(57)【要約】本発明は、無核細胞を含有する細胞懸濁液を狭窄部に通すことであって、抗原および／または免疫寛容原性因子が該細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ことより、該抗原への寛容性を誘導するための方法および／または該抗原への免疫応答を抑制するための方法を提供する。一部の実施形態では、前記無核細胞は、個体に送達され、前記抗原は、寛容原性環境に送達され、該寛容原性環境においてプロセシングされて該抗原への寛容性を誘導し、かつ／または該抗原への免疫応答を抑制する。
2019519483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において免疫応答を抑制するための方法であって、
ａ．無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．該個体に該無核細胞を導入するステップと
を含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法。
【請求項２】
個体において免疫応答を抑制するための方法であって、
ａ．無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．該個体に該無核細胞を導入するステップと
を含み、該寛容原性因子が、免疫応答を抑制する寛容原性環境に寄与する、方法。
【請求項３】
個体において免疫応答を抑制するための方法であって、
ａ．無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原および寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．該個体に該無核細胞を導入するステップと
を含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法。
【請求項４】
個体において免疫応答を抑制するための方法であって、
ａ．第１の無核細胞を含む第１の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．第２の無核細胞を含む第２の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｃ．該個体に該第１の無核細胞および第２の無核細胞を導入するステップと
を含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法。
【請求項５】
個体において免疫応答を抑制するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原を含み、該抗原が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法。
【請求項６】
個体において免疫応答を抑制するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原および免疫寛容原性因子を含み、該抗原および該寛容原性因子が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原および該寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法。
【請求項７】
無核細胞に寛容原性因子を送達するための方法であって、該無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、該寛容原性因子が該細胞に入るように、該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こすステップを含み、ここで、該細胞懸濁液が、該寛容原性因子と接触する、方法。
【請求項８】
寛容原性環境に抗原を導入するための方法であって、個体に無核細胞を送達するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原を含み、該抗原が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされる、方法。
【請求項９】
寛容原性環境に抗原および寛容原性因子を導入するための方法であって、個体に無核細胞を送達するステップを含み、ここで、該無核細胞が、該抗原および該寛容原性因子を含み、該抗原および該寛容原性因子が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原および該寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされる、方法。
【請求項１０】
個体において抗原特異的寛容性を誘導するための方法であって、
ａ．無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．該個体に該無核細胞を導入するステップと
を含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法。
【請求項１１】
個体において寛容性を誘導するための方法であって、
ａ．無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．該個体に該無核細胞を導入するステップと
を含み、該寛容原性因子が、寛容性を誘導する寛容原性環境に寄与する、方法。
【請求項１２】
個体において寛容性を誘導するための方法であって、
ａ．無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原および寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．該個体に該無核細胞を導入するステップと
を含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法。
【請求項１３】
個体において抗原特異的寛容性を誘導するための方法であって、
ａ．第１の無核細胞を含む第１の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．第２の無核細胞を含む第２の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｃ．該個体に該第１の無核細胞および第２の無核細胞を導入するステップと
を含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法。
【請求項１４】
個体において抗原特異的寛容性を誘導するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原を含み、該抗原が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法。
【請求項１５】
個体において抗原特異的寛容性を誘導するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原および免疫寛容原性因子を含み、該抗原および該寛容原性因子が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原および該寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法。
【請求項１６】
無核細胞に抗原を送達するための方法であって、該無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、該抗原が該細胞に入るように、該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こすステップを含み、ここで、該細胞懸濁液が、該抗原と接触する、方法。
【請求項１７】
無核細胞に抗原および寛容原性因子を送達するための方法であって、該無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、該抗原および該寛容原性因子が該細胞に入るように、該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こすステップを含み、ここで、該細胞懸濁液が、該抗原および該寛容原性因子と接触する、方法。
【請求項１８】
寛容原性環境における前記抗原のプロセシングおよび提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
寛容原性環境における前記抗原のプロセシングおよび提示が、該抗原への寛容性を誘導する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つのさらなる抗原が、前記細胞に導入される、請求項１、４、５、８、１０および１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つのさらなる寛容原性因子が、前記細胞に導入される、請求項２〜４、６、７、９、１１、１２、１３、１５および１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記寛容原性環境が、脾臓、肝臓またはリンパ節に位置する、請求項１〜６、８〜１５、１８および１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記狭窄部が、マイクロ流体チャネルの中に含有される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記チャネルが、約０．２５μｍ〜約４μｍの狭窄部幅を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記チャネルが、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの狭窄部幅を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記狭窄部が、孔であるか、または孔の中に含有される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記孔が、表面に含有される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記表面が、フィルターである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記表面が、膜である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記孔サイズが、約０．５μｍ〜約４μｍである、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記孔サイズが、４μｍ、約３μｍ、約２μｍ、約１μｍまたは約０．５μｍである、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記狭窄部サイズが、前記無核細胞の直径の関数である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記狭窄部サイズが、前記細胞直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
約−５℃〜約４５℃の間で実行される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞懸濁液が、混合された細胞集団を含む、請求項１〜４、７、１０〜１３および１６〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞懸濁液が、全血である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞懸濁液が、精製された細胞集団を含む、請求項１〜４、７、１０〜１３および１６〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞懸濁液が、精製された無核細胞集団を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞懸濁液が、哺乳動物細胞を含む、請求項１〜４、７、１０〜１３および１６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞懸濁液が、サル細胞、マウス細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞またはウサギ細胞を含む、請求項１〜４、７、１０〜１３および１６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞懸濁液が、ヒト細胞を含む、請求項１〜４、７、１０〜１３および１６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記無核細胞が、赤血球である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）が、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記赤血球が、網状赤血球である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記無核細胞が、血小板である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記無核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記無核細胞が、サル細胞、マウス細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞またはウサギ細胞である、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記無核細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記無核細胞が、前記個体に由来する、請求項１〜５、８〜１４および２２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記無核細胞が、異なる個体に由来する、請求項１〜５、８〜１４および２２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗原が、細胞溶解物中にある、請求項１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗原が、外来抗原である、請求項１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗原が、自己抗原である、請求項１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗原が、同種移植抗原である、請求項１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗原が、タンパク質またはポリペプチドである、請求項１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗原が、溶解物である、請求項１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗原が、微生物である、請求項１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗原が、脂質抗原である、請求項１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗原が、炭水化物抗原である、請求項１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗原が、修飾抗原である、請求項１、４、５、８〜１０および１３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記修飾抗原が、ポリペプチドと融合している抗原を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記修飾抗原が、治療剤と融合している抗原を含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記修飾抗原が、ターゲティングペプチドと融合している抗原を含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記修飾抗原が、脂質と融合している抗原を含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記修飾抗原が、炭水化物と融合している抗原を含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗原が、移植組織に関連した抗原である、請求項１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗原が、ウイルスに関連する、請求項１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞懸濁液が、前記狭窄部を通る前に、それと同時に、またはその後に前記抗原と接触する、請求項１、４、１０、１３および１６〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記寛容原性因子が、ポリペプチドを含む、請求項２〜４、７、１１〜１３および２２〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ポリペプチドが、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−３５、ＩＦＮαまたはＴＧＦβである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチドの断片である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記ポリペプチドが、治療用ペプチドである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記ポリペプチドが、炭水化物にコンジュゲートしている、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞懸濁液が、前記狭窄部を通る前に、それと同時に、またはその後に前記寛容原性因子と接触する、請求項２〜４、７、１１〜１３および２２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記無核細胞の半減期が、減少する、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記無核細胞の半減期が、増加する、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記免疫応答が、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％または約１００％抑制される、請求項１〜６、１８および２２〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記抑制される免疫応答が、１つまたは複数の炎症性サイトカインの減少した産生および／または分泌を含む、請求項１〜６、１８および２２〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記１つまたは複数の炎症性サイトカインが、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記抑制される免疫応答が、１つまたは複数の抗炎症性サイトカインの増加した産生および／または分泌を含む、請求項１〜６、１８および２２〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記１つまたは複数の抗炎症性サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−３５、ＩＦＮ−αおよびトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）からなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記抑制される免疫応答が、Ｔ細胞応答の減少を含む、請求項１〜６、１８および２２〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞活性化の減少を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞生存の減少を含む、請求項８３または８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞増殖の減少を含む、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞機能性の減少を含む、請求項８３〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞表現型の変化を含む、請求項８３〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記抑制される免疫応答が、Ｔ細胞の非共刺激活性化を含む、請求項１〜６、１８および２２〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記抑制される免疫応答が、Ｔｒｅｇ応答の増強を含む、請求項１〜６、１８および２２〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記抑制される免疫応答が、Ｂ細胞応答の減少を含む、請求項１〜６、１８および２２〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記Ｂ細胞応答の減少が、抗体産生の減少を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記抑制される免疫応答が、サイトカイン産生の減少を含む、請求項１〜６、１８および２２〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記抑制される免疫応答が、自己免疫応答の減少を含む、請求項１〜６、１８および２２〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記抑制される免疫応答が、アレルギー応答の減少を含む、請求項１〜６、１８および２２〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記抑制される免疫応答が、前記移植組織に対する免疫応答の減少を含む、請求項１〜６、１８および２２〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記抑制される免疫応答が、前記ウイルスへの病原性免疫応答の減少を含む、請求項１〜６、１８および２２〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記抑制される免疫応答が、治療剤に対する免疫応答の減少を含む、請求項１〜６、１８および２２〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記抑制される免疫応答が、治療ビヒクルに対する免疫応答の減少を含む、請求項１〜６、１８および２２〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記寛容性が、１つまたは複数の炎症性サイトカインの減少した産生および／または分泌を含む、請求項１０〜１５および１９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記１つまたは複数の炎症性サイトカインが、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記寛容性が、１つまたは複数の抗炎症性サイトカインの増加した産生および／または分泌を含む、請求項１０〜１５および１９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記１つまたは複数の抗炎症性サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−３５、ＩＦＮ−αおよびトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）からなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記寛容性が、Ｔ細胞応答の減少を含む、請求項１０〜１５および１９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞活性化の減少を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞生存の減少を含む、請求項１０４または１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞増殖の減少を含む、請求項１０４〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞機能性の減少を含む、請求項１０４〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞表現型の変化を含む、請求項１０４〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記寛容性が、Ｔ細胞の非共刺激活性化を含む、請求項１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記寛容性が、Ｔｒｅｇ応答の増強を含む、請求項１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記寛容性が、Ｂ細胞応答の減少を含む、請求項１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記Ｂ細胞応答の減少が、抗体産生の減少を含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記寛容性が、サイトカイン産生の減少を含む、請求項１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記寛容性が、自己免疫応答の減少を含む、請求項１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記寛容性が、アレルギー応答の減少を含む、請求項１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記寛容性が、前記移植組織に対する免疫応答の減少を含む、請求項１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記寛容性が、前記ウイルスへの病原性免疫応答の減少を含む、請求項１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記寛容性が、治療剤に対する免疫応答の減少を含む、請求項１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記寛容性が、治療ビヒクルに対する免疫応答の減少を含む、請求項１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
少なくとも１、２、３、４、５または６回繰り返される、請求項１〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記方法の任意の２回の繰り返しの間の時間間隔が、少なくとも１日、１週、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月または１年である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
請求項１、４、１０、１３および１６〜１２０のいずれか一項に記載の方法で使用するための、前記狭窄部、細胞懸濁液および抗原を含む系。
【請求項１２４】
請求項２〜４、７、１１〜１３および２２〜１２０のいずれか一項に記載の方法で使用するための、前記狭窄部、細胞懸濁液および寛容原性因子を含む系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年５月３日に出願された米国仮出願第６２／３３１，３６８号の優先権を主張し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、概して、細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通すことにより細胞中に化合物を送達することによって、免疫応答を抑制するかまたは寛容性を誘導するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
脾臓の非炎症性のアポトーシス環境における抗原の存在は、アネルギーおよび寛容性を誘導することが示されている。この寛容原性環境における目的の抗原の一貫した提示を確実にする１つの方法は、赤血球（ＲＢＣ）との物理的相互作用を介する。
【０００４】
しかしながら、赤血球は不規則な形状（両凹面）で無核であり、転写不活性であることを考えれば、抗原性物質と関係付けるように赤血球を操作することは、困難である。その結果、標準のトランスフェクション技術はうまくいかず、それゆえ赤血球の寛容原性の可能性の証明は当初、赤血球の表面に材料をコンジュゲートすることに集中していた（Lorentzら、Sci.  Adv.２０１５年、１巻：ｅ１５００１１２頁；Grimmら、Sci  Rep.２０１５年１０月２９日、５巻：１５９０７頁；Kontosら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA.２０１３年１月２日、１１０巻（１号）：Ｅ６０〜８頁）。表面コンジュゲーションを使用した当初の研究は、モデル抗原および１型糖尿病のマウスモデルで有望な結果を示したが、いくつかの顕著な欠点がある。これらの欠点としては、ａ）付着のための化学修飾された抗原の必要性、ｂ）限定的なローディング表面積、ｃ）免疫原性が挙げられる。
したがって、自己免疫疾患および移植片拒絶の根底にある病原性免疫応答の処置のために、赤血球の細胞質に抗原を送り込み、強力な免疫抑制応答を促進することができる細胞内送達技術に対する満たされていないニーズがある。細胞に化合物を送達するためにマイクロ流体狭窄部を使用する方法を記載する参考文献として、ＷＯ２０１３０５９３４３、ＷＯ２０１５０２３９８２、ＷＯ２０１６０７０１３６、ＷＯ２０１６０７７７６１およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／１３１１３が挙げられる。
特許出願および公開を含む本明細書で引用する全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０５９３４３号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０２３９８２号
【特許文献３】国際公開第２０１６／０７０１３６号
【特許文献４】国際公開第２０１６／０７７７６１号
【特許文献５】国際公開第２０１６／１１５１７９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lorentzら、Sci.  Adv.２０１５年、１巻：ｅ１５００１１２頁
【非特許文献２】Grimmら、Sci  Rep.２０１５年１０月２９日、５巻：１５９０７頁
【非特許文献３】Kontosら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA.２０１３年１月２日、１１０巻（１号）：Ｅ６０〜８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の簡潔な要約
本発明は、個体において免疫応答を抑制するための方法であって、無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入するステップとを含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法を提供する。
【０００８】
本発明のある特定の態様は、個体において免疫応答を抑制するための方法であって、無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、１つまたは複数の寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入するステップとを含み、該１つまたは複数の寛容原性因子の作用が、寛容原性環境および免疫応答の抑制に寄与する、方法を提供する。
【０００９】
本発明のある特定の態様は、個体において免疫応答を抑制するための方法であって、無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原および１つまたは複数の寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入するステップとを含み、寛容原性環境における該抗原のプロセシングが、免疫応答を抑制する、方法を提供する。
【００１０】
本発明のある特定の態様は、個体において免疫応答を抑制するための方法であって、第１の無核細胞を含む第１の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、第２の無核細胞を含む第２の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該第１の無核細胞および第２の無核細胞を導入するステップとを含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法を提供する。
【００１１】
本発明のある特定の態様は、個体において免疫応答を抑制するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原を含み、該抗原が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法を提供する。
【００１２】
本発明のある特定の態様は、無核細胞に寛容原性因子を送達するための方法であって、該無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、該寛容原性因子が該細胞に入るように、該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こすステップを含み、ここで、該細胞懸濁液が、該寛容原性因子と接触する、方法を提供する。
【００１３】
本発明のある特定の態様は、個体に無核細胞を送達するステップを含む、寛容原性環境に抗原を導入するための方法であって、ここで、該無核細胞が、抗原を含み、該抗原が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされる、方法を提供する。
【００１４】
本発明のある特定の態様は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法であって、無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入するステップとを含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法を提供する。
【００１５】
本発明のある特定の態様は、個体において寛容性を誘導するための方法であって、無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入するステップとを含み、該寛容原性因子の作用が、寛容性を誘導する寛容原性環境に寄与する、方法を提供する。
【００１６】
本発明のある特定の態様は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法であって、第１の無核細胞を含む第１の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、第２の無核細胞を含む第２の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該第１の無核細胞および第２の無核細胞を導入するステップとを含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法を提供する。
【００１７】
本発明のある特定の態様は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、該抗原を含み、該抗原が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法を提供する。
【００１８】
本発明のある特定の態様は、無核細胞に抗原を送達するための方法であって、該無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、該抗原が該細胞に入るように、該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こすステップを含み、該細胞懸濁液が、該抗原と接触する、方法を提供する。一部の実施形態では、寛容原性環境における前記抗原のプロセシングおよび提示は、該抗原への免疫応答を抑制する。一部の実施形態では、前記寛容原性環境における前記抗原のプロセシングおよび提示は、該抗原への寛容性を誘導する。前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記寛容原性環境は、脾臓、肝臓またはリンパ節に位置する。
【００１９】
一部の実施形態では、前記狭窄部は、マイクロ流体チャネルの中に含有される。一部の実施形態では、前記チャネルは、約０．２５μｍ〜約４μｍの狭窄部幅を含む。一部の実施形態では、前記チャネルは、約４μｍ、約３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの狭窄部幅を含む。一部の実施形態では、前記狭窄部は、孔であるか、または孔の中に含有される。一部の実施形態では、前記孔は、表面に含有される。一部の実施形態では、前記表面は、フィルターである。一部の実施形態では、前記表面は、膜である。一部の実施形態では、前記孔サイズは、約０．５μｍ〜約４μｍである。一部の実施形態では、前記孔サイズは、４μｍ、約３μｍ、約２μｍ、約１μｍまたは約０．５μｍである。一部の実施形態では、前記狭窄部サイズは、前記無核細胞の直径の関数である。一部の実施形態では、前記狭窄部サイズは、前記細胞直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である。一部の実施形態では、本方法は、約−５℃〜約４５℃の間で実行される。
【００２０】
無核細胞の直径についての参照は、別に特定されない限り、例えば前記細胞が狭窄部に接近するときの、該狭窄部を通る前の流体中の該細胞の直径を意味する。
【００２１】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、混合された細胞集団を含む。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、全血である。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、精製された細胞集団を含む。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、精製された無核細胞集団を含む。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、サル細胞、マウス細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞またはウサギ細胞を含む。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、ヒト細胞を含む。一部の実施形態では、前記無核細胞は、赤血球である。一部の実施形態では、前記赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）は、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）である。一部の実施形態では、前記赤血球は、網状赤血球である。一部の実施形態では、前記無核細胞は、血小板である。
【００２２】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記抗原は、細胞溶解物中にある。一部の実施形態では、前記抗原は、外来抗原である。一部の実施形態では、前記抗原は、自己抗原である。一部の実施形態では、前記抗原は、同種移植抗原である。一部の実施形態では、前記抗原は、微生物である。一部の実施形態では、前記抗原は、脂質抗原である。一部の実施形態では、前記抗原は、炭水化物抗原（例えば糖）である。一部の実施形態では、前記抗原は、修飾抗原である。一部の実施形態では、修飾抗原は、ポリペプチドと融合している抗原を含む。一部の実施形態では、修飾抗原は、治療剤と融合している抗原を含む。一部の実施形態では、修飾抗原は、ターゲティングペプチドと融合している抗原を含む。一部の実施形態では、修飾抗原は、脂質と融合している抗原を含む。一部の実施形態では、修飾抗原は、炭水化物（例えば糖）と融合している抗原を含む。一部の実施形態では、前記抗原は、移植組織に関連した抗原である。一部の実施形態では、前記抗原は、ウイルスに関連する。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、前記狭窄部を通る前に、それと同時に、またはその後に前記抗原と接触する。
【００２３】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−３５、ＩＦＮαまたはＴＧＦβである。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、治療用ポリペプチドの断片である。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、治療用ペプチドである。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、炭水化物（例えば糖）にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、前記狭窄部を通る前に、それと同時に、またはその後に前記寛容原性因子と接触する。一部の実施形態では、前記無核細胞の半減期は、減少する。一部の実施形態では、前記無核細胞の半減期は、増加する。
【００２４】
免疫応答が抑制される実施形態では、前記免疫応答は、少なくとも約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％または約２００％よりも多く抑制される。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答は、Ｔ細胞応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞活性化の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞生存の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞増殖の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞機能性の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞表現型の変化を含む。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答は、Ｔ細胞の非共刺激活性化を含む。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答は、Ｔｒｅｇ応答の増強を含む。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答は、Ｂ細胞応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｂ細胞応答の減少は、抗体産生の減少を含む。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答は、サイトカイン産生の減少を含む。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答は、自己免疫応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答は、アレルギー応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答は、前記移植組織に対する免疫応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答は、前記ウイルスへの病原性免疫応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答は、治療剤に対する免疫応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答は、治療ビヒクルに対する免疫応答の減少を含む。
【００２５】
寛容性が誘導される実施形態では、前記寛容性は、Ｔ細胞応答の減少を含むことができる。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞活性化の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞生存の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞増殖の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞機能性の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞表現型の変化を含む。一部の実施形態では、前記寛容性は、Ｔ細胞の非共刺激活性化を含む。一部の実施形態では、前記寛容性は、Ｔｒｅｇ応答の増強を含む。一部の実施形態では、前記寛容性は、Ｂ細胞応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｂ細胞応答の減少は、抗体産生の減少を含む。一部の実施形態では、前記寛容性は、サイトカイン産生の減少を含む。一部の実施形態では、前記寛容性は、自己免疫応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記寛容性は、アレルギー応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記寛容性は、移植組織に対する免疫応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記寛容性は、前記ウイルスへの病原性免疫応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記寛容性は、治療剤に対する免疫応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記寛容性は、治療ビヒクルに対する免疫応答の減少を含む。
【００２６】
改変無核細胞が個体に投与される一部の実施形態では、方法は、上記に説明する改変無核細胞の少なくとも１回の（例えば少なくとも２、３、４、５、６回またはそれよりも多い）さらなる投与をさらに含む。一部の実施形態では、任意の２回の投与の間の時間間隔（duration  of  time）は、少なくとも１日、１週、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月または１年である。
【００２７】
本発明のある特定の態様は、上記に挙げる方法のいずれか１つで使用するための、前記狭窄部、細胞懸濁液および抗原を含む系に関する。本発明のある特定の態様は、上記に挙げる方法のいずれか１つで使用するための、前記狭窄部、細胞懸濁液および寛容原性因子を含む系に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ヒトＲＢＣへのＩｇＧ抗体（図１Ａ）およびデキストラン粒子（図１Ｂ）の狭窄部媒介性の送達（ＳＱＺ）後の蛍光をエンドサイトーシス対照と比べて示す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。
【００２９】
【図２】図２Ａは、ヒトＲＢＣへのＩｇＧ抗体およびデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の送達効率を示す。図２Ｂは、ヒトＲＢＣへのＩｇＧ抗体およびデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の推定細胞生存率を示す。
【００３０】
【図３Ａ】図３Ａは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体の狭窄部媒介性の送達後の蛍光を示す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。図３Ｂは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体の狭窄部媒介性の送達後の推定細胞生存率を示す。図３Ｃは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体の狭窄部媒介性の送達後の送達効率を示す。
【図３ＢＣ】図３Ａは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体の狭窄部媒介性の送達後の蛍光を示す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。図３Ｂは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体の狭窄部媒介性の送達後の推定細胞生存率を示す。図３Ｃは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体の狭窄部媒介性の送達後の送達効率を示す。
【００３１】
【図４ＡＢＣ】図４Ａ〜Ｉは、２ｐｓｉ（図４Ｄ）、４ｐｓｉ（図４Ｅ）、６ｐｓｉ（図４Ｆ）、１０ｐｓｉ（図４Ｇ）、２０ｐｓｉ（図４Ｈ）での、または手動シリンジ圧力（図４Ｉ）を使用してのマウスＲＢＣへのデキストラン粒子の送達をエンドサイトーシス（図４Ａ）、陰性対照（図４Ｂ）、および材料無し対照（図４Ｃ）と比べて実証する例示的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図４ＤＥＦ】図４Ａ〜Ｉは、２ｐｓｉ（図４Ｄ）、４ｐｓｉ（図４Ｅ）、６ｐｓｉ（図４Ｆ）、１０ｐｓｉ（図４Ｇ）、２０ｐｓｉ（図４Ｈ）での、または手動シリンジ圧力（図４Ｉ）を使用してのマウスＲＢＣへのデキストラン粒子の送達をエンドサイトーシス（図４Ａ）、陰性対照（図４Ｂ）、および材料無し対照（図４Ｃ）と比べて実証する例示的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図４ＧＨＩ】図４Ａ〜Ｉは、２ｐｓｉ（図４Ｄ）、４ｐｓｉ（図４Ｅ）、６ｐｓｉ（図４Ｆ）、１０ｐｓｉ（図４Ｇ）、２０ｐｓｉ（図４Ｈ）での、または手動シリンジ圧力（図４Ｉ）を使用してのマウスＲＢＣへのデキストラン粒子の送達をエンドサイトーシス（図４Ａ）、陰性対照（図４Ｂ）、および材料無し対照（図４Ｃ）と比べて実証する例示的なＦＡＣＳプロットを示す。
【００３２】
【図５Ａ】図５Ａは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の推定細胞生存率を示す。図５Ｂは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体またはデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の送達効率を示す。図５Ｃは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体またはデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の幾何平均の蛍光を示す。
【図５ＢＣ】図５Ａは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の推定細胞生存率を示す。図５Ｂは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体またはデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の送達効率を示す。図５Ｃは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体またはデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の幾何平均の蛍光を示す。
【００３３】
【図６ＡＢ】図６Ａは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の蛍光を示す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。図６Ｂは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の推定細胞生存率を示す。図６Ｃは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の送達効率を示す。図６Ｄは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の幾何平均の蛍光を示す。
【図６ＣＤ】図６Ａは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の蛍光を示す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。図６Ｂは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の推定細胞生存率を示す。図６Ｃは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の送達効率を示す。図６Ｄは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の狭窄部媒介性の送達後の幾何平均の蛍光を示す。
【００３４】
【図７】図７は、処置スケジュールの図解を示す。
【００３５】
【図８】図８は、４つの処置群のマウスでのＯＴ−Ｉ特異的Ｔ細胞の数を示す。
【００３６】
【図９】図９は、高レベルのＩＦＮ−γを発現した脾臓Ｔ細胞のパーセント（左）およびＩＦＮ−γ産生レベル（右）を示す。
【００３７】
【図１０】図１０は、全てのＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちのＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞の割合（上図）およびＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞のうちのＩＦＮ−γ応答性Ｔ細胞の割合（下図）の代表的なフローサイトグラムを示す。
【００３８】
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、代表的な処置スケジュールの図解を示す。
【００３９】
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、代表的な処置スケジュールの図解を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、無核細胞を含有する細胞懸濁液を狭窄部に通し、該無核細胞への抗原および／または寛容原性因子の送達を可能にすることによる、個体において寛容性を誘導する方法および／または免疫応答を抑制する方法を提供する。一部の実施形態では、前記狭窄部は、マイクロ流体チャネルの中に含有される。一部の実施形態では、前記狭窄部は、孔であるか、または孔の中に含有される。
【００４１】
本開示のある特定の態様は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法および／または該抗原への免疫応答を抑制するための方法であって、無核細胞を含有する細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入するステップとを含み、寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導し、かつ／または該抗原への免疫応答を抑制する、方法に関する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、前記寛容性および／または免疫抑制は、抗原特異的である。一部の実施形態では、前記寛容性および／または免疫抑制は非特異的であり、複数の抗原への寛容性および／または免疫応答の抑制を含む。
【００４２】
本開示のある特定の態様は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法および／または抗原への免疫応答を抑制するための方法であって、無核細胞を含有する細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、該細胞と接触した抗原および寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入し、それによって該抗原への寛容性を誘導し、かつ／または該抗原への免疫応答を抑制するステップとを含む、方法に関する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境において提示される。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境を発生させるか、または促進し、該寛容原性環境における前記抗原の提示は、該抗原への寛容性を誘導し、かつ／または該抗原への免疫応答を抑制する。例えば、一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境において作用して、該環境の該寛容原性性質をさらに増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、非寛容原性環境において作用して、寛容原性環境を発生させる。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、前記寛容性および／または免疫抑制は、抗原特異的である。一部の実施形態では、前記寛容性および／または免疫抑制は非特異的であり、複数の抗原への寛容性および／または免疫応答の抑制を含む。
【００４３】
本開示のある特定の態様は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法および／または抗原への免疫応答を抑制するための方法であって、無核細胞を含有する細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入し、それによって抗原への寛容性を誘導し、かつ／または抗原への免疫応答を抑制するステップとを含む、方法に関する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境を発生させるか、または促進し、該寛容原性環境における抗原の提示は、該抗原への寛容性を誘導し、かつ／または該抗原への免疫応答を抑制する。一部の実施形態では、前記寛容性および／または免疫抑制は、抗原特異的である。一部の実施形態では、前記寛容性および／または免疫抑制は非特異的であり、複数の抗原への寛容性および／または免疫応答の抑制を含む。
【００４４】
Ｉ．一般技術
本明細書で記載または参照される技術および手順は、一般によく理解されており、当業者によって従来の方法論、例えば、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual（Sambrookら、第４版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、２０１２年）；Current  Protocols  in  Molecular  Biology（F.M.  Ausubelら編、２００３年）；Methods  in  Enzymologyシリーズ（Academic  Press,  Inc.）；PCR  2:  A  Practical  Approach（M.J.  MacPherson、B.D.  HamesおよびG.R.  Taylor編、１９９５年）；Antibodies,  A  Laboratory  Manual（HarlowおよびLane編、１９８８年）；Culture  of  Animal  Cells:  A  Manual  of  Basic  Technique  and  Specialized  Applications（R.I.  Freshney、第６版、J.  Wiley  and  Sons、２０１０年）；Oligonucleotide  Synthesis（M.J.  Gait編、１９８４年）；Methods  in  Molecular  Biology、Humana  Press；Cell  Biology:  A  Laboratory  Notebook（J.E.  Cellis編、Academic  Press、１９９８年）；Introduction  to  Cell  and  Tissue  Culture（J.P.  MatherおよびP.E.  Roberts、Plenum  Press、１９９８年）；Cell  and  Tissue  Culture:  Laboratory  Procedures（A.  Doyle、J.B.  GriffithsおよびD.G.  Newell編、J.  Wiley  and  Sons、１９９３〜８年）；Handbook  of  Experimental  Immunology（D.M.  WeirおよびC.C.  Blackwell編、１９９６年）；Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells（J.M.  MillerおよびM.P.  Calos編、１９８７年）；PCR:  The  Polymerase  Chain  Reaction（Mullisら編、１９９４年）；Current  Protocols  in  Immunology（J.E.  Coliganら編、１９９１年）；Short  Protocols  in  Molecular  Biology（Ausubelら編、J.  Wiley  and  Sons、２００２年）；Immunobiology（C.A.  Janewayら、２００４年）；Antibodies（P.  Finch、１９９７年）；Antibodies:  A  Practical  Approach（D.  Catty.編、IRL  Press、１９８８〜１９８９年）；Monoclonal  Antibodies:  A  Practical  Approach（P.  ShepherdおよびC.  Dean編、Oxford  University  Press、２０００年）；Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual（E.  HarlowおよびD.  Lane、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９９９年）；The  Antibodies（M.  ZanettiおよびJ.  D.  Capra編、Harwood  Academic  Publishers、１９９５年）；およびCancer:  Principles  and  Practice  of  Oncology（V.T.  DeVitaら編、J.B.  Lippincott  Company、２０１１年）に記載される広く利用される方法論などを使用して普通に用いられる。
【００４５】
ＩＩ．定義
この明細書の解釈のために、以下の定義が適用され、該当する限り、単数で使用される用語は複数形も含み、逆もまた同じである。下に示される任意の定義が参照により本明細書に組み込まれる任意の文献と矛盾する場合には、示される定義が優先される。
【００４６】
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、特に明記しない限り複数の参照物を含む。
【００４７】
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」ことを含むものと理解される。
【００４８】
本明細書で使用される用語「約」は、この技術分野の当業者に容易に分かる、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書で「約」のついた値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。
【００４９】
本明細書で使用される用語「孔」は、材料の中の穴、裂け目、空洞、開口、亀裂、空隙または穿孔を限定されずに含む、開口部を指す。一部の例では、（示される場合）用語は本開示の表面の中の孔を指す。他の例では、（示される場合）孔は、細胞膜中の孔を指すことができる。
【００５０】
本明細書で使用される用語「膜」は、孔を含有する選択的障壁またはシートを指す。用語は、境界またはライニングとして作用する柔軟なシート様構造を含む。一部の例では、用語は、孔を含有する表面またはフィルターを指す。この用語は、用語「細胞膜」とは異なる。
【００５１】
本明細書で使用される用語「フィルター」は、孔を通した選択的通過を可能にする多孔性物品を指す。一部の例では、用語は、孔を含有する表面または膜を指す。
【００５２】
本明細書で使用される用語「不均一な」は、構造または組成が混成しているかまたは均一でない物を指す。一部の例では、用語は、所与の表面の中の様々なサイズ、形または分布を有する孔を指す。
【００５３】
本明細書で使用される用語「均一な」は、構造または組成全体が一貫しているかまたは均一である物を指す。一部の例では、用語は、所与の表面の中の一貫したサイズ、形または分布を有する孔を指す。
【００５４】
本明細書で使用される用語「異種」は、異なる生物体に由来する分子を指す。一部の例では、用語は、所与の生物体の中で通常は見出されないかまたは発現されない核酸またはタンパク質を指す。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「阻害する」は、特定の標的の存在または活性を遮断する、低減する、排除する、さもなければ拮抗する作用を指すことができる。阻害は、部分的な阻害または完全な阻害を指すことができる。例えば、免疫応答を阻害することは、免疫応答の遮断、低減、排除または任意の他の拮抗につながる任意の作用を指すことができる。他の例では、核酸の発現の阻害には、これらに限定されないが、核酸の転写の低減、ｍＲＮＡ存在度の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写サイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害、遺伝子編集などを含めることができる。他の例では、タンパク質の発現の阻害には、これらに限定されないが、タンパク質をコードする核酸の転写の低減、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の低減、タンパク質の翻訳の阻害、タンパク質の安定性の低減などを含めることができる。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「抑制する」は、特定の標的の存在または活性を低下させる、低減する、妨げる、制限する、減少させる、さもなければ減弱させる作用を指すことができる。抑制は、部分的な抑制または完全な抑制を指すことができる。例えば、免疫応答を抑制することは、免疫応答を低下させる、低減する、妨げる、制限する、減少させる、さもなければ減弱させることにつながる任意の作用を指すことができる。他の例では、核酸の発現の抑制には、これらに限定されないが、核酸の転写の低減、ｍＲＮＡ存在度の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写サイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害などを含めることができる。他の例では、タンパク質の発現の抑制には、これらに限定されないが、タンパク質をコードする核酸の転写の低減、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の低減、タンパク質の翻訳の阻害、タンパク質の安定性の低減などを含めることができる。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「増強する」は、特定の標的の存在または活性を向上させる、増進する、強化する、さもなければ増加させる行為を指すことができる。例えば、免疫応答を増強することは、免疫応答を向上させる、増進する、強化する、さもなければ増加させることにつながる任意の作用を指すことができる。他の例では、核酸の発現を増強することには、これらに限定されないが、核酸の転写の増加、ｍＲＮＡ存在度の増加（例えば、ｍＲＮＡの転写の増加）、ｍＲＮＡの分解の減少、ｍＲＮＡ翻訳の増加などを含めることができる。他の例では、タンパク質の発現を増強することには、これらに限定されないが、タンパク質をコードする核酸の転写の増加、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の増加、タンパク質の翻訳の増加、タンパク質の安定性の増加などを含めることができる。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「誘導する」は、結果を開始する、促進する、刺激する、確立する、さもなければ生じさせる作用を指すことができる。例えば、免疫応答を誘導することは、所望の免疫応答を開始する、促進する、刺激する、確立する、さもなければ生じさせることにつながる任意の作用を指すことができる。他の例では、核酸の発現を誘導することには、これらに限定されないが、核酸の転写の開始、ｍＲＮＡの翻訳の開始などを含めることができる。他の例では、タンパク質の発現を誘導することには、これらに限定されないが、タンパク質をコードする核酸の転写の増加、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の増加、タンパク質の翻訳の増加、タンパク質の安定性の増加などを含めることができる。
【００５９】
本明細書で使用される用語「同種」は、同じ生物体に由来する分子を指す。一部の例では、用語は、所与の生物体の中で通常見出されるかまたは発現される核酸またはタンパク質を指す。
【００６０】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む任意の長さのヌクレオチドのポリマー形を指す。したがって、この用語には、これらに限定されないが、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基およびピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれる。ポリヌクレオチドの骨格は、（ＲＮＡまたはＤＮＡで一般的に見出され得る）糖およびリン酸基、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドの骨格は、ペプチド結合によって連結される、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンなどの反復単位を含むことができる（すなわち、ペプチド核酸）。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミデートなどの合成サブユニットのポリマーを含むことができ、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミデート（Ｐ−ＮＨ２）または混合されたホスホロアミデート−ホスホジエステルオリゴマーであってよい。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、適当な条件下で鎖をアニールすることによるか、または適当なプライマーによるＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を新規に合成することによるかのいずれかで、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド生成物から得ることができる。
【００６１】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用され、最小長に限定されない。アミノ酸残基のそのようなポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有することができ、これらに限定されないが、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体および多量体が含まれる。完全長タンパク質およびその断片の両方は、定義により包含される。用語は、ポリペプチドの発現後の修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然の配列への改変、例えば欠失、付加および置換（一般的に本来保存的な）を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発を通じて意図的であってもよく、または、例えばタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅によるエラーを通じて偶然であってもよい。
【００６２】
本明細書に記載される構造的および機能的特徴のいずれかについて、これらの特徴を決定する方法は、当技術分野で公知である。
【００６３】
ＩＩＩ．免疫抑制および寛容性
ある特定の態様では、本発明は、個体において免疫応答を抑制するための方法および／または寛容性を誘導するための方法であって、無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原および／または寛容原性化合物が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入するステップとを含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法を提供する。
【００６４】
免疫学的寛容性は、寛容性が誘導された抗原でのチャレンジへの免疫学的無応答性である。寛容性は、被験体が前記寛容性誘導抗原での次なるチャレンジに無応答性である場合に、示される。寛容性は、自己反応性細胞のアポトーシス、アネルギーの誘導またはリンパ球表現型の偏向を含むいくつかの異なる機構により媒介され得る。一部の実施形態では、前記寛容性は、特異的抗原への免疫応答の脱活性化を引き起こす、Ｔ細胞無応答性を含み得る。また、寛容性は、免疫抑制サイトカインの分泌を通して、かつ細胞表面分子または細胞毒性因子との接触依存的相互作用を介して調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）により媒介され得る。寛容原性機構における欠陥は、自己免疫疾患、移植拒絶、抗薬物応答およびウイルス感染への病原性応答に寄与し得る。免疫抑制は、免疫応答の活性における減少である。例えば、免疫抑制として、抗原でのチャレンジへの応答性の減少、免疫細胞活性化および増殖の減少、サイトカイン分泌の調節、免疫細胞生存の減少または免疫細胞エフェクター機能の減少を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記免疫抑制は、所与の抗原について特異的である。例えば、自己抗原に対する免疫応答は、抑制される。
【００６５】
一部の実施形態では、抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされ、提示される。寛容原性環境は、寛容原性免疫応答の発生を支持する体内の位置であり得る。一部の実施形態では、前記寛容原性環境は、一次リンパ性組織、例えば胸腺に位置する。一部の実施形態では、前記寛容原性環境は、二次リンパ性組織に位置する。二次リンパ性組織の例として、脾臓、リンパ節および粘膜関連リンパ性組織（ＭＡＬＴ）が挙げられる。一部の実施形態では、前記寛容原性環境は、脾臓に位置する。一部の実施形態では、前記寛容原性環境は、非リンパ性組織、例えば肝臓に位置する。一部の実施形態では、前記寛容原性環境は、寛容原性因子の送達により炎症部位で誘導される。例えば、炎症性環境は、寛容原性因子により寛容原性環境に変換される。
【００６６】
一部の実施形態では、本発明は、無核細胞への送達のための方法であって、該細胞が、哺乳動物細胞である、方法を提供する。無核細胞は、核を欠く。一部の実施形態では、前記無核細胞は、サル細胞、マウス細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞またはウサギ細胞である。一部の実施形態では、前記無核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、前記無核細胞は、非哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記無核細胞は、ニワトリ細胞、カエル細胞、昆虫細胞、魚類細胞または線虫細胞である。一部の実施形態では、前記無核細胞は、赤血球である。赤血球（ＲＢＣ）は、柔軟であり、酸素担体生体分子ヘモグロビンを多く含む細胞質を有する楕円形両凹面円板である。ＲＢＣは、ヒト体内全体を通した酸素送達および二酸化炭素除去のための主要手段として働く。ＲＢＣは最大１２０日間循環中に留まることができ、その後、それらは脾臓におけるクリアランスにより身体から除去される。網状赤血球は、無核未成熟（まだ両凹面でない）赤血球であり、典型的にヒト体内の赤血球の約１％を構成する。成熟赤血球（ｍａｔｕｒｅ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）は、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）とも呼ばれる。一部の実施形態では、前記無核細胞は、血小板である。血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）は、血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）とも呼ばれ、その機能が血液凝固に関連する血液の構成成分である。血小板は、直径２〜３μｍの両凸面円板状（レンズ状）構造である。
【００６７】
一部の実施形態では、前記寛容原性環境における抗原の提示は、該抗原への免疫応答を抑制するか、または該抗原への寛容原性応答を誘導する。脾臓の寛容原性環境において普通は取り除かれるアポトーシス細胞、例えばＲＢＣ由来の抗原は、反応性Ｔ細胞の欠失（例えば殺滅）またはアネルギーを介して該抗原への寛容性を駆動し、かつ／または該抗原への免疫応答を抑制し得る。一部の実施形態では、前記寛容性および／または免疫抑制は、抗原特異的である。ＲＢＣは、限定的な寿命を有し、自己修復できず、アポトーシスに類似のプロセスであるエリプトーシス（ｅｒｙｐｔｏｓｉｓ）によるＲＢＣ死をもたらし、続いて血流から除去される。一部の実施形態では、前記抗原は、前記寛容原性環境内での前記無核細胞のアポトーシスに際して放出される場合があり、それは次に、抗原提示細胞により取り込まれ、プロセシングされ、提示される。一部の実施形態では、前記抗原を含有する前記無核細胞は、抗原提示細胞、例えばマクロファージにより貪食され、該抗原は続いて、該抗原提示細胞によりプロセシングされ、提示される。
【００６８】
一部の実施形態では、前記無核細胞の半減期は、改変することができる。一部の実施形態では、前記無核細胞の半減期は、増加する。例えば、前記無核細胞（the  anucleate）は、該無核細胞が脾臓におけるクリアランス前に血流中で循環する時間を増加させるように改変することができる。一部の実施形態では、前記無核細胞の半減期は、減少する。例えば、前記無核細胞は、該無核細胞が脾臓におけるクリアランス前に血流中で循環する時間を減少させるように改変することができる。一部の実施形態では、前記無核細胞表面上の脂質比の変更は、該無核細胞の半減期を減少させる。例えば、前記無核細胞の表面上のホスファチジルセリンの存在は、例えば表面ホスファチジルセリンを増加させるための本分野で公知の任意の方法を使用することにより、該無核細胞の半減期を減少させるために増加させることができる（Hamidiら、J.  Control.  Release、２００７年、１１８巻（２号）：１４５〜６０頁を参照のこと）。外側細胞膜上へのホスファチジルセリン露出は、アポトーシスの特徴であり、取込みを促進する様式で食細胞上の受容体により認識される。一部の実施形態では、前記無核細胞を、個体への送達前に脂質とインキュベートする。一部の実施形態では、前記無核細胞を、該無核細胞の半減期を減少させるためにポリマーと会合させる。
【００６９】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への免疫応答を抑制するための方法であって、無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入するステップとを含み、寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法を提供する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、前記免疫応答は、抗原特異的である。
【００７０】
ある特定の態様では、本発明は、個体において免疫応答を抑制するための方法であって、無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入し、それによって免疫応答を抑制するステップとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境を発生させるか、または促進し、該寛容原性環境における該抗原の提示は、該抗原への免疫応答を抑制する。一部の実施形態では、前記免疫抑制は非特異的であり、複数の抗原への免疫応答の抑制を含む。
【００７１】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への免疫応答を抑制するための方法であって、無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原および寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入し、それによって該抗原への免疫応答を抑制するステップとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境において提示される。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境を発生させるか、または促進し、該寛容原性環境における該抗原の提示は、該抗原への免疫応答を抑制する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、前記免疫抑制は、抗原特異的である。一部の実施形態では、前記免疫抑制は非特異的であり、複数の抗原への免疫応答の抑制を含む。
【００７２】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への免疫応答を抑制するための方法であって、第１の無核細胞を含む第１の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、第２の無核細胞を含む第２の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該第１の無核細胞および第２の無核細胞を導入し、それによって該抗原への免疫応答を抑制するステップとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境において提示される。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境を発生させるか、または促進し、該寛容原性環境における該抗原の提示は、該抗原への免疫応答を抑制する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、前記第１の無核細胞および第２の無核細胞を、同時に導入する。一部の実施形態では、前記第１の無核細胞および第２の無核細胞を、逐次的に導入する。一部の実施形態では、前記第１の無核細胞を、前記第２の無核細胞の導入前に前記個体に導入する。一部の実施形態では、前記第１の無核細胞を、前記第２の無核細胞の導入前の約１分、５分、１０分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間または２４時間のいずれかより長い時間、前記個体に導入する。一部の実施形態では、前記第２の無核細胞を、前記第１の無核細胞の導入前に個体に導入する。一部の実施形態では、前記第２の無核細胞を、前記第１の無核細胞の導入前の約１分、５分、１０分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間または２４時間のいずれかより長い時間、前記個体に導入する。一部の実施形態では、前記免疫抑制は、抗原特異的である。一部の実施形態では、前記免疫抑制は非特異的であり、複数の抗原への免疫応答の抑制を含む。
【００７３】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法であって、無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入するステップとを含み、寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法を提供する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、前記寛容性は、抗原特異的である。
【００７４】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法であって、無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入し、それによって該抗原への寛容性を誘導するステップとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境を発生させるか、または促進し、該寛容原性環境における前記抗原の提示は、該抗原への寛容性を誘導する。一部の実施形態では、前記寛容性は非特異的であり、複数の抗原への寛容性を含む。
【００７５】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法であって、無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原および寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該無核細胞を導入し、それによって該抗原への寛容性を誘導するステップとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境において提示される。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境を発生させるか、または促進し、該寛容原性環境における前記抗原の提示は、該抗原への寛容性を誘導する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、前記寛容性は、抗原特異的である。一部の実施形態では、前記寛容性は非特異的であり、複数の抗原への寛容性を含む。
【００７６】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法であって、第１の無核細胞を含む第１の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、第２の無核細胞を含む第２の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、該個体に該第１の無核細胞および第２の無核細胞を導入し、それによって該抗原への寛容性を誘導するステップとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境において提示される。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境を発生させるか、または促進し、該寛容原性環境における前記抗原の提示は、該抗原への寛容性を誘導する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、前記第１の無核細胞および第２の無核細胞を、同時に導入する。一部の実施形態では、前記第１の無核細胞および第２の無核細胞を、逐次的に導入する。一部の実施形態では、前記第１の無核細胞を、前記第２の無核細胞の導入前に前記個体に導入する。一部の実施形態では、前記第１の無核細胞を、前記第２の無核細胞の導入前の約１分、５分、１０分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間または２４時間のいずれかより長い時間、前記個体に導入する。一部の実施形態では、前記第２の無核細胞を、前記第１の無核細胞の導入前に前記個体に導入する。一部の実施形態では、前記第２の無核細胞を、前記第１の無核細胞の導入前の約１分、５分、１０分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間または２４時間のいずれかより長い時間、前記個体に導入する。一部の実施形態では、前記寛容性は、抗原特異的である。一部の実施形態では、寛容性は非特異的であり、複数の抗原への寛容性を含む。
【００７７】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、該抗原を含み、該抗原が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法を提供する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、前記寛容性は、抗原特異的である。
【００７８】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への免疫応答を抑制するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、該抗原を含み、該抗原が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法を提供する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、前記免疫抑制は、抗原特異的である。
【００７９】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、寛容原性因子を含み、該寛容原性因子が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、それによって該抗原への寛容性を誘導する、方法を提供する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境を発生させるか、または促進し、該寛容原性環境における前記抗原の提示は、該抗原への寛容性を誘導する。一部の実施形態では、前記寛容性は非特異的であり、複数の抗原への寛容性を含む。
【００８０】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への免疫応答を抑制するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、寛容原性因子を含み、該寛容原性因子が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、それによって該抗原への免疫応答を抑制する、方法を提供する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境を発生させるか、または促進し、該寛容原性環境における前記抗原の提示は、該抗原への免疫応答を抑制する。一部の実施形態では、前記免疫抑制は非特異的であり、複数の抗原への免疫応答の抑制を含む。
【００８１】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への寛容性を誘導するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原および寛容原性因子を含み、該抗原および該寛容原性因子が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原および該寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法を提供する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境を発生させるか、または促進し、該寛容原性環境における前記抗原の提示は、該抗原への寛容性を誘導する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、前記寛容性は、抗原特異的である。一部の実施形態では、前記寛容性は非特異的であり、複数の抗原への寛容性を含む。
【００８２】
ある特定の態様では、本発明は、個体において抗原への免疫応答を抑制するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原および寛容原性因子を含み、該抗原および該寛容原性因子が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原および該寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法を提供する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、寛容原性環境を発生させるか、または促進し、該寛容原性環境における前記抗原の提示は、該抗原への免疫応答を抑制する。一部の実施形態では、前記抗原は、寛容原性環境においてプロセシングされる。一部の実施形態では、前記免疫抑制は、抗原特異的である。一部の実施形態では、前記免疫抑制は非特異的であり、複数の抗原への免疫応答の抑制を含む。
【００８３】
ある特定の態様では、本発明は、個体に無核細胞を送達するステップを含む、該個体において寛容原性環境に抗原を導入するための方法であって、ここで、該無核細胞が、該抗原を含み、該抗原が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、方法を提供する。一部の実施形態では、前記抗原は、前記寛容原性環境において提示される。一部の実施形態では、前記抗原は、前記寛容原性環境においてプロセシングされる。
【００８４】
ある特定の態様では、本発明は、個体に無核細胞を送達するステップを含む、該個体において寛容原性環境を発生させるための方法であって、ここで、該無核細胞が、寛容原性因子を含み、該寛容原性因子が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、方法を提供する。一部の実施形態では、前記寛容原性環境における前記抗原の提示は、該抗原への寛容性を誘導し、かつ／または該抗原への免疫応答を抑制する。一部の実施形態では、前記寛容性および／または免疫抑制は非特異的であり、複数の抗原への寛容性および／または免疫応答の抑制を含む。
【００８５】
一部の実施形態では、前記免疫応答は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれかまで抑制される。一部の実施形態では、前記抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、Ｔ細胞応答の減少を含む。例えば、Ｔ細胞応答の減少には、限定されずに、Ｔ細胞活性化もしくは増殖の減少、Ｔ細胞生存の減少、または細胞機能性の減少を含めることができる。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞活性化の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞生存の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞増殖の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞応答の減少は、Ｔ細胞機能性の減少を含む。例えば、Ｔ細胞機能性の減少には、限定されずに、サイトカイン分泌のモジュレーション、炎症部位へのＴ細胞移動の減少およびＴ細胞細胞傷害活性の低下を含めることができる。一部の実施形態では、前記抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、炎症性サイトカインの産生および／もしくは分泌の減少、ならびに／または抗炎症性サイトカインの産生および／もしくは分泌の増加を含む。一部の実施形態では、前記抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）から選択される１つまたは複数の炎症性サイトカインの産生および／または分泌の減少を含む。一部の実施形態では、前記抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−３５、ＩＦＮ−アルファおよびトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）から選択される１つまたは複数の抗炎症性サイトカインの産生および／または分泌の減少を含む。一部の実施形態では、前記抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、Ｔ細胞表現型の変化を含む。例えば、前記Ｔ細胞の状態は、炎症誘発性表現型から調節性または抗炎症性の表現型に変化することができる。一部の実施形態では、前記抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、Ｔ細胞の非共刺激活性化を含み、それは細胞死にその後つながる可能性がある。一部の実施形態では、前記抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、Ｔｒｅｇ応答の増強を含む。一部の実施形態では、前記抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、Ｂ細胞応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記Ｂ細胞応答の減少は、抗体産生の減少を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、抑制される免疫応答および／または誘導される寛容性は、自己免疫応答の減少を含む。例えば、前記自己免疫応答の減少として、Ｉ型糖尿病；関節リウマチ；乾癬；多発性硬化症；アルツハイマー病、ＡＬＳ、ハンチントン病およびパーキンソン病などの免疫構成要素を有し得る神経変性疾患；全身性エリテマトーデス；シェーグレン症候群；クローン病または潰瘍性大腸炎に関連した抗原に対する免疫応答の減少または寛容性の誘導を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答および／または誘導される寛容性は、アレルギー応答の減少を含む。例えば、前記アレルギー応答の減少として、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）または食物アレルギーに関連した抗原に対する免疫応答の減少または寛容性の誘導を挙げることができる。一部の実施形態では、前記抗原は、移植組織に関連した抗原である。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答および／または誘導される寛容性は、前記移植組織に対する免疫応答の減少または寛容性の誘導を含む。一部の実施形態では、前記抗原は、ウイルスに関連する。一部の実施形態では、前記抑制される免疫応答および／または誘導される寛容性は、前記ウイルスへの病原性免疫応答の減少または該ウイルスへの寛容性の誘導を含む。例えば、前記病原性免疫応答は、ある特定のウイルス感染症により発生したサイトカインストームを含み得る。サイトカインストームは、サイトカインと白血球との間の正のフィードバックループからなる潜在的に致死的な免疫反応である。
【００８７】
一部の実施形態では、前記抑制された免疫応答は、治療剤に対する免疫応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記治療剤は凝固因子である。例示的な凝固因子には、限定されずに、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子が含まれる。一部の実施形態では、前記治療剤は、抗体である。例示的な治療抗体には、限定されずに、抗ＴＮＦα、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０、抗ＩＬ−２Ｒ、抗Ｈｅｒ２、抗ＲＳＶＦ、抗ＣＥＡ、抗ＩＬ−１ベータ、抗ＣＤ１５、抗ミオシン、抗ＰＳＭＡ、抗４０ｋＤａ糖タンパク質、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ５２、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１ａ、抗ＥＧＦＲ、抗Ｃ５、抗アルファ−４インテグリン、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３、抗ＩＬ−６Ｒおよび抗ＲＡＮＫＬが含まれる。一部の実施形態では、前記治療剤は、成長因子である。例示的な治療成長因子には、限定されずに、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）ならびに巨核球の分化および成長因子（ＭＤＧＦ）が含まれる。一部の実施形態では、前記治療剤は、ホルモンである。例示的な治療ホルモンには、限定されずに、インスリン、ヒト成長ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンが含まれる。一部の実施形態では、前記治療剤は、組換えサイトカインである。例示的な治療組換えサイトカインには、限定されずに、ＩＦＮβ、ＩＦＮαおよびＧＭ−ＣＳＦが含まれる。一部の実施形態では、前記抑制された免疫応答は、治療ビヒクルに対する免疫応答の減少を含む。一部の実施形態では、前記治療ビヒクルは、遺伝子療法のために使用されるウイルス、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルスまたはレトロウイルスである。一部の実施形態では、前記治療ビヒクルは、リポソームである。一部の実施形態では、前記治療ビヒクルは、ナノ粒子である。
【００８８】
ＩＶ．細胞を変形させる狭窄部を提供するためのマイクロ流体チャネル
一部の実施形態では、本発明は、細胞懸濁液を狭窄部に通すことにより免疫応答を抑制するための方法または寛容性を誘導するための方法であって、抗原または化合物が無核細胞に入るように、マイクロ流体チャネルの中に含有される該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、方法を提供する。一部の実施形態では、複数の狭窄部は、マイクロ流体チャネルの中に並列に、かつ／または直列に置いてもよい。本明細書で開示する方法で使用するための細胞を変形させる狭窄部を含有するマイクロ流体チャネルの例は、ＷＯ２０１３０５９３４３に記載されている。本明細書で開示する方法で使用するための孔を有する表面の例は、２０１５年９月４日出願の米国仮出願第６２／２１４，８２０号に記載されている。
【００８９】
一部の実施形態では、マイクロ流体チャネルは、ルーメンを含み、緩衝液中に懸濁した細胞が通ることができるように構成されており、該マイクロ流体チャネルは、狭窄部を含む。前記マイクロ流体チャネルは、シリコン、金属（例えばステンレススチール）、プラスチック（例えばポリスチレン、ＰＥＴ、ＰＥＴＧ）、セラミックス、ガラス、結晶基板、非晶質基板またはポリマー（例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ＰＤＭＳ、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）など）を含む、いくつかの材料のいずれか１つで作ることができる。マイクロ流体チャネルの製作は、乾式エッチング、湿式エッチング、フォトリソグラフィ、射出成形、レーザー焼灼術またはＳＵ−８マスクを含む、本分野で公知の任意の方法により実行することができる。
【００９０】
一部の実施形態では、前記マイクロ流体チャネルの中の前記狭窄部は、入口部分、中心点および出口部分を含む。一部の実施形態では、前記マイクロ流体チャネルの中の前記狭窄部の長さ、深さおよび幅は、変動し得る。一部の実施形態では、前記マイクロ流体チャネルの中の前記狭窄部の直径は、前記細胞または細胞クラスターの直径の関数である。一部の実施形態では、前記マイクロ流体チャネルの中の前記狭窄部の直径は、前記細胞の直径の約１０％〜約９９％である。一部の実施形態では、前記狭窄部サイズは、前記細胞直径の約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である。一部の実施形態では、前記狭窄部サイズは、前記細胞（例えばＲＢＣなどの無核細胞）の最小断面距離の約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である。一部の実施形態では、前記チャネルは、約０．２５μｍ〜約４μｍの狭窄部幅を含む。一部の実施形態では、前記チャネルは、約４μｍ、約３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍ（これらの値間の任意の範囲を含む）の幅の狭窄部幅を含む。また、前記チャネル、前記入口部分、前記中心点および前記出口部分の断面は、変動し得る。例えば、前記断面は、形状が円形、楕円形、細長いスリット、正方形、六角形または三角形であってよい。前記入口部分は、狭窄部角を規定し、該狭窄部角は、前記チャネルの目詰まりを低減するように最適化され、前記細胞への化合物の送達の向上のために最適化される。前記出口部分の角度も変動し得る。例えば、前記出口部分の角度は、非層状流動をもたらし得る乱流の可能性を低減するように構成される。一部の実施形態では、前記入口部分および／または前記出口部分の壁は、直線状である。他の実施形態では、前記入口部分および／または前記出口部分の壁は、湾曲している。
【００９１】
Ｖ．細胞を変形させる狭窄部を提供するための孔を有する表面
一部の実施形態では、本発明は、細胞懸濁液を狭窄部に通すことにより免疫応答を抑制するための方法または寛容性を誘導するための方法であって、抗原化合物が無核細胞に入るように、孔であるかまたは孔の中に含有される該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、方法を提供する。一部の実施形態では、前記孔は、表面に含有される。本明細書で開示する方法で使用するための孔を有する表面の例は、２０１５年９月４日出願の米国仮出願第６２／２１４，８２０号に記載されている。
【００９２】
本明細書に開示する表面は、いくつかの材料のいずれか１つから作られたものであってよく、またいくつかの形態のいずれか１つを取ることができる。一部の実施形態では、前記表面はフィルターである。一部の実施形態では、前記表面は膜である。一部の実施形態では、前記フィルターはタンジェンシャルフローフィルターである。一部の実施形態では、前記表面はスポンジまたはスポンジ様マトリックスである。一部の実施形態では、前記表面はマトリックスである。
【００９３】
一部の実施形態では、前記表面は、曲がりくねった経路の表面である。一部の実施形態では、前記曲がりくねった経路の表面は酢酸セルロースを含む。一部の実施形態では、前記表面は、以下に限定されないが、合成または天然ポリマー、ポリカーボネート、シリコン、ガラス、金属、合金、硝酸セルロース、銀、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ、ポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluorethylene）、混合セルロースエステル、磁器、およびセラミックから選択される材料を含む。
【００９４】
本明細書に開示する表面は、当技術分野で公知の任意の形状、例えば三次元形状を有することができる。前記表面の二次元形状は、以下に限定されないが、円形、楕円、丸形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、または八角形であってよい。一部の実施形態では、前記表面は丸形の形状である。一部の実施形態では、前記表面の三次元形状は、円筒形、円錐形、または立方形である。
【００９５】
前記表面は、様々な断面幅および断面厚さを有することができる。一部の実施形態では、前記表面の断面幅は約１ｍｍから約１ｍの間またはこれらの間の任意の断面幅もしくは断面幅の範囲である。一部の実施形態では、前記表面は、規定された厚さを有する。一部の実施形態では、前記表面の厚さは均一である。一部の実施形態では、前記表面の厚さは可変である。例えば、一部の実施形態では、前記表面の部分は、該表面のその他の部分よりも厚いまたは薄い。一部の実施形態では、前記表面の厚さは、約１％から約９０％またはこれらの間の任意のパーセンテージもしくはパーセンテージの範囲で変動する。一部の実施形態では、前記表面は、約０．０１μｍから約５ｍｍの厚さまたはこれらの間の任意の厚さもしくは厚さの範囲である。
【００９６】
一部の実施形態では、前記狭窄部は、孔であるか、または孔の中に含有される。前記孔の断面幅は、処理する細胞の種類に関連する。一部の実施形態では、前記孔サイズは、処理する細胞または細胞クラスター（the  cell  of  cluster  of  cells）の直径の関数である。一部の実施形態では、前記孔サイズは、細胞が前記孔を通る際に摂動されるようなサイズである。一部の実施形態では、前記孔サイズは、細胞の直径未満である。一部の実施形態では、前記孔サイズは、前記細胞の直径の約１０％〜約９９％である。一部の実施形態では、前記孔サイズは、前記細胞直径の約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％である。最適な孔サイズまたは孔の断面幅は、適用および／または細胞型に基づいて変動し得る。一部の実施形態では、前記孔サイズは、約０．１μｍ〜約４μｍである。一部の実施形態では、前記孔サイズは、約４μｍ、約３μｍ、約２μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．２５μｍまたは約０．１μｍである。一部の実施形態では、前記孔の断面幅は、約４μｍ、約３μｍ、約２μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．２５μｍもしくは約０．１μｍのいずれかであるか、またはそれらのいずれか未満である。前記孔通路の入口および出口は、様々な角度を有し得る。前記孔の角度は、細胞が通る間、該孔の目詰まりを最小限にするように選択してもよい。一部の実施形態では、前記表面を通る流速は、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒〜約１００Ｌ／ｃｍ２／秒の間またはその間の任意の速度もしくは速度範囲である。例えば、前記入口部分または出口部分の角度は、約０〜約９０度の間であり得る。一部の実施形態では、入口または出口部分は、９０度より大きくてもよい。一部の実施形態では、前記孔は、同一の入口角度および出口角度を有する。一部の実施形態では、前記孔は、異なる入口角度および出口角度を有する。一部の実施形態では、前記孔の縁部は、平滑、例えば丸形であるまたは湾曲している。平滑な孔の縁部は、出っ張り、隆起、または凹凸の部分を有しない、連続的な、平坦な、かつ凹凸のない表面を有する。一部の実施形態では、前記孔の縁部は、とがっている。とがった孔の縁部は、とがった、または鋭角の薄い縁を有する。一部の実施形態では、前記孔通路は、直線的である。直線的な孔通路は、湾曲、屈曲、角または他の不規則性を有しない。一部の実施形態では、前記孔通路は、湾曲している。湾曲した孔通路は、曲がっているか、または直線からはずれている。一部の実施形態では、前記孔通路は、多数の曲線、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの曲線を有する。
【００９７】
前記孔は、二次元または三次元形状などの当技術分野で公知の任意の形状を有することができる。前記孔の形状（例えば、前記断面形状）は、以下に限定されないが、円形、楕円、丸形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、および八角形であってもよい。一部の実施形態では、前記孔の断面は丸形の形状である。一部の実施形態では、前記孔の三次元形状は円筒形または円錐形である。一部の実施形態では、前記孔は、溝付きの入口および出口の形状を有する。一部の実施形態では、前記孔の形状は、所与の表面の中の孔の間で均一（すなわち、一貫したまたは規則的）である。一部の実施形態では、前記孔の形状は、所与の表面の中の孔の間で不均一（すなわち、混合的または可変）である。
【００９８】
本明細書に記載する表面は、広範な合計の孔数を有することができる。一部の実施形態では、前記孔は、総表面積の約１０％から約８０％に及ぶ。一部の実施形態では、前記表面は、合計で約１．０×１０５個から約１．０×１０３０個の孔またはこれらの間の任意の数または数の範囲を含有する。一部の実施形態では、前記表面は、１ｍｍ２の表面積あたり約１０から約１．０×１０１５個の孔を含む。
【００９９】
前記孔は、所与の表面の中で多数の様式で分布することができる。一部の実施形態では、前記孔は、所与の表面の中で並列に分布する。一つのそのような例では、前記孔は、同一方向に並んで分布し、かつ所与の表面の中で同じ距離だけ離れている。一部の実施形態では、前記孔の分布は、規則正しいまたは均一である。一つのそのような例では、前記孔は、規則的な系統的パターンで分布しており、または所与の表面の中で同じ距離だけ離れている。一部の実施形態では、前記孔の分布は、ランダムまたは不均一である。一つのそのような例では、前記孔は、不規則で無秩序なパターンで分布しており、または所与の表面の中で異なる距離だけ離れている。一部の実施形態では、複数の表面が、列をなして分布する。前記複数の表面は、表面サイズ、形状、および／または粗さについて均一または不均一であってよい。前記複数の表面は、均一または不均一な孔径、形状、および／または数の孔をさらに含有し、それによって異なる細胞型への一連の化合物の同時の送達を可能とすることができる。
【０１００】
一部の実施形態では、個々の孔は、一様な幅寸法（すなわち、該孔の通路の長さに沿って一定の幅）を有する。一部の実施形態では、個々の孔は、可変の幅（すなわち、該孔の通路の長さに沿って増加または減少する幅）を有する。一部の実施形態では、所与の表面の中の孔は、同じ個々の孔の深さを有する。一部の実施形態では、所与の表面の中の孔は、異なる個々の孔の深さを有する。一部の実施形態では、前記孔は、互いにすぐ隣にある。一部の実施形態では、前記孔は、ある距離だけ互いに離れている。一部の実施形態では、前記孔は、約０．００１μｍから約３０ｍｍの距離またはこれらの間の任意の距離もしくは距離の範囲だけ互いに離れている。
【０１０１】
一部の実施形態では、前記表面は材料でコーティングされている。前記材料は、以下に限定されないが、Ｔｅｆｌｏｎ、粘着剤コーティング、界面活性剤、タンパク質、接着分子、抗体、抗凝固剤、細胞機能をモジュレートする因子、核酸、脂肪、炭水化物、または膜貫通タンパク質などの当技術分野で公知の任意の材料から選択することができる。一部の実施形態では、前記表面はポリビニルピロリドンでコーティングされている。一部の実施形態では、前記材料は前記表面に共有結合的に付着している。一部の実施形態では、前記材料は前記表面に非共有結合的に付着している。一部の実施形態では、前記表面分子は、前記細胞が前記孔を通過する際に放出される。
【０１０２】
一部の実施形態では、前記表面は、改質された化学的特性を有する。一部の実施形態では、前記表面は親水性である。一部の実施形態では、前記表面は疎水性である。一部の実施形態では、前記表面は帯電している。一部の実施形態では、前記表面は正および／または負に帯電している。一部の実施形態では、前記表面は、一部の領域で正に帯電し、かつその他の領域で負に帯電していてもよい。一部の実施形態では、前記表面は、全体として正または全体として負の電荷を有する。一部の実施形態では、前記表面は、平滑であるか、電解研磨されているか、粗いか、またはプラズマ処理されているかのいずれか１つであってもよい。一部の実施形態では、前記表面は、両性イオンまたは二極性化合物を含む。一部の実施形態では、前記表面はプラズマ処理されている。
【０１０３】
一部の実施形態では、前記表面は、より大きなモジュールの中に含有される。一部の実施形態では、前記表面は、プラスチックまたはガラスシリンジなどのシリンジの中に含有される。一部の実施形態では、前記表面は、プラスチックフィルターホルダーの中に含有される。一部の実施形態では、前記表面は、ピペットチップの中に含有される。
【０１０４】
ＶＩ．細胞摂動
一部の実施形態では、本発明は、細胞懸濁液を狭窄部に通すことにより免疫応答を抑制するための方法または寛容性を誘導するための方法であって、抗原または化合物が無核細胞に入るように、該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該細胞における該摂動が、該細胞外からの材料が該細胞内に移動することを可能にする該細胞における割れ目（例えば穴、裂孔、腔、開口部、孔、裂け目、間隙、穿孔）である、方法を提供する。前記変形は、例えば機械的歪みおよび／または剪断力により誘導される圧力により引き起こすことができる。一部の実施形態では、前記摂動は、前記細胞膜内の摂動である。一部の実施形態では、前記摂動は、一過性である。一部の実施形態では、前記細胞摂動は、約１．０×１０−９秒〜約２時間またはその間の任意の時間もしくは時間範囲、続く。一部の実施形態では、前記細胞摂動は、約１．０×１０−９秒〜約１秒、約１秒〜約１分または約１分〜約１時間の間続く。一部の実施形態では、前記細胞摂動は、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−２、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−３、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−４、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−５、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−６、約１．０×１０−９〜約１．０×１０−７または約１．０×１０−９〜約１．０×１０−８秒のいずれか１つの間続く。一部の実施形態では、前記細胞摂動は、約１．０×１０−８〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−７〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−６〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−５〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−４〜約１．０×１０−１、約１．０×１０−３〜約１．０×１０−１または約１．０×１０−２〜約１．０×１０−１秒のいずれか１つの間続く。本明細書で記載する方法により作り出された細胞摂動（例えば孔または穴）は、補体または細菌ヘモリシンにより作り出されるものなど多量体孔構造を形成するタンパク質サブユニットの集合の結果として形成されない。
【０１０５】
前記細胞が前記狭窄部を通過する際に該狭窄部は該細胞膜に一時的に損傷を与え、それが前記摂動を通じて材料の受動拡散を引き起こす。一部の実施形態では、細胞のシグナル伝達機構を通じてアポトーシス経路を活性化する可能性を最小化するために、前記細胞は１００μｓのオーダーの短期間のみ変形するが、その他の継続期間も可能である（例えば、数ナノ秒から数時間かに及ぶ）。一部の実施形態では、前記細胞は、約１．０×１０−９秒から約２時間またはこれらの間の任意の時間もしくは時間の範囲にわたって変形する。一部の実施形態では、前記細胞は、約１．０×１０−９秒から約１秒、約１秒から約１分、または約１分から約１時間にわたって変形する。一部の実施形態では、前記細胞は、約１．０×１０−９秒から約１．０×１０−１秒、約１．０×１０−９秒から約１．０×１０−２秒、約１．０×１０−９秒から約１．０×１０−３秒、約１．０×１０−９秒から約１．０×１０−４秒、約１．０×１０−９秒から約１．０×１０−５秒、約１．０×１０−９秒から約１．０×１０−６秒、約１．０×１０−９秒から約１．０×１０−７秒、または約１．０×１０−９秒から約１．０×１０−８秒のいずれか１つの間にわたって変形する。一部の実施形態では、前記細胞は、約１．０×１０−８秒から約１．０×１０−１秒、約１．０×１０−７秒から約１．０×１０−１秒、約１．０×１０−６秒から約１．０×１０−１秒、約１．０×１０−５秒から約１．０×１０−１秒、約１．０×１０−４秒から約１．０×１０−１秒、約１．０×１０−３秒から約１．０×１０−１秒、または約１．０×１０−２秒から約１．０×１０−１秒のいずれか１つにわたって変形する。一部の実施形態では、前記細胞を変形させることは、以下に限定されないが、約１μｓから少なくとも約７５０μｓに及ぶ時間、例えば、少なくとも約１μｓ、１０μｓ、５０μｓ、１００μｓ、５００μｓ、または７５０μｓにわたって該細胞を変形させることを含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、前記細胞への前記化合物の通過は、該細胞による前記狭窄部の通過および／または該細胞の摂動と同時に起こる。一部の実施形態では、前記細胞への前記化合物の通過は、該細胞が前記狭窄部を通過した後に起こる。一部の実施形態では、前記細胞への前記化合物の通過は、該細胞が前記狭窄部を通過してから分のオーダーで起こる。一部の実施形態では、前記細胞への前記化合物の通過は、該細胞が前記狭窄部を通過してから約１．０×１０−２秒から少なくとも約３０分後に起こる。例えば、前記細胞への前記化合物の通過は、該細胞が前記狭窄部を通過してから約１．０×１０−２秒から約１秒後、約１秒から約１分後、または約１分から約３０分後に起こる。一部の実施形態では、前記細胞への前記化合物の通過は、該細胞が前記狭窄部を通過してから約１．０×１０−２秒から約１０分後、約１．０×１０−２秒から約５分後、約１．０×１０−２秒から約１分後、約１．０×１０−２秒から約５０秒後、約１．０×１０−２秒から約１０秒後、約１．０×１０−２秒から約１秒後、または約１．０×１０−２秒から約０．１秒後に起こる。一部の実施形態では、前記細胞への前記化合物の通過は、該細胞が前記狭窄部を通過してから約１．０×１０−１秒から約１０分後、約１秒から約１０分後、約１０秒から約１０分後、約５０秒から約１０分後、約１分から約１０分後、または約５分から約１０分後に起こる。一部の実施形態では、前記細胞が前記狭窄部を通過した後の該細胞の摂動は、該細胞が該狭窄部を通過してから約５分のオーダー以内に矯正される。
【０１０７】
一部の実施形態では、前記狭窄部を通過した後の前記細胞生存率は、約５％から約１００％である。一部の実施形態では、前記狭窄部を通過した後の前記細胞生存率は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％である。一部の実施形態では、前記細胞生存率は、該細胞が前記狭窄部を通過してから約１．０×１０−２秒から少なくとも約１０日後に測定される。例えば、前記細胞生存率は、該細胞が前記狭窄部を通過してから約１．０×１０−２秒から約１秒後、約１秒から約１分後、約１分から約３０分後、または約３０分から約２時間後に測定される。一部の実施形態では、前記細胞生存率は、該細胞が前記狭窄部を通過してから約１．０×１０−２秒から約２時間後、約１．０×１０−２秒から約１時間後、約１．０×１０−２秒から約３０分後、約１．０×１０−２秒から約１分後、約１．０×１０−２秒から約３０秒後、約１．０×１０−２秒から約１秒後、または約１．０×１０−２秒から約０．１秒後に測定される。一部の実施形態では、前記細胞生存率は、該細胞が前記狭窄部を通過してから約１．５時間から約２時間後、約１時間から約２時間後、約３０分から約２時間後、約１５分から約２時間後、約１分から約２時間後、約３０秒から約２時間後、または約１秒から約２時間後に測定される。一部の実施形態では、前記細胞生存率は、該細胞が前記狭窄部を通過してから約２時間から約５時間後、約５時間から約１２時間後、約１２時間から約２４時間後、または約２４時間から約１０日後に測定される。
【０１０８】
ＶＩＩ．送達のパラメーター
本明細書に記載する方法によって免疫応答を抑制するまたは寛容性を誘導するための細胞への化合物の送達にはいくつかのパラメーターが影響し得る。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、前記狭窄部を通る前に、それと同時にまたはその後に前記化合物と接触させられる。前記細胞は、送達するための前記化合物を含む溶液中に懸濁されて前記狭窄部を通過してもよいが、該細胞が該狭窄部を通過した後に該化合物を前記細胞懸濁液に加えてもよい。一部の実施形態では、送達される前記化合物は前記狭窄部上でコーティングされる。
【０１０９】
前記細胞への前記化合物の送達に影響し得るパラメータの例として、前記狭窄部の寸法、該狭窄部の入口角度、該狭窄部の表面特性（例えば粗さ、化学修飾、親水性、疎水性など）、作動流速（operating  flow  speed）（例えば該狭窄部を通る細胞の通過時間）、該細胞濃度、該細胞懸濁液中の該化合物の濃度が挙げられるが、これらに限定されず、該細胞が該狭窄部を通った後に回復するか、またはインキュベートする時間の量は、該細胞に送達される化合物の通過に影響し得る。前記細胞への前記化合物の送達に影響する追加のパラメータは、前記狭窄部中の該細胞の速度、該狭窄部中の剪断率、前記細胞懸濁液の粘度、流速に垂直な速度構成要素および該狭窄部中の時間を含み得る。かかるパラメータは、前記化合物の送達を制御するように設計され得る。一部の実施形態では、前記細胞濃度は、約１０〜少なくとも約１０１２個の細胞／ｍｌまたはその間の任意の濃度もしくは濃度範囲に及ぶ。一部の実施形態では、送達化合物濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１ｇ／ｍＬまたはその間の任意の濃度もしくは濃度範囲に及び得る。一部の実施形態では、送達化合物濃度は、約１ｐＭ〜少なくとも約２Ｍまたはその間の任意の濃度もしくは濃度範囲に及び得る。前記細胞懸濁液の組成（例えば容量オスモル濃度、塩濃度、血清含有量、細胞濃度、ｐＨなど）は、免疫応答を抑制するため、または寛容性を誘導するための前記化合物の送達に影響し得る。一部の実施形態では、前記水溶液は、等浸透圧または等張である。
【０１１０】
本開示の方法に使用される温度を調整して、化合物の送達および細胞生存率に影響を及ぼすことができる。一部の実施形態では、本方法は、約−５℃から約４５℃の間で実行される。例えば、本方法は、室温（例えば、約２０℃）、生理的温度（例えば、約３７℃）、生理的温度より高い温度（例えば、約３７℃より高い温度から４５℃またはさらに高い温度）、または低下させた温度（例えば、約−５℃から約４℃）、あるいはこれらの例示的な温度の間の温度で実行することができる。
【０１１１】
様々な方法を利用して、前記細胞が前記狭窄部を通るのを推進することができる。例えば、前記入口側にポンプによって圧力を加えてもよく（例えば、ガスシリンダーまたはコンプレッサー）、前記出口側に真空ポンプによって真空を適用してもよく、チューブを通じて毛管作用を適用してもよく、かつ／または前記系は重力供給してもよい。排出ベースのフローシステム（displacement  based  flow  system）を使用することもできる（例えば、シリンジポンプ、蠕動運動ポンプ、手動のシリンジまたはピペット、ピストンなど）。一部の実施形態では、前記細胞は、陽圧または陰圧によって前記狭窄部に通される。一部の実施形態では、前記細胞は、一定圧力または可変圧力によって前記狭窄部に通される。一部の実施形態では、シリンジを使用して圧力を加える。一部の実施形態では、ポンプを使用して圧力を加える。一部の実施形態では、前記ポンプは蠕動運動ポンプまたはダイアフラムポンプである。一部の実施形態では、真空を使用して圧力を加える。一部の実施形態では、前記細胞は重力によって前記狭窄部に通される。一部の実施形態では、前記細胞は遠心力によって前記狭窄部に通される。一部の実施形態では、前記細胞は毛管圧力によって前記狭窄部に通される。
【０１１２】
一部の実施形態では、流体流れは、前記細胞を、前記狭窄部を通るように方向付ける。一部の実施形態では、前記流体流れは、前記細胞が前記狭窄部を通過する前に乱流である。乱流は、所与の点における速度の大きさおよび方向が不規則に変動する流体流れである。一部の実施形態では、前記狭窄部を通る流体流れは、層流である。層流は、あらゆる点での流れの方向が一定のままである固体境界近くの流体の連続した流れを伴う。一部の実施形態では、前記流体流れは、前記細胞が前記狭窄部を通過した後に乱流である。前記細胞が前記狭窄部を通過する速度は可変であってよい。一部の実施形態では、前記細胞は、一様な細胞速度で前記狭窄部を通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、変動する細胞速度で前記狭窄部を通過する。
【０１１３】
他の実施形態では、組合せ処理、例えば本明細書で記載する方法および続く狭窄部の下流の電場への曝露は、細胞懸濁液を該狭窄部に通すことであって、抗原または化合物が無核細胞に入るように、該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ことにより免疫応答を抑制するため、または寛容性を誘導するために使用される。一部の実施形態では、前記細胞は、前記狭窄部を通った後に少なくとも１つの電極により発生した電場を通る。一部の実施形態では、前記電場は、前記細胞内の第２の位置への化合物の送達を補助する。例えば、細胞を変形させる狭窄部と電場との組合せは、抗体をコードするプラスミドを前記細胞へ送達し、抗体のデノボ産生をもたらす。一部の実施形態では、１つまたは複数の電極は、細胞を変形させる狭窄部に近位であり、電場を発生させる。一部の実施形態では、前記電場は、約０．１ｋＶ／ｍ〜約１００ＭＶ／ｍの間またはその間の任意の数もしくは数の範囲である。一部の実施形態では、集積回路を、前記電極を駆動する電気シグナルを提供するために使用する。一部の実施形態では、前記細胞は、約１ｎｓ〜約１ｓの間のパルス幅および約１００ｎｓ〜約１０ｓの間の期間またはそれらの間の任意の時間もしくは時間範囲にわたって、前記電場に曝露される。
【０１１４】
ＶＩＩＩ．無核細胞への送達のための細胞懸濁液
前記細胞懸濁液は、混合された、または精製された細胞集団であってもよい。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、混合された細胞集団、例えば全血である。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、精製された細胞集団、例えば精製された無核細胞の集団である。
【０１１５】
前記細胞懸濁液の組成（例えば容量オスモル濃度、塩濃度、血清含有量、細胞濃度、ｐＨなど）は、免疫応答を抑制するため、または寛容性を誘導するための前記化合物の送達に影響し得る。一部の実施形態では、前記懸濁液は、全血を含む。あるいは、前記細胞懸濁液は、生理食塩溶液または血液以外の生理学的媒体中の細胞の混合物である。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、水溶液を含む。一部の実施形態では、前記水溶液は、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、成長因子、動物由来生成物、増量剤（bulking  material）、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、アミノ酸、タンパク質、細胞周期インヒビターおよび／またはアクチン重合に影響する剤を含む。一部の実施形態では、前記細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）、ＩＭＤＭまたはＲＰＭＩである。加えて、溶液緩衝液は、例えば前記表面の目詰まりを低減または除去し、細胞生存性を改善するように設計され得る１つまたは複数の潤滑剤（プルロニックまたは他の界面活性剤）を含んでもよい。界面活性剤の例として、ポロキサマー、ポリソルベート、糖または糖アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、動物由来血清およびアルブミンタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記水溶液は、等浸透圧または等張である。一部の実施形態では、前記水溶液は、血漿を含む。
【０１１６】
ある特定の種類の細胞を伴う一部の構成では、該細胞は、該細胞内への前記化合物の送達を補助する１つまたは複数の溶液中でインキュベートされてもよい。一部の実施形態では、前記水溶液は、アクチン重合に影響を及ぼす剤を含む。一部の実施形態では、アクチン重合に影響を及ぼす剤は、ラトランクリンＡ、サイトカラシン、および／またはコルヒチンである。例えば、送達前に前記細胞をラトランクリンＡ（Lantrunculin  A）（０．１μｇ／ｍｌ）などの解重合溶液中で１時間インキュベートして、アクチン細胞骨格を解重合させることができる。追加の例として、送達前に前記細胞を１０μＭコルヒチン（Ｓｉｇｍａ）中で２時間インキュベートして、微小管ネットワークを解重合させることができる。
【０１１７】
一部の実施形態では、前記細胞集団は、開示する方法において使用する前に富化される。例えば、細胞を体液（例えば、末梢血）から得、それを必要に応じて富化または精製してＢ細胞を濃縮する。細胞は、以下に限定されないが、磁気細胞分離、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または密度勾配遠心分離などの当技術分野で公知の任意の方法によって富化することができる。
【０１１８】
前記細胞懸濁液の粘度もまた、本明細書に開示する方法に影響し得る。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液の粘度は、約８．９×１０−４Ｐａ．ｓから約４．０×１０−３Ｐａ．ｓまたはこれらの間の任意の値または値の範囲に及ぶ。一部の実施形態では、前記粘度は、約８．９×１０−４Ｐａ．ｓから約４．０×１０−３Ｐａ．ｓの間、約８．９×１０−４Ｐａ．ｓから約３．０×１０−３Ｐａ．ｓの間、約８．９×１０−４Ｐａ．ｓから約２．０×１０−３Ｐａ．ｓの間、または約８．９×１０−３Ｐａ．ｓから約１．０×１０−３Ｐａ．ｓの間のいずれか１つに及ぶ。一部の実施形態では、前記粘度は、約０．８９ｃＰから約４．０ｃＰの間、約０．８９ｃＰから約３．０ｃＰの間、約０．８９ｃＰから約２．０ｃＰの間、または約０．８９ｃＰから約１．０ｃＰの間のいずれか１つに及ぶ。一部の実施形態では、ずり流動化効果が観察され、前記細胞懸濁液の粘度はせん断歪みの条件下で減少する。粘度は、以下に限定されないが、ガラスキャピラリー粘度計などの粘度計またはレオメーターなどの当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。粘度計は１つの流れ状態下での粘度を測定するが、レオメーターは流れ状態が変化する粘度を測定するために使用される。一部の実施形態では、前記粘度は、血液などのずり流動化溶液について測定される。一部の実施形態では、前記粘度は、約−５℃から約４５℃の間で測定される。例えば、前記粘度は、室温（例えば、約２０℃）、生理的温度（例えば、約３７℃）、生理的温度より高い温度（例えば、約３７℃より高い温度から４５℃またはさらに高い温度）、または低下させた温度（例えば、約−５℃から約４℃）、あるいはこれらの例示的な温度の間の温度で測定される。
【０１１９】
ＩＸ．免疫応答を抑制するため、または寛容性を誘導するための抗原および寛容原性因子
一部の実施形態では、本発明は、免疫応答を抑制するため、または寛容性を誘導するための抗原の送達を提供し、ここで、該抗原が、本明細書で記載する方法のいずれかにより前記細胞に送達される。一部の実施形態では、前記抗原は、単一抗原である。一部の実施形態では、前記抗原は、抗原の混合物である。抗原は、特異的免疫応答、例えば細胞または抗体媒介免疫応答を刺激する物質である。抗原は、特定の抗原に特異的な、免疫細胞が発現する受容体、例えばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合する。抗原と受容体の結合は続いて、細胞内シグナル伝達経路を誘発し、これは下流の免疫エフェクター経路、例えば細胞活性化、サイトカイン産生、細胞遊走、細胞毒性因子分泌、細胞アポトーシスおよび抗体産生をもたらす。
【０１２０】
一部の実施形態では、前記抗原は、タンパク質またはポリペプチド抗原である。一部の実施形態では、前記化合物は、疾患関連抗原を含む。一部の実施形態では、前記抗原は、外来源、例えば細菌、真菌、ウイルスまたはアレルゲンに由来する。一部の実施形態では、前記抗原は、内部源、例えば自己タンパク質（すなわち自己抗原）に由来する。一部の実施形態では、前記抗原は、細胞溶解物中にある。自己抗原は、生物自体の細胞上、または細胞内に存在する抗原である。自己抗原は通常、免疫応答を刺激しないが、自己免疫疾患の状況、例えばＩ型糖尿病または関節リウマチでは刺激し得る。一部の実施形態では、前記抗原は、治療剤である。一部の実施形態では、前記抗原は、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリペプチドの断片である。一部の実施形態では、前記治療剤は、炭水化物にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、前記治療剤は、凝固因子である。凝固因子の例として、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、前記抗原は、血友病の処置で使用される第ＶＩＩＩ因子タンパク質であってよい。一部の実施形態では、前記治療剤は、抗体である。治療用抗体の例として、抗ＴＮＦα、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０、抗ＩＬ−２Ｒ、抗Ｈｅｒ２、抗ＲＳＶＦ、抗ＣＥＡ、抗ＩＬ−１ベータ、抗ＣＤ１５、抗ミオシン、抗ＰＳＭＡ、抗４０ｋＤａ糖タンパク質、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ５２、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１ａ、抗ＥＧＦＲ、抗Ｃ５、抗アルファ−４インテグリン、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３、抗ＩＬ−６Ｒおよび抗ＲＡＮＫＬが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記治療剤は、成長因子である。治療用成長因子の例として、エリスロポエチン（ＥＰＯ）および巨核球分化成長因子（ＭＤＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記治療剤は、ホルモンである。治療用ホルモンの例として、インスリン、ヒト成長ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記治療剤は、組換えサイトカインである。治療用組換えサイトカインの例として、ＩＦＮβ、ＩＦＮαおよびＧＭ−ＣＳＦが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
一部の実施形態では、前記抗原は、同種移植抗原である。同種移植は、同じ種の遺伝的に非同一のドナーからレシピエントへの細胞、組織または器官の移入である。一部の実施形態では、前記抗原は、修飾抗原である。例えば、抗原は、治療剤またはターゲティングペプチドと融合してもよい。一部の実施形態では、前記修飾抗原は、ポリペプチドと融合している。一部の実施形態では、前記修飾抗原は、脂質と融合している。一部の実施形態では、前記抗原は、炭水化物と融合している。一部の実施形態では、前記抗原は、非タンパク質抗原、例えば脂質、糖脂質または多糖である。一部の実施形態では、前記抗原は、微生物全体、例えばインタクトな細菌である。
【０１２２】
一部の実施形態では、前記抗原はウイルスに関連する。一部の実施形態では、前記抗原はウイルス抗原である。例示的なウイルス抗原としては、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗原およびインフルエンザ抗原が挙げられる。一部の実施形態では、前記化合物は、未知の病原体に感染した組織からの細胞溶解物を含む。一部の実施形態では、前記抗原は治療ビヒクルである。一部の実施形態では、前記治療ビヒクルは、遺伝子療法のために使用されるアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスなどのウイルスである。一部の実施形態では、前記治療ビヒクルはリポソームである。一部の実施形態では、治療ビヒクルはナノ粒子である。
【０１２３】
一部の実施形態では、前記抗原は微生物（例えば、細菌）に関連する。一部の実施形態では、前記抑制された免疫応答および／または誘導された寛容性は、減少した病原性免疫応答または前記微生物（例えば、細菌）への誘導された寛容性を含む。一部の実施形態では、前記微生物は、前記個体のマイクロバイオームの部分である。一部の実施形態では、前記微生物は、前記個体のマイクロバイオームに利益を与え得る。
【０１２４】
ある特定の態様では、本発明は、無核細胞に抗原を送達するための方法であって、該無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、該抗原が該細胞に入るように、該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こすステップを含み、ここで、該細胞懸濁液が、該抗原と接触する、方法を提供する。一部の実施形態では、寛容原性環境における前記抗原の提示は、該抗原への免疫応答を抑制する。一部の実施形態では、寛容原性環境における前記抗原の提示は、該抗原への寛容性を誘導する。一部の実施形態では、前記抗原は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｅｘ  ｖｉｖｏで、またはｉｎ  ｖｉｖｏで前記無核細胞に送達される。
【０１２５】
一部の実施形態では、本発明は、免疫応答を抑制するため、または寛容性を誘導するための寛容原性因子の送達を提供し、ここで、該寛容原性因子が、本明細書で記載する方法のいずれかにより前記細胞に送達される。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、抗原への免疫応答の抑制を向上させ、かつ／または抗原への寛容性の誘導を向上させる。例えば、前記寛容原性因子は、抗原提示細胞による前記抗原の寛容原性提示を促進し得る。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記抗原と同時に導入される。一部の実施形態では、前記寛容原性因子および抗原は、逐次的に導入される。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−３５、ＩＦＮαまたはＴＧＦβである。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、治療用ポリペプチドの断片である。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、炭水化物にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、核酸である。一部の実施形態では、前記核酸として、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、前記寛容原性因子は、炎症性遺伝子の発現をノックダウンするためのｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、ＮＦκＢに結合し、ＮＦκＢ活性化および下流のシグナル伝達を防ぐＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、小分子である。
【０１２６】
一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、免疫調節因子（例えば、免疫賦活因子（例えば、共刺激分子）、免疫抑制因子、または炎症性もしくは抗炎症性分子など）の発現および／または活性をモジュレートする。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、免疫賦活因子（例えば、共刺激分子）の発現および／または活性を阻害し、免疫抑制分子の発現および／または活性を増強し、炎症性分子の発現および／または活性を阻害し、かつ／または抗炎症性分子の発現および／または活性を増強する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、共刺激分子の活性を阻害する。共刺激分子とそれらのリガンドとの間の相互作用は、ＴＣＲシグナル伝達を維持および統合して、最適なＴ細胞の増殖および分化を刺激するために重要である。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、共刺激分子の発現を減少させる。抗原提示細胞上で発現される例示的な共刺激分子としては、以下に限定されないが、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＣＤ７９、またはＩＣＯＳリガンドが挙げられる。一部の実施形態では、前記共刺激分子はＣＤ８０またはＣＤ８６である。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記共刺激分子を発現するまたはその発現をモジュレートする核酸の発現を阻害する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記共刺激分子を発現するまたはその発現をモジュレートする核酸を欠失させる。一部の実施形態では、前記共刺激分子を発現するまたはその発現をモジュレートする前記核酸の欠失は、遺伝子編集を通じて達成される。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は前記共刺激分子を阻害する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記共刺激分子を阻害するｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記共刺激分子の発現を抑制する転写レギュレーターの活性を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、共刺激分子の発現を抑制するタンパク質インヒビターの活性を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記共刺激分子のサプレッサーをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は前記共刺激分子を分解させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、破壊のために前記共刺激分子を標識する。例えば、寛容原性因子は、前記共刺激分子のユビキチン化を増強し、それによってそれを破壊の標的にし得る。
【０１２７】
一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、免疫抑制分子の発現および／または活性を増強する。一部の実施形態では、前記免疫抑制分子は、共阻害分子、転写レギュレーター、または免疫抑制分子である。共阻害分子は、リンパ球の活性化を負に調節する。例示的な共阻害分子としては、以下に限定されないが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＶＥＭ、Ｂ７−Ｈ３、ＴＲＡＩＬ、免疫グロブリン様転写物（ＩＬＴ）受容体（ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４）、ＦａｓＬ、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３９、ＣＤ７３、およびＢ７−Ｈ４が挙げられる。一部の実施形態では、前記共阻害分子はＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２である。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記共阻害分子の活性を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、共阻害分子の発現を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は前記共阻害分子をコードする。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記共阻害分子の活性を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記共阻害分子の発現を増強する転写レギュレーターの活性を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記共阻害分子の発現を増加させるポリペプチドの活性を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記共阻害分子のエンハンサーをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、共阻害分子のインヒビターを阻害する。
【０１２８】
一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、免疫抑制分子の発現および／または活性を増加させる。例示的な免疫抑制分子としては、以下に限定されないが、アルギナーゼ−１（ＡＲＧ１）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、一酸化窒素（ＮＯ）、一酸化窒素シンターゼ２（ＮＯＳ２）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびＩＬ−３５が挙げられる。一部の実施形態では、前記免疫抑制分子はＮＯまたはＩＤＯである。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記免疫抑制分子をコードする。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記免疫抑制分子の活性を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記免疫抑制分子の発現を増強する転写レギュレーターの活性を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記免疫抑制分子の発現を増強するポリペプチドの活性を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記免疫抑制分子のエンハンサーをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、免疫抑制分子の負の調節因子を阻害する。
【０１２９】
一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、炎症性分子の発現および／または活性を阻害する。一部の実施形態では、前記炎症性分子は炎症性転写因子である。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は前記炎症性転写因子を阻害する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、炎症性転写因子の発現を減少させる。一部の実施形態では、前記炎症性転写因子は、ＮＦ−κＢ、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）、またはＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に関連した分子である。前記ＮＦ−κＢ経路は、サイトカイン、ケモカイン、および接着分子などの炎症誘発性遺伝子の発現を媒介する原型的な炎症誘発性シグナル伝達経路である。インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）は、炎症誘発性遺伝子の発現を調節できる転写因子のファミリーを構成する。前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路は、細胞外サイトカインシグナルからの情報を核に伝達し、免疫細胞の増殖および分化に関与する遺伝子のＤＮＡ転写および発現を生じさせる。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ系は、細胞表面受容体、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）、およびシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）タンパク質からなる。例示的なＪＡＫ−ＳＴＡＴ分子としては、以下に限定されないが、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、Ｔｙｋ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂ）、およびＳＴＡＴ６が挙げられる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ）タンパク質の発現を増強する。ＳＯＣＳタンパク質は、前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を通じたシグナル伝達を阻害し得る。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記炎症性転写因子をコードする核酸の発現を阻害する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記炎症性転写因子をコードする核酸を欠失させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記炎症性転写因子の発現を抑制する転写レギュレーターの活性を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記炎症性転写因子の発現を抑制するタンパク質インヒビターの活性を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記炎症性転写因子のサプレッサーをコードする核酸を含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、抗炎症性分子の発現および／または活性を増強する。一部の実施形態では、前記抗炎症性分子は抗炎症性転写因子である。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は前記抗炎症性転写因子を増強する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、抗炎症性転写因子の発現を増加させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記抗炎症性転写因子をコードする核酸の発現を増強する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記抗炎症性転写因子の発現を抑制する転写レギュレーターの活性を減少させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記抗炎症性転写因子の発現を抑制するタンパク質インヒビターの活性を減少させる。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、前記抗炎症性転写因子のエンハンサーをコードする核酸を含む。
【０１３１】
ある特定の態様では、本発明は、無核細胞に寛容原性因子を送達するための方法であって、該無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、該寛容原性因子が該細胞に入るように、該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こすステップを含み、ここで、該細胞懸濁液が、該寛容原性因子と接触する、方法を提供する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｅｘ  ｖｉｖｏで、またはｉｎ  ｖｉｖｏで前記無核細胞に送達される。
【０１３２】
一部の実施形態では、前記寛容原性因子は核酸を含む。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は核酸である。例示的な核酸としては、以下に限定されないが、組換え核酸、ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡが挙げられる。一部の実施形態では、前記核酸は、前記細胞中の核酸と同種である。一部の実施形態では、前記核酸は、前記細胞中の核酸とは異種である。一部の実施形態では、前記寛容原性因子はプラスミドである。一部の実施形態では、前記核酸は治療用核酸である。一部の実施形態では、前記核酸は治療用ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡをコードする核酸を含む。例えば、寛容原性因子は、炎症性遺伝子の発現をノックダウンするためのｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、ＮＦκＢに結合し、ＮＦκＢの活性化および下流のシグナル伝達を防止するＤＮＡ配列である。
【０１３３】
一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、前記タンパク質またはポリペプチドは、治療用タンパク質、抗体、融合タンパク質、抗原、合成タンパク質、レポーターマーカーまたは選択可能マーカーである。一部の実施形態では、前記タンパク質は、遺伝子編集タンパク質またはヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＣＲＥリコンビナーゼ、トランスポサーゼ、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えばＣＡＳ９酵素）、ＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼまたはインテグラーゼ酵素である。一部の実施形態では、前記融合タンパク質として、キメラタンパク質薬物、例えば抗体薬物コンジュゲートまたは組換え融合タンパク質、例えばＧＳＴもしくはストレプトアビジンでタグ付けしたタンパク質を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記化合物は、転写因子である。転写因子の例として、Ｏｃｔ５、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ−４、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＦｏｘＰ３およびＲＯＲγｔが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−３５、ＩＦＮαまたはＴＧＦβである。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、治療用ポリペプチドの断片である。一部の実施形態では、前記ポリペプチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【０１３４】
一部の実施形態では、前記寛容原性因子はタンパク質核酸複合体を含む。一部の実施形態では、前記寛容原性因子はタンパク質核酸複合体である。一部の実施形態では、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ９などのタンパク質核酸複合体は、ゲノム編集での応用において使用される。これらの複合体は、非特異的ＤＮＡ切断ヌクレアーゼと組み合わせて配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを含有する。これらの複合体は、特定の遺伝子の配列の付加、破壊、または変更などの標的ゲノム編集を可能とする。一部の実施形態では、標的遺伝子の転写をブロックまたは誘導するために、無能力化されたＣＲＩＳＰＲが使用される。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含有する。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記遺伝子編集複合体は、共刺激分子（例えば、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６）の発現を標的にする。
【０１３５】
一部の実施形態では、前記寛容原性因子はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一部の実施形態では、前記寛容原性因子はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。一部の実施形態では、前記ＣＡＲは、細胞外認識ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインの融合物である。抗原が結合すると、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分は、免疫細胞内での免疫抑制または寛容原性に関連した応答を開始することができる。一部の実施形態では、前記ＣＡＲはキメラＴ細胞抗原受容体である。一部の実施形態では、前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは一本鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、抗原に結合すると免疫抑制サイトカインの産生を誘発する細胞質シグナル伝達ドメインを含有する改変されたＴＣＲをコードする。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、抗原に結合すると免疫抑制サイトカインの産生を誘発する細胞質シグナル伝達ドメインを含有するキメラ抗原受容体をコードする。
【０１３６】
一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、小分子を含む。一部の実施形態では、前記寛容原性因子は、小分子である。一部の実施形態では、前記小分子は、共刺激分子の活性を阻害し、共阻害分子の活性を増強し、かつ／または炎症性分子の活性を阻害する。小分子の例として、医薬品、代謝産物または放射性核種が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記医薬品は、治療用薬物および／または細胞毒性剤である。一部の実施形態では、前記化合物は、ナノ粒子を含む。ナノ粒子の例として、金ナノ粒子、量子ドット、カーボンナノチューブ、ナノシェル、デンドリマーおよびリポソームが挙げられる。一部の実施形態では、前記ナノ粒子は、治療用分子を含有するか、または治療用分子に（共有または非共有で）連結されている。一部の実施形態では、前記ナノ粒子は、核酸、例えばｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含有する。
【０１３７】
一部の実施形態では、送達される前記化合物は精製されている。一部の実施形態では、前記化合物は、少なくとも約６０重量％（乾燥重量）の目的の化合物である。一部の実施形態では、前記精製された化合物は、少なくとも約７５％、９０％、または９９％の目的の化合物である。一部の実施形態では、前記精製された化合物は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）の目的の化合物である。純度は、以下に限定されないが、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分析、ＮＭＲ、質量分析、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの任意の公知の方法によって決定される。精製されたＤＮＡまたはＲＮＡは、外因性の核酸、炭水化物、および脂肪を含まないＤＮＡまたはＲＮＡとして定義される。
【０１３８】
一部の実施形態では、前記化合物は中間体化合物である。前記中間体化合物は、先行する中間体から形成され、さらに反応して最終反応生成物を与える分子的実体であり得る。一部の実施形態では、前記中間体化合物は、酵素によって切断されて、タンパク質の成熟した機能的形態を産生するタンパク質前駆体、またはプロタンパク質である。一部の実施形態では、前記中間体化合物は、活性酵素を産生するために修飾または切断を必要とする不活性の酵素前駆体、またはチモーゲンである。
【０１３９】
Ｘ．適用
一部の態様では、本発明は、化合物が無核細胞に入るように狭窄部に通すことにより改変した該無核細胞を患者に導入することにより、該患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、前記処置は、前記患者に、かかる改変した無核細胞を導入する複数の（例えば２、３、４、５、６回のいずれかまたはそれよりも多い）ステップを含む。一部の実施形態では、前記細胞を、患者から単離し、開示する方法に従って改変し、該患者に導入して戻す。例えば、無核細胞集団を、患者から単離し、前記狭窄部に通して化合物の送達を達成し、その後該患者に再注入して治療免疫応答を増強する。一部の実施形態では、前記細胞を、個体から単離し、開示する方法に従って改変し、該個体に導入して戻す。例えば、無核細胞集団を、個体から単離し、前記狭窄部に通して化合物の送達を達成し、その後該患者に再注入して該個体において免疫応答を抑制するか、または寛容性を誘導する。
【０１４０】
一部の実施形態では、無核細胞を、万能供血者（例えばＯ型供血者）から単離し、その後、後の狭窄部媒介送達および個体への導入のために保存および／または凍結する。一部の実施形態では、抗原を、個体から単離し、万能供血者から単離した無核細胞に送達し、該個体に導入する。一部の実施形態では、無核細胞を、供血者から単離し、その後、後の狭窄部媒介送達および該供血者と適合する血液型の個体への導入のために保存および／または凍結する。一部の実施形態では、抗原を、個体から単離し、供血者から単離した無核細胞に送達し、該個体に導入する。
【０１４１】
一部の実施形態では、本発明は、化合物が細胞に入るように狭窄部に通すことにより改変した該細胞を個体に導入することにより、該個体を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、前記細胞は、自家細胞である。例えば、前記無核細胞を、個体（例えば患者）から単離し、開示する方法に従って改変し、該個体に導入して戻す。一部の実施形態では、前記細胞を、個体から単離し、開示する方法に従って改変し、同じ個体に導入して戻す。一部の実施形態では、前記細胞は、同種異系細胞である。例えば、前記細胞を、異なる個体から単離し、開示する方法に従って改変し、第１の個体（例えば患者）に導入する。一部の実施形態では、複数の個体からの細胞プールを、開示する方法に従って改変し、前記第１の個体（例えば前記患者）に導入する。一部の実施形態では、前記細胞を、個体から単離し、開示する方法に従って改変し、異なる個体に導入する。一部の実施形態では、細胞集団を、個体（患者）または異なる個体から単離し、前記狭窄部に通して化合物の送達を達成し、その後該患者に再注入して治療応答を増強する。
【０１４２】
一部の実施形態では、前記処置は、前記個体に本明細書で記載するように改変した無核細胞を投与する複数の（例えば２、３、４、５、６回のいずれかまたはそれよりも多い）ステップを含む。例えば、一部の実施形態では、化合物が細胞に入るように狭窄部に通すことにより改変した該細胞を個体に２、３、４、５、６回またはそれよりも多い回数、投与することにより、該個体を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、前記細胞の任意の２回の連続投与の間の時間間隔は、少なくとも約１日である（例えば少なくとも約２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年のいずれかまたはそれよりも長く、これらの値間の任意の範囲を含む）。
【０１４３】
上記の方法のいずれについても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｅｘ  ｖｉｖｏで、またはｉｎ  ｖｉｖｏで実行される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの応用のために、デバイスを血管内腔に埋め込むことができ、例えば、インラインのステントが動脈または静脈に埋め込まれる。一部の実施形態では、本方法は、患者細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ処理および該患者への該細胞の即時の再導入のためのベッドサイドシステムの部分として使用される。そのような方法は、個体において免疫応答を抑制するまたは寛容性を誘導する手段として用いられ得る。一部の実施形態では、本方法は、ごくわずかに訓練された技師を有する典型的な病院の試験室で実行することができる。一部の実施形態では、患者操作処置システム（patient  operated  treatment  system）が使用され得る。一部の実施形態では、本方法は、インラインの血液処理システムを使用して実行され、該システムでは、血液が患者から直接的に採取され、前記狭窄部に通されて血液細胞への化合物送達を生じ、そして処理後に該患者に再び直接的に輸血される。
【０１４４】
ＸＩ．系およびキット
一部の態様では、本発明は、本明細書で開示する方法で使用するための、前記狭窄部、細胞懸濁液および化合物を含む系を提供する。前記系は、細胞を変形させる狭窄部を提供するためのマイクロ流体チャネルもしくは孔を有する表面、細胞懸濁液、細胞摂動、送達パラメータ、化合物および／またはアプリケーションなどを含む、上記に開示する方法を記載する任意の実施形態を含み得る。一部の実施形態では、前記細胞を変形させる狭窄部は、無核細胞への送達のための大きさである。一部の実施形態では、前記送達パラメータ、例えば作動流速、細胞および化合物濃度、前記狭窄部中の該細胞の速度ならびに前記細胞懸濁液の組成（例えば容量オスモル濃度、塩濃度、血清含有量、細胞濃度、ｐＨなど）を、免疫応答を抑制するため、または寛容性を誘導するための化合物の最大応答のために最適化する。
【０１４５】
免疫応答を抑制するまたは寛容性を誘導するための化合物の送達に使用するためのキットまたは物品も提供される。一部の実施形態では、前記キットは、好適な包装中に本明細書中に記載する組成物（例えば、マイクロ流体チャネルまたは孔を含有する表面、細胞懸濁液、および／または化合物）を含む。好適な包装材料は当技術分野で公知であり、例えば、バイアル（密封バイアルなど）、容器、アンプル、ボトル、瓶、軟包装（例えば、密封マイラーまたはプラスチック袋）などが挙げられる。これらの製品は、さらに滅菌および／または密封されていてもよい。
【０１４６】
また、本開示は、本明細書で記載する方法の構成成分を含み、免疫応答を抑制するため、または寛容性を誘導するために該方法を実行するための指示（複数可）をさらに含んでもよいキットを提供する。本明細書で記載するキットは、他のバッファ、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび本明細書で記載する任意の方法を実行するための指示、例えば免疫応答を抑制するため、または寛容性を誘導するための指示を有する添付文書を含む、他の材料をさらに含んでもよい。
【０１４７】
ＸＩＩ．例示的実施形態
実施形態１．個体において免疫応答を抑制するための方法であって、
ａ．無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．該個体に該無核細胞を導入するステップと
を含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法。
【０１４８】
実施形態２．個体において免疫応答を抑制するための方法であって、
ａ．無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．該個体に該無核細胞を導入するステップと
を含み、該寛容原性因子が、免疫応答を抑制する寛容原性環境に寄与する、方法。
【０１４９】
実施形態３．個体において免疫応答を抑制するための方法であって、
ａ．無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原および寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．該個体に該無核細胞を導入するステップと
を含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法。
【０１５０】
実施形態４．個体において免疫応答を抑制するための方法であって、
ａ．第１の無核細胞を含む第１の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．第２の無核細胞を含む第２の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｃ．該個体に該第１の無核細胞および第２の無核細胞を導入するステップと
を含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法。
【０１５１】
実施形態５．個体において免疫応答を抑制するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原を含み、該抗原が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法。
【０１５２】
実施形態６．個体において免疫応答を抑制するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原および寛容原性因子を含み、該抗原および該寛容原性因子が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原および該寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、方法。
【０１５３】
実施形態７．無核細胞に寛容原性因子を送達するための方法であって、該無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、該寛容原性因子が該細胞に入るように、該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こすステップを含み、ここで、該細胞懸濁液が、該寛容原性因子と接触する、方法。
【０１５４】
実施形態８．寛容原性環境に抗原を導入するための方法であって、個体に無核細胞を送達するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原を含み、該抗原が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされる、方法。
【０１５５】
実施形態９．寛容原性環境に抗原および寛容原性因子を導入するための方法であって、個体に無核細胞を送達するステップを含み、ここで、該無核細胞が、該抗原および該寛容原性因子を含み、該抗原および該寛容原性因子が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原および該寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされる、方法。
【０１５６】
実施形態１０．個体において抗原特異的寛容性を誘導するための方法であって、
ａ．無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．該個体に該無核細胞を導入するステップと
を含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法。
【０１５７】
実施形態１１．個体において寛容性を誘導するための方法であって、
ａ．無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．該個体に該無核細胞を導入するステップと
を含み、該寛容原性因子が、寛容性を誘導する寛容原性環境に寄与する、方法。
【０１５８】
実施形態１２．個体において寛容性を誘導するための方法であって、
ａ．無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原および寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．該個体に該無核細胞を導入するステップと
を含み、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法。
【０１５９】
実施形態１３．個体において抗原特異的寛容性を誘導するための方法であって、
ａ．第１の無核細胞を含む第１の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｂ．第２の無核細胞を含む第２の細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こす、ステップと、
ｃ．該個体に該第１の無核細胞および第２の無核細胞を導入するステップと
を含み、該抗原および該寛容原性因子が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法。
【０１６０】
実施形態１４．個体において抗原特異的寛容性を誘導するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原を含み、該抗原が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法。
【０１６１】
実施形態１５．個体において抗原特異的寛容性を誘導するための方法であって、該個体に無核細胞を導入するステップを含み、ここで、該無核細胞が、抗原および免疫寛容原性因子を含み、該抗原および該寛容原性因子が、該無核細胞を狭窄部に通すことにより該無核細胞に導入され、ここで、該抗原および該寛容原性因子が該無核細胞に入るように、該狭窄部が該細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こし、該抗原が、寛容原性環境においてプロセシングされ、該寛容原性環境における該抗原の提示が、該抗原への寛容性を誘導する、方法。
【０１６２】
実施形態１６．無核細胞に抗原を送達するための方法であって、該無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、該抗原が該細胞に入るように、該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こすステップを含み、ここで、該細胞懸濁液が、該抗原と接触する、方法。
【０１６３】
実施形態１７．無核細胞に抗原および寛容原性因子を送達するための方法であって、該無核細胞を含む細胞懸濁液を狭窄部に通すステップであって、該抗原および該寛容原性因子が該細胞に入るように、該狭窄部が該無核細胞を変形させ、それによって該細胞の摂動を引き起こすステップを含み、ここで、該細胞懸濁液が、該抗原および該寛容原性因子と接触する、方法。
【０１６４】
実施形態１８．寛容原性環境における前記抗原のプロセシングおよび提示が、該抗原への免疫応答を抑制する、実施形態１６または１７に記載の方法。
【０１６５】
実施形態１９．寛容原性環境における前記抗原のプロセシングおよび提示が、該抗原への寛容性を誘導する、実施形態１６または１７に記載の方法。
【０１６６】
実施形態２０．少なくとも１つのさらなる抗原が、前記細胞に導入される、実施形態１、４、５、８、１０および１３〜１９のいずれか一つに記載の方法。
【０１６７】
実施形態２１．少なくとも１つのさらなる寛容原性因子が、前記細胞に導入される、実施形態２〜４、６、７、９、１１、１２、１３、１５および１７のいずれか一つに記載の方法。
【０１６８】
実施形態２２．前記寛容原性環境が、脾臓、肝臓またはリンパ節に位置する、実施形態１〜６、８〜１５、１８および１９のいずれか一つに記載の方法。
【０１６９】
実施形態２３．前記狭窄部が、マイクロ流体チャネルの中に含有される、実施形態１〜２２のいずれか一つに記載の方法。
【０１７０】
実施形態２４．前記チャネルが、約０．２５μｍ〜約４μｍの狭窄部幅を含む、実施形態１〜２３のいずれか一つに記載の方法。
【０１７１】
実施形態２５．前記チャネルが、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍまたは約０．２５μｍの狭窄部幅を含む、実施形態１〜２４のいずれか一つに記載の方法。
【０１７２】
実施形態２６．前記狭窄部が、孔であるか、または孔の中に含有される、実施形態１〜２２のいずれか一つに記載の方法。
【０１７３】
実施形態２７．前記孔が、表面に含有される、実施形態２６に記載の方法。
【０１７４】
実施形態２８．前記表面が、フィルターである、実施形態２７に記載の方法。
【０１７５】
実施形態２９．前記表面が、膜である、実施形態２７に記載の方法。
【０１７６】
実施形態３０．前記孔サイズが、約０．５μｍ〜約４μｍである、実施形態２６〜２９のいずれか一つに記載の方法。
【０１７７】
実施形態３１．前記孔サイズが、４μｍ、約３μｍ、約２μｍ、約１μｍまたは約０．５μｍである、実施形態２６〜３０のいずれか一つに記載の方法。
【０１７８】
実施形態３２．前記狭窄部サイズが、前記無核細胞の直径の関数である、実施形態１〜３１のいずれか一つに記載の方法。
【０１７９】
実施形態３３．前記狭窄部サイズが、前記細胞直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％である、実施形態１〜３２のいずれか一つに記載の方法。
【０１８０】
実施形態３４．約−５℃〜約４５℃の間で実行される、実施形態１〜３３のいずれか一つに記載の方法。
【０１８１】
実施形態３５．前記細胞懸濁液が、混合された細胞集団を含む、実施形態１〜４、７、１０〜１３および１６〜３４のいずれか一つに記載の方法。
【０１８２】
実施形態３６．前記細胞懸濁液が、全血である、実施形態３５に記載の方法。
【０１８３】
実施形態３７．前記細胞懸濁液が、精製された細胞集団を含む、実施形態１〜４、７、１０〜１３および１６〜３４のいずれか一つに記載の方法。
【０１８４】
実施形態３８．前記細胞懸濁液が、精製された無核細胞集団を含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１８５】
実施形態３９．前記細胞懸濁液が、哺乳動物細胞を含む、実施形態１〜４、７、１０〜１３および１６〜３８のいずれか一つに記載の方法。
【０１８６】
実施形態４０．前記細胞懸濁液が、サル細胞、マウス細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞またはウサギ細胞を含む、実施形態１〜４、７、１０〜１３および１６〜３９のいずれか一つに記載の方法。
【０１８７】
実施形態４１．前記細胞懸濁液が、ヒト細胞を含む、実施形態１〜４、７、１０〜１３および１６〜３９のいずれか一つに記載の方法。
【０１８８】
実施形態４２．前記無核細胞が、赤血球である、実施形態１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
【０１８９】
実施形態４３．前記赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）が、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）である、実施形態４２に記載の方法。
【０１９０】
実施形態４４．前記赤血球が、網状赤血球である、実施形態４２に記載の方法。
【０１９１】
実施形態４５．前記無核細胞が、血小板である、実施形態１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
【０１９２】
実施形態４６．前記無核細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１〜４５のいずれか一つに記載の方法。
【０１９３】
実施形態４７．前記無核細胞が、サル細胞、マウス細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞またはウサギ細胞である、実施形態１〜４６のいずれか一つに記載の方法。
【０１９４】
実施形態４８．前記無核細胞が、ヒト細胞である、実施形態１〜４６のいずれか一つに記載の方法。
【０１９５】
実施形態４９．前記無核細胞が、前記個体に由来する、実施形態１〜５、８〜１４および２２〜４８のいずれか一つに記載の方法。
【０１９６】
実施形態５０．前記無核細胞が、異なる個体に由来する、実施形態１〜５、８〜１４および２２〜４８のいずれか一つに記載の方法。
【０１９７】
実施形態５１．前記抗原が、細胞溶解物中にある、実施形態１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一つに記載の方法。
【０１９８】
実施形態５２．前記抗原が、外来抗原である、実施形態１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一つに記載の方法。
【０１９９】
実施形態５３．前記抗原が、自己抗原である、実施形態１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一つに記載の方法。
【０２００】
実施形態５４．前記抗原が、同種移植抗原である、実施形態１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一つに記載の方法。
【０２０１】
実施形態５５．前記抗原が、タンパク質またはポリペプチドである、実施形態１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一つに記載の方法。
【０２０２】
実施形態５６．前記抗原が、溶解物である、実施形態１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一つに記載の方法。
【０２０３】
実施形態５７．前記抗原が、微生物である、実施形態１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一つに記載の方法。
【０２０４】
実施形態５８．前記抗原が、脂質抗原である、実施形態１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一つに記載の方法。
【０２０５】
実施形態５９．前記抗原が、炭水化物抗原である、実施形態１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一つに記載の方法。
【０２０６】
実施形態６０．前記抗原が、修飾抗原である、実施形態１、４、５、８〜１０および１３〜５９のいずれか一つに記載の方法。
【０２０７】
実施形態６１．前記修飾抗原が、ポリペプチドと融合している抗原を含む、実施形態６０に記載の方法。
【０２０８】
実施形態６２．前記修飾抗原が、治療剤と融合している抗原を含む、実施形態６０または６１に記載の方法。
【０２０９】
実施形態６３．前記修飾抗原が、ターゲティングペプチドと融合している抗原を含む、実施形態６０または６１に記載の方法。
【０２１０】
実施形態６４．前記修飾抗原が、脂質と融合している抗原を含む、実施形態６０または６１に記載の方法。
【０２１１】
実施形態６５．前記修飾抗原が、炭水化物と融合している抗原を含む、実施形態６０または６１に記載の方法。
【０２１２】
実施形態６６．前記抗原が、前記移植組織に関連した抗原である、実施形態１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一つに記載の方法。
【０２１３】
実施形態６７．前記抗原が、ウイルスに関連する、実施形態１、４、５、８〜１０および１３〜５０のいずれか一つに記載の方法。
【０２１４】
実施形態６８．前記細胞懸濁液が、前記狭窄部を通る前に、それと同時に、またはその後に抗原と接触する、実施形態１、４、１０、１３および１６〜６７のいずれか一つに記載の方法。
【０２１５】
実施形態６９．前記寛容原性因子が、ポリペプチドを含む、実施形態２〜４、７、１１〜１３および２２〜６８のいずれか一つに記載の方法。
【０２１６】
実施形態７０．前記ポリペプチドが、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−３５、ＩＦＮαまたはＴＧＦβである、実施形態６９に記載の方法。
【０２１７】
実施形態７１．前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、実施形態６９に記載の方法。
【０２１８】
実施形態７２．前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチドの断片である、実施形態６９に記載の方法。
【０２１９】
実施形態７３．前記ポリペプチドが、治療用ペプチドである、実施形態６９に記載の方法。
【０２２０】
実施形態７４．前記ポリペプチドが、炭水化物にコンジュゲートしている、実施形態６９に記載の方法。
【０２２１】
実施形態７５．前記細胞懸濁液が、前記狭窄部を通る前に、それと同時に、またはその後に前記寛容原性因子と接触する、実施形態２〜４、７、１１〜１３および２２〜７４のいずれか一つに記載の方法。
【０２２２】
実施形態７６．前記無核細胞の半減期が、減少する、実施形態１〜７５のいずれか一つに記載の方法。
【０２２３】
実施形態７７．前記無核細胞の半減期が、増加する、実施形態１〜７５のいずれか一つに記載の方法。
【０２２４】
実施形態７８．前記免疫応答が、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％または約１００％抑制される、実施形態１〜６、１８および２２〜７７のいずれか一つに記載の方法。
【０２２５】
実施形態７９．前記抑制される免疫応答が、１つまたは複数の炎症性サイトカインの減少した産生および／または分泌を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜７８のいずれか一つに記載の方法。
【０２２６】
実施形態８０．前記１つまたは複数の炎症性サイトカインが、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される、実施形態７９に記載の方法。
【０２２７】
実施形態８１．前記抑制される免疫応答が、１つまたは複数の抗炎症性サイトカインの増加した産生および／または分泌を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜７８のいずれか一つに記載の方法。
【０２２８】
実施形態８２．前記１つまたは複数の抗炎症性サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−３５、ＩＦＮ−αおよびトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）からなる群から選択される、実施形態８１に記載の方法。
【０２２９】
実施形態８３．前記抑制される免疫応答が、Ｔ細胞応答の減少を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜７８のいずれか一つに記載の方法。
【０２３０】
実施形態８４．前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞活性化の減少を含む、実施形態８３に記載の方法。
【０２３１】
実施形態８５．前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞生存の減少を含む、実施形態８３または８４に記載の方法。
【０２３２】
実施形態８６．前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞増殖の減少を含む、実施形態８３〜８５のいずれか一つに記載の方法。
【０２３３】
実施形態８７．前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞機能性の減少を含む、実施形態８３〜８６のいずれか一つに記載の方法。
【０２３４】
実施形態８８．前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞表現型の変化を含む、実施形態８３〜８７のいずれか一つに記載の方法。
【０２３５】
実施形態８９．前記抑制される免疫応答が、Ｔ細胞の非共刺激活性化を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜８８のいずれか一つに記載の方法。
【０２３６】
実施形態９０．前記抑制される免疫応答が、Ｔｒｅｇ応答の増強を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜８９のいずれか一つに記載の方法。
【０２３７】
実施形態９１．前記抑制される免疫応答が、Ｂ細胞応答の減少を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜９０のいずれか一つに記載の方法。
【０２３８】
実施形態９２．前記Ｂ細胞応答の減少が、抗体産生の減少を含む、実施形態９１に記載の方法。
【０２３９】
実施形態９３．前記抑制される免疫応答が、サイトカイン産生の減少を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜９２のいずれか一つに記載の方法。
【０２４０】
実施形態９４．前記抑制される免疫応答が、自己免疫応答の減少を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜９３のいずれか一つに記載の方法。
【０２４１】
実施形態９５．前記抑制される免疫応答が、アレルギー応答の減少を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜９４のいずれか一つに記載の方法。
【０２４２】
実施形態９６．前記抑制される免疫応答が、前記移植組織に対する免疫応答の減少を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜９５のいずれか一つに記載の方法。
【０２４３】
実施形態９７．前記抑制される免疫応答が、前記ウイルスへの病原性免疫応答の減少を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜９５のいずれか一つに記載の方法。
【０２４４】
実施形態９８．前記抑制される免疫応答が、治療剤に対する免疫応答の減少を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜９５のいずれか一つに記載の方法。
【０２４５】
実施形態９９．前記抑制される免疫応答が、治療ビヒクルに対する免疫応答の減少を含む、実施形態１〜６、１８および２２〜９５のいずれか一つに記載の方法。
【０２４６】
実施形態１００．前記寛容性が、１つまたは複数の炎症性サイトカインの減少した産生および／または分泌を含む、実施形態１０〜１５および１９〜７７のいずれか一つに記載の方法。
【０２４７】
実施形態１０１．前記１つまたは複数の炎症性サイトカインが、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される、実施形態１００に記載の方法。
【０２４８】
実施形態１０２．前記寛容性が、１つまたは複数の抗炎症性サイトカインの増加した産生および／または分泌を含む、実施形態１０〜１５および１９〜７７のいずれか一つに記載の方法。
【０２４９】
実施形態１０３．前記１つまたは複数の抗炎症性サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−３５、ＩＦＮ−αおよびトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）からなる群から選択される、実施形態１０２に記載の方法。
【０２５０】
実施形態１０４．前記寛容性が、Ｔ細胞応答の減少を含む、実施形態１０〜１５および１９〜７７のいずれか一つに記載の方法。
【０２５１】
実施形態１０５．前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞活性化の減少を含む、実施形態１０４に記載の方法。
【０２５２】
実施形態１０６．前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞生存の減少を含む、実施形態１０４または１０５に記載の方法。
【０２５３】
実施形態１０７．前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞増殖の減少を含む、実施形態１０４〜１０６のいずれか一つに記載の方法。
【０２５４】
実施形態１０８．前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞機能性の減少を含む、実施形態１０４〜１０７のいずれか一つに記載の方法。
【０２５５】
実施形態１０９．前記Ｔ細胞応答の減少が、Ｔ細胞表現型の変化を含む、実施形態１０４〜１０８のいずれか一つに記載の方法。
【０２５６】
実施形態１１０．前記寛容性が、Ｔ細胞の非共刺激活性化を含む、実施形態１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１０９のいずれか一つに記載の方法。
【０２５７】
実施形態１１１．前記寛容性が、Ｔｒｅｇ応答の増強を含む、実施形態１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１０のいずれか一つに記載の方法。
【０２５８】
実施形態１１２．前記寛容性が、Ｂ細胞応答の減少を含む、実施形態１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１１のいずれか一つに記載の方法。
【０２５９】
実施形態１１３．前記Ｂ細胞応答の減少が、抗体産生の減少を含む、実施形態１１２に記載の方法。
【０２６０】
実施形態１１４．前記寛容性が、サイトカイン産生の減少を含む、実施形態１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１３のいずれか一つに記載の方法。
【０２６１】
実施形態１１５．前記寛容性が、自己免疫応答の減少を含む、実施形態１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１４のいずれか一つに記載の方法。
【０２６２】
実施形態１１６．前記寛容性が、アレルギー応答の減少を含む、実施形態１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１５のいずれか一つに記載の方法。
【０２６３】
実施形態１１７．前記寛容性が、前記移植組織に対する免疫応答の減少を含む、実施形態１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１６のいずれか一つに記載の方法。
【０２６４】
実施形態１１８．前記寛容性が、前記ウイルスへの病原性免疫応答の減少を含む、実施形態１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１６のいずれか一つに記載の方法。
【０２６５】
実施形態１１９．前記寛容性が、治療剤に対する免疫応答の減少を含む、実施形態１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１６のいずれか一つに記載の方法。
【０２６６】
実施形態１２０．前記寛容性が、治療ビヒクルに対する免疫応答の減少を含む、実施形態１０〜１５、１９〜７７および１０４〜１１６のいずれか一つに記載の方法。
【０２６７】
実施形態１２１．少なくとも１、２、３、４、５または６回繰り返される、実施形態１〜１２０のいずれか一つに記載の方法。
【０２６８】
実施形態１２２．前記方法の任意の２回の繰り返しの間の時間間隔が、少なくとも１日、１週、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月または１年である、実施形態１２１に記載の方法。
【０２６９】
実施形態１２３．実施形態１、４、１０、１３および１６〜１２０のいずれか一つに記載の方法で使用するための、前記狭窄部、細胞懸濁液および抗原を含む系。
【０２７０】
実施形態１２４．実施形態２〜４、７、１１〜１３および２２〜１２０のいずれか一つに記載の方法で使用するための、前記狭窄部、細胞懸濁液および寛容原性因子を含む系。
【実施例】
【０２７１】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を、例を挙げて説明する目的で示すものであり、どのような形でも本開示を限定することを意図するものではない。本開示は目的を実行し、記載した結果および利点ならびに本明細書に内在的に示唆される目的、結果、および利点を得るために十分に適合されることを当業者には容易に理解される。特許請求の範囲によって規定される本開示の精神の範囲内に包含されるその変更およびその他の使用を当業者には想起される。
【０２７２】
（実施例１）
ヒトＲＢＣへのデキストランおよびＩｇＧ抗体の狭窄部媒介性の送達
序
無核細胞への分子のフィルター媒介性の送達を評価するために、蛍光デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合したヒトＲＢＣを規定の大きさの孔を含有するシリンジフィルターに通し、細胞内粒子送達をＦＡＣＳ分析により評価した。
【０２７３】
材料および方法
市販のフィルターとホルダーとの組合せを有する直径２μｍの孔径のポリカーボネートメンブレンフィルター（ＣＯＴＳのフィルター）は、ＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）より入手した。ヒトＲＢＣは、フィコール勾配分離法を使用して全血または白血球除去カラーから分離し、所望の濃度（５０〜５００Ｍ／ｍＬ）でＯｐｔｉｍｅｍ中に再懸濁した。鉗子を使用してポリカーボネートメンブレンフィルターをＯｐｔｉｍｅｍ中に浮遊させ、メンブレンフィルターを湿らせた。プラスチックフィルターホルダーの蓋を外し、フィルターを、光沢面を上に向けて内部表面上に置き、フィルターホルダーに再び蓋をした。デキストラン粒子およびＩｇＧ抗体を０．１ｍｇ／ｍＬで懸濁した。デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合した１ｍＬの細胞を室温でフィルターホルダーに加えた。手動でシリンジを指押しして、細胞をフィルターに通した。フィルターのフロースルーを１５ｍｌのファルコンチューブまたはＦＡＣＳチューブに回収した。ＦＡＣＳ分析の前に全ての試料を遠心分離し、４℃で４分間、４００ｒｃｆで３回洗浄して細胞外のデキストランを除去した。ＦＡＣＳ分析の準備のために以下のステップを行った。ＦＡＣＳ緩衝液を調製し（ＰＢＳ＋最終濃度：１％  ＦＢＳ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）、チューブあたり４００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。フローサイトメトリーの前方散乱光、側方散乱光、および蛍光チャネルの電圧を調整して、全ての細胞事象を可視化し、試料あたり１０，０００以上の事象を記録した。デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合したがフィルターに通さない細胞をエンドサイトーシスによる送達のための対照として使用した。これらの細胞は色素と接触させたが、フィルターに通さなかった。全てのその他のステップは、エンドサイトーシス対照について同じであった。
【０２７４】
結果
１０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７デキストラン粒子、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７にコンジュゲートした１５０ｋＤａのＩｇＧ抗体と混合したＲＢＣを２μｍのサイズのフィルター孔に通した。狭窄部媒介性の送達（ＳＱＺ）後の蛍光デキストランおよびＩｇＧの増加した送達をエンドサイトーシス対照と対比して示す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを図１Ａおよび図１Ｂに示す。フィルター送達後のＩｇＧ抗体のデキストラン粒子（the  dextran  particles  of  IgG  antibody）について陽性の細胞のパーセンテージによって示される送達効率を図２Ａに示す。エンドサイトーシス対照における両方の分子の送達効率は１０％未満であったのに対し、フィルター送達後のＩｇＧ抗体の送達効率は８８．６％、デキストラン粒子の送達効率は９５．６％であった。
【０２７５】
細胞生存率をフィルター送達後に測定した。フィルター送達後のＦＳＣおよびＳＳＣゲート内に存在する細胞のパーセンテージによって示される推定細胞生存率を図２Ｂに示す。フィルター送達後のＩｇＧ抗体を送達された細胞の推定生存率は６８．８％、デキストラン粒子を送達された細胞の推定生存率は６３．３％であった。
【０２７６】
ヒトＲＢＣへのデキストラン粒子およびＩｇＧ抗体の狭窄部媒介性の送達が達成された。
【０２７７】
（実施例２）
マウスＲＢＣへのデキストランおよびＩｇＧ抗体の狭窄部媒介性の送達
序
無核細胞への分子のフィルター媒介性の送達を評価するために、蛍光デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合したマウスＲＢＣを規定の大きさの孔を含有するシリンジフィルターに通し、細胞内粒子送達をＦＡＣＳ分析により評価した。
【０２７８】
材料および方法
市販のフィルターとホルダーとの組合せを有する直径１μｍおよび２μｍの孔径のポリカーボネートメンブレンフィルター（ＣＯＴＳのフィルター）は、ＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）より入手した。全血を遠心沈降させ、細胞を所望の濃度（１００〜５００Ｍ／ｍｌ）でＯｐｔｉｍｅｍ中に再懸濁した。鉗子を使用してポリカーボネートメンブレンフィルターをＯｐｔｉｍｅｍ中に浮遊させ、メンブレンフィルターを湿らせた。プラスチックフィルターホルダーの蓋を外し、フィルターを、光沢面を上に向けて内部表面上に置き、フィルターホルダーに再び蓋をした。デキストラン粒子およびＩｇＧ抗体を０．１ｍｇ／ｍＬで懸濁した。デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合した１ｍＬの細胞を室温でフィルターホルダーに加えた。手動でシリンジを指押しして、細胞をフィルターに通した。あるいは、制御された圧力システムを使用して、デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合した２００μＬの細胞をフィルターに通すのを推進した。フィルターのフロースルーを１５ｍｌのファルコンチューブまたはＦＡＣＳチューブに回収した。ＦＡＣＳ分析の前に全ての試料を遠心分離し、２４℃で１０分間、１０００ｒｆｃで３回洗浄して細胞外のデキストランを除去した。ＦＡＣＳ分析の準備のために以下のステップを行った。ＦＡＣＳ緩衝液を調製し（ＰＢＳ＋最終濃度：１％  ＦＢＳ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）、チューブあたり４００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。フローサイトメトリーの前方散乱光、側方散乱光、および蛍光チャネルの電圧を調整して、全ての細胞事象を可視化し、試料あたり１０，０００以上の事象を記録した。デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合したがフィルターに通さない細胞をエンドサイトーシスによる送達のための対照として使用した。これらの細胞は色素と接触させたが、フィルターに通さなかった。全てのその他のステップは、エンドサイトーシス対照について同じであった。ＮＣ（無接触）試料は色素と接触させなかったが、実験試料と同じステップに供したが、フィルターに通さなかった。
【０２７９】
結果
ＩｇＧ抗体（１５０ｋＤａ）と混合したマウスＲＢＣを、手動シリンジ圧力を使用して１μｍおよび２μｍのサイズのフィルター孔に通した。エンドサイトーシス（Ｅｎｄｏ）、陰性（ＮＣ）、および材料無し対照（no  material  control）の対照と対比して狭窄部媒介性の送達（ＳＱＺ）後の蛍光を示す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを図３Ａに示す。「材料無し」対照はＩｇＧ抗体と接触させなかったが、実験試料と同じステップに供し、かつフィルターに通した。
【０２８０】
細胞生存率をフィルター送達後に測定した。手動シリンジ圧力を使用したＩｇＧ抗体のフィルター送達後のＦＳＣおよびＳＳＣゲート内に存在する細胞のパーセンテージによって示される推定細胞生存率を図３Ｂに示す。フィルター媒介性の送達は対照と対比して推定生存率を約７０％減少させたが、図３Ｃに示すように、４〜１２倍高いＩｇＧ抗体の送達効率をもたらした。
【０２８１】
２ｐｓｉ、４ｐｓｉ、６ｐｓｉ、１０ｐｓｉ、２０ｐｓｉの制御圧力システムを使用してまたは手動シリンジ圧力を使用して、７０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８デキストラン粒子、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７にコンジュゲートしたＩｇＧ抗体（１５０ｋＤａ）と混合したＲＢＣを２μｍのサイズのフィルター孔に通した。例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを図４Ａ〜Ｉに示し、これらは、エンドサイトーシス（Ｅｎｄｏ、図４Ａ）、陰性（ＮＣ、図４Ｂ）、および材料無し対照（図４Ｃ）と対比して狭窄部媒介性の送達（ＳＱＺ、図４Ｄ〜Ｉ）後の蛍光を示している。これらのデータは、フィルター媒介性の送達は、Ｅｎｄｏ、ＮＣ、および材料無し対照と比べてデキストランおよびＩｇＧの送達の最大５５％の増加をもたらしたことを示した。細胞生存率もフィルター送達後に測定した。デキストラン粒子のフィルター送達後にＦＳＣおよびＳＳＣゲート内に存在する細胞のパーセンテージにより示される推定細胞生存率を図５Ａに示す。フィルター送達後のデキストラン粒子またはＩｇＧ抗体について陽性の細胞のパーセンテージによって示される送達効率を図５Ｂに示す。デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体のフィルター送達後の幾何平均の蛍光を図５Ｃに示す。
【０２８２】
１０ｐｓｉ、１２ｐｓｉ、１４ｐｓｉ、１６ｐｓｉ、または１８ｐｓｉの制御圧力システムを使用して、７０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８デキストラン粒子と混合したＲＢＣを２μｍのサイズのフィルター孔に通した。エンドサイトーシス（Ｅｎｄｏ）および陰性（ＮＣ）対照と対比して狭窄部媒介性の送達（ＳＱＺ）後の蛍光を示す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを図６Ａに示す。細胞生存率をフィルター送達後に測定した。デキストラン粒子のフィルター送達後にＦＳＣおよびＳＳＣゲート内に存在する細胞のパーセンテージによって示される推定細胞生存率を図６Ｂに示す。フィルター送達後にデキストラン粒子について陽性の細胞のパーセンテージによって示される送達効率を図６Ｃに示す。デキストラン粒子のフィルター送達後の幾何平均の蛍光を図６Ｄに示す。
【０２８３】
マウスＲＢＣへのデキストラン粒子およびＩｇＧ抗体の狭窄部媒介性の送達が達成された。
【０２８４】
（実施例３）
寛容性を誘導するためのＲＢＣへの抗原の狭窄部媒介性の送達
モデル抗原およびトランスジェニックＴ細胞を使用して、寛容性の誘導を実証するための一連の実験に着手する。
【０２８５】
ＲＢＣをＯＶＡ抗原と混合し、マイクロ流体チャネルの中の狭窄部、または孔を含有する表面に通す。送達を達成するために圧力、温度、および緩衝液組成を最適化する。次いで、ＣＦＳＥ標識された養子移入されたＯＴ−Ｉ細胞を有するＣＤ４５．１マウスにＯＶＡ保有ＲＢＣを導入する。あるいは、ＣＤ４５．１マウスに移入する前にＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞をｅｘ−ｖｉｖｏで活性化する。９日後、寛容原性の提示およびその後のＴ細胞の欠失を可能とするために、マウスを可溶性ＯＶＡおよびＬＰＳでチャレンジする。チャレンジの４日後に脾臓および流入リンパ節をＯＴ−Ｉの増殖について分析する。
【０２８６】
（実施例４）
寛容性を誘導するためのＲＢＣへの抗原の狭窄部媒介性の送達
ＳＱＺによって送達された抗原を含有するＲＢＣの、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原依存的寛容性を誘導する能力を決定するために、抗原特異的Ｔ細胞の数および炎症性サイトカインＩＦＮ−γのレベルをフローサイトメトリーによって測定した。
【０２８７】
材料および方法
０日目に雌ＯＴ−Ｉドナーマウス（ＣＤ４５．２）からＣ５７ＢＬ／６Ｊレシピエントマウス（ＣＤ４５．１）にマウス毎に１ＭのＯＶＡ特異的ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞を養子移入した。１日目（プライム）および６日目（ブースト）に、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスからＲＢＣを回収し、ＲＢＣを全長ＯＶＡタンパク質とインキュベートしたか、またはＯＶＡをフィルター媒介性のＳＱＺ条件によって送達した後、レシピエントマウスに２０〜１２５ＭのＲＢＣ／マウスを注射した。対照動物には注射を与えず（ナイーブ）、またはＰＢＳ（チャレンジ対照）もしくは遊離ＯＶＡ（１０μｇ／動物、寛容性対照）のいずれかを注射した。ナイーブ（抗原もＬＰＳもなし）と比べて、チャレンジ動物において１５日目に１０μｇのＯＶＡタンパク質＋５０ｎｇのＬＰＳ／マウスの皮内注射で抗原チャレンジを行った。１９日目に抗原チャレンジに対するＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞応答をＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞の数およびＩＦＮ−γ細胞内染色についてのフローサイトメトリーによって測定した。処置スケジュールの図解を図７に示し、処置群を表１に要約する。
【表１】
2019519483.tif 000003
【０２８８】
結果
ＯＶＡタンパク質とインキュベートしたＲＢＣ（ＲＢＣ−Ｅｎｄｏ）またはＳＺＱによる細胞内にＯＶＡタンパク質を送達したＲＢＣ（ＲＢＣ−ＳＱＺ）のいずれかで処置した群について抗原（ＯＶＡ）およびアジュバント（ＬＰＳ）でチャレンジしたマウスにおいてＯＴ−Ｉ特異的Ｔ細胞数を測定した（図８）。これらの条件を、抗原、アジュバント、またはＲＢＣを経験しなかった動物（ナイーブ）、または遊離ＯＶＡタンパク質（寛容性対照）もしくはＰＢＳ（チャレンジ対照）で処置した後に抗原＋アジュバントをチャレンジしたマウスと比較した。流入リンパ節および脾臓の両方でＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞数は、チャレンジ対照と比べて、ＯＶＡタンパク質をＳＱＺしたＲＢＣでプライム／ブーストしたマウスにおいて有意に阻害された（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。これらのマウスではナイーブマウスまたは寛容性対照と同様のＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞数が見られた一方、ＯＶＡタンパク質とインキュベートしたＲＢＣでの処置はチャレンジ対照差がなかった。
【０２８９】
Ｔ細胞機能に対するＳＱＺ  ＲＢＣ媒介性の寛容性の機能的効果を評価するために、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号１）（活性ＯＶＡエピトープ）で再刺激されたＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞のうちの高レベルのＩＦＮ−γを発現した脾臓Ｔ細胞の％（図９左）および細胞あたりのＩＦＮ−γ産生レベル（図９右（righ）；全てのＣＤ４４ｈｉ細胞に基づく）を細胞内サイトカインの染色によって全ての群について評価した。ＯＶＡをＳＱＺしたＲＢＣで処置したマウスからのＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞は、チャレンジ対照と比べて、高ＩＦＮ−γ発現細胞の中程度だが有意な減少（＊＊Ｐ＜０．００５）およびＩＦＮ−γ産生の大きい減少（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）を示し、寛容性対照（遊離ＯＶＡ；＊＊Ｐ＜０．００５）よりも大きい減少であった。しかしながら、ＯＶＡタンパク質とインキュベートしたＲＢＣでは、チャレンジ対照と比べてＩＦＮ−γ産生の減少は見られなかった。
【０２９０】
全てのＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちのＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞の割合およびＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞のうちのＩＦＮ−γ応答性Ｔ細胞の割合についての代表的なフローサイトグラム（図１０、表２に要約される）は、ＲＢＣ−ＳＱＺ試料はチャレンジ対照およびＲＢＣ−Ｅｎｄｏ条件と比べてより少ないＯＴ−Ｉおよびより低いＩＦＮｇ応答を有したことを示す。
【表２】
2019519483.tif 000004
【０２９１】
（実施例５）
ＣＤ４＋／ＣＤ８＋媒介性の寛容性
ＳＱＺによって送達された抗原を含有する赤血球（ＲＢＣ）の、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ４媒介性および／またはＣＤ８媒介性のＴ細胞抗原依存的寛容性を誘導する能力を決定するために、抗原特異的Ｔ細胞の数および炎症性サイトカインＩＦＮ−γのレベルをフローサイトメトリーによって測定する。
【０２９２】
材料および方法
０日目に雌ドナーマウスからＣ５７ＢＬ／６Ｊレシピエントマウス（ＣＤ４５．１＋）にマウス毎に１ＭのＯＶＡ特異的ＣＤ８＋  ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞および２〜４ＭのＣＤ４＋  ＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞（共にＣＤ４５．２＋）を養子移入する。１日目（プライム）および６日目（ブースト）に、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスからＲＢＣを回収し、ＲＢＣを全長ＯＶＡタンパク質とインキュベートするか、またはＯＶＡをＳＱＺ条件によって送達した後、レシピエントマウスに２０〜１２５ＭのＲＢＣ／マウスを注射する。対照動物にはＰＢＳ（チャレンジ対照）または遊離ＯＶＡ（１０μｇ／動物、寛容性対照）のいずれかの注射を与える。チャレンジ動物において１５日目に１０μｇのＯＶＡタンパク質＋５０ｎｇのＬＰＳ／マウスの皮内注射で抗原チャレンジを行う。１９日目に各マウスの流入リンパ節および脾臓を分析し、抗原チャレンジに対するＯＴ−ＩおよびＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞応答をＯＴ−ＩおよびＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞の数およびＩＦＮ−γ細胞内染色についてのフローサイトメトリー、およびＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定する。代表的な処置スケジュールの図解を図７に示し、処置群を表３に要約する。
【表３】
2019519483.tif 000005
【０２９３】
（実施例６Ａ）
マウスＩ型糖尿病モデルにおける予防
序
ＳＱＺによって送達された抗原を含有するＲＢＣの、マウスＩ型糖尿病の予防ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて抗原依存的寛容性を誘導する能力を決定するために、寛容性誘導後に経時的に毎週、血液グルコースレベルを測定する。
【０２９４】
材料および方法
１０週齢時にＮＯＤ／ＳｈｉｌｔＪマウスをＲＢＣで処置する。０日目（プライム）および５日目（ブースト）に、ＮＯＤ／ＳｈｉｌｔＪマウスからＲＢＣを回収し、ＲＢＣをインスリンＢ鎖ペプチド９〜２３（ＩｎｓＢ９〜２３：ＣＫＫＧＳＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧ、配列番号２）とインキュベートするか、またはＩｎｓＢ９〜２３をＳＱＺ条件によって送達した後、レシピエントマウスに２０〜１２５ＭのＲＢＣ／マウスを注射する。対照動物にはＰＢＳを注射する（チャレンジ対照）。処置後７日目（１１週齢）に開始して、血液グルコース測定を毎週実行する。Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｎｔｏｕｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔｅｒ／Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｅｓｔ  Ｓｔｒｉｐにより測定して血液グルコースレベルが２６０ｍｇ／ｄＬを超えたときにマウスは糖尿病であるとみなす。代表的な処置スケジュールの図解を図１１Ａに示し、処置群を表４に要約する。
【表４】
2019519483.tif 000006
【０２９５】
（実施例６Ｂ）
マウスＩ型糖尿病モデルの治療
序
ＳＱＺによって送達された抗原を含有するＲＢＣの、マウスＩ型糖尿病の処置のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて抗原依存的寛容性を誘導する能力を決定するために、マウスでの寛容性誘導後に経時的に毎週、血液グルコースレベルを測定する。
【０２９６】
材料および方法
レシピエントでＴ１Ｄの迅速な発症を誘導するために、ＢＤＣ２．５  ＮＯＤマウスからＣＤ４  Ｔ細胞を回収し、ｐ３１ミメトープ（mimetope）ペプチド（ＹＶＲＰＬＷＶＲＭＥ、配列番号３）で４日間ｅｘ  ｖｉｖｏで活性化し、正常血糖のＮＯＤレシピエントに養子移入する（５Ｍ細胞／マウス）。養子移入の８時間後に寛容性誘導を開始し、３日毎、計３回の投与となるように繰り返す。レシピエントをＰＢＳ（チャレンジ対照）またはｐ３１とインキュベートした２０〜１２５ＭのＲＢＣ（ＲＢＣ−Ｅｎｄｏ）もしくはｐ３１をＳＱＺによって送達した２０〜１２５ＭのＲＢＣ（ＲＢＣ−ＳＱＺ）で処置する。Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｎｔｏｕｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔｅｒ／Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｅｓｔ  Ｓｔｒｉｐによって血液グルコースを毎日測定する。血液グルコースレベルが２６０ｍｇ／ｄＬを超えたときにマウスを糖尿病とみなす。代表的な処置スケジュールの図解を図１１Ｂに示し、処置群を表５に要約する。
【表５】
2019519483.tif 000007
【０２９７】
（実施例７Ａ）
マウスＭＳ型自己免疫障害の予防
序
ＳＱＺによって送達された抗原を含有するＲＢＣの、マウスＭＳ型自己免疫障害のｉｎ  ｖｉｖｏ予防モデルにおいて抗原依存的寛容性を誘導する能力を決定するために、運動性の臨床スコアを経時的に毎日評価する。
【０２９８】
材料および方法
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０〜１２週齢）を実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘導前にＲＢＣで処置する。−７日目（プライム）および−２日目（ブースト）にＣ５７ＢＬ／６マウスからＲＢＣを回収し、ＲＢＣを狭窄なしでミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド３５〜５５（ＭＯＧ３５〜５５：ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＧＳ、配列番号４）もしくはＯＶＡ３２３〜３３９ペプチド（陰性対照：ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲＧＳ、配列番号５）とインキュベートするか、またはＭＯＧ３５〜５５ペプチドをＳＱＺ条件によってＲＢＣに送達した後、レシピエントマウスに２０〜１２５ＭのＲＢＣ／マウスを注射する。０日目に、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５〜５５およびＰＢＳ中の百日咳毒素（Ｈｏｏｋｅ  ｋｉｔ）の投与によってＥＡＥを誘導する。７日目に開始してマウスを毎日スコア付けする。臨床スコアは以下の通りに定義する：１．尾の引きずり；２．部分的な後肢の麻痺；３．完全な後肢の麻痺；４．完全な後肢および部分的な前肢の麻痺；および５．瀕死。代表的な処置スケジュールの図解を図１２Ａに示し、処置群を表６に要約する。
【表６】
2019519483.tif 000008
【０２９９】
（実施例７Ｂ）
マウスＭＳ型自己免疫障害の治療
序
ＳＱＺによって送達された抗原を含有するＲＢＣの、確立されたマウスＭＳ型自己免疫障害のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて抗原依存的寛容性を誘導する能力を決定するために、運動性の臨床スコアを経時的に毎日評価する。
【０３００】
材料および方法
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０〜１２週齢）において、０日目にＣＦＡ中のＭＯＧ３５〜５５およびＰＢＳ中の百日咳毒素（Ｈｏｏｋｅ  ｋｉｔ）の投与によって実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導する。次いで、下記の運動性基準に基づいてマウスが１以上のスコアとなった日であるＥＡＥの発症日に、マウスをＲＢＣで処置する。約１１／１２日目（プライム）および約１７／１８日目（ブースト）にＣ５７ＢＬ／６マウスからＲＢＣを回収し、ＲＢＣを狭窄なしでミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド３５〜５５（ＭＯＧ３５〜５５：ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＧＳ、配列番号４）とインキュベートするか、またはＯＶＡ３２３〜３３９ペプチド（陰性対照：ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲＧＳ、配列番号５）もしくはＭＯＧ３５〜５５ペプチドをＳＱＺ条件によってＲＢＣに送達した後、レシピエントマウスに２０〜１２５ＭのＲＢＣ／マウスを注射する。１９日目に開始してマウスを毎日スコア付けする。臨床スコアは以下の通りに定義する：１．尾の引きずり；２．部分的な後肢の麻痺；３．完全な後肢の麻痺；４．完全な後肢および部分的な前肢の麻痺；および５．瀕死。代表的な処置スケジュールの図解を図１２Ｂに示し、処置群を表７に要約する。
【表７】
2019519483.tif 000009
【表８】
2019519483.tif 000010
【図１】
2019519483.tif 000011
【図２】
2019519483.tif 000012
【図３Ａ】
2019519483.tif 000013
【図３ＢＣ】
2019519483.tif 000014
【図４ＡＢＣ】
2019519483.tif 000015
【図４ＤＥＦ】
2019519483.tif 000016
【図４ＧＨＩ】
2019519483.tif 000017
【図５Ａ】
2019519483.tif 000018
【図５ＢＣ】
2019519483.tif 000019
【図６ＡＢ】
2019519483.tif 000020
【図６ＣＤ】
2019519483.tif 000021
【図７】
2019519483.tif 000022
【図８】
2019519483.tif 000023
【図９】
2019519483.tif 000024
【図１０】
2019519483.tif 000025
【図１１】
2019519483.tif 000026
【図１２】
2019519483.tif 000027
【配列表】
2019519483000001.app
【国際調査報告】
2019519483.tif 000028
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