(57)【要約】本発明はトリアデノウイルス免疫原性タンパク質、それから製造するワクチン及び当該ワクチンの製造方法、並びにその使用を提供する。また、本発明はワクチン組成物に関し、当該ワクチン組成物は免疫量のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質、或いは、免疫量のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子を組換えた生ベクター、及び製薬上許容されるベクターを含む。本発明は、免疫原性に優れ、トリを全面的に保護できて、臨床の場合、多種の遺伝子型トリアデノウイルスの感染を予防及び／又は治療できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリアデノウイルスに抵抗性を有するワクチン組成物であって、前記ワクチン組成物は免疫量のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質、或いは免疫量のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子を組換えた生ベクター、及び製薬上許容されるベクターを含む。
【請求項２】
前記トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で表されるヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質である請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の含有量がＡＧＰ力価＞１：２であり、好ましくは、前記トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の含有量がＡＧＰ力価１：２〜１：１６である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記製薬上許容されるベクターはアジュバントを含み、前記アジュバントは、（１）アルミニウムゲルアジュバント、サポニン、アブリジン、及びＤＤＡ、（２）油中水乳剤、水中油乳剤、及び水中油中水乳剤、あるいは（３）アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、マレイン酸無水物とアルケニル誘導体の共重合体、ＲＩＢＩアジュバントシステム、Ｂｌｏｃｋ  ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ、ＳＡＦ−Ｍ、モノホスホリルリピドＡ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、大腸菌易熱性エンテロトキシン、コレラ毒素、ＩＭＳ  １３１４、ムラミルジペプチド、及びＧｅｌアジュバントからの１種或いは複数種を含み、
好ましくは、サポニンがＱｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１、ＧＰＩ−０１００であり、
好ましくは、乳剤がＳＰＴ乳剤、ＭＦ５９乳剤であり、あるいは乳剤がオイルと乳化剤の組み合わせからなり、乳剤が、軽質流動パラフィン油、オレフィンがオリゴ重合したイソプレノイド油（例えばスクワラン又はスクアレンオイル、オレフィン、特にイソブテン或いはデセンがオリゴ重合したオイル）、酸或いはアルコールの直鎖アルキル含有エステル（特に植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールビス−（カプリル酸エステル／カプリン酸エステル）、グリセリントリ−（カプリル酸エステル／カプリン酸エステル）或いはプロピレングリコールビスオレイン酸エステル）、分岐鎖脂肪酸或いはアルコールのエステル（特にイソステアリン酸エステル）によるものであり、乳化剤は、ノニオン性界面活性剤（特にポリオキシエチレン化脂肪酸（例えばオレイン酸）のエステル、ソルビタンのエステル、ジアンヒドロマンニトールのエステル（例えば無水マンニトールオレイン酸エステル）、脂肪族グリコールのエステル、グリセリンのエステル、ポリグリセロールのエステル、プロピレングリコールのエステル及びオレイン酸のエステル、イソステアリン酸のエステル、リシノール酸のエステル或いはヒドロキシルステアリン酸のエステルであり、前記エステルはエトキシ化され、脂肪族アルコールとポリオール（例えばオレイルアルコール）のエーテル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体（特にＰｌｕｒｏｎｉｃ(R)、とりわけＬ１２１））であってもよく、
好ましくは、アクリル酸或いはメタクリル酸の重合体が架橋したアクリル酸或いはメタクリル酸重合体であり、特に糖類のポリアルケニルエーテル或いはポリアルコールと架橋した化合物であるカルボマーであり、好ましくはカーボポール974P、934P、971Pであり、
好ましくは、マレイン酸無水物とアルケニル誘導体の共重合体がマレイン酸無水物とエチレンの共重合体ＥＭＡであり、
好ましくは、前記アジュバントは油中水乳剤を製造するのに用いられるホワイトオイルアジュバントであり、
前記アジュバントの濃度範囲は５％〜７０％Ｖ／Ｖであり、好ましくは３０％〜７０％であり、より好ましくは６６％Ｖ／Ｖである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記ワクチン組成物は１種或いは多種の他の抗原を更に含み、前記他の抗原はトリニューカッスル病ウイルス抗原、トリインフルエンザウイルス抗原、鶏伝染性気管支炎ウイルス抗原、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原、産卵低下症候群ウイルス抗原、鳥レオウイルス抗原、大腸菌抗原、アビバクテリウム・パラガリナルム抗原、マイコプラズマ・シノビアエ抗原、マイコプラズマ・ガリセプチカム抗原、パスツレラ・ムルトシダス抗原、マレック病ウイルス抗原、鳥脳脊髄炎ウイルス抗原、及び鳥伝染性喉頭気管炎ウイルス抗原を含み、好ましくは、前記他の抗原はトリニューカッスル病ウイルス不活化抗原、トリインフルエンザウイルス不活化抗原、鶏伝染性気管支炎ウイルス不活化抗原、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原ＶＰ２タンパク質、又は産卵低下症候群ウイルス不活化抗原である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記トリニューカッスル病ウイルス抗原はＮ７ａ株不活化抗原であり、前記トリインフルエンザウイルス抗原はＳＺ株不活化抗原であり、前記鶏伝染性気管支炎ウイルス抗原はＭ４１株不活化抗原であり、前記トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原はＶＰ２タンパク質であり、前記産卵低下症候群ウイルス抗原はＡＶ−１２７株不活化抗原である、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：２〜１：１６であり、前記トリニューカッスル病ウイルス抗原の含有量は不活化前に１０８．０〜１０９．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、前記トリインフルエンザウイルスの含有量は不活化前に１０６．５〜１０８．５ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、前記鶏伝染性気管支炎ウイルスの含有量は不活化前に１０６．０〜１０７．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、前記トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原ＶＰ２タンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：１６〜１：１２８であり、前記産卵低下症候群ウイルス抗原の含有量は不活化前に１０７．０〜１０８．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、好ましくは、前記トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：２であり、前記トリニューカッスル病ウイルス抗原の含有量は不活化前に１０８．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、前記トリインフルエンザウイルスの含有量は不活化前に１０８．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、前記鶏伝染性気管支炎ウイルスの含有量は不活化前に１０６．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、前記トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原ＶＰ２タンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：１６であり、並びに、前記産卵低下症候群ウイルス抗原の含有量は不活化前に１０７．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌである、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記の製薬上許容されるベクターは、薬物、免疫刺激剤、酸化防止剤、界面活性剤、着色剤、揮発性オイル、緩衝剤、分散剤、推進剤、及び防腐剤を含み、前記免疫刺激剤は、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、及びインターロイキン２（ＩＬ２）を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物の製造方法であって、
前記トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子をクローニングする工程（１）と、前記工程（１）でクローニングしたＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子を形質転換・組換えして、Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質を組換えた大腸菌を獲得する工程（２）と、前記組換えトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を発現する工程（３）と、前記組換えトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を分離して精製し、ノニオン性界面活性剤を使用して前記精製した組換えトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を処理する工程（４）と、前記処理したトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原をアジュバントと混合して乳化する工程（５）と、を含むワクチン組成物の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物の、トリアデノウイルスに起因する感染を予防及び／又は治療する医薬品製造への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトリアデノウイルスに抵抗力を有するワクチン組成物及びその製造方法と使用に関し、バイオ医薬品分野に該当する。
【背景技術】
【０００２】
トリアデノウイルス（Ｆｏｗｌ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ＦＡＤＶ）感染症はＩ群トリアデノウイルス（ＦＡＤＶ）によって発症する伝染病である。ＦＡＤＶはアデノウイルス科（Ｆａｍｉｌｙ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）に属し、そのゲノム（ｇｅｍｏｎｅ）はセグメント化していない線状２本鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）ＤＮＡからなる。
トリアデノウイルスはエンベロープ無しの球状構造を有し、そのウイルス粒子は感染された細胞核に常に結晶格子として配列されており、各々のウイルス粒子は一つの３６ｋｂの線状２本鎖ＤＮＡを含み、線状２本鎖ＤＮＡとコアタンパク質より形成した直径６０〜６５ｎｍのコアがキャプソメアー内に包含される。キャプソメアーは２０面体対称であり、２５２個の直径８〜１０ｎｍのキャプソメアーからなる。キャプソメアーは三角形の面に配列しており、各辺には六つずつあり、その中では、２４０個が六量体であり（頂点キャプソメアー以外）、残りの１２個は五量体基礎となる（頂点キャプソメアー、Ｐｅｎｔｏｎタンパク）。各五量体基礎には２本の長さ９〜７７．５ｎｍの繊維突起（Ｆｉｂｅｒ−１タンパク質とＦｉｂｅｒ−２タンパク質）を結合している。
【０００３】
近年、トリアデノウイルスによる発病率は急増しており、特に３〜５週齢の肉鶏は非常に厳しく、深刻な場合、死亡率は８０％以上に急増することもある。
ワクチンによる免疫は当該疾病の予防に有効であるが、従来技術において、トリアデノウイルスの培養は困難で、高力価のウイルスを獲得しがたく、特に異なる分離株について差異が大きいことから、製造したワクチンは望ましい免疫効果を奏せずに、しかも全粒子ワクチンは完全に不活化されておらず生物学的安全性にも危険性があった。従来のサブユニットワクチンの抗原成分はウイルスキャプソメアーの主成分となる六量体（２４０／２５２）であるが、従来から、力価が低く、製品として開発されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、臨床の場で、当該疾病の流行を有効に防止できるよう、よりよい免疫効果を有するワクチン組成物が強く望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従来技術の問題点を解決するために、本発明はトリアデノウイルス免疫原性タンパク質、それから製造するワクチン及び当該ワクチンの製造方法並びにその使用を提供する。当該ワクチンはトリアデノウイルスの感染を効果的に予防及び／又は治療できる。
本発明は抗トリアデノウイルスのワクチン組成物に関し、その中で、上記のワクチン組成物は免疫量のトリアデノウイルス抗原及び製薬上許容されるベクターを含む。また、上記のトリアデノウイルス抗原は本発明に係るトリアデノウイルス免疫原性タンパク質のサブユニット抗原、或いは上記のトリアデノウイルス免疫原性タンパク質遺伝子を組換えた生ベクターを含む。
本発明は更にワクチン組成物に関し、上記のワクチン組成物は免疫量のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質或いは免疫量のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子を組換えた生ベクター、及び製薬上許容されるベクターを含む。
【０００６】
本発明は更に上記のワクチン組成物を製造する方法に関する。上記製造方法は、本発明に係るトリアデノウイルスタンパク質遺伝子をクローニングする工程（１）と、上記の工程（１）でクローニングしたタンパク質遺伝子を形質転換・組換えする工程（２）と、上記の組換えトリアデノウイルスタンパク質を発現する工程（３）と、上記の組換えトリアデノウイルスタンパク質を分離して精製し、ノニオン性界面活性剤を使用して上記の精製した組換えトリアデノウイルスタンパク質を処理する工程（４）と、上記のトリアデノウイルスタンパク質抗原とアジュバントとを割合で混合し、乳化する工程（５）とを含む。
【０００７】
本発明は、更に、本発明に係るワクチン組成物の、トリアデノウイルス感染を予防及び／又は治療する医薬品の製造への使用に関する。
本発明で選ばれるトリアデノウイルスタンパク質遺伝子を効率的に発現した後で、初めてトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を採用して製造したワクチン組成物は、トリアデノウイルスの感染を予防及び／又は治療できる。さらに、当該タンパク質を含むワクチン組成物により動物を免疫した後に、動物は速やかに抗体を生じ、現在流行しているトリアデノウイルスの単独或いは混合感染に対して優れた予防・制御効果をもたらすともに、バイオ安全性に優れる。本発明は初めてトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を採用してワクチン組成物を製造したものである。本発明は、その免疫原性に優れ、トリを全面的に保護でき、臨床の場合、多種の遺伝子型トリアデノウイルスの感染を予防及び／又は治療できる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態を説明する。
「トリアデノウイルス」（Ｆｏｗｌ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ＦＡＤＶ）という用語は、該ウイルスがアデノウイルス科に属し、そのゲノムがセグメント化していない線状２本鎖ＤＮＡからなることを意味し、引き起こされる臨床症状は、り患したトリが無気力で、スクワットしており、羽根がふわふわしており、コブと顔の皮膚が青白く、発育不全を含む。病理的変化として、急性気管炎と心嚢水症候群を特徴とする。
【０００９】
本発明はワクチン組成物に関し、前記ワクチン組成物は免疫量のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質或いは免疫量のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子を組換えた生ベクター、及び製薬上許容されるベクターを含む。
本発明のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子は、発現ベクター、生ベクター、核酸ワクチン、診断試薬の開発及びトリアデノウイルスを予防及び／又は治療する関係薬物の開発にも適用できる。
また、本発明は組換えベクターに関し、前記組換えベクターは本発明に係るヌクレオチド配列がコードするＦｉｂｅｒ−２タンパク質を発現できる。
本発明中、トリアデノウイルスキャプソメアー表面での含有量が極めて少ないＦｉｂｅｒ−２タンパク質は優れた免疫原性を有する。それから製造したサブユニット抗原またはその遺伝子を組換えた生ベクターは、いずれも免疫後に優れた力価を生じて、トリに対して１００％の保護を提供することを初めて発見した。
【００１０】
「生ベクター」とは、ある抗原又は抗原デターミナントの遺伝子を遺伝子工学的手法によって非病原性微生物に付与して発現させ、免疫原性を生じることである。ここで、非病原性微生物は、細菌とウイルスであってもよい。また、ウイルスの生ベクターにおいて、常にベクターとするウイルスは、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスを含み、細菌の生ベクターは弱毒化サルモネラ、Ｂ．Ｃ．Ｇ、弱毒化リステリア・モノサイトゲネス、弱毒化ビブリオコレラエ、弱毒化赤痢菌、乳酸菌、ラクトバチルス・スポロゲネス、ストレプトコッカス・ゴルドニを含む。
本発明のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子を組換えた生ベクターは、本分野でよく見られる生ベクターの形態であってもよく、例えば組換えニューカッスル病ウイルス、組換えポックスウイルス、組換えサルモネラの弱毒ワクチン株である。
【００１１】
本発明の生ベクターワクチン組成物は不活化ワクチンと生ワクチンの長所を兼備しているため、免疫効力として産卵禽を保護できることを確保できるとともに、その力価が強く、アジュバントを添加しなくてもよい。
本発明は形質転換体に関し、前記形質転換体は取り入れた本発明に係る組換えベクターを含有する。
本発明はトリアデノウイルスワクチン組成物に関し、その中で、上記のワクチン組成物は免疫量の本発明に係るトリアデノウイルス抗原及び製薬上許容されるベクターを含み、さらに、前記トリアデノウイルス抗原はサブユニット抗原を含む。
【００１２】
本発明で用いられる用語「ワクチン組成物」とは、トリアデノウイルス免疫原性を有する医薬組成物を意味し、当該医薬組成物は、トリのトリアデノウイルスのみに対する免疫反応を誘発・刺激・増加することができる。
「免疫量」という用語は、「免疫有効量」と理解すべきであり、免疫保護量或いは免疫応答を発生させるための有効量とも呼ばれる。さらに、受験者体内で免疫応答を効果的に誘発できる抗原量を意味し、予防又は病気の徴候や病状（健康影響に対する不利な影響または合併症を含む）の改善に十分な量である。上記の免疫応答は、診断または他の試験にも十分使用、或いは病気の徴候或いは病状（病原体に起因する感染による不利な健康結果または合併症を含む）の予防に適用できる可能性もある。体液性免疫力または細胞媒介免疫力、或いはその両方ともに誘導される。動物の免疫原性組成物への免疫応答は、例えば抗体の力価を測定すること、リンパ細胞の増殖を分析することよって間接的に評価でき、或いは、野生型毒株で攻撃した後に徴候或いは病状をモニタリングすることで直接評価できる。そのワクチンから提供される保護性免疫力は、例えば被験者の臨床徴候、例えば死亡率や発病率の低下、温度値、被験者の全体生理状況及び全体健康と表現によって評価できる。上記の免疫応答は細胞誘導性及び／又は体液性免疫力を含むが、それに限定されない。
【００１３】
「トリアデノウイルス抗原」と言う用語は、少なくとも１種のトリアデノウイルス抗原形態を含むあらゆる組成物を意味する。前記トリアデノウイルス抗原はトリアデノウイルス感染による免疫応答を誘発して刺激又は抵抗することができる。また、上記の抗原形態は、消滅、弱毒化抗原或いはサブユニット抗原を含むが、それに限定されない。
本発明の一実施態様として、上記のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１によってコードされるタンパク質である。
本発明の一実施態様として、上記のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２によってコードされるタンパク質である。
本発明の一実施態様として、上記のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の含有量は、ＡＧＰ力価＞１：２である。
本発明の一好ましい実施態様として、上記のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の含有量は、ＡＧＰ力価１：２〜１：１６である。
【００１４】
また、「製薬上許容されるベクター」という用語は、本発明のワクチン組成物においてトリアデノウイルス抗原以外の全ての成分であり、機体を刺激せずに、化合物を使用するときのバイオ活性と特性を妨害しないベクター又は希釈剤を意味し、好ましくはアジュバントである。
「アジュバント」という用語は、アルミニウムゲルアジュバント、サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）、例えばＱｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＡＬ）、油中水乳剤、水中油乳剤、水中油中水乳剤、アクリル酸或いはメタクリル酸の重合体、マレイン酸無水物とアルケニル（ａｌｋｅｎｙｌ）誘導体の共重合体から選ぶ化合物を含んでもよい。
【００１５】
「乳剤」と言う用語は、特に、軽質流動パラフィン油（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅａ類型）、オレフィンがオリゴ重合したイソプレノイドオイル（ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  ｏｉｌ）、例えばスクワラン（ｓｑｕａｌａｎｅ）又はスクアレンオイル（ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｏｉｌ）、特にイソブテン或いはデセン、酸或いはアルコールの直鎖アルキルを有するエステル、特に植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールビス−（カプリル酸エステル／カプリン酸エステル）、グリセリントリ−（カプリル酸エステル／カプリン酸エステル）或いはプロピレングリコールビスオレイン酸エステル、分岐鎖脂肪酸或いはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルであってもよい。オイルと乳化剤を組み合わせて使用して乳剤を形成する。
【００１６】
乳化剤は、好ましくノニオン性界面活性剤、特にソルビタンのエステル、ジアンヒドロマンニトール（ｍａｎｎｉｄｅ）のエステル（例えば無水マンニトールオレイン酸エステル）、脂肪族グリコール（ｇｌｙｃｏｌ）のエステル、ポリグリセロール（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ）のエステル、プロピレングリコールのエステル及びオレイン酸のエステル、イソステアリン酸のエステル、リシノール酸のエステル或いはヒドロキシルステアリン酸のエステルであり、それらはエトキシ化してもよく、また、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体、特にＰｌｕｒｏｎｉｃ製品、とりわけＬ１２１が挙げられる。
Ｈｕｎｔｅｒ等が編集した「Ｔｈｅ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ」（Ｅｄ．ｂｙ  ＤＥＳ  Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５：５１−９４）とＴｏｄｄ等が編集した「Ｖａｃｃｉｎｅ」（１９９７、１５：５６４−５７０）を参照。例えば、Ｐｏｗｅｌｌ  ＭとＮｅｗｍａｎ  Ｍが編集した「Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ、ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｉｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５）第１４７頁に記載しているＳＰＴ乳剤及び第１８３頁に記載しているＭＦ５９乳剤を使用できる。
【００１７】
「アクリル酸或いはメタクリル酸の重合体」と言う用語は、好ましく架橋したアクリル酸或いはメタクリル酸重合体を意味し、特に糖類（ｓｕｇａｒ）のポリアルケニルエーテル或いはポリアルコールと架橋している。それらの化合物はカルボマー（Ｃａｒｂｏｍｅｒ、商品名Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（Ｐｈａｍｅｕｒｏｐａ，１９９６，８（２））と呼ばれることが既知である。当業者は米国特許ＵＳ２９０９４６２を参照することができ、このようなアクリル酸重合体がポリヒドロキシル化した化合物と架橋し、上記の化合物が少なくとも三つ、好ましくは八つ未満のヒドロキシル基を有し、その中では、少なくとも三つのヒドロキシル基の水素原子が少なくとも二つの炭素原子を有する不飽和脂肪族炭化水素基（ａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｒａｄｉｃａｌ）によって置換されていることを記載している。
【００１８】
好ましい基は２〜４個の炭素原子を有する基であり、例えばビニル、アリルと他のエチレン性不飽和基（ｅｔｈｙｌｅｎｉｃａｌｌｙ  ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｇｒｏｕｐ）である。上記の不飽和基そのものは他の置換基、例えばメチルを有してもよい。これらの製品はカーボポールとして販売され、（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）が特に望ましい。それらはアリルショ糖或いはアリルペンタエリトリトール（ａｌｌｙｌ  ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）と架橋する。ここで、カーボポール９７４Ｐ、９３４Ｐ、９７１Ｐが挙げられるが、最も好ましくは、カーボポール９７１Ｐを用いる。
【００１９】
「マレイン酸無水物とアルケニル誘導体の共重合体」と言う用語は、マレイン酸無水物とエチレンの共重合体ＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）を意味し、これらの重合体は水において溶解して酸性溶液をなす。また、中和して、好ましく生理ｐＨまで中和することにより、アジュバント溶液をなし、それに免疫原性、免疫誘導性或いはワクチン性組成物そのものを添加できる。
【００２０】
「アジュバント」という用語は、更にＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｂｌｏｃｋ  ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ  ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、大腸菌易熱性エンテロトキシン（組換えまたはその他）、コレラ毒素、ＩＭＳ  １３１４、ムラミルジペプチド、Ｇｅｌアジュバント等を含むが、それらに限定されない。好ましくは、前記アジュバントは、アルミニウムゲルアジュバント、サポニン、油中水乳剤、水中油乳剤、水中油中水乳剤、アクリル酸或いはメタクリル酸の重合体、マレイン酸無水物とアルケニル（ａｌｋｅｎｙｌ）誘導体の共重合体、ＲＩＢＩアジュバントシステム、Ｂｌｏｃｋ  ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ、ＳＡＦ−Ｍ、モノホスホリルリピドＡ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、大腸菌易熱性エンテロトキシン、コレラ毒素、ＩＭＳ  １３１４、ムラミルジペプチド、Ｇｅｌアジュバントからの１種或いは複数種である。
【００２１】
本発明の一実施態様として、上記の製薬上許容されるベクターはアジュバントを含み、前記アジュバントは、（１）アルミニウムゲルアジュバント、サポニン、アブリジン、ＤＤＡ、（２）油中水乳剤、水中油乳剤、水中油中水乳剤、あるいは（３）アクリル酸或いはメタクリル酸の重合体、マレイン酸無水物とアルケニル誘導体の共重合体、及びＲＩＢＩアジュバントシステム、Ｂｌｏｃｋ  ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ、ＳＡＦ−Ｍ、モノホスホリルリピドＡ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、大腸菌易熱性エンテロトキシン、コレラ毒素、ＩＭＳ  １３１４、ムラミルジペプチド、Ｇｅｌアジュバントからの１種或いは複数種である。
【００２２】
好ましくは、サポニンは、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１、ＧＰＩ−０１００である。
好ましくは、乳剤は、ＳＰＴ乳剤、ＭＦ５９乳剤であり、あるいは乳剤はオイルと乳化剤の組み合わせからなる。また、乳剤は、軽質流動パラフィン油、オレフィンがオリゴ重合したイソプレノイドオイル（例えばスクワラン又はスクアレンオイル、オレフィン、特にイソブテン或いはデセンがオリゴ重合したオイル）、酸或いはアルコールの直鎖アルキルを有するエステル（特に植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールビス−（カプリル酸エステル／カプリン酸エステル）、グリセリントリ−（カプリル酸エステル／カプリン酸エステル）或いはプロピレングリコールビスオレイン酸エステル）、分岐鎖脂肪酸或いはアルコールのエステル（特にイソステアリン酸エステル）によるものであってもよい。
【００２３】
乳化剤は、ノニオン性界面活性剤（特にポリオキシエチレン化脂肪酸（例えばオレイン酸）のエステル、ソルビタンのエステル、ジアンヒドロマンニトールのエステル（例えば無水マンニトールオレイン酸エステル）、脂肪族グリコールのエステル、グリセリンのエステル、ポリグリセロールのエステル、プロピレングリコールのエステル及びオレイン酸のエステル、イソステアリン酸のエステル、リシノール酸のエステル或いはヒドロキシルステアリン酸のエステルである。上記のエステルはエトキシ化したもの、脂肪族アルコールとポリオール（例えばオレイルアルコール）のエーテル、また、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体（特にＰｌｕｒｏｎｉｃ(R)、とりわけＬ１２１））であってもよい。
【００２４】
好ましくは、アクリル酸或いはメタクリル酸の重合体が架橋したアクリル酸或いはメタクリル酸重合体であり、特に糖類のポリアルケニルエーテル或いはポリアルコールと架橋した化合物であるカルボマーであり、好ましくはカーボポール９７４Ｐ、９３４Ｐ、９７１Ｐである。
好ましくは、マレイン酸無水物とアルケニル誘導体の共重合体は、マレイン酸無水物とエチレンの共重合体ＥＭＡである。
好ましくは、上記のアジュバントは、油中水乳剤を製造するのに用いられるホワイトオイルアジュバントである。
上記のアジュバントの濃度範囲は、５％〜７０％Ｖ／Ｖであり、好ましくは３０％〜７０％であり、より好ましくは６６％Ｖ／Ｖである。
【００２５】
本発明は更にワクチン組成物に関し、前記ワクチン組成物は免疫量の本発明に係るＦｉｂｅｒ−２タンパク質或いはその機能性変異体及び製薬上許容されるベクターを含む。
本発明の一実施態様として、本発明に係るワクチン組成物は、免疫量の本発明に係るＦｉｂｅｒ−２タンパク質と製薬上許容されるベクターを含み、そのＦｉｂｅｒ−２タンパク質が実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明の一実施態様として、本発明に係るワクチン組成物は、免疫量の本発明に係るＦｉｂｅｒ−２タンパク質と製薬上許容されるベクターを含み、そのＦｉｂｅｒ−２タンパク質が実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２６】
本発明のＦｉｂｅｒ−２タンパク質は、本分野の既知のあらゆる方法によって製造され、例えばＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子を組換えて発現し、Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質を製造でき、発現システムとして既知のあらゆる発現システム、例えば真核細胞発現システム、原核細胞発現システムを使用できる。或いはＦｉｂｅｒ−２タンパク質配列を直接合成する。
本発明の一実施態様としては、本発明に係るワクチン組成物はＡＧＰ力価＞１：２のＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原またはその機能性変異体を含む。
本発明の一実施態様としては、本発明に係るワクチン組成物はＡＧＰ力価＞１：２のＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原を含み、それは実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明の一実施態様としては、本発明に係るワクチン組成物はＡＧＰ力価＞１：２のＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原を含み、それは実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２７】
本発明の一実施態様としては、本発明に係るワクチン組成物はＡＧＰ力価１：２〜１：１６のＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原またはその機能性変異体を含む。
本発明の一実施態様としては、本発明に係るワクチン組成物はＡＧＰ力価１：２〜１：１６のＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原を含み、それは実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明の一実施態様としては、本発明に係るワクチン組成物はＡＧＰ力価１：２〜１：１６のＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原を含み、それは実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明の一実施態様としては、本発明に係るワクチン組成物はＡＧＰ力価１：４のＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原またはその機能性変異体を含む。
本発明の一実施態様としては、本発明に係るワクチン組成物はＡＧＰ力価１：４のＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原を含み、それは実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明の一実施態様としては、本発明に係るワクチン組成物はＡＧＰ力価１：４のＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原を含み、それは実質上配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２８】
本発明の一実施態様としては、上記のワクチン組成物は１種或いは多種の他の抗原を更に含み、上記の他の抗原はトリニューカッスル病ウイルス抗原、トリインフルエンザウイルス抗原、鶏伝染性気管支炎ウイルス抗原、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原、産卵低下症候群ウイルス抗原、鳥レオウイルス抗原、大腸菌抗原、アビバクテリウム・パラガリナルム抗原、マイコプラズマ・シノビアエ抗原、マイコプラズマ・ガリセプチカム抗原、パスツレラ・ムルトシダス抗原、マレック病ウイルス抗原、鳥脳脊髄炎ウイルス抗原、鳥伝染性喉頭気管炎ウイルス抗原を含む。
本発明の一好ましい実施態様としては、上記のワクチン組成物は更に１種或いは多種の他の抗原を含み、上記の他の抗原はトリニューカッスル病ウイルス不活化抗原、トリインフルエンザウイルス不活化抗原、鶏伝染性気管支炎ウイルス不活化抗原、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原ＶＰ２タンパク質、産卵低下症候群ウイルス不活化抗原である。
【００２９】
本発明の一好ましい実施態様としては、上記のトリニューカッスル病ウイルス抗原がＮ７ａ株不活化抗原であり、トリインフルエンザウイルス抗原がＳＺ株不活化抗原であり、鶏伝染性気管支炎ウイルス抗原がＭ４１株不活化抗原であり、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原がＶＰ２タンパク質であり、産卵低下症候群ウイルス抗原がＡＶ−１２７株不活化抗原である。
本発明の一実施態様としては、上記のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の含有量がＡＧＰ力価１：２〜１：１６であり、上記のトリニューカッスル病ウイルス抗原の含有量が不活化前１０８．０〜１０９．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、上記のトリインフルエンザウイルスの含有量が不活化前１０６．５〜１０８．５ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、上記の鶏伝染性気管支炎ウイルスの含有量が不活化前１０６．０〜１０７．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、上記のトリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原ＶＰ２タンパク質の含有量がＡＧＰ力価１：１６〜１：１２８であり、上記の産卵低下症候群ウイルス抗原の含有量が不活化前１０７．０〜１０８．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌである。
【００３０】
本発明の一好ましい実施態様としては、上記のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の含有量がＡＧＰ力価１：２〜１：１６であり、上記のトリニューカッスル病ウイルス抗原の含有量が不活化前１０８．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、上記のトリインフルエンザウイルスの含有量が不活化前１０８．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、上記の鶏伝染性気管支炎ウイルスの含有量が不活化前１０６．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、上記のトリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原ＶＰ２タンパク質含有量がＡＧＰ力価１：１６であり、上記の産卵低下症候群ウイルス抗原の含有量が不活化前１０７．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌである。
本発明の一実施態様としては、上記の製薬上許容されるベクターは、薬物、免疫刺激剤、酸化防止剤、界面活性剤、着色剤、揮発性オイル、緩衝剤、分散剤、推進剤、防腐剤を含み、上記の免疫刺激剤は、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ２）を含む。
本発明のワクチン組成物は更に他の病原体或いは抗原を含有して併用することで、トリアデノウイルスによる感染をはじめる各種類の疾病を抵抗する混合ワクチン或いは複合ワクチンを製造する。
【００３１】
本発明における「混合ワクチン」という用語は、本発明のトリアデノウイルスと少なくとも１種の異種ウイルスとのウイルス混合物から製造したワクチンを意味する。本発明の「複合ワクチン」という用語は、本発明のトリアデノウイルスと細菌から製造したワクチンである。例えば、本発明のトリアデノウイルスは、トリニューカッスル病ウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルス、トリインフルエンザウイルス、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、鳥レオウイルス及び／又は大腸菌、アビバクテリウム・パラガリナルム、マイコプラズマ・シノビアエ、マイコプラズマ・ガリセプチカムと混合しまたは組み合わせることができる。
【００３２】
本発明のワクチン組成物は更に他の試薬を本発明の組成物に加入しても良い。
本発明の一実施態様としては、本発明に係るワクチン組成物において、上記のワクチン組成物は、更に、薬物、免疫刺激剤、酸化防止剤、界面活性剤、着色剤、揮発性オイル、緩衝剤、分散剤、推進剤、防腐剤を含む。
好ましくは、免疫刺激剤はα−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ２）を含む。
【００３３】
このような組成物を製造するために、本分野の公知の方法を使用できる。
本発明は更に上記のワクチン組成物を製造する方法に関する。前記方法は、上記のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子をクローニングする工程（１）と、上記の工程（１）でクローニングしたＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子を形質転換・組換えして、Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質を組換えた大腸菌を獲得する工程（２）と、上記の組換えトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を発現する工程（３）と、上記の組換えトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を分離して精製し、ノニオン性界面活性剤を使用して上記の精製した組換えトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を処理する工程（４）と、処理したトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原をアジュバントと混合して乳化する工程（５）とを含む。
本発明は、更に、前記ワクチン組成物の、トリアデノウイルス感染を予防及び／又は治療する医薬品の製造への使用に関する。
本発明に係るトリアデノウイルス感染を予防及び／又は治療する医薬品の製造の付与対象は鶏を含む。
【００３４】
「予防及び／又は治療」と言う用語は、トリアデノウイルス感染に関わる場合、トリアデノウイルスの複製を抑制し、トリアデノウイルスの伝播を抑制し、或いはトリアデノウイルスの宿主体内での定住を防止するとともに、トリアデノウイルス感染の疾病或いは病症の病状を減軽することを意味する。ウイルスの担持量が減少し、病状が減軽し、及び／又は、摂食量及び／又は成長が増加した場合、上記の治療が治療効果を実現したと考える。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の利点と特徴がより明らかになるように、具体的な実施例を参照して、本発明を更に説明する。ただし、それらの実施例は例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。当業者は、本発明の主旨と範囲から逸脱しない限り、本発明の技術方案の詳細や態様に対して修正又は変更を加えられるが、それらの修正と変更はいずれも本発明の保護範囲に入るものと理解すべきである。
本発明の実施例で用いられる化学試薬は何れも分析純度であり、国薬集団から購入した。
本発明をより明らかにするために、以下、具体的の実施例を参照して、本発明を更に説明する。なお、本発明に係る実験方法は、特別な説明がない限り、何れも通常の方法であり、下記のバイオ材料は、特別な説明がない限り、いずれも市販品である。          
【実施例１】
【００３６】
（ｐＥＴ２８ａ＿ＦＡＤＶ＿Ｆｉｂｅｒ−２発現ベクターの構築）
１、ＦＡＤＶウイルスＤＮＡの抽出
プラスミド抽出キットは天根生物より購入し、Ｔ４  ＤＮＡ  ＬｉｇａｓｅはＢｉｏＬａｂより購入し、ｐＥＴ２８ａプラスミドはＮｏｖａｇｅｎより購入し、アガロースゲル回収キットは天澤生物より購入した。また、他の試薬は何れも分析純度のものを用いた。
ウイルスＤＮＡ抽出キットの明細書に従い、０．２ｍｌ  トリアデノウイルス感染ＦＡＶ−ＨＮ株（トリアデノウイルス，ＦＡＶ−ＨＮ株（Ｆｏｗｌ  ａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ  ＦＡＶ−ＨＮ）、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ２０１６０９であり、寄託期間は中国典型培養物センタであり、寄託場所は中国武漢?武漢大学であり、寄託日は２０１６年２月２９日である）を取出した。トリのレバー懸濁液を無菌１．５ｍｌ遠心管に置いて、０．４ｍｌ  ＶＢを試料液に加えて渦流混合し、室温で１０分間放置した。０．４５ｍｌ  ＡＤ  ｂｕｆｆｅｒを試料液に加え入れ、強力に混合した。ＶＢカラムを２ｍｌ収集管に入れ、０．６ｍｌ混合液を取ってＶＢカラムに加え、１４０００ｇで１分間遠心分離し、残りの混合液をＶＢカラムに加えて、１４０００ｇで１分間遠心分離した。前記２ｍｌ収集管を廃棄し、ＶＢカラムを新しい２ｍｌ収集管に置いて、０．４ｍｌ  Ｗ１  ｂｕｆｆｅｒを加えて、１４０００ｇで３０秒間遠心分離し、０．６ｍｌ  Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒをＶＢカラムに加え、１４０００ｇで３０秒間遠心分離した。続いて、空白遠心分離を３分間行い、５０ｕｌ  ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを加えてフィルム中央に置き、３分間放置した。さらに、１４０００ｇで１分間遠心分離して、ＤＮＡゲノムを含む遠心分離した液体を得た。
【００３７】
２、Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子の増幅
Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子５’と３’末端の保存配列によりオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ＰＣＲを行った。プライマー配列を表１に示す。
【表１】
2019509260.tif 000002
ＰＣＲ生成物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社で配列決定を行い、配列決定の結果により、Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子に対してコドン最適化を行った。最適化したＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子配列は配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で示される。
【００３８】
３、発現ベクターの構築
最適化したＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子は、蘇州金唯智生物科技有限公司で全配列合成を行い、それぞれｐＥＴ２８ａプラスミドに接続した。接続したプラスミドにより大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、モノクローナルを選別して１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培養基において一晩培養し、プラスミドを抽出した後に、配列決定分析を行った。陽性クローンは、ｐＥＴ２８ａ＿ＦＡＤＶ＿Ｆｉｂｅｒ−２発現菌株であった。
【実施例２】
【００３９】
（Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質の製造）
実施例１で製造したｐＥＴ２８ａ＿ＦＡＤＶ＿Ｆｉｂｅｒ−２／Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を含む菌株を、５０−１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培養基に、接種量を１％（Ｖ／Ｖ）として接種し、３７℃で振動培養した。ＯＤ６００値＝０．４−０．６において、２８℃で３０分間放置した。最終濃度が０．１−１．０ｍＭとなるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え、２８℃で２４時間振動培養した。培養が完了した後、菌体を収集して、ＰＢＳ（塩化ナトリウム８ｇ、塩化カリウム０．２ｇ、リン酸水素二ナトリウム１．４４ｇ、リン酸二水素カリウム０．２４ｇを含み、ｐＨ７．４に調節し、１Ｌとした）により菌体を再び懸濁し、超音波により粉砕し、遠心分離して上澄みを取った。発現生成物に含まれる可溶性目的タンパク質の含有量は、さらに多くなって、Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質のＡＧＰ力価が１：６４に達した。また、エンドトキシンの含有量が０．４８×１０５ＥＵ／ｍｌであった。
【実施例３】
【００４０】
（大腸菌発現Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質エンドトキシンの除去）
１．５ｍｌ遠心管に０．５ｍｌの処理すべき溶液と最終濃度が１％（ｖ／ｖ）であるトリトンＸ−１１４（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４）（５μｌ）を加え、渦流振動した。試料を氷中に５分間放置した。渦流振動して試料を冷却した後、直ちに遠心管を３７℃の水浴において５分間温浴し、新しく二相を生じさせた。次に、試料を３７℃で６０秒遠心分離した。遠心分離した後、目的タンパク質は上層にあり、一方、エンドトキシンを含む洗浄剤は油状滴として遠心管の底部に残した。この操作全体を三回繰り返した。測定した結果、Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質のＡＧＰ力価は１：６４となり、エンドトキシンの含有量は０．００８×１０５ＥＵ／ｍｌであった。
以上の結果から、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４は、組換えタンパク質に残留しているエンドトキシンを除去する一方で、Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質の免疫原性には影響しないことが判明した。
【実施例４】
【００４１】
（トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質サブユニットワクチンの製造）
実施例３の方法に従い精製したＦｉｂｅｒ−２タンパク質を、ホワイトオイルアジュバントにゆっくりと加えると同時に、モータを起動し、１７５００ｒ／ｍｉｎで５分間攪拌した。攪拌終了前に、１％チメロサール溶液を加え、最終濃度を０．０１％とした。
具体的な配合比を表２に示す。
【表２】
2019509260.tif 000003
【実施例５】
【００４２】
（トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質サブユニットワクチンの安全性試験）
２１日齢のＳＰＦ鶏６０羽を１群１５羽で群分けした。第１群〜第３群では、それぞれ実施例４で製造したワクチン１〜ワクチン３を頚部皮下に注射して免疫し、免疫剤量は０．６ｍｌであった。また、第４群では０．６ｍｌ生理食塩水を皮下注射して、ブランク対照とした。全て同じ条件で飼育し、免疫後第３週から臨床症状、加重率、死亡率を三週間観察し、３週、４週、５週にそれぞれ５羽解剖し、接種箇所に肉眼で識別できる病変があるか否かを観察した。
これらの結果（表３、表４）によれば、ワクチン１〜ワクチン３接種群では、臨床症状と死亡は確認されず、また、接種群と対照群の加重率には明らかな差異がなく、肉芽腫の形成も確認されなかった。このことから、本発明で製造したトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質サブユニットワクチンを鶏の免疫に用いることは、安全であることが判明した。
【００４３】
【表３】
2019509260.tif 000004
【表４】
2019509260.tif 000005
【実施例６】
【００４４】
（トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質サブユニットワクチンの免疫原性試験）
２１日齢のＳＰＦ鶏４０羽を１０羽／群で４群に群分けした。第５群〜第７群では、それぞれ実施例４で製造したワクチン１〜ワクチン３を頚部皮下に注射して免疫し、免疫剤量を０．３ｍｌとした。また、第８群では０．３ｍｌ生理食塩水を皮下注射して、ブランク対照とした。全ての試験鶏はいずれも隔離されて飼育し、免疫後２１日目に、ＦＡＶ−ＨＮ株ウイルス液を筋肉注射して感染させ、１４日観察して、発病、死亡及び保護数を記録した。結果を表５に示す。
【００４５】
【表５】
2019509260.tif 000006
この結果により、第８群の対照群では、いずれも発病して死亡したが、第５群〜第７群の免疫群では、免疫した鶏に対してより良い免疫保護効果が得られ、免疫効果が優れていた。ＡＧＰ力価が１：２以上であるトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質サブユニットワクチンであれば、鶏群に有効な免疫保護が与えられることが判明した。
【実施例７】
【００４６】
（トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質サブユニットワクチンの干渉効果試験）
２１日齢のＳＰＦ鶏１００羽を１０羽／群で１０群に群分けした。第９群〜第１３群では、それぞれ実施例４で製造したワクチン１を頚部皮下に注射して免疫し、免疫剤量を０．３ｍｌとした。また、第１４群〜第１８群では０．３ｍｌ生理食塩水を皮下注射して、ブランク対照とした。全ての試験鶏はいずれも隔離して飼育し、免疫後２１日目に、異種血清型（血清型２、３、５、８、１１）ウイルス液をそれぞれ筋肉注射して感染させた。１４日間観察して、発病、死亡及び保護数を記録した。結果を表６に示す。
【００４７】
【表６】
2019509260.tif 000007
上記結果により、第１４群〜第１８群の対照群では、異なる程度で発病して死亡した。他方、第９群〜第１３群の免疫群では、免疫した鶏に対してより良い免疫保護効果が得られ、免疫効果に優れた。ＡＧＰ力価が１：２以上であるトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質サブユニットワクチンであれば、異種血清型アデノウイルスにより感染させた鶏群に、有効な免疫保護を与えることが判明した。
【実施例８】
【００４８】
（トリニューカッスル病抗原の製造）
ニューカッスル病ウイルス株（遺伝子ＶＩＩ型）、Ｎ７ａ株（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｖｉｒｕｓ（ｇｅｎｏｔｙｐｅＶＩＩ）、ｓｔｒａｉｎ  Ｎ７ａ）（中国典型培養物寄託センタに寄託され、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｖ２０１５４５であり、寄託日が２０１５年１０月１９日であり、寄託場所は中国武漢・武漢大学である）を取出し、滅菌生理食塩水により適切に希釈し（１０−４或いは１０−５）、１０〜１１日齢感受性鶏胚に０．１ｍｌ／胚で接種した。接種後、３７℃で引き続き孵化した。接種後４８〜１２０時間の間に死亡した鶏胚と生存している鶏胚を選択して、尿膜液を採取した。ウイルス含有量を測定したところ、１０８．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであった。次に。最終濃度０．１％のホルムアルデヒド溶液（ｖ／ｖ）を加え、３７℃で不活化させ、４〜６時間毎に一回攪拌し、１６時間不活化した。完全に不活化した後に、抗原として使用した。
【実施例９】
【００４９】
（トリインフルエンザ抗原の製造）
Ｈ９亜型トリインフルエンザウイルスＳＺ株（中国特許出願番号第ＣＮ１０３７８９２７２Ａ号に開示）毒株を取出し、無菌生理食塩水で１０−３に希釈した（ウイルス液０．１ｍｌを取って０．９ｍｌ無菌生理食塩水に加え、振動して均一に混合した後、この順に更に二回希釈した）。続いて、１０日齢感受性鶏胚（北京梅里亜維通実験動物技術有限公司より購入したＳＰＦ種卵を使用して自己孵化したもの）に０．１ｍｌ／胚（１０５ＥＩＤ５０含有）で尿膜腔接種した。接種後針穴を密封し、３６〜３７℃で引き続いて孵育した。このとき、卵の反転は不要だった。９６時間後に取り出し、気室を上向きして、２〜８℃で１２〜２４時間冷却した。冷却した鶏胚から胚液を採取した。ウイルス含有量を測定したところ、１０８．５ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであった。次に、最終濃度０．１％のホルムアルデヒド溶液（ｖ／ｖ）を加えて３７℃で不活化させ、４〜６時間毎に一回攪拌し、２４時間不活化した。完全に不活化した後に、抗原として使用した。
【実施例１０】
【００５０】
（鶏伝染性気管支炎抗原の製造）
鶏伝染性気管支炎ウイルスＭ４１株（中国獣医薬品監察所より購入）を取出し、滅菌生理食塩水で適切に希釈し（１０−２或いは１０−３）、１０〜１１日齢感受性鶏胚に０．１ｍｌ／胚で接種し、接種後３６〜３７℃で引き続いて孵育した。接種後２４〜４８時間の間に死亡した鶏胚と生存している鶏胚を選択して、尿膜液を採取した。ウイルス含有量を測定したところ、１０６．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであった。次に、最終濃度０．１％のホルムアルデヒド溶液（ｖ／ｖ）を加えて３７℃で不活化させる間、４〜６時間毎に一回攪拌し、１６時間不活化した。こうして、完全に不活化した後で、抗原として使用した。
【実施例１１】
【００５１】
（ファブリキウス嚢抗原の製造）
１、ＶＰ２  ｃＤＮＡの製造
ウイルスＲＮＡ抽出キットに従い操作し、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルススーパーウイルス成都株を、感染したＳＰＦ鶏ファブリキウス嚢からＩＢＤＶウイルスＲＮＡを抽出して、ランダムプライマーで逆転写した。ＶＰ２遺伝子５’末端と３’末端の保存配列によりオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、合成したオリゴヌクレオチドプライマーの配列を表７に示し、また、ＰＣＲ増幅を行い、アガロースゲル回収キットにより回収し、−２０℃で保存した。
【表７】
2019509260.tif 000008
【００５２】
２、ｐＣｏｌｄＩＩＩ＿ＶＰ２／Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株の構築
上記で製造したＶＰ２  ｃＤＮＡを取り、二重消化（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）し、且つ酵素消化した断片をｐＣｏｌｄＩＩＩベクターに接続した。接続した生成物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に直接形質転換し、かつ１００μｇアンピシリンＬＢを含有する固形培養基に塗布して一晩培養した。こうして成長させたコロニーがｐＣｏｌｄＩＩＩ＿ＶＰ２／Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株となった。
３、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＶＰ２タンパク質の製造
培養タンクで好気培養し、容積の７０％まで培養基及びピーナツ油消泡剤を加えた。滅菌後、培養基量の２％〜４％でｐＣｏｌｄＩＩＩ＿ＶＰ２／Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株の種菌液を接種した。３７℃で培養し、菌液のＯＤ６００値が０．６〜１．０に達したとき、０．２ｍｏｌ／Ｌのα−乳糖を加えて、最終濃度を０．０２ｍｏｌ／Ｌとし、引き続き５〜８時間培養した。
培養が終了した後、遠心分離して菌体を収集し、再び懸濁させ、超音波により破砕し、遠心分離して上澄みを収集した。硫酸アンモニウムで沈澱した後、ＶＰ２タンパク質液を収集した。
【実施例１２】
【００５３】
（産卵低下症候群抗原の製造）
鶏産卵低下症候群ＡＶ−１２７株（中国獣医薬品監察所により購入）を滅菌生理食塩水により所定の割合で希釈し、１０日齢感受性鴨胚に０．１ｍｌ／胚に尿膜腔接種した。接種後３６〜３７℃で引き続いて孵育し、２４時間までに死亡した鴨胚を捨て、１２０時間まで６〜８時間毎に卵を照射し、死亡した鴨胚を随時除去した。次に、全ての鴨胚を取り出し、気室を上向きし、２〜８℃で１２〜２４時間冷却した後、鴨胚の尿膜液を無菌において採取した。ウイルス含有量を測定したところ、１０８．５ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであった。最終濃度０．２％のホルムアルデヒド溶液（ｖ／ｖ）を加えて３７℃で不活化させる間、４〜６時間毎に一回攪拌し、１６時間不活化した。こうして、完全に不活化した後に、抗原として使用した。
【実施例１３】
【００５４】
（トリアデノウイルス混合ワクチンの製造）
実施例３で精製したトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原をそれぞれ実施例８で製造したトリニューカッスル病抗原、実施例９で製造したトリインフルエンザ抗原、実施例１０で製造した鶏伝染性気管支炎抗原、実施例１１で製造した伝染性ファブリキウス嚢抗原、実施例１２で製造した産卵低下症候群抗原と所定の割合で混合した。続いて、ホワイトオイルアジュバントを加えるとともに、モータを起動し、１７５００ｒ／ｍｉｎで５分間攪拌した。攪拌を停止する直前、１％チメロサール溶液を加えて、最終濃度を０．０１％とした。具体的な配合比を表８、９、１０、及び１１に示す。
【表８】
2019509260.tif 000009
【００５５】
【表９】
2019509260.tif 000010
【表１０】
2019509260.tif 000011
【００５６】
【表１１】
2019509260.tif 000012
【実施例１４】
【００５７】
（トリアデノウイルス混合ワクチンの免疫原性試験）
１、トリアデノウイルス部分免疫原性試験
２１日齢のＳＰＦ鶏１７０羽を１０羽／群で１7群に群分けした。第１９群〜第３４群では、それぞれ実施例１３で製造したワクチン４〜ワクチン１９を０．３ｍｌ／羽で頚部皮下に注射して免疫し、第３５群では０．３ｍｌ生理食塩水を皮下注射して、ブランク対照とした。全ての試験鶏をいずれも隔離して飼育した。免疫後２１日目に、ＦＡＶ−ＨＮ株ウイルス液を筋肉注射して感染させた。１４日間観察し、発病、死亡及び保護数を記録した。結果を表１２に示す。
【表１２】
2019509260.tif 000013
この結果により、ワクチン４〜ワクチン１９の免疫群では、免疫後２１日まで優れた免疫保護が得られることが判明した。こうして、本発明が提供するトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を抗原として製造した油乳剤混合ワクチンが、鶏群を全面的に保護できることが判明した。
【００５８】
２、ニューカッスル病ウイルス部分免疫原性試験
２１日齢のＳＰＦ鶏１３０羽を１０羽／群で１３群に群分けした。第３６群〜第４７群では、それぞれ実施例１３で製造したワクチン４、ワクチン９〜ワクチン１９を２０μｌ／羽で頚部皮下に注射して免疫し、第４８群では２０μｌ生理食塩水を皮下注射して、ブランク対照とした。全ての試験鶏を隔離して飼育し、免疫後２１日目に、第３６群〜第４７群の免疫鶏を第４８群の対照鶏とともに採血して血清を分離した。ニューカッスル病ウイルスＨＩ抗体を測定するとともに、ニューカッスル病ウイルス強毒ＨＮ１１０１株ウイルス液を筋肉注射して感染させた。１４日間観察し、発病、死亡及び保護数を記録した。結果を表１３に示す。
【表１３】
2019509260.tif 000014
この結果により、ワクチン４、ワクチン９〜ワクチン１９の免疫群では、免疫後２１日まで優れたニューカッスル病ウイルス抗体が生じ、免疫群を対照群と比べると、強毒性の感染から全面的に保護できることが判明した。こうして、本発明が提供するＮ７ａ株ニューカッスル病ウイルス液を抗原として製造した油乳剤混合ワクチンが、鶏群を全面的に保護できることが判明した。
【００５９】
３、トリインフルエンザ部分免疫原性試験
２１日齢のＳＰＦ鶏９０羽を１０羽／群で９群に群分けした。第４９群〜第５６群では、それぞれ実施例１３で製造したワクチン５、ワクチン９、ワクチン１３、ワクチン１６〜ワクチン１９を０．３ｍｌ／羽で頚部皮下に注射して免疫し、第５７群では０．３ｍｌ生理食塩水を皮下注射して、ブランク対照とした。全ての試験鶏を隔離して飼育した。免疫後２１日目に、第４９群〜第５６群の免疫鶏を第５７群の対照鶏とともに採血して血清を分離した。Ｈ９亜型トリインフルエンザＨＩ抗体力価を測定し、同時にＳＺ株ウイルス液を０．２ｍｌ／羽（１０７．０ＥＩＤ５０含有）で静脈注射して感染させた。ウイルス感染後５日目に、排出腔綿棒を採取し、処理した後、１０〜１１日齢ＳＰＦ鶏胚５個に尿膜腔接種した。５日間孵育しながら観察し、死胚や生胚にもかかわらず、いずれの鶏胚液赤血球凝集能を測定した。ここで、各綿棒試料により接種された５個鶏胚の中で、１個の鶏胚液の凝集能が１：１６以上（微量法）であるとき、ウイルス分離が陽性であると判断した。ウイルス分離が陰性であると判断した試料に対して、一回ブラインド継代した後で再び判定した。免疫群では、少なくとも９羽の鶏はウイルス分離が陰性であると判断すべきであり、対照群では少なくとも４羽の鶏はウイルス分離が陽性であると判断すべきであった。結果を表１４に示す。
【表１４】
2019509260.tif 000015
【００６０】
この結果により、ワクチン５、ワクチン９、ワクチン１３、ワクチン１６〜ワクチン１９は、免疫後２１日目まで優れたトリインフルエンザウイルス抗体を生じさせた。さらに、免疫群は対照群に比較すると、強毒性の感染から全面的に保護できることが判明した。こうして、本発明が提供するＨ９亜型トリインフルエンザウイルス液を抗原として製造した油乳剤混合ワクチンが、鶏群を全面的に保護できることが判明した。
【００６１】
４、鶏伝染性気管支炎部分免疫原性試験
２１日齢のＳＰＦ鶏８０羽を１０羽／群で８群に群分けした。第５８群〜第６４群では、それぞれ鶏伝染性気管支炎生ワクチン（Ｈ１２０株）を０．０５ｍｌ／羽で点眼や点鼻して接種した。接種後２１日目に、第６５群の対照鶏とともに採血して血清を分離した。同時に、第５８群〜第６４群の各群では、実施例１３で製造したワクチン６、ワクチン１０、ワクチン１３、ワクチン１４、ワクチン１５、ワクチン１８、ワクチン１９を０．３ｍｌ／羽で頚部皮下注射して免疫した。接種後２８日目に、第６５群の対照鶏とともにそれぞれ採血して血清を分離した。第５８〜第６４群の免疫鶏を、生ワクチンにより初回免疫した後２１日目と、不活化ワクチンで免疫した後２８日目とで二回採取した血清（第６５群の対照鶏も同じ時間で血清を採取した）について、ＨＩ抗体力価を測定した。免疫群の二回免疫した血清ＨＩ抗体力価の幾何平均値は初回免疫の血清ＨＩ抗体力価の幾何平均値の４倍以上であり、他方、非免疫対照群の血清ＨＩ抗体力価の幾何平均値は１：８（微量法）以下であった。同時に鶏伝染性気管支炎Ｍ４１強毒により１羽ずつ１０３．０ＥＩＤ５０で点鼻して感染させて、ウイルス感染実験を行った。結果を表１５に示す。
【００６２】
【表１５】
2019509260.tif 000016
この結果により、ワクチン６、ワクチン１０、ワクチン１３、ワクチン１４、ワクチン１５、ワクチン１８、ワクチン１９の二回免疫血清ＨＩ抗体力価の幾何平均値は、いずれも初回免疫血清ＨＩ抗体力価の幾何平均値の４倍以上であった。さらに、ウイルス感染後免疫鶏はいずれも気管内からウイルスを分離しなかったため、強毒性の感染から全面的に保護できることが判明した。こうして、本発明が提供する鶏伝染性気管支炎ウイルス液を抗原として製造した油乳剤混合ワクチンが、鶏群を全面的に保護できることが判明した。
【００６３】
５、ファブリキウス嚢部分免疫原性試験
２１日齢のＳＰＦ鶏６０羽を１０羽／群で６群に群分けした。第６６群〜第７０群では、それぞれ実施例１３で製造したワクチン７、ワクチン１１、ワクチン１４、ワクチン１６、ワクチン１８を０．３ｍｌ／羽で頚部皮下に注射して免疫し、第７１群では０．３ｍｌ生理食塩水を皮下注射して、ブランク対照とした。全ての試験鶏は隔離して飼育した。免疫後２１日目に、第６６群〜第７１群では、１羽ずつ１００倍希釈したトリ伝染性ファブリキウス嚢病強毒ＢＣ６−８５（（ＣＶＣＣ  ＡＶ７株）中国獣医薬品監察所より購入した）株ウイルス液０．１ｍｌ（実際の毒含有量＞１００個ＢＩＤ）を点眼接種した。ウイルス感染後、毎日鶏の臨床表現を観察し、発病及び死亡の羽数を記録した。７２〜９６時間後に生存している鶏を屠殺し、逐一解剖して、ファブリキウス嚢などの病変を観察した。免疫鶏は少なくとも８羽が正常で、ファブリキウス嚢病変が現れなかった。一方、対照鶏は少なくとも４羽が発病し、明らかなファブリキウス嚢病変（例えば胸筋或いは腿筋の筋状出血、ファブリキウス嚢の腫れ又は萎縮、黄色み、ジェル状分泌物有り等の１種以上の病変）が現れた。結果を表１６に示す。
【表１６】
2019509260.tif 000017
この結果により、ワクチン７、ワクチン１１、ワクチン１４、ワクチン１６、ワクチン１８群では、免疫後２１日目までトリ伝染性ファブリキウス嚢病強毒性感染から全面的に保護できることが判明した。
【００６４】
６、産卵低下症候群部分免疫原性試験
２１日齢のＳＰＦ鶏６０羽を１０羽／群で６群に群分けした。第７２群〜第７６群では、それぞれ実施例１３で製造したワクチン８、ワクチン１２、ワクチン１５、ワクチン１７、ワクチン１９を０．３ｍｌ／羽で頚部皮下に注射して免疫し、第７７群では０．３ｍｌ生理食塩水を皮下注射して、ブランク対照とした。全ての試験鶏は隔離して飼育した。免疫後２１日目に、第７２群〜第７７群では採血し、産卵低下症候群ＨＩ抗体力価を測定した。免疫鶏のＨＩ抗体幾何平均力価＞７ｌｏｇ２、対照鶏のＨＩ抗体力価＜２ｌｏｇ２であった。結果を表１７に示す。
【表１７】
2019509260.tif 000018
この結果により、ワクチン８、ワクチン１２、ワクチン１５、ワクチン１７、ワクチン１９は、免疫後２１日目までより高い産卵低下症候群抗体を生じ、鶏群を産卵低下症候群の発症から有効に保護できることが判明した。こうして、本発明の提供するトリアデノウイルス混合ワクチンが関連病原からの感染性疾患に抵抗でき、優れた免疫原性を示し、我が国のトリアデノウイルス関連病気の流行を有効に制御できることが証明された。
【実施例１５】
【００６５】
（トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の効果的発現）
トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子に基づき設計したプライマーＦｉｂｅｒ−Ｆ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）：５−ＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＡＧＡＣＴＣＣＧＡＧＣＣＣＣＴＡＡＡＡＧ−３、Ｆｉｂｅｒ−Ｒ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）：５−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡ−３を利用して、ＰＣＲ増幅によりトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子断片を得た。
ＰＣＲ生成物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社で配列決定した。配列決定結果は配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で表示された。
ＰＣＲ生成物を電気泳動して目的断片を回収し、ｐＥＴ２４ａプラスミドに接続した。接続したプラスミドにより大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、モノクローナルを選別して１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培養基において一晩培養した。次に、プラスミドを抽出した後で配列決定分析を行い、陽性クローンは、ｐＥＴ２４ａ＿ＦＡＤＶ＿Ｆｉｂｅｒ−２発現菌株であった。
【００６６】
ｐＥＴ２４ａ＿ＦＡＤＶ＿Ｆｉｂｅｒ−２／Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を含む菌株を、５０−１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培養基に接種した。接種量は１％（Ｖ／Ｖ）であり、３７℃で振動培養した。ＯＤ６００値＝０．４−０．６のときに２８℃で３０分間放置した。最終濃度が０．１−１．０ｍＭとなるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え、２８℃で２４時間振動培養した。培養が完了した後、菌体を収集して、ＰＢＳ（塩化ナトリウム８ｇ、塩化カリウム０．２ｇ、リン酸水素二ナトリウム１．４４ｇ、リン酸二水素カリウム０．２４ｇを含み、ｐＨ７．４に調節し１Ｌとした）により菌体を再び懸濁した。続いて、超音波により粉砕し、遠心分離して上澄みを取った。発現生成物に含まれる可溶性目的タンパク質の含有量はより多く、Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質のＡＧＰ力価は１：１２８に達した。さらに、エンドトキシンの含有量は０．４６×１０５ＥＵ／ｍｌであった。
【００６７】
実施例３の方法に従いエンドトキシンを除去して測定した結果、Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質のＡＧＰ力価は１：１２８であり、エンドトキシンの含有量は０．００８×１０５ＥＵ／ｍｌであった。
この結果から、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４は、組換えタンパク質に残留するエンドトキシンを除去するとともに、Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質の免疫原性に影響しないことが判明した。
【実施例１６】
【００６８】
（ニューカッスル病、伝染性気管支炎、トリインフルエンザ、伝染性ファブリキウス嚢、トリアデノウイルスの五種混合ワクチン（ニューカッスル病・伝染性気管支炎・トリインフルエンザ・伝染性ファブリキウス嚢・トリアデノウイルス五種混合ワクチン）の製造及び免疫原性試験）
１、ニューカッスル病・伝染性気管支炎・トリインフルエンザ・伝染性ファブリキウス嚢・トリアデノウイルス五種混合ワクチンの製造
実施例１５で精製したＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原をそれぞれ実施例８で製造しトリニューカッスル病抗原、実施例９で製造したトリインフルエンザ抗原、実施例１０で製造した鶏伝染性気管支炎抗原、実施例１１で製造した伝染性ファブリキウス嚢抗原と所定の割合で混合した。続いて、ホワイトオイルアジュバントを加えるとともに、モータを起動し、１７５００ｒ／ｍｉｎで５分間攪拌した。攪拌を停止する直前に、１％チメロサール溶液を加えて、最終濃度を０．０１％とした。具体的な配合比を表１８に示す。
【表１８】
2019509260.tif 000019
【００６９】
２、ニューカッスル病・伝染性気管支炎・トリインフルエンザ・伝染性ファブリキウス嚢・トリアデノウイルス五種混合ワクチンのトリアデノウイルス部分免疫原性試験
実施例１４の第１部分のトリアデノウイルス部分免疫原性試験方法を参照して、五種混合ワクチンのトリアデノウイルス部分免疫原性を検証した。第７８群は免疫群であり、第７９群はブランク対照とした。結果を表１９に示す。
【表１９】
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この結果により、免疫群では、免疫後２１日目まで優れた免疫保護を与えることが判明した。こうして、本発明が提供するトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を抗原として製造したニューカッスル病・伝染性気管支炎・トリインフルエンザ・伝染性ファブリキウス嚢・トリアデノウイルス五種混合ワクチンは、鶏群を全面的に保護できることが判明した。
【００７０】
３、ニューカッスル病・伝染性気管支炎・トリインフルエンザ・伝染性ファブリキウス嚢・トリアデノウイルス五種混合ワクチンのニューカッスル病ウイルス部分免疫原性試験
実施例１４の第２部分に記載したニューカッスル病ウイルス部分免疫原性試験方法を参照して、五種混合ワクチンのニューカッスル病ウイルス部分免疫原性を検証した。第８０群は免疫群であり、第８１群はブランク対照とした。結果を表２０に示す。
【表２０】
2019509260.tif 000021
この結果により、免疫群では、免疫後２１日目までより高いニューカッスル病ウイルス抗体を生じた。免疫群を対照群と比較すると、強毒性の感染から全面的に保護できることが判明した。こうして、本発明が提供するＮ７ａ株ニューカッスル病ウイルス液を抗原として製造したニューカッスル病・伝染性気管支炎・トリインフルエンザ・伝染性ファブリキウス嚢・トリアデノウイルス五種混合ワクチンは、鶏群を全面的に保護できることが判明した。
【００７１】
４、ニューカッスル病・伝染性気管支炎・トリインフルエンザ・伝染性ファブリキウス嚢・トリアデノウイルス五種混合ワクチンのトリインフルエンザ部分免疫原性試験
実施例１４の第３部分に記載したトリインフルエンザ部分免疫原性試験方法を参照して、五種混合ワクチンのトリインフルエンザ部分免疫原性を検証した。第８２群を免疫群とし、第８３群をブランク対照とした。結果を表２１に示す。
【表２１】
2019509260.tif 000022
この結果により、ワクチン２０は、免疫後２１日目までより高いトリインフルエンザウイルス抗体を生じた。免疫群を対照群に比較すると、強毒性の感染から全面的に保護できることが判明した。こうして、本発明が提供するＨ９亜型トリインフルエンザウイルス液を抗原として製造したニューカッスル病・伝染性気管支炎・トリインフルエンザ・伝染性ファブリキウス嚢・トリアデノウイルス五種混合ワクチンは、鶏群を全面的に保護できることが判明した。
【００７２】
５、ニューカッスル病・伝染性気管支炎・トリインフルエンザ・伝染性ファブリキウス嚢・トリアデノウイルス五種混合ワクチンの鶏伝染性気管支炎部分免疫原性試験
実施例１４の第４部分に記載した鶏伝染性気管支炎部分免疫原性試験方法を参照して、五種混合ワクチンの鶏伝染性気管支炎部分免疫原性を検証した。第８４群は免疫群であり、第８５群はブランク対照とした。結果を表２２に示す。
【表２２】
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この結果により、ワクチン２０の二回免疫血清ＨＩ抗体力価の幾何平均値は、いずれも初回免疫血清ＨＩ抗体力価の幾何平均値の４倍以上であった。また、ウイルス感染後免疫鶏はいずれも気管内からウイルスを分離しなかったので、強毒性の感染から全面的に保護できることが判明した。こうして、本発明が提供する鶏伝染性気管支炎ウイルス液を抗原として製造したニューカッスル病・伝染性気管支炎・トリインフルエンザ・伝染性ファブリキウス嚢・トリアデノウイルス五種混合ワクチンは、鶏群を全面的に保護できることが判明した。
【００７３】
６、ニューカッスル病・伝染性気管支炎・トリインフルエンザ・伝染性ファブリキウス嚢・トリアデノウイルス五種混合ワクチンのファブリキウス嚢部分免疫原性試験
実施例１４の第５部分に記載したファブリキウス嚢部分免疫原性試験方法を参照して、五種混合ワクチンのファブリキウス嚢部分免疫原性を検証した。第８６群は免疫群とし、第８７群はブランク対照とした。結果を表２３に示す。
【表２３】
2019509260.tif 000024
この結果により、ワクチン２０は、免疫後２１日目までトリ伝染性ファブリキウス嚢病の強毒性感染から全面的に保護できることが判明した。こうして、本発明が提供するトリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＶＰ２タンパク質を抗原として製造したニューカッスル病・伝染性気管支炎・トリインフルエンザ・伝染性ファブリキウス嚢・トリアデノウイルス五種混合ワクチンは、鶏群を全面的に保護できることが判明した。
【００７４】
以上の記載はただ本発明の好ましい実施例であり、本発明に対するいかなる形式的な制限を行うものではない。好ましい実施例として本発明を以上のように開示したが、本発明を限定するものではない。本分野における当業者であれば、本発明の技術方案を逸脱しない範囲で、以上開示された技術内容を利用して変更又は修飾を等価変化させた若干の等価実施例を行うことができる。また、本発明の技術方案を逸脱せず、本発明の技術実質によって上記実施例に対して行い得るいかなる簡単修正、等価変化及び修飾であれば、全てが依然として本発明の技術方案の範囲内に含まれる。
【配列表】
2019509260000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月20日(2018.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリアデノウイルスに抵抗性を有するワクチン組成物であって、前記ワクチン組成物は免疫量のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質、或いは免疫量のトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子を組換えた生ベクター、及び製薬上許容されるベクターを含む。
【請求項２】
前記トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で表されるヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質である請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の含有量がＡＧＰ力価＞１：２である請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の含有量がＡＧＰ力価１：２〜１：１６である請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記製薬上許容されるベクターはアジュバントを含み、前記アジュバントは、（１）アルミニウムゲルアジュバント、サポニン、アブリジン、及びＤＤＡ、（２）油中水乳剤、水中油乳剤、水中油中水乳剤、あるいは（３）アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、マレイン酸無水物とアルケニル誘導体の共重合体、ＲＩＢＩアジュバントシステム、Ｂｌｏｃｋ  ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ、ＳＡＦ−Ｍ、モノホスホリルリピドＡ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、大腸菌易熱性エンテロトキシン、コレラ毒素、ＩＭＳ  １３１４、ムラミルジペプチド、及びＧｅｌアジュバントからの１種或いは複数種を含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記アジュバントは油中水乳剤を製造するのに用いられるホワイトオイルアジュバントである請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記アジュバントの濃度範囲は５％〜７０％Ｖ／Ｖである請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記アジュバントの濃度範囲は３０％〜７０％Ｖ／Ｖである請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記アジュバントの濃度は６６％Ｖ／Ｖである請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記ワクチン組成物は１種或いは多種の他の抗原を更に含み、前記他の抗原はトリニューカッスル病ウイルス抗原、トリインフルエンザウイルス抗原、鶏伝染性気管支炎ウイルス抗原、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原、産卵低下症候群ウイルス抗原、鳥レオウイルス抗原、大腸菌抗原、アビバクテリウム・パラガリナルム抗原、マイコプラズマ・シノビアエ抗原、マイコプラズマ・ガリセプチカム抗原、パスツレラ・ムルトシダス抗原、マレック病ウイルス抗原、鳥脳脊髄炎ウイルス抗原、及び鳥伝染性喉頭気管炎ウイルス抗原を含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記他の抗原はトリニューカッスル病ウイルス不活化抗原、トリインフルエンザウイルス不活化抗原、鶏伝染性気管支炎ウイルス不活化抗原、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原ＶＰ２タンパク質、又は産卵低下症候群ウイルス不活化抗原である請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記トリニューカッスル病ウイルス抗原はＮ７ａ株不活化抗原であり、前記トリインフルエンザウイルス抗原はＳＺ株不活化抗原であり、前記鶏伝染性気管支炎ウイルス抗原はＭ４１株不活化抗原であり、前記トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原はＶＰ２タンパク質であり、前記産卵低下症候群ウイルス抗原はＡＶ−１２７株不活化抗原である請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：２〜１：１６であり、前記トリニューカッスル病ウイルス抗原の含有量は不活化前に１０８．０〜１０９．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、前記トリインフルエンザウイルスの含有量は不活化前に１０６．５〜１０８．５ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、前記鶏伝染性気管支炎ウイルスの含有量は不活化前に１０６．０〜１０７．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、前記トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原ＶＰ２タンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：１６〜１：１２８であり、並びに、前記産卵低下症候群ウイルス抗原の含有量は不活化前に１０７．０〜１０８．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌである請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：２であり、前記トリニューカッスル病ウイルス抗原の含有量は不活化前に１０８．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、前記トリインフルエンザウイルスの含有量は不活化前に１０８．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、前記鶏伝染性気管支炎ウイルスの含有量は不活化前１０６．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌであり、前記トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原ＶＰ２タンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：１６であり、並びに、前記産卵低下症候群ウイルス抗原の含有量は不活化前に１０７．０ＥＩＤ５０／０．１ｍｌである請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のワクチン組成物の製造方法であって、
前記トリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子をクローニングする工程（１）と、前記工程（１）でクローニングしたＦｉｂｅｒ−２タンパク質遺伝子を形質転換・組換えして、Ｆｉｂｅｒ−２タンパク質を組換えた大腸菌を獲得する工程（２）と、前記組換えトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を発現する工程（３）と、前記組換えトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を分離して精製し、ノニオン性界面活性剤を使用して前記精製した組換えトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質を処理する工程（４）と、前記処理したトリアデノウイルスＦｉｂｅｒ−２タンパク質抗原をアジュバントと混合して乳化する工程（５）と、を含むワクチン組成物の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のワクチン組成物の、トリアデノウイルスに起因する感染を予防及び／又は治療する医薬品製造への使用。
【国際調査報告】
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