(57)【要約】  がんの併用療法における使用のための、骨髄由来抑制細胞阻害剤（「ＭＤＳＣ阻害剤」）およびバクテリオクロロフィル誘導体（以下、「Ｂｃｈｌ−Ｄ」）が提供される。このＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄは連続投与され、Ｂｃｈｌ−Ｄの投与に続いて、光線力学療法（ＰＤＴ）または血管標的ＰＤＴ（ＶＴＰ）が行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんの併用療法における使用のための、骨髄由来抑制細胞阻害剤（以下、「ＭＤＳＣ阻害剤」）およびバクテリオクロロフィル誘導体（以下、「Ｂｃｈｌ−Ｄ」）であって、該ＭＤＳＣ阻害剤および該Ｂｃｈｌ−Ｄが連続投与され、該Ｂｃｈｌ−Ｄの投与に続いて光線力学療法（ＰＤＴ）が行われることを特徴とする、ＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項２】
前記併用療法が、前記ＭＤＳＣ阻害剤の単独投与の効果または前記Ｂｃｈｌ−Ｄの単独投与に続いてＰＤＴを行うことの効果と比較して増強された治療効果を有する、請求項１に記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項３】
前記増強された治療効果が相乗治療効果である、請求項２に記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項４】
前記ＭＤＳＣ阻害剤がゲムシタビン；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；シスプラチン；パクリタキセル；シクロホスファミド；スニチニブ；ＳＣ−５８２３６およびＳＣ−５８１２５のようなシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）阻害剤；ゾレドロン酸のようなビスフォスフォネート製剤、またはアレンドロン酸塩のようなアミノビスフォスフォネート製剤；オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）；ビタミンＤ３；ビタミンＡ；ＫＩＴ特異抗体；ニトロアスピリン誘導体；（ＣＤＤＯ−Ｍｅとして知られている）バルドキソロンメチルのような合成トリテルペノイド誘導体；ならびにシルデナフィルおよびタダラフィルのようなホスホジエステラーゼ−５（ＰＤＥ−５）阻害剤から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項５】
前記ＭＤＳＣ阻害剤がゲムシタビンまたはシクロホスファミドである、請求項４に記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項６】
前記Ｂｃｈｌ−Ｄが、ＲＧＤ含有ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣残基と複合体を形成していてもよいアニオン性バクテリオクロロフィル誘導体である、請求項１〜５のいずれかに記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項７】
前記アニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄが、式Ｉ：
【化１】
2019510807.tif 000008
［式中、Ｍは２ＨまたはＰｄを表し；
Ｒ１はＯ−Ｒ４または−ＮＨＲ５であり、ここでＲ４は、Ｈ、Ｈ＋、アンモニウム基またはＮａ＋もしくはＫ＋のような１価の金属カチオンであり、Ｒ５はＲＧＤ含有ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣残基であり；
Ｒ２は−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、好ましくはメチルであり；
Ｒ３は−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｒ６＋であり、ここでｎは２または３であり、Ｒ６＋はＮａ＋もしくはＫ＋のような１価の金属カチオンである］
を有するＢｃｈｌ−Ｄ、または薬学的に許容されるその塩もしくは光学異性体である、請求項６に記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項８】
前記アニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄが、ＲＧＤ含有ペプチドともＲＧＤペプチド模倣残基とも複合体を形成していないアニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄであり、例えば、ＷＳＴ１１と称されるＢｃｈｌ−ＤまたはＳＴＬ−７０１２と称されるＢｃｈｌ−Ｄである、請求項７に記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項９】
前記ＰＤＴが血管標的ＰＤＴ（ＶＴＰ）であり、前記複合体を形成していないＢｃｈｌ−Ｄの投与後に、治療対象部位を０〜３０分間のような短時間照射する、請求項８に記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項１０】
前記式Ｉのアニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄが、ＲＧＤ含有ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣残基と複合体を形成している、請求項７に記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項１１】
前記式Ｉのアニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄが、環状ＲＧＤ含有ペプチドまたは環状ＲＧＤペプチド模倣残基と複合体を形成しているアニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄであり、例えば、ＳＴＬ−６０１４と称されるＢｃｈｌ−Ｄ、ＳＴＬ−６０３３と称されるＢｃｈｌ−Ｄ、ＳＴＬ−６０３８と称されるＢｃｈｌ−ＤまたはＳＴＬ−６０６８と称されるＢｃｈｌ−Ｄである、請求項１０に記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項１２】
前記ＰＤＴが組織を標的とし、治療される局所組織が、前記複合体を形成しているＢｃｈｌ−Ｄの投与から少なくとも４時間経過後、好ましくは少なくとも６時間経過後に照射される、請求項８に記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項１３】
前記ＰＤＴまたはＶＴＰによる治療が、前記治療される局所組織の照射に先立って前記Ｂｃｈｌ−Ｄを単独投与することを含み、前記ＭＤＳＣ阻害剤による治療が、所定の様々な間隔をあけて前記ＭＤＳＣ阻害剤を複数回投与することを含む、請求項８に記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項１４】
前記ＭＤＳＣ阻害剤が、前記ＰＤＴまたはＶＴＰによる治療の前に一度投与され、その後所定の間隔をあけて複数回投与される、請求項１３に記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項１５】
前記ＭＤＳＣ阻害剤が、前記ＰＤＴまたはＶＴＰによる治療の後に、所定の間隔をあけて複数回投与される、請求項１３に記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項１６】
前記ＭＤＳＣ阻害剤による治療が、５〜１２日間またはそれ以上である所定の時間間隔をあけて前記ＭＤＳＣ阻害剤を４〜１０回投与することを含み、そのような所定の２つの休薬期間に挟まれた１つの休薬期間が、各所定の休薬期間よりも長くてもよい、請求項１３〜１５のいずれかに記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項１７】
前記ＭＤＳＣ阻害剤がゲムシタビンであり、ＰＤＴを実施するために使用されるＢｃｈｌ−ＤがＳＴＬ−６０１４である、請求項１３〜１６のいずれかに記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項１８】
前記ＭＤＳＣ阻害剤がゲムシタビンであり、ＶＴＰを実施するために使用されるＢｃｈｌ−ＤがＷＳＴ１１である、請求項１３〜１６のいずれかに記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項１９】
前記ＭＤＳＣ阻害剤がシクロホスファミドであり、ＶＴＰを実施するために使用されるＢｃｈｌ−ＤがＷＳＴ１１である、請求項１３〜１６のいずれかに記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項２０】
前記ＭＤＳＣ阻害剤が、従来の単剤化学療法における該剤の従来の用量の３分の１または４分の１のような低用量で投与される、請求項１〜１９のいずれかに記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項２１】
治療される前記がんが、黒色腫、腎細胞がん、大腸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、脳腫瘍、膵腺がんまたは頭頸部腫瘍のような原発性固形癌腫および転移癌腫である、請求項１〜２０のいずれかに記載のＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項２２】
がんの治療のための併用療法においてＢｃｈｌ−Ｄとともに使用するためのＭＤＳＣ阻害剤であって、該ＭＤＳＣ阻害剤および該Ｂｃｈｌ−Ｄが連続投与され、該Ｂｃｈｌ−Ｄの投与に続いて光線力学療法（ＰＤＴ）が行われることを特徴とする、ＭＤＳＣ阻害剤。
【請求項２３】
がんの治療のための併用療法においてＭＤＳＣ阻害剤とともに使用するためのＢｃｈｌ−Ｄであって、該ＭＤＳＣ阻害剤および該Ｂｃｈｌ−Ｄが連続投与され、該Ｂｃｈｌ−Ｄの投与に続いて光線力学療法（ＰＤＴ）が行われることを特徴とする、Ｂｃｈｌ−Ｄ。
【請求項２４】
前記併用療法が、前記ＭＤＳＣ阻害剤の単独投与の効果または前記Ｂｃｈｌ−Ｄの単独投与に続いてＰＤＴを行うことの効果と比較して増強された治療効果を有する、請求項２２に記載のＭＤＳＣ阻害剤または請求項２３に記載のＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項２５】
前記増強された治療効果が相乗治療効果である、請求項２４に記載のＭＤＳＣ阻害剤またはＢｃｈｌ−Ｄ。
【請求項２６】
併用療法によるがんの治療方法であって、（ｉ）治療有効量の骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）阻害剤（以下、「ＭＤＳＣ阻害剤」）ならびに（ｉｉ）治療有効量のバクテリオクロロフィル誘導体（Ｂｃｈｌ−Ｄ）およびそれに続く光線力学療法（ＰＤＴ）（以下、「Ｂｃｈｌ−Ｄ  ＰＤＴ」）を、がんの治療を必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項２７】
前記併用療法が、それぞれ単独で投与された前記ＭＤＳＣ阻害剤または前記Ｂｃｈｌ−Ｄ  ＰＤＴと比較して増強された治療効果を奏する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記併用療法が相乗治療効果を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＭＤＳＣ阻害剤と前記Ｂｃｈｌ−Ｄ  ＰＤＴとが連続して投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＭＤＳＣ阻害剤がゲムシタビン；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；シスプラチン；パクリタキセル；シクロホスファミド；スニチニブ；ＳＣ−５８２３６およびＳＣ−５８１２５のようなシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）阻害剤；ゾレドロン酸のようなビスフォスフォネート製剤、またはアレンドロン酸塩のようなアミノビスフォスフォネート製剤；オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）；ビタミンＤ３；ビタミンＡ；ＫＩＴ特異抗体；ニトロアスピリン誘導体；（ＣＤＤＯ−Ｍｅとして知られている）バルドキソロンメチルのような合成トリテルペノイド誘導体；ならびにシルデナフィルおよびタダラフィルのようなホスホジエステラーゼ−５（ＰＤＥ−５）阻害剤から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＭＤＳＣ阻害剤がゲムシタビンまたはシクロホスファミドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｂｃｈｌ−Ｄが、ＲＧＤ含有ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣残基と複合体を形成していてもよいアニオン性バクテリオクロロフィル誘導体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記アニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄが、式Ｉ：
【化２】
2019510807.tif 000009
［式中、Ｍは２ＨまたはＰｄを表し；
Ｒ１はＯ−Ｒ４または−ＮＨＲ５であり、ここでＲ４は、Ｈ、Ｈ＋、アンモニウム基またはＮａ＋もしくはＫ＋のような１価の金属カチオンであり、Ｒ５はＲＧＤ含有ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣残基であり；
Ｒ２は−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、好ましくはメチルであり；
Ｒ３は−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｒ６＋であり、ここでｎは２または３であり、Ｒ６＋はＮａ＋もしくはＫ＋のような１価の金属カチオンである］
を有するＢｃｈｌ−Ｄ、または薬学的に許容されるその塩もしくは光学異性体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記式Ｉのアニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄが、ＲＧＤ含有ペプチドともＲＧＤペプチド模倣残基とも複合体を形成していないアニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄであり、例えば、ＷＳＴ１１と称されるＢｃｈｌ−ＤまたはＳＴＬ−７０１２と称されるＢｃｈｌ−Ｄである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＰＤＴが血管標的ＰＤＴ（ＶＴＰ）であり、前記複合体を形成していないＢｃｈｌ−Ｄの投与後に、治療対象部位を０〜３０分間のような短時間照射する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記式Ｉのアニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄが、ＲＧＤ含有ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣残基と複合体を形成している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記式Ｉのアニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄが、環状ＲＧＤ含有ペプチドまたは環状ＲＧＤペプチド模倣残基と複合体を形成しているアニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄであり、例えば、ＳＴＬ−６０１４、ＳＴＬ−６０３３、ＳＴＬ−６０３８またはＳＴＬ−６０６８と称されるＢｃｈｌ−Ｄである、、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＤＴが組織を標的とし、治療される局所組織が、前記複合体を形成しているＢｃｈｌ−Ｄの投与から少なくとも４時間経過後、好ましくは少なくとも６時間経過後に照射される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＰＤＴまたはＶＴＰによる治療が、前記治療される局所組織の照射に先立って前記Ｂｃｈｌ−Ｄを単独投与することを含み、前記ＭＤＳＣ阻害剤による治療が、所定の様々な間隔をあけて前記ＭＤＳＣ阻害剤を複数回投与することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＭＤＳＣ阻害剤が、前記ＰＤＴまたはＶＴＰによる治療の前に一度投与され、その後所定の間隔をあけて複数回投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＭＤＳＣ阻害剤が、前記ＰＤＴまたはＶＴＰによる治療の後、所定の間隔をあけて複数回投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＭＤＳＣ阻害剤による治療が、５〜１０日間またはそれ以上である所定の時間間隔をあけて前記ＭＤＳＣ阻害剤を４〜１０回投与することを含み、そのような所定の２つの休薬期間に挟まれた１つの休薬期間が、各所定の休薬期間よりも長くてもよい、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＭＤＳＣ阻害剤がゲムシタビンであり、ＰＤＴを実施するために使用されるＢｃｈｌ−ＤがＳＴＬ−６０１４である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＭＤＳＣ阻害剤がゲムシタビンであり、ＶＴＰを実施するために使用されるＢｃｈｌ−ＤがＷＳＴ１１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＭＤＳＣ阻害剤がシクロホスファミドであり、ＶＴＰを実施するために使用されるＢｃｈｌ−ＤがＷＳＴ１１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＭＤＳＣ阻害剤が、従来の単剤化学療法における該剤の従来の用量の３分の１または４分の１のような低用量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの治療およびそのための併用療法に関する。
【０００２】
定義と略語
Ｂｃｈｌ：バクテリオクロロフィル；Ｂｃｈｌ−Ｄ：バクテリオクロロフィル誘導体；ＢＬＩ：生物発光イメージング；Ｂｐｈｅｉｄ：バクテリオフェオフォルビドａ（中心金属原子を有さず、Ｃ−１７２位が遊離カルボン酸となったＢｐｈｅの誘導体）；ＣＴＸ，ＣＹ：シクロホスファミド；ＤＣ：樹状細胞；ＤＤＷ：再蒸留水；ＧＥＭ：ジェムザール，ゲムシタビン；ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質；ＩＶＩＳ：Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｌｕｃ：ルシフェリン，ルシフェラーゼ；ＩＶＩＳ：Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ；ｌｕｃ：ルシフェラーゼ；Ｌｙ６Ｇ：リンパ球抗原６複合体は、２１〜２５ｋＤのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と結合した分化抗原であり、骨髄由来細胞に発現する；Ｌｙ６Ｇ：リンパ球抗原６複合体は、２１〜２５ｋＤのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と結合した分化抗原であり、骨髄由来細胞に発現する；ＭＤＳＣ：骨髄由来抑制細胞；ロドバクテリオクロリン：１７位に−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ基、１３位に−ＣＯＯＨ、２位，７位，１２位および８位にメチル基、ならびに３位および８位にエチル基を有する、四環性７，８，１７，１８−テトラヒドロポルフィリン；Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄ：Ｐｄ−バクテリオフェオフォルビドａ；ＮＩＲ：近赤外；ＰＤＴ：光線力学療法；ＲＧＤ−４Ｃ：環状ノナペプチドＣＤＣＲＧＤＣＦＣ−ＮＨ２；ＲＯＳ：活性酸素種；ＶＴＰ：血管標的ＰＤＴ；
【背景技術】
【０００３】
がんおよび免疫抑制細胞を標的とする治療法の併用は、原発性腫瘍の増殖を抑制し、転移増殖を予防するための有望な手段を構成している。
【０００４】
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）は、骨髄に由来すること、未熟な状態にあること、およびＴ細胞の応答に対する強い抑制能を有することによって定義付けられる不均一な細胞集団である。ＭＤＳＣは、健常な個体において免疫反応および組織の修復を制御する。この細胞集団は、炎症、感染において急速に増殖する。ＭＤＳＣは、２つのサブセット、すなわち顆粒球型（Ｇ−ＭＤＳＣ）と単球型（Ｍ−ＭＤＳＣ）とに大別され、これらは、形態学的にはそれぞれ顆粒球および単球と類似している（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，２０１７）。
【０００５】
ＭＤＳＣは、がんにおいて強い免疫抑制活性を示す。ＭＤＳＣは腫瘍に浸潤し、がんに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を強力に抑制する（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，２０１７）。抗腫瘍免疫を抑制して周囲環境内および遠位部位における腫瘍の増殖を促進するというＭＤＳＣのこのような特性を、血管新生および転移に有効に「利用」することで、腫瘍は増殖する。免疫反応によって腫瘍細胞を効率的に抑制するためには、ＭＤＳＣの活性を抑制する新たな療法が不可欠である（Ｃｏｎｄａｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｄｉａｚ−Ｍｏｎｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，２０１７；Ｍａｒｖｅｌ  ａｎｄ  Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，２０１５；Ｎａｊｊａｒ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋｅ，２０１３；Ｑｕａｉｌ，２０１３  ＃１８）。
【０００６】
単核細胞系または多形核細胞系の骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）は、一酸化窒素およびペルオキシ亜硝酸の産生を通じて細胞傷害性Ｔ細胞を中和することによって免疫抑制を促進し、それによってがん細胞の抗腫瘍免疫回避を促進する（Ｃｏｎｄａｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｇａｒａｊ，２００９）。さらに、骨髄性前駆細胞のＭＤＳＣへの早期分化は、プロフェッショナル抗原提示細胞による腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の提示、先天免疫反応および適応免疫反応の開始に必要とされる樹状細胞の成熟（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，２０１７）によって生じる。乳腺、前立腺、肺、腎臓のがんおよびその他のがんの進行が、初期の局在ステージから播種および転移のステージに至るまで、（患者の末梢、脾臓、リンパ節および腫瘍内微小環境に存在する）ＭＤＳＣの増殖と密接に関連していることが見出された。（Ｂｒｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｃｏｎｄａｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，２０１７；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｇａｒａｊ，２００９；Ｎａｊｊａｒ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋｅ，２０１３）。ＭＤＳＣの増加によってＣＤ−４Ｔ細胞およびＣＤ−８Ｔ細胞の活性化が阻害され、免疫抑制が増強される（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，２０１７）。この増加は主として、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−６のようなサイトカインががん細胞から分泌され、その後、ＩＬ−６等を通じてＭＤＳＣによるオートクリン刺激が起こることと関連付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｇａｒａｊ，２００９）。高濃度において、ＭＤＳＣは、原発性腫瘍および循環がん細胞を免疫監視および毒性から保護し、腫瘍ニッチの確立を支援する。
【０００７】
ＭＤＳＣを抑制する複数の方法について、現在研究が行われている。これらは、大まかに、（ａ）成熟した非抑制性細胞への、ＭＤＳＣの分化を促進する方法（オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ）（Ｎａｊｊａｒ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋｅ，２０１３）、（ｂ）ＭＤＳＣの濃度を低下させる方法（スニチニブ、ゲムシタビン（ＧＥＭ）、フルオロウラシル（ｆ−５Ｕ）、バルドキソロンメチル（ＣＤＤＯ−Ｍｅ））（Ｎａｊｊａｒ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋｅ，２０１３）または（ｃ）ＭＤＳＣを機能的に抑制する方法（ホスホジエステラーゼ−５（ＰＤＥ−５）阻害剤、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）阻害剤）（Ｎａｊｊａｒ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋｅ，２０１３）に分類することができる。
【０００８】
臨床分野において様々ながんの治療に使用されているゲムシタビン（ＧＥＭ、ジェムザール）、フルオロウラシル（ｆ−５Ｕ）およびＦＤＡの承認を受けたその他の化学療法剤が、がんを有するマウスおよびヒトのいずれにおいてもＭＤＳＣの細胞数を選択的に低減させることが見出された（Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０。しかしながら、がん進行に遅延が見られたものの、これらの医薬品の中に、転移までの時間を顕著に延ばし、患者の生存率（例えば膵臓がんの治療における生存率）を顕著に高めるものは見出されなかった。
【０００９】
一般的な光線力学療法（ＰＤＴ）、および特に新規なバクテリオクロロフィル誘導体（以下、Ｂｃｈｌ−Ｄ）を使用する血管標的ＰＤＴ（ＶＴＰ）が、種々の標的における局所的な固形腫瘍を選択的に除去することが示されている（ＷＯ  ００／３３８３３；ＷＯ  ２００４／０４５４９２）。特に、ＷＳＴ１１と称されるＢｃｈｌ−Ｄを用いるＶＴＰは、臨床試験が成功を収めた後（Ａｚｚｏｕｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，２０１７；Ｅｙｍｅｒｉｔ−Ｍｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、前立腺がんの初期ステージの治療における使用が最近になって承認されている。
【００１０】
メトロノミック化学療法は元来、血管新生を抑制するよう設計されており、低用量の化学療法剤を、間隔を長くあけることなく定期的に頻回に投与することで、強い毒性を最小限に抑えるものである（Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；  Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。このような治療は、細胞集団特異的に腫瘍増殖促進免疫細胞の増殖に特に効果を及ぼすことが見出された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様において、本発明は、がんの併用療法における使用のための、骨髄由来抑制細胞阻害剤（以下、「ＭＤＳＣ阻害剤」）およびバクテリオクロロフィル誘導体（以下、「Ｂｃｈｌ−Ｄ）であって、該ＭＤＳＣ阻害剤および該Ｂｃｈｌ−Ｄが連続投与され、該Ｂｃｈｌ−Ｄの投与に続いて光線力学療法（ＰＤＴ）が行われることを特徴とする、ＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄを提供する。
【００１２】
別の一態様において、本発明は、併用療法によるがんの治療方法であって、（ｉ）治療有効量の骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）阻害剤（以下、「ＭＤＳＣ阻害剤」）ならびに（ｉｉ）治療有効量のバクテリオクロロフィル誘導体（Ｂｃｈｌ−Ｄ）およびそれに続く光線力学療法（ＰＤＴ）（以下、「Ｂｃｈｌ−Ｄ  ＰＤＴ」）を、がんの治療を必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本願明細書は、少なくとも１枚のカラー図面を含む。カラー図面を含む本願明細書のコピーは、米国特許商標庁に請求し、所定の費用を支払うことによって、入手することができる。
【００１４】
【図１Ａ】４Ｔ１乳がんを有するマウスにおける、ＳＴＬ−６０１４（上列）およびＳＴＬ−７０１２（下列）のインビボ蓄積およびクリアランスを示す。
【図１Ｂ】投与から１６時間後の、腫瘍および種々の器官におけるＳＴＬ−６０１４の蓄積および／または滞留を示す。
【００１５】
【図２】（２Ａ）乳腺脂肪体に４Ｔ１腫瘍を有するマウスの、ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴとジェムザールの投与を併用する治療スキーム１を示す。ジェムザールの投与は、ＰＤＴの２日前に開始される（青色の矢印）か、またはＰＤＴの１日後に開始される（橙色の矢印）。（２Ｂ）ＳＴＬ−６０１４のボーラス注入から６時間後の、照射された腫瘍を示す。（２Ｃ）原発性腫瘍および転移性腫瘍を有するマウス（左）、原発性腫瘍のみのマウス（中間）および治癒したマウス（右）のルシフェリン生物発光を示す。
【００１６】
【図３】５種類の治療レジメンのいずれかの実施から７日後（白抜き）および３０日後（黒）に、同所性４Ｔ１腫瘍を有さない動物のパーセンテージを示す。４Ｔ１を乳腺脂肪体に移植し、図２に示した治療スキーム１によってジェムザール（ＧＥＭ）を投与してから７日後に、ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴ療法を適用した。以下のレジメンを適用した：（１）治療せず（対照，Ｎ＝１８）；（２）ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴ（ＰＤＴ，Ｎ＝２９）；（３）ジェムザールのメトロノミック療法を移植の５日後に開始（ＧＥＭ，Ｎ＝１１）；（４）ジェムザールのメトロノミック療法を、ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴ  の１日後に開始（Ｎ＝１９，ＰＤＴはＳＴＬ−６０１４注入の６時間後に適用）；（５）ジェムザールのメトロノミック療法を、ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴ  の２日前に開始（Ｎ＝２０，ＰＤＴはＳＴＬ−６０１４注入の６時間後）。
【００１７】
【図４】同所性４Ｔ１腫瘍を有し、図３に記載の種々の治療レジメンにより治療したＢａｌｂ／ｃマウスの、カプランマイヤー生存曲線を示す。対照（Ｎ＝１８）（◆）：治療せず；ＳＴＬ−６０１４（Ｎ＝２９）（■）：「材料および方法」に記載したように腫瘍を移植し、７日後に単独療法としてＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴを適用；Ｇｅｍ（▲）（Ｎ＝１１）：腫瘍移植の５日後に、単独療法としてジェムザールの最初の投与を適用；ＰＤＴ６時間とＧＥＭ（Ｎ＝１９）：ＳＴＬ−６０１４の投与から６時間後にＰＤＴを適用し、これと併用してＰＤＴの１日後にジェムザールの投与を開始し、その後さらに５週間、毎週投与を行う；ＰＤＴ６時間とＧＥＭ（第−２日）（Ｎ＝２０）（●）：ＳＴＬ−６０１４の投与から６時間後にＰＤＴを適用し、これと併用してジェムザールの投与を５回行う。投与はＰＤＴの２日前に開始し、その後さらに５週間、毎週投与を行う。
【００１８】
【図５】ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴとジェムザールとを併用する２つの異なる治療レジメンに従った後、動物を犠死させた。犠死当日に４Ｔ１肺転移の見出された動物のパーセンテージを円グラフに示す。（５Ａ）ＳＴＬ−６０１４−ＰＤＴをジェムザールと併用し、ジェムザールの投与は、ＳＴＬ−６０１４−ＰＤＴの適用の１日後に開始する（Ｎ＝２０）。（５Ｂ）ＳＴＬ−６０１４−ＰＤＴをジェムザールと併用し、ジェムザールの投与は、ＳＴＬ−６０１４−ＰＤＴの適用の２日前に開始する（Ｎ＝１９）。
【００１９】
【図６】ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴと、ＰＤＴの２日前のジェムザールとの併用により４Ｔ１腫瘍が治癒したＢａｌｂ／ｃマウスに、２×１０５個の４Ｔ１細胞を用いた２度目の同所移植による再誘発を行い、４Ｔ１腫瘍の進行を観察した。再誘発は、最初の治癒の１２０日後（最初の腫瘍移植の２４０日後）に行った。（６Ａ）ナイーブ動物への４Ｔ１腫瘍移植後の動物個体（Ｎ＝１０）の生存を示し、曲線のそれぞれが１匹の動物を表す。（６Ｂ）最初の腫瘍移植後に治療を受けて治癒した動物への４Ｔ１腫瘍移植後の動物個体（Ｎ＝１５）の生存を示す。曲線のそれぞれが１匹の動物を表すが、橙色／緑色の曲線は、それぞれ１０匹の動物を表す。治療の５０日後、これら１０／１５匹の動物には、原発性腫瘍も転移性腫瘍も見られなかった。
【００２０】
【図７】ＭＢ４９（膀胱）腫瘍を有するマウスのための、ＷＳＴ１１  ＶＴＰとジェムザールとを併用投与する治療スキーム２を示す。ＭＢ４９がん細胞（１０６個）を、第−１５日にＢａｌｂ／ｃマウスの後肢に移植した。ジェムザールの最初の投与（５０ｍｇ／ｋｇ）を第−３日に行い、次いで４日後に投与し、その後は週に２回、月に３週のサイクルで、９０日間に計１２回の治療が行われるよう継続した。ＷＳＴ１１  ＶＴＰは、腫瘍移植の１５日後に行った。ＷＳＴ１１（９ｍｇ／ｋｇ）を５分間かけて静脈に注入し、その後Ｍｏｄｕｌｉｇｈｔレーザーを用いて、７５３ｎｍ、１２０ｍＷ／ｃｍ２で１０分間の照射を行った。
【００２１】
【図８】治療スキーム２（図７）に基づいた、種々の治療レジメンに対する、ＭＢ４９腫瘍移植マウスの反応を示す。（８Ａ）平均腫瘍増殖（エラーバー：ＳＥＭ）。黒色：対照（１７匹中０匹が治癒、ｐ＜０．０００１  対ＶＴＰ＋ジェムザール）；青色：ジェムザール単独（１９匹中０匹が治癒、ｐ＜０．０００１  対ＶＴＰ＋ジェムザール）；赤色：ＶＴＰ単独（１９匹中３匹が治癒、ｐ＜０．０００５  対ＶＴＰ＋ジェムザール）；緑色：ＶＴＰ＋ジェムザール（１７匹中１１匹が治癒）。ｐ値の計算は、２元配置分散分析に基づく。（８Ｂ）上記ＷＳＴ１１とＶＴＰとの併用治療後の、個々のマウスの後肢における腫瘍増殖。上パネル左：対照，１７匹中０匹が治癒；上パネル右：ジェムザール単独，１９匹中０匹が治癒；下パネル左：ＶＴＰ単独，１９匹中３匹が治癒；下パネル右：ＶＴＰ＋ジェムザール，１７匹中１１匹が治癒。（８Ｃ）治療開始から２５日後の生物発光に反映される肺転移の予防：上パネル：個々のマウスの肺における平均放射輝度（＊ｐ＜０．００５，＊＊ｐ＜０．０００１）；下パネル上列：対照動物およびジェムザールのみで治療した動物の画像；下パネル下列：治癒した動物の画像。（８Ｄ）種々の治療レジメン実施後の動物の粗生存率。
【００２２】
【図９】種々の治療レジメン実施後の全身的抗腫瘍反応の発生を示す。第−１５日に、ＭＢ４９がん細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの右後肢に移植した。（９Ａ）ジェムザールの最初の投与（５０ｍｇ／ｋｇ）を第−３日に行い、次いで４日後に投与し、その後は週に２回のサイクルを３週間継続した。１週間休薬した後、再び３週間のサイクルを行って、９０日間に計１２回の治療となるようにした。ＷＳＴ１１  ＶＴＰを、腫瘍移植の１５日後に行った。ＷＳＴ１１（９ｍｇ／ｋｇ）を５分間かけて静脈に注入し、その後Ｍｏｄｕｌｉｇｈｔレーザーを用いて、７５３ｎｍ、１２０ｍＷ／ｃｍ２で１０分間の照射を行った。第２の腫瘍は、ＶＴＰの翌日に、左後肢に移植した。（９Ｂ）個々の動物における、ＷＳＴ１１  ＶＴＰの翌日に左後肢に移植した第２の腫瘍の腫瘍増殖；上パネル左：対照（２０匹中１４匹の動物で増殖）；上パネル右：ジェムザール（２０匹中１５匹の動物で増殖）；下パネル左：ＷＳＴ１１  ＶＴＰ単独（１９匹中１２匹で増殖）；下パネル右：ＶＴＰ＋ジェムザール（１７匹中５匹で増殖）。（９Ｃ）ＰＤＴによってＭＢ４９が治癒し、その後尾静脈からＭＢ４９を注入した動物のカプランマイヤー生存曲線を示す。
【００２３】
【図１０】Ｔ細胞集団およびＢ細胞集団の欠如により、ＭＢ４９腫瘍におけるＶＴＰ、ゲムシタビンおよびそれらの併用による治療効果が低減されている。（１０Ａ）カプランマイヤー生存曲線から、免疫不全マウス（Ｒａｇ１ＫＯ，ｎ＝２２）の粗生存率が、ＷＳＴ１１  ＶＴＰで治療した免疫応答性マウス（ＷＴ  Ｎ＝１９）と比較して統計的に有意に低下（ｐ＜０．０００１）していることがわかる。（１０Ｂ）ジェムザール単独で治療したマウスの粗生存率（ＷＴ  Ｎ＝１０，Ｒａｇ１ＫＯ，Ｎ＝１０，ｐ＜０．０５）。（１０Ｃ）併用治療したマウスの粗生存率（ＷＴ  Ｎ＝１０，Ｒａｇ１ＫＯ  Ｎ＝７，ｐ＜０．００５）。
【００２４】
【図１１】治療されていない（対照）動物中の４Ｔ１を有するマウスの脾臓における免疫細胞集団の代表的な図である：（１１Ａ）顆粒球型／単球型骨髄由来抑制細胞（Ｇ／Ｍ−ＭＤＳＣ）および好中球；（１１Ｂ）樹状細胞（ＤＣ）；（１１Ｃ）腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）；（１１Ｄ）ＣＤ−４Ｔ細胞およびＣＤ−８Ｔ細胞；（１１Ｅ）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のゲーティング。
【００２５】
【図１２】４Ｔ１を有するマウスの脾臓免疫細胞に対する、治療スキーム１（図２）で説明したＳＴＬ−６０１４−ＰＤＴとジェムザール投与との併用による治療後１〜３週間の治療効果を示す。（１２Ａ）Ｇ／Ｍ−ＭＤＳＣ（白抜き），ＴＡＭ（黒）；（１２Ｂ）ＤＣ（白抜き），（ＣＤ８（黒）；（１２Ｃ）Ｔｒｅｇ。
【００２６】
【図１３】４Ｔ１がん細胞を同所移植した動物の、移植後治療を行わなかった場合ならびに移植の７日後にＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴ単独で治療した場合、ジェムザール単独で治療した場合および併用治療した場合の、１週間後および３週間後の脾臓重量の変化を示す。治療スキームを図２に示す。
【００２７】
【図１４】後肢にＭＢ４９腫瘍を移植し、その後治療を行わなかった動物（対照）および２つのジェムザール治療レジメンのうちの１つと併用してＷＳＴ１１  ＶＴＰを行った動物の脾臓内の自然免疫細胞集団を示す。（１４Ａ）ＶＴＰの６日後の、脾臓内ＣＤ１１ｂ＋の免疫組織（ＩＨＣ）染色（４倍、スケールバー＝２００μｍ）。（１４Ｂ）ＷＳＴ１１  ＶＴＰの９日後の、好中球／Ｇ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋（中央のグラフ））および単球／Ｍ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋（右端のグラフ））。ＦＡＣＳ分析用に選択された動物には、低用量（６０ｍｇ／ｋｇ，赤色）または高用量（１２０ｍｇ／ｋｇ，緑色）のジェムザールの投与を、第−３日、第１日、第４日、第７日に行った（＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。
【００２８】
【図１５】ＭＢ４９腫瘍を有するマウスの、種々の治療レジメンに対する適応的免疫反応を示す。左：流入領域リンパ節，中央：脾臓，右：血液；（１５Ａ）上パネル：ＣＤ８＋細胞，下パネル：ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ。緑色：１２０ｍｇ／ｋｇのジェムザールによる治療との併用治療または対照；青色：図７（スキーム２）に示したような高用量（１２０ｍｇ／ｋｇ）のジェムザールによる治療とＷＳＴ１１  ＶＴＰとの併用治療、またはジェムザール治療による影響のない対照でのＷＳＴ１１  ＶＴＰによる治療から６日後の、腫瘍、血液および脾臓中のＣＤ８＋およびＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ（＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。（１５Ｂ）上パネル：６日後、青色：ジェムザールによる治療は行わず，緑色：１２０ｍｇ／ｋｇのジェムザールによる治療；下パネル：９日後；青色：ジェムザールによる治療は行わず，赤色：７５ｍｇ／ｋｇのジェムザールによる治療；緑色：１２０ｍｇ／ｋｇのジェムザールによる治療；左のカラム：Ｔｒｅｇ，中央のカラム：Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ，右のカラム：Ｔｃｍ（活性化されたＣＤ−８Ｔ細胞）。
【００２９】
【図１６】後肢に４Ｔ１腫瘍を有するマウスにおける、ＶＴＰの３日前にシクロホスファミド（ＣＴＸ）による免疫調節を行う場合および行わない場合の、腫瘍移植の７日後のＷＳＴ１１  ＶＴＰによる治療スキームを示す。
【００３０】
【図１７】後肢に４Ｔ１腫瘍を有する個々のＢａｌｂ／ｃマウスの、種々の光強度（ｍＷ／ｃｍ２）およびＣＴＸ用量下において一定用量（９．０ｍｇ／ｋｇ）のＷＳＴ１１を用いた種々の治療レジメンに対する局所応答を示す。上列：治療していないマウス（左，Ｎ＝５）、５０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸによる治療（中央，Ｎ＝４）、１５０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸによる治療（右，Ｎ＝６）。中列：１００ｍＷ（左，Ｎ＝８）または１５０ｍＷ（右，Ｎ＝７）のＷＳＴ１１  ＶＴＰによる治療。下列：５０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸと１００ｍＷのＶＴＰとの併用（左，Ｎ＝１０）、１５０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸと１００ｍＷのＶＴＰとの併用（中央，Ｎ＝７）、５０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸと５０ｍＷのＶＴＰとの併用（右，Ｎ＝７）による治療。
【００３１】
【図１８】後肢に皮下移植した４Ｔ１−ｌｕｃ乳がんを有するＢａｌｂ／ｃマウスを、低い光強度（１００ｍＷ／ｃｍ２）（１８Ａ，１８Ｂ）もしくは高い光強度（１５０ｍＷ／ｃｍ２）（１８Ｃ，１８Ｄ）を用いたＷＳＴ１１  ＶＴＰ単独、またはＶＴＰの３日前に行われるＣＴＸ（ＣＹ）の単回投与（１５０ｍｇ／ｋｇもしくは５０ｍｇ／ｋｇ）との併用に供した場合のカプランマイヤー生存曲線を示す。治療の結果は、治療したすべてのマウスについて示す（１８Ａ，１８Ｃ，１８Ｄ）か、または原発性腫瘍の不可逆的で完全なアブレーションに供され、転移を経験せず９０日後に生存していた動物について示している（１８Ｄ）。
【００３２】
【図１９】後肢の皮下に４Ｔ１−ｌｕｃ乳がんを有し、肺転移の見られるＢａｌｂ／ｃマウスに対する、種々の治療レジメンの効果を示す。（１９Ａ）後肢への４Ｔ１−ｌｕｃ乳がんの移植から７日後のＢａｌｂ／ｃマウスの肺から単離した細胞から生じた４Ｔ１−ｌｕｃコロニーが見られるシャーレを示す（ＷＳＴ１１  ＶＴＰ当日）。（１９Ｂ）ＣＴＸ（５０ｍｇ／ｋｇ）＋低い光強度のＶＴＰ（Ｎ＝１０）もしくは高い光強度のＶＴＰ（Ｎ＝５）、または低い光強度のＶＴＰ単独（Ｎ＝４）もしくは高い光強度のＶＴＰ単独（Ｎ＝５）を用いた治療の９０日後に、原発性腫瘍の完全なアブレーション後の転移のない動物のパーセンテージ。
【００３３】
【図２０】Ｆｏｘｐ３陽性細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の４Ｔ１−ｌｕｃ腫瘍への浸潤を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスの後肢に４Ｔ１腫瘍を移植し、ＣＴＸまたは生理食塩水の投与後、表示の時間が経過した時点で、３０〜６０ｍｍ３に達した腫瘍を切除した。これをホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。切片を準備し、Ｆｏｘｐ３の発現を見るために染色した。Ｆｉｊｉソフトウェアを用いて、陽性細胞の数を測定した。図２０Ａは、腫瘍の移植から７日後の、治療していない対照の代表的な写真および定量化した結果であり、図２０Ｂは、ＣＴＸで治療した動物の代表的な写真である。図２０Ｃは、治療していない動物、治療の２４時間後にＣＴＸで処置した動物、および治療の７２時間後にＣＴＸで処置した動物におけるＦｏｘｐ３（Ｔｒｅｇ細胞）のパーセンテージを示す。
【００３４】
【図２１】４Ｔ１−ｌｕｃ腫瘍を有するマウスの流入領域リンパ節および脾臓におけるＴ細胞集団に対する、ＷＳＴ１１  ＶＴＰの３日前の低用量ＣＴＸ投与の効果を示す。（図２１Ａ）流入領域リンパ節（ＬＮ，左）および脾臓（右）における総細胞数。図１６に示した治療スキーム４に従って、ＣＴＸの投与（黒）または非投与（白抜き）後にＷＳＴ１１  ＶＴＰを実施した後、表示されている時点でＬＮおよび脾臓を採取した。抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗Ｆｏｘｐ３抗体を用いたフローサイトメトリーのために、細胞を単離し、染色した。脾臓内の総細胞数は、赤血球除去の後に計数した。（図２１Ｂ）ＶＴＰの３日前にＣＴＸによる治療を実施した場合（黒）または実施しなかった場合（白抜き）の、ＷＳＴ１１  ＶＴＰ後の異なる時点における、流入領域ＬＮ内のＣＤ８＋（左）、ＣＤ４＋（中央）およびＦｏｘｐ３（Ｔｒｅｇ，右）のパーセンテージ（＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．０５）；（図２１Ｃ）ＶＴＰの３日前にＣＴＸによる治療を実施した場合（黒）または実施しなかった場合（白抜き）の、ＷＳＴ１１  ＶＴＰ後の異なる時点における、脾臓内のＣＤ８＋（左）、ＣＤ４＋（中央）およびＦｏｘｐ３（Ｔｒｅｇ，右）のパーセンテージ（＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０５）
【００３５】
【図２２】後肢の皮下に４Ｔ１−ｌｕｃ腫瘍を有するマウスの腫瘍および脾臓における骨髄細胞集団に対する、移植の７日後（ＶＴＰ当日）の低用量ＣＴＸ投与の効果を示す。左：腫瘍；右：脾臓。
【００３６】
【図２３Ａ】乳腺脂肪体に４Ｔ１腫瘍を有するマウスの併用治療のための、ＷＳＴ１１  ＶＴＰを単独で（移植の７日後、腫瘍の直径が５〜７ｍｍに達した時点で）用いる治療スキーム５を示す。ＶＴＰの３日前に開始され、さらに３回行われるＣＴＸのメトロノミック投与（黒色矢印）（ＣＴＸ  ２）と併用されるＷＳＴ１１  ＶＴＰ；ＶＴＰの１日前に行われ（ＣＴＸ  １）、さらに３回行われるＣＴＸの１用量投与（赤色矢印）と併用されるＷＳＴ１１  ＶＴＰ；ＶＴＰの２日前（青色）または１日前（黄色）に開始され、さらに５日間の間隔をあけて３回継続されるジェムザールのメトロノミック投与と併用されるＶＴＰ；治療した動物の経過観察は、９０日間あるいは腫瘍負荷により動物を犠死させるまで継続した。
【図２３Ｂ】乳腺に４Ｔ１−ｌｕｃ腫瘍を有し、ＷＳＴ１１  ＶＴＰとＣＴＸまたはジェムザールとを併用する種々の治療レジメンにより治療された動物の生存率を示すカプランマイヤー生存曲線である。
【図２３Ｃ】乳腺脂肪体に４Ｔ１腫瘍を有するマウスのうち、種々の治療レジメンを実施した後の９０日の時点で、完全に治癒したもの（白抜き）、原発性腫瘍は治癒したが転移したもの（斜線）、および原発性腫瘍の再発と転移がいずれも見られた動物のパーセンテージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
特定の実施形態において、本発明は、バクテリオクロロフィルに基づく光線力学療法（ＰＤＴ）または血管標的ＰＤＴ（ＶＴＰ）と免疫細胞、特に骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）とを使用する併用療法、原発性腫瘍を除去するための調節薬およびがんの播種の予防に関する。
【００３８】
本発明により、原発性腫瘍のアブレーションに有効であることが見出されたバクテリオクロロフィルの種々の誘導体と、抗ＭＤＳＣ活性を有することが見出された薬剤とを併用することで、原発性腫瘍のアブレーションおよび転移性腫瘍進行の予防が、おそらくは遠隔微小転移を消滅させることによって達成されることがわかった。
【００３９】
特定の実施形態において、本発明は、局所的な固形腫瘍の非熱的アブレーションおよびそれらの遠隔微小転移の除去を目的とする。
【００４０】
一態様において、本発明は、がんの併用療法における使用のための、骨髄由来抑制細胞阻害剤（以下、「ＭＤＳＣ阻害剤」）およびバクテリオクロロフィル誘導体（以下、「Ｂｃｈｌ−Ｄ）であって、該ＭＤＳＣ阻害剤および該Ｂｃｈｌ−Ｄが連続投与され、該Ｂｃｈｌ−Ｄの投与に続いて光線力学療法（ＰＤＴ）が行われることを特徴とする、ＭＤＳＣ阻害剤およびＢｃｈｌ−Ｄを提供する。
【００４１】
本発明の併用療法は、前記ＭＤＳＣ阻害剤の単独投与の効果または前記Ｂｃｈｌ−Ｄの単独投与に続いてＰＤＴを行うことの効果と比較して増強された治療効果を有する。特定の実施形態において、この増強された治療効果は相乗効果であり、すなわち、それぞれの治療法の効果を足し合わせたものよりもはるかに強力である。
【００４２】
本発明による使用のための前記ＭＤＳＣ阻害剤は、ゲムシタビン；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；シスプラチン；パクリタキセル；シクロホスファミド（ＣＴＸ，ＣＹ）；スニチニブ；ＳＣ−５８２３６およびＳＣ−５８１２５のようなシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）阻害剤；ゾレドロン酸のようなビスフォスフォネート製剤、またはアレンドロン酸塩のようなアミノビスフォスフォネート製剤；オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）；ビタミンＤ３；ビタミンＡ；ＫＩＴ特異抗体；ニトロアスピリン誘導体；（ＣＤＤＯ−Ｍｅとして知られている）バルドキソロンメチルのような合成トリテルペノイド誘導体；ならびにシルデナフィルおよびタダラフィルのようなホスホジエステラーゼ−５（ＰＤＥ−５）阻害剤であってよいが、これらに限定はされない。
【００４３】
特定の実施形態において、前記ＭＤＳＣ阻害剤はゲムシタビンまたはシクロホスファミドである。
【００４４】
本発明によれば、腫瘍のアブレーションを引き起こすことが示される任意のＢｃｈｌ−Ｄを使用することができる。
【００４５】
特定の実施形態において、本発明による使用のための前記Ｂｃｈｌ−Ｄは、好ましくは、ＲＧＤ含有ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣残基と複合体を形成していてもよい水溶性のアニオン性バクテリオクロロフィル誘導体である。
【００４６】
特定の実施形態において、前記Ｂｃｈｌ−Ｄは、式Ｉ：
【化１】
2019510807.tif 000002
［式中、
Ｍは２ＨまたはＰｄを表し；
Ｒ１はＯ−Ｒ４または−ＮＨＲ５であり、ここでＲ４は、Ｈ、Ｈ＋、アンモニウム基またはＮａ＋もしくはＫ＋のような１価の金属カチオンであり、Ｒ５はＲＧＤ含有ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣残基であり；
Ｒ２は−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、好ましくはメチルであり；
Ｒ３は−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｒ６＋であり、ここでｎは２または３であり、Ｒ６＋はＮａ＋もしくはＫ＋のような１価の金属カチオンである］
を有するアニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄ、または薬学的に許容されるその塩もしくは光学異性体である。
【００４７】
特定の実施形態において、本発明における前記アニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄは式Ｉを有し、式中、１７３位のＲ１がＯＲ４である場合、すなわちＲＧＤ含有ペプチドともＲＧＤペプチド模倣残基とも複合体を形成していないＢｃｈｌ−Ｄ（以下、「複合体を形成していないＢｃｈｌ−Ｄ」）であり、本発明においてＷＳＴ１１およびＳＴＬ−７０１２と称されるＢｃｈｌ−Ｄが例示されるが、これらに限定はされない。
【００４８】
ＷＳＴ１１、すなわちパラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン  １３１−（２−スルホエチル）アミドジカリウム塩であるロドバクテリオクロリン誘導体は、ワイツマン科学研究所（レホヴォト，イスラエル）のＡｖｉｇｄｏｒ  Ｓｃｈｅｒｚ教授（本願の共同発明者）の実験室で合成されＷＯ  ２００４／０４５４９２に開示されている。臨床試験に成功した後、ＷＳＴ１１は、前立腺がんの初期ステージにおける使用が最近になって承認されている。
【００４９】
ＳＴＬ−７０１２は、非メタル化Ｂｃｈｌ−Ｄ、３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン  １３１−（２−スルホエチル）アミドジカリウム塩である（ＷＯ  ２００８／０２３３７８に開示されており、式は後の付録に提示される）。
【００５０】
本発明において使用することのできるその他のアニオン性Ｂｃｈｌ−Ｄは、ＷＯ  ２００４／０４５４９２に開示されている以下の化合物を含む：パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン  １３１−（３−スルホプロピル）アミドジカリウム塩；３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン  １３１−（２−スルホエチル）アミドジカリウム塩；３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン  １３１−（３−スルホプロピル）アミドジカリウム塩；およびパラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン  １３１−（２−スルホエチル）アミドカリウム塩。
【００５１】
本発明において複合体を形成していないＢｃｈｌ−Ｄが使用される場合、前記ＰＤＴは血管標的ＰＤＴ（ＶＴＰ）であり、前記治療される局所領域は、該複合体を形成していないＢｃｈｌ−Ｄの投与後に、短時間照射される。この時間は、通常０〜３０分間、例えば０分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間または３０分間である。
【００５２】
特定の実施形態において、本発明による使用のための前記Ｂｃｈｌ−Ｄは、ＲＧＤ含有ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣残基と複合体を形成している式ＩのＢｃｈｌ−Ｄであり、このとき式中の１７３位のＲ１はＮＨ−Ｒ５であり、すなわちＢｃｈｌ−ＤはＣと複合体を形成している（以下、「複合体を形成しているＢｃｈｌ−Ｄ」）。このＲＧＤ含有ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣残基は、非環状ペプチドであっても環状ペプチドであってもよい。
【００５３】
特定の好ましい実施形態において、本発明による使用のための前記複合体を形成しているＢｃｈｌ−Ｄは、環状のＲＧＤ含有ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣残基と複合体を形成している。本発明による使用のための、環状のＲＧＤ含有ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣残基と複合体を形成しているＢｃｈｌ−Ｄの例としては、本発明においてＳＴＬ−６０１４、ＳＴＬ−６０３３、ＳＴＬ−６０３８およびＳＴＬ−６０６８と称されるＢｃｈｌ−Ｄ（これらの構造は、後の付録に提示される）のような、公開公報ＷＯ  ２００８／０２３３７８およびＷＯ  ２０１０／０４６９００に開示されているものが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００５４】
特定の好ましい実施形態において、前記複合体を形成しているＢｃｈｌ−Ｄは、ＳＴＬ−６０１４、すなわちＷＯ  ２００８／０２３３７８に開示されている３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン  １３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（シクロＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩であり、式中のｆはＤ−Ｐｈｅを示す。
【００５５】
本発明において使用することのできる、ＷＯ  ２００８／０２３３７８に開示されているその他の複合体を形成しているＢｃｈｌ−Ｄは、以下を含むが、これらに限定はされない。
パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン  １３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（シクロＲＧＤｆＫ）アミドカリウム塩；
パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン  １３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（シクロＲＡＤｆＫ）アミドカリウム塩；
パラジウム３１−オキソ−１５−メトキシカルボニルメチル−ロドバクテリオクロリン  １３１−（２−スルホエチル）アミド−１７３−（シクロＲＧＤｆ−Ｎ（Ｍｅ）Ｋ）アミドカリウム塩
【００５６】
本発明において複合体を形成しているＢｃｈｌ−Ｄが使用される場合、前記ＰＤＴは組織を標的とするものであり、前記治療される局所領域は、前記複合体を形成しているＢｃｈｌ−Ｄが標的組織に蓄積されて最適濃度となるよう、しばらく時間を置いた後に照射される。この時間は、前記複合体を形成しているＢｃｈｌ−Ｄの投与が終わった後、少なくとも４時間、好ましくは６時間であってよい。
【００５７】
本発明による使用のための前記ＭＤＳＣ阻害剤および前記Ｂｃｈｌ−Ｄは、いくつかの異なるレジメンに従って連続投与される。一般に、原発性腫瘍または転移腫瘍のアブレーションのための治療セッションにおいて、前記ＰＤＴまたはＶＴＰによる治療は、前記治療される局所領域の照射に先立って前記Ｂｃｈｌ−Ｄを単独投与することを含み、前記ＭＤＳＣ阻害剤による治療は、所定の様々な間隔をあけて前記ＭＤＳＣ阻害剤を複数回投与することを含む。新たな転移が後で見つかった場合、前記セッションは、必要に応じて１回または複数回繰り返されてもよい。
【００５８】
あるレジメンスキームによれば、前記ＭＤＳＣ阻害剤は、前記ＰＤＴまたはＶＴＰによる治療の前に一度投与され、その後所定の間隔をあけて複数回投与される。
【００５９】
また別のレジメンスキームによれば、前記ＭＤＳＣ阻害剤は、前記ＰＤＴまたはＶＴＰによる治療の後に所定の間隔をあけて複数回投与される。
【００６０】
特定の実施形態において、前記ＭＤＳＣ阻害剤による治療は、５〜１２日間またはそれ以上の所定の時間間隔をあけて、前記ＭＤＳＣ阻害剤を４〜１２回またはそれ以上の回数投与することを含んでもよい。例えば、前記ＭＤＳＣ阻害剤による治療は、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間もしくは１２日間またはそれ以上の所定の時間間隔をあけて、前記ＭＤＳＣ阻害剤を４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回もしくは１２回またはそれ以上の回数投与することを含んでもよい。
【００６１】
これらの数値は、本明細書に記載の動物実験に基づくものであり、ヒトの治療に限定されるものと解されるべきではないことに留意されたい。治療されるがんの種類、患者の免疫系の状態および治療に対する患者の反応に応じて、ＭＤＳＣ阻害剤の投与回数を変更することおよび／または該ＭＤＳＣ阻害剤の投与と投与との間の所定の時間間隔の日数を変更することによって、医師が治療プロトコールを修正してもよい。例えば、医師は、治療中に該治療を一時的に休止して、前記所定の間隔よりも長い間隔をあけることを決定し、該休止の後に、元のプロトコールを再開してもよい。例えば、前記治療プロトコールにおいてＭＤＳＣ阻害剤を５日間隔で投与することが定められている場合、医師は、２回目または３回目の投与の後に１０〜２０日間の休薬期間を置いた後に、所定の５日間の間隔に戻って以降の投与を行うよう決定してもよい。この休薬期間は常に、所定のプロトコールの間隔よりも長い。
【００６２】
特定の実施形態において、前記ＭＤＳＣ阻害剤はゲムシタビンであり、ＰＤＴは、ＳＴＬ−６０１４であるＢｃｈｌ−Ｄを用いて行われる。別の実施形態において、前記ＭＤＳＣ阻害剤はゲムシタビンであり、ＶＴＰは、ＷＳＴ１１であるＢｃｈｌ−Ｄを用いて行われる。
【００６３】
特定の実施形態において、前記ＭＤＳＣ阻害剤はシクロホスファミドであり、ＶＴＰは、ＷＳＴ１１であるＢｃｈｌ−Ｄを用いて行われる。
【００６４】
本発明の特定の実施形態によれば、前記ＭＤＳＣ阻害剤は、従来の単剤化学療法における該剤の従来の用量の３分の１または４分の１のような低用量で投与される。これはメトロノミック化学療法の概念によるものであり、低用量の化学療法剤を、間隔を長くあけることなく定期的に頻回に投与することで、強い毒性を最小限に抑えるものである。
【００６５】
本発明によれば、数種類のがんを、原発性原発性固形癌腫であっても転移癌腫であっても治療することが可能であり、治療可能ながんの種類としては、黒色腫、腎細胞がん、大腸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、脳腫瘍、膵腺がんまたは頭頸部腫瘍が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００６６】
本発明はさらに、がんの治療のための併用療法においてＢｃｈｌ−Ｄとともに使用するためのＭＤＳＣ阻害剤であって、該ＭＤＳＣ阻害剤および該Ｂｃｈｌ−Ｄが連続投与され、該Ｂｃｈｌ−Ｄの投与に続いて光線力学療法（ＰＤＴ）が行われることを特徴とする、ＭＤＳＣ阻害剤に関する。
【００６７】
さらに本発明は、がんの治療のための併用療法においてＭＤＳＣ阻害剤とともに使用するためのＢｃｈｌ−Ｄであって、該ＭＤＳＣ阻害剤および該Ｂｃｈｌ−Ｄが連続投与され、該Ｂｃｈｌ−Ｄの投与に続いて光線力学療法（ＰＤＴ）が行われることを特徴とする、Ｂｃｈｌ−Ｄに関する。
【００６８】
いずれの場合においても、前記併用療法は、前記ＭＤＳＣ阻害剤の単独投与の効果または前記Ｂｃｈｌ−Ｄの単独投与に続いてＰＤＴを行うことの効果と比較して増強された治療効果を有する。この増強された治療効果は、相乗治療効果であってもよい。
【００６９】
別の一態様において、本発明は、併用療法によるがんの治療方法であって、（ｉ）治療有効量の骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）阻害剤（以下、「ＭＤＳＣ阻害剤」）ならびに（ｉｉ）治療有効量のバクテリオクロロフィル誘導体（Ｂｃｈｌ−Ｄ）およびそれに続く光線力学療法（ＰＤＴ）（以下、「Ｂｃｈｌ−Ｄ  ＰＤＴ」）を、がんの治療を必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
【００７０】
特定の実施形態において、本発明の方法による前記併用療法は、それぞれ単独で投与された前記ＭＤＳＣ阻害剤または前記Ｂｃｈｌ−Ｄ  ＰＤＴと比較して増強された治療効果を奏する。この増強された効果は、相乗治療効果であってもよい。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明は、ＭＤＳＣ阻害剤として機能する化学療法剤の投与と、バクテリオクロロフィルの種々の化学的誘導体（Ｂｃｈｌ−Ｄ）を用いた細胞／組織を標的とする光線力学療法（ＰＤＴ）または血管を標的とする光線力学療法（ＶＴＰ）とを同時に行う。該化学療法剤の低用量投与を、所定の時間間隔で複数回、治療対象に対して行うことで、ＭＤＳＣ阻害剤の投与量の低減が達成される。特定の実施形態において、化学療法剤の最初の投与の後、選択された時間間隔で、原発性腫瘍または観察された転移腫瘍のアブレーションのために、Ｂｃｈｌ−Ｄを用いたＰＤＴまたはＶＴＰが適用される。数種類の薬剤を用いたメトロノミックな適用（低薬量を週１回適用）が、その後数週間にわたって継続される。治療効果は、種々のイメージング技術（例えばＭＲＩ、超音波）を用いた原発性腫瘍のアブレーションの経過観察、組織構造（例えば生検）、血液循環におけるＭＤＳＣ数の低減、転移増殖の遅延または排除、および対象の生存の延長によってモニタリングされてもよいが、これらに限定はされない。前記治療は、患者に新たな転移が見つかった場合は、後で繰り返すことができる。
【００７２】
特定の実施形態において、本発明は、がんを治療する方法を提供し、該方法は、（ｉ）治療有効量の骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）阻害剤（以下、「ＭＤＳＣ阻害剤」）ならびに（ｉｉ）治療有効量のバクテリオクロロフィル誘導体（Ｂｃｈｌ−Ｄ）およびそれに続く光線力学療法（ＰＤＴ）（以下、「Ｂｃｈｌ−Ｄ  ＰＤＴ」）または組織を標的とするＰＤＴ（以下、「Ｂｃｈｌ−Ｄ  ＶＴＰ」）を、がんの治療を必要とする患者に投与することを含み、該投与により、それぞれ単独で投与された前記ＭＤＳＣ阻害剤または前記Ｂｃｈｌ−Ｄ  ＰＤＴと比較して増強された治療効果を奏する併用療法が提供される。
【００７３】
本明細書において、用語「治療すること」および「治療」は、がんを患う患者に益を与える任意の種類の治療を言い、該益には、患者の状態の改善（例えば、１以上の症状における改善）、前記状態の進行の遅延、生存時間の延長などが含まれる。
【００７４】
本明細書において、前記ＭＤＳＣ阻害剤についての用語「治療有効量」は、上記で定義したがんの治療において、本発明による併用療法において反復投与された際に治療的に有効な量を言う。本明細書において、前記Ｂｃｈｌ−Ｄについての用語「治療有効量」は、ＰＤＴまたはＶＴＰの実施後に腫瘍または転移がんをアブレーション可能な能力を言う。
【００７５】
腫瘍の再発、例えば新たな転移がんが形成された場合、これは、原発性腫瘍とは異なるクローンの新たな微小転移の発生を示している可能性があることから、前記免疫調節されたＢｃｈｌＤ  ＰＤＴまたはＶＴＰを繰り返し実施してもよい。
【００７６】
本明細書および添付の図面に示した研究によれば、本願において提案されたように前記２種の治療法を組み合わせることによって、それぞれの治療法の効果が相乗された結果、悪性転移性がんを有する動物の４０〜５０％において原発性腫瘍のアブレーションが可能となるとともに、微小転移およびそれに続く転移がんの形成を縮小および排除できることがわかった。これらの研究およびその結果に基づいて構築されたプロトコールは、そのまま臨床適用することができる。
【００７７】
以降、本発明を以下の非限定的な実施例により例示する。
【実施例】
【００７８】
材料および方法
材料
（ｉ）バクテリオクロロフィル誘導体：Ｂｃｈｌ誘導体およびそのＲＧＤ複合体は、Ｓｔｅｂａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（レホヴォト，イスラエル）により提供された。ＳＴＬ−６０１４は粉末形態のアンモニウム塩として提供され、この粉末をＤＤＷ（１ｍｇ／ｍｌ）に溶解させることによってＫ＋塩に変換した。ｐＨは１ＮのＫＯＨを加えることによって８に調整し、得られた溶液を液体窒素によって凍結させ、凍結乾燥によってＳＴＬ−６０１４  Ｋ＋塩を得た。ＳＴＬ−６０１４  Ｋ＋塩を５％のマンニトール溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に溶解させることによって使用溶液を調製し、５％のマンニトール中でトリス緩衝液（０．１５％）を加えることによってｐＨを８に調整し、この溶液を実験での必要性に応じて数本の試験管に等分し、凍結させた後に凍結乾燥させて、ＳＴＬ−６０１４  Ｋ＋塩製剤を得た。濃度は、分光光度計を用いた測定によって確認した。ＳＴＬ−７０１２は、ジカリウム塩として提供された。ＳＴＬ−７０１２  Ｋ＋塩を５％のマンニトール溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に溶解させることによって使用溶液を調製した。ｐＨの調整、アリコートの調製および濃度の確認は、ＳＴＬ−６０１４の場合と同様に行った。ＷＳＴ１１は粉末として供給され、−２０℃の暗所に保存された。原液は、５％のグルコースと０．６７％のマンニトールとを含有するＤＤＷにＷＳＴ１１を溶解させることによって調製し、これを等分して凍結乾燥させた。使用溶液はＤＤＷを用いて再構成し、溶液の濃度は分光光度計を用いた測定によって確認した。あるいは、臨床用ＷＳＴ１１（バッチ：Ｐ００６１１および１０−１３０６１１）を、凍結乾燥製剤として入手した。ＷＳＴ１１を５％のデキストロースに溶解させ、等分して−２０℃で保存した。治療当日に、前記アリコートを融解させてろ過し、溶液の濃度を分光光度計を用いた測定によって確認した。
【００７９】
（ｉｉ）化学療法薬の調製および保存：ゲムシタビン（ＧＥＭ，ジェムザール（登録商標），リリー）は、地元の薬局から散剤を購入し、３８ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう生理食塩水に溶解させ、等分して−２０℃で保存した。アリコートを融解させ、生理食塩水で所望の濃度に希釈し、同日に７５ｍｇ／ｋｇの用量で使用した。シクロホスファミド（ＣＴＸ，エンドキサン（登録商標），Ｂａｘｔｅｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ社，ドイツ）は、地元の薬局から購入した。０．９％のＮａＣｌに溶解させて２０ｍｇ／ｍｌの原液を調製し、等分して−２０℃で保存した。アリコートを融解させ、必要であれば生理食塩水で所望の濃度に希釈し、調製と同日に指示用量で使用した。
【００８０】
（ｉｉｉ）マウス細胞株：ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）標識乳がん４Ｔ１細胞株（４Ｔ１−Ｌｕｃ）は、Ｚｖｉ  Ｇｒａｎｏｔ博士（エルサレム・ヘブライ大学医学部，イスラエル）の好意により寄贈された。黒色腫Ｂ１６−Ｆ１０細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から入手した。膀胱がんＭＢ４９細胞株は、Ｊａｍｅｓ  Ａｌｌｉｓｏｎ（ＭＳＫＣＣ，ニューヨーク，アメリカ）の好意により寄贈された。またｌｕｃ標識ＭＢ４９細胞株は、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）−ピューロマイシン−ｌｕｃ−ＧＦＰコンストラクト（Ｈｕｍａｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ，ＭＳＫＣＣのＥｍｉｌｙ  Ｃｈｅｎｇ博士の好意により提供された）を用いて樹立した。４Ｔ１細胞およびＭＢ４９細胞はＤＭＥＭ培地中で、Ｂ１６−Ｆ１０細胞はＲＰＭＩ培地中で、１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２５０μｇ／ｍｌのヒグロマイシン、０．０６ｍｇ／ｍｌのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加して維持した。細胞は、３７℃の加湿環境（５％ＣＯ２、９５％空気）下で、単層として増殖させた。
【００８１】
（ｉｖ）マウス腫瘍モデル：雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）に対して、５０μｌまたは１００μｌのＰＢＳに懸濁した１×１０６個の４Ｔ１細胞の、右後肢への皮下移植または同所性移植を行った。再誘発の研究用には、２×１０５個の４Ｔ１細胞を、同所的に移植した。膀胱がんモデルについては、ＶＴＰ治療の１５日前に、雄性Ｃ５７Ｂ／６マウス（７〜８週齢，Ｔａｃｏｎｉｃ社，ニューヨーク州ハドソン）の右脇腹に、５×１０４個のＭＢ４９細胞株またはＭＢ４９−ルシフェラーゼ細胞株を皮下注入した。免疫不全マウスにおけるＶＴＰの効能研究用には、同数のＭＢ４９細胞を、Ｃ５７Ｂ／６系統または雄性Ｃ５７Ｂ／６のＲａｇ−／−マウス（７〜８週齢，ジャクソン研究所，メイン州バーハーバー）の脇腹に注入した。ＭＢ４９細胞の両側性モデルについては、５×１０４個のＭＢ４９細胞を第−１５日に右脇腹に、第＋１日に左脇腹に、それぞれマウスに移植した。実験の手順はすべて、ワイツマン科学研究所（レホヴォト，イスラエル）の動物実験委員会およびメモリアル・スローン・ケタリングがんセンター（ＭＳＫＣＣ，ニューヨーク，アメリカ）によって承認された。
【００８２】
方法
（ｖ）全身の蛍光イメージング（ＰＤＴによる研究）：７．５ｍｇ／ｋｇのＳＴＬ−６０１４またはＳＴＬ−７０１２を静注した後、励起用および発光用にそれぞれ８４７ｎｍおよび８７５ｎｍのフィルターを備えたＩｎ  Ｖｉｖｏ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ社，カリフォルニア州アラメダ）を用いて、積算時間を１秒として、全身の腫瘍組織および正常な器官の近赤外蛍光画像を記録した。７５ｍｇ・ｋｇ−１のＤ−ルシフェリンを腹腔内に注射した後、それぞれのフィルターセットを用いて、ルシフェラーゼでトランスフェクトした腫瘍および転移の全身イメージングを行い、５分間記録した。
【００８３】
（ｖｉ）ＰＤＴ治療プロトコール：４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳腺脂肪体に移植した。原発性腫瘍が約５０ｍｍ３に達した時点で、７．５ｍｇ／ｋｇのＳＴＬ−６０１４をマウスに静注し、薄暗い条件下に６時間置いた。その後、腫瘍を含む１ｃｍ２の領域に対し、７５３ｎｍのレーザーを、フロントフェース光ファイバー（Ｍｅｄｌｉｇｈｔ社，スイス）を通じて２００ｍＷ／ｃｍ２で照射した。治療後最初の２日間は、マウスに鎮痛剤（２．５ｍｇ／ｋｇのフルネキシン，１日１回）を投与した。原発性腫瘍のアブレーションは、ルシフェラーゼを介した腫瘍の生物発光シグナルをＩＶＩＳの使用によってイメージングすることにより、７日ごとに評価した。腫瘍の直径が１５ｍｍに達した時点で、またはＩＶＩＳの全身蛍光によって転移が生じたと判定された時点で、（ワイツマン科学研究所のガイドラインに従って）マウスを犠死させた。
【００８４】
（ｖｉｉ）ＶＴＰ治療プロトコール：皮下腫瘍の治療：腫瘍を有するマウスに対し、体重１ｋｇ当たりそれぞれ１００ｍｇ／１０ｍｇのケタミン／キシラジン混合物の溶液を腹腔内注射することにより、麻酔を施した。次いで、用量９ｍｇ／ｋｇのＷＳＴ１１を、尾静脈への定速点滴により、５分間かけて投与した。点滴の終了直後に、フロントオプティカルディフューザを備えた４Ｗ，７５５ｎｍのダイオードレーザー（Ｃｅｒａｍｏｐｔｅｃ社，ドイツ）を用いて、フルエンス率１００ｍＷ／ｃｍ２または１５０ｍＷ／ｃｍ２の１０分間の照射を開始した。腫瘍を露出させるために、左側を下にしてマウスを配置し、正常組織を保護するために、非透過性材料の覆いをかけた。乳腺腫瘍の治療：マウスに、上述のように麻酔を施した。ＷＳＴ１１の用量は９ｍｇ／ｋｇであり、これを５分間の点滴で投与した。マウスを仰向けに配置し、腫瘍を体から離すためにクリップで持ち上げ、重要器官の損傷を防ぐために黒色材料で動物を保護した。点滴の終了直後に、フロントオプティカルディフューザを備えた４Ｗ，７５５ｎｍのダイオードレーザー（Ｍｏｄｕｌｉｇｈｔ社，フィンランド）を用いて、フルエンス率２００ｍＷ／ｃｍ２の１５分間の照射を開始した。
【００８５】
（ｖｉｉｉ）ＰＤＴと低用量ジェムザール（登録商標）（ＧＥＭ）との組み合わせを含む併用療法：４Ｔ１−ｌｕｃ細胞の移植から６日後（原発性腫瘍が約５０ｍｍ３に達した時点）のマウスに、７．５ｍｇ／ｋｇのＳＴＬ−６０１４を静注した。薬剤の投与から６時間後に、７５３ｎｍ（２００ｍＷ／ｃｍ２）で１５分間、腫瘍を照射した。ＧＥＭの併用治療のための２つのプロトコールを適用した：（１）７５ｍｇ／ｋｇのＧＥＭ（１００μｌの生理食塩水に溶解）を、ＰＤＴの２日前、１日後、およびその後５日ごとに、第３３日まで腹腔内投与する；または（２）７５ｍｇ／ｋｇのＧＥＭを、ＰＤＴの１日後、およびその後５日ごとに、第３３日まで投与する。転移の進行／退縮については、ルシフェラーゼ生物発光の全身イメージングによって、１２０日間の経過観察を行った。
【００８６】
（ｉｘ）ＶＴＰと低用量ＧＥＭとを含む併用療法：ＧＥＭは、用量７５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。使用した治療レジメンは、以下の通りであった：（ｉ）ＶＴＰの第（−１）日に開始し、その後第１日、第６日および第１１日の３回、投与を行う；（ｉｉ）第（−２）日に開始し、その後第３日、第８日および第１３日の３回、投与を行う。あるいは、各実験で指示されるように、３週サイクルの臨床計画に従って５０ｍｇ／ｋｇの投与を行い、３週目は休薬とし、またはＢＩＷ（週に２回）の計画に従って１２０ｍｇ／ｋｇの投与を行う。投与の開始は、ＶＴＰ治療の３日前とする。
【００８７】
（ｘ）ＶＴＰとシクロホスファミド（ＣＴＸ）とを含む併用療法：皮下腫瘍の治療のために、ＣＴＸを１５０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇ（後者は、新たに原液を０．９％のＮａＣｌで１：３に希釈して、容量範囲を維持するようにした）の単回用量で、ＶＴＰの３日前に腹腔内投与した。対照群には０．９％のＮａＣｌを投与した。乳腺腫瘍の治療のためには、以下のレジメンに従って、５０ｍｇ／ｋｇを投与した：（ｉ）ＶＴＰの第（−１）日に開始し、その後第１日、第６日および第１１日の３回、投与を行う；（ｉｉ）第（−３）日に開始し、その後第３日、第１０日および第１７日の３回、投与を行う。
【００８８】
（ｘｉ）原発性腫瘍と肺転移に関する、インビボＶＴＰによる結果の経過観察：局所の腫瘍反応を、生物発光イメージング（ＢＬＩ）およびノギスを用いた測定によって評価した。腫瘍の体積は、公開（Ｐｒｅｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ，２００３）されている方法で計算した。ＢＬＩによる評価のために、腫瘍を有するマウスに麻酔を施し、ルシフェリン（１．２μｇ／匹，Ｒｅｇｉｓ社，アメリカ）を腹腔内注射した。次いで、マウスをＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社，マサチューセッツ州，アメリカ）に配置し、約１０分間の蓄積の後に、６０秒間で画像を取得した。皮下腫瘍に関しては、原発性腫瘍のイメージングのために、片側を下にしてマウスを配置し、次いで転移の評価のために、仰向けに配置した。乳腺腫瘍モデルの場合、原発性腫瘍および肺転移のイメージングがいずれも可能となるように、仰臥位を使用した。原発性腫瘍の組織量が長径で１５ｍｍを超えるか、または転移が検出された場合には、動物の苦痛や死亡を防止するために、早期に終了した。
【００８９】
（ｘｉｉ）組織構造：ワイツマン科学研究所（ＩＡＣＵＣ，レホヴォト，イスラエル）の動物実験委員会のガイドラインに従って、マウスを犠死させた。組織を取り出し、４％／１０％緩衝ホルマリン中で４８時間かけて固定した。標準的な手準によって、試料を組織構造単位でパラフィンに包埋して薄切し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Ｆｏｘｐ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体およびＫｉ６７抗体を使用した免疫染色は、メモリアル・スローン・ケタリングにおいて自動で行われた。
【００９０】
（ｘｉｉｉ）Ｌｙ６Ｇの染色（ＰＤＴによる研究）：同所性の４Ｔ１−Ｌｕｃ腫瘍を２箇所（左右の乳腺脂肪体）に有するマウスの片側にのみＰＤＴを施し、これと第２のＧＥＭ治療プロトコールとを併用した。ＰＤＴの２４時間後、３日後および３週間後に、腫瘍を切除および固定し、Ｌｙ６Ｇを染色した。オフラインの分析のために、スライドスキャナーを使用して画像を取得した。
【００９１】
（ｘｉｖ）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ分析）：人道的に犠死させた動物から脾臓を切除し、７０μｍメッシュを用いてろ過した。塩化アンモニウム溶解液（ＡＣＫ）を用いて赤血球を溶解させ、細胞数を計測し、染色を行うために調整した。リンパ節はＰＢＳ中で破砕し、洗浄した後、染色を行うために細胞数を調整した。腫瘍を小片に切断し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ１ｍｌ当たり２．５ｍｇのコラゲナーゼＩＩ、２．５ｍｇのコラゲナーゼＩＶおよび０．５ｍｇのデオキシリボヌクレアーゼを含む混合物中で振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートした。７０μｍフィルターを用いて細胞懸濁液（腫瘍または脾臓）を加圧ろ過し、ＦＡＣＳ緩衝液で２度洗浄し、（指示のある場合は）ＰＢＳで希釈（１：１０００）した固定可能な生存率解析用色素ｅＦｌｕｏｒ  ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社，カリフォルニア州サンディエゴ）とともに氷上で３０分間インキュベートした。１〜５×１０６個の細胞を１００μｌのＰＢＳに懸濁し、非特異的な抗体結合を防止するために、ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（０．５μｇ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社カリフォルニア州サンディエゴ）とともに４℃で１５分間インキュベートした。別の実験では、細胞を、ｐｅｒｃｐ−ｃｙ５．５／ＡＰＣ−Ｃｙ７−ＣＤ１１ｂ、ＰＥ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５−Ｌｙ６Ｇ、ＰＥ−ｃｙ７−Ｌｙ６Ｃ、ＡＰＣ−Ｆ４／８０、Ａｌｅｘａ４８８／ＰＥ−ＣＤ１１ｃ、ｅＶｏｌｖｅ６５５／ｖ４５０−ＭＨＣＩＩ、ｐｅｒｃｐ−ｃｙ５．５−ＣＤ３、ＡＰＣ／ｖ４５０−ＣＤ４、Ａｌｅｘａ４８８−ＣＤ８、ＰＥ−ｃｙ７−Ｆｏｘｐ３、ＣＤ４−ＡＰＣ、Ａｌｅｘａ４８８／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５／ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ＣＤ８、ＰＥ／ＡＰＣ−Ｆｏｘｐ３、Ａｌｅｘａ  ７００／ＦＩＴＣ−ＣＤ４５、ＦＩＴＣ−Ｋｉ６７、ＡＰＣ−Ｃｙ７−ＣＤ２５、ＰＥ  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ、ＰＥ−ＣＤ６２Ｌ、ＰＥ−Ｃｙ７−ＣＤ４４、ＡＰＣ−ＣＤ８６（これらの抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（カリフォルニア州サンディエゴ）およびＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した）などの蛍光抗体とともに、室温で引き続き３０分間インキュベートした。データの収集は、カスタマイズされたＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社，カリフォルニア州サンノゼ）を用いて行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社，オレゴン州アシュランド）を用いて解析した。
【００９２】
（ｘｖ）転移細胞の単離とコロニー形成アッセイ：マウスに４Ｔ１−ｌｕｃ細胞を移植した。７日後に、氷冷した滅菌ＰＢＳで灌流した後の、麻酔を施したマウスから肺を単離した。切除後のマウスは、安楽死させた。肺をＰＢＳ中で破砕し、洗浄した後、１００μｍメッシュを用いてろ過した。次いで、５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＡを用いて３７℃で４５分間、組織を消化させ、洗浄後、温めた完全培地中に再懸濁した。７０μｍメッシュを用いて懸濁液をろ過し、組織培養インキュベーター内に播種した。７日後、ルシフェリンを添加し、ＩＶＩＳイメージングシステムを用いて、培養物の生物発光により増殖を検出した。
【００９３】
（ｘｖｉ）統計解析：データは、マイクロソフト社のＥｘｃｅｌを用いた対応のないスチューデントの両側ｔ検定、または２元配置分散分析（ＧｒａｐｈＰａｄ社，カリフォルニア州サンディエゴ，アメリカ）のによって解析した。ｐ値が０．０５未満であれば、統計的に有意とみなした。生存曲線の比較には、ログランク検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６，カリフォルニア州サンディエゴ，アメリカ）を用いた。
【００９４】
実施例１
４Ｔ１腫瘍を有するマウスの原発性腫瘍および転移によるＳＴＬ−６０１４の薬物動態および取り込み
予備実験において、同所性４Ｔ１−Ｌｕｃ乳がんを有する雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスに対し、ＳＴＬ−６０１４（７．５ｍｇ／ｋｇ）またはＳＴＬ−７０１２（９．５ｍｇ／ｋｇ）を静注した。近赤外（ＮＩＲ）蛍光画像により、ＳＴＬ−６０１４が腫瘍内中に選択的に蓄積することが示された（図１Ａ上列）。投与の約２時間後に腫瘍がはっきりとわかるようになったが、かなり強いシグナルがクリアランス器官（例えば膀胱など）で観察された。投与の翌日、腫瘍内でのＳＴＬ−６０１４の蓄積は周囲組織と比較して著しいものとなり、腹部クリアランス器官内での濃度は相当低くなった（図１Ｂ上列）。ＳＴＬ−７０１２は腫瘍内には蓄積せず（図１Ａ下パネル）、注射から数時間で、肝臓により除去された（図１Ａ下パネル）。ＷＳＴ１１も同様であった（データ示さず）。腫瘍および肺転移における蓄積と、クリアランス器官内での蓄積を、図１Ｂに示す。上パネル：腫瘍を有するマウスの種々の組織における生物発光；下パネル：それらの器官におけるＳＴＬ−６０１４の蛍光
【００９５】
実施例２
スキーム１に従ってＳＴＬ−６０１４およびジェムザールを使用する、４Ｔ１を有する動物の治療
Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳腺脂肪体に、１×１０６個の４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞を接種した。移植の７日後、腫瘍の直径が５〜７ｍｍに達した時点で、４Ｔ１−Ｌｕｃを有するマウスを、治療スキーム１（図２Ａ）に記載される以下の治療オプションのうち１つに供した。
（ｉ）唯一の治療法としての光線力学療法（ＰＤＴ）の使用において、７．５ｍｇ／ｋｇのＳＴＬ−６０１４を、動物にボーラス静注（３分間）した。注入の６時間後に、７５３ｎｍ，２００ｍＷ／ｃｍ２（Ｍｏｄｕｌｉｇｈｔ社，フィンランド）により、腫瘍を１０分間照射した。
（ｉｉ）唯一の治療アプローチとしてのゲムシタビン（ジェムザール）の使用において、腫瘍を有する動物に対し、７５ｍｇ／ｋｇのジェムザールを腹腔内投与した。治療スキーム１に記載されているように、腫瘍の移植の５日後（青色）または８日後（橙色）に投与を開始し、その後、５日間隔でさらに６回の投与を行った。
（ｉｉｉ）併用治療アプローチにおいて、動物に（ａ）７５ｍｇ／ｋｇのジェムザールを第５日に腹腔内投与し、その後、第７日にＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴを行い、さらに６回ジェムザールを投与する；または（ｂ）第７日にＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴを行い、次いで第８日にジェムザールを投与し、さらに６回ジェムザールを投与する、のいずれかを行う。ルシフェリンの生物発光シグナルを用いて、腫瘍の増殖および播種を第１２０日まで、または腫瘍負荷により動物を死亡させるまで週に１回モニタリングし、ＩＶＩＳ（酸素）によって記録した。
【００９６】
実施例３
ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴおよびジェムザールを用いた治療に対する、４Ｔ１を有する動物の原発性腫瘍の反応
４Ｔ１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスを、５群に分けた。（１）治療せず（対照）；（２）ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴによる治療；（３）メトロノミックなジェムザールによる治療：（４）ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴおよびＰＤＴの１日後に開始するメトロノミックなジェムザールによる治療；ならびに（５）ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴおよびＰＤＴの２日前に開始するメトロノミックなジェムザールによる治療。図３に、ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴ単独の治療または治療スキーム１に記載される２つの治療法のうち１つで提供されるジェムザールとの併用の、７日後（白抜き）および３０日後（黒）の原発性腫瘍の反応を示す。ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴ単独またはジェムザールとの併用により治療したマウスの７０〜８０％において、治療の７日後に原発性腫瘍の消失が観察された。しかしながら、治療の３０日後になると、ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴ単独で治療した動物の８２％に原発性腫瘍の再増殖が見られ、これはＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴ＋ジェムザールの併用では３０〜４０％に過ぎなかったこととは対照的である。対照動物（治療せず、またはジェムザールのみによる治療）では、原発性腫瘍の治癒は全く見られなかった（０％）。
【００９７】
実施例４
ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴおよびジェムザールによる治療における４Ｔ１腫瘍を有するマウスの生存率
図４に、４Ｔ１−Ｌｕｃを有するマウスを種々の治療レジメンおよび対照に供し、１２０日にわたって経過観察して得たカプランマイヤー生存曲線を示す。ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴによる治療（Ｎ＝２９）では、対照マウス（Ｎ＝１８）と比較して有意な生存率の差は見られなかった。ジェムザールで治療したマウスでは、生存期間は延長されたが、原発性腫瘍の治癒は見られなかった（Ｎ＝１１）。４Ｔ１を移植した動物において、ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴと、ＰＤＴの１日後に投与されるジェムザールとを併用した動物（Ｎ＝１９）では、３２％が生存し、一方、ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴの２日前にジェムザールを投与したマウス（Ｎ＝２０）では、５０％が治癒（１２０日間生存）に至った。
【００９８】
実施例５
ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴおよびジェムザールを用いた治療に対する、肺転移の反応
図５Ａおよび図５Ｂで提示する円グラフには、ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴとジェムザールとを併用する２つの異なる治療レジメンに従った後に犠死させた動物のうち、犠死当日に４Ｔ１肺転移が見られた動物のパーセンテージを示す。ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴと、ＰＤＴの２日前に投与されるジェムザールとを併用したマウス（Ｎ＝２０）の７９％において、転移は観察されなかった（５Ｂ）。一方、ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴと、ＰＤＴの１日後に投与されるジェムザールとによって治療した動物では、６１％（Ｎ＝１９）において、転移は観察されなかった（５Ａ）。この差は統計的に有意（ｐ＜０．０１）であり、ＰＤＴに先立ってジェムザールを投与することが有利でありうることを示している。
【００９９】
実施例６
ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴおよびジェムザールによって治療した、４Ｔ１を有するマウスの生存率
図６Ｂに、４Ｔ１細胞の最初の移植の１２０日後に、最初に移植した腫瘍の完治を４Ｔ１細胞の生物発光の消失によって確認した後、２×１０５個の４Ｔ１細胞を移植して再誘発を行った個々の動物の生存率を示す。比較のために、図６Ａに、２×１０５個の４Ｔ１細胞を初めて移植されたナイーブマウスの生存率を示す。動物の６７パーセントは４Ｔ１腫瘍を拒絶し（黄緑色の曲線，Ｎ＝１０）、また１５匹のうち５匹で腫瘍増殖の遅延が見られたが、同時に誘発を行ったナイーブマウスでは、１０匹中の１０匹で腫瘍が生じた。これらの知見は、ＰＤ／ジェムザールの併用治療により、治療される動物に長期的な適応免疫が提供されることを実証するものである。
【０１００】
実施例７
ＷＳＴ１１  ＶＴＰおよびジェムザールを用いてＭＢ４９マウス膀胱がんモデルを治療するためのスキーム２
図７に、本発明においてＭＢ４９（マウス膀胱がん）を有するＢａｌｂ／Ｃマウスに適用した第２の治療スキームを示す。このスキームの適用は、右後肢に２×１０５個のＭＢ４９細胞を移植した１５日後、腫瘍の直径が約４〜７ｍｍに達した時点とした。この治療スキームでは、ＷＳＴ１１  ＶＴＰを単独投与するか、または、移植の１２日後に５０ｍｇ／ｋｇのジェムザールを腹腔内投与し、その後毎月、３週間のサイクルで各週の第１日および第７日にジェムザールを投与し、第４週には投与を行わないこととした。合計すると、動物へのジェムザールの投与は、１２回実施した。ＶＴＰ治療では、９．０ｍｇ／ｋｇのＷＳＴ１１を５分間かけて静脈に注入し、その後Ｍｏｄｕｌｉｇｈｔレーザーを用いて、７５３ｎｍ、１２０ｍＷ／ｃｍ２で１０分間の照射を行った。
【０１０１】
実施例８
ＷＳＴ１１  ＶＴＰとジェムザールとを用いた異なる治療レジメンに対する、ＭＢ４９腫瘍移植マウスの反応
図８Ａ〜図８Ｄに、図７に記載した異なる治療レジメンに対する、ＭＢ４９腫瘍を有するＢａｌｂ／Ｃマウスの反応を示す。図８Ａおよび図８Ｂはそれぞれ、上記したＷＳＴ１１  ＶＴＰ／ジェムザール併用治療後の、マウスの後肢におけるＭＢ４９腫瘍の増殖を、平均としておよび個別に示す（エラーバー，ＳＥＭ、対照対併用療法  ｐ＜０．０００１、ジェムザール対併用療法  ｐ＜０．０００１、ＶＴＰ対併用療法  ｐ＜０．０００５（２元配置分散分析））。対照動物はいずれも、腫瘍負荷のために、移植後２０〜２５日で犠死させる必要があった。ジェムザールまたはＷＳＴ１  ＶＴＰによる単独療法では、腫瘍の増殖にわずかな遅延が見られたが、完治はそれぞれ０％（ジェムザール対併用療法  ｐ＜０．０００１）および１６％（ＶＴＰ対併用療法  ｐ＜０．００１）という結果になった。しかしながら、併用治療では、移植の１００日後に６５％の動物が無病であることが示された。図８Ｃは、治療を行わない場合（対照）および異なる治療レジメン（ジェムザール、ＶＴＰ、またはＶＴＰ＋ジェムザール）により治療した場合の、ＩＶＩＳ生物発光イメージング（イメージング（Ａ１０３＋Ａ１１２））によって毎週モニタリングした第２５日の肺遠隔転移の予防を示す。４つの治療群の動物から得た代表的な発光画像を下パネルに示し、またＶＴＰから２５日後の転移腫瘍部位からの平均発光強度を定量化して上パネルにプロットしている。図８Ｄに示される、併用群における粗生存率の改善は、統計的に有意であった（ＶＴＰ対併用療法，ｐ＜０．００１；ジェムザール対併用療法，ｐ＜０．０００１）。粗生存率（ＯＳ）はカプランマイヤー生存曲線としてプロットし、統計解析にはログランク検定を使用した。肢の腫瘍が２５００ｍｍ３に達した時点でマウスを安楽死させ、死亡として数えた。データはいずれも、別個の２つの実験から得て組み合わせたものである。
【０１０２】
実施例９
ＷＳＴ１１  ＶＴＰおよびジェムザールによって治療された動物における転移の発生および再誘発の成功に反映される適応性抗腫瘍免疫の発生
ＷＳＴ１１  ＶＴＰとともにジェムザールを使用するあるいは使用しない種々の投与レジメン実施後の、Ｍｂ４９細胞を有する動物における全身的抗腫瘍反応の発生の検討を目的とした動物モデルおよび治療スキームについて、図９に示すように試験した。図９Ａに治療スキーム３を示す。移植から１５日後、腫瘍の直径が４〜７ｍｍに達した時点（第０日）で、ＶＴＰを実施した。ＶＴＰアブレーションの翌日、マウスの左後肢への２度目のＭＢ４９細胞の注入により、再誘発を行った。ジェムザール群および併用群に対し、５０ｍｇ／ｋｇのジェムザールの投与を、ＶＴＰの３日前に開始し、週に１回（３週間のサイクル、３週目は休薬）、第９０日まで行った。図９Ｂは、両側性モデルの個々の動物における第２の腫瘍の増殖に関する。４つのパネルに、治療されていないマウス（対照）または、ジェムザール、ＷＳＴ１１  ＶＴＰもしくはその併用により治療されたマウスにおける腫瘍の増殖を示す。併用群のマウスの７１％で腫瘍が発生しなかったことがわかる。図９Ｃに、ＶＴＰ治療の１２５日後（最後のジェムザール投与は、第９０日に実施）に尾静脈からＭＢ４９細胞株を注入して再誘発を行ったマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。ナイーブマウスは、いずれもＭＢ４９細胞の注射から３５日以内に死亡したが、ＷＳＴ１１  ＶＴＰまたはＷＳＴ１１  ＶＴＰ／ジェムザールを投与したマウスは、７０％が腫瘍細胞を拒絶して生存した。
【０１０３】
実施例１０
ＷＳＴ１１  ＶＴＰとジェムザールの併用による治療に対する腫瘍を有するマウスの反応における、Ｔ細胞およびＢ細胞の欠失の影響
図１０から、Ｔ細胞集団およびＢ細胞集団の欠如により、ＭＢ４９腫瘍を有するＢａｌｂ／ＣマウスにおけるＷＳＴ１１  ＶＴＰ、ゲムシタビンおよびそれらの併用による治療効果が低減されていることがわかる。治療効果に対する宿主免疫系の影響は、免疫不全（ヌード）Ｒａｇ１ノックアウトマウス（ＫＯ、点線）と、ＷＴ  Ｃ５７Ｂ／６系統マウス（ＷＴ、実線）を比較することによって評価した。図１０Ａのカプランマイヤー生存曲線から、免疫不全マウスの粗生存率が、ＷＳＴ１１  ＶＴＰで治療したＷＴマウスと比較して統計的に有意に低下していることがわかる（ＷＴ  ｎ＝１９，Ｒａｇ１ＫＯ  ｎ＝２２，ｐ＜０．０００１）。同様の差は、ジェムザール単独で治療したマウスの粗生存率でも見出された（ＷＴ  ｎ＝１０，Ｒａｇ１ＫＯ  ｎ＝１０，ｐ＜０．０５）（図１０Ｂ）。この実験では、免疫適格マウスの３０％が併用治療によって治癒に至ったが（図１０Ｃ）、ＷＳＴ１１  ＶＴＰと１２０ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／ｋｇのジェムザールとの併用による治療を行った免疫不全マウスでは、治癒は見られなかった（ｐ＜０．２４）（ＷＴ  ｎ＝１０、Ｒａｇ１ＫＯ  ｎ＝７、ｐ＜０．００５）。３つの治療法いずれの効果もＲａｇ１  ＫＯマウスでは減弱されたことから、ＶＴＰ、ジェムザールまたはその組み合わせによる治療効果は、Ｔ細胞集団により媒介されていることがわかる。
【０１０４】
以下の実施例１１〜１８により、本願に記載されている種々の治療プロトコールに対する、腫瘍を有する動物の自然免疫反応に関する洞察が得られる。
【０１０５】
実施例１１
治療を行わないＢａｌｂ／Ｃマウスの脾臓中の免疫細胞集団
４Ｔ１を有する対照（治療されていない）マウスの脾臓中の免疫細胞集団のＦＡＣＳ分析を、先の「材料および方法」の記載の通りに実施した。結果を図１１に示す。（Ａ）顆粒球型／単球型骨髄由来抑制細胞（Ｇ／Ｍ−ＭＤＳＣ）および好中球；（Ｂ）樹状細胞（ＤＣ）；（Ｃ）腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）；（Ｄ）ＣＤ−４Ｔ細胞およびＣＤ−８Ｔ細胞；（Ｅ）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）。
【０１０６】
実施例１２
４Ｔ１を有するマウスの脾臓における免疫細胞プロファイルに対する、ＳＴＬ−６０１４−ＰＤＴとジェムザール投与との併用による治療の影響
図１２に、４Ｔ１を有するマウスの脾臓における免疫細胞プロファイルに対する、ＳＴＬ−６０１４−ＰＤＴとジェムザール投与との併用による治療の影響を示す。３つの治療レジメン、すなわちＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴ、ＳＴＬ−６０１４  ＰＤＴとジェムザール（ＰＤＴの２日前に開始）との併用およびジェムザール単独を実施した後、脾臓細胞集団のプロファイルを評価した。治療群と、腫瘍を有する対照とを比較した。治療反応（治療から１週間、２週間および３週間後の原発性腫瘍のアブレーションにより判断した）が良好であった動物を、分析に供した。脾臓細胞の自然免疫マーカーおよび適応免疫マーカーを染色し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社，カリフォルニア州サンノゼ）によって解析し、かつＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社，オレゴン州アシュランド）を用いて解析した。治療後の最初の週に、ＰＤＴおよびジェムザール単独はいずれも、Ｇ−ＭＤＳＣ／好中球およびＭ−ＭＤＳＣのパーセンテージを対照と比較して顕著に低減させた。しかし、併用療法の効果は、はるかに強く現れた。治療の２週間後、対照と比べたジェムザール単独の相対効果は低減されたが、ＰＤＴの効果は十分に顕著であり、併用療法の効果は極めて高かった。３週目には、対照と比較してＭＤＳＣが低減されていたのは、併用治療された動物のみであった。ＭＤＳＣプロファイル上での併用療法の持続性は、適応免疫（Ｆｉｓｈｅｒら、２０１７年；Ｎｏｗａｋら、２００３年；Ｐｉｔｔら、２０１６年）の発生に要する時間とよく相関している。相補的に、該併用治療は、特に最初の２週間に樹状細胞集団を、また治療後の３週間を通してＣＤ８細胞集団を、対照と比較して劇的に増加させた。３つの治療法のいずれにおいても、対照との比較におけるＴｒｅｇ集団への効果は、はるかに小さかった。
【０１０７】
実施例１３
治療された動物の脾臓に対するＷＳＴ１１  ＶＴＰおよびジェムザールの影響
図１３は、４Ｔ１がん細胞を同所移植した動物の、治療を行わなかった場合（対照）と、ジェムザールによる治療、ＷＳＴ１１  ＶＴＰによる治療、およびそれらの併用による治療を行った場合の、脾臓重量の変化を比較するものである。治療されていない動物では脾臓重量が６倍に増加したが、このような増加は、ＶＴＰおよびＶＴＰ＋ジェムザールによって完全に予防され、ジェムザール単独でもほぼ完全に回避された。図１１および図１２のデータの組み合わせから、脾臓重量の増加は、主として顆粒球および単球の集団の増加によるものであり、この増加はＶＴＰ＋ジェムザールを用いた治療によって大幅に低減されることがわかる。
【０１０８】
実施例１４
４９ＭＢ腫瘍を有するマウスにおける抗腫瘍自然免疫の発生に対する、ＷＳＴ１１  ＶＴＰとジェムザール投与との併用の影響
ＭＢ４９腫瘍を有するマウスにおける、それぞれ異なる治療レジメンに対する自然免疫反応を、図１４に示す。（Ａ）脾臓内ＣＤ１１ｂ＋の免疫組織（ＩＨＣ）染色から、ＶＴＰおよびジェムザール単独はいずれも脾臓のＣＤ１１ｂ＋細胞を激減させるが、併用治療の効果は、はるかに高いことがわかる。（Ｂ）治療された動物の脾臓細胞のＦＡＣＳ分析から、治療の９日後、ＷＳＴ１１  ＶＴＰ単独またはゲムシタビンによる治療によって、好中球／Ｇ−ＭＤＳＣおよび単球／Ｍ−ＭＤＳＣは激減していることがわかる。ここで、併用によっても骨髄細胞集団は減少しておらず、ＶＴＰとジェムザールが同一の細胞集団を標的としている可能性が示唆される。ジェムザールの投与スケジュールは、第−３日、第１日、第４日、第７日に低用量（６０ｍｇ／ｋｇ）または高用量（１２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを投与するものであった。重要なことに、４Ｔ１マウスモデルにおいて、併用治療は、個々の治療法をそれぞれ行うよりも大きな効果を有していた。
【０１０９】
実施例１５
抗腫瘍適応免疫の発生に対する、ＷＳＴ１１  ＶＴＰとジェムザール投与との併用の影響
ＭＢ４９腫瘍を有する動物に対する、ＶＴＰおよびＶＴＰ＋ジェムザールを用いた治療により、治療の６日後には、脾臓、血液および流入領域リンパ節のＣＤ８細胞集団の顕著な上昇が見られた。興味深いことに、このときＴｒｅｇ集団における有意な効果は観察されなかった。しかしながら、併用療法の６日後には、腫瘍中のＴｒｅｇ集団は、ほとんど完全に消滅していた（図１５Ｂ）。ＷＳＴ１１−ＶＴＰ／ジェムザール併用により、ＶＴＰの６日後のリンパ節（ＬＮ）、脾臓および血液中の細胞傷害性Ｔ細胞集団（ＣＤ８）およびＴｅｆｆが増加した（＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。ＶＴＰ単独ではＣＤ−８Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ比の上昇は見られないが、ＶＴＰ／ジェムザール併用では強力な効果が見られた。ＶＴＰ／Ｇｅｍ併用は、Ｔｒｅｇ集団を減少させ、腫瘍中のＴｅｆｆ集団を顕著に増加させた。Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ値の増加は、治療の９日後も維持されていた。腫瘍内のセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）のレベルは、併用によりＶＴＰの６日後および９日後において増加していた。この集団は、いくつかの異なるモデルシステムにおいて、ＴＥＭ細胞と比較してより優れたがん防御効果をもたらすことが報告されている。
【０１１０】
実施例１６
ＷＳＴ１１  ＶＴＰとシクロホスファミド（ＣＴＸ）の低用量投与との併用治療スキーム
図１６に、ＷＳＴ１１  ＶＴＰと、４Ｔ１腫瘍を有するマウスを治療するための免疫調節薬としてのシクロホスファミド（ＣＴＸ）の低用量投与との併用治療スキームを示す。動物の後肢に１×１０６個のがん細胞を移植した４日後に、シクロホスファミド（例えば５０ｍｇまたは１５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与する。３日後、腫瘍の直径が４〜７ｍｍに達した時点で、動物にＷＳＴ１１（９．５ｍｇ／ｋｇ）を１０分間かけて注入し、その直後に７５３ｎｍ（１２０〜２００ｍＷ／ｃｍ２）の照射を１０〜１５分間適用する。
【０１１１】
実施例１７
マウス後肢の皮下に移植した４Ｔ１−ｌｕｃ乳がんの、ＷＳＴ１１  ＶＴＰを介したアブレーションに対する、低用量および高用量シクロホスファミド（ＣＴＸ）投与の影響
図１７および図１８に、マウス後肢の皮下に移植した４Ｔ１−ｌｕｃ乳がんの、ＷＳＴ１１  ＶＴＰを介したアブレーションに対する、低用量および高用量シクロホスファミド（ＣＴＸ）投与の影響を示す。後肢に４Ｔ１−ｌｕｃ乳がんを有するマウスを、治療しない、あるいは単回のＣＴＸ投与のみ（上パネル）；ＷＳＴ１１  ＶＴＰ（低い光強度または高い光強度）による治療（中段パネル）；またはＷＳＴ１１（ＷＳＴ１１  ９．０ｍｇ／ｋｇ）ＶＴＰと、ＶＴＰの３日前に単回投与されるＣＴＸ（５０ｍｇまたは１５０ｍｇ／ｋｇ）との併用による治療（下パネル）に供した。個々の動物における疾患の進行に対する、異なる治療プロトコールの効果を、図１７に示す。
【０１１２】
ＣＴＸの両用量の投与による単独療法、および低い光強度のＷＳＴ１１  ＶＴＰはいずれも、原発性腫瘍の増殖を抑制できないように思われる。高い光強度のＷＳＴ１１  ＶＴＰでは、腫瘍再増殖までの時間が２倍になった。ＷＳＴ１１  ＶＴＰとＣＴＸとの併用では、腫瘍の増殖が顕著に抑制され、その結果、約６０％で原発性腫瘍の完全なアブレーションが得られた。種々の治療プロトコールの後のマウス累積生存率を、図１８に示す。ここでは、後肢に皮下移植した４Ｔ１−ｌｕｃ乳がんを有するＢａｌｂ／ｃマウスを、低い光強度（上パネル）もしくは高い光強度（下パネル）を用いたＷＳＴ１１  ＶＴＰ単独、またはＶＴＰの３日前に行われるＣＴＸの単回投与（５０もしくは５０ｍｇ／ｋｇ）との併用に供した。治療の結果を、治療したすべてのマウスについて（図１８Ａ，Ｃ）、または原発性腫瘍の不可逆的で完全なアブレーションに供された動物についての（図１８Ｂ，Ｄ）カプランマイヤー曲線で示す。ＷＳＴ１１  ＶＴＰと低用量（５０ｍｇ／ｋｇ）ＣＴＸとの併用により、マウスの生存率が顕著に改善され、最終的には、９０日間の経過観察後、３０％のマウスが完全治癒に至った。その他の治療レジメン、すなわち高い光強度のＶＴＰ、または高用量のＣＴＸ投与では、生存を延長することはかなわず、局所再発およびその後の肺転移への進行に至った。原発性腫瘍の完全なアブレーションが得られたマウスの群では、併用治療によってのみ、治療されたマウスにおける肺転移の防御が、相当な割合（ＶＴＰプロトコールに依存して、６０〜８０％）で誘導された。
【０１１３】
実施例１８
皮下に４Ｔ１−ｌｕｃ乳がんを有するＢａｌｂ／ｃマウスのうち肺転移を有する動物のパーセンテージに対する、種々の治療レジメンの効果
図１９Ａのコロニーアッセイに示すように、後肢に４Ｔ１がん細胞を移植したＢａｌｂ／Ｃマウスの肺内に、がん細胞が見られた。ＷＳＴ１１  ＶＴＰとＣＴＸ投与との併用（図１６に記載の治療スキーム４）によって腫瘍を有する動物を治療した結果、移植の９０日後、高い光強度および低用量のＣＴＸを適用した時点で、肺転移が完全に消失した（図１９Ｂ）。対照的に、ＶＴＰのみに供したマウスのほとんどは、原発性腫瘍を完全にアブレーションした場合であっても、肺転移を起こした。
【０１１４】
実施例１９
移植された腫瘍内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団に対するＣＴＸの効果
ＣＴＸは、メトロノミックレジメンによって低用量で患者に投与された際、Ｔｒｅｇ集団を弱化させることが過去に示されている。よって、ＷＳＴ１１  ＶＴＰの効果に対するその相乗効果は、腫瘍誘導性（ｐｒｏｔｕｍｏｒｉｃ）Ｔｒｅｇの相対パーセンテージの低減による、細胞傷害性Ｔ細胞の活性増強による可能性がある。Ｂａｌｂ／Ｃマウスの後肢に移植された４Ｔ１−ｌｕｃ腫瘍への、Ｆｏｘｐ３陽性細胞の実際の浸潤を、図２０に示す。４Ｔ１腫瘍は  ＣＴＸまたは生理食塩水投与後の、記載の時点、すなわち３０〜６０ｍｍ３に達した時点で切除し、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。切片を作製し、Ｆｏｘｐ３発現のために染色した。陽性細胞数を、Ｆｉｊｉソフトウェアを用いて測定した。ＶＴＰ実施日における代表的な写真および定量化した結果を示す（図１９Ａ，Ｂ）。ＣＴＸを投与したことで、３日後のＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞による腫瘍浸潤は、顕著に低減された（図１９Ｃ）。これにより、腫瘍内の免疫抑制性微小環境が除去され、ＶＴＰ後に抗腫瘍免疫反応が得られることとなる。
【０１１５】
実施例２０
４Ｔ１−ｌｕｃ腫瘍を有するマウスの流入領域リンパ節および脾臓におけるＴ細胞集団に対する、ＷＳＴ１１  ＶＴＰの３日前の低用量ＣＴＸ投与の効果
図２０に、ＷＳＴ１１  ＶＴＰの３日前に低用量ＣＴＸを投与すると、腫瘍を有するマウスの流入領域リンパ節および脾臓における細胞数が、ＶＴＰの実施日に減少していることを示す。ＣＴＸによる治療を行った動物では、ＶＴＰのみに供されて細胞数が減少した動物と比較して、総細胞数の顕著な増加が観察された。この知見から、ＣＴＸの媒介による免疫細胞枯渇後の、ナイーブ免疫細胞の再増殖が示唆される。より具体的に言えば、ＣＴＸ投与により、ＶＴＰのみに供した動物と比較して、ＶＴＰ実施後のリンパ節においても脾臓においても、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の数は減少した。脾臓ではさらに、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の増加が見られた。この増加は大きくはないが重要であり、抗腫瘍免疫を生じるために有益な免疫活性状態への全体的な変化を示している。
【０１１６】
実施例２１
後脇腹の皮下に４Ｔ１−ｌｕｃ腫瘍を有するマウスの腫瘍および脾臓における骨髄細胞集団に対する低用量ＣＴＸ投与の効果
ＣＴＸ投与の３日後（ＶＴＰ当日）に腫瘍および脾臓を採取し、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗Ｌｙ６Ｇ抗体および抗Ｌｙ６Ｃ抗体を用いたフローサイトメトリーを行うために、細胞を単離し、染色した。
【０１１７】
図２１から、低用量ＣＴＸによって、腫瘍内微小環境中の抗腫瘍免疫反応を抑制することが知られているＧ−ＭＤＣＳ／好中球が減少し、ＶＴＰの後により効率的な免疫反応を生じさせることが可能となる。
【０１１８】
実施例２０および２１から、ＷＳＴ１１  ＶＴＰに先立ってＣＴＸを投与することでＴｒｅｇおよびＭＤＳＣがいずれも弱化され、動物の自然免疫反応および適応免疫反応がいずれも強化されるという治療上の利点が得られると結論付けることができる。
【０１１９】
実施例２２
乳腺脂肪体の皮下に４Ｔ１−ｌｕｃ腫瘍を有するＢａｌｂ／Ｃマウスの、種々の治療レジメン実施後の生存率
ＷＳＴ１１  ＶＴＰとＣＴＸ投与との併用（図２３Ａ，黒色，５０ｍｇ／ｋｇ）後の動物の生存率を、ＷＳＴ１１  ＶＴＰとジェムザールとの併用（図２３Ａ，青色，７５ｍｇ／ｋｇ）によって治療した動物の生存率と比較した。
【０１２０】
９ｍｇ／ｋｇのＷＳＴ１１を使用し、２００ｍＷ／ｃｍ２の照射を１５分間行ったＶＴＰ単独における生存率は極めて限定的であり、ほとんどのマウスに局所再発と肺への転移が起こった（図２３Ｂ，緑色）。ＶＴＰとＣＴＸ投与との併用では、ＶＴＰの１日前に開始したＣＴＸ投与をＶＴＰの１日後、６日後および１１日後にも継続したが、治療結果を顕著に改善することはかなわなかった（図２３Ｂ，赤色）。一方、同じプロトコールによるＶＴＰとジェムザール投与とを併用したところ約２０％のマウスが治癒に至った（図２３Ｂ，黄色）。第２のプロトコール（第−２日に開始し、さらに５日ごとに計３回投与）によるＶＴＰとジェムザールとの併用では、生存率は高まり、３０％を超えた（図２３Ｂ，青色）。最もよい結果が得られたのは、ＣＴＸの投与を第−３日、第３日、第８日および第１３日に実施した場合であり、ほぼ６０％の動物が治癒に至った（図２３Ｂ，灰色）。これらの結果を、図２３Ｃにまとめて示す。ＷＳＴ１１  ＶＴＰとの併用において、ＣＴＸがジェムザールによる治療よりもいくらか有利であると言えるかもしれない。ジェムザールのメトロノミックなレジメンをさらに延長してＷＳＴ１１  ＶＴＰと併用した場合、上記ＭＢ４９細胞で実証されたように、ＣＴＸ１とＷＳＴ１１  ＶＴＰとの併用と同様の治癒に至る可能性がある。
【０１２１】
付録
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【０１２２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ−Ｃ】
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【図１１Ｄ−Ｅ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ−Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【国際調査報告】
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