(57)【要約】本開示は、これに限定されないが、２つ以上の抗体分子を含んだ混合物から抗体分子の量を定量する方法に関し、その方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィ高速液体クロマトグラフィ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって前記混合物から前記２つ以上の抗体分子のそれぞれを分離することと、各抗体分子の量を定量することとを含み、各抗体分子の分子量は、前記混合物中の他の抗体分子の１５ｋＤａ以内であり、各抗体分子は、カイトおよびドリトルの疎水性指標で約０．２５単位を超えるだけ前記混合物中の別の抗体分子と異なるか、あるいはＨＩＣ−ＨＰＬＣで単独で分析される場合、前記抗体分子のそれぞれは、前記混合物中の別の抗体分子とほとんど重複せずに異なる分析時間で溶出するかのいずれか一方またはその両方である。
2019529350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の抗体を含んだ混合物から抗体の量を定量する方法であって、前記方法は、
疎水性相互作用クロマトグラフィ高速液体クロマトグラフィ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）を使用して前記混合物中の前記複数の抗体のそれぞれを分離することと、
前記混合物中の各抗体の量を定量することと
を含み、前記混合物中の各抗体の分子量は、前記混合物中の他の抗体の分子量の１５ｋＤａ以内であり、前記混合物中の各抗体の表面疎水性は、カイトおよびドリトルの疎水性指標で約０．２５単位を超えるだけ前記混合物中の別の抗体の表面疎水性と異なるか、あるいはＨＩＣ−ＨＰＬＣで個々に分析される場合、前記混合物中の各抗体は、前記混合物中の別の抗体とは異なる分析時間で溶出するかのいずれか一方またはその両方である、方法。
【請求項２】
前記混合物中の各抗体の前記表面疎水性は、カイトおよびドリトルの疎水性指標で約０．５〜約１．０単位だけ前記混合物中の別の各抗体の前記表面疎水性と異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合物中の第１の抗体はＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の間の第１の分析時間で溶出し、前記混合物中の第２の抗体はＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の間の第２の分析時間で溶出し、前記第１の分析時間および前記第２の分析時間は重複していない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＩＣ−ＨＰＬＣは、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の緩衝液中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の抗体は３つの抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記混合物中の各抗体の前記表面疎水性は、タンパク質構造または構造的モデルに基づいて算出される表面疎水性、硫酸アンモニウムまたはＰＥＧ８０００中の溶解性についての高速スクリーニング、あるいは親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ−ＳＩＮＳ）による分子相互作用についての高速スクリーニングからなる群から選択される１つ以上の方法によって判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記混合物中の第１の抗体および前記混合物中の第２の抗体は少なくとも９０％相同なタンパク質配列を有するか、
前記第１の抗体および前記第２の抗体は、これらのタンパク質配列によって判定される場合に少なくとも９０％相同なタンパク質構造を有するか、あるいは、
前記第１の抗体および前記第２の抗体は、これらのタンパク質配列によって判定される場合に互いに約０．６以内の等電点（ｐＩ）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物中の前記抗体のうちの１つ以上はモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記混合物中の前記モノクローナル抗体のうちの１つ以上はヒトモノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記混合物中の前記抗体のうちの２つ以上は同じアイソタイプである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記混合物中の前記抗体のうちの２以上は互いの変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記混合物中の前記抗体のうちの２つ以上は同じ抗原に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記混合物は合剤組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記合剤組成物は、ヒト患者におけるＭＥＲＳを治療するように構成されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記合剤組成物は、ヒト患者におけるエボラ出血熱を治療するように構成されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記合剤組成物は、ヒト患者における黄斑変性症を治療するように構成されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記合剤組成物中の前記２つ以上の抗体は、ヒト患者における感染症を治療するように構成されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記合剤組成物は医薬製品中に含まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＨＩＣ−ＨＰＬＣからクロマトグラフを生成することをさらに含み、前記混合物中の各抗体の溶出に対して、前記クロマトグラフは、前記クロマトグラフ中の他のピークとは重複しないピークを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
複数の抗体を含んだ混合物から抗体の量を定量する方法であって、前記方法は、
疎水性相互作用クロマトグラフィ高速液体クロマトグラフィ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）を使用して前記混合物中の前記複数の抗体のそれぞれを分離することであって、前記混合物中の各抗体の分子量は、前記混合物中の別の各抗体の分子量の１５ｋＤａ以内であることと、
前記混合物中の各抗体の量を定量することと、
前記ＨＩＣ−ＨＰＬＣからクロマトグラフを生成することと
を含み、前記混合物中の各抗体の溶出に対して、前記クロマトグラフは、前記クロマトグラフ中の他のピークとは重複しないピークを示す、方法。
【請求項２１】
前記複数の抗体のうちの１つ以上はヒトモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記混合物中の各抗体の表面疎水性は、カイトおよびドリトルの疎水性指標で約０．２５単位を超えるだけ前記混合物中の別の抗体の表面疎水性と異なるか、あるいはＨＩＣ−ＨＰＬＣで個々に分析される場合、前記混合物中の各抗体は、前記混合物中の別の抗体とは異なる分析時間で溶出するかのいずれか一方またはその両方である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、治療用抗体の合剤（co-formulation）のためのアッセイの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
単一ではなく複数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を患者に投与すると、患者の診断的または治療的適応および有効性が改善される場合がある。これらのｍＡｂは、単一の医薬製品（ＤＰ）中および患者に投与されるＤＰ中に共配合されてもよい。
【０００３】
規制当局は、ＤＰ中に混合される合剤原薬（ｃＦＤＳ）中の個々のｍＡｂ、またはＤＰ自体を定量する方法を求めている。２つ以上の抗体分子を分離して各ｍＡｂの濃度を測定する方法を開発することは、それら抗体分子が類似の分子量、タンパク質構造および電荷特性を有する可能性があるために困難である。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、複数の抗体を含んだ混合物から抗体の量を定量する方法を含む。いくつかの態様において、本方法はとりわけ、疎水性相互作用クロマトグラフィ高速液体クロマトグラフィ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）を使用して混合物中の複数の抗体のそれぞれを分離することと、混合物中の各抗体の量を定量することとを含んでもよく、混合物中の各抗体の分子量は、混合物中の他の抗体の分子量の１５ｋＤａ以内であり、混合物中の各抗体の表面疎水性は、カイトおよびドリトル（Kyte & Doolittle）の疎水性指標で約０．２５単位を超えるだけ混合物中の別の抗体の表面疎水性と異なるか、あるいはＨＩＣ−ＨＰＬＣで個々に分析される場合、混合物中の各抗体は、混合物中の別の抗体とは異なる分析時間で溶出するかのいずれか一方またはその両方である。
【０００５】
いくつかの実施形態において、混合物中の各抗体の表面疎水性は、カイトおよびドリトルの疎水性指標で約０．５〜約１．０単位だけ混合物中の別の各抗体の表面疎水性と異なる。さらなる実施形態において、混合物中の各抗体の表面疎水性は、タンパク質構造または構造的モデルに基づく表面疎水性の算出、硫酸アンモニウムまたはＰＥＧ８０００中の溶解性についての高速スクリーニング、あるいは親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ−ＳＩＮＳ）による分子相互作用についての高速スクリーニングによって判定される。
【０００６】
追加的な実施形態において、混合物中の第１の抗体はＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の間の第１の分析時間で溶出し、混合物中の第２の抗体はＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の間の第２の分析時間で溶出し、第１および第２の分析時間は重複していない。さらなる実施形態において、混合物中の第１の抗体および混合物中の第２の抗体は少なくとも９０％相同なタンパク質配列を有し、これらのタンパク質配列によって判定される場合に第１の抗体および第２の抗体は少なくとも９０％相同なタンパク質構造を有するか、あるいは、これらのタンパク質配列によって判定される場合に第１の抗体および第２の抗体は互いに約０．６以内の等電点（ｐＩ）を有する。
【０００７】
いくつかの態様において、複数の抗体は３つの抗体を含む。さらなる実施形態において、混合物中の１つ以上の抗体はモノクローナル抗体である。さらなる実施形態において、混合物中の１つ以上の抗体はヒトモノクローナル抗体である。他の実施形態において、混合物中の２つ以上の抗体は同じアイソタイプである。いくつかの実施形態において、混合物中の２つ以上の抗体は互いの変異体である。さらなる実施形態において、混合物中の２つ以上の抗体は同じ抗原に結合する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、混合物は合剤組成物（co-formulated composition）である。追加の実施形態において、合剤組成物は、ヒト患者におけるＭＥＲＳを治療するように構成されている。さらなる実施形態において、合剤組成物は、ヒト患者におけるエボラ出血熱を治療するように構成されている。さらなる実施形態において、合剤組成物は、ヒト患者における黄斑変性症を治療するように構成されている。さらなる実施形態において、合剤組成物中の２つ以上の抗体は、ヒト患者における感染症を治療するように構成されている。いくつかの実施形態において、合剤組成物は、医薬製品中に含まれる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ＨＩＣ−ＨＰＬＣは、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の緩衝液中で行われる。さらなる実施形態において、本方法は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣからクロマトグラフを生成することをさらに含み、混合物中の各抗体の溶出に対して、クロマトグラフは、クロマトグラフ中の他のピークとは重複しないピークを示す。
【００１０】
本開示はまた、複数の抗体を含んだ混合物から抗体の量を定量する方法を含み、その方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィ高速液体クロマトグラフィ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）を使用して混合物中の複数の抗体のそれぞれを分離することであって、混合物中の各抗体の分子量は、混合物中の別の各抗体の分子量の１５ｋＤａ以内であることと、混合物中の各抗体の量を定量することと、ＨＩＣ−ＨＰＬＣからクロマトグラフを生成することとを含み、混合物中の各抗体の溶出に対して、クロマトグラフは、クロマトグラフ中の他のピークとは重複しないピークを示す。いくつかの実施形態において、複数の抗体のうちの１つ以上はヒトモノクローナル抗体である。さらなる実施形態において、混合物中の各抗体の表面疎水性は、カイトおよびドリトルの疎水性指標で約０．２５単位を超えるだけ混合物中の別の抗体の表面疎水性と異なるか、あるいはＨＩＣ−ＨＰＬＣで個々に分析される場合、混合物中の各抗体は、混合物中の別の抗体とは異なる分析時間で溶出するかのいずれか一方またはその両方である。
【００１１】
本開示のこれらおよび他の態様に従って、多数の他の態様および実施形態が提供される。本開示の他の特徴および態様は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本明細書に組み込まれてその一部を構成する添付の図面は、様々な例を示し、明細書と共に本開示の原理を説明するのに役立つ。本明細書に記載の実施形態または実施例の任意の特徴（例えば、装置、方法など）は、任意の他の実施形態または実施例と組み合わせてもよく、本開示に含まれる。
【図１】抗エボラｍＡｂを含んだ合剤のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の例示的なクロマトグラフである。
【図２】抗ＭＥＲＳｍＡｂを含んだ合剤のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の例示的なクロマトグラフである。
【図３】抗ＭＥＲＳｍＡｂを含んだ合剤のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の例示的なクロマトグラフである。
【図４】抗ＭＥＲＳｍＡｂを含んだ合剤のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の例示的なクロマトグラフである。
【図５】抗ＭＥＲＳｍＡｂを含んだ合剤のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の例示的なクロマトグラフである。
【図６】抗ＭＥＲＳｍＡｂを含んだ合剤のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の例示的なクロマトグラフである。
【図７】抗ＭＥＲＳｍＡｂを含んだ合剤のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の例示的なクロマトグラフである。
【図８】抗ＭＥＲＳｍＡｂを含んだ合剤のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の例示的なクロマトグラフである。
【図９】抗エボラｍＡｂを含んだ合剤のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の例示的なクロマトグラフである。
【図１０】ＨＩＣ−ＨＰＬＣの線形性のプロットであり、個々の抗エボラｍＡｂ分析の量に対するピーク面積をプロットしている。
【図１１】範囲のプロットであり、個々の抗エボラｍＡｂ分析の量に対するｍＡｂの回復率をプロットしている。
【図１２】異なる混合物サンプルロットを用いたＨＩＣ−ＨＰＬＣの正確度のプロットであり、個々の抗エボラｍＡｂ分析の量に対するｍＡｂの回復率をプロットしている。
【図１３】個々の抗エボラｍＡｂの異なる比率を用いたＨＩＣ−ＨＰＬＣの正確度のプロットであり、個々の抗エボラｍＡｂ分析の量に対するｍＡｂの回収率をプロットしている。
【図１４】ｃＦＤＳ中のｍＡｂの貯蔵安定性のプロットであり、月単位の貯蔵時間に対する個々の抗エボラｍＡｂの量をプロットしている。
【図１５】抗エボラｍＡｂを含んだ合剤の陽イオン交換超高圧液体クロマトグラフィ（ＣＥＸ−ＵＰＬＣ）分析の例示的なクロマトグラフを示す。
【図１６】ＣＥＸ−ＵＰＬＣの線形性のプロットであり、個々の抗エボラｍＡｂの量に対するピーク面積をプロットしている。
【図１７】抗エボラｍＡｂを含んだ合剤のサイズ排除超高圧液体クロマトグラフィ（ＳＥ−ＵＰＬＣ）分析の例示的なクロマトグラフを示す。
【図１８】抗エボラｍＡｂを含んだ合剤の例示的な画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）プロファイルを示す。
【図１９】抗エボラｍＡｂを含んだ合剤の逆相超高圧液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＵＰＬＣ）分析の例示的なクロマトグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」という用語と互換的に使用されることがある。簡単に言えば、それは２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含む抗体全体を称してもよい。全抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体を含む異なる抗体アイソタイプを含む。用語「抗体」は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ化抗体またはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、および完全ヒト抗体を含んでもよい。抗体は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、オランウータン、ヒヒ、またはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、およびマウスなどの哺乳類の様々な種のうちの任意から作製または誘導されてもよい。抗体は、精製抗体または組換え抗体であってもよい。抗体はまた、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含有する人工タンパク質または抗体様タンパク質（例えば、融合タンパク質）であってもよい。人工タンパク質または抗体様タンパク質はまた、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または二量体、三量体もしくは多量体抗体、または二重特異性抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣＯＤＶ−Ｉｇ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、またはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であってもよい。
【００１４】
「抗体の変異体」、「抗体変異体」などの用語は、変異体抗体が他の抗体の欠失変異体、挿入変異体、および／または置換変異体であるという点で別の抗体とは異なる抗体を称する。
【００１５】
本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図している。ヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコード化されないアミノ酸残基（例えば、生体外でのランダムまたは部位特異的変異誘発または生体内での体細胞変異によって導入された変異）を含んでもよい。しかしながら、本明細書で使用されるような「ヒト抗体」という用語は、他の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列に移植されているｍＡｂを含むことを意図しない。この用語は、非ヒト哺乳動物において、または非ヒト哺乳動物の細胞において組換え的に産生された抗体を含む。この用語は、ヒト被験者から単離された抗体や、あるいはヒト被験者において生成された抗体を含むことを意図していない。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「治療する」、「治療すること」、または「治療」とは、２つ以上の抗体の合剤を治療が必要な被験者に処方することにより、少なくとも１つの症状または疾患もしくは状態の兆候の程度の軽減または改善を称する。この用語は、疾患の進行の阻害を含む。この用語にはまた、疾患のポジティブな予後も含まれる。
【００１７】
「予防する」、「予防すること」または「予防」という用語は、２つ以上の抗体の合剤を投与した際の、疾患もしくは状態の発現、またはその疾患もしくは状態の任意の症状または兆候の阻害を称する。
【００１８】
「例えば」および「などの」という用語およびこれらの文法上の等価物については、他に明示的に述べられていない限り、「および限定なしに」という語句が続くことが理解される。本明細書中で使用される場合、用語「約」および記号「〜」は、実験誤差による変動を説明することを意味する。本明細書において報告されているすべての測定値は、他に明示的に述べられていない限り、その用語が明示的に使用されているかどうかにかかわらず、用語「約」によって修飾されると理解される。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の言及を含む。
【００１９】
他に規定されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載されている。当該分野で公知の他の好適な方法および材料もまた使用されてもよい。材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図しない。本明細書で言及されたすべての出版物、特許出願、特許、配列、データベース入力、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配することとなる。
【００２０】
モノクローナル抗体分子などの抗体分子は、患者（ヒト患者を含む）における１つ以上の疾患または状態を治療するために共配合することができる。「患者」および「被験者」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００２１】
共配合された医療製品（ＤＰ）は、２つ以上（例えば３つ）のヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）分子を含有する合剤原薬（ｃＦＤＳ）（本明細書では合剤とも呼ばれる）を含んでもよい。ｃＦＤＳは、精製ｍＡｂを所定の割合で混合することにより調製される。規制機関は、ｃＦＤＳ中の個々のｍＡｂをそれぞれ定量する方法を求めている。
【００２２】
合剤中のｍＡｂ分子は、互いに類似していてもよく、それらは、類似のタンパク質構造および電荷特性を有するほぼ同じ分子量（例えば、約１４５ｋＤａ）の免疫グロブリン（ＩｇＧ１など）であってもよい。
【００２３】
合剤中の類似のｍＡｂ分子を定量するための本明細書に開示の方法は、正確かつ精密で再現性があり、品質管理環境での使用に好適で、高価な装置を使用せず、そして面倒な試料調製を必要としない。
【００２４】
方法
本開示は、２つ以上の抗体分子を含んだ混合物から抗体分子の量を定量する方法を提供する。本方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィ高速液体クロマトグラフィ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって混合物から２つ以上の抗体分子のそれぞれを分離することと、各抗体分子の量を定量することとを含んでもよく、各抗体分子の分子量は、混合物中の他の抗体分子の１５ｋＤａ以内であり、各抗体分子は、カイトおよびドリトルの疎水性指標（例えば、カイトおよびドリトル、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１５７巻、１０５〜１３２ページ（１９８２年）を参照）で約０．２５単位を超えるだけ混合物中の別の抗体分子と異なるか、あるいはＨＩＣ−ＨＰＬＣで単独で分析される場合、抗体分子のそれぞれは、混合物中の別の抗体分子とはほとんど重複せずに異なる分析時間で溶出するかのいずれか一方またはその両方である。特定の実施形態において、例えば、各抗体分子の相対疎水性は、カイトおよびドリトルの疎水性指標で約０．５〜約１．０単位だけ混合物中の別の各抗体分子と異なる。他の特定の実施形態において、ＨＩＣ−ＨＰＬＣで単独で分析される場合、抗体分子のそれぞれは、混合物中の別の抗体分子とほとんど重複せずに異なる分析時間で溶出する。特定の実施形態において、混合物は、複数の抗体分子（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つの抗体分子）を含む。
【００２５】
混合物からの２つの抗体分子は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣで分析される場合、吸収性対溶出時間による抗体分子の溶出プロファイルを監視するクロマトグラフにおいて有意な重複を有し、これは、２つの抗体分子が近い時間で溶出し、結果として抗体分子が精製されないようなカラム内の不十分な分離となる（例えば、５０％未満の純度）ことを示す。そのような場合、その有意な重複のために個々の抗体を完全に定量することはできない。いくつかの実施形態において、混合物からの２つの抗体分子は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣで分析される場合、吸収性対溶出時間による抗体分子の溶出プロファイルを監視するクロマトグラフにおいてほとんどまたは全く重複を有さず、抗体分子は、近くない時間で溶出し、結果として抗体分子が実質的に精製されるような分離となり、それぞれ少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の純度である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示の方法は、「抗体分子」とも称される抗体の個々の集団を、２つ以上の異なる抗体の集団を含んだ抗体の混合物から定量するために使用され、異なる集団は、それらの間に少なくとも１つのアミノ酸配列の差異を有する。いくつかの実施形態において、抗体の集団は、抗体の混合物中の別の集団のものと同じアミノ酸配列を有してもよいが、それらは、翻訳後修飾において異なってもよい。特定の実施形態において、混合物は、合剤原薬（ｃＦＤＳ）などのまたはそれを含む合剤組成物である。特定の実施形態において、混合物は賦形剤を含む。特定の実施形態において、混合物はスクロースを含み、ｍＡｂ分子を含んだスクロース原薬であってもよい。抗体混合物中の各抗体は、互いに１、２、３、４、５、１０、または１５キロダルトン（ｋＤａ）以内の類似の分子量を有するであろう。他の態様において、全抗体の平均分子量は約１５０ｋＤａであろう。この方法はまた、類似の分子量を有する２つ以上のトラップ分子と共に使用されることができる。特定のさらなる実施形態において、合剤組成物はＶＥＧＦトラップを含む。（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第９２６５８２７号明細書および米国特許出願公開第１４／９４３４９０号明細書を参照。）この方法はまた、貯蔵安定性を監視する際に混合物（例えば、合剤）中のｍＡｂのそれぞれの濃度を監視するためにも使用されてもよい。特定の実施形態において、本方法は、逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）または超高圧液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）などの別のクロマトグラフィ方法によっては分離することができない抗体分子を分離するために使用される。
【００２７】
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）は、抗体の表面疎水性の差異に基づいて、減少する塩勾配で抗体を分離する。ＨＩＣを用いる分離は、抗体とクロマトグラフィマトリックスに結合した疎水性リガンドとの間の可逆的相互作用に基づく。タンパク質およびペプチドの疎水性アミノ酸は、通常分子表面から離れて位置しているが、生体分子は、媒体上の疎水性リガンドとの相互作用を可能にするために露出したいくつかの疎水性基を有する。疎水性相互作用は、高いイオン強度を有する緩衝液によって増強される。
【００２８】
限定するものではないが、Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＨＩＣ−１０、ｍＡｂＰａｃ  ＨＩＣ−１０、ｍＡｂＰａｃ  ＨＩＣ−２０、ｍＡｂＰａｃ  ＨＩＣ−Ｂｕｔｙｌ（Ｄｉｏｎｅｘ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、サニーベール、ＣＡ）を含んだ任意の好適なＨＩＣ−ＨＰＬＣカラムを本明細書に開示の方法に採用してもよい。緩衝剤は、任意の好適な緩衝剤であってもよい。特定の実施形態において、ＨＩＣ−ＨＰＬＣは、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０、または約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．０、または約６．５〜約７．５の緩衝液ｐＨ中で行われる。特定の実施形態において、カラムは、Ｄｉｏｎｅｘ  ＭａｂＰａｃ  ＨＩＣ−１０（１００×４．６ｍｍ、５μｍ、孔径１０００Ａ°）およびＰｒｏＰａｃ  ＨＩＣ−１０（１００×４．６ｍｍ、５μｍ、孔径３００Ａ°）である。
【００２９】
２つ以上の抗体を含んだ混合物をＨＩＣ−ＨＰＬＣで分析する。抗体は、別々の時間（分析時間）で溶出する。抗体は、ＵＶスペクトルの、例えば２８０ｎｍでそれらの吸光度を測定することにより監視される。クロマトグラフを使用して分析結果を監視および記録することができる。特定の実施形態において、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにおいて使用される緩衝液は、１００ｍＭリン酸緩衝液中の１Ｍ硫酸アンモニウム（１００％〜０％）の異なる勾配である。
【００３０】
特定の実施形態において、抗体分子は、２８０ｎｍでのそれらの吸光度を標準曲線と比較することにより定量される。標準曲線は、例えば２８０ｎｍの吸光度で、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析から既知の濃度で既知の抗体の吸光度を判定することによって構築されてもよい。吸光度（または「光学密度」）が大きいほど、タンパク質濃度は高くなる。抗体の既知濃度についてのこれらのデータを用いて標準曲線を作成し、濃度をＸ軸にプロットし、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析からの抗体の溶出プロファイルのクロマトグラフから得られた吸光度をＹ軸にかける。標準曲線からの抗体を含んだ未知の濃度の２つ以上の抗体を含む試料を分析する。データを解析するために、抗体をＨＩＣ−ＨＰＬＣにより分離する。抗体の溶出プロファイルをクロマトグラフに表示し、分光光度計により経時的に監視する吸光度で抗体濃度を表現する。溶出時間（分析時間）によって識別される各抗体の吸光度は、標準曲線上の対応する吸光度の値を求めるために使用される。標準曲線上のその点に対応するＸ軸値は、試料中のその抗体の濃度である。
【００３１】
現在の開示のいくつかの態様において、本明細書に開示の混合物中の個々の抗体を定量するための方法は、混合物中の各抗体の相対表面疎水性がカイトおよびドリトルの疎水性指標で約０．５〜約１．０単位など約０．２５単位を超えるだけ混合物中の別の各抗体と異なる場合に有用であってもよい。抗体の相対表面疎水性は、いくつかの方法によって判定／推定されてもよい。
【００３２】
例えば、ＨＩＣ−ＨＰＬＣは、異なる抗体分子の相対表面疎水性を判定するために使用されてもよい。抗体分子のそれぞれをＨＩＣ−ＨＰＬＣで単独で分析し、各抗体の分析時間（溶出時間）を判定する。
【００３３】
特定の実施形態において、混合物中の抗体間の表面疎水性の差異は、以下の方法のうちの１つ以上、すなわち、タンパク質構造または構造的モデルに基づく表面疎水性の算出、硫酸アンモニウムまたはＰＥＧ８０００中の溶解性についての高速スクリーニング、および親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ−ＳＩＮＳ）による分子相互作用についての高速スクリーニングのうちの１つ以上によって判定される。
【００３４】
相対表面疎水性は、抗体の既知の構造（例えば、結晶構造またはＮＭＲ構造に基づく）または構造モデルに基づいて算出されてもよい。そのような計算方法は、当技術分野において公知である。
【００３５】
相対表面疎水性は、例えば、硫酸アンモニウムまたはＰＥＧ８０００におけるような疎水性を増大する条件における溶解度についての高速スクリーニング方法により抗体分子の溶解度を判定することによって算出／推定されてもよい。タンパク質の溶解度が高いほど疎水性は低くなる。（例えば、クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、第１０２巻、４月、１９０７〜１９１５ページ（２０１２年）を参照。）
相対表面疎水性は、親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ−ＳＩＮＳ）による分子相互作用についての高速スクリーニングによって算出／推定されてもよい。（例えば、エステップ（Ｅｓｔｅｐ）ら、ｍＡｂｓ、第７巻、３、５５３〜５６１ページ（２０１５年）を参照。）ＡＣ−ＳＩＮＳは、金ナノ粒子をポリクローナル抗ヒト抗体でコーティングし、これらの複合体を使用してヒトｍＡｂを固定化し、抗体複合体のプラズモン波長を硫酸アンモニウム濃度の関数として測定することによってｍＡｂ自己相互作用を評価するアプローチである。
【００３６】
他の特定の実施形態では、説明された方法を使用して分離可能な混合物中の抗体は、以下の方法のうちの１つ以上、すなわち、配列および他の既知のタンパク質構造に基づくタンパク質構造または構造的モデル化、タンパク質配列に基づいて算出されるタンパク質全体電荷、タンパク質配列に基づいて算出される疎水性、タンパク質シーケシングのうちの１つ以上によって判定されるように、類似のサイズまたは全体電荷を有する。
【００３７】
特定の実施形態において、混合物中の抗体は、配列および他の既知のタンパク質構造に基づいて、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同タンパク質構造または構造モデルを有する。特定の実施形態において、混合物中の抗体は、互いの３、４、または５、１０、または１５基本単位以内の算出されたタンパク質電荷特性を有し、タンパク質電荷特性は、タンパク質配列に基づいて算出される。特定の実施形態において、混合物中の２つ以上の抗体は、それらのタンパク質配列間で少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。
【００３８】
一態様において、本明細書に開示されるようなＨＩＣ−ＨＰＬＣを用いて混合物中の抗体を定量する方法は、タンパク質構造、配列ベースの構造モデル、タンパク質配列、およびタンパク質構造の他の既知の態様によって算出または推定される抗体分子間に大きな差異がある場合、それほど有用ではない。抗体の疎水性プロファイルに差異がある場合、それでもＨＩＣ−ＨＰＬＣを使用する方法は、抗体種の分離を促進してもよい。
【００３９】
別の態様において、本明細書に開示されるようにＨＩＣ−ＨＰＬＣを使用して混合物中の抗体を定量する方法は、各抗体分子のタンパク質配列に基づいて算出される各抗体分子のタンパク質の全体電荷特性により算出／推定される抗体分子間に大きな差異がある場合、それほど有用ではない。抗体の疎水性プロファイルに差異がある場合、それでもＨＩＣ−ＨＰＬＣを使用する方法は、抗体種の分離を促進してもよい。
【００４０】
別の態様において、本明細書に開示されるようにＨＩＣ−ＨＰＬＣを使用して混合物中の抗体を定量する方法は、タンパク質電荷またはサイズを調べることによって算出／推定される抗体分子間に大きな差異がある場合、それほど有用ではない。抗体の疎水性プロファイルに差異がある場合、それでもＨＩＣ−ＨＰＬＣを使用する方法は、抗体種の分離を促進してもよい。
【００４１】
特定の実施形態において、混合物中の抗体の１つ以上はモノクローナル抗体である。特定の実施形態において、モノクローナル抗体の１つ以上はヒトモノクローナル抗体である。特定の実施形態において、抗体分子の２つ以上は同じアイソタイプのものである。特定の実施形態において、抗体分子の２つ以上は互いの変異体である。さらに特定の他の実施形態において、抗体分子の２つ以上は同じ抗原に結合する。ｍＡｂは、全抗体分子であってもよい。
【００４２】
特定の実施形態において、混合物は合剤組成物である。特定のさらなる実施形態において、合剤組成物は、ヒト患者における中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）の治療に有効である２つ以上のｍＡｂを含む。ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）に対する抗体は、例えば、米国特許出願公開第１４／７１７７６０号明細書および国際公開第２０１５／１７９５３５号（Ａ１）に開示されている。特定のさらなる実施形態において、合剤組成物は、ヒト患者におけるエボラ出血熱を治療するのに有効であるｍＡｂを含む。エボラウイルスに対する抗体は、例えば、２０１６年１月２５日に出願された米国特許出願公開第１５／００５３３４号明細書に開示されている。特定のさらなる実施形態において、合剤組成物は、ヒト患者における黄斑変性症の治療に有効なｍＡｂを含む。特定のさらなる実施形態において、合剤組成物は、米国特許仮出願第６２／３０２９０７号明細書に開示されているｍＡｂアリロクマブおよびエビナクマブを含む。特定の実施形態において、合剤組成物は、ＰＤ１抗体および他の免疫腫瘍抗体産物、例えば、二重特異性抗体を含む。（例えば、米国仮出願第６２／２７０７４９号明細書、米国特許出願公開第１５／３８６４４３号明細書、および米国特許出願公開第１５／３８６４５３号明細書におけるＰＤ−１およびＣＤ３ｘＣＤ２０の開示、および米国仮出願第６２／３６５００６号明細書および米国特許出願公開第１５／２８９０３２号明細書におけるＰＤ−１およびＬａｇ３の開示を参照。）特定の実施形態において、合剤組成物は抗ジカウイルス抗体を含む。（例えば、米国仮出願第６２／３６３５４６号明細書を参照。）特定のさらなる実施形態において、合剤組成物はトレボグルマブおよびアクチビンＡ抗体を含む。（例えば、米国特許第８８７１２０９号明細書を参照。）特定の実施形態において、合剤組成物中の２つ以上の抗体は、ヒト患者における感染症を治療することができる。本段落における上記に引用した特許文献のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
合剤中の抗ＭＥＲＳ  ｍＡｂは、例えば、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのスパイクタンパク質（例えば、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ単離物ＥＭＣ／２０１２のスパイクタンパク質）に結合してもよい。スパイクタンパク質のエピトープは、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦＳ８８９３６．１のアミノ酸３６７〜６０６から選択されるアミノ酸）内であってもよい。合剤組成物中の抗ＭＥＲＳ  ｍＡｂは、ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質に結合する完全ヒトモノクローナル抗体、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦＳ８８９３６．１のアミノ酸残基３６７〜６０６から選択されるＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン内の１つ以上のアミノ酸残基と相互作用するもの、表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、１８．５ｎＭ未満の解離定数（Ｋｏ）でＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質に結合するもの、またはＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質のジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）への結合を９０％超ブロックするものであってもよい。
【００４４】
合剤組成物は、同じまたは異なる標的に対する２つ以上の抗体を含む任意の組成物であってもよく、ヒト患者を含む患者における同じまたは異なる疾患または状態を治療するのに有効である。
【００４５】
医薬組成物および製剤
２つ以上の抗体分子を含有する組成物は、被験者に投与するための医薬組成物（例えば、ＤＰ）として配合されてもよい。医薬組成物は、例えば３つの抗体分子を含むことができる。任意の好適な医薬組成物および製剤、ならびに製剤化に適切な方法および好適な経路および好適な投与部位は、本発明の範囲内である。また、特に明記しない限り、任意の好適な投与量および投与頻度が検討される。
【００４６】
合剤中のｍＡｂは、同時投与される前に当該分野で公知の方法によって精製される。２つ以上の抗体の合剤は、任意の好適な合剤であってもよい。
医薬組成物／合剤は、薬学的に許容される担体（すなわち、賦形剤）を含んでもよい。「薬学的に許容される担体」とは、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、希釈剤、流動促進剤などを称し、これらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含むことができる（例えば、ベルジュ（Ｂｅｒｇｅ）ら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、第６６巻、１〜１９ページ（１９７７年）を参照）。組成物は、スクロースを含むことができ、あるいは適切な場合にはコーティングされうる。
【００４７】
特定の実施形態において、タンパク質組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、凍結乾燥ケーキ、固体などとして安定化および配合することができる。無菌注射用溶液は、必要に応じて２つ以上のｍＡｂを必要量で上に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。全体的に、分散液は、基本的な分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに２つ以上のｍＡｂ分子を組み込むことによって調製される。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる試薬、例えば、モノステアリン酸塩、およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【００４８】
実施例
本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、説明の目的のためのみであり、そして本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【００４９】
実施例１および３〜７において使用された合剤中の抗エボラｍＡｂは、全部の、完全なヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。３つのｍＡｂ（ｍＡｂ  Ａ、ｍＡｂ  Ｂ、およびｍＡｂ  Ｃ）は、類似の分子量（例えば、約１４５ｋＤａ）、タンパク質構造、および電荷特性（例えば、タンパク質配列によって判定される場合、約０．６以下のｐＩの差異）を有する。ｍＡｂ  Ａの等電点（ｐＩ）は９．０であると判定され、ｍＡｂ  ＢのｐＩは８．５であると判定され、ｍＡｂ  ＣのｐＩは９．１であると判定される。
【００５０】
実施例２で使用した合剤中の抗ＭＥＲＳ  ｍＡｂは、全部の、完全なヒト抗エボラｍＡｂである。２つのｍＡｂは、類似の分子量（例えば、互いに約１５ｋＤａ以内）および電荷特性を有する。（米国特許出願公開第２０１５／０３３７０２９号明細書、国際公開第２０１５／１７９５３５号（Ａ１）、および米国特許出願公開第１４／７１７７６０号明細書を参照し、それぞれの開示内容は、参照により本明細書に組み込まれている。）
実施例１
ＨＩＣ−ＨＰＬＣ法を用いて、最初に３つのｍＡｂを合剤から分離し、次に抗体をそれぞれ定量することによって、合剤から類似の分子量、タンパク質構造、および電荷特性を有する３つの抗エボラモノクローナル抗体（ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、およびｍＡｂ３）を定量する。
【００５１】
Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＨＩＣ−１０カラム、カタログ番号０６３６５５（Ｄｉｏｎｅｘ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、サニーベール、ＣＡ）、４．６×１００ｍｍを使用する。
【００５２】
移動相の調製
移動相は、移動相Ａおよび移動相Ｂを含む。移動相Ａは、７．０のｐＨで１Ｍのリン酸アンモニアおよび１００ｍＭのリン酸を含む。移動相Ａの調製は、１３．８ｇのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物（ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ）および１３２．１ｇのリン酸アンモニアを８００ｍＬのＭｉｌｌｉＱに溶解することと、５０％ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整することと、容量を１０００ｍＬにすることと、０．２２μＭフィルタを通して溶液を濾過することとを含む。移動相Ｂは、７．０のｐＨで１００ｍＭのリン酸塩を含む。移動相Ｂの調製は、１３．８ｇのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物（ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２０）を９００ｍＬのＭｉｌｌｉＱに溶解することと、５０％ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整することと、容量を１０００ｍＬにすることと、０．２２μＭフィルタを通して溶液を濾過することとを含む。
【００５３】
ＨＩＣ−ＨＰＬＣ法
ＨＩＣ−ＨＰＬＣは、０．５ｍＬ／分の流速で上記カラムを流動させる。カラム温度は３０℃に保ち、合剤試料温度は５℃である。カラムの停止時間は４０分である。流出液の２８０ｎｍ紫外線の吸光度を、ＵＶ検出器を用いて監視する。以下の表１は、カラム分析時間にわたって導入される移動相組成勾配の割合として移動相Ａおよび移動相Ｂの混合を示す。
【００５４】
2019529350.tif 000003
３つの個々のｍＡｂによる較正
３つの個々のｍＡｂについての結果を較正するために、ＦＤＳ中の既知量の各ｍＡｂが分析される。既知濃度の各ｍＡｂを有するＦＤＳを調製し、濃度を逆相（ＲＰ）クロマトグラフィまたはＳｏｌｏ  ＶＰＥ（登録商標）分光法（例えば、シーテクノロジーズ社）のいずれかによって測定する。各ｍＡｂの既知のＦＤＳは次のとおりである。
【００５５】
2019529350.tif 000004
較正シーケンス用の対照試料も用意されている。対照配列は、Ｓｏｌｏ  ＶＰＥ（登録商標）分光法（例えば、シーテクノロジーズ社）によって測定されるように５０．３１ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。対照試料の１回の注入は１２．０μＬ（６０３．７２μｇ）である。
【００５６】
以下の表２は、ｍＡｂ  ＦＤＳのそれぞれの使用された較正試料を列挙する。
【００５７】
2019529350.tif 000005
較正シーケンスが実行される。較正シーケンス中、ｍＡｂ  ＦＤＳの２０〜２４回の注入毎に、および各注入シーケンスの終わりに、対照試料の１回の注入が各サンプルセットの始めに導入される（例えば、ｍＡｂ１ＦＤＳ注入のセット、ｍＡｂ２ＦＤＳ注入のセット、またはｍＡｂ３ＦＤＳ注入のセット）。
【００５８】
１回の較正シーケンスの間に、既知量の各ｍＡｂの１回の注入が行われる。別の較正シーケンスの間に、既知量の各ｍＡｂの４回の注入が注入の再現性を判定するために行われる。
【００５９】
各ｍＡｂについて標準検量線を作成する。各ｍＡｂの検量線は、Ｒ２≧０．９９９を有し、同量の各ｍＡｂの反復注入の変動性は≦１％である。
対照仕様
既知の各ｍＡｂ  ＦＤＳの対照ＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析を行う。既知の各ｍＡｂ  ＦＤＳの回収率は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにより濃度を測定し、次いでＨＩＣ−ＨＰＬＣにより測定された濃度を表２の既知ｍＡｂ濃度で割ることにより算出される。回収率は、３つの既知ｍＡｂ  ＦＤＳのすべてについて既知濃度の９０〜１１０％であると算出されている。
【００６０】
未知の試料
合計６００μｇのｍＡｂ（例えば、１２μＬの５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ試料）を有するサンプル合剤をＨＩＣ−ＨＰＬＣに流す。例えば、合計６００μｇのｍＡｂを含む１２μＬの合剤には、２００μｇ／注入の個々のｍＡｂを３回注入するのと同じ量が含まれる。合剤中の個々のｍＡｂは、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、およびｍＡｂ３である。
【００６１】
試料の２連の分析を行い、そして合剤中の個々のｍＡｂの平均濃度（ｍｇ／ｍＬ）および各ｍＡｂ対ｍＡｂの総量の比を報告する。
図１は、この合剤のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析を示すクロマトグラフである。各ｍＡｂは、別々の線で描かれており、ｃＦＤＳも全体として線で描かれている。３つの抗体は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにより十分に分離されており、ピークはほとんど重複しない。
【００６２】
実施例２
複数のＨＩＣ−ＨＰＬＣ法を用いて、最初に２つのｍＡｂを合剤から分離し、次にそれらをそれぞれ定量することによって、合剤から類似の分子量および電荷特性を有する２つの抗ＭＥＲＳモノクローナル抗体を定量する。
【００６３】
ｍＡｂ原薬
２つのｍＡｂ（ｍＡｂ１およびｍＡｂ２）原薬が組み合わされる。ｍＡｂ１原薬は、ｐＨ５．５の５２．３ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ１および１０ｍＭ  Ｈｉｓを含む（リジェネロンファーマシューティカルズ社、タリータウン、ＮＹ）。ｍＡｂ２原薬は、ｐＨ６．０の４０．４ｍｇ／ｍｌ  ｍＡｂ２および１０ｍＭ  Ｈｉｓを含み、５％（ｗ／ｖ）スクロース（リジェネロンファーマシューティカルズ社、タリータウン、ＮＹ）を含む。
【００６４】
ＨＩＣ−ＨＰＬＣ法
７つのＨＩＣ−ＨＰＬＣ法が行われる。それぞれの方法において、５０μｇ（ｍＡｂ１およびｍＡｂ２）の試料をロードする。流出液を２８０ｎｍのＵＶ検出を用いて監視する。移動相には、２種類の溶媒がさまざまな割合で使用される。溶媒ＡはｐＨ５．５の１Ｍ（ＮＨ４）ＳＯ４  ２０ｍＭ酢酸塩であり、溶媒ＢはｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸塩である。
【００６５】
１．  方法１
【００６６】
2019529350.tif 000006
図２は、この分析のクロマトグラフを示す。２つの抗体は、多少離れているが、かなり重複している。
【００６７】
２．  方法２  １分あたり０．５％
【００６８】
2019529350.tif 000007
図３は、この分析のクロマトグラフを示す。２つの抗体は、多少離れているが、かなり重複している。
【００６９】
３．  方法３  １分あたり０．２％
【００７０】
2019529350.tif 000008
図４は、この分析のクロマトグラフを示す。２つの抗体は、多少離れているが、かなり重複している。
【００７１】
４．  方法４  １分あたり２％
【００７２】
2019529350.tif 000009
図５は、この分析のクロマトグラフを示す。２つの抗体は、多少分離されているが、それでも多少の重複を有する。
【００７３】
５．  方法５  １分あたり１％
【００７４】
2019529350.tif 000010
図６は、この分析のクロマトグラフを示す。２つの抗体は、多少分離されているが、多少の重複を有する。
【００７５】
６．  方法６  １分あたり１％
【００７６】
2019529350.tif 000011
図７は、この分析のクロマトグラフを示す。２つの抗体は、多少分離されているが、多少の重複を有する。
【００７７】
７．  方法７  １分あたり０．５％
【００７８】
2019529350.tif 000012
図８は、この分析のクロマトグラフを示す。２つの抗体は、多少分離されているが、多少の重複を有する。
【００７９】
実施例３
類似の分子量、タンパク質構造、および電荷特性を有する３つの抗エボラｍＡｂを含んだ合剤のＨＩＣ分離を開発し、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣシステムで評価する。
【００８０】
ＨＩＣ−ＨＰＬＣ法は、二液型移動相（移動相Ａ（１００ｍＭリン酸、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０）および移動相Ｂ（１００ｍＭリン酸、ｐＨ７．０）を含む）を有するＤｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＨＩＣ−１０カラムを０．５ｍＬ／分の流速で使用する。ＨＩＣ法は、各ｍＡｂについて５点の検量線を使用して認定されている。正確度（回収率）は、測定された濃度を各ｍＡｂの理論濃度と比較することによって判定される。６００〜０ｍＭの硫酸アンモニウムの勾配を使用してカラムを分析する。
【００８１】
図９は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析のクロマトグラフを示す。３つの異なるピークから分かるように、３つの抗体はよく分離されており、それらのピークはほとんどまたは全く重複していない。
【００８２】
ＨＩＣ−ＨＰＬＣの再現性と精度
再現性は、目標量の７５％、１００％、１２５％、１５０％の３組でｃＦＤＳの試料を解析することによって評価される（６００μｇ／ｃＦＤＳの注入）。再現性の相対標準偏差（ＲＳＤ）は、≦０．２％と判定されている。
【００８３】
2019529350.tif 000013
再現性試験は、異なるロットのカラムと異なるバッチの移動相とを使用して、異なる日に繰り返される。中間精度のＲＳＤは、≦１．７％と判定されている。
【００８４】
2019529350.tif 000014
ＨＩＣ−ＨＰＬＣの線形性
線形性は、ｃＦＤＳ試料の試料を９段階（７５〜１２００μｇのｃＦＤＳ、２５〜４００μｇの個々のｍＡｂ）で３回解析することによって判定される。注入量に対する個々のｍＡｂのピーク面積のプロット（図１０）は、以下の線形曲線をもたらす。７５〜３００μｇでは、Ｒ２≧０．９９９、２５〜４００μｇでは、Ｒ２≧０．９８である。
【００８５】
ＨＩＣ−ＨＰＬＣの範囲
範囲は、この方法が許容可能な精度（≦１．７％）、正確度（９３〜１０６％の回収率）および直線性（Ｒ２≧０．９９９）を実証することができる最低濃度と最高濃度との間の間隔である。範囲は、ｃＦＤＳ試料で３００〜９００μｇ（個々のｍＡｂについて１００〜３００μｇ）と判定されている。図１１は、ｍＡｂの回収率対個々のｍＡｂの量のプロットである。
【００８６】
異なるｃＦＤＳのロットにわたるＨＩＣ−ＨＰＬＣの正確度
日内精度および日間精度（ｃＦＤＳロット＃１）、および範囲調査（ｃＦＤＳロット＃２）から得られたデータを使用して方法の正確度を評価する。図１２は、個々のｍＡｂの量に対するｍＡｂの回収率のプロットである。回収率は、目標量の７５％、１００％、１２５％、１５０％で９３〜１０６％以内である（６００μｇの総タンパク質、２００μｇの各ｍＡｂ）。正確度（回収率）は、９３％〜１０６％であると判定されている。
【００８７】
ｃＦＤＳ中の個々のｍＡｂのさまざまな比率にわたるＨＩＣ−ＨＰＬＣの正確度
ＣＦＤＳは、個々のｍＡｂの１：１：１、２：１：１、１：２：１、１：１：２混合によって配合される。各ｃＦＤＳは、目標量の１００％（６００μｇ／注入、ｎ＝３）で解析される。図１３は、異なるｃＦＤＳ比における個々のｍＡｂに対するｍＡｂの回収率である。回収率は、９４〜１０６％以内であり、再現性は、≦０．３％である。
【００８８】
2019529350.tif 000015
合剤開発におけるＨＩＣ−ＨＰＬＣの応用
合剤またはＤＰ中のｍＡｂのそれぞれを定量するためのＨＩＣ−ＨＰＬＣの使用は、合剤開発において様々な用途を有してもよい。例えば、合剤またはＤＰ中の各ｍＡｂの濃度は、貯蔵安定性試験において監視されてもよい。
【００８９】
図１４は、ＤＰ中の３つのｍＡｂの貯蔵安定性を時間（月）の関数として監視するチャートである。ＨＩＣ−ＨＰＬＣを用いて、１年間にわたる６時点で３つのｍＡｂのそれぞれの量、従って濃度を定量する。この研究におけるある時点からの例示的なデータポイントの組は、１６．６ｍｇ／ｍＬでのｍＡｂ  Ａの濃度、１７．５ｍｇ／ｍＬでのｍＡｂ  Ｂの濃度、および１７．１ｍｇ／ｍＬでのｍＡｂ  Ｃの濃度の測定を含む。この場合には、貯蔵安定性は、監視された期間にわたって、ｍＡｂのそれぞれの濃度（≦４％）に明らかな変化がないことを示している。
【００９０】
ＨＩＣ−ＨＰＬＣ法は、１００〜３００μｇ（個々のｍＡｂ）の範囲で、許容可能な再現性（≦０．２％）、中間精度（≦１．７％）、正確度（９３％〜１０６％回収率）、線形性（Ｒ２≧０．９９９）を有し、ｃＦＤＳおよびＤＰ中の３種類のｍＡｂのそれぞれの濃度を判定するために使用できる。
【００９１】
ＨＩＣ−ＨＰＬＣ法は、共配合ＤＳおよびＤＰ中の３つのｍＡｂのそれぞれを定量するための放出方法として使用することができる。この方法は、配合開発を支援するためにも使用できる。
【００９２】
実施例４
類似の分子量、タンパク質構造、および電荷特性を有する３つの抗エボラｍＡｂを含んだ合剤の陽イオン交換超高圧液体クロマトグラフィ（ＣＥＸ−ＵＰＬＣ）分離を開発し、評価する。
【００９３】
ＣＥＸ−ＵＰＬＣ法は、２００ｍＭのＭＥＳ緩衝液およびｐＨ６．５の１０〜１２０ｍＭのＮａＣｌ勾配を含んだ移動相を有するＹＭＣ−ＢｉｏＰｒｏ  ＳＰ−Ｆカラムを使用する。３つのｍＡｂ分子（ｍＡｂ  Ａ、ｍＡｂ  Ｂ、ｍＡｂ  Ｃ）のそれぞれについて６点標準検量線を作成する。各検量線の線形性は、Ｒ２≧０．９９を有するように判定される。３つのｍＡｂ分子は、ＣＥＸ−ＵＰＬＣを用いて合剤（すなわち混合物）から分離され、そしてＵＰＬＣのクロマトグラフが生成される。クロマトグラフは、ｍＡｂ  ＡとｍＡｂ  Ｃとの間にいくらかの重複がある各ｍＡｂの分離を示す。
【００９４】
この方法の再現性は、合剤試料を３つの異なる量（１５０μｇ、２２５μｇ、および３００μｇ）で３回解析することによって評価される。正確度（回収率）は、各試料の測定濃度を理論値と比較することによって判定される。各ｍＡｂの直線的な定量範囲は、ｍＡｂ  Ａを除いて、各抗体について５０〜１００μｇであると判定され、Ｒ２≧０．９７３および７５％〜９１％の正確度である。
【００９５】
図１５は、合剤からの３つのｍＡｂの分離のＣＥＸ−ＵＰＬＣ分析のクロマトグラフを示す。３つの抗体は、ｍＡｂ  ＡとｍＡｂ  Ｃとの間にわずかな重複を伴って分離される。
【００９６】
ＣＥＸ−ＵＰＬＣの再現性および正確度
再現性は、ｃＦＤＳの試料を目標量の５つの異なる割合（２５％〜１００％）（６００μｇ／注入のｃＦＤＳ）で３回解析することによって評価される。再現性のＲＳＤは、３．７％〜２１．４％の間であると判定される。
【００９７】
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ＣＥＸ−ＵＰＬＣの線形性
再現性試験のデータを使用して、ＣＥＸ−ＵＰＬＣ法の範囲と線形性を評価する。注入量に対する個々のｍＡｂのピーク面積のプロット（図１６）は、一般に、各ｍＡｂについて線形曲線をもたらす。ただし、ｍＡｂのＲＳＤは１０％を超えるため、１００μｇでのｍＡｂ  Ａのデータポイントは、ｍＡｂ  Ａには１００μｇまで伸びる直線曲線が存在すると結論づけるのに十分なほど統計的に有意ではない。
【００９８】
ＣＥＸ−ＵＰＬＣの範囲
総抗体量が１５０〜３００μｇのｃＦＤＳ試料では、再現性（ＲＳＤ≦１０％）、正確度（＞８０％）、および線形性（Ｒ２≧０．９７）が示される。しかしながら、ＣＥＸ−ＵＰＬＣの範囲は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣの場合ほど明確には示されていない。
【００９９】
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ＣＥＸ−ＵＰＬＣ法では、いくつかの重複を有するそれらの電荷特性に基づいて３つのｍＡｂを分離する。重複は、方法の手動統合が必要であることを意味する。ＣＥＸ−ＵＰＬＣの精度、正確度、および範囲は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣほど最適ではない。
【０１００】
実施例５
類似の分子量を有する３つの抗エボラｍＡｂを含んだ合剤のＳＥ−ＵＰＬＣを評価する。ＳＥ−ＵＰＬＣは、サイズによってｍＡｂを分離する。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ  ＵＰＬＣシステムが使用される。２つのＷａｔｅｒｓ  ＢＥＨ２００  ＳＥＣカラムが直列にリンクされている。移動相は、ｐＨ６．０の１０ｍＭリン酸緩衝液、および１Ｍ過塩素酸塩を含む。図１７は、ＳＥ−ＵＰＬＣのクロマトグラムである。図示されるように、３つのｍＡｂの溶出時間の間には有意な重複がある。よって、ＳＥ−ＵＰＬＣは、類似の分子量の３つの抗ＭＥＲＳ  ｍＡＢを分離するための次善の方法である。
【０１０１】
実施例６
類似の分子量、タンパク質構造、および電荷特性を有する３つの抗エボラｍＡｂを含んだ合剤のｉＣＩＥＦを評価する。ｉＣＩＥＦは、タンパク質を等電点（ｐＩ）で分離する。ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ｉＣＥ３電荷変異体分析器を使用する。両性電解質として４％ｐＨ３〜１０Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（登録商標）を使用し、緩衝液として２Ｍ尿素を使用する。図１８は、これらの仕様を使用して生成されたｉＣＩＥＦプロファイルを示す。図示されるように、ｍＡｂ  ＡとｍＡｂ  Ｃとの溶出時間の間に有意な重複がある。よって、ｉＣＩＥＦは、３つの抗ＭＥＲＳ  ｍＡＢを分離するための次善の方法である。
【０１０２】
実施例７
類似の分子量の、タンパク質構造、および電荷特性を有する３つの抗エボラｍＡｂを含んだ合剤のＲＰ−ＵＰＬＣを評価する。ＲＰ−ＵＰＬＣは、疎水性によってｍＡｂを分離する。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムが使用される。ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ−Ｃ８カラムを使用し、カラムを８０℃で分析する。移動相は、０．１％ＴＦＡ中６０〜９０％アセトニトリルを含む。図１９は、ＲＰ−ＵＰＬＣのクロマトグラムを示す。図示されるように、ｍＡｂ  ＡとｍＡｂ  Ｂとの溶出時間の間に有意な重複がある。よって、ＲＰ−ＵＰＬＣは、類似の分子量の３つの抗ＭＥＲＳ  ｍＡＢを分離するための次善の方法である。
【０１０３】
実施形態
前述の説明は、本発明の例示的な実施形態のみを開示している。
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、例示を意図したものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、添付の特許請求の範囲内にある。よって、本発明の特定の特徴のみを図示し説明してきたが、当業者には多くの修正および変更が想起されよう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨の範囲内に入るようなすべてのそのような修正形態および変更形態を網羅するように意図されていることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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