(57)【要約】  ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団の有効量を投与することにより急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）を処置する方法であって、ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団が、幹細胞動員因子を含む培地中で造血幹細胞または前駆細胞の集団を培養するステップを含む３段階法、例えば、胎盤の細胞からの、例えば、胎盤潅流液（例えば、ヒト胎盤潅流液）または他の組織、例えば臍帯血もしくは末梢血からの、造血幹または前駆細胞から出発する、幹細胞動員因子を含む培地中でＮＫ細胞を製造する３段階法により製造される、方法が本明細書で提供される。急性骨髄性白血病細胞の増殖を抑制するために、本明細書で提供される３段階法により製造されたＮＫ細胞を使用する方法が、本明細書でさらに提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されたＮＫ細胞は、ＩＬ−２と組み合わせて使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団の有効量を投与することにより急性骨髄性白血病を有する個体を処置する方法であって、ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団が、
（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、第１細胞集団を製造するステップ；
（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２培地中で前記第１細胞集団を培養して、第２細胞集団を製造するステップ；および
（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３培地中で前記第２細胞集団を培養して、第３細胞集団を製造するステップを含み、
前記第３細胞集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも８０％が生存している、方法により製造され、処置の方法がＩＬ−２の有効量を患者に投与することをさらに含む、方法。
【請求項２】
ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団の有効量を投与することにより多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法であって、ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団が、
（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、第１細胞集団を製造するステップ；
（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２培地中で前記第１細胞集団を培養して、第２細胞集団を製造するステップ；および
（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３培地中で前記第２細胞集団を培養して、第３細胞集団を製造するステップを含み、
前記第３細胞集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも８０％が生存している、方法により製造され、処置の方法がＩＬ−２の有効量を患者に投与することをさらに含む、方法。
【請求項３】
前記ＩＬ−２の有効量が、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）の有効量である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記造血幹細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記造血幹細胞が胎盤造血幹細胞である、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記胎盤造血幹細胞が、ヒト胎盤潅流液から得られる、または得ることができる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記胎盤造血幹細胞が、ヒト胎盤潅流液から単離された有核細胞から得られる、または得ることができる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔｐｏが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で第１培地中に存在する、請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔｐｏが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で第１培地中に存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔｐｏが約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で第１培地中に存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩＬ−１５が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第２培地中に存在する、請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩＬ−１５が、１０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第２培地中に存在する、請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩＬ−１５が、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第２培地中に存在する、請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩＬ−２が１０Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在し、前記ＩＬ−１５が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在する、請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＩＬ−２が３００Ｕ／ｍＬ〜３，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在し、前記ＩＬ−１５が１０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在する、請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＩＬ−２が約１，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在し、前記ＩＬ−１５が約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在する、請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔｐｏ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５が第１培地、第２培地または第３培地の組成不明の成分中に含まれていない、請求項１〜１６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｔｐｏ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５が血清中に含まれていない、請求項１〜１６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記幹細胞動員剤がアリール炭化水素受容体阻害剤である、請求項１〜１６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記アリール炭化水素受容体阻害剤がＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ−１）（４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アリール炭化水素受容体阻害剤がレスベラトロールである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記アリール炭化水素受容体阻害剤が化合物ＣＨ２２３１９１（１−メチル−Ｎ−［２−メチル−４−［２−（２−メチルフェニル）ジアゼニル］フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド］である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記幹細胞動員剤がピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体である、請求項１〜１８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体が以下の化学構造
【化１】
2019519486.tif 000020
を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２５】
前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体が以下の化学構造
【化２】
2019519486.tif 000021
を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１培地が、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球・マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜２５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１培地がＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第１培地中にＬＭＷＨが１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
第１培地中にＬＭＷＨが４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で第１培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
第１培地中にＬＭＷＨが約４．５Ｕ／ｍＬの濃度で第１培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌが約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２培地がＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜３０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２培地がＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれをさらに含む、請求項１〜３１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
第２培地中にＬＭＷＨが１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第２培地中にＬＭＷＨが４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で第２培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
第２培地中にＬＭＷＨが約４．５Ｕ／ｍＬの濃度で第２培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌが約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦが約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記第３培地が、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜３５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第３培地が、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの各々を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
第３培地中に、ＳＣＦが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第３培地中に、ＳＣＦが２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
第３培地中に、ＳＣＦが約２２ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６が約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７が約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦが約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦが約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦが第１培地、第２培地または第３培地の組成不明の成分中に含まれていない、請求項２６〜４０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦが血清中に含まれていない、請求項２６〜４０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１培地、第２培地または第３培地のいずれもヒト血清ＡＢを含む、請求項１〜４２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１培地、第２培地または第３培地のいずれも１％〜２０％のヒト血清ＡＢを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１培地、第２培地または第３培地のいずれも５％〜１５％のヒト血清ＡＢを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１培地、第２培地または第３培地のいずれも約１０％のヒト血清ＡＢを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１培地、第２培地または第３培地のいずれも２−メルカプトエタノールを含む、請求項１〜４６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１培地、第２培地または第３培地のいずれもゲンタマイシンを含む、請求項１〜４６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
造血幹細胞を第１培地中で７〜１３日間培養するステップを含む、請求項１〜４８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
造血幹細胞を第１培地中で８〜１２日間培養するステップを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
造血幹細胞を第１培地中で約１０日間培養するステップを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２培地中で前記第１細胞集団を２〜６日間培養するステップを含む、請求項１〜４８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２培地中で前記第１細胞集団を３〜５日間培養するステップを含む、請求項１〜４８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記第２培地中で前記第１細胞集団を約４日間培養するステップを含む、請求項１〜４８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記第３培地中で前記第２細胞集団を１０〜３０日間培養するステップを含む、請求項１〜４８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記第３培地中で前記第２細胞集団を１５〜２５日間培養するステップを含む、請求項１〜４８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記第３培地中で前記第２細胞集団を約２１日間培養するステップを含む、請求項１〜４８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１培地、第２培地および第３培地中で前記培養するステップがすべて静的培養条件下で行われる、請求項１〜４８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１培地、第２培地または第３培地のうちの少なくとも１つで前記培養するステップがスピナーフラスコ中で行われる、請求項１〜４８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１培地および前記第２培地中で前記培養するステップが静的培養条件下で行われ、前記第３培地中で前記培養するステップがスピナーフラスコ中で行われる、請求項１〜４８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記造血細胞を１ｘ１０４〜１ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第１培地中に最初に接種する、請求項１〜６０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記造血細胞を約３ｘ１０４細胞／ｍＬで前記第１培地中に最初に接種する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記第１細胞集団を５ｘ１０４〜５ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第２培地中に最初に接種する、請求項１〜６０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１細胞集団を約１ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第２培地中に最初に接種する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第２細胞集団を１ｘ１０５〜５ｘ１０６細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する、請求項１〜６０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記第２細胞集団を１ｘ１０５〜１ｘ１０６細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第２細胞集団を約５ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記第２細胞集団を約３ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜６８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
少なくとも１０，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも５０，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
少なくとも７５，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜６８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜６８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜６８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜６８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した場合、前記ナチュラルキラー細胞が前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも２０％の細胞傷害性を示す、請求項１〜６８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ナチュラルキラー細胞がＫ５６２細胞に対して少なくとも３５％の細胞傷害性を示す、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ナチュラルキラー細胞がＫ５６２細胞に対して少なくとも４５％の細胞傷害性を示す、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記ナチュラルキラー細胞がＫ５６２細胞に対して少なくとも６０％の細胞傷害性を示す、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記ナチュラルキラー細胞がＫ５６２細胞に対して少なくとも７５％の細胞傷害性を示す、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記ナチュラルキラー細胞の生存率を７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色により決定する、請求項１〜８１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ナチュラルキラー細胞の生存率をアネキシンＶ染色により決定する、請求項１〜８１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記ナチュラルキラー細胞の生存率を７ＡＡＤ染色およびアネキシンＶ染色の両方により決定する、請求項１〜８１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記ナチュラルキラー細胞の生存率をトリパンブルー染色により決定する、請求項１〜８１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
ステップ（ｃ）の後に前記細胞集団を凍結保存するステップをさらに含む、請求項１〜８１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
ステップ（ｃ）の後に前記ナチュラルキラー細胞を凍結保存するステップをさらに含む、請求項１〜８１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記個体が、再発性／難治性急性骨髄性白血病を有する、請求項１〜８７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記個体が、急性骨髄性白血病に対する少なくとも１回の非ナチュラルキラー細胞治療が奏功しなかった急性骨髄性白血病を有する、請求項１〜８７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記個体が６５歳以上であり、第１寛解期にある、請求項１〜８７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記ナチュラルキラー細胞を投与するステップの前に、前記個体がフルダラビン、シタラビンまたは両方でコンディショニングされている、請求項１〜８７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されている、請求項１〜９１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されていない、請求項１〜９１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＩＬ−２が皮下投与される、請求項１〜９２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＩＬ−２が、６百万単位の用量で１日おきに合計６用量投与される、請求項１〜９４のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
アセトアミノフェンおよび／またはジフェンヒドラミンが、前記個体へのＩＬ−２の前記投与の前に、前記個体へのＩＬ−２の前記投与の後に、または前記個体へのＩＬ−２の前記投与の前と後両方に、前記個体に投与される、請求項１〜９５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記個体に、個体の１キログラム当たり、約１×１０６、３×１０６、１０×１０６、または３０×１０６個のナチュラルキラー細胞が投与される、請求項１〜９６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記ナチュラルキラー細胞を投与するステップの前に、前記個体がフルダラビン、シクロホスファミドまたは両方でコンディショニングされている、請求項１〜９７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
急性骨髄性白血病細胞の増殖を抑制する方法であって、前記方法が、急性骨髄性白血病細胞を複数のナチュラルキラー細胞と接触させるステップを含み、ナチュラルキラー細胞が、
（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、第１細胞集団を製造するステップ；
（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２培地中で第１細胞集団を培養して、第２細胞集団を製造するステップ；および
（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３培地中で第２細胞集団を培養して、第３細胞集団を製造するステップ
を含み、第３細胞集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも８０％が生存している、方法
によるものであり、前記抑制する方法が、急性骨髄性白血病細胞をＩＬ−２と接触させるステップをさらに含む、方法。
【請求項１００】
さらに、急性骨髄性白血病細胞の前記接触させるステップに使用されるＩＬ−２が、ｒｈＩＬ−２である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記接触させるステップがインビトロで行われる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記接触させるステップがインビボで行われる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記接触させるステップがヒト個体において行われる、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与するステップを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記個体が、再発性／難治性ＡＭＬを有する、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記個体が、ＡＭＬに対する少なくとも１回の非ナチュラルキラー細胞治療が奏功しなかったＡＭＬを有する、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記個体が６５歳以上であり、第１寛解期にある、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ナチュラルキラー細胞を投与するステップの前に、前記個体がフルダラビン、シタラビンまたは両方でコンディショニングされている、請求項１０３〜１０７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＩＬ−２が前記個体に皮下投与される、請求項１０３〜１０８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＩＬ−２が、前記個体に６百万単位の用量で１日おきに合計６用量投与される、請求項１０３〜１０９のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
アセトアミノフェンおよび／またはジフェンヒドラミンが、前記個体へのＩＬ−２の前記投与の前に、前記個体へのＩＬ−２の前記投与の後に、または前記個体へのＩＬ−２の前記投与の前と後両方に、前記個体に投与される、請求項１０３〜１１０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記個体に、個体の１キログラム当たり約１×１０６、３×１０６、１０×１０６、または３０×１０６個のナチュラルキラー細胞が投与される、請求項１０３〜１１１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ナチュラルキラー細胞を投与するステップの前に、前記個体がフルダラビン、シクロホスファミドまたは両方でコンディショニングされている、請求項１０３〜１１２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されている、請求項９９〜１１３のいずれ１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されていない、請求項９９〜１１３のいずれ１項に記載の方法。
【請求項１１６】
多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法であって、前記方法が、多発性骨髄腫細胞を複数のナチュラルキラー細胞と接触させるステップを含み、ナチュラルキラー細胞が、
（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１培地中で造血幹細胞または前駆細胞を培養して、第１細胞集団を製造するステップ；
（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２培地中で第１細胞集団を培養して、第２細胞集団を製造するステップ；および
（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３培地中で第２細胞集団を培養して、第３細胞集団を製造するステップ
を含み、第３細胞集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも８０％が生存している、方法
によるものであり、前記抑制する方法が、多発性骨髄腫細胞をＩＬ−２と接触させるステップをさらに含む、方法。
【請求項１１７】
さらに、多発性骨髄腫細胞の前記接触させるステップに使用されるＩＬ−２がｒｈＩＬ−２である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記接触させるステップがインビトロで行われる、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記接触させるステップがインビボで行われる、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記接触させるステップがヒト個体において行われる、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与するステップを含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記個体が、自家幹細胞移植を受けたことがある、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記ＩＬ−２が前記個体に皮下投与される、請求項１２０〜１２２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ＩＬ−２が、前記個体に６百万単位の用量で１日おきに合計６用量投与される、請求項１２０〜１２３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
アセトアミノフェンおよび／またはジフェンヒドラミンが、前記個体へのＩＬ−２の前記投与の前に、前記個体へのＩＬ−２の前記投与の後に、または前記個体へのＩＬ−２の前記投与の前と後両方に、前記個体に投与される、請求項１２０〜１２４のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記個体に、前記個体の１キログラム当たり約１×１０６、３×１０６、１０×１０６、または３０×１０６個のナチュラルキラー細胞が投与される、請求項１２０〜１２５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ナチュラルキラー細胞を投与するステップの前に、前記個体がメルファランを受けている、請求項１２０〜１２６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されている、請求項１１６〜１２７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されていない、請求項１１６〜１２７のうちいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれがその全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年５月７日に出願した米国特許仮出願第６２／３３３，１８６号、２０１６年５月７日に出願した米国特許仮出願第６２／３３３，１８７号、２０１６年１１月１日に出願した米国特許仮出願第６２／４１５，９１８号および２０１６年１１月１日に出願した米国特許仮出願第６２／４１５，９５４号の利益を主張するものである
【０００２】
１．  分野
ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団の有効量を投与することにより急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）を処置する方法であって、ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団が、幹細胞動員因子を含む培地中で造血幹細胞または前駆細胞の集団を培養するステップを含む３段階法、例えば、胎盤の細胞からの、例えば、胎盤潅流液（例えば、ヒト胎盤潅流液）または他の組織、例えば臍帯血もしくは末梢血からの、造血幹または前駆細胞から出発する、幹細胞動員因子を含む培地中でＮＫ細胞を製造する３段階法により製造される方法が、本明細書で提供される。急性骨髄性白血病細胞の増殖を抑制するために本明細書で提供される３段階法により製造されたＮＫ細胞を使用する方法が本明細書でさらに提供される。ある特定の実施形態では、本明細書で述べる３段階法により製造されたＮＫ細胞をＩＬ−２と組み合わせて使用する。
【背景技術】
【０００３】
２．  背景
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の主要な構成要素を構成する細胞傷害性リンパ球である。
【０００４】
ＮＫ細胞は、インターフェロンまたはマクロファージ由来のサイトカインに反応して活性化される。一部の受容体、例えば、ＣＤ９４および２Ｂ４（ＣＤ２４４）は、リガンド相互作用によっていずれの方向にも機能し得るが、ＮＫ細胞の細胞傷害活性は、「活性化受容体」または「抑制性受容体」と見なされ得る、２種類の表面受容体により主として調節される。
【０００５】
ＮＫ細胞は、他の活性もあるが特に、腫瘍の宿主拒絶に役割を果たし、ウイルス感染細胞を殺滅することができることが示された。ナチュラルキラー細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質を欠くか、またはそのレベルの低下を示す細胞によって活性化された状態になり得る。自己クラスＩ  ＭＨＣ発現のレベルの変化または低下を有するがん細胞は、ＮＫ細胞感受性の誘導をもたらす。活性化および増幅ＮＫ細胞ならびに場合によって末梢血からのＬＡＫ細胞は、進行がんを有する患者のｅｘ  ｖｉｖｏ療法およびｉｎ  ｖｉｖｏ治療の両方に用いられ、白血病のような骨髄関連疾患；乳がん；およびある特定の種類のリンパ腫に対してある程度の成功を収めた。
【０００６】
腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を殺滅するうえでのＮＫ細胞の有利な特性にもかかわらず、ＮＫ細胞は、培養および増幅中にそれらの腫瘍標的化能力および殺腫瘍能力を維持することが困難であることに主として起因して、免疫療法への応用が依然として困難である。したがって、当技術分野では、殺腫瘍機能を保持するナチュラルキラー細胞を製造し、増幅する効率的な方法を開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０１８３５６４号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１４／００２３６２６号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１４／０１１４０７０号
【特許文献４】米国特許第７，０４５，１４８号
【特許文献５】米国特許第７，４６８，２７６号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００９／０１０４１６４号
【特許文献７】米国出願公開第２００７／０１９００４２号
【特許文献８】米国特許第５，３７２，５８１号
【特許文献９】米国特許第５，４１５，６６５号
【特許文献１０】米国特許第７，１４７，６２６号
【特許文献１１】米国特許第７，２５５，８７９号
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００７０２７５３６２号（米国特許第８，０５７，７８８号として発行）
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００４／００４８７９６号
【特許文献１４】米国特許第４，７９８，８２４号
【特許文献１５】米国特許第５，５５２，２６７号
【特許文献１６】米国特許第７，４９８，１７１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】キム（Ｋｉｍ）ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００６、６９、１８７１−１８７８
【非特許文献２】サウサード（Ｓｏｕｔｈａｒｄ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４９（２）：２５１−２５７（１９９０）
【非特許文献３】ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、２００５、Ｂｌｏｏｄ  １０５：３０５１−３０５７
【非特許文献４】ラブニッツ（Ｒｕｂｎｉｔｚ）ら、２０１０、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２８：９５５−９５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
３．  概要
本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用して、急性骨髄性白血病を有する個体を処置する方法が、本明細書で提供される。本明細書で提供される処置の方法は、ＩＬ−２の投与を含む抗がん治療レジメンの一部になることができる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、ヒトＩｌ−２である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）である。
【００１０】
急性骨髄性白血病細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、急性骨髄性白血病細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と急性骨髄性白血病細胞を接触させるステップを含む方法が、本明細書でさらに提供される。ある特定の実施形態では、急性骨髄性白血病細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、急性骨髄性白血病細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と急性骨髄性白血病細胞を接触させるステップを含み、ＩＬ−２をＮＫ細胞および／または急性骨髄性白血病細胞と近接させる、例えば、ＩＬ−２とＮＫ細胞および／または急性骨髄性白血病細胞を接触させるステップをさらに含む方法が、本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＩＬ−２は、ｒｈＩＬ−２である。
【００１１】
本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用して、多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法が、本明細書で提供される。本明細書で提供される処置の方法は、ＩＬ−２の投与を含む抗がん治療レジメンの一部になることができる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、ヒトＩｌ−２である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）である。
【００１２】
多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、多発性骨髄腫細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と多発性骨髄腫細胞を接触させるステップを含む方法が、本明細書でさらに提供される。ある特定の実施形態では、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、多発性骨髄腫細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と多発性骨髄腫細胞を接触させるステップを含み、ＩＬ−２をＮＫ細胞および／または多発性骨髄腫細胞と近接させる、例えば、ＩＬ−２とＮＫ細胞および／または多発性骨髄腫細胞を接触させるステップをさらに含む方法が、本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＩＬ−２は、ｒｈＩＬ−２である。
【００１３】
細胞、例えば、造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞のような、造血細胞を増幅し、分化させて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を製造する方法が本明細書で提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一態様では、本明細書で述べる３つの段階を含むＮＫ細胞集団を製造する方法（本明細書で「３段階法」と呼ぶ）が本明細書で提供される。本明細書で提供する３段階法により製造されたナチュラルキラー細胞は、「３段階法により製造されたＮＫ細胞」と本明細書で呼ぶ。ある特定の実施形態では、前記方法は、細胞を接触させる（または培養する）第４のまたは中間のステップを含まない。
【００１５】
一態様では、造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞を幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１培地中で培養して、第１細胞集団を製造するステップ、その後、前記第１細胞集団を幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２培地中で前記第１細胞集団を培養して、第２細胞集団を製造するステップ、その後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤および低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を欠いている第３培地中で前記第２細胞集団を培養して、第３細胞集団を製造するステップを含み、第３細胞集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％、例えば、８０％が生存している、ＮＫ細胞を製造する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋またはＣＤ１６＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４−またはＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋およびＣＤ１６＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４−およびＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記第１培地、第２培地および第３培地の少なくとも１つ、２つまたは３つすべては、ＧＢＧＭ（登録商標）培地でない。ある特定の実施形態では、第３培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。ある特定の実施形態では、第３培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。
【００１６】
ある特定の実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、哺乳類細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、ヒト細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹脂肪または前駆細胞は、霊長類細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、イヌ細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、げっ歯類細胞である。
【００１７】
ある特定の態様では、第１培地中で培養される造血幹細胞または前駆細胞は、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞である。ある特定の態様では、造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤造血幹細胞または前駆細胞である。ある特定の態様では、胎盤造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤潅流液から得られる、または得ることができる（例えば、胎盤潅流液から単離された有核細胞から得られる、または得ることができる）。ある特定の態様では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、臍帯血から得られる、または得ることができる。ある特定の態様では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、胎児肝臓細胞である。ある特定の態様では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、動員末梢血細胞である。ある特定の態様では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、骨髄細胞である。
【００１８】
ある特定の態様では、３段階法に使用される前記第１培地は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む。ある特定の態様では、３段階法に使用される第１培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球・マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、前記第１培地は、添加されるＬＭＷＨを含まない。ある特定の態様では、前記第１培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを含まない。ある特定の態様では、前記第１培地は、ＬＭＷＨを含まない。ある特定の態様では、前記第１培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを含まない。ある特定の態様では、３段階法に使用される第１培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、３段階法に使用される第１培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、前記Ｔｐｏは、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬまたは約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で第１培地中に存在する。ある特定の態様では、第１培地中に、ＬＭＷＨは、１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１培地中に、ＬＭＷＨは、４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１培地中に、ＬＭＷＨは、約４．５Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、前記第１培地は、ＧＢＧＭ（登録商標）でない。
【００１９】
ある特定の態様では、３段階法に使用される前記第２培地は、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用される第２培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、第２培地は、添加されるＬＭＷＨを含まない。ある特定の態様では、第２培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを含まない。ある特定の態様では、第２培地は、ＬＭＷＨを含まない。ある特定の態様では、第２培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを含まない。ある特定の態様では、３段階法に使用される第２培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、３段階法に使用される第２培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、前記ＩＬ−１５は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬまたは約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第２培地中に存在する。ある特定の態様では、前記第２培地中に、ＬＭＷＨは、１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２培地中に、ＬＭＷＨは、４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で第２培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２培地中に、ＬＭＷＨは、４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で第２培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２培地中に、ＬＭＷＨは、約４．５Ｕ／ｍＬの濃度で第２培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、前記第２培地は、ＧＢＧＭ（登録商標）でない。
【００２０】
ある特定の態様では、前記第１培地、前記第２培地または前記第１および第２培地に存在する幹細胞動員因子は、アリール炭化水素受容体阻害剤、例えば、アリール炭化水素受容体アンタゴニストである。ある特定の態様では、前記アリール炭化水素受容体阻害剤は、デスベラトロールである。ある特定の態様では、前記アリール炭化水素受容体阻害剤は、以下の式
【００２１】
【化１】
2019519486.tif 000002
の化合物
（式中、
Ｇ１は、ＮおよびＣＲ３から選択され、
Ｇ２、Ｇ３およびＧ４は、ＣＨおよびＮから独立に選択され、ただし、Ｇ３およびＧ４のうちの少なくとも１つは、Ｎであることを条件とし、ただし、Ｇ１およびＧ２は、両方がＮであるわけではないことを条件とし、
Ｌは、−−ＮＲ５ａ（ＣＨ２）０−３−−、−−ＮＲ５ａＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３）ＣＨ２−−、−−ＮＲ５ａ（ＣＨ２）２ＮＲ５ｂ−−、−−ＮＲ５ａ（ＣＨ２）２Ｓ−−、−−ＮＲ５ａＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−−、−−ＮＲ５ａＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−−および−−ＮＲ５ａＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−−から選択され、Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、水素およびＣ１−４アルキルから独立に選択され、
Ｒ１は、水素、フェニル、チオフェニル、フラニル、１Ｈ−ベンゾイミダゾリル、イソキノリニル、１Ｈ−イミダゾピリジニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、１Ｈ−ピラゾリル、ピリジニル、１Ｈ−イミダゾリル、ピロリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、１Ｈ−ピロリルおよびチアゾリルから選択され、Ｒ１の前記フェニル、チオフェニル、フラニル、１Ｈ−ベンゾイミダゾリル、イソキノリニル、１Ｈ−イミダゾピリジニル、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、１Ｈ−ピラゾリル、ピリジニル、１Ｈ−イミダゾリル、ピロリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、１Ｈ−ピロリルまたはチアゾリルは、シアノ、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロ、ハロ置換Ｃ１−４アルキル、ハロ置換Ｃ１−４アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、−−Ｃ（Ｏ）Ｒ８ａ、−−Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ８ａ、−−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８ａおよび−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８ａＲ８ｂから独立に選択される１〜３個の基により任意選択で置換することができ、Ｒ８ａおよびＲ８ｂは、水素およびＣ１−４アルキルから独立に選択され、ただし、Ｒ１およびＲ３は、両方が水素であるわけではないことを条件とし、
Ｒ２は、−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６ａＲ６ｂ、−−ＮＲ９ａＣ（Ｏ）Ｒ９ｂ、−−ＮＲ６ａＣ（Ｏ）ＮＲ６ｂＲ６ｃ、フェニル、１Ｈ−ピロロピリジン−３−イル、１Ｈ−インドリル、チオフェニル、ピリジニル、１Ｈ−１，２，４−トリアゾリル、２−オキソイミダゾリジニル、１Ｈ−ピラゾリル、２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾリルおよび１Ｈ−インダゾリルから選択され、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂおよびＲ６ｃは、水素およびＣ１−４アルキルから独立に選択され、Ｒ２の前記フェニル、１Ｈ−ピロロピリジン−３−イル、１Ｈ−インドリル、チオフェニル、ピリジニル、１Ｈ−１，２，４−トリアゾリル、２−オキソイミダゾリジニル、１Ｈ−ピラゾリル、２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾリルまたは１Ｈ−インダゾリルは、ヒドロキシ、ハロ、メチル、メトキシ、アミノ、−−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ７ａＲ７ｂ、−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ７ａＲ７ｂ、−−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ７ａＲ７ｂおよび−−ＮＲ７ａＳ（Ｏ）２Ｒ７ｂから独立に選択される１〜３個の基で任意選択で置換され、Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、水素およびＣ１−４アルキルから独立に選択され、
Ｒ３は、水素、Ｃ１−４アルキルおよびビフェニルから選択され、
Ｒ４は、Ｃ１−１０アルキル、プロパ−１−エン−２−イル、シクロヘキシル、シクロプロピル、２−（２−オキソピロリジン−１−イル）エチル、オキセタン−３−イル、ベンズヒドリル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル、フェニル、テトラヒドロフラン−３−イル、ベンジル、（４−ペンチルフェニル）（フェニル）メチルおよび１−（１−（２−オキソ−６，９，１２−トリオキサ−３−アザテトラデカン−１４−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチルから選択され、前記アルキル、シクロプロピル、シクロヘキシル、２−（２−オキソピロリジン−１−イル）エチル、オキセタン−３−イル、オキセタン−２−イル、ベンズヒドリル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル、フェニル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロフラン−２−イル、ベンジル、（４−ペンチルフェニル）（フェニル）メチルまたは１−（１−（２−オキソ−６，９，１２−トリオキサ−３−アザテトラデカン−１４−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチルは、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキルおよびハロ置換Ｃ１−４アルキルから独立に選択される１〜３個の基で任意選択で置換することができる）またはその塩である。
【００２２】
ある特定の態様では、前記アリール炭化水素受容体阻害剤は、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ−１）（４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール）である。ある特定の態様では、前記アリール炭化水素受容体阻害剤は、化合物ＣＨ２２３１９１（１−メチル−Ｎ−［２−メチル−４−［２−（２−メチルフェニル）ジアゼニル］フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド］である。
【００２３】
ある特定の態様では、前記第１培地、前記第２培地または前記第１および第２培地に存在する幹細胞動員因子は、ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体である。ある特定の態様では、前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体は、
【００２４】
【化２】
2019519486.tif 000003
のうちの１つもしくは複数
またはその塩もしくはプロドラッグであり、式中、
Ｚは、
１）−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ＜１＞）（ＯＲ＜１＞）、
２）−Ｃ（０）ＯＲ＜１＞、
３）−Ｃ（０）ＮＨＲ＜１＞、
４）−Ｃ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
５）−Ｃ（０）Ｒ＜１＞、
６）−ＣＮ、
７）−ＳＲ、
８）−Ｓ（０）２ＮＨ２、
９）−Ｓ（０）２ＮＨＲ＜１＞、
１０）−Ｓ（０）２Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
１１）−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
１２）−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
１３）−Ｌ、
１４）１つ、２つもしくは３つのＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ベンジル、
１５）Ｌおよびヘテロアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリール、
１６）Ｌおよびヘテロシクリル基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリル、
１７）Ｌおよびヘテロアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−アリール、
１８）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ヘテロアリール、または
１９）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−アリール
であり、各置換基は、それが既に存在していない場合には、Ｌ基に任意選択で結合しており、（Ｒ＜１＞）およびＲ＜１＞が窒素原子に結合している場合、任意選択でそれらは、窒素原子と一緒になって、１つまたは複数のＲ＜１＞またはＲ＜Ａ＞で任意選択で置換されている、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つもしくは複数の他のヘテロ原子を任意選択で含む３〜７員環を形成しており、
Ｗは、
１）−Ｈ、
２）−ハロゲン、
３）−ＯＲ＜１＞、
４）−Ｌ−ＯＨ、
５）−Ｌ−ＯＲ＜１＞、
６）−ＳＲ＜１＞、
７）−ＣＮ、
８）−Ｐ（０）（ＯＲ＜１＞）（ＯＲ＜１＞）、
９）−ＮＨＲ＜１＞、
１０）−Ｎ（Ｒ＜１＞）Ｒ＜１＞、
１１）−Ｌ−ＮＨ２、
１２）−Ｌ−ＮＨＲ＜１＞、
１３）−Ｌ−Ｎ（Ｒ＜１＞）Ｒ＜１＞、
１４）−Ｌ−ＳＲ＜１＞、
１５）−Ｌ−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
１６）−Ｌ−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
１７）−Ｌ−Ｐ（０）（ＯＲ＜１＞）（ＯＲ＜１＞
１８）−Ｃ（０）ＯＲ＜１＞、
１９）−Ｃ（０）ＮＨ２、
２０）−Ｃ（０）ＮＨＲ＜１＞、
２１）−Ｃ（０）Ｎ（Ｒ＜１＞）Ｒ＜１＞、
２２）−ＮＨＣ（０）Ｒ＜１＞、
２３）−ＮＲ１Ｃ（０）Ｒ＜１＞、−ＮＨＣ（０）０Ｒ＜１＞、
−ＮＲ１Ｃ（０）０Ｒ＜１＞、
−０Ｃ（０）ＮＨ２、
−０Ｃ（０）ＮＨＲ＜１＞、
−０Ｃ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
−０Ｃ（０）Ｒ＜１＞、
−Ｃ（０）Ｒ＜１＞、
−ＮＨＣ（０）ＮＨ２、
−ＮＨＣ（０）ＮＨＲ＜１＞、
−ＮＨＣ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
−ＮＲＣ（０）ＮＨ２、
−ＮＲＣ（０）ＮＨＲ＜１＞、
−ＮＲＣ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
−ＮＨＳ（０）２Ｒ＜１＞、
−ＮＲＳ（０）２Ｒ＜１＞、
−Ｓ（０）２ＮＨ２、
−Ｓ（０）２ＮＨＲ＜１＞、
−Ｓ（０）２Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
−０Ｓ（０）２Ｒ１、
−Ｓ（０）２０Ｒ＜１＞、
１つ、２つもしくは３つのＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ベンジル、
Ｌおよびヘテロアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリール
Ｌおよびヘテロシクリル基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリル、
Ｌおよびアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−アリール、
−Ｌ−ＮＲ＜１＞（Ｒ＜１＞）、
−Ｌ−）２ＮＲ＜１＞、
−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）Ｒ１、Ｌおよびヘテロアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、
Ｌおよびヘテロシクリル基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、
Ｌおよびアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−アリール、
−Ｏ−Ｌ−Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
Ｌおよびヘテロアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−ヘテロアリール、
Ｌおよびヘテロシクリル基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−ヘテロシクリル、
Ｌおよびアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−アリール、
−Ｏ−Ｌ）２−ＮＲ＜１＞、
−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ  ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ  ）Ｒ＜１＞、
Ｌおよびヘテロアリール基いずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、
Ｌおよびヘテロシクリル基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、
１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−アリール、
１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−ヘテロアリール、
１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−ヘテロシクリル、
Ｌおよびアリール基のいずれかもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−アリール、
−Ｓ−Ｌ）２ＮＲ１、
−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１）−Ｌ）’’−Ｎ（Ｒ１）Ｒ１、
１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−アリール、
−ＮＲ＜１＞（Ｒ＜１＞）、
−（Ｎ（Ｒ１）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１）Ｒ１、
−Ｎ（Ｒ１）Ｌ）２−ＮＲ１、７６）−（Ｎ（Ｒ１）−Ｌ）”−Ｎ（Ｒ１）ＲＡ、
７７）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、
７８）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、
７９）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ＜１＞）−Ｌ）ｎ−アリール、
８０）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−ヘテロアリール、または
８１）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞置換基で任意選択で置換されている−アリール
であり、各置換基は、それが既に存在していない場合には、Ｌ基に任意選択で結合しており、２つのＲ＜１＞置換基が同じ窒素原子上に存在する場合、各Ｒ＜１＞置換基は、後に述べるＲ＜１＞の値のリストから独立に選択され、
ｎは、０、１、２、３、４または５に等しい整数であり、
（Ｒ＜１＞）およびＲ＜１＞が窒素原子に結合している場合、任意選択でそれらは、窒素原子と一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つまたは複数の他のヘテロ原子を任意選択で含む３〜７員環を形成しており、任意選択で環は、１つまたは複数のＲ＜１＞またはＲ＜Ａ＞で置換されており、
Ｌは、
１）−Ｃｉ〜６アルキル、
２）−Ｃ２〜６アルケニル、
３）−Ｃ２〜６アルキニル、
４）−Ｃ３〜７シクロアルキル、
５）−Ｃ３〜７シクロアルケニル、
６）ヘテロシクリル、
７）−Ｃｉ〜６アルキル−Ｃ３〜７シクロアルキル、
８）−Ｃｉ〜６アルキル−ヘテロシクリル、
９）アリール、または
１０）ヘテロアリール
であり、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリール基は、１つもしくは２つのＲ＜Ａ＞置換基でそれぞれ独立に任意選択で置換されており、
Ｒｉは、
１）−Ｈ、
２）−Ｃ１〜６アルキル、
３）−Ｃ２〜６アルケニル、
４）−Ｃ２〜６アルキニル、５）−Ｃ３〜７シクロアルキル、
６）−Ｃ３〜７シクロアルケニル、
７）−Ｃ１〜５過フッ化、
８）−ヘテロシジル、
９）−アリール、
１０）−ヘテロアリール、
１１）−ベンジル、または
１２）５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタノイル
であり、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルケニル、ペルフルオロ化アルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびベンジル基は、１つ、２つまたは３つのＲ＜Ａ＞またはＲ＜１＞置換基でそれぞれ独立に任意選択で置換されており、
Ｒ２は、
１）−Ｈ、
２）−Ｃ１〜６アルキル、
３）−ＳＲ、
４）−Ｃ（０）Ｒ１、
５）−Ｓ（０）Ｒ１、
６）−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
７）１つ、２つもしくは３つのＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ベンジル、
８）Ｌおよびヘテロアリール基のいずれか１つもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリール、
９）Ｌおよびヘテロシクリル基のいずれか１つもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリル、
１０）Ｌおよびアリール基のいずれか１つもしくは両方に結合する１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−Ｌ−アリール、
１１）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−ヘテロアリール、または
１２）１つもしくは複数のＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている−アリール
であり、各置換基は、それが既に存在していない場合にはＬ基に任意選択で結合されており、
Ｒ＜Ａ＞は、
１）−ハロゲン、
２）−ＣＦｓ、３）−ＯＨ、
４）−ＯＲ＜１＞、
５）−Ｌ−ＯＨ、
６）−Ｌ−ＯＲ＜１＞、
７）−ＯＣＦｓ、
８）−ＳＨ、
９）−ＳＲ１、
１０）−ＣＮ、
１１）−ＮＯ２、
１２）−ＮＨ２、
１３）−ＮＨＲ＜１＞、
１４）−ＮＲ＜１＞Ｒ＜１＞、
１５）−Ｌ−ＮＨ２、
１６）−Ｌ−ＮＨＲ＜１＞、
１７）−Ｌ−ＮＲ＜４＞Ｒ＜１＞、
１８）−Ｌ−ＳＲ＜１＞、
１９）−Ｌ−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
２０）−Ｌ−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
２１）−Ｃ（０）ＯＨ、
２２）−Ｃ（０）ＯＲ＜１＞、
２３）−Ｃ（０）ＮＨ２、
２４）−Ｃ（０）ＮＨＲ＜１＞、
２５）−Ｃ（０）Ｎ（Ｒ＜１＞）Ｒ＜１＞、
２６）−ＮＨＣ（０）Ｒ＜１＞、
２７）−ＮＲ１Ｃ（０）Ｒ＜１＞、
２８）−ＮＨＣ（０）ＯＲ＜１＞、
２９）−ＮＲ１Ｃ（０）０Ｒ＜１＞、
３０）−ＯＣ（０）ＮＨ２、
３１）−ＯＣ（０）ＮＨＲ＜１＞、
３２）−ＯＣ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
３３）−ＯＣ（０）Ｒ＜１＞、
３４）−Ｃ（０）Ｒ１、３５）−ＮＨＣ（０）ＮＨ２、
３６）−ＮＨＣ（０）ＮＨＲ１、
３７）−ＮＨＣ（０）Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
３８）−ＮＲＣ（０）ＮＨ２、
３９）−ＮＲＣ（０）ＮＨＲ＜１＞、
４０）−ＮＲ１Ｃ（０）Ｎ（Ｒ１）Ｒ１、
４１）−ＮＨＳ（０）２Ｒ＜１＞、
４２）−ＮＲＳ（０）２Ｒ＜１＞、
４３）−Ｓ（０）２ＮＨ２、
４４）−Ｓ（０）２ＮＨＲ＜１＞、
４５）−Ｓ（０）２Ｎ（Ｒ）Ｒ＜１＞、
４６）−Ｓ（０）Ｒ＜１＞、
４７）−Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
４８）−０Ｓ（０）２Ｒ＜１＞、
４９）−Ｓ（０）２０Ｒ＜１＞、
５０）−ベンジル、
５１）−Ｎ３、または
５２）−Ｃ（−Ｎ＝Ｎ−）（ＣＦ３）
であり、ベンジル基は、１つ、２つもしくは３つのＲ＜Ａ＞もしくはＲ＜１＞置換基で任意選択で置換されている。
【００２５】
ある特定の態様では、前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体は、以下の化学構造
【００２６】
【化３】
2019519486.tif 000004
を有する。
【００２７】
ある特定の態様では、前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体は、以下の化学構造
【００２８】
【化４】
2019519486.tif 000005
を有する。
【００２９】
ある特定の態様では、３段階法に使用される前記第３培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用される第３培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、３段階法に使用される第３培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、１０Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在する。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、１００Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在する。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、３００Ｕ／ｍＬ〜３，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、１０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在する。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、約１，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在する。ある特定の態様では、前記第３培地中に、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、前記第３培地中に、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、前記第３培地中に、ＳＣＦは、約２２ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、前記第３培地は、ＧＢＧＭ（登録商標）でない。
【００３０】
一般的に、特定する形で列挙する培地成分は、前記培地の組成不明の成分中の、例えば、血清中の可能な成分を指すものでない。例えば、前記Ｔｐｏ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、第１培地、第２培地または第３培地の組成不明の成分中に含まれない、例えば、前記Ｔｐｏ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、血清中に含まれない。さらに、前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦは、第１培地、第２培地または第３培地の組成不明の成分中に含まれない、例えば、前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦは、血清中に含まれない。
【００３１】
ある特定の態様では、前記第１培地、第２培地または第３培地は、ヒト血清ＡＢを含む。ある特定の態様では、前記第１培地、第２培地または第３培地のいずれも、１％〜２０％のヒト血清ＡＢ、５％〜１５％のヒト血清ＡＢまたは約２、５もしくは１０％のヒト血清ＡＢを含む。
【００３２】
ある特定の態様では、前記第１培地、第２培地または第３培地のいずれも、２−メルカプトエタノールを含む。ある特定の態様では、前記第１培地、第２培地または第３培地のいずれも、ゲンタマイシンを含む。
【００３３】
本明細書で述べる３段階法における、ある特定の実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を、前記第２培地中で前記培養するステップの前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間にわたり前記第１培地中で培養する。ある特定の実施形態では、細胞を、前記第３培地中で前記培養するステップの前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間にわたり前記第２培地中で培養する。ある特定の実施形態では、細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０日間または３０日を超える期間にわたり前記第３培地中で培養する。
【００３４】
本明細書で述べる３段階法における、一実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を前記第１培地中で７〜１３日間培養して、第１細胞集団を製造し、前記第１細胞集団を前記第２培地中で２〜６日間培養して、第２細胞集団を製造し、前記第２細胞集団を前記第３培地中で１０〜３０日間培養する、すなわち、細胞を合計１９〜４９日間培養する。
【００３５】
本明細書で述べる３段階法における、一実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を前記第１培地中で８〜１２日間培養して、第１細胞集団を製造し、前記第１細胞集団を前記第２培地中で３〜５日間培養して、第２細胞集団を製造し、前記第２細胞集団を前記第３培地中で１５〜２５日間培養する、すなわち、細胞を合計２６〜４２日間培養する。
【００３６】
本明細書で述べる３段階法における、具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を前記第１培地中で１０日間培養して、第１細胞集団を製造し、前記第１細胞集団を前記第２培地中で４日間培養して、第２細胞集団を製造し、前記第２細胞集団を前記第３培地中で２１日間培養する、すなわち、細胞を合計３５日間培養する。
【００３７】
ある特定の態様では、前記第１培地、第２培地および第３培地中で前記培養するステップは、すべて静的培養条件下で、例えば、培養皿または培養フラスコ中で行われる。特定の態様では、前記第１培地、第２培地または第３培地のうちの少なくとも１つで前記培養するステップは、スピナーフラスコ中で行われる。ある特定の態様では、前記第１培地および前記第２培地中で前記培養するステップは、静的培養条件下で行われ、前記第３培地中で前記培養するステップは、スピナーフラスコ中で行われる。
【００３８】
ある特定の態様では、前記培養するステップは、スピナーフラスコ中で行われる。他の態様では、前記培養するステップは、Ｇ−Ｒｅｘデバイスで行われる。さらに他の態様では、前記培養するステップは、ＷＡＶＥバイオリアクター中で行われる。
【００３９】
ある特定の態様では、前記造血幹細胞または前駆細を１ｘ１０４〜１ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第１培地中に最初に接種する。具体的な態様では、前記造血幹細胞または前駆細を３ｘ１０４細胞／ｍＬで前記第１培地中に最初に接種する。
【００４０】
ある特定の態様では、前記第１細胞集団を５ｘ１０４〜５ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第２培地中に最初に接種する。具体的な態様では、前記第１細胞集団を１ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第２培地中に最初に接種する。
【００４１】
ある特定の態様では、前記第２細胞集団を１ｘ１０５〜５ｘ１０６細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する。ある特定の態様では、前記第２細胞集団を１ｘ１０５〜１ｘ１０６細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する。具体的な態様では、前記第２細胞集団を約５ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する。より具体的な態様では、前記第２細胞集団をスピナーフラスコ中で約５ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する。具体的な態様では、前記第２細胞集団を約３ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する。より具体的な態様では、前記第２細胞集団を静的培養で約３ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する。
【００４２】
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、前記第１培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも１０，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも７５，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率を７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色により決定する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率をアネキシンＶ染色により決定する。具体的な態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率を７ＡＡＤ染色およびアネキシンＶ染色の両方により決定する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率をトリパンブルー染色により決定する。
【００４３】
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも７０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも７５％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。
【００４４】
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも２０％の細胞傷害性を示すナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも３５％の細胞傷害性を示すナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも４５％の細胞傷害性を示すナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも６０％の細胞傷害性を示すナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した場合に前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも７５％の細胞傷害性を示すナチュラルキラー細胞を製造する。
【００４５】
ある特定の態様では、前記第３培養するステップの後に、前記第３細胞集団、例えば、ナチュラルキラー前記細胞集団を凍結保存する。
【００４６】
ある特定の態様では、ナチュラルキラー細胞、すなわち、本明細書で述べた３段階法により製造されたナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が本明細書で提供される。したがって、本明細書で述べた３段階法により製造された単離ナチュラルキラー細胞集団が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。
【００４７】
一実施形態では、単離ＮＫ前駆細胞集団が本明細書で提供され、前記ＮＫ前駆細胞は、本明細書で述べた３段階法により製造される。
【００４８】
別の実施形態では、単離成熟ＮＫ細胞集団が本明細書で提供され、前記成熟ＮＫ細胞は、本明細書で述べた３段階法により製造される。
【００４９】
別の実施形態では、単離ＮＫ細胞集団が本明細書で提供され、前記ＮＫ細胞は、活性化されており、前記活性化ＮＫ細胞は、本明細書で述べた３段階法により製造される。
【００５０】
したがって、別の態様では、急性骨髄性白血病細胞増殖を抑制するための、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団の使用が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞集団は、ＩＬ−２と組み合わせて使用される。
【００５１】
別の態様では、多発性骨髄腫細胞増殖を抑制するための、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団の使用が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞集団は、ＩＬ−２と組み合わせて使用される。
【００５２】
別の具体的な実施形態では、ＮＫ細胞集団が製造される、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤潅流液、臍帯血または末梢血から得られる。一実施形態では、ＮＫ細胞集団が製造される、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤から、例えば、胎盤潅流液から得られる。一実施形態では、ＮＫ細胞集団が製造される、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、臍帯血から得られない。一実施形態では、ＮＫ細胞集団が製造される、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、末梢血から得られない。別の具体的な実施形態では、ＮＫ細胞集団が製造される、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤潅流液および臍帯血、例えば、潅流液と同じ胎盤由来の臍帯血に由来する混合細胞である。別の具体的な実施形態では、前記臍帯血は、前記胎盤潅流液が得られる胎盤以外の胎盤から単離する。ある特定の実施形態では、混合細胞は、臍帯血および胎盤潅流液をプールすることまたは合わせることにより得ることができる。ある特定の実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の容量比で合わせて、混合細胞を得る。具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１〜１：１０、５：１〜１：５または３：１〜１：３の比で合わせる。別の具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５または１：１０の比で合わせる。より具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を８．５：１．５（８５％：１５％）の比で合わせる。
【００５３】
ある特定の実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を、総有核細胞（ＴＮＣ）含量により決定される、１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の比で合わせて、混合細胞を得る。具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１〜１：１０、５：１〜１：５または３：１〜１：３の比で合わせる。別の具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５または１：１０の比で合わせる。
【００５４】
したがって、一実施形態では、急性骨髄性白血病を有する個体を処置する方法であって、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された単離ＮＫ細胞集団からの細胞の有効量を前記個体に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。ある特定の態様では、前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されている。他の態様では、前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されていない。
【００５５】
したがって、一実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法であって、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された単離ＮＫ細胞集団からの細胞の有効量を前記個体に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。ある特定の態様では、前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されている。他の態様では、前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞が凍結保存されていない。
【００５６】
具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造したＮＫ細胞集団は、前記投与するステップの前に、免疫調節化合物、例えば、本明細書で述べる免疫調節化合物またはサリドマイドで処理した。具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造したＮＫ細胞集団は、前記投与するステップの前に、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ１２およびＩＬ１５、ＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ２およびＩＬ１２およびＩＬ１５およびＩＬ１８、またはＩＬ２およびＩＬ１５およびＩＬ１８で処理した。別の具体的な実施形態では、方法は、（１）本明細書で述べた３段階法を使用して製造した、有効量の単離ＮＫ細胞集団；および（２）有効量の免疫調節化合物またはサリドマイドを個体に投与するステップを含む。この文脈における「有効量」は、ＮＫ細胞集団および、任意選択で、免疫調節化合物またはサリドマイドを投与しなかった前記がんまたは前記感染を有する個体と比較して、前記がんまたは前記感染の１つもしくは複数の症状の検出可能な改善をもたらす、前記ＮＫ細胞集団における細胞、および任意選択で免疫調節化合物またはサリドマイドの量を意味する。具体的な実施形態では、前記免疫調節化合物は、レナリドミドまたはポマリドミドである。
【００５７】
別の実施形態では、急性骨髄性白血病細胞の増殖を抑制する方法であって、ＮＫ細胞集団の治療有効量を急性骨髄性白血病細胞と近接させる、例えば、ＮＫ細胞集団内の細胞と急性骨髄性白血病細胞を接触させるステップを含む方法が、本明細書で提供される。以後、特に示さない限り、「近接」という用語は、所望の結果を生じさせるのに十分に近いことを意味するものであり、例えば、ある特定の実施形態では、近接という用語は、接触を意味する。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップがｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップがｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。
【００５８】
別の実施形態では、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法であって、ＮＫ細胞集団の治療有効量を急性骨髄性白血病細胞と近接させる、例えば、ＮＫ細胞集団内の細胞と多発性骨髄腫細胞を接触させるステップを含む方法が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。他の実施形態では、前記接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。
【００５９】
ＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、全身である。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、注入による。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、静脈内（ＩＶ）注入による。
【００６０】
別の態様では、急性骨髄性白血病を有する個体を処置する方法であって、前記個体におけるＡＭＬの処置に有効であるＮＫ細胞を個体に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞であるか、または臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から製造されたＮＫ細胞である。別の実施形態では、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を製造するための、例えば、本明細書で示した３段階法を使用してＮＫ細胞集団を製造するための本明細書で述べた方法のいずれかにより製造された。急性骨髄性白血病を有する個体を処置する方法の、ある特定の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞集団は、本明細書に記載の通り、３段階法により製造される。特定の実施形態では、前述の方法により処置されることになる急性骨髄性白血病は、難治性急性骨髄性白血病、予後不良急性骨髄性白血病、または小児急性骨髄性白血病を含む。ある特定の実施形態では、前記個体は、急性骨髄性白血病に対する少なくとも１回の非ナチュラルキラー細胞治療が奏功しなかった急性骨髄性白血病を有する。具体的な実施形態では、前記個体は、６５歳以上であり、第１寛解期にある。具体的な実施形態では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与するステップの前に、化学療法、例えば、フルダラビン、シタラビン、または両方でコンディショニングされている。
【００６１】
別の態様では、多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法であって、前記個体における多発性骨髄腫の処置に有効であるＮＫ細胞を個体に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞であるかまたは臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から製造されたＮＫ細胞である。別の実施形態では、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を製造するための、例えば、本明細書で示した３段階法を使用してＮＫ細胞集団を製造するための、本明細書で述べた方法のいずれかにより製造された。多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法の、ある特定の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞集団は、本明細書に記載の通り、３段階法により製造される。具体的な実施形態では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与するステップの前に、自家幹細胞移植を受けている。具体的な実施形態では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与するステップの前に、メルファランを受けている。
【００６２】
ある特定の実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団は、凍結保存する、例えば、本明細書で述べる方法を使用して凍結保存する。ある特定の実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団は、凍結保存媒体中、例えば、本明細書で述べる凍結保存媒体中で凍結保存する。具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＮＫ前駆細胞集団および／またはＮＫ細胞集団の凍結保存は、（１）本明細書で述べた３段階法を使用して製造されたＮＫ前駆細胞集団および／またはＮＫ細胞集団を含む細胞懸濁溶液を調製するステップ；（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に加えて、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ；（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して、凍結保存試料を得るステップ；および（４）凍結保存試料を−８０℃以下で保管するステップを含む。
【００６３】
上記の治療または腫瘍抑制の方法のある特定の実施形態では、本明細書で述べた３段階法により製造されたＮＫ細胞集団を、他のナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤潅流液、臍帯血もしくは末梢血から単離された、または異なる方法により造血細胞から製造されたナチュラルキラー細胞と合わせる。具体的な実施形態では、ナチュラルキラー細胞集団を、約１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の比で別の供給源からの、または異なる方法により製造されたナチュラルキラー細胞と合わせる。
【００６４】
別の態様では、本明細書で述べた３段階法により製造される単離ＮＫ細胞を含む組成物が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、造血細胞、例えば、胎盤潅流液、臍帯血および／または末梢血から単離された造血幹細胞または前駆細胞から製造される。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、組成物中の細胞の少なくとも７０％を構成する。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、組成物中の細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を構成する。ある特定の実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞の少なくとも８０％、８２％、８４％、８６％、８８％または９０％は、ＣＤ３−およびＣＤ５６＋である。ある特定の実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％または９０％は、ＣＤ１６−である。ある特定の実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または６０％は、ＣＤ９４＋である。
【００６５】
具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、単一個体に由来する。より具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、異なる少なくとも２個体に由来するナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞による治療が意図される個体と異なる個体に由来する。別の具体的な実施形態では、免疫調節化合物もしくはサリドマイドと接触も近接もさせていない同等の数のナチュラルキラー細胞、すなわち、ＮＫ細胞よりも検出可能に多くのグランザイムＢまたはパーフォリンを前記ＮＫ細胞が発現するのに十分な量で、かつ時間にわたり前記ＮＫ細胞を前記免疫調節化合物もしくはサリドマイドと接触または近接させた。
【００６６】
より具体的な実施形態では、組成物は、本明細書で述べた３段階法により製造されたＮＫ細胞および別の供給源からの、または別の方法により製造されたナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記他の供給源は、胎盤血および／または臍帯血である。別の具体的な実施形態では、前記他の供給源は、末梢血である。より具体的な実施形態では、ＮＫ細胞を別の供給源からの、または別の方法により製造されたナチュラルキラー細胞と約１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の比で合わせる。
【００６７】
別の態様では、例えば、本明細書で述べた３段階法により製造された、単離ＮＫ細胞集団を含む、組成物、例えば、医薬組成物が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記単離ＮＫ細胞集団は、造血細胞、例えば、胎盤から、例えば、胎盤潅流液、臍帯血および／または末梢血から単離された造血幹細胞または前駆細胞から製造される。別の具体的な実施形態では、前記単離ＮＫ細胞集団は、組成物中の細胞の少なくとも７０％を構成する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＮＫ細胞集団は、組成物中の細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を構成する。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、組成物中の細胞の少なくとも７０％を構成する。ある特定の実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞の少なくとも８０％、８２％、８４％、８６％、８８％または９０％は、ＣＤ３−およびＣＤ５６＋である。ある特定の実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％または９０％は、ＣＤ１６−である。ある特定の実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または６０％は、ＣＤ９４＋である。
【００６８】
別の具体的な実施形態では、前記組成物中の前記単離ＮＫ細胞は、単一個体に由来する。より具体的な実施形態では、前記単離ＮＫ細胞は、異なる少なくとも２個体に由来するＮＫ細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記組成物中の前記単離ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞による治療が意図される個体と異なる個体に由来する。別の具体的な実施形態では、免疫調節化合物もしくはサリドマイドと接触も近接もさせていない同等の数のナチュラルキラー細胞、すなわち、ＮＫ細胞よりも検出可能に多くのグランザイムＢまたはパーフォリンを前記ＮＫ細胞が発現するのに十分な量で、かつ時間にわたり前記ＮＫ細胞を前記免疫調節化合物もしくはサリドマイドと接触または近接させた。
【００６９】
より具体的な実施形態では、組成物は、別の供給源からの、または別の方法により製造されたＮＫ細胞を含む。具体的な実施形態では、前記他の供給源は、胎盤血および／または臍帯血である。別の具体的な実施形態では、前記他の供給源は、末梢血である。より具体的な実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞集団を、別の供給源からの、または別の方法により製造されたＮＫ細胞と約１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の比で合わせる。
【００７０】
３．１．  用語
本明細書で使用される「免疫調節化合物」および「ＩＭｉＤ（商標）」という用語は、サリドマイドを包含しない。
【００７１】
本明細書で使用される「レナリドミド」は、３−（４’アミノイソインドリン−１’−オン）−１−ピペリジン−２，６−ジオン（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ名）または２，６−ピペリジンジオン，３−（４−アミノ−１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−（国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）名）を意味する。本明細書で使用される「ポマリドミド」は、４−アミノ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）イソインドール−１，３−ジオンを意味する。
【００７２】
本明細書で使用される「多能性」（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）は、細胞について述べる場合、細胞が別の細胞型の細胞に分化する能力を有することを意味する。ある特定の実施形態では、「多能性細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）」は、哺乳類の身体の約２６０の細胞型のサブセットに発達する能力を有する細胞である。多能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）と異なり、多能性細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）は、細胞型のすべてを形成する能力を有するわけではない。
【００７３】
本明細書で使用される「フィーダー細胞」は、第２型の細胞を維持し、多分増殖させることができる環境を与えるために、第２型の細胞と共培養される１つの型の細胞を意味する。いかなる理論にも拘束されるものでないが、フィーダー細胞は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、電気シグナル、有機分子（例えば、ステロイド）、核酸分子、増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ）、他の因子（例えば、サイトカイン）および代謝栄養素を標的細胞に供給する。ある特定の実施形態では、フィーダー細胞は、単層に成長する。
【００７４】
本明細書で使用される、さらなる修正なしに、本明細書で述べた方法を使用して製造した「ナチュラルキラー細胞」または「ＮＫ細胞」は、あらゆる組織供給源に由来するナチュラルキラー細胞を含む。
【００７５】
本明細書で使用される「胎盤潅流液」は、胎盤、例えば、ヒト胎盤の少なくとも一部を、例えば、胎盤血管系内を通過させた潅流溶液を意味し、胎盤内の通過中に潅流溶液により収集された複数の細胞を含む。
【００７６】
本明細書で使用される「胎盤潅流液細胞」は、胎盤潅流液から単離された、または単離可能な有核細胞、例えば、総有核細胞を意味する。
【００７７】
本明細書で使用される「腫瘍細胞の抑制」、「腫瘍細胞の増殖の抑制」などは、例えば、本明細書で述べた３段階法を使用して製造したＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団を例えば、腫瘍細胞の集団と接触させるステップまたは近接させるステップにより、例えば、腫瘍細胞の集団を本明細書で述べた３段階法を使用して製造したＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団と接触させるステップにより、例えば、腫瘍前記細胞集団における１つまたは複数の腫瘍細胞を殺滅するステップにより、腫瘍細胞の集団の増殖を遅くすることを含む。ある特定の実施形態では、前記接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。他の実施形態では、前記接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。
【００７８】
本明細書で使用される「造血細胞」という用語は、造血幹細胞および造血前駆細胞を含む。
【００７９】
本明細書で使用される「組成不明の成分」は、その構成物質が一般的に示されていないまたは定量化されていない成分を指す培養培地の分野における専門用語である。「組成不明の成分」の例としては、制限なしに、血清、例えば、ヒト血清（例えば、ヒト血清ＡＢ）および胎児血清（例えば、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）またはウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）などがある。
【００８０】
本明細書で使用される「＋」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用される場合、細胞マーカーが、蛍光活性化細胞選別においてアイソタイプ対照を上回って検出可能に存在すること；または定量的もしくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて、バックグラウンドを超える形で検出可能であることを意味する。
【００８１】
本明細書で使用される「−」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用される場合、細胞マーカーが、蛍光活性化細胞選別においてアイソタイプ対照を上回って検出可能に存在しないこと；または定量的もしくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて、バックグラウンドを超える形で検出可能ではないことを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
４．  詳細な説明
本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用して、急性骨髄性白血病を有する個体を処置する方法が、本明細書で提供される。本明細書で提供される処置の方法は、ＩＬ−２の投与を含む抗がん治療レジメンの一部になることができる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、ヒトＩｌ−２である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）である。
【００８３】
急性骨髄性白血病細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、急性骨髄性白血病細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と急性骨髄性白血病細胞を接触させるステップを含む方法が、本明細書でさらに提供される。ある特定の実施形態では、急性骨髄性白血病細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、急性骨髄性白血病細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と急性骨髄性白血病細胞を接触させるステップを含み、ＩＬ−２をＮＫ細胞および／または前性骨髄性白血病細胞と近接させる、例えば、ＩＬ−２とＮＫ細胞および／または急性骨髄性白血病細胞を接触させるステップをさらに含む方法が、本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＩＬ−２は、ｒｈＩＬ−２である。
【００８４】
本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用して、多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法が、本明細書で提供される。本明細書で提供される処置の方法は、ＩＬ−２の投与を含む抗がん治療レジメンの一部になることができる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、ヒトＩｌ−２である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）である。ある特定の実施形態では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞の投与の前に、化学療法を受けている。具体的な実施形態では、化学療法は、アルキル化剤である。より具体的な実施形態では、アルキル化剤は、メルファランである。ある特定の実施形態では、メルファランは、ラベルに従って投与される。ある特定の実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体は、前記投与の前に自家幹細胞移植を受けた個体である。ある特定の実施形態では、自家幹細胞移植は、前記多発性骨髄腫の処置におけるものであった。ある特定の実施形態では、自家幹細胞移植における幹細胞は、末梢血単核細胞である。
【００８５】
多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、多発性骨髄腫細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と急性骨髄性白血病細胞を接触させるステップを含む方法が、本明細書でさらに提供される。ある特定の実施形態では、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、多発性骨髄腫細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と多発性骨髄腫細胞を接触させるステップを含み、ＩＬ−２をＮＫ細胞および／または多発性骨髄腫細胞と近接させる、例えば、ＩＬ−２とＮＫ細胞および／または多発性骨髄腫細胞を接触させるステップをさらに含む方法が、本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＩＬ−２は、ｒｈＩＬ−２である。
【００８６】
造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞からＮＫ細胞を製造し、増幅する新規方法が本明細書で提供される。また造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞からＮＫ細胞集団を製造する方法、例えば、３段階法が本明細書で提供される。ＮＫ細胞およびＮＫ細胞集団を製造するために使用する造血細胞は、あらゆる供給源、例えば、制限なしに、胎盤、臍帯血、胎盤血、末梢血、脾臓または肝臓から得ることができる。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団は、増幅造血細胞、例えば、造血幹細胞および／または造血前駆細胞から製造される。一実施形態では、造血細胞は、そのような細胞の供給源、例えば、胎盤、例えば、胎盤潅流液、臍帯血、胎盤血、末梢血、脾臓、肝臓および／または骨髄から収集する。
【００８７】
ＮＫ細胞およびＮＫ細胞集団を製造するために使用する造血細胞は、あらゆる動物種から得ることができる。ある特定の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞は、哺乳類細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、ヒト細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、霊長類細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、イヌ細胞である。具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞は、げっ歯類細胞である。
【００８８】
４．１  造血細胞
本明細書で開示した方法において有用な造血細胞は、ＮＫ細胞に分化することができる任意の造血細胞、例えば、前駆細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞などであり得る。造血細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、胎盤血、末梢血、肝臓など、またはそれらの組合せのような組織供給源から得ることができる。造血細胞は、胎盤から得ることができる。具体的な実施形態では、造血細胞は、胎盤潅流液から得られる。一実施形態では、造血細胞は、臍帯血から得られない。一実施形態では、造血細胞は、末梢血から得られない。胎盤潅流液に由来する造血細胞は、胎児および母体造血細胞の混合物、例えば、母体細胞が造血細胞の総数の５％以上を構成する混合物を含み得る。ある特定の実施形態では、胎盤潅流液に由来する造血細胞は、少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の胎児細胞を含む。
【００８９】
別の具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用してＮＫ細胞集団を製造する、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤潅流液、臍帯血、胎児肝臓、動員末梢血または骨髄から得られる。別の具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用してＮＫ細胞集団を製造する、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、胎盤潅流液および臍帯血、例えば、潅流液と同じ胎盤由来の臍帯血に由来する混合細胞である。別の具体的な実施形態では、前記臍帯血は、前記胎盤潅流液が得られる胎盤以外の胎盤から単離する。ある特定の実施形態では、混合細胞は、臍帯血および胎盤潅流液をプールすることまたは合わせることにより得ることができる。ある特定の実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の容量比で合わせて、混合細胞を得る。具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１〜１：１０、５：１〜１：５または３：１〜１：３の比で合わせる。別の具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５または１：１０の比で合わせる。より具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を８．５：１．５（８５％：１５％）の比で合わせる。
【００９０】
ある特定の実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を、総有核細胞（ＴＮＣ）含量による、１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、または同様の比で合わせて、混合細胞を得る。具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１〜１：１０、５：１〜１：５または３：１〜１：３の比で合わせる。別の具体的な実施形態では、臍帯血および胎盤潅流液を１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５または１：１０の比で合わせる。
【００９１】
別の具体的な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して前記ＮＫ細胞集団を製造する、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、臍帯血および胎盤潅流液の両方に由来するが、前記臍帯血は、前記胎盤潅流液が得られる胎盤以外の胎盤から単離される。
【００９２】
ある特定の実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。具体的な実施形態では、本明細書で開示した方法において有用な造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋またはＣＤ３４＋ＣＤ３８−である。より具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−である。別の具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ２−、ＣＤ３−、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１６−、ＣＤ１９−、ＣＤ２４−、ＣＤ５６−、ＣＤ６６ｂ−および／またはグリコホリンＡ−でのうちの１つまたは複数である。別の具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ２−、ＣＤ３−、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１６−、ＣＤ１９−、ＣＤ２４−、ＣＤ５６−、ＣＤ６６ｂ−およびグリコホリンＡ−である。別のより具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−ＣＤ１１７−である。別のより具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−ＣＤ１１７−ＣＤ２３５−ＣＤ３６−である。
【００９３】
別の実施形態では、造血細胞は、ＣＤ４５＋である。別の具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋である。別の実施形態では、造血細胞は、Ｔｈｙ−１＋である。具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋である。別の実施形態では、造血細胞は、ＣＤ１３３＋である。具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋またはＣＤ１３３＋Ｔｈｙ−１＋である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋造血細胞は、ＣＸＣＲ４＋である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋造血細胞は、ＣＸＣＲ４−である。別の実施形態では、造血細胞は、ＫＤＲ（血管増殖因子受容体２）について陽性である。具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋、ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋またはＴｈｙ−１＋ＫＤＲ＋である。ある特定の他の実施形態では、造血細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼについて陽性である（ＡＬＤＨ＋）。例えば、細胞は、ＣＤ３４＋ＡＬＤＨ＋である。
【００９４】
ある特定の実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４−である。
【００９５】
造血細胞は、分化系列決定、または発達の自由さ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｎａｉｖｅｔｅ）の欠乏を示すある特定のマーカーも欠き得る。例えば、別の実施形態では、造血細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ−である。具体的な実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋ＨＬＡ−ＤＲ−、ＣＤ１３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−、Ｔｈｙ−１＋ＨＬＡ−ＤＲ−またはＡＬＤＨ＋ＨＬＡ−ＤＲ−である。別の実施形態では、造血細胞は、細胞系列マーカーＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂおよびグリコホリンＡの１つもしくは複数、またはすべてについて陰性である。
【００９６】
したがって、造血細胞は、未分化状態を示すマーカーの存在に基づいて、または少なくとも一部の系列分化が起こったことを示す細胞系列マーカーの非存在に基づいて、本明細書で開示した方法に使用するために選択することができる。固有のマーカーの有無に基づいて、造血細胞を含む、細胞を単離する方法は、以下で詳細に述べる。
【００９７】
本明細書で提供する方法に使用する造血細胞は、実質的に均一な集団、例えば、単一組織供給源に由来する少なくとも約９５％、少なくとも約９８％もしくは少なくとも約９９％の造血細胞を含む集団、または同じ造血細胞関連細胞マーカーを示す造血細胞を含む集団であり得る。例えば、様々な実施形態では、造血細胞は、骨髄、臍帯血、胎盤血、末梢血または胎盤、例えば、胎盤潅流液に由来する少なくとも約９５％、９８％または９９％の造血細胞を含み得る。
【００９８】
本明細書で提供する方法に使用する造血細胞は、単一個体から、例えば、単一胎盤から、または複数の個体から得ることができ、例えば、プールすることができる。造血細胞を複数の個体から得て、プールする場合、造血細胞は、同じ組織供給源から得ることができる。したがって、様々な実施形態では、プールされた造血細胞は、すべて胎盤、例えば、胎盤潅流液に、すべて胎盤血に、すべて臍帯血に、すべて末梢血などに由来する。
【００９９】
本明細書で開示した方法に使用する造血細胞は、ある特定の実施形態では、２つまたはそれ以上の組織供給源に由来する造血細胞を含む。例えば、ある特定の実施形態では、２つまたはそれ以上の供給源に由来する造血細胞を、本明細書における方法に使用するために合わせる場合、本明細書で述べた３段階法を使用してナチュラルキラー細胞を製造するために使用する複数の造血細胞は、胎盤、例えば、胎盤潅流液に由来する造血細胞を含む。様々な実施形態では、本明細書で述べた３段階法を使用して製造されるＮＫ細胞集団を製造するために使用する造血細胞は、胎盤に由来するおよび臍帯血に由来する；胎盤および末梢血に由来する；胎盤および胎盤血または胎盤および骨髄に由来する造血細胞を含む。一実施形態では、造血細胞は、臍帯血に由来する造血細胞と組み合わされた胎盤潅流液に由来する造血細胞を含み、臍帯血および胎盤は、同じ個体に由来する。すなわち、潅流液および臍帯血が一致している。造血細胞が２つの組織供給源に由来する造血細胞を含む実施形態では、供給源に由来する造血細胞は、例えば、１：１０、２：９、３：８、４：７、５：６、６：５、７：４、８：３、９：２、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１または９：１の比で合わせることができる。
【０１００】
４．１．１  胎盤造血幹細胞
ある特定の実施形態では、本明細書で提供する方法に使用する造血細胞は、胎盤造血細胞である。一実施形態では、胎盤造血細胞は、ＣＤ３４＋である。具体的な実施形態では、胎盤造血細胞は、主として（例えば、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞である。別の具体的な実施形態では、胎盤造血細胞は、主として（例えば、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞である。胎盤造血細胞は、分娩後哺乳類（例えば、ヒト）胎盤から当業者に公知の手段、例えば、潅流により得ることができる。
【０１０１】
別の実施形態では、胎盤造血細胞は、ＣＤ４５−である。具体的な実施形態では、胎盤造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、胎盤造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋である。
【０１０２】
４．２  ナチュラルキラー細胞およびナチュラルキラー細胞集団の製造
本方法によるＮＫ細胞およびＮＫ細胞集団の製造は、造血細胞の集団を増幅することを含む。細胞増幅中、造血細胞集団内の複数の造血細胞がＮＫ細胞に分化する。一態様では、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１培地中で造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞を培養して、第１細胞集団を製造し、その後、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２培地中で前記第１細胞集団を培養して、第２細胞集団を製造し、その後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３培地中で前記第２細胞集団を培養して、第３細胞集団を製造するステップを含み、第３細胞集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％、例えば、８０％がある特定の実施形態で生存している、ＮＫ細胞を製造する方法が本明細書で提供され、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋またはＣＤ１６＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４−またはＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４＋およびＣＤ１６＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の実施形態では、そのようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４−およびＣＤ１６−であるナチュラルキラー細胞を含む。
【０１０３】
４．２．１  ３段階法を使用したＮＫ細胞集団の製造
一実施形態では、ＮＫ細胞集団を製造する３段階法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、本明細書で述べた３段階法によりＮＫ細胞集団を製造するための、本明細書で述べた、造血細胞の増幅および分化の方法は、１ミリリットル当たり約２ｘ１０４から約６ｘ１０６細胞の前記造血細胞を含む細胞集団を維持することステップを含む。ある特定の態様では、前記造血幹細胞または前駆細胞を１ｘ１０４〜１ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第１培地中に最初に接種する。具体的な態様では、前記造血幹細胞または前駆細胞を約３ｘ１０４細胞／ｍＬで前記第１培地中に最初に接種する。
【０１０４】
ある特定の態様では、前記第１細胞集団を５ｘ１０４〜５ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第２培地中に最初に接種する。具体的な態様では、前記第１細胞集団を約１ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第２培地中に最初に接種する。
【０１０５】
ある特定の態様では、前記第２細胞集団を１ｘ１０５〜５ｘ１０６細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する。ある特定の態様では、前記第２細胞集団を１ｘ１０５〜１ｘ１０６細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する。具体的な態様では、前記第２細胞集団を約５ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する。より具体的な態様では、前記第２細胞集団をスピナーフラスコ中で約５ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する。具体的な態様では、前記第２細胞集団を約３ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する。より具体的な態様では、前記第２細胞集団を静的培養で約３ｘ１０５細胞／ｍＬで前記第３培地中に最初に接種する。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、３段階法は、例えば、本明細書で述べたように、第１培地中で規定の時間にわたり造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞を培養して、第１細胞集団を製造することを含む第１段階（「段階１」）を含む。ある特定の実施形態では、第１培地は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む。ある特定の実施形態では、第１培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。具体的な実施形態では、第１培地のそれぞれは、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。具体的な実施形態では、第１培地は、添加されるＬＭＷＨを欠いている。具体的な実施形態では、第１培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な実施形態では、第１培地は、ＬＭＷＨを欠いている。具体的な実施形態では、第１培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な実施形態では、第１培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、その後、「段階２」において、例えば、本明細書で述べたように、第２培地中で規定の時間にわたり前記細胞を培養して、第２細胞集団を製造する。ある特定の実施形態では、第２培地は、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている。ある特定の実施形態では、第２培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、第２培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。具体的な実施形態では、第２培地は、添加されるＬＭＷＨを欠いている。具体的な実施形態では、第２培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な実施形態では、第２培地は、ＬＭＷＨを欠いている。具体的な実施形態では、第２培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。ある特定の実施形態では、第２培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、その後、「段階３」において、例えば、本明細書で述べたように、第３培地中で規定の時間にわたり前記細胞を培養して、第３細胞集団、例えば、ナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の実施形態では、第３培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている。ある特定の実施形態では、第３培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、第３培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。具体的な実施形態では、第３培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な実施形態では、第３培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。
【０１０９】
具体的な実施形態では、３段階法を使用して、ＮＫ細胞集団を製造する。ある特定の実施形態では、３段階法は、間質フィーダー細胞支持の非存在下で行われる。ある特定の実施形態では、３段階法は、外から添加されるステロイド（例えば、コルチゾン、ヒドロコルチゾンまたはその誘導体）の非存在下で行われる。
【０１１０】
ある特定の態様では、３段階法に使用する前記第１培地は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む。ある特定の態様では、３段階法に使用する第１培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、３段階法に使用する第１培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、３段階法に使用する第１培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。具体的な態様では、第１培地は、添加されるＬＭＷＨを欠いている。具体的な態様では、第１培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な態様では、第１培地は、ＬＭＷＨを欠いている。具体的な態様では、第１培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。ある特定の態様では、前記Ｔｐｏは、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬまたは約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で第１培地中に存在する。ある特定の態様では、第１培地中に、ＬＭＷＨは、１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１培地中に、ＬＭＷＨは、４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１培地中に、ＬＭＷＨは、約４．５Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第１培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、前記第１培地は、以下、ゲンタマイシンのような抗生物質；トランスフェリン、インスリンおよび／またはベータ−メルカプトエタノールのような抗酸化物質；亜セレン酸ナトリウム；アスコルビン酸；エタノールアミン；ならびにグルタチオンのうちの１つまたは複数をさらに含む。ある特定の実施形態では、第１培地の主成分となる培地は、当業者に公知の細胞／組織培養培地、例えば、ＳＣＧＭ（商標）、ＳＴＥＭＭＡＣＳ（商標）、ＧＢＧＭ（登録商標）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）Ｈ３０００、ＣＥＬＬＧＲＯ  ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（「Ｆ１２」）（例えば、２：１比、または高グルコースもしくは低グルコースＤＭＥＭ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＬ０８−１Ｄ２、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ５１００、ＩＭＤＭおよび／もしくはＲＰＭＩ−１６４０のような市販の細胞／組織培養培地；またはＧＢＧＭ（登録商標）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）Ｈ３０００、ＣＥＬＬＧＲＯ  ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（「Ｆ１２」）（例えば、２：１比、または高グルコースもしくは低グルコースＤＭＥＭ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＬ０８−１Ｄ２、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ５１００、ＩＭＤＭおよび／もしくはＲＰＭＩ−１６４０に含まれている成分のような、公知の細胞／組織培養培地に一般的に含まれている成分を含む培地である。ある特定の実施形態では、前記第１培地は、ＧＢＧＭ（登録商標）でない。
【０１１１】
ある特定の態様では、３段階法に使用する前記第２培地は、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用する第２培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、３段階法に使用する第２培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、３段階法に使用する第２培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ−１５に加えて、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。具体的な態様では、第２培地は、添加されるＬＭＷＨを欠いている。具体的な態様では、第２培地は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。具体的な態様では、第２培地は、ＬＭＷＨを欠いている。具体的な態様では、第２培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠いている。ある特定の態様では、前記ＩＬ−１５は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬまたは約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第２培地中に存在する。ある特定の態様では、前記第２培地中に、ＬＭＷＨは、１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの濃度で存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、前記第２培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２培地中に、ＬＭＷＨは、４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で第２培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２培地中に、ＬＭＷＨは、４Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬの濃度で第２培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２培地中に、ＬＭＷＨは、約４．５Ｕ／ｍＬの濃度で第２培地中に存在し、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、第２培地中に、Ｆｌｔ−３Ｌは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＳＣＦは、約２７ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、約０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、前記第２培地は、以下、ゲンタマイシンのような抗生物質；トランスフェリン、インスリンおよび／またはベータ−メルカプトエタノールのような抗酸化物質；亜セレン酸ナトリウム；アスコルビン酸；エタノールアミン；ならびにグルタチオンのうちの１つまたは複数をさらに含む。ある特定の実施形態では、第２培地の主成分となる培地は、当業者に公知の細胞／組織培養培地、例えば、ＳＣＧＭ（商標）、ＳＴＥＭＭＡＣＳ（商標）、ＧＢＧＭ（登録商標）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）Ｈ３０００、ＣＥＬＬＧＲＯ  ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（「Ｆ１２」）（例えば、２：１比、または高グルコースもしくは低グルコースＤＭＥＭ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＬ０８−１Ｄ２、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ５１００、ＩＭＤＭおよび／もしくはＲＰＭＩ−１６４０のような市販の細胞／組織培養培地；またはＧＢＧＭ（登録商標）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）Ｈ３０００、ＣＥＬＬＧＲＯ  ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（「Ｆ１２」）（例えば、２：１比、または高グルコースもしくは低グルコースＤＭＥＭ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＬ０８−１Ｄ２、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ５１００、ＩＭＤＭおよび／もしくはＲＰＭＩ−１６４０に含まれている成分のような、公知の細胞／組織培養培地に一般的に含まれている成分を含む培地である。ある特定の実施形態では、前記第２培地は、ＧＢＧＭ（登録商標）でない。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、３段階法に使用される第３培地は、      を含む培地を含む。ある特定の実施形態では、３段階法に使用される前記第３培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている。ある特定の態様では、３段階法に使用される第３培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、３段階法に使用される第３培地は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、１０Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在する。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、１００Ｕ／ｍＬ〜１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在する。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、３００Ｕ／ｍＬ〜３，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、１０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在する。ある特定の態様では、前記ＩＬ−２は、約１，０００Ｕ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在し、前記ＩＬ−１５は、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記第３培地中に存在する。ある特定の態様では、前記第３培地中に、ＳＣＦは、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜０．５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、前記第３培地中に、ＳＣＦは、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、０．０４ｎｇ／ｍＬ〜０．０６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、０．２０ｎｇ／ｍＬ〜０．３０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．００５ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の態様では、前記第３培地中に、ＳＣＦは、約２２ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−６は、約０．０５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＩＬ−７は、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、Ｇ−ＣＳＦは、約０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＧＭ−ＣＳＦは、０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある特定の実施形態では、前記第３培地は、以下、ゲンタマイシンのような抗生物質；トランスフェリン、インスリンおよび／またはベータ−メルカプトエタノールのような抗酸化物質；亜セレン酸ナトリウム；アスコルビン酸；エタノールアミン；ならびにグルタチオンのうちの１つまたは複数をさらに含む。ある特定の実施形態では、第３培地の主成分となる培地は、当業者に公知の細胞／組織培養培地、例えば、ＳＣＧＭ（商標）、ＳＴＥＭＭＡＣＳ（商標）、ＧＢＧＭ（登録商標）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）Ｈ３０００、ＣＥＬＬＧＲＯ  ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（「Ｆ１２」）（例えば、２：１比、または高グルコースもしくは低グルコースＤＭＥＭ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＬ０８−１Ｄ２、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ５１００、ＩＭＤＭおよび／もしくはＲＰＭＩ−１６４０のような市販の細胞／組織培養培地；またはＧＢＧＭ（登録商標）、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１０、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５、ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）Ｈ３０００、ＣＥＬＬＧＲＯ  ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（「Ｆ１２」）（例えば、２：１比、または高グルコースもしくは低グルコースＤＭＥＭ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＥＬ０８−１Ｄ２、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）Ｈ５１００、ＩＭＤＭおよび／もしくはＲＰＭＩ−１６４０に含まれている成分のような、公知の細胞／組織培養培地に一般的に含まれている成分を含む培地である。ある特定の実施形態では、前記第３培地は、ＧＢＧＭ（登録商標）でない。
【０１１３】
一般的に、個別に列挙する培地成分は、前記培地の組成不明の成分中の可能な成分を指すものでない。例えば、前記Ｔｐｏ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、第１培地、第２培地または第３培地の組成不明の成分中に含まれない、例えば、前記Ｔｐｏ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、血清中に含まれない。さらに、前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦは、第１培地、第２培地または第３培地の組成不明の成分中に含まれない、例えば、前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦは、血清中に含まれない。
【０１１４】
ある特定の態様では、前記第１培地、第２培地または第３培地は、ヒト血清ＡＢを含む。ある特定の態様では、前記第１培地、第２培地または第３培地のいずれも、１％〜２０％のヒト血清ＡＢ、５％〜１５％のヒト血清ＡＢまたは約２、５もしくは１０％のヒト血清ＡＢを含む。
【０１１５】
本明細書で述べた３段階法における、ある特定の実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を前記第１培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日間培養する。本明細書で述べた３段階法における、ある特定の実施形態では、細胞を前記第２培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日間培養する。本明細書で述べた３段階法における、ある特定の実施形態では、細胞を前記第３培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０日間または３０日を超える期間にわたり培養する。
【０１１６】
本明細書で述べた３段階法における、具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を、前記第２培地中で前記培養するステップの前に、前記第１培地中で７〜１３日間培養して、第１細胞集団を製造し；前記第１細胞集団を、前記第３培地中で前記培養するステップの前に前記第２培地中で２〜６日間培養して、第２細胞集団を製造し；前記第２細胞集団を前記第３培地中で１０〜３０日間培養する、すなわち、細胞を合計１９〜４９日間培養する。
【０１１７】
本明細書で述べた３段階法における、具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を、前記第２培地中で前記培養するステップの前に、前記第１培地中で８〜１２日間培養して、第１細胞集団を製造し；前記第１細胞集団を、前記第３培地中で前記培養するステップの前に前記第２培地中で３〜５日間培養して、第２細胞集団を製造し；前記第２細胞集団を前記第３培地中で１５〜２５日間培養する、すなわち、細胞を合計２６〜４２日間培養する。
【０１１８】
本明細書で述べた３段階法における、具体的な実施形態では、前記造血幹細胞または前駆細胞を、前記第２培地中で前記培養するステップの前に、前記第１培地中で約１０日間培養して、第１細胞集団を製造し；前記第１細胞集団を、前記第３培地中で前記培養するステップの前に前記第２培地中で約４日間培養して、第２細胞集団を製造し；前記第２細胞集団を前記第３培地中で約２１日間培養する、すなわち、細胞を合計約３５日間培養する。
【０１１９】
ある特定の態様では、本明細書で開示する３段階法は、前記第１培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも１０，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも５０，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記３段階法は、前記第１培地中に最初に接種された造血幹細胞の数と比較して少なくとも７５，０００倍多いナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率を７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色により決定する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率をアネキシンＶ染色により決定する。具体的な態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率を７ＡＡＤ染色およびアネキシンＶ染色の両方により決定する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞の生存率をトリパンブルー染色により決定する。
【０１２０】
ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも７０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する。
【０１２１】
ある特定の態様では、３段階法は、ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも２０％の細胞傷害性を示す前記ナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも３５％の細胞傷害性を示す前記ナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも４５％の細胞傷害性を示す前記ナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも６０％の細胞傷害性を示す前記ナチュラルキラー細胞を製造する。ある特定の態様では、３段階法は、ナチュラルキラー細胞およびＫ５６２細胞を１０：１の比でｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した場合、前記Ｋ５６２細胞に対して少なくとも７５％の細胞傷害性を示す前記ナチュラルキラー細胞を製造する。
【０１２２】
ある特定の態様では、前記第３培養するステップの後、前記第３細胞集団、例えば、ナチュラルキラー前記細胞集団を凍結保存する。
【０１２３】
ある特定の態様では、ナチュラルキラー細胞、すなわち、本明細書で述べた３段階法により製造されたナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が本明細書で提供される。したがって、本明細書で述べた３段階法により製造された単離ナチュラルキラー細胞集団が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも２０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも４０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも６０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくも６０％のＣＤ１６−細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくも８０％のＣＤ１６−細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくも２０％のＣＤ９４＋細胞を含む。具体的な実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくも４０％のＣＤ９４＋細胞を含む。
【０１２４】
４．３．  幹細胞動員因子
４．３．１．化学定義
本明細書に記載の幹細胞動員因子についての開示の理解を補助するために、多数の用語が下段にて定義される。
【０１２５】
一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに本明細書に記載の生物学、細胞生物学、生化学、有機化学、医化学および薬理学に関する実験手順は、当技術分野において周知の、一般に用いられているものである。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を一般に有する。
【０１２６】
用語「約」または「おおよそ」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差を意味し、前記誤差は、前記値が測定または決定される方法に一部依存する。ある特定の実施形態では、用語「約」または「おおよそ」は、１、２、３または４標準偏差内を意味する。ある特定の実施形態では、用語「約」または「おおよそ」は、所定の値または範囲の５０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．０５％以内を意味する。
【０１２７】
用語「アリール炭化水素受容体」または「ＡＨＲ」は、ヒトにおけるＡＨＲ遺伝子によりコードされているタンパク質、またはその変異体（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ３５８６９．２およびＡＡＨ７００８０．１を参照されたい）を意味する。
【０１２８】
用語「アリール炭化水素受容体アンタゴニスト」、「ＡＨＲアンタゴニスト」、「アリール炭化水素受容体阻害剤」、または「ＡＨＲ阻害剤」は、アリール炭化水素受容体の活性をダウンレギュレートするまたは低下させる化合物を意味する。
【０１２９】
用語「アルキル」は、直鎖状のまたは分岐した飽和一価炭化水素ラジカルを意味し、ここでのアルキルは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。用語「アルキル」はまた、別段の規定がない限り、直鎖状アルキルと分岐アルキルの両方を包含する。ある特定の実施形態では、アルキルは、炭素原子１〜２０個（Ｃ１〜２０）、１〜１５個（Ｃ１〜１５）、１〜１０個（Ｃ１〜１０）、もしくは１〜６個（Ｃ１〜６）を有する直鎖状の飽和一価炭化水素ラジカルであるか、または炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、もしくは３〜６個（Ｃ３〜６）の分岐した飽和一価炭化水素ラジカルである。本明細書で使用される直鎖状Ｃ１〜６および分岐Ｃ３−６アルキル基は、「低級アルキル」とも呼ばれる。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル（すべての異性体型を含む）、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル（すべての異性体型を含む）、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル（すべての異性体型を含む）、およびヘキシル（すべての異性体型を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃ１〜６アルキルは、炭素原子１〜６個の直鎖状の飽和一価炭化水素ラジカル、または炭素原子３〜６個の分岐した飽和一価炭化水素ラジカルを意味する。
【０１３０】
用語「アルキレン」は、直鎖状のまたは分岐した飽和二価炭化水素ラジカルを意味し、ここでのアルキレンは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。例えば、Ｃ１〜６アルキレンは、炭素原子１〜６個の直鎖状の飽和二価炭化水素ラジカル、または炭素原子３〜６個の分岐した飽和二価炭化水素ラジカルを意味する。ある特定の実施形態では、アルキレンは、炭素原子１〜２０個（Ｃ１〜２０）、１〜１５個（Ｃ１〜１５）、１〜１０個（Ｃ１〜１０）、もしくは１〜６個（Ｃ１〜６）を有する直鎖状の飽和二価炭化水素ラジカルであるか、または炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、もしくは３〜６個（Ｃ３〜６）の分岐した飽和二価炭化水素ラジカルである。本明細書で使用される直鎖状Ｃ１〜６および分岐Ｃ３〜６アルキレン基は、「低級アルキレン」とも呼ばれる。アルキレン基の例としては、メチレン、エチレン、プロピレン（すべての異性体型を含む）、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ブチレン（すべての異性体型を含む）、ｎ−ブチレン、イソブチレン、ｔ−ブチレン、ペンチレン（すべての異性体型を含む）、およびヘキシレン（すべての異性体型を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
用語「アルケニル」は、１つまたは複数、一実施形態では１、２、３、４または５つ、別の実施形態では１つの炭素−炭素二重結合を含有する、直鎖状のまたは分岐した一価炭化水素ラジカルを意味する。アルケニルは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。用語「アルケニル」は、当業者により認識されているように、「シス」および「トランス」立体配置、または代替的に、「Ｚ」および「Ｅ」立体配置を有すラジカルも包含する。本明細書で使用される用語「アルケニル」はまた、別段の規定がない限り、直鎖状アルケニルと分岐アルケニルの両方を包含する。例えば、Ｃ２〜６アルケニルは、炭素原子２〜６個の直鎖状の不飽和一価炭化水素ラジカル、または炭素原子３〜６個の分岐した不飽和一価炭化水素ラジカルを意味する。ある特定の実施形態では、アルケニルは、炭素原子２〜２０個（Ｃ２〜２０）、２〜１５個（Ｃ２〜１５）、２〜１０個（Ｃ２〜１０）、もしくは２〜６個（Ｃ２〜６）の直鎖状の一価炭化水素ラジカルであるか、または炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、もしくは３〜６個（Ｃ３〜６）の分岐した一価炭化水素ラジカルである。アルケニル基の例としては、エテニル、プロペン−１−イル、プロペン−２−イル、アリル、ブテニル、および４−メチルブテニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
用語「アルケニレン」は、１つまたは複数、一実施形態では１〜５つ、別の実施形態では１つの炭素−炭素二重結合を含有する、直鎖状のまたは分岐した二価炭化水素ラジカルを意味する。アルケニレンは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。用語「アルケニレン」は、当業者により認識されているように、「シス」もしくは「トランス」立体配置もしくはこれらの混合配置、または代替的に、「Ｚ」もしくは「Ｅ」立体配置もしくはこれらの混合配置を有すラジカルを包含する。例えば、Ｃ２〜６アルケニレンは、炭素原子２〜６個の直鎖状の不飽和二価炭化水素ラジカル、または炭素原子３〜６個の分岐した不飽和二価炭化水素ラジカルを意味する。ある特定の実施形態では、アルケニレンは、炭素原子２〜２０個（Ｃ２〜２０）、２〜１５個（Ｃ２〜１５）、２〜１０個（Ｃ２〜１０）、もしくは２〜６個（Ｃ２〜６）の直鎖状の二価炭化水素ラジカルであるか、または炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、もしくは３〜６個（Ｃ３〜６）の分岐した二価炭化水素ラジカルである。アルケニレン基の例としては、エテニレン、アリレン、プロペニレン、ブテニレン、および４−メチルブテニレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
用語「アルキニル」は、１つまたは複数、一実施形態では１、２、３、４または５つ、別の実施形態では１つの炭素−炭素三重結合を含有する、直鎖状のまたは分岐した一価炭化水素ラジカルを意味する。アルキニルは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。用語「アルキニル」はまた、別段の規定がない限り、直鎖状アルキニルと分岐アルキニルの両方を包含する。ある特定の実施形態では、アルキニルは、炭素原子２〜２０個（Ｃ２〜２０）、２〜１５個（Ｃ２〜１５）、２〜１０個（Ｃ２〜１０）、もしくは２〜６個（Ｃ２〜６）の直鎖状の一価炭化水素ラジカルであるか、または炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、もしくは３〜６個（Ｃ３〜６）の分岐した一価炭化水素ラジカルである。アルキニル基の例としては、エチニル（−Ｃ≡ＣＨ）およびプロパルギル（−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃ２〜６アルキニルは、炭素原子２〜６個の直鎖状の不飽和一価炭化水素ラジカル、または炭素原子３〜６個の分岐した不飽和一価炭化水素ラジカルを意味する。
【０１３４】
用語「アルキニレン」は、１つまたは複数、一実施形態では１〜５つ、別の実施形態では１つの炭素−炭素三重結合を含有する、直鎖状のまたは分岐した二価炭化水素ラジカルを意味する。アルキニレンは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。例えば、Ｃ２〜６アルキニレンは、炭素原子２〜６個の直鎖状の不飽和二価炭化水素ラジカル、または炭素原子３〜６個の分岐した不飽和二価炭化水素ラジカルを意味する。ある特定の実施形態では、アルキニレンは、炭素原子２〜２０個（Ｃ２〜２０）、２〜１５個（Ｃ２〜１５）、２〜１０個（Ｃ２〜１０）、もしくは２〜６個（Ｃ２〜６）の直鎖状の二価炭化水素ラジカルであるか、または炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、もしくは３〜６個（Ｃ３〜６）の分岐した二価炭化水素ラジカルである。アルキニレン基の例としては、エチニレン、プロピニレン（すべての異性体型、例えば、１−プロピニレンおよびプロパルギレンを含む）、ブチニレン（すべての異性体型、例えば、１−ブチン−１−イレンおよび２−ブチン−１−イレンを含む）、ペンチニレン（すべての異性体型、例えば、１−ペンチン−１−イレンおよび１−メチル−２−ブチン−１−イレンを含む）、およびヘキシニレン（すべての異性体型、例えば、１−ヘキシン−１−イレンを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
用語「シクロアルキル」は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている、環式飽和または非芳香族不飽和、架橋または非架橋一価炭化水素ラジカルを意味する。ある特定の実施形態では、シクロアルキルは、環式不飽和架橋または非架橋一価炭化水素ラジカルである。ある特定の実施形態では、シクロアルキルは、炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、または３〜７個（Ｃ３〜７）を有する。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ビシクロ［２．１．１］ヘキシル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、デカリニル、およびアダマンチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
用語「シクロアルキレン」は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている、環式二価炭化水素ラジカルを意味する。一実施形態では、シクロアルキル基は、飽和している、もしくは不飽和だが非芳香族の、および／または架橋している、および／もしくは非架橋の、および／または縮合している二環式の基である。ある特定の実施形態では、シクロアルキレンは、炭素原子３〜２０個（Ｃ３〜２０）、３〜１５個（Ｃ３〜１５）、３〜１０個（Ｃ３〜１０）、または３〜７個（Ｃ３〜７）を有する。シクロアルキレン基の例としては、シクロプロピレン（例えば、１，１−シクロプロピレンおよび１，２−シクロプロピレン）、シクロブチレン（例えば、１，１−シクロブチレン、１，２−シクロブチレン、または１，３−シクロブチレン）、シクロペンチレン（例えば、１，１−シクロペンチレン、１，２−シクロペンチレン、または１，３−シクロペンチレン）、シクロヘキシレン（例えば、１，１−シクロヘキシレン、１，２−シクロヘキシレン、１，３−シクロヘキシレン、または１，４−シクロヘキシレン）、シクロヘプチレン（例えば、１，１−シクロヘプチレン、１，２−シクロヘプチレン、１，３−シクロヘプチレン、または１，４−シクロヘプチレン）、デカリニレン、およびアダマンチレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
用語「アリール」は、少なくとも１つの芳香族炭化水素環を含有する、単環式芳香族炭素環基および／または多環式一価芳香族炭素環基を意味する。ある特定の実施形態では、アリールは、環原子６〜２０個（Ｃ６〜２０）、６〜１５個（Ｃ６〜１５）、または６〜１０個（Ｃ６〜１０）を有する。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アズレニル、アントリル、フェナントリル、ピレニル、ビフェニル、およびテルフェニルが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、用語「アリール」は、環の１つが芳香族であり、その他が、飽和されていてもよく、部分不飽和であってもよく、または芳香族であってよい、二環式または三環式炭素環、例えば、ジヒドロナフチル、インデニル、インダニル、またはテトラヒドロナフチル（テトラリニル）を意味する。アリールは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
【０１３８】
用語「アリーレン」は、少なくとも１つの芳香族炭素環を含有する、二価単環式芳香族基および／または二価多環式芳香族基を意味する。ある特定の実施形態では、アリーレンは、環原子６〜２０個（Ｃ６〜２０）、６〜１５個（Ｃ６〜１５）、または６〜１０個（Ｃ６〜１０）を有する。アリーレン基の例としては、フェニレン、ナフチレン、フルオレニレン、アズレニレン、アントリレン、フェナントリレン、ピレニレン、ビフェニレン、およびテルフェニレンが挙げられるが、これらに限定されない。アリーレンはまた、環の１つが芳香族であり、その他が、飽和されていてもよく、部分不飽和であってもよく、または芳香族であってよい、二環式または三環式炭素環、例えば、ジヒドロナフチレン、インデニレン、インダニレン、またはテトラヒドロナフチレン（テトラリニレン）を意味する。アリーレンは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
【０１３９】
用語「アラルキル」または「アリールアルキル」は、１つまたは複数のアリール基で置換されている一価アルキル基を意味する。ある特定の実施形態では、アラルキルは、炭素原子７〜３０個（Ｃ７〜３０）、７〜２０個（Ｃ７〜２０）、または７〜１６個（Ｃ７〜１６）を有する。アラルキル基の例としては、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、および３−フェニルプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。アラルキルは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
【０１４０】
用語「ヘテロアリール」は、各々がＯ、Ｓ、ＮおよびＰから独立に選択される１個または複数のヘテロ原子を環内に含有する少なくとも１つの芳香族環を含有する一価単環式芳香族基または一価多環式芳香族基を意味する。明確にするために、本明細書で使用される用語「アリール」および「ヘテロアリール」は相互排他的である、すなわち、「アリール」基は「ヘテロアリール」基を含まず、逆もまた同様である。ヘテロアリール基は、その芳香族環によって分子の残部に結合している。ヘテロアリール基の各環は、１もしくは２個のＯ原子、１もしくは２個のＳ原子、１〜４個のＮ原子、および／または１もしくは２個のＰ原子を含有することができるが、ただし、各環内のヘテロ原子の総数が４以下であること、および各環が少なくとも１個の炭素原子を含有することを条件とする。ある特定の実施形態では、ヘテロアリールは、５〜２０個、５〜１５個、または５〜１０個の環原子を有する。単環式ヘテロアリール基の例としては、フラニル、イミダゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、テトラゾリル、トリアジニル、およびトリアゾリルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリール基の例としては、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾピラニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサゾリル、フロピリジル、イミダゾピリジニル、イミダゾチアゾリル、インドリジニル、インドリル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソベンゾチエニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、ナフチリジニル、オキサゾロピリジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピリドピリジル、ピロロピリジル、キノリニル、キノキサリニル、キナゾリニル、チアジアゾロピリミジル、およびチエノピリジルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリール基の例としては、アクリジニル、ベンゾインドリル、カルバゾリル、ジベンゾフラニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、フェナントリジニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、およびキサンテニルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリールは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
【０１４１】
用語「ヘテロアリーレン」は、Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択される１個または複数のヘテロ原子を環内に含有する少なくとも１つの芳香族環を含有する二価単環式芳香族基または二価多環式芳香族基を意味する。明確にするために、本明細書で使用される用語「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」は相互排他的である、すなわち、「アリーレン」基は「ヘテロアリーレン」基を含まず、逆もまた同様である。ヘテロアリーレン基は、その芳香族環によって分子の残部に結合している。ヘテロアリーレン基の各環は、１もしくは２個のＯ原子、１もしくは２個のＳ原子、および／または１〜４個のＮ原子を含有することができるが、ただし、各環内のヘテロ原子の総数が４以下であること、および各環が少なくとも１個の炭素原子を含有することを条件とする。ある特定の実施形態では、ヘテロアリーレンは、５〜２０個、５〜１５個、または５〜１０個の環原子を有する。単環式ヘテロアリーレン基の例としては、フラニレン、イミダゾリレン、イソチアゾリレン、イソオキサゾリレン、オキサジアゾリレン、オキサジアゾリレン、オキサゾリレン、ピラジニレン、ピラゾリレン、ピリダジニレン、ピリジレン、ピリミジニレン、ピロリレン、チアジアゾリレン、チアゾリレン、チエニレン、テトラゾリレン、トリアジニレン、およびトリアゾリレンが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリーレン基の例としては、ベンゾフラニレン、ベンゾイミダゾリレン、ベンゾイソオキサゾリレン、ベンゾピラニレン、ベンゾチアジアゾリレン、ベンゾチアゾリレン、ベンゾチエニレン、ベンゾトリアゾリレン、ベンゾオキサゾリレン、フロピリジレン、イミダゾピリジニレン、イミダゾチアゾリレン、インドリジニレン、インドリレン、インダゾリレン、イソベンゾフラニレン、イソベンゾチエニレン、イソインドリレン、イソキノリニレン、イソチアゾリレン、ナフチリジニレン、オキサゾロピリジニレン、フタラジニレン、プテリヂニレン、プリニレン、ピリドピリジレン、ピロロピリジレン、キノリニレン、キノキサリニレン、キナゾリニレン、チアジアゾロピリミジレン、およびチエノピリジレンが挙げられるが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリーレン基の例としては、アクリジニレン、ベンゾインドリレン、カルバゾリレン、ジベンゾフラニレン、ペリミジニレン、フェナントロリニレン、フェナントリジニレン、フェナルサジニレン、フェナジニレン、フェノチアジニレン、フェノキサジニレン、およびキサンテニレンが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリーレンは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
【０１４２】
用語「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、非芳香族環原子の１個または複数がヘテロ原子であり、これらのヘテロ原子の各々が、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＰから独立に選択され、残りの環原子が炭素原子である少なくとも１つの非芳香族環を含有する一価単環式非芳香族環系または一価多環式環系を意味する。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリルまたは複素環式基は、３〜２０個、３〜１５個、３〜１０個、３〜８個、４〜７個、または５〜６個の環原子を有する。ヘテロシクリル基は、その非芳香族環によって分子の残部に結合している。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリルは、スピロであってもよく、縮合していてもよく、または架橋していてもよい、単環式、二環式、三環式、または四環式環系であり、ここで、窒素または硫黄原子が任意選択で酸化されていてもよく、窒素原子が任意選択で四級化されていてもよく、一部の環が部分的にもしくは完全に飽和していてもよく、または芳香族であってもよい。ヘテロシクリルは、安定した化合物を生じさせる結果となるいずれのヘテロ原子または炭素原子で主構造に結合していてもよい。複素環式基の例としては、アゼピニル、ベンゾジオキサニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラノニル、ベンゾピラノニル、ベンゾピラニル、ベンゾテトラヒドロフラニル、ベンゾテトラヒドロチエニル、ベンゾチオピラニル、ベンゾオキサジニル、β−カルボリニル、クロマニル、クロモニル、シンノリニル、クマリニル、デカヒドロイソキノリニル、ジヒドロベンゾイソチアジニル、ジヒドロベンゾイソオキサジニル、ジヒドロフリル、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロピラニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジオキソラニル、１，４−ジチアニル、フラノニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソベンゾテトラヒドロフラニル、イソベンゾテトラヒドロチエニル、イソクロマニル、イソクマリニル、イソインドリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、オキサゾリジノニル、オキサゾリジニル、オキシラニル、ピペラジニル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロロリジニル、ピロロリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチエニル、チアモルホリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロキノリニル、および１，３，５−トリチアニルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクリルは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
【０１４３】
用語「ヘテロシクリレン」は、非芳香族環原子の１個または複数が、Ｏ、ＳおよびＮから独立に選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子が炭素原子である少なくとも１つの非芳香族環を含有する二価単環式非芳香族環系または二価多環式環系を意味する。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリレン基は、３〜２０個、３〜１５個、３〜１０個、３〜８個、４〜７個、または５〜６個の環原子を有する。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリレンは、縮合または架橋していてもよい、単環式、二環式、三環式、または四環式環系であり、ここで、窒素または硫黄原子が任意選択で酸化されていてもよく、窒素原子が任意選択で四級化されていてもよく、一部の環が部分的にもしくは完全に飽和されていてもよく、または芳香族であってもよい。ヘテロシクリレンは、安定した化合物を生じさせる結果となるいずれのヘテロ原子または炭素原子で主構造に結合していてもよい。そのようなヘテロシクリレン基の例としては、アゼピニレン、ベンゾジオキサニレン、ベンゾジオキソリレン、ベンゾフラノニレン、ベンゾピラノニレン、ベンゾピラニレン、ベンゾテトラヒドロフラニレン、ベンゾテトラヒドロチエニレン、ベンゾチオピラニレン、ベンゾキサジニレン、β−カルボニレン、クロマニレン、クロモニレン、シンノリニレン、クマリニレン、デカヒドロイソキノリニレン、ジヒドロベンゾイソチアジニレン、ジヒドロベンゾイソオキサジニレン、ジヒドロフリレン、ジヒドロイソインドリレン、ジヒドロピラニレン、ジヒドロピラゾリレン、ジヒドロピラジニレン、ジヒドロピリジニレン、ジヒドロピリミジニレン、ジヒドロピロリレン、ジオキソラニリレン、１，４−ジチアニレン、フラノニレン、イミダゾリジニレン、イミダゾリニレン、インドリニレン、イソベンゾテトラヒドロフラニレン、イソベンゾテトラヒドロチエニレン、イソクロマニレン、イソクマリニレン、イソインドリニレン、イソチアゾリジニレン、イソオキサゾリジニレン、モルホリニレン、オクタヒドロインドリレン、オクタヒドロイソインドリレン、オキサゾリジノニレン、オキサゾリジニレン、オキシラニレン、ピペラジニレン、ピペリジニレン、４−ピペリドニレン、ピラゾリジニレン、ピラゾリニレン、ピロリジニレン、ピロリニレン、キヌクリジニレン、テトラヒドロフリレン、テトラヒドロイソキノリニレン、テトラヒドロピラニレン、テトラヒドロチエニレン、チアモルホリニレン、チアゾリジニレン、テトラヒドロキノリニレン、および１，３，５−トリチアニレンが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクリレンは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
【０１４４】
用語「ハロゲン」、「ハロゲン化物」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素および／またはヨウ素を意味する。
【０１４５】
用語「ハロアルキル」は、１つまたは複数、一実施形態では１、２または３つのハロ基で置換されているアルキル基を意味し、この場合のアルキルは、本明細書で定義される通りである。ハロアルキルは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
【０１４６】
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキルを意味し、この場合のアルキルは、本明細書で定義される通りである。
【０１４７】
用語「ハロアルコキシ」は、−Ｏ−ハロアルキルを意味し、この場合のハロアルキルは、本明細書で定義される通りである。
【０１４８】
用語「任意選択で置換されている」は、基または置換基、例えば、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキル、シクロアルキレン、アリール、アリーレン、アラルキル（例えば、ベンジル）、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、ヘテロシクリル、およびヘテロシクリレン基が、１つまたは複数の置換基Ｑで置換されていてもよいことを意味することを意図したものであり、前記１つまたは複数の置換基Ｑの各々は、例えば、（ａ）オキソ（＝Ｏ）、シアノ（−ＣＮ）、ハロ、およびニトロ（−ＮＯ２）、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル［これらの各々は、１つまたは複数の、一実施形態では１、２、３、４もしくは５つの置換基Ｑａで、さらに任意選択で置換されている］、ならびに（ｃ）−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−Ｃ（ＮＲａ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＣ（＝ＮＲａ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ、−ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｄ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲｄ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＣ（＝ＮＲｄ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＳ（Ｏ）Ｒｄ、−ＮＲａＳ（Ｏ）２Ｒｄ、−ＮＲａＳ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＳ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ、−Ｐ（Ｏ）ＲａＲｄ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）Ｒｄ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＲｄ）、−ＳＲａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ［これらの式中の各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄは、独立に、（ｉ）水素であるか、（ｉｉ）Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリル（これらの各々は、１つまたは複数、一実施形態では１、２、３もしくは４つの置換基Ｑａで任意選択で置換されている）であり、または（ｉｉｉ）ＲｂおよびＲｃは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリルを形成し、前記ヘテロアリールもしくはヘテロシクリルの各々は、１つまたは複数の、一実施形態では１、２、３もしくは４つの置換基Ｑａで、任意選択で置換されている］から独立に選択される。本明細書で使用される、置換されていてもよい本明細書に記載のすべての基は、別段の規定がない限り、「任意選択で置換されている」。
【０１４９】
一実施形態では、各置換基Ｑａは、（ａ）オキソ、シアノ、ハロ、およびニトロ；ならびに（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル；ならびに（ｃ）−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｅ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−Ｃ（ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＣ（＝ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）Ｒｈ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＯＲｈ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（＝ＮＲｈ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）Ｒｈ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２Ｒｈ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−Ｐ（Ｏ）ＲｅＲｈ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｅ）Ｒｈ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｅ）（ＯＲｈ）、−ＳＲｅ、−Ｓ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ［これらの式中の各Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、およびＲｈは、独立に、（ｉ）水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリルであるか、または（ｉｉ）ＲｆおよびＲｇは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリルを形成する］からなる群から独立に選択される。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、「光学活性の」および「鏡像異性的に活性の」は、約５０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上、約９９．５％以上、または約９９．８％以上の鏡像体過剰率を有する分子の一群を意味する。ある特定の実施形態では、化合物は、問題の２つの鏡像異性体の総重量に基づいて約９５％以上の望ましい鏡像異性体と約５％以下の然程好ましくない鏡像異性体とを含む。
【０１５１】
光学活性化合物を記載する際、光学活性化合物のそのキラル中心の周りの絶対配置を示すために、接頭語ＲおよびＳが使用される。（＋）および（−）は、光学活性化合物の旋光性、すなわち、偏光面が光学活性化合物により回転される方向を示すために使用される。（−）という接頭語は、光学活性化合物が左旋性であること、すなわち、前記化合物が偏光面を左にまたは反時計回りに回転させることを示す。（＋）という接頭語は、光学活性化合物が右旋性であること、すなわち、前記化合物が偏光面を右にまたは時計回りに回転させることを示す。しかし、旋光性の符号、（＋）および（−）は、化合物の絶対配置、ＲおよびＳとは無関係である。
【０１５２】
用語「同位体異型」は、化合物を構成する原子のうちの１個または複数に関して非天然の同位体比率を有する当該化合物を意味する。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体異型」は、水素（１Ｈ）、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、炭素１１（１１Ｃ）、炭素１２（１２Ｃ）、炭素１３（１３Ｃ）、炭素１４（１４Ｃ）、窒素１３（１３Ｎ）、窒素１４（１４Ｎ）、窒素１５（１５Ｎ）、酸素１４（１４Ｏ）、酸素１５（１５Ｏ）、酸素１６（１６Ｏ）、酸素１７（１７Ｏ）、酸素１８（１８Ｏ）、フッ素１７（１７Ｆ）、フッ素１８（１８Ｆ）、リン３１（３１Ｐ）、リン３２（３２Ｐ）、リン３３（３３Ｐ）、硫黄３２（３２Ｓ）、硫黄３３（３３Ｓ）、硫黄３４（３４Ｓ）、硫黄３５（３５Ｓ）、硫黄３６（３６Ｓ）、塩素３５（３５Ｃｌ）、塩素３６（３６Ｃｌ）、塩素３７（３７Ｃｌ）、臭素７９（７９Ｂｒ）、臭素８１（８１Ｂｒ）、ヨウ素１２３（１２３Ｉ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、ヨウ素１２７（１２７Ｉ）、ヨウ素１２９（１２９Ｉ）およびヨウ素１３１（１３１Ｉ）を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の同位体の非天然比率を有する。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体異型」は、安定した形態、すなわち、非放射性である。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体異型」は、水素（１Ｈ）、重水素（２Ｈ）、炭素１２（１２Ｃ）、炭素１３（１３Ｃ）、窒素１４（１４Ｎ）、窒素１５（１５Ｎ）、酸素１６（１６Ｏ）、酸素１７（１７Ｏ）、酸素１８（１８Ｏ）、フッ素１７（１７Ｆ）、リン３１（３１Ｐ）、硫黄３２（３２Ｓ）、硫黄３３（３３Ｓ）、硫黄３４（３４Ｓ）、硫黄３６（３６Ｓ）、塩素３５（３５Ｃｌ）、塩素３７（３７Ｃｌ）、臭素７９（７９Ｂｒ）、臭素８１（８１Ｂｒ）およびヨウ素１２７（１２７Ｉ）を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の同位体の非天然比率を有する。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体異型」は、不安定な形態、すなわち、放射性である。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体異型」は、三重水素（３Ｈ）、炭素１１（１１Ｃ）、炭素１４（１４Ｃ）、窒素１３（１３Ｎ）、酸素１４（１４Ｏ）、酸素１５（１５Ｏ）、フッ素１８（１８Ｆ）、リン３２（３２Ｐ）、リン３３（３３Ｐ）、硫黄３５（３５Ｓ）、塩素３６（３６Ｃｌ）、ヨウ素１２３（１２３Ｉ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、ヨウ素１２９（１２９Ｉ）およびヨウ素１３１（１３１Ｉ）を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の同位体の非天然比率を有する。当業者の判断に従って実行可能な場合、本明細書で提供されるような化合物中の、いずれの水素が例えば２Ｈであってもよく、またはいずれの炭素が例えば１３Ｃであってもよく、またはいずれの窒素が例えば１５Ｎであってもよく、またはいずれの酸素が例えば１８Ｏであってもよいことは、理解されるであろう。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体異型」は、重水素（Ｄ）の非天然比率を有する。
【０１５３】
用語「溶媒和物」は、溶質、例えば本明細書で提供される化合物、の１つまたは複数の分子と溶媒の１つまたは複数の分子とで形成された、化学量論量もしくは非化学量論量で存在する、複合体または凝集体を意味する。好適な溶媒としては、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールおよび酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、溶媒は、薬学的に許容されるものである。一実施形態では、複合体または凝集体は、結晶形態である。別の実施形態では、複合体または凝集体は、非結晶形態である。溶媒が水である場合、溶媒和物は、水和物である。水和物の例としては、半水和物、一水和物、二水和物、三水和物、四水和物、および五水和物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
句「その鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ」は、句「（ｉ）その中で言及されている化合物の鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしく同位体異型、（ｉｉ）その中で言及されている化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ、または（ｉｉｉ）その中で言及されている化合物の鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型の、薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ」と同じ意味を有する。
【０１５５】
４．３．２．幹細胞動員化合物
一実施形態では、幹細胞動員化合物は、アリール炭化水素受容体阻害剤、例えば、アリール炭化水素受容体アンタゴニストである。
【０１５６】
別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、（特許文献１）、（特許文献２）および（特許文献３）に記載されているものを含むがこれらに限定されない、５，６−縮合ヘテロアリール化合物であり、前記特許文献の各々についての開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【０１５７】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式Ｉの化合物：
【０１５８】
【化５】
2019519486.tif 000006
(I)
（式中、
Ｇ１は、ＮおよびＣＲ３であり、
Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、各々独立に、ＣＨおよびＮであり、ただし、Ｇ３およびＧ４の少なくとも一方がＮであり、Ｇ１およびＧ２の少なくとも一方がＮでないことを条件とし、
Ｌ１は、−ＮＲ１ａ−、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）１〜３−、−ＮＲ１ａＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３）ＣＨ２−、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）２ＮＲ１ｃ−、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）２Ｓ−、−ＮＲ１ａＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、−ＮＲ１ａＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−、または−ＮＲ１ａＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−であり、
Ｒ１は、（ｉ）水素であるか、または（ｉｉ）フェニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チエニル、チアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ベンゾイミダゾリル、イソキノリニル、イミダゾピリジニルもしくはベンゾチエニル（これらの各々は、１、２もしくは３つの置換基により任意選択で置換されており、この場合の各置換基は、独立に、シアノ、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４ハロアルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１ａＲ１ｂ、−ＳＲ１ａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａ、もしくは−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａである）であり、
Ｒ２は、（ｉ）−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）Ｒ１ｃ、−ＮＲ１ｃＣ（Ｏ）ＮＲ１ａＲ１ｂ、もしくは−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１ａＲ１ｂであるか、または（ｉｉ）フェニル、ピロロピリジン−３−イル、インドリル、チエニル、ピリジニル、１，２，４−トリアゾリル、２−オキソイミダゾリジニル、ピラゾリル、２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾリル、もしくはインダゾリル（これらの各々は、１、２または３つの置換基で任意選択で置換されており、この場合の各置換基は、独立に、ヒドロキシル、ハロ、メチル、メトキシ、アミノ、−Ｏ（ＣＨ２）１〜３ＮＲ１ａＲ１ｂ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ１ａＲ１ｂ、−ＮＲ１ａＳ（Ｏ）２Ｒ１ｂ、もしくは−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１ａＲ１ｂである）であり、
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜４アルキル、またはビフェニルであり、ただし、Ｒ１およびＲ３の少なくとも一方が水素でないことを条件とし、
Ｒ４は、Ｃ１〜１０アルキル、プロパ−１−エン−２−イル、シクロヘキシル、シクロプロピル、２−（２−オキソピロリジン−１−イル）エチル、オキセタン−３−イル、ベンズヒドリル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル、フェニル、テトラヒドロフラン−３−イル、ベンジル、（４−ペンチルフェニル）（フェニル）メチル、または１−（１−（２−オキソ−６，９，１２−トリオキサ−３−アザテトラデカン−１４−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチルであり、これらの各々は、１、２もしくは３つの置換基で任意選択で置換されており、この場合の各置換基は、独立に、ヒドロキシル、Ｃ１〜４アルキル、またはＣ１〜４ハロアルキルであり、ならびに
各Ｒ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃは、独立に、水素もしくはＣ１〜４アルキルであるか、またはＲ１ａおよびＲ１ｂは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、ヘテロシクリルを形成する）
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
【０１５９】
一実施形態では、式Ｉ中、Ｇ１は、ＣＲ３、一実施形態ではＣＨであり、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４は、各々Ｎであり、ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＬ１は、各々、本明細書で定義される通りである。
【０１６０】
別の実施形態では、式Ｉ中、Ｇ１、Ｇ３およびＧ４は、各々Ｎであり、Ｇ２は、ＣＨであり、ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ４およびＬ１は、各々、本明細書で定義される通りである。
【０１６１】
さらに別の実施形態では、式Ｉ中、Ｇ１は、ＣＲ３、一実施形態ではＣＨであり、Ｇ２およびＧ３は、各々Ｎであり、Ｇ４は、ＣＨであり、ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＬ１は、各々、本明細書で定義される通りである。
【０１６２】
さらに別の実施形態では、式Ｉ中、Ｇ１は、ＣＲ３、一実施形態ではＣＨであり、Ｇ２およびＧ４は、各々Ｎであり、Ｇ３は、ＣＨであり、ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＬ１は、各々、本明細書で定義される通りである。
【０１６３】
さらに別の実施形態では、式Ｉ中、Ｇ１は、ＣＲ３、一実施形態ではＣＨであり、Ｇ２は、ＣＨであり、Ｇ３およびＧ４は、各々Ｎであり、ならびにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＬ１は、各々、本明細書で定義される通りである。
【０１６４】
さらに実施形態では、式Ｉ中、
Ｇ１は、ＣＨであり、
Ｇ２、Ｇ３およびＧ４は、各々Ｎであり、
Ｒ１は、１、２または３つの置換基により任意選択で置換されているベンゾチエニルであり、これらの置換基の各々は、独立に、シアノ、ハロ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４ハロアルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１ａＲ１ｂ、−ＳＲ１ａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、
Ｒ２は、１、２または３つの置換基で任意選択で置換されているフェニルであり、これらの置換基の各々は、独立に、ヒドロキシル、ハロ、メチル、メトキシ、アミノ、−Ｏ（ＣＨ２）１〜３ＮＲ１ａＲ１ｂ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ１ａＲ１ｂ、−ＮＲ１ａＳ（Ｏ）２Ｒ１ｂ、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１ａＲ１ｂであり、
Ｒ４は、１、２または３つの置換基で任意選択で置換されているＣ１〜１０アルキルであり、これらの置換基の各々は、独立に、ヒドロキシル、Ｃ１〜４アルキルまたはＣ１〜４ハロアルキルであり、
Ｌ１は、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）２−であり、ならびに
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。
【０１６５】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式ＩＩの化合物：
【０１６６】
【化６】
2019519486.tif 000007
(II)
（式中、Ｒ２およびＲ４は、各々、本明細書で定義される通りである）
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
【０１６７】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式ＩＩＩの化合物：
【０１６８】
【化７】
2019519486.tif 000008
(III)
（式中、Ｒ２およびＲ４は、各々、本明細書で定義される通りであり、ならびにＲ５ａ、Ｒ５ｂおよびＲ５ｃは、各々独立に、水素、シアノ、メチル、ハロ、トリフルオロメチル、または−ＳＯ２ＣＨ３である）
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
【０１６９】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、４−（２−（２−ベンゾ［ｂ］チエン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノールである。ある特定の実施形態では、幹細胞動員化合物は、下記の構造を有する、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ−１）である：
【０１７０】
【化８】
2019519486.tif 000009
【０１７１】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、１−メチル−Ｎ−（２−メチル−（４−（２−（２−メチルフェニル）ジアゼニル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミドである。ある特定の実施形態では、幹細胞動員化合物は、下記の構造を有する、ＣＨ２２３１９１である：
【０１７２】
【化９】
2019519486.tif 000010
【０１７３】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、ピリミド（４，５−ｂ）インドールである。
【０１７４】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式ＩＶの化合物：
【０１７５】
【化１０】
2019519486.tif 000011
(IV)
｛式中、
Ｚは、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ベンジル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｌ−ヘテロアリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１ａ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１ａ）（ＯＲ１ｃ）、−ＳＲ１ａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ１ａ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、
Ｗは、水素、ハロ、シアノ、Ｃ６〜１４アリール、ベンジル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｌ−ヘテロアリール、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｌ−ＯＨ、−Ｌ−ＯＲ１ａ、−Ｌ−ＮＨ２、−Ｌ−ＮＨＲ１ａ、−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｌ−ＳＲ１ａ、−Ｌ−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｌ−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−Ｌ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１ａ）（ＯＲ１ｃ）、−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、−Ｏ−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｏ−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｏ−Ｌ−ヘテロアリール、−Ｏ−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、−Ｓ−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｓ−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｓ−Ｌ−ヘテロアリール、−Ｓ−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリール、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリール、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１ａ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−ＮＨＲ１ａ、−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１ａ、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）Ｒ１ｃ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ１ａ、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）ＯＲ１ｃ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＲ１ｃＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａ、−ＮＲ１ｃＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−ＮＲ１ｃＳ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−ＯＲ１ａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１ａ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１ａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１ａ）（ＯＲ１ｃ）、−ＳＲ１ａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ１ａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、または−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ１ａであり、
各Ｌは、独立に、Ｃ１〜６アルキレン、Ｃ２〜６アルケニレン、Ｃ２〜６アルキニレン、Ｃ３〜７シクロアルキレン、Ｃ６〜１４アリーレン、ヘテロアリーレン、ヘテロシクリレン、Ｃ１〜６アルキレン−Ｃ３〜７シクロアルキレン、またはＣ１〜６アルキレン−ヘテロシクリレンであり、
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１４アリール、ベンジル、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａ、−ＳＲ１ａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａ、−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、−Ｌ−ヘテロアリール、または−Ｌ−ヘテロシクリルであり、
各ｎは、独立に、１、２、３、４または５の整数であり、ならびに
各Ｒ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃは、独立に、（ｉ）水素であるか、（ｉｉ）Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２−〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリルであり、または（ｉｉｉ）Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、ヘテロシクリルを形成し、
各アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキル、シクロアルキレン、アリール、ベンジル、アリーレン、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、ヘテロシクリル、およびヘテロシクリレンは、１つまたは複数、一実施形態では１、２、３または４つの置換基Ｑで任意選択で置換されており、各置換基Ｑは、（ａ）オキソ、シアノ、ハロ、およびニトロ、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜１５アラルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル［これらの各々は、１つ複数の、一実施形態では１、２、３または４つの置換基Ｑａで、さらに任意選択で置換されている］、ならびに（ｃ）−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−Ｃ（ＮＲａ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＣ（＝ＮＲａ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ、−ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＣ（Ｏ）Ｒｄ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＲｄ、−ＮＲａＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＣ（＝ＮＲｄ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＳ（Ｏ）Ｒｄ、−ＮＲａＳ（Ｏ）２Ｒｄ、−ＮＲａＳ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、−ＮＲａＳ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ、−ＳＲａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃ［これらの式中、各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄは、独立に（ｉ）水素であるか、（ｉｉ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ７−１５アラルキル、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリル（これらの各々は、１つまたは複数、一実施形態では１、２、３もしくは４つの置換基Ｑａでさらに任意選択で置換されている）であり、または（ｉｉｉ）ＲｂおよびＲｃは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、ヘテロシクリルを形成し、前記ヘテロシクリルは、１つまたは複数、一実施形態では１、２、３もしくは４つの置換基Ｑａでさらに任意選択で置換されている］から独立に選択され、
各Ｑａは、（ａ）オキソ、シアノ、ハロ、およびニトロ、ならびに（ｂ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ７−１５アラルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル、ならびに（ｃ）−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｅ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−Ｃ（ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＣ（＝ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）Ｒｈ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＯＲｈ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（＝ＮＲｈ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）Ｒｈ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２Ｒｈ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＳＲｅ、−Ｓ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ［これらの式中、各Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、およびＲｈは、独立して、（ｉ）水素であるか、（ｉｉ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、Ｃ７−１５アラルキル、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリルであり、または（ｉｉ）ＲｆおよびＲｇは、それらが結合しているＮ原子と一緒に、ヘテロシクリルを形成する］からなる群から独立して選択される｝
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
【０１７６】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式Ｖの化合物：
【０１７７】
【化１１】
2019519486.tif 000012
(V)
（式中、Ｒ６、Ｗ、およびＺは、各々、本明細書で定義される通りである）
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
【０１７８】
一実施形態では、式ＩＶまたはＶ中、
Ｚは、シアノ、ヘテロアリール、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａであり、
Ｗは、ヘテロシクリル、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｏ−Ｌ−ヘテロシクリル、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、−ＮＨＲ１ａ、または−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、
各Ｌは、独立に、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ３〜７シクロアルキレンであり、
Ｒ６は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ベンジル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａ、−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、または−Ｌ−ヘテロアリールであり、
各ｎは、独立に、１の整数であり、ならびに
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りであり、
各アルキル、アルキレン、シクロアルキレン、アリール、ベンジル、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、本明細書で定義される通りの１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
【０１７９】
別の実施形態では、式ＩＶまたはＶ中、
Ｚは、シアノ、５員ヘテロアリール、または−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−〜６アルキルであり、
Ｗは、ヘテロシクリル、−Ｌ−ヘテロシクリル、−Ｏ−Ｌ−ヘテロシクリル、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリル、−ＮＨＲ１ａ、または−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、
各Ｌは、独立に、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ３〜７シクロアルキレンであり、
Ｒ６は、水素、メチル、ベンジル、−Ｌ−Ｃ６〜１４アリール、または−Ｌ−ヘテロアリールであり、
各ｎは、独立に、１の整数であり、ならびに
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りであり、
各アルキレン、シクロアルキレン、アリール、ベンジル、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、本明細書で定義される通りの１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている。
【０１８０】
一実施形態では、式ＩＶまたはＶ中、Ｗは、−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｏ−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｓ−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂ、または−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、Ｒ６、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、ＬおよびＺは、各々、本明細書で定義される通りである。
【０１８１】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式ＶＩの化合物：
【０１８２】
【化１２】
2019519486.tif 000013
(VI)
（式中、Ｘは、結合、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１ｃであり、Ｒ１ａ、Ｒ１ｃ、Ｒ６、ＬおよびＺは、各々、本明細書で定義される通りである）
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
【０１８３】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、式ＶＩＩの化合物：
【０１８４】
【化１３】
2019519486.tif 000014
(VII)
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ６、Ｌ、ＸおよびＺは、各々、本明細書で定義される通りである）
またはその鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、２つ以上のジアステレオマーの混合物、もしくは同位体異型、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグである。
【０１８５】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、下記の構造を有する化合物である：
【０１８６】
【化１４】
2019519486.tif 000015
(UM729).
【０１８７】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、下記の構造を有する化合物である：
【０１８８】
【化１５】
2019519486.tif 000016
【０１８９】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、レスベラトロール、テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）、アルファナフトフラボン、３’−メトキシ−４’−ニトロフラボン、３，４−ジメトキシフラボン、４’，５，７−トリヒドロキシフラボン（アピゲニン）、６−メチル−１，３，８−トリクロロジベンゾフラン、エピガロカテキン、または没食子酸エピガロカテキンである。
【０１９０】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、レスベラトロールである。ある特定の実施形態では、幹細胞動員化合物は、（Ｚ）−レスベラトロールである。ある特定の実施形態では、幹細胞動員化合物は、（Ｅ）−レスベラトロールである。
【０１９１】
さらに別の実施形態では、幹細胞動員化合物は、テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）である。
【０１９２】
本明細書に記載の化合物のすべては、市販されているか、または本明細書で開示される特許または特許公報に記載されている方法に従って調製することができる。さらに、公知の分割剤もしくはキラルカラムおよび他の標準的な合成有機化学技術を使用して、光学的に純粋な化合物を不斉合成または分割することができる。幹細胞動員化合物、それらの調製法および使用に関する追加情報は、例えば、（特許文献１）、（特許文献２）および（特許文献３）、ならびに（非特許文献１）において見つけることができ、これらの参考文献の各々についての開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【０１９３】
本明細書で提供される式、例えば、式Ｉ〜ＶＩＩ中の基または可変要素、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ、Ｒ６、Ｘ、Ｌ、Ｌ１、Ｘ、Ｗ、Ｚおよびｎは、本明細書に記載の実施形態の中でさらに定義される。そのような基および／または可変要素について本明細書で提供される実施形態のすべての組合せは、本開示の範囲内である。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、Ｇ１は、Ｎである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ＣＲ３であり、この式中のＲ３は、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｇ１は、ＣＨである。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、Ｇ２は、Ｎである。ある特定の実施形態では、Ｇ２は、ＣＨである。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、Ｇ３は、Ｎである。ある特定の実施形態では、Ｇ３は、ＣＨである。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、Ｇ４は、Ｎである。ある特定の実施形態では、Ｇ４は、ＣＨである。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているフェニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているフラニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピロリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているイミダゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピラゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているチエニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているチアゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピリジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピリミジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピロリジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピラジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピリダジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているベンゾイミダゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているイソキノリニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているイミダゾピリジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているベンゾチエニルである。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）Ｒ１ｃであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、−ＮＲ１ｃＣ（Ｏ）ＮＲ１ａＲ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１ａＲ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているフェニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピロロピリジン−３−イルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているインドリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているチエニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピリジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されている１，２，４−トリアゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されている２−オキソイミダゾリジニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているピラゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されている２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているインダゾリルである。
【０２００】
ある特定の実施形態では、Ｒ３は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ１〜４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているビフェニルである。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているＣ１〜１０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているプロパ−１−エン−２−イルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているシクロヘキシルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているシクロプロピルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されている２−（２−オキソピロリジン−１−イル）エチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているオキセタン−３−イルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているベンズヒドリルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているフェニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているテトラヒドロフラン−３−イルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されているベンジルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されている（４−ペンチルフェニル）（フェニル）メチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載の通り任意選択で置換されている１−（１−（２−オキソ−６，９，１２−トリオキサ−３−アザテトラデカン−１４−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチルである。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａ−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）１〜３−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３）ＣＨ２−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）２ＮＲ１ｃ−であり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａ（ＣＨ２）２Ｓ−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は、−ＮＲ１ａＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、シアノである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、メチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、ハロである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、フルオロ、クロロ、またはブロモである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、トリフルオロメチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ａは、−ＳＯ２ＣＨ３である。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、シアノである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、メチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、ハロである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、フルオロ、クロロ、またはブロモである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、トリフルオロメチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｂは、−ＳＯ２ＣＨ３である。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、シアノである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、メチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、ハロである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、フルオロ、クロロ、またはブロモである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、トリフルオロメチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５ｃは、−ＳＯ２ＣＨ３である。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ１〜６アルキレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで各々任意選択で置換されている、エチレン、プロピレンまたはブチレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ２〜６アルケニレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ２〜６アルキニレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ３〜７シクロアルキレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているシクロヘキシレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ６〜１４アリーレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロアリーレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロシクリレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ１〜６アルキレン−Ｃ３〜７シクロアルキレンである。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ１〜６アルキレン−ヘテロシクリレンである。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、Ｒ６は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているメチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ６〜１４アリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているベンジルである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−ＳＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−Ｌ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−Ｌ−ヘテロアリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、−Ｌ−ヘテロシクリルであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。
【０２０８】
ある特定の実施形態では、Ｗは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｗは、ハロである。ある特定の実施形態では、Ｗは、シアノである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ６〜１４アリールである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているベンジルである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロシクリレンである。
【０２０９】
ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリルであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−ＯＨであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−ＮＨ２であり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−ＳＲ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＬ、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１ａ）（ＯＲ１ｃ）であり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｃおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリルであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｏ−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−ヘテロアリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−ヘテロシクリルであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｏ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリルであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ−Ｌ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂおよびＬは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−ヘテロアリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−ヘテロシクリルであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｓ−Ｌ−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリルであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、Ｗは、−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロアリールであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−（Ｎ（Ｒ１ｃ）−Ｌ）ｎ−ヘテロシクリルであり、この式中のＲ１ｃ、Ｌおよびｎは、各々、本明細書で定義される通りである。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）Ｒ１ｃであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）ＯＲ１ｃであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＲ１ａＣ（Ｏ）ＮＨ２であり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＲ１ｃＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＲ１ｃＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＮＲ１ｃＳ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１ａ）（ＯＲ１ｃ）であり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−ＳＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｗは、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、Ｚは、シアノである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ２〜６アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ２〜６アルキニルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ３〜１０シクロアルキルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ６〜１４アリールである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているＣ７〜１５アラルキルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているベンジルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている５員ヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているテトラゾイルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている１，２，４−オキサジアゾリルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されているヘテロシクリルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−Ｃ６〜１４アリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロアリールであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｌ−ヘテロシクリルであり、この式中のＬは、本明細書で定義される通りである。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、本明細書に記載の通り１つまたは複数の置換基Ｑで任意選択で置換されている−Ｃ（Ｏ）ＯＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１ａ）（ＯＲ１ｃ）であり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｃは、各々、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−ＳＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ１ａであり、この式中のＲ１ａは、本明細書で定義される通りである。ある特定の実施形態では、Ｚは、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ１ａ）Ｒ１ｂであり、この式中のＲ１ａおよびＲ１ｂは、各々、本明細書で定義される通りである。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、Ｘは、結合である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｏである。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｓである。ある特定の実施形態では、Ｘは、ＮＲ１ｃであり、この式中のＲ１ｃは、本明細書で定義される通りである。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、ｎは、１である。ある特定の実施形態では、ｎは、２である。ある特定の実施形態では、ｎは、３である。ある特定の実施形態では、ｎは、４である。ある特定の実施形態では、ｎは、５である。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される化合物は、ＡＨＲのアンタゴニストとしての活性を示す。
【０２２２】
本明細書で提供される化合物は、鏡像異性的に純粋であり、例えば、単一の鏡像異性体もしくは単一のジアステレオマーであってもよく、または立体異性体混合物、例えば、鏡像異性体の混合物、例えば、２つの鏡像異性体のラセミ混合物、もしくは２つ以上のジアステレオマーの混合物であってもよい。したがって、化合物のその（Ｒ）形態での投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏでエピマー化される化合物については、前記化合物のその（Ｓ）形態での投与と等価であることが当業者に認識されよう。個々の鏡像異性体の従来の調製／単離技術としては、好適な光学的に純粋な前駆体からの合成、アキラル出発物質からの不斉合成、または鏡像異性体混合物の分割、例えば、キラルクロマトグラフィー、再結晶、分割、ジアステレオマー塩形成、もしくはジアステレオマー付加体への誘導体化、その後の分離が挙げられる。
【０２２３】
４．４．ＮＫ細胞の単離
ナチュラルキラー細胞を単離する方法は当技術分野において公知であり、そのような方法を使用して、ナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞を単離することができる。例えば、ＮＫ細胞は、一実施形態ではＣＤ５６およびＣＤ３に対する抗体で、細胞を染色すること、およびＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞について選択することにより、単離または富化することができる。ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞は、市販のキット、例えば、ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、単離することができる。ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞は、ＮＫ細胞、例えば本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞、を含む細胞集団内のＮＫ細胞以外の細胞の除去により、単離または富化することもできる。例えば、ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造された細胞を、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１２３、ＨＬＡ  ＤＲおよび／またはＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）のうちの１つまたは複数に対する抗体を使用して、非ＮＫ細胞マーカーを提示する細胞を枯渇させることにより、単離または富化してもよい。市販のキット、例えば、ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、ネガティブアイソレーションを行うことができる。これらの方法により単離された細胞を、例えば、ＣＤ１６＋細胞とＣＤ１６−細胞、および／またはＣＤ９４＋とＣＤ９４−を分離するために、さらに選別してもよい。
【０２２４】
細胞分離は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または、一実施形態では、特異的抗体とコンジュゲートしたマイクロビーズを使用する磁気細胞選別により、遂行することができる。例えば、１つまたは複数の特異的抗体、例えば抗ＣＤ５６抗体、を含む磁気ビーズ（例えば、直径約０．５〜１００μｍ）に結合する粒子の能力に基づいて粒子を分離する方法である、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術を使用して、細胞を単離してもよい。磁気細胞分離は、例えば、ＡＵＴＯＭＡＣＳ（商標）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、行うことおよび自動化することができる。特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合性付加を含む、様々な有用な修飾を、磁気マイクロスフェアに対して行うことができる。次いで、ビーズを細胞と混合して、結合させる。次いで、細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を取り出す。一実施形態では、次いでこれらの細胞を単離し、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体に結合した磁気ビーズと再混合する。細胞を再び磁場に通し、両方の抗体に結合している細胞を単離する。次いで、そのような細胞をクローン単離のために別々のディッシュ、例えばマイクロターターディッシュに入れて希釈することができる。
【０２２５】
４．５．胎盤潅流液
ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されるＮＫ細胞集団は、任意の源、例えば、胎盤組織、胎盤潅流液、臍帯血、胎盤血、抹消血、脾臓、肝臓などからの、造血細胞、例えば造血幹または前駆細胞から製造することができる。ある特定の実施形態では、造血幹細胞は、胎盤潅流液からの造血幹細胞と、前記胎盤潅流液を生じさせるために使用されたのと同じ胎盤からの臍帯血からの造血幹細胞とを合わせたものである。例えば、（特許文献４）および（特許文献５）、ならびに（特許文献６）に開示されている方法により得ることができる、胎盤潅流液細胞を含む胎盤潅流液。前記特許文献の開示は、それら全体が本明細書に組み入れられている。
【０２２６】
４．５．１．細胞収集組成物
造血幹または前駆細胞を単離することができる胎盤潅流液および潅流液細胞、あるいは腫瘍抑制に有用な、または腫瘍細胞、がんもしくはウイルス感染症を有する個体の処置に有用な胎盤潅流液および潅流液細胞、例えば、ＮＫ細胞、例えば、本明細書で提供される３段階法に従って製造されたＮＫ細胞集団との組合せでの前記胎盤潅流液および潅流液細胞は、胎盤細胞収集組成物を使用する哺乳動物分娩後胎盤、例えばヒト分娩後胎盤の潅流により、収集することができる。潅流液は、任意の生理学的に許容される溶液、例えば、生理食塩水、培養培地、またはより複雑な細胞収集組成物を用いる胎盤の潅流により、胎盤から収集することができる。胎盤の潅流にならびに潅流液細胞の収集および保存に好適な細胞収集組成物は、関連する（特許文献７）に詳細に記載されており、前記特許文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【０２２７】
細胞収集組成物は、幹細胞の収集および／または培養に好適な任意の生理学的に許容される溶液、例えば、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水、クレブス溶液、変性クレブス溶液、イーグル溶液、０．９％ＮａＣｌなど）、培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｈ．ＤＭＥＭなど）などを含むことができる。
【０２２８】
細胞収集組成物は、収集時から培養時までの胎盤細胞の保存、すなわち胎盤細胞の死滅の防止、または胎盤細胞の死滅の遅延、死滅する細胞集団内の胎盤細胞の数の低減などに役立つ、１つまたは複数の成分を含むことができる。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤もしくはＪＮＫ阻害剤）、血管拡張薬（例えば、硫酸マグネシウム、降圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシンもしくは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）、壊死阻害剤（例えば、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、ピロリジンジチオカルバミン酸、もしくはクロナゼパム）、ＴＮＦ−α阻害剤、および／または酸素担持ペルフルオロカーボン（例えば、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミドなど）であり得る。
【０２２９】
細胞収集組成物は、１つまたは複数の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、神経プロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、リボヌクレアーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼなどを含むことができる。そのような酵素には、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ、クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）からのコラゲナーゼなど）、ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、ＬＩＢＥＲＡＳＥ、ヒアルロニダーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３０】
細胞収集組成物は、殺菌または静菌有効量の抗生物質を含むことができる。ある特定の非限定的実施形態では、抗生物質は、マクロライド（例えば、トブラマイシン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セフィキシムもしくはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ）またはキノロン（例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシンもしくはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施形態では、抗生物質は、グラム（＋）および／またはグラム（−）菌、例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，）などに対して活性である。
【０２３１】
細胞収集組成物はまた、次の化合物のうちの１つまたは複数を含むことができる：アデノシン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）、Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）、マグネシウムイオン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）、２０，０００ダルトンより高い分子量の高分子、一実施形態では、内皮完全性および細胞生存率を維持するのに十分な量で存在する前記高分子（例えば、約２５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌ、もしくは約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌで存在する、合成もしくは天然に存在するコロイド、多糖類、例えばデキストラン、もしくはポリエチレングリコール）、酸化防止剤（例えば、約２５μＭ〜約１００μＭで存在する、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣもしくはビタミンＥ）、還元剤（例えば、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭで存在するＮ−アセチルシステイン）、細胞へのカルシウム侵入を防止する薬剤（例えば、約２μＭ〜約２５μＭで存在するベラパミル）、ニトログリセリン（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）、抗凝固薬、一実施形態では残留血の凝固の防止を補助するのに十分な量で存在する前記抗凝固薬（例えば、約１０００単位／ｌ〜約１００，０００単位／ｌの濃度で存在するヘパリンもしくはヒルジン）、またはアミロライド含有化合物（例えば、約１．０μＭ〜約５μＭで存在する、アミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライドもしくはイソブチルアミロライド）。
【０２３２】
４．５．２．胎盤の収集および処理
一般に、ヒト胎盤は、産後、その娩出直後に回収される。一実施形態では、胎盤は、インフォームドコンセント後かつ患者の全病歴を聴取し、胎盤と関連付けた後に、患者から回収される。一実施形態では、前記病歴は、分娩後も継続する。
【０２３３】
潅流液の回収前に、臍帯血および胎盤血は除去される。ある特定の実施形態では、分娩後に胎盤内の臍帯血が回収される。胎盤を従来の臍帯血回収プロセスに付してもよい。概して、針またはカニューレを使用して、重量を活用して、胎盤を瀉血する（例えば、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）（特許文献８）；ヘッセル（Ｈｅｓｓｅｌ）ら（特許文献９）を参照されたい）。針およびカニューレを通常は臍帯静脈内に留置し、胎盤を穏やかに揉んで胎盤からの臍帯血の排出を補助することができる。そのような臍帯血回収は、商業的に行われることもある、例えば、ＬｉｆｅＢａｎｋ  Ｉｎｃ．、Ｃｅｄａｒ  Ｋｎｏｌｌｓ、Ｎ．Ｊ．、ＶｉａＣｏｒｄ、Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＣｒｙｏＣｅｌｌ。一実施形態では、臍帯血回収中の組織破壊を最小にするためのさらなる操作がない、胎盤の落差脱血が行われる。
【０２３４】
概して、胎盤は、臍帯血の回収および潅流液の収集のために分娩または出産室から別の場所、例えば研究室に輸送される。胎盤を滅菌断熱輸送デバイス（胎盤の温度を２０〜２８℃で維持する）で、例えば、臍帯近位部をクランプした胎盤を滅菌ジップロックプラスチックバッグの中に入れ、次いでそれを断熱コンテナに入れることにより、輸送することができる。別の実施形態では、胎盤は、実質的に（特許文献１０）に記載されている通りの臍帯血採取キットで輸送される。一実施形態では、胎盤は、分娩の４〜２４時間後に研究室に配達される。ある特定の実施形態では、臍帯血回収前に臍帯近位部、例えば、胎盤円盤体（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｄｉｓｃ）への挿入４〜５ｃｍ（センチメートル）以内でクランプされる。他の実施形態では、臍帯近位部は、臍帯血回収後だが胎盤のさらなる処理前にクランプされる。
【０２３５】
潅流液収集前の胎盤を無菌条件下、室温で、または５〜２５℃（摂氏）の温度で保管することができる。胎盤を４８時間より長い間保管してもよく、または一切の残留臍帯血を除去するための胎盤の潅流前に４〜２４時間の間保管してもよい。胎盤を抗凝固溶液中、５℃〜２５℃（摂氏）の温度で保管することができる。好適な抗凝固溶液は、当技術分野において周知である。例えば、ヘパリンまたはワルファリンナトリウムの溶液を使用することができる。一実施形態では、抗凝固溶液は、ヘパリンの溶液（例えば、１：１０００溶液で１％  ｗ／ｗ）を含む。一部の実施形態では、瀉血された胎盤は、胎盤潅流液を収集する前３６時間以下、保管される。
【０２３６】
４．５．３．胎盤潅流液
哺乳動物胎盤を潅流する方法および胎盤潅流液を得る方法は、例えば、ハリリ（Ｈａｒｉｒｉ）、（特許文献４）および（特許文献１１）に、ならびに（特許文献６）、（特許文献７）および（特許文献１２）に開示されており、前記特許文献の開示はそれら全体が本明細書における参照により本明細書に組み入れられている。
【０２３７】
潅流液は、胎盤血管系に潅流溶液、例えば、生理食塩水、培養培地または上記の細胞収集組成物を通すことにより得ることができる。一実施形態では、哺乳動物胎盤は、臍帯動脈および臍帯静脈のどちらかまたは両方に潅流溶液を通すことにより潅流される。例えば胎盤への重力流を使用して、胎盤を通る潅流溶液の流れを達成してもよい。例えば、潅流溶液は、ポンプ、例えば蠕動ポンプを使用して、胎盤を通って強制的に送られる。臍帯静脈に、例えば、滅菌チューブなどの滅菌接続器具に接続されているカニューレ、例えば、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）またはプラスチックカニューレを挿入することができる。前記滅菌接続器具は、潅流マニホールドに接続されている。
【０２３８】
潅流の準備の際、臍帯動脈および臍帯静脈が胎盤の最高点に位置するように胎盤を配向させることがきる。潅流溶液を胎盤血管系にまたは胎盤血管系および周囲組織に通すことによって、胎盤を潅流することができる。一実施形態では、臍帯動脈および臍帯静脈は、潅流溶液のリザーバに可撓性コネクタにより接続されているピペットに、同時に接続される。潅流溶液は、臍帯静脈および動脈に送られる。潅流溶液は、血管壁から胎盤の周囲組織に滲出し、および／または血管壁を通過して胎盤の周囲組織に入り、妊娠中に母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開放容器に収集される。潅流溶液を、臍帯開口部を通して導入し、母体の子宮壁と接合していた胎盤壁の開口部から流出または浸出させてもよい。別の実施形態では、潅流溶液は、臍帯静脈に通され、臍帯動脈から収集されるか、または臍帯動脈に通され、臍帯静脈から回収され、すなわち、胎盤血管系（胎児組織）のみに通される。
【０２３９】
一実施形態では、例えば、臍帯動脈および臍帯静脈は、例えば、潅流溶液のリザーバに可撓性コネクタにより接続されているピペットに、同時に接続される。潅流溶液は、臍帯静脈および動脈に送られる。潅流溶液は、血管壁から胎盤の周囲組織に滲出し、および／または血管壁を通過して胎盤の周囲組織に入り、妊娠中に母親の子宮に付着していた胎盤の表面から好適な開放容器に収集される。潅流溶液を、臍帯開口部を通して導入し、母体の子宮壁と接合していた胎盤壁の開口部から流出または浸出させてもよい。「パン」法と呼ばれることもある、この方法により収集される胎盤細胞は、概して、胎児細胞と母体細胞の混合物である。
【０２４０】
別の実施形態では、潅流溶液は、臍帯静脈に通され、臍帯動脈から収集されるか、または臍帯動脈に通され、臍帯静脈から収集される。「閉回路」法と呼ばれることもある、この方法により収集される胎盤細胞は、概して、ほぼ排他的に胎児のものである。
【０２４１】
閉回路潅流法は、一実施形態では、次のように行うことができる。分娩後の胎盤を産後約４８時間以内に得る。臍帯をクランプし、クランプの上で切断する。臍帯を廃棄することができ、または処理して、例えば臍帯幹細胞を回収することおよび／もしくは生体材料の製造用に臍帯膜を加工することができる。潅流中、羊膜を保持することができ、または例えば指での鈍的切開を使用して、絨毛膜から分離することができる。羊膜を潅流前に絨毛膜から分離する場合、羊膜を、例えば、廃棄することができ、または処理して、例えば、酵素的消化により幹細胞を得ること、もしくは例えば羊膜生体材料、例えば、（特許文献１３）に記載されている生体材料を製造することができる。例えば滅菌ガーゼを使用して、胎盤から目に見える血餅および残留血をすべて取り除いた後、臍帯血管を、例えば、臍帯膜を部分的に切断して臍帯の断面を露出させることにより、露出させる。血管を特定し、例えば、閉じたアリゲータークランプを各血管の切断端に通して前進させることにより、血管を開く。次いで、器具、例えば、潅流デバイスまたは蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブを、胎盤動脈の各々に挿入する。ポンプは、目的に適するいずれのポンプであってもよく、例えば、蠕動ポンプであってもよい。次いで、滅菌収集リザーバ、例えば、血液バッグ、例えば２５０ｍＬ採血バッグに接続されたプラスチックチューブを臍帯静脈に挿入する。あるいは、ポンプに接続されたチューブを胎盤静脈に挿入し、収集リザーバへのチューブを胎盤動脈の一方または両方に挿入する。次いで、ある容量の潅流溶液、例えば、約７５０ｍｌの潅流溶液で胎盤を潅流する。次いで、潅流液中の細胞を、例えば遠心分離により、収集する。
【０２４２】
一実施形態では、潅流中、臍帯近位部をクランプし、より具体的には、胎盤円盤体への臍帯の挿入４〜５ｃｍ（センチメートル）以内でクランプすることができる。
【０２４３】
瀉血プロセス中の哺乳動物胎盤からの潅流液の初回収集物は、臍帯血および／または胎盤血の残留赤血球で一般に着色されている。潅流液は、潅流が進むにつれてより無色になり、残留臍帯血球は、胎盤から洗い流される。一般に、３０〜１００ｍＬの潅流液が胎盤からの血液の初回フラッシュに適当であるが、観察結果次第でより多いまたはより少ない潅流液を使用してもよい。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、臍帯血は、潅流前に胎盤から（例えば、落差脱血により）除去されるが、胎盤は、残留血を除去するために溶液でフラッシュ（例えば、潅流）されない。ある特定の実施形態では、臍帯血は、潅流前に胎盤から（例えば、落差脱血により）除去され、胎盤は、残留血を除去するために溶液でフラッシュ（例えば、潅流）される。
【０２４５】
胎盤を潅流するために使用される潅流液の容量は、収集されることになる胎盤細胞の数、胎盤のサイズ、単一の胎盤で行われることになる収集の回数などに依存して変わることがある。様々な実施形態では、潅流液の容量は、５０ｍＬ〜５０００ｍＬ、５０ｍＬ〜４０００ｍＬ、５０ｍＬ〜３０００ｍＬ、１００ｍＬ〜２０００ｍＬ、２５０ｍＬ〜２０００ｍＬ、５００ｍＬ〜２０００ｍＬ、または７５０ｍＬ〜２０００ｍＬであり得る。概して、胎盤は、瀉血後に７００〜８００ｍＬの潅流液で潅流される。
【０２４６】
胎盤を数時間から数日にわたって複数回潅流することができる。胎盤を複数回潅流することになる場合、胎盤をコンテナまたは他の好適な容器内で無菌条件下で維持または培養し、細胞収集組成物、または標準的な潅流溶液（例えば、抗凝固薬（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）を伴うもしくは伴わない、および／または抗菌剤（例えば、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ））、抗生物質、例えば、ストレプトマイシン（例えば、４０〜１００μｇ／ｍｌで）、ペニシリン（例えば、４０Ｕ／ｍｌで）、アンホテリシンＢ（例えば、０．５μｇ／ｍｌで）を伴うもしくは伴わない、通常の生理食塩水、例えばリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」））で、潅流することができる。一実施形態では、単離された胎盤は、潅流液を収集せずに、ある期間、維持または培養され、例えば、前記胎盤は、潅流および潅流液収集前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間、または２もしくは３日以上の日数、維持または培養される。潅流された胎盤を、さらに１または複数回、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間以上維持し、例えば７００〜８００ｍＬの潅流液で再び潅流することができる。胎盤を１、２、３、４、５回以上、例えば、１、２、３、４、５または６時間ごとに１回、潅流することができる。一実施形態では、胎盤の潅流、および潅流溶液、例えば胎盤細胞収集組成物の回収は、回収される有核細胞の数が細胞１００個／ｍｌを下回るまで繰り返される。異なる時点での潅流液をさらに個々に処理して、細胞、例えば全有核細胞、の経時的集団を回収することができる。異なる時点からの潅流液をプールすることもできる。
【０２４７】
４．５．４．胎盤潅流液および胎盤潅流液細胞
概して、単一の胎盤灌からの胎盤潅流液は、造血細胞を含む、約１億〜約５億個の有核細胞を含み、それらの造血細胞から、ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されるＮＫ細胞を、本明細書で開示される方法により製造することができる。ある特定の実施形態では、胎盤潅流液または潅流液細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞を含む。そのような細胞は、より特異的な実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−幹細胞または前駆細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋幹細胞または前駆細胞などを含むことができる。ある特定の実施形態では、潅流液または潅流液細胞は、それらからの造血細胞の単離前に凍結保存される。ある特定の他の実施形態では、胎盤潅流液は、または潅流液細胞は、胎児細胞のみを含むか、または胎児細胞と母体細胞の組合せを含む。
【０２４８】
４．６．ＮＫ細胞
４．６．１．３段階法により製造されるＮＫ細胞
別の実施形態では、単離されたＮＫ細胞集団であって、前記ＮＫ細胞が上記の３段階法に従って製造される、ＮＫ細胞集団が本明細書で提供される。
【０２４９】
一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造される、単離されたＮＫ細胞集団であって、本明細書に記載の３段階法により製造されたＮＫ前駆細胞集団、例えば、ＮＫ前駆細胞集団を製造するために使用される第３培養ステップがＮＫ細胞集団を製造するために使用される第３培養ステップより短い期間のものであったことを除いて同じ３段階法により製造されたＮＫ前駆細胞集団より、高いパーセンテージのＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む、ＮＫ細胞集団が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞集団は、約７０％以上、一部の実施形態では７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞集団は、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％以上ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞集団は、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜９９％ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。
【０２５０】
ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＮＫｐ４６＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ１６−であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ１６＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ９４−であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。ある特定の実施形態では、前記ＮＫ細胞集団内の前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、さらにＣＤ９４＋であるＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞を含む。
【０２５１】
一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＮＫ細胞集団は、ＣＤ１１７＋である細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＮＫ細胞集団は、ＮＫＧ２Ｄ＋である細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＮＫ細胞集団は、ＮＫｐ４４＋である細胞を含む。一実施形態では、本明細書に記載の３段階法により製造されるＮＫ細胞集団は、ＣＤ２４４＋である細胞を含む。
【０２５２】
４．７．細胞の保存
細胞、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団、または造血幹細胞もしくは前駆細胞を含む胎盤潅流液細胞を、保存することができる、すなわち、長期保管を可能ならしめる条件下、または例えばアポトーシスもしくは壊死による、細胞死を阻害する条件下に置くことができる。
【０２５３】
胎盤潅流液は、細胞収集組成物を胎盤の少なくとも一部に、例えば胎盤血管系に、通すことによって製造することができる。細胞収集組成物は、潅流液中に含有されている細胞を保存するように作用する１つまたは複数の化合物を含む。そのような胎盤細胞収集組成物は、関連する（特許文献７）に記載されているような、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤および／または酸素担持ペルフルオロカーボンを含むことができ、前記特許文献の開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【０２５４】
一実施形態では、潅流液、または胎盤細胞集団は、前記潅流液または細胞集団を、アポトーシス阻害剤と酸素担持ペルフルオロカーボンとを含む細胞収集組成物と近接させることにより、哺乳動物の、例えばヒトの、分娩後の胎盤から収集され、その際、前記アポトーシス阻害剤は、前記アポトーシス阻害剤と接触も近接もさせていない細胞集団と比較して胎盤細胞集団、例えば、接着胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤複能性細胞、の集団におけるアポトーシスを低減させるまたは防止するのに十分な量でおよび十分な時間、存在する。例えば、胎盤を細胞収集組成物で潅流することができ、胎盤細胞、例えば、全有核胎盤細胞が胎盤から単離される。具体的な実施形態では、アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤は、ＪＮＫ阻害剤である。より具体的な実施形態では、前記ＪＮＫ阻害剤は、接着胎盤細胞、例えば、接着胎盤幹細胞または接着胎盤複能性細胞の分化も増殖も調節しない。別の実施形態では、細胞収集組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素担持ペルフルオロカーボンを別々の相に含む。別の実施形態では、細胞収集組成物は、エマルジョン中の前記アポトーシス阻害剤と前記酸素担持ペルフルオロカーボンとを含む。別の実施形態では、細胞収集組成物は、乳化剤、例えばレシチンをさらに含む。別の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、胎盤細胞を細胞収集組成物と近接させる時点で約０℃〜約２５℃である。別のより具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、胎盤細胞を細胞収集組成物と近接させる時点で約２℃〜１０℃、または約２℃〜５℃である。別のより具体的な実施形態では、前記近接させることは、前記細胞の集団の輸送中に行われる。別のより具体的な実施形態では、前記近接させることは、前記細胞集団の凍結および融解中に行われる。
【０２５５】
別の実施形態では、胎盤潅流液および／または胎盤細胞を収集し、前記潅流液および／または細胞をアポトーシス阻害剤および臓器保存用化合物と近接させることにより、保存することができ、その際、前記アポトーシス阻害剤は、前記アポトーシス阻害剤と接触も近接もさせていない潅流液または胎盤細胞と比較して、細胞のアポトーシスを低減させるまたは防止するのに十分な量でおよび十分な時間、存在する。具体的な実施形態では、臓器保存用化合物は、ＵＷ溶液（（特許文献１４）に記載されており、ＶＩＡＳＰＡＮ（商標）としても公知である；（非特許文献２）も参照されたい）、またはシュテルン（Ｓｔｅｒｎ）ら、（特許文献１５）に記載されている溶液であり、前記参考文献の開示はそれら全体が参照により本明細書に組み入れられている。別の実施形態では、前記臓器保存用組成物は、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトビオン酸、ラフィノース、またはそれらの組合せである。別の実施形態では、胎盤細胞収集組成物は、酸素担持ペルフルオロカーボンを２相でまたはエマルジョンとしてさらに含む。
【０２５６】
方法の別の実施形態では、胎盤細胞は、アポトーシス阻害剤および酸素担持ペルフルオロカーボン、臓器保存用化合部またはそれらの組合せを含む細胞収集組成物と、潅流中に近接される。別の実施形態では、胎盤細胞は、潅流による収集後に前記細胞収集化合物と近接される。
【０２５７】
概して、胎盤細胞収集、富化および単離中の、低酸素に起因する細胞ストレスおよび機械的ストレスを最小にすることまたは無くすことが好ましい。したがって、方法の別の実施形態では、胎盤潅流液、または胎盤細胞集団は、正常血中酸素濃度未満である酸素濃度である低酸素条件に、収集、富化または単離中、前記保存中は６時間未満曝露される。より具体的な実施形態では、前記潅流液、または胎盤細胞集団は、前記保存中に２時間未満、前記低酸素条件に曝露される。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤細胞集団は、収集、富化もしくは単離中、１時間未満、もしくは３０分未満、前記低酸素条件に曝露されるか、または低酸素条件に曝露されない。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞の集団は、収集、富化または単離中、剪断ストレスに曝露されない。
【０２５８】
細胞、例えば、胎盤潅流液細胞、造血細胞、例えばＣＤ３４＋造血幹細胞、本明細書に記載の方法を使用して産生されたＮＫ細胞、本明細書で提供される単離された接着胎盤細胞を、例えば、小型コンテナ、例えばアンプルまたはセプタムバイアル、内の凍結保存媒体中で、凍結保存することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される細胞は、１ｍＬ当たり細胞約１×１０４〜５×１０８個の濃度で凍結保存される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される細胞は、１ｍＬ当たり細胞約１×１０６〜１．５×１０７個の濃度で凍結保存される。より具体的な実施形態では、本明細書で提供される細胞は、１ｍＬ当たり細胞約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７個の濃度で凍結保存される。
【０２５９】
好適な凍結保存媒体としては、生理食塩水、培養培地（例えば、成長培地を含む）、または細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、Ｃ２６９５、Ｃ２６３９もしくはＣ６０３９（Ｓｉｇｍａ）；ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、凍結保存媒体は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０％（ｖ／ｖ）の濃度で含む。凍結保存媒体は、さらなる薬剤、例えば、メチルセルロース、デキストラン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、トレハロースおよび／またはグリセロールを含むこともある。ある特定の実施形態では、凍結保存媒体は、約１％〜１０％ＤＭＳＯ、約２５％〜７５％デキストランおよび／または約２０〜６０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。ある特定の実施形態では、凍結保存媒体は、約１％〜１０％ＤＭＳＯ、約２５％〜７５％トレハロースおよび／または約２０〜６０％ヒトＨＳＡを含む。具体的な実施形態では、凍結保存媒体は、５％ＤＭＳＯ、５５％デキストランおよび４０％ＨＳＡを含む。より具体的な実施形態では、凍結保存媒体は、５％ＤＭＳＯ、５５％デキストラン（生理食塩水中１０％  ｗ／ｖ）および４０％ＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、凍結保存媒体は、５％ＤＭＳＯ、５５％トレハロースおよび４０％ＨＳＡを含む。より具体的な実施形態では、凍結保存媒体は、５％ＤＭＳＯ、５５％トレハロース（生理食塩水中１０％  ｗ／ｖ）および４０％ＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、凍結保存媒体は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５を含む。別の具体的な実施形態では、凍結保存媒体は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０を含む。
【０２６０】
本明細書で提供される細胞を、様々な方法のいずれによって、および細胞培養、増幅または分化のいずれの段階で、凍結保存してもよい。例えば、本明細書で提供される細胞を、起源組織もしくは臓器、例えば胎盤潅流液もしくは臍帯血、からの単離直後に凍結保存してもよく、または上で概要を述べた方法の第１、第２もしくは第３ステップ中もしくは後に凍結保存してもよい。ある特定の実施形態では、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞は、起源組織または臓器からの単離後、約１、５、１０、１５、２０、３０、４５分以内または約１、２、４、６、１０、１２、１８、２０または２４時間以内に凍結保存される。ある特定の実施形態では、前記細胞は、起源組織または臓器からの単離後、１、２または３日以内に凍結保存される。ある特定の実施形態では、前記細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日間、上記の第１培地中で培養された後、凍結保存される。一部の実施形態では、前記細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日間、上記の第１培地中で、および約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日間、第２培地中で上記の通り培養された後、凍結保存される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞が、本明細書に記載の３段階法を使用して製造される場合、前記細胞は、第１培地中で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５日間培養された後、および／または第２培地中で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５日間培養された後、および／または第３培地中で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５日間培養された後、凍結保存される。具体的な実施形態では、ＮＫ細胞は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造され、前記細胞は、第１培地中で１０日間培養された後、第２培地中で４日間培養された後、および第３培地中で２１日間培養された後、凍結保存される。
【０２６１】
一態様では、ＮＫ細胞集団、例えば本明細書に記載の３段階法により製造されたＮＫ細胞、の集団を凍結保存する方法が本明細書で提供される。一実施形態では、前記方法は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１培地中で造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞を培養して、第１細胞集団を製造するステップ、その後、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２培地中で、前記第１細胞集団を培養して、第２細胞集団を製造するステップ、およびその後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３培地中で前記第２細胞集団を培養して、第３細胞集団を製造するステップであって、前記第３細胞集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、前記ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０％が生存している、ステップ、そして次に、前記ＮＫ細胞を凍結保存媒体中で凍結保存するステップを含む。具体的な実施形態では、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁溶液を調製するステップ、（２）凍結保存媒体をステップ（１）からの細胞懸濁溶液に添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップ、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存試料を得るステップ、および（４）前記凍結保存試料を−８０℃未満で保管するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、前記方法は、中間ステップを一切含まない。
【０２６２】
本明細書で提供される細胞を速度制御フリーザーで、例えば、凍結保存中に約０．１、０．３、０．５、１または２℃／分で、冷却することができる。一実施形態では、凍結保存温度は、約−８０℃〜約−１８０℃、または約−１２５℃〜約−１４０℃である。凍結保存細胞を、使用のために融解する前に、液体窒素に移すことができる。一部の実施形態では、例えば、アンプルが約−９０℃に達したら、それらは、液体窒素保管場所に移される。凍結保存細胞を約２５℃〜約４０℃の温度で融解することができ、より具体的には約３７℃の温度で融解することができる。ある特定の実施形態では、凍結保存細胞は、約１、２、４、６、１０、１２、１８、２０もしくは２４時間、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８日間凍結保存された後、融解される。ある特定の実施形態では、凍結保存細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８カ月間凍結保存された後、融解される。ある特定の実施形態では、凍結保存細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０年間凍結保存された後、融解される。
【０２６３】
好適な融解媒体としては、生理食塩水、プラズマライト、培養培地（例えば、成長培地、例えばＲＰＭＩ培地を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、融解媒体は、媒体補充物（ｍｅｄｉｕｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（例えば、栄養素、サイトカインおよび／または因子）のうちの１つまたは複数を含む。本明細書で提供される細胞の融解に好適な媒体補充物としては、例えば、限定ではないが、血清、例えば、ヒト血清ＡＢ、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ）もしくはウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）（ＦＣＳ）、ビタミン類、ヒト血清アルブミン（ＨＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、アミノ酸類（例えば、Ｌ−グルタミン）、脂肪酸類（例えば、オレイン酸、リノール酸もしくはパルミチン酸）、インスリン（例えば、組換えヒトインスリン）、トランスフェリン（鉄飽和型ヒトトランスフェリン）、β−メルカプトエタノール、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）、サイトカイン類、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）またはヘパリンが挙げられる。具体的な実施形態では、本明細書で提供される方法において有用な融解媒体は、ＲＰＭＩを含む。別の具体的な実施形態では、前記融解媒体は、プラズマライトを含む。別の具体的な実施形態では、前記融解媒体は、約０．５〜２０％ＦＢＳを含む。別の具体的な実施形態では、前記融解媒体は、約１、２、５、１０、１５または２０％ＦＢＳを含む。別の具体的な実施形態では、前記融解媒体は、約０．５％〜２０％ＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、前記融解媒体は、約１、２．５、５、１０、１５または２０％ＨＳＡを含む。より具体的な実施形態では、前記融解媒体は、ＲＰＭＩおよび約１０％ＦＢＳを含む。別のより具体的な実施形態では、前記融解媒体は、プラズマライトおよび約５％ＨＳＡを含む。
【０２６４】
本明細書で提供される凍結保存方法を、長期保管を可能ならしめるように、または例えばアポトーシスまたは壊死による、細胞死を阻害する条件下で、最適化することができる。一実施形態では、融解後の細胞は、例えば自動細胞計数器またはトリパンブルー法により判定して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％超の生存細胞を含む。別の実施形態では、融解後の細胞は、約０．５、１、５、１０、１５、２０または２５％の死細胞を含む。別の実施形態では、融解後の細胞は、約０．５、１、５、１０、１５、２０または２５％の早期アポトーシス細胞を含む。別の実施形態では、融解後の細胞の約０．５、１、５、１０、１５または２０％は、例えばアポトーシスアッセイ（例えば、ＴＯ−ＰＲＯ３またはＡｎｎＶ／ＰＩ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓアッセイキット）により判定して、融解された後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８日後にアポトーシスを受ける。ある特定の実施形態では、融解後の細胞は、本明細書で提供される方法を使用して培養、増幅または分化された後、再び凍結保存される。
【０２６５】
４．８．ＮＫ細胞を含む組成物
４．８．１．３段階法を使用して製造されるＮＫ細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載の３段階法を使用して製造される単離されたＮＫ細胞集団を含む組成物、例えば、医薬組成物が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記単離されたＮＫ細胞集団は、造血細胞、例えば、胎盤潅流液、臍帯血および／または抹消血から単離された造血幹細胞または前駆細胞から製造される。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＮＫ細胞集団は、組成物中の細胞の少なくとも５０％を構成する。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＮＫ細胞集団、例えば、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、組成物中の細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を構成する。ある特定の実施形態では、前記単離されたＮＫ細胞集団内の細胞の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％以下は、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞である。ある特定の実施形態では、前記ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ１６−である。
【０２６６】
別の具体的な実施形態では、前記組成物中の前記単離されたＮＫ細胞は、単一個体に由来する。より具体的な実施形態では、前記単離されたＮＫ細胞は、異なる少なくとも２個体に由来するＮＫ細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記組成物中の前記単離されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞での処置が予定されている個体とは異なる個体に由来する。別の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、同数のナチュラルキラー細胞、すなわち、前記免疫調節化合物またはサリドマイドと接触も近接もさせていないＮＫ細胞、より多くのグランザイムＢまたはパーフォリンを検出可能に発現するのに十分な量および時間、免疫調節化合物またはサリドマイドと接触または近接させた。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、免疫調節化合物またはサリドマイドをさらに含む。ある特定の実施形態では、免疫調節化合物は、下記の化合物である。例えば、（特許文献１６）を参照されたく、この特許文献の開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。ある特定の実施形態では、免疫調節化合物は、アミノ置換イソインドリンである。一実施形態では、免疫調節化合物は、３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロイソインドール−２−イル）−ピペリジン−２，６−ジオン、３−（４’アミノイソインドリン−１’−オン）−１−ピペリジン−２，６−ジオン、４−（アミノ）−２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−イソインドリン−１，３−ジオン、または４−アミノ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）イソインドール−１，３−ジオンである。別の実施形態では、免疫調節化合物は、ポマリドミドまたはレナリドミドである。別の実施形態では、前記免疫調節化合物は、下記の構造を有する化合物：
【０２６７】
【化１６】
2019519486.tif 000017
（式中、ＸおよびＹの一方は、Ｃ＝Ｏであり、ＸおよびＹの他方は、Ｃ＝ＯまたはＣＨ２であり、ならびにＲ２は、水素または低級アルキルである）
またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、もしくは立体異性体の混合物である。別の実施形態では、前記免疫調節化合物は、下記の構造を有する化合物：
【０２６８】
【化１７】
2019519486.tif 000018
（式中、
ＸおよびＹの一方は、Ｃ＝Ｏであり、他方は、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｓ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ３、Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ３’、Ｃ（Ｓ）ＮＲ３Ｒ３’または（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、ベンジル、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ８）アルキニルであり、
Ｒ３およびＲ３’は、独立に、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール、（Ｃ０−Ｃ８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５、またはＣ（Ｏ）ＯＲ５であり、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル−ＯＲ５、ベンジル、アリール、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、または（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリールであり、
Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、または（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリールであり、
Ｒ６の各出現は、独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール、もしくは（Ｃ０−Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ５であるか、またはＲ６基は、ヘテロシクロアルキル基を形成するように連結していてもよく、
ｎは、０または１であり、ならびに
＊は、キラル炭素中心を表す）
またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、もしくは立体異性体の混合物である。別の実施形態では、前記免疫調節化合物は、下記の構造を有する化合物：
【０２６９】
【化１８】
2019519486.tif 000019
（式中、
ＸおよびＹの一方は、Ｃ＝Ｏであり、他方は、ＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、
Ｒは、ＨまたはＣＨ２ＯＣＯＲ’であり、
（ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３もしくはＲ４の各々は、他のものとは無関係に、ハロ、炭素原子１〜４個のアルキル、もしくは炭素原子１〜４個のアルコキシであるか、または（ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３もしくはＲ４のうちの１つは、ニトロもしくは−ＮＨＲ５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、もしくはＲ４の残りは、水素であり、
Ｒ５は、水素、または炭素１〜８個のアルキルであり、
Ｒ６は、水素、炭素原子１〜８個のアルキル、ベンゾ、クロロ、またはフルオロであり、
Ｒ’は、Ｒ７−ＣＨＲ１０−Ｎ（Ｒ８Ｒ９）であり、
Ｒ７は、ｍ−フェニレンもしくはｐ−フェニレン、または−（ＣｎＨ２ｎ）−（この式中のｎは、０〜４の値である）であり、
Ｒ８およびＲ９の各々は、他方とは無関係に見て、水素、もしくは炭素原子１〜８個のアルキルであるか、またはＲ８およびＲ９は、一緒に見て、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、もしくは−ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１ＣＨ２ＣＨ２−（この式中のＸ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、もしくは−ＮＨ−である）であり、
Ｒ１０は、水素、炭素原子８個までのアルキル、またはフェニルであり、ならびに
＊は、キラル炭素中心を表す）
またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体、もしくは立体異性体の混合物である。
【０２７０】
別の具体的な実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗がん化合物、例えば、下記の抗がん化合物の１つまたは複数をさらに含む。
【０２７１】
より具体的な実施形態では、組成物は、別の源からの、または別の方法により製造された、ＮＫ細胞を含む。具体的な実施形態では、前記他の源は、胎盤血および／または臍帯血である。別の具体的な実施形態では、前記他の源は、抹消血である。より具体的な実施形態では、前記組成物中のＮＫ細胞集団は、別の源からの、または別の方法により製造された、ＮＫ細胞と、約１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００などの比で合わせられる。
【０２７２】
別の具体的な実施形態では、組成物は、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団、ならびに単離された胎盤潅流液または単離された胎盤潅流液細胞のいずれかを含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液は、前記ＮＫ細胞集団と同じ個体に由来する。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液は、前記ＮＫ細胞集団とは異な個体に由来する胎盤潅流液を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液中の細胞のすべてまたは実質的にすべて（例えば、９０％、９５％、９８％または９９％を超える）は、胎児細胞である。別の具体的な実施形態では、胎盤潅流液または胎盤潅流液細胞は、胎児細胞および母体細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液中の胎児細胞は、前記潅流液中の細胞の約９０％、８０％、７０％、６０％または５０％未満を構成する。別の具体的な実施形態では、前記潅流液は、胎盤血管系内の０．９％  ＮａＣｌ溶液の通過によって得られる。別の具体的な実施形態では、前記潅流液は、培養培地を含む。別の具体的な実施形態では、前記潅流液を処理して、赤血球を除去した。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、免疫調節化合物、例えば、以下で述べる免疫調節化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗がん化合物、例えば、以下で述べる１つまたは複数の抗がん化合物をさらに含む。
【０２７３】
別の具体的な実施形態では、組成物は、ＮＫ細胞集団ならびに胎盤潅流液細胞を含む。より具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液細胞は、前記ＮＫ細胞集団と同じ個体に由来する。別のより具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液細胞は、前記ＮＫ細胞集団とは異な個体に由来する。別の具体的な実施形態では、組成物は、単離胎盤潅流液および単離胎盤潅流液細胞を含み、前記単離胎盤潅流液および前記単離胎盤潅流液細胞は、異なる個体に由来する。胎盤潅流液を含む上記の実施形態のいずれかの別のより具体的な実施形態では、前記胎盤潅流液は、少なくとも２個体に由来する胎盤潅流液を含む。胎盤潅流液細胞を含む上記の実施形態のいずれかの別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤潅流液細胞は、少なくとも２個体に由来する。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、免疫調節化合物を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗がん化合物、例えば、以下で述べる１つまたは複数の抗がん化合物をさらに含む。
【０２７４】
４．９．３段階法を使用して製造されるＮＫ細胞の使用
本明細書で提供される、本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されるＮＫ細胞は、急性骨髄性白血病を有する個体、例えば、急性骨髄性白血病細胞を有する個体を処置する方法において使用することができる。一部のそのような実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞の有効投薬量は、体重１キログラム当たり細胞１×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７個以上の範囲である。より具体的な実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞の有効投薬量は、１×１０６〜３０×１０６の範囲である。本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞は、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法においても使用することができる。
【０２７５】
本明細書で提供される、本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されるＮＫ細胞は、多発性骨髄腫を有する個体、例えば、多発性骨髄腫細胞を有する個体を処置する方法において使用することができる。一部のそのような実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞の有効投薬量は、体重１キログラム当たり細胞１×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７個以上の範囲である。より具体的な実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞の有効投薬量は、１×１０６〜３０×１０６の範囲である。本明細書に記載の方法を使用して製造されるＮＫ細胞は、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法においても使用することができる。
【０２７６】
４．９．１．がんを有する個体の処置
一実施形態では、急性骨髄性白血病を有する個体を処置する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団の治療有効量を前記個体に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、個体は、ナチュラルキラー細胞の欠乏、例えば、急性骨髄性白血病に対して活性のＮＫ細胞の欠乏を有する。ある特定の実施形態では、急性骨髄性白血病を有する個体を処置する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団の治療有効量を前記個体に投与するステップを含み、ＩＬ−２の治療有効量を前記個体に投与するステップをさらに含む方法が、本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＩＬ−２は、ｒｈＩＬ−２である。
【０２７７】
一実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団の治療有効量を前記個体に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、個体は、ナチュラルキラー細胞の欠乏、例えば、多発性骨髄腫に対して活性のＮＫ細胞の欠乏を有する。ある特定の実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団の治療有効量を前記個体に投与するステップを含み、ＩＬ−２の治療有効量を前記個体に投与するステップをさらに含む方法が、本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＩＬ−２は、ｒｈＩＬ−２である。ある特定の実施形態では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与するステップの前に、化学療法を受けている。具体的な実施形態では、化学療法は、アルキル化剤である。より具体的な実施形態では、アルキル化剤は、メルファランである。ある特定の実施形態では、メルファランは、ラベルに従って投与される。
【０２７８】
一実施形態では、ＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、全身である。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、注入による。より具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、静脈内（ＩＶ）注入による。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２の対象への投与は、皮下注射による。具体的な実施形態では、ＩＬ−２は、ｒｈＩＬ−２である。
【０２７９】
ある特定の実施形態では、急性骨髄性白血病を有する個体は、前記投与の前に骨髄移植を受けた個体である。ある特定の実施形態では、骨髄移植は、前記急性骨髄性白血病の処置におけるものであった。ある特定の他の実施形態では、骨髄移植は、前記がん以外の状態の処置におけるものであった。ある特定の実施形態では、個体は、前記骨髄移植に加えて免疫抑制剤を受けた。ある特定の実施形態では、骨髄移植を受けたことがある個体は、前記投与のときに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の１つまたは複数の症状を示す。ある特定の実施形態では、骨髄移植を受けたことがある個体は、ＧＶＨＤの症状が発現してしまう前に前記細胞の投与を受ける。
【０２８０】
ある特定の実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体は、前記投与の前に骨髄移植を受けた個体である。ある特定の実施形態では、骨髄移植は、前記多発性骨髄腫の処置におけるものであった。ある特定の他の実施形態では、骨髄移植は、前記がん以外の状態の処置におけるものであった。ある特定の実施形態では、個体は、前記骨髄移植に加えて免疫抑制剤を受けた。ある特定の実施形態では、骨髄移植を受けたことがある個体は、前記投与のときに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の１つまたは複数の症状を示す。ある特定の実施形態では、骨髄移植を受けたことがある個体は、ＧＶＨＤの症状が発現してしまう前に前記細胞の投与を受ける。ある特定の実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体は、前記投与するステップの前に自家幹細胞移植を受けた個体である。ある特定の実施形態では、自家幹細胞移植は、前記多発性骨髄腫の処置におけるものであった。ある特定の実施形態では、自家幹細胞移植における幹細胞は、末梢血単核細胞である。自家幹細胞移植は、患者から採取され、保管され、後の使用のために凍結された幹細胞を使用して行われる。ある特定の実施形態では、自家幹細胞は、患者の末梢血から採取され、凍結され、保管され、化学療法および／または放射線での処置後に患者に再び導入される。
【０２８１】
ある特定の具体的な実施形態では、急性骨髄性白血病または多発性骨髄腫を有する個体は、前記投与の前に、少なくとも１用量のＴＮＦα阻害剤、例えばＥＴＡＮＥＲＣＥＰＴ（登録商標）（Ｅｎｂｒｅｌ）を受けたことがある。具体的な実施形態では、前記個体は、前記急性骨髄性白血病の診断の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２カ月以内に前記用量のＴＮＦα阻害剤を受けた。具体的な実施形態では、本明細書で提供される３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞は、前記用量のＴＮＦα阻害剤を受けた前記個体に、ＴＮＦα阻害剤の前記用量を受けて〜１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２カ月以内に投与される。具体的な実施形態では、ある用量のＴＮＦα阻害剤を受けたことがあり、急性骨髄性白血病を示す個体は、血球の５番染色体長腕の欠失をさらに示す。別の実施形態では、急性骨髄性白血病を有する個体は、フィラデルフィア染色体を示す。
【０２８２】
ある特定の他の実施形態では、前記個体における急性骨髄性白血病または多発性骨髄腫には、１つまたは複数の抗がん薬が効かない。具体的な実施形態では、急性骨髄性白血病または多発性骨髄腫にはＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（メシル酸イマチニブ）が効かない。
【０２８３】
ある特定の実施形態では、前記個体における急性骨髄性白血病は、少なくとも１つの抗がん薬に応答し、この実施形態では、胎盤潅流液、単離された胎盤潅流液細胞、単離されたナチュラルキラー細胞、例えば胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤由来の中間ナチュラルキラー細胞、単離された混合ナチュラルキラー細胞、もしくは本明細書に記載のＮＫ細胞、および／またはそれらの組合せ、ならびに任意選択でＩＬ−２が、補助的処置として、または前記抗がん薬との併用治療として加えられる。ある特定の他の実施形態では、急性骨髄性白血病を有する個体は、前記投与の前に、少なくとも１つの抗がん薬での処置を受け、再発している。ある特定の実施形態では、処置されることになる個体は、難治性急性骨髄性白血病を有する。ある特定の実施形態では、処置されることになる個体は、続発性急性骨髄性白血病を有する。具体的な実施形態では、続発性骨髄性白血病は、処置に関連したものである。具体的な実施形態では、続発性急性骨髄性白血病は、骨髄異形成症候群形質転換により引き起こされる。ある特定の実施形態では、処置されることになる個体には、移植〜２カ月より後に急性骨髄性白血病再発があった。一実施形態では、本明細書に記載の細胞での急性骨髄性白血病処置方法は、急性骨髄性白血病の再発を防ぐ（例えば、予防するまたは遅延させる）。一実施形態では、本明細書に記載の急性骨髄性白血病処置方法は、１カ月以上、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月以上、１年以上、２年以上、３年以上、または４年以上の急性骨髄性白血病の寛解をもたらす。
【０２８４】
別の実施形態では、急性骨髄性白血病を有する個体を処置する方法であって、前記個体における急性骨髄性白血病の処置に有効であるＮＫ細胞を個体に投与することを含む方法が、本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞、または臍帯血造血細胞、例えば造血幹細胞、から製造されたＮＫ細胞である。別の実施形態では、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を製造するための本明細書に記載の３段階法により製造されたものである。急性骨髄性白血病を有する個体を処置する方法の、ある特定の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、本明細書に記載の通り、３段階法により製造される。特定の実施形態では、前述の方法により処置されることになる急性骨髄性白血病は、難治性急性骨髄性白血病、予後不良急性骨髄性白血病、または小児急性骨髄性白血病を含む。難治性急性骨髄性白血病、予後不良急性骨髄性白血病、または小児急性骨髄性白血病の処置のためにＮＫ細胞を投与するための当技術分野において公知の方法をこの目的に適応させることができる。例えば、（非特許文献３）；（非特許文献４）を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。ある特定の実施形態では、前記個体は、急性骨髄性白血病に対する少なくとも１回の非ナチュラルキラー細胞治療が奏功しなかった急性骨髄性白血病を有する。具体的な実施形態では、前記個体は、６５歳以上であり、第１寛解期にある。具体的な実施形態では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前に、フルダラビン、シタラビン、または両方でコンディショニングされている。
【０２８５】
急性骨髄性白血病を有する個体を処置する方法の、他の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１培地中で造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞を培養して、第１細胞集団を製造するステップ、その後、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２培地中で、前記第１細胞集団を培養して、第２細胞集団を製造するステップ、およびその後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３培地中で前記第２細胞集団を培養して、第３細胞集団を製造するステップを含み、第３細胞集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０％が生存している、方法により製造される。
【０２８６】
ある特定の実施形態では、前記個体における多発性骨髄腫は、少なくとも１つの抗がん薬に応答し、この実施形態では、胎盤潅流液、単離された胎盤潅流液細胞、単離されたナチュラルキラー細胞、例えば胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤由来の中間ナチュラルキラー細胞、単離された混合ナチュラルキラー細胞、もしくは本明細書に記載のＮＫ細胞、および／またはそれらの組合せ、ならびに任意選択でＩＬ−２が、補助的処置として、または前記抗がん薬との併用治療として加えられる。ある特定の他の実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体は、前記投与の前に、少なくとも１つの抗がん薬での処置を受け、再発している。ある特定の実施形態では、処置されることになる個体は、難治性多発性骨髄腫を有する。ある特定の実施形態では、処置されることになる個体は、続発性多発性骨髄腫を有する。具体的な実施形態では、続発性多発性骨髄腫は、処置に関連したものである。具体的な実施形態では、続発性多発性骨髄腫は、骨髄異形成症候群形質転換により引き起こされる。ある特定の実施形態では、処置されることになる個体には、移植〜２カ月より後に多発性骨髄腫再発があった。一実施形態では、本明細書に記載の細胞での多発性骨髄腫処置方法は、多発性骨髄腫の再発を防ぐ（例えば、予防するまたは遅延させる）。一実施形態では、本明細書に記載の多発性骨髄腫処置方法は、１カ月以上、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月以上、１年以上、２年以上、３年以上、または４年以上の多発性骨髄腫の寛解をもたらす。
【０２８７】
別の実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法であって、前記個体における多発性骨髄腫の処置に有効であるＮＫ細胞を個体に投与することを含む方法が、本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞であるかまたは臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から製造されたＮＫ細胞である。別の実施形態では、前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を製造するための本明細書に記載の３段階法により製造されたものである。多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法の、ある特定の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、本明細書に記載の通り、３段階法により製造される。具体的な実施形態では、個体は、成人である。ある特定の実施形態では、個体は、６５歳以上である。具体的な実施形態では、個体は、第１寛解期にある。ある特定の実施形態では、前記個体は、多発性骨髄腫に対する少なくとも１回の非ナチュラルキラー細胞治療が奏功しなかった多発性骨髄腫を有する。具体的な実施形態では、前記個体は、６５歳以上であり、第１寛解期にある。
【０２８８】
多発性骨髄腫を有する個体を処置する方法の、他の具体的な実施形態では、前記ＮＫ細胞は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１培地中で造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞を培養して、第１細胞集団を製造するステップ、その後、幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠いている第２培地中で前記第１細胞集団を培養して、第２細胞集団を製造するステップ、およびその後、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第３培地中で前記第２細胞集団を培養して、第３細胞集団を製造するステップを含み、前記第３細胞集団がＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣＤ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、前記ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０％が生存している、方法により製造される。
【０２８９】
４．９．２．急性骨髄性白血病細胞および多発性骨髄腫細胞増殖の抑制
急性骨髄性白血病細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、急性骨髄性白血病細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と急性骨髄性白血病細胞を接触させるステップを含む方法が本明細書でさらに提供される。ある特定の実施形態では、急性骨髄性白血病細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、急性骨髄性白血病細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と急性骨髄性白血病細胞を接触させるステップを含み、ＩＬ−２をＮＫ細胞および／または急性骨髄性白血病細胞と近接させる、例えば、ＩＬ−２とＮＫ細胞および／または急性骨髄性白血病細胞を接触させるステップをさらに含む方法が、本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＩＬ−２は、ｒｈＩＬ−２である。
【０２９０】
多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、多発性骨髄腫細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と多発性骨髄腫細胞を接触させるステップを含む方法が本明細書でさらに提供される。ある特定の実施形態では、多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を、多発性骨髄腫細胞と近接させる、例えば、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と多発性骨髄腫細胞を接触させるステップを含み、ＩＬ−２をＮＫ細胞および／または多発性骨髄腫細胞と近接させる、例えば、ＩＬ−２とＮＫ細胞および／または多発性骨髄腫を接触させるステップをさらに含む方法が、本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ＩＬ−２は、ｒｈＩＬ−２である。ある特定の実施形態では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前に化学療法を受けている。具体的な実施形態では、化学療法は、アルキル化剤である。より具体的な実施形態では、アルキル化剤は、メルファランである。ある特定の実施形態では、メルファランは、ラベルに従って投与される。ある特定の実施形態では、多発性骨髄腫を有する個体は、前記投与前に自家幹細胞移植を受けた個体である。ある特定の実施形態では、自家幹細胞移植は、前記多発性骨髄腫の処置におけるものであった。ある特定の実施形態では、自家幹細胞移植における幹細胞は、末梢血単核細胞である。
【０２９１】
細胞に関して、本明細書において、ある特定の実施形態で使用される、「接触させること」は、一実施形態では、胎盤潅流液、胎盤潅流液細胞、ナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されたＮＫ細胞集団、および／または単離された混合ナチュラルキラー細胞と、急性骨髄性白血病細胞または多発性骨髄腫細胞との直接的な物理的、例えば細胞−細胞、接触を包含する。別の実施形態では、「接触させること」は、同じ物理的空間内に存在することを包含し、例えば、胎盤潅流液、胎盤潅流液細胞、ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、本明細書に記載のナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されたＮＫ細胞集団、および／または単離された混合ナチュラルキラー細胞は、急性骨髄性白血病細胞または多発性骨髄腫細胞と同じコンテナ（例えば、培養皿、マルチウェルプレート）内に置かれる。別の実施形態では、胎盤潅流液、胎盤潅流細胞、混合ナチュラルキラー細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、または本明細書に記載のナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法に従って製造されたＮＫ細胞集団と、急性骨髄性白血病細胞または多発性骨髄腫細胞を「接触させること」は、例えば、胎盤潅流液または細胞、例えば胎盤潅流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、もしくはナチュラルキラー細胞、例えば胎盤中間ナチュラルキラー細胞を、個体、例えば、急性骨髄性白血病細胞を有するヒト、例えばがん患者に注射または注入することにより果たされる。免疫調節化合物および／またはサリドマイドに関して「接触させること」は、例えば、細胞と免疫調節化合物および／またはサリドマイドを互いに直接物理的に接触させること、または同じ物理的体積（例えば、細胞培養コンテナまたは個体）の中に置くことを意味する。
【０２９２】
本明細書で使用される「治療に有益な」および「治療上の利点」には、例えば、腫瘍サイズの低下、腫瘍増殖の緩和または停止、転位性疾患の低減または予防、組織試料、例えば血液試料中の単位体積当たりのがん細胞数の低減、前記個体が有する特定のがんまたは腫瘍の任意の症状の臨床的改善、個体が有する特定のがんの任意の症状の悪化の緩和または停止などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２９３】
４．９．３．ＮＫ細胞およびＩＬ−２を使用する急性骨髄性白血病または多発性骨髄腫細胞の処置
本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、急性骨髄性白血病を有する個体の処置は、ＩＬ−２の投与を含む抗がん治療レジメンの一部になることができる。本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団を使用する、多発性骨髄腫を有する個体の処置は、ＩＬ−２の投与を含む抗がん治療レジメンの一部になることができる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、ヒトＩＬ−２である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）である。ある特定の実施形態では、ｒｈＩＬ−２は、アルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である。ｒｈＩＬ−２のアミノ酸配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５７７．２で提供される。ある特定の実施形態では、ｒｈＩＬ−２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５７７．２と９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、アセトアミノフェンおよび／またはジフェンヒドラミンと組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２は、コンディショニングレジメン後に投与される。例えば、コンディショニングレジメンは、例えば、ＮＫ細胞の投与およびＩＬ−２の任意選択の投与の直前または１、２、３もしくは４日前に行うことができる。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、１つまたは複数の化学療法の投与、例えば、フルダラビンおよび／またはシクロホスファミドの投与を含む。より具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンおよびシクロホスファミドでの処置を含む。さらにいっそう具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンでの３、４、５、６または７日間のおよびシクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含む
【０２９４】
４．９．４．投与
細胞、例えば本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団の数の決定と、ＩＬ−２の量の決定とを、互いに独立に行うことができる。
【０２９５】
ＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、全身である。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞の単離された集団またはその医薬組成物の投与は、注射による。具体的な実施形態では、対象へのＮＫ細胞の単離集団またはその医薬組成物の投与は、静脈内（ＩＶ）注入による。ある特定の実施形態では、対象へのＩＬ−２またはその医薬組成物の投与は、注射による。具体的な実施形態では、対象へのＩＬ−２またはその医薬組成物の投与は、皮下注射による。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞は、ＩＬ−２、例えば、ｒｈＩＬ−２の１用量または複数用量と組み合わせて対象に投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、６百万単位の用量で１日おきに対象に合計６用量投与される。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞の投与に先行して、本明細書に記載のコンディショニングレジメン、例えば、フルダラビンおよび／またはシクロホスファミドの投与を含むコンディショニングレジメンが行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞は、ｒｈＩＬ−２の１用量または複数用量と組み合わせて対象に投与され、ＮＫ細胞の投与に先行して、フルダラビンおよびシクロホスファミドの投与を含むコンディショニングレジメンが行われ、ｒｈＩＬ−２の各用量の投与に先行しておよび続いて、アセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンの投与が行われる。
【０２９６】
４．９．４．１．細胞の投与
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団は、急性骨髄性白血病を有する個体、例えば、急性骨髄性白血病患者に、検出可能な治療上の利点をもたらす任意の量または数、例えば有効量で、使用、例えば投与される。他の実施形態では、個体は、多発性骨髄腫を有し、例えば、多発性骨髄腫患者である。そのような細胞をそのような個体に細胞の絶対数により投与することができ、例えば、前記個体に、約、少なくとも約、または最大で約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、または１×１０１１個の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞を投与することができる。具体的な実施形態では、前記個体に、約、少なくとも約、または最大で約３×１０６、１×１０７、３×１０７、１×１０８、３×１０８、または１×１０９個の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞が投与される。具体的な実施形態では、前記個体に、約、少なくとも約、または最大で約１×１０６個の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞が投与される。具体的な実施形態では、前記個体に、約、少なくとも約、または最大で約３×１０６個の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞が投与される。具体的な実施形態では、前記個体に、約、少なくとも約、または最大で約１０×１０６個の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞が投与される。具体的な実施形態では、前記個体に、約、少なくとも約、または最大で約３０×１０６個の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞が投与される。他の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞をそのような個体に細胞の相対数により投与することができ、例えば、前記個体に、個体の１キログラム当たり、約、少なくとも約、または最大で約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、または１×１０１１個の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞を投与することができる。具体的な実施形態では、前記個体に、個体の１キログラム当たり、約、少なくとも約、または最大で約１×１０６、３×１０６、１０×１０６、または３０×１０６個の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞が投与される。他の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞をそのような個体に細胞の相対数により投与することができ、例えば、前記個体に、個体の１キログラム当たり、約、少なくとも約、または最大で約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、または５×１０８個の、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞を投与することができる。
【０２９７】
ある特定の実施形態では、急性骨髄性白血病細胞の増殖を例えば個体において抑制する方法；自身のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の処置の方法；または急性骨髄性白血病細胞を有する個体、例えば急性骨髄性白血病細胞を有する個体、の処置の方法は、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と胎盤潅流液および／または胎盤潅流液細胞の１つまたは複数との組合せと、前記急性骨髄性白血病細胞を近接させるステップ、またはそのような組合せを前記個体に投与するステップを含む。
【０２９８】
ある特定の実施形態では、多発性骨髄腫細胞の増殖を例えば個体において抑制する方法；自身のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の処置の方法；または多発性骨髄腫細胞を有する個体、例えば多発性骨髄腫細胞を有する個体の処置、の方法は、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞と胎盤潅流液および／または胎盤潅流液細胞の１つまたは複数との組合せと、前記多発性骨髄腫細胞を近接させるステップ、またはそのような組合せを前記個体に投与するステップを含む。
【０２９９】
別の具体的な態様では、自身のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の処置；急性骨髄性白血病を有する個体の処置；または急性骨髄性白血病細胞増殖の抑制；または多発性骨髄腫細胞増殖の抑制は、免疫調節化合物またはサリドマイドと、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞とを併用して行われ、この場合、前記細胞に、条件培地、例えば、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋組織培養プラスチック接着胎盤細胞により条件付けられた培地、例えば、潅流液１単位当たり、または本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、もしくは１０１１個当たり、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．１、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＬの幹細胞条件培養培地が補充される。ある特定の実施形態では、組織培養プラスチック接着胎盤細胞は、（特許文献５）および（特許文献１２）に記載されている複能性接着胎盤細胞であり、前記特許文献の開示は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられている。別の具体的な実施形態では、方法は、腫瘍細胞を免疫調節化合物もしくはサリドマイドと近接させること、または個体に免疫調節化合物もしくはサリドマイドを投与することをさらに含む。
【０３００】
本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および任意選択で潅流液または潅流液細胞は、急性骨髄性白血病を有する個体、または急性骨髄性白血病細胞を有する個体に、抗がん治療の過程で１回投与することができ、あるいは治療中に複数回、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３時間に１回、または１、２、３、４、５、６もしくは７日に１回、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２４、３６週間以上に１回投与することができる。
【０３０１】
本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞および任意選択で潅流液または潅流液細胞は、多発性骨髄腫を有する個体、または多発性骨髄腫細胞を有する個体に、抗がん治療の過程で１回投与することができ、あるいは治療中に複数回、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３時間に１回、または１、２、３、４、５、６もしくは７日に１回、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２４、３６週間以上に１回投与することができる。
【０３０２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載の３段階法を使用して製造されたＮＫ細胞集団は、急性骨髄性白血病を有する個体、例えば、急性骨髄性白血病患者、または多発性骨髄腫を有する個体、例えば、多発性骨髄腫患者に、検出可能な治療上の利点をもたらす任意の量または数、例えば有効量で、使用、例えば投与される。
【０３０３】
本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞は、本明細書に記載の方法を使用して製造されたＮＫ細胞が、過去に個体に投与されたことがあるかどうかに関係なく、投与することができる。
【０３０４】
４．９．４．２．ＩＬ−２の投与
別の具体的な実施形態では、自身のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の処置；急性骨髄性白血病を有する個体の処置；もしくは急性骨髄性白血病細胞増殖の抑制；または多発性骨髄腫を有する個体の処置；もしくは多発性骨髄腫細胞増殖の抑制では、本明細書に記載の方法を使用して製造された前記ＮＫ細胞にインターロイキン２（ＩＬ−２）が補充される。細胞およびＩＬ−２が使用される実施形態では、ＩＬ−２および細胞を個体に、一緒に、例えば、同じ製剤で投与することができ、別々に、例えば、別々の製剤で、ほぼ同時に投与することができ、または別々に、例えば、異なる投薬スケジュールで、もしくはその日の異なる時点で投与することができる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、ヒトＩＬ−２である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）である。ある特定の実施形態では、ｒｈＩＬ−２は、アルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である。ｒｈＩＬ−２のアミノ酸配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５７７．２で提供される。ある特定の実施形態では、ｒｈＩＬ−２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５７７．２と９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２単位は、国際単位を指す。
【０３０５】
細胞およびＩＬ−２が使用される実施形態では、ＩＬ−２を皮下投与することができる。具体的な実施形態では、ＩＬ−２を注射により皮下投与することができる。より具体的な実施形態では、皮下ＩＬ−２注射は、ＮＫ細胞注入の４時間以上後に、グレード４（例えば、米国国立がん研究所共通毒性基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ）によるグレード４）注入関連毒性の非存在下で開始される。より具体的な実施形態では、皮下ＩＬ−２注射は、対象が、グレード４（例えば、米国国立がん研究所共通毒性基準によるグレード４）注入関連毒性を経験し、それがグレード２（例えば、米国国立がん研究所共通毒性基準によるグレード２）またはそれより良好なグレードに回復している場合、ＮＫ細胞注入〜４８時間以内に開始される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２をＮＫ細胞注入後４８時間以内に開始することができない場合、ＩＬ−２は、与えられないことになる。
【０３０６】
ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に６百万単位の用量で投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に３百万、４百万、５百万、６百万、７百万、８百万または９百万単位の用量で投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に１日おきに合計６用量投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に１日おきに合計３、４、５、６、７、８または９用量投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に毎日、合計６用量投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に毎日、合計３、４、５、６、７、８または９用量投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に１、２、３、４または５日ごとに合計６用量投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に毎週、６用量投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に１、２、３、４または５日ごとに合計３、４、５、６、７、８または９用量投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に毎週、合計３、４、５、６、７、８または９用量投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に３百万、４百万、５百万、６百万、７百万、８百万または９百万単位の用量で１日おきに投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に３百万、４百万、５百万、６百万、７百万、８百万または９百万単位の用量で１日おきに合計６用量投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に３百万、４百万、５百万、６百万、７百万、８百万または９百万単位の用量で１日おきに合計３、４、５、６、７、８または９用量投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に６百万単位の用量で１日おきに投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に６百万単位の用量で１日おきに合計３、４、５、６、７、８または９用量投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２またはその医薬組成物は、対象に６百万単位の用量で１、２、３、４または５日ごとに合計６用量投与される。
【０３０７】
ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、アセトアミノフェンと組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２は、ジフェンヒドラミンと組み合わせて投与される。具体的な実施形態では、ＩＬ−２は、アセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンと組み合わせて投与される。より具体的な実施形態では、アセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンは、ＩＬ−２の前に投与される。より具体的な実施形態では、アセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンは、ＩＬ−２の後に投与される。より具体的な実施形態では、アセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンは、ＩＬ−２の前および後に投与される。
【０３０８】
細胞およびＩＬ−２が使用される実施形態では、ＩＬ−２を６百万単位の用量で１日おきに合計６用量投与することができる。具体的な実施形態では、体重４５キログラム未満の患者に対して、ＩＬ−２は、３百万単位／ｍ２で１日おきに合計６用量投与される。具体的な実施形態では、ＩＬ−２の各用量が投与される前および投与された４時間後にアセトアミノフェン  ６５０ｍｇ  ＰＯおよびジフェンヒドラミン  ２５ｍｇ  ＰＯ／ＩＶの前投薬が施される。より具体的な実施形態では、２４時間より長い継続時間の新たな（すなわち、既存のものではない）グレード３（例えば、米国国立がん研究所共通毒性基準によるグレード３）またはそれより高いグレードの有害事象の発生により、ＩＬ−２の用量が５０％低減される結果となる。具体的な実施形態では、グレード３（例えば、米国国立がん研究所共通毒性基準によるグレード３）またはそれより高いグレードの有害事象は、次の事象からなる群から選択される：心臓障害、臨床検査（血液学的なものを除外する）、神経系障害、腎臓および尿障害、ならびに呼吸器（肺）障害。具体的な実施形態では、毒性が４８時間以内にグレード２（例えば、米国国立がん研究所共通毒性基準によるグレード２）またはそれより良好なグレードに回復した場合、ＩＬ−２は、５０％低減された用量で再開され、その低減された用量で継続される。より具体的な実施形態では、同毒性が持続、悪化または再発した場合、ｒｈＩＬ−２は、永久に中止される。具体的な実施形態では、毒性がグレード４（例えば、米国国立がん研究所共通毒性基準によるグレード４）であった場合、ＩＬ−２は、永久に中止される。
【０３０９】
４．９．４．３．コンディショニングレジメン
ある特定の実施形態では、コンディショニングレジメンは、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の前に対象に投与される。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンでの処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンでの５日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンでの５日間の処置を含み、フルダラビンでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の６日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの５日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２０〜３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの５日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの５日間の処置を含み、フルダラビンでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の６日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２０〜３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの５日間の処置を含み、フルダラビンでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の６日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、シクロホスファミドでの処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、シクロホスファミドでの２日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、シクロホスファミドでの２日間の処置を含み、シクロホスファミドでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の５日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの２日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、５０〜７０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの２日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの２日間の処置を含み、シクロホスファミドでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の５日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、５０〜７０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの２日間の処置を含み、シクロホスファミドでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の５日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンおよびシクロホスファミドでの処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンでの５日間のおよびシクロホスファミドでの２日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンでの５日間のおよびシクロホスファミドでの２日間の処置を含み、フルダラビンでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の６日前に開始し、シクロホスファミドでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の５日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの５日間のおよび６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの２日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２０〜３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの５日間のおよび５０〜７０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの２日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの５日間のおよび６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの２日間の処置を含み、フルダラビンでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の６日前に開始し、シクロホスファミドでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の５日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２０〜３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの５日間のおよび５０〜７０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの２日間の処置を含み、フルダラビンでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の６日前に開始し、シクロホスファミドでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の５日前に開始する。
【０３１０】
具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンでの３、４、５、６または７日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンでの３、４、５、６または７日間の処置を含み、フルダラビンでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の４、５、６、７または８日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの３、４、５、６または７日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２０〜３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの３、４、５、６または７日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの３、４、５、６または７日間の処置を含み、フルダラビンでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の４、５、６、７または８日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２０〜３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの３、４、５、６または７日間の処置を含み、フルダラビンでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の４、５、６、７または８日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、シクロホスファミドでの処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、シクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、シクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含み、シクロホスファミドでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の４、５、６または７日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、５０〜７０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含み、シクロホスファミドでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の４、５、６または７日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、５０〜７０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含み、シクロホスファミドでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の４、５、６または７日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンおよびシクロホスファミドでの処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンでの３、４、５、６または７日間のおよびシクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、フルダラビンでの３、４、５、６または７日間のおよびシクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含み、フルダラビンでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の４、５、６、７または８日前に開始し、シクロホスファミドでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の４、５、６または７日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの３、４、５、６または７日間のおよび６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２０〜３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの３、４、５、６または７日間のおよび５０〜７０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含む。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの３、４、５、６または７日間のおよび６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含み、フルダラビンでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の６日前に開始し、シクロホスファミドでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の５日前に開始する。具体的な実施形態では、コンディショニングレジメンは、２０〜３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビンでの３、４、５、６または７日間のおよび５０〜７０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでの１、２、３または４日間の処置を含み、フルダラビンでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の４、５、６、７または８日前に開始し、シクロホスファミドでの処置は、ＮＫ細胞および任意選択のＩＬ−２での処置の４、５、６または７日前に開始する。
【０３１１】
５．キット
本明細書では、例えば、本明細書に記載の方法によって産生されるＮＫ細胞、例えば本明細書に記載の３段階法を使用して産生したＮＫ細胞集団を含む組成物のような、本明細書に記載の組成物の１つまたは複数で満たされた１つまたは複数のコンテナを含む医薬パックまたはキットが提供される。そのようなコンテナに任意選択で付随するのは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された書式の通知であり、その通知は、機関によるヒトへの投与のための製造、使用または販売の承認を反映するものである。
【０３１２】
本明細書に包含されるキットは、本明細書に記載の方法、例えば、急性骨髄性白血病細胞の増殖を抑制する方法および／もしくは急性骨髄性白血病を処置する方法または多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制する方法および／もしくは多発性骨髄腫を処置する方法に従って使用することができる。一実施形態では、キットは、１つまたは複数のコンテナの中に、本明細書に記載の方法またはその組成物によって産生されたＮＫ細胞を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載の３段階方法によって産生されるＮＫ細胞集団、またはその組成物を含むキットが本明細書において提供される。一実施形態では、キットは、１つまたは複数のコンテナの中に、本明細書に記載の方法により製造されたＮＫ細胞またはそれらの組成物を、および１つまたは複数のコンテナの中に、ＩＬ−２またはその組成物を含む。一実施形態では、キットは、（ｉ）１つもしくは複数のコンテナの中に、本明細書に記載の方法により製造されたＮＫ細胞またはそれらの組成物を、（ｉｉ）１つもしくは複数のコンテナの中に、ＩＬ−２またはその組成物を、および（ｉｉｉ）１つもしくは複数のコンテナの中に、アセトアミノフェンを、および／または（ｉｖ）１つもしくは複数のコンテナの中に、ジフェンヒドラミンを含む。一実施形態では、キットは、（ｉ）１つもしくは複数のコンテナの中に、本明細書に記載の方法により製造されたＮＫ細胞またはそれらの組成物を、（ｉｉ）１つもしくは複数のコンテナの中に、ＩＬ−２またはその組成物を、および（ｉｉｉ）１つもしくは複数のコンテナの中に、フルダラビンを、および／または（ｉｖ）１つもしくは複数のコンテナの中に、シクロホスファミドを含む。一実施形態では、キットは、（ｉ）１つもしくは複数のコンテナの中に、本明細書に記載の方法により製造されたＮＫ細胞またはそれらの組成物を、（ｉｉ）１つもしくは複数のコンテナの中に、ＩＬ−２またはその組成物を、および（ｉｉｉ）１つもしくは複数のコンテナの中に、アセトアミノフェンを、および／または（ｉｖ）１つもしくは複数のコンテナの中に、ジフェンヒドラミンを、および（ｖ）１つもしくは複数のコンテナの中に、フルダラビンを、および／または（ｖｉ）１つもしくは複数のコンテナの中に、シクロホスファミド含む。
【実施例】
【０３１３】
６．実施例
【実施例１】
【０３１４】
６．１．実施例１：臨床研究−急性骨髄性白血病
皮下組換えヒトＬ−２（ｒｈＩＬ−２）を伴う、ヒト臍帯血由来、培養増幅３段階ナチュラルキラー細胞注入についての第Ｉ相、多施設、非盲検、用量漸増安全性研究を、再発性および／または難治性急性骨髄性白血病を有する成人において行う。
【０３１５】
スクリーニング／ベースライン期間は、３段階ＮＫ細胞の投与の２８日前〜７日前の２１日と定義し、この期間中に対象の適格性を評価する。スクリーニング／ベースライン期間の後に、シクロホスファミド（５日前および４日前の６０ｍｇ／ｋｇ×２日、ただし、以前の移植〜４カ月未満の場合には４日前のシクロホスファミド用量を除く）およびフルダラビン（６日前から開始して２５ｍｇ／ｍ２×５日）（研究の６日前〜２日前）からなる、５日のコンディショニング処置期間が続く。以前の移植〜４カ月以上経過していなかった場合には第２日のフルダラビンを省く。
【０３１６】
処置期間中、３段階ＮＫ細胞注入前６０分以内および３段階ＮＫ細胞注入のおおよそ４時間後に、アセトアミノフェン  ６５０ｍｇ  ＰＯおよびジフェンヒドラミン  ２５ｍｇ  ＰＯ／ＩＶを対象に前投薬する。３段階ＮＫ細胞注入を０日目にＩＶ投与する。注入終了〜４時間経ったら直ちに、いずれの（米国国立がん研究所共通毒性基準による）グレード４注入関連毒性も非存在の場合には６百万単位のｒｈＩＬ−２を指示に従って皮下（ＳＣ）注射する。その後、ｒｈＩＬ−２注射の合計６回の注射を０日目に始めて１日おきに繰り返す。アセトアミノフェン  ６５０ｍｇ  ＰＯおよびジフェンヒドラミン  ２５ｍｇ  ＰＯを、各ｒｈＩＬ−２注射の前の前投薬として、および各ｒｈＩＬ−２注射後の後投薬として推奨する。
【０３１７】
これらの前および後投薬のタイミングは、研究者の裁量での、または実施施設のプロトコールに従ってのタイミングである。臨床的に必要と判断された場合、悪寒を制御するためにメペリジンも投与してもよい。
【０３１８】
この研究は、３〜６名の対象を４つの用量コホート（細胞１×１０６個／ｋｇ、細胞３×１０６個／ｋｇ、細胞１０×１０６個／ｋｇ、および細胞３０×１０６個／ｋｇ）に登録し、４名のさらなる対象を最大耐用量（ＭＴＤ）に加える、３＋３用量漸増デザインを利用する。
【０３１９】
最初に、３名の対象を細胞１×１０６個／ｋｇの単回注入を受けるように登録する。対象を研究への参加順序に基づいて用量コホートに割り当てる。４つの３段階ＮＫ細胞用量レベルをこの研究では計画する：
・用量レベル１：０日目に投与する細胞１×１０６個／ｋｇ。
・用量レベル２：０日目に投与する細胞３×１０６個／ｋｇ。
・用量レベル３：０日目に投与する細胞１０×１０６個／ｋｇ。
・用量レベル４：０日目に投与する細胞３０×１０６個／ｋｇ。
【０３２０】
主要評価項目測定基準は、用量制限毒性（ＤＬＴ）、投与〜２８日以内の有害事象の数および重症度、ならびにＡＭＬを有する患者の処置のために安全に投与される最大用量であるＭＴＤの評定である。主要評価項目測定基準の時間枠は、最大おおよそ２８日である。有害事象の数は、最大おおよそ１２カ月間判定する。
【０３２１】
副次評価項目測定基準は、血小板回復が不完全な完全寛解（ＣＲｐ）、および完全寛解（ＣＲ）である。ＣＲｐは、白血病排除（５％未満の骨髄芽球および循環末梢芽球なし）、および好中球回復しかし血小板回復は不完全と定義する。ＣＲは、絶対好中球数（１０００／μＬ超）および血小板数（１００，０００／μＬ超）の正常値ならびに赤血球輸血への非依存性と併せての、白血病排除（（５％未満の骨髄芽球および循環末梢芽球なし）と定義する。副次評価項目測定基準の時間枠は、最大おおよそ４２日である。
【０３２２】
対象は、研究への登録に適格な次のような疾患を有さなければならない：
・  原発性急性骨髄性白血病に対する導入失敗：２回以上の導入試行後にＣＲなし；または
・  再発性急性骨髄性白血病：１サイクルもしくは複数サイクルの標準的再導入化学療法後にＣＲ状態にない。６０歳より高齢の再発した対象については、次の基準のどちらかを満たす場合、１サイクルの標準的再導入化学療法を必要としない：最終化学療法〜６カ月以内の再発；もしくはこのプロトコール治療の開始〜１０日以内に芽球数＜３０％；または
・  続発性急性骨髄性白血病（ＭＤＳ形質転換もしくは処置関連）；または
・  移植後２カ月より後の急性骨髄性白血病再発；過去に中枢神経系合併症があった対象は、それが処置されており、脳脊髄液が来院１の前に少なくとも２週間透明であることを条件に、適格である。
【実施例２】
【０３２３】
６．２．実施例２：臨床研究−多発性骨髄腫
自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）後の皮下組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）を伴う、ヒト臍帯血由来、培養増幅３段階ナチュラルキラー細胞注入についての第Ｉ相、多施設、非盲検、安全性研究を、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する成人において行う。
【０３２４】
この研究の主要目的は、ＡＳＣＴ後のＭＭを有する対象において３段階ＮＫ細胞の安全性を評定することおよび最大耐用量を決定することである。副次的目的は、１００日目までの潜在的な臨床的有効性を詳しく調査することである。
【０３２５】
３段階ナチュラルキラー細胞についての最大耐用量をＡＳＣＴ後２日目および７日目に評価し、ＡＳＣＴ後１４日目に特定する。３段階ナチュラルキラー細胞の投与は、静脈内であり、その投与後、体内のＮＫ細胞を支持するために合計６回のＩＬ−２注射を行う。
【０３２６】
主要評価項目測定基準は、有害事象および用量制限毒性であり、これら両方の時間枠は最大２８日である。副次評価項目測定基準は、最大１００日の時間枠での奏功率であり、この場合の奏功には微小残存病変が含まれる。
【０３２７】
研究プロトコールは、次の通りである：先ず、メルファランを投与し、その後、ＡＳＣＴ（５日前〜０日目）を行い、その後、異なる最大３つ用量レベルで３段階ナチュラルキラー細胞を投与し、その後、０日目〜１３日目まで１日おきにｒｈＩＬ−２を投与する。
【０３２８】
均等物：
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際に、記載されたものに加えて、本発明の様々な改変は、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
【０３２９】
本明細書で引用したすべての参考文献は、個々の刊行物、特許または特許出願が、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示についてのものであり、本発明が先行発明によりその刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月13日(2019.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団の有効量を投与することにより急性骨髄性白血病
を有する個体を処置する方法であって、ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団が、
（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１培地中で造血幹細胞
または前駆細胞を培養して、第１細胞集団を製造するステップ；
（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠い
ている第２培地中で前記第１細胞集団を培養して、第２細胞集団を製造するステップ；お
よび
（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第
３培地中で前記第２細胞集団を培養して、第３細胞集団を製造するステップを含み、
前記第３細胞集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣ
Ｄ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の
少なくとも８０％が生存している、方法により製造され、処置の方法がＩＬ−２の有効量
を患者に投与することをさらに含む、方法。
【請求項２】
ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団の有効量を投与することにより多発性骨髄腫を有
する個体を処置する方法であって、ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団が、
（ａ）幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１培地中で造血幹細胞
または前駆細胞を培養して、第１細胞集団を製造するステップ；
（ｂ）幹細胞動員剤およびインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含み、Ｔｐｏを欠い
ている第２培地中で前記第１細胞集団を培養して、第２細胞集団を製造するステップ；お
よび
（ｃ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを欠いている第
３培地中で前記第２細胞集団を培養して、第３細胞集団を製造するステップを含み、
前記第３細胞集団が、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−またはＣＤ１６＋、およびＣ
Ｄ９４＋またはＣＤ９４−であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の
少なくとも８０％が生存している、方法により製造され、処置の方法がＩＬ−２の有効量
を患者に投与することをさらに含む、方法。
【請求項３】
前記造血幹細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞または胎盤造血幹細胞である、請求項１〜２の
うちいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記胎盤造血幹細胞が、ヒト胎盤潅流液から得られるもしくは得ることができる細胞を
含み、または、ヒト胎盤潅流液から単離された有核細胞から得られるもしくは得ることが
できる細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞動員剤がアリール炭化水素受容体阻害剤である、請求項１〜４のうちいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項６】
前記アリール炭化水素受容体阻害剤がＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ−１）（４−
（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン
−６−イルアミノ）エチル）フェノール）であり、または、
前記アリール炭化水素受容体阻害剤がレスベラトロールであり、または、
前記アリール炭化水素受容体阻害剤が化合物ＣＨ２２３１９１（１−メチル−Ｎ−［２
−メチル−４−［２−（２−メチルフェニル）ジアゼニル］フェニル−１Ｈ−ピラゾール
−５−カルボキサミド］である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞動員剤がピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体であり、
前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体が以下の化学構造
【化１】
2019519486.tif 000022
を有する、請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ピリミド（４，５−ｂ）インドール誘導体が以下の化学構造
【化２】
2019519486.tif 000023
を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１培地が、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ
）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ
）または顆粒球・マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数をさ
らに含む、または、
前記第１培地が、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦ
およびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれを含む、請求項１〜８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２培地が、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦお
よびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つまたは複数をさらに含む、または、
前記第２培地が、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦお
よびＧＭ−ＣＳＦのそれぞれをさらに含む、請求項１〜９のうちいずれか１項に記載の方
法。
【請求項１１】
前記第３培地が、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのうち
の１つまたは複数をさらに含む、または、
前記第３培地が、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの各々
を含む、請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／または
ＧＭ−ＣＳＦが第１培地、第２培地または第３培地の組成不明の成分中に含まれていない
、または、
前記ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ−３、ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｇ−ＣＳＦおよび／または
ＧＭ−ＣＳＦが血清中に含まれていない、請求項９〜１３のうちいずれか１項に記載の方
法。
【請求項１３】
前記第１培地、前記第２培地または前記第３培地のいずれもヒト血清ＡＢを含み、
前記第１培地、前記第２培地または前記第３培地のいずれも２−メルカプトエタノール
を含む、または、
前記第１培地、前記第２培地または前記第３培地のいずれもゲンタマイシンを含む、請
求項１〜１２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
造血幹細胞を第１培地中で７〜１３日間培養するステップ、または、
造血幹細胞を第１培地中で８〜１２日間培養するステップ、または、
造血幹細胞を第１培地中で約１０日間培養するステップを含む、請求項１〜１３のうち
いずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２培地中で前記第１細胞集団を２〜６日間培養するステップ、または、
前記第２培地中で前記第１細胞集団を３〜５日間培養するステップ、または、
前記第２培地中で前記第１細胞集団を約４日間培養するステップを含む、請求項１〜１
４のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第３培地中で前記第２細胞集団を１０〜３０日間培養するステップ、または、
前記第３培地中で前記第２細胞集団を１５〜２５日間培養するステップ、または、
前記第３培地中で前記第２細胞集団を約２１日間培養するステップを含む、請求項１〜
１５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも２０％、４０％、６０％または８０％のＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラ
ー細胞を含むナチュラルキラー細胞を製造する、請求項１〜１６のうちいずれか１項に記
載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）の後に前記細胞集団を凍結保存するステップをさらに含む、または、
ステップ（ｃ）の後に前記ナチュラルキラー細胞を凍結保存するステップをさらに含む
、または、
前記接触させるステップまたは前記投与するステップの前に前記ナチュラルキラー細胞
が凍結保存されている、請求項１〜１７のうちいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2019519486.tif 000024
2019519486.tif 000025