(57)【要約】  広範に防御的な抗インフルエンザ抗体を誘発するワクチン。本ワクチンは、グループ２インフルエンザウイルス由来のＨＡ三量体を表面上に提示するナノ粒子を含む。ナノ粒子は、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の安定化されたステム領域に連結された単量体サブユニット（例えば、フェリチン）を含む融合タンパク質である。融合タンパク質は自己集合してＨＡ提示ナノ粒子を形成する。本発明はまた、融合タンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸分子、および本発明のナノ粒子を使用する抗インフルエンザ抗体を検出するためのアッセイも提供する。
2019537424.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グループ２インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を含む組換えタンパク質であって、ヘッド領域のアミノ酸配列が、インフルエンザＨＡタンパク質のヘッド領域に由来する５個未満の連続アミノ酸を含むリンカーで置き換えられており、タンパク質の哺乳動物への投与が、哺乳動物におけるグループ２インフルエンザＨＡタンパク質に対する免疫応答を誘発する、組換えタンパク質。
【請求項２】
組換えタンパク質が、グループ２インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質のステム領域に由来する第１のアミノ酸配列と、グループ２インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質のステム領域に由来する第２のアミノ酸配列とを含み、
第１および第２のアミノ酸配列が、リンカー配列によって共有結合により連結され、
第１のアミノ酸配列が、ヘッド領域配列のアミノ末端の上流のアミノ酸配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含み、
第２のアミノ酸配列が、ヘッド領域配列のカルボキシル末端の下流のアミノ酸配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む、
請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
単量体サブユニットに連結している、請求項１または２に記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
単量体サブユニットタンパク質が、フェリチンまたはルマジンシンターゼに由来する、請求項３に記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を含むナノ粒子であって、インフルエンザＨＡタンパク質の三量体を表面上に提示する、ナノ粒子。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、または請求項５に記載のナノ粒子、およびアジュバントを含むワクチン組成物。
【請求項８】
請求項７に記載のワクチン組成物の免疫学的有効量を、必要とするヒトに投与することを含む、ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染の病理学的作用を阻止または低減する方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする核酸。
【請求項１０】
ＤＮＡである、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項５に記載のナノ粒子、請求項６に記載の免疫原性組成物、請求項７に記載のワクチン組成物、請求項９に記載の核酸分子、または請求項１１に記載のベクターの予防または治療有効量を対象に投与することを含む、ワクチン接種方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項５に記載のナノ粒子、請求項６に記載の免疫原性組成物、請求項７に記載のワクチン組成物、請求項９に記載の核酸分子、または請求項１１に記載のベクターの予防または治療有効量を、必要とする対象に投与することを含む、インフルエンザ関連疾患の処置方法。
【請求項１７】
生理学的に許容される担体と組み合わせた、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を含むワクチン。
【請求項１８】
抗インフルエンザ抗体を検出する方法であって、
ａ．抗インフルエンザ抗体の存在に関して試験される試料の少なくとも一部を、請求項５に記載のナノ粒子に接触させること；および
ｂ．ナノ粒子／抗インフルエンザ抗体複合体の存在を検出すること
を含み、
ナノ粒子／抗体複合体の検出は、試料が抗インフルエンザ抗体を含むことを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
インフルエンザウイルスに対するワクチン接種によって誘導される防御免疫応答は主に、ウイルスと宿主細胞受容体との相互作用に関与するウイルス表面上の糖タンパク質であるウイルスＨＡタンパク質に向けられる。ウイルス表面上のＨＡタンパク質は、ＨＡタンパク質単量体の三量体であり、これらは酵素的に切断されてアミノ末端のＨＡ１ポリペプチドと、カルボキシル末端のＨＡ２ポリペプチドとを生じる。球状のヘッドは、ＨＡ１ポリペプチドの主要部分のみからなり、ＨＡタンパク質をウイルス脂質エンベロープに固定するステムは、ＨＡ２およびＨＡ１の一部で構成される。ＨＡタンパク質の球状のヘッドは、２つのドメイン、すなわち、シアル酸結合部位を含む約１４８アミノ酸残基のドメインである受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と、ＲＢＤのすぐ下のより小さい約７５アミノ酸残基の領域であるvestigialエステラーゼドメインとを含む。球状のヘッドは、免疫優性エピトープを含むいくつかの抗原性部位を含む。例には、Ｓａ、Ｓｂ、Ｃａ１、Ｃａ２、およびＣｂ抗原性部位が挙げられる（例えば、Caton, et al, 1982, Cell 31, 417-427を参照されたい）。ＲＢＤ−Ａ領域は、Ｓａ抗原性部位およびＳｂ抗原性部位の一部を含む。
【０００２】
インフルエンザに対する抗体はしばしば、保存されたシアル酸結合部位を取り巻く、ＨＡの球状ヘッドにおける可変の抗原性部位を標的とし、このため抗原的に近縁のウイルスのみを中和する。ＨＡヘッドの可変性は、インフルエンザウイルスの不断の抗原連続変異が原因であり、インフルエンザの季節性エンデミックの一因である。これに対し、ＨＡステムは、高度に保存されており、抗原連続変異をほとんど受けない。残念なことに、免疫優性ヘッドとは異なり、保存されたＨＡステムはそれほど免疫原性ではない。さらに、ウイルスゲノムの遺伝子セグメントは、宿主種中で遺伝子再集合（抗原不連続変異）を受け得、それによって、パンデミックとなりうる、抗原性が変化した新規ウイルスを作製することができる［Salomon, R. et al. Cell 136, 402-410 (2009)］。現在まで、インフルエンザワクチンは、新たに流行するウイルスに関して予想されるＨＡおよびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を反映するように毎年最新のものにされている。
【０００３】
最近、高度に保存されたＨＡステムを認識する、インフルエンザウイルスに対する全く新しいクラスの広範な中和抗体が単離された［Corti, D. et al. J Clin Invest 120, 1663-1673 (2010); Ekiert, D.C. et al. Science 324, 246-251 (2009); Kashyap, A.K. et al. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5986-5991 (2008); Okuno, Y. et al. J Virol 67, 2552-2558 (1993); Sui, J. et al. Nat Struct Mol Biol 16, 265-273 (2009); Ekiert, D.C. et al. Science 333, 843-850 (2011); Corti, D. et al. Science 333, 850-856 (2011)］。株特異的抗体とは異なり、これらの抗体は、多数の抗原的に異なるウイルスを中和することができ、したがってそのような抗体を誘導することは、次世代万能ワクチン開発の焦点となっている［Nabel, G.J. et al. Nat Med 16, 1389-1391 (2010)］。しかし、そのような多中和プロファイルを有する抗体をワクチン接種によって強く誘発することは難しい［Steel, J. et al. MBio 1, e0018 (2010); Wang, T.T. et al. PLoS Pathog 6, e1000796 (2010); Wei, C.J. et al. Science 329, 1060-1064 (2010)］。遺伝子操作によって、ＨＡの免疫優性ヘッド領域（競合するエピトープを含む）を除去し、得られたステムドメインを安定化することは、広く中和作用を示すステム抗体の誘発を改善する１つの有望な方法である。
【０００４】
現行のインフルエンザワクチン戦略は、化学的に不活化した、または生きている弱毒化インフルエンザウイルスのいずれかを使用する。いずれのワクチンも一般的に、発育卵において産生されているが、プロセスに時間がかかり、生産能力が限られることから、製造上の制限が大きい。現行のワクチンの別のより重要な制限は、その有効性が非常に株特異的であることである。これらの問題は、２００９年のＨ１Ｎ１型のパンデミックの出現により特に明白となり、それら制限を克服することができる新規ワクチンプラットフォームの必要性が確認された。ウイルス様粒子は、そのような代替アプローチの１つを表し、現在、臨床試験において評価されている［Roldao, A. et al. Expert Rev Vaccines 9, 1149-1176 (2010); Sheridan, C. Nat Biotechnol 27, 489-491 (2009)］。発育卵の代わりに、しばしばＨＡ、ＮＡ、およびマトリックスタンパク質１（Ｍ１）を含むＶＬＰを、哺乳動物または昆虫細胞発現系において大量産生することができる［Haynes, J.R. Expert Rev Vaccines 8, 435-445 (2009)］。このアプローチの利点は、その微粒子の多価の性質、および感染性のビリオンを忠実に模倣する適切に折り畳まれた三量体ＨＡスパイクが正しく提示されることにある。一方、エンベロープを有するＶＬＰは、その構成の性質により、少量ではあってもある程度、宿主細胞構成要素を含むので、このプラットフォームの繰り返し使用により潜在的に、安全性、免疫原性の問題が生じ得る［Wu, C.Y. et al. PLoS One 5, e9784 (2010)］。その上、ＶＬＰによって誘導される免疫は、現行のワクチンと本質的に同じであり、このため、ワクチン誘導防御免疫の効力および幅の両方を有意に改善する可能性は低い。ＶＬＰに加えて、組換えＨＡタンパク質も、ヒトにおいても評価されているが［Treanor, J.J. et al. Vaccine 19, 1732-1737 (2001); Treanor, J.J. JAMA 297, 1577-1582 (2007)］、防御中和抗体力価を誘導する能力は限定的である。それらの治験において使用された組換えＨＡタンパク質は、昆虫細胞において産生されており、ネイティブの三量体を優先的に形成しないかもしれない［Stevens, J. Science 303, 1866-1870 (2004)］。
【０００５】
旧来のインフルエンザワクチンの代替物はいくつかあったが、過去数十年間の生物工学の進歩は、生物材料の操作を、新規ワクチンプラットフォーム生成のために利用することを可能にした。ほぼ全ての生きている生物に見出される鉄貯蔵タンパク質であるフェリチンは、多数の潜在的生化学／生物医学的目的のために、広範に研究され、操作されている一例であり［Iwahori, K. 米国特許出願公開第２００９／０２３３３７７号(2009); Meldrum, F.C. et al. Science 257, 522-523 (1992); Naitou, M. et al. 米国特許出願公開第２０１１／００３８０２５号(2011); Yamashita, I. Biochim Biophys Acta 1800, 846-857 (2010)］。そのような例には、外因性のエピトープペプチドを提示するための潜在的ワクチンプラットフォームが含まれる［Carter, D.C. et al. 米国特許出願公開第２００６／０２５１６７９号(2006); Li, C.Q. et al. Industrial Biotechnol 2, 143-147 (2006)］。ワクチンプラットフォームとしてのその使用は、その自己集合および抗原の多価提示のために特に興味深く、それによって一価型より強くＢ細胞応答を誘導し、また、Ｔ細胞非依存性の抗体応答を誘導する［Bachmann, M.F. et al. Annu Rev Immunol 15, 235-270 (1997); Dintzis, H.M. et al. Proc Natl Acad Sci USA 73, 3671-3675 (1976)］。さらに、４３２対称性を有する八面体のケージに集合する２４サブユニットからなるフェリチンの分子構造は、その表面上に多量体抗原を提示する潜在性を有する。
【０００６】
これまでの研究から、グループ１ヘマグルチニンタンパク質のステム領域を修飾して、立体構造が完全長の野生型（ｗｔ）インフルエンザヘマグルチニンタンパク質の融合前の立体構造に非常に類似している、安定化したＨＡステムタンパク質を形成することができることが示されている。加えて、そのような修飾された安定化ステム（ＳＳ）ＨＡタンパク質を、フェリチンなどの単量体サブユニットタンパク質に結合させると、得られた融合タンパク質は、表面にＳＳ−ＨＡタンパク質の三量体を提示するナノ粒子を形成した。その上、そのようなナノ粒子は、グループ１インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発することができ、それにより、ナノ粒子によって提示されるＳＳ−ＨＡタンパク質三量体が、ｗｔインフルエンザＨＡタンパク質の立体構造と類似の立体構造を有することが示された。そのようなコンストラクトは、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３２６９５号に開示されている。しかし、上記ナノ粒子によって誘発される抗体は、グループ２インフルエンザウイルスに対するよりグループ１インフルエンザウイルスに対して防御的であった。
【０００７】
したがって、グループ２インフルエンザウイルスに対する強い防御を提供する有効なインフルエンザワクチンがなおも必要である。さらに、将来の進化する季節性およびパンデミックインフルエンザウイルス株を含む、インフルエンザウイルスの多くの株から個体を保護するインフルエンザワクチンもなおも必要である。本発明は、可変の免疫優性ヘッド領域を欠く新規グループ２ＨＡ安定化ステム（ＳＳ）がナノ粒子表面に融合したものからなる新規ナノ粒子ベースのワクチンを提供し、それにより、製造が容易で、強力で、広範にヘテロサブタイプ防御的である抗体を誘発するインフルエンザワクチンを提供することによって、前記必要を満たすものである。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本開示は、グループ２インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を含む組換えタンパク質であって、ヘッド領域のアミノ酸配列が、インフルエンザＨＡタンパク質のヘッド領域からの５個未満の連続アミノ酸を含むリンカーで置き換えられている組換えタンパク質を提供する。この組換えタンパク質は、哺乳動物に投与すると、該哺乳動物においてグループ２インフルエンザＨＡタンパク質に対する免疫応答を誘発する。
【０００９】
本開示の組換えタンパク質は、グループ２インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質のステム領域からの第１のアミノ酸配列と、グループ２インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質のステム領域からの第２のアミノ酸配列とを含み得、第１および第２のアミノ酸配列は、リンカー配列によって共有結合により連結され、第１のアミノ酸配列は、ヘッド領域配列のアミノ末端の上流のアミノ酸配列からの少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含み、第２のアミノ酸配列は、ヘッド領域配列のカルボキシル末端の下流のアミノ酸配列からの少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含み得る。この組換えタンパク質コンストラクトにおいて、第１のアミノ酸配列は、ヘッド領域のアミノ末端に直接に隣接する上流ポリペプチド配列からの少なくとも２０個の連続アミノ酸を含み得る。あるいは、またはさらに、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号２９からの少なくとも２０個の連続アミノ酸を含み得る。あるいは、またはさらに、第２のアミノ酸配列は、ヘッド領域のカルボキシル末端に直接に隣接する下流ポリペプチド配列からの少なくとも２０個の連続アミノ酸を含み得る。あるいは、またはさらに、第１のアミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３３からの少なくとも２０個の連続アミノ酸を含み得る。
【００１０】
本開示の組換えタンパク質は、第１のシステインアミノ酸を含むように修飾されたヘッド領域配列に連結されたヘリックスＣのアミノ末端（すなわちヘリックスＣの膜遠位末端）と、第１および第２のシステインがジスルフィド結合を形成するように第２のシステインアミノ酸を含むリンカー配列とを含み得る。
【００１１】
本開示の組換えタンパク質は、組換えＨＡステムタンパク質の三次元構造が、ネイティブのグループ２ＨＡタンパク質におけるＨＡステム領域の三次元構造に類似するように修飾されたヘリックス間領域（すなわち、ヘリックスＣのＮ末端をヘリックスＡのカルボキシル末端（すなわち、ヘリックスＡの膜遠位末端）に連結するアミノ酸配列）を含み得る。本開示の組換えタンパク質は、ヘリックス間領域を置換する、８個未満のアミノ酸長のアミノ酸リンカー配列を含み得る。
【００１２】
本開示の組換えタンパク質は、アミノ酸の付加によって伸長したヘリックスＡの膜遠位末端を含み得る。
【００１３】
本開示の組換えタンパク質は、ヘリックスＡを形成するアミノ酸配列のカルボキシル末端に結合してヘリックスＡの長さを伸長させるヘリックスを形成する第３のアミノ酸リンカーを含み得る。ヘリックスＣの遠位末端は、第３のリンカーのカルボキシル末端に、リンカーペプチドによって結合し得る。リンカーペプチドは、好ましくは８個未満のアミノ酸長である。
【００１４】
本開示の組換えタンパク質は、該タンパク質の安定性を高める１つまたは複数の突然変異を含み得る。そのような安定化突然変異は、好ましくはヘリックスＡおよびヘリックスＣのうちの少なくとも１つを形成するアミノ酸配列中に存在する。
【００１５】
本開示の組換えタンパク質は、フェリチンまたはルマジンシンターゼから選択される単量体サブユニットに結合され得る。
【００１６】
本開示の例示的な組換えタンパク質は、配列番号４７〜１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、または少なくとも８５％同一、または少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
【００１７】
本開示の例示的な組換えタンパク質は、配列番号４７〜１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【００１８】
本開示はまた、本開示の少なくとも１つの組換えタンパク質を含むナノ粒子も提供する。
【００１９】
本開示はまた、本開示の組換えタンパク質と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのタンパク質を含む免疫原性組成物も提供する。本開示の免疫原性組成物は、配列番号４７〜１５９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を含み得る。この免疫原性組成物は、配列番号４７〜１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含み得る。本開示はまた、本開示の免疫原性組成物とアジュバントとを含むワクチン組成物も提供する。
【００２０】
本開示はまた、本開示のワクチン組成物の免疫学的有効量を、それを必要とするヒトに投与することを含む、ヒトにおけるインフルエンザウイルス感染の病理学的作用を予防または低減する方法も提供する。
【００２１】
本開示はまた、本開示の組換えタンパク質をコードする核酸を提供する。好ましくは、核酸はＤＮＡである。本開示はまた、本開示の核酸を含むベクターを提供する。本開示はまた、本開示のベクターを含む宿主細胞を提供する。本開示の宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞であり得る。これらの宿主細胞は不活化されてもよい。
【００２２】
本開示はまた、本開示の組換えタンパク質を含む医薬組成物も提供する。本開示の組成物は、生理学的に許容される担体と組み合わせて本開示の組換えタンパク質を含むワクチンであり得る。
【００２３】
本開示はまた、本開示の組換えタンパク質の予防または治療有効量を対象に投与することを含む、ワクチン接種方法も提供する。
【００２４】
本開示はまた、本開示の組換えタンパク質の予防または治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、インフルエンザ関連疾患を処置する方法も提供する。好ましくは、対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、先行技術の概要を示すものである。図１Ａは、完全長ＨＡ−フェリチンナノ粒子のデザインを表すリボンダイヤグラムである。図１Ｂは、ＨＩＶ  ｇｐ４１三量体化ドメインによって安定化されたＨＡステム−フェリチンナノ粒子のデザインを表すリボンダイヤグラムである。両方のデザインは、参照により本明細書に組み込まれる特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／５６８２２号に詳細に記載されている。図１Ｃは、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３２６９５号に開示される、グループ１ＨＡ安定化ステムナノ粒子のデザインを表すリボンダイヤグラムである。
【図２】図２は、自己集合するグループ２ＨＡステムナノ粒子の作製を示す。リボンダイヤグラムは、グループ２ＨＡ安定化ステムナノ粒子のデザインを表す（左から右に）。１つのＨＡ単量体のヘッド領域を濃灰色で表す。その同じ単量体のステム領域を中間の灰色で示す。他の２つの単量体を淡灰色で示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、グループ２ＨＡ安定化ステムナノ粒子の形成を可能にするＨ３Ｎ２デザイン２３１における突然変異を示す。図３Ａは、ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＹＰ２に基づくグループ２  Ｈ３Ｎ２安定化ＨＡステム三量体のモデルを表すリボンダイヤグラムである。ヘリックスにおける突然変異の領域を濃灰色で示す。図３Ｂは、Ｈ３デザイン＃２３１（Ａ／デンマーク３５／２００５  Ｈ３Ｎ２、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢＵ９２６９４のＨＡステムに基づく）の配列を示す。配列に対して作製した突然変異を枠で囲む。参考に、Ｃ末端ＳＧＧリンカーを太字で示し、Ｃ末端フェリチンを下線で示し、Ｎ結合（N-linked）グリカンを除去するためのＡｓｎからＧｌｎへのフェリチンの突然変異を太字で示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、Ｈ３Ｎ２デザイン２３１における、ＨＡ１ヘッドに置き換わるループにおける突然変異を示す。図４Ａは、ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＹＰ２に基づくグループ２  Ｈ３Ｎ２安定化ＨＡステム三量体のモデルを表すリボンダイヤグラムである。ＨＡ１ヘッド領域に置き換わるループにおける７つの突然変異、および該ループとジスルフィドを形成するヘリックスＣにおける追加のシステインを示す。ヘリックス領域における他の全ての突然変異を濃灰色で示す。図４Ｂは、側鎖をスティックモデルで示した、突然変異ループ（図４Ａにおいてヘッド領域に置き換わるものとして示される）を示す。図４Ｃは、ループ配列の変異体を示す。図４Ｄは、Ｈ３デザイン＃２３１の配列を示す。図４Ａ〜４Ｃに示されるヘッドおよびヘリックス領域における突然変異を枠で囲む。参考に、Ｃ末端ＳＧＧリンカーを太字で示し、Ｃ末端フェリチンを下線で示し、Ｎ結合グリカンを除去するためのＡｓｎからＧｌｎへのフェリチン突然変異を太字で示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、Ｈ３Ｎ２デザイン２３１における、ＨＡ２ヘリックスＡとＣとを連結するループにおける突然変異を示す。図５Ａは、ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＹＰ２に基づくグループ２  Ｈ３Ｎ２安定化ＨＡステム三量体のモデルを表すリボンダイヤグラムである。ＨＡ２ヘリックスＡとＣとを連結する４つの残基を示す。ヘリックスにおける突然変異を濃灰色で示す。図５Ｂは、側鎖をスティックモデルで示した、ループ（図５Ａにおいて示した領域）の拡大図である。図５Ｃは、Ｈ３デザイン＃２３１の配列を示す。図５Ａおよび５Ｂに示される、ヘリックスにおける突然変異、および短いリンカーを構成するアミノ酸を枠で囲む。参考に、Ｃ末端ＳＧＧリンカーを太字で示し、Ｃ末端フェリチンを下線で示し、Ｎ結合グリカンを除去するためのＡｓｎからＧｌｎへのフェリチン突然変異を太字で示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、Ｈ３Ｎ２デザイン２３１における、ヘリックスＡのＣ末端伸長部における突然変異を示す。図６Ａは、ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＹＰ２に基づくグループ２Ｈ３Ｎ２安定化ＨＡステム三量体のモデルを示すリボンダイヤグラムである。ヘリックスＡの５残基の伸長部を示す。ヘリックスにおける突然変異を濃灰色で示す。図６Ｂは、側鎖をスティックモデルで示した、ヘリックス伸長部（図６Ａにおいても示される）の拡大図である。図６Ｃは、Ｈ３デザイン＃２３１の配列を示す。ヘリックスにおける突然変異、および５残基の伸長部を構成する酸を枠で囲む。参考に、Ｃ末端ＳＧＧリンカーを太字で示し、Ｃ末端フェリチンを下線で示し、Ｎ結合グリカンを除去するためのＡｓｎからＧｌｎへのフェリチン突然変異を太字で示す。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、Ｈ３Ｎ２デザイン２３１における、空洞を充填する突然変異を示す。図７Ａは、ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＹＰ２に基づくグループ２  Ｈ３Ｎ２安定化ＨＡステム三量体のモデルを表すリボンダイヤグラムである。７つの空洞充填突然変異を濃灰色で示し、側鎖をスティックモデルで示す。図７Ｂは、Ｈ３デザイン＃２３１の配列を示す。ヘリックスおよびヘッド領域に対する突然変異を枠で囲む。参考に、Ｃ末端ＳＧＧリンカーを太字で示し、Ｃ末端フェリチンを下線で示し、Ｎ結合グリカンを除去するためのＡｓｎからＧｌｎへのフェリチン突然変異を太字で示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、Ｈ３安定化ステムフェリチンナノ粒子２３１（Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１）の発現および特徴付けを示す。図８Ａは、Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１のゲル濾過溶出プロファイルを示し、予想された溶出容量で単一のピークを認めた。ゲル濾過後のＥｘｐｉ２９３細胞からのＨ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１の発現収量は、７．７ｍｇ／Ｌであった。図８Ｂは、Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１のネガティブ染色電子顕微鏡法の２Ｄクラス平均を示す。中空の球体から突出するＨＡステムの整列を視認できる粒子の形成が示される。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１のＨＡステム抗体認識を示す。図９Ａは、３つのＨＡステム抗体によるカイネティックＥＬＩＳＡ  Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１認識アッセイのＥＣ５０値を記載する。Ｈ１−ＳＳ−ｎｐの認識の値も、対照として示す。いずれの場合も、ナノ粒子をプレートに固定した。図９Ｂは、Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１のＣＴ１４９認識に関するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ、Ｏｃｔｅｔ）の結合曲線（上図）、ならびにＨＡステム抗体ＣＴ１４９およびＣＲ９１１４のＢＬＩ速度定数（下図）を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｅは、Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１の５つの変異体のゲル濾過プロファイルを示す。Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１変異体、２４９（図１０Ａ）、２５６（図１０Ｂ）、２５８（図１０Ｃ）、２６２（図１０Ｄ）および２６４（図１０Ｅ）のゲル濾過Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３０プロファイル。各々の場合において、およそ１４．５ｍｌで単一のピークが溶出した。ゲル濾過後のＥｘｐｉ２９３細胞からの最終収量は、培養１Ｌ当たり６〜８ｍｇであった。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｆは、Ｈ３−ＳＳ−ｎｐナノ粒子変異体の電子顕微鏡法を示す。Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ変異体のネガティブ染色電子顕微鏡法の２Ｄクラス平均により、中空の球体から突出するＨＡステムの整列を視認できる粒子の形成が示される。Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ  ２３１粒子の画像（左上）を陽性対照として示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１の５つの変異体のカイネティックＥＬＩＳＡの結果を示す。図１２Ａ〜１２Ｃは、Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１変異体２４９、２５６、２５８、２６２、および２６４のＦＩ６（図１２Ａ）、ＣＴ１４９（図１２Ｂ）、およびＣＲ８０２０（図１２Ｃ）認識に関するカイネティックＥＬＩＳＡ曲線を示す。図１２Ｄは、図１２Ａ〜１２Ｃの曲線から求めたＥＣ５０値を記載する。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ変異体２３５〜２９５のカイネティックＥＬＩＳＡの結果を示す。図１３Ａは、広範な中和作用を有するＨＡステム抗体ＦＩ６、ＣＴ１４９、およびＤ２５（陰性対照）によるデザイン２３５〜２６５の認識を示すＥＬＩＳＡ力価を記載する。図１３Ｂは、Ｄ２５およびＣＴ１４９によるデザイン２６６〜２９６の認識を示すＥＬＩＳＡ力価を記載する。デザイン免疫原を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を播種して、上記抗体によって検出した。
【図１４】図１４は、Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ（＃２３１）および５つの変異体の動的走査熱量測定（ＤＳＣ）プロットを示す。熱容量（Ｃｐ）の温度に対するプロットは、各タンパク質に関する融解転移を表す。各デザインに関して最も早期の融解点（ＴＭ）を記す。デザインの番号をそれぞれ括弧内に記載する。このダイヤグラムでは、Ｙ軸のＣｐ値は任意スケールで示す。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、グループ２ＨＡに対するＨ３−ＳＳ−ｎｐ免疫マウスの免疫応答を示す。播種したＡ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）ＨＡ（図１５Ａ）およびＡ／アンホイ省（Ａｎｈｕｉ）／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）（図１５Ｂ）に対する、ＳＡＳアジュバント化Ｈ３−ＳＳ−ｎｐの６つの異なるバージョンによって３回免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）の血清のＥＬＩＳＡ抗体エンドポイント力価。空のフェリチンナノ粒子のみで免疫したマウスの血清を陰性対照とする。幾何平均力価を水平線で示す。濃灰色で示す部分は陰性対照の平均力価を示し、淡灰色で示す部分は陰性対照の平均力価の４倍までの範囲を示す。両側スチューデントｔ検定を使用して統計分析を実施した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｄは、グループ１ＨＡに対するＨ３−ＳＳ−ｎｐ免疫マウスの免疫応答を示す。播種したＡ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）ＨＡ（図１６Ａ）、Ａ／カナダ／７２０／２００５（Ｈ２Ｎ２）（図１６Ｂ）、Ａ／香港／１０７４／１９９９（Ｈ９Ｎ２）（図１６Ｃ）、およびＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（図１６Ｄ）に対する、ＳＡＳアジュバント化Ｈ３−ＳＳ−ｎｐの６つの異なるバージョンによって３回免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）の血清のＥＬＩＳＡ抗体エンドポイント力価。空のフェリチンナノ粒子のみで免疫したマウスの血清を陰性対照とする。幾何平均力価を水平線で示す。濃灰色で示す部分は陰性対照の平均力価を示し、淡灰色で示す部分は陰性対照の平均力価の４倍までの範囲を示す。
【図１７】図１７は、アクイフェクス・エオリクス（ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）のルマジンシンターゼ（ＬＳ）６０量体の正二十面体ナノ粒子のＮ末端に融合したＨ３−ＳＳ  ＃２３１の配列を示す。Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１の突然変異を枠で囲む。Ｈ３−ＳＳ  ＃２３１をＬＳに連結する６残基リンカー、およびＬＳにおけるＮ結合グリカンを除去する単一のＬＳ突然変異（Ｎ１０２Ｄ）を太字で示す。Ｃ末端ＬＳを下線で示す。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｆは、Ｈ３−ＬＳ−ｎｐの６つの変異体のゲル濾過プロファイルである。Ａ−Ｆ：Ｈ３−ＳＳ−ＬＳ−ｎｐ変異体０１（図１８Ａ）、０２（図１８Ｂ）、０３（図１８Ｃ）、０４（図１８Ｄ）、０６（図１８Ｅ）および０７（図１８Ｆ）のゲル濾過Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３０プロファイル。Ｈ３−ＳＳ−ＬＳ−０４を除く各場合において、単一のピークが溶出した。ゲル濾過後のＥｘｐｉ２９３細胞からの最終収量は、培養１Ｌ当たり１〜２ｍｇ／Ｌであった。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂは、Ｈ３−ＬＳ−ｎｐの４つの変異体のＥＬＩＳＡ結果を示す。図１９Ａおよび１９Ｂは、Ｈ３−ＳＳ−ＬＳ−ｎｐ変異体０１、０２、０３、および０４の、ＨＡステム抗体ＣＴ１４９（図１９Ａ）およびＣＲ８０２０（図１９Ｂ）認識のＥＬＩＳＡ曲線を示す。曲線から求めたＥＣ５０値を各プロットの下に示す。
【図２０】図２０は、３つのＨ３−ＳＳ−ＬＳ変異体の動的走査熱量測定（ＤＳＣ）プロットである。熱容量（Ｃｐ）の温度に対するプロットは、各タンパク質に関する融解転移を表す。各デザインに関して最も早期の融解点（ＴＭ）を記し、関連する曲線にマッチするように色分けする。デザインの番号をそれぞれ括弧内に記載する。このダイヤグラムでは、Ｙ軸のＣｐ値を任意スケールで示す。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｄは、多様なＨＡに対するＨ３−ＳＳ−ＬＳ−ｎｐ免疫マウスの免疫応答を示す。播種したＡ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）ＨＡ（図２１Ａ）、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（図２１Ｂ）、Ａ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）（図２１Ｃ）、およびＡ／アンホイ省／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）（図２１Ｄ）に対する、ＳＡＳアジュバント化Ｈ３−ＳＳ−ＬＳ−ｎｐの４つの異なるバージョンによって３回免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）の血清のＥＬＩＳＡ抗体エンドポイント力価。空のフェリチンナノ粒子のみ、およびＨ３−ＳＳ−ｎｐ（＃２３１）で免疫したマウスの血清を対照とする。幾何平均力価を水平線によって示す。
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは、Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ９に対する、Ｈ３−ＳＳ−ＬＳ−ｎｐ免疫マウスの中和血清応答を示す。ＳＡＳアジュバント化Ｈ３−ＳＳ−ＬＳ−ｎｐの４つの異なるバージョンによって３回免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）からの血清のシュードウイルス中和力価。図２２Ａは、Ａ／アンホイ省／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）の中和を示す。図２１Ｂは、Ａ／ウィスコンシン州／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）の中和を示す。空のフェリチンナノ粒子、Ｈ１−ＳＳ−ｎｐ、およびＨ３−ＳＳ−ｎｐ（＃２３１）によって免疫したマウスからの血清を対照とする。幾何平均力価を水平線で示す。水平の破線は、５０のベースライン力価を示す。
【図２３】図２３は、グループ２  Ｈ７  ＨＡ安定化ステムナノ粒子の形成を可能にする２５の突然変異の配列位置を示す。Ｈ７−ＳＳ−ｎｐ＿１６（Ａ／アンホイ省／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）ＨＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００９１１８４７５．１に基づく）の配列を示し、Ｈ３  ＃２３１突然変異を枠で囲む。新たなＨ７突然変異を星印で示す（Ｈ３Ｎ２  ＨＡにマッチするように突然変異させた２つの残基）。参考に、Ｃ末端ＳＧＧリンカーを太字で示し、Ｃ末端フェリチンを下線で示し、Ｎ結合グリカンを除去するためのＡｓｎからＧｌｎへのフェリチン突然変異を太字で示す。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｆは、Ｈ７−ＳＳ−ｎｐ変異体の精製を示す。ＧＮＡレクチンアフィニティクロマトグラフィー後のＨ７−ＳＳ−ｎｐ変異体１６（図２４Ａ）、１８（図２４Ｂ）、２０（図２４Ｃ）、２１（図２４Ｄ）、２３（図２４Ｅ）、および２６（図２４Ｆ）のゲル濾過Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３０プロファイル。ゲル濾過後のＥｘｐｉ２９３細胞からの最終収量は、培養１Ｌ当たり５〜１０ｍｇ／Ｌであった。
【図２５】図２５は、Ｈ７−ＳＳ−ｎｐの電子顕微鏡法を示す。Ｈ７−ＳＳ−ｎｐ変異体のネガティブ染色電子顕微鏡法２Ｄクラス平均により、中空の球体から突出するＨＡステムの整列を視認できる粒子の形成が示される。Ｈ１−ＳＳ−ｎｐ粒子の画像（左上）を陽性対照として示す。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｄは、Ｈ７−ＳＳ−ｎｐの変異体のカイネティックＥＬＩＳＡの結果を示す。図２６Ａ〜２６Ｃは、Ｈ７−ＳＳ−ｎｐ変異体１６、１８、２０、２１、２３、２５、２６、およびＨ１−ＳＳ−ｎｐ陽性対照の、ＦＩ６（図２６Ａ）、ＣＴ１４９（図２６Ｂ）、およびＣＲ８０２０（図２６Ｃ）認識に関するカイネティックＥＬＩＳＡ曲線を示す。図２６Ｄは、図２６Ａ〜２６Ｃにおける曲線から求めたＥＣ５０値を記載する。ＮＤ：測定せず。
【図２７】図２７は、Ｈ７−ＳＳ−ｎｐのＨＡステム抗体認識を示す。６つのＨ７−ＳＳ−ｎｐ変異体（図２７Ａ：Ｈ７−ＳＳ−１６；図２７Ｂ：Ｈ７−ＳＳ−１８；図２７Ｃ：Ｈ７−ＳＳ−２１；図２７Ｄ：Ｈ７−ＳＳ−２３；図２７Ｅ：Ｈ７−ＳＳ−２５；図２７Ｆ：Ｈ７−ＳＳ−２６）のＣＴ１４９認識に関するバイオレイヤー干渉法結合曲線を示し、各曲線セットの右側に速度定数を記載する。ナノ粒子を、アミンカップリングによってセンサーチップに固定し、様々な濃度の抗体Ｆａｂとインキュベートした。
【図２８】図２８は、７つのＨ７−ＳＳ−ｎｐ変異体の動的走査熱量測定（ＤＳＣ）プロットを示す。熱容量（Ｃｐ）の温度に対するプロットは、各タンパク質に関する融解転移を表す。各デザインに関する最も早期の融解点（ＴＭ）を記し、関連する曲線にマッチするように色分けする。Ｈ７−ＳＳ−ｎｐデザイン番号をそれぞれ括弧内に記載する。このダイヤグラムでは、Ｙ軸のＣｐ値を任意スケールで示す。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｄは、多様なＨＡに対するＨ７−ＳＳ−ｎｐ免疫マウスの免疫応答を示す。播種したＡ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）ＨＡ（図２９Ａ）、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（図２９Ｂ）、Ａ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）（図２９Ｃ）およびＡ／アンホイ省／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）（図２９Ｄ）に対する、ＳＡＳアジュバント化Ｈ７−ＳＳ−ｎｐの６つの異なるバージョンによって３回免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）からの血清のＥＬＩＳＡ抗体エンドポイント力価。空のフェリチンナノ粒子、Ｈ１−ＳＳ−ｎｐ、およびＨ３−ＳＳ−ｎｐ（＃２３１）で免疫したマウスからの血清を対照とする。幾何平均力価を水平線で示す。水平の破線は、５０のベースライン力価を示す。
【図３０】図３０Ａおよび３０Ｂは、Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ９に対する、Ｈ７−ＳＳ−ｎｐ免疫マウスの中和血清応答を示す。ＳＡＳアジュバント化Ｈ７−ＳＳ−ｎｐの６つの異なるバージョンによって３回免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）からの血清のシュードウイルス中和力価。図３０Ａは、Ａ／アンホイ省／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）に対する中和を示す。図３０Ｂは、Ａ／ウィスコンシン州／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）に対する中和を示す。空のフェリチンナノ粒子、Ｈ１−ＳＳ−ｎｐ、およびＨ３−ＳＳ−ｎｐ（＃２３１）で免疫したマウスからの血清を対照とする。幾何平均力価を水平線によって示す。水平の破線は、５０のベースライン力価を示す。
【図３１】図３１は、インフルエンザ亜型１０ＨＡ（Ｈ１０）タンパク質の配列に基づく、本発明のタンパク質コンストラクトの４つの異なる例の配列を示す。インフルエンザＨＡ配列に対して作製した突然変異を枠で囲む。参考に、Ｃ末端ＳＧＧリンカーを太字で示し、Ｃ末端フェリチン配列を下線で示す。
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｅは、Ｈ１０ｓｓＦ変異体１（図３２Ａ）、２（図３２Ｂ）、３（図３２Ｃ）、４（図３２Ｄ）および５（図３２Ｅ）のゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３０プロファイルを示す。各々の場合において、単一のピークがおよそ１２．５ｍｌの容量で溶出した。ゲル濾過後のＥｘｐｉ２９３細胞からの最終収量は、培養１Ｌ当たり６〜８ｍｇ／Ｌであった。
【図３３】Ｈ１０ｓｓＦナノ粒子変異体の電子顕微鏡法。Ｈ１０ｓｓＦ変異体のネガティブ染色電子顕微鏡法２Ｄクラス平均により、中空の球体から突出するＨＡステムの整列を視認できる粒子の形成が示される。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｄは、Ｈ１０ｓｓＦ変異体２〜５のカイネティックＥＬＩＳＡの結果を示す。図Ａ〜Ｃは、ＥＬＩＳＡ曲線を示す。図Ｄは、曲線から計算したＩＣ５０値を示す。デザイン免疫原を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を播種して、前記の抗体によって検出した。
【図３５】図３５Ａおよび３５Ｂは、グループ２ＨＡに対するＨ１０ｓｓＦ免疫マウスの免疫応答を示す。固定したＡ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）ＨＡ（図３５Ａ）およびＡ／アンホイ省／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）（図３５Ｂ）に対する、ＳＡＳアジュバント化Ｈ１０ｓｓＦ（２μｇ／マウス）の５つの異なるバージョンによって３回免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）からの血清のＥＬＩＳＡ抗体エンドポイント力価。空のフェリチンナノ粒子のみ、Ｈ７Ｎ９  ＡＨ１３一価不活化ワクチン（ＭＩＶ）、またはＨ７ｓｓＦ２６によって免疫したマウスからの血清に対する応答を対照とする。幾何平均力価を水平線で示す。下部の破線は、５０のベースライン力価を示し、上部の破線は記録された最高値を示す。
【図３６】図３６Ａ〜３６Ｄは、致死量のＨ３Ｎ２で攻撃したＨ１０ｓｓＦ免疫マウスの応答を示す。図３６Ａ〜Ｃは、空のナノ粒子（図３６Ａ）、Ｈ１０ｓｓＦ＿４（図３６Ｂ）、またはＨ１０ｓｓＦ＿５（図３６Ｃ）によって免疫し、その後致死量のＡ／フィリピン／１９８２（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザで攻撃したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）の体重減少曲線を示す。図３６Ｄは、Ａと同じマウスの生存曲線を示す。フェリチンナノ粒子のみ（empty np）によって免疫したマウスを陰性対照とする。
【図３７】図３７Ａ〜３７Ｇは、致死量のＨ７Ｎ９攻撃に対するＨ１０ｓｓＦ免疫マウスの応答を示す。図３７Ａは、致死量のＡ／上海／２／２０１３様（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザで攻撃したＨ１０ｓｓＦ免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）の生存曲線を示す。フェリチンナノ粒子のみ（empty np）によって免疫したマウスを陰性対照とする。図３７Ｂは、図３７Ａと同じマウスに関する攻撃後６日目での体重減少を示す。図３７Ｃ〜Ｇは、図３７Ａおよび３７Ｂと同じマウスに関する攻撃後１２日間の体重減少を示す。
【図３８】図３８は、インフルエンザ亜型３  ＨＡ（Ｈ３）タンパク質の配列に基づく、本発明のタンパク質コンストラクトの４つの異なる例の配列を示す。インフルエンザＨＡ配列に対して作製した突然変異を枠で囲む。参考に、Ｃ末端ＳＧＧリンカーを太字で示し、Ｃ末端フェリチン配列を下線で示す。また、Ｎ結合グリカンを除去するＡｓｎからＧｌｎへのフェリチン突然変異を枠で囲み、太字で示す。
【図３９】図３９は、インフルエンザ亜型７  ＨＡ（Ｈ７）タンパク質の配列に基づく、本発明のタンパク質コンストラクトの４つの異なる例の配列を示す。インフルエンザＨＡ配列に対して作製した突然変異を枠で囲む。参考に、Ｃ末端ＳＧＧリンカーを太字で示し、Ｃ末端フェリチン配列を下線で示す。また、Ｎ結合グリカンを除去するＡｓｎからＧｌｎへのフェリチン突然変異を枠で囲み、太字で示す。
【図４０】図４０Ａ〜４０Ｃは、本発明の様々なタンパク質コンストラクトが、生殖系列復帰１６．ａ．２６  Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現するＢ細胞を活性化する能力を示す。グラフは、抗ＩｇＭ陽性対照（Ｈ１陰性対照の使用で活性化なし）（図４０Ａ）、Ｈ３−ｓｓ−ｎｐタンパク質コンストラクト（図４０Ｂ）、Ｈ７−ｓｓ−ｎｐタンパク質コンストラクト（図４０Ｃ）、およびＨ１０ｓｓＦタンパク質コンストラクト（ＦＩＧ４０Ｄ）とＢ細胞との接触に起因するカルシウムの流れ（Ｂ細胞活性化を示す）を示す。
【図４１】図４１は、図４０Ａ〜Ｃに示したＢ細胞活性化アッセイにおいて活性を示したタンパク質コンストラクトのＨＡ部分の配列を示す。インフルエンザＨＡ配列に対して作製した突然変異を枠で囲む。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、インフルエンザウイルスの新規ワクチンに関する。より具体的には、本発明は、広範囲のインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質のステム領域に対する免疫応答を誘発する新規なグループ２インフルエンザＨＡタンパク質ベースのワクチンに関する。ワクチンはまた、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域の融合前立体構造の免疫原性部分を表面に提示する、自己集合ナノ粒子にも関する。そのようなナノ粒子は、個体にインフルエンザウイルスに対するワクチン接種を行うために有用である。したがって、本発明は、そのようなナノ粒子を製造するためのタンパク質コンストラクト、およびそのようなタンパク質をコードする核酸分子にも関する。さらに、本発明は、本発明のナノ粒子を製造する方法、および個体のワクチン接種のためにそのようなナノ粒子を使用する方法に関する。
【００２７】
本発明を詳しく記載する前に、記載される特定の実施形態は、当然変化し得るので、本発明は記載される特定の実施形態に限定されないと理解すべきである。同様に、本明細書において使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、制限的であることは意図されず、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されると理解すべきである。
【００２８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈が明らかにそれ以外を指示していない限り、複数形を含むことに留意すべきである。例えば、１つの核酸分子は１つまたは複数の核酸分子を指す。そのため、用語「１つの」、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」は、互換的に使用することができる。同様に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、互換的に使用することができる。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように記載されうることに留意されたい。この記載はしたがって、特許請求の範囲における要素の記載に関する「単に」、「のみ」などといった排他的用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行記述として機能することを意図するものである。
【００２９】
便宜上、本発明のタンパク質コンストラクト、およびその一部を指すためにある特定の省略語を使用することができる。例えば、ＨＡは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質またはその一部を指すことができる。ＨＡ−ＳＳは、インフルエンザＨＡタンパク質の安定化ステム領域またはステム領域の一部を指す。典型的に、そのような名称のＨＡ部分は、ヘマグルチニンタンパク質の亜型を指しうる。例えば、亜型３ヘマグルチニンの安定化ステム領域は、Ｈ３−ＳＳと呼ぶことができる。インフルエンザＨＡタンパク質膜貫通ドメインに連結したＨＡ−ＳＳ（例えば、Ｈ３−ＳＳ）を含むタンパク質コンストラクトは、ＨＡ−ＳＳ−ＴＭ（例えば、Ｈ３−ＳＳ−ＴＭ）と呼ぶことができる。フェリチン単量体サブユニットに連結したＨＡ−ＳＳを含むタンパク質コンストラクトは、ＨＡ−ＳＳ−ｎｐと呼ぶことができる。そのような名称の後に、特定の変化を含む特定のコンストラクトを示す番号が続くこともある（例えば、Ｈ３−ＳＳ−ｎｐ＿２３１（配列番号４７））。そのようなコンストラクトはまた、ＨＡｓｓＦ（例えば、Ｈ３ｓｓＦ＿２３１）と呼ぶこともできることに注意すべきである。本発明のある特定の態様では、ＨＡ−ＳＳは、例えばルマジンシンターゼなどの他の単量体サブユニットに連結される。そのようなコンストラクトは、ＨＡ−ＳＳ−ＬＳ（例えば、Ｈ３−ＳＳ＿ＬＳ−０１（配列番号８３））またはＨＡｓｓＬ（例えば、Ｈ３ｓｓＬＳ−０１（配列番号８３））という名称でと呼ぶことができる。
【００３０】
上記に加えて、別の明らかな定義がなされない限り、本開示の様々な実施形態に共通である以下の用語および語句の定義を次に記載する。
【００３１】
本書において使用される用語タンパク質コンストラクトは、天然に見出されない配列を含むようにタンパク質のアミノ酸配列が修飾されている、ヒトの手で作製されたタンパク質である。タンパク質コンストラクトは、２つまたはそれより多くのアミノ酸配列が天然に見出されない様式で共有結合により連結されているタンパク質を包含する。連結されるアミノ酸配列は、関連するもの、または関連しないものであり得る。本書において、アミノ酸配列どうしが通常、それらに天然の環境（例えば、細胞内部）において共有結合を介して連結した状態で見出されない場合、それらポリペプチド配列は関連しないものである。例えば、フェリチン単量体サブユニットのアミノ酸配列と、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列とは、通常、共有結合を介して連結した状態で見出されない。このため、それら配列は関連しないものと考える。
【００３２】
タンパク質コンストラクトはまた、関連するアミノ酸配列を含み得る。例えば、インフルエンザＨＡタンパク質の構造は、ヘッド領域アミノ酸配列の両端にステム領域アミノ酸配列が隣接するという構造である。遺伝的手段を通して、ヘッド領域の中央部からアミノ酸残基を除去し、ステム領域配列が隣接するヘッド領域の一部を維持することによって、ＨＡタンパク質の修飾型を作製することが可能である。そのような最終的な分子において配列の順序は同じに維持されても、アミノ酸間の空間的関係は、天然のタンパク質とは異りうる。このため、そのような分子はタンパク質コンストラクトであると考えうる。本発明に従って、タンパク質コンストラクトはまた、融合タンパク質とも呼ばれ得る。
【００３３】
タンパク質コンストラクトにおけるアミノ酸配列は、互いに直接連結するか、またはリンカーを使用して連結することができる。リンカー、リンカー配列、リンカーペプチド等は、所望の特徴（例えば、構造、エピトープ、免疫原性、活性等）を有する２つのタンパク質を連結するために使用される短い（例えば、２〜２０個の）アミノ酸配列である。リンカー配列は典型的に、それ自体は活性を有さず、通常、タンパク質コンストラクトの他の部分を連結し、それによって所望の立体構造をとらせるために使用される。リンカー配列は典型的に、小さいアミノ酸残基および／またはその連続、例えばセリン、アラニン、およびグリシンで作製されるが、他のアミノ酸残基の使用も除外されない。例えば、共有結合を形成することができるシステイン残基などのアミノ酸をリンカー配列に含めることが望ましいことがある。
【００３４】
本明細書において使用される免疫原性という用語は、特定のタンパク質またはその特定の領域が、該特定のタンパク質、または該特定のタンパク質と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質に対する免疫応答を誘発する能力を指す。本発明に従って、高い同一性を有する２つのタンパク質は、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。２つのアミノ酸または核酸配列の間のパーセント同一性を決定する方法は、当技術分野で公知である。
【００３５】
本書において、本発明のワクチンまたはナノ粒子に対する免疫応答とは、ワクチンに存在するグループ２ＨＡタンパク質に対する液性および／または細胞性免疫応答が対象において発現することである。本発明の目的に関して、「液性免疫応答」は、分泌型（ＩｇＡ）またはＩｇＧ分子を包含する抗体分子によって仲介される免疫応答を指し、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球細胞によって仲介される応答である。細胞性免疫の１つの重要な態様は、細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を伴う。ＣＴＬは、細胞の表面上に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質と結合して提示され発現されるペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導および促進するために役立つ。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣ分子と結合したペプチド抗原を表面上に提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を助け刺激し、その活性を集中させる。細胞性免疫応答はまた、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む、活性化Ｔ細胞および／または他の白血球細胞による、サイトカイン、ケモカイン、および他のそのような分子の産生も指す。
【００３６】
したがって、免疫応答は、ＣＴＬ、および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激する応答であり得る。ケモカインおよび／またはサイトカインの産生も刺激され得る。本開示のワクチンはまた、抗体により仲介される免疫応答も誘発し得る。したがって、免疫応答は、以下の作用のうちの１つまたは複数を含み得る：Ｂ細胞による抗体（例えば、ＩｇＡまたはＩｇＧ）の産生；および／またはサプレッサー、細胞傷害性、もしくはヘルパーＴ細胞、および／またはワクチンに存在するグループ２ＨＡタンパク質に対して特異的なＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し（例えば抗体依存的防御）、および／または抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を仲介して、免疫した個体に保護を提供するように作用し得る。そのような応答は、当技術分野で周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを使用して決定することができる。
【００３７】
本書において、「抗原性の」、「抗原性」等の用語は、抗体または抗体の群が結合するタンパク質のことを指す。同様に、タンパク質の抗原性部分は、抗体または抗体の群によって認識される任意の部分である。本発明に従って、抗体によるタンパク質の認識は、抗体がタンパク質に選択的に結合することを意味する。本書において使用される、「選択的に結合する」、「選択的結合」等の用語は、試料もしくはアッセイ中の、ＨＡと関連しないタンパク質または非タンパク質構成要素との結合と比較して、ＨＡタンパク質に優先的に結合する抗体の能力を指す。ＨＡに優先的に結合する抗体は、ＨＡに結合するが、試料またはアッセイに存在し得る他の分子または構成要素に有意に結合しない抗体である。有意な結合とは、例えば、試料中の抗インフルエンザ抗体またはＨＡタンパク質のレベルを検出および／または決定するアッセイ能力を妨害するために十分に大きい親和性またはアビディティでの、非ＨＡ分子に対する抗ＨＡ分子の結合であると考えられる。試料またはアッセイに存在し得る他の分子および化合物の例には、アルブミンなどの非ＨＡタンパク質、脂質、および炭水化物が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に従って、非ＨＡタンパク質は、本書に開示されるインフルエンザＨＡタンパク質の配列と６０％未満の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一部の実施形態では、抗体または複数の抗体は、広いヘテロサブタイプ防御を提供する。一部の実施形態では、抗体または複数の抗体は中和性である。
【００３８】
本書において、中和抗体とは、インフルエンザウイルスが１ラウンドの複製を完了するのを妨げる抗体である。本書において定義される場合、１ラウンドの複製は、ウイルスの宿主細胞への結合から始まり、新たに形成されたウイルスが宿主細胞から出芽することによって終わるウイルスのライフサイクルを指す。このライフサイクルは、細胞への結合、細胞への侵入、ＨＡタンパク質の切断および再構成、ウイルス膜とエンドソーム膜との融合、ウイルスリボヌクレオタンパク質の細胞質への放出、新規ウイルス粒子の形成、およびウイルス粒子の宿主細胞膜からの出芽、の過程を含むがこれらに限定されない。本発明に従って、中和抗体は、１つまたは複数のそのような過程を阻害する抗体である。
【００３９】
本書において、広範な中和抗体とは、インフルエンザウイルスの１つより多くの型、亜型、および／または株を中和する抗体である。例えば、Ａ型インフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質に対して誘発された広範な中和抗体は、Ｂ型またはＣ型ウイルスを中和し得る。さらなる例として、グループ２インフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質に対して誘発された広範な中和抗体は、グループ１ウイルスを中和し得る。さらなる例として、ウイルスの１つの亜型または株由来のＨＡタンパク質に対して誘発された広範な中和抗体は、ウイルスの別の亜型または株を中和し得る。例えば、Ｈ３インフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質に対して誘発された広範な中和抗体は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ８、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、またはＨ１８からなる群から選択される１つまたは複数の亜型のウイルスを中和し得る。
【００４０】
本発明に従って、インフルエンザウイルスを分類するために使用される全ての命名法は当業者によって一般的に使用される命名法である。したがって、インフルエンザウイルスの型またはグループは、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、またはＣ型インフルエンザを指す。特定の型としてのウイルスの名称が、それぞれのＭ１（マトリックス）タンパク質またはＮＰ（ヌクレオタンパク質）における配列の差に関連することは当業者によって理解される。Ａ型インフルエンザウイルスは、グループ１およびグループ２にさらに分けられる。これらのグループは、そのＨＡタンパク質の配列に基づくウイルスの分類を指す亜型にさらに分けられる。現在一般的に認識されている亜型の例は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ８、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、またはＨ１８である。グループ１インフルエンザ亜型は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、およびＨ１８である。グループ２インフルエンザ亜型は、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、およびＨ１５である。最後に、株という用語は、それらがそのゲノムに小さい遺伝子変異を有するという点において互いに異なる亜型内のウイルスを指す。
【００４１】
本明細書において、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質またはＨＡタンパク質は、本発明のタンパク質コンストラクトおよびナノ粒子を製造するために有用であるか、または免疫応答を誘発することができる、完全長のインフルエンザヘマグルチニンタンパク質またはその任意の部分を指す。好ましいＨＡタンパク質は、三量体を形成することができるタンパク質である。完全長のインフルエンザＨＡタンパク質のエピトープは、同じ（homologous）インフルエンザ株、すなわち当該ＨＡが由来する株に対する抗体応答を誘発することができる、そのようなタンパク質の部分を指す。一部の実施形態では、そのようなエピトープはまた、異なる（heterologous）インフルエンザ株、すなわち当該免疫原のＨＡの株と同一ではないＨＡを有する株に対する抗体応答も誘発することができる。一部の実施形態では、エピトープは、広範なヘテロサブタイプ防御的応答を誘発する。一部の実施形態では、エピトープは中和抗体を誘発する。
【００４２】
本明細書において、変異体とは、その配列が参照配列と類似するが同一ではないタンパク質または核酸分子であって、変異体タンパク質（または変異体核酸分子によってコードされるタンパク質）の活性が有意に変化しないタンパク質または核酸分子を指す。そのような配列の変異は、天然に生じる変異であり得るか、または当業者に公知の遺伝子工学技術の使用を通して操作されたものであり得る。そのような技術の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれてる、Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al., in Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57)、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6において見出される。
【００４３】
変異体に関して、得られる変異体タンパク質が、インフルエンザウイルスに対する中和抗体または非中和抗体を誘発する能力を保持する限り、アミノ酸または核酸配列における任意の型の変化が許容可能である。そのような変異の例には、欠失、挿入、置換、およびその組合せが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、タンパク質に関して、しばしば１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のアミノ酸を、タンパク質のアミノおよび／またはカルボキシル末端から、そのタンパク質の活性に有意に影響を及ぼすことなく除去できることは、当業者によって十分に理解されている。同様に、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意に影響を及ぼすことなくタンパク質にしばしば挿入することができる。挿入がなされている変異体では、挿入されたアミノ酸は、その後に挿入が行われたアミノ酸残基を参照することによって言及され得る。例えば、アミノ酸残基４０２の後の４つのアミノ酸残基の挿入は、４０２ａ−４０２ｄと呼ぶことができる。さらに、それらの挿入されたアミノ酸のうちの１つを、後に別のアミノ酸に置換する場合、そのような変化は、その文字位置を参照することによって言及することができる。例えば、挿入されたグリシン（挿入による追加位置における）のスレオニンでの置換の場合は、Ｓ４０２ｄＴのように呼ぶことができる。
【００４４】
前記のように、本発明の変異体タンパク質は、本書に開示されるインフルエンザＨＡタンパク質と比較してアミノ酸置換を含み得る。タンパク質の活性が有意に影響を受けない限り、任意のアミノ酸置換が許容可能である。これに関連して、アミノ酸は、その物理的特性に基づいて群に分類することができることが、当分野において認識されている。そのような群の例には、荷電アミノ酸、非荷電アミノ酸、極性非荷電アミノ酸、および疎水性アミノ酸が挙げられるがこれらに限定されない。置換を含む好ましい変異体は、アミノ酸が同じ群のアミノ酸に置換される変異体である。そのような置換は保存的置換と呼ばれる。
【００４５】
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分割され得る：
１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００４６】
例えば、非保存的置換は、これらの群の１つのメンバーを、別の群のメンバーに置換することを伴い得る。
【００４７】
アミノ酸の変更を行う場合、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮してもよい。各々のアミノ酸は、その疎水性および荷電特徴に基づくハイドロパシー指数を有する。ハイドロパシー指数は以下のとおりである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。タンパク質への相互作用生物学的機能の付与においてハイドロパシーアミノ酸指数が重要であることは、当技術分野において一般的に理解されている（Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-31）。ある特定のアミノ酸を、類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸に代えても、類似の生物学的活性が保持されることは公知である。ハイドロパシー指数に基づいて変更を行う場合、ハイドロパシー指数が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１の範囲内の置換が特に好ましく、±０．５の範囲内の置換がより一層好ましい。
【００４８】
また、類似のアミノ酸の置換を親水性に基づいて有効に行うことができることは、当技術分野において理解される。このことは、それにより作製される、生物学的に機能的に同等のタンパク質またはペプチドが、本発明のような免疫学的発明における使用のために意図される場合に特に当てはまる。近接するアミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最も高い局所的な平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。以下の親水性値がアミノ酸残基に与えられ：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変更を行う場合、親水性値が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、±０．５の範囲内であるアミノ酸の置換がより一層好ましい。また、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定し得る。
【００４９】
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的）は、そのような置換が望ましいときに当業者が決定することができる。例えば、アミノ酸置換を使用して、ＨＡタンパク質の重要な残基を同定することができ、または本書に記載のＨＡタンパク質の免疫原性、溶解性、もしくは安定性を増加もしくは減少することができる。例示的なアミノ酸置換を以下の表１に示す。
【００５０】
【表１】
2019537424.tif 000003
【００５１】
本明細書において使用される語句「タンパク質活性に有意に影響を及ぼす」は、タンパク質の活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％の減少を指す。本発明に関して、そのような活性は、例えばタンパク質がインフルエンザウイルスに対して防御抗体を誘発する能力として測定してもよい。そのような活性は、インフルエンザウイルスに対するそのような抗体の力価を測定すること、そのような抗体がインフルエンザ感染に対して防御する能力を測定すること、または誘発された抗体によって中和される型、亜型、もしくは株の数を測定すること、によって測定され得る。抗体力価を決定する、防御アッセイを実施する、およびウイルス中和アッセイを実施する方法は、当業者に公知である。上記の活性に加えて、測定され得る他の活性には、赤血球凝集能、および細胞に対するタンパク質の結合親和性が挙げられる。そのような活性を測定する方法は当技術分野で公知である。
【００５２】
個体、対象、および患者という用語は、当技術分野で周知であり、本書においてインフルエンザ感染に感受性の任意のヒトまたは他の動物を指すために互換的に使用される。例には、ヒト、ならびに非ヒト霊長類、例えばチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種を含む他の霊長類；家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、アザラシ、ヤギ、およびウマ；ペット哺乳動物、例えばイヌおよびネコ；齧歯類を含む実験動物、例えばマウス、ラットおよびモルモット；家畜、野生、および競技用鳥類を含む鳥類、例えばニワトリ、七面鳥、および他のキジ目のトリ、アヒル、ガチョウ等が挙げられるがこれらに限定されない。個体、対象、および患者という用語はそれ自身、特定の年齢、性別、人種等を指すものではない。したがって、男女を問わず任意の年齢の個体が、本開示の範囲に含まれると意図され、それには、高齢者、成人、小児、新生児、乳児、および幼児が含まれるがこれらに限定されない。同様に、本発明の方法は、例えばコーカソイド（白人）、アフリカ系アメリカ人（黒人）、ネイティブアメリカン、ネイティブハワイアン、ヒスパニック、ラテンアメリカ人、アジア人、およびヨーロッパ人を含む任意の人種に適用され得る。感染した対象とは、その身体にインフルエンザウイルスを有することがわかっている対象である。
【００５３】
本明細書において、ワクチン接種された対象とは、インフルエンザウイルスに対する防御効果を提供することが意図されるワクチンが投与された対象である。
【００５４】
本明細書において使用される、「曝露される」、「曝露」等の用語は、対象が、インフルエンザウイルスに感染していることがわかっているヒトまたは動物に接触することを指す。
【００５５】
本書において議論する刊行物は、単に、本願の出願日前のその開示のために提供される。本書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明の故に刊行物の先行技術を回避する権利がないと認めるものと解釈してはならない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行の日付とは異なり得るので、個々に確認する必要があり得る。
【００５６】
異なる定義がなされない限り、本書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本書に記載の方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を次に記載する。本書において言及する刊行物は全て、参照により、刊行物が引用される内容に関連して方法および／または材料を開示および記載するために本書に組み込まれる。
【００５７】
明解のために個別の実施形態の文脈において記載される本発明のある特徴は、単一の実施形態中に組み合わせて提供されてもよいと認識される。逆に、簡潔のために単一の実施形態の文脈において記載される本発明の複数の特徴は、個別に、または任意の適当なサブコンビネーションとして提供されてもよいと認識される。実施形態の全ての組合せが本発明によって具体的に包含され、それぞれの組合せが全て、個々におよび明白に本書において開示されているかのように、本書において開示される。加えて、全てのサブコンビネーションも本発明に具体的に包含され、それぞれのサブコンビネーションが全て、個々におよび明白に本書において開示されているかのように、本書において開示される。
【００５８】
本発明の一実施形態は、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質コンストラクトであって、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質のヘッド領域が、インフルエンザＨＡタンパク質のヘッド領域からの５個未満の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列で置き換えられているタンパク質コンストラクトである。本明細書において、グループ２ＨＡタンパク質とは、本発明のタンパク質コンストラクトおよびナノ粒子の製造のために有用である、グループ２インフルエンザウイルスの完全長のインフルエンザＨＡタンパク質、またはその任意の部分／複数の部分および／または変異体を指す。したがって、本発明は、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に対する免疫応答を誘発することができる分子を対象とする。一部の実施形態では、ＨＡタンパク質コンストラクトの配列は、免疫系に提示可能な形態でのタンパク質のステム領域の安定化のために、さらに変化（すなわち、突然変異）されている。本発明を実施するために有用なグループ２インフルエンザＨＡタンパク質、およびそれから作製されたタンパク質コンストラクトの例を、以下の表２に示す。
【００５９】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【００６０】
上に挙げたインフルエンザウイルスおよびそれ由来の配列は、例示的であり、本発明を実施するために、他の任意のグループ２インフルエンザウイルス、それ由来の配列およびタンパク質を使用することができる。
【００６１】
ウイルスの表面上の三量体ＨＡタンパク質は、球状のヘッド領域と、ＨＡタンパク質をウイルス脂質エンベロープに固定させるステムまたは茎領域とを含む。インフルエンザＨＡのヘッド領域は、ＨＡ１ポリペプチドの主要な部分のみから形成され、茎部分は、ＨＡ１およびＨＡ２のセグメントで構成される。本発明に従って、ヘッド領域は、Ａ型インフルエンザウイルスの完全長ＨＡタンパク質（Ａ／デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））（配列番号４）のアミノ酸６０〜３２９におおよそ対応する、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸からなる。同様に、本書において、ステム領域は、Ａ型インフルエンザウイルスの完全長のＨＡタンパク質（Ａ／デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））（配列番号４）のアミノ酸１〜５９および３３０〜５１９に対応する、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列から形成される。本書において、ヘッドおよびステム領域に関連して用いられる、「おおよそ」という用語は、上記で引用した配列が、本発明の性質に影響を及ぼすことなく数個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のアミノ酸分の長さが異なり得ることを意味する。このため、例えば、ヘッド領域は、アミノ酸６４〜３２９、アミノ酸６０〜３２６、またはアミノ酸６２〜３２７からなり得る。通常、ヘッドおよびステム領域は、上記で列挙した位置から１０アミノ酸分より多くは異ならない。本発明のある特定の態様では、ヘッド領域は、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））（配列番号４）のＣｙｓ６８およびＣｙｓ３２１に対応するアミノ酸残基の間のアミノ酸配列（それら両端のアミノ酸残基を含む）からなる。ＨＡタンパク質に関して、異なるインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質は、タンパク質における配列の差（挿入、欠失）により異なる長さを有し得ることは当業者によって理解される。このため、対応する領域とは、比較される領域と、配列、構造、および／または機能において同一である、またはほぼ同一（例えば、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）である別のタンパク質の領域を指す。例えば、ＨＡタンパク質のステム領域に関して、別のＨＡタンパク質における対応する領域は、同じ残基数を有さない場合もあるが、ほぼ同一の配列を有し、同じ機能を示しうる。一例として、上記の実施形態では、Ａ型インフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質（Ａ／デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））（配列番号４）のヘッド領域は、アミノ酸６０で始まる。Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１）におけるヘッド領域の開始部の対応するアミノ酸は、アミノ酸Ｃ６０である。ウイルス間の配列比較をより明確にするために、アミノ酸位置を参照配列と関連させる、当分野のものによるナンバリングシステムを使用する。したがって、異なるインフルエンザ株由来のＨＡタンパク質における対応するアミノ酸残基は、タンパク質のＮ末端アミノ酸からの距離に関する残基番号が同じでなくてもよい。例えば、Ｈ３ナンバリングシステムを使用する場合、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（１９９９  ＮＣ，Ｈ１）における残基１００は、それが、Ｎ末端アミノ酸から１００番目の残基であることを意味しない。そうではなくて、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（１９９９  ＮＣ，Ｈ１）の残基１００は、インフルエンザＨ３Ｎ２株の残基１００にアラインする。そのようなナンバリングシステムの使用は当業者によって理解されている。Ｈ３ナンバリングシステムは、アミノ酸の位置を特定するために使用することができるが、ＨＡタンパク質中のアミノ酸残基の位置は、異なる記載がなされない限り、本書に開示される配列由来の対応するアミノ酸の位置の一般的言及によって特定され得る。
【００６２】
本発明者らはまた、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の特定の配列を、関連のないタンパク質、およびそれから作られる、ＨＡタンパク質を免疫系に提示することができるナノ粒子と組み合わせることによって、標的とするＨＡタンパク質領域に対する免疫応答を誘発できることを見出した。したがって、本発明の一実施形態は、単量体サブユニットタンパク質の少なくとも一部に連結したグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含むタンパク質コンストラクトであって、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のヘッド領域が、インフルエンザＨＡタンパク質のヘッド領域からの５個未満の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列で置き換えられており、タンパク質コンストラクトがナノ粒子を形成することができる、タンパク質コンストラクトである。
【００６３】
グループ２インフルエンザＨＡタンパク質の少なくとも一部を単量体サブユニットに連結させることによって、本発明のタンパク質コンストラクトは、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質の三量体を表面上に発現するナノ粒子に集合することができる。そのような三量体は、融合前形態のものであり、単量体サブユニットへの連結、およびそのナノ粒子上での発現によって、融合前の三量体形態のタンパク質は安定化される。このため、ＨＡタンパク質は、よりネイティブな形態で提示され、これは、ステムポリペプチドのある特定の表面が露出しないことを意味し、それによってステムポリペプチドが望ましくない抗体応答を誘導し得るリスクを低減させることができる。
【００６４】
ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域由来の少なくとも１つの免疫原性部分を含み、タンパク質コンストラクトは、インフルエンザウイルスに対する防御抗体を誘発する。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、Ｈ３インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ７インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１０インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、およびＨ１５インフルエンザウイルスＨＡタンパク質からなる群から選択されるＨＡタンパク質のステム領域由来の少なくとも１つの免疫原性部分を含む。
【００６５】
ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、配列番号４〜配列番号２６からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質のＨＡ部分に由来する、少なくとも１つの免疫原性部分を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、配列番号４〜配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質のＨＡ部分に由来する、少なくとも１つの免疫原性部分を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質のＨＡ部分に由来する、少なくとも１つの免疫原性部分を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質のＨＡ部分に由来する、少なくとも１つの免疫原性部分を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質のＨＡ部分に由来する、少なくとも１つの免疫原性部分を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質のＨＡ部分に由来する、少なくとも１つの免疫原性部分を含む。一実施形態では、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質の免疫原性部分を含むタンパク質コンストラクトは、インフルエンザウイルスに対する広範な防御抗体の産生を誘発する。
【００６６】
タンパク質の免疫原性部分は、免疫系によって認識されるアミノ酸残基のクラスタであるエピトープを含み、それによって免疫応答を誘発することができる。そのようなエピトープは、連続するアミノ酸残基（すなわち、タンパク質において互いに隣接するアミノ酸残基）からなり得るか、またはそれらは、最終的に折り畳まれたタンパク質において空間的に近い位置に存在する不連続なアミノ酸残基（すなわち、タンパク質において互いに隣接しないアミノ酸残基）からなり得る。エピトープが免疫系によって認識されるためには、最少で６アミノ酸残基を必要とすることは当業者に周知である。したがって、ある特定の態様では、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質の免疫原性部分は、少なくとも１つのエピトープを含む。一実施形態では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域由来の少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、Ｈ３インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ７インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１０インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、およびＨ１５インフルエンザウイルスＨＡタンパク質からなる群から選択されるグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域由来の少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、表２に記載されるウイルスから選択されるインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来する少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、表２に記載されるウイルスおよびその変異体から選択されるインフルエンザウイルスのグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来する少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、配列番号４〜配列番号２６からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一である配列を含むグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来する少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、配列番号４〜配列番号２６からなる群から選択される配列を含むグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来するの少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一である配列を含むタンパク質のＨＡ部分に由来するの少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部は、配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択される配列を含むタンパク質のＨＡ部分に由来する少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸を含む。
【００６７】
本発明のある特定の態様では、前記アミノ酸は、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域由来の連続するアミノ酸である。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域由来の少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸を含む本発明のタンパク質コンストラクトは、インフルエンザウイルスに対する広範な防御抗体の産生を誘発する。本発明のある特定の態様では、タンパク質コンストラクトは、配列番号４〜配列番号２６からなる群から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、タンパク質コンストラクトは、配列番号４〜配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸を含む。ある特定の態様では、前記アミノ酸は不連続であるが、最終的なタンパク質において空間的に近い位置に存在する。
【００６８】
本出願は、いくつかの例示的なグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来のステム領域配列の使用を例示するが、本発明は、開示されるグループ２インフルエンザＨＡ配列の変異配列を含むタンパク質に由来するステム領域を使用しても同様に実施され得る。したがって、本発明のある特定の態様では、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質は、表２に記載されるグループ２ウイルスおよびその変異体から選択されるウイルスに由来する。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、配列番号４〜配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質は、配列番号４〜配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６９】
本発明のある特定の態様では、タンパク質コンストラクトにおいて、ＨＡタンパク質のヘッド領域配列は、リンカー配列で置き換えられている。ステム領域配列が所望の立体構造をとることができる限り、任意のリンカー配列を使用してよい。任意のアミノ酸を使用してリンカー配列を作製してよいが、本発明のある特定の態様では、そのようなアミノ酸は、大きい側鎖または荷電側鎖を欠如する。使用するために好ましいアミノ酸には、システイン、セリン、グリシン、アラニン、バリン、およびプロリンが挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、リンカーは、セリン、グリシン、システイン、バリン、プロリン、および／またはフェニルアラニン残基からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸から作製される。ある特定の実施形態では、別のアミノ酸とジスルフィド結合などの共有結合を形成することができる側鎖を有するアミノ酸残基を含めることが有利であり得る。そのようなアミノ酸の一例はシステインである。リンカー配列の長さは多様であり得るが、好ましい実施形態は、ステム配列に所望の構造を形成させるために、可能な最短の配列を使用する。ある特定の態様では、リンカー配列は、１２個未満のアミノ酸長である。一実施形態では、リンカー配列は、１０個未満のアミノ酸長である。一実施形態では、リンカー配列は、５個未満のアミノ酸長である。好ましい実施形態では、リンカー配列は、ＨＡタンパク質のヘッド領域由来の連続するアミノ酸配列を欠如する。ある特定の態様では、リンカー配列は、ＨＡタンパク質のヘッド領域由来の５個未満の連続アミノ酸を含む。ある特定の態様では、ヘッド領域配列は、配列番号３４、配列番号３５、またはその変異体を含むアミノ酸配列で置き換えられる。
【００７０】
本発明者らはまた、開示されるタンパク質コンストラクトのグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に対してさらなる変更を加えることによって、本発明のタンパク質コンストラクトおよびナノ粒子の安定性を改善できることを見出した。例えば、本発明者らは、ヘリックスＡの長さを伸長させると、本発明のタンパク質コンストラクトの性能が改善されることを見出した。したがって、一実施形態は、ヘリックスＡがアミノ酸の付加によって伸長されている本発明のタンパク質コンストラクトである。一実施形態は、本発明のタンパク質コンストラクトであって、タンパク質コンストラクトが、単量体サブユニットの少なくとも一部に連結したグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含み、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のヘッド領域が、インフルエンザＨＡタンパク質のヘッド領域由来の５個未満の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列で置き換えられており、ヘリックスＡのカルボキシル末端（すなわち、ヘリックスＣのアミノ末端に連結する部分）が、アミノ酸残基の付加によって伸長されている、タンパク質コンストラクトである。目的とするのはヘリックスの伸長であるから、ヘリックスＡのカルボキシ末端に付加されるアミノ酸の配列は、好ましくはヘリックスを形成すべきであることを認識すべきである。本発明のある特定の態様では、ヘリックスＡの長さは、配列番号３６もしくは３７またはそのヘリックス形成変異体を含むアミノ酸配列を、ヘリックスＡのカルボキシル末端に付加することによって伸長する。本発明のある特定の態様では、ヘリックスＡの長さは、Ｘ１ＬＭＸ２Ｑを含むか、もしくはそれからなる配列、またはそのヘリックス形成変異体を、ヘリックスＡのカルボキシル末端に付加することによって伸長し、ここで、位置Ｘ１およびＸ２のアミノ酸は、酸性アミノ酸である。Ｘ１およびＸ２は、同じアミノ酸残基であり得るが、必ずしもその必要はないことに注意すべきである。ある特定の態様では、そのようなリンカーの第１および第４位の残基は、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、およびプロリンからなる群から選択される。一実施形態では、ヘリックスＡは、配列番号３６もしくは３７からなるアミノ酸配列またはそのヘリックス形成変異体を、ヘリックスＡのカルボキシル末端に付加することによって伸長する。本発明のある特定の態様では、ヘリックスＡの長さは、ＡＬＭＡＱもしくはＥＬＭＥＱを含む配列またはそのヘリックス形成変異体を、ヘリックスＡのカルボキシル末端に付加することによって伸長する。本発明のある特定の態様では、ヘリックスＡの長さは、ＡＬＭＡＱもしくはＥＬＭＥＱからなる配列またはそのヘリックス形成変異体を、ヘリックスＡのカルボキシル末端に付加することによって伸長する。
【００７１】
ヘリックスＡの伸長に加えて、本発明者らは、ヘリックスＡのカルボキシル末端をヘリックスＣのアミノ末端に連結させるアミノ酸配列（本書において、ヘリックス間領域またはヘリックス間ループとも呼ばれ、その一例は配列番号３８によって表される）の修飾が、本発明のタンパク質コンストラクトおよびナノ粒子の安定性および性能を改善することを見出した。より詳しくは、本発明者らは、ヘリックス間領域の長さを短縮すると、本発明のタンパク質コンストラクトおよびナノ粒子の安定性および性能を改善することを見出した。したがって、本発明のある特定の態様では、本発明のタンパク質コンストラクトにおいてヘリックスＡのカルボキシル末端をヘリックスＣのアミノ末端に連結するアミノ酸配列を、本発明のタンパク質コンストラクトの安定性を改善するように修飾する。本発明のタンパク質コンストラクトの安定性を改善することは、本発明のタンパク質コンストラクトの三次元構造、特に本発明のタンパク質コンストラクトのステム領域の三次元構造を安定化させて、ネイティブのグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域の三次元構造に類似させ、グループ２インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発することができることを意味すると認識すべきである。したがって、本発明のある特定の態様では、本発明のタンパク質コンストラクトのヘリックス間領域は短縮される。そのような短縮は、既存のヘリックス間領域からアミノ酸を除去することによって、またはヘリックス間領域のアミノ酸をリンカー配列で置き換えることによって達成することができる。ある特定の態様では、本発明のタンパク質コンストラクトのヘリックス間領域を、６個未満のアミノ酸に短縮する。ある特定の態様では、ヘリックス間領域のアミノ酸を、リンカー配列で置き換える。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のヘリックス間領域に対応するヘリックス間領域のアミノ酸を、リンカー配列で置き換える。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のアミノ酸４０２〜４３７に対応するヘリックス間領域のアミノ酸を、リンカー配列で置き換える。本発明のある特定の態様では、配列番号４のアミノ酸４０２〜４３７を含むヘリックス間領域を、リンカー配列で置き換える。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）の配列番号３８によって表される領域に対応するヘリックス間領域を、リンカー配列で置き換える。本発明のある特定の態様では、配列番号３８と少なくとも９０％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のヘリックス間領域を、リンカー配列で置き換える。一実施形態では、配列番号３８を含むグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の領域を、リンカー配列で置き換える。本発明のある特定の態様では、配列番号３８からなるグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の領域を、リンカー配列で置き換える。本発明のある特定の態様では、ヘリックス間領域を、ＧＧＰＤ（配列番号３９）を含むリンカー配列で置き換える。本発明のある特定の態様では、配列番号４のアミノ酸４０２〜４３７に対応するヘリックス間領域を、ＧＧＰＤからなるペプチドの物理的、空間的、および／または化学的特性を有するリンカー配列で置き換える。本発明のある特定の態様では、配列番号４のアミノ酸４０２〜４３７に対応するヘリックス間領域を、ヘリックスを形成する傾向を有するリンカー配列で置き換える。本発明のある特定の態様では、配列番号４のアミノ酸４０２〜４３７に対応するヘリックス間領域を、ＧＧＰＤ（配列番号３９）を含むリンカー配列またはその保存的変異体で置き換える。本発明のある特定の態様では、ヘリックス間領域を、ＧＧＰＤからなるリンカー配列で置き換える。
【００７２】
先に述べたように、本発明のタンパク質コンストラクトは、本書に記載の突然変異および配列変化の１つ、いくつか、または全てを含み得る。したがって、例えば、上記のようなヘリックスＡが伸長しているタンパク質コンストラクトもまた、上記のような短縮されたヘリックス間領域またはリンカー配列で置き換えられたヘリックス間領域を有することができる。したがって、本発明の一態様は、単量体サブユニットタンパク質の少なくとも一部に連結したグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含むタンパク質コンストラクトであって、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のヘッド領域が、インフルエンザＨＡタンパク質のヘッド領域由来の５個未満の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列で置き換えられており、ヘリックス間領域が、短縮されているか、またはリンカー配列で置き換えられており、およびタンパク質コンストラクトがナノ粒子を形成することができるタンパク質コンストラクトである。ＨＡタンパク質ヘッド領域を置き換える方法、ヘリックス間領域を短縮または置き換える方法を、本書に開示する。ヘリックスＡのカルボキシル末端がアミノ酸の付加によって伸長している実施形態では、ヘリックス間領域が、ヘリックスＣのアミノ末端をヘリックスＡの伸長配列のカルボキシル末端に結合させるリンカーで置き換えられ得ると理解すべきである。
【００７３】
本発明者らは、グループ２インフルエンザウイルスステム領域の配列中に部位特異的突然変異を作製することによって、本発明のタンパク質コンストラクトの安定性を改善できることをさらに見出した。特に、イオン結合、塩架橋を形成する突然変異、疎水性パッキングを増加させる突然変異等は、本発明のタンパク質コンストラクトおよびナノ粒子の安定性を増強することができる。したがって、本発明のある特定の態様では、本発明のタンパク質コンストラクトは、イオン相互作用もしくは塩架橋を形成もしくは強化する、または疎水性パッキングを増加させる、１つもしくは複数の突然変異を含む。本発明のタンパク質コンストラクトの安定性を増加させるという所望の効果を有する任意のタイプの突然変異を作製することができるが、置換突然変異が好ましい。本発明のある特定の態様では、突然変異は、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質において、配列番号４におけるＫ３９６、Ｌ３９７、Ｌ４００、Ｓ４３８、Ｎ４４０、Ｅ４４８、Ｔ４５２、およびＮ４６１からなる群から選択される位置に対応するアミノ酸位置で作製される。一実施形態では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＫ３９６に対応するアミノ酸を、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＫ３９６に対応するアミノ酸を、メチオニンまたはロイシンに変更する。一実施形態では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＬ３９７に対応するアミノ酸を、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＬ３９７に対応するアミノ酸を、バリンに変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＬ４００に対応するアミノ酸を、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＬ４００に対応するアミノ酸を、バリンに変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＳ４３８に対応するアミノ酸残基を、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびシステインからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＳ４３８に対応するアミノ酸を、システインに変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＮ４４０に対応するアミノ酸を、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＮ４４０に対応するアミノ酸を、ロイシンに変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＥ４４８に対応するアミノ酸を、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＥ４４８に対応するアミノ酸を、ロイシンに変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＴ４５２に対応するアミノ酸残基を、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＴ４５２に対応するアミノ酸を、バリンに変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＮ４６１に対応するアミノ酸を、ヒスチジン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＮ４６１に対応するアミノ酸を、ヒスチジン、リシン、およびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＮ４６１に対応するアミノ酸を、アルギニンに変更する。
【００７４】
本発明のタンパク質コンストラクトを安定化させ得るさらなる突然変異は、配列番号４におけるＧ３９、Ｔ４６、Ｎ５４、Ｔ５８、Ｌ３３１、Ｎ３３８、およびＱ３９２からなる群から選択される位置に対応するアミノ酸位置での突然変異を含む。そのような位置での突然変異は、挿入されるアミノ酸が、本書において示唆されるアミノ酸と特性が類似する突然変異を含み得ると理解すべきである。
【００７５】
本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＧ３９に対応するアミノ酸を、システイン、セリン、スレオニン、プロリン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＧ３９に対応するアミノ酸を、システインに変更する。
【００７６】
本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＴ４６に対応するアミノ酸を、システイン、セリン、スレオニン、プロリン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルスＡ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＴ４６に対応するアミノ酸を、システインに変更する。
【００７７】
本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＮ５４に対応するアミノ酸を、ヒスチジン、アルギニン、およびリシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＮ５４に対応するアミノ酸を、ヒスチジンに変更する。
【００７８】
本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＴ５８に対応するアミノ酸を、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＴ５８に対応するアミノ酸を、ロイシンに変更する。
【００７９】
本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＬ３３１に対応するアミノ酸を、ヒスチジン、アルギニン、およびリシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＬ３３１に対応するアミノ酸を、リシンに変更する。
【００８０】
本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＮ３３８に対応するアミノ酸を、システイン、セリン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＮ３３８に対応するアミノ酸を、システインに変更する。
【００８１】
本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＱ３９２に対応するアミノ酸を、システイン、セリン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更する。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のＱ３９２に対応するアミノ酸を、システインに変更する。
【００８２】
上記に加えて、本発明者らは、グリカン結合部位を付加する突然変異が有益であり得ることを見出した。したがって、本発明のある特定の態様では、タンパク質コンストラクトは、Ｑ４９Ｎ／Ｅ５１Ｔ（グループ１グリカンを付加する突然変異）、Ｅ５６Ｎ／Ｖ５９Ｔ（ヘッドリンカーおよび隣接する残基における突然変異）、Ｖ５９Ｎ／Ｐ６１Ｔ（ヘッドリンカーにおける突然変異）、Ｇ６２Ｎ／Ｇ６４Ｔ（ヘッドリンカーにおける突然変異）、Ｖ３２９Ｎ／Ｌ３３１Ｔ（ヘッドリンカーおよび隣接する残基における突然変異）、Ｌ３３１Ｎ／Ｌ３３３Ｔ、Ｄ４３７Ｎ／Ｙ４３９Ｔ（ヘリックス間リンカーおよび隣接する残基における突然変異）、Ｑ４３２Ｎ／Ｇ４３４Ｔ（挿入されたＧ）（ヘリックス間リンカーおよび隣接する残基における突然変異）、Ｑ３７２Ｎ／Ｓ３７４Ｔ、およびＡ４９２Ｎ／Ｉ４９４Ｔからなる群から選択される、１つもしくは複数の突然変異、または１つもしくは複数の組の突然変異を含む。
【００８３】
さらに、本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザウイルス（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質（配列番号４）のアミノ酸３３９〜３５７に対応するループを、グリシンリンカーで置き換えることができる。
【００８４】
先に述べたように、本発明のタンパク質コンストラクトは、本書に記載の突然変異および配列変化の１つ、いくつか、または全てを含み得る。したがって、例えば、本書に記載されるようなヘリックスＡが伸長しているタンパク質コンストラクトは、本書に記載されるような短縮されたヘリックス間領域またはリンカー配列で置き換えられたヘリックス間領域をも有することができ、本書に記載の部位特異的突然変異の１つまたは複数をも含み得る。したがって、本発明の一態様は、単量体サブユニットタンパク質の少なくとも一部に連結したグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含むタンパク質コンストラクトであって、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のヘッド領域がインフルエンザＨＡタンパク質のヘッド領域由来の５個未満の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列で置き換えられており、ヘリックス間領域が短縮されているか、またはリンカー配列で置き換えられており、タンパク質コンストラクトのＨＡ部分が、配列番号４におけるＫ３９６、Ｌ３９７、Ｌ４００、Ｓ４３８、Ｎ４４０、Ｅ４４８、Ｔ４５２、Ｎ４６１、Ｇ３９、Ｔ４６、Ｎ５４、Ｔ５８、Ｌ３３１、Ｎ３３８、およびＤ４３７からなる群から選択される位置に対応する位置における１つまたは複数の部位特異的突然変異を含み、タンパク質コンストラクトが、ナノ粒子を形成することができる、タンパク質コンストラクトである。そのようなコンストラクトはまた、Ｑ４９Ｎ／Ｅ５１Ｔ、Ｅ５６Ｎ／Ｖ５９Ｔ（ヘッドリンカーおよび隣接する残基における突然変異）、Ｖ５９Ｎ／Ｐ６１Ｔ（ヘッドリンカーにおける突然変異）、Ｇ６２Ｎ／Ｇ６４Ｔ（ヘッドリンカーにおける突然変異）、Ｖ３２９Ｎ／Ｌ３３１Ｔ（ヘッドリンカーおよび隣接する残基における突然変異）、Ｌ３３１Ｎ／Ｌ３３３Ｔ、Ｄ４３７Ｎ／Ｙ４３９Ｔ（ヘリックス間リンカーおよび隣接する残基における突然変異）、Ｑ４３２Ｎ／Ｇ４３４Ｔ（挿入されたＧ）（ヘリックス間リンカーおよび隣接する残基における突然変異）、Ｑ３７２Ｎ／Ｓ３７４Ｔ、およびＡ４９２Ｎ／Ｉ４９４Ｔからなる群から選択される、１つもしくは複数の突然変異、または１つもしくは複数の組の突然変異を含み得る。ＨＡタンパク質ヘッド領域を置き換える、ヘリックスＡを伸長させる、ヘリックス間領域を短縮または置き換える、および適した部位特異的突然変異を導入する方法は、本書において開示される。ヘリックスＡのカルボキシル末端がアミノ酸の付加によって伸長している実施形態では、ヘリックス間領域を、ヘリックスＣのアミノ末端をヘリックスＡの伸長配列のカルボキシル末端に連結させるリンカーで置き換え得ると理解すべきである。
【００８５】
ここまで、ナノ粒子ワクチンを製造するために有用な本発明のタンパク質コンストラクトの特定の態様を記述してきた。本発明を明解にするよう、本発明者らは次に、様々な態様を、選択肢を示して、また、より詳細に記載する。以下に記載される本発明の態様は、本書において上記したタンパク質コンストラクトの実施形態および態様にも当てはめられると理解すべきである。
【００８６】
本発明のタンパク質コンストラクトは、組換え技術を使用して、グループ３インフルエンザＨＡタンパク質の様々な部分を連結し、それに対して配列変化を導入して作製することができる。また、組換え技術を使用して、適切なリンカーおよび単量体サブユニットを付加することができる。このようにして、本発明のタンパク質コンストラクト、および結果として本発明のナノ粒子ワクチンを製造するために必要な特定の配列を含むタンパク質コンストラクトを製造することができる。したがって、本発明の一態様は、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域由来の第１のアミノ酸配列、およびグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域由来の第２のアミノ酸配列を含むタンパク質コンストラクト（本明細書において融合タンパク質とも呼ぶ）であって、第１および第２のアミノ酸配列がリンカー配列によって共有結合により連結され、
第１のアミノ酸配列が、ヘッド領域配列のアミノ末端の上流のアミノ酸配列由来の少なくとも２０個の連続アミノ酸を含み、
第２のアミノ酸配列が、ヘッド領域配列のカルボキシル末端の下流のアミノ酸配列ユリアの少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含み、および
タンパク質コンストラクトがナノ粒子を形成することができるように、第１または第２のアミノ酸配列が単量体サブユニットドメインの少なくとも一部に連結する
タンパク質コンストラクトである。
【００８７】
本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、Ｈ３インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ７インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１０インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、およびＨ１５インフルエンザウイルスＨＡタンパク質からなる群から選択されるウイルス由来グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、表２に記載されるグループ２ウイルスに由来するＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来し、ＨＡタンパク質は、配列番号４〜配列番号２６および配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来し、ＨＡタンパク質は、配列番号４〜配列番号２６および配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択される配列を含む。
【００８８】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ｈ３インフルエンザウイルス、Ｈ４インフルエンザウイルス、Ｈ７インフルエンザウイルス、Ｈ１０インフルエンザウイルス、Ｈ１４インフルエンザウイルス、およびＨ１５インフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、表２に記載されるグループ２ウイルスに由来するＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来し、ＨＡタンパク質は、配列番号４〜配列番号２６および配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号４〜配列番号２６および配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択される配列を含むグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する。
【００８９】
上記のように、第１のアミノ酸配列は、ヘッド領域配列のアミノ末端の上流のアミノ酸配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明に従って、上流という用語は、ヘッド領域の第１のアミノ酸残基のアミノ末端に連結したアミノ酸配列の全体を指す。好ましい上流の配列は、ヘッド領域配列に直接に隣接する配列である。本発明のある特定の態様では、ヘッド領域のアミノ末端は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のＨＡタンパク質のＱ６０に対応するアミノ酸残基に位置する。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号４によって表されるＡ型インフルエンザデンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））のＨＡタンパク質のアミノ酸残基１〜５９に対応するグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９からなる群から選択される配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。
【００９０】
本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のアミノ酸残基１〜５９に対応するＨＡタンパク質アミノ酸領域に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７または配列番号２８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７または配列番号２８に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。
【００９１】
本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列を含む。一実施形態では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７を含む。
【００９２】
上記のように、第２のアミノ酸配列は、ヘッド領域配列のカルボキシル末端の下流のアミノ酸配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明に従って、下流という用語は、ヘッド領域のカルボキシル末端アミノ酸残基に連結したアミノ酸配列の全体を指す。好ましい上流の配列は、ヘッド領域配列に直接に隣接する配列である。本発明のある特定の態様では、ヘッド領域のカルボキシル末端は、配列番号４によって表されるＡ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質のＨＡタンパク質のＴ３２９に対応するアミノ酸位置に位置する。したがって、本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質のアミノ酸残基３３０〜５１９に対応するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））（配列番号４）のアミノ酸残基３３０〜５１９を含むグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む。一実施形態では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。一実施形態では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択される配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。
【００９３】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質のアミノ酸残基３３０〜５１９に対応するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））（配列番号４）のアミノ酸残基３３０〜５１９を含むグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択される配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。
【００９４】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３６と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３６を含む。
【００９５】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質のアミノ酸残基３３０〜５１９に対応するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも６０、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも１７５、または少なくとも１９０個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））（配列番号４）のアミノ酸残基３３０〜５１９を含むグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも６０、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも１７５、または少なくとも１９０個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも１７５、または少なくとも１９０個の連続アミノ酸残基を含む。一実施形態では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０に由来する少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも１７５、または少なくとも１９０個の連続アミノ酸残基を含む。
【００９６】
上記のように、タンパク質コンストラクトの第１および第２のアミノ酸配列を、リンカー配列によって連結することができる。リンカー配列がＨＡタンパク質のヘッド領域に由来する５個未満の連続アミノ酸残基を有する限り、ならびに第１および第２のアミノ酸が所望の立体構造を形成することができる限り、任意のリンカー配列を使用することができる。一実施形態では、リンカー配列は、１０個未満のアミノ酸長、７個未満のアミノ酸長、または５個未満のアミノ酸長である。一実施形態では、リンカー配列は、グリシンおよびセリンを含む。一実施形態では、リンカー配列は、第１のアミノ酸配列のカルボキシル末端を、第２のアミノ酸配列のアミノ末端に連結する。本発明のある特定の態様では、リンカー配列は、第２のアミノ酸配列のカルボキシル末端を第１のアミノ酸配列のアミノ末端に結合する。本発明のある特定の態様では、リンカー配列は、配列番号３４または配列番号３５からなるペプチドと化学的特性および空間的特性において類似する。本発明のある特定の態様では、リンカーは、配列番号３４または配列番号３５、またはその保存的変異体を含む。一実施形態では、リンカーは、配列番号３４または配列番号３５を含む。本発明のある特定の態様では、リンカーは、配列番号３４または配列番号３５からなる。
【００９７】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のアミノ酸３３０〜５１９に対応するグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に由来するアミノ酸配列を含み、ＨＡタンパク質（配列番号４）のヘリックス間領域に対応する領域が、リンカーペプチドに置き換えられる。本発明のある特定の態様では、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のヘリックス間領域は、配列番号４のアミノ酸４０２〜４３７から本質的になる。したがって、本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のアミノ酸３３０〜５１９に対応するグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来のアミノ酸配列を含み、配列番号４のアミノ酸４０２〜４３７に対応する領域がリンカーペプチドに置き換えられる。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ヘリックス間領域（すなわち、配列番号４のアミノ酸４０２〜４３７）に対応する領域がリンカーペプチドで置き換えられる。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０を含み、ヘリックス間領域（すなわち、配列番号４のアミノ酸４０２〜４３７）に対応する領域がリンカーペプチドで置き換えられる。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０を含み、配列番号３０のアミノ酸７３〜１０８がリンカーペプチドで置き換えられる。タンパク質コンストラクトが所望の立体構造を形成することができる限り、任意のリンカー配列を、第２のアミノ酸配列におけるリンカーペプチドとして使用することができる。本発明のある特定の態様では、リンカーペプチドは、１０個未満のアミノ酸長、７個未満のアミノ酸長、または５個未満のアミノ酸長である。一実施形態では、リンカーペプチドは、４アミノ酸長である。本発明のある特定の態様では、リンカー配列は、グリシン、セリン、プロリン、およびアスパラギン酸からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、リンカーペプチドは、配列番号３９からなるペプチドと化学的特性および空間的特性の類似するアミノ酸配列を含む。本発明のある特定の態様では、リンカーペプチドは、配列番号３９、またはその保存的変異体を含む。本発明のある特定の態様では、リンカーペプチドは配列番号３８を含む。本発明のある特定の態様では、リンカーペプチドは、配列番号３９からなる。
【００９８】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３からなる群から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一である配列を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３からなる群から選択される配列を含む。
【００９９】
本発明の一実施形態は、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する第１のアミノ酸配列、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する第２のアミノ酸配列、およびグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する第３のアミノ酸配列を含むタンパク質コンストラクト（融合タンパク質とも呼ばれる）であって；
第１のアミノ酸配列が、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のヘッド領域配列のアミノ末端の上流のアミノ酸配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、またはＡ型インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のヘッド領域配列のアミノ末端の上流のアミノ酸配列に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸と少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；
第２のアミノ酸配列が、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のヘッド領域配列のカルボキシル末端をヘリックス間領域に連結させるアミノ酸配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、またはＡ型インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のヘッド領域配列のカルボキシル末端をヘリックス間領域に連結させるアミノ酸配列に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基と少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；
第３のアミノ酸配列が、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のヘリックス間領域のカルボキシル末端を膜貫通ドメイン（ＴＭ）に連結させるアミノ酸配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸、またはＡ型インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のヘリックス間領域のカルボキシル末端を膜貫通ドメインに連結させるアミノ酸配列に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基と少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；
第１および第２のアミノ酸配列が、リンカー配列によって連結され、第２および第３のアミノ酸配列がリンカーペプチドによって連結され、ならびに
タンパク質コンストラクトがナノ粒子を形成することができるように、第１または第３のアミノ酸配列が単量体サブユニットドメインの少なくとも一部に連結する
タンパク質コンストラクトである。
【０１００】
本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質に由来する。一実施形態では、第１のアミノ酸配列は、Ｈ３インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ７インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１０インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、およびＨ１５インフルエンザウイルスＨＡタンパク質からなる群から選択されるウイルス由来グループ２インフルエンザＨＡタンパク質に由来する。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、表２に記載されるグループ２ウイルスに由来するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質に由来する。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号４〜配列番号２６および配列番号４７〜１５９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号４〜配列番号２６および配列番号４７〜１５９からなる群から選択される配列を含むグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来する。
【０１０１】
本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））のＨＡタンパク質のアミノ酸残基１〜５９に対応するグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９からなる群から選択される配列と少なくとも少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９からなる群から選択される配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。
【０１０２】
本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））のアミノ酸残基１〜５９に対応するＨＡタンパク質アミノ酸領域に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７および配列番号２８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７および配列番号２８由来の少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。
【０１０３】
本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のアミノ酸残基１〜５９に対応する配列を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７からなる。
【０１０４】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質に由来する。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ｈ３インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ７インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１０インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、およびＨ１５インフルエンザウイルスＨＡタンパク質からなる群から選択されるウイルス由来グループ２インフルエンザＨＡタンパク質に由来する。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、表２に記載されるグループ２ウイルスに由来するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質に由来する。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号４〜配列番号２６および配列番号４７〜１５９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号４〜配列番号２６および配列番号４７〜１５９からなる群から選択される配列を含むグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来する。
【０１０５】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））（配列番号４）のアミノ酸残基３３０〜４０１に対応するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択される配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択される配列に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。
【０１０６】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は配列番号３１を含む。
【０１０７】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質のヘッド領域配列のカルボキシル末端に直接に続く下流であるグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列に由来する少なくとも６０、または少なくとも７２個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のアミノ酸残基３３０〜４０１に対応するグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のアミノ酸領域に由来する少なくとも６０、または少なくとも７２個の連続アミノ酸を含む。
【０１０８】
第１および第２のアミノ酸配列は、リンカー配列によって連結される。本発明のある特定の態様では、リンカー配列は、１０個未満のアミノ酸長、７個未満のアミノ酸長、または５個未満のアミノ酸長である。本発明のある特定の態様では、リンカー配列は、グリシンおよびセリンを含む。本発明のある特定の態様では、リンカー配列は、第１のアミノ酸配列のカルボキシル末端を、第２のアミノ酸配列のアミノ末端に連結する。本発明のある特定の態様では、リンカー配列は、第２のアミノ酸配列のカルボキシル末端を、第１のアミノ酸配列のアミノ末端に連結する。本発明のある特定の態様では、リンカー配列は、配列番号３４または配列番号３５からなるペプチドと化学的および空間的な特性において類似する。本発明のある特定の態様では、リンカーは、配列番号３４もしくは配列番号３５、またはその保存的変異体を含む。一実施形態では、リンカーは、配列番号３４または配列番号３５を含む。本発明のある特定の態様では、リンカーは、配列番号３４または配列番号３５からなる。
【０１０９】
本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質に由来する。本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、Ｈ３インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ７インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１０インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、およびＨ１５インフルエンザウイルスＨＡタンパク質からなる群から選択されるウイルス由来グループ２インフルエンザＨＡタンパク質に由来する。本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、表２に記載されるグループ２ウイルスに由来するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質に由来する。本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、配列番号４〜配列番号２６および配列番号４７〜１５９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、配列番号４〜配列番号２６、および配列番号４７〜１５９からなる群から選択される配列を含むグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来する。
【０１１０】
本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のアミノ酸残基４３８〜５１９に対応するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６からなる群から選択される配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６からなる群から選択される配列に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。
【０１１１】
本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、グループ２Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質のヘリックス間領域配列のカルボキシル末端に直接続く下流であるグループ２インフルエンザＨＡタンパク質アミノ酸配列に由来する少なくとも６０、または少なくとも７５個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のアミノ酸残基４３８〜５１９に対応するグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質アミノ酸領域に由来する少なくとも６０、または少なくとも７５個の連続アミノ酸を含む。
【０１１３】
リンカーペプチドは、タンパク質コンストラクトが所望の立体構造を形成することができる限り、任意のアミノ酸配列を含み得る。本発明のある特定の態様では、リンカーペプチドは、１０個未満のアミノ酸長、７個未満のアミノ酸長、または５個未満のアミノ酸長である。本発明のある特定の態様では、リンカーペプチドは、４アミノ酸長である。本発明のある特定の態様では、リンカー配列は、グリシン、セリン、プロリン、およびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、リンカーペプチドは、配列番号３９を含む。本発明のある特定の態様では、リンカーペプチドは、配列番号３９からなる。
【０１１４】
前記のように、本発明のタンパク質コンストラクトにおける様々な位置での突然変異は、タンパク質コンストラクトおよび／またはコンストラクトを含むナノ粒子の三次元構造を安定化させることができる。したがって、本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号４におけるＧ３９、Ｔ４６、およびＴ５８からなる群から選択される位置に対応するアミノ酸位置における少なくとも１つの突然変異を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、Ｇ３９Ｃ、Ｔ４６Ｃ、およびＮ５４Ｈ、Ｔ５８Ｌ（ナンバリングはＡ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質の配列に基づく）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１１５】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号４におけるＬ３３１、Ｎ３３８、Ｑ３９２、Ｋ３９６、Ｌ３９７、およびＬ４００からなる群から選択される位置に対応するアミノ酸位置における少なくとも１つの突然変異を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、Ｌ３３１Ｋ、Ｎ３３８Ｃ、Ｑ３９２Ｃ、およびＬ４００Ｖ（ナンバリングはＡ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質の配列に基づく）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１１６】
本発明のある特定の態様では、第３のアミノ酸配列は、配列番号４におけるＳ４３８、Ｎ４４０、Ｅ４４８、Ｔ４５２、およびＮ４６１からなる群から選択される位置に対応するアミノ酸位置における少なくとも１つの突然変異を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、Ｓ４３８Ｃ、Ｎ４４０Ｌ、Ｅ４４８Ｌ、Ｔ４５２Ｖ、およびＮ４６１Ｒ（ナンバリングはＡ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質の配列に基づく）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１１７】
上記のように、本発明のタンパク質コンストラクトは、タンパク質コンストラクトがナノ粒子を形成することができるように、単量体サブユニットタンパク質の少なくとも一部に連結させることができる。本発明のある特定の態様では、単量体サブユニットタンパク質の少なくとも一部は、第３のアミノ酸配列に連結する。好ましい実施形態では、単量体サブユニットタンパク質の少なくとも一部は、第３のアミノ酸配列のカルボキシル末端に連結する。本発明のある特定の態様では、単量体サブユニットタンパク質の前記部分は、単量体サブユニット由来の少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、単量体サブユニットはフェリチンである。本発明のある特定の態様では、単量体サブユニットは、ルマジンシンターゼである。本発明のある特定の態様では、単量体サブユニットの前記部分は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に由来する少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、単量体サブユニットは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３と少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である配列を含む。本発明のある特定の態様では、単量体サブユニットは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる群から選択される配列を含む。
【０１１８】
本書に開示されるグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に対してなされる修飾は、個別の実施形態として記載されているが、そのような全ての修飾を単一のタンパク質コンストラクトに含めてもよいと認識すべきである。例えば、第１のアミノ酸配列がリンカーによって第２のアミノ酸配列に連結しているタンパク質コンストラクトであって、第２のアミノ酸配列が、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質のヘッド領域のカルボキシル末端の下流領域に由来するアミノ酸配列を含み、グループ２ Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質のアミノ酸４０２〜４３７に対応するヘリックス間領域がリンカーペプチドで置き換えられ、１つまたは複数の突然変異が、グループ２ Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質のＬ３３１、Ｎ３３８、Ｋ３９６、Ｌ３９７、Ｌ４００、Ｓ４３８、Ｎ４４０、Ｅ４４８、Ｔ４５２、およびＮ４６１からなる群から選択される位置に対応する位置で第２のアミノ酸配列に導入されており、それによって、折り畳まれたタンパク質におけるこれらアミノ酸残基間の相互作用の強度が増加させられている、タンパク質コンストラクトを作製することができる。
【０１１９】
上記のタンパク質コンストラクトを使用して、１つまたは複数のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を生じることができるナノ粒子を製造することができるが、本発明のタンパク質のアミノ酸配列にさらなる突然変異を操作することは有用であり得る。例えば、タンパク質に有益な特性（例えば、溶解性、半減期、免疫監視からタンパク質の部分を隠すこと）を与えるために、単量体サブユニットタンパク質、三量体化ドメイン、またはリンカー配列において酵素認識部位またはグリコシル化部位などの部位を変化させることが有用であり得る。この点において、フェリチンの単量体サブユニットは、天然ではグリコシル化されないことが公知である。しかし、これは、哺乳動物または酵母細胞において分泌タンパク質として発現させると、グリコシル化され得る。このため、本発明のある特定の態様では、単量体フェリチンサブユニット由来のアミノ酸配列における潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を、突然変異したフェリチンサブユニット配列が突然変異位置でもはやグリコシル化されないように突然変異させる。突然変異した単量体フェリチンサブユニットのそのような１つの配列を、配列番号２によって表す。有用な突然変異の詳しい記載は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３２６９５号に開示されている。
【０１２０】
一部の例では、タンパク質コンストラクトにおけるある特定のアミノ酸配列に対する免疫応答の生成を遮断することが望まれ得る。これは、遮断すべき部位付近にグリコシル化部位を付加して、免疫系が遮断部位に到達する能力をグリカンにより立体的に妨害することによって行われ得る。したがって、本発明のある特定の態様では、タンパク質コンストラクトの配列は、１つまたは複数のグリコシル化部位を含むように変化されている。そのような部位の例には、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ、およびＡｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓが挙げられるがこれらに限定されない。一部の例では、グリコシル化部位を、リンカー配列に導入することができる。グリコシル化部位を導入するために有用な部位のさらなる例には、Ａ型インフルエンザニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１）のＨＡタンパク質のアミノ酸４５〜４７、またはアミノ酸３７０〜３７２に対応するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質における位置が挙げられるがこれらに限定されない。グリコシル化部位を導入する方法は当業者に公知である。
【０１２１】
本発明のタンパク質およびタンパク質コンストラクトは、本発明の核酸分子によってコードされる。さらに、それらは本発明の核酸コンストラクトによって発現される。本書において、核酸コンストラクトは、組換え発現ベクター、すなわち核酸コンストラクトが例えば対象または臓器、組織もしくは細胞に投与されたときに核酸分子がタンパク質の発現を行うことができるように、タンパク質をコードする核酸分子に連結されたベクターである。ベクターはまた、臓器、組織、または細胞培養などの、しかしこれらに限定されない環境内の細胞への核酸分子の輸送も可能にする。本発明の核酸コンストラクトは、ヒトの介入によって生成される。本発明の核酸コンストラクトは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその変異体であり得る。ベクターはＤＮＡプラスミド、ウイルスベクター、または他のベクターであり得る。本発明のある特定の態様では、ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、または他の任意のＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクターであり得る。本発明のある特定の態様では、ベクターは、偽型レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターであり得る。本発明のある特定の態様では、ベクターは、ＤＮＡプラスミドであり得る。本発明のある特定の態様では、ベクターは、核酸分子のデリバリーおよび発現を可能にするウイルス構成要素およびプラスミド構成要素を含むＤＮＡプラスミドであり得る。本開示の核酸コンストラクトを構築する方法は周知である。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Sambrook et al. 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1994を参照されたい。本発明のある特定の態様では、ベクターは、ＤＮＡプラスミド、例えばＣＭＶ／Ｒプラスミド、例えばＣＭＶ／ＲまたはＣＭＶ／Ｒ  ８ＫＢ（本書においてＣＭＶ／Ｒ  ８ｋｂとも呼ばれる）である。ＣＭＶ／ＲおよびＣＭＶ／Ｒ  ８ｋｂの例を本書に提供する。ＣＭＶ／Ｒはまた、２００６年８月２２日発行の米国特許第７，０９４，５９８号Ｂ２にも記載される。
【０１２２】
本書において、核酸分子は、本発明のタンパク質コンストラクトをコードする核酸配列を含む。核酸分子は、組換えによって、合成によって、または組換えと合成の組合せによって生成することができる。本開示の核酸分子は、野生型核酸配列、または例えばヒトの翻訳系によってより良好に認識されるコドンを組み入れるためにコドン修飾核酸配列を有し得る。本発明のある特定の態様では、核酸分子は、さまざまなアミノ酸をコードするコドンを導入するためまたは除去するため、例えばＮ結合グリコシル化部位をコードするコドンを導入するために遺伝子操作することができる。本開示の核酸分子を生成する方法は当技術分野で公知であり、特に核酸配列がわかっている場合の生成方法は公知である。核酸コンストラクトは、１つの核酸分子または１つより多くの核酸分子を含み得ると認識すべきである。同様に、核酸分子は１つのタンパク質または１つより多くのタンパク質をコードし得ることも認識すべきである。
【０１２３】
本発明のある特定の態様では、本発明の核酸分子は、タンパク質コンストラクトをコードする。本発明のある特定の態様では、核酸分子は、表２に記載されるタンパク質コンストラクトと少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％であるタンパク質をコードする。本発明のある特定の態様では、核酸分子は、配列番号４７〜１５９からなる群から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【０１２４】
本発明のタンパク質コンストラクトを生成するための発現系もまた、本発明に包含される。本発明のある特定の態様では、本発明の核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結される。本書において、作動可能に連結されるとは、連結されたプロモーターが活性化されると、連結された核酸分子によってコードされるタンパク質が発現され得ることを意味する。本発明を実施するために有用なプロモーターは、当業者に周知である。本発明の一実施形態は、本発明の核酸分子を含む組換え細胞である。本発明の一実施形態は、本発明の核酸分子を含む組換えウイルスである。
【０１２５】
上記のように、本発明のタンパク質コンストラクトの組換えによる生成は、当技術分野で現在知られている任意の適当な従来の組換え技術を使用して達成することができる。例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子の生成は、適当な単量体サブユニットタンパク質、例えばヘリコバクター・ピロリ（ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）フェリチン単量体サブユニットをコードする核酸分子を使用し、それを、本書に開示される適当なインフルエンザタンパク質をコードする核酸分子に融合させることによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において行うことができる。次いで、タンパク質発現細胞をコンストラクトで形質転換し、適当なサイズに増殖させ、融合タンパク質を産生するように誘導してもよい。
【０１２６】
前記のように、本発明のタンパク質コンストラクトは、単量体サブユニットタンパク質を含むことから、それらは自己集合することができる。本発明に従って、そのような自己集合の結果としての超分子は、ＨＡ発現単量体サブユニットベースのナノ粒子と呼ばれる。簡潔のために、ＨＡ発現単量体サブユニットベースのナノ粒子を、単にナノ粒子（ｎｐ）と呼び得る。本発明のナノ粒子は、その作製の元となった単量体タンパク質のナノ粒子と類似の構造的特徴を有する。例えば、フェリチンに関して、フェリチンベースのナノ粒子は、２４のサブユニット含み、４３２の対称性を有する。本発明のナノ粒子の場合、サブユニットは、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に連結した単量体サブユニット（例えば、フェリチン、ルマジンシンターゼ等）を含むタンパク質コンストラクトである。そのようなナノ粒子は、その表面上にＨＡ三量体としてのグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも一部を提示する。そのような構成において、ＨＡ三量体は、免疫系にアクセス可能であり、したがって免疫応答を誘発することができる。したがって、本発明の一実施形態は、本書に開示または記載される任意のタンパク質コンストラクトを含むナノ粒子である。本発明の一実施形態は、本発明のタンパク質コンストラクトを含むナノ粒子であって、タンパク質コンストラクトが、単量体サブユニットタンパク質に連結した、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来するアミノ酸を含む、ナノ粒子である。本発明のある特定の態様では、ナノ粒子は、その表面上にＨＡ三量体としてのグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を提示する。本発明のある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、インフルエンザウイルスに対する防御抗体を誘発することができる。
【０１２７】
本発明の一実施形態は、本発明のタンパク質コンストラクトを含むナノ粒子である。本発明のある特定の態様では、タンパク質コンストラクトは、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質を含み、グループ２インフルエンザＨＡタンパク質のヘッド領域は、インフルエンザＨＡタンパク質のヘッド領域に由来する５個未満の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列で置き換えられている。本発明のある特定の態様では、タンパク質コンストラクトのＨＡタンパク質はまた、ヘリックスＡの長さの伸長によって変化されている。本発明のある特定の態様では、タンパク質コンストラクトのＨＡタンパク質はまた、ヘリックス間領域の短縮によって、またはヘリックス間領域のリンカー配列により置き換えによって変化されている。本発明のある特定の態様では、タンパク質コンストラクトのＨＡタンパク質はまた、三量体構造を安定化させるための特定位置における突然変異によって変化されている。適当な位置の例には、配列番号４におけるＬ３３１、Ｎ３３８、Ｋ３９６、Ｌ３９７、Ｌ４００、Ｓ４３８、Ｎ４４０、Ｅ４４８、Ｔ４５２、Ｎ４６１、Ｇ３９、Ｔ４６、Ｎ５４、およびＴ５８からなる群から選択される位置に対応する位置が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、タンパク質コンストラクトは、ナノ粒子を形成することができる。ＨＡタンパク質ヘッド領域を置き換える、ヘリックスＡを伸長させる、ヘリックス間領域を短縮するまたは置き換える、および適当な部位特異的突然変異を導入する方法が、本書において開示される。本発明のある特定の態様では、ナノ粒子は、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する第１のアミノ酸配列、およびグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する第２のアミノ酸配列を含むタンパク質コンストラクトであって、第１および第２のアミノ酸配列がリンカー配列によって共有結合により連結され、
第１のアミノ酸配列が、ヘッド領域配列のアミノ末端の上流のアミノ酸配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含み；
第２のアミノ酸配列が、ヘッド領域配列のカルボキシル末端の下流のアミノ酸配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含み；および
タンパク質コンストラクトがナノ粒子を形成することができるように、第１または第２のアミノ酸配列が単量体サブユニットドメインの少なくとも一部に連結する
タンパク質コンストラクトを含む。
【０１２８】
本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、Ｈ３インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ７インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１０インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、およびＨ１５インフルエンザウイルスＨＡタンパク質からなる群から選択されるウイルス由来グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、表２に記載されるグループ２ウイルスに由来するＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号４〜配列番号２６および配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号４〜配列番号２６、および配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択される配列を含むグループ２インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に由来する。
【０１２９】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ｈ３インフルエンザウイルス、Ｈ４インフルエンザウイルス、Ｈ７インフルエンザウイルス、Ｈ１０インフルエンザウイルス、Ｈ１４インフルエンザウイルス、およびＨ１５インフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来するグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、表２に記載されるグループ２ウイルスに由来するＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号４〜配列番号２６および配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号４〜配列番号２６、および配列番号４７〜配列番号１５９からなる群から選択される配列を含むグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のステム領域に由来する。
【０１３０】
上記のように、第１のアミノ酸配列は、ヘッド領域配列のアミノ末端の上流のアミノ酸配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明に従って、上流という用語は、ヘッド領域の第１のアミノ酸残基のアミノ末端に連結したアミノ酸配列の全体を指す。好ましい上流の配列は、ヘッド領域配列に直接に隣接する配列である。本発明のある特定の態様では、ヘッド領域のアミノ末端は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のＨＡタンパク質のＱ６０に対応するアミノ酸残基に位置する。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号４によって表されるＡ型インフルエンザ デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））のＨＡタンパク質のアミノ酸残基１〜５９に対応するグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９からなる群から選択される配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。
【０１３１】
本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質（配列番号４）のアミノ酸残基１〜５９に対応するＨＡタンパク質アミノ酸領域に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７または配列番号２８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７または配列番号２８に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。
【０１３２】
本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列を含む。本発明のある特定の態様では、第１のアミノ酸配列は、配列番号２７を含む。
【０１３３】
上記のように、第２のアミノ酸配列は、ヘッド領域配列のカルボキシル末端の下流のアミノ酸配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明に従って、下流という用語は、ヘッド領域のカルボキシル末端アミノ酸残基に連結したアミノ酸配列の全体を指す。好ましい上流の配列は、ヘッド領域配列に直接に隣接する配列である。本発明のある特定の態様では、ヘッド領域のカルボキシル末端は、配列番号４によって表されるＡ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））ＨＡタンパク質のＨＡタンパク質のＴ３２９に対応するアミノ酸位置に位置する。したがって、本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質のアミノ酸残基３３０〜５１９に対応するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））（配列番号４）のアミノ酸残基３３０〜５１９を含むグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択される配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。
【０１３４】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質のアミノ酸残基３３０〜５１９に対応するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））（配列番号４）のアミノ酸残基３３０〜５１９を含むグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択される配列に由来する少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含む。
【０１３５】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３７を含む。
【０１３６】
本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２）ＨＡタンパク質のアミノ酸残基３３０〜５１９に対応するグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも６０、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも１７５、または少なくとも１９０個の連続アミノ酸を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ（デンマーク／３５／２００５（Ｈ３Ｎ２））（配列番号４）のアミノ酸残基３３０〜５１９を含むグループ２インフルエンザＨＡタンパク質領域に由来する少なくとも６０、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも１７５、または少なくとも１９０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一である配列に由来する少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも１７５、または少なくとも１９０個の連続アミノ酸残基を含む。本発明のある特定の態様では、第２のアミノ酸配列は、配列番号３０由来の少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも１７５、または少なくとも１９０個の連続アミノ酸残基を含む。
【０１３７】
本発明のある特定の態様では、ナノ粒子は、表２に挙げられるタンパク質コンストラクト配列と少なくとも８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質コンストラクトを含み、ナノ粒子は、抗インフルエンザ抗体を選択的に結合することができる。本発明のある特定の態様では、ナノ粒子は、配列番号４７〜１５９からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質コンストラクトを含み、ナノ粒子は、抗インフルエンザ抗体を選択的に結合することができる。本発明のある特定の態様では、ナノ粒子は、配列番号４７〜１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質コンストラクトを含む。
【０１３８】
本発明のナノ粒子は、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発するために使用することができる。免疫応答の１つの型はＢ細胞応答であり、これによって、免疫応答を誘発する抗原に対する抗体の産生がもたらされる。したがって、本発明のある態様では、ナノ粒子は、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来するＡ型インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に結合する抗体を誘発する。本発明の一実施形態は、Ｈ１インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ３インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ５インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ６インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ７インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ８インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ９インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１０インフルエンザウイルスＨＡタンパク質ＨＡタンパク質、Ｈ１１インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１３インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１５インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１６インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１７インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、およびＨ１８インフルエンザウイルスＨＡタンパク質からなる群から選択されるインフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に結合する抗体を誘発するナノ粒子である。本発明の一実施形態は、表２に記載されるウイルス由来のインフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に結合する抗体を誘発するナノ粒子である。
【０１３９】
全ての抗体が、抗体産生をもたらした免疫応答を誘発した抗原に結合することができるが、好ましい抗体は、インフルエンザウイルスに対して広いヘテロサブタイプ防御を提供する抗体である。したがって、本発明の一実施形態は、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来するインフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に結合する防御抗体を誘発するナノ粒子である。本発明の一実施形態は、Ｈ１インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ３インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ５インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ６インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ７インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ８インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ９インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１０インフルエンザウイルスＨＡタンパク質ＨＡタンパク質、Ｈ１１インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１３インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１４インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１５インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１６インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ｈ１７インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、およびＨ１８インフルエンザウイルスＨＡタンパク質からなる群から選択されるインフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に結合する防御抗体を誘発するナノ粒子である。本発明の一実施形態は、表２に記載されるウイルス由来のインフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に結合する抗体を誘発するナノ粒子である。本発明の一実施形態は、配列番号４〜２６からなる群から選択される配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する抗体を誘発するナノ粒子である。本発明の一実施形態は、配列番号４〜２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する抗体を誘発するナノ粒子である。
【０１４０】
本発明のタンパク質によって誘発される防御抗体は、ウイルスのライフサイクルにおける任意の過程に影響を及ぼすことによって、ウイルス感染に対する防御を提供することができる。例えば、防御抗体は、インフルエンザウイルスが、細胞に結合する、細胞に侵入する、ウイルスリボヌクレオタンパク質を細胞質に放出する、感染した細胞において新規ウイルス粒子を形成する、および感染宿主細胞膜から新規ウイルス粒子を出芽させることを防止し得る。本発明のある特定の態様では、本発明のタンパク質によって誘発される防御抗体は、インフルエンザウイルスが宿主細胞に侵入するのを阻止する。本発明のある特定の態様では、本発明のタンパク質によって誘発される防御抗体は、ウイルス膜とエンドソーム膜との融合を阻止する。本発明のある特定の態様では、本発明のタンパク質によって誘発される防御抗体は、リボヌクレオタンパク質が宿主細胞の細胞質に放出されるのを阻止する。本発明のある特定の態様では、本発明のタンパク質によって誘発される防御抗体は、感染した宿主細胞における新規ウイルスの集合を阻止する。本発明のある特定の態様では、本発明のタンパク質によって誘発される防御抗体は、新たに形成されたウイルスの感染宿主細胞からの放出を阻止する。
【０１４１】
インフルエンザウイルスのステム領域のアミノ酸配列は、高度に保存されていることから、本発明のナノ粒子によって誘発される防御抗体は、広範な防御を提供し得る。すなわち、本発明のナノ粒子によって誘発される防御抗体は、１つより多くの型、亜型、および／または株のインフルエンザウイルスに対する防御を提供し得る。したがって、本発明の一実施形態は、インフルエンザＨＡタンパク質のステム領域に結合する広範に防御的な抗体を誘発するナノ粒子である。一実施形態は、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスからなる群から選択される１つより多くの型のインフルエンザウイルスに由来するＨＡタンパク質のステム領域に結合する抗体を誘発するナノ粒子である。一実施形態は、Ｈ１インフルエンザウイルス、Ｈ２インフルエンザウイルス、Ｈ３インフルエンザウイルス、Ｈ４インフルエンザウイルス、Ｈ５インフルエンザウイルス、Ｈ６インフルエンザウイルス、Ｈ７インフルエンザウイルス、Ｈ８インフルエンザウイルス、Ｈ９インフルエンザウイルス、Ｈ１０インフルエンザウイルス、Ｈ１１インフルエンザウイルス、Ｈ１２インフルエンザウイルス、Ｈ１３インフルエンザウイルス、Ｈ１４インフルエンザウイルス、Ｈ１５インフルエンザウイルス、Ｈ１６インフルエンザウイルス、Ｈ１７インフルエンザウイルス、およびＨ１８インフルエンザウイルスからなる群から選択される１つより多くの亜型のインフルエンザウイルスに由来するＨＡタンパク質のステム領域に結合する抗体を誘発するナノ粒子である。一実施形態は、１つより多くの株のインフルエンザウイルスに由来するＨＡタンパク質のステム領域に結合する抗体を誘発するナノ粒子である。本発明の一実施形態は、配列番号４〜２６からなる群から選択される配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む１つより多くのタンパク質に結合する抗体を誘発するナノ粒子である。本発明の一実施形態は、配列番号４〜２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つより多くのタンパク質に結合する抗体を誘発するナノ粒子である。
【０１４２】
上記のように、ＨＡ配列は、単量体サブユニットタンパク質の一部に連結される。本書において、単量体サブユニットタンパク質は、単量体サブユニットタンパク質がナノ粒子に自己集合するように、他の単量体サブユニットタンパク質に結合することができるタンパク質単量体を指す。タンパク質コンストラクトが、ＨＡタンパク質を表面上に提示する多量体構造を形成することができる限り、任意の単量体サブユニットタンパク質を使用して本発明のタンパク質コンストラクトを製造することができる。本発明のある特定の態様では、単量体サブユニットはフェリチンである。
【０１４３】
フェリチンは、全ての動物、細菌、および植物において見出される球状のタンパク質であり、ミネラル化コアへのおよびミネラル化コアからの水和した鉄イオンおよびプロトンの輸送を通して多核Ｆｅ（ＩＩＩ）２Ｏ３形成の速度および位置を主に制御するように作用する。フェリチンの球状の形態は、単量体サブユニットタンパク質（単量体フェリチンサブユニットとも呼ばれる）で構成され、これはおよそ１７〜２０ｋＤａの分子量を有するポリペプチドである。１つのそのような単量体フェリチンサブユニットの配列の例を、配列番号１に示す。各々の単量体フェリチンサブユニットは、逆並行４ヘリックスモチーフを含み、第５のより短いヘリックス（Ｃ末端ヘリックス）が前記４ヘリックスバンドルの長軸に対してほぼ垂直に存在するヘリックスバンドルのトポロジーを有する。慣例に従って、ヘリックスをＮ末端からそれぞれ、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤおよびＥと呼ぶ。Ｎ末端配列は、ナノ粒子の３回対称軸に隣接して存在して表面に伸長するが、Ｅヘリックスは、４回対称軸でパッキングして、Ｃ末端は粒子コア内に伸長する。このパッキングの結果、ナノ粒子表面上に２つの孔が形成される。これらの孔の一方または両方が、水和した鉄がナノ粒子に出入りする地点を表すと考えられる。産生後、これらの単量体フェリチンサブユニットタンパク質は、球状のフェリチンタンパク質に自己集合する。このため、フェリチンの球状の形態は、２４個の単量体フェリチンサブユニットタンパク質を含み、４３２対称性を有するカプシド様構造を有する。
【０１４４】
本発明に従って、本発明の単量体フェリチンサブユニットは、単量体フェリチンサブユニットの球状形態のタンパク質への自己集合を指示することができる、フェリチンタンパク質の完全長単一ポリペプチドまたはその任意の一部である。そのようなタンパク質の例には、配列番号１および配列番号２が挙げられるがこれらに限定されない。単量体フェリチンサブユニットがＨＡを表面上に提示するナノ粒子に自己集合することができる限り、任意の公知のフェリチンタンパク質の単量体フェリチンサブユニットに由来するアミノ酸配列を使用して、本発明のタンパク質コンストラクトを製造することができる。本発明のある特定の態様では、単量体サブユニットは、細菌フェリチンタンパク質、植物フェリチンタンパク質、藻類フェリチンタンパク質、昆虫フェリチンタンパク質、真菌フェリチンタンパク質、および哺乳動物フェリチンタンパク質からなる群から選択されるフェリチンタンパク質に由来する。本発明のある特定の態様では、フェリチンタンパク質は、ヘリコバクター・ピロリに由来する。
【０１４５】
本発明のタンパク質コンストラクトは、フェリチンタンパク質の単量体サブユニットポリペプチドの完全長の配列を含む必要はない。その部分が、タンパク質の球状形態への単量体フェリチンサブユニットの自己集合を指示するアミノ酸を含む限り、単量体フェリチンサブユニットタンパク質の部分または領域を利用することができる。そのような領域の一例は、ヘリコバクター・ピロリのフェリチンタンパク質のアミノ酸５〜１６７の間に位置する。より詳しい領域は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Zhang, Y. Self-Assembly in the Ferritin Nano-Cage Protein Super Family. 2011, Int. J. Mol. Sci., 12, 5406-5421に記載されている。
【０１４６】
本発明のある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、フェリチン由来の少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸に連結し、タンパク質コンストラクトは、ナノ粒子を形成することができる。本発明のある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、配列番号１または配列番号２由来の少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸に連結し、タンパク質コンストラクトはナノ粒子を形成することができる。本発明のある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、フェリチンの配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質に連結し、タンパク質コンストラクトは、ナノ粒子を形成することができる。本発明のある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、配列番号１または配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質に連結し、タンパク質コンストラクトは、ナノ粒子を形成することができる。
【０１４７】
本発明のある特定の態様では、単量体サブユニットはルマジンシンターゼである。本発明のある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、ルマジンシンターゼ由来の少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも１５０アミノ酸に連結し、タンパク質コンストラクトは、ナノ粒子を形成することができる。本発明のある特定の態様では、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、ルマジンシンターゼと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一であるタンパク質に連結し、タンパク質コンストラクトはナノ粒子を形成することができる。
【０１４８】
本書において、本発明のナノ粒子は、本発明のタンパク質コンストラクト（融合タンパク質）の自己集合によって形成される三次元粒子を指す。本発明のナノ粒子は一般的に球状の形状であるが、他の形状も除外されず、一般的に直径約２０ｎｍ〜約１００ｎｍである。本発明のナノ粒子は、それを形成するタンパク質コンストラクト以外に、他の分子、例えばタンパク質、脂質、炭水化物等を含んでもよいが、必ずしも含む必要はない。
【０１４９】
本発明のナノ粒子は、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発することができることから、それらは、インフルエンザウイルスによる感染に対して個体を保護するためのワクチンとして有用である。したがって、本発明の一実施形態は、本発明のナノ粒子を含むワクチンである。本発明のワクチンはまた、アジュバント、緩衝液等などの他の構成要素も含み得る。任意のアジュバントを使用することができるが、好ましい実施形態は、化学アジュバント、例えばリン酸アルミニウム、塩化ベンジルアルコニウム、ウベニメクス、およびＱＳ２１；遺伝子アジュバント、例えばＩＬ−２遺伝子またはその断片、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子またはその断片、ＩＬ−１８遺伝子またはその断片、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２１（ＣＣＬ２１）遺伝子またはその断片、ＩＬ−６遺伝子またはその断片、ＣｐＧ、ＬＰＳ、ＴＬＲアゴニスト、および他の免疫刺激遺伝子；タンパク質アジュバント、例えばＩＬ−２またはその断片、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはその断片、ＩＬ−１８またはその断片、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２１（ＣＣＬ２１）またはその断片、ＩＬ−６またはその断片、ＣｐＧ、ＬＰＳ、ＴＬＲアゴニストおよび他の免疫刺激サイトカインまたはその断片；脂質アジュバント、例えば陽イオン性リポソーム、Ｎ３（陽イオン脂質）、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ１）；他のアジュバント、例えばコレラ毒素、エンテロトキシン、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ブピバカイン、マーカイン、およびレバミソールを含み得る。
【０１５０】
本発明の一実施形態は、１つより多くのインフルエンザＨＡタンパク質を含むナノ粒子ワクチンである。そのようなワクチンは、単一のナノ粒子において、またはナノ粒子の混合物として、その少なくとも２つが独自のインフルエンザＨＡタンパク質を有する異なるインフルエンザＨＡタンパク質の組合せを含み得る。多価ワクチンは、所望の範囲のウイルス株に対する防御に必要な免疫応答をもたらすために必要な、多くのインフルエンザＨＡタンパク質を含み得る。本発明のある特定の態様では、ワクチンは、少なくとも２つの異なるインフルエンザ株に由来するＨＡタンパク質を含む（二価）。本発明のある特定の態様では、ワクチンは、少なくとも３つの異なるインフルエンザ株に由来するＨＡタンパク質を含む（三価）。本発明のある特定の態様では、ワクチンは、少なくとも４つの異なるインフルエンザ株に由来するＨＡタンパク質を含む（四価）。本発明のある特定の態様では、ワクチンは、少なくとも５つの異なるインフルエンザ株に由来するＨＡタンパク質を含む（五価）。本発明のある特定の態様では、ワクチンは、少なくとも６つの異なるインフルエンザ株に由来するＨＡタンパク質を含む（六価）。様々な実施形態では、ワクチンは、７、８、９、または１０個の異なるインフルエンザウイルス株に由来するＨＡタンパク質を含む。そのような組合せの例は、Ａ型インフルエンザグループ１ＨＡタンパク質、Ａ型インフルエンザグループ２ＨＡタンパク質、およびＢ型インフルエンザＨＡタンパク質を含むナノ粒子ワクチンである。本発明のある特定の態様では、インフルエンザＨＡタンパク質は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、およびＢ  ＨＡである。多価ワクチンの別の例は、４つの異なるインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質を含むナノ粒子ワクチンである。本発明のある特定の態様では、多価ワクチンは、表２に記載される１つまたは複数のＨＡタンパク質と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一である１つまたは複数のＨＡタンパク質を含む。本発明のある特定の態様では、多価ワクチンは、表２に記載される１つまたは複数のＨＡタンパク質を含む。
【０１５１】
本発明の一実施形態は、個体にインフルエンザウイルスに対してワクチン接種する方法であって、方法が、インフルエンザウイルスに対する免疫応答が個体において生じるように、個体にナノ粒子を投与することを含み、ナノ粒子が、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に連結した単量体サブユニットタンパク質を含み、ナノ粒子が、その表面上にインフルエンザＨＡを提示する、方法である。本発明のある特定の態様では、ナノ粒子は一価のナノ粒子である。本発明のある特定の態様では、ナノ粒子は多価のナノ粒子である。本発明の別の実施形態は、個体にインフルエンザウイルス感染に対してワクチン接種する方法であって、
ａ）単量体サブユニット含むナノ粒子であって、単量体サブユニットがインフルエンザヘマグルチニンタンパク質に連結し、ナノ粒子がその表面上にグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を提示する、ナノ粒子を得ること；および
ｂ）インフルエンザウイルスに対する免疫応答が生じるように、個体にナノ粒子を投与すること
を含む方法である。
【０１５２】
本発明の一実施形態は、個体にインフルエンザウイルスに対してワクチン接種する方法であって、インフルエンザウイルスに対する免疫応答が個体において生じるように個体に本実施形態のワクチンを投与することを含み、ワクチンが、インフルエンザＨＡタンパク質に連結した単量体サブユニットを含む少なくとも１つのナノ粒子を含み、ナノ粒子がその表面上にインフルエンザＨＡを提示する、方法である。本発明のある特定の実施形態では、ワクチンは一価のワクチンである。本発明のある特定の実施形態では、ワクチンは多価のワクチンである。本発明の一実施形態は、個体にインフルエンザウイルス感染に対してワクチン接種する方法であって、
ａ）本発明のタンパク質コンストラクトを含む少なくとも１つのナノ粒子を含むワクチンであって、タンパク質コンストラクトが、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に連結した単量体サブユニットタンパク質を含み、ナノ粒子がその表面上にインフルエンザＨＡを提示する、ワクチンを得ること；および
ｂ）インフルエンザウイルスに対する免疫応答が生じるように、ワクチンを個体に投与すること
を含む方法である。
【０１５３】
本発明のある特定の態様では、ナノ粒子は一価のナノ粒子である。本発明のある特定の態様では、ナノ粒子は多価のナノ粒子である。
【０１５４】
本発明のある特定の態様では、ナノ粒子は、八面体対称性を有する。本発明のある特定の態様では、インフルエンザＨＡタンパク質は、インフルエンザウイルスに対する抗体を誘発することができる。本発明のある特定の態様では、インフルエンザＨＡタンパク質は、インフルエンザウイルスに対する抗体を広範に誘発することができる。好ましい実施形態では、誘発される抗体は防御抗体である。好ましい実施形態では、誘発される抗体は広くヘテロサブタイプ防御的である。
【０１５５】
本発明のワクチンは、プライム／ブーストプロトコールを使用して個体にワクチン接種するために使用することができる。そのようなプロトコールは、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１０１７７１２２号に記載されている。そのようなプロトコールでは、第１のワクチン組成物を個体に投与（プライム）し、次に一定期間の後、第２のワクチン組成物を個体に投与（ブースト）することができる。ブースティング組成物の投与は一般的に、プライミング組成物の投与の数週間ないし数ヶ月後、好ましくは約２〜３週間後、または４週間後、または８週間後、または１６週間後、または２０週間後、または２４週間後、または２８週間後、または３２週間後である。本発明のある特定の態様では、ブースティング組成物は、プライミング組成物の投与の約１週間後、または２週間後、または３週間後、または４週間後、または５週間後、または６週間後、または７週間後、または８週間後、または９週間後、または１６週間後、または２０週間後、または２４週間後、または２８週間後、または３２週間後に投与するように処方される。
【０１５６】
第１および第２のワクチン組成物は、同じ組成物であってもよいが、必ずしもそうでなくてよい。したがって、本発明のある特定の態様では、ワクチンを投与するステップは、第１のワクチン組成物を投与することを含み、後に第２のワクチン組成物を投与することを含む。本発明のある特定の態様では、第１のワクチン組成物は、本発明のナノ粒子を含む。本発明のある特定の態様では、第１のワクチン組成物は、本発明のナノ粒子を含む。
【０１５７】
本発明のある特定の態様では、ワクチン接種される個体は、インフルエンザウイルスに曝露されている。本書において、「曝露される」、「曝露」等の用語は、対象が、インフルエンザウイルスに感染していることがわかっているヒトまたは動物に接触していることを指す。本発明のワクチンは、当業者に周知の技術を使用して投与され得る。製剤化および投与のための技術は、例えば"Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PAに見出され得る。ワクチンは、従来のシリンジ、無針注射装置、または微粒子遺伝子銃を含むがこれらに限定されない手段によって投与され得る。適当な投与経路の例としては、非経口デリバリー、例えば筋肉内、皮内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射が挙げられるが、これらに限定されない。注射のために、本発明の一実施形態の化合物は、水溶液、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液中に製剤化され得る。
【０１５８】
本発明のある特定の態様では、本発明のワクチンまたはナノ粒子を使用して、異種インフルエンザウイルスによる感染から個体を保護することができる。すなわち、インフルエンザウイルスの１つの株由来のＨＡタンパク質を使用して作製したワクチンは、さまざまなインフルエンザ株による感染から個体を保護することができる。例えば、Ａ型インフルエンザ／デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２）由来のＨＡタンパク質を使用して作製したワクチンを使用して、表２に挙げたインフルエンザウイルスによる感染からて個体を保護することができる。
【０１５９】
本発明のある特定の態様では、本発明のワクチンまたはナノ粒子を使用して、抗原性が多様化するインフルエンザウイルスによる感染から個体を保護することができる。抗原性が多様化するとは、インフルエンザウイルスの株が経時的に突然変異する傾向があり、その結果免疫系に提示されるアミノ酸が変化することを指す。そのような経時的な突然変異は抗原連続変異とも呼ばれる。したがって、例えば、インフルエンザウイルスのＡ型インフルエンザ／デンマーク／３５／２００５）（Ｈ３Ｎ２）株に由来するＨＡタンパク質を使用して作製したワクチンは、より初期の抗原性多様化インフルエンザデンマーク株による感染から、および将来の進化する（または多様化する）インフルエンザ株による感染から、個体を保護することができる。
【０１６０】
本発明のナノ粒子は、インタクトＨＡと抗原性が類似するグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を提示することから、それらを、インフルエンザウイルスに対する抗体（抗インフルエンザ抗体）を検出するアッセイに使用することができる。
【０１６１】
したがって、本発明の一実施形態は、本発明のナノ粒子を使用して抗インフルエンザウイルス抗体を検出する方法である。本発明の検出方法は、
ａ．抗インフルエンザ抗体の存在に関して試験される試料の少なくとも一部を、本発明のナノ粒子に接触させること；および
ｂ．ナノ粒子／抗体複合体の存在を検出すること
によって一般的に達成することができ、
ナノ粒子／抗体複合体の存在は、試料が抗インフルエンザ抗体を含むことを示す。
【０１６２】
本発明のある特定の実施形態では、試料は、抗インフルエンザウイルス抗体の存在に関して試験される個体から得られるか、または収集される。個体は、抗インフルエンザ抗体を有するか、またはインフルエンザウイルスに曝露されていることが疑われてもよく、または疑われなくてもよい。試料は、抗インフルエンザウイルス抗体の存在に関して試験するために使用することができる個体から得た任意の標本である。好ましい試料は、抗インフルエンザウイルス抗体の存在を検出するために使用することができる体液である。本発明の方法を実施するために使用され得る体液の例には、血液、血漿、血清、涙液、および唾液が挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、本開示の方法を実施するために適切な試料を容易に決定することができる。
【０１６３】
血液または血液由来の液体、例えば血漿、血清等は、試料として特に適切である。そのような試料は、当技術分野で公知の方法を使用して個体から収集および調製することができる。試料を、アッセイ前に冷蔵または凍結してもよい。
【０１６４】
ナノ粒子が抗インフルエンザウイルス抗体に結合する限り、本発明の任意のナノ粒子を使用して本開示の方法を実施することができる。有用なナノ粒子およびその製造方法は、本書に詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ナノ粒子はタンパク質コンストラクトを含み、タンパク質コンストラクトは、ナノ粒子がその表面上にグループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質三量体のエピトープを含むように、グループ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の少なくとも１つのエピトープに連結した（融合した）単量体サブユニットタンパク質に由来する少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、または少なくとも１５０の連続アミノ酸を含み、タンパク質コンストラクトはナノ粒子に自己集合することができる。
【０１６５】
本明細書において使用される接触させるという用語は、本発明のナノ粒子が、抗インフルエンザ抗体の存在に関して試験される試料中の抗体（存在すれば）と物理的に接触することができるように、試料とナノ粒子とを、例えば組み合わせるかまたは混合することによって、合することを指す。抗インフルエンザ抗体が試料中に存在する場合、抗体／ナノ粒子複合体が形成される。そのような複合体形成とは、検出することができる安定な複合体を形成するために、ナノ粒子中のタンパク質コンストラクトのＨＡ部分に選択的に結合する抗インフルエンザウイルス抗体の能力を指す。試料中の抗インフルエンザウイルス抗体のナノ粒子への結合は、複合体を形成するために適した条件で達成される。そのような条件（例えば、適切な濃度、緩衝液、温度、反応時間）ならびにそのような条件を最適化する方法は当業者に公知である。結合は、凝集アッセイ、沈降アッセイ、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、イムノブロットアッセイ、および例えば、参照により本明細書に組み込まれるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)、およびHarlow et al., Antibodies, a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Labs Press, 1988）に記載の他のイムノアッセイを包含するがこれらに限定されない、当技術分野で標準的な多様な方法を使用して測定することができる。これらの参考文献は、複合体形成条件の例も提供する。
【０１６６】
本書において、「ＨＡに選択的に結合する」、「ＨＡに対する選択的結合」等の語句は、ＨＡと関連の無い結合タンパク質、または試料もしくはアッセイ中の非タンパク質構成要素と比較して、ＨＡタンパク質に優先的に結合する抗体の能力を指す。ＨＡに選択的に結合する抗体とは、ＨＡに結合するが、試料またはアッセイ中に存在し得る他の分子または構成要素に有意に結合しない抗体である。有意な結合は、例えば、アッセイが試料中の抗インフルエンザ抗体を検出する、および／またはそのレベルを決定する能力を妨害するために十分に大きい親和性またはアビディティでの、非ＨＡ分子に対する抗ＨＡ抗体の結合であると考えられる。試料またはアッセイに存在し得る他の分子および化合物の例には、アルブミンなどの非ＨＡタンパク質、脂質、および炭水化物が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６７】
本発明のある特定の態様では、本書において抗体／ナノ粒子複合体とも呼ばれる抗インフルエンザウイルス抗体／ナノ粒子複合体は、溶液中で形成することができる。本発明のある特定の態様では、ナノ粒子が基質上に固定されて（例えば、コーティングされて）、抗体／ナノ粒子複合体を形成することができる。固定技術は当業者に公知である。適した基質材料には、プラスチック、ガラス、ゲル、セルロイド、繊維製品、紙製品、および微粒子材料が挙げられるがこれらに限定されない。基質材料の例には、ラテックス、ポリスチレン、ナイロン、ニトロセルロース、アガロース、コットン、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、および磁性ビーズが挙げられるがこれらに限定されない。基質材料の適した形状には、ウェル（例えば、マイクロタイターディッシュのウェル）、マイクロタイタープレート、ディップスティック、ストリップ、ビーズ、ラテラルフロー装置、メンブレン、フィルター、チューブ、ディッシュ、セルロイド型マトリックス、磁性粒子、および他の微粒子が挙げられるがこれらに限定されない。特に好ましい基質には、例えば、ＥＬＩＳＡプレート、ディップスティック、イムノドットストリップ、ラジオイムノアッセイプレート、アガロースビーズ、プラスチックビーズ、ラテックスビーズ、綿糸、プラスチックチップ、イムノブロットメンブレン、イムノブロットペーパー、およびフロースルーメンブレンが挙げられる。本発明のある特定の態様では、微粒子などの基質は、検出可能なマーカーを含み得る。基質材料の例に関しては、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるKemeny, D.M. (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press, Elmsford, NY pp 33-44、およびPrice, C. and Newman, D. eds. Principles and Practice of Immunoassay, 2nd edition (1997) Stockton Press, NY, NYを参照されたい。
【０１６８】
本発明に従って、抗インフルエンザウイルス抗体／ナノ粒子複合体が形成されたら、それを検出する。検出は、定性的、定量的、または半定量的であり得る。本書において使用される「複合体の形成を検出する」、「複合体を検出する」等の語句は、ナノ粒子と複合体を形成した抗インフルエンザウイルス抗体の存在を同定することを指す。複合体が形成されると、形成された複合体の量を定量することができるが、必ずしもその必要はない。推定の抗インフルエンザウイルス抗体とナノ粒子との間の複合体形成または選択的結合は、その例を本書において開示する当技術分野で標準的な多様な方法（例えば、Sambrook et al. 上記を参照されたい）を使用して測定する（すなわち、検出する、決定する）ことができる。複合体は、以下のアッセイの１つまたは複数の使用が挙げられるがこれらに限定されない多様な様式で検出することができる：ヘマグルチニン阻害アッセイ、放射拡散アッセイ、酵素結合イムノアッセイ、競合的酵素結合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、ラテラルフローアッセイ、フロースルーアッセイ、微粒子ベースのアッセイ（例えば、磁性粒子またはラテックスもしくはポリスチレンビーズなどのプラスチックポリマーなどの、しかしこれらに限定されない微粒子を使用する）、免疫沈降アッセイ、ＢｉｏＣｏｒｅＪアッセイ（例えば、金コロイドを使用する）、イムノドットアッセイ（例えば、ＣＭＧ  Ｉｍｍｕｎｏｄｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｆｒｉｂｏｕｒｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびイムノブロットアッセイ（例えば、ウェスタンブロット）、燐光アッセイ、フロースルーアッセイ、クロマトグラフィーアッセイ、ＰＡＧｅベースのアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、分光測光アッセイ、および電子検知アッセイ。そのようなアッセイは当業者に周知である。
【０１６９】
アッセイは、それらが使用される方法に応じて定性的または定量的結果を得るために使用することができる。凝集、微粒子分離、および沈殿アッセイなどの一部のアッセイは、検出可能なマーカーを必要とすることなく視覚的に（例えば、肉眼または機器、例えば濃度計もしくは分光光度計によって）観察することができる。
【０１７０】
他のアッセイにおいて、検出可能なマーカーの、ナノ粒子、またはナノ粒子に選択的に結合する試薬へのコンジュゲーション（結合）は、複合体形成の検出に役立つ。検出可能なマーカーを、抗インフルエンザウイルス抗体に結合するナノ粒子の能力を妨害しない部位で、ナノ粒子またはナノ粒子結合試薬にコンジュゲートさせることができる。コンジュゲーションの方法は、当業者に公知である。検出可能なマーカーの例には、放射活性標識、蛍光標識、化学発光標識、発色標識、酵素標識、燐光標識、電子標識、金属ゾル標識、着色ビーズ、物理的標識、またはリガンドが挙げられるがこれらに限定されない。リガンドとは、別の分子に選択的に結合する分子を指す。好ましい検出可能なマーカーには、フルオレセイン、放射性同位元素、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、ビオチン、アビジン、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、およびビオチン関連化合物またはアビジン関連化合物（例えば、ストレプトアビジンまたはＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ７  ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７１】
本発明のある特定の態様では、抗体／ナノ粒子複合体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされた、抗インフルエンザ抗体、フェリチン、または抗体／ナノ粒子複合体に結合する、特定の化合物、例えば抗体に、試料を接触させることによって検出することができる。検出可能なマーカーは、特定の化合物に、該化合物が検出される複合体に結合する能力を阻害しないように、コンジュゲートさせることができる。好ましい検出可能なマーカーには、フルオレセイン、放射性同位元素、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、ビオチン、アビジン、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、およびビオチン関連化合物またはアビジン関連化合物（例えば、ストレプトアビジンまたはＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ７  ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７２】
別の実施形態では、複合体は、複合体を指標分子に接触させることによって検出される。適した指標分子は、抗インフルエンザウイルス抗体／ナノ粒子複合体、抗インフルエンザウイルス抗体、またはナノ粒子に結合することができる分子を包含する。したがって、指標分子は、例えば免疫グロブリンを認識する抗体などの抗インフルエンザウイルス抗体に結合する試薬を含み得る。抗体である好ましい指標分子は、例えば、抗インフルエンザウイルス抗体が産生される個体の種に由来する抗体と反応性である抗体を含む。指標分子そのものを、本発明の検出可能なマーカーに結合させることができる。例えば、抗体をビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはフルオレセインに結合させることができる。
【０１７３】
本発明は、指標分子の存在を検出することができる１つまたは複数の層および／または型の二次分子または他の結合分子をさらに含み得る。例えば、指標分子に選択的に結合する非タグ付き（すなわち検出可能なマーカーにコンジュゲートされていない）二次抗体を、二次抗体に選択的に結合するタグ付き（すなわち、検出可能なマーカーにコンジュゲートした）三次抗体に結合させることができる。適した二次抗体、三次抗体、および他の二次または三次分子を、当業者は容易に選択することができる。当業者はまた、好ましい三次抗体を、二次分子の特徴に基づいて選択することができる。同じ戦略を次の層に適用することができる。
【０１７４】
好ましくは、指標分子は、検出可能マーカーにコンジュゲートされる。必要に応じて展開試薬を添加し、基質を解析のために検出装置に供する。一部のプロトコールでは、１つまたは両方の複合体形成工程の後に、過剰量の試薬を除去するために洗浄工程を追加する。そのような工程を使用する場合、それらは過剰量の試薬が除去されるが複合体は保持されるように、当業者に公知の条件を伴う。
【０１７５】
本発明のアッセイは、血液試料を含む試料中の抗インフルエンザウイルス抗体を検出することができることから、そのようなアッセイを使用して、抗インフルエンザ抗体を有する個体を同定することができる。したがって、本発明の一実施形態は、抗インフルエンザウイルス抗体を有する個体を同定する方法であって、
ａ．抗インフルエンザ抗体に関して試験される個体からの試料を、本発明のナノ粒子に接触させること；および
ｂ．接触させた試料をナノ粒子／抗体複合体の存在に関して分析すること
を含み、
ナノ粒子／抗体複合体の存在は、個体が抗インフルエンザ抗体を有することを示す、方法である。
【０１７６】
任意の本開示のアッセイフォーマットを使用して、本開示の方法を実施することができる。有用なアッセイフォーマットの例には、放射拡散アッセイ、酵素結合イムノアッセイ、競合的酵素結合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、ラテラルフローアッセイ、フロースルーアッセイ、微粒子ベースのアッセイ（例えば、磁性粒子またはラテックスもしくはポリスチレンビーズなどのプラスチックポリマーなどの、しかしこれらに限定されない微粒子を使用する）、免疫沈降アッセイ、ＢｉｏＣｏｒｅＪアッセイ（例えば、金コロイドを使用する）、イムノドットアッセイ（例えば、ＣＭＧ  Ｉｍｍｕｎｏｄｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｆｒｉｂｏｕｒｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびイムノブロットアッセイ（例えば、ウェスタンブロット）、燐光アッセイ、フロースルーアッセイ、クロマトグラフィーアッセイ、ＰＡＧｅベースのアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、分光測光アッセイ、および電子検知アッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７７】
試料中に抗インフルエンザ抗体が検出されない場合、そのような結果は、個体が抗インフルエンザウイルス抗体を有しないことを示している。試験される個体は、インフルエンザウイルスに対する抗体を有することが疑われてもよく、疑われなくてもよい。本開示の方法を使用して、個体が、インフルエンザウイルスの１つまたは複数の特定の型、グループ、サブグループ、または株に曝露されているか否かを決定してもよい。そのような決定を行うために、試料を、過去のいずれかの時期（例えば、約１年超、２年超、３年超、４年超、５年超等）に１つまたは複数の特定の型、グループ、サブグループ、または株に対する抗体に関して試験で陰性であった（すなわち、抗体を欠如していた）個体から得る。次に試料を、本発明のナノ粒子ベースのアッセイを使用して、インフルエンザウイルスの１つまたは複数の型、グループ、サブグループ、または株に対する抗インフルエンザウイルス抗体の存在に関して試験する。アッセイがそのような抗体の存在を示している場合、個体は、抗インフルエンザ抗体に関して陰性であると判定された試験の後のいずれかの時期に、インフルエンザウイルスの１つまたは複数の型、グループ、サブグループ、または株に曝露されたことが示される。したがって、本発明の一実施形態は、インフルエンザウイルスに曝露されている個体を同定する方法であって、
ａ．抗インフルエンザ抗体に関して試験される個体からの試料の少なくとも一部を、本発明のナノ粒子に接触させること；
ｂ．接触させた試料を、抗体／ナノ粒子複合体の存在またはレベルに関して分析すること；ここで、抗体／ナノ粒子複合体の存在またはレベルは、最近の抗インフルエンザ抗体の存在またはレベルを示す；
ｃ．最近の抗インフルエンザ抗体レベルを過去の抗インフルエンザ抗体レベルと比較すること
を含み、
最近の抗インフルエンザ抗体レベルが過去のインフルエンザ抗体レベルと比較して増加すれば、個体が、過去の抗インフルエンザ抗体レベルの決定後にインフルエンザウイルスに曝露たことを示す、
方法である。
【０１７８】
本発明の方法はまた、ワクチンに対する個体の応答を決定するためにも有用である。したがって、一実施形態は、インフルエンザワクチンに対する個体の応答を測定する方法であって、
ａ．インフルエンザウイルスに関するワクチンを個体に投与すること；
ｂ．個体からの試料の少なくとも一部を本発明のナノ粒子に接触させること；
ｃ．接触させた試料を、抗体／ナノ粒子複合体の存在またはレベルに関して分析すること
を含み、
抗体／ナノ粒子複合体の存在またはレベルは、最近の抗インフルエンザ抗体の存在またはレベルを示し、試料中の抗体レベルが個体におけるワクチン投与前の抗体レベルと比較して増加すれば、ワクチンが個体において免疫応答を誘導したことを示す、
方法である。
【０１７９】
個体に投与されるインフルエンザワクチンは、ナノ粒子が、投与されたワクチンによって誘導される抗インフルエンザ抗体に結合することができるＨＡタンパク質を含む限り、本発明のワクチンを含んでもよく、または含む必要はない。インフルエンザワクチンを投与する方法は当業者に公知である。
【０１８０】
個体から得た試料の分析は、本開示のアッセイフォーマットのいずれかを使用して実施され得る。本発明のある特定の態様では、試料の分析は、放射拡散アッセイ、酵素結合イムノアッセイ、競合的酵素結合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、ラテラルフローアッセイ、フロースルーアッセイ、微粒子ベースのアッセイ（例えば、磁性粒子またはラテックスもしくはポリスチレンビーズなどのプラスチックポリマーなどの、しかしこれらに限定されない微粒子を使用する）、免疫沈降アッセイ、ＢｉｏＣｏｒｅＪアッセイ（例えば、金コロイドを使用する）、イムノドットアッセイ（例えば、ＣＭＧ  Ｉｍｍｕｎｏｄｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｆｒｉｂｏｕｒｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびイムノブロットアッセイ（例えば、ウェスタンブロット）、燐光アッセイ、フロースルーアッセイ、クロマトグラフィーアッセイ、ＰＡＧＥベースのアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、バイオレイヤー干渉アッセイ、分光測光アッセイ、および電子検知アッセイからなる群から選択されるアッセイフォーマットを使用して実施される。
【０１８１】
本発明のある特定の態様では、本方法は、ワクチンを投与する前に個体に存在する抗インフルエンザ抗体のレベルを決定する工程を含む。しかし、過去の医療記録が利用可能である場合、そのような情報から個体に存在する抗インフルエンザ抗体のレベルを決定することも可能である。
【０１８２】
本開示の方法を実施するために必要ではないが、ワクチンを投与する工程と、個体における抗インフルエンザ抗体のレベルを決定する工程との間に、いくらか時間を置くことが有利であり得る。本発明のある特定の態様では、個体に存在する抗インフルエンザ抗体のレベルの決定は、ワクチン投与の、少なくとも１日後、少なくとも２日後、少なくとも３日後、少なくとも４日後、少なくとも５日後、少なくとも６日後、少なくとも１週間後、少なくとも２週間後、少なくとも３週間後、少なくとも４週間後、少なくとも２ヶ月後、少なくとも３ヶ月後、または少なくとも６ヶ月後に実施される。
【０１８３】
本発明はまた、抗インフルエンザ抗体を検出するために適したキットも含む。適した検出手段は、本発明のナノ粒子を利用する、本書に開示される技術を含む。キットはまた、ナノ粒子または他の指標分子に選択的に結合する抗体などの検出可能なマーカーも含み得る。キットはまた、緩衝液、ラベル、容器、添付文書、チューブ、バイアル、シリンジ等などの、しかしこれらに限定されない、関連する構成要素を含み得る。
【実施例】
【０１８４】
本実施例は、本書に開示されるパラメータおよび方法論を使用してデザインされたグループ２ＨＡナノ粒子の５つのＨ１０変異体の特性および活性を特徴付けるものである。変異体は全て、ヒトＡ／江西省／ＩＰＢ１３／２０１３（Ｈ１０Ｎ８）株に基づいた。Ｈ１０変異体をコードする核酸分子をＥｘｐｉ２９３細胞に導入し、コードされる変異体タンパク質の発現にとって適した条件で細胞を培養した。発現されたナノ粒子を、レクチンアフィニティクロマトグラフィーの後にサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、細胞培養上清から精製した。精製したナノ粒子のクロマトグラムを図３２Ａ〜３２Ｅに示す。
【０１８５】
精製したナノ粒子を、ネガティブ染色電子顕微鏡法によって分析したところ、ＨＡステムを周期的な配置で外方向に突出する個々のナノ粒子が形成されたことが示された。各々の変異体の代表的な電子顕微鏡写真を図３３に示す。
【０１８６】
Ｈ１０ｓｓＦ変異体の抗原性を、ＨＡステム抗体ＦＩ６、ＣＴ１４９、およびＣＲ８０２０に対する親和性を測定することによってＥＬＩＳＡフォーマットにおいて評価した。この評価の結果を図３４Ａ〜３４Ｄに示す。
【０１８７】
次に、ナノ粒子を、マウスにおける様々なインフルエンザ株に対する免疫応答の誘発能に関して試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）を、ＳＡＳアジュバントを使用して、変異体ナノ粒子の１つの２μｇによって免疫した。免疫を定期的な間隔でさらに２回繰り返した。最後の免疫の２週間後に、血清を収集して、Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ９に由来するＨＡタンパク質を認識するその能力に関して試験した（ＥＬＩＳＡによって）。図３５Ａおよび３５Ｂに示す結果は、血清がＨ３Ｎ２およびＨ７Ｎ９  ＨＡタンパク質の両方に関して交叉反応性であったことを示している。
【０１８８】
次に、免疫したマウスを、Ｈ３Ｎ２（Ａ／フィリピン／１９８２）またはＨ７Ｎ９（Ａ／上海／２／２０１３様）の致死量で攻撃し、体重減少および生存をモニターした。図３６Ａ〜３６Ｄ、および図３７Ａ〜３７Ｇに示す結果から、変異体ナノ粒子による免疫が、有意な体重減少を引き起こすことなく両方の攻撃株に対し保護をもたらしたことが示された。これらの結果は、Ｈ１０ｓｓＦ免疫原が、Ｈ３Ｎ２およびＨ７Ｎ９株に対してヘテロサブタイプ防御を提供し得ることを証明する。
【０１８９】
ＶＨ１−１８  ｖ遺伝子を使用する、ヒトの広範に中和性のステムモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１６．ａ．２６）は、グループ１およびグループ２インフルエンザウイルスの両方を強力に中和することができることが示されている。したがって、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９、およびＨ１０Ｎ８サブタイプを含むいくつかのＨＡ−ＳＳ−ｎｐ変異体を、ｍＡｂ  １６．ａ．２６の生殖系列復帰型を発現するＢ細胞を活性化する能力に関して評価した。アッセイにおいて、Ｂ細胞の活性化は、Ｃａ＋＋の流れによって示される。図４０に示すこの評価の結果は、変異体ナノ粒子Ｈ３ｓｓＦ＿２５６、Ｈ７ｓｓＦ＿２６、およびＨ１０ｓｓＦ＿０４の各々が、ＩｇＭ陽性対照によって観察されるものと類似の高レベルの活性化をもたらしたことを示している。図４１に示すように、これらのデザインの３つ全てが、同じヘリックスＡのＣ末端伸長部（ＥＬＭＥＱ）を共有し、このことは、この特定のモチーフがインフルエンザＨＡタンパク質に対する１６．ａ．２６  ｂＮＡｂ応答を誘発するために有用であることを示唆している。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２４−５】
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【図２４−６】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３７−４】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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