(57)【要約】本発明は、組換え微生物、ならびにステビオールグリコシド、ステビオール前駆体のグリコシド、及びステビオールグリコシド前駆体を産生する方法に関する。【選択図】図３
2019519212.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生することが可能な組換え宿主細胞であって、
（ａ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｃ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／または
（ｄ）ステビオール前駆体を、Ｃ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
を含み、
前記遺伝子の少なくとも１つが、組換え遺伝子である、前記組換え宿主細胞。
【請求項２】
（ａ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能な前記ポリペプチドが、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＮ１６７１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドであり、
（ｂ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能な前記ポリペプチドが、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドであり、
（ｃ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能な前記ポリペプチドが、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＣａＵＧＴ３ポリペプチド、ＵＮ３２４９１ポリペプチド、及び／またはＵＮ１６７１ポリペプチドであり、かつ／または
（ｄ）ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能な前記ポリペプチドが、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｄ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、ＣａＵＧＴ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドである、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
前記ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチドが、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチドが、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチドが、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチドが、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチドが、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７４Ｄ１ポリペプチドが、配列番号１４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチドが、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチドが、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドが、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＯｌｅＩポリペプチドが、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ５ポリペプチドが、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチドが、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＤＰＧ１ポリペプチドが、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＮ１６７１ポリペプチドが、配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチドが、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチドが、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチドが、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドが、配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチドが、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＣａＵＧＴ３ポリペプチドが、配列番号１６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＮ３２４９１ポリペプチドが、配列番号１９９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、かつ／または前記ＣａＵＧＴ２ポリペプチドが、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の���換え宿主細胞。
【請求項４】
前記組換え宿主細胞が、
（ａ）ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｃ）ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｄ）ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｅ）シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｆ）ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｇ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｈ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／または
（ｋ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
をさらに含み、
前記遺伝子の少なくとも１つが、組換え遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
（ａ）ＧＧＰＰを合成することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、もしくは配列番号１１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｂ）ｅｎｔ−コパリルジホスファートを合成することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、もしくは配列番号１２０に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｃ）ｅｎｔ−カウレンを合成することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、もしくは配列番号５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｄ）ｅｎｔ−カウレン酸を合成することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号６０、配列番号６２、配列番号１１７、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、もしくは配列番号７６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｅ）シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｆ）ステビオールを合成することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、もしくは配列番号１１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｇ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドを、Ｃ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｈ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能な前記ポリペプチドが、配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能な前記ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、かつ／または
（ｋ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能な前記ポリペプチドが、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、または配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
前記１つ以上の組換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組換え遺伝子を欠損している対応する宿主と比較して、前記細胞により蓄積される前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物の量を増加させる、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
前記１つ以上の組換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組換え遺伝子を欠損している対応する宿主と比較して、前記細胞により蓄積される前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物の前記量を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記１つ以上の組換え遺伝子の発現が、前記１つ以上の組換え遺伝子を欠損している対応する宿主と比較して、前記細胞により蓄積されるｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃３６）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）、ならびに／またはｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１及び／または異性体２）の前記量を増加させる、請求項６または７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体が、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１９−Ｏグルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、トリグリコシル化ステビオールグリコシド、テトラグリコシル化ステビオールグリコシド、ペンタグリコシル化ステビオールグリコシド、ヘキサグリコシル化ステビオールグリコシド、ヘプタグリコシル化ステビオールグリコシド、またはそれらの異性体であるか、またはそれらの前記組成物が、これらを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
前記モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸が、表１のＫＡ１．５８を含み、及び／または前記ペンタグリコシル化ステビオールが、表１の化合物５．２４を含む、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
前記組換え宿主細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞を含む、請求項１〜１０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を細胞培養物中で産生する方法であって、前記遺伝子が発現される条件下、前記細胞培養物中で請求項１〜１１のいずれか１項に記載の前記組換え宿主細胞を成長させることを含み、前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物が、前記組換え宿主細胞により産生される、前記方法。
【請求項１３】
前記遺伝子が、構成的に発現され、及び／または前記遺伝子の発現が、誘導される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換え宿主細胞により蓄積される、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）、１３−ＳＭＧ、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃３６）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）、ならびに／またはｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１及び／または異性体２）の量が、前記１つ以上の組換え遺伝子を欠損している対応する宿主と比較して、少なくとも約５％増加する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
それにより産生された前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を、前記細胞培養物から単離することをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離ステップが、
（ａ）前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を含む前記細胞培養物を提供すること、
（ｂ）前記産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を含む上清を得るために、前記細胞培養物の液相を、前記細胞培養物の固相から分離すること、
（ｃ）充填カラム中の吸着樹脂を提供することを含む、１つ以上の吸着樹脂を提供すること、ならびに
（ｄ）前記産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物の少なくとも一部を得るために、ステップ（ｂ）の前記上清を、前記１つ以上の吸着樹脂と接触させて、それにより、前記産生された１つ以上のステビオールグリコシドまたは前記ステビオールグリコシド組成物を単離すること、
あるいは
（ａ）前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を含む前記細胞培養物を提供すること、
（ｂ）前記産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を含む上清を得るために、前記細胞培養物の液相を、前記細胞培養物の固相から分離すること、
（ｃ）１つ以上のイオン交換またはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムを提供すること、ならびに
（ｄ）前記産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物の少なくとも一部を得るために、ステップ（ｂ）の前記上清を、前記１つ以上のイオン交換またはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムと接触させて、それにより、前記産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を単離すること、
あるいは
（ａ）前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を含む前記細胞培養物を提供すること、
（ｂ）前記産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を含む上清を得るために、前記細胞培養物の液相を、前記細胞培養物の固相から分離すること、
（ｃ）前記産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を結晶化または抽出して、それにより、前記産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を単離すること、
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を、前記細胞培養物から回収することをさらに含み、前記細胞培養物が、ステビア植物由来のステビオールグリコシド組成物と比較して、前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはステビオール前駆体のグリコシド、またはそれらの前記組成物について富化されており、かつ植物由来のステビア抽出物と比較して低減したステビア植物由来構成成分レベルを有する、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記回収された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物が、ステビア植物から回収されたステビオールグリコシド組成物とは異なり、かつ植物由来のステビア抽出物と比較して低減したステビア植物由来構成成分レベルを有する、相対量で存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生する方法であって、
（ａ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｃ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、及び／または
（ｄ）ステビオール前駆体を、Ｃ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
を使用する組換え宿主細胞の細胞培地中の植物由来または合成のステビオール、ステビオール前駆体、及び／またはステビオールグリコシドの全細胞生物変換を含み、
前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、前記組換え宿主細胞内で発現される組換えポリペプチドであり、
それにより、前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を産生することを含む、前記方法。
【請求項２０】
（ａ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能な前記ポリペプチドが、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＮ１６７１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドであり、
（ｂ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能な前記ポリペプチドが、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドであり、
（ｃ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能な前記ポリペプチドが、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＣａＵＧＴ３ポリペプチド、ＵＮ３２４９１ポリペプチド、及び／またはＵＮ１６７１ポリペプチドであり、及び／または
（ｄ）ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能な前記ポリペプチドが、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチドが、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチドが、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチドが、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチドが、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチドが、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７４Ｄ１ポリペプチドが、配列番号１４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチドが、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチドが、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドが、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＯｌｅＩポリペプチドが、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ５ポリペプチドが、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチドが、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＤＰＧ１ポリペプチドが、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＮ１６７１ポリペプチドが、配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチドが、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチドが、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチドが、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドが、配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチドが、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＣａＵＧＴ３ポリペプチドが、配列番号１６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ＵＮ３２４９１ポリペプチドが、配列番号１９９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、または前記ＣａＵＧＴ２ポリペプチドが、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換え宿主細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞である、請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生するインビトロの方法であって、
（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド、
（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、
（ｄ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドを含むＵＧＴ９１Ｄ２機能的ホモログポリペプチド、もしくは配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド、
（ｅ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチド、及び／または
（ｆ）配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、配列番号１４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｄ１ポリペプチド、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＯｌｅＩポリペプチド、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ５ポリペプチド、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＤＰＧ１ポリペプチド、配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＮ１６７１ポリペプチド、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチド、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、配列番号１６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＣａＵＧＴ３ポリペプチド、配列番号１９９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＮ３２４９１ポリペプチド、または配列番号２０９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＣａＵＧＴ２ポリペプチド、
ならびに植物由来もしくは合成のステビオールグリコシド前駆体、または、植物由来もしくは合成のステビオール前駆体を反応混合物に添加することを含み、
前記ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、組換えポリペプチドであり、
それにより、前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物を産生することを含む、前記方法。
【請求項２４】
前記反応混合物が、
（ａ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジンジホスファート（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、及び／または
（ｂ）反応緩衝液及び／または塩、
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体が、１３−ＳＭＧ、１９−ＳＭＧ、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＩ、ズルコシドＡ、モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、トリグリコシル化ステビオールグリコシド、テトラグリコシル化ステビオールグリコシド、ペンタグリコシル化ステビオールグリコシド、ヘキサグリコシル化ステビオールグリコシド、ヘプタグリコシル化ステビオールグリコシド、またはそれらの異性体であるか、またはそれらの前記組成物が、これらを含む、請求項１２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸が、表１のＫＡ１．５８を含み、及び／または前記ペンタグリコシル化ステビオールが、表１の化合物５．２４を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞培養物であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞を含み、前記細胞培養物が、
（ａ）前記組換え宿主細胞により産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、ならびに
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母ニトロゲンベース（ＹＮＢ）、及び／またはアミノ酸を含む補助栄養素、
をさらに含み、
前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物が、前記細胞培養物の少なくとも１ｍｇ／リットルの濃度で存在し、
前記細胞培養物が、ステビア植物由来のステビオールグリコシド組成物と比較して、前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはステビオール前駆体のグリコシド、またはそれらの前記組成物について富化されており、かつ植物由来のステビア抽出物と比較して低減したステビア植物由来構成成分レベルを有する、前記細胞培養物。
【請求項２８】
（ａ）前記組換え宿主細胞により産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、及び／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母ニトロゲンベース、ＹＮＢ、及び／またはアミノ酸を含む補助栄養素、
を含み、
前記組換え宿主細胞により産生された前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの前記組成物が、前記細胞培養物の少なくとも１ｍｇ／リットルの濃度で存在する、細胞培養物中で成長した、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞の細胞溶解物。
【請求項２９】
反応混合物であって、
（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド、
（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、
（ｄ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドを含むＵＧＴ９１Ｄ２機能的ホモログポリペプチド、もしくは配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド、
（ｅ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチド、及び／または
（ｆ）配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＯｌｅＩポリペプチド、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ５ポリペプチド、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＤＰＧ１ポリペプチド、配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＮ１６７１ポリペプチド、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチド、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、配列番号１６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＣａＵＧＴ３ポリペプチド、もしくは配列番号１９９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＮ３２４９１ポリペプチド、
を含み、かつ
（ｇ）１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物、
（ｈ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジンジホスファート（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、ならびに／または
（ｉ）反応緩衝液及び／または塩、
をさらに含む、前記反応混合物。
【請求項３０】
前記組換え宿主細胞により産生された前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体が、ステビア植物由来のステビオールグリコシド組成物とは異なり、かつ植物由来のステビア抽出物と比較して低減したステビア植物由来構成成分レベルを有する、相対量で存在する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞により産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体の組成物。
【請求項３１】
前記組換え宿主細胞により産生された前記１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体が、ステビア植物由来のステビオールグリコシド組成物とは異なり、かつ植物由来のステビア抽出物と比較して低減したステビア植物由来構成成分レベルを有する、相対量で存在する、請求項１２〜２６のいずれか１項に記載の方法により産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体の組成物。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載の１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体を含む、甘味料組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の甘味料組成物を含む食品。
【請求項３４】
請求項３２に記載の甘味料組成物を含む、飲料または飲料濃縮物。
【請求項３５】
単離核酸分子であって、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードし、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位またはその前記触媒活性部分でグリコシル化することが可能な前記コードされたポリペプチドが、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性、または配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有する、前記単離核酸分子。
【請求項３６】
単離核酸分子であって、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードし、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位またはその前記触媒活性部分でグリコシル化することが可能な前記コードされたポリペプチドが、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、または配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、前記単離核酸分子。
【請求項３７】
単離核酸分子であって、ステビオールグリコシドまたはその触媒活性部分の１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードし、ステビオールグリコシドまたはその前記触媒活性部分の１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能な前記コードされたポリペプチドが、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号１９９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、または配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有する、前記単離核酸分子。
【請求項３８】
単離核酸分子であって、ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードし、ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位またはその前記触媒活性部分でグリコシル化することが可能な前記コードされたポリペプチドが、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性、または配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有する、前記単離核酸分子。
【請求項３９】
前記核酸が、ｃＤＮＡである、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の単離核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、組換え宿主内での、ステビオールグリコシド、ステビオール前駆体のグリコシド、及びステビオールグリコシド前駆体の組換え産生に関する。特に、本開示は、組換え宿主内での、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、１，２−ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール（ｋａｕｒｅｎｏｌ）、トリグリコシル化ステビオールグリコシド、テトラグリコシル化ステビオールグリコシド、ペンタグリコシル化ステビオールグリコシド、ヘキサグリコシル化ステビオールグリコシド、ヘプタグリコシル化ステビオールグリコシド、またはそれらの異性体を含むステビオールグリコシドの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
甘味料は、食品、飲料、または菓子業界で最も一般に使用される成分として周知である。甘味料は、卓上甘味料またはベーキング時の砂糖の家庭用代替品として、適切に希釈される時に、製造中の最終食品中に組み込むことができるか、または独立の使用のためのものとすることができるかのいずれかである。甘味料は、天然甘味料、例えば、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、糖蜜、メープルシロップ、及び蜂蜜、ならびに、人工甘味料、例えば、アスパルテーム、サッカリン、及びスクラロースを含む。ステビア抽出物は、多年草であるＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａから単離及び抽出することができる天然甘味料である。ステビアは、ステビア抽出物を商業的に製造するために、南米及びアジアで一般に栽培される。種々の程度に精製されたステビア抽出物は、食品中の高強度甘味料として、かつ、卓上甘味料としてブレンドまたは単独で、商業的に使用される。
【０００３】
ジテルペンステビオール及び種々のステビオールグリコシドを含む、いくつかのステビオールグリコシドの化学構造は、図１に示される。ステビア植物の抽出物は一般に、甘味に寄与するステビオールグリコシドを含む。但し、各ステビオールグリコシドの量は多くの場合、とりわけ、異なる製造バッチ間で変動する。
【０００４】
ステビア植物由来のステビオールグリコシドの回収及び精製が、労働集約的かつ非効率的であることが証明されているので、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭなどの所望のステビオールグリコシドを高収率で蓄積することができる組換え産生系が依然として必要とされる。商業的使用のための組換え宿主内でのステビオールグリコシドの産生の改善も依然として必要とされる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明が従来技術を超える特定の利点及び進歩を提供することは、上述の背景に反する。
【０００６】
本明細書に開示の本発明は、具体的な利点または機能に限定されないが、本発明は、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生することが可能な組換え宿主細胞を提供し、組換え宿主細胞は、
（ａ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｃ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／または
（ｄ）ステビオール前駆体を、Ｃ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
を含み、
遺伝子の少なくとも１つは、組換え遺伝子である。
【０００７】
本明細書に開示の組換え宿主細胞の一態様では、
（ａ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＮ１６７１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドであり、
（ｂ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドであり、
（ｃ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＣａＵＧＴ３ポリペプチド、ＵＮ３２４９１ポリペプチド、及び／またはＵＮ１６７１ポリペプチドであり、かつ／または
（ｄ）ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｄ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、ＣａＵＧＴ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドである。
【０００８】
本明細書に開示の組換え宿主細胞の一態様では、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチドは、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチドは、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチドは、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチドは、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチドは、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７４Ｄ１ポリペプチドは、配列番号１４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチドは、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチドは、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドは、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＯｌｅＩポリペプチドは、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ５ポリペプチドは、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチドは、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＤＰＧ１ポリペプチドは、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＮ１６７１ポリペプチドは、配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチドは、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチドは、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチドは、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドは、配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチドは、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＣａＵＧＴ３ポリペプチドは、配列番号１６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＮ３２４９１ポリペプチドは、配列番号１９９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、かつ／またはＣａＵＧＴ２ポリペプチドは、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０００９】
本明細書に開示の組換え宿主細胞の一態様では、組換え宿主細胞は、
（ａ）ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｃ）ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｄ）ｅｎｔ−カウレン酸をｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｅ）シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｆ）ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｇ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｈ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｉ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／または
（ｋ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
をさらに含み、
遺伝子の少なくとも１つは、組換え遺伝子である。
【００１０】
本明細書に開示の組換え宿主細胞の一態様では、
（ａ）ＧＧＰＰを合成することが可能なポリペプチドは、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、もしくは配列番号１１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｂ）ｅｎｔ−コパリルジホスファートを合成することが可能なポリペプチドは、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、もしくは配列番号１２０に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｃ）ｅｎｔ−カウレンを合成することが可能なポリペプチドは、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、もしくは配列番号５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｄ）ｅｎｔ−カウレン酸を合成することが可能なポリペプチドは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号１１７、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、もしくは配列番号７６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｅ）シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドは、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｆ）ステビオールを合成することが可能なポリペプチドは、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、もしくは配列番号１１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｇ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドを、Ｃ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能な前記ポリペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｈ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｇ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、かつ／または
（ｋ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチド、もしくは配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１１】
本明細書に開示の組換え宿主細胞の一態様では、１つ以上の組換え遺伝子の発現は、１つ以上の組換え遺伝子を欠損している対応する宿主と比較して、細胞により蓄積される１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物の量を増加させる。
【００１２】
本明細書に開示の組換え宿主細胞の一態様では、１つ以上の組換え遺伝子の発現は、１つ以上の組換え遺伝子を欠損している対応する宿主と比較して、細胞により蓄積される１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物の量を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。
【００１３】
本明細書に開示の組換え宿主細胞の一態様では、１つ以上の組換え遺伝子の発現は、１つ以上の組換え遺伝子を欠損している対応する宿主と比較して、細胞により蓄積されるｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ）、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃３６）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）、ならびに／またはｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１及び／または異性体２）の量を増加させる。
【００１４】
本明細書に開示の組換え宿主細胞の一態様では、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体は、１３−ＳＭＧ、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）、ズルコシドＡ、モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、トリグリコシル化ステビオールグリコシド、テトラグリコシル化ステビオールグリコシド、ペンタグリコシル化ステビオールグリコシド、ヘキサグリコシル化ステビオールグリコシド、ヘプタグリコシル化ステビオールグリコシド、もしくはそれらの異性体、であるか、またはそれらの組成物は、これらを含む。
【００１５】
本明細書に開示の組換え宿主細胞の一態様では、モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸は、表１のＫＡ１．５８を含み、かつ／またはペンタグリコシル化ステビオールは、表１の化合物５．２４を含む。
【００１６】
本明細書に開示の組換え宿主細胞の一態様では、組換え宿主細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞を含む。
【００１７】
本発明は、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を、細胞培養物中で産生する方法も提供し、方法は、遺伝子が発現される条件下で、本明細書に開示の組換え宿主細胞を細胞培養物中で成長させることを含み、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物は、組換え宿主細胞により産生される。
【００１８】
本明細書に開示の方法の一態様では、遺伝子は構成的に発現され、かつ／または遺伝子の発現が誘導される。
【００１９】
本明細書に開示の方法の一態様では、組換え宿主細胞により蓄積される、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）、１３−ＳＭＧ、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃３６）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）、ならびに／またはｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１及び／または異性体２）の量は、１つ以上の組換え遺伝子を欠損している対応する宿主と比較して、少なくとも約５％増加する。
【００２０】
一態様では、本明細書に開示の方法は、それにより産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を、細胞培養物から単離することをさらに含む。
【００２１】
本明細書に開示の方法の一態様では、単離ステップは、
（ａ）１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を含む細胞培養物を提供すること、
（ｂ）産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を含む上清を得るために、細胞培養物の液相を、細胞培養物の固相から分離すること、
（ｃ）充填カラム中の吸着樹脂を提供することを含む、１つ以上の吸着樹脂を提供すること、ならびに
（ｄ）産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物の少なくとも一部を得るために、ステップ（ｂ）の上清を、１つ以上の吸着樹脂と接触させて、それにより、産生された１つ以上のステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド組成物を単離すること、
あるいは
（ａ）１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を含む細胞培養物を提供すること、
（ｂ）産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を含む上清を得るために、細胞培養物の液相を、細胞培養物の固相から分離すること、
（ｃ）１つ以上のイオン交換またはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムを提供すること、ならびに
（ｄ）産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物の少なくとも一部を得るために、ステップ（ｂ）の上清を、１つ以上のイオン交換またはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムと接触させて、それにより、産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を単離すること、
あるいは
（ａ）１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を含む細胞培養物を提供すること、
（ｂ）産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を含む上清を得るために、細胞培養物の液相を、細胞培養物の固相から分離すること、
（ｃ）産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を結晶化または抽出して、それにより、産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を単離すること、
を含む。
【００２２】
一態様では、本明細書に開示の方法は、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を、細胞培養物から回収することをさらに含み、細胞培養物は、ステビア植物由来のステビオールグリコシド組成物と比較して、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはステビオール前駆体のグリコシド、またはそれらの組成物について富化されており、植物由来のステビア抽出物と比較して低減したステビア植物由来構成成分レベルを有する。
【００２３】
本明細書に開示の方法の一態様では、回収された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物は、ステビア植物から回収されたステビオールグリコシド組成物とは異なり、かつ植物由来のステビア抽出物と比較して低減したステビア植物由来構成成分レベルを有する、相対量で存在する。
【００２４】
本発明は、
（ａ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｃ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、ならびに／または
（ｄ）ステビオール前駆体を、Ｃ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子、
を使用する組換え宿主の細胞培地中の植物由来または合成のステビオール、ステビオール前駆体、及び／またはステビオールグリコシドの全細胞生物変換（ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、組換え宿主細胞内で発現される組換えポリペプチドである）、ならびに、それにより、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生することを含む、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生する方法も提供する。
【００２５】
本明細書に開示の方法の一態様では、
（ａ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＮ１６７１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドであり、
（ｂ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドであり、
（ｃ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＣａＵＧＴ３ポリペプチド、ＵＮ３２４９１ポリペプチド、及び／またはＵＮ１６７１ポリペプチドであり、かつ／または
（ｄ）ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドである。
【００２６】
本明細書に開示の方法の一態様では、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチドは、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチドは、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチドは、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチドは、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチドは、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７４Ｄ１ポリペプチドは、配列番号１４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチドは、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチドは、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドは、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＯｌｅＩポリペプチドは、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ５ポリペプチドは、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチドは、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＤＰＧ１ポリペプチドは、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＮ１６７１ポリペプチドは、配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチドは、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチドは、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチドは、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドは、配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチドは、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＣａＵＧＴ３ポリペプチドは、配列番号１６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＮ３２４９１ポリペプチドは、配列番号１９９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、またはＣａＵＧＴ２ポリペプチドは、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００２７】
本明細書に開示の方法の一態様では、組換え宿主細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞である。
【００２８】
本発明は、
（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド、
（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、
（ｄ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドを含むＵＧＴ９１Ｄ２機能的ホモログポリペプチド：もしくは配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド、
（ｅ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチド、及び／または
（ｆ）配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、配列番号１４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｄ１ポリペプチド、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＯｌｅＩポリペプチド、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ５ポリペプチド、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＤＰＧ１ポリペプチド、配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＮ１６７１ポリペプチド、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチド、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、配列番号１６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＣａＵＧＴ３ポリペプチド、配列番号１９９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＮ３２４９１ポリペプチド、もしくは配列番号２０９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＣａＵＧＴ２ポリペプチド、
ならびに植物由来もしくは合成のステビオールグリコシド前駆体、または、植物由来もしくは合成のステビオール前駆体を反応混合物に添加すること(ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、組換えポリペプチドであり)、ならびに、それにより、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生することを含む、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生するインビトロの方法も提供する。
【００２９】
本明細書に開示の方法の一態様では、反応混合物は、
（ａ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジンジホスファート（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、ならびに／または
（ｂ）反応緩衝液及び／または塩、
を含む。
【００３０】
本明細書に開示の方法の一態様では、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体は、１３−ＳＭＧ、１９−ＳＭＧ、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、１，２−ステビオシド、１，３−ステビオシド、ルブソシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＩ、ズルコシドＡ、モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、トリグリコシル化ステビオールグリコシド、テトラグリコシル化ステビオールグリコシド、ペンタグリコシル化ステビオールグリコシド、ヘキサグリコシル化ステビオールグリコシド、ヘプタグリコシル化ステビオールグリコシド、及び／またはそれらの異性体、であるか、またはそれらの組成物は、これらを含む。
【００３１】
本明細書に開示の方法の一態様では、モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸は、表１のＫＡ１．５８を含み、かつ／またはペンタグリコシル化ステビオールは、表１の化合物５．２４を含む。
【００３２】
本発明は、本明細書に開示の組換え宿主細胞を含む細胞培養物も提供し、細胞培養物は、
（ａ）組換え宿主細胞により産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、ならびに
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母ニトロゲンベース（ＹＮＢ）、及び／またはアミノ酸を含む補助栄養素、
をさらに含み、
１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物は、細胞培養物の少なくとも１ｍｇ／リットルの濃度で存在し、
細胞培養物は、ステビア植物由来のステビオールグリコシド組成物と比較して、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはステビオール前駆体のグリコシド、またはそれらの組成物について富化されており、植物由来のステビア抽出物と比較して低減したステビア植物由来構成成分レベルを有する。
【００３３】
本発明は、
（ａ）組換え宿主細胞により産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物、
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、及び／または
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母ニトロゲンベース、ＹＮＢ、及び／またはアミノ酸を含む補助栄養素、
を含む細胞培養物中で成長した本明細書に開示の組換え宿主細胞の細胞溶解物も提供し、
組換え宿主細胞により産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物は、細胞培養物の少なくとも１ｍｇ／リットルの濃度で存在する。
【００３４】
本発明は、
（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド、
（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、
（ｄ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドを含むＵＧＴ９１Ｄ２機能的ホモログポリペプチド：もしくは配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド、
（ｅ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチド、及び／または
（ｆ）配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＯｌｅＩポリペプチド、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ５ポリペプチド、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＤＰＧ１ポリペプチド、配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＮ１６７１ポリペプチド、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチド、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、配列番号１６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＣａＵＧＴ３ポリペプチド、もしくは配列番号１９９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＮ３２４９１ポリペプチド、
を含み、かつ
（ｇ）１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物、
（ｈ）グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジンジホスファート（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、及び／またはＮ−アセチル−グルコサミン、ならびに／または
（ｉ）反応緩衝液及び／または塩、
をさらに含む、反応混合物も提供する。
【００３５】
本発明は、本明細書に開示の組換え宿主細胞により産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体の組成物も提供し、組換え宿主細胞により産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体は、ステビア植物由来のステビオールグリコシド組成物とは異なり、かつ植物由来のステビア抽出物と比較して低減したステビア植物由来構成成分レベルを有する、相対量で存在する。
【００３６】
本発明は、本明細書に開示の方法により産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体の組成物も提供し、組換え宿主細胞により産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体は、ステビア植物由来のステビオールグリコシド組成物とは異なり、かつ植物由来のステビア抽出物と比較して低減したステビア植物由来構成成分レベルを有する、相対量で存在する。
【００３７】
本発明は、本明細書に開示の組換え宿主細胞及び／または方法により産生された１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体を含む甘味料組成物も提供する。
【００３８】
本発明は、本明細書に開示の甘味料組成物を含む食品も提供する。
【００３９】
本発明は、本明細書に開示の甘味料組成物を含む飲料または飲料濃縮物も提供する。
【００４０】
本発明は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする単離核酸分子も提供し、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なコードされたポリペプチドは、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性、または配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有する。
【００４１】
本発明は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする単離核酸分子も提供し、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なコードされたポリペプチドは、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、または配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する。
【００４２】
本発明は、ステビオールグリコシドまたはその触媒活性部分の１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする単離核酸分子も提供し、ステビオールグリコシドまたはその触媒活性部分の１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なコードされたポリペプチドは、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号１９９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、または配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有する。
【００４３】
本発明は、ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする単離核酸分子も提供し、ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なコードされたポリペプチドは、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性、または配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の配列同一性を有する。
【００４４】
本明細書に開示の単離核酸の一態様では、核酸は、ｃＤＮＡである。
【００４５】
本発明のこれら及び他の特徴及び利点は、添付の特許請求の範囲と共に、次の発明を実施するための形態からより完全に理解されるであろう。特許請求の範囲の範囲は、そこに列挙されるものにより規定され、本明細書に記載の特徴及び利点の具体的な検討により規定されないことに注意する。
【００４６】
本発明の実施形態の次の詳細な説明は、次の図面と共に読まれる時、最も良く理解することができ、類似の構造は、類似の参照番号で示される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】好適なウリジン５′−ジホスホ（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素により触媒される代表的な主要なステビオールグリコシドグリコシル化反応及びステビア抽出物に見出される化合物のうちのいくつかの化学構造を示す。
【図２】ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ）、ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）、ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、及びｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドを使用して、ステビオールをゲラニルゲラニルジホスファートから産生する生化学的経路を示す。
【図３】ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）及びステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の構造を示す。
【図４】ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）及びｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）の構造を示す。
【図５】ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）及びｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）の構造を示す。
【図６Ａ】ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｂ】ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｃ】ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｄ】ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに２Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｅ】ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに２Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｆ】ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに２Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｇ】ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｈ】ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｉ】ｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｊ】ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｋ】ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｌ】ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｍ】ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｎ】ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｏ】ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｐ】ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｑ】ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｒ】ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｓ】ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｔ】ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【図６Ｕ】ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルならびに１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【００４８】
図中の要素が、平易かつ明快にするために示されており、必ずしも縮尺通りに描かれていないことを、当業者らは理解するであろう。例えば、図の一部の要素の寸法は、本発明の実施形態（複数可）の理解を高めるのを助けるために、他の要素と比較して誇張されている可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、本明細書により全ての目的のために参照により明示的に組み込まれる。
【００５０】
本発明を詳細に説明する前に、多数の用語が定義されることになる。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「核酸」への言及は、１つ以上の核酸を意味する。
【００５１】
「好ましくは」、「一般に」、及び「通常」のような用語は、特許請求される発明の範囲を限定するために、または特定の特徴が特許請求される発明の構造もしくは機能に決定的、必須、もしくはさらに重要であることを意味するために、本明細書では利用されないことに注意する。むしろ、これらの用語は単に、本発明の特定の実施形態で利用することができるか、または利用することができない代替または追加の特徴を強調することが意図される。
【００５２】
本発明を説明及び記載する目的で、「実質的に」という用語は、本明細書では、定量的な比較、値、測定値、または他の表現に起因する可能性がある不確実性の固有の程度を表すために利用されることに注意する。「実質的に」という用語もまた、本明細書では、問題となっている主題の基本機能に変化をもたらさずに、定量的表現が記載された基準と異なる可能性がある程度を表すために利用される。
【００５３】
当業者らに周知の方法は、本発明による遺伝子発現構築物及び組換え細胞を構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、インビボ組換え技術、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に記載の技術を参照のこと。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、当業者に理解されるように、文脈に応じて、一本鎖または二本鎖のいずれかの実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせを含む核酸を指すために互換的に使用することができる。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「微生物」、「微生物宿主」、及び「微生物宿主細胞」という用語は、互換的に使用することができる。本明細書で使用される場合、「組換え宿主」及び「組換え宿主細胞」という用語は、互換的に使用することができる。「微生物」、「微生物宿主」、及び「微生物宿主細胞」という用語は、組換え遺伝子を含む細胞を記載するために使用される場合、「組換え宿主」または「組換え宿主細胞」を意味すると解釈され得ることを、当業者は理解するであろう。本明細書で使用される場合、「組換え宿主」という用語は、宿主を指すことが意図され、このゲノムは、少なくとも１つのＤＮＡ配列により増強されている。このようなＤＮＡ配列は、天然には存在しない遺伝子、ＲＮＡに正常に転写されないか、またはタンパク質に翻訳され（「発現され」）ないＤＮＡ配列、及び宿主内に導入することが所望される他の遺伝子またはＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されない。通常は、本明細書に記載の組換え宿主のゲノムは、１つ以上の組換え遺伝子の安定した導入により増強されることが理解されるであろう。一般に、導入されたＤＮＡは、ＤＮＡのレシピエントである宿主内に元々存在していないが、ＤＮＡセグメントを所与の宿主から単離すること、及びその後、そのＤＮＡの１つ以上のさらなるコピーを同じ宿主内に導入すること、例えば、遺伝子の産物の産生を増強させるか、または遺伝子の発現パターンを変更することは、本開示の範囲内である。一部の場合では、導入されたＤＮＡは、例えば、相同組換えまたは部位特異的変異導入により、内因性遺伝子またはＤＮＡ配列を改変または置換するであろう。好適な組換え宿主は、微生物を含む。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「組換え遺伝子」という用語は、同じまたは類似の遺伝子またはＤＮＡ配列が、このような宿主内に既に存在し得るかどうかにかかわらず、レシピエント宿主内に導入される遺伝子またはＤＮＡ配列を指す。本文脈における「導入された」または「増強された」は、人の手により導入または増強されることを意味することが当該技術分野で既知である。従って、組換え遺伝子は、別の種に由来するＤＮＡ配列とすることができ、または同じ種に由来するか、もしくは同じ種に存在するが組換え宿主を形成するために組換え法により宿主に組み込まれているＤＮＡ配列とすることができる。宿主に導入される組換え遺伝子は、形質転換される宿主に通常存在するＤＮＡ配列と同一である可能性があり、かつ、ＤＮＡの１つ以上のさらなるコピーを提供し、それにより、そのＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または改変された発現が可能になるように導入されることが理解されるであろう。一部の態様では、該組換え遺伝子は、ｃＤＮＡによりコードされる。他の実施形態では、組換え遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内での発現のために合成及び／またはコドン最適化される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「操作された生合成経路」という用語は、本明細書に記載の通り、組換え宿主内で生じる生合成経路を指す。一部の態様では、生合成経路の１つ以上のステップは、未改変宿主内で自然に生じない。一部の実施形態では、異種バージョンの遺伝子は、内因性バージョンの遺伝子を含む宿主内に導入される。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「内因性」遺伝子という用語は、特定の生体、組織、または細胞に由来し、かつそれら内で産生または合成される遺伝子を指す。一部の実施形態では、内因性遺伝子は、酵母遺伝子である。一部の実施形態では、遺伝子は、限定されないが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２８８Ｃを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対して内因性である。一部の実施形態では、内因性酵母遺伝子が、過剰発現される。本明細書で使用される場合、「過剰発現」という用語は、野生型生体内の遺伝子発現のレベルよりも高いレベルでの生体内の遺伝子の発現を指すために使用される。例えば、Ｐｒｅｌｉｃｈ，２０１２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９０：８４１−５４を参照のこと。一部の実施形態では、内因性酵母遺伝子、例えば、ＡＤＨが欠失する。例えば、Ｇｉａｅｖｅｒ  ＆  Ｎｉｓｌｏｗ，２０１４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９７（２）：４５１−６５を参照のこと。本明細書で使用される場合、「欠失」、「欠失した」、「ノックアウト」、及び「ノックアウトした」という用語は、限定されないが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む生体内で今後発現されないように操作されている内因性遺伝子を指すために互換的に使用することができる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「異種配列」及び「異種コード配列」という用語は、組換え宿主以外の種に由来する配列を記載するために使用される。一部の実施形態では、組換え宿主は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞であり、異種配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の生体に由来する。異種コード配列は、例えば、異種配列を発現する組換え宿主と異なる原核微生物、真核微生物、植物、動物、昆虫、または真菌由来である可能性がある。一部の実施形態では、コード配列は、宿主に固有の配列である。
【００６０】
「選択マーカー」は、宿主細胞栄養要求性を補完するか、抗生物質耐性を提供するか、または色の変化をもたらす任意の数の遺伝子のうちの１つとすることができる。次に、遺伝子置換ベクターの線状化されたＤＮＡフラグメントは、当該技術分野で周知の方法を使用して、細胞に導入される（以下を参照のこと）。線状フラグメントのゲノムへの組み込み及び遺伝子の破壊は、選択マーカーに基づいて決定することができ、例えば、ＰＣＲまたはサザンブロット分析により確認することができる。選択に使用された後、選択マーカーは、例えば、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰシステムにより、宿主細胞のゲノムから除去することができる（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３６：１５３−１７３及びＵ．Ｓ．２００６／００１４２６４を参照のこと）。あるいは、遺伝子置換ベクターは、破壊されるべき遺伝子の部分を含むように構成することができ、部分は、任意の内因性遺伝子のプロモーター配列を欠損しており、何もコードしないか、または遺伝子のコード配列の不活性フラグメントをコードする。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「多様体」及び「変異体」という用語は、特定のタンパク質の野生型配列と比較して、１つ以上のアミノ酸が修飾されているタンパク質配列を記載するために使用される。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「不活性フラグメント」という用語は、遺伝子の全長コード配列から産生されるタンパク質の活性の例えば、約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または０％）を有するタンパク質をコードする遺伝子フラグメントである。遺伝子のこのような一部分は、既知のプロモーター配列が遺伝子配列に作動可能に連結されていないが、終止コドン及び転写終結配列が遺伝子配列の部分に作動可能に連結されるようにベクターに挿入される。このベクターは、その後、遺伝子配列の部分で線状化し、細胞内に形質転換することができる。次に、単一の相同組換えにより、この線状化されたベクターは、不活化された状態の遺伝子の内因性対応物に組み込まれる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ステビオールグリコシド」という用語は、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）（ＣＡＳ＃５８５４３−１６−１）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）（ＣＡＳ＃５８５４３−１７−２）、レバウジオシドＣ（ＲｅｂＣ）（ＣＡＳ＃６３５５０−９９−２）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）（ＣＡＳ＃６３２７９−１３−０）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）（ＣＡＳ＃６３２７９−１４−１）、レバウジオシドＦ（ＲｅｂＦ）（ＣＡＳ＃４３８０４５−８９−７）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）（ＣＡＳ＃１２２０６１６−４４−３）、ルブソシド（ＣＡＳ＃６３８４９−３９−４）、ズルコシドＡ（ＣＡＳ＃６４４３２−０６−０）、レバウジオシドＩ（ＲｅｂＩ）（ＭａｓｓＢａｎｋ  Ｒｅｃｏｒｄ：ＦＵ０００３３２）、レバウジオシドＱ（ＲｅｂＱ）、１，２−ステビオシド（ＣＡＳ＃５７８１７−８９−７）、１，３−ステビオシド（ＲｅｂＧ）、ステビオール１，２−ビオシド（ＭａｓｓＢａｎｋ  Ｒｅｃｏｒｄ：ＦＵ０００２９９）、ステビオール１，３−ビオシド、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（１３−ＳＭＧ），ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、トリグルコシル化ステビオールグリコシド、テトラグリコシル化ステビオールグリコシド、ペンタグルコシル化ステビオールグリコシド、ヘキサグルコシル化ステビオールグリコシド、ヘプタグルコシル化ステビオールグリコシド、及びそれらの異性体を指す。図１を参照のこと。Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ６９ｔｈ  ＪＥＣＦＡ，  ２００７，ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  Ｈａｒｒｉｅｔ  Ｗａｌｌｉｎ，Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．Ｏｒｇ．も参照のこと。本明細書に記載のステビオールグリコシド異性体の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、図６に見出すことができる。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「ステビオールグリコシド前駆体」及び「ステビオールグリコシド前駆体化合物」という用語は、ステビオールグリコシド生合成経路における中間体化合物を指すために使用される。ステビオールグリコシド前駆体は、ゲラニルゲラニルジホスファート（ＧＧＰＰ）、ｅｎｔ−コパリルジホスファート、ｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナル、ｅｎｔ−カウレン酸、及びステビオールを含むが、これらに限定されない。図２を参照のこと。さらに、本明細書で使用される場合、「ステビオール前駆体」及び「ステビオール前駆体化合物」という用語は、ステビオール生合成経路における中間化合物（すなわち、ステビオールが最終的に合成され得る化合物）を指すために使用される。ステビオール前駆体は、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、ｅｎｔ−コパリルジホスファート、ｅｎｔ−カウレン、ｅｎｔ−カウレノール、ｅｎｔ−カウレナル、及びｅｎｔ−カウレン酸を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ステビオール前駆体は、グリコシル化、例えば、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸（ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ）、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、モノグリコシル化ｅｎｔ−カウレン酸、トリグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール、ジグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール（ｅｎｔ−カウレノール＋２Ｇｌｃ）、またはモノグリコシル化ｅｎｔ−カウレノール（ｅｎｔ−カウレノール＋１Ｇｌｃ）とすることができる。ステビオール前駆体がステビオールグリコシド前駆体であり得ることを、当業者は理解するであろう。一部の実施形態では、ステビオールグリコシド前駆体は、それ自体、ステビオールグリコシド化合物である。例えば、１９−ＳＭＧ、ルブソシド、ステビオシド、及びＲｅｂＥは、ＲｅｂＭのステビオールグリコシド前駆体である。図１を参照のこと。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「接触」という用語は、２つの物体間の任意の物理的相互作用を指すために使用される。例えば、「接触」という用語は、酵素及び基質の間の相互作用を指すことがある。別の例では、「接触」という用語は、液体（例えば、上清）及び吸着樹脂の間の相互作用を指すことがある。
【００６６】
ステビオールグリコシド、ステビオールグリコシド前駆体、及び／またはステビオール前駆体のグリコシドは、インビボで（すなわち、組換え宿主内で）、インビトロで（すなわち、酵素的に）、または全細胞生物変換により産生することができる。本明細書で使用される場合、「産生する」及び「蓄積する」という用語は、インビボでの、インビトロでの、または全細胞生物変換による、ステビオールグリコシド、ステビオール前駆体のグリコシド、及びステビオールグリコシド前駆体の合成を記載するために互換的に使用することができる。
【００６７】
組換えステビオールグリコシド産生Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８に記載される。全細胞生物変換により、かつインビトロで、組換え宿主内で、ステビオールグリコシドを産生する方法もまた、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８に記載されている。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「培養液」、「培地」、及び「成長培地」という用語は、細胞の成長をサポートする液体または固体を指すために互換的に使用することができる。培養液は、グルコース、フルクトース、スクロース、微量金属、ビタミン、塩、酵母ニトロゲンベース（ＹＮＢ）、及び／またはアミノ酸を含むことができる。微量金属は、限定されないが、Ｍｎ２＋及び／またはＭｇ２＋を含む二価カチオンとすることができる。一部の実施形態では、Ｍｎ２＋は、ＭｎＣｌ２二水和物の形態をとることができ、約０．０１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの範囲である。一部の実施形態では、Ｍｇ２＋は、ＭｇＳＯ４七水和物の形態をとることができ、約０．０１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの範囲である。例えば、培養液は、ｉ）約０．０２〜０．０３ｇ／ＬのＭｎＣｌ２二水和物及び約０．５〜３．８ｇ／ＬのＭｇＳＯ４七水和物、ｉｉ）約０．０３〜０．０６ｇ／ＬのＭｎＣｌ２二水和物及び約０．５〜３．８ｇ／ＬのＭｇＳＯ４七水和物、ならびに／または、ｉｉｉ）約０．０３〜０．１７ｇ／ＬのＭｎＣｌ２二水和物及び約０．５〜７．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４七水和物、を含むことができる。さらに、培養液は、本明細書に記載の通り、組換え宿主により産生された１つ以上のステビオールグリコシドを含むことができる。
【００６９】
一部の実施形態では、ゲラニルゲラニルピロホスファート（ＧＧＰＰ）をファルネシルジホスファート（ＦＰＰ）及びイソペンテニルジホスファート（ＩＰＰ）から合成することが可能なポリペプチド（例えば、ゲラニルゲラニルジホスファートシンターゼ（ＧＧＰＰＳ））をコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチド（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ））をコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチド（例えば、カウレンシンターゼ（ＫＳ））をコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチド（例えば、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ））をコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチド（例えば、テルペノイド生合成のための補因子として利用される、例えば、限定されないが、ＮＡＤＰＨのＮＡＤＰ＋への変換中のＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０複合体への電子移動が可能なポリペプチドを含む、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）もしくはＰ４５０オキシドレダクターゼ（ＰＯＲ））をコードする遺伝子；）ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチド（例えば、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ））をコードする遺伝子；ならびに／またはｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチド（例えば、ｅｎｔ−コパリルジホスファートシンターゼ（ＣＤＰＳ）−ｅｎｔ−カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド）をコードする遺伝子を含む組換え宿主は、ステビオールをインビボで産生することができる。例えば、図１を参照のこと。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、宿主に対して内因性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００７０】
一部の実施形態では、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド）をコードする遺伝子；ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２またはＥＵＧＴ１１ポリペプチド）をコードする遺伝子を含む組換え宿主は、ステビオールグリコシドをインビボで産生することができる。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、宿主に対して内因性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００７１】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシド、ステビオール前駆体のグリコシド、及び／またはステビオールグリコシド前駆体は、組換え宿主内で、ステビオールグリコシド生合成経路に関与する１つ以上の酵素の発現を介してインビボで産生される。例えば、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換え宿主は、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体をインビボで産生することができる。例えば、図１及び２を参照のこと。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、宿主に対して内因性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００７２】
一部の態様では、一部の態様では、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチドは、配列番号２０（配列番号１９に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号２２（配列番号２１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号２４（配列番号２３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号２６（配列番号２５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号２８（配列番号２７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号３０（配列番号２９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号３２（配列番号３１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号１１６（配列番号１１５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７３】
一部の態様では、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドは、配列番号３４（配列番号３３に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号３６（配列番号３５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号３８（配列番号３７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号４０（配列番号３９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号４２（配列番号４１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドは、葉緑体輸送ペプチドを欠損している。
【００７４】
一部の態様では、ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能なポリペプチドは、配列番号４４（配列番号４３に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号４６（配列番号４５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号４８（配列番号４７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号５０（配列番号４９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号５２（配列番号５１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７５】
一部の実施形態では、組換え宿主は、ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルピロホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。一部の態様では、二機能性ポリペプチドは、配列番号５４（配列番号５３に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号５６（配列番号５５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号５８（配列番号５７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７６】
一部の態様では、ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドは、配列番号６０（配列番号５９に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号６２（配列番号６１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１１７（配列番号６３もしくは配列番号６４に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号６６（配列番号６５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号６８（配列番号６７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号７０（配列番号６９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号７２（配列番号７１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号７４（配列番号７３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号７６（配列番号７５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７７】
一部の態様では、シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドは、配列番号７８（配列番号７７に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号８０（配列番号７９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号８２（配列番号８１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号８４（配列番号８３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号８６（配列番号８５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号８８（配列番号８７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号９０（配列番号８９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号９２（配列番号９１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７８】
一部の態様では、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドは、配列番号９４（配列番号９３に記載のヌクレオチド配列によりコードすることができる）、配列番号９７（配列番号９５もしくは配列番号９６に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１００（配列番号９８もしくは配列番号９９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６（配列番号１０５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１０８（配列番号１０７に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１１０（配列番号１０９に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、配列番号１１２（配列番号１１１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）、または配列番号１１４（配列番号１１３に記載のヌクレオチド配列によりコードされる）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００７９】
一部の実施形態では、組換え宿主は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする核酸、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする核酸、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする核酸、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする核酸を含む。このような特定の実施形態では、組換え宿主は、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ならびに／またはｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む。
【００８０】
一部の実施形態では、組換え宿主は、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド、例えば、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＮ１６７１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を含む。このような特定の実施形態では、組換え宿主は、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む。
【００８１】
一部の実施形態では、組換え宿主は、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド、例えば、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。このような特定の実施形態では、組換え宿主は、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む。
【００８２】
一部の実施形態では、組換え宿主は、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化（つまり、グルコシル位グリコシル化の例）が可能なポリペプチド、例えば、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＣａＵＧＴ３ポリペプチド、ＵＮ３２４９１ポリペプチド、及び／またはＵＮ１６７１ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。このような特定の実施形態では、組換え宿主は、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む。
【００８３】
一部の実施形態では、組換え宿主は、ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド、例えば、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を含む。このような特定の実施形態では、組換え宿主は、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ならびに／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む。
【００８４】
一部の実施形態では、組換え宿主は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド）（配列番号７）をコードする核酸、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド）（配列番号９）をコードする核酸、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド）（配列番号４）をコードする核酸、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、ＥＵＧＴ１１ポリペプチド）（配列番号１６）をコードする核酸を含む。一部の態様では、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチド）は、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド（配列番号１１）またはＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド（配列番号１３）とすることができる。
【００８５】
一部の態様では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、配列番号５または配列番号６に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドは、配列番号８に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドは、配列番号１０、１２、１４、または１５に記載のヌクレオチド配列によりコードされる。これらの遺伝子の少なくとも１つ（及び一部の実施形態では、全て）が組換え宿主に導入された組換え遺伝子である場合に、これらの遺伝子の発現が特定のステビオールグリコシドを産生するために必要であり得るが、これらの遺伝子のうちの１つ以上が宿主に対して内因性である可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００８６】
特定の実施形態では、ステビオール産生組換え微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにステビオールグリコシドポリペプチドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする外来性核酸を含む。
【００８７】
別の特定の実施形態では、ステビオール産生組換え微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド；ならびにステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする外来性核酸を含む。
【００８８】
一部の実施形態では、インビトロでの、組換え宿主内での、または全細胞生物変換による、ｅｎｔ−カウレン酸（ＫＡ）のｅｎｔ−カウレン酸＋１Ｇｌｃ（＃５８）への１９−Ｏ−グリコシル化を触媒することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１（配列番号１２７）、ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号１３３）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号１３５）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号１３７）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号１４１）、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号４）、ＵＧＴ７５Ｂ１（配列番号１４５）、ＵＧＴ７５Ｌ６（配列番号１４７）、ＵＧＴ７６Ｅ１２（配列番号１５３）、ＯｌｅＩ（配列番号１７７）、ＵＧＴ５（配列番号１８１）、ＳＡＧｔａｓｅ（配列番号１８３）、ＵＤＰＧ１（配列番号１８５）、ＵＧＴ７４Ｆ１（配列番号２０３）、ＵＧＴ７５Ｄ１（配列番号２０５）、ＵＧＴ８４Ｂ２（配列番号２０７）、ＣａＵＧＴ２（配列番号２０９）、及びＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチド（配列番号２１１）を含む。例３を参照のこと。
【００８９】
一部の実施形態では、インビトロでの、組換え宿主内での、または全細胞生物変換による、ステビオールの１３−ＳＭＧへの１３−Ｏ−グリコシル化を触媒することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１（配列番号１２７）、ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号１３３）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号１３５）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号１３７）、ＵＧＴ７３Ｃ７（配列番号１３９）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号１４１）、ＵＧＴ７６Ｅ１２（配列番号１５３）、及びＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号７）を含む。例３を参照のこと。
【００９０】
一部の実施形態では、インビトロでの、組換え宿主内での、または全細胞生物変換による、ステビオールの１９−ＳＭＧへの１９−Ｏ−グリコシル化を触媒することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１（配列番号１２７）、ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号１３３）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号１３５）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号１３７）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号１４１）、ＵＧＴ７４Ｄ１（配列番号１４３）、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号４）、ＵＧＴ７５Ｂ１（配列番号１４５）、ＵＧＴ７５Ｌ６（配列番号１４７）、ＯｌｅＩ（配列番号１７７）、ＵＧＴ５（配列番号１８１）、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ（配列番号１８３）、及びＵＤＰＧ１（配列番号１８５）を含む。例３を参照のこと。
【００９１】
一部の実施形態では、インビトロでの、組換え宿主内での、または全細胞生物変換による、１３−ＳＭＧのルブソシドへの１９−Ｏ−グリコシル化を触媒することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１（配列番号１２７）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号１３７）、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号４）、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号７）、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ（配列番号１８３）、ＵＤＰＧ１（配列番号１８５）、ＵＮ１６７１（配列番号２０１）、ＵＧＴ７４Ｆ１（配列番号２０３）、ＵＧＴ７５Ｄ１（配列番号２０５）、ＵＧＴ８４Ｂ２（配列番号２０７）、ＣａＵＧＴ２（配列番号２０９）、及びＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチド（配列番号２１１）を含む。例３を参照のこと。
【００９２】
一部の実施形態では、インビトロでの、組換え宿主内での、または全細胞生物変換による、１３−ＳＭＧのステビオール−１，２−ビオシドへのグリコシル化（つまり、グリコシル位グリコシル化の例）を触媒することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１３）、ＥＵＧＴ１１（配列番号１６）、及びＵＮ３２４９１（配列番号１９９）を含む。
【００９３】
一部の実施形態では、インビトロでの、組換え宿主内での、または全細胞生物変換による、ルブソシドの１，２−ステビオシドへのグリコシル位グリコシル化を触媒することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号１３７）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１３），ＣａＵＧＴ３（配列番号１６９）、及びＥＵＧＴ１１（配列番号１６）を含む。例３を参照のこと。
【００９４】
一部の実施形態では、インビトロでの、組換え宿主内での、または全細胞生物変換による、ルブソシドのステビオール＋３Ｇｌｃ（＃５５）へのグリコシル位グリコシル化を触媒することが可能なポリペプチドは、ＥＵＧＴ１１（配列番号１６）を含む。
【００９５】
一部の実施形態では、インビトロでの、組換え宿主内での、または全細胞生物変換による、ＲｅｂＢのＲｅｂＡへの１９−Ｏ−グリコシル化を触媒することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号４）を含む。例３を参照のこと。
【００９６】
一部の実施形態では、インビトロでの、組換え宿主内での、または全細胞生物変換による、ＲｅｂＡのＲｅｂＤへのグリコシル位グリコシル化を触媒することが可能なポリペプチドは、ＥＵＧＴ１１（配列番号１６）を含む。
【００９７】
一部の実施形態では、インビトロでの、組換え宿主内での、または全細胞生物変換による、ＲｅｂＡのステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）へのグリコシル位グリコシル化を触媒することが可能なポリペプチドは、ＥＵＧＴ１１（配列番号１６）及びＵＮ１６７１（配列番号２０１）を含む。例３を参照のこと。
【００９８】
一部の態様では、インビトロでの、組換え宿主内での、または全細胞生物変換による、ステビオール、ステビオールグリコシド、及びそれらの前駆体の１９−Ｏ−グリコシル化活性を可能にするポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１（配列番号１２７）、ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号１３３）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号１３５）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号１３７）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号１４１）、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号４）、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号７）、ＵＧＴ７５Ｂ１（配列番号１４５）、ＵＧＴ７５Ｌ６（配列番号１４７）、ＵＧＴ７６Ｅ１２（配列番号１５３）、ＯｌｅＩ（配列番号１７７）、ＵＧＴ５（配列番号１８１）、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ（配列番号１８３）、ＵＤＰＧ１（配列番号１８５）、ＵＮ１６７１（配列番号２０１）、ＵＧＴ７４Ｆ１（配列番号２０３）、ＵＧＴ７５Ｄ１（配列番号２０５）、ＵＧＴ８４Ｂ２（配列番号２０７）、及びＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴ（配列番号２１１）を含む。例３を参照のこと。１９−Ｏ−グリコシル化反応の非限定例としては、ｅｎｔ−カウレン酸のｅｎｔ−カウレン酸＋１Ｇｌｃ（＃５８）への変換、１３−ＳＭＧのルブソシドへの変換、及び／またはステビオールの１９−ＳＭＧへの変換が挙げられる（例えば、図１を参照のこと）。
【００９９】
一部の態様では、インビトロでの、組換え宿主内での、または全細胞生物変換による、ステビオール及びステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グリコシル化活性を可能にするポリペプチドには、ＵＧＴ７３Ｃ１（配列番号１２７）、ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号１３３）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号１３５）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号１３７）、ＵＧＴ７３Ｃ７（配列番号１３９）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号１４１）、ＵＧＴ７６Ｅ１２（配列番号１５３）、及びＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号７）を含む。例３を参照のこと。１３−Ｏ−グリコシル化反応の非限定例としては、ステビオールの１３−ＳＭＧへの変換が挙げられる（例えば、図１を参照のこと）。
【０１００】
一部の態様では、インビトロでの、組換え宿主の、または全細胞生体変換による、限定されないが、１３−ＳＭＧのステビオール−１，２−ビオシドへの変換を触媒すること、ルブソシドの１，２−ステビオシドへの変換を触媒すること、及び／またはＲｅｂＡのステビオール＋５Ｇｌｃ（＃２４）への変換を触媒すること（例えば、図１を参照のこと）を含むステビオールグリコシドのグルコース残基に対するグリコシル化活性を可能にするポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号１３７）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１３）、ＣａＵＧＴ３（配列番号１６９）、ＥＵＧＴ１１（配列番号１６）、ＵＮ３２４９１（配列番号１９９）、及びＵＮ１６７１（配列番号２０１）を含む。例３を参照のこと。
【０１０１】
一部の実施形態では、組換え宿主は、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド（配列番号７）をコードする核酸、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド（配列番号９）をコードする核酸、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド（配列番号４）をコードする核酸、ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする核酸、及び／またはＥＵＧＴ１１ポリペプチド（配列番号１６）をコードする核酸を含む。一部の態様では、ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド（配列番号１１）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド（配列番号１３）とすることができる。一部の実施形態では、組換え宿主は、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド（配列番号１２７）をコードする核酸、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド（配列番号１３３）をコードする核酸、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド（配列番号１３５）をコードする核酸、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド（配列番号１３７）をコードする核酸、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド（配列番号１３９）をコードする核酸、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド（配列番号１４１）をコードする核酸、ＵＧＴ７４Ｄ１ポリペプチド（配列番号１４３）をコードする核酸、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド（配列番号１４５）をコードする核酸、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド（配列番号１４７）をコードする核酸、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド（配列番号１５３）をコードする核酸、ＣａＵＧＴ３ポリペプチド（配列番号１６９）をコードする核酸、ＯｌｅＩポリペプチド（配列番号１７７）をコードする核酸、ＵＧＴ５（配列番号１８１）をコードする核酸、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド（配列番号１８３）をコードする核酸、ＵＤＰＧ１ポリペプチド（配列番号１８５）をコードする核酸、ＵＮ３２４９１ポリペプチド（配列番号１９９）をコードする核酸、ＵＮ１６７１ポリペプチド（配列番号２０１）をコードする核酸、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド（配列番号２０３）をコードする核酸、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド（配列番号２０５）をコードする核酸、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド（配列番号２０７）をコードする核酸、ＣａＵＧＴ２ポリペプチド（配列番号２０９）をコードする核酸、またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチド（配列番号２１１）をコードする核酸を含む。
【０１０２】
一部の態様では、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは、配列番号８に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、配列番号３または配列番号２１３に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドは、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチドは、配列番号１２または配列番号２１２に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、配列番号１４または配列番号１５に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチドは、配列番号１２６に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチドは、配列番号１３２に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチドは、配列番号１３４に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチドは、配列番号１３６に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチドは、配列番号１３８に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチドは、配列番号１４０に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７４Ｄ１ポリペプチドは、配列番号１４２に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチドは、配列番号１４４に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチドは、配列番号１４６に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドは、配列番号１５２に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＣａＵＧＴ３ポリペプチドは、配列番号１６８に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＯｌｅＩポリペプチドは、配列番号１７６に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ５ポリペプチドは、配列番号１８０に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチドは、配列番号１８２に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＤＰＧ１ポリペプチドは、配列番号１８４に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＮ３２４９１ポリペプチドは、配列番号１９８に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＮ１６７１ポリペプチドは、配列番号２００に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチドは、配列番号２０２に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチドは、配列番号２０４に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチドは、配列番号２０６に記載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＣａＵＧＴ２ポリペプチドは、配列番号２０８に記\h載のヌクレオチド配列によりコードされ、ＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドは、配列番号２１０に記載のヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１０３】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシド、ステビオール前駆体のグリコシド、及び／またはステビオールグリコシド前駆体は、ステビオールグリコシド前駆体を、ステビオールグリコシド経路に関与する１つ以上の酵素とインビトロで接触させることにより産生される。例えば、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド、ならびにステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドまたはステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子のうちの１つ以上と、ステビオールを接触させると、インビトロでのステビオールグリコシドの産生をもたらすことができる。一部の実施形態では、ステビオールグリコシド前駆体は、上流のステビオールグリコシド前駆体を、ステビオールグリコシド経路に関与する１つ以上の酵素と接触させることによりインビトロで産生される。例えば、ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドと、ｅｎｔ−カウレン酸を接触させると、インビトロでのステビオールの産生がもたらされる可能性がある。
【０１０４】
一部の実施形態では、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物は、インビトロで産生される。一部の実施形態では、方法は、配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドを含むＵＧＴ９１Ｄ２機能的ホモログポリペプチドまたは配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド、配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチド、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＯｌｅＩポリペプチド、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ５ポリペプチド、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＤＰＧ１ポリペプチド、配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＮ１６７１ポリペプチド、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチ���、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、配列番号１６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＣａＵＧＴ３ポリペプチド、及び／または配列番号１９９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含むＵＮ３２４９１ポリペプチド、ならびに植物由来もしくは合成のステビオールグリコシド前駆体、または、植物由来もしくは合成のステビオールを、反応混合物に添加すること（ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、組換えポリペプチドである）、ならびに、それにより、１つ以上のステビオールグリコシド及び／もしくはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生すること、を含む。
【０１０５】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、全細胞生物変換により産生される。全細胞生物変換が起こるためには、ステビオールグリコシド経路に関与する１つ以上の酵素を発現する宿主細胞は、細胞内でステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体を取り込んで修飾し；インビボでの修飾後に、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体は、細胞内に残り、及び／または細胞培地に排出される。例えば、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子を発現する宿主細胞は、細胞内にステビオールを取り込み、ステビオールをグリコシル化することができ；インビボでグリコシル化した後に、ステビオールグリコシドを培地に排出させることができる。特定のこのような実施形態では、宿主細胞は、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び／またはｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに発現することがある。
【０１０６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生するための方法は、（ａ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド；（ｂ）ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド；（ｃ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２’のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化（つまり、グリコシル位グリコシル化の例）の、ステビオールグリコシドでの活性を可能にするポリペプチド；及び／または（ｄ）ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド；を使用する組換え宿主細胞の細胞培地中の植物由来もしくは合成のステビオールグリコシド前駆体または植物由来もしくは合成のステビオール前駆体の全細胞生物変換（ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、組換え宿主細胞内で発現される組換えポリペプチドである）、ならびに、それにより、１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生すること、を含む。
【０１０７】
本明細書に記載の組換え宿主細胞の細胞培地中の植物由来もしくは合成のステビオールグリコシド前駆体または植物由来もしくは合成のステビオール前駆体の全細胞生物変換により、本明細書に開示の１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生するための方法の一部の実施形態では、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＮ１６７１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドを含み；ステビオールもしくはステビオールグリコシドを、Ｃ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドを含み；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２’のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化（つまり、グリコシル位グリコシル化の例）の、ステビオールグリコシドの活性を可能にするポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＣａＵＧＴ３ポリペプチド、ＵＮ３２４９１ポリペプチド、及び／またはＵＮ１６７１ポリペプチドを含み；及び／またはステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドを含む。
【０１０８】
本明細書に記載の組換え宿主細胞の細胞培地中の植物由来もしくは合成のステビオールグリコシド前駆体または植物由来もしくは合成のステビオール前駆体の全細胞生物変換により、本明細書に開示の１つ以上のステビオールグリコシド及び／またはグリコシル化ステビオール前駆体、またはそれらの組成物を産生するための方法の一部の実施形態では、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチドは、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチドは、配列番号１３３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチドは、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチドは、配列番号１３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチドは、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチドは、配列番号１４５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチドは、配列番号１４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドは、配列番号１５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＯｌｅＩポリペプチドは、配列番号１７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ５ポリペプチドは、配列番号１８１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチドは、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＤＰＧ１ポリペプチドは、配列番号１８５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＮ１６７１ポリペプチドは、配列番号２０１に記載のアミノ酸配列と少なくとも４５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチドは、配列番号２０３に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチドは、配列番号２０５に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチドは、配列番号２０７に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドは、配列番号２１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチドは、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するポリペプチドを含み、ＣａＵＧＴ３ポリペプチドは、配列番号１６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含み、またはＵＮ３２４９１ポリペプチドは、配列番号１９９に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１０９】
一部の実施形態では、ポリペプチド、例えば、ＵＧＴポリペプチドは、アンカーモチーフと融合させることにより、本明細書に開示の組換え宿主細胞の表面上に提示することができる。
【０１１０】
一部の実施形態では、細胞は、修飾されるべき基質を取り込むために、または修飾された産物を排出するために透過処理される。一部の実施形態では、透過処理剤は、原材料が宿主に入ること及び産物が出ることを助けるために添加することができる。一部の実施形態では、細胞は、トルエンなどの溶媒、またはＴｒｉｔｏｎ−ＸもしくはＴｗｅｅｎなどの界面活性剤を用いて透過処理される。一部の実施形態では、細胞は、界面活性剤、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）などのカチオン性界面活性剤、を用いて透過処理される。一部の実施形態では、細胞は、エレクトロポレーションまたは低浸透圧ショックなどの周期的な機械的衝撃を用いて透過処理される。例えば、培養された微生物の粗溶解物は、上清を得るために遠心分離することができる。次に、得られる上清は、クロマトグラフィーカラム、例えば、Ｃ−１８カラムに加え、親水性化合物を除去するために水で洗浄し、続いて、目的の化合物（複数可）を、メタノールなどの溶媒で溶出させることができる。次に、化合物（複数可）は、分取ＨＰＬＣによりさらに精製することができる。ＷＯ２００９／１４０３９４も参照のこと。
【０１１１】
一部の実施形態では、ステビオール、１つ以上のステビオールグリコシド前駆体、及び／または１つ以上のステビオールグリコシドは、２つ以上の宿主の共培養により産生される。一部の実施形態では、ステビオールグリコシド経路に関与する１つ以上の酵素をそれぞれ発現する１つ以上の宿主は、ステビオール、１つ以上のステビオールグリコシド前駆体、及び／または１つ以上のステビオールグリコシドを産生する。例えば、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び／またはｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成し、かつｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能な二機能性ポリペプチドをコードする遺伝子、を発現する宿主、ならびにステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子、を発現する宿主は、１つ以上のステビオールグリコシドを産生する。
【０１１２】
一部の実施形態では、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド、例えば、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＮ１６７１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチド、をコードする遺伝子を含む組換え宿主は、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；及び／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子をさらに含む。このような特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号６０または配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号７８、配列番号８６、または配列番号９２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；及び／またはステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号９４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子をさらに含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド、例えば、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換え宿主は、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；及び／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子をさらに含む。このような特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号６０または配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号７８、配列番号８６、または配列番号９２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；及び／またはステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号９４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子をさらに含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２’のβ１，２グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３グリコシル化（つまり、グリコシル位グリコシル化の例である）が可能なポリペプチド、例えば、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＣａＵＧＴ３ポリペプチド、ＵＮ３２４９１ポリペプチド、及び／またはＵＮ１６７１ポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換え宿主は、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；及び／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子をさらに含む。このような特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号６０もしくは配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号７８、配列番号８６、もしくは配列番号９２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；及び／またはステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号９４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子をさらに含む。
【０１１５】
一部の実施形態では、ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド、例えば、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、及び／またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換え宿主は、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；及び／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子をさらに含む。このような特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号６０もしくは配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号７８、配列番号８６、もしくは配列番号９２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；及び／またはステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号９４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子をさらに含む。
【０１１６】
一部の実施形態では、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド、例えば、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ（例えば、配列番号１８３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、をコードする遺伝子を含む組換え宿主は、ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ３′のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ステビオールもしくはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位でグリコシル化することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；及び／またはステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、もしくは１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド（例えば、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子をさらに含む。このような特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、ＧＧＰＰをＦＰＰ及びＩＰＰから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−コパリルジホスファートをＧＧＰＰから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレンをｅｎｔ−コパリルジホスファートから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；ｅｎｔ−カウレン酸、ｅｎｔ−カウレノール、及び／またはｅｎｔ−カウレナルをｅｎｔ−カウレンから合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号６０もしくは配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号７８、配列番号８６、もしくは配列番号９２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子；及び／またはステビオールをｅｎｔ−カウレン酸から合成することが可能なポリペプチド（例えば、配列番号９４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする遺伝子をさらに含む。
【０１１７】
一部の態様では、ＧＧＰＰＳポリペプチド（例えば、配列番号１９、配列番号２０）をコードする組換え遺伝子、短縮型ＣＤＰＳポリペプチド（例えば、配列番号３９、配列番号４０）をコードする組換え遺伝子、ＫＳポリペプチド（例えば、配列番号５１、配列番号５２）をコードする組換え遺伝子、ＫＯポリペプチド（例えば、配列番号５９、配列番号６０）をコードする組換え遺伝子、ＡＴＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号９１、配列番号９２）をコードする組換え遺伝子、ＥＵＧＴ１１ポリペプチド（例えば、配列番号１４／配列番号１５、配列番号１６）をコードする組換え遺伝子、ＫＡＨポリペプチド（例えば、配列番号９３、配列番号９４）をコードする組換え遺伝子、ＣＰＲ８ポリペプチド（例えば、配列番号８５、配列番号８６）をコードする組換え遺伝子、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド（例えば、配列番号５／配列番号６／配列番号１４９、配列番号７）または配列番号７のＵＧＴ８５Ｃ２多様体（もしくは機能的ホモログ）をコードする組換え遺伝子、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド（例えば、配列番号３、配列番号４）または配列番号４のＵＧＴ７４Ｇ１多様体（もしくは機能的ホモログ）をコードする組換え遺伝子、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド（例えば、配列番号８、配列番号９）または配列番号９のＵＧＴ７６Ｇ１多様体（もしくは機能的ホモログ）をコードする組換え遺伝子、ならびにＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド（例えば、配列番号１０、配列番号１１）及び／または配列番号１１のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ多様体（もしくは機能的ホモログ）、例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１２、配列番号１３）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子、のうちの１つ以上のコピーを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内でのＳＡ  Ｇｔａｓｅ（配列番号１８２、配列番号１８３）の発現は、ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）、１３−ＳＭＧ、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃３６）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）、及び／またはｅｎｔ−カウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１及び／もしくは異性化２）の増加をもたらす。例４を参照のこと。
【０１１８】
一部の実施形態では、インビボで、インビトロで、または全細胞生物変換により産生されるステビオール前駆体のステビオールグリコシド及び／またはグリコシド、またはそれらの組成物は、とりわけ、ステビア植物由来のステビア抽出物よりも少量の汚染物質または少量の任意の特定の汚染物質を含む。汚染物質は、異臭の原因となる植物由来の化合物を含むことができる。潜在的な汚染物質は、顔料、脂質、タンパク質、フェノール類、糖類、スパツレノール、及び他のセスキテルペン、ラブダンジテルペン、モノテルペン、デカン酸、８，１１，１４−エイコサトリエン酸、２−メチルオクタデカン、ペンタコサン、オクタコサン、テトラコサン、オクタデカノール、スチグマステロール、β−シトステロール、α−アミリン、β−アミリン、ルペオール、β−アミリンアセタート、五環性トリテルペン、センタレジン、ケルシチン、ｅｐｉ−αカジノール、カロフィレン（ｃａｒｏｐｈｙｌｌｅｎｅｓ）及び誘導体、β−ピネン、β−シトステロール、ならびにジベレリンを含む。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「検出可能な量」、「検出可能な濃度」、「測定可能な量」、及び「測定可能な濃度」という用語は、ＡＵＣ、μＭ／ＯＤ６００、ｍｇ／Ｌ、μＭ、またはｍＭで測定されたステビオールグリコシドのレベルを指す。ステビオールグリコシド産生（すなわち、全ての、上清の、及び／または細胞内のステビオールグリコシドレベル）は、例えば、限定されないが、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、紫外可視分光法／分光測光法（ＵＶ−Ｖｉｓ）、質量分析法（ＭＳ）、及びＮＭＲを含む、当業者に一般に利用可能な技術により検出及び／または分析することができる。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「検出不能な濃度」という用語は、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＵＶ−Ｖｉｓ、ＭＳ、またはＮＭＲなどの技術により測定及び／または分析するには低すぎる化合物のレベルを指す。一部の実施形態では、「検出不能な濃度」の化合物は、ステビオールグリコシドまたはステビオールグリコシド前駆体組成物中に存在しない。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「または」及び「及び／または」という用語は、複数の構成要素を、組み合わせてまたは互いに排他的に記載するために利用される。例えば、「ｘ、ｙ、及び／またはｚ」は、「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、及びｚ」、「（ｘ及びｙ）またはｚ」、「ｘまたは（ｙ及びｚ）」、または「ｘまたはｙまたはｚ」を指すことができる。一部の実施形態では、「及び／または」は、組換え細胞が含む外因性核酸を指すために使用され、組換え細胞は、グループから選択される１つ以上の外因性核酸を含む。一部の実施形態では、「及び／または」は、ステビオールグリコシド及び／またはステビオールグリコシド前駆体の産生を指すために使用される。一部の実施形態では、「及び／または」は、１つ以上のステビオールグリコシドが産生される、ステビオールグリコシドの産生を指すために使用される。一部の実施形態では、「及び／または」は、１つ以上のステビオールグリコシドが次のステップ：組換え微生物を培養すること、組換え微生物内で１つ以上のステビオールグリコシドを合成すること、及び／または１つ以上のステビオールグリコシドを単離すること、のうちの１つ以上により産生される、ステビオールグリコシドの産生を指すために使用される。
【０１２２】
機能的ホモログ
上記ポリペプチドの機能的ホモログは、組換え宿主内でのステビオールグリコシドの産生における使用にも適する。機能的ホモログは、参照ポリペプチドと配列類似性を有し、かつ参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能（複数可）のうちの１つ以上を行うポリペプチドである。機能的ホモログ及び参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドとすることができ、配列類似性は、収斂または分岐進化事象に起因する可能性がある。そのようなものであるから、機能的ホモログは、ホモログ、またはオーソログ、またはパラログとして文献に示される場合がある。天然に存在する機能的ホモログの多様体、例えば、野生型コード配列の変異体によりコードされるポリペプチドは、それ自体、機能的ホモログとすることができる。機能的ホモログは、ポリペプチドのコード配列の部位特異的変異導入により、または異なる天然に存在するポリペプチドのコード配列由来のドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピング」）により作製することもできる。本明細書に記載の機能的ポリペプチドをコードする遺伝子を改変するための技術は、既知であり、とりわけ、指向性進化技術、部位特異的変異導入技術、及びランダム変異導入技術を含み、ポリペプチドの比活性を増加させるのに有用であり、基質特異性を変更し、発現レベルを変更し、細胞内の場所を変更し、または所望の仕方でポリペプチド−ポリペプチド相互作用を改変することができる。このような修飾されたポリペプチドは、機能的ホモログと考えられる。「機能的ホモログ」という用語は、機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される場合がある。
【０１２３】
機能的ホモログは、ヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントの分析により同定することができる。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースに対するクエリーを実行することにより、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドのホモログを同定することができる。配列分析は、参照配列としてＵＧＴアミノ酸配列を使用する非重複データベースのＢＬＡＳＴ、相互ＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ分析を含むことができる。一部の場合では、アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から推定される。４０％を超える配列同一性を有するデータベース中のポリペプチドは、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドとしての適合性についてさらに評価するための候補である。アミノ酸配列類似性は、１つの疎水性残基の別の疎水性残基への置換または１つの極性残基の別の疎水性残基への置換などの保存的アミノ酸置換を可能にする。必要に応じて、このような候補の手動検査は、さらに評価されるべき候補の数を減らすために実行することができる。手動検査は、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドに存在するドメイン、例えば、保存された機能的ドメイン、を有すると思われる候補を選択することにより実施することができる。一部の実施形態では、核酸及びポリペプチドは、ＢＬＡＳＴ分析を使用することによるというより、発現レベルに基づいてトランスクリプトームデータから同定される。
【０１２４】
保存領域は、反復配列であるか、一部の二次構造（例えば、ヘリックス及びβシート）を形成するか、正もしくは負に荷電したドメインを確立するか、またはタンパク質モチーフもしくはドメインを表すステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの１次アミノ酸配列内に領域を配置させることにより同定することができる。例えば、ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／及びｐｆａｍ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／のワールドワイドウェブ上の様々のタンパク質モチーフ及びドメインに対するコンセンサス配列について記載するＰｆａｍウェブサイトを参照のこと。Ｐｆａｍデータベースに含まれる情報は、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：３２０−３２２（１９９８）；Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２８：４０５−４２０（１９９７）；及びＢａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：２６０−２６２（１９９９）に記載される。保存領域は、密接に関連する種からの同じまたは関連するポリペプチドの配列をアラインすることにより決定することもできる。密接に関連する種は、好ましくは、同じファミリーのものである。一部の実施形態では、２つの異なる種に由来する配列のアラインメントは、このようなホモログを同定するのに適切である。
【０１２５】
通常、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドは、保存領域を同定するために有用である。関連するポリペプチドの保存領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。一部の実施形態では、保存領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。
【０１２６】
例えば、組換え宿主内でステビオールを産生するのに適するポリペプチドは、ＵＧＴの機能的ホモログを含む。
【０１２７】
例えば、ＵＧＴの基質特異性を改変する方法は、当業者らに既知であり、部位特異的／合理的変異導入アプローチ、ランダム指向性進化アプローチ、及びランダム変異導入／飽和技術が酵素の活性部位付近で実施される組み合わせを含むが、これらに限定されない。例えば、Ｏｓｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７０：３２５−３４７を参照のこと。
【０１２８】
候補配列は通常は、参照配列の長さの８０％〜２００％、例えば、参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００％、である長さを有する。機能的ホモログポリペプチドは通常、参照配列の長さの９５％〜１０５％、例えば、参照配列の長さの９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、もしくは１２０％、または間の任意の範囲、である長さを有する。参照核酸またはポリペプチドに対する任意の候補核酸またはポリペプチドの％同一性は、次の通り決定することができる。参照配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列またはアミノ酸配列）は、コンピュータープログラムＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（バージョン１．２．１、デフォルトパラメーター）を使用して、１つ以上の候補配列にアラインされ、これにより、核酸またはポリペプチド配列のアラインメントをそれらの全長にわたって実施することが可能になる（グローバルアラインメント）。Ｃｈｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）：３４９７−５００。
【０１２９】
ＣｌｕｓｔａｌＷは、参照及び１つ以上の候補配列間の最良の一致を計算し、同一性、類似性、及び相違性を決定することができるようにそれらをアラインする。１つ以上の残基のギャップは、配列アラインメントを最大化するために、参照配列、候補配列、またはその双方に挿入することができる。核酸配列の迅速なペアワイズアラインメントのために、次のデフォルトパラメーター：ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；採点方法：％年齢；上対角線の数：４；及びギャップペナルティー：５が使用される。核酸配列の複数のアラインメントのために、次のパラメーター：ギャップ開始ペナルティー：１０．０；ギャップ伸長ペナルティー：５．０；及び重み移動：有り、が使用される。タンパク質配列の迅速なペアワイズアラインメントでは、次のパラメーター：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；得点方法：％年齢；上対角線の数：５；ギャップペナルティー：３が使用される。タンパク質配列のマルチプルアラインメントでは、次のパラメーター：質量マトリクス：ｂｌｏｓｕｍ；ギャップ開始ペナルティー：１０．０；ギャップ伸長ペナルティー：０．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；残基特異的なギャップペナルティー：オンが使用される。ＣｌｕｓｔａｌＷ出力は、配列間の関係を反映する配列アラインメントである。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ワールドワイドウェブ上のＢａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｌａｕｎｃｈｅｒサイト（ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ）及びＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅサイト（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）で実行することができる。
【０１３０】
候補核酸またはアミノ酸配列の参照配列との％同一性を決定するために、配列は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａを使用してアラインされ、アラインメントにおける完全一致の数を参照配列の長さで除し、結果に１００を掛ける。％同一性値は、少数第２位で四捨五入することができることに注意する。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、及び７８．１４は、７８．１に切り下げられる一方、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、及び７８．１９は、７８．２に切り上げられる。
【０１３１】
機能的ＵＧＴタンパク質は、酵素により行われる酵素活性に関与しない追加のアミノ酸を含むことができることが理解されるであろう。一部の実施形態では、ＵＧＴタンパク質は、融合タンパク質である。「キメラ」、「融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」、「融合酵素」、「融合構築物」、「キメラタンパク質」、「キメラポリペプチド」、「キメラ構築物」、及び「キメラ酵素」という用語は、本明細書では、異なるタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子の連結により操作されるタンパク質を指すために互換的に使用することができる。一部の実施形態では、ＵＧＴポリペプチドをコードする核酸配列は、その後の操作（例えば、精製または検出を容易にするように）コードされたポリペプチドの分泌、または局在化を容易にするように、設計された「タグ」をコードするタグ配列を含むことができる。タグ配列は、コードされたタグがポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかに位置するように、ポリペプチドをコードする核酸配列に挿入することができる。コードされたタグの非限定例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジンタグ（ＨＩＳタグ）、及びＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）が挙げられる。タグの他の例としては、葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、または分泌タグが挙げられる。
【０１３２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ドメインスワッピングにより変更されたタンパク質である。本明細書で使用される場合、「ドメインスワッピング」という用語は、第１のタンパク質のドメインを第２のタンパク質のドメインと置換するプロセスについて記載するために使用される。一部の実施形態では、第１のタンパク質のドメイン及び第２のタンパク質のドメインは、機能的に同一または機能的に類似している。一部の実施形態では、第２のタンパク質のドメインの構造及び／または配列は、第１のタンパク質のドメインの構造及び／または配列とは異なる。一部の実施形態では、ＵＧＴポリペプチドは、ドメインスワッピングにより変更される。
【０１３３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、後に他の場所で開かれることになるタンパク質の末端の共有結合に存在する円順列により変更されたタンパク質である。従って、配列の順序は、タンパク質のアミノ酸の変化を引き起こすことなく変更される。一部の実施形態では、標的化円順列は、例えば、限定されないが、元のタンパク質の末端を連結するスペーサーを設計することにより、生成させることができる。スペーサーが規定されていると、一般に受け入れられている分子生物学技術により、例えば、限定されないが、ＰＣＲを用いてコンカテマーを産生することにより、かつ続くコンカテマー内での具体的な順列の増幅により、または異なる順序で連結するように交換するタンパク質の別個のフラグメントを増幅することにより、順列を生成するいくつかの可能性がある。順列を生成するステップに、フラグメント末端を結合させ、かつランダムに切断することにより環状遺伝子を作製し、それにより、順列の集合を独特の構築物から形成することが続く可能性がある。
【０１３４】
ステビオール及びステビオールグリコシド生合成核酸
本明細書に記載のポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、ポリペプチドを発現するのに適する１つ以上の制御領域にセンス方向で作動可能に連結されたそのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物が複数の遺伝子産物をポリシストロン性ｍＲＮＡから発現することが可能であるので、必要に応じて、それらの微生物に対する単一の制御領域のコントロール下で、複数のポリペプチドを発現させることができる。制御領域が配列の転写または翻訳を制御するのに有効であるように、制御領域及びコード配列が配置される時、コード配列及び制御領域は、作動可能に連結されていると考えられる。通常、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、モノシストロン性遺伝子の制御領域の１〜約５０ヌクレオチド下流に位置する。
【０１３５】
多くの場合、本明細書に記載のポリペプチドのコード配列は、組換え宿主以外の種内で確認され、すなわち、異種核酸である。従って、組換え宿主が微生物である場合、コード配列は、他の原核もしくは真核微生物由来、植物由来、または動物由来とすることができる。しかし、一部の場合では、コード配列は、宿主に固有であり、かつその生体に再導入されている配列である。
【０１３６】
天然配列は多くの場合、外因性核酸と連結される非天然配列、例えば、組換え核酸構築物内の天然配列にフランキングする非天然制御配列の存在により、天然に存在する配列と区別することができる。加えて、安定して形質転換された外因性核酸は通常、天然配列が見出される位置以外の位置に組み込まれる。「制御領域」は、転写または翻訳産物の転写または翻訳開始及び速度、ならびに安定性及び／または移動度に影響を与えるヌクレオチド配列を有する核酸を指す。制御領域は、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５′及び３′非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。制御領域は通常、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。制御領域は、エンハンサー配列、上流エレメント、または上流活性化領域（ＵＡＲ）などの少なくとも１つの制御エレメントも含み得る。制御領域は、制御領域が配列の転写または翻訳を制御するのに有効であるように制御領域及びコード配列を配置することにより、コード配列に作動可能に連結される。例えば、コード配列及びプロモーター配列を作動可能に連結するために、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は通常、プロモーターの１〜約５０ヌクレオチド上流に位置する。しかし、制御領域は、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドもの上流に、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流に位置することができる。
【０１３７】
含まれるべき制御領域の選択は、限定されないが、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、及び特定の培養期中の優先的発現を含むいくつかの因子に依存する。コード配列に対する制御領域を適切に選択及び配置することにより、コード配列の発現を調節することは、当業者には日常的な事項である。複数の制御領域、例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写ターミネーター、及び誘導性エレメントが、存在し得ることが理解されるであろう。
【０１３８】
１つ以上の遺伝子は、別個の態様のステビオール及び／またはステビオールグリコシド産生に有用な「モジュール」の組換え核酸構築物内で組み合わせることができる。モジュール、特に、ポリシストロン性モジュール内で複数の遺伝子を組み合わせると、様々の種においてモジュールの使用が促進される。例えば、ステビオール生合成遺伝子クラスターまたはＵＧＴ遺伝子クラスターは、好適な制御領域の挿入後に、モジュールが多種多様な種に導入することができるように、ポリシストロン性モジュール内で組み合わせることができる。別の例として、ＵＧＴ遺伝子クラスターは、ＵＧＴモジュールを形成するために、各ＵＧＴコード配列が別々の制御領域に作動可能に連結されるように組み合わせることができる。このようなモジュールは、モノシストロン性発現が必要または望ましいそれらの種に使用することができる。ステビオールまたはステビオールグリコシド産生に有用な遺伝子に加えて、組換え構築物は通常、複製起点、及び適切な種において構築物を維持するための１つ以上の選択マーカーも含有する。
【０１３９】
遺伝コードの縮重のために、多くの核酸が特定のポリペプチドをコードすることができること；すなわち、多くのアミノ酸の場合、アミノ酸のコドンとして機能する複数のヌクレオチドトリプレットが存在することが理解されるであろう。従って、所与のポリペプチドのコード配列中のコドンは、その宿主（例えば、微生物）のための適切なコドンバイアス表を使用して、特定の宿主内での最適な発現が得られるように改変することができる。単離核酸として、これらの改変配列は、精製された分子として存在することができ、組換え核酸構築物のためのモジュールの構築に使用されるベクターまたはウイルスに組み込むことができる。
【０１４０】
一部の場合では、代謝中間体をステビオールまたはステビオールグリコシド生合成に転用するために、内因性ポリペプチドの１つ以上の機能を阻害することが望ましい。例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシド産生をさらに増加させるために、例えば、スクワレンエポキシダーゼを下方制御することにより、酵母株のステロールの合成を下方制御することが望ましいことがある。別の例として、特定の内因性遺伝子産物、例えば、本明細書で検討されるような二次代謝産物またはホスファターゼからグルコース部分を除去するグリコヒドロラーゼ、の分解機能を阻害することが望ましいことがある。このような場合では、ポリペプチドまたは遺伝子産物を過剰発現する核酸は、株に形質転換される組換え構築物に含まれ得る。あるいは、変異導入は、機能を増加させるかまたは増強することが望ましい遺伝子に変異体を生じさせるために使用することができる。
【０１４１】
本開示の一態様は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする単離核酸分子である。核酸は、ｃＤＮＡである。一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なコードされたポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅポリペプチド、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＮ１６７１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なコードされたポリペプチドは、配列番号１２７、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１７７、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０７、または配列番号２１１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１４２】
本開示の別の態様は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする単離核酸分子である。一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なコードされたポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ７ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、またはＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１３ヒドロキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なコードされたポリペプチドは、配列番号１２７、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、または配列番号１５３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１４３】
本開示の別の態様は、ステビオールグリコシドまたはその触媒活性部分の１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２−グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３−グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする単離核酸分子である。核酸は、ｃＤＮＡである。一部の実施形態では、ステビオールグリコシドまたはその触媒活性部分の１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２−グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３−グリコシル化が可能なコードされたポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＣａＵＧＴ３ポリペプチド、ＵＮ３２４９１ポリペプチド、またはＵＮ１６７１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ステビオールグリコシドまたはその触媒活性部分の１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコース及び１９−Ｏ−グルコースの双方のＣ２′のβ１，２−グリコシル化及び／またはＣ３′のβ１，３−グリコシル化が可能なコードされたポリペプチドは、配列番号１３７、配列番号１６９、配列番号１９９、または配列番号２０１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１４４】
本開示の別の態様は、ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする単離核酸分子である。核酸は、ｃＤＮＡである。一部の実施形態では、ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なコードされたポリペプチドは、ＵＧＴ７３Ｃ１ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ３ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ５ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｃ６ポリペプチド、ＵＧＴ７３Ｅ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｂ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｌ６ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｅ１２ポリペプチド、ＯｌｅＩポリペプチド、ＵＧＴ５ポリペプチド、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ、ＵＤＰＧ１ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｆ１ポリペプチド、ＵＧＴ７５Ｄ１ポリペプチド、ＵＧＴ８４Ｂ２ポリペプチド、またはＵＧＴ７４Ｆ２様ＵＧＴポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ステビオール前駆体をＣ−１９カルボキシル位もしくはＣ−１９ヒドロキシル位またはその触媒活性部分でグリコシル化することが可能なコードされたポリペプチドは、配列番号１２７、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１５３、配列番号１７７、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、または配列番号２１１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１４５】
宿主微生物
組換え宿主は、哺乳類、昆虫、植物、及び藻類細胞を含むステビオールグリコシドを産生するためのポリペプチドを発現するために使用することができる。多数の原核生物及び真核生物もまた、本明細書に記載の組換え微生物、例えば、グラム陰性菌、酵母、及び真菌の構築における使用に適する。ステビオールグリコシド産生株として使用するために選択された種及び株は、どの産生遺伝子が株に対して内因性であるか、かつどの遺伝子が存在しないかを決定するために最初に分析される。内因性対応物が株に存在しない遺伝子は、１つ以上の組換え構築物に有利に組み立てられ、次に、これは、欠損機能（複数可）を補うために株に形質転換される。
【０１４６】
通常、組換え微生物は、ある温度（複数可）で一定期間、発酵槽中で成長し、温度及び期間は、ステビオールグリコシドの産生を促進する。本発明により提供される構築及び遺伝子操作された微生物は、とりわけ、ケモスタット、バッチ、流加培養、取り出し及び充填などの半連続発酵、連続灌流発酵、ならびに連続灌流細胞培養を含む従来の発酵プロセスを使用して培養することができる。方法で使用される特定の微生物に応じて、イソペンテニル生合成遺伝子ならびにテルペンシンターゼ及びシクラーゼ遺伝子などの他の組換え遺伝子も存在及び発現し得る。基質及び中間体、例えば、イソペンテニルジホスファート、ジメチルアリルジホスファート、ＧＧＰＰ、ｅｎｔ−カウレン、及びｅｎｔ−カウレン酸、のレベルは、公表された方法に従って分析のために試料を培地から抽出することにより決定することができる。
【０１４７】
本方法で使用される炭素源は、ステビオールグリコシドの成長及び／または産生を促進するために組換え宿主細胞により代謝される可能性がある任意の分子を含む。好適な炭素源の例としては、スクロース（例えば、糖蜜に見出されるような）、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、グルコース、セルロース、デンプン、セロビオース、または他のグルコース含有ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。酵母を宿主として用いる実施形態では、例えば、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、及びグルコースなどの炭素源が適する。炭素源は、培養期間にわたって宿主生体に提供することができ、または代わりに、生体は、別のエネルギー源、例えば、タンパク質、の存在下で一定期間成長させ、次に、流加段階中のみに、炭素源と共に提供することができる。
【０１４８】
温度及び期間がステビオールグリコシドの産生を促進する一定期間の培養中に、組換え微生物が成長した後、ステビオール及び／または１つ以上のステビオールグリコシドは、当該技術分野で既知の種々の技術を使用して培養物から回収することができる。一部の実施形態では、透過処理剤は、原材料が宿主に入ること及び産物が出ることを助けるために添加することができる。例えば、培養された微生物の粗溶解物は、上清を得るために遠心分離することができる。次に、得られる上清は、クロマトグラフィーカラム、例えば、Ｃ−１８カラムに添加し、親水性化合物を除去するために水で洗浄し、続いて、目的の化合物（複数可）を、メタノールなどの溶媒で溶出させることができる。次に、化合物（複数可）は、分取ＨＰＬＣによりさらに精製することができる。ＷＯ２００９／１４０３９４も参照のこと。
【０１４９】
本明細書で検討される種々の遺伝子及びモジュールは、単一の宿主ではなく２つ以上の組換え宿主に存在することができることが理解されるであろう。複数の組換え宿主が使用される時、それらは、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドを蓄積するために、混合培養物中に成長させることができる。
【０１５０】
あるいは、２つ以上の宿主はそれぞれ、別々の培地で成長させることができ、第１の培地の産物、例えば、ステビオールは、その後の中間体に、または、例えば、ＲｅｂＡなどの最終産物に変換するために、第２の培地に導入することができる。次に、第２または最終の宿主により産生される産物が回収される。一部の実施形態では、組換え宿主は、培地以外の栄養源を使用し、かつ発酵槽以外のシステムを利用して成長することも理解されるであろう。
【０１５１】
例示的な原核生物種及び真核生物種は、以下により詳細に記載される。しかし、他の種が、好適である可能性があることが理解されるであろう。例えば、好適な種は、Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ／Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａなどの属のものとすることができる。このような属の例示的な種としては、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｔｉｇｒｉｎｕｓ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ／Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。
【０１５２】
一部の実施形態では、微生物は、原核生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細菌細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌細胞；Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌細胞；Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌細胞；Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ細菌細胞；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ細菌細胞；またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌細胞、とすることができる。
【０１５３】
一部の実施形態では、微生物は、Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ、例えば、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、とすることができる。
【０１５４】
一部の実施形態では、微生物は、藻類細胞、例えば、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓ種、とすることができる。
【０１５５】
一部の実施形態では、微生物は、シアノバクテリア細胞、例えば、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓ、とすることができる。
【０１５６】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、合成生物学に広く使用されているシャーシ生体であり、組換え微生物のプラットフォームとして使用することができる。例えば、変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデル、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで利用可能な他の情報のライブラリーがあり、種々のモジュールの合理的設計により産物収率を向上させることが可能になる。組換え微生物を作製するための方法が知られている。
【０１５７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．
Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、及びＡ．ｓｏｊａｅなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種は、食品製造に広く使用される微生物であり、組換え微生物プラットフォームとして使用することもできる。ヌクレオチド配列は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、及びＡ．ｔｅｒｒｅｕｓのゲノムに利用可能であり、内因性経路の合理的設計及び改変により、フラックスを高め、かつ産物収率を増加させることが可能になる。代謝モデルは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓならびに転写学研究及びプロテオミクス研究のために開発されている。Ａ．ｎｉｇｅｒは、クエン酸及びグルコン酸などの多数の食品成分の工業生産のために培養され、それにより、Ａ．ｎｉｇｅｒなどの種は一般に、ステビオールグリコシドを産生するのに適する。
【０１５８】
Ｅ．ｃｏｌｉ
合成生物学で広く使用される別のプラットフォーム生体であるＥ．ｃｏｌｉは、組換え微生物プラットフォームとして使用することもできる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓと同様に、変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデル、及びＥ．ｃｏｌｉで利用可能な他の情報のライブラリーがあり、種々のモジュールの合理的設計により、産物収率を向上させることが可能になる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓについて上記のものと類似した方法は、組換えＥ．ｃｏｌｉ微生物を作製するために使用することができる。
【０１５９】
Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｐｐ．
Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｐｐ．は、培養中に大量のイソプレノイドを産生することが知られているので、有用である可能性がある。従って、大量のステビオールグリコシドを産生するためのテルペン前駆体は既に、内因性遺伝子により産生されている。従って、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの組換え遺伝子を含むモジュールは、メバロナートまたはＭＥＰ経路遺伝子を導入する必要がなく、このような属に由来する種に導入することができる。
【０１６０】
Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ（Ｂｌａｓｔｏｂｏｔｒｙｓ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）
Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓは、珍しい生化学的特徴を有する二形性酵母である（それは、パン酵母のような出芽酵母として４２℃の温度まで成長し、この閾値を超えて、糸状形態で成長する）。それは、幅広い基質上で成長することができ、硝酸同化し得る。それは、天然プラスチックを産生することができる株の生成、または環境試料中のエストロゲンに対するバイオセンサーの開発に効率よく適用されている。
【０１６１】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、二形性酵母（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓを参照のこと）であり、Ｈｅｍｉａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓファミリーに属する。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの全ゲノムは、既知である。Ｙａｒｒｏｗｉａ種は、好気性であり、非病原性であると考えられる。Ｙａｒｒｏｗｉａは、疎水性基質（例えば、アルカン、脂肪酸、油）を使用する際に有効であり、糖上で成長することができる。それは、工業用途のための高い可能性を有しており、油性微生物である。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｐｔｉｃａは、その乾燥細胞重量の約４０％の脂質含有量を蓄積することができ、脂質蓄積及び再流動化のためのモデル生体である。例えば、Ｎｉｃａｕｄ，２０１２，Ｙｅａｓｔ  ２９（１０）：４０９−１８；Ｂｅｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ９１（６）：６９２−６；Ｂａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８４（５）：８４７−６５を参照のこと。
【０１６２】
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａは、単細胞性の着色酵母である。油性赤酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓは、脂質及びカロテノイドを粗製グリセロールから産生することが示されている（Ｓａｅｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６（１）：２１０−８）。Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ株は、改良されたバイオマス及び脂質産生能のための効率的な流加発酵システムであることが示されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４１：３１２−７）。
【０１６３】
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓは、油性酵母であり、脂質産生経路を遺伝子操作によって作り変えるのに有用である（例えば、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎ．３：１１１２；Ａｇｅｉｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９０（４）：１２１９−２７を参照のこと）。
【０１６４】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ
Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉは、メチロトローフ酵母である（メタノール上で成長することができる）。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの他のメチロトローフ種と同様に、それは、異種タンパク質を産生するための優れたプラットフォームを提供する。マルチグラム範囲の収率の分泌された外来タンパク質が報告されている。計算方法ＩＰＲＯにより、近年、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉキシロースレダクターゼの補因子特異性を、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＨに実験的に切り替えた変異が予測された。例えば、Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．８２４：３２９−５８；Ｋｈｏｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１８（１０）：２１２５−３８を参照のこと。
【０１６５】
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、メチロトローフ酵母である（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉを参照のこと）。それは、幅広い他の基質上でさらに成長することができ；それは、耐熱性であり、硝酸同化し得る（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓも参照のこと）。それは、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリン、及びＣ型肝炎の処置のためのインターフェロンα−２ａを産生することに適用されており、さらに、幅広い技術的酵素に適用されている。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｖｉｒｏｌ  Ｓｉｎ．２９（６）：４０３−９を参照のこと。
【０１６６】
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓは、ケフィアの産生に通常適用される酵母である。それは、いくつかの糖上で、最も重要なことには、ミルク及び乳清中に存在するラクトース上で、成長することができる。それは、とりわけ、チーズを製造するためのキモシン（通常は子ウシの胃に存在する酵素）を産生するために効率よく適用されている。産生は、４０，０００Ｌ規模の発酵槽で行われる。例えば、Ｏｏｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．６（３）：３８１−９２を参照のこと。
【０１６７】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、メチロトローフ酵母である（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ及びＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを参照のこと）。それは、外来タンパク質を産生するための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォーム要素は、キットとして入手可能であり、それは、タンパク質を産生するために学界で世界的に使用される。複雑なヒトＮ−グリカンを産生することができる株が操作されている（酵母グリカンは、類似しているがヒトに見られるものと同一ではない）。例えば、Ｐｉｉｒａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（６）：５３２−７を参照のこと。
【０１６８】
Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．
Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｍｏｓｓｅｓは、浮遊培養で成長させた時、酵母または他の真菌培養と類似の特徴を有する。この属は、植物の二次代謝産物を産生するために使用することができ、これは、他のタイプの細胞内で産生することが困難である可能性がある。
【０１６９】
本明細書に開示の組換え宿主細胞は、植物、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を含む真菌細胞中で成長する植物細胞を含む植物細胞を含むことができ、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、もしくはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ種由来の細胞であるか、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅであるか、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、藻類細胞、もしくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、もしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞を含む細菌細胞であることが理解されるであろう。
【０１７０】
ステビオールグリコシド組成物
ステビオールグリコシドは、必ずしも異なる食品システムにおいて同等の性能を有するとは限らない。それ故、合成を、選択すべきステビオールグリコシド組成物に指向する能力を有することが望ましい。本明細書に記載の組換え宿主は、具体的なステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭ）について選択的に富化され、かつ均一な味覚プロファイルを有する組成物を産生することができる。本明細書で使用される場合、「富化された」という用語は、ステビア植物由来のステビオールグリコシド組成物（抽出物）と比較して、特定のステビオールグリコシドの割合が増加したステビオールグリコシド組成物について記載するために使用される。従って、本明細書に記載の組換え宿主は、所与の食品に望ましい甘味プロファイルを満たすように調整され、かつ各ステビオールグリコシドの割合がバッチ間で均一である組成物の産生を促進することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の宿主は、ステビア抽出物に見出される望ましくない植物副産物を産生しないか、または、それを低減した量で産生する。従って、本明細書に記載の組換え宿主により産生されるステビオールグリコシド組成物は、ステビア植物由来の組成物と区別される。
【０１７１】
蓄積された個々のステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭ）の量は、約１〜約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約１〜約１０ｍｇ／Ｌ、約３〜約１０ｍｇ／Ｌ、約５〜約２０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約５０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｍｇ／Ｌ、約２５〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１，５００ｍｇ／Ｌ、もしくは約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，４００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，６００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，８００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２，８００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌ、とすることができる。一部の態様では、個々のステビオールグリコシドの量は、７，０００ｍｇ／Ｌを超えることができる。蓄積されたステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、またはＲｅｂＭ）の組み合わせの量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約２００〜約１，５００、少なくとも約２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６，０００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌとすることができる。一部の態様では、ステビオールグリコシドの組み合わせの量は、７，０００ｍｇ／Ｌを超えることができる。一般に、より長い培養時間は、より多くの量の産物をもたらすであろう。従って、組換え微生物は、１日間〜７日間、１日間〜５日間、３日間〜５日間、約３日間、約４日間、または約５日間培養することができる。
【０１７２】
本明細書で検討される種々の遺伝子及びモジュールは、単一の微生物ではなく２つ以上の組換え微生物に存在することができると理解されるであろう。複数の組換え微生物は、使用される場合、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドを産生させるために混合培養物中で成長させることができる。例えば、第１の微生物は、ステビオールグリコシド前駆体を産生するための１つ以上の生合成遺伝子を含むことができる一方、第２の微生物は、ステビオールグリコシド生合成遺伝子を含む。次に、第２または最終の微生物により産生された産物が回収される。一部の実施形態では、組換え微生物が、培地以外の栄養源を使用し、かつ発酵槽以外のシステムを利用して成長することも理解されるであろう。
【０１７３】
あるいは、２つ以上の微生物はそれぞれ、別々の培地で成長させることができ、第１の培地の産物、例えば、ステビオールは、その後の中間体に、または、ＲｅｂＡなどの最終産物に変換するために、第２の培地に導入することができる。次に、第２の、または最終の微生物により産生された産物が回収される。一部の実施形態では、組換え微生物が、培地以外の栄養源を使用し、かつ発酵槽以外のシステムを利用して成長することも理解されるであろう。
【０１７４】
本明細書に開示の方法により得られるステビオールグリコシド及び組成物は、食品、栄養補助食品、及び甘味料組成物の作製に使用することができる。例えば、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８を参照のこと。
【０１７５】
例えば、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシド、例えば、ＲｅｂＭまたはＲｅｂＤは、食品、例えば、アイスクリーム、炭酸飲料、フルーツジュース、ヨーグルト、焼き菓子、チューインガム、ハードキャンディー及びソフトキャンディー、ならびにソース、に含まれる可能性がある。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、非食品、例えば、医薬製品、医薬品、栄養補助食品、及び栄養剤、にも含まれる可能性がある。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、農業及びコンパニオンアニマル業界の双方のための動物飼料製品にも含まれ得る。あるいは、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドの混合物は、組換え微生物を別々に培養すること、具体的なステビオールまたはステビオールグリコシドをそれぞれ産生すること、ステビオールまたはステビオールグリコシドを各微生物から実質的に純粋な形態で回収すること、次に、所望の割合で各化合物を含む混合物を得るために、化合物を組み合わせることにより作製することができる。本明細書に記載の組換え微生物により、現在のステビア製品と比較してより正確で一貫した混合物を得ることができる。
【０１７６】
別の代替案では、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、他の甘味料、例えば、サッカリン、デキストロース、スクロース、フルクトース、エリスリトール、アスパルテーム、スクラロース、モナチン、またはアセスルファムカリウムと共に食品中に組み込むことができる。ステビオールまたはステビオールグリコシドの、他の甘味料に対する重量比は、最終食品で満足な味を達成するために、要望通りに変動させることができる。例えば、Ｕ．Ｓ．２００７／０１２８３１１を参照のこと。一部の実施形態では、ステビオールまたはステビオールグリコシドは、風味調節剤として、フレイバー（例えば、柑橘類）と共に提供されてもよい。
【０１７７】
本明細書に記載の組換え微生物により産生された組成物は、食品に組み込むことができる。例えば、組換え微生物により産生されるステビオールグリコシド組成物は、ステビオールグリコシド及び食品のタイプに応じて、乾燥重量基準で約２０ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品〜約１８００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品の範囲の量で食品に組み込むことができる。例えば、組換え微生物により産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量基準で最大５００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、デザート、冷菓子（例えば、アイスクリーム）、乳製品（例えば、ヨーグルト）、または飲料（例えば、炭酸飲料）に組み込むことができる。組換え微生物により産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量基準で最大３００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、焼き菓子（例えば、ビスケット）に組み込むことができる。組換え微生物により産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量基準で最大１０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、ソース（例えば、チョコレートシロップ）または野菜製品（例えば、ピクルス）に組み込むことができる。組換え微生物により産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量基準で最大１６０ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、パンに組み込むことができる。組換え微生物、植物、または植物細胞により産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量基準で最大１６００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、ハードキャンディーまたはソフトキャンディーに組み込むことができる。組換え微生物、植物、または植物細胞により産生されるステビオールグリコシド組成物は、食品が乾燥重量基準で最大１０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を有するように、加工フルーツ製品（例えば、フルーツジュース、フルーツ充填物、ジャム、及びゼリー）に組み込むことができる。一部の実施形態では、本明細書で産生されるステビオールグリコシド組成物は、医薬組成物の構成成分である。例えば、Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ６９ｔｈ  ＪＥＣＦＡ，２００７，ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  Ｈａｒｒｉｅｔ  Ｗａｌｌｉｎ，Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．Ｏｒｇ．；ＥＦＳＡ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ａｄｄｅｄ  ｔｏ  Ｆｏｏｄ（ＡＮＳ），“Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｓｔｅｖｉｏｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｕｓｅｓ  ａｓ  ａ  ｆｏｏｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅ，”２０１０，ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８（４）：１５３７；Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ＧＲＡＳ  Ｎｏｔｉｃｅ  ３２３；Ｕ．Ｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ＧＲＡＳ  Ｎｏｔｉｃｅ  Ｎｏｔｉｃｅ  ３２９；ＷＯ２０１１／０３７９５９；ＷＯ２０１０／１４６４６３；ＷＯ２０１１／０４６４２３；及びＷＯ２０１１／０���６８３４を参照のこと。
【０１７８】
例えば、このようなステビオールグリコシド組成物は、９０〜９９重量％のＲｅｂＡ及び検出不可能な量のステビア植物由来の汚染物質を有することができ、乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇで、食品に取り込まれる。
【０１７９】
このようなステビオールグリコシド組成物は、３重量％を超えるＲｅｂＢを有する、ＲｅｂＢが富化された組成物とすることができ、産物中のＲｅｂＢの量が乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるように、食品に組み込むことができる。通常、ＲｅｂＢが富化された組成物は、検出不可能な量のステビア植物由来の汚染物質を有する。
【０１８０】
このようなステビオールグリコシド組成物は、３重量％を超えるＲｅｂＤを有する、ＲｅｂＤが富化された組成物とすることができ、産物中のＲｅｂＤの量が乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるように、食品に組み込むことができる。通常は、ＲｅｂＤが富化された組成物は、検出不可能な量のステビア植物由来の汚染物質を有する。
【０１８１】
このようなステビオールグリコシド組成物は、３重量％を超えるＲｅｂＥを有する、ＲｅｂＥが富化された組成物とすることができ、産物中のＲｅｂＥの量が乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるように、食品に組み込むことができる。通常は、ＲｅｂＥが富化された組成物は、検出不可能な量のステビア植物由来の汚染物質を有する。
【０１８２】
このようなステビオールグリコシド組成物は、３重量％を超えるＲｅｂＭを有する、ＲｅｂＭが富化された組成物とすることができ、産物中のＲｅｂＭの量が乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるように、食品に組み込むことができる。通常は、ＲｅｂＭが富化された組成物は、検出不可能な量のステビア植物由来の汚染物質を有する。
【０１８３】
一部の実施形態では、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、卓上甘味料または「カップ用カップ」製品に組み込まれる。このような製品は通常、当業者らに既知の１つ以上の増量剤、例えば、マルトデキストリンで、適切な甘味レベルに希釈される。ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、またはＲｅｂＭについて富化されたステビオールグリコシド組成物は、卓上使用のために、例えば、乾燥重量基準で１０，０００〜３０，０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ製品で、サッシェにパッケージングすることができる。一部の実施形態では、インビトロで、インビボで、または全細胞生物変換により産生されるステビオールグリコシド。
【０１８４】
本発明は、次の実施例にさらに記載されることになり、これは、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１８５】
続く実施例は、本発明の具体的な実施形態及びそれらの種々の使用を例示するものである。それらは、説明のためのみに記載されており、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１８６】
実施例１：ＬＣ−ＭＳ分析手順
ネガティブモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を備えたＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＴＱＤトリプル四重極質量分析計と結合されたＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒子、１３０Å孔径）を備えたＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で、ＬＣ−ＭＳ分析を実施した。
【０１８７】
０．３〜２．０分に２０％から５０％までＢを増加させ、２．０１分に１００％までＢを増加させ、０．６分間１００％にＢを保持し、０．６分間再平衡化させることにより、２つの移動相：Ａ（０．１％のギ酸を含む水）及びＢ（０．１％のギ酸を含むＭｅＣＮ）の勾配により、方法Ａのための化合物分離を達成した。
【０１８８】
２．５分で６０％から１００％までＢを増加させ、０．１分間１００％にＢを保持し、０．３分間再平衡化させることにより、２つの移動相Ａ（０．１％のギ酸を含む水）及びＢ（０．１％のギ酸を含むＭｅＣＮ）の勾配により、方法Ｂのための化合物分離を達成した。
【０１８９】
流速は、０．６ｍＬ／分であり、カラム温度は、５５℃であった。ＳＩＭ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を使用して、ステビオールグリコシドを監視し、根拠のある標準と比較することにより定量した。検出されたステビオールグリコシドのｍ／ｚトレース及び保持時間値については、表１を参照のこと。
【表１】
2019519212.tif 000003
【０１９０】
実施例２：粗溶解物の調製
ＵＧＴポリペプチドを発現するように構築されたＥ．ｃｏｌｉ株のコロニーを、アンピシリンを含むＮＺＣＹＭ細菌培養液１ｍＬと共に滅菌９６深型ウェルプレートに入れた。プレートを密閉し、試料を、２００ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で一晩成長させた。翌日（すなわち、２日目）、５０μＬの各培養物を、アンピシリン及びポリペプチド発現誘導物質を含むＮＺＣＹＭ細菌培養液１ｍＬを含む新しい滅菌９６深型ウェルプレートに移した。プレートを密封し、試料を、２００ｒｐｍで振盪しながら、２０℃で約２０時間インキュベートした。３日目に、プレートを、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清をデカントした後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、及びプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液５０μＬを、各ウェルに添加し、細胞を、２００ｒｐｍ、４℃で５分間振盪することにより再懸濁した。次に、各ウェルの内容物（すなわち、細胞スラリー）を、−８０℃で一晩凍結させる前に、ＰＣＲプレートに移し、密封した。凍結した細胞スラリーを、室温で最大３０分間解凍した。解凍混合物が細胞溶解に起因して、粘性ではなかった場合、試料を、再度冷凍及び解凍した。試料がほぼ解凍された時に、ＤＮａｓｅ及びＭｇＣｌ２を含む結合緩衝液２５μＬを各ウェルに添加した。試料の粘性が低くなるまで、５００ｒｐｍで振盪しながら、ＰＣＲプレートを室温で５分間インキュベートした。最終的に、試料を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後、上清を使用して、実施例３に記載のＵＧＴ活性を測定した。
【０１９１】
実施例３：ＵＧＴ活性アッセイ
実施例２に従って調製したＵＧＴポリペプチド試料を、表２に従って反応混合物を調製することにより、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ルブソシド、ステビオール、ｅｎｔ−カウレン酸、及び１３−ＳＭＧを含む基質の活性についてインビトロでスクリーニングした。
【表２】
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【０１９２】
反応混合物を、３０℃で一晩インキュベートした。１００％のＤＭＳＯ  ３０μＬを加えることにより、反応を停止させた。得られた混合物を、実施例１に従って、ＬＣ−ＭＳ分析のために、５０％のＤＭＳＯ  ９０μＬでさらに希釈した。形成された生成物及び各生成物の曲線下面積（ＡＵＣ）値の双方を、基質ごとにまとめた表３〜７に示す。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【０１９３】
表３〜７に示す通り、いくつかの基質上のＵＧＴポリペプチドによる１９−Ｏ−グリコシル化、１３−Ｏ−グリコシル化、及びグリコシル基グリコシル化活性が観察され、ｅｎｔ−カウレン酸及びステビオールのグリコシドの形成がもたらされた。
【０１９４】
【表８】
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【０１９５】
表８に示す通り、ＵＤＰＧ１（配列番号１８５）及びＵＧＴ７５Ｄ１（配列番号２０５）は、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号４）と比較して、インビトロでｅｎｔ−カウレン酸＋１Ｇｌｃ（＃５８）をｅｎｔ−カウレン酸から産生するよりも、相対的に多くのルブソシドを１３−ＳＭＧから産生する。
【０１９６】
実施例４：株操作及び発酵
ＧＧＰＰＳポリペプチド（配列番号１９、配列番号２０）をコードする組換え遺伝子、短縮型ＣＤＰＳポリペプチド（配列番号３９、配列番号４０）をコードする組換え遺伝子、ＫＳポリペプチド（配列番号５１、配列番号５２）をコードする組換え遺伝子、ＫＯポリペプチド（配列番号５９、配列番号６０）をコードする組換え遺伝子、ＡＴＲ２ポリペプチド（配列番号９１、配列番号９２）をコードする組換え遺伝子、ＥＵＧＴ１１ポリペプチド（配列番号１４／配列番号１５、配列番号１６）をコードする組換え遺伝子、ＫＡＨポリペプチド（配列番号９３、配列番号９４）をコードする組換え遺伝子、ＣＰＲ８ポリペプチド（配列番号８５、配列番号８６）をコードする組換え遺伝子、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド（配列番号５／配列番号６／配列番号１４９、配列番号７）または配列番号７のＵＧＴ８５Ｃ２多様体（もしくは機能的ホモログ）をコードする組換え遺伝子、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド（配列番号３、配列番号４）または配列番号４のＵＧＴ７４Ｇ１多様体（もしくは機能的ホモログ）をコードする組換え遺伝子、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド（配列番号８、配列番号９）または配列番号９のＵＧＴ７６Ｇ１多様体（もしくは機能的ホモログ）をコードする組換え遺伝子、ならびにＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド（配列番号１０、配列番号１１）及び配列番号１１のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ多様体（もしくは機能的ホモログ）、例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１２、配列番号１３）をコードする組換え遺伝子、のうちの１つ以上のコピーを含むステビオールグリコシド産生Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株内で、ｐ４１６−ＧＰＤベクターを用いて、ＳＡ  Ｇｔａｓｅ（配列番号１８２、配列番号１８３）を発現させた。
【０１９７】
この株を、４００ｒｐｍで振盪しながら、１ｍＬの合成完全（ＳＣ）ウラシルドロップアウト培地中、３０℃で５日間インキュベートした。５０μＬの各培養物を、５０μＬのＤＭＳＯに移し、８０℃で１０分間インキュベートし、３２２０ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、実施例１に従って実施したＬＣ−ＭＳ分析のために、得られた上清１５μＬを、５０％のＤＭＳＯ  １０５μＬに移した。ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭに対応するＬＣ−ＭＳ由来ピークについての正規化曲線下面積（ＡＵＣ）値はそれぞれ、約０．２５μＭ／ＯＤ６００及び１．１５μＭ／ＯＤ６００であった。ｅｎｔ−カウレン酸＋２Ｇｌｃ（＃７）、ｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体１）、及びｅｎｔ−カウレン酸＋３Ｇｌｃ（異性体２）は、それぞれ、約２００ＡＵＣ／ＯＤ６００、１５ＡＵＣ／ＯＤ６００、及び１０００ＡＵＣ／ＯＤ６００のレベルで蓄積した。１３−ＳＭＧ、ＲｅｂＡ、及びＲｅｂＢは、それぞれ約４．８μＭ／ＯＤ６００、２．５μＭ／ＯＤ６００、及び０．２５μＭ／ＯＤ６００のレベルで蓄積した。ステビオール＋４Ｇｌｃ（＃２６）、ステビオール＋６Ｇｌｃ（異性体１）、ステビオール＋７Ｇｌｃ（異性体２）、及びカウレノール＋３Ｇｌｃ（異性体１及び／または２）はそれぞれ、約２００ＡＵＣ／ＯＤ６００、１５ＡＵＣ／ＯＤ６００、７５ＡＵＣ／ＯＤ６００、及び７５０ＡＵＣ／ＯＤ６００のレベルで蓄積した。
【０１９８】
本発明を詳細に、かつその具体的な実施形態への言及により説明しているが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱することなく、修正及び変形が可能であることは明らかであろう。より具体的には、本発明の一部の態様が、本明細書において特に有利であると確認されるが、本発明は、必ずしも本発明のこれらの特定の態様に限定されないことが企図される。
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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【図６Ｏ】
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【図６Ｐ】
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【図６Ｑ】
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【図６Ｒ】
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【図６Ｓ】
2019519212.tif 000122
【図６Ｔ】
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【図６Ｕ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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