(57)【要約】  本開示は、少なくとも２つの異なる標的抗原または標的エピトープと同時に結合することができる多重特異性分子に関する。分子は、第１の標的抗原または標的エピトープに結合する少なくとも１つの結合ドメイン分子（ＢＤＭ）を含み、かかるＢＤＭは異種標的に選択的に結合するよう修飾され、かつ、第２の標的抗原または標的エピトープに結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片または非抗体タンパク質もしくはペプチドである、薬理的に活性なタンパク質またはペプチドと結合されており、これらＢＤＭは、その薬理的に活性なタンパク質またはペプチド内に存在するポリペプチドのＣ末端と結合されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の異なる標的抗原または標的エピトープに結合することができる多重特異性分子であって、
（ｉ）内部に含有される３つの露出した結合ループ（ＢＬ）を有するＶ様ドメイン（ＶＬＤ）足場を含み、前記３つのＢＬのうち少なくとも２つが異種の標的抗原または標的エピトープに選択的に結合するよう、前記足場内のそれらの対応天然配列に対して修飾または置換されている、第１の標的抗原または標的エピトープに結合する少なくとも１つの結合ドメイン分子（ＢＤＭ）と、
（ｉｉ）第２の標的抗原または標的エピトープに結合する、抗体もしくはその抗原結合断片または非抗体タンパク質もしくはペプチドである薬理的に活性なタンパク質またはペプチドと
を含み、
ここで、少なくとも１つのＢＤＭは、前記薬理的に活性なタンパク質またはペプチド内に存在するポリペプチドのＣ末端に結合されている、前記分子。
【請求項２】
抗体重鎖ポリペプチドのＣ末端に少なくとも１つのＢＤＭが結合されている、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
抗体軽鎖ポリペプチドのＣ末端に少なくとも１つのＢＤＭが結合されている、請求項１または２に記載の分子。
【請求項４】
すべての抗体重鎖ポリペプチド及び抗体軽鎖ポリペプチドのＣ末端に少なくとも１つのＢＤＭが結合されている、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項５】
前記薬理的に活性なタンパク質は完全長抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項６】
抗体鎖とＢＤＭの比は４：２ｎであり、ここで、ｎは１〜５の数である、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項７】
前記薬理的に活性なタンパク質は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または化学的に結合しているＦ（ａｂ’）２からなる群から選択される抗原結合性断片である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分子。
【請求項８】
抗原結合性断片鎖とＢＤＭの比が２：ｎであり、ここで、ｎは１〜１６の数である、請求項７に記載の分子。
【請求項９】
前記重鎖ポリペプチドのＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのＣ末端に少なくとも１つのＢＤＭが結合されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１０】
前記非抗体タンパク質またはポリペプチドの各ポリペプチド鎖のＣ末端に少なくとも１つのＢＤＭが結合されている、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１１】
前記ＶＬＤ足場はヒトＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８の細胞外部分を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１２】
前記薬理的に活性なタンパク質は、その本来の標的抗原または標的エピトープに結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１３】
前記第１の標的抗原及び前記第２の標的抗原は異なる、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１４】
前記第１の標的エピトープ及び前記第２の標的エピトープは、同一抗原または異なる抗原上にある、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１５】
前記分子は二重特異性または三重特異性である、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１６】
前記分子は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＢＤＭを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１７】
前記分子は、１対または２対のＢＤＭを含み、ここで、前記対の前記ＢＤＭは同一である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのＢＤＭは１つ以上のさらなるＢＤＭに連結されている、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１９】
前記分子は、少なくとも２つのＢＤＭ、または少なくとも１対のＢＤＭを含み、ここで、各ＢＤＭ（またはＢＤＭ対）は異なる標的抗原または標的エピトープに結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項２０】
各ＢＤＭは、前記薬理的に活性なタンパク質またはポリペプチドが結合する前記標的抗原エピトープとは異なる標的抗原または標的エピトープに結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項２１】
前記非抗体タンパク質またはペプチドは、血液凝固因子、アンチカリン、トキソイド、コラーゲン結合タンパク質、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＴＮＦ−α受容体結合タンパク質、インテグリン結合タンパク質、ＶＥＧＦもしくはその擬似物質、ＥＰＯもしくはその擬似物質、Ｃ４結合タンパク質、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、リンホカイン、サイトカイン、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、または、プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）から選択されるタンパク質の細胞外ドメインからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項２２】
前記ＶＬＤ足場は、ヒトＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＩＣＯＳの細胞外ドメインからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項２３】
前記ＶＬＤ足場は、
【表１】
2019510812.tif 000028
に記載の配列番号１の残基１〜２５、３４〜５４、６０〜９７及び１０６〜１２６に相当するフレームワーク配列で構成される、請求項２２に記載の分子。
【請求項２４】
前記ＶＬＤ足場は、配列番号１の残基１〜２５、３４〜５４、６０〜９７及び１０６〜１２６に対する少なくとも約７０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２３に記載の分子。
【請求項２５】
配列番号１の２６〜３３位、及び／または５５〜５９位及び／または９８〜１０５位におけるアミノ酸残基は、異種配列で修飾されるかまたは置き換えられる、請求項２３または２４に記載の分子。
【請求項２６】
前記ＢＤＭは、
【表２】
2019510812.tif 000029
（配列番号５）
に記載の配列を含むかまたは構成要素とし、
ここで、Ｘｎ１、Ｘｎ２及びＸｎ３は任意のアミノ酸残基であり、ｎは５〜１５の数であり、１、２、３はそれぞれ、ＢＬ１、ＢＬ２及びＢＬ３を指す、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項２７】
Ｘｎ１は５〜８アミノ酸であり、Ｘｎ２は５〜８アミノ酸であり、Ｘｎ３は１０〜１５アミノ酸である、請求項２６に記載の分子。
【請求項２８】
Ｘｎ１は８アミノ酸である、請求項２６または２７に記載の分子。
【請求項２９】
Ｘｎ２は５アミノ酸である、請求項２６または２７に記載の分子。
【請求項３０】
Ｘｎ３は１０〜１５アミノ酸である、請求項２６または２７に記載の分子。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのＢＤＭは、単量体、二量体、または互いに連結されている一連のＢＤＭ単量体として存在する、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのＢＤＭと前記薬理的に活性なタンパク質もしくはペプチドとの結合は、リンカー手段、直接融合、複合体化、または共有結合もしくは非共有結合によるものである、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項３３】
前記リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーである、請求項３２に記載の分子。
【請求項３４】
前記標的抗原は、タンパク質、糖タンパク質、グリカン、脂質、リポタンパク質または核酸である、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項３５】
前記分子は、前記個々のＢＤＭ及び前記分子の薬理学的に活性なタンパク質部分によって認識される２つ以上の異なる標的抗原または標的エピトープを発現する細胞に選択的に結合し、前記標的抗原または標的エピトープの１つのみを発現する細胞には結合しない、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項３６】
ポリペプチドである、先行請求項のいずれか１項に記載の分子。
【請求項３７】
前記ポリペプチドは、配列番号５、６、１３、１４、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２８または２９からなる群から選択される、請求項３４に記載の分子。
【請求項３８】
核酸である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の分子。
【請求項３９】
請求項３８に記載の核酸で形質転換される、宿主細胞。
【請求項４０】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の分子を、薬理学的に許容される担体及び／または添加物と共に含む、医薬組成物。
【請求項４１】
医薬品の製造において使用するための、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記分子は検出を容易にする薬剤で標識化される、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の分子。
【請求項４３】
前記分子が結合する１つ以上の標的抗原を検出するための、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、少なくとも２つの異なる標的抗原または標的エピトープと同時に結合することができる多重特異性分子に関する。分子は、第１の標的抗原または標的エピトープに結合する少なくとも１つの結合ドメイン分子（ＢＤＭ）を含み、かかるＢＤＭは異種標的に選択的に結合するよう修飾され、かつ、第２の標的抗原または標的エピトープに結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片または非抗体タンパク質もしくはペプチドである、薬理的に活性なタンパク質またはペプチドと結合されており、これらＢＤＭは、その薬理的に活性なタンパク質またはペプチド内に存在するポリペプチドのＣ末端と結合されている。
【０００２】
参照による組み込み
本明細書において引用または参照されている全資料、及び本明細書で引用した資料において引用または参照されている全資料は、本明細書または参照により本明細書に組み込まれるあらゆる文献で言及されるあらゆる製品についてのあらゆる製造者による説明書、記載事項、製品仕様書、及び製品シートと併せて、その全体が本明細書によって参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本出願は、オーストラリア特許出願第２０１６９００７０８号及びオーストラリア特許出願第２０１６９００７０９号の優先権を主張するものであり、その全記載内容は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００４】
配列表の参照
電子的に提出された配列表の全記載内容はあらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００５】
治療剤として数多くの組換えタンパク質が開発されている。しかしながら、非修飾形態にあるタンパク質は、腎臓のろ過作用、細網内皮系での細胞クリアランス機序、またはタンパク質分解によって生体内で急速に除去されることが知られている（Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９２）Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１１）。治療用タンパク質の安定性、循環時間及び生物学的活性を高めるためにタンパク質及びペプチドのさまざまな修飾が開発されている（Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９２）Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０を参照のこと）。しかしながら、そのような治療用タンパク質が生体内でより長く存在し続けられるようにする機序が当該技術分野で求められている。
【０００６】
抗体−融合タンパク質、抗体断片、及び抗体−薬物複合体（以後、まとめて抗体製品という）といった治療用モノクローナル抗体及び抗体関連製品は、バイオ医薬品市場内部で主要製品クラスとなるまでに成長した。今日、抗体製品は、いくつかを挙げると、一部のがん、多発性硬化症、喘息及び関節リウマチなどさまざまな疾患の治療用に承認されている。
【０００７】
抗体薬物開発分野の近年のこうした比類なき成功にもかかわらず、特定の標的疾患に対する有効性が欠如していることから、さらに有効な抗体薬物を開発する新戦略の探索が求められている。抗体の有効性改善に使用される一つの方法は、同時に２つの標的に結合する、すなわち、二重特異性の抗体様タンパク質構造を作製することである。通常の抗体は１つの特定の標的にしか結合できない（すなわち、１つの特異性を有する）。二重特異性抗体は一般に、かかる二重特異性抗体が同時に２種類の異なる標的に結合することができるよう（すなわち、２つの特異性）互いに融合された、２つの異なる抗体または抗体様断片（抗体様足場として知られる）で構成される工学的に操作されたタンパク質である。大部分の抗体様足場は、一般に、抗体の断片から構築されるか、または抗体のように特定の標的に結合することができる抗体様タンパク質で作製される。二重特異性抗体により、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞を誘導及び活性化させて腫瘍を特異的に死滅させること、複数の標的に結合して複数の病原性経路に作用すること、１つの標的細胞または標的タンパク質上の複数部位に結合して特異性を高めるかまたは相乗的誘導を誘導すること、及び不均一な性質の腫瘍を標的とすることを目指して設計され得る、より強力な抗体薬物が可能になる。
【０００８】
現在のところ、二重特異性抗体製品を作製するために実施されている既存技術を区別する重要な要素は、さまざまな抗体様足場を共に融合させて二重特異性抗体製品を作製する一般方法である。この種の二重特異性抗体製品には多数の重要な欠点があり、第一は、２つ以上の抗体様足場を共に融合させて創製された小サイズの二重特異性抗体製品は、一般に腎閾値を大幅に下回り、典型的に血液循環半減期が数分〜数時間の範囲と非常に短いことである。半減期がこのように短いため、投与間隔を連日にするかまたは常時注入が必要となり、これにより薬物の毒性閾値超えをもたらし得る。第二は、多くの抗体様足場は、それらの標的に対する親和性が一価である性質上、不十分である（すなわち、それらには、抗原結合部位が２つある抗体と比べ抗原結合部位が１つしかない）ことである。完全抗体はいずれの抗原結合部位とも結合して全体的な結合強度（アビディティ効果として知られる）を改善させ、一価抗体様足場と比較してある種の利点を提供する。
【０００９】
現在、二重特異性抗体製品を全ＩｇＧフォーマットで作製できる方法は数えるほどしかない。一般にこれらの方法では、特異性の異なる２つの異なる親抗体を共に合わせて、異なる標的と結合する腕をもつ単一ＩｇＧ（すなわち、カツマキソマブ）を形成させることができる抗体骨格を人工的に作り出す。この全抗体法には、より小さな断片を融合させる方法に対してある種の利点はあるものの、この種の全ＩｇＧ型二重特異性による方法では小断片二重特異性抗体に見られる半減期の問題は回避されるが、それぞれの標的に対して二重特異性抗体の腕は１本しか結合しないのでアビディティの損失には対処していない。
【００１０】
したがって、既存の治療用タンパク質及び抗原結合性分子の治療有効性及び／または半減期を改善する一助となる、そのような分子を改善する方法が当該技術分野では必要とされている。さらに、現在の二重特異性抗体による方法及びそれらの使用に伴う欠点を克服する方法が当該技術分野では必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
本開示は、抗体または免疫グロブリン抗原結合性断片など、タンパク質またはペプチドの１つ以上の特徴を改善する方法に基づいている。より詳細には、本開示は、治療効果の不十分なタンパク質（例えば、治療用抗体）を、多重特異性フォーマットに変換することによって改善する方法に基づいている。タンパク質またはペプチドを本明細書に記載する少なくとも１つの結合ドメイン分子（ＢＤＭ）と結合させることにより二重特異性または多重特異性の分子を提供し、それにより、かかる分子を、タンパク質及びＢＤＭの結合標的（すなわち、抗原またはエピトープ）が異なる点を利用して異なる複数の標的に結合させる。したがって、治療有効性、半減期、免疫による会合、アビディティ、細胞内移行及び／または忍容性など、タンパク質またはペプチドの１つ以上の特徴を改善することができる。したがって、かかる分子は、従来の二重特異性抗体に対する代替法を提供する。
【００１２】
好ましくは、ＢＤＭにより結合される標的抗原または標的エピトープは、タンパク質またはペプチドにより結合される標的抗原または標的エピトープとは異なる。例えば、タンパク質は、細胞または組織上に存在する標的抗原または標的エピトープに結合してよく、またＢＤＭは、細胞死滅を促進する細胞傷害性Ｔ細胞もしくはタンパク質などの免疫調節細胞上に存在する標的抗原または標的エピトープ、またはタンパク質もしくはペプチドの半減期が延長されるようヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の標的抗原に結合してよい。
【００１３】
タンパク質またはペプチド及びＢＤＭが各自の標的と同時に結合することを利用して、タンパク質またはペプチドの治療有効性は、ＢＤＭが結合する標的の機能性を利用することにより促進され得る。さらなるＢＤＭをタンパク質またはペプチドと結合させることによって、タンパク質またはペプチドを二重特異性、三重特異性、さらには多重特異性のものに変換することができる。特に、ＢＤＭの小ささ、結合親和性特性及び溶解度から、これらＢＤＭは、治療効果の不十分なタンパク質またはペプチドの有効性を改善する、例えば、腫瘍細胞を破壊する体の自然免疫機構を促進する、理想的な薬剤となる。
【００１４】
したがって、本開示は、２つ以上の異なる標的抗原または標的エピトープに結合できる多重特異性分子を提供し、かかる分子は、
（ｉ）第１の標的抗原または標的エピトープに結合する少なくとも１つの結合ドメイン分子（ＢＤＭ）であり、かかるＢＤＭは、内部に含有される３つの露出した結合ループ（ＢＬ）を有するＶ様ドメイン（ＶＬＤ）足場を含むかまたは構成要素とし、ここで、かかる３つのＢＬのうち少なくとも２つは、異種の標的抗原または標的エピトープに選択的に結合するよう、足場内のそれらの対応天然配列に関して修飾または置換されていること、かつ
（ｉｉ）第２の標的抗原または標的エピトープに結合する、抗体もしくはその抗原結合断片または非抗体タンパク質もしくはペプチドである薬理的に活性なタンパク質またはペプチドを含み、
ここで、少なくとも１つのＢＤＭは、その薬理的に活性なタンパク質またはペプチド内に存在するポリペプチドのＣ末端に結合されていることを含む。
【００１５】
一例では、薬理的に活性なタンパク質は、その本来の標的抗原または標的エピトープに結合する。
【００１６】
好ましくは、エピトープは別々の抗原上にある。
【００１７】
一例では、第１及び第２の標的抗原は異なる。一例では、第１及び第２の標的抗原は同一であるが、分子は、その標的抗原上の異なるエピトープに結合する。一例では、第１及び第２の標的エピトープは異なる。
【００１８】
一例では、分子は二重特異性分子である。一例では、分子は三重特異性分子である。
【００１９】
一例では、分子は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＢＤＭ（またはその倍数、例えば、ＢＤＭ二量体）を含む。別の例では、分子は、１対または２対のＢＤＭを含み、ここで、かかる対のＢＤＭは同一である。一例では、１つ、２つまたは３つのＢＤＭ（またはその倍数、例えば、二量体）を、非抗体タンパク質またはペプチドと結合させる。
【００２０】
一例では、分子は、少なくとも２つのＢＤＭ、または少なくとも１対のＢＤＭを含み、ここで、各ＢＤＭ（またはＢＤＭ対）は異なる標的抗原または標的エピトープに結合する。さらなる例では、各ＢＤＭ（またはＢＤＭ対）は、薬理的に活性なタンパク質またはペプチドが結合する標的抗原または標的エピトープとは異なる標的抗原または標的エピトープに結合する。
【００２１】
別の例では、２つ、４つ、６つ、または８つのＢＤＭを完全長抗体と結合させ、ここで、分子は、少なくとも２つの異なる標的抗原または標的エピトープに結合する。一例では、分子は、２つの異なる標的抗原または標的エピトープに結合する。別の例では、分子は、３つの異なる標的抗原または標的エピトープに結合する。別の例では、分子は、４つの異なる標的抗原または標的エピトープに結合する。
【００２２】
一例では、薬理学的に活性なタンパク質は、完全長抗体またはその免疫グロブリン抗原結合性断片である。別の例では、タンパク質は、非抗体タンパク質またはペプチドである。
【００２３】
一例では、非抗体タンパク質またはペプチドは、血液凝固因子、アンチカリン、トキソイド、コラーゲン結合タンパク質、ヒト血清結合タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α受容体結合タンパク質、インテグリン結合タンパク質、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）もしくはその擬似物質、エリスロポエチン（ＥＰＯ）もしくはその擬似物質、Ｃ４結合タンパク質、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、リンホカイン、サイトカイン、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、またはプログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）から選択されるタンパク質の細胞外ドメインからなる群から選択される。
【００２４】
一例では、血液凝固因子は第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子である。
【００２５】
一例では、トキソイドはボツリヌストキソイドである。
【００２６】
一例では、リンホカインはＩＬ−２もしくはその擬似物質またはＧＭ−ＣＳＦもしくはその擬似物質である。
【００２７】
一例では、サイトカインはＧ−ＣＳＦもしくはその擬似物質または幹細胞因子（ＳＣＦ）もしくはその擬似物質である。
【００２８】
一例では、分子は、非抗体タンパク質と結合させたＢＤＭを１つ含む。一例では、ＢＤＭと非抗体タンパク質の比は１：１である。
【００２９】
一例では、少なくとも１つのＢＤＭを抗体重鎖ポリペプチドのＣ末端に結合させる。一例では、少なくとも１つのＢＤＭを両方の抗体重鎖ポリペプチドのＣ末端に結合させる。
【００３０】
一例では、少なくとも１つのＢＤＭを抗体軽鎖ポリペプチドのＣ末端に結合させる。一例では、少なくとも１つのＢＤＭを両方の抗体軽鎖ポリペプチドのＣ末端に結合させる。
【００３１】
一例では、少なくとも１つのＢＤＭをすべての抗体重鎖ポリペプチド及び抗体軽鎖ポリペプチドのＣ末端に結合させる。
【００３２】
一例では、少なくとも１つのＢＤＭを抗体重鎖ポリペプチドのＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのＣ末端に結合させる。
【００３３】
一例では、少なくとも１つのＢＤＭを抗体ＦｃのＣ末端に結合させる。
【００３４】
一例では、少なくとも１つのＢＤＭを、
（ｉ）抗体軽鎖ポリペプチドのＣ末端、
（ｉｉ）各抗体軽鎖ポリペプチドのＣ末端、
（ｉｉｉ）抗体重鎖ポリペプチドのＣ末端、
（ｉｖ）各抗体重鎖ポリペプチドのＣ末端
に結合させる。
【００３５】
本開示による完全長抗体または免疫グロブリン抗原結合性断片は、それ自身が単一特異性または二重特異性であってよい。単一特異性抗体の場合、その抗体が、ある単一の標的抗原または標的エピトープに対して同一の特異性を共有する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわち、１対のＶＨ／ＶＬ）の相補性を介して、かかる標的またはエピトープに結合することを意味する。二重特異性抗体は、Ｙ字形抗体分子の各腕にＶＨ／ＶＬ対を１対ずつ含み、ここで、各ＶＨ／ＶＬは異なる標的抗原または標的エピトープに結合する。
【００３６】
完全長抗体は２本の重鎖及び２本の軽鎖を含み、各々が対を形成している。したがって、一例では、抗体鎖とＢＤＭの比は４：２である。一例では、分子は、抗体と結合させたＢＤＭを４つ（すなわち、各軽鎖にＢＤＭが１つずつ、及び各重鎖にＢＤＭが１つずつ）を含む。一例では、抗体鎖とＢＤＭの比は４：４である。一例では、分子は、抗体と結合させた６つのＢＤＭを含む。一例では、抗体鎖とＢＤＭの比は４：６である。別の例では、分子は、抗体と結合させた８つのＢＤＭを含む。別の例では、抗体鎖とＢＤＭの比は４：８である。別の例では、抗体鎖とＢＤＭの比は４：２ｎであり、ここで、ｎは１及び５を含む１〜５の数である。
【００３７】
一例では、免疫グロブリン抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、または化学的に結合しているＦ（ａｂ’）２からなる群から選択される。
【００３８】
一例では、分子は、免疫グロブリン抗原結合性断片と結合させた単一ＢＤＭを含む。一例では、免疫グロブリン抗原結合断片鎖とＢＤＭの比は２：１である。一例では、免疫グロブリン抗原結合性断片鎖とＢＤＭの比は２：２である。別の例では、ＢＤＭの鎖を抗原結合性断片と結合させてよく、その場合、免疫グロブリン抗原結合断片鎖とＢＤＭの比は２：ｎであり、ｎは１〜１６の数である。別の例では、ｎは１〜１４、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜４、または２、または１の数である。
【００３９】
本開示は、少なくとも１つのＢＤＭが完全長抗体に結合され得る多数の異なる構成を意図しており、例えば、以下がある。
（ｉ）少なくとも１つのＢＤＭを抗体の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に結合させる、
（ｉｉ）少なくとも１つのＢＤＭを軽鎖ポリペプチドのＣＨ１ドメインのＣ末端に結合させる、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのＢＤＭを重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端及び軽鎖ポリペプチドのＣＨ１ドメインのＣ末端に結合させる、
（ｉｖ）少なくとも１つのＢＤＭを両方の重鎖ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に結合させる、または
（ｖ）少なくとも１つのＢＤＭを両方軽鎖ポリペプチドのＣＨ１ドメインのＣ末端に結合させる。
【００４０】
免疫グロブリン抗原結合性断片に関しては、ＢＤＭを免疫グロブリン断片の重鎖または軽鎖のいずれのＣ末端に結合させてもよい。別の例では、ＢＤＭを免疫グロブリン断片の重鎖及び軽鎖の両方のＣ末端に結合させてよい。別の例では、ＢＤＭを、免疫グロブリン断片の軽鎖及び／または重鎖のいずれの定常ドメイン（例えば、ＣＨ１）と結合させてもよい（例えば、Ｆａｂ）。
【００４１】
例えば、
（ｉ）少なくとも１つのＢＤＭをＦａｂの軽鎖ポリペプチドの定常領域のＣ末端に結合させる、
（ｉｉ）少なくとも１つのＢＤＭをＦａｂの重鎖ポリペプチドのＣＨ１のＣ末端に結合させる、または
（ｉｉｉ）少なくとも１つのＢＤＭをＦａｂの軽鎖ポリペプチドの定常領域のＣ末端及び重鎖ポリペプチドのＣＨ１のＣ末端に結合させる。
【００４２】
本開示によるＢＤＭは、好ましくは、内部に含有される３つの露出した結合ループ（ＢＬ）を有する足場を含むかまたは構成要素とする。足場は、免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを含有しているスーパーファミリーメンバー、Ｖ様ドメイン、ｉ−ｂｏｄｙ、ＶＮＡＲまたはＶＨＨからなる群から選択されてよい。
【００４３】
一例では、露出したＢＬの配列は、天然ＢＬ配列から修飾または置換が行われており、異種の標的抗原または標的エピトープに対して選択的に結合する改変型結合ループを提供する。これらの結合ループを、図１Ａに例示するようにそれぞれＢＬ１、ＢＬ２及びＢＬ３とする。ＢＬは、抗体可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３各領域に類似している。
【００４４】
一例では、ＢＬ１及びＢＬ３は、天然ＢＬ配列から修飾または置換が行われている。別の例では、ＢＬ１、ＢＬ２及びＢＬ３は、天然ＢＬ配列から修飾または置換が行われている。
【００４５】
別の例では、ＢＤＭ足場は、ヒト免疫グロブリン可変領域ドメインに対する配列同一性が約２０％未満であり、前記足場は、２つ以上の改変型ＢＬを有し、かつ異種の標的抗原または標的エピトープに対し選択的結合性を示す。
【００４６】
Ｉｇ様ドメイン含有スーパーファミリーメンバーは、Ｖ様ドメイン（ＶＬＤ）、Ｃセットドメイン、ＴｈｙＯｘファミリーメンバーポリペプチド、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、クラスＩ  ＭＨＣ、クラスＩＩ  ＭＨＣ、ＣＤ１、サイトカイン受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ホルモン受容体、増殖ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、インターフェロンガンマ受容体、プロラクチン受容体、ＮＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、フィブロネクチン、テネイシン、及びＩセット含有ドメインのポリペプチドまたはその機能性断片からなる群から選択されてよい。
【００４７】
本開示によるＢＤＭ足場は、Ｖ様ドメイン（ＶＬＤ）、Ｃ１セットドメインまたはＣ２セットドメインからなる群から選択されてよい。タンパク質またはペプチドと結合させたＢＤＭの組み合わせもまた意図される。例として、１つのＢＤＭはＶＬＤであってよく、別のＢＤＭはＣセットドメインであってよい。
【００４８】
一例では、ＢＤＭ足場は、天然ＶＬＤの細胞外部分、または天然ＶＬＤに関する改変型結合ループ（すなわち、修飾ＢＤＭ）を有するＶＬＤを含むかまたは構成要素とし、ここで、ＶＬＤは、ＡＣＡＮ、ＡＤＯＲＡ３、ＡＬＣＡＭ、ＪＡＭＬ、ＡＭＩＧＯ１、ＡＸＬ、ベイシジン、ＢＣＡＭ、ＢＴＮＬ２、３、８、９もしくは１０、ブチロフィリン（ＢＴＮ）、細胞接着分子（ＣＡＭ）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ４８、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１０１、ＣＤ１１２、ＣＤ２２６、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＤ３００、がん胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）、ＣＲＴＡＭ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＡＤＲ、Ｃ１０ｏｒｆ５４、ＥＲＭＡＰ、ＥＳＡＭ、ＦＡＭ１８７Ａ、ＦＣＡＭＲ、Ｆ１１Ｒ、ＧＰＡ３３、ヒアルロナン及びプロテオグリカンリンクタンパク質（ＨＡＰＬＮ）、ＨＡＶＣＲ１、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＨＨＬＡ２、ＨＳＰＧ２、ＩＣＯＳ、ＩＧＨＡ、ＩＧＳＦ、ＪＡＭ２、ＪＡＭ３、ＫＤＲ、ＫＩＲＲＥＬ、ＬＹ６Ｇ６Ｆ、ＭＣＡＭ、ＭＯＧ、ＭＰＺ、ＭＸＲＡ８、ＮＣＡ、ＮＣＲ２、ＮＣＲ３、ＮＰＨＳ１、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＰＩＧＲ、ＰＩＬＲ、ＰＳＧ、ＰＴＧＦＲＮ、ＰＶＲ、ナトリウムチャネルサブユニットタンパク質（ＳＣＮ）、ＳＥＭＡ３Ｄ、シアロアドヘシンタンパク質（ＳＩＧＬＥＣ）、シグナル制御タンパク質（ＳＩＲＰ）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭＤ４、ＴＲＥＭ、ＴＲＥＭＬ、ＶＣＡＮ、ＶＰＲＥＢ、ＶＳＩＧ、ＶＳＴＭ、及びＶＴＣＮ１からなる群から選択されるタンパク質に由来する。
【００４９】
一例では、ＢＤＭ足場は、天然Ｃセットドメイン（Ｃ１セットドメインまたはＣ２セットドメイン）の細胞外部分、または天然Ｃセットドメインに関する改変型結合ループを有するＣセットドメイン（すなわち、修飾Ｃセットドメイン）を含むかまたは構成要素とし、ここで、Ｃセットドメインは、ＡＺＧＰ１；ベイシジン、Ｂ２Ｍ；ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、５、６、７、８；ＣＤ１Ａ；ＣＤ１Ｂ；ＣＤ１Ｃ；ＣＤ１Ｄ；ＣＤ１Ｅ；ＤＭＡ；ＤＱＢ２；ＤＲＢ１；ＥＬＫ２Ｐ１；ＦＣＧＲＴ；ＨＦＥ；ＨＨＬＡ２；ＨＬＡ−Ａ；ＨＬＡ−Ｂ；ＨＬＡ−Ｂ３５；ＨＬＡ−Ｂ５７；ＨＬＡ−Ｃ；ＨＬＡ−ＣＷ；ＨＬＡ−Ｃｗ；ＨＬＡ−Ｄ；ＨＬＡ−ＤＭＡ；ＨＬＡ−ＤＭＢ；ＨＬＡ−ＤＯＡ；ＨＬＡ−ＤＯＢ；ＨＬＡ−ＤＰ；ＨＬＡ−ＤＰＡ１；ＨＬＡ−ＤＰＢ１；ＨＬＡ−ＤＱＡ１；ＨＬＡ−ＤＱＡ２；ＨＬＡ−ＤＱＢ１；ＨＬＡ−ＤＱＢ２；ＨＬＡ−ＤＲＡ；ＨＬＡ−ＤＲＢ１；ＨＬＡ−ＤＲＢ２；ＨＬＡ−ＤＲＢ３；ＨＬＡ−ＤＲＢ４；ＨＬＡ−ＤＲｗ１２；ＨＬＡ−Ｄｗ１２；ＨＬＡ−Ｅ；ＨＬＡ−Ｆ；ＨＬＡ−Ｇ；ＨＬＡ−Ｇ２．２；ＨＬＡ−Ｈ；ＨＬＡＣ；ＩＧＨＡ１；ＩＧＨＡ２；ＩＧＨＤ；ＩＧＨＥ；ＩＧＨＧ１；ＩＧＨＧ２；ＩＧＨＧ３；ＩＧＨＧ４；ＩＧＨＭ；ＩＧＨＶ４−３１；ＩＧＫＣ；ＩＧＫＶ１−５；ＩＧＫＶ２−２４；ＩＧＬ；ＩＧＬＣ１；ＩＧＬＣ３；ＩＧＬＬ１；ＩＧＬＶ２−１４；ＩＧＬＶ３−２１；ＩＧＬＶ３−２５；ＩＧＬＶ４−３；ＭＩＣＡ；ＭＩＣＢ；ＭＲ１；ＳＩＲＰＡ；ＳＩＲＰＢ１；ＳＩＲＰＧ；ＳＮＣ７３；ＴＡＰＢＰ；ＴＡＰＢＰＬ；ＴＲＢＣ１；ＴＲＢＶ１９；ＴＲＢＶ２１−１；ＴＲＢＶ３−１；ＴＲＢＶ５−４；ＴＲＢＶ７−２；ｍｉｃＢ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８０、ＶＣＡＭ及びＩＣＡＭからなる群から選択されるタンパク質に由来する。
【００５０】
一例では、ＢＤＭ足場は、天然Ｉｇ様ドメインの全部もしくはその一部または天然Ｉｇ様ドメインに関する改変型結合ループ（すなわち、修飾Ｉｇ様ドメイン）をもつＩｇ様ドメインを含むかまたは構成要素とし、ここで、Ｉｇ様ドメインは、ＴｈｙＯｘファミリーメンバーポリペプチド、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、クラスＩ  ＭＨＣ、クラスＩＩ  ＭＨＣ、ＣＤ１、サイトカイン受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ホルモン受容体、増殖ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、インターフェロンガンマ受容体、プロラクチン受容体、ＮＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、フィブロネクチン、テネイシン、及びＩセット含有ドメインポリペプチドまたはその機能性断片からなる群から選択される。
【００５１】
本明細書において用語「修飾ＶＬＤ」、「修飾Ｃセットドメイン」などは、異種の標的抗原または標的エピトープに対する結合が得られるよう、露出した結合ループの少なくとも２つ、好ましくは３つすべてが改変されているＢＤＭを指す。改変は、アミノ酸置換または個々の結合ループの全部もしくはその一部の置き換えによって達成されてよい。結合ループ内の改変アミノ酸配列により、改変されていないＩｇ様ドメイン含有足場が結合する標的抗原以外の標的抗原に対する選択的結合活性が付与される。アミノ酸改変は、当該技術分野で公知の方法を使用して核酸またはポリペプチドレベルで行うことができる。
【００５２】
ＶＬＤまたはＣセットドメインは、異種の標的抗原または標的エピトープに結合するＢＤＭを包含し得る。修飾されたＶＬＤまたはＣセットドメインはまた、ＢＤＭの天然の標的に対するその親和性を改変する１つ以上の修飾も含み得る。天然の標的に対する親和性は、天然のＶＬＤもしくはＣセットドメインと比較して高まっていても低下していてもよい。
【００５３】
一例では、修飾ＢＤＭは、天然のＶＬＤもしくはＣセットドメインの配列に対して少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、または９５％同一な配列を含むかまたは構成要素とする。
【００５４】
当業者は、ＢＤＭを所望の標的抗原に結合させる適切な異種結合ループ配列の選択に精通しているであろう。そのような例には、ＵＳ７，１６６，６９７に記載のものが挙げられ、その記載内容全体は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００５５】
別の例では、ＢＤＭは、対応する天然のＶＬＤタンパク質またはＣセットドメインタンパク質と比較して５〜３０のアミノ酸置換、５〜２０のアミノ酸置換、５〜１５のアミノ酸置換、５〜１０のアミノ酸置換、または最高で５のアミノ酸置換を含む、ＶＬＤタンパク質もしくはＣセットドメインタンパク質の全部またはその一部を含むかまたは構成要素とする。別の例では、ＢＤＭは、ＵＳ７，０９４，８７４に記載のＣＬＴＡ−４  ＶＬＤ変異分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹまたはＬ１０４Ｅではない。
【００５６】
特定の例では、修飾ＢＤＭは、異種のＢＬ配列を１つ含む。別の例では、修飾ＢＤＭは、異種のＢＬ配列を２つ含む。さらに別の例では、ＢＤＭは、異種のＢＬ配列を３つ含む。
【００５７】
特定の例では、ＢＤＭは、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＩＣＯＳの細胞外部分を含むかまたは構成要素とするＶＬＤ足場である。さらなる例では、ＶＬＤ足場は、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外部分である。別の例では、ＢＤＭ  ＶＬＤは、
【表１】
2019510812.tif 000002
（配列番号１）
に記載の配列を含むかまたは構成要素とする。
【００５８】
一例では、３１位のアラニン（Ａ）をチロシン（Ｙ）で置換する。一例では、５６位のメチオニン（Ｍ）をスレオニン（Ｔ）で置き換える。
【００５９】
別の例では、ＢＤＭ  ＶＬＤ足場は、配列番号１の残基１〜２５、３４〜５４、６０〜９６及び１０６〜１２６に相当するフレームワーク配列で構成される。
【００６０】
別の例では、ＢＤＭ足場は、それに対する配列同一性が少なくとも約７０％である配列、または配列番号１もしくは配列番号１の残基１〜２５、３４〜５４及び６０〜１０７及び１１６〜１３６に対する同一性が少なくとも７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％である配列を含むかまたは構成要素とする。
【００６１】
別の例では、天然ＢＤＭ足場の１つの露出した結合ループ、２つの露出した結合ループまたは３つのすべての露出した結合ループを、アミノ酸の置換、付加もしくは欠失、及び／または１つ以上の物理的特性（例えば、大きさ、形状、電荷、疎水性など）を任意で変化させることによって修飾してよい。
【００６２】
さらなる例では、天然型ヒトＣＴＬＡ−４  ＶＬＤ配列の露出した結合ループ（ＢＬ１）配列ＡＳＰＧＫＡＴＥ（配列番号２）もしくはＡＳＰＧＫＹＴＥ（配列番号７）、及び／または露出したループ（ＢＬ２）配列ＭＭＧＮＥ（配列番号３）及び／または露出した結合ループ（ＢＬ３）配列ＥＬＭＹＰＰＰＹＹ（配列番号４）を、アミノ酸の置換、付加もしくは欠失または異種配列での置き換えによって修飾する。
【００６３】
一例では、配列番号１の２６〜３３位、及び／または５５〜５９位及び／または９８〜１０５位のアミノ酸残基を修飾するかまたは置き換える。
【００６４】
別の例では、配列番号１の２７〜３３位、及び／または５４〜６２位及び／または９８〜１０６位のアミノ酸残基を異種配列で修飾するかまたは置き換える。
【００６５】
別の例では、天然型ヒトＣＴＬＡ−４  ＶＬＤの修飾による効果は、ＣＤ８０及びＣＤ８６に対するＶＬＤの天然の親和性を消失させることである。
【００６６】
一例では、ＢＤＭ  ＶＬＤ足場は、配列
【表２】
2019510812.tif 000003
（配列番号５）
を含むかまたは構成要素とし、
ここで、Ｘｎ１、Ｘｎ２及びＸｎ３は任意のアミノ酸残基であり、ｎは５〜１５の数であり、数字の１、２及び３は結合ループ領域を指す。より詳細には、１、２及び３はそれぞれ、ＢＤＭのＢＬ−１、ＢＬ−２及びＢＬ−３に対応する。
【００６７】
一例では、ＢＤＭ  ＶＬＤ足場は、配列
【表３】
2019510812.tif 000004
（配列番号６）
を含むかまたは構成要素とし、
ここで、Ｘｎ１、Ｘｎ２及びＸｎ３は任意のアミノ酸残基であり、ｎは５〜１５の数であり、数字の１、２、及び３は結合ループ領域を指す。より詳細には、１、２及び３はそれぞれ、ＢＤＭのＢＬ−１、ＢＬ−２及びＢＬ−３に対応する。
【００６８】
一例では、ＢＤＭのＢＬ−１、ＢＬ−２及びＢＬ−３はそれぞれ、ＡＳＰＧＫＡＴＥ（配列番号２）またはＡＳＰＧＫＹＴＥ（配列番号７）、ＭＭＧＮＥ（配列番号３）及びＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬ（配列番号９）を含むかまたは構成要素とし、ここで、ＢＤＭはＢ７−１に結合する。
【００６９】
一例では、分子のＢＤＭのＢＬ−１、ＢＬ−２及びＢＬ−３はそれぞれ、ＴＶＳＷＶＤＭＥ（配列番号１０）、ＷＮＧＲＷ（配列番号１１）及びＱＬＤＰＳＷＧＹＹＷＱＧＹＥ（配列番号１２）を含むかまたは構成要素とし、ここで、ＢＤＭは、スクレロスチンに結合する。
【００７０】
一例では、ＢＤＭ  ＶＬＤは、配列
【表４】
2019510812.tif 000005
（配列番号１３）を含むかまたは構成要素とし、ここで、ＢＤＭはＢ７−１に結合する。
【００７１】
別の例では、ＢＤＭ  ＶＬＤは、配列
【表５】
2019510812.tif 000006
（配列番号１４）を含むかまたは構成要素とし、ここで、ＢＤＭは、スクレロスチンに結合する。
【００７２】
さらなる例では、ＢＤＭのＢＬ−１、ＢＬ−２及びＢＬ−３それぞれを、抗体のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列で置き換える。ＣＤＲ配列が由来する抗体は、任意の種に由来してよい。一例では、抗体はヒトに由来する。別の例では、抗体は、飼育動物、例えば、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモットまたはウマに由来する。
【００７３】
一例では、少なくとも１つのＢＤＭは、分子中に単量体形態または二量体形態で存在してよい。別の例では、少なくとも１つのＢＤＭは、互いに連結されている一連のＢＤＭ単量体で構成されてよい。
【００７４】
したがって、本明細書で使用する用語「ＢＤＭ」には、単量体形態のＢＤＭが含まれるものする。一例では、ＢＤＭは二量体である。二量体は、各ＣＴＬＡ４単量体の茎内のシステイン残基（Ｃｙｓ１２０）同士のジスルフィド結合を介して形成されてよい（各茎は、ＶＬＤと膜貫通領域をつなぐ約１０残基に相当する）。別法として、二量体は、単量体単位の連結によって形成されてよい。一例では、一連（またはデイジーチェーン）の単量体ＢＤＭが互いに連結され得る。例えば、２〜１６のＢＤＭ単量体を頭−尾でつなぎ合わせてデイジーチェーン様の配置にしてよい。別の例では、２〜１４、２〜１２、２〜１０、２〜８、または２〜４のＢＤＭを頭−尾でつなぎ合わせる。
【００７５】
ＢＤＭ単量体の連結は、例えば、共有結合もしくは非共有結合の利用によって、または本明細書に詳述されるような短いペプチドリンカーの使用によって達成され得る。本明細書で言及する連結方法のいずれを用いてもＢＤＭ単量体を互いに連結することができる。別の方法では、隣接するＢＤＭ単量体を直接互いに融合させてよい。
【００７６】
一例では、ＢＤＭは可溶性である。本開示のＢＤＭ足場の「溶解度」は、正しく折り畳まれた、単量体ドメインの生成と相関する。溶解度は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって評価してよい。例えば、可溶性の単量体ＢＤＭでは、ＨＰＬＣクロマトグラフで単一ピークが生じる一方、不溶性の（例えば、多量体または凝集した）ＢＤＭでは、複数のピークが生じるであろう。
【００７７】
少なくとも１つのＢＤＭと薬理的に活性なタンパク質の結合は、当業者に公知の方法によって達成してよい。結合を、例えば、リンカーの使用、直接融合、複合体化または共有結合もしくは非共有結合によって達成してよい。
【００７８】
一例では、薬理的に活性なタンパク質と少なくとも１つのＢＤＭの結合を、ペプチドリンカーを利用して達成する。当該技術分野で公知の好適なペプチドリンカーはいずれも本開示で利用することができる。一例では、リンカーは、配列（ＳＧＧＧＧ）ｎＳ、（配列番号１５）を含み、ここで、ｎは２〜８、または３〜６もしくは３〜４の任意の数である。一例では、リンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）を含むかまたは構成要素とする。
【００７９】
別の例では、薬理的に活性なタンパク質と少なくとも１つのＢＤＭの結合を、リンカーを使用せずに達成する。
【００８０】
一例では、分子は、第１の標的抗原、第２の標的抗原及び／または任意選択で第３の標的抗原に同時に結合することができる。
【００８１】
別の例では、分子は、Ｂ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンに同時に結合することができる。
【００８２】
さらなる例では、薬理的に活性なタンパク質もしくはペプチド及び少なくとも１つのＢＤＭは、これらの標的抗原それぞれに特異的に結合する。別の例では、分子は、その分子の個々のＢＤＭ及び薬理学的に活性なタンパク質部分によって認識される２つ以上の異なる標的抗原または標的エピトープを発現する細胞に選択的に結合するが、標的抗原または標的エピトープの１つしか発現しない細胞には選択的に結合しない。
【００８３】
本開示は、薬理的に活性なタンパク質またはペプチドと結合させたＢＤＭ足場を含むポリペプチドも提供する。一例では、ポリペプチドはリンカーをさらに含む。一例では、リンカーは、配列（ＳＧＧＧＧ）ｎＳを含み、ここで、ｎは２〜８、または３〜６もしくは３〜４の任意の数である。一例では、リンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）を含むかまたは構成要素とする。
【００８４】
本開示は、配列番号５、６、１３、１４、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２８または２９のいずれか１つの配列を含むかまたは構成要素とする群から選択されるポリペプチドも提供する。好ましくは、ポリペプチドは単離される。一例では、本開示のポリペプチドにはポリペプチドタグが含まれる。好適なタグの例には、ｐ９７分子、ｍｙｃ、ヘキサ−ｈｉｓタグ、ｆｌａｇ、Ｅ７が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８５】
一実施形態では、本開示による分子は核酸である。本開示は、本開示のポリペプチド、特に配列番号５、６、１３、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２８または２９のいずれか１つのポリペプチドをコードする核酸も提供する。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはその両方を含むことができる。
【００８６】
一例では、分子は、
【表６】
2019510812.tif 000007
（配列番号３０）
に記載のＢＤＭ  ＶＬＤ核酸配列を含むかまたは構成要素とし、ここで、Ｎ１は第１の結合ループをコードするヌクレオチドの長さ、Ｎ２は第２の結合ループをコードするヌクレオチドの長さ及びＮ３は第３の結合ループをコードするヌクレオチドの長さである。一例では、Ｎ１、Ｎ２及びＮ３は、１５〜４５ヌクレオチドである。一例では、Ｎ１は１５〜２４ヌクレオチドである。Ｎ２は１５ヌクレオチドであり、Ｎ３は３０〜４５ヌクレオチドである。Ｎは任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）である。
【００８７】
一例では、核酸を発現構成体にして提供し、その場合、かかる核酸はプロモーターに機能的に連結されている。そのような発現構成体は、ベクター、例えば、プラスミドであり得る。一例では、発現構成体は、バイシストロン性発現構成体であってよい。本開示ではまた、抗体または免疫グロブリン抗原結合性断片の重鎖及び軽鎖に対する別々の発現構成体も意図される。例えば、一方のベクターは、免疫グロブリン軽鎖及びＢＤＭ  ＶＬＤをコードする核酸を含んでよく、もう一方は、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸を含む、またはその逆であってよい。
【００８８】
核酸には、部分、例えば、精製及び同定を容易にするＦＬＡＧがさらに含まれてよい。さまざまな異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現用の系が公知であり、本明細書に詳述されるとおりである。
【００８９】
本開示は、本明細書に記載する核酸で形質転換された宿主細胞も提供する。好適な宿主細胞には、細菌、哺乳類細胞、酵母、コケ（コケ植物）、及びバキュロウイルス系が含まれる。
【００９０】
本開示は、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で本開示の宿主細胞を培養すること、及び任意選択で、そのポリペプチドを回収することを含む、本開示のポリペプチド分子を作製する方法も提供する。選択する宿主細胞に応じて、ポリペプチドはグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。
【００９１】
本開示は、薬理的に活性なタンパク質と結合させた少なくとも１つのＢＤＭ  ＶＬＤを含む多重特異性分子を作製する方法も提供し、かかる方法は、
（ｉ）ＢＤＭ  ＶＬＤ配列をコードする核酸であり、ここで、ＶＬＤの３つのＢＬのうち少なくとも２つが異種配列で修飾または置き換られている核酸を提供すること、
（ｉｉ）薬理的に活性なタンパク質またはペプチドをコードする核酸を提供すること、及び
（ｉｉｉ）任意選択で、リンカー配列をコードする核酸を提供すること、
（ｉｖ）上述核酸配列を好適なベクターに発現させること、
（ｖ）発現したタンパク質を回収すること
を含む。
【００９２】
本開示は、抗体と結合させた少なくとも１つのＢＤＭ  ＶＬＤを含む多重特異性分子を作製する方法も提供し、かかる方法は、
（ｉ）抗体軽鎖配列またはその一部をコードする核酸を提供すること、
（ｉｉ）抗体重鎖配列またはその一部をコードする核酸を提供すること、
（ｉｉｉ）ＢＤＭ  ＶＬＤ配列をコードする核酸であり、ここで、ＶＬＤの３つのＢＬのうち少なくとも２つが異種配列で修飾または置き換られている核酸を提供すること、
（ｉｖ）上述核酸配列を好適なベクター（複数可）に発現させること、及び
（ｖ）発現したタンパク質を回収すること
を含む。
【００９３】
方法に従った一例では、抗体重鎖は完全長配列で構成される。方法に従った別の例では、抗体重鎖は可変領域及び少なくともＣＨ１領域で構成される。別の例では、抗体重鎖は可変領域ならびに少なくともＣＨ１及びＣＨ２の領域で構成される。
【００９４】
方法に従った一例では、リンカー配列は存在せず、薬理的に活性なタンパク質またはペプチドの核酸配列とＢＤＭ  ＶＬＤの核酸配列は連続している。別の例では、リンカー配列は存在せず、抗体の重鎖及び／または軽鎖をコードする核酸配列とＢＤＭ配列は連続している。
【００９５】
抗体の核酸配列は、ヒンジ領域をさらに含んでよい。
【００９６】
本開示は、本明細書に記載する核酸配列１つ以上を含むベクター（複数可）も提供する。一例では、ベクターは、本明細書に記載する薬理的に活性なタンパク質及びＢＤＭ  ＶＬＤをコードする核酸配列ならびに任意選択でリンカーをコードする核酸配列を含む。一例では、ベクター（複数可）は、本明細書に記載する抗体軽鎖または抗体重鎖をコードする核酸配列及びＢＤＭ  ＶＬＤをコードする核酸配列及び任意選択でリンカーをコードする核酸配列を含む。別の例では、ベクター（複数可）は、本明細書に記載する抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする核酸配列及びＢＤＭ  ＶＬＤをコードする核酸配列及び任意選択でリンカーをコードする核酸配列を含む。
【００９７】
本開示は、ベクターを含有している宿主細胞、または本明細書に記載する核酸配列１つ以上を含有している宿主細胞も提供する。
【００９８】
本開示は、本明細書に記載する方法によって作製される多重特異性分子も提供する。
【００９９】
本開示の分子を組成物で提供してよい。したがって、別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載する多重特異性分子を含む医薬組成物を、薬理学的に許容される担体及び／または添加物と共に提供する。組成物を医薬品として提供してよい。一例では、組成物は障害の治療で使用するためのものである。別の例では、組成物はアンチエイジング用または化粧品である。
【０１００】
別の例では、分子を、検出を容易にする薬剤で標識化してよい。
【０１０１】
本開示の組成物を、特定の治療適応に従って使用するための説明書を備えたキットという形態で提供してもよい。
【０１０２】
本開示は、分子の１つ以上の部分が結合する１つ以上の標的抗原を検出するための、本明細書に記載の多重特異性分子の使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】Ａは、フレームワーク配列ならびに結合ループ１、２及び３の各配列（ＢＬ１、ＢＬ２及びＢＬ３と表す）が位置する場所を示す、天然型ヒトＣＴＬＡ４  ＶＬＤ足場の配列の概略図を表す。Ｂは、ＣＴＬＡ４  ＶＬＤにおける結合ループの置き換えの位置を示し、ここで、ＢＬ１はＸｎ１で表され、ＢＬ２はＸｎ２で表され、ＢＬ３はＸｎ３で表されており、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは５〜１５の数である。Ｃは、スクレロスチンヒトＶＬＤ足場の配列を示し、ここで、結合ループ領域の配列には下線が引かれている。
【図２】本開示の一例に従った抗体−ＶＬＤ二重特異性分子の概略図を示す。抗体は、その重鎖及び軽鎖のＶドメインを介して標的Ａに結合する。抗体重鎖のＣＨ３定常ドメインＣ末端に結合されているＶＬＤは、標的Ｂに結合する。二重特異性分子は、標的Ａと標的Ｂの両方に個々別々または同時に結合することができる。
【図３】本開示の一例に従った抗体−ＶＬＤ二重特異性分子の概略図を示す。抗体は、その重鎖及び軽鎖のＶドメインを介して標的Ａに結合する。ＶＬＤは軽鎖の定常ドメイン（軽鎖定常領域、ＣＬ）それぞれのＣ末端で結合されており、標的Ｂに結合する。二重特異性分子は、標的Ａと標的Ｂの両方に個々別々または同時に結合することができる。
【図４】本開示の一例に従った抗体−ＶＬＤ三重特異性分子の概略図を示す。抗体は、その重鎖及び軽鎖のＶドメインを介して標的Ａに結合する。ＶＬＤは、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ３）のそれぞれのＣ末端に結合されている。三重特異性分子は、標的Ａ及び標的Ｂ及び標的Ｃに対し、個々別々または同時または標的３つの組み合わせで（例えば、標的ＡとＢまたは標的ＡとＣまたは標的ＢとＣ）結合することができる。
【図５】本開示の一例に従ったＦａｂ−ＶＬＤ二重特異性分子の概略図を示す。Ｆａｂは、その重鎖及び軽鎖のＶドメインを介して標的Ａに結合する。ＶＬＤは、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）のＣ末端に結合されており、標的Ｂに結合する。二重特異性分子は、標的Ａと標的Ｂの両方に個々別々または同時に結合することができる。
【図６】本開示の一例に従ったＦａｂ−ＶＬＤ二重特異性分子の概略図を示す。Ｆａｂは、その重鎖及び軽鎖のＶドメインを介して標的Ａに結合する。ＶＬＤは、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）のＣ末端に結合されており、標的Ｂに結合する。二重特異性分子は、標的Ａと標的Ｂの両方に個々別々または同時に結合することができる。
【図７】本開示の一例に従ったＦａｂ−ＶＬＤ三重特異性分子の概略図を示す。Ｆａｂは、その重鎖及び軽鎖のＶドメインを介して標的Ａに結合する。ＶＬＤは、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）のＣ末端に結合されて標的Ｂに結合し、また、ＶＬＤは重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）のＣ末端に結合されて標的Ｃに結合する。三重特異性分子は、標的Ａ及び標的Ｂ及び標的Ｃに対し、個々別々または同時または標的３つの組み合わせで（例えば、標的ＡとＢまたは標的ＡとＣまたは標的ＢとＣ）結合することができる。
【図８】親Ｄ１．３  Ｆａｂ、ならびに二重特異性変異型及び三重特異性変異型の非還元条件下での発現（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）を示す。Ｄ１．３  Ｆａｂは抗リゾチームＦａｂであり、Ｄ１．３  Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）は重鎖のＣＨ１ドメインと融合させたＶＬＤを有する抗リゾチームＦａｂであり、Ｄ１．３  Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＬＣ）は軽鎖のＣＬドメインと融合させたＶＬＤを有する抗リゾチームＦａｂであり、Ｄ１．３  Ｆａｂ−ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）は重鎖のＣＨ１ドメインと融合させたＶＬＤと軽鎖のＣＬドメインと融合させたＶＬＤとを有する抗リゾチームＦａｂである。
【図９】親Ｄ１．３  Ｆａｂ、二重特異性変異型及び三重特異性変異型の還元条件下でのＳＤＳ  ＰＡＧＥ発現分析を示す。Ｄ１．３  Ｆａｂは抗リゾチームＦａｂであり、Ｄ１．３  Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）は重鎖のＣＨ１ドメインと融合させたＶＬＤを有する抗リゾチームＦａｂであり、Ｄ１．３  ＶＬＤ×１（ＬＣ）は軽鎖のＣＬドメインと融合させたＶＬＤを有する抗リゾチームＦａｂであり、Ｄ１．３  ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）は重鎖のＣＨ１ドメインと融合させたＶＬＤと軽鎖のＣＬドメインと融合させたＶＬＤとを有する抗リゾチームＦａｂである。
【図１０】ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに対する二重特異性分子［ＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＨＣ）］の初期結合、続くＢ７．１−Ｆｃに対する二次結合のＢＬｉｔｚ（登録商標）分析を示す。二重特異性分子は、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］重鎖と融合させた各Ｂ７−１結合ＶＬＤを有する。トレース１は、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後ポイント１にてバッファーを加えられた、Ｄ１．３抗リゾチーム抗体である。トレース２は、リゾチームに結合し、その後ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを加えられた、Ｄ１．３抗リゾチーム抗体である。ポイント２にてＢ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。トレース３は、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、続いてポイント１にてバッファーを加えられた、二重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＨＣ）である。トレース４は、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを加えられた、二重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＨＣ）である。ポイント２にてＢ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。センサーグラムにより、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃに対する二重標的同時結合が示されている。
【図１１】ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに対する二重特異性分子［ＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＬＣ）］の初期結合、続くＢ７−１−Ｆｃに対する二次結合のＢＬｉｔｚ（登録商標）分析を示す。二重特異性分子は、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］軽鎖と融合させたＢ７−１結合ＶＬＤを有する。トレース１は、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後ポイント１にてバッファーを加えられた、Ｄ１．３抗リゾチーム抗体である。トレース２は、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを加えられた、Ｄ１．３抗リゾチーム抗体である。ポイント２にてＢ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。トレース３は、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、続いてポイント１にてバッファーを加えられた、二重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＬＣ）である。トレース４は、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを加えられた、二重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＬＣ）である。ポイント２にてＢ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。センサーグラムにより、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃに対する二重標的同時結合が示されている。
【図１２】ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに対する三重特異性［ＩｇＧ  ＶＬＤ×４（ＨＣＬＣ）］の初期結合、続くＢ７−１−Ｆｃに対する二次結合のＢＬｉｔｚ（登録商標）分析を示す。三重特異性分子は、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］の重鎖及び軽鎖の両方と融合させた各Ｂ７−１結合ＶＬＤを有する。トレース１は、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後ポイント１にてバッファーを加えられた、Ｄ１．３抗リゾチーム抗体である。トレース２は、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを加えられた、Ｄ１．３抗リゾチーム抗体である。ポイント２にてＢ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。トレース３は、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、続いてポイント１にてバッファーを加えられた、三重特異性Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×４（ＨＣＬＣ）である。トレース４は、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを加えられた、三重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×４（ＨＣＬＣ）である。ポイント２にてＢ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。センサーグラムにより、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃに対する二重標的同時結合が示されている。
【図１３】Ｂ７−１−Ｆｃについて、三重特異性分子が二重特異性分子より高い結合を示す、ＢＬｉｔｚ（登録商標）分析を示す。抗体数が同等の二重特異性分子及び三重特異性分子を、バイオセンサー表面に結合させたビオチン標識化リゾチームに捕捉した後、バッファーまたはＢ７−１−Ｆｃを加えた（ポイント１）ところ、三重特異性分子は二重特異性分子より高い結合能を示した。トレース１は、二重特異性分子及び三重特異性分子の構築に使用したＤ１．３抗リゾチーム抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］である。ポイント１にてバッファーのみを注入し、結合した抗体が示されている。トレース２はＤ１．３抗リゾチーム抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］であり、ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを注入した場合が示されている。ポイント２にて、Ｂ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。トレース３は、抗体ＣＬ鎖と融合させた各ＶＬＤを有する二重特異性Ｄ１．３抗リゾチーム抗体［二重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＬＣ）］である。捕捉された二重特異性分子が、ポイント１にて注入したＢ７−１−Ｆｃに結合したことを示している。ポイント２にて、Ｂ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。トレース４は、抗体のＣＨ鎖及びＣＬ鎖と融合させた各ＶＬＤを有する三重特異性Ｄ１．３抗リゾチーム抗体である［三重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）］。捕捉された二重特異性分子が、ポイント１にて注入したＢ７−１−Ｆｃに結合したことを示している。ポイント２にて、Ｂ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。
【図１４】ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに対する二重特異性分子［ＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＨＣ）］の初期結合、続くある濃度系列のＢ７−１−Ｆｃ（５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、３．１２５μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ及び０μｇ／ｍｌ）に対する二次結合を示す、一連のＳＰＲによる結合のセンサーグラムを重ね合わせたものを示す。二重特異性分子は、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］重鎖と融合させた各Ｂ７−１結合ＶＬＤを有する。
【図１５】ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに対する二重特異性分子［ＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＬＣ）］の初期結合、続くある濃度系列のＢ７−１−Ｆｃ（５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、３．１２５μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ及び０μｇ／ｍｌ）に対する二次結合を示す、一連のＳＰＲによる結合のセンサーグラムを重ね合わせたものを示す。二重特異性分子は、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］軽鎖と融合させたＢ７−１結合ＶＬＤを有する。
【図１６】ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに対する三重特異性［ＩｇＧ  ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）］の初期結合、続くある濃度系列のＢ７−１−Ｆｃ（５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、３．１２５μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ及び０μｇ／ｍｌ）に対する二次結合を示す、一連のＳＰＲによる結合のセンサーグラムを重ね合わせたものを示す。三重特異性分子は、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］の重鎖及び軽鎖の両方と融合させた各Ｂ７−１結合ＶＬＤを有する。
【図１７】リゾチームに結合し、その後ある濃度系列のＢ７−１−Ｆｃ（２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、３．１２５μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ）に同時結合する二重特異性［Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）］を示す、結合についての重なり合うＳＰＲセンサーグラムを示す。二重特異性分子は、Ｄ１．３  Ｆａｂ［Ｄ１．３  Ｆａｂ］重鎖と融合させたＢ７−１結合ＶＬＤを有する。
【図１８】リゾチームに結合し、その後ある濃度系列のＢ７−１−Ｆｃ（２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、３．１２５μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ）に同時結合する二重特異性［Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＬＣ）］を示す、結合についての重なり合うＳＰＲセンサーグラムを示す。二重特異性分子は、Ｄ１．３  Ｆａｂ［Ｄ１．３  Ｆａｂ］軽鎖と融合させたＢ７−１結合ＶＬＤを有する。
【図１９】リゾチームに結合し、その後ある濃度系列のＢ７−１−Ｆｃ（２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、３．１２５μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ）に同時結合する三重特異性［Ｆａｂ−ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）］を示す、結合についての重なり合うＳＰＲセンサーグラムを示す。三重特異性分子は、Ｄ１．３  Ｆａｂ［Ｄ１．３  Ｆａｂ］の重鎖及び軽鎖の両方と融合させた各Ｂ７−１結合ＶＬＤを有する。
【図２０】Ｂ７−１−Ｆｃに結合する二重特異性及び三重特異性の抗体−ＶＬＤ分子についてのＳＰＲ分析によって求めたＲＭＡＸ（最大量）の割合として決定した結合化学量論を示す。
【図２１】Ｂ７−１−Ｆｃに結合する二重特異性及び三重特異性のＦａｂ−ＶＬＤ分子についてのＳＰＲ分析によって求めたＲＭＡＸの割合として決定した結合化学量論を示す。
【図２２】三重特異性［ＩｇＧ  ＶＬＤ×４（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）］が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに最初に結合し、その後Ｂ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンに対して順に同時結合することを示す、一連のＳＰＲによる結合のセンサーグラムを重ね合わせたものを示す。三重特異性分子は、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］重鎖と融合させたスクレロスチン（Ｓｃｌ）結合ＶＬＤ及び軽鎖と融合させたＢ７−１結合ＶＬＤを有する。Ｂ７−１−Ｆｃのみのトレースは、三重特異性分子がバイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、続いてＢ７−１−Ｆｃを加えられた場合を示すセンサーグラムである。センサーグラムにより、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃに対する二重標的同時結合が示されている。スクレロスチンのみのトレースは、三重特異性分子がバイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、続いてスクレロスチンを加えられた場合を示すセンサーグラムである。センサーグラムにより、リゾチーム及びスクレロスチンに対する二重標的同時結合が示される。Ｂ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンのトレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームへの結合、その後のＢ７−１−Ｆｃの添加、それに続くスクレロスチンの添加を示す、三重特異性分子のセンサーグラムである。センサーグラムにより、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンに対する三重標的同時結合が示されている。    三重特異性分子の注入：センサー表面にＩｇＧ  ＶＬＤ×４（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）を加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに対するＩｇＧ  ＶＬＤ×４（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）の結合を示す。    バッファーの注入１：ＩｇＧ  ＶＬＤ×４（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）の注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームからのＩｇＧ  ＶＬＤ×４（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）の解離を示す。    Ｂ７−１−Ｆｃの注入：第２の分析対象物Ｂ７−１−Ｆｃを加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームにまだ結合したままのＩｇＧ  ＶＬＤ×４（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）に対するＢ７−１−Ｆｃの結合を示す。    バッファーの注入２：Ｂ７−１−Ｆｃの注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームとまだ結合しているＩｇＧ  ＶＬＤ×４（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）からのＢ７−１−Ｆｃの解離を示す。    スクレロスチンの注入：第３の分析対象物スクレロスチンを加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームにまだ結合しつつ同時にＢ７−１−Ｆｃとまだ結合しているＩｇＧ  ＶＬＤ×４（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）に対して結合するスクレロスチンを示す。    バッファーの注入３：スクレロスチンの注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームとまだ結合しているＩｇＧ  ＶＬＤ×４（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）からのスクレロスチンの解離を示す。
【図２３】三重特異性［Ｆａｂ  ＶＬＤ×２（Ｂ７−ＨＣ）（Ｓｃｌ−ＬＣ）］が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに最初に結合し、その後Ｂ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンに対して順に同時結合することを示す、ＢＬｉｔｚ（登録商標）結合分析を示す。三重特異性分子は、Ｄ１．３  Ｆａｂ［Ｄ１．３  Ｆａｂ］の軽鎖と融合させたスクレロスチン結合ＶＬＤ及び重鎖と融合させたＢ７−１結合ＶＬＤを有する。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに対する三重特異的結合、それに続くＢ７−１−Ｆｃの添加を示す。結合トレースより、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃに対する二重標的同時結合が示される。スクレロスチンを加え、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンに対する三重標的同時結合が示される。    三重特異性分子の添加：センサー表面にＦａｂ  ＶＬＤ×２（Ｂ７−ｌ−ＨＣ）（Ｓｃｌ−ＬＣ）を加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに対するＦａｂ  ＶＬＤ×２（Ｂ７−ｌ−ＨＣ）（Ｓｃｌ−ＬＣ）の結合を示す。    Ｂ７−１−Ｆｃの添加：Ｂ７−１−Ｆｃを加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームにまだ結合したままのＦａｂ  ＶＬＤ×２（Ｂ７ｌ−ＨＣ）（Ｓｃｌ−ＬＣ）に対するＢ７−１−Ｆｃの結合を示す。    スクレロスチンの添加：スクレロスチンを加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームにまだ結合しつつ同時にＢ７−１−Ｆｃとまだ結合しているＦａｂ  ＶＬＤ×２（Ｂ７ｌ−ＨＣ）（Ｓｃｌ−ＬＣ）に対して結合するスクレロスチンを示す。    バッファーの添加：スクレロスチンをバッファーで置き換えるポイント。
【図２４】三重特異性［Ｆａｂ  ＶＬＤ×２（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）］が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに最初に結合し、その後Ｂ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンに対して順に同時結合することを示す、ＢＬｉｔｚ（登録商標）結合分析を示す。三重特異性分子は、Ｄ１．３  Ｆａｂ［Ｄ１．３  Ｆａｂ］の重鎖と融合させたスクレロスチン結合ＶＬＤ及び軽鎖と融合させたＢ７−１結合ＶＬＤを有する。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに対する三重特異的結合、それに続くＢ７−１−Ｆｃの添加を示す。結合トレースより、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃに対する二重標的同時結合が示される。スクレロスチンを加え、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンに対する三重標的同時結合が示される。    三重特異性分子の添加：センサー表面にＦａｂ  ＶＬＤ×２（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）を加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに対するＦａｂ  ＶＬＤ×２（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）の結合を示す。    Ｂ７−１−Ｆｃの添加：Ｂ７−１−Ｆｃを加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームにまだ結合したままのＦａｂ  ＶＬＤ×２（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）に対するＢ７−１−Ｆｃの結合を示す。    スクレロスチンの添加：スクレロスチンを加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームにまだ結合しつつ同時にＢ７−１−Ｆｃとまだ結合しているＦａｂ  ＶＬＤ×２（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）に対して結合するスクレロスチンを示す。    バッファーの添加：スクレロスチンをバッファーで置き換えるポイント。
【図２５】本開示の一例に従ったＶＬＤと結合させたタンパク質（一般的描写）の概略図を示す。タンパク質は標的Ａに結合する。ＶＬＤは、タンパク質ポリペプチドのＣ末端に結合され、標的Ｂに結合する。二重特異性分子は、標的Ａと標的Ｂの両方に個々別々または同時に結合することができる。
【図２６】精製ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）−ＶＬＤ融合タンパク質の、抗Ｈｉｓホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いたウエスタンブロット法による解析及び検出を示す。レーン１はＣ末端と融合させたＶＬＤを有するＨＳＡであり、レーン２はＮ末端と融合させたＶＬＤを有するＨＳＡであり、レーン３はＮ末端及びＣ末端の両方と融合させた各ＶＬＤを有するＨＳＡである。
【図２７】ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚバイオセンサーを使用した分析を示し、Ｂ７−２−Ｆｃに対するＨＳＡ−ＶＬＤ融合タンパク質の結合を実証している。トレース１は、ＨＳＡのＣ末端に結合させたＢ７−２結合ＶＬＤとしてのＨＳＡ−ＶＬＤ融合タンパク質と一致する。トレース２は、ＨＳＡのＮ末端及びＣ末端の両方に結合させたＢ７−２結合ＶＬＤを有するＶＤＬ−ＨＳＡ−ＶＬＤ構成体と一致する。ポイント１はバッファーの添加に対応する。
【図２８】ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚバイオセンサーを使用した分析を示し、ＣＤ３に対するＨＳＡ−ＶＬＤの結合を実証している。図示トレースは、ＣＤ３ｄｅに対する分子の結合と一致する。ポイント１はバッファーの添加に対応する。
【図２９】ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚバイオセンサーを使用した分析を示し、抗ＨＳＡアフィボディー及びＢ７−２−Ｆｃに対するＨＳＡ−ＶＬＤ融合タンパク質の結合を実証している。図示トレースは、抗ＨＳＡアフィボディーに対する分子の結合と一致する。ポイント１、２及び３はバッファーの添加と一致する。配列表の鍵配列番号１  ヒト天然型ＣＴＬＡ４足場（細胞外ドメイン）の配列配列番号２  ＣＴＬＡ４の露出結合ループ１の配列配列番号３  ＣＴＬＡ４の露出結合ループ２の配列配列番号４  ＣＴＬＡ４の露出結合ループ３の配列配列番号５  ＢＤＭ  ＶＬＤ足場の配列配列番号６  ＢＤＭ  ＶＬＤ足場の配列配列番号７  結合ループ１の配列配列番号８  シグナルペプチド配列配列番号９  結合ループ３の配列配列番号１０  結合ループ１の配列配列番号１１  結合ループ２の配列配列番号１２  結合ループ３の配列配列番号１３  Ｂ７−１結合ＶＬＤ足場の配列配列番号１４  スクレロスチン結合ＶＬＤ足場の配列配列番号１５  リンカー配列配列番号１６  リンカー配列配列番号１７  リンカー配列配列番号１８  抗リゾチームＩｇＧ１重鎖の配列配列番号１９  リンカーによってＢ７−１結合ＶＬＤと結合させた抗リゾチームＩｇＧ１重鎖の配列配列番号２０  抗リゾチームＩｇＧカッパ軽鎖の配列配列番号２１  リンカーによってＢ７−１結合ＶＬＤと結合させた抗リゾチームＩｇＧカッパ軽鎖の配列配列番号２２  リンカーによってＢ７−１結合ＶＬＤに結合させた抗リゾチームＦａｂカッパ軽鎖の配列配列番号２３  リンカーによってＢ７−１結合ＶＬＤに結合させた抗リゾチームＦａｂ重鎖の配列配列番号２４  Ｃ末端のヒスチジンタグとｍｙｃタグを有する抗リゾチームＦａｂ重鎖の配列配列番号２５  抗スクレロスチンＶＬＤと融合させた抗リゾチームＩｇＧ１重鎖の配列配列番号２６  ヒト血清アルブミンのＣ末端と融合させたＢ７−２結合ＶＬＤの配列配列番号２７  ヒト血清アルブミンのＮ末端と融合させたＢ７−２結合ＶＬＤの配列配列番号２８  ヒト血清アルブミンのＮ末端及びＣ末端の両方と融合させたＢ７−２結合ＶＬＤの配列配列番号２９  ヒト血清アルブミンのＣ末端と融合させたＣＤ３結合ＶＬＤの配列配列番号３０  ＢＤＭ  ＶＬＤ足場の塩基配列。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
概要
本明細書全体を通して、特に具体的な断りがある、または文脈において特に指定がある場合を除いては、単一のステップ、組成物、ステップ群または組成物群への言及には、かかるステップ、組成物、ステップ群または組成物群を１つ及び複数（すなわち１つ以上）包含すると解釈されるべきである。
【０１０５】
本開示は、具体的に記載されているもの以外の変更及び修正が可能であることは、当業者には理解されるであろう。本開示には、そのような変更及び修正すべてが含まれることを理解されるべきである。また、本開示には、本明細書において個別または集合的に言及または指示されるステップ、特徴、組成物及び化合物のすべて、ならびに前記ステップもしくは特徴の任意の２つ以上のあらゆる組み合わせも含まれる。
【０１０６】
本明細書の開示のいかなる例または実施形態も、特に具体的に断らない限り、本開示のいかなる他の例にも準用すると理解されるべきである。
【０１０７】
特に具体的に明記しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、当該技術分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学）の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を有すると理解されるべきである。
【０１０８】
特に明記しない限り、本開示で利用する組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的手技である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者ら）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５及び１９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編集者ら）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての更新を含む）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編集者ら）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（編集者ら）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までのすべての更新を含む）などの原文献に十分な記載及び説明がある。
【０１０９】
本明細書の可変領域とその部分、免疫グロブリン、抗体とその断片についての記載及び定義は、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９８７及び１９９１、Ｂｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９−３２０，１９９４，Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１  −９１７，１９８７，Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，８７７−８８３，１９８９  及び／またはまたはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７３，９２７−９４８，１９９７における考察によってさらに明確となり得る。
【０１１０】
「及び／または」、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」という用語は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」を意味すると理解されるべきであり、両方の意味またはいずれかの意味を明白に支持するものと理解されるべきである。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は、文脈により特に示唆されない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【０１１２】
本明細書全体を通して語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記述されている要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を含むが、他の任意の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。
【０１１３】
選択定義
本明細書においてアミノ酸配列で使用される文字「ｘ」は、特に明記しない限り、標準アミノ酸２０個のうちいずれをこの位置に置いてもよいことを示すものとする。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、「同一性」は、２つ以上の配列を、配列一致が最大になるよう、すなわち、ギャップ及び挿入を考慮に入れてアラインメントを行った場合に、かかる配列内の対応する位置において同一なヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を意味する。同一性は、公知の方法によって容易に計算することができ、それらには、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載のものが含まれるが、これに限定されるものではない。同一性を決定する方法は、被験配列間の一致が最大になるよう設計される。さらに、同一性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムの形で体系的にまとめられている。２配列間の同一性を決定するコンピュータプログラムによる方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−  ３４０２（１９９７））が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴ  Ｘ  プログラムはＮＣＢＩ及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））から公的に入手可能である。
【０１１５】
本明細書で使用する用語「配列同一性」は、本開示のポリペプチドの配列と対象配列とのアラインメントを、これらの２配列のより長い配列の残基数について行った際に、対で同一な残基の割合を意味する。同一性は、同一残基数を総残基数で除して得たものに１００を乗じて求められる。したがって、２配列間の同一性は典型的にパーセンテージとして表されることになる。
【０１１６】
用語「免疫グロブリン」は、抗体分子の免疫グロブリン折り畳み特性を保持しているポリペプチドのファミリーを指し、２つのベータシート及び、通常は、保存されたジスルフィド結合を含有する。Ｉｇスーパーファミリーのメンバーには、抗体、Ｔ細胞受容体分子等、ＩＣＡＭ分子（細胞接着に関与）、細胞内シグナル伝達に関与するＰＤＧＦ受容体のような受容体分子が含まれる。好ましくは、本発明は抗体に関する。
【０１１７】
「免疫グロブリン様ドメイン」は、機能の異なる各種タンパク質、例えば、細胞外マトリックスタンパク質、筋タンパク質、免疫タンパク質、細胞表面受容体及び酵素などに見られるベータ−サンドイッチ構造のモチーフを指す。Ｉｇ様ドメインのメンバーは、さまざまなスーパーファミリーに分けられており、それらには、例えば、免疫グロブリン、フィブロネクチンＩＩＩ型及びカドヘリンといったスーパーファミリーが挙げられる。Ｉｇ様ドメイン構造のモチーフを含有する他のスーパーファミリーとしては、例えば、ＰＫＤドメインの各メンバー、β−ガラクトシダーゼ／グルコシダーゼドメイン、トランスグルタミナーゼ２のＣ末端ドメイン、アクチノキサンチン様、ＣｕＺｎスーパーオキシドディスムターゼ様、ＣＢＤ９様、ラミンＡ／Ｃ球状尾部ドメイン、クラスリンアダプター付属ドメイン、インテグリンドメイン、ＰａｐＤ様、紫色酸性ホスファターゼＮ末端ドメイン、スーパーオキシドレダクターゼ様、チオール：ジスルフィド交換タンパク質ＤｓｂＤのＮ末端ドメイン、及びインバシン／インチミン細胞接着断片の各スーパーファミリーが挙げられる。Ｉｇ様ドメイン構造の類似性は、有意な配列同一性に関係なく異なるスーパーファミリーメンバー間で維持されている。当該用語には、各スーパーファミリー内及び各スーパーファミリー間のＩｇ様ドメインメンバーが含まれるものとする。したがって、用語「免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン含有スーパーファミリー」は、これらのスーパーファミリーならびに当該技術分野で公知の他のスーパーファミリーの任意のものに入るＩｇ様ドメイン含有メンバーのポリペプチドを指すものとする。各種Ｉｇ様ドメイン含有スーパーファミリーの記載は、例えば、Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ．Ｄｅｓ．７：１１４５−５３（１９９９）及びｐｄｂ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｓｃｏｐ／ｄａｔａ／ｓｃｏｐ．ｂ．ｃ．ｂ．ｈｔｍｌのＵＲＬなどの構造データベース内に見出すことができる。
【０１１８】
用語「抗体」には、すべてのクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥまたはサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が含まれ得、自然界で抗体を産生する任意の種に由来するものであるか、または組換えＤＮＡ技術によって創製されたものであるかを問わず、また血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母もしくは細菌からから単離されたものであるか、または合成により作製されたものであるかを問わない。用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、霊長類化抗体またはｓｙｎヒト化抗体を包含する。用語「ヒト抗体」は、考えられる非ヒトＣＤＲ領域を除く、ヒト由来配列を含有する抗体を指し、ヒトにおける免疫原性が最小限のものを指す。
【０１１９】
本明細書で使用する用語「完全長抗体」は、抗体の抗原結合断片とは異なり、実質的に無傷の形態にある抗体を指すものとする。完全長抗体は、単離されたものでも組換え型であってもよい。具体的には、全抗体には、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものが含まれる。定常ドメインは、野生型配列の定常ドメイン（例えば、ヒト野生型配列定常ドメイン）であっても、そのアミノ酸配列変異型であってもよい。抗体タンパク質は、複数のポリペプチド鎖、例えば、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチド及び重鎖可変領域（ＶＨ）を含むポリペプチドで構成される可変領域を含む。抗体は定常ドメインも含み、その一部は定常領域内に配置され得、それには、定常断片または重鎖の場合は結晶化可能断片（Ｆｃ）が含まれる。ＶＨ及びＶＬは相互作用して、１つまたは少数の密接に関連する抗原に特異的に結合することができる抗原結合領域を含むＦｖを形成する。抗体と抗原との結合相互作用は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上のアミノ酸残基との分子間接触として現われうる。一般に、哺乳類の軽鎖はκ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかであり、哺乳類の重鎖はα、δ、ε、γ、またはμである。抗体は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であってよい。さらに別の例では、抗体はサメ、ラクダ科、ネコ科またはイヌ科の抗体である。
【０１２０】
本明細書で使用する用語「免疫グロブリン抗原結合性断片」は、抗体の断片を指すものとし、その断片には、相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が含まれる。かかる用語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、または化学的に結合しているＦ（ａｂ’）２を包含する。
【０１２１】
用語「Ｆａｂ」は、抗原と結合し、重鎖及び軽鎖のそれぞれの定常ドメイン１つと可変ドメイン１つで構成される、抗体の領域を指すものと理解される。
【０１２２】
用語「相補的」は、対応する対を形成する免疫グロブリンドメインを指す。例えば、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインは相補的であり、２つのＶＨドメインは相補的ではなく、２つのＶＬドメインは相補的ではない。
【０１２３】
用語「ドメイン」は、折り畳まれているタンパク質構造であり、そのタンパク質の他の部分とは独立して自身の三次構造を保持しているものを指す。
【０１２４】
用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、抗体または抗体断片（抗原に結合）内の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非連続的な抗原結合部位を意味するものとする。これらの特定領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）によって記載されており、そこでの定義には、アミノ酸残基同士を互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれている。上述したものの、いずれかの定義を適用して抗体または移植抗体またはその変異型のＣＤＲに言及する場合、その適用は本明細書で定義し使用する用語の範囲内であるものとする。
【０１２５】
「結合ドメイン分子（ＢＤＭ）」は、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）と類似した構造的特徴を有する単量体ドメインを指す。これらの類似した構造的特徴としては、特定抗原に結合する抗体可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）と同様の方法で機能する、表面ポリペプチドのループ状の構造または領域であるＢＬ（結合ループ）配列が挙げられる。ＢＤＭ足場は、フレームワーク配列及びその間に含有される３つのＢＬ配列で構成される。本明細書のＢＤＭは抗体の可変ドメインではない。ＢＤＭ足場は本明細書に記載されており、それには、例えば、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、フィブロネクチン、ＩＣＯＳ及びＣＤ２８などがある。
【０１２６】
「ＢＬ配列」は、特定抗原に結合する抗体可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）と同様の方法で機能する、表面ポリペプチドのループ状の構造または領域である。３つの抗原結合ループ配列（本明細書ではそれぞれＢＬ−１、ＢＬ−２及びＢＬ−３とする）はＢＤＭに存在し、かかるループ配列の所望の三次元コンホメーションを提供する足場配列内にある。天然ＢＬ配列は、足場上に移植可能な、対応する１つ以上の抗体ＣＤＲで置き換えることができる。ＢＤＭのＢＬ部位に多様性を導入することができ、これは、足場の特定ループのアミノ酸配列を無作為化する、例えば、ＮＮＫコドンを導入した後、所望の結合特性について、例えば、ディスプレイ技術を使用して選択を行うことによって可能である。この機構は、高親和性の抗原特異的抗体による自然選択と類似している。
【０１２７】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドにおいて用語「結合特異性」は、標的抗原または標的エピトープ上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存して、タンパク質またはペプチド及び／またはＢＤＭが各自の標的抗原または標的エピトープと結合する能力を指す。例えば、タンパク質及び／またはＢＤＭは、タンパク質全般に結合するのではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合する。例を挙げると、あるタンパク質がエピトープ「Ａ」に結合する場合、標識化「Ａ」と該タンパク質が含まれている反応では、エピトープ「Ａ」（すなわち遊離の非標識「Ａ」）を含有する分子が存在することにより、該タンパク質と結合した標識化「Ａ」の量は減少することになる。また、かかる用語には、薬理的に活性なタンパク質もしくはペプチド及び／またはＢＤＭは標的抗原に「特異的に結合する」ことが含まれることも理解されるべきである。用語「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」または「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」は、薬理的に活性なタンパク質（または、抗体の場合はその抗原結合ドメイン）もしくはペプチド及び／または本開示のＢＤＭが、代替的な標的抗原の場合よりも特定の標的抗原と、より高頻度、より短時間で反応または会合し、持続時間がより長いこと、及び／または親和性がより高いことを意味するものと理解されるべきである。「結合」への言及により、用語「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」または「特異的結合（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」を明確に支持するものである。典型的に、かかる用語は、ある部分（すなわち、本明細書のタンパク質またはＢＤＭ）の所与の標的抗原に対する親和性を述べるために使用される。一部の状況では、毒性が問題となり得る場合には親和性の低い結合が望ましいことがある。別の状況では、他の標的抗原に対する交差反応性を最小限にするために親和性の高い結合が望ましいことがある。一例では、結合は、本明細書で定義するような特異的結合である。
【０１２８】
用語「選択的結合」は本明細書の他の箇所に詳述されている。
【０１２９】
選択標的に対する分子（すなわち、タンパク質またはＢＤＭ）の部分の「結合親和性」または「親和性」は測定することができる。用語「親和性」は、２つの物質の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数（Ｋｄ）または平衡解離定数（ＫＤ）として表される。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、用語「アビディティ」は、２つ以上の物質からなる複合体の希釈後の解離に対する抵抗性を指す。
【０１３１】
本発明において用語「抗原」は、薬理的に活性なタンパク質もしくはペプチドまたはＢＤＭが結合する物質を意味する。抗原は、典型的に、ＢＤＭまたはタンパク質もしくはペプチドよって認識される１つ以上の抗原エピトープを含むであろう。タンパク質抗原は、可溶性タンパク質または膜結合型タンパク質であってよい。可溶性タンパク質の例には、転写因子、抗体、増殖因子、血液タンパク質（例えば、アルブミン）、または薬物（例えば、ステロイド、医薬品など）が挙げられるが、これに限定されるものではない。膜結合型タンパク質の種類には、増殖因子受容体、腫瘍マーカー、細胞表面マーカー、または細胞内への輸送を媒介するマーカー（例えば、トランスフェリン）、またはＦｃ受容体が含まれる。抗原は典型的に、生体内で免疫応答を引き起こすことのできる物質を指す。抗原は、ポリペプチド、タンパク質、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡの組み合わせ）または他の分子であってよい。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ「（同義語「抗原決定基」）は、タンパク質（または抗体の抗原結合性ドメインまたは免疫グロブリン抗原結合性断片）が結合する領域または本開示のＢＤＭが結合する領域を意味すると理解されるべきである。従来より、かかる用語は、免疫グロブリンのＶＨ／ＶＬ対により結合される構造を指す。エピトープにより、抗体または抗体様ドメイン（例えば、ＢＤＭ）の最小結合部位が定義される。この用語は、必ずしも分子のタンパク質及び／またはＢＤＭが接触を行う特定の残基もしくは構造に限定されるわけではない。例えば、この用語には、抗体のＣＤＲまたは免疫グロブリン抗原結合性断片またはＢＤＭのＢＬ配列それぞれによって接触されるアミノ酸が広がる領域、及びこの領域の外側の５〜１０個（またはそれ以上）または２〜５個または１〜３個のアミノ酸が含まれる。いくつかの例では、エピトープは、ポリペプチドが折り畳まれた際に互いに近くに位置し、例えば、別のポリペプチドと会合する、一連の不連続アミノ酸、すなわち、「立体構造エピトープ」を含む。かかる用語には、線状ペプチド配列（すなわち、「連続している」）で構成されるエピトープまたは非連続的なアミノ酸配列（すなわち、「立体構造的」または「不連続」である）で構成されるエピトープが含まれる。
【０１３３】
本明細書で使用する用語「標的」は、抗原またはエピトープを指す。特定の例では、標的は、細胞表面タンパク質、例えば、受容体またはウイルスコートタンパク質を指す。他の例では、標的は分泌タンパク質である。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、抗体または免疫グロブリン抗原結合性断片における「抗原結合ドメイン」という用語は、ある抗原、より詳しくは、抗原上に存在するエピトープに特異的に結合することができる抗体または免疫グロブリン抗原結合性断片の領域を意味するものと理解されるべきである。抗体では、抗原結合ドメインはＶＨ及びＶＬと対応する。ＶＨ及びＶＬ領域内には、エピトープと接触するＣＤＲがある。
【０１３５】
本明細書で使用する用語「位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」または「位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）」は、本明細書に示すアミノ酸配列内のアミノ酸の位置を意味し、典型的には配列の左側または５’末端から数える。本明細書で使用する、ＢＤＭのアミノ酸配列の位置における用語「対応する」は、天然または「野生型」のＢＤＭ配列を参照したアミノ酸の位置を指す。好ましくは、かかる位置は、天然ＢＤＭ配列においてＢＬＳ１、及び／またはＢＬＳ２及び／またはＢＬＳ３それぞれに相当するアミノ酸となるであろう。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、用語「天然配列」は、対応する天然由来ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する配列を指すものとする。したがって、「天然ＢＤＭ」は、対応する天然由来ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。そのような天然配列ポリペプチドは、組換えまたは合成という手段によって作製することができる。
【０１３７】
用語「タンパク質」には、１本の連続する非分岐ポリペプチド鎖、すなわち、ペプチド結合により連結されている一連の連続アミノ酸、または共有結合もしくは非共有結合で互いに連結されている一連のポリペプチド鎖（すなわち、ポリペプチド複合体）が含まれると理解されるべきである。例えば、一連のポリペプチド鎖は、好適な化学的結合またはジスルフィド結合を使用して共有結合で連結され得る。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用が挙げられる。
【０１３８】
本明細書で使用する用語「ペプチド」は、ペプチド（アミド）結合によって連結されているアミノ酸単量体からなる短い鎖（典型的には約５０個またはそれ以下のアミノ酸）を指すものと理解される。
【０１３９】
本明細書で使用する用語「単離された」は、その天然の環境またはそれが作製された環境の構成成分から同定、分離、及び／または回収が行われたポリペプチド、抗体、タンパク質などを指す。その天然環境の汚染成分とは、治療へのポリペプチドの使用を妨げると考えられる物質であり、例えば、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含めることができる。一例では、ポリペプチドは、（１）ローリー法で決定した場合に８０％、８５％、９０％、９５％、または９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によりＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、及び／または（３）クマシーブルーもしくは銀染色を使用する還元条件または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一になるまで精製されるであろう。用語「単離されたポリペプチド」には、組換え型細胞内部のインサイチュのポリペプチドがその範囲内に含まれるが、これは、組換え型細胞にはポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないことになるためである。一般に、ポリペプチドの単離には、少なくとも１つの精製ステップが含まれるであろう。
【０１４０】
「組換え型」という用語は、人工的な遺伝子組換え産物を意味するものと理解されるべきである。組換え型ポリペプチドには、細胞、組織または対象の内部にある、例えば、内部で発現している場合、人工的組換え手法により発現させたポリペプチドも包含される。
【０１４１】
本明細書で使用する用語「検出する（ｄｅｔｅｃｔ）」または「検出する（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」は、定量的及び定性的な両レベル、ならびにそれらを組み合わせたレベルで理解される。したがって、それには、対象分子の定量的測定、半定量的測定及び定性的測定が含まれる。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒトを含めた任意の動物、例えば哺乳類を意味するものと理解されるべきである。例示的対象としては、ヒト及び非ヒト霊長類が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば、対象はヒトである。用語「対象」には、例えば、ハムスター、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ及びウマなどのような非ヒト対象も含まれるものとする。
【０１４３】
結合ドメイン分子（ＢＤＭ）
本開示の結合ドメイン分子（ＢＤＭ）は、好ましくは、３つの露出結合ループ（ＢＬ）を有するタンパク質足場を含有する。ＢＬを改変して、すなわち、アミノ酸置換により置き換えまたは修飾を行って、ＢＤＭに所与の標的抗原に対する結合特異性を付与することができる。本開示のＢＤＭ足場は、免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン含有スーパーファミリーメンバー、ｉ−ｂｏｄｙ、ＶＮＡＲまたはＶＨＨからなる群から選択されてよい。
【０１４４】
Ｉｇ様ドメイン含有スーパーファミリーメンバーは、ＣＴＬＡ−４などのＶ様ドメイン（例えば、ＶＬＤ）、Ｃセットドメイン、ＴｈｙＯｘファミリーメンバーポリペプチド、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、クラスＩ  ＭＨＣ、クラスＩＩ  ＭＨＣ、ＣＤ１、サイトカイン受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ホルモン受容体、増殖ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、インターフェロンガンマ受容体、プロラクチン受容体、ＮＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、フィブロネクチン、テネイシン、及びＩセット含有ドメインポリペプチドまたはその機能性断片からなる群から選択されてよい。
【０１４５】
本開示にしたがったＢＤＭの例としては、リポカリン、タンパク質ＡのＺ−ドメインなどのタンパク質Ａ由来分子（アフィボディー、ＳｐＡ）、アフィボディー、アドネクチン（例えば、フィブロネクチン）またはアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が挙げられる。
【０１４６】
本開示のＢＤＭは、足場ドメイン構造ならびに広範な異種の結合ループ配列に対する受入れ能力の両方において、安定かつ調整可能であるという利点を有する。その上、ＢＤＭ足場は、ヒトの治療薬として使用した場合にその免疫原性がごくわずかであるようヒト材料から容易に入手可能である。ＢＤＭ足場は、天然に生じる多糖鎖を含有または除外するよう容易に構築することもできる。
【０１４７】
ＢＤＭ足場内への異種の結合ループ配列の結合は、例えば、化学的、生化学的または組換えによる手法で実施することができる。
【０１４８】
好ましくは、本開示のＢＤＭは、Ｂ細胞により産生されるようなヒト抗体以外の分子を指す。本開示のＢＤＭ分子はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）より大きい抗体断片を除外するものとする。したがって、約５０アミノ酸、７５アミノ酸、１００アミノ酸または１１０アミノ酸より大きいヒト抗体可変領域断片はＢＤＭという用語には包含されない。さらに、ＢＤＭには、ｄＡｂ構造、ＶＨ−ＶＨ構造またはＶＬ−ＶＬ構造などの抗体可変領域は含まれない。
【０１４９】
用語「足場」は、所与の標的に対する結合特異性を付与する異種の結合ループまたは改変アミノ酸配列を組織する、配向させる、及び保持させるために使用するポリペプチド支持フレームワークを意味するものとする。足場は、結合特異性を付与するアミノ酸配列から構造的に分離可能である。足場の構造的に分離可能な部分には、多種多様な異なる構造モチーフが含まれ得、例えば、ベータ−サンドイッチ、ベータシート、アルファ−ヘリックス、ベータ−バレル、コイルドコイルならびに当該技術分野で公知の他のポリペプチド二次構造及び三次構造などがある。本開示の足場はまた、支持フレームワーク構造の安定性を実質的に低下させることなくアミノ酸配列を変えることができる１つ以上の領域も含有するであろう。変えることができる例示的領域には、ベータ−サンドイッチまたはベータシートの２本の鎖をつなぐ結合ループセグメントが含まれる。
【０１５０】
本開示のＢＤＭ足場は、好ましくは、ヒト免疫グロブリンの可変重鎖配列または可変軽鎖配列に対し、約５０％未満のアミノ酸同一性を示す。一般に、足場は、例えば、ヒト免疫グロブリンの可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と比較して約４５％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１５％未満、または約１０％未満のアミノ酸配列同一性を示すであろう。
【０１５１】
変えることができる足場残基は、本明細書では、外部結合ループまたは結合ループ配列（本明細書ではそれぞれＢＬ−１、ＢＬ−２及びＢＬ−３とする）という。二次構造または三次構造の特性を付与する残基は、足場の全体構造が維持される限り、保持、修飾または保存が可能である。当業者は、ポリペプチド足場の構造安定性において機能する残基、ならびにそのような残基の可能な修飾の程度について知識があるか、または決定することができる。
【０１５２】
一例では、ＢＤＭ足場はＶ様ドメイン（ＶＬＤ）タンパク質である。
【０１５３】
ＶＬＤは、典型的に、それらが互いに結合してＦｖ−型分子になる傾向がないため、抗体またはＴ細胞受容体のそれとは区別される。ＶＬＤは、Ｔｈｅ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ  １９９３，Ｅｄｓ  Ｂａｒｃｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；及びＣＤ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  １９９６（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １８，１００−１０１、及びＡｒｌｅｎｅ  Ｈ  Ｓｈａｒｐｅ  ａｎｄ  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｊ  Ｆｒｅｅｍａｎ，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２，１１６−１２６で考察されており、その記載内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
本開示の対象の技術分野の当業者は、本開示での使用に好適な、適切なＶＬＤ含有タンパク質を、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）の検索を行うことによって容易に決定することができる。
【０１５５】
ＣＴＬＡ−４などのＶＬＤ含有タンパク質により、標的分子に対する親和性の高い新規な結合部分を開発するための代替的フレームワークが提供され得る。これらの結合部分に由来する単一ドメインＶ様結合分子は可溶性であるため、望ましい。ＶＬＤを含有する好適な結合部分の例は、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８及びＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７（６７１６）：２６３−６）である。
【０１５６】
細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）ならびに相同な細胞表面タンパク質ＣＤ２８及びＩＣＯＳは、免疫応答時のＴ細胞による制御に関与している。ＣＴＬＡ−４は４４ｋＤａのホモ二量体であり、活性化Ｔ細胞の表面に一過性に主に発現し、そこで、抗原提示細胞上の表面抗原ＣＤ８０及びＣＤ８６と相互作用して免疫応答の制御を行う（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １５３：１８３−２０７，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８５（３）：３９３−４０３）。
【０１５７】
ＣＤ２８は４４ｋＤａのホモ二量体であり、ＣＴＬＡ−４同様、主としてＴ細胞に発現し、抗原提示細胞上の表面抗原ＣＤ８０及びＣＤ８６と相互作用して免疫応答の制御を行う（Ｌｉｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８２（５）：２５５９−６３）。現在の理論では、ＣＴＬＡ−４とＣＤ２８間で利用可能なリガンドを競合することにより免疫応答レベルを制御することが示唆されており、例えば、ＣＴＬＡ−４遺伝子欠損のノックアウトマウスでは活性化Ｔ細胞の大量の過剰増殖がもたらされる（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０（５２３８）：９８５−８）。
【０１５８】
各ＣＴＬＡ−４単量体サブユニットは、Ｎ末端細胞外ドメイン、膜貫通領域及びＣ末端細胞内ドメインで構成される。細胞外ドメインは、Ｎ末端Ｖ様ドメイン（ＶＬＤ；免疫グロブリンスーパーファミリーに対する相同性により分子量約１４ｋＤａと予測）及びＶＬＤと膜貫通領域をつなぐ約１０残基の茎を含む。ＶＬＤは、ＢＬ−１、ＢＬ−２及びＢＬ−３それぞれに相当する表面ループを含み（Ｍｅｔｚｌｅｒ  ＷＪ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４（７）：５２７−３１）、ＣＤ８０及び／またはＣＤ８６に結合する。ヒトＣＴＬＡ−４の配列はこれまでに決定されている（ＵＳ５，４３４，１３１；ＵＳ５，８４４，０９５；ＵＳ５，８５１，７９５）。
【０１５９】
ＣＴＬＡ−４に関する構造及び変異研究から、ＣＤ８０及びＣＤ８６に対する結合は、Ａ’ＧＦＣＣ’のＶ様ベータ鎖により形成されるほか、ＢＬ−３において高度に保存されたＭＹＰＰＰＹＹ配列により形成されるＶＬＤ表面を介して生じることが示唆される。ＣＴＬＡ−４単量体同士の二量体化は２つの茎のシステイン残基（Ｃｙｓ１２０）同士のジスルフィド結合を介して生じ、これにより２つの細胞外ドメインが繋ぎ止められるが、Ｖ様ドメイン同士の明らかな直接的会合はない（Ｍｅｔｚｌｅｒ  ＷＪ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４（７）：５２７−３１）。二量体化は、リガンドに対する高いアビディティにのみ寄与すると思われる。
【０１６０】
ＣＤ２７８またはＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激分子）はＩＣＯＳ遺伝子によってコードされる免疫チェックポイントタンパク質である。これは活性化Ｔ細胞に発現する。かかるタンパク質は、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４細胞表面受容体ファミリーに属する。このタンパク質はホモ二量体を形成し、シグナル伝達、免疫応答及び細胞増殖制御における役割を果たす。
【０１６１】
ヒトのＣＴＬＡ４、ＣＤ２８及びＩＣＯＳの各配列は公的にアクセス可能なデータベースにて利用可能である。
【０１６２】
ヒトのＣＴＬＡ−４配列はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ１６４１０として利用可能である。ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインは、かかる配列の３６位〜１６１位に対応する（ここで、ＣＴＬＡ−４は全長１２６アミノ酸長である）。アミノ酸残基１〜３５はシグナルペプチドに対応する。
【０１６３】
ヒトのＣＤ２８配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ１０７４７として利用可能である。細胞外ドメインは、配列の１９位〜１５２位に対応する。
【０１６４】
ヒトのＩＣＯＳ配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９Ｙ６Ｗ８として利用可能である。Ｉｇ様ＶＬＤは、配列の３０位〜１３２位に対応する。
【０１６５】
一例では、ＢＤＭは免疫グロブリンＣセットドメインタンパク質であり、より好ましくはＣ１セットドメインタンパク質である。Ｃセットドメインは、抗体の定常ドメインに類似した古典的Ｉｇ様ドメインであり、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びＩＩの複合体分子ならびにさまざまなＴ細胞受容体など、免疫系に関与する分子にほぼ排他的に見られる。
【０１６６】
本開示の対象の技術分野の当業者は、本明細書での使用に好適なＣセットドメイン含有タンパク質を容易に決定することができる。例えば、ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）検索では３００を超えるヒトタンパク質が明らかにされている。
【０１６７】
ベイシジンのようなタンパク質はＣセットドメインを含有する（Ｘｉａｏ−Ｌｉｎｇ  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＪＢＣ  ｖｏｌ  ２８３（２６）：１８０５６−１８０６５）。Ｃセットドメインのさらなる例としては、ＲＯＲ１細胞外ドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１〜ＣＥＡＣＡＭ８などのＣＥＡファミリーメンバーが挙げられる。
【０１６８】
ＢＤＭは、公知の選択方法及び／または変異誘発方法を使用して親和性を成熟させることができる。親和性が成熟したＢＤＭは、開始時ＢＤＭより２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍またはそれ以上の親和性を有し得る。見かけの親和性は、ＥＬＩＳＡのような方法または当業者に馴染みのある他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴法によって決定することができる。
【０１６９】
ｉ−ｂｏｄｙは、ヒト由来の単一ドメイン抗体様分子である。ｉ−ｂｏｄｙのフレームワークはサメ由来の単一ドメイン抗体と類似しており、そのため、サメ抗体の好ましい生物物理学的特性と標的指向特性が共有されている。これらについては、例えば、ＵＳ７，９７７，０７１に記載されている。
【０１７０】
ＶＮＡＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：可変新規抗原受容体）は、サメ免疫グロブリン新規抗原受容体抗体（ＩｇＮＡＲ）由来の単一可変領域ドメイン断片を指す。これらについては、例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ２（１）：６６−８１に記載されている。
【０１７１】
ＶＨＨ（重鎖の可変ドメイン）ドメインまたはナノボディは、ラクダ科抗体由来の単一単量体可変抗体ドメインを指す。それらについては、例えば、Ｈａｒｍｓｅｎ  ＭＭ  ａｎｄ  ＨＪ  Ｄｅ  Ｈａａｒｄ（２００７）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）：１３−２２に記載されている。
【０１７２】
ＢＤＭの結合特異性及び分子の薬理的に活性なタンパク質部分を利用して、分子が、１つ以上の異なる標的抗原または標的エピトープ、好ましくは、少なくとも２つの異なる標的抗原または標的エピトープに結合できるようにすることができる。一例では、タンパク質は第１の標的抗原に対する結合特異性を有し、少なくとも１つのＢＤＭは第２の標的抗原に対する結合特異性を有する。
【０１７３】
複数のＢＤＭをタンパク質と結合させる例では、タンパク質は第１の標的抗原に対する結合特異性を有し得、ＢＤＭは第２の標的抗原に対する結合特異性を有し得、さらなるＢＤＭ（存在する場合）は第３の標的抗原に対する結合特異性を有し得る。タンパク質が抗体または免疫グロブリン抗原結合性断片である他の例では、抗体または抗原結合性断片は第１の標的抗原に対する結合特異性を有し得、ＢＤＭ（または、ＢＤＭが、例えば、各重鎖または各軽鎖に存在する場合はそのＢＤＭ対）は、第２の標的抗原に対する結合特異性を有し得、さらなるＢＤＭ（またはその対）は、第３の標的抗原に対する結合特異性を有し得る。
【０１７４】
本開示の分子は、少なくとも１つの標的抗原、少なくとも２つの異なる標的抗原、少なくとも３つの異なる標的抗原、少なくとも４つの異なる標的抗原または少なくとも５つの異なる標的抗原に結合してよい。
【０１７５】
好ましくは、分子は、１つの標的抗原、２つの異なる標的抗原または３つの異なる標的抗原に結合する。非限定的なさまざまな例が意図され、
（ｉ）タンパク質またはペプチドは、ＢＤＭが結合している第２の標的抗原と同一であるかまたは異なる第１の標的抗原に結合する、
（ｉｉ）抗体または免疫グロブリン抗原結合性断片は、ＢＤＭが結合している第２の標的抗原と同一である第１の標的抗原に結合する、
（ｉｉｉ）抗体または免疫グロブリン抗原結合性断片は、ＢＤＭが結合している第２の標的抗原とは異なる第１の標的抗原に結合する、
（ｉｖ）抗体または免疫グロブリン抗原結合性断片は第１の標的抗原に結合し、ＢＤＭは第１の標的抗原と同一の第２の標的抗原に結合し、さらなるＢＤＭは第１及び第２の標的抗原とは異なる第３の標的抗原に結合する、
（ｖ）抗体または免疫グロブリン抗原結合性断片は第１の標的抗原に結合し、ＢＤＭとさらなるＢＤＭはそれぞれ第２及び第３の標的抗原に結合し、ここで、第２及び第３の標的抗原は同一であっても異なっていてもよいが、第２及び第３の標的抗原は第１の標的抗原とは異なる、
（ｖｉ）抗体または免疫グロブリン抗原結合性断片は第１の標的抗原に結合し、ＢＤＭは第２の標的抗原に結合し、さらなるＢＤＭは第３の標的抗原に結合し、ここで、第１、第２、及び第３の標的抗原は異なる
ことが含まれる。
【０１７６】
２つ以上のＢＤＭが互いに連結される場合、分子が結合可能な考えられる標的の数は増加し得ることは認識されよう。
【０１７７】
ＢＤＭの生成
本明細書で示されるように、細菌の発現系を使用して、ＢＤＭドメイン（例えば、ＣＴＬＡ−４）の１つ以上の結合ループ構造をスクレロスチンまたはＣＤ３の異種の結合ループ配列で置き換えると、可溶性の非グリコシル化単量体結合分子が生成された。したがって、Ｖ様ドメインにより、結合ループ構造を修飾して分子の結合特異性を工学的に操作できる、可溶性単一ドメイン分子構築用の基本的フレームワークが提供される。
【０１７８】
ＢＤＭのフレームワーク残基は、ラクダ科抗体に存在する構造的特徴に従って修飾してよい。ラクダの重鎖免疫グロブリンは、１つのＶＨドメインで構成されている点で従来の抗体構造とは異なる。
【０１７９】
従来にはない幾つかの置換（主に疎水性から極性にする）を露出したフレームワーク残基にて行うと、疎水性表面は減少するが、内部のベータシートフレームワーク構造は維持される（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ３：８０３−８１１）。３つの結合ループ内部では、通常はＶＬドメインにより提供される抗原結合表面の欠如を幾つかの構造的特徴により補償している。ＢＬ２ループは他のＶＨドメインと大きく異なってはいないが、ＢＬ１及びＢＬ３は、長さが極めて異種な非標準的なコンフォメーションをとっている。例えば、Ｉｇ分子では通常５残基であるのに対し、Ｈ１ループは２〜８個の何個の残基を含有してもよい。しかしながら、大きな変動が示されるのはＢＬ３であり、報告されている１７のラクダ抗体配列では、この領域の長さは７〜２１残基の間でばらついている（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ７：１１２９−１１３５）。第三に、多くのラクダ科ＶＨドメインはジスルフィド結合を有するが、ラクダの場合はＢＬ１とＢＬ３を相互に連結するジスルフィド結合、またラマの場合はＣＤＲの１と２を相互に連結するジスルフィド結合を有する（Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。この構造的特徴の機能は、ループの安定性を維持すること、及び平面とは異なる、より曲線的なループコンホメーションを提供することであると考えられ、この双方の点により、抗原内部のポケットへの結合を可能にし、大きい表面積を与えている。ただし、すべてのラクダ科抗体がこのジスルフィド結合を有するわけではないことから、これが構造上の絶対要件ではないことが示唆される。
【０１８０】
これら上述の特徴により、ラクダ科Ｖドメインを、可溶性分子として生体内で、しかも多種多様な標的抗原に対して効果的な免疫応答を生じさせるのに十分に高い親和性で提示させることができた。
【０１８１】
標的分子に対する新規な結合親和性を有する単一ＶＬＤ分子を作製し選択する方法は、ＵＳ７，１６６，６９７に記載されており、その記載内容全体は参照により組み込まれる。かかる方法は、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー由来のＶ様ドメインに対し周知の分子進化技術を適用するものである。方法では、大量の変異Ｖ様ドメインのスクリーニングを行うための、ファージまたはリボソームのディスプレイライブラリーの作製を行ってよい。
【０１８２】
繊維状ｆｄバクテリオファージがその表面に、ファージ内部に含有されるＤＮＡによってコードされるＩｇ様タンパク質（Ｆａｂ）などのタンパク質を提示するよう、かかるファージのゲノムを工学的に操作する（Ｓｍｉｔｈ，１９８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。タンパク質分子は、Ｆｄバクテリオファージの表面に提示させることができ、遺伝子ＩＩＩ、または頻度は低いが遺伝子ＶＩＩＩによってコードされるファージコートタンパク質と共有結合されている。遺伝子ＩＩＩコートタンパク質を抗体遺伝子に挿入すると、ファージあたり３〜５個の、末端に位置する組換えタンパク質分子が発現する。対照的に、遺伝子ＶＩＩＩへの抗体遺伝子挿入では、ファージ粒子あたり約２０００コピーの組換えタンパク質が提示される可能性があるが、この場合、多価系になり、１個の提示タンパク質の親和性が覆い隠されてしまう可能性がある。Ｆｄバクテリオファージ表面への機能性Ｉｇ様断片の提示から、Ｅ．ｃｏｌｉへの可溶性Ｉｇ様断片の分泌へと容易にスイッチが可能であることから、Ｆｄファージミドベクターも使用される。ファージに提示させた、遺伝子ＩＩＩコートタンパク質のＮ末端との組換えタンパク質融合体は、アンバーコドンを２つのタンパク質遺伝子の間に戦略的に位置させることによって可能となる。Ｅ．ｃｏｌｉのアンバーサプレッサー株では、得られるＩｇドメイン−遺伝子ＩＩＩ融合体はファージコートに固定される。
【０１８３】
タンパク質親和性に基づく選択方法は、抗体、抗原、受容体及びリガンドなど、どのような高親和性結合試薬にも適用可能である（例えば、その記載内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９を参照のこと）。したがって、バクテリオファージに提示される最も親和性の高い結合タンパク質の選択と、かかるタンパク質をコードする遺伝子の回収とを組み合わせる。Ｉｇを提示するファージは、ＥＬＩＳＡまたは固相ラジオイムノアッセイと類似の方法でビーズに共有結合しているかまたは可塑性表面に吸着している、対応する結合相手に結合させることによって親和性選択することができる。ほとんどすべての可塑性表面がタンパク質抗原を吸着するが、Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅのようにこの目的に特化して作製されている市販製品もある。
【０１８４】
リボソームディスプレイライブラリーでは、選択を行うために、無細胞翻訳系でデノボ合成され、リボソーム表面に提示されるポリペプチドを使用する（Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２；Ｈｅ  ａｎｄ  Ｔａｕｓｓｉｇ，（１９９７）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：５１３２−５１３４）。「無細胞翻訳系」は、リボソーム、タンパク質合成に必要とされる可溶性酵素（通常、リボソームと同一細胞に由来）、トランスファーＲＮＡ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸再生系（ホスホエノールピルビン酸及びピルビン酸キナーゼなど）、ならびに外来ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の合成に必要とされる塩及びバッファーを含む。ポリペプチドの翻訳は、無傷ポリソームが維持される、すなわち、リボソーム、ｍＲＮＡ分子及び翻訳されたポリペプチドが会合して単一複合体になっている条件下で実施させることができる。これにより、翻訳されたポリペプチドの「リボソームディスプレイ」が効果的に行われる。
【０１８５】
選択では、対応するリボソーム複合体と会合している翻訳されたポリペプチドを、マトリックス（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）に結合した標的分子と混合する。標的分子は、任意の対象化合物（またはその部分）、例えば、ＤＮＡ分子、タンパク質、受容体、細胞表面分子、代謝物、抗体、ホルモンまたはウイルスであってよい。翻訳されたポリペプチドを提示しているリボソームは標的分子と結合することとなるので、これらの複合体を選択し、ＲＴ−ＰＣＲを使用してｍＲＮＡを再増幅させることができる。
【０１８６】
結合分子を修飾する代替方法は幾つかあるが、どの提示タンパク質についても一般的方法は、ある様式、すなわち、個々の結合試薬を、それらの対応受容体に対する親和性によりディスプレイライブラリーから選択するという方法に従っている。これらの試薬をコードする遺伝子は、多数あるインビボ及びインビトロでの変異戦略のいずれか１つまたは組み合わせによって修飾され、親和性の最も高い結合分子を提示させ選択するための新遺伝子プールとして構築される。
【０１８７】
ＢＤＭ二量体
一例では、分子のＢＤＭ部分はＢＤＭ単量体の二量体である。二量体形成は、天然に生じても、またはリンカーを使用して促進してもよい。例えば、ＢＤＭがＣＴＬＡ−４  ＶＬＤである場合、二量体化は、２つの茎の配列が保持されている場合、それらのシステイン残基（Ｃｙｓ１２０）同士のジスルフィド結合を介して生じてよい。
【０１８８】
別法として、リンカーを使用してＢＤＭ単量体（例えば、ＣＴＬＡ−４単量体）を互いに結合させることができる。これと同じ原理を使用して、多数のＢＤＭ単量体を互いに縦列に連結させてストリングを形成させることもできる。リンカーにより、高い柔軟性の促進、及び／または任意の２つの単量体同士の立体障害の低減が可能である。リンカーは天然由来であり得る。
【０１８９】
使用可能な他の種類のリンカーは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎリンカーを含め、以下に詳述する。
【０１９０】
ＣＴＬＡ−４の可溶性形態のインビトロ発現
ヒトＣＴＬＡ−４分子の細胞外ドメインもＶ様ドメイン（ＶＬＤ）も、細菌細胞で可溶性単量体としての発現に成功しておらず、これは恐らく発現タンパク質の凝集によるものと思われる（Ｌｉｎｓｌｅｙ  ＰＳ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７０：１５４１７−２４）。Ｅ．ｃｏｌｉで細胞外Ｎ末端ドメイン（Ｍｅｔ１〜Ａｓｐ１２４、Ｃｙｓ１２０を含む）を発現させると、分子量２８ｋＤａの二量体タンパク質が精製され、２つのＣＴＬＡ−４  Ｖ様ドメインがＣｙｓ１２０にてジスルフィド結合により繋がれている。Ｖａｌ１１４で切断するとこれらのシステインは除去されるが、この切断は、１４ｋＤａのＶＬＤを可溶性の単量体形態で発現させることを意図したものであった。しかしながら、生成物は凝集し、これは、通常グリコシル化によって隠れている疎水性部位が露出したため、凝集が引き起こされたと結論づけられた（Ｌｉｎｓｌｅｙ  ＰＳ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７０：１５４１７−２４）。
【０１９１】
単量体グリコシル化ＣＴＬＡ−４細胞外ドメインを真核生物発現系（すなわち、ＣＨＯ細胞及び酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ；Ｌｉｎｓｌｅｙ  ＰＳ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７０：１５４１７−２４；Ｍｅｔｚｌｅｒ  ＷＪ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４（７）：５２７−３１；Ｇｅｒｓｔｍａｙｅｒ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４０７（１）：６３−８）で発現させたという幾つかの成功事例が報告されている。これらの真核生物発現系でのグリコシル化は、ＶＬＤの２つのＮ−結合型グリコシル化部位（Ａｓｎ７６及びＡｓｎ１０８）で生じると推定される。しかし、高収率が記載されていたのは、Ｆｃサブユニットに結合したＣＴＬＡ−４  ＶＬＤ２つを有する二量体組換えタンパク質を生成させる、Ｉｇ−ＣＨ２／ＣＨ３ドメインと融合させたＣＴＬＡ−４  ＶＬＤをコードする遺伝子の発現に関してのみであった（ＷＯ９５／０１９９４及びＡＵ１６４５８／９５）。ＡＵ６０５９０／９６には、ＭＹＰＰＰＹ表面ループの第１のチロシン（Ｙ）の単一アミノ酸の置き換えを行ったＣＴＬＡ−４  ＶＬＤの変異型が記載されており、これは天然のＣＤ８０リガンド及びＣＤ８６リガンドに対する親和性を保持し、かつ修飾するものである。ＡＵ６０５９０／９６には、ＣＴＬＡ−４  ＶＬＤのかかる好ましい可溶性形態が、真核細胞で発現させた組換え型ＣＴＬＡ−４／Ｉｇ融合タンパク質として記載されているが、原核生物発現系における凝集の問題は解決されていない。ＥＰ０７５７０９９Ａ２には、ＣＴＬＡ−４変異分子の使用、例えば、ＢＬ配列における変異のリガンド結合に与える各種変化の影響が記載されている。
【０１９２】
Ｂ７−１（ＣＤ８０）タンパク質及びＢ７−２（ＣＤ８６）タンパク質
Ｂ７タンパク質は、活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）に見られる表在性膜タンパク質であり、Ｔ細胞の表面タンパク質ＣＤ２８またはＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）のいずれかと対になると、それぞれ、共刺激シグナルまたは共抑制性シグナルを発してＡＰＣとＴ細胞間のＭＨＣ−ＴＣＲシグナルの活性の増強または低下を行うことができる。Ｂ７は、活性化ＡＰＣ上に存在するほか、Ｔ細胞上にも見られる。
【０１９３】
Ｂ７タンパク質は多数のファミリーメンバーを含み、それらには、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ１〜Ｂ７−Ｈ７が挙げられる。Ｂ７−１タンパク質はＣＤ８０とも呼ばれ、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）に結合する。ヒト配列のＵｎｉｐｒｏｔ参照番号はＰ３３６８１である。
【０１９４】
一例では、ＢＤＭはＢ７−１ヒトタンパク質に結合する。一例では、ＢＤＭはＢ７−２タンパク質に結合する。
【０１９５】
スクレロスチン
スクレロスチンは、Ｃ末端にシステインノット様ドメイン、及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニストのＤＡＮ（ディファレンシャルスクリーニング法で選択した神経芽腫における異常遺伝子）ファミリーに対する配列類似性を有する分泌糖タンパク質である。スクレロスチンは骨細胞により産生され、骨形成の抗同化作用を有する。ヒト配列のＵｎｉｐｒｏｔ参照番号はＱ９ＢＱＢ４である。
【０１９６】
一例では、ＢＤＭはヒトのスクレロスチンタンパク質に結合する。
【０１９７】
薬理的に活性なタンパク質
本開示の完全なタンパク質種は薬理学的に活性である。そのようなタンパク質には、抗体（例えば、完全長抗体）もしくは免疫グロブリン抗原結合性断片または本明細書に記載する非抗体タンパク質が含まれる。
【０１９８】
用語「薬理学的に活性である」は、医療用パラメータまたは疾患状態に影響を与えるか、または免疫応答に関与する細胞の活性化を引き起こす活性を有すると決定される物質を意味する。タンパク質は、アゴニストタンパク質、アンタゴニストタンパク質または擬似タンパク質であってよい。タンパク質は治療用抗体であってもよい。
【０１９９】
「擬似」または「アゴニスト」という用語は、天然タンパク質（例えば、ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦ）に匹敵する生物学的活性を有するタンパク質（またはペプチド）を指す。
【０２００】
本願開示に従う好適な例示的タンパク質としては、血液凝固因子、アンチカリン、トキソイド、ヒト血清アルブミン、コラーゲン結合タンパク質、ＴＮＦ−α受容体結合タンパク質、インテグリン結合タンパク質、ＶＥＧＦまたはその擬似物質、ＥＰＯまたはその擬似物質、Ｃ４結合タンパク質、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、リンホカイン、サイトカイン、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、またはプログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）から選択されるタンパク質の細胞外ドメインが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２０１】
血液凝固因子は当該技術分野で公知であり、例としては、血友病に関連する第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子が挙げられる。
【０２０２】
一例では、トキソイドはボツリヌストキソイドである。トキソイドは、Ａ型ボツリヌストキソイドまたはＢ型ボツリヌストキソイドであってよい。ボツリヌストキソイドの合成形態もまた意図される。
【０２０３】
一例では、リンホカインはＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦまたはその擬似物質である。
【０２０４】
一例では、サイトカインはＧ−ＣＳＦもしくはその擬似物質または幹細胞因子もしくはその擬似物質である。
【０２０５】
一例では、タンパク質をＢＤＭと結合させ、それがヒト血清アルブミンに結合し、かかるタンパク質の半減期が、ＢＤＭが存在しないタンパク質よりも生体内で延長されるようにする。
【０２０６】
抗体
特定の例では、多重特異性分子は完全長抗体を含む。一例では、抗体はヒト化抗体である。別の例では、抗体はヒト抗体である。別の例では、抗体はキメラ抗体である。
【０２０７】
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種由来抗体に由来する抗原結合部位または可変領域、ならびにそれ以外の部分としてヒト抗体の構造及び／または配列に基づく抗体構造を有するキメラ抗体のサブクラスを指すと理解されるべきである。ヒト化抗体では、抗原結合性部位は一般に、ヒト抗体の可変領域にある適切なフレームワーク領域（ＦＲ）に移植した非ヒト抗体由来相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びそれ以外の部分としてのヒト抗体由来領域を含む。抗原結合部位は、野生型（すなわち、非ヒト抗体のものと同一）であっても、または１つ以上のアミノ酸置換で修飾されていてもよい。ある場合には、ヒト抗体のＦＲ残基を対応する非ヒト残基で置き換える。一般に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、かつ、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域はヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である、少なくとも１つの可変ドメイン、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むことになる。
【０２０８】
本開示のヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリンの定常領域も含有するであろう（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９；及びＰｒｅｓｔａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６）。
【０２０９】
非ヒト抗体またはその部分（例えば、可変領域）をヒト化する方法は、当該技術分野で公知である。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び協力者ら（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２  ５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３  ３２７（１９８８））；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４  １５３６（１９８８））の方法またはＵＳ５２２５５３９またはＵＳ５５８５０８９に記載の方法に従って本質的に実施可能である。抗体をヒト化する他の方法を除外するものではない。
【０２１０】
本明細書で使用する用語「ヒト抗体」は、可変領域（例えば、ＶＨ、ＶＬ）、及び任意選択で、ヒトにおいて、例えば、ヒトの生殖系列細胞もしくは体細胞において見られる配列に由来するかまたは一致する定常領域を有する抗体を指す。「ヒト」抗体には、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、ランダムまたは部位特異的な変異によってインビトロで導入された変異（特定の変異では、少数の抗体残基、例えば、抗体の残基のうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ、例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲを構成する残基のうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つにおいて、保存的置換または変異を行う）が含まれ得る。これらの「ヒト抗体」は、ヒトによって実際に産生される必要はなく、むしろ、組換え手法の使用による作製、及び／またはヒト抗体の定常領域及び／または可変領域（例えば、上述）をコードする核酸を含むトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウス）からの単離が可能である。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（例えば、ＵＳ５８８５７９３に記載のもの）など、当該技術分野で公知のさまざまな技術を使用して作製することができる。
【０２１１】
選択エピトープを認識するヒト抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を使用して作製することもできる。この方法では、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全にヒトである抗体の選択を誘導するものである（例えば、ＵＳ５，５６５，３３２に記載）。
【０２１２】
ヒト化抗体を含め、ヒト化免疫グロブリンが遺伝子工学によって構築されてきている。先に記載したほとんどのヒト化免疫グロブリンは、特定のヒト免疫グロブリン鎖（すなわち、アクセプターまたはレシピエント）のフレームワークと同一なフレームワーク、及び非ヒト（ドナー）免疫グロブリン鎖由来の３つのＣＤＲを含んでいた。ヒト化には、ヒト化免疫グロブリン鎖を含む抗体の親和性を高めるため、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク内の限られた数のアミノ酸を同定し、アクセプターではなくドナーにおける位置のアミノ酸と同一となるよう選択する基準も含まれ得る。
【０２１３】
ヒト化抗体には一般に、ヒトの治療での使用について、マウスまたはキメラ抗体に対して少なくとも３つの大きな利点がある。抗体のエフェクター部分がヒトであるため、ヒト免疫系の他の部分とより良く相互作用する（例えば、補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）によって標的細胞をより効率的に破壊する）と考えられている。さらに、ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワークまたは定常領域を異物として認識してはいけないため、そのような注入抗体に対する抗体反応は、完全外来性のマウス抗体または部分的に外来性のキメラ抗体に対する反応よりも少なくなるはずである。最後に、マウス抗体は、ヒトの血液循環における半減期がヒト抗体の半減期よりもかなり短いことが知られている。ヒト化抗体は、推定上、天然に生じるヒト抗体とより類似した半減期を有することができ、より少量で低頻度の投与を可能にする。
【０２１４】
所望の標的に結合する完全長抗体はいずれも本開示で使用することができることは認識されよう。一例では、完全長抗体をさらに親和性成熟させてからＢＤＭと結合させる。
【０２１５】
別の例では、完全長免疫グロブリンは非ヒト免疫グロブリンである。一例では、免疫グロブリンはマウス、ラット、ハムスター、ネコ、イヌ、ウマまたはウシの免疫グロブリンである。
【０２１６】
従来の方法を使用して抗体を調製することができる。例えば、ペプチドまたは完全長標的タンパク質の使用により、標準的方法を用いてポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を作製することができる。哺乳類（例えば、マウス、ハムスター、またはウサギ）は、哺乳類で抗体反応を示すペプチドの免疫原形態で免疫することができる。ペプチドに高い免疫原性を付与する技術には、担体への複合体化または当該技術分野において周知の他の技術が含まれる。例えば、タンパク質またはペプチドは、アジュバント存在下で投与可能である。血漿または血清中の抗体価を検出することにより免疫化の進行を監視することができる。抗原として免疫原を用いて標準的ＥＬＩＳＡまたは他の免疫測定手順を使用し、抗体レベルを評価することができる。免疫化の後、抗血清を得、所望であれば、血清からポリクローナル抗体を単離することができる。
【０２１７】
抗体は、細胞培養、ファージ、またはウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、類人猿が含まれるが、これに限定されない多様な動物で作製可能である。したがって、本開示で有用な抗体は典型的に哺乳類の抗体である。ファージ法を使用して、初期抗体の単離または改変された特異性もしくはアビディティ特性を有する変異型の作製が可能である。そのような技術は常套的であり当該技術分野において周知である。一例では、抗体は、当該技術分野で公知の組換え手法により作製される抗体である。例えば、組換え型抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることによって作製可能である。１つ以上のベクターを使用して、宿主細胞に少なくとも１つのＶＬ領域と１つのＶＨ領域を発現しているＤＮＡ配列をトランスフェクトすることができる。抗体の作製及び産生の組換え手法に関する例示的な記載には、Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｗｉｌｅｙ，１９９７）；Ｓｈｅｐｈａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；及びＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）が含まれる。
【０２１８】
生体内での抗体の有効性を高めるために、抗体をエフェクター機能について修飾することが望ましい場合がある。例えば、システイン残基（複数可）をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域で鎖間ジスルフィド結合を形成させてよい。こうして作製された抗体は、改善された内部移行能力及び／または補体介在による高い殺細胞性及び高い抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５及びＳｈｏｐｅｓ，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２を参照のこと。
【０２１９】
抗体断片
抗体断片は、無傷抗体の部分を含み、それには、無傷抗体の抗原結合領域または可変領域が含まれ得る。本開示での使用に好適な抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、または化学的に結合しているＦ（ａｂ’）２が挙げられる。特定の例では、抗体断片はＦａｂである。
【０２２０】
Ｆｖは、完全な抗原認識性及び結合性部位を含有する抗体断片を指す。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが強い非共有結合で会合している二量体で構成される。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互に作用してＶＨ−ＶＬ二量体表面の抗原結合部位を画定するのは、この立体配置にある場合である。まとめると、６つのＣＤＲにより抗体断片に抗原結合特異性が付与される。
【０２２１】
Ｆａｂ断片はＦｖを含有し、かつ軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域から１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において、少数の残基が付加されている点でＦａｂ’断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、間にヒンジのシステイン残基を有するＦａｂ’断片対として作製する。
【０２２２】
化学的に連結されたＦ（ａｂ’）２は、２つの異なるＦａｂ’断片を互いに対にすることにより形成され、その各々が異なる結合特異性を有する二重特異性分子である。抗体断片から二重特異性抗体を作製する技術は、文献に記載がある。例えば、二重特異性抗体は、化学的結合を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１には、無傷抗体をタンパク質の分解により切断してＦ（ａｂ’）２断片を作製する手順が記載されている。これらの断片を、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元させて、近接するジチオールを安定化させるとともに、分子間のジスルフィドが形成されないようにする。その後、作製されたＦａｂ’断片をチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換させる。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つをメルカプトエチルアミンを用いた還元により再度Ｆａｂ’−チオールに変換させ等モル量の別のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成させる。
【０２２３】
多重特異性分子の作製
本開示は、本開示の多重特異性分子を作成するための方法も提供する。
【０２２４】
分子の発現は、原核細胞でも真核細胞でも可能である。原核生物は、多種多様な株の細菌に代表されることが最も多い。細菌は、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。典型的に、Ｅ．ｃｏｌｉなどのグラム陰性細菌が好ましい。他の微生物菌株も使用してよい。
【０２２５】
分子をコードする配列は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞で外来配列を発現させるために設計されたベクターにクローニングすることができる。これらのベクターには、本明細書において、転写開始用プロモーター及び任意選択でオペレーターを、リボソーム結合部位配列と共に含むと定義される、一般的に使用される原核生物の制御配列が含まれ得、そのような一般的に使用されるプロモーターには、ベータ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７）及びラムダ由来ＰＬプロモーター及びＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８）が含まれ得る。
【０２２６】
そのような発現ベクターには、ベクターが細菌内で複製することができるよう、また、そのプラスミドを担持する細胞が、アンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生物質存在下で増殖させた場合に選択可能となるよう、複製起点、及び抗生物質に対する耐性を付与するベータ−ラクタマーゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子などの選択マーカーも含まれるであろう。
【０２２７】
Ｅ．ｃｏｌｉ及び酵母などの単細胞生物での抗体発現は当該技術分野で十分に確立されている。概説については、例えばＡｎｄｒｅ  Ｆｒｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：２１７を参照のこと。培養真核細胞での発現もまた、本明細書に記載の二重特異性分子を作製するための一つの選択肢として当業者に公知であり、最近の総説、例えばＲａｆｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６；Ｔｒｉｌｌ  Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６：５５３−５６０を参照のこと。
【０２２８】
これらの目的を達成する分子クローニング技術は当該技術分野で公知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、（編集者ら）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての更新を含む）またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。多種多様なクローニング法及びインビトロ増幅法は、組換え型核酸の構築に好適である。組換え型抗体を作製する方法も当該技術分野で公知であり、例えば、ＵＳ４８１６５６７またはＵＳ５５３０１０１を参照のこと。
【０２２９】
さまざまな各種の宿主細胞でポリペプチドをクローニングし発現させる系が周知である。好適な宿主細胞には、細菌、哺乳類細胞、酵母及びバキュロウイルスの各系が含まれる。好適な宿主細胞には、細菌、哺乳類細胞、酵母及びバキュロウイルスの各系が含まれる。異種ポリペプチドの発現について当該技術分野で利用可能な哺乳類細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞及び他の多くの細胞が含まれる。好適な宿主は、例えば、選択ベクターとの宿主の適合性、宿主の分泌特性、タンパク質を正確に折り畳む宿主の能力、及び宿主の発酵要件、ならびに発現させるＤＮＡ配列によってコードされる産物の宿主に対する毒性、及び発現産物の精製の容易さなどを考慮して選択されるであろう。
【０２３０】
単離後、核酸を、発現構成体または発現ベクター内にプロモーターに機能的に連結させて挿入し、さらなるクローニング（ＤＮＡ増幅）または無細胞系もしくは細胞での発現に供する。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルスベクター、例えば、「ファージ」、またはファージミドであり得る。
【０２３１】
本開示のベクター構成体を作製するため、本明細書に記載する抗体の軽鎖配列、重鎖配列、及びリンカー配列ならびにＢＤＭ配列をコードする核酸配列を標準的方法によって好適なベクターにクローニングする。
【０２３２】
いくつかの例では、ＢＤＭは、抗体軽鎖配列のＣ末端にクローニングされるであろう。いくつかの例では、ＢＤＭは、抗体重鎖配列のＣ末端にクローニングされるであろう。いくつかの例では、ＢＤＭは、抗体軽鎖配列のＮ末端にクローニングされるであろう。いくつかの例では、ＢＤＭは、抗体重鎖配列のＮ末端にクローニングされるであろう。いくつかの例では、ＢＤＭは、抗体軽鎖配列のＮ末端及びＣ末端の両方にクローニングされるであろう。いくつかの例では、ＢＤＭは、抗体重鎖配列のＮ末端及びＣ末端の両方にクローニングされるであろう。いくつかの例では、ＢＤＭは、抗体の軽鎖配列及び重鎖配列両方のＮ末端及びＣ末端両方にクローニングされるであろう。いくつかの例では、抗体の重鎖または軽鎖及びＢＤＭをコードする核酸配列を１つのベクター内に提供し、その抗体のもう一方の鎖を別のベクターに提供する。他の例では、抗体軽鎖配列、リンカー配列及びＢＤＭ配列をコードする核酸配列を１つのベクター内にクローニングし、抗体重鎖配列、リンカー配列及びＢＤＭ配列をコードする核酸配列を別のベクター内にクローニングする。別の方法では、抗体の軽鎖と重鎖の両方が同一ベクター上に発現するバイシストロン性ベクターを使用してよい。特定の例では、重鎖及び軽鎖のコード配列（そのうちの１つにはＢＤＭも含まれるであろう）は単一ベクター上に、例えば、同一ベクター内に２つの発現カセットに入れて存在してよい。
【０２３３】
分子をコードする核酸配列を、真核生物宿主で外来配列を発現するよう設計されたベクターに挿入することもできる。ベクターの調節エレメントは、特定の真核生物宿主に応じて異なり得る。
【０２３４】
有用な発現ベクターは、例えば、染色体ＤＮＡ、非染色体ＤＮＡ及び合成ＤＮＡの各配列で構成され得る。好適なベクターには、ＳＶ４０及び公知の細菌プラスミドの誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドのｃｏｌ  Ｅｌ、Ｐｃｒ１、Ｐｂｒ３２２、Ｐｍｂ９及びその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージλ、例えばＮＭ９８９、ならびに、その他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ファージＤＮＡの多数の誘導体；２ｕプラスミドまたはその誘導体などの酵母プラスミド；真核細胞において有用なベクター、例えば、昆虫または哺乳類の細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を利用するよう修飾されているプラスミドなどの、プラスミド及びファージのＤＮＡの組み合わせに由来するベクター；ならびに同類のものが含まれる。
【０２３５】
分子をコードする核酸配列を真核生物の宿主細胞のゲノムに組み込み、宿主ゲノム複製試料として複製することができる。別法として、かかる核酸配列を担持するベクターは、染色体外での複製を可能にする複製起点を含有し得る。
【０２３６】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は、その最も広い文脈で解釈されるべきであり、かかる用語には、ＴＡＴＡボックスまたはイニシエーターエレメントなど、ゲノム遺伝子の転写調節配列が含まれるが、プロモーターは、例えば、発達及び／または外部の刺激に応答して、または組織特異的に、核酸の発現を改変するさらなる調節エレメント（例えば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー）の有無にかかわらず、転写開始が正確に行われるために必要である。本願の文脈においては、用語「プロモーター」は、組換え型核酸、合成核酸もしくは融合核酸、またはプロモーターが機能的に連結されている核酸の発現を与える、活性化する、もしくは高める誘導体を表すためにも使用される。例示的なプロモーターは、前記核酸の発現をさらに増強させる、及び／または空間的発現及び／または一時的発現を改変する、１つ以上の特定の調節エレメントのさらなるコピーを含有することができる。
【０２３７】
本明細書で使用する場合、用語「機能的に連結される」は、核酸の発現がプロモーターによって制御されるよう、そのプロモーターを核酸に対して配置することを意味する。
【０２３８】
細胞での発現用に多くのベクターが利用可能である。ベクターの構成成分としては一般に、シグナル配列、タンパク質をコードする配列（例えば、本明細書で提供する情報に由来）、エンハンサーエレメント、プロモーター、ポリアデニル化配列及び転写終結配列のうち１つ以上が挙げられるが、これに限定されるものではない。当業者は、タンパク質の発現に好適な配列について認識しているであろう。例示的なシグナル配列には、原核生物の分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または耐熱性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダー、または酸性ホスファターゼリーダー）または哺乳類の分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が含まれる。
【０２３９】
哺乳類細胞で活性な例示的プロモーターには、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α−ミオシン重鎖プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β−アクチンプロモーター；ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターまたはその活性断片を含むハイブリッド調節エレメントなどが含まれる。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児由来腎臓株（浮遊培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞または２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。
【０２４０】
単離された核酸またはそれを含む発現構成体を発現用宿主細胞内に導入する手段は当業者に公知である。所与の細胞に使用する技術は、成功したことが既知である技術に依存する。細胞に組換えＤＮＡを導入する手段としては、中でも、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランにより誘導されるトランスフェクション、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ，ＵＳＡ）及び／またはｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ，ＵＳＡ）などを使用する、リポソームで誘導されるトランスフェクション、ＰＥＧ誘導性のＤＮＡ取込み、レトロウイルス遺伝子導入、電気穿孔法ならびにＤＮＡでコーティングしたタングステンまたは金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ  Ｉｎｃ．，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用するような微粒子の撃ち込みが挙げられる。
【０２４１】
導入の後に、核酸からの発現を、例えば、発現用条件下での宿主細胞の培養によって、生じさせるかまたは可能にすることができる。
【０２４２】
本開示は、抗体または免疫グロブリンの抗原結合性断片鎖及びＢＤＭを発現させるため、発現系において上述の構成体を使用することを含む方法も提供する。
【０２４３】
本開示は、本明細書に記載する核酸配列を１つ以上含む組換え型宿主細胞も提供する。タンパク質産生に使用される宿主細胞は、使用する細胞種に応じて多種多様な培地で培養され得る。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭｌ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販培地は、哺乳類細胞の培養に好適である。本明細書で論じる他の細胞種の培養用培地は当該技術分野で公知である。
【０２４４】
本開示の核酸配列を発現させる際に、多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせを活用することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体ＤＮＡ、非染色体ＤＮＡ及び合成ＤＮＡの配列で構成され得る。好適なベクターには、ＳＶ４０及び公知の細菌プラスミドの誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドのｃｏｌ  Ｅｌ、Ｐｅｒｌ、Ｐｂｒ３２２、Ｐｍｂ９及びその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージλ、例えばＮＭ９８９、ならびに、その他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ファージＤＮＡの多数の誘導体；２ｕプラスミドまたはその誘導体などの酵母プラスミド；真核細胞において有用なベクター、例えば、昆虫または哺乳類の細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を利用するよう修飾されているプラスミドなどの、プラスミド及びファージのＤＮＡの組み合わせに由来するベクター；ならびに同類のものが含まれる。
【０２４５】
本明細書に記載する１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え型宿主細胞も本明細書で提供される。
【０２４６】
多種多様な発現制御配列、すなわち、それに機能的に連結された核酸配列の発現を制御する配列のいずれも、その核酸配列を発現させるためにこれらのベクター内で使用することができる。そのような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマもしくはアデノウイルスの初期または後期のプロモーター、ｌａｃ系、ｔｉｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージλの主要なオペレーター領域とプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母接合因子のプロモーター、及び、原核細胞もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子発現制御が既知である他の配列、ならびにその組み合わせ各種が含まれる。
【０２４７】
当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく、過度の実験を行わずに適切なベクター、発現制御配列、及び宿主を選択して、所望の発現を達成することができるであろう。例えば、ベクター選択の際は、そのベクターが宿主で機能する必要があるので、宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及びそのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質の発現、例えば、抗生物質マーカーなども考慮されるであろう。当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく、適切なベクター、発現制御配列、及び宿主を選択して、所望の発現を達成することができる。例えば、ベクター選択の際は、そのベクターが宿主で機能するので、宿主を考慮する。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及びそのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質の発現、例えば、抗生物質マーカーなども考慮され得る。
【０２４８】
本開示は、本明細書に記載するようなポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド（核酸）、そのようなポリヌクレオチドを含有するベクター、ならびにそのようなポリヌクレオチドを転写しポリペプチドに翻訳する宿主細胞及び発現系を提供する。
【０２４９】
本開示は、本明細書の他の箇所に記載があるようなプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の、上述ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含む構成体も提供する。
【０２５０】
本開示は、本明細書に開示する１つ以上のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞も提供する。
【０２５１】
発現により作製した後、任意の好適な技術を使用して分子を単離及び／または精製することができる。核酸がコードされることにより、本明細書に記載する分子及びベクターは、例えばその天然環境から、実質的に純粋もしくは均一な形態で、または核酸の場合は、必要機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の、本来の核酸もしくは遺伝子を含まないかまたは実質的に含まずに、単離及び／または精製されて提供され得る。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができ、全部または一部が合成であり得る。
【０２５２】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで核酸配列を発現させる場合、内在性酵母プラスミド由来の複製起点、２μ環を使用することができる。（Ｂｒｏａｃｈ、（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：３０７）。別法として、自律複製を促進することができる酵母ゲノム由来の配列を使用することができる（例えば、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｇｅｎｅ  １０：１５７；及びＣｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：３００を参照のこと）。
【０２５３】
酵母ベクターの転写調節配列には、糖分解酵素合成のプロモーターが含まれる（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９６８）Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９；Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００）。当該技術分野で公知のさらなるプロモーターには、ＣＤＭ８ベクターで提供されるＣＭＶプロモーター（Ｔｏｙａｍａ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，（１９９０）ＦＥＢＳ  ２６８：２１７−２２１）；３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３）のプロモーター、及び他の糖分解酵素のプロモーターが挙げられる。
【０２５４】
当該技術分野で公知の方法によってポリペプチドの発現を検出することができる。例えば、抗体、免疫グロブリンの抗原結合性断片またはＢＤＭのいずれかと結合する抗体を使用して、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及び免疫ブロット法によって分子を検出することができる。タンパク質の回収は、標準のタンパク質精製手段、例えば、アフィニティクロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用して実施し、実質的に純粋な生成物を得ることができる（Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ  ｉｎ：  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”，Ｔｈｅｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９４））。
【０２５５】
本開示は、本開示の多重特異性分子を作製する方法も提供し、その方法は、
（ｉ）タンパク質（例えば、抗体）及びＢＤＭをコードするポリヌクレオチドを含むベクター（複数可）を提供し、
（ｉｉ）かかるベクターを用いて哺乳類宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）を形質転換し、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の宿主細胞を、宿主細胞から培地中へのタンパク質分泌を促す条件下で培養し、かつ
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の分泌タンパク質を回収する
というステッップを含む。
【０２５６】
一例では、方法は、
（ｉ）多重特異性分子の重鎖をコードする第１のベクターを提供すること、
（ｉｉ）多重特異性分子の軽鎖をコードする第２のベクターを提供すること、及び
（ｉｉｉ）前記第１及び第２のベクターを用いて哺乳類宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）を形質転換すること
を含む。
【０２５７】
合成による作製
本開示のポリペプチドをコードする核酸は、クローニングによることに加えて、またはクローニングによってではなく、合成によって調製することができる。核酸は、ポリペプチド部分（例えば、免疫グロブリン及びＢＤＭ）のための適切なコドンを用いて設計することができる。一般に、配列を発現に使用するのであれば、ある意図する宿主に好ましいコドンが選択されるであろう。一般に、配列を発現に使用するのであれば、その意図する宿主に好ましいコドンが選択されるであろう。完全ポリヌクレオチドは、標準的方法で調製され、完全なコード配列に構築されている重複オリゴヌクレオチドから組み立てることができる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：６３１１（１９８４）を参照のこと。
【０２５８】
タンパク質の単離
ポリペプチドを単離する方法は、当該技術分野で公知であり、及び／または本明細書に記載されている。
【０２５９】
ポリペプチドが培地中に分泌される場合、そのような発現系から得た上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットなどを使用して、初めに濃縮することができる。タンパク質分解を阻害するため、上述ステップのいずれかにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害薬を含めてよく、また外来性汚染物の増殖を予防するため、抗生物質を含めてよい。別法または追加として、上清は、ポリペプチドを発現している細胞から、例えば連続遠心分離を使用して、ろ過及び／または分離が可能である。
【０２６０】
宿主細胞から調製されたポリペプチドは、例えば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーまたはタンパク質Ｇクロマトグラフィー）、または上述のものの任意の組み合わせを使用して、精製することができる。これらの方法は当該技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ９９／５７１３４またはＥｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編集者ら）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）に記載されている。
【０２６１】
いくつかの例では、本開示のポリペプチドを異種のアミノ酸配列、例えば、シグナル配列または親和性タグなどに、生物学的活性（すなわち、その標的に対する結合性）に影響を与えずに融合させる。
【０２６２】
当業者は、精製または検出を容易にする親和性タグ、例えば、ポリヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、またはインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、またはシミアンウイルス５（Ｖ５）タグ、またはＦＬＡＧタグ、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグなどが含まれるようポリペプチドの修飾が可能であることも認識するであろう。その後、得られるポリペプチドを、当該技術分野で公知の方法、例えば、アフィニティ精製を使用して精製する。例えば、ヘキサ−ｈｉｓタグを含むポリペプチドは、かかるポリペプチドを含む試料を、固体または半固体の支持体上に固定化したヘキサ−ｈｉｓタグに特異的に結合するニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）と接触させ、その試料を洗浄して未結合タンパク質を除去し、その後、結合しているタンパク質を溶出させることによって精製される。
【０２６３】
薬理的に活性なタンパク質とＢＤＭの結合
薬理的に活性なタンパク質またはペプチドと、少なくとも本開示によるＢＤＭとの結合は、化学的結合（Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１）または化学的カップリング（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７５：２１７−２２５）または遺伝子融合を使用して調製することができる。
【０２６４】
さらに、タンパク質（例えば、抗体）とＢＤＭ間の融合または結合は、従来の共有結合もしくはイオン結合、タンパク質融合、またはヘテロ二官能性クロスリンカー、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等によって達成され得る。単純に、タンパク質とＢＤＭの間に所望量の空間を提供するだけの従来の不活性リンカー配列（例えば、ペプチドリンカー）を使用してもよい。そのようなリンカーの設計は当業者に周知であり、例えば、ＵＳ８，５８０，９２２；ＵＳ５，５２５，４９１；及びＵＳ６，１６５，４７６に記載されている。
【０２６５】
タンパク質の共有結合による複合体化にはさまざまなカップリング剤または架橋剤を使用することができる。架橋剤の例としては、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセタート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（スルホ−ＳＭＣＣ）（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｌ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １６０  １６８６，Ｌｉｕ，ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２  ８６４８を参照のこと）が挙げられる。他の方法には、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ  Ｍｉｔｔ  Ｎｏ  ７８，１  １８−１３２，Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９  ８１−８３及びＧｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３９  ２３６７−２３７５）に記載のものが挙げられる。
【０２６６】
リンカーにより、高い柔軟性の促進、及び／または任意の２タンパク質間の立体障害の低減が可能になる。リンカーは、天然由来のもの、例えば、タンパク質の２つのドメイン間のランダムコイルに存在するよう決定されている配列であり得る。例示的なリンカー配列は、ＲＮＡポリメラーゼアルファサブユニットのＣ末端ドメインとＮ末端ドメイン間に見られるリンカーである。天然に生じるリンカーの他の例としては、１ＣＩタンパク質及びＬｅｘＡタンパク質に見られるリンカーが挙げられる。
【０２６７】
リンカー内部では、アミノ酸配列は、経験的に決定されたかまたはモデリングにより明らかにされた好ましいリンカー特性に基づき異なり得る。リンカー選択時に考慮する点としては、リンカーの柔軟性、リンカーの電荷、及び天然に生じるサブユニットのリンカーの一部のアミノ酸の存在が挙げられる。リンカーは、リンカー内の残基がＤＮＡと接触し、これにより結合親和性または特異性に影響を与えるかまたは他のタンパク質と相互作用するように設計することもできる。いくつかの場合には、特に、サブユニットの間が長い距離に及ぶことが必要な場合、またはドメインを特定の立体配置で保持しなければならない場合、リンカーは、任意選択で、折り畳まれたさらなるドメインを含有してよい。
【０２６８】
いくつかの例では、リンカーの設計は、リンカーが比較的短い距離、好ましくは、約１０オングストローム（Å）未満に及ぶことが要求されるドメイン配置を行うことが好ましい。しかし、ある実施形態では、リンカーは、最高約５０Åまたはそれ以上の距離に及ぶ。
【０２６９】
用語「ペプチドリンカー」は、タンパク質と多重特異性分子のポリペプチドのＢＤＭ部分とを接続または連結させる短いペプチド断片を指す。リンカーは好ましくは、ペプチド結合で互いに連結されているアミノ酸で構成される。例えば、ペプチドリンカーは、低分子アミノ酸残基または親水性アミノ酸残基（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、アスパラギンなど）を含むことができる。例えば、ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸長、または約５〜約１００アミノ酸長、または約１０〜５０アミノ酸長、もしくは約１０〜１５アミノ酸長のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【０２７０】
一例では、リンカーは、グリシン及びアラニンなど、立体障害のないアミノ酸の大部分で構成される。したがって、さらなる例では、リンカーは、ポリグリシン、ポリアラニンまたはポリセリンである。
【０２７１】
当業者であれば、一般に使用される多くのペプチドリンカーを本開示の実施形態で使用してよいことを理解するであろう。ある実施形態では、短いペプチドリンカーは、リンカー長を延長する繰り返し単位を含んでよい。例えば、２回、３回または４回繰り返されるリンカーである。一例では、リンカーは、式（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎを含むかまたは式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｎ  Ｓｅｒを含み、ここで、ｎは３〜６の数である。
【０２７２】
一例では、リンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）を含むかまたは構成要素とする。
【０２７３】
非ペプチドリンカーも可能である。例えば、ｓ＝２〜２０である−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−などのアルキルリンカーを使用することができるであろう。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなど、立体障害のない任意の基でさらに置換されてよい。例示的な非ペプチドリンカーは分子量が１００〜５０００ｋＤ、好ましくは１００〜５００ｋＤのＰＥＧリンカーである。
【０２７４】
使用に好適な他のリンカーの例としては、ＧＳＴＶＡＡＰＳ、ＴＶＡＡＰＳＧＳまたはＧＳＴＶＡＡＰＳＧＳまたはそのようなリンカーの倍数体が挙げられる。他の例には、（ＴＶＳＤＶＰ）ｎ（ＧＳ）ｍが挙げられ、ここで、ｎ＝１かつｍ＝１であるか、またはｎ＝２かつｍ＝１であるか、またはｎ＝２かつｍ＝０である。
【０２７５】
別の例では、リンカーはＧＳである。
【０２７６】
ポリペプチド活性の評価
公知の方法に従ったさまざまな手段によって本開示のタンパク質（またはペプチド）及びＢＤＭ部分を評価することができる。そのような評価法には、機能解析、例えば、殺細胞アッセイ（ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）、ｃＡＭＰもしくはカルシウムフラックスアッセイまたは結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたは競合アッセイが含まれ得る。
【０２７７】
利用する機能解析の種類は、ポリペプチドのタンパク質またはペプチド及びＢＤＭ部分が結合する標的に依存するであろう。
【０２７８】
半減期アッセイを使用してもよい。そのような方法は当該技術分野で公知である。タンパク質の半減期測定に一般に使用される２つの方法は、放射性パルスチェイス解析及びシクロヘキシミドチェイス（Ｚｈｏｕ  Ｐ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：６７−７７）である。
【０２７９】
結合親和性の測定
エピトープの結合は、ＥＬＩＳＡのような従来の抗原結合アッセイ、ＦＲＥＴなど蛍光を利用する技術、または分子の質量を測定するする表面プラズモン共鳴のような技術によって測定することができる。抗原結合タンパク質（例えば、ＢＤＭ）の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、スキャッチャード解析及び／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ及びサンドイッチ競合アッセイのような酵素免疫測定法といった競合結合アッセイを含む、好適なアッセイによって決定することができる。
【０２８０】
表面プラズモン共鳴法のような競合アッセイを使用して、特定の標的に結合するよう工学的に操作されたＢＤＭが、そのように結合することができるか否かを決定できる。例として、ＢＤＭを幹細胞因子受容体（ＣＳＦＲまたはｃ−ｋｉｔ受容体）に結合するよう工学的に操作し、ＢＤＭの天然リガンド（ｃ−ｋｉｔ）の結合と競合する能力について試験することができる。修飾ＢＤＭが標的への結合を競合する能力の決定ならびに解離定数（ＫＤ）の決定を行うインビトロでの競合アッセイは当該技術分野で公知である。
【０２８１】
タンパク質またはポリペプチドのＢＤＭ部分と、各自の標的との相互作用の結合親和性または解離定数（ＫＤ）は、当該技術分野で公知の多数の方法により測定することができる。そのような方法としては、蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡ、熱量測定法、例えば等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）またはバイオレイヤー干渉法（例えば、Ｂｌｉｔｚシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２８２】
好ましい表面プラズモン共鳴法は当該技術分野で公知のＢＩＡｃｏｒｅである。
【０２８３】
ほとんどの結合部分はＫＤ値が低マイクロモル（１０−６）〜ナノモル（１０−７〜１０−９）の範囲である。高親和性結合部分は一般に、ピコモル１０−１２）範囲の親和性が非常に高い結合部分を有する低ナノモル範囲（１０−９）であると考えられる。
【０２８４】
それぞれの部分とその標的間の複合体形成は、多くの異なる因子、例えば、それぞれの結合相手の濃度、競合相手の有無、使用する緩衝系のｐＨ及びイオン強度、ならびにＫＤ（例えば、蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴）を決定するために使用する実験方法または実験データの評価に使用する数学アルゴリズムにより影響される。
【０２８５】
したがって、所与の標的に対する特定の免疫グロブリンまたはＢＤＭの親和性決定に使用される方法と実験の設定に応じて、ＫＤ値が特定の実験範囲内で異なり得ることは当業者には明らかである。このことは、ＫＤ値を表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）、競合ＥＬＩＳＡまたは「直接ＥＬＩＳＡ」のいずれの方法で決定したかによって、測定したＫＤ値または許容範囲にわずかな偏差があり得ることを意味する。
【０２８６】
好ましい例では、表面プラズモン共鳴法を使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を固定化した標的に使用してＫＤ値を決定する。
【０２８７】
親和性は、無関係なアミノ酸配列に対するタンパク質またはＢＤＭの親和性よりも、少なくとも１倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも３０倍高い、少なくとも４０倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも６０倍高い、少なくとも７０倍高い、少なくとも８０倍高い、少なくとも９０倍高い、少なくとも１００倍高い、または少なくとも１０００倍高い、またはそれ以上であり得る。標的（例えば、タンパク質抗原）に対するタンパク質またはＢＤＭの親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）〜約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル（ｐＭ）、または約１００ｎＭ〜約１フェムトモル（ｆＭ）またはそれ以上であり得る。
【０２８８】
一例では、タンパク質は、ＫＤで測定した親和性が約２００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約１ｎＭ以下または約０．５ｎＭ以下である。
【０２８９】
一例では、ＢＤＭは、ＫＤで測定した親和性が約２００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約１ｎＭ以下または約０．５ｎＭ以下である。
【０２９０】
バイオレイヤー干渉法は、インタラクトーム内の生体分子間相互作用を測定する、標識を用いない技術である。これは、バイオセンサー先端にある固定化されたタンパク質の層と、内部の参照層の２つの表面から反射される白色光の干渉パターンを解析する光学的分析手法である。バイオセンサー先端に結合する分子数に変化があると、干渉パターンにシフトが生じ、これをリアルタイムで測定することができる。
【０２９１】
バイオセンサー先端表面に固定化されたリガンドと、溶液中の分析対象物とが結合すると、バイオセンサー先端の光学的厚さが増加して波長シフトΔλが生じ、これが生物学的層の厚さの変化の直接的な測定値となる。相互作用をリアルタイムで測定し、結合特異性、会合と解離の速度、または濃度を精密かつ正確に監視することを可能にする。
【０２９２】
バイオセンサーに結合する分子またはバイオセンサーから解離する分子のみが干渉パターンをシフトさせ、反応プロファイルの作成を可能にする。未結合分子、周辺培地の屈折率の変化、または流速変化が干渉パターンに影響を及ぼすことはない。これはバイオレイヤー干渉法固有の特徴であり、タンパク質−タンパク質相互作用、定量、親和性、及び速度論についての用途で使用される粗試料で幅広く実施することができる。
【０２９３】
標的
本開示による標的は好ましくは抗原である。抗原は、タンパク質、グリカン、脂質、リポタンパク質または核酸から選択されてよい。タンパク質は、ヒトタンパク質、非ヒトタンパク質（例えば、霊長類、イヌ科、ネコ科など）、ウイルスタンパク質、酵母タンパク質、細菌タンパク質、藻類タンパク質、植物タンパク質または原生動物タンパク質であってよい。タンパク質は、可溶性タンパク質または膜結合型タンパク質であってよい。可溶性タンパク質の例には、転写因子、抗体、増殖因子、血液タンパク質（例えば、アルブミン）、または薬物（例えば、ステロイド、医薬品など）が挙げられるが、これに限定されるものではない。膜結合型タンパク質の種類には、増殖因子受容体、腫瘍マーカー、もしくは細胞内への輸送を媒介するマーカー（例えば、トランスフェリン）、またはＦｃ受容体が含まれる。
【０２９４】
核酸標的は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡの組み合わせであってよい。
【０２９５】
より詳細には、標的は抗原上に存在するエピトープである。抗原は多数の特有のエピトープを含んでよく、その各々は、タンパク質（例えば、抗体）またはＢＤＭによって認識されるであろうということを当業者は理解するであろう。
【０２９６】
本開示のポリペプチドは、異なる標的に結合することができる。一例では、異なる標的は２つまたは３つの異なる抗原である。それぞれの抗原は異なる細胞に存在してよい。別の例では、ポリペプチドは、同一抗原上の異なる２つまたは３つの標的（例えば、エピトープ）に結合してよい。好ましくは、タンパク質が結合する標的は、ＢＤＭが結合する標的とは異なる。
【０２９７】
本開示による「標的抗原」は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、多糖類、グリカン、脂質、リポタンパク質または核酸であってよい。本開示による標的抗原は、分泌型または膜結合型のいずれでもよい。そのような抗原は、細菌、哺乳類（ヒト及び非ヒト）、真菌、藻類、原生動物の材料に由来してよい。タンパク質は、ヒトタンパク質、非ヒトタンパク質（例えば、霊長類、イヌ科、ネコ科など）、ウイルスタンパク質、酵母タンパク質、細菌タンパク質、藻類タンパク質、植物タンパク質または原生動物タンパク質であってよい。
【０２９８】
同一である「第１の標的抗原」、「第２の標的抗原」等への言及は、薬理的に活性なタンパク質及び少なくとも１つのＢＤＭ部分は同一の抗原に結合するが、その抗原上に存在する異なるエピトープに結合し得ることを意味すると理解されるであろう。
【０２９９】
異なっている「第１の標的抗原」、「第２の標的抗原」等への言及は、薬理的に活性なタンパク質部分及び少なくとも１つのＢＤＭ部分は、異なる細胞上に存在する異なる抗原、したがって異なるエピトープに結合することを意味すると理解されるであろう。
【０３００】
（ｉ）細菌抗原
抗原は細菌に由来し得、それらとしてはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、及びＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３０１】
（ｉｉ）ウイルス抗原
抗原はウイルスに由来し得、それらとしてはインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、エプスタイン−バーウイスル、ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ヘルペスウイルス（ヒト及び動物）、単純ヘルペスウイルス、パルボウイルス（ヒト及び動物）、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、ブニヤウイルス、狂犬病ウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ウシＬＶ、ＦｅＩＶ、イヌジステンパーウイルス、イヌ伝染性肝炎ウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、ＴＧＥウイルス（ブタ）、及び口蹄疫が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３０２】
（ｉｉｉ）腫瘍抗原
標的抗原は腫瘍関連抗原であってよい。そのような腫瘍関連抗原としては、ＭＵＣ−１及びそのペプチド断片、タンパク質ＭＺ２−Ｅ、多形性上皮ムチン、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、ＭＡＧＥ−１またはＭＡＧＥ−３及びそのペプチド断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのペプチド断片、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びそのペプチド断片、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）及びそのペプチド断片、膵癌胎児抗原及びそのペプチド断片、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ５４９、ＣＡ１９５及びそのペプチド断片、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びそのペプチド断片、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）及びそのペプチド断片、扁平上皮癌抗原（ＳＣＣＡ）及びそのペプチド断片、卵巣癌抗原（ＯＣＡ）及びそのペプチド断片、膵癌関連抗原（ＰａＡ）及びそのペプチド断片、Ｈｅｒ１／ｎｅｕ及びそのペプチド断片、ｇｐ−１００及びそのペプチド断片、変異Ｋ−ｒａｓタンパク質及びそのペプチド断片、変異ｐ５３及びそのペプチド断片、非変異ｐ５３及びそのペプチド断片、切断型上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、キメラタンパク質ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ、テロメラーゼ及びそのペプチド断片、サバイビン及びそのペプチド断片、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１タンパク質及びそのペプチド断片、ＷＴ１タンパク質及びペプチド断片、ＬＭＰ２タンパク質及びペプチド断片、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７タンパク質及びペプチド断片、イディオタイプタンパク質及びペプチド断片、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質及びペプチド断片、ＰＡＰタンパク質及びペプチド断片、癌・精巣タンパク質及びペプチド断片、及び５Ｔ４タンパク質及びペプチド断片が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３０３】
（ｉｖ）他の哺乳類抗原
標的抗原は、心臓、血液系、肺、腸、胃、直腸、前立腺、甲状腺、肝臓または食道内に位置する細胞上に存在する抗原またはエピトープであってよい。標的抗原は、分泌タンパク質上に存在する抗原またはエピトープであってよい。分泌タンパク質の例には、ホルモン、酵素、毒素及び抗菌物質、ペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。別法として、抗原またはエピトープは非膜結合型タンパク質上に存在する。
【０３０４】
選択的結合
一例では、分子は、多重特異性分子の異なる標的抗原のうち１つしか発現しない細胞よりも、その標的抗原の２つ以上を発現する細胞に選択的に結合することができる。
【０３０５】
そのような細胞選択性は、二重特異性または三重特異性分子の各部分（例えば、タンパク質またはＢＤＭ）の結合親和性を調節することによって達成することができるが、その際、個々の部分それぞれは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫蛍光標識または殺細胞を可能にするにはその標的に対する結合が不十分である、または細胞がその標的を発現するのは、二重特異性または三重特異性の分子と結合している他の標的が存在しない場合であるが、ここで、それらの弱く結合している各部分が組み合わさることで、二重特異性または三重特異性の分子に十分なアビディティを促し、そのような標的を１つしか発現していない細胞より、関連する標的分子を共発現している細胞と選択的に結合することができ、そのため、選択的なＦＡＣＳ選別、免疫蛍光標識または殺細胞が達成され得るようにすることができる。
【０３０６】
組成物
本開示の多重特異性分子は、薬理学的に許容される担体または添加物と組み合わせた場合に組成物として使用することができる。そのような医薬組成物は、対象の生体内投与にとって有用である。
【０３０７】
薬理学的に許容される担体は、投与を受けた患者に生理学的に許容され、投与に併用される分子の治療特性を保持する。薬理学的に許容される担体及びそれらの処方は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８ｔｈ  ｅｄｎ．Ｅｄ．Ａ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ  １９９０）に概説されている。一つの例示的担体は生理食塩水である。本明細書で使用する語句「薬理学的に許容される担体」は、投与部位である臓器または体の部分から、別の臓器、または体の部分までのポリペプチドの運搬または輸送を担う、液体もしくは固体の賦形剤、希釈剤、添加物、溶媒または封じ込め物質のような、薬理学的に許容される物質、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があるという意味で許容されるものでなければならず、患者にとって有害であってはならない。
【０３０８】
薬理学的に許容される添加物には、保存剤または凍結保存剤が含まれ得る。
【０３０９】
医薬組成物は、全身投与または局所投与いずれでも、特定の投与経路と適合するよう製剤化することができる。
【０３１０】
一例では、本明細書に記載する組成物は、従来の薬理学的に許容される非毒性担体を含有する投与製剤にするか、または他の好都合な任意の剤形によって、経口投与、非経口投与、吸入用スプレーによる投与、吸着、吸収、局所投与、直腸内投与、経鼻投与、経頬側投与、経腟投与、脳室内投与、埋め込み型リザーバーを用いた投与が可能である。本明細書で使用する用語「非経口」には、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、脳室内、胸骨内、及び頭蓋内への注射法または注入法が含まれる。
【０３１１】
対象への投与に好適な形態に分子を調製する方法（例えば、医薬組成物）は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）及び米国薬局方：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８４）に記載の方法が含まれる。
【０３１２】
本開示の医薬組成物は、静脈内投与または臓器もしくは関節の体腔もしくは内腔への投与のような非経口投与に特に有用である。投与用組成物は、一般に、薬理学的に許容される担体、例えば、水性キャリアに溶解させたポリペプチドの溶液を含むであろう。多種多様な水性キャリア、例えば、緩衝生理食塩水等を使用することができる。組成物は、必要に応じ生理的条件に近づけるため、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調節剤等、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等などの薬理学的に許容される助剤を含有してよい。これらの製剤中の本開示タンパク質濃度は大きく異なってよく、選択される特定の投与方法及び患者のニーズに従って主に液量、粘度、体重等に基づいて選択されるであろう。例示的な担体には、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。混合油及びオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルを使用してもよい。リポソームを担体として使用してもよい。ビヒクルは等張性及び化学的安定性を高める少量の添加剤、例えば、緩衝剤、保存剤または添加剤を含有してよい。
【０３１３】
製剤化時、本開示のポリペプチドは、投与製剤と適合する方法、かつ治療上／予防上有効な量で投与されるであろう。製剤は、上記の注射液タイプのような多種多様な剤形で容易に投与されるが、他の薬理学的に許容される形態、例えば、錠剤、丸剤、カプセルもしくは経口投与用の他の固形剤、坐剤、ペッサリー、点鼻液もしくはスプレー、エアロゾル、吸入剤、リポソーム形態等もまた意図される。医薬「除放性」カプセルまたは組成物を使用してもよい。除放性製剤は、一般に、一定の薬物レベルを長期にわたり提供するよう設計されており、本開示の化合物を送達するために使用してよい。
【０３１４】
静脈内投与では、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びその好適な混合物などを含有している溶媒または分散媒であり得る。流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散時の必要粒径の維持、及び界面活性剤の使用などにより維持することができる。抗菌薬及び抗真菌薬には、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸及びチメロサールが含まれる。等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールなど、及び塩化ナトリウムなどを組成物中に含めてよい。得られる溶液は、そのままの状態で使用するために包装するか、または凍結乾燥が可能で、凍結乾燥した調製物は、後で投与前に滅菌溶液と合わせることができる。
【０３１５】
薬理学的に許容される担体は、吸収またはクリアランスを安定化させる、高める、または遅延させる化合物を含有することができる。そのような化合物には、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストランのような炭水化物；低分子量タンパク質；ペプチドのクリアランスまたは加水分解を低下させる組成物；または添加物もしくは他の安定化剤及び／または緩衝剤が含まれる。吸収を遅延させる薬剤には、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンが含まれる。リポソーム担体など医薬組成物の吸収の安定化または増減を図るために界面活性剤を使用することもできる。消化から保護するため、化合物を組成物と複合体化させて酸加水分解及び酵素加水分解に対して抵抗性をもたせることも、または化合物を適切な抵抗性のある担体、例えばリポソームなどに複合体化することも可能である。ポリペプチドを消化から保護する手段は当該技術分野で公知である（例えば、Ｆｉｘ（１９９６）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１３：１７６０  １７６４；Ｓａｍａｎｅｎ（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１１９  １３５；及び治療剤を経口送達するための脂質組成物を記載した米国特許第５，３９１，３７７号を参照のこと）。
【０３１６】
生物分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などを使用することができる。そのような製剤を調製する方法は当業者に公知である。材料は、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されているものを入手することもできる。リポソーム懸濁液（抗体またはウイルスコートタンパク質を使用して細胞または組織に指向されたリポソームを含む）を薬理学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、当該技術分野で公知の方法、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；第４，５０１，７２８号；第４，５２２，８１１号；第４，８３７，０２８号；第６，１１０，４９０号；第６，０９６，７１６号；第５，２８３，１８５号；第５，２７９，８３３号；Ａｋｉｍａｒｕ（１９９５）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：１９７  ２１０；Ａｌｖｉｎｇ（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４５：５  ３１；及びＳｚｏｋａ（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７）に記載の方法に従って調製することができる。生物分解性のミクロ粒子もしくはカプセルまたはペプチドなど低分子を持続的に送達可能な他の生物分解性ポリマー構成は当該技術分野で公知である（例えば、Ｐｕｔｎｅｙ（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１５３  １５７を参照のこと）。
【０３１７】
本開示の分子をミセル内部に組み込むことができる（例えば、Ｓｕｎｔｒｅｓ（１９９４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：２３  ２８；Ｗｏｏｄｌｅ（１９９２）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：２６０  ２６５を参照のこと）。分子は、脂質の単層または二重層の表面に結合され得る。例えば、分子を、ヒドラジド−ＰＥＧ−（ジステアロイルホスファチジル）エタノールアミン含有リポソームに結合させることができる（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．６：７０５  ７０８を参照のこと）。別法として、任意の形態の脂質膜、例えば、脂質平面膜または無傷細胞の細胞膜、例えば赤血球などを使用することができる。リポソーム製剤及び脂質含有製剤は、例えば、静脈内、経皮吸収（例えば、Ｖｕｔｌａ（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８５：５  ８を参照のこと）、経粘膜、または経口投与など、あらゆる手段により送達可能である。
【０３１８】
本開示の組成物は、本明細書で提供するように、他の治療用部分または造影用／診断用部分と組み合わせることができる。治療用部分及び／または造影用部分は、別々の組成物として、または複合体部分として提供され得る。リンカーは、必要に応じて複合体化部分に含めることができ、本明細書の他の箇所に記載されている。
【０３１９】
本明細書に開示する分子をイムノリポソームとして製剤化してよい。ポリペプチドを含有するリポソームは、当該技術分野で公知の方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載の方法などによって調製される。循環時間の長いリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０３２０】
インビボ投与用の製剤は無菌である。滅菌は、滅菌ろ過膜によるろ過を介して容易に達成することができる。
【０３２１】
本開示の組成物は、他の治療剤、例えば、化学療法薬などと共に投与可能である。化学療法薬は当該技術分野で公知であり、細胞傷害性薬物及び細胞増殖抑制剤が含まれる。非限定的例としては、パクリタキセル、シスプラチン、メトトレキサート、ドキソルビシン、フルダラビン等が挙げられる。治療すべき状態に応じて他の治療剤が意図される。
【０３２２】
本開示の一実施形態では、障害治療用の医薬品を製造するため、本開示の任意の医薬組成物の使用が意図される。医薬品は、対象における障害治療の指示に関する適切なラベルの付いた好適な医薬包装体に包装され得る。
【０３２３】
標識及び検出
本開示は、薬剤で標識した本明細書に記載の分子を提供する。一例では、薬剤は造影用／検出用部分である。別の例では、薬剤は治療用部分である。ポリペプチドを標識する方法は当業者に馴染みがあるであろう。
【０３２４】
「標識」または「標識化した」という用語により、タンパク質（例えば、抗体）またはＢＤＭに検出可能な物質を結合（すなわち、物理的連結）させることによる前記タンパク質またはＢＤＭの直接標識、ならびに直接標識した別の試薬との反応性による間接標識を包含するものとする。かかる用語には共有結合または非共有結合いずれの結合も含まれる。
【０３２５】
一例では、毒素、放射性核種、鉄関連化合物、染料、造影剤もしくは蛍光標識または化学療法薬を用いて分子を標識化することができる。
【０３２６】
別法として、分子は、検出可能標識、例えば、放射性核種、鉄関連化合物、染料、造影剤もしくは標的抗原の免疫学的検出用蛍光物質などを用いて標識化することができる。
【０３２７】
放射性標識体の非限定的な例には、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７１Ｇｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７７Ａｓ、８１Ｒｂ／８１ＭＫｒ、８７ＭＳｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１００Ｐｄ、１０１Ｒｈ、１０３Ｐｂ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１９Ｓｂ、１２１Ｓｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２８Ｂａ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３１Ｃｓ、１４３Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９１Ｏｓ、１９３Ｐｔ、１９４Ｉｒ、１９７Ｈｇ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ及び２１３Ｂｉが含まれる。
【０３２８】
放射性複合体タンパク質の作製にはさまざまな放射性核種が利用可能である。例としては、１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ等などの低エネルギー放射性核（例えば、診断用に好適）が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば、放射性核種は、投与から撮像部位局在までの時間経過後に作用または検出を可能にする好適な半減期を有するガンマ線、光子、または陽電子を放出する放射性核種である。本開示はまた、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅなどの高エネルギー放射性核（例えば、治療用）も包含する。これらの同位体は、典型的に、飛程の短い、高エネルギーのα粒子またはβ粒子を発生させる。そのような放射性核種は、それらが近接している細胞、例えば、複合体により結合または侵入された腫瘍性細胞を死滅させる。これらは非限局性細胞に対してはほとんど、または全く作用せず、本質的に非免疫原性である。別法として、高エネルギー同位体は、例えば、ホウ素中性子捕捉療法の場合のように、本来ならば安定な同位体に熱照射することにより生成され得る（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。好適であり得る他の同位体は、Ｃａｒｔｅｒ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １，１１８−１２９，Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ２；３９７−４１６，Ｐａｙｎｅ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３，２０７−２１２，Ｓｃｈｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．５，１４７−１５９，Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ６；３４９−３５６に記載されている。
【０３２９】
毒素には、細胞にとって有害な（例えば、死滅させる）任意の薬剤が含まれる。抗体と免疫毒素との複合体調製に関連するさらなる技術は、例えば、ＵＳ５，１９４，５９４で提供されており、本開示で利用されてよい。毒素の非限定的な例には、例えば、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害因子、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害因子、ゲロニン、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセン、クロストリジウム−パーフリンジェンスホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ウシ膵臓リボヌクレアーゼ（ＢＰＲ）、抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、アブリン、コブラ毒因子（ＣＶＦ）、ゲロニン（ＧＥＬ）、サポリン（ＳＡＰ）ビスクミン（ｖｉｓｃｕｍｉｎ）が含まれる。
【０３３０】
鉄関連化合物の非限定的な例には、例えば、磁性酸化鉄粒子、第二鉄または第一鉄の粒子、Ｆｅ２０３及びＦｅ３０４が含まれる。ポリペプチド、タンパク質及びペプチドを標識する鉄関連化合物及び方法は、例えば、米国特許第４，１０１，４３５号及び第４，４５２，７７３号、ならびに米国公開出願第２００２００６４５０２号及び第２００２０１３６６９３号に見出すことができ、それらはすべて参照によりその全体が本明細書により組み込まれる。
【０３３１】
特定の例では、分子を細胞毒素または他の細胞増殖阻害化合物に標識化して、その薬剤の腫瘍細胞への送達位置を特定することができる。例えば、薬剤は、薬剤、酵素阻害剤、増殖阻害剤、溶解剤、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成阻害剤、膜透過性修飾物質、ＤＮＡ代謝物、ジクロロエチルスルフィド誘導体、タンパク生成阻害剤、リボソーム阻害剤、アポトーシス誘導物質、及び神経毒で構成される群からから選択され得る。
【０３３２】
一例では、本明細書に記載する分子は、検出及び／または単離を容易にする１つ以上の検出可能マーカーを含む。例えば、ポリペプチドは、例えば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、及びシアニン色素のＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）などの蛍光標識を含む。これらの蛍光色素では、吸収極大及び発光極大はそれぞれ、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）及びＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）である。
【０３３３】
特定の例では、分子を、腫瘍画像診断において有用な薬剤と結合させることができる。そのような薬剤には、金属、金属キレート剤、ランタニド、ランタニドキレート剤、放射性金属、放射性金属キレート剤、陽電子放出核、マイクロバブル（超音波用）、リポソーム、リポソームまたはナノ粒子にマイクロカプセル化した分子、単結晶酸化鉄ナノ化合物、磁気共鳴画像法用造影剤、吸光剤、反射剤及び／または散乱剤、コロイド粒子、近赤外蛍光団などの蛍光団が含まれる。多くの例では、そのような二次機能性／部分は、比較的大きくなり、例えば、少なくとも２５ａｍｕの大きさとなり、多くの場合、少なくとも５０ａｍｕ、１００ａｍｕまたは２５０ａｍｕの大きさであり得る。特定の例では、二次機能性は、金属をキレートするためのキレート部分、例えば、放射性金属イオンまたは常磁性イオンに対するキレート剤である。さらなる例では、二次機能性は、放射線治療または画像法に有用な、放射性核種に対するキレート剤である。
【０３３４】
別法または追加として、分子は、例えば、磁性もしくは常磁性化合物、例えば、鉄、鋼、ニッケル、コバルト、希土類物質、ネオジミウム−鉄−ホウ素、第一鉄−クロミウム−コバルト、ニッケル−第一鉄、コバルト−白金、またはストロンチウムフェライトなどを用いて標識化されてよい。
【０３３５】
別の例では、分子を「受容体」（ストレプトアビジンなど）と複合体化させ、細胞の事前標的化（ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）において利用し、その場合、かかる複合体を患者に投与した後、消失剤（ｃｌｅａｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を使用して未結合の複合体を循環から除去し、次いで、治療剤（例えば、放射性ヌクレオチド）と複合体化させた「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
【０３３６】
例示的な治療剤としては、抗血管新生薬、抗血管新生及び／または他の血管新生薬、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、化学療法薬、抗有糸分裂剤（例えば、抗有糸分裂剤アウリスタチン、（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１４，５３，１−６によるＭＭＡＦ／ＭＭＡＥ）または治療用核酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３３７】
本明細書の薬剤として有用な化学療法薬には、細胞傷害性及び細胞増殖抑制性の薬物が含まれる。化学療法薬には、細胞に対し他の作用を及ぼす、例えば形質転換された状態から分化状態へと逆転させるものなど、または細胞複製を阻害するものが含まれ得る。本発明において有用な公知の細胞傷害性薬剤の例は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”  Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｂ．Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．／Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０に掲載されている。これらには、パクリタキセル及びドセタキセルなどのタキサン系；メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード及びクロラムブシルなどの窒素；チオテパなどのエチレンイミン誘導体；ブスルファンなどのアルキルスルホン酸系；ロムスチン、セムスチン及びストレプトゾシンなどのニトロソ尿素系；ダカルバジンなどのトリアゼン系；メトトレキサートなどの葉酸類似体；フルオロウラシル、シタラビン及びアザリビンなどのピリミジン類似体；メルカプトプリン及びチオグアニンなどのプリン類似体；ビンブラスチン及びビンクリスチンなどのビンカアルカロイド；ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、及びマイトマイシンなどの抗生物質；酵素、シスプラチンなどの白金配位錯体；ヒドロキシウレアなどの尿素置換体；プロカルバジンなどのメチルヒドラジン誘導体；ミトタンなどの副腎皮質抑制剤；コルチコステロイド（プレドニゾン）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸塩及び酢酸メゲストロール）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール）、及びアンドロゲン（プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン）などのホルモン及びアンタゴニストが含まれる。
【０３３８】
一例では、本明細書に記載する多重特異性分子を別のタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンまたはＨＳＡ）とさらに複合体化または連結させる。別の例では、非抗体タンパク質はＨＳＡである。
【０３３９】
分子を治療剤またはリポソーム（例えば、薬物含有リポソーム）と複合体化または連結させてよい。
【０３４０】
タンパク質合成を妨害する薬物を使用してもよく、そのような薬物は当業者に公知であり、ピューロマイシン、シクロヘキシミド、及びリボヌクレアーゼが挙げられる。
【０３４１】
さらに、他の標識、例えば、ビオチン、それに続くストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼなどが本開示により意図される。
【０３４２】
当該技術分野で公知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含有するよう本開示の分子を修飾することができる。例えば、タンパク質の誘導体化に好適な部分は、生理学的に許容されるポリマー、例えば、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３４３】
使用
一例では、アフィニティ精製または、タンパク質（またはペプチド）及び／またはＢＤＭが結合するエピトープを担持している所望抗原の検出に本開示の分子を使用することができる。
【０３４４】
本開示は、ポリペプチドのタンパク質及びＢＤＭ部分のいずれか、または両方が結合する標的を検出する方法も提供する。そのような方法には、例えば、上記のような検出可能な標識の使用を利用してよい。一例では、結合した標的がタンパク質またはＢＤＭのいずれが結合したものなのかを確認するため、タンパク質及びＢＤＭに異なるラベルを用いることが可能であろう。
【０３４５】
タンパク質もしくはペプチド及び／またはＢＤＭに結合する標的（例えば、タンパク質）が試料に含有されているか否かの決定には、さまざまなフォーマットを利用することができる。そのようなフォーマットの例には、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット法及び酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３４６】
一フォーマットでは、ウエスタンブロット法または免疫蛍光抗体法などの方法にポリペプチドを使用して標的を検出することができる。
【０３４７】
タンパク質（またはペプチド）またはＢＤＭが結合するポリペプチドもしくは標的抗原を固体支持体に固定化してよい。別法として、多重特異性分子を固体支持体に結合させてよい。好適な固相支持体または担体には、抗原（すなわち、標的）または免疫グロブリンまたはＢＤＭと結合できる、いかなる支持体も含まれる。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロース及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩、ならびに磁鉄鉱が挙げられる。当業者は、タンパク質、ＢＤＭまたは標的抗原と結合させるための好適な担体を他にも多く知ることであろうし、そのような支持体を本開示を用いた使用に合わせて適応させることができるであろう。例えば、標的タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動で走らせて、ニトロセルロースなどの固相支持体上に固定化することができる。その後、支持体を好適な緩衝液で洗浄した後、検出可能に標識化したポリペプチドで処理することができる。次いで、固相支持体に２度目のバッファー洗浄を行って未結合ポリペプチドを除去することができる。その後、従来の手段によって、固体支持体に結合した標識の量を検出することができる。
【０３４８】
一例では、本開示の分子を医薬品として使用することができる。
【０３４９】
本開示の多重特異性分子の利点
非抗体タンパク質に関しては、そのようなタンパク質にＢＤＭを付加することにより、タンパク質の安定性、循環時間及び／または生物学的活性の増加が促され得る。例えば、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を、ヒト血清アルブミンに結合するＶＬＤと結合させて、かかるタンパク質の半減期を延長させることができる。これは、血友病に罹患した対象にとって、投与頻度の減少という点で明らかに利点となる。
【０３５０】
抗体に関しては、本開示による分子により、二重特異性抗体を用いる治療薬に対する利点が提供される。抗体、例えば、治療効果の不十分な抗体の１つ以上の特徴を改善する簡便かつ効率的な方法は、特定の治療標的に結合する１つ以上の単一結合ドメイン分子（ＢＤＭ）を、対象標的に対して特異的な抗体または免疫グロブリン抗原結合性断片に結合させることである。
【０３５１】
この二重特異性による方法の利点は、簡便かつ高効率の二重特異性抗体が作製されること；かかる方法はあらゆる抗体配列に適用可能であること；親抗体に、その本来の結合部位と特異性が保持されること；親抗体にそのアビディティが保持されること；親抗体にその本来の構造と機能が保持され、かつ選択用途について、抗体によるエフェクター機能が保持されること；血清中半減期など抗体の薬物動態が保持されること；二重特異性生成物は、既存のＩｇＧ作製工程、例えば、製造、精製、製剤化及び標準的ＩｇＧ作製工程に基づく他のあらゆる工程にシームレスに組み込まれることである。
【０３５２】
選択用途では、抗体Ｆａｂ断片を用いる二重特異性分子はまた、その分子量が小さいこと、血流中で半減期が短いこと、及び全抗体に比べて分子量と結合部位の比が改善されていることから望ましいものとなろう。
【０３５３】
一例として、従来より全抗体で処理されてきた毒性物質の中和は、より有効にＦａｂで処理することができる。抗体の分子量（１５０ｋＤａ）は、毒性物質（典型的に１ｋＤａ未満）と比べて比較的大きいため、化学量論的に毒素に結合するためには大量の抗体が必要となる。本明細書に記載する二重特異性または三重特異性のＦａｂは、二重特異性または三重特異性の分子により複数の結合部位が提供されるため、低用量での使用が可能である。抗体に対してサイズが小さいＦａｂでは、毒性物質−Ｆａｂ複合体の腎臓を介したすばやい排泄が見られる。やはり、Ｆａｂを用いた二重特異性分子を作製する効率的かつ簡便な方法は、特定の標的に結合するＢＤＭを、対象標的に対して特異的な既存のＦａｂに結合させることである。
【０３５４】
キット
本開示は、本明細書に記載する多重特異性分子を、使用説明書と共に含むキットも提供する。組成物が凍結乾燥されている場合、キットには、調製物を再構成するさらなる溶液調製物が含有され得る。指示書きは、「印刷物」、例えば、キット内に入っているかまたはキットに添付の紙もしくは厚紙に記されている、またはキットもしくは包装材料に貼付のラベルに記されている、またはキットの構成成分を含有するバイアルもしくは管に貼付されていてよい。
【０３５５】
さらに、キットには、本明細書で提供される任意の他の部分、例えば、化学療法薬がさらに含まれ得る。
【０３５６】
キットにはさらに、本明細書で提供するアッセイ用、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ用の構成成分が含まれ得る。
【０３５７】
キットには、例えば、製品概要、投与方法及び治療適応などを明記したラベルがさらに含まれてよい。ラベルまたは添付文書には、適切な文書による指示事項が含まれ得る。
【０３５８】
本開示の広義の一般的範囲から逸脱することなく、上記の実施形態に対し多数の変形及び／または修正を行ってよいことは当業者には理解されるであろう。したがって、本願実施形態は、あらゆる点で、例示的なものであって限定的なものではないとみなされるべきである。
【実施例】
【０３５９】
実施例１  二重特異性及び三重特異性の抗体分子の作製
ｉ）ベクター作製
ＣＴＬＡ−４  ＢＤＭの遺伝子構築とクローニングは標準的で、十分な記載のある技術、さらには先に記載されているＵＳ７，１６６，６９７に従った。ＣＴＬＡ−４  ＢＤＭはライブラリー（Ｇｅｎｅａｒｔ）から得た。結合ループ領域に相当するＤＮＡ配列中に異なる置換を含有させる目的で、縮重オリゴヌクレオチド合成を使用して遺伝子ライブラリー１６９６３２７を構築した。
【０３６０】
これらの例で使用するＣＴＬＡ−４配列は、天然配列ＰＥＰＣＰＤＳＤＧＳＴＧがＰＥＰＳＰＤＳＮで置き換えられる、天然配列のＣ末端修飾を含む。これらの配列にはＣ末端のＣｙｓ残基が含有されていないため、ＢＤＭは単量体形態のままでいることができる。
【０３６１】
Ｂ７−１結合ＣＴＬＡ−４  Ｖ様ドメイン配列と融合させた抗リゾチームＩｇＧ１重鎖配列をコードする核酸構成体（Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＨＣ）と表す）、及びＢ７−１結合Ｖ様ドメイン配列と融合させた抗リゾチームＩｇＧカッパ軽鎖配列をコードする核酸構成体（Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＬＣ）と表す）を作製した。ＶＬＤを、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列を介して抗体の重鎖（Ｈ）または軽鎖（Ｌ）のそれぞれと結合させた。すべてのＤＮＡ構成体を、制限酵素による分析及びＤＮＡシークエンシングによって検証し、標準的な十分に理解されている技術によって組換えタンパク質の発現について試験した。
これらの構成体の配列を下記に示す。抗原結合性ループは該当箇所に下線が引かれている：
Ｂ７−１結合Ｖ様ドメイン（ＶＬＤ）の配列（配列番号１３）
【表７】
2019510812.tif 000008
ＶＬＤの結合ループには下線が引かれている。
リンカー配列（配列番号１６）
【表８】
2019510812.tif 000009
リンカー配列（配列番号１７）
【表９】
2019510812.tif 000010
抗体−ＶＬＤ融合体に使用する抗リゾチームＩｇＧ１重鎖配列（配列番号１８）
【表１０】
2019510812.tif 000011
リンカーによってＢ７−１結合ＶＬＤに結合させた抗リゾチームＩｇＧ１重鎖の配列（Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤｘ２（ＨＣ））（配列番号１９）
【表１１】
2019510812.tif 000012
ＶＬＤの結合ループには下線が引かれている。
抗リゾチームＩｇＧカッパ軽鎖（配列番号２０）
【表１２】
2019510812.tif 000013
２１アミノ酸Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを有するＢ７−１結合ＶＬＤと結合させた抗リゾチームＩｇＧカッパ軽鎖（Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＬＣ）と表す）（配列番号２１）
【表１３】
2019510812.tif 000014
ＶＬＤの結合ループには下線が引かれている。
２１アミノ酸Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを有するＢ７．１結合ＶＬＤと結合させた抗リゾチームＦａｂカッパ軽鎖（Ｄ１．３  Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＬＣ）と表す（配列番号２２）
【表１４】
2019510812.tif 000015
ＶＬＤの結合ループには下線が引かれている。
２１アミノ酸Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを有するＢ７．１結合ＶＬＤと結合させた抗リゾチームＦａｂ重鎖（Ｄ１．３  Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）と表す（配列番号２３）
【表１５】
2019510812.tif 000016
ＶＬＤの結合ループには下線が引かれている。
抗リゾチームＦａｂ重鎖（Ｃ末端にＨｉｓ６タグとｍｙｃタグを有する）（配列番号２４）
【表１６】
2019510812.tif 000017
【０３６２】
ｉｉ）二重特異性分子及び三重特異性分子の作製
抗体−ＶＬＤ配列またはＦａｂ−ＶＬＤ配列をコードする個々の重鎖及び軽鎖を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｔｅｎ  Ｂｌｕｅ）にベクターの作製／増幅を行った。
【０３６３】
本開示による二重特異性及び三重特異性の分子の概略図を、抗体−ＶＬＤ分子については図２〜４に、またＦａｂ−ＶＬＤ分子については図５〜７に例として示す。
【０３６４】
図２は、標的特異的ＶＬＤ（例えば、標的Ｂに結合）と、抗リゾチームＩｇＧ１抗体重鎖の各重鎖定常領域（ＣＨ３）配列の末端とを結合させることによって創製した一例に従う、抗体−ＶＬＤ二重特異性分子［Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＨＣ）］の概略図を示す。抗体分子は、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を介して標的Ａに結合し、重鎖のＶＬＤを介して標的Ｂに結合する。
【０３６５】
図３は、標的特異的ＶＬＤ（例えば、標的Ｂに結合）と、抗リゾチームＩｇＧ１抗体軽鎖の各軽鎖定常領域（ＣＬ）配列の末端とを結合させることによって創製した一例に従う、抗体−ＶＬＤ二重特異性分子［Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＬＣ）］の概略図を示す。分子は、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を介して標的Ａに結合し、軽鎖のＶＬＤを介して標的Ｂに結合する。
【０３６６】
図４は、標的特異的ＶＬＤ（例えば、標的Ｂに結合）と、重鎖及び軽鎖の両方とを結合させることによって創製した一例に従う、抗体−ＶＬＤ三重特異性分子Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×４（ＬＣ＋ＨＣ）の概略図を示し、この場合、ＶＬＤは末端のＣＬ配列に結合され、末端の重鎖ＣＨ３配列にも結合されている。分子は、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を介して標的Ａに結合し、軽鎖のＶＬＤを介して標的Ｂに結合し、標的Ｂが結合するＶＬＤと同一または異なるＶＬＤを介して標的Ｃに結合する。三重特異性分子は、標的Ａ、Ｂ及びＣに個々別々または同時または標的３つの組み合わせで（例えば、標的ＡとＢまたは標的ＡとＣまたは標的ＢとＣ）結合することができる。
【０３６７】
図５は、本開示の一例に従った二重特異性Ｆａｂ−ＶＬＤ分子（Ｄ１．３  Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ））の概略図を示す。この概略図では、標的特異的ＶＬＤ（例えば、この例ではＶＬＤは標的Ｂに対して特異的である）と、標的Ａに結合するＦａｂ（例えば、この例ではＦａｂは標的Ａに対して特異的である）の定常領域（ＣＨ１）配列の末端とを融合させることによって二重特異性を創製する。二重特異性分子は、標的Ａと標的Ｂの両方に個々別々または同時に結合することができる。
【０３６８】
図６は、本開示の一例に従った二重特異性Ｆａｂ−ＶＬＤ分子（Ｄ１．３  Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＬＣ））の概略図を示す。この概略図では、標的特異的ＶＬＤ（例えば、この例ではＶＬＤは標的Ｂに対して特異的である）と、標的Ａに結合するＦａｂ（例えば、この例ではＦａｂは標的Ａに対して特異的である）のＣＬ配列の末端とを融合させることによって二重特異性を創製する。二重特異性分子は、標的Ａと標的Ｂの両方に個々別々または同時に結合することができる。
【０３６９】
図７は、本開示に従った三重特異性Ｆａｂ−ＶＬＤ分子（Ｄ１．３  Ｆａｂ−ＶＬＤ×２（ＬＣ＋ＨＣ））の概略図を示す。この概略図では、標的特異的ＶＬＤ（例えば、この例ではＶＬＤは標的Ｂに対して特異的である）と、Ｆａｂ  ＣＬ配列の末端とを融合させること、及び第２の標的に特異的なＶＬＤ（例えば、この例ではＶＬＤは標的Ｃに対して特異的である）と、標的Ａに結合するＦａｂ  ＣＨ３配列（例えば、この例ではＦａｂは標的Ａに対して特異的である）の末端とを融合させることによって三重特異的を創製する。三重特異性分子は、標的Ａ及び標的Ｂ及び標的Ｃに対し、個々別々または同時または標的３つの組み合わせで（例えば、標的ＡとＢまたは標的ＡとＣまたは標的ＢとＣ）結合することができる。
【０３７０】
電気穿孔法用コンピテント細胞株（例えば、ＥｌｅｃｔｒｏＴｅｎ−Ｂｌｕｅ細胞、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００１５９）を使用し２ｎｇのＤＮＡを使用する標準的な技術に従ってベクターによる細菌の形質転換を実施した。
【０３７１】
ベクター増幅後、Ｑｉａｇｅｎ  ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号１２６６３）またはＱｉａｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（カタログ番号１２２８１）を使用してＤＮＡを抽出し、調製した。ヌクレアーゼを含まない精製水にＤＮＡを溶出させた。
【０３７２】
ｉｉｉ）タンパク質発現用哺乳類細胞へのＤＮＡトランスフェクション
Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、約２×１０６Ｅｘｐｉ２９３細胞／ｍＬのトランスフェクション（哺乳類細胞生存率９５％超）を実施した。二重特異性または三重特異性のＤＮＡベクターをＨＣ  ＤＮＡ：ＬＣ  ＤＮＡ比１：３で調製した。ＤＮＡを６５℃まで５分間加熱し、室温まで降温させてからＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号３１９８５０７０）及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ１４５２５）を加え、室温で３０分間インキュベートした。トランスフェクション複合体を細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍでインキュベートした。約４〜５日後、タンパク質を含有している上清を採取した。
【０３７３】
抗体−ＶＬＤ及びＦａｂ−ＶＬＤの親抗リゾチームＤ１．３抗体、Ｅｘｐｉ２９３発現系を使用したトランスフェクションから得られた二重特異性変異型及び三重特異性変異型のタンパク質発現レベルを測定したものをそれぞれ表１及び表２に示す。抗体またはＦａｂはリゾチームに結合し、ＶＬＤはＢ７．１に結合する。
表１  二重特異性及び三重特異性の抗体−ＶＬＤ変異型におけるタンパク質発現レベル
【表１７】
2019510812.tif 000018
表２  二重特異性及び三重特異性のＦａｂ−ＶＬＤ変異型におけるタンパク質発現レベル
【表１８】
2019510812.tif 000019
【０３７４】
ｉｖ）精製
二重特異性分子及び三重特異性分子の精製にはＰｒｏｓｅｐＡ精製を使用した。カラム容量の５倍のＰＢＳ／Ｔｒｉｓ（２ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８）を用いてＰｒｏｓｅｐＡカラムの平衡化を行った。二重特異性分子をｐＨ８で含有しているトランスフェクトされた細胞の上清をカラムに担持させ、ＰＢＳ、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８をカラム容量の１０倍用いてカラムを洗浄した。０．１Ｍグリシン（ｐＨ３）でタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質画分を１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８で約ｐＨ７に中和し、標準的方法に従って透析を行った。
【０３７５】
変異型のタンパク質発現レベルをＳＤＳ  ＰＡＧＥにより決定した。アフィニティクロマトグラフィーにより精製した３０ｍｌの発現培養物から各値を得た（図示せず）。
【０３７６】
実施例２  Ｆａｂ分子の発現
親Ｄ１．３  Ｆａｂ、及び最適化していない標準Ｅｘｐｉ２９３発現系で発現させた親Ｄ１．３  Ｆａｂの二重特異性変異型と三重特異性変異型の発現を、非還元条件下及び還元条件下でＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した。アフィニティクロマトグラフィーにより精製した３０ｍｌの発現培養物から各値を得た。親ＦａｂはＤ１．３  Ｆａｂであり、二重特異性型はＤ１．３  Ｆａｂと、Ｄ１．３  ＦａｂのＣＨ配列の末端に融合させたＶＬＤとを合わせたＤ１．３  Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）、及びＤ１．３  Ｆａｂと、Ｄ１．３  ＦａｂのＣＬ配列の末端に融合させたＶＬＤとを合わせたＤ１．３  Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＣＬ）である。三重特異性分子は、Ｄ１．３  Ｆａｂと、Ｄ１．３  ＦａｂのＣＨ配列及びＣＬ配列の両方の末端に融合させた各ＶＬＤとを合わせたＤ１．３  Ｆａｂ−ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）である。非還元条件下の結果を図８に示す。還元条件下の結果を図９に示す。解析から、適切な重鎖と軽鎖の融合体は予測した大きさの範囲であったことが指された。
【０３７７】
実施例３  二重特異性分子及び三重特異性分子の結合評価
標準の化学と試薬を使用し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚバイオセンサーを使用して、精製した二重特異性分子及び三重特異性分子の結合特性の特徴付けを行った。
【０３７８】
アフィニティクロマトグラフィーで精製した抗体、抗体−ＶＬＤ二重特異性分子及び抗体−ＶＬＤ三重特異性分子を市販のリゾチーム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｌ４９１９）及びＢ７−１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号１４０−Ｂ１）と共に使用した。ストレプトアビジン捕捉表面（ＳＡ  Ｓｅｎｓｏｒ  ＦｏｒｔｅＢｉｏカタログ番号１８−５０１９、またはＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ、ＧＥ  カタログ番号ＢＲ−１０００−３２）を使用してビオチン標識化リゾチームを捕捉した。抗体、抗体−ＶＬＤ二重特異性分子及び抗体−ＶＬＤ三重特異性分子を、バイオセンサー表面に捕捉された標的に通し、結合のセンサーグラムを作成した（すなわち、第１の特異性）。この同じ標的に対し、解離段階にある時に、Ｂ７−１−Ｆｃを、すでに結合済みの抗体、抗体−ＶＬＤ二重特異性分子及び抗体−ＶＬＤ三重特異性分子（すなわち、第２の特異性）に通し、第２の結合相互作用を実証した。
【０３７９】
図１０は、二重特異性分子［ＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＨＣ）］が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに結合し、続いて、Ｂ７．１−Ｆｃに対し二次結合したことを示す、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚバイオセンサーを使用した予備分析を示す。二重特異性分子は、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］重鎖と結合させたＢ７−１結合ＶＬＤを有する。トレース１は、二重特異性の構築に使用したＤ１．３抗リゾチーム抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］のセンサーグラムである。抗体が、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後、ポイント１にてバッファーを加えられた場合を示す。トレース２は、二重特異性の構築に使用したＤ１．３抗リゾチーム抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］のセンサーグラムである。抗体が、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後、ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを加えられた場合を示す。ポイント２にてＢ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。トレース３は、抗体の定数重鎖（ＣＨ）鎖に結合させたＶＬＤを有する二重特異性Ｄ１．３抗リゾチーム抗体［二重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＨＣ）］のセンサーグラムである。二重特異性分子が、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、続いてポイント１にてバッファーを加えられた場合を示す。トレース４は、抗体のＣＨ鎖に結合させたＶＬＤを有する二重特異性Ｄ１．３抗リゾチーム抗体［二重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＨＣ）］のセンサーグラムである。二重特異性分子が、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後、ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを加えられた場合を示す。ポイント２にてＢ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。
【０３８０】
図１１は、二重特異性分子［ＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＬＣ）］が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに結合し、続いてＢ７−１−Ｆｃに対し二次結合したことを示す、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚバイオセンサーを使用した予備分析を示す。二重特異性分子は、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］軽鎖と結合させたＢ７−１結合ＶＬＤを有する。トレース１は、二重特異性の構築に使用したＤ１．３抗リゾチーム抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］のセンサーグラムである。抗体が、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後、ポイント１にてバッファーを加えられた場合を示す。トレース２は、二重特異性の構築に使用したＤ１．３抗リゾチーム抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］のセンサーグラムである。抗体が、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後、ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを加えられた場合を示す。ポイント２にてＢ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。トレース３は、抗体の軽鎖定常領域（ＣＬ）に結合させたＶＬＤを有する二重特異性Ｄ１．３抗リゾチーム抗体［二重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＬＣ）］のセンサーグラムである。二重特異性分子が、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、続いてポイント１にてバッファーを加えられた場合を示す。トレース４は、抗体ＣＬ鎖と結合させたＶＬＤを有する二重特異性Ｄ１．３抗リゾチーム抗体［二重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＬＣ）］のセンサーグラムである。二重特異性分子が、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後、ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを加えられた場合を示す。ポイント２にてＢ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。
【０３８１】
図１２は、三重特異性［ＩｇＧ  ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）］が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに結合し、続いてＢ７−１−Ｆｃに二次結合したことを示す、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚバイオセンサーを使用した予備分析を示す。三重特異性分子は、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］の重鎖及び軽鎖の両方に結合させた各Ｂ７−１結合ＶＬＤを有する。トレース１は、二重特異性の構築に使用したＤ１．３抗リゾチーム抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］のセンサーグラムである。抗体が、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後、ポイント１にてバッファーを加えられた場合を示す。トレース２は、二重特異性の構築に使用したＤ１．３抗リゾチーム抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］のセンサーグラムである。抗体が、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後、ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを加えられた場合を示す。ポイント２にてＢ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。トレース３は、抗体のＣＨ及びＣＬ鎖に結合させたＶＬＤを有する三重特異性Ｄ１．３抗リゾチーム抗体［三重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×４（ＨＣＬＣ）］のセンサーグラムである。三重特異性分子が、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、続いてポイント１にてバッファーを加えられた場合を示す。トレース４は、抗体のＣＨ鎖及びＣＬ鎖に結合させたＶＬＤを有する三重特異性Ｄ１．３抗リゾチーム抗体［三重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−Ｉｍ×４（ＨＣ＋ＬＣ）］のセンサーグラムである。三重特異性分子が、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後、ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを加えられた場合を示す。ポイント２にてＢ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。
【０３８２】
図１３は、三重特異性分子が二重特異性分子より結合性が高いことを示す、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚバイオセンサーを使用した予備分析を示す。図は、三重特異性分子が二重特異性分子よりもＢ７−１−Ｆｃに対する結合レベルが高いことを実証している。抗体数が同等の二重特異性分子及び三重特異性分子を、バイオセンサー表面に結合させたビオチン標識化リゾチームに捕捉した後、バッファーまたはＢ７−１−Ｆｃを加えた（ポイント１）ところ、三重特異性分子は二重特異性分子より高い結合能を示した。トレース１は、二重特異性分子及び三重特異性分子の構築に使用したＤ１．３抗リゾチーム抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］である。ポイント１にてバッファーのみを注入し、結合した抗体が示されている。トレース２はＤ１．３抗リゾチーム抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］であり、ポイント１にてＢ７−１−Ｆｃを注入した場合が示されている。ポイント２にて、Ｂ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。トレース３は、抗体ＣＬ鎖と融合させた各ＶＬＤを有する二重特異性Ｄ１．３抗リゾチーム抗体［二重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＬＣ）］である。捕捉された二重特異性分子が、ポイント１にて注入したＢ７−１−Ｆｃに結合したことを示している。ポイント２にて、Ｂ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。トレース４は、抗体のＣＨ鎖及びＣＬ鎖と融合させた各ＶＬＤを有する三重特異性Ｄ１．３抗リゾチーム抗体である［三重特異性分子−Ｄ１．３  ＩｇＧ−ＶＬＤ×４（ＨＣＬＣ）］。捕捉された二重特異性分子が、ポイント１にて注入したＢ７−１−Ｆｃに結合したことを示している。ポイント２にて、Ｂ７−１−Ｆｃをバッファーで置き換えた。
【０３８３】
実施例４  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で決定したＢ７．１−Ｆｃに対する分子の結合親和性
本項での結合分析は、標準の化学と試薬を使用してＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００ＳＰＲ装置（ＧＥ）で実施した。濃度系列トレースは、重ね合わせて表示し、全データとも、リゾチームを含有していなかった参照用表面からの応答を差し引いた後の応答ユニット（ＲＵ）として提示されている。
【０３８４】
図１４は、二重特異性［ＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＨＣ））］が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに結合し、続いてある濃度系列のＢ７−１−Ｆｃ（５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０μｇ／ｍｌ）に二次結合することをＳＰＲ分析によって決定し、各濃度系列のＳＰＲによる結合センサーグラムを重ね合わせたものを示す。二重特異性分子は、図２に例示するように、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］の重鎖及び軽鎖の両方と融合させた各Ｂ７−１結合ＶＬＤを有する。
二重特異性分子の注入：これは、センサー表面にＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＨＣ）を加えるポイントである。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに対するＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＨＣ）の結合を示す。
バッファーの注入１：ＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＨＣ）の注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイントである。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームからのＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＨＣ）の解離を示す。
Ｂ７−１−Ｆｃの注入：第２の分析対象物Ｂ７−１−Ｆｃを特定の濃度（５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０ｕμｇ／ｍｌ）で加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームにまだ結合したままのＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＨＣ）に対するＢ７−１−Ｆｃの結合を示す。
バッファーの注入２：Ｂ７−１−Ｆｃの注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームとまだ結合したままのＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＨＣ）からのＢ７−１−Ｆｃの解離を示す。
【０３８５】
図１５は、二重特異性分子［ＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＬＣ）］が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに結合し、続いてある濃度系列のＢ７−１−Ｆｃ（５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０μｕｇ／ｍｌ）に二次結合することをＳＰＲ分析によって決定し、各濃度系列のＳＰＲによる結合センサーグラムを重ね合わせたものを示す。二重特異性分子は、図３に例示するように、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］の軽鎖と融合させた各Ｂ７−１結合ＶＬＤを有する。
二重特異性分子の注入：センサー表面にＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＬＣ）を加えるポイントである。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに対するＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＬＣ）の結合を示す。
バッファーの注入１：ＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＬＣ）の注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームからのＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＬＣ）の解離を示す。
Ｂ７−１−Ｆｃの注入：第２の分析対象物Ｂ７−１−Ｆｃを特定の濃度（５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０μｇ／ｍｌ）で加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームにまだ結合したままのＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＬＣ）に対するＢ７−１−Ｆｃの結合を示す。
バッファーの注入２：Ｂ７−１−Ｆｃの注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームとまだ結合したままのＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＬＣ）からのＢ７−１−Ｆｃの解離を示す。
【０３８６】
図１６は、三重特異性［ＩｇＧ  ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）］がストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに結合し、続いてある濃度系列のＢ７−１−Ｆｃ（２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０μｇ／ｍｌ）に二次結合することをＳＰＲ分析によって決定し、各濃度系列のＳＰＲによる結合センサーグラムを重ね合わせたものを示す。三重特異性分子は、図４に例示するように、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］の重鎖及び軽鎖の両方と融合させた各Ｂ７−１結合ＶＬＤを有する。
三重特異性分子の注入：センサー表面にＩｇＧ  ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）を加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに対するＩｇＧ  Ｉｍ×４（ＨＣＬＣ）の結合を示す。
バッファーの注入１：ＩｇＧ  ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）の注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームからのＩｇＧ  ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）の解離を示す。
Ｂ７−１−Ｆｃの注入：第２の分析対象物Ｂ７−１−Ｆｃを特定の濃度（２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０μｇ／ｍｌ）で加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームにまだ結合したままのＩｇＧ  ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）に対するＢ７−１−Ｆｃの結合を示す。
バッファーの注入２：Ｂ７−１−Ｆｃの注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームとまだ結合したままのＩｇＧ  ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）からのＢ７−１−Ｆｃの解離を示す。
【０３８７】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、精製したＦａｂ、Ｆａｂ−ＶＬＤ二重特異性分子及び三重特異性分子の結合特性の特徴付けも行った。
【０３８８】
図１７は、二重特異性［Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）］が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに最初に結合し、続いてある濃度系列のＢ７−１−Ｆｃ（２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０ｕｇ／ｍｌ）に二次結合することを示す、一連のＳＰＲによる結合のセンサーグラムを重ね合わせたものを示す。二重特異性分子は、図５に例示するように、Ｄ１．３  Ｆａｂ［Ｄ１．３  Ｆａｂ］重鎖と融合させたＢ７−１結合ＶＬＤを有する。
二重特異性分子の注入：センサー表面にＦａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）を加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに対するＦａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）の結合を示す。
バッファーの注入１：Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）の注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームからのＦａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）の解離を示す。
Ｂ７−１−Ｆｃの注入：第２の分析対象物Ｂ７−１−Ｆｃを特定の濃度（２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０ｕｇ／ｍｌ）で加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームにまだ結合したままのＦａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）に対するＢ７−１−Ｆｃの結合を示す。
バッファーの注入２：Ｂ７−１−Ｆｃの注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームとまだ結合したままのＦａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）からのＢ７−１−Ｆｃの解離を示す。
【０３８９】
図１８は、二重特異性［Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＬＣ）］が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに最初に結合し、続いてある濃度系列のＢ７−１−Ｆｃ（２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０ｕｇ／ｍｌ）に二次結合することを示す、一連のＳＰＲによる結合のセンサーグラムを重ね合わせたものを示す。二重特異性分子は、図６に例示されるように、Ｄ１．３  Ｆａｂ［Ｄ１．３  Ｆａｂ］軽鎖と融合させたＢ７−１結合ＶＬＤを有する。
二重特異性分子の注入：センサー表面にＦａｂ−ＶＬＤ×１（ＬＣ）を加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに対するＦａｂ−ＶＬＤ×１（ＬＣ）の結合を示す。
バッファーの注入１：Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＬＣ）の注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームからのＦａｂ−ＶＬＤ×１（ＬＣ）の解離を示す。
Ｂ７−１−Ｆｃの注入：第２の分析対象物Ｂ７−１−Ｆｃを特定の濃度（２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０ｕｇ／ｍｌ）で加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームにまだ結合したままのＦａｂ−ＶＬＤ×１（ＬＣ）に対するＢ７−１−Ｆｃの結合を示す。
バッファーの注入２：Ｂ７−１−Ｆｃの注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームとまだ結合したままのＦａｂ−ＶＬＤ×１（ＬＣ）からのＢ７−１−Ｆｃの解離を示す。
【０３９０】
図１９は、三重特異性［Ｆａｂ−ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）］が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに最初に結合し、続いてある濃度系列のＢ７−１−Ｆｃ（２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０μｇ／ｍｌ）に二次結合することを示す、一連のＳＰＲによる結合のセンサーグラムを重ね合わせたものを示す。三重特異性分子は、図７に例示するように、Ｄ１．３  Ｆａｂ［Ｄ１．３  Ｆａｂ］の重鎖及び軽鎖の両方と融合させた各Ｂ７−１結合ＶＬＤを有する。
三重特異性分子の注入：センサー表面にＦａｂ−ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）を加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームに対するＦａｂ−ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）の結合を示す。
バッファーの注入１：Ｆａｂ−ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）の注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームからのＦａｂ−ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）の解離を示す。
Ｂ７−１−Ｆｃの注入：第２の分析対象物Ｂ７−１−Ｆｃを特定の濃度（２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０μｇ／ｍｌ）で加えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームにまだ結合したままのＦａｂ−ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）に対するＢ７−１−Ｆｃの結合を示す。
バッファーの注入２：Ｂ７−１−Ｆｃの注入を中止し、バッファー注入で置き換えるポイント。トレースは、バイオセンサー表面に固定化したリゾチームとまだ結合したままのＦａｂ−ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）からのＢ７−１−Ｆｃの解離を示す。
【０３９１】
実施例５  分子の結合化学量論
Ｂ７−１−Ｆｃに対する二重特異性分子［ＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＨＣ）］及び三重特異性分子［ＩｇＧ  Ｉｍ×４（ＨＣ＋ＬＣ）］の結合化学量論もＳＰＲにより決定した（図２０）。ビオチン−リゾチーム表面で捕捉し、分析対象物として一連の濃度のＢ７−１−Ｆｃ（５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０μｇ／ｍｌ）を用いて、ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＨＣ）、ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＬＣ）及びＩｇＧ−ＶＬＤ×４（ＨＣＬＣ）の速度論的解析を実施した。分析対象物及びリガンドの分子量を考慮し、捕捉したＩｇＧ−ＶＬＤタンパク質量に基づいて、分析対象物の理論的最大結合シグナル（Ｒｍａｘ）を計算した。
【０３９２】
すべての試料の化学量論を１：１と仮定し、各濃度について、リガンドに対する分析対象物の結合レベルをＲｍａｘ値のパーセンテージとしてプロットした。分析対象物濃度が２５μｇ／ｍｌに上昇すると、結合レベルは飽和レベルまたは平衡レベルに近づいた。４価タンパク質ＩｇＧ−ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）の平衡結合レベル（Ｒｍａｘ：１０３．９％）は、二価タンパク質ＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＨＣ）（５６．７％）及びＩｇＧ−ＶＬＤ×２（ＬＣ）（５１．４％）の約２倍であった。このことは、ＩｇＧ−ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）が、重鎖及び軽鎖と融合させたＶＬＤドメインを同時に介してＢ７．１−Ｆｃと結合できることを示唆する。
【０３９３】
二重特異性［Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＨＣ）］、［Ｆａｂ−ＶＬＤ×１（ＬＣ）］及び［Ｆａｂ−ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）のＢ７−１−Ｆｃに対する結合化学量論を図２１に示す。結果は、Ｆａｂ−ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）が、重鎖及び軽鎖と融合させたＶＬＤドメインを同時に介してＢ７．１と結合できることを示唆している。
【０３９４】
実施例６  Ｂ７．１−Ｆｃに対する分子の結合親和性
抗体−ＶＬＤの二重特異性分子と三重特異性分子及びＦａｂ−ＶＬＤの二重特異性分子と三重特異性分子の結合速度論を表面プラズモン共鳴により決定した。会合定数（Ｋａ）、解離定数（Ｋｄ）及び平衡解離定数／結合定数ＫＤをそれぞれ表３及び表４に示す。
表３  Ｂ７．１−Ｆｃに対する抗体−ＶＬＤ分子の親和性
【表１９】
2019510812.tif 000020
【０３９５】
結果は、Ｂ７−１−Ｆｃに対し、三重特異性分子ＩｇＧ  ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）の結合親和性と二重特異性分子ＩｇＧ  ＶＬＤ×２（ＨＣ）の結合親和性は比較可能であることを実証している。
表４  Ｂ７．１−Ｆｃに対するＦａｂ−ＶＬＤ分子の親和性
【表２０】
2019510812.tif 000021
【０３９６】
結果は、Ｂ７−１−Ｆｃに対し、三重特異性分子Ｆａｂ  ＶＬＤ×４（ＨＣ＋ＬＣ）の結合親和性と二重特異性分子Ｆａｂ  ＶＬＤ×１（ＨＣ）の結合親和性は比較可能であることを実証している。
【０３９７】
実施例７  三重特異的結合の分析
ＩｇＧ  ＶＬＤ×４（ＨＣＬＣ）構成体の修飾を行い、ここでは、スクレロスチン（Ｓｃｌ）結合ＶＬＤを抗リゾチーム抗体Ｄ１．３の重鎖のＣ末端と結合させ、Ｂ７−１結合ＶＬＤを抗リゾチーム抗体の抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）と結合させた。この三重特異性分子を［ＩｇＧ  ＶＬＤ×４（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）］とした。抗スクレロスチンＶＬＤ「１Ｅ１」と融合させた抗リゾチームＩｇＧ１重鎖の配列を下記に示す（配列番号２５）：
【０３９８】
【表２１】
2019510812.tif 000022
抗スクレロスチンＶＬＤの配列を下記に示す：
【表２２】
2019510812.tif 000023
（配列番号１４）
配列番号２５及び配列番号１４のＶＬＤ結合ループには下線が引かれている。
【０３９９】
リゾチーム、Ｂ７−１及びスクレロスチンの同時三重結合について分析するため、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００ＳＰＲ装置（ＧＥ）で分析を実施した。先にフローセル２でビオチン化リゾチームを捕捉させておいた（約２００ＲＵ）ストレプトアビジンセンサーチップ表面に抗体−Ｉｍｕｎｅｘｉｎタンパク質を３５μｇ／ｍｌで注入した。抗体−Ｉｍｕｎｅｘｉｎタンパク質を注入し、その後、安定化時間を置いた。第１の分析対象物Ｂ７．１−Ｆｃを濃度２５μｇ／ｍｌで注入した。Ｂ７．１−Ｆｃの代わりにバッファーのみを注入した対照サイクルを実施した。次いで、第２の分析対象物スクレロスチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号１４０６−ＳＴ／ＣＦ）を１５μｇ／ｍｌで速やかに６０秒間注入し、１２０秒の解離時間を設けた。スクレロスチンの代わりにバッファーのみを注入した対照サイクルを実施した。
【０４００】
ｐＨ２．１のグリシンバッファー１０ｍＭを３０秒注入して表面の再生を行った。
【０４０１】
全データとも、リゾチームを含有していなかった参照用表面（フローセル１）からの応答を差し引いた後の応答ユニット（ＲＵ）として提示されている。
【０４０２】
（ａ）完全長抗体構成体の三重特異的結合の分析
図２２は、三重特異性［ＩｇＧ  ＶＬＤ×４（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−ＬＣ）］が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに最初に結合し、続いてＢ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンに対し同時結合することを示す、一連のＳＰＲによる結合のセンサーグラムを重ね合わせたものを示す。三重特異性分子は、Ｄ１．３抗体［Ｄ１．３  ＩｇＧ］の重鎖と融合させたスクレロスチン結合ＶＬＤ及び軽鎖と融合させたＢ７−１結合ＶＬＤを有する。
【０４０３】
Ｂ７−１−Ｆｃのみのトレースは、三重特異性分子がバイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、続いてＢ７−１−Ｆｃを加えられた場合を示すセンサーグラムである。センサーグラムにより、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃに対する二重標的同時結合が示されている。
【０４０４】
スクレロスチンのみのトレースは、三重特異性分子がバイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、続いてスクレロスチンを加えられた場合を示すセンサーグラムである。センサーグラムにより、リゾチーム及びスクレロスチンに対する二重標的同時結合が示される。
【０４０５】
Ｂ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンのトレースは、三重特異性分子がバイオセンサー表面に固定化したリゾチームに結合し、その後Ｂ７−１−Ｆｃを加えられ、次いでスクレロスチンを加えられ場合が示されているセンサーグラムである。センサーグラムにより、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンに対する三重標的同時結合が示されている。
【０４０６】
図２２に示すように、ＳＰＲによってＢ７−１及びスクレロスチンに対する分子の結合を調べた。結果から、三重特異性分子はＢ７−１とスクレロスチンの両方に同時結合することができることがわかる。
【０４０７】
（ｂ）Ｆａｂ構成体の三重特異的結合の分析
Ｆａｂ  ＶＬＤ×２（ＨＣ＋ＬＣ）構成体の修飾を行い、ここでは、Ｂ７−１結合ＶＬＤを抗リゾチームＦａｂ  Ｄ３．１の重鎖のＣ末端と結合させ、スクレロスチン（Ｓｃｌ）結合ＶＬＤを抗リゾチームＦａｂのＦａｂ軽鎖定常領域（ＣＬ）と結合させた。この三重特異性分子を［Ｆａｂ  ＶＬＤ×２（Ｂ７−１−ＨＣ）（Ｓｃｌ−ＬＣ）］とした。第２の構成体の作製を行い、ここでは、スクレロスチン結合ＶＬＤを抗リゾチームＦａｂ  Ｄ３．１の重鎖のＣ末端と結合させ、Ｂ７−１結合ＶＬＤを抗リゾチームＦａｂのＦａｂ軽鎖定常領域（ＣＬ）と結合させた。この三重特異性分子を、［Ｆａｂ  ＶＬＤ×２（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−１−ＬＣ）］とした。
【０４０８】
図２３は、三重特異性Ｆａｂ  ＶＬＤ×２（Ｂ７−１−ＨＣ）（Ｓｃｌ−ＬＣ）の結合分析を示し、図２４は、三重特異性Ｆａｂ  ＶＬＤ×２（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−１−ＬＣ）の結合分析を示す。ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚを使用して結合分析を実施した。結合トレースは、三重特異性分子（Ｆａｂ  ＶＬＤ×２（Ｂ７−ＨＣ）（Ｓｃｌ−ＬＣ）（図２３）及びＦａｂ  ＶＬＤ×２（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−１−ＬＣ）（図２４））が、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化リゾチームに最初に結合し、その後Ｂ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンに対して順に同時結合することを示す。バイオセンサートレースは、三重特異性分子が、最初にバイオセンサー表面に固定化したリゾチーム結合し、その後、Ｂ７−１−Ｆｃに結合することを示す（指定ポイントにてＢ７−１−Ｆｃを加えた）。結合トレースは、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃに対する二重標的同時結合を示す。続いて、指定ポイントにてスクレロスチンを加え、そのバイオセンサートレースは、Ｆａｂ  ＶＬＤ×２（Ｂ７−１−ＨＣ）（Ｓｃｌ−ＬＣ）及びＦａｂ  ＶＬＤ×２（Ｓｃｌ−ＨＣ）（Ｂ７−１−ＬＣ）両分子とも、リゾチーム及びＢ７−１−Ｆｃ及びスクレロスチンに対し三重標的同時結合することを示している。最後に、スクレロスチンをバッファーに置き換え、解離速度を示す。
【０４０９】
実施例８  ヒト血清アルブミン−ＶＬＤ融合タンパク質の作製
方法
図２５は、本開示の一例に従ったＶＬＤと結合させたタンパク質の概略図を示す。二重特異性分子は、標的Ａと標的Ｂの両方に個々別々または同時に結合することができる。
【０４１０】
ベクター作製
１つまたは２つのＶＬＤと融合させたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をコードする配列を作製し、これには、１６アミノ酸のリンカー配列（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（強調表示）及びＣ末端ヒスチジンタグが含まれる。配列を哺乳類の発現ベクターにクローニングした。使用したベクターｐｃＤＮＡ３．４ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）であった。タンパク質が分泌されるようシグナルペプチドを用いて配列をクローニングした。ペプチドの配列はＭＡＷＭＭＬＬＬＧＬＬＡＹＧＳＧ（配列番号８）である。
【０４１１】
電気穿孔法用コンピテント細胞（例えば、ＥｌｅｃｔｒｏＴｅｎ−Ｂｌｕｅ細胞、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００１５９）を使用して標準的技術に従いベクターによる細菌の形質転換を実施した。
【０４１２】
ベクター増幅後、Ｑｉａｇｅｎ  ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号１２６６３）またはＰｒｏｍｅｇａ  ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号Ａ２４９２）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出し、調製した。ヌクレアーゼを含まない精製水にＤＮＡを溶出させた。
【０４１３】
トランスフェクション
Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ１４６３５）を使用して、密度３×１０６〜５×１０６細胞／ｍＬ、生存率＞９５％のＥｘｐｉ２９３哺乳類細胞のトランスフェクションを実施した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号３１９８５０７０）及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ１４５２５）にＤＮＡベクターを加え、室温で２０分間インキュベートした。トランスフェクション複合体を細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍでインキュベートした。２０時間後、細胞にＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  １及び２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ１４５２５）を加えた。約４〜５日後、タンパク質を含有している上清を採取した。
【０４１４】
精製
Ｎｉｃｋｅｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｅｘｃｅｌ（ＧＥ、カタログ番号１７−３７１２−０１）を使用してアフィニティクロマトグラフィーによりタンパク質を精製した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐｈ７．４をカラム容量の５倍用いてＮｉｃｋｅｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの平衡化を行った。Ｈｉｓタグの付いたＨＳＡ−ＶＬＤタンパク質を含有している、トランスフェクトした細胞培養上清をカラムに担持させ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐｈ７．４をカラム容量の１０倍用いてカラムを洗浄した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールｐｈ７．４を用いてタンパク質を溶出させた。溶出させた画分をプールし、標準的な方法に従ってＰＢＳで透析を行った。
【０４１５】
図２６は、抗Ｈｉｓ  ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１１９６５０８５００１）を用いて行った、精製したＨＳＡ融合タンパク質のウエスタンブロット解析と検出を示し、かかるタンパク質は、ＨＳＡのＣ末端、Ｎ末端、またはＣ末端とＮ末端の両方と融合させたＶＬＤを含む。タンパク質それぞれの推定サイズは、６７ｋＤａ（予測サイズ：８１．９ｋＤａ）；６９．３ｋＤａ（予測サイズ：８１．８ｋＤａ）；及び９４．４ｋＤａ（予測サイズ：９６．２ｋＤａ）である。
【０４１６】
結合の評価
標準の化学と試薬を使用し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚバイオセンサーを使用して、精製した分子の結合特性の特徴付けを行った。
【０４１７】
市販のＢ７．２−Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１４１−Ｂ２）、ＣＤ３（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＣＤＤ−Ｈ５２Ｗ３）、及びビオチン化抗ＨＳＡアフィボディー（Ａｂｃａｍ、カタログ番号３１８９８）を用いてアフィニティ精製した分子を試験した。
【０４１８】
ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２１３２７）を標準的方法に従って使用し、ＣＤ３及びＢ７．２Ｆｃタンパク質をモル比１：１でビオチン化した。
【０４１９】
ビオチン標識化タンパク質の捕捉にはストレプトアビジン捕捉表面（ＳＡ  Ｓｅｎｓｏｒ、ＦｏｒｔｅＢｉｏカタログ番号１８−５０１９）を使用した。ＨＳＡ−ＶＬＤ分子を、バイオセンサー表面に捕捉された標的に通し、結合のセンサーグラムを作成した。
【０４２０】
図２７は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚバイオセンサーを使用した分析を示し、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化Ｂ７．２−Ｆｃに対するＨＳＡ−ＶＬＤ分子の結合を実証している。トレース１は、Ｃ末端に結合しているＢ７結合ＶＬＤを有するＨＳＡ−ＶＬＤ融合タンパク質のセンサーグラムである。トレース２は、Ｎ末端とＣ末端の両方に結合しているＢ７結合ＶＬＤを有するＶＬＤ−ＨＳＡ−ＶＬＤ融合タンパク質のセンサーグラムである。分子が、バイオセンサー表面に固定化されたＢ７．２−Ｆｃに結合し、その後、ポイント１にてバッファーを加えられた場合を示す。
【０４２１】
図２８は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚバイオセンサーを使用した分析を示し、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化ＣＤ３デルタ／イプシロン（ｄｅ）ヘテロダイマーに対するＨＳＡ−ＶＬＤ分子の結合を実証している。図示トレースは、Ｃ末端に結合させたＣＤ３結合ＶＬＤを有するＨＳＡ−ＶＬＤ融合タンパク質のセンサーグラムである。分子が、バイオセンサー表面に固定化されたＣＤ３ｄｅに結合し、その後、ポイント１にてバッファーを加えられた場合を示す。
【０４２２】
図２９は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｂｌｉｔｚバイオセンサーを使用した分析を示し、ストレプトアビジンで捕捉したビオチン標識化抗ＨＳＡアフィボディーに対するＨＳＡ−ＶＬＤ分子の結合を実証している。図示トレースは、Ｃ末端に結合させたＢ７結合ＶＬＤを有するＨＳＡ−ＶＬＤ融合タンパク質のセンサーグラムである。分子が、バイオセンサー表面に固定化された抗ＨＳＡアフィボディーに結合し、その後、ポイント１にてバッファーを加えられた場合を示す。ポイント２にて、センサー表面に捕捉された分子にＢ７．２Ｆｃタンパク質を結合させた。その後、ポイント３にてＢ７．２Ｆｃをバッファーで置き換えた。
結果
（ｉ）ＨＳＡのＣ末端、Ｎ末端またはＣ末端とＮ末端の両方のいずれかでヒト血清アルブミンと融合させたＣＴＬＡ４  ＶＬＤ。
配列を下記に示す：
ＨＳＡのＣ末端と融合させたＢ７−２結合ＶＬＤ（配列番号２６）：
【表２３】
2019510812.tif 000024
ＨＳＡのＮ末端と融合させたＢ７−１結合ＶＬＤ（配列番号２７）：
【表２４】
2019510812.tif 000025
ＨＳＡのＮ末端とＣ末端の両方と融合させたＢ７−２結合ＶＬＤ（配列番号２８）：
【表２５】
2019510812.tif 000026
（ｉｉ）ヒト血清アルブミンのＣ末端と融合させたＣＤ３結合ＶＬＤ（ＡＦ３と呼ぶ）
配列は下記に示す：
ＨＳＡのＣ末端と融合させたＣＤ３結合ＶＬＤ「ＡＦ３」（配列番号２９）：
【表２６】
2019510812.tif 000027
【図１】
2019510812.tif 000030
【図２】
2019510812.tif 000031
【図３】
2019510812.tif 000032
【図４】
2019510812.tif 000033
【図５】
2019510812.tif 000034
【図６】
2019510812.tif 000035
【図７】
2019510812.tif 000036
【図８】
2019510812.tif 000037
【図９】
2019510812.tif 000038
【図１０】
2019510812.tif 000039
【図１１】
2019510812.tif 000040
【図１２】
2019510812.tif 000041
【図１３】
2019510812.tif 000042
【図１４】
2019510812.tif 000043
【図１５】
2019510812.tif 000044
【図１６】
2019510812.tif 000045
【図１７】
2019510812.tif 000046
【図１８】
2019510812.tif 000047
【図１９】
2019510812.tif 000048
【図２０】
2019510812.tif 000049
【図２１】
2019510812.tif 000050
【図２２】
2019510812.tif 000051
【図２３】
2019510812.tif 000052
【図２４】
2019510812.tif 000053
【図２５】
2019510812.tif 000054
【図２６】
2019510812.tif 000055
【図２７】
2019510812.tif 000056
【図２８】
2019510812.tif 000057
【図２９】
2019510812.tif 000058
【配列表】
2019510812000001.app
【国際調査報告】
2019510812.tif 000059
2019510812.tif 000060
2019510812.tif 000061
2019510812.tif 000062
2019510812.tif 000063
2019510812.tif 000064
2019510812.tif 000065
2019510812.tif 000066
2019510812.tif 000067
2019510812.tif 000068
2019510812.tif 000069
2019510812.tif 000070
2019510812.tif 000071
2019510812.tif 000072
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2019510812.tif 000074
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2019510812.tif 000076
2019510812.tif 000077