(57)【要約】本発明は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、または薬学的に許容可能なその塩と、その用途を提供する。本発明によってベータアミロイドの脳内流入を抑制することができる。また、本発明は、ベータアミロイドの脳内作用抑制に関し、より容易に適用できるため、適用性に優れるという長所を有する。
2019526530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、または薬学的に許容可能なその塩。
【請求項２】
請求項１のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を含む、ベータアミロイドの脳内流入抑制剤。
【請求項３】
請求項１のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を含む、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、認知症、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、または脳内炎症の中から選ばれた一つ以上の治療または予防用薬学組成物。
【請求項４】
前記アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、前記認知症、前記パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、前記ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、または前記脳内炎症の中から選ばれた一つ以上は、脳内のベータアミロイド沈着によるものである請求項３に記載の薬学組成物。
【請求項５】
前記治療または予防は、ベータアミロイドの脳内流入抑制によるものである請求項３に記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチドに関し、より詳細にはベータアミロイドの脳内流入を抑制する効果を表わす新規ペプチドとその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベータアミロイド（ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ）は、脳内で作用し、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、血管性認知症、アルコール性認知症、レビー小体型認知症などの認知症、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、脳内炎症などの疾患を誘発するものとして知られている（Ｉｒｖｉｎｅ  ＧＢ、Ｅｌ−Ａｇｎａｆ  ＯＭ、Ｓｈａｎｋａｒ  ＧＭ、Ｗａｌｓｈ  ＤＭ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ：ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００８；１４（７−８）：４５１−６４．など参照）。その中でアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）は、認知症を起こす最も一般的な種類の退行性脳疾患であり、全体認知症の５５〜７０％を占める。
【０００３】
現在認知症に関連して開発された薬物の多くは記憶機能において非常に重要な神経伝達物質であるアセチルコリンの分解を抑制するアセチルコリン分解酵素（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）抑制剤である（米国特許第４，８９５，８４１号明細書など参照）。アセチルコリン分解酵素抑制剤は、原因治療よりは症状緩和に焦点を合わせた薬物であり、これらの治療剤の主な副作用としてはアセチルコリンの過度な増加により副交感神経を亢進させてひどい下痢、吐き気、嘔吐、憂鬱症、不安、不眠、頭痛などのような消化器系と神経精神系の異常反応を示すものとして知られている。このような薬物は実用的なアルツハイマー病の治療剤であるとはいえない。
【０００４】
一方、特定のアミノ酸配列（ＤＡＥＦ）を含むペプチドの場合、ベータアミロイドによって誘導された神経細胞毒性を抑制する神経保護性ペプチドとして知られている（国際公開第２００６／０３１３３０号参照）。このようなペプチドは、タウタンパク質のリン酸化または神経細胞死のようにベータアミロイドによって誘導された効果自体を低減または予防するものとして知られているだけである。
【０００５】
また、このような神経保護性ペプチドの場合、脳内で効果を表わすためには血液脳障壁（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）を通過しなければならないので、脳内への流入のための追加的な手段（例、神経外科手術によって挿入されるカテーテルなど）を適用しなければならないだけでなく、このような手段を適用することも容易でない問題があった。
【０００６】
したがって、ベータアミロイドの脳内作用抑制に関し、より容易に適用できる薬物の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，８９５，８４１号明細書、１９９０．１．２３、要約
【特許文献２】国際公開第２００６／０３１３３０号、２００６．３．２３、請求範囲
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｉｒｖｉｎｅ  ＧＢ、Ｅｌ−Ａｇｎａｆ  ＯＭ、Ｓｈａｎｋａｒ  ＧＭ、Ｗａｌｓｈ  ＤＭ．  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ：  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００８；１４（７−８）：４５１−６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする一つの課題は、適用性に優れた新規ペプチドを提供することにある。
【００１０】
また、本発明が解決しようとする他の一つの課題は、本発明のペプチドの用途を提供することにある。
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されないまた他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列（ＤＧＥＦＦ）または配列番号２のアミノ酸配列（ＤＧＥＦ）からなるペプチド、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。
【００１３】
前記アミノ酸配列のＤはアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ａｓｐ）、Ｇはグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇｌｙ）、Ｅはグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｇｌｕ）、Ｆはフェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｐｈｅ）を示す。
【００１４】
前記ペプチドを構成するアミノ酸にはＬ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体が存在し、本発明のペプチドを構成するアミノ酸はこれらをすべて含む。また、前記ＤはＡｓｐａｒｔａｔｅ、またはＡｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄで指称されるアミノ酸をすべて含む意味で解析できることは自明である。また、前記ＥはＧｌｕｔａｍａｔｅ、またはＧｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄで指称されるアミノ酸をすべて含む意味で解析できることは自明である。
【００１５】
前記ペプチドは変異体を含むものであり、自然的変異または人工的変異によって主要活性に変化を与えず、本発明のペプチド構造の一部が変異されたものを含む。
【００１６】
前記薬学的に許容可能な塩は、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、スズ酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、またはｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。
【００１７】
配列番号１のアミノ酸配列（ＤＧＥＦＦ）や配列番号２のアミノ酸配列（ＤＧＥＦ）はいずれも共通してＤＧＥＦを含む。本発明者らはこのように共通配列を有する本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩は、ベータアミロイド（ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ）の脳内流入を抑制する効果を表わすことを以下の実験で確認した。
【００１８】
このような効果によって、本発明は、より直接的でかつ容易にベータアミロイドの脳内作用（脳内沈着など）を抑制できる。すなわち、本発明によって血液脳障壁を通過させるために追加的な手段（例、神経外科手術によって挿入されるカテーテルなど）を適用しなくてもベータアミロイドが脳内で作用することを容易に抑制できる。また、本発明は、ベータアミロイド自体の脳内への流入を抑制するので、より直接的にベータアミロイド関連の疾患、症状などに効果を表わすことができる。ベータアミロイドの脳内流入抑制による脳内の作用抑制の結果、ベータアミロイドの脳内作用による疾患、症状などの治療、予防、緩和などが可能であるからである。
【００１９】
前記ベータアミロイドの脳内流入抑制は、前記ペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩によるＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）とベータアミロイドの結合抑制によるものであり得る。ＲＡＧＥは、ベータアミロイドを脳内へ輸送する受容体であり、前記ペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩がベータアミロイドの代わりにＲＡＧＥに結合することで、ベータアミロイドのＲＡＧＥとの結合を抑制し、ベータアミロイドの脳内流入を抑制できるものと見られる。
【００２０】
したがって、本発明は、また本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩の用途、好ましくはベータアミロイドの脳内流入抑制の用途またはアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、認知症、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、または脳内炎症の中から選ばれた一つ以上の治療または予防用途を提供する。治療は、症状の改善、軽減などを包括する意味であり、予防は、疾病以前の段階から疾病に発展することの抑制を包括する意味である。認知症は、アルツハイマー性認知症、血管性認知症、アルコール性認知症、またはレビー小体型認知症の中から選ばれた一つ以上であり得る。
【００２１】
前記アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、前記認知症、前記パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、前記ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、または前記脳内炎症の中から選ばれた一つ以上は脳内のベータアミロイドの沈着によるものであり得る。
【００２２】
前記治療または予防は、ベータアミロイドの脳内流入抑制によるものであり得る。
【００２３】
また、前記治療または予防は、脳内のベータアミロイドの沈着抑制または脳内炎症抑制の中から選ばれた一つ以上によるものであり得る。
【００２４】
前記沈着抑制は、ベータアミロイドの脳内流入抑制によるものであり得る。
【００２５】
したがって、本発明は、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を含むベータアミロイドの脳内流入抑制剤を提供する。
【００２６】
また、本発明は、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を含むアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、認知症、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、または脳内炎症の中から選ばれた一つ以上の治療または予防用組成物を提供する。前記組成物は薬学組成物であり得る。
【００２７】
前記抑制剤または前記組成物は、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を有効性分として含むことを特徴とし得る。
【００２８】
また、前記抑制剤または前記組成物は、薬剤学的に許容される添加剤をさらに含み、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩及び前記添加剤からなる。
【００２９】
本発明のペプチドは、ペプチド化学において通常用いられる方法によって製造できる。例えば、ペプチドをＳｃｈｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｂｋｅ著、「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」第１券、Ａｃａｄｍｅｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５）などに記載された方法によって製造でき、溶液相合成または固体相合成などの方法によって製造できる。
【００３０】
ペプチド結合を形成するための方法の例としては、アシルアジド法、アシルハライド法、アシルイミダゾール法、カルボジイミド法、ホスホニウム法、無水物法、混合無水物法、酸化−還元法、及びＷｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋを使用する方法などがある。
【００３１】
縮合反応を行う前に反応に関与しないカルボキシル基、アミノ基などを保護させ得、縮合反応に関与するカルボキシル基などを当分野に公示された方法により活性化させ得る。
【００３２】
カルボキシル基を保護する基の例としては、メチル、ｔ−ブチル、アリール、ペンタフルオロフェニル、ベンジル、パラ−メトキシベンジル、またはメトキシエトキシメチルのようなエステル形成基が挙げられる。
【００３３】
アミノ基を保護する基の例としては、トリチルカルボニル、アリールオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、トリクロロエチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、及び／または９−フルオレニルメチルオキシカルボニルなどが挙げられる。
【００３４】
カルボキシル基の活性形態の例としては、混合無水物、アジド、アシルクロライドまたは活性エステル［アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシルイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロオキシフタルアミド、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）とのエステル］などが挙げられる。
【００３５】
ペプチド結合を形成するための縮合反応に使用できる溶媒は、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、アセトン、ニトロメタン、シクロヘキサン、エーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、エチルアセテート、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、水、メタノール、またはエタノールなどの単一溶媒またはこれらの混合溶媒であり得る。
【００３６】
反応温度は、反応に一般的に使用される約−７０℃〜１００℃の範囲であり得、より好ましくは−３０℃〜３０℃の範囲であり得る。
【００３７】
ペプチド保護基を除去する反応は保護基の種類によって異なるが、ペプチド結合に何らの影響を与えず保護基を離脱させる酸化合物、塩基化合物、または遷移金属などを用いて除去し得る。
【００３８】
保護基を酸処理、例えば、塩化水素、臭化水素、フッ化水素、酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、トリメチルクロロシラン、またはこれらの混合物で処理することにより除去し得る。
【００３９】
前記酸処理により保護基を除去する反応を行う時、アニソール、フェノール及びチオアニソールなどを補助剤として添加して反応を促進させることができる。
【００４０】
保護基を塩基処理、例えば、アンモニア、ジエチルアミン、ヒドラジン、モルホリン、Ｎ−メチルピロリジン、ピペリジン、炭酸ナトリウム、またはこれら塩基の混合物を用いて除去し得る。
【００４１】
また、保護基を遷移金属処理、例えば、亜鉛、水銀、パラジウム／水素などを用いて除去し得る。
【００４２】
反応完結後、通常のペプチドの精製方法、例えば、抽出、層分離、固体沈殿、再結晶またはカラムクロマトグラフィーによってペプチドを精製し得る。
【００４３】
また、本発明のペプチドを通常の方法によって変異体または薬学的に許容可能なその塩に転換させ得る。
【００４４】
本発明によるペプチドは、自動ペプチド合成機によって合成でき、遺伝子組み換え技術によっても生産できる。例えば、遺伝子組み換えにより融合パートナーと本発明のペプチドからなる融合タンパク質とをコートする融合遺伝子を製造し、これにより宿主微生物を形質転換させた後、宿主微生物から融合タンパク質形態に発現させた後にタンパク質分解酵素または化合物を用いて融合タンパク質から本発明のペプチドを切断、分離して所望するペプチドを生産できる。
【００４５】
前記ペプチド、または薬学的に許容可能なその塩の投与量は、非経口投与時２００ｍｇ／日〜５００ｍｇ／日であり、好ましくは２６７ｍｇ／日〜４００ｍｇ／日である。経口投与の場合、投与量は、非経口投与量の２〜５倍である。１日１回または数回に分けて投与することも可能であり、このような投与量は、成人（体重６０ｋｇ）基準であり得るが、体重、身体状態などによって変わることは当然である。本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を主に非経口的な方法で、例えば、局所注射、静脈または皮下注射、大脳室内または脊髄腔内投与、経皮投与、あるいは経鼻投与または直腸内投与により投与する。また、場合によっては経口的に投与し得る。
【００４６】
本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩、抑制剤または組成物は、薬学的に許容される添加剤とともに製剤化して注射剤、坐剤、粉末、点鼻剤、顆粒、錠剤、経皮投与用パッチ剤などの型で作ることができる。
【００４７】
薬学的に許容される添加剤は、当業者によく知られている様々な因子によって適用されるが、例えば、用いられた特定の生理活性物質、これの濃度、安定性及び意図した生体利用性；治療しようとする疾患及び疾病または状態；治療を受ける個体、年齢、大きさ及び一般的な状態；組成物の投与に用いられる経路、例えば、鼻腔、口腔、眼球、局所、経皮及び筋肉などの要因を考慮しなければならないが、これに制限されない。一般に経口投与の経路以外の生理活性物質の投与に用いられる薬剤学的に利用可能な添加剤にはＤ５Ｗ（水の中の５％ブドウ糖）、デキストロース及び生理学的塩を容積の５％以内で含む水溶液などを含み、病巣内局所注射の場合、治療効果を増進させて持続時間を増加させるために様々な注射可能なヒドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）を使用し得る。また薬学的に利用可能な添加剤は、保存剤及び抗酸化剤のような活性成分の安定性を補強させる追加成分を含み得る。本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩、抑制剤、または組成物は、当該分野の適切な方法により製剤化でき、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（最近版）などに開示されている方法を参照して各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化できる。
【００４８】
本発明のペプチドを生理食塩水溶液で保管し得、マンニトールまたはソルビトールの添加後にアンプル（ａｍｐｌｅ）に凍結乾燥させ得、これを投与するために使用する時は生理食塩水などに溶解させ得る。
【００４９】
本発明はまた本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩の投与を必要とする人間を含む哺乳類に投与する段階を含むベータアミロイドの脳内流入を抑制する方法を提供する。また、本発明は、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩の投与を必要とする人間を含む哺乳類に投与する段階を含むアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、認知症、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、または脳内炎症の中から選ばれた一つ以上の治療または予防法を提供する。また、本発明は、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩のベータアミロイドの脳内流入抑制剤の製造のための用途を提供する。また、本発明は、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩のアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、認知症、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、または脳内炎症の中から選ばれた一つ以上の治療または予防用製剤の製造のための用途を提供する。前記投与されるペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩は、有効量のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩であり得る。
【００５０】
特に言及しない限り、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能な塩、用途、抑制剤、組成物、方法において言及された事項は、互いに矛盾しない限り、同一性の範囲で互いに同一に適用される。
【発明の効果】
【００５１】
本発明は、ベータアミロイドの脳内流入を抑制する効果を有する。また、本発明は、ベータアミロイドの脳内作用抑制に関し、より容易に適用できるため、適用性に優れるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の一実施例における血中のベータアミロイドの脳内流入の抑制効果の確認結果を示すグラフである。
【図２】本発明の一実施例における動物の学習及び記憶回復に及ぶ効果の確認結果を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施例におけるベータアミロイド１−４２の低減効果の確認結果を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施例におけるＴＮＦ−αの低減効果の確認結果を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施例におけるＧＦＡＰ低減効果の確認結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なそれの塩は、従来に知られているものがない。ただし、国際公開第２００６／０３１３３０号にはベータアミロイドに関するペプチドが開示されているが、このようなペプチドはいずれもベータアミロイドの自体作用によって誘導された効果の低減または予防、特にベータアミロイドによって誘導されたタウタンパク質のリン酸化または神経細胞死を抑制する効果と関連しており、単に神経保護性ペプチドとして知られているだけである。すなわち、このような神経保護性ペプチドは、神経細胞死滅及びタウリン酸化などのベータアミロイドによって誘導された効果を抑制するものとして知られているだけである。神経保護性ペプチドが有するこのような効果は、本発明が有するベータアミロイドの脳内流入抑制効果とは相違する。本発明の場合、ベータアミロイドの脳内流入を抑制する効果を表わすので、血液脳障壁（ＢＢＢ）の通過とは関係なく適用できるため適用性に優れるが、神経保護性ペプチドは、脳内で作用するためには血液脳障壁（ＢＢＢ）を通過しなければならないからである。結局、神経保護性ペプチドは、所望する作用のために脳内への流入のための追加的な手段（例、神経外科手術によって挿入されるカテーテルなど）を適用しなければならないが、本発明の場合、脳内への流入のための追加的な手段が不要である点においても神経保護性ペプチドでは予想できない効果を有する。したがって、本発明の効果は、国際公開第２００６／０３１３３０号に開示されたペプチドの効果とは全く相違するだけでなく、これより予想もできないものである。さらに、下記の実験結果においても確認されるように、神経保護性ペプチドは、ベータアミロイドの脳内流入抑制の効果を表わすことができないことからも、本発明がこのようなペプチドとは全く相違するだけでなく、これより予想できない効果を有するものであることを再確認できる。
【００５４】
以下、実施例、比較例及び製造例によって本発明をより詳細に説明するが、下記実施例及び製造例は、本発明を例示するためであり、本発明の内容は下記実施例や製造例によって限定されない。
【００５５】
以下、実施例などにおいて使用した試薬は、市販で入手できるものであり、最上品を使用し、特に言及しない限り、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社から購入したものを使用した。以下の実験結果については必要に応じて、平均と標準偏差とを求め、統計的な有意性を検定した。
【００５６】
＜ペプチドの製造＞
下記表１に記載したペプチドをＡｎｙＧｅｎ（株）（ＡｎｙＧｅｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，韓国）に依頼して製造した。具体的にＦｍｏｃ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）化学的性質を用いたソリッドフェーズ法（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｍｅｔｈｏｄ）によって合成した。より具体的には、固相樹脂（Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎ；Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社）０．５５ｍｍｏｌ／ｇを使用してペプチドのＣ−末端を固相樹脂に結合して実施した。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨアミノ酸のカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）は、Ｏ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｕｒｏｎｉｕｍ−ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＨＢＴＵ）とともに実施された。アミノ酸の側鎖はｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌとｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌで保護した。保護基の除去（Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）とレジン（ｒｅｓｉｎ）での分離は、トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と水を９５：５（ｖ／ｖ）の割合で混合した溶液を使用して室温で３時間実施した。粗（Ｃｒｕｄｅ）ペプチドは、ジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）で繰り返して洗浄した後、真空乾燥してＳｈｉｍａｄｚｕ  ５  ｕｍ  Ｓｈｉｍｐａｋ  ＯＤＳ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（２０ｘ２５０ｍｍ）を用いて逆相高速液体クロマトグラフィー｛ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣ；ＲＰ−ＨＰＬＣ｝方法により精製した。精製されたペプチドは、Ｓｈｉｍｐａｋ  ５  ｕｍ  ＯＤＳ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｘ２５０ｍｍ）を用いて分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ＲＰ−ＨＰＬＣ）方法により確認した。合成されたペプチドの分子量は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化マススペクトルメータ｛ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ｝（Ａｘｉｍａ  ＣＦＲ、Ｋｒａｔｏｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）を用いて確認した。
［表１］
2019526530.tif 000003
【００５７】
表１において、Ｄはアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ａｓｐ）、Ｇはグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇｌｙ）、Ｅはグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｇｌｕ）、Ｆはフェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｐｈｅ）、Ａはアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ；Ａｌａ）、Ｖはバリン（Ｖａｌｉｎｅ；Ｖａｌ）、Ｋはリシン（Ｌｙｓｉｎｅ；Ｌｙｓ）、Ｍはメチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ；Ｍｅｔ）、Ｒはアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ａｒｇ）を示す。
【００５８】
＜ベータアミロイドの脳内流入抑制効果の確認I＞
実施例１のペプチドが血中のベータアミロイド１−４２の脳内流入を抑制することを実験により確認した。具体的には、実施例１のペプチドがアルツハイマー病の原因の一つであるベータアミロイド１−４２の脳内への流入を阻害する効果を確認するために、ベータアミロイド１−４２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）１ｍｇにヘキサフルオロイソプロパノ−ル（Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ：ＨＦＩＰ）２ｍｌ処理後に常温で３日間放置し、１００μＬずつチューブに分注した。Ｓｐｅｅｄ  ｖａｃｕｕｍを用いてヘキサフルオロイソプロパノ−ル（ＨＦＩＰ）を蒸発させた後、分注した一つのチューブ（ｔｕｂｅ）に無水ＤＭＳＯ溶液｛ａｎｈｙｄｒｏｕｓ  ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）｝を１０μＬ入れて十分に溶かした後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）４００μＬを追加して最終的に２５ｕＭのベータアミロイド１−４２溶液になるように準備した。
【００５９】
準備したＩＣＲマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）は、正常群、対照群、２群の実験群に分けた。実験群には各々実施例１のペプチドを２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ腹腔投与し、対照群には実施例１のペプチドの代わり賦形剤（１０％  ＤＭＳＯ  ｉｎ  Ｓａｌｉｎｅ、１０ｍｌ／ｋｇ）を処理したことを除いては実験群と同様に処理した。２０分経過後、対照群と実験群とにベータアミロイド１−４２  ２５ｕＭ  ４００μＬを尾静脈に静脈注射（ｉ．ｖ）して投与した。また、正常群は、ベータアミロイド１−４２を処理しないことを除いては対照群と同様に処理した。ベータアミロイドを尾静脈に注射により投与して１０分経過後、マウス眼窩静脈でナトリウムヘパリンを処理したキャピラリーチューブ（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅｄ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｕｂｅ）を用いて５０μＬ程度を採血し、直ちに二酸化炭素（ＣＯ２）ガスで安楽死させた後マウスの右半球を摘出して液体窒素に保管した。採血したすべての血液サンプルを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。準備したチューブに上層液のみ集めて、１／４０００希釈後、ベータアミロイド１−４２を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ、またはＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｓｓａｙ）により測定した。
【００６０】
凍らせた右半球に３ｍｌＲＩＰＡバッファー（ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ；Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ）を入れて音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）した後、遠心分離機を用いて上澄液を分離した後、ＢＣＡアッセイ（ＢＣＡ  ａｓｓａｙ；ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙ）を行い、タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）濃度を測定した。ＢＣＡアッセイは、キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２３２２７）内のプロトコルどおりに行った。脳内のベータアミロイド１−４２濃度は、ＲＩＰＡ−ホモジネート（ＲＩＰＡ−ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）で酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、キット（ＩＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２７７１１）内のプロトコルどおりに行った。
【００６１】
その結果を図１に示した。図１は本発明の一実施例における血中のベータアミロイドの脳内流入抑制効果の確認結果を示すグラフであり、図１の左側グラフは、正常群、対照群、２個の実験群（ペプチド２．５ｍｇ／ｋｇ投与群、ペプチド２５ｍｇ／ｋｇ投与群）それぞれにおいて脳内のベータアミロイド濃度を測定した結果を示すグラフであり、右側グラフは、血液（血漿）のベータアミロイド濃度を測定した結果を示すグラフである。図面に示すように、実施例１のペプチド２．５ｍｇ／ｋｇ腹腔投与群と２５ｍｇ／ｋｇ腹腔投与群とにおいて各々脳内のベータアミロイド１−４２濃度は、１９５．５±５．６ｐｇ／ｍｇ、１８７．８±２．４ｐｇ／ｍｇで測定され、対照群に対して脳内のベータアミロイド濃度が濃度依存的に減少することがわかる。また、このような結果は、統計的有意性（ｐ＜０．０１）を有することがわかる。一方、血漿のベータアミロイド濃度は、対照群や実験群の両方とも大きな差は見られなかったことがわかる。このような結果から、血中のベータアミロイド１−４２の脳内への流入を実施例１のペプチドが濃度依存的に抑制することがわかる。
【００６２】
したがって、本発明のペプチドは、血中のベータアミロイド１−４２の脳内への流入抑制が可能であり、それによってアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、血管性認知症、アルコール性認知症、レビー小体型認知症などの認知症、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、及び／または脳内炎症などの治療及び／または予防が可能であると見られる。
【００６３】
脳内に流入したベータアミロイドが沈着して誘発する疾患は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、血管性認知症、アルコール性認知症、レビー小体型認知症などの認知症、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、脳内炎症などが知られており（Ｉｒｖｉｎｅ  ＧＢ、Ｅｌ−Ａｇｎａｆ  ＯＭ、Ｓｈａｎｋａｒ  ＧＭ、Ｗａｌｓｈ  ＤＭ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ：  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００８；１４（７−８）：４５１−６４など参照）、本発明のペプチドは、血中のベータアミロイド１−４２の脳内への流入を抑制するので、このような治療及び／または予防が可能である。
【００６４】
＜動物モデルを用いた学習及び記憶回復効果の確認＞
実施例１のペプチドの学習及び記憶回復効果を実験により確認した。具体的には、実施例１のペプチドがアルツハイマー病の症状の一つである学習能力及び記憶力の低下を抑制する効果を確認するために、遺伝子組み換えによりＳｗｅｄｉｓｈ変異（Ｓｗｅｄｉｓｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）があるベータアミロイド前駆タンパク質ＡＰＰ（ＡＰＰｓｗ；アミロイド突然変異）の人間由来遺伝子とγセクレターゼであるＰＳ１遺伝子のエクソン−９欠損形態の人間由来遺伝子とが脳中に過量発現するようにして人間のアルツハイマー病を誘発させた３０週齢のダブルトランスジェニックマウス｛Ｄｏｕｂｌｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ（ＤＴｇマウス）、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国｝モデルを用いた実験を実施した。
【００６５】
ＤＴｇマウスは、生後１．５ヶ月前後で脳中にアミロイドプラーク（ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｌａｑｕｅｓ）が発見され、４〜５ヶ月から認知機能の障害が現れることが知られているので（Ｏａｋｌｅｙ  Ｈ、Ｃｏｌｅ  ＳＬ、Ｌｏｇａｎ  Ｓ、Ｍａｕｓ  Ｅ、Ｓｈａｏ  Ｐ、Ｃｒａｆｔ  Ｊ、Ｇｕｉｌｌｏｚｅｔ−Ｂｏｎｇａａｒｔｓ  Ａ、Ｏｈｎｏ  Ｍ、Ｄｉｓｔｅｒｈｏｆｔ  Ｊ、Ｖａｎ  Ｅｌｄｉｋ  Ｌ、Ｂｅｒｒｙ  Ｒ、Ｖａｓｓａｒ  Ｒ．  “Ｉｎｔｒａｎｅｕｒｏｎａｌ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ、ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｆｉｖｅ  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．”  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６  Ｏｃｔ  ４；２６（４０）：１０１２９−４０．参照）、実施例１のペプチドが学習及び記憶回復効果を表わすかどうかを確認するための動物モデルとして用いた。
【００６６】
実験動物は、実験動物の試験ガイドラインに従い、入手後動物室で順化させて承認された動物実験計画書に従って行った。実験的環境は、温度２３±１℃、湿度５０±５％を維持し、明暗周期は１２時間（０７：００消灯−１９：００点灯）とした。実験が行われる間に動物は水と飼料を自由に摂取した。実験動物は、各々１０匹ずつ二つの群に分けて、一つの群は対照群、他の一つの群は実験群とした。実験群は、実施例１のペプチドを５０ｍｇ／ｋｇの濃度で一日一回注射器を用いて週５回の頻度で総１３週間腹腔投与した。対照群は、実施例１のペプチドの代わり賦形剤（１０％  ＤＭＳＯ  ｉｎ  Ｓａｌｉｎｅ、１０ｍｌ／ｋｇ）を処理したことを除いては実験群と同様に処理した。実施例１のペプチドを投与して１０週経過時、行動実験（Ｙ字迷路試験）を１回実施した。
【００６７】
Ｙ字迷路試験は、動物の新しい環境に対する自発的な探索傾向を短期記憶能力により観察する実験である。実験は、動物を迷路の真ん中に位置させた後８分間自由に迷路内で動くようにし、動物がそれぞれの通路に入る順序を視覚的に観察、記録する方式で行った。自発的交替行動量（％、Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ値）は、次の数式により計算した。
％自発的交替行動量＝｛（実際交差回数）／（全体交差回数−２）｝ｘ１００
【００６８】
実際交差回数は、動物がそれぞれ異なる３つの方向の通路を重なることなく連続して入った時を１回として測定した。試験結果に対する統計処理は、ＳＰＳＳプログラム（ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）を用いた。Ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて対照群に対して実験群（実施例１のペプチド投与群）について統計的な有意性を検定した。有意性の認定はｐ＜０．０５，ｐ＜０．０１とした。図２にその結果を示す。
【００６９】
図２は本発明の一実施例における動物の学習及び記憶回復に及ぶ効果の確認結果を示すグラフである。図２に示すように、自発的交替行動量値が、対照群は４９．４４±３．８８％、実施例１のペプチド投与群は６３．２２±２．５６％で各々測定され、実施例１のペプチドが投与された実験群において学習及び記憶回復効能が有意に（Ｐ＜０．０１）回復することを確認した。
【００７０】
したがって、実施例１のペプチドは学習及び記憶回復に効果を有することがわかる。
【００７１】
結果的に、学習及び記憶回復によって治療及び／または予防が可能なアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、血管性認知症、アルコール性認知症、レビー小体型認知症などの認知症、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）などの治療及び／または予防が本発明のペプチドによって可能であると見られる。
【００７２】
＜動物モデルにおけるバイオマーカー変化効果の確認＞
＜動物モデルを用いた学習及び記憶回復効果の確認＞実験において総１３週間の投与期間が終了した動物モデルを用いてバイオマーカー変化効果を確認する実験を実施した。総１３週間の腹腔投与が終了した動物モデルを二酸化炭素（ＣＯ２）を用いて安楽死させた後、直ちに脳を摘出した。脳を摘出する時、傷をつけないように脳全体を取り出した後生理食塩水を用いて軽く洗浄した。手術用メスを用いて半球を分離して左半球は準備したＥＰチューブ（ＥｐＰｅｎｄｏｒｆ  ｔｕｂｅ）に入れた後、液体窒素で急速冷却させて次の実験時まで摂氏−８０度のディープフリーザー（ｄｅｅｐ  ｆｒｅｅｚｅｒ）に保管した。
【００７３】
摂氏−８０度のディープフリーザー（ｄｅｅｐ  ｆｒｅｅｚｅｒ）に保管した左半球をＲＩＰＡバッファー（ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ；Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ）に入れて音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）して脳ホモジネート（ｂｒａｉｎ  ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）を準備した。その後、ＢＣＡアッセイ（ＢＣＡ  ａｓｓａｙ；ＢｉｃｉｎＣｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｓｓａｙ）を行いタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）量を確認した。ＢＣＡアッセイは、キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｓａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２３２２７）内のプロトコルどおりに行った。バイオマーカーの発現量は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）方法により測定し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、キット｛Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ（１−４２）Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔ：ＩＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ（２７７１１）、ＴＮＦ−αＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  ：  Ｋｏｍａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ソウル、韓国（Ｋ０３３１１８６Ｐ）、ＧＦＡＰ  Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｎｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ（ＮＳ８３０）｝内のプロトコルどおりに行った。すべての反応が完了した後、スペクトロフォトメーター（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて吸光度４５０ｎｍでサンプルのＯＤ値（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定して定量分析プログラムを用いて濃度を算出した。
【００７４】
ＥＬＩＳＡを用いて測定したバイオマーカーは、ベータアミロイド１−４２、ＴＮＦ−α、ＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；グリア繊維酸性タンパク質）であった。ＥＬＩＳＡによって測定したバイオマーカーの発現量は、対照群と実験群（実施例１のペプチド５０ｍｇ／ｋｇ投与群）の各群別に平均値と標準偏差とを計算して算出した。
【００７５】
その結果を図３ないし図５に示した。
【００７６】
図３は本発明の一実施例におけるベータアミロイド１−４２の低減効果の確認結果を示すグラフである。図３に示すように、対照群のベータアミロイド１−４２濃度は、７６．０３±２５．６３ｎｇ／ｍｇタンパク質、実験群のベータアミロイド１−４２濃度は、５７．５６±２８．４７ｎｇ／ｍｇタンパク質で各々測定され、対照群に対して僅かに減少したことを確認した。
【００７７】
図４は本発明の一実施例におけるＴＮＦ−αの低減効果の確認結果を示すグラフである。図４に示すように、対照群のＴＮＦ−α濃度が１１０９．９１±２８５．３０ｐｇ／ｍｇタンパク質、実験群のＴＮＦ−α濃度が７９８．９９±１７２．９０ｐｇ／ｍｇタンパク質で各々測定され、対照群に対して統計的に有意（ｐ＜０．０５）に減少することを確認した。ＴＮＦ−αは炎症因子であり、これの低減は、炎症の抑制を意味すると解釈できる。特にこのような結果から、実施例１のペプチドによって脳内の炎症を抑制できることがわかる。
【００７８】
図５は本発明の一実施例におけるＧＦＡＰ低減効果の確認結果を示すグラフである。図５に示すように、アストロサイト（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）マーカーＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の場合、対照群のＧＦＡＰ濃度が７０．６１±２６．８２ｎｇ／ｍｇタンパク質、実験群のＧＦＡＰ濃度が４７．６３±２４．９２ｎｇ／ｍｇタンパク質で各々測定され、対照群に対して僅かに減少したことを確認した。
【００７９】
このようなバイオマーカーの実験結果から、実施例１のペプチドの長期投与時、脳内のベータアミロイドが減少し、炎症反応が抑制されることがわかる。このようなバイオマーカーの変化は、実施例１のペプチドによる動物の学習及び記憶回復効能増加の結果を裏付けるものであると見られる。
【００８０】
以上の結果から、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩によって、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、血管性認知症、アルコール性認知症、レビー小体型認知症などの認知症、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、及び／または脳内炎症などの治療及び／または予防が可能であると見られ、このような治療及び／または予防は、ベータアミロイドの脳内流入抑制、脳内のベータアミロイド沈着抑制及び／または脳内の炎症抑制によるものであることがわかる。
【００８１】
＜ベータアミロイドの脳内流入抑制効果の確認II＞
実施例１に対する以上の実験結果に基づいて、実施例１とともに実施例２及び比較例１ないし２のベータアミロイド１−４２の脳内流入抑制効果の有無を確認するための実験を実施した。
【００８２】
実施例２のペプチドは、実施例１のペプチドから末端のＦを除いた４個のアミノ酸からなるペプチド（ＤＧＥＦ）であり、比較例１は、国際公開第２００６／０３１３３０号に開示された神経細胞保護ペプチドのうち代表的でかつ核心的なアミノ酸配列（ＤＡＥＦ）からなるペプチドであり、比較例２は、当該アミノ酸配列を含むものと知られた神経細胞保護ペプチドのうち最も効果が優れるペプチドである。
【００８３】
具体的には、まずベータアミロイド１−４２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）１ｍｇにヘキサフルオロイソプロパノ−ル（Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ：ＨＦＩＰ）２ｍｌ処理後、常温で３日間放置して１００μＬずつチューブに分注した。Ｓｐｅｅｄ  ｖａｃｕｕｍを用いてヘキサフルオロイソプロパノ−ル（ＨＦＩＰ）を蒸発させた後、分注した一つのチューブ（ｔｕｂｅ）に無水ＤＭＳＯ溶液｛ａｎｈｙｄｒｏｕｓ  ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）｝を１０μＬ入れて十分に溶かした後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）４００μＬを追加して最終的に２５ｕＭのベータアミロイド１−４２溶液になるように準備した。
【００８４】
準備したＩＣＲマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）は、正常群、対照群、４群の実験群に分けた。実験群には各々実施例１、実施例２、比較例１、比較例２のペプチドを２５ｍｇ／ｋｇ腹腔投与し、対照群にはペプチドの代わり賦形剤（１０％  ＤＭＳＯ  ｉｎ  Ｓａｌｉｎｅ、１０ｍｌ／ｋｇ）を処理したことを除いては実験群と同様に処理した。２０分経過後、対照群と実験群とにベータアミロイド１−４２  ２５ｕＭ  ４００μＬを尾静脈に静脈注射（ｉ．ｖ）して投与した。また、正常群は、ベータアミロイド１−４２を処理しないことを除いては対照群と同様に処理した。ベータアミロイドの尾静脈に注射投与して１０分経過後、マウス眼窩静脈でナトリウムヘパリンを処理したキャピラリーチューブ（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅｄ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｕｂｅ）を用いて５０μＬ程度を採血し、直ちに二酸化炭素（ＣＯ２）ガスで安楽死させた後、マウスの右半球を摘出して液体窒素に保管した。採血したすべての血液サンプルを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。準備したチューブに上層液のみ集めて、１／４０００希釈後、ベータアミロイド１−４２を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ、またはＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｓｓａｙ）により測定した。
【００８５】
凍らせた右半球に３ｍｌ  ＲＩＰＡバッファー（ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ；Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ）を入れて音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）した後、遠心分離機を用いて上澄液を分離した後、ＢＣＡアッセイ（ＢＣＡ  ａｓｓａｙ；ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙ）を行い、タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）濃度を測定した。ＢＣＡアッセイは、キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２３２２７）内のプロトコルどおりに行った。脳内のベータアミロイド１−４２濃度は、ＲＩＰＡ−ホモジネート（ＲＩＰＡ−ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）で酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、キット（ＩＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２７７１１）内のプロトコルどおりに行った。
【００８６】
その結果を下記表２に示した。
［表２］
2019526530.tif 000004
【００８７】
表２に記載したように、実施例２のペプチドは、実施例１のペプチドと同様にベータアミロイドの脳内流入を効果的に抑制することがわかる。結局、実施例２のペプチドは、実施例１のペプチドと同様、ベータアミロイドの脳内流入を抑制し、ベータアミロイドの脳内沈着を抑制することがわかる。その結果、実施例２のペプチドもベータアミロイドの脳内沈着と関連するアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、血管性認知症、アルコール性認知症、レビー小体型認知症などの認知症、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、及び／または脳内炎症などの治療及び／または予防が可能であると見られ、このような治療及び／または予防は、ベータアミロイドの脳内流入抑制、脳内のベータアミロイド沈着抑制及び／または脳内の炎症抑制によるものであることがわかる。
【００８８】
しかし、比較例１と比較例２のペプチドは、実施例１のペプチドとは異なりベータアミロイドの脳内流入を全く抑制できないことがわかる。
【００８９】
このような結果から本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩は、知られた神経保護性ペプチドとは全く相違する効果を表わすことがわかる。
【００９０】
結局、本発明は、血液脳障壁の通過のための追加的な手段なしにもベータアミロイドの脳内作用抑制が可能である面から、容易に適用できる長所を有する。
【００９１】
また、本発明は、ベータアミロイドが脳内で作用することを源泉的に抑制するので、ベータアミロイドの脳内作用抑制に関してより直接的に適用できるので、適用性に優れることがわかる。
【００９２】
＜ベータアミロイドの脳内流入抑制効果の確認III＞
下記の方法により、実施例１と実施例２のペプチドがＲＡＧＥと結合することを確認することで、ベータアミロイドとＲＡＧＥとの結合が抑制されてベータアミロイドの脳内流入が抑制されることを確認した。
【００９３】
これは、血液脳障壁内皮細胞膜に発現されるＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）がベータアミロイドを脳に輸送する役割を果たし、ＲＡＧＥとベータアミロイドとの結合抑制物質が、脳組織にベータアミロイドタンパク質の沈着と関連する疾病であるアルツハイマー病、認知障害、または認知症などに対し、治療または予防効果がある点を用いたものである（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ｊｕｎ  ８；６２（１１）：１９８４−１９８９；Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１２  Ａｐｒ；１２２（４）：１３７７−１３９２など参照）。
【００９４】
具体的に、ＭＳＴ（Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）技術を用いて、実施例１または実施例２のペプチドとＲＡＧＥとの結合力を測定した。
【００９５】
まず、キット｛Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＲＥＤ−ＮＨＳ（Ｌ００１、  ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）｝を用いて、ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ組み換えタンパク質ＲＡＧＥ（１１６２９−Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）にＲＥＤ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ  ＮＴ−６４７−ＮＨＳを結合させた後に精製する。その後、ＭＳＴ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）溶液中のＲＥＤ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ  ＮＴ−６４７−ＮＨＳ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＲＡＧＥが２０ｕＭ含量になるようにＲＡＧＥ溶液を準備する。また、実施例１または実施例２のペプチドを各々５０ｕＭから始めて１．５２ｎＭになるまでＭＳＴ  ｂｕｆｆｅｒで希釈を繰り返す方式により、１６段階の濃度になるようにペプチド溶液を準備する。その後、ＲＡＧＥ溶液とペプチド溶液とを各々１００ｕｌずつ入れて混合して毛細管に注入した後、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５（Ｇ００９、ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のトレーに濃度順に装着する。Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５作動方法を守ってソフトウェアを作動する。同様の方法で３回繰り返した後、Ｋｄ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）の平均値を得た。
【００９６】
その結果、ＲＡＧＥと実施例１のペプチドとの間のＫｄは、７６．８６ｎＭであり、ＲＡＧＥと実施例２のペプチドとの間のＫｄは、８０．８９ｎＭであった。この結果から実施例１のペプチド及び実施例２のペプチドはいずれもＲＡＧＥと結合することで、ベータアミロイドがＲＡＧＥと結合することを抑制して脳への流入を抑制する作用をすることがわかる。
【００９７】
結局、本発明のペプチドは、ＲＡＧＥとベータアミロイドとが結合することを抑制することで、ベータアミロイドの脳内流入を抑制し、より源泉的にベータアミロイドの脳内作用を抑制することがわかる。その結果、本発明のペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩は、ベータアミロイドの脳内沈着と関連するアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、血管性認知症、アルコール性認知症、レビー小体型認知症などの認知症、パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）病、及び／または脳内炎症などの治療及び／または予防が可能であると見られる。また、本発明は、ベータアミロイドの脳内作用の抑制に関し、より直接的でかつ容易に適用できるため、適用性に優れることがわかる。
【００９８】
＜製造例＞注射液剤の製造
実施例１または実施例２と同様の方法により製造したペプチド５００ｍｇを生理食塩水に溶解させて溶液１０ｍｌを作る。作られた溶液は、注射剤用アンプルに充填して製造例１または製造例２の注射液剤を製造する。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、ベータアミロイドの脳内流入を抑制する効果を有する。また、本発明は、ベータアミロイドの脳内作用の抑制に関し、より容易に適用できるため、適用性に優れる効果を有する。したがって、本発明は、産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2019526530.tif 000005
【図２】
2019526530.tif 000006
【図３】
2019526530.tif 000007
【図４】
2019526530.tif 000008
【図５】
2019526530.tif 000009
【配列表】
2019526530000001.app
【国際調査報告】
2019526530.tif 000010
2019526530.tif 000011
2019526530.tif 000012
2019526530.tif 000013
2019526530.tif 000014
2019526530.tif 000015