッフルライブラリー（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４，１９９０；及び米国特許第４，９４６，７７８号明細書）を用いて同定することができる。特に、ｓｃＦｖ抗体は、例えば、以下：Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８に記載される方法を用いて取得することができる。Ｆｖ抗体フラグメントは、Ｓｋｅｒｒａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−４１，１９８８に記載されているように作製することができる。ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）は、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７：１１３−２３，１９９６に記載されている方法を用いて作製することができる。同様に、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、例えば、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９；及びＣａｉ  ａｎｄ  Ｇａｒｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６２８０−８５，１９９６に記載されている多様な方法を用いて生成することができる。ラクダ科単一ドメイン抗体は、当技術分野で公知の方法、例えば、Ｄｕｍｏｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１：５００−５１５，２００２；Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４：５２１−５２６，１９９７；及びＢｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：６４３−５５，２００３に記載の方法を用いて生成することができる。他のタイプの抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はＦｄフラグメント）も、日常的に実施されている免疫学方法を用いて容易に生成することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８を参照されたい。
【００５８】
一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、図１に示される抗体と実質的に同一である、それらの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と、それらの軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列とを有する。例示した抗体の軽鎖及び重鎖ＣＤＲ配列を全て図面に表示する。これらの実施形態の一部では、抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、以下を有する：（１）配列番号２５〜２７とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号６１〜６３とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（２）配列番号２８〜３０とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号６４〜６６とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（３）配列番号３１〜３３とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号６７〜６９とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（４）配列番号３４〜３６とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号７０〜７２とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（５）配列番号３７〜３９とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号７３〜７５とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（６）配列番号４０〜４２とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号７６〜７８とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（７）配列番号４３〜４５とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号７９〜８１とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（８）配列番号４６〜４８とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号８２〜８４とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（９）配列番号４９〜５１とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号８５〜８７とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（１０）配列番号５２〜５４とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号８８〜９０とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；（１１）配列番号５５〜５７とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号９１〜９３とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列；又は（１２）配列番号５８〜６０とそれぞれ実質的に同一の重鎖ＣＤＲ１〜３配列；及び配列番号９４〜９６とそれぞれ実質的に同一の軽鎖ＣＤＲ１〜３配列。
【００５９】
一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、以下に示される配列とそれぞれ同一である重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列と軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ配列を含む：（１）配列番号２５〜２７と配列番号６１〜６３（抗体ＸＢＲ２−４０１）、（２）配列番号２８〜３０と配列番号６４〜６６（抗体ＸＢＲ２−４１６）、（３）配列番号３１〜３３と配列番号６７〜６９（抗体ＸＢＲ２−４３３）、（４）配列番号３４〜３６と配列番号７０〜７２（抗体ＸＢＲ２−３２７）、（５）配列番号３７〜３９と配列番号７３〜７５（抗体ＸＢＲ２−ＴＯＰ９）、（６）配列番号４０〜４２と配列番号７６〜７８（抗体ＸＢＲ２−ＴＯＰ７２）、（７）配列番号４３〜４５と配列番号７９〜８１（抗体ＥＲＲ２−３０２）、（８）配列番号４６〜４８と配列番号８２〜８４（抗体ＥＲＲ２−３０８）、（９）配列番号４９〜５１と配列番号８５〜８７（抗体ＥＲＲ２−３１６）、（１０）配列番号５２〜５４と配列番号８８〜９０（抗体ＥＲＲ２−３１７）、（１１）配列番号５５〜５７と配列番号９１〜９３（抗体ＥＲＲ２−ＴＯＰ２）、又は（１２）配列番号５８〜６０と配列番号９４〜９６（抗体ＥＲＲ２−ＴＯＰ３５）。
【００６０】
他の実施形態では、ヒトＲＯＲ２と特異的に結合する本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、以下を含む：（ａ）配列番号１３〜２４のいずれか１つと実質的に同一の配列を有する軽鎖可変ドメイン、（ｂ）配列番号１〜１２のいずれか１つと実質的に同一の配列を有する重鎖可変ドメイン、又は（ｃ）（ａ）の軽鎖と（ｂ）の重鎖の両方。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、（ａ）の軽鎖と（ｂ）の重鎖の両方を含む。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、以下を含む：（ａ）配列番号１３〜２４のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン、（ｂ）配列番号１〜１２のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン、又は（ｃ）（ａ）の軽鎖と（ｂ）の重鎖の両方。一部の実施形態では、同一性の割合は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、あるいは１００％であってよい。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１３〜２４のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１３〜２４のいずれか１つに対して１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、配列番号１〜１２のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。他の実施形態では、同一性の割合は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、あるいは１００％であってよい。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１〜１２のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１〜１２のいずれか１つに対して１００％の同一性を有する。
【００６１】
一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、本明細書に例示するものなどのいずれか好適な軽鎖と組み合わせて、本明細書に記載するいずれかの重鎖（例えば、図１に示す重鎖）を含み得る。同様に、抗体は、本明細書に例示するものなどのいずれか好適な重鎖と組み合わせて、前述した軽鎖（例えば、図１に示す軽鎖）のいずれかを含み得る。例えば、好ましい実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、配列番号１３に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖と、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖、又は配列番号１４に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖と、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖、又は配列番号１５に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖と、配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖を含む。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、以下にそれぞれ示す軽鎖配列と重鎖配列を含み得る：（１）配列番号１３と配列番号１、（２）配列番号１４と配列番号２、又は（３）配列番号１５と配列番号３。様々な実施形態において、ペプチド配列の同一性（％）は、例えば、１００×［（同一の位置）／ｍｉｎ（ＴＧＡ，ＴＧＢ）］（式中、ＴＧＡ及びＴＧＢは、ＴＧＡ及びＴＧＢを最小にするアラインメント中のペプチド配列Ａ及びＢにおける残基の数と、内部ギャップ位置の数の総和である）として算出できる。例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４４：３３２−３５０（１９９４）を参照されたい。
【００６２】
本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、ヒトＲＯＲ２の細胞外ドメインを特異的に認識するか、若しくはこれと特異的に結合する完全長抗体又は抗体フラグメントをはじめとする、いずれの抗体であってもよい。例えば、抗体、抗体フラグメント又は抗体ベースの結合タンパク質は、ポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ、又はヒト化抗体であってよい。さらに、抗体は、限定されないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭなどのいずれのアイソタイプのものであってもよい。このように、例えば、抗体は、ＩｇＡ１若しくはＩｇＡ２などのいずれのＩｇＡ、又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、若しくは合成ＩｇＧなどのいずれのＩｇＡであってもよい。抗体は、ヒトＲＯＲ２の細胞外ドメインに対する特異性を有するいずれかの抗体フラグメント又は抗体ベースの結合タンパク質、例えば、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、または二価抗体であってもよい。抗体は、限定されないが、非枯渇ＩｇＧ抗体、ＣＡＲ、又は抗体の他のＦｃ若しくはＦａｂ変異体であってもよい。
【００６３】
前述した重鎖に加えて、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、連続的なナイーブ鎖シャッフリングを用いて、Ｆａｂライブラリーから選択した軽鎖をさらに含み得る。同様に、前述した軽鎖に加えて、本発明の抗体は、連続的なナイーブ鎖シャッフリングを用いて、Ｆａｂライブラリーから選択した重鎖をさらに含み得る。
【００６４】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に例示する抗ＲＯＲ２抗体の保存的修飾変異体である、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを提供する。典型的に、これらの変異体の可変領域は、１又は複数のアミノ酸残基における保存的置換を除いて、これらの例示した配列の１つと同一のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲは、ヒトＲＯＲ２に特異的に結合し、且つ、配列番号２５〜９６からなる群から選択される１配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む。本発明はまた、前述のＣＤＲ配列又は実質的に同一のＣＤＲ配列の１つ又は複数の変異体を含む、ＲＯＲ２に対する特異性を有する単離された抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ＡＤＣ又はＣＡＲも提供する。これらの抗体における変異型ＣＤＲ配列は、配列番号２５〜９６からなる群から選択される１配列に１、２、若しくは３つの置換、挿入、欠失、又はそれらの組合せを含み得る。例えば、組換えキメラ若しくはヒト化抗体（又はそのフラグメント）は、前述したＣＤＲ配列の１、２、３、４、５、若しくは６つを含み得る。しかしながら、一部の実施形態では、組換えキメラ若しくはヒト化抗体（又はそのフラグメント）は、例えば、配列番号６１〜６３、配列番号６４〜６６、若しくは配列番号６７〜６９に示される軽鎖ＣＤＲ；及び配列番号２５〜２７、配列番２８〜３０、若しくは配列番号３１〜３３に示される重鎖ＣＤＲなど、同じ軽鎖又は重鎖の３つＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態では、組換えキメラ若しくはヒト化抗体（又はそのフラグメント）は、例えば、（ａ）配列番号６１〜６３と配列番号２５〜２７；（ｂ）配列番号６４〜６６と配列番号２８〜３０；又は（ｃ）配列番号６７〜６９と配列番号３１〜３３など、同じ抗体の６つのＣＤＲ配列を含む。
【００６５】
一部の実施形態では、本発明は、約１０μＭ以下、５μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、又は２００ｎＭ以下のＲＯＲ２に対する結合活性を有する抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを提供する。一部の実施形態では、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、又は約５ｎＭ以下の結合活性で、ＲＯＲ２に結合する。一部の実施形態では、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、約１ｎＭ以下、約８００ｐＭ以下、約７００ｐＭ以下、約６００ｐＭ以下、約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、又は約１００ｐＭ以下の結合活性で、ＲＯＲ２に結合する。結合活性は、ＥＬＩＳＡ、バイオレイヤー干渉法、又は表面プラズモン共鳴などの当技術分野で公知の技術を用いて測定することができる。
【００６６】
本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、いずれか好適な技術により、例えば、いずれか好適な真核又は非真核生物発現系を用いて、生成することができる。特定の実施形態では、哺乳動物発現系を用いて、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを生成する。本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを生成するいくつかの具体的な技術を本明細書に例示する。一部の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、細菌発現系などの好適な非真核生物発現系を用いて生成することができる。細菌発現系を用いて、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、及びダイアボディなどのフラグメントを生成することができる。こうしたフラグメントを生成するためにＤＮＡコード配列を改変する技術は、当技術分野において公知である。
【００６７】
本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、いずれか好適なタイプの結合を用いて、合成分子に結合させることができる。組換え操作及び組み込みセレノシステイン（例えば、２０１４年１２月２３日に発行された米国特許第８，９１６，１５９号明細書に記載されているような）を用いて、合成分子に結合させることができる。他の結合方法は、ネイティブ若しくは操作リシン側鎖アミン又はシステイン側鎖チオールとの共有結合を含み得る。例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３：１  １３７−１  １４６（２００５）を参照されたい。
【００６８】
好ましい実施形態では、合成分子と結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント（毒素である合成分子との抗体薬物複合体の場合、「ＡＤＣ」と呼ばれる）は、部位特異的ソルターゼ酵素媒介抗体結合を用いて取得される。国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレットに開示されているように、ソルターゼ（ソルターゼトランスペプチダーゼとも呼ばれる）は、特定のペプチドモチーフ（「ソルターゼ認識タグ」又は「ソルターゼタグ」と呼ばれる）を認識して、切断することにより、表面タンパク質を修飾する一群の原核生物酵素を形成する。通常、所与のソルターゼ酵素は、１つ又は複数のソルターゼ認識タグを認識する。ソルターゼ酵素は、天然に存在するものであってもよいし、又は遺伝子操作に付したものであってもよい（Ｄｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２０１４；１１１，１３３４３−８）。
【００６９】
好ましい実施形態では、複合体は、以下：（ａ）１つ又は複数のソルターゼ認識タグを担持する本明細書に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントと、（ｂ）グリシン若しくはオリゴグリシンタグ、Ｇｌｙ(n)を担持する１つ又は複数の合成分子の部位特異的ソルターゼ酵素媒介結合によって得られる。好ましくは、ソルターゼ認識タグを抗体の少なくとも１つのサブドメインのＣ末端に融合又は結合させる。前記ソルターゼ認識タグは、以下：ＬＰＸＳＧ（配列番号１３７）、ＬＰＸＡＧ（配列番号１３８）、ＬＰＸＴＧ（配列番号１３９）、ＬＡＸＴＧ（配列番号１４０）、及びＮＰＱＴＧ（配列番号１４１）からなる群から選択するのが好ましく、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸残基である。好ましくは、オリゴグリシンタグ、Ｇｌｙ(n)は、長さ１〜２１グリシン残基を有し、長さ３〜５アミノ酸を有するのが好ましい（すなわち、Ｇｌｙ(3)、Ｇｌｙ(4)、又はＧｌｙ(5)）。
【００７０】
合成分子は、腫瘍をターゲティングするものなどの任意の分子であってよい。一部の実施形態では、抗体と結合させる合成分子は、タンパク質（例えば、抗体）又はＲＮＡ若しくはＤＮＡアプタマーである。一実施形態では、合成分子と結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、一般式Ａ−（Ｌ−Ｐ）nを有し、式中、Ａは、本明細書に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントであり、Ｌは、１つ又は複数のリンカーであり、Ｐは、標識及び細胞傷害性若しくは細胞静止剤からなる群から選択される１つ又は複数のペイロードであり、ここで、ｎは、≧１〜≦１０の範囲の整数である。この実施形態では、リンカーは、好ましくは、以下：オリゴペプチドリンカー（開裂可能及び開裂不可能なオリゴペプチドリンカーを含む）、ヒドラジンリンカー、チオ尿素、自壊的（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）リンカー、スクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、マレイミドリンカー、ジスルフィドリンカー、チオエーテルリンカー、及び／又はマレイミドリンカーからなる群から選択される少なくとも１つを含むか、又はそれから構成される。
【００７１】
当業者は、別のリンカーも好適となり得ることを理解されよう。こうしたリンカーは、開裂不可能であってもよいし、又はｐＨ、酸化還元電位若しくは特定の細胞内酵素により開裂可能であってもよい。開裂可能なオリゴペプチドリンカーとしては、プロテアーゼ−又はマトリックスメタロプロテアーゼ−開裂可能リンカーがある。リンカーが、上記の組み合わせを含んでもよいことは理解されよう。例えば、リンカーは、バリン−シトルリンＰＡＢリンカーであってもよい。好ましい実施形態では、リンカーは、ペンタペプチドモチーフ：ＬＰＸＳＧ（配列番号１３７）、ＬＰＸＡＧ（配列番号１３８）、ＬＰＸＴＧ（配列番号１３９）、ＬＡＸＴＧ（配列番号１４０）、及びＮＰＱＴＧ（配列番号１４１）を含む配列を有するオリゴペプチド（Ｘは、任意のアミノ酸である）、続いてオリゴ−グリシン区間、Ｇｌｙ(n)（ｎは、≧１〜≦２１の整数である）を含む。好ましい実施形態では、リンカーは、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントの少なくとも１つのサブドメインのＣ末端に結合される。
【００７２】
様々な実施形態では、抗体と結合させる好適な合成分子（「ペイロード」）としては、例えば、細胞傷害性薬剤、細胞静止剤、又は血管新生阻害剤、放射性同位体、及びリポソームが挙げられる。細胞傷害性薬剤は、植物、真菌、又は細菌分子であってよい。一部の実施形態では、本発明の抗体と結合させる細胞傷害性薬剤は、低分子量毒素（ＭＷ＜２’０００ダルトン、好ましくは、ＭＷ＜１’０００ダルトン）、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素である。これらの毒素の多くの具体的な例が当技術分野で公知である。例えば、Ｄｙｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１０：２３１１−３４，２００４；Ｋｕｙｕｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：１６４５−５８，２０１４；Ｂｅｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．１０：３２２−４２，２０１１；及びＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８：１９９−２２１，１９８４を参照されたい。一部の実施形態では、治療薬を抗体と結合させる。例えば、治療薬は、メイタンシノイド（例えば、メイタンシノール若しくはＤＭ１メイタンシノイド）、タキサン、カリケアミシン、セマドチン、モノメチルラウリスタチン（例えば、モノメチルラウリスタチンＥ若しくはモノメチルラウリスタチンＦ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）又は、好ましくは、アントラサイクリン、より好ましくは極めて強力なアントラサイクリンＰＮＵ−１５９６８２の誘導体であってよい。極めて強力なアントラサイクリンＰＮＵ−１５９６８２の特に好ましい誘導体は、国際公開第２０１６１０２６７９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。治療薬はまた、ビンクリスチン及びプレドニゾンを含んでもよい。様々な実施形態では、本発明で使用することができる治療薬は、抗代謝物質（例えば、メトトレキサートなどの抗葉酸剤、５−フルオロウラシルなどのフルオロピリミジン、システインアラビノシド、又はプリン若しくはアデノシンのアナログ）；挿入剤（例えば、ドキソルビシン、ネモルビシン、又は好ましくはＰＮＵ−１５９６８２の誘導体などのアントラサイクリン）、ダウノマイシン、エピラビシン、イダルビシン、ミトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、若しくはミトラマイシン、又はピロロベンゾジアゼピンなどの他の挿入剤；カリケアミシン、チアンシマイシン、及びその他のエンジインなどのＤＮＡ反応剤；白金誘導体（例えば、シスプラチン若しくはカルボプラチン）；アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミドニトロウレア若しくはチオテパ）；α−アマニチンなどのＲＮＡポリメラーゼ阻害剤；有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド、又はパクリタキセル若しくはドセタキセルなどのタキソイド）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、トポテカン）；細胞周期阻害剤（例えば、フラボピリドール）；又は微小管剤（例えば、エポチロン、チューブリシン、プレ−チューブリシン、ジスコデルモリドアナログ、若しくはエリュテロビンアナログ）であってよい。治療薬は、ボルテゾミブ、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、若しくはドキソルビシンなどのプロテアソーム阻害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤であってよい。治療用放射性同位体としては、ヨウ素（131Ｉ）、イットリウム（90Ｙ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、アクチニウム（225Ａｃ）、プラセオジム、アスタチン（Ａｔ）、レニウム（Ｒｅ），ビスマス（Ｂｉ若しくはＢｉ）、及びロジウム（Ｒｈ）が挙げられる。血管新生阻害剤としては、リモミド、ベバクジマブ、アンギオスタチン、及びラゾキサンが挙げられる。
【００７３】
好ましい実施形態では、合成毒素分子は、Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）に記載されているようなＰＮＵ−１５９６８２及びその誘導体（以下の式（ｉ）を参照）、メイタンシン、モノメチルアウリスタチンＭＭＡＥ、及びモノメチルアウリスタチンＭＭＡＦから選択される。好ましい実施形態では、リンカーと、その波線（ｗａｖｙ  ｌｉｎｅ）で連結する毒素は、国際公開第２０１６１０２６７９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような式（ｉ）のものである：
【化１】
2019509023.tif 000003
【００７４】
合成分子が、式（ｉ）のものである実施形態では、アミノ結合を形成するために、リンカーは、１つのアミノ基が、式（ｉ）の波線に直接連結されるように、形態ＮＨ2−（ＣＨ2）m−ＮＨ2（ｍ≧１且つ≦１１、好ましくはｍ＝２）のアルキルジアミノ基を含むのが好ましい。第２のアミノ基がオリゴペプチドリンカーに連結しているのがさらに好ましい。第２アミノ基は、オリゴペプチドリンカーと連結されるのがさらに好ましく、このリンカーは、より好ましくは、オリゴグリシンＧｌｙ(n)であり、ここで、ｎは、≧１且つ≦２１である。最も好ましいペイロードを図１３（Ｂ）に示す。
【００７５】
一部の実施形態では、合成分子は、任意の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、又は抗体フラグメントに結合させることができる。一部の実施形態では、合成分子は、標識である。標識は、診断用途で有用となり得、例えば、造影剤を含み得る。造影剤は、ヨウ素（131Ｉ若しくは125Ｉ）、インジウム（111Ｉｎ）、テクネチウム（99Ｔｃ）、リン（32Ｐ）、炭素（14Ｃ）、トリチウム（3Ｈ）などの放射性同位体標識、その他の放射性同位体標識（例えば、放射性イオン）、又は上に挙げた治療用放射性同位体の１つなどの治療用放射性同位体標識であってよい。加えて、造影剤は、Ｘ線不透過物質、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）剤、超音波イメージング剤、及び動物の身体をイメージングする装置による検出に好適ないずれか他の造影剤を含み得る。さらに、合成分子は、蛍光標識、生物活性酵素標識、発光性標識、又は発色団標識であってもよい。
【００７６】
一部の実施形態では、合成分子は、Ｂｅｎｄａｓ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，１５：２１５−２２４，２００１に記載されているように、リポソームであってよい。こうした実施形態では、抗体は、コロイド粒子、例えば、リポソームに結合させて、疾患細胞への薬剤の制御送達に用いることができる。リポソーム、例えば、免疫リポソームと結合した抗体を作製する場合、化学療法薬などの薬剤又はその他の薬物を、標的細胞への送達のためにリポソームに封入することができる。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、ＲＯＲ２以外に、１つ又は複数の抗原に対する特異性を有してもよい。例えば、本発明の抗体は、ＲＯＲ２と別の腫瘍抗原、例えば、神経芽細胞腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、結腸癌（例えば、結腸腺癌）、又は乳癌（例えば、乳腺癌）に関連する抗原に対する特異性を有するように、操作する（例えば、二価ダイアボディ、又は結合したＦａｂ二量体若しくは三量体として）ことができる。抗体は、ＲＯＲ２と、細胞傷害性エフェクター細胞の活性化又はターゲティングを促進する抗原とを有するように、操作することができる。
【００７７】
ＲＯＲ２ターゲティングｍＡｂの治療有用性をさらに調べるために、ｍＡｂに基づくキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した。典型的には、本発明のキメラ抗原受容体は、膜貫通領域及び細胞内Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインと融合した、本明細書に記載のｈＲＯＲ２抗体又は抗体フラグメントを含有する。これまでに記載されている方法（Ｈｕｄｅｃｅｋ，Ｍ．，Ｌｕｐｏ−Ｓｔａｎｇｈｅｌｌｉｎｉ，Ｍ．Ｔ．，Ｋｏｓａｓｉｈ，Ｐ．Ｌ．，Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ，Ｄ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｒａｄｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．Ｒ．（２０１３）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＯＲ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９，３１５３−３１６４）を用いて、ＸＢＲ２−４０１をベースとするＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した。手短には、エクスビボで拡大した正常ドナーＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞に、レンチウイルスにより、ｓｃＦｖフォーマットのＸＢＲ２−４０１を含有するＥＦ１αプロモータ駆動の発現カセット、続いて短い若しくは長いスペーサ、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン、並びに切断型リガンド結合及びチロシンキナーゼドメインを含むＴ２Ａ分断膜貫通ＥＧＦＲフラグメントを形質導入した。ＥＧＦＲ＋形質導入Ｔ細胞のＦＡＣＳ単離によって、＞９０％のＣＡＲ−Ｔ細胞における頑健な抗ＲＯＲ２認識が明らかにされた。乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ（ＲＯＲ２＋ＲＯＲ１−）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＲＯＲ２−ＲＯＲ１＋）に対する、短い及び長いスペーサを有するＲＯＲ２ターゲティングＸＢＲ２−４０１  ＣＡＲ−Ｔの活性。ＸＢＲ２−４０１は、ＲＯＲ２のＫｒドメイン内の膜近傍エピトープに結合することから、ＸＢＲ２−４０１  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、短いスペーサよりも長いスペーサの方が、活性である可能性がある。これは、ＲＯＲ２＋ＲＯＲ１−標的細胞の存在下で、増殖、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２分泌、並びに細胞傷害性に関して確認された（図１６）。
【００７８】
ＩＶ．ＲＯＲ２抗体を生成するためのポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントのセグメント若しくはドメインを含むポリペプチドをコードする配列と同一又は相補的である、実質的に精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）を提供する。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、図１に示す重鎖又は軽鎖ドメイン配列をコードする。例示として、抗体ＸＢＲ２−４０１、ＸＢＲ２−４１６及びＸＢＲ２−４３３の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン配列をコードする１対のポリヌクレオチドが、配列番号１２９及び１３２、配列番号１３０及び１３３、並びに配列番号１３１及び１３４にそれぞれ示される。本発明のポリヌクレオチドの一部は、配列番号１２９、１３０、若しくは１３１に示されるヌクレオチド配列及び／又は配列番号１３２、１３３、若しくは１３４に示される軽鎖可変領域配列を含む。本発明のいくつかの他のポリヌクレオチドは、配列番号１２９〜１３４から選択される配列と実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含む。適切な発明ベクターから発現されると、これらのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、ＲＯＲ２抗原結合能力を呈示することができる。
【００７９】
さらに、本発明には、本明細書に記載の抗体の重鎖若しくは軽鎖からの少なくとも１つのＣＤＲ領域、通常、３つのＣＤＲ領域全てをコードするポリヌクレオチドも提供される。いくつかの他のポリヌクレオチドは、例示した抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域配列の全部若しくは実質的に全部をコードする。例えば、これらのポリヌクレオチドの一部は、配列番号１〜１２のいずれか１つに示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び／又は配列番号１３〜２４のいずれか１つに示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする。コードの縮重のために、様々な核酸配列が、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードすることになる。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチドは、例示した抗体の可変領域配列だけをコードすることができる。これらはまた、抗体の可変領域及び定常領域の両方をコードすることもできる。本発明のポリヌクレオチド配列の一部は、配列番号１〜１２のいずれか１つに示される成熟重鎖可変領域配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％若しくは９９％）同一の成熟重鎖可変領域配列をコードする。本発明のポリヌクレオチド配列の一部は、配列番号１３〜２４のいずれか１つに示される成熟軽鎖可変領域配列と実質的に同一の成熟軽鎖可変領域配列をコードする。ポリヌクレオチド配列の一部は、例示した抗体のうちの１抗体の重鎖及び軽鎖両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。一部の他のポリヌクレオチドは、例示した抗体のうちの１抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一である２つのポリペプチドセグメントをコードする。
【００８１】
ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成により、又は例示した機能抗体をコードする既存の配列（例えば、以下の実施例に記載する配列）のＰＣＲ突然変異によって、生成することができる。核酸の直接の化学合成は、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０，１９７９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９，１９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９，１９８１のジエチルホスホロアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号明細書に記載の固体支持体法などの当技術分野で公知の方法によって達成することができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入は、例えば、下記の文献に記載されているように実施することができる：ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（Ｅｄ．），Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１；及びＥｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７，１９９１。
【００８２】
さらに、本明細書に記載の機能抗体を生成するための発現ベクター及び宿主細胞も本発明に提供される。抗体を発現するためのプラスミド及びトランスポゾンベースのベクターの具体的な例は、以下の実施例に記載されている。機能抗体鎖又は結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現するために、様々な他の発現ベクターを使用することもできる。ウイルスベース及び非ウイルス発現ベクターを用いて、哺乳動物宿主細胞において抗体を生成することができる。非ウイルスベクター及び系としては、プラスミド、典型的にはタンパク質若しくはＲＮＡを発現するための発現カセットを備えるエピソーマルベクター、ヒト人工染色体が挙げられる（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５，１９９７を参照）が挙げられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞における抗体ポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターには、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ４、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ，Ｂ＆Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ，Ｂ＆Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、並びに他のタンパク質を発現するための当技術分野において知られている多数の他のベクターがある。他の有用な非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃｋ及びその他のトランスポゾン系によって動員することができる発現カセットを含む。有用なウイルスベクターとしては、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ）又はその他のレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）をベースとするベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＢＰ  エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）ベクター及びセムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＶ）をベースとするベクターが挙げられる。Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，前掲；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３，１９９２を参照されたい。
【００８３】
発現ベクターの選択は、ベクターを発現させることが意図される宿主細胞に左右される。典型的には、発現ベクターは、機能抗体鎖又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモータ及び他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含む。一部の実施形態では、誘導性プロモータを使用して、誘導条件下を除き、挿入配列の発現を阻止する。誘導性プロモータとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモータ又はヒートショックプロモータが挙げられる。その発現産物が宿主細胞による耐容性が優れたコード配列について集団を偏らせることなく、形質転換生物の培養物を非誘導条件下で拡大することができる。プロモータに加えて、機能抗体鎖又はフラグメントの効率的な発現のために他の調節エレメントが必要となる、又は望ましい場合もある。これらのエレメントは、典型的に、ＡＴＧ開始コドン及び隣接リボソーム結合部位（コザック共通配列）又はその他の配列を含む。さらに、発現の効率は、使用する細胞系に適したエンハンサーの含有によって増強される（例えば、Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４；及びＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７を参照）。例えば、哺乳動物宿主細胞での発現を増大するために、ＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーを使用することができる。
【００８４】
発現ベクターはまた、挿入された機能抗体配列によってコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も賦与し得る。大抵の場合、挿入された機能抗体配列は、ベクターへの導入の前に、シグナル配列に連結される。また、機能抗体軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする配列を受けるために用いられるベクターも、それらの定常領域若しくは部分をコードすることがある。こうしたベクターは、定常領域を有する融合タンパク質と同様に、可変領域の発現を可能にし、これにより、インタクトな抗体又はそのフラグメントの生成をもたらす。典型的に、こうした定常領域は、ヒト型であり、好ましくはヒトＩｇＧ１抗体のものである。
【００８５】
機能抗体鎖を含有し、これを発現させる宿主細胞は、原核又は真核細胞のいずれであってもよい。一部の好ましい実施形態では、哺乳動物宿主細胞を用いて、本発明の抗体ポリペプチドを発現すると共に、これを生成する。例えば、宿主細胞は、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株又は外性発現ベクターを含有する哺乳動物細胞株のいずれであってもよい。これらは、任意の正常な可死又は正常若しくは異常な不死動物細胞若しくはヒト細胞を含む。本明細書に例示する細胞株以外に、インタクトな免疫グロブリンを分泌することができるいくつかの他の好適な宿主細胞株も当技術分野で知られている。こうした細胞株として、例えば、ＣＨＯ細胞株、各種ＨＥＫ２９３細胞株、各種Ｃｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞及びハイブリドーマが挙げられる。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養物の使用は、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７に概要が論じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモータ、及びエンハンサーなどの発現制御配列、並びにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列などの必要なプロセシング情報部位を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子由来又は哺乳動物ウイルス由来のプロモータを含有する。好適なプロモータは、構成性、細胞型特異的、発生期特異的、及び／又はモジュレート可能若しくは調節可能なものであってよい。有用なプロモータとして、限定されないが、本明細書に例示するＥＦ１α及びヒトＵｂＣプロモータ、メタロチオネインプロモータ、構成性アデノウイルス後期プロモータ、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＭＲＰ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータ、構成性ＭＰＳＶプロモータ、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモータ（ヒト最初期ＣＭＶプロモータなど）、構成性ＣＭＶプロモータ、及び当技術分野で公知のプロモータ−エンハンサー複合体が挙げられる。
【００８６】
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類によって変わる。例えば、原核細胞の場合には、一般に塩化ナトリウム形質転換が使用されるが、他の細胞宿主の場合には、リン酸ナトリウム処理又はエレクトロポレーションが用いられ得る（概要については、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，前掲を参照）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、注射及びマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３，１９９７）、薬剤によるＤＮＡの取り込み強化、並びにエクスビボ形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期、高収率生成のためには、多くの場合、安定した発現が望ましい。例えば、ウイルス複製起点又は内在性発現エレメント及び選択マーカ遺伝子を含有する本発明の発現ベクターを用いて、抗体鎖又は結合断片を安定して発現する細胞株を調製することができる。ベクターの導入後、選択培地に移す前に、細胞を濃縮培地中で１〜２日間増殖させてもよい。選択マーカの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在によって、選択培地中で導入配列を好適に発現する細胞の増殖が可能になる。耐性の、安定にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。
【００８７】
本発明は、さらに、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを生成するように組換えにより操作された真核又は非真核細胞（例えば、Ｔリンパ球）も提供する。真核又は非真核細胞は、本発明の抗体を生成するための発現系として使用することができる。一部の実施形態では、本発明は、本発明のＲＯＲ２特異的抗体を組換えにより発現するように操作されたＲＯＲ２標的免疫細胞を提供する。例えば、本発明は、本発明の抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、若しくは（ｓｃＦｖ）２）を発現するように操作されたＴ細胞を提供し、これは、下記ドメイン：スペーサ又はヒンジ領域（例えば、ＣＤ２８配列若しくはＩｇＧ４ヒンジ−Ｆｃ配列）、膜貫通領域（例えば、膜貫通規定ドメイン）、及び細胞内Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインの１つ又は複数を含む合成分子と連結しており、これによって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴボディを形成する。ＣＡＲ（又はＴボディ）内に含有させることができる細胞内ＴＣＲシグナル伝達ドメインとして、限定されないが、ＣＤ３ζ、ＦｃＲ−γ、及びＳｙｋ−ＰＴシグナル伝達ドメイン並びにＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ１３４同時シグナル伝達ドメインが挙げられる。ＣＡＲ（又はＴボディ）を発現するＴ細胞を構築するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｍａｒｃｕ−Ｍａｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．５（２００９年４月１６日にインターネットで公開）を参照されたい。
【００８８】
Ｖ．治療及び診断用途
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載する抗体、抗体ベースの結合タンパク質若しくはその抗体フラグメント、若しくは抗体薬物複合体（ＡＤＣ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）含有の操作細胞と細胞を接触させることにより、ＲＯＲ２を発現する細胞（ＲＯＲ２細胞）を阻害する方法を提供する。抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、ネイキッド（非結合）分子であっても、又は合成分子、例えば、細胞傷害剤、細胞静止剤、又は血管新生阻害剤、放射性同位体、あるいはリポソームに結合した抗体分子であってもよい。この方法を用いて、インビトロで又は対象において（すなわち、インビボで）ＲＯＲ２細胞を阻害することができる。接触させるＲＯＲ２細胞は、例えば、ＲＯＲ２のレベル増大に関連する障害の細胞培養物又は動物モデルに存在するものであってよい。この方法は、例えば、特定のＲＯＲ２細胞型の抗体の阻害活性を測定及び／又はランク付け（別の抗体に対して）する上で有用である。ＲＯＲ２細胞の阻害は、ＲＯＲ２細胞の活性若しくは増殖を阻止又は低減することを含む。阻害はまた、ＲＯＲ２細胞の殺傷も含み得る。この方法は、特定の作用機構に何ら拘束又は制限されるものではないが、阻害活性は、ＲＯＲ２媒介性シグナル伝達を阻止することにより、又はＲＯＲ２関連受容体のシグナル伝達を阻止することによって、媒介することができる。阻害活性はまた、ＲＯＲ２細胞を攻撃する免疫系エフェクターの動員により、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体系の成分を活性化することによって、媒介することもできる。
【００８９】
一部の関連する実施形態では、本発明は、ＲＯＲ２のレベル増大に関連する障害を有する、有することが疑われる、又はそうした障害を発生するリスクがある対象を治療する方法を提供する。一般に、本方法は、治療有効量の本発明の単離された抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、ＡＤＣ又はＣＡＲを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む。抗体は、本明細書に記載するいずれの抗ＲＯＲ２抗体であってもよい。従って、抗体は、キメラ、ヒト化、合成、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧＡＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、Ｆａｂ、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、又は（ｓｃＦｖ）２であってよい。一部の実施形態では、本方法は、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、又は二価抗体を投与するステップを含む。投与される抗体又は抗原結合フラグメントは、前述した合成分子、例えば、細胞傷害剤、細胞静止剤、若しくは血管新生阻害剤、治療用放射性同位体、又はリボソームと結合させることができる。例示的な細胞傷害剤は、緑膿菌外毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ）Ａ（ＰＥ３８）である。治療することができる障害としては、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、及びＲＯＲ２発現の増大に関連するその他の障害が挙げられる。
【００９０】
一部の実施形態では、本発明は、遺伝子操作された本明細書に記載のＴ細胞の養子移入によって、ＲＯＲ２の発現に関連する障害を有する、有することが疑われる、又はそうした障害を発生するリスクがある対象を治療する方法を提供し、ここで、Ｔ細胞は、ＲＯＲ２と選択的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを発現する。組換え技術を用いて、治療しようとする対象からのいずれか好適なＴ細胞、例えば、セントラルメモリＴ細胞にＣＡＲコード遺伝子材料を導入することができる。遺伝子材料を担持するＴ細胞を拡大することができる（例えば、サイトカインの存在下で）。遺伝子操作されたＴ細胞は、典型的に、注入によって、患者に移入する。その後、移入された本発明のＴ細胞は、対象においてＲＯＲ２発現細胞に対する免疫応答を高めることができる。養子移入法を用いて、例えば、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、及びその他の癌を含む、ＲＯＲ２に関連する癌のいずれかを有するか、又は有することが疑われる対象を治療することができる。
【００９１】
一部の実施形態では、前述の治療方法は、さらに、ＲＯＲ２のレベル増大に関連する障害を治療するための第２の治療薬を同時投与するステップも含み得る。例えば、治療しようとする障害が、ＲＯＲ２を発現する癌を含むとき、本方法は、癌を治療するのに好適な、細胞傷害剤、細胞静止剤、若しくは血管新生阻害剤、又は免疫刺激剤（例えば、免疫チェックポイント阻害抗体、例えば、限定されないが、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＴＩＭ３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３などに結合するもの）の同時投与をさらに含み得る。癌が、Ｂ細胞悪性疾患である場合、本方法は、例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、又はＣＨＯＰ化学療法薬レジメンの同時投与をさらに含み得る。
【００９２】
一部の他の実施形態では、本発明は、ＦＡＣＳ、免疫組織化学（ＩＨＣ）又はウエスタンブロッティングのいずれかにより、例えばコントロールに比べて、変化したレベルのＲＯＲ２（例えば、細胞表面ＲＯＲ２）を生体サンプル中で検出する方法を提供する。一般に、本方法は、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントと生体サンプルを接触させるステップと、サンプル中で材料（例えば、細胞）に選択的に結合する抗体の量を決定することにより、生体サンプル中のＲＯＲ２のレベルを決定するステップを含む。生体サンプルは、細胞培養物又は試験対象由来のものでよく、例えば、ＲＯＲ２のレベル増大に関連する疾患又は状態を有する、有することが疑われる、又はそうした疾患又は状態を発生するリスクがある対象からの血漿若しくは組織サンプルであってよい。コントロールレベルは、１つ又は複数のコントロール培養物若しくは疾患のない対象からの対応するサンプル中の同じ抗体を用いて検出されたＲＯＲ２レベルと一致するのが望ましい。本発明の抗体を用いてＲＯＲ２レベルを決定する方法は、イムノ−（ウエスタン）ブロッティング、酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）及びフローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析などの任意の免疫アッセイを含み得る。
【００９３】
検出方法を用いて、ＲＯＲ２増大に関連する障害の存在をスクリーニングすることができる。本方法は、スクリーニングを必要とする試験対象、例えば、ＲＯＲ２増大に関連する障害を有する、有することが疑われる、又はそうした障害を発生するリスクがある対象から、サンプルを取得するステップを含む。本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを用いて、サンプル中のＲＯＲ２のレベル（例えば、量又は濃度）を測定し、サンプル中のレベルをＲＯＲ２のコントロールレベルと比較する。コントロールレベルは、例えば、ＲＯＲ２増大に関連する障害のない１又は好ましくは複数のコントロールグループ対象からのサンプル中の平均レベル（例えば、量又は濃度）を表す。あるいは、コントロールレベルは、試験対象が、ＲＯＲ２増大に関連する状態がなかった、又はそれを呈示していなかったときなど、以前の１又は複数の時点に、試験対象から採取された１つ又は複数のサンプル中のＲＯＲ２のレベル若しくは平均レベルと一致してもよい。コントロールレベルに比べて、生体サンプル中の有意に高いＲＯＲ２のレベルは、対象におけるＲＯＲ２増大に関連する障害を示している。細胞表面ＲＯＲ２発現が主に胚形成に限定されるヒトなどの対象の場合、ＲＯＲ２のコントロールレベルは、ゼロ又は無であってよい。このように、本発明が提供する検出方法の一部の実施形態では、生体サンプル中のＲＯＲ２のどんな有意且つ検出可能な量も、対象におけるＲＯＲ１増大に関連する障害を示す可能性がある。
【００９４】
さらに、検出方法を用いて、ＲＯＲ２増大に関連する障害の進行をモニターすることができる。本方法は、スクリーニングを必要とする対象、例えば、ＲＯＲ２増大に関連する障害を有すると診断されたか、又は有することが疑われる対象からサンプルを取得するステップを含む。本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを用いて、サンプル中のＲＯＲ２のレベルを測定し、サンプル中のレベルを、以前の１又は複数の時点で試験対象から採取された１つ又は複数のサンプル中のＲＯＲ２のレベル若しくは平均レベルに一致するコントロールレベルと比較する。コントロールに比べて、有意に増大又は低下したＲＯＲ２のレベルは、対象の障害が、それぞれ、悪化又は改善していることを示している。前述の検出方法を用いて、例えば、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、及びその他の癌を含む障害の存在をスクリーニングする、又はその進行をモニターすることができる。
【００９５】
一部の実施形態では、本発明は、変化したレベルのＲＯＲ２について対象をスクリーニングする方法を提供する。一般に、本方法は、標識（例えば、造影剤）と結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを対象に投与するステップ、標識を検出するのに好適な様式で対象をイメージングするステップ、及び対象における１領域が、近傍の組織中の標識のバックグラウンドレベルと比較して、変化した密度若しくは濃度の標識を有するか否かを決定するステップを含む。あるいは、本方法は、対象の同じ領域中で以前検出された標識の密度若しくは濃度と比較して、領域中の標識の密度若しくは濃度に変化があるか否を決定するステップを含む。対象をイメージングする方法は、抗体に結合した標識を検出する上で適した、Ｘ線イメージング、Ｘ線コンピュータ断層（ＣＴ）イメージング（例えば、ＣＴ血管造影（ＣＴＡ）イメージング）、磁気共鳴（ＭＲ）イメージング、磁気共鳴血管造影（ＭＲＡ）、核医学、超音波（ＵＳ）イメージング、最適イメージング、エラストグラフィ、赤外線イメージング、マイクロ波イメージングなどを含み得る。好ましい実施形態では、対象は、例えば、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、及びその他の癌などのＲＯＲ２発現腫瘍を有する、有することが疑われる、又はそれを発生するリスクがあり、本方法を用いて、腫瘍の存在をスクリーニング又は検出する。別の実施形態では、本方法を用いて、時間経過による、例えば、治療期間中のＲＯＲ２発現腫瘍サイズ又は密度をモニターすることができる。
【００９６】
ＶＩ．医薬組成物及び併用
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、又はＡＤＣと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、本明細書に記載の抗体又は関連化合物のいずれかから調製することができる。例示的な組成物として、１つ又は複数の配列番号１３（軽鎖）及び／又は配列番号１（重鎖）を有するキメラ抗体、配列番号１４（軽鎖）及び／又は配列番号２（重鎖）を有するキメラ抗体、並びに配列番号１５（軽鎖）及び／又は配列番号３（重鎖）を有するキメラ抗体が挙げられる。本発明の医薬組成物に好適な他の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、又はＡＤＣとしては、配列番号１６〜２４に示される軽鎖及び／又は配列番号４〜１２に示される重鎖を有するものが挙げられる。本発明の他の例示的な組成物は、配列番号２５〜９６からなる群から選択される１、２、３、４、５、若しくは６つのＣＤＲを有するヒト化抗体を含有することができる。しかし、一部の実施形態では、抗体は、図１に示される同じ例示軽鎖又は重鎖の３つのＣＤＲ配列を含む。これらは、以下：（ｉ）配列番号２５〜２７と配列番号６１〜６３（抗体ＸＢＲ２−４０１）、（ｉｉ）配列番号２８〜３０と配列番号６４〜６６（抗体ＸＢＲ２−４１６）、（ｉｉｉ）配列番号３１〜３３と配列番号６７〜６９（抗体ＸＢＲ２−４３３）、（ｉｖ）配列番号３４〜３６と配列番号７０〜７２（抗体ＸＢＲ２−３２７）、（ｖ）配列番号３７〜３９と配列番号７３〜７５（抗体ＸＢＲ２−ＴＯＰ９）、（ｖｉ）配列番号４０〜４２と配列番号７６〜７８（抗体ＸＢＲ２−ＴＯＰ７２）、（ｖｉｉ）配列番号４３〜４５と配列番号７９〜８１（抗体ＥＲＲ２−３０２）、（ｖｉｉｉ）配列番号４６〜４８と配列番号８２〜８４（抗体ＥＲＲ２−３０８）、（ｉｘ）配列番号４９〜５１と配列番号８５〜８７（抗体ＥＲＲ２−３１６）、（ｘ）配列番号５２〜５４と配列番号８８〜９０（抗体ＥＲＲ２−３１７）、（ｘｉ）配列番号５５〜５７と配列番号９１〜９３（抗体ＥＲＲ２−ＴＯＰ２）、及び（ｘｉｉ）配列番号５８〜６０と配列番号９４〜９６（抗体ＥＲＲ２−ＴＯＰ３５）にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列とを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、図１に例示される同じ抗体の６つのＣＤＲ配列、例えば、（ａ）配列番号２５〜２７と配列番号６１〜６３（抗体ＸＢＲ２−４０１）；（ｂ）配列番号２８〜３０と配列番号６４〜６６（抗体ＸＢＲ２−４１６）；又は（ｃ）配列番号３１〜３３と配列番号６７〜６９（抗体ＸＢＲ２−４３３）を有する抗体を含む。また別の例示的な医薬組成物は、ｄｓＦｖフラグメントを含み、これは、必要に応じて、また当業者には理解されるように、アミノ酸配列に１つ又は複数の修飾を含んでもよい。
【００９７】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質又はＡＤＣのための担体、望ましくは薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、任意の好適な薬学的に許容される担体であってよい。これは、ヒト若しくは動物患者への投与に適した１種又は複数種の適合性固体若しくは液体充填材、希釈剤、他の賦形剤、又は封入物質（例えば、生理学的に許容される担体又は薬理学的に許容される担体）であってよい。用語「担体」は、活性成分の使用、例えば、対象への活性成分の投与を容易にするために活性成分と併用される有機若しくは無機成分（天然若しくは合成）を意味する。薬学的に許容される担体は、所望の薬効を実質的に損なわないように、１種若しくは複数種の活性成分、例えば、ハイブリッド分子と混合することができ、また、組成物中に２種以上の薬学的に許容される担体が存在する場合には、互いに混合することができる。薬学的に許容される材料は、典型的に、吐気、めまい、発疹、若しくは急性胃蠕動などの有意な望ましくない生理学的作用を生じることなく、対象、例えば、患者への投与を可能にする。例えば、治療目的のためにヒト患者に投与される場合、薬学的に許容される担体を含む組成物は免疫原性ではないことが望ましい。
【００９８】
本発明の医薬組成物は、さらに、例えば、塩の形態の酢酸、塩の形態のクエン酸、塩の形態のホウ酸、及び塩の形態のリン酸などの好適な緩衝剤を含有することができる。組成物は、さらに、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、及びチメロサールなどの好適な防腐剤を任意選択的に含有することもできる。本発明の医薬組成物は、単位剤形で提供することができ、また、いずれか好適な方法で調製することができ、その多くは、製剤分野で公知である。こうした方法は、本発明の抗体を、１若しくは複数の補助成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般に、組成物は、活性剤を液体担体、微粉化した固体担体、又はその両方と均一且つ入念に会合させた後、必要であれば、生成物を造形することにより調製される。
【００９９】
非経口投与に好適な組成物は、本発明の組成物の滅菌水性調製物を含むのが好都合であり、これは、好ましくはレシピエントの血液と等張性である。この水性調製物は、好適な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、公知の方法に従い製剤化することができる。滅菌注射調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤若しくは溶媒中の滅菌注射液若しくは懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であってよい。使用することができる許容されるビヒクル及び溶媒として、水、リンガー溶液、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、溶媒又は懸濁媒として、滅菌、不揮発性油が一般に使用される。この目的のために、いずれの無刺激の不揮発性油を使用してもよく、例えば、合成モノ−若しくはジ−グリセリドがある。加えて、オレイン酸などの脂肪酸を注射液の調製に使用することもできる。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に好適な担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見いだすことができる。
【０１００】
本発明の医薬組成物の調製及びそれらの様々な投与経路は、当技術分野で公知の方法に従って実施することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，２０th  ｅｄ．，２０００；及びＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。本発明に関して有用な送達系は、本発明の組成物の送達が、治療しようとする部位の感作を引き起こす前に、並びにそれを引き起こすのに十分な時間で、実施されるように、定時放出、遅延放出、及び持続的放出を含む。本発明の組成物は、他の治療薬又は療法と一緒に使用することができる。このような系は、本発明の組成物の反復投与を回避して、対象及び医師に対する便宜を高めることができ、しかも、本発明の組成物にとって特に好適となり得る。
【０１０１】
多くのタイプの放出送達系が入手可能であり、当業者には周知である。好適な送達系としては、ポリ（ラクチド−グリコシド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ無水物が挙げられる。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号明細書に記載されている。送達系はまた、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロール、脂肪酸又はモノ−ジ−及びトリグリセリドなどの中性脂肪を含む脂質である非ポリマー系；ハイドロゲル放出系；シラスティック系；ペプチドベース系；ワックスコーティング；通常の結合剤及び賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分的に融合したインプラントなどを含んでもよい。具体的な例として、限定されないが、以下のものが挙げられる：（ａ）活性組成物が、米国特許第４，４５２，７７５号明細書、同第４，６６７，０１４号明細書、同第４，７４８，０３４号明細書、及び同第５，２３９，６６０号明細書に記載されるものなどのマトリックス内の形態で含有されるエロージョン系、並びに（ｂ）米国特許第３，８３２，２５３号明細書及び同第３，８５４，４８０号明細書に記載されているようなポリマーから制御された速度で活性成分が透過する分散系。さらに、ポンプを用いたハードウエア送達系を使用することができ、そのいくつかは、移植のために改変されている。
【０１０２】
本発明はまた、本発明の方法を実施する上で好適なキットも提供する。典型的には、キットは、本発明の治療及び診断方法を実施するために必要な２種以上の構成要素を含む。キット構成要素としては、限定されないが、本発明の１種又は複数種の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、若しくはＡＤＣ、適切な試薬、及び／又は装置が挙げられる。一部の実施形態では、キットは、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、及びＲＯＲ２を検出する上で好適な免疫アッセイバッファー（例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、磁気選別、又はＦＡＣＳによる）を含み得る。キットは、さらに、１若しくは複数のマイクロタイタープレート、標準、アッセイ希釈剤、洗浄バッファー、接着プレートカバー、磁気ビーズ、磁石、及び／又はキットを使用する本発明の方法を実施するための指示書を含んでもよい。キットスキャンは、基質（例えば、マルチウェルプレート若しくはチップ）に結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを含み、これは、好適にパッケージングされ、ＲＯＲ２を検出する上で有用である。一部の実施形態では、キットは、蛍光標識、生体活性酵素標識、発光性標識、若しくは発色団標識などの標識に結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを含む。キットは、さらに、結合した抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、例えば、酵素の基質を視覚化するための試薬も含み得る。一部の実施形態では、キットは、造影剤に結合した本発明の抗体又は抗原結合フラグメント、並びに任意選択で、対象における抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントをイメージングする上で有用な１つ又は複数の試薬又は装置の構成要素を含む。
【０１０３】
一般に、キット内の本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント又はＡＤＣは、例えば、バイアル、ポーチ、アンプル、及び／又は治療若しくは検出方法に適した任意の容器内に好適にパッケージされる。キット構成要素は、濃縮物（凍結乾燥組成物を含む）として提供することができ、これは、使用前にさらに希釈してもよいし、又は使用濃度で提供することができる。インビボでの本発明の抗体の使用のために、所望の量及び濃度の構成要素を有する滅菌容器内に単一用量を供給してもよい。
【実施例】
【０１０４】
本発明をさらに説明するために以下に実施例を記載するが、本発明の範囲を制限しない。本発明の他の変形は、当業者には容易に理解され、それらは、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０１０５】
実施例１．ヒトＲＯＲ２特異的モノクローナル抗体の作製
細胞株：ＡＴＣＣからのＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＴ４７Ｄを、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養した。マウスＢ前駆細胞６３−１２（Ｓｈｉｎｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８，８５５−８６７，１９９２）、並びにｈＲＯＲ１又はｈＲＯＲ２を異所性発現する６３−１２細胞を、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１％（ｖ／ｖ）β−ＭＥ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充したＩＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、１％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ中に維持した。
【０１０６】
完全長ｈＲＯＲ２哺乳動物発現ベクターのクローニング：合成した、又は配列確認した市販のベクターから得られたフランキング制限部位を有するモジュラー部分から転移可能なベクターバックボーン（ｐＰＢ−Ｐｕｒｏ）をアセンブルしたが、これらについては、国際公開第２０１４０１３０２６Ａ１号パンフレットに詳しく記載されている。これらの元の転移可能なベクターバックボーンは、元のベクター中のプロマイシン耐性遺伝子のＩＲＥＳ駆動発現を個別のホスホグリセリン酸キナーゼプロモータ（ＰＧＫ）駆動発現と交換することによって修飾した。これは、ＩＲＥＳ配列を、多回クローニング部位の３’側に位置するＳＶ４０−ｐＡ配列で置換した後、プロマイシン耐性遺伝子の５’側にＰＧＫプロモータ配列を導入することによって実施した。フランキング制限部位（５’ＮｏｔＩ／３’ＢｓｔＢＩ）を用いた全遺伝子合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）によって完全長ＲＯＲ２オープンリーディングフレームを合成し、次に、これらを、それぞれの制限酵素を用いて転移可能なベクターの多回クローニング部位にクローニングした。
【０１０７】
ＥＭＴ−６マウス乳癌細胞株におけるｈＲＯＲ２の異所性発現のための細胞株の操作：マウスＥＭＴ−６乳癌細胞（バーゼル大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．ｍｅｄ．Ａｌｆｒｅｄ  Ｚｉｐｐｅｌｉｕｓからの親切な寄贈品）を、完全ＤＭＥＭ（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ及び２ｍＭのＬ−グルタミン（全て、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース（４．５ｇ／ｌ））において、３７℃及び５％ＣＯ2で培養した。細胞は、下記の通り、転位によってヒトＲＯＲ２を過剰発現するように操作した：細胞を遠心分離（６分、１２００ｒｐｍ、４℃）し、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に再懸濁させた（５×１０6細胞／ｍＬ）。次に、１３．３μｇの転移性ベクターｐＰＢ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ−ＲＯＲ２（完全長ヒトＲＯＲ２（ＮＰ＿００４５５１．２）及びプロマイシン耐性遺伝子の同時発現を指令する）と、６．６μｇのトランスポザーゼ含有ベクターｐＣＤＮＡ３．１＿ｈｙ＿ｍＰＢを含有する４００μＬのＲＰＭＩに、４００μＬの上記細胞懸濁物を添加した。ＤＮＡ／ＥＭＴ−６細胞混合物をエレクトロポレーションキュベット（０．４ｃｍ−ギャップ、１６５−２０８８，ＢｉｏＲａｄ，Ｃｒｅｓｓｉｅｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移し、３００Ｖ及び９５０μＦのキャパシタンスエクステンダーを備えたＢｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを用いて、エレクトロポレーションした。次に、細胞を室温で５〜１０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１２００ｒｐｍで６分間遠心分離し、１回洗浄してから、完全ＤＭＥＭ中に再懸濁させた後、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃にて、加湿インキュベータ内でのインキュベーションに付した。エレクトロポレーションから１日後、３μｇ／ｍＬのプロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ８８３３）を添加することによって、ヒトＲＯＲ２を安定に発現する細胞プールを選択した。
【０１０８】
選択したＥＭＴ−６−ＲＯＲ２細胞上でのＲＯＲ２発現をフローサイトメトリーにより確認した。手短には、トリプシン処理後、１０6個の細胞をＦＡＣＳチューブ内で遠心分離し；得られたペレットをバッファー（２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＰＢＳ）中に再懸濁させた。次に、細胞をＸＢＲ２−４０１（ｍＡｂ００３）；３０分、４℃、最終濃度２μｇ／ｍＬ）と一緒にインキュベートした後、遠心分離及び洗浄した。続いて、細胞を前述のように再懸濁させ、１：２５０希釈率で、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃγ特異的）ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ，１２−４９９８−８２）と一緒に暗所で（３０分、４℃）インキュベートし、バッファーで１回洗浄してから、ＦＡＣＳソーティングまで氷上で維持した。
【０１０９】
ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩを用いて、ウェル当たり２００μＬの完全ＤＭＥＭを含有する９６ウェル平底プレート中に細胞をシングルセルソーティングした。このプレートを３７℃でインキュベートし、クローンを６ウェルプレートに拡大した後、分析用のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ計器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて、上に概説したフローサイトメトリーによるＲＯＲ２発現の分析を行った。
図１５Ｃは、抗ＲＯＲ２抗体ＸＢＲ２−４０１（ｍＡｂ００３）を用いて検出された、クローン１４（高ＲＯＲ２発現）及びＷＴ（ＲＯＲ２陰性）ＥＭＴ−６のＦＡＣＳ分析データを示す。
【０１１０】
実施例２．高複雑度ウサギＦａｂライブラリーの作製及びスクリーニング用の試薬
組換えヒトＲＯＲ２タンパク質ｈＦｃ−ｈＲＯＲ２−Ｔ245の構築、発現、精製、及びビオチン化：Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのヒトＲＯＲ２  ｃＤＮＡ（クローンＩＤ：４０／４６５５３）をテンプレートとして使用した。ＲＯＲ２は、アミノ酸２４５位に一塩基多型（ＳＮＰ）を有する。クローニングの一環として、クローン４０／４６５５３の２４５位の比較的稀なアラニンを、より一般的なトレオニンに変異させた。手短には、ＲＯＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＮ末端及びＣ末端部分をコードする２つのｃＤＮＡフラグメントを、（ｉ）プライマーｈＲＯＲ２ＥＣＤ＿Ｆ（ｇｃｃｔａａｇｃｔｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔｇｃｃｇａａｇｔｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇａｔｃｃｇａａｃｇ）（配列番号９７）及びｈＲＯＲ２＿Ａ２４５Ｔ＿Ｒ（ｇｃｔｃａｃｇｃｇｇｃｔｔｇｇｇｔｇｔｃｃｇｇｇａｇｃｇｃｇｃｇｔｃｇｃ）（配列番号９８）並びに（ｉｉ）プライマーｈＲＯＲ２＿Ａ２４５Ｔ＿Ｆ（ｇｃｇａｃｇｃｇｃｇｃｔｃｃｃｇｇａｃａｃｃｃａａｇｃｃｇｃｇｔｇａｇｃ）（配列番号９９）及びｈＲＯＲ２ＥＣＤ＿Ｒ（ａｇｃｔｃｔｃｇａｇｔｃａｃｃｃｃａｔｃｔｔｇｃｔｇｃｔｇｔｃｔｃｇｇｇｇａｃｔａｃａｃｇａｇｇ）（配列番号１００）でＰＣＲ増幅した。続いて、フランキングプライマーｈＲＯＲ２ＥＣＤ＿Ｆ及びｈＲＯＲ２ＥＣＤ＿Ｒを用いたオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、全ＲＯＲ２  ＥＣＤ（アミノ酸５５〜３９４）をアセンブルしてから、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩを介したｐＣＥＰ４−ｈＦｃ（Ｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）にクローニングした。得られたｐＣＥＰ４−ｈＦｃ−ｈＲＯＲ２の構築物を、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び製造者のプロトコルに詳述される条件を用いて、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ無タンパク質培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、ｈＦｃ−ｈＲＯＲ２融合タンパク質を上清からプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。精製したｈＦｃ−ｈＲＯＲ２を、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｔａｇ  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてビオチン化した。手短には、５０μＬの０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）中３００μｇのｈＦｃ−ｈＲＯＲ２を１μＬの５ｍｇ／ｍＬビオチンアミドヘキサン酸３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシニドエステルと一緒に、穏やかに攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートした。キットにより供給されるＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−５０カラムを用いて、ビオチン化ｈＦｃ−ｈＲＯＲ２を単離した。
【０１１１】
組換えヒトＲＯＲ１（ｈＲＯＲ１−Ｈｉｓ）及びヒトＲＯＲ２（ｈＲＯＲ２−Ｈｉｓ）タンパク質の構築、発現、及び精製：ｈＲＯＲ１−Ｈｉｓは、テンプレートとしてｐＣＥＰ４−ｈＦｃ−ｈＲＯＲ１（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を用い、プライマーＳＰ−ｈＲＯＲ１＿Ｆ（５’ｇｃｔｇｇｇｔａｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃｔｇｇａｃｔｔｇｇａｇａａｔｃｃｔｇｔｔｔｃｔｃｇｔａｇｃｔｇｃｔｇｃａａｃｔｇｇａｇｃａｃａｃｔｃｃｇｃｃｃｇｇｇｇｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃｃａｇ３’）（配列番号１０１）及びｈＲＯＲ１−Ｈｉｓ＿Ｒ（５’ ｃｇｇｃｃｔｃｇａｇｔｃａｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃｃａｔｃｔｔｇｔｔｃｔｔｃｔｃｃｔｔ  ３’）（配列番号１０２）でＰＣＲ増幅し、ｈＲＯＲ２−Ｈｉｓは、テンプレートとしてｐＣＥＰ４−ｈＦｃ−ｈＲＯＲ２を用い、プライマーＳＰ−ｈＲＯＲ２＿Ｆ（ｇｃｔｇｇｇｔａｃｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃｔｇｇａｃｔｔｇｇａｇａａｔｃｃｔｇｔｔｔｃｔｃｇｔａｇｃｔｇｃｔｇｃａａｃｔｇｇａｇｃａｃａｃｔｃｃｇａａｇｔｇｇａｇｇｔｔｃｔｇｇａｔｃｃｇ）（配列番号１０３）及びｈＲＯＲ２−Ｈｉｓ＿Ｒ（ｃｇｇｃｃｔｃｇａｇｔｃａｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｇｃｃｃｃａｔｃｔｔｇｃｔｇｃｔｇｔｃｔｃｇ）（配列番号１０４）でＰＣＲ増幅した。ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩを介して個別にｐＣＥ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした後、これらの構築物を、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクトし、記載されている（Ｋｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｅｒ，２００９）通りに、１−ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙにより、対応する組換えタンパク質産物を精製した。精製したｈＲＯＲ１−Ｈｉｓ及びｈＲＯＲ２−Ｈｉｓの品質及び量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡ280吸光度によりそれぞれ分析した。
【０１１２】
ナイーブキメラウサギ／ヒトＦａｂライブラリーの作製及び選択：ウサギの取り扱いは全て、Ｐｏｃｏｎｏ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｆａｒｍ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ，ＰＡ）又はＲ＆Ｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔａｎｗｏｏｄ，ＷＡ）の家畜担当職員により実施された。計９匹のウサギ（月齢３〜４ヵ月）を使用した。これらのウサギの５匹は、ニュージーランドホワイト（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ）（ＮＺＷ）系統であり、そのうち３匹は、Ｐｏｃｏｎｏ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｆａｒｍ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ，ＰＡ）から取得し、２匹は、Ｒ＆Ｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔａｎｗｏｏｄ，ＷＡ）から取得した。４匹のｂ９野生型ウサギは、米国立アレルギー・感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）（ＮＩＡＩＤ）（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ−Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ８１：１７９４−１７９８，１９８４；及びＰｏｐｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２５：３２５−３３５，２００３で開発され、特性決定された純種を起源とする個別のＲ＆Ｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから得られた。各ウサギからの脾臓及び骨髄を収集し、確立されたプロトコル（Ｒａｄｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５２５：１０１−１２８，ｘｉｖ，  ２００９を用いて、全ＲＮＡ作製並びにウサギＶκ、Ｖλ、及びＶHコード配列のＲＴ−ＰＣＲ増幅のために処理した。ウサギ（ｒｂ）Ｖκ／ヒト（ｈｕ）Ｃκ／ｒｂＶH及びｒｂＶλ／ｈｕＣλ／ｒｂＶHセグメントは、それぞれ、３フラグメントオーバーラップ発現ＰＣＲに基づく１融合ステップでアセンブルした。ｂ９ウサギに由来するＶLも、ＮＺＷウサギ由来のＶHを用いてアセンブルしたことに留意されたい。ＦａｂコードフラグメントをＳｆｉＩで消化し、ＳｆｉＩ処理ファージディスプレイベクターｐＣ３Ｃ（Ｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ３１８：７５−８７，２００７）と１６℃で２４時間連結した。続いて、３０回の個別のエレクトロポレーション（各々、５０μｌのエレクトロコンピテントセル中０．５μｇのＤＮＡを用いる）により、１５μｇの精製ｐＣ３Ｃ−ｒｂＶκ／ｈＣκ／ｒｂＶH連結産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＳＲ３２０（トロント大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏ，  Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）Ｄｒ．Ｓａｃｈｄｅｖ  Ｓ．Ｓｉｄｈｕからの親切な寄贈品）に形質転換し、ライブラリーκについて７．５×１０9個の独立した形質転換体を取得した。ライブラリーλの場合、同じ手順を用いて、４．８×１０9個の独立した形質転換体が得られた。ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、ファージミドライブラリーをファージライブラリーに変換し、−８０℃で保存した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又はＥＲ２７３８（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を用いて、ファージライブラリーκ及びライブラリーλを再度増幅し、同様に混合した後、ビオチン化ｈＦｃ−ｈＲＯＲ２に対する４ラウンドのパニングに付した。パニングの間、５��ｇ／ｍＬの抗原をストレプトアビジンコート磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に３７℃で３０分間プレインキュベートした後、１ｍｇ／ｍＬの非特異的ポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下で、ファージライブラリーからの結合物質を捕捉した。第３ラウンドのパニングから、空のビーズを用いたインキュベーションにより、インプットファージをネガティブディプリーションした後、抗原負荷ビーズに対する選択に付した。選択の後、ＩＰＴＧ誘導細菌クローンの上清をＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーにより分析した。ＡｌｕＩを用いたＤＮＡ指紋法により反復クローンを同定し、ユニークなクローンのＶL及びＶH配列をＤＮＡシーケンシングにより決定した（図１）。
【０１１３】
実施例３．キメラウサギ／ヒトＦａｂ及び完全長ＩｇＧ１抗体の発現及び精製
キメラウサギ／ヒトＦａｂ及びＩｇＧ１の構築、発現及び精製：キメラウサギ／ヒトＦａｂフォーマットのＭＡｂ：ＸＢＲ２−４０１、ＸＢＲ２−４１６、及びＸＢＲ２−４３３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミドｐＣ３Ｃ−Ｈｉｓにクローニングして、発現させた後、記載されているように（Ｋｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｅｒ，２００９）精製した。キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１フォーマットのｍＡｂ：ＸＢＲ２−４０１、ＸＢＲ２−４１６、及びＸＢＲ２−４３３の発現のために、以前記載されているベクターＰＩＧＧ−Ｒ１１を使用した（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。発現に使用した様々なプライマー配列を表１に示す。Ｆａｂ：ＸＢＲ２−４０１、ＸＢＲ２−４１６、及びＸＢＲ２−４３３のＶHコード配列を、プライマー４−１＿ＶＨ＿Ｆ及び４−１＿ＶＨ＿Ｒ、４−１６＿ＶＨ＿Ｆ及び４−１６＿ＶＨ＿Ｒ、並びに４−３３＿ＶＨ＿Ｆ及び４−３３＿ＶＨ＿Ｒをそれぞれ用いてＰＣＲ増幅した後、ＡｐａＩ／ＳａｃＩを介してＰＩＧＧ−Ｒ１１にクローニングした。次に、Ｆａｂ４−１、４−１６、及び４−３３の軽鎖コード配列を、それぞれ、プライマー４−１＿κ＿Ｆ、４−１６＿κ＿Ｆ、及び４−３３＿λ＿Ｆを、ＬＥＡＤ−Ｂと組み合わせて用いて、ＰＣＲ増幅した後、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩを介して、対応する重鎖コード配列を有するＰＩＧＧ−Ｒ１１にクローニングした。Ｆａｂ  ＸＢＲ２−４０１のＶHコード配列のＦＲ４の内部ＡｐａＩ部位は、プライマー４−１＿ＶＨ＿Ｒにおけるサイレント突然変異によって除去されたことに留意されたい。さらに、ＸＢＲ２−４１６、及びＸＢＲ２−４３３について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおける選択の間に抑制されていたＴＡＧ停止コドンは、プライマー４−１６＿ＶＨ＿Ｆ及び４−３３＿ＶＨ＿Ｆを用いて、ＸＢＲ２−４１６、及びＸＢＲ２−４３３両方のネイティブＶHの第１アミノ酸をコードするＣＡＧ（グルタミン）に変更した（図１）。得られたＰＩＧＧ−ＸＢＲ２−４０１、ＰＩＧＧ−ＸＢＲ２−４１６、及びＰＩＧＧ−ＸＢＲ２−４３３プラスミドは、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクトし、記載されているように（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｅｒ，２０１２）、１ｍＬ組換えＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、対応するタンパク質産物を精製した。精製したＩｇＧ１の品質及び量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡ280吸光度によりそれぞれ分析した。
【０１１４】
キメラウサギ／ヒトＦａｂフォーマット中の他の全てのｍＡｂを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミドｐＥＴ１１ａにクローニングして、発現させ、記載されているように（Ｋｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｅｒ，２００９）精製した。キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１フォーマットのｍＡｂ：ＥＲＲ２−３０２、ＥＲＲ２−３０８、ＥＲＲ２−３１７、ＸＢＲ２−３２７及びＸＢＲ２−ＴＯＰ７２の発現のために、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、重鎖及び軽鎖を個別にクローニングした。重鎖の場合、重鎖シグナルペプチドコード配列を含むｇＢｌｏｃｋ、ＥＲＲ２−３０２のＶH及びヒトＩｇＧ１のＣH１（１〜４９）をＩＤＴ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）により合成し、プライマーＫｐｎＩ／ＡｓｃＩ−シグナル及びＣＨ１−内部／オーバーラップ−Ｒを用いて増幅して、プライマーＣＨ１−内部／オーバーラップ−Ｆ及びＨＣ−ＣＨ３−Ｒ−ＸｈｏＩを用いてＰＩＧＧから増幅されたＣH１（５０〜８８）−ＣH２−ＣH３と、プライマーＫｐｎＩ／ＡｓｃＩ−シグナル及びＨＣ−ＣＨ３−Ｒ−ＸｈｏＩを用いたオーバーラップ伸長ＰＣＲにより融合した後、ＡｓｃＩ／ＸｈｏＩによりｐＣＥＰ４にクローニングした。ｇＢＬＯＣＫを合成したとき、ＮｈｅＩ部位は、同義突然変異によってＡｌａ12のＣH１に導入されたことに留意されたい。この構築物は、ＡｓｃＩ／ＮｈｅＩを用いてＶHを置換することにより、他のｍＡｂ重鎖をクローニングするためのベクターとして役立ち：ＥＲＲ２−３０８、ＥＲＲ２−３１７、ＸＢＲ２−３２７及びＸＢＲ２−ＴＯＰ７２のＶHを、フォワードプライマーＥＲＲ２−３０８  ＨＣ−Ｆ、ＥＲＲ２−３１７  ＨＣ−Ｆ、ＸＢＲ２−３２７  ＨＣ−Ｆ及びＥＲＲ２−３０８  ＨＣ−Ｆ並びにリバースプライマーＶＨ−ＣＨ１−Ｒ−ＥｈｅＩで個別に増幅した後、伸長ＰＣＲにより、プライマーＫｐｎＩ／ＡｓｃＩ−シグナル及びＶＨ−ＣＨ１−Ｒ−ＥｈｅＩを含むシグナルペプチドを付加した。次に、ＡｓｃＩ／ＮｈｅＩにより、各ＶHをベクターに挿入した。軽鎖のクローニングのために、ＥＲＲ２−３０２及びＸＢＲ２−ＴＯＰ７２のλ軽鎖は、プライマーＬＣ−Ｒ−Ｘｈｏｌと個別に組み合わせたプライマーＥＲＲ２−３０２  ＬＣ−Ｆ及びＸＢＲ２−ＴＯＰ７２  ＬＣ−Ｆで増幅し、ＥＲＲ２−３０８、ＥＲＲ２−３１７及びＸＢＲ２−３２７のκ鎖は、プライマーＫＣ−Ｒ−ＸｈｏＩとそれぞれ個別に組み合わせたプライマーＥＲＲ２−３０８  ＫＣ−Ｆ、ＥＲＲ２−３１７  ＫＣ−Ｆ、及びＥＲＲ２−３１７  ＫＣ−Ｆで増幅した。次に、フォワードプライマーＫｐｎＩ／ＡｓｃＩ−シグナル及びリバースプライマーＬＣ−Ｒ−ＸｈｏＩ又はＫＣ−Ｒ−ＸｈｏＩを用いた伸長ＰＣＲにより、シグナルペプチドを付加した。続いて、各軽鎖ＰＣＲ産物をＡｓｃＩ／ＸｈｏＩによりｐＣＥＰ４にクローニングした。各ＩｇＧについて重鎖又は軽鎖を含む、得られた構築物は、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性に同時トランスフェクトし、記載されているように（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｅｒ，２０１２）、１ｍＬ組換えＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａ���ｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、対応する組換えタンパク質産物を精製した。精製したＩｇＧ１の品質及び量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡ280吸光度によりそれぞれ分析した。
【０１１５】
【表１】
2019509023.tif 000004
2019509023.tif 000005
【０１１６】
実施例４．抗体結合活性の試験
ＥＬＩＳＡ：ＲＯＲ２抗体の結合特性をＥＬＩＳＡにより調べた。コーティングのために、９６ウェルＣｏｓｔａｒ３６９０プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の各ウェルを２５μＬのコーティングバッファー（０．１Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．６）中１００ｎｇの抗原と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。１５０μＬの３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＴＢＳで、３７℃にて１時間遮断してから、１００ｎｇ／５０μＬのＦａｂを添加し、３７℃で２時間インキュベートした後、１５０μＬのＰＢＳで１０回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＴＢＳ中のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に結合させたマウス抗ＨｉｓタグｍＡｂの１：１０００希釈物５０μＬと一緒に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳによる洗浄を繰り返してから、基質として２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、製造者の指示に従い、比色検出を実施した。図２Ａに示すように、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）及びＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
【０１１７】
フローサイトメトリー：抗体の抗原結合特性は、フローサイトメトリー分析によっても調べた。具体的には、標準的なフローサイトメトリー方法を用いて、細胞を染色した。手短には、精製済の抗ＲＯＲ２Ｆａｂの場合、０．１〜１×１０6個の細胞を氷上の１μｇ／１００μＬのＦａｂで１時間かけて染色した。氷冷フローサイトメトリーバッファー（１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）で２回洗浄した後、氷上の１００μＬフローサイトメトリーバッファー中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｑｉａｇｅｎ）と結合したマウス抗ＨｉｓタグｍＡｂの１：１０００希釈物と一緒に、３０分かけて細胞をインキュベートした。精製済の抗ＲＯＲ２ＩｇＧ１の場合、０．１〜１×１０6個の細胞を１００ｎｇ／１００μＬのＩｇＧと一緒に氷上で１時間インキュベートした。氷冷フローサイトメトリーバッファーで２回洗浄した後、氷上の１００μＬフローサイトメトリーバッファー中のＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ  ｐＡｂの１：５００希釈物で、３０分かけて細胞を染色した。最後に、分析から死滅細胞を排除するために、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍＬまで添加した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ計器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて、細胞を分析した。試験の結果を図２Ｂ、図４〜８、及び図１１に示す。
【０１１８】
単離した抗体の交差反応性及びエピトープマッピングを調べるために、別の試験を実施した。これらの試験では、１４５にＴｈｒ（ｈＲＯＲ２−Ｔ245）（５５〜３９４）を有するヒトＲＯＲ２及びより低頻度のＳＮＰ  ｈＲＯＲ２−Ａ245（５５〜３９４）を有するヒトＲＯＲ２、並びにマウスＲＯＲ２（３４〜４０３）の細胞外ドメインを、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ）と、膜貫通ドメイン（アミノ酸５３３〜５５３）を含むＰＤＧＦＲＢセグメント（アミノ酸５１３〜５６１）が続く（Ｇ4Ｓ）3リンカーに個別に融合させ、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞上に安定して展示させた（図３）。次に、ｈＲＯＲ２−Ｔ245、ｈＲＯＲ２−Ａ245、及びｍＲＯＲ２に対するキメラウサギ／ヒトＦａｂフォーマット中の全てのｍＡｂの交差反応性を、これらの細胞を用いたフローサイトメトリーにより試験した（図４）。同様に、ｈＲＯＲ２−Ｔ245の３つの細胞外ドメインの様々な組成物、Ｉｇ（アミノ酸５５〜１４５）、Ｆｒ（１６９〜３０３）、Ｋｉ（３１６〜３９４）Ｉｇ＋Ｆｒ（５５〜３０３）、Ｆｒ＋Ｋｉ（１６９〜３９４）も、ＨＥＫ２９３細胞上に個別に安定して展示させた（図３）。これらのＲＯＲ２ドメイン展示細胞株を使用し、フローサイトメトリーにより、キメラウサギ／ヒトＩｇＧを用いて、ｍＡｂ：ＸＢＲ２−４０１（図５）、ＸＢＲ２−４３３（図６）、及びＸＢＲ２−４１６（図７）のエピトープを決定した。手短には、０．１〜１×１０6個の細胞を精製済（１μｇ／ｍＬ）のキメラウサギ／ヒトＩｇＧと一緒に、氷上で１時間インキュベートした。氷冷フローサイトメトリーバッファー（１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）で２回洗浄した後、１００μｌのフローサイトメトリーバッファー中のＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ  ｐＡｂの１：５００希釈物と一緒に氷上で３０分間細胞をインキュベートした。氷冷フローサイトメトリーバッファーで２回洗浄した後、１００μｌのフローサイトメトリーバッファー中のビオチン化ラット抗ＨＡｍＡｂ  ３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ）の１：５００希釈物と一緒に氷上で１時間細胞をインキュベートし、前回と同様に洗浄した後、２μｇ／ｍＬのＰＥ結合ストレプトアビジン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により氷上で３０分間染色した。分析から死滅細胞を排除するために、ＤＡＰＩを最終濃度１００ｎｇ／ｍＬまで添加した。他のｍＡｂのエピトープは全て、前述したものと同じ手順のフローサイトメトリーにより、キメラウサギ／ヒトＦａｂを用いて決定した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ計器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて、細胞を分析した。
【０１１９】
表面プラズモン共鳴：さらに、ｈＦｃ−ｈＲＯＲ２に対する全Ｆａｂの親和性を測定するために表面プラズモン共鳴試験を実施し、Ｂｉａｃｏｒｅ試薬及びソフトウエアを用いたＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００計器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でエピトープマッピング試験を実施した。Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の指示に従い、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体をＣＭ５センサーチップ上に固定化した。次に、ｈＦｃ−ｈＲＯＲ２融合タンパク質を特定の密度（図９及び図１０Ｂに示す）で捕捉した。各センサーチップは、即座のバックグラウンド除去のために空のフローセルを含んだ。全結合アッセイは、１×ＨＢＳ−ＥＰ＋泳動バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）、及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）及び流量３０ｍＬ／分を用いた。親和性測定のために、全てのＦａｂを５つの異なる濃度（希釈係数は２）で注射し、そのうちの１つは２回反復して試験した（各Ｆａｂの最も高い濃度を図１０Ｂに示す）。センサーチップは、結合能力を一切喪失することなく、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔから３Ｍ  ＭｇＣｌ2を用いて再生した。会合（ｋon）及び解離（ｋoff）速度定数の計算は、１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルに基づいて行った。平衡解離定数（ＫD）をｋoff／ｋonから算出した。エピトープマッピング試験のために、図９に示す順で、各Ｆａｂを１×ＨＢＳ−ＥＰ＋泳動バッファー中に、５００ｎＭの単独で、又は混合物として調製し、注射した。
【０１２０】
ウエスタンブロッティング：変性ＲＯＲ２ポリペプチドに対する、単離された抗体の結合活性を調べるために、ウエスタンブロッティングアッセイを実施した。１×サンプルバッファー（１％β−メルカプトエタノールを含有）により、細胞又はタンパク質を溶解させ、ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上での泳動の前に煮沸した。膜転写及び５％ミルクによる遮断の後、２μｇ／ｍＬのキメラウサギ／ヒトＩｇＧ１  ＸＢＲ２−４０１を塗布して、変性タンパク質を検出し、続いて、ＨＲＰに結合した１／１０００抗ヒトＦｃとのインキュベーションの後、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて展開させた。図１２に示すように、結果から、抗体が、実際に変性ｈＲＯＲ２を認識することがわかる。
【０１２１】
実施例５．精製、組換えツインストレップタグ付き（ｔｗｉｎ  ｓｔｒｅｐ−ｔａｇｇｅｄ）ヒト、マウス及びカニクイザルＲＯＲ２の発現
ツインストレップタグ付きヒト、マウス及びカニクイザルＲＯＲ２−細胞外ドメインを次のように生成した：ヒトＲＯＲ２（ＮＰ＿００４５５１．２）、マウスＲＯＲ２（ＮＰ＿０３８８７４．３）及びカニクイザルＲＯＲ２（ＸＰ＿００５５８２２９１．１）の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を各々、シグナル配列（ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣ）とＮ末端に融合させ、ツインストレップタグ（ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧ）をコードする配列とＣ末端に融合させた。全遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）により、フランキングする５’ＮｏｔＩ及び３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する全ヌクレオチド配列を生成し、哺乳動物発現ベクターｐＣＢ１４中にアセンブルして、ＤＮＡシーケンシングにより確認した。このベクター、すなわち、エピソーム哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体は、ＥＢＶ複製起点を担持し、染色体外複製を可能にするためにＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ−１）をコードし、元のヒグロマイシンＢ耐性遺伝子の代わりに、プロマイシン選択マーカを含有する。
【０１２２】
組換えヒトツインストレップタグ付きＲＯＲ２（ＮＰ＿００４５５１．２）、マウスツインストレップタグ付きＲＯＲ２（ＮＰ＿０３８８７４．３）、及びカニクイザルツインストレップタグ付きＲＯＲ２（ＸＰ＿００５５８２２９１．１）を下記のプロトコルに従って発現させ、実験室内で精製した：ＴｗｉｎＳｔｒｅｐタグでＣ末端がタグ付けされ、ＲＯＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の発現を指令するＥＢＮＡ発現ベクターｐＣＢ１４ｂ−ＲＯＲ２−ＥＣＤ−ＴｗｉｎＳｔｒｅｐ（ヒトＲＯＲ２）、ｐＣＢ１４ｇ−マウスＲＯＲ２−ＥＣＤ−ＴｗｉｎＳｔｒｅｐ（マウスＲＯＲ２）又はｐＣＢ１４ｂ−カニクイザルＲＯＲ２−ＥＣＤ−ＴｗｉｎＳｔｒｅｐ（カニクイザルＲＯＲ２）を、ＰＬＵＳ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１５３８８１００）と共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクトした。１日のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ2、増殖培地：１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全て、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（４．５ｇ／ｌ））の後、細胞を選択条件（２μｇ／ｍＬのプロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、２ｍｇ／ｍＬのＰ８８３３−２５ｍｇストック））下で拡大した。細胞を分割して、さらに拡大し（３７℃、５％ＣＯ2）；一旦密集に達したら、組織培養皿を２０μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ１５２４）で、３７℃にて２時間コーティングし、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄した後、ポリ−Ｌ−リシンコーティングプレート上に１：３に分割した。再度、密集に達した後、細胞をＰＢＳで洗浄してから、１μｇ／ｍＬのプロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８８３３）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、４−０２Ｆ００−Ｈ）、１６１μｇ／ｍＬのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ８１９９）及び１０μｇ／ｍＬのＬ−グルタチオン還元型（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ６５２９）で補充した生成培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２，Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，３１３３０−０３）を用いて培地の取替えを行った。上清を隔週で回収し、濾過する（０．２２μｍ）ことにより細胞を除去して、精製まで４℃で保存した。精製のために、濾過した上清をＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（登録商標）高容量カートリッジ（ＩＢＡ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２−１２３８−００１）カラムにロードし；ＡＥＫＴＡ  ｐｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、製造者のプロトコルに従い、精製及び溶離を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質純度及び完全性について画分を分析した。タンパク質含有画分を混合し、Ａｍｉｃｏｎ濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＰＢＳ中≧１：１００の希釈率に達するまでバッファー交換に付した後、ローリテンションフィルタ（０．２０μｍ，Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ＰＡ４９．１）を用いて滅菌濾過した。
【０１２３】
実施例６．精製、組換え抗ヒトＲＯＲ２及びアイソタイプコントロール抗体の発現
発現ベクター：リーダ配列としてＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣを用いた全遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）によって抗体可変領域コード領域を生成し、発現ベクターｐＣＢ１４において、ヒトＩｇＨ−γ及びＩｇＬ−κ（ＥＲＲ２−３０８、ＥＲＲ２−３１６、ＥＲＲ２−３１７、ＸＢＲ２−３２７、Ｈｕｌｕｃ６３）又はＩｇＬ−λ（ＥＲＲ２−３０２、ＥＲＲ２−Ｔｏｐ３５）定常領域とアセンブルした。
【０１２４】
完全長重鎖及び軽鎖の各々をコードする発現ベクターは、独自の哺乳動物発現ベクター（スイス国）にアセンブルした。当技術分野で公知の方法により、抗体をＣＨＯ細胞に一過性に発現させ、組換え抗体を、当技術分野で公知のように、標準プロテインＡ精製によりＣＨＯ細胞上清から精製した。手短には、ＣＨＯ細胞上清を遠心分離により回収し、滅菌濾過（０．２μｍ）した後、以下に記載するように、ＡｍｐｈｅｒｅプロテインＡカラム（ＪＳＲ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＦＰＬＣによるアフィニティクロマトグラフィーを実施した。
【０１２５】
実験室内発現及び精製：ＰＬＵＳ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｉｎａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，１５３８８１００）と共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、ｐＣＢ１４ベースの発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。１日のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ2、増殖培地：１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全て、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（４．５ｇ／ｌ））の後、細胞を選択条件（２μｇ／ｍＬのプロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｕｃｈｓ  ＳＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、２ｍｇ／ｍＬのＰ８８３３−２５ｍｇストック））下で拡大した。細胞を分割し、さらに拡大した（３７℃、５％ＣＯ2）；一旦密集に達したら、組織培養皿を２０μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ１５２４）で、３７℃にて２時間コーティングし、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞をトリプシン処理し、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたプレート上に１：３に分割した。再度、密集に達した後、細胞をＰＢＳで洗浄してから、１μｇ／ｍＬのプロマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８８３３）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）、１６１μｇ／ｍＬのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ８１９９）及び１０μｇ／ｍＬのＬ−グルタチオン還元型（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ６５２９）で補充した生成培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２，Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，３１３３０−０３）への培地の取替えを行った。上清を隔週で回収し、濾過する（０．２２μｍ）ことにより細胞を除去して、精製まで４℃で保存した。
【０１２６】
精製のために、濾過した上清をＰＢＳ平衡Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１７−０４０５−０１）又はＪＳＲ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＪＳＲ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ，ＪＷＴ２０３ＣＥ）にロードし、ＰＢＳで洗浄し；ＡＥＫＴＡ  ｐｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を用いて、溶離を実施した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で画分を直ちに中和してから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質純度及び完全性について分析した。タンパク質含有画分を混合し、Ａｍｉｃｏｎ濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ＵＦＣ９０１００８）を用いて、表２に列記するバッファー中で１：１００の希釈率に達するまでバッファー交換に付した後、ローリテンションフィルタ（０．２０μｍ，Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ＰＡ４９．１）を用いて滅菌濾過した。
【０１２７】
表２は、後の実施例で使用する抗体を、それらの最終濃度及びバッファーと共に列記する。
【０１２８】
【表２】
2019509023.tif 000006
【０１２９】
Ｈｕｌｕｃ６３は、非関連コントロール抗体に相当し；重鎖及び軽鎖を以下に記載する。
【０１３０】
【表３】
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【０１３１】
実施例７．マウス及びカニクイザルＲＯＲ２に対する抗ヒトＲＯＲ２抗体の交差反応性
９６ウェルプレートの各ウェルを、０．１Ｍ重炭酸塩コーティングバッファー（ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍＬのツインストレップタグ付きヒト、マウス又はカニクイザルＲＯＲ２（実施例４から）５０μＬでコーティングした後、４℃で１２時間インキュベートした。別の９６ウェルプレートも、抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１０９−００６−００８）を用いた以外は、同様に調製した。３７℃にて、１５０μＬの３％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳで１時間遮断してから、下記の抗体を０．５μｇ／ｍＬの濃度で各プレートのウェルに添加し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＴＢＳで連続的に希釈（希釈係数４）した後、３７℃で１時間のインキュベーションに付した：ＥＲＲ２−３０２（ｍＡｂ００４）、ＥＲＲ２−３０８（ｍＡｂ０３７）、ＥＲＲ２−３１６（ｍＡｂ０００５）、ＥＲＲ２−３１７（ｍＡｂ００６）、ＸＢＲ２−３２７（ｍＡｂ００７）、ＥＲＲ２−Ｔｏｐ３５（ｍａｂ１３０）、及びＸＢＲ２−４０１（ｍａｂ００３）。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰに結合したＦ（ａｂ’）2抗ヒトＦＣγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，１０９−０３６−００８）を１：１０，０００の希釈率で、ウェル当たり５０μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、Ｓｐａｒｋ  １０Ｍプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ）を用いた検出に付した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対するＯＤ４９０ｎｍの曲線を当てはめた。Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅの組み込み「ログ（阻害剤）対応答−可変傾き（４つのパラメータ）」ＩＣ50決定関数を用いて決定したＩＣ50値を、ヒト及びマウスＲＯＲ２については表３に、またヒト及びカニクイザルＲＯＲ２については表４に報告する。図１４に示すように、抗ヒトＲＯＲ２抗体ＥＲＲ２−３０２及びＥＲＲ２−Ｔｏｐ３５は、ヒトＲＯＲ２（パネルＡ、Ｃ）及びマウスＲＯＲ２（パネルＢ）に結合し；残りは、マウスＲＯＲ２と交差反応性ではない。しかしながら、本発明の抗ヒトＲＯＲ２抗体の全てが、カニクイザルＲＯＲ２と交差反応性である（パネルＤ）。
【０１３２】
【表４】
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【０１３３】
【表５】
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【０１３４】
実施例８．ヒト及びカニクイザルＲＯＲ２に対する抗ヒトＲＯＲ２抗体の結合親和性
ヒトＲＯＲ２及びカニクイザルＲＯＲ２に対する抗ＲＯＲ２抗体の親和性の測定のための表面プラズモン共鳴をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００計器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。ヤギαヒトＦｃγ特異的ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１０９−００５−０９８）をＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＢＲ−１００５−３０）上に共有結合によって固定化した。親和性の測定のために、精製済抗ヒトＲＯＲ２抗体を使用した。全てのケースで、抗ＲＯＲ２抗体を１×ＨＢＳ−ＥＰ＋泳動バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）、及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  Ｐ２０）で、７．５μｇ／ｍｌまで希釈し、流量１０μｌ／分で６０秒捕捉した。ヒトＲＯＲ２−ＴｗｉｎＳｔｒｅｐ又はカニクイザルＲＯＲ２−ＴｗｉｎＳｔｒｅｐを、２００ｎＭ〜１２．５ｎＭの２倍連続希釈物を用いて、泳動バッファー中に希釈した。会合及び解離を流量３０μｌ／分でそれぞれ１２０秒及び２００秒間測定した。会合（ｋon）及び解離（ｋoff）速度定数の計算は、１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルに基づいて行った。平衡解離定数（Ｋd）は、ｋoff／ｋonから算出した。値を表５に報告する。
【０１３５】
【表６】
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【０１３６】
実施例９．ＳＭＡＣ技術を用いた部位特異的結合ＡＤＣの作製
ソルターゼＡ酵素。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の組換え及びアフィニティ精製ソルターゼＡ酵素は、国際公開第２０１４１４０３１７Ａ１号パンフレットに開示されているように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から生成した。
【０１３７】
グリシン修飾毒素の作製。ペンタグリシン修飾ＰＮＵ−１５９６８２誘導体を含むＳＭＡＣ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）結合ＡＤＣを作製するために、国際公開第２０１６１０２６９７号パンフレットに開示されているように、Ｇｌｙ5−ＥＤＡ−ＰＮＵ（図１３Ｂ）を製造した。質量分析法及びＨＰＬＣによって、ペンタグリシン修飾ＰＮＵ毒素のアイデンティティ及び純度を確認した。Ｇｌｙ5−修飾毒素は、ＨＰＬＣクロマトグラムにおける単一ピークによって決定される通り、＞９５％の純度を示した。
【０１３８】
ソルターゼ媒介性抗体結合。列記した結合バッファー中のグリシン修飾毒素［２００μＭ］及び３μＭソルターゼＡと一緒に、ＬＰＥＴＧタグ付きｍＡｂ［１０μＭ］を２５℃で３．５時間インキュベートすることによって、前述の毒素を表３に従い抗ＲＯＲ２抗体に結合させた。これを、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＢｉｏＲａｄ）に通過させることによって、反応を停止した。５カラム体積の溶出バッファー（０．１ＭグリシンｐＨ２．５、５０ｎＭ  ＮａＣｌ）で、結合したコンジュゲートを溶離し、１カラム体積画分を、酸を中和するために２５％ｖ／ｖ  １Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８を含有するチューブに収集した。タンパク質含有画分をプールし、ＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩カラムを用いて表７の製剤化バッファー中で製剤化した。
【０１３９】
ＡＤＣ解析学。Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ  ＰＬＲＰ  ２．１ｍｍ×５ｃｍ、０．０５〜０．１％のＴＦＡ／Ｈ2Ｏと０．０４〜０．１％のＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮとの間の２５分の線形勾配を用いた１ｍＬ／分／８０℃の５μｍカラムランで実施した逆相クロマトグラフィーにより、ＤＡＲを評価した。まず、ｐＨ８．０のＤＴＴとの３７℃、１５分間のインキュベーションによりサンプルを還元した。逆相クロマトグラフィーにより決定されるＤＡＲを以下の表６にまとめる。
【０１４０】
【表７】
2019509023.tif 000011
【０１４１】
実施例１０．野生型ＥＭＴ−６及びＲＯＲ２過剰発現ＥＭＴ−６乳癌細胞に対する抗ＲＯＲ２抗体ベースのＡＤＣのインビトロ細胞傷害性アッセイ
表５の抗ＲＯＲ２  ＡＤＣの細胞傷害性を、野生型（ＷＴ）ＥＭＴ−６及びヒトＲＯＲ２を過剰発現するように操作されたＥＭＴ−６細胞（実施例１から）を用いて調べた。アイソタイプコントロールとして、Ｈｕｌｕｃ−Ｇ５−ＰＮＵ（ａｄｃ１０１）を含んだ。
【０１４２】
このために、ウェル当たり９．７５×１０3個のＷＴ  ＥＭＴ−６及びｈＲＯＲ２過剰発現ＥＭＴ−６細胞を、１０体積％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補充した７５μＬのＤＭＥＭを含む９６ウェルプレート上に平板培養し（水を含有するエッジウェルを除く）、３７℃にて、７．５％ＣＯ2雰囲気下の加湿したインキュベータ内で増殖させた。１日のインキュベーションの後、増殖培地中３．５倍連続希釈物を２５μＬの量でそれぞれのウェルに、各ＡＤＣを添加した（これにより、２０μｇ／ｍＬ〜０．８８ｎｇ／ｍｌの最終ＡＤＣ濃度が得られた）。さらに４日後、プレートをインキュベータから取り出し、室温に平衡させた。約３０分後、各ウェルから５０μＬを取り出し、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ９２４３）を各ウェルに添加した。７５０ｒｐｍで５分間のプレートの振盪に続いて、振盪なしで２０分のインキュベーションの後、Ｔｅｃａｎ  ｉＣｏｎｔｒｏｌプレートリーダで発光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ＡＤＣ濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対する発光の曲線を当てはめた。Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅの組み込み「ログ（阻害剤）対応答−可変傾き（４つのパラメータ）」ＩＣ50決定関数を用いて決定したＩＣ５０値を表７に報告する。
【０１４３】
【表８】
2019509023.tif 000012
【０１４４】
図１５は、表７のＡＤＣを用いたＷＴ及びｈＲＯＲ２過剰発現ＥＭＴ６細胞に対するインビトロ細胞殺傷アッセイの用量−応答曲線を示す。上の表及び図１５によれば、本発明のＡＤＣは、ＲＯＲ２発現状態に依存的な特異的殺傷を達成する。
【０１４５】
実施例１１．ＸＢＲ２−４０１に基づく抗ｈＲＯＲ２  ＣＡＲを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞の機能性評価
以前記載されている方法（Ｈｕｄｅｃｅｋ，Ｍ．，Ｌｕｐｏ−Ｓｔａｎｇｈｅｌｌｉｎｉ，Ｍ．Ｔ．，Ｋｏｓａｓｉｈ，Ｐ．Ｌ．，Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ，Ｄ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｒａｄｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．Ｒ．（２０１３）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＯＲ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９，３１５３−３１６４）を用いて、ＸＢＲ２−４０１ベースのＣＡＲ−Ｔ細胞を操作した。エクスビボ拡大一次ヒトＣＤ８+ＣＤ６２Ｌ+Ｔ細胞に、レンチウイルスにより、ＣＤ３ζ及び４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン、並びに短い若しくは長いスペーサを含有するＸＢＲ２−４０１  ＣＡＲを形質導入した。形質導入したＴ細胞をＦＡＣＳによりｔＥＧＦＲを介して精製し、機能性アッセイの前日にそれらの表現型を評価した。ＣＤ８＋純度は、９７％〜９９％の間で変動し、ｔＥＧＦＲ発現は、９５％〜９９％の間で変動した。ＲＯＲ２陽性又はＲＯＲ２陰性ヒト乳癌細胞との７２時間の同時培養後、ＣＦＳＥ染色ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞をフローサイトメトリーにより分析したところ、ＸＢＲ２−４０１の標的依存性増殖が判明した（図１６；上のパネル）。ＲＯＲ２陽性及びＲＯＲ２陰性細胞との１１時間の同時培養後、ルシフェラーゼを用いた細胞傷害性アッセイにより、選択的細胞傷害性を測定した（図１６；下のパネル）。
【０１４６】
実施例１２．ＸＢＲ２−４０１の特異性分析
図１８は、Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍの概略を示す。一次スクリーン：ＲＯＲ２をターゲティングする精製済キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１  ＸＢＲ２−４０１と、ＲＯＲ１をターゲティングする精製済キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１  ＸＢＲ１−４０２を各々濃度２μｇ／ｍＬまでプールした。４，３３６のヒト血漿膜タンパク質を個別に発現する固定ＨＥＫ２９３細胞／スライドに対する結合について、プールをスクリーニングした（１３スライドセット；ｎ＝２スライド／スライドセット）。トランスフェクション効率は全て、最小閾値を超えた。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ検出抗体を使用した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔで蛍光（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７及びＺｓＧｒｅｅｎ１）を分析することによって、一次ヒット（重複スポット）を同定した。全ヒットをコードするベクターをシーケンシングすることにより、それらの正しいアイデンティティを確認した。確認スクリーン：全ヒットをコードするベクター、並びにコントロールベクターを新しいスライドに２回反復してスポットし、これらを用いて、前回と同様に、ヒトＨＥＫ２９３細胞をリバーストランスフェクトした。トランスフェクション効率は全て、最小閾値を超えた。同一の固定スライドを２つの試験抗体（ＸＢＲ２−４０１及びＸＢＲ１−４０２）の各々で個別に処理し、さらにポジティブ及びネガティブコントロール（ｎ＝２スライド／処理）でも処理した。スライドを前述と同様に分析した（図１８）。
【０１４７】
本明細書で引用する一部の追加文献を以下に挙げる。
Ｈｏｆｅｒ，Ｔ．，Ｗ．Ｔａｎｇｋｅａｎｇｓｉｒｉｓｉｎ，Ｍ．Ｇ．Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｒ．Ｇ．Ｍａｇｅ，Ｓ．Ｊ．Ｒａｉｋｅｒ，Ｋ．Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ，Ｈ．Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ．Ｇｉｇｅｒ，ａｎｄＣ．Ｒａｄｅｒ．２００７．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｒａｂｂｉｔ／ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  ａｎｄ  ＩｇＧ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｇｏ−６６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ３１８：７５−８７．
Ｈｏｆｅｒ，Ｔ．，Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｔ．Ｒ．Ｂｕｒｋｅ，Ｊｒ．，ａｎｄ  Ｃ．Ｒａｄｅｒ．２００８．Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  ａ  １０５：１２４５１−１２４５６．
Ｋｗｏｎｇ，Ｋ．Ｙ．，Ｓ．Ｂａｓｋａｒ，Ｈ．Ｚｈａｎｇ，Ｃ．Ｌ．Ｍａｃｋａｌｌ，ａｎｄ  Ｃ．Ｒａｄｅｒ．２００８．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＮＫＧ２Ｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ｄｕａｌ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｄ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３８４：１１４３−１１５６．
Ｋｗｏｎｇ，Ｋ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｃ．Ｒａｄｅｒ．２００９．Ｅ．ｃｏｌｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｂ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６：Ｕｎｉｔ  ６  １０．
ＭｃＣａｒｔｎｅｙ−Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｎ．，Ｒ．Ｍ．Ｓｋｕｒｌａ，Ｊｒ．，Ｒ．Ｇ．Ｍａｇｅ，ａｎｄ  Ｋ．Ｅ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ．１９８４．Ｋａｐｐａ−ｃｈａｉｎ  ａｌｌｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｂｂｉｔ：ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｂ９  ｓｕｇｇｅｓｔ  ａｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｄｏｍａｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｉｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｌｌｏｔｙｐｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  ａ  ８１：１７９４−１７９８．
Ｐｏｐｋｏｖ，Ｍ．，Ｒ．Ｇ．Ｍａｇｅ，Ｃ．ｂ．  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｓ．Ｔｈｕｎｄｉｖａｌａｐｐｉｌ，Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ，３ｒｄ，ａｎｄ  Ｃ．Ｒａｄｅｒ．２００３．Ｒａｂｂｉｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ａｓ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｋａｐｐａ  ａｌｌｏｔｙｐｅ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２５：３２５−３３５．
Ｒａｄｅｒ，Ｃ．２００９．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５２５：１０１−１２８，ｘｉｖ．
Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｓ．Ｂａｓｋａｒ，Ｋ．Ｙ．Ｋｗｏｎｇ，Ｍ．Ｇ．Ｋｅｎｎｅｄｙ，ａ．Ｗｉｅｓｔｎｅｒ，ａｎｄ  Ｃ．Ｒａｄｅｒ．２０１１．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ＲＯＲ１  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２１０１８．
Ｙａｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｃ．  Ｒａｄｅｒ．２０１２．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ｆｏｒｍａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９０１：２０９−２３２．
【０１４８】
本明細書に記載するいくつかの追加ヌクレオチド配列を以下に挙げる。
配列番号１２９
５’−ＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＧＡＧＧ
ＴＣＴＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＣＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＧＣＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＡＣＡＴＴＡＡＴＡＣＴＧＣＴＧＧＴＡＡＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＡＧＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＴＧＧＡＣＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＧＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＣＣＴＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡ−３’
配列番号１３０
５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＴＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＣＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＧＡＣＣＡＴＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＡＡＣＡＣＧＧＡＣＴＡＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣＣＧＡＣＡＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＧＡＴＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＡ−３’
配列番号１３１
５’−ＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＧＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＣＣＣＴＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＣＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＧＧＣＣＡＴＴＧＧＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＡＣＣＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＡＴＡＧＴＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＡ−３’
配列番号１３２
５’−ＧＡＣＣＣＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＡＣＣＧＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＴＡＧＴＧＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＡＧＧＴＧＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＴＡＴＣＧＡＡＣＴＧＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ−３’
配列番号１３３
５’−ＣＡＡＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＧＣＧＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＡＣＡＴＣＣＴＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＡＧＧＴＧＧＴＴＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＴＴＣＴＴＡＣＣＧＧＴＣＴＧＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ−３’
配列番号１３４
５’−ＴＣＣＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＴＣＴＣＣＣＴＣＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＧＡＴＡＣＣＡＧＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＴＣＡＧＴＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＡＣＡＧＧＣ−３’
【０１４９】
以上において本発明を明瞭な理解のために例示及び実施例によってある程度詳しく説明してきたが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付の請求項の精神又は範囲を逸脱することなく、本発明にいくつかの変更及び修正が加えられ得ることは容易に理解されよう。
【０１５０】
本明細書で引用した刊行物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許、及び特許出願の全ては、その各々が、あたかも明示的且つ個別に、参照により組み込まれていると示されているのと同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019509023.tif 000013
【図２】
2019509023.tif 000014
【図３】
2019509023.tif 000015
【図４】
2019509023.tif 000016
【図５】
2019509023.tif 000017
【図６】
2019509023.tif 000018
【図７】
2019509023.tif 000019
【図８】
2019509023.tif 000020
【図９】
2019509023.tif 000021
【図１０】
2019509023.tif 000022
【図１１】
2019509023.tif 000023
【図１２】
2019509023.tif 000024
【図１３】
2019509023.tif 000025
【図１４】
2019509023.tif 000026
【図１５】
2019509023.tif 000027
【図１６】
2019509023.tif 000028
【図１７】
2019509023.tif 000029
【図１８】
2019509023.tif 000030
【配列表】
2019509023000001.app
【国際調査報告】
2019509023.tif 000031
2019509023.tif 000032
2019509023.tif 000033