(57)【要約】  本発明は、試料（１２）中に存在している粒子（１１ａ〜１１ｆ）の取得のデバイス（１０）に関するものであり、前記取得デバイスは空間的にコヒーレントな光源（１５）、光学系、および光学系の焦平面内に置かれ、強度画像をキャプチャするように構成されている画像センサ（１６）、ならびに  −  光学系の焦点面に関して複数のピンぼけオフセットについて得られた一連の電磁伝搬行列を構成し、  −  一連の電磁行列から粒子に対する第１の平均焦点電磁行列を決定し、  −  第１の電磁行列内の粒子の少なくとも１つを同定し、前記粒子の座標を記憶し、  −  記憶されている座標を有する一連の電磁行列の成分から同定された粒子上の焦点距離において第２の電磁行列を決定するように構成されている計算ユニットを備える。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料（１２）中に存在する複数の粒子（１１ａ〜１１ｆ）の取得のデバイス（１０）であって、
−  前記試料（１２）の第１の表面（１３）の方へ向けられた空間的にコヒーレントな、または疑似コヒーレントな光源（１５）と、
−  前記第１の表面（１３）と反対の前記試料（１２）の第２の表面（１４）の方へ向けられ、前記粒子が焦点面内にないように前記試料に対して置かれる、光軸を有しており前記焦点面と焦平面との間の連結を達成する光学系（２３）と、
−  前記光学系の前記焦平面内に置かれ、前記光源（１５）と前記試料（１２）との間の干渉によって形成される強度画像（Ｉｈ）を得るように構成されている、画像センサ（１６）と、
−  計算処理ユニット（２０）であって、
○  前記取得された画像（Ｉｈ）から、前記焦点面に平行な平面内にあり前記平面に関する複数のオフセットに対して前記試料に含まれる電磁波をモデル化する、一連の電磁行列（Ｉ１−ＩＮ）のデジタル構成のユニット（５１）と、
○  前記一連の電磁行列（Ｉ１−ＩＮ）から前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）上の平均焦点距離において第１の電磁行列（Ｉｆｍｏｙ）を決定するためのユニット（５２）と、
○  前記第１の電磁行列（Ｉｆｍｏｙ）内の前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）の少なくとも１つを同定し、前記粒子の座標を記憶するためのユニット（５３）と、
○  前記記憶されている座標を有する前記一連の電磁行列（Ｉ１−ＩＮ）の成分から同定された粒子（１１ａ〜１１ｆ）上の焦点距離において第２の電磁行列（Ｉｆｐ）を決定するためのユニット（５４）とを含む計算処理ユニット（２０）とを備える取得デバイス（１０）。
【請求項２】
前記画像センサ（１６）は、画像フロー（Ｉｈ）を取得するように構成され、前記処理ユニットは、第１の電磁行列（Ｉｆｍｏｙ）の前記フロー内の粒子を追跡するように構成される請求項１に記載の画像取得デバイス。
【請求項３】
前記粒子は、微生物であり、前記画像センサ（１６）に由来する２つの取得された画像（Ｉｈ）の間の持続時間は、１分以内である請求項２に記載の画像取得デバイス。
【請求項４】
前記一連の電磁行列（Ｉ１−ＩＮ）は、前記試料（１２）を通る光のデジタル伝搬のモデルによって得られ、前記電磁行列（Ｉ１−ＩＮ）は前記伝搬モデルの光軸までの距離（ｚ）を変調することによって変化する請求項１から３のいずれか一項に記載の取得デバイス。
【請求項５】
前記処理ユニットは、複素空間から実空間への全射の適用による前記伝搬モデルに由来する前記電磁行列を変換するためのユニットを含む請求項４に記載の画像取得デバイス。
【請求項６】
前記第１の電磁行列（Ｉｆｍｏｙ）は、各座標について、前記光軸までの前記距離（ｚ）に従って前記電磁行列（Ｉ１−ＩＮ）の前記座標における前記成分を表現することによって、またすべての表現の最大値の平均を求めることによって得られる請求項４または５に記載の画像取得デバイス。
【請求項７】
前記第２の電磁画像は、前記同定された粒子の各座標について、前記光軸までの前記距離（ｚ）に従って前記電磁行列（Ｉ１−ＩＮ）の前記座標における前記成分を表現することによって、またすべての表現の最大値の平均を求めることによって得られる請求項５または６に記載の画像取得デバイス。
【請求項８】
前記第１の電磁行列（Ｉｆｍｏｙ）を決定し、および／または前記第２の電磁行列を決定するために使用される前記一連の電磁行列（Ｉ１−ＩＮ）のうちの行列は、前記距離に従ってサブサンプリングされる請求項１から７のいずれか一項に記載の取得デバイス。
【請求項９】
複数の取得ユニットを備え、各取得ユニットは画像センサと特定のフォーカシング手段とを備え、前記デバイスは各試料の粒子の画像を表すように構成される請求項１から８のいずれか一項に記載の画像取得デバイス。
【請求項１０】
試料（１２）中に存在する少なくとも１つの粒子（１１ａ〜１１ｆ）の分析の方法であって、
−  前記試料（１２）の第１の表面（１３）の方へ向けられた空間的にコヒーレントな、または疑似コヒーレントな光源（１５）の光を放射するステップと、
−  画像センサを用いて強度画像（Ｉｈ）を取得するステップ（５０）であって、前記センサは、光軸を有しており焦点面と焦平面との間の連結を実行する光学系（２３）の前記焦平面内に置かれ、前記光学系は、前記第１の表面（１３）と反対の前記試料（１２）の第２の表面（１４）の方へ向けられ、前記粒子が前記焦点面内にないように前記試料に対して置かれ、前記画像（Ｉｈ）は前記光源（１５）と前記試料（１２）との間の干渉によって形成される、ステップと、
−  前記取得された画像（Ｉｈ）から、前記焦点面に平行な平面内にあり前記平面に関する複数のオフセットに対して前記試料に含まれる前記電磁波をモデル化する、一連の電磁行列（Ｉ１−ＩＮ）をデジタル方式で構成するステップと、
−  前記一連の電磁行列（Ｉ１−ＩＮ）から前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）上の焦点距離において電磁行列（Ｉｆｐ）を取得するステップ（５４）と、
−  前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）上の前記焦点距離における前記電磁行列（Ｉｆｐ）による前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）の状態を決定するステップ（６０）とを含む方法。
【請求項１１】
前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）上の前記焦点距離における前記電磁行列（Ｉｆｐ）を取得する前記ステップは、
−  前記一連の電磁行列（Ｉ１−ＩＮ）から前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）上の平均焦点距離において第１の電磁行列（Ｉｆｍｏｙ）を決定するステップ（５２）と、
−  前記第１の電磁行列（Ｉｆｍｏｙ）内の前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）を同定し（５３）、前記粒子の座標を記憶するステップと、
−  前記記憶されている座標を有する前記一連の電磁行列（Ｉ１−ＩＮ）の前記成分から前記粒子上の焦点距離において前記電磁行列（Ｉｆｐ）を決定するステップ（５４）とを含む請求項１０に記載の分析方法。
【請求項１２】
前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）の状態を決定する前記ステップは、
−  前記電磁行列（Ｉｆｐ）を前記粒子上の前記焦点距離において回転させて（６１）前記粒子を事前定義済み軸と整列させるステップと、
−  前記事前定義済み軸に沿って整列された前記行列の分布を計算するステップ（６２）とを含む請求項１０または１１に記載の分析方法。
【請求項１３】
画像（Ｉｈ）を取得する前記ステップから前記粒子上の前記焦点距離において前記電磁行列（Ｉｆｐ）を取得する前記ステップまでは、複数の画像について時間の経過を追って実行され、前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）の状態を決定する前記ステップは前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）の時間的変化に従って実行される請求項１０から１２のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１４】
前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）の状態を決定する前記ステップは、
−  各取得された画像について、前記電磁行列を前記粒子上の前記焦点距離（Ｉｆｐ）において回転させて（６１）前記粒子を事前定義済み軸と整列させるステップと、
−  各取得された画像について、前記事前定義済み軸に沿って整列された前記行列の分布を計算するステップ（６２）と、
−  時間の経過を追って各画像に関連付けられている前記分布の行列表現（６３）を形成するステップとを含む請求項１３に記載の分析方法。
【請求項１５】
前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）の状態を決定する前記ステップ（６０）は、前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）の分裂状態に従って実行される請求項１０から１４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１６】
前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）の状態を決定する前記ステップ（６０）は、前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）の形態学的特徴、たとえば、長さに従って実行される請求項１０から１５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１７】
前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）の状態を決定する前記ステップ（６０）は、前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）の生理学的特徴、たとえば、核数に従って実行される請求項１０から１６のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１８】
前記粒子（１１ａ〜１１ｆ）は細菌に対応し、前記試料（１２）は抗生物質を組み込む請求項１０から１７のいずれか一項に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物学的粒子の光学的取得（ｏｐｔｉｃａｌ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）の分野に関する。生物学的粒子は、たとえば、細菌、菌類、または酵母などの微生物であってよい。これらは、細胞、多細胞生物、または汚染粒子タイプの他の粒子、ホコリでもあり得る。
【０００２】
本発明は特に、生物学的粒子の状態を分析して、たとえば、抗生物質の使用後に細菌の代謝状態を知るために有利に応用される。本発明は、たとえば、細菌の耐性記録を形成することを可能にする。
【背景技術】
【０００３】
耐性記録は、１つまたは複数の抗生物質に関して細菌の菌株の表現型を検査することを対象とする検査技法である。耐性記録は、従来、細菌および抗生物質を含む試料の培養によって形成される。
【０００４】
欧州特許出願第２  ６０３  ６０１号では、抗生物質の存在下でインキュベーション期間の後に細菌の状態を可視化することによって耐性記録を形成する方法を説明している。細菌を可視化するために、細菌は２種類の蛍光マーカーでマークされ、その構造を明らかにすることができる。次いで、マーカーの蛍光の測定は、抗生物質が細菌に対して効率的な作用を有したかどうかを決定することを可能にする。
【０００５】
しかしながら、マーキングプロセスは、実施する上で特に長く、複雑なプロセスであり、そのような化学的マーカーは、細菌に対して細胞毒性効果を有する。その結果、そのような可視化モードは、細菌の培養を数回行ったときに細菌を観察することを可能にしない。
【０００６】
したがって、測定の信頼性を保証するために２４から７２時間程度の十分に長い培養時間を使用する必要がある。
【０００７】
生物学的粒子可視化の他の方法は顕微鏡を使用するものであり、試料の非破壊測定を可能にする。
【０００８】
デジタルホログラフィー顕微鏡またはＤＨＭは、従来の光学顕微鏡の被写界深度の制約を撤廃できる撮像技術である。概して、これは、観察される対象物によって回折される光波と空間的コヒーレンスを有する参照波との間の干渉によって形成されるホログラムを記録するステップを含む。そのような技術はＭｙｕｎｇ  Ｋ．  Ｋｉｍの公開されている論文、名称「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、ＳＰＩＥ  Ｒｅｖｉｅｗｓ第１巻第１号、２０１０年１月において説明されている。
【０００９】
近年、自動化された方式で微生物を同定するためにホログラフィーデジタル顕微鏡を使用することが提案されている。そこで、Ｎ．  Ｗｕらの公開されている論文、名称「Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２０１３巻、ａｒｔ．  ＩＤ  Ｎｒ．  １６２１０５において、粒子の焦点面の方へデジタル伝搬により分析される体積中の異なる種類の細菌を同定する方法を説明している。異なる深度で焦点を合わせた画像が、微生物の３次元表現を再構成するために使用される。次いで、後者は３Ｄ非線形フィルタ処理を用いて分類される。
【００１０】
同様に、Ａｈｍｅｄ  Ｅｌ  Ｍａｌｌａｈｉの公開されている論文、名称「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｙ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐａｔｉａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ｓｏｕｒｃｅ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｄｒｉｎｋｉｎｇ  ｗａｔｅｒ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ、第５２巻、第１号、２０１３年１月では、分析される体積中の細菌の位置を検出する第１のステップと、デジタル伝搬を用いて体積中の異なる深度に焦点を合わせるステップと、次いでその形態学的特徴に基づき細菌を分類するステップとを含む方法を説明している。
【００１１】
しかしながら、上述の同定方法は、連続する焦点面におけるフォーカシング（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）を必要とするので複雑である。
【００１２】
その一方で、単一の焦点面、すなわち単一の分析深度におけるフォーカシングは、一般的に、低い誤検出率で微生物の種類を同定するのには十分でない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】欧州特許出願第２  ６０３  ６０１号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｍｙｕｎｇ  Ｋ．  Ｋｉｍの論文、名称「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、ＳＰＩＥ  Ｒｅｖｉｅｗｓ第１巻第１号、２０１０年１月発行
【非特許文献２】Ｎ．  Ｗｕらの論文、名称「Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２０１３巻、ａｒｔ．  ＩＤ  Ｎｒ．  １６２１０５
【非特許文献３】Ａｈｍｅｄ  Ｅｌ  Ｍａｌｌａｈｉの論文、名称「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｙ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐａｔｉａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ｓｏｕｒｃｅ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｄｒｉｎｋｉｎｇ  ｗａｔｅｒ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ、第５２巻、第１号、２０１３年１月発行
【非特許文献４】Ｓａｎｇ−Ｈｙｕｋ  Ｌｅｅらの論文、名称「Ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ  ｔｒａｐｐｅｄ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、第１５巻、第４号、２０１７年２月１９日、１５０５〜１５１２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的とする技術的問題は、したがって、取得時間を制限しながら、すなわち、マーキングなしで、また光学系の正確なフォーカシングなしで、生物学的粒子を観察することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
技術的問題を解決するために、本発明は、フォーカシングのデジタル再構成に関連付けられているフォーカシングなしで単純な取得を組み込んだ粒子の取得のデバイスを実現し、これは少なくとも１つの粒子を検出することを意図されている第１の平均フォーカシングと、粒子を含む関心領域の第２の特定のフォーカシングとを含む。
【００１７】
この目的のために、第１の態様によれば、本発明は、試料中に存在する複数の粒子の取得のデバイスに関係し、前記取得デバイスは
−  前記試料の第１の表面の方へ向けられた空間的にコヒーレントな、または疑似コヒーレントな光源と、
−  前記第１の表面と反対の前記試料の第２の表面の方へ向けられ、粒子が焦点面内にないように試料に対して置かれる、光軸を有しており焦点面と焦平面との間の連結を達成する光学系と、
−  光学系の焦平面内に置かれ、前記光源と前記試料との間の干渉によって形成される強度画像を得るように構成されている、画像センサと、
−  計算処理ユニットであって、
○  取得された画像から、焦点面に平行な平面内にあり前記平面に関する複数のオフセットに対して試料に含まれる電磁波をモデル化する、一連の電磁行列（ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｍａｔｒｉｘ）のデジタル構成のユニットと、
○  一連の電磁行列から粒子上の平均焦点距離において第１の電磁行列を決定するためのユニットと、
○  第１の電磁行列内の粒子の少なくとも１つを同定し、前記粒子の座標を記憶するためのユニットと、
○  記憶されている座標を有する一連の電磁行列の成分から同定された粒子上の焦点距離において第２の電磁行列を決定するためのユニットとを含む計算処理ユニットとを備える。
【００１８】
したがって、本発明は、化学的マーキングなしの最先端技術において説明されているものに似た現象を観察することを可能にする。フォーカシングは、フォーカシングのデジタル再構成に関連付けられている焦点外画像からデジタル方式で実行され、これは少なくとも１つの粒子を検出することを意図されている第１の平均フォーカシングと、粒子を含む関心領域の第２の特定のフォーカシングとを含む。
【００１９】
その結果、計測装置は、数ナノメートルの画像の焦点を合わせることを可能にする高精度のフォーカシングデバイスを使用する必要がないので簡素化される。フォーカシングまたはマーキングがもはや必要ないので、取得時間も短縮される。
【００２０】
さらに、マーキングおよびフォーカシングの動作は、従来から手作業で実行されている。本発明は、また、取得時にそのような手作業による相互作用を制限し、したがって粒子取得プロセスを自動化することも可能である。その結果、試料中に存在する粒子の取得のデバイスは、患者の治療の迅速性を改善するために患者に最も近い位置に位置決めされ得る。
【００２１】
細菌の菌株上で効率的な抗生物質を決定する従来のプロセスは、前記菌株（たとえば、患者、動物、食品バッチ、などにおける）を含む試料を収集するステップと、その後に試料を分析センターに送るステップとを含む。分析センターが試料を受け取ると、最初に、細菌の菌株を培養し、その少なくとも１つのコロニーを取得するが、その培養は２４時間から７２時間続く。次いで、コロニーから、異なる抗生物質および／または異なる濃度の抗生物質を含む複数の試料を調製し、次いで、それらの試料を再びインキュベートさせる。２４から７２時間の範囲内でもある新しい培養期間の後に、各試料は手作業で分析され、抗生物質が効率的な作用を有していたかどうかを決定する。次いで、これらの結果は医療専門家に送り返され、医療専門家は最も効率的な抗生物質および／または抗生物質濃度を適用する。本発明は、分析デバイスを医療専門家の近くに移動させることによってこのプロセスを完全に形成し直すことを可能にするが、それはフォーカシングまたはマーキングを実行するために操作者による繊細な操作がもはや必要ないからである。
【００２２】
典型的には、本発明は、数日かかる場合がある先に説明したプロセスとは反対に、わずか数十分程度のインキュベーションの後の抗生物質の存在下での細菌の構造的変化、および２時間後の反応性（分裂の、または分裂を符号化するパターンの存在または不存在の検出）を検出することを可能にした。実際、測定は非破壊的であり、試料を破壊する、したがって分析時間を長引かせる危険性なく、培養プロセスにおいて非常に早く分析を実行することが可能である。
【００２３】
一実施形態によれば、前記画像センサは、画像フローを取得するように構成され、処理ユニットは、第１の電磁行列のフロー内の粒子を追跡するように構成される。
【００２４】
この実施形態は、複数の連続する画像上で粒子を追跡し、時間の経過を追って粒子の挙動を示すフィルムを形成することを可能にする。従来の化学的マーキング法は、粒子が第１の分析の後に改変されるので時間の経過を追って粒子の挙動を示すことは可能でない。
【００２５】
従来の（非ホログラフィー）顕微鏡を使用する生物学的粒子の可視化の従来の方法は、時間の経過を追って粒子を示すことを可能にするが、各画像について手作業によるフォーカシングを必要とする。実際、粒子は試料中で固定されず、支持平面内で、または試料深度にわたって移動する可能性がある。粒子がその支持平面内でのみ移動するとしても、粒子上のフォーカシングは、支持体が凸凹しているため２つの画像の間で誤る可能性がある。
【００２６】
この実施形態は、支持平面に従って、または試料深度にわたって変化し得るフォーカシングを探索することによって時間の経過を追って粒子を示すことを可能にする。有利には、粒子は、微生物であり、前記画像センサに由来する２つの取得された画像の間の持続時間は、１分以内である。
【００２７】
典型的には、本発明のこの実施形態は、細菌の細胞分裂を観察することを可能にしている。
【００２８】
その結果、この実施形態は、粒子の状態の分析の信頼性および迅速性を向上させることを可能にする。実際、その生理学的特徴だけで粒子を分析する代わりに、その挙動に従って粒子を研究することが可能である。たとえば、効率的な抗生物質が試料中に存在しているときには細菌はもはや分裂しないことを観察することが可能である。
【００２９】
一実施形態によれば、前記一連の電磁行列は、前記試料を通る光のデジタル伝搬のモデルによって得られ、電磁行列は前記伝搬モデルの光軸までの距離を変調することによって変化する。この実施形態は、粒子の画像を効率的に再構成することを可能にする。
【００３０】
有利には、処理ユニットは、複素空間から実空間への全射の適用（ｓｕｒｊｅｃｔｉｖｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）による伝搬モデルに由来する電磁行列を変換するためのユニットを含む。得られる行列は、操作者によって直接理解可能な可視化だけでなく、たとえば粒子形態に基づく従来の画像処理の実装も提供する。
【００３１】
一実施形態によれば、第１の電磁行列は、各座標について、前記光軸までの前記距離に従って電磁行列の前記座標における成分を表現することによって、またすべての表現の最大値の平均を求めることによって得られる。この実施形態は、平均焦点行列を効率的に検出することを可能にする。
【００３２】
一実施形態によれば、第２の電磁画像は、同定された粒子の各座標について、前記光軸までの前記距離に従って電磁行列の前記座標における成分を表現することによって、またすべての表現の最大値の平均を求めることによって得られる。この実施形態は、粒子上に焦点を合わせた行列を効率的に検出することを可能にする。
【００３３】
一実施形態によれば、前記第１の電磁行列を決定し、および／または前記第２の電磁行列を決定するために使用される前記一連の電磁行列のうちの行列は、前記距離に従ってサブサンプリングされる。この実施形態は、フォーカシングに必要な計算時間を制限することを可能にする。
【００３４】
一実施形態によれば、前記デバイスは、複数の取得ユニットを備え、各取得ユニットは画像センサと特定のフォーカシング手段とを備え、前記デバイスは各試料の粒子の画像を表すように構成される。この実施形態は、複数の試料間の高速比較を行い、たとえば耐性記録を形成することを可能にする。
【００３５】
本発明のこの第１の態様は、試料中に存在している複数の粒子を取得する方法の形態でも定式化され、前記取得方法は、
−  前記試料の第１の表面の方へ向けられた空間的にコヒーレントな、または疑似コヒーレントな光源から光を放射するステップと、
−  画像センサを用いて強度画像を取得するステップであって、前記センサは、光軸を有しており焦点面と焦平面との間の連結を実行する光学系の焦平面内に置かれ、光学系は、前記第１の表面と反対の前記試料の第２の表面の方へ向けられ、粒子が焦点面内にないように試料に対して置かれ、画像は前記光源と前記試料との間の干渉によって形成される、ステップと、
−  取得された画像から、焦点面に平行な平面内にあり前記平面に関する複数のオフセットに対して試料に含まれる電磁波をモデル化する、一連の電磁行列をデジタル方式で構成するステップと、
−  第１の電磁行列内の粒子の少なくとも１つを同定し、前記粒子の座標を記憶するステップと、
−  記憶されている座標を有する一連の電磁行列の成分から同定された粒子上の焦点距離において第２の電磁行列を決定するステップとを含む。
【００３６】
第２の態様によれば、本発明は、試料中に存在する少なくとも１つの粒子を分析する方法も対象とし、前記分析方法は、
−  前記試料の第１の表面の方へ向けられた空間的にコヒーレントな、または疑似コヒーレントな光源から光を放射するステップと、
−  画像センサを用いて強度画像を取得するステップであって、前記センサは、光軸を有しており焦点面と焦平面との間の連結を実行する光学系の焦平面内に置かれ、光学系は、前記第１の表面と反対の前記試料の第２の表面の方へ向けられ、粒子が焦点面内にないように試料に対して置かれ、画像は前記光源と前記試料との間の干渉によって形成される、ステップと、
−  取得された画像から、焦点面に平行な平面内にあり前記平面に関する複数のオフセットに対して試料に含まれる電磁波をモデル化する、一連の電磁行列をデジタル方式で構成するステップと、
−  一連の電磁行列から粒子上の焦点距離において電磁行列を取得するステップと、
−  粒子上の焦点距離における電磁行列による前記粒子の状態を決定するステップとを含む。
【００３７】
この第２の態様によれば、本発明は、化学的マーキングなしの最先端技術において説明されているものに似た現象を観察することも可能にする。
【００３８】
フォーカシングは、フォーカシングのデジタル再構成に関連付けられている焦点外画像からデジタル方式で実行される。最終的に、粒子の状態は、焦点画像から決定される。その結果、計測装置は、数ナノメートルの画像の焦点を合わせることを可能にする高精度のフォーカシングデバイスを使用する必要がないので簡素化される。フォーカシングまたはマーキングがもはや必要ないので、取得時間も短縮される。
【００３９】
さらに、マーキングおよびフォーカシングの動作は、従来から手作業で実行されている。この第２の態様によれば、本発明は、また、取得時にそのような手作業による相互作用を制限し、したがって粒子分析プロセスを自動化することも可能である。その結果、試料中に存在する粒子の分析の方法は、患者の治療の迅速性を改善するために患者に最も近い位置で実行され得る。
【００４０】
一実施形態によれば、粒子上の焦点距離における電磁行列を取得するステップは、
−  一連の電磁行列から粒子上の平均焦点距離において第１の電磁行列を決定するステップと、
−  第１の電磁行列内の粒子を同定し、前記粒子の座標を記憶するステップと、
−  記憶されている座標を有する一連の電磁行列の成分から粒子上の焦点距離において電磁行列を決定するステップとを含む。
【００４１】
この実施形態は、少なくとも１つの粒子を検出することを意図されている第１の平均フォーカシングおよび粒子上の第２の特定のフォーカシングを用いて前記粒子の焦点を合わせた行列を効率的に決定することを可能にする。
【００４２】
一実施形態によれば、前記粒子の状態を決定する前記ステップは、
−  電磁行列を粒子上の焦点距離において回転させて粒子を事前定義済み軸と整列させるステップと、
−  前記事前定義済み軸に沿って整列された行列の分布を計算するステップとを含む。
【００４３】
この実施形態は、粒子の配向および位置を不要にすることを可能にする。さらに、この分布は、粒子の形状を分類することを可能にする。
【００４４】
一実施形態によれば、ホログラフィー画像を取得するステップから粒子の焦点画像を取得するステップまでが、複数の画像について時間の経過を追って実行され、前記粒子の状態を決定するステップは前記粒子の時間的変化に従って実行される。
【００４５】
この実施形態は、支持平面に従って、または試料深度にわたって変化し得るフォーカシングを探索することによって時間の経過を追って粒子を示すことを可能にする。有利には、前記画像センサに由来する２つの画像の間の期間は、微生物、特に細菌の場合に、１分以内である。
【００４６】
一実施形態によれば、前記粒子の状態を決定する前記ステップは、
−  各取得された画像について、電磁行列を粒子上の焦点距離において回転させて粒子を事前定義済み軸と整列させるステップと、
−  各取得された画像について、前記事前定義済み軸に沿って整列された行列の分布を計算するステップと、
−  時間の経過を追って各画像に関連付けられている分布の行列表現を形成するステップとを含む。
【００４７】
この実施形態は、粒子分類を改善することを可能にする。
【００４８】
一実施形態によれば、前記粒子の状態を決定する前記ステップは前記粒子の分裂状態に従って実行される。
【００４９】
この実施形態は、たとえば、細菌が分裂周期にあるかどうか、または阻害物質が分裂周期を阻害しているかどうかを検出することを可能にする。
【００５０】
一実施形態によれば、前記粒子の状態を決定する前記ステップは、前記粒子の形態学的特徴、たとえば、長さに従って実行される。
【００５１】
一実施形態によれば、前記粒子の状態を決定する前記ステップは、前記粒子の生理学的特徴、たとえば、核数に従って実行される。
【００５２】
一実施形態によれば、前記粒子は細菌に対応し、前記試料は抗生物質を組み込む。
【００５３】
本発明のこの第２の態様は、試料中に存在している少なくとも１つの粒子を取得するデバイスの形態でも定式化され、前記取得デバイスは、
−  前記試料の第１の表面の方へ向けられた空間的にコヒーレントな、または疑似コヒーレントな光源と、
−  前記第１の表面と反対の前記試料の第２の表面の方へ向けられ、粒子が焦点面内にないように試料に対して置かれる、光軸を有しており焦点面と焦平面との間の連結を実行する光学系と、
−  光学系の焦平面内に置かれ、前記光源と前記試料との間の干渉によって形成される強度画像を得るように構成されている、画像センサと、
−  計算処理ユニットであって、
○  取得された画像から、焦点面に平行な平面内にあり前記平面に関する複数のオフセットに対して試料に含まれる電磁波をモデル化する、一連の電磁行列のデジタル構成のユニットと、
○  一連の電磁行列から粒子上の焦点距離において電磁行列を取得するためのユニットと、
○  第１の電磁行列内の粒子の少なくとも１つを同定し、前記粒子の座標を記憶するためのユニットと、
○  粒子上の焦点距離における電磁行列による前記粒子の状態を決定するためのユニットとを備える。
【００５４】
本発明を実装する方法、さらには結果として得られる利点は、添付図面に基づき、指示として与えられている、次の非限定的な実施形態の説明からさらによくわかり、図１から図６は以下を示している。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の一実施形態による試料中に存在する粒子の取得のデバイスの簡略化された断面図である。
【図２】第１の実施形態による図１の処理ユニットの動作を示すフローチャートの簡略化された表現の図である。
【図３】図２の平均焦点画像決定ユニットの動作を示すフローチャートの簡略化された表現の図である。
【図４】図２の関心領域を決定するためのユニットの動作を示すフローチャートの簡略化された表現の図である。
【図５】第２の実施形態による図１の処理ユニットの動作を示すフローチャートの簡略化された表現の図である。
【図６】図５の粒子状態予測ユニットの動作を示すフローチャートの簡略化された表現の図である。
【図７】閾値分布行列の画像の簡略化された表現の図である。
【図８】本発明の一実施形態による方法による時間の経過を追って観察される細菌を含むサムネイル画像の集合の簡略化された表現の図である。
【図９】図８のサムネイル画像に対応する分布集合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
図１は、試料１２中に存在している粒子１１ａ〜１１ｆを観察するためのデバイス１０を例示している。試料１２は、空間的におよび時間的にコヒーレント（たとえば、レーザー）または疑似コヒーレント（たとえば、発光ダイオード、レーザーダイオード）である光源１５と、光源のスペクトル範囲内で感知できるデジタルセンサ１６との間に配置構成される。好ましくは、光源１５は、小スペクトル幅、たとえば、２００ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、または２５ｎｍ未満の幅を備える。以下では、光源の中心放射波長、たとえば、可視域が参照される。光源１５は、たとえば、光ファイバなどの導波路によって伝達される、試料の第１の表面１３の方へ向けられるコヒーレント信号Ｓｎを放射する。
【００５７】
試料１２は、観察されるべき粒子１１ａ〜１１ｆを含む水、緩衝液、培地、または反応媒体（抗生物質を含むか、または含まない）などの液体である。
【００５８】
一変更形態として、試料１２は、粒子１１ａ〜１１ｆを含む、寒天ゲロースなどの好ましくは半透明の固形培地の形態をとり得る。試料１２は、気体媒体であってもよい。粒子１１ａ〜１１ｆは、媒体内、または試料１２の表面に配置され得る。
【００５９】
粒子１１ａ〜１１ｆは、細菌、菌類、または酵母などの微生物であってよい。これらは、細胞、多細胞生物、または汚染粒子タイプの他の粒子、ホコリでもあり得る。観察される粒子１１ａ〜１１ｆのサイズは、５００ｎｍから数百μｍ、さらには数ミリメートルまで様々なサイズである。
【００６０】
試料１２は、下側プレートおよび上側プレート、たとえば、従来の顕微鏡プレートによって縦に区切られた分析チャンバー内に収容される。分析チャンバーは、接着剤または他の密閉材料によって横方向に区切られる。下側および上側プレートは、光源１５の波長を透過し、試料およびチャンバーはたとえば下側プレート上の法線入射の下で光源の波長の５０％超を通す。
【００６１】
好ましくは、粒子１１ａ〜１１ｆは、上側プレートのレベルで試料１２内に配置構成される。上側プレートの下面は、この目的のために、粒子、たとえば微生物の場合にはポリカチオン（たとえば、ポリ−Ｌ−リジン）を結合することを可能にするリガンドを含む。これは、粒子を光学系の被写界深度に等しい、または近い厚さ内に、すなわち、１ｍｍ未満（たとえば、チューブレンズ）、および好ましくは１００μｍ未満（たとえば、顕微鏡レンズ）の厚さ内に収容することを可能にする。しかしながら、粒子１１ａ〜１１ｆは、試料１２内で移動し得る。
【００６２】
好ましくは、デバイスは、空中に配置構成され、試料から固定された距離のところにある、たとえば顕微鏡レンズおよびチューブレンズから形成される光学系２３を備える。光学系２３は、レンズの前またはレンズとチューブレンズとの間に配置されることが可能であるフィルタを任意選択により装備する。光学系２３は、その光軸、レンズから一定距離のところにある焦点面とも呼ばれるその対物面、および光学系に関して対物面の共役面であるその像面を特徴とする。言い替えれば、対物面内に配置されている対象物は、焦平面とも呼ばれる、像面内にこの対象物の対応する鮮明な像を有する。光学系２３の光学特性は、固定である（たとえば、固定焦点光学系）。対物面および像面は、光軸に直交する。
【００６３】
画像センサ１６は、焦平面内、またはそれに近い位置に、試料の第２の表面１４と反対の側に配置される。センサ、たとえば、ＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサは、感知基本部位（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｉｔｅ）の周期的２次元格子、およびそれ自体知られている仕方で部位の露出時間およびリセットを設定する近接電子システム（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ）を備える。基本部位の出力信号は、露出時間における前記部位に入射するスペクトル範囲の放射線の量の関数として変化する。次いで、この信号は、たとえば、近接電子システムによって、デジタル画像の像点または「ピクセル」に変換される。したがって、センサは、Ｃ列とＬ行からなる行列の形態のデジタル画像を生成する。行列内の座標（ｃ，ｌ）の、この行列の各ピクセルは、それ自体知られている仕方で、光学系２３の焦平面内の直交座標（ｘ（ｃ，ｌ），ｙ（ｃ，ｌ））の位置、たとえば、矩形形状の基本感知部位の中心の位置に対応する。
【００６４】
周期的格子のピッチおよび充填率は、粒子毎に少なくとも２つのピクセルを定義するため、観察されている粒子のサイズに関してシャノン−ナイキスト基準を留意するように選択される。したがって、画像センサ１６は、光源のスペクトル範囲内の試料の透過像を取得する。
【００６５】
画像センサ１６によって取得される画像Ｉｈは、ホログラフィー情報を含むが、それは粒子１１ａ〜１１ｆによって回折される波Ｆｉとそれらとの相互作用をすることなく試料を横切った参照波Ｆｎとの間の干渉の結果生じるからである。もちろん、上で説明されているように、ＣＭＯＳまたはＣＣＤセンサの場合に、ユニット２０で取得され、記憶されているデジタル画像Ｉｈは、強度画像であり、位相情報はしたがってここで強度で符号化され、Ｉｈは関係式
【００６６】
【数１】
2019519761.tif 000003
【００６７】
により表されることは理解され得る。
【００６８】
一変更形態として、光源１５から発せられるコヒーレント信号Ｓｎを２つの成分に、たとえば、ビームスプリッタを用いて分割することが可能である。次いで、第１の成分は、参照波として使用され、第２の成分は、試料１２によって回折され、光学系２３の像面内の画像は回折波と参照波との間の干渉の結果得られる。
【００６９】
画像センサ１６によって得られる強度画像Ｉｈは、観察されるべき粒子上に焦点を合わされず、粒子上に焦点を合わせた情報の取得は、処理ユニット２０によってデジタル方式で達成され、処理ユニット２０は画像センサ１６に接続されており、後者によって取得された画像を受信する。
【００７０】
「焦点外」は、ここでは、焦点面と観察されるべき粒子との間に交差がないことを意味する。
【００７１】
処理ユニット２０は、コンピュータ、マイクロコントローラ、タッチタブレット、もしくはスマートフォン、または一般的に、データを受信し、コンピュータメモリに記憶されている計算命令を実装することによってデータを処理し、コンピュータメモリに処理の結果を配送しおよび／もしくは記憶することができるプロセッサに基づく任意のコンピュータシステムに対応し得る。処理ユニット２０は、有線もしくはワイヤレス方式で画像センサ１６に接続され得るか、またはワイヤレス通信を用いて接続され得る。ユニットは、本発明の方法の中間結果または最終結果を表示するように画面に関連付けられ得る。
【００７２】
図２は、画像センサ１６による強度画像Ｉｈの取得５０の後に、コンピュータによって実装されるコンピュータ命令の形態で処理ユニット２０に組み込まれているコンピュータ処理ユニット５１〜５３を例示している。
【００７３】
第１のユニット５１は、画像Ｉｈから、光学系２３の焦点面に関する複数のオフセット、および特に試料中に位置決めされているオフセットによって光軸に沿って伝搬される光波面をモデル化する「電磁行列」ＥＭと称される一連の複素行列Ｉ１、．．．、Ｉｎ、．．．、ＩＮを構成する。
【００７４】
デジタル伝搬による波面を計算する方法は、Ｓａｎｇ−Ｈｙｕｋ  Ｌｅｅらの公開された論文、名称「Ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ  ｔｒａｐｐｅｄ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、第１５巻、第４号、２０１７年２月１９日、１５０５〜１５１２頁において説明されている。
【００７５】
より具体的には、Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｄの伝搬関数ｈｚ（ｒ）に注目する、すなわち、
【００７６】
【数２】
2019519761.tif 000004
【００７７】
ここで、
−  ｚは、いわゆる「ピンぼけ」高さ、すなわち、焦点面に関する距離である。
−  ｒ＝（｜ｒ｜，θ）は、動径座標｜ｒ｜および角座標の、像面内の極座標における位置である。
−  Ｒ２＝｜ｒ｜２＋ｚ２、および
−  ｋ＝２πｎ／λは、光源の波長λにおける屈折率ｎの伝搬媒質の波数である。
【００７８】
この関係式に基づき、縦座標平面ｚ内の振幅｜ａ（ｒ，ｚ）｜および位相φ（ｒ，ｚ）の電磁波ａ（ｒ，ｚ）は、次の式で表され得る。
ａ（ｒ，ｚ）＝｜ａ（ｒ，ｚ）｜ｅｘｐ（ｉφ（ｒ，ｚ））
【００７９】
【数３】
2019519761.tif 000005
【００８０】
ここで、
−  ｂ（ｒ）は、測定された強度、すなわち、画像Ｉｈ（参照波の強度はここでは一定であると仮定される）である。
−  Ｂ（ｑ）は、ｂ（ｒ）のフーリエ変換である。
−  Ｈ−ｚ（ｑ）は、ｈ−ｚ（ｒ）のフーリエ変換である。
−  ｑは、フーリエ変換におけるｒの双対変数である。
【００８１】
上記の式は、振幅ａ（ｒ，ｚ）の解析的定式化を定義する。このモデルは、均質媒質内の伝搬（したがって、波数の変更がない、波の反射および／または逸脱を発生させる界面が存在しない、など）について開発され、したがって、試料およびエンクロージャ（たとえば、多数の界面および屈折率変化を含む）との関係がないけれども、発明者らは、後で説明されるように、観察された粒子に関連する豊富な電磁情報を再構成することが可能になることに注目した。したがって、有利には、処理ユニット２０は、関わっているすべての媒質に対して共通の単一波数、たとえば、空気の屈折率を記憶する。一変更形態として、ユニット２０は、光軸に沿って異なる関わっている媒質の屈折率を記憶し、界面における現象を考慮して近いところから近いところまで行列Ｉ１−ＩＮを構成する。
【００８２】
細菌については、ｚ方向のサンプリングピッチは、好ましくは、細菌の厚さの１／１０未満、たとえば、０．１μｍ未満、および好ましくは０．０３μｍ未満である。
【００８３】
したがって、電磁行列Ｉ１−ＩＮのスタックは、光軸に沿って縦座標ｚ１、ｚ２、．．．、ｚｎ、ｚＮについて構成されてよく、縦座標の原点（ｚ＝０）は軸焦点位置で取られ、各行列Ｉｎは関係式
【００８４】
【数４】
2019519761.tif 000006
【００８５】
【数５】
2019519761.tif 000007
【００８６】
に従って複素振幅ａ（ｒ，ｚｎ）によって定義されることは理解され得る。
【００８７】
次いで、処理ユニット２０は、複素空間
【００８８】
【数６】
2019519761.tif 000008
【００８９】
から実空間
【００９０】
【数７】
2019519761.tif 000009
【００９１】
への正の全射の適用ＡＳを各行列Ｉｎ上で
【００９２】
【数８】
2019519761.tif 000010
【００９３】
のように計算する。
【００９４】
たとえば、ユニット２０は、成分
【００９５】
【数９】
2019519761.tif 000011
【００９６】
のエルミートノルム（またはその平方）、成分
【００９７】
【数１０】
2019519761.tif 000012
【００９８】
、または
【００９９】
【数１１】
2019519761.tif 000013
【０１００】
、または
【０１０１】
【数１２】
2019519761.tif 000014
【０１０２】
の虚部（
【０１０３】
【数１３】
2019519761.tif 000015
【０１０４】
と表される）または実部（
【０１０５】
【数１４】
2019519761.tif 000016
【０１０６】
と表される）の絶対値または平方を計算する。
【０１０７】
理論によって束縛されることなく、行列ＡＳ（Ｉ１）−ＡＳ（ＩＮ）は、必ずしも、光強度を表さないが、発明者らは、非コヒーレント照明の下で得られる強度画像との類似性に注目した。特に、粒子は、写真の中では、その粒子形態で表現されている。
【０１０８】
したがって、任意の種類の従来の画像処理（セグメンテーション、閾値処理、その形態に基づく粒子の検出など）を適用することが可能であり、さらには、操作者が裸眼で粒子を識別することすら可能である（縞模様の形態で強度で符号化されている画像符号化干渉とは逆に）。以下では、表記を簡単にするために、行列ＡＳ（Ｉ１）−ＡＳ（ＩＮ）は、−ＩＮと表され、表記
【０１０９】
【数１５】
2019519761.tif 000017
【０１１０】
は
【０１１１】
【数１６】
2019519761.tif 000018
【０１１２】
に対応している。
【０１１３】
次いで、本発明による方法は、行列Ｉ１−ＩＮに従って試料中の粒子を同定するステップと、同定された各粒子について、この粒子に対する最適な焦点距離ｚを決定するステップと、次いでこの距離に対応する一連のＩ１−ＩＮの行列内でこの粒子に属するピクセルの集合を決定するステップとを含む。
【０１１４】
第２のユニット５２は、一連の行列Ｉ１−ＩＮから平均焦点距離ｚｆｍｏｙを決定するステップと、この一連の行列の中でＩｆｍｏｙと表される、距離ｚｆｍｏｙに等しいかまたは最も近い距離ｚを有する行列を選択するステップとを対象とする。一変更形態として、ユニット２０は、距離ｚｆｍｏｙについて行列Ｉｆｍｏｙを再計算する。平均焦点距離ｚｆｍｏｙは、所定のフォーカシング基準の意味で粒子１１ａ〜１１ｆの集合上に焦点を合わせる理想的条件に最もよく対応する距離である。この距離は、信号処理の、または写真の分野ではたとえばオートフォーカスの知られているすべての技術によって決定され得る。結果として得られる電磁行列Ｉｆｍｏｙは、行列Ｉｆｍｏｙにおける異なる深度で粒子を検出することができるよう十分に「焦点を合わされている」。検出された粒子は、特に、被写界深度に等しい試料の深度に含まれるものである。前に説明されているように、好ましい一実施形態において、粒子は、この被写界深度に近いか、または等しい厚さを有する体積内に配置構成され、したがって、試料のすべてまたはほとんどすべての粒子は行列Ｉｆｍｏｙ内で検出され得る。
【０１１５】
図３は、画像スタックＩ１−ＩＮ内の距離ｚに従って各座標（ｃ，ｌ）について
【０１１６】
【数１７】
2019519761.tif 000019
【０１１７】
の変化を表すことによる平均焦点距離ｚｆｍｏｙの決定の一例を示している。試料中の粒子が、焦平面内の座標（ｃ，ｌ）の、光学系２３の光軸に平行な軸上に配置されたときに、
【０１１８】
【数１８】
2019519761.tif 000020
【０１１９】
の変化が観察され得る。たとえば、変化
【０１２０】
【数１９】
2019519761.tif 000021
【０１２１】
の、５５における表現は、距離ｚによるガウス関数に類似している。それと反対に、この軸上に粒子が存在していないときに、これは試料の中間のみが存在していることを意味し、
【０１２２】
【数２０】
2019519761.tif 000022
【０１２３】
は全く変化しないか、またはごくわずかしか変化しない。したがって、５６において、この座標に対する特定の焦点距離ｚを表す各座標（ｃ，ｌ）に対する最適なＩｐｍを検出することが可能である。したがって、平均焦点距離ｚｆｍｏｙは、５７において、各座標（ｃ，ｌ）の最適なＩｐｍを検出することによって得られる距離ｚの平均を計算することによってユニット２０により探索され得る。Ｉｆｍｏｙは、計算された距離ｚに最も近い一連の行列Ｉ１−ＩＮのうちの行列である。一変更形態として、ユニット２０は、ｚに従って値
【０１２４】
【数２１】
2019519761.tif 000023
【０１２５】
の最大の変化を有する（たとえば、最大値と最小値との間の最大の差を有する）、Ｐ個の座標、たとえば、１０，０００個の座標を選択し、次いで、これらのＰ個の座標上で距離ｚｆｍｏｙを計算するが、これはこの距離における精度を高める。一変更形態として、集合Ｐの値
【０１２６】
【数２２】
2019519761.tif 000024
【０１２７】
は平均され、ｚに従って平均された値の曲線の最適値が計算され、最適値の距離ｚは距離ｚｆｍｏｙである。
【０１２８】
平均焦点距離ｚｆｍｏｙは、画像の一般フォーカシングを例示しているけれども、各粒子１１ａ〜１１ｆ上のフォーカシングは最適でなく、これは特に互いに関する粒子１１ａ〜１１ｆの深度変化によるものである。特定の粒子１１ａ〜１１ｆ上のフォーカシングを改善するために、本発明は、各粒子に対する最適な焦点距離を決定するステップと、粒子に特有の焦点行列を決定するステップとを提供する。この目的のために、処理ユニット２０は、粒子同定ユニット５３と、各同定された粒子に対する最適な焦点距離を決定し、この距離に対する粒子のピクセルを決定するためのユニット５４とを備える。
【０１２９】
行列Ｉｆｍｏｙにおける粒子の同定のユニット５３は、有限要素の輪郭を検出するためのこの行列の走査などの、最新技術の画像セグメンテーションの複数の形状をとり得る。一変更形態として、ユニット２０は、前の閾値処理を行列Ｉｆｍｏｙに適用し、閾値はたとえばＭｏｙ（Ｉｆｍｏｙ）＋ｐ×Ｅ（Ｉｆｍｏｙ）に等しく、Ｍｏｙ（Ｉｆｍｏｙ）は、行列Ｉｆｍｏｙのピクセルの平均であり、Ｅ（Ｉｆｍｏｙ）は、その標準偏差であり、ｐは１より大きい整数、たとえば６に等しい。次いで、この閾値より大きい値は、粒子に属していると決定され、画像セグメンテーションが、閾値行列上で実装される。そこで、同定の最後に、Ｐａｒｔ＿１、．．．、Ｐａｒｔ＿ｉ、．．．Ｐａｒｔ＿Ｉと表されるピクセル座標（ｃ，  ｌ）のＩ個の集合が得られる。ユニット２０内に記憶される、各集合は、同じ粒子に属している画像ピクセルＩｆｍｏｙの座標のリストである。
【０１３０】
次いで、この方法は、５４において、座標Ｐａｒｔ＿ｉの各集合について、どの距離ｚが対応する粒子に対する最良のフォーカシングを提供するかを決定し、次いで、一連のＩ１−ＩＮにおけるどのような行列がこの距離に対応するかを決定し（またはこの距離に対する新しい画像を計算し）、最後に、集合Ｒｉに集合Ｐａｒｔ＿ｉにリストされている座標に対応する選択された行列のピクセルを記憶する。
【０１３１】
図４は、集合Ｒｉの決定の一例を示している。そのような決定は、５８において、最適な焦点距離ｚｆｏｐｔ＿ｉの計算、たとえば、平均焦点距離の計算に類似する計算から始まる。たとえば、集合Ｐａｒｔ＿ｉの各座標（ｃ，ｌ）について、
【０１３２】
【数２３】
2019519761.tif 000025
【０１３３】
の最適値に対応する距離が計算され、その後、最適な焦点距離ｚｆｏｐｔ＿ｉが計算された距離ｚの平均値に等しくなるように選択される。一変更形態として、集合Ｐａｒｔ＿ｉの値
【０１３４】
【数２４】
2019519761.tif 000026
【０１３５】
は平均され、ｚに従って平均された値の曲線の最適値が計算され、最適値の距離ｚは距離ｚｆｏｐｔ＿ｉである。次いで、５９において、Ｉ＿ｉと表される距離ｚｆｏｐｔ＿ｉに対応する一連のＩ１−ＩＮの行列が選択される。７０において、集合Ｐａｒｔ＿ｉにリストされている座標の選択された行列のピクセルが選択され、集合Ｒｉに記憶される。
【０１３６】
さらに、図３および図４の実施形態は、それらが同じガウス関数を使用するので容易に組み合わされ得る。したがって、処理は、並列実行され、計算時間を制限することができる。計算時間は、また、これは集合Ｒｉを選択することを可能にする行列スタックＩ１−ＩＮの行列を（たとえば、０．１μｍ周期でｚ方向に）サブサンプリングすることによって短縮され得る。
【０１３７】
各同定された粒子について、画像Ｉｆｐ＿ｉは、好ましくは画面２２上に表示される。この画像は、たとえば、ピクセルＲｉを含む行列Ｉ＿ｉの矩形ウィンドウである。図面に例示されているように、桿菌は、実質的に、焦点行列Ｉ＿ｉ内に棒の形状を有する。したがって、医療専門家は、光学系２３を操作することなく粒子１１ａ〜１１ｆの形状を極めて素早く観察することができる。粒子１１ａ〜１１ｆの分析を改善するために、粒子は複数の連続する取得を介して時間の経過を追って表され得る。
【０１３８】
この目的のために、集合Ｒｉが得られたときに、これは処理ユニット２０に結合されているメモリ２１に記憶される。所定の期間の後に、新しい集合Ｒｉが、新しい画像収集Ｉｈを介して探査され、時間ピッチは細菌の場合に５分以内であり、好ましくは１分以内である。発明者らは、この期間は任意の種類の細菌の表現型上のまたは形態学的な変化に追随することを可能にすることを発明を通じて見出した。実際、細菌の画像Ｉｆｐ＿ｉの時系列の単純な目視検査によって、特定の細菌が１分から他の時間までの間に変化することが観察され得る。
【０１３９】
新しい集合Ｒｉは、第１の集合Ｒｉと同じ粒子１１ａ〜１１ｆに対応すべきである。この目的のために、ユニット５３は、前の行列Ｉｆｍｏｙ上で選択された粒子１１ａ〜１１ｆの位置および／または形状に従って集合Ｐａｒｔ＿１〜Ｐａｒｔ＿Ｎを決定する。焦点を合わせたＩｆｐ＿ｉ集合Ｒｉは、すべてメモリ２１に記憶され、画面２２は、医療専門家が粒子１１ａ〜１１ｆに関する焦点画像Ｉｆｐ＿ｉのフローを送り、その挙動を分析することを可能にする。
【０１４０】
デバイスは、また、複数の試料１２の分析を同時に実行し、たとえば、細菌の耐性記録を実行し得る。この目的のために、処理ユニット２０は、複数の試料１２に関連付けられている複数の画像センサ１６に結合されてよい。次いで、処理ユニット２０は、複数の画像センサ１６からの複数の画像Ｉｈを処理し、画面２２は、焦点画像Ｉｆｐを示す。
【０１４１】
説明したばかりの実施形態において、最適な焦点距離ｚｆｏｐｔ＿ｉは、粒子上の平均フォーカシングに対応し、通常その結果、粒子の正中面のフォーカシングが生じる。これは、特に、複数の取得時間の間の集合Ｒｉを比較することを可能にする。一変更形態として、各ピクセルについてフォーカシングが探索され（たとえば、ｚによる
【０１４２】
【数２５】
2019519761.tif 000027
【０１４３】
の最適値に対応する距離の計算、この距離における電磁行列の探索、座標（ｃ，ｌ）のこの行列のピクセルの集合Ｒｉへの記憶）、これは粒子の３Ｄ可視化を構築することを可能にする。しかしながら、粒子の２つの連続する再構成の間の比較はさらに難しい。
【０１４４】
本発明による取得は焦点なしで実行されるが、これは非常に高い周波数で実行されてよく、必要ならば、処理は取得後に実行されてよい。
【０１４５】
図５は、時間の経過を追って微生物の分裂を検出するステップを含む本発明の第２の実施形態を示している。この実施形態では、処理ユニット２０は、微生物に関連付けられているピクセルＲｉの集合の時間的変化による粒子１１ａ〜１１ｆの状態、たとえば、細菌の表現型上のまたは形態学的な状態を決定するためのユニット６０を備える。
【０１４６】
図５の実施形態において、ピクセルＲｉの集合の決定５４は、二重フォーカシング探索（ｄｏｕｂｌｅ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｓｅａｒｃｈ）が実行される図２の実施形態とは逆に画像スタックＩ１−ＩＮからの単純デジタルフォーカシング探索（ｓｉｍｐｌｅ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｓｅａｒｃｈ）によって実行され得る。次いで、集合Ｒｉのピクセルは、行列Ｉｆｍｏｙのピクセルである。一変更形態として、ピクセルＲｉの集合の決定５４は、図２のものと似たプロセスにより実行され得る。
【０１４７】
粒子１１ａ〜１１ｆの状態を決定するためのユニット６０は、異なる指標および処理を実装し得る。たとえば、粒子１１ａ〜１１ｆの状態は、その分裂周期、その形態学的特徴、その生理学的特徴、または複数の指標の組合せの状態に従って分析され得る。
【０１４８】
好ましくは、指標は、状態が探索される粒子１１ａ〜１１ｆの性質に従って定義される。
【０１４９】
抗生物質の存在下の細菌に類似する粒子１１ａ〜１１ｆについて、図６の実施形態は特に効率的である。この実施形態では、強度画像Ｉｈは定期的に、有利には、上で説明された理由から１分毎に取得され、各取得された画像Ｉｈについて、細菌に関連付けられている集合Ｒｉが決定される。
【０１５０】
回転６１は集合Ｒｉに適用され、たとえば、横座標の軸ｘ（すなわち、取得された画像の行に対応する軸）上で粒子を左手側に整列することによって、時間不変の事前定義済み軸上で粒子１１ａ〜１１ｆを整列し、位置決めする。次いで、整列された集合Ｒｉは、たとえば、各縦座標（すなわち、取得された画像の列軸）上のピクセルの平均を計算することによって、整合軸上に投影される。こうして得られた分布Ｉｐは、６２に、ピクセルの縦座標ｘの位置による列毎の和Ｉｍの分布の形態で示され、たとえば、行ベクトルの形態でユニット２０に記憶される。
【０１５１】
次いで、分布は、行列内で分布Ｉｐを連結することによって時間の経過を追って表される。ｑ番目の取得された画像Ｉｈから得られた分布Ｉｐ＿ｑ、および最後の取得時間Ｑに注意すると、そこでＤｉｓｔ＿Ｑと表される行列は、
【０１５２】
【数２６】
2019519761.tif 000028
【０１５３】
と書かれ得る。
【０１５４】
こうして得られた行列表現は、粒子１１ａ〜１１ｆの状態を決定するために特に効率的である。たとえば、そのような行列表現は、粒子の伸長または少なくとも１つの細胞分裂の存在を観察することを可能にする。
【０１５５】
次いで、行列表現の形状に対する単純な閾値処理は、抗生物質が細菌に対して効率的な作用を有したかどうかを定義することを可能にする。特に、図７に例示されているように、０と１とから形成される、閾値行列において、０のブロックの出現が分裂の開始時間をマークする、１の２つのブロックで囲まれた０のブロックが現れ、増大することがわかる。処理ユニット２０による、そのようなブロックの出現の同定は、したがって、単純な方式で細菌の分裂を同定することを可能にする。一変更形態として、他の分析は、画像センサ１６によってキャプチャされたホログラフィー画像Ｉｈの間の粒子１１ａ〜１１ｆの移動速度をモデル化することによって、または知られている形状の粒子との照合により粒子１１ａ〜１１ｆの構造的特徴を分析することによって実行され得る。
【０１５６】
したがって、本発明は、試料１２中に存在している粒子１１ａ〜１１ｆの正確な画像を取得することを可能にする。典型的には、本発明は、１００から４００ピクセルの範囲内の多数のピクセルで細菌を表現するサムネイル画像を取得することを可能にした。その結果、微生物の内容を可視化することが視覚的にまたはデジタル方式で、したがってマーキング（たとえば、蛍光）なしで、可能である。特に、細菌の細胞内物質の分布が観察できる。理論に拘束されることなく、発明者らは、その分裂の前の細菌内の２つの棒の出現を観察することができたが、これは細菌の時間的変化を示す図８に示されているように、細菌の減数分裂に対応し得る。したがって、類似の値の２つの領域の出現を決定するために、処理ユニット２０は、細菌の集合Ｒｉの、または分布Ｉｐ＿ｑの処理を時間の経過を追って実施する。したがって、細菌の分裂は、分裂が生じるかなり前に予測される。図９は、図８に例示されている細菌の分布Ｉｐ＿ｑを示している。図面を観察するとわかるように、細菌が分裂の準備をするときに、実際の分裂が生じるかなり前に、分布の異なる２つの部分に変形する２つの棒が分布内に現れる。処理ユニット２０は、たとえば、分布内の２つの棒の出現を検出し、この検出に従って、細菌の分裂を予測し、それに従って、試料中に存在する抗生物質への反応性を予測するように構成される。
【０１５７】
さらに、本発明は、また、時間の経過を追って粒子１１ａ〜１１ｆの変化を得て、その挙動、たとえば、その移動速度またはその細胞分裂過程を可視化することを可能にする。
【０１５８】
特に、本発明によって得られる解像度（発明者らによって設計されたシステムに対しては細菌毎に数百ピクセル）により、細菌の形態および細胞内含有物に対する抗生物質の影響を観察することが可能である。さらに、本発明の高い取得率は、細菌の変化（たとえば、成長、分裂、培地に対する反応、抗生物質を含む媒体に対する反応、など）を時間の変化とともに非常に精密に追跡することを可能にする。
【０１５９】
空中および試料から一定距離のところにある対象物が説明された。他の種類の配置構成も可能であり、たとえば、試料を受け入れ、および／または試料に関して移動することができる液体タンク内に浸漬された顕微鏡レンズも可能である。
【符号の説明】
【０１６０】
１０  デバイス
１１ａ〜１１ｆ  粒子
１２  試料
１３  第１の表面
１４  第２の表面
１５  光源
１６  画像センサ
２０  ユニット
２１  メモリ
２２  画面
２３  光学系
５０  取得
５１〜５３  コンピュータ処理ユニット
５３  粒子同定ユニット
５４  ユニット
５４  決定
６０  ユニット
【図１】
2019519761.tif 000029
【図２】
2019519761.tif 000030
【図３】
2019519761.tif 000031
【図４】
2019519761.tif 000032
【図５】
2019519761.tif 000033
【図６】
2019519761.tif 000034
【図７】
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【図８】
2019519761.tif 000036
【図９】
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【国際調査報告】
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