(57)【要約】  本発明は、B細胞成熟抗原（BCMA）ポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメントを含む細胞外抗原結合ドメインを含む、単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドに関する。このCARは、ヒトBCMAのN末端の残基13〜32の1個以上のアミノ酸を含むエピトープに好んで結合する。本発明はさらに、本発明のCARをコードする核酸分子と、本発明のCARを発現する遺伝子改変された免疫細胞（好ましくはT細胞）と、病原性B細胞の存在に関連する医学的障害（例えば形質細胞、および／または記憶B細胞、および／または成熟B細胞の疾患、特に多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、自己抗体依存性自己免疫疾患）の治療におけるその細胞の利用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
i．B細胞成熟抗原（BCMA）ポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメントを含む細胞外抗原結合ドメインと、
ii．膜貫通ドメインと、
iii．細胞内ドメイン
を含んでいて、ヒトBCMAのN末端の残基13〜32の1個以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する、単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項２】
前記細胞外抗原結合ドメインが、
- 配列番号1（GFTFSRYW）と配列が少なくとも80％一致する重鎖相補性決定領域1（H-CDR1）と、
- 配列番号2（INPSSSTI）と配列が少なくとも80％一致する重鎖相補性決定領域2（H-CDR2）と、
- 配列番号3（ASLYYDYGDAYDY）と配列が少なくとも80％一致する重鎖相補性決定領域3（H-CDR3）
を含む可変重鎖（VH）と、
- 配列番号4（QSVESN）と配列が少なくとも80％一致する軽鎖相補性決定領域1（L-CDR1）と、
- 配列番号5（SAS）と配列が少なくとも80％一致する軽鎖相補性決定領域2（L-CDR2）と、
- 配列番号6（QQYNNYPLT）と配列が少なくとも80％一致する軽鎖相補性決定領域3（L-CDR3）
を含む可変軽鎖（VL）を含む、請求項1に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項３】
- GFTFSRYW（H-CDR1；配列番号1）と、
- INPX2X3STI（H-CDR2；配列番号7）（ただしX2X3は、SS、NS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DEである）と、
- ASLYX4DYGDAX5DY（H-CDR3；配列番号8）（ただしX4は、Y、L、A、V、F、I、Wである、および／またはX5はY、L、F、I、V、A、Cである）
というCDR配列を含むVHドメインと、
- QSVX1X2N（L-CDR1；配列番号9）（ただしX1X2は、ES、SS、TS、QS、HS、DHである）と、
- SAS（L-CDR2；配列番号5）と、
- QQYNNYPLTFG（L-CDR3；配列番号10）
というCDR配列を含むVLドメインを含む、請求項1または2に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項４】
以下の配列：
i．H-CDR1：GFTFSRYW（配列番号1）と、
ii．H-CDR2：INPSSSTI（配列番号2）と、
iii．H-CDR3：ASLYYDYGDAYDY（配列番号3）と、
iv．L-CDR1：QSVESN（配列番号4）と、
v．L-CDR2：SAS（配列番号5）と、
vi．L-CDR3：QQYNNYPLT（配列番号6）
を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号11（EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWV
GEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS）と配列が少なくとも80％一致するVHドメインと；
配列番号12（EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIY
SASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELK）と配列が少なくとも80％一致するVLドメインを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号11の少なくともW36、E50、L99、Y100、Y101、A106と、配列番号12の少なくともS31、A34、S50、L53、Q89、Y91、Y94、L96を含む、請求項5に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項７】
少なくとも配列番号1〜6のCDR配列を含む、請求項5または6に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項８】
配列番号11に記載のVHドメインと、配列番号12に記載のVLドメインを含む、請求項5〜7の1項以上に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドにおいて、そのCARが、遺伝子改変された免疫細胞、好ましくはTリンパ球で発現するとき、その免疫細胞が、そのCARを通じて非ホジキンリンパ腫（B-NHL）の表面上のBCMAに結合して活性化されることによりそのB-NHLに対する細胞傷害活性を誘導する、単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項１０】
前記B-NHLが、JeKo-1細胞系、および／またはDOHH-2細胞系、および／またはSU-DHL4細胞系、および／またはJVM-3細胞系、および／またはMEC-1細胞系である、請求項9に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項１１】
前記細胞外抗原結合ドメインが、前記VHドメインと前記VLドメインの間に位置するリンカーポリペプチドを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項１２】
前記リンカーの選択が、Whitlowリンカー（配列番号13；GSTSGSGKPGSGEGSTKG）、Gly-Serリンカー（配列番号14；SSGGGGSGGGGSGGGGS）、配列番号13または14と配列が少なくとも80％一致するリンカーからなされる、請求項11に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項１３】
前記細胞外抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインの間に位置するスペーサペプチドを含んでいて、そのスペーサの選択が、
a．IgG1-CD28 スペーサ（配列番号15；PAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPK
DTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKK）
b．IgG1Δ- 4-1BB スペーサ（配列番号16；PAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFP
PKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSSLSPGKK）
c．IgG4 (Hi-CH2-CH3) スペーサ（配列番号17；ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPP
KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK）
d．IgG4 (Hi-CH3) スペーサ（配列番号18；ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQE
EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK)
e．IgG4 (Hi) スペーサ（配列番号19；ESKYGPPCPPCP）
f．配列番号15〜19のいずれか1つと配列が少なくとも80％一致するスペーサ
からなされる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項１４】
前記膜貫通ドメインの選択が、CD8αドメイン（配列番号20；IYIWAPLAGTCGVLL
LSLVITLYC）、CD28ドメイン（配列番号21；FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV）、配列番号20または21と配列が少なくとも80％一致する膜貫通ドメインからなされる、請求項1〜13のいずれか1項に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項１５】
前記細胞内ドメインが、4-1BB共刺激ドメイン（配列番号22；KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL）、CD28共刺激ドメイン（配列番号23；RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS）、配列番号22または23と配列が少なくとも80％一致する共刺激ドメインから選択された共刺激ドメインを含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項１６】
シグナル伝達ドメインを含んでいて、そのシグナル伝達ドメインが、CD3ζ（CD28または4-1BB）シグナル伝達ドメイン（配列番号24；LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNEL
NLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR）、または配列番号24と配列が少なくとも80％一致するシグナル伝達ドメインから選択される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項１７】
4-1BB共刺激ドメイン（配列番号22）と、CD28共刺激ドメイン（配列番号23）と、CD3ζシグナル伝達／活性化ドメイン（配列番号24）を含むタンデム式共刺激ドメインを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチド。
【請求項１８】
a）- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または
- 配列番号66および／または67、または配列番号86〜94に記載の配列を含むヌクレオチド配列
を含む核酸分子；
b）a）に記載のヌクレオチド配列と相補的な核酸分子；
c）a）またはb）に記載のヌクレオチド配列と機能が類似している／同等であるくらいに配列が十分に一致していて、好ましくはa）またはb）に記載のヌクレオチド配列と少なくとも80％一致するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
d）遺伝コードの帰結として縮重によりa）〜c）に記載のヌクレオチド配列になる核酸分子；
e）欠失、および／または付加、および／または置換、および／または転位、および／または逆転、および／または挿入によって改変されているが、a）〜d）に記載のヌクレオチド配列と機能的に類似している／同等である、a）〜d）に記載の核酸分子
からなるグループから選択される、好ましくはベクター（例えばウイルスベクター）の形態の単離された核酸分子。
【請求項１９】
請求項18に記載の核酸分子またはベクターを含む、および／または請求項1〜17のいずれか1項に記載のCARを発現する、遺伝子改変された免疫細胞。
【請求項２０】
Tリンパ球とNK細胞からなるグループから選択される、請求項19に記載の遺伝子改変された免疫細胞。
【請求項２１】
前記Tリンパ球が細胞傷害性Tリンパ球である、請求項20に記載の遺伝子改変された免疫細胞。
【請求項２２】
病原性B細胞の存在に関連する医学的障害の治療に利用するための、請求項19〜21のいずれか1項に記載の免疫細胞。
【請求項２３】
病原性B細胞の存在に関連する前記医学的障害が、形質細胞の疾患、および／または成熟B細胞の疾患、および／または記憶B細胞の疾患である、薬として利用するための、請求項22に記載の免疫細胞。
【請求項２４】
前記医学的障害が多発性骨髄腫である、薬として利用するための、請求項22に記載の遺伝子改変された免疫細胞。
【請求項２５】
前記医学的障害が非ホジキンリンパ腫である、薬として利用するための、請求項22に記載の免疫細胞。
【請求項２６】
前記医学的障害が自己抗体依存性自己免疫疾患である、薬として利用するための、請求項22に記載の免疫細胞。
【請求項２７】
前記医学的障害が全身性エリテマトーデス（SLE）または関節リウマチである、薬として利用するための、請求項26に記載の免疫細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、B細胞成熟抗原（BCMA）ポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメントを含む細胞外抗原結合ドメインを含む、単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドに関する。このCARは、ヒトBCMAのN末端の残基13〜32の1個以上のアミノ酸を含むエピトープに好んで結合する。本発明はさらに、本発明のCARをコードする核酸分子と、本発明のCARを発現する遺伝子改変された免疫細胞（好ましくはT細胞）と、病原性B細胞の存在に関連する医学的障害（例えば形質細胞、および／または記憶B細胞、および／または成熟B細胞の疾患、特に多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、自己抗体依存性自己免疫疾患）の治療におけるその細胞の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの免疫療法では、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原を認識するように遺伝子が改変されたT細胞の養子移植（ATT）が、腫瘍と腫瘍幹細胞を根絶するための有望なアプローチである。そのため伝統的な化学療法、放射線療法、外科療法とは異なり、腫瘍の再発を回避できる可能性がある。さらに、新規な経路選択的薬によって腫瘍を非常にうまく制御できることがしばしばあるが、この疾患の経過中に通常は明確に腫瘍が排除されないまま慢性相に切り換わる。
【０００３】
患者は、あらかじめ手厚い治療を施され、以前に何回か化学療法や抗体療法、それどころか自家／同種骨髄移植さえ受けていたという事実があるにもかかわらず、CARを発現する遺伝子改変T細胞の出現により、B細胞リンパ腫／白血病の治療が非常にうまくいくことが証明された。例えばCAR-T細胞を用いたATTが救援療法として利用されて成功した。
【０００４】
CARは、合成による操作された免疫グロブリン由来の受容体であり、MHCとは独立に表面抗原を認識することができる。CARは、TCRとは異なってより広範囲のアフィニティを持っており、必ずしも交差反応性を示すことなく標的抗原に結合することができる。標的抗原は表面に堆積されている必要があって、標的抗原には、腫瘍関連タンパク質または炭水化物が含まれている可能性、それどころか糖脂質さえ含まれている可能性がある。CAR-T細胞の別の利点は、自家T細胞の形質導入によって迅速に生成することである。自家T細胞は、CD4+またはCD8+を起源とするものが可能である。CARは「既製品」として作製することができ、その標的は、典型的には、CD19+B細胞白血病やリンパ腫で示されているように、特定の腫瘍の中で広く発現している（90％超）。CAR-T細胞は、T細胞の輸液が1回だけでもその後維持することのできる「生きている薬」として作用することが示唆されている。
【０００５】
本明細書に記載したキメラ抗原受容体（CAR）-T細胞製品が医学では強く必要とされている。第1に、多発性骨髄腫は、悪性に変化した形質細胞クローンに由来する不治のB細胞非ホジキンリンパ腫（B-NHL）である。特殊性として、腫瘍細胞は、主に骨髄に局在している。この疾患は骨と骨髄でもっとも頻繁に見られる腫瘍であり、集中治療を受けた若い患者の10年生存率が50％で、がんによる年間死者の2％を占める。罹患率は5/100,000であり、診断される年齢の中央値は70歳である。これは、多くの患者で併存疾患が存在するため集中的な長期の化学療法が不可能であることを示している。標準治療は、単独の化学療法であるか、自家幹細胞移植、免疫調節薬、局所的照射、プロテアソーム阻害剤と組み合わせた化学療法であり、ごく少数の患者には同種幹細胞移植を実施することができる。上記様式の集中治療にもかかわらず、この疾患は通常は再発し、多数回の治療の後に2回目の抵抗性が生じる。
【０００６】
第2に、古典的なB-NHLのはるかに大きなグループに含まれるのは、通常は二次リンパ器官に向かうBリンパ球に由来する多彩な腫瘍（例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、濾胞性リンパ腫（FL）や、慢性リンパ性白血病（CLL）のサブグループ）である。あらゆるNHLの合計罹患率は約10〜12/100,000（85％超がB細胞起源）であるが、その大半は成人の疾患であり、年長者ほど大きく増加する。人口動向から、西洋社会の高齢化が原因で合計数は増加することが予想される。臨床的にはB-NHLはさまざまな種類からなるが、攻撃的な経過と遅発性の経過によって区別することができる。過去15年の間にB-NHLの治療は大きく進歩してきた。標準療法は、抗体／化学療法の併用であり、それが単独で実施されるか、自家幹細胞移植、免疫調節薬、放射線照射、プロテアソーム阻害剤、シグナル伝達経路阻害剤と組み合わせて実施され、ごく少数の患者には同種幹細胞移植を実施する。多くのB-NHLでは診断される年齢の中央値が55〜60歳よりも上であるため併存疾患も存在しており、集中的な長期の化学療法はできず、同種骨髄移植さえ不可能である。
【０００７】
リンパ腫B細胞の表面に広く発現しているCD19抗原を標的とする養子CAR-T細胞療法が出現したことで、こうした制約を克服することが可能になり、現在は、B-NHLとB-ALLの治療に向けた約20件のCD19 CAR-T細胞の研究がFDAに登録されている。発明者が知る限り、大きなブレイクスルーがCLLに関する臨床試験で2011年に、B-ALLに関する臨床試験で2013年にすでに達成されているとはいえ、ドイツでバイオメディカル企業が同じCD19 CAR製品を用いることが許可されたのはほんの最近のことである。EUの他の国々（例えばオーストリア）では、CD19 CAR T細胞を用いた臨床試験が実施されているところである。より重要なこととして、B-NHLに対する抗CD19抗体療法またはCAR-T細胞療法において、抗原喪失が原因で抵抗性が発生している。治療抵抗性は多数回の化学／免疫療法の後に観察されているため、代わりの標的構造が緊急に望まれている。
【０００８】
多発性骨髄腫という病気については、2つの抗BCMA-CAR製品が以前に報告されていて、臨床試験の第I相に入っている。これらの試験ではB-NHLに抗BCMA-CARを適用できることが証明されない。B-NHLについては、抗BCMA標的療法は、特に抗CD19 CARが失敗したときの可能な代替法である。多発性骨髄を標的としていて臨床試験が実施された他の免疫療法戦略は、抗CD19 CAR、NY-ESO1、MAGE-A1に向かうTCR形質導入T細胞である。腫瘍標的としてのBCMAとは大きく異なり、選択可能な患者の数ははるかに少ない。なぜなら、これらの標的抗原は10％未満のケースでしか発現していないからである。他の標的療法には抗CD38抗体と抗SLAMF7抗体が含まれるが、これらの療法は考え方がまったく異なっている。なぜなら抗体は自立しておらず、記憶を形成せず、われわれが知る限り、十分な腫瘍撲滅に関与することがまだ証明されていないからである。
【０００９】
それに加え、特異的に形質細胞を標的とする能力は、自己免疫疾患の治療に大きな利益をもたらすと考えられる。自己免疫疾患の穏やかな形態は、通常は、最初に非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）または疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）で治療される。進行中の疾患が原因となった臓器の機能不全が関係する全身性エリテマトーデス（SLE）のより重症な形態は、通常は、ステロイドに強力な免疫抑制剤（例えば循環している細胞を標的とする細胞傷害剤であるシクロホスファミド）を組み合わせて治療する。
【００１０】
ごく最近になり、SLEで使用するため、サイトカインBAFF（自己免疫疾患の患者の血清中に高レベルで見られる）を標的とする抗体であるベリムマブが食品医薬品局（FDA）によって認可された。しかし新たに形成されたB細胞だけが、ヒトの体内で生き延びるためにBAFFに依存している一方で、記憶B細胞と形質細胞は、選択的なBAFF抑制に対する感受性がより小さい（Jacobi他（2010年）Arthritis Rheum 第62巻：201〜210ページ）。関節リウマチ（RA）については、TNF阻害剤が最初に認可された生物剤であり、その後アバタセプト、リツキシマブ、トシリズマブなどが続いた。これらは、関節の炎症と破壊に関与する重要な炎症経路を抑制するが、相対的に免疫が抑制されることを原因とする感染リスクの増大という代償を払うことになる（Chan他（2010年）Nat Rev Immunol第10巻：301〜316ページ、Keyser（2011年）Curr Rheumatol Rev 第7巻：77〜87ページ）。
【００１１】
ごく最近になり、自己抗体が関与する疾患を治療するため、標的アプローチとしてのCAR-T細胞も議論された（Ellebrecht他（2016年）Science 第353巻：179〜184ページ）。骨髄の中の生存ニッチに滞在して長期生存する固着性形質細胞は、従来の免疫抑制薬と細胞傷害薬に対してと、B細胞とその活性化を標的とする療法に対して抵抗性であることがしばしばある。特にリツキシマブはそのような治療に適していないように見える。というのも、その標的である抗原CD20が形質細胞の表面に発現していないからである。治療におけるこの課題には、抗BCMA CAR-T細胞コンストラクトを用いることによって応えることができた。というのも、長期生存する形質細胞の表面にBCMAが発現しているからである。
【００１２】
これまで、他の多数の抗BCMA CARコンストラクトが本分野で報告されてきた。2013年には、James N. Kochenderferのグループが、抗BCMA CARを形質導入したT細胞のアプローチを初めて公開した。これは、インビトロアッセイとマウスでの試験を利用した前臨床試験である（Carpenter他、2013年；Clin Cancer Res；第19巻(8)；2048〜2060ページ）。2015年6月、Bluebird Bio社とCelgene社は、共同開発中のBCMA CAR-T細胞療法に焦点を当てることを宣言した。多発性骨髄患者に向けた第I相の臨床試験への参加者募集が2016年1月に始まった。2016年初め、ペンシルベニア大学のAbramson Cancer Centerは、多発性骨髄患者の治療に抗BCMA CARを形質導入したT細胞を用いる第I相試験の参加者募集を開始した（ClinicalTrials.gov識別記号：NCT02546167）。BCMAに向かうCARは、WO 2016/014789、WO 2016/014565、WO 2013/154760に記載されている。WO 2015/128653にも、BCMAに結合するCAR配列が開示されている。CARでエピトープの認識に関わる部分はAPRILリガンドのバリアントであり、BCMAに対して野生型APRILよりも改善された結合を示す。代わりの治療戦略は、抗CD38 CARに関係する。BCMA結合抗体が、WO 2015/166073とWO 2014/068079に開示されている。
【００１３】
可能性のある代わりの治療法が多数開発中だが、病原性B細胞の存在に関連する医学的障害（特に多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、自己抗体依存性自己免疫疾患）に対処する効果的な手段を提供することが大いに必要とされる状態が継続している。
【発明の概要】
【００１４】
先行技術に照らすと、本発明の元になる技術的問題は、病原性B細胞に関連する疾患の治療に適した薬剤を提供することであった。
【００１５】
この問題は、独立請求項の特徴によって解決される。本発明の好ましい実施態様は、従属請求項によって提供される。
【００１６】
したがって本発明は、単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドに関するものであり、そのCARは、
i．B細胞成熟抗原（BCMA）ポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメントを含む細胞外抗原結合ドメインと、
ii．膜貫通ドメインと、
iii．細胞内ドメイン
を含んでいて、ヒトBCMAのN末端の残基13〜32の1個以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。
【００１７】
したがって本発明は、本発明のCARを発現する遺伝子改変された免疫細胞（T細胞が好ましい）と、病原性B細胞の存在に関連する医学的障害の治療におけるその細胞の利用に関する。
【００１８】
したがって本発明により、移植に適したT細胞（自家T細胞が好ましい）として、異なる段階の成熟B-NHLと多発性骨髄腫を治療するための、抗BCMA CARを含む自家T細胞が提供される。本発明の免疫療法アプローチの好ましい実施態様では、患者由来のT細胞を好ましくはレトロウイルスによって形質導入し、細胞外抗体に由来していて膜貫通区画に融合した抗原認識部分と、それに続く細胞内シグナル伝達ドメインからなる、本明細書に記載した人工免疫受容体を発現させる。本明細書に記載したコンストラクトは、形質導入されたT細胞に抗腫瘍細胞溶解能力を与える。
【００１９】
臨床での他のCAR-T細胞輸送に関して示されているように、本発明は、本明細書に記載したCARに基づく抗BCMA CAR-T細胞が、予想可能で、忍容可能で、管理可能な副作用を有することを特徴とする。本明細書に記載した抗BCMA CAR-T細胞の前臨床試験は、腫瘍関連抗原BCMAに対する選択性を示している。抗BCMA CARを備えたT細胞は、大きなアフィニティとアビディティを持ち、多発性骨髄腫細胞を認識して破壊する一方で、正常な造血細胞には影響を与えない。好ましい一実施態様では、自家T細胞の移植によって移植片対宿主病の可能性が回避される。再発を阻止する上で重要な記憶CAR-T細胞の形成が進展する可能性がある。
【００２０】
本明細書に記載した抗BCMA CAR-T細胞はアフィニティとアビディティが大きいため、BCMAの発現が少ない成熟B-NHLでさえ認識することができ、そのことによってT細胞の活性化と腫瘍細胞の殺傷が可能になる。
【００２１】
好ましい実施態様では、そのような成熟B-NHLに、いくつかの段階のFL（濾胞性リンパ腫）、DLBCL（びまん性大細胞型B細胞リンパ腫）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、CLL（慢性リンパ性白血病）が含まれる。
【００２２】
本明細書に記載したCARの抗原認識部分は、WO/2015/166073に記載されているヒト化抗体に基づくことが好ましい。そこに記載されている抗体を使用して、BCMAに対する大きなアフィニティと特異性を保持している多数のCARコンストラクトを構成した。大きなアフィニティと特異性により、標的外反応性を低下させることが可能になるため、他のBCMA CARコンストラクトを上回る利点が提供される。元の抗体の大きな特異性とアフィニティを本明細書に記載したCARにおいて維持できてBCMA抗原の発現が非常に少ないB細胞さえ標的になったというのは驚くべき結果であった。
【００２３】
本発明のCARは、BCMAのN末端の残基13〜32の1個以上のアミノ酸を含むエピトープに好んで結合する。別の実施態様では、BCMAの他のエピトープ（特にBCMAのN末端）に結合することも可能である。
【００２４】
本発明には、さまざまなシグナル伝達ドメインも含まれる。シグナル伝達ドメインの交換は、強力で迅速なエフェクタ相（CD28共刺激ドメイン）、またはT細胞記憶集団によって保証される長く続く再発制御（4-1BBシグナル伝達ドメイン）という要求に合致する。本明細書に示したように、さまざまなシグナル伝達ドメインを交換して多くの配置にすることで、有利な結合特性を失うことなく、CARを柔軟に設計することができる。
【００２５】
本明細書に記載した抗BCMA CAR-T細胞製品は、独自の特性を特徴とする。CAR-T細胞コンストラクトの細胞外ドメインのアフィニティがナノモルレベルと低いことが理由で、本明細書に記載した抗BCMA CARは比類のない大きなアフィニティを持ち、T細胞に極めて大きな特異性とアビディティを与える。これらの特性により、腫瘍細胞が、BCMAの表面発現が多い腫瘍細胞と、驚くべきことにBCMAの表面発現が少ない腫瘍細胞i）を認識すること、ii）に対して活性化されること、iii）を殺傷することが可能になる。
【００２６】
腫瘍細胞の表面に発現するBCMA抗原の数は、（Becton Dicksinson社からの）Quantibriteビーズと組み合わせた蛍光染料にカップルさせた抗BCMA抗体を用いて定量することができる。腫瘍細胞の表面に発現するBCMA抗原の定量に用いられる好ましい方法は、「蛍光活性化細胞ソーティング／細胞分析」（FACS）である。ビーズの蛍光強度は、細胞に結合した蛍光性抗体の数と正確に相関しているため、これが、細胞表面にあるBCMA分子の数の1つの指標となる。骨髄腫細胞に関係する蛍光密度は、典型的には、低蛍光B-NHL細胞と比べて少なくとも2〜3 log10倍大きい。これは、BCMA抗原の密度も少なくとも2〜3 log10倍の範囲で変化しうることを示している。
【００２７】
競合するどの抗BCMA CARも、多発性骨髄腫細胞以外、または非常に稀なケースではバーキットリンパ腫以外のB-NHLとの反応性がないことがわかった。したがって抗BCMA CARは、これまでになく多様なB-NHLに対して反応性を示す。これらの特性は、CAR-T療法に関する予想外で驚くべき利点である。当業者の典型的な予測によれば、CAR-Tターゲティングが可能であるためには標的抗原を多く発現させる必要がある。本発明のCARを用いたCAR-Tは、標的抗原の発現レベルが低いB細胞に対してこれまでにない活性を示す。
【００２８】
好ましい実施態様では、MP71-ベクターおよびγ-レトロウイルス発現系と組み合わせることで、ヒトT細胞の並外れて大きな形質導入率を達成することができる。
【００２９】
CARが結合したBCMAエピトープに関する好ましい実施態様
本発明のCARは、ヒトBCMAのN末端の残基13〜32の1個以上のアミノ酸を含むエピトープに好んで向かう。CD269の残基13〜32のアミノ酸配列を配列番号33に示す。CD269のN末端の配列は配列番号32に示す。CD269の細胞外ドメインは配列番号31に提示する。
【００３０】
本発明においてCAR形式で用いるために改変した本明細書と以前（WO/2014/068079）に記載されているマウス抗体とキメラ抗体の結合特異性を生み出すため、配列番号31に記載のCD269の細胞外ドメインを含む抗原をワクチン接種で利用した。抗体を作製するとき、CD269タンパク質の全体、または膜結合ドメインまたは細胞内ドメインを含むその断片を抗原として用いると、CD269の隠れたドメインまたは細胞内ドメインに結合する抗体を作製することができ、そのことによってそのような薬剤は治療用途には不適であるか不利になる。したがって本発明のCARは、CD269の細胞外部分に結合することを特徴とする。細胞外ドメイン内の特異的エピトープは、本発明の新規かつ予想外の好ましい特徴でもある。
【００３１】
本発明のCARの出所となるマウス抗体またはキメラ抗体から調製したFabフラグメントを、精製されたBCMA細胞外ドメインとの複合体として結晶化させ、その複合体構造を溶解させた。構造分析から、本発明の抗体／CARの結合領域のエピトープの詳細な情報と、その生物学的重要性が明らかになった。細胞外ドメインのBCMAの残基13〜32の1個以上のアミノ酸を含むエピトープに本発明の抗体が結合することは、その大きな結合特異性と細胞外の位置が理由で有利な特性である。発明者が知る限り、この領域に結合するCARが以前に報告されたことはない。
【００３２】
一実施態様では、本発明のCARは、CD269（BCMA）のアミノ酸13、15、16、17、18、19、20、22、23、26、27、32の1個以上を含むエピトープに結合することを特徴とする。別の一実施態様では、本発明のCARは、CD269（BCMA）のアミノ酸13、15、16、17、18、19、20、22、23、26、27、32からなるエピトープに結合することを特徴とする。これらの残基は、本明細書に提示した結晶構造のデータによって確認されるように、本発明の抗体と直接相互作用するアミノ酸を表わしている。これら残基の番号付けは、BCMAのN末端の配列を与える配列番号32に対して実施した。
【００３３】
すでに開示したように、本発明のCARの出所となる抗体のアフィニティは驚くほど大きく、先行技術で試みられている同様のアプローチと比較しても優れている。したがって本発明のCARは、他の抗BCMA CAR分子には見られない大きなアフィニティを特徴とする。（下記のように）pM範囲のKdが、一般には予想されない顕著なアフィニティとして一般に受け入れられている。
【００３４】
別の1つの側面では、本発明のCARの出所となるヒト化抗体またはヒト化抗体フラグメントは、BCMAと大きなアフィニティで結合する。表面プラズモン共鳴（例えばBiacore）によって測定すると、抗体はヒトBCMAに、100 nM、90、80、70、60、50、40、30 nM、またはそれ以下、または20 nM以下のアフィニティで、または15 nM以下のアフィニティで、または5 nM以下のアフィニティで、または1000 pM以下のアフィニティで、または500 pM以下のアフィニティで、または100 pM以下、または80 pM以下、または例えば約50 pMのアフィニティで結合する。したがって本発明のCARは、対応するアフィニティを示す。
【００３５】
さらに別の一実施態様では、本発明のCARの出所となる抗体は、表面プラズモン共鳴（例えばBiacore）によって測定すると、約1 pM〜約100 nM、または約100 pM〜約50 nM、または約200 pM〜約20 nMのアフィニティでヒトCD269に結合する。したがって本発明のCARは、対応するアフィニティを示す。
【００３６】
一実施態様では、本発明のCARおよび／またはCAR-Tは、BCMAを発現する細胞に結合し、多発性骨髄腫細胞と比べて、好ましくは本明細書に示した実施例で用いる多発性骨髄腫細胞系と比べて少ない1/1 log10〜1/4 log10、好ましくは1/2 log10〜1/3 log10の量で細胞の表面に存在しているBCMAを検出できることを特徴とする。そのような細胞の非限定的な例は、非ホジキンリンパ腫（B-NHL）細胞、例えばDOHH-2細胞系、および／またはSU-DHL4細胞系、および／またはJEKO-1細胞系、および／またはJVM-3細胞系、および／またはMEC-1細胞系である。
【００３７】
CAR配列に関する好ましい実施態様：
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗体受容体（CAR）ポリペプチドは、細胞外抗原結合ドメインが、
- 配列番号1（GFTFSRYW）と配列が少なくとも80％一致する重鎖相補性決定領域1（H-CDR1）と、
- 配列番号2（INPSSSTI）と配列が少なくとも80％一致する重鎖相補性決定領域2（H-CDR2）と、
- 配列番号3（ASLYYDYGDAYDY）と配列が少なくとも80％一致する重鎖相補性決定領域3（H-CDR3）
を含む可変重鎖（VH）と、
- 配列番号4（QSVESN）と配列が少なくとも80％一致する軽鎖相補性決定領域1（L-CDR1）と、
- 配列番号5（SAS）と配列が少なくとも80％一致する軽鎖相補性決定領域2（L-CDR2）と、
- 配列番号6（QQYNNYPLT）と配列が少なくとも80％一致する軽鎖相補性決定領域3（L-CDR3）
を含む可変軽鎖（VL）を含むことを特徴とする。
【００３８】
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗体受容体（CAR）ポリペプチドは、細胞外抗原結合ドメインが、
- 配列番号25（RYWFS）と配列が少なくとも80％一致する重鎖相補性決定領域1（H-CDR1）と、
- 配列番号26（EINPSSSTINYAPSLKDK）と配列が少なくとも80％一致する重鎖相補性決定領域2（H-CDR2）と、
- 配列番号27（SLYYDYGDAYDYW）と配列が少なくとも80％一致する重鎖相補性決定領域3（H-CDR3）
を含む可変重鎖（VH）と、
- 配列番号28（KASQSVESNVA）と配列が少なくとも80％一致する軽鎖相補性決定領域1（L-CDR1）と、
- 配列番号29（SASLRFS）と配列が少なくとも80％一致する軽鎖相補性決定領域2（L-CDR2）と、
- 配列番号30（QQYNNYPLTFG）と配列が少なくとも80％一致する軽鎖相補性決定領域3（L-CDR3）
を含む可変軽鎖を含むことを特徴とする。
【００３９】
配列番号25〜30として示した上記のCDR配列は、CDR領域を規定するため代わりのパラメータを用いて得られる実施態様を表わしており、例えば配列番号1〜6と比べて追加された隣接アミノ酸を含んでいる。
【００４０】
配列番号1〜6と25〜30のCDR配列は、掲載した具体的な配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、または少なくとも95％一致するポリペプチド配列が本発明に含まれるように決めることもできる。
【００４１】
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗体受容体（CAR）ポリペプチドは、CDR配列：
- GFTFSRYW（H-CDR1；配列番号1）と、
- INPX2X3STI（H-CDR2；配列番号7）（ただしX2X3は、SS、NS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DEである）と、
- ASLYX4DYGDAX5DY（H-CDR3；配列番号8）（ただしX4は、Y、L、A、V、F、I、Wである、および／またはX5はY、L、F、I、V、A、Cである）
を含むVHドメインと、
CDR配列：
- QSVX1X2N（L-CDR1；配列番号9）（ただしX1X2は、ES、SS、TS、QS、HS、DHである）と、
- SAS（L-CDR2；配列番号5）と、
- QQYNNYPLTFG（L-CDR3；配列番号10）
を含むVLドメインを含むことを特徴とする。
【００４２】
代わりの実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗体受容体（CAR）ポリペプチドは、CDR配列：
- RYWX1S（H-CDR1；配列番号34）（ただしX1は、I、F、L、V、Y、C、G、A、S、Tである）と、
- EINPX2X3STINYAPSLKDK（H-CDR2；配列番号35）（ただしX2X3は、SS、NS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DEである）と、
- SLYX4DYGDAX5DYW（H-CDR3；配列番号36）（ただしX4は、Y、L、A、V、F、I、Wである、および／またはX5は、Y、L、F、I、V、A、Cである）
を含むVHドメインと、
CDR配列：
- KASQSVX1X2NVA（L-CDR1；配列番号37）（ただしX1X2は、ES、SS、TS、QS、HS、DHである）と、
- SASLRFS（L-CDR2；配列番号29）と、
- QQYNNYPLTFG（L-CDR3；配列番号30）
を含むVLドメインを含むことを特徴とする。
【００４３】
配列番号34〜37として示した上記のCDR配列は、CDR領域を規定するため代わりのパラメータを用いて得られる実施態様を表わしており、例えば配列番号1〜6と比べて追加された隣接アミノ酸を含んでいる。
【００４４】
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗体受容体（CAR）ポリペプチドは、以下の配列：
- H-CDR1：GFTFSRYW（配列番号1）と、
- H-CDR2：INPSSSTI（配列番号2）と、
- H-CDR3：ASLYYDYGDAYDY（配列番号3）と、
- L-CDR1：QSVESN（配列番号4）と、
- L-CDR2：SAS（配列番号5）と、
- L-CDR3：QQYNNYPLT（配列番号6）
を含むことを特徴とする。
【００４５】
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗体受容体（CAR）ポリペプチドは、CDR配列：
- H-CDR1：RYWFS（配列番号25）と、
- H-CDR2：EINPSSSTINYAPSLKDK（配列番号26）と、
- H-CDR3：SLYYDYGDAYDYW（配列番号27）と、
- L-CDR1：KASQSVESNVA（配列番号28）と、
- L-CDR2：SASLRFS（配列番号29）と、
- L-CDR3：QQYNNYPLTFG（配列番号30）
を含むことを特徴とする。
【００４６】
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗体受容体（CAR）ポリペプチドは、配列番号11（EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINP
SSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS）と配列が少なくとも80％一致するVHドメインと；
配列番号12（EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIY
SASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELK）と配列が少なくとも80％一致するVLドメインを含むことを特徴とする。
【００４７】
配列番号11と12は、好ましいCARの「完全長」VHドメインと「完全長」VLドメインを表わす。配列番号11および12と配列が少なくとも70％、好ましくは80％、85％、90％、または少なくとも95％一致する配列は、特にそのような配列バリアントが望むBCMA結合特異性（機能が類似／同等）を示すとき、本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
一実施態様では、配列番号11と12のVH配列とVL配列を含むか、配列番号11および12と少なくとも80％一致する配列を含む単離されたキメラ抗体受容体（CAR）ポリペプチドは、配列番号11の少なくともW36、E50、L99、Y100、Y101、A106と、配列番号12の少なくともS31、A34、S50、L53、Q89、Y91、Y94、L96を含んでいる。
【００４９】
上に列挙したアミノ酸残基は、標的BCMAエピトープと直接相互作用することが知られているアミノ酸残基である。したがって本発明は、VHとVLの中の配列変化が、配列番号11および12と配列が少なくとも70％、好ましくは80％、85％、90％、または少なくとも95％一致する範囲内で起こるが、少なくとも標的エピトープと相互作用することが知られているアミノ酸残基はVHドメインとVLドメインに含まれるCARに関する。
【００５０】
一実施態様では、配列番号11と12のVH配列とVL配列を含むか、配列番号11および12と少なくとも80％一致する配列を含む単離されたキメラ抗体受容体（CAR）ポリペプチドは、本明細書に記載したように、少なくとも配列番号1、7、8、9、5、10のCDR配列、好ましくは配列番号1〜6のCDR配列を含んでいる。
【００５１】
したがって本発明は、VHとVLの中の配列変化が、配列番号11および12と配列が少なくとも70％、好ましくは80％、85％、90％、または少なくとも95％一致する範囲内で起こるが、少なくとも本明細書に記載したCDR配列はVHドメインとVLドメインに含まれるCARに関する。CDRは、本明細書でCDRと名づけた任意の配列、特に配列番号1〜6または配列番号25〜30を表わす。
【００５２】
好ましい一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗体受容体（CAR）ポリペプチドは、そのCARが、遺伝子改変された免疫細胞、好ましくはTリンパ球で発現するとき、その免疫細胞が、そのCARを通じて非ホジキンリンパ腫（B-NHL）の表面上のBCMAに結合して活性化されることによりそのB-NHLに対する細胞傷害活性を誘導することを特徴とする。
【００５３】
好ましい一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗体受容体（CAR）ポリペプチドは、B細胞リンパ腫が非ホジキンリンパ腫（B-NHL）細胞であること、例えばJeKo-1細胞系、および／またはDOHH-2細胞系、および／またはSU-DHL4細胞系、および／またはJVM-3細胞系、および／またはMEC-1細胞系であることを特徴とする。
【００５４】
本発明のCARは、細胞の表面におけるBCMAのレベルが非常に低い場合でさえ、CARの結合、T細胞の活性化、結合した細胞に対する細胞殺傷につながる可能性があるという驚くべき特性を特徴とする。それは、一般に報告されているCARと比較して顕著な利点である。典型的には、CARは、活性化に続く細胞傷害活性を可能にするのに多数の表面抗原を必要とする。したがって本発明のCARは、先行技術で知られているCARに照らすと予想外の利点を伴っている。
【００５５】
本明細書に記載したCARを生成させるため上記のマウス抗体、および／またはキメラ抗体、および／またはヒト抗体を誘導体化することにより、いくつかの実施態様では、この利点を提供することができる。いくつかの実施態様では、BCMAエピトープの特徴がこの利点へとつながりやすくなる。別の実施態様では、本明細書に記載したVHフラグメントとVLフラグメントの大きなアフィニティと特異性によって本発明のCARの感受性が可能になる。しかしこの特性が、以前に報告されている抗体からのCARとの組み合わせで生じることは予想外であった。本明細書に提示した個々の配列、好ましくは結合に関与するVL領域とVH領域のCDR領域が、CAR-T細胞を活性化させてBCMAの発現が非常に少ない細胞に向かわせるのに十分な特異的かつ強力な結合を示すというのはまったく驚くべきことであった。
【００５６】
本明細書に記載したVHフラグメントとVLフラグメントを本明細書に記載したCARの中で多彩な配置にしても標的エピトープに対する大きな特異性と大きなアフィニティを維持できるというのは予想外であった。下に示すとともに図3に示してあるように、CARは、VH-VL配置またはVL-VH配置にし、リンカー、および／またはヒンジ、および／または膜貫通ドメイン、および／または共刺激ドメイン、および／または活性化ドメインにバリエーションがあるようにしても、効果を維持することができる。本発明のこの驚くべき特徴により、BCMAに向かうCARをより柔軟に設計することができるため、さらなる発展が必要であったり望ましかったりするとしても、本明細書に記載したVHドメインとVLドメインに基づいてCAR構造をさらに改変および／または最適化することが可能になる。
【００５７】
好ましい一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗体受容体（CAR）ポリペプチドは、遺伝子改変された免疫細胞（Tリンパ球が好ましい）の中で発現させるとき、その免疫細胞は、CARを通じて多発性骨髄腫（MM）細胞の表面にあるBCMAに結合して活性化され、そのことによってMM細胞に対する細胞傷害活性を誘導することを特徴とする。好ましいMM細胞は、本明細書に開示した細胞である。好ましい一実施態様では、本明細書に記載したCARは、MMとB-NHLの両方に対して効果的な結合と細胞傷害活性を示す。先行技術に照らすと、本明細書に記載したCARがこれら両方のタイプの細胞に対して活性を示すことができると当業者が予想することはなかったと考えられる。
【００５８】
ヒト化されたVHドメインとVLドメインに関する好ましい実施態様
本明細書と以前（WO/2015/166073）に詳しく開示されているように、ヒト対象への投与により適した試薬を提供するため、抗体J22.9-xiの配列がヒト化された。J22.9-xiのさまざまなヒト化配列バリアントが作製されて、ヒトBCMAとカニクイザルBCMAの両方に対するその結合アフィニティと特異性が試験された。好ましい実施態様では、本発明のCARにこれらヒト化配列が組み込まれている。対応する抗体を用いて実施した結合アッセイの結果から、ヒト化配列はキメラ試薬J22.9-xiの望ましい結合特性を維持していることが明らかになる。下記の配列では、下線を引いた領域は、CDRの決定に用いた方法が何であるかに応じてCDRまたは仮CDRを表わす。
【００５９】
ヒト化VHバリアントに関する好ましい実施態様
本発明のCARによって組み込むことが好ましいヒト化VH配列とヒト化VL配列に関する追加情報を以下に提示する。
【００６０】
キメラ配列：
HCマウス（配列番号38）：
QVQLQQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGIDFSRYWMSWVRRAPGKGLEWIGEINPDSSTINYAPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCASLYYDYGDAMDYWGQGTSVTVSS
【００６１】
このHCマウス配列は、元々はキメラ抗体J22.9-xiに関して開発された重鎖（VH）の可変領域であり、マウス抗体から得られたVLドメインとVHドメインを含んでいて、CD269（BCMA）の細胞外ドメインのエピトープに結合することができ、そのVLドメインとVHドメインは、ヒトのCLドメインとCHドメインにそれぞれ融合している。いくつかの実施態様では、CARは、このHCマウス配列またはそのCDRを含むことができる。
【００６２】
一部がヒト化された配列：
一部がヒト化されたHC（配列番号39）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYWMSWVRQAPGKGLEWVGEINPDSSTINYAPSLKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAMDYWGQGTLVTVSS
【００６３】
一部がヒト化されたこのHC配列は、本明細書に開示したキメラ抗体と比べて（アミノ酸置換を通じて）改変されたアミノ酸配列を表わす。そのことによってVL結合領域とVH結合領域はそれらの配列に対して改変されて、ヒトへの投与により適した形態になっている。
【００６４】
ヒト化VH配列：
hHC01（配列番号40）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLVWVGEINPDSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAMDYWGQGTLVTVSS
【００６５】
翻訳後修飾モチーフが除去されたヒト化VH配列：
hHC02（配列番号41）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWX1SWVRQAPGKGLVWVGEINPX2X3STINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYX4DYGDAX5DYWGQGTLVTVSS
ただし、
X1：I、F、L、V、Y、C、G、A、S、T、好ましくはIまたはF；および／または
X2X3：SS、NS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DE、好ましくはSS；および／または
X4：Y、L、A、V、F、I、W、好ましくはY；および／または
X5：Y、L、F、I、V、A、C、好ましくはY。
【００６６】
「hHC01」および「hHC02」というヒト化配列は、本発明のCARにとって好ましいアミノ酸配列を表わしており、元のキメラ配列と、本明細書に記載した一部がヒト化された配列のどちらと比べても配列が変化している。
【００６７】
PTM変異は、潜在的に有害な翻訳後修飾モチーフをタンパク質から除去しつつ、有利な結合特性を維持することを意図している。hHC01とhHC02の位置1、および／または5、および／または6、および／または19、および／または27、および／または28、および／または34、および／または39、および／または46、および／または48、および／または54、および／または69、および／または84、および／または85、および／または86、および／または88、および／または93、および／または107、および／または115が、元のキメラ配列と比べて変異する（置換される）ことが好ましい。置換の重要性は、主に、得られるアミノ酸に関係し、元のアミノ酸には関係しない。したがって変化は、元のキメラ配列または他のバリアント（例えば一部がヒト化された配列）の対応するアミノ酸から起こる可能性もある。
【００６８】
以下の置換がいくつかの実施態様では好ましく、キメラ配列（配列番号38）と比べて異なっている：
- HC（VH）配列のアミノ酸M34が、任意のアミノ酸、好ましくはI、L、F、V、Y、C、G、A、S、Tで置換されている；および／または
- HC（VH）配列のアミノ酸E46が、Vで置換されている；および／または
- HC（VH）配列のアミノ酸D54とS55が、任意のアミノ酸の組み合わせ、好ましくはSS、TS、GS、KS、RS、SD、SN、DEで置換されている；および／または
- HC（VH）配列のアミノ酸Y101が、任意のアミノ酸、好ましくはL、A、V、F、I、Wで置換されている；および／または
- HC（VH）配列のアミノ酸M107が、任意のアミノ酸、好ましくはL、Y、F、I、V、A、Cで置換されている。
【００６９】
BCMAと直接相互作用するのに必要な残基の位置が変化している可能性のある配列：
hHC03 - BCMAとの相互作用に関与する変化したアミノ酸（配列番号42）：
NYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASX5X6X7DYGDX8MDYWGQGTLVTVSS
ただし、好ましいアミノ酸は、
X1：W、F、Y、好ましくはW；および／または
X2：S、T、N、Q、D、E、好ましくはS；および／または
X3：W、F、Y、好ましくはW；および／または
X4：E、Q、好ましくはE；および／または
X5：L、I、V、G、A、好ましくはL；および／または
X6：Y、X、好ましくはY；および／または
X7：Y、F、L、I、V、M、好ましくはY；および／または
X8：A、G、V、好ましくはAである。
【００７０】
「hHC03」ヒト化配列は、元のキメラ配列と一部がヒト化された配列のどちらと比べても変化しているアミノ酸配列を含む好ましいアミノ酸配列を表わす。配列のこうした変化は、BCMA標的に結合する置換可能なアミノ酸の潜在的な変化を反映させつつ、有利な結合特性を維持することを意図している。置換の重要性は、主に、得られるアミノ酸に関係し、元のアミノ酸には関係しない。したがって変化は、元のキメラ配列やそれ以外のバリアントの対応するアミノ酸から起こる可能性もある。
【００７１】
例えば：
- HC（VH）配列のアミノ酸W33は、W、F、Yである；および／または
- HC（VH）配列のアミノ酸S35は、S、T、N、Q、D、Eである；および／または
- HC（VH）配列のアミノ酸W47は、W、F、Yである；および／または
- HC（VH）配列のアミノ酸E50は、E、Qである；および／または
- HC（VH）配列のアミノ酸L99は、L、I、V、G、Aである；および／または
- HC（VH）配列のアミノ酸Y100は、Y、Xである；および／または
- HC（VH）配列のアミノ酸Y101は、Y、F、L、I、V、Mである；および／または
- HC（VH）配列のアミノ酸A106は、A、G、Vである。
【００７２】
一般に、ヒト化中に起こるCDR領域のあらゆる変化は、フレームワーク配列全体とは独立に考えるとき、CDR配列の1つの特徴と見なすこともできる。そのような改変されたCDR配列は、本明細書に記載したフレームワーク領域全体での文脈において、またはその文脈とは独立に、本発明の特徴を明確にしていると見なすことができる。例えばhHC01〜hHC03の中で下線によって示したCDR配列は、周囲の可変領域配列とは独立に本発明の1つの特徴を明確にしていると見なすことができる。
【００７３】
ヒト化HC（VH）配列の具体例：
hHC04（配列番号43）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWISWVRQAPGKGLVWVGEINPNSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS
hHC05（配列番号44）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPNSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS
hHC06（配列番号45）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWISWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS
hHC07（配列番号46）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS
【００７４】
ヒト化J22.9の中の潜在的な翻訳後修飾部位を除去するため、重鎖CDR2の残基D54をアスパラギン（N）に変異させてN結合グリコシル化のための新たな潜在的修飾部位を作り出した（例えばhHC04、hHC05）。変異してN54を含んでいる重鎖は、グリコシル化することができる。しかし対応するIgGであるJ22.9-FNYはFACSとELISAにおいてBCMAに結合しており、結晶化してBCMAとの複合体になった。側鎖のこのような大きな延長部がBCMAへの結合を妨げないのは驚くべきことであり、こうした観察から、この位置で多くのさまざまなアミノ酸置換が許容され、潜在的には糖以外の誘導体化も許容されることを予測できた。
【００７５】
アラインメント：
HC配列内のさまざまな置換位置のA CLUSTAL W（1.83）多重配列アラインメントにより、図13に示した適切な配列比較が提供される。「一般的な配列」は1つのHC配列を表わし、その中のそれぞれのXは、所与の任意のアミノ酸に対する潜在的なアミノ酸変化を表わす。好ましいアミノ酸置換は、潜在的な変異位置それぞれでの上に説明した置換である。
【００７６】
ヒト化VLバリアントに関する好ましい実施態様
キメラ配列：
LCマウス（配列番号47）：
DIVMTQSQRFMTTSVGDRVSVTCKASQSVDSNVAWYQQKPRQSPKALIFSASLRFSGVPARFTGSGSGTDFTLTISNLQSEDLAEYFCQQYNNYPLTFGAGTKLELKR
【００７７】
LCマウス配列は、元々はキメラ抗体J22.9-xiに関して開発された軽鎖（VL）の可変領域を表わし、マウス抗体から得られたVLドメインとVHドメインを含んでいて、CD269（BCMA）の細胞外ドメインのエピトープに結合することができる。いくつかの実施態様では、マウスVLドメインまたはそのCDRを本発明のCARで用いることができる。
【００７８】
一部がヒト化された配列：
一部がヒト化されたLC（配列番号48）：
DIVMTQSPATLSVSVGDEVTLTCKASQSVDSNVAWYQQKPGQAPKLLIYSDDLRFSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELKR
【００７９】
一部がヒト化されたLC配列は、キメラ抗体と比べて（アミノ酸置換を通じて）改変された配列を表わす。そのことによってVL結合領域とVH結合領域はそれらの配列に対して改変されて、ヒトへの投与により適した形態になっている。
【００８０】
ヒト化VL配列：
hLC01（配列番号49）：
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVDSNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELKR
翻訳後修飾モチーフが除去されたヒト化VL配列：
hLC02（配列番号50）：
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVX1X2NVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELKR
ただし、
X1X2：ES、SS、TS、QS、HS、DH、好ましくはESである。
【００８１】
「hLC01」および「hLC02」というヒト化配列は、元のキメラ配列と本明細書に記載した一部がヒト化された配列のどちらと比べても変化したアミノ酸配列を含む好ましいアミノ酸配列を表わす。
【００８２】
PTM変異は、潜在的に有害な翻訳後修飾モチーフをタンパク質から除去しつつ、有利な結合特性を維持することを意図している。hHC01とhHC02の位置1、および／または8、および／または9、および／または10、および／または13、および／または15、および／または17、および／または19、および／または20、および／または21、および／または22、および／または30、および／または41、および／または43、および／または45、および／または49、および／または58、および／または63、および／または70、および／または77、および／または83、および／または85、および／または87が、元のキメラ配列と比べて変異する（置換される）ことが好ましい。置換の重要性は、主に、得られるアミノ酸に関係し、元のアミノ酸には関係しない。したがって変化は、元のキメラ配列または他のバリアント（例えば一部がヒト化された配列）の対応するアミノ酸から起こる可能性もある。
【００８３】
以下の置換が好ましく、キメラ配列および一部がヒト化された配列と異なっている：
- LC（VL）配列のアミノ酸D1がEで置換されている；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸V15がPで置換されている；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸D17がEで置換されている；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸V19がAで置換されている；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸T22がSで置換されている；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸D30とS31が任意のアミノ酸の組み合わせ、好ましくはES、SS、TS、QS、HS、DHで置換されている；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸V58がIで置換されている；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸D70がEで置換されている。
【００８４】
CDR結合領域内でBCMAと直接相互作用するのに必要な残基の位置が変化している可能性のある配列：
hLC03 - BCMAとの相互作用に関与する変化したアミノ酸（配列番号51）：
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVDX1X2VX3WX4QQKPGQAPRALIX5X6AX7X8RX9SGIPARFSGSX10X11GTEFTLTISSLQSEDFAVYYCX12QX13NNX14PX15TFGAGTKLELKR
ただし好ましいアミノ酸は、
X1：S、H、T、N、D、Q；および／または
X2：N、E、Q；および／または
X3：A、G、V、S、T、L、I；および／または
X4：Y、F、L、I、V、A、G；および／または
X5：Y、F、L；および／または
X6：S、T；および／または
X7：S、T、D、N、H、E、Q；および／または
X8：L、V、I、M；および／または
X9：F、L、I、V、Y、M；および／または
X10：G、X；および／または
X11：S、X；および／または
X12：Q、V、L、I、M；および／または
X13：Y、F、L、I、Q；および／または
X14：Y、F、R、Q、K；および／または
X15：L、I、V、Fである。
【００８５】
「hLC03」ヒト化配列は、元のキメラ配列と一部がヒト化された配列のどちらと比べても変化しているアミノ酸配列を含む好ましいアミノ酸配列を表わす。配列のこうした変化は、BCMA標的に結合する置換可能なアミノ酸の潜在的な変化を反映させつつ、有利な結合特性を維持することを意図している。置換の重要性は、主に、得られるアミノ酸に関係し、元のアミノ酸には関係しない。したがって変化は、元のキメラ配列やそれ以外のバリアントの対応するアミノ酸から起こる可能性もある。
【００８６】
例えば：
- LC（VL）配列のアミノ酸S31はS、H、T、N、D、Qである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸N32はN、E、Qである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸A34はA、G、V、S、T、L、Iである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸Y36はY、F、L、I、V、A、Gである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸Y49はY、F、Lである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸S50はS、Tである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸S52はS、T、D、N、H、E、Qである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸L53はL、V、I、Mである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸F55はF、L、I、V、Y、Mである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸G66はG、Xである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸S67はS、Xである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸Q89はQ、V、L、I、Mである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸Y91はY、F、L、I、Qである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸Y94はY、F、R、Q、Kである；および／または
- LC（VL）配列のアミノ酸L96はL、I、V、Fである。
【００８７】
一般に、ヒト化中に起こるCDR領域のあらゆる変化は、フレームワーク配列全体とは独立に考えるとき、CDR配列の1つの特徴と見なすこともできる。そのような改変されたCDR配列は、本明細書に記載したフレームワーク領域全体での文脈において、またはその文脈とは独立に、本発明の特徴を明確にしていると見なすことができる。例えばhLC01〜hLC03の中で下線によって示したCDR配列は、周囲の可変領域配列とは独立に本発明の1つの特徴を明確にしていると見なすことができる。
【００８８】
ヒト化LC配列の例：
hLC04（配列番号52）：
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELKR
【００８９】
アラインメント：
HC配列内のさまざまな置換位置のA CLUSTAL W（1.83）多重配列アラインメントにより、図14に示した適切な配列比較が提供される。「一般的な配列」は1つのHC配列を表わし、その中のそれぞれのXは、所与の任意のアミノ酸に対する潜在的なアミノ酸変化を表わす。好ましいアミノ酸置換は、潜在的な変異位置それぞれでの上に説明した置換である。
【００９０】
したがって本発明は、hHC01、および／またはhHC02、および／またはhHC03、および／またはhHC04、および／またはhHC05、および／またはhHC06、および／またはhHC07、および／またはhLC01、および／またはhLC02、および／またはhLC03、および／またはhLC04の配列、またはこれらの任意の組み合わせに関する。
【００９１】
潜在的な任意の代替残基（「一般的な」配列の中でXによって示す）に関して本明細書に提示した潜在的な改変の可能なあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。これらのさまざまな置換の1個以上を組み合わせることにより、本明細書に示した元々開発されていたキメラ抗体の望む結合特性を示すヒト化バリアントを生み出すことができる。本明細書に記載した抗体またはその一部には、明示的に開示したヒト化配列、または配列式を通じて開示したヒト化配列と配列が少なくとも80％、好ましくは90％一致する配列も含まれる。
【００９２】
本発明はさらに、X1VQLX2X3SGGGLVQPGGSLX4LSCAASGX5X6FX7X8YWZ1SWVRX9AP
GKGLEWX10GEINPZ2SSTINYAPSLKX11X12FX13ISRDNAKNTLYLQMX14X15X16RX17EDTAX18YYCASLYYDYGDAZ3DYWGQGTX19VTVSS（配列番号53）に従う配列を含むVHドメインを含んでいて、CD269（BCMA）の細胞外ドメインに特異的に結合する、本明細書に記載した抗体またはそのフラグメントに関する（ただしX1：Q、E；X2：Q、V；X3：Q、E；X4：K、R；X5：I、F；X6：D、T；X7：S、D；X8：R、D；X9：R、Q；X10：I、V；X11：D、G；X12：K、R；X13：I、T；X14：S、N；X15：K、S；X16：V、L；X17：S、A；X18：L、V；X19：S、Lであり；Z1の少なくとも1つは、I、F、L、V、Y. C、G、A、S、T、好ましくは IまたはFである；および／またはZ2：S、N、T、G、K、R、D、好ましくはSである 、および／またはZ3：Y、L、F、I、V、A、C、好ましくはYである）。
【００９３】
この実施態様は、本発明のCARに関するさまざまなヒト化配列、特にそのVH配列と、本明細書に記載したCDRの中で実施された有利なヒト化を特徴とするあらゆるバリアントを含んでいる。
【００９４】
本発明はさらに、DIVMTQSX1X2X3X4X5X6SVGDX7VX8X9TCKASQSVESNVAWYQQKPX10
QX11PKX12LIX13SX14X15LRFSGVPARFX16GSGSGTDFTLTISX17LQSEDX18AX19YX20CQQYNNYPLTFGAGTKLELKR（配列番号54）に従う配列を含むVLドメインを含んでいて、CD269（BCMA）の細胞外ドメインに特異的に結合する、本明細書に記載した抗体またはそのフラグメントに関する（ただしX1：Q、P；X2：R、A；X3：F、T；X4：M、L；X5：T、S；X6：T、V；X7：R、E；X8：S、T；X9：V、L；X10：R、G；X11：S、A；X12：A、L；X13：F、Y；X14：A、D；X15：S、D；X16：T、S；X17：N、S；X18：L、F；X19：E、V；X20：F、Y）。
【００９５】
この実施態様は、本発明のCARに関するさまざまなヒト化配列、特にそのVL配列と、本明細書に記載したCDRの中で実施された有利なヒト化を特徴とするあらゆるバリアントを含んでいる。
【００９６】
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドは、細胞外結合ドメインが、VHドメインとVLドメインの間に位置するリンカーポリペプチドを含んでいて、そのリンカーの選択が、好ましくは、Whitlowリンカー（配列番号13；GSTSGSGKPGSGEGSTKG）、Gly-Serリンカー（配列番号14；SSGGGGSGGGGSGGGGS）、配列番号13または14と配列が少なくとも80％一致するリンカーからなされることを特徴とする。
【００９７】
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドは、そのCARが、細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するスペーサポリペプチドを含んでいて、そのスペーサの選択が、好ましくは、
- IgG1-CD28 スペーサ（配列番号15；PAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPK
DTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKK）、
- IgG1Δ - 4-1BB スペーサ（配列番号16；PAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFP
PKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSSLSPGKK）、
- IgG4 (Hi-CH2-CH3) スペーサ（配列番号17；ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPP
KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK）、
- IgG4 (Hi-CH3) スペーサ（配列番号18；ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQE
EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK)、
- IgG4 (Hi) スペーサ（配列番号19；ESKYGPPCPPCP）、
- 配列番号15〜19のいずれか1つと配列が少なくとも80％一致するスペーサ
からなされることを特徴とする。
【００９８】
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドは、膜貫通ドメインの選択が、好ましくは、CD8αドメイン（配列番号20；IYIWAPLAGTCGVL
LLSLVITLYC）、CD28ドメイン（配列番号21；FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV）、配列番号20または21と配列が少なくとも80％一致する膜貫通ドメインからなされることを特徴とする。
【００９９】
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドは、細胞内ドメインが共刺激ドメインを含み、その共刺激ドメインの選択が、好ましくは、4-1BB共刺激ドメイン（配列番号22；KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGG
CEL）、CD28共刺激ドメイン（配列番号23；RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQ
PYAPPRDFAAYRS）、配列番号22または23と配列が少なくとも80％一致する共刺激ドメインからなされることを特徴とする。
【０１００】
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドは、シグナル伝達ドメインを含み、そのシグナル伝達ドメインが、好ましくは、CD3ζ（CD28または4-1BB）シグナル伝達ドメイン（配列番号24；LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLY
NELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR）、または配列番号24と配列が少なくとも80％一致するシグナル伝達ドメインから選択されることを特徴とする。
【０１０１】
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドは、そのCARが、4-1BB共刺激ドメイン（配列番号22）と、CD28共刺激ドメイン（配列番号23）と、CD3ζシグナル伝達／活性化ドメイン（配列番号24）を含むタンデム式共刺激ドメインを含むことを特徴とする。
【０１０２】
一実施態様では、本発明の単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドは、そのCARがリーダー配列を含み、そのリーダー配列の選択が、好ましくは、IgKリーダー（配列番号55；MDFQVQIFSFLLISASVIMSR）、GMCSFリーダー（配列番号56；MLLLVTSLLLCELPHPAFLLI）、配列番号55または56と配列が少なくとも80％一致するリーダー配列からなされることを特徴とする。
【０１０３】
本発明のさらに別の1つの側面は、
a）- 本明細書に記載した単離されたキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または
- 配列番号66および／または67、または配列番号86〜94に記載の配列を含むヌクレオチド配列
を含む核酸分子；
b）a）に記載のヌクレオチド配列と相補的な核酸分子；
c）a）またはb）に記載のヌクレオチド配列と機能が類似している／同等であるくらいに配列が十分に一致していて、好ましくはa）またはb）に記載のヌクレオチド配列と少なくとも80％一致するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
d）遺伝コードの帰結として縮重によりa）〜c）に記載のヌクレオチド配列になる核酸分子；
e）欠失、および／または付加、および／または置換、および／または転位、および／または逆転、および／または挿入によって変化しているが、a）〜d）に記載のヌクレオチド配列と機能的に類似している／同等である、a）〜d）に記載の核酸分子
からなるグループから選択される単離された核酸分子に関する。
【０１０４】
【表１−１】
2019527537.tif 000002
【表１−２】
2019527537.tif 000003
【表１−３】
2019527537.tif 000004
【表１−４】
2019527537.tif 000005
【表１−５】
2019527537.tif 000006
【表１−６】
2019527537.tif 000007
【０１０５】
【表２−１】
2019527537.tif 000008
【表２−２】
2019527537.tif 000009
【表２−３】
2019527537.tif 000010
【表２−４】
2019527537.tif 000011
【表２−５】
2019527537.tif 000012
【表２−６】
2019527537.tif 000013
【表２−７】
2019527537.tif 000014
【表２−８】
2019527537.tif 000015
【表２−９】
2019527537.tif 000016
【表２−１０】
2019527537.tif 000017
【０１０６】
本発明のさらに別の1つの側面は、本明細書に記載した核酸分子を含むベクターに関する。そのベクターはウイルスベクターが好ましく、γレトロウイルスベクターがより好ましい。
【０１０７】
本発明のさらに別の1つの側面は、本明細書に記載した核酸分子またはベクターを含む遺伝子改変された免疫細胞、および／または本明細書に記載したCARを発現する遺伝子改変された免疫細胞に関するものであり、その免疫細胞はTリンパ球とNK細胞からなるグループから選択されることが好ましく、細胞傷害性Tリンパ球であることがより好ましい。
【０１０８】
好ましい一実施態様では、本明細書に記載した核酸分子またはベクターを含む遺伝子改変された免疫細胞、および／または本明細書に記載したCARを発現する遺伝子改変された免疫細胞は、CD4+および／またはCD8+ T細胞（CD4+ T細胞とCD8+ T細胞の混合物が好ましい）であることを特徴とする。これらT細胞の集団、好ましくはCD4+形質変換細胞とCD8+形質変換細胞の両方を含む組成物は、さまざまな悪性B細胞（例えば多発性骨髄腫とB-NHL）に対して、好ましいことにこれらの細胞および／または本明細書に記載した関連する医学的障害に対して、特に効果的な細胞溶解活性を示す。
【０１０９】
好ましい一実施態様では、本明細書に記載した核酸分子またはベクターを含む遺伝子改変された免疫細胞、および／または本明細書に記載したCARを発現する遺伝子改変された免疫細胞は、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞が1：10〜10：1の比になったものであることが好ましく、5：1〜1：5、または2：1〜1：2、または1：1の比になったものであることがより好ましい。CARを発現していてBCMAに向かう改変されたCAR-T細胞を上記の比、好ましくはCD4+/ CD8+比を1：1で投与すると、本明細書で言及した疾患を治療している間に有利な性質につながる。例えばこれらの比にすると、治療反応が改善され、毒性が低下する。
【０１１０】
好ましい一実施態様では、本明細書で言及した疾患の治療で投与するための免疫細胞は、「眠れる美女」トランスポゾン系（特に眠れる美女トランスポザーゼ）を利用して、本明細書に記載した抗BCMA CARをコードしていて発現する本明細書に記載した核酸分子で遺伝子改変されている。眠れる美女トランスポゾン系は、免疫細胞を改変して本明細書に記載したCARを発現させることを目的とする本発明の文脈では、正確に決められたDNA配列を脊椎動物の染色体の中に導入するように設計された合成DNAトランスポゾンである。眠れる美女トランスポゾンは、ウイルスの利点と裸のDNAの利点を併せ持つ。ウイルスは、新たな宿主細胞に感染してその中で複製する能力に基づいて進化で選択されてきた。それと同時に、細胞は、自らをウイルス感染から保護するため主要な分子防御機構を進化させてきた。ウイルスの利用を回避することは、社会的な理由と調節上の理由でも重要である。したがって眠れる美女系などの非ウイルスベクターを利用すると、細胞がベクターに対して利用している防御のすべてではないにしても多くが回避される。このような理由で、眠れる美女系により、患者に投与するための免疫細胞を特に有効かつ安全に遺伝子改変することが可能になる。
【０１１１】
本発明のさらに別の1つの側面は、病原性B細胞の存在に関係する医学的障害（例えば形質細胞、および／または記憶B細胞、および／または成熟B細胞の疾患、特に多発性骨髄腫や非ホジキンリンパ腫）の治療で薬として使用するための、本明細書に記載した核酸分子またはベクターを含む、および／または本明細書に記載したCARを発現する、本明細書に記載した免疫細胞に関する。
【０１１２】
一実施態様では、免疫細胞の医学的利用は、治療する医学的障害が多発性骨髄腫であることを特徴とする。
【０１１３】
一実施態様では、免疫細胞の医学的利用は、治療する医学的障害が非ホジキンリンパ腫であることを特徴とする。
【０１１４】
一実施態様では、免疫細胞の医学的利用は、治療する医学的障害が病原性成熟B細胞に関連していることを特徴とする。発明者が知る限り、そのような成熟B細胞が本明細書に記載したBCMA CAR-Tの効果的な標的となりうることを教示する本分野における以前の開示は明らかではない。下記の実施例に示されている試験した腫瘍細胞系のいくつかは成熟B細胞に関係しているが、必ずしも記憶型ではない。それに対して未熟B細胞は、急性リンパ性白血病を引き起こすB細胞と考えられる。したがって本発明は、本明細書に開示した医学的障害を治療する方法も含んでおり、この方法は、CAR、または本発明のCARを含む治療剤の治療に有効な量を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含んでいる。
【０１１５】
本発明のさらに別の1つの側面は、CAR、または本明細書に記載したCARを含む治療剤を医薬として許容可能な基剤とともに含む医薬組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【０１１６】
多発性骨髄腫（形質細胞腫とも呼ばれる）は、悪性に転換した形質細胞クローンに由来する現在のところ不治のB細胞リンパ腫である。この疾患は、骨と骨髄で最も頻繁に見られる腫瘍で、余命の中央値が7年であり、がんによる年間死者数の2％を占める。悪性形質転換は、二次リンパ系器官の胚中心において、B細胞がVDJ再配列とアイソタイプスイッチを終えた発生段階で起こると考えられている。診断される中央値は70歳である。これは、多くの患者に併存疾患が存在していて、集中的で長期にわたる化学療法や放射線療法が不可能であることを示している。さらに、この患者コホートでは通常は同種骨髄移植が除外される。この疾患は、臨床的には、骨溶解損傷、高カルシウム血症、造血不全、アミロイド堆積、腎不全、重鎖および／または軽鎖の過剰な産生、超粘性、感染、出血障害を特徴とする。標準治療は、単独の化学療法であるか、自家幹細胞移植、免疫調節剤（例えば免疫調節薬（IMID））、局所的照射、プロテアソーム阻害剤と組み合わせた化学療法であり、少数の患者では同種幹細胞移植が実施される。上記の様式の集中的な治療にもかかわらず、この疾患は通常は再発し、多種類の治療の後に一次抵抗性と二次抵抗性が生じる。
【０１１７】
B細胞成熟抗原（BCMA）を標的とする本明細書に記載した養子キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞療法は、多発性骨髄腫におけるこうした制約を克服することができる。なぜならBCMAは、多発性骨髄腫腫瘍細胞で多く発現しているが、正常なB細胞や前駆B細胞では発現していないからである。第2に、B細胞非ホジキンリンパ腫（B-NHL）に対する抗CD19抗体療法または抗CD19 CAR-T細胞療法では、抗原が失われることが理由で抵抗性が生じる。B-NHLでは治療抵抗性が多数回の化学療法／免疫療法の後に生じるため、代わりの標的構造が保証される。成熟B-NHLでは、BCMAが適切な標的であるため、下に具体的に述べるように、B-NHLにおいてさえ、大きなアフィニティを持つ抗BCMA CAR-Tを治療に用いることができる。
【０１１８】
腫瘍関連抗原BCMAに対してBCMA CAR-T細胞の移植が選択され、高齢者に対してや、多剤抵抗性が出現した後でさえ適用可能であり、しかも有効である。この移植は、副作用が予測可能であり、忍容可能であり、管理可能である。抗BCMA CARを有する自家T細胞は大きなアフィニティとアビディティを持ち、多発性骨髄細胞を認識して破壊する一方で、正常な造血細胞（例えばT細胞、B細胞、これらの骨髄前駆体）は回避し、すべての骨髄細胞とNK細胞も同様に回避する。T細胞の自家移植であるため、移植片対宿主病は発生しえない。抗BCMA CAR-T細胞はアフィニティとアビディティが大きいことが理由でBCMAの発現が少ない成熟B細胞NHLでさえ認識することができるため、T細胞の活性化と腫瘍細胞の殺傷が可能になる。このような成熟B-NHLに含まれるのは、いくつかの段階の濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病である。
【０１１９】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載した抗BCMA CAR-T細胞を、他の治療法が適さない多発性骨髄腫とB-NHLの患者に適用することができる。より具体的には、i）多剤耐性を有する患者、および／またはii）同種幹細胞移植が適さない患者、および／またはiii）併存疾患が存在していてさらなる化学療法が不可能な患者、および／またはiv）化学療法に耐えられない高齢の患者、および／またはv）このCARは、疾患が進行して多数回の他の標準的な治療法が失敗した後でさえ、救済療法として適用できる、および／またはvi）このCARは、標的腫瘍細胞の表面の抗原密度が非常に小さくて抗体がうまくいかない可能性があっても適用できる、および／またはvii）ほぼ原子解像度でBCMAと複合体になる元の抗体の構造が、このCARのすばらしい特異性を証明しており、これは、生物学的に安全であるという、他の抗BCMA CAR-T細胞では見られない特徴である、および／またはviii）抗体には当てはまらない単独療法として適用できる。
【０１２０】
先行技術に記載されている他の抗BCMA CAR-T細胞については、その反応性は、多発性骨髄の細胞と患者で見られているだけである。逆に、われわれの抗BCMA CARは、BCMAの発現が少ないB-NHL細胞系に対してさえ予想外の大きな感度を有する。われわれの抗BCMA CARは、抗腫瘍効果に必要な極めて大きなアビディティをT細胞に与える。他のどの抗BCMA CARも、成熟B-NHL、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、特定の段階の濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病と反応することは報告されていない。本発明では、われわれの抗BCMA CARが、生理学的なB細胞、T細胞、NK細胞、内皮細胞、あらゆる骨髄腫細胞系とその前駆体に対してT細胞反応性を与えないことを明らかにする。したがって本発明は、他の造血組織の表面において、これまでになく小さな標的外反応性を有する。抗CD38 CAR-T細胞とは異なり、われわれの抗BCMA CARは、骨髄腫細胞前駆体に対する望ましくない反応性は持たない。
【０１２１】
以前にWO/2015/166073とWO/2014/068079に記載されているscFVフラグメントのアミノ酸配列を改変し、i）膜貫通受容体構造の文脈で折り畳みと発現が可能になるようにした；ii）軽鎖フラグメントと重鎖フラグメントの順序を逆転させた；iii）重鎖と軽鎖の間のリンカー配列を長くした。改変により、T細胞の表面での十分な発現が可能になる一方で、抗原の適切な結合は相変わらず維持される。
【０１２２】
元のFSY IgG（CAR-T細胞コンストラクトのscFv部分のための抗体鋳型）のアフィニティがナノモルと小さいことが理由で、本発明は、好ましい実施態様では、抗BCMA CARが予想外に大きなアフィニティを持ち、T細胞に対する極めて大きな特異性とアビディティを与えることを特徴とする。アフィニティとアビディティが大きいことで、CAR-T細胞は、表面でのBCMAの発現が多い、中程度の、少ない腫瘍標的細胞、i）を認識すること、ii）に対して活性化されること、iii）を殺すことが可能になる。先行技術の上記のどの抗BCMA CARも、多発性骨髄細胞以外のB-NHLに対する反応性は証明されていない。したがって本発明の抗BCMA CARは、BCMA分子が低レベル／少数であるこれまでになく多彩なB-NHLに対する特異的で活性が大きい試薬である。
【０１２３】
レトロウイルスベクター（MP71-ベクターが好ましい）およびγ-レトロウイルス発現系と組み合わせると、ヒトT細胞で並外れて大きな形質導入率を達成することができる。
【０１２４】
本発明の別の1つの明確な利点は、CARのscFvによって認識されるBCMAエピトープに関する詳細な知識である。これまで、抗体に基づく他の発明や刊行物では、BCMAエピトープは同定されていない。例えば本明細書に記載した抗BCMA CARは、実質的により大きな生物学的安全性プロファイルを示し、生体内およびインビトロで判明している標的外反応性がない。
【０１２５】
それに加え、発明者は、本発明のCARコンストラクトのシグナル伝達要素を簡単な3工程のクローニングで交換し、臨床に適用できる抗BCMA CARのモジュール式組成物を可能にした。
【０１２６】
インビトロ同時培養系では、本発明の抗BCMA CAR-T細胞は、BCMAを発現しているヒトB-NHL細胞系と多発性骨髄腫腫瘍細胞系に曝露されると活性化された状態になる。するとこれらT細胞は、IFN-γを高レベルで分泌するエフェクタ表現型を発達させる。これは、細胞傷害活性を予測させる表現型である。
【０１２７】
臨床前評価には、i）患者からの適切なB-NHL細胞系と一次骨髄腫細胞に対するインビトロ細胞傷害性試験と、ii）異種移植されたB-NHL細胞系と多発性骨髄腫細胞系に対する抗BCMA CAR活性の生体内試験が含まれる。
【０１２８】
ヒトの生体内という設定において、以下の特徴を持つ骨髄腫患者を、第1相臨床試験を通じて評価する。その患者とは、i）多剤耐性を有する患者、ii）同種幹細胞移植が適さない患者、iii）併存疾患が存在していてさらなる化学療法が不可能である患者、iv）化学療法に耐えられない高齢の患者、v）疾患が進行した後の救済療法のための患者、vi）多種類の他の標準的な療法が失敗した患者、vii）自家幹細胞移植の後に疾患が進行している患者、viii）同種幹細胞移植の後に疾患が進行している患者、ix）同種幹細胞移植の前のブリッジング療法として適用される患者である。
【０１２９】
さらに、ヒトの設定では、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫を持っていて以下の特徴があるB-NHL患者を、第1相臨床試験を通じて評価する。その患者とは、i）多剤耐性を有する患者、ii）同種幹細胞移植が適さない患者、iii）併存疾患が存在していてさらなる化学療法が不可能である患者、iv）化学療法に耐えられない高齢の患者、v）疾患が進行した後の救済療法のための患者と、多種類の他の標準的な療法が失敗した患者、vi）自家幹細胞移植の後に疾患が進行している患者、vii）同種幹細胞移植の後に疾患が進行している患者、viii）同種幹細胞移植の前のブリッジング療法として適用される患者、ix）腫瘍細胞の表面でCD19および／またはCD20のエスケープバリアントまたはエスケープ変異体を示すため、現在の抗体療法（抗CD20、リツキシマブ、抗CD19、オレツズマブ、BITE CD19/CD2、ブリマツモナブ）または抗CD19 CAR療法がその標的構造を喪失／下方調節し、無効になっている患者である。
【０１３０】
本発明の追加の驚くべき1つの側面は、本明細書に開示したCARの安定性が向上していることである。CARポリペプチドは、結合アフィニティをまったく失うことなく、適切な条件下で長期にわたって保管することが容易にできる。
【０１３１】
キメラ抗原受容体：
CARは、抗体に由来する細胞外ドメインと、T細胞シグナル伝達タンパク質に由来するシグナル伝達モジュールを含む細胞内ドメインとからなる。好ましい一実施態様では、細胞外ドメインは、単鎖可変フラグメント（scFv）として構成された免疫グロブリンの重鎖と軽鎖からの可変領域を含むことが好ましい。scFvは、可撓性を提供するとともに固定膜貫通部分を通じてシグナルを細胞内シグナル伝達部分に伝達するヒンジ領域に付着していることが好ましい。膜貫通ドメインは、CD8αまたはCD28に由来することが好ましい。第1世代のCARでは、シグナル伝達ドメインは、TCR複合体のζ鎖からなる。「世代」という用語は、細胞内シグナル伝達ドメインの構造を意味する。第2世代のCARは、CD28または4-1BBに由来する単一の共刺激ドメインを備えている。第3世代のCARは、2つの共刺激ドメイン（例えばCD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD3ζ）をすでに含んでいる。本発明は、第2世代または第3世代のCARに関係することが好ましい。
【０１３２】
さまざまな実施態様では、免疫エフェクタ細胞の細胞傷害性をB細胞にリダイレクトする遺伝子操作された受容体が提供される。遺伝子操作されたこれら受容体を本明細書ではキメラ抗原受容体（CAR）と呼ぶ。CARは、特異的抗BCMA細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成させるため、抗体に基づき望む抗原（例えばBCMA）に対して示す特異性に、T細胞受容体活性化細胞内ドメインが組み合わさった分子である。本明細書では、「キメラ」という用語は、出所が違う異なったタンパク質またはDNAの部分で構成されていることを記述している。
【０１３３】
本明細書で考察したCARは、BCMAに結合する細胞外ドメイン（結合ドメインまたは抗原結合ドメインとも呼ぶ）と、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる。CARの抗BCMA抗原結合ドメインが標的細胞の表面にあるBCMAに結合することによってCARがクラスター化し、活性化刺激をCAR含有細胞に送達する。CARの主要な特徴は、免疫エフェクタ細胞の特異性をリダイレクトする能力であり、そのことによって主要組織適合性（MHC）とは独立に、増殖や、サイトカイン産生や、ファゴサイトーシスや、標的抗原を発現している細胞の細胞死を媒介することのできる分子の産生を開始させ、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、細胞特異的共受容体が細胞特異的に標的に向かう能力を発揮させる。
【０１３４】
さまざまな実施態様では、CARは、ヒト化BCMA特異的結合ドメインを含む細胞外結合ドメインと；膜貫通ドメインと；1つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる。特別な実施態様では、CARは、ヒト化抗BCMA抗原結合フラグメントを含む細胞外結合ドメインと；1つ以上のスペーサドメインと；膜貫通ドメインと；1つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる。
【０１３５】
「細胞外抗原結合ドメイン」または「細胞外結合ドメイン」は交換可能に使用され、興味ある標的抗原であるBCMAに特異的に結合する能力を有するCARを提供する。結合ドメインは、天然供給源、合成供給源、半合成供給源、組み換え供給源のどれに由来してもよい。好ましいのはscFvドメインである。
【０１３６】
「特異的結合」は、当業者が理解しているように理解されるべきであり、この用語により、当業者は、結合と結合特異性を調べるのに利用できるさまざまな実験手続きを明確に認識する。平衡会合定数または平衡解離定数を求める方法は先行技術で知られている。多くのタンパク質-タンパク質相互作用ではいくらかの交差反応またはバックグラウンドの結合を避けられない可能性があるが、それがCARとエピトープの間の結合の「特異性」を損なうことはない。「特異的結合」は、抗BCMA抗体またはその抗原結合フラグメント（またはそれを含むCAR）が、バックグラウンドの結合よりも大きな結合アフィニティでBCMAに結合することを記述している。「に向かう」という表現は、抗体とエピトープの間の相互作用を理解するのに「特異性」という用語を考慮するときにも適用できる。
【０１３７】
「抗原（Ag）」は、動物の体内で抗体を産生させること、またはT細胞応答を刺激することのできる化合物、組成物、物質を意味する。特別な実施態様では、標的抗原は、BCMAポリペプチドのエピトープである。「エピトープ」は、抗原のうちで結合剤が結合する領域を意味する。エピトープは、タンパク質が折り畳まれた三次構造によって隣接している近接アミノ酸または非近接アミノ酸の両方から形成することができる。
【０１３８】
「単鎖Fv」抗体フラグメントまたは「scFv」抗体フラグメントは、抗体のVHドメインとVLドメインを含んでいて、これらドメインが単鎖ポリペプチドの中にいずれかの向き（例えばVL-VHまたはVH-VL）で存在している。一般に、scFvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインの間にさらにポリペプチドリンカーを含んでおり、そのことによってscFvは、抗原が結合する上で望ましい構造を形成することが可能になる。好ましい実施態様では、本明細書で考察したCARは、scFvという抗原特異的結合ドメインを含んでいる。scFvとして、マウスscFv、ヒトscFv、ヒト化scFvが可能である。単鎖抗体をクローニングすることにより、望む標的に特異的なハイブリドーマのV領域遺伝子を形成することができる。特別な実施態様では、抗原特異的結合ドメインは、ヒトBCMAポリペプチドに結合するヒト化scFvである。本明細書で考察した抗BCMA CARを構成するのに適した可変重鎖の非限定的な1つの実例に含まれるのは、配列番号11に示したアミノ酸配列である。本明細書で考察した抗BCMA CARを構成するのに適した可変軽鎖の非限定的な1つの実例に含まれるのは、配列番号12に示したアミノ酸配列である。
【０１３９】
抗体と抗体フラグメント：
CARは、B細胞成熟抗原（BCMA）ポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメントを含む細胞外抗原結合ドメインを含んでいる。したがって本発明の抗体または抗体フラグメントの非限定的な例に含まれるのは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖フラグメント（scFv）、一本鎖可変フラグメント（ssFv）、単ドメイン抗体（例えばナノボディからのVHHフラグメント）、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab発現ライブラリによって作製したフラグメント、抗イディオタイプ抗体、エピトープ結合フラグメント、またはこれらの任意の組み合わせであるが、本明細書に記載したCARと同様の結合特性を保持していることが条件であり、本明細書に記載したように対応するCDR、またはVH領域とVL領域を含んでいることが好ましい。ミニ抗体と多価抗体（例えば二価抗体、三価抗体、四価抗体、五価抗体）を本発明の方法で用いることもできる。本発明の免疫グロブリン分子として、任意のクラス（すなわちIgG、IgE、IgM、igD、IgA）またはサブクラスの免疫グロブリン分子が可能である。したがって本明細書では、抗体という用語に、抗体全体の改変によって作製するか、組み換えDNA法を利用して新たに合成した本発明のCARからなる抗体と抗体フラグメントも含まれる。
【０１４０】
本明細書では、「抗体」は、一般に、免疫グロブリン遺伝子またはその断片によって実質的にコードされている1つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。「抗体」という用語が使用されるとき、「抗体フラグメント」という用語も意味していると見なすことができる。知られている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、μ定常領域遺伝子と、数多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、εとして分類され、それが今度は免疫グロブリンのクラスIgG、IgM、IgA、IgD、IgEをそれぞれ規定する。免疫グロブリン（抗体）の基本的な構造単位は、四量体または二量体を含むことが知られている。それぞれの四量体は、同じ2つのポリペプチド鎖ペアからなり、各ペアは、1つの「軽」（L）鎖（約25 kD）と1つの「重」（H）鎖（約50〜70 kD）を有する。各鎖のN末端は、抗原の認識を主に担う約100〜110個またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。「可変軽鎖」と「可変重鎖」という用語は、それぞれ軽鎖と重鎖の可変領域を意味する。場合によっては、抗体、または抗体の免疫部分を他のタンパク質との融合タンパク質に化学的に共役させること、または他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。
【０１４１】
本発明のCARは、哺乳動物（特にヒト）のタンパク質標的に結合することが想定されている。用いるタンパク質の名称は、マウスまたはヒトのタンパク質に対応している可能性がある。
【０１４２】
本開示による結合ドメインポリペプチドとCARタンパク質のアフィニティは、従来からの技術を利用し、例えば標識したリガンドを用いた競合ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、結合会合アッセイ、置換アッセイによって、または表面プラズモン共鳴装置（例えばBiacore）を用いて容易に求めることができる。
【０１４３】
本発明の抗体の1つ以上のCDRを含むか、その抗体に由来する1つ以上のCDRを含むヒト化抗体は、本分野で知られている任意の方法を利用して作製することができる。例えば4つの一般的な工程を利用してモノクローナル抗体をヒト化することができる。その工程とは、（1）出発材料である抗体の軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインのヌクレオチドと予想アミノ酸配列を求める工程、（2）ヒト化抗体を設計する工程、すなわちヒト化プロセスでどの抗体フレームワーク領域を使用すべきか判断する工程、（3）実際にヒト化する方法／技術、（4）ヒト化抗体のトランスフェクションと発現である。例えばアメリカ合衆国特許第4,816,567号；第5,807,715号；第5,866,692号；第6,331,415号；第5,530,101号；第5,693,761号；第5,693,762号；第5,585,089号；第6,180,370号；第5,225,539号；第6,548,640号を参照されたい。
【０１４４】
ヒト化抗体という用語は、フレームワーク領域の少なくとも一部と、場合によっては免疫グロブリンの結合に関与するCDR領域または他の領域の一部が、ヒト免疫グロブリン配列に由来するか、ヒト免疫グロブリン配列に適合するようにされていることを意味する。マウスモノクローナル抗体のヒト化バージョン、またはキメラバージョン、または一部がヒト化されたバージョンは、H鎖またはL鎖をコードするマウスおよび／またはヒトのゲノムDNA配列から出発するか、H鎖またはL鎖をコードするcDNAから出発して、例えば組み換えDNA技術によって作製することができる（Queen他、1989年；WO 90/07861）。あるいは本発明の方法で用いるモノクローナル抗体として、ヒトモノクローナル抗体が可能である。ヒト抗体は、例えばファージ提示法（WO 91/17271；WO 92/01047）を利用して得ることができる。
【０１４５】
本明細書では、ヒト化抗体は、含まれる非ヒト免疫グロブリン由来の配列ができるだけ短い特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、そのフラグメント（例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2、抗体の他の抗原結合部分配列）という非ヒト（例えばマウス、ラクダ、ラマ、サメ）抗体の形態も意味する。
【０１４６】
本明細書では、ヒト抗体、ヒト抗体フラグメント、ヒト化抗体、ヒト化抗体フラグメントは、ヒトが産生した抗体、および／または先行技術で知られているか本明細書に開示した任意のヒト抗体作製技術を利用して作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体またはそのフラグメントは、競合結合実験その他により、特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を持つものを選択することができる。本発明のヒト化抗体は、驚くべきことに、マウス抗体の有用な機能特性をかなりの程度共有している。ヒトポリクローナル抗体は、免疫原で免疫化したヒトからの血清の形で提供することもできる。場合によっては、そのようなポリクローナル抗体は、アミロイド繊維状および／または非繊維状ポリペプチドまたはそのフラグメントをアフィニティ試薬として用いたアフィニティ精製によって濃縮することができる。モノクローナル抗体は、WO 99/60846に記載されている技術に従って血清から得ることができる。
【０１４７】
可変領域とCDR
抗体の可変領域は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域の一方だけ、または両方の組み合わせを意味する。重鎖と軽鎖の可変領域のそれぞれは、3つの相補性決定領域（CDR）（超可変領域としても知られる）によって接続された4つのフレームワーク領域（FR）からなる。それぞれの鎖の中のCDRはFRによって互いに近接して保持され、他の鎖からのCDRとで抗体の抗原結合部位を形成するのに寄与する。
【０１４８】
CDRの決定に利用できる技術は多数存在しており、例えば異種間配列可変性に基づくアプローチ（すなわちKabat他『Sequences of Proteins of Immunological Interest』（第5版、1991年、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州）；抗原-抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Al-lazikani他（1997年）J. Molec. Biol. 第273巻：927〜948ページ）がある。代わりのアプローチに、IMGT国際ImMunoGeneTics情報システム（Marie-Paule Lefranc）が含まれる。Kabatの定義は配列の可変性に基づいており、最も一般的に用いられている方法である。Chothiaの定義は構造的ループ領域の位置に基づいていて、AbMの定義はその2つの折衷であり、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウエアで使用されている（www.bioinf.org.uk： Andrew C.R. Martin博士のグループを参照されたい）。本明細書では、CDRは、1つ以上のアプローチ、またはこれらアプローチの組み合わせによって規定されるCDRを意味することができる。
【０１４９】
いくつかの実施態様では、本発明により、CARに組み込まれる抗体またはそのフラグメントとして、本発明の抗体の少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、またはそれ以上のCDRと実質的に同じ少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つ、またはそれ以上のCDRを含む抗体またはそのフラグメントが提供される。他の実施態様に含まれるのは、本発明の抗体の少なくとも2つ、または3つ、または4つ、または5つ、または6つのCDRと実質的に同じであるか、本発明の抗体の少なくとも2つ、または3つ、または4つ、または5つ、または6つのCDRに由来する少なくとも2つ、または3つ、または4つ、または5つ、または6つのCDRを持つ抗体である。いくつかの実施態様では、その少なくとも1つ、または2つ、または3つ、または4つ、または5つ、または6つのCDRは、本発明の抗体の少なくとも1つ、または2つ、または3つのCDRと少なくとも約70％、または75％、または85％、または86％、または87％、または88％、または89％、または90％、または95％、または96％、または97％、または98％、または99％一致している。本発明の目的のため、結合特異性および／または全体的活性が一般に保持されるが、活性の大きさはその抗体とは異なっている可能性（より大きい可能性、またはより小さい可能性）があることがわかる。
【０１５０】
CARの追加要素
いくつかの実施態様では、本明細書で考察したCARは、さまざまなドメインの間に、分子を適切な間隔とコンホメーションにするため付加したリンカー残基を含むことができる。それは例えば、VHドメインとVLドメインを接続するとともに2つのサブ結合ドメインの相互作用に適合したスペーサ機能を提供するアミノ酸配列を含むリンカーであるため、得られるポリペプチドは、同じ軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合アフィニティを保持している。本明細書で考察したCARは、1つ、または2つ、または3つ、または4つ、または5つ、またはそれ以上のリンカーを含むことができる。特別な実施態様では、リンカーの長さは、約1〜約25個のアミノ酸、または約5〜約20個のアミノ酸、または約10〜約20個のアミノ酸、またはこれらの間の任意の長さのアミノ酸である。
【０１５１】
リンカーの実例に含まれるのは、グリシンポリマー；グリシン-セリンポリマー；グリシン-アラニンポリマー；アラニン-セリンポリマー；本分野で知られている他の可撓性リンカー（例えばWhitlowリンカー）である。グリシンポリマーとグリシン-セリンポリマーは比較的構造化されていないため、融合タンパク質（例えば本明細書に記載したCAR）のドメイン間の中性のつなぎ紐として役立つ可能性がある。
【０１５２】
特別な実施態様では、CARの結合ドメインの後に、エフェクタ細胞表面から抗原結合ドメインを離して適切な細胞／細胞接触、抗原結合、活性化を可能にする領域である1つ以上の「スペーサ」または「スペーサポリペプチド」が続く。いくつかの実施態様では、スペーサドメインは免疫グロブリンの一部であり、その部分には例えば1つ以上の重鎖定常領域（例えばCH2とCH3）が含まれるが、含まれるのがそれに限定されることはない。スペーサドメインは、天然の免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ酸配列、または変化した免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。一実施態様では、スペーサドメインは、IgG1またはIgG4のCH2ドメインとCH3ドメインを含んでいる。
【０１５３】
CARの結合ドメインの後には、いくつかの実施態様では、抗原結合ドメインをエフェクタ細胞の表面から離した位置にして適切な細胞／細胞接触、抗原結合、活性化を可能にする役割を果たす1つ以上の「ヒンジドメイン」を続けることができる。CARは、結合ドメインと膜貫通ドメイン（TM）の間に1つ以上のヒンジドメインを含むことができる。ヒンジドメインは、天然の供給源、合成供給源、半合成供給源、組み換え供給源のどれに由来してもよい。ヒンジドメインは、天然の免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ酸配列、または変化した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。本明細書に記載したCARで用いるのに適したヒンジドメインの実例に含まれるのは、1型膜タンパク質（CD8α、CD4、CD28、PD1、CD152、CD7）の細胞外領域に由来するヒンジ領域である。ヒンジ領域は、これら分子からの野生型ヒンジ領域であっても、変化していてもよい。別の一実施態様では、ヒンジドメインは、PD1ヒンジ領域、CD152ヒンジ領域、CD8αヒンジ領域のいずれかを含んでいる。
【０１５４】
「膜貫通ドメイン」は、CARのうちで細胞外結合部分と細胞内シグナル伝達ドメインを融合させている部分であり、CARを免疫エフェクタ細胞の細胞膜に係留する。膜貫通ドメインは、天然の供給源、合成供給源、半合成供給源、組み換え供給源のどれに由来してもよい。膜貫通ドメインは、T細胞受容体のα鎖、β鎖、ζ鎖に由来するものや、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、PD1に由来するものが可能である。一実施態様では、本明細書で考察したCARは、CD8αまたはCD28に由来する膜貫通ドメインを含んでいる。
【０１５５】
特別な実施態様では、本明細書で考察したCARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、CARのうちで、抗BCMA CARがヒトBCMAポリペプチドにうまく結合したというメッセージを免疫エフェクタ細胞の内部に伝達してエフェクタ細胞の機能（例えば活性化、サイトカイン産生、増殖、細胞傷害活性であり、その中には、CARが結合した標的細胞への細胞傷害因子の放出や、抗原が細胞外CARドメインに結合することによって誘導される他の細胞応答が含まれる）を誘導するのに関与する部分を意味する。「エフェクタ機能」という用語は、免疫エフェクタ細胞の特殊化された機能を意味する。T細胞のエフェクタ機能として、例えば細胞溶解活動や、サイトカインの分泌などの援助または活動が可能である。したがって「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、タンパク質のうちで、エフェクタ機能シグナルを伝達し、細胞が特殊化された機能を実施するよう指示する部分を意味する。
【０１５６】
本明細書で考察したCARは、CAR受容体を発現するT細胞の効率、および／または増殖、および／または記憶形成を増大させる1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含んでいる。本明細書では、「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを意味する。共刺激分子は、抗原に結合してTリンパ球の効率的な活性化と機能に必要な第2のシグナルを提供する細胞表面分子で、抗原受容体やFc受容体を除くものである。
【０１５７】
ポリペプチド
「ペプチド」、「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「タンパク質」は、特に断わらない限り交換可能に用いられ、通常の意味で、すなわちアミノ酸の配列として用いられる。ポリペプチドが特定の長さに限定されることはなく、例えば完全長タンパク質配列を含むことや、完全長タンパク質の断片を含むことが可能であり、ポリペプチドの翻訳後修飾（例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など）や、本分野で知られている他の修飾が含まれていてもよい（天然の修飾と非天然の修飾の両方が可能である）。
【０１５８】
さまざまな実施態様では、本明細書で考察したCARポリペプチドは、タンパク質のN末端に位置するシグナル（またはリーダー）配列を含んでいて、タンパク質の輸送を翻訳と同時に、または翻訳後に指示する。ポリペプチドは、周知の多彩な組み換え技術および／または合成技術のうちの任意のものを利用して調製することができる。本明細書で考察したポリペプチドには特に、本開示のCARや、本明細書に開示したCARに1個以上のアミノ酸の欠失、および／または付加、および／または置換を有する配列が含まれる。
【０１５９】
本明細書では、「単離されたペプチド」や「単離されたポリペプチド」などは、インビトロで細胞環境から単離および／または精製されたペプチド分子またはポリペプチド分子と、細胞の他の成分と会合した状態から単離および／または精製されたペプチド分子またはポリペプチド分子を意味する。すなわちこのペプチドまたはポリペプチドは、生体内物質と顕著には会合していない。同様に、「単離された細胞」は、生体内の組織または器官から得られて実質的に細胞外マトリックスを含まない細胞を意味する。
【０１６０】
核酸
本明細書では、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、メッセンジャーRNA（mRNA）、RNA、ゲノムRNA（gRNA）、プラス鎖RNA（RNA(+)）、マイナス鎖RNA（RNA(-)）、ゲノムDNA（gDNA）、相補的DNA（cDNA）、組み換えDNAのいずれかを意味する。ポリヌクレオチドには一本鎖ポリヌクレオチドと二本鎖ポリヌクレオチドが含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、本明細書に記載した任意の参照配列と配列が少なくとも約50％、または55％、または60％、または65％、または70％、または75％、または80％、または85％、または90％、または95％、または96％、または97％、または98％、または99％、または100％一致したポリヌクレオチドまたはバリアントが含まれることが好ましく、典型的にはそのバリアントは、参照配列の少なくとも1つの生物活性を維持している。例を示すさまざまな実施例では、本発明の一部において、発現ベクター、ウイルスベクター、輸送プラスミドを含むポリヌクレオチドと、組成物と、これらを含む細胞を考慮する。
【０１６１】
ポリヌクレオチドは、本分野で知られていて利用可能なよく確立された多彩な技術のうちの任意のものを利用して調製すること、および／または操作すること、および／または発現させることができる。望むポリペプチドを発現させるため、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することができる。ベクターの例は、プラスミド、自律的に複製する配列、転写可能なエレメントである。ベクターの追加例の非限定的な例に含まれるのは、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体（例えば酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、PI由来人工染色体（PAC））、バクテリオファージ（例えばλファージ、MI 3ファージ）、動物ウイルスである。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの非限定的な例に含まれるのは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えばSV40）である。発現ベクターの例は、哺乳動物の細胞で発現させるためのpClneoベクター（Promega社）；レンチウイルスを媒介として哺乳動物の細胞に遺伝子を導入して発現させるためのpLenti4/V5-DEST（商標）、pLenti6/V5-DEST（商標）、pLenti6.2/V5-GW/lacZ（Invitrogen社）である。特別な実施態様では、本明細書に開示したキメラタンパク質のコード配列をそのような発現ベクターに連結し、哺乳動物の細胞の中でそのキメラタンパク質を発現させることができる。発現ベクターの中に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、そのベクターの非翻訳領域（複製起点、選択カセット、プロモータ、エンハンサ、翻訳開始シグナル（ダルガノ配列またはコザック配列）イントロン、ポリアデニル化配列、5'非翻訳領域、3'非翻訳領域）であり、それが宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写と翻訳を実行する。そのようなエレメントは長さと特異性が異なる可能性がある。用いるベクター系と宿主に応じ、任意の数の適切な転写エレメントと翻訳エレメント（普遍的プロモータと誘導プロモータが含まれる）を用いることができる。
【０１６２】
ベクター
特別な実施態様では、CARをコードするレトロウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）を用いて細胞（例えば免疫エフェクタ細胞（T細胞など））に形質導入する。例えば、BCMAポリペプチドに結合するヒト化抗BCMA抗体または抗原結合フラグメントを含んでいて膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを有するCARをコードするベクターを用いて免疫エフェクタ細胞に形質導入すると、形質導入されたこれら細胞がCARを媒介とした細胞傷害応答を誘導することができる。
【０１６３】
レトロウイルスは、遺伝子送達のための一般的なツールである。特別な実施態様では、レトロウイルスを用い、キメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達する。本明細書では、「レトロウイルス」という用語は、自身のゲノムRNAを逆転写して直線状の二本鎖DNAコピーにし、その後そのゲノムDNAを宿主のゲノムと共有結合によって一体化するRNAウイルスを意味する。ウイルスは、宿主のゲノムと一体化すると、「プロウイルス」と呼ばれる。プロウイルスはRNAポリメラーゼIIの鋳型として機能し、新たなウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質と酵素をコードするRNA分子の発現を指示する。
【０１６４】
特別な実施態様で用いるための適切なレトロウイルスの非限定的な実例に含まれるのは、モロニーマウス白血病ウイルス（M-MuLV）、モロニーマウス肉腫ウイルス（MoMSV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳房腫瘍ウイルス（MuMTV）、ギボン白血病ウイルス（GaLV）、ネコ白血病ウイルス（FLV）、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、レンチウイルスである。
【０１６５】
本明細書では、「レンチウイルス」という用語は、一群（または1つの属）のさまざまなレトロウイルスを意味する。レンチウイルスの非限定的な実例に含まれるのは、HIV（ヒト免疫不全ウイルス；1型HIVと2型HIVが含まれる）、ビスナ-マエディウイルス（VMV）；ヤギ関節炎-脳炎ウイルス（CAEV）；ウマ感染性貧血ウイルス（EIAV）；ネコ免疫不全ウイルス（FIV）；ウシ免疫不全ウイルス（BIV）；サル免疫不全ウイルス（SIV）である。 一実施態様では、HIVに基づくベクター骨格（すなわちHIV シス作用配列エレメント）が好ましい。特別な実施態様では、レンチウイルスを用いてCARを含むポリヌクレオチドを細胞に送達する。
【０１６６】
本明細書では、「ベクター」という用語は、別の核酸分子を導入または輸送することのできる核酸分子を意味する。導入された核酸は、一般に、ベクターの核酸分子に連結される（例えば挿入される）。ベクターは、細胞内での自律複製を指示する配列を含むこと、または宿主細胞のDNAとの一体化を可能にするのに十分な配列を含むことができる。有用なベクターに含まれるのは、例えば、プラスミド（例えばDNAプラスミドまたはRNAプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、ウイルスベクターである。有用なウイルスベクターに含まれるのは、例えば複製欠陥レトロウイルスと複製欠陥レンチウイルスである。
【０１６７】
当業者には明らかなように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には細胞のゲノムへの核酸分子の導入または一体化を容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば輸送プラスミド）の意味で、または核酸の導入を媒介するウイルス粒子の意味で広く用いられている。ウイルス粒子は、典型的にはさまざまなウイルス成分を含んでおり、ときには核酸に加えて宿主細胞の成分も含んでいる。
【０１６８】
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞に導入することのできるウイルスまたはウイルス粒子、または導入された核酸そのものを意味することができる。ウイルスベクターと導入プラスミドは、ウイルスに主に由来する構造的および／または機能的遺伝因子を含んでいる。「レトロウイルスベクター」という用語は、レトロウイルスに主に由来する構造的遺伝因子と機能的遺伝因子、またはその一部を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを意味する。
【０１６９】
したがって好ましい一実施態様では、本発明は、CARをコードする発現ベクターを細胞にトランスフェクトする方法に関する。例えばいくつかの実施態様では、ベクターは、追加配列（例えばCARの発現を容易にする配列、例えばプロモータ、および／またはエンハンサ、および／またはポリ-Aシグナル、および／または1つ以上のイントロン）を含んでいる。好ましい実施態様では、CARをコードする配列にはトランスポゾン配列が隣接しているため、トランスポザーゼの存在により、トランスフェクトされた細胞のゲノムにそのコード配列を一体化することが可能になる。
【０１７０】
いくつかの実施態様では、遺伝子変換された細胞に、トランスフェクトされた細胞のゲノムへのCARコード配列の一体化を容易にするトランスポザーゼをさらにトランスフェクトする。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼはDNA発現ベクターとして提供される。しかし好ましい実施態様では、トランスポザーゼは、トランスジェニック細胞の中でトランスポザーゼの長期発現が起こらない発現可能なRNAまたはタンパク質として提供される。例えばいくつかの実施態様では、トランスポザーゼはmRNA（例えばキャップとポリ-Aテイルを含むmRNA）として提供される。任意のトランスポザーゼ系を本発明の実施態様で用いることができる。しかしいくつかの実施態様では、トランスポザーゼはサルモニド型のTel様トランスポザーゼ（SB）である。例えばトランスポザーゼとしていわゆる「眠れる美女」トランスポザーゼが可能である。例えばアメリカ合衆国特許第6,489,458号を参照されたい（本明細書に参照によって組み込まれている）。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼは、増大した酵素活性を有する操作された酵素である。トランスポザーゼの非限定的ないくつかの具体例に含まれるのは、SB 10トランスポザーゼ、SB 11トランスポザーゼ、SB 100Xトランスポザーゼである（例えばMates他、2009年、Nat Genet. 第41巻(6)：753〜761ページ、またはアメリカ合衆国特許第9228180号を参照されたい（本明細書に参照によって組み込まれている））。例えば1つの方法は、SB 10トランスポザーゼ、SB 11トランスポザーゼ、SB 100XトランスポザーゼのいずれかをコードするmRNAを細胞に電気穿孔することを含むことができる。
【０１７１】
配列バリアント：
本発明の核酸、および／またはタンパク質、および／または抗体、および／または抗体フラグメント、および／またはCARの配列バリアント（例えば％配列一致によって規定される配列バリアント）で本発明の結合特性と同様の結合特性を維持しているものも本発明の範囲に含まれる。提示した具体的な配列とは配列が異なるが実質的に同じ結合特性（例えば標的特異性）を維持しているそのようなバリアントは、機能類似体、または機能類似として知られている。配列一致は、配列のアラインメントを実施したときにヌクレオチドまたはアミノ酸が一致する割合に関する。
【０１７２】
本明細書では、「配列一致」は、配列が比較ウインドウ上でヌクレオチドごとに、またはアミノ酸ごとに一致する程度を意味する。したがって「配列一致の割合」は、比較ウインドウ上で最適なアラインメントにした2つの配列を比較し、両方の配列で核酸塩基（例えばA、T、G、C、I）、またはアミノ酸残基（例えばAla、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、Met）が一致する位置の数を決定して一致した数を取得し、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の合計数（すなわちウインドウのサイズ）で割り、その結果に100を掛けて配列一致の割合を得ることによって計算できる。含まれるのは、本明細書に記載した任意の参照配列と配列が少なくとも約50％、または55％、または60％、または65％、または70％、または75％、または80％、または85％、または90％、または95％、または96％、または97％、または98％、または99％、または100％一致するヌクレオチドとポリペプチドであり、典型的にはそのポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも1つの生物活性を維持している。
【０１７３】
遺伝コードが縮重している結果として、本明細書に記載したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は多数存在することが当業者にはわかるであろう。それらポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然状態の遺伝子のヌクレオチド配列との相同性または配列一致が最少である。しかしコドンの利用の違いが原因で異なるポリヌクレオチドを本発明では特に考慮する。配列内の欠失、置換や、それ以外の変化のうちで、ここに記載した配列一致に該当するものも本発明に含まれる。
【０１７４】
置換を通じて生じる可能性のあるタンパク質配列の変化も本発明の範囲に含まれる。本明細書で定義する置換は、タンパク質のアミノ酸配列に対してなされる変化であり、それによって1個以上のアミノ酸が同数の（異なる）アミノ酸で置換され、最初のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を生じさせる。置換を実施してもタンパク質の機能が顕著に変化しないようにできることが好ましい。付加と同様、置換も天然の置換と人工的な置換が可能である。本分野では、アミノ酸置換を実施してもタンパク質の機能が顕著に変化しないようにできることは周知である。それは特に、変化が、1個のアミノ酸が似た特性の別のアミノ酸で置換される「保存的」アミノ酸置換に関係するときに当てはまる。そのような「保存された」アミノ酸として、サイズ、電荷、極性、コンホメーションに基づきタンパク質の構造と機能に顕著な影響を与えることなく置き換えることのできる天然アミノ酸または人工アミノ酸が可能である。タンパク質の機能に悪影響を及ぼすことなく多くのアミノ酸を保存的アミノ酸で置き換えうることがしばしばある。
【０１７５】
一般に、非極性アミノ酸Gly、Ala、Val、Ile、Leu；非極性芳香族アミノ酸Phe、Trp、Tyr；中性極性アミノ酸Ser、Thr、Cys、Gln、Asn、Met；正に帯電しているアミノ酸Lys、Arg、His；負に帯電しているアミノ酸Asp、Gluが、保存的アミノ酸のグループを表わす。このリストは網羅的ではない。例えばAla、Gly、Serと、ときにはCysは、異なるグループに属しているにもかかわらず互いに置き換わることができる。
【０１７６】
置換バリアントでは、抗体分子内の少なくとも1個のアミノ酸残基が除去されていて、その場所に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発にとって最も興味深い部位には超可変領域が含まれるが、FRの変化も考慮される。そのような置換によって生物活性が変化する場合には、より実質的な変化（すぐ下に示す表で「置換例」と表記した変化、またはアミノ酸のクラスを参照して以下により詳しく説明する変化）を導入して生成物をスクリーニングすることができる。
【０１７７】
【表３】
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【０１７８】
抗体の生物学的特性の実質的な変化は、（a）置換の領域内のポリペプチド骨格の構造（例えばシートまたは螺旋コンホメーション）、（b）標的部位における分子の電荷または疎水性、（c）側鎖の大きさを維持することに対する効果が顕著に異なる置換を選択することによって実現される。
【０１７９】
保存的アミノ酸置換が天然のアミノ酸に限定されることはなく、合成アミノ酸も含まれる。一般に用いられている合成アミノ酸は、さまざまな長さの鎖を持つωアミノ酸と、中性非極性類似体であるシクロヘキシルアラニン；中性非極性類似体であるシトルリンとメチオニンスルホキシド；芳香族中性類似体であるフェニルグリシン；負に帯電した類似体であるシステイン酸；正に帯電した類似体であるオルニチンである。天然アミノ酸と同様、このリストは網羅的ではなく、本分野でよく知られている置換の単なる例示である。
【０１８０】
遺伝子改変された細胞と免疫細胞
本発明では、特別な実施態様において、B細胞関連疾患の治療で使用するため本明細書で考察したCARを発現するように遺伝子改変された細胞を考慮する。本明細書では、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という表現は、細胞内の全遺伝材料の中に追加の遺伝材料をDNAまたはRNAの形態で付加することを意味する。「遺伝子改変された細胞」と、「改変された細胞」、「リダイレクト細胞」という表現は交換可能に用いられる。本明細書では、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子の発現を回復させる、または正しくする、または変化させるため、または治療用ポリペプチド（例えばCAR）を発現させるため、追加の遺伝材料をDNAまたはRNAの形態で細胞内の全遺伝材料の中に導入することを意味する。特別な実施態様では、本明細書で考察したCARは免疫エフェクタ細胞に導入されて発現し、その特異性を興味ある標的抗原（例えばBCMAポリペプチド）にリダイレクトする。
【０１８１】
「免疫細胞」または「免疫エフェクタ細胞」は、1つ以上のエフェクタ機能（例えば細胞傷害性細胞の殺傷活性、サイトカインの分泌、ADCCおよび／またはCDCの誘導）を持つ、免疫系の中のあらゆる細胞である。
【０１８２】
本発明の免疫エフェクタ細胞として、自家／（「自己」）または非自家（「非自己」、例えば同種、同系、異種）のものが可能である。本明細書では、「自家」は、同じ対象からの細胞を意味し、本発明の好ましい一実施態様である。本明細書では、「同種」は、同じ種に由来するが、比較する細胞と遺伝的に異なっている細胞を意味する。本明細書では、「同系」は、異なる対象に由来するが、比較する細胞と遺伝的に同じ細胞を意味する。本明細書では、「異種」は、比較する細胞とは異なる種の細胞を意味する。好ましい実施態様では、本発明の細胞は自家または同種である。
【０１８３】
本明細書で考察したCARとともに用いられる免疫エフェクタ細胞の実例にTリンパ球が含まれる。「T細胞」または「Tリンパ球」という用語は本分野で知られており、胸腺細胞、未熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、休止Tリンパ球、サイトカイン誘導キラー細胞（CIK細胞）、活性化Tリンパ球を含むことが想定されている。サイトカイン誘導キラー細胞（CIK細胞）は、典型的にはCD3陽性かつCD56陽性の非腫瘍組織的合成複合体（MHC）制限ナチュラルキラー（NK）様Tリンパ球である。T細胞として、Tヘルパー（Th）細胞（例えばTヘルパー1（Th1）細胞またはTヘルパー2（Th2）細胞）が可能である。そのT細胞として、ヘルパーT細胞（HTL；CD4+ T細胞）、細胞傷害性T 細胞（CTL；CD8+ T細胞）、CD4+CD8+ T細胞、CD4 CD8 T細胞や、T細胞の他の任意のサブセットが可能である。特別な実施態様で用いるのに適したT細胞の他の集団の実例に含まれるのは、ナイーブT細胞と記憶T細胞である。
【０１８４】
例えば本明細書に記載した本発明のCARを用いて改変されたT細胞は、自家細胞移植後に患者に再導入するとき、腫瘍細胞を認識して殺すことができる。CIK細胞は、他のT細胞と比べて大きな細胞傷害活性を持つため、本発明の免疫細胞の好ましい一実施態様である。
【０１８５】
当業者であれば理解できるように、他の細胞も本明細書に記載したCARを有する免疫エフェクタ細胞として用いることができる。特に、免疫エフェクタ細胞には、NK細胞、NKT細胞、好中球、マクロファージも含まれる。免疫エフェクタ細胞には、エフェクタ細胞の前駆細胞も含まれ、生体内またはインビトロでそのような前駆細胞を誘導して免疫エフェクタ細胞へと分化させることができる。
【０１８６】
本発明により、本明細書で考察したCARを発現する免疫エフェクタ細胞を作製する方法が提供される。一実施態様では、この方法は、個人から単離された免疫エフェクタ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することにより、その免疫エフェクタ細胞に本明細書に記載した1つ以上のCARを発現させることを含んでいる。いくつかの実施態様では、免疫エフェクタ細胞は個人から単離された後、インビトロでさらに操作することなく遺伝子改変される。その後、そのような細胞は、個人に直接再投与することができる。さらに別の実施態様では、インビトロで免疫エフェクタ細胞を最初に活性化させ、刺激して増殖させた後、CARを発現するように遺伝子を改変する。この点に関し、免疫エフェクタ細胞は、遺伝子改変（すなわち本明細書で考察したCARを発現させるための形質導入またはトランスフェクション）の前および／または後に培養することができる。
【０１８７】
特別な実施態様では、本明細書に記載した免疫エフェクタ細胞をインビトロで操作または遺伝子改変する前に、細胞の供給源を対象から取得する。特別な実施態様では、CARで改変された免疫エフェクタ細胞は、T細胞を含んでいる。T細胞は、多数の供給源から得ることができ、供給源の非限定的な例に含まれるのは、末梢血単球細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍である。いくつかの実施態様では、T細胞は、対象から回収した一定量の血液から、当業者に知られている多数の技術（例えば沈降（例えばFICOLL（商標）分離）、抗体が共役したビーズに基づく方法（例えばMACS（商標）分離（Miltenyi社）））のうちの任意の技術を利用して得ることができる。一実施態様では、個人の循環している血液からの細胞をアフェレーシスによって取得する。アフェレーシス生成物は、典型的にはリンパ球（その中にはT細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、血小板が含まれる）を含んでいる。一実施態様では、アフェレーシスによって回収した細胞を洗浄して血漿分画を除去し、その後の処理のため適切な緩衝液または媒体の中に細胞を入れることができる。細胞は、PBSで洗浄するか、カルシウムを含まず、マグネシウムを含まず、すべてではないにしても大半の2価カチオンを含まない他の適切な溶液で洗浄することができる。当業者であればわかるように、洗浄工程は、本分野で知られている方法（例えば半自動化したフロースルー遠心分離）によって実現することができる。例えばCobe 2991細胞プロセッサ、Baxter CytoMateなど。洗浄後、細胞を多彩な生体適合緩衝液や、緩衝液を含む他の生理食塩水、緩衝液を含まない他の生理食塩水に再懸濁させることができる。いくつかの実施態様では、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を、細胞を直接再懸濁させた培地から除去することができる。
【０１８８】
いくつかの実施態様では、T細胞は、末梢血単球細胞（PBMC）から、赤血球細胞を溶解させ、例えばPERCOLL（商標）勾配を通じた遠心分離で単球を激減させることによって単離される。正の選択技術または負の選択技術によってT細胞の特定の下位集団をさらに単離することができる。本明細書で用いる1つの方法は、負の磁性免疫粘着を通じた細胞ソーティングおよび／または選択、または負の選択をされた細胞の表面に存在する細胞表面マーカーに向かうモノクローナル抗体のカクテルを用いたフローサイトメトリーである。
【０１８９】
本明細書で考察した方法を利用してPBMCを直接遺伝子改変し、CARを発現させることができる。いくつかの実施態様では、PBMCを単離した後、Tリンパ球をさらに単離し、いくつかの実施態様では、遺伝子改変および／または増殖の前または後に、細胞傷害性Tリンパ球とヘルパーTリンパ球の両方をナイーブT細胞、記憶T細胞、エフェクタT細胞という下位集団に分類することができる。CD8+細胞は標準的な方法を用いて得ることができる。いくつかの実施態様では、CD8+細胞をさらにナイーブ細胞、セントラル記憶細胞、エフェクタ細胞に分類することが、これらのタイプのCD8+細胞それぞれに関係する細胞表面抗原を同定することによってなされる。
【０１９０】
免疫エフェクタ細胞（例えばT細胞）を単離した後に既知の方法を利用して遺伝子改変すること、または免疫エフェクタ細胞をインビトロで活性化させて増殖（または前駆細胞の場合には分化）させた後に遺伝子改変することができる。特別な一実施態様では、本明細書で考察したキメラ抗原受容体を用いて（例えばCARをコードする核酸を含むウイルスベクターを用いて形質導入した）免疫エフェクタ細胞（例えばT細胞）を遺伝子改変した後、インビトロで活性化させて増殖させる。さまざまな実施態様では、CARを発現させるため遺伝子改変する前または後にT細胞を活性化させて増殖させることが、例えばアメリカ合衆国特許第6,352,694；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号と、アメリカ合衆国特許出願公開第20060121005号に記載されている方法を利用することによって可能になる。
【０１９１】
さらに別の一実施態様では、例えば1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の異なる発現ベクター（ただし各ベクターは、本明細書で考察した異なるキメラ抗原受容体タンパク質をコードしている）の混合物を用いてドナーからの免疫エフェクタ細胞の集団を遺伝子改変することができる。得られる改変された免疫エフェクタ細胞は、改変された細胞が混合した集団を形成し、その集団には、2つ以上の異なるCARタンパク質を発現する改変された細胞がある割合で含まれている。
【０１９２】
一実施態様では、本発明により、遺伝子改変されたマウスCARタンパク質、またはヒトCARタンパク質、またはヒト化CARタンパク質を発現していてBMCAタンパク質を標的とする免疫エフェクタ細胞を保管する方法として、細胞が凍結時に生きたままの状態に留まるよう、その免疫エフェクタ細胞を凍結保存することを含む方法が提供される。CARタンパク質を発現する免疫エフェクタ細胞の一部を本分野で知られている方法で凍結保存することで、B細胞関連疾患に冒された患者を将来治療するためのそのような細胞の永久的な供給源を提供することができる。形質転換された免疫エフェクタ細胞を凍結保存したものを必要なときに解凍し、増殖させ、体積を増やすことで、そのような細胞をより多くすることができる。
【０１９３】
組成物と製剤
【０１９４】
本明細書で考察した組成物は、本明細書で考察した1つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞などを含むことができる。組成物には医薬組成物が含まれるが、それに限定されない。「医薬組成物」は、細胞または動物に単独で投与するか、1つ以上の他の治療様式と組み合わせて投与するため、医薬として許容可能な溶液または生理学的に許容可能な溶液の形にされた組成物を意味する。望むのであれば、本発明の組成物は、他の薬剤のほか、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬、抗体や、医薬として活性な他のさまざまな薬剤などと組み合わせて投与することができることも理解されよう。組成物に含めることのできる他の成分に実質的に制限はないが、追加する薬剤が、想定する治療をその組成物が実現する能力に悪影響を及ぼさないという条件が満たされる必要がある。
【０１９５】
「医薬として許容可能な」という表現は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内でヒトと動物の組織に接触させて用いるのに適していて、過度な毒性、刺激、アレルギー反応や、他の問題または合併症がなく、合理的な便益／リスク比である化合物、および／または材料、および／または組成物、および／または剤形を意味する。
【０１９６】
本明細書では、「医薬として許容可能な基剤、希釈剤、賦形剤」の非限定的な例に含まれるのは、アメリカ合衆国食品・医薬品局によってヒトと家畜での使用を許容できるとして認可されている任意のアジュバント、基剤、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、染料／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、乳化剤である。医薬として許容可能な基剤の非限定的な例に含まれるのは、糖（例えばラクトース、グルコース、スクロース）；デンプン（例えばコーンスターチ、ジャガイモのデンプン）；セルロースとその誘導体（例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース）；トラガカントゴム；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター、蝋、動物と植物の脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油（例えばピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ダイズ油）；グリコール（例えばプロピレングリコール）；ポリオール（例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール）；エステル（例えばオレイン酸エチル、ラウリン酸エチル）；寒天；緩衝剤（例えば水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム）；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；リン酸塩緩衝溶液；医薬製剤で用いられている適合性のある他の任意の物質である。
【０１９７】
特別な実施態様では、本発明の組成物は、本明細書で考察したCAR発現免疫エフェクタ細胞をある量含んでいる。本明細書では、「量」という用語は、遺伝子改変された治療用細胞（例えばT細胞）が、有利な予防効果または治療効果、または望む予防効果または治療効果（その中には臨床結果が含まれる）を実現する「有効量」または「有効な量」を意味する。
【０１９８】
「予防に有効な量」は、遺伝子改変された治療用細胞が望む予防結果を達成するための量を意味する。疾患の発症前または初期段階に予防量が対象で用いられるため、予防に有効な量は、典型的には治療に有効な量よりも少ないが、必ずしもそうとは限らない。予防的という用語は、個々の医学的障害の完全な抑制または予防を必ずしも意味しない。予防的という用語は、ある医学的障害が起こったり、その症状が悪化したりするリスクの低下も意味する。
【０１９９】
遺伝子改変された治療用細胞の「治療に有効な量」は、個人の疾患状態、年齢、性別、体重や、幹細胞と前駆細胞が個人に望む反応を起こさせる能力などの因子に応じて異なる可能性がある。治療に有効な量は、治療のプラスの効果が、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の何らかの毒性効果または有害効果を上回る量でもある。「治療に有効な量」という表現には、対象（例えば患者）を「治療する」のに有効な量が含まれる。治療量を示すときには、投与すべき本発明の組成物の正確な量は、医師が、年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度、患者（対象）の状態の個人差を考慮して決めることができる。一般に、本明細書に記載したT細胞を含む医薬組成物は、体重1 kg当たり細胞102〜1010個の用量、好ましくは体重1 kg当たり細胞105〜106個の用量（その中には、この範囲内のあらゆる整数値が含まれる）で投与できると言うことが可能である。細胞の数は、組成物の最終的な用途や、その中に含まれる細胞のタイプに応じて異なるであろう。本明細書に提示した利用に関しては、細胞は一般に1l以下の体積であり、500 ml以下、それどころか250 mlまたは100 ml以下が可能である。したがって望む細胞の密度は、典型的には細胞106個/ml超であり、一般には細胞107個/ml超、細胞108個/ml、またはそれ以上である。臨床的に重要な数の免疫細胞を多数回の輸液に配分し、累積値が細胞105個、106個、107個以上、または108個以上、または109個以上、または1010個以上、または1011個以上、または1012個以上になるようにすることができる。本発明のいくつかの側面では、特に輸液で導入された細胞はすべて特定の標的抗原にリダイレクトされることになるため、投与する細胞をより少なくすることができる。CARを発現する細胞組成物は、これらの範囲内の用量で複数回投与することができる。細胞として、治療中の患者にとって同種の細胞、同系の細胞、異種の細胞、自家細胞が可能である。
【０２００】
一般に、本明細書に記載したようにして活性化させて増殖させた細胞を含む組成物は、免疫抑制されている個人で生じる疾患の治療と予防に用いることができる。特に、本明細書で考察したCAR改変T細胞を含む組成物をB細胞悪性腫瘍の治療に用いる。本発明のCAR改変T細胞は、単独で投与すること、または基剤、希釈剤、賦形剤と組み合わせた医薬組成物として、および／または他の諸成分（例えばIL-2や他のサイトカイン）や細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。特別な実施態様では、本明細書で考察した医薬組成物は、一定量の遺伝子改変T細胞を、医薬としてまたは生理学的に許容可能な1つ以上の基剤、希釈剤、賦形剤とともに含んでいる。
【０２０１】
CAR発現免疫エフェクタ細胞集団（例えばT細胞）を含む本発明の医薬組成物は、緩衝液（例えば中性の緩衝化生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水など）；炭水化物（例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えばグリシン）；抗酸化剤；キレート剤（例えばEDTAやグルタチオン）；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；保存剤を含むことができる。本発明の組成物は、非経口投与（例えば血管内（静脈内または動脈内）投与、腹腔内投与、筋肉内投与）用の製剤にすることが好ましい。
【０２０２】
液体医薬組成物は、溶液の形態であるかどうか、または懸濁液の形態であるかどうか、または他の同様の形態であるかどうかに関係なく、減菌希釈液（例えば注射用の水、食塩水（生理食塩水が好ましい）、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム）、不揮発性油（例えば溶媒または懸濁媒体として機能することのできる合成したモノグリセリドまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリオール、他の溶媒）；抗菌剤（例えばベンジルアルコールやメチルパラベン）；抗酸化剤（例えばアスコルビン酸や硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えば酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩）；張度（tonicity）調節剤（例えば塩化ナトリウムやデキストロース）のうちの1つ以上を含むことができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、ガラス製またはプラスチック製の複数回投与バイアルに封入することができる。注射可能な医薬組成物は無菌であることが好ましい。
【０２０３】
特別な一実施態様では、本明細書で考察した組成物は、CAR発現免疫エフェクタ細胞の有効量を単独で含むか、1つ以上の治療剤と組み合わせて含んでいる。したがってCAR発現免疫エフェクタ細胞組成物は、単独で適用するか、既知の他のがん治療法（例えば放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学療法など）と組み合わせて適用することができる。この組成物は、抗生剤と組み合わせて投与することもできる。そのような治療剤は、本明細書に記載した個別の疾患状態（例えば個々のがん）の標準療法として本分野で受け入れ可能である。考察する治療剤の例に含まれるのは、サイトカイン、増殖因子、ステロイド、NSAID、DMARD、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法剤、治療用抗体、他の活性な付属的薬剤である。
【０２０４】
治療法
本明細書で考察した遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞は、B細胞関連疾患（その非限定的な例に免疫調節疾患と造血性悪性腫瘍が含まれる）の治療で用いるための改良された養子免疫療法を提供する。
【０２０５】
特別な実施態様では、本明細書で考察したCAR発現免疫エフェクタ細胞を含む組成物を、B細胞の異常な活性に関連する病気（または「病原性B細胞の存在に関連する医学的障害」と呼ぶ）の治療に用いる。
【０２０６】
本明細書では、「病原性B細胞の存在に関連する医学的障害」または「B細胞悪性腫瘍」は、B細胞の中に形成されるがんなどの医学的状態を意味する。特別な実施態様では、本明細書で考察したCAR改変T細胞を含む組成物を造血性悪性腫瘍（その非限定的な例にB細胞悪性腫瘍である例えば多発性骨髄腫（MM）、非ホジキンリンパ腫（NHL）が含まれる）の治療で用いる。
【０２０７】
本発明の別の1つの側面では、本明細書に記載した本発明のCARとCAR-Tが、B細胞を媒介とした疾患、形質細胞を媒介とした疾患、抗体を媒介とした疾患または異常の治療に用いるために提供される。その疾患の選択は、多発性骨髄腫（MM）、慢性リンパ性白血病（CLL）、非分泌性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、意義不明の単クローン性グロブリン血症（MGUS）、孤立性形質細胞腫（骨、髄外）、リンパ形質細胞リンパ腫（LPL）、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、形質細胞白血病、原発性アミロイドーシス（AL）、重鎖疾患、全身性エリテマトーデス（SLE）、POEMS 症候群／骨硬化性骨髄腫、I型とII型のクリオグロブリン血症、軽鎖沈着症、グッドパスチャー症候群、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、急性糸球体腎炎、天疱瘡と類天疱瘡、後天性表皮水疱症； BCMAが発現しているあらゆる非ホジキンリンパ腫、B細胞白血病、ホジキンリンパ腫（HL）、または患者が組み換えタンパク質置換療法（この方法は、本明細書に記載したCARまたは CAR-Tを治療に有効な量で患者に投与する工程を含んでいる）を中和する抗体を発達させるあらゆる疾患からなされる。
【０２０８】
多発性骨髄腫は、成熟形質細胞の形態のB細胞悪性腫瘍であり、このタイプの細胞のクローンが1つだけ悪性形質転換したことを特徴とする。これら形質細胞は骨髄の中で増殖し、隣接する骨とときには血液に侵入する可能性がある。多発性骨髄腫のバリアントの形態には、明白な多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型骨髄腫、IgD骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫が含まれる。
【０２０９】
非ホジキンリンパ腫には、リンパ球（白血球細胞）のがんの大きなグループが含まれる。非ホジキンリンパ腫はあらゆる年齢で発症する可能性があり、正常よりも大きいリンパ節、発熱、体重減少を特徴とすることがしばしばある。非ホジキンリンパ腫は、節外部位、例えば中枢神経系、粘膜組織（肺、小腸、大腸、消化管など）にも存在する可能性がある。多くの異なるタイプの非ホジキンリンパ腫が存在している。非ホジキンリンパ腫は、例えば攻撃性（速く成長する）と遅発性（ゆっくり成長する）に分けることができる。非ホジキンリンパ腫はB細胞とT細胞に由来する可能性があるが、本明細書では、「非ホジキンリンパ腫」と「B細胞非ホジキンリンパ腫」という用語は交換可能に用いられる。B細胞非ホジキンリンパ腫（NHL）に含まれるのは、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ性リンパ腫（CLL/SLL）、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽細胞性大細胞リンパ腫、前駆B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫である。骨髄または幹細胞の移植後に発生するリンパ腫は、通常はB細胞非ホジキンリンパ腫である。
【０２１０】
慢性リンパ性白血病（CLL）は、遅発性（成長が遅い）がんであり、Bリンパ球またはB細胞と呼ばれる未熟な白血球細胞をゆっくりと増加させる。がん細胞は血液と骨髄を通じて広がり、リンパ節や他の臓器（例えば肝臓、脾臓）も冒す可能性がある。CLLは最終的に骨髄をだめにする。この疾患の異なる姿は小リンパ性リンパ腫と呼ばれており、二次的リンパ器官（例えばリンパ節、脾臓）に大半が局在する。
【０２１１】
本発明の一実施態様では、CAR、またはそのCARを発現する免疫細胞は、自己免疫疾患（自己抗体に依存した自己免疫疾患が好ましく、炎症要素を有する自己免疫疾患が好ましい）の治療に用いることを想定している。自己免疫疾患の選択は、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、家族性地中海熱、川崎病、結節性多発動脈炎、皮膚結節性多発動脈炎、肝炎関連動脈炎、ベーチェット症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ANCA-血管炎、チャーグ-ストラウス症候群、顕微鏡的多発血管炎、結合組織疾患の血管炎、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、クリオグロブリン血症性血管炎、皮膚白血球破砕性血管炎、熱帯性大動脈炎、サルコイドーシス、コーガン症候群、ウィスコット-アルドリッチ症候群、癩腫性動脈炎、中枢神経限局性血管炎、閉塞性血栓性血管炎、腫瘍随伴動脈炎、蕁麻疹、デゴス病、骨髄異形成症候群、持久制隆起性紅斑、高免疫グロブリンD、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患、歯周炎、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、アミロイドーシス、Morbus Chron、潰瘍性大腸炎、自己免疫筋炎、糖尿病、ギラン-バレー症候群、組織球症、変形性関節症、アトピー性皮膚炎、歯周炎、慢性鼻副鼻腔炎、乾癬、乾癬性関節炎、顕微鏡的大腸炎、肺線維症、糸球体腎炎、ウィップル病、スティル病、結節性紅斑、中耳炎、クリオグロブリン血症、シェーグレン症候群、エリテマトーデス（全身性エリテマトーデス（SLE）が好ましい）、再生不良性貧血、骨髄線維症、慢性炎症性脱髄多発神経炎、木村病、全身性硬化症、慢性大動脈周囲炎、慢性前立腺炎、特発性肺線維症、慢性肉芽腫症、特発性アカラシア、ブレオマイシン誘発性肺炎、シタラビン誘発性肺炎、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性リンパ球減少症、シャーガス病、慢性自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、橋本病、萎縮性甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性多内分泌腺症候群、自己免疫性アディソン症候群、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、疱疹状皮膚炎、自己免疫性脱毛症、白斑、抗リン脂質抗体症候群、重症筋無力症、スティッフマン症候群、グッドパスチャー症候群、交感性眼炎、毛嚢炎、シャープ症候群、エヴァンス症候群からなされることが好ましく、特に花粉症、歯周病、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチが好ましく、SLEが最も好ましい。
【０２１２】
全身性エリテマトーデス（SLE）（ループスとしても知られる）は、身体の免疫系が身体のさまざまな部位の健康な組織を攻撃する自己免疫疾患である。症状は人によって異なり、穏やかなものから重度のものがありうる。一般的な症状には、痛みがあって腫れた関節、発熱、胸部痛、脱毛、口部潰瘍、腫れたリンパ節、疲労感、顔に非常によく見られるほてりが含まれる。
【０２１３】
本明細書では、「個体」と「対象」という用語は交換可能に用いられることがしばしばあり、遺伝子治療ベクターや、細胞に基づく治療薬や、本明細書のどこかに開示した方法を用いて治療することのできる疾患、障害、状態の症状を示すあらゆる動物を意味する。好ましい実施態様で対象に含まれるのは、遺伝子治療ベクターや、細胞に基づく治療薬や、本明細書のどこかに開示した方法を用いて治療することのできる造血系の疾患、障害、状態（例えばB細胞悪性腫瘍）の症状を示すあらゆる動物である。適切な対象に含まれるのは、実験室動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）、家畜、飼育動物またはペット（例えばネコやイヌ）である。非ヒト霊長類とヒト患者が含まれ、ヒト患者が好ましい。典型的な対象に含まれるのは、B細胞悪性腫瘍を有するヒト、B細胞悪性腫瘍と診断されたヒト、B細胞悪性腫瘍のリスクがあるヒトである。
【０２１４】
本明細書では、「治療」または「治療する」に、疾患または病的状態の症状または病状に対するあらゆる有利な効果または望ましい効果が含まれるとともに、治療中の疾患または状態の1つ以上の測定可能なマーカーのほんのわずかな減少さえ含めることができる。治療には、場合によっては疾患または状態の症状の低減または改善や、疾患または病気の進行の遅延を含めることができる。「治療」は、疾患または状態やそれに付随する症状の根絶や完全治癒を必ずしも意味しない。
【０２１５】
本明細書では、「予防する」と、それと同様の「予防された」、「予防している」、「予防の」などの表現は、疾患または状態の発生または再発の可能性を予防する、または抑制する、または低下させるためのアプローチを示す。この表現は、疾患または状態の発症または再発の遅延や、疾患または状態の症状の発生または再発の遅延も意味する。本明細書では、「予防」とその類義語は、疾患または状態の発症または再発の前にその疾患または状態の程度、および／または効果、および／または症状、および／または負荷を減らすことも含んでいる。
【０２１６】
一実施態様では、治療を必要とする対象のB細胞関連疾患を治療する方法は、本明細書で考察した遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞を含む組成物を有効量（例えば治療に有効な量）投与することを含んでいる。投与する量と頻度は、患者の状態、患者の疾患の種類と重症度などの因子によって決まることになるが、適切な用量は臨床試験によって決めることができる。
【０２１７】
本明細書で考察した組成物の投与は、便利な任意のやり方で実施することができ、その中に含まれるのは、エーロゾル吸入、注射、摂取、輸液、埋め込み、移植である。好ましい一実施態様では、組成物は非経口投与される。本明細書では、「非経口投与」と「非経口で投与される」という表現は、腸投与と局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射による投与であり、その非限定的な例に含まれるのは、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、胸骨内への注射と輸液である。一実施態様では、本明細書で考察した組成物は、対象の腫瘍、リンパ節、感染部位に直接注射することによって投与される。
【０２１８】
本明細書に開示した実施例と図面により、実例を通じて本発明を明らかにする。本明細書に提示した図面は本発明の具体的な実施態様を表わしており、本発明の範囲を制限することは想定していない。図面は、1つ以上の非限定的な実施態様のより大きな技術的裏付けとなる、可能であって好ましい可能性のある実施態様のさらなる説明を提供すると見なすべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】図1：好ましいCAR構造の模式図。
【図２】図2：好ましいCARコンストラクトIX、X、XI、XV、XVI、XVIIの模式図。
【図３】図3：本明細書に記載したCARの好ましいコンストラクトとさまざまな構造エレメントの可能な組み合わせのリスト。
【図４】図4： mAb結合領域と本発明のCARで用いる好ましいヒト化配列の間の配列比較。
【図５】図5：BCMA-CAR配列を有するGeneArt（商標）プラスミド。
【図６】図6：制限後のコンストラクトとベクターのゲル電気泳動。
【図７】図7：レトロウイルスによる形質導入後のヒトT細胞におけるBCMA CAR発現の確認：CAR発現コンストラクトIX〜XII、CD19、SP6。
【図８】図8：CAR形質導入ヒトT細胞をさまざまな標的細胞系とともに培養すると、明確にBCMA+多発性骨髄腫（MM）細胞系とB-NHL細胞系による特異的T細胞活性化がわかる。機能的インビトロ同時培養とIFN-γELISA。
【図９】図9：多発性骨髄腫細胞とともに培養したCAR-T細胞のCD107a（LAMP1）染色：抗原特異的（BCMA）刺激によって活性化された脱顆粒中のCD8+ T細胞をフローサイトメトリーによって検出。機能的インビトロ同時培養とFACSによるLAMP1検出。
【図１０−１】図10：細胞傷害アッセイによってBCMA陽性細胞系の選択的殺傷が明らかになる；BCMA陰性細胞系では実質的に殺傷が見られなかった。機能的インビトロ同時培養と51Cr放出アッセイ。
【図１０−２】図10：細胞傷害アッセイによってBCMA陽性細胞系の選択的殺傷が明らかになる；BCMA陰性細胞系では実質的に殺傷が見られなかった。機能的インビトロ同時培養と51Cr放出アッセイ。
【図１１−１】図11： さまざまなタイプの細胞表面におけるBCMAとCD19の発現を機能的アッセイで評価。MACSに基づいてPBMCからB細胞を単離した結果も、抗BCMA染色および抗CD19染色とともに示してある。
【図１１−２】図11： さまざまなタイプの細胞表面におけるBCMAとCD19の発現を機能的アッセイで評価。MACSに基づいてPBMCからB細胞を単離した結果も、抗BCMA染色および抗CD19染色とともに示してある。
【図１１−３】図11： さまざまなタイプの細胞表面におけるBCMAとCD19の発現を機能的アッセイで評価。MACSに基づいてPBMCからB細胞を単離した結果も、抗BCMA染色および抗CD19染色とともに示してある。
【図１１−４】図11： さまざまなタイプの細胞表面におけるBCMAとCD19の発現を機能的アッセイで評価。MACSに基づいてPBMCからB細胞を単離した結果も、抗BCMA染色および抗CD19染色とともに示してある。
【図１２】図12：CARのscFvとBCMAエピトープの間の結合相互作用の模式図。
【図１３】図13：HCの好ましいヒト化配列をJ22.9-xiと比較した配列アラインメント。
【図１４】図14：LCの好ましいヒト化配列をJ22.9-xiと比較した配列アラインメント。
【図１５】図15：BCMAリダイレクトCAR-T細胞は、異種移植NSGマウスモデルにおいてMM腫瘍に対して有効である。（A）異種移植NSGマウスモデルにおけるMM腫瘍の移植。マウスにMM.1S細胞を腹腔内移植するチャレンジを行なった。腫瘍を接種してから8日目に腫瘍細胞の成長をIVISイメージングによって可視化した。腫瘍負荷を測定するため、イメージングを延長して300秒にした（-1日目）。（B）治療効果を追跡することと、生体発光強度を小さくしてより見やすくすることを目的として、（A）のようなマウスのイメージングを-1日目に再び30秒間実施した。CAR-T細胞（対照SP6 CAR-T細胞（n＝4）とBCMA CAR-T細胞（n＝6））を移植した後にIVIS曝露を30秒間実施することで、-1日目と、強度が最大の17日目の間でのよりよい比較が可能になった。白い十字架：疾患の進行と動物保護法を理由としてマウスを安楽死させた。（C）各マウスの全身をカバーする興味ある領域から得られた生体発光信号強度の平均値を各群について各時点でプロットしてある。
【図１６】図16：BCMAリダイレクトCAR-T細胞は、異種移植NSGマウスモデルにおいてB-NHL腫瘍に対して有効である。（A）異種移植NSGマウスモデルにおけるマントル細胞リンパ腫の移植。マウスに6×105個のJeKo-1細胞を腹腔内移植するチャレンジを行なった。腫瘍を接種してから7日目に腫瘍細胞の成長をIVISイメージングによって可視化した。IVIS曝露、120秒間。（B）治療効果を追跡することと、生体発光強度を小さくしてより見やすくすることを目的として、（A）のようなマウスのイメージングを0日目に再び30秒間実施した。CAR-T細胞（対照SP6 CAR-T細胞（n＝7）とBCMA CAR-T細胞（n＝7））を移植した後にIVIS曝露を30秒間実施することで、0日目と、強度が最大の16日目の間でのよりよい比較が可能になった。（C）各マウスの全身をカバーする興味ある領域から得られた生体発光信号強度の平均値を各群について各時点でプロットしてある。
【実施例】
【０２２０】
本発明を、本明細書に開示した実施例によって明らかにする。実施例は、本発明の好ましい可能性がある非限定的な実施態様の技術的裏付けとして、そしてより詳細な記述として提示する。本明細書に記載したCARの機能を明らかにするため、発明者は以下の実験を実施した：
- CAR形質導入ヒトT細胞をさまざまな標的細胞系とともに培養すると、明確にBCMA+ MM細胞系とNHL細胞系による特異的T細胞活性化がわかる；読み取ったのは、T細胞から放出されるエフェクタサイトカインとしてのIFN-γであった；
- 細胞傷害アッセイにより、BCMA+細胞系の選択的殺傷が明らかになる；BCMA陰性細胞系または初代細胞（例えばHUVEC（内皮細胞に由来）、HEK293（腎臓）、末梢血B細胞、末梢血全リンパ球、T-ALL、B-ALL、大腸癌）では実質的に殺傷が見られなかった。
- 多発性骨髄腫細胞とともに培養したCAR-T細胞をCD107a染色し、抗原特異的（BCMA）刺激によって活性化された脱顆粒中のCD8+ T細胞をフローサイトメトリーによって検出。
- 生体内実験は、異種移植NSGマウスモデルを用いてi）機能性に関するデータ、ii）標的外反応性に関するデータ、iii）T細胞記憶に関するデータ、iv）養子移植されたCAR-T細胞のB-NHL細胞系と多発性骨髄腫細胞系に対する生体安全性に関するデータを得ることに関する。B-NHLに関しては、抗BCMA CAR-T細胞の細胞溶解能力を、確立されている抗CD19 CAR-T細胞製品と比較する。
【０２２１】
実施例1：クローニングとプラスミドの調製：
GeneArt（商標）（Gene Synthesis Service社）を用いてCAR配列を合成した。NotIとEcoRIを用いてCARコンストラクトの制限消化を実施した（図5）。レトロウイルスベクターMP71もNotIとEcoRIで消化させ、その後脱リン酸化した。
【０２２２】
ゲル電気泳動を利用してCARとベクターを分離し（図6）、断片を精製した。その後、CARコンストラクトをベクター（50 ng）に3：1の比で連結した。連結混合物をMACH-1に形質転換した（図3）。制限消化を実施し、Mini-Preparationをシークエンシングした。その後、コンストラクトを再度MACH-1に形質転換した。MP71-BCMA-CARプラスミドのMaxi-Preparationを作製した。
【０２２３】
MP71は、一本（+）鎖RNAウイルスである。逆転写酵素がそのレトロウイルスRNA-ゲノムをDNAコピーに変換する。DNAはプロウイルスとして標的ゲノムのランダムな位置に統合される。細胞分裂を通じてウイルスはプロウイルスとして安定に再生産される。
【０２２４】
実施例2：トランスフェクションと形質導入：
0日目：ウイルス生成のため、6ウエルのプレートにHekT(293T)細胞またはGalV細胞を播種。
【０２２５】
1日目：ウイルス生成のための一過性の3-プラスミドトランスフェクション（リン酸カルシウムトランスフェクション）。標準的なプロトコルに従い、ウエルごとに250 mlのCaCl2と150μlのH2Oの中で18μgのDNAを使用した。細胞を37℃で6時間インキュベートし、培地を交換し、37℃でさらに48時間インキュベートした。
【０２２６】
24ウエル非組織培養プレートを抗huCD3抗体と抗huCD28抗体で覆う：
ウエルごとに0.5 ml のPBSの中で抗CD3／抗CD28抗体溶液を調製する（5μg/mlの抗CD3抗体、1μg/mlの抗CD28抗体）。各ウエルを0.5 mlの抗体溶液とともに37℃で2時間インキュベートし、（水の中の）減菌2％BSA溶液と置き換え、30分間（37℃）インキュベートする。BSA溶液を除去し、ウエルを2 mlのPBSで洗浄する。
【０２２７】
40 mlの血液からのPBMCの精製（約2.5×107個のPBMC）：
2×50 mlのFalcon-Tubeの中で12.5 mlのFicoll-Gradient培地を調製し、血液をRPMI（＋100 IU/mlのペニシリン、ストレプトマイシン）で希釈して45 mlにし、混合し、22.5 mlの血液-培地混合物で被覆し、遠心分離する（20分間、20℃、1800 rpm、RZB *648、G 17.9）。上方の相を15 ml廃棄する。上方の相の残部を乳白色のPBMC含有中間相とともに新しい50 mlのFalcon-Tubeに移し、RPMI（＋100 IU/mlのペニシリン、ストレプトマイシン）を添加して45 mlにし、遠心分離する。45 mlのRPMI（＋100 IU/mlのペニシリン、ストレプトマイシン）の中にペレットを再懸濁させ、遠心分離し、10〜20 mlのT細胞培地の中にペレットをまとめ、1つのサンプルをトリパンブルーで染色し、細胞をカウントし、抗CD3と抗CD28で被覆したウエルに細胞を1〜1.5×106細胞/mlの濃度（T細胞培地（＋100 IU/mlのIL-2）は400 U/mlの臨床的IL-2に対応する）で添加する。PBMCの残部を遠心分離し、凍結培地の中に再懸濁させ、Cryoチューブの中に-80℃で保管する。
【０２２８】
3日目：PBLの形質導入
Hekt細胞またはGalV細胞からウイルス上清を取り出して濾過する（0.45μmのフィルタ）。刺激されたPBMCを1.5 mlのウイルス上清で処理する。
【０２２９】
4日目：PBLの形質導入
残っているウイルス上清（4℃）とHekt細胞またはGalV細胞からの第2の上清（0.45μl）を濾過する。PBLから1 ml〜1.5 mlの上清を回収する。刺激されたPBMCを1 ml〜1.5 mlのウイルス上清で処理し、CD3/CD28で被覆したウエルの中で遠心分離する（90分間、32℃、2000 rpm）。最終濃度は、100 IU/mlのIL-2（400 U/μl から1μl）、または10 ng/μlのIL-7と10 ng/μlのIL-15に加え、4μg/ml（8μl）の硫酸プロタミン。32℃にて2000 rpmで90分間遠心分離する。
７日目〜13日目：PBLを培養し、T細胞培地を新鮮なIL-2またはIL-7/IL-15で処理する。
13日目：T細胞刺激の終了。
細胞培養フラスコからのPBL培養物を洗浄し、遠心分離し、ペレットをT細胞培地（＋10 IU/mlのIL-2）の中に再懸濁させる。
15日目：機能的アッセイ
【０２３０】
実施例3：抗BCMA CAR-T細胞の機能的インビトロ試験
I．レトロウイルス形質導入後のヒトT細胞の表面におけるBCMA CAR発現の確認
【０２３１】
ヒトT細胞の文脈でCAR受容体が折り畳まれて輸送される証拠を得た；レトロウイルス形質導入プロトコルの機能性を評価した。
【０２３２】
Ficoll-Gradientを通じてヒト末梢血白血球を精製した。上に記載したようにして、細胞を培養し、刺激し、レトロウイルスを用いて細胞に形質導入した。形質導入に続いて細胞をさらにIL-2含有培地またはIL-7/IL-15含有培地の中で培養した後、BCMA-CARの発現を分析した。
【０２３３】
形質導入率と生存率をフローサイトメトリー（FACS）分析によって評価した。BCMA-CARの発現を検出するため、CARコンストラクトのスペーサ領域の中にあるヒトのIgG1区画またはIgG4区画を選択的に認識する抗ヒトIg抗体で細胞を染色した。CD3/CD8/CD4 T細胞を同時に染色した。結果に関しては図7を参照されたい。
【０２３４】
II．CAR形質導入ヒトT細胞をさまざまな標的細胞系とともに培養すると、明確にBCMA+多発性骨髄腫（MM）細胞系とB-NHL細胞系による特異的T細胞活性化がわかる
【０２３５】
読み取ったのは、T細胞から放出されるエフェクタサイトカインとしてのIFN-γであった
【０２３６】
すでに詳述したようにして、レトロウイルスで形質導入したヒトT細胞を作製する；すべてのBCMA CAR受容体バリアント（IX〜XVII）、SP6陰性対照CAR、CD19 CAR、UT＝形質転換なしのT細胞を使用する。同時培養では標的細胞として以下のヒト細胞系を使用する：
【０２３７】
【表４】
2019527537.tif 000019
【０２３８】
レトロウイルスで形質導入したT細胞を、掲載した細胞系または初代細胞を1：1の比で存在させて、18〜20時間にわたって同時培養する。その時間が経過した後、無細胞培地の上清を採取する；最多の放出は、エフェクタT細胞のPMA／イオノマイシン刺激によって誘導される；最少の放出は、T細胞だけの場合である。上清の中へのIFN-γの放出はELISAによって調べる。結果に関しては図8を参照されたい。
【０２３９】
III．多発性骨髄腫細胞とともに培養したCAR-T細胞のCD107a（LAMP1）染色：抗原特異的（BCMA）刺激によって活性化された脱顆粒中のCD8+ T細胞をフローサイトメトリーによって検出
すでに詳述したようにして、レトロウイルスで形質導入したヒトT細胞を作製する；BCMA CAR受容体バリアント（IX〜XI）、SP6陰性対照CARを使用する。
【０２４０】
レトロウイルスで形質導入したT細胞を、掲載した細胞系を1：1の比で存在させて、18時間にわたって同時培養する。
【０２４１】
一晩培養した抗CD107a（LAMP1）抗体を細胞培地に添加する；抗体は、分泌性リソソームが細胞膜と融合してその小胞体の中の酵素を放出するとき、連続的にT細胞に結合する。これら小胞体は、細胞溶解メディエータ（例えばグランザイムやパーフォリン）を含んでいる。翌日、T細胞を抗CD8および／または抗CD3とともに染色する。
【０２４２】
フローサイトメトリーによる分析：平均蛍光強度（MFI）として示されるCD107a反応性がより大きいというのは、T細胞の活性化がより強いことを示している。T細胞の活性化が抗原に依存していることを確認できる。結果に関しては図9を参照されたい。
【０２４３】
IV．細胞傷害アッセイにより、BCMA陽性細胞系の選択的殺傷が明らかになる；BCMA陰性細胞系では実質的に殺傷が見られなかった
51Cr放出アッセイを利用して細胞傷害性Tリンパ球の活性を定量する。標的細胞の細胞溶解を測定する。
【０２４４】
すでに詳述したようにして、レトロウイルスで形質導入したヒトT細胞を作製する；BCMA CAR受容体バリアント（IX〜XI）、SP6陰性対照CAR；対照としてのCD19 CARを使用する。
【０２４５】
標的細胞を51Crで標識する。その後、CAR-T細胞と標識した標的細胞を4時間にわたって同時培養する。標的に対するエフェクタの比を滴定する。
E：T
80：1
40：1
20：1
10：1
5：1
2.5：1
【０２４６】
無細胞細胞培養物の上清を回収する。上清をLUMA-シンチレーションプレートに移し、放出される51Crをγ-シンチレーションカウンタで測定する。最多の放出：Triton X-100 透過剤によって溶解した標的細胞。最少の放出：標的細胞のみ。結果に関しては図10を参照されたい。
【０２４７】
さらに、図11は、細胞傷害性に関して評価した各種細胞のそれぞれの表面に発現したBCMAとCD19の量を示す結果である。図12は、CARのscFvとBCMAエピトープの間の結合相互作用の模式図である。
【０２４８】
実施例4：養子移植されたCAR-T細胞をB-NHL細胞系および多発性骨髄腫細胞系と比べて評価するための、異種移植NSGマウスモデルを用いた生体内実験
NSGマウスへの異種移植を利用した生体内実験：
1）さまざまな抗BCMAバリアントを備えるCAR-T細胞がインサイチュ条件下でもエフェクタ活性を有することを証明するため、さまざまなBCMA抗原密度の多発性骨髄腫細胞を静脈内経路でNSGマウス（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1 Wjl/SzJ）に移植する。使用できる多発性骨髄腫細胞系は、BCMAの密度が低いRPMI-8226；BCMAの密度が中程度のMM1S；BCMAの密度が高いNCI-H229である。
【０２４９】
2）インサイチュでのB-NHL細胞系に対する抗BCMA CAR-T細胞の反応性を確認するため、NSGマウスの静脈内に、ルシフェラーゼを形質導入した細胞系（例えばSU-DHL4（DLBCL）、JEKO-1（マントル細胞リンパ腫）、JVM3（CLL）、MEC1（CLL）、DOHH-2（FL））を注射した。
【０２５０】
BCMA CAR-T細胞は、多発性骨髄腫（MM）とB細胞非ホジキンリンパ腫（B-NHL）のマウスモデルにおいて生体内抗腫瘍活性に関与する：
BCMA CARで改変したT細胞の強いインビトロ活性は生体内での効果的な抗腫瘍活性につながるという考え方を証明するため、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1 Wjl/SzJ（NSG）マウスのコホートにヒトMM.1S細胞系（図15）またはB-NHL細胞系JeKo-1（マントル細胞リンパ腫）（図16）を静脈内接種し、GFPとタンデムにしたルシフェラーゼ遺伝子を形質導入した。NSGマウスはT細胞、B細胞、NK細胞を発達させることがないため、異種移植されたヒト細胞の寛容性と成長に適している。ここに示した実験期間内では、「移植片対宿主」（GvHD）反応（異種反応性）は観察されなかった（データは示さない）。腫瘍の成長をIVISイメージングによってモニタし、7〜8日後にルシフェリンを注入した。腫瘍の成長を確認してから1日後（＝0日目）にCAR-T細胞を静脈内注射した。機能的生体内実験のため、CARコンストラクトIX（B IX）を使用した。マウス1匹につきCAR-T細胞の合計数が6〜7×106個を超えることは決してなく、この集団内のT細胞の平均形質導入率は40〜60％であった。ドナーごとにSP6とBCMAの形質導入率は±10％の範囲内で一致した。示してある2つの実験では、形質導入された有効なCAR-T細胞を3×106個使用した。対照マウスにはSP6 CAR-T細胞を与えた。
【０２５１】
MM1.S実験（図15）において、形質導入されたCAR-T細胞を3×106個（上記のように、合計は6〜7×106個）移植し、観察期間を17日目まで延長した。SP6 CARで処理した実質的にすべてのマウスは、MM疾患が進行する（疾患の進行は、脊髄、骨盤、後肢での強い蛍光信号によって特徴づけられる）か、（ベルリン連邦州）動物保護法に従って疾患の進行を理由に安楽死させるかしたが、BCMA CARで処理した群では明らかにそうならなかった。われわれは、この比較的少数のCAR-T細胞ですでに、BCMA CAR-T細胞が抗骨髄腫活性を有すると結論する（図15A〜図15C）。
【０２５２】
抗BCMA CAR-T細胞はアフィニティとアビディティが大きいという理由で、BCMAの発現が少ない成熟B細胞NHLでさえ認識することができるため、T細胞の活性化と腫瘍細胞の殺傷が可能になる。このような成熟B-NHLは、いくつかの段階の濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病を含んでいる（図11、図10、図9、図8を参照されたい）。BCMAがB-NHLにおいて標的構造として適していることを証明するため、形質導入されたCAR-T細胞（合計：6〜7×106個）を、マントルリンパ腫細胞系JeKo-1のチャレンジをすでに受けていたNSGマウスに移植した。SP6 CARで処理した実質的にすべてのマウスがリンパ腫を進行させた（疾患の進行は、肝臓、胸郭器官、後肢の骨髄、脾臓での強い蛍光信号によって特徴づけられる）が、BCMA CARで処理した群では明らかにそうならなかった。それを受けて、われわれは、BCMA CAR-T細胞が、多発性骨髄腫を超えてB-NHLリンパ腫へと拡張された抗腫瘍活性を有するという、臨床前生体内試験での最初の証拠を提示する（図16A〜図16C）。
【０２５３】
実施例5：BCMA分子の表面密度の測定
抗BCMA CAR-T細胞はアフィニティとアビディティが大きいという理由で、BCMAの発現が少ない成熟B細胞NHLでさえ認識することができるため、T細胞の活性化と腫瘍細胞の殺傷が起こる。このような成熟B-NHLは、いくつかの段階の濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病を含んでいる。
【０２５４】
BCMA分子の表面密度を定量するため、PEフィコトエリトリン蛍光検出キット（BD Quantibriteアッセイとも呼ぶ（BD Bioscience社））を適用した。細胞ごとのPE分子の数は、細胞ごとの抗体の数に変換することができる。それが、細胞ごとの抗原の数の定量的推定値である。フローサイトメトリー検出法を適用した。
【０２５５】
この方法を利用して、多発性骨髄腫細胞系NCI-H929が12555という相対的表面BCMA抗原密度を持つこと、多発性骨髄腫細胞系OPM-2が3443個のBCMA分子を持つこと、多発性骨髄腫細胞系MM.1Sが相対値3181を持つことを見いだした。
【０２５６】
言及したB-NHL細胞系のBCMA抗原密度は、NCI-H929に対して、DOHH-2：1/20、JeKo-1：1/250、MEC-1：1/34であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
2019527537.tif 000029
【図１０−２】
2019527537.tif 000030
【図１１−１】
2019527537.tif 000031
【図１１−２】
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【図１１−３】
2019527537.tif 000033
【図１１−４】
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【図１２】
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【図１３】
2019527537.tif 000036
【図１４】
2019527537.tif 000037
【図１５】
2019527537.tif 000038
【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019527537.tif 000042
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2019527537.tif 000044
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