(57)【要約】複数のラウンドの蛍光染色を使用して、生体試料においてバイオマーカーを特徴づけるための簡易で正確な方法を記載する。本方法は、細胞、組織または任意の生体試料のクエンチング、非誘導体化、アミンの除去、および再染色（ＱＵＡＳ−Ｒ）のステップを含む。
2019509468.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料をバイオマーカーについて再染色する方法であって、
ａ．蛍光を還元剤でクエンチングするステップと、
ｂ．非誘導体化させ、且つ、アミンを除去するステップと、
ｃ．前記試料を１つまたは複数の追加の蛍光マーカーで再染色するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記生体試料が、１つまたは複数の蛍光マーカーで予め染色されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料が、蛍光マーカーで予め染色されておらず、且つ、少なくとも１週間保管されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ａ．前記試料を表面上に固定するステップと、
ｂ．前記バイオマーカーを可視化するステップと
をさらに含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素シアノ、水素化ホウ素テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、および水素化ホウ素ベンジルトリエチルアンモニウムからなる群から選択されるホウ化水素誘導体である、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ホウ化水素が水素化ホウ素ナトリウムである、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオマーカーが、細胞、ウイルス成分、細菌成分および疾患成分から本質的になる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、組織、血液中のがんに関連する細胞、ＣＴＣ、ＥＭＴ、ＣＡＭＬ、ＣＥＣ、血液細胞、リンパ細胞、毛髪細胞、皮膚細胞および骨髄細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記がん細胞がヒトがん細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料が、血液、尿、骨髄、リンパ組織、脳脊髄液、羊水、胆液、唾液、痰、腹水、胸水、膣液、卵巣嚢腫液、子宮内膜液、リンパ浮腫からなる群から選択される、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
生体試料においてバイオマーカーについてスクリーニングする方法であって、
ａ．蛍光を還元剤でクエンチングするステップと、
ｂ．非誘導体化させ、且つ、アミンを除去するステップと、
ｃ．前記試料を１つまたは複数の追加の蛍光マーカーで再染色するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記生体試料が、１つまたは複数の蛍光マーカーで予め染色されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体試料が、蛍光マーカーで予め染色されておらず、且つ、少なくとも１週間保管されたものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素シアノ、水素化ホウ素テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、および水素化ホウ素ベンジルトリエチルアンモニウムからなる群から選択されるホウ化水素誘導体である、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ａ．前記試料を表面上に固定するステップと、
ｂ．前記バイオマーカーを可視化するステップと
をさらに含む、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
生体試料においてバイオマーカーを特徴づける方法であって、
ａ．蛍光を還元剤でクエンチングするステップと、
ｂ．非誘導体化させ、且つ、アミンを除去するステップと、
ｃ．前記試料を１つまたは複数の追加の蛍光マーカーで再染色するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
前記生体試料が１つまたは複数の蛍光マーカーで予め染色されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体試料が、蛍光マーカーで予め染色されておらず、且つ、少なくとも１週間保管されたものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ａ．前記試料を表面上に固定するステップと、
ｂ．前記バイオマーカーを可視化するステップと
をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素シアノ、水素化ホウ素テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、水素化ホウ素ベンジルトリエチルアンモニウムからなる群から選択されるホウ化水素誘導体である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年８月１２日に出願された仮出願第６２／３７４，４５６号、２０１６年８月１１日に出願された仮出願第６２／３７３，８６７号、２０１６年３月３日に出願された仮出願第６２／３０３，２４３号、および２０１６年１月７日に出願された仮出願第６２／２７５，９４９号の優先権を主張するものである。
【０００２】
ホルマリン固定パラフィン包埋組織、循環血球またはマウントした任意の生体試料は、特異的同定および分類のために蛍光マーカーで染色できる。しかし本発明以前では、染色は１〜５種の蛍光マーカーに限定されていた。例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、原発性／転移性の固形腫瘍から遊離し、循環系で見られるがん細胞である。長年、全末梢血を使用してがん患者からＣＴＣを分離して、進行疾患の予後の指標として使用されてきた。現在、臨床的に有効な唯一の予後アッセイでは、抗体を媒介とする捕捉に基づいてＣＴＣを分離し、３種の細胞蛍光マーカーに基づいてＣＴＣを同定する。このＦＤＡ承認アッセイ（ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）ＣＴＣテスト）では、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対する抗体にコンジュゲートした強磁性流体ナノ粒子を使用して、血液からＣＴＣを捕捉する。その後、捕捉された細胞は、蛍光マーカーである、ＤＡＰＩ（核を染色し対象物を細胞と同定する）、サイトケラチン（ＣＫ）（細胞を上皮性と同定する）およびＣＤ４５（白血球を除外する）を使用して同定される。
【０００３】
数多くの代替の血液細胞分離法が導入されている。これらのアッセイでは、ＣＴＣの捕捉を超えて、循環がん関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、上皮間葉転換（ＥＭＴ）細胞、循環繊維芽細胞（ＣＦ）等を含む分析が展開される。細胞の同定およびサブタイプ分類によるＣＴＣの簡単な検体計数は、多くの用途に対して不適切な場合が多い。分離プラットフォームにかかわらず、蛍光検出は細胞同定の一般的な手段であり、以前は細胞１個当たり合計４〜５種の発光体に限定されていた。これにより、蛍光に基づく細胞の特性評価は、前述の３種の同定バイオマーカーと、１〜２種のさらなるサブタイプ分類バイオマーカーに制限されている。これにより研究者らは、臨床的にも生物学的にも、細胞の表面的なプロテオーム同定に制限されているが、重要な細胞の表現型を真に調査するには複数のサブタイプ分類マーカーが必要とされる。研究者らは、同一の患者から複数の生体試料を収集すること、例えば血液を数多くのチューブに収集し、各チューブの細胞を異なるマーカーについて分析することによって、この制限を乗り越えようとしてきた。しかしながら、細胞は表現型にばらつきが大きいことにより、異なる血液収集チューブの個々の細胞を染色しても比較不可能となる。同様に、５種を超えるマーカーを分析するのに、複数の組織生検スライドが必要であった。診断および治療を向上させるために複数のマーカーを使用して同一の試料を分析する迅速で簡単な方法は、臨床的に数多くの利点をもたらすであろう。
【０００４】
疾患の進行、疾患の拡大に関連して、および疾患の治療に応答して、細胞の様々なサブグループが表現型をアップレギュレートおよび／またはダウンレギュレートするため、疾患における細胞の同定および分類は複雑である。例えば、がん細胞が、上皮から間充織への転換など、様々な状態に転換する能力、または炎症性の免疫チェックポイントの発現を変更する能力は、がんが進行しまたは治療に応答するにつれてリアルタイムでダイナミックに変化する腫瘍の活動状態の例である。これらの変化が多くの障害で生じるため、循環細胞（例えばＣＴＣ、ＣＡＭＬ、ＣＥＣ、ＥＭＴなど）は、疾患進行をリアルタイムで追跡するための代表となり得るサロゲートバイオマーカーとして比類なく好適である。
【０００５】
４〜５種を超えるマーカーの蛍光染色が必要とされる一例は、ＥＭＴを経たＣＴＣである。この現象は、がん患者の血液において一般的であり、原発細胞の構成部分として転移の拡大に関与するとされている。残念なことに、ＥＭＴには広く認められたバイオマーカーの陽性セットがなく、通常、上皮性タンパク質、例えばＥｐＣＡＭおよびＣＫのダウンレギュレーションおよび間葉系幹細胞タンパク質、例えばビメンチンおよびＣＤ３４のアップレギュレーションにより説明される。しかしながら、ＥＭＴは現在大きな関心を呼んでいるトピックであり、利用できる蛍光チャンネルが制限されているためプロテオーム解析には限界があるので、ＥＭＴのサブタイプ分類は非プロテオーム的手法、例えばｍＲＮＡ発現またはＤＮＡ分析を使用して、スクリーニングされるのが一般的である。
【０００６】
生体試料の蛍光に基づいた染色において、ホウ化水素誘導体（例えば水素化ホウ素シアノおよび水素化ホウ素リチウム）は、プロテオームマーカー／ゲノムマーカーを傷つけずにバックグラウンドとなる自家蛍光を減少させるために使用される主要な試薬である。興味深いことに、ホウ化水素誘導体はかつては、生検された検鏡用薄切片において蛍光を減弱するために使用されたが、特定の蛍光染料信号を完全に除去するためには使用されなかった。ホウ化水素（ＢＨ4）は、有機化学において一般に使用される弱い、選択的なカルボニル還元剤であり、アミドまたはカルボキシの酸官能基を還元せずに、ケトンおよびアルデヒドをアルコールに、および／またはイミンを第二級アミンに還元する。顕微鏡法では、ＢＨ4誘導体は固定した生体試料におけるホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドの自家蛍光をクエンチするために使用されることが多い。ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよび他の固定剤の多くは、例えば組織、細胞、タンパク質などの生体試料と反応すると、自家蛍光を生じる。自家蛍光は、試料上のカルボニル化およびシッフ塩基化合物の蓄積により引き起こされる。ＢＨ4誘導体を固定した生体試料に追加する第２の利点は遊離したアルデヒド基を減少させる能力であり（例えばアルデヒドブロッキング）、この能力によってさらに組織化学的試薬の非特異的結合を最小限にできる。
【発明の概要】
【０００７】
驚いたことに、本発明は、古典的ながんの病理組織学的サブタイプ分類と同様に、少なくとも異なる２５個の蛍光マーカーで連続して生体試料を染色できること、および生体試料を視覚化して、厳密な細胞学的評価が可能となることを発見した。本発明は、生物学的な細胞試料をｉｎ  ｓｉｔｕで固定し、連続して蛍光マーカーで再染色するプラットフォームを提供する。４〜５個の蛍光染料のパネルで染色する第１のラウンドに続いて、細胞を画像化、配置、マーキング、および保管する。細胞をマーキングすることで、ユーザーはクエンチング（quenching:消光）のプロセスにおける各ステップの後に同一の細胞を再配置できる。本発明は、４〜５個を超えるマーカーを染色するための方法および試薬からなり、細胞のクエンチング、非誘導体化、アミン除去および再染色（ＱＵＡＳ−Ｒ）のステップを含んでいる。一実施形態において、細胞をＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）ミクロフィルター（Ｃｒｅａｔｖ  ＭｉｃｒｏＴｅｃｈ）などのフィルターで分離する。本技術ではホウ化水素での完全なクエンチングにもかかわらず、エピトープが完全に保たれることが重要である。ＱＵＡＳ−Ｒ技術を、最初にＤＡＰＩおよびＣＴＣマーカー（ＣＫおよびＥｐＣＡＭ）およびＣＤ４５白血球マーカーを染色した膵がん患者試料上でテストした。目標は、間葉系幹細胞マーカー（ＣＤ３４およびビメンチン）、運動性マーカー（ＣＸＣＲ４およびビメンチン）および炎症性マーカー（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ１）に対して細胞を再評価することである。本発明は、同一の細胞試料上で、ＤＡＰＩに加えてこれら９つの異なる表現型のがんマーカーを連続して分析、サブタイプ分類、追跡するために使用できる。
【０００８】
細胞試料は、４〜５個の蛍光マーカーで一度に染色し画像化できる。最大５回の再染色が実証された。したがって２５種を超える異なるマーカーを同一の細胞上で評価できる。
【０００９】
試料を再染色できる制限回数は、再染色の必要性と、細胞損失を防止するために載せる（mounting）試料に依存する。
【００１０】
本発明は、任意の載せる生体試料（例えば血液から収集した細胞、組織生検、ウイルスまたは細菌に感染した細胞、尿から収集した細胞、髄液から収集した細胞、他の体液から収集した細胞、手術後に除去された組織）に適用し、任意の載せられる基材（例えばガラス、ポリマー、金属）に固定することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上の蛍光マーカーの蛍光クエンチング。図１ａは実施前。図１ｂはホウ化水素溶液にて１．５時間経過後。スケールバーの長さは１０μｍである。
【図２】各蛍光マーカーの細胞対バックグラウンドの信号の強度。図２ａは、マーカー信号の平均強度を表す。図２ｂはバックグラウンド信号を表す。画像の大きさは４５μｍ×４５μｍである。
【図３】ホウ化水素の追加後０、３０分、６０分および９０分のサイトケラチン陽性細胞の蛍光クエンチングを表す。画像の大きさは４５μｍ×４５μｍである。
【図４】ＱＵＡＳ−Ｒを２ラウンド実施したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞。図４ａは、サイトケラチン、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４５の最初の染色を示す。図４ｂは、初回のＱＵＡＳ−Ｒ後にＣＤ１４、ＣＸＣＲ４およびビメンチンマーカーを再染色した細胞を示す。図４ｃは、２回目のＱＵＡＳ−Ｒ後にＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３４およびＰＤ１マーカーで再染色した細胞を示す。画像の大きさは４５μｍ×４５μｍである。
【図５】マーカー染料を染色の第１のラウンド、第２のラウンドまたは第３のラウンドで使用した時の実験計画および信号強度のパーセント変化の代表例。図５ａは、ＱＵＡＳ−Ｒを３ラウンド使用する細胞染色の代表的な方法を示す。図５ｂは、代表的な信号強度が染色順序にかかわらず減弱を示さないことを表す。
【図６】全般的な細胞の信号強度、およびＱＵＡＳ−Ｒ２ラウンド後の５つの異なる細胞株（ＨＵＶＥＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ａ２０５８、ＬＮＣａＰ、ＭＣＦ−７）上の９つの細胞マーカーの変化のグラフ。ＱＵＡＳ−Ｒ３ラウンド後、どの表面レセプターおよび細胞内マーカーも低下しなかった。
【図７】ＤＡＰＩ、抗ＣＤ１４および抗ＣＤ３４で染色したＨＵＶＥＣ内皮細胞。
【図８】図８ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上のＥｐＣＡＭを示す。白い矢印は高発現するＥｐＣＡＭ細胞を指し示し、灰色の矢印は低発現する細胞を指し示す。図８ｂは実施例２のＥｐＣＡＭ染色の拡大図である。
【図９】ＱＵＡＳ−Ｒ後の患者由来のＥＭＴは、細胞のサブタイプ分類および薬物スクリーニングの標的を示す。図９ａは、ＣＫ、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４Ｓの最初の染色を示す。図９ｂは、最初のＱＵＡＳ−Ｒラウンド後のＣＤ１４、ＣＸＣＲ４およびビメンチンの再染色を示す。図９ｃは、第２のＱＵＡＳ−Ｒラウンド後のＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３４およびＰＤ１の再染色を示す。図９ｄは、マーカーのパーセンテージを濃い灰色（１００％）および白（０％）で表現した異なるマーカーのヒートマップである。灰色の濃淡は１００％から０％までの陽性発現のパーセンテージを示す。ＶＭ＝ビメンチン、ＣＫ＝サイトケラチン。画像の大きさは７５μｍ×７５μｍである。
【図１０】ＱＵＡＳ−Ｒを２ラウンド実施し、染色順序を変えたＡ２０５８細胞を表す。図１０ａはＣＤ１４、ＣＸＣＲ４およびビメンチンでの最初の染色を示す。図１０ｂは、ＱＵＡＳ−Ｒでクエンチし、サイトケラチン、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４５で染色した同一のＡ２０５８細胞を示す。図１０ｃは、同一のＡ２０５８をＱＵＡＳ−Ｒで再びクエンチし、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３４およびＰＤ１で染色したことを示す。
【図１１】ＱＵＡＳ−Ｒを２ラウンド実施したＬＮＣａＰ細胞の染色を表す。図１１ａは、サイトケラチン、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４５の最初の染色を示す。図１１ｂは、第１のＱＵＡＳ−Ｒラウンド後のＣＤ１４、ＣＸＣＲ４およびビメンチンの再染色を示す。図１１ｃは、第２のＱＵＡＳ−Ｒラウンド後のＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３４およびＰＤ１の再染色を示す。
【図１２】ＱＵＡＳ−Ｒを２ラウンド実施したＨＵＶＥＣ細胞株の染色を表す。図１２ａはＣＤ１４、ＣＸＣＲ４およびビメンチンの最初の染色を示す。図１２ｂは、第１のＱＵＡＳ−Ｒラウンド後のサイトケラチン、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４５の再染色を示す。図１２ｃは、第２のＱＵＡＳ−Ｒラウンド後のＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３４およびＰＤ１の再染色を示す。
【図１３】ＱＵＡＳ−Ｒを２ラウンド実施したＭＣＦ−７細胞の染色を表す。図１３ａはＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３４およびＰＤ１の最初の染色を示す。図１３ｂは、第１のＱＵＡＳ−Ｒラウンド後のサイトケラチン、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４５の再染色を示す。図１３ｃは、第２のＱＵＡＳ−Ｒラウンド後のＣＤ１４、ＣＸＣＲ４およびビメンチンの再染色を示す。
【図１４】５つのモデル細胞株での蛍光マーカーのパーセンテージのヒートマップ。濃い灰色（１００％）および白（０％）でパーセンテージを表現している。灰色の濃淡は１００％から０％までの陽性発現のパーセンテージを示す。
【図１５】パーセンテージの数値を示した図９ｄのヒートマップ。１試料当たりの細胞数の中央値が１０である、合計７６４のＥＭＴを、９つのマーカーの有無に関して測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書に記載された特定の実施形態は、本発明の原理を表すものに過ぎず、開示された実施形態に限定されることを意図しない。
【００１３】
ＱＵＡＳ−Ｒ技術を使用すると、ＤＡＰＩに加え少なくとも２５個の異なる蛍光マーカーで細胞株を迅速かつ連続的に染色できることが発見された。一実施形態において、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）フィルター上に固定し、ＤＡＰＩ（青色）、ＣＫ（緑色）、ＥｐＣＡＭ（赤色）およびＣＤ４５（紫色）のＣＴＣマーカーパネルを使用して染色した。図１ａ。ホウ化水素溶液を使用して、１．５時間、細胞をクエンチした。蛍光シグナルのうちＣＫの緑色、ＥｐＣＡＭの赤色、ＣＤ４５の紫色は１００％、ＤＡＰＩの青色の大部分が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から除去された。図１ｂ。顕微鏡上で画像取得に使用された露出時間は、クエンチング前後で同じである。
【００１４】
細胞の信号強度をバックグラウンドと比較した。図２ａ。図２ａは、各蛍光チャンネルにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の画像を示す。信号の平均強度はＺｅｎ２０１１  Ｂｌｕｅソフトウェアを使用して測定した。各蛍光チャンネルの信号を、フィルター上で細胞が存在しない領域と比較してバックグラウンドを決定した。図２ｂ。各細胞の全体的な染色強度は細胞信号からバックグラウンド信号を引くことにより計算した。
【００１５】
第２の実施形態において、ＦＩＴＣタグ付きサイトケラチン抗体で染色した患者試料でクエンチング技術を実施した。時間０において、ホウ化水素溶液を追加する前に細胞を画像化し、信号を測定した。ホウ化水素溶液を追加し、細胞を３０分、６０分および９０分後に画像化した。９０分後、元の蛍光の９９％がクエンチされた。
【００１６】
他の実施形態において、血液ベースの生検（ＢＢＢ）または他の生体試料を使用して、複数のタイプの細胞型（例えばＣＴＣ、ＣＡＭＬ、内皮細胞、繊維芽細胞等）を多数の異なるマーカーで分析した。胸部、内皮、前立腺およびメラノーマに由来する５つの細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＬＮＣａＰ、Ａ２０５８およびＨＵＶＥＣ）でＱＵＡＳ−Ｒを実施したが、エピトープの完全性は保たれた。図４、図５および図６。
【００１７】
免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）が細胞内および細胞外の両方のエピトープに対するがんのサブタイプ分類に使用されるため、細胞内（サイトケラチンおよびビメンチン）および細胞外（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＰＤ−Ｌ１、ＣＸＣＲ４およびＣＤ１４）にまたがる広範囲の細胞の局在化に関して９つのマーカーが本明細書に例示される。一実施形態において、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をフィルター上に固定し、ＣＴＣ染色のサイトケラチン、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４５で染色した。図４ａ。細胞をＱＵＡＳ−Ｒ法によってクエンチし、ＣＤ１４、ＣＸＣＲ４およびビメンチンで染色した。図４ｂ。細胞は、ＱＵＡＳ−Ｒ法によって再びクエンチし、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３４およびＰＤ１で染色した。図４ｃ。
【００１８】
一実施形態において、５つの細胞株（Ａ２０５８、ＬＮＣａＰ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７およびＨＵＶＥＣ）をフィルター上に固定し、順序を変えて９つの異なるマーカーで染色した。図５。１つのフィルターセットでは、５つの細胞株の各々を、ＣＴＣマーカー（抗ＦＩＴＣ標識ＣＫ抗体（ＣＫ−ＦＩＴＣ）、抗ＰＥ標識ＥｐＣＡＭ抗体（ＥｐＣＡＭ−ＰＥ）、抗Ｃｙ５標識ＣＤ４５抗体（ＣＤ４５−Ｃｙ５））を使用して染色した。第２のフィルターセットでは、５つの細胞株を、ＰＤ−Ｌ１−ＦＩＴＣ、ＣＤ３４−ＰＥおよびＰＤ１−Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０からなるパネルで染色した。第３のフィルターセットでは、５つの細胞株をＣＤ１４−ＦＩＴＣ、ＣＸＣＲ４−ＰＥおよびビメンチン−ｅｆｌｕｏｒ６６０のパネルで染色した。図５ａ。バックグラウンド信号を決定し、各マーカーの強度（各マーカーは１０細胞の平均）を正規化した。その後、ＱＵＡＳ−Ｒを全フィルター上で実施し、第２のマーカーパネルで各セットを再染色した。図５ａ。各マーカーの強度をすべての細胞型で測定し、バックグラウンドに対して正規化した。図６。第２のＱＵＡＳ−Ｒを実施し、各フィルターセットを第３のマーカーパネルで再染色した。図５ａ。信号強度は、染色が適用された順序にかかわらず減弱を示さなかった。反復測定ＡＮＯＶＡは、３つの連続した染色間の信号強度において有意差を示さなかった［ビメンチンＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｐ＝０．２０１）、サイトケラチンＬＮＣａＰ（ｐ＝０．２９１）、ＣＤ１４  ＨＵＶＥＣ（ｐ＝０．４９９）およびＣＸＣＲ４  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｐ＝０．８５７）］。
【００１９】
全体的な細胞の信号強度、およびＱＵＡＳ−Ｒを実施した５つの細胞株での９つの細胞マーカーの変化を図６に示す。どのＱＵＡＳ−Ｒラウンドにおいても、表面レセプターおよび細胞内マーカーは減弱しなかった。細胞は蛍光顕微鏡とＺｅｎ  Ｂｌｕｅ画像化ソフトウェアを使用して画像化した。各細胞の信号平均画素強度は０〜４０９６の範囲でソフトウェアにより導き出す。各画像のローカルバックグラウンドの信号平均画素強度は、０〜４０９６の範囲でソフトウェアにより導き出す。細胞の画素がローカルバックグラウンドの画素強度の少なくとも２倍の強度を有している場合、信号を陽性であるとみなす。通常、バックグラウンドの４倍の細胞強度を高陽性信号とみなす。スケールは、蛍光染料、フィルターキューブ、顕微鏡および露出時間に依存してわずかに変化する可能性がある。図６ａは、ＰＤ−１がすべての細胞株において陰性であることを示す。図６ｂは、ＣＤ３４がＨＵＶＥＣ細胞株において弱陽性であり、そのため全体的に低信号として現われていることを示す。図６ｃは、ＣＤ４５がすべての細胞株において陰性であることを示す。図６ｄは、ＰＤ−Ｌ１は、標準偏差（ＳＤ）が大きいことが示すように変動しているが、大部分はＡ２０５８およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において発現していることを示す。図６ｅは、ＣＤ１４がＨＵＶＥＣにおいてのみ陽性であり、細胞上の突出部においてのみ発現するため大きく変動していることを示す。さらに、ＣＤ１４信号は、ＨＵＶＥＣのサブセットの周辺の突出部に局在しているため（図７）、細胞の内部で低信号および無信号となる。図６ｆは、ＥｐＣＡＭがＬＮＣａＰ、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１上で発現が変動する表面マーカーとして存在していることを示す。全体的に信号が低いのは、マーカーが局在化していることが原因である。ＥｐＣＡＭは、細胞間で信号の不均一度が高いため、発現が低く、ＳＤは大きく表現されており、またレセプターは細胞表面に凝集しているため、細胞に信号が高い領域と低い領域が存在する。図８。図６ｇは、サイトケラチンがＬＮＣａＰ、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における細胞内フィラメントとして存在することを示す。図６ｈは、ＣＸＣＲ４が大部分はＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＵＶＥＣ細胞で発見される、変動が大きい表面マーカーであることを示す。変動が大きい細胞集団のためＳＤが大きいにもかかわらず、ＣＸＣＲ４がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に正しく局在した。図６ｉは、ビメンチンがＨＵＶＥＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡ２０５８細胞内で細胞内フィラメントとして存在することを示す。
【００２０】
ＰＤ−Ｌ１およびビメンチンはすべて、正しい細胞株で高染色を示し（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：高ビメンチン／高ＰＤ−Ｌ１、Ａ２０５８：高ビメンチン／高ＰＤ−Ｌ１およびＨＵＶＥＣ：高ビメンチン）、正しい細胞株で低／無染色を示し（ＨＵＶＥＣ：無ＰＤ−Ｌ１、ＬＮＣａＰ：無ビメンチン／低ＰＤ−Ｌ１およびＭＣＦ−７：無ビメンチン／低ＰＤ−Ｌ１）、一方、サイトケラチンはＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＬＮＣａｐＰで高染色を示した。２回の再染色間で強度が下がったバイオマーカーは無く、適切な細胞株の各々に適切な染色強度が現われたことが重要である。図６。例外の可能性としてはＰＤ−Ｌ１だが、これは第３の染色中に下降したように見えるが、ＳＤ内に留まっていた。総合すれば、これらの実験は、ＱＵＡＳ−Ｒがエピトープの質に悪影響を与えず、蛍光標識した細胞を完全にクエンチングし、生物標本の再染色を可能とすることを実証した。
【００２１】
別の実施形態では、ＥｐＣＡＭ発現の変動性はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内で示された。図８。図８ａで白い矢印は、高発現するＥｐＣＡＭ細胞を、一方で、灰色の矢印は低発現する細胞を指し示している。図８ｂは、第２のパネルのＥｐＣＡＭ信号の拡大画像を示す。ＥｐＣＡＭは細胞全域にわたり点状に拡散しており、その結果全体的な細胞信号強度は数値的に低く現われている。
【００２２】
（患者試料）
標準的なＣＴＣ蛍光染色パネルは、ＦＤＡが承認したＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムと同じ臨床的に予後を判定するＣＴＣを同定し、定量し、および採点できることが示されている。しかしながら、本発明は、サイトケラチン信号がダウンレギュレートした細胞、およびＥｐＣＡＭ信号が無い細胞を含む、ＥＭＴのさらなる数多くのサブタイプの同定を可能にする。上皮性マーカーのダウンレギュレーションはがんにおけるＥＭＴの特徴であるが、さらに間葉マーカーのアップレギュレートを確認することは、それらの幹細胞および運動特性を適切にプロファイルするために重要である。
【００２３】
一実施形態において、膵がん患者由来の血液試料をろ過し、フィルター上に収集した細胞を、ＥＭＴマーカーパネル（ＣＫおよびビメンチン）およびＣＤ４５で染色し、画像化した。ステージにかかわらず、膵臓試料の７８％にＥＭＴが認められたが、対照試料ではＥＭＴ、ＣＡＭＬまたはＣＴＣに対して陽性と判定されたものはなかった。がん患者試料は合計７６４のＥＭＴを有し、１試料当たりの細胞数の中央値は１０であった。９つのマーカーの存在を検出するために、ＱＵＡＳ−Ｒをすべてのがん試料上で実施した。ステージＩＶの膵臓試料のＣＫ、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４５の発現プロファイルを図９ａに示す。細胞を抗ＣＤ１４、抗ＣＸＣＲ４および抗ビメンチンで再染色し再画像化した。図９ｂ。全細胞を画像化した後に、第２のＱＵＡＳ−Ｒを実施し、試料を抗ＰＤＬ−１、抗ＣＤ３４および抗ＰＤ−１で再染色した。図９ｃ。各マーカーの存在を、各染色に対するＥＭＴ陽性のパーセントを表すヒートマップで示す。図９ｄ。ヒートマップは、濃い灰色（１００％）および白（０％）で表現されたパーセンテージを示している。灰色の濃淡は１００％から０％までの陽性発現のパーセンテージを示す。
【００２４】
驚くことではないが、全ＥＭＴはＣＫに対して陽性で、ＣＤ４５に対して陰性、またＣＤ１４およびＰＤ−１も全ＥＭＴで陰性であった。これらはそれぞれマクロファージおよび活性化Ｔ細胞に対してマーカーであるためである。ＥｐＣＡＭはこの細胞型において非常にまれであり、細胞集団の２％にしか存在しなかった。図９ｄ。ＥＭＴにおけるＥｐＣＡＭの欠如はＥＭＴプロセスにおいて良く認識されている部分である。ビメンチンは次に良く普及しているマーカーで、３つの細胞を除く全細胞、または全細胞の９９％で発見された。ＥＭＴのプロセスでは、サイトケラチンがダウンレギュレートし、かつビメンチンがアップレギュレートすることが報告されているため、これは驚くことではない。このプロセスでは細胞の間葉系表現型が増加し、細胞の運動性が向上することが示されている。数名の患者がＣＸＣＲ４を保有していることは、これらの間葉系細胞が移動性であることを示す。ＰＤ−Ｌ１とＣＸＣＲ４の発現は、患者間で大きくばらつき、ＰＤ−Ｌ１陽性は１００％から０％、ＣＸＣＲ４陽性は９０％から０％の範囲におよんだ。さらに、ＣＤ３４はほぼ発見されず、３患者の５細胞だけがわずかに陽性であった。
【００２５】
標準的ＣＴＣ蛍光染色法を使用して、ＥＭＴをサイトケラチン、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４５の存在により同定し、定量し、そして採点した。循環細胞の患者試料でのＥＭＴの同定により、診断および治療目的に対してＱＵＡＳ−Ｒ技術が有効であることを示す。
【００２６】
これらの実験により、生体試料の細胞を複数の免疫標的で再画像化しサブタイプ分類できること、また、これらのマーカーを定量し、そして採点できることが実証された。複数の異なる生体試料のスライスを使用する生検である、古典的ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）のマルチパネルＩＨＣ検査とは異なり、ＱＵＡＳ−Ｒ法では同一の生体試料を複数のバイオマーカーで再染色することが可能となる。
【００２７】
生体試料を取得することは難しい場合があり、また、臨床的に重要なバイオマーカーは、陽性蛍光マーカーをわずか２〜３個、陰性蛍光マーカーを１個使用して表面的に同定されるに過ぎず、追加の分類マーカーは制限される。根底にある生物学的事象に関する臨床情報の検査のため、古典的な組織生検を使用する現在の慣例では、同一の生体試料由来の異なった断片（例えばＦＦＰＥ断片）を検査しなければならない。例えばがん病理学では、ＩＨＣは標準的な生物アッセイであり、大きなＦＦＰＥ生検組織切片から切断した薄片（最大５〜１０μｍ）を使用して達成される。しかしながら、ＦＦＰＥ断片は同一ではないため、各染色剤は異なる細胞へ投与されることになる。それぞれが異なる細胞集団を有する複数の断片を、様々なサブタイプ分類マーカーで染色しても、診断および治療に必要な一貫した結果は得られない。一方、血液ベースの生検（ＢＢＢ）では、関連する細胞型をいくつか分離するのみであることが一般的である。したがって、試料の大多数（７４％）が有する診断上重要な細胞型（例えばＣＴＣ、ＣＥＣ等）は２つより少ない（０〜８１ＣＴＣ／７．５ｍｌ試料）。どちらの状況においても、細胞の型を同定し、それらを臨床的に関連するマーカーに対してプロテオーム的にサブタイプ分類する必要がある。
【００２８】
ＥＭＴ（低サイトケラチンおよび低／無ＥｐＣＡＭ細胞）は、一般に乳がん、前立腺がん、肺がんおよび膵がんから分離される。しかしながら、患者のがんに関してさらなる情報が必要なことが多く、追加のマーカーを染色する必要がある。複数のバイオマーカーでの調査がＥＭＴを適切に同定するために必要であるが、ＥＭＴに対する単一のバイオマーカーパネルは存在しないため、ＥＭＴ指標バイオマーカーのパネルでこれらの細胞を検査することが正確な診断には必要となる。過去には、４〜５個を超える数のマーカーを染色してＥＭＴを取得するには、複数の血液のチューブが必要であった。
【００２９】
生体試料のプロファイリングにおいて技術的な困難さは軽視できない。例えば、組織生検は、がん細胞の存在を検出し、かつ薬物標的のコンパニオン診断を実施するために利用される。免疫療法では、適切なマーカーで追加検査を行うことが腫瘍の特性を明らかにし、Ｔ細胞およびマクロファージの存在の有無に関して腫瘍微小環境を分析するのに必要である。腫瘍細胞を正確に同定し、薬剤標的を染色し、そして腫瘍微小環境を評価するには、ＦＦＰＥ試料の複数の断片、多数のバイオマーカー染色の使用が必要とされる。検査に利用可能な生検組織試料の数は大抵限られており、４〜５個を超える数のバイオマーカー染色を使用することはできない。９〜２５個の臨床的に適用可能なバイオマーカーを使用して、ＦＦＰＥ組織または任意の生体試料を連続的にマルチパネルで再染色することにより、細胞のサブタイプの存在に関するより多くの情報を得られる。
【００３０】
別の実施形態では、患者の血液内のがんに関連する細胞の分析を含む。血液試料でのＣＴＣのプロファイリングにおける技術的困難さの一つはＣＴＣがまれにしか存在しないということである。がん患者の血液試料は、一般的に１０9の血液細胞当たり最大１個のＣＴＣしか含まないため、過去、詳細な細胞プロファイリングを実施する能力には限界があった。ＣＴＣはＤＡＰＩ、ＣＴＣを同定するサイトケラチン、および白血球を除外するＣＤ４５で蛍光的に同定されなければならず、プロテオーム的サブタイプ分類に利用可能なチャンネルはわずか１〜２個しか残っていない。標準的なマーカー（ＤＡＰＩ、ＥｐＣＡＭ、ＣＫおよびＣＤ４５）に加えて追加でＣＴＣを染色できることが報告されているが、この染色の多くはマーカーを１〜２個に追加することに限定されている。同一患者の複製サンプルまたは複数のサンプルから分離したＣＴＣの検査では、ある程度の多重化が可能であるが、血液中の腫瘍細胞は大変少なく、非常に不均質であり、また偏在しているため、このオプションでは一貫して信頼性の高い結果を得ることができなかった。血液試料におけるＣＴＣのクラスター形成は計数したＣＴＣのわずか３９％でしかない。これは、高度に不均一の膵がん生検において観察されるＣＴＣの細胞塊と同等である。図９に示すように、膵がん細胞間の強度変動はサイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、ＣＸＣＲ４、ビメンチン、ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ３４において可視化できる。ＱＵＡＳ−Ｒ技術により、９〜２５個の別個の蛍光抗体を簡易で低コストのクエンチングおよび再染色方法に使用して、血液試料のプロテオーム的細胞のサブタイプ分類を拡張できる。
【００３１】
ＣＴＣ以外の重要な細胞型ががん患者の血液中に数多く存在する。例えばＣＡＭＬは腫瘍由来の循環細胞であり、早期がん検出を含む臨床応用の可能性が多々ある。ＣＡＭＬに一貫して現われるマーカーには特に、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１４６、ＣＤ１１ｃがある。循環ＥＭＴは蛍光染色ビメンチンにより一貫して同定され得る。したがって、様々なマーカーの大規模パネルでの染色にＱＵＡＳ−Ｒを使用することは、患者の血液中にある目的の全細胞の同定の改善には不可欠である。
【００３２】
最近、光活性化可能な蛍光体の部分的なＢＨ4クエンチングは、クエンチしたタンパク質を変質せず、高解像度顕微鏡法と適合することが示された。ホウ化水素の特性はホウ化水素の任意のおよびすべての誘導体（例えば水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素シアノなど）を使用して記述され、エピトープ破壊の懸念なく生体試料から蛍光信号を一時的に減弱させるのに適していることも示された。しかしながら、従来技術では蛍光を一時的に、わずかに減弱するのみで、蛍光を完全に除去できなかった。ＱＵＡＳ−Ｒ技術では、ホウ化水素を使用して、エピトープを損傷せず特定の蛍光体を永続的にクエンチングすることが含まれる。ＩＨＣの特定の蛍光はすべて、ＩＨＣのエピトープの視覚化や定量化を損なわずに、結合抗体から除去できる。ホウ化水素溶液はさらに残留するバックグラウンド蛍光を除去し、ブロックされたエピトープを露出させることができる。少なくとも６つの別個のコンジュゲートした蛍光体（ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８、ＦＩＴＣ、ｅｆｌｕｏｒ６１５、ｅｆｌｕｏｒ６６０、ＰＥ、ＡＰＣおよびＣｙａｎｉｎｅ５）が、任意の有機染料（例えばｅｆｌｕｏｒ、ナノ結晶等）と同様にこの方法を使用して完全に消光された。実施例では、ＢＢＢでのＱＵＡＳ−Ｒの使用を記述するが、本方法は固定されたか、または固定されていない試料を含む、任意の生物検定に適用可能である。
【００３３】
実施例では、ＥＭＴがすべてＣＫを発現しており、また多くはビメンチンを発現していることを実証する。もちろんＥＭＴは、そのすべてが完全に同定されたわけではない、数多くの分子的およびプロテオーム的経路により定義された一時的なプロセスである。複数の細胞マーカーで染色できる能力によって、ＥＭＴプロセスを開始したＣＴＣの根底にある生物学的事象、例えば低／陰性ＣＫ、ＥｐＣＡＭ、を解明できる一方、細胞が本来は造血性（ＣＤ４５）または骨髄性（ＣＤ１４）の系統ではないことを実証できる。今や、バイオマーカーパネルを展開して公知の生物学的な細胞型およびマーカー型をすべて含めることができる。ＥＭＴに関しては、これらのパネルに、Ｎ−カドヘリン、ＴＷＩＳＴ、ＳＮＡＩＬ、ＺＥＢ１等の他のマーカーを含むことができる。ＱＵＡＳ−Ｒ法は、マニュアル同定とＡｘｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ’ｓ  Ｍａｒｋ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄモジュールとの組み合わせを使用する。しかしながら、これを完全な自動化システムに適合させてプロセスを合理化できる。過剰なサンプリングまたは不適合な試料断片を使用する必要無く、同定バイオマーカーおよび分類バイオマーカーを複数使用して、基礎的な同定を越えて生体試料を自動または手動でスクリーニングできる能力によって、診断精度および臨床的有用性は大いに高まる。
【実施例】
【００３４】
（実施例１）
（健常者および患者の血液試料）
２０１２年から２０１３年までウィスコンシン医科大学でステージＩ〜ＩＶの膵がんの治療を積極的に受けていた患者から１２の全末梢血試料を採取した。試料はウィスコンシン医科大学の地方の施設内治験審査委員会（ＩＲＢ）に従って収集され承認された。患者はインフォームドコンセントに署名した。血液試料をすべてＣｅｌｌＳａｖｅ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｔｕｂｅ（商標）（約９ｍＬ、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に取り込み、処理のため臨床で中核となる実験室へ輸送した。研究機関からの結果および患者の識別は、研究の完成まで共有されたり伝えらたりすることはなかった。患者試料はすべて、ＦＩＴＣ標識抗サイトケラチン８、１８、１９；ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＥｐＣＡＭ；およびシアニン５標識抗ＣＤ４５からなる、上皮細胞を染色する標準的な抗体の混合物で最初に標識した。
【００３５】
健康な匿名のボランティア（ｎ＝１２）の血液試料は、書面によるインフォームドコンセントへの署名を経て入手した。インフォームドコンセントはＷｅｓｔｅｒｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄに従い、承認された。ドナーの血液は、標準的な除外基準を使用する血液収集センターにあるため、例えば、試料はすべて正常で健康な個体由来であると判断された。血液試料をＣｅｌｌＳａｖｅ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｔｕｂｅに保存し、処理のため臨床で中核となる実験室へ輸送した。
【００３６】
（実施例２）
（ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）フィルターで実施したＣＴＣ染色手順）
低圧の真空システムを使用して、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）ＣＴＣ  Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ試薬（Ｃｒｅａｔｖ  ＭｉｃｒｏＴｅｃｈ）で試料をろ過した。このシステムは約７ミクロンのサイズ排除に基づいてＣＴＣを分離する。ＣＴＣ計数染色剤（実施例４）を使用して、細胞を蛍光により染色し、そして同定した。低圧システムは、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）フィルターが取り付けられたフィルターホルダーアセンブリーを使用して作成された。末梢血（７．５ｍｌ）を前固定緩衝液で希釈し、フィルターを通して吸引した。フィルターを洗浄し、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）後固定緩衝液で後固定し、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）透過緩衝液で透過処理した。捕捉した細胞を、ＦＩＴＣ抗サイトケラチン８、１８、１９、ＰＥ−抗−ＥｐＣＡＭおよびＣｙ５−抗−ＣＤ４５からなる抗体カクテルで１時間染色し、そして、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ／ＤＡＰＩ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にマウントした。Ｃａｒｌ  ＺｅｉｓｓのＡｘｉｏＣａｍを備えたオリンパスＢＸ５４ＷＩ蛍光顕微鏡を用いて試料を画像化した。露出は、細胞間で信号を同等に比較するため、２秒（Ｃｙａｎｉｎｅ５）、２秒（ＰＥ）、１００〜７５０ｍｓｅｃ（ＦＩＴＣ）および１０〜５０ｍｓｅｃ（ＤＡＰＩ）にプリセットした。Ｚｅｎ２０１１  Ｂｌｕｅ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）とＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｍａｒｋ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄモジュールを使用し、半自動化された形で、画像を処理し、細胞のｘ／ｙ配置をマークし、そして、以前に画像化した細胞を再配置した。試料を１週間から２年間、保管所で４℃で保管し、そして配置した。
【００３７】
（実施例３）
（細胞株）
ＭＣＦ−７（ＨＴＢ−２２）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＴＢ−２６）ヒト乳がん細胞株；ＬＮＣａＰ（ＣＲＬ−１７４０、クローンＦＧＣ）前立腺腺癌；Ａ２０５８（ＣＲＬ−１１１４７）ヒト皮膚メラノーマ細胞株；および、ＨＵＶＥＣ−Ｃ（ＣＲＬ−１７３０）内皮細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。細胞株はすべて、ＡＴＣＣ推奨のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む細胞株特異的培地で増殖した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株以外の細胞株は指示された細胞培養条件（５％ＣＯ2、３７℃）で、３〜４日ごとに培地を交換しながら、Ｔ−７５フラスコ内で維持した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株のみＣＯ2を加えず３７℃で培養した。細胞はトリプシン−ＥＤＴＡ（ＡＴＣＣ  Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を使用し回収し、１２５×ｇで５分間、遠心分離し、１％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで再懸濁した。インキュベーション後、細胞を１０倍ＰＢＳ溶液で希釈し、遠心分離し、新鮮なＰＢＳで再懸濁してから、正常な血液に加え、５分以内にミクロフィルターで分離した。
【００３８】
（実施例４）
（追加のマーカーパネル）
マーカーはマーカーに対する抗体により同定される。試料を、室温で１時間、蛍光の標識抗体でインキュベートして染色した。第１のＣＴＣパネル：ＦＩＴＣ標識抗サイトケラチン８、１８、１９；ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＥｐＣＡＭ；およびＣｙａｎｉｎｅ５標識抗ＣＤ４５（Ｃｒｅａｔｖ  ＭｉｃｒｏＴｅｃｈ）、第２のパネル：Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤＬ１（２．５μｇ／ｍＬ）およびＤｙｌｉｇｈｔ６５０標識ＰＤ−１（５μｇ／ｍＬ）、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１どちらもＭＤアンダーソンがんセンターのＳｔｅｖｅｎ  Ｌｉｎ博士からの寄贈、ＰＥ標識ＣＤ３４（２．５μｇ／ｍｌ、クローン４Ｈ１１）、および第３のパネル：ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１４（５μｇ／ｍｌ、クローン６１Ｄ３）、ＰＥ標識抗ＣＤ１８４（５μｇ／ｍｌ、クローン２Ｂ１１）、ｅｆｌｕｏｒ６６０標識抗ビメンチン（２．５μｇ／ｍｌ、クローンＶ９）。
【００３９】
Ｃａｒｌ  ＺｅｉｓｓのＡｘｉｏＣａｍを備えたオリンパスＢＸ５４ＷＩ蛍光顕微鏡を用いて試料を画像化した。露出は、細胞間で信号を同等に比較するため、２秒（Ｃｙａｎｉｎｅ５およびＡＰＣ）、２秒（ＰＥ）、１０００ｍｓｅｃ（ＦＩＴＣおよびＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８）、５００ｍｓｅｃ（ｅｆｌｕｏｒ６６０）および１０〜５０ｍｓｅｃ（ＤＡＰＩ）にプリセットした。Ｚｅｎ２０１１  Ｂｌｕｅ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用し、画像を処理し、細胞のｘ／ｙ配置をマークし、そして、以前に画像化した細胞を再配置した。
【００４０】
（実施例５）
１．フィルター上の細胞の蛍光クエンチング（ＱＵＡＳ−Ｒ）
保管試料を、最初のＣＴＣ染色後１週間から２年で保管所から取り出した。試料は、クエンチング手順に先立って予め染色し、画像化し、そして、マークした。スライドを１５分間、１００ｍＬの１×ＰＢＳに浸漬し、慎重に取り外した。フィルターを反応槽（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に置き、１ｍＬの１×ＰＢＳで５回洗浄した。
【００４１】
クエンチング：結合細胞を有するフィルターをドラフトチャンバー中で、室温で１時間、１ｍｇ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウム溶液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でインキュベートした。ホウ化水素溶液を除去し、フィルターを１ｍｌの１×ＰＢＳで６回洗浄した。
【００４２】
非誘導体化およびアミン除去：アルデヒド固定中に、固定剤中のポリマーが反応し、タンパク質と架橋する。試料が古くなるにつれ、ポリマーは分解し、様々なポリマー誘導体が形成される。非誘導体化は、様々なポリマー誘導体の除去を説明するために発明者が作成した用語である。アルデヒド固定剤（グルタルアルデヒドまたはホルマリン等）はアミンおよびタンパク質と反応して自家蛍光を引き起こす。アミン除去では、遊離アミン、反応したアミン、およびそれらに付随した自家蛍光を洗い流す。これらのステップは、（ａ）清潔な反応槽（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にフィルターを置き、そして、室温で１時間、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝９．０でインキュベートしてホウ化水素を除去し、（ｂ）１ｍｌの１×ＰＢＳでフィルターを３回洗浄して、Ｔｒｉｓを除くことからなる。
【００４３】
再染色：１×ＰＢＳ／２０％ＦＢＳを反応槽に加え、３０分間細胞をブロックした。インキュベーション後、ＰＢＳ／ＦＢＳ溶液を除去した。抗体染色の次のセットを反応槽に加え、室温で１時間置いた。抗体インキュベーション後、フィルターを１×ＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、スライドをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ／ＤＡＰＩ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にマウントした。
【００４４】
試料をｘ／ｙ軸に沿って配置し、そして、以前に画像化した細胞を、蛍光顕微鏡およびＺｅｎ２０１１  Ｂｌｕｅ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）ソフトウェア等のソフトウェアを使用して再配置した。画像および露出を上述のようにプリセットし、そして、Ｚｅｎ２０１１  Ｂｌｕｅ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用して画像を処理した。細胞上の蛍光マーカーの画像化後、ＱＵＡＳ−Ｒ手順を次の抗体カクテルで繰り返し、そして、再画像化した。蛍光クエンチングを可視化することを含む、時間ゲート実験では、フィルターを排気フード内の蛍光顕微鏡（オリンパス等）下に配置し、そして、ホウ化水素溶液内にフィルターを残したまま画像化した。
【００４５】
２．スライドガラス上にマウントした細胞または生検の蛍光クエンチング（ＱＵＡＳ−Ｒ）
保管した生検試料を、最初の蛍光染色後１週間から２年で保管所から取り出した。試料は、クエンチング手順に先立って予め画像化し、そして、マークした。スライドを１５分間、１００ｍＬの１×ＰＢＳに浸漬した。スライドを１ｍＬの１×ＰＢＳで５回洗浄した。その後スライドをコートするか、またはドラフトチャンバーで、室温で１時間、１ｍｇ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウム溶液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むコプリンジャーに浸漬した。ホウ化水素溶液を除去し、スライドを１ｍｌの１×ＰＢＳで６回洗浄した。スライドを清潔なコプリンジャー内に置き、室温で１時間、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝９．０でインキュベートした。Ｔｒｉｓを除去し、そして、スライドを１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、そして、１×ＰＢＳ／２０％ＦＢＳの入ったコプリンジャー内に３０分間置いた。インキュベーション後、ＰＢＳ／ＦＢＳ溶液を除去し、そして、抗体染色の次のセットを室温で１時間、生検試料に追加した。抗体インキュベーション後、スライドを１×ＰＢＳ／１％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、そして、スライドをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ／ＤＡＰＩ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にマウントした。試料をｘ／ｙ軸に沿って配置し、そして、以前に画像化した細胞を、蛍光顕微鏡およびＺｅｎ２０１１  Ｂｌｕｅ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）ソフトウェア等のソフトウェアを使用して再配置した。画像および露出を上述のようにプリセットし、そして、Ｚｅｎ２０１１  Ｂｌｕｅ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用して画像を処理した。細胞上の蛍光マーカーの画像化後、ＱＵＡＳ−Ｒ手順を別の抗体カクテルで繰り返し、そして、再画像化できる。
【００４６】
（実施例６）
（細胞株におけるバイオマーカーの連続的スクリーニング）
各細胞株をミクロフィルターで個々にろ過し、各細胞型（ｎ＝３）を、抗体パネル１（ＣＫ、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４５）、抗体パネル２（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３４およびＰＤ−１）または抗体パネル３（ＣＤ１４、ＣＸＣＲ４およびビメンチン）のいずれかで染色した。図５ａ。画像化およびマーキングの後、個々のフィルターはそれぞれ、上述の通りにＱＵＡＳ−Ｒ法によりクエンチし、次に第２の抗体セットで染色した。つまり、フィルターセット１を最初、ＣＫ、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４５で染色し、そして、次に抗体パネル２（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３４およびＰＤ−１）で染色した；フィルターセット２は最初、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３４およびＰＤ−１で染色し、そして、次に抗体パネル３（ＣＤ１４、ＣＸＣＲ４、ビメンチン）で染色した；また、フィルターセット３は最初、ＣＤ１４、ＣＸＣＲ４およびビメンチンで染色し、そして、次に抗体パネル２（ＣＫ、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ４５）で染色した。元々マークされていた細胞をすべて発見し、そして再画像化した。
【００４７】
細胞株をすべて画像化した後に、２回目のＱＵＡＳ−Ｒを各フィルターセットおよび細胞株で実施した。ここでは、フィルターセット１は抗体パネル３で再染色し、フィルターセット２は抗体パネル１で再染色し、フィルターセット３は抗体パネル１で再染色した。再び、元々マークされていた細胞をすべて発見し、そして再画像化した。
【００４８】
本発明を特定の実施形態および実施例に関して説明したが、本発明の概念は広く適用できる。
【００４９】
他の疾患および障害には、ＱＵＡＳ−Ｒ技術を使用して分析できる、目的の細胞および／または成分がある。活性または不活性のウイルス感染、ウイルス成分、細菌感染、細菌成分および他の疾患および疾患成分を含む細胞は血液および組織でも見出せる。各疾患または障害のマーカーは多様であるため、異なるバイオマーカーでの染色が必要となる。
【００５０】
アフィニティー成分は実施例において記述したような抗体に限定されない。アプタマー、レクチン、タンパク質、酵素等のような他の共通のアフィニティー成分も、ＱＵＡＳ−Ｒ技術において使用できる。
【００５１】
さらに細胞は様々な体液の中に存在し、例としては血液、尿、骨髄、リンパ組織、脳脊髄液、羊水、胆液、唾液、痰、腹水、胸水、子宮頚管液、卵巣嚢胞液、子宮内膜液、子宮洗浄液、リンパ浮腫があるがこれらに限定されない。本明細書に記述されたＱＵＡＳ−Ｒ技術もこれらの体液内の異なる細胞およびバイオマーカーをスクリーニングするために使用できる。
【００５２】
任意のホウ化水素誘導体を試料のクエンチに使用できる（例えば水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素シアノ、水素化ホウ素テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、水素化ホウ素ベンジルトリエチルアンモニウム等）。前述のクエンチングの実施例では、水素化ホウ素ナトリウム誘導体を使用したが、他の誘導体も良好に機能する。
【００５３】
ＱＵＡＳ−Ｒ技術は細胞を含む任意の生体試料上で使用できる。生体試料の例には、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、浮遊細胞、血液細胞、がん細胞、病変細胞、異なる臓器由来の組織、リンパ細胞、毛髪、皮膚、骨髄等が含まれるがこれらに限定するものではない。ＣＴＣは、プロセスを説明するために使用される細胞の一例に過ぎず、用途を限定するものではない。
【００５４】
ＱＵＡＳ−Ｒ技術はまた、基板上にマウントした試料に使用できる。基板の種類にはガラス、金属、ポリマー、プラスチック、紙、繊維材料などが含まれるがこれらに限定するものではない。 
ａ．上述のクエンチング工程は、ポリマー上にマウントした細胞への適用を記述する。このプロセスは、生体試料をマウントするすべての材料で使用できる。 
ｂ．ＱＵＡＳ−Ｒ技術は、基板上にマウントしていない、溶液中の細胞で実施できる。
ｃ．この技術はスライドガラス上にマウントしたＦＦＰＥ試料で実施できる。
【００５５】
ＱＵＡＳ−Ｒ技術は時間経過が原因で起こる自家蛍光のある古い試料をクエンチするために使用できる。時間経過により蛍光体が分解する場合がある。時間経過により、アフィニティー成分（例えば抗体、アプタマー、レクチン、タンパク質、酵素等）が分解する場合もある。 
ａ．これは固定された試料または固定されていない試料を含む。 
ｂ．特定の蛍光のクエンチに加えて、古い試料にはクエンチングが必要な追加の非特異蛍光がある。 
ｃ．非特異蛍光もプロセスの間にクエンチされる。 
ｄ．過去に染色されていない試料は、バックグラウンド蛍光および天然の自家蛍光の除去のためクエンチされなければならない。 
ｅ．固定生体試料または古い試料には三次構造において化学的修飾または変質によりブロックされる可能性のあるエピトープがある。クエンチングに加えて、ホウ化水素の副次的効果には、再染色のためエピトープのブロックを解除する能力がある。
【００５６】
ＱＵＡＳ−Ｒプロトコルは、最大５回、再染色できることが実証されている。一試料上でＱＵＡＳ−Ｒを実行できる制限回数は、その必要性と細胞消失を防止するための試料の取り付け方法に依存する。
【００５７】
ＱＵＡＳ−Ｒの工程を実施するための試薬の種類および濃度、インキュベーション時間およびプロトコルは試料の種類により変化する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月10日(2018.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料をバイオマーカーについて再染色する方法であって、
ａ．蛍光を還元剤でクエンチングするステップと、
ｂ．非誘導体化させ、且つ、アミンを除去するステップと、
ｃ．前記試料を１つまたは複数の追加の蛍光マーカーで再染色するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記生体試料が、１つまたは複数の蛍光マーカーで予め染色されているか、又は、蛍光マーカーで予め染色されておらず、且つ、少なくとも１週間保管されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ．前記試料を表面上に固定するステップと、
ｂ．前記バイオマーカーを可視化するステップと
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素シアノ、水素化ホウ素テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、および水素化ホウ素ベンジルトリエチルアンモニウムからなる群から選択されるホウ化水素誘導体であり、好ましくは、前記ホウ化水素誘導体は水素化ホウ素ナトリウムである、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記生体試料が、血液、尿、骨髄、リンパ組織、脳脊髄液、羊水、胆液、唾液、痰、腹水、胸水、膣液、卵巣嚢腫液、子宮内膜液、リンパ浮腫からなる群から選択される、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体試料においてバイオマーカーについてスクリーニングする方法であって、
ａ．蛍光を還元剤でクエンチングするステップと、
ｂ．非誘導体化させ、且つ、アミンを除去するステップと、
ｃ．前記試料を１つまたは複数の追加の蛍光マーカーで再染色するステップと
を含む方法。
【請求項７】
前記生体試料が、１つまたは複数の蛍光マーカーで予め染色されているか、又は、蛍光マーカーで予め染色されておらず、且つ、少なくとも１週間保管されたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素シアノ、水素化ホウ素テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、および水素化ホウ素ベンジルトリエチルアンモニウムからなる群から選択されるホウ化水素誘導体である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ａ．前記試料を表面上に固定するステップと、
ｂ．前記バイオマーカーを可視化するステップと
をさらに含む、請求項６〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
生体試料においてバイオマーカーを特徴づける方法であって、
ａ．蛍光を還元剤でクエンチングするステップと、
ｂ．非誘導体化させ、且つ、アミンを除去するステップと、
ｃ．前記試料を１つまたは複数の追加の蛍光マーカーで再染色するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記生体試料が１つまたは複数の蛍光マーカーで予め染色されているか、又は、蛍光マーカーで予め染色されておらず、且つ、少なくとも１週間保管されたものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ａ．前記試料を表面上に固定するステップと、
ｂ．前記バイオマーカーを可視化するステップと
をさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素シアノ、水素化ホウ素テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、水素化ホウ素ベンジルトリエチルアンモニウムからなる群から選択されるホウ化水素誘導体である、請求項１０〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体試料が、細胞、ウイルス成分、細菌成分および疾患成分から本質的になる群から選択される、請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体試料が、組織、血液中のがん関連細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、上皮間葉転換細胞（ＥＭＴ）、循環がん関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、血液細胞、リンパ細胞、毛細胞、皮膚細胞、及び、骨髄細胞からなる群から選択される細胞である、請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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