(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は分化能と活性を維持しながら癌細胞の増殖を抑制する癌治療用間葉幹細胞の培養培地組成物及び前記組成物を用いた癌治療用間葉幹細胞の製造方法に係り、より詳しくはビタミンＣとアスピリンを含む改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞製造用培地組成物及び前記組成物を用いた癌治療用間葉幹細胞の製造方法に関する。
2019526277.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスピリンを含む、改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞を製造するための培地組成物。
【請求項２】
ビタミンＣをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の培地組成物。
【請求項３】
５〜１０％ＦＢＳ及びＮＡＣ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎ）を含むＤＭＥＭ又はＫ−ＳＦＭであることを特徴とする、請求項１に記載の培地組成物。
【請求項４】
カルシウム、ｒＥＧＦ、インスリン及びヒドロコルチゾンをさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の培地組成物。
【請求項５】
前記間葉幹細胞は、脂肪、子宮、骨髓、筋肉、胎盤、臍帯血、小便、毛嚢及び皮膚からなる群から選択された組職来由のものであることを特徴とする、請求項１に記載の培地組成物。
【請求項６】
前記アスピリンの濃度は０．１ｍＭ〜１ｍＭであることを特徴とする、請求項１に記載の培地組成物。
【請求項７】
前記癌細胞は乳房癌、膵膓癌、神経膠腫、神経膠肉腫、 逆形成性星細胞腫 、髄芽細胞腫、肺癌、小細胞肺癌種、子宮頸癌、結腸癌、直膓癌、軟骨腫、咽喉癌、カポシ肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、白血病、前立腺癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、精巣癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、膀胱癌、血管肉腫、内皮肉腫、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、気管支癌、髄様癌、肥満細胞腫、中皮腫、滑膜腫、黒色腫、平滑筋腫、横紋筋腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、乏突起膠腫、聴神経腫、血管芽細胞腫、髄膜腫、松果体腫、上衣細胞腫、頭蓋咽頭腫、上皮癌、胎生期癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、線維肉腫、粘液腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫細胞又は癌幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の培地組成物。
【請求項８】
アスピリンを含む培地で間葉幹細胞を培養する段階を含む、改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞の製造方法。
【請求項９】
前記培地はビタミンＣをさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記培地は５〜１０％ＦＢＳ及びＮＡＣ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎ）を含むＤＭＥＭ又はＫ−ＳＦＭであることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１１】
カルシウム、ｒＥＧＦ、インスリン及びヒドロコルチゾンをさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記間葉幹細胞はビタミンＣで前処理されることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記間葉幹細胞は、脂肪、子宮、骨髓、筋肉、胎盤、臍帯血、小便、毛嚢及び皮膚からなる群から選択された組職来由のものであることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記アスピリンの濃度は０．１ｍＭ〜１ｍＭであることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記癌細胞は、乳房癌、膵膓癌、神経膠腫、神経膠肉腫、逆形成性星細胞腫、髄芽細胞腫、肺癌、小細胞肺癌種、子宮頸癌、結腸癌、直膓癌、軟骨腫、咽喉癌、カポシ肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、白血病、前立腺癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、精巣癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、膀胱癌、血管肉腫、内皮肉腫、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、気管支癌、髄様癌、肥満細胞腫、中皮腫、滑膜腫、黒色腫、平滑筋腫、横紋筋腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、乏突起膠腫、聴神経腫、血管芽細胞腫、髄膜腫、松果体腫、上衣細胞腫、頭蓋咽頭腫、上皮癌、胎生期癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、線維肉腫、粘液腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫細胞又は癌幹細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記培養の時間は２４時間であることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は活性を維持しながら癌細胞の増殖を抑制する癌治療用間葉幹細胞の培養培地組成物に係り、より詳しくはビタミンＣとアスピリンを含む、改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞を製造するための培地組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とは自己複製能を有するとともに二つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞を言い、全能幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、分化多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）及び多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）に分類することができる。
【０００３】
全能幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は一つの完全な個体に発生して行くことができる全能の性質を有する細胞であり、卵子と精子の受精後、８細胞期までの細胞がこの性質を有し、この細胞を分離して子宮に移植すれば一つの完全な個体に発生して行くことができる。
【０００４】
分化多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は外胚葉、中胚葉、内胚葉来由の多様な細胞と組職で発生することができる細胞であり、受精４〜５日後に現れる胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の内側に位置する内細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）から由来し、これを胚幹細胞と言い、多様な他の組職細胞に分化するが新しい生命体を形成することはできない。
【０００５】
多能性（又は多分化能）幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）はこの細胞が含まれている組職及び器官に特異的な細胞にだけ分化することができる幹細胞であり、胎児期、新生児期及び成体期の各組職及び臓器の成長と発達はもちろんのこと、成体組職の恒常性維持と組職損傷時に再生を誘導する機能に関与しており、組職特異的多能性細胞を総称して間葉幹細胞と言う。
【０００６】
間葉幹細胞（Rebecca S. Y. Wong, et al., J Biomed Biotechnology 24:2011, 2011）は心臓疾患、骨形成不全症及び脊髄損傷のような多様な疾病状態で細胞に基づく治療に使われて来たし、その結果が注目されている。また、最近には、小便来由の幹細胞を用いた細胞に基づく治療及び再生医学に関する研究（Bharadwaj et al., Stem Cells. 31(9):1840-56, 2013; Zhang D et al., Genes Dis. 1(1):8-17, 2014; Guan et al., Tissue Eng, 20(13-14):1794-806, 2014）も進んでいる。
【０００７】
しかし、一部の研究ではＭＳＣ治療の副作用の報告がある。特に、いくつかの研究で腫瘍への変異及び悪性変異によって腫瘍の成長と転移が早く進むことを確認したし、坑癌薬物に耐性を現した。さらに、多様な研究で間葉幹細胞の自発的悪性変化として現れたことが分かった。
【０００８】
一方、“癌”とは‘制御されない細胞成長’と特徴付けられ、このような異常的な細胞成長によって腫瘍（ｔｕｍｏｒ）と呼ばれる細胞塊が形成されて周囲の組職に侵透し、ひどい場合には身体の他の器官に転移することもある。学問的には新生組織形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）とも呼ばれる。
【０００９】
癌を治療するための方法としては、手術療法、放射線療法及び抗癌剤を投与する化学療法などがある。抗癌剤は無制限に増殖する癌細胞に作用して癌細胞の増殖と成長を抑制させる薬物である。現在広く使われているシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）又はシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）などのアルキル化抗癌剤はＤＮＡの構成成分であるヌクレオチド内の窒素と共有結合して坑癌作用を現し、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）は核酸の生合成に関与する酵素を抑制するか、ＤＮＡ又はＲＮＡに直接挿入されて活性を現すことになる。
【００１０】
また、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）などの抗生物質（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）はＤＮＡに力強く作用してＤＮＡ固有の機能を抑制して坑癌効果を現す。しかし、これらの抗癌剤は腫瘍細胞だけではなく正常細胞、特に生体細胞のうち早い増殖と分化をする骨髓細胞（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ）又は腸上皮細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｃｅｌｌ）にも作用して、妊娠中毒症、嘔吐及び神経毒性などのさまざまな副作用を伴う欠点がある。
【００１１】
さらに、腫瘍内で癌幹細胞は、他の癌細胞とは違い、休止期状態にとどまっており、転移癌細胞に比べて攻撃性が少ない形態を示す。よって、抗癌剤の攻撃から排除されて生き残るので、腫瘍内に存在する一般癌細胞の死滅を誘導することだけでは腫瘍を完全に除去することができない。
【００１２】
したがって、本発明者らは抗癌剤などの副作用を克服することができる間葉幹細胞を用いた癌治療剤を開発するために鋭意努力した結果、アスピリン（Ａｓｐｉｒｉｎ）、ビタミンＣ（Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ）などを添加した培地で間葉幹細胞を培養する場合、このように製造された間葉幹細胞が細胞の活性を維持しながら癌細胞の増殖を抑制する効果を確認して本発明を完成することになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、ビタミンＣとアスピリンを含む改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞を製造するための培地組成物及び前記培地で間葉幹細胞を培養して改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明は、アスピリンを含む改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞を製造するための培地組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、アスピリンを含む培地で間葉幹細胞を培養する段階を含む、改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞を製造する方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、アスピリンを含む幹細胞製造用培地組成物を、改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞の製造のために使用する用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣに対するアスピリン濃度による毒性を分析した図である。
【図２】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの形態を示した図である。
【図３】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの増殖率、生存率及び細胞大きさを示した図である。
【図４】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣのＣＦＡ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙ）結果を写真で示した図である。
【図５】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣのコロニー形成能を測定した図である。
【図６】アスピリンが添加されなかった対照群培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣのＣＤマーカー発現をＦＡＣＳで分析した図である。
【図７】０．１ｍＭアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣのＣＤマーカー発現をＦＡＣＳで分析した図である。
【図８】０．５ｍＭアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣのＣＤマーカー発現をＦＡＣＳで分析した図である。
【図９】１ｍＭアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣのＣＤマーカー発現をＦＡＣＳで分析した図である。
【図１０】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの脂肪細胞への分化能をＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色で確認した図である。
【図１１】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの脂肪細胞への分化程度を吸光度５２０ｎｍで測定した図である。
【図１２】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの骨細胞への分化能をＡｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓ染色で確認した図である。
【図１３】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの骨細胞への分化程度を吸光度５６０ｎｍで測定した図である。
【図１４】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣとＭＣＦ−７癌細胞を癌細胞培養培地で直接共培養した後、癌細胞の分布をＦＡＣＳで確認した後、総細胞数のうち癌細胞を計算して示した図である。
【図１５】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣとＰＡＮＣ−１癌細胞を癌細胞培養培地で直接共培養した後、癌細胞の分布をＦＡＣＳで確認した後、総細胞数のうち癌細胞を計算して示した図である。
【図１６】０．５ｍＭアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣと乳房癌ＭＣＦ−７又は膵膓癌ＰＡＮＣ−１癌細胞を癌細胞培養培地で直接共培養した後、癌細胞増殖抑制効果を確認した図である。
【図１７】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣとＭＣＦ−７癌細胞を癌細胞培養培地で間接共培養した後、癌細胞数を示した図である。
【図１８】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣとＰＡＮＣ−１癌細胞を癌細胞培養培地で間接共培養した後、癌細胞数を示した図である。
【図１９】０．５ｍＭアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣと乳房癌ＭＣＦ−７又は膵膓癌ＰＡＮＣ−１癌細胞を癌細胞培養培地で間接共培養した後、癌細胞増殖抑制効果を確認した図である。
【図２０】０．５ｍＭアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣとＰＡＮＣ−１癌細胞（ｒｅｄ）を癌細胞培養培地で直接共培養した後、０時間及び４８時間の蛍光燎微鏡写真である。
【図２１】０．１、０．５及び１ｍＭ濃度のアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣにおいてＦａｓ  Ｌの発現を実時間ＰＣＲで定量して示した図である。
【図２２】０．１、０．５及び１ｍＭ濃度のアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣにおいてＴＲＡＩＬの発現をＲＴ−ＰＣＲで比較して示した図である。
【図２３】０．５ｍＭアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣにおいてＦａｓ  Ｌ、ＴＲＡＩＬ及びＣＸＣＲ４の発現程度を比較して示した図である。
【図２４】０．１、０．５及び１ｍＭ濃度のアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣにおいてＶＥＧＦの発現を（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲで測定した後、（Ｂ）比較して示した図である（１：Ｖｉｔ．Ｃ  ＭＳＣ、２：０．１ｍＭ  ＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ  ＭＳＣ、３：０．５ｍＭ  ＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ  ＭＳＣ、４：１ｍＭ  ＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ  ＭＳＣ）。
【図２５】０．５ｍＭアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣにおいてＮｒｆ２、ｃ−ｍｙｃ及びｐ２１の発現程度を比較して示した図である。
【図２６】０．５ｍＭアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣにおいてＳｏｘ２、Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇの発現を比較して示した図である。
【図２７】０．５ｍＭアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣ（Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）と癌細胞培養条件で間接共培養した癌細胞においてＢｃｌ−２遺伝子の発現を分析した図である。
【図２８】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣ（Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）と癌細胞培養条件で間接共培養した癌細胞においてＰＰＡＲ−γ遺伝子の発現を分析した図である。
【図２９】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣ（Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）と癌細胞培養条件で間接共培養した癌細胞においてＡｐａｆ−１遺伝子の発現を分析した図である。
【図３０】アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣ（Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）と癌細胞培養条件で間接共培養した癌細胞においてＯｃｔ４遺伝子の発現を分析した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
他に定義しない限り、本明細書で使う全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野で熟練した専門家によって通常に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使う命名法はこの技術分野でよく知られており、通常に使うものである。
【００１９】
成体幹細胞は発生過程が進んで胚芽の各臓器が形成される段階又は成体段階で現れる幹細胞であり、組職及び器官に特異的な細胞にだけ分化することができる多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）を持っているものと知られている。このような組職特異的多分化能を有する幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）はこの細胞が含まれている組職及び器官に特異的な細胞にだけ分化することができる幹細胞であり、胎児期、新生児期及び成体期の各組職及び臓器の成長と発達はもちろんのこと、成体組職の恒常性維持と組職損傷時の再生を誘導する機能に関与している。
【００２０】
本発明では、成体幹細胞、好ましくは人間来由の成体幹細胞を使うことができる。
【００２１】
これは、脂肪、子宮、骨髓、筋肉、胎盤、臍帯血、小便又は皮膚（上皮）などの組職来由のものであり得る。好ましくは、脂肪組職又は毛嚢・羊膜などの上皮組職から得られる成体幹細胞を用いることができる。特に、間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）であることが好ましく、一番好ましくはヒト脂肪組職来由の間葉幹細胞（Ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ＡＴ−ＭＳＣｓ）である。
【００２２】
本発明の小便来由の幹細胞は自己再生能（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）及び多分化能を有し、間葉幹細胞マーカーを発現する。すなわち、内皮細胞、骨形成細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋肉細胞のような中胚葉細胞系及び尿路上皮細胞（ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）のような内胚葉細胞系に分化することができる。さらに、小便来由の幹細胞は高いテロメラーゼ活性及び長いテロメアを有するものと知られている（Bharadwaj et al., Stem Cells. 31(9):1840-56, 2013; Stem Cells: Current Challenges and New Directions Part of the series Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, 19-28: 2013）。
【００２３】
本発明で使う “幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）”と言う用語は自己複製能を有しながら二つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞を言い、“成体幹細胞”は発生過程が進んで胚芽の各臓器が形成される段階又は成体段階で現れる幹細胞を意味する。
【００２４】
本発明で使う“間葉幹細胞”と言う用語は人間又は哺乳類の組職から分離し出した未分化の幹細胞であり、多様な組職から由来することができる。特に、臍帯来由の間葉幹細胞、臍帯血来由の間葉幹細胞、骨髓来由の間葉幹細胞、脂肪来由の間葉幹細胞、筋肉来由の間葉幹細胞、神経来由の間葉幹細胞、皮膚来由の間葉幹細胞、羊膜来由の間葉幹細胞及び胎盤来由の間葉幹細胞であり得るし、各組職から幹細胞を分離する技術は当該分野に既に公知となっている。
【００２５】
本発明で使う“脂肪来由幹細胞”と言う用語は脂肪組職から分離し出した未分化の幹細胞であり、その分離方法は例えば次のようであり得る。すなわち、脂肪吸入術によって得られる生理食塩水に浮遊する脂肪含有サスペンションを培養した後、フラスコなどの培養容器に付着した幹細胞層をトリプシンで処理した後に回収するとか、スクレーパーで掻いて少量の生理食塩水に浮遊するものを直接回収するとかする方法などによって脂肪来由の間葉幹細胞を分離することができる。
【００２６】
このような“脂肪組職来由の成体幹細胞”又は“脂肪組職来由の間葉幹細胞”という用語は脂肪組職から分離し出した未分化の成体幹細胞であり、本明細書では縮約して“脂肪幹細胞”とも指称する。これは当該分野に公知となった通常の方法によって収得することができる。
【００２７】
前記脂肪幹細胞物の獲得に使われる培地としては、当該分野で幹細胞の培養に適すると知られている通常の培地を使うことができる。好ましくは、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）又はケラチノサイト−ＳＦＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ）を使うことができ、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ａ−ＭＥＭ（Ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｆ１２（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２）培地を混合した培地も使うことができるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
脂肪幹細胞培養用培地は脂肪幹細胞の未分化の表現型の増殖を促進しながら分化は抑制する添加剤で補充されることができる。また、培地は、一般に、等張液中の中性緩衝剤（例えば、リン酸塩及び／又は高濃度重炭酸塩）及びタンパク質栄養分（例えば、血清、例えば、ＦＢＳ、血清代替物、アルブミン、又は必須アミノ酸及び非必須アミノ酸、例えば、グルタミン）を含むことができる。さらに、脂質（脂肪酸、コレステロール、血清のＨＤＬ又はＬＤＬ抽出物）及びこの種類の大部分の保存液培地で発見されるその他の成分（例えば、インスリン又はトランスフェリン、ヌクレオシド又はヌクレオチド、ピルビン酸塩、任意のイオン化形態又は塩である糖原、例えば、グルコース、セレニウム、グルココルチコイド、例えば、ヒドロコルチゾン及び／又は還元剤、例えば、β−メルカプトエタノール）を含むことができる。
【００２９】
また、培地は、細胞が互いに癒着するとか、容器壁に癒着するとか、あまりにも大きな束を形成するとかすることを防止する目的で、抗凝集剤（ａｎｔｉ−ｃｌｕｍｐｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社で販売するものなど（Ｃａｔ  ＃  ００１００５７ＡＥ）を含むことが有益であり得る。
【００３０】
特に、本発明の一具体例で使われる脂肪幹細胞を収得又は培養するための培地は、ＤＭＥＭ、Ｄｅｆｉｎｅｄ  ケラチノサイト−ＳＦＭ、α−ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｆ１２及びＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる群から選択される基本培地、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸（ビタミンＣ）、牛胎児血清及びＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を含む間葉幹細胞培養のための培地組成物にアスピリンを含むものが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３１】
本発明において、前記培地は、０．０５〜１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、２〜２０％牛胎児血清、０．２〜２０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）及び０．１〜１ｍＭアスピリンを含むことを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
【００３２】
本発明は、一観点で、アスピリンを含む、改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞を製造するための培地組成物に関する。
【００３３】
本発明は、他の観点で、アスピリンを含む培地で間葉幹細胞を培養する段階を含む、改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞を製造する方法に関する。
【００３４】
本発明は、さらに他の観点で、アスピリンを含む幹細胞製造用培地組成物を、改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞の製造のために使用する用途に関する。
【００３５】
本発明で、前記培地はビタミンＣをさらに含むことが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３６】
本発明において、５〜１０％ＦＢＳ及びＮＡＣ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎ）を含むＤＭＥＭ又はＫ−ＳＦＭであることが好ましく、さらにカルシウム、ｒＥＧＦ、インスリン及びヒドロコルチゾンを含むことがより好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３７】
本発明において、前記間葉幹細胞はビタミンＣで前処理されたものが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３８】
本発明において、前記間葉幹細胞は、脂肪、子宮、骨髓、筋肉、胎盤、臍帯血、小便、毛嚢及び皮膚からなる群から選択された組職来由のものが好ましく、より好ましくは脂肪来由のものであるが、これに限定されるものではない。
【００３９】
本発明において、前記アスピリンの濃度は０．１ｍＭ〜１ｍＭであることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００４０】
本発明において、前記培養の時間は２４時間であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００４１】
本発明において、前記癌細胞は、神経膠腫、神経膠肉腫、未分化星状細胞腫、髄芽細胞腫髄芽細胞腫、肺癌、小細胞肺癌種、子宮頸癌、結腸癌、直膓癌、軟骨腫、咽喉癌、カポシ肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、白血病、前立腺癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、精巣癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、膀胱癌、血管肉腫、内皮肉腫、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、気管支癌、髄様癌、肥満細胞腫、中皮腫、滑膜腫、黒色腫、平滑筋腫、横紋筋腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、乏突起膠腫、聴神経腫、血管芽細胞腫、髄膜腫、松果体腫、上衣細胞腫、頭蓋咽頭腫、上皮癌、胎生期癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、線維肉腫、粘液腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫細胞又は癌幹細胞であることが好ましく、より好ましくは乳房癌又は膵膓癌であるが、これに限定されるものではない。
【００４２】
本発明は、さらに他の観点で、アスピリンを含む培地で間葉幹細胞を培養して製造した改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞を投与する段階を含む癌治療方法を提供する。
【００４３】
本発明は、さらに他の観点で、アスピリンを含む培地で間葉幹細胞を培養して製造した改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞を癌治療に使用する用途を提供する。
【００４４】
‘癌’とは制御されなかった細胞成長と特徴付けられ、このような異常的な細胞成長によって腫瘍（ｔｕｍｏｒ）と呼ばれる細胞塊が形成されて周囲の組職に侵透し、ひどい場合には身体の他の器官に転移することもある。
【００４５】
‘坑癌’という用語は、癌疾患の治療、すなわち癌細胞又は癌幹細胞の増殖を抑制するか癌細胞又は癌幹細胞を殺すだけではなく、癌疾患の予防、すなわち癌発病以前に癌に対する抵抗力を高めることも含むものと解釈される。よって、本明細書で“癌予防又は治療”又は“癌の増殖抑制”という用語と‘坑癌’という用語は混在して使った。
【００４６】
本発明において、“癌細胞”は正常細胞の増殖及び生長期前に遺伝的な変形によって異常的な細胞生長をし、転移と指称することができる攻撃的な他器官への移動性を有する細胞を含む。また、“癌幹細胞”は腫瘍内に存在するものと知られており、正常幹細胞の遺伝的な情報の異常的な転移によって発生すると思われている。癌幹細胞はそれが生存するための微細環境、ニッチ（ｎｉｃｈｅ）の存在によって維持及び増殖され、周辺に存在する正常細胞、免疫関連細胞又は分化した癌細胞がこれらの特性維持及び増殖に影響を及ぼすと知られている。
【００４７】
‘治療する’と言う用語は、他に言及しない限り、前記用語が適用される疾患又は疾病、あるいは前記疾患又は疾病の一つ以上の症状を逆転させるとか、緩和させるとか、その進行を抑制するとか、又は予防するとかすることを意味する。
【００４８】
本願で使ったように、‘治療’という用語は‘治療する’が前記のように定義される場合に治療する行為を言う。
【００４９】
したがって、哺乳動物における癌の“治療”又は“治療療法”は下記の一つ以上を含む。
【００５０】
（１）癌の成長を阻害する。すなわち、その発達を阻止する。
【００５１】
（２）癌の拡散を予防する。すなわち、転移を予防する。
【００５２】
（３）癌を軽減させる。すなわち、癌の退行を引き起こす。
【００５３】
（４）癌の再発を予防する。
【００５４】
（５）癌の症状を緩和する（ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）。
【００５５】
癌は、手術、放射線及び化学療法で治療しても多くの場合に根本的な治癒とならなくて患者に苦痛を与え、究極的には死に至らせる難治性晩成疾患である。去る数十年間の手術療法、化学療法（抗癌剤治療）、放射線療法などは多くの発展にもかかわらず、癌に対する究極的な解決策となることができない。
【００５６】
癌治療剤としての幹細胞は癌抑制及び癌促進の相反する報告がある。本発明ではこのような相反する効果が幹細胞の培養培地及び方法によって変わることを確認した。
【００５７】
本発明の一様態では、ビタミンＣ含有培地で培養された脂肪来由の間葉幹細胞を、アスピリンを含む培地で培養して、改善した癌細胞増殖抑制能を有する間葉幹細胞を製造した。すなわち、ビタミンＣを前処理して培養した脂肪来由の間葉幹細胞を、アスピリンを含む培地で培養して製造した坑癌機能を有する幹細胞であってもよく、ビタミンＣとアスピリンをともに含む培地で脂肪来由の間葉幹細胞を培養して製造した坑癌機能を有する幹細胞であってもよく、また、ビタミンＣを前処理して培養した脂肪来由の間葉幹細胞をビタミンＣとアスピリンをともに含む培地で培養して製造した坑癌機能を有する幹細胞であってもよい。本発明者はこのような細胞をいずれも“Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ”と名付けた。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例はひたすら本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないというのは当該分野で通常の知識を有する者に明らかであろう。
【００５９】
実施例１：ヒト脂肪組職来由の間葉幹細胞の分離
脂肪吸入術（Ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ）によって腹部脂肪から得られたヒト脂肪組職を分離してＰＢＳで洗浄した。組職を細く切った後、コラゲナーゼ型１（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  １）（１ｍｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ培地を用いて３７℃で２時間ダイジェスト（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した。ＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄み液は吸引し（ｓｕｃｔｉｏｎ）底に残ったペレットはＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００μｍメッシュでフィルタリングして屑を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸を含むＤＭＥＭ培地で培養した。
【００６０】
ひと晩の経過後、付着しなかった細胞はＰＢＳで洗浄し、ＲＫＣＭ−Ｎ培地である５％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸、０．０９ｍＭカルシウム、５ｎｇ／ｍｌ  ｒＥＧＦ、５μｇ／ｍｌインスリン及び７４ｎｇ／ｍｌヒドロコルチゾンを含むケラチノサイト（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）−ＳＦＭ培地を２日ごとに入れ替えながら継代培養して脂肪組職来由の多分化能間葉幹細胞を分離した。
【００６１】
前記のように分離した脂肪組職来由の多分化能間葉幹細胞はビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣであり、すなわちビタミンＣ前処理ＭＳＣであり、以後の実施例で使った。
【００６２】
以下の実施例で使用した各種の培地及び試薬の入手先は下記表１に記載した通りである。
【表１】
2019526277.tif 000003
【００６３】
実施例２：アスピリンのＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣに対する毒性評価
実施例１のビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを９６−ウェル細胞培養プレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｐｌａｔｅ濃度で接種した後、ひと晩培養して付着及び安定化させる。その後、ＲＫＣＭ−Ｎ培地である５％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸、０．０９ｍＭカルシウム、５ｎｇ／ｍｌ  ｒＥＧＦ、５μｇ／ｍｌインスリン及び７４ｎｇ／ｍｌヒドロコルチゾンを含むケラチノサイト−ＳＦＭにアスピリンをそれぞれ０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ及び１０ｍＭの濃度で添加した培地に交換した後、２４時間培養した。各ウェルにｃｃｋ−８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８、Ｄｏｊｉｎｄｏ）溶液（１０μｌ／１００μｌ）を添加して２時間反応させた後、Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＬｏｎＺａ）を用いて４５０ｎｍ吸光度値を測定した。
【００６４】
その結果、図１に示したように、アスピリン濃度５ｍＭ以下ではＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣに対して細胞毒性をほとんど現さないことが分かった。したがって、以下の分析では０．１〜１ｍＭ濃度のアスピリンを使った。
【００６５】
実施例３：アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの特性
実施例１のビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを２日間培養して付着及び安定化させた後、アスピリンをそれぞれ０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ及び１０ｍＭの濃度で添加したＲＫＣＭ−Ｎ培地に交換して２４時間培養した。
【００６６】
Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣのアスピリンによる細胞の形態を×１００倍率の電子燎微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩＬ）で確認し（図２）、増殖率、生存率及び細胞大きさをａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｌｕｎａ（Ｌｏｇｏｙ）を用いて分析（図３）した。
【００６７】
その結果、アスピリン濃度１ｍＭ以下は幹細胞の形態、増殖率、生存率及び細胞大きさに影響を及ぼさないことを確認した（図２及び図３）。
【００６８】
実施例４：アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）分析
４−１：ＣＦＡ（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙ）
ビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを２日間培養して付着及び安定化させた後、アスピリンをそれぞれ０．１ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭの濃度で添加したＲＫＣＭ−Ｎ培地に交換して２４時間培養した。その後、それぞれのアスピリン濃度別細胞３００個をＲＫＣＭ−Ｎ培地に混合して１００ｍｍ細胞培養トレイに接種した。２〜３日ごとに培地を交換しながら１０日間３７℃、５％ＣＯ２で培養した。１０日後、培地を除去し、０．１％クリスタルバイオレット試薬３ｍｌを添加して１０分間反応させた後、洗浄して乾燥した。形成されたコロニー数を測定し、形成能（ＰＥ）＝コロニー形成個数／総接種細胞数×１００％を計算した。
【００６９】
その結果、１ｍＭ濃度以下のアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣはコロニー形成能に変化がなく、幹細胞が幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を失わなく、幹細胞能に変化がないことが分かった（図４及び図５）。
【００７０】
４−２：表面ＣＤマーカー確認
ビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを２日間培養して付着及び安定化させた後、アスピリンを０．１ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭの濃度で添加したＲＫＣＭ−Ｎ培地に交換して２４時間培養した。
【００７１】
下記の［表２］の幹細胞表面ＣＤマーカー発現をＦＡＣＳを用いてＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣとアスピリンで培養した２個のＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣで比較した。
【表２】
2019526277.tif 000004
【００７２】
その結果、図６〜図９に示したように、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭ濃度のアスピリンによって幹細胞表面ＣＤマーカーの発現は変化がなかった。すなわち、アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣは幹細胞の特性である幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を失わなく、幹細胞能に変化がないことが分かった。
【００７３】
実施例５：アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの分化能確認
５−１：脂肪細胞分化誘導
ビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを２日間培養して付着及び安定化させた後、アスピリンを０．１ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭの濃度で添加したＲＫＣＭ−Ｎ培地交換して２４時間培養した。その後、１２ウェルプレートに２×１０４ｃｅｌｌｓで接種し、脂肪分化誘導培地（ＳＴＥＭＰＲＯ  Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）で２〜３日に一度ずつ培地を交換しながら１４日間培養した。
【００７４】
１４日間分化誘導後、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏで染色して燎微鏡で分析した結果、脂肪細胞への分化を確認することができた（図１０）。Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色をイソプロパノールで脱染して分化程度を５２０ｎｍ吸光度で確認した（図１１）。
【００７５】
５−２：骨細胞分化誘導
ビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを２日間培養して付着及び安定化させた後、アスピリンを０．１ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭの濃度で添加したＲＫＣＭ−Ｎ培地に交換して２４時間培養した。その後、１２ウェルプレートに２×１０４ｃｅｌｌｓで接種し、骨分化誘導培地（ＳＴＥＭＰＲＯ  Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）で２〜３日に一度ずつ培地を交換しながら２１日間培養した。
【００７６】
２１日間分化誘導後、Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓで染色して燎微鏡で分析した結果、骨細胞への分化を確認することができた（図１２）。Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ染色を１０％ｃｅｔｙｌｐｙｔｉｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅで脱染して分化程度を５６０ｎｍ吸光度で確認した（図１３）。
【００７７】
実施例６：アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣと癌細胞との直接共培養による坑癌効果確認
６−１：乳房癌及び膵膓癌細胞
直接共培養（ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）を実施するために、実施例１のビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣをＴ７５フラスコに１０％密度（０．５×１０６ｃｅｌｌｓ）でＲＫＣＭ−Ｎ培地に接種した。２日後、５０〜６０％密度になれば、ＲＫＣＭ−Ｎ培地である５％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸、０．０９ｍＭカルシウム、５ｎｇ／ｍｌ  ｒＥＧＦ、５μｇ／ｍｌインスリン及び７４ｎｇ／ｍｌヒドロコルチゾンを含むケラチノサイト−ＳＦＭ培地にそれぞれ０．５ｍＭ、１ｍＭ及び１０ｍＭの濃度でアスピリンを処理し、２４時間培養した後、ＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣ（Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を回収した。
【００７８】
その後、２×１０７細胞数の乳房癌細胞ＭＣＦ−７及び膵膓癌細胞ＰＡＮＣ−１をそれぞれ血清のないＤＭＥＭ培地で２回洗浄する。ＰＫＨ２６  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用い、希釈Ｃ溶液（Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１ｍｌ当たり４μｌ赤染色溶液（ｒｅｄ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で細胞を１０分間染色した後、同量の血清（ＦＢＳ）を入れて１分間ブロック（ｂｌｏｃｋ）させて血清の添加されたＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、血清（ＦＢＳ）の添加された培地で３０分間反応させる。染色された癌細胞を×１００倍率の蛍光燎微鏡（ＺＥＩＳＳ、Ｍｉｒａｘ）で確認した（図２０）。赤色蛍光剤（Ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）で蛍光標識されたＭＣＦ−７及びＰＡＮＣ−１癌細胞を１００ｍｍ細胞培養トレイに０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで接種し、ひと晩の間に付着及び安定化させる。
【００７９】
ＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣと癌細胞の直接共培養によって坑癌効果を確認するために、ＭＣＦ−７及びＰＡＮＣ−１癌細胞がそれぞれ付着培養された１００ｍｍ細胞培養トレイにアスピリン処理濃度別にＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣ  ０．５×１０６ｃｅｌｌｓをさらに接種した。癌細胞と幹細胞の総細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓになるようにし、１０％ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ培地で４８時間培養し、全ての細胞を回収した。回収した細胞の細胞数、生存率、細胞大きさをａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｌｕｎａ（Ｌｏｇｏｙ）を用いて確認し、回収した全ての細胞のうち蛍光染色された癌細胞はＦＡＣＳでその分布を確認した。
【００８０】
その結果、乳房癌細胞ＭＣＦ−７及び膵膓癌細胞ＰＡＮＣ−１の両方で、Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣに比べてアスピリン濃度０．５ｍＭのＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣで蛍光染色された癌細胞の分布がめっきり低いことが分かった。すなわち、Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌの坑癌効果が優れたことを確認した（図１４〜図１６）。
【００８１】
図１４〜図１６の対照群ＭＳＣ＋癌細胞のＭＳＣは、細胞培養時に０．２ｍＭアスコルビン酸が含まれた培地で培養されてビタミンＣが前処理されたＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣである。
【００８２】
６−２：癌幹細胞
実施例６−１と同様にアスピリンを処理したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣであるＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを製造した後、癌幹細胞との直接共培養によってＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの坑癌効果を確認した。
【００８３】
癌幹細胞は赤色蛍光剤（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）で標識した後、０．５×１０６ｃｅｌｌｓのＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣが接種されている１００ｍｍ細胞培養トレイに０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで接種してＣＯ２培養器で３７℃で４８時間直接共培養した。
【００８４】
４８時間後、癌幹細胞を回収して総細胞数、生存率及び大きさを測定し、赤色蛍光剤（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）で標識された癌幹細胞の分布をＦＡＣＳで確認してＡｎｇｅｌ−ＭＳＣの癌幹細胞に対する坑癌能力を比較分析した。
【００８５】
実施例７：アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣと癌細胞との間接共培養による坑癌効果確認
７−１：乳房癌及び膵膓癌細胞
間接共培養（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）を実施するために、２元化細胞培養ができるトランスウェルを使い、ウェルの底に癌細胞を付着させ、ウェルの挿入膜（ｉｎｓｅｒｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）上にはＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを付着させた後、１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地で５％ＣＯ２の供給及び３７℃の条件の下で４８時間共培養した。
【００８６】
まず、実施例１のビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣをＴ７５フラスコで１０％密度（０．５×１０６ｃｅｌｌｓ）でＲＫＣＭ−Ｎ培地に接種する。２日後、５０〜６０％密度になれば、ＲＫＣＭ−Ｎ培地である５％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸、０．０９ｍＭカルシウム、５ｎｇ／ｍｌ  ｒＥＧＦ、５μｇ／ｍｌインスリン及び７４ｎｇ／ｍｌヒドロコルチゾンを含むケラチノサイト−ＳＦＭ培地にそれぞれ０．１ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭの濃度でアスピリンを処理し、２４時間培養した後、ＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣ（Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を回収した。アスピリン濃度別に回収したＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣのそれぞれはインサートトランスウェル（６−ウェル）に１．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種して癌細胞があるアンダーウェル上に置く。
【００８７】
ＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣと癌細胞の間接共培養によって坑癌効果を確認するために、ＭＣＦ−７及びＰＡＮＣ−１癌細胞がそれぞれ付着されて培養されたトランスウェル（６−ウェル）のアンダーウェルにアスピリン濃度別ＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣがあるインサートトランスウェル（６−ウェル）を置き、１０％ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ培地で４８時間培養し、癌細胞を回収した。回収した癌細胞の細胞数、生存率、細胞大きさをａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｌｕｎａ（Ｌｏｇｏｙ）を用いて確認した。
【００８８】
その結果、乳房癌細胞ＭＣＦ−７及び膵膓癌細胞ＰＡＮＣ−１の両方で、Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣに比べてアスピリン濃度０．５ｍＭのＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣで癌細胞の増殖が抑制されて癌細胞数が減少したことが分かった（図１７〜図１９）。すなわち、Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣに比べてＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣであるＡｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌの坑癌効果が優れたことを確認した。
【００８９】
図１７〜図１９の対照群ＭＳＣ＋癌細胞のＭＳＣは、細胞培養時、０．２ｍＭアスコルビン酸が含まれた培地で培養されてビタミンＣが前処理されたＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣである。
【００９０】
７−２：癌幹細胞
２元化細胞培養ができるトランスウェルを使って癌幹細胞とＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの間接共培養（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）を実施してＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの坑癌効果を確認した。
【００９１】
まず、２００〜４００μｍ大きさの球形（ｓｐｈｅｒｅ  ｆｏｒｍ）に培養した癌幹細胞をトランスウェル（６−ウェル）のアンダーウェルに１．４×１０５ｃｅｌｌｓで接種した後、ＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣが１．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種されているインサートトランスウェル（６−ウェル）をアンダーウェル上に置く。ＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣは実施例１のビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを前記実施例７−１と同様な方法で製造した。
【００９２】
ＣＯ２培養器で３７℃で４８時間間接共培養した後、癌幹細胞を回収し、総細胞数、生存率及び細胞大きさを測定してＡｎｇｅｌ−ＭＳＣの癌幹細胞に対する坑癌能力を比較分析した。
【００９３】
実施例８：アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣの遺伝子発現分析
実施例１のビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを２日間培養して付着及び安定化させた後、アスピリンをそれぞれ０．１ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭの濃度で添加した培地に交換して２４時間培養した。その後、坑癌メカニズムに関連した遺伝子、アポトーシス及び血管新生関連遺伝子の発現を確認した。
【００９４】
Ｔ７５フラスコで培養したＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡを処理して細胞を分離した後、ＰＢＳで洗浄し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を収集した。収集した細胞は、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（１５５９６−０２６、Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて総ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を抽出した。ＲＮＡ  １〜３μｇからＤｉａＳｔａｒ  ２Ｘ  ＲＴ  Ｐｒｅ−Ｍｉｘ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、ＤＲ４１−Ｐ０９６）でｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成効率を高めるために、Ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎ８０８０１２７）とＲｉｂｏＬｏｃｋ  ＲＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＯ０３８４）を共に使ったし、それぞれの試薬は製造社の指示による濃度で混合した後、Ｔｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ＴＲＩＯ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）を用い、５０〜５５℃で６０分、９５℃で５分の条件の下で合成した。ＲＴ−ＰＣＲは、２Ｘｈ−Ｔａｇ  ＰＣＲ  Ｓｍａｒｔ  ｍｉｘ（ＳｏｌＧｅｎｔ、ＳＴＤ０１−Ｍ５０ｈ）２５μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ、バイオニア）２μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ、バイオニア）２μｌでｃＤＮＡを９８℃で１０秒間ＤＮＡ変性させた後、各アニーリング温度で３０秒間プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を加熱させ、７２℃で１分間ＰＣＲ産物を伸長させる反応を３０ｃｙｃｌｅの条件の下でＴｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ＴＲＩＯ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）を用いて行って遺伝子増幅を行った。それぞれの遺伝子に対するプライマー配列は表３に示した。
【００９５】
ＰＣＲ産物を２．０％アガロースゲルと１Ｘ  ＴＡＥ試薬を用いて１１０Ｖで１時間３０分間電気泳動した後、Ｆｕｊｉ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅでイメージ測定を行った。コントロール遺伝子としてベータ−アクチンを使った。
【００９６】
また、遺伝子発現を定量するために、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ  ＱＰＳ−２０１Ｔ）で実時間−ＰＣＲを遂行した。ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ  １０μｌ、１０μＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｗ（バイオニア）０．５μｌ、１０μＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｖ（バイオニア）０．５μｌ、ｃＤＮＡ  １μｌを９５℃で１５秒間ＤＮＡ変性させた後、各アニーリング温度で６０秒間プライマーを加熱させる反応を４０ｃｙｃｌｅの条件の下でＡＢａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＳｔｅｐＯＮＥ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分析した。
【００９７】
遺伝子発現量を比較するためには、ＰｉｋｏＲｅａｌ（登録商標）  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）器機とＭａｘｉｍａ  ＳＹＢＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（×２）（Ｔｈｅｒｍｏ  ＰＩＫＯＲＥＡＬ  ９６）（Ｔｈｅｒｍｏ、＃Ｋ０２２１）を使ってＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを進めた。ＰＣＲ  Ｃｙｃｌｅは９５℃で１５秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させた後、６０℃で６０秒間アニーリング及び伸長（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ＆  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）過程を経た。このようなサイクルを総４０回実施した。発現量の比較はＨｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ（ｂ−ａｃｔ）のＣｔ値と目的遺伝子のＣｔ値を活用し、相対比較によって遺伝子発現量を比較した。
【表３】
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【００９８】
実施例９：アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣでの坑癌、アポトーシス及び血管新生関連遺伝子分析
９−１：Ｆａｓ  Ｌ、ＴＲＡＩＬ及びＣＸＣＲ４遺伝子発現分析による坑癌メカニズム確認
実施例１のビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを２日間培養して付着及び安定化させた後、アスピリンをそれぞれ０．１ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭの濃度で添加した培地に交換して２４時間培養した。
【００９９】
幹細胞で発現するＦａｓ  Ｌは癌細胞のＦａｓと結合してアポトーシス経路を介して癌細胞のアポトーシスを進めるので、癌細胞のアポトーシスに関与するＦａｓ  Ｌ遺伝子の発現を確認した。また、このようなＦＡＳを含めてＤＲ４／ＤＲ５も細胞死滅経路に関与する受容体であるＦＤＡＡ（Ｆａｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｏｍａｉｎ）に属し、ＴＲＡＩＬがＤＲ４／ＤＲ５という受容体と結合してアポトーシスを誘導する。よって、Ｆａｓ  ＬだけでなくＴＲＡＩＬ遺伝子の発現も確認した。実施例８と同様な方法でＲＴ−ＰＣＲ及び実時間ＰＣＲを遂行し、表３のプライマーを使った。
【０１００】
その結果、癌細胞のアポトーシスに関与する坑癌メカニズムに関連した遺伝子であるＦａｓ  ＬとＴＲＡＩＬの発現が０．５ｍＭ濃度のアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣで最も高いことを確認することができた（図２１〜図２３）。すなわち、ＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣであるＡｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌの坑癌効果が０．５ｍＭアスピリンで最も優れたことを確認した。
【０１０１】
また、ｈｏｍｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ因子であるＣＸＣＲ４遺伝子発現の増加を確認した（図２３）。これから、アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣはＦａｓ  Ｌ、ＴＲＡＩＬ及びＣＸＣＲ４と関連した経路を介して坑癌作用をすることを確認することができた。
【０１０２】
９−２：ＶＥＧＦ遺伝子発現分析による癌細胞の血管新生確認
実施例１のビタミンＣを含む培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣを２日間培養して付着及び安定化させた後、アスピリンをそれぞれ０．１ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭの濃度で添加した培地に交換して２４時間培養した。
【０１０３】
幹細胞で発現するＶＥＧＦは癌細胞の血管新生に関与するので、ＶＥＧＦ遺伝子の発現を確認した。実施例８と同様な方法でＲＴ−ＰＣＲを遂行し、表３のプライマーを使った。
【０１０４】
その結果、癌細胞の血管新生に関与するＶＥＧＦの発現が０．５ｍＭ濃度のアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣで最も低いことを確認することができた（図２４）。すなわち、ＡＳＰ−Ｖｉｔ．Ｃ−ＭＳＣであるＡｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌの坑癌効果が０．５ｍＭアスピリンで最も優れたことを確認した。
【０１０５】
９−３：発癌性形質転換（Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）減少効果
実施例７と同様な条件の下で０．５ｍＭアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣ（Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とＭＳＣでＮｒｆ２、ｃ−ｍｙｃ及びｐ２１遺伝子の発現を比較した。実施例８と同様な方法でＲＴ−ＰＣＲを遂行し、表３のプライマーを使った。
【０１０６】
その結果、図２５のように、Ｎｒｆ２、ｃ−ｍｙｃ及びｐ２１遺伝子の発現がいずれも減少した。これは、アスピリン含有培地で培養した脂肪来由の幹細胞が発癌性形質転換（Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から自由になることができるという証拠である（Juan et al., Molecular Cancer. 13:20, 2014）。ｐ２１遺伝子が減少したというのは幹細胞がずっと若くなったと期待することもできる。
【０１０７】
また、Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌで幹細胞特性を分析するために、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇの発現を分析してＭＳＣと比較した。
【０１０８】
その結果、Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌはＭＳＣと同様な様相で遺伝子を発現しており、幹細胞の特性が変わらずに維持されていることが分かった（図２６）。
【０１０９】
実施例１０：アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣと間接共培養した癌細胞の遺伝子発現分析
実施例７と同様な条件の下でアスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣ（Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）と癌細胞を間接共培養した後、癌細胞で遺伝子発現を分析した。遺伝子発現分析は実施例８と同様な方法で遂行した。
【０１１０】
遺伝子発現分析に使用したそれぞれの遺伝子のプライマーは表３及び表４に示した。
【表４】
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【０１１１】
１０−１：癌細胞でのアポトーシス遺伝子発現
アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣ（Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）の癌細胞増殖抑制メカニズムを明かすために、癌細胞でアポトーシス関連因子の発現を分析した。
【０１１２】
その結果、間接共培養した乳房癌、膵膓癌細胞でＢｃｌ−２発現が減少したことを確認することができた（図２７）。また、間接共培養した乳房癌細胞でＰＰＡＲ−γ及びＡｐａｆ−１の発現が増加したことを確認することができた（図２８及び図２９）。これは、アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣ（Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）との共培養によって癌細胞でアポトーシスが増加するということを示す。
【０１１３】
１０−２：Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌによる癌細胞転移抑制効果
アスピリン含有培地で培養したＶｉｔ．Ｃ−ＭＳＣ（Ａｎｇｅｌ−Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）の癌細胞転移抑制効果を確認するために、癌細胞でＯｃｔ４遺伝子の発現を分析した。Ｏｃｔ４プライマーは実施例９−３で使ったものと同じプライマー（表３）で分析した。
【０１１４】
Ｏｃｔ４は癌の転移程度を判断する指標として使われるという報告がある（Liu et al., Ann Surg. 253(6):1165-71, 2011; HAI LIN et al., MOLECULAR MEDICINE REPORTS 9:1335-1342, 2014）。よって、Ｏｃｔ４の発現が減少すれば転移程度が低いと判断することができる。
【０１１５】
図３０の結果を見れば、間接共培養した乳房癌、膵膓癌細胞でＯｃｔ４の発現が減少したことを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明によるビタミンＣとアスピリンを含む間葉幹細胞製造用培地は活性を維持しながら癌細胞の増殖を抑制する間葉幹細胞を製造することができるので、幹細胞治療剤の癌からの安全性確保と坑癌細胞治療剤としての製造に非常に有用である。
【０１１７】
以上で本発明の内容の特定部分を詳細に説明したが、当該分野の通常の知識を有する者にこのような具体的技術は単に好適な実施例であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求範囲とそれらの等価物によって定義されると言える。本発明の単純な変形又は変更はこの分野の通常の知識を有する者によって容易になされることができ、このような変形又は変更はいずれも本発明の領域に含まれるものと見なされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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