(57)【要約】本発明は、発色アッセイを使用してサンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含む試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下における発色基質の変化によって生じる発色効果を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法に関する。本方法はまた、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを含む組成物及びキット、並びにそのようなものを生成する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発色アッセイを使用して、サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、前記方法が、
ａ．前記サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含む試薬と接触させるステップと、
ｂ．前記サンプル中のエンドトキシンの存在下における前記発色基質の変化によって生じる発色効果を測定するステップとを含み、
前記ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法。
【請求項２】
前記基質が、３個を超えるアミノ酸と共有結合したｐ−ニトロアニリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発色基質が、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記発色基質の前記変化が、酵素反応により起こる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素反応が、ポリペプチドからの発色団の切断である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
発色効果を測定する前記ステップが、３８０ｎｍ〜４２０ｎｍにおける吸光度を測定することによって達成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
発色効果を測定する前記ステップが、４０５ｎｍにおける吸光度を測定することによって達成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試薬が、液体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試薬が、水性液体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試薬が、凍結乾燥され、その後、前記サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＬＡＬが、凍結乾燥され、その後、前記サンプルと接触させるステップに先立って再構成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発色基質が、凍結乾燥され、その後、前記サンプルと接触させるステップに先立って再構成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、生物学的サンプルである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが、非経口剤形、ワクチン、抗生剤、治療用タンパク質、治療用核酸、治療用抗体、及び生物学的製剤からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
実質的にコアギュローゲンを含まない前記ＬＡＬが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって測定される場合に、前記ＬＡＬ中の総タンパク質に対して５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
実質的にコアギュローゲンを含まない前記ＬＡＬが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって測定される場合に、前記ＬＡＬ中の総タンパク質に対して２％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
実質的にコアギュローゲンを含まない前記ＬＡＬが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって測定される場合に、前記ＬＡＬ中の総タンパク質に対して０．５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記発色アッセイが、シングルキュベット分光測定、マルチキュベット分光測定、又はマイクロプレートリーダーを使用して行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記発色効果を標準と比較して、前記サンプル中のエンドトキシンの量を求めるステップをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
発色アッセイを使用して、生物学的サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、前記方法が、
ａ．前記生物学的サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及びＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含む水性試薬と接触させるステップと、
ｂ．前記サンプル中のエンドトキシンの存在下におけるＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡからのｐＮＡの酵素切断によって生じる４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定するステップとを含み、
前記ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法。
【請求項２１】
＞０．００１ＥＵ／ｍＬエンドトキシンの感度を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含み、前記ＬＡＬは実質的にコアギュローゲンを含まない、組成物。
【請求項２３】
前記発色基質が、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＬＡＬ及び発色基質が、凍結乾燥されている、請求項２２又は２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＬＡＬ及び発色基質が、水溶液中にある、請求項２２又は２３に記載の組成物。
【請求項２６】
７０％のＬＡＬ調製物及び３０％の発色基質を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
ａ．実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）と、
ｂ．発色基質と、
ｃ．前記ＬＡＬ及び発色基質を使用してエンドトキシンを検出するための説明書と
を含む、キット。
【請求項２８】
前記ＬＡＬが、凍結乾燥されている、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記ＬＡＬが、水溶液中にある、請求項２７又は２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記ＬＡＬ及び前記発色基質が、単一の容器に入れてある、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
前記ＬＡＬを含む滅菌容器をさらに含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記滅菌容器が、滅菌バイアルである、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
対照標準エンドトキシンをさらに含む、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を生成する方法であって、前記方法が、
ａ．コアギュローゲンを含むＬＡＬを含む、組成物を準備するステップと、
ｂ．バッファーを調整するステップと、
ｃ．（ｂ）の前記組成物を２０ｋＤａ〜５０ｋＤａフィルターを使用したタンジェンシャルフローろ過に供することにより、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを単離するステップと
を含む、方法。
【請求項３５】
前記ＴＦＦが、３５０ｍｌ／分〜５００ｍｌ／分の流量で実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記バッファーが、トリスバッファー又はＭＥＳバッファーである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記バッファーが、約７．０〜８．０のｐＨを有する、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記フィルターが、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＴＦＦフィルターが、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）メンブランフィルターである、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、発色アッセイを使用してサンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含む試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下における発色基質の変化によって生じる発色効果を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法に関する。本方法はまた、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを含む組成物及びキット、並びにそのようなものを生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]グラム陰性菌エンドトキシンは、静脈内に導入されたときに発熱の原因となる生物学的パイロジェンである。リポ多糖（ＬＰＳ）としても知られているエンドトキシンは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）及びナイセイラ（Ｎｅｉｓｓｅｉｒａ）などのグラム陰性菌の外膜に見られる。エンドトキシンが引き起こす毒性機構は、リポ多糖の脂質部分が原因となる。例えば、生物内において細菌の溶解が起きると、血流に入る脂質の存在下における応答は、補体系の活性化による可能性がある。この脂質部分がインターロイキン１及び８などのさまざまなサイトカインの放出につながる。腫瘍壊死因子の産生も活性化される場合がある。もたらされた感染症は、炎症過程と関連づけられ、感染した生物に大きな危険性を与える可能性がある。インターロイキン１は、免疫応答として、炎症に対して生物が放出する一連のサイトカインである。このシグナルは、感染症が起こった場所への好中球の遊走につながり、走化性をもたらす。これは、ファゴサイトーシスが生じるのを促進するが、ある場合には、個体の免疫系の状態及び感染のレベルに応じて、エンドトキシンが敗血症によってもたらされるリスクとともに、全身敗血症に至ることもあろう。グラム陰性菌が高等な哺乳動物において全身感染症による多臓器不全及びさらには死を引き起こした多くの症例があることが知られている。エンドトキシンと関連する有害な影響のため、医薬産業及び医療界にとってエンドトキシンの早期の高感度の検出があることが重要である。
【０００３】
[0003]リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）試験は、エンドトキシンを検知するための方法として１９７０年代に商業的に導入された。ＬＡＬは、カブトガニ、アメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）の血液細胞、又はアメボサイト由来のものである。もともとのＬＡＬ試験は、セリンプロテアーゼのカスケードを構成し、このカスケードはわずかなレベルのエンドトキシンによって引き起こされ、反応の終わりにゲル凝塊となる。通常、酵素前駆体として存在するＣ因子は、この凝固カスケードのプライマーである。インビボにおいて、Ｃ因子は、グラム陰性感染菌の存在をカブトガニに警告する完璧なバイオセンサーである。血流停止の終点は、感染菌を捕捉し、感染菌を死滅させ、さらなる感染を制限する。
【０００４】
[0004]ＬＡＬ試験は、エンドトキシンに対するアメボサイトの応答を測定するためのさまざまな方法を使用するために改変することができる。こうした方法としては、いわゆるゲル化法、比濁法及び発色法が挙げられる。これらのＬＡＬ試験は、薬剤の製造及び最終製品に対して使用される原料中の両方の細菌毒素を検出するための方法として国際的薬局方において推奨されている。こうした試験は、ＦＤＡ（食品医薬品局）が推奨するパイロジェンの検出のための方法であるため、化粧品産業に対して及び食物生産においても有用である。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を含む発色アッセイを使用して、サンプル中のエンドトキシンを検出する方法が本明細書において提供される。
【０００６】
[0006]本明細書中の実施形態は、発色アッセイを使用して、サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含む試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下における発色基質の変化によって生じる発色効果を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法を対象とする。
【０００７】
[0007]いくつかの実施形態において、発色基質は、３個を超えるアミノ酸と共有結合したｐ−ニトロアニリンである。いくつかの実施形態において、発色基質は、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡである。いくつかの実施形態において、発色基質の変化は、酵素反応により起こる。いくつかの実施形態において、酵素反応は、ポリペプチドからの発色団の切断である。いくつかの実施形態において、発色効果は、３８０ｎｍ〜４２０ｎｍにおける吸光度を検出することによって測定される。いくつかの実施形態において、発色効果は、４０５ｎｍにおける吸光度を検出することによって測定される。
【０００８】
[0008]いくつかの実施形態において、試薬は、液体である。いくつかの実施形態において、試薬は、水性液体である。いくつかの実施形態において、試薬は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される。
【０００９】
[0009]いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って再構成される。いくつかの実施形態において、発色基質は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って再構成される。
【００１０】
[0010]いくつかの実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは、非経口剤形、ワクチン、抗生剤、治療用タンパク質、治療用核酸、治療用抗体、及び生物学的製剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定され、ウエスタンブロットによって確認される場合に、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬは、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して２％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬは、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して０．５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、シングルキュベット分光測定、マルチキュベット分光測定、又はマイクロプレートリーダーを使用して行われる。
【００１１】
[0011]いくつかの実施形態において、本方法は、発色効果を標準と比較して、サンプル中のエンドトキシンの量を求めるステップをさらに含む。
【００１２】
[0012]いくつかの実施形態において、本開示は、発色アッセイを使用して、生物学的サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）生物学的サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及びＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含む水性試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下におけるＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡからのｐＮＡの酵素切断によって生じる４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法を対象とする。
【００１３】
[0013]いくつかの実施形態において、本開示の方法は、高い感度を有する。いくつかの実施形態において、本方法は、＞０．００１ＥＵ／ｍＬエンドトキシンの感度を有する。
【００１４】
[0014]いくつかの実施形態において、本開示の方法は、実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含む組成物を対象とする。いくつかの実施形態において、発色基質は、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡである。いくつかの実施形態において、ＬＡＬ及び発色基質は、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態において、ＬＡＬ及び発色基質は、水溶液中にある。
【００１５】
[0015]いくつかの実施形態において、本開示の方法は、キットであって、（ａ）実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）と、（ｂ）発色基質と、（ｃ）ＬＡＬ及び発色基質を使用してエンドトキシンを検出するための説明書とを含む、キットを対象とする。
【００１６】
[0016]いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、水溶液中にある。いくつかの実施形態において、ＬＡＬ及び発色基質は、単一の容器に入れてある。いくつかの実施形態において、キットは、ＬＡＬを含む滅菌容器をさらに含む。いくつかの実施形態において、滅菌容器は、滅菌バイアルである。いくつかの実施形態において、キットは、対照標準エンドトキシンをさらに含む。
【００１７】
[0017]いくつかの実施形態において、本開示は、実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を生成する方法であって、本方法は、（ａ）コアギュローゲンを含むＬＡＬを含む、組成物を準備するステップと、（ｂ）バッファーを調整するステップと、（ｃ）（ｂ）の組成物を２０ｋＤａ〜５０ｋＤａフィルターを使用したタンジェンシャルフローろ過に供することにより、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを単離するステップとを含む、方法を対象とする。
【００１８】
[0018]いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、３５０ｍｌ／分〜５００ｍｌ／分の流量で実施される。いくつかの実施形態において、バッファーは、トリスバッファー又はＭＥＳバッファーである。いくつかの実施形態において、バッファーは、約７．０〜８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、フィルターは、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）である。いくつかの実施形態において、ＴＦＦフィルターは、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）メンブランフィルターである。
【００１９】
[0019]本技術の前述及び他の特徴及び態様は、実施形態の以下の説明から、さらに添付の図面に示されているとおり、さらに良好に理解可能である。本明細書に組み込まれ、明細書の一部を形成する添付の図面は、本技術の原理を説明するためにさらに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】濁度及び発色分析点を含む、エンドトキシン関連カスケードの略図である。
【図２】通常のＬＡＬ対実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを含むサンプルの比較が、複数のオンセットミリ光学密度（ｍＯＤ）値において分離の増加を示している表である。ＥＵ／ｍｌ＝１ミリリットル当たりのエンドトキシン単位。
【図３】標準的なＬＡＬ（Ｌ）及びズイッタージェント（ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）（Ｚ）の濃度の反応速度に対する影響の比較を示す表である。Ｌ及びＺの濃度を高めると、それぞれ標準の反応速度が増加する。反応の速度が増加するため、ブランクと最低の標準（０．００５ＥＵ／ｍｌ）との間の分離が失われる。
【図４】実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ（Ｌ−ｃｏ）及びズイッタージェント（Ｚ）の濃度の反応速度に対する影響の比較を示す表である。Ｌ−ｃｏ及びＺの濃度を高めると、それぞれ標準の反応速度が増加する。すべての配合物に関して少なくとも２００秒の分離が維持されている。増加したズイッタージェントと配合したＬ−ｃｏは、許容される分離を伴い０．００１ＥＵ／ｍｌの感度を達成した（データは示していない）。
【図５Ａ】（Ａ）２００ｍＯＤ及び（Ｂ）５０ｍＯＤにおけるＬ−ｃｏ及び発色基質に関するさまざまな濃度の反応時間を示すグラフである。図５Ｃは、Ｌを使用したアッセイと比較したＬ−ｃｏを使用したアッセイの増加した感度、反応時間、及び分離の概要を示す表である。
【図５Ｂ】（Ａ）２００ｍＯＤ及び（Ｂ）５０ｍＯＤにおけるＬ−ｃｏ及び発色基質に関するさまざまな濃度の反応時間を示すグラフである。図５Ｃは、Ｌを使用したアッセイと比較したＬ−ｃｏを使用したアッセイの増加した感度、反応時間、及び分離の概要を示す表である。
【図５Ｃ】（Ａ）２００ｍＯＤ及び（Ｂ）５０ｍＯＤにおけるＬ−ｃｏ及び発色基質に関するさまざまな濃度の反応時間を示すグラフである。図５Ｃは、Ｌを使用したアッセイと比較したＬ−ｃｏを使用したアッセイの増加した感度、反応時間、及び分離の概要を示す表である。
【図６Ａ】（Ａ）７０％のＬ−ｃｏ調製物及び３０％の発色基質を使用した３つの別々のロットのＬ−ｃｏの５０ｍＯＤにおける反応時間を示す表である（分離範囲：７３２秒〜２１１秒）。
【図７Ａ】（Ａ）タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）（３０ｋＤａ）に供されたＬＡＬサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析であり、３ランに関して還元条件下においてＴＦＦ生成物が流される。３回目のランの後、ゲル凝固は確認されていない。ゲル凝塊のデータは、固体ゲル凝塊を「＋」、ゲル凝塊なしを「−」、及び柔らかいゲル凝塊を「−／＋」と表した。（Ｂ）３ランに関して還元条件下において行ったタンジェンシャルフローろ過（３０ｋＤａ）生成物のウエスタンブロット分析である。抗体希釈物は以下のとおりとした：α−コアギュローゲン  １：１，０００、α−凝固酵素前駆体  １：１０，０００、α−ｓｕｓｈｉ３  １：１００。
【図７Ｂ】（Ａ）タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）（３０ｋＤａ）に供されたＬＡＬサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析であり、３ランに関して還元条件下においてＴＦＦ生成物が流される。３回目のランの後、ゲル凝固は確認されていない。ゲル凝塊のデータは、固体ゲル凝塊を「＋」、ゲル凝塊なしを「−」、及び柔らかいゲル凝塊を「−／＋」と表した。（Ｂ）３ランに関して還元条件下において行ったタンジェンシャルフローろ過（３０ｋＤａ）生成物のウエスタンブロット分析である。抗体希釈物は以下のとおりとした：α−コアギュローゲン  １：１，０００、α−凝固酵素前駆体  １：１０，０００、α−ｓｕｓｈｉ３  １：１００。
【図８Ａ】（Ａ）α−コアギュローゲンを使用したウエスタンブロット分析を使用したコアギュローゲンの定量である。（Ｂ）標準曲線にプロットした図８（Ａ）のデータのグラフである。データは、総ＬＡＬタンパク質の約３３％がコアギュローゲンであることを示唆している。
【図８Ｂ】（Ａ）α−コアギュローゲンを使用したウエスタンブロット分析を使用したコアギュローゲンの定量である。（Ｂ）標準曲線にプロットした図８（Ａ）のデータのグラフである。データは、総ＬＡＬタンパク質の約３３％がコアギュローゲンであることを示唆している。
【図９】コアギュローゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。還元条件下において行う３３と、コアギュローゲンの３つのバンドが存在する。タンパク質配列決定により、３つのバンドがコアギュローゲン断片であることを確認した。Ａ＝コアギュローゲン１：位置２１  ＧＤＰＮＶＰＴＣＬＣ；Ｂ＝コアギュローゲン２：位置３９  ＫＶＩＶＳＱＥＫＴＤ；Ｃ＝コアギュローゲン３：位置６７  ＧＦＳＩＦＧＧＨＰＡ。
【図１０Ａ】２つの別々のロットのＬ−ｃｏの安定性を５０ｍＯＤにおいて１０週間にわたって判断した。このデータは、Ｌ−ｃｏが１０週間の期間を超えて安定であったことを示唆している。
【図１０Ｂ】２つの別々のロットのＬ−ｃｏの安定性を５０ｍＯＤにおいて１０週間にわたって判断した。このデータは、Ｌ−ｃｏが１０週間の期間を超えて安定であったことを示唆している。
【図１１Ａ】ロンザ（Ｌｏｎｚａ）、チャールズリバーラボラトリーズインターナショナル（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、及びアソシエーツオブケープコッドインク（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．）（ＡＣＣ）からの市販のＬＡＬ中のコアギュローゲンの存在をタンパク質染色及びウエスタンブロット分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して試験した。これにより、３つすべての供給業者からのＬＡＬはコアギュローゲンを含有していたことを確認した。
【図１１Ｂ】ロンザ（Ｌｏｎｚａ）、チャールズリバーラボラトリーズインターナショナル（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、及びアソシエーツオブケープコッドインク（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．）（ＡＣＣ）からの市販のＬＡＬ中のコアギュローゲンの存在をタンパク質染色及びウエスタンブロット分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して試験した。これにより、３つすべての供給業者からのＬＡＬはコアギュローゲンを含有していたことを確認した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
[0031]本明細書において示され、記載されている個々の実装は例であり、別の方法で本出願の範囲を限定することは全く意図されないことが理解されるべきである。
【００２２】
[0032]本明細書において言及される公開特許、特許出願、ウェブサイト、企業名、及び科学文献は、それぞれが参照により組み込まれることを具体的に個別に示したのと同じ程度までその全体を参照により本明細書に組み込んだものとする。本明細書中で引用される任意の文献と本明細書の特定の教示の間のいかなる矛盾も後者を優先して決定されるものとする。同様に、語又は語句の本分野において理解されている定義と本明細書において具体的に教示されている語又は語句の定義の間のいかなる矛盾も後者を優先して決定されるものとする。
【００２３】
[0033]本明細書において使用される場合、内容が明らかに別のことを指示しない限り、単数形の「１つ（ａ、ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」は、具体的にそれらが言及する用語の複数形も包含する。「約」という用語は、ほぼ、〜の辺り、だいたい、又はおよそを意味するよう本明細書中で使用される。「約」という用語が数値的な範囲と共に使用される場合、その用語は、記載した数値を超える及び下回る境界に拡大することによってその範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、２０％の変動だけ明記された値を上回る及び下回る数値に変更するよう本明細書中で使用される。
【００２４】
[0034]本明細書中で使用される技術及び科学用語は、別に定義されない限り、本出願が属する分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。本明細書では、当業者に知られているさまざまな技法及び材料に対する参照を行う。本明細書中で引用されるいかなる文献の開示も、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２５】
[0035]いくつかの実施形態において、本発明は、エンドトキシンを検出する方法を対象とする。「エンドトキシン」という用語は、一般にグラム陰性菌の外膜と関連づけられるリポ多糖複合体を指す。「エンドトキシン」という用語は、ときとして、任意の細胞関連細菌毒素を指すために使用される。エンドトキシンは細胞関連リポ多糖を指すが、エクソトキシンは細菌が分泌する毒素を指し、本質的に主としてポリペプチドである。
【００２６】
[0036]エンドトキシンの生物学的活性は、リポ多糖（ＬＰＳ）と関連づけられる。リポ多糖は、グラム陰性菌の細胞壁の外膜の部分である。リポ多糖は、微生物が病原性であろうとなかろうと常にグラム陰性菌と関連づけられる。毒性は、脂質成分（リピドＡ）と関連づけられ、免疫原性は、多糖成分と関連づけられる。グラム陰性菌の細胞壁抗原（Ｏ抗原）は、ＬＰＳの多糖成分である。さらに、ＬＰＳは、動物においてさまざまな炎症反応を誘発する可能性がある。
【００２７】
[0037]動物内のグラム陰性菌は、増殖している間に微量のエンドトキシンを放出することがある。エンドトキシンが、自然免疫の刺激をもたらすこともある。実験室で増殖された幼若培養菌によって少量のエンドトキシンが可溶型で放出されることもあることが知られている。しかしながら、大部分に関して、エンドトキシンは微生物の崩壊まで細胞壁と関連づけられたままである。細菌性生物の崩壊は、細菌細胞の自己溶解、補体及びリゾチームが関係する外因的溶解、並びに食細胞消化によって生じる場合がある。細菌性エンドトキシンは、ヒト腸内に豊富にある。高濃度のエンドトキシンは、いくつかのメタボリックシンドローム疾患を含む多くの状態と関連づけられる。メタボリックシンドローム疾患としては、例えば、アテローム動脈硬化症、インスリン耐性、真性糖尿病、及び肥満が挙げられる。エンドトキシンレベルの増加は、脂肪肝疾患及びクローン病とも関連づけられている。高いレベルで存在する場合、胃腸管からエンドトキシンが漏れ出す可能性もある。エンドトキシンは強力な炎症性抗原であり、エンドトキシンの漏出は、全身性炎症反応をもたらす可能性がある。
【００２８】
[0038]細菌の典型的なエクソトキシンと比較して、エンドトキシンは、酵素的に作用しないため、作用があまり強力でなく、あまり特異的でない。エンドトキシンは熱安定性である（３０分間の煮沸はエンドトキシンを不安定にしない）が、スーパーオキシド、ペルオキシド及び次亜塩素酸塩などの特定の強力な酸化剤がエンドトキシンを中和することが報告されている。これらの酸化剤は、強力な酸化剤であるため、エンドトキシンを中和するための治療用組成物にはあまり適用できない。
【００２９】
[0039]本発明のエンドトキシンは、グラム陰性菌から作り出すことができる。例となるグラム陰性菌としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）菌種、シゲラ菌種、サルモネラ菌種、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）菌種、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）菌種、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌種、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）菌種、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）菌種、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）菌種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）菌種、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌種、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）菌種、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）菌種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）菌種、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）菌種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）菌種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌種、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）菌種及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）菌種が挙げられるが、これらに限定されるものではない。グラム陰性細菌はまた、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ナイセリア科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、ベイヨネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、ビブリオ科（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）、パスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、及びフソバクテリア科（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に入るものでもよい。いくつかの実施形態において、エンドトキシンは、サルモネラ又はエシェリキア菌種由来である。
【００３０】
[0040]本明細書中で使用される場合、「エンドトキシン活性」という用語は、発熱性及び敗血症性ショックを含む毒性の原因となり得るグラム陰性菌の部分を指す。エンドトキシンによる毒の影響は、グラム陰性菌の外膜に存在するか、又はそれに由来するリポ多糖分子のグリコシル化リピドＡ部分と関連づけられることがわかっている。
【００３１】
[0041]「リポ多糖」（ＬＰＳ）という用語は、共有結合によって結合した脂質及び多糖からなる大きな分子（糖リン脂質）を指す。ＬＰＳは、３つの部分：１）Ｏ抗原、２）コアオリゴ糖、及び３）リピドＡを含む。Ｏ抗原は、コアオリゴ糖と結合した反復グリカンポリマーであり、ＬＰＳ分子の最も外側の領域を含む。コアオリゴ糖は、リピドＡと直接結合しており、一般的にヘプトース及び３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸（ＫＤＯ、ケトデオキシオクツロソナートとしても知られている）などの糖を含有する。リピドＡは、複数の脂肪酸と結合したリン酸化グルコサミン二糖である。脂肪酸は、ＬＰＳを細菌膜に固定し、ＬＰＳの残りの部分は、細胞表面から突き出ている。ＬＰＳが変化したか、又は除去された場合、細菌死が起こることもある。
【００３２】
[0042]エンドトキシン活性は、ＬＰＳのリピドＡ領域部分に存在する。細菌細胞が免疫系によって溶解されると、リピドＡを含有する膜の断片が血液循環に放出され、発熱（発熱性）、下痢、及び場合によっては、命にかかわるショック（エンドトキシン又は敗血症性ショックと呼ばれる）を引き起こす。ＬＰＳの毒性は、宿主に対して命にかかわる結果がある場合もある、炎症性サイトカイン、主に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の分泌に至るプロセスである哺乳動物の免疫系のＢ細胞及びマクロファージとの相互作用によりリピドＡによって示される。リピドＡはまた、「インビトロにおいて」ヒトＴリンパ球（Ｔｈ−１）並びに「インビボにおいて」マウスのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、その特性が、宿主の免疫系がＬＰＳの可変サイズの炭水化物鎖に対して特異的な既往ＩｇＧ抗体応答を開始するのを可能にする。これらに基づいて、ＬＰＳは、「インビボにおける」Ｔ細胞依存性抗原として最近、認識されている。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、リピドＡを検出することを対象とする。
【００３３】
[0043]いくつかの実施形態において、エンドトキシンは、発色アッセイを使用して検出される。本明細書中で使用される場合、発色アッセイは、エンドトキシンの存在下における発色基質（すなわち、色原体）の吸光度の変化を測定又は検出する。いくつかの実施形態において、発色基質の吸光度の変化は、酵素活性によるものである。いくつかの実施形態において、「発色基質」という用語は、酵素活性の前及び後の基質を指す。例えば、発色基質が、酵素によって切断されて、ペプチドと発色団を生じるペプチド発色団である場合、「発色基質」という用語は、ペプチド発色団、切断されたペプチド、及び放出発色団を指すであろう。いくつかの実施形態において、合成色原体が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、天然に産生される色原体が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、発色基質は、合成ペプチドである。いくつかの実施形態において、基質は、極めて高感度であり、すなわち、非常に低い酵素活性を検出することができる。
【００３４】
[0044]低い酵素濃度を検出するための発色基質を含む試薬の能力は、発色基質を、例えば、研究又は品質管理手順のいずれかにおけるエンドトキシンと関連づけられる特定の酵素活性の存在に関する調査に対して有用にする。場合によっては、特定の酵素調製物に対する基質の応答が天然発色基質（すなわち、酵素に対する天然基質）と合成発色基質との間で一致しないこともある。いくつかの実施形態において、発色基質は、天然基質と比較して選択性が低く、すなわち、関連酵素に対する反応性において低い識別力を有する。
【００３５】
[0045]「発色基質」という用語は、エンドトキシンの存在下において基質の吸光度スペクトルを変化させる、例えば、色を変化させる、アッセイにおける基質、例えば、化合物又はポリペプチドを指す。発色基質は、特定の波長において（ｉ）吸収する、及び／又は（ｉｉ）吸収しない、の両方の基質を指す。したがって、例えば、本開示によると、発色基質は、特定の波長をもともと吸収しない場合もあり（例えば、可視波長において非吸収）、その後、エンドトキシンの存在下において、特定の波長で（例えば、可視波長において）吸収し始める場合もある。或いは、例えば、発色基質は、特定の波長においてもともと吸収する場合もあり（例えば、可視波長において吸収する）、その後、エンドトキシンの存在下において、特定の波長において吸収しない場合もある（例えば、可視波長において吸収しない）。いくつかの実施形態において、発色基質は、エンドトキシンの非存在下で所与の波長において吸収し、その後、エンドトキシンの存在下で異なる波長において吸収する場合もある。１つ以上の特定の波長における吸光度特性すなわち、発色効果の変化は、エンドトキシンの存在と相互に関連する場合がある。
【００３６】
[0046]いくつかの実施形態において、発色基質は、発色ペプチド基質である。いくつかの実施形態において、発色ペプチド基質は、初めは無色である。いくつかの実施形態において、発色ペプチド基質は、初めに色、例えば、可視スペクトル（およそ３９０〜７００ｎｍ）の色を有する。いくつかの実施形態において、発色ペプチド基質が、酵素によって切断されると、色の変化が生じる場合があり、例えば、発色団が放出されて、得られた生成物の色の変化を引き起こす。いくつかの実施形態において、切断が生成物の光学的性質を変化させ、この性質は切断されていない基質の性質とは異なり、分光光度測定によって測定することができる。ペプチド基質と結合できる発色基の非限定例は、パラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）、５−アミノ−２−ニトロ安息香酸（ＡＮＢＡ）、７−アミノ−４−メトキシクマリン（ＡＮＣ）、キノニルアミド（ＱＵＡ）、ジメチル５−アミノイソフタレート（ＤＰＡ）及びそれらの誘導体である。蛍光基質としては、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣ［Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル；ＡＭＣ＝７−アミノ−４−メチルクマリン］、ホモバニリン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、還元型フェノキサジン、還元型ベンゾチアジン、アンプレックス（Ａｍｐｌｅｘ）（登録商標）、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド及びそれらの構造的変形（参照により組み込まれる、米国特許第５，２０８，１４８号、同第５，２４２，８０５号、同第５，３６２，６２８号、同第５，５７６，４２４号、及び同第５，７７３，２３６号）、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド及びフッ素化クマリンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（参照により組み込まれる、米国特許第５，８３０，９１２号）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３７】
[0047]非限定発色アッセイは、Ｃ因子／Ｂ因子カスケードに基づく酵素活性アッセイである。そのカスケードにおける第１の成分であるＣ因子は、エンドトキシン結合によって活性化されるプロテアーゼ前駆体である。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、組換え型のＣ因子（ｒＦＣ）を使用する。この経路において、Ｂ因子は、Ｃ因子によって活性化される。Ｂ因子は、凝固酵素前駆体を凝固酵素に活性化する。いくつかの実施形態において、凝固酵素前駆体は、発色基質の発色変化を引き起こす。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、ＬＡＬアッセイ、例えば、ロンザのエンドポイント発色ＬＡＬアッセイ（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  Ａｓｓａｙ）である。
【００３８】
[0048]いくつかの実施形態において、発色アッセイは、ＬＡＬアッセイであり、この場合、ＬＡＬエンドトキシン反応の最初の部分が、凝固酵素前駆体を活性化し、酵素が、次に合成基質からｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）を酵素的に切断して、黄色の色を生じさせる。
【００３９】
酵素前駆体＋エンドトキシン→酵素
基質＋Ｈ２Ｏ＋酵素→ペプチド＋ｐＮＡ（黄色）
[0049]いくつかの実施形態において、グラム陰性菌エンドトキシンは、ＬＡＬ中の酵素前駆体の活性化を間接的に触媒することが可能である。活性化の最初の速度は、存在するエンドトキシンの濃度によって決まる可能性がある。
【００４０】
[0050]いくつかの実施形態において、発色基質の変化は、酵素反応により生じる。いくつかの実施形態において、酵素反応は、ペプチド結合の切断をもたらし、それによって、ポリペプチドから発色団置換基（例えば、ｐ−ＮＡ）を切断する。例えば、活性化酵素は、無色のペプチド基質、例えば、Ａｃ−ｌｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡからのｐＮＡの放出を触媒することができる。いくつかの実施形態において、ペプチド基質は、３個を超えるアミノ酸と共有結合したｐ−ニトロアニリンである。いくつかの実施形態、実施形態において、発色基質は、Ａｃ−ｌｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡである。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、遊離ｐＮＡを測定する。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、３８０ｎｍ〜４１０ｎｍ、例えば、４００ｎｍ〜４１０ｎｍ、又は４０５ｎｍの吸光度において遊離ｐＮＡを測光法で測定する。吸光度を測定する方法は、当業者に周知である。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、吸光度を測定するために、シングルキュベット分光測定、マルチキュベット分光測定、又はマイクロプレートリーダーを使用して行われる。
【００４１】
[0051]遊離ｐＮＡは、反応が停止試薬により停止された後、３８０ｎｍ〜４１０ｎｍ、例えば、４０５ｎｍにおいて測光法で測定することができる。サンプル中のエンドトキシンの濃度は、既知の量のエンドトキシン標準を含有する溶液の吸光度値の標準曲線から算出される。
【００４２】
[0052]エンドトキシンを検出するための標準的な発色アッセイの１つは、サンプルを試薬と接触させるステップを含み、試薬は、リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を含む。いくつかの実施形態において、試薬は、液体、例えば、水性液体である。或いは、試薬は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させられる前に水性液体、例えば、滅菌水又はバッファー溶液中で再構成されてもよい。いくつかの実施形態において、試薬は、液体である。いくつかの実施形態において、試薬は、水性液体である。いくつかの実施形態において、試薬は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される。いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される。いくつかの実施形態において、発色基質は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される。いくつかの実施形態において、凍結乾燥は、発色アッセイにおける試薬、ＬＡＬ、及び／又は発色基質のより長い及び／又はより確固とした保管を可能にする。例えば、いくつかの実施形態において、凍結乾燥試薬、ＬＡＬ及び／又は発色基質は、発色アッセイにおける非凍結乾燥試薬、ＬＡＬ、及び又は発色基質と比較して、２０％を超える、３０％を超える、４０％を超える、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える又は１００％を超える安定性の時間の増加を可能にする。この文脈において使用される場合の「安定性」は、意図した目的のため、すなわち、同じ速度及び感度でエンドトキシンを検出するために働くアッセイを指す。例えば、非凍結乾燥試薬が３週間安定であった場合、６週間安定の凍結乾燥試薬が、安定性の時間の「１００％の増加」を有することになろう。
【００４３】
[0053]本開示は、サンプル中のエンドトキシンを検出するための改善された方法を提供する。「サンプル」という用語は、任意の物質、化合物、ツール又は機器を含んでもよい。但し、実際的な目的に対して、サンプルとしては、生物学的な生物、例えば、哺乳動物、ヒト、飼育動物、又は動物園の動物と接触した物質、化合物、ツール又は機器を挙げることができる。「サンプル」という用語は、（製造プロセスの終わりまでに受け取る原料からの）エンドトキシンの発生源が、サンプルを脳脊髄液又は心血管系と接触させるのには適していないものにする可能性のあるあらゆる医療機器、医薬品及びバイオテクノロジー製品を指す場合がある。いくつかの実施形態において、サンプルという用語は、インビボで脳脊髄液又は心血管系、例えば、ヒトと接触させることになる医療機器を指す。いくつかの実施形態において、サンプルという用語は、生物学的サンプルを指す。いくつかの実施形態において、サンプルは、非経口剤形、ワクチン、抗生剤、治療用タンパク質、治療用核酸、治療用抗体、及び生物学的製剤からなる群から選択される。
【００４４】
[0054]「リムルスアメボサイトライセート」（ＬＡＬ）という用語は、カブトガニ、アメリカカブトガニ由来の血液細胞の水性抽出物（アメボサイト）を指す。カブトガニ由来の血液細胞の水性抽出物は、感染菌を動けなくすることによって感染菌の広がりを妨げる血リンパのゲル形成タンパク質であるコアギュローゲンを含む。例えば、Ｉｗａｎａｇａ  Ｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８：３０５〜３１８ページ（１９８５年）及びＩｗａｎａｇａ  Ｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５（６）：１７９３〜１８０１ページ（１９８４年）参照。
【００４５】
[0055]カブトガニ（リムルス）の凝固カスケード系は、血流停止及び宿主防御の両方に関与する。このカスケードは、可溶性タンパク質であるコアギュローゲンの不溶性コアギュリンゲルへの変換をもたらす。凝固酵素は、コアギュローゲンから断片ペプチドＣを削り取り、モノマーの凝集を引き起こす。
【００４６】
[0056]「コアギュローゲン」という用語は、Ｉｗａｎａｇａ（１９８４年）及びＩｗａｎａｇａ（１９８５年）において見られるとおりのポリペプチド鎖を指し、このポリペプチド鎖は、単一の１７５残基のポリペプチド鎖であり、血球に含有される凝固酵素によってＡｒｇ−１８及びＡｒｇ−４６の後で切断され、細菌性エンドトキシン（リポ多糖）によって活性化される。切断は、ペプチドＣとともに、２つのジスルフィド結合によって連結されコアギュリンの２つの鎖、Ａ及びＢを放出する。ゲル形成は、コアギュリン分子の連結の結果生じる。二次構造予測は、コアギュローゲンからコアギュリンゲルへのタンパク質分解性変換中に放出されるＣペプチドがアルファ−ヘリックスを形成することを示唆する。分子中に見られるベータ−シート構造及び１６ハーフシスチンが、酸及び熱に対して安定な小型のタンパク質をもたらすようである。
【００４７】
[0057]コアギュローゲンは、ゲル形成（例えば、凝固アッセイ）に重要であるが、本開示は、発色アッセイには必須ではないことを発見している。本開示は、天然に生じる量のコアギュローゲンを伴うＬＡＬを含む発色アッセイと比較して、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを含む発色アッセイが高いレベルの速度、感度、及び分離を達成したことを発見している。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを含む発色アッセイを対象とする。
【００４８】
[0058]いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、実質的にコアギュローゲンを含まない。当業者は、本開示を読むと、さまざまな量のコアギュローゲンの減少が発色アッセイ、例えば、ＬＡＬアッセイにおける速度、感度及び／又は分離のレベルを高めることになることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、「実質的に含まない」という用語は、タンパク質染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定され、ウエスタンブロットによって確認された場合に、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満又は０．５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有するＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、「実質的に含まない」という用語は、タンパク質染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定され、ウエスタンブロットによって確認された場合に、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して１０％未満又は５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有するＬＡＬを指す。
【００４９】
[0059]いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬという用語は、コアギュローゲンが除去されていないＬＡＬ中のコアギュローゲンの量と比較して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％（ｗｔ／ｗｔ）のコアギュローゲンが除去されたＬＡＬを指す。
【００５０】
[0060]いくつかの実施形態において、発色アッセイは、サンプル中のエンドトキシンの有無を判断する。他の実施形態において、発色アッセイは、サンプル中のエンドトキシンの量を定量することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、サンプル中のエンドトキシンの量を求めるために、サンプル中のエンドトキシンの発色効果を既知のエンドトキシン標準と比較するステップをさらに含む。
【００５１】
[0061]いくつかの実施形態において、本開示は、発色アッセイを使用して、生物学的サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）生物学的サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及びＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含む水性試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下におけるＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡからのｐＮＡの酵素切断によって生じる４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法を対象とする。
【００５２】
[0062]ＬＡＬからコアギュローゲンを除去することによって、発色アッセイは高い感度を有することが可能である。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、高い感度を有する。いくつかの実施形態において、本方法は、０．０５ＥＵ／ｍＬ未満、０．０３ＥＵ／ｍＬ未満、０．０１ＥＵ／ｍＬ未満、０．００８ＥＵ／ｍＬ未満、０．００６ＥＵ／ｍＬ未満、０．００５ＥＵ／ｍＬ未満、０．００４ＥＵ／ｍＬ未満、０．００３ＥＵ／ｍＬ未満、０．００２ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．００１ＥＵ／ｍＬ未満の感度を有する。
【００５３】
[0063]本開示は、（１）実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬと、（２）発色基質とを含む、組成物をさらに対象とする。いくつかの実施形態において、組成物中の発色基質は、ｐＮＡを含む。いくつかの実施形態において、組成物中の発色基質は、Ａｃ−ｌｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡである。いくつかの実施形態において、組成物は、６０％〜８０％の実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ調製物と、２０％〜４０％の発色基質とを含む（ｗｔ／ｗｔ）。いくつかの実施形態において、組成物は、約６％〜約２５％の実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、７０％の実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ調製物と、３０％の発色基質とを含む（ｗｔ／ｗｔ）。いくつかの実施形態において、組成物は、７０％の実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ調製物と、３０％のＡｃ−ｌｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡとを含む（ｗｔ／ｗｔ）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、単一の容器、例えば、単一のバイアルに入れてある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、凍結乾燥されている。例えば、本開示は、７０％の実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ調製物と、３０％のＡｃ−ｌｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ｗｔ／ｗｔ）とを含む、凍結乾燥組成物を特に示す。
【００５４】
[0064]いくつかの実施形態において、本発明は、発色アッセイキットを対象とする。本キットは、ＬＡＬ及び発色基質を含む試薬を含む、ＬＡＬ発色アッセイと通常関連づけられる１つ以上の成分を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、（ａ）実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）と、（ｂ）発色基質と、（ｃ）ＬＡＬ及び発色基質を使用してエンドトキシンを検出するための説明書とを含む、キットを対象とする。いくつかの実施形態において、本キットは、さまざまな試薬を含み、それぞれの試薬が異なる量のコアギュローゲンが除去されたＬＡＬを有する。
【００５５】
[0065]本キットは、１つ以上の容器を含むことが可能である。いくつかの実施形態において、ＬＡＬ及び発色基質は、単一の容器に入れてある。いくつかの実施形態において、ＬＡＬ及び発色基質は、２つの別個の容器に入れてある。いくつかの実施形態において、本キットは、ＬＡＬを含む滅菌容器を含む。いくつかの実施形態において、本キットは、アッセイに使用するためのＬＡＬ及び／又は発色基質を再構成することができる再構成バッファーを含む。いくつかの実施形態において、滅菌容器は、滅菌バイアルである。いくつかの実施形態において、本キットは、陽性エンドトキシン対照として使用することが可能であるか、又は標準中のエンドトキシンの量を定量するために使用可能である対照標準エンドトキシンをさらに含む。いくつかの実施形態において、本キットは、２つ以上の対照標準エンドトキシンを１つ以上の濃度で含む。
【００５６】
[0066]当業者は、ＬＡＬからコアギュローゲンを除去するためにさまざまな方法を使用することが可能であることを理解することができる。これらのそれぞれの方法は、効率、精製率、費用、及び労力が異なる場合もあるが、当業者の知識の範囲内である。本開示は、タンジェンシャルフローろ過を使用して、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを生成する改善された方法を含む。タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）は、供給流の大部分がフィルターの中へではなく、フィルターの面を横切って接線方向に移動するクロスフローろ過を指す。本開示は、ＴＦＦを使用することによって、（フィルターを詰まらせる可能性がある）大半のＬＡＬタンパク質を含む保持液が、ろ過プロセスの間に実質的に洗い流され、コアギュローゲンが透過液にろ過されることを発見している。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、バッチ式デッドエンドろ過とは異なる連続的なプロセスである。
【００５７】
[0067]いくつかの実施形態において、本開示は、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを生成する方法を対象とし、当該方法は、ＬＡＬをＴＦＦに供するステップを含む。いくつかの実施形態において、当該ＬＡＬは、ＴＦＦに先立ってバッファーに入れられる。いくつかの実施形態において、バッファーは、トリスバッファー又はＭＥＳバッファーである。いくつかの実施形態において、バッファーは、約６．０〜約９．０、又は約７．０〜約８．０のｐＨを有する。
【００５８】
[0068]さまざまな膜をＴＦＦに使用することができる。いくつかの実施形態において、膜は、１０〜８０ｋＤａフィルター、又は２０〜５０ｋＤａフィルターである。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を生成する方法であって、本方法は、（ａ）コアギュローゲンを含むＬＡＬを含む、組成物を準備するステップと、（ｂ）バッファーを調整するステップと、（ｃ）（ｂ）の組成物を２０ｋＤａ〜５０ｋＤａフィルターを使用したタンジェンシャルフローろ過に供し、保持液を回収し、それにより、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを単離するステップとを含む、方法を対象とする。
【００５９】
[0069]本明細書中で開示されている方法に使用される膜としては、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを生成する方法は、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）メンブランフィルターを使用したＴＦＦを使用して実施される。ＬＡＬからのコアギュローゲンの除去を最適化するために、膜を横切るＬＡＬの流量を調節することができる。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、２００ｍｌ／分〜８００ｍｌ／分、３００ｍｌ／分〜６００ｍｌ／分、又は３５０ｍｌ／分〜５００ｍｌ／分の流量で実施される。
【実施例】
【００６０】
実施例１
タンジェンシャルフローろ過を使用したＬＡＬの精製
[0070]カブトガニの血液細胞（アメボサイト）から抽出したリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）をロンザ（バーゼル、スイス）から入手した。コアギュローゲンを除去するために、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）用のホローファイバー修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）メンブランフィルター（スペクトラムラボラトリーズ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ））にＬＡＬを供した。３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ｍＰＥＳフィルター、コールパーマー（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ）マスターフレックスポンプチュービング（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｐｕｍｐ  Ｔｕｂｉｎｇ）並びに適したポンプ及び背圧弁を使用してＴＦＦシステムをセットアップした。そのシステムをＬＡＬ試薬水（ＬＲＷ）で洗い流し、その後、１Ｎ  ＮａＯＨを使用して室温で１時間脱パイロジェン処理をした。脱パイロジェン処理後、ＬＲＷを使用して、システムをすすぎ、その後、そのシステムを、ＴＦＦバッファーを使用して平衡化した。
【００６１】
[0071]ＬＡＬを、１：１０〜１：８の比率でＴＦＦバッファー（室温でｐＨ７．４〜７．５の７７ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス）により希釈した後、９０％の総体積が透過液中に回収されるまで、５〜８ｐｓｉの膜間差圧（ＴＭＰ）を維持しながら４３０ｍｌ／分の流量でフィルターに供給した。その後、保持液を１：１０〜１：８の比率でＴＦＦバッファーによりさらに希釈した後、フィルターに供給した。保持液の体積がＬＡＬの最初の体積と同じになるまで、保持液の希釈を繰り返し、ＬＡＬを処理した。コアギュローゲンは、透過液中に回収された一方で、残りのタンパク質は保持液中に保持された。透過液及び保持液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析は、保持液中のコアギュローゲンが実質的に減少したことを示した。
【００６２】
[0072]ＴＦＦ最適化プロセスの間、ｐＨ６．２の７７ｍＭ  ＮａＣｌを有する５０ｍＭ  ＭＥＳを含む、バッファーも使用した。但し、ＬＡＬから除去される総タンパク質の最高パーセンテージは、トリスバッファーを用いたときに見られた。
【００６３】
[0073]ＴＦＦに使用する前、ロンザの標準的なＫＱＣＬキットを使用してすべてのバッファーをエンドトキシンに関して試験した。
【００６４】
実施例２
コアギュローゲンの定量
[0074]ＬＡＬ保持液に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ／タンパク質ゲル染色を実施し、元のＬＡＬ中の２０ｋＤコアギュローゲンバンドのバンド密度を、あれば、ＴＦＦ保持液中のコアギュローゲンバンドのバンド密度と比較することによって、ＬＡＬ中の残存コアギュローゲンの半定量的評価を行った。例えば、図７Ａ参照。
【００６５】
[0075]さらに、α−コアギュローゲン抗体を使用して、ウエスタンブロットを実施した後、２０ｋＤコアギュローゲンバンドのバンド密度を比較した。例えば、図７Ｂを参照。
【００６６】
[0076]（コアギュローゲンを含有する）ＬＡＬ透過液を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した後、３つのバンドの配列決定をすることによってコアギュローゲンの正体を確認した。図９参照。タンパク質配列決定によって３つのバンドのそれぞれがコアギュローゲン断片と確認された。
【００６７】
[0077]両定量方法は、本発明がかなりの割合のコアギュローゲンをＬＡＬから除去したことを確認している。
【００６８】
[0078]ＬＡＬ中のコアギュローゲンの量は、ウエスタンブロット分析を使用して決定した。図８Ａ。ウエスタンブロット分析の結果は、標準曲線と合っていた。図８Ｂ。その結果は、約６６２ｎｇ／２０００ｎｇ、すなわちＬＡＬ中の総タンパク質の約３３％がコアギュローゲンであることを示した。
【００６９】
実施例３
実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬの安定性
[0079]実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬの安定性を調査した。実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬサンプルを１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０週間保管した。示した期間の終わりに、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬサンプルを９６ウェルプレート中のＬＡＬ発色試薬と混合し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定するインキュベートプレートリーダーに入れる。その反応を黄色の外観により経時的に自動的に監視した。
【００７０】
[0080]エンドトキシンの存在下において、ライセートは、発色基質を切断して、溶液を黄色くすることになる。変化に必要とされる時間は、存在するエンドトキシンの量と反比例する。各サンプルに関して５０ｍＯＤに達するのに必要とされる時間は、図１０でわかる。このデータは、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬが少なくとも１０週間安定であることを示唆している。
【００７１】
実施例４
コアギュローゲン除去は分離を改善する
[0081]複数のオンセットｍＯＤにおける分離に対して、ＬＡＬからコアギュローゲンを除去することが有する効果の調査を行った。通常のＬＡＬ対実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬの比較は、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを使用した場合に、それぞれのオンセットｍＯＤにおける分離の増加を示した。分離を増加させるために実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを使用することによって、アッセイの目標の感度を、より低いオンセットｍＯＤ設定においてより短い時間で達成することができる。配合物を調製するために実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを使用すると、０．００５ＥＵ／ｍｌの目標の感度を、３６８秒の分離で２６分で達成できる。通常のＬＡＬを使用すると、０．００５ＥＵ／ｍｌの感度を５０ｍＯＤにおいて３２分で達成するが、分離はわずか６７秒である。
【００７２】
[0082]このデータは、ＬＡＬからのコアギュローゲンの除去が分離を改善することを示唆している。
【００７３】
実施例５
ＬＡＬ及び実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ配合物の発色検出
[0083]ＬＡＬ及び実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬの両方のサンプルを、０．００５ＥＵ／ｍｌ、０．０５ＥＵ／ｍｌ、０．５ＥＵ／ｍｌ、５ＥＵ／ｍｌ及び５０ＥＵ／ｍｌの標準に対してＬＡＬ調製物中２０％、３０％、４０％及び５０％の濃度で試験した。さらに、さまざまな濃度のズイッタージェントも試験した。図３及び図４。このデータは、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ及びズイッタージェントの濃度を高めると、ＬＡＬ及び実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ配合物の両方に関してそれぞれ標準に対する反応速度が増加したことを示唆している。但し、ＬＡＬ配合物により反応速度が増加するため、ブランクと最低の標準（０．００５ＥＵ／ｍｌ）との間では分離が失われる一方で、すべての実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ配合物に関しては、少なくとも２００秒の分離が維持されている。増加したズイッタージェントと配合した実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬは、許容される分離で０．００１ＥＵ／ｍｌの感度を達成した。（データは示していない）。
【００７４】
実施例６
実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬと発色基質の比率
[0084]実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬと発色基質の最適な比率を２００ｍＯＤ及び５０ｍＯＤにおいて調査した。図５Ａ及び図５Ｂ。このデータは、７０％のＬＡＬ調製物と３０％の発色基質の比率が最速の反応時間になったことを示している。実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬの３つの異なるロットを見ると、この観察結果が確認された。図６Ａ。
【００７５】
[0085]実施形態のいずれの範囲からも逸脱することなく、本明細書に記載されている方法及び用途に対する他の適した変更及び適応が行えることは、関連分野の当業者には容易にわかるであろう。上述の実施例は、例示する目的のためだけに含まれ、限定することは意図しない。
【００７６】
[0086]特定の実施形態が本明細書中で例示され、記載されてきたが、特許請求の範囲は、記載され、示されている特定の形態又は部分の配置に限定されないことが理解されるべきである。本明細書には、実例となる実施形態が開示されてきており、特定の用語が利用されているが、それらの用語は、一般的で説明的な意味でのみ使用され、限定の目的ではない。上記の教示を考慮して、実施形態の変更及び変形が可能である。したがって、実施形態が具体的に記載されている以外の方法で実施されてもよいことが理解されるべきである。
【００７７】
[0087]各種実施形態が上に記載されてきたが、当然のことながら、それら実施形態は、本技術の実例及び例として提示されたにすぎず、限定の意図ではない。本技術の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び細部にさまざまな変更を行うことができることは関連分野の当業者には明白であろう。したがって、本技術の広さ及び範囲は、上記の実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ定義されるべきである。本明細書において述べられているそれぞれの実施形態、及び本明細書中で引用されるそれぞれの文献のそれぞれの特徴を、任意のその他の実施形態の特徴と組み合わせて使用することができることも理解されるであろう。本明細書において述べられているすべての特許及び公報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019526052.tif 000002
【図２】
2019526052.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月4日(2018.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発色アッセイを使用して、サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、前記方法が、
ａ．前記サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含む試薬と接触させるステップと、
ｂ．前記サンプル中のエンドトキシンの存在下における前記発色基質の変化によって生じる発色効果を測定するステップとを含み、
前記ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法。
【請求項２】
前記基質が、３個を超えるアミノ酸と共有結合したｐ−ニトロアニリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発色基質が、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記発色基質の前記変化が、酵素反応により起こる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素反応が、ポリペプチドからの発色団の切断である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
発色効果を測定する前記ステップが、３８０ｎｍ〜４２０ｎｍにおける吸光度を測定することによって達成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
発色効果を測定する前記ステップが、４０５ｎｍにおける吸光度を測定することによって達成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試薬が、液体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試薬が、水性液体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試薬が、凍結乾燥され、その後、前記サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＬＡＬが、凍結乾燥され、その後、前記サンプルと接触させるステップに先立って再構成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発色基質が、凍結乾燥され、その後、前記サンプルと接触させるステップに先立って再構成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、生物学的サンプルである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが、非経口剤形、ワクチン、抗生剤、治療用タンパク質、治療用核酸、治療用抗体、及び生物学的製剤からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
実質的にコアギュローゲンを含まない前記ＬＡＬが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって測定される場合に、前記ＬＡＬ中の総タンパク質に対して５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
実質的にコアギュローゲンを含まない前記ＬＡＬが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって測定される場合に、前記ＬＡＬ中の総タンパク質に対して２％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
実質的にコアギュローゲンを含まない前記ＬＡＬが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって測定される場合に、前記ＬＡＬ中の総タンパク質に対して０．５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記発色アッセイが、シングルキュベット分光測定、マルチキュベット分光測定、又はマイクロプレートリーダーを使用して行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記発色効果を標準と比較して、前記サンプル中のエンドトキシンの量を求めるステップをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
発色アッセイを使用して、生物学的サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、前記方法が、
ａ．前記生物学的サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及びＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）を含む水性試薬と接触させるステップと、
ｂ．前記サンプル中のエンドトキシンの存在下におけるＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）からのｐＮＡの酵素切断によって生じる４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定するステップとを含み、
前記ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法。
【請求項２１】
＞０．００１ＥＵ／ｍＬエンドトキシンの感度を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含み、前記ＬＡＬは実質的にコアギュローゲンを含まない、組成物。
【請求項２３】
前記発色基質が、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＬＡＬ及び発色基質が、凍結乾燥されている、請求項２２又は２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＬＡＬ及び発色基質が、水溶液中にある、請求項２２又は２３に記載の組成物。
【請求項２６】
７０％のＬＡＬ調製物及び３０％の発色基質を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
ａ．実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）と、
ｂ．発色基質と、
ｃ．前記ＬＡＬ及び発色基質を使用してエンドトキシンを検出するための説明書と
を含む、キット。
【請求項２８】
前記ＬＡＬが、凍結乾燥されている、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記ＬＡＬが、水溶液中にある、請求項２７又は２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記ＬＡＬ及び前記発色基質が、単一の容器に入れてある、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
前記ＬＡＬを含む滅菌容器をさらに含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記滅菌容器が、滅菌バイアルである、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
対照標準エンドトキシンをさらに含む、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を生成する方法であって、前記方法が、
ａ．コアギュローゲンを含むＬＡＬを含む、組成物を準備するステップと、
ｂ．バッファーを調整するステップと、
ｃ．（ｂ）の前記組成物を２０ｋＤａ〜５０ｋＤａフィルターを使用したタンジェンシャルフローろ過に供することにより、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを単離するステップと
を含む、方法。
【請求項３５】
前記ＴＦＦが、３５０ｍｌ／分〜５００ｍｌ／分の流量で実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記バッファーが、トリスバッファー又はＭＥＳバッファーである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記バッファーが、約７．０〜８．０のｐＨを有する、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記フィルターが、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＴＦＦフィルターが、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）メンブランフィルターである、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、発色アッセイを使用してサンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含む試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下における発色基質の変化によって生じる発色効果を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法に関する。本方法はまた、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを含む組成物及びキット、並びにそのようなものを生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]グラム陰性菌エンドトキシンは、静脈内に導入されたときに発熱の原因となる生物学的パイロジェンである。リポ多糖（ＬＰＳ）としても知られているエンドトキシンは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）及びナイセイラ（Ｎｅｉｓｓｅｉｒａ）などのグラム陰性菌の外膜に見られる。エンドトキシンが引き起こす毒性機構は、リポ多糖の脂質部分が原因となる。例えば、生物内において細菌の溶解が起きると、血流に入る脂質の存在下における応答は、補体系の活性化による可能性がある。この脂質部分がインターロイキン１及び８などのさまざまなサイトカインの放出につながる。腫瘍壊死因子の産生も活性化される場合がある。もたらされた感染症は、炎症過程と関連づけられ、感染した生物に大きな危険性を与える可能性がある。インターロイキン１は、免疫応答として、炎症に対して生物が放出する一連のサイトカインである。このシグナルは、感染症が起こった場所への好中球の遊走につながり、走化性をもたらす。これは、ファゴサイトーシスが生じるのを促進するが、ある場合には、個体の免疫系の状態及び感染のレベルに応じて、エンドトキシンが敗血症によってもたらされるリスクとともに、全身敗血症に至ることもあろう。グラム陰性菌が高等な哺乳動物において全身感染症による多臓器不全及びさらには死を引き起こした多くの症例があることが知られている。エンドトキシンと関連する有害な影響のため、医薬産業及び医療界にとってエンドトキシンの早期の高感度の検出があることが重要である。
【０００３】
[0003]リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）試験は、エンドトキシンを検知するための方法として１９７０年代に商業的に導入された。ＬＡＬは、カブトガニ、アメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）の血液細胞、又はアメボサイト由来のものである。もともとのＬＡＬ試験は、セリンプロテアーゼのカスケードを構成し、このカスケードはわずかなレベルのエンドトキシンによって引き起こされ、反応の終わりにゲル凝塊となる。通常、酵素前駆体として存在するＣ因子は、この凝固カスケードのプライマーである。インビボにおいて、Ｃ因子は、グラム陰性感染菌の存在をカブトガニに警告する完璧なバイオセンサーである。血流停止の終点は、感染菌を捕捉し、感染菌を死滅させ、さらなる感染を制限する。
【０００４】
[0004]ＬＡＬ試験は、エンドトキシンに対するアメボサイトの応答を測定するためのさまざまな方法を使用するために改変することができる。こうした方法としては、いわゆるゲル化法、比濁法及び発色法が挙げられる。これらのＬＡＬ試験は、薬剤の製造及び最終製品に対して使用される原料中の両方の細菌毒素を検出するための方法として国際的薬局方において推奨されている。こうした試験は、ＦＤＡ（食品医薬品局）が推奨するパイロジェンの検出のための方法であるため、化粧品産業に対して及び食物生産においても有用である。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を含む発色アッセイを使用して、サンプル中のエンドトキシンを検出する方法が本明細書において提供される。
【０００６】
[0006]本明細書中の実施形態は、発色アッセイを使用して、サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含む試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下における発色基質の変化によって生じる発色効果を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法を対象とする。
【０００７】
[0007]いくつかの実施形態において、発色基質は、３個を超えるアミノ酸と共有結合したｐ−ニトロアニリンである。いくつかの実施形態において、発色基質は、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）である。いくつかの実施形態において、発色基質の変化は、酵素反応により起こる。いくつかの実施形態において、酵素反応は、ポリペプチドからの発色団の切断である。いくつかの実施形態において、発色効果は、３８０ｎｍ〜４２０ｎｍにおける吸光度を検出することによって測定される。いくつかの実施形態において、発色効果は、４０５ｎｍにおける吸光度を検出することによって測定される。
【０００８】
[0008]いくつかの実施形態において、試薬は、液体である。いくつかの実施形態において、試薬は、水性液体である。いくつかの実施形態において、試薬は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される。
【０００９】
[0009]いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って再構成される。いくつかの実施形態において、発色基質は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って再構成される。
【００１０】
[0010]いくつかの実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは、非経口剤形、ワクチン、抗生剤、治療用タンパク質、治療用核酸、治療用抗体、及び生物学的製剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定され、ウエスタンブロットによって確認される場合に、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬは、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して２％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬは、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して０．５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、シングルキュベット分光測定、マルチキュベット分光測定、又はマイクロプレートリーダーを使用して行われる。
【００１１】
[0011]いくつかの実施形態において、本方法は、発色効果を標準と比較して、サンプル中のエンドトキシンの量を求めるステップをさらに含む。
【００１２】
[0012]いくつかの実施形態において、本開示は、発色アッセイを使用して、生物学的サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）生物学的サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及びＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）を含む水性試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下におけるＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）からのｐＮＡの酵素切断によって生じる４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法を対象とする。
【００１３】
[0013]いくつかの実施形態において、本開示の方法は、高い感度を有する。いくつかの実施形態において、本方法は、＞０．００１ＥＵ／ｍＬエンドトキシンの感度を有する。
【００１４】
[0014]いくつかの実施形態において、本開示の方法は、実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含む組成物を対象とする。いくつかの実施形態において、発色基質は、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）である。いくつかの実施形態において、ＬＡＬ及び発色基質は、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態において、ＬＡＬ及び発色基質は、水溶液中にある。
【００１５】
[0015]いくつかの実施形態において、本開示の方法は、キットであって、（ａ）実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）と、（ｂ）発色基質と、（ｃ）ＬＡＬ及び発色基質を使用してエンドトキシンを検出するための説明書とを含む、キットを対象とする。
【００１６】
[0016]いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、水溶液中にある。いくつかの実施形態において、ＬＡＬ及び発色基質は、単一の容器に入れてある。いくつかの実施形態において、キットは、ＬＡＬを含む滅菌容器をさらに含む。いくつかの実施形態において、滅菌容器は、滅菌バイアルである。いくつかの実施形態において、キットは、対照標準エンドトキシンをさらに含む。
【００１７】
[0017]いくつかの実施形態において、本開示は、実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を生成する方法であって、本方法は、（ａ）コアギュローゲンを含むＬＡＬを含む、組成物を準備するステップと、（ｂ）バッファーを調整するステップと、（ｃ）（ｂ）の組成物を２０ｋＤａ〜５０ｋＤａフィルターを使用したタンジェンシャルフローろ過に供することにより、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを単離するステップとを含む、方法を対象とする。
【００１８】
[0018]いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、３５０ｍｌ／分〜５００ｍｌ／分の流量で実施される。いくつかの実施形態において、バッファーは、トリスバッファー又はＭＥＳバッファーである。いくつかの実施形態において、バッファーは、約７．０〜８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、フィルターは、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）である。いくつかの実施形態において、ＴＦＦフィルターは、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）メンブランフィルターである。
【００１９】
[0019]本技術の前述及び他の特徴及び態様は、実施形態の以下の説明から、さらに添付の図面に示されているとおり、さらに良好に理解可能である。本明細書に組み込まれ、明細書の一部を形成する添付の図面は、本技術の原理を説明するためにさらに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】濁度及び発色分析点を含む、エンドトキシン関連カスケードの略図である。
【図２】通常のＬＡＬ対実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを含むサンプルの比較が、複数のオンセットミリ光学密度（ｍＯＤ）値において分離の増加を示している表である。ＥＵ／ｍｌ＝１ミリリットル当たりのエンドトキシン単位。
【図３】標準的なＬＡＬ（Ｌ）及びズイッタージェント（ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）（Ｚ）の濃度の反応速度に対する影響の比較を示す表である。Ｌ及びＺの濃度を高めると、それぞれ標準の反応速度が増加する。反応の速度が増加するため、ブランクと最低の標準（０．００５ＥＵ／ｍｌ）との間の分離が失われる。
【図４】実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ（Ｌ−ｃｏ）及びズイッタージェント（Ｚ）の濃度の反応速度に対する影響の比較を示す表である。Ｌ−ｃｏ及びＺの濃度を高めると、それぞれ標準の反応速度が増加する。すべての配合物に関して少なくとも２００秒の分離が維持されている。増加したズイッタージェントと配合したＬ−ｃｏは、許容される分離を伴い０．００１ＥＵ／ｍｌの感度を達成した（データは示していない）。
【図５Ａ】（Ａ）２００ｍＯＤ及び（Ｂ）５０ｍＯＤにおけるＬ−ｃｏ及び発色基質に関するさまざまな濃度の反応時間を示すグラフである。図５Ｃは、Ｌを使用したアッセイと比較したＬ−ｃｏを使用したアッセイの増加した感度、反応時間、及び分離の概要を示す表である。
【図５Ｂ】（Ａ）２００ｍＯＤ及び（Ｂ）５０ｍＯＤにおけるＬ−ｃｏ及び発色基質に関するさまざまな濃度の反応時間を示すグラフである。図５Ｃは、Ｌを使用したアッセイと比較したＬ−ｃｏを使用したアッセイの増加した感度、反応時間、及び分離の概要を示す表である。
【図５Ｃ】（Ａ）２００ｍＯＤ及び（Ｂ）５０ｍＯＤにおけるＬ−ｃｏ及び発色基質に関するさまざまな濃度の反応時間を示すグラフである。図５Ｃは、Ｌを使用したアッセイと比較したＬ−ｃｏを使用したアッセイの増加した感度、反応時間、及び分離の概要を示す表である。
【図６Ａ】（Ａ）７０％のＬ−ｃｏ調製物及び３０％の発色基質を使用した３つの別々のロットのＬ−ｃｏの５０ｍＯＤにおける反応時間を示す表である（分離範囲：７３２秒〜２１１秒）。
【図７Ａ】（Ａ）タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）（３０ｋＤａ）に供されたＬＡＬサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析であり、３ランに関して還元条件下においてＴＦＦ生成物が流される。３回目のランの後、ゲル凝固は確認されていない。ゲル凝塊のデータは、固体ゲル凝塊を「＋」、ゲル凝塊なしを「−」、及び柔らかいゲル凝塊を「−／＋」と表した。（Ｂ）３ランに関して還元条件下において行ったタンジェンシャルフローろ過（３０ｋＤａ）生成物のウエスタンブロット分析である。抗体希釈物は以下のとおりとした：α−コアギュローゲン  １：１，０００、α−凝固酵素前駆体  １：１０，０００、α−ｓｕｓｈｉ３  １：１００。
【図７Ｂ】（Ａ）タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）（３０ｋＤａ）に供されたＬＡＬサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析であり、３ランに関して還元条件下においてＴＦＦ生成物が流される。３回目のランの後、ゲル凝固は確認されていない。ゲル凝塊のデータは、固体ゲル凝塊を「＋」、ゲル凝塊なしを「−」、及び柔らかいゲル凝塊を「−／＋」と表した。（Ｂ）３ランに関して還元条件下において行ったタンジェンシャルフローろ過（３０ｋＤａ）生成物のウエスタンブロット分析である。抗体希釈物は以下のとおりとした：α−コアギュローゲン  １：１，０００、α−凝固酵素前駆体  １：１０，０００、α−ｓｕｓｈｉ３  １：１００。
【図８Ａ】（Ａ）α−コアギュローゲンを使用したウエスタンブロット分析を使用したコアギュローゲンの定量である。（Ｂ）標準曲線にプロットした図８（Ａ）のデータのグラフである。データは、総ＬＡＬタンパク質の約３３％がコアギュローゲンであることを示唆している。
【図８Ｂ】（Ａ）α−コアギュローゲンを使用したウエスタンブロット分析を使用したコアギュローゲンの定量である。（Ｂ）標準曲線にプロットした図８（Ａ）のデータのグラフである。データは、総ＬＡＬタンパク質の約３３％がコアギュローゲンであることを示唆している。
【図９】コアギュローゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。還元条件下において行う３３と、コアギュローゲンの３つのバンドが存在する。タンパク質配列決定により、３つのバンドがコアギュローゲン断片であることを確認した。Ａ＝コアギュローゲン１：位置２１  ＧＤＰＮＶＰＴＣＬＣ（配列番号：２）；Ｂ＝コアギュローゲン２：位置３９  ＫＶＩＶＳＱＥＫＴＤ（配列番号：３）；Ｃ＝コアギュローゲン３：位置６７  ＧＦＳＩＦＧＧＨＰＡ（配列番号：４）。
【図１０Ａ】２つの別々のロットのＬ−ｃｏの安定性を５０ｍＯＤにおいて１０週間にわたって判断した。このデータは、Ｌ−ｃｏが１０週間の期間を超えて安定であったことを示唆している。
【図１０Ｂ】２つの別々のロットのＬ−ｃｏの安定性を５０ｍＯＤにおいて１０週間にわたって判断した。このデータは、Ｌ−ｃｏが１０週間の期間を超えて安定であったことを示唆している。
【図１１Ａ】ロンザ（Ｌｏｎｚａ）、チャールズリバーラボラトリーズインターナショナル（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、及びアソシエーツオブケープコッドインク（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．）（ＡＣＣ）からの市販のＬＡＬ中のコアギュローゲンの存在をタンパク質染色及びウエスタンブロット分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して試験した。これにより、３つすべての供給業者からのＬＡＬはコアギュローゲンを含有していたことを確認した。
【図１１Ｂ】ロンザ（Ｌｏｎｚａ）、チャールズリバーラボラトリーズインターナショナル（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、及びアソシエーツオブケープコッドインク（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．）（ＡＣＣ）からの市販のＬＡＬ中のコアギュローゲンの存在をタンパク質染色及びウエスタンブロット分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して試験した。これにより、３つすべての供給業者からのＬＡＬはコアギュローゲンを含有していたことを確認した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
[0031]本明細書において示され、記載されている個々の実装は例であり、別の方法で本出願の範囲を限定することは全く意図されないことが理解されるべきである。
【００２２】
[0032]本明細書において言及される公開特許、特許出願、ウェブサイト、企業名、及び科学文献は、それぞれが参照により組み込まれることを具体的に個別に示したのと同じ程度までその全体を参照により本明細書に組み込んだものとする。本明細書中で引用される任意の文献と本明細書の特定の教示の間のいかなる矛盾も後者を優先して決定されるものとする。同様に、語又は語句の本分野において理解されている定義と本明細書において具体的に教示されている語又は語句の定義の間のいかなる矛盾も後者を優先して決定されるものとする。
【００２３】
[0033]本明細書において使用される場合、内容が明らかに別のことを指示しない限り、単数形の「１つ（ａ、ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」は、具体的にそれらが言及する用語の複数形も包含する。「約」という用語は、ほぼ、〜の辺り、だいたい、又はおよそを意味するよう本明細書中で使用される。「約」という用語が数値的な範囲と共に使用される場合、その用語は、記載した数値を超える及び下回る境界に拡大することによってその範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、２０％の変動だけ明記された値を上回る及び下回る数値に変更するよう本明細書中で使用される。
【００２４】
[0034]本明細書中で使用される技術及び科学用語は、別に定義されない限り、本出願が属する分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。本明細書では、当業者に知られているさまざまな技法及び材料に対する参照を行う。本明細書中で引用されるいかなる文献の開示も、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２５】
[0035]いくつかの実施形態において、本発明は、エンドトキシンを検出する方法を対象とする。「エンドトキシン」という用語は、一般にグラム陰性菌の外膜と関連づけられるリポ多糖複合体を指す。「エンドトキシン」という用語は、ときとして、任意の細胞関連細菌毒素を指すために使用される。エンドトキシンは細胞関連リポ多糖を指すが、エクソトキシンは細菌が分泌する毒素を指し、本質的に主としてポリペプチドである。
【００２６】
[0036]エンドトキシンの生物学的活性は、リポ多糖（ＬＰＳ）と関連づけられる。リポ多糖は、グラム陰性菌の細胞壁の外膜の部分である。リポ多糖は、微生物が病原性であろうとなかろうと常にグラム陰性菌と関連づけられる。毒性は、脂質成分（リピドＡ）と関連づけられ、免疫原性は、多糖成分と関連づけられる。グラム陰性菌の細胞壁抗原（Ｏ抗原）は、ＬＰＳの多糖成分である。さらに、ＬＰＳは、動物においてさまざまな炎症反応を誘発する可能性がある。
【００２７】
[0037]動物内のグラム陰性菌は、増殖している間に微量のエンドトキシンを放出することがある。エンドトキシンが、自然免疫の刺激をもたらすこともある。実験室で増殖された幼若培養菌によって少量のエンドトキシンが可溶型で放出されることもあることが知られている。しかしながら、大部分に関して、エンドトキシンは微生物の崩壊まで細胞壁と関連づけられたままである。細菌性生物の崩壊は、細菌細胞の自己溶解、補体及びリゾチームが関係する外因的溶解、並びに食細胞消化によって生じる場合がある。細菌性エンドトキシンは、ヒト腸内に豊富にある。高濃度のエンドトキシンは、いくつかのメタボリックシンドローム疾患を含む多くの状態と関連づけられる。メタボリックシンドローム疾患としては、例えば、アテローム動脈硬化症、インスリン耐性、真性糖尿病、及び肥満が挙げられる。エンドトキシンレベルの増加は、脂肪肝疾患及びクローン病とも関連づけられている。高いレベルで存在する場合、胃腸管からエンドトキシンが漏れ出す可能性もある。エンドトキシンは強力な炎症性抗原であり、エンドトキシンの漏出は、全身性炎症反応をもたらす可能性がある。
【００２８】
[0038]細菌の典型的なエクソトキシンと比較して、エンドトキシンは、酵素的に作用しないため、作用があまり強力でなく、あまり特異的でない。エンドトキシンは熱安定性である（３０分間の煮沸はエンドトキシンを不安定にしない）が、スーパーオキシド、ペルオキシド及び次亜塩素酸塩などの特定の強力な酸化剤がエンドトキシンを中和することが報告されている。これらの酸化剤は、強力な酸化剤であるため、エンドトキシンを中和するための治療用組成物にはあまり適用できない。
【００２９】
[0039]本発明のエンドトキシンは、グラム陰性菌から作り出すことができる。例となるグラム陰性菌としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）菌種、シゲラ菌種、サルモネラ菌種、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）菌種、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）菌種、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌種、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）菌種、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）菌種、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）菌種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）菌種、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌種、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）菌種、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）菌種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）菌種、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）菌種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）菌種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌種、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）菌種及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）菌種が挙げられるが、これらに限定されるものではない。グラム陰性細菌はまた、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ナイセリア科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、ベイヨネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、ビブリオ科（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）、パスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、及びフソバクテリア科（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に入るものでもよい。いくつかの実施形態において、エンドトキシンは、サルモネラ又はエシェリキア菌種由来である。
【００３０】
[0040]本明細書中で使用される場合、「エンドトキシン活性」という用語は、発熱性及び敗血症性ショックを含む毒性の原因となり得るグラム陰性菌の部分を指す。エンドトキシンによる毒の影響は、グラム陰性菌の外膜に存在するか、又はそれに由来するリポ多糖分子のグリコシル化リピドＡ部分と関連づけられることがわかっている。
【００３１】
[0041]「リポ多糖」（ＬＰＳ）という用語は、共有結合によって結合した脂質及び多糖からなる大きな分子（糖リン脂質）を指す。ＬＰＳは、３つの部分：１）Ｏ抗原、２）コアオリゴ糖、及び３）リピドＡを含む。Ｏ抗原は、コアオリゴ糖と結合した反復グリカンポリマーであり、ＬＰＳ分子の最も外側の領域を含む。コアオリゴ糖は、リピドＡと直接結合しており、一般的にヘプトース及び３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸（ＫＤＯ、ケトデオキシオクツロソナートとしても知られている）などの糖を含有する。リピドＡは、複数の脂肪酸と結合したリン酸化グルコサミン二糖である。脂肪酸は、ＬＰＳを細菌膜に固定し、ＬＰＳの残りの部分は、細胞表面から突き出ている。ＬＰＳが変化したか、又は除去された場合、細菌死が起こることもある。
【００３２】
[0042]エンドトキシン活性は、ＬＰＳのリピドＡ領域部分に存在する。細菌細胞が免疫系によって溶解されると、リピドＡを含有する膜の断片が血液循環に放出され、発熱（発熱性）、下痢、及び場合によっては、命にかかわるショック（エンドトキシン又は敗血症性ショックと呼ばれる）を引き起こす。ＬＰＳの毒性は、宿主に対して命にかかわる結果がある場合もある、炎症性サイトカイン、主に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の分泌に至るプロセスである哺乳動物の免疫系のＢ細胞及びマクロファージとの相互作用によりリピドＡによって示される。リピドＡはまた、「インビトロにおいて」ヒトＴリンパ球（Ｔｈ−１）並びに「インビボにおいて」マウスのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、その特性が、宿主の免疫系がＬＰＳの可変サイズの炭水化物鎖に対して特異的な既往ＩｇＧ抗体応答を開始するのを可能にする。これらに基づいて、ＬＰＳは、「インビボにおける」Ｔ細胞依存性抗原として最近、認識されている。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、リピドＡを検出することを対象とする。
【００３３】
[0043]いくつかの実施形態において、エンドトキシンは、発色アッセイを使用して検出される。本明細書中で使用される場合、発色アッセイは、エンドトキシンの存在下における発色基質（すなわち、色原体）の吸光度の変化を測定又は検出する。いくつかの実施形態において、発色基質の吸光度の変化は、酵素活性によるものである。いくつかの実施形態において、「発色基質」という用語は、酵素活性の前及び後の基質を指す。例えば、発色基質が、酵素によって切断されて、ペプチドと発色団を生じるペプチド発色団である場合、「発色基質」という用語は、ペプチド発色団、切断されたペプチド、及び放出発色団を指すであろう。いくつかの実施形態において、合成色原体が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、天然に産生される色原体が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、発色基質は、合成ペプチドである。いくつかの実施形態において、基質は、極めて高感度であり、すなわち、非常に低い酵素活性を検出することができる。
【００３４】
[0044]低い酵素濃度を検出するための発色基質を含む試薬の能力は、発色基質を、例えば、研究又は品質管理手順のいずれかにおけるエンドトキシンと関連づけられる特定の酵素活性の存在に関する調査に対して有用にする。場合によっては、特定の酵素調製物に対する基質の応答が天然発色基質（すなわち、酵素に対する天然基質）と合成発色基質との間で一致しないこともある。いくつかの実施形態において、発色基質は、天然基質と比較して選択性が低く、すなわち、関連酵素に対する反応性において低い識別力を有する。
【００３５】
[0045]「発色基質」という用語は、エンドトキシンの存在下において基質の吸光度スペクトルを変化させる、例えば、色を変化させる、アッセイにおける基質、例えば、化合物又はポリペプチドを指す。発色基質は、特定の波長において（ｉ）吸収する、及び／又は（ｉｉ）吸収しない、の両方の基質を指す。したがって、例えば、本開示によると、発色基質は、特定の波長をもともと吸収しない場合もあり（例えば、可視波長において非吸収）、その後、エンドトキシンの存在下において、特定の波長で（例えば、可視波長において）吸収し始める場合もある。或いは、例えば、発色基質は、特定の波長においてもともと吸収する場合もあり（例えば、可視波長において吸収する）、その後、エンドトキシンの存在下において、特定の波長において吸収しない場合もある（例えば、可視波長において吸収しない）。いくつかの実施形態において、発色基質は、エンドトキシンの非存在下で所与の波長において吸収し、その後、エンドトキシンの存在下で異なる波長において吸収する場合もある。１つ以上の特定の波長における吸光度特性すなわち、発色効果の変化は、エンドトキシンの存在と相互に関連する場合がある。
【００３６】
[0046]いくつかの実施形態において、発色基質は、発色ペプチド基質である。いくつかの実施形態において、発色ペプチド基質は、初めは無色である。いくつかの実施形態において、発色ペプチド基質は、初めに色、例えば、可視スペクトル（およそ３９０〜７００ｎｍ）の色を有する。いくつかの実施形態において、発色ペプチド基質が、酵素によって切断されると、色の変化が生じる場合があり、例えば、発色団が放出されて、得られた生成物の色の変化を引き起こす。いくつかの実施形態において、切断が生成物の光学的性質を変化させ、この性質は切断されていない基質の性質とは異なり、分光光度測定によって測定することができる。ペプチド基質と結合できる発色基の非限定例は、パラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）、５−アミノ−２−ニトロ安息香酸（ＡＮＢＡ）、７−アミノ−４−メトキシクマリン（ＡＮＣ）、キノニルアミド（ＱＵＡ）、ジメチル５−アミノイソフタレート（ＤＰＡ）及びそれらの誘導体である。蛍光基質としては、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣ［Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル；ＡＭＣ＝７−アミノ−４−メチルクマリン］、ホモバニリン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、還元型フェノキサジン、還元型ベンゾチアジン、アンプレックス（Ａｍｐｌｅｘ）（登録商標）、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド及びそれらの構造的変形（参照により組み込まれる、米国特許第５，２０８，１４８号、同第５，２４２，８０５号、同第５，３６２，６２８号、同第５，５７６，４２４号、及び同第５，７７３，２３６号）、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド及びフッ素化クマリンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（参照により組み込まれる、米国特許第５，８３０，９１２号）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３７】
[0047]非限定発色アッセイは、Ｃ因子／Ｂ因子カスケードに基づく酵素活性アッセイである。そのカスケードにおける第１の成分であるＣ因子は、エンドトキシン結合によって活性化されるプロテアーゼ前駆体である。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、組換え型のＣ因子（ｒＦＣ）を使用する。この経路において、Ｂ因子は、Ｃ因子によって活性化される。Ｂ因子は、凝固酵素前駆体を凝固酵素に活性化する。いくつかの実施形態において、凝固酵素前駆体は、発色基質の発色変化を引き起こす。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、ＬＡＬアッセイ、例えば、ロンザのエンドポイント発色ＬＡＬアッセイ（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  Ａｓｓａｙ）である。
【００３８】
[0048]いくつかの実施形態において、発色アッセイは、ＬＡＬアッセイであり、この場合、ＬＡＬエンドトキシン反応の最初の部分が、凝固酵素前駆体を活性化し、酵素が、次に合成基質からｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）を酵素的に切断して、黄色の色を生じさせる。
【００３９】
酵素前駆体＋エンドトキシン→酵素
基質＋Ｈ２Ｏ＋酵素→ペプチド＋ｐＮＡ（黄色）
[0049]いくつかの実施形態において、グラム陰性菌エンドトキシンは、ＬＡＬ中の酵素前駆体の活性化を間接的に触媒することが可能である。活性化の最初の速度は、存在するエンドトキシンの濃度によって決まる可能性がある。
【００４０】
[0050]いくつかの実施形態において、発色基質の変化は、酵素反応により生じる。いくつかの実施形態において、酵素反応は、ペプチド結合の切断をもたらし、それによって、ポリペプチドから発色団置換基（例えば、ｐ−ＮＡ）を切断する。例えば、活性化酵素は、無色のペプチド基質、例えば、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）からのｐＮＡの放出を触媒することができる。いくつかの実施形態において、ペプチド基質は、３個を超えるアミノ酸と共有結合したｐ−ニトロアニリンである。いくつかの実施形態、実施形態において、発色基質は、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１））である。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、遊離ｐＮＡを測定する。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、３８０ｎｍ〜４１０ｎｍ、例えば、４００ｎｍ〜４１０ｎｍ、又は４０５ｎｍの吸光度において遊離ｐＮＡを測光法で測定する。吸光度を測定する方法は、当業者に周知である。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、吸光度を測定するために、シングルキュベット分光測定、マルチキュベット分光測定、又はマイクロプレートリーダーを使用して行われる。
【００４１】
[0051]遊離ｐＮＡは、反応が停止試薬により停止された後、３８０ｎｍ〜４１０ｎｍ、例えば、４０５ｎｍにおいて測光法で測定することができる。サンプル中のエンドトキシンの濃度は、既知の量のエンドトキシン標準を含有する溶液の吸光度値の標準曲線から算出される。
【００４２】
[0052]エンドトキシンを検出するための標準的な発色アッセイの１つは、サンプルを試薬と接触させるステップを含み、試薬は、リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を含む。いくつかの実施形態において、試薬は、液体、例えば、水性液体である。或いは、試薬は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させられる前に水性液体、例えば、滅菌水又はバッファー溶液中で再構成されてもよい。いくつかの実施形態において、試薬は、液体である。いくつかの実施形態において、試薬は、水性液体である。いくつかの実施形態において、試薬は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される。いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される。いくつかの実施形態において、発色基質は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される。いくつかの実施形態において、凍結乾燥は、発色アッセイにおける試薬、ＬＡＬ、及び／又は発色基質のより長い及び／又はより確固とした保管を可能にする。例えば、いくつかの実施形態において、凍結乾燥試薬、ＬＡＬ及び／又は発色基質は、発色アッセイにおける非凍結乾燥試薬、ＬＡＬ、及び又は発色基質と比較して、２０％を超える、３０％を超える、４０％を超える、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える又は１００％を超える安定性の時間の増加を可能にする。この文脈において使用される場合の「安定性」は、意図した目的のため、すなわち、同じ速度及び感度でエンドトキシンを検出するために働くアッセイを指す。例えば、非凍結乾燥試薬が３週間安定であった場合、６週間安定の凍結乾燥試薬が、安定性の時間の「１００％の増加」を有することになろう。
【００４３】
[0053]本開示は、サンプル中のエンドトキシンを検出するための改善された方法を提供する。「サンプル」という用語は、任意の物質、化合物、ツール又は機器を含んでもよい。但し、実際的な目的に対して、サンプルとしては、生物学的な生物、例えば、哺乳動物、ヒト、飼育動物、又は動物園の動物と接触した物質、化合物、ツール又は機器を挙げることができる。「サンプル」という用語は、（製造プロセスの終わりまでに受け取る原料からの）エンドトキシンの発生源が、サンプルを脳脊髄液又は心血管系と接触させるのには適していないものにする可能性のあるあらゆる医療機器、医薬品及びバイオテクノロジー製品を指す場合がある。いくつかの実施形態において、サンプルという用語は、インビボで脳脊髄液又は心血管系、例えば、ヒトと接触させることになる医療機器を指す。いくつかの実施形態において、サンプルという用語は、生物学的サンプルを指す。いくつかの実施形態において、サンプルは、非経口剤形、ワクチン、抗生剤、治療用タンパク質、治療用核酸、治療用抗体、及び生物学的製剤からなる群から選択される。
【００４４】
[0054]「リムルスアメボサイトライセート」（ＬＡＬ）という用語は、カブトガニ、アメリカカブトガニ由来の血液細胞の水性抽出物（アメボサイト）を指す。カブトガニ由来の血液細胞の水性抽出物は、感染菌を動けなくすることによって感染菌の広がりを妨げる血リンパのゲル形成タンパク質であるコアギュローゲンを含む。例えば、Ｉｗａｎａｇａ  Ｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８：３０５〜３１８ページ（１９８５年）及びＩｗａｎａｇａ  Ｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５（６）：１７９３〜１８０１ページ（１９８４年）参照。
【００４５】
[0055]カブトガニ（リムルス）の凝固カスケード系は、血流停止及び宿主防御の両方に関与する。このカスケードは、可溶性タンパク質であるコアギュローゲンの不溶性コアギュリンゲルへの変換をもたらす。凝固酵素は、コアギュローゲンから断片ペプチドＣを削り取り、モノマーの凝集を引き起こす。
【００４６】
[0056]「コアギュローゲン」という用語は、Ｉｗａｎａｇａ（１９８４年）及びＩｗａｎａｇａ（１９８５年）において見られるとおりのポリペプチド鎖を指し、このポリペプチド鎖は、単一の１７５残基のポリペプチド鎖であり、血球に含有される凝固酵素によってＡｒｇ−１８及びＡｒｇ−４６の後で切断され、細菌性エンドトキシン（リポ多糖）によって活性化される。切断は、ペプチドＣとともに、２つのジスルフィド結合によって連結されコアギュリンの２つの鎖、Ａ及びＢを放出する。ゲル形成は、コアギュリン分子の連結の結果生じる。二次構造予測は、コアギュローゲンからコアギュリンゲルへのタンパク質分解性変換中に放出されるＣペプチドがアルファ−ヘリックスを形成することを示唆する。分子中に見られるベータ−シート構造及び１６ハーフシスチンが、酸及び熱に対して安定な小型のタンパク質をもたらすようである。
【００４７】
[0057]コアギュローゲンは、ゲル形成（例えば、凝固アッセイ）に重要であるが、本開示は、発色アッセイには必須ではないことを発見している。本開示は、天然に生じる量のコアギュローゲンを伴うＬＡＬを含む発色アッセイと比較して、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを含む発色アッセイが高いレベルの速度、感度、及び分離を達成したことを発見している。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを含む発色アッセイを対象とする。
【００４８】
[0058]いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、実質的にコアギュローゲンを含まない。当業者は、本開示を読むと、さまざまな量のコアギュローゲンの減少が発色アッセイ、例えば、ＬＡＬアッセイにおける速度、感度及び／又は分離のレベルを高めることになることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、「実質的に含まない」という用語は、タンパク質染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定され、ウエスタンブロットによって確認された場合に、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満又は０．５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有するＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、「実質的に含まない」という用語は、タンパク質染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定され、ウエスタンブロットによって確認された場合に、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して１０％未満又は５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有するＬＡＬを指す。
【００４９】
[0059]いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬという用語は、コアギュローゲンが除去されていないＬＡＬ中のコアギュローゲンの量と比較して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％（ｗｔ／ｗｔ）のコアギュローゲンが除去されたＬＡＬを指す。
【００５０】
[0060]いくつかの実施形態において、発色アッセイは、サンプル中のエンドトキシンの有無を判断する。他の実施形態において、発色アッセイは、サンプル中のエンドトキシンの量を定量することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、サンプル中のエンドトキシンの量を求めるために、サンプル中のエンドトキシンの発色効果を既知のエンドトキシン標準と比較するステップをさらに含む。
【００５１】
[0061]いくつかの実施形態において、本開示は、発色アッセイを使用して、生物学的サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）生物学的サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及びＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）を含む水性試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下におけるＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）からのｐＮＡの酵素切断によって生じる４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法を対象とする。
【００５２】
[0062]ＬＡＬからコアギュローゲンを除去することによって、発色アッセイは高い感度を有することが可能である。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、高い感度を有する。いくつかの実施形態において、本方法は、０．０５ＥＵ／ｍＬ未満、０．０３ＥＵ／ｍＬ未満、０．０１ＥＵ／ｍＬ未満、０．００８ＥＵ／ｍＬ未満、０．００６ＥＵ／ｍＬ未満、０．００５ＥＵ／ｍＬ未満、０．００４ＥＵ／ｍＬ未満、０．００３ＥＵ／ｍＬ未満、０．００２ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．００１ＥＵ／ｍＬ未満の感度を有する。
【００５３】
[0063]本開示は、（１）実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬと、（２）発色基質とを含む、組成物をさらに対象とする。いくつかの実施形態において、組成物中の発色基質は、ｐＮＡを含む。いくつかの実施形態において、組成物中の発色基質は、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）である。いくつかの実施形態において、組成物は、６０％〜８０％の実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ調製物と、２０％〜４０％の発色基質とを含む（ｗｔ／ｗｔ）。いくつかの実施形態において、組成物は、約６％〜約２５％の実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、７０％の実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ調製物と、３０％の発色基質とを含む（ｗｔ／ｗｔ）。いくつかの実施形態において、組成物は、７０％の実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ調製物と、３０％のＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）とを含む（ｗｔ／ｗｔ）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、単一の容器、例えば、単一のバイアルに入れてある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、凍結乾燥されている。例えば、本開示は、７０％の実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ調製物と、３０％のＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（配列番号：１）（ｗｔ／ｗｔ）とを含む、凍結乾燥組成物を特に示す。
【００５４】
[0064]いくつかの実施形態において、本発明は、発色アッセイキットを対象とする。本キットは、ＬＡＬ及び発色基質を含む試薬を含む、ＬＡＬ発色アッセイと通常関連づけられる１つ以上の成分を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、（ａ）実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）と、（ｂ）発色基質と、（ｃ）ＬＡＬ及び発色基質を使用してエンドトキシンを検出するための説明書とを含む、キットを対象とする。いくつかの実施形態において、本キットは、さまざまな試薬を含み、それぞれの試薬が異なる量のコアギュローゲンが除去されたＬＡＬを有する。
【００５５】
[0065]本キットは、１つ以上の容器を含むことが可能である。いくつかの実施形態において、ＬＡＬ及び発色基質は、単一の容器に入れてある。いくつかの実施形態において、ＬＡＬ及び発色基質は、２つの別個の容器に入れてある。いくつかの実施形態において、本キットは、ＬＡＬを含む滅菌容器を含む。いくつかの実施形態において、本キットは、アッセイに使用するためのＬＡＬ及び／又は発色基質を再構成することができる再構成バッファーを含む。いくつかの実施形態において、滅菌容器は、滅菌バイアルである。いくつかの実施形態において、本キットは、陽性エンドトキシン対照として使用することが可能であるか、又は標準中のエンドトキシンの量を定量するために使用可能である対照標準エンドトキシンをさらに含む。いくつかの実施形態において、本キットは、２つ以上の対照標準エンドトキシンを１つ以上の濃度で含む。
【００５６】
[0066]当業者は、ＬＡＬからコアギュローゲンを除去するためにさまざまな方法を使用することが可能であることを理解することができる。これらのそれぞれの方法は、効率、精製率、費用、及び労力が異なる場合もあるが、当業者の知識の範囲内である。本開示は、タンジェンシャルフローろ過を使用して、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを生成する改善された方法を含む。タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）は、供給流の大部分がフィルターの中へではなく、フィルターの面を横切って接線方向に移動するクロスフローろ過を指す。本開示は、ＴＦＦを使用することによって、（フィルターを詰まらせる可能性がある）大半のＬＡＬタンパク質を含む保持液が、ろ過プロセスの間に実質的に洗い流され、コアギュローゲンが透過液にろ過されることを発見している。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、バッチ式デッドエンドろ過とは異なる連続的なプロセスである。
【００５７】
[0067]いくつかの実施形態において、本開示は、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを生成する方法を対象とし、当該方法は、ＬＡＬをＴＦＦに供するステップを含む。いくつかの実施形態において、当該ＬＡＬは、ＴＦＦに先立ってバッファーに入れられる。いくつかの実施形態において、バッファーは、トリスバッファー又はＭＥＳバッファーである。いくつかの実施形態において、バッファーは、約６．０〜約９．０、又は約７．０〜約８．０のｐＨを有する。
【００５８】
[0068]さまざまな膜をＴＦＦに使用することができる。いくつかの実施形態において、膜は、１０〜８０ｋＤａフィルター、又は２０〜５０ｋＤａフィルターである。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を生成する方法であって、本方法は、（ａ）コアギュローゲンを含むＬＡＬを含む、組成物を準備するステップと、（ｂ）バッファーを調整するステップと、（ｃ）（ｂ）の組成物を２０ｋＤａ〜５０ｋＤａフィルターを使用したタンジェンシャルフローろ過に供し、保持液を回収し、それにより、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを単離するステップとを含む、方法を対象とする。
【００５９】
[0069]本明細書中で開示されている方法に使用される膜としては、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを生成する方法は、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）メンブランフィルターを使用したＴＦＦを使用して実施される。ＬＡＬからのコアギュローゲンの除去を最適化するために、膜を横切るＬＡＬの流量を調節することができる。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、２００ｍｌ／分〜８００ｍｌ／分、３００ｍｌ／分〜６００ｍｌ／分、又は３５０ｍｌ／分〜５００ｍｌ／分の流量で実施される。
【実施例】
【００６０】
実施例１
タンジェンシャルフローろ過を使用したＬＡＬの精製
[0070]カブトガニの血液細胞（アメボサイト）から抽出したリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）をロンザ（バーゼル、スイス）から入手した。コアギュローゲンを除去するために、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）用のホローファイバー修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）メンブランフィルター（スペクトラムラボラトリーズ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ））にＬＡＬを供した。３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ｍＰＥＳフィルター、コールパーマー（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ）マスターフレックスポンプチュービング（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｐｕｍｐ  Ｔｕｂｉｎｇ）並びに適したポンプ及び背圧弁を使用してＴＦＦシステムをセットアップした。そのシステムをＬＡＬ試薬水（ＬＲＷ）で洗い流し、その後、１Ｎ  ＮａＯＨを使用して室温で１時間脱パイロジェン処理をした。脱パイロジェン処理後、ＬＲＷを使用して、システムをすすぎ、その後、そのシステムを、ＴＦＦバッファーを使用して平衡化した。
【００６１】
[0071]ＬＡＬを、１：１０〜１：８の比率でＴＦＦバッファー（室温でｐＨ７．４〜７．５の７７ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス）により希釈した後、９０％の総体積が透過液中に回収されるまで、５〜８ｐｓｉの膜間差圧（ＴＭＰ）を維持しながら４３０ｍｌ／分の流量でフィルターに供給した。その後、保持液を１：１０〜１：８の比率でＴＦＦバッファーによりさらに希釈した後、フィルターに供給した。保持液の体積がＬＡＬの最初の体積と同じになるまで、保持液の希釈を繰り返し、ＬＡＬを処理した。コアギュローゲンは、透過液中に回収された一方で、残りのタンパク質は保持液中に保持された。透過液及び保持液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析は、保持液中のコアギュローゲンが実質的に減少したことを示した。
【００６２】
[0072]ＴＦＦ最適化プロセスの間、ｐＨ６．２の７７ｍＭ  ＮａＣｌを有する５０ｍＭ  ＭＥＳを含む、バッファーも使用した。但し、ＬＡＬから除去される総タンパク質の最高パーセンテージは、トリスバッファーを用いたときに見られた。
【００６３】
[0073]ＴＦＦに使用する前、ロンザの標準的なＫＱＣＬキットを使用してすべてのバッファーをエンドトキシンに関して試験した。
【００６４】
実施例２
コアギュローゲンの定量
[0074]ＬＡＬ保持液に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ／タンパク質ゲル染色を実施し、元のＬＡＬ中の２０ｋＤコアギュローゲンバンドのバンド密度を、あれば、ＴＦＦ保持液中のコアギュローゲンバンドのバンド密度と比較することによって、ＬＡＬ中の残存コアギュローゲンの半定量的評価を行った。例えば、図７Ａ参照。
【００６５】
[0075]さらに、α−コアギュローゲン抗体を使用して、ウエスタンブロットを実施した後、２０ｋＤコアギュローゲンバンドのバンド密度を比較した。例えば、図７Ｂを参照。
【００６６】
[0076]（コアギュローゲンを含有する）ＬＡＬ透過液を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した後、３つのバンドの配列決定をすることによってコアギュローゲンの正体を確認した。図９参照。タンパク質配列決定によって３つのバンドのそれぞれがコアギュローゲン断片と確認された。
【００６７】
[0077]両定量方法は、本発明がかなりの割合のコアギュローゲンをＬＡＬから除去したことを確認している。
【００６８】
[0078]ＬＡＬ中のコアギュローゲンの量は、ウエスタンブロット分析を使用して決定した。図８Ａ。ウエスタンブロット分析の結果は、標準曲線と合っていた。図８Ｂ。その結果は、約６６２ｎｇ／２０００ｎｇ、すなわちＬＡＬ中の総タンパク質の約３３％がコアギュローゲンであることを示した。
【００６９】
実施例３
実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬの安定性
[0079]実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬの安定性を調査した。実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬサンプルを１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０週間保管した。示した期間の終わりに、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬサンプルを９６ウェルプレート中のＬＡＬ発色試薬と混合し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定するインキュベートプレートリーダーに入れる。その反応を黄色の外観により経時的に自動的に監視した。
【００７０】
[0080]エンドトキシンの存在下において、ライセートは、発色基質を切断して、溶液を黄色くすることになる。変化に必要とされる時間は、存在するエンドトキシンの量と反比例する。各サンプルに関して５０ｍＯＤに達するのに必要とされる時間は、図１０でわかる。このデータは、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬが少なくとも１０週間安定であることを示唆している。
【００７１】
実施例４
コアギュローゲン除去は分離を改善する
[0081]複数のオンセットｍＯＤにおける分離に対して、ＬＡＬからコアギュローゲンを除去することが有する効果の調査を行った。通常のＬＡＬ対実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬの比較は、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを使用した場合に、それぞれのオンセットｍＯＤにおける分離の増加を示した。分離を増加させるために実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを使用することによって、アッセイの目標の感度を、より低いオンセットｍＯＤ設定においてより短い時間で達成することができる。配合物を調製するために実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを使用すると、０．００５ＥＵ／ｍｌの目標の感度を、３６８秒の分離で２６分で達成できる。通常のＬＡＬを使用すると、０．００５ＥＵ／ｍｌの感度を５０ｍＯＤにおいて３２分で達成するが、分離はわずか６７秒である。
【００７２】
[0082]このデータは、ＬＡＬからのコアギュローゲンの除去が分離を改善することを示唆している。
【００７３】
実施例５
ＬＡＬ及び実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ配合物の発色検出
[0083]ＬＡＬ及び実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬの両方のサンプルを、０．００５ＥＵ／ｍｌ、０．０５ＥＵ／ｍｌ、０．５ＥＵ／ｍｌ、５ＥＵ／ｍｌ及び５０ＥＵ／ｍｌの標準に対してＬＡＬ調製物中２０％、３０％、４０％及び５０％の濃度で試験した。さらに、さまざまな濃度のズイッタージェントも試験した。図３及び図４。このデータは、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ及びズイッタージェントの濃度を高めると、ＬＡＬ及び実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ配合物の両方に関してそれぞれ標準に対する反応速度が増加したことを示唆している。但し、ＬＡＬ配合物により反応速度が増加するため、ブランクと最低の標準（０．００５ＥＵ／ｍｌ）との間では分離が失われる一方で、すべての実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ配合物に関しては、少なくとも２００秒の分離が維持されている。増加したズイッタージェントと配合した実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬは、許容される分離で０．００１ＥＵ／ｍｌの感度を達成した。（データは示していない）。
【００７４】
実施例６
実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬと発色基質の比率
[0084]実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬと発色基質の最適な比率を２００ｍＯＤ及び５０ｍＯＤにおいて調査した。図５Ａ及び図５Ｂ。このデータは、７０％のＬＡＬ調製物と３０％の発色基質の比率が最速の反応時間になったことを示している。実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬの３つの異なるロットを見ると、この観察結果が確認された。図６Ａ。
【００７５】
[0085]実施形態のいずれの範囲からも逸脱することなく、本明細書に記載されている方法及び用途に対する他の適した変更及び適応が行えることは、関連分野の当業者には容易にわかるであろう。上述の実施例は、例示する目的のためだけに含まれ、限定することは意図しない。
【００７６】
[0086]特定の実施形態が本明細書中で例示され、記載されてきたが、特許請求の範囲は、記載され、示されている特定の形態又は部分の配置に限定されないことが理解されるべきである。本明細書には、実例となる実施形態が開示されてきており、特定の用語が利用されているが、それらの用語は、一般的で説明的な意味でのみ使用され、限定の目的ではない。上記の教示を考慮して、実施形態の変更及び変形が可能である。したがって、実施形態が具体的に記載されている以外の方法で実施されてもよいことが理解されるべきである。
【００７７】
[0087]各種実施形態が上に記載されてきたが、当然のことながら、それら実施形態は、本技術の実例及び例として提示されたにすぎず、限定の意図ではない。本技術の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び細部にさまざまな変更を行うことができることは関連分野の当業者には明白であろう。したがって、本技術の広さ及び範囲は、上記の実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ定義されるべきである。本明細書において述べられているそれぞれの実施形態、及び本明細書中で引用されるそれぞれの文献のそれぞれの特徴を、任意のその他の実施形態の特徴と組み合わせて使用することができることも理解されるであろう。本明細書において述べられているすべての特許及び公報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７８】
［配列表］
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年９月５日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、０１３２−００２３ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、１，０５５バイトのサイズである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2019526052.tif 000019
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2019526052.tif 000020
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2019526052.tif 000021
【国際調査報告】
2019526052.tif 000022
2019526052.tif 000023
2019526052.tif 000024