(57)【要約】原核生物に由来したプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｓｅ）またはそのアミノ酸変異体を用いて植物および／または藻類（ａｌｇａｅ）の除草剤に対するより強化された耐性を付与するかおよび／または耐性をより増進させる技術が提供される。
2019527538.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下から選択されたポリペプチド：
配列番号２のアミノ酸配列中のＮ５９、Ｓ６０、Ｒ８９、Ｆ１６１、Ｖ１６５、Ａ１６７、Ｑ１８４、Ｐ３０３、Ｖ３０５、Ｆ３２４、Ｌ３２７、Ｉ３４０、Ｆ３６０、およびＩ４０８からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失またはＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、およびＫ（Ｌｙｓ）からなる群より選択され、該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号４のアミノ酸配列中のＲ１０１、Ｆ１７１、Ｖ１７５、Ａ１７７、Ｇ１９４、Ｐ３１６、Ｖ３１８、Ｆ３３７、Ｌ３４０、Ｉ３５３、およびＦ３７３からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失またはＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、およびＫ（Ｌｙｓ）からなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、
配列番号２のアミノ酸配列中のＮ５９、Ｓ６０、Ｒ８９、Ｆ１６１、Ｖ１６５、Ａ１６７、Ｑ１８４、Ｐ３０３、Ｖ３０５、Ｆ３２４、Ｌ３２７、Ｉ３４０、Ｆ３６０、およびＩ４０８からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立してＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、およびＧ（Ｇｌｙ）からなる群より選択されたアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号４のアミノ酸配列中のＲ１０１、Ｆ１７１、Ｖ１７５、Ａ１７７、Ｇ１９４、Ｐ３１６、Ｖ３１８、Ｆ３３７、Ｌ３４０、Ｉ３５３、およびＦ３７３からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立してＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、およびＮ（Ａｓｎ）からなる群より選択されたアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
からなる群より選択されたものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｆ３６０Ｍ、Ｆ３６０Ｖ、Ｆ３６０Ｉ、Ｆ３６０Ｔ、Ｆ３６０Ｌ、Ｆ３６０Ｃ、Ａ１６７Ｃ、Ａ１６７Ｌ、Ａ１６７Ｉ、Ｐ３０３Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５Ｍ、Ｖ３０５Ｔ、Ｎ５９Ｔ、Ｓ６０Ｔ、Ｒ８９Ａ、Ｒ８９Ｌ、Ｒ８９Ｖ、Ｆ１６１Ａ、Ｖ１６５Ｓ、Ｖ１６５Ｃ、Ｑ１８４Ｇ、Ｆ３２４Ｖ、Ｌ３２７Ｔ、Ｉ３４０Ｔ、Ｉ４０８Ｒ、およびＩ４０８Ｗからなる群より選択された１種以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号４のアミノ酸配列において、Ｆ３７３Ｍ、Ｆ３７３Ｖ、Ｆ３７３Ｉ、Ｆ３７３Ｔ、Ｆ３７３Ｌ、Ｆ３７３Ｃ、Ｆ３７３Ｎ、Ｆ３７３Ｈ、Ａ１７７Ｃ、Ａ１７７Ｌ、Ａ１７７Ｉ、Ｐ３１６Ａ、Ｐ３１６Ｌ、Ｖ３１８Ｌ、Ｖ３１８Ｍ、Ｒ１０１Ａ、Ｆ１７１Ａ、Ｖ１７５Ｃ、Ｖ１７５Ｌ、Ｇ１９４Ｅ、Ｇ１９４Ｑ、Ｇ１９４Ｍ、Ｇ１９４Ｋ、Ｇ１９４Ｒ、Ｆ３３７Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、およびＩ３５３Ｔからなる群より選択された１種以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
からなる群より選択されたものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｆ３６０Ｍ、Ｆ３６０Ｖ、Ｆ３６０Ｉ、Ｆ３６０Ｔ、Ｆ３６０Ｌ、Ｆ３６０Ｃ、Ａ１６７Ｃ、Ａ１６７Ｌ、Ｐ３０３Ｌ、Ｎ５９Ｔ、Ｓ６０Ｔ、Ｒ８９Ａ、Ｒ８９Ｌ、Ｒ８９Ｖ、Ｆ１６１Ａ、Ｖ１６５Ｓ、Ｖ１６５Ｃ、Ａ１６７Ｉ、Ｑ１８４Ｇ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５Ｍ、Ｖ３０５Ｔ、Ｆ３２４Ｖ、Ｌ３２７Ｔ、Ｉ３４０Ｔ、Ｉ４０８Ｒ、Ｉ４０８Ｗ、Ｐ３０３Ｌ＋Ｖ３０５Ｌ、Ｎ５９Ｔ＋Ｆ３６０Ｖ、Ｓ６０Ｔ＋Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｓ６０Ｔ＋Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｓ６０Ｔ＋Ｉ３４０Ｔ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｒ８９Ａ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｒ８９Ａ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｒ８９Ａ＋Ｆ３６０Ｌ、Ｒ８９Ｌ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｒ８９Ｖ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｒ８９Ａ＋Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｒ８９Ａ＋Ｖ３０５Ｔ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｌ、Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｖ、Ｖ１６５Ｃ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｃ＋Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｃ＋Ａ１６７Ｉ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｃ＋Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｉ、Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｉ、Ａ１６７Ｉ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ３０５Ｍ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ３０５Ｔ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｖ３０５Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｉ４０８Ｒ＋Ｆ３６０Ｍ、またはＩ４０８Ｗ＋Ｆ３６０Ｍのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号４のアミノ酸配列において、Ｆ３７３Ｍ、Ｆ３７３Ｖ、Ｆ３７３Ｉ、Ｆ３７３Ｔ、Ｆ３７３Ｌ、Ｆ３７３Ｃ、Ｆ３７３Ｎ、Ｆ３７３Ｈ、Ａ１７７Ｃ、Ａ１７７Ｌ、Ａ１７７Ｉ、Ｐ３１６Ａ、Ｐ３１６Ｌ、Ｖ３１８Ｌ、Ｖ３１８Ｍ、Ｒ１０１Ａ、Ｆ１７１Ａ、Ｖ１７５Ｃ、Ｖ１７５Ｌ、Ｇ１９４Ｅ、Ｇ１９４Ｑ、Ｇ１９４Ｍ、Ｇ１９４Ｋ、Ｇ１９４Ｒ、Ｆ３３７Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｉ３５３Ｔ、Ｐ３１６Ｌ＋Ｖ３１８Ｌ、Ｐ３１６Ａ＋Ｖ３１８Ｌ、Ｒ１０１Ａ＋Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｃ＋Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｉ＋Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｉ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｌ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｔ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｖ、Ａ１７７Ｃ＋Ｆ３７３Ｔ、Ａ１７７Ｃ＋Ｆ３７３Ｖ、Ｖ１７５Ｌ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｅ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｑ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｍ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｋ＋Ｆ３７３Ｍ、１９４Ｒ＋Ｆ３７３Ｍ、またはＶ３１８Ｍ＋Ｆ３７３Ｍのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
からなる群より選択されたものである、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか一項のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項６の組換えベクターを含む組換え細胞。
【請求項８】
配列番号２のポリペプチド；配列番号４のポリペプチド；請求項１〜４のうちのいずれか一項のポリペプチド；前記ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上を含む、植物または藻類（ａｌｇａｅ）の除草剤に対する抵抗性付与または増進用組成物。
【請求項９】
前記除草剤は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記除草剤は、ピリミジンジオン系（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、ジフェニルエーテル系（ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｅｔｈｅｒｓ）、フェニルピラゾール系（ｐｈｅｎｙｌｐｙｒａｚｏｌｅｓ）、フェニルフタルイミド系（Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅｓ）、フェニルエステル系（ｐｈｅｎｙｌｅｓｔｅｒｓ）、チアジアゾール系（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅｓ）、オキサジアゾール系（ｏｘａｄｉａｚｏｌｅｓ）、トリアゾリノン系（ｔｒｉａｚｏｌｉｎｏｎｅｓ）、オキサゾリジンジオン系（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、ピラクロニル（ｐｙｒａｃｌｏｎｉｌ）、フルフェンピル−エチル（ｆｌｕｆｅｎｐｙｒ−ｅｔｈｙｌ）およびプロフルアゾル（ｐｒｏｆｌｕａｚｏｌ）からなる群より選択される１種以上である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記除草剤は、ブタフェナシル（ｂｕｔａｆｅｎａｃｉｌ）、サフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）、ベンズフェンジゾン（ｂｅｎｚｆｅｎｄｉｚｏｎｅ）、チアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）、ホメサフェン（ｆｏｍｅｓａｆｅｎ）、オキシフルオルフェン（ｏｘｙｆｌｕｏｒｆｅｎ）、アクロニフェン（ａｃｌｏｎｉｆｅｎ）、アシフルオルフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）、ビフェノックス（ｂｉｆｅｎｏｘ）、エトキシフェン（ｅｔｈｏｘｙｆｅｎ）、ラクトフェン（ｌａｃｔｏｆｅｎ）、クロメトキシフェン（ｃｈｌｏｍｅｔｈｏｘｙｆｅｎ）、クロルニトロフェン（ｃｈｌｏｒｎｉｔｒｏｆｅｎ）、フルオログリコフェン−エチル（ｆｌｕｏｒｏｇｌｙｃｏｆｅｎ−ｅｔｈｙｌ）、ハロサフェン（ｈａｌｏｓａｆｅｎ）、ピラフルフェン−エチル（ｐｙｒａｆｌｕｆｅｎ−ｅｔｈｙｌ）、フルアゾレート（ｆｌｕａｚｏｌａｔｅ）、フルミオキサジン（ｆｌｕｍｉｏｘａｚｉｎ）、シニドン−エチル（ｃｉｎｉｄｏｎ−ｅｔｈｙｌ）、フルミクロラック−ペンチル（ｆｌｕｍｉｃｌｏｒａｃ−ｐｅｎｔｙｌ）、フルチアセット（ｆｌｕｔｈｉａｃｅｔ）、チジアジミン（ｔｈｉｄｉａｚｉｍｉｎ）、オキサジアルギル（ｏｘａｄｉａｒｇｙｌ）、オキサジアゾン（ｏｘａｄｉａｚｏｎ）、カルフェントラゾン（ｃａｒｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）、スルフェントラゾン（ｓｕｌｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）、アザフェニジン（ａｚａｆｅｎｉｄｉｎ）、ペントキサゾン（ｐｅｎｔｏｘａｚｏｎｅ）、ピラクロニル（ｐｙｒａｃｌｏｎｉｌ）、フルフェンピル−エチル（ｆｌｕｆｅｎｐｙｒ−ｅｔｈｙｌ）、プロフルアゾル（ｐｒｏｆｌｕａｚｏｌ）、フェノピレート（ｐｈｅｎｏｐｙｌａｔｅ）、フェノピレートのカルバメート類似体、これらの農薬的に許容可能な塩からなる群より選択される１種以上である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
上記植物または藻類は、第２の除草剤抵抗性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含み、前記第２の除草剤に対する抵抗性が付与または増進されたものである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第２の除草剤は、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネート（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）、ジカンバ（ｄｉｃａｍｂａ）、２，４−Ｄ（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、イソキサフルトール（ｉｓｏｘａｆｌｕｔｏｌｅ）、ＡＬＳ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）阻害性除草剤、第２光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ）阻害性除草剤、フェニルウレア（ｐｈｅｎｙｌｕｒｅａ）系除草剤、ブロモキシニル（ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）系除草剤およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第２の除草剤抵抗性ポリペプチドは、
グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）除草剤耐性ＥＰＳＰＳ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ５−ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＧＯＸ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、ＧＡＴ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）またはグリホサートデカルボキシラーゼ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）；
グルホシネート（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）除草剤耐性ＰＡＴ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）；
ジカンバ（ｄｉｃａｍｂａ）除草剤耐性ＤＭＯ（ｄｉｃａｍｂａ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；
２，４−Ｄ（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）除草剤耐性２，４−ＤモノオキシゲナーゼまたはＡＡＤ（ａｒｙｌｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ  Ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；
ＡＬＳ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）阻害性スルホニルウレア系除草剤耐性ＡＨＡＳ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＡＨＡＳ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）またはＡｔａｈａｓｌ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｎｉｔ）；
第２光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ）阻害性除草剤耐性光系ＩＩ（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ）蛋白質Ｄ１；
フェニルウレア（ｐｈｅｎｙｌｕｒｅａ）除草剤耐性シトクロムＰ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０）；
色素体阻害性除草剤耐性ＨＰＰＤ（ｈｙｄｏｒｘｙｌｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；
ブロモキシニル（ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）除草剤耐性ニトリラーゼ（ｎｉｔｒｉｌａｓｅ）；および
これらの組み合わせからなる群より選択される１種以上である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第２の除草剤耐性ポリペプチドを暗号化する遺伝子は、
グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）除草剤耐性ｃｐ４  ｅｐｓｐｓ、ｅｐｓｐｓ（ＡＧ）、ｍｅｐｓｐｓ、２ｍｅｐｓｐｓ、ｇｏｘｖ２４７、ｇａｔ４６０１またはｇａｔ４６２１遺伝子；
グルホシネート（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）除草剤耐性ｂａｒまたはｐａｔ遺伝子；
ジカンバ（ｄｉｃａｍｂａ）除草剤耐性ｄｍｏ遺伝子；
２，４−Ｄ（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）除草剤耐性ＡＡＤ−１またはＡＡＤ−１２遺伝子；
イソキサフルトール除草剤耐性ＨＰＰＤＰＦ  Ｗ３３６遺伝子；
スルホニルユレア除草剤耐性ＡＬＳ、Ｃｓｒ１、Ｃｓｒ１−１、Ｃｓｒ１−２、ＧＭ−ＨＲＡ、Ｓ４−ＨＲＡ、Ｚｍ−ＨＲＡ、ＳｕｒＡまたはＳｕｒＢ；
第２光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍＩＩ）阻害性除草剤耐性ｐｓｂＡ遺伝子；
フェニルウレア（ｐｈｅｎｙｌｕｒｅａ）除草剤耐性ＣＹＰ７６Ｂ１遺伝子；
ブロモキシニル（ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）除草剤耐性ｂｘｎ遺伝子；および
これらの組み合わせからなる群より選択される１種以上である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
配列番号２のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、請求項１〜４のうちのいずれか一項のポリペプチドまたは前記ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性を有する形質転換体、そのクローンまたは子孫。
【請求項１７】
前記形質転換体は、藻類、または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体である、請求項１６に記載の形質転換体、そのクローンまたは子孫。
【請求項１８】
配列番号２のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、請求項１〜４のうちのいずれか一項のポリペプチド、または前記ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを藻類、または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体に形質転換する段階を含む、除草剤に対する耐性を有する植物または藻類の製造方法。
【請求項１９】
配列番号２のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、請求項１〜４のうちのいずれか一項のポリペプチド、または前記ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを藻類、または植物の原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体に形質転換する段階を含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性を付与または増進させる方法。
【請求項２０】
配列番号２のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、請求項１〜４のうちのいずれか一項のポリペプチド、または前記ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを含む植物を栽培地に提供する段階、および
前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階を含む、
栽培地で雑草を防除する方法。
【請求項２１】
前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階は、２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用することである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記植物は、第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含むものであり、
前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤および第２の除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号２のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、請求項１〜４のうちのいずれか一項のポリペプチド、または前記ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを含む藻類を培養培地に提供する段階、および
前記培養培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階を含む、培養培地で望まない水生生物を除去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
原核生物に由来したプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｓｅ）またはその変異体を用いて植物および／または藻類（Ａｌｇａｅ）の除草剤に対する耐性を付与および／または増進させる技術が提供される。
【背景技術】
【０００２】
ポルフィリン合成経路は植物の代謝過程で重要な葉緑素とヘム（Ｈｅｍｅ）を合成する過程であって、葉緑体で行われる。この経路で、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＸ  ｏｘｉｄａｓｅ、以下、ＰＰＯ；ＥＣ：１．３．３．４）は、プロトポルフィリノーゲンＩＸ（Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＸ）からプロトポルフィリンＩＸ（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ＩＸ）への酸化過程を触媒する。プロトポルフィリノーゲンＩＸがプロトポルフィリンＩＸに酸化された後、Ｍｇ−ｃｈｅｌａｔａｓｅによってマグネシウムと結合すれば葉緑素が合成され、Ｆｅ−ｃｈｅｌａｔａｓｅによって鉄と結合すればヘム（Ｈｅｍｅ）が合成される。
【０００３】
したがって、ＰＰＯの活性が阻害されれば葉緑素とヘムの合成が抑制され、基質であるプロトポルフィリノーゲンＩＸが正常なポルフィリン合成経路から離脱して葉緑体から細胞質に移動して急速にプロトポルフィリンＩＸに酸化されると、光と酸素分子の存在下で活性の高い一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔｏｘｙｇｅｎ、１Ｏ２）を発生させて植物の細胞膜を破壊することによって急速な植物細胞死滅を起こす。このような原理を用いて、ＰＰＯ活性を抑制する除草剤が開発され、現在まで化学構造によってピリミジンジオン系（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、ジフェニルエーテル系（ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｅｔｈｅｒｓ）、フェニルピラゾール系（ｐｈｅｎｙｌｐｙｒａｚｏｌｅｓ）、フェニルフタルイミド系（Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅｓ）、チアジアゾール系（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅｓ）、オキサジアゾール系（ｏｘａｄｉａｚｏｌｅｓ）、トリアゾリノン系（ｔｒｉａｚｏｌｉｎｏｎｅｓ）、オキサゾリジンジオン系（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）およびその他の９個系統の除草剤が使用されている。
【０００４】
また、前記除草剤を使用しながらも栽培対象作物の生長には影響を与えないようにするためには、栽培対象作物に前記除草剤に対する耐性を付与する必要性が台頭してきた。
【０００５】
一方、藻類（Ａｌｇａｅ）は光合成生物であって、光エネルギーを多様な有用化合物を合成できるエネルギーに転換することができる。例えば、藻類は光合成によって炭素を固定させ、二酸化炭素を糖、デンプン、脂質、脂肪または他の生体分子に転換することによって、大気中の温室ガスを除去することができる。また、藻類の大規模培養を通じて産業的酵素、治療化合物および蛋白質、栄養物質、商業的物質、燃料物質のような多様な物質を生産することができる。
【０００６】
しかし、生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）または公開されたまたは閉鎖された池で藻類を大規模に培養する場合、望まない競争生物、例えば望まない藻類、かび、ワムシ類（ｒｏｔｉｆｅｒ）または動物性プランクトンによって汚染が発生することがある。
【０００７】
したがって、所望の植物および／または藻類に除草剤耐性を付与した後、除草剤耐性のない競争生物の成長を阻害できる濃度で除草剤を処理して、所望の植物および／または藻類を大規模に収穫することができる技術が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願登録公報ＵＳ６，３０８，４５８（２００１年１０月３０日）
【特許文献２】米国特許出願登録公報ＵＳ６，８０８，９０４（２００４年１０月２６日）
【特許文献３】米国特許出願登録公報ＵＳ７，５６３，９５０（２００９年７月２１日）
【特許文献４】国際特許出願公開公報ＷＯ２０１１／０８５２２１（２０１１年７月１４日）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌｉ  Ｘ，Ｖｏｌｒａｔｈ  ＳＬ，Ｃｈｉｌｃｏｔｔ  ＣＥ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＭＡ，Ｗａｒｄ  ＥＲ，Ｌａｗ  ＭＤ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ．Ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３３：７３６−７４７，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本明細書で、原核生物からｈｅｍＹタイプのＰＰＯ遺伝子を分離してこの遺伝子およびそのアミノ酸変異体がプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）活性阻害除草剤に対して広範囲な除草剤耐性を示すのが立証され、これを植物および／または藻類（Ａｌｇａｅ）に発現させれば除草剤耐性を付与するか、および／または耐性を増進させることができるのが提案される。
【００１１】
一例は、配列番号２のポリペプチドとＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号２のアミノ酸（例えば、配列番号２のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体を提供する。前記配列番号２のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸からなる群より選択された１種以上は、配列番号２のアミノ酸配列中のＮ５９、Ｓ６０、Ｒ８９、Ｆ１６１、Ｖ１６５、Ａ１６７、Ｑ１８４、Ｐ３０３、Ｖ３０５、Ｆ３２４、Ｌ３２７、Ｉ３４０、Ｆ３６０、およびＩ４０８からなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００１２】
他の例は、配列番号４のポリペプチドとＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号４のアミノ酸（例えば、配列番号４のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体を提供する。前記配列番号４のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸からなる群より選択された１種以上は、配列番号４のアミノ酸配列中のＲ１０１、Ｆ１７１、Ｖ１７５、Ａ１７７、Ｇ１９４、Ｐ３１６、Ｖ３１８、Ｆ３３７、Ｌ３４０、Ｉ３５３、およびＦ３７３からなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００１３】
他の例は、前記ポリペプチド変異体を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
他の例は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。
【００１５】
他の例は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００１６】
他の例は、
配列番号２のポリペプチド、配列番号２のポリペプチドの変異体、配列番号４のポリペプチド、配列番号４のポリペプチドの変異体、およびこれらと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するポリペプチド；
前記ポリペプチド、ポリペプチド変異体、およびこれらと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド；
前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および
前記組換えベクターを含む組換え細胞
からなる群より選択された１種以上を含む、植物および／または藻類の除草剤に対する耐性付与および／または増進用組成物を提供する。一例で、前記配列番号２のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドは配列番号１のポリヌクレオチド配列を含むものであってもよく、配列番号４のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドは配列番号３のポリヌクレオチド配列を含むものであってもよいが、これに制限されるのではない。
【００１７】
前記除草剤は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤であってもよい。
【００１８】
具体例として、前記除草剤は、ピリミジンジオン系（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、ジフェニルエーテル系（ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｅｔｈｅｒｓ）、フェニルピラゾール系（ｐｈｅｎｙｌｐｙｒａｚｏｌｅｓ）、フェニルフタルイミド系（Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅｓ）、フェニルエステル系（ｐｈｅｎｙｌｅｓｔｅｒｓ）、チアジアゾール系（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅｓ）、オキサジアゾール系（ｏｘａｄｉａｚｏｌｅｓ）、トリアゾリノン系（ｔｒｉａｚｏｌｉｎｏｎｅｓ）、オキサゾリジンジオン系（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）およびその他の除草剤からなる群より選択される１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。
【００１９】
具体例として、前記除草剤は、ブタフェナシル（ｂｕｔａｆｅｎａｃｉｌ）、サフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）、ベンズフェンジゾン（ｂｅｎｚｆｅｎｄｉｚｏｎｅ）、チアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）、ホメサフェン（ｆｏｍｅｓａｆｅｎ）、オキシフルオルフェン（ｏｘｙｆｌｕｏｒｆｅｎ）、アクロニフェン（ａｃｌｏｎｉｆｅｎ）、アシフルオルフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）、ビフェノックス（ｂｉｆｅｎｏｘ）、エトキシフェン（ｅｔｈｏｘｙｆｅｎ）、ラクトフェン（ｌａｃｔｏｆｅｎ）、クロメトキシフェン（ｃｈｌｏｍｅｔｈｏｘｙｆｅｎ）、クロルニトロフェン（ｃｈｌｏｒｎｉｔｒｏｆｅｎ）、フルオログリコフェン−エチル（ｆｌｕｏｒｏｇｌｙｃｏｆｅｎ−ｅｔｈｙｌ）、ハロサフェン（ｈａｌｏｓａｆｅｎ）、ピラフルフェン−エチル（ｐｙｒａｆｌｕｆｅｎ−ｅｔｈｙｌ）、フルアゾレート（ｆｌｕａｚｏｌａｔｅ）、フルミオキサジン（ｆｌｕｍｉｏｘａｚｉｎ）、シニドン−エチル（ｃｉｎｉｄｏｎ−ｅｔｈｙｌ）、フルミクロラック−ペンチル（ｆｌｕｍｉｃｌｏｒａｃ−ｐｅｎｔｙｌ）、フルチアセット（ｆｌｕｔｈｉａｃｅｔ）、チジアジミン（ｔｈｉｄｉａｚｉｍｉｎ）、オキサジアルギル（ｏｘａｄｉａｒｇｙｌ）、オキサジアゾン（ｏｘａｄｉａｚｏｎ）、カルフェントラゾン（ｃａｒｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）、スルフェントラゾン（ｓｕｌｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）、アザフェニジン（ａｚａｆｅｎｉｄｉｎ）、ペントキサゾン（ｐｅｎｔｏｘａｚｏｎｅ）、ピラクロニル（ｐｙｒａｃｌｏｎｉｌ）、フルフェンピル−エチル（ｆｌｕｆｅｎｐｙｒ−ｅｔｈｙｌ）、プロフルアゾル（ｐｒｏｆｌｕａｚｏｌ）、フェノピレート（ｐｈｅｎｏｐｙｌａｔｅ；２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  １−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、フェノピレートのカルバメート類似体（例えば、Ｏ−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ−ａｎｄ  ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏｃａｒｂａｍａｔｅ  ａｎａｌｏｇｅｓ（“Ｕｊｊａｎａ  Ｂ．Ｎａｎｄｉｈａｌｌｉ，Ｍａｒｙ  Ｖ．Ｄｕｋｅ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｏ．Ｄｕｋｅ，Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｏ−ｐｈｅｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ−ａｎｄ  ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏｃａｒｂａｍａｔｅ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，１９９２，４０（１０）  １９９３−２０００”参照））、これらの農薬的に許容可能な塩、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。
【００２０】
上記植物は光合成を行う多細胞真核生物を意味するものであって、単子葉植物または双子葉植物であるか、草本植物または木本植物であってもよい。前記藻類（Ａｌｇａｅ）は光合成を行う単細胞生物を意味するものであって、原核（Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ）藻類または真核（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ）藻類であってもよい。
【００２１】
一例で、上記植物または藻類は、第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含むように遺伝的に操作され、前記第２の除草剤に対するさらに広い範囲の除草剤耐性が付与されるか、および／または増進されたものであってもよい。前記第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含むように遺伝的に操作された植物または藻類は、前記除草剤に対する耐性付与および／または増進用組成物に第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含ませたものを使用して製造されたものであってもよい。したがって、除草剤に対する耐性付与および／または増進用組成物は、第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含むものであってもよい。
【００２２】
具体例として、前記第２の除草剤は、細胞分裂阻害性除草剤、光合成阻害性除草剤、アミノ酸合成阻害性除草剤、色素体阻害性除草剤および細胞膜阻害性除草剤を含むが、これに制限されるのではない。
【００２３】
具体例として、前記第２の除草剤は、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネート（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）、ジカンバ（ｄｉｃａｍｂａ）、２，４−Ｄ（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、イソキサフルトール（ｉｓｏｘａｆｌｕｔｏｌｅ）、ＡＬＳ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）阻害性除草剤、第２光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ）阻害性除草剤、フェニルウレア（ｐｈｅｎｙｌｕｒｅａ）系除草剤、またはブロモキシニル（ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）系除草剤またはこれらの組み合わせを例示することができるが、これに制限されるのではない。
【００２４】
具体例として、第２の除草剤耐性ポリペプチドは、グリホサート除草剤耐性ＥＰＳＰＳ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ５−ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＧＯＸ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、ＧＡＴ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）またはグリホサートデカルボキシラーゼ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）；グルホシネート除草剤耐性ＰＡＴ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）；ジカンバ除草剤耐性ＤＭＯ（ｄｉｃａｍｂａ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；２，４−Ｄ除草剤耐性２，４−ＤモノオキシゲナーゼまたはＡＡＤ（ａｒｙｌｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ）系除草剤耐性ＡＬＳ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＡＨＡＳ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、またはＡｔｈａｈａｓｌ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ）；第２光系阻害性除草剤耐性光系ＩＩ（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ）蛋白質Ｄ１；フェニルウレア系除草剤耐性シトクロムＰ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０）；色素体阻害性除草剤耐性ＨＰＰＤ（ｈｙｄｏｒｘｙｌｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；ブロモキシニル除草剤耐性ニトリラーゼ（ｎｉｔｒｉｌａｓｅ）；およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上を例示することができるが、これに制限されるのではない。
【００２５】
また、前記第２の除草剤耐性ポリペプチドを暗号化する遺伝子は、グリホサート除草剤耐性ｃｐ４  ｅｐｓｐｓ、ｅｐｓｐｓ（ＡＧ）、ｍｅｐｓｐｓ、２ｍｅｐｓｐｓ、ｇｏｘｖ２４７、ｇａｔ４６０１またはｇａｔ４６２１遺伝子；グルホシネート除草剤耐性ｂａｒ、ｐａｔまたはｐａｔ（ＳＹＮ）遺伝子；ジカンバ除草剤耐性ｄｍｏ遺伝子；２，４−Ｄ除草剤耐性ＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１２遺伝子；ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア系除草剤耐性ＡＬＳ、ＧＭ−ＨＲＡ、Ｓ４−ＨＲＡ、ＺＭ−ＨＲＡ、Ｃｓｒ１、Ｃｓｒ１−１、Ｃｓｒ１−２、ＳｕｒＡまたはＳｕｒＢ；第２光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ）阻害性除草剤耐性ｐｓｂＡ遺伝子；フェニルウレア除草剤耐性ＣＹＰ７６Ｂ１遺伝子；イソキサフルトール除草剤耐性ＨＰＰＤＰＦ  Ｗ３３６遺伝子およびブロモキシニル除草剤耐性ｂｘｎ遺伝子；およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上を例示することができるが、これに制限されるのではない。
【００２６】
他の例は、前記ポリヌクレオチドで形質転換された、除草剤耐性植物および／または藻類の除草剤に対する耐性が付与および／または増進された形質転換体、そのクローン、または子孫を提供する。
【００２７】
他の例は、前記ポリヌクレオチドを植物および／または藻類に形質転換する段階を含む、除草剤に対する耐性が付与および／または増進された植物または藻類を製造する方法を提供する。
【００２８】
他の例は、前記ポリヌクレオチドを植物および／または藻類に形質転換する段階を含む、植物および／または藻類の除草剤に対する耐性を付与および／または増進させる方法を提供する。
【００２９】
前記形質転換は、藻類、および／または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽、または全体（ｗｈｏｌｅ  ｂｏｄｙ）に対して行われることであってもよい。
【００３０】
前記形質転換体は、藻類、または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽、または全体（ｗｈｏｌｅ  ｂｏｄｙ）であってもよい。
【００３１】
他の例は、前記ポリペプチド、ポリペプチド変異体、これを暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上を含む群より選択される１種以上を含む植物を栽培地に提供する段階、および前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階を含む、栽培地で雑草を防除する方法を提供する。
【００３２】
具体例として、前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階は、２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用して行われることであってもよい。
【００３３】
他の例として、前記植物は、第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含むように遺伝的に操作されたものであり、前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤および第２の除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用するものであってもよい。
【００３４】
他の例は、前記ポリペプチド、ポリペプチド変異体、これを暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上を含む群より選択される１種以上を含む藻類を培養培地に提供する段階、および前記培養培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階を含む、栽培地で望まない生物を除去する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
植物または藻類に除草剤に対する耐性を付与および／または増進する技術が提供される。
【００３６】
本明細書で、「植物または藻類の除草剤に対する耐性付与および／または増進」または「植物または藻類の除草剤に対する耐性増進」とは、除草剤に対する耐性がない植物または藻類に対して耐性を付与すること、または除草剤に対する耐性を有している植物または藻類に対してその耐性をより向上させること、またはこれらを両方とも包括する広範囲な意味として解釈される。
【００３７】
本明細書で、「配列からなる」または「配列を含む」というのは、記載された配列を含むか、前記配列を必須的に含む場合を全て意味するために使用され、記載された配列以外の配列を含むことを排除しようとする意図として解釈されない。
【００３８】
一例で、配列番号２のポリペプチドとＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号２のアミノ酸（例えば、配列番号２のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体；および配列番号４のポリペプチドとＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号４のアミノ酸（例えば、配列番号４のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体からなる群より選択される１種以上のポリペプチド変異体が提供される。
【００３９】
他の例で、配列番号２または４のポリペプチドまたは前記ポリペプチド変異体、これらを暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞が提供される。前記ポリヌクレオチドは、各アミノ酸を暗号化するコドンのうちの形質導入される細胞に最適化された（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）コドンを含むように設計されたものであってもよい。前記最適化コドンは、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば容易に知ることができる（例えば、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｃｏｄｏｎ−ｏｐｔ．ｈｔｍｌ」、「ｈｔｔｐ：／／ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ」など参照）。
【００４０】
他の例で、
配列番号２のポリペプチド、配列番号２と９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するポリペプチド、配列番号２のポリペプチドの変異体、配列番号４のポリペプチド、配列番号４と９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するポリペプチド、および配列番号４のポリペプチドの変異体；
前記配列番号２のポリペプチドまたはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、配列番号４のポリペプチドまたはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、および前記ポリペプチドの変異体を暗号化するポリヌクレオチド；
前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および
前記組換えベクターを含む組換え細胞
からなる群より選択された１種以上を含む、植物および／または藻類の除草剤に対する耐性付与および／または増進用組成物を提供する。
【００４１】
一例で、前記配列番号２のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドは配列番号１のポリヌクレオチド配列を含むものであってもよく、配列番号４のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドは配列番号３のポリヌクレオチド配列を含むものであってもよいが、これに制限されるのではない。
【００４２】
他の例で、前記ポリペプチドまたはポリペプチドの変異体を暗号化するポリヌクレオチドで形質転換された、除草剤に対する耐性を有する形質転換体が提供される。前記ポリヌクレオチドは、各アミノ酸を暗号化するコドンのうちの形質導入される細胞に最適化された（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）コドンを含むように設計されたものであってもよい。前記最適化コドンは、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば容易に知ることができる（例えば、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｃｏｄｏｎ−ｏｐｔ．ｈｔｍｌ」、「ｈｔｔｐ：／／ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ」など参照）。
【００４３】
他の例で、前記ポリヌクレオチドを藻類または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽、または植物全体に形質転換する段階を含む、除草剤に対する耐性を有する植物または藻類の製造方法が提供される。
【００４４】
他の例で、前記ポリヌクレオチドを藻類または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽、または植物全体に形質転換する段階を含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性を付与および／または増進させる方法を提供する。
【００４５】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００４６】
本明細書で提供される配列番号２および４のアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびその変異体は原核生物（例えば、藍色細菌）に由来するＰＰＯ蛋白質であって、ＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性を有する除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質である。具体的に、サーモシネココッカスエロンガータス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）ＢＰ−１に由来したＰＰＯ蛋白質が提供され、これをＣｙＰＰＯ１０と命名し、そのアミノ酸配列を配列番号２と、これを暗号化する遺伝子の塩基配列を配列番号１とそれぞれ表す。また、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＪＡ−３−３Ａｂ菌株に由来したＰＰＯが提供され、これをＣｙＰＰＯ１３と命名し、そのアミノ酸配列を配列番号４と、これを暗号化する遺伝子の塩基配列を配列番号３とそれぞれ表す。
【００４７】
本明細書で、前述のポリペプチドおよびポリペプチド変異体は、それぞれＰＰＯ系列除草剤に対して耐性を有する除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質または除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体とも表現することができる。また、本明細書に使用されたものとして、「除草剤耐性ＰＰＯまたはその変異体」は、前記除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質または除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体、除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質暗号化遺伝子または除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体暗号化遺伝子、またはこれら全てを意味するために使用することができる。
【００４８】
藍色細菌由来ＰＰＯ蛋白質はそれ自体で植物ＰＰＯより酵素活性に優れた特性を有し、ＰＰＯ活性阻害除草剤に対して耐性を付与することができるだけでなく、これらＰＰＯ蛋白質は固有の酵素活性を全体的に維持させる範囲内でアミノ酸変異を含むことによって野生型ＰＰＯ蛋白質より除草剤耐性を強化させることができる。このようなアミノ酸変異は、ＰＰＯ蛋白質と除草剤間相互作用部位のアミノ酸残基の中から選択された１種以上のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入を含むものであってもよい。
【００４９】
以下、前記ＰＰＯ蛋白質の変異体をより具体的に説明する。
【００５０】
一例は、配列番号２のポリペプチド（ＣｙＰＰＯ１０）とＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号２のアミノ酸（配列番号２のポリペプチド（ＣｙＰＰＯ１０）のＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または該当位置の元のアミノ酸（即ち、野生型の該当位置のアミノ酸）とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか前記アミノ酸配列からなるポリペプチド変異体を提供する。
【００５１】
前記配列番号２のポリペプチドの欠失または該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されるアミノ酸残基（例えば、配列番号２のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸からなる群より選択された１種以上）は、配列番号２のアミノ酸配列中のＮ５９（「５９番目位置のＮ（Ａｓｎ）」を意味；以下のアミノ酸残基の表現はこれと同一な方式で解釈される）、Ｓ６０、Ｒ８９、Ｆ１６１、Ｖ１６５、Ａ１６７、Ｑ１８４、Ｐ３０３、Ｖ３０５、Ｆ３２４、Ｌ３２７、Ｉ３４０、Ｆ３６０、およびＩ４０８からなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００５２】
一具体例で、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号２のアミノ酸配列中のＮ５９、Ｓ６０、Ｒ８９、Ｆ１６１、Ｖ１６５、Ａ１６７、Ｑ１８４、Ｐ３０３、Ｖ３０５、Ｆ３２４、Ｌ３２７、Ｉ３４０、Ｆ３６０、およびＩ４０８からなる群より選択された１種以上が、それぞれ独立して、欠失またはＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｋ（Ｌｙｓ）などからなる群より選択され、該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換（例えば、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、およびＧ（Ｇｌｙ）などからなる群より選択され、該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換）されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００５３】
例えば、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｆ３６０Ｍ（３６０番目位置のアミノ酸残基がＦ（Ｐｈｅ）からＭ（Ｍｅｔ）に置換されることを意味する；以下のアミノ酸変異の表現はこれと同一な方式で解釈される）、Ｆ３６０Ｖ、Ｆ３６０Ｉ、Ｆ３６０Ｔ、Ｆ３６０Ｌ、Ｆ３６０Ｃ、Ａ１６７Ｃ、Ａ１６７Ｌ、Ａ１６７Ｉ、Ｐ３０３Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５Ｍ、Ｖ３０５Ｔ、Ｎ５９Ｔ、Ｓ６０Ｔ、Ｒ８９Ａ、Ｒ８９Ｌ、Ｒ８９Ｖ、Ｆ１６１Ａ、Ｖ１６５Ｓ、Ｖ１６５Ｃ、Ｑ１８４Ｇ、Ｆ３２４Ｖ、Ｌ３２７Ｔ、Ｉ３４０Ｔ、Ｉ４０８Ｒ、およびＩ４０８Ｗからなる群より選択された１種以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。より具体的に、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｆ３６０Ｍ、Ｆ３６０Ｖ、Ｆ３６０Ｉ、Ｆ３６０Ｔ、Ｆ３６０Ｌ、Ｆ３６０Ｃ、Ａ１６７Ｃ、Ａ１６７Ｌ、Ａ１６７Ｉ、Ｐ３０３Ｌ、Ｎ５９Ｔ、Ｓ６０Ｔ、Ｒ８９Ａ、Ｒ８９Ｌ、Ｒ８９Ｖ、Ｆ１６１Ａ、Ｖ１６５Ｓ、Ｖ１６５Ｃ、Ｑ１８４Ｇ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５Ｍ、Ｖ３０５Ｔ、Ｆ３２４Ｖ、Ｌ３２７Ｔ、Ｉ３４０Ｔ、Ｉ４０８Ｒ、Ｉ４０８Ｗ、Ｐ３０３Ｌ＋Ｖ３０５Ｌ（３０３番目残基のＰからＬへの置換および３０５番目残基のＶからＬへの置換を全て含む；以下の２つ以上のアミノ酸変異の表現はこれと同一な方式で解釈される）、Ｎ５９Ｔ＋Ｆ３６０Ｖ、Ｓ６０Ｔ＋Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｓ６０Ｔ＋Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｓ６０Ｔ＋Ｉ３４０Ｔ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｒ８９Ａ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｒ８９Ａ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｒ８９Ａ＋Ｆ３６０Ｌ、Ｒ８９Ｌ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｒ８９Ｖ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｒ８９Ａ＋Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｒ８９Ａ＋Ｖ３０５Ｔ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｌ、Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｖ、Ｖ１６５Ｃ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｃ＋Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｃ＋Ａ１６７Ｉ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｃ＋Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｉ、Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｉ、Ａ１６７Ｉ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ３０５Ｍ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ３０５Ｔ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｖ３０５Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｉ４０８Ｒ＋Ｆ３６０Ｍ、またはＩ４０８Ｗ＋Ｆ３６０Ｍのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００５４】
他の例は、配列番号４のポリペプチド（ＣｙＰＰＯ１３）とＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号４のアミノ酸（配列番号４のポリペプチド（ＣｙＰＰＯ１３）のＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または該当位置の元のアミノ酸（即ち、野生型の該当位置のアミノ酸）とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか前記アミノ酸配列からなるポリペプチド変異体を提供する。
【００５５】
前記配列番号４のポリペプチドの欠失または該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されるアミノ酸残基（例えば、配列番号４のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸からなる群より選択された１種以上）は、配列番号４のアミノ酸配列中のＲ１０１、Ｆ１７１、Ｖ１７５、Ａ１７７、Ｇ１９４、Ｐ３１６、Ｖ３１８、Ｆ３３７、Ｌ３４０、Ｉ３５３、およびＦ３７３からなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００５６】
一具体例で、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号４のアミノ酸配列中のＲ１０１、Ｆ１７１、Ｖ１７５、Ａ１７７、Ｇ１９４、Ｐ３１６、Ｖ３１８、Ｆ３３７、Ｌ３４０、Ｉ３５３、およびＦ３７３からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して、欠失またはＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｋ（Ｌｙｓ）などからなる群より選択され、該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換（例えば、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｎ（Ａｓｎ）などからなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換）されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００５７】
例えば、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号４のアミノ酸配列において、Ｆ３７３Ｍ、Ｆ３７３Ｖ、Ｆ３７３Ｉ、Ｆ３７３Ｔ、Ｆ３７３Ｌ、Ｆ３７３Ｃ、Ｆ３７３Ｎ、Ｆ３７３Ｈ、Ａ１７７Ｃ、Ａ１７７Ｌ、Ａ１７７Ｉ、Ｐ３１６Ａ、Ｐ３１６Ｌ、Ｖ３１８Ｌ、Ｖ３１８Ｍ、Ｒ１０１Ａ、Ｆ１７１Ａ、Ｖ１７５Ｃ、Ｖ１７５Ｌ、Ｇ１９４Ｅ、Ｇ１９４Ｑ、Ｇ１９４Ｍ、Ｇ１９４Ｋ、Ｇ１９４Ｒ、Ｆ３３７Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、およびＩ３５３Ｔ からなる群より選択された１種以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。より具体的に、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号４のアミノ酸配列においてＦ３７３Ｍ、Ｆ３７３Ｖ、Ｆ３７３Ｉ、Ｆ３７３Ｔ、Ｆ３７３Ｌ、Ｆ３７３Ｃ、Ｆ３７３Ｎ、Ｆ３７３Ｈ、Ａ１７７Ｃ、Ａ１７７Ｌ、Ａ１７７Ｉ、Ｐ３１６Ａ、Ｐ３１６Ｌ、Ｖ３１８Ｌ、Ｖ３１８Ｍ、Ｒ１０１Ａ、Ｆ１７１Ａ、Ｖ１７５Ｃ、Ｖ１７５Ｌ、Ｇ１９４Ｅ、Ｇ１９４Ｑ、Ｇ１９４Ｍ、Ｇ１９４Ｋ、Ｇ１９４Ｒ、Ｆ３３７Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｉ３５３Ｔ、Ｐ３１６Ｌ＋Ｖ３１８Ｌ、Ｐ３１６Ａ＋Ｖ３１８Ｌ、Ｒ１０１Ａ＋Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｃ＋Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｉ＋Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｉ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｌ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｔ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｖ、Ａ１７７Ｃ＋Ｆ３７３Ｔ、Ａ１７７Ｃ＋Ｆ３７３Ｖ、Ｖ１７５Ｌ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｅ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｑ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｍ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｋ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｒ＋Ｆ３７３Ｍ、またはＶ３１８Ｍ＋Ｆ３７３Ｍのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００５８】
本明細書に記載された配列相同性（例えば、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはポリペプチド変異体は、配列相同性判断の基準となるアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば、前述のアミノ酸配列またはアミノ酸変異を有するＰＰＯ蛋白質）と同等程度の酵素活性、例えば、植物内（植物体内、植物細胞または細胞培養体内、植物組織内など）、藻類内、および／または試験管内で基準となるアミノ酸配列を有するポリペプチドの５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の酵素活性を維持しながら除草剤抵抗性を付与する機能を保有するものであってもよく、前記のような配列相同性基材は、本明細書に記載された除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質または変異体が前記条件（酵素活性を維持しながら除草剤抵抗性を付与する機能を保有）を満足する範囲の全ての配列変異を含むことができるのを明確にするために使用される。
【００５９】
本明細書で使用されたアミノ酸の命名を以下の表に整理した：
【表０】
2019527538.tif 000003
前記除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体は、酵素活性は維持しながら、野生型と比較して増進された除草剤耐性を示すことを特徴とする。
【００６０】
また、前記ポリペプチド（除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質）およびポリペプチド変異体（除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体）は、前述のような配列番号２または配列番号４、または前述のようなアミノ酸変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと生物学的均等な活性を示す変異を追加的に含むことができる。例えば、前記追加的変異は、分子の活性を全体的に変更させないアミノ酸置換であってもよく、このようなアミノ酸置換は当該分野に公知されている。一例で、前記追加的置換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、またはＡｓｐ／Ｇｌｙ間の置換が挙げられるが、これに制限されるのではない。場合によって、前記除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体は、一つ以上のアミノ酸がリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アシル化（ａｃｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などからなる群より選択された１種以上に修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。また、前記除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体は、アミノ酸変異および／または修飾によって蛋白質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性が増加するか蛋白質活性が増加した蛋白質変異体を含むことができる。
【００６１】
用語「配列相同性」とは、野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）または基準となるアミノ酸配列または塩基配列との類似の程度を示すためのものであって、除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体のアミノ酸配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上同一なアミノ酸残基を含みながら、前記除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質またはその変異体と生物学的に均等な活性を保有すれば本発明の範囲に含まれ得る。このような蛋白質相同物は目的蛋白質と同一な活性部位を含むことができる。このような相同性の比較は、肉眼で、または購入が容易な比較プログラムを用いて行うことができる。オンライン分析プログラムは、２つ以上の配列間の相同性を百分率（％）に計算することができる。比較のための配列整列方法は当業界に知られた方法を用いることができ、例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、およびＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａなどを含む。
【００６２】
前記除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質またはこれらの変異体は、当分野に広く公知された方法で天然から抽出および精製して得ることができる。または、遺伝子組換え技術を用いた組換え蛋白質として得ることができる。遺伝子組換え技術を用いる場合、除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質またはこれらの変異体を暗号化する核酸を適切な発現ベクターに挿入し、ベクターを宿主細胞に形質転換して目的蛋白質が発現されるように宿主細胞を培養した後、宿主細胞から除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質またはこれらの変異体を回収する過程で得ることができる。蛋白質は選択された宿主細胞で発現させた後、分離および精製のために通常の生化学分離技術、例えば蛋白質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、超音波破砕、限外ろ過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどを用いることができ、純度の高い蛋白質を分離するためにこれらのうちの２種類以上を組み合わせて用いることができる。
【００６３】
前記除草剤耐性ＰＰＯ核酸分子（ＰＰＯ蛋白質またはこれらの変異体を暗号化するポリヌクレオチド）は、標準分子生物学技術、例えば化学的合成方法または組換え方法を用いて分離または製造するか、市販されるものを使用することができる。
【００６４】
具体的な実施例で、前記提供されたＰＰＯ蛋白質／核酸分子またはこれらの変異体はＰＰＯが欠乏した大腸菌ＢＴ３（ΔＰＰＯ）を用いた除草剤耐性検証システムを通じて、化学構造によって９個系統に属する代表的なＰＰＯ活性阻害除草剤に対して広範囲な除草剤耐性を示すということが検証され、トランジットペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＴＰ）を使用すれば植物の葉緑体で発現できるということが確認された。また、前記ＰＰＯ蛋白質／核酸分子は植物発現用ベクターによってシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｅｃｏｔｙｐｅ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ−０）のような双子葉植物または稲のような単子葉植物で発現が可能であり、このように形質転換された植物体にＰＰＯ活性阻害除草剤を処理しても植物が発芽および／または生長可能であることが確認された。同時に、後代遺伝性試験を通じて上記のような除草剤耐性形質が次世代に成功的に伝達されることが確認された。
【００６５】
したがって、本明細書で提供するＰＰＯ蛋白質またはこれらの変異体を植物または藻類に導入することによって植物または藻類の除草剤耐性を付与および／または増進させるのに使用できる。
【００６６】
一例は、
（１）配列番号２、配列番号４、またはこれらと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）前述のポリペプチド変異体、
（３）前記ポリペプチド（１）またはポリペプチド変異体（２）を暗号化するポリヌクレオチド、
（４）前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
（５）前記組換えベクターを含む組換え細胞
からなる群より選択された１種以上を含む、植物および／または藻類の除草剤に対する耐性付与および／または増進用組成物を提供する。
【００６７】
本明細書で除草剤とは、植物または藻類を死滅させるか防除するか、または植物または藻類の生長を不利に調整する活性成分をいう。また、本願で除草剤耐性とは、正常または野生型植物または藻類を正常に死滅させるかその生長を正常に抑制させる除草剤を処理しても、正常または野生型の植物または藻類に比べて植物または藻類生長の阻害程度が弱化されるか除去され、植物または藻類の生長が持続的に行われることをいう。前記除草剤は、植物または藻類のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を抑制する除草剤を含む。このようなＰＰＯ阻害除草剤は、化学構造によってピリミジンジオン系（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、ジフェニルエーテル系（ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｅｔｈｅｒｓ）、フェニルピラゾール系（ｐｈｅｎｙｌｐｙｒａｚｏｌｅｓ）、フェニルフタルイミド系（Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅｓ）、フェニルエステル系（ｐｈｅｎｙｌｅｓｔｅｒｓ）、チアジアゾール系（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅｓ）、オキサジアゾール系（ｏｘａｄｉａｚｏｌｅｓ）、トリアゾリノン系（ｔｒｉａｚｏｌｉｎｏｎｅｓ）、オキサゾリジンジオン系（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）およびその他の除草剤を例示することができる。
【００６８】
具体例として、ピリミジンジオン系除草剤は、ブタフェナシル（ｂｕｔａｆｅｎａｃｉｌ）、サフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）、ベンズフェンジゾン（ｂｅｎｚｆｅｎｄｉｚｏｎｅ）およびチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を含むが、これに制限されない。
【００６９】
ジフェニルエーテル系除草剤は、ホメサフェン（ｆｏｍｅｓａｆｅｎ）、オキシフルオルフェン（ｏｘｙｆｌｕｏｒｆｅｎ）、アクロニフェン（ａｃｌｏｎｉｆｅｎ）、アシフルオルフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）、ビフェノックス（ｂｉｆｅｎｏｘ）、エトキシフェン（ｅｔｈｏｘｙｆｅｎ）、ラクトフェン（ｌａｃｔｏｆｅｎ）、クロメトキシフェン（ｃｈｌｏｍｅｔｈｏｘｙｆｅｎ）、クロルニトロフェン（ｃｈｌｏｒｎｉｔｒｏｆｅｎ）、フルオログリコフェン−エチル（ｆｌｕｏｒｏｇｌｙｃｏｆｅｎ−ｅｔｈｙｌ）およびハロサフェン（ｈａｌｏｓａｆｅｎ）を含むが、これに制限されない。
【００７０】
フェニルピラゾール系除草剤は、ピラフルフェン−エチル（ｐｙｒａｆｌｕｆｅｎ−ｅｔｈｙｌ）およびフルアゾレート（ｆｌｕａｚｏｌａｔｅ）を含むが、これに制限されない。
【００７１】
フェニルフタルイミド系除草剤は、フルミオキサジン（ｆｌｕｍｉｏｘａｚｉｎ）、シニドン−エチル（ｃｉｎｉｄｏｎ−ｅｔｈｙｌ）およびフルミクロラック−ペンチル（ｆｌｕｍｉｃｌｏｒａｃ−ｐｅｎｔｙｌ）を含むが、これに制限されない。
【００７２】
フェニルエステル系（ｐｈｅｎｙｌｅｓｔｅｒｓ）除草剤は、フェノピレート（ｐｈｅｎｏｐｙｌａｔｅ；２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  １−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）およびフェノピレートのカルバメート類似体（例えば、Ｏ−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ−  ａｎｄ  ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏｃａｒｂａｍａｔｅ  ａｎａｌｏｇｅｓ（“Ｕｊｊａｎａ  Ｂ．Ｎａｎｄｉｈａｌｌｉ，Ｍａｒｙ  Ｖ．Ｄｕｋｅ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｏ．Ｄｕｋｅ，Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｏ−ｐｈｅｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ−  ａｎｄ  ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏｃａｒｂａｍａｔｅ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，１９９２，４０（１０）  １９９３−２０００”参照））などを含むが、これに制限されるのではない。一具体例で、前記フェノピレートのカルバメート類似体は、ピロリジン−１カルボン酸フェニルエステル（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｅｎｙｌ  ｅｓｔｅｒ；ＣＡＳ  Ｎｏ．５５３７９−７１−０）、１−ピロリジンカルボン酸、２−クロロフェニルエステル（１−Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ、２−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｅｓｔｅｒ；ＣＡＳ  Ｎｏ．１４３１２１−０６−６）、４−クロロフェニルピロリジン−１−カルボキシレート（４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：ＣＡＳ  Ｎｏ．１７５９−０２−０）、カルバミン酸、ジエチル−、２，４−ジクロロ−５−（２−プロピニルオキシ）フェニルエステル（ｃａｒｂａｍｉｃ  ａｃｉｄ、ｄｉｅｔｈｙｌ−、２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−５−（２−ｐｒｏｐｙｎｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ  ｅｓｔｅｒ（９ＣＩ）；ＣＡＳ  Ｎｏ．１４３１２１−０７−７）、１−ピロリジンカルボン酸、２，４−ジクロロ−５−ヒドロフェニルエステル（１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ、２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−５−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ｅｓｔｅｒ；ＣＡＳ  Ｎｏ．１４３１２１−０８−８）、２，４−ジクロロ−５−（メトキシカルボニル）フェニルピロリジン−１−カルボキシレート（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−５−（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＣＡＳ  Ｎｏ．１３３６３６−９４−９）、２，４−ジクロロ−５−［（プロパン−２−イルオキシ）カルボニル］フェニルピロリジン−１−カルボキシレート（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−５−［（ｐｒｏｐａｎ−２−ｙｌｏｘｙ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＣＡＳ  Ｎｏ．１３３６３６−９６−１）、１−ピペリジンカルボン酸、２，４−ジクロロ−５−（２−プロピニルオキシ）フェニルエステル（１−Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ、２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−５−（２−ｐｒｏｐｙｎｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ  ｅｓｔｅｒ；ＣＡＳ  Ｎｏ．８７３７４−７８−５）、２，４−ジク���ロ−５−（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）フェニルピロリジン−１−カルボキシレート（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−５−（ｐｒｏｐ−２−ｙｎ−１−ｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＣＡＳ  Ｎｏ．８７３６５−６３−７）、２，４−ジクロロ−５−（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）フェニル４，４−ジフルオロピペリジン−１−カルボキシレート（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−５−（ｐｒｏｐ−２−ｙｎ−１−ｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ  ４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＣＡＳ  Ｎｏ．１３８９２６−２２−４）、１−ピロリジンカルボン酸、３，３−ジフルオロ−、２，４−ジクロロ−５−（２−プロピン−１−イルオキシ）フェニルエステル（１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ、３，３−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−、２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−５−（２−ｐｒｏｐｙｎ−１−ｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ  ｅｓｔｅｒ；ＣＡＳ  Ｎｏ．１４３１２１−１０−２），４−クロロ−２−フルオロ−５−［（プロパン−２−イルオキシ）カルボニル］フェニルピロリジン−１−カルボキシレート（４−ｃｈｌｏｒｏ−２−ｆｌｕｏｒｏ−５−［（ｐｒｏｐａｎ−２−ｙｌｏｘｙ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＣＡＳ  Ｎｏ．１３３６３６−９８−３）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００７３】
チアジアゾール系除草剤は、フルチアセット（ｆｌｕｔｈｉａｃｅｔ）およびチジアジミン（Ｔｈｉｄｉａｚｉｍｉｎ）を含むが、これに制限されない。
【００７４】
オキサジアゾール系除草剤は、オキサジアルギル（ｏｘａｄｉａｒｇｙｌ）およびオキサジアゾン（Ｏｘａｄｉａｚｏｎ）を含むが、これに制限されない。
【００７５】
トリアゾリノン系除草剤は、カルフェントラゾン（ｃａｒｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）、スルフェントラゾン（ｓｕｌｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）およびアザフェニジン（ａｚａｆｅｎｉｄｉｎ）を含むが、これに制限されない。
【００７６】
オキサゾリジンジオン系除草剤は、ペントキサゾン（ｐｅｎｔｏｘａｚｏｎｅ）を含むが、これに制限されない。
【００７７】
その他の除草剤は、ピラクロニル（ｐｙｒａｃｌｏｎｉｌ）、フルフェンピル−エチル（ｆｌｕｆｅｎｐｙｒ−ｅｔｈｙｌ）およびプロフルアゾル（ｐｒｏｆｌｕａｚｏｌ）を含むが、これに制限されない。
【００７８】
本願で提供する除草剤耐性ＰＰＯ遺伝子またはその変異体は当業界に公知された多様な方法によって植物体または藻類内に導入することができ、好ましくは植物または藻類形質転換用発現ベクターを用いることができる。
【００７９】
植物体形質転換の場合、ベクターに含まれる適したプロモーターとしては、植物体内遺伝子導入のために当業界で通常用いられるいずれのものも用いることができ、例えば、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＰＭプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、サトウキビバシリフォルムウイルスプロモーター、コメリナイエローモットルウイルスプロモーター、リブロース−１，５−ビス−ホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）の光誘導性プロモーター、稲サイトゾルトリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、シロイヌナズナのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）プロモーター、オクトピンシンターゼプロモーターおよびＢＣＢ（ｂｌｕｅ  ｃｏｐｐｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）プロモーターなどからなる群より選択された１種以上を使用することができるが、これに制限されるのではない。
【００８０】
また、前記ベクターは、３’−末端のポリアデニル化を引き起こすポリＡシグナル配列を含むことができ、例えば、アグロバクテリウムツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子に由来したもの（ＮＯＳ  ３’ｅｎｄ）、アグロバクテリウムツメファシエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子に由来したターミネーター（ｏｃｔｏｐｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、トマトまたはジャガイモのプロテアーゼインヒビターＩまたはＩＩ遺伝子の３’末端部分、ＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーター、稲α−アミラーゼＲＡｍｙ１  Ａターミネーターおよびファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎｅ）ターミネーターを含むことができるが、これに制限されるのではない。
【００８１】
また、藻類形質転換の場合、プロモーターとして葉緑体特異的プロモーター、核プロモーター、常時性プロモーターまたは誘導性プロモーターを使用することができる。本明細書で提供される除草剤耐性ＰＰＯ遺伝子またはその変異体は、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに作動的に連結され藻類の核中で機能を発揮するように設計できる。また、前記ベクターは、藻類形質転換に適した転写調節配列をさらに含むことができる。除草剤耐性を付与する組換え遺伝子は、宿主藻類で核のゲノムまたは葉緑体のゲノムに統合できるが、これに制限されるのではない。
【００８２】
また、前記ベクターは、除草剤耐性ＰＰＯ遺伝子またはその変異体を葉緑体に発現させるために、葉緑体へのターゲッティングに必要なトランジットペプチドをＰＰＯ遺伝子またはその変異体の５’−位置に連結させることができる。
【００８３】
また、前記ベクターは選択的に、リポーター分子として選択標識を暗号化する遺伝子を追加的に含むことができ、選択標識の例として抗生剤（例：ネオマイシン、カルベニシリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコールなど）または除草剤（グリホサート、グルホシネート、ホスフィノトリシンなど）耐性遺伝子などを含むことができるが、これに制限されるのではない。
【００８４】
また、植物発現用組換えベクターは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）バイナリーベクター、コインテグレーションベクター（ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）またはＴ−ＤＮＡ部位を含まないが、植物で発現されるようにデザインされた一般ベクターが使用できる。この中、バイナリーベクターはＴｉ（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プラスミドで移動に必要な部分であるＬＢ（ｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒ）とＲＢ（ｒｉｇｈｔ  ｂｏｒｄｅｒ）を有するプラスミドと、ターゲットヌクレオチドを移すのに必要な遺伝子を有するプラスミドを含むベクターを言い、その内部に植物体で発現させるためのプロモーター部位とポリアデニル化信号配列を含むベクターを使用することができる。
【００８５】
前記でバイナリーベクターまたはコインテグレーションベクターを使用する場合、植物体に前記組換えベクターを導入するための形質転換用菌株としてはアグロバクテリウムを使用することが好ましく（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、この時、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウムリゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用することができる。その他に、Ｔ−ＤＮＡ部位を含まないベクターを用いる場合には、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、粒子銃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、ポリエチレングリコール沈殿法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｕｐｔａｋｅ）などが組換えプラスミドを植物体に導入するのに用いられ得る。
【００８６】
前記のような方法で遺伝子が導入された形質転換植物は、当業界に公知された標準技術を使用してカルス誘導、発根および土壌純化のような過程を経て植物体に再分化させることができる。
【００８７】
本明細書で形質転換の対象になる植物は、成熟した植物体だけでなく成熟した植物に発育可能な植物細胞（懸濁培養細胞含み）、原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）、カルス（ｃａｌｌｕｓ）、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、種子（ｓｅｅｄ）、子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）、新芽（ｓｈｏｏｔ）などを全て含む意味として理解される。
【００８８】
また、本明細書の形質転換体の範疇には前記遺伝子が導入された形質転換体だけでなくそのクローンまたは子孫（Ｔ１世代、Ｔ２世代、Ｔ３世代、Ｔ４世代、Ｔ５世代、またはそれ以上）を含み、例えば、ＰＰＯ遺伝子またはその変異体が形質転換された植物の無性または有性子孫として除草剤耐性形質が遺伝した植物も本発明の形質転換植物の範疇に含まれる。また、本願の遺伝子が形質転換された植物の全ての交配および融合生成物と共に、初期形質転換された植物の特性を示す全ての突然変異体および変異体が本発明の範疇に含まれる。同時に、本発明の方法で予め形質転換させた形質転換された植物、またはこれらの子孫に起源し形質転換された細胞の少なくとも一部からなる種子、花、幹、果実、葉、根、塊茎、および／または塊根のような植物の一部も本発明の範疇に含まれる。
【００８９】
本発明が適用される植物は特に制限されず、単子葉または双子葉植物を全て含んでなる群より選択された１種以上であってもよい。また草本または木本植物であってもよい。前記単子葉植物は、オモダカ科（Ａｌｉｓｍａｔａｃｅａｅ）、トチカガミ科（Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｃｅａｅ）、シバナ科（Ｊｕｎｃａｇｉｎａｃｅａｅ）、ホロムイソウ科（Ｓｃｈｅｕｃｈｚｅｒｉａｃｅａｅ）、ヒルムシロ科（Ｐｏｔａｍｏｇｅｔｏｎａｃｅａｅ）、イバラモ科（Ｎａｊａｄａｃｅａｅ）、アマモ科（Ｚｏｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、ハエモドルム科（Ｈａｅｍｏｄｏｒａｃｅａｅ）、リュウゼツラン科（Ａｇａｖａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、ヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）、ミズアオイ科（Ｐｏｎｔｅｄｅｒｉａｃｅａｅ）、アヤメ科（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）、ヒナノシャクジョウ科（Ｂｕｒｍａｎｎｉａｃｅａｅ）、イグサ科（Ｊｕｎｃａｃｅａｅ）、ツユクサ科（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｃｅａｅ）、ホシクサ科（Ｅｒｉｏｃａｕｌａｃｅａｅ）、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ、Ｐｏａｃｅａｅ）、サトイモ科（Ａｒａｃｅａｅ）、ウキクサ科（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）、ミクリ科（Ｓｐａｒｇａｎｉａｃｅａｅ）、ガマ科（Ｔｙｐｈａｃｅａｅ）、カヤツリグサ科（Ｃｙｐｅｒａｃｅａｅ）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）、カンナ科（Ｃａｎｎａｃｅａｅ）、ラン科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）の植物を含むことができるが、これに制限されるのではない。
【００９０】
前記双子葉植物は、イワウメ科（Ｄｉａｐｅｎｓｉａｃｅａｅ）、リョウブ科（Ｃｌｅｔｈｒａｃｅａｅ）、イチヤクソウ科（Ｐｙｒｏｌａｃｅａｅ）、ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）、サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）、イソマツ科（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ）、カキノキ科（Ｅｂｅｎａｃｅａｅ）、エゴノキ科（Ｓｔｙｒａｃａｃｅａｅ）、ハイノキ科（Ｓｙｍｐｌｏｃａｃｅａｅ）、モクセイ科（Ｏｌｅａｃｅａｅ）、マチン科（Ｌｏｇａｎｉａｃｅａｅ）、リンドウ科（Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）、ミツガシワ科（Ｍｅｎｙａｎｔｈａｃｅａｅ）、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、ガガイモ科（Ａｓｃｌｅｐｉａｄａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）、ヒルガオ科（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ）、ムラサキ科（Ｂｏｒａｇｉｎａｃｅａｅ）、クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ノウゼンカズラ科（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａｅ）、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、ゴマ科（Ｐｅｄａｌｉａｃｅａｅ）、ハマウツボ科（Ｏｒｏｂａｎｃｈａｃｅａｅ）、イワタバコ科（Ｇｅｓｎｅｒｉａｃｅａｅ）、タヌキモ科（Ｌｅｎｔｉｂｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ハエドクソウ科（Ｐｈｒｙｍａｃｅａｅ）、オオバコ科（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、スイカズラ科（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）、レンプクソウ科（Ａｄｏｘａｃｅａｅ）、オミナエシ科（Ｖａｌｅｒｉａｎａｃｅａｅ）、マツムシソウ科（Ｄｉｐｓａｃａｃｅａｅ）、キキョウ科（Ｃａｍｐａｎｕｌａｃｅａｅ）、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、ヤマモモ科（Ｍｙｒｉｃａｃｅａｅ）、クルミ科（Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ）、ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）、カバノキ科（Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ）、ブナ科（Ｆａｇａｃｅａｅ）、ニレ科 （Ｕｌｍａｃｅａｅ）、クワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）、イラクサ科（Ｕｒｔｉｃａｃｅａｅ）、ビャクダン科（Ｓａｎｔａｌａｃｅａｅ）、ヤドリギ科（Ｌｏｒａｎｔｈａｃｅａｅ）、タデ科（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）、ヤマゴボウ科（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａｃｅａｅ）、オシロイバナ科（Ｎｙｃｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、ザクロソウ科（Ａｉｚｏａｃｅａｅ）、スベリヒユ科（Ｐｏｒｔｕｌａｃａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、ヒユ科（Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ）、サボテン科（Ｃａｃｔａｃｅａｅ）、モクレン科（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ）、シキミ科（Ｉｌｌｉｃｉａｃｅａｅ）、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、カツラ科（Ｃｅｒｃｉｄｉｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、キンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）、メギ科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）、アケビ科（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌａｃｅａｅ）、ツヅラフジ科（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍａｃｅａｅ）、スイレン科（Ｎｙｍｐｈａｅａｃｅａｅ）、マツモ科（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、ハゴロモモ科（Ｃａｂｏｍｂａｃｅａｅ）、ドクダミ科（Ｓａｕ��ｕｒａｃｅａｅ）、コショウ科（Ｐｉｐｅｒａｃｅａｅ）、センリョウ科（Ｃｈｌｏｒａｎｔｈａｃｅａｅ）、ウマノスズクサ科（Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａｃｅａｅ）、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）、オトギリソウ科（Ｇｕｔｔｉｆｅｒａｅ）、モウセンゴケ科（Ｄｒｏｓｅｒａｃｅａｅ）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、フウチョウソウ科（Ｃａｐｐａｒｉｄａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、スズカケノキ科（Ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）、マンサク科（Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｃｅａｅ）、ベンケイソウ科（Ｃｒａｓｓｕｌａｃｅａｅ）、ユキノシタ科（Ｓａｘｉｆｒａｇａｃｅａｅ）、トチュウ科（Ｅｕｃｏｍｍｉａｃｅａｅ）、トベラ科（Ｐｉｔｔｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）、カタバミ科（Ｏｘａｌｉｄａｃｅａｅ）、フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）、ノウゼンハレン科（Ｔｒｏｐａｅｏｌａｃｅａｅ）、ハマビシ科（Ｚｙｇｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、アマ科（Ｌｉｎａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、アワゴケ科（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）、ニガキ科（Ｓｉｍａｒｏｕｂａｃｅａｅ）、センダン科（Ｍｅｌｉａｃｅａｅ）、ヒメハギ科（Ｐｏｌｙｇａｌａｃｅａｅ）、ウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、カエデ科（Ａｃｅｒａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）、トチノキ科（Ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎａｃｅａｅ）、アワブキ科（Ｓａｂｉａｃｅａｅ）、ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）、モチノキ科（Ａｑｕｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）、ニシキギ科（Ｃｅｌａｓｔｒａｃｅａｅ）、ミツバウツギ科（Ｓｔａｐｈｙｌｅａｃｅａｅ）、ツゲ科（Ｂｕｘａｃｅａｅ）、ガンコウラン科（Ｅｍｐｅｔｒａｃｅａｅ）、クロウメモドキ科（Ｒｈａｍｎａｃｅａｅ）、ブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、ホルトノキ科（Ｅｌａｅｏｃａｒｐａｃｅａｅ）、シナノキ科（Ｔｉｌｉａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、アオギリ科（Ｓｔｅｒｃｕｌｉａｃｅａｅ）、ジンチョウゲ科（Ｔｈｙｍｅｌａｅａｃｅａｅ）、グミ科（Ｅｌａｅａｇｎａｃｅａｅ）、イイギリ科（Ｆｌａｃｏｕｒｔｉａｃｅａｅ）、スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）、トケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）、ギョリュウ科（Ｔａｍａｒｉｃａｃｅａｅ）、ミゾハコベ科（Ｅｌａｔｉｎａｃｅａｅ）、シュウカイドウ科（Ｂｅｇｏｎｉａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ミソハギ科（Ｌｙｔｈｒａｃｅａｅ）、ザクロ科（Ｐｕｎｉｃａｃｅａｅ）、アカバナ科（Ｏｎａｇｒａｃｅａｅ）、アリノトウグサ科（Ｈａｌｏｒａｇａｃｅａｅ）、ウリノキ科（Ａｌａｎｇｉａｃｅａｅ）、ミズキ科（Ｃｏｒｎａｃｅａｅ）、ウコギ科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）、セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ（Ａｐｉａｃｅａｅ））の植物を含むことができるが、これに限定されるのではない。
【００９１】
具体例として、上記植物は、稲、小麦、麦、トウモロコシ、大豆、ジャガイモ、小豆、燕麦およびキビを含む食糧作物類；ハクサイ、ダイコン、トウガラシ、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、ネギ、タマネギおよびニンジンを含む野菜作物類；朝鮮人参、タバコ、ワタ、馬草、牧草、ゴマ、サトウキビ、サトウダイコン、エゴマ、ピーナッツ、アブラナ、芝およびトウゴマを含む特用作物類；リンゴの木、ナシの木、ナツメの木、桃、キウイフルーツ、ブドウ、ミカン、柿、スモモ、アンズおよびバナナを含むやり果樹類；松、パームオイルおよびユーカリを含む木本類；バラ、グラジオラス、ガーベラ、カーネーション、菊、ユリおよびチューリップを含む花卉類；およびライグラス、レッドクローバー、オーチャードグラス、アルファルファ、トールフェスクおよびペレニアルライグラスを含む飼料作物類などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されない。具体例として、上記植物は、シロイヌナズナ、ジャガイモ、ナス、タバコ、トウガラシ、トマト、ゴボウ、シュンギク、チシャ、キキョウ、ホウレンソウ、フダンソウ、サツマイモ、セロリ、ニンジン、セリ、パセリ、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、スイカ、マクワウリ、キュウリ、カボチャ、ユウガオ、イチゴ、大豆、緑豆、インゲンマメ、またはエンドウなどの双子葉植物；および稲、小麦、麦、トウモロコシ、キビなどの単子葉植物などからなる群より選択された１種以上が挙げられるが、これに制限されるのではない。
【００９２】
本発明が適用される藻類は特に制限されず、原核（Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ）藻類または真核（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ）藻類であってもよい。例えば、藻類は、シアノバクテリア、緑藻類、紅藻類、褐藻類、大型藻類（ｍａｃｒｏａｌｇａｅ）または微細藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）であってもよい。
【００９３】
シアノバクテリア類としては、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ門（例、Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ、Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ、Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｏｏｇｌｏｅｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｃｙａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ、Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ、Ｊｏｈａｎｎｅｓｂａｐｔｉｓｔｉａ、Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒａｄｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒｈａｂｄｏｄｅｒｍａ、Ｓｎｏｗｅｌｌａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｗｏｒｏｎｉｃｈｉｎｉａ）、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ門（例、Ｍｉｃｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、Ｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ、Ｒｉｖｕｌａｒｉａｃｅａｅ、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａｔａｃｅａｅ）、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ門（例、Ａｒｔｈｒｏｎｅｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ、Ｂｌｅｎｎｏｔｈｒｉｘ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ、Ｇｅｉｔｌｅｒｉｎｅｍａ、Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｎｅｍａ、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｈｙｄｒｏｃｏｌｅｕｍ、Ｊａａｇｉｎｅｍａ、Ｋａｔａｇｎｙｍｅｎｅ、Ｋｏｍｖｏｐｈｏｒｏｎ、Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ、Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ、Ｌｙｎｇｂｙａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ、Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｓｔａｒｒｉａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｔｙｃｈｏｎｅｍａ）、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓ門（例、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐａ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ、Ｓｏｌｅｎｔｉａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒａｌｅｓ門、またはＳｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓ門（例、Ｃａｐｓｏｓｉｒａ、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ、Ｈａｐａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｏｐｓｉｓ、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ、Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ、Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ、Ｓｙｍｐｈｙｏｎｅｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｎｅｍｏｐｓｉｓ、Ｕｍｅｚａｋｉａ、Ｗｅｓｔｉｅｌｌｏｐｓｉｓ）などを例示することができる。
【００９４】
藻類の他の例として、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｖｏｌｖａｃａｌｅｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、またはＨｅｍａｔｏｃｏｃｃｍを例示することができる。
【００９５】
藻類の他の例として、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ  ｈｙａｌｉｎｅ、Ａｍｐｈｏｒａ  ｓｐｐ．、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐａｌｅａ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｃａｒｔｅｒａｅ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｃｈｕｉｉ、Ｐａｖｌｏｖａ  ｓｐｐ．、Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ  ｓｐｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐｐ．などを例示することができる。しかし、前記の列挙した種類に制限されるのではなく、その他の多様なの属および種に属する藻類が含まれ得る。
【００９６】
本明細書で提供される除草剤耐性ＰＰＯまたはその変異体が導入された植物または藻類は、２種以上のＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性を示すことができる。
【００９７】
したがって、本明細書で提供される技術は、２種以上のＰＰＯ阻害除草剤を順次に、または同時に使用することによって雑草を防除するか望まない水生生物を除去することに使用することができる。
【００９８】
一例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子を含む植物を栽培地に提供する段階、および前記栽培地に２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用する段階を含む、栽培地で雑草を防除する方法を提供する。
【００９９】
他の例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子を含む藻類を培養培地に提供する段階、および前記培養培地に２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用する段階を含む、培養培地で望まない水生生物を除去する方法を提供する。
【０１００】
また、本明細書で提供する除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子は、第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子と組み合わせて使用することができる。
【０１０１】
これにより、本明細書で提供する除草剤耐性ＰＰＯまたはその変異体が導入された植物または藻類は、作用機序が相異なる２種以上の除草剤に対して耐性を示すことができる。したがって、本発明は、作用機序がＰＰＯ阻害除草剤を含む相異なる２種以上の除草剤を順序に関係なく順次に、または同時に使用することによって雑草を防除するかおよび／または望まない水生生物を除去するのに使用することができる。以下、ＰＰＯ阻害除草剤と作用機序が異なる除草剤を「第２の除草剤」と称する。
【０１０２】
一例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子；および第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子を含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性付与および／または増進用組成物を提供する。
【０１０３】
他の例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子；および第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子を含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性を有する形質転換体、そのクローンまたは子孫を提供する。
【０１０４】
他の例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子；および第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子を藻類、または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体に形質転換する段階を含む、除草剤に対する耐性を有する植物または藻類を製造する方法を提供する。
【０１０５】
他の例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子；および第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子を含む植物を栽培地に提供する段階、および前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤および第２の除草剤の有効量を同時にまたは順序に関係なく順次に適用する段階を含む、栽培地で雑草を防除する方法を提供する。
【０１０６】
他の例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質またはこれを暗号化する遺伝子；および第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子を含む藻類を培養培地に提供する段階、および前記培養培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤および第２の除草剤の有効量を同時にまたは順序に関係なく順次に適用する段階を含む、培養培地で望まない水生生物を除去する方法を提供する。
【０１０７】
例えば、上記植物または藻類は第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含み、前記第２の除草剤に対する耐性が付与および／または増進されたものであってもよい。
【０１０８】
例えば、前記第２の除草剤は、細胞分裂阻害性除草剤、光合成阻害性除草剤、アミノ酸合成阻害性除草剤、色素体阻害性除草剤、細胞膜阻害性除草剤および／またはこれらの組み合わせを含むが、これに制限されるのではない。具体例として、前記第２の除草剤は、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネート（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）、ジカンバ（ｄｉｃａｍｂａ）、２，４−Ｄ（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ＡＬＳ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）阻害性除草剤（例えば、イミダゾリジノン、スルホニルウレア、トリアゾルピリミジン、スルホンアニリド、ピリミジンチオベンゾエートなど）、第２光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ）阻害性除草剤、フェニルウレア（ｐｈｅｎｙｌｕｒｅａ）系除草剤、色素体阻害性除草剤、ブロモキシニル（ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）系除草剤および／またはこれらの組み合わせを例示することができるが、これに制限されるのではない。
【０１０９】
例えば、第２の除草剤耐性ポリペプチドは、グリホサート除草剤耐性ＥＰＳＰＳ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ５−ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＧＯＸ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、ＧＡＴ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）またはグリホサートデカルボキシラーゼ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）；グルホシネート除草剤耐性ＰＡＴ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）；ジカンバ除草剤耐性ＤＭＯ（ｄｉｃａｍｂａ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；２，４−Ｄ除草剤耐性２，４−ＤモノオキシゲナーゼまたはＡＡＤ（ａｒｙｌｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ  Ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ）系除草剤耐性ＡＬＳ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＡＨＡＳ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、またはＡｔｈａｈａｓｌ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ）；第２光系阻害性除草剤耐性光系ＩＩ（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ）蛋白質Ｄ１；フェニルウレア系除草剤耐性シトクロムＰ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０）；色素体阻害性除草剤耐性ＨＰＰＤ（ｈｙｄｏｒｘｙｌｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；ブロモキシニル除草剤耐性ニトリラーゼ（ｎｉｔｒｉｌａｓｅ）；およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上を例示することができるが、これに制限されるのではない。
【０１１０】
また、前記第２の除草剤耐性ポリペプチドを暗号化する遺伝子は、グリホサート除草剤耐性ｃｐ４  ｅｐｓｐｓ、ｅｐｓｐｓ（ＡＧ）、ｍｅｐｓｐｓ、２ｍｅｐｓｐｓ、ｇｏｘｖ２４７、ｇａｔ４６０１またはｇａｔ４６２１遺伝子；グルホシネート除草剤耐性ｂａｒ、ｐａｔまたはｐａｔ（ＳＹＮ）遺伝子；ジカンバ除草剤耐性ｄｍｏ遺伝子；２，４−Ｄ除草剤耐性ＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１２遺伝子；ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア系除草剤耐性ＡＬＳ、ＧＭ−ＨＲＡ、Ｓ４−ＨＲＡ、ＺＭ−ＨＲＡ、Ｃｓｒ１、Ｃｓｒ１−１、Ｃｓｒ１−２、ＳｕｒＡまたはＳｕｒＢ；第２光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ）阻害性除草剤耐性ｐｓｂＡ遺伝子；フェニルウレア除草剤耐性ＣＹＰ７６Ｂ１遺伝子；イソキサフルトール除草剤耐性ＨＰＰＤＰＦ  Ｗ３３６遺伝子；ブロモキシニル除草剤耐性ｂｘｎ遺伝子；およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上を例示することができるが、これに制限されるのではない。
【発明の効果】
【０１１１】
本発明で提供する除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質の変異体またはこれを暗号化する遺伝子を植物または藻類に適用することによってより優れた除草剤耐性形質を付与および／または増進させ、除草剤を用いた選別的防除を通じて経済的に雑草を防除するか望まない水生生物を除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ｐＡＣＢＢベクターの開裂地図である。
【図２】ＰＰＯが欠乏したＢＴ３大腸菌（ΔＰＰＯ）にｐＡＣＢＢ−ｅＧＦＰベクターのみ導入された大腸菌）（Ｖ）、ＰＰＯ感受性シロイヌナズナＰＰＯ１遺伝子が導入されたＢＴ３大腸菌（ＡｔＰＰＯ１  ＷＴ）、ＰＰＯ抵抗性シロイヌナズナＰＰＯ１変異遺伝子が導入されたＢＴ３大腸菌（ＡｔＰＰＯ１  ＳＬＹＭ）、ＣｙＰＰＯ１０遺伝子が導入されたＢＴ３大腸菌（Ｃｙ１０  ＷＴ）、およびＣｙＰＰＯ１３遺伝子が導入されたＢＴ３大腸菌（Ｃｙ１３  ＷＴ）にチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を０μＭ（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）、１００μＭおよび４００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図３】ｐＥＴ３０３−ＣＴ−Ｈｉｓベクターの開裂地図である。
【図４】ＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とＰＰＯ蛋白質が融合された蛋白質製造のための組換えベクターを模式的に示す図である。
【図５】ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘベクターの開裂地図である。
【図６】ＣｙＰＰＯ遺伝子の植物形質転換のためのバイナリーベクターの構造を例示的に示す模式図である。
【図７】ＣｙＰＰＯ１０変異体（Ｆ３６０Ｉ変異体またはＦ３６０Ｍ変異体）またはＣｙＰＰＯ１３変異体（Ｆ３７３Ｍ変異体）遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ２）でのＣｙＰＰＯ変異蛋白質の発現程度を示すウェスタンブロット結果である。
【図８】ＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３野生型遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ３）にチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を１μＭ濃度で処理した場合のシロイヌナズナの生長程度を示す写真である。
【図９】ＣｙＰＰＯ１０変異体（Ｆ３６０Ｃ、Ｆ３６０Ｉ、Ｆ３６０Ｌ、Ｆ３６０Ｍ、Ｆ３６０Ｖ、Ｆ３６０Ｔ、Ａ１６７Ｃ、Ａ１６７Ｌ、Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、またはＡ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｉ）を暗号化する遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ２）にチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を１μＭ、５μＭまたは２５μＭ濃度で処理した場合のシロイヌナズナの生長程度を示す写真である。
【図１０】ＣｙＰＰＯ１３変異体（Ａ１７７Ｃ、Ｆ３７３Ｃ、Ｆ３７３Ｉ、Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｌ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｉ）を暗号化する遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ２）にチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を１μＭまたは１０μＭ濃度で処理した場合のシロイヌナズナの生長程度を示す写真である。
【図１１】ＰＰＯが欠乏したＢＴ３大腸菌（ΔＰＰＯ）にＣｙＰＰＯ１０野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）遺伝子（Ｃｙ１０  ＷＴと示す）または多様なＣｙＰＰＯ１０変異遺伝子を形質転換させた後、チアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図１２】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１０  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１０変異遺伝子を形質転換させた後、サフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図１３】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１０  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１０変異遺伝子を形質転換させた後、ホメサフェン（ｆｏｍｅｓａｆｅｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図１４】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１０  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１０変異遺伝子を形質転換させた後、アシフルオルフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図１５】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１０  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１０変異遺伝子を形質転換させた後、フルミオキサジン（ｆｌｕｍｉｏｘａｚｉｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図１６】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１０  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１０変異遺伝子を形質転換させた後、スルフェントラゾン（ｓｕｌｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図１７】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１０  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１０変異遺伝子を形質転換させた後、ペントキサゾン（ｐｅｎｔｏｘａｚｏｎｅ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図１８】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１０  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１０変異遺伝子を形質転換させた後、ピラフルフェン−エチル（ｐｙｒａｆｌｕｆｅｎ−ｅｔｈｙｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図１９】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１０  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１０変異遺伝子を形質転換させた後、ピラクロニル（ｐｙｒａｃｌｏｎｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図２０】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙＰＰＯ１３野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）遺伝子（Ｃｙ１３  ＷＴと示す）または多様なＣｙＰＰＯ１３変異遺伝子を形質転換させた後、チアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、および５０μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図２１】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１３  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１３変異遺伝子を形質転換させた後、サフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、および５０μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図２２】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１３  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１３変異遺伝子を形質転換させた後、ホメサフェン（ｆｏｍｅｓａｆｅｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図２３】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１３  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１３変異遺伝子を形質転換させた後、アシフルオルフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図２４】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１３  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１３変異遺伝子を形質転換させた後、フルミオキサジン（ｆｌｕｍｉｏｘａｚｉｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、および５０μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図２５】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１３  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１３変異遺伝子を形質転換させた後、スルフェントラゾン（ｓｕｌｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図２６】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１３  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１３変異遺伝子を形質転換させた後、ペントキサゾン（ｐｅｎｔｏｘａｚｏｎｅ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図２７】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１３  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１３変異遺伝子を形質転換させた後、ピラフルフェン−エチル（ｐｙｒａｆｌｕｆｅｎ−ｅｔｈｙｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図２８】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１３  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１３変異遺伝子を形質転換させた後、ピラクロニル（ｐｙｒａｃｌｏｎｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図２９】ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ１３  ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ１３変異遺伝子を形質転換させた後、オキサジアゾン（ｏｘａｄｉａｚｏｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。
【図３０】ｐＥＴ−２９ｂベクターの開裂地図である。
【図３１ａ】ＣｙＰＰＯ１０またはＣｙＰＰＯ１３の野生型または変異遺伝子が挿入された形質転換シロイヌナズナを除草剤が含まれている培地に播種７日後の種子発芽結果を示す写真である。
【図３１ｂ】ＣｙＰＰＯ１０またはＣｙＰＰＯ１３の野生型または変異遺伝子が挿入された形質転換シロイヌナズナを除草剤が含まれている培地に播種７日後の種子発芽結果を示す写真である。
【図３１ｃ】ＣｙＰＰＯ１０またはＣｙＰＰＯ１３の野生型または変異遺伝子が挿入された形質転換シロイヌナズナを除草剤が含まれている培地に播種７日後の種子発芽結果を示す写真である。
【図３２】ＣｙＰＰＯ１０変異体（Ｆ３６０Ｉ、Ｆ３６０Ｌ、Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｉ、Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｍ、またはＶ３０５Ｍ＋Ｆ３６０Ｍ）を暗号化する遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ３）にチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を２５μＭ濃度またはサフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）を１００μＭ濃度で処理した後、シロイヌナズナの薬害程度を示す写真である。
【図３３ａ】ＣｙＰＰＯ１０変異体（Ｆ３６０Ｉ、またはＡ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ）を暗号化する遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ３）にチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）、サフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）、フルミオキサジン（ｆｌｕｍｉｏｘａｚｉｎ）、またはスルフェントラゾン（ｓｕｌｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）をそれぞれ５０μＭ濃度で処理した後、シロイヌナズナの薬害程度を示す写真である。
【図３３ｂ】ＣｙＰＰＯ１３変異体（Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｌ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｉ）を暗号化する遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ３）にサフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）、チアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）、フルミオキサジン（ｆｌｕｍｉｏｘａｚｉｎ）、スルフェントラゾン（ｓｕｌｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）、オキシフルオルフェン（ｏｘｙｆｌｕｏｒｆｅｎ）またはピラクロニル（ｐｙｒａｃｌｏｎｉｌ）をそれぞれ５０μＭ濃度で処理した後、シロイヌナズナの薬害程度を示す写真である。
【図３４】ＣｙＰＰＯ１０のＦ３６０Ｉ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ４）のチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）１５μＭまたはサフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）１５０μＭ処理時の薬害程度を示す写真である。
【図３５】ＣｙＰＰＯ１０のＦ３６０Ｉ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ５）のチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）１５μＭまたはサフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）１５０μＭ処理時の薬害程度を示す写真である。
【図３６】ＣｙＰＰＯ１０のＦ３６０Ｉ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ４およびＴ５）でのＣｙＰＰＯ１０  Ｆ３６０Ｉ変異蛋白質発現の有無を示すウェスタンブロット写真である。
【図３７】ｐＢ２ＧＷ７．０バイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ）の開裂地図である。
【図３８】ＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ挿入された大豆（クァンアン豆（Ｋｗａｎｇａｎ  ｓｏｙｂｅａｎ））形質転換体に５μＭまたは１５μＭチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）処理時の葉での薬害程度を示す写真である。
【図３９】ＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ形質転換大豆で変異遺伝子の存否を確認したサザンブロッティング（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）結果を示す。
【図４０】ＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ形質転換大豆（クァンアン豆（Ｋｗａｎｇａｎ  ｓｏｙｂｅａｎ））のＴ１植物体を対象にして２５μＭチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）または１５０μＭサフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）を処理して５日後の様子の写真である。
【図４１】ＣｙＰＰＯ１０の突然変異遺伝子を形質転換したＢＴ３（ΔＰＰＯ）を除草剤含有培地で培養後、生長を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明が下記の実施例によって限定されるのではない。
【実施例】
【０１１４】
実施例１．原核生物からＰＰＯ遺伝子の分離
サーモシネココッカスエロンガータスＢＰ−１（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１）およびシネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＪＡ−３−３ＡｂのＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いてＰＰＯ遺伝子情報を獲得した。ＢＴ３  Ｅ．ｃｏｌｉでより効率的な除草剤抵抗性スクリーニングのために各ＰＰＯ遺伝子をコドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）して合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。これを、ｐＡＣＢＢベクターにクローニングするために表１のプライマーを用いて、下記の条件でＰＰＯ遺伝子を増幅した。
【０１１５】
ＰＣＲ反応液は、鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）（各遺伝子の合成ＤＮＡ）１μｌ、１０Ｘバッファー（１０Ｘ  ｂｕｆｆｅｒ）５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ）（各１０ｍＭ）１μｌ、フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）（表１参照；１０μＭ）１μｌ、リバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）（表１参照；１０μＭ）１μｌ、ＤＤＷ４０μｌ、およびＰｆｕ−Ｘ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、２．５ｕｎｉｔ／μｌ）１μｌを含む反応液５０μｌから構成し、９４℃で４分間反応した後、２５サイクル（９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、および７２℃で１．５分）繰り返し、７２℃で５分反応して増幅した。
【０１１６】
サーモシネココッカスエロンガータスＢＰ−１から分離したＰＰＯをＣｙＰＰＯ１０と、シネココッカス属ＪＡ−３−３Ａｂ菌株から分離したＰＰＯをＣｙＰＰＯ１３とそれぞれ命名した。
【０１１７】
【表１】
2019527538.tif 000004
【０１１８】
実施例２．ＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３の除草剤抵抗性確認
前記準備されたＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３の除草剤耐性をＰＰＯ遺伝子が欠乏した大腸菌を用いて試験した。
【０１１９】
前記ＰＰＯ遺伝子をＰＰＯが欠乏したＢＴ３大腸菌（ΔＰＰＯ）に形質転換した後、ＰＰＯ阻害除草剤が含まれている培地で培養して、形質転換大腸菌の生長阻害の有無を確認した。ＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株は北海道大学（Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、日本）から提供を受け、ｈｅｍＧタイプＰＰＯが欠如した大腸菌であり、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）に対して耐性を有する菌株である（“Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｕａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｃｈ  ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｓｅ  ＩＩ  ｔｏ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｉｎ−ｆｒａｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎｓ，ＪＢＣ  ２００１  ２７６（２３）：２０４７４−２０４８１；Ｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎ  Ｓｐｉｎａｃｈ  Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００  Ｓｅｐ；１２４（１）：５９−７０”）．参照）。
【０１２０】
具体的な試験過程は、以下の通りである：
前記準備されたＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３遺伝子をｐＡＣＢＢベクター（Ｐｌａｓｍｉｄ＃３２５５１；Ａｄｄｇｅｎｅ；図１参照）にクローニングした。
【０１２１】
具体的に、前記実施例１で増幅したＰＣＲ産物（ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ）をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で処理して、同一制限酵素で処理したｐＡＣＢＢ−ｅＧＦＰベクターとライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）した。
【０１２２】
前記制限酵素処理は下記の条件下で行った：
ＰＣＲ産物３０μｌ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）各０．５μｌ、１０Ｘバッファー４μｌ、水（ｗａｔｅｒ）５．５μｌ；制限酵素反応（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）３７℃、１時間
ライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）は下記の条件下で行った：
Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（ＲＢＣ）０．５μｌ、Ａバッファー１μｌ、Ｂバッファー１μｌ、前記の制限酵素で処理したＰＣＲ産物とベクター、総（ｔｏｔａｌ）１０μｌ；２２℃、３０分
前記クローニングしたプラスミドをそれぞれＢＴ３コンピテントセル（ＢＴ３  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）に熱衝撃方法で形質転換した。各変異遺伝子種類別にクロラムフェニコール（Ｄｕｃｈｅｆａ）が含まれているＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天培地で培養した。
【０１２３】
各遺伝子で形質転換された大腸菌の種培養のために、各単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｙ）をクロラムフェニコールを含む３ｍｌのＬＢブロス（ＬＢ  ｂｒｏｔｈ）で１２時間以上培養（２２０ｒｐｍ、３７℃）した後、５０〜１００μｌを新たな３ｍｌのＬＢブロス（ＬＢ  ｂｒｏｔｈ）に継代して４〜５時間培養した後、吸光度（ＯＤ６００）が０．５〜１になるまで培養し、吸光度（ＯＤ６００）を０．５に合わせるためにＬＢブロス（ＬＢ  ｂｒｏｔｈ）で希釈した。この稀釈液をＬＢブロス（ＬＢ  ｂｒｏｔｈ）で１０倍ずつ５回希釈した。その次に、チアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）が濃度別（０、１００μＭ、４００μＭ）に混合されたＬＢ寒天培地（ペトリ皿）に前記準備した形質転換大腸菌培養稀釈液を１０μｌずつ落とした。ＬＢ寒天培地を３７℃、光（ｌｉｇｈｔ）条件で培養し、１６〜２０時間後に生長阻害程度を確認した。
【０１２４】
比較のために、ｐＡＣＢＢ−ｅＧＦＰベクター（Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃３２５５１；Ａｄｄｇｅｎｅ；図１参照）で形質転換されたＢＴ３大腸菌形質転換体（Ｖ；ＰＰＯ欠乏大腸菌）；前記原核細胞由来のＰＰＯ遺伝子の代わりにシロイヌナズナ由来の野生型ＰＰＯ遺伝子（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ＡｔＰＰＯ１；ＰＰＯ感受性）（配列番号６）が導入されたＢＴ３大腸菌形質転換体（ＷＴ）；および野生型（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）ＡｔＰＰＯ１のアミノ酸配列（配列番号５）でＹ４２６Ｍ（４２６番目アミノ酸であるチロシンがメチオニンで置換）およびＳ３０５Ｌ（３０５番目アミノ酸であるセリンがロイシンで置換）のアミノ酸置換が発生した変異（ｍｕｔａｎｔ）（アミノ酸配列：配列番号７）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ．Ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３  １３３：７３６−７４７）を暗号化する遺伝子が導入されたＢＴ３大腸菌形質転換体（ＡｔＰＰＯ１  ＳＬＹＭ）を使用して同一な試験を行った。
【０１２５】
前記得られた結果を図２に示した。図２に示されているように、除草剤を含んでいない培地（チアフェナシル０μＭ）で、ＰＰＯ遺伝子が挿入されていないｐＡＣＢＢ−ｅＧＦＰで形質転換されたＢＴ３形質転換体（Ｖ）は正常生長を回復しなく、シロイヌナズナＰＰＯ野生型遺伝子（ＡｔＰＰＯ１  ＷＴ）、シロイヌナズナＰＰＯ変異遺伝子（ＡｔＰＰＯ１  ＳＬＹＭ）、ＣｙＰＰＯ１０遺伝子（Ｃｙ１０  ＷＴ）、またはＣｙＰＰＯ１３遺伝子（Ｃｙ１３  ＷＴ）がそれぞれ挿入されたＢＴ３形質転換体は、各挿入遺伝子がＢＴ３内ＰＰＯ機能を回復させることによって正常生長を示した。このような結果は、前記ＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３が両方とも正常機能を発揮することを意味する。
【０１２６】
一方、チアフェナシル感受性であるシロイヌナズナＰＰＯ１野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）が挿入されたＢＴ３形質転換体（ＡｔＰＰＯ１  ＷＴ）は除草剤が含まれていない培地（０μＭ）では正常に育つが、１００μＭチアフェナシルが含まれている培地では育たなく、チアフェナシル抵抗性であるシロイヌナズナＰＰＯ１変異型（ｍｕｔａｎｔ  ｔｙｐｅ）が挿入されたＢＴ３形質転換体（ＡｔＰＰＯ１  ＳＬＹＭ）はチアフェナシル処理濃度が１００μＭから生長阻害が発生し、４００μＭまで育つことが観察された。ＣｙＰＰＯ１０またはＣｙＰＰＯ１３遺伝子が挿入されたＢＴ３形質転換体は１００μＭチアフェナシルが含まれている培地でチアフェナシルが含まれていない培地と同等水準の生長を示し、４００μＭチアフェナシルが含まれている培地でも優れた生長が観察された。このような結果からＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３遺伝子がチアフェナシル感受性であるシロイヌナズナＰＰＯ１野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）に比べて顕著に高いチアフェナシル耐性を有し、チアフェナシル耐性を有するシロイヌナズナＰＰＯ１変異型（ｍｕｔａｎｔ  ｔｙｐｅ）と比較して類似または高い水準のチアフェナシル抵抗性を有しているのを確認することができる。
【０１２７】
実施例３．ＰＰＯ−除草剤複合体構造分析を通じた除草剤と相互作用するＰＰＯのアミノ酸情報獲得
ＰＰＯ蛋白質と除草剤の結合構造情報の確認のために、ＰＰＯ蛋白質の代表例としてＣｙＰＰＯ１０を、ＰＰＯ阻害除草剤の代表例としてチアフェナシル、サフルフェナシル、フルミオキサジン、スルフェントラゾンを使用して試験した。ＣｙＰＰＯ１０の蛋白質を暗号化する遺伝子をｐＥＴ２９ｂベクター（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ：６９８７２−３；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；図３０参照）にクローニングし、大腸菌システムを使用してＣｙＰＰＯ１０蛋白質を発現させた。発現されたＣｙＰＰＯ１０蛋白質をニッケル親和クロマトグラフィーを通じて純粋分離し、精製されたＣｙＰＰＯ１０蛋白質に各１ｍＭ濃度のチアフェナシル、サフルフェナシル、フルミオキサジン、またはスルフェントラゾンを添加してＣｙＰＰＯ１０とチアフェナシル、サフルフェナシル、フルミオキサジン、またはスルフェントラゾンが結合した結晶を獲得した。その後、放射光加速器を用いて２．４Å解像度のＣｙＰＰＯ１０とチアフェナシル、サフルフェナシル、フルミオキサジン、スルフェントラゾン結合体のＸ−線回折データを確保し、分子水準の３次元構造を糾明した。このような過程を通じて除草剤抵抗性を付与するＣｙＰＰＯ１０蛋白質内アミノ酸変異位置に関する情報を収集した。
【０１２８】
ＣｙＰＰＯ１０とチアフェナシル複合体構造分析結果、ＣｙＰＰＯ１０蛋白質（配列番号２）のＮ５９、Ｓ６０、Ｒ８９、Ｆ１６１、Ｖ１６５、Ａ１６７、Ｑ１８４、Ｐ３０３、Ｖ３０５、Ｆ３２４、Ｌ３２７、Ｉ３４０、Ｆ３６０、およびＩ４０８位置のアミノ酸がチアフェナシルと相互作用しているのを確認した。
【０１２９】
このようにＣｙＰＰＯ１０−チアフェナシル複合体構造から導出された結合アミノ酸情報を用いて、ＣｙＰＰＯ１０（配列番号２）と、ＣｙＰＰＯ１３のアミノ酸間の配列ホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）分析（ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ）を通じてＣｙＰＰＯ１３（配列番号４）蛋白質でチアフェナシルと相互作用するアミノ酸残基を導出した。
【０１３０】
その結果、ＣｙＰＰＯ１３蛋白質（配列番号４）のＲ１０１、Ｆ１７１、Ｖ１７５、Ａ１７７、Ｇ１９４、Ｐ３１６、Ｖ３１８、Ｆ３３７、Ｌ３４０、Ｉ３５３、およびＦ３７３位置のアミノ酸がチアフェナシルと相互作用すると判断した。
【０１３１】
実施例４．ＰＰＯ変異体の製造
ＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３のＰＰＯ阻害除草剤耐性をより高めるためにそれぞれＰＰＯアミノ酸配列中の前記実施例３で得られた除草剤と相互作用する位置のアミノ酸に変異を誘発してＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３の変異遺伝子を製作した。
【０１３２】
具体的な試験過程は以下の通りである：
表３のプライマーを用いて、以下の条件下でＰＣＲを行ってＰＰＯ遺伝子を分離および増幅させた：
ＰＣＲ反応液条件
鋳型（ＣｙＰＰＯ１０またはＣｙＰＰＯ１３の合成ＤＮＡ）              １μｌ
１０Ｘバッファー                                                    ５μｌ
ｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ）                                        １μｌ
フォワードプライマー（１０μＭ）                                    １μｌ
リバースプライマー（１０μＭ）                                      １μｌ
ＤＤＷ                                                              ４０μｌ
Ｐｆｕ−Ｘ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、２．５ｕｎｉｔ／μｌ）                  １μｌ
総（Ｔｏｔａｌ）                                                    ５０μｌ
【表２】
2019527538.tif 000005
【表３】
2019527538.tif 000006
前記増幅した遺伝子産物（ｐｒｏｄｕｃｔｓ）とｐＥＴ３０３−ＣＴ  Ｈｉｓベクター（ＶＴ０１６３；Ｎｏｖａｇｅｎ；図３参照）をＸｂａＩ、ＸｈｏＩで切断した後、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（ＲＢＣ、３ｕｎｉｔ／μｌ）を用いてｐＥＴ３０３−ＣｙＰＰＯ１０とｐＥＴ３０３−ＣｙＰＰＯ１３プラスミドをそれぞれ製作した。
【０１３３】
前記ｐＥＴ３０３−ＣＴ  ＨｉｓベクターにクローニングしたＣｙＰＰＯ１０とＣｙＰＰＯ１３を鋳型にして、下記表５および表６のプライマーを使用して以下の条件下でＰＣＲを行ってＣｙＰＰＯ１０とＣｙＰＰＯ１３の変異遺伝子を製作した。
【０１３４】
ＰＣＲ反応液条件
鋳型                                                                １μ
１０Ｘバッファー                                                    ５μｌ
ｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ）                                        １μｌ
フォワードプライマー（１０μＭ）                                    １μｌ
リバースプライマー（１０μＭ）                                      １μｌ
ＤＤＷ                                                              ４０μｌ
Ｐｆｕ−Ｘ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、２．５ｕｎｉｔ／μｌ）                  １μｌ
総（Ｔｏｔａｌ）                                                    ５０μｌ
【表４】
2019527538.tif 000007
【表５】
2019527538.tif 000008
2019527538.tif 000009
2019527538.tif 000010
【表６】
2019527538.tif 000011
2019527538.tif 000012
2019527538.tif 000013
【０１３５】
実施例５．ＰＰＯおよびその変異体のＰＰＯ阻害除草剤耐性検証（大腸菌で試験）
ＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３のＰＰＯ阻害除草剤耐性をより高めるためにそれぞれＰＰＯアミノ酸配列中の前記実施例３で得られた除草剤と相互作用する位置のアミノ酸に変異を誘発した。このような変異を誘発させることができるＰＰＯ遺伝子を設計してＰＰＯが欠乏したＢＴ３大腸菌（ＢＴ３（ΔＰＰＯ））に形質転換した後、ＰＰＯ阻害除草剤を処理した環境で培養して、形質転換大腸菌の生長阻害の有無を確認した。
【０１３６】
具体的な試験過程は以下の通りである：
前記実施例４で製作したｐＥＴ３０３−ＣｙＰＰＯ１０とｐＥＴ３０３−ＣｙＰＰＯ１３プラスミドとそれぞれの変異遺伝子が含まれているプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）をＢＴ３コンピテントセル（ＢＴ３  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）に熱衝撃方法で形質転換してアンピシリンが含まれているＬＢ寒天培地で培養した。
【０１３７】
各遺伝子が挿入されたＢＴ３形質転換体の種培養のために、アンピシリンが含まれているＬＢブロス（ＬＢ  ｂｒｏｔｈ、ＬＰＳＳ、３ｍｌ）に単一コロニーを接種して１２時間以上培養し、この培養液５０〜１００μｌを新たなＬＢブロス（ＬＢ  ｂｒｏｔｈ）に継代して吸光度（ＯＤ６００）が０．５〜１になるまで培養し、この培養液をＬＢブロス（ＬＢ  ｂｒｏｔｈ）で希釈して吸光度を０．５に一定に合わせた後、ＬＢブロス（ＬＢ  ｂｒｏｔｈ）で１０倍ずつ５回希釈して形質転換大腸菌培養稀釈液を準備した。
【０１３８】
ＬＢ２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ  １２ｇ／Ｌ、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、および多様な除草剤ストックを濃度別（０〜２００μＭ）に混合して除草剤を含む培地を準備した。前記除草剤ストックは全てＤＭＳＯを用いて除草剤を溶解したものである。
【０１３９】
前記準備された形質転換大腸菌培養稀釈液を除草剤培地に１０μｌずつ落とし、３７℃および光条件下で１６〜２０時間培養し、各遺伝子を含む形質転換大腸菌の生長程度を肉眼で確認して、形質転換大腸菌のＰＰＯ阻害除草剤耐性を試験した。
【０１４０】
試験に使用された除草剤を下記の表７に整理した：
【表７】
2019527538.tif 000014
前記得られた除草剤耐性をＣｙＰＰＯ野生型と比較した相対的水準で評価して下記の表８〜表１１および図１１〜図２９に示した：
【表８】
2019527538.tif 000015
【表９】
2019527538.tif 000016
【表１０】
2019527538.tif 000017
【表１１】
2019527538.tif 000018
上記表８〜１１で、野生型の除草剤耐性水準を「−」で表示し、これと同等水準の耐性を「−」で、高いほど「＋」を付加して最大「＋＋＋＋＋」まで等級を定めて評価した。
【０１４１】
図１１〜図１９（ＣｙＰＰＯ１０の野生型または変異型）および図２０〜図２９（ＣｙＰＰＯ１３の野生型または変異型）はＣｙＰＰＯ遺伝子（野生型または変異型）が形質導入された大腸菌の培養結果を示す写真であって、上端に記載された濃度は除草剤処理濃度であり、各濃度別６個のカラムは大腸菌培養液を１０倍ずつ希釈した結果を示すものであって、最も左側のカラムがＯＤ６００＝０．５の大腸菌培養液の実験結果であり、右側に行くほど１０倍ずつ希釈された培養液の実験結果である。
【０１４２】
前記表８〜１１および図１１〜図２９で示されるように、ＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３の変異遺伝子が導入された形質転換体は全て多様な種類の除草剤に対して野生型遺伝子が導入された形質転換体と同等水準または上昇した水準の除草剤耐性を示すのを確認することができる。
【０１４３】
実施例６：ＰＰＯの酵素活性および除草剤別ＩＣ５０値測定
ＰＰＯ蛋白質および特定位置のアミノ酸を変異させたＰＰＯ蛋白質変異体の酵素活性を測定しＰＰＯ阻害除草剤による阻害試験（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を行った。ＰＰＯ蛋白質は水溶性が低いが、ＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と共に融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＢＰ−ＰＰＯ）で発現させる場合、安定的に水溶性蛋白質が発現されることを確認し、下記の野生型および変異型蛋白質をＭＢＰとの融合蛋白質形態に発現させて本試験に使用した（図４参照）。
【０１４４】
ＣｙＰＰ０１０およびＣｙＰＰＯ１３の野生型遺伝子および変異遺伝子（実施例１および実施例４参照）を発現させるために、前記遺伝子をそれぞれｐＭＡＬ−ｃ２Ｘベクター（図５参照）に挿入した後、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ）に形質転換した。
【０１４５】
前記得られた形質転換大腸菌を以下の条件で培養して挿入されたＰＰＯ遺伝子を発現させた：
誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）：ＯＤ６００＝０．２、最終濃度０．３ｍＭ  ＩＰＴＧ添加；
発現温度：２３℃、２００ｒｐｍの振盪培養；
発現時間：１６ｈｒｓ
培養規模：２００ｍｌ／１，０００ｍｌフラスコ（ｆｌａｓｋ）。
【０１４６】
前記培養された形質転換大腸菌に対して以下の過程で細胞破砕および蛋白質抽出を行った：
抽出バッファー：カラムバッファー（Ｃｏｌｕｍｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）５ｍｌ  ｂｕｆｆｅｒ／ｇ  ｃｅｌｌ；
超音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）：ＳＯＮＩＣＳ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ社  ＶＣＸ１３０（１３０ｗａｔｔｓ）；
１５  ｓｅｃ  ＯＮ、１０  ｓｅｃ  ＯＦＦ  ｆｏｒ  ５  ｍｉｎ  ｏｎ  ｉｃｅ；
４℃および２０分条件下で遠心分離（２０，０００ｘｇ）；および
前記遠心分離で得られた上澄み液をカラムバッファー（ｃｏｌｕｍｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を使用して１：６比率で希釈した。
【０１４７】
前記得られた蛋白質抽出物に対して以下の過程を４℃低温室で行ってＰＰＯ蛋白質の精製を行った。１．５×１５ｃｍカラム（ｃｏｌｕｍｎ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｃｏｎｏ  Ｃｏｌｕｍｎｓ  １．５×１０ｃｍ、ｇｌａｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎ、ｍａｘ．ｖｏｌ）にアミロースレジン（ａｍｙｌｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を注いでカラムをパッキング（ｐａｃｋｉｎｇ）し、前記得られた蛋白質抽出物をカラムに０．２ｍｌ／ｍｉｎの速度でローディングした。前記カラムをカラム体積基準に３体積倍のカラムバッファー（ｃｏｌｕｍｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）後、洗浄液内の蛋白質量を確認してそれ以上蛋白質が検出されなければ洗浄を終了した。前記カラム体積基準に約２体積倍の２０ｍＭマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を含むカラムバッファー（ｃｏｌｕｍｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でＭＢＰ−ＰＰＯ蛋白質を溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）（１．５ｍｌのＥ−ｔｕｂｅに各フラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を分取）しながら各溶出液（ｅｌｕｅｎｔ）の蛋白質濃度を確認した。それ以上蛋白質が検出されなければ溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）を終了させた。各フラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を１０μｌの量で取って蛋白質定量後、蛋白質が検出されたフラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、純度が高いフラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を取って酵素活性分析試験に使用した。
【０１４８】
前記精製されたＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３の野生型蛋白質および変異型蛋白質の酵素活性を下記の過程で測定した。
【０１４９】
まず、ＰＰＯ蛋白質の基質であるプロトポルフィリノーゲンＩＸ（Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ  ＩＸ）を合成した。この過程は窒素気体がストリーミング（ｓｔｒｅａｍｉｎｇ）される空間で行われた。プロトポルフィリンＩＸ（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＩＸ）６ｍｇを２０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ２０ｍｌに溶解させ、暗条件（ｄａｒｋ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で３０分間攪拌した。前記得られたプロトポルフィリンＩＸ溶液を１５ｍｌのスクリューチューブ（ｓｃｒｅｗ  ｔｕｂｅ）に８００μｌの量で入れ、５分間窒素気体をフラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）した。ここにアマルガムナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｍａｌｇａｍ）１ｇを入れ、２分間激しく振盪（ｖｉｇｏｒｏｕｓ  ｓｈａｋｉｎｇ）した。チューブの中の水素気体を排出するために蓋を開けておいた。その後、蓋を閉じて３分間インキュベーションした後、シリンジ（Ｓｙｒｉｎｇｅ）とセルロースメンブレンフィルター（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ）を用いてプロトポルフィリノーゲンＩＸ溶液をろ過（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）した。前記得られたプロトポルフィリノーゲンＩＸ溶液６００μｌに２Ｍ  ＭＯＰＳ［３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ］を約３００μｌの量で添加してｐＨを８．０に調節した。ＰＰＯ蛋白質の酵素活性を測定するために次の組成で反応混合物（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）を準備した（１０ｍｌ基準）：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）；５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０４％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０；４０ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ（０．０７２ｇ）；５  ｕｎｉｔｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ（１６．６ｍｇ）；および１０  ｕｎｉｔｓ  ｃａｔａｌａｓｅ（１μｌ）。
【０１５０】
前記反応混合物（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）１８０μｌを９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ）に入れ、先に精製されたＰＰＯ蛋白質（前記ＭＢＰ−融合タンパク質を精製した産物）２０μｌを添加し、約５０μｌのミネラルオイル（ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ）で表面をカバーした。基質であるプロトポルフィリノーゲンＩＸ溶液を最終濃度５０μＭになるように添加して室温で３０分間反応させた。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｈｉｄｅｘ社ｓｅｎｓｅ）を用いてプロトポルフィリンＩＸ（Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ＩＸ）の蛍光を測定した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４０５ｎｍ；ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６３３ｎｍ）。ＰＰＯ酵素活性値を計算するために、前記プロトポルフィリノーゲンＩＸ溶液が入っているチューブを空気中に開放して溶液を１２時間以上酸化させた。ここに２．７Ｎ  ＨＣｌを添加して４０８ｎｍでの吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定した。標準（Ｓｔａｎｄａｒｄ）プロトポルフィリンＩＸを用いて標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｒｖｅ）を作成し、これを用いてプロトポルフィリノーゲンＩＸの濃度を検定（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）してＰＰＯ活性を測定した。
【０１５１】
前記得られたＰＰＯ野生型および変異体の酵素活性を下記の表１２に示した。
【０１５２】
一方、ＰＰＯ蛋白質（ＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３）の酵素活性能力を評価するために各酵素の最大反応速度（Ｖｍａｘ、Ｔｈｅ  ｍａｘｉｍａｌ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）値を求めた。初期反応速度は基質濃度を異にして濃度によって反応速度が比例する区間を選定し、常温で２０分間経時変化（ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ）として酵素反応産物であるプロトポルフィリンＩＸの生成量を測定した。Ｖｍａｘ値はミカエリス−メンテン式によって酵素反応速度（ｅｎｚｙｍｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）分析プログラムで計算し、対照群として植物ＰＰＯを使用した。前記得られた結果を下記の表１２に示した：
【表１２】
2019527538.tif 000019
前記結果から、ＣｙＰＰＯ１０とＣｙＰＰＯ１３はシロイヌナズナＰＰＯ１（ＡｔＰＰＯ１）、アマランサスＰＰＯ１よりＶｍａｘ値が最少２．５倍から最大１６倍以上高いのを確認することができた。結論的に、ＣｙＰＰＯ１０とＣｙＰＰＯ１３のＰＰＯ蛋白質が植物由来のシロイヌナズナＰＰＯ０１またはアマランサスＰＰＯ１よりＰＰＯ酵素としての能力がさらに優れるのを示す。
【０１５３】
また、ＰＰＯ酵素活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）を各除草剤別に測定した。この時、各除草剤の最終濃度は下記のとおりであった：
−チアフェナシル、サフルフェナシル、ホメサフェン、ブタフェナシル、フルミオキサジン、およびスルフェントラゾン各除草剤の最終濃度：０、１０、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００ｎＭ
ＩＣ５０値は、前記酵素活性測定過程に除草剤を前記濃度で添加してＰＰＯ酵素活性を除草剤添加前の５０％に阻害する除草剤の濃度として求めた。
【０１５４】
このように得られた除草剤別ＩＣ５０を下記の表１３に示した。
【０１５５】
【表１３】
2019527538.tif 000020
2019527538.tif 000021
2019527538.tif 000022
2019527538.tif 000023
上記表１３から確認されるように、ＣｙＰＰＯ蛋白質変異体の場合、野生型と比較して各除草剤のＩＣ５０値が顕著に上昇するのを確認することができる。このような結果は、ＰＰＯ蛋白質の特定位置のアミノ酸変異によって除草剤に対する耐性が増加するのを立証するものである。本試験結果でＣｙＰＰＯ蛋白質変異体が大体的に野生型に比べて減少した酵素活性を有することが確認され、これは組換え蛋白質と植物で精製された蛋白質間の蛋白質折りたたみまたは疎水性が異なることに起因することと思われる。植物に存在するＰＰＯ蛋白質は植物体の葉緑体膜に存在し、疎水性であるが、大腸菌が生産する組換えＰＰＯ蛋白質はＭＢＰ蛋白質との融合蛋白質であって、親水性である。したがって、変異ＰＰＯ蛋白質が植物の葉緑体で正常的な条件で発現されれば、変異蛋白質と野生型蛋白質間の酵素活性の差が大きくないことと思われる。
【０１５６】
実施例７．ＣｙＰＰＯおよびその変異体を用いたシロイヌナズナ形質転換体製作およびＰＰＯ阻害除草剤耐性試験
７−１．シロイヌナズナ形質転換ベクター製作およびシロイヌナズナ形質転換体製作
シロイヌナズナ形質転換は選別マーカであるｂａｒ遺伝子（グルホシネート耐性遺伝子）のＯＲＦとそれぞれのＣｙＰＰＯ１０またはＣｙＰＰＯ１３のアミノ酸変異体の暗号化遺伝子のＯＲＦを有するバイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ）を製作して行った。ＰＰＯ阻害除草剤と作用機序が異なる除草剤を交差使用する場合、その効果を確認するためにｂａｒ遺伝子を使用し、前記遺伝子は後代遺伝が安定的に行われているかどうかを検証することにも使用した。Ｂａｒ遺伝子の発現のためにＮＯＳプロモーターと転写終結のためのＥ９ターミネーターを使用した。
【０１５７】
ＣｙＰＰＯ１０、ＣｙＰＰＯ１０変異体、ＣｙＰＰＯ１３、およびＣｙＰＰＯ１３変異体それぞれを植物体で発現させるためにＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターを使用した。ＣｙＰＰＯ１０、ＣｙＰＰＯ１０変異体、ＣｙＰＰＯ１３、およびＣｙＰＰＯ１３変異体の暗号化遺伝子はＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ制限酵素を用いて挿入した。また、発現された蛋白質の確認のためにヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＨＡ）タグをＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ制限酵素を用いてＰＰＯ遺伝子の３’末端部位に挿入した。ＨＡタグの後にＮＯＳターミネーター（ＮＯＳ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）が挿入されてＰＰＯ遺伝子の転写終結を誘導した。また、葉緑体への蛋白質の移動と発現を誘導するためにＡｔＰＰＯ１遺伝子（配列番号６）の輸送ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＴＰ）をＸｂａＩ、ＸｈｏＩ制限酵素を用いてＰＰＯ遺伝子の５’前に挿入した。ベクター内挿入された輸送ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ）部位を配列番号２７と、挿入されたＨＡタグ配列を配列番号２８と示した。本実施例に用いた植物形質転換バイナリーベクターの構造模式図を図６に例示的に示した。
【０１５８】
前記で製作したそれぞれのベクターをアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１コンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）に凍結−融解（ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ）方法で導入して形質転換させた。ＧＶ３１０１コンピテントセル（ＧＶ３１０１  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）を製造するために、ＧＶ３１０１菌株を５ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ  ｍｅｄｉａ）に３０℃および２００ｒｐｍ条件で１２時間培養した。この培養液を２００ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ  ｍｅｄｉａ）に接種して、３０℃および２００ｒｐｍ条件で３〜４時間培養し、３０００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離した。滅菌蒸留水でペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を洗浄した後、２０ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ  ｍｅｄｉａ）で再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。２００μｌずつ等分（ａｌｉｑｕｏｔ）して液体窒素に瞬間凍結（ｓｎａｐ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ）した後、超低温冷凍庫に保管した。
【０１５９】
それぞれの形質転換アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を抗生剤培地（スペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）を含むＬＢ寒天（ＬＢ  ａｇａｒ））で培養および選別した。前記選別されたコロニーをＬＢブロス（ＬＢ  ｂｒｏｔｈ）で液体培養した。この培養液からアグロバクテリウムセル（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｅｌｌ）を収穫（ｈａｒｖｅｓｔ）した後、５％（ｗ／ｖ）スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）溶液に吸光度（ＯＤ６００）０．８の濃度で懸濁した後、０．０５％（ｖ／ｖ）シルウェット（Ｓｉｌｗｅｔ）Ｌ−７７（Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｃｏｍｐａｎｙ）を添加した。フロラルディップ（Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐｐｉｎｇ）方法でＣｏｌ−０生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）シロイヌナズナ野生型に形質転換して形質転換シロイヌナズナを製作し、１〜２ヵ月後に種子（Ｔ１）を収穫した。
【０１６０】
ベクター製作時に形質転換固体選抜のために挿入されたｂａｒ遺伝子を用いて形質転換個体を選抜した。前記得られたＴ１種子を２５μＭグルホシネートが添加された１／２ＭＳ培地（２．２５ｇ／Ｌ  ＭＳ塩（ＭＳ  ｓａｌｔ）、１０ｇ／Ｌスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、７ｇ／Ｌ寒天（Ａｇａｒ））に播種し、播種７日後に生存した個体を選抜して土に移植し成長させてＴ１植物体を収得した。
【０１６１】
移植したＴ１植物体のＰＰＯ阻害除草剤耐性を判断するために、３〜４週育てた後、抽苔前にチアフェナシルを処理した。４０×６０ｃｍ面積（０．２４ｍ２）にチアフェナシル溶液１００ｍｌ（１μＭチアフェナシル＋０．０５％（ｖ／ｖ）シルウェット（Ｓｉｌｗｅｔ）Ｌ−７７）を満遍なく噴射した。野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０  ｅｃｏｔｙｐｅ）の場合、前記と同一な濃度および量でチアフェナシルを処理する場合に死滅する。前記のようなチアフェナシル処理後４〜７日経過後、各形質転換体のＰＰＯ阻害除草剤耐性の有無を判別した。
【０１６２】
耐性を示して生残る植物体は持続的に育てて種子を収穫し（Ｔ２種子）、前記Ｔ２種子を２５μＭグルホシネートを添加した１／２ＭＳ培地（２．２５ｇ／Ｌ  ＭＳ塩（ＭＳ  ｓａｌｔ）、１０ｇ／Ｌスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、７ｇ／Ｌ寒天（Ａｇａｒ））に播種して６〜７日間育てた後、生存個体を選抜した。
【０１６３】
Ｂａｒ遺伝子挿入によるグルホシネート（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）抵抗性と感受性個体の分離比（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｒａｔｉｏ）を各挿入遺伝子別およびライン別に判断した。グルホシネート（Ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）耐性個体：感受性個体の比が約３：１を示せば、メンデルの法則によって挿入遺伝子が単一コピーで挿入され、世代が進展するにつれて分離されよく発現することと判断した。
【０１６４】
１／２ＭＳ培地で生存した個体を土に移植して３〜４週間育ててＴ１と同一な条件で４０×６０ｃｍ面積（０．２４ｍ２）にチアフェナシル溶液１００ｍｌ（１μＭ、５μＭ、１０μＭまたは２５μＭチアフェナシル＋０．０５％シルウェットＬ−７７）を満遍なく処理して形質転換体のチアフェナシル耐性を判断した。Ｔ３種子はチアフェナシル抵抗性Ｔ２植物体を持続的に育てて確保した。
【０１６５】
Ｔ１およびＴ２種子選別と同一に、２５μＭグルホシネートを含む１／２ＭＳ培地でＴ３種子を選別し、グルホシネート抵抗性個体が１００％であるラインをホモライン（ｈｏｍｏｌｉｎｅ）と判断した。
【０１６６】
７−２．種子発芽
前記製作されたＣｙＰＰＯ１０およびＣｙＰＰＯ１３の野生型および変異遺伝子が挿入された形質転換シロイヌナズナの除草剤抵抗性を確認した。
【０１６７】
各形質転換シロイヌナズナのＴ３世代種子を２５個ずつ除草剤が含まれている１／２ＭＳ培地に播種した。対照群としてＣｏｌ−０  ｅｃｏｔｙｐｅ（野生型）種子を使用した。使用された除草剤種類および使用濃度は以下の通りである：
図３１ａ：２５μＭグルホシネート（ＰＰＴ）、７０ｎＭチアフェナシル、１００ｎＭサフルフェナシル、２５μＭグルホシネート＋７０ｎＭチアフェナシル、または２５μＭグルホシネート＋３０ｎＭチアフェナシル＋４０ｎＭサフルフェナシル；
図３１ｂおよび３１ｃ：０．１μＭまたは１μＭチアフェナシル、０．３μＭまたは３μＭサフルフェナシル、０．１μＭまたは１μＭフルミオキサジン、０．５μＭまたは５μＭピラクロニル、または１μＭまたは１０μＭスルフェントラゾン。
【０１６８】
前記得られた播種７日後種子発芽結果を図３１ａ〜３１ｃに示した。図３１ａ〜３１ｃでＣｏｌ−Ｏは対照群、１０−３はＣｙＰＰＯ１０野生型、１０ＦＭ−４−７はＣｙＰＰＯ１０  Ｆ３６０Ｍ変異遺伝子挿入個体、１０ＦＬ−１−９はＣｙＰＰＯ１０  Ｆ３６０Ｌ変異遺伝子挿入個体、１０ＦＣ−３−５はＣｙＰＰＯ１０  Ｆ３６０Ｃ変異遺伝子挿入個体、１０ＡＣ−５−４はＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｃ変異遺伝子挿入個体、１３−１はＣｙＰＰＯ１３野生型、１３ＦＭ−３−１はＣｙＰＰＯ１３  Ｆ３７３Ｍ変異遺伝子挿入個体、１３ＦＣ−１−１はＣｙＰＰＯ１３  Ｆ３７３Ｃ変異遺伝子挿入個体、１３ＦＩ−２−１はＣｙＰＰＯ１３  Ｆ３７３Ｉ変異遺伝子挿入個体、１３ＡＣ−１−３はＣｙＰＰＯ１３  Ａ１７７Ｃ変異遺伝子挿入個体、ＣｙＰＰＯ１３＿ＡＬＦＬはＣｙＰＰＯ１３  Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｌ変異遺伝子挿入個体、およびＣｙＰＰＯ１３＿ＡＬＦＩはＣｙＰＰＯ１３  Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｉ変異遺伝子挿入個体をそれぞれ意味する。
【０１６９】
図３１ａ〜３１ｃに示されているように、野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０  ｅｃｏｔｙｐｅ）は除草剤を含まない１／２ＭＳ培地では正常に発芽する反面、前記のような除草剤を含む１／２ＭＳ培地で正常発芽せずに死滅することが確認された。したがって、各除草剤が含まれている培地で形質転換シロイヌナズナが正常発芽すれば、ＣｙＰＰＯ野生型または変異体の形質導入によって各除草剤に対する抵抗性が付与されるか増進されたと判断することができる。
【０１７０】
また、ＣｙＰＰＯ１０野生型またはＣｙＰＰＯ１０の変異遺伝子（Ｆ３６０Ｍ、Ｆ３６０Ｉ、Ｆ３６０Ｌ、Ｆ３６０Ｃ、Ａ１６７Ｃ）、ＣｙＰＰＯ１３野生型またはＣｙＰＰＯ１３の変異遺伝子（Ｆ３７３Ｍ、Ｆ３７３Ｃ、Ｆ３７３Ｉ、Ａ１７７Ｃ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｌ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｉ）がそれぞれ挿入された形質転換シロイヌナズナＴ３ライン種子を対象にして実験した結果、除草剤が含まれている培地（２５μＭグルホシネート、２５μＭグルホシネート＋７０ｎＭチアフェナシル、または２５μＭグルホシネート＋３０ｎＭチアフェナシル＋４０ｎＭサフルフェナシル含む）で全ての形質転換シロイヌナズナが正常発芽および生存するか、対照群より優れた発芽率および生存比率を示すことが確認された。選抜用として挿入したｂａｒ遺伝子の発現でグルホシネート抵抗性が付与されるので、前記結果はＰＰＯ阻害除草剤抵抗性因子と他の除草剤抵抗性因子（例えば、グルホシネート抵抗性、ｂａｒ遺伝子）が同時に植物体に挿入されて独立的に抵抗性を示すことができるのを示すものであると言える。
【０１７１】
図３１ａ乃至３１ｃに示されているように、多様な種類および濃度のＰＰＯ阻害除草剤が含まれている培地で、対照群は正常発芽しない反面、形質転換シロイヌナズナは正常発芽して生存することを確認した。このような結果は、形質転換体の挿入された遺伝子によって形質転換シロイヌナズナが多様なＰＰＯ阻害除草剤に対して抵抗性の付与を受けるか増進した抵抗性を保有するようになるのを示すもののである。
【０１７２】
７−３．ＣｙＰＰＯ遺伝子が導入されたシロイヌナズナ（Ｔ２）でのＣｙＰＰＯ蛋白質発現調査
ＣｙＰＰＯ１０、ＣｙＰＰＯ１０変異体（Ｆ３６０Ｉ変異体またはＦ３６０Ｍ変異体）、ＣｙＰＰＯ１３、またはＣｙＰＰＯ１３変異体（Ｆ３７３Ｍ変異体）を暗号化する遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ２）で各蛋白質が発現されるか調査した。
【０１７３】
各形質転換体のＴ２世代ライン別に播種４週後シロイヌナズナ形質転換体葉を液体窒素と共に摩砕した後、蛋白質抽出バッファー（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ）を添加して蛋白質を抽出した。抽出した蛋白質を用いてウェスタンブロットを行った。シロイヌナズナ形質転換ベクターに含まれているＨＡタグを用いてＰＰＯ蛋白質を検出した。ＲｕＢｉｓＣＯ大サブユニット（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ、実験蛋白質量比較）をクマシーブルーステイニング（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）で確認した。各変異体別に２つのラインを試験し、野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０  ｅｃｏｔｙｐｅ）を対照群として使用した。
【０１７４】
前記得られた結果を図７に示した。図７に示したように、ＣｙＰＰＯ１０変異体（Ｆ３６０Ｉ変異体またはＦ３６０Ｍ変異体）またはＣｙＰＰＯ１３変異体（Ｆ３７３Ｍ変異体）遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体は全てＰＰＯ蛋白質を発現するのを確認することができる。
【０１７５】
７−４．形質転換シロイヌナズナ（Ｔ２またはＴ３）の除草剤抵抗性検証
ＣｙＰＰＯ１０、ＣｙＰＰＯ１０変異体（Ｆ３６０Ｃ、Ｆ３６０Ｉ、Ｆ３６０Ｌ、Ｆ３６０Ｍ、Ｆ３６０Ｖ、Ｆ３６０Ｔ、Ａ１６７Ｃ、Ａ１６７Ｌ、Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｉ、またはＶ３０５Ｍ＋Ｆ３６０Ｍ）、ＣｙＰＰＯ１３、またはＣｙＰＰＯ１３変異体（Ａ１７７Ｃ、Ｆ３７３Ｃ、Ｆ３７３Ｉ、Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｉ、またはＡ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｌ）を暗号化する遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ２またはＴ３）に対して除草剤抵抗性をテストした。
【０１７６】
ＣｙＰＰＯ１０野生型遺伝子またはＣｙＰＰＯ１３野生型遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ３）に４０×６０ｃｍ面積（０．２４ｍ２）当り、チアフェナシル溶液１００ｍｌ（１μＭチアフェナシル＋０．０５％（ｖ／ｖ）シルウェットＬ−７７）を処理し、７日後に、植物の薬害程度を判断した。野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０  ｅｃｏｔｙｐｅ）を対照群として使用した。
【０１７７】
前記得られた結果を図８に示した。
【０１７８】
また、ＣｙＰＰＯ１０変異体（Ｆ３６０Ｃ、Ｆ３６０Ｉ、Ｆ３６０Ｌ、Ｆ３６０Ｍ、Ｆ３６０Ｖ、Ｆ３６０Ｔ、Ａ１６７Ｃ、Ａ１６７Ｌ、Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、またはＡ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｉ）またはＣｙＰＰＯ１３変異体（Ａ１７７Ｃ、Ｆ３７３Ｃ、Ｆ３７３Ｉ、Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｉ、またはＡ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｌ）を暗号化する遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ２）に４０×６０ｃｍ面積（０．２４ｍ２）当り、チアフェナシル溶液１００ｍｌ（１μＭ、５μＭ、１０μＭ、または２５μＭチアフェナシル＋０．０５％（ｖ／ｖ）シルウェットＬ−７７）を処理し、７日後に、植物の薬害程度を判断した。
【０１７９】
前記得られた結果を図９（ＣｙＰＰＯ１０変異体暗号化遺伝子挿入形質転換体Ｔ２個体）および図１０（ＣｙＰＰＯ１３変異体暗号化遺伝子挿入形質転換体Ｔ２個体）に示した。
【０１８０】
また、前記図８〜１０に示されたＣｙＰＰＯ遺伝子またはＣｙＰＰＯ変異遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体のチアフェナシル（１μＭ、５μＭ、１０μＭおよび２５μＭ）による薬害水準（Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎｄｅｘ）を数値化して下記の表１４に示した。
【０１８１】
【表１４】
2019527538.tif 000024
ＣｙＰＰＯ１０変異体（Ｆ３６０Ｉ、Ｆ３６０Ｌ、Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｉ、Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｍ、またはＶ３０５Ｍ＋Ｆ３６０Ｍ）を暗号化する遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ３）にチアフェナシル溶液（２５μＭチアフェナシル＋０．０５％（ｖ／ｖ）シルウェットＬ−７７）およびサフルフェナシル（１００μＭサフルフェナシル＋０．０５％（ｖ／ｖ）シルウェットＬ−７７）を４０×６０ｃｍ面積（０．２４ｍ２）に各１００ｍｌずつ処理し、７日後に、植物の薬害程度を判断した。
【０１８２】
前記得られたＣｙＰＰＯ１０変異体暗号化遺伝子挿入形質転換体Ｔ３個体での結果を図３２に示した。
【０１８３】
また、図３２のＣｙＰＰＯ１０変異遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体のチアフェナシルまたはサフルフェナシルによる薬害水準（Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎｄｅｘ）を数値化して下記の表１５に示した。
【０１８４】
【表１５】
2019527538.tif 000025
上記表１４および表１５のＡｖｅｒａｇｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎｄｅｘは、各ライン別試験個体（１０〜２０個）の薬害水準を下記の表１６の基準で評価した点数の平均を示す。
【０１８５】
前記Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎｄｅｘの評価基準を下記の表１６に整理した：
【表１６】
2019527538.tif 000026
チアフェナシル、サフルフェナシル、フルミオキサジン、スルフェントラゾン、オキシフルオルフェンまたはピラクロニル（各５０μＭ）処理後７日目にＣｙＰＰＯ１０変異遺伝子（Ｆ３６０Ｉ、またはＡ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ）またはＣｙＰＰＯ１３変異遺伝子（Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｌ、またはＡ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｉ）が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ３）の抵抗性水準を確認した。除草剤抵抗性と知られたシロイヌナズナＰＰＯ１の変異体（ＡｔＰＰＯ１  ＳＬＹＭ、Ｓ３０５Ｌ＋Ｙ４２６Ｍ）が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ３）またはシロイヌナズナ野生型（Ｃｏｌ−０）を対照群として使用した。
【０１８６】
除草剤種類別耐性実験は各除草剤５０μＭ濃度を４０×６０ｃｍ面積（０．２４ｍ２）に１００ｍｌずつ満遍なく撒布した。チアフェナシルの分子量（ＭＷ）は５１１．８７、サフルフェナシルの分子量は５００．８５、フルミオキサジンの分子量は３５４．３４、スルフェントラゾンの分子量は３８７．１８である。換算された除草剤処理薬量は、チアフェナシルは１０６．７ｇ  ａｉ／ｈａ、サフルフェナシルは１０４．４ｇ  ａｉ／ｈａ、フルミオキサジンは７３．８ｇ  ａｉ／ｈａ、スルフェントラゾンは８０．７ｇ  ａｉ／ｈａに該当する。
【０１８７】
前記得られた結果を図３３ａおよび３３ｂに示した。
【０１８８】
また、図３３ａに示された形質転換体の除草剤による薬害水準（Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎｄｅｘ）を数値化して下記の表１７に示した。
【０１８９】
【表１７】
2019527538.tif 000027
図３３ａおよび表１７で、「Ｃｙ１０＿ＦＩ」はＣｙＰＰＯ１０  Ｆ３６０Ｉ変異遺伝子挿入個体、「ＡｔＰＰＯ１＿ＳＬＹＭ」はＡｔＰＰＯ１のＳ３０５Ｌ＋Ｙ４２６Ｍ変異遺伝子挿入個体（対照群）、「Ｃｙ１０＿ＡＬＦＭ」はＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ変異遺伝子挿入個体での結果をそれぞれ示す。
【０１９０】
図３３ｂで、「Ｃｏｌ−０」は野生型シロイヌナズナ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、「ＡＬＦＬ」はＣｙＰＰＯ１３  Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｌ挿入個体、および「ＡＬＦＩ」はＣｙＰＰＯ１３  Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｉ挿入個体での結果をそれぞれ示す。
【０１９１】
図３３ａに示されているように、変異遺伝子形質転換体の抵抗性が対照群（ＡｔＰＰＯ１＿ＳＬＹＭ）と比較して同等以上であるのを確認することができる。ＣｙＰＰＯ１０＿ＦＩおよびＣｙＰＰＯ１０＿ＡＬＦＭは全て対照群（ＡｔＰＰＯ１＿ＳＬＹＭ）に比べて多様な除草剤に対する高い水準の抵抗性を付与することを確認した。
【０１９２】
前記表１４および図８に示されているように、１μＭチアフェナシル処理時、野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）は全ての個体が死滅した反面、ＣｙＰＰＯ１０野生型または変異型遺伝子またはＣｙＰＰＯ１３野生型または変異型遺伝子が挿入されたシロイヌナズナ形質転換体はほとんど薬害無く正常に生長するのを確認することができる。
【０１９３】
また、前記表１５、表１７、図９、図１０、図３２、および図３３ａおよび３３ｂに示されているように、変異型遺伝子挿入シロイヌナズナ形質転換体はチアフェナシル５μＭ以上処理時にも試験されたほとんど全ての形質転換個体で薬害が示されないか弱い水準に示されるのを確認することができる。前記結果は、ＣｙＰＰＯ１０、ＣｙＰＰＯ１３、またはこれら変異遺伝子の導入によってシロイヌナズナに除草剤抵抗性が付与および／または増進されるのを示す。
【０１９４】
Ｔ２で抵抗性を示した変異体がＴ３で抵抗性が維持されるのを確認することができる。これによって世代が進展しても変異体による除草剤抵抗性が安定的に伝達されるのを確認することができる。
【０１９５】
また、チアフェナシルを含む他のＰＰＯ阻害除草剤に対してＣｙＰＰＯの変異遺伝子が導入された形質転換シロイヌナズナがＣｏｌ−０に比べて高い抵抗性を示すので、該当変異遺伝子を用いて多様なＰＰＯ阻害除草剤に対する抵抗性を保有した植物を開発するのに活用できる。
【０１９６】
７−５．形質転換シロイヌナズナでの挿入遺伝子の後代（Ｔ４またはＴ５）安定性確認
本実施例では、シロイヌナズナ内挿入した遺伝子が世代を進展しても安定的に遺伝して発現されるか確認した。
【０１９７】
ＣｙＰＰＯ１０のＦ３６０Ｉ挿入形質転換体のＴ３ライン７−２、１０−２、１０−５をＴ４、Ｔ５世代に展開させて、各ラインの後代世代（Ｔ４、Ｔ５世代）でのチアフェナシルまたはサフルフェナシル抵抗性および挿入された遺伝子の発現による蛋白質を以下の方法で確認した。
【０１９８】
蛋白質抽出
形質転換体の世代別、ライン別に蛋白質を抽出した。具体的に、芽生え（Ｓｅｅｄｌｉｎｇ）状態の植物体を液体窒素を用いて摩砕した後、蛋白質抽出バッファー（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ）を添加して総タンパク（ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を抽出し、これを用いてウエスタンブロットを行った。
【０１９９】
抽出した蛋白質を電気泳動してＰＶＤＦ膜（ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に転移した後、抗−ＨＡ抗体（Ｓａｎｔ  ａ  ｃｒｕｚ）を用いて挿入したＰＰＯ蛋白質を検出した。
【０２００】
除草剤抵抗性確認
約４週育った抽苔前シロイヌナズナ（Ｔ４およびＴ５ＣｙＰＰＯ１０  Ｆ３６０Ｉ形質転換体）を対象にして１５μＭチアフェナシルまたは１５０μＭサフルフェナシルを４０×６０ｃｍ面積（０．２４ｍ２）に１００ｍｌずつ満遍なく撒布した。除草剤処理後７日目に除草剤薬害程度を観察した。
【０２０１】
前記除草剤抵抗性は図３４（Ｔ４）および図３５（Ｔ５）で確認し、その薬害水準（Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎｄｅｘ）を表１８に数値化して示した。
【０２０２】
【表１８】
2019527538.tif 000028
図３４、図３５、および表１８に示されているように、対照群（Ｃｏｌ−０；シロイヌナズナ野生型）は前記除草剤処理によって死滅する反面、Ｔ３で除草剤抵抗性を示した変異体（ＣｙＰＰＯ１０  Ｆ３６０Ｉ）のＴ４およびＴ５世代で除草剤抵抗性が維持されるのを確認することができる。これによって世代が進展しても変異体による除草剤抵抗性が安定的に伝達されるのを確認することができる。
【０２０３】
また、前記各ラインの芽生え（Ｓｅｅｄｌｉｎｇ）状態の植物体を用いて挿入遺伝子の発現をウェスタンブロットで確認した（図３６）。対照群（Ｃｏｌ−０；シロイヌナズナ野生型）を除いたＣｙＰＰＯ１０  Ｆ３６０Ｉ変異遺伝子が挿入された形質転換体のＴ４およびＴ５世代で全てＣｙＰＰＯ１０  Ｆ３６０Ｉ変異蛋白質が発現されるのを確認することができる。これは、世代が進展しても導入された変異遺伝子による変異蛋白質が安定的に発現し、前記実施例７−５で確認されたＴ４およびＴ５での抵抗性維持が前記変異遺伝子の発現によるものであるのを示す。
【０２０４】
実施例８．ＣｙＰＰＯおよびその変異体を用いた大豆形質転換体製作およびＰＰＯ阻害除草剤耐性試験
８−１．大豆形質転換用組換えベクターおよびこれを用いた大豆形質転換体の製作
ＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ遺伝子を大豆植物体に発現させてチアフェナシル抵抗性を付与するために形質転換用ベクターを製作した。
【０２０５】
具体的に、シロイヌナズナ形質転換時用いたベクター（図６）を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にしてシロイヌナズナＰＰＯ１遺伝子の輪送ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が結合されたＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ遺伝子をＰＣＲで増幅した。ｐＥＮＴＲ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ産物（ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ）をクローニングし、ＤＨ５αコンピテントセル（ＤＨ５  ａｌｐｈａ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。前記製作されたエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ）を用いて大豆形質転換用ベクターであるｐＢ２ＧＷ７．０バイナリーベクター（図３７）にクローニングした。前記クローニングは、ＧａｔｅｗａｙＬＲクロナーゼＩＩ酵素ミックスキット（Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。前記ＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ遺伝子が挿入されたｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターとｐＢ２ＧＷ７．０プラスミド、ＴＥバッファー、およびＬＲクロナーゼＩＩ酵素ミックス（ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ）を混合した後、２５℃で１時間反応させた。前記得られた反応物にプロテイナーゼＫ溶液（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した後、３７℃で１０分間反応させＤＨ５αコンピテントセルに形質転換した。
【０２０６】
前記製作したベクターを電気穿孔法でアグロバクテリウムツメファシエンスＥＨＡ１０５（Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｐｌａｎｔｓ（ＥＨＡ１０５）．Ｔｒａｎｓ  Ｒｅｓ．１９９３  ２：２０８−２１８）に形質転換した。
【０２０７】
クァンアン豆を用いて大豆形質転換体の製作を行った。滅菌した３次水に浸漬しておいた種子の両子葉の間に外科用メス（Ｓｃａｐｅｌ）を入れて下胚軸まで垂直に切断して種皮を除去した。胚軸を子葉の下部約１ｃｍになる所で切断した後、胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｘｉｓ）がついている一方を外科用メス（＃１１ブレード（ｂｌａｄｅ））で７〜８回程度切り付けた。大略５０個程度の切片体を形質転換されたアグロバクテリウムツメファシエンスＥＨＡ１０５と混合後、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を２０秒間行った後、３０分間接種させた。それぞれの切片体を滅菌したろ過紙の上に置いて水気を除去した後、固体ＣＣＭ（共培養培地（Ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）；０．３２ｇ／Ｌガムボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５、４．２６ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、３０ｇ／Ｌスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、０．７％寒天（Ａｇａｒ））にもろ過紙を一枚敷いて１０個体を載せておいた。この時、切片体の向軸（ａｄａｘｉａｌ）部分が下へ向かうように置いた。マイクロポアサージカルテープ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔａｐｅ）で封じた後、２５℃、１８時間光周期で５日間共培養した。
【０２０８】
５日間共培養した後、除菌のために液体１／２ＳＩＭ培地（シュート誘導培地（ｓｈｏｏｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）；３．２ｇ／Ｌガムボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５、１．６７ｍｇ／Ｌ  ＢＡ、３ｍＭ  ＭＥＳ、０．８％（ｗ／ｖ）寒天（ａｇａｒ）、３％（ｗ／ｖ）スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）、５０ｍｇ／Ｌバンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、１００ｍｇ／Ｌチカルシリン（ｔｉｃａｒｃｉｌｌｉｎ）、ｐＨ５．６）に１０分間洗浄した。それぞれの切片体をろ過紙の上に置いて水気を除去した後、選抜抗生剤がないＳＩＭにプレート（ｐｌａｔｅ）当り６個体ずつ胚軸部分が培地に固着され再分化される部分が３０度程度の角度で上へ向かうように置床した。それぞれのプレートをマイクロポアサージカルテープ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔａｐｅ）で封じた後、２５℃、１８時間光周期で培養した。
【０２０９】
２週後、新芽が出た切片体を選抜抗生剤ＰＰＴ１０ｍｇ／Ｌが入っているＳＩＭ−１（ＳＩＭにＤＬ−ホスフィノトリシン（ＤＬ−ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）１０ｍｇ／Ｌ添加、ｐＨ５．６）に、新芽を除いた残りの部分は切り捨て、向軸（ａｄａｘｉａｌ）部分が下へ向かうように置床した。
【０２１０】
２週後、褐変した新芽／新芽パッド（ｐａｄ）は外科用メス（＃１５ブレード（ｂｌａｄｅ））で削って選抜抗生剤ＰＰＴ５ｍｇ／Ｌが入っているＳＥＭ（ｓｈｏｏｔ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ、新芽伸張培地；ＭＳ塩（ＭＳ  ｓａｌｔ）４．４ｇ／Ｌ、ＭＥＳ  ３ｍＭ、ＧＡ３  ０．５ｍｇ／Ｌ、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）５０ｍｇ／Ｌ、ピログルタミン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）１００ｍｇ／Ｌ、ＩＡＡ  ０．１ｍｇ／Ｌ、ゼアチン（ｚｅａｔｉｎ）１ｍｇ／Ｌ、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）３％、寒天（ａｇａｒ）０．８％、セフォタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）２５０ｍｇ／Ｌ、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）５０ｍｇ／Ｌ、チカルシリン（ｔｉｃａｒｃｉｌｌｉｎ）１００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−ホスフィノトリシン（ＤＬ−ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）５ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）に置床した。２週ごとに新たなＳＥＭに移しながら、新芽の褐変部位は外科用メス（＃１５ブレード（ｂｌａｄｅ））で除去し、新芽パッドは少しずつ継続して削って培地がよく吸収されるようにした。
【０２１１】
ＳＥＭで選抜を経て伸張した新芽が４ｃｍ以上である時、外科用メス（＃１１ブレード（ｂｌａｄｅ））で切断してＲＩＭ（ｒｏｏｔｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ、根誘導培地；ＭＳ塩（ＭＳ  ｓａｌｔ）４．４ｇ／Ｌ、ＭＥＳ  ３ｍＭ、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）３％、寒天（ａｇａｒ）０．８％、セフォタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）５０ｍｇ／Ｌ、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）５０ｍｇ／Ｌ、チカルシリン（ｔｉｃａｒｃｉｌｌｉｎ）５０ｍｇ／Ｌ、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）２５ｍｇ／Ｌ、ピログルタミン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）２５ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）に移した。この時、分離した伸張した新芽の下部分を１ｍｇ／ｍＬ濃度のＩＢＡ（Ｉｎｄｏｌｅ−３−ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）に３分間浸漬した後に取り出してＲＩＭが入っているテストチューブに入れた。
【０２１２】
根が十分に育つようになると、３次蒸留水でＲＭを洗浄し、床土（バイオプラグ２号、ファームハンノン）とバーミキュライトを２：１体積比で混合して入れた小さいポット（６ｃｍ×６ｃｍ×５．６ｃｍ）に植えた。１０日程度経過後、葉の表面に１００ｍｇ／ＬのＤＬ−ホスフィノトリシン（ＤＬ−ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）でリーフペインティング（ｌｅａｆ  ｐａｉｎｔｉｎｇ）して抵抗性個体を１次選抜した。
【０２１３】
植物体が十分に育った後、さらに大きなポット（ｐｏｔ）に移植し、透明なプラスチック蓋に１０個程度の孔を作って被せた。１０日後、植物体にＢａｓｔａ（ＢＡＹＥＲ、５３ｍｇ／Ｌ）を処理して抵抗性個体を２次選抜した。
【０２１４】
８−２．形質転換大豆の除草剤抵抗性確認
ＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ形質転換大豆Ｔ０世代２番ラインおよび形質転換されていない大豆（クァンアン；野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ））の葉に５μＭまたは１５μＭチアフェナシル溶液を筆を用いて２〜３回塗布した。チアフェナシル溶液は展着剤としてシルウェットＬ−７７を０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度で含む。
【０２１５】
前記除草剤処理７日後の形質転換大豆の様子を図３８に示した。図３８に示されているように、クァンアン（形質転換していない大豆）では５μＭチアフェナシル処理時激しい薬害が示される反面、ＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ形質転換大豆は１５μＭの高濃度処理時にも薬害が示されないのを確認することができる。
【０２１６】
一方、ＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ形質転換体大豆２番ラインを展開して得られたＴ１世代（播種後、４週程度育ったＶ２〜３Ｓｔａｇｅの植物体）に除草剤（チアフェナシルまたはサフルフェナシル）をスプレー処理した。４０×６０ｃｍ面積に２５μＭチアフェナシルまたは１５０μＭサフルフェナシルが含まれている溶液１００ｍｌを満遍なくスプレーして処理した後、５日後の植物体の状態を評価した。
【０２１７】
前記得られた結果を図４０に示した。図４０で、「対照群」は野生型クァンアン豆を意味し、「１０ＡＬＦＭ」はＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ形質転換体大豆を意味する。図４０に示されているように、対照群と比較して、ＣｙＰＰＯ１０変異遺伝子形質転換大豆は比較的に高濃度の除草剤処理時にも薬害がほとんど示されないのが分かる。
【０２１８】
８−３．形質転換大豆内挿入遺伝子数確認
ＣｙＰＰＯ１０Ａ  １６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ形質転換大豆２、２３番ラインの葉２５０ｍｇでゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）抽出して形質転換大豆内の挿入遺伝子数を確認した。
【０２１９】
前記ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）抽出は、ＣＴＡＢバッファー方法を用いて行った。具体的に、液体窒素で凍らせた状態で乳棒と乳鉢を用いて前記形質転換大豆の葉組織を微細に擦った後、組織１ｇ当り５ｍｌのＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％（ｖ／ｖ）ｂｅｔａ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）を入れてボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した。６０℃で１時間以上加熱した後、クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）：イソアミルアルコール（ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）（２４：１）を１ｖｏｌｕｍｅ添加しインバーティング（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ）して混合した。７０００ｘｇおよび４℃条件で１０分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）した後、上澄み液を新しいチューブに移して２．５ｖｏｌｕｍｅエタノールを混合した。５０００ｘｇおよび４℃条件で５分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）した後、上澄み液を捨て、ペレットをＴＥバッファー（ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＬＰＳＳ）で溶かした。ＲＮａｓｅ  Ａ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を最終濃度２０μｇ／ｍｌで添加した後、３７℃で３０分間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。１ｖｏｌｕｍｅのフェノール：クロロホルム（１：１）を入れて混合した後、１００００ｘｇおよび４℃条件で１０分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）し、上澄み液を新しいチューブに移した後、１ｖｏｌｕｍｅのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を入れて混合した。１００００ｘｇおよび４℃条件で１０分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）し、上澄み液を新しいチューブに移した後、０．１ｖｏｌｕｍｅ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）と２ｖｏｌｕｍｅエタノールを添加して混合した。５０００ｘｇおよび４℃条件で５分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）し、得られたＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄した。空気乾燥（Ａｉｒ  ｄｒｙ）した後、適正量のＴＥバッファー（ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ）でゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）を溶かした。
【０２２０】
前記抽出されたＤＮＡ１０〜４０μｇをＥｃｏＲＩ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を用いて１２時間以上温浸（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した。
【０２２１】
その後、下記の条件でアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）０．８％（ｗ／ｖ）電気泳動（５０Ｖ）後、ゲル処理（ｇｅｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を行った：
１）脱プリン反応（ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ）：０．２５Ｎ  ＨＣｌ、１５分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
２）変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）：０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、３０分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
３）中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）：０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
そ  の後、キャピラリートランスファー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）方法を用いてゲル内のＤＮＡ片をニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した後、ＵＶ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（ＵＶＣ−５０８；ＵＬＴＲＡ  ＬＵＭ  Ｉｎｃ．）を用いて架橋結合（ｃｒｏｓｓ  ｌｉｎｋｉｎｇ）を行った。
【０２２２】
下記の方法で混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った：前記ニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）をＤＩＧ  Ｅａｓｙハイブリダイゼーション溶液（ＤＩＧ  Ｅａｓｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｒｏｃｈｅ、１１６０３５５８００１）で４２℃で３時間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。その後、新たなＤＩＧ  Ｅａｓｙハイブリダイゼーション溶液で交替した後、プローブ（ｐｒｏｂｅ）を入れて、４２℃で１２時間以上反応させた。
【０２２３】
前記プローブ（ｐｒｏｂｅ）は下記の方法で合成した：
Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ
ＤＩＧ  ｄＵＴＰ（Ｊｅｎａ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてｄｉｇが標識されたｂａｒ遺伝子を増幅させ、この時使用されたプライマーは以下の通りである：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｂａｒ  ｐｒｏｂｅ：５’−ＴＴＣ  ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＧＡ−３’（配列番号１２４）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｂａｒ  ｐｒｏｂｅ：５’−ＣＧＴ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡ−３’（配列番号１２５）
ＰＣＲ：Ｓｏｌｇｅｎｔ  ｅ−Ｔａｑｋｉｔ使用
条件：９５℃５分後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を３５ｃｙｃｌｅ反復、７２℃２分
前記反応した膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に対してｌｏｗ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｗａｓｈｉｎｇ（２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）とｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｗａｓｈｉｎｇ（０．５Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を行った。下記の条件でＤＩＧ検出（ＤＩＧ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を行ってバンドを確認した：
１）膜をブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ、Ｒｏｃｈｅ、１１５８５７６２００１）に入れて３０分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
２）ＤＩＧ抗体（ａｎｔｉ−ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ＡＰ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｒｏｃｈｅ）を入れて３０分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
３）洗浄バッファー（Ｒｏｃｈｅ）で１５分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
４）検出バッファー（Ｒｏｃｈｅ）を入れて３分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
５）ＣＤＰ−Ｓｔａｒ、ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に塗布した後、Ｘ線フィルム（ｘ−ｒａｙ  ｆｉｌｍ）でバンド（ｂａｎｄ）を現像する。
【０２２４】
比較のために、形質転換していないクァンアン豆のゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）を用いて同一な試験を行った（陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）；ＷＴ）。
【０２２５】
前記得られた結果を図３９に示した。図３９で、フィルム上に示されるバンドの数が挿入された遺伝子の数を意味する。図３９に示されているように、ＣｙＰＰＯ１０  Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ遺伝子の挿入個体である２、２３番ラインそれぞれの形質転換体で一つのバンドが観察されたので、挿入遺伝子が単一コピー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｐｙ）で存在するのを確認することができる。
【０２２６】
実施例９：ＰＰＯ変異体と配列相同性を有する蛋白質の活性試験
ＣｙＰＰＯプラスミド（ｐＡＣＢＢベクター）を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にして以下の条件でエラープロンＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）を行って、ＣｙＰＰＯ内ランダム（ｒａｎｄｏｍ）突然変異を誘導した：
鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）                                           ０．５μｌ
１０Ｘバッファー                                                   ５μｌ
１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２                                               １．５μｌ
ｄＮＴＰ                                                           ５μｌ
ｅ−Ｔａｑ（Ｓｏｌｇｅｎｔ社）                                     １μｌ
フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）（１００μＭ） ０．５μｌ
リバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）（１００μＭ）   ０．５μｌ
ＤＤＷ                                                             ３６μｌ
総５０μｌ
１０Ｘバッファー：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．３；５００ｍＭ  ＫＣｌ、７０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）
ｄＮＴＰ：１０ｍＭ  ｄＡＴＰ、１０ｍＭ  ｄＧＴＰ、１００ｍＭ  ｄＣＴＰ、１００ｍＭ  ｄＴＴＰ
９４℃  ３ｍｉｎ；（９４℃  ３０ｓｅｃ、５７℃  ３０ｓｅｃ、７２℃  １．５ｍｉｎ、７２℃  ５ｍｉｎ）３５ｃｙｃｌｅｓ
プライマー配列：
ＣｙＰＰＯ１０＿ＢａｍＨＩ  Ｆ
ｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＴＡ（配列番号１２６）
ＣｙＰＰＯ１０＿ＸｈｏＩ  Ｒ
ｃｃｃｃｃｔｃｇａｇＴＧＡＴＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＴＡＡＧ（配列番号１２７）
ＣｙＰＰＯ１３＿ＢａｍＨＩ  Ｆ
ｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＡＡＣＣＣＴＧＣＴＡＣＣＣＣＴＧＡＡＣ（配列番号１２８）
ＣｙＰＰＯ１３＿ＸｈｏＩ  Ｒ
ｃｃｃｃｔｃｇａｇＣＡＣＣＴＧＴＧＡＴＡＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＡＧ（配列番号１２９）
前記得られたエラープロン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ産物（ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ）をアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）に電気泳動した後、ゲル溶出（ｇｅｌ  ｅｌｕｔｉｏｎ）し、ｐＡＣＢＢベクターとＰＣＲ産物（ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ）をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した。制限酵素処理されたベクターとＰＣＲ産物（ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ）をアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）に電気泳動した後、ゲル溶出（ｇｅｌ  ｅｌｕｔｉｏｎ）し、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）した。ライゲーション産物（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ）をＢＴ３コンピテントセル（ＢＴ３  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）に形質転換し、コロニーＰＣＲ（ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ）した後、突然変異ＣｙＰＰＯの配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を確認した。突然変異が確認されたクローン（ｃｌｏｎｅ）をチアフェナシルまたはサフルフェナシルが濃度別（０、５０、１００、２００μＭ）に含まれているＬＢプレート（ＬＢ  ｐｌａｔｅ）にスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して大腸菌の生長を調査した。突然変異クローンの中で、最終の下のクローンが除草剤抵抗性突然変異として選抜された：
ＣｙＰＰＯ１０ｍ−６：９個アミノ酸変異（Ｅ２２５Ｇ、Ｇ２５８Ｓ、Ｑ２６６Ｌ、Ｔ３３６Ｉ、Ｖ３５６Ｆ、Ｆ３６０Ｍ、Ａ３６４Ｄ、Ｒ４０６Ｇ、Ｗ４１９Ｒ）含む；遺伝子配列−配列番号１３０、アミノ酸配列−配列番号１３１（野生型ＣｙＰＰＯ１０アミノ酸配列と９８％配列相同性）
前記ＣｙＰＰＯ１０ｍ−６の突然変異遺伝子を挿入したＢＴ３形質転換体の除草剤抵抗性を確認して、その結果を図４１に示した。図４１で、「ＡｔＰＰＯ１  ＷＴ」は野生型シロイヌナズナＰＰＯ１、「ＡｔＰＰＯ１  ＳＬＹＭ」はＹ４２６ＭおよびＳ３０５Ｌ変異を含む変異型シロイヌナズナＰＰＯ１、「ＣｙＰＰＯ１０  ＷＴ」は野生型ＣｙＰＰＯ１０、「ＣｙＰＰＯ１０ｍ−６」は前述のＣｙＰＰＯ１０変異体をそれぞれ示す。
【０２２７】
図４１のように、野生型ＣｙＰＰＯ１０アミノ酸配列基準９８％以上の配列相同性を有する変異体は２００μＭの高濃度チアフェナシルまたはサフルフェナシルを含有する培地でも野生型と同等程度の生存を示すのを確認することができる。このような結果は、野生型と９８％以上の配列相同性を有するＣｙＰＰＯ１０変異体は野生型の除草剤抵抗性（除草剤含有培地での生存率）を維持しているのを示す。
【図１】
2019527538.tif 000029
【図２】
2019527538.tif 000030
【図３】
2019527538.tif 000031
【図４】
2019527538.tif 000032
【図５】
2019527538.tif 000033
【図６】
2019527538.tif 000034
【図７】
2019527538.tif 000035
【図８】
2019527538.tif 000036
【図９】
2019527538.tif 000037
【図１０】
2019527538.tif 000038
【図１１】
2019527538.tif 000039
【図１２】
2019527538.tif 000040
【図１３】
2019527538.tif 000041
【図１４】
2019527538.tif 000042
【図１５】
2019527538.tif 000043
【図１６】
2019527538.tif 000044
【図１７】
2019527538.tif 000045
【図１８】
2019527538.tif 000046
【図１９】
2019527538.tif 000047
【図２０】
2019527538.tif 000048
【図２１】
2019527538.tif 000049
【図２２】
2019527538.tif 000050
【図２３】
2019527538.tif 000051
【図２４】
2019527538.tif 000052
【図２５】
2019527538.tif 000053
【図２６】
2019527538.tif 000054
【図２７】
2019527538.tif 000055
【図２８】
2019527538.tif 000056
【図２９】
2019527538.tif 000057
【図３０】
2019527538.tif 000058
【図３１ａ】
2019527538.tif 000059
【図３１ｂ】
2019527538.tif 000060
【図３１ｃ】
2019527538.tif 000061
【図３２】
2019527538.tif 000062
【図３３ａ】
2019527538.tif 000063
【図３３ｂ】
2019527538.tif 000064
【図３４】
2019527538.tif 000065
【図３５】
2019527538.tif 000066
【図３６】
2019527538.tif 000067
【図３７】
2019527538.tif 000068
【図３８】
2019527538.tif 000069
【図３９】
2019527538.tif 000070
【図４０】
2019527538.tif 000071
【図４１】
2019527538.tif 000072
【配列表】
2019527538000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月14日(2019.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
配列番号２のアミノ酸配列中のＮ５９、Ｓ６０、Ｒ８９、Ｆ１６１、Ｖ１６５、Ａ１６７、Ｑ１８４、Ｐ３０３、Ｖ３０５、Ｆ３２４、Ｌ３２７、Ｉ３４０、Ｆ３６０、およびＩ４０８からなる群より選択された少なくとも１つがそれぞれ独立して欠失またはＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、およびＫ（Ｌｙｓ）からなる群より選択され、該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号４のアミノ酸配列中のＲ１０１、Ｆ１７１、Ｖ１７５、Ａ１７７、Ｇ１９４、Ｐ３１６、Ｖ３１８、Ｆ３３７、Ｌ３４０、Ｉ３５３、およびＦ３７３からなる群より選択された少なくとも１つがそれぞれ独立して欠失またはＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、およびＫ（Ｌｙｓ）からなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
から選択されたポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、
配列番号２のアミノ酸配列中のＮ５９、Ｓ６０、Ｒ８９、Ｆ１６１、Ｖ１６５、Ａ１６７、Ｑ１８４、Ｐ３０３、Ｖ３０５、Ｆ３２４、Ｌ３２７、Ｉ３４０、Ｆ３６０、およびＩ４０８からなる群より選択された少なくとも１つがそれぞれ独立してＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、およびＧ（Ｇｌｙ）からなる群より選択されたアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号４のアミノ酸配列中のＲ１０１、Ｆ１７１、Ｖ１７５、Ａ１７７、Ｇ１９４、Ｐ３１６、Ｖ３１８、Ｆ３３７、Ｌ３４０、Ｉ３５３、およびＦ３７３からなる群より選択された少なくとも１つがそれぞれ独立してＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、およびＮ（Ａｓｎ）からなる群より選択されたアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
からなる群より選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｆ３６０Ｍ、Ｆ３６０Ｖ、Ｆ３６０Ｉ、Ｆ３６０Ｔ、Ｆ３６０Ｌ、Ｆ３６０Ｃ、Ａ１６７Ｃ、Ａ１６７Ｌ、Ａ１６７Ｉ、Ｐ３０３Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５Ｍ、Ｖ３０５Ｔ、Ｎ５９Ｔ、Ｓ６０Ｔ、Ｒ８９Ａ、Ｒ８９Ｌ、Ｒ８９Ｖ、Ｆ１６１Ａ、Ｖ１６５Ｓ、Ｖ１６５Ｃ、Ｑ１８４Ｇ、Ｆ３２４Ｖ、Ｌ３２７Ｔ、Ｉ３４０Ｔ、Ｉ４０８Ｒ、およびＩ４０８Ｗからなる群より選択された少なくとも１つのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号４のアミノ酸配列において、Ｆ３７３Ｍ、Ｆ３７３Ｖ、Ｆ３７３Ｉ、Ｆ３７３Ｔ、Ｆ３７３Ｌ、Ｆ３７３Ｃ、Ｆ３７３Ｎ、Ｆ３７３Ｈ、Ａ１７７Ｃ、Ａ１７７Ｌ、Ａ１７７Ｉ、Ｐ３１６Ａ、Ｐ３１６Ｌ、Ｖ３１８Ｌ、Ｖ３１８Ｍ、Ｒ１０１Ａ、Ｆ１７１Ａ、Ｖ１７５Ｃ、Ｖ１７５Ｌ、Ｇ１９４Ｅ、Ｇ１９４Ｑ、Ｇ１９４Ｍ、Ｇ１９４Ｋ、Ｇ１９４Ｒ、Ｆ３３７Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、およびＩ３５３Ｔからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
からなる群より選択される、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｆ３６０Ｍ、Ｆ３６０Ｖ、Ｆ３６０Ｉ、Ｆ３６０Ｔ、Ｆ３６０Ｌ、Ｆ３６０Ｃ、Ａ１６７Ｃ、Ａ１６７Ｌ、Ｐ３０３Ｌ、Ｎ５９Ｔ、Ｓ６０Ｔ、Ｒ８９Ａ、Ｒ８９Ｌ、Ｒ８９Ｖ、Ｆ１６１Ａ、Ｖ１６５Ｓ、Ｖ１６５Ｃ、Ａ１６７Ｉ、Ｑ１８４Ｇ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５Ｍ、Ｖ３０５Ｔ、Ｆ３２４Ｖ、Ｌ３２７Ｔ、Ｉ３４０Ｔ、Ｉ４０８Ｒ、Ｉ４０８Ｗ、Ｐ３０３Ｌ＋Ｖ３０５Ｌ、Ｎ５９Ｔ＋Ｆ３６０Ｖ、Ｓ６０Ｔ＋Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｓ６０Ｔ＋Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｓ６０Ｔ＋Ｉ３４０Ｔ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｒ８９Ａ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｒ８９Ａ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｒ８９Ａ＋Ｆ３６０Ｌ、Ｒ８９Ｌ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｒ８９Ｖ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｒ８９Ａ＋Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｒ８９Ａ＋Ｖ３０５Ｔ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｌ、Ｖ１６５Ｓ＋Ｆ３６０Ｖ、Ｖ１６５Ｃ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｃ＋Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｃ＋Ａ１６７Ｉ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ１６５Ｃ＋Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｌ＋Ｆ３６０Ｉ、Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｍ、Ａ１６７Ｃ＋Ｆ３６０Ｉ、Ａ１６７Ｉ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ３０５Ｍ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｖ３０５Ｔ＋Ｆ３６０Ｉ、Ｖ３０５Ｌ＋Ｆ３６０Ｍ、Ｉ４０８Ｒ＋Ｆ３６０Ｍ、またはＩ４０８Ｗ＋Ｆ３６０Ｍのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号４のアミノ酸配列において、Ｆ３７３Ｍ、Ｆ３７３Ｖ、Ｆ３７３Ｉ、Ｆ３７３Ｔ、Ｆ３７３Ｌ、Ｆ３７３Ｃ、Ｆ３７３Ｎ、Ｆ３７３Ｈ、Ａ１７７Ｃ、Ａ１７７Ｌ、Ａ１７７Ｉ、Ｐ３１６Ａ、Ｐ３１６Ｌ、Ｖ３１８Ｌ、Ｖ３１８Ｍ、Ｒ１０１Ａ、Ｆ１７１Ａ、Ｖ１７５Ｃ、Ｖ１７５Ｌ、Ｇ１９４Ｅ、Ｇ１９４Ｑ、Ｇ１９４Ｍ、Ｇ１９４Ｋ、Ｇ１９４Ｒ、Ｆ３３７Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｉ３５３Ｔ、Ｐ３１６Ｌ＋Ｖ３１８Ｌ、Ｐ３１６Ａ＋Ｖ３１８Ｌ、Ｒ１０１Ａ＋Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｃ＋Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｉ＋Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｍ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｉ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｌ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｔ、Ａ１７７Ｌ＋Ｆ３７３Ｖ、Ａ１７７Ｃ＋Ｆ３７３Ｔ、Ａ１７７Ｃ＋Ｆ３７３Ｖ、Ｖ１７５Ｌ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｅ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｑ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｍ＋Ｆ３７３Ｍ、Ｇ１９４Ｋ＋Ｆ３７３Ｍ、１９４Ｒ＋Ｆ３７３Ｍ、またはＶ３１８Ｍ＋Ｆ３７３Ｍのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
前記ポリペプチドのアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項６の組換えベクターを含む組換え細胞。
【請求項８】
配列番号２のポリペプチド；配列番号４のポリペプチド；請求項１〜４のいずれか一項のポリペプチド；前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される少なくとも１つを含む、植物または藻類（ａｌｇａｅ）の除草剤に対する抵抗性付与または増進のための組成物。
【請求項９】
前記除草剤は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記除草剤は、ピリミジンジオン系、ジフェニルエーテル系、フェニルピラゾール系、Ｎ−フェニルフタルイミド系、フェニルエステル系、チアジアゾール系、オキサジアゾール系、トリアゾリノン系、オキサゾリジンジオン系、ピラクロニル、フルフェンピル−エチルおよびプロフルアゾルからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記除草剤は、ブタフェナシル、サフルフェナシル、ベンズフェンジゾン、チアフェナシル、ホメサフェン、オキシフルオルフェン、アクロニフェン、アシフルオルフェン、ビフェノックス、エトキシフェン、ラクトフェン、クロメトキシフェン、クロルニトロフェン、フルオログリコフェン−エチル、ハロサフェン、ピラフルフェン−エチル、フルアゾレート、フルミオキサジン、シニドン−エチル、フルミクロラック−ペンチル、フルチアセット、チジアジミン、オキサジアルギル、オキサジアゾン、カルフェントラゾン、スルフェントラゾン、アザフェニジン、ペントキサゾン、ピラクロニル、フルフェンピル−エチル、プロフルアゾル、フェノピレート、フェノピレートのカルバメート類似体、これらの農薬的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
上記植物または藻類は、第２の除草剤抵抗性ポリペプチドまたはこれをコードする遺伝子をさらに含み、前記第２の除草剤に対する抵抗性が付与または増進される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第２の除草剤は、グリホサート、グルホシネート、ジカンバ、２，４−Ｄ、イソキサフルトール、ＡＬＳ阻害性除草剤、光化学系ＩＩ阻害性除草剤、フェニルウレア系除草剤、ブロモキシニル系除草剤およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第２の除草剤は、
グリホサート除草剤耐性ＥＰＳＰＳ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ５−ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＧＯＸ、ＧＡＴまたはグリホサートデカルボキシラーゼ；
グルホシネート除草剤耐性ＰＡＴ；
ジカンバ除草剤耐性ＤＭＯ；
２，４−Ｄ除草剤耐性２，４−ＤモノオキシゲナーゼまたはＡＡＤ；
ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア系除草剤耐性ＡＬＳ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＡＨＡＳまたはＡｔＡＨＡＳＬ；
光化学系ＩＩ阻害性除草剤耐性光化学系ＩＩタンパク質Ｄ１；
フェニルウレア除草剤耐性シトクロムＰ４５０；
色素体阻害性除草剤耐性ＨＰＰＤ；
ブロモキシニル除草剤耐性ニトリラーゼ；および
これらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第２の除草剤耐性ポリペプチドをコードする遺伝子は、
グリホサート除草剤耐性ｃｐ４  ｅｐｓｐｓ、ｅｐｓｐｓ（ＡＧ）、ｍｅｐｓｐｓ、２ｍｅｐｓｐｓ、ｇｏｘｖ２４７、ｇａｔ４６０１またはｇａｔ４６２１遺伝子；
グルホシネート除草剤耐性ｂａｒまたはｐａｔ遺伝子；
ジカンバ除草剤耐性ｄｍｏ遺伝子；
２，４−Ｄ除草剤耐性ＡＡＤ−１またはＡＡＤ−１２遺伝子；
イソキサフルトール除草剤耐性ＨＰＰＤＰＦ  Ｗ３３６遺伝子；
スルホニルウレア除草剤耐性ＡＬＳ、Ｃｓｒ１、Ｃｓｒ１−１、Ｃｓｒ１−２、ＧＭ−ＨＲＡ、Ｓ４−ＨＲＡ、Ｚｍ−ＨＲＡ、ＳｕｒＡまたはＳｕｒＢ遺伝子；
光化学系ＩＩ阻害性除草剤耐性ｐｓｂＡ遺伝子；
フェニルウレア除草剤耐性ＣＹＰ７６Ｂ１遺伝子；
ブロモキシニル除草剤耐性ｂｘｎ遺伝子；および
これらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
配列番号２のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、請求項１〜４のいずれか一項のポリペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性を有する形質転換体、そのクローンまたは子孫。
【請求項１７】
前記形質転換体は、植物の細胞、プロトプラスト、カルス、胚軸、種子、子葉、シュートまたは植物体全体である、請求項１６に記載の形質転換体、そのクローンまたは子孫。
【請求項１８】
配列番号２のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、請求項１〜４のいずれか一項のポリペプチド、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを藻類、または植物の細胞、プロトプラスト、カルス、胚軸、種子、子葉、シュートまたは植物体全体に形質転換することを含む、除草剤に対する耐性を有する植物または藻類の製造方法。
【請求項１９】
配列番号２のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、請求項１〜４のいずれか一項のポリペプチド、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを藻類、または植物細胞、プロトプラスト、カルス、胚軸、種子、子葉、シュートまたは植物体全体に形質転換することを含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性を付与または増進させる方法。
【請求項２０】
配列番号２のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、請求項１〜４のいずれか一項のポリペプチド、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む植物を栽培地に提供すること、および
前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用することを含む、
栽培地で雑草を防除する方法。
【請求項２１】
前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用することは、２つ以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用することである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記植物は、第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれをコードする遺伝子をさらに含み、
前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの有効量を抑制する除草剤を適用することが、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤および第２の除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用することにより実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号２のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、請求項１〜４のいずれか一項のポリペプチド、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む藻類を培養培地に提供すること、および
前記培養培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用することを含む、
培養培地で望まない水生生物を除去する方法。
【国際調査報告】
2019527538.tif 000073
2019527538.tif 000074