(57)【要約】ジェランガムヒドロゲル、調製物、方法、およびそれらの使用  本明細書において、in vitro細胞培養および組織工学および再生医療用途のためのジェランガムベースのヒドロゲルが開示される。そのようなジェランガムベースのヒドロゲルは、単独で、または生細胞および／もしくは生体分子と組み合わせて使用され、ヒトおよび／または動物に適用されてもよい。選択されたイオンキレート置換基を有するジェランガムの化学修飾は、調整可能な物理化学的および生物学的特性を付与された新規ジェランガムヒドロゲルを提供する。本明細書に記載の修飾ジェランガムヒドロゲルは、カプセル化細胞を長い培養期間中生存可能に維持し、健常な細胞外マトリックスマーカーの発現を上方調節する一方で、溶解性、イオン架橋多用途性、製剤の容易さおよび注射可能性ならびに生物学的組織および表面内でのより優れた接着性を含む、既存のヒドロゲル系に優る利点を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iの構造を含む、ジェランガム：
【化１】
2019509387.tif 000009
式I
式中、
nは1〜4000、好ましくは50〜4000、より好ましくは500〜4000の整数であり、
Aは基-N-R7R8を表し、式中
R8は水素またはC1-C6アルキル基であり、
R7は、式IIの基を表す：
-(CH2)g-B
式II
式中、
gは0〜18の整数であり、
Bは、その芳香族環上で、1つ以上の以下の基、またはそれらの組み合わせによって任意に置換されたフェノールまたはカテコール基である：
C1-C6アルキル基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基またはハロゲン基；
低級アルコキシ基-OR1、式中、R1はC1-C6アルキル基を表す；基-C(O)-R2、式中、R2は水素もしくはC1-C6アルキル基を表す；基-C(O)-OR3、式中、R3は水素もしくはC1-C6アルキル基を表す；基-C(O)NR4R5、式中、R4およびR5は水素もしくはC1-C6アルキル基を表す；または基-SO2R6、式中、R6は水素もしくはC1-C6アルキル基を表す、またはBは3-ヒドロキシ-4-ピリジノンもしくは5-ヒドロキシピリミドン-4(3H)-オン基である。
【請求項２】
式IIIの構造を含む、請求項１に記載のジェランガム：
【化２】
2019509387.tif 000010
式III
式中、
R9、R10、R11またはR12は、互いに独立して選択され、
R10、R11またはR12は、以下である：水素、ヒドロキシル基、C1-C6アルキル基；ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基もしくはハロゲン基；アルコキシ基-OR1、式中、R1はC1-C6アルキル基を表す；基-C(O)-R2、式中、R2は水素もしくはC1-C6アルキル基を表す；基-C(O)-OR3、式中、R3は水素もしくはC1-C6アルキル基を表す；基-C(O)NR4R5、式中、R4およびR5は水素もしくはC1-C6アルキル基を表す、または基-SO2R6、式中、R6は水素もしくはC1-C6アルキル基を表す、
nは1〜4000、好ましくは50〜4000、より好ましくは500〜4000の整数である。
【請求項３】
式IVの構造を含む、請求項１または２に記載のジェランガム：
【化３】
2019509387.tif 000011
式IV
式中；R11およびR12は、互いに独立して選択され、
R11またはR12は、水素、ニトロ、シアノまたはハロゲンであり、
nは1〜4000、好ましくは50〜4000、より好ましくは500〜4000の整数である。
【請求項４】
以下を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のジェランガム：
【化４】
2019509387.tif 000012
式中、nは1〜4000、好ましくは50〜4000、より好ましくは500〜4000の整数である。
【請求項５】
nが500〜4000の整数である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項６】
前記C1-C6アルキル基が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルまたはイソヘキシルからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項７】
前記ハロゲン基が、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項８】
前記ジェランガムが、Na+、K+、Li+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Sr2+、Ba2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Sn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Ga3+およびTi3+からなる群より選択される1つ以上の一価、二価もしくは三価カチオン、またはそれらの混合物によってイオン架橋可能である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項９】
前記ジェランガムの置換度が0.1〜30%、好ましくは0.1〜15%、より好ましくは0.2〜5%である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項１０】
100〜2500KDa、より好ましくは500〜2500KDa、さらにより好ましくは1000〜2500KDaの分子量を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項１１】
ヒドロゲル、多孔質足場、繊維三次元構造、微粒子、ナノ粒子、カプセル、膜、ネット、ガーゼ、ディスクまたは噴霧可能なゲルの形態である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項１２】
ヒト医学もしくは獣医学における、または医薬品としての使用のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項１３】
組織工学または再生医療における使用のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項１４】
In vitro細胞培養における使用のための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項１５】
マイクロフラクチャーにおける使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項１６】
骨、軟骨もしくは軟部組織の疾患もしくは損傷の治療または療法における使用のための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項１７】
硝子軟骨損傷、特に膝軟骨損傷の治療または療法における使用のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項１８】
ヒト間葉系幹細胞の軟骨形成および／または骨形成および／または脂肪生成分化における使用のための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項１９】
ヒト間葉系幹細胞の軟骨形成および／もしくは骨形成および／もしくは脂肪生成分化から良い影響を受ける疾患の治療または療法における使用のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項２０】
骨修復における使用のための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項２１】
骨折、骨修復の治療もしくは療法における、または整骨療法における、または骨軟骨炎の治療における使用のための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項２２】
皮内および経皮療法における使用のための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のジェランガム。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項で定義したジェランガムと、適切な溶媒、特に水溶液とを含む、ヒドロゲル。
【請求項２４】
前記適切な溶媒が、水、細胞培養培地、水性生理食塩水溶媒、またはそれらの混合物である、請求項２３に記載のヒドロゲル。
【請求項２５】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のジェランガムの濃度が0.01%〜5%w/V、好ましくは0.5%〜5%w/Vである、請求項２３または２４に記載のヒドロゲル。
【請求項２６】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のジェランガムの濃度が0.5%〜2.5%w/V、より好ましくは1.0%〜2%w/Vである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
【請求項２７】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のジェランガムまたは請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のヒドロゲルと、細胞、幹細胞、タンパク質、生体分子、小分子活性物質、治療剤もしくは診断マーカーからなる群より選択される生物活性成分、またはそれらの混合物とを含む、組成物。
【請求項２８】
前記細胞または幹細胞が、哺乳類軟骨細胞、哺乳類間葉系間質／幹細胞、哺乳類骨髄間葉系幹細胞からなる群、またはそれらの混合物より選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
哺乳類細胞と、イオン架橋のための有効量のカチオンを含む生理学的イオン性溶液とを含む、請求項２７または２８に記載の組成物。
【請求項３０】
骨髄穿刺濃縮物、成長因子および／または抗生物質をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のジェランガムを含む組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のジェランガムまたは請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のヒドロゲルと、ヒト脂肪間葉系間質／幹細胞とを含むマトリックスを含む、組成物。
【請求項３２】
前記細胞が、前記ジェランガム、好ましくは自己細胞内にカプセル化されている、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項３３】
前記治療剤が、以下からなるリストより選択される、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の使用のための組成物：α-アドレナリン作動性アゴニスト；β-アドレナリン作動性アゴニスト；α-アドレナリン遮断薬；β-アドレナリン遮断薬；アルコール抑制剤；アルドースレダクターゼ阻害剤；アルドステロンアンタゴニスト；アミノ酸；同化剤；鎮痛剤；麻酔薬；食欲抑制剤、制酸薬；駆虫剤；抗にきび剤；抗アレルギー薬；抗アンドロゲン剤；抗狭心症薬；抗不安薬；抗不整脈薬；抗喘息薬；抗菌剤および抗生物質；抗脱毛症剤および抗抜け毛予防剤；抗アメーバ剤；抗体；抗コリン作用薬；抗凝固剤および抗凝血剤；抗結腸炎薬；抗けいれん薬および抗てんかん薬；抗膀胱炎薬；抗うつ薬；抗糖尿病薬；抗下痢剤；抗利尿薬；解毒剤；抗嘔吐薬；抗エストロゲン剤；整腸剤；抗真菌剤；抗原；抗緑内障薬；抗ヒスタミン剤；抗亢進薬；抗甲状腺機能亢進剤；抗高リポタンパク血症；抗高血圧薬；抗低血圧薬；抗感染薬；抗炎症剤；抗マラリア薬；抗片頭痛薬；抗新生物薬；抗肥満薬；抗パーキンソン病薬；抗運動障害薬；抗肺炎剤；抗原虫剤；かゆみ止め薬；抗乾癬薬；抗精神病薬；解熱薬；抗リウマチ剤；抗分泌剤；抗ショック薬；鎮痙薬；抗血栓剤；抗腫瘍剤；鎮咳剤；抗潰瘍薬；抗ウイルス剤；抗不安薬；殺菌素；骨緻密化剤；気管支拡張剤；カルシウムチャネル遮断薬；炭酸脱水酵素阻害剤；強心剤および心臓刺激剤；化学療法薬；利胆薬；コリン作動薬；慢性疲労症候群薬；CNS刺激薬および抑制剤；凝固剤；避妊薬；嚢胞性線維症治療薬；うっ血除去薬；利尿薬；ドーパミン受容体アゴニストおよびアンタゴニスト；酵素、エストロゲン；去痰薬；胃過活動薬；グルココルチコイド；止血薬；HMG CoA還元酵素阻害剤；ホルモン；催眠薬；免疫調節剤；免疫抑制剤；緩下剤；口腔および歯周病のための医薬；縮瞳薬；モノアミン酸化酵素阻害剤；粘液溶解剤；多発性硬化症薬；筋弛緩剤；散瞳薬；麻薬拮抗薬；NMDA受容体アンタゴニスト；オリゴヌクレオチド；眼科用薬剤、分娩促進剤；ペプチド、ポリペプチド；タンパク質；多糖類；プロゲストゲン；プロスタグランジン；プロテアーゼ阻害剤；呼吸刺激薬；鎮静剤；セロトニン取り込み阻害剤；性ホルモン；禁煙薬；平滑筋弛緩剤および刺激剤；ステロイド；血栓溶解剤；精神安定剤；尿酸性化剤；尿失禁治療薬；血管拡張剤；血管保護剤；皮膚保護剤および日焼け止め、またはそれらの混合物。
【請求項３４】
前記成長因子が、TGF-β1、骨形成タンパク質-2（BMP-2）、BMP-7（骨形成タンパク質-1［OP-1］としても知られる）もしくは軟骨由来の形態形成タンパク質CDMP-1およびCDMP-2、血小板溶解物、またはそれらの混合物である、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
注射可能な形態での、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項３６】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のジェランガムもしくは請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のヒドロゲル、または請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の組成物を含む、メッシュ、ディスク、足場、三次元構造、ストリップ、ネット、ガーゼまたは膜。
【請求項３７】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のジェランガムもしくは請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のヒドロゲル、または請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の組成物を含む、経皮治療システム、特にパッチ。
【請求項３８】
請求項１〜２２に記載のジェランガムもしくは請求項２３〜２６に記載のヒドロゲル、または請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の組成物および哺乳類細胞を含有するマトリックスを含む、組織工学、再生医療、またはin vitro細胞培養における使用に使用するためのキット。
【請求項３９】
式Vのジェランガムを反応させることによって、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のジェランガムを得る方法：
【化５】
2019509387.tif 000013
式V
式中、
nは1〜4000、好ましくは50〜4000、より好ましくは500〜4000の整数であり、
M+は、基Na+、K+およびLi+から選択される一価アルカリ金属イオンであるか；または基NX4であり、式中、Xは水素、またはメチル、エチル、プロピルもしくはブチルから選択されるC1-C4アルキル基を表し、
以下を有する：
第一級アミン、または、式HN-R7R8を有する第二級アミン、
R7、R8は、互いに独立して選択され、ここでR7およびR8は、少なくとも1つのカップリング剤の存在下で、任意に非求核性塩基の存在下で、請求項１で定義されるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、スタンドアロン医療器具としての使用または細胞のカプセル化に適した、改善された物理化学的および生物学的特性を有するヒドロゲルを形成する、修飾されたバイオインスパイアードジェランガムに関する。カプセル化細胞を含有する修飾ジェランガムヒドロゲルは、in vitro細胞培養のために、または組織工学、再生医療ならびに薬物送達適用における細胞および／もしくは活性物質および／もしくは生体分子の低侵襲in vivo送達ならびに保持のために使用され得る。本明細書に開示されている修飾ジェランガムヒドロゲルは、製造の再現性、高い水溶性および製剤の容易さを含む、既存のヒドロゲル系に従来から付きものである制限を克服する。修飾ジェランガムは、広範囲の生理学的に適切なカチオンによって制御可能なイオン架橋を示し、哺乳類細胞を長いin vitro培養期間中も生存可能に維持しながら、優れた接着性をin situで有する。修飾ジェランガムヒドロゲルは、健常な軟骨形成細胞外マトリックスマーカーの発現の上方調節をさらに促進する。
【０００２】
本開示は、軟骨および軟組織工学ならびに再生医療における使用のための組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞カプセル化技術は、広範なin vitro細胞培養およびスクリーニングモデル、ならびに組織工学および再生医療用途のために、ますます注目を集め続けている。特に、生理学的に適切な条件下でヒドロゲルを形成することができる、微生物源または海洋源から得られる多糖類を含む天然起源のポリマーは、in vitro細胞培養のための、ならびに哺乳類細胞および／または生体分子のin vivoでのカプセル化および送達のためのマトリックスとして、広く研究されている。さらに、特定のヒドロゲルは、他の無細胞組織工学用途における医療器具の形態のスタンドアロン製品として適用することもできる。ヒドロゲルは、物理的、酵素的、化学的またはイオン性架橋プロセスで組織化された3次元ネットワークを形成する親水性ポリマーからなる高度に水和した材料であり、哺乳類組織の細胞外マトリックス（ECM）に似ているかまたはそれを模倣する軟質および多孔質構造を形成する。気体、栄養素および代謝老廃物の連続流入を可能にする、例えば注射、生体適合性、および透過性によるなど、低侵襲処置による送達の容易さは全て、機能性細胞／生体分子カプセル化材料にとって必須条件である。さらに、ポリマーは、細胞の生存能力または機能を損なわずに架橋プロセスを介してヒドロゲル形成を経ることができ、所望の作用部位で移植された細胞および／または生体分子をしっかりと保持する能力を有していなければならない。
【０００４】
今日まで、天然の多糖類およびタンパク質に基づく多くのヒドロゲルが、推定上の細胞培養および細胞／生物活性カプセル化／送達剤として研究されてきた。これらには、とりわけ、アガロース、アルギネート、カラギーナンのファミリー、キトサン、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブリン、ゼラチンおよびシルクフィブロインが含まれる。しかしながら、これらの物質の大部分は、in vivoでの細胞培養、細胞送達、またはin vivoでのスタンドアロン治療環境におけるそれらの一般的適用性を著しく制限する重大な欠点を有する。これらには、とりわけ、製造または抽出中の構造的一貫性および合成再現性の欠如、短期および長期の物理的および代謝的不安定性、ならびに生理学的に適切な培地およびpHにおける不適切な溶解性が含まれる。場合によっては、それらは、熱感受性治療薬と相いれない生理学的温度を超える処理温度も必要とし、特定の用途には不適切な機械的特性を有するヒドロゲルの形成をもたらす。さらに、これらの材料のいくつかは、制御されていない分解速度を有し、生体材料の代謝および排除が、カプセル化細胞および／または生体分子送達によるECMまたは組織生成の速度と同期もしくは相いれないようになる。
【０００５】
したがって、細胞および／または生体分子のカプセル化のための、ならびにスタンドアロン医療器具としての、より汎用性のある生体材料の探索が続けられている。近年、そのような目的のために、ジェランガムが代替生体材料として提案されている（Oliveira、2009; 2010）。ジェランガムは、細菌シュードモナス・エロディアから分泌され、2つのD-グルコース、1つのD-グルクロン酸および1つのL-ラムノース残基[→3)-β-D-Glc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-L-Rhap-(1→]から構成される反復四糖類単位からなる線状アニオン性細胞外エキソ多糖類である。
【０００６】
商業的には、ジェランガムは、アセチル化（高アシル）および脱アセチル化（低アシル）の2つの形態で利用可能である。高アシルジェランガムは、2つのアシル置換基、すなわちアセテート（2反復単位ごとに1つのアセテート基）およびグリセラート（各反復単位ごとに1つのグリセレート基）を、両方とも同じグルコース残基の位置で含有し、一方で低アシルジェランガムは、塩基性加水分解によって生成され、典型的にはアシル置換基を5%未満で含む〜アシル基を全く含まない。これらの2つのアイソフォームは、Ca2+およびMg2+などの二価カチオンの存在下での溶液の温度低下の際に、顕著に異なる機械的特性を有する熱可逆的ヒドロゲルを生成する。これは、ジェランガムヒドロゲルの形成が不都合な加熱／冷却サイクルを必要とし、二価カチオンの存在が必須であることを意味する。ナトリウム（Na+）およびカリウム（K+）などの一価カチオンのみの存在下でのジェランガム溶液の冷却では、二価カチオンで得られたものと同様の機械的特性を有するヒドロゲルを提供するために、約100倍高いイオン濃度を必要とする。そのような高い濃度は、浸透圧ショックのためにカプセル化細胞生存を制限すると予想される。一方、ジェランガムヒドロゲルは、低い細胞傷害性を示し、温和な熱および希酸に対して比較的安定であるが、in vivoで移植された場合、3Dマトリックス内の生理学的一価カチオンとの有効な架橋を担う二価カチオンの拡散および交換のために、経時的に機械的強度を失う傾向がある。細胞カプセル化研究は、ジェランガムヒドロゲルが、ヒト関節軟骨細胞によるECMの成長および沈着をある程度まで支えることができることを証明している。それにもかかわらず、負に荷電したヒドロゲルの大きな親水性は、水分子の結合に選択的に好都合であり、細胞接着性タンパク質の吸着が細胞材料表面で大きく阻害されるようになり、結果として細胞が付着することができない。ポリマー表面での結合部位または細胞接着リガンドの欠如は、接着依存性細胞の生存および機能に有害となる可能性があり、時間の経過とともに細胞生存率が低下し、最終的に性能低下の結果をもたらす可能性がある。
【０００７】
上述のように、ジェランガムヒドロゲルの治療的有用性は、生理学的温度（37℃）以下での市販のポリマーの低い水溶性によってさらに妨げられる。市販の低アシルポリマーを、典型的には約90℃の過酷な温度の水中で少なくとも1時間加熱することによってのみ、希釈水溶液、典型的には約1%w/V濃度を得ることができる。不都合なことに、熱可逆的ゲル化は、溶液の温度が約40〜42℃に低下したときに起こる。明らかに、溶解および熱ゲル化の温度はいずれも生理学的温度（37℃）よりもかなり高いため、カプセル化すると細胞が熱ショックを受けやすくなり、それにより細胞の生存率および機能性が低下する。ジェランガムの早過ぎる熱ゲル化は、狭いゲージ針を介した注入によって送達される溶液の主要な欠点も示すため、狭い温度ウィンドウは深刻な技術的限界をもたらす。
【０００８】
ジェランガムに関連するさらなる欠点は、特に体液および外科処置中に使用される洗浄液の存在下での、生体組織および生体表面へのその限られた接着性に関する。ジェランガムヒドロゲルは、ほとんどのヒドロゲルと同様に高親水性であるため、湿潤環境において有機または無機表面（軟質または硬質組織）に効果的に接着することができない。したがって、in vivoで送達または移植されたジェランガムヒドロゲルは、いったん物理的または機械的ストレスを受けると生体表面に保持される可能性が低くなり、それにより治療的設定におけるそれらの一般的適用性および有効性を著しく低下させる。
【０００９】
ジェランガムは、グルクロン酸残基の四糖反復単位ごとに1つのカルボン酸（-CO2H）官能基を含有するため、その物理化学的および生物学的特性を最適化することを視野に入れて、ジェランガムを化学的に修飾する可能性が探求されてきた。わずかに塩基性の条件下での、大過剰のグリシジルメタクリレートとのジェランガムの反応（Silva-Correia、2011a）は、メタクリル化ジェランガム（GG-MA）を提供する。この非常に汎用性のある半合成材料は、より低い温度で親ジェランガムよりも高い水溶性を有し、水中で1〜2%w/V濃度の溶液を室温または生理学的温度のいずれかで得ることができるが、高濃度で得られる溶液粘度は、注入による送達に許容可能な範囲の上限にあり、架橋が起こった後のヒドロゲル内の望ましくない泡の形成につながり得る溶解プロセス中の過剰な空気の閉じ込めを避けるために注意を払わなければならない。親ポリマーと同様に、GG-MAは、Ca2+およびMg2+などの生理学的に適切な二価陽イオンによって促進されるイオン架橋を受け、ヒドロゲルを形成する。さらに、メタクリレート置換基上のα,β-不飽和ケトン残基の存在のために、適切なラジカル光開始剤の存在下でポリマー溶液を紫外線に曝すことによって共有結合による架橋を行うことができる。ポリマー濃度および架橋の方法／程度を変えることによって、調整可能な機械的特性を有するGG-MAヒドロゲルを調製することができる（Silva-Correia、2011b）。イオン架橋および光架橋GG-MAヒドロゲルは両方とも生体適合性であることが示されており、いくつかの細胞型をカプセル化するために使用されてきた（Silva-Correia、2013）。
【００１０】
GG-MAは、水溶性および物理化学的特性に関して上述した改善にもかかわらず、親ポリマーとある種の制限を共有する。WO2011/119059A1に記載されているように、GG-MAは「ある程度の生体接着性」を有し、それによりGG-MAヒドロゲルも湿潤環境において生物学的組織または表面に効率的に付着する可能性が低く、ストレスを加えた際にin situで保持される可能性は低い。さらに、メタクリレート置換基のグラフト化は、ジェランガムヒドロゲルに関する高親水性の問題に対処するものではなく、それによってGG-MAヒドロゲルも接着依存性細胞によるECMの長期機能的挙動および産生に最も適切な環境を提供しない。最後に、in vivoで移植された場合、3Dマトリックス内の一価カチオンによる二価カチオンの交換に起因する経時的な機械的強度の損失に関して懸念が残る。
【００１１】
近年、表面接着性生体材料の開発は生体模倣法に焦点を当てている。海産イガイは、岩表面に直接接触するそれらの接着パッドの遠位端に接着タンパク質が生成されるため、海の波の絶え間ない攻撃にもかかわらず、濡れて滑りやすい岩表面に対する優れた接着を示す。接着パッドを貝に接続する足糸は、カテコールアミンファルマコフォアを含むL-DOPA（3,4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン）として知られているアミノ酸の高い量を含有する。カテコール官能基（1,2-ジヒドロキシフェニル）は、カテコール基のオルトキノンへの酸化を含む機構、海水の中程度のアルカリ性pHによって促進されるプロセスを介して接着を媒介する役割を担う。続いて、海水中に十分に存在する三価金属イオン（主にFe3+）に対するオルトキノン部位の配位を伴うイオン架橋が、タンパク質ネットワークからなる粘着性の耐水性接着剤の形成をもたらす。カテコール官能基と三価第二鉄イオンとの間のイオン配位結合の強さは、見かけによらず強い。特定のトリス-およびビス-カテコール-Fe3+錯体は、任意の既知金属配位子キレートの最も高い安定性定数のいくつかを有し、多くの場合金属イオン-カテコール錯体を破壊するために必要な力は、共有結合のそれに匹敵する。
【００１２】
したがって、天然の接着機構を模倣することの前提は、細胞カプセル化に使用されるヒドロゲルの接着特性を改善する目的で、多くの天然ポリマーを用いて検討されてきた。調整可能な物理的および機械的特性を有するカテコール結合ポリマーが、とりわけ、キトサン（Ryu、2015）、アルギネート（Lee、2013）、ポリエチレングリコール（PEG）（Barrett、2013）およびヒアルロン酸（Shin、2015）およびそれらの混合物について記載されている。カテコール-結合アルギン酸ヒドロゲル［Huh-7、Neuro-2A、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト脂肪由来幹細胞（hASC）およびヒト神経幹細胞（hNSC）］ならびにカテコール結合ヒアルロン酸（ヒト肝細胞）にカプセル化されたさまざまな細胞型についての細胞生存率データが報告されたが、比較的短い培養期間（それぞれ最大14日間および7日間）についてのみであった。しかしながら、カテコール官能基の過ヨウ素酸ナトリウム酸化を含む、両ポリマー-カテコール共役体のさらなる化学処理工程が、金属カチオンでのイオン架橋が起こる前に必要であった。この余分な合成処理工程の不都合の他に、こうして形成されたヒドロゲルは、得られたオルト-キノンの形成および重合のために、非常に高度に着色した（褐色-黒色）。好ましくは、in vitro細胞培養剤、組織工学および再生医療用途における組織生体接着剤または細胞送達マトリックスとしての使用には、透明で無色のヒドロゲルが、生体材料および細胞懸濁成分の混合時にマトリックス内の細胞の均質な分散の視覚的確認を可能にし、ならびに画像化および生化学的アッセイによる生物学的事象の観測を容易にすることを可能にするため、好ましいとされる。PEG-カテコール結合体の場合、ヒドロゲルは三価第二鉄イオン（Fe3+）のみで形成され、pHは形成されたヒドロゲルの機械的特性に著しい影響を及ぼした。
【００１３】
強電子求引性ニトロ基のさらなる組み込みによるポリマーカテコール結合体のカテコール環の官能基化、ならびに架橋および特定のヒドロゲルの生体接着特性に及ぼすニトロ基置換の影響が報告されている（Shafiq, 2012; Cencer、2015およびDing、2015）。
【００１４】
AU2011381641 B2は、チオール基を含有するポロキサマーを含む組成物に含まれるカテコール基結合キトサンの、止血効果を有する生体接着剤としての調製を開示している。
【００１５】
EP2784101 A1は、生体接着特性を有するヒドロキシフェニル官能基化ポリ（エステルアミド）を開示している。
【００１６】
US8968716 B2は、組織接着剤として使用するための、酵素反応によりヒドロゲルをin situで形成するカテコール修飾ポリマーを開示している。
【００１７】
WO2015175655A1は、組織接着剤または防汚塗装としてのカテコール修飾ポリマーを開示している。
【００１８】
WO2013/123946は、自己治癒的、pH応答性カテコール修飾ポリマーおよびゲル組成物を開示している。機械的特性の選択的調整が特許請求されたが、好ましい細胞カプセル化特性または生物学的応答に関する詳細は明らかにされていない。
【００１９】
文献から、既存の生体材料は、in vitro細胞培養ならびに組織工学および再生医療用途の両方において、物理化学的および／または生物学的限界を示す。そのような目的のための改善された生体材料の設計は、さまざまな要因を考慮すべきである：（i）一貫した品質の観点からの再現性（ii）ヒドロゲル前駆体には、生理学的温度以下の適切濃度での迅速な溶解を促進する良好な水溶性が付与されるべきであり、（iii）ヒドロゲル前駆体は、架橋官能基を分子に導入するためのさらなる中間化学的または製造工程を必要とすることなく、機械的に安定な、組織または表面接着性および実質的に無色のヒドロゲルを形成することが可能であるべきであり、（iv）薬学的に許容されかつ生理学的に適切である、広範な一価、二価および三価の金属イオンでイオン架橋が可能であるべきである。最後に、最も望ましいヒドロゲル系は、カプセル化細胞の生存能力および長期間にわたる生体分子の機能性を維持することができ、健常な細胞外マトリックスマーカーの発現の上方調節を促進することができなければならない。
【００２０】
これらの事実は、本開示によって対処される技術的問題を例示するために開示される。
【発明の概要】
【００２１】
本開示は、一価、二価および／または三価の金属イオンをキレート化することによってヒドロゲルを形成することができる、フェノール性またはカテコール性基もしくはそれらのアイソスターで修飾されたジェランガムを含む新規ジェランガムベース材料を提供する。これらのジェランガムヒドロゲルには、in vitro細胞培養ならびに／または組織工学および再生医療における適用のための哺乳類細胞および／もしくは生体分子のカプセル化およびin vivo送達／保持のための、改善された物理化学的および生物学的特性が付与される。修飾ジェランガムヒドロゲルは、哺乳類細胞を長い培養期間中生存可能に維持し、健常な細胞外マトリックスマーカーの発現の上方調節および組織再生を促進しながら、製剤化および注射の容易さ、迅速な溶解、複数のイオン架橋モード、時間が経っても持続する機械的特性およびin situでのより高い接着性を含む、現在のヒドロゲル系に関連する従来の制限を克服する。
【００２２】
好ましい実施形態では、修飾ジェランガムのアシル化度は、アシル基なし（低アシル）〜2つのアシル置換基（高アシル）であり、すなわちアセテートおよびグリセラートが、両方とも同じグルコース残基に位置し、より好ましくは各反復単位ごとに1つのグリセラート置換基、2反復単位ごとに1つのアセテート置換基である。好ましくは、ジェランガムは、アシル基を5%未満で含む〜アシル基を全く含まない。
【００２３】
一実施形態では、市販のジェランガム（GGc）を、本明細書に記載の修飾ジェランガムヒドロゲルの調製のための出発物質として使用することができる。好ましくは、市販のジェランガムは、低アシルジェランガムである。より好ましい実施形態では、ヒドロゲル前駆体材料は、出発材料として精製ジェランガム（GGp）を用いて調製される（Doner、1997）。市販のジェランガムは、酸形態の適当なイオン交換樹脂で処理してジェランガムを中間遊離カルボン酸形態に変換することによって除去することができる二価カチオン不純物ならびに無機灰を含有する。この中間遊離カルボン酸形態のジェランガムを、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液または水酸化リチウム水溶液などの希薄なアルカリ金属水酸化物水溶液で処理すると、室温で最大5%w/Vの濃度で水にかなり可溶である対応する一価アルカリ金属塩形態のジェランガムが形成され、この形態のポリマーを、水性条件下での合成有機化学によるさらなる構造操作により適したものにする。精製ジェランガムは、二価および三価カチオンの存在下でヒドロゲルを形成するが、一価イオンのみの存在下では機械的に安定なヒドロゲルを形成することはできない。このようにして、生物学的研究における対照として使用された精製ジェランガムヒドロゲルを、架橋剤として二価カチオンCa2+およびMg2+を使用して調製した。
【００２４】
あるいは、中間遊離カルボン酸形態のジェランガムを水酸化アンモニウムまたは水酸化テトラアルキルアンモニウムで処理し、対応するアンモニウム塩形態のジェランガムを形成することができる。そのような塩は、とりわけ、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリジノンおよびDMSOなどの極性有機溶媒に可溶であるという利点を有し、これらのアンモニウム塩形態のポリマーを、非水性条件下での合成有機化学によるさらなる構造操作により適したものにする。
【００２５】
一実施形態では、物理化学的および機械的特性の制御を可能にし、修飾ジェランガムの架橋反応速度を調整するために、精製ジェランガム出発材料の分子量を変えることによって、修飾ジェランガムを100KDa〜2500KDaに及ぶ分子量の範囲で得ることができる。ジェランガムの分子量を低下させる方法は、当業者によく知られている。例えば、特許US6242035は、均質化、超音波処理、放射線、酸化および加水分解を含む、ジェランガムの分子量を低下させるいくつかの方法を記載している。酸によって触媒される加水分解は、多糖類ベースのポリマーの分子量を低下させるために使用される、特によく知られている技術である。より過酷な加水分解条件下では、多糖は、オリゴ糖および構成糖に分解され得る。とりわけ、硫酸、塩酸、酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機および無機酸を異なる濃度および反応温度で使用することにより、ジェランガムを広範な分子量で得ることが可能である。あるいは、ジェランガムの分子量は、過ヨウ素酸ナトリウム、過酸化物または2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-N-オキシル（TEMPO）などの酸化剤を用いるポリマー骨格の化学的切断を介して減少させることができる。過ヨウ素酸ナトリウムによるジェラン酸化は、広範な減少した分子量ジェランガムを得るのに特に有効である（Gong、2009）。あるいは、バシラス種GL1細菌由来の細胞外ジェランリアーゼに基づく酵素的方法を採用して、ジェランガムの分子量を減少させることができる（Hashimoto、1999）。
【００２６】
好ましい実施形態では、修飾ジェランガムは、100〜2500KDa、より好ましくは500〜2500KDa、さらにより好ましくは1000〜2500KDaの分子量を有する。
【００２７】
好ましい実施形態では、一価、二価および／または三価イオンをキレート化することができるジェランガムに結合した単位は、フェノールもしくはカテコール単位またはそのアイソスターである。フェノール基は、1つのヒドロキシル基を含む炭素環式芳香環であり、カテコールは、2つの隣接ヒドロキシル基を含む炭素環式芳香環である。好ましくは、フェノールまたはカテコール単位は、芳香環上で、1つ以上の以下の基、またはそれらの組み合わせによってさらに置換されていてもよい：C1-C6低級アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、ペンチルおよびヘキシル）；ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基またはハロゲン基（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）；低級アルコキシ基-OR1、式中、R1は上記定義のC1-C6低級アルキル基を表す；基-C(O)-R2、式中、R2は水素もしくは上記定義のC1-C6低級アルキル基を表す；基-C(O)-OR3、式中、R3は水素もしくは上記定義のC1-C6低級アルキル基を表す；基-C(O)NR4R5、式中、R4およびR5は水素もしくは上記定義のC1-C6低級アルキル基を表す；または基-SO2R6、式中、R6は水素もしくは上記定義のC1-C6低級アルキル基を表す。
【００２８】
一実施形態では、フェノールまたはカテコール単位は、ジェランガムに、酸素または任意に置換された窒素のいずれかであり得るヘテロ原子を介して直接、あるいはヘテロ原子とスペーサーまたはリンカー基とを介して共有結合していてもよい。リンカー基の適切な例には、酸素または任意に置換された窒素のいずれかであり得るヘテロ原子を介してジェランガムのカルボン酸官能基に結合されるC1-C18低級アルキル基（メチル〜オクタデシル）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、C1-C18アルキルリンカー基は、直鎖状または分岐鎖状であってよく、任意にさらに置換されていてもよく、窒素、酸素または硫黄から選択される1つ以上のヘテロ原子を任意に組み込んでいてもよい。別の実施形態では、C1-C18リンカー基は、任意に不飽和炭素-炭素結合を含んでいてもよい。
【００２９】
最も好ましい実施形態では、フェノールまたはカテコール単位は、アミド窒素ヘテロ原子およびエチル基リンカー（-NH(CH2)2-カテコールまたはフェノール）を介して、カルボン酸官能基ジェランガムに共有結合される。
【００３０】
一実施形態では、一価、二価および三価の金属カチオンをキレートすることができる、よく知られているカテコールアイソスターの例には、直交ケトン、アミノ、またはヒドロキシル官能基を含む飽和または不飽和脂肪族、炭素環または複素環式基、例えばトロポロン、キノリノン、ピロン、ピリジノンおよびピリミドンなどが挙げられる。他の可能なカテコールアイソスターは、当業者によく知られている。
【００３１】
特に好ましい実施形態では、カテコールアイソスターには、3-ヒドロキシ-4-ピリジノンまたは5-ヒドロキシピリミドン-4(3H)-オンが含まれる。
【００３２】
好ましい実施形態では、フェノールもしくはカテコール単位またはそのアイソスターを含む修飾ジェランガムは、Na+、K+、Li+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Sr2+、Ba2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Sn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Ga3+およびTi3+イオンを含む1つ以上の一価、二価および／もしくは三価金属イオン、またはそれらの混合物の存在下でイオン架橋を受けることができる。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、フェノールまたはカテコール単位を含有する修飾ジェランガムは、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存在下で、酵素的架橋を受けることができる。
【００３４】
さらに別の好ましい実施形態では、本明細書に記載の修飾ジェランガムは、水、または他の生理学的に許容される溶媒に、室温または生理学的温度（15〜37℃）で、0.01〜5%w/V、より好ましくは1〜3%w/Vの濃度で完全に可溶である。さらにより好ましくは、修飾ジェランガムは、水または生理学的に許容される溶媒に、室温で30分以下で可溶である。修飾ジェランガム溶液は、ある範囲の針ゲージ（7〜34）を介した注射により適した粘度を有する。
【００３５】
本発明は、式Iの組成を有する修飾ジェランガムのイオン架橋または酵素的架橋によってヒドロゲルを調製することができる修飾ジェランガムに関する：
【化１】
2019509387.tif 000002
式I
式中、
nは1〜4000、好ましくは50〜4000、より好ましくは500〜4000の整数であり、
Aは基-O-R7または-N-R7R8を表し、式中、R7は式IIの基を表す：
-(CH2)g-B
式II
式中、
gは0〜18の整数であり、
Bは、その芳香族環上で、1つ以上の以下の基、またはそれらの組み合わせによって任意に置換されたフェノールまたはカテコール基を表す：C1-C6アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル）；ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基またはハロゲン基（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）；アルコキシ基-OR1、式中、R1は上記定義のC1-C6アルキル基を表す；基-C(O)-R2、式中、R2は水素もしくは上記定義のC1-C6アルキル基を表す；基-C(O)-OR3、式中、R3は水素もしくは上記定義のC1-C6アルキル基を表す；基-C(O)NR4R5、式中、R4およびR5は水素もしくは上記定義のC1-C6アルキル基を表す；または基-SO2R6、式中、R6は水素もしくは上記定義のC1-C6アルキル基を表す；またはBは3-ヒドロキシ-4-ピリジノンもしくは5-ヒドロキシピリミドン-4(3H)-オン基を表す；R8は水素またはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、イソペンチルもしくはヘキシルから選択されるC1-C6アルキル基を表す。
【００３６】
別の好ましい実施形態では、本発明は、式IIIの組成を有する修飾ジェランガムのイオン架橋または酵素的架橋によってヒドロゲルを調製することができる修飾ジェランガムに関する：
【化２】
2019509387.tif 000003
式III
式中、
nは1〜4000、好ましくは50〜4000、より好ましくは500〜4000の整数であり、
R9、R10、R11およびR12は、同じかもしくは異なり、以下を表す：水素、ヒドロキシル基、C1-C6アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル）；ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基もしくはハロゲン基（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）；アルコキシ基-OR1、式中、R1は上記定義のC1-C6アルキル基を表す；基-C(O)-R2、式中、R2は水素もしくは上記定義のC1-C6アルキル基を表す；基-C(O)-OR3、式中、R3は水素もしくは上記定義のC1-C6アルキル基を表す；基-C(O)NR4R5、式中、R4およびR5は水素もしくは上記定義のC1-C6アルキル基を表す；または基-SO2R6、式中、R6は水素もしくは上記定義のC1-C6アルキル基を表す。
【００３７】
さらにより好ましい実施形態では、本発明は、式IVの組成を有するジェランガムのイオン架橋または酵素的架橋によってヒドロゲルを調製することができる修飾ジェランガムに関する：
【化３】
2019509387.tif 000004
式IV
式中：
nは1〜4000、好ましくは50〜4000、より好ましくは500〜4000の整数であり、
R11およびR12は、同じかまたは異なり、水素、ニトロ、シアノまたはハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）を表す。
【００３８】
最も好ましい実施形態では、本発明は、式Vの組成物を有する修飾ジェランガムのイオン架橋または酵素的架橋によってヒドロゲルを調製することができる修飾ジェランガムに関する：
【化４】
2019509387.tif 000005
式V
nは1〜4000、好ましくは50〜4000、より好ましくは500〜4000の整数である。
【００３９】
一実施形態では、C1-C6アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルまたはイソヘキシルからなる群より選択される。
【００４０】
一実施形態では、ハロゲン基は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素からなる群より選択される。
【００４１】
一実施形態では、ジェランガムは、特に西洋ワサビペルオキシダーゼおよび過酸化水素によって酵素的に架橋可能であり得る。
【００４２】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示のジェランガムは、ヒト医学もしくは獣医学において、または医薬品として使用されるか、またはin vitro細胞培養における使用のためのものである。好ましくは、本開示のジェランガムは、組織工学または再生医療において使用される。より好ましくは、本開示のジェランガムは、マイクロフラクチャー、または骨、軟骨もしくは軟部組織の疾患もしくは損傷の治療または療法に使用される。さらにより好ましくは、硝子軟骨損傷、特に膝軟骨損傷の治療または療法における使用のためのもの。さらにより好ましくは、本開示のジェランガムは、ヒト間葉系幹細胞の軟骨形成および／または骨形成および／または脂肪生成分化に使用される。
【００４３】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示のジェランガムは、ヒト間葉系幹細胞の軟骨形成および／もしくは骨形成および／もしくは脂肪生成分化から良い影響を受ける疾患の治療または療法に使用され得る。
【００４４】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示のジェランガムは、骨修復およびマイクロフラクチャーに使用され得る。
【００４５】
より良好な結果のための実施形態では、本開示のジェランガムは、骨折、骨修復の治療もしくは療法において、または整骨療法において、または骨軟骨炎の治療において使用され得る。
【００４６】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示のジェランガムは、皮内および経皮療法で使用され得る。
【００４７】
一実施形態では、式I、III、IVおよびVの組成を有する修飾ジェランガムは、当業者によく知られている適切なカップリング剤の存在下で、市販のジェランガム（GGc）または精製ジェランガム（GGp）を、適切に置換されたアルコールまたは適切に置換された第一級および第二級アミンと反応させ、酸素または窒素求核剤との反応のためにカルボン酸の活性化を促進し、それぞれエステルおよびアミドを形成することによって調製することができる。適切なカップリング剤には、以下が含まれる：カルボジイミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）または1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC）などを、ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）またはN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）などの添加剤の有無に関わらず、ホスホニウム塩、例えばベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、グアニジニウムおよびウラン塩、例えば(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートおよびN,N,N',N'-テトラメチル-O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)ウロニウムテトラフルオロボラートならびにトリアジン、例えば塩化シアヌルおよび2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン（CDMT）などを、とりわけ、N-メチルモルホリンと組み合わせて。特に好ましいカップリング剤には、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DTMMCl）が含まれる。驚くべきことに、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミンまたはDBUなどの非求核性塩基の添加を必要とせずに、精製ゲランガムと塩形態の第一級および第二級アミン（塩酸塩、臭化水素酸塩）との反応のためのカップリング剤としてDTMMClを使用し、第一級および第二級アミンの反応性遊離塩基形態を放出することができることが見出された。これは特に、ドーパミンなど、遊離塩基形態では反応性が高く、迅速に自己縮合して強く着色したポリドーパミンを形成し、望ましくない暗色をドーパミン修飾ジェランガムに与えるアミンの場合に重要である。ドーパミン塩酸塩を使用する際にカップリング剤としてDTMMClを使用することにより、アミン塩に対してわずかに過剰の塩基を添加する必要はなく、白色から灰白色の粉末として修飾ジェランガムが得られる。
【００４８】
本開示の別の態様は、本開示の修飾ジェランガムと、適切な溶媒、特に水溶液とを含むヒドロゲルに関する。好ましくは、適切な溶媒は、水、細胞培養培地、水性生理食塩水溶媒、またはそれらの混合物である。
【００４９】
より良好な結果のための実施形態では、本開示のジェランガムの濃度は、0.01%〜5%w/V、好ましくは0.5%〜5%w/V、より好ましくは0.5%〜2.5%w/Vさらにより好ましくは1.25%〜2%w/Vである。
【００５０】
本開示の別の態様は、本開示のジェランガムまたはヒドロゲルと、細胞、幹細胞、タンパク質、生体分子、小分子活性物質、治療剤もしくは診断マーカーからなる群より選択される生物活性成分、またはそれらの混合物とを含む組成物に関する。
【００５１】
より良好な結果のための実施形態では、細胞または幹細胞は、哺乳類軟骨細胞、哺乳類間葉系間質／幹細胞、哺乳類骨髄間葉系幹細胞からなる群、またはそれらの混合物より選択される。
【００５２】
より良好な結果のための実施形態では、組成物は、哺乳類細胞と、イオン架橋のための有効量のカチオンを含む生理学的イオン性溶液とを含み得る。
【００５３】
より良好な結果のための実施形態では、組成物は、骨髄穿刺濃縮物、成長因子および／または抗生物質をさらに含み得る。
【００５４】
より良好な結果のための一実施形態では、組成物は、本開示のジェランガムまたは本開示のヒドロゲルと、ヒト脂肪間葉系間質／幹細胞とを含むマトリックスをさらに含み得る。
【００５５】
より良好な結果のための実施形態では、細胞は、ジェランガム、好ましくは自己細胞内にカプセル化され得る。
【００５６】
より良好な結果のための実施形態では、成長因子は、TGF-β1、骨形成タンパク質-2（BMP-2）、BMP-7（骨形成タンパク質-1［OP-1］としても知られる）もしくは軟骨由来の形態形成タンパク質CDMP-1およびCDMP-2、血小板溶解物、またはそれらの混合物であり得る。
【００５７】
組成物は、局所、経腸および非経口を含むさまざまな経路によって投与することができる。非経口投与経路には、動脈内、関節内、腔内、皮内、リンパ管内、筋肉内、滑液嚢内、静脈内、および皮下が含まれる。経腸経路には、経口および胃腸が含まれる。局所経路には、皮膚および粘膜への塗布が含まれる。
【００５８】
好ましい実施形態では、組成物は、注射可能な形態または経皮的形態、すなわちin situ注射または経皮治療システム、より好ましくはパッチで患者に送達される。
【００５９】
本開示の別の態様は、本開示のジェランガムもしくは本開示のヒドロゲル、または本開示の組成物を含む、メッシュ、ディスク、足場、三次元構造、ストリップ、ネット、ガーゼまたは膜に関する。
【００６０】
本開示のジェランガムもしくは本開示のヒドロゲル、または本開示の組成物を含む、経皮治療システム、特にパッチ。
【００６１】
本開示のジェランガムもしくは本開示のヒドロゲル、または本開示の組成物および哺乳類細胞を含む、組織工学、再生医療、またはin vitro細胞培養における使用に使用するためのキット。
【００６２】
したがって、本開示の別の態様は、式VIの精製ジェランガムを反応させることによって、式I、式III、式IVおよび式Vの無色の修飾ジェランガムを調製する方法を含む：
【化５】
2019509387.tif 000006
式VI
式中：
nは1〜4000、好ましくは50〜4000、より好ましくは500〜4000の整数であり、
M+は、基Na+、K+およびLi+から選択される一価アルカリ金属イオンを表すか；またはM+は基N+X4を表し、式中、Xは水素もしくはC1-C4アルキル基（メチル、エチル、プロピル、ブチル）を表し、以下を有する：第一級、第二級または第三級アルコール、式HO-R7もしくはHN-R7R8を有する第一級アミンまたは第二級アミン、式中、R7およびR8は上記で定義した通りであり、反応は少なくとも1つのカップリング剤の存在下で、任意に非求核性塩基の存在下で行われる。
【００６３】
式I、IIIおよびIVのジェランガムヒドロゲルを得るための、市販または精製ジェランガムとアルコールおよびアミンとのカップリングは、水、蒸留水もしくは滅菌水中、またはN,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリジノンおよびジメチルスルホキシド（DMSO）などの極性有機溶媒中、反応のpH制御が望ましいと考えられる場合、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（MES）またはリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）の水溶液などの緩衝媒体中で実施することができる。好ましくは、カップリング反応は、水と1つまたは任意により多くの極性有機溶媒との混合物中で実施され得る。
【００６４】
より良好な結果のための実施形態では、市販または精製ジェランガムとアルコールおよびアミンとのカップリングは、非求核性塩基の存在下で実施され得る。適切な非求核性塩基には、とりわけ以下が含まれる：アルキルアミン、例えばトリエチルアミン、トリブチルアミンおよびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（ヒューニッヒ塩基）など、環状アミン、例えば1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン（DBU）およびN-メチルモルホリンなど、ならびに芳香族アミン、例えばピリジン、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン、2,6-ジメチルピリジンおよびコリジンなど。
【００６５】
より良好な結果のための一実施形態では、ジェランガムとアルコールおよびアミンとのカップリング反応は、0℃〜溶媒の沸点、好ましくは10〜60℃、さらにより好ましくは15〜40℃の温度で実施され得る。
【００６６】
より良好な結果のための一実施形態では、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールなどのアルコール、アセトンなどのケトン、またはジエチルエーテルもしくはジイソプロピルエーテルなどのジアルキルエーテルを含む、1〜50容量の水混和性有機溶媒の添加による生成物の沈殿によって、その後の濾過による相分離によって、本開示の修飾ジェランガムを反応混合物から回収することができる。所望であれば、このようにして得られた修飾ジェランガムは、水中での反復再構成および沈殿によってさらに精製することができる。
【００６７】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の沈殿した修飾ジェランガムを水に可溶化し、低分子量汚染物質の拡散を可能にする適切な細孔サイズを有するセルロース膜を使用する水での透析によって精製することができる。あるいは、例えば、前記汚染物質を通過させる適切な細孔サイズを有するセルロースまたはポリエーテルスルホン膜を使用して、限外濾過によって精製を達成することができる。
【００６８】
より良好な結果のための実施形態では、例えば、0.22μmの病原体非含有ポリエーテルスルホン膜を通す濾過により、真空または圧力を加えることにより、修飾および精製ジェランガムを含有する水溶液を無菌化（細菌性微生物および内毒素の不在）することができる。
【００６９】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の修飾ジェランガムは、0〜-210℃、好ましくは-20〜-80℃の温度で溶液をまず凍結し、続いて-40〜-90℃の温度で約0.01ミリバールの圧力で真空凍結乾燥（凍結乾燥）させることによって単離することができる。あるいは、修飾ジェランガムは、溶液の噴霧乾燥によって単離されてもよい。噴霧乾燥条件を慎重に選択することにより、さまざまな粒径を有する修飾ジェランガムを得ることができる。好ましい場合、噴霧乾燥を、抗生物質、医療用成分および添加剤と組み合わせて使用し、ジェランガムをカプセル化したまたは充填した材料を形成することができる。
【００７０】
より良好な結果のための一実施形態では、溶液または固体状態での修飾ジェランガムの滅菌方法には、とりわけ以下が含まれる：湿式または乾式加熱、エチレンオキシドへのばく露、適切な圧力および温度で、二酸化炭素などの超臨界流体との接触、メタノール、エタノールもしくはイソプロパノールを含むアルコールなどの共溶媒、または過酸化水素もしくはペルオキシ酢酸などの過酸化物の任意の存在、またはUVもしくはガンマ線照射。
【００７１】
このようにして得られた修飾ジェランガムは、核磁気共鳴（NMR）分光法などの分析技術によって、構造の観点から特徴付けることができる。この技術は、選択された参照ピークの統合に基づく数学的方程式の適用によって、イオンキレート化フェノール性およびカテコール性置換基による修飾ジェランガムの置換度を決定するためにも使用できる（Hamcerencu、2008）。
【００７２】
ある実施形態では、適切な反応温度、試薬の化学量論および反応時間の選択により、ジェランガムの異なる置換度を得ることができ、修飾ジェランガムの物理化学的、機械的および生物学的特性を特定の用途のために調整することができる。好ましくは、ジェランガムの置換度は0.01〜30%、より好ましくは0.1〜20%、最も好ましくは0.5〜15%である。前段落で述べたように、置換度は、ジェランガムのエステル誘導体に関する文献に報告されている方程式を用いて計算することができる（Hamcerencu、2008の2.4章に記載のNMR分光法による）。
【００７３】
より良好な結果のための実施形態では、本開示の修飾ジェランガムは、空気中、生理学的温度（37℃）および室温（20℃）以下で安定な物質であり、これらは、粉末、水溶液、または注射用の滅菌水、生理食塩水もしくはリン酸緩衝化生理食塩水などの薬学的に許容される溶媒中の滅菌注射溶液の形態で、組成物中に提供され得る。
【００７４】
より良好な結果のための一実施形態では、本発明のガムの修飾ジェランガムは、低い多分散指数（Mw/Mn）、好ましくは＜3、より好ましくは＜2.5を有する。多分散指数は、ゲル透過クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって決定され得る。この目的のために、典型的に4つのカラムのセットに直角散乱および粘度計検出器、屈折率検出（RI-Detector 8110、Bischoff）を備えたMalvern Viscotek TDA 305屈折計を使用することができる。系を30℃に保ち、MilliQ水またはその他の適切な溶媒を約1mL/分の流速で溶離液として使用する。溶出時間およびRI検出シグナルは、狭い多分散性および180Da〜708KDaに及ぶMp（最大ピークでの分子量）を有する規格を含む市販の多糖類セットで較正することができる。
【００７５】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の修飾ジェランガムは、in vitroおよびin vivo適用のための無細胞系または細胞系のいずれかとして使用されてよく、手動またはコンピュータ支援システムを用いて自動で分配することができ、注射などの低侵襲処置によってヒト／動物の身体に送達されてもよく、生理学的に適切なカチオンによって所望の作用部位で直接的にイオン架橋されるか、あるいは他の薬学的に許容されるカチオン添加剤によって製剤にイオン架橋される。
【００７６】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の修飾ジェランガムは、部位特異的送達および保持のために、生物活性剤または治療剤と、薬学的に許容される量で混合されてもよい。好ましい実施形態では、生物活性剤または治療剤は、細胞、幹細胞、タンパク質、診断マーカーまたは小分子活性物質、またはそれらの混合物である。生物活性剤または治療剤が細胞である場合、細胞は自己または同種異系であり得る。
【００７７】
より良好な結果のための実施形態では、細胞は軟骨形成細胞に関連し得る。好ましい実施形態では、細胞は、多能性または多分化能性幹細胞に関する。より好ましい実施形態では、細胞は、成体間葉系間質／幹細胞と関連する。好ましい実施形態では、細胞は骨髄または脂肪組織から得られ、これを患者からの単離の直後に使用することができ、または別の方法としてマスター細胞バンクもしくはワーキングセルバンクから供給される。この場合、前記細胞のドナーは、年齢、体格指数、血液媒介病原体の不在、任意の特定の病状の有無などの関連因子に関しても適格とされている。好ましい実施形態では、細胞は、無菌性、生存率、および間葉系間質／幹細胞マーカーの発現について適格とされている。より好ましい実施形態では、軟骨形成前駆細胞の亜集団は、限定されないが、CD73、CD106、CD271、CD29、SOX-9、dlk1/FA1、CD44およびCD151マーカーを発現する細胞などの初期間質／幹細胞から選択される。好ましい実施形態では、細胞を異物非含有細胞培養培地中で増殖させて必要な細胞数を得て、これらを1〜10の継代、好ましくは2〜5の継代で使用する。
【００７８】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の修飾ジェランガムは、軟骨細胞のみと、または間葉系間質／幹細胞と組み合わせて軟骨細胞と混合され得る。あるいは、修飾ジェランガムは、以下から選択される細胞と混合され得る：胚性幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、羊水幹細胞、人工多能性幹細胞、外胚葉系統の細胞、例えば星状細胞、ベッチェル細胞、脈絡叢上皮細胞、上皮細胞、クラウジウス細胞、円柱細胞、錐体光受容体、暗細胞、導管細胞、上衣細胞、上皮細胞、腺細胞、有毛細胞、硝子体細胞、歯間細胞、ケラチノサイト、レンズ線維細胞、明細胞、メルケル細胞、ミュラー細胞、筋上皮細胞、ニューロン、希突起神経膠細胞、指節細胞、柱状細胞、松果間質細胞、松果体細胞、下垂体細胞、下垂体細胞、半月状面細胞、桿体細胞、皮脂腺細胞、分泌細胞、扁平上皮細胞、星状細胞、血管条細胞、支持細胞、タニサイト、I型味蕾細胞、前庭器膜細胞、内胚葉系統の細胞、例えば腺房細胞、アルファ細胞、銀親和性細胞、ベータ細胞、刷子縁細胞、腺房中心細胞、色素嫌性細胞、繊毛呼吸器管細胞、クララ細胞、デルタ細胞、導管細胞、上皮細胞、胃腸膵管細胞、腺細胞、肝細胞、酸分泌細胞、パネート細胞、肺細胞、主（主）細胞、肺内分泌細胞、分泌性胃細胞、胸腺上皮-網様細胞、胸腺細胞、甲状腺濾胞細胞、酵素原細胞、中胚葉系統の細胞、例えば脂肪細胞、刷子縁細胞、セメント芽細胞、軟骨吸収細胞、繊毛生殖細胞（男性および女性）、黄体細胞、樹状細胞、導管細胞、内皮細胞、上皮細胞、赤血球、線維芽網状細胞、卵胞細胞、腺細胞、間質細胞、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、白血球、ライディッヒ細胞、沿岸細胞、リンパ球、マクロファージ、緻密斑細胞、肥満細胞、巨核球、メサンギウム細胞、中皮細胞、小膠細胞、単球、破骨細胞、骨芽細胞、筋肉細胞、筋線維芽細胞、非繊毛細胞、髄核細胞、壁細胞、極周囲細胞、形質細胞、形質細胞様樹状細胞、精巣上体主細胞、プルキンエ線維細胞、分泌細胞、漿膜細胞、セルトリ細胞、腱細胞、精巣間質細胞、内莢膜細胞、束状帯、球状帯および網様体細胞、有足細胞、軟骨細胞、周皮細胞、骨細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、神経堤系列の細胞、例えば頸動脈小体i型細胞、クロム親和性細胞、腸管グリア細胞、上皮細胞、メラニン形成細胞、筋上皮細胞、ニューロン、象牙芽細胞、傍濾胞細胞、衛星細胞、シュワン細胞、小強度の蛍光細胞、扁平上皮細胞、頸動脈小体ii型細胞および分泌細胞、またはそれらの混合物。
【００７９】
より良好な結果のための一実施形態では、修飾ジェランガムは、全体的な有効性を改善するために、物質の生物学的利用能および／または放出プロファイルを改善するための手段として、局所、経腸または非経口経路、例えば眼、鼻、耳、舌下、直腸、膣または経皮投与を介した部位特異的送達および保持に対して薬学的に許容される量の生物活性剤もしくは治療剤と混合またはカプセル化することができる。この文脈における生物活性剤または治療剤は、生物学的または生理学的機能性を増強、修飾または維持することを目的とする薬物または化粧剤として定義される。例えば、生物活性剤または治療剤は、以下を含み得る：α-アドレナリン作動性アゴニスト；β-アドレナリン作動性アゴニスト；α-アドレナリン遮断薬；β-アドレナリン遮断薬；アルコール抑制剤；アルドースレダクターゼ阻害剤；アルドステロンアンタゴニスト；アミノ酸；同化剤；鎮痛剤；麻酔薬；食欲抑制剤、制酸薬；駆虫剤；抗にきび剤；抗アレルギー薬；抗アンドロゲン剤；抗狭心症薬；抗不安薬；抗不整脈薬；抗喘息薬；抗菌剤および抗生物質；抗脱毛症剤および抗抜け毛予防剤；抗アメーバ剤；抗体；抗コリン作用薬；抗凝固剤および抗凝血剤；抗結腸炎薬；抗けいれん薬および抗てんかん薬；抗膀胱炎薬；抗うつ薬；抗糖尿病薬；抗下痢剤；抗利尿薬；解毒剤；抗嘔吐薬；抗エストロゲン剤；整腸剤；抗真菌剤；抗原；抗緑内障薬；抗ヒスタミン剤；抗亢進薬；抗甲状腺機能亢進剤；抗高リポタンパク血症；抗高血圧薬；抗低血圧薬；抗感染薬；抗炎症剤（ステロイド性および非ステロイド性）；抗マラリア薬；抗片頭痛薬；抗新生物薬；抗肥満薬；抗パーキンソン病薬；抗運動障害薬；抗肺炎剤；抗原虫剤；かゆみ止め薬；抗乾癬薬；抗精神病薬；解熱薬；抗リウマチ剤；抗分泌剤；抗ショック薬；鎮痙薬；抗血栓剤；抗腫瘍剤；鎮咳剤；抗潰瘍薬；抗ウイルス剤；抗不安薬；殺菌素；骨緻密化剤；気管支拡張剤；カルシウムチャネル遮断薬；炭酸脱水酵素阻害剤；強心剤および心臓刺激剤；化学療法薬；利胆薬；コリン作動薬；慢性疲労症候群薬；CNS刺激薬および抑制剤；凝固剤；避妊薬；嚢胞性線維症治療薬；うっ血除去薬；利尿薬；ドーパミン受容体アゴニストおよびアンタゴニスト；酵素、エストロゲン；去痰薬；胃過活動薬；グルココルチコイド；止血薬；HMG CoA還元酵素阻害剤；ホルモン；催眠薬；免疫調節剤；免疫抑制剤；緩下剤；口腔および歯周病のための医薬；縮瞳薬；モノアミン酸化酵素阻害剤；粘液溶解剤；多発性硬化症薬；筋弛緩剤；散瞳薬；麻薬拮抗薬；NMDA受容体アンタゴニスト；オリゴヌクレオチド；眼科用薬剤、分娩促進剤；ペプチド、ポリペプチド；タンパク質；多糖類；プロゲストゲン；プロスタグランジン；プロテアーゼ阻害剤；呼吸刺激薬；鎮静剤；セロトニン取り込み阻害剤；性ホルモン；禁煙薬；平滑筋弛緩剤および刺激剤；ステロイド；血栓溶解剤；精神安定剤；尿酸性化剤；尿失禁治療薬；血管拡張剤；血管保護剤；皮膚保護剤および日焼け止め、ならびにそれらの組み合わせ。
【００８０】
より良好な結果のための実施形態では、手動または自動プロセスおよびシステムを使用して本開示の修飾ジェランガムを処理し、ヒドロゲル、多孔質足場、繊維、三次元構造体、微粒子、ナノ粒子、カプセル、膜、ネット、ガーゼまたはディスクなどの異なるタイプの足場を形成することができる。別の好ましい実施形態では、修飾ジェランガムは、改善された粘膜付着特性を有する噴霧可能なゲルを形成するように処理されてもよい。
【００８１】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の修飾ジェランガムヒドロゲルは、第2の修飾ジェランガムまたは非修飾ジェランガムをさらに含んでもよい。
【００８２】
より良好な結果のための一実施形態では、本明細書に開示の修飾ジェランガムヒドロゲルは、組織充填剤またはパッチとしてのスタンドアロン医療器具として使用され得る。好ましい実施形態では、一例として、修飾ジェランガムヒドロゲルは、マイクロフラクチャー（MFX）に関して足場増強のために使用される他の材料よりも改善された医療器具として使用され得る。1980年代に開発されたMFXは、比較的小さく症候性の軟骨損傷のための第一次関節鏡治療法となっていた。要するに、マイクロフラクチャーの間に、軟骨欠損内の軟骨下骨プレートの貫通は、穿孔またはキルシュナー鋼線の使用のいずれかにより、出血およびフィブリン塊の形成を引き起こし、欠損部位を満たし露出骨表面を覆うと考えられる。多能性の骨髄由来の間葉系幹細胞は、凝血塊に浸潤し、修復組織の形成を促進する。残念ながら、修復組織は、主に線維軟骨からなり、通常の健常硝子軟骨と比較して劣った生化学的および生体力学的性質を有する。さらに、おそらくフィブリン塊が損傷部位から単に離脱し、それを取り除くか、または放出された骨髄幹細胞の脱出を可能にするという事実のために、処置の臨床効果は非常に変わりやすい。
【００８３】
したがって、II型コラーゲンの形成およびプロテオグリカン含量の増加をより促進しやすい損傷部位内の環境を提供することによって、硝子様組織のより効果的な再生を改善することに努力が集中している。このように、天然または合成ポリマーに基づく足場移植は、修復組織と健常軟骨の隣接周囲領域との統合を補助しながら、フィブリン塊を欠損内に維持し、骨髄幹細胞の接着および移動を容易にする目的で、MFX処置を増強する医療器具（表１）としての使用に提案されてきた。
【表１】
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【００８４】
それにもかかわらず、表１に提示された医療器具は全てさまざまな欠点がある。第1に、後者の3つは、関節接合部の完全な露出を伴う関節切開手術を必要とし、患者に病的状態および複雑な術後回復プロセスをもたらす。理想的な医療器具は、低侵襲処置、すなわち関節鏡処置を介する注入によって送達されるべきである。第2に、MFX空間における既存の医療器具の大部分には、潜在的なプリオン汚染および感染の問題、アレルギー反応ならびに一部の地域における倫理的考慮に起因する、望ましくない動物成分が含まれている。理想的な医療器具は異物がなく、非動物源からの材料で製造される。最後に、最も重要なのは、既存の医療器具の大部分に自律的な接着性がなく、つまり、フィブリン糊などの追加の固定補助剤を必要とする。異物非含有でないことによる考慮に加えて、これは、外科的処置に別の複雑な工程を追加する。理想的な医療器具は、さらなる固定を必要とせずに、損傷部位内の所定の位置に留まることができる。
【００８５】
驚くべきことに、本明細書中に開示の異物非含有修飾ジェランガムは、これらの要求を提示し、現状の最先端技術の限界を克服する。MFX処置中に出血が観察された直後に、修飾ジェランガム製剤を関節鏡検査中にシリンジによる注射によって損傷部位に適用し、約10分間重合させることができる。この時間中、修飾ジェランガムヒドロゲルは、0.9%w/v塩化ナトリウム溶液を用いて水和状態に維持され、その一価ナトリウムイオンが表面のポリマーのイオン架橋を促進する。修飾ジェランガムヒドロゲルの接着特性のために、さらなる固定補助剤は必要とされず、ヒドロゲルは、損傷部位のより良好な充填を提供することができ、損傷内の骨髄幹細胞を含む血餅を維持することもでき、より高品質な軟骨の再生および周囲の健常組織とのより良好な統合をもたらす。
【００８６】
別の好ましい実施形態では、修飾ジェランガムヒドロゲルを使用して、自己骨髄穿刺濃縮物をカプセル化することができ、これは当業者に知られている技術によって得ることができ、調製物は同じ手順を使用して関節鏡検査法で損傷部位に送達され得る。
【００８７】
さらなる実施形態では、修飾ジェランガムヒドロゲルは、単独でまたは細胞とともに、例えば以下などの成長因子をさらに含んでいてもよい：TGF-β1、骨形成タンパク質-2（BMP-2）、BMP-7（骨形成タンパク質-1［OP-1］としても知られる）ならびに軟骨由来の形態形成タンパク質CDMP-1およびCDMP-2、血小板溶解物および／または抗生物質などの小分子。
【００８８】
以下の図面は、説明を例示するための好ましい実施形態を提供するものであり、発明の範囲を限定するものとして見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】精製ジェランガム（D2O、1%w/v、70℃）の1H NMRスペクトルを表す図である。
【図２】3当量のドーパミン（GG-DOPA3、D2O、1%w/v、70℃）で修飾された精製ジェランガムの1H NMRスペクトルを表す図である。
【図３】6-ニトロドーパミンヘミ硫酸塩（NITRODOPA、DMSO-d6,1%w/v、70℃）の1H NMRスペクトルを表す図である。
【図４】1当量の6-ニトロドーパミン（GG-NITRODOPA1、D2O、1%w/v、70℃）で修飾された精製ジェランガムの1H NMRスペクトルを表す図である。
【図５】1%w/vの濃度のGG-DOPA3水溶液のせん断速度の増加に応じた粘度プロファイルを表す図である。
【図６】修飾ジェランガムから調製された典型的な多孔質脱水無細胞足場（左）、再水和無細胞足場（中）、およびヒドロゲル（右）を表す図である。
【図７】全血を架橋剤として使用して修飾ジェランガムから調製された典型的なヒドロゲルを表す図である。
【図８】時間をかけて水溶液に浸漬された修飾ジェランガム足場の膨潤特性を表す図である。
【図９】時間をかけて水溶液に浸漬された修飾ジェランガム足場の吸水能力を表す図である。
【図１０ａ】試験条件後の、直径8mmおよび厚さ2mmのex vivo軟骨損傷内のGGベースのヒドロゲルの固定を表す図である。GGp-DOPA1およびGGp-DOPA3ヒドロゲルの完全な固定ならびにGGpおよびGG-MAヒドロゲルの部分的固定のみであることに留意されたい。
【図１０ｂ】ブタ関節（中心画像）の、全ての接着試験に順番に合格した後の、GGp-DOPA3ヒドロゲルで充填した1および3〜7として示される6つの離脱を表す図である。Xとして示される離脱は、空の対照欠損である。
【図１１】培養21日後にGGベースの製剤にカプセル化された細胞の生／死画像を表す図である。緑 = 生きている；赤 = 死んでいる。倍率 = 50倍。
【図１２】GGp-DOPA1、GGp-DOPA3、GGpまたはGG-MAヒドロゲル内で軟骨形成系統に分化したヒト脂肪間質／幹細胞の遺伝子発現を表す図である。結果を、培養21日後の細胞の発現比（d21）として示し、培養前値（d0）に正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
本開示は、室温および生理学的温度（37℃）でゲル化および製剤特性を改善するのに適したイオンキレート化フェノール性ならびにカテコール性置換基を含む修飾ジェランガムを提供し、それらは必要最小限に着色され、顕著に表面接着性のヒドロゲルを形成し、それはヒドロゲル内にカプセル化した後により高い細胞生存率をより長い時間維持し、健常な細胞外マトリックスマーカーの発現の上方制御を促進する。
【００９１】
当業者であれば、以下の説明、ならびに本明細書で使用される用語を、開示の主題を最も良く説明するためのものと理解し、そうするように選択された実施形態が包括的であること、または本発明を開示の形態に限定することを意図するものではないことを理解するであろう。代替の手法、等価物および条件は、当業者には明らかであろう。
【００９２】
（市販のジェランガムの精製）
市販のジェランガム（Sigma、5g）を、蒸留水（500mL）に60℃に加熱しながら溶解した。溶液pHが約2.4に安定するまで、Amberlyst IR-120（H+型）イオン交換樹脂を、溶液のpHが約2.4に安定するまで30分間添加した。この溶液を60℃で10分間撹拌し、濾過して樹脂を除去した。濾液に、pHが8.5に達するまで水酸化ナトリウム水溶液を添加した。溶液をエタノールに注ぎ、沈殿物を形成させた。室温で1時間撹拌した後、液相をデカントし、残った沈殿物を濾過し、蒸留水に溶解し、蒸留水で透析した。凍結および凍結乾燥の後、精製ジェランガムを白色固体3.2gとして得た。精製ジェランガム生成物の1H NMRスペクトル（図１）は、予想される構造と一致する。
【００９３】
（3当量のドーパミン（GGp-DOPA3）での精製ジェランガムの修飾）
精製ジェランガム100mgを10mLの蒸留水に室温で溶解した。次に0.124gのDTMMClを2mLの水に溶解し、溶液に滴加し、これを室温で30分間撹拌した。次に、3モル当量のドーパミン塩酸塩（DOPA、85mg）を2mLの水に溶解し、溶液に滴加し、その後溶液を24時間撹拌したままにした。翌日、溶液を撹拌から除去し、エタノール10mLを加え、溶液を1時間静置した。次に、エタノールをデカントし、残った沈殿物を蒸留水に溶解し、蒸留水で5日間透析した後、-20℃で凍結し、凍結乾燥して生成物（GGp-DOPA3）を白色固体128mgとして得た。生成物の1H NMRスペクトル（図２）は、ドーパミンで修飾されたジェランガムの予想される構造と一致する。この場合の置換度は約4%と測定された。
【００９４】
精製ジェランガム出発材料に対して、上記実施例で使用した活性化剤およびドーパミン塩酸塩のモル当量を適切に減少または増加させることにより、置換度が0.01〜30%の修飾ジェランガムを得ることが可能である。例えば、上記手順を1または7.5モル当量のいずれかで適用すると、より低い（GGp-DOPA1）およびより高い（GGp-DOPA 7.5）置換度（2.1および5.6%）をそれぞれ有するDOPA修飾ジェランガムを得ることが可能である。
【００９５】
典型的には、DOPA修飾ジェランガムは、約7〜10%の残留水分を水の形態で含有する。残留溶媒、金属、重金属、および浸出性不純物の試験は、通常、試験方法の検出限界未満の分析レベルを返す。
【００９６】
精製ジェランガム出発材料の分子量をさらに変化させることにより、ゲル浸透またはサイズ排除クロマトグラフィー（GPC-SEC）、ポリマー材料の平均分子量（Mw）、平均分子数（Mn）および固有粘度（IV）を測定するための標準技術によって決定される、さまざまな分子量のDOPA修飾ジェランガムを得ることが可能である（表II）。
【表２】
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【００９７】
当業者には明らかであるように、同じ合成手順を適用し、適切に置換されたアルコール（R7-OH）および第一級／第二級アミン（HN-R7R8）をドーパミンの代わりに使用することによって、全範囲の本明細書で開示の修飾ジェランガムを調製することができる。
【００９８】
（ドーパミン塩酸塩のニトロ化）
蒸留水（25mL）中のドーパミン塩酸塩（1.92g、10mmol）の撹拌溶液に亜硝酸ナトリウム（1.52g、22mmol）を加え、溶液を氷水浴で冷却した。その後、蒸留水（10mL）中の硫酸（1mL）の溶液を滴加し、反応混合液の外観を深い橙赤色に変えた。添加の終わり頃に、濃い黄橙色の沈殿物が形成された。次いで、混合液を室温で一晩撹拌し、次いで濾過し、氷冷水、無水エタノール、次いでジエチルエーテルで連続的に洗浄した。真空乾燥後、6-ニトロドーパミンヘミ硫酸塩を黄色固体として得た。生成物の1H NMRスペクトル（図３）は、予想される構造と一致する。
【００９９】
（1当量の6-ニトロドーパミン（GGp-NITRODOPA1）での精製ジェランガムの修飾）
500mgの精製ジェランガムを室温で蒸留水（50mL）に溶解した。次いで0.20gのDTMMClを蒸留水（5mL）に溶解し、溶液に滴加し、室温で30分間撹拌した。次に、1モル当量の6-ニトロドーパミンヘミ硫酸塩（NITRODOPA、220mg）をN,N-ジメチルアセトアミド（8mL）に溶解し、溶液に滴加し、次いでこれを24時間撹拌した。翌日、溶液を500mLのエタノールに注ぎ、沈殿物を1時間撹拌したまま静置した。その後、沈殿物を濾過し、エタノールで洗浄した後、蒸留水（200mL）に溶解した。生成物を蒸留水で5日間透析し、次いで凍結および凍結乾燥させて、生成物（GGp-NITRODOPA1）を橙黄色固体として得た。生成物の1H NMRスペクトル（図４）は、ニトロドーパミンで修飾されたジェランガムの予想される構造と一致する。
【０１００】
上記実施例で使用した活性化剤およびニトロドーパミンヘミ硫酸塩のモル当量を適切に減少または増加させることにより、置換度が0.01〜30%の修飾ジェランガムを得ることが可能である。例えば、上記手順を3モル当量のいずれかで適用すると、より高い（GGp-NITRODOPA3）置換度のNITRODOPA修飾ジェランガムを得ることが可能である。
【０１０１】
2-クロロドーパミン塩酸塩（McCarthy、1986）および1-(2'-アミノエチル)-2-メチル-3-ヒドロキシ-4-ピリジノン二塩酸塩（Dobbin、1993）を、記載のように調製した。上記実施例の手順をこれらの材料で適用することにより、対応する修飾ジェランガムヒドロゲル前駆体も得られた。
【０１０２】
好ましい実施形態では、本明細書でGG-DOPA3と例示される修飾ジェランガムは、脱イオン水中に、無菌で、またはそうでなければ、5〜40℃、好ましくは15〜37℃の温度で、好ましくは1時間未満の穏やかな撹拌下で、溶解および維持することができる。また、別の好ましい実施形態では、溶解媒体は、細胞培養培地、リン酸緩衝液生理食塩水または塩化ナトリウム生理食塩水溶液を含み得る。
【０１０３】
一実施形態では、溶解時間は0.5〜1時間、好ましくは30分未満である。
【０１０４】
修飾ジェランガム溶液の好ましい濃度は、0.01%〜5%w/V、より好ましくは0.1〜4%w/V、さらにより好ましくは0.5〜3%w/Vである。
【０１０５】
好ましい実施形態では、修飾ジェランガム溶液は、シリンジによって注入されるように十分に可動性で適切な粘度を有する（図５）、せん断減粘性液体である。修飾ジェランガム溶液の好ましい固有粘度は、5mg/mLの濃度で1000〜5000cm3/g、より好ましくは1500〜4500cm3/gの範囲である（表２）。修飾ジェランガム溶液は、閉じ込められた空気をほとんど含まず、透明で無色であり、外観が実質的に無色または薄く着色されている。そのような溶液のイオン架橋によって形成された修飾ジェランガムヒドロゲルは、透明であり、閉じ込められた気泡を有意に含まない。
【０１０６】
（修飾ジェランガムヒドロゲル形成）
初期目標ポリマー濃度は1.25%w/Vである。12.5mgのGGp-DOPA3をプラスチックバイアルに量り、磁気撹拌棒を加える。注射用の滅菌水1mLを加える。手動で、やさしく、バイアルの水が全ての材料に触れて湿潤させていることを確認する。磁気撹拌を開始し、材料が室温で完全に溶解するまで続ける。最終溶液は透明で粘性である。理想的な磁石寸法および示された磁気撹拌速度を使用し、気泡の形成を最小限にする。必要に応じて、閉じ込められた気泡を逃がすために溶液を静置する。
【０１０７】
溶解が完了したら、磁気撹拌を停止する。リン酸緩衝生理食塩水250μL（Ca2+/Mg2+を含むPBS）を、ポリマー溶液（Ca2+/Mg2+を含む、8:2のヒドロゲル:PBS比）に加える。Ca2+/Mg2+を含むPBS中の二価カチオンは、ポリマーのイオン架橋を促進する。最終ポリマー濃度は1%w/Vである。静かに溶液を1分間かき混ぜる。その一方で、ウェルプレートには、各ウェルの底に円筒状のプラスチック鋳型を置く。鋳型を乱すことなく、所望の容量の架橋ポリマー溶液で鋳型を慎重に満たす。5分後、鋳型をPBS（Ca2+/Mg2+を含む）で覆う。ウェルプレートを適切な時間休ませてから、鋳型を取り外す。PBS溶液中（懸濁液中）に静置したまま、ゲルを適切な時間放置する。ウェルプレートからゲルを取り出す（図６、右）。
別の好ましい実施形態では、細胞培養培地をPBSの代わりに使用し、イオン架橋を促進することができる。
【０１０８】
さらに好ましい実施形態では、Ca2+およびMg2+以外のカチオンを添加して、イオン架橋を介して修飾ジェランガムヒドロゲルを形成することができる。Fe2+、Cu2+、Sr2+、Ba2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Sn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Ga3+およびTi3+などの1つ以上の二価および三価イオン、またはそれらの混合物を、塩化物および硫酸塩ならびにそれらの水和物などの薬学的に許容される塩形態で、生理学的に適切な濃度で調製物に添加することができる。これらのイオンの異なる価数およびイオン半径のために、広範な物理化学的および機械的特性を有する修飾ジェランガムヒドロゲルを得ることができる。
【０１０９】
驚くべきことに、ジェランガムおよび以前に報告されたジェランガムの修飾とは対照的に、二価および三価カチオン以外のイオンを使用して、本明細書に開示の修飾ジェランガムを等価濃度でイオン架橋することができる。特に、生理学的に適切な一価カチオン、例えばNa+、K+およびLi+単独またはそれらの混合物は、全て機械的に安定なヒドロゲルの形成を促進することができる。これは、先に述べたように、一価カチオンのみの存在下ではヒドロゲルを形成しない未修飾の精製ジェランガムとは対照的である。好ましい実施形態では、0.9%塩化ナトリウム溶液によってイオン架橋が促進される。
【０１１０】
この発見は、生理学的流体に関して特に重要である。したがって、修飾ジェランガムヒドロゲルは、架橋剤としてヒトまたは動物の全血または血漿を使用することによって得ることができるが（図７）、それは、これらでは一価カチオンが電解質として豊富であるためである。この態様は、マイクロフラクチャーの文脈内で特に重要である。
【０１１１】
さらに、一価カチオンの存在下で安定なヒドロゲルを形成する本明細書に開示の修飾ジェランガムの驚くべき能力は、二価および一価カチオンの交換に関連して、ジェランガムおよびメタクリル化ガムでin vivoで経時的に観察される機械的安定性の問題を克服する。したがって、本明細書に開示の修飾ジェランガムは、ジェランガムおよびメタクリル化ジェランガムの両方よりも長い期間にわたってin vivoでその機械的特性を維持することができる。
【０１１２】
（修飾ジェランガム多孔質無細胞足場）
修飾ジェランガム多孔質無細胞足場は、以下の代表的な手順を適用することによって、修飾ジェランガムから形成することができる。
【０１１３】
GGp-DOPA3（375mg）を、撹拌しながら室温で蒸留水（30mL）に溶解し、1.25%w/v溶液を得た。次にCa2+およびMg2+イオンを含む7.5mLのPBSをプラスチックディスクの中央に置き、直後に、GGp-DOPA3溶液をプラスチックディスクに添加し、スパチュラを用いて架橋溶液と激しく混合した。次いで、得られた混合液を30分間〜1時間放置した。この期間の後、ディスクの上部が完全に浸かるまで、PBS溶液をさらに添加した。次いで、ディスクを15〜30分間放置した。ヒドロゲルを直径12mmの円筒形のパンチで打ち抜くことによって、ポリマーシリンダーを形成した。次いで、得られたポリマーシリンダーを24ウェルプレート（各ウェルに1枚のディスク）に移し、PBSで覆った後、PBSを9時間ごとに3回交換した。次いで、各ウェルから過剰のPBSを除去した後、プレートを-80℃で24時間凍結させた。次いで、プレートを冷凍庫から取り出し、3〜5日間凍結乾燥させて、多孔質脱水GGp-DOPA3足場を得る（図６、左）。
前記多孔質足場は、組織移植、組織充填剤として、または足場増強のために、例えばマイクロフラクチャーと組み合わせて使用され得る。
【０１１４】
GGp-DOPA3足場は、例えばPBS溶液（図６、中央）を用いて再水和され、無細胞構築物などとして使用され得るか、または脂肪もしくは骨髄由来の間葉系間質／幹細胞を含むさまざまな細胞型のin vitro播種に使用することができ、それによりin vivo適用のための細胞含有移植を提供する。
【０１１５】
（GGp-DOPA3足場の膨潤特性）
カリパスで9つの円筒状足場を測定し（長さと高さ）、各足場を別々のプレートウェルに置いた。各ウェルをPBSで満たし、1分後、足場を溶液から取り出し、直ちにカリパスで（長さおよび高さ）を測定した。その後、足場を直ちに再びPBS溶液に入れ、同じ手順を30分、1時間、6時間、24時間、2日、3日、4日、5日および6日の時点で繰り返した。全ての測定値を記録し、異なる時点での足場の体積を図８に示すように計算した。
【０１１６】
（GGp-DOPA3足場の吸水特性）
9つの円筒状足場を秤量し、各足場を別々のプレートウェルに入れた。各ウェルをPBSで満たした。1分後、足場を溶液から取り出し、余分な溶液を除去し、足場を秤量した。その後、足場を再び溶液に入れ、同じ手順を30分、1時間、6時間、24時間、2日、3日、4日、5日および6日の時点で繰り返した。全ての重量を、図９に示すように異なる時点で記録した。
【０１１７】
（GGp-DOPAヒドロゲル接着性の評価および比較 - 軟骨損傷内での固定 - ex vivo）
ヒトの膝関節では、大腿骨内側顆が、重度IIIおよびIV損傷の最も頻度の高い部位である。軟骨修復のために治療されるヒトの損傷は、0.5〜12cm2と大きさに差がある。ヒトでは、5ヶ所以上の平均関節軟骨の厚さは、ブタの2〜4mmと比較して、2.2〜2.5mmに及ぶ。軟骨損傷を引き起こす軟骨の厚さに関しては、ブタモデルはヒトのシナリオによく似ている。したがって、ヒトに見られるものと同様のex vivo条件を使用し、以下を含む、新規修飾ジェランガムベースのヒドロゲルの固定を試験した：損傷の位置、大きさ、深さ、ならびに物理的ストレス（重力および摩擦）。
【０１１８】
ブタ関節（臨界サイズの欠損 - 軟骨の幅の50%）において、円形8mm直径（0.5cm2）の軟骨損傷を作製した。軟骨下骨に到達し、損傷の深さが約2mmになるまで、損傷部位の軟骨を除去した。試験を行うために規定したヒドロゲル体積を、各損傷について計算した（V=πr2×高さ）。GGp-DOPA1（1%w/V）、GGp-DOPA3（1%w/V）、GGp（1%w/V）およびGG-MA（2%w/V）ヒドロゲルを、先に記載したように形成し、各損傷が完全に満たされるように、損傷にピペットで入れた。生理食塩水（0.9%w/v）を用いて架橋を5分間誘導した。以下のストレス試験を実施した；
【０１１９】
重力試験：プロトタイプをゆっくりと上下に回転させ、損傷を下にして置いた。損傷内のヒドロゲルの固定を確認するために（陽性結果）、またはヒドロゲルが損傷部から脱落する（陰性結果）かどうかを確認するために、プロトタイプを激しく振盪させた。
【０１２０】
摩擦試験 - 損傷内のヒドロゲルの固定を確認するために（陽性結果）、またはヒドロゲルが損傷部から離脱したり脱落したりする（陰性結果）かどうかを確認するために、プロトタイプ関節を組み立て、関節運動を模倣した。
【０１２１】
生理学的温度内での固定を、関節接合部を37℃の生理食塩水溶液に一晩浸漬することによってさらに模倣した。
【０１２２】
両方のGGp-DOPAヒドロゲル製剤（GGp-DOPA1およびGGp-DOPA3）は、2mm厚の軟骨損傷内で全面的な完全性を維持しながら、全てのストレス試験条件にうまく耐えた（図１０ａ）。さらに、固定試験後に3D GGp-DOPAヒドロゲルを損傷部から完全に無傷で取り去ることが可能であった。これとは反対に、GGpおよびGG-MA製剤の部分的固定のみが同じ試験系内で観察され、ヒドロゲルの破砕も観察された。
【０１２３】
ヒドロゲル製剤の濃度に関しては、粉末溶解時間、溶液粘度および3Dヒドロゲルの粘稠度および安定性に関して、1%w/Vが、GGp-DOPA1、GGp-DOPA3およびGGpに特に適切であることが見出された。しかしながら、GG-MAについては、同様の特性を達成するために2%w/Vの最小濃度が必要であった。これらの結果は、最新技術のジェランガムヒドロゲルと同等またはより低い濃度のイオンキレート置換基で修飾されたジェランガムヒドロゲルの有意により優れた接着性を確認する。
【０１２４】
ジェランガムヒドロゲルの接着特性をさらに確認するために、この固定試験を、ブタの関節内のいくつかの位置で作られた軟骨損傷を用いて繰り返し、ここで、軟骨の厚さの変化は、ヒドロゲルの接着にさらに挑戦し得る。6つの位置全てにおいて（図１０ｂ）、ヒドロゲルは一連の試験後に所定の場所に見られた。
【０１２５】
本明細書に開示の修飾ジェランガムヒドロゲルの改良された接着特性は、他のヒドロゲルとは異なり、本修飾ジェランガムヒドロゲルがより広い面積の表面に粘着することができるため、より大きなサイズの軟骨損傷（＞4cm2）が治療され得ることを意味する。例を挙げると、マイクロフラクチャー、ACIまたはMACIなどの現在利用可能な治療選択肢は、1〜4cm2の間の小さな損傷の治療にのみ有効である。したがって、修飾ジェランガムヒドロゲルは、最新技術およびケア治療選択肢の基準を上回る利点を提供する。
【０１２６】
（In vitroでのGGp-DOPAヒドロゲル内の細胞生存率の評価）
ジェランガムベースのヒドロゲル内にカプセル化されたヒト軟骨細胞の生存率を、in vitro培養により21日まで評価したが、これは軟骨形成に必要な最小時間枠である。細胞を代表的なGGベースの溶液と室温で混合し、GGp-DOPA1、GGp-DOPA3およびGGpヒドロゲルを1%w/v濃度で、ならびにGG-MAヒドロゲルを2%w/V濃度で得て、全ての製剤は500万細胞/mLを含有していた。
【０１２７】
異なる細胞型の2つの独立した培養を、すなわちヒト軟骨細胞およびヒト脂肪間葉系間質／幹細胞（hASC）で実施した。hASCを未分化に維持したか、または軟骨形成性成長因子を用いて軟骨形成系列に誘導した。個々の20μLの細胞性ヒドロゲルをピペットで採取し、細胞培養培地を加えてヒドロゲルの架橋を促進し、安定した移送可能な個々の3D構造を得た。
【０１２８】
In vitro培養後、生細胞および死細胞を特異的染色により顕微鏡で観察し、それにより生細胞をカルセインAMで緑色に染色し、死細胞をヨウ化プロピジウムで赤色に染色した（図１１）。
【０１２９】
脂肪間質／幹細胞に関して、他の製剤と比較して明らかに増加した生細胞密度が、GGp-DOPA3ヒドロゲル内で観察される。これは、分化細胞および非分化細胞の両方で明らかであった（図１１、中央および右の欄）。さらに、GGp-DOPA3ヒドロゲル内ではGGp-DOPA1ヒドロゲル内よりも良好な細胞分布が観察されたが、GGpおよびGG-MAヒドロゲル内では細胞のない間隙領域が有意に観察された。
【０１３０】
軟骨細胞培養に関しては、さまざまなヒドロゲル製剤の間で、実質的に同等の細胞密度および生存率が観察された（図１１、左欄）。これらの結果は、GGp-DOPAヒドロゲルが、最新技術のジェランガムヒドロゲルと比べて、異なる細胞型をカプセル化後に長期間生存可能に維持することができ、置換度の賢明な選択により、細胞生存率および分布をヒドロゲルを通して最適化することが可能であることを確認する。
【０１３１】
（In vitroでのGGp-DOPAヒドロゲル内の軟骨形成の評価）
II型コラーゲンは、健常な関節硝子軟骨が最も豊富な細胞外マトリックス成分である。一方、I型コラーゲンの存在は、不健康な線維性軟骨組織と関連している。
【０１３２】
したがって、ジェランガムベースのヒドロゲル内にカプセル化されたヒト軟骨形成細胞によるこれら2つのマーカーの発現を、最大21日間のin vitro培養によって評価した。実験プロトコルは、細胞生存率の評価について先に記載した通りであった。
【０１３３】
驚くべきことに、異なるヒドロゲル製剤が、II型コラーゲンおよびI型コラーゲンの発現に非常に深刻で予期しない影響を及ぼしたことが分かった。試験した4つの製剤のうち、GGp-DOPA3は、II型コラーゲンの発現を、I型コラーゲンよりも高いレベルまで明らかに誘導した（図１２）。この分化因子は明らかであったが、II型コラーゲンの発現がI型コラーゲンより4倍高かったという事実はさらに注目に値する。コラーゲンIと比較したコラーゲンIIの発現の増加に加えて、II型コラーゲン上方調節の全体的なレベルは、他の製剤のいずれよりもGGp-DOPA3で平均して13倍高く、それはその軟骨形成性に優しい性質も維持する。
【０１３４】
したがって、驚くべきことに、イオンキレート基の性質およびこの置換基によるジェランガムの置換度の両方が軟骨形成に有利であることが示される。硝子軟骨再生などの潜在的な治療用途を考慮すると、本明細書に記載されているように規定された置換度のイオンキレート基を含む特定の修飾ジェランガムヒドロゲルは、細胞ベースの軟骨損傷治療剤の効力を著しく改善する可能性を有する。
【０１３５】
したがって、本明細書に記載のイオンキレート置換基で修飾されたジェランガムヒドロゲルは、身体組織および表面内での改善された接着挙動示す一方で、長期細胞生存率および健常な細胞外マトリックスマーカーの発現の上方制御を促進することによって、in vitro細胞培養および組織工学および再生医療における重要な利点を示す。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、記載された特徴、整数、工程、構成要素の存在を示すことを意図しているが、1つ以上の他の特徴、整数、工程、構成要素またはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。
【０１３７】
この文献に引用された全ての参考文献は、あたかも各参考文献が個別に参照により組み込まれているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３８】
当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または通常の実験のみを用いて確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されている通りである。
【０１３９】
特許請求の範囲の明細書で単数形の要素または特徴が使用される場合、特に除外されない限り、複数形も含まれ、逆も同様である。例えば、用語「細胞」は、複数形の「細胞」も含み、逆もまた同様である。特許請求の範囲において、冠詞は、文脈から逆のまたはそうでないことが明らかでない限り、1つまたは複数を意味し得る。群の1つ以上の要素間に「または」を含む請求項または説明は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかである場合を除いて、1つの、複数の、または全ての群の要素が、所与の製品またはプロセスに存在し、使用され、または関連する場合に満たされているとみなされる。本発明は、その群のちょうど1つの要素が、所与の製品またはプロセスに存在し、使用され、または関連する実施形態を含む。本発明は、複数のまたは全ての群の要素が、所与の製品またはプロセスに存在し、使用され、または関連する実施形態も含む。
【０１４０】
さらに、本発明は、1つ以上の請求項からのまたは説明の関連部分からの1つ以上の制限、要素、句、記述的用語などが別の請求項に導入される、全ての変形、組み合わせ、および置換を包含することが理解されるべきである。例えば、別の請求項に依存する任意の請求項は、同じ基本請求項に依存する任意の他の請求項に見られる1つ以上の制限を含むように変更することができる。さらに、特許請求の範囲が組成物を挙げる場合、特に断りのない限り、または矛盾しているもしくは矛盾が生じることが当業者にとって明らかでない限り、本明細書に開示された任意の目的のために組成物を使用する方法が含まれ、本明細書に開示された任意の製造方法、または当技術分野で知られている他の方法に従って組成物を製造する方法が含まれることは理解されるべきである。
【０１４１】
範囲が指定されている場合は、終点が含まれる。さらに、文脈および／または当業者の理解から別段の指示がない限り、もしくは明白でない限り、範囲として表される値は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、本発明の異なる実施形態において記載された範囲内の任意の特定の値を、範囲の下限の単位の10分の1までとすることができることが理解されるべきである。文脈および／または当業者の理解から別段の指示がない限り、もしくは明白でない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意の部分範囲を取ることができ、部分範囲の終点は、その範囲の下限の単位の10分の1と同じ精度で表されることが理解されるべきである。
【０１４２】
さらに、本発明の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲の任意の1つ以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。範囲が示されている場合、範囲内の任意の値は、特許請求の範囲の任意の1つ以上から明示的に除外されてもよい。本発明の組成物および／または方法の任意の実施形態、要素、特徴、用途または態様は、任意の1つ以上の特許請求の範囲から除外することができる。簡潔にするために、1つ以上の要素、特徴、目的、または態様が除外される実施形態の全ては、本明細書において明示的には示されていない。
【０１４３】
上記の実施形態は組み合わせ可能である。
【０１４４】
以下の特許請求の範囲は、本開示の特定の実施形態をさらに説明する。
【０１４５】
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【図１】
2019509387.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019509387.tif 000020
【図８】
2019509387.tif 000021
【図９】
2019509387.tif 000022
【図１０ａ】
2019509387.tif 000023
【図１０ｂ】
2019509387.tif 000024
【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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2019509387.tif 000028