(57)【要約】  本発明の目的は、長期投与中の毒性がより低い新規なＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２阻害剤を創出することである。この目的は、式１の新規化合物Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］−フェニル｝−シクロプロパンカルボキサミドジメチルスルホキシド溶媒和物により達成される。
2019531350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１のＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］−フェニル｝−シクロプロパンカルボキサミドジメチルスルホキシド溶媒和物。
【化１】
2019531350.tif 000011
【請求項２】
請求項１に記載の化合物を含む、医薬組成物及び剤形の調製のための活性成分。
【請求項３】
ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２阻害剤特性を示し、治療有効量の活性成分としての式１の化合物と、医薬的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項４】
医薬的に許容される容器に入れられた錠剤、カプセル剤、又は注射剤の形で用いるための、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物を含む、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２に関連する疾患の処置用の薬物。
【請求項６】
有効量の請求項１に記載の化合物又は請求項２に記載の活性成分又は請求項３に記載の医薬組成物又は請求項５に記載の薬物の投与を含む、がんの予防及び／又は処置方法。
【請求項７】
悪性黒色腫の予防及び／又は処置を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
治療有効量の式１の化合物と医薬的に許容される賦形剤とを混合することによる、がんの処置用の薬物の調製方法。
【請求項９】
悪性黒色腫の処置のための、請求項８に記載の薬物の調製方法。
【請求項１０】
式２の化合物又はその塩とシクロプロパンカルボン酸又はその活性化誘導体との相互作用を含む、請求項１に記載の化合物の調製方法。
【化２】
2019531350.tif 000012
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有害な細胞増殖を原因とする障害の処置のための薬物、特に抗腫瘍剤として関心のあるピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−２，４，７−トリオンの新しい誘導体、即ちＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］−フェニル｝−シクロプロパンカルボキサミドジメチルスルホキシド溶媒和物に関する。より具体的には、本発明は、悪性黒色腫の処置のために用いることができる抗腫瘍薬として関心のあるＭЕＫ１、ＭЕＫ２、及びＭЕＫ１／２阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
公知のＭЕＫ１、ＭЕＫ２、及びＭЕＫ１／２阻害剤が存在し、その構造は、１Ｈ，６Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−２，４，７−トリオンを含み（特許文献１〜３）、最先端の薬物は、メキニストである（トラメチニブジメチルスルホキシド、ＧＳＫ１１２０２１２）（非特許文献１）。ＧＳＫ１１２０２１２は、効率的なＭＥＫ１／２阻害剤であり、活性化前のもの（ｐｐ−ＭЕＫ１：ＩＣ５０＝１４．９ｎＭ）と比べてＣ−Ｒａｆ活性化（ｕＭＥＫ１：ＩＣ５０＝０．７ｎＭ）の前にｕ−ＭＥＫｌ／２に対してより高い効率を示す（非特許文献２）。
【０００３】
【化１】
2019531350.tif 000003
【０００４】
しかし、トラメチニブ及びメキニストは、рН＝２からрН＝８の間の水性媒体にほとんど溶けない。トラメチニブ及びメキニストは、極性が高い溶媒を含む有機溶媒にも非常に溶けにくい（熱非極性溶媒にやや溶けにくい）。
【０００５】
このために、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭЕＫ１／２に関して好ましい効率プロファイル、並びに水性又は有機溶媒に高い溶解性を示し得る化合物がいまだに望まれているのである。バイオアベイラビリティの改善により、これらの化合物は、がん治療剤としてより適切になることが期待される。
【０００６】
その他に、メキニストは、単一用量経口毒性が低いが（マウスについてＬＤ５０＞２０００ｍｇ／ｋｇ）、長期の高用量レベルの投与中に、著しい体重減少又は時には動物の死さえ観察される。よって、長期投与毒性がより低いこの群の製品についての探索がいまだに非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００５／１２１１４２号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０８８０３３号
【特許文献３】米国特許第７３７８４２３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈ．Ａｂｅ、Ｓ．Ｋｉｋｕｃｈｉ、Ｋ．Ｈａｙａｋａｗａら、ＡＣＳ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１１、２、３２０−３２４
【非特許文献２】ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｃａｎｃｅｒｒｅｓ．ａａｃｒｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１７／５／９８９．ｆｕｌｌ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、長期投与中の毒性がより低い新規なＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２阻害剤を創出することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、式１の新規化合物Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］−フェニル｝−シクロプロパンカルボキサミドジメチルスルホキシド溶媒和物により達成される。
【００１１】
本出願人は、式１の新規化合物Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］−フェニル｝−シクロプロパンカルボキサミドジメチルスルホキシド溶媒和物が、長期投与中に非毒性であり、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２に対する効率においてトラメチニブに匹敵することを予期せぬことに見出した。
【００１２】
よって、式１の新規化合物Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］−フェニル｝−シクロプロパンカルボキサミドジメチルスルホキシド溶媒和物は、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２が関与する障害の処置、例えば悪性黒色腫を含むがんの処置において特に有用であり得る。
【００１３】
本発明の主題は、式１のＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］−フェニル｝−シクロプロパンカルボキサミドジメチルスルホキシド溶媒和物である。
【００１４】
【化２】
2019531350.tif 000004
【００１５】
本発明の主題は、式１の化合物を含むＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２阻害剤でもある。
【００１６】
式１の新規化合物の利点は、有機媒体中の溶解性がより高いことであり、このことは、より広い種類の適切な処方を提供でき、より高いバイオアベイラビリティ及びその他の薬物動態パラメータを可能にする。よって、例えば、ジメチルスルホキシド中の式１の化合物の溶解性は、トラメチニブのものより２倍を超えて大きい。４％ジメチルスルホキシドと９６％植物油との混合物中の溶解性もより高い。トラメチニブのものと比較して、様々な媒体中の式１の化合物の溶解性を、表１に示す。
【００１７】
表１．様々な媒体中の式１の化合物及びトラメチニブの溶解性
【表１】
2019531350.tif 000005
【００１８】
式１の新規化合物の阻害活性は、ＭＥＫ１に関してトラメチニブの阻害活性と匹敵し、実験値はＩС５０＝８．０２ｎＭ（トラメチニブについてＩＣ５０＝８．１４ｎＭ）である。
【００１９】
原型（メキニスト、トラメチニブのジメチルスルホキシド複合体）と比較して投与毒性の推移が著しく低いことが、式１の新規化合物の絶対的な利点である。Ａ３７５ヒト黒色腫異種移植片モデルに対する効率研究は、式１の化合物が腫瘍成長を阻害し、用量依存性の様式で腫瘍退縮を引き起こしたことを示した。式１の化合物の効率はメキニストのものに匹敵し、式１の化合物は毒性がより低い。メキニストによる実験的処置は、著しい体重減少及び２匹の動物の死をもたらしたが、式１の化合物は、より高い用量でさえ動物の死を引き起こさなかった。
【００２０】
式１の化合物対メキニストの抗腫瘍活性研究を、ＮＭＲＩヌード雌マウスに対して行った。腫瘍の形成後、動物を、群における平均腫瘍サイズが約１５０ｍＭ３となるように群分けした。動物を、試験生成物で２１日間処置した。３ｍｇ／ｋｇ以下の用量で式１の化合物を投与された実験群の動物の体重は、対照群の動物のものと有意に異ならなかった（図１）。１０ｍｇ／ｋｇの用量の式１の化合物による処置は、動物の体重減少をもたらし、これは、１回目の投与から研究中を通して観察されたが、処置開始日と比較して２０％以下であった。しかし、９日間の３ｍｇ／ｋｇのメキニストの胃内投与は、著しい体重減少と２匹の動物の死をもたらし、このことにより、この群において、体重の回復のために３日間処置を中止する必要があった。
【００２１】
腫瘍成長の動態を図２に示す。０．３ｍｇ／ｋｇの式１の化合物の胃内投与は、腫瘍成長に影響しなかったが、腫瘍成長の著しい阻害が全ての他の群で観察された。また、１ｍｇ／ｋｇの式１の化合物を投与された８匹の動物のうち３匹、並びに３及び１０ｍｇ／ｋｇの式１の化合物を投与されたそれぞれ７／８匹及び８／８匹の動物で腫瘍退縮が観察された。３ｍｇ／ｋｇのメキニストの胃内投与も、群における１００％の動物において退縮を引き起こした。
【００２２】
よって、式１の化合物は、用量依存性腫瘍成長阻害及び退縮を示し、動物の死を引き起こさず、研究した最大用量においてのみ動物の体重を中程度に低減させた。
【００２３】
本発明の主題は、式１の化合物を含むＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２阻害剤でもある。この阻害剤は、患者における悪性黒色腫を含むがんの処置のために用いられることが好ましい。
【００２４】
本発明の主題は、溶媒、例えばＣＨ２Ｃｌ２、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎージメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、又はＮ−メチルピロリドン中での、式２の１−（３−アミノフェニル）−３−シクロプロピル−５−｛（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ｝−６，８−ジメチルピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−２，４，７（１Н，３Н，６Н）−トリオン又はその塩とシクロプロピルカルボン酸又はその活性化誘導体（例えば、この酸のクロロ無水物又はそれぞれの活性化エステル若しくは無水物）との相互作用と、ジメチルスルホキシド中の熱飽和溶液を徐々に冷却することにより、得られた生成物の結晶溶媒和物を更に得る、式１の化合物の製造方法でもある。
【００２５】
【化３】
2019531350.tif 000006
【００２６】
本発明の主題は、式１の化合物を含む医薬組成物及び剤形の調製のための活性成分である。
【００２７】
本発明の主題は、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２阻害剤特性を示し、治療有効量の活性成分としての式１の化合物と、医薬的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物である。
【００２８】
医薬組成物は、経口用（例えば、錠剤、香錠、ハード若しくはソフトカプセル剤、水性若しくは油性懸濁剤、乳剤、分散性粉剤若しくは顆粒剤、シロップ剤、又はエリキシル剤）、外用（例えば、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、水性若しくは油性液剤、又は懸濁剤）、吸入用（例えば、微粉末又は液体エアロゾル）、吹送用（例えば、微粉剤）又は非経口投与用（例えば、静脈内、皮下若しくは筋内投与注射用の滅菌水性若しくは油性液剤、又は直腸投与用の坐剤）に適切な形態であり得る。
【００２９】
医薬組成物は、公知の従来の医薬賦形剤を用いる通常の方法により得ることができる。よって、経口投与を意図する医薬組成物は、例えば１又はいくつかの着色剤、甘味料、香料、及び／又は防腐剤を含んでよい。
【００３０】
通常、式１の化合物は、治療有効用量を通常提供する５〜５０００ｍｇ／ｍ２の体表面積、即ち、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの単一用量として患者に投与される。通常、単一剤形、例えば錠剤又はカプセル剤は、例えば１〜２５０ｍｇの活性成分を含む。１日用量は、患者、具体的な投与経路及び処置の際の障害の重症度に依存して常に変動する。よって、特定の患者の処置を行う医師は、最適用量を決定できる。本明細書において、用語「療法」は、「予防」を含む。
【００３１】
ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２に対する阻害活性を有する式１の化合物は、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２活性に関する疾患又は医療状態の処置、例えばがんの処置のために用いることができる。式１の化合物又はその医薬的に許容される塩及び／若しくは溶媒和物を用いる処置に感受性であり得るがんの種類は、（限定することなく）悪性黒色腫を含む。
【００３２】
本発明の主題は、治療有効量の式１の化合物を含む、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２に関する疾患の処置のための薬物でもある。本発明のバージョンの１つは、この薬物が、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２に関し、がんを含む疾患の処置を意図することである。
【００３３】
本発明の主題は、上で規定する式１の化合物の使用を含む、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２に関する疾患の処置の方法でもある。本発明のバージョンの１つは、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２に関し、がんを含む疾患の処置である。
【００３４】
本発明の別の態様によると、式１の化合物は、上で規定するように、治療有効量の式１の化合物を医薬的に許容される賦形剤と混合することによる、がんの処置のための薬物の調製のために用いることが提案される。
【００３５】
本発明の別の態様によると、処置を必要とする患者において抗がん効果を得る方法も提案され、該方法は、患者に有効量の式１の化合物を投与することを含む。
【００３６】
本発明の別の態様によると、ＭＥＫ１／２阻害が有用である疾患に罹患した人の処置の方法も提案され、該方法は、そのような処置を必要とする患者に、有効量の式１の化合物を投与する工程を含む。特に、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及びＭＥＫ１／２阻害が有用な疾患は、がんである。
【００３７】
がんが一般的な意味において示される本明細書中で言及する任意の態様又はバージョンにおいて、前記がんは、脳腫瘍（悪性星細胞腫及び乏突起神経膠腫の要素を有する神経膠腫等）、食道癌、胃癌、肝癌、膵癌、結腸直腸癌（大腸癌、直腸癌等）、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌、原発及び転移性扁平上皮癌等）、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、皮膚癌、神経芽腫、肉腫、骨軟骨腫、骨腫、骨肉腫、精上皮腫、性腺外の腫瘍、精巣腫瘍、子宮癌（子宮頸癌、子宮内膜癌等）、頭部癌及び頸部腫瘍（上顎洞、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、口腔癌等）、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫（細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、真性赤血球増加症、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病等）、甲状腺腫、骨盤癌、尿管腫瘍、膀胱腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、悪性黒色腫、小児腫瘍（ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、血管肉腫、胎児性精巣腫瘍、神経芽腫、網膜芽細胞腫、肝芽腫、腎芽腫等）等から選択できる。
【００３８】
上記のがん疾患の処置は、単剤療法として用いることができるか、あるいは本発明による化合物に加えて一般的な手術又は放射線療法若しくは化学療法若しくは免疫療法を含むことができる。この化学療法は、同時、連続的、又は別々に導入でき、以下の範疇からの１以上の抗がん剤を更に含むことができる：抗増殖性／抗がん剤及び医療的腫瘍学において用いられるそれらの組み合わせ、細胞分裂阻害剤、浸潤抑制剤、増殖因子阻害剤、血管新生抑制剤、血管剤、損傷性エンドセリン受容体アンタゴニスト、アンチセンス療法、遺伝子療法アプローチ、及び免疫療法アプローチ（Ｊ）。
【００３９】
よって、本発明は、式１の化合物と上で規定するようなさらなる抗腫瘍物質とを含む、がんの併用処置のための医薬組成物を提案する。
【００４０】
本発明は、式１の化合物と上で規定するような更なる抗腫瘍物質とを含む、がんの併用処置のための医薬組成物を提案する。
【００４１】
併用療法に関して用いる用語「併用処置」は、同時、別々、又は連続的な投与と理解されるべきである。
【００４２】
本発明は、がんの併用処置のための、式１の化合物と更なる抗腫瘍物質との使用を提案する。
【００４３】
本発明は、図面により支持される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】研究中の薬物による処置中の動物の体重変化の動態。
【図２】メキニスト及び式１の化合物での処置中の異種移植片モデルにおけるＡ３７５ヒト黒色腫腫瘍成長の動態。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明を、具体例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は、説明のために提示され、本発明を限定することを意図しない。当業者は、実質的に同じ結果を得るために変更又は改変できる様々な重要でないパラメータを容易に理解できる。
【実施例】
【００４６】
実施例１．Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］−フェニル｝−シクロプロパンカルボキサミドジメチルスルホキシド溶媒和物の調製方法
【００４７】
塩化シクロプロピルカルボニル（１８２ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）を、式２の１−（３−アミノフェニル）−３−シクロプロピル−５−｛（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ｝−６，８−ジメチルピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−２，４，７（１Н，３Н，６Н）−トリオン（５００ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２２５ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）の５ｍＬのジメチルホルムアミド中の溶液に周囲温度にて加え、反応物を一晩混合した。反応の完了時に、真空下で溶媒を蒸発させ、残渣を５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液及び塩化ナトリウム飽和水溶液で連続的に洗浄した。有機層を分け、無水硫酸ナトリウムで一晩乾燥し、ろ過し、ろ液を真空下で蒸発させた。ジクロロメタン及びジクロロメタンと酢酸エチル（１：１）との混液を溶離液として用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより生成物を単離した。粗生成物（２５０ｍｇ）を１．３ｍＬのジメチルスルホキシドに７０℃にて溶解し、溶液を１時間混合し、次いで周囲温度に冷却し、一晩混合した。沈殿物をろ取し、フィルタ上でジクロロメタンを用いて洗浄し、高真空下、４０〜５０℃にて２時間乾燥した。Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］−フェニル｝−シクロプロパンカルボキサミドジメチルスルホキシド溶媒和物（１３０ｍｇ、４８％）を白色結晶粉末として得た。
【００４８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，４００ＭＨｚ）：０．７９（ｍ，２Н），０．８６（ｍ，２Н），１．０５−１．１５（ｍ，４Н），１．４４（ｓ，３Н），１．５（ｍ，１Н），２．６２（ｓ，６Ｈ），２．７４（ｍ，１Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ），６．７（ｔ，１Ｈ），７．０３（ｍ，１Ｈ），７．３１−７．４（ｍ，２Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），７．５３（ｄ，１Ｈ），７．６５（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ），１１．３（ｓ，１Ｈ）．
【００４９】
実施例２．式１の化合物及びトラメチニブ原型の熱力学的溶解性の決定。研究中の化合物５ｍｇを、１ｍＬのユニバーサル緩衝液（Ｐｉｏｎ  Ｌｔｄ）、ｐＨ＝２．０、４．０又は７．０と１５分間２５℃にて混合した。溶液が濁り始めるまで更なる量の物質を用いた。溶液を含むバイアルを混合しながら２５℃にて２４時間インキュベートして、飽和溶液と沈殿物との間の平衡を達成した。平衡時に、２００μＬの溶液（１つの試料につき２つ）を、９６ウェルフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過して、沈殿物を分けた。ろ液中の化合物の濃度を、標準検量線を用いる分光光度法により決定した。物質の光吸収スペクトルを測定し、選択した波長（通常、物質最大吸収λｍａｘに相当する）にて検量線をプロットした。ろ液中の物質の濃度（即ち溶解度）を、以下の式により算出した：
【００５０】
溶解度＝（ＯＤλｍａｘろ液−ＯＤλｍａｘブランク）／傾き×１．６７×ろ液希釈
式中：
ＯＤλｍａｘろ液＝ろ液の吸光度：
ＯＤλｍａｘブランク＝物質を含まないブランク溶液の吸光度；
傾き＝検量線の傾き；
１．６７＝アセトニトリル中のろ液の希釈係数；
ろ液希釈＝緩衝液中のろ液の希釈係数。
【００５１】
結果を表１に示す。
【００５２】
実施例３．アッセイ。物質を、Ｚ’−ＬＹＴＥスクリーニングプラットフォーム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＭＥＫ１キナーゼ活性に対する影響について試験した。反応混合物中のＤＭＳＯの濃度は１％であった。１００％ＤＭＳＯ中の研究中の物質の１００ｎＬの１００倍液だめを、２．４μＬキナーゼ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．０１％ＢＲＩＪ−３５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ）で希釈し、３８４ウェルプレート（黒色、小容量、Ｃｏｒｎｉｎｇ製、カタログ＃３６７６）中の、５μＬの２倍基質／キナーゼ混合物（ＭЕＫ１／不活性化ＭＡＲＫ１（ＥＲＫ２）／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ０３、最終含量０．０８〜０．３１ｎｇのＭЕＫ１、１０５ｎｇの不活性化ＭＡＲＫ１（ＥＲＫ２）、及び２μＭのＳｅｒ／Ｔｈｒ０３）に加えた。物質をキナーゼと周囲温度にて１０分間プレインキュベートした。その後、２．５μＬの４倍ＡＴＰ溶液を加えて、反応を開始した（反応混合物中のＡＴＰの最終濃度は１００μＭである）。振とう機上での３０秒のインキュベーションの後に、反応物を周囲温度にて６０分間インキュベートした。次いで、１：１０２４に希釈した５μＬの試薬В（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、周囲温度にて更に６０分間インキュベートした。励起４００ｎＭ並びに発光４４５ｎＭ及び５２０ｎＭにて蛍光を測定した。ペプチド基質のリン酸化度を、以下の式により算出した（低い発光比は、ペプチドがリン酸化されている、即ち、キナーゼ活性が阻害されないことを意味し、高い発光比は、ペプチドがリン酸化されていない、すなわちキナーゼ活性が阻害されていることを意味する）。
【００５３】
以下のようにしてリン酸化％を算出した：
【数１】
2019531350.tif 000007
【００５４】
以下のようにして阻害％を算出した：
【数２】
2019531350.tif 000008
【００５５】
式中：
Ｃ１００％＝平均クマリン発光シグナル、１００％リン酸化対照；
Ｃ０％＝平均クマリン発光シグナル、０％リン酸化対照；
Ｆ１００％＝平均蛍光発光シグナル、１００％リン酸化対照；
Ｆ０％＝平均蛍光発光シグナル、０％リン酸化対照。
【００５６】
実施例４．ヒト黒色腫異種移植片モデルにおける効率の研究。この研究は、ＰｒｏＱｉｎａｓｅ  ＧｍｂＨフライブルグ、Ｂｒｅｉｓａｃｈｅｒ  Ｓｔｒ．１１７、Ｄ−７９１０６フライブルグ、ドイツにおいて行った。
【００５７】
А３７５ヒト黒色腫細胞を、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いて、９５％空気及び５％СＯ２を含む湿潤雰囲気において、３７℃にてバイアル中で培養した。がん細胞を、適応期間の後に動物に移行した。その最後に、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて収集し、洗浄し、３×１０７細胞／ｍＬの最終濃度にて滅菌ＰＢＳに懸濁した。この細胞懸濁物を、マウスの左側腹部に皮下（ＳＣ）注射した（マウス当たり３×１０６細胞又は１００μＬ）。
【００５８】
平均腫瘍サイズが１００〜２００ｍｍ３に達したときに、動物を実験群に分け、試験薬物での処置を開始した。生成物を毎日胃内投与し、対照群は溶媒を投与された。実験での生成物用量を表２に示す。
【００５９】
表２．ヒト黒色腫異種移植片モデルにおける効率の研究における生成物の用量
【表２】
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【００６０】
重要な測定パラメータ：
皮下移植した腫瘍の測定は、細胞導入の日から開始して週２回行った。腫瘍量（ｍｍ３）は、以下の式により決定した：
Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２，
【００６１】
式中、Ｌ及びＷは、それぞれ最大及び最小腫瘍直径（ｍｍ）に相当する。測定は、スライド式ノギスを用いて行った。
【００６２】
研究は、腫瘍成長阻害値の算出を含んだ：
Т／С＝Ｖｅｘｐ／Ｖｃｔｒｌ×１００％，
【００６３】
式中：
Ｖｃｔｒｌ＝対照群における平均腫瘍量；
Ｖｅｘｐ＝実験群における平均腫瘍量。
【００６４】
動物の健康及び挙動も監視し、致死数の結果及び腫瘍退縮も記録した：
退縮＝（Ｖｉｎｉ−Ｖｆｉｎ）／Ｖｉ×１００％
【００６５】
式中：
Ｖｉｎｉ＝処置開始時の初期腫瘍量；
Ｖｆｉｎ＝処置終了時の腫瘍量。
【００６６】
動物の体重測定は、週３回行った。
【００６７】
表３．処置２１日後の腫瘍阻害パラメータ（Т／С）
【表３】
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【００６８】
図２は、メキニスト及び式１の化合物での処置中の異種移植片モデルにおけるＡ３７５黒色腫腫瘍成長の動態を示す。
【００６９】
式１の化合物は、メキニストの効果の強度に匹敵する用量依存性の腫瘍成長阻害及び退縮を示した。しかし、メキニストとは異なり、式１の化合物は、研究したいずれの用量でも動物の死を引き起こさず（メキニスト処置は、著しい体重減少及び２匹の動物の死をもたらした）、研究した最大用量において動物体重が中程度減少しただけであった。このことは、黒色腫処置効率を損なうことなく、メキニストと比較して式１の化合物の毒性がより低いことを示唆する。
【００７０】
実施例５．錠剤としての薬物の調製。１６００ｍｇのデンプン、１６００ｍｇの粉砕ラクトース、４００ｍｇのタルク、及び１０００ｍｇの式１の阻害剤を混合し、棒に圧縮する。この棒を顆粒に粉砕し、ふるいにかけて１４〜１６メッシュの顆粒を収集する。これらの顆粒を適切な形の錠剤（各５００ｍｇ）に圧縮する。
【００７１】
実施例６．カプセル剤としての薬物の調製。式１の阻害剤をラクトースと混合する（２：１）。この粉末混合物を、適切なサイズのゼラチンカプセルに充填する（各６００ｍｇ）。
【００７２】
実施例７．筋内、腹腔内又は皮下注射用の組成物としての薬物の調製。５００ｍｇの式１の阻害剤を３００ｍｇのクロロブタノール、２ｍＬのプロピレングリコール、及び１００ｍＬの注射用水と混合する。溶液をろ過し、１ｍＬのアンプルに充填し、次いでこれを密閉する。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
当業者は、同じ結果を得るために変更又は改変できる様々な重要でないパラメータを容易に理解できる。本明細書に記載したもの以外の本発明の様々な改変は、上で提供した記載から当業者に明らかである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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