(57)【要約】  Ｌ−リジンを発酵生産する方法であって、コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／ＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を改造し、ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を低下させること、コリネバクテリウム属の細菌の染色体における１個または複数の遺伝子のプロモーターをＥＰ５プロモーターに変えること、および改造された細菌を使用してＬ−リジンを発酵生産することを含む。当該方法から発生した方法および使用、ならびにこれらの方法および使用に用いられる細菌およびプロモーターなど。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−リジンを発酵生産する方法またはＬ−リジンの発酵量を向上させる方法であって、
（１）コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１およびＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を改造し、ＮＰ＿６０１０２９．１およびＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を低下させ、好ましくはなくなるようにする工程、
（２）工程（１）で改造された細菌の染色体における一つまたは複数の遺伝子のプロモーターをＥＰ５プロモーターに変え、ここで、
前記遺伝子は、酵素活性および／または発現量の向上がＬ−リジンの生産量の向上に有利なタンパク質をコードし、
前記ＥＰ５プロモーターのポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、たとえば９８％、９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままである工程、および、
（３）工程（２）で改造された細菌を使用してＬ−リジンを発酵生産する工程、を
含む方法。
【請求項２】
Ｌ−リジンの発酵生産またはＬ−リジンの発酵量の向上における改造された細菌の使用であって、前記改造は、コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を改造し、ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を低下させ、好ましくはなくなるようにすること、
および／または、コリネバクテリウム属の細菌の染色体における一つまたは複数の遺伝子のプロモーターをＥＰ５プロモーターに変えることで、ここで、
前記遺伝子は、酵素活性および／または発現量の向上がＬ−リジンの生産量の向上に有利なタンパク質をコードし、
前記ＥＰ５プロモーターのポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、たとえば９８％、９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままであることである、使用。
【請求項３】
コリネバクテリウム属の細菌を改造する方法であって、コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を改造し、ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を低下させ、好ましくはなくなるようにすること、
および／または、コリネバクテリウム属の細菌の染色体における一つまたは複数の遺伝子のプロモーターをＥＰ５プロモーターに変えることを含み、ここで、
前記遺伝子は、酵素活性および／または発現量の向上がＬ−リジンの生産量の向上に有利なタンパク質をコードし、
前記ＥＰ５プロモーターのポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、たとえば９８％、９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままであることである、方法。
【請求項４】
コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子の改造は、前記遺伝子のヌクレオチド配列に対する１個または複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換、好ましくはノックアウトである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項５】
前記１個または複数の遺伝子は、ｌｙｓＣ、ｌｙｓＡ、ｄｄｈおよび／またはｇｎｄである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属の細菌は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）またはコリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）で、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれかに記載の方法によって改造された細菌。
【請求項８】
ポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、たとえば９８％、９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままである、
ＥＰ５プロモーター。
【請求項９】
請求項８に記載のプロモーターおよび前記プロモーターの後ろに操作可能に連結したコード配列を含む、発現カセットまたはベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現カセットまたはベクター、あるいは請求項９に記載の発現カセットまたはベクターによって形質転換された宿主細胞、好ましくはコリネバクテリウム属の細菌、例えばコリネバクテリウム・グルタミクム。
【請求項１１】
たとえばコリネバクテリウム属の細菌におけるＬ−リジンの発酵生産またはＬ−リジンの発酵量の向上における請求項８に記載のプロモーターの使用。
【請求項１２】
コリネバクテリウム属の細菌の発酵生産のＬ−リジンの生産量に影響する遺伝子を選別する方法であって、
（１）コリネバクテリウム属の細菌の染色体における「仮想タンパク質」をコードする遺伝子を改造し、「仮想タンパク質」の活性および／または発現量を向上または低下させる工程、
（２）工程（１）で改造された細菌を使用してＬ−リジンを発酵生産する工程、および、
（３）工程（２）で得られたＬ−リジンの生産量を未改造のコリネバクテリウム属の細菌のＬ−リジンの生産量と比較する工程、
を含む方法。
【請求項１３】
影響は増強で、かつ「仮想タンパク質」の活性および／または発現量を低下させ、好ましくはなくなるようにする、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は出願日が２０１６年９月１日の中国特許出願ＣＮ２０１６１０８００６０１．ＸおよびＣＮ２０１６１０８００５６７．６の優先権を要求する。本願は上記中国特許出願の全文を引用する。
【０００２】
[技術分野]
本発明は、アミノ酸発酵の分野に属し、具体的に、本発明はＬ−リジンを発酵生産する方法および使用、ならびにこれらの方法および使用に用いられる細菌およびプロモーターなどに関する。
【０００３】
[背景技術]
Ｌ−リジンを生産する細菌（たとえば、エスケリキア属の大腸菌やコリネバクテリウム属の桿状細菌）の発酵によるＬ−リジンの生産はすでに産業化の応用がされている。これらの細菌は、自然界から単離された細菌でもよく、突然変異誘発または遺伝子工学的改造によって得られた細菌でもよく、あるいは両者を兼ねたものでもよい。
【０００４】
Ｌ−リジンを生産する細菌はコリネバクテリウム属の細菌を含む。遺伝子工学によるコリネバクテリウム属の細菌の改造は、主にＬ−リジン代謝経路に関連する酵素活性または発現量を増加または減少することによって実現される。たとえば、中国特許ＣＮ１０１７９０６Ｂでは、ジヒドロジピコリン酸合成酵素および／またはスクシニルテトラヒドロピリジンカルボン酸合成酵素を合成する組み換えＤＮＡを含有するコリネバクテリウム属の細菌を使用して発酵する工程を含む、Ｌ−リジンを生産する方法が公開された。中国特許出願ＣＮ１１８７５３９Ａでは、アスパラギン酸キナーゼおよびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする組み換えＤＮＡを含有するコリネバクテリウム属の細菌を使用して発酵する工程を含む、Ｌ−リジンを生産する方法が公開された。中国特許出願ＣＮ１３１０２３４Ａでは、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を含有するコリネバクテリウム属の細菌を使用して発酵する工程を含む、Ｌ−リジンを生産する方法が公開された。中国特許出願ＣＮ１８９０３７２Ａでは、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼの活性を増加させるコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を使用して発酵する工程を含む、Ｌ−リジンを生産する方法が公開された。中国特許出願ＣＮ１０１０６５４８４Ａでは、アセチルＣｏＡヒドロラーゼの活性が減少するように修飾された、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有するコリネバクテリウム属の細菌が公開された。中国特許出願ＣＮ１０４２４５９２１Ａでは、キシロースイソメラーゼおよびキシルロースキナーゼをコードする遺伝子を含有するコリネバクテリウム属の細菌を使用して発酵する工程を含む、Ｌ−リジンを生産する方法が公開された。中国特許出願ＣＮ１０１８５５３５７Ａでは、フルクトース−ＰＴＳ酵素をコードするｐｔｓＦ遺伝子に突然変異があるコリネバクテリウム・グルタミクムを使用して発酵する工程を含む、Ｌ−リジンを生産する方法が公開された。中国特許出願ＣＮ１０４２４５９２１Ａでは、キシロースイソメラーゼおよびキシルロースキナーゼをコードする遺伝子を含有するコリネバクテリウム属の細菌を使用して発酵する工程を含む、Ｌ−リジンを生産する方法が公開された。本出願は上記すべての特許文献の全文を引用する。
【０００５】
上記Ｌ−リジンを生産する文献はいずれも既知の生物学的機能の酵素または遺伝子に基づいたものである。すでに配列決定されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ  １３０３２の全ゲノム（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００３４５０．３）には、約３０５７個の遺伝子がある。しかし、これらの遺伝子には、生物学的機能が明らかになった遺伝子以外、約１１９６個の遺伝子が生物学的機能が不明な「仮想タンパク質」をコードする。これらの「仮想タンパク質」のうち、約２３６個の遺伝子がコードするタンパク質は生物情報学的方法によって注釈されて、あるタンパク質または酵素に類似すること、あるいはあるドメインを含むことが示された。しかし、まだ約９６０個の遺伝子がコードするタンパク質は、生物学的機能が示唆されておらず、Ｌ−リジンの発酵生産における作用も不明である。
【０００６】
また、酵素の活性を増加するには、遺伝子そのものの改造以外、主にプロモーターに対する改良に関する。しかし、既存技術におけるコリネバクテリウム属の桿状細菌のプロモーターの多くは野生型プロモーターが残っているが、たとえばコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ  １３８６９株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１６３３５．１の２５３１５２８〜２５３１９７２番目を参照する）、ＣＰ株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１２１９４．１の２５７５８０５〜２５７６２４９番目を参照する）、ＺＬ−６株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００４０６２．１の２５６０６７７〜２５６１１２１番目を参照する）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）ＺＬ−１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００４０４６．１の  ２５６９１７６〜２５６９６２０番目を参照する）が挙げられる。
【０００７】
本発明者は長期間にわたって研究および実践し、多くの失敗を経験し、運良く、意外に、コリネバクテリウム菌の染色体では、２つの「仮想タンパク質」をコードする遺伝子の改造がＬ−リジンの生産量の向上に有利であることを見出した。また、ｃｓｐＢ遺伝子の野生型のプロモーターの２つの部位を突然変異させて、改良されたプロモーターが得られ、それでコリネバクテリウム属の桿状細菌の染色体におけるほかの部位の野生型プロモーターを置き換えると、相応する遺伝子の発現を増強し、そして最終的にＬ−リジンの生産量を向上させることができることを見出した。この２つの発見は、既存の改造された大量のＬ−リジンを高生産する細菌の染色体の改造部位に相反せず、向上効果を相乗させることで、実践において多くの細菌のＬ−リジンの発酵生産に使用することができる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明が解決しようとする技術課題は、未改造の細菌よりもＬ−リジンの発酵生産量を向上させる方法、Ｌ−リジンの発酵生産における改造された細菌の使用、未改造の細菌よりもＬ−リジンの発酵生産量を向上させることにおける改造された細菌の使用、および／または、細菌を改造する方法などを含む、新規なＬ−リジンを発酵生産する方法およびそれに関連する方法を提供することにある。また、本発明は相応的に改造された細菌、およびそれに使用されるプロモーターおよびその発現カセット、ベクターおよび宿主細胞などに関する。
【０００９】
具体的に、第一の側面では、本発明は、Ｌ−リジンを発酵生産する方法であって、
（１）コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を改造して、ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を低下させる工程、
（２）任意に工程（１）で改造された細菌の染色体における一つまたは複数の遺伝子のプロモーターをＥＰ５プロモーターに変え、ここで、
前記遺伝子は、酵素活性および／または発現量の向上がＬ−リジンの生産量の向上に有利なタンパク質をコードし、
前記ＥＰ５プロモーターのポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままである、工程、および、
（３）工程（１）または（２）で改造された細菌を使用して、Ｌ−リジンを発酵生産する工程、
を含む方法を提供する。
【００１０】
本明細書において、用語「任意に」とは選択してもよく、選択しなくてもよいことをいう。たとえば、上記工程（２）を選択しなくてもよいが、そうすると、Ｌ−リジンの発酵生産は工程（１）で改造された細菌で行われる。本発明の第一の側面の方法において、上記工程（２）を選択し、そして工程（２）で改造された細菌を使用してＬ−リジンを発酵生産することが好ましい。
【００１１】
本明細書において、用語「改造」とは相応的に改造された対象が変化することで、ある程度の効果に達することをいう。染色体に位置する遺伝子を改造する手段は、突然変異誘発、部位特異的突然変異、および／または相同組み換えを含むが、これらに限定されず、後者の２つが好ましい。染色体に位置する遺伝子を改造することで、当該遺伝子のヌクレオチド配列は１個または複数のヌクレオチドが挿入、欠失または置換され、たとえば当該遺伝子にナンセンスコドンを挿入してもよく、当該遺伝子をノックアウトしてもよい。当該遺伝子の調節配列を改造して間接的に当該遺伝子を改造することによって、それによってコードされるタンパク質の活性および／または発現量を低下させてもよい。
【００１２】
これらの技術手段は幅広く分子生物学および微生物学の文献に記載され、その多くがすでに商品化された。本発明の具体的な実施形態において、相同組み換えの原理に従い、Ａｄｄｇｅｎｅ社の商品化されたｐＫＯＶプラスミド系によって改造してもよく、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド系によって改造してもよい。そのため、本明細書において、改造は相同組み換えによる改造が好ましく、相同組み換えによるノックアウトがより好ましい。
【００１３】
本明細書において、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１（ＮＰ＿６０１０２９．１と略する）は「仮想タンパク質」で、そのアミノ酸配列は、配列番号１で表される（サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ，ＮＰ＿６０１０２９．１からも得られる）。ＮＰ＿６０１０２９．１をコードする遺伝子の（相補）ヌクレオチド配列は、配列番号２で表される（サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ，ＮＣｇｌ１７５１からも得られる）。ＮＰ＿６０１０２９．１の具体的な活性はまだ未知であるが、本発明の具体的な実施形態において、ＮＣｇｌ１７５１遺伝子がノックアウトされると（すなわち、その活性および／または発現量がなくなると）、リジンの生産量が向上される。そのため、本明細書において、ＮＰ＿６０１０２９．１の活性および／または発現量がなくなることが好ましい。
【００１４】
本明細書において、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿５９９３５０．１（ＮＰ＿５９９３５０．１と略する）は「仮想タンパク質」で、そのアミノ酸配列は、配列番号３で表される（サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ，ＮＰ＿５９９３５０．１からも得られる）。ＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子の（相補）ヌクレオチド配列は、配列番号４で表される（サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ，ＮＣｇｌ００９７からも得られる）。ＮＰ＿５９９３５０．１の具体的な活性はまだ未知であるが、本発明の具体的な実施形態において、ＮＣｇｌ００９７遺伝子がノックアウトされると（すなわち、その活性および／または発現量がなくなると）、リジンの生産量が向上される。そのため、本明細書において、ＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量がなくなることが好ましい。
【００１５】
また、置き換えられた１個または複数の遺伝子のプロモーターは、このまたはこれらの遺伝子の野生型のプロモーターが好ましい。本明細書において、野生型のプロモーターは、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２（そのゲノムの全配列はサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから得られる）における遺伝子のプロモーターと定義されている。
【００１６】
本明細書において、前記遺伝子は、酵素活性および／または発現量の向上がＬ−リジンの生産量の向上に有利なタンパク質をコードする。これらの遺伝子は、本発明の実施例および背景技術の部分で挙げられたものに限定されない。
【００１７】
置き換えられた遺伝子のプロモーターは、１個でもよく、複数でもよく、数個、たとえば２〜６個が好ましい。本発明の具体的な実施形態における置き換えられた遺伝子のプロモーターは、それぞれ１、２、３、４個ある。
【００１８】
本発明者が設計して改造したプロモーターのポイントは、配列番号５に相応する５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままであるため、この２つの部位が変わらなければ、ほかの部位は少し変わってもよく、１個および／または複数のヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換を含む。本発明のＥＰ５プロモーターのポリヌクレオチド配列は、配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９５％（より好ましくは９７％、たとえば９８％、９９％）以上の相同性を有するるポリヌクレオチド配列が好ましい。通常のＢｌａｓｔやＦＡＳＴＡなどのプログラムによって、当業者は、ポリヌクレオチド配列の相同性を算出することができる。
【００１９】
相応的に、本発明は、ほかの使用または方法も提供する。たとえば、第二の側面では、本発明は、Ｌ−リジンの発酵量を向上させる方法であって、
（１）コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を改造して、ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を低下させる（好ましくはなくなるようにする）工程、
（２）任意に工程（１）で改造された細菌の染色体における一つまたは複数の遺伝子のプロモーターをＥＰ５プロモーターに変え、ここで、
前記遺伝子は、酵素活性および／または発現量の向上がＬ−リジンの生産量の向上に有利なタンパク質をコードし、
前記ＥＰ５プロモーターのポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％（好ましくは９５％、より好ましくは９７％、たとえば９８％、９９％）以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままである、工程、および、
（３）工程（１）または（２）で改造された細菌を使用してＬ−リジンを発酵生産する工程、
を含む方法を提供する。
【００２０】
第三の側面では、本発明は、Ｌ−リジンの発酵生産における改造された細菌の使用を提供するが、前記改造は、コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を改造して、ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を低下させる（好ましくはなくなるようにする）こと、
および／または、前記改造は、コリネバクテリウム属の細菌の染色体における一つまたは複数の遺伝子のプロモーターをＥＰ５プロモーターに変えることで、ここで、
前記遺伝子は、酵素活性および／または発現量の向上がＬ−リジンの生産量の向上に有利なタンパク質をコードし、
前記ＥＰ５プロモーターのポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％（好ましくは９５％、より好ましくは９７％、たとえば９８％、９９％）以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままである。
【００２１】
相応的に、第四の側面では、本発明は、Ｌ−リジンの発酵量の向上における改造された細菌の使用を提供するが、前記改造は、コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を改造して、ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を低下させる（好ましくはなくなるようにする）こと、
および／または、前記改造は、コリネバクテリウム属の細菌の染色体における一つまたは複数の遺伝子のプロモーターをＥＰ５プロモーターに変えることで、ここで、
前記遺伝子は、酵素活性および／または発現量の向上がＬ−リジンの生産量の向上に有利なタンパク質をコードし、
前記ＥＰ５プロモーターのポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％（好ましくは９５％、より好ましくは９７％、たとえば９８％、９９％）以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままである。
【００２２】
本明細書において、特に限定しない（たとえば「改造」で限定しない）限り、用語「細菌」または「コリネバクテリウム属の細菌」は、未改造または改造前の細菌またはコリネバクテリウム属の細菌で、その染色体は野生型のＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を有し、および／またはその染色体は、改造しようとする１個または複数の遺伝子に野生型のプロモーターを有する。
【００２３】
Ｌ−リジンは、細菌の重要な代謝物で、多くのコリネバクテリウム属の細菌は、少なからずある程度の量のＬ−リジンを発酵生産することができる。既存技術では、リジンの生産／発酵において、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子が注目されず、本発明のプロモーターの置き換えの相応する部位におけるプロモーター（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ：  ＣＰ０１６３３５．１の２５３１５２８〜２５３１９７２番目など）も注目されていないため、既存技術におけるＬ−リジンを生産するコリネバクテリウム属の細菌は、通常、いずれも野生型のＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を有し、大量の野生型のプロモーターを有し、基本的にいずれも本発明の方法によって改造し、Ｌ−リジンの発酵量を向上させることができる。本明細書において、コリネバクテリウム属の細菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムまたはコリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）を含み、コリネバクテリウム・グルタミクムが好ましい。
【００２４】
より本質的に、第五の側面では、本発明は、細菌を改造する方法を提供するが、コリネバクテリウム属の細菌を改造する方法を含み、コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を改造して、ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を低下させる（好ましくはなくなるようにする）こと、
および／または、コリネバクテリウム属の細菌の染色体における一つまたは複数の遺伝子のプロモーターをＥＰ５プロモーターに変えることを含み、ここで、
前記遺伝子は、酵素活性および／または発現量の向上がＬ−リジンの生産量の向上に有利なタンパク質をコードし、
前記ＥＰ５プロモーターのポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％（好ましくは９５％、より好ましくは９７％、たとえば９８％、９９％）以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままである。
【００２５】
本発明の第五の側面の方法によって改造された細菌は、Ｌ−リジンの発酵生産または産出に使用することができる。そのため、第六の側面では、本発明は本発明の第五の側面の方法によって改造された細菌を提供する。本発明の第六の側面の細菌は、コリネバクテリウム属の細菌で、その染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子座のヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子のヌクレオチド配列と異なり、および／または、その染色体における１個または複数の野生型プロモーターの遺伝子座のヌクレオチド配列は、本発明のＥＰ５プロモーターのヌクレオチド配列に置き換えられた。好ましくは、本発明の第六の側面の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子がノックアウトされた。
【００２６】
第七の側面では、本発明は、Ｌ−リジンの発酵生産におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１および／またはそのコード遺伝子の使用を提供する。ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を増加することによって、コリネバクテリウム属の細菌の発酵生産のＬ−リジンの生産量を低下させることが可能であるが、好ましくは前記使用は、コリネバクテリウム属の細菌の発酵生産のＬ−リジンの生産量を向上させるための、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量の低下（好ましくは消失、たとえばそのコード遺伝子のノックアウト）の使用である。ここで、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１のアミノ酸配列は配列番号１で表され、そのコード遺伝子の（相補）ヌクレオチド配列は、配列番号２で表され、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿５９９３５０．１のアミノ酸配列は配列番号３で表され、そのコード遺伝子の（相補）ヌクレオチド配列は、配列番号４で表される。
【００２７】
第八の側面では、本発明は、ＥＰ５プロモーターを提供するが、そのポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％（好ましくは９５％、より好ましくは９７％、たとえば９８％、９９％）以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままである。
【００２８】
第九の側面では、本発明は、本発明の第八の側面のプロモーターおよび前記プロモーターの後ろに操作可能に連結したコード配列を含む発現カセットを提供する。本明細書において、「操作可能に連結した」とは、プロモーター配列がコード配列の転写を開始または仲介することができるように、コード配列が機能的にプロモーターに連結し、通常、プロモーターの３’末端に連結することをいう。
【００２９】
第十の側面では、本発明は、本発明の第八の側面のプロモーターおよび前記プロモーターの後ろに操作可能に連結したコード配列を含むベクターを提供する。ベクターは発現ベクターが好ましい。
【００３０】
第十一の側面では、本発明は、本発明の第九の側面の発現カセットまたは本発明の第十の側面のベクターを含むか、あるいは本発明の第九の側面の発現カセットまたは本発明の第十の側面のベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞はＥＰ５プロモーターを含む。宿主細胞は、コリネバクテリウム属の細菌、たとえばコリネバクテリウム・グルタミクムが好ましい。
【００３１】
第十二の側面では、本発明は、Ｌ−リジンの発酵生産またはＬ−リジンの発酵量の向上、好ましくはコリネバクテリウム属の細菌におけるＬ−リジンの発酵生産またはＬ−リジンの発酵量の向上における、本発明の第八の側面のプロモーターの使用を提供する。
【００３２】
第十三の側面では、本発明は、コリネバクテリウム属の細菌の発酵生産のＬ−リジンの生産量に影響する遺伝子を選別する方法であって、
（１）コリネバクテリウム属の細菌の染色体における「仮想タンパク質」をコードする遺伝子を改造し、「仮想タンパク質」の活性および／または発現量を向上または低下させる工程、
（２）工程（１）で改造された細菌を使用してＬ−リジンを発酵生産する工程、および、
（３）工程（２）で得られたＬ−リジンの生産量を、未改造のコリネバクテリウム属の細菌のＬ−リジンの生産量と比較する工程、
を含む方法を提供する。
【００３３】
本発明の第十三の側面の方法において、影響は増強で、かつ「仮想タンパク質」の活性および／または発現量を低下させ、好ましくはなくなるようにし、たとえば「仮想タンパク質」をコードする遺伝子をノックアウトすることが好ましい。
【００３４】
本発明の有益的な効果は、新しいＬ−リジンの発酵量を向上させる方法を開拓し、そして実践で証明し、また既存の改造された大量のＬ−リジンを高生産するコリネバクテリウム属の細菌の染色体の改造部位に相反しないため、実践においてＬ−リジンの生産量をさらに向上させることができる。
【００３５】
以下、理解しやすいように、具体的な実施例を通して本発明を詳しく説明する。特に強調したいのは、これらの説明は例示的なものだけで、本発明の範囲の制限にはならない。本明細書の記載に基づき、本発明の多くの変化、変更は当業者にとって容易に想到できるものである。
【００３６】
また、本発明は公開文献を引用し、これらの文献は本発明をより明晰に説明するためのもので、これらの全部の内容が本明細書にもう一度記載されたように本明細書に参照として取り入れた。
【００３７】
生物材料の寄託情報
本発明のコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＹＰ０９７１５８菌株は、既に２０１６年８月１６日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託先は、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所で、郵便番号は１００１０１で、菌株寄託番号はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１２８５６で、そして登録され、生存が証明された。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
具体的な実施形態
以下、実施例によってさらに本発明の内容を説明する。特別に説明しない限り、実施例で使用された技術手段は当業者に熟知の通常の手段および市販の通常の設備、試薬で、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル（第３版）」（科学出版社）、「微生物学実験（第４版）」（高等教育出版社）ならびに相応する設備および試薬のメーカーの説明書などを参照する。
【００３９】
実施例１    ＮＣｇｌ１７５１遺伝子発現下方調節実験
ＮＣＢＩで公開されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列を参照し、２対のＮＣｇｌ１７５１遺伝子のコード領域の両末端の断片を増幅するプライマーを合成し、上・下流のホモロジーアームの断片とした。プライマーの設計は以下の通りである（上海英俊社によって合成された）。
【００４０】
Ｐ１：５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＡＴＴＧ    ３’（ＨｉｎｄIII）
Ｐ２：５’ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴ  ＡＣＧＴＣＡＡＧＧＴ  ＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴ  ＣＴＴＴＡＡＣＡＣＣ    ３’
Ｐ３：５’ＧＧＴＧＴＴＡＡＡＧ  ＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡ  ＡＣＣＴＴＧＡＣＧＴ  ＡＴＴＴＣＴＣＣＡＴ    ３’
Ｐ４：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴ    ３’  （ＢａｍＨI）
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を鋳型とし、それぞれプライマーＰ１／Ｐ２およびＰ３／Ｐ４で、ＰＣＲ増幅を行い、上流のホモロジーアームの断片６６０ｂｐおよび下流のホモロジーアームの断片７８０ｂｐを得、さらにプライマーＰ１／Ｐ４でＯＶＥＲ  ＰＣＲを行って完全のホモロジーアームの断片１４４０ｂｐを得、両末端にそれぞれＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨIの酵素切断部位が含まれる。ＰＣＲ反応終了後、増幅された産物を電気泳動によって回収し、カラム式ＤＮＡゲル回収キットによって必要な１４００ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、そして酵素切断して回収し、シャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢと連結させ、ノックアウトプラスミドを得た。当該プラスミドにカナマイシン耐性標識が含まれる。
【００４１】
ノックアウトプラスミドをリジンを生産する特許菌株ＹＰ９７１３６（その構築方法はＷＯ２０１４１２１６６９Ａ１を参照する。配列決定によって当該菌株の染色体に野生型のＮＣｇｌ１７５１遺伝子が残っていることが確認された）に電気的形質転換し、培養して生成した単一の集落に対してそれぞれ以下のようなプライマー（上海英俊社によって合成された）でＰＣＲによる同定を行った。
【００４２】
Ｐ５：５’    ＧＧＴＡＧＴＣＣＣＡＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴ    ３’
Ｐ６：５’    ＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＴＧＧＴＴＣＴ    ３’
上記ＰＣＲで大きさ１０００ｂｐおよび７４０ｂｐのバンドが増幅された菌株は陽性菌株で、１０００ｂｐのバンドだけが増幅された菌株は元の菌である。陽性菌株はそれぞれカナマイシンを含有する培地およびカナマイシンを含有しない培地で培養し、カナマイシンを含有しない培地で生長するが、カナマイシンを含有する培地で生長しない菌株はさらにＰ５／Ｐ６プライマーでＰＣＲ同定を行い、大きさ７４０ｂｐのバンドが増幅された菌株はＮｃｇｌ１７５１遺伝子のコード領域がノックアウトされた遺伝子工学菌株で、ＹＰＬ−１−００１と名付けられた。
【００４３】
実施例２    ＮＣｇｌ００９７遺伝子発現の下方調節実験
ＮＣＢＩで公開されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列を参照し、２対のＮＣｇｌ００９７遺伝子のコード領域の両末端の断片を増幅するプライマーを合成し、上・下流のホモロジーアームの断片とした。プライマーの設計は以下の通りである（上海英俊社によって合成された）。
【００４４】
Ｐ７：５’    ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＴＣＡＣ    ３’（ＨｉｎｄIII）
Ｐ８：５’    ＣＡＣＴＴＣＡＴＡＧ  ＧＧＴＴＧＡＡＴＡＣ  ＡＧＣＡＣＧＣＧＣＡ  ＣＧＧＡＡＡＧＣＣＡ  ３’
Ｐ９：５’    ＴＧＧＣＴＴＴＣＣＧ  ＴＧＣＧＣＧＴＧＣＴ  ＧＴＡＴＴＣＡＡＣＣ  ＣＴＡＴＧＡＡＧＴＧ  ３’
Ｐ１０：５’    ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＣＡＴ    ３’  （ＸｂａI）
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を鋳型とし、それぞれプライマーＰ７／Ｐ８およびＰ９／Ｐ１０で、ＰＣＲ増幅を行い、上流のホモロジーアームの断片７４０ｂｐおよび下流のホモロジーアームの断片６４０ｂｐを得、さらにプライマーＰ７／Ｐ１０でＯＶＥＲ  ＰＣＲを行って、完全のホモロジーアームの断片１３８０ｂｐを得、両末端にそれぞれＨｉｎｄIIIおよびＸｂａIの酵素切断部位が含まれる。ＰＣＲ反応終了後、増幅された産物を電気泳動によって回収し、カラム式ＤＮＡゲル回収キットによって必要な１３８０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、そして酵素切断して回収し、シャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢと連結させ、ノックアウトプラスミドを得た。当該プラスミドにカナマイシン耐性標識が含まれ、カナマイシン選別によってプラスミドがゲノムに組み込まれた組み換え体を得た。
【００４５】
ノックアウトプラスミドをリジンを生産する特許菌株ＹＰ９７１３６（配列決定によって当該菌株の染色体に野生型のＮＣｇｌ００９７遺伝子が残っていることが確認された）に電気的形質転換し、培養して生成した単一の集落に対してそれぞれ以下のようなプライマー（上海英俊社によって合成された）でＰＣＲによる同定を行った。
【００４６】
Ｐ１１：５’    ＡＡＣＴＧＧＧＣＴＣＴＴＧＴＴＡＣＴＧ    ３’
Ｐ１２：５’    ＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＴ    ３’
上記ＰＣＲで大きさ１１９５ｂｐおよび６４５ｂｐのバンドが増幅された菌株は陽性菌株で、１１９５ｂｐのバンドだけが増幅された菌株は元の菌である。陽性菌株はそれぞれカナマイシンを含有する培地およびカナマイシンを含有しない培地で培養し、カナマイシンを含有しない培地で生長するが、カナマイシンを含有する培地で生長しない菌株はさらにＰ１１／Ｐ１２プライマーでＰＣＲ同定を行い、大きさ６４５ｂｐのバンドが増幅された菌株はＮｃｇｌ００９７遺伝子のコード領域がノックアウトされた遺伝子工学菌株で、ＹＰＬ−１−００２と名付けられた。
【００４７】
実施例３    ＮＣｇｌ１７５１およびＮＣｇｌ００９７遺伝子二重発現下方調節実験
ＹＰＬ−１−００１菌株をもとに、ゲノムにおけるＮｃｇｌ００９７遺伝子のコード領域をノックアウトし、具体的な過程は上記Ｎｃｇｌ００９７遺伝子のコード領域のノックアウトと同様で、同定プライマーＰ５／Ｐ６、Ｐ１１／Ｐ１２で菌株に対してＰＣＲ検証を行い、それぞれ大きさが７４０ｂｐおよび６４５ｂｐの断片（元の菌株ＰＣＲの大きさはそれぞれ１０００ｂｐおよび１１９５ｂｐである）を得、ＮＣｇｌ１７５１およびＮＣｇｌ００９７遺伝子のコード領域がノックアウトされた遺伝子工学菌株で、ＹＰＬ−１−００３（ＹＰ０９７１５８とも呼ばれる）と名付け、２０１６年８月１６日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１２８５６である。
【００４８】
実施例４  本発明のプロモーター
本発明者が設計したポリヌクレオチド配列は、配列番号５で表されるプロモーターに準じ、相応するポリヌクレオチドの合成およびｐＭＤ１９−Ｔベクターへの連結を依頼し、得られた新規なベクターはＴ−ＥＰ５で、配列決定し（上海英俊社に配列決定を依頼した）、配列決定の結果は以下の通りである。
【００４９】
ＧＴＡＡＣＣＣＧＡＧ  ＧＴＴＡＡＧＴＧＴＡ  ＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡ  ＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡ  ＧＣＴＴＣＧＧＧＴＡ  
ＧＡＡＧＡＣｃＴＴＣＧＡＴＧＣＧＣＴＴＣ  ＡＧＡＧＣＴＴＣＴＡ  ＴＴＧＧＧＡＡＡＴＣ  ＴＧＡｔＡＣＣＡＣＴ  
ＴＧＡＴＴＡＡＡＴＡ  ＧＣＣＴＡＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＧＧＧＧＧ  ＡＴＴＧＧＴＣＡＴＴ  ＴＴＴＴＧＣＴＧＴＧ  
ＡＡＧＧＴＡＧＴＴＴ  ＴＧＡＴＧＣＡＴＡＴ  ＧＡＣＣＴＧＣＧＴＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＡ  ＧＴＡＡＡＣＧＴＧ  
ＡＴＣＡＧＡＴＣＧＡ  ＴＡＴＡＡＡＡＧＡＡ  ＡＣＡＧＴＴＴＧＴＡ  ＣＴＣＡＧＧＴＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＴＣ  
ＴＣＣＧＡＴＴＣＧＣ  ＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡ  ＴＣＴＣＡＡＴＴＧＴ  ＣＧＣＴＴＡＣＡＧＴ  ＴＴＴＴＣＴＣＡＡＣ
ＧＡＣＡＧＧＣＴＧＣ  ＴＡＡＧＣＴＧＣＴＡ  ＧＴＴＣＧＧＴＧＧＣ  ＣＴＡＧＴＧＡＧＴＧ  ＧＣＧＴＴＴＡＣＴＴ  
ＧＧＡＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＣＣＣＡＴＧＴ  ＣＧＴＧＡＴＣＡＧＣ  ＣＡＴＴＴＴＧＧＧＴ  ＴＧＴＴＴＣＣＡＴＡ  
ＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡ  ＧＧＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＣＧＡＴＡＣＣＴ  ＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧ  ＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣ  Ｔ
配列決定の結果は配列番号５で表されるプロモーターを含み、クローンが正しいことが示された。野生型のプロモーターに対し、本発明者が設計したプロモーター配列は、主にＴ→ＣおよびＣ→Ｔの２つの突然変異（小文字で表示される）を設計し、配列番号５で表されるプロモーターは、下記でＥＰ５と略する。
【００５０】
実施例５  ＥＰ５プロモーターによるｄｄｈ遺伝子の発現調節の構築実験
上記ＥＰ５の配列およびＮＣＢＩで公開されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列を参照してプライマーを設計し、ＥＰ５がｄｄｈ遺伝子の発現を駆動するように、ＥＰ５断片のｄｄｈ遺伝子の開始コドンＡＴＧの前への挿入に使用し、具体的なプライマーの設計は以下の通りである。
【００５１】
Ｐ１３：５’  ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡＧＣＣＡＡＣＧＡＡＧＴＡＡＴＣ  ３’  （ＸｂａI）
Ｐ１４：５’ＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧ  ＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣ  ＴＣＴＡＴＧＡＣＣＡ  ＡＣＡＴＣＣＧＣＧＴ  ＡＧＣＴＡＴＣ  ３’
Ｐ１５：５’ＧＡＴＡＧＣＴＡＣＧ  ＣＧＧＡＴＧＴＴＧＧ  ＴＣＡＴＡＧＡＧＧＣ  ＧＡＡＧＧＣＴＣＣＴ  ＴＧＡＡＴＡＧ３’
Ｐ１６：５’ＣＡＡＴＴＴＴＧＧＡ  ＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧ  ＡＡＣＧＴＡＡＣＣＣ  ＧＡＧＧＴＴＡＡＧＴ  ＧＴＡＴＴＴＴＡＧ３’
Ｐ１７：５’ＣＴＡＡＡＡＴＡＣＡ  ＣＴＴＡＡＣＣＴＣＧ  ＧＧＴＴＡＣＧＴＴＣ  ＴＴＧＴＡＡＴＣＣＴ  ＣＣＡＡＡＡＴＴＧ３’
Ｐ１８：  ５’    ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡＴＡＴＡＧ    ３’    （ＥｃｏＲI）
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を鋳型とし、それぞれプライマーＰ１３／Ｐ１４およびＰ１７／Ｐ１８で、ＰＣＲ増幅を行い、上流のホモロジーアームの断片７００ｂｐおよび下流のホモロジーアームの断片６５０ｂｐを得、さらにプライマーＰ１５／Ｐ１６で、Ｔ−ＥＰ５を鋳型としてＥＰ５断片４５０ｂｐを増幅し、さらにＰ１３／Ｐ１８をプライマーとし、以上で増幅された３つの断片の混合物を鋳型として増幅し、完全のホモロジーアームの断片を得、両末端にそれぞれＸｂａIおよびＥｃｏＲIの酵素切断部位が含まれる。ＰＣＲ反応終了後、増幅された産物を電気泳動によって回収し、カラム式ＤＮＡゲル回収キットによって必要な１８００ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、そして酵素切断して回収し、シャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢと連結させ、組み込みプラスミドを得た。当該プラスミドにカナマイシン耐性標識が含まれ、カナマイシン選択によってプラスミドがゲノムに組み込まれた組み換え体を得た。
【００５２】
組み込みプラスミドを、リジンを生産する菌株ＹＰＬ−１−００３菌株（配列決定によって当該菌株の染色体に野生型のｄｄｈ遺伝子が残っていることが確認された）に電気的形質転換し、培養して生成した単一の集落に対してＰ１５／Ｐ１８プライマーでＰＣＲによる同定を行い、ＰＣＲで大きさ１１００ｂｐの断片を含有するものが、増幅された菌株は陽性菌株で、断片が増幅されなかった菌株は元の菌である。陽性菌株はそれぞれカナマイシンを含有する培地およびカナマイシンを含有しない培地で培養し、カナマイシンを含有しない培地で生長するが、カナマイシンを含有する培地で生長しない菌株は、さらにＰ１５／Ｐ１８プライマーでＰＣＲ同定を行い、大きさ１１００ｂｐのバンドが増幅された菌はＥＰ５がｄｄｈ遺伝子の開始コドンの前に組み込まれた菌株で、ＹＰＬ−１−００４と名付けられた。
【００５３】
実施例６  ＥＰ５プロモーターによるｌｙｓＣ遺伝子の発現調節の構築実験
上記ＥＰ５の配列およびＮＣＢＩで公開されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列を参照してプライマーを設計し、ＥＰ５がｌｙｓＣ遺伝子の発現を駆動するように、ＥＰ５断片のｌｙｓＣ遺伝子の開始コドンＧＴＧの前への挿入に使用し、具体的なプライマーの設計は以下の通りである。
【００５４】
Ｐ１９：５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＴＣ    ３’（ＥｃｏＲI）
Ｐ２０：５’ＣＴＡＡＡＡＴＡＣＡ  ＣＴＴＡＡＣＣＴＣＧ  ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＴ  ＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴ  ＣＧＡＴＣＴＡＣ３’
Ｐ２１：５’ＧＴＡＧＡＴＣＧＡＡ  ＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡ  ＡＧＧＴＡＡＣＣＣＧ  ＡＧＧＴＴＡＡＧＴＧ  ＴＡＴＴＴＴＡＧ３’
Ｐ２２：５’ＣＡＴＡＴＴＴＣＴＧ  ＴＡＣＧＡＣＣＡＧＧ  ＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧ  ＣＧＡＡＧＧＣＴＣＣ  ＴＴＧＡＡＴＡＧ３’
Ｐ２３：５’ＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧ  ＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣ  ＴＣＴＣＴＧＧＣＣＣ  ＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡ  ＧＡＡＡＴＡＴＧ３’
Ｐ２４：５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧ    ３’  （ＨｉｎｄIII）
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を鋳型とし、それぞれプライマーＰ１９／Ｐ２０およびＰ２３／Ｐ２４で、ＰＣＲ増幅を行い、上流のホモロジーアームの断片７４０ｂｐおよび下流のホモロジーアームの断片９４０ｂｐを得、さらにプライマーＰ２１／Ｐ２２でＴ−ＥＰ５を鋳型としてＥＰ５断片４５０ｂｐを増幅し、さらにＰ１９／Ｐ２４をプライマーとし、以上で増幅された３つの断片の混合物を鋳型として増幅し、完全のホモロジーアームの断片を得、両末端にそれぞれＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲIの酵素切断部位が含まれる。ＰＣＲ反応終了後、増幅された産物を電気泳動によって回収し、カラム式ＤＮＡゲル回収キットによって必要な２１４０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、そして酵素切断して回収し、シャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢと連結させ、組み込みプラスミドを得た。当該プラスミドにカナマイシン耐性標識が含まれ、カナマイシン選別によってプラスミドがゲノムに組み込まれた組み換え体を得た。
【００５５】
組み込みプラスミドをＹＰＬ−１−００４（配列決定によって当該菌株の染色体に野生型のｌｙｓＣ遺伝子が残っていることが確認された）に電気的形質転換し、培養して生成した単一の集落に対してＰ２１／Ｐ２４プライマーでＰＣＲによる同定を行い、ＰＣＲで大きさ１４００ｂｐの断片を含有するものが増幅された菌株は陽性菌株で、断片が増幅されなかった菌株は元の菌である。陽性菌株はそれぞれカナマイシンを含有する培地およびカナマイシンを含有しない培地で培養し、カナマイシンを含有しない培地で生長するが、カナマイシンを含有する培地で生長しない菌株は、さらにＰ２１／Ｐ２４プライマーでＰＣＲ同定を行い、大きさ１４００ｂｐのバンドが増幅された菌は、ＥＰ５がｌｙｓＣ遺伝子の開始コドンの前に組み込まれた菌株で、ＹＰＬ−１−００５と名付けられた。
【００５６】
実施例７  ＥＰ５プロモーターによるｌｙｓＡ遺伝子の発現調節の構築実験
上記ＥＰ５の配列およびＮＣＢＩで公開されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列を参照してプライマーを設計し、ＥＰ５がｌｙｓＡ遺伝子の発現を駆動するように、ＥＰ５断片のｌｙｓＡ遺伝子の開始コドンＡＴＧの前への挿入に使用し、具体的なプライマーの設計は以下の通りである。
【００５７】
Ｐ２５：５’  ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＧＴＡＧＧＴＴＣＣＧＴＡＧＧ    ３’  （ＥｃｏＲI）
Ｐ２６：５’  ＣＴＡＡＡＡＴＡＣＡ  ＣＴＴＡＡＣＣＴＣＧ  ＧＧＴＴＡＣＧＧＧＧ  ＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡ  ＧＣＣＧＡＧＧ  ３’
Ｐ２７：５’  ＣＣＴＣＧＧＣＴＡＧ  ＡＡＴＴＴＣＴＣＣＣ  ＣＧＴＡＡＣＣＣＧＡ  ＧＧＴＴＡＡＧＴＧＴ  ＡＴＴＴＴＡＧ  ３’
Ｐ２８：５’  ＧＴＴＧＣＧＡＧＡＴ  ＣＡＧＣＴＧＧＴＧＴ  ＣＡＴＡＧＡＧＧＣＧ  ＡＡＧＧＣＴＣＣＴＴ  ＧＡＡＴＡＧ  ３’
Ｐ２９：５’  ＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧ  ＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣ  ＴＣＴＡＴＧＡＣＡＣ  ＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴ  ＣＧＣＡＡＣ  ３’
Ｐ３０：５’    ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＣＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＡＣＡＧ    ３’  （ＨｉｎｄIII）
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を鋳型とし、それぞれプライマーＰ２５／Ｐ２６およびＰ２９／Ｐ３０で、ＰＣＲ増幅を行い、上流のホモロジーアームの断片７５０ｂｐおよび下流のホモロジーアームの断片８５０ｂｐを得、さらにプライマーＰ２７／Ｐ２８でＴ−ＥＰ５を鋳型としてＥＰ５断片４５０ｂｐを増幅し、さらにＰ２５／Ｐ３０をプライマーとし、以上で増幅された３つの断片の混合物を鋳型として増幅し、完全のホモロジーアームの断片を得、両末端にそれぞれＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲIの酵素切断部位が含まれる。ＰＣＲ反応終了後、増幅された産物を電気泳動によって回収し、カラム式ＤＮＡゲル回収キットによって必要な２０５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、そして酵素切断して回収し、シャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢと連結させ、組み込みプラスミドを得た。当該プラスミドにカナマイシン耐性標識が含まれ、カナマイシン選別によってプラスミドがゲノムに組み込まれた組み換え体を得た。
【００５８】
組み込みプラスミドをＹＰＬ−１−００５（配列決定によって当該菌株の染色体に野生型のｌｙｓＡ遺伝子が残っていることが確認された）に電気的形質転換し、培養して生成した単一の集落に対してＰ２７／Ｐ３０プライマーでＰＣＲによる同定を行い、ＰＣＲで大きさ１３００ｂｐの断片を含有するものが増幅された菌株は陽性菌株で、断片が増幅されなかった菌株は元の菌である。陽性菌株はそれぞれカナマイシンを含有する培地およびカナマイシンを含有しない培地で培養し、カナマイシンを含有しない培地で生長するが、カナマイシンを含有する培地で生長しない菌株はさらにＰ２７／Ｐ３０プライマーでＰＣＲ同定を行い、大きさ１３００ｂｐのバンドが増幅された菌はＥＰ５がｌｙｓＡ遺伝子の開始コドンの前に組み込まれた菌株で、ＹＰＬ−１−００６と名付けられた。
【００５９】
実施例８  ＥＰ５プロモーターによるｇｎｄ遺伝子の発現調節の構築実験
上記ＥＰ５の配列およびＮＣＢＩで公開されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列を参照してプライマーを設計し、ＥＰ５がｇｎｄ遺伝子の発現を駆動するように、ＥＰ５断片のｇｎｄ遺伝子の開始コドンＡＴＧの前への挿入に使用し、具体的なプライマーの設計は以下の通りである。
【００６０】
Ｐ３１：５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴ  ＴＣＧＣＣＴＧＣＧＴＴＣＣＡＴＴＣＣ    ３’  （ＨｉｎｄIII）
Ｐ３２：  ５’ＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧ  ＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣ  ＴＣＴＡＴＧＣＣＧＴ  ＣＡＡＧＴＡＣＧＡＴ  ＣＡＡＴＡＡＣ  ３’
Ｐ３３：  ５’ＧＴＴＡＴＴＧＡＴＣ  ＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧ  ＧＣＡＴＡＧＡＧＧＣ  ＧＡＡＧＧＣＴＣＣＴ  ＴＧＡＡＴＡＧ３’
Ｐ３４：  ５’ＣＧＡＴＴＴＴＧＣＴ  ＧＡＣＡＣＣＧＧＧＣ  ＴＧＴＡＡＣＣＣＧＡ  ＧＧＴＴＡＡＧＴＧＴ  ＡＴＴＴＴＡＧ３’
Ｐ３５：  ５’ＣＴＡＡＡＡＴＡＣＡ  ＣＴＴＡＡＣＣＴＣＧ  ＧＧＴＴＡＣＡＧＣＣ  ＣＧＧＴＧＴＣＡＧＣ  ＡＡＡＡＴＣＧ３’
Ｐ３６：５’ＣＧＧＡＡＴＴＣ  ＴＧＣＧＣＴＧＧＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＧ    ３’  （ＥｃｏＲI）
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を鋳型とし、それぞれプライマーＰ３１／Ｐ３２およびＰ３５／Ｐ３６で、ＰＣＲ増幅を行い、上流のホモロジーアームの断片７２０ｂｐおよび下流のホモロジーアームの断片７００ｂｐを得、さらにプライマーＰ３３／Ｐ３４でＴ−ＥＰ５を鋳型としてＥＰ５断片４５０ｂｐを増幅し、さらにＰ３１／Ｐ３６をプライマーとし、以上で増幅された３つの断片の混合物を鋳型として増幅し、完全のホモロジーアームの断片を得、両末端にそれぞれＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲIの酵素切断部位が含まれる。ＰＣＲ反応終了後、増幅された産物を電気泳動によって回収し、カラム式ＤＮＡゲル回収キットによって必要な１８７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、そして酵素切断して回収し、シャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢと連結させ、組み込みプラスミドを得た。当該プラスミドにカナマイシン耐性標識が含まれ、カナマイシン選択によってプラスミドがゲノムに組み込まれた組み換え体を得た。
【００６１】
組み込みプラスミドをＹＰＬ−１−００６（配列決定によって当該菌株の染色体に野生型のｇｎｄ遺伝子が残っていることが確認された）に電気的形質転換し、培養して生成した単一の集落に対してＰ３３／Ｐ３６プライマーでＰＣＲによる同定を行い、ＰＣＲで大きさ１１５０ｂｐの断片を含有するものが増幅された菌株は陽性菌株で、断片が増幅されなかった菌株は元の菌である。陽性菌株はそれぞれカナマイシンを含有する培地およびカナマイシンを含有しない培地で培養し、カナマイシンを含有しない培地で生長するが、カナマイシンを含有する培地で生長しない菌株はさらにＰ３３／Ｐ３６プライマーでＰＣＲ同定を行い、大きさ１１５０ｂｐのバンドが増幅された菌はＥＰ５がｇｎｄ遺伝子の開始コドンの前に組み込まれた菌株で、ＹＰＬ−１−００７と名付けられた。
【００６２】
実施例９  リジン発酵実験
実施例１〜３および５〜８で構築された菌株および元の菌株をモデルＢＬＢＩＯ−５ＧＣ−４−Ｈの発酵タンク（上海百崙生物科技有限公司から購入）で表１に示す培地および表２に示す過程で発酵実験を行った。各菌株は３回繰り返し（ただし、ＹＰＬ−１−００３は６回測定した）、結果を表３に示す。
【００６３】
【表１】
2019526283.tif 000002
【００６４】
【表２】
2019526283.tif 000003
【００６５】
【表３】
2019526283.tif 000004
【００６６】
結果は表３に示すように、コリネバクテリウム菌においてＮＣｇｌ１７５１および／またはＮＣｇｌ００９７遺伝子の発現の下方調節は、いずれもＬ−リジンの生産量の向上に有利で、中でも、ＮＣｇｌ１７５１およびＮＣｇｌ００９７遺伝子の発現を同時に下方調節する場合、Ｌ−リジンの生産量が最も向上した。コリネバクテリウム菌において、ＥＰ５プロモーターを、発現量の向上がＬ−リジンの生産量に有利な遺伝子の前に構築してこれらの発現を調節することは、基本的にいずれもＬ−リジンの生産量の向上に有利で、かつＥＰ５プロモーターの構築が多いほど、Ｌ−リジンの生産量も基本的に増加し、相乗効果の存在が示された。
【００６７】
以上、本発明の具体的な実施形態を記述したが、当業者にとって、これらは例示の説明だけで、本発明の原理と実質に反しないという前提下において、これらの実施形態に対して様々な変更や修正をすることができる。そのため、本発明の保護範囲は添付の請求の範囲によって限定される。
【配列表】
2019526283000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月6日(2019.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−リジンを発酵生産する方法またはＬ−リジンの発酵量を向上させる方法であって、
（１）コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１およびＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を改造し、ＮＰ＿６０１０２９．１およびＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を低下させる工程、
（２）工程（１）で改造された細菌の染色体における一つまたは複数の遺伝子のプロモーターをＥＰ５プロモーターに変え、ここで、
前記遺伝子は、酵素活性および／または発現量の向上がＬ−リジンの生産量の向上に有利なタンパク質をコードし、
前記ＥＰ５プロモーターのポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままである工程、および、
（３）工程（２）で改造された細菌を使用してＬ−リジンを発酵生産する工程、を含む方法。
【請求項２】
Ｌ−リジンの発酵生産またはＬ−リジンの発酵量の向上における改造された細菌を使用する方法であって、前記改造は、コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を改造し、ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を低下させること、
および／または、コリネバクテリウム属の細菌の染色体における一つまたは複数の遺伝子のプロモーターをＥＰ５プロモーターに変えることで、ここで、
前記遺伝子は、酵素活性および／または発現量の向上がＬ−リジンの生産量の向上に有利なタンパク質をコードし、
前記ＥＰ５プロモーターのポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままであることである、方法。
【請求項３】
コリネバクテリウム属の細菌を改造する方法であって、コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子を改造し、ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量を低下させること、
および／または、コリネバクテリウム属の細菌の染色体における一つまたは複数の遺伝子のプロモーターをＥＰ５プロモーターに変えることを含み、ここで、
前記遺伝子は、酵素活性および／または発現量の向上がＬ−リジンの生産量の向上に有利なタンパク質をコードし、
前記ＥＰ５プロモーターのポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままであることである、方法。
【請求項４】
コリネバクテリウム属の細菌の染色体におけるＮＣＢＩ参照の配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子の改造は、前記遺伝子のヌクレオチド配列に対する１個または複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記１個または複数の遺伝子は、ｌｙｓＣ、ｌｙｓＡ、ｄｄｈおよび／またはｇｎｄである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属の細菌は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）またはコリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれかに記載の方法によって改造された細菌。
【請求項８】
ポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５で表されるもの、あるいは
（ｂ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列であって、（ａ）前記プロモーターのプロモーター活性が残り、かつその５１番目はＣのままで、その８８番目はＴのままである、
ＥＰ５プロモーター。
【請求項９】
請求項８に記載のプロモーターおよび前記プロモーターに操作可能に連結したコード配列を含む、発現カセットまたはベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現カセットまたはベクター、あるいは請求項９に記載の発現カセットまたはベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
たとえばコリネバクテリウム属の細菌におけるＬ−リジンの発酵生産またはＬ−リジンの発酵量の向上のための請求項８に記載のプロモーターの使用。
【請求項１２】
コリネバクテリウム属の細菌の発酵生産のＬ−リジンの生産に影響を与える遺伝子を選別する方法であって、
（１）コリネバクテリウム属の細菌の染色体における「仮想タンパク質」をコードする遺伝子を改造し、「仮想タンパク質」の活性および／または発現量を向上または低下させる工程、
（２）工程（１）で改造された細菌を使用してＬ−リジンを発酵生産する工程、および、
（３）工程（２）で得られたＬ−リジンの生産量を未改造のコリネバクテリウム属の細菌のＬ−リジンの生産量と比較する工程、
を含む方法。
【請求項１３】
前記影響はＬ−リジンの生産量を増強させ、かつ前記「仮想タンパク質」の活性および／または発現量を低下させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（１）において、ＮＰ＿６０１０２９．１およびＮＰ＿５９９３５０．１の活性および／または発現量をなくなるようにする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＮＣＢＩ参照の配列ＮＰ＿６０１０２９．１および／またはＮＰ＿５９９３５０．１をコードする遺伝子は、コリネバクテリウム属の細菌の前記染色体からノックアウトされたものである、請求項４に記載の方法。
【国際調査報告】
2019526283.tif 000005
2019526283.tif 000006
2019526283.tif 000007
2019526283.tif 000008
2019526283.tif 000009
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