(57)【要約】  本発明は、匂い物質を検出するためのバイオセンサー、特に哺乳動物、例えばヒト、イヌまたはネコによる匂い物質検出を模倣するバイオセンサーに関する。本発明の分野はまた、本発明のバイオセンサーを用いた、香り、臭いおよび食味に関する匂いの標準化、ならびに新規の匂いを生成し、匂いをマスキングし、匂いを増進させ、そして匂いを設計するための匂い物質のアゴニスト、アンタゴニスト、および混合物の発見にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
匂い物質を検出するための方法であって：各バイオセンサーが、嗅覚受容体、Ｇタンパク質サブユニットＧα、Ｇタンパク質サブユニットＧβ、およびＧタンパク質サブユニットＧγ、ならびにレポーターを含む、複数のバイオセンサーを提供し、ここで嗅覚受容体への匂い物質の結合がＧタンパク質サブユニットを通じてシグナルを送り、レポーターからのシグナルを生じ、ここでバイオセンサーの少なくともいくつかは異なる嗅覚受容体を有し、バイオセンサーに匂い物質を添加し、そしてレポーターの増加を検出し、それによって嗅覚受容体への匂い物質の結合を検出する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
バイオセンサーが、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、デバロマイセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）におけるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バイオセンサーが宿主細胞の膜分画中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
宿主細胞が、アスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、クリソスポリウム属、クロイベロミセス属、カンジダ属、ピキア属、デバロマイセス属、ハンセヌラ属、ヤロウィア属、ジゴサッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ペニシリウム属またはリゾプス属である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
匂い物質に関するアロマグラフを作成する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
レポーターが光学レポーターである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
長期に渡って、光学レポーターにおける変化を測定することによって、異なる嗅覚受容体各々で、匂い物質の結合をリアルタイムで定量化する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
匂い物質に関するアロマグラフを作成する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アロマグラフから情報を抽出する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
製品のアロマグラフを作成する方法であって：請求項４に記載の方法を用いて、製品の構成要素に関してアロマグラフを得る工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
そのすべての構成要素を含む製品に関してアロマグラフを作成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
製品の第二の構成要素に関して第二のアロマグラフを作成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
製品を記述する方法であって：請求項８に記載の方法を用いて、製品に関してアロマグラフを得て、そして製品を記述するために該アロマグラフを用いる工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
アロマグラフから情報を得て、そして製品を記述するために該情報を用いる工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
製品を同定する方法であって：請求項８に記載の方法を用いて、アロマグラフを得て、そして製品を同定するために該アロマグラフを用いる工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
アロマグラフから情報を得て、そして製品を同定するために該情報を用いる工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
製品を宣伝する方法であって：請求項８に記載の方法を用いて、製品に関してアロマグラフを得て、そして製品を宣伝するために該アロマグラフを用いる工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
アロマグラフから情報を得て、そして製品を宣伝するために該情報を用いる工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
製品を販売する方法であって：請求項８に記載の方法を用いて、製品に関してアロマグラフを得て、そして製品を販売するために定量化されたデータを用いる工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
アロマグラフから情報を得て、そして製品を販売するために該情報を用いる工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
悪臭を持つ製品を修正するための方法であって：各バイオセンサーが、嗅覚受容体、Ｇタンパク質サブユニットＧα、Ｇタンパク質サブユニットＧβ、およびＧタンパク質サブユニットＧγ、ならびにレポーターを含む、複数のバイオセンサーを得て、ここで嗅覚受容体への匂い物質の結合がＧタンパク質サブユニットを通じてシグナルを送り、レポーターからのシグナルを生じ、ここでバイオセンサーの少なくともいくつかは異なる嗅覚受容体を有し、ここで宿主細胞の少なくともいくつかは異なる嗅覚受容体を発現し、悪臭を持つ製品に関する定量化されたデータを、悪臭を持たない製品の複数のバイオセンサーでの複数の相互作用に関する複数の定量化されたデータに比較し、製品および悪臭を持つ製品の間のバイオセンサーでの定量化された相互作用の相違を同定し、そして悪臭を持つ製品に関して、バイオセンサーでの相互作用を改変して、相互作用が悪臭を持たない製品のバイオセンサー相互作用に近付くかまたはマッチするようにすることによって、悪臭を修正する工程を含む、前記方法。
【請求項２２】
悪臭を持つ製品によって活性化される新規嗅覚受容体を同定する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
新規嗅覚受容体での結合を阻害する組成物を添加することによって、悪臭を修正する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
製品および悪臭を持つ製品の間で共有される嗅覚受容体での新規相互作用を同定する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
嗅覚受容体での相互作用を減少させるかまたは増加させる組成物を添加して、この相互作用が悪臭を持たない製品のものと近似するようにすることによって、新規相互作用を持つ嗅覚受容体で悪臭を修正する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表、表またはコンピュータプログラムに関する言及
［１］配列表の公式コピーは、ＥＦＳ−ウェブを通じてＡＳＣＩＩフォーマットテキストファイルとして本明細書と同時に提出され、ファイル名は「ＡＲＸ００７＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、生成日は２０１７年２月２３日であり、そしてサイズは４５キロバイトである。ＥＦＳ−ウェブを通じて提出される配列表は、本明細書の一部であり、そして本明細書にその全体が援用される。
【背景技術】
【０００２】
［２］嗅覚受容体遺伝子は、７つの膜貫通ドメインを持つＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）として相同性を通じて特徴付けられてきている。ヒトではおよそ５００〜７５０の嗅覚受容体遺伝子配列がある一方、ラットおよびマウスにおいては５００〜１０００の嗅覚遺伝子があると概算されている。嗅覚受容体は、粘液でコーティングされた繊毛の表面上で濃縮され、そして匂い物質（оｄｏｒａｎｔ）分子が嗅覚上皮における嗅覚受容体に結合する。哺乳動物は、少なくとも１０，０００の匂いを検出可能であり、そしておよそ１，０００またはそれ未満の嗅覚受容体が存在するため、多くの匂い物質は多数の嗅覚受容体と相互作用するはずである。
【０００３】
［３］嗅覚受容体の区別能力は、数千の揮発性化学物質が異なる匂い（оｄｏｒ）を有すると知覚可能であるようなものである。嗅覚系が組み合わせた受容体のコードスキームを用いて、匂い分子を解読することが知られている。１つの嗅覚受容体は、多数の匂い物質を認識可能であり、そして１つの匂い物質は、多数の嗅覚受容体によって認識される。匂い物質のわずかな構造変化または環境における匂い物質の濃度変化は、これらの受容体の匂いコードの変化を生じる。
【０００４】
［４］各哺乳動物嗅覚受容体ニューロンは、１つの嗅覚受容体のみをコードする。同じ嗅覚受容体を発現するニューロンの軸索は、１つの嗅球に収束し、これが次いで、情報を脳にプロセシングする。嗅覚受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）と構造的に類似であり、そしてループによって連結された７つの膜貫通（ＴＭ）ドメインを含有する。機能的に重要な残基は、膜貫通らせん２〜７上に存在する。
【０００５】
［５］匂い分子は：アルコール、アルデヒド、ケトンおよびカルボン酸からイオウ含有化合物および精油までの多様な化学クラスに属する。匂い分子の物理化学的記述子は、嗅覚受容体による匂い反応の予測に重要な役割を果たす。まさに同一の嗅覚受容体配列は、リガンドに存在する炭素原子の数に基づいて、リガンド特異性に関して、構造的なバイアスを有しうる。食品中には、約８０００の匂い物質が同定されている。約４００の食品匂い物質が特徴付けられ、そしてこの数は、ヒトにおいて見出される嗅覚受容体の数とほぼ等しい。匂い物質の混合物の反応は、構成要素の加算でも平均でもない。いくつかの混合物は、個々の構成要素には存在しなかった新規の知覚品質の出現を導く。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
［６］本発明の目的は、混合物、組成物、または分子に関するアロマグラフを生じるバイオセンサーを提供することである。本発明の目的は、混合物、組成物または分子の香り（ｓｃｅｎｔ）、臭い（ｓｍｅｌｌ）、匂い（оｄｏｒ）、芳香（ａｒｏｍａ）、および／または食味（ｔａｓｔｅ）の原因となる混合物、組成物または分子の構成要素を分析するために用いられるバイオセンサーを提供することである。また、本発明の目的は、悪臭を診断し、そして修正するために用いるバイオセンサーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
［７］本発明は、嗅覚受容体での相互作用の検出のためのバイオセンサーに関する。いくつかの態様において、本発明は、嗅覚受容体での匂い物質の相互作用を検出するための本発明のバイオセンサーの使用に関する。いくつかの態様において、複数の嗅覚受容体での匂い物質の相互作用を検出するために、複数のバイオセンサーを用いる。いくつかの態様において、複数のバイオセンサーは、動物の嗅覚受容体レパートリーまたはレパートリーの一部に相当する。いくつかの態様において、複数のバイオセンサーは、ヒト嗅覚受容体レパートリーまたはレパートリーの一部に相当する。いくつかの態様において、複数のバイオセンサーは、溶液中の匂い物質を検出するヒト嗅覚受容体のレパートリーの一部に相当する。いくつかの態様において、複数のバイオセンサーは、気相中の匂い物質を検出するヒト嗅覚受容体のレパートリーの一部に相当する。いくつかの態様において、複数のバイオセンサーは、特定の匂い物質を検出するヒト嗅覚受容体のレパートリーの一部に相当する。いくつかの態様において、複数のバイオセンサーは、特定のクラスまたはタイプの匂い物質を検出するヒト嗅覚受容体のレパートリーの一部に相当する。
【０００８】
［８］いくつかの態様において、個々のバイオセンサーは、宿主細胞膜に向けて新生ポリペプチドをターゲティングするポリペプチド配列に、そのＮ末端領域で融合し、そして受容体を安定化させるポリペプチドに、そのＣ末端で融合している嗅覚受容体で構成される。いくつかの態様において、嗅覚受容体のＣ末端領域に融合したポリペプチドは、受容体を宿主細胞の外膜に向けてターゲティングする。いくつかの態様において、バイオセンサーのＮ末端部分はラット嗅覚受容体Ｒ１７（Ｒ１７）の１〜５５位由来である。いくつかの態様において、別のタンパク質に融合させることなく、全長嗅覚受容体を用いる。いくつかの態様において、融合受容体または全長嗅覚受容体のＲ１７部分をコードする核酸には、例えば嗅覚受容体融合タンパク質の同定および精製に用いられる、８アミノ酸ＦＬＡＧタグ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１））をコードする核酸が先行する。いくつかの態様において、嗅覚受容体配列には、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質をコードするカセットが続く。ＧＦＰまたはＲＦＰを嗅覚受容体に融合させて、宿主細胞で発現された際に嗅覚受容体の位置の検出を可能にする。いくつかの態様において、嗅覚受容体は哺乳動物嗅覚受容体である。いくつかの態様において、嗅覚受容体はヒト嗅覚受容体である。いくつかの態様において、ヒト嗅覚受容体はＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ５Ｐ３、またはＯＲ６Ａ２である。いくつかの態様において、構築物中で融合されるＯＲＦ配列は、アミノ酸５６位からアミノ酸配列末端までの嗅覚受容体のアミノ酸配列をコードする核酸を含む。
【０００９】
［９］いくつかの態様において、ＯＲＦカセットを受け入れて、本発明の新規バイオセンサーを作製するために、構築物を用いる。いくつかの態様において、構築物中に全長ヒト受容体タンパク質がコードされるように、ＯＲＦカセットを構築物内で融合させる。いくつかの態様において、全長ヒト嗅覚受容体をコードする核酸を、インフレームで、８アミノ酸ＦＬＡＧタグ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１））をコードする核酸と融合させる。いくつかの態様において、嗅覚受容体配列には、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質をコードするカセットが続く。
【００１０】
［１０］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーはまた、Ｇタンパク質およびアデニル酸シクラーゼで構成される。いくつかの態様において、Ｇタンパク質は、Ｇαサブユニット、Ｇβサブユニット、およびＧγサブユニットの３つのサブユニットで構成される。いくつかの態様において、アデニル酸シクラーゼおよびＧタンパク質は、同じ種由来である。いくつかの態様において、アデニル酸シクラーゼおよびＧタンパク質は、異なる種由来である。いくつかの態様において、Ｇタンパク質サブユニットは同じまたは異なる種由来である。いくつかの態様において、嗅覚受容体、Ｇタンパク質およびアデニル酸シクラーゼは同じ種由来であり、そしていくつかの態様において、構成要素の１またはそれより多くは異なる種由来である。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーポリペプチドには、配列番号６〜１０および１２〜１７と、７０％、８０％、９０％、９５％、および９９％の配列相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００１１】
［１１］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーには、直接または間接的にレポーター分子を産生するポリペプチドが含まれる。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーには、レポーター分子（例えば光学レポーター）であるポリペプチドが含まれる。いくつかの態様において、ポリペプチドはアデニル酸シクラーゼである。いくつかの態様において、レポーター分子はｃＡＭＰである。いくつかの態様において、バイオセンサーによって産生されるレポーター（単数または複数）は６〜７桁のダイナミックレンジを有し、そしてレポーターにカップリングしたバイオセンサーは、０．１５の十億分率〜約４２０，０００の十億分率、または１０−９Ｍ〜約１０−３Ｍの範囲の匂い物質および他の分子の結合を検出可能である。いくつかの態様において、検出ウィンドウは１０Ｍ〜１０−１２Ｍの範囲内の６〜７桁である。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーは、９〜１０桁のダイナミックレンジを有する。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーは、１０−１１Ｍから約１０−２Ｍの範囲の匂い物質および他の分子の結合を検出可能である。いくつかの態様において、検出ウィンドウは１０Ｍ〜１０−１２Ｍの範囲内の９〜１０桁である。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーは、３〜５桁のダイナミックレンジを有する。いくつかの態様において、検出ウィンドウは１０Ｍ〜１０−１２Ｍの範囲内の３〜５桁である。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０桁のダイナミックレンジを有する。
【００１２】
［１２］本発明はまた、本発明のバイオセンサーをコードする核酸にも関する。１つの態様において、本発明の核酸には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明のバイオセンサーポリペプチドの１つをコードする核酸にハイブリダイズする核酸が含まれる。１つの態様において、本発明のバイオセンサーポリペプチドには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記バイオセンサーポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドが含まれる。１つの態様において、本発明の核酸は、配列番号６〜１０および１２〜１７の１つのポリペプチドをコードするか、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号６〜１０および１２〜１７の１つのポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸である。１つの態様において、本発明の核酸は、配列番号６〜１０および１２〜１７の１つと、７０％、８０％、９０％、９５％、および９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００１３】
［１３］本発明は宿主細胞内に含有されるバイオセンサーポリペプチドおよびバイオセンサー核酸に関する。いくつかの態様において、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は真菌細胞、動物細胞、植物細胞、または藻類細胞である。いくつかの態様において、真菌細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）より選択される。いくつかの態様において、真菌細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、またはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）である。いくつかの態様において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター細胞、ヒト腎臓細胞、サル腎臓細胞、ヒト子宮頸癌細胞、またはマウス骨髄腫細胞由来の哺乳動物細胞株である。いくつかの態様において、宿主細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞はネズミ細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞はイヌ細胞である。
【００１４】
［１４］本発明はまた、本発明のバイオセンサーポリペプチドおよびバイオセンサー核酸を含有する宿主細胞の使用にも関する。いくつかの態様において、本発明は、バイオセンサーを含む宿主細胞から作製される、バイオセンサーを含む膜分画の使用に関する。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサー上で、相対的なリアルタイム測定が行われるのを可能にするため、参照受容体−レポーターが宿主細胞または膜分画に含まれる。いくつかの態様において、リアルタイム測定を用いて、少なくとも１つの嗅覚受容体と匂い物質の相互作用を測定する。いくつかの態様において、リアルタイム測定を用いて、複数の異なる嗅覚受容体と匂い物質の相互作用を測定する。いくつかの態様において、リアルタイム測定を用いて、同じまたは異なる嗅覚受容体と、複数の異なる匂い物質の相互作用を測定する。いくつかの態様において、リアルタイム測定を行い、そして参照に比較して、嗅覚受容体と匂い物質の相互作用に関する比較数値を提供する。いくつかの態様において、リアルタイム測定を行い、そして参照に比較して、同じまたは異なる嗅覚受容体での異なる匂い物質の相互作用に関する比較数値を提供する。いくつかの態様において、参照に対する定量化は、分子、混合物、および／または組成物に関するアロマグラフを生じ、該アロマグラフは比較し、そして対比させることも可能である。いくつかの態様において、リアルタイムで監視されるレポーターは、光学レポーターである。いくつかの態様において、リアルタイムで監視されるレポーターは、非光学レポーターである。いくつかの態様において、参照は、既知のリガンドに関して既知のアフィニティを持つ、Ｇタンパク質共役受容体である。いくつかの態様において、参照受容体は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９桁の範囲の活性を有する。いくつかの態様において、参照受容体は２〜４桁の活性範囲を有し、そして１０Ｍ〜１０−１２Ｍの嗅覚受容体の活性範囲をカバーするため、４〜５の異なる参照受容体を用いる。いくつかの態様において、試験する嗅覚受容体−匂い物質対のアフィニティに類似のアフィニティを有する参照受容体−リガンド対を選択する。いくつかの態様において、試験する匂い物質の濃度は、３、４、５、６、７、８、９、または１０桁の範囲に渡って、一連のウェルで多様であり、そしてこれらを参照に比較する。いくつかの態様において、試験する匂い物質の濃度は、３〜１０桁の範囲に渡って、一連のウェルにおいて多様であり、そしてこれらを参照に比較する。いくつかの態様において、嗅覚受容体は、試験する匂い物質と、強い、中程度の、または弱い相互作用を有すると同定される。いくつかの態様において、参照受容体は、嗅覚受容体（単数または複数）と会合するレポーターとは異なるレポーターと会合する。いくつかの態様において、異なるレポーターは光学レポーターである。いくつかの態様において、異なる光学レポーターをリアルタイムで、同じ反応において監視する。
【００１５】
［１５］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、混合物または組成物の香り、匂い、臭い、芳香、または食味に寄与する、混合物または組成物中の匂い物質を同定する。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、組成物、混合物、または複数の混合物および／または組成物の香り、匂い、臭い、芳香、または食味を特徴付ける。いくつかの態様において、バイオセンサーを用いて、特徴的な香り、匂い、臭い、芳香、または食味を有する組成物または混合物に関して、配合またはレシピを作成する。この態様において、バイオセンサーを用いて、置換する構成要素として、嗅覚受容体で類似の相互作用を有する置換構成要素（単数または複数）を見出すことによって、特徴的な香り、匂い、臭い、芳香、または食味を喪失することなく、異なる構成要素（単数または複数）によって組成物または混合物の構成要素を置換することも可能である。いくつかの態様において、置換構成要素は、天然供給源由来である（非天然構成要素（単数または複数）を置換する）。いくつかの態様において、置換構成要素は健康的であると見なされ、そして非健康的であると見なされる構成要素を置換する。いくつかの態様において、置換構成要素はよりコストが低い。いくつかの態様において、置換構成要素は製造がより容易であるか、またはより優れた特性を有する。いくつかの態様において、置換構成要素は、禁止されているか、あるいはそうでなければ高価になったか、入手不能となったか、または入手困難となった成分の代わりとなる。いくつかの態様において、置換構成要素は、組成物中の２またはそれより多い成分の代わりとなる。いくつかの態様において、組成物は、完全にリバース・エンジニアリングされ、そして組成物ならびにその特徴的な香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を生じる構成要素セットが設計される。
【００１６】
［１６］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、設計されたまたは所望の香り、匂い、臭い、芳香、または食味を構築するかまたは維持するために使用可能な既知のアロマグラフを含む分子ライブラリーを作製する。いくつかの態様において、既知のアロマグラフを伴うまたは伴わないライブラリー由来の分子を用いて、所望の既知の混合物または組成物のアロマグラフを模倣する混合物または組成物を構築することも可能である。いくつかの態様において、ライブラリー由来の分子を用いて、アロマグラフ明細を満たす混合物または組成物を構築することも可能である。いくつかの態様において、アロマグラフは、既知の混合物、組成物または分子に関するものである。いくつかの態様において、アロマグラフは、設計されたまたは理論的な香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味に関するものである。いくつかの態様において、アロマグラフは、既知の混合物、組成物、または分子の所望の修飾に関するものである。いくつかの態様において、ライブラリー由来の分子はまた、悪臭を修正するためにも使用可能である。
【００１７】
［１７］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を標準化する。例えば、アロマグラフを用いて、異なる香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を定量化し、そして特徴付けて、組成物、混合物、および／または分子を比較しそして対比するための共通の言語および記述を生成することも可能である。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味とＯＲレパートリーの相互作用を定量化する。これらの定量化された相互作用を用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を記述することも可能である。例えば、数百のバニラフレーバー剤またはバニラ抽出物製品は、これらがバニラのフレーバー（または臭い、香り、芳香）を提供すると宣伝する。本発明のバイオセンサーは、ＯＲレパートリーとこれらのバニラ製品の相互作用を定量化し、そして機能に基づいた、これらの製品の標準化を可能にするであろう。ＯＲ相互作用のコアセットは、これらのバニラ製品間の相違を生じる多くの重要でないまたは副次的なＯＲ相互作用を伴う、バニラ反応を定義するであろう。標準化はまた、ブランド化、商標、および／または著作権の目的のための、香り、臭い、芳香、匂い、および／または食味の定量的な記述も可能にする。標準化はまた、新規の香り、臭い、芳香、匂い、および／または食味の定量的記述も可能にする。
【００１８】
［１８］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、悪臭を修正する。この態様において、バイオセンサーを用いて、（例えばスポーツ用品、衣類または靴、あるいは香り／臭いに依存する製品からの）悪臭をマスキング可能な分子（単数または複数）を見出すことも可能である。いくつかの態様において、マスキング分子は、悪臭の香りを引き起こす嗅覚受容体に結合するが（同じ方式では）活性化しない。この態様において、マスキング分子は、悪臭を知覚する嗅覚受容体（単数または複数）を遮断することも可能である。いくつかの態様において、マスキング分子は、悪臭によって活性化される嗅覚受容体と組み合わされて、悪臭の知覚を、陽性の知覚またはヌル知覚に変化させる、他の嗅覚受容体を活性化する。
【００１９】
［１９］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、所望の香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を有する組成物または混合物を生成する。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、食欲を抑制する組成物または混合物を作製する。この態様において、食欲を抑制する混合物または組成物を、被験体に食欲抑制剤を送達するためのエアロゾルを生成するデバイス中に入れる。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、製品の香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を調節して、異なる地理的位置および／または異なる人口統計学群の被験体の嗜好に合うようにする。いくつかの態様において、所望の香り、臭い、匂い、および／または芳香は、所望の香り、臭い、匂い、および／または芳香に関する構成要素を含有する固体から放出される。いくつかの態様において、芳香剤送達系を用いて、所望の香り、臭い、匂い、および／または芳香を提供する（例えばｇｌａｄｅプラグインまたは他の芳香剤製品）。
【００２０】
［２０］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、ある被験体による所望の知覚を引き起こすアロマスケープまたはオドスケープの構成要素を同定することによって、アロマスケープまたはオドスケープを特徴付ける。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、特定の被験体から所望の反応を生じるアロマスケープまたはオドスケープを構築する。いくつかの態様において、特定の被験体は、アロマスケープまたはオドスケープを、魅力的な、不快な、官能的な、落ち着かせる、または所望の振る舞いを生じるための他の所望の状態であると感じるであろう。いくつかの態様において、アロマスケープまたはオドスケープを用いて、製品またはサービスをブランド化する。
【００２１】
［２１］いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を同定する。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味をユニークに同定する。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味に関して情報交換する。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味に関する取引に用いる。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、製品またはサービスを記述する。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、製品またはサービスを市場に出す。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、製品またはサービスを販売する。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、製品またはサービスを購入する。
【００２２】
［２２］いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を同定する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味をユニークに同定する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味に関して情報交換する。いくつかの態様において、アロマグラフを、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味に関する取引に用いる。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、製品またはサービスを記述する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、製品またはサービスを市場に出す。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、製品またはサービスを販売する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、製品またはサービスを購入する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】［２３］図１は、いくつかのＯＲ構築物のプラスミドマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
［２４］多様な態様を記載する前に、本開示の解説は、記載する特定の態様に限定されず、そしてこうしたものとして、もちろん、多様でありうることが理解されるものとする。また、本明細書で用いる用語は、特定の態様のみを記載することを目的とし、そして限定することを意図されず、これは、本解説の範囲が、付随する請求項によってのみ限定されるためであることも理解されるものとする。
【００２５】
［２５］別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する業の一般の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似かまたは同等のいかなる方法および材料もまた、本開示の実施または試験において使用可能であるが、ここで、いくつかの例示的な方法および材料を記載する。
【００２６】
［２６］本開示を読んだ際、当業者には明らかとなるであろうように、本明細書に記載し、そして例示する個々の態様は各々、本解説の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの態様のいずれかの特徴から容易に分離するかまたは組み合わせることも可能な、別個の構成要素および特徴を有する。列挙する方法はいずれも、列挙する事象の順に、または論理的に可能である任意の他の順序で実行可能である。
【００２７】
定義
［２７］本明細書において、「アロマグラフ」は、嗅覚受容体のレパートリーによる匂い物質に対する反応のデジタル提示を指す。
【００２８】
［２８］本明細書において、「アロマスケープ」および「オドスケープ」は、交換可能に用いられ、そしてどちらも場所の環境における匂い、芳香、臭いおよび／または香りを指す。アロマスケープまたはオドスケープは、天然存在であってもよいし、あるいは個体または個体群から所望の反応（単数または複数）を生じるように操作されていてもよい。アロマスケープまたはオドスケープは、ビジネスの場の領域、例えば店舗、ホテル、またはスポーツアリーナ、アウトドア領域、例えば公園、スポーツまたはエンターテインメントスタジアムであってもよい。
【００２９】
［２９］本明細書において、「有効量」は、本明細書に記載するような、特定の生物学的結果を達成するために有効な、化合物、配合物、材料、または組成物の量を指す。
［３０］本明細書において、用語「発現する」または「発現」は、核酸配列内に含有される遺伝情報からのタンパク質産物の産生を指す。
【００３０】
［３１］本明細書において、「発現ベクター」および「発現構築物」は、交換可能に用いられ、そしてどちらも、細胞におけるタンパク質発現のために設計された、プラスミド、ウイルス、または他の核酸であると定義される。ベクターまたは構築物は、宿主細胞内に遺伝子を導入するために用いられ、それによってベクターは細胞中のポリメラーゼと相互作用して、ベクター／構築物にコードされるタンパク質を発現する。発現ベクターおよび／または発現構築物は、細胞中、染色体外に存在してもよいし、または染色体内に組み込まれてもよい。染色体内に組み込まれる場合、発現ベクターまたは発現構築物を含む核酸は、発現ベクターまたは発現構築物のままであろう。
【００３１】
［３２］本明細書において、用語「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、交換可能に用いられ、そしてどちらも、一緒にクローニングされており、そして単一のポリペプチドセグメントをコードする、異なる遺伝子から得られた２またはそれより多いヌクレオチド配列を指す。融合タンパク質はまた、「ハイブリッドタンパク質」または「キメラタンパク質」とも称される。本明細書において、用語「融合タンパク質」には、異なる種から得たポリペプチドコードセグメント、ならびに同じ種から得たコードセグメントが含まれる。
【００３２】
［３３］本明細書において、用語「異種」は、ポリヌクレオチドの部分に関して用いられた際、核酸が、天然に、互いに対して通常は同じ関係では見出されない、２またはそれより多い下位配列を含むことを示す。例えば、例えば新規機能性核酸を作製するように配置された関連しない遺伝子由来の、２またはそれより多い配列を有する核酸は、典型的には組換え的に産生される。同様に、「異種」ポリペプチドまたはタンパク質は、天然に、互いに対して通常は同じ関係では見出されない、２またはそれより多い下位配列を指す。
【００３３】
［３４］本明細書において、用語「宿主細胞」は、本発明のベクターが導入され、発現され、そして／または増殖されることが可能な原核または真核細胞を指す。微生物宿主細胞は、細菌、酵母、顕微鏡的真菌、ならびに真菌および粘菌の生活環における顕微鏡的相を含む、原核または真核微生物の細胞である。典型的な原核宿主細胞には、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の多様な株が含まれる。典型的な真核宿主細胞は、酵母または糸状菌、あるいは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター細胞、ネズミＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞、ヒト腎臓細胞、または齧歯類骨髄腫またはハイブリドーマ細胞である。
【００３４】
［３５］本明細書において、用語「単離された」は、核酸またはポリペプチドの天然供給源に存在する他の核酸またはポリペプチドからだけではなく、他の細胞構成要素からも分離された核酸またはポリペプチドを指し、そして好ましくは、（あるとしても）該供給源の溶液中に通常存在する溶媒、緩衝剤、イオン、または他の構成要素のみの存在下で見られる核酸またはポリペプチドを指す。用語「単離された」および「精製された」は、天然供給源に存在する核酸またはポリペプチドを含まない。
【００３５】
［３６］本明細書において、用語「哺乳動物」は、そのすべてが体毛を所持し、そしてその幼体に授乳する温血脊椎動物を指す。
［３７］本明細書において、用語「天然存在」は、構成要素が、組換え手段によって改変されておらず、そして生物にあらかじめ存在する単一遺伝子によってコードされることを意味する。
【００３６】
［３８］本明細書において、「匂い物質」は、少なくとも１つの嗅覚受容体によって検出可能である任意の物質を指す。
［３９］本明細書において、「嗅覚」または「嗅覚受容」は、細胞シグナル伝達経路にカップリングした嗅覚受容体による化合物の検出を指す。検出される化合物は「匂い物質」と称され、そして浮遊性（すなわち揮発性）および／または溶液中であることも可能である。
【００３７】
［４０］本明細書において、用語「嗅覚受容体」または「ＯＲ」は、本明細書において交換可能に用いられ、嗅覚受容体、微量アミン関連受容体、鋤鼻受容体、ホルミルペプチド受容体、膜グアニリルシクラーゼ、サブタイプＧＣ−Ｄ受容体、およびＧタンパク質共役食味受容体を指す。嗅覚受容体には、嗅覚受容体、微量アミン関連受容体、鋤鼻受容体、ホルミルペプチド受容体、膜グアニリルシクラーゼ、サブタイプＧＣ−Ｄ受容体、およびＧタンパク質共役食味受容体から作製されるハイブリッド受容体が含まれる。
【００３８】
［４１］本明細書において、「配列同一性パーセント」および「相同性パーセント」は、交換可能に用いられ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の比較を指し、そして比較ウィンドウに渡って、２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適整列のため、参照配列に比較した際、付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことも可能である。割合は、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位の数を決定して、マッチした位の数を得て、比較ウィンドウ中の位の総数によってマッチした位の数を割り、そして結果に１００を乗じて配列同一性パーセントを得ることによって、計算可能である。あるいは、割合は、同一核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列に存在するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップを含んで整列されたかいずれかの位の数を決定して、マッチした位の数を得て、比較ウィンドウ中の位の総数によってマッチした位の数を割り、そして結果に１００を乗じて配列同一性パーセントを得ることによって、計算可能である。当業者は、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを認識するであろう。比較のための配列の最適整列は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ．  ２：４８２，  １９８１の局所相同アルゴリズムによって；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３，  １９７０の相同整列アルゴリズムによって；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４，  １９８８の類似性検索法によって；これらのアルゴリズムのコンピュータ実行によって（ＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケージ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または視覚的検査によって（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  （１９９５補遺）を参照されたい）、実行可能である。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するために適したアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０，  １９９０；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９−３４０２，  １９７７に記載される、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトを通じて、公的に入手可能である。ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴは、デフォルトパラメータ、例えば１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較で、ＢＬＡＳＴＮプログラムを使用可能である。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴは、デフォルトパラメ��タ、例えば３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５，  １９８９を参照されたい）で、ＢＬＡＳＴＰプログラムを使用可能である。配列整列および配列同一性％の例示的な決定はまた、提供されるデフォルトパラメータを用いて、ＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、ウィスコンシン州マディソン）中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用することも可能である。
【００３９】
［４２］本明細書において、用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「ポリペプチド断片」は交換可能に用いられ、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリマーは直鎖であってもまたは分枝していてもよく、修飾アミノ酸またはアミノ酸類似体を含んでもよく、そしてアミノ酸以外の化学部分によって中断されていてもよい。該用語はまた、天然にまたは介入；例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ＰＥＧ化、あるいは任意の他の操作または修飾、例えば標識または生物活性構成要素とのコンジュゲート化によって修飾されているアミノ酸ポリマーも含む。
【００４０】
［４３］本明細書において、用語「精製」は、示す核酸またはポリペプチドが、他の生物学的巨大分子、例えばポリヌクレオチド、タンパク質等の実質的な非存在下で存在することを意味する。１つの態様において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、存在する、示す生物学的巨大分子の少なくとも重量９５％、より好ましくは少なくとも重量９９．８％を構成するように精製される（が、水、緩衝剤、および他の小分子、特に１０００ダルトン未満の分子量を有する分子は存在可能である）。
【００４１】
［４４］本明細書において、用語「リアルタイム」は、反応終了時または明記する時点に１回測定を行うのとは対照的に、反応または相互作用中に多数回の測定を行うことを指す。リアルタイム測定は、しばしば、試料中の構成要素の量を定量化するために、あるいは試料中の２またはそれより多い構成要素の相対的定量化を提供するために用いられる。リアルタイム測定はまた、反応または相互作用の動力学的パラメータを決定するためにも使用可能である。
【００４２】
［４５］本明細書において、用語「組換え核酸」は、天然では通常見られない型の核酸を指す。例えば、組換え核酸は、該核酸に天然には隣接していないヌクレオチド配列によって隣接されていることも可能であるし、または組換え核酸は、天然では通常見られない配列を有することも可能である。組換え核酸は、制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、あるいはポリメラーゼ連鎖反応のような技術を用いることによって、元来、形成可能である。組換え核酸がひとたび作製され、そして宿主細胞または生物内に再導入されたら、非組換え的に、すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作ではなく宿主細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞機構を用いて、複製可能である；が、こうした核酸は、ひとたび組換え的に産生されれば、続いて非組換え的に複製されるとしても、なお、本発明の目的のためには組換えと見なされることが理解される。
【００４３】
［４６］本明細書において、用語「組換えポリペプチド」は、組換え核酸から発現されるポリペプチド、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで化学的に合成されるポリペプチドを指す。
［４７］本明細書において、用語「組換え変異体」は、組換えＤＮＡ技術を用いて生成されるアミノ酸挿入、欠失、および置換によって、天然存在ポリペプチドとは異なる任意のポリペプチドを指す。関心対象の活性、例えば酵素活性または結合活性を損なうことなく、どのアミノ酸残基が置換、付加、または欠失可能であるかを決定する指針は、特定のポリペプチドの配列を、相同ペプチドのものと比較して、そして高相同性領域で行うアミノ酸配列変化の数を最小限にすることによって、見出されうる。
【００４４】
［４８］本明細書において、用語「レパートリー」または「ライブラリー」は、複数の異なる嗅覚受容体をコードする遺伝子のライブラリーを指す。いくつかの態様において、レパートリーまたはライブラリーは、種、例えばヒト、イヌ、またはネコの嗅覚受容体すべてに相当する。いくつかの態様において、レパートリーまたはライブラリーは、食味、香り、臭い、芳香、および／または匂いを検出する嗅覚受容体に相当する。いくつかの態様において、レパートリーまたはライブラリーは、望ましい、心地よい、官能的な、または不都合な食味、香り、臭い、芳香、および／または匂いを検出する嗅覚受容体に相当する。いくつかの態様において、レパートリーまたはライブラリーは、あるクラス、ファミリーまたはタイプの嗅覚受容体に相当する。
【００４５】
［４９］本明細書において、用語「レポーター」または「レポーター分子」は、間接的にまたは直接検出されることが可能な部分を指す。レポーターには、限定なしに、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、発光タンパク質、受容体、ハプテン、酵素、および放射性同位体が含まれる。
【００４６】
［５０］本明細書において、用語「レポーター遺伝子」は、直接または間接的にのいずれかで検出可能であるレポーター分子をコードするポリヌクレオチドを指す。例示的なレポーター遺伝子は、とりわけ、酵素、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、受容体、抗原性エピトープ、および輸送体をコードする。
【００４７】
［５１］本明細書において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、４２℃の温度で５ＸＳＳＣでの５０％ホルムアミド中のハイブリダイズ、および６０℃、０．２ＸＳＳＣ中のフィルター洗浄を指す（１ＸＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件はまた、洗浄に関して低イオン強度および高温、例えば５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム；変性剤、例えばホルムアミドを含むハイブリダイゼーション、例えば４２℃での、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む、ｐＨ６．５の０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤を含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド；または４２℃での５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５Ｘデンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを含み、４２℃での０．２ＸＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、および５５℃での５０％ホルムアミドでの洗浄、その後、５５℃でのＥＤＴＡを含有する０．１ＸＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を伴う。
【００４８】
［５２］本明細書において、「実質的同一性」は、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、および８９〜９５パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。実質的同一性はまた、少なくとも２０残基位の比較ウィンドウまたは少なくとも３０〜５０残基のウィンドウに渡る参照配列に比較した際の少なくとも９９パーセントの配列同一性も含み、ここで配列同一性パーセントは、参照配列を、比較ウィンドウに渡って、欠失または付加または置換を含む配列に比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される特定の態様において、用語「実質的に同一」は、例えば標準パラメータ、すなわちデフォルトパラメータを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるなどで最適に整列された際、２つのポリペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれより多く（例えば９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。
【００４９】
［５３］好ましくは、アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、類似の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸で置換、すなわち保存的アミノ酸置換した結果である。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性性質の類似性に基づいて行われることも可能である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；そして陰性荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００５０】
［５４］本明細書において、「食味受容体」は、甘味、苦味、およびうまみ（グルタミン酸）を検出するためのＧタンパク質共役食味受容体、ならびに塩気および酸味を検出するためのイオンチャネルおよびイオンチャネル型受容体を指す。
【００５１】
［５５］本明細書において、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」は、外因性核酸が宿主細胞内にトランスファーまたは導入されるプロセスと定義される。「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」細胞は、外因性核酸でトランスフェクション、形質転換または形質導入されている細胞である。細胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
【００５２】
［５６］単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別に示さない限り、複数の参照物質が含まれる。同様に、単語「または（оｒ）」は、文脈が明らかに別に示さない限り、「および（ａｎｄ）」を含むと意図される。物質、例えば抗原の濃度またはレベルに関して示される数値限界は、およそであると意図される。したがって、濃度が、少なくとも（例えば）２００μｇであると示される場合、濃度は、少なくともおよそ「約」または「約」２００μｇであると意図される。
【００５３】
嗅覚受容体
［５７］大部分の嗅覚受容体は、受容体が匂い物質によって活性化された後のシグナル伝達のため、Ｇタンパク質と会合しているＧタンパク質共役受容体である。ＧＰＣＲは、７つのαらせん膜貫通領域の保存された構造特徴を有する。大部分の嗅覚受容体は、長さ約３２０±２５アミノ酸である。長さの相違は、大部分、Ｎ末端およびＣ末端領域の変動から生じる。大部分の嗅覚受容体には、ＴＭ３（膜貫通セクション３）ならびにＴＭ３およびＴＭ４の間の細胞内ループのジャンクションに位置する、モチーフＭＡＹＤＲＹＶＡＩＣ（配列番号２）が含まれる。いくつかの嗅覚受容体に保存される他のモチーフには、例えば第一の細胞内ループ内のＬＨＴＰＭＹ（配列番号３）、ＴＭ６の開始部のＦＳＴＣＳＳＨ（配列番号４）、およびＴＭ７中のＰＭＬＮＰＦ（配列番号５）が含まれる。
【００５４】
［５８］いくつかの態様において、本発明で用いる嗅覚受容体は、ヒト嗅覚受容体、または別の哺乳動物由来の嗅覚受容体、または別の生物由来の嗅覚受容体である。いくつかの態様において、本発明で用いる嗅覚受容体は、ハイブリッド嗅覚受容体である。いくつかの態様において、１つの嗅覚受容体のＮ末端領域由来のアミノ酸を、第二の異なる嗅覚受容体のＮ末端領域に融合させる。いくつかの態様において、Ｎ末端アミノ酸は、ドナー嗅覚受容体のアミノ酸１〜６１位由来である。いくつかの態様において、Ｎ末端アミノ酸は、ドナー嗅覚受容体のアミノ酸１〜５５位由来である。いくつかの態様において、Ｎ末端アミノ酸は、アミノ酸１〜２０位、または第一の膜貫通ドメインまでのアミノ酸、または第一の膜貫通ドメインのコンセンサス配列を含むアミノ酸１〜４０位由来である。いくつかの態様において、Ｎ末端アミノ酸を、アミノ酸１〜６１位のＮ末端領域で、アクセプター嗅覚受容体に融合させる。いくつかの態様において、ドナーポリペプチドのＣ末端由来のアミノ酸を、アクセプター嗅覚受容体のＣ末端に融合させる。いくつかの態様において、アクセプター嗅覚受容体のＣ末端由来の１〜５０アミノ酸を、ドナーポリペプチド由来のアミノ酸によって置換する。いくつかの態様において、アクセプター嗅覚受容体のＣ末端由来の１〜５５アミノ酸を、ドナーポリペプチド由来のアミノ酸によって置換する。いくつかの態様において、ドナーポリペプチドは、嗅覚受容体である。
【００５５】
［５９］いくつかの態様において、アクセプター嗅覚受容体はヒト嗅覚受容体であり、そしてドナー嗅覚受容体はヒト嗅覚受容体である。いくつかの態様において、アクセプター嗅覚受容体はヒト嗅覚受容体であり、そしてドナー嗅覚受容体はネズミ嗅覚受容体である。いくつかの態様において、アクセプター嗅覚受容体はヒト嗅覚受容体であり、そしてドナー嗅覚受容体は酵母ポリペプチドである。いくつかの態様において、アクセプター嗅覚受容体はネズミ嗅覚受容体であり、そしてドナー嗅覚受容体はネズミ嗅覚受容体である。いくつかの態様において、アクセプター嗅覚受容体はネズミ嗅覚受容体であり、そしてドナー嗅覚受容体はヒト嗅覚受容体である。いくつかの態様において、アクセプター嗅覚受容体はネズミ嗅覚受容体であり、そしてドナー嗅覚受容体は酵母ポリペプチドである。いくつかの態様において、アクセプター嗅覚受容体はイヌ嗅覚受容体であり、そしてドナー嗅覚受容体はイヌ嗅覚受容体である。いくつかの態様において、アクセプター嗅覚受容体はイヌ嗅覚受容体であり、そしてドナー嗅覚受容体はヒトまたはネズミ嗅覚受容体である。いくつかの態様において、アクセプター嗅覚受容体はイヌ嗅覚受容体であり、そしてドナー嗅覚受容体は酵母ポリペプチドである。
【００５６】
［６０］いくつかの態様において、ドナー嗅覚受容体から付加されるアミノ酸が、アクセプター嗅覚受容体中の対応するアミノ酸位を置換する。いくつかの態様において、ドナー嗅覚受容体から付加されるアミノ酸は、アクセプター嗅覚受容体中のアミノ酸総数を増加させる。いくつかの態様において、アクセプター嗅覚受容体は、融合を行った後、より少ない（出発アクセプター嗅覚受容体よりも）アミノ酸を有する。
【００５７】
［６１］大部分の哺乳動物嗅覚受容体は、２つの系統発生群、クラスＩおよびクラスＩＩ嗅覚受容体に分類可能である。クラスＩ嗅覚受容体は魚類嗅覚受容体に類似であり、そしてクラスＩＩ受容体は哺乳動物に最も特徴的である。哺乳動物において、嗅覚受容体の大部分はクラスＩＩであるが、哺乳動物はまた、クラスＩ受容体も有し、例えばヒトおよびマウスは、各々、１００を超えるクラスＩ嗅覚受容体を有する。嗅覚遺伝子の数は、哺乳動物間で、霊長類における約８００（偽遺伝子を含む）から、イヌおよびマウスにおける約１，５００まで多様である。機能性嗅覚受容体の数は、カモノハシ（ｐｌａｔｙｐｕｓ）の約２６２およびヒトの３９０から、ラットの１，２８４およびマウスの１，１９４まで、多様である。
【００５８】
［６２］ヒト嗅覚受容体のレパートリーには、１８の遺伝子ファミリーおよび３００のサブファミリー中、約３９０の推定上の機能性遺伝子を含む、約８５０の遺伝子および偽遺伝子が含まれる。嗅覚受容体のポリペプチドおよび核酸配列へのリンクとともに、ヒト嗅覚受容体遺伝子のファミリーおよびサブファミリーへの組織化を示すデータベースが、すべての目的のため、その全体がすべて本明細書に援用される、ＨＵＧＯ遺伝子命名委員会ウェブサイト、ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｆａｍｉｌｉｅｓ／ＯＲ、ｓｅｎｓｅｌａｂ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ＯＲＤＢ／ｉｎｆｏ／ｈｕｍａｎｏｒｓｅｑａｎａｌの嗅覚受容体データベース、およびｇｅｎｏｍｅ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｈｏｒｄｅ／に見られる、ＨＯＲＤＥ、ヒト嗅覚データエクスプローラーで見出されうる。
【００５９】
［６３］マウス嗅覚受容体のレパートリーには、２２８ファミリー中で約１，２９６の遺伝子および偽遺伝子が含まれ、このうち約８０％は推定上機能性である。嗅覚受容体のポリペプチドおよび核酸配列へのリンクとともに、マウス嗅覚受容体遺伝子のファミリーおよびサブファミリーへの組織化を示すデータベースが、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ｓｅｎｓｅｌａｂ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ＯＲＤＢ／ｉｎｆｏ／ｈｕｍａｎｏｒｓｅｑａｎａｌの嗅覚受容体データベースで見出されうる。
【００６０】
［６４］イヌ嗅覚受容体のレパートリーには約１，０９４遺伝子が含まれる。すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｑｕｉｇｎｏｎら，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  ｖｏｌ．  ６，  ｐｐ．  Ｒ８３−Ｒ８３．９（２００５）；  Ｏｌｅｎｄｅｒら，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｖｏｌ．  ８３，  ｐｐ．  ３６１−３７２（２００４）；  Ｑｕｉｇｎｏｎら，  第１３章，  ＣＳＨ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４４：  Ｔｈｅ  Ｄｏｇ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｇｅｎｏｍｅ（２００６）。
【００６１】
［６５］他の哺乳動物の嗅覚受容体レパートリーもまた、本発明の範囲内であり、これには例えば、マウス、ラット、ネコ、乳牛および畜牛、ウマ、ヤギ、ブタ、およびクマの嗅覚受容体レパートリーが含まれる。
【００６２】
［６６］いくつかの態様において、バイオセンサーは、アミノ酸配列（ＯＲ１Ａ１、ＮＣＢＩ  ９６０６、ＵＰ０００００５６４０、ＨＧＮＣ  ８１７９、ＮＰ＿０５５３８０．２、ＤＭＤＭ  ２１２２７６４５１）を有するヒト嗅覚受容体１Ａ１より作製される：
【００６３】
【化１】
2019510510.tif 000002
【００６４】
いくつかの態様において、ヒト嗅覚受容体１Ａ１のＮ末端アミノ酸は、配列（ＯＲ６Ａ２、ＮＣＢＩ  ９６０６、ＵＰ０００００５６４０、ＨＧＮＣ  １５３０１；  ＮＰ＿００３６８７．２）を有するヒト嗅覚受容体６Ａ２由来のＮ末端アミノ酸で置換されている。
【００６５】
【化２】
2019510510.tif 000003
【００６６】
いくつかの態様において、ＯＲ６Ａ２のＮ末端領域由来のアミノ酸（アミノ酸１〜６１位）をＯＲ１Ａ１に融合させて、バイオセンサーで用いる融合嗅覚受容体を作製する。いくつかの態様において、ＯＲ６Ａ２のＮ末端領域由来の少なくとも２０の隣接アミノ酸をＯＲ１Ａ１に融合させる。いくつかの態様において、ＯＲ６Ａ２のＮ末端領域は、アミノ酸１〜５５位である。ＯＲ６Ａ２のこれらのアミノ酸を１〜６１の範囲でＯＲ１Ａ１のＮ末端領域の位に融合させる。いくつかの態様において、ＯＲ６Ａ２由来のＮ末端配列をＯＲ１Ａ１のアミノ酸５６位に融合させる。いくつかの態様において、ヒトＯＲ６Ａ２を修飾なしにバイオセンサーにおいて用いる。いくつかの態様において、ヒトＯＲ６Ａ２受容体を、他の嗅覚受容体由来の他のＣ末端配列と融合させることによって、Ｃ末端で修飾する。いくつかの態様において、ヒトＯＲ２６Ａ２を、他の嗅覚受容体由来のＮ末端配列と融合させることによって、Ｎ末端で修飾する。
【００６７】
［６７］いくつかの態様において、ヒト嗅覚受容体２Ｊ２（ＯＲ２Ｊ２、ＨＧＮＣ  ８２６０；  ＮＰ＿１１２１６７）からバイオセンサーを作製する。
【００６８】
【化３】
2019510510.tif 000004
【００６９】
［６８］いくつかの態様において、ヒト嗅覚受容体２Ｗ１（ＯＲ２Ｗ１、ＨＧＮＣ  ８２８１；  ＮＰ＿１１２１６５）からバイオセンサーを作製する。
【００７０】
【化４】
2019510510.tif 000005
【００７１】
［６９］いくつかの態様において、ヒト嗅覚受容体５Ｐ３（ＯＲ５Ｐ３、ＨＧＮＣ  １４７８４；  ＮＰ＿７０３１４６）からバイオセンサーを作製する。
【００７２】
【化５】
2019510510.tif 000006
【００７３】
［７０］いくつかの態様において、ラットＲ１７嗅覚受容体由来のＮ末端アミノ酸を、ヒト嗅覚受容体のＮ末端に融合させる。ラットＲ１７嗅覚受容体はＮ末端配列：
【００７４】
【化６】
2019510510.tif 000007
【００７５】
を有する。いくつかの態様において、ラットＲ１７嗅覚受容体のＮ末端配列のアミノ酸１〜５５位をヒト嗅覚受容体のＮ末端に融合させる。
［７１］いくつかの態様において、嗅覚受容体をＮまたはＣ末端でＦＬＡＧまたはＨＩＳタグに融合させて、バイオセンサーポリペプチドの特定の精製および生化学的特徴付けを補助する。
【００７６】
［７２］ヒト嗅覚受容体は、１８のファミリー：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、５１、５２、５５および５６に分類される。ファミリーＯＲ１は２１のメンバーを有する：ＯＲ１Ａ、ＯＲ１Ｂ、ＯＲ１Ｃ、ＯＲ１Ｄ、ＯＲ１Ｅ、ＯＲ１Ｆ、ＯＲ１Ｇ、ＯＲ１Ｈ、ＯＲ１Ｉ、ＯＲ１Ｊ、ＯＲ１Ｋ、ＯＲ１Ｌ、ＯＲ１Ｍ、ＯＲ１Ｎ、ＯＲ１Ｐ、ＯＲ１Ｑ、ＯＲ１Ｒ、ＯＲ１Ｓ、ＯＲ１Ｘ、ＯＲ１ＡＡ、およびＯＲ１ＡＢ。ファミリーＯＲ２は４１のメンバーを有する：ＯＲ２Ａ、ＯＲ２Ｂ、ＯＲ２Ｃ、ＯＲ２Ｄ、ＯＲ２Ｅ、ＯＲ２Ｆ、ＯＲ２Ｇ、ＯＲ２Ｈ、ＯＲ２Ｉ、ＯＲ２Ｊ、ＯＲ２Ｋ、ＯＲ２Ｌ、ＯＲ２Ｍ、ＯＲ２Ｎ、ＯＲ２Ｑ、ＯＲ２Ｒ、ＯＲ２Ｓ、ＯＲ２Ｔ、ＯＲ２Ｕ、ＯＲ２Ｖ、ＯＲ２Ｗ、ＯＲ２Ｘ、ＯＲ２Ｙ、ＯＲ２Ｚ、ＯＲ２ＡＤ、ＯＲ２ＡＥ、ＯＲ２ＡＦ、ＯＲ２ＡＧ、ＯＲ２ＡＨ、ＯＲ２ＡＩ、ＯＲ２ＡＪ、ＯＲ２ＡＫ、ＯＲ２ＡＬ、ＯＲ２ＡＭ、ＯＲ２ＡＯ、ＯＲ２ＡＰ、ＯＲ２ＡＳ、およびＯＲ２ＡＴ。ファミリーＯＲ３は３つのメンバーを有する：ＯＲ３Ａ、ＯＲ３Ｂ、およびＯＲ３Ｄ。ファミリーＯＲ４は２１のメンバーを有する：ＯＲ４Ａ、ＯＲ４Ｂ、ＯＲ４Ｃ、ＯＲ４Ｄ、ＯＲ４Ｅ、ＯＲ４Ｆ、ＯＲ４Ｇ、ＯＲ４Ｈ、ＯＲ４Ｋ、ＯＲ４Ｌ、ＯＲ４Ｍ、ＯＲ４Ｎ、ＯＲ４Ｐ、ＯＲ４Ｑ、ＯＲ４Ｒ、ＯＲ４Ｓ、ＯＲ４Ｔ、ＯＲ４Ｕ、ＯＲ４Ｖ、ＯＲ４Ｗ、およびＯＲ４Ｘ。ファミリーＯＲ５は４９のメンバーを有する：ＯＲ５Ａ、ＯＲ５Ｂ、ＯＲ５Ｃ、ＯＲ５Ｄ、ＯＲ５Ｅ、ＯＲ５Ｆ、ＯＲ５Ｇ、ＯＲ５Ｈ、ＯＲ５Ｉ、ＯＲ５Ｊ、ＯＲ５Ｋ、ＯＲ５Ｌ、ＯＲ５Ｍ、ＯＲ５Ｐ、ＯＲ５Ｒ、ＯＲ５Ｓ、ＯＲ５Ｔ、ＯＲ５Ｖ、ＯＲ５Ｗ、ＯＲ５ＡＣ、ＯＲ５ＡＨ、ＯＲ５ＡＫ、ＯＲ５ＡＬ、ＯＲ５ＡＭ、ＯＲ５ＡＮ、ＯＲ５ＡＯ、ＯＲ５ＡＰ、ＯＲ５ＡＱ、ＯＲ５ＡＲ、ＯＲ５ＡＳ、ＯＲ５ＡＵ、ＯＲ５Ｗ、ＯＲ５Ｘ、ＯＲ５Ｙ、ＯＲ５Ｚ、ＯＲ５ＢＡ、ＯＲ５ＢＢ、ＯＲ５ＢＣ、ＯＲ５ＢＤ、ＯＲ５ＢＥ、ＯＲ５ＢＨ、ＯＲ５ＢＪ、ＯＲ５ＢＫ、ＯＲ５ＢＬ、ＯＲ５ＢＭ、ＯＲ５ＢＮ、ＯＲ５ＢＰ、ＯＲ５ＢＱ、ＯＲ５ＢＲ、ＯＲ５ＢＳ、およびＯＲ５ＢＴ。ファミリーＯＲ６は２１のメンバーを有する：ＯＲ６Ａ、ＯＲ６Ｂ、ＯＲ６Ｃ、ＯＲ６Ｄ、ＯＲ６Ｅ、ＯＲ６Ｆ、ＯＲ６Ｊ、ＯＲ６Ｋ、ＯＲ６Ｌ、ＯＲ６Ｍ、ＯＲ６Ｎ、ＯＲ６Ｐ、ＯＲ６Ｑ、ＯＲ６Ｒ、ＯＲ６Ｓ、ＯＲ６Ｔ、ＯＲ６Ｕ、ＯＲ６Ｖ、ＯＲ６Ｗ、ＯＲ６Ｘ、およびＯＲ６Ｙ。ファミリーＯＲ７は９のメンバーを有する：ＯＲ７Ａ、ＯＲ７Ｃ、ＯＲ７Ｄ、ＯＲ７Ｅ、ＯＲ７Ｇ、ＯＲ７Ｈ、ＯＲ７Ｋ、ＯＲ７Ｌ、およびＯＲ７Ｍ。ファミリーＯＲ８は１８のメンバーを有する：ＯＲ８Ａ、ＯＲ８Ｂ、ＯＲ８Ｃ、ＯＲ８Ｄ、ＯＲ８Ｆ、ＯＲ８Ｇ、ＯＲ８Ｈ、ＯＲ８Ｉ、ＯＲ８Ｊ、ＯＲ８Ｋ、ＯＲ８Ｌ、ＯＲ８Ｑ、ＯＲ８Ｒ、ＯＲ８Ｓ、ＯＲ８Ｔ、ＯＲ８Ｕ、ＯＲ８Ｖ、およびＯＲ８Ｘ。ファミリーＯＲ９は１２のメンバーを有する：ＯＲ９Ａ、ＯＲ９Ｇ、ＯＲ９Ｈ、ＯＲ９Ｊ、ＯＲ９Ｋ、ＯＲ９Ｌ、ＯＲ９Ｍ、ＯＲ９Ｎ、ＯＲ９Ｐ、ＯＲ９Ｑ、ＯＲ９Ｒ、およびＯＲ９Ｓ。ファミリーＯＲ１０は２９のメンバーを有する：ＯＲ１０Ａ、ＯＲ１０Ｂ、ＯＲ１０Ｃ、ＯＲ１０Ｄ、ＯＲ１０Ｇ、ＯＲ１０Ｈ、ＯＲ１０Ｊ、ＯＲ１０Ｋ、ＯＲ１０Ｎ、ＯＲ１０Ｐ、ＯＲ１０Ｑ、ＯＲ１０Ｒ、ＯＲ１０Ｓ、ＯＲ１０Ｔ、ＯＲ１０Ｕ、ＯＲ１０Ｖ、ＯＲ１０Ｗ、ＯＲ１０Ｘ、ＯＲ１０Ｙ、ＯＲ１０Ｚ、ＯＲ１０ＡＡ、ＯＲ１０ＡＢ、ＯＲ１０ＡＣ、ＯＲ１０ＡＤ、ＯＲ１０ＡＥ、ＯＲ１０ＡＦ、ＯＲ１０ＡＧ、ＯＲ１０ＡＨ、およびＯＲ１０ＡＫ。ファミリーＯＲ１１は１１のメンバーを有する：ＯＲ１１Ａ、ＯＲ１１Ｇ、ＯＲ１１Ｈ、ＯＲ１１Ｉ、ＯＲ１１Ｊ、ＯＲ１１Ｋ、ＯＲ１１Ｌ、ＯＲ１１Ｍ、ＯＲ１１Ｎ、ＯＲ１１Ｐ、ＯＲ１１Ｑ。ファミリーＯＲ１２は１つのメンバーを有する：ＯＲ１２Ｄ。ファミリーＯＲ１３は１１のメンバーを有する：ＯＲ１３Ａ、ＯＲ１３Ｃ、ＯＲ１３Ｄ、ＯＲ１３Ｅ、ＯＲ１３Ｆ、ＯＲ１３Ｇ、ＯＲ１３Ｈ、ＯＲ１３Ｉ、ＯＲ１３Ｊ、ＯＲ１３Ｋ、およびＯＲ１３Ｚ。ファミリーＯＲ１４は６のメンバーを有する：ＯＲ１４Ａ、ＯＲ１４Ｃ、ＯＲ１４Ｉ、ＯＲ１４Ｊ、ＯＲ１４Ｋ、およびＯＲ１４Ｌ。ファミリーＯＲ５１は２１のメンバーを有する：ＯＲ５１Ａ、ＯＲ５１Ｂ、ＯＲ５１Ｃ、ＯＲ５１Ｄ、ＯＲ５１Ｅ、ＯＲ５１Ｆ、ＯＲ５１Ｇ、ＯＲ５１Ｈ、ＯＲ５１Ｉ、ＯＲ５１Ｊ、ＯＲ５１Ｋ、ＯＲ５１Ｌ、ＯＲ５１Ｍ、ＯＲ５１Ｎ、ＯＲ５１Ｐ、ＯＲ５１Ｑ、ＯＲ５１Ｒ、ＯＲ５１Ｓ、ＯＲ５１Ｔ、ＯＲ５１Ｖ、およびＯＲ５１ＡＢ。ファミリーＯＲ５２は２２のメンバーを有する：ＯＲ５２Ａ、ＯＲ５２Ｂ、ＯＲ５２Ｄ、ＯＲ５２Ｅ、ＯＲ５２Ｈ、ＯＲ５２Ｉ、ＯＲ５２Ｊ、ＯＲ５２Ｋ、ＯＲ５２Ｌ、ＯＲ５２Ｍ、ＯＲ５２Ｎ、ＯＲ５２Ｐ、ＯＲ５２Ｑ、ＯＲ５２Ｒ、ＯＲ５２Ｓ、ＯＲ５２Ｔ、ＯＲ５２Ｕ、ＯＲ５２Ｖ、ＯＲ５２Ｗ、ＯＲ５２Ｘ、ＯＲ５２Ｙ、およびＯＲ５２Ｚ。ファミリーＯＲ５５は１つのメンバーを有する：ＯＲ５５Ｂ。ファミリーＯＲ５６は２つのメンバーを有する：ＯＲ５６ＡおよびＯＲ５６Ｂ。
【００７７】
バイオセンサー
［７３］本発明は、嗅覚受容体での相互作用の検出のためのバイオセンサーに関する。いくつかの態様において、バイオセンサーを用いて、嗅覚受容体での匂い物質の相互作用を検出する。いくつかの態様において、バイオセンサーは複数の嗅覚受容体を含み、そして複数の嗅覚受容体を用いて匂い物質を検出する。いくつかの態様において、バイオセンサー中の複数の嗅覚受容体は、動物の嗅覚受容体レパートリーまたはレパートリーの一部に相当する。いくつかの態様において、バイオセンサー中の複数の嗅覚受容体は、ヒト嗅覚受容体レパートリーまたはレパートリーの一部に相当する。いくつかの態様において、バイオセンサー中の複数の嗅覚受容体は、溶液中の匂い物質を検出するヒト嗅覚受容体のレパートリーの一部に相当する。いくつかの態様において、バイオセンサー中の複数の嗅覚受容体は、気相中の匂い物質を検出するヒト嗅覚受容体のレパートリーの一部に相当する。いくつかの態様において、バイオセンサー中の複数の嗅覚受容体は、快いまたは陽性の反応を生じるヒト嗅覚受容体のレパートリーの一部に相当する。いくつかの態様において、バイオセンサー中の複数の嗅覚受容体は、不都合なまたは陰性の反応を生じるヒト嗅覚受容体のレパートリーの一部に相当する。いくつかの態様において、バイオセンサー中の複数の嗅覚受容体は、ヒト嗅覚受容体の１８ファミリーの１つに由来するヒト嗅覚受容体のレパートリーの一部に相当する。
【００７８】
［７４］いくつかの態様において、個々のバイオセンサーは、膜内に嗅覚受容体を挿入するための宿主細胞分泌装置に向けて新生ポリペプチドをターゲティングするポリペプチド配列に、そのＮ末端領域で融合し、そして膜において受容体を安定化させるポリペプチドに、そのＣ末端領域で融合している嗅覚受容体で構成される。いくつかの態様において、嗅覚受容体のＣ末端領域に融合したポリペプチドは、受容体を宿主細胞の外膜に向けてターゲティングする。いくつかの態様において、嗅覚受容体は哺乳動物嗅覚受容体である。いくつかの態様において、嗅覚受容体はヒト嗅覚受容体である。いくつかの態様において、バイオセンサーにおいて、全長嗅覚受容体を用いる。いくつかの態様において、全長嗅覚受容体はヒト嗅覚受容体である。
【００７９】
［７５］いくつかの態様において、バイオセンサーにはＧタンパク質シグナル伝達経路が含まれる。多くのＧタンパク質シグナル伝達経路が使用可能である。いくつかの態様において、Ｇタンパク質シグナル伝達経路は、アデニル酸シクラーゼのＧタンパク質仲介活性化を含み、二次メッセンジャーとしてｃＡＭＰの産生が生じる。いくつかの態様において、ｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ活性化陽イオンチャネルと相互作用する。
【００８０】
［７６］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーはまた、Ｇタンパク質およびアデニル酸シクラーゼ（例えばＵｎｉｐｒｏｔ  Ｏ６０２６６）で構成される。いくつかの態様において、Ｇタンパク質は、３つのサブユニット、Ｇαサブユニット（例えばＵｎｉｐｒｏｔ  Ｐ３８４０５）、Ｇβサブユニット（例えばＵｎｉｐｒｏｔ  Ｐ６２８７９）およびＧγサブユニット（例えばＵｎｉｐｒｏｔ  Ｐ６３２１８）で構成される。いくつかの態様において、アデニル酸シクラーゼおよびＧタンパク質は同じ種由来である。いくつかの態様において、アデニル酸シクラーゼおよびＧタンパク質は異なる種由来である。いくつかの態様において、Ｇタンパク質サブユニットは同じ種または異なる種由来である。いくつかの態様において、嗅覚受容体、Ｇタンパク質およびアデニル酸シクラーゼは同じ種由来であり、そしていくつかの態様において、構成要素の１またはそれより多くは、異なる種由来である。いくつかの態様において、バイオセンサーの嗅覚受容体およびＧタンパク質は、ヒトポリペプチドから生じる。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーポリペプチドには、配列番号６〜１０および１２〜１７、または１８のヒトＯＲ遺伝子ファミリー由来のヒトＯＲ受容体の１つと７０％、８０％、９０％、９５％、および９９％の配列相同性を有するポリペプチドが含まれる。
【００８１】
［７７］いくつかの態様において、バイオセンサーにはレポーターが含まれる。いくつかの態様において、バイオセンサーのＧタンパク質は、レポーターポリペプチドと直接相互作用して、検出可能なシグナルを生じ、例えばアデニル酸シクラーゼは、ｃＡＭＰを生じるレポーターポリペプチドである。ｃＡＭＰ分子はそれ自体、検出可能である（例えば商業的に入手可能なキットが、例えばＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、およびＣｅｌｌ  ＢｉｏＬａｂｓによって販売されている）。いくつかの態様において、バイオセンサーのＧタンパク質は、レポーターを誘導するポリペプチドと相互作用する。いくつかの態様において、Ｇタンパク質はポリペプチド（例えばアデニル酸シクラーゼ）と相互作用して第一のシグナルを生成し、そしてレポーターが第一のシグナルと反応した際、第二の系が第一のシグナルを増幅する。いくつかの態様において、多数の増幅工程を用いて、嗅覚受容体での相互作用の検出を増加させる。いくつかの態様において、バイオセンサーによって検出される結合相互作用のダイナミックレンジを増加させるために、一次シグナルおよび増幅されたまたは多数の増幅されたシグナルの両方を検出する。
【００８２】
［７８］いくつかの態様において、バイオセンサーには１またはそれより多いレポーターが含まれる。いくつかの態様において、宿主細胞がレポーターを発現し、そしてバイオセンサーの嗅覚受容体で適切な相互作用が生じた際に、バイオセンサーがレポーターを活性化するように、レポータータンパク質をコードする異種遺伝子を宿主細胞内に導入する。いくつかの態様において、宿主細胞は、単一のレポーターを発現するように操作される。いくつかの態様において、各々異なるレポーターを発現する異なる宿主細胞を用いて、バイオセンサーのシグナル検出を増進させる。いくつかの態様において、宿主細胞を操作して、例えば２またはそれより多いレポーターをコードする単一ベクター構築物を用いることによって、２またはそれより多いレポーター産物を発現させる。いくつかの態様において、単数または複数のレポーターは、約１０−１２Ｍ〜約１０Ｍの範囲の嗅覚受容体での検出範囲を含む、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０桁に渡る検出のダイナミックレンジを提供する。
【００８３】
［７９］いくつかの態様において、単数または複数のレポーターは、蛍光レポーター、生物発光レポーター、酵素、およびイオンチャネルの１またはそれより多くである。蛍光レポーターの例には、例えば、エクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）またはレニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の緑色蛍光タンパク質、およびその活性変異体（例えば青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質等）；ヒドロ虫（Ｈｙｄｒｏｉｄ）クラゲ、カイアシ類（Ｃｏｐｅｐｏｄ）、有櫛動物（Ｃｔｅｎｏｐｈｏｒａ）、花虫綱（Ａｎｔｈｒｏｚｏａｓ）、およびサンゴイソギンチャク（Ｅｎｔａｃｍａｅａ  ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒ）由来の蛍光タンパク質、およびその活性変異体；ならびにフィコビリタンパク質およびその活性変異体が含まれる。他の蛍光レポーターには、例えば、ＣＰＳＤ（二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ｔ２１４１）などの小分子が含まれる。生物発光レポーターには、例えばエクオリン（および他のＣａ＋２制御発光タンパク質）、ルシフェリン基質に基づくルシフェラーゼ、セレンテラジン基質に基づくルシフェラーゼ（例えば、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）、およびメトリジナ（Ｍｅｔｒｉｄｉｎａ））、およびシプリジナ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）由来のルシフェラーゼ、およびその活性変異体が含まれる。いくつかの態様において、生物発光レポーターには、例えば北米ホタル（Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ、日本ホタル（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ、イタリアホタル（Ｉｔａｌｉａｎ  ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ、東欧ホタル（Ｅａｓｔ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ、ペンシルバニアホタル（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ、コメツキムシ（Ｃｌｉｃｋ  ｂｅｅｔｌｅ）ルシフェラーゼ、レイルロードワーム（ｒａｉｌｒｏａｄ  ｗｏｒｍ）ルシフェラーゼ、レニラ・ルシフェラーゼ、ガウシア・ルシフェラーゼ、シプリジナ・ルシフェラーゼ、メトリダ（Ｍｅｔｒｉｄａ）ルシフェラーゼ、ＯＬｕｃ、および赤色ホタル（ｒｅｄ  ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼが含まれ、これらはすべて、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよび／またはＰｒｏｍｅｇａから商業的に入手可能である。酵素レポーターには、例えば、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、セイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、およびカタラーゼが含まれる。イオンチャネルレポーターには、例えばｃＡＭＰ活性化陽イオンチャネルが含まれる。単数または複数のレポーターにはまた、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）レポーター、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）レポーター、光音響レポーター、Ｘ線レポーター、および超音波レポーターも含まれることも可能である。
【００８４】
［８０］いくつかの態様において、抗体を用いて、嗅覚受容体結合相互作用からのシグナルを増幅する。いくつかの態様において、レポーターは、抗体によって検出可能なポリペプチドまたは小分子である。いくつかの態様において、小分子またはポリペプチドはＥＬＩＳＡにおいて検出される。いくつかの態様において、抗体サンドイッチアッセイを用いて、小分子またはポリペプチドレポーターからのシグナルを増幅する。
【００８５】
［８１］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーでリアルタイム測定を行う。いくつかの態様において、レポーターは光を放出するか、または光学センサーで検出可能な分子を生じる。これらの態様において、バイオセンサーが潜在的リガンドと相互作用する際に、長期に渡って、光放出の変化を記録することによって、バイオセンサーからリアルタイム測定を得ることも可能である。リアルタイム測定を用いて、絶対測定または相対測定によって、結合相互作用を定量化することも可能である。絶対測定において、リアルタイムシグナルを標準に比較して、嗅覚受容体での結合活性を決定する。いくつかの態様において、嗅覚受容体に対する既知の量のリガンドを用いて、レポーター遺伝子出力に対する受容体占有に関する標準結合曲線を生成する。次いで、試験リガンドの結合を標準曲線に比較して、嗅覚受容体での試験リガンドの相互作用を定量化することも可能である。相対測定において、バイオセンサーには、比較しようとする嗅覚受容体での相互作用の相違を可能にする内部参照が含まれる。いくつかの態様において、参照Ｇタンパク質共役受容体が宿主細胞に含まれ、そして既知の量の参照リガンドを、標準として作用する参照受容体に添加する。いくつかの態様において、参照受容体を異なるレポーター、例えば嗅覚受容体レポーターとは異なる光学シグナルを提供するレポーターポリペプチドにカップリングする。いくつかの態様において、参照および試験受容体を、異なる蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ、および赤色蛍光タンパク質、ＲＦＰにカップリングする。赤色蛍光に対する緑色蛍光の比を、同じ嗅覚受容体での異なる試験リガンドに関して比較するか、または異なる嗅覚受容体への同じ試験リガンドの結合を比較することも可能である。
【００８６】
［８２］いくつかの態様において、リアルタイムデータを非光学レポーターを含むバイオセンサーから得る。いくつかの態様において第一のレポーター系由来のシグナルを、嗅覚受容体での弱い相互作用からのシグナルを増加させるように、第二のレポーター系によって増幅する。いくつかの態様において、受容体からのＧタンパク質共役シグナル伝達の感度を制御するために、バイオセンサーのＧＴＰ／ＧＤＰ比を調節する。いくつかの態様において、バイオセンサーのダイナミックレンジを改変するため、ＧＴＰ／ＧＤＰ比を調節する。
【００８７】
［８３］レポーター遺伝子から発現されるレポーター産物のタイプに応じて、任意の適切な検出法および装置によって、レポーター遺伝子の産物を検出することも可能である。例えば、例示的なレポーター遺伝子は、光産生タンパク質（例えばルシフェラーゼまたはｅＧＦＰ）をコードし、そしてこの表現型を、光学画像化を用いて検出可能である。本明細書の説明において、レポーターの発現は、コードされるレポーターまたはレポーター分子の発現を生じる、対応するレポーター遺伝子の発現が含まれるよう意味される。
【００８８】
［８４］１つの態様において、本発明のポリペプチドには、配列番号６〜１０および１２〜１７のポリペプチドの１つをコードする、またはヒト嗅覚受容体の１８ファミリー由来のヒトＯＲ受容体の１つをコードする核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドが含まれる。１つの態様において、本発明のポリペプチドには、配列番号６〜１０および１２〜１７のポリペプチドの１つをコードする核酸、またはヒト嗅覚受容体の１８ファミリー由来のヒトＯＲ受容体の１つをコードする核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドが含まれる。１つの態様において、本発明のポリペプチドには、配列番号６または７のポリペプチドをコードする核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドが含まれる。
【００８９】
［８５］１つの態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号６〜１０および１２〜１７の１つ、またはヒト嗅覚受容体の１８ファミリー由来のヒトＯＲ受容体の１つに、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。１つの態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号６〜７の１つに、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。１つの態様において、本発明のＥｐｈＡ３ポリペプチドは、配列番号６に、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。
【００９０】
［８６］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサー中のヒト嗅覚受容体の検出の閾値は、約０．１５の十億分率〜約４２０，０００の十億分率であるか、６〜７桁の範囲に渡る。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサー中のヒト嗅覚受容体の検出範囲は、約１０−９Ｍから約１０−３Ｍ、または約６桁の範囲に渡る。いくつかの態様において、検出範囲は、１０Ｍ〜１０−１２Ｍのリガンド範囲の、３、４、５、６、７、８、９、または１０桁に渡る。
【００９１】
［８７］本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの断片および変異体を含む。したがって、用語「断片または変異体ポリペプチド」は、ポリペプチドが本明細書に記載するように機能する限り、配列に対する欠失、付加および置換をさらに意図する。用語「保存的変異」は、別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換、あるいは、コードされるアミノ酸残基が変化しないか、または別の構造的、化学的もしくは別の意味で機能的に類似の残基に変化するような、核酸配列中のヌクレオチドの置換を意味する。これに関連して、特に好ましい置換は、一般的に、事実上、保存的であるもの、すなわちアミノ酸ファミリー内で起こる置換であろう。例えば、アミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、およびチロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、ときに、芳香族アミノ酸と分類される。保存的変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの疎水性残基の、別の疎水性残基に対する置換、あるいは１つの極性残基の別の極性残基に対する置換、例えばリジンに対するアルギニン、アスパラギン酸に対するグルタミン酸の置換等；あるいは生物学的活性に大きな影響を及ぼさないであろう、構造的に関連するアミノ酸でのアミノ酸の類似の保存的置換が含まれる。参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさない、重要でないアミノ酸置換を所持するタンパク質は、したがって、参照ポリペプチドの定義内である。これらの修飾によって産生されるポリペプチドはすべて、本明細書に含まれる。用語「保存的変異」にはまた、置換されたポリペプチドに対して作製された抗体がまた、非置換ポリペプチドと免疫反応するならば、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することもまた含まれる。
【００９２】
［８８］本発明の「変異体」ポリペプチドまたは核酸は、実質的に類似の配列を持つポリペプチドまたは核酸を含む。ポリヌクレオチドに関して、変異体は、天然ポリヌクレオチド内の１またはそれより多い部位での１またはそれより多いヌクレオチドの欠失および／または付加、ならびに／あるいは天然ポリヌクレオチドにおける１またはそれより多い部位での１またはそれより多いヌクレオチドの置換を含む。本明細書において、「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、天然存在ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。本発明の特定のポリヌクレオチド（すなわち参照ポリヌクレオチド）の変異体はまた、変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドおよび参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの間の配列同一性パーセントの比較によって評価可能である。「変異体」タンパク質は、天然タンパク質における１またはそれより多い部位での１またはそれより多いアミノ酸の欠失または付加、ならびに／あるいは天然タンパク質における１またはそれより多い部位での１またはそれより多いアミノ酸の置換によって、天然タンパク質から得られるタンパク質を意味するよう意図される。本発明に含まれる変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち免疫反応を誘発する能力を所持する。
【００９３】
［８９］他のアレル由来の本発明のポリペプチドの相同体が、本発明の範囲内にあると意図される。本明細書において、用語「相同体」には、類似体およびパラログが含まれる。用語「類似体」は、同じまたは類似の機能を有するが、関連しない宿主生物において別個に進化している２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。用語「パラログ」は、ゲノム内の複製によって関連している２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。パラログは、通常、異なる機能を有するが、これらの機能は関連していることも可能である。野生型ポリペプチドの類似体およびパラログは、翻訳後修飾によって、アミノ酸配列相違によって、または両方によって、野生型ポリペプチドとは異なることも可能である。特に、本発明の相同体は、一般的に、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と、少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、または９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を示し、そして類似の機能を示すであろう。変異体にはアレル変異体が含まれる。用語「アレル変異体」は、タンパク質のアミノ酸配列中の変化を導き、そして天然集団内に存在する多型（例えばウイルス種または変種）を含有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。こうした天然アレル変異は、典型的には、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおいて、１〜５％の変動を生じうる。アレル変異体は、いくつかの異なる種における関心対象の核酸配列を配列決定することによって同定可能であり、これは、ハイブリダイゼーションプローブを用いて、これらの種における同じ遺伝子座を同定することによって、容易に実行可能である。天然アレル変異の結果であり、そして関心対象の遺伝子の機能的活性を改変しない、あらゆるこうした核酸変異および生じるアミノ酸多型または変異が本発明の範囲内であると意図される。
【００９４】
［９０］本明細書において、用語「誘導体」または「変異体」は、（１）対応するポリペプチドが、野生型ポリペプチドと比較した際、実質的に同等の機能を有するか、または（２）ポリペプチドに対して作製した抗体が、野生型ポリペプチドと免疫反応性であるように、１またはそれより多い保存的アミノ酸変異または他の重要でない修飾を有するポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を指す。これらの変異体または誘導体には、修飾されていない対応ポリペプチドに比較した際、実質的に同等の活性を有するペプチドを生じうる、ポリペプチド一次アミノ酸配列の重要でない修飾を有するポリペプチドが含まれる。こうした修飾は、部位特異的突然変異誘発によるように意図的であることも可能であるし、または自発的であることも可能である。用語「変異体」は、ポリペプチドが、本明細書で定義するような免疫学的反応を生じるように機能する限り、配列に対する欠失、付加、および置換をさらに意図する。用語「変異体」にはまた、天然シグナルペプチドが、宿主種からのポリペプチドの発現または分泌を促進するために異種シグナルペプチドで置換されているポリペプチドの修飾も含まれる。用語「変異体」にはまた、完全に異なるタンパク質配列であるが、類似の構造を有し、やはり交差反応免疫を誘導する、「ミミトープ」が含まれる。
【００９５】
［９１］本発明のポリペプチドにはまた、ポリペプチドの修飾または誘導体化のため、グリコシル化部位または他の部位を導入するためのアミノ酸配列も含まれることも可能である。１つの態様において、上述の本発明のポリペプチドには、グリコシル化部位として作用しうるアミノ酸配列Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−Ｔが含まれることも可能である。グリコシル化中、オリゴ糖鎖を、３ペプチド配列Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−Ｔ、式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であることも可能である、中に存在するアスパラギン（Ｎ）に付着させる。この配列は、グリコシル化配列と呼ばれる。このグリコシル化部位は、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または内部配列内に配置されることも可能である。
【００９６】
宿主細胞
［９２］本発明において、多様な真核細胞が宿主細胞として使用可能である。いくつかの態様において、宿主細胞は、真菌細胞、動物細胞、植物細胞、または藻類細胞である。いくつかの態様において、真核細胞は、限定されるわけではないが、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、デバロマイセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）の真菌を含む、真菌細胞である。いくつかの態様において、真菌細胞は、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、クロコウジカビ、コウジカビ、クリソスポリウム・ルクノウェンス、またはトリコデルマ・リーゼイである。
【００９７】
［９３］いくつかの態様において、本発明の宿主細胞は動物細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、商業的に価値がある家畜由来の細胞である。いくつかの態様において、動物細胞は、哺乳動物細胞、例えばウシ、イヌ、ネコ、ハムスター、マウス、ブタ、ウサギ、ラット、またはヒツジのものである。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、限定されるわけではないが、サル、チンパンジー、ゴリラ、およびヒトを含む、霊長類の細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、マウス細胞であり、これは、マウスが他の哺乳動物、特にヒトのモデルとしてルーチンに機能しているためである（例えば、Ｈａｎｎａ，  Ｊ．ら，  “自己皮膚から生成したｉＰＳ細胞を用いた、鎌状赤血球貧血マウスモデルの治療，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９２０−２３，  ２００７；  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，  Ｄ．Ｍ．ら，  “ヒト・アポリポタンパク質Ｅの発現は、アルツハイマー病のマウスモデルにおけるアミロイドβ沈着を減少させる，”  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０３（６）：Ｒ１５−Ｒ２１，  １９９９；  Ｗａｒｒｅｎ，  Ｒ．Ｓ．ら，  “実験的肝臓転移のマウスモデルにおけるヒト結腸癌腫瘍発生の血管内皮増殖因子による制御，”  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：  １７８９−１７９７，  １９９５を参照されたい；各刊行物は本明細書に援用される）。動物細胞には、例えば、線維芽細胞、上皮細胞（例えば腎臓、乳腺、前立腺、肺）、角化細胞、肝細胞、脂肪細胞、内皮細胞、造血細胞が含まれる。いくつかの態様において、動物細胞は成体細胞（例えば最終分化、分裂性または非分裂性）または幹細胞である。いくつかの態様において、本発明の宿主細胞株として、哺乳動物細胞株を用いる。いくつかの態様において、細胞株は、チャイニーズハムスター細胞、ヒト腎臓細胞、サル腎臓細胞、ヒト子宮頸癌細胞、またはマウス骨髄腫細胞由来である。これらのおよび他の哺乳動物細胞株は、当該技術分野に周知であり、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）、およびＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．から公的に入手可能な哺乳動物細胞株である。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＡＴＣＣ、およびＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのウェブサイトで開示される細胞株は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
【００９８】
［９４］いくつかの態様において、真核細胞は植物細胞である。いくつかの態様において、植物細胞は、単子葉または双子葉植物であり、限定されるわけではないが、アルファルファ、アーモンド、アスパラガス、アボカド、バナナ、大麦、マメ、ブラックベリー、アブラナ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、チェリー、チコリ、柑橘類、コーヒー、ワタ、キュウリ、ユーカリ、麻、レタス、レンズマメ、トウモロコシ、マンゴー、メロン、オート麦、パパイヤ、エンドウマメ、ピーナツ、パイナップル、プラム、ジャガイモ（サツマイモを含む）、カボチャ、ラディッシュ、ブドウ種子、ラズベリー、イネ、ライ麦、ソルガム、ダイズ、ホウレンソウ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、タバコ、トマト、カブ、小麦、ズッキーニ、および他の結実野菜（例えばトマト、コショウ、チリ、ナス、キュウリ、カボチャ等）、他の鱗茎菜類（例えばニンニク、タマネギ、リーキ等）、他の仁果類（例えばリンゴ、セイヨウナシ等）、他の核果類（例えばモモ、ネクタリン、アプリコット、セイヨウナシ、プラム等）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、木本植物、例えば針葉樹および落葉樹、観賞植物、多年生牧草、飼料作物、花、他の野菜、他の果物、他の農作物、ハーブ、草、または多年生植物部分（例えば球根；塊茎；根；樹冠（ｃｒｏｗｎ）；茎；走根；ひこばえ；芽；無根挿し木、有根挿し木、およびカルス挿し木またはカルス生成小植物を含む挿し木；頂端分裂組織）が含まれる。用語「植物」は、種、実生、若木、根、塊茎、茎、柄、葉および果実を含む、植物のすべての生理学的部分を指す。
【００９９】
［９５］いくつかの態様において、真核細胞は、限定されるわけではないが、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、デュナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、ナノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、またはプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の藻類を含む藻類である。
【０１００】
核酸
［９６］いくつかの態様において、本発明は、少なくとも部分的に、本発明の個々のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をコードする核酸に関する。いくつかの態様において、核酸は、天然、合成またはその組み合わせであることも可能である。本発明の核酸は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成核酸であることも可能である。
【０１０１】
［９７］いくつかの態様において、本発明の核酸にはまた、発現ベクター、例えばプラスミド、またはウイルスベクター、または直鎖ベクター、または染色体ＤＮＡ内に組み込まれるベクターも含まれる。発現ベクターは、１またはそれより多い選択された宿主細胞においてベクターが複製することを可能にする核酸配列を含有可能である。こうした配列は、多様な細胞に関して周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適している。真核宿主細胞、例えば哺乳動物細胞において、発現ベクターは、宿主細胞染色体内に組み込まれ、そして次いで、宿主染色体とともに複製することも可能である。同様に、ベクターは、原核細胞の染色体内に組み込まれることも可能である。いくつかの態様において、ベクターは、酵母における自律複製プラスミド、ＹＲｐ、ＹＥｐ、およびＹＣｐに関する。３つすべては、Ｓ．セレビシエ／大腸菌シャトルベクターであり、典型的には発現カセットの挿入のためのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を所持する。いくつかの態様において、酵母エピトープタグ付けベクター、ｐＥＳＣを用いる。ｐＥＳＣベクターは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより商業的に入手可能である。
【０１０２】
［９８］発現ベクターはまた、一般的に、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含有する。選択可能マーカーは、本発明の宿主細胞を含めて、原核および真核細胞に関して、当該技術分野に周知である。一般的に、選択遺伝子は、選択培地中で増殖する形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培地中で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求不全を補完するか、あるいは（ｃ）複合培地からは入手可能でない必須栄養素を供給する、例えばバチルス（Ｂａｃｃｉｌｌｉ）にＤ−アラニン・ラセマーゼをコードする遺伝子を供給する。いくつかの態様において、例示的な選択スキームは、薬剤を利用して、宿主細胞の増殖を抑制する。異種遺伝子で成功裡に形質転換された細胞は、薬剤耐性を与えるタンパク質を産生し、そしてしたがって、選択措置を生き延びる。細菌または真核（哺乳動物を含む）系で使用するための他の選択可能マーカーが当該技術分野に周知である。酵母選択遺伝子の例には、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＬＹＳ２、ＡＤＥ２、ＭＥＴ１５、ｈｐｈＮＴ１、およびｎａｔＮＴ２が含まれる。すべての目的のため、本明細書にその全体が援用される、Ｄａ  Ｓｉｌｖａら，  ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：１９７−２１４（２０１２）。いくつかの態様において、これらの酵母選択遺伝子は、適切な栄養要求酵母株とともに用いられる。
【０１０３】
［９９］誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの例には、限定されるわけではないが、ＧＡＬＩ、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０（ガラクトース誘導性）ＣＵＰ１（銅イオン誘導性）、ＡＤＨ２（グルコース抑制）の酵母プロモーター、ならびに哺乳動物プロモーター、例えばメタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、ｃ−ｆｏｓプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターからの発現をテトラサイクリンオペレーター（単数または複数）の制御下に置くＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＴ−ＲＥｘ系、およびＩｎｔｒｅｘｏｎのＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈプロモーターが含まれる。すべての目的のため、その全体がすべて本明細書に援用される、Ｋａｒｚｅｎｏｗｓｋｉ，  Ｄ．ら，  ＢｉｏＴｅｃｈｉｑｕｅｓ  ３９：１９１−１９６（２００５）；  Ｄａｉ，  Ｘ．ら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ  ４２：２３６−２４５（２００５）；  Ｐａｌｌｉ，  Ｓ．  Ｒ．ら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７０：１３０８−１５１５（２００３）；  Ｄｈａｄｉａｌｌａ，  Ｔ．  Ｓ．ら，  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．  Ｅｎｔｏｍｏｌ．  ４３：５４５−５６９（１９９８）；  Ｋｕｍａｒ，  Ｍ．  Ｂ，ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：２７２１１−２７２１８（２００４）；  Ｖｅｒｈａｅｇｅｎｔ，  Ｍ．ら，  Ａｎｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７４：４３７８−４３８５（２００２）；  Ｋａｔａｌａｍ，  Ａ．  Ｋ．，ら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：Ｓ１０３（２００６）；およびＫａｒｚｅｎｏｗｓｋｉ，  Ｄ．ら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：Ｓ１９４（２００６），  Ｄａ  Ｓｉｌｖａら，  ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：１９７−２１４（２０１２）；米国特許第８，８９５，３０６号、第８，８２２，７５４号、第８，７４８，１２５号、第８，５３６，３５４号。
【０１０４】
［１００］本発明の発現ベクターは、典型的には、転写開始頻度を制御するため、プロモーター要素、例えばエンハンサーを有する。典型的には、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流に機能性要素を含有することもまた示されてきている。プロモーター要素の間のスペーシングはしばしば柔軟であり、したがって、プロモーター機能は、要素が反転するかまたは互いに対して移動していても保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーター要素間のスペーシングは、活性が減少し始める前に、５０ｂｐまで離れることも可能である。プロモーターに応じて、個々の要素は、協同で、または独立に機能して、転写を活性化することも可能である。
【０１０５】
［１０１］本発明の核酸は、適切なプロモーターの制御下で発現されるように、別の核酸に機能可能であるように連結されることも可能である。本発明の核酸はまた、核酸の効率的な転写を達成するために、プロモーターまたは転写開始部位と協同する他の制御要素、例えばエンハンサー配列、ポリＡ部位、またはターミネーター配列を含む核酸に機能可能であるように連結されることも可能である。本発明の核酸に加えて、核酸の発現を確認するためのマーカー（例えば薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子）であってもよい遺伝子を取り込むことも可能である。
【０１０６】
［１０２］いくつかの態様において、本発明のポリペプチドを修飾することが望ましい可能性もある。当業者は、変異体ポリペプチドを生成するため、所定の核酸構築物において、改変を生じる多くの方法を認識するであろう。こうした周知の方法には、部位特異的突然変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅、核酸を含有する細胞の突然変異誘発剤または放射線への曝露、望ましいオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば連結および／またはクローニングと組み合わせて、巨大核酸を生成する）および他の周知の技術が含まれる（例えば、すべての目的のため、その全体が援用される、ＧｉｌｌａｍおよびＳｍｉｔｈ，  Ｇｅｎｅ  ８：８１−９７，  １９７９；  Ｒｏｂｅｒｔｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４，  １９８７を参照されたい）。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸を修飾して、選択した生物における核酸の翻訳を増進する好ましいコドンを提供する。
【０１０７】
［１０３］本発明のポリヌクレオチドにはまた、本発明のポリヌクレオチドと実質的に同等であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含まれる。本発明記載のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドに、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、そしてさらにより典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有することも可能である。本発明はまた、上に列挙するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、そしてさらにより典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補体も提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、増幅、または合成）またはＲＮＡであることも可能である。こうしたポリヌクレオチドを得るための方法およびアルゴリズムが、当業者に周知であり、そしてこれには、例えば、所望の配列同一性のポリヌクレオチドをルーチンに単離可能なハイブリダイゼーション条件を決定するための方法が含まれることも可能である。
【０１０８】
［１０４］プライマー（単数または複数）が所望の点突然変異を有する、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ増幅を用いて、本発明にしたがってタンパク質類似体または変異体（すなわち１またはそれより多いアミノ酸が、野生型ポリペプチドとは異なるように設計されている）をコードする核酸を産生することも可能である。適切な突然変異誘発技術の詳細な説明に関しては、各々、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ（１９９４）を参照されたい。当該技術分野に周知の方法、例えばＥｎｇｅｌｓら，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ  Ｅｄ．  ２８：７１６−３４，  １９８９（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）によって記載されるものなどを用いた化学合成を用いて、こうした核酸を調製することもまた可能である。
【０１０９】
［１０５］いくつかの態様において、変異体を生成するためのアミノ酸「置換」は、好ましくは、１つのアミノ酸を、類似の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸と置換する、すなわち保存的アミノ酸置換の結果である。アミノ酸置換は、関与する残基の、極性、荷電、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性性質に基づいて、行われることも可能である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；そして陰性荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【０１１０】
［１０６］「挿入」または「欠失」は、典型的には、約１〜５のアミノ酸の範囲である。許容される変異は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を体系的に作製し、そして生じた組換え体を活性に関してアッセイすることによって、実験的に決定可能である。
【０１１１】
［１０７］あるいは、遺伝暗号の「冗長性」を利用することによって、これらの同じまたは類似のポリペプチドをコードする組換え変異体を合成するかまたは選択することも可能である。多様なコドン置換、例えば多様な制限部位を生じるサイレント変化を導入して、プラスミドまたはウイルスベクターへのクローニングあるいは特定の原核または真核系における発現を最適化することも可能である。ポリヌクレオチド配列における突然変異は、ポリペプチドまたはポリペプチドに付加される他のペプチドのドメインに反映されて、ポリペプチドの任意の部分の特性を修飾して、リガンド結合アフィニティ、または分解／ターンオーバー速度などの特性を変化させることも可能である。
【０１１２】
［１０８］あるいは、機能の改変が望ましい場合、挿入、欠失または非保存的改変を操作して、改変されたポリペプチドまたはキメラポリペプチドを産生することも可能である。こうした改変は、例えば、本発明のポリペプチドの生物学的機能または生化学的特性の１またはそれより多くを改変することも可能である。例えば、こうした改変は、リガンド結合アフィニティまたは分解／ターンオーバー速度などのポリペプチド特性を変化させることも可能である。さらに、こうした改変を、発現のために選択した宿主細胞において、発現、スケールアップ等により適したポリペプチドを生成するように、選択することも可能である。
【０１１３】
［１０９］好ましい方法において、部位特異的突然変異誘発を通じて、新規核酸をコードするポリヌクレオチドを変化させる。この方法は、所望のアミノ酸変異体のポリヌクレオチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、ならびに変化させる部位のいずれかの側に安定な二重鎖を形成させるために十分な、変化させるアミノ酸の両側の隣接ヌクレオチドをコードするオリゴヌクレオチド配列を用いる。一般的に、部位特異的突然変異誘発の技術は、当業者に周知であり、そしてこの技術は、例えば、Ｅｄｅｌｍａｎら，  ＤＮＡ  ２：１８３（１９８３）などの文献に例示される。ポリヌクレオチド配列に部位特異的変化を生じるための多用途および効率的な方法は、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０：６４８７−６５００（１９８２）に記載される。
【０１１４】
［１１０］ＰＣＲを用いて、核酸のアミノ酸配列変異体を生成することも可能である。少量のテンプレートＤＮＡを出発材料として用いた際、テンプレートＤＮＡ中の対応する領域と配列がわずかに異なるプライマー（単数または複数）は、所望のアミノ酸変異体を生成可能である。ＰＣＲ増幅は、プライマーによって特定される位で、ターゲットをコードするポリヌクレオチドテンプレートとは異なる産物ＤＮＡ断片集団を生じる。産物ＤＮＡ断片は、プラスミドにおいて、対応する領域を置換し、そしてこれは、所望のアミノ酸変異体を生じる。
【０１１５】
［１１１］アミノ酸変異体を生成するためのさらなる技術は、Ｗｅｌｌｓら，  Ｇｅｎｅ  ３４：３１５（１９８５）に記載されるカセット突然変異誘発技術、ならびに当該技術分野に周知の他の突然変異誘発技術、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら上記、およびＡｕｓｕｂｅｌら上記における技術である。
【０１１６】
バイオセンサーを含む宿主細胞を作製するためのプロセス
［１１２］上述のように、嗅覚受容体は、望ましい宿主細胞における発現のために遺伝子操作される。嗅覚受容体は特定の種由来であることも可能であるし、あるいは融合またはハイブリッド構築物であることも可能である。嗅覚受容体または融合／ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端配列は、嗅覚受容体または融合／ハイブリッドを宿主細胞膜に局在化させ、そして適切な場合、宿主細胞の外膜に局在化させる。これらの嗅覚受容体または融合／ハイブリッド遺伝子構築物は、宿主細胞に適した発現ベクター内に配置され、そして次いで、これらの発現構築物または発現ベクターは、宿主細胞内部に配置される。
【０１１７】
［１１３］いくつかの態様において、宿主細胞はまた、ヒトＧタンパク質サブユニットを発現するように遺伝子操作される。いくつかの態様において、宿主細胞はまた、ヒトＧタンパク質サブユニット、Ｇα、Ｇβ、およびＧγを発現するように遺伝子操作される。この態様において、ヒトＧα、Ｇβ、およびＧγサブユニットをコードする遺伝子は、所望の宿主細胞に適した制御配列（プロモーター、エンハンサー、翻訳開始配列、ポリＡ部位等）の制御下に配置され、そしてヒトＧα、Ｇβ、およびＧγサブユニットのためのこれらの構築物は、所望の細胞内に配置される。いくつかの態様において、ヒトＧタンパク質はまた、アデニル酸シクラーゼと関連する。この態様において、適切なアデニル酸シクラーゼの遺伝子を、所望の宿主細胞に適した制御配列の制御下に配置し、そしてこの構築物を所望の宿主細胞内に配置する。
【０１１８】
［１１４］本発明のプロセスにおいて、上述のような真核宿主細胞を用いる。いくつかの態様において、真菌細胞を用いる。いくつかの態様において、真菌細胞は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、クリソスポリウム属、クロイベロミセス属、カンジダ属、ピキア属、デバロマイセス属、ハンセヌラ属、ヤロウィア属、ジゴサッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ペニシリウム属またはリゾプス属由来である。いくつかの態様において、真菌細胞はサッカロミセス・セレビシエである。いくつかの態様において、哺乳動物由来の真核細胞、例えばヒト細胞、あるいはサル、マウス、ラット、ブタ、ウマ、またはイヌなどの非ヒト哺乳動物由来の細胞を用いることも可能である。本発明のプロセスで用いる細胞は、特に限定されず、そして任意の細胞が使用可能である。
【０１１９】
［１１５］いくつかの態様において、バイオセンサーをコードする核酸を、トランスフェクション（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｇｏｒｍａｎら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７９．２２（１９８２）：  ６７７７−６７８１）、形質導入（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＣｅｐｋｏおよびＰｅａｒ（２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｕｎｉｔ  ９．９；  ＤＯＩ：  １０．１００２／０４７１１４２７２７．ｍｂ０９０９ｓ３６）、リン酸カルシウム形質転換（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ（２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｃ；  ＤＯＩ：  １０．１００２／０４７１１４２３０１．ｎｓａ０１ｃｓ０１）、細胞浸透性ペプチド（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｃｏｐｏｌｏｖｉｃｉ，  Ｌａｎｇｅｌ，  Ｅｒｉｓｔｅ，およびＬａｎｇｅｌ（２０１４）  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１４  ８  （３），  １９７２−１９９４；  ＤＯＩ：  １０．１０２１／ｎｎ４０５７２６９）、エレクトロポレーション（例えば、Ｐｏｔｔｅｒ（２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｕｎｉｔ  １０．１５；  ＤＯＩ：  １０．１００２／０４７１１４２７３５．ｉｍ１０１５ｓ０３およびＫｉｍら（２０１４）  Ｇｅｎｏｍｅ  １０１２−１９．  ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１７１３２２．１１３、Ｋｉｍら  ２０１４は、最適化エレクトロポレーション系、Ａｍａｚａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを記載し、これらの参考文献はどちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、マイクロインジェクション（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＭｃＮｅｉｌ（２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｕｎｉｔ  ２０．１；  ＤＯＩ：  １０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ２００１ｓ１８）、リポソームまたは細胞融合（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｈａｗｌｅｙ−ＮｅｌｓｏｎおよびＣｉｃｃａｒｏｎｅ（２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｆ；  ＤＯＩ：  １０．１００２／０４７１１４２３０１．ｎｓａ０１ｆｓ１０）、機械的操作（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｓｈａｒｏｎら（２０１３）  ＰＮＡＳ  ２０１３  １１０（６）；  ＤＯＩ：  １０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１８７０５１１０）または核酸を真核細胞に送達するための他の周知の技術によって、宿主細胞に導入する。ひとたび導入されたら、核酸は、エピソームで一過性に発現されることも可能であるし、あるいは組換え（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＬｉｓｂｙおよびＲｏｔｈｓｔｅｉｎ（２０１５）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ���  Ｍａｒ  ２；７（３）．  ｐｉｉ：  ａ０１６５３５．  ｄｏｉ：  １０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０１６５３５）、または非相同組込み（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＤｅｙｌｅおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００９）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  Ａｕｇ；１１（４）：４４２−７）などの周知の技術を用いて、真核細胞ゲノム内に組み込まれることも可能である。相同および非相同組換えの効率は、ターゲティング二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するゲノム編集技術によって、促進されうる。ＤＳＢ生成技術の例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または同等の系（例えば、すべての目的のため、そのすべての全体が本明細書に援用される、Ｃｏｎｇら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９．６１２１  （２０１３）：  ８１９−８２３、Ｌｉら  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  （２０１１）：  ｇｋｒ１８８、Ｇａｊｅｔら  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１．７  （２０１３）：  ３９７−４０５）、トランスポゾン、例えばスリーピングビューティー（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｓｉｎｇｈら（２０１４）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．  ２０１４  Ｊａｎ；２５７（１）：１８１−９０．  ｄｏｉ：  １０．１１１１／ｉｍｒ．１２１３７）、例えばＦＬＰレコンビナーゼを用いたターゲティング組換え（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，  ＦｏｘおよびＷａｈｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９１）  １５：２５１（４９９９）：１３５１−１３５５）、ＣＲＥ−ＬＯＸ（例えば、ＳａｕｅｒおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＰＮＡＳ  （１９８８）：  ８５；  ５１６６−５１７０）、または同等の系、あるいは真核細胞ゲノム内に核酸を組み込むための当該技術分野に知られる他の技術である。
【０１２０】
［１１６］１つの態様において、Ｇα、Ｇβ、Ｇγ、アデニル酸シクラーゼ、および嗅覚受容体をコードする核酸（単数または複数）を、ゲノム的に安全であるハーバー部位、例えばヒト細胞のＣＣＲ５、ＡＡＶＳ１、ヒトＲＯＳＡ２６、ＰＳＩＰ１遺伝子座に組み込む。（例えば、すべての目的のため、すべてのその全体が本明細書に援用される、Ｓａｄｅｌａｉｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  １２：５１−５８（２０１２）；  Ｆａｄｅｌら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８８（１７）：９７０４−９７１７（２０１４）；  Ｙｅら，  ＰＮＡＳ  １１１（２６）：９５９１−９５９６（２０１４））。酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエに関する安全なハーバー部位には、例えば、酵母Ｔｙ  δ配列が含まれる。１つの態様において、宿主細胞はヒト細胞であり、そしてＧα、Ｇβ、Ｇγ、アデニル酸シクラーゼ、および嗅覚受容体をコードする核酸（単数または複数）のＣＣＲおよび／またはＰＳＩＰ１遺伝子座での組込みは、遺伝子編集系、例えばＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ系を用いて行われる。１つの態様において、真核細胞はサッカロミセス・セレビシエ細胞であり、そしてＣＲＩＳＰＲ系を用いて、Ｇα、Ｇβ、Ｇγ、アデニル酸シクラーゼ、および嗅覚受容体をＴｙ  δ遺伝子座に組み込む。１つの態様において、安全なハーバー遺伝子座での核酸の組込みはまた、安全なハーバー遺伝子座の一部またはすべても欠失させる。１つの態様において、真核細胞中のＣａｓ９は、Ｃａｓ９をコードするプラスミド、Ｃａｓ９をコードする外因性ｍＲＮＡ、あるいは単独のまたは核タンパク質複合体中の組換えＣａｓ９ポリペプチドに由来してもよい。（例えば、すべての目的のため、どちらもその全体が本明細書に援用される、Ｋｉｍら（２０１４）  Ｇｅｎｏｍｅ  １０１２−１９．  ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１７１３２２．１１３．；  Ｗａｎｇら（２０１３）  Ｃｅｌｌ  １５３  （４）．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｉｎｃ．：  ９１０−１８．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０４．０２５。）
［１１７］宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段には、コロイド性分散系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球体、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの送達ビヒクルとして使用するための例示的コロイド系は、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。核酸の最新技術のターゲティング送達の他の方法、例えばターゲティングナノ粒子または他の適切なミクロン未満のサイズの送達系でのポリヌクレオチドの送達が利用可能である。
【０１２１】
バイオセンサーの使用
［１１８］いくつかの態様において、バイオセンサーの構成要素（例えば嗅覚受容体、Ｇタンパク質、およびアデニル酸シクラーゼおよび／または他の受容体）をコードする核酸を、適切な宿主細胞（例えばサッカロミセス・セレビシエ）中に配置し、そしてバイオセンサーを含む宿主細胞を匂い物質の検出に用いる。いくつかの態様において、宿主細胞を溶解し、そして嗅覚受容体、Ｇタンパク質、およびアデニル酸シクラーゼ（および／または他のレポーター）を含む膜分画を得る。この態様において、膜分画を匂い物質の検出のためのバイオセンサーとして用いる。
【０１２２】
［１１９］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、混合物、組成物、または分子と相互作用する嗅覚受容体、ならびに各嗅覚受容体での混合物、組成物、または分子による相互作用の度合いを同定する。嗅覚受容体の同一性および相互作用の度合いは、混合物、組成物、または分子に関するアロマグラフを生じる。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、混合物、組成物、および／または分子のアロマグラフを分析して、混合物、組成物、または分子のどの構成要素または置換基がアロマグラフを生じるかを同定する。いくつかの態様において、混合物から構成要素を除去して、そしてバイオセンサー上で構成要素をマイナスした混合物を試験することによって、混合物のアロマグラフを分析する。アロマグラフに寄与する、除去した構成要素は、アロマグラフの変化によって同定されるであろう。同様に、構成要素を除去し、そしてアロマグラフに対する変化を同定することによって、組成物を分析することも可能である。いくつかの態様において、除去した構成要素をまた、バイオセンサー上で試験して、構成要素に関してアロマグラフを特徴付ける。いくつかの態様において、分子のどの置換基が嗅覚受容体（単数または複数）と相互作用するかを同定するために、分子上の置換基を変化させる。
【０１２３】
［１２０］いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、混合物、組成物、および／または分子の明細を生成する。このアロマグラフ明細は、製品のＱＣおよびＱＡに用いることも可能である。いくつかの態様において、ＱＣまたはＱＡのための製品には、例えば、スパイス、シーズニング、香料、香水、食品、ペット製品が含まれる。いくつかの態様において、アロマグラフ明細を製品の成分に関して用いる。この態様において、アロマグラフ明細が適合する限り、異なる成分または異なる供給源由来の同じ成分に関して成分を交換することも可能である。いくつかの態様において、新規成分または異なる供給源由来の同じ成分は、アロマグラフ明細を満たすために、わずかな修飾（例えば分子の添加）を必要とするであろう。本発明のバイオセンサーおよびアロマグラフの使用は、芳香、香り、臭い、匂い、および／または食味に頼る製品の生成および維持において、合理的設計および合理的置換を可能にする。いくつかの態様において、製品または組成物に関するアロマグラフを用いて、入手不能になったか、高価になったか、または入手困難になった、製品または組成物中の成分を置換する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、不健康な成分を健康な成分で置換する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、非天然成分を天然成分で置換する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、成分をよりコストが低い成分で置換する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、複数の成分をより少ない成分で置換する。いくつかの態様において、製品または組成物は、フレーバーまたは香料であり、そしてフレーバーまたは香料に関するアロマグラフを用いて、フレーバーまたは香料の代替レシピを構築する。本発明はまた、これらの新規配合による新規製品にも関する。
【０１２４】
［１２１］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、香り、臭い、芳香、匂い、および／または食味を標準化する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、香り、臭い、芳香、匂い、および／または食味を標準化する。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、香り、臭い、匂い、および／または食味とＯＲレパートリーの相互作用を定量化する。これらの定量化された相互作用を用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を記述することも可能である。例えば、数百のバニラフレーバー剤またはバニラ抽出物製品は、バニラフレーバー（または臭い、香り、芳香）を提供すると宣伝する。本発明のバイオセンサーは、これらのバニラ製品とＯＲレパートリーの相互作用を定量化し、そして機能に基づいて、これらの製品の標準化を可能にすることも可能である。ＯＲ相互作用のコアセットは、これらのバニラ製品間の相違を生じる、多くの重要でないまたは副次的ＯＲ相互作用とともに、バニラ反応を定義するであろう。標準化はまた、ブランド化、商標、および／または著作権のため、香り、臭い、芳香、匂い、および／または食味の定量的説明も可能にする。標準化はまた、新規の香り、臭い、芳香、匂い、および／または食味の定量的記述も可能にする。いくつかの態様において、フレーバーホイールの要素を、アロマグラフにデジタル化し、そしてフレーバーホイール由来の定性的用語を、嗅覚受容体での定量化された相互作用と関連させる。フレーバーホイールに関してはＧｏｏｇｌｅ  Ｉｍａｇｅｓを参照されたい。例えば、フレーバーホイール記述子、カラメル（ハチミツ、バタースコッチ、バター、醤油、チョコレート、糖蜜）、化学薬品（二酸化イオウ、エタノール、酢酸、酢酸エチル、湿った木、湿ったイヌ、二酸化イオウ、マッチの燃えさし、キャベツ、スカンク、ニンニク、メルカプタン、硫化水素、ゴム状、ディーゼル、灯油、プラスチック、タール）、土（かび臭い、かび臭いコルク、マッシュルーム、くすんだ）、フローラル（ゼラニウム、スミレ、バラ、オレンジの花）、フルーティ（グレープフルーツ、レモン、ブラックベリー、ラズベリー、イチゴ、カシス、チェリー、アプリコット、モモ、リンゴ、パイナップル、メロン、バナナ、イチゴジャム、レーズン、プルーン、イチジク、アントラニル酸メチル）、ハーブまたは植物性（カットした緑草、パプリカ、ユーカリ、ミント、グリーンビーン、アスパラガス、グリーンオリーブ、ブラックオリーブ、アーティチョーク、干し草、藁、茶、タバコ）、微生物的（ネズミ、ウマ、ヨーグルト、汗、ザウワークラウト、澱、パン酵母、ナッツ（クルミ、ヘイゼルナッツ、アーモンド）、酸化（シェリー酒）、刺激臭（メントール、アルコール）、清潔（リコリス・アニス、黒コショウ、クローブ）、および木（スモーキー、焦げたトースト、コーヒー、薬、フェノール様、ベーコン、オーク、ヒマラヤスギ、バニラ）は、嗅覚受容体反応によって定量化される。
【０１２５】
［１２２］いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を同定する。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味をユニークに同定する。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味に関して情報伝達する。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味に関する取引に用いる。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、製品またはサービスを記述する。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、製品またはサービスを市場に出す。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、製品またはサービスを販売する。いくつかの態様において、定量化された香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を用いて、製品またはサービスを購入する。
【０１２６】
［１２３］いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味を同定する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味をユニークに同定する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味に関して情報伝達する。いくつかの態様において、アロマグラフを、香り、臭い、匂い、芳香、および／または食味に関する取引に用いる。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、製品またはサービスを記述する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、製品またはサービスを市場に出す。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、製品またはサービスを販売する。いくつかの態様において、アロマグラフを用いて、製品またはサービスを購入する。
【０１２７】
［１２４］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、悪臭を修正する。いくつかの態様において、悪臭は、特徴的な香り、臭い、芳香、匂い、および／または食味を有する製品の製造において生じる。悪臭を伴う製品のロットを、本発明のバイオセンサー上で試験し、そして得たアロマグラフを製品のアロマグラフ明細に比較する。これは悪臭を引き起こす新規のまたは変化した嗅覚受容体相互作用を同定するであろう。いくつかの態様において、この悪臭は、悪臭を伴う製品を分析して、どの構成要素が悪臭を引き起こすか同定することによって修正される。いくつかの態様において、悪臭は、新規の嗅覚受容体での新規相互作用によって引き起こされる。この態様において、悪臭は、新規の嗅覚受容体（単数または複数）が活性化されることを遮断する阻害剤（単数または複数）を添加することによって修正可能である。あるいは、新規嗅覚受容体刺激と組み合わされて、悪臭知覚を、快い、重要でない、または知覚されない臭い、香り、芳香、匂い、および／または食味に変える、他の嗅覚重要体を活性化する分子を添加することも可能である。いくつかの態様において、悪臭は、アロマグラフ明細において、嗅覚受容体での相互作用を変化させる、構成要素における不均衡によって引き起こされる。この態様において、製品のアロマグラフ明細を回復するように、製品の構成要素を均衡させることによって、悪臭を除去可能である。いくつかの態様において、特定の成分の量を増加させて、成分のアロマグラフに基づいて、製品明細に対してアロマグラフを合理的に均衡化することによって、アロマグラフは均衡化されうる。いくつかの態様において、悪臭を伴う製品のアロマグラフが、そのアロマグラフ明細と再び均衡するように、特定の嗅覚受容体を刺激するかまたは阻害することが知られる分子を添加することによって、アロマグラフは均衡化されうる。
【０１２８】
［１２５］いくつかの態様において、悪臭は、スポーツ用品、衣類または靴と関連する。悪臭は、悪臭アロマグラフを生成する本発明のバイオセンサーに対して特徴付け可能である。いくつかの態様において、悪臭は、悪臭アロマグラフにおいて、嗅覚受容体（単数または複数）が活性化されるのを遮断する阻害剤（単数または複数）を添加することによって修正される。あるいは、悪臭によって刺激される嗅覚受容体と組み合わされて、悪臭の知覚を、快い、重要でない、または知覚されない臭い、香り、芳香、匂い、および／または食味に変える、他の嗅覚重要体を活性化する分子を添加することも可能である。
【０１２９】
［１２６］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、所望のアロマグラフ明細を持つ混合物、組成物、または分子を作製する。例えば、本発明のバイオセンサーを用いて、カダベリンおよび／またはプトレシンに関して、アロマグラフを分析することも可能である。これらの化合物は、ある被験体において、回避行動を引き起こすことが知られている。カダベリンおよびプトレシン・アロマグラフへの特定の部分の寄与を分析すると、これらの分子の回避行動に関与する嗅覚受容体を同定することも可能である。次いで、合理的設計を用いて、これらの嗅覚受容体を刺激して、カダベリンまたはプトレシンの嫌な臭いを伴わずに、回避行動を引き起こすことが可能な、混合物、組成物、または分子を作製することも可能である。こうした合理的に設計された芳香、香り、臭いまたは匂いをエアロゾル中で用いて、回避行動を引き起こし、そして被験体において食欲を抑制することも可能である。あるいは、これらの嗅覚受容体によって引き起こされる回避行動が、被験体に、香り、臭い、芳香、および／または匂いを回避させるため、合理的に設計された芳香、香り、臭いまたは匂いを用いて、ある領域から被験体を遠ざけることも可能である。
【０１３０】
［１２７］いくつかの態様において、合理的に設計された芳香、香り、臭い、匂い、および／または食味は、既知の芳香、香り、臭い、匂い、および／または食味からリバース・エンジニアリングされる。このリバース・エンジニアリングは、既知の芳香、香り、臭い、匂い、および／または食味を作製するための新規配合物を産生することも可能である。いくつかの態様において、合理的に設計された芳香、香り、臭い、匂い、および／または食味には、例えば新車の匂い、香水、香料、またはフレーバーが含まれる。いくつかの態様において、香水または香料は、Ｏｓｍｏｔｈｅｑｕｅにおいてアーカイブされることも可能である。いくつかの態様において、Ｏｓｍｏｔｈｅｑｕｅ由来のアーカイブされた香料または香水に関するアロマグラフを用いて、香料または香水を作製するための新規配合およびレシピを生成する。いくつかの態様において、Ｏｓｍｏｔｈｅｑｕｅ由来の香料または香水のためのレシピは失われており、そして本発明のバイオセンサーおよびアロマグラフを用いて、香料または香水を作製するためのレシピおよび配合を生成する。
【０１３１】
［１２８］いくつかの態様において、合理的に設計された芳香、香り、臭い、および／または匂いは、素材（プラスチック、皮、衣類、木、ワックス等）中に配置されて、そこから芳香、香り、臭い、および／または匂いが長期間に渡ってゆっくりと放出されることによって、環境に送達される。いくつかの態様において、芳香、香り、臭い、および／または匂いは、異なる条件セットに供された際に、素材から放出される。例えば、芳香、香、臭い、および／または匂いは、素材の加熱に際して放出されるように、素材中に配置されることも可能である（例えばｇｌａｄプラグインと同様に）。温度に加えて、例えば溶媒、ｐＨ、気流、光等を含む条件の他の変化を用いて、素材から芳香、香り、臭い、および／または匂いを放出することも可能である。
【０１３２】
［１２９］いくつかの態様において、特定の被験体の社会経済学的、文化的、地理的、または他の群の嗜好の相違を考慮するように、アロマグラフ明細を設計する。いくつかの態様において、特定の社会経済的、文化的、地理的、および／または他の群から、被験体における望ましい反応または状態を生じるアロマスケープまたはオドスケープに関して、アロマグラフ明細を生成する。いくつかの態様において、特定の社会経済的、文化的、地理的、および／または他の群の被験体がリラックスし、惹きつけられ、反発する等のために、アロマスケープ明細を設計する。いくつかの態様において、特定の社会経済的、文化的、地理的、および／または他の群の被験体が、製品に対して望ましい反応を有するであろうように、製品に関してアロマグラフ明細を生成する。いくつかの態様において、製品またはサービスブランド化の一部として、アロマグラフ明細を生成するかまたは定義する。
【０１３３】
［１３０］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーおよびアロマグラフを用いて、異なる地理的位置における消費者の嗜好に合わせて、製品をあつらえる。いくつかの態様において、異なる地理的位置の消費者にアピールするように、製品の芳香、香り、臭い、匂い、および／または食味を設計することも可能である。いくつかの態様において、異なる文化および／または地理的位置由来の製品のクラスまたは群に関するアロマグラフを用いて、異なる地理的／文化的市場のクラスまたは群の新規製品をあつらえることも可能である。例えば、これらの地理的領域由来の類似のタイプの製品に関するアロマグラフを用いて、これらのタイプの製品に関して消費者によって好まれるＯＲ相互作用を同定することによって、チョコレート製品を、中東またはインド市場のために設計することも可能である。ＯＲ受容体およびアロマグラフに関するこの情報を用いて、これらの異なる市場に向けてチョコレート製品を合理的に設計することも可能である。
【０１３４】
［１３１］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、疾患を検出し、そして診断する。多くの疾患は、匂いまたは臭いに関連し、これを用いて疾患を診断することも可能である。例えば、特定の肺、肝臓、腎臓および消化器疾患は、患者の息から検出可能であり、糖尿病、統合失調症、パーキンソン病、および特定の感染性疾患（結核および腸チフス）は、患者の匂いによって検出可能であり、そしてある種の癌は、イヌの嗅覚レパートリーによって検出可能である。いくつかの態様において、患者の皮膚、汗、毛髪、唾液、および他の体分泌物（例えば耳垢）と関連する匂い、香り、および／または臭いは、疾患診断と関連しうる。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、匂い、香り、および／または臭いによって検出可能な疾患を有する患者のアロマグラフを生成する。いくつかの態様において、アロマグラフは、嗅覚受容体のヒト・レパートリーに基づく。いくつかの態様において、アロマグラフは、嗅覚受容体のイヌ・レパートリーに基づく。いくつかの態様において、アロマグラフは、嗅覚受容体のマウスまたはラット・レパートリーに基づく。いくつかの態様において、アロマグラフは、嗅覚受容体の哺乳動物レパートリーに基づく。次いで、匂い、息または他の試料を採取し、そして特定の疾患に関するアロマグラフが検出されるかどうかを見ることによって、疾患に関して患者を診断することも可能である。
【０１３５】
［１３２］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、疾患と関連するＯＲセットを同定する。いくつかの態様において、これらの疾患特異的ＯＲ（単数または複数）に関するリガンドのパネルを作製し、そしてこれを用いて、疾患と関連するＯＲでの患者の反応における変化によって、疾患を監視することも可能である。例えば、臭いの劣った感知は、アルツハイマーの初期警告徴候の１つである。臭いの感知の崩壊は、いくつかのＯＲを感知する脳の能力の喪失、および嗅覚受容体記憶（特定のＯＲの刺激と臭いの関連）の喪失の両方と関連する。ＯＲ反応およびＯＲ記憶の喪失は、アルツハイマーの初期警告徴候として使用可能であり、そしてまた、臭いの喪失は、いくつかの症例では可逆性であるため、抗アルツハイマー治療に対する反応の監視に使用可能である。いくつかの態様において、アルツハイマーのリスクがある患者を、疾患関連ＯＲでの臭いの喪失に関して、およびＯＲ記憶に関して試験することも可能である。いくつかの態様において、特定の年齢に達した患者を、疾患関連ＯＲでの臭いの喪失に関して、およびＯＲ記憶に関してスクリーニングすることも可能である。いくつかの態様において、匂い物質のパネルを用いて、疾患関連ＯＲでの臭いの患者の感知を監視することも可能である。いくつかの態様において、匂い物質のパネルは、強い相互作用から弱い相互作用まで、疾患関連ＯＲでの異なる相互作用を有する。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、疾患関連ＯＲを同定し、そして初期アルツハイマーを診断するために使用可能なリガンドを同定することも可能である。
【０１３６】
［１３３］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを薬剤発見に用いる。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、薬剤および／または薬学的組成物の食味、臭い、匂い、香り、および／または芳香を設計する。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、薬剤および／または薬学的組成物と関連する食味、臭い、匂い、香り、および／または芳香を同定し、そしてマスキングする。いくつかの態様において、マスキングされる食味、臭い、匂い、香り、および／または芳香は、特定の被験体において、陰性の反応を生じる。いくつかの態様において、マスキングされる食味、臭い、匂い、香り、および／または芳香は、特定の被験体において、陽性のまたは中毒性の反応を生じる。いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、乱用抑止配合物を設計する。いくつかの態様において、例えば、ヒドロコドン（バイコディン）、オキシコドン（オキシコンチン、パーコセット、ロキシコドン、オキセクタ）、モルヒネ（カディアン、アビンザ）、コデイン、ブプレノルフィン（ブプレネックス、ブトランス）、ブトルファノール（スタドール）、ヒドロモルホン（ディラウディド、ヒドロスタット、エクサルゴ）、レボルファノール（レボドロモラン）、メペリジン（デメロール）、メタドン（ドロフィン、メタドーズ）、ナルブフィン（ヌバイン）、オキシモルホン（ヌモルファン）、ペンタゾシン（タルウィン）、プロポキシフェン（コタナール−６５、ダルボン）、フェンタニル（スブリメーズ、アクティク、デュロジェシック、フェントラ、マトリフェン、ハディド、オンソリス、インスタニル、アブストラル、ラザンダ）、トラマドール（ウルトラム）、およびタペンタドール（ヌシンタ）を含むオピオイド薬剤に関して、アドバーサント（ａｄｖｅｒｓａｎｔ）配合物を用いる。いくつかの態様において、被験体による、回避行動または他の強い陰性の反応を生じる、食味、臭い、匂い、香り、および／または芳香を生じるアドバーサントを配合物中に含める。いくつかの態様において、アドバーサントは、ともに感知された際に、陰性の反応を生じるが、個々に感知された際には陰性の反応を誘導しない、２またはそれより多い構成要素で構成される。いくつかの態様において、乱用抑止配合物において、２つの構成要素が異なる時点で放出されるが、配合物が薬剤を乱用するために粉砕されるかまたは抽出された際には、これが両方の構成要素を放出して、アドバーサントを形成するように操作することも可能である。いくつかの態様において、２つの構成要素が組み合わされた際に形成されるアドバーサントは、室温で気体になるか、または構成要素が混合され、そして薬剤配合物が加熱された後に気体になる。
【０１３７】
［１３４］いくつかの態様において、アドバーサントは製品に適用するために設計される。いくつかの態様において、アドバーサントは、例えばタバコまたはマリファナを含む製品に適用される。これらの態様において、アドバーサントは植物組織内に吸着するように配合されて、したがって、タバコまたはマリファナが用いられる際に一緒に放出され、例えばアドバーサントはタバコまたはマリファナが燃やされた際に放出するよう設計されることも可能である。いくつかの態様において、アドバーサントは、被験体のＯＲと製品の相互作用を改変して、不都合な芳香、香り、臭い、匂い、および／または食味を生じるものである。
【０１３８】
［１３５］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、ＯＲ群に関する匂い物質のパネルを同定する。いくつかの態様において、匂い物質のパネルを用いて、臭いおよび／または食味の個体の感知を監視する。いくつかの態様において、匂い物質のパネルを用いて、個体群、例えば製品の臭いおよび／または食味を試験するための個体のパネルにおいて、臭いおよび／または食味の感知を監視する。いくつかの態様において、匂い物質のパネルを用いて、個体に関するベースラインを設定する。いくつかの態様において、匂い物質のパネルを用いて、個体の食味／臭いパネルの明細を設定する。いくつかの態様において、明細を用いて、各々の食味／臭いパネル研究に関して、個体のパネルを設定する。
【０１３９】
［１３６］いくつかの態様において、本発明のバイオセンサーを用いて、多様な食味、臭い、匂い、香り、および／または芳香の構成要素が一緒にまたは連続して放出されて、所望の時点で所望の効果を生じるような、食味、臭い、匂い、香り、および／または芳香の構成要素を同定する。いくつかの態様において、第一の期間で、構成要素が、第一の期間において所望の反応を生じる食味、臭い、匂い、香り、および／または芳香を生じ、そして次いで、別のまたは異なる群の構成要素が第二の期間に放出されて、食味、臭い、匂い、香り、および／または芳香を変化させるかまたは新規の食味、臭い、匂い、香り、および／または芳香を導入して、第二の期間における異なる所望の反応を生じるように、一連の構成要素が放出される。異なる期間におけるこの食味、臭い、匂い、香り、および／または芳香の変化は、望ましいように多くの期間に関して反復することも可能である。
【０１４０】
［１３７］いくつかの態様において、本発明は、本発明のバイオセンサーから生じる既知のアロマグラフを持つ匂い物質のパネルまたはライブラリーに関する。所望のアロマグラフを有するであろう組成物を作製するために、これらの匂い物質のパネルまたはライブラリーを混合し、そしてマッチさせることも可能である。いくつかの態様において、デバイスは、匂い物質のパネルまたはライブラリーを含有し、そしてパネルまたはライブラリーから匂い物質を混合することによって、特定のアロマグラフに適合するであろうように、組成物を作製可能である。いくつかの態様において、デバイスは、組成物からアロマグラフを生成し、そして試験組成物のアロマグラフにマッチする組成物を作製する。いくつかの態様において、デバイスは、組成物試験を行う場所とは離れた部位で、試験組成物のアロマグラフにマッチする組成物を作製する。いくつかの態様において、デバイスは、所望のアロマグラフを入力する場所から離れた部位で、試験組成物のアロマグラフにマッチする組成物を作製する。
【０１４１】
［１３８］本明細書に引用するすべての刊行物および特許は、各々の個々の刊行物または特許が、具体的に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるかのように、本明細書に援用され、そして刊行物を引用したものと関連する方法および／または材料を開示し、そして記載するために、本明細書に援用される。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：酵母細胞におけるバイオセンサーの作製
［１３９］ヒトＯＲ６Ａ２受容体のＮ末端５５アミノ酸を、ＯＲ１Ａ１のＮ末端５５アミノ酸の代わりにヒトＯＲ１Ａ１受容体のＮ末端領域に融合させて、配列：
【０１４３】
【化７】
2019510510.tif 000008
【０１４４】
を有するバイオセンサー嗅覚受容体を生じる。
［１４０］この嗅覚受容体をコードする核酸を、ヒトＧタンパク質サブユニットＧα、Ｇβ、およびＧγ、ならびにアデニル酸シクラーゼを発現するようあらかじめ操作されている酵母細胞内に操作する。ヒトＧα、ＧβおよびＧγサブユニット：
【０１４５】
【化８】
2019510510.tif 000009
【０１４６】
を、酵母ＧＡＬＩまたはＧＡＬ１０プロモーターのいずれかの制御下に配置する構築物で、酵母を操作した。また、ヒトアデニル酸シクラーゼ（ヒト５型アデニル酸シクラーゼ、ＮＰ＿００１１８６５７１．１）：
【０１４７】
【化９】
2019510510.tif 000010
【０１４８】
またはヒトアデニル酸シクラーゼ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ６０２６６）：
【０１４９】
【化１０】
2019510510.tif 000011
【０１５０】
を、酵母ＧＡＬＩまたはＧＡＬ１０プロモーターのいずれかの制御下で発現するよう、酵母株を操作した。
［１４１］ハイブリッド嗅覚受容体、ヒトＧα、Ｇβ、およびＧγサブユニット、ならびにヒトアデニル酸シクラーゼを発現する酵母細胞を含むバイオセンサーを、構成要素の発現に関して、およびハイブリッドＯＲによるシグナル伝達に関して試験する。
【０１５１】
実施例２：嗅覚受容体レパートリーでのリガンド結合を定量化するためのリアルタイム検出の使用
［１４２］実施例１に記載するような複数のバイオセンサーをＯＲファミリーＯＲ７由来のヒト嗅覚受容体に関して用いる。ＯＲ７ファミリー嗅覚受容体を含む酵母細胞をまた、ｃＡＭＰによって活性化される制御領域によって発現される組換えＧＦＰ遺伝子も含むように遺伝子修飾する。したがって、バイオセンサーが匂い物質によって活性化された際、バイオセンサーはＧＦＰを生じ、そして活性は蛍光によって監視可能である。
【０１５２】
［１４３］ＯＲ７ファミリーにおける嗅覚受容体は、哺乳動物フェロモン、例えばアンドロステロンに関連するものの受容体である。匂い物質のパネルを、アンドロスタジエノール（５，１６−アンドロスタジエン−３β−オール）、アンドロスタジエノン（アンドロスタ−４，１６−ジエン−３−オン）、アンドロスタノール（５α−アンドロスト−１６−エン−３α−オール）、およびエストラテトラエノール（エストラ−１，３，５（１０），１６−テトラエン−３−オール）を含むアンドロステノン関連分子のパネルに対してスクリーニングする。
【０１５３】
［１４４］嗅覚受容体のＯＲ７ファミリーの異なるメンバーを発現する酵母細胞を、別個のウェルまたは容器に入れ、パネル由来の個々の匂い物質を調べ、そして０、１０秒、２０秒、３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、および１時間の時点で蛍光読み取りを行う。
【０１５４】
実施例３：ヒト嗅覚受容体ＯＲ１Ａ１を含むバイオセンサーの作製
［１４５］全長ヒト嗅覚受容体ＯＲ１Ａ１を用いて、発現プラスミドＮＩＸｐ２１８およびＮＩＸｐ３５４を作製した。ＮＩＸｐ２１８およびＮＩＸｐ３５４はどちらも、ＯＲ１Ａ１をコードする核酸が、ＧＡＬ１−１０プロモーターの制御下にある。ＯＲ構築物に関するプラスミドマップを図１に示す。ＮＩＸｐ３５４において、ＯＲ１Ａ１をＮ末端でＦＬＡＧタグ（配列番号１）と、そしてＣ末端で赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）のコード配列と融合させる。
【０１５５】
［１４６］プラスミドＮＩＸｐ３５４またはＮＩＸｐ２１８は、一倍体サッカロミセス・セレビシエ（ＭＡＴａ株）中に配置された。ＦＬＡＧタグを用いて、ＮＩＸｐ３５４からのＯＲ１Ａ１の発現を監視して、発現を測定し（イムノアッセイを用いる）、そしてＲＦＰからの蛍光によって、ＯＲ１Ａ１の細胞局在を監視する。ＮＩＸｐ２１８を含むサッカロミセス・セレビシエ株を、ヒトＧタンパク質サブユニットＧα、Ｇβ、およびＧγ、ならびにアデニル酸シクラーゼで修飾されている相補的サッカロミセス・セレビシエ株（ＭＡＴα）と交配させることによって、バイオセンサーの機能を評価する。これらの２つの酵母株をともに交配させると、ＯＲ１Ａ１受容体がヒトＧタンパク質サブユニットＧα、Ｇβ、およびＧγ、ならびにアデニル酸シクラーゼと機能的に関連する。ＯＲ１Ａ１受容体の刺激後、ＯＲ１Ａ１受容体の機能をｃＡＭＰアッセイによって評価することも可能である。
【０１５６】
実施例４：ヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｊ２を含むバイオセンサーの作製
［１４７］全長ヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｊ２を用いて、発現プラスミドＮＩＸｐ２１９およびＮＩＸｐ３５２を作製した。ＮＩＸｐ２１９およびＮＩＸｐ３５２はどちらも、ＯＲ２Ｊ２をコードする核酸が、ＧＡＬ１−１０プロモーターの制御下にある。ＯＲ構築物に関するプラスミドマップを図１に示す。ＮＩＸｐ３５２において、ＯＲ２Ｊ２をＮ末端でＦＬＡＧタグ（配列番号１）と、そしてＣ末端で赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）のコード配列と融合させる。
【０１５７】
［１４８］プラスミドＮＩＸｐ３５２またはＮＩＸｐ２１９は、一倍体サッカロミセス・セレビシエ（ＭＡＴａ株）中に配置された。ＦＬＡＧタグを用いて、ＮＩＸｐ３５２からのＯＲ２Ｊ２の発現を監視して、発現を測定し（イムノアッセイを用いる）、そしてＲＦＰからの蛍光によって、ＯＲ２Ｊ２の細胞局在を監視する。ＮＩＸｐ２１９を含むサッカロミセス・セレビシエ株を、ヒトＧタンパク質サブユニットＧα、Ｇβ、およびＧγ、ならびにアデニル酸シクラーゼで修飾されている相補的サッカロミセス・セレビシエ株（ＭＡＴα）と交配させることによって、バイオセンサーの機能を評価する。これらの２つの酵母株をともに交配させると、ＯＲ２Ｊ２受容体がヒトＧタンパク質サブユニットＧα、Ｇβ、およびＧγ、ならびにアデニル酸シクラーゼと機能的に関連する。ＯＲ２Ｊ２受容体の刺激後、ＯＲ２Ｊ２受容体の機能をｃＡＭＰアッセイによって評価することも可能である。
【０１５８】
実施例５：ヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１を含むバイオセンサーの作製
［１４９］全長ヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１を用いて、発現プラスミドＮＩＸｐ２２０およびＮＩＸｐ３５１を作製した。ＮＩＸｐ２２０およびＮＩＸｐ３５１はどちらも、ＯＲ２Ｗ１をコードする核酸が、ＧＡＬ１−１０プロモーターの制御下にある。ＯＲ構築物に関するプラスミドマップを図１に示す。ＮＩＸｐ３５１において、ＯＲ２Ｗ１をＮ末端でＦＬＡＧタグ（配列番号１）と、そしてＣ末端で赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）のコード配列と融合させる。
【０１５９】
［１５０］プラスミドＮＩＸｐ３５１またはＮＩＸｐ２２０は、一倍体サッカロミセス・セレビシエ（ＭＡＴａ株）中に配置された。ＦＬＡＧタグを用いて、ＮＩＸｐ３５１からのＯＲ２Ｗ１の発現を監視して、発現を測定し（イムノアッセイを用いる）、そしてＲＦＰからの蛍光によって、ＯＲ２Ｗ１の細胞局在を監視する。ＮＩＸｐ２２０を含むサッカロミセス・セレビシエ株を、ヒトＧタンパク質サブユニットＧα、Ｇβ、およびＧγ、ならびにアデニル酸シクラーゼで修飾されている相補的サッカロミセス・セレビシエ株（ＭＡＴα）と交配させることによって、バイオセンサーの機能を評価する。これらの２つの酵母株をともに交配させると、ＯＲ２Ｗ１受容体がヒトＧタンパク質サブユニットＧα、Ｇβ、およびＧγ、ならびにアデニル酸シクラーゼと機能的に関連する。ＯＲ２Ｗ１受容体の刺激後、ＯＲ２Ｗ１受容体の機能をｃＡＭＰアッセイによって評価することも可能である。
【０１６０】
実施例６：ヒト嗅覚受容体ＯＲ５Ｐ３を含むバイオセンサーの作製
［１５１］全長ヒト嗅覚受容体ＯＲ５Ｐ３を用いて、発現プラスミドＮＩＸｐ２１７およびＮＩＸｐ３５３を作製した。ＮＩＸｐ２１７およびＮＩＸｐ３５３はどちらも、ＯＲ５Ｐ３をコードする核酸が、ＧＡＬ１−１０プロモーターの制御下にある。ＯＲ構築物に関するプラスミドマップを図１に示す。ＮＩＸｐ３５３において、ＯＲ５Ｐ３をＮ末端でＦＬＡＧタグ（配列番号１）と、そしてＣ末端で赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）のコード配列と融合させる。
【０１６１】
［１５２］プラスミドＮＩＸｐ３５３またはＮＩＸｐ２１７は、一倍体サッカロミセス・セレビシエ（ＭＡＴａ株）中に配置された。ＦＬＡＧタグを用いて、ＮＩＸｐ３５３からのＯＲ５Ｐ３の発現を監視して、発現を測定し（イムノアッセイを用いる）、そしてＲＦＰからの蛍光によって、ＯＲ５Ｐ３の細胞局在を監視する。ＮＩＸｐ２１７を含むサッカロミセス・セレビシエ株を、ヒトＧタンパク質サブユニットＧα、Ｇβ、およびＧγ、ならびにアデニル酸シクラーゼで修飾されている相補的サッカロミセス・セレビシエ株（ＭＡＴα）と交配させることによって、バイオセンサーの機能を評価する。これらの２つの酵母株をともに交配させると、ＯＲ５Ｐ３受容体がヒトＧタンパク質サブユニットＧα、Ｇβ、およびＧγ、ならびにアデニル酸シクラーゼと機能的に関連する。ＯＲ５Ｐ３受容体の刺激後、ＯＲ５Ｐ３受容体の機能をｃＡＭＰアッセイによって評価することも可能である。
【０１６２】
実施例７：ヒト嗅覚受容体ＯＲ６Ａ２を含むバイオセンサーの作製
［１５３］全長ヒト嗅覚受容体ＯＲ６Ａ２を用いて、発現プラスミドＮＩＸｐ２３９を作製した。ＮＩＸｐ２３９において、ＯＲ６Ａ２をコードする核酸が、ＧＡＬ１−１０プロモーターの制御下にある。ＯＲ構築物に関するプラスミドマップを図１に示す。
【０１６３】
［１５４］プラスミドＮＩＸｐ２３９は、一倍体サッカロミセス・セレビシエ（ＭＡＴａ株）中に配置された。ＮＩＸｐ２３９を含むサッカロミセス・セレビシエ株を、ヒトＧタンパク質サブユニットＧα、Ｇβ、およびＧγ、ならびにアデニル酸シクラーゼで修飾されている相補的サッカロミセス・セレビシエ株（ＭＡＴα）と交配させることによって、バイオセンサーの機能を評価する。これらの２つの酵母株をともに交配させると、ＯＲ６Ａ２受容体がヒトＧタンパク質サブユニットＧα、Ｇβ、およびＧγ、ならびにアデニル酸シクラーゼと機能的に関連する。ＯＲ６Ａ２受容体の刺激後、ＯＲ６Ａ２受容体の機能をｃＡＭＰアッセイによって評価することも可能である。
【０１６４】
実施例８：バイオセンサーを含む細胞抽出物の作製
［１５５］本実施例において、実施例３〜７由来の、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｐ３、およびＯＲ６Ａ２から作製したバイオセンサーを含む酵母細胞を用いる。嗅覚受容体、Ｇタンパク質およびアデニル酸シクラーゼを含む酵母細胞を、ブレンダー中、ガラスビーズとともに溶解する。溶解物を６００Ｘｇで遠心分離することによって、細胞破片を除去する。残った溶解物を超遠心機（１０４，３００Ｘｇ）で遠心分離して、嗅覚受容体、Ｇタンパク質およびアデニル酸シクラーゼを含む膜分画を得た。膜分画を再懸濁して、そして匂い物質の検出のため、マルチウェルプレート内に入れた。
【０１６５】
［１５６］本明細書に引用するすべての刊行物および特許は、各々の個々の刊行物または特許が、具体的に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるかのように、本明細書に援用され、そして刊行物を引用したものと関連する方法および／または材料を開示し、そして記載するために、本明細書に援用される。
【０１６６】
［１５７］当業者は、ルーチンの実験以上のものを用いずに、本明細書に記載する本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するかまたは確認することが可能であろう。こうした同等物は、以下の請求項によって含まれると意図される。
【配列表】
2019510510000001.app
【国際調査報告】
2019510510.tif 000012