(57)【要約】本開示は、操作されたＩｇＧ  Ｆｃコンストラクト及びその使用に関する。【選択図】図２
2019519528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ａ）  式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、
ｉ）  Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、
ｉｉ）  Ｌはグリシンスペーサーであり、
ｉｉｉ）  Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、
前記第一のポリペプチドと；
ｂ）  式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、
ｉ）  Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、
ｉｉ）  Ｌ’はグリシンスペーサーであり、
ｉｉｉ）  Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、
前記第二のポリペプチドと；
ｃ）  第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと；
ｄ）  第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと
を含むＦｃコンストラクトであって、
前記第一のポリペプチド及び前記第二のポリペプチドのそれぞれが、
2019519528.tif 000095
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
前記第三のポリペプチド及び前記第四のポリペプチドのそれぞれが、
2019519528.tif 000096
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
ＢとＢ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ａと前記第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ａ’と前記第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、
Ｂ及びＢ’のそれぞれが変異Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄを含み、Ａ及びＡ’のそれぞれが変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＥ３５７Ｋを含み、前記第五のＦｃドメイン単量体及び前記第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＫ３７０Ｄを含み、
Ｌ及びＬ’のそれぞれが１２〜３０個のグリシンを含み、
前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチド、前記第三のポリペプチド、及び前記第四のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リシンを欠いている、
前記Ｆｃコンストラクト。
【請求項２】
Ｌ及びＬ’のそれぞれが、
2019519528.tif 000097
の配列を含む、請求項１記載のＦｃコンストラクト。
【請求項３】
前記第一のポリペプチド及び前記第二のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有し、前記第三のポリペプチド及び前記第四のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する、請求項１記載のＦｃコンストラクト。
【請求項４】
前記第一のポリペプチド及び前記第二のポリペプチドのそれぞれが、
2019519528.tif 000098
の配列を含む、請求項１記載のＦｃコンストラクト。
【請求項５】
前記第三のポリペプチド及び前記第四のポリペプチドのそれぞれが、
2019519528.tif 000099
の配列を含む、請求項１記載のＦｃコンストラクト。
【請求項６】
前記第一のポリペプチド及び前記第二のポリペプチドのそれぞれが、
2019519528.tif 000100
の配列を含み、
前記第三のポリペプチド及び前記第四のポリペプチドのそれぞれが、
2019519528.tif 000101
の配列を含む、
請求項１記載のＦｃコンストラクト。
【請求項７】
以下：
ａ）  式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、
ｉ）  Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、
ｉｉ）  Ｌはリンカーであり、
ｉｉｉ）  Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、
前記第一のポリペプチドと；
ｂ）  式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、
ｉ）  Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、
ｉｉ）  Ｌ’はリンカーであり、
ｉｉｉ）  Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、
前記第二のポリペプチドと；
ｃ）  第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと；
ｄ）  第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと
を含むＦｃコンストラクトであって、
前記第一のポリペプチドのＡと前記第二のポリペプチドのＡ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のポリペプチドのＢと前記第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、前記第二のポリペプチドのＢ’と前記第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、
前記第一のポリペプチド及び前記第二のポリペプチドが、配列番号：４９の配列を含み、前記第三のポリペプチド及び前記第四のポリペプチドが、配列番号：４８の配列を含む、
前記Ｆｃコンストラクト。
【請求項８】
抗炎症活性を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のＦｃコンストラクト。
【請求項９】
前記Ｆｃドメイン単量体の一つ又は複数が、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン単量体である、請求項１から８のいずれか一項に記載のＦｃコンストラクト。
【請求項１０】
前記Ｆｃドメイン単量体の一つ又は複数が、最大１０個のアミノ酸修飾を有するＩｇＧ  Ｆｃドメイン単量体である、請求項１から９のいずれか一項に記載のＦｃコンストラクト。
【請求項１１】
各Ｆｃドメイン単量体が、１０個以下のアミノ酸修飾を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載のＦｃコンストラクト。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のＦｃコンストラクトを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
対象における免疫応答の免疫細胞活性化を軽減する方法であって、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＦｃコンストラクトを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
前記対象が、自己免疫疾患を有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
対象における炎症を治療する方法であって、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＦｃコンストラクトを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
以下：
ａ）  式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、
ｉ）  Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、
ｉｉ）  Ｌはグリシンスペーサーであり、
ｉｉｉ）  Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、
前記第一のポリペプチドと；
ｂ）  式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、
ｉ）  Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、
ｉｉ）  Ｌ’はグリシンスペーサーであり、
ｉｉｉ）  Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、
前記第二のポリペプチドと；
ｃ）  第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと；
ｄ）  第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと
を含むＦｃコンストラクトの、実質的に均質な集団を含む細胞培養培地であって、
前記第一のポリペプチド及び前記第二のポリペプチドのそれぞれが、
2019519528.tif 000102
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
前記第三のポリペプチド及び前記第四のポリペプチドのそれぞれが、
2019519528.tif 000103
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有し、
ＢとＢ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ａと前記第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ａ’と前記第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、
Ｂ及びＢ’のそれぞれが変異Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄを含み、Ａ及びＡ’のそれぞれが変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＥ３５７Ｋを含み、前記第五のＦｃドメイン単量体及び前記第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＫ３７０Ｄを含み、
Ｌ及びＬ’のそれぞれが１２〜３０個のグリシンを含み、
前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチド、前記第三のポリペプチド、及び前記第四のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リシンを欠いている、
前記細胞培養培地。
【請求項１７】
前記Ｆｃコンストラクトの実質的に均質な集団が、少なくとも８５％均質である、請求項１６記載の細胞培養培地。
【請求項１８】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む細胞培養培地を調製する方法であって、
ａ）  請求項１記載の前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチド、前記第三のポリペプチド、及び前記第四のポリペプチドのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、細胞培養培地中に提供することと、
ｂ）  前記Ｆｃコンストラクトの形成と前記細胞培養培地への分泌とを可能にする条件下で、前記宿主細胞内で前記ポリペプチドを発現させることと、
ｃ）  前記細胞培養培地を回収することと
を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記Ｆｃコンストラクトの実質的に均質な集団が、少なくとも８５％均質である、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年５月２３日出願の同時係属米国特許仮出願第６２／３４０，３２２号の優先権、及び又は、２０１７年１月６日出願の同時係属米国特許仮出願第６２／４４３，４５１の優先権の利益を主張する。上記出願の開示は、その全体を参照によってここに組み入れるものとする。
【背景技術】
【０００２】
背景
治療用タンパク質、例えば、治療用抗体及びＦｃ融合タンパク質は、急速に、免疫疾患及び炎症性疾患、癌ならびに感染症をもつ患者にとって臨床的に重要な薬剤分類になっている。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、生物活性なＦｃドメインを含有する治療コンストラクトを特徴とする。こうしたコンストラクトは、所望の血中半減期、ならびに／又は、Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／もしくは結合活性を有し得る。
【０００４】
概して、この開示は、２〜１０個のＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトを特徴とする。一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクトが、２〜１０個のＦｃドメイン、２〜５個のＦｃドメイン、２〜４個のＦｃドメイン、２〜３個のＦｃドメイン、３〜５個のＦｃドメイン、２〜８個のＦｃドメイン、又は２〜６個のＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクトが、２〜４個のＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクトが、５〜１０個のＦｃドメイン（例えば、５〜６、５〜７、５〜８、５〜９、又は５〜１０個のＦｃドメイン）を含む。
【０００５】
一部の実施形態では、この開示の、コンストラクト（例えば、２〜４個のＦｃドメイン、例えば２、３、又は４個のＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）及び均質な医薬組成物（例えば、２〜４個のＦｃドメイン、例えば２、３、又は４個のＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトを含有するもの）が、例えば、対象における炎症を軽減する、対象における自己抗体のクリアランスを促進する、対象における抗原提示を抑制する、例えば対象における免疫応答の免疫複合体に基づく活性化を防止することである、免疫応答を防止する、ならびに、対象における免疫疾患及び炎症性疾患（例えば、自己免疫疾患）を治療するのに有用である。本明細書に記載のＦｃコンストラクトは、免疫細胞を有意に刺激することなく、免疫疾患及び炎症性疾患を有する患者の治療に用いることが可能である。一部の実施形態では、この開示の、コンストラクト（例えば、５〜１０個のＦｃドメイン、例えば５、６、７、８、９、又は１０個のＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）及び均質な医薬組成物（例えば、５〜１０個のＦｃドメイン、例えば５、６、７、８、９、又は１０個のＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトを含有するもの）が、例えば、対象における免疫応答の免疫細胞活性化を誘導する、対象における標的細胞（すなわち、癌細胞又は感染細胞）のファゴサイトーシスを増加する、及び、対象における癌及び感染症等の疾患を治療するのに有用である。
【０００６】
これらコンストラクトの性質が、実質的に均質な組成物の効率的な生成を可能にする。組成物の均質性の程度が、組成物の薬物動態と生体内での性能とに影響を与える。組成物の安全性、効能、均一性、及び信頼性を確実にするためには、組成物におけるこうした均質性は望ましい。この開示のＦｃコンストラクトは、実質的に均質（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％均質）である集団又は組成物中にあることが可能である。
【０００７】
本明細書においてさらに詳細に記載するように、この開示は、同数のＦｃドメインを全てが有するＦｃコンストラクトを含有する実質的に均質な組成物のみならず、こうした実質的に均質な組成物を調製する方法を特徴とする。
【０００８】
第一の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトであって、ＢとＢ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ａと第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ａ’と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成する、Ｆｃコンストラクトを特徴とする。
【０００９】
この態様の一部の実施形態では、Ｂ及びＢ’のそれぞれが変異Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄを含み、Ａ及びＡ’のそれぞれが変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＥ３５７Ｋを含み、第五及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＫ３７０Ｄを含む。
【００１０】
第二の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトであって、ＡとＡ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ｂと第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ｂ’と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成する、Ｆｃコンストラクトを特徴とする。
【００１１】
この態様の一部の実施形態では、Ａ及びＡ’のそれぞれが変異Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｂ及びＢ’のそれぞれが変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＥ３５７Ｋを含み、第五及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＫ３７０Ｄを含む。
【００１２】
この開示の先述の二つの態様の一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’のそれぞれは、少なくとも４、８、１２、１４、１６、１８、又は２０個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’のそれぞれは、４〜３０、８〜３０、又は１２〜３０個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’のそれぞれは、
2019519528.tif 000003
を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００１３】
この開示の先述の二つの態様の一部の実施形態では、ＡはＦｃドメイン単量体からなる。一部の実施形態では、ＢはＦｃドメイン単量体からなる。一部の実施形態では、Ａ’はＦｃドメイン単量体からなる。一部の実施形態では、Ｂ’はＦｃドメイン単量体からなる。一部の実施形態では、第三のポリペプチドはＦｃドメイン単量体からなる。一部の実施形態では、第四のポリペプチドはＦｃドメイン単量体からなる。
【００１４】
一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つ又は複数が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、及びＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、及びＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体である。
【００１５】
この開示の先述の二つの態様の一部の実施形態では、第一、第二、第三、及び第四のポリペプチドのうちの一つ又は複数におけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。一部の実施形態では、第一、第二、第三、及び第四のポリペプチドのそれぞれにおけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。
【００１６】
一部の実施形態では、第一、第二、第三、及び第四のポリペプチドのうちの一つ又は複数は、Ｃ末端リシンを欠いている。一部の実施形態では、第一、第二、第三、及び第四のポリペプチドのそれぞれは、Ｃ末端リシンを欠いている。
【００１７】
この開示の先述の二つの態様の一部の実施形態では、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有し、また第三のポリペプチド及び第四のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
この開示の第一の態様の一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000004
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％の配列同一性）を有する。一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000005
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００１９】
この開示の一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
最大１０（９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ、
2019519528.tif 000006
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００２０】
この開示の第一の態様の一部の実施形態では、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000007
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％の配列同一性）を有する。一部の実施形態では、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000008
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００２１】
この開示の一部の実施形態では、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、最大１０（９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ、
2019519528.tif 000009
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００２２】
この開示の第一の態様の一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000010
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなるものであり、
第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000011
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００２３】
この開示の第一の態様の一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、最大１０（９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ、
2019519528.tif 000012
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなるものであり、
第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、最大１０（９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ、
2019519528.tif 000013
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００２４】
この開示の第一の態様の一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000014
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなるものであり、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000015
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００２５】
この開示の第二の態様の一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000016
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％の配列同一性）を含む、該配列同一性からなる、又は、実質的に該配列同一性からなる。
【００２６】
一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000017
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００２７】
この開示の一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、最大１０（９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ、
2019519528.tif 000018
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００２８】
この開示の第二の態様の一部の実施形態では、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000019
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％の配列同一性）を有する。一部の実施形態では、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000020
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。一部の実施形態では、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
最大１０（９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ、
2019519528.tif 000021
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００２９】
この開示の第二の態様の一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000022
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなるものであり、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000023
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００３０】
この開示の第二の態様の一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000024
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなるものであり、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000025
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００３１】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトであって、ＢとＢ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ａと第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ａ’と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成するものであって、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドはそれぞれ、配列番号：４９の配列を含む、該配列からなる、又は実質的に該配列からなるものであり、また第三のポリペプチド及び第四のポリペプチドはそれぞれ、配列番号：４８の配列を含む、該配列からなる又は実質的に該配列からなる、Ｆｃコンストラクトを特徴とする。
【００３２】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトであって、ＡとＡ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ｂと第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ｂ’と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成するものであって、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドはそれぞれ、配列番号：６１の配列を含む、該配列からなる又は実質的に該配列からなるものであり、また第三のポリペプチド及び第四のポリペプチドはそれぞれ、配列番号：４８の配列を含む、該配列からなる又は実質的に該配列からなる、Ｆｃコンストラクトを特徴とする。
【００３３】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドとを含むＦｃコンストラクトであって、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成する、Ｆｃコンストラクトを特徴とする。
【００３４】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、第一及び第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体及び第三のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第二及び第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体及び第四のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。一部の実施形態では、第一及び第二のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された突起を含み、第三及び第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された空洞を含む。
【００３５】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、Ｌは少なくとも４、８、又は１２個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌは、４〜３０、８〜３０、又は１２〜３０個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌは、
2019519528.tif 000026
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００３６】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、Ａ、Ｂ、第二のポリペプチド、及び第三のポリペプチドのうちの一つ又は複数が、Ｆｃドメイン単量体からなる。一部の実施形態では、Ａ、Ｂ、第二のポリペプチド、及び第三のポリペプチドのそれぞれが、Ｆｃドメイン単量体からなる。
【００３７】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、第一、第二、及び第三のポリペプチドのうちの一つ又は複数におけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。一部の実施形態では、第一、第二、及び第三のポリペプチドのそれぞれにおけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。
【００３８】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、第一、第二、及び第三のポリペプチドのうちの一つ又は複数は、Ｃ末端リシンを欠いている。一部の実施形態では、第一、第二、及び第三のポリペプチドのそれぞれは、Ｃ末端リシンを欠いている。
【００３９】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、第二のポリペプチド及び第三のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する。
【００４０】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃは第三のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ１’−Ｂ’−Ｌ２’−Ｃ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第四のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１’はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第五のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２’はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃ’は第六のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトであって、Ａと第七のＦｃドメイン単量体とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、ＢとＢ’とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ｃと第八のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、Ａ’と第九のＦｃドメイン単量体とが結合して第四のＦｃドメインを形成し、Ｃ’と第十のＦｃドメイン単量体とが結合して第五のＦｃドメインを形成する、Ｆｃコンストラクトを特徴とする。
【００４１】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、第一及び第七のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体及び第七のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第二及び第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体及び第五のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第三及び第八のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第三のＦｃドメイン単量体及び第八のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第四及び第九のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第四のＦｃドメイン単量体及び第九のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第六及び第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第六のＦｃドメイン単量体及び第十のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００４２】
一部の実施形態では、第二のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが、負電荷をもつアミノ酸置換を含み、第五のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが、正電荷をもつアミノ酸置換を含み、第一、第三、第四、及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された突起を含み、第七、第八、第九、及び第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された空洞を含む。
【００４３】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃは第三のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ１’−Ｂ’−Ｌ２’−Ｃ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第四のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１’はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第五のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２’はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃ’は第六のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトであって、ＣとＣ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ｂと第七のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ａと第八のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、Ｂ’と第九のＦｃドメイン単量体とが結合して第四のＦｃドメインを形成し、Ａ’と第十のＦｃドメイン単量体とが結合して第五のＦｃドメインを形成する、Ｆｃコンストラクトを特徴とする。
【００４４】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、第三及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第三のＦｃドメイン単量体及び第六のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第二及び第七のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体及び第七のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第一及び第八のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体及び第八のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第五及び第九のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第五のＦｃドメイン単量体及び第九のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第四及び第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第四のＦｃドメイン単量体及び第十のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００４５】
一部の実施形態では、第三のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが、負電荷をもつアミノ酸置換を含み、第六のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが、正電荷をもつアミノ酸置換を含み、第一、第二、第四、及び第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された突起を含み、第七、第八、第九、及び第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された空洞を含む。
【００４６】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃは第三のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ１’−Ｂ’−Ｌ２’−Ｃ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第四のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１’はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第五のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２’はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃ’は第六のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトであって、ＡとＡ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ｂと第七のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ｃと第八のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、Ｂ’と第九のＦｃドメイン単量体とが結合して第四のＦｃドメインを形成し、Ｃ’と第十のＦｃドメイン単量体とが結合して第五のＦｃドメインを形成する、Ｆｃコンストラクトを特徴とする。
【００４７】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、第一及び第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体及び第四のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第二及び第七のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体及び第七のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第三及び第八のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第三のＦｃドメイン単量体及び第八のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第五及び第九のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第五のＦｃドメイン単量体及び第九のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第六及び第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第六のＦｃドメイン単量体及び第十のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００４８】
一部の実施形態では、第一のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが、負電荷をもつアミノ酸置換を含み、第四のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが、正電荷をもつアミノ酸置換を含み、第二、第三、第五、及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された突起を含み、第七、第八、第九、及び第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された空洞を含む。
【００４９】
本明細書に記載の五つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトの一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ１’、及びＬ２’のそれぞれは、少なくとも４、８、又は１２個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ１’、及びＬ２’のそれぞれは、４〜３０、８〜３０、又は１２〜３０個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ１’及びＬ２’のそれぞれは、
2019519528.tif 000027
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００５０】
本明細書に記載の五つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトの一部の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、及び第六のポリペプチドは、Ｆｃドメイン単量体からなる。
【００５１】
本明細書に記載の五つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトの一部の実施形態では、第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のポリペプチドのうちの一つ又は複数内のＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。一部の実施形態では、第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のポリペプチドのそれぞれにおけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。
【００５２】
一部の実施形態では、第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のポリペプチドのうちの一つ又は複数は、Ｃ末端リシンを欠いている。一部の実施形態では、第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のポリペプチドのそれぞれは、Ｃ末端リシンを欠いている。
【００５３】
一部の実施形態では、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有し、第三、第四、第五、及び第六のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する。
【００５４】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃは第三のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ１’−Ｂ’−Ｌ２’−Ｃ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第四のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第五のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２’はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃ’は第六のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトであって、第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、第四のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、第三のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成する、Ｆｃコンストラクトを特徴とする。
【００５５】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、第一及び第二のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体及び第二のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第四及び第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第四のＦｃドメイン単量体及び第五のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第三及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第三のＦｃドメイン単量体及び第六のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００５６】
一部の実施形態では、第一及び第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された突起を含み、第二及び第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された空洞を含み、第三のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが、負電荷をもつアミノ酸置換を含み、第六のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが、正電荷をもつアミノ酸置換を含む。
【００５７】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、Ｌ２及びＬ２’のそれぞれは少なくとも１２個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ２及びＬ２’のそれぞれは、４〜３０、８〜３０、又は１２〜３０個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ２及びＬ２’のそれぞれは、
2019519528.tif 000028
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００５８】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ’、Ｂ’、及びＣ’のそれぞれは、Ｆｃドメイン単量体からなる。
【００５９】
この開示のこの態様の一部の実施形態では、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する。
【００６０】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトであって、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ｌ及びＬ’の少なくとも一つはグリシンスペーサーである、Ｆｃコンストラクトを特徴とする。
【００６１】
この態様の一部の実施形態では、第一及び第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体及び第三のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第二及び第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体及び第四のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００６２】
この態様の一部の実施形態では、第一及び第二のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された突起を含み、第三及び第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された空洞を含む。
【００６３】
この態様の一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’の少なくとも一つは、少なくとも４、８、又は１２個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’の少なくとも一つは、４〜３０、８〜３０、又は１２〜３０個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’の少なくとも一つは、
2019519528.tif 000029
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。この態様の一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’のそれぞれは、少なくとも４、８、又は１２個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’のそれぞれは、４〜３０、８〜３０、又は１２〜３０個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’のそれぞれは、
2019519528.tif 000030
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００６４】
この態様の一部の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ａ’、及びＢ’のうちの一つ又は複数が、Ｆｃドメイン単量体からなる。この態様の一部の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ａ’、及びＢ’のそれぞれが、Ｆｃドメイン単量体からなる。
【００６５】
この開示の先述の二つの態様の一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのうちの一つ又は複数におけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれにおけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。
【００６６】
この開示の先述の二つの態様の一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのうちの一つ又は複数は、Ｃ末端リシンを欠いている。一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、Ｃ末端リシンを欠いている。
【００６７】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト内のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、及びＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト内のＦｃドメイン単量体のそれぞれは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体である。
【００６８】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、ＢとＢ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ａと第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ａ’と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成する、組成物を特徴とする。
【００６９】
この態様の一部の実施形態では、Ｂ及びＢ’のそれぞれが変異Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄを含み、Ａ及びＡ’のそれぞれが変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＥ３５７Ｋを含み、第五のＦｃドメイン単量体及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＫ３７０Ｄを含む。
【００７０】
この態様の一部の実施形態では、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有し、また第三のポリペプチド及び第四のポリペプチドが、組成物中のＦｃコンストラクトにおいて同一のアミノ酸配列を有する。
【００７１】
一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000031
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％の配列同一性）を有する。一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000032
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、最大１０（９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ、
2019519528.tif 000033
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００７２】
一部の実施形態では、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000034
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％の配列同一性）を有する。一部の実施形態では、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000035
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。この開示の一部の実施形態では、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、最大１０（９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ、
2019519528.tif 000036
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００７３】
この態様の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内の第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000037
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなるものであり、組成物中のＦｃコンストラクト内の第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000038
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、最大１０（９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ、
2019519528.tif 000039
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなるものであり、組成物中のＦｃコンストラクト内の第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
最大１０（９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ、
2019519528.tif 000040
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。一部の場合では、本明細書に記載のＦｃコンストラクトのいずれか一つは、抗炎症活性を有する。
【００７４】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトのいずれかの一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つ又は複数が、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン単量体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）である。一部の場合では、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つ又は複数が、最大１０個のアミノ酸修飾（例えば、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸修飾）を有するＩｇＧ  Ｆｃドメイン単量体である。一部の場合では、Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが、１０個以下のアミノ酸修飾（例えば、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸修飾）を有する。
【００７５】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、ＡとＡ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ｂと第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ｂ’と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成する、組成物を特徴とする。
【００７６】
この態様の一部の実施形態では、Ａ及びＡ’のそれぞれが変異Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｂ及びＢ’のそれぞれが変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＥ３５７Ｋを含み、第五及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＫ３７０Ｄを含む。
【００７７】
この態様の一部の実施形態では、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有し、また第三のポリペプチド及び第四のポリペプチドが、組成物中のＦｃコンストラクトにおいて同一のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号：４９）を有し、また第三のポリペプチド及び第四のポリペプチドが、組成物中のＦｃコンストラクトにおいて同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号：４８）を有する。
【００７８】
この態様の一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000041
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％の配列同一性）を有する。一部の実施形態では、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000042
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００７９】
この態様の一部の実施形態では、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000043
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％の配列同一性）を有する。一部の実施形態では、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000044
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００８０】
この態様の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内の第一及び第二のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000045
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなるものであり、組成物中のＦｃコンストラクト内の第三及び第四のポリペプチドのそれぞれは、
2019519528.tif 000046
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【００８１】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物を特徴するものであって、ＢとＢ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ａと第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ａ’と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成するものであって、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドはそれぞれ、配列番号：４９の配列を含む、該配列からなる、又は実質的に該配列からなるものであり、また第三のポリペプチド及び第四のポリペプチドはそれぞれ、配列番号：４８の配列を含む、該配列からなる、又は実質的に該配列からなる。
【００８２】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、ＡとＡ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ｂと第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ｂ’と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成するものであって、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドはそれぞれ、配列番号：６１の配列を含む、該配列からなる、又は実質的に該配列からなるものであり、また第三のポリペプチド及び第四のポリペプチドはそれぞれ、配列番号：４８の配列を含む、該配列からなる、又は実質的に該配列からなる、組成物を特徴とする。
【００８３】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドとを含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成する、組成物を特徴とする。
【００８４】
この態様の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内の第一及び第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体及び第三のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第二及び第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体及び第四のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００８５】
この態様の一部の実施形態では、第一及び第二のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された突起を含み、第三及び第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された空洞を含む。
【００８６】
この態様の一部の実施形態では、第二のポリペプチド及び第三のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する。
【００８７】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃは第三のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ１’−Ｂ’−Ｌ２’−Ｃ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第四のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１’はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第五のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２’はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃ’は第六のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、Ａと第七のＦｃドメイン単量体とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、ＢとＢ’とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ｃと第八のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、Ａ’と第九のＦｃドメイン単量体とが結合して第四のＦｃドメインを形成し、Ｃ’と第十のＦｃドメイン単量体とが結合して第五のＦｃドメインを形成する、組成物を特徴とする。
【００８８】
この態様の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内の第一及び第七のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体及び第七のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第二及び第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体及び第五のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第三及び第八のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第三のＦｃドメイン単量体及び第八のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第四及び第九のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第四のＦｃドメイン単量体及び第九のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第六及び第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第六のＦｃドメイン単量体及び第十のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００８９】
この態様の一部の実施形態では、第二のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが負電荷をもつアミノ酸置換を含み、第五のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが正電荷をもつアミノ酸置換を含み、第一、第三、第四、及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが操作された突起を含み、第七、第八、第九、及び第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが操作された空洞を含む。
【００９０】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃは第三のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ１’−Ｂ’−Ｌ２’−Ｃ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第四のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１’はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第五のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２’はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃ’は第六のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、ＣとＣ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ｂと第七のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ａと第八のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、Ｂ’と第九のＦｃドメイン単量体とが結合して第四のＦｃドメインを形成し、Ａ’と第十のＦｃドメイン単量体とが結合して第五のＦｃドメインを形成する、組成物を特徴とする。
【００９１】
この態様の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内の第三及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第三のＦｃドメイン単量体及び第六のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第二及び第七のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体及び第七のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第一及び第八のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体及び第八のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第五及び第九のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第五のＦｃドメイン単量体及び第九のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第四及び第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第四のＦｃドメイン単量体及び第十のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００９２】
この態様の一部の実施形態では、第三のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが、負電荷をもつアミノ酸置換を含み、第六のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが、正電荷をもつアミノ酸置換を含み、第一、第二、第四、及び第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された突起を含み、第七、第八、第九、及び第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された空洞を含む。
【００９３】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃは第三のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ１’−Ｂ’−Ｌ２’−Ｃ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第四のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１’はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第五のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２’はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃ’は第六のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、ＡとＡ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ｂと第七のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ｃと第八のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、Ｂ’と第九のＦｃドメイン単量体とが結合して第四のＦｃドメインを形成し、Ｃ’と第十のＦｃドメイン単量体とが結合して第五のＦｃドメインを形成する、組成物を特徴とする。
【００９４】
この態様の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内の第一及び第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体及び第四のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第二及び第七のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体及び第七のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第三及び第八のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第三のＦｃドメイン単量体及び第八のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第五及び第九のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第五のＦｃドメイン単量体及び第九のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第六及び第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第六のＦｃドメイン単量体及び第十のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００９５】
この態様の一部の実施形態では、第一のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが負電荷をもつアミノ酸置換を含み、第四のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが正電荷をもつアミノ酸置換を含み、第二、第三、第五、及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが操作された突起を含み、第七、第八、第九、及び第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが操作された空洞を含む。
【００９６】
本明細書に記載の五つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有し、第三、第四、第五、及び第六のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する。
【００９７】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃは第三のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ１’−Ｂ’−Ｌ２’−Ｃ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第四のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第五のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２’はグリシンスペーサーであり、ｖ）Ｃ’は第六のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、第四のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、第三のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成する、組成物を特徴とする。
【００９８】
この態様の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内の第一及び第二のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体及び第二のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第四及び第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第四のＦｃドメイン単量体及び第五のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第三及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第三のＦｃドメイン単量体及び第六のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００９９】
この態様の一部の実施形態では、第一及び第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された突起を含み、第二及び第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された空洞を含み、第三のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが、負電荷をもつアミノ酸置換を含み、第六のＦｃドメイン単量体の相補的な二量体形成選択性モジュールが、正電荷をもつアミノ酸置換を含む。
【０１００】
この態様の一部の実施形態では、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する。
【０１０１】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ｌ及びＬ’の少なくとも一つはグリシンスペーサーである、組成物を特徴とする。
【０１０２】
この態様の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内の第一及び第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体及び第三のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第二及び第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体及び第四のＦｃドメイン単量体間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【０１０３】
この態様の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内の第一及び第二のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された突起を含み、組成物中のＦｃコンストラクト内の第三及び第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれの相補的な二量体形成選択性モジュールが、操作された空洞を含む。
【０１０４】
この態様の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のＬ及びＬ’の少なくとも一つは、少なくとも４、８、又は１２個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’の少なくとも一つは、４〜３０、８〜３０、又は１２〜３０個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’の少なくとも一つは、
2019519528.tif 000047
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。この態様の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のＬ及びＬ’のそれぞれは、少なくとも４、８、又は１２個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’のそれぞれは、４〜３０、８〜３０、又は１２〜３０個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’のそれぞれは、
2019519528.tif 000048
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【０１０５】
この態様の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のＡ、Ｂ、Ａ’、及びＢ’のうちの一つ又は複数が、Ｆｃドメイン単量体からなる。この態様の一部の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ａ’、及びＢ’のそれぞれが、Ｆｃドメイン単量体からなる。
【０１０６】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のＬ、Ｌ’、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ１’、及びＬ２’のうちの一つ又は複数は、少なくとも４、８、又は１２個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ、Ｌ’、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ１’、及びＬ２’のそれぞれは、少なくとも４、８、又は１２のグリシンを含む。
【０１０７】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のＬ、Ｌ’、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ１’、及びＬ２’のうちの一つ又は複数は、４〜３０、８〜３０、又は１２〜３０個のグリシンを含む。一部の実施形態では、Ｌ、Ｌ’、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ１’、及びＬ２’のそれぞれは、４〜３０、８〜３０、又は１２〜３０個のグリシンを含む。
【０１０８】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のＬ、Ｌ’、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ１’、及びＬ２’のうちの一つ又は複数は、
2019519528.tif 000049
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。一部の実施形態では、Ｌ、Ｌ’、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ１’、及びＬ２’のそれぞれは、
2019519528.tif 000050
の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【０１０９】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のＡ、Ｂ、Ｃ、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、及び第六のポリペプチドのうちの一つ又は複数は、Ｆｃドメイン単量体からなる。本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、及び第六のポリペプチドのそれぞれは、Ｆｃドメイン単量体からなる。
【０１１０】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のＦｃドメイン単量体のうちの一つ又は複数が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、及びＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、及びＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。
【０１１１】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のＦｃドメイン単量体のうちの一つ又は複数が、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体である。本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体である。
【０１１２】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のポリペプチドのうちの一つ又は複数におけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のポリペプチドのそれぞれにおけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。
【０１１３】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のポリペプチドのうちの一つ又は複数が、Ｃ末端リシンを欠いている。本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リシンを欠いている。
【０１１４】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、ＢとＢ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ａと第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ａ’と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成するものであって、第一、第二、第三、及び第四のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リシンを欠いている、組成物を特徴する。
【０１１５】
別の態様では、この開示は、両方がＣ末端リシンのコドンを欠いている二つのポリヌクレオチドを発現する宿主細胞であって、第一のポリヌクレオチドが、この開示の先述の態様の第一及び第二のポリペプチドのそれぞれをコードし、第二のポリヌクレオチドが、この開示の先述の態様の第三及び第四のポリペプチドのそれぞれをコードする、宿主細胞を特徴とするもの。
【０１１６】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドとを含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、第一、第二、及び第三のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リシンを欠いている、組成物を特徴とする。
【０１１７】
別の態様では、この開示は、両方がＣ末端リシンのコドンを欠いている二つのポリヌクレオチドを発現する宿主細胞であって、第一のポリヌクレオチドが、この開示の先述の態様の第一のポリペプチドをコードし、また第二のポリヌクレオチドが、この開示の先述の態様の第二及び第三のポリペプチドのそれぞれをコードする、宿主細胞を特徴とする。
【０１１８】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２はリンカーであり、ｖ）Ｃは第三のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ１’−Ｂ’−Ｌ２’−Ｃ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第四のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第五のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２’はリンカーであり、ｖ）Ｃ’は第六のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、Ａと第七のＦｃドメイン単量体とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、ＢとＢ’とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ｃと第八のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、Ａ’と第九のＦｃドメイン単量体とが結合して第四のＦｃドメインを形成し、Ｃ’と第十のＦｃドメイン単量体とが結合して第五のＦｃドメインを形成し、第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リシンを欠いている、組成物を特徴とする。
【０１１９】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２はリンカーであり、ｖ）Ｃは第三のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ１’−Ｂ’−Ｌ２’−Ｃ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第四のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第五のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２’はリンカーであり、ｖ）Ｃ’は第六のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、ＣとＣ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ｂと第七のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ａと第八のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、Ｂ’と第九のＦｃドメイン単量体とが結合して第四のＦｃドメインを形成し、Ａ’と第十のＦｃドメイン単量体とが結合して第五のＦｃドメインを形成し、第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リシンを欠いている、組成物を特徴とする。
【０１２０】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２はリンカーであり、ｖ）Ｃは第三のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ１’−Ｂ’−Ｌ２’−Ｃ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第四のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第五のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２’はリンカーであり、ｖ）Ｃ’は第六のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、ＡとＡ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ｂと第七のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ｃと第八のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、Ｂ’と第九のＦｃドメイン単量体とが結合して第四のＦｃドメインを形成し、Ｃ’と第十のＦｃドメイン単量体とが結合して第五のＦｃドメインを形成し、第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リシンを欠いている、組成物を特徴とする。
【０１２１】
別の態様では、この開示は、両方がＣ末端リシンのコドンを欠いている二つのポリヌクレオチドを発現する宿主細胞であって、第一のポリヌクレオチドが、この開示の先述の三つの態様のいずれか一つの第一及び第二のポリペプチドのそれぞれをコードし、また第二のポリヌクレオチドが、この開示の先述の三つの態様のいずれか一つの第三、第四、第五、及び第六のポリペプチドのそれぞれをコードする、宿主細胞を特徴とする。
【０１２２】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２はリンカーであり、ｖ）Ｃは第三のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ１’−Ｂ’−Ｌ２’−Ｃ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第四のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ１’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第五のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｖ）Ｌ２’はリンカーであり、ｖ）Ｃ’は第六のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、第四のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、第三のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リシンを欠いている、組成物を特徴とする。
【０１２３】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物であって、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リシンを欠いている、組成物を特徴とする。
【０１２４】
別の態様では、この開示は、Ｃ末端リシンのコドンを欠いているポリヌクレオチドを発現する宿主細胞であって、該ポリヌクレオチドが、この開示の先述の二つの態様のいずれかの第一及び第二のポリペプチドのそれぞれをコードする、宿主細胞を特徴とする。
【０１２５】
別の態様では、この開示は、本明細書に記載のＦｃコンストラクトを調製する方法を特徴とする。該方法には、ａ）この開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供することと、ｂ）Ｆｃコンストラクトの形成を可能にするする条件下で該宿主細胞中でポリペプチドを発現させることと、ｃ）Ｆｃコンストラクトを回収することとが含まれる。
【０１２６】
別の態様では、この開示は、本明細書に記載のＦｃコンストラクトを発現する宿主細胞を特徴とする。該宿主細胞は、この開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであって、該ポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現される。
【０１２７】
別の態様では、この開示は、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）の実質的に均質な集団を含む医薬組成物又は本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物）、及び、一つ又は複数の薬剤的に許容できるキャリアもしくは賦形剤を特徴とする。こうした医薬組成物は、Ｆｃコンストラクトの実質的な凝集又は望まない多量体形成なしに作製することができる。
【０１２８】
別の態様では、この開示は、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）又は本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物）を、対象に投与することを含む、対象において免疫応答の免疫細胞活性化を軽減する方法を特徴とする。一部の実施形態では、対象は自己免疫疾患を有する。
【０１２９】
別の態様では、この開示は、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）又は本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物）を、対象に投与することを含む、対象における炎症又は炎症性疾患を治療する方法を特徴とする。
【０１３０】
別の態様では、この開示は、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）又は本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物）を、対象に投与することを含む、対象において自己抗体のクリアランスを促進する又は抗原提示を抑制する方法を特徴とする。
【０１３１】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を投与することによって治療され得る例示的な疾患には、関節リウマチ（ＲＡ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；ＡＮＣＡ関連血管炎；抗リン脂質抗体症候群；自己免疫性溶血性貧血；慢性炎症性脱髄性ニューロパシー；移植における抗アロ（ａｎｔｉ−ａｌｌｏ）、ＧＶＨＤにおける抗自己（ａｎｔｉ−ｓｅｌｆ）、抗置換、ＩｇＧ治療、ＩｇＧパラプロテインのクリアランス；皮膚筋炎；グッドパスチャー症候群；抗体依存性細胞媒介性細胞障害により媒介される器官系を標的とするＩＩ型過敏症症候群、例えばギラン・バレー症候群、ＣＩＤＰ、皮膚筋炎、フェルティ症候群、抗体媒介性拒絶反応、自己免疫性甲状腺疾患、潰瘍性大腸炎、自己免疫性肝疾患；突発性血小板減少性紫斑病；重症筋無力症、視神経脊髄炎；天疱瘡及び他の自己免疫性水疱性疾患；シェーグレン症候群；抗体依存性ファゴサイトーシスにより媒介される、自己免疫性血球減少症及び他の障害；例えば滑膜炎、皮膚筋炎、全身性血管炎、糸球体炎、及び血管炎である他のＦｃＲ依存性炎症症候群を含む。
【０１３２】
別の態様では、この開示は、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はグリシンスペーサーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、を含むＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む細胞培養培地であって、第一及び第二のポリペプチドのそれぞれが、
2019519528.tif 000051
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有し、第三及び第四のポリペプチドのそれぞれが、
2019519528.tif 000052
の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有し、ＢとＢ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ａと第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ａ’及び第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成し、Ｂ及びＢ’のそれぞれが変異Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄを含み、Ａ及びＡ’のそれぞれが変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＥ３５７Ｋを含み、第五及び第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＫ３７０Ｄを含み、Ｌ及びＬ’のそれぞれが１２〜３０個のグリシンを含み、第一、第二、第三、及び第四のポリペプチドのそれぞれがＣ末端リシンを欠いている、細胞培養培地を特徴とする。
【０１３３】
別の態様では、この開示は、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、この開示の第一の態様のＦｃコンストラクト）の実質的に均質な集団を含む細胞培養培地を調製する方法を特徴とする。該方法は、ａ）細胞培養培地中において宿主細胞を提供することであって、該細胞がＦｃコンストラクト（例えば、この開示の第一の態様のＦｃコンストラクト）の第一、第二、第三、及び第四のポリペプチドのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを含むことと、ｂ）Ｆｃコンストラクトの形成及び細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、宿主細胞内でポリペプチドを発現させることと、ｃ）細胞培養培地を回収することとを含む。
【０１３４】
さらに、この開示はまた、開示の他のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む他の細胞培養培地と、こうした細胞培養培地を調製する方法とを特徴とする。
【０１３５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクトは、抗原認識領域、例えば可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含まない。一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクト（又はＦｃコンストラクト内のＦｃドメイン）は、異なるポリペプチド内に存在する、Ｆｃドメイン単量体の会合によって全体的に又は一部形成される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクトは、抗原認識領域、例えば可変領域又はＣＤＲを含む。或る実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、二つのポリペプチドの会合を促進する追加ドメイン（例えば、ＩｇＭテールピース（ｔａｉｌｐｉｅｃｅ）又はＩｇＡテールピース）を含まない。他の実施形態では、連結してＦｃドメインを形成する二つのＦｃドメイン単量体の間にのみ、Ｆｃコンストラクト内に、共有結合が存在する。他の実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、Ｆｃドメイン間に共有結合を含まない。さらに他の実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、Ｆｃコンストラクト内のＦｃドメインの全て又は実質的に全てが、細胞表面上のＦｃ受容体と同時に相互作用することができるように、十分な構造的柔軟性を備える。一実施形態では、ドメイン単量体は、一次配列が野生型と異なる又は互いに異なるものであって、それらは、二量体形成選択性モジュール（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｍｏｄｕｌｅ）を有する。
【０１３６】
コンストラクトのＦｃドメインのうちのＦｃドメイン単量体は、同一の一次アミノ酸配列を有することが可能である。例えば、ＦｃドメインのうちのＦｃドメイン単量体は両方とも同一の二量体形成選択性モジュールを有してよく、例えばＦｃドメインのうちのＦｃドメイン単量体が両方とも、ＣＨ３ドメイン間の界面において電荷をもつ残基の環の範囲内の少なくとも二つの位置において同一の逆電荷の変異を有することができる。
【０１３７】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトのいずれかにおいては、或るコンストラクトのＦｃドメインのうちのＦｃドメイン単量体は、二つのＦｃドメイン単量体間（すなわち、ＦｃコンストラクトのＦｃドメイン単量体と他の単量体との間）において、異なる配列、例えば２０個以下、１５個以下、１０個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、又は２個以下のアミノ酸である、２０個以下のアミノ酸（例えば、１５個以下、１０個以下のアミノ酸）だけ異なる配列を有することが可能である。例えば、本明細書に記載のコンストラクトのうちのＦｃドメイン単量体配列は異なるものであってよいが、それはＦｃコンストラクトのいずれかの相補的な二量体形成選択性モジュールが、ドメイン単量体の一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内に操作された空洞と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３抗体定常ドメイン内に操作された突起とを含むことが可能であり、該操作された空洞及び該操作された突起は、Ｆｃドメイン単量体の空洞に突起が挿入された対を形成するように位置決めされる。例示的な操作された空洞及び突起を表１に示している。他の実施形態では、相補的な二量体形成選択性モジュールは、ドメイン単量体の一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内に操作された（置換された）負電荷をもつアミノ酸と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３抗体定常ドメイン内に操作された（置換された）正電荷をもつアミノ酸とを含むものであって、負電荷をもつアミノ酸及び正電荷をもつアミノ酸は、相補的なドメイン単量体間においてＦｃドメインの形成を促進するように位置決めされる。例示的な相補的アミノ酸の変更を表２Ａ〜２Ｃに示している。
【０１３８】
この開示はまた、本明細書に記載の任意のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、医薬品使用適格の滅菌注射器又はバイアルが、医薬組成物を含有するものであって、唯一の活性成分が又は主要活性成分が、本明細書に記載のＦｃコンストラクトのうちのいずれか一つの実質的に均質な集団である。該医薬組成物は、例えば塩類、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、サーファクタント、充填剤、ポリマー、防腐剤、及び他の医薬品賦形剤から選択される、一つ又は複数の不活性成分を含んでもよい。
【０１３９】
他の態様では、この開示は、本明細書に記載のＦｃコンストラクトのいずれかを含む医薬組成物を提供する。
【０１４０】
一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、異なるポリペプチド内に存在する、Ｆｃドメイン単量体の会合によって少なくとも一部形成される。或る実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、異なるポリペプチド内に存在する、Ｆｃドメイン単量体の会合によって形成される。これら実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、二つのポリペプチドの会合を促進する追加ドメイン（例えば、ＩｇＭテールピース又はＩｇＡテールピース）を含まない。他の実施形態では、連結してＦｃドメインを形成する二つのＦｃドメイン単量体の間にのみ、共有結合（例えば、ジスルフィド架橋）が存在する。他の実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、Ｆｃドメイン間に共有結合（例えば、ジスルフィド架橋）を含まない。さらに他の実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、Ｆｃコンストラクト内のＦｃドメインの全て又は実質的に全てが、細胞表面上のＦｃ受容体と同時に相互作用することができるように、十分な構造的柔軟性を備える。これら実施形態のいずれかのうちの或る実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、リンカー（例えば、柔軟なアミノ酸スペーサー）を介して連結する、少なくとも二つのＦｃドメインを含む。
【０１４１】
別の態様では、この開示は、Ｆｃドメイン単量体の選択的な二量体形成を促進する組成物及び方法を特徴とする。この開示は、Ｆｃドメインを含むものであって、該Ｆｃドメインのうちの二つのＦｃドメイン単量体が、ＣＨ３抗体定常ドメイン間の界面において電荷をもつ残基の環の範囲内の少なくとも二つの位置において同一の変異を含む。この開示はまた、こうしたＦｃドメインの作製方法を含み、ＣＨ３抗体定常ドメイン間の界面において電荷をもつ残基の環の範囲内の少なくとも二つの位置において二つのＦｃドメイン単量体配列内に同一の変異を有する相補的な二量体形成選択性モジュールを導入することを含む。ＣＨ３抗体定常ドメイン間の界面は、電荷をもつ残基の環により包囲される疎水性パッチ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｐａｔｃｈ）からなる。一つのＣＨ３抗体定常ドメインが他と一体となるとき、これら電荷をもつ残基は、反対の電荷をもつ残基と共に対を形成する。残基の２以上の相補的な対の両要素の電荷が反転していることによって、変異したＦｃドメイン単量体は同じ変異の配列のＦｃドメイン単量体に対して相補性を維持するが、こうした変異なしではＦｃドメイン単量体に対する相補性はより小さい。この実施形態では、同一の二量体形成選択性モジュールが、ホモ二量体形成を促進する。こうしたＦｃドメインは、二重変異体である、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３５６Ｋ／Ｋ４３９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｅ／Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｄ、又はＤ３５６Ｋ／Ｋ４３９Ｅを含有するＦｃドメイン単量体を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、例えばＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｅである二重変異体の任意の対を結合した四重変異体を含むＦｃドメイン単量体を含む。
【０１４２】
別の実施形態では、同一の二量体形成選択性モジュールに加えて、ＦｃドメインのＦｃドメイン単量体は、特定の会合を促進する非同一の変異（例えば、操作された空洞と突起）を有する相補的な二量体形成選択性モジュールを有する。結果として、二つのＦｃドメイン単量体が、二つの二量体形成選択性モジュールを含み、互いに対して相補性を維持するが、他のＦｃドメイン単量体に対する相補性は小さい。この実施形態は、空洞含有Ｆｃドメインと突起含有Ｆｃドメイン単量体との間でのヘテロ二量体形成を促進する。一実施例では、両Ｆｃドメイン単量体の電荷をもつ対の残基内の非同一の変異を有する相補的な二量体形成選択性モジュールが、一方のＦｃドメイン単量体上の突起及び他方のＦｃドメイン単量体上の空洞と組み合わされる。
【０１４３】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトのいずれかにおいては、Ｆｃドメイン単量体の順序は入れ替え可能であるということが理解される。例えば、式Ａ−Ｌ−Ｂを有するポリペプチドにおいて、Ａのカルボキシ末端がＬのアミノ末端と連結可能であり、またＬはそのカルボキシ末端がＢのアミノ末端と連結している。あるいは、Ｂのカルボキシ末端はＬのアミノ末端と連結可能であり、またＬはそのカルボキシ末端がＣのアミノ末端と連結している。これら構成はどちらも式Ａ−Ｌ−Ｂに含まれる。
【０１４４】
定義：
ここで、「Ｆｃドメイン単量体」という語は、少なくとも一つのヒンジドメインと第二の抗体定常ドメイン及び第三の抗体定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）を含むポリペプチド鎖又はその機能的断片（例えば、（ｉ）他のＦｃドメイン単量体と二量体形成してＦｃドメインを形成することと、（ｉｉ）Ｆｃ受容体と結合することとが可能である断片）を指す。Ｆｃドメイン単量体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＤを含む、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプとすることが可能である（例えば、ＩｇＧ）。さらに、Ｆｃドメイン単量体は、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）とすることが可能である（例えば、ＩｇＧ１）。Ｆｃドメイン単量体は、抗原認識領域、例えば可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）として機能することが可能である、免疫グロブリンの部分を何も含まない。Ｆｃドメイン単量体は、野生型Ｆｃドメイン単量体配列からの変更を１０程度（例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４のアミノ酸置換、付加、又は欠失）含有することが可能であり、該変更は、ＦｃドメインとＦｃ受容体間の相互作用を変える。好適な変更の例は、この技術分野で公知である。
【０１４５】
ここで、「Ｆｃドメイン」という語は、Ｆｃ受容体を結合することが可能である二つのＦｃドメイン単量体による二量体を指す。野生型Ｆｃドメインでは、二つのＦｃドメイン単量体が二つのＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体形成するのみならず、二量体形成している二つのＦｃドメイン単量体のヒンジドメイン間に、一つ又は複数のジスルフィド結合を形成する。
【０１４６】
本開示では、「Ｆｃコンストラクト」という語は、本明細書に記載のＦｃドメインを形成する会合したポリペプチド鎖を指す（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）。本明細書に記載されるＦｃコンストラクトは、同一又は異なる配列を有するＦｃドメイン単量体を含むことが可能である。例えば、Ｆｃコンストラクトは三つのＦｃドメインを有することが可能であり、そのうちの二つがＩｇＧ１又はＩｇＧ１由来のＦｃドメイン単量体を含み、三つ目がＩｇＧ２又はＩｇＧ２由来のＦｃドメイン単量体を含む。別の例では、Ｆｃコンストラクトは三つのＦｃドメインを有することが可能であり、そのうちの二つが「空洞に突起が挿入された対（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ  ｐａｉｒ）」を含み、三つ目は「空洞に突起が挿入された対（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ  ｐａｉｒ）」を含まない。本開示では、Ｆｃドメインは例えばＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ、又はＨＶＲである、抗体の可変領域を含まない。Ｆｃドメインは、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃγＲＩＶであるＦｃ受容体と結合する最小限の構造を形成する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクトは、抗原認識領域、例えば可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含まない。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクトは、抗原認識領域、例えば可変領域又はＣＤＲを含む。
【０１４７】
ここで、「抗体定常ドメイン」という語は、抗体の定常領域ドメイン（例えば、ＣＬ抗体定常ドメイン、ＣＨ１抗体定常ドメイン、ＣＨ２抗体定常ドメイン、又はＣＨ３抗体定常ドメイン）に相当するポリペプチドを指す。
【０１４８】
ここで、「促進する」という語は、例えば他の別個のＦｃドメイン単量体に対するよりも、互いに高い結合親和性を有する二つのＦｃドメイン単量体でＦｃドメインを形成することを支持するといったように、促すこと及び支持することを意味する。本明細書に記載するように、結合してＦｃドメインを形成する二つのＦｃドメイン単量体は、それらの各ＣＨ３抗体定常ドメインの界面において適合可能なアミノ酸修飾（例えば、操作された突起及び操作された空洞）を有することが可能である。適合可能なアミノ酸修飾は、こうしたアミノ酸修飾を有さない、又は適合しないアミノ酸修飾をもつ他のＦｃドメイン単量体よりも、こうしたＦｃドメイン単量体同士での選択的な相互作用を促進する又は支持する。これは、相互作用する二つのＣＨ３抗体定常ドメインの界面におけるアミノ酸修飾に起因して、Ｆｃドメイン単量体が、アミノ酸修飾を有さない他のＦｃドメイン単量体に対するよりも互いに対して高い親和性を有することを理由に起こる。
【０１４９】
ここで「二量体形成選択性モジュール」という語は、二つのＦｃドメイン単量体間の好都合な対形成を促進するＦｃドメイン単量体の配列を指す。「相補的」な二量体形成選択性モジュールは、二つのＦｃドメイン単量体の互いに対する選択的な相互作用を促進する又は支持する二量体形成選択性モジュールである。相補的な二量体形成選択性モジュールは、同一の配列又は異なる配列を有することが可能である。例示的な相補的な二量体形成選択性モジュールを本明細書に記載している。
【０１５０】
ここで「操作された空洞（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃａｖｉｔｙ）」という語は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸残基のうちの少なくとも一つが、本来のアミノ酸残基よりも低分子量の側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されることによって、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に形成された三次元の空洞を指す。「本来のアミノ酸残基」という語は、野生型のＣＨ３抗体定常ドメインの遺伝コードによってコードされた天然のアミノ酸残基を指す。
【０１５１】
ここで「操作された突起（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ）」という語は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸残基のうちの少なくとも一つが、本来のアミノ酸残基よりも高分子量の側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されることによって、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に形成された三次元の突起を指す。「本来のアミノ酸残基」という語は、野生型のＣＨ３抗体定常ドメインの遺伝コードによってコードされた天然のアミノ酸残基を指す。
【０１５２】
「空洞に突起が挿入された対」という語は、第一のＦｃドメイン単量体がそのＣＨ３抗体定常ドメイン内に操作された空洞を含む一方で、第二のＦｃドメイン単量体がそのＣＨ３抗体定常ドメイン内に操作された突起を含むものである二つのＦｃドメイン単量体を含んだＦｃドメインを説明するものである。空洞に突起が挿入された対においては、第一のＦｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内の操作された突起は、該突起が第二のＦｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内の操作された空洞と、ＣＨ３抗体定常ドメイン間の界面における二量体の正常な会合を有意に邪魔することなく相互作用するように配置される。
【０１５３】
ここで、「ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」という語は、二つのＦｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、該二つのＦｃドメイン単量体は、これら二つのＦｃドメイン単量体の好ましい形成を促進する異なる逆電荷の変異（例えば、表２Ａの変異を参照）を含有する。図１及び２に示すように、三つのＦｃドメインである、一つのカルボキシル末端「幹」Ｆｃドメインと二つのアミノ末端「枝」Ｆｃドメインとを有するＦｃコンストラクトにおいては、アミノ末端「枝」Ｆｃドメインのそれぞれが、ヘテロ二量体のＦｃドメイン（「枝ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」とも称する）であり得る（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１０６及び１１４、又はＦｃドメイン単量体１１２及び１１６によって形成されるヘテロ二量体Ｆｃドメイン、図２のＦｃドメイン単量体２０６及び２１４、又はＦｃドメイン単量体２１２及び２１６によって形成されるヘテロ二量体Ｆｃドメイン）。
【０１５４】
ここで「ホモ二量体Ｆｃドメイン」という語は、二つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、該二つのＦｃドメイン単量体は、同一の逆電荷の変異（例えば、表２Ｂ及び２Ｃの変異を参照）を含有する。図１及び２に示すように、三つのＦｃドメインである、一つのカルボキシル末端「幹」Ｆｃドメインと二つのアミノ末端「枝」Ｆｃドメインとを有するＦｃコンストラクトにおいては、カルボキシ末端「幹」Ｆｃドメインが、ホモ二量体のＦｃドメイン（「幹ホモ二量体Ｆｃドメイン」とも称する）であり得る（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１０４及び１１０によって形成されるホモ二量体Ｆｃドメイン、図２のＦｃドメイン単量体２０４及び２１０によって形成されるホモ二量体Ｆｃドメイン）。
【０１５５】
ここで「ヘテロ二量体形成選択性モジュール」という語は、適合するヘテロ二量体形成選択性モジュールを有する二つのＦｃドメイン単量体の好ましいヘテロ二量体形成を促進するために、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内に作製することが可能である、操作された突起、操作された空洞、及び特定の逆電荷のアミノ酸置換を指す。ヘテロ二量体形成選択性モジュールを含有するＦｃドメイン単量体が結合して、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成し得る。ヘテロ二量体形成選択性モジュールの例を、表１及び２Ａに示している。
【０１５６】
ここで「ホモ二量体形成選択性モジュール」という語は、Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成を促進してホモ二量体Ｆｃドメインを形成するＣＨ３ドメイン間の界面において電荷をもつ残基の環の範囲内の少なくとも二つの位置におけるＦｃドメイン単量体内の逆電荷の変異を指す。ホモ二量体形成選択性モジュールの例を、表２Ａ及び２Ｂに示している。
【０１５７】
ここで、「連結する」という語は、化学的な連結、組換え手段、ならびに例えばジスルフィド結合及びアミド結合である化学結合を含む手段によって、２以上の成分、要素、成分、又は例えばポリペプチドであるタンパク質ドメインを組み合わせる又は結合させることを説明するために用いる。例えば、二つの単一ポリペプチドを連結して、化学的な連結、化学結合、ペプチドリンカー又はその他の共有結合手段を介して、一つの隣接し合うタンパク質構造を形成することが可能である。一部の実施形態では、第一のＦｃドメイン単量体が、ペプチドリンカーを介して第二のＦｃドメイン単量体に連結するものであって、該ペプチドリンカーのＮ末端が、例えばペプチド結合である化学結合を介して、第一のＦｃドメイン単量体のＣ末端に連結し、またペプチドリンカーのＣ末端が、例えばペプチド結合である化学結合を介して、第二のＦｃドメイン単量体のＮ末端に連結する。他の実施形態では、アルブミン結合ペプチドのＮ末端が、上記に記載したものと同一の方式で、リンカーを介してＦｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインのＣ末端に連結する。
【０１５８】
ここで、「会合した」という語は、ポリペプチド（又は一つの単一ポリペプチド内の配列）が、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を形成するように位置されるように、例えば水素結合、疎水性相互作用、又はイオン性相互作用であるポリペプチド（又は一つの単一ポリペプチド内の配列）間の相互作用を説明するために用いる。例えば、一部の実施形態では、例えば二つのＦｃドメイン単量体をそれぞれ含む二つのポリペプチドと、一つのＦｃドメイン単量体をそれぞれ含む二つのポリペプチドとである四つのポリペプチドが会合して、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトを形成する（例えば、図１及び２に図示するとおり）。四つのポリペプチドは、それらの各Ｆｃドメイン単量体を介して会合することが可能である。ポリペプチド間の会合は、共有結合相互作用を含まない。
【０１５９】
ここで「リンカー」という語は、二つの要素間、例えばタンパク質ドメイン間の結合を指す。リンカーは、共有結合又はスペーサーとすることが可能である。「結合」という語は、化学結合、例えばアミド結合もしくはジスルフィド結合、又は、例えば化学的な連結である化学反応により形成される任意の種類の結合を指す。「スペーサー」という語は、二つのポリペプチド又はポリペプチドドメイン間に生じて二つのポリペプチドもしくはポリペプチドドメイン間に空間及び／又は柔軟性をもたらすような、部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー）又はアミノ酸配列（例えば、３〜２００アミノ酸、３〜１５０アミノ酸、３〜１００アミノ酸、３〜６０アミノ酸、３〜５０アミノ酸、３〜４０アミノ酸、３〜３０アミノ酸、３〜２０アミノ酸、３〜１０アミノ酸、３〜８アミノ酸、３〜５アミノ酸、４〜３０アミノ酸、５〜３０アミノ酸、６〜３０アミノ酸、８〜３０アミノ酸、１０〜２０アミノ酸、１０〜３０アミノ酸、１２〜３０アミノ酸、１４〜３０アミノ酸、２０〜３０アミノ酸、１５〜２５アミノ酸、１５〜３０アミノ酸、１８〜２２アミノ酸、及び２０〜３０アミノ酸の配列）を指す。アミノ酸スペーサーは、ポリペプチドの一次配列の一部（例えば、ポリペプチド骨格を介して、離間したポリペプチド又はポリペプチドドメインに連結されるような）である。例えばＦｃドメインを形成する二つのヒンジ領域又は二つのＦｃドメイン単量体の間におけるジスルフィド結合の形成は、リンカーとは考えない。
【０１６０】
ここで「グリシンスペーサー」という語は、二つのＦｃドメイン単量体を直列に連結する、グリシンのみを含有するリンカーを指す。グリシンスペーサーは、少なくとも４、８、１０、１２、１４、１６、１８、又は２０個のグリシン（例えば、４〜３０、８〜３０、１２〜３０、１２〜５０、１２〜１００、又は１２〜２００個のグリシン、例えば、１２〜３０、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のグリシン）を含有し得る。一部の実施形態では、グリシンスペーサーは、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：２７）の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【０１６１】
ここで、「アルブミン結合ペプチド」という語は、血清アルブミンに対する親和性及び血清アルブミンを結合する機能を有する１２〜１６のアミノ酸のアミノ酸配列を指す。アルブミン結合ペプチドは、例えばヒト、マウス、又はラットである様々な起源のものとすることが可能である。本開示の一部の実施形態では、アルブミン結合ペプチドがＦｃドメイン単量体のＣ末端と融合して、Ｆｃコンストラクトの血中半減期を増加させる。アルブミン結合ペプチドは、直接又はリンカーを介して、Ｆｃドメイン単量体のＮ末端又はＣ末端と融合することが可能である。
【０１６２】
ここで、「精製用ペプチド」という語は、ポリペプチドの精製、単離、又は同定に用いることが可能である任意の長さのペプチドを指す。精製用ペプチドは、ポリペプチドに連結して、例えば細胞溶解混合物からの、ポリペプチドの精製及び／又はポリペプチドの単離を支援し得る。一部の実施形態では、精製用ペプチドは、精製用ペプチドに対して特異的な親和性を有する別の部分と結合する。一部の実施形態では、精製用ペプチドと特異的に結合するこうした部分は、基剤、樹脂、又はアガロースビーズ等の固相支持体に結合する。Ｆｃコンストラクトと連結し得る精製用ペプチドの例は、本明細書でさらに詳細に記載する。
【０１６３】
ここで「多量体」という語は、本明細書に記載の少なくとも二つの会合したＦｃコンストラクトを含む分子を指す。
【０１６４】
ここで「抗原認識領域」という語は、抗体の抗原に対する認識及び結合を担う、抗体の軽鎖及び重鎖の部分を指す。抗原認識領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ、例えばＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、及びＣＤＲ  Ｈ３）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、軽鎖及び重鎖の可変領域（Ｆａｂ）を含む。
【０１６５】
ここで「免疫応答の免疫細胞活性化」という句は、免疫複合体又はＦｃコンストラクトの、細胞（例えば、免疫細胞（例えば、単球））上のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）（例えば、活性化ＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、又はＦｃγＲＩＩＩｂ）との結合によって誘導される又は活性化される免疫応答を指す。免疫複合体は、抗体が抗原と結合することで形成される抗原−抗体複合体である。免疫複合体はしばしば、ＦｃγＲを凝集して、かつ、炎症、感染症、及び他の疾患において重要な役割を果たす細胞内プロセスを抑制又は活性化する、複数のＦｃドメインを有する。一部の実施形態では、この開示のＦｃコンストラクトは、ＦｃγＲと結合して、免疫細胞（例えば、単球）上でシグナル伝達する活性化ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、又はＦｃγＲＩＩＩｂ）を誘導することができる。ＦｃγＲ−発現細胞におけるキナーゼリン酸化（例えば、Ｓｙｋリン酸化）及びカルシウム流入等である、或る下流のシグナル伝達事象の測定を用いて、免疫複合体又はＦｃコンストラクトの結合によって引き起こされる免疫応答の免疫細胞活性化を検出することができる。例えば、細胞のキナーゼリン酸化（例えば、Ｓｙｋリン酸化）のレベル又はカルシウム流入のレベルが、免疫複合体又はＦｃコンストラクトによる活性化を何も含まない、細胞のキナーゼリン酸化（例えば、Ｓｙｋリン酸化）のレベル又はカルシウム流入のレベルよりも、少なくとも５倍高い、例えば５〜１００倍（例えば、５〜１００、１０〜９５、１５〜９０、２０〜８５、２５〜８０、３０〜７５、３５〜７０、４０〜６５、４５〜６０、又は５０〜５５倍、例えば５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、５１倍、５２倍、５３倍、５４倍、５５倍、５６倍、５７倍、５８倍、５９倍、６０倍、６１倍、６２倍、６３倍、６４倍、６５倍、６６倍、６７倍、６８倍、６９倍、７０倍、７１倍、７２倍、７３倍、７４倍、７５倍、７６倍、７７倍、７８倍、７９倍、８０倍、８１倍、８２倍、８３倍、８４倍、８５倍、８６倍、８７倍、８８倍、８９倍、９０倍、９１倍、９２倍、９３倍、９４倍、９５倍、９６倍、９７倍、９８倍、９９倍、又は１００倍）高いものである場合に、免疫応答の免疫細胞活性化が誘導される。
【０１６６】
ここで「ファゴサイトーシス」という語は、細胞、しばしば食細胞（例えば、単球）が別の細胞、粒子、又は病原体（例えば、微生物又は寄生体）を取り込んでファゴソームを形成するものである、エンドサイトーシスの形態を指す。免疫系では、ファゴサイトーシスは、疾患細胞（例えば、癌細胞、感染細胞、又は死細胞）、病原体及び細胞片を除去するために用いられる主要な機序である。別の細胞（例えば、食細胞（例えば、単球））により貪食されるものとして標的化される細胞を、標的細胞と称する。例えば、この開示のＦｃコンストラクトが、免疫細胞上のＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、又はＦｃγＲＩＩＩｂ）と結合することによって活性化される免疫細胞（例えば、単球）は、対象における癌細胞又は感染細胞であり得る標的細胞を貪食し得る。
【０１６７】
ここで、標的細胞のファゴサイトーシスを「増加する（させる）」又は「増加する（させる）こと」とは、この開示のＦｃコンストラクトが免疫細胞（例えば、単球）上のＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、又はＦｃγＲＩＩＩｂ）と結合することによって誘導されるファゴサイトーシスが、Ｆｃコンストラクトによる誘導なく発生するファゴサイトーシスのレベルと比較して、増加することを指す。例えば、ファゴサイトーシスのレベルが、Ｆｃコンストラクトによる誘導なく発生するファゴサイトーシスのレベルよりも少なくとも１０％高い、例えば１０〜１００％（例えば、１０〜１００％、１５〜９５％、２０〜９０％、２５〜８５％、３０〜８０％、３５〜７５％、４０〜７０％、４５〜６５％、又は５０〜６０％、例えば１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）高いものである場合、標的細胞のファゴサイトーシスは増加する。
【０１６８】
ここで、「癌を治療する」という語は、対象における癌の治療的処置を指す。治療的処置は、癌の進行を遅らせ、対象の予後を改善し、及び／又は癌を除去する。
【０１６９】
ここで、「感染症を治療する」という語は、対象における感染症の治療的処置を指す。治療的処置は、感染症の進行を遅らせ、対象の予後を改善し、及び／又は感染症を除去する。
【０１７０】
ここで「感染症」という語は、例えば細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、原生動物、節足動物ならびに他の微生物、寄生体、及び虫等の病原体による、対象の細胞、組織、及び／又は器官への侵入を指す。一部の実施形態では、病原体は、対象の細胞、組織、及び／又は器官中で成長し、増殖し、及び／又は毒素を生成し得る。一部の実施形態では、対象は病原体に対してネガティブな反応（すなわち、アレルギー反応又は免疫応答）を発生し得る。感染症の例としては、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、及び原生動物感染症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
ここで「細菌感染症」という語は、一つ又は複数の細菌によって引き起こされる感染症を指す。感染症の原因となる細菌の例は、この技術分野で周知であり、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌（例えば、Ａ群レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌（例えば、大腸菌）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属の細菌（例えば、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ））、腸炎（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）属の細菌（例えば、サルモネラ腸炎（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ））、及び、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属の細菌（例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７２】
ここで「ウイルス感染症」という語は、一つ又は複数のウイルスによって引き起こされる感染症を指す。感染症の原因となるウイルスの例は、この技術分野で周知であり、レトロウイルス科のウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））、アデノウイルス科のウイルス（例えば、アデノウイルス）、ヘルペスウイルス科のウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型）、パピローマウイルス科のウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、ポックスウイルス科のウイルス（例えば、天然痘）、ピコルナウイルス科のウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス）、ヘパドナウイルス科のウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、フラビウイルス科のウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス）、トガウイルス科のウイルス（例えば、ルビウイルス）、オルトミクソウイルス科のウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、フィロウイルス科のウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス）、及び、パラミクソウイルス科のウイルス（例えば、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７３】
ここで「真菌感染症」という語は、一つ又は複数の真菌によって引き起こされる感染症を指す。感染症の原因となる真菌の例は、この技術分野で周知であり、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の真菌（例えば、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・カンジダス（Ａ．ｃａｎｄｉｄｕｓ）、アスペルギルス・クラバツス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・オクラセウス（Ａ．ｏｃｈｒａｃｅｕｓ））、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の真菌（例えば、カンジダ・アルビカンス（  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・パラプローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ギリエルモンジィ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の真菌（例えば、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、及び、ファサリウム属（  Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の真菌（例えば、フザリウム・ソラニ（  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７４】
ここで「寄生虫感染症」という語は、一つ又は複数の寄生虫によって引き起こされる感染症を指す。寄生虫の例としては、サナダムシ（条虫類（ｃｅｓｔｏｄｅ））、回虫（線虫類（ｎｅｍａｔｏｄｅ））、吸虫（吸虫類（ｔｒｅｍａｔｏｄｅ））、及び単生類が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７５】
ここで「原生動物感染症」という語は、一つ又は複数の原生動物によって引き起こされる感染症を指す。原生動物の例としては、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）の原生動物（例えば、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ））、マラリア原虫属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の原生動物（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、ジアルディア属（Ｇｉａｒｄｉａ）の原生動物（例えば、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、及び、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）の原生動物（例えば、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ））が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７６】
ここで「ポリヌクレオチド」という語は、オリゴヌクレオチド又はヌクレオチド、及びその断片又は部分を指し、またゲノム由来もしくは合成由来のＤＮＡ又はＲＮＡを指し、それは一本鎖又は二本鎖であり、センス鎖又はアンチセンス鎖を表し得る。単一のポリヌクレオチドが、単一のポリペプチドに翻訳される。
【０１７７】
ここで「ポリペプチド」という語は、モノマーがアミド結合を介して共に連結するアミノ酸残基であるような単一のポリマーを説明している。ポリペプチドは、天然、組換え、又は合成的に産生されるかのいずれかである任意のアミノ酸配列を包含することを意図する。
【０１７８】
ここで「アミノ酸位置」という語は、タンパク質又はタンパク質ドメイン内のアミノ酸の位置番号を指す。抗体又はＦｃコンストラクトのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．,Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ｅｄ  ５，１９９１）を用いて番号付けた。
【０１７９】
ここで「アミノ酸修飾」という語は、参照配列（例えば、野生型の、非変異の、又は修飾されていないＦｃ配列）と比較して、Ｆｃコンストラクトの、薬物動態（ＰＫ）及び／又は薬力学（ＰＤ）の性質、血中半減期、エフェクタ機能（例えば、細胞溶解（例えば、抗体依存性細胞媒介毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞毒性活性（ＣＤＣ））、ファゴサイトーシス（例えば、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣＣ））、免疫活性化及びＴ−細胞活性化）、Ｆｃ受容体に対する親和性（例えば、Ｆｃ−ガンマ受容体（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、及び／又はＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ））、Ｆｃ−アルファ受容体（ＦｃαＲ）、Ｆｃ−イプシロン受容体（ＦｃεＲ）、及び／又は胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ））、補体カスケードに関与するタンパク質に対する親和性（例えば、Ｃ１ｑ）、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、シアリル化）、凝集性（例えば、二量体（例えば、ホモ二量体及び／又はヘテロ二量体）及び／又は多量体を形成する能力）、及び、生物物理学的性質（例えば、ＣＨ１及びＣＬ間の相互作用を変える、安定性を変える、ならびに／又は、温度及び／もしくはｐＨに対する感受性を変える）上の効果を有し得る、また免疫学的な及び炎症性疾患、癌ならびに感染症の治療の効能の改善を促進し得るような、Ｆｃドメインのポリペプチド配列の変更を指す。アミノ酸修飾は、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を含む。一部の実施形態では、アミノ酸修飾は単一アミノ酸修飾である。他の実施形態では、アミノ酸修飾は、複数の（例えば１以上）アミノ酸の修飾である。アミノ酸修飾は、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の組み合わせを含んでもよい。アミノ酸修飾の説明には、Ｆｃポリペプチドに対してコードするヌクレオチド配列の、点突然変異（例えば、単一のヌクレオチドの他のものとの交換）、挿入及び欠失（例えば一つ又は複数のヌクレオチドの付加及び／又は除去）等の、遺伝子（すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡ）の変更である。
【０１８０】
或る実施形態では、Ｆｃコンストラクト内の少なくとも一つ（例えば、少なくとも１、２、又は３個）のＦｃドメインがアミノ酸修飾を含む。一部の例では、少なくとも一つのＦｃドメインが、一つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は２０個、又はそれ以上）のアミノ酸修飾を含む。一部の例では、少なくとも一つのＦｃドメインが、１６個以下のアミノ酸修飾（例えば、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、又は１６個以下のアミノ酸修飾）を含む。一部の場合では、Ｆｃドメイン単量体が、１０個以下のアミノ酸修飾を含む。一部の場合では、Ｆｃドメイン単量体が、１２個以下のアミノ酸修飾を含む。一部の場合では、Ｆｃドメイン単量体が、１４個以下のアミノ酸修飾を含む。
【０１８１】
ここで「パーセント（％）同一性」という語は、例えば本明細書に記載のＦｃコンストラクト内のＦｃドメイン単量体の配列である候補配列のアミノ酸（又は核酸）残基であって、配列を整列させて、必要であれば最大のパーセント同一性を達成するようにしてギャップを導入した後で（すなわち、最適なアラインメントのために候補配列及び参照配列の一方又は両方においてギャップを導入することが可能であり、比較目的のために非均一の配列は無視することが可能である）、野生型のＦｃドメイン単量体の配列等の参照配列のアミノ酸（又は核酸）残基に対して一致している、候補配列のアミノ酸（又は核酸）残基の百分率を指すものである。パーセント同一性の決定のためのアラインメントは、この分野の技術の範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公に利用可能であるコンピュータソフトウェアを用いて達成することが可能である。当業者は、比較している配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメント測定用の適切なパラメータを決定することが可能である。一部の実施形態では、所与の参照配列との、該参照配列での又は該参照配列に対する、所与の候補配列のパーセントアミノ酸（又は核酸）配列同一性（あるいは、所与の参照配列との、該参照配列での又は該参照配列に対する、特定のパーセントアミノ酸（又は核酸）配列同一性を有する又は含む、所与の候補配列と表すことがある）は、以下のとおりに計算される：
１００×（Ａ／Ｂの分数）
式中、Ａは候補配列及び参照配列のアラインメント内で同一として採点されたアミノ酸（又は核酸）残基の数であり、Ｂは参照配列内のアミノ酸（又は核酸）残基の総数である。候補配列の長さが参照配列の長さと等しくない場合の一部の実施形態では、参照配列に対する候補配列のパーセントアミノ酸（又は核酸）配列同一性は、候補配列に対する参照配列のパーセントアミノ酸（又は核酸）配列同一性と等しくないはずである。
【０１８２】
特定の実施形態では、候補配列の全長にわたって又は候補配列の連続的なアミノ酸（又は核酸）残基の選択された部分にわたって、候補配列が５０％〜１００％の同一性（例えば、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、９０％〜１００％、９２％〜１００％、９５％〜１００％、９７％〜１００％、９９％〜１００％、又は９９．５％〜１００％の同一性）をみせるということを、候補配列との比較のために整列した参照配列が示し得る。比較の目的のために整列された候補配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％である。候補配列内のある位置が参照配列内の対応する位置と同じアミノ酸（又は核酸）残基で占有されている場合であれば、分子同士はその位置において一致している。
【０１８３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）内のＦｃドメイン単量体は、野生型のＦｃドメイン単量体の配列（例えば、配列番号：４２）と、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を有することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）内のＦｃドメイン単量体は、配列番号：４４、４６、４８、及び５０〜５３のいずれか一つの配列と、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を有することができる。或る実施形態では、Ｆｃコンストラクト内のＦｃドメイン単量体は、配列番号：４８、５２、及び５３の配列と、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を有することができる。
【０１８４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト内のＦｃドメイン単量体（例えば、複数のＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）は、最大１０（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ配列を有することができる。一部の例では、少なくとも一つのＦｃドメインが、１６個以下のアミノ酸修飾（例えば、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、又は１６個以下のアミノ酸修飾）を含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト内の二つのＦｃドメイン単量体を有するポリペプチド（例えば、図１のポリペプチド１０２及び１０８、図２のポリペプチド２０２及び２０８）は、配列番号：４３、４５、４７、及び４９のうちのいずれか一つの配列と、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を有することができる。或る実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト内の二つのＦｃドメイン単量体を有するポリペプチドは、配列番号：４９の配列と、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を有することができる。
【０１８６】
一部の実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、本明細書でさらに記載する配列番号：１〜３６（例えば、配列番号：１７、１８、２６、及び２７）のうちのいずれか一つの配列と、少なくとも７５％同一（例えば、７５％、７７％、７９％、８１％、８３％、８５％、８７％、８９％、９１％、９３％、９５％、９７％、９９％、９９．５％、又は１００％同一）である配列を有することができる。
【０１８７】
ここで「宿主細胞」という語は、タンパク質をそれらの対応する核酸から発現するのに必要であるような、例えばオルガネラである、必要な細胞成分を含む担体を指す。核酸は典型的に、この技術分野で公知の従来の技術（形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注入等）によって宿主細胞内に導入されることが可能である核酸ベクター中に含まれる。宿主細胞は、例えば細菌細胞である原核細胞、又は、例えば哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）である真核細胞とすることができる。本明細書に記載するように、宿主細胞を用いて、その後結合して所望のＦｃコンストラクトを形成することが可能である所望のドメインをコードする一つ又は複数のポリペプチドを発現する。
【０１８８】
ここで「医薬組成物」という語は、活性成分のみならず、活性成分を投与方法に好適であるようにさせることが可能である、一つ又は複数の賦形剤及び希釈剤を含有する薬用製剤又は医薬製剤を指す。本開示の医薬組成物は、Ｆｃコンストラクトと互換性がある、薬剤的に許容できる成分を含む。該医薬組成物は典型的に、静脈投与又は皮下投与のために水性形態である。
【０１８９】
ここでポリペプチド又はＦｃコンストラクトの「実質的に均質な集団」は、組成物（例えば、細胞培養培地又は医薬組成物）中のポリペプチド又はＦｃコンストラクトのうちの少なくとも５０％が、非還元ＳＤＳゲル電気泳動又はサイズ排除クロマトグラフィーにより決定されるように、同数のＦｃドメインを有するというものである。ポリペプチドの又はＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団（例えば、少なくとも８５％、９０％、又は９５％均質である集団）は、精製前、又は、プロテインＡもしくはプロテインＧ精製後、又は、任意のＦａｂもしくはＦｃ特異的なアフィニティークロマトグラフィー単独の後で、得ることができる。種々の実施形態では、組成物中のポリペプチド又はＦｃコンストラクトのうちの少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、又は８５％が、同数のＦｃドメインを有する。他の実施形態では、組成物中のポリペプチドの又はＦｃコンストラクトのうちの最大８５％、９０％、９２％、又は９５％が、同数のＦｃドメインを有する。
【０１９０】
ここで「薬剤的に許容できるキャリア」という語は、医薬組成物中の賦形剤又は希釈剤を指す。薬剤的に許容できるキャリアは、製剤の他の成分と互換性があり、摂取者にとって有害でないものでなくてはならない。本開示では、薬剤的に許容できるキャリアは、Ｆｃコンストラクトに対して十分な薬剤的安定性を与える必要がある。キャリアの性質は、投与形態によって異なる。例えば、経口投与では、固形キャリアが好ましく、静脈内投与では概して、水溶液キャリア（例えば、ＷＦＩ及び／又は緩衝液）が用いられる。
【０１９１】
ここで「治療有効量」は、例えば薬剤投与量である、対象もしくは患者において所望の生物学的な効果の誘導に、又は、本明細書に記載の状態又は障害を有する患者の治療に有効である量を指す。本明細書においては、「治療有効量」が、単回投与又は任意の投薬もしくは経路での摂取、単独で、又は他の治療薬剤と組み合わせての摂取のいずれでも、所望の治療効果をもたらす量として解釈できるということも理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】図１は、四つのポリペプチドで形成される、三つのＦｃドメインを含有するＦｃコンストラクト（Ｆｃコンストラクト１、Ｆｃコンストラクト２、又はＦｃコンストラクト３）の説明図である。第一のポリペプチド（１０２）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１０６）と直列に連結した、野生型Ｆｃドメイン単量体配列と比べてＣＨ３−ＣＨ３界面において異なる電荷をもつアミノ酸を含有する一つのＦｃドメイン単量体（１０４）を含有する。第二のポリペプチド（１０８）は、他の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１１２）と直列に連結した、野生型Ｆｃドメイン単量体配列と比べてＣＨ３−ＣＨ３界面において異なる電荷をもつアミノ酸を含有するＦｃドメイン単量体（１１０）を含有する。第三のポリペプチド及び第四のポリペプチド（それぞれ１１４及び１１６）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。
【図２】図２は、四つのポリペプチドで形成される、三つのＦｃドメインを含有するＦｃコンストラクト（Ｆｃコンストラクト４）の説明図である。第一のポリペプチド（２０２）は、異なる電荷をもつアミノ酸及び突起を含有する他のＦｃドメイン単量体（２０６）と直列に連結された、野生型Ｆｃドメイン単量体配列と比べてＣＨ３−ＣＨ３界面において異なる電荷をもつアミノ酸を含有する一つのＦｃドメイン単量体（２０４）を含有する。第二のポリペプチド（２０８）は、異なる電荷をもつアミノ酸及び突起を含有する他のＦｃドメイン単量体（２１２）と直列に連結された、野生型Ｆｃドメイン単量体配列と比べてＣＨ３−ＣＨ３界面において異なる電荷をもつアミノ酸を含有するＦｃドメイン単量体（２１０）を含有する。第三のポリペプチド及び第四のポリペプチド（それぞれ２１４及び２１６）はそれぞれ、異なる電荷をもつアミノ酸及び空洞を含有するＦｃドメイン単量体を含有する。
【図３】図３は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる、Ｆｃコンストラクト２のリンカー（ＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号：１８））内のＯ−キシロシル化された（Ｏ−ｘｙｌｏｓｙｌａｔｅｄ）Ｓｅｒの同定を示す。
【図４】図４は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで決定された、二つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト（図１３に示すＦｃコンストラクト）内のリンカーのＯ−キシロシル化（Ｏ−ｘｙｌｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の存在度を示している。
【図５】図５は、ＣＥ−ＳＤＳで決定された、４５℃で保存した、Ｆｃコンストラクト２及び４からの単量体Ｆｃ種の形成を示している。
【図６】図６は、ＬＣ−ＭＳで決定された、４５℃で２週間保存した、Ｆｃコンストラクト２のタンパク質分解産物を示している。
【図７】図７は、ＬＣ−ＭＳで決定された、４５℃で２週間保存した、Ｆｃコンストラクト４のタンパク質分解産物を示している。
【図８】図８は、リンカー長を変化させたＦｃコンストラクト２による、ＴＨＰ−１細胞によるＩＬ−８放出の抑制を示している。
【図９】図９は、リンカー長を変化させたＦｃコンストラクト２による、好中球中のカルシウム流出の抑制を示している。
【図１０】図１０は、未精製培地中のＦｃコンストラクト２及びＦｃコンストラクト４の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるサイズ分布を示している。
【図１１】図１１は、Ｆｃコンストラクト２（「静電的ステアリングあり」）と、三つのＦｃドメインを有するが「幹」サブユニット内の静電的ステアリング変異のない他のＦｃコンストラクト（「静電的ステアリングなし」）とについての発現及びアセンブリを示している。
【図１２】図１２は、Ｃ末端リシンを除去してＦｃコンストラクト２を生成することにより、インビトロで補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）が誘導されなかったということを示している。
【図１３】図１３は、三つのポリペプチドで形成される、二つのＦｃドメインを含有するＦｃコンストラクトの説明図である。
【図１４】図１４は、六つのポリペプチドで形成される、五つのＦｃドメインを含有するＦｃコンストラクト（Ｆｃ５Ｘ）の説明図である。
【図１５】図１５は、六つのポリペプチドで形成される、五つのＦｃドメインを含有するＦｃコンストラクト（Ｆｃ５Ｙ）の説明図である。
【図１６】図１６は、六つのポリペプチドで形成される、五つのＦｃドメインを含有するＦｃコンストラクト（反転Ｆｃ５Ｙ）の説明図である。
【図１７】図１７は、二つのポリペプチドで形成される、三つのＦｃドメインを含有するＦｃコンストラクトの説明図である。
【図１８】図１８は、慢性ＩＴＰモデルにおける、ＩＶＩＧ、コンストラクト２、及びコンストラクト４を比較する血小板レベルを示している。
【図１９】図１９は、慢性ＩＴＰモデルにおける、ＩＶＩＧ、コンストラクト２、及びコンストラクト４を比較する血小板レベルを示している。
【図２０】図２０は、慢性ＩＰＴモデルにおける、ＩＶＩＧ、コンストラクト２、及びコンストラクト４を比較する血小板レベルを示している。
【図２１】図２１は、精製したＦｃコンストラクト４（中央）及び精製したコンストラクトＸ１（右）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるサイズ分布を示している。左には分子量基準を示している。
【図２２】図２２は、コンストラクト４（実線上の黒四角）及びコンストラクトＸ１（破線上の白丸）についての、２４時間にわたる薬物動態学的挙動を示している。
【図２３】図２３は、コンストラクト４（実線上の黒四角）及びコンストラクトＸ１（破線上の白丸）についての、１２時間にわたる薬物動態学的挙動を示している。
【図２４】図２４は、コラーゲン抗体誘発性関節炎（ＣＡＩＡ）モデルにおける、６日目に、５０ｍｇ／ｋｇ（黒三角、黒実線）、２５ｍｇ／ｋｇ（黒四角、黒点線）、又は１２．５ｍｇ／ｋｇ（黒丸、黒破線）で治療的に投与されたコンストラクト４を示している。担体コントロールとして、等量の食塩水（灰色ｘ、灰実線）を６日目に投与した。平均及び平均の標準誤差を各時点に示している。
【図２５】図２５では、コラーゲン抗体誘発性関節炎（ＣＡＩＡ）モデルにおける、１日目に、１００ｍｇ／ｋｇで予防的に投与されたコンストラクト４（ＡＡ：黒四角、実線）又は食塩水（灰丸、一点鎖線）の効能を比較している。等量の食塩水（灰丸、一点鎖線）は１日目に投与した。各時点について、平均及び平均の標準誤差を示している。
【図２６】図２６は、コンストラクト４（ＳＩＦ）及びコンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂ＋変異体の発現から得られた清澄培地の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるサイズ分布を示している。
【図２７】図２７は、ＩｇＧ１コントロール、コンストラクト４（ＳＩＦ３）及びコンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂ＋変異体（ＦｃｆＲＩＩＢ＋）の、Ｆｃガンマ受容体に対する相対的結合を示している。
【図２８】図２８は、単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）上のＣＤ８６表面発現を示している。
【図２９】図２９は、単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）上のＣＤ８６表面発現を示している。
【発明を実施するための形態】
【０１９３】
発明の詳細な説明
ＩｇＧのＦｃドメインを含む治療用タンパク質を用いて、炎症ならびに免疫疾患及び炎症性疾患、癌ならびに感染症を治療することが可能である。本開示は、Ｆｃドメインを含有するＦｃコンストラクト（例えば、２〜１０個のＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を調製する組成物及び方法を特徴とする。本明細書に記載のＦｃコンストラクトは、製造結果を有意に向上させる構造的特徴（例えば、グリシンスペーサー）を組み込むことによって、均質な医薬組成物の調製を促進する。
【０１９４】
したがって、この開示は、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）の実質的に均質な集団を含む医薬組成物を特徴とする。均質性は薬物動態及び生体内での組成物の性能に影響するため、均質性は医薬組成物の重要な側面である。従来、医薬品の製造においては、製品の製造方法に依存していくつかの因子によって引き起こされ得る、製品の均質性の問題が存在している。例えば、医薬品は、ランダムな産物の切断、タンパク質加水分解、分解、及び／もしくは凝集、適切でないサブユニットの会合、ならびに／又は効率の悪いタンパク質フォールディングを経るものであり得る。様々な生合成過程又は医薬品製造のために用いられる細胞機械（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を有する様々な有機体がまた、産物内に異種構造を引き起こし得る。しばしば、所望の医薬品を含有する初期培養は、厳しい精製過程を経て、医薬品を含有する異種性の低い組成物を生成することが必要とされる。
【０１９５】
一態様では、この開示は、Ｆｃコンストラクトのフォールディング効率を有意に改善し、かつ、適切でないサブユニットの会合を最小限にするような構造的特徴を有するＦｃコンストラクトを特徴とし、これによって高い均質性をもつこれらＦｃコンストラクトを含有する医薬組成物を導く。高度な均質性を有することで、医薬組成物の安全性、効能、均一性、及び信頼性が保証される。また高度な均質性を有することで、望まない物質によって引き起こされる医薬品の可能性のある凝集又は分解（例えば、産物の分解及び／又は産物もしくは多量体の凝集を最小限にするのみならず、望まない物質によって引き起こされる適切でなく有害な副作用を制限する。
【０１９６】
本明細書において詳細に記載するように、この開示は、同数のＦｃドメインを全てが有するＦｃコンストラクトを含有する実質的に均質のみならず、こうした実質的に均質な組成物を調製する方法を特徴とする。
【０１９７】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトは、Ｆｃドメイン間にグリシンスペーサーを含む。この技術分野で周知であるように、セリン及びグリシンの両方を含有するリンカーは、タンパク質中で構造的柔軟性を提供するものであり、二つのポリペプチドの連結に通常用いられる。実験を通して（実施例４を参照）、セリン及びグリシンの両方を含有するリンカーは、リンカー内の複数のセリンにおいてＯ−グリコシル化（Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）（例えば、Ｏ−キシロシル化）を受け、セリンのＮ末端においてタンパク質分解を受ける、ということが観察された。我々は、リンカーの配列と長さを最適化して、Ｆｃコンストラクトの均質性をさらに向上させることを目指した。我々は、コンストラクト内の全てのリンカーを、グリシンのみを有するグリシンスペーサー（例えば、少なくとも１２のグリシン、例えば、１２〜３０のグリシン、例えば、２０のグリシン、配列番号：２７）とするようなＦｃコンストラクトを作製した。Ｆｃコンストラクト内にオールグリシンスペーサーを有することで、セリンにおけるＯ−グリコシル化が除去され、またコンストラクトのタンパク質分解速度が減少することによってＦｃコンストラクトの均質性がさらに向上した（実施例４を参照）。結果的に、Ｆｃコンストラクト内にオールグリシンスペーサーを用いることによって、Ｆｃコンストラクトのより実質的に均質な集団を達成することができた。
【０１９８】
均質性は、Ｆｃコンストラクト組成物の結果である。例えば、第一のアプローチ（「アプローチ（ａ）」）では、グリシンのみを含有するリンカーを組み込んでＦｃドメイン単量体を連結することを利用することができる。実験を通して観察されたように、Ｆｃコンストラクト内のオールグリシンスペーサー（例えば、少なくとも１２のグリシン、例えば、１２〜３０のグリシン、配列番号：２７）は、Ｏ−グリコシル化を受けず、セリン及びグリシンを含む従来のリンカーと比較してタンパク質分解の影響を受けにくかった（実施例４を参照）。
【０１９９】
さらに、別のアプローチ（「アプローチ（ｂ）」）では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を含有する組成物の均質性は、Ｃ末端リシンを除去することによって向上する。こうしたＣ末端リシン残基は、多くの種にわたって免疫グロブリン中で高度に保護されるが、タンパク質産生中に分子機械によって完全に又は部分的に除去できる。この開示のＦｃコンストラクトのＣ末端リシンの除去により、得られる組成物の均一性が向上し、より均質なＦｃコンストラクトの調製が達成される（実施例８を参照）。例えば、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）の一部の実施形態では、Ｃ末端リシンのコドンを除去し、それによってＣ末端リシン残基のないポリペプチドを有するＦｃコンストラクトと、結果物の均質な集団とを生成する。
【０２００】
本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を含有する組成物の均質性を向上するさらなるアプローチ（「アプローチ（ｃ）」）では、以下のヘテロ二量体形成選択性モジュールの二つのセットを利用した：（ｉ）異なる逆電荷の変異を有するヘテロ二量体形成選択性モジュール、及び、（ｉｉ）操作された空洞及び突起を有するヘテロ二量体形成選択性モジュール。例えば実施例６で参照される実験を通して、Ｆｃコンストラクト内にヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成しようとする場合に、（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を有することで、Ｆｃドメイン単量体の制御されない会合と、それによる望まないオリゴマー及び多量体とが軽減されることによって、生成される医薬組成物の均質性をさらに向上するということが観察された。特定の実施例では、（ｉ）少なくとも一つの逆電荷の変異と、（ｉｉ）少なくとも一つの操作された空洞又は少なくとも一つの操作された突起とを含有するＦｃドメイン単量体を生成することができ、（ｉ）少なくとも一つの逆電荷の変異と、（ｉｉ）少なくとも一つの操作された突起又は少なくとも一つの操作された空洞とを含有する他のＦｃドメイン単量体と選択的に結合してＦｃドメインを形成することとなる。別の実施例では、反転した電荷の変異Ｋ３７０Ｄと、操作された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含有するＦｃドメイン単量体と、反転した電荷の変異Ｅ３５７Ｋと、操作された突起Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗとを含有する他のＦｃドメイン単量体とを生成することができ、選択的に結合してＦｃドメインを形成することとなる。
【０２０１】
本明細書に詳細に記載するように、この開示のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を含有する実質的に均質な組成物は、Ｆｃコンストラクト内の二つのＦｃドメイン単量体間でオールグリシンスペーサーを用いること（アプローチ（ａ））と、Ｆｃコンストラクト内にＣ末端リシンを欠いているポリペプチドを用いること（アプローチ（ｂ））と、及び／又は、ヘテロ二量体形成選択性モジュールの二つのセット（（ｉ）異なる逆電荷の変異を有するヘテロ二量体形成選択性モジュール及び（ｉｉ）操作された空洞及び突起を有するヘテロ二量体形成選択性モジュール）を用いて、Ｆｃコンストラクト内の一部のＦｃドメイン単量体によってヘテロ二量体Ｆｃドメイン形成を促進すること（アプローチ（ｃ））とによって、達成され得る。
【０２０２】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を含有する実質的に均質な組成物は、アプローチ（ａ）を経て達成され得る。
【０２０３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を含有する実質的に均質な組成物は、アプローチ（ｂ）を経て達成され得る。
【０２０４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を含有する実質的に均質な組成物は、アプローチ（ｃ）を経て達成され得る。
【０２０５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を含有する実質的に均質な組成物は、アプローチ（ａ）及び（ｂ）を組み合わせることで達成され得る。
【０２０６】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を含有する実質的に均質な組成物は、アプローチ（ａ）及び（ｃ）を組み合わせることで達成され得る。
【０２０７】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を含有する実質的に均質な組成物は、アプローチ（ｂ）及び（ｃ）を組み合わせることで達成され得る。
【０２０８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を含有する実質的に均質な組成物は、アプローチ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を組み合わせることで達成され得る。
【０２０９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクトを含有する医薬組成物の均質性をさらに向上させるために、組成物中のＦｃコンストラクト内のポリペプチドのうちの一つ又は複数におけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。本明細書に記載のＦｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む組成物の一部の実施形態では、組成物中のＦｃコンストラクト内のポリペプチドのそれぞれにおけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。
【０２１０】
また、この開示のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）では、Ｆｃドメイン単量体を連結するリンカーの長さが、Ｆｃコンストラクトのフォールディング効率に影響を及ぼす。一部の実施形態では、少なくとも４、８、又は１２個のグリシン（例えば、４〜３０、８〜３０、１２〜３０個のグリシン、配列番号：２６及び２７）を有するリンカーを用いて、この開示のＦｃコンストラクト内のＦｃドメイン単量体を連結することができる。
【０２１１】
Ｉ．Ｆｃドメイン単量体
Ｆｃドメイン単量体は、ヒンジドメイン、ＣＨ２抗体定常ドメイン、及びＣＨ３抗体定常ドメインを含む。Ｆｃドメイン単量体は、免疫グロブリン抗体アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＤのものとすることが可能である。Ｆｃドメイン単量体はまた、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のものとしてもよい。Ｆｃドメイン単量体はまた複合型であってもよく、例えば、ヒンジ及びＩｇＧ１からのＣＨ２及びＩｇＡからのＣＨ３による複合型、又は、ヒンジ及びＩｇＧ１からのＣＨ２であるがＩｇＧ３からのＣＨ３による複合型であってもよい。Ｆｃドメイン単量体の二量体は、白血球表面上にある受容体である、例えばＦｃγＲＩＩＩａであるＦｃ受容体と結合することが可能なＦｃドメイン（本明細書でさらに規定される）である。本開示では、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３抗体定常ドメインの界面におけるアミノ酸置換を含有して、それらの相互による会合を促進し得る。他の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、例えばアルブミン結合ペプチド又は精製用ペプチドである、Ｎ末端又はＣ末端に結合するさらなる部分を含む。本開示では、Ｆｃドメイン単量体は、例えばＶＨ、ＶＬ、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域（ＨＶＲ）である、いずれの種類の抗体可変領域も含有しない。Ｆｃドメイン単量体は、例えばヒト、マウス、又はラットである、様々な起源のものとすることが可能である。
【０２１２】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）内のＦｃドメイン単量体は、野生型のＦｃドメイン単量体の配列（配列番号：４２）と、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を有することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）内のＦｃドメイン単量体は、最大１０（９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ野生型のＦｃドメイン単量体の配列（配列番号：４２）である配列を含み得る、該配列からなり得る、又は、実質的に該配列からなり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）内のＦｃドメイン単量体は、配列番号：４４、４６、４８、及び５０〜５３（実施例１、表４及び５を参照）のうちのいずれか一つの配列と、少なくとも９５％同一（例えば、９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を有することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）内のＦｃドメイン単量体は、最大１０（９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ、配列番号：４４、４６、４８、及び５０〜５３（実施例１、表４及び５を参照）のうちのいずれか一つの配列である配列を有することができる。或る実施形態では、Ｆｃコンストラクト内のＦｃドメイン単量体は、配列番号：４８、５２、及び５３のうちのいずれか一つの配列と、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を有することができる。或る実施形態では、Ｆｃコンストラクト内のＦｃドメイン単量体は、最大１０（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）個の単一アミノ酸修飾（例えば置換、例えば保存的置換）をもつ、配列番号：４８、５２、及び５３のうちのいずれか一つの配列である配列を有することができる。
【０２１３】
2019519528.tif 000053
2019519528.tif 000054
【０２１４】
ＩＩ．Ｆｃドメイン
本明細書で規定するように、Ｆｃドメインは、ＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体形成する二つのＦｃドメイン単量体を含む。本開示では、Ｆｃドメインは例えばＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ、又はＨＶＲである、抗体の可変領域を含まない。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、例えばＦｃ−ガンマ受容体（すなわち、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ））、Ｆｃ−アルファ受容体（すなわち、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲ））、Ｆｃ−イプシロン受容体（すなわち、Ｆｃε受容体（ＦｃεＲ））、及び／又は胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する最小限の構造を形成する。一部の実施形態では、本開示のＦｃドメインは、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ））、及び／又はＦｃγＲＩＶ、及び／又は胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する。
【０２１５】
本明細書に記載のＦｃコンストラクトのいずれかにおいては、アミノ酸修飾が、一つ又は複数のＦｃ受容体に対する結合親和性を変え得る。一部の実施形態では、アミノ酸修飾はＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆである。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩｂである。一部の場合、本明細書に記載の修飾が、ＦｃγＲＩＩｂ受容体に対する親和性を増加させる。一部の場合、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ修飾が、ＦｃγＲＩＩｂに対する結合親和性を増加させる。
【０２１６】
ＩＩＩ．二量体形成選択性モジュール
本開示では、二量体形成選択性モジュールは、二つのＦｃドメイン単量体の好ましい対形成を促進してＦｃドメインを形成する、Ｆｃドメイン単量体の部分である。詳細には、二量体形成選択性モジュールは、二つのＦｃドメイン単量体の相互作用するＣＨ３抗体定常ドメイン間の界面に位置するアミノ酸置換を含む、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインの部分である。二量体形成選択性モジュールにおいては、アミノ酸置換が、それら置換に選択されたアミノ酸の適合性の結果として、二つのＣＨ３抗体定常ドメインの好ましい二量体形成を行う。好ましいＦｃドメインの最終形態は、二量体形成選択性モジュールをもたないＦｃドメイン単量体で、又は二量体形成選択性モジュール内に適合しないアミノ酸置換をもつＦｃドメイン単量体で形成される他のＦｃドメインに対して選択的である。この種のアミノ酸置換は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ等のこの技術分野で周知の従来の分子クローニング技術を用いて行うことが可能である。
【０２１７】
一部の実施形態では、二量体形成選択性モジュールは、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に操作された空洞（本明細書でさらに説明する）を含む。他の実施形態では、二量体形成選択性モジュールは、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に操作された突起（本明細書でさらに説明する）を含む。選択的にＦｃドメインを形成するために、適合可能な二量体形成選択性モジュールをもつ二つのＦｃドメイン単量体、例えば操作された空洞を含む一方のＣＨ３抗体定常ドメインと、操作された突起を含むもう一方のＣＨ３抗体定常ドメインとを結合して、Ｆｃドメイン単量体の空洞に突起が挿入された対を形成する。操作された突起及び操作された空洞は、ヘテロ二量体形成選択性モジュールの例であり、それらは、適合するヘテロ二量体形成選択性モジュールを有する二つのＦｃドメイン単量体の好ましいヘテロ二量体形成を促進するために、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内に作製することが可能である。
【０２１８】
他の実施形態では、正電荷をもつアミノ酸置換を含有する二量体形成選択性モジュールをもつＦｃドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換を含有する二量体形成選択性モジュールをもつＦｃドメイン単量体とを選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリング（本明細書においてさらに説明する）を経てＦｃドメインを形成することができる。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、以下の正電荷をもつアミノ酸置換及び負電荷をもつアミノ酸置換のうちの一つを含み得る：Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅ。一実施例では、正電荷をもつアミノ酸置換、例えばＤ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換、例えばＫ３７０Ｄ又はＫ３７０Ｅを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。別の実施例では、Ｅ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、Ｋ３７０Ｄを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。一部の実施形態では、逆電荷のアミノ酸置換を、ヘテロ二量体形成選択性モジュールとして用い得るものであって、異なるが適合する逆電荷のアミノ酸置換を含有する二つのＦｃドメイン単量体が結合して、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成する。特定の二量体形成選択性モジュールを、さらに以下に説明される表１及び２Ａにさらに列記しているが、これらに限定されない。
【０２１９】
他の実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体が、ＣＨ３ドメイン間の界面における電荷をもつ残基の環内の少なくとも二つの位置において、同一の逆電荷の変異を含有するホモ二量体形成選択性モジュールを含む。ホモ二量体形成選択性モジュールは、Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成を促進してホモ二量体Ｆｃドメインを形成する、逆電荷のアミノ酸置換である。二つのＦｃドメイン単量体内の残基の２以上の相補的な対の両要素の電荷が反転していることによって、変異したＦｃドメイン単量体は同じ変異の配列のＦｃドメイン単量体に対して相補性を維持するが、こうした変異なしではＦｃドメイン単量体に対する相補性はより小さい。一実施形態では、Ｆｃドメインは、二重変異体である、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３５６Ｋ／Ｋ４３９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｅ／Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｄ、又はＤ３５６Ｋ／Ｋ４３９Ｅを含むＦｃ単量体を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、例えばＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｅである二重変異体の任意の対を結合した四重変異体を含むＦｃドメイン単量体を含む。ホモ二量体形成選択性モジュールの例を、表２Ｂ及び２Ｃにさらに示している。
【０２２０】
修飾されていないＦｃドメイン単量体は、天然のヒトＦｃドメイン単量体又はＷＴヒトＦｃドメイン単量体とすることが可能である。Ｆｃドメイン単量体は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む天然のヒトＦｃドメイン単量体、もしくは、定方向の二量体形成を調整又は促進する、最大１６（例えば、最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６）個のアミノ酸修飾（例えば、単一アミノ酸修飾）を有するその変異体とすることが可能である。一部の場合では、Ｆｃドメインは少なくとも一つのアミノ酸修飾を含むものであって、該アミノ酸修飾は、（ｉ）一つ又は複数のＦｃ受容体に対する結合親和性、（ｉｉ）エフェクタ機能、（ｉｉｉ）Ｆｃドメインの硫酸化のレベル、（ｉｖ）半減期、（ｖ）プロテアーゼ耐性、（ｖｉ）Ｆｃドメイン安定性、及び／又は、（ｖｉｉ）分解に対する感受性、のうちの一つ又は複数を変える（例えば、修飾されていないＦｃドメインと比較して）。さらなる実施形態では、（ｉ）少なくとも一つの逆電荷の変異と、（ｉｉ）少なくとも一つの操作された空洞又は少なくとも一つの操作された突起とを含有するＦｃドメイン単量体を、（ｉ）少なくとも一つの逆電荷の変異と、（ｉｉ）少なくとも一つの操作された突起又は少なくとも一つの操作された空洞とを含有する他のＦｃドメイン単量体と選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成することができる。例えば、反転した電荷の変異Ｋ３７０Ｄと、操作された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含有するＦｃドメイン単量体と、反転した電荷の変異Ｅ３５７Ｋと、操作された突起Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗとを含有する他のＦｃドメイン単量体とを選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成する。一部の場合では、Ｆｃドメインは１６個以下のアミノ酸修飾（例えば、ＣＨ３ドメインにおける２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、又は１６個以下のアミノ酸修飾）を含む。
【０２２１】
こうしたＦｃドメインの形成は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内の適合するアミノ酸置換によって促される。ＣＨ３−ＣＨ３界面において、二つの二量体形成選択性モジュールが適合しないアミノ酸置換を含有する場合、例えば、操作された空洞を両方が含有する、操作された突起を両方が含有する、又は、同じ電荷をもつアミノ酸を両方が含有する場合は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成は促されない。
【０２２２】
さらに、画成されたＦｃドメイン単量体によるＦｃドメインの形成を促進するために用いる他の方法には、ヘテロ二量体の形成を可能にする、ロイシンジッパーの単量体α−へリックスのＦｃドメイン単量体それぞれに対するＣ末端融合を含むＬＵＺ−Ｙアプローチ（米国特許出願公開公報第ＷＯ２０１１０３４６０５号）のみならず、ＩｇＡ及びＩｇＧ  ＣＨ３配列の交互セグメントをそれぞれが含むヘテロ二量体のＦｃドメイン単量体によりＦｃドメインを生成する、ストランド交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ））体のアプローチ（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２３：１９５−２０２，２０１０）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２３】
ＩＶ．操作された空洞及び操作された突起
操作された空洞及び操作された突起の使用（すなわち、「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」ストラテジー）は、Ｃａｒｔｅｒ及びその共同研究者（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：６１７−６１２，１９９６；Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２７０：２６−３５，１９９７；Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６７７−６８１，１９９８）によって記述されている。ノブとホールとの相互作用は、ヘテロ二量体形成を支持するが、一方、ノブ間及びホール間の相互作用は、立体的な不一致及び好ましい相互作用の損失に起因してホモ二量体形成を妨げる。「ノブイントゥホール」技術は、米国特許第５，７３１，１６８号にも開示されている。
【０２２４】
本開示では、操作された空洞及び操作された突起を、本明細書に記載のＦｃコンストラクトの調製に用いる。操作された空洞は、あるタンパク質中の本来のアミノ酸が、より低分子量の側鎖をもつ異なるアミノ酸で置換されたときに形成される空隙である。操作された突起は、あるタンパク質中の本来のアミノ酸が、より高分子量の側鎖をもつ異なるアミノ酸で置換されたときに形成される突起である。詳細には、置換されようとするアミノ酸は、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内にあり、二つのＦｃドメイン単量体の二量体形成に関与する。一部の実施形態では、一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の操作された空洞は、もう一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の操作された突起を収納するように形成されるため、両ＣＨ３抗体定常ドメインが、二つのＦｃドメイン単量体の二量体形成を促進する又は支持する二量体形成選択性モジュール（例えば、ヘテロ二量体形成選択性モジュール）（上記に記載した）として機能する。他の実施形態では、一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の操作された空洞は、もう一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸をより良好に収納するように形成されている。さらに他の実施形態では、一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の操作された突起は、もう一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸とのさらなる相互作用を形成するように形成されている。
【０２２５】
操作された空洞は、チロシン又はトリプトファン等のより長い側鎖を含有するアミノ酸を、アラニン、バリン、又はトレオニン等のより短い側鎖を含有するアミノ酸で置換することによって構築することが可能である。詳細には、一部の二量体形成選択性モジュール（例えば、ヘテロ二量体形成選択性モジュール）（上記でさらに記載した）は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内にＹ４０７Ｖ変異等の操作された空洞を含有する。同様に、操作された突起は、より短い側鎖を含有するアミノ酸を、より長い側鎖を含有するアミノ酸で置換することによって構築することが可能である。詳細には、一部の二量体形成選択性モジュール（例えば、ヘテロ二量体形成選択性モジュール）（上記でさらに記載した）は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内にＴ３６６Ｗ変異等の操作された突起を含有する。本開示では、操作された空洞及び操作された突起はまた、ヘテロ二量体形成を促進する、ＣＨ３ドメイン間のジスルフィド結合操作と組み合わされる。一実施例では、操作された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含有するＦｃドメイン単量体は、操作された突起Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含有する他のＦｃドメイン単量体と選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成することができる。別の実施例では、操作された空洞Ｙ３４９Ｃを含有するＦｃドメイン単量体と、操作された突起Ｓ３５４Ｃを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成することができる。ジスルフィド結合操作又は構造的計算のいずれかと組み合わせた（ＨＡ−ＴＦ混合）、他の操作された空洞及び操作された突起を表１に示すが、これらに限定されない。
【０２２６】
【表１】
2019519528.tif 000055
【０２２７】
ＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することは、本来のアミノ酸残基をコードする核酸を変更することによって達成することが可能である。置換することが可能である本来のアミノ酸残基の数の上限は、界面における十分な相互作用を維持したままにすることを考えれば、ＣＨ３抗体定常ドメインの界面における残基の総数である。
【０２２８】
Ｖ．静電的ステアリング
静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメイン、及びタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の好ましい静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングの効果を用いて、二重特異性抗体の生成の際のヘテロ二量体形成に有利に、ホモ二量体の形成を低減するように抗体ドメインの相互作用を変える方法が、米国特許出願公開公報第２０１４−００２４１１１号に開示されている。
【０２２９】
本開示では、静電的ステアリングを用いて、Ｆｃドメイン単量体の二量体形成及びＦｃコンストラクトの形成を制御する。特に、静電的ステアリングを用いてＦｃドメイン単量体の二量体形成を制御することは、ＣＨ３−ＣＨ３界面を形成する一つ又は複数のアミノ酸残基が、正電荷をもつか又は負電荷をもつアミノ酸残基で置換されるため、導入された特定の電荷をもつアミノ酸に応じて、相互作用は静電的に好ましくなるか又は好ましくないものとなる。一部の実施形態では、リシン、アルギニン、又はヒスチジン等、界面の正電荷をもつアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸等の負電荷をもつアミノ酸で置換される。他の実施形態では、界面の負電荷をもつアミノ酸が、正電荷をもつアミノ酸で置換される。電荷をもつアミノ酸は、相互作用するＣＨ３抗体定常ドメインの一方又は両方に導入され得る。相互作用するＣＨ３抗体定常ドメインに電荷をもつアミノ酸を導入することによって、二量体形成選択性モジュール（上記においてさらに説明した）が形成されるが、それは電荷をもつアミノ酸間の相互作用の結果としての静電的ステアリング効果で制御されるとおりに、Ｆｃドメイン単量体の二量体を選択的に形成することが可能である。
【０２３０】
一部の実施形態では、静電的ステアリング効果で制御されるとおりにＦｃドメイン単量体の二量体を選択的に形成することが可能である、反転した電荷を含む二量体形成選択性モジュールを形成するために、二つのＦｃドメイン単量体は、ヘテロ二量体形成又はホモ二量体形成を経て選択的に形成され得る。
【０２３１】
Ｆｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成
Ｆｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成は、限定するものではないが表２Ａに含むような電荷残基対などである、二つのＦｃドメイン単量体内に異なるものであるが適合する変異を導入することによって促進することが可能である。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、以下の正電荷をもつアミノ酸置換及び負電荷をもつアミノ酸置換のうちの一つを含み得る：Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅ。一実施例では、正電荷をもつアミノ酸置換、例えばＤ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換、例えばＫ３７０Ｄ又はＫ３７０Ｅを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。別の実施例では、Ｅ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、Ｋ３７０Ｄを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。
【０２３２】
例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトでは、三つのうち二つのＦｃドメインは、静電的ステアリング効果によって促進されるように、二つのＦｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成によって形成され得る。「ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」という語は、二つのＦｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、該二つのＦｃドメイン単量体は、これら二つのＦｃドメイン単量体の好ましい形成を促進する異なる逆電荷の変異（ヘテロ二量体形成選択性モジュール）（例えば、表２Ａの変異を参照）を含有する。図１及び２に示すように、三つのＦｃドメインである、一つのカルボキシル末端「幹」Ｆｃドメインと二つのアミノ末端「枝」Ｆｃドメインとを有するＦｃコンストラクトにおいては、アミノ末端「枝」Ｆｃドメインのそれぞれが、ヘテロ二量体のＦｃドメイン（「枝ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」とも称する）となり得る（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１０６及び１１４、又はＦｃドメイン単量体１１２及び１１６によって形成されるヘテロ二量体Ｆｃドメイン、図２のＦｃドメイン単量体２０６及び２１４、又はＦｃドメイン単量体２１２及び２１６によって形成されるヘテロ二量体Ｆｃドメイン）。枝へテロ二量体Ｆｃドメインは、Ｅ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、Ｋ３７０Ｄを含有する他のＦｃドメイン単量体とによって形成され得る。
【０２３３】
【表２Ａ】
2019519528.tif 000056
【０２３４】
Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成
Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成は、対称的であるように両Ｆｃドメイン単量体内に、同一の静電的ステアリング変異（ホモ二量体形成選択性モジュール）を導入することによって、促進することが可能である。一部の実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体が、ＣＨ３ドメイン間の界面における電荷をもつ残基の環内の少なくとも二つの位置において、同一の逆電荷の変異を含有するホモ二量体形成選択性モジュールを含む。二つのＦｃドメイン単量体内の残基の２以上の相補的な対の両要素の電荷が反転していることによって、変異したＦｃドメイン単量体は同じ変異の配列のＦｃドメイン単量体に対して相補性を維持するが、こうした変異なしではＦｃドメイン単量体に対する相補性はより小さい。Ｆｃドメイン単量体に導入されて、そのホモ二量体形成を促進し得る静電的ステアリング変異を、表２Ｂ及び２Ｃに示しているが、これらに限定されない。一実施形態では、Ｆｃドメインは、例えばＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋである二重の逆電荷の変異体（表２Ｂ）をそれぞれ含む、二つのＦｃドメイン単量体を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、例えばＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ／Ｋ３７０Ｄ／Ｅ３５７Ｋである四重の逆電荷の変異体（表２Ｃ）をそれぞれ含む、二つのＦｃドメイン単量体を含む。
【０２３５】
例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトでは、三つのうち一つのＦｃドメインは、静電的ステアリング効果によって促進されるように、二つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体形成によって形成され得る。「ホモ二量体Ｆｃドメイン」という語は、二つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、該二つのＦｃドメイン単量体は、同一の逆電荷の変異（例えば、表２Ｂ及び２Ｃの変異を参照）を含有する。図１及び２に示すように、三つのＦｃドメインである、一つのカルボキシル末端「幹」Ｆｃドメインと二つのアミノ末端「枝」Ｆｃドメインとを有するＦｃコンストラクトにおいては、カルボキシ末端「幹」Ｆｃドメインが、ホモ二量体のＦｃドメイン（「幹ホモ二量体Ｆｃドメイン」とも称する）であり得る（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１０４及び１１０によって形成されるホモ二量体Ｆｃドメイン、図２のＦｃドメイン単量体２０４及び２１０によって形成されるホモ二量体Ｆｃドメイン）。幹ホモ二量体Ｆｃドメインは、二重変異体Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋをそれぞれ含有する二つのＦｃドメイン単量体によって形成され得る。
【０２３６】
【表２Ｂ】
2019519528.tif 000057
【０２３７】
【表２Ｃ】
2019519528.tif 000058
2019519528.tif 000059
【０２３８】
ＶＩ．リンカー
本開示では、ポリペプチド又はタンパク質ドメイン及び／又は会合する非タンパク質部分間における結合又は接続を説明するために、リンカーを用いる。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも二つのＦｃドメイン単量体間の結合又は接続であり、それに対してリンカーが、第一のＦｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインのＣ末端を、第二のＦｃドメイン単量体のヒンジドメインのＮ末端に対して、二つのＦｃドメイン単量体が互いに直列に連結するように接続するものである。他の実施形態では、リンカーは、Ｆｃドメイン単量体とそれに結合するその他のタンパク質ドメインとの間の結合である。例えばリンカーは、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインのＣ末端を、アルブミン結合ペプチドのＮ末端に結合させることが可能である。
【０２３９】
リンカーは、例えばペプチド結合である単純な共有結合、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーである合成ポリマー、又は、例えば化学的な連結である化学反応で形成した任意の種類の結合とすることが可能である。リンカーがペプチド結合である場合は、一方のタンパク質ドメインのＣ末端におけるカルボン酸基が、縮合反応でもう一方のタンパク質ドメインのＮ末端におけるアミノ酸と反応して、ペプチド結合を形成することが可能である。詳細には、ペプチド結合は、この技術分野で周知の従来の有機化学反応を経る合成手段により、又は、宿主細胞からの自然な産生により形成することが可能であるものであって、例えば二つのＦｃドメイン単量体である、直列にしたタンパク質両方のＤＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド配列を、宿主細胞内の、例えばＤＮＡポリメラーゼ及びリボソームである、必要な分子機械（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）によって両方のタンパク質をコードする隣接し合うポリペプチドへと直接転写又は翻訳されることが可能である。
【０２４０】
リンカーが合成ポリマー、例えばＰＥＧポリマーである場合においては、該ポリマーは、各端部が反応性の化学官能基で官能化されて、二つのタンパク質の接続端にある末端アミノ酸と反応することが可能である。
【０２４１】
リンカー（上記に示したペプチド結合は除く）が化学反応により形成される場合においては、例えばアミン、カルボン酸、エステル、アジド、又はこの技術分野で通常用いられる他の官能基である化学官能基は、一方のタンパク質のＣ末端と、もう一方のタンパク質のＮ末端とのそれぞれに対して合成的に結合させることが可能である。この二つの官能基はその後、合成化学手段を経て反応して化学結合を形成することによって、二つのタンパク質をひとつに接続することが可能である。こうした化学的連結手順は、当業者にとってルーチンである。
【０２４２】
スペーサー
本開示では、二つのＦｃドメイン単量体間のリンカーは、３〜２００アミノ酸（例えば、３〜２００、３〜１８０、３〜１６０、３〜１４０、３〜１２０、３〜１００、３〜９０、３〜８０、３〜７０、３〜６０、３〜５０、３〜４５、３〜４０、３〜３５、３〜３０、３〜２５、３〜２０、３〜１５、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２００、５〜２００、６〜２００、７〜２００、８〜２００、９〜２００、１０〜２００、１５〜２００、２０〜２００、２５〜２００、３０〜２００、３５〜２００、４０〜２００、４５〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、又は１８０〜２００アミノ酸）（例えば、３〜１５０、３〜１００、３〜６０、３〜５０、３〜４０、３〜３０、３〜２０、３〜１０、３〜８、３〜５、４〜３０、５〜３０、６〜３０、８〜３０、１０〜２０、１０〜３０、１２〜３０、１４〜３０、２０〜３０、１５〜２５、１５〜３０、１８〜２２、及び２０〜３０アミノ酸）を含むアミノ酸スペーサーとすることが可能である。一部の実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体間のリンカーは、少なくとも１２アミノ酸、例えば、１２〜２００アミノ酸（例えば、１２〜２００、１２〜１８０、１２〜１６０、１２〜１４０、１２〜１２０、１２〜１００、１２〜９０、１２〜８０、１２〜７０、１２〜６０、１２〜５０、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、又は１２〜１３アミノ酸）（例えば、１４〜２００、１６〜２００、１８〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、１８０〜２００、又は１９０〜２００アミノ酸）（例えば、３〜１５０、３〜１００、３〜６０、３〜５０、３〜４０、３〜３０、３〜２０、３〜１０、３〜８、３〜５、４〜３０、５〜３０、６〜３０、８〜３０、１０〜２０、１０〜３０、１２〜３０、１４〜３０、２０〜３０、１５〜２５、１５〜３０、１８〜２２、及び２０〜３０アミノ酸）を含有するアミノ酸スペーサーである。一部の実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体間のリンカーは、１２〜３０アミノ酸（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０アミノ酸）を含有するアミノ酸スペーサーである。好適なペプチドスペーサーはこの分野において公知であり、例えば、グリシン及びセリン等のフレキシブルなアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを含む。或る実施形態では、スペーサーは、例えばＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ（配列番号：１）、ＧＧＳＧ（配列番号：２）、又はＳＧＧＧ（配列番号：３）の、複数のモチーフ又は繰り返しモチーフであるモチーフを含有することが可能である。或る実施形態では、スペーサーは、例えば
2019519528.tif 000060
である、ＧＳのモチーフを含む２〜１２のアミノ酸を含有することが可能である。他の或る実施形態では、スペーサーは、例えば
2019519528.tif 000061
である、ＧＧＳのモチーフを含む３〜１２のアミノ酸を含有することが可能である。さらに他の実施形態では、スペーサーは、例えば
2019519528.tif 000062
である、ＧＧＳＧ（配列番号：２）のモチーフを含む４〜２０のアミノ酸を含有することが可能である。他の実施形態では、スペーサーは、例えば
2019519528.tif 000063
である、ＧＧＧＧＳ（配列番号：１）のモチーフを含有することが可能である。或る実施形態では、スペーサーは、
2019519528.tif 000064
である。
【０２４３】
一部の実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、グリシン残基のみを含有し、例えば、少なくとも四つのグリシン残基（例えば、４〜２００、４〜１８０、４〜１６０、４〜１４０、４〜４０、４〜１００、４〜９０、４〜８０、４〜７０、４〜６０、４〜５０、４〜４０、４〜３０、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、又は４〜５個のグリシン残基）（例えば、４〜２００、６〜２００、８〜２００、１０〜２００、１２〜２００、１４〜２００、１６〜２００、１８〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、１８０〜２００、１９０〜２００、又は２０個のグリシン残基）を含有する。或る実施形態では、スペーサーは、４〜３０個のグリシン残基（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のグリシン残基）を有する。一部の実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、グリコシル化（例えば、Ｏ−結合型グリコシル化、Ｏ−グリコシル化とも称する）されていないものであり得るか、又は、例えば一つ又は複数のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、
2019519528.tif 000065
と比較して、低減されたレベルのグリコシル化（例えば、低減されたレベルのＯ−グリコシル化）（例えば、キシロース、マンノース、シアル酸、フコース（Ｆｕｃ）、及び／又はガラクトース（Ｇａｌ）等のグリカン（例えば、キシロース）による低減したレベルのＯ−グリコシル化）を有し得る（実施例４を参照）。
【０２４４】
一部の実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、Ｏ−グリコシル化（例えば、Ｏ−キシロシル化）されていないものであり得るか、又は、例えば一つ又は複数のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、
2019519528.tif 000066
）と比較して、低減されたレベルのＯ−グリコシル化（例えば、低減されたレベルのＯ−キシロシル化）を有し得る。
【０２４５】
一部の実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、タンパク質分解を受けないものであり得るか、又は、例えば一つ又は複数のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、
2019519528.tif 000067
）と比較して、低減されたタンパク質分解速度を有し得る（実施例４を参照）。
【０２４６】
或る実施形態では、スペーサーは、例えば
2019519528.tif 000068
である、ＧＧＧＧ（配列番号：１９）のモチーフを含有することが可能である。或る実施形態では、スペーサーは、例えば
2019519528.tif 000069
である、ＧＧＧＧＧ（配列番号：２４）のモチーフを含有することが可能である。或る実施形態では、スペーサーは、
2019519528.tif 000070
である。
【０２４７】
他の実施形態では、スペーサーはまた、グリシン及びセリン以外のアミノ酸を含有すること、例えば
2019519528.tif 000071
を含有することも可能である。
【０２４８】
本開示における或る実施形態では、１２アミノ酸ペプチドスペーサー又は２０アミノ酸ペプチドスペーサーを用いて、二つのＦｃドメイン単量体、それぞれ配列
2019519528.tif 000072
からなる１２アミノ酸ペプチドスペーサー及び２０アミノ酸ペプチドスペーサーである二つのＦｃドメイン単量体が直列に接続される（例えば、図１のポリペプチド１０２及び１０８、図２の２０２及び２０８）。他の実施形態では、配列
2019519528.tif 000073
からなる１８アミノ酸ペプチドスペーサーを用いることができる。
【０２４９】
一部の実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、上記に記載した配列番号：１〜３６のうちのいずれか一つの配列と、少なくとも７５％同一（例えば、少なくとも７７％、７９％、８１％、８３％、８５％、８７％、８９％、９１％、９３％、９５％、９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。或る実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、配列番号：１７、１８、２６、及び２７のうちのいずれか一つの配列と、少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。或る実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、配列番号：１８又は２７の配列と、少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。或る実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、上記に記載した配列番号：１〜３６のうちのいずれか一つの配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【０２５０】
ＶＩＩ．血清タンパク質結合ペプチド
血清タンパク質をペプチドに結合することで、タンパク質薬剤の薬物動態を向上させることが可能であり、特にここに記載するＦｃコンストラクトは、血清タンパク質結合ペプチドと融合し得る。
【０２５１】
一例として、ここに記載の方法及び組成物に用いることが可能であるアルブミン結合ペプチドは、概して、この技術分野において公知である。一実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列
2019519528.tif 000074
を含む。一部の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列番号：３７の配列と、少なくとも８０％同一（例えば、８０％、９０％、又は１００％同一）である配列を有する。
【０２５２】
本開示では、アルブミン結合ペプチドは、Ｆｃコンストラクト内の特定のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に結合し得る。一実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、コンストラクト１〜４（図１及び２）内の一つ又は複数のポリペプチドのＣ末端に結合し得る。別の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、コンストラクト１〜４（例えば、図１のポリペプチド１０２及び１０８ならびに図２のポリペプチド２０２及び２０８）内の直列に接続した二つのＦｃドメイン単量体をコードするポリペプチドのＣ末端に融合することが可能である。さらに別の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、直列に接続した二つのＦｃドメイン単量体をコードするポリペプチド内の第二のＦｃドメイン単量体と連結するＦｃドメイン単量体Ｃ末端（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１１４及び１１６、図２のＦｃドメイン単量体２１４及び２１６）に結合することが可能である。アルブミン結合ペプチドは、例えば化学的連結である化学的手段を介して、Ｆｃコンストラクトと遺伝的に融合、又は、Ｆｃコンストラクトに結合させることが可能である。所望であれば、Ｆｃコンストラクトとアルブミン結合ペプチドとの間にスペーサーを挿入することが可能である。理論に拘束されなくとも、開示のＦｃコンストラクト内にアルブミン結合ペプチドを包含することが、血清アルブミンに対するその結合を介して治療用タンパク質の長い保持をもたらし得るということが予測される。
【０２５３】
ＶＩＩＩ．Ｆｃコンストラクト
概して、この開示は、Ｆｃドメインを有するＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）を特徴とする。これらは、例えばＦｃγＲＩＩＩａであるＦｃ受容体に対する単一の野生型Ｆｃドメインよりも大きい結合親和性及び／又はアビディティーを有し得る。この開示は、Ｆｃドメインの二つのＦｃドメイン単量体が互いと二量体を選択的に形成して、それによって望まない多量体又は凝集の形成を回避するように、相互作用する二つのＣＨ３抗体定常ドメインの界面においてアミノ酸を操作する方法を開示する。Ｆｃコンストラクトは、偶数のＦｃドメイン単量体を含み、Ｆｃドメイン単量体の各対がＦｃドメインを形成する。Ｆｃコンストラクトは、二つのＦｃドメイン単量体の二量体から形成される一つの機能的なＦｃドメインを、最低でも含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクトは、抗原認識領域、例えば可変領域（例えば、ＶＨ、ＶＬ、超可変領域（ＨＶＲ））又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含まない。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクトは、抗原認識領域、例えば可変領域（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＨＶＲ）又はＣＤＲを含む。
【０２５４】
三つのＦｃドメインを含有するＦｃコンストラクトは、四つのポリペプチドで形成され得る（図１及び２）。第一及び第二のポリペプチド（例えば、図１のポリペプチド１０２及び１０８、図２のポリペプチド２０２及び２０８）は、同一又は異なるものとすることが可能であり、第三及び第四のポリペプチド（例えば、図１のポリペプチド１１４及び１１６、図２のポリペプチド２１４及び２１６）についてもそうすることが可能である。図１では、第一及び第二のポリペプチドは両方とも、リンカーを介して直列に連結された二つのＦｃドメイン単量体（例えば、Ｆｃドメイン単量体１０４、１０６、１１０、及び１１２）をコードするものであって、一方のＦｃドメイン単量体は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に電荷をもつアミノ酸置換を含有し（例えば、Ｆｃドメイン単量体１０４及び１１０）、一方、他方のＦｃドメイン単量体は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に突起を含有する（例えば、Ｆｃドメイン単量体１０６及び１１２）。第三及び第四のポリペプチドは両方とも、空洞をもつＦｃドメイン単量体（例えば、Ｆｃドメイン単量体１１４及び１１６）をコードする。幹ホモ二量体Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン単量体１０４及び１１０を結合することによって形成され得、そのそれぞれが、そのＣＨ３抗体定常ドメイン内に同一の逆電荷の変異を含有する（例えば、Ｆｃドメイン単量体１０４及び１１０のそれぞれがＤ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄを含有する）。第一の枝へテロ二量体Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン単量体１０６及び１１４を結合することによって形成され得る（例えば、Ｆｃドメイン単量体１０６が、操作された突起Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含有し、Ｆｃドメイン単量体１１４が操作された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０９Ｖを含有する）。第二のへテロ二量体Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン単量体１１２及び１１６を結合することによって形成され得る（例えば、Ｆｃドメイン単量体１１２が、操作された突起Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含有し、Ｆｃドメイン単量体１１６が操作された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０９Ｖを含有する）。
【０２５５】
図２では、第一及び第二のポリペプチドは両方とも、リンカーを介して直列に連結された二つのＦｃドメイン単量体（例えば、Ｆｃドメイン単量体２０４、２０６、２１０、及び２１２）をコードするものであって、一方のＦｃドメイン単量体は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に電荷をもつアミノ酸置換を含有し（例えば、Ｆｃドメイン単量体２０４及び２１０）、一方、他方のＦｃドメイン単量体は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に突起と電荷をもつアミノ酸置換とを含有する（例えば、Ｆｃドメイン単量体２０６及び２１２）。第三及び第四のポリペプチドは両方とも、空洞と電荷をもつアミノ酸置換とをもつＦｃドメイン単量体（例えば、Ｆｃドメイン単量体２１４及び２１６）をコードする。幹ホモ二量体Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン単量体２０４及び２１０を結合することによって形成され得、そのそれぞれが、そのＣＨ３抗体定常ドメイン内に同一の逆電荷の変異を含有する（例えば、Ｆｃドメイン単量体２０４及び２１０のそれぞれがＤ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄを含有する）。第一の枝へテロ二量体Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン単量体２０６及び２１４を結合することによって形成され得る（例えば、Ｆｃドメイン単量体２０６が、操作された突起Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗと逆電荷の変異Ｅ３５７Ｋとを含有し、Ｆｃドメイン単量体２１４が操作された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０９Ｖと逆電荷の変異Ｋ３７０Ｄとを含有する）。第二のへテロ二量体Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン単量体２１２及び２１６を結合することによって形成され得る（例えば、Ｆｃドメイン単量体２１２が、操作された突起Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗと逆電荷の変異Ｅ３５７Ｋとを含有し、Ｆｃドメイン単量体２１６が操作された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０９Ｖと逆電荷の変異Ｋ３７０Ｄとを含有する）。
【０２５６】
さらなる実施形態では、（ｉ）少なくとも一つの逆電荷の変異と、（ｉｉ）少なくとも一つの操作された空洞又は少なくとも一つの操作された突起とを含有するＦｃドメイン単量体を、（ｉ）少なくとも一つの逆電荷の変異と、（ｉｉ）少なくとも一つの操作された突起又は少なくとも一つの操作された空洞とを含有する他のＦｃドメイン単量体と選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成することができる。例えば、反転した電荷の変異Ｋ３７０Ｄと、操作された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖとを含有するＦｃドメイン単量体と、反転した電荷の変異Ｅ３５７Ｋと、操作された突起Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗとを含有する他のＦｃドメイン単量体とを選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成する。
【０２５７】
一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、ａ）式Ａ−Ｌ−Ｂを有する第一のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａは第一のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌはリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂは第二のＦｃドメイン単量体を含む、第一のポリペプチドと、ｂ）式Ａ’−Ｌ’−Ｂ’を有する第二のポリペプチドであって、式中、ｉ）Ａ’は第三のＦｃドメイン単量体を含み、ｉｉ）Ｌ’はリンカーであり、ｉｉｉ）Ｂ’は第四のＦｃドメイン単量体を含む、第二のポリペプチドと、ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、を含むものであって、ＢとＢ’とが結合して第一のＦｃドメインを形成し、Ａと第五のＦｃドメイン単量体とが結合して第二のＦｃドメインを形成し、Ａ’と第六のＦｃドメイン単量体とが結合して第三のＦｃドメインを形成するものであり、該Ｆｃコンストラクト内のＦｃドメイン単量体内に組み込むことが可能である一部のアミノ酸変異の例は、表３Ａ〜３Ｄに示している。一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクト内の第一、第二、第三、及び第四のポリペプチドのそれぞれは、Ｃ末端リシンを欠いている。一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクト内の第一、第二、第三、及び第四のポリペプチドのそれぞれにおけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。一部の実施形態では、Ｌ及びＬ’のそれぞれは、配列
2019519528.tif 000075
を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなる。
【０２５８】
【表３Ａ】
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【０２５９】
【表３Ｂ】
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【０２６０】
【表３Ｃ】
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【０２６１】
【表３Ｄ】
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【０２６２】
一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、三つのポリペプチドで形成された二つのＦｃドメインを含有する。第一のポリペプチドは、リンカー（例えば、グリシンスペーサー、配列番号：２６及び２７）を介した連結で直列に連結した二つのＦｃドメイン単量体を含有し、第二及び第三のポリペプチドは、一つのＦｃドメイン単量体を含有する。第二及び第三のポリペプチドは、同一のポリペプチドであってもよく、又は、異なるポリペプチドであってもよい。図１３は、こうしたＦｃコンストラクトの例を図示している。第一のポリペプチド（１３０２）は、リンカー（例えば、グリシンスペーサー、配列番号：２６及び２７）を介して直列に連結した二つのＦｃドメイン単量体（１３０４及び１３０６）を含有する。Ｆｃドメイン単量体１３０４及び１３０６はいずれも、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に操作された突起を含有する。第二及び第三のポリペプチド（１３０８及び１３１０）はそれぞれ、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に操作された空洞を有する一つのＦｃドメイン単量体を含有する。第一のポリペプチド内の一方のＦｃドメイン単量体（１３０４）が、第二のポリペプチド（１３０８）と共に第一のヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成し、一方、第一のポリペプチド内のもう一方のＦｃドメイン単量体（１３０６）が、第三のポリペプチド（１３１０）と共に第二のヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成する。この第二のポリペプチドと第三のポリペプチドとは、互いに結合又は連結していない。操作された、空洞に突起が挿入されるＣＨ３−ＣＨ３の界面が、Ｆｃドメイン単量体のヘテロ二量体の形成を支持し、望まない多量体の制御されていない形成を回避する。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが、逆電荷の変異をさらに含有して、ヘテロ二量体形成を促進し得る。例えば、操作された突起及び逆電荷の変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を有するＦｃドメイン単量体１３０４が、操作された空洞及び逆電荷の変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を有するＦｃドメイン単量体１３０８をもつヘテロ二量体Ｆｃドメインを良好に形成することができる。
【０２６３】
さらに他の実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、六つのポリペプチドで形成される五つのＦｃドメインを含有することが可能である。二つの例を図１４及び１５に図示している。これらの図示されたＦｃコンストラクトは、六つのポリペプチドで構成されるが、該ポリペプチドのうち四つが同一の核酸によってコードされることが可能であり、残りの二つのポリペプチドもまた、同一の核酸によってコードされることが可能である。結果としてこれらＦｃコンストラクトは、好適な宿主細胞内の二つの核酸の発現によって産生可能である。
【０２６４】
図１４は、六つのポリペプチドで形成される、五つのＦｃドメインを含有するＦｃコンストラクトの説明図である。第一のポリペプチド及び第二のポリペプチド（１４０２及び１４１０）はそれぞれ、リンカー（例えば、グリシンスペーサー、配列番号：２６及び２７）を介して直列に連結した三つのＦｃドメイン単量体（それぞれ、１４０４、１４０６、１４０８、及び１４１２、１４１４、１４１６）を含有する。詳細には、ポリペプチド１４０２又は１４１０においては、第一の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１４０４又は１４１２）が、野生型配列と比べてＣＨ３−ＣＨ３界面において異なる電荷をもつアミノ酸を含有する第二のＦｃドメイン単量体（１４０６又は１４１４）と結合しており、該第二のＦｃドメイン単量体（１４０６又は１４１４）は、第三の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１４０８又は１４１６）と結合している。Ｆｃドメイン単量体１４０６及び１４１４は、ホモ二量体Ｆｃドメインの形成を促進する、同一の逆電荷の変異（例えば、Ｄ３９９Ｋ／Ｋ４０９Ｄ）をそれぞれ含有し得る。第三のポリペプチド〜第六のポリペプチド（１４１８、１４２０、１４２２、及び１４２４）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有して、それぞれ１４０４、１４０８、１４１２、及び１４１６であるＦｃドメイン単量体のそれぞれと共にヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成する。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体１４０４、１４０８、１４１２、１４１６、１４１８、１４２０、１４２２、及び１４２４のそれぞれは、逆電荷の変異をさらに含有しヘテロ二量体形成を促進し得る。例えば、操作された突起及び逆電荷の変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を有するＦｃドメイン単量体１４０８が、操作された空洞及び逆電荷の変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を有するＦｃドメイン単量体１４２０をもつヘテロ二量体Ｆｃドメインを良好に形成することができる。
【０２６５】
図１５は、六つのポリペプチドで形成される、五つのＦｃドメインを含有するＦｃコンストラクトの説明図である。第一のポリペプチド及び第二のポリペプチド（１５０２及び１５１０）はそれぞれ、リンカー（例えば、グリシンスペーサー、配列番号：２６及び２７）を介して直列に連結した三つのＦｃドメイン単量体（それぞれ、１５０４、１５０６、１５０８、及び１５１２、１５１４、１５１６）を含有する。詳細には、ポリペプチド１５０２又は１５１０においては、第一の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１５０４又は１５１２）が、第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１５０６又は１５１４）と結合しており、該第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１５０６又は１５１４）は、野生型配列と比べてＣＨ３−ＣＨ３界面において異なる電荷をもつアミノ酸を含有する第三のＦｃドメイン単量体（１５０８又は１５１６）と結合している。Ｆｃドメイン単量体１５０８及び１５１６は、ホモ二量体Ｆｃドメインの形成を促進する、同一の逆電荷の変異（例えば、Ｄ３９９Ｋ／Ｋ４０９Ｄ）をそれぞれ含有し得る。第三のポリペプチド〜第六のポリペプチド（１５１８、１５２０、１５２２、及び１５２４）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有して、それぞれ１５０４、１５０６、１５１２、及び１５１４である各Ｆｃドメイン単量体と共にヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成する。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体１５０４、１５０６、１５１２、１５１４、１５１８、１５２０、１５２２、及び１５２４のそれぞれは、逆電荷の変異をさらに含有しヘテロ二量体形成を促進し得る。例えば、操作された突起及び逆電荷の変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を有するＦｃドメイン単量体１５０４が、操作された空洞及び逆電荷の変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を有するＦｃドメイン単量体１５１８をもつヘテロ二量体Ｆｃドメインを良好に形成することができる。
【０２６６】
図１６は、六つのポリペプチドで形成される、五つのＦｃドメインを含有する別のＦｃコンストラクトの説明図である。第一のポリペプチド及び第二のポリペプチド（１６０２及び１６１０）はそれぞれ、リンカー（例えば、グリシンスペーサー、配列番号：２６及び２７）を介して直列に連結した三つのＦｃドメイン単量体（それぞれ、１６０４、１６０６、１６０８、及び１６１２、１６１４、１６１６）を含有する。詳細には、ポリペプチド１６０２又は１６１０においては、ＣＨ３−ＣＨ３界面において異なる電荷をもつアミノ酸を含有する第一のＦｃドメイン単量体（１６０４又は１６１２）が、第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１６０６又は１６１４）と結合しており、該第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１６０６又は１６１４）は、野生型配列と比べて第三の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１６０８又は１６１６）と結合している。Ｆｃドメイン単量体１６０４及び１６１２は、ホモ二量体Ｆｃドメインの形成を促進する、同一の逆電荷の変異（例えば、Ｄ３９９Ｋ／Ｋ４０９Ｄ）をそれぞれ含有し得る。第三のポリペプチド〜第六のポリペプチド（１６１８、１６２０、１６２２、及び１６２４）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有して、それぞれ１６０６、１６０８、１６１４、及び１６１６である各Ｆｃドメイン単量体と共にヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成する。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体１６０６、１６０８、１６１４、１６１６、１６１８、１６２０、１６２２、及び１６２４のそれぞれは、逆電荷の変異をさらに含有しヘテロ二量体形成を促進し得る。例えば、操作された突起及び逆電荷の変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を有するＦｃドメイン単量体１６０８が、操作された空洞及び逆電荷の変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を有するＦｃドメイン単量体１６２０をもつヘテロ二量体Ｆｃドメインを良好に形成することができる。
【０２６７】
別の実施形態では、二つ以上のＦｃドメインを含有するＦｃコンストラクトは、同一の一次配列を有する二つのポリペプチドで形成可能である。こうしたコンストラクトは、宿主細胞内で、単一のポリペプチド配列の発現により形成することが可能である。図１７に一例を図示している。この例では、三つのＦｃドメインを含有するＦｃコンストラクトをコードするのに、単一の核酸は十分である。同一のポリペプチドの部分である二つのＦｃドメイン単量体は、十分な長さ及び柔軟性であるフレキシブルなリンカーを含むことによってヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成することが許容される。この同一のポリペプチドはまた、フレキシブルなリンカー（例えば、グリシンスペーサー、配列番号：２６及び２７）を介して連結される第三のＦｃドメイン単量体も含有する。この第三のＦｃドメイン単量体（１７０８）は、他のＦｃドメイン単量体（１７１６）に連結して、ホモ二量体Ｆｃドメインを形成し、図１７に図示するＹ形状Ｆｃコンストラクトを産生することが可能である。Ｆｃドメインの形成は、図１７にも図示するように、二量体形成選択性モジュールを使用することで制御することが可能である。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体１７０４、１７０６、１７１２、及び１７１４のそれぞれは、逆電荷の変異をさらに含有しヘテロ二量体形成を促進し得る。例えば、操作された突起及び逆電荷の変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を有するＦｃドメイン単量体１７０４が、操作された空洞及び逆電荷の変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を有するＦｃドメイン単量体１７０６をもつヘテロ二量体Ｆｃドメインを良好に形成することができる。
【０２６８】
一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクト（例えば、図１のＦｃコンストラクト１〜３、図２のＦｃコンストラクト４）内の一つ又は複数のＦｃポリペプチドが、Ｃ末端リシン残基を欠いている。一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクト内のＦｃポリペプチドの全てが、Ｃ末端リシン残基を欠いている。一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクト内の一つ又は複数のＦｃポリペプチドにおいてＣ末端リシン残基が不在であることで、Ｆｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）の集団、例えば実質的に均質である三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトの集団の均質性が向上し得る（実施例８を参照）。一実施例では、配列番号：４３及び４４（実施例１、表６を参照）のうちのいずれか一つの配列を有するＦｃポリペプチド内のＣ末端リシン残基は除去されて、Ｃ末端リシン残基を含有しない対応するＦｃポリペプチドを生成することができる。
【０２６９】
一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクト内の一つ又は複数のＦｃポリペプチドが、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆの変異を含む。一部の場合では、Ｆｃコンストラクトは、Ｆｃコンストラクト４であり、該コンストラクトは、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆの変異を含む。この変異は、ＦｃコンストラクトのＦｃγＲＩＩｂに対する結合親和性を増加させる。
【０２７０】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）内のＦｃドメイン単量体は、野生型のＦｃドメイン単量体の配列（例えば、配列番号：４２）と、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を有することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）内のＦｃドメイン単量体は、配列番号：４４、４６、４８、及び５０〜５３のいずれか一つの配列と、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を有することができる。或る実施形態では、Ｆｃコンストラクト内のＦｃドメイン単量体は、配列番号：４８、５２、及び５３の配列と、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を有することができる。
【０２７１】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト内の二つのＦｃドメイン単量体を有するポリペプチド（例えば、図１のポリペプチド１０２及び１０８、図２のポリペプチド２０２及び２０８）は、配列番号：４３、４５、４７、及び４９（実施例１、表６を参照）のうちのいずれか一つの配列と、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を含み得る、該配列からなり得る、又は、実質的に該配列からなり得る。或る実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト内の二つのＦｃドメイン単量体を有するポリペプチドは、配列番号：４９の配列と、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、又は９９．５％同一）である配列を含み得る、該配列からなり得る、又は、実質的に該配列からなり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト内の二つのＦｃドメイン単量体を有するポリペプチド（例えば、図１のポリペプチド１０２及び１０８、図２のポリペプチド２０２及び２０８）におけるアミノ酸変異は、Ｆｃドメイン単量体（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１０４、１０６、１１０、及び１１２、図２のＦｃドメイン単量体２０４、２０６、２１０、及び２１２）でのみ発生し、スペーサー内で発生しない。例えば、表８に示すポリペプチドにおいては、配列番号：５０〜５３の配列を含む、該配列からなる、又は、実質的に該配列からなるＦｃドメイン単量体内で、追加のアミノ酸変異がなされ得るものであり、一方、配列番号：１８、２６、及び２７の配列を有するスペーサーは変化がない。
【０２７２】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト内の第一、第二、第三、及び第四のポリペプチド（例えば、図１のポリペプチド１０２、１０８、１１４、及び１１６、図２の２０２、２０８、２１４、及び２１６）のうちの一つ又は複数におけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト内の第一、第二、第三、及び第四のポリペプチドのそれぞれにおけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異される。他の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）は、Ｇｌｎに変異されるものであるＮ末端Ａｓｐを有する一つ又は複数のＦｃドメイン単量体を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト内の第一、第二、第三、及び第四のポリペプチドのうちの一つ又は複数におけるＮ末端ＡｓｐがＧｌｎに変異することで、Ｆｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）の集団、例えば実質的に均質である三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトの集団の均質性が向上し得る。例えば、表４では、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトにおいてＮ末端ＡｓｐをＧｌｎに変異させた、第一、第二、第三、及び第四のポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【０２７３】
【表４】
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【０２７４】
ＩＸ．宿主細胞及びタンパク質の産生
本開示では、宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチド又はコンストラクトを、それらの対応する核酸から発現するのに必要であるような、例えばオルガネラである、必要な細胞成分を含む担体を指す。核酸は、この技術分野で公知の従来の技術（形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注入等）によって宿主細胞内に導入されることが可能である核酸ベクター中に含まれ得る。宿主細胞は、哺乳動物起源、細菌起源、真菌起源、又は虫起源のものとすることが可能である。哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ（又はＣＨＯ誘導細胞株、例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１  ＣＨＯ−ＤＧ４４）、マウス宿主細胞（例えば、ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ＶＥＲＹ、ＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、及びＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ならびにＨｓＳ７８Ｂｓｔの細胞が含まれるが、これらに限定されない。また、タンパク質コンストラクトの発現を調節する、又は所望の特定の手法でタンパク質産物を修飾及びプロセシングする、宿主細胞を選択することが可能である。様々な宿主細胞が、タンパク質産物の翻訳後プロセシング及び修飾に関する特性及び特異的な機序を有する。適切な株化細胞又は宿主系を選択して、発現されたタンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確実にすることが可能である。
【０２７５】
タンパク質産物の、それらの対応するＤＮＡプラスミドコンストラクトからの発現及び分泌のために、宿主細胞が、プロモータ、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位及び選択可能な標識を含む、この技術分野で公知である適切な発現制御要素によって制御されるＤＮＡで、トランスフェクト又は形質転換され得る。治療用タンパク質の発現方法は、この技術分野で公知である。例えば、Ｐａｕｌｉｎａ  Ｂａｌｂａｓ，Ａｒｇｅｌｉａ  Ｌｏｒｅｎｃｅ（ｅｄｓ．）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ  ｅｄ．２００４  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ  ２０，２００４）；Ｖｌａｄｉｍｉｒ  Ｖｏｙｎｏｖ  ａｎｄ  Ｊｕｓｔｉｎ  Ａ．Ｃａｒａｖｅｌｌａ（ｅｄｓ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ  ｅｄ．２０１２  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｎｅ  ２８，２０１２）を参照されたい。
【０２７６】
Ｘ．精製
Ｆｃコンストラクトは、タンパク質精製分野の公知である任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー（例えばプロテインＡアフィニティー）及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又はタンパク質の精製に関するその他の標準技術によって、精製することが可能である。例えば、Ｆｃコンストラクトは、プロテインＡカラム等のアフィニティーカラムを、適切に選択することと、クロマトグラフィーカラム、濾過、限外濾過、塩析、及び透析手順と組み合わせることとによって、単離及び精製することが可能である（例えば、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｕｗｅ  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ（ｅｄ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００９；ａｎｄ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ（ｅｄ．）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ−Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００４）を参照）。
【０２７７】
一部の例では、Ｆｃコンストラクトは、一つ又は複数の精製用ペプチドに連結して、例えば全細胞溶解混合物からの、Ｆｃコンストラクトの精製及び単離を促進することが可能である。一部の実施形態では、精製用ペプチドは、精製用ペプチドに対して特異的な親和性を有する別の部分と結合する。一部の実施形態では、精製用ペプチドと特異的に結合するこうした部分は、基剤、樹脂、又はアガロースビーズ等の固相支持体に結合する。Ｆｃコンストラクトに連結することができる精製用ペプチドの例としては、ヘキサヒスチジンペプチド、ＦＬＡＧペプチド、ｍｙｃペプチド、及び赤血球凝集素（ＨＡ）ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ヘキサヒスチジンペプチド（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号：３８））は、マイクロモル親和性をもつニッケル官能性アガロースアフィニティーカラムと結合する。一部の実施形態では、ＦＬＡＧペプチドは、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号：３９）を含む。一部の実施形態では、ＦＬＡＧペプチドは、直列にした、整数倍にした配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ、例えば３×ＤＹＫＤＤＤＤＫを含む。一部の実施形態では、ｍｙｃペプチドは、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号：４０）を含む。一部の実施形態では、ｍｙｃペプチドは、直列にした、整数倍にした配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、例えば３×ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを含む。一部の実施形態では、ＨＡペプチドは、配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号：４１）を含む。一部の実施形態では、ＨＡペプチドは、直列にした、整数倍にした配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、例えば３×ＹＰＹＤＶＰＤＹＡを含む。ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、又はＨＡの精製用ペプチドに対して特異的に認識かつ結合する抗体は、この技術分野で周知であり、しばしば市販されている。これらの抗体により官能化された固相支持体（例えば、基剤、樹脂、又はアガロースビーズ）を用いて、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、又はＨＡ  ペプチドを含むＦｃ  コンストラクトを精製することができる。
【０２７８】
Ｆｃコンストラクトに関しては、精製方法としてプロテインＡカラムクロマトグラフィーを採用することができる。プロテインＡリガンドは、Ｆｃ領域を介してＦｃコンストラクトと相互作用するものであって、プロテインＡクロマトグラフィーは、大半の宿主細胞タンパク質を除去することができる高度な選択的捕捉方法となっている。本開示では、実施例２に記載するようにプロテインＡカラムクロマトグラフィーを用いて、Ｆｃコンストラクトを精製できる。
【０２７９】
ＸＩ．医薬組成物／製剤
この開示は、本明細書に記載する一つ又は複数のＦｃコンストラクトを含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、医薬組成物は、Ｆｃコンストラクトの実質的に均質な集団を含む。種々の実施例では、医薬組成物は、Ｆｃコンストラクト１〜４のいずれか一つの実質的に均質な集団を含む。
【０２８０】
例えば本明細書に記載のＦｃコンストラクト（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト）である本開示の治療用タンパク質コンストラクトを、医薬組成物内に組み込むことが可能である。治療用タンパク質を含む医薬組成物は、当業者に公知である方法によって調製することが可能である。医薬組成物は、水又は他の薬剤的に許容できる液体の滅菌溶液又は懸濁液を含む注射製剤で非経口投与することが可能である。例えば医薬組成物は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）、生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、サーファクタント、安定剤、希釈剤、結合剤、賦形剤等の薬剤的に許容できる担体又は溶媒とＦｃコンストラクトとを好適に組み合わせて、次いで通常許容される薬務で求められる単位用量形態で混合することによって、調製することが可能である。医薬製剤に含まれる活性成分の量は、指定される範囲内で好適な用量が与えられるようなものとする。
【０２８１】
注射用の滅菌組成物は、従来の薬務に従って、担体として注射用蒸留水を用いて調製することが可能である。例えば、グルコースと、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の他の添加とを含有する生理食塩水又は等張液を、任意に、好適な可溶化剤、例えばこの技術分野で通常知られる、エタノール等のアルコール及びプロピレングリコール又はポリエチレングリコール等のポリアルコール、及びポリソルベート８０ＴＭ（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤と組み合わせて、注射用水溶液として用いることができる。治療用タンパク質産物の調製方法は、この技術分野で公知であり、例えば、Ｂａｎｇａ（ｅｄ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （２ｄ  ｅｄ．）Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００６）を参照されたい。
【０２８２】
ＸＩＩ．用量
医薬組成物は、投与形態と互換性のある手法で、治療効果があるような量で投与されて、症状の改善又は治療をもたらす。医薬組成物は、例えば静脈内投与形態、皮下投与形態、摂取可能な溶液、薬剤放出カプセル等の経口投与形態である、種々の投与形態で投与される。個々の対象に適切な用量は、治療目的、投与経路、及び患者の状態に依存する。概して、組換えタンパク質は、１〜２００ｍｇ／ｋｇ、例えば１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば２０〜１００ｍｇ／ｋｇで投与される。したがって、最適な治療効果を得るために求められるとおりに、医療提供者が、用量を誂えて、決定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を調整することが必要となる。
【０２８３】
ＸＩＩＩ．適応症
この開示の医薬組成物（例えば、２、３、又は４つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトを含有するもの）は、対象における炎症を軽減し、対象における自己抗体のクリアランスを促進し、対象における抗原提示を抑制し、例えば対象における免疫応答の免疫複合体に基づく活性化を防止することである、免疫応答を軽減し、ならびに、対象における免疫の状態又は疾患及び炎症性の状態又は疾患を治療するのに有用である。例示的な状態及び疾患には、関節リウマチ（ＲＡ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；ＡＮＣＡ関連血管炎；抗リン脂質抗体症候群；自己免疫性溶血性貧血；慢性炎症性脱髄性ニューロパシー；移植における抗アロ（ａｎｔｉ−ａｌｌｏ）、ＧＶＨＤにおける抗自己（ａｎｔｉ−ｓｅｌｆ）、抗置換、ＩｇＧ治療、ＩｇＧパラプロテインのクリアランス；皮膚筋炎；グッドパスチャー症候群；抗体依存性細胞媒介性細胞障害により媒介される器官系を標的とするＩＩ型過敏症症候群、例えばギラン・バレー症候群、ＣＩＤＰ、皮膚筋炎、フェルティ症候群、抗体媒介性拒絶反応、自己免疫性甲状腺疾患、潰瘍性大腸炎、自己免疫性肝疾患；突発性血小板減少性紫斑病；重症筋無力症、視神経脊髄炎；天疱瘡及び他の自己免疫性水疱性疾患；シェーグレン症候群；抗体依存性ファゴサイトーシスにより媒介される、自己免疫性血球減少症及び他の障害；例えば滑膜炎、皮膚筋炎、全身性血管炎、糸球体炎、及び血管炎である他のＦｃＲ依存性炎症症候群を含む。
【０２８４】
一部の実施形態では、５〜１０のＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトを含有するこの開示の医薬組成物もまた、例えば、対象における免疫応答の免疫細胞活性化を誘導する、対象における標的細胞（すなわち、癌細胞又は感染細胞）のファゴサイトーシスを増加する、及び、対象における癌及び感染症等の疾患を治療するのに有用である。この開示のＦｃコンストラクト及び均質な医薬組成物は、活性化Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂ）と結合して、免疫応答を誘導することができる。この開示のＦｃコンストラクト及び均質な医薬組成物は、プライマリＴＨＰ−１単球からの、Ｓｙｋリン酸化及びカルシウム流出を活性化し得る。活性化単球及びそれらの分化したマクロファージは、標的細胞を貪食する又は死滅させる能力を有する。したがってこの開示では、癌及び感染症等の疾患及び障害を抱える対象を治療するために用いることができる、治療方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＦｃコンストラクト及び均質な医薬組成物を、治療有効量で対象に投与して、対象において癌細胞又は感染細胞を貪食させる又は死滅させることができる。
【０２８５】
この開示の方法により治療できる癌には、膀胱癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、大腸癌、胃癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、腎臓癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、直腸癌、呼吸器系癌、泌尿器系癌、口腔癌、皮膚癌、白血病、肉腫、カルシノーマ、基底細胞癌、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ−細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、赤白血病、腎細胞癌、星細胞腫、乏突起星細胞腫、胆道癌、絨毛癌、ＣＮＳ癌、喉頭癌、小細胞肺癌、腺癌、巨細胞癌（又は燕麦細胞癌）、扁平上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、非小細胞肺癌、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、神経外胚葉性癌、神経膠芽腫、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、悪性黒色腫、炎症性筋線維芽細胞腫瘍癌、及び、軟部組織腫瘍癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８６】
この開示の方法により治療できる感染の例には、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、及び原生動物感染症が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８７】
感染症の原因となる細菌の例は、この技術分野で周知であり、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌（例えば、Ａ群レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属の細菌（例えば、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ））、腸炎（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）属の細菌（例えば、サルモネラ腸炎（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ））、及び、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属の細菌（例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２８８】
感染症の原因となるウイルスの例は、この技術分野で周知であり、レトロウイルス科のウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））、アデノウイルス科のウイルス（例えば、アデノウイルス）、ヘルペスウイルス科のウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型）、パピローマウイルス科のウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、ポックスウイルス科のウイルス（例えば、天然痘）、ピコルナウイルス科のウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス）、ヘパドナウイルス科のウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、フラビウイルス科のウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス）、トガウイルス科のウイルス（例えば、ルビウイルス）、オルトミクソウイルス科のウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、フィロウイルス科のウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス）、及び、パラミクソウイルス科のウイルス（例えば、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２８９】
感染症の原因となる真菌の例は、この技術分野で周知であり、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の真菌（例えば、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・カンジダス（Ａ．ｃａｎｄｉｄｕｓ）、アスペルギルス・クラバツス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・オクラセウス（Ａ．ｏｃｈｒａｃｅｕｓ））、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の真菌（例えば、カンジダ・アルビカンス（  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・パラプローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ギリエルモンジィ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の真菌（例えば、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））、及び、ファサリウム属（  Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の真菌（例えば、フザリウム・ソラニ（  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２９０】
寄生虫の例としては、サナダムシ（条虫類（ｃｅｓｔｏｄｅ））、回虫（線虫類（ｎｅｍａｔｏｄｅ））、吸虫（吸虫類（ｔｒｅｍａｔｏｄｅ））、及び単生類が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２９１】
原生動物の例としては、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）の原生動物（例えば、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ））、マラリア原虫属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の原生動物（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ））、ジアルディア属（Ｇｉａｒｄｉａ）の原生動物（例えば、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ））、及び、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）の原生動物（例えば、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ））が挙げられるがこれらに限定されない。
【実施例】
【０２９２】
実施例１  Ｆｃコンストラクトの設計
望ましくは、Ｆｃコンストラクトは、フォールディング効率が増加し、望まない高分子量のオリゴマー及び多量体を形成し得るサブユニットの制御されていない会合が最小化されて、実質的に均質な組成物が生成されるように設計される。こうした目標を念頭に、我々は、スペーサーで離間された二つのＦｃドメイン単量体を含む長ポリペプチド（図１のポリペプチド１０２及び１０８ならびに図２のポリペプチド２０２及び２０８）と、単一のＦｃドメイン単量体を含む短ポリペプチド（図１のポリペプチド１１４及び１１６ならびに図２のポリペプチド２１４及び２１６）とをそれぞれが含む四つのＦｃコンストラクトを設計した（図１及び２）。それぞれはＩｇＧ１  Ｆｃ配列に基づくものであり、ポリペプチドのアセンブリを制御する操作された空洞、操作された突起、及び／又は静電的ステアリングの修飾を包含する。長ポリペプチド及び短ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現のために最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクターにクローン化された。ＤＮＡプラスミドコンストラクトを、リポソームによって、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトした。合計八つのＤＮＡプラスミドコンストラクトを用いて、それぞれが三つのＦｃドメインを有する四つのＦｃコンストラクトを構築した。
【０２９３】
Ｆｃコンストラクト毎に、長ポリペプチド及び短ポリペプチドは、共発現されたときに三つのＦｃドメインを含有する分枝した分子を産生するものであり、該長ポリペプチドのＣ末端Ｆｃ単量体が互いに特異的に会合して一つのＣ末端Ｆｃドメインを形成することと、長ポリペプチドのＮ末端Ｆｃ単量体が短ポリペプチドと特異的に会合して二つのＮ末端Ｆｃドメインを形成することを伴う。Ｆｃコンストラクト１〜４及びそれらの設計は、表５ならびに図１及び２に記載している。各Ｆｃコンストラクトで利用される配列を、表６に示している。以下の表７では、コンストラクト１〜４のそれぞれにおける長ポリペプチド及び短ポリペプチドの特性をさらに要約している。
【０２９４】
【表５】
2019519528.tif 000082
【０２９５】
【表６】
2019519528.tif 000083
2019519528.tif 000084
【０２９６】
【表７】
2019519528.tif 000085
★配列位置は、Kabatナンバリングシステム（Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., ed 5, 1991）に従って番号付けた。
【０２９７】
Ｆｃコンストラクト１〜３における長ポリペプチド１０２及び１０８（図１）及びＦｃコンストラクト４における長ポリペプチド２０２及び２０８（図２）のそれぞれは、スペーサーを介して直列に連結した二つのＦｃドメイン単量体を含有する。以下の表８では、長ポリペプチドにおけるＦｃドメイン単量体及びＦｃコンストラクト１〜４におけるスペーサーの配列を提供している。
【０２９８】
【表８】
2019519528.tif 000086
2019519528.tif 000087
【０２９９】
実施例２  Ｆｃコンストラクトの発現
発現したタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを用いて、プロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。捕捉したＦｃコンストラクトを、リン酸緩衝食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離した。溶出物は、１ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．４を添加することによって素早く中和して、０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。
【０３００】
タンパク質は、Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、イオン交換クロマトグラフィーによってさらに分取した。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化して、溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（緩衝液Ｂ）を用いたステップグラジェントにより、サンプルを溶離した。
【０３０１】
イオン交換の後、標的のフラクションは、タンジェンシャルフロー・フィルトレーションシステムにおいて、１０ｋＤａをカットオフするポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを用いて、ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換した。サンプルはおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。
【０３０２】
実施例３  Ｆｃコンストラクトを特性決定するために用いる実験アッセイ
ペプチド及びグリコペプチドの液体クロマトグラフィー−ＭＳ／ＭＳ
タンパク質は、６Ｍのグアニジン（Ｓｉｇｍａ社）中で１μｇ／μＬに希釈した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を濃度１０ｍＭまで加えて、６５℃で３０分間、変性条件下でジスルフィド結合を減らした。氷冷後、サンプルを、暗闇中で１時間、３０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）と共にインキュベートして、遊離チオールをアルキル化（カルバミドメチル化（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｅ））した。その後タンパク質を、１０ｋＤａ膜を介して２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．８）中に透析し、ＩＡＭ、ＤＴＴ及びグアニジンを除去した。タンパク質は、Ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒ（ＮＥＰ  ２３２０、Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中で、トリプシンで消化した。圧力は、３７℃で、２０，０００ｐｓｉと周囲圧力との間を１時間に合計３０サイクルで循環させた。ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００（Ｄｉｏｎｅｘ）クロマトグラフィーシステムとＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）質量分析計とで行った。ペプチドは、移動相として０．１％ＦＡ水溶液及び０．１％ＦＡアセトニトリル溶液を用いて、ＢＥＨ  ＰｅｐＭａｐ（Ｗａｔｅｒｓ社）カラムで分離した。四重極型の分離幅（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｗｉｄｔｈ）±１．５Ｄａで、２価イオン（ｚ＝２）ｍ／ｚ  ８４２．５に基づいて、一つずつキシロシル化されたリンカーペプチドをターゲットとした。
【０３０３】
インタクト質量分析
タンパク質は、７８．９８％の水、２０％のアセトニトリル、１％のギ酸（ＦＡ）及び０．０２％のトリフルオロ酢酸からなる移動緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）中で、２μｇ／μＬの濃度に希釈した。サイズ排除クロマトグラフィー分離は、合計カラム長が７００ｍｍになるよう直列にした二つのＺｅｎｉｘ−Ｃ  ＳＥＣ−３００（Ｓｅｐａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、デラウェア州ニューアーク）２．１×３５０ｍｍで行った。タンパク質は、８０μＬ／分の流量で、上記した移動緩衝液を用いてＳＥＣカラムから溶出した。質量スペクトルは、ポジティブモードで動作させたＱＳＴＡＲ  Ｅｌｉｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）Ｑ−ＴｏＦ質量分光計で取得した。それぞれのサイズのフラクション下の中性質量を、クロマトグラフィーピークの全幅にわたってスペクトルを合計することによって、ベイズのピークデコンボリューション（Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｐｅａｋ  ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を用いてデコンボリュートした。
【０３０４】
キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）アッセイ
サンプルを１ｍｇ／ｍＬに希釈して、ＨＴタンパク質発現変性緩衝液（ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社）と混合した。混合物を４０℃で２０分間インキュベートした。サンプルを７０μＬの水で希釈して、９６ウェルプレートに移した。サンプルは、ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（パーキンエルマー社）を備えたＣａｌｉｐｅｒ  ＧＸＩＩ機器（パーキンエルマー社）で分析した。蛍光強度を用いて、各サイズの変異体の相対存在度を計算した。
【０３０５】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させた。サンプルを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射又はクマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。
【０３０６】
補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）
ＣＤＣは、連続希釈されたリツキシマブ、Ｆｃコンストラクト４又はＩＶＩｇでＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）がコーティングされた、比色分析アッセイで評価した。全てのウェルにヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ社）を２５％ｖ／ｖで添加し、３７℃で２時間インキュベートした。細胞は、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加した後で、３７℃で１２時間インキュベートした。プレートを振とう機に２分間移し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０３０７】
実施例４  リンカーセリン残基のＯ−グリコシル化及びタンパク質分解
リンカーセリン残基におけるＯ−グリコシル化
実施例１で記載したように、我々は、フォールディング効率が増加し、制御されていないサブユニットの会合が最小化されて、実質的に均質な医薬品用の組成物が生成されるように、Ｆｃコンストラクトを設計した。こうした目的を達成するための努力として、長ポリペプチド内の二つのＦｃドメイン単量体（図１の１０２及び１０８、図２の２０２及び２０８）間における様々なリンカーを調べた。Ｆｃコンストラクト１及びＦｃコンストラクト２はそれぞれ、長ポリペプチド内の二つのＦｃドメイン単量体間にセリン−グリシンリンカー
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を有する。
【０３０８】
長ポリペプチド内の二つのＦｃドメイン単量体間にリンカー：
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を含有するＦｃコンストラクト２をペプチドＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析したとき、Ｏ−キシロシル化が観察された（図３）。しかしながら、フラグメントｙ２〜ｙ９がキシロースを含有していないように、リンカー内の５番目のセリンはＯ−キシロシル化されていない。Ｏ−キシロシル化されている部位は複数存在し得るが、各ペプチドは、一つずつＯ−キシロシル化されているのみである。この翻訳後修飾の範囲及び位置は、配列と発現系との両方に依存し得る。
【０３０９】
同様に、同一の（ＳＧ３）５リンカーを含有する二つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト（図１３に示すＦｃコンストラクト）内でＯ−キシロシル化が観察された（図４）。複数の部位での修飾が観察され、各リンカー内に最大二つのキシロース修飾を有した。さらに、修飾のレベルは、バッチ間で一定しなかった。
【０３１０】
セリン−グリシンリンカー内のセリン残基におけるＯ−キシロシル化が観察された後で、リンカー配列をさらに最適化し、またＦｃコンストラクトの均質性をさらに向上させるために、グリシン残基のみを含有する代替的なリンカーについて調べた。結果として、Ｆｃコンストラクト３及びＦｃコンストラクト４内での使用に、オールグリシンスペーサーを選択した。Ｆｃコンストラクト３は、長ポリペプチド内の二つのＦｃドメイン単量体間に、１５ｍｅｒのオールグリシンスペーサー：
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を有する。Ｆｃコンストラクト４は、長ポリペプチド内の二つのＦｃドメイン単量体間に、２０ｍｅｒのオールグリシンスペーサー：
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を有する。
【０３１１】
リンカーセリン残基におけるタンパク質分解
一部の実施形態では、Ｆｃコンストラクトは、リン酸緩衝食塩水中で４５℃でインキュベーションすると、リンカー内でタンパク質分解を受け、単量体のＦｃ産物を生成することがわかった。Ｆｃコンストラクト２（ポリペプチド１０２及び１０８のそれぞれにおいてリンカー：
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を含有する）における単量体形成速度は、Ｆｃコンストラクト４（ポリペプチド２０２及び２０８のそれぞれにおいてオールグリシンスペーサー：
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を含有する）における単量体形成速度よりも速く（図５）、オールグリシンスペーサーは、タンパク質分解の影響を受けにくいということを示唆した。この効果は、多様なリンカー長である三つのＦｃドメインを有する分枝したＦｃコンストラクトのうちでは普通であるということが見出され、オールグリシンスペーサーは、セリン−グリシンリンカーよりもゆっくりとタンパク質分解されるものであった（表９）。
【０３１２】
【表９】
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【０３１３】
また、ポリペプチド１０２及び１０８のそれぞれに（ＳＧ３）５リンカーをもつＦｃコンストラクト２における単量体Ｆｃ産物の質量分析法による分析は、主要な産物はセリンのＮ末端側に対して開裂されており、はじめのセリンを除く全てがタンパク質分解を受け易いということを示していた（図６）。対照的に、ポリペプチド２０２及び２０８のそれぞれにＧ２０スペーサーをもつＦｃコンストラクト４の開裂された産物は、任意の特定のスペーサー残基に関して強い特異性を示さなかった（図７）。総合して、これらの結果は、オールグリシンスペーサーは、タンパク質分解に対する感受性が低くなることを示唆した。タンパク質分解を制限するために、Ｆｃコンストラクト４で用いたＧ２０スペーサーであるような、セリンを含まないスペーサーを用いることができる。こうしたグリシンスペーサーを使用することで、最終的なＦｃコンストラクトの組成物の均質性が実質的に向上する。
【０３１４】
実施例５  リンカー長の最適化
均質性をさらに最適化するために、（ＳＧ３）５リンカーを、Ｇ８、Ｇ１５、又はＧ２０スペーサーで置き換えて、Ｆｃコンストラクト２における配列が変動するように調整することでリンカー長を探索した。インビトロアッセイによる解析では、おそらくＦｃγ受容体と相互作用するＦｃコンストラクトの能力が変化することによって、リンカー長が生物活性に影響を及ぼすことを示唆した。
【０３１５】
プレート固定ＩｇＧによって刺激されたＴＨＰ−１細胞によるＩＬ−８放出の抑制は、リンカー長に依存することがわかった（図８）。低Ｆｃコンストラクト濃度での抑制は、Ｇ８＜Ｇ１５＜Ｇ２０の順となり、Ｇ２０スペーサーをもつＦｃコンストラクト２において、ＴＨＰ−１細胞によるＩＬ−８放出を最も大きく抑制した。
【０３１６】
また、好中球におけるカルシウム流出の抑制が、リンカー長に依存していることがわかった（図９）。Ｇ８＜Ｇ１５＜Ｇ２０の順で抑制され、Ｇ２０スペーサーを有するＦｃコンストラクト２において、好中球におけるカルシウム流出を最も大きく抑制することを示した。
【０３１７】
実施例６  ノブイントゥホール（Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ）技術によるヘテロ二量体形成の最適化
Ｆｃコンストラクト２の長ポリペプチド及び短ポリペプチド（図１のポリペプチド１０２、１０８、１１４、及び１１６）又はＦｃコンストラクト４の長ポリペプチド及び短ポリペプチド（図２のポリペプチド２０２、２０８、２１４及び２１６）を発現するプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。培養７日後に、遠心分離で細胞を除き、生培地上清を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した（図１０）。可視化したタンパク質バンドの濃度測定分析で、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクト２と、三つのＦｃドメイン（Ｆｃ３）を有するＦｃコンストラクト４とが同様のレベルで発現していることが明らかになった。しかしながら、Ｆｃコンストラクト２のコンストラクトは、夾雑二量体の種（Ｆｃ２）を有意に高いレベルで発現した（図１０）。コンストラクトの両セットは、単量体の種（Ｆｃ１）を同様のレベルで発現した。画像中に存在するさらなるバンドは、モックトランスフェクトコントロール（ｍｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ）中に存在している培養成分を表す。
【０３１８】
これらの結果は、ヘテロ二量体形成を促進する静電的ステアリング変異と、「枝」サブユニット内のヘテロ二量体形成を促進するノブイントゥホール変異（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１０６、１１４、１１２、及び１１６、図２のＦｃドメイン単量体２０６、２１４、２１２、及び２１６）との両方を有することが、Ｆｃコンストラクトにおいてヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を増強し、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトのアセンブリを最適化させて、Ｆｃコンストラクトを含有する組成物の均質性を向上させるということを示唆する。
【０３１９】
実施例７  ホモ二量体形成を制御するための静電的ステアリング
望まない高分子量オリゴマー及び多量体を生成するものである、サブユニットの予想不可能（ｏｆｆ−ｒｅｇｉｓｔｅｒ）な会合を最小化するために、ヘテロ二量体形成を支持する変異（例えば、ノブ及びホール）を「枝」サブユニット内に導入した（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１０６、１１２、１１４、及び１１６、図２のＦｃドメイン単量体２０６、２１２、２１４、及び２１６）。これらアミノ酸置換が、ノブサブユニット（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１０６及び１１２、図２のＦｃドメイン単量体２０６及び２１２）による、対の片側であるホール（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１１４及び１１６、図２のＦｃドメイン単量体２１４及び２１６）に対する誘引を保持し、また同時にノブサブユニット間での会合を邪魔する。ノブ変異はまた、野生型のＦｃ配列とのアセンブリを抑制するため、「幹」Ｆｃサブユニット（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１０４及び１１０、図２のＦｃドメイン単量体２０４及び２１０）のノブ及びホールの「枝」サブユニットに対する親和性をさらに減少させるような更なる変異を含む必要性は疑問視される。この疑問に対処するため、カルボキシル末端「幹」サブユニット内に野生型Ｆｃドメイン単量体配列と、アミノ末端「枝」サブユニット内にノブ変異をもつＦｃドメイン単量体とを含有する、Ｆｃコンストラクトの長ポリペプチドを生成した。対応する短ポリペプチドは、ホール変異をもつＦｃドメイン単量体とした。このＦｃコンストラクトは、Ｆｃコンストラクト２内のポリペプチドの配列に基づいているが、長ポリペプチドのそれぞれにおけるカルボキシル末端「幹」サブユニット内に野生型Ｆｃドメイン単量体配列を有する。
【０３２０】
ＨＥＫ２９３細胞を、Ｆｃコンストラクト２（長ポリペプチドのそれぞれにおけるカルボキシル末端「幹」サブユニット内のＦｃドメイン単量体にホモ二量体形成静電的ステアリング変異を有する。実施例１の表５及び６）を発現するプラスミドと共に、又は、長ポリペプチドのそれぞれにおけるカルボキシル末端「幹」サブユニット内のＦｃドメイン単量体を、野生型Ｆｃドメイン単量体配列（配列番号：４２）（上に記載する）で置き換えたＦｃコンストラクト２に基づくＦｃコンストラクトと共に、同時導入した。培養７日後に、遠心分離で細胞を除き、生培地上清を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。染色したタンパク質のイメージングにより、「幹」サブユニット内に静電的ステアリング変異をもたないＦｃコンストラクト（図１１において「静電的ステアリングなし」と記したもの（レーン１〜３））では、相手方のＦｃコンストラクト２（図１１において「静電的ステアリングあり」と記したもの（レーン４及び５））よりも、はるかに高いレベルの単量体（Ｆｃ１）及び二量体（Ｆｃ２）を含有していることが明らかになった。また、三量体よりも大きい分子量のバンドが、はるかに大量に検出できる（図１１のレーン１〜３）。
【０３２１】
これらの結果により、「幹」サブユニット内にホモ二量体形成を促進する静電的ステアリング変異を有すること（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１０４及び１１０、図２のＦｃドメイン単量体２０４及び２１０）により、Ｆｃコンストラクト内でのホモ二量体Ｆｃドメイン形成をさらに増強し、三つのＦｃドメインを有するＦｃコンストラクトのアセンブリをさらに最適化させ、Ｆｃコンストラクトを含有する組成物の均質性をさらに向上させるということが確認される。
【０３２２】
実施例８  Ｃ末端リシン残基を排除することによる組成物均質性の最適化
免疫グロブリンのＣ末端リシン残基は、多数の種にわたって高度に保存されている。一部の例では、ポリペプチド内のＣ末端リシンは、タンパク質産生中に細胞機構（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）によって除去される。我々は、Ｆｃコンストラクト内のポリペプチドのそれぞれからＣ末端リシンを除去することによって、組成物中のＦｃコンストラクトの均一性をさらに向上させることと、本明細書に記載するＦｃコンストラクトを含有するより均質な組成物を達成することとを目指した。Ｆｃコンストラクト２は、その長ポリペプチド（１０２及び１０８、実施例１、表５〜７、図１を参照）又は短ポリペプチド（１１４及び１１６）のいずれにも、Ｃ末端リシン残基を何も含有していない。図１２は、Ｃ末端リシンを除去してＦｃコンストラクト２を生成することで、インビトロで補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）が誘導されなかったということを示している。これにより、Ｃ末端リシン残基を除去することによって、免疫学的な有害な副作用を誘引することなく、Ｆｃコンストラクトの医薬組成物の均質性を向上させることができた。
【０３２３】
実施例９  慢性特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）モデルにおけるＦｃコンストラクトの効能
体重１８〜２２グラムの雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ社より購入し、１週間の順応後に試験に用いた。マウスに、ラット抗−マウスＣＤ４１抗体（抗−ＣＤ４１、１．５μｇ／マウス）を４日間、腹腔内処置した。３日目の第３回抗体注射の１〜２時間後に、食塩水、ＩＶＩｇ、コンストラクト２及びコンストラクト４を、静脈内に与えた。５日目の第４回抗−ＣＤ４１抗体注射の２４時間後に、顎下出血より得た血液で、血小板レベルを測定した。
【０３２４】
ＩＴＰモデルにおいて、コンストラクト２とコンストラクト４とを比較する複数の試験を行った（図１８、図１９、及び２０）。三つの全ての試験において、０．１ｇ／ｋｇでの投与で、コンストラクト４はコンストラクト２よりも高い効能を示した。
【０３２５】
実施例１０  Ｆｃ多量体コンストラクトと比較した、コンストラクト４の薬物動態挙動
（Ｓｔｒｏｍｅら、米国特許公開公報第２０１０／０２３９６３３Ａ１号；Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．１４，Ｒ１９２（２０１２））に記載されるとおり、Ｆｃ多量体を生成した。詳細には、野生型ＩｇＧ１  ＦｃをＣ末端においてＩｇＧ２ヒンジ配列と融合した（コンストラクトＸ１）。ＤＮＡプラスミドコンストラクトを、リポソームによって、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。培養７日後に、遠心分離により細胞を除去した。
【０３２６】
発現したタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａカラムを用いて、プロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。捕捉したコンストラクトを、リン酸緩衝食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離した。溶出物は、１ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．４を添加することによって素早く中和して、０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。
【０３２７】
タンパク質は、Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂を用いて、イオン交換クロマトグラフィーによってさらに分取した。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化して、サンプルは、ロードする前に平衡用緩衝液で希釈した。溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（緩衝液Ｂ）を用いた多段ステップグラジェントにより、サンプルを溶離した。グラジェントステップには、低分子量の種を除去するための２カラム体積（ＣＶ）での０〜４０％のＢのステップ、４０％のＢ（４ＣＶ）で保持するステップ、次いで標的の種を単離するための４０〜８０％のＢ（４ＣＶ）のステップ、その後１００％のＢまで直線的に増加させるステップを含めた。全てのタンパク質含有フラクションを分析用サイズ排除クロマトグラフィーでスクリーニングし、成分を２８０ｎｍの吸光度で定量した。足して全体積のわずか８％の、Ｆｃ（およそ５０ｋＤａ）及びＦｃ二量体（およそ１００ｋＤａ）のフラクションを合わせて、精製されたＦｃ多量体を生成した。
【０３２８】
イオン交換の後、標的のフラクションは、タンジェンシャルフロー・フィルトレーションシステムにおいて、３０ｋＤａをカットオフするポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを用いて、ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換した。サンプルはおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。
【０３２９】
コンストラクト４及びコンストラクトＸ１の分子量分布を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で比較した（図２１）。コンストラクト４は主として、約１５０ｋＤａの種（三つのＦｃドメイン）により構成されている。対照的に、コンストラクトＸ１は、約１００ｋＤａ（二つのＦｃドメイン）から２５０ｋＤａを超える複数のバンドを伴う範囲にわたる複数の種により構成され、大多数が単一成分ではない。
【０３３０】
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１５、８週齢）に、コンストラクトＸ１又はコンストラクト４のそれぞれを０．１ｇ／ｋｇで静脈内に投与した。血液（２５μＬ）を、顎下の静脈より採取し、血清用に処理した。第５日目までは、交互の時点において１群当たり５匹のマウスを出血させるが、残りの全ての時点では、各群内で１５匹全てのマウスを出血させた。採集の時点としては、１５分及び３０分；１、２、４、６、８、及び２４時間；２、３、４、５、７、９、１１、１４、１６、１８、２１、及び２４日を含めた。Ｆｃ多量体の血清中濃度は、Ｆｃ特異的検出抗体を含む抗−ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡで決定した。
【０３３１】
図２２に提示するように、コンストラクトＸ１の血清中濃度は、ほとんどの時点でコンストラクト４よりも低いが、３日目から５日目の短期間、曲線が交差している。図２２では、コンストラクト４を黒四角と実線で示し、コンストラクトＸ１を白丸と破線で示している。コンストラクト４（実線上の黒四角）とコンストラクトＸ１（破線上の白丸）の早い時点の拡大図を図２３に示している。
【０３３２】
実施例１１  コラーゲン抗体誘発関節炎（ＣＡＩＡ）モデルにおけるＦｃコンストラクトの効能
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、コラーゲンＩＩに対する四つの抗体の関節炎誘導用モノクローナル抗体カクテル（ＡｒｔｈｒｉｔｏＭａｂ、ＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；８ｍｇ）を腹腔内注射した。４日目に、動物にリポ多糖（１００μｇ）を腹腔内注射した。１日目から１４日目（日数は０日を省いて数えた）の間の１日に、動物に担体又は試験化合物を静脈内投与した。臨床スコアパラメータは以下のとおりとした：０＝正常：腫れ、赤み、又は捻挫なし；完全な関節柔軟性。１＝軽度の関節炎：軽度の腫れ及び／又は捻挫；完全な関節柔軟性。２＝中程度の関節炎：中程度の腫れ及び／又は捻挫；関節柔軟性又は握力の低下。３＝重度の関節炎：重度の腫れ及び／又は捻挫；関節柔軟性又は握力の重度の低下。４＝強直性関節；関節柔軟性なし、かつ、重度の障害性動作；瀕死。動物は、１２日後に屠殺した。
【０３３３】
図２４は、コラーゲン抗体誘発性関節炎（ＣＡＩＡ）モデルにおいて、６日目に、５０ｍｇ／ｋｇ（黒三角、黒実線）、２５ｍｇ／ｋｇ（黒四角、黒点線）、又は１２．５ｍｇ／ｋｇ（黒丸、黒破線）で治療的に投与されたコンストラクト４の効能を比較したグラフを示している。担体コントロールとして、等量の食塩水（灰色ｘ、灰実線）を６日目に投与した。各時点について、平均及び平均の標準誤差を示している。
【０３３４】
ＣＡＩＡモデルにおいて、１日目に１００ｍｇ／ｋｇのコンストラクト４を予防的に投与した（図２５）。担体コントロール（食塩水）は、１日目にのみ投与した。
【０３３５】
図２５は、コラーゲン抗体誘発性関節炎（ＣＡＩＡ）モデルにおいて、１日目に１００ｍｇ／ｋｇで予防的に投与されたコンストラクト４（ＡＡ：黒四角、実線）又は食塩水（灰丸、一点鎖線）の効能を比較したグラフである。等量の食塩水（灰丸、一点鎖線）は１日目に投与した。各時点について、平均及び平均の標準誤差を示している。
【０３３６】
治療的に投与（図２４）又は予防的に投与（図２５）したときに、コンストラクト４は、担体コントロールと比較して疾患の重症度を軽減することがわかった。
【０３３７】
実施例１２  ＦｃγＲＩＩｂに対するＦｃコンストラクト結合の強化
これまでに、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異が、ＦｃγＲＩＩｂ受容体へのＩｇＧ１の結合を有意に特異的に高めることが証明されている（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４５  ２００８）。Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異をコンストラクト４（ＳＩＦ）の骨格に組み入れた。このコンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂ＋変異体は、良好に発現して構築される（図２６を参照）（ＳＩＦ：コンストラクト４、ＦｃγＲＩＩｂ＋：コンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂ＋変異体）。図２６は、コンストラクト４（ＳＩＦ）及びコンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂ＋変異体の一過性発現から得られた清澄培地に関する、非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動結果の画像である。長鎖及び短鎖のコンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂをコードするプラスミドを、１／１（ｗ／ｗ）又は２／１の比でＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。
【０３３８】
コンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂ＋変異体の、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体への結合が、コンストラクト４（ＳＩＦ３）コントロールと比較すると大きく増強された（結合が３００倍以上増加）。逆に、活性化ＦｃγＲＩＩａへの結合は、相対的に影響を受けないが、一方でＦｃγＲＩＩＩａへの結合は減少する（図２７を参照）。
【０３３９】
図２７は、ＩｇＧ１コントロール、コンストラクト４、及びコンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂ＋変異体のＦｃガンマ受容体への結合を比較する、実験結果を要約したグラフである。細胞に基づく、競合的な時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ（ＣｉｓＢｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社、マサチューセッツ州ベドフォード）を用いて相対的な結合を測定した。結果はＥＣ５０値として表しており、特定の細胞表面のＦｃガンマ受容体と結合する蛍光標識した抗体を移動させるのに必要なプロバンド（ｐｒｏｂａｎｄ）の濃度を示している。数値が大きいほど、結合又は親和性は小さい。
【０３４０】
実施例１３  単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）活性化の抑制
コンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂ＋変異体は、単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の活性化を大きく増強した。プロフェッショナル抗原提示細胞の最も重要な集団である樹状細胞（ＤＣ）は、抗原物質をプロセシングし、Ｔ細胞応答を開始する目的で、細胞表面上にそれを提示する。ＦｃγＲは、ｍｏＤＣの機能を制御する際に大きな役割を果たすことが可能である。ＦｃγＲを活性化することにおいての免疫複合体の接着は、未熟なヒトｍｏＤＣの成熟及び活性化の契機となり得る。逆に、阻害性ＦｃγＲＩＩｂの接着は、成熟及び活性化を抑制し得る（Ｂｏｒｕｃｈｏｖ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００５  １１５（１０））。我々は、ＦｃコンストラクトがｍｏＤＣの成熟及び活性化を抑制することができるということを既に証明している（Ｏｒｔｉｚ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１６、及び図３を参照）。一方、ＦｃγＲＩＩｂ＋変異を伴うＦｃコンストラクト（例えば、コンストラクト４／ＳＩＦ３）は、プレートに固定したＩｇＧ１等の免疫複合体代替物にさらすことにより、ｍｏＤＣ活性化を有意に増強させることが可能である（図２８）。コンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂ＋単独でのインキュベーションは、ｍｏＤＣ活性化を誘導しない（図２９）。
【０３４１】
未熟なヒトｍｏＤＣは、１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４の存在下で、ネガティブセレクションしたＣＤ１４＋単球より発生させた。採取したＤＣを、ＰＢＳ、抗−ＣＤ３２ａ抗体ＩＶ．３、コンストラクト４（ＳＩＦ３）又はコンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂ＋のいずれかと共に、３７℃で２０分間、培地中でインキュベートした。ブロッキング後、細胞浮遊液をＩｇＧ１被覆プレートに移し、追加のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を補った培地を添加した。４８時間のインキュベーション後、軽く接着した細胞を、氷冷したＰＢＳでプレートを２回洗浄することによって採取した。採取した細胞を、抗−ＨＬＡ−ＤＲ  ＦＩＴＣ  Ａｂ及び抗−ＣＤ８６−ＰＥ  Ｃｙ７  Ａｂで染色した。細胞を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ）及びＦｌｏｗＪｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。
【０３４２】
図２８：コンストラクト４は、プレート固定ＩｇＧによってｍｏＤＣ活性化を抑制するが、一方、コンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂ＋は、活性化を高める。代表となるヒストグラムが、ネガティブコントロールとして未処理プレート（ＵＴ）上で培養したｍｏＤＣ上、又は、活性化ＦｃγＲＩＩａを阻害する抗体（ＩＶ．３）、コンストラクト４もしくは増加濃度のコンストラクト４−ＦｃγＲＩＩＢ＋で２０分間前処理したｍｏＤＣ上の、ＣＤ８６表面発現を示している。処理した細胞はその後、固定化ＩｇＧ１（ＰＢ  ＩｇＧ）を含有するプレートに移した。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）処置を、ポジティブコントロールとして用いた。ＣＤ８６の表面発現は、フローサイトメトリーで評価した。ＣＤ８６発現のヒストグラムは、コントロールとして非刺激細胞を用いてゲートした。処置条件に対して、ＣＤ８６陽性である細胞の百分率をｙ軸に示した。
【０３４３】
図２９：コンストラクト４−ＦｃγＲＩＩｂ＋は、それ自体ではｍｏＤＣ活性化を誘導しないが、プレート固定ＩｇＧによって活性化を増強する。代表となるヒストグラムが、ネガティブコントロールとして未処理プレート（ＵＴ）上で培養したｍｏＤＣ上、又は、コンストラクト４−ＦｃγＲＩＩＢ＋で２０分間前処理して、その後未処理プレートに移した（ＦｃγＲＩＩｂ＋単独）ものであるｍｏＤＣ上の、ＣＤ８６表面発現を示している。ＰＢＳ（ＰＢ  ＩｇＧ）で、活性化ＦｃγＲＩＩａを阻害する抗体（ＩＶ．３）で、又は、コンストラクト４−ＦｃγＲＩＩＢ＋（ＦｃｇＲＩＩｂ＋）で前処理したｍｏＤＣを、固定化ＩｇＧ１を含有するプレートに移した。ＣＤ８６の表面発現は、フローサイトメトリーで評価した。ＣＤ８６発現のヒストグラムは、コントロールとして非刺激細胞を用いてゲートした。処置条件に対して、ＣＤ８６陽性である細胞の百分率をｙ軸に示した。
【０３４４】
他の実施形態
この明細書中に記載した全ての公開公報、特許及び特許出願は、あたかも独立の公開公報又は特許出願それぞれが特別にかつ個別に示されて参照によって組み入れられるかのように、同じ程度まで参照することによってここに組み入れるものとする。
【０３４５】
この開示について、その特定の実施形態に関連して説明したが、さらなる変形が可能であることと、この出願は、概してこの開示の原則に従い、かつ、この開示が関係する技術分野の範囲内で公知又は通例である範囲にあり、先に述べた本質的な特徴に応用することができるような、この開示からの逸脱を含んだ、この開示の任意のバリエーション、使用又は適応を網羅することを意図し、請求項の範囲に従うものであることとが理解されるであろう。
【０３４６】
他の実施形態は、特許請求の範囲の範囲内とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月6日(2019.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019519528.tif 000134
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