(57)【要約】  本発明は，乳に乳酸菌を添加することを含む発酵乳製品を製造する方法に関し，ここで前記菌はラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・カゼイ以外の種の少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含み，ここで前記更なる株は，ラクトース代謝に欠損を有するが，前記乳に存在するラクトース以外の1つ又はいくつかの炭水化物を代謝することが可能である。
2019502393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳に乳酸菌を添加することを含む発酵乳製品を製造する方法であって，ここで前記菌はラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・カゼイ以外の種の少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含み，ここで前記更なる株は，ラクトース代謝に欠損を有するが，前記乳に存在するラクトース以外の1つ又はいくつかの炭水化物を代謝することが可能である，前記方法。
【請求項２】
ラクトース代謝に欠損を有する前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，スクロース，ガラクトース，およびグルコースからなる群より選択される1つ又は複数の炭水化物を代謝することが可能であり，そして前記炭水化物は，発酵前に乳に添加される，請求項1に記載の発酵乳製品を製造する方法。
【請求項３】
前記ラクトバチルス・カゼイ株は，ATCC55544として寄託されたL.カゼイCRL431及びDSM19465として寄託されたL.カゼイCHCC2115からなる群より選択される，請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記更なる株は，
（a）下記（i）又は（ii）であるストレプトコッカス・サーモフィルス株：
（i）2014年06月12日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM28952で寄託された株；
（ii）又は，DSM28952由来の株，ここで該由来株は更に，ラクトース及びX-Galを含む培地上に白色コロニーを生成する能力を有するという特徴がある；
（b）下記（i）又は（ii）であるストレプトコッカス・サーモフィルス株：
（i）2014年06月12日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM28953で寄託された株；
（ii）又は，DSM28953由来の株，ここで該由来株は更に，ラクトース及びX-Galを含む培地上に白色コロニーを生成する能力を有するという特徴がある；
（c）下記（i）又は（ii)であるラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株：
（i）2014年06月12日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM28910で寄託された株；
（ii）又は，DSM28910由来の株，ここで該由来株は更に，ラクトース及びX-Galを含む培地上に白色コロニーを生成する能力を有するという特徴がある，
からなる群より選択される，請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
ラクトース代謝に欠損を有する前記更なる株はS.サーモフィルスのタンパク質分解性の株である，ここで，タンパク質分解性の株は，以下の特徴を有する：
（a）活性細胞壁プロテイナーゼの存在；及び／又は
（b）蛍光標識カゼインを含有する培地中で当該株を6時間増殖させると，対照試料と比較して蛍光が増加する，
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法は，L.カゼイを，1×108〜5×109CFU／g，好ましくは1×109〜5×109CFU／g，より好ましくは1×109〜3×109CFU／gの濃度で産生する，請求項1〜5のいずれか1項に記載の発酵乳製品を製造する方法。
【請求項７】
発酵乳製品を製造するための，L.カゼイ種の菌およびL.カゼイ以外の種の少なくとも1つの更なる乳酸菌の株の使用であって，前記更なる株は，ラクトース代謝に欠損を有するが，前記乳に存在するラクトース以外の1つ又はいくつかの炭水化物を代謝することが可能である，前記使用。
【請求項８】
前記使用は，スクロース，ガラクトース及び／又はグルコースを乳に添加することを更に含む，請求項7に記載のL.カゼイ種の菌および少なくとも1つの更なる乳酸菌の株の使用。
【請求項９】
ラクトース代謝に欠損を有する前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスからなる群より選択される種の菌である，請求項7又は8に記載のL.カゼイ種の菌および少なくとも1つの更なる乳酸菌の株の使用。
【請求項１０】
L.カゼイ種の菌および少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含む組成物であって，前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ラクトース代謝に欠損を有する，前記組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも1つの更なる菌は，ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスからなる群より選択される種の菌である，請求項10に記載のL.カゼイ種の菌および少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含む組成物。
【請求項１２】
L.カゼイ種の菌および少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含む食料又は飼料製品であって，前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ラクトース代謝に欠損を有する，前記食料又は飼料製品。
【請求項１３】
前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスからなる群より選択される種の菌である，請求項12に記載の食料又は飼料製品。
【請求項１４】
L.カゼイを，1×108〜5×109CFU／g，好ましくは1×109〜5×109CFU／g，より好ましくは1×109〜3×109CFU／gの濃度で含む，請求項12又は13に記載の食料又は飼料製品。
【請求項１５】
前記食料又は飼料製品は発酵乳飲料である，請求項12〜14のいずれか1項に記載の食料又は飼料製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，乳に乳酸菌を添加することを含む発酵乳製品を製造する方法であって，前記菌はラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・カゼイ以外の種の少なくとも1つの更なる乳酸菌の株，例えばストレプトコッカス・サーモフィルス，を含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクスショットとしても知られる，培養プロバイオティクス飲料は，ラクトバチルス・カゼイ又はラクトバチルス・パラカゼイを含有する場合が多い。本出願において，L.カゼイという用語は，L.カゼイ種またはL．パラカゼイ種の菌を指すために使用される。これらのプロバイオティクス飲料は，中国，韓国，極東地域，メキシコなどの世界の多くの地域で非常に人気がある。世界の他の地域でも，これらの飲料の人気が高まっている。
【０００３】
これらの製品は，典型的には単一のL.カゼイ株を用いる乳の発酵によって得られる。乳におけるL.カゼイの増殖は遅く，その結果，発酵も遅い。発酵には一般に50〜96時間が必要である。増殖が遅いため，更に，他の乳酸菌の混入および交差汚染を防ぐための特定の措置が発酵に必要なことが多い。
【０００４】
L.カゼイ株は，4.2〜3.7のpH値に達するまで増殖する。その段階で，発酵乳を加工し，場合によりシロップを用い30：60〜75：25の発酵乳：シロップの比で希釈する。最終製品は，典型的には65〜100mlの量で包装される。最終的な希釈発酵乳飲料におけるL.カゼイの標的細胞カウント数は，1×108CFU／mlより多い。
【０００５】
酸性化を増大させ，生産時間を短縮するために，L.カゼイを，S.サーモフィルス，例えばFD-DVS CT-01，を含む他の乳酸菌種と組み合わせて発酵させた。このアプローチでは，発酵時間は約15〜20時間に短縮された。しかし，これらの補助種はL.カゼイよりも早く増殖し，補助培養物の増殖により酸が生成することによりL.カゼイの増殖の阻害が引き起され，その結果達した濃度はわずか3〜5×107CFU／mlであった。したがって，依然としてL.カゼイを発酵に使用する発酵乳製品の製造方法を改良する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
この問題は，乳に乳酸菌を添加することを含む発酵乳製品を製造する方法であって，ここで前記菌はラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・カゼイ以外の種の少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含み，ここで前記更なる株は，ラクトース代謝に欠損を有するが，前記乳に存在するラクトース以外の1つ又はいくつかの炭水化物を代謝することが可能である方法に関する本発明により解決される。
【０００７】
本願発明者らは，驚くべきことに，L.カゼイを使用して発酵乳製品を生成する際における上記問題は，L．caseiおよびラクトース代謝に欠損を有する少なくとも1つの更なる株を用いて乳を発酵させることにより，解決できることを見出した。前記更なる株は，例えば，スクロース，ガラクトース，及び／又はグルコースを代謝することが可能であってもよい。これらの炭水化物の1つまたはいくつか（one or several）は，発酵する乳に低濃度で添加できる。前記更なる株は，これらの炭水化物を迅速に代謝し，したがって乳を迅速に酸性化し始める。酸性化は，汚染による望ましくない乳酸菌の増殖リスクを低減する。前記更なる株の増殖は，L.カゼイの増殖を加速する。これは，明らかに，前記更なる株が，カゼインおよび他の乳タンパク質のタンパク質分解によって乳中にアミノ酸およびペプチドを生成するという事実に起因する。アミノ酸およびペプチドは，L.カゼイの増殖を促進する。しかしながら，前記更なる株は，L.カゼイの増殖を著しく阻害する程には増殖しすぎず，あるいは乳を酸性化しすぎない。本発明の発酵乳製品の製造方法では，他の乳酸菌を使用しないL.カゼイの増殖方法における細胞数と同じだけのL.カゼイの最大細胞数を達成する。つまり，汚染のリスクを低減しつつ，短期間で高濃度のL.カゼイが達成される。
【０００８】
一態様において，ラクトース代謝に欠損を有する前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，タンパク質分解性の株である。好ましい態様では，ラクトース代謝に欠損を有する前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，タンパク質分解性が高い株である。
【０００９】
関連する態様において，ラクトース代謝に欠損を有する前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ストレプトコッカス・サーモフィルス及び／又はラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの種の菌である。
【００１０】
本発明の更なる実施形態は，発酵乳製品を製造するための，L.カゼイ菌およびL.カゼイ以外の種の少なくとも1つの更なる乳酸菌の株の使用であって，前記更なる株は，ラクトース代謝に欠損を有するが，前記乳に存在するラクトース以外の1つ又はいくつかの炭水化物を代謝することが可能である，前記使用に関する。
【００１１】
本発明はまた，L.カゼイ種の菌および少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含む組成物であって，前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ラクトース代謝に欠損を有する，前記組成物を提供する。組成物中に存在するラクトース代謝に欠損を有する前記少なくとも1つの更なる菌は，好ましくはストレプトコッカス・サーモフィルス及び／又はラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの種の菌である。
【００１２】
本発明の別の実施形態では，本発明は，L.カゼイ種の菌および少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含む食料又は飼料製品であって，前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ラクトース代謝に欠損を有する，前記食料又は飼料製品を提供する。特に，食料又は飼料製品は，発酵乳飲料であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1は，様々なスターター培養物を用いた乳の酸性化曲線を示す。
【００１４】
【図２】図2は，発酵および保存後のL.カゼイの細胞カウント数（CFU／g）を示す。
【００１５】
【図３】図3は，発酵および保存後のL.カゼイの細胞カウント数（CFU／g）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
概して，本発明は，乳に乳酸菌を添加することを含む発酵乳製品を製造する方法であって，ここで，前記菌はラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・カゼイ以外の種の少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含み，ここで前記更なる株は，ラクトース代謝に欠損を有するが，前記乳に存在するラクトース以外の1つ又はいくつかの炭水化物を代謝することが可能である，方法を提供する。
【００１７】
本出願の文脈において，用語「乳」は，動物の乳腺又は植物によって産生される液体を指す一般的な意味で広範に使用される。本発明によれば，乳は加工されていてもよく，用語「乳」は，全乳，スキムミルク，脱脂乳，低脂肪乳，全脂肪乳，ラクトースを低減した乳又は濃縮乳を含む。脱脂乳は，無脂肪又はスキムミルクの製品である。低脂肪乳は，典型的には，約1％〜約2％の脂肪を含む乳として定義される。全脂肪乳は2％以上の脂肪を含むことが多い。用語「乳」は，各種哺乳類及び植物由来のミルクを包含する意図である。乳の哺乳類の由来源としては，牛，羊，山羊，水牛，ラクダ，ラマ，ウマ，及びシカが含まれるが，これらに限定されない。乳の植物由来源としては，大豆，豆，ピーナッツ，大麦，米，オート麦，キヌア，アーモンド，カシュー，ココナッツ，ヘーゼルナッツ，麻，ゴマの種及びヒマワリの種子から抽出された乳が含まれるが，これらに限定されない。
【００１８】
本発明の方法及び製品において，牛由来の乳は，発酵のための出発物質として最も好ましく使用される。
【００１９】
本発明の方法では，ラクトースを低減した及び／又脂肪を低減した乳も使用できる。ラクトースを低減及び脂肪を低減した乳は市販されており，ラクトースを，ラクトース酵素によりグルコースやガラクトースに加水分解する，又はナノ濾過，電気透析，イオン交換クロマトグラフィー及び遠心分離によりことを含む，当該分野で公知の任意の方法に従って製造することができる。
【００２０】
用語「乳ベース」は，本出願では，乳酸菌の増殖及び発酵のための培地として使用することができる乳又は乳成分ベースの組成物を指すのに広範に使用される。乳ベースは，乳由来の成分及び乳酸菌を増殖又は発酵させる目的で使用可能なその他の成分を含む。
【００２１】
すでに上述したように，用語「ラクトバチルス・カゼイ」および「L.カゼイ」は，L.カゼイ種またはL．パラカゼイ種の菌を指すために本出願で使用される。複数の株の混合物を含めた任意のL.カゼイ株が本発明の文脈において使用できる。好ましくは，L.カゼイの食品グレード株が使用される。それぞれの株は，多くの供給源から入手可能である。
【００２２】
本出願の文脈において，用語「乳酸菌（lactic acid bacteria）」又は「乳酸菌（LAB）」は，炭水化物発酵の主な代謝最終産物として乳酸を生産する食品グレードの菌を指す。これらの菌は，共通の代謝的特徴及び生理学的特徴を有し，通常，グラム陽性，低GC，酸耐性，非胞子形成性，非呼吸性，棒状の桿菌又は球菌である。発酵段階では，これらの菌によるラクトースの消費が乳酸の形成を引き起こし，pHを低下させてタンパク質凝集物の形成をもたらす。したがって，これらの菌は乳の酸性化及び乳製品の質感に関与する。本明細書で使用される用語「乳酸菌」は，ラクトバチルス属の種（Lactobacillus spp.），ビフィドバクテリウム属の種（Bifidobacterium spp.），ストレプトコッカス属の種（Streptococcus spp.），ラクトコッカス属の種（Lactococcus spp.）といった属の菌，例えば，ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus），ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus），ラクトバチルス・ラクティス（Lactobacillus lactis），ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis），ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis），ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei），ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum），ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus），ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus），ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve），及びリューコノストック属の種（Leuconostoc spp.）に属する菌を包含するが，これらに限定されない。
【００２３】
発酵乳製品を製造するための発酵工程は，乳に乳酸菌を添加することを含む。乳に添加される菌は，スターター培養物と称されることが多い。本文脈において使用される用語「スターター培養物」は，乳ベースの酸性化に関与する1種以上の食品グレードの微生物，特に乳酸菌の培養物を指す。スターター培養物は新鮮，凍結，又は凍結乾燥状態であってもよい。発酵乳製品の製造のために，スターターは任意の量で添加することができる。典型的には，スターターは，乳の総量の0.001〜3％，好ましくは0.001〜0.025体積％の濃度を達成する量で添加される。
【００２４】
用語「ラクトース代謝に欠損を有する」および「ラクトース欠損」は，本発明の文脈において，細胞増殖または細胞生存維持のための源としてラクトースを使用する能力を部分的または完全に失ったLABを特徴付けるために使用される。それぞれのLABは，スクロース，ガラクトースおよびグルコースからなる群より選択される1つ又はいくつかの炭水化物，または別の発酵可能な炭水化物を代謝することができる。これらの炭水化物は，ラクトース欠損変異体による発酵を補助するのに十分な量で乳中に天然に存在しないので，これらの炭水化物を乳に添加することが必要であろう。ラクトースを欠損したおよび部分的に欠損したLABは，ラクトース及びX-Galを含む培地上における白色コロニーとして特徴付けることができる。
【００２５】
一態様において，本発明は，したがって，乳に乳酸菌を添加することを含む発酵乳製品を製造する方法であって，ここで前記菌はラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・カゼイ以外の種の少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含み，ここで前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ラクトース代謝に欠損を有するが，スクロース，ガラクトース，およびグルコースからなる群より選択される1つ又は複数の炭水化物を代謝することが可能であり，前記炭水化物は，発酵前に乳に添加される方法を提供する。
【００２６】
好ましい実施形態では，ラクトース代謝に欠損を有する前記株は，タンパク質分解性の株，例えばS.サーモフィルスのタンパク質分解性の株，より好ましくはラクトース代謝に欠損を有する前記株は，S.サーモフィルスDSM28952である，発酵乳製品を製造する方法が提供される。
【００２７】
上述のように，カゼインおよび他の乳タンパク質のタンパク質分解によって，前記更なる株が乳中にアミノ酸およびペプチドをもたらすという事実により，前記更なる株の増殖は，明らかにL.カゼイの増殖を加速する。したがって，タンパク質分解活性を有する更なるLABの使用は，本発明の有利な実施形態を表す。
【００２８】
本発明によれば，LABは，活性細胞壁プロテイナーゼを含有する場合，タンパク質分解性LABである。細胞壁プロテイナーゼは，カゼインなどの乳タンパク質を加水分解し，それによって，アミノ酸栄養要求性を有するLABの急速な増殖用の培地として乳の品質を向上させる。細胞壁プロテイナーゼは，例えば，L.ラクティスのPrtP，S.サーモフィルスのPrtS，Lb.ブルガリカスのPrtBといった，多数のLABにおいて同定され，詳細に特徴付けられている。したがって，タンパク質分解性LABは，細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子の存在によって同定することができる。
【００２９】
さらに，タンパク質分解性LABは，その株を蛍光標識カゼインを含有する培地中で6時間増殖させることによる蛍光の増加を，該株の細胞を含まない対照試料と比較して決定する，蛍光基質フルオレセインイソチオシアネート標識カゼインまたはFITCカゼインアッセイによって同定することができる。アッセイの詳細は実施例1に記載されている。
【００３０】
したがって，本発明は，以下の方法を提供する：発酵乳製品を製造する方法であって，乳に乳酸菌を添加することを含み，ここで，前記菌はラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・カゼイ以外の種の少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含み，ここで前記更なる株は，ラクトース代謝に欠損を有するが，前記乳に存在するラクトース以外の1つ又はいくつかの炭水化物を代謝することが可能であり，ラクトース代謝に欠損を有する前記更なる株はS.サーモフィルスのタンパク質分解性の株であり，ここで，タンパク質分解性の株は，以下の特徴を有する：
（a）活性細胞壁プロテイナーゼの存在；及び／又は
（b）蛍光標識カゼインを含有する培地中で当該株を6時間増殖させると，対照試料と比較して蛍光が増加する。
【００３１】
本発明の方法の特定の実施形態では，ラクトース代謝に欠損を有する前記更なる株は，S.サーモフィルスのタンパク質分解性の株である，ここで，タンパク質分解性の株は，以下の特徴を有する：
（a）活性細胞壁プロテイナーゼの存在；及び／又は
（b）蛍光標識カゼインを含有する培地中で当該株を6時間増殖させると，対照試料と比較して蛍光が増加する。
【００３２】
本発明の方法の特定の実施形態では，タンパク質分解性のS.サーモフィルス株は，以下からなる群より選択される：
（a）下記（i）又は（ii）であるストレプトコッカス・サーモフィルス株：
（i）2014年06月12日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM28952で寄託された株；
（ii）又は，DSM28952由来の株，ここで該由来株は更に，ラクトース及びX-Galを含む培地上に白色コロニーを生成する能力を有するという特徴がある；
（b）下記（i）又は（ii）であるストレプトコッカス・サーモフィルス株：
（i）2014年06月12日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM28953で寄託された株；
（ii）又は，DSM28953由来の株，ここで該由来株は更に，ラクトース及びX-Galを含む培地上に白色コロニーを生成する能力を有するという特徴がある。
【００３３】
本発明の方法の特定の実施形態では，ラクトバチルス・カゼイ株は，ATCC55544として寄託されたL.カゼイCRL431及びDSM19465として寄託されたL.カゼイCHCC2115からなる群より選択される。
【００３４】
本発明の方法の更なる態様では，以下の株の1つまたは複数を使用する：
（a）ATCC55544として寄託されたL.カゼイCRL431；
（b）DSM19465として寄託されたL.カゼイCHCC2115；
（c）ラクトース代謝に欠損を有する株であるDSM28952として寄託されたS.サーモフィルスCHCC17861。
【００３５】
好ましい態様において，本方法は，以下の株の組み合わせの1つから選択される乳酸菌を使用する：
（i）ATCC55544として寄託されたL.カゼイCRL431及びラクトース代謝に欠損を有する株であるDSM28952として寄託されたS.サーモフィルスCHCC17861；又は
（ii）2007年06月27日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，DSM19465として寄託されたL.カゼイCHCC2115及びラクトース代謝に欠損を有する株であるDSM28952として寄託されたS.サーモフィルスCHCC17861。
【００３６】
ラクトース欠損LABおよびその製造方法は，WO2013／160413，PCT／EP2015／063767及びPCT／EP2015／063742を含む先行特許出願に概説，例示，寄託されており，これらはラクトース代謝に欠損を有するLABを生成する方法およびこれらの方法によって得られる特定の株について記載されている。
【００３７】
ラクトース代謝に欠損を有する任意のLABおよび様々な株の混合物を，本発明の方法に使用することができる。本発明の方法の好ましい実施形態では，ラクトース代謝に欠損を有する更なる株は，ストレプトコッカス・サーモフィルス（ST）及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス（LB）からなる群より選択される。これらのラクトース欠損LABは，ラクトース以外の炭水化物，例えば，スクロースを代謝する。本発明の方法の好ましい実施形態では，前記更なる株は，
（a）下記（i）又は（ii）であるストレプトコッカス・サーモフィルス株：
（i）2014年06月12日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM28952で寄託された株；
（ii）又は，DSM28952由来の株，ここで該由来株は更に，ラクトース及びX-Galを含む培地上に白色コロニーを生成する能力を有するという特徴がある；
（b）下記（i）又は（ii）であるストレプトコッカス・サーモフィルス株：
（i）2014年06月12日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM28953で寄託された株；
（ii）又は，DSM28953由来の株，ここで該由来株は更に，ラクトース及びX-Galを含む培地上に白色コロニーを生成する能力を有するという特徴がある；
（c）下記（i）又は（ii）であるラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株：
（i）2014年06月12日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM28910で寄託された株；
（ii）又は，DSM28910由来の株，ここで該由来株は更に，ラクトース及びX-Galを含む培地上に白色コロニーを生成する能力を有するという特徴がある；からなる群より選択される。
【００３８】
用語「前記乳に存在するラクトース以外の1つ又はいくつかの炭水化物を代謝することが可能」は，本発明の文脈では，ラクトース以外の炭水化物を用いた炭水化物発酵の主要な代謝最終生成物として乳酸の生成を引き起こすラクトース欠損LABの代謝活性を指すために使用される。ラクトース以外の炭水化物に基づく検出可能な代謝活性を達成するためには，当該他の炭水化物を乳に添加する必要がある場合もある。
【００３９】
いくつかの実施形態では，本発明の方法は，スクロース，ガラクトース，及び／又はグルコースを代謝することが可能なLABを使用する。したがって，本発明は，スクロース，ガラクトース及び／又はグルコースが，発酵前に乳に添加される方法を提供する。乳に添加される炭水化物の量は，使用するLAB，及び，主にL.カゼイ以外のLABによって引き起こされる所望の酸性化に基づいて容易に決定することができる。ほとんどの場合，スクラロース，ガラクトースおよび／またはグルコースは，0.4 g／l〜10 g／lの範囲内，又は1 g／l〜8 g／lの範囲内，又は2 g／l〜6 g／lの範囲内の濃度となるような量で乳に添加される。
【００４０】
発酵開始におけるスターター培養物または乳における，L.カゼイとラクトース代謝に欠損を有する少なくとも1つの更なる乳酸菌株との細胞数の割合は，当業者により容易に決定することができる。特定の実施形態では，その割合は，L.カゼイ：更なる乳酸菌株として，95：5〜5：95の範囲内にある。好ましい割合は，80：20〜20：80，好ましくは70：30〜30：70，より好ましくは60：40〜40：60，例えば，約50：50の範囲内にある。
【００４１】
本発明の方法の1つの実施形態では，発酵は22〜45℃の温度で，好ましくは約30℃で行われる。発酵は，一般に4.5未満のpH，好ましくは約4.0のpH，例えば3.7〜4.3のpHに達するまで行われる。
【００４２】
本発明の方法は，特に，高濃度，好ましくは1×108〜5×109CFU／g，より好ましくは1×109〜5×109CFU／g，最も好ましくは1×109〜3×109CFU／gの濃度のL.カゼイを達成するという特徴を有する。これらの濃度は，比較的短時間，例えば，30〜50時間の期間で，最も好ましくは35〜45時間の期間で達成される。
【００４３】
本発明は，特に，乳に乳酸菌を添加することを含む発酵乳製品の製造方法であって，ここで，前記菌は，以下（a）及び（b）を含み：
（a）L.カゼイ，及び
（b）ストレプトコッカス・サーモフィルス，ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス及びそれらの混合物から選択されるラクトース代謝に欠損を有する菌，
ここで，前記菌は，（a）：（b）を95：5〜5：95の割合で乳に添加される，そして，前記方法は，1×108〜1×1011CFU／gの濃度のL.カゼイを35〜45時間の期間で産生する方法，を提供する。
【００４４】
本発明は，更に，乳に乳酸菌を添加することを含む発酵乳製品の製造方法であって，ここで，前記菌は，前記菌は，以下（a）及び（b）を含み：
（a）以下の（i）及び／又は（ii）から選択されるL.カゼイ菌の株：
（i）ATCC55544として寄託されたL.カゼイCRL431；及び／又は
（ii）DSM19465として寄託されたL.カゼイCHCC2115；
（b）ストレプトコッカス・サーモフィルス，ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス，及びそれらの混合物，好ましくは株DSM28952として寄託されたS.サーモフィルスCHCC17861を含む，から選択されるラクトース代謝に欠損を有する菌；
ここで，前記菌は，（a）：（b）を95：5〜5：95の割合で乳に添加される，そして，前記方法は，1×108〜1×1011CFU／gの濃度のL.カゼイを35〜45時間の期間で産生する方法，を提供する。
【００４５】
好ましい実施形態では，ラクトース代謝に欠損を有する前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスからなる群より選択される種の菌である。
【００４６】
本発明の方法の特定の実施形態では，ラクトース代謝に欠損を有する前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ストレプトコッカス・サーモフィルスの種の菌である。
【００４７】
本発明の方法の特定の実施形態では，ラクトース代謝に欠損を有する前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの種の菌である。
【００４８】
関連する実施形態では，本発明は，発酵乳製品を製造するための，L.カゼイ菌及びL.カゼイ以外の種の少なくとも1つの更なる乳酸菌の株の使用であって，ここで前記更なる株は，ラクトース代謝に欠損を有するが，前記乳に存在するラクトース以外の1つ又はいくつかの炭水化物を代謝することが可能である前記使用を提供する。L.カゼイ菌及び少なくとも1つの更なる乳酸菌の株の前記使用は，スクロース，ガラクトース及び／又はグルコースを乳に添加することを更に含んでもよい。
【００４９】
好ましい実施形態では，前記使用は，ラクトース代謝に欠損を有する前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株が，ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスからなる群より選択される種の菌である，という特徴を有する。
【００５０】
別の態様において，本発明は，L.カゼイ種の菌および少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含む組成物であって，前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ラクトース代謝に欠損を有する，前記組成物を提供する。本発明の特定の実施形態では，前記組成物は，請求項10に記載のL.カゼイ種の菌および少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含み，ここで，前記少なくとも1つの更なる乳酸菌は，ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスからなる群より選択される種の菌である。
【００５１】
本発明の組成物は，発酵乳，食品添加物，安定剤，凍結保護剤，香味剤，人工甘味料などを含む任意の数のさらなる成分を含むことができる。この組成物は，上記のような本発明の方法を用いて発酵乳製品を製造するためのスターター培養物として使用することができる。
【００５２】
あるいは，これらの組成物は，乳製品そのものを表すものであってもよい。
【００５３】
本発明は，更に，L.カゼイ種の菌および少なくとも1つの更なる乳酸菌の株を含む食料又は飼料製品であって，前記少なくとも1つの更なる乳酸菌の株は，ラクトース代謝に欠損を有する，前記食料又は飼料製品に関する。
【００５４】
本発明の食料又は飼料製品の特定の実施形態では，前記少なくとも1つの更なる乳酸菌は，ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスからなる群より選択される種の菌である。
【００５５】
本発明の食料又は飼料製品の特定の実施形態は，L.カゼイを，1×108〜5×109CFU／g，好ましくは1×109〜5×109CFU／g，より好ましくは1×109〜3×109CFU／gの濃度で含む。
【００５６】
本発明の食料又は飼料製品の特定の実施形態では，食料又は飼料製品は発酵乳飲料である。
【００５７】
特に好ましい食料又は飼料製品の特定の実施形態は，以下の（a）及び（b）を含む：
（a）1×108〜1×1011CFU／gの濃度又は1×109〜1×1011CFU／gの濃度のL.カゼイ，及び
（b）ストレプトコッカス・サーモフィルス，ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス及びそれらの混合物から選択されるラクトース代謝に欠損を有する菌。
【００５８】
本発明は，例えば，以下の（a）及び（b）を含む食料又は飼料製品を提供する：
（a）1×108〜1×1011CFU／gの濃度又は1×109〜1×1011CFU／gの濃度のL.カゼイの株，ここで，前記株は，以下（i）及び／又は（ii）から選択される
（i）ATCC55544として寄託されたL.カゼイCRL431；及び／又は
（ii）DSM19465として寄託されたL.カゼイCHCC2115；及び
（b）ストレプトコッカス・サーモフィルス，ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス，及びそれらの混合物，好ましくはS.サーモフィルスCHCC17861を含む，から選択されるラクトース代謝に欠損を有する菌。
【００５９】
食料又は飼料製品は，ヨーグルト，フルーツヨーグルト，ヨーグルト飲料，又はチーズを含む，任意の発酵乳製品であり得る。
【００６０】
本出願の文脈において，用語「ヨーグルト」は，ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス，そして場合により他の微生物，例えばラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス，ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス，ラクトコッカス・ラクティス，ラクトバチルス・アシドフィルス，及びラクトバチルス・パラカゼイ，又はそれらに由来する任意の微生物を含む製品を指す。ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス以外の乳酸菌株も，最終製品に様々な特性，例えば腸内叢の平衡を促進する特性，を付与するために含まれる。本明細書で使用される用語「ヨーグルト」は，セットヨーグルト，スタードヨーグルト，飲用ヨーグルト，プチスイス，熱処理ヨーグルト，高タンパク質量であるという特徴を有する水切りヨーグルト又はギリシャスタイルヨーグルト，及びヨーグルト風の製品を包含する。
【００６１】
特に，用語「ヨーグルト」は，フランス及びヨーロッパの規制に従って定義されるヨーグルト，つまり特定の好熱性乳酸菌（つまり，ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス及びストレプトコッカス・サーモフィルス）のみによる乳酸発酵によって得られ，これらの菌が同時に培養され最終製品中に少なくとも10×106CFU（コロニー形成単位）／gの量で生存している凝固乳製品も含むが，これらに限定されない。ヨーグルトは場合により，酪農原料（例えば，クリーム），あるいは砂糖又は甘味剤，1つ又は複数の香味料，果物，穀物，又は栄養物質，特にビタミン，ミネラル，繊維，ならびに安定剤及び増粘剤といった他の成分を含有してもよい。あるいは，ヨーグルトはAFNOR NF 04-600規格及び／又はcodex StanA-lla-1975規格の発酵乳及びヨーグルトの基準を満たす。AFNOR NF 04-600規格を満たすためには，製品は発酵後に加熱してはならず，酪農原料は完成品の最低70％（m／m）を占める必要がある。
【００６２】
また，本発明の食料製品は，当技術分野で周知のチーズ製造の技術（Hoier et al. (2010) in The Technology of Cheesemaking, 2nd Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192）に上記の方法を適用することによって製造されるモッツァレラ，ピザおよびフェタチーズを含めたチーズも含む。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態では，上記の方法で得られた発酵乳飲料，例えば発酵ヨーグルトを提供する。発酵乳飲料は，例えば，以下（a）および（b）を含むという特徴を有してもよい：
（a）1×108〜1×1011CFU／gの濃度又は1×109〜1×1011CFU／gの濃度のL.カゼイ，及び
（b）ストレプトコッカス・サーモフィルス，ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス及びそれらの混合物から選択されるラクトース代謝に欠損を有する菌。
【００６４】
この発酵乳飲料は，特に以下（a）および（b）を含んでもよい：
（a）1×108〜1×1011CFU／gの濃度又は1×109〜1×1011CFU／gの濃度のL.カゼイの株，ここで，前記株は，以下（i）及び／又は（ii）から選択される
（i）ATCC55544として寄託されたL.カゼイCRL431；及び／又は
（ii）DSM19465として寄託されたL.カゼイCHCC2115；及び
（b）ストレプトコッカス・サーモフィルス，ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス，及びそれらの混合物，好ましくはS.サーモフィルスCHCC17861を含む，から選択されるラクトース代謝に欠損を有する菌。
【実施例】
【００６５】
実施例1FITCアッセイ：Hamilton液体処理ユニットを用いた乳酸菌（LAB）中のプロテアーゼ活性を測定するためのプロトコル。
【００６６】
細胞壁に関連するプロテイナーゼは，乳中のLABの急速な成長に寄与する。これらのプロテイナーゼは，カゼインの分解の第一段階にも関与し，それによって風味の向上を引き起こす。本アッセイは，蛍光基質フルオレセインイソチオシアネート標識カゼイン（FITC）に基づく。
【００６７】
材料
Costarディープウェルプレート：2.0ml
マイクロタイタープレート：Nunc Blackプレート（カタログ番号：237105），Nunc（製品番号：167008），MJR PCRプレート（V型，製品番号：HSP-9665）
Hamilton液体処理ロボット
Hamilton使い捨て滅菌チップ
塩化カルシウム二水和物（Merckカタログ番号：1.02382.1000）
MES水和物，最低99.5％滴定（Sigma M8250-1kg）
Tris（Sigmaカタログ番号：T1503）
Costarディープウェルプレートに入れた試料（2.0ml）
Enspire，2300マルチラベルリーダー，PerkinElmer
対照株：LH-Emfour，バッチ番号：2995517，材料番号：501638（LH-32バッチ番号：2990465，材料番号：616703を解凍DVSとして添加（50μl）し一晩増殖。対照の新しいバッチを使用する場合は，使用前に古いバッチとタンパク質分解活性を比較。）
500 mM Tris-HCL，pH8.5（60.55 g Tris-HCl。Milli-Q水を加えて800 mlにし，1M HClを用いてpHを8.5に調整。Milli-Q水で1000 mlまで満たす。）
FITC，FITC標識カゼイン（Sigma C3777）（5mg／ml FITC，滅菌濾過Milli-Q水で調製。）
MES100 mM＋CaCl2，pH6.5（19.52 g MESおよび7.35 g CaCl2。水を加えて800 mlにし，pHを6.5に調整し，水で1000 mlまで満たし，滅菌濾過。）
5％TCA（5gの三塩化酢酸をMilli-Q水に溶解し，全量を100mlにする。）
培養培地：BD5-3ブロス
【００６８】
方法細胞の洗浄株は，1800μlのBD5-3ブロスを含むディープウェルプレート中で10％接種となるようにWS-Plateから適切に希釈して一晩増殖させる。ラクトコッカス種は30℃でインキュベートし，ラクトバチルス種およびストレプトコッカス種は37℃でインキュベートする。pH6.5の冷MES緩衝液で3回洗浄し（各洗浄後にディープウェルプレートを10℃で4分間4000rpmの遠心分離），OD620を測定し，FITC基質上のプロテイナーゼ活性を測るためそこから試料を採取しプレートを37℃で6時間インキュベートする。
【００６９】
FITCプロトコル
・8μlのFITC溶液をMJR PCRマイクロタイタープレート（インキュベーション中の蒸発を最小にするためV字形のウェル）に分注する。
・40μlの洗浄した細胞懸濁液をMJR PCRマイクロタイタープレートに分注し，プレートを密封する。
・MJR PCRマイクロタイタープレートを37℃で0〜6時間インキュベートする（ラクトバチルス種およびストレプトコッカス種）。
・115μlの5％w／v TCAをMJR PCRマイクロタイタープレートに分注する。
・MRJ PCRマイクロタイタープレートを室温で1時間または氷浴上で30分間インキュベートする。
・MJR PCRマイクロタイタープレートを遠心分離する（3700rpm，100分間，10℃）。
・125μlのTris-HCl 0.5M（pH8.5）をNunc Blackマイクロタイタープレートに分注する。
・MJR PCRマイクロタイタープレートから45μlをNunc Blackマイクロタイタープレートに吸引する。
・Enspire，2300マルチラベルリーダー，PerkinElmerを用い励起497nm-発光515nmで蛍光を読み取る。
【００７０】
T0  インキュベーションしない試料。
T6  MES緩衝液で洗浄した直後に，37℃で6時間インキュベートした試料。
【００７１】
データ処理：T6からT0を減算してグラフを作成し，その後，洗浄した細胞のODで除算して新しいグラフを作成する。非常に高い活性が低いODに起因するものであるか否かを確認する。対照が正常範囲内にあるか否かを確認する。
【００７２】
実施例2乳は，以下の2種の異なるChr. HansenのL.カゼイ株を単独で，又は以下のChr. Hansenのストレプトコッカス・サーモフィルス株と組み合わせて発酵させた：
ATCC55544として寄託されたL.カゼイCRL431；
DSM19465として寄託されたL.カゼイ01，CHCC2115；及び
S.サーモフィルスDSM28952として寄託されたS.サーモフィルスCHCC17861。
【００７３】
上記S.サーモフィルス株は，ラクトース代謝に欠損を有する。
【００７４】
組み合わせて使用する場合，以下の比率を使用した：
（1）50：50
（2）90：90，及び
（3）10：90。
【００７５】
ラクトース代謝に欠損を有するS.サーモフィルス単独及び上記の2種のL.カゼイ株のそれぞれ単独を対照として使用した。
【００７６】
試験には標準乳を使用した（3.8％タンパク質，1.5％脂肪）。スクロース（0.4％w／v）を乳に加えてラクトース代謝に欠損を有するS.サーモフィルスによるpH5.50への酸性化を促進した。酸性化は，39℃および37℃で行った。
【００７７】
発酵中にpHの推移を測定した。発酵から1，7，14日目に細胞カウント数の増加を測定した。
【００７８】
3回繰り返してデータを確認した。
【００７９】
代表的な結果を図1と図2に示す。図1に示すように，L.カゼイ01単独だと非常に長い誘導期（lag phase）を有し，発酵の40時間後にpH4.5に達する。しかしながらラクトース代謝に欠損を有するS.サーモフィルスを様々な比率で組み合わせると，誘導期が著しく低減する（L.カゼイ01単独ではpH6.3に達するまで8時間；一方，ラクトース代謝に欠損を有するS.サーモフィルスと組み合わせるとわずか1時間）。ラクトース代謝に欠損を有するS.サーモフィルス単独では，スクロース枯渇後，pH値が低下して最終pHは5.1となった。しかし，L.カゼイ01と組み合わせると，前記乳に存在するラクトースを使用することができるL.カゼイ01の存在により酸性化が継続する。
【００８０】
L.カゼイCRL431および37℃で実施された試験でも同じ結果が得られた（データ示さず）。
【００８１】
L.カゼイ01の細胞カウント数を図2に示す。図2は，L.カゼイ01はラクトース代謝に欠損を有するS.サーモフィルスとの共培養によって，単体の株による発酵と比較してL.カゼイの細胞カウント数が減少しないことを示す。
【００８２】
結果として，L.カゼイ01とLac(-)STとの組み合わせにより，L.カゼイ01の増殖を阻害せず（競合せず）促進する。この組み合わせにより，高い細胞カウント数を維持しながら，誘導期を大幅に低減することができる。
【００８３】
実施例3乳は，以下のChr. HansenのL.カゼイ株を単独で，又は以下のChr. Hansenのストレプトコッカス・サーモフィルス株と組み合わせて発酵させた：
ATCC55544として寄託されたL.カゼイCRL431を単独，又は以下の1)又は2)の株のいずれかと組み合わせる：
1）ラクトース代謝に欠損を有する株（Lac(-)）であり，S.サーモフィルスDSM28952として寄託されたS.サーモフィルスCHCC17861；又は
2）ラクトース代謝に欠損を有さない株（Lac(+)）であり，DSM22935として寄託されたS.サーモフィルスCHCC11977（CHCC17861の親株）。
【００８４】
組み合わせて使用する場合，以下の比率を使用した：
（1）50：50
【００８５】
本実験に使用した乳ベースは，スキムミルクパウダー（SMP）を9.6％で再構成したものである。この乳ベースを99℃で15分間熱処理した。スクロース（0.3％w／v）を乳に加えてラクトース代謝に欠損を有するS.サーモフィルスによるpH5.50への酸性化を促進した。酸性化は，39℃で行った。
【００８６】
発酵の40時間後に細胞カウント数の増加を測定した。
【００８７】
実験を1回繰り返した。
【００８８】
図3から明らかなように，L.カゼイの細胞カウント数は，従来のS.サーモフィルス株（ラクトース代謝の欠損を有さない（Lac(+)））と共に培養すると，L.カゼイを単独で培養した場合と比べて著しく減少した。また，L.カゼイの細胞カウント数は，ラクトース代謝の欠損を有するS.サーモフィルス株（Lac(-)）と共に培養すると，L.カゼイを単独で培養した場合と比べて著しく増加した。
【００８９】
寄託と専門家のソリューション
出願人は，下記の寄託された微生物の試料が，出願人により承認された専門家のみに利用可能であるべきことを要求する。
2014年06月12日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM28952で寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株。
2014年06月12日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM28953で寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株。
2009年09月08日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM22935で寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株。
2014年06月12日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM28910で寄託されたラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株。
2007年06月27日付で，ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ）, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに，受託番号：DSM19465で寄託されたラクトバチルス・カゼイ株。
以上の寄託は，特許手続を目的とする微生物の寄託の国際的承認についてのブダペスト条約に従い行われた。
【図１】
2019502393.tif 000003
【図２】
2019502393.tif 000004
【図３】
2019502393.tif 000005
【国際調査報告】
2019502393.tif 000006
2019502393.tif 000007
2019502393.tif 000008
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