(57)【要約】    本開示は、疎水性鎖を含むポリ（Ｌ−リジンイソフタルアミド）（ＰＬＰ）誘導体に基づく新たな生分解性両親媒性である、ペプチド及びペプチド類似体の提供、並びに哺乳動物細胞の透過処理、及び薬剤、例えば治療剤、造影剤、及び細胞保存剤の送達におけるそれらの使用に関する。【選択図】図９Ｂ
2019531330.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2019531330.tif 000013
を含むポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体であって、
式中、Ｒは、ＮＲ１Ｒ２又はＯＨを含み、Ｒの少なくとも１つがＮＲ１Ｒ２であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ；Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニル、Ｃ６〜１０アリール、又はＣ５〜１０ヘテロアリールを含み、
Ｒ１及びＲ２のアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基は、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、＝ＮＲ３、＝Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ３〜７シクロアルキル、Ｃ３〜１０ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基、及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、Ｒ３で置換されたアリール、及びＲ３で置換されたヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、並びに化学的に適切な場合、＝Ｏであり、並びに
Ｒ３及びＲ４のそれぞれは、独立してＨ、又はＣ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ６〜１０アリールであり、
Ｒ１及びＲ２のアリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１６アルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ４〜１４ヘテロアリール、又はＳ−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アルキル基は、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
Ｒ３及びＲ４は上記で定義した通りであり、並びにＲ５及びＲ６はそれぞれ独立して、Ｈ；ＯＲ３若しくはハロで任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、又はＣ１〜６アルキル、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜６アルキル）、若しくはＯ−Ｃ６〜１４アリールで任意選択で置換されたＣ６〜１４アリールであり、或いは
Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する窒素原子と共に、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ又は複数の追加のヘテロ原子を任意選択で含有し、並びにＣ１〜１６アルキル、Ｃ１〜１６ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール、又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換された５員、１２員複素環を形成し、
アルキル基及びハロアルキル基は、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
Ｒ３及びＲ４は上記で定義した通りであり、及びｎ≧４である、
ポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、
Ｈ；
ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換されたＣ６〜３０アルキル基、Ｃ６〜３０アルケニル基、又はＣ６〜３０アルキニル基を含み、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、並びにＲ３及びＲ４のそれぞれは、独立してＨ又はＣ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ６〜１０アリールであり、
Ｃ６〜１０アリールは、Ｃ１〜１６アルキル、Ｃ１〜１６ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール、又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アルキル基及びハロアルキル基は、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
Ｒ３及びＲ４は上記で定義した通りであり、或いは
Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する窒素原子と共に、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ又は複数の追加のヘテロ原子を任意選択で含有し、並びにＣ１〜１６アルキル、Ｃ１〜１６ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換された５員、１２員複素環を形成し、
アルキル基及びハロアルキル基は、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
Ｒ３及びＲ４は、上記で定義した通りであり、及びｎ≧４である、
請求項１に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項３】
Ｒ１は、請求項１で定義する通りであり、及びＲ２は、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニル、Ｃ６〜１０アリール、又はＣ５〜１０ヘテロアリールであり、そのいずれも、請求項１で定義するように任意選択で置換される、請求項１に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項４】
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニルであり、そのいずれも、請求項１で定義するように任意選択で置換されてもよく、及びＲ２は、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニルであり、そのいずれも、請求項１で定義するように任意選択で置換されてもよい、請求項３に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項５】
Ｒ１は、Ｈ、又はＣ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニルであり、そのいずれも、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＳＨ、メトキシ、又はエトキシで置換されていない又は置換されており、及び
Ｒ２は、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニルであり、そのいずれも、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＳＨ、メトキシ、又はエトキシで置換されていない、又は置換されている
請求項４に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項６】
Ｒ１は、Ｈ又は置換されていないＣ６〜３０アルキル、置換されていないＣ６〜３０アルケニル、又は置換されていないＣ６〜３０アルキニルであり、及びＲ２は、置換されていないＣ６〜３０アルキル、置換されていないＣ６〜３０アルケニル、又は置換されていないＣ６〜３０アルキニルである、請求項５に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項７】
Ｒ１は、Ｈであり、及びＲ２は、置換されていないＣ７〜１８アルキルである、請求項５に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項８】
Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立して置換されていないＣ７〜１８アルキルである、請求項７に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項９】
Ｒ２は、ｎ−ヘプチル、ｎ−デシル、ｎ−テトラデシル、又はｎ−オクタデシルである、請求項７に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項１０】
前記Ｒ２は、ｎ−デシルである、請求項９に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項１１】
部分Ｒの０．１〜９９％がＮＲ１Ｒ２である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項１２】
部分Ｒの３〜１８％が、ＮＲ１Ｒ２である、請求項１１に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項１３】
Ｒ１及びＲ２のそれぞれが、Ｃ７〜１８アルキル、Ｃ７〜１８アルケニル、又はＣ７〜１８アルキニルであり、そのいずれも、請求項２で定義するように任意選択で置換されていてもよい、請求項２から１２に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項１４】
Ｒ１及びＲ２のそれぞれが、Ｃ７アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１４アルキル、又はＣ１８アルキルであり、そのいずれも、請求項２に記載のように任意選択で置換されていてもよい、請求項１３に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項１５】
Ｒ１及びＲ２のそれぞれが、ハロ、シアノ、ニトロ、アゾ、ジアゾニウム、リン酸、リン酸エステル、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、ＲＮ３、リン酸、リン酸エステルから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、並びに
Ｒ３及びＲ４のそれぞれは、独立してＨ又はＣ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニルである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項１６】
Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、ハロ、シアノ、ニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ３ＳＲ３、Ｃ６〜１０アリール又はヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル、ハロ、シアノ、又はニトロから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、並びにＲ３及びＲ４のそれぞれは、独立してＨ又はＣ１〜６アルキルである、請求項２から１４のいずれか一項に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項１７】
前記ペプチドが、細胞に細胞内送達するための薬剤と直接的又は間接的のいずれかで会合している、請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項１８】
前記薬剤が、前記ポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体と共有結合的又は非共有結合的に会合している、請求項１７に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項１９】
前記薬剤が、治療剤である、請求項１８に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項２０】
前記薬剤が、造影剤である、請求項１８に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項２１】
前記薬剤が、細胞保存剤である、請求項１８に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体。
【請求項２２】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体を調製する方法であって、
ｉ）アセトン中で、水性リジンメチルエステル・２ＨＣｌを、１当量の塩化イソフタロイルと重合させ、その後エタノール性水酸化ナトリウムを用いて、ＤＭＳＯ中で加水分解するステップと、
ｉｉ）ＮＲ１Ｒ２を含み、上記のように定義されるＲを、ジシクロヘキシルカルボジイミド／ジメチルアミノピリジン（ＤＣＣ／ＤＭＡＰ）カップリングによりポリマー骨格にコンジュゲートするステップ、又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）カップリングによりＲをコンジュゲートするステップと
を含む方法。
【請求項２３】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体を含む組成物。
【請求項２４】
薬剤が、治療剤であり、及び組成物が、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、哺乳動物細胞又は哺乳動物細胞の集合を含む、請求項２３又は２４に記載の組成物。
【請求項２６】
少なくとも１つの薬剤を哺乳動物細胞、細胞凝集物、組織又は器官に送達する際に使用される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
薬剤を細胞に送達するｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であって、
ｉ）細胞又は細胞凝集物、細胞を含む組織又は器官を、有効量の請求項２３に記載の組成物と接触させるステップと、
ｉｉ）前記細胞、細胞凝集物、組織又は器官をインキュベートして、前記哺乳動物細胞又は細胞凝集物、細胞を含む組織又は器官の透過処理を可能にし、それにより前記薬剤を送達するステップと
を含む方法。
【請求項２８】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
哺乳動物細胞、細胞凝集物、組織又は器官を保存するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であって、
ｉ）哺乳動物細胞調製物、哺乳動物細胞凝集物、組織又は器官、及び請求項２３に記載の組成物を含む調製物を提供するステップと、
ｉｉ）前記哺乳動物細胞、細胞凝集物、組織又は器官の哺乳動物細胞膜を透過処理するために前記調製物をインキュベートするステップと、
ｉｉｉ）前記透過処理された細胞、細胞凝集物、組織又は器官を、１つ又は複数の保存剤と接触させるステップと
を含む方法。
【請求項３０】
前記保存剤が、糖である、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、疎水性ペンダント鎖を含む新たな生分解性両親媒性ペプチド及びペプチド類似体に基づく誘導体の提供、哺乳動物細胞の透過処理におけるその使用、並びに１つ又は複数の薬剤の細胞内送達における、ペプチド又はペプチド類似体に基づく誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子は有利な物理的及び化学的特性を有することから、生物学及び医療におけるその応用が近年急速に増加している。ナノ粒子は、様々な無機又は有機材料から構成されることがわかり、細胞療法、組織工学、バイオマーカー、ラベリング及びトラッキング剤、遺伝子療法用のベクター、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、造影剤、並びに薬物送達などの様々な生物医学的用途に使用されている。
【０００３】
薬物送達を目的とする場合、ナノ粒子は、生体適合性のあるサブミクロンサイズの粒子（＜１μｍ）であって、その中で所望の薬物が、溶解、カプセル化、複合体形成又は共有結合している粒子として定義される。ナノ粒子は、生物医学的用途において有用であるためには、しばしば矛盾する広範囲の技術的特徴を満たさなければならない。ナノ粒子は、標的を定めた薬物送達及び持続放出を可能にするためにきわめて安定であることが必須である。ナノ粒子は、親水性化合物及び疎水性化合物の両方の輸送を可能にする両親媒特性を有しており、材料の選択をしばしば制限する化学修飾に適している。更に、ナノ粒子は、様々な投与経路、例えば経口投与又は吸入による投与等に適合するように調整されなければならない。別の重要な側面は、拒絶されるリスクを最小限に抑え、毒性成分への分解を回避するために、ナノ粒子は、合成若しくは天然ポリマー又は脂質のような生体適合性の生分解性物質から構成されるということである。生分解性有機ポリマー、例えばポリヒドロキシブテレート(ＰＨＢ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクタム（ＰＣＬ）、ポリアミノ酸、ポリアミド、ポリグリシドール等は、薬物送達用のナノ粒子の開発において適する物質として現在考えられている。ナノ粒子に基づく送達媒体の更なる目的は、疾患及び障害の治療において、治療剤が細胞を特異的に標的とすることにより投与量を低減する手段を提供し、これにより副作用プロファイルを低下させ、これにより患者に対して改善した治療レジメンを提供することである。
【０００４】
生分解性の擬ペプチドポリマーが設計され、そして薬剤の送達において高分子透過処理剤として使用されている。例えば、国際公開第２０１１０８９３９１号では、薬剤、例えば公知の細胞保護剤として知られるトレハロースの取り込みを改善するために細胞膜を可逆的に透過処理するためのポリ（Ｌ−リジンイソフタルアミド）（ＰＬＰ）のカルボン酸基にグラフト結合した１つ又は複数の疎水性アミノ酸を有するポリマーの使用が開示されている。国際公開第２００４／０５２４０２号では、ナノ粒子と任意選択で会合した治療剤、例えば化学療法剤、抗体、抗生物質、及びｓｉＲＮＡ等の送達、並びに造影剤の送達で使用するための擬ペプチドに基づく高分子薬剤が開示されている。
【０００５】
生物学的製品を保存及び長期保管する方法の改善は、有用な生体試料、例えば臨床医学及び生物製剤の用途で使用される造血細胞（例えば、赤血球、血小板、及びリンパ球）、幹細胞（例えば、骨髄細胞）、免疫細胞、生殖細胞等を保護及び保管するために緊急に必要とされる。細胞凍結保存法は、細胞の寿命を延ばすために研究室で日常的に使用されているが、細胞内の酵素活性及び化学活性に対する何らかの障害を低下させることを目的として、氷点下の温度で細胞又は組織を低速凍結する従来の方法、又は超高速凍結する方法と関係する。しかし、凍結すれば細胞の寿命を延ばすことができるが、細胞間若しくは細胞外での氷結晶形成又は浸透圧ショックを原因とする細胞障害を引き起こすおそれもある。細胞保護（ｃｙｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）方法、例えば、細胞を凍結又はガラス化すること等は、従って冷却及び加温プロセス期間中に生ずる障害から細胞構造を保護する目的で、細胞保護剤（ＣＰＡ）、例えばジメチルスルホキシド、グリセロール、１，２−プロパンジオール、ヒドロキシエチルスターチ、又はポリエチレングリコール等の存在下で多くの場合実施されるが、但しこのような化合物は有益な効果を有することが公知であるであるものの、細胞の溶解、細胞の分化、及び毒性を防止するために、ＣＰＡを制御下で添加及び除去する必要がある。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、細胞の保管において、現在のところ最も幅広く用いられている凍結保護物質である；但し、ＤＭＳＯはきわめて毒性であり、また間葉系幹細胞の３０％及びヒト胚性幹細胞の約５０％で細胞死を引き起こす。更に、ＣＰＡを用いて保管された細胞を取得した患者の約１．５％で、極度の副作用、例えば呼吸器系及び／又は心血管系の問題等を経験する。
【０００６】
天然の細胞保存方法は、細胞内に高濃度のトレハロースが存在することにより凍結しても生存可能な多細胞生物である緩歩類（Ｔａｒｄｉｇｒａｄａ）から公知である。低分子の炭化水素である糖、例えばトレハロース、スクロース、又はマルトース等は、従来型のＣＰＡ、例えばＤＭＳＯ又はグリセロール等よりも優れた物理化学特性を有することが公知であり、また当技術分野において公知である。国際公開第２０１２／０９８３５８号は、凍結乾燥した細胞の生存率及び機能性を改善するための、異なるバッファーと再構成溶液とを組み合わせた保存剤としてのトレハロース及びその他の炭化水素について開示している。
【０００７】
しかし、低分子の糖は、細胞保護特性に優れるものの、何らかの細胞保護効果を得るのに必要な細胞膜を横断する細胞内輸送が困難である。糖の取り込みを改善するために、微量注入、電気的膜透過処理、又は細菌毒素を使用することによる細胞透過性の増加等の方法が開発された。米国特許第２００５２７７１０７号は、微量注入により細胞内に送達するためのトレハロースのような炭化水素を含む組成物について開示する。米国特許第６１２２７１７７号は、細胞を一時的に穿孔させてトレハロース等のバイオ防腐剤をローディングするためのＨ５−アルファ毒素の使用を開示する。高分子化合物、例えば修飾されたビニルポリマー（ビニルポリ（α−アルキルアクリル酸）ポリマー）等は、エンドソームｐＨ値において脂質二重膜を破壊することが公知であり、また細胞質薬物送達における潜在的用途を有する。但し、ビニルポリマーは生分解性ではない。
【０００８】
本開示は、疎水性側鎖、例えば脂肪族アルカン側鎖等を含む新たな両親媒性ペプチド及びペプチド類似体に基づく誘導体の提供、及び細胞膜の透過処理を通じて薬剤の取り込みを増加させるためのそのようなペプチド又はペプチド類似体に基づく誘導体の使用に関する。例えば、凍結又は乾燥の有害な影響から細胞、組織、及び器官を保護する薬剤の送達におけるペプチド又はペプチド類似体に基づく誘導体の使用が挙げられる。更に、ペプチド誘導体は、疾患及び障害の治療における治療剤の送達に有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様によれば、両親媒性ペプチド又は両親媒性ペプチド類似体が提供され、前記ペプチドは、１つ又は複数の疎水性ペンダント鎖を含む。
【００１１】
好適には、疎水性ペンダント鎖は、Ｃ１〜２００アルキル基、Ｃ２〜２００アルケニル基、又はＣ２〜２００アルキニル基であり、そのいずれもハロ、シアノ、ニトロ、アゾ、ジアゾニウム、リン酸、リン酸エステル、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール、又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で置換されていてもよく、アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、リン酸、リン酸エステルから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、並びにＲ３及びＲ４のそれぞれは、独立してＨ、又はＣ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニルである。
【００１２】
好適には、疎水性ペンダント鎖は、上記のように任意選択で置換されていてもよいＣ５〜４０アルキル、Ｃ５〜４０アルケニル、又はＣ５〜４０アルキニルである。
【００１３】
本明細書では、「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードを指す。
【００１４】
好適には、疎水性ペンダント鎖は、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニル基であり、そのいずれも、ハロ、シアノ、ニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ６〜１０アリール又はヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で置換されていてもよく、アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル、ハロ、シアノ、又はニトロから選択される１つ又は複数の置換基で  任意選択で置換され、並びにＲ３及びＲ４のそれぞれは、独立してＨ又はＣ１〜６アルキルである。
【００１５】
好適には、疎水性ペンダント鎖は、上記のように任意選択で置換されていてもよいＣ７アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１４アルキル、又はＣ１８アルキルである。
【００１６】
適する疎水性ペンダント鎖の例は、オクタトリアコンタン酸（Ｃ３８）、ヘントリアコンタン酸（Ｃ３１）、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２）、アミノ官能化ポリラクチド２５００Ｄａ及び４０００Ｄａ、アミン末端ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）２５００Ｄａ、５０００Ｄａ、又は５５００Ｄａ、プルロニック、飽和及び不飽和脂肪酸、デシルアミン、オクタデシルアミン、ジヘキシルアミン、ジオクタデシルアミン、３−ブテニルアミン塩酸塩、オレイルアミン、エチル（プロプ−２−エン−１−イル）アミン、ビス［（２Ｚ）−３−クロロブタ−２−エン−１−イル］アミン、メチル［７−（メチルイミノ）ヘプタ−１，３，５−トリエン−１−イル］アミン、ブタ−３−イン−１−アミン塩酸塩、３−フルオロ−２−メチルオクト−７−イン−１−アミン、［４，４−ジメチル−２−（ペント−４−イン−１−イル）シクロヘキシル］メタンアミン、ビス（ブタ−２−イン−１−イル）アミン、（デカ−１−イン−４−イル）（プロピル）アミン、（８−アミノオクタ−１，３，５，７−テトライン−１−イル）ボラン、Ｎ−（２−ナフチル）−１−ナフチルアミン、ｃ−（２−ｐ−トリル−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル）−メチルアミン、１，１−ビス（４−クロロフェニル）−２−［（２−フルオロベンジル）アミノ］−１−エタノール、４−テトラデシルアニリンビス［２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）エチル］アミン溶液、３−（Ｆｍｏｃ−アミノ）ベンゾニトリル、ｈ−ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ｎｈ２、１，７−ジベンジル−１，４，７、１０−テトラアザシクロドデカン、２−（３−オキソ−デカヒドロ−キノキザリン−２−イル）−Ｎ−（４−フェノキシ−フェニル）−アセトアミド、ポンタシルカルミン２ｂ、２−［（２−アミノ−４−メチルフェニル）スルファニル］−Ｎ−（２−メチルフェニル）アセトアミド、４−ニトロフェネチルアミン塩酸塩、３−（エトキシジメチルシリル）プロピルアミン、（１，２，３，６−テトラヒドロピリジン−４−イル）ホスホン酸、ポリ（プロピレングリコール）−、ポリエチレン−、及びポリスチレンに基づくポリマーからなる群より選択される。
【００１７】
適する疎水性ペンダント鎖は、ジシクロヘキシルカルボジイミド／ジメチルアミノピリジン（ＤＣＣ／ＤＭＡＰ）カップリング、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）カップリングにより、又は当業者にとって公知のその他の確立された架橋技術を使用して両親媒性ペプチド又は両親媒性ペプチド類似体にコンジュゲートし得る。
【００１８】
疎水性ペンダント鎖は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｓ（Ｏ２）Ｎ−、−ＳＳ、−ＮＮ−、−ＣＮ−、−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（Ｏ）−、−Ｐ（Ｏ）Ｏ−、−ＳｉＯ−、−Ｎ３−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＮＲ−、−ＯＰ（ＯＯＨ）Ｏ−、−Ｐ（ＯＯＲ）−結合から選択されるリンカーを介してポリマー骨格と連結し得る。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、前記ペプチド類似体は、ポリ（リジンイソフタルアミド）（ＰＬＰ）を含む。
【００２０】
本発明の１つの実施形態では、前記ペプチドは、弱電離カルボン酸基を有する両親媒性ポリマーを含み、ここで、前記ポリマーは、（ａ）２つのカルボキシル基を含有するモノマー、例えばイソフタル酸等、又は２つの塩化アシルを含有するモノマー、例えば塩化イソフタロイル等；及び（ｂ）２つのアミン基を含有するモノマー、例えば、リジン、システイン、セレノシスチン、２，４−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、オルニチン、及び２，６−ジアミノピメリン酸等のコポリマーを含む。
【００２１】
本発明の更なる代替的な実施形態では、前記ペプチドは、天然のポリアミノ酸、例えばポリ（アスパラギン酸）及びポリ（グルタミン酸）、及びその誘導体等を含む。
本発明の特別な実施形態
【００２２】
本発明の１つの態様、又は好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物
【００２３】
【化１】
2019531330.tif 000003
を含むペプチドであって、
式中、Ｒは、ＮＲ１Ｒ２又はＯＨを含み、Ｒの少なくとも１つがＮＲ１Ｒ２であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ；ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール、又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ若しくは複数の置換基で任意選択で置換されたＣ１〜２００アルキル、Ｃ２〜２００アルケニル、又はＣ２〜２００アルキニル基を含み、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、並びにＲ３及びＲ４のそれぞれは、独立してＨ、又はＣ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ６〜１０アリールであり、
Ｃ６〜１０アリールは、Ｃ１〜１６アルキル、Ｃ１〜１６ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール、又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ若しくは複数の置換基で任意選択で置換され、
アルキル基及びハロアルキル基は、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
Ｒ３及びＲ４は、上記で定義した通りである、或いは
Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する窒素原子と共に、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ又は複数の追加のヘテロ原子を任意選択で含有し、並びにＣ１〜１６アルキル、Ｃ１〜１６ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール、又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換された５員、１２員複素環を形成し、
アルキル基及びハロアルキル基は、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
Ｒ３及びＲ４は上記で定義した通りであり、及びｎ≧４である、
ペプチドが提供される。
【００２４】
代替的実施形態では、前記ペプチドは、一般式（Ｉ）
【００２５】
【化２】
2019531330.tif 000004
を含むポリ（リジンイソフタルアミド）化合物であり、
式中、Ｒは、ＮＲ１Ｒ２又はＯＨを含み、Ｒの少なくとも１つがＮＲ１Ｒ２であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ；Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニル、Ｃ６〜１０アリール、又はＣ５〜１０ヘテロアリールを含み、
Ｒ１及びＲ２のアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基は、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、＝ＮＲ３、＝Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ３〜７シクロアルキル、Ｃ３〜１０ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基、及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、Ｒ３で置換されたアリール、及びＲ３で置換されたヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、及び化学的に適切な場合、＝Ｏであり、並びに
Ｒ３及びＲ４のそれぞれは、独立してＨ、又はＣ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ６〜１０アリールであり、
Ｒ１及びＲ２のＣ６〜１０アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１６アルキル、Ｃ１〜１６ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール若しくはＣ４〜１４ヘテロアリール、又はＳ−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アルキル基及びハロアルキル基は、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
Ｒ３及びＲ４は上記で定義した通りであり、並びにＲ５及びＲ６はそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＲ３若しくはハロで任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、又はＣ１〜６アルキル、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜６アルキル）、若しくはＯ−Ｃ６〜１４アリールで任意選択で置換されたＣ６〜１４アリールであり、或いは
Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する窒素原子と共に、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ又は複数の追加のヘテロ原子を任意選択で含有し、並びにＣ１〜１６アルキル、Ｃ１〜１６ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、＝Ｏ、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール、又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換された５員、１２員複素環を形成し、
アルキル基及びハロアルキル基は、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
Ｒ３及びＲ４は上記で定義した通りであり、及びｎ≧４である。
【００２６】
場合によっては、本発明のこの態様では、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ；ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール、又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換されたＣ６〜３０アルキル基、Ｃ６〜３０アルケニル基、又はＣ６〜３０アルキニル基を含み、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、並びにＲ３及びＲ４のそれぞれは、独立してＨ又はＣ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ６〜１０アリールであり、
Ｃ６〜１０アリールは、Ｃ１〜１６アルキル、Ｃ１〜１６ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール、又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アルキル基及びハロアルキル基は、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
Ｒ３及びＲ４は上記で定義した通りであり、或いは
Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する窒素原子と共に、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ又は複数の追加のヘテロ原子を任意選択で含有し、並びにＣ１〜１６アルキル、Ｃ１〜１６ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、−ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換された５、１２員複素環を形成し、
アルキル基及びハロアルキル基は、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、ＣＭ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、
Ｒ３及びＲ４は上記で定義した通りであり、及びｎ≧４である。
【００２７】
好ましい化合物では、ｎは４〜３６２３の間；好ましくは４〜１０００、１００１〜２０００、２００１〜３０００の間、及びなおいっそうより好ましくは３００１〜３６２３の間である。
【００２８】
代替的な好ましい化合物では、ｎは４〜３６２の間；好ましくは４〜２７２、４〜１８１の間、及びなおいっそうより好ましくは４〜１５０の間である。
【００２９】
代替的な好ましい化合物では、ｎは４〜２００の間；好ましくは２０〜１７０の間、及びなおいっそうより好ましくは４０〜１４０の間である。
【００３０】
代替的な好ましい化合物では、ｎは１２０〜１５０の間；好ましくはｎ＝１３０である。
【００３１】
代替的な好ましい化合物では、ｎは４０〜６０の間、好ましくはｎ＝４９である。
【００３２】
ＰＬＰポリマーの例は、特許出願国際公開第２００４／０５２４０２号及び米国特許第２００６１７２４１８号に記載されており、その内容は本明細書により参照としてそのまま組み込まれている。
【００３３】
ポリ（リジンイソフタルアミド）誘導体は、ポリ（Ｌ−リジンイソフタルアミド）化合物であり得る。
【００３４】
代替的な化合物では、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、上記のように任意選択で置換されていてもよいＣ５〜４０アルキル、Ｃ５〜４０アルケニル、又はＣ５〜４０アルキニルを含む。
【００３５】
代替的な化合物では、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニルを含み、そして上記のように任意選択で置換されている。
【００３６】
代替的な化合物では、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ７〜２２アルキル、Ｃ７〜２２アルケニル、又はＣ７〜２２アルキニルを含み、そして上記のように任意選択で置換されている。
【００３７】
更なる代替的化合物では、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ７〜２２アルキル、Ｃ７〜２２アルケニル、又はＣ７〜２２アルキニルであり、及びＲ２は、Ｃ７〜２２アルキル、Ｃ７〜２２アルケニル、又はＣ７〜２２アルキニルであり、そして上記のように任意選択で置換されている。
【００３８】
代替的な化合物では、アリールは、Ｃ６〜１０である。代替的な化合物では、ヘテロアリールは、Ｃ６〜１０である。
【００３９】
代替的な化合物では、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニルを含み、そのいずれも、ハロ、シアノ、ニトロ、ジアゾニウム、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１０アリール、又はＣ４〜１４ヘテロアリールから選択される１つ又は複数の置換基で置換されていてもよく、アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、アジ化物、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４ホスフェートから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され；並びにＲ３及びＲ４のそれぞれは、独立してＨ又はＣ１〜６アルキルである。
【００４０】
好ましい化合物では、部分Ｒの０．１〜９９％、例えば、０．１〜５％、０．５〜１０％、１〜２０％、２〜１９％、３〜１８％、４〜１７％、５〜１６％、６〜１５％、７〜１４％、８〜１３％、９〜１２％、１０〜９５％、１５〜８５％、２０〜８０％、２５〜７５％、３０〜７０％、３５〜６５％、４０〜６０％、４５〜５５％がＮＲ１Ｒ２である。
【００４１】
更なる好ましい化合物では、Ｒの３〜１８％がＮＲ１Ｒ２である。
【００４２】
更なる好ましい化合物では、Ｒの３、１０、又は１８％が、ＮＲ１Ｒ２である。
【００４３】
本発明のより適する化合物では、Ｒ１及びＲ２は、両方Ｈではない。従って、好適には、Ｒ１は上記で定義した通りであり、またＲ２は水素でない点を除き上記で定義した通りである。
【００４４】
いくつかの適する化合物では、Ｒ１は上記で定義した通りであり、またＲ２は、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニル、Ｃ６〜１０アリール、又はＣ５〜１０ヘテロアリールであり、そのいずれも、上記で定義したように任意選択で置換されている。
【００４５】
より好適には、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニルであり、そのいずれも上記で定義したように任意選択で置換されていてもよく、またＲ２は、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニルであり、そのいずれも上記で定義したように任意選択で置換されていてもよい。
【００４６】
本発明のいくつかの適する化合物では、Ｒ１は、Ｈ、又はＣ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、若しくはＣ６〜３０アルキニルであり、そのいずれも、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＳＨ、メトキシ、又はエトキシで置換されていない又は置換されており；及びＲ２は、Ｃ６〜３０アルキル、Ｃ６〜３０アルケニル、又はＣ６〜３０アルキニルであり、そのいずれも、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＳＨ、メトキシ、又はエトキシで置換されていない又は置換されている。
【００４７】
特に適する化合物では、Ｒ１は、Ｈ又は置換されていないＣ６〜３０アルキル、置換されていないＣ６〜３０アルケニル、又は置換されていないＣ６〜３０アルキニルであり；及びＲ２は、置換されていないＣ６〜３０アルキル、置換されていないＣ６〜３０アルケニル、又は置換されていないＣ６〜３０アルキニルである。
【００４８】
本発明の特定の適する化合物では、Ｒ１はＨであり、またＲ２は、Ｃ７〜１８アルキル、Ｃ７〜１８アルケニル、又はＣ７〜１８アルキニルであり、そのいずれも、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、ＳＨ、メトキシ、又はエトキシで置換されていない又は置換されている。
【００４９】
このタイプの化合物では、Ｒ１はＨであり、及びＲ２は、置換されていないＣ７〜１８アルキル、例えばヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、又はオクタデシル、特に直鎖Ｃ７〜１８アルキル基、例えば、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−テトラデシル、又はｎ−オクタデシル等、及び特にｎ−デシルであることが好ましい。
【００５０】
代替的に、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、Ｃ７〜１８アルキル、Ｃ７〜１８アルケニル、又はＣ７〜１８アルキニルであり、そのいずれも上記のように任意選択で置換されていてもよい。
【００５１】
このタイプの化合物では、Ｒ１及びＲ２は、それぞれＣ７〜１８アルキル、例えばヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、又はオクタデシル、特に直鎖Ｃ７〜１８アルキル基、例えばｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−テトラデシル、又はｎ−オクタデシル等、及び特にｎ−デシルであることが好ましい。
【００５２】
好適には、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、Ｃ７アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１４アルキル、又はＣ１８アルキルであり、そのいずれも上記のように任意選択で置換されていてもよい。
【００５３】
場合によっては、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は置換されていない。
【００５４】
場合によっては、Ｒ１及びＲ２の両方は置換されていない。
【００５５】
場合によっては、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は、上記のように置換されている。
【００５６】
場合によっては、Ｒ１及びＲ２の両方は、上記のように置換されている。
【００５７】
Ｒ１及びＲ２にとってより適する置換基は、ハロ、シアノ、ニトロ、アゾ、ジアゾニウム、リン酸、リン酸エステル、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＳＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、アジ化物、Ｃ６〜１４アリール又はＣ４〜１４ヘテロアリールからなる群より選択され、アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ハロ、シアノ、又はニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、ＯＰ（Ｏ）ＯＲ３ＯＲ４、−ＰＲ３Ｒ４から選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され、並びにＲ３及びＲ４のそれぞれは、独立してＨ、又はＣ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニルである。
【００５８】
或いは、Ｒ１及びＲ２にとって適する置換基は、ハロ、シアノ、ニトロ、ＮＲ３Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ６〜１０アリール又はヘテロアリールからなる群より選択され、アリール基及びヘテロアリール基は、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル、ハロ、シアノ、又はニトロから選択される１つ又は複数の置換基で任意選択で置換され；並びにＲ３及びＲ４のそれぞれは、独立してＨ又はＣ１〜６アルキルである。
【００５９】
更に好ましい化合物では、Ｒは、ｎ−デシルアミノ、オクタデシルアミノ、ジヘキシルアミノ、ジオクタデシルアミノ、３−ブテニルアミノ、５−ヘキセニルアミノ、オクト−３−エン−１−アミノ、テトラデカ−３−エン−１−アミノ、オレイルアミノ、エチル（プロプ−２−エン−１−イル）アミノ、ビス［（２Ｚ）−３−クロロブタ−２−エン−１−イル］アミノ、メチル［７−（メチルイミノ）ヘプタ−１，３，５−トリエン−１−イル］アミノ、ブタ−３−イン−１−アミノ、ヘキス−５−インイルアミノ、オクト−３−イン−１−アミノ、ドデカ−３−イン−１−アミノ、３−フルオロ−２−メチルオクト−７−イン−１−アミノ、［４，４−ジメチル−２−（ペント−４−イン−１−イル）シクロヘキシル］メタンアミノ、ビス（ブタ−２−イン−１−イル）アミノ、（デカ−１−イン−４−イル）（プロピル）アミン、Ｎ−（２−ナフチル）−１−ナフチルアミノ、ｃ−（２−ｐ−トリル−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル）−メチルアミノ、［２，２−ビス（４−クロロフェニル）−２−ヒドロキシエチル］−（２−フルオロベンジル）アミノ、４−テトラデシルフェニルアミノ、ビス［２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）エチル］アミノ、ｈ−ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ｎｈ２、４、１０−ジベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル、２−（３−オキソ−デカヒドロ−キノキザリン−２−イル）−Ｎ−（４−フェノキシ−フェニル）−アセトアミド、２−［（２−アミノ−４−メチルフェニル）スルファニル］−Ｎ−（２−メチルフェニル）アセトアミド、４−ニトロフェンエチルアミノからなる群より選択される。
【００６０】
本明細書では、用語「Ｃ１〜２００アルキル」とは、１〜２００個の炭素原子を有する直鎖又は分岐状の飽和した炭化水素基を指す。ＮＲ１Ｒ２構造を形成し得る試薬の例として、デシルアミン、オクタデシルアミン、ジヘキシルアミン、ジオクタデシルアミンが挙げられる。
【００６１】
本明細書では、用語「Ｃ６〜３０アルキル」とは、６〜３０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐状の飽和した炭化水素基を指す。ＮＲ１Ｒ２構造を形成し得る試薬の例として、デシルアミン、オクタデシルアミン、ジヘキシルアミン、ジオクタデシルアミンが挙げられる。
【００６２】
その他のアルキル基、例えば、Ｃ１〜４、Ｃ１〜６、及びＣ１〜１０アルキルは、異なる数の炭素原子を有す点を除き、上記で定義した通りである。
【００６３】
用語「Ｃ２〜２００アルケニル」とは、２〜２００個の原子、及び少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖又は分岐状の炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、２個以上の炭素−炭素二重結合、例えば、２、３、４、又は５個の二重結合を含み得る。場合によっては、アルケニル基は５個を超える二重結合を含み得る。
【００６４】
用語「Ｃ６〜３０アルケニル」とは、６〜３０個の原子、及び少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖又は分岐状の炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、２個以上の炭素−炭素二重結合、例えば、２、３、４、又は５個の二重結合を含み得る。場合によっては、アルケニル基は５個を超える二重結合を含み得る。ＮＲ１Ｒ２構造を形成し得る試薬の例として、５−ヘキセニルアミン、オクト−３−エン−１−アミン、テトラデカ−３−エン−１−アミン、オレイルアミンが挙げられる。
【００６５】
その他のアルケニル基、例えば、Ｃ２〜１０アルケニルは、異なる数の炭素原子を含む点を除き、Ｃ６〜３０アルケニルについて定義された通りである。
【００６６】
用語「Ｃ２〜２００アルキニル」とは、２〜２００個の炭素原子、及び少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖又は分岐状の炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、２つ以上の炭素−炭素三重結合、例えば、２、３、４、又は５個の炭素−炭素三重結合を含み得る。場合によっては、アルケニル基は５個を超える三重結合を含み得る。場合によっては、アルキニル基は、１つ又は複数の炭素−炭素三重結合に付加して１つ又は複数の炭素−炭素二重結合を含み得る。
【００６７】
用語「Ｃ６〜３０アルキニル」とは、６〜３０個の炭素原子及び少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖又は分岐状の炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、２つ以上の炭素−炭素三重結合、例えば、２、３、４、又は５個の炭素−炭素三重結合を含み得る。場合によっては、アルケニル基は５個を超える三重結合を含み得る。場合によっては、アルキニル基は、１つ又は複数の炭素−炭素三重結合に付加して１つ又は複数の炭素−炭素二重結合を含み得る。ＮＲ１Ｒ２構造を形成し得る試薬の例として、ヘキス−５−イルインアミン、オクト−３−イン−１−アミン、ドデカ−３−イン−１−アミン、（デカ−１−イン−４−イル）（プロピル）アミンが挙げられる。
【００６８】
その他のアルキニル基、例えば、Ｃ２〜１０アルキニルは、異なる数の炭素原子を含む点を除き、Ｃ６〜３０アルキニルについて定義した通りである。
【００６９】
本明細書の文脈における用語「Ｃ６〜１０アリール」とは、６〜１０員環炭素原子を有し、及び単環式又は２つの縮合環を含有する芳香族特性を備えた環構造を指す。アリール基が２つの縮合環を含有する場合、両方の環がその特性において完全に芳香族性である必要はない。芳香族部分の例として、フェニル、ナフタレン、テトラヒドロナフタレン、インダン、及びインデンが挙げられる。
【００７０】
Ｃ６〜１４アリール基は、６〜１４員環炭素原子を有する以外上記で定義した通りである。例として、アントラセン及びフルオレンが挙げられる。
【００７１】
本明細書の文脈における用語「ヘテロアリール」とは、４〜１４員環原子を有し、そのうちの少なくとも１つが、例えば、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択されるヘテロ原子であり、並びに最大３つの環を含有する、芳香族特性を備えた環構造を指す。ヘテロアリール基が２つ以上の環を含有する場合、すべての環が、必ずしもその特性において完全に芳香族でなければならないわけではない。ヘテロアリール基の例として、ピリジン、ピリミジン、インドール、ピロール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾフラン、ベンズイミダゾール、及びインドレンが挙げられる。
【００７２】
一般式（Ｉ）の化合物は、
ｉ）アセトン中で、水性リジンメチルエステル・２ＨＣｌを、１当量の塩化イソフタロイルと重合させ、その後エタノール性水酸化ナトリウムを用いて、ＤＭＳＯ中で加水分解すること、並びに
ｉｉ）ＮＲ１Ｒ２を含み、上記のように定義されるＲを、ジシクロヘキシルカルボジイミド／ジメチルアミノピリジン（ＤＣＣ／ＤＭＡＰ）カップリングによりポリマー骨格上にコンジュゲートすること
により調製される。
【００７３】
本発明の更に好ましい実施形態では、前記Ｒをコンジュゲートすることは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）カップリングによる。
【００７４】
一般式（Ｉ）の鎖に付加して、本発明の化合物は、末端基Ｘ及びＹを含み、式（Ｉａ）として表すことができ、
【００７５】
【化３】
2019531330.tif 000005
式中、Ｘは、ＯＨ又は重合開始剤又は停止剤の残基であり、Ｙは、Ｈ又は重合開始剤又は停止剤の残基である。場合によっては、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。
【００７６】
部分Ｘ及び部分Ｙの正確な性質は、選択された重合方法並びに使用される開始剤及び停止剤に依存する。適する方法は当業者にとって公知であり、また例えば、米国特許第２００６１７２４１８号、及びＥｃｃｌｅｓｔｏｎらの、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ＆  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、４２巻、１４７〜１６１頁（１９９９年）に記載されている。米国特許第２００６１７２４１８号の内容は、本明細書により参照としてそのまま組み込まれている。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリ（リジンイソフタルアミド）化合物（ペプチド／ペプチド類似体に基づく誘導体）は、細胞に細胞内送達するための薬剤と直接的又は間接的に会合する。薬剤は、前記ペプチドと共有結合的又は非共有結合的に会合し得る。
【００７８】
本発明の好ましい実施形態では、前記共有結合的会合は、アミドカップリング、ジスルフィド結合、ヒドロゾン結合（hydrozone linkage）、アジドクリックケミストリーにより、又は架橋剤、例えばスクシンイミド−マレイミド架橋剤等の使用により実現される。
【００７９】
いくつかの事例では、ポリ（リジンイソフタルアミド）化合物上の置換側鎖（ＮＲ１Ｒ２）は、骨格ポリマーへの結合反応前に、薬剤とコンジュゲートし得る（例えば、カルボン酸又は酸ハロゲン化合物が関係する場合、薬剤とポリマー骨格との間で望ましくない結合、又は第２のポリマー骨格との側鎖連結、若しくは同一骨格上の未反応カルボキシル酸基とのループ形成を引き起こす反応が生じないように）。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態では、前記非共有結合的会合は、静電的複合体形成、疎水的会合、水素結合、キレート化、ゲスト−ホスト相互作用、又はカプセル化を通じて実現される。
【００８１】
非共有結合的相互作用として、イオン性又は静電的相互作用（この場合、＋、−、δ＋、又はδ−の電荷を担持する薬剤上のある部分が、電荷を有する本発明によるペプチド上の部分と相互作用する）、疎水的薬物／薬物の疎水的成分とポリマーの疎水的成分の間の疎水的会合が非限定的に挙げられ、薬物のローディングに利用可能である。金属イオンと結合するリガンド（例えば、金−ヒスチジン、この場合、置換側鎖にはヒスチジン様の部分が組み込まれている）、そしてファンデルワールス会合も、薬剤と本発明によるペプチドとの非共有結合的相互作用に含まれる。
【００８２】
非共有結合的相互作用として、生物学的抗体−抗原相互作用（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン、この場合いずれか一方が置換側鎖に事前コンジュゲートし、そして他方は本明細書で開示するような薬剤にコンジュゲートする）も挙げられ、また本明細書に開示する核酸薬剤上の一本鎖に対して相補性の一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡが組み込まれるのと同様に、本開示の範囲に含まれる。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態では、前記薬剤は、治療剤である。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態では、前記治療剤は、有機小分子である。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態では、前記有機分子は、下記で定義するような化学療法剤である。
【００８６】
本発明の好ましい代替的実施形態では、前記有機小分子は、下記で定義するような抗生物質である。
【００８７】
本発明の更なる代替的実施形態では、前記有機小分子は、下記で定義するような抗ウイルス剤である。
【００８８】
本発明の好ましい代替的実施形態では、前記治療剤は、タンパク質性である。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態では、前記タンパク質性の治療剤は、治療用抗体又はその活性な結合断片である。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体である。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体はキメラ抗体である。
【００９２】
本発明の好ましい代替的実施形態では、前記抗体は、ヒト化又はヒト抗体である。
【００９３】
本発明の好ましい代替的実施形態では、前記活性な結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、単鎖抗体断片の群から選択される。
【００９４】
本発明の好ましい実施形態では、前記断片は、単鎖抗体断片である。
【００９５】
本発明の好ましい代替的実施形態では、前記タンパク質性の薬剤は、非抗体医薬ペプチド又はタンパク質である。
【００９６】
本発明の更なる好ましい代替的実施形態では、前記治療剤は、核酸である。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態では、前記核酸薬剤は、アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００９８】
本発明の好ましい実施形態では、前記核酸薬剤は、低分子干渉ＲＮＡ［ｓｉＲＮＡ］である。
【００９９】
本発明の好ましい実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡは、改変されたヌクレオチドを含む。
【０１００】
本発明の好ましい実施形態では、前記核酸薬剤は、ｍｉＲＮＡである。
【０１０１】
本発明の代替的実施形態では、前記核酸薬剤は、ベクター、好ましくは発現ベクターである。
【０１０２】
本発明の好ましい実施形態では、前記ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルスベクター、又はウイルスに基づくベクターからなる群より選択される。
【０１０３】
本発明の代替的実施形態では、前記薬剤は、造影剤である。
【０１０４】
更に好ましい実施形態では、前記造影剤は、カルセインである。
【０１０５】
本発明の好ましい実施形態では、前記薬剤は、保存剤、例えば糖である。
【０１０６】
「糖」として、例えば、単糖類、二糖類、及び三糖類が挙げられる。
【０１０７】
本発明の好ましい実施形態では、糖は、グルコース、スクロース、トレハロース、マンニトール、ラクチトール、ラクツロース、ラクトース、マンノビオース、イソマルトース、パラチニット、ソルビトール、ラフィノース、マルトトリオース、α−Ｄ−グルコピラノシル−１−６−ソルビトール、α−Ｄ−グルコピラノシル−１−６−マンニトール、マルトオリゴ糖、及び水素化されたマルトオリゴ糖からなる群より選択される。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態では、前記保存剤は、トレハロースである。
【０１０９】
保存剤は、不適切な保管条件による酸化的障害若しくは細胞膜破壊、又は乾燥、凍結乾燥、若しくは氷点下温度での凍結による障害を最小限に抑えることにより、細胞又は細胞群の寿命を延長する。凍結による障害から細胞を保護する従来型の化合物は、グリセロール又はＤＭＳＯ等のグリコールである。
【０１１０】
本発明の更なる態様によれば、本発明によるペプチドを含む組成物が提供される。
【０１１１】
本発明の好ましい実施形態では、前記組成物は、本明細書に開示するような、細胞に細胞内送達するための薬剤を更に含む。
【０１１２】
本発明の好ましい実施形態では、薬剤は、治療剤であり、及び組成物は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【０１１３】
投与する際には、本発明の組成物は、薬学的に許容される調製物中に投与される。そのような調製物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合担体、及び補助的治療剤［例えば、抗がん剤］を通常含み得る。
【０１１４】
本発明の組成物は、経口、直腸、鼻腔、気管支（吸入式）、経上皮、局所的（真皮、経皮、点眼、バッカル、及び舌下を含む）、膣腔、又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内を含む）投与を含む任意の従来経路により投与可能であり、また薬学の分野において周知の任意の方法により調製され得る。
【０１１５】
組成物は、これまでに定義した活性な薬剤を担体と会合させることにより調製され得る。一般的に、製剤は、活性な薬剤を液体担体又は細かく分割された固体担体又はその両方と均一且つ緊密に会合させ、次に必要な場合には生成物を成形することにより調製される。本発明は、一般式（Ｉ）の化合物を、薬学的又は獣医学的に許容される担体又は媒体と併存させる又は会合させるステップを含む、医薬組成物の調製方法にまで拡張される。
【０１１６】
本発明における経口投与用の製剤は、分離した単位、例えば事前に決定された量の活性な薬剤をそれぞれ含有するカプセル、サシェ剤、若しくは錠剤等として；粉末若しくは顆粒として；水性液体若しくは非水性液体に含まれる活性な薬剤の溶液若しくは懸濁物として；又は水中油型液体エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョンとして；又はボーラス等として提供され得る。
【０１１７】
経口投与用の組成物（例えば、錠剤及びカプセル）の場合、用語「許容される担体」として、一般的な添加剤等の媒体、例えば、結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、及びスターチ；充填剤及び担体、例えばコーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム、及びアルギン酸；並びに潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、及びその他のステアリン酸金属塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコーン液、タルクワックス、油、及びコロイドシリカ等が挙げられる。香味剤、例えばハッカ油、ウィンターグリーンの油、チェリーフレーバリング（cherry flavoring）等も利用可能である。剤形が直ちに識別可能となるように、着色料を添加するのが望ましい場合もある。錠剤は、当技術分野において周知の方法によりコーティングされる場合もある。
【０１１８】
錠剤は、圧縮又はモールディングにより、任意選択で１つ又は複数の副成分と共に製造され得る。圧縮錠剤は、適する機械内で、粉末又は顆粒等の自由流動形態にある活性な薬剤を圧縮することにより調製され得るが、任意選択でバインダー、潤滑剤、不活性な賦形剤、防腐剤、界面活性剤又は分散剤と混合され得る。湿製錠剤は、粉末化された化合物を不活性な液体賦形剤で湿らせ、この混合物を適する機械内でモールディングすることにより製造され得る。錠剤は、任意選択でコーティング又は刻印され得るが、また活性な薬剤の徐放又は制御放出を実現するように処方化され得る。
【０１１９】
経口投与に適するその他の製剤として、香味基材（flavoured base）、通常スクロース及びアカシア又はトラガントの中に活性な薬剤を含むロゼンジ；不活性な基材、例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシア等の中に活性な薬剤を含む香錠；並びに適する液体担体中に活性な薬剤を含むうがい薬が挙げられる。
【０１２０】
皮膚に局所的に適用する場合、一般式（Ｉ）の化合物は、クリーム、軟膏、ゼリー、溶液、又は懸濁液等に作り込むことができる。薬物で使用され得るクリーム又は軟膏製剤は、例えば、英国薬局方等の薬剤学の標準的な教科書に記載されるように、当技術分野において周知の従来型の製剤である。
【０１２１】
一般式（Ｉ）の化合物は、例えば、粉末の形態、又は溶液若しくは懸濁液の液滴の形態で薬理学的有効成分を分散することができるエアゾール又はスプレーを鼻腔、気管支、又はバッカル投与することにより、呼吸気管を治療するのに使用され得る。粉末分散特性を有する医薬組成物は、有効成分に付加して、室温より低い沸点を有する液体噴霧剤、並びに所望の場合には付加物、例えば液体若しくは固体の非イオン性若しくは陰イオン性界面活性剤、及び／又は賦形剤等を通常含む。薬理学的有効成分が溶液の状態にある医薬組成物は、これに付加して、適する噴霧剤、必要な場合には更に追加の溶媒及び／又は安定剤を含む。噴霧剤の代わりに圧縮空気も利用可能であり、この圧縮空気の生成は、必要に応じて適する圧縮及び膨張デバイスによって可能である。非経口製剤は一般的に無菌である。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態では、前記組成物は、哺乳動物細胞又は哺乳動物細胞の集合を含む。
【０１２３】
更に好ましい実施形態では、前記細胞は、赤血球、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＳＵ−ＤＨＬ−８、Ａ５４９、ＭＥＳ−ＳＡ、ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５、又はｈＭＳＣ細胞、特にＨｅＬＡ、ＣＨＯ、又はＡ５４９細胞からなる群より選択される。
【０１２４】
本発明の更に好ましい実施形態では、前記細胞の集合は、細胞凝集物、組織又は器官、特に組織又は器官である。
【０１２５】
本発明の態様によれば、哺乳動物細胞、細胞凝集物、組織又は器官、特に組織又は器官への少なくとも１つの薬剤の送達に使用するための本発明による組成物が提供される。
【０１２６】
本発明の態様によれば、薬剤を細胞に送達するｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であって、
ｉ）細胞又は細胞凝集物、細胞を含む組織又は器官を、有効量の本発明による組成物と接触させるステップと、
ｉｉ）前記細胞、細胞凝集物、組織又は器官をインキュベートして、前記細胞又は細胞凝集物、細胞を含む組織又は器官の透過処理を可能にし、これにより前記薬剤を送達するステップと
を含む方法が提供される。
【０１２７】
好適には、方法は、ステップ（ｉ）では、細胞又は細胞を含む組織若しくは器官を接触させるステップ、及びステップ（ｉｉ）では、前記細胞又は細胞を含む組織若しくは器官をインキュベートして、前記細胞又は細胞を含む組織若しくは器官の透過処理を可能にし、これにより前記薬剤を送達するステップを含む。
【０１２８】
本発明の好ましい方法では、前記組成物は、本明細書で開示する１つ又は複数の薬剤を含む。
【０１２９】
一実施形態では、前記細胞は、哺乳動物細胞である。
【０１３０】
更なる実施形態では、前記細胞は、卵母細胞、精子細胞、赤血球、白血球、幹細胞、及び免疫細胞、特に卵母細胞、精子細胞、赤血球、白血球、及び幹細胞からなる群より選択される。
【０１３１】
好ましい方法では、前記ステップｉ）は、ｐＨ５．０〜ｐＨ８．０、好ましくはｐＨ６．０〜７．１の間で実施される。
【０１３２】
更に好ましい方法では、前記ステップｉ）は、ｐＨ５．０〜６．０の間、なおいっそうより好ましくはｐＨ５．５で実施される。
【０１３３】
本発明の更なる態様によれば、哺乳動物の対象を治療する方法が提供され、同方法は、本明細書で開示するように、有効量の薬剤を含む本発明による組成物を投与するステップを含む。
【０１３４】
本発明の好ましい方法では、前記哺乳動物の対象は、がんに罹患している。
【０１３５】
本発明の更なる態様によれば、がんの治療における本発明による組成物の使用が提供される。
【０１３６】
本発明の更なる態様によれば、がんの治療で使用される、本発明による組成物及び抗がん剤を含む複合製剤が提供され、前記組成物及び抗がん剤は、同時に、連続して、又は個別に投与され得る。
【０１３７】
同時に投与される場合、組成物及び抗がん剤は、単一組成物で、又は分離した組成物で異なる経路により投与され得る。
【０１３８】
本発明は、がんを治療するための薬剤を調製する際の、本発明の組成物及び抗がん剤の使用も提供する。
【０１３９】
本明細書で使用する場合、用語「がん」とは、自律的増殖能力、すなわち、急速に増える細胞増殖により特徴付けられる異常な状態又は状況を有する細胞を指す。該用語は、病理組織型又は侵襲ステージを問わず、すべての種類のがん性増殖、又は発癌プロセス、転移性組織、又は悪性変換した細胞、組織、若しくは器官が含まれように意図されている。用語「がん」には、罹患性の、例えば、肺、乳房、甲状腺、リンパ、胃腸、及び泌尿生殖路の悪性腫瘍等の様々な臓器系の悪性腫瘍、並びにほとんどの結腸がん、腎細胞癌、前立腺がん、及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸のがん、及び食道のがん等の悪性腫瘍を含む腺癌が含まれる。用語「癌腫」は、当該技術分野において承認されており、呼吸器系の癌、胃腸系の癌、尿生殖器系の癌、睾丸癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、及びメラノーマを含む、上皮又は内分泌組織の悪性腫瘍を指す。代表的な癌腫として、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭部及び頸部、結腸、並びに卵巣の組織から形成される癌腫が挙げられる。用語「癌腫」には、例えば、癌性及び肉腫性の組織から構成される悪性腫瘍を含む癌肉腫も含まれる。「腺癌」とは、腺組織に由来する癌腫、又は腫瘍細胞がその内部に認識可能な腺構造を形成する癌腫を指す。用語「肉腫」は、当該技術分野において承認されており、間葉系派生物の悪性腫瘍を指す。
【０１４０】
本発明の更なる態様によれば、哺乳動物の細胞、細胞凝集物、組織又は器官の保存を目的とするｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であって、
ｉ）哺乳動物の細胞調製物、哺乳動物の細胞凝集物、組織又は器官、及び本発明による組成物を含む調製物を提供するステップと、
ｉｉ）前記調製物をインキュベートして前記哺乳動物の細胞、細胞凝集物、組織又は器官の哺乳動物細胞膜を透過処理するステップと、
ｉｉｉ）前記透過処理された細胞、細胞凝集物、組織又は器官を、１つ又は複数の保存剤と接触させるステップと
を含む方法が提供される。
【０１４１】
好適には、方法は、哺乳動物の細胞、組織又は器官の保存を目的とし、そしてステップ（ｉ）では、調製物は、哺乳動物の細胞調製物又は哺乳動物の組織若しくは器官、及び本発明による組成物を含み、ステップ（ｉｉ）は、前記調製物をインキュベートして哺乳動物の細胞、組織又は器官の哺乳動物細胞膜を透過処理するステップを含み、並びにステップ（ｉｉｉ）は、透過処理された細胞、組織又は器官を、１つ又は複数の保存剤と接触させるステップを含む。
【０１４２】
本発明の好ましい方法では、前記保存剤は、糖、例えば、トレハロース、スクロース、又はマルトースである。好ましくは、前記保存剤は、トレハロースである。
【０１４３】
好ましい方法では、前記保存剤は、少なくとも０．００１Ｍの濃度で存在する。好ましくは、０．００１Ｍ〜１Ｍの間、及びなおいっそうより好ましくは、０．０５〜０．７Ｍの間である。
【０１４４】
更なる好ましい方法では、前記薬剤は、少なくとも０．１Ｍ、好適には０．１〜０．７Ｍの濃度で存在する。
【０１４５】
好ましい方法では、前記式（Ｉ）の化合物は、少なくとも１ｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜５０００μｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【０１４６】
更なる好ましい方法では、前記式（Ｉ）の化合物は、５０〜１０００μｇ／ｍｌ、及び好ましくは４００μｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【０１４７】
代替的方法では、前記式（Ｉ）の化合物は、５〜１００００μｇ／ｍｌ、なおいっそうより好ましくは１００〜５００μｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【０１４８】
更なる代替的方法では、前記式（Ｉ）の化合物は、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、２０００、５０００、又は１００００μｇ／ｍｌからなる群より選択される濃度で存在する。
【０１４９】
更なる代替的方法では、前記式（Ｉ）の化合物は、５００μｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【０１５０】
好ましい方法では、前記細胞は、前記薬剤と共に、ｐＨ５．０〜ｐＨ８．０でインキュベートされる。
【０１５１】
更なる好ましい方法では、前記細胞は、前記薬剤と共に、ｐＨ６．０〜７．１でインキュベートされる。
【０１５２】
好ましい方法では、前記細胞は、前記薬剤と共に、少なくとも１分間、好ましくは１分〜２４時間の間、及びよりいっそう好ましくは、５分〜９時間の間、及びなおいっそうより好ましくは５〜６０分の間インキュベートされる。
【０１５３】
好ましい方法では、前記細胞は、前記薬剤と共に、５分間インキュベートされる。
【０１５４】
更なる好ましい方法では、前記細胞は、前記薬剤と共に、１０分間インキュベートされる。
【０１５５】
好ましい方法では、前記細胞は、摂氏２５〜３７度の間でインキュベートされる。
【０１５６】
更なる好ましい方法では、前記細胞は、摂氏３７度でインキュベートされる。
【０１５７】
更なる好ましい方法では、前記細胞は、少なくとも５０ｍＭ、好ましくは１００〜５００ｍＭ、１５０〜３００ｍＭの間、及びなおいっそうより好ましくは２００〜２２５ｍＭの間のトレハロースを含む。
【０１５８】
定義
有機小分子
「化学療法剤」の一般的な定義は、一般的に低分子の化学物質の薬剤であって、細胞、特に罹患細胞を殺傷することが好ましいが、少なくとも細胞増殖抑制的な薬剤である。薬剤は、その構造又は作用機序に関して分類され得る。例えば、化学療法剤には、アルキル化剤、代謝抵抗物質、アントラサイクリン、アルカロイド、植物テルペノイド、及びトポイソメラーゼ阻害剤が含まれる。化学療法剤は、細胞分裂又はＤＮＡ合成に対してその効果を一般的に発揮する。アルキル化剤の例として、シスプラチン、カルボプラチン、又はオキサリプラチンが挙げられる。代謝抵抗物質の例として、プリン又はピリミジン類似体が挙げられる。プリン類似体は、当技術分野において公知である。例えば、チオグアニンが、急性白血病を治療するのに使用される。フルダラビンは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡプライマーゼ、及びＤＮＡリガーゼの機能を阻害し、また細胞周期のＳ期に対して特異的である。ペントスタチン及びクラドリビンは、アデノシン類似体であり、また有毛細胞白血病に対して有効である。更なる例として、アデニン類似体であるメルカプトプリンが挙げられる。ピリミジン類似体も、同様に当技術分野において公知である。例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン、及びシトシンアラビノシド等。５−ＦＵは、乳房、結腸直腸がん、膵臓、及びその他のがんの治療において長年使用されてきた。５−ＦＵもまた、腫瘍内で５−ＦＵに変換されるプロドラッグのカペシタビンから形成可能である。ロイコボリンはフォリン酸としても知られ、がん化学療法においてアジュバントとして投与され、また５−ＦＵのチミジレートシンターゼに対する阻害効果を増強する。アルキル化剤も当技術分野において公知であり、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン又はビンブラスチンが挙げられる。テルペノイドも長年使用されており、タキサン、例えば、パクリタキセルが挙げられる。
【０１５９】
抗生物質及び抗ウイルス剤は、微生物、例えば、細菌、及び寄生虫性の病原体、及び病原性ウイルスの治療において有効である。本発明による送達媒体は、特に細胞内微生物病原体の治療に好適である。例えば、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ブルセラ属（Brucella）、フランシセラ属（Francisella）、レジオネラ属（Legionella）、及びリステリア属（Listeria）の種は、細胞内型で存在し得る。その他の細菌種は、細胞内種、又は偏性細胞内種、例えば、クラミジア属（Chlamydia）、リケッチア属（Rickettsia）、サルモネラ属（Salmonella）、及びエルシニア属（Yersinia）の種である。ウイルスは、もちろん、偏性細胞内寄生体である。寄生的微生物細胞内病原体として、プラスモジウム属（Plasmodia）、トキソプラズマ属（Toxoplasma）、リーシュマニア属（Leishmania）の種、及びトリパノソーマ類（trypanosomatid）の種トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）が挙げられる。細菌性病原体の制御において効な抗生物質のクラスの例として、事例に限定して、ペニシリン、セファロスポリン、リファマイシン、スルホンアミド、マクロライド、及びテトラサイクリンが挙げられる。抗菌性ペプチド、例えばデルミシジン、セクロピン、及びデフェンシン等も本発明の範囲に含まれる。抗ウイルス剤として、抗レトロウイルス薬、例えばジドブジン、ラミブジン、エファビレンツ、及びアバカビル等；並びに抗ウイルス薬、例えばガンシクロビル、アシクロビル、及びオセルタミビル等が挙げられる。抗原虫剤として、マラリアの治療、及びアルテミシニンと組み合わせてこれらの薬剤を使用する併用療法でも使用されるルメファントリン、メフロキン、アモジアキン、スルファドキシン、クロロキンが挙げられる。これらは、本発明による送達媒体と共に利用可能である薬剤の非限定的な例である。
【０１６０】
抗体
抗体には、従来法に基づき調製されるポリクローナル及びモノクローナル抗体が含まれる。
【０１６１】
キメラ抗体は、マウス又はラット抗体のＶ領域のすべてがヒト抗体Ｃ領域と組み合わさった組換え抗体である。ヒト化抗体は、齧歯類抗体Ｖ領域に由来する相補性決定領域がヒト抗体Ｖ領域由来のフレームワーク領域と融合している組換えハイブリッド抗体である。ヒト抗体由来のＣ領域もまた使用される。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の重鎖及び軽鎖両方のＮ末端ドメイン内の、Ｖ領域の大部分の変動がそこに限定して存在する領域である。このような領域は、抗体分子の表面でループを形成する。このようなループは、抗体と抗原の間に結合表面を提供する。
【０１６２】
抗体がヒト以外の動物に由来すると、外来抗体に対する免疫応答が誘発され、その抗体は循環から除去される。キメラ抗体及びヒト化抗体のいずれも、組換えハイブリッド抗体内に存在する齧歯類（すなわち、外来）の抗体量が低下している一方、ヒト抗体領域は免疫応答を誘発しないので、ヒト対象に注射したときに抗原性が抑えられている。このような抗体が引き起こす免疫応答はより弱く、また抗体の排出も減少する。ヒトの疾患治療で治療抗体を使用する場合、これは明らかに望ましい。ヒト化抗体は、「外来」抗体領域がより少なくなるように設計され、従ってキメラ抗体よりも免疫原性が低いと考えられる。
【０１６３】
抗体の様々な断片が、当技術分野において公知である。Ｆａｂ断片は、共有結合により互いに結びついた免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的に活性な部分からなる多量体タンパク質であり、抗原に特異的に結合する能力を有する。Ｆａｂ断片は、天然の免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断により（例えば、パパインを用いて）生成される。Ｆａｂ２断片は、２つの繋がったＦａｂ断片を含む。このような２つの断片が免疫グロブリンヒンジ領域で繋がると、Ｆ（ａｂ’）２断片が生じる。Ｆｖ断片は、共有結合により互い結びついた免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的に活性な部分からなる多量体タンパク質であり、抗原に特異的に結合する能力を有する。また断片は、軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する１本の軽鎖可変領域又はその断片のみを含有し、重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する関連する重鎖可変領域又はその断片を有さず、関連する軽鎖部分も有さない、一本鎖ポリペプチドでもあり得るが、また複数の抗体断片から形成されたマルチ特異的抗体でもあり得、これは、例えば米国特許第６，２４８，５１６号に記載されている。Ｆｖ断片又は単一領域（ドメイン）断片は、関連する被識別領域の宿主細胞株における発現により一般的に生成される。この及びその他の免疫グロブリン又は抗体断片は本発明の範囲内であり、また標準的な免疫学教科書、例えばＰａｕｌのＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、又はＪａｎｅｗａｙらのＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ等（上記で引用済み）に記載されている。分子生物学は、今日、このような断片の直接合成（細胞内発現により又は化学的に）、並びにそれらを組み合わせた合成を可能にする。抗体又は免疫グロブリンの断片は、上記のように二重特異的機能も有し得る。
【０１６４】
阻害性ＲＮＡ
幅広く受け入れられている、遺伝子機能を特異的に切断する技術は、低分子阻害性又は干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とも呼ばれる二本鎖ＲＮＡの細胞への導入により、これはｓｉＲＮＡ分子に含まれる配列に対して相補的なＲＮＡの破壊を引き起こす。ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ（センス鎖及びアンチセンス鎖）の２本の相補鎖を含み、相互にアニーリング化されて二本鎖ＲＮＡ分子を形成する。ｓｉＲＮＡ分子は、切除されることとなる遺伝子のエクソンに一般的に由来する。多くの生物は、ｓｉＲＮＡの形成を引き起こすカスケードを活性化させることにより、二本鎖ＲＮＡの存在に応答する。二本鎖ＲＮＡの存在は、ＲＮａｓｅＩＩＩを含むタンパク質複合体を活性化させるが、同複合体は二本鎖のＲＮＡをリボヌクレオタンパク質複合体の一部となるより低分子の断片（ｓｉＲＮＡ、長さ約２１〜２９個のヌクレオチド）へとプロセシングする。ｓｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ複合体がｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に対して相補的なｍＲＮＡを切断し、これによりｍＲＮＡの破壊を引き起こすためのガイドとして作用する。
【０１６５】
改変された核酸分子
用語「改変された」は、本明細書で使用する場合、以下のような核酸分子について記載する；
ｉ）そのヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、合成ヌクレオシド間結合（すなわち、一方のヌクレオチドの５’末端と他方のヌクレオチドの３’末端の間のホスホジエステル結合以外の結合）により共有結合している。代替的には又は好ましくは、前記結合は、一方のヌクレオチドの５’末端と他方のヌクレオチドの５’末端との結合、又は一方のヌクレオチドの３’末端と他方のヌクレオチドの３’末端との結合であり得る、並びに／或いは
ｉｉ）核酸と通常は会合しないコレステロール等の化学基が二本鎖核酸と共有結合している、
ｉｉｉ）好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミダート、カルバマート、リン酸トリエステル、アセトアミダート、ペプチド、及びカルボキシメチルエステルである。
【０１６６】
用語「改変された」には、共有結合的に改変された塩基及び／又は糖を有するヌクレオチドも含まれる。例えば、改変されたヌクレオチドには、３’位置ではヒドロキシル基以外、及び５’位置ではリン酸基以外の低分子量有機基と共有結合した糖を有するヌクレオチドが含まれる。従って、改変されたヌクレオチドとして、２’置換型の糖、例えば２’−Ｏ−メチル−；２−Ｏ−アルキル；２−Ｏ−アリル；２’−Ｓ−アルキル；２’−Ｓ−アリル；２’−フルオロ−；２’−ハロ、又は２；アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖；エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、及びセドヘプツロース等も挙げることができる。
【０１６７】
改変されたヌクレオチドは当技術分野において公知であり、また事例として、非制限的に、アルキル化プリン及び／又はピリミジン；アシル化プリン及び／又はピリミジン；又はその他のヘテロ環が挙げられる。このようなピリミジン及びプリンのクラスは、当技術分野において公知であり、またシュードイソシトシン；Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン；８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン；４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル；５−フルオロウラシル；５−ブロモウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル；ジヒドロウラシル；イノシン；Ｎ６−イソペンチル−アデニン；１−メチルアデニン；１−メチルシュードウラシル；１−メチルグアニン；２，２−ジメチルグアニン；２−メチルアデニン；２−メチルグアニン；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；７−メチルグアニン；５−メチルアミノメチルウラシル；５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル；β−Ｄ−マンノシルケオシン；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メトキシウラシル；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル；プソイドウラシル（psueouracil）；２−チオシトシン；５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル；４−チオウラシル；５−メチルウラシル；Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル；ウラシル−５−オキシ酢酸；キューオシン（queuosine）；２−チオシトシン；５−プロピルウラシル；５−プロピルシトシン；５−エチルウラシル；５−エチルシトシン；５−ブチルウラシル；５−ペンチルウラシル；５−ペンチルシトシン；及び２，６，−ジアミノプリン；メチルプソイドウラシル（methylpsuedouracil）；１−メチルグアニン；１−メチルシトシンが挙げられる。改変された二本鎖核酸もまた、塩基類似物、例えばＣ−５プロピン改変型塩基等を含み得る（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４巻：８４０〜８４４頁、１９９６年を参照）。
【０１６８】
本明細書で使用する場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「アンチセンス」は、生理的条件下で特定の遺伝子を含むＤＮＡ又は当該遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、これにより当該遺伝子の転写及び／又は当該ｍＲＮＡの翻訳を阻害するオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、改変されたオリゴリボヌクレオチド、又は改変されたオリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドについて記載する。アンチセンス分子は、標的遺伝子とハイブリダイズした際に、標的遺伝子の転写又は翻訳を妨害するように設計される。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さ及びそれとその標的との間の相補性の程度は、標的の配列及び当該配列を含む特定の塩基を含め、選択された特定の標的に依存するものと認識する。
【０１６９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理的条件下で標的と選択的に結合する、すなわち、生理的条件下で、標的細胞内の任意のその他の配列よりも標的配列に実質的に多くハイブリダイズするように構築及び構成されることが好ましい。十分に選択的であり、また強力な阻害が実現するように、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的に対して相補的な少なくとも７個（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻：８４０〜８４４頁、１９９６年）、及びより好ましくは、少なくとも１５個の連続した塩基を含むべきである。最も好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０〜３０塩基の相補的配列を含む。
【０１７０】
ベクター
治療剤としてのウイルス又は「ウイルスベクター」の使用は当技術分野において周知されている。更に、いくつかのウイルスが、外因性遺伝子を送達するためのベクターとして一般的に使用される。一般的に採用されるベクターとして、好ましくは、バキュロウイルス科（baculoviridae）、パルボウイルス科（parvoviridae）、ピコルナウイルス科（picornaviridae）、ヘルペスウイルス科（herpesvirdae）、ポックスウイルス科（poxviridae）、アデノウイルス科（adenoviridae）、又はピコルンナウイルス科（picornnaviridae）から選択される、組換えにより改変されたエンベロープ又は非エンベロープＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが挙げられる。親ベクター特性のそれぞれの好都合な要素を利用するキメラベクターも採用され得る（例えば、Ｆｅｎｇら、（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５巻：８６６〜８７０頁を参照）。そのようなウイルスベクターは、野生型であり得る、又は複製欠損、条件付き複製、又は複製コンピテントとなるように組換えＤＮＡ技術により改変され得る。
【０１７１】
好ましいベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、及びレトロウイルスのゲノムに由来する。本発明の最も好ましい実践法では、ベクターはヒトアデノウイルスゲノムに由来する。特に好ましいベクターは、ヒトアデノウイルス血清型２又は５に由来する。そのようなベクターの複製能力は、Ｅ１ａ及び／又はＥ１ｂコード領域内の改変又は欠損により弱体化され得る（「複製欠損」とみなされる点まで）。特定の発現特性を実現する、又は反復投与若しくは低免疫応答を可能にするような、ウイルスゲノムに対するその他の改変が好ましい。
【０１７２】
或いは、ウイルスベクターは、条件付き複製又は複製コンピテントであり得る。好ましくない広域スペクトル感染症を回避しつつ、特定の細胞型における選択的発現を実現するのに、条件付き複製ウイルスベクターが使用される。条件付き複製ベクターの例は、Ｐｅｎｎｉｓｉ，Ｅ．（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻：３４２〜３４３頁；Ｒｕｓｓｅｌｌ、及びＳ．Ｊ．（１９９４年）Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ３０Ａ（８）：１１６５〜１１７１頁に記載されている。選択的複製ベクターの追加の例として、ウイルスの複製に必須の遺伝子が、そのような遺伝子の発現が存在しない場合にはウイルスが複製しないように、特定の細胞型又は細胞状態においてのみ活性なプロモーターの制御下に置かれているベクターが挙げられる。そのようなベクターの例は、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，６９８，４４３号；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，８７１，７２６号に記載されており、その全教示は本明細書において参照として組み込まれている。複製に関して弱体化されているウイルスもまた遺伝子療法で有用であることが実証されている。例えば、Ｅ１ｂ５５Ｋ遺伝子内に特異的欠損を含有するアデノウイルスｄｌ１５２０（Ｂａｒｋｅｒ及びＢｅｒｋ（１９８７年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５６巻：１０７頁）が、ヒトを対象に使用され、治療効果を有した。そのようなベクターは、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋの米国特許第５，６７７、１７８号、及び米国特許第５，８４６，９４５号にも記載されている。
【０１７３】
特定のベクターは、特定の組織型に対して自然指向性を示す。例えば、ヘルペスウイルス属に由来するベクターは、神経細胞に優先的に感染することが明らかにされている。改変された組換えヘルペスウイルスベクターの例は、米国特許第５，３２８，６８８号に開示されている。細胞型特異性又は細胞型ターゲティングもまた、感染範囲が特徴的に広いウイルスに由来するベクターにおいて、ウイルス性のエンベロープタンパク質の改変により実現され得る。例えば、細胞ターゲティングは、固有の細胞表面受容体と特異的に相互作用する改変されたノブ及びファイバードメインの発現を実現するため、アデノウイルスベクターを用いて、ウイルス性ゲノムノブ及びファイバーコーディング配列を選択的に改変することより実現した。細胞の特異的ターゲティングに関するその他の方法は、抗体又は抗体断片とエンベロープタンパク質とのコンジュゲーションにより達成された（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら（１９９３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８巻：６８６６〜６８６９頁、Ｗａｔｋｉｎｓら（１９９７年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４巻：１００４〜１０１２頁；Ｄｏｕｇｌａｓら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４巻：１５７４〜１５７８頁を参照）。或いは、ターゲティングを実現するために、特定の部分をウイルス表面にコンジュゲートし得る（例えば、Ｎｉｌｓｏｎら（１９９６年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、３巻：２８０〜２８６頁（ＥＧＦとレトロウイルスタンパク質とのコンジュゲーション）を参照）。
【０１７４】
造影剤
「造影剤」は、例えば分光光度法、フローサイトメトリー、又は顕微鏡法により検出する能力を有する薬剤である。例えば、標識を送達媒体に結合させれば、これによりｉｎ  ｖｉｖｏでの送達媒体の検出が可能となる。造影剤の例として、放射性同位体、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光剤、蛍光物質、ハプテン、酵素、及びその組み合わせが挙げられるが、但しこれらに限定されない。様々な目的に適する標識を選択する際の標識方法及びガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年）、及びＡｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８年）で議論されている。
【０１７５】
細胞、組織、器官
本発明は、哺乳動物の細胞及び哺乳動物の器官を含む様々な哺乳動物細胞型、細胞凝集物、組織、特に哺乳動物の細胞及び哺乳動物の器官を含む様々な哺乳動物細胞型、組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの治療に関する。
【０１７６】
例えば、神経細胞、筋肉細胞（横紋筋、平滑筋、心筋）；肝細胞、腎細胞、血球（例えば、末梢血単核球、赤血球、ＣＤ４＋リンパ球、ＣＤ８＋リンパ球、樹状細胞、Ｔ調節性細胞、自然リンパ球系細胞、ナチュラルキラー細胞）、膵β細胞、上皮細胞、内皮細胞、精母細胞、及び卵母細胞、皮膚線維芽細胞、胎児線維芽細胞、角膜線維芽細胞、腸粘膜線維芽細胞、口腔粘膜線維芽細胞、口腔粘膜ケラチノサイト、及び尿道の線維芽細胞等の細胞を含む哺乳動物細胞、細胞凝集物、組織又は器官（特に哺乳動物の細胞、組織又は器官）。
【０１７７】
分化した細胞、細胞凝集物、組織及び器官（特に分化した細胞、組織及び器官）に付加して、本発明は、幹細胞及び系統限定的幹細胞に期待する。用語「幹細胞」は、分化した細胞及び組織を形成するための様々な潜在能力を保持しつつ、自己再生能力を有する一般的な未分化細胞群を表す。幹細胞は、多能性又は多分化性であり得る。多能性幹細胞は、天然の生物に見出されるあらゆる組織を形成する能力を有する細胞であるが、多能性幹細胞は天然の生物を形成することはできない。更に、ヒト体細胞は、胚性幹細胞と類似した未分化状態にリプログラムされ得ることが公知である。例えば、国際公開第２００７／０６９６６６号は、胚性幹細胞を使用する必要のない、分化した細胞（例えば、マウス線維芽細胞）のリプログラミングについて記載する。核のリプログラミングは、核のリプログラミング因子、例えば、転写因子のＯｃｔファミリー、Ｓｏｘファミリー、Ｋｌｆファミリー、及びＭｙｃファミリーをコードする体細胞中に、レトロウイルスベクターをトランスフェクトすることにより達成される。体細胞は脱分化し、そしてヒト胚性幹細胞のマーカーを発現するようになり、「誘導多能性細胞」［ｉＰＳ］が生成する。Ｔａｋａｈａｓｈｉらの［Ｃｅｌｌ、１３１巻、８６１〜８７２頁、２００７年］では、４つの転写因子、すなわちＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃを含む成人ヒト皮膚線維芽細胞は、形態、増殖、表面抗原、遺伝子発現、多能性細胞特異的遺伝子のエピジェネティックな状態、及びテロメラーゼ活性においてヒトＥＳ細胞に脱分化する。
【０１７８】
多能性細胞は、分化した細胞及び組織を形成する限定された能力を有する。一般的に、成人幹細胞は、多能性幹細胞であり、並びにいくつかの細胞又は組織を形成し、及び老化又は損傷を受けた細胞／組織を補充する能力を有する前駆体幹細胞又は系統限定的幹細胞である。一般的に、成人幹細胞は、生物に見出されるすべての組織を形成することはできないが、そのような「成人」幹細胞について当初考えられていたものよりも大きな潜在能力を主張する報告もいくつかある。多能性幹細胞の例として、間葉系幹細胞が挙げられる。間葉系幹細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、及びニューロンを含む、様々な細胞型に分化する。一般的に、間葉系幹細胞は骨髄から得られる。現在のところ、幹細胞療法は、多能性及び多分化性幹細胞の異なる起源、並びに幹細胞を細胞に効率的に分化させるための細胞培養条件、及び組織修復で使用するのに適する組織について探索中である。
【０１７９】
造血幹細胞等の幹細胞、神経幹細胞、骨幹細胞、筋幹細胞、間葉系幹細胞、栄養膜幹細胞、上皮幹細胞（器官、例えば皮膚、胃腸粘膜、腎臓、膀胱、乳腺、子宮、前立腺等、及び内分泌腺、例えば脳下垂体等に由来する）、内胚葉系幹細胞（器官、例えば肝臓、膵臓、肺、及び血管等に由来する）；胚性幹（ＥＳ）細胞；胚性生殖（ＥＧ）細胞。
【０１８０】
疎水性鎖と両親媒性ペプチド又はペプチド類似体とのコンジュゲーション
疎水性ペンダント鎖は、ＤＣＣ／ＤＭＡＰカップリングにより、又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）カップリングにより、両親媒性ポリマー骨格に連結することができる。ＣＯＯＨを含む疎水性鎖は、架橋剤Ｎ−Ｂｏｃ−カダベリン（Ｓｉｇｍａ社）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１３年、２３巻、５６５〜５７４頁）及びＤＣＣ／ＤＭＡＰカップリングによりＰＬＰ上にコンジュゲートし得る。同様に、含チオール疎水性鎖（又は薬剤）は、開裂可能なジスルフィド結合架橋剤（例えば、ピリジルジチオール−及び−ヒドラジド架橋剤）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によりポリカーボネート上にコンジュゲート可能である。ＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジン）等のピリジルジチオール−及び−ヒドラジド架橋剤のアミン基は、ＤＣＣ／ＤＭＡＰカップリングによりＣＯＯＨとカップリングさせることができ、またＰＤＰＨを通じて、含チオール疎水性鎖（又は薬剤）は、ポリマー上にコンジュゲートすることができる。また、含アルキン疎水性鎖（若しくは薬剤）、又はアルキン基で機能化された疎水性鎖は、架橋剤、例えば、アミン−ＰＥＧ−アジ化物（Ｓｉｇｍａ社）を使用するクリックケミストリーによりポリカーボネート上にコンジュゲートすることができる。アミン−ＰＥＧ−アジ化物のアミン基は、ＤＣＣ／ＤＭＡＰカップリングによりＣＯＯＨとカップリングさせることができ、またクリックケミストリーを通じて疎水性鎖（又は薬剤）は、ポリマー上にコンジュゲートすることができる。或いは、ポリマーは、含アミンアルキンにより機能化され得、また疎水性鎖（又は薬剤）は、アジ化物を用い機能化され得る。含アミン疎水性鎖（又は薬剤）は、本特許の材料及び方法に記載されているアミドカップリング化学反応によりポリカーボネート上に直接コンジュゲートすることができる。一級アミン末端プルロニック誘導体が、ポリエチレンオキサイドの改変についてＨａｒｒｉｓらが記載する方法に基づき合成可能である（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８４年、２２巻、３４１〜３５２頁）。
【０１８１】
本明細書の説明及び主張の全体を通じて、単語「含む（comprise）」、及び「含む（contain）」、及びこれらの単語の変化形、例えば、「含むこと（comprising）」及び「含む（comprises）」は、「含む、但し、〜に限定されない」を意味し、及びその他の部分、追加物、エント（ｅｎｔ）、整数、又はステップを除外するように意図されない（及び除外しない）。「実質的に〜からなる」とは、実質的なインテジャーの機能に顕著に影響を及ぼさないインテジャーを含め、実質的なインテジャーを有することを意味する。
【０１８２】
本明細書の説明及び主張の全体を通じて、文脈が別途要求する場合を除き、単数形は複数形を含む。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈が別途要求する場合を除き、本明細書は複数並びに単数について検討するものと理解される。
【０１８３】
本発明の特定の態様、実施形態、又は実施例と関連して記載されている特性、整数、特徴、化合物、化学的な部分又は基は、本明細書に記載する任意のその他の態様、実施形態、又は実施例に、それらと矛盾しない限り適用されるものと理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
ここで、本発明の実施形態を、例示目的に限定して、下記の図を参照しながら記載する。
【図１Ａ】酸性型のＮＤＡがグラフト結合したＰＬＰの、室温、ｄ６−ＤＭＳＯ中における１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。ＮＤＡ（Ｃ１０）に加えて、ＨＤＡ（Ｃ７）、ＴＤＡ（Ｃ１４）、及びＯＤＡ（Ｃ１８）を含むその他のペンダント鎖もまた擬ペプチド骨格にコンジュゲートされている。
【図１Ｂ】酸性型のＮＤＡがグラフト結合したＰＬＰのＦＴＩＲスペクトルを示す図である。ＮＤＡ（Ｃ１０）に加えて、ＨＤＡ（Ｃ７）、ＴＤＡ（Ｃ１４）、及びＯＤＡ（Ｃ１８）を含むその他のペンダント鎖もまた擬ペプチド骨格にコンジュゲートされている。
【図２Ａ】１００ｍＭバッファー中、１．０ｍｇ／ｍＬにおける、ＰＬＰ（■）、ＰＬＰ−ＮＤＡ３％（●）、ＰＬＰ−ＮＤＡ１０％（▲）、及びＰＬＰ−ＮＤＡ１８％（▼）の水溶液のｐＨ依存性透過率を示す図である。
【図２Ｂ】１００ｍＭバッファー中、０．５ｍｇ／ｍＬにおける、ＰＬＰ（■）、ＰＬＰ−ＮＤＡ３％（●）、ＰＬＰ−ＮＤＡ１０％（▲）、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％（▼）の各水溶液に溶解したピレンの励起スペクトルに認められたＩ３３８／Ｉ３３３のｐＨ依存性変化を示す図である。
【図２Ｃ】１００ｍＭバッファー中、ｐＨ７．４における、ＰＬＰ（■）、ＰＬＰ−ＮＤＡ３％（●）、ＰＬＰ−ＮＤＡ１０％（▲）、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％（▼）の各水溶液に溶解したピレンの励起スペクトルに認められたＩ３３８／Ｉ３３３の濃度依存性変化を示す図である。
【図３Ａ】濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４（実線）及びｐＨ５．５（点線）における、ＰＬＰの粒径分布を示す図である。
【図３Ｂ】濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４（実線）及びｐＨ５．５（点線）における、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の粒径分布を示す図である。
【図４Ａ】ＰＬＰ及びその誘導体が存在するときの赤血球の相対的な溶血率を示す図である。０．５ｍｇ／ｍＬで１時間、ＰＬＰ（■）、ＰＬＰ−ＮＤＡ３％（●）、ＰＬＰ−ＮＤＡ１０％（▲）、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％（▼）と共にインキュベートしたときのＲＢＣのｐＨ依存性の溶血を示す。
【図４Ｂ】ＰＬＰ及びその誘導体が存在するときの赤血球の相対的な溶血率を示す図である。ｐＨ７．４（白いバー）及びｐＨ５．５（黒いバー）において、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％と共にインキュベートしたときのＲＢＣの濃度依存性の溶血を示す。
【図４Ｃ】ＰＬＰ及びその誘導体が存在するときの赤血球の相対的な溶血率を示す図である。０．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５において、ＰＬＰ（■）、ＰＬＰ−ＮＤＡ３％（●）、ＰＬＰ−ＮＤＡ１０％（▲）、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％（▼）と共にインキュベートしたときのＲＢＣの時間依存性の溶血を示す。
【図５Ａ】Ｉｎ−ｖｉｔｒｏでの細胞毒性を示す図である。様々な濃度で４時間（白色）、１２時間（灰色）、２４時間（黒色）、及び４８時間（斜線）、ＰＬ−ＮＤＡ１８％と共にインキュベートしたときのＨｅＬａ細胞の生存率を示す。
【図５Ｂ】Ｉｎ−ｖｉｔｒｏでの細胞毒性を示す図である。様々な濃度で４時間（白色）、１２時間（灰色）、２４時間（黒色）、及び４８時間（斜線）、ＰＬ−ＮＤＡ１８％と共にインキュベートしたときのＣＨＯ細胞の生存率を示す。
【図５Ｃ】Ｉｎ−ｖｉｔｒｏでの細胞毒性を示す図である。様々な濃度で４時間（白色）、１２時間（灰色）、２４時間（黒色）、及び４８時間（斜線）、ＰＬ−ＮＤＡ１８％と共にインキュベートしたときのＡ５４９細胞の生存率を示す。
【図５Ｄ】ポリマー濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、２４時間におけるＨｅＬａ、ＣＨＯ、及びＡ５４９細胞に対するＰＬＰ（白色）及びＰＬＰ−ＮＤＡ１８％（灰色）のｉｎ−ｖｉｔｒｏでの細胞毒性を示す。
【図６Ａ】Ｈｅｌａ細胞について、カルセイン蛍光の細胞内分布を表す共焦点顕微鏡画像を示す図である。細胞を、２．０ｍｇ／ｍＬのカルセイン単独、２．０ｍｇ／ｍＬのカルセイン及び０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰの両方、又は２．０ｍｇ／ｍＬのカルセイン及び０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の両方で処置した。取り込みから１時間後、細胞の画像を取得し、そして更に３時間インキュベートした。スケールバー：１０μｍ
【図６Ｂ】ＣＨＯ細胞について、カルセイン蛍光の細胞内分布を表す共焦点顕微鏡画像を示す図である。細胞を、２．０ｍｇ／ｍＬのカルセイン単独、２．０ｍｇ／ｍＬのカルセイン及び０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰの両方、又は２．０ｍｇ／ｍＬのカルセイン及び０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の両方で処置した。取り込みから１時間後、細胞の画像を取得し、そして更に３時間インキュベートした。スケールバー：１０μｍ
【図６Ｃ】Ａ５４９細胞について、カルセイン蛍光の細胞内分布を表す共焦点顕微鏡画像を示す図である。細胞を、２．０ｍｇ／ｍＬのカルセイン単独、２．０ｍｇ／ｍＬのカルセイン及び０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰの両方、又は２．０ｍｇ／ｍＬのカルセイン及び０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の両方で処置した。取り込みから２時間後、細胞の画像を取得し、そして更に２時間インキュベートした。スケールバー：１０μｍ
【図７Ａ】異なる分子量のＦＩＴＣ−デキストランのＨｅＬａ細胞中への、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％が媒介する送達を示す図である。ＨｅＬａ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及びＦＩＴＣ−デキストランと共に、ｐＨ６．５で３０分間インキュベートした。スケールバー：２０μｍ。
【図７Ｂ】異なる分子量のＦＩＴＣ−デキストランのＨｅＬａ細胞中への、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％が媒介する送達を示す図である。ＨｅＬａ細胞を、ＦＩＴＣ−デキストランのみと、ｐＨ６．５で３０分間インキュベートした。スケールバー：２０μｍ。
【図７Ｃ】異なる分子量のＦＩＴＣ−デキストランのＨｅＬａ細胞中への、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％が媒介する送達を示す図である。ＨｅＬａ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及びＦＩＴＣ−デキストランと共に、Ｈ７．４で３０分間インキュベートした。スケールバー：２０μｍ。
【図８】ポリマー濃度依存性の細胞内送達を示す図である。ＨｅＬａ細胞を、様々な濃度のＰＬＰ−ＮＤＡ１８％、及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）と共に、ｐＨ６．５で３０分間インキュベートした。スケールバー：２０μｍ。
【図９Ａ】ポリマー媒介式の送達について、フローサイトメトリーにより分析した共焦点顕微鏡画像を示す図である。ＨｅＬａ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬの異なる長さのアルキル鎖を含有する櫛型ポリマーの不存在下（コントロール）又は存在下で、２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）と共に、ｐＨ６．５で３０分間インキュベートした。スケールバー：２０μｍ。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図９Ｂ】ポリマー媒介式の送達について、フローサイトメトリーにより分析した相対的な平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。ＨｅＬａ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬの異なる長さのアルキル鎖を含有する櫛型ポリマーの不存在下（コントロール）又は存在下で、２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）と共に、ｐＨ６．５で３０分間インキュベートした。スケールバー：２０μｍ。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１０】ｐＨ依存性ポリマー媒介式の細胞内送達の共焦点顕微鏡画像を示す図である。ＨｅＬａ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）と共に、様々な細胞外ｐＨで３０分間同時インキュベートした。スケールバー：２０μｍ。
【図１１Ａ】２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）のポリマー媒介式送達についてフローサイトメトリーにより分析した、異なる細胞外ｐＨにおける相対的なＭＦＩを示す図である。ＨｅＬａ細胞を、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の不存在下（白いバー）又は０．５ｍｇ／ｍＬで存在下（黒いバー）、異なる細胞外ｐＨにおいて３０分間インキュベートした。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１１Ｂ】２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）のポリマー媒介式送達についてフローサイトメトリーにより分析した、異なる細胞外ｐＨにおける代表的なヒストグラムプロットを示す図である。ＨｅＬａ細胞を、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の不存在下（白いバー）又は０．５ｍｇ／ｍＬで存在下（黒いバー）、異なる細胞外ｐＨにおいて３０分間インキュベートした。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１２】時間依存性ポリマー媒介式細胞内送達の共焦点顕微鏡画像を示す図である。ＨｅＬａ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）と共に、ｐＨ６．５で様々な時間、同時インキュベートした。スケールバー：２０μｍ。
【図１３】フローサイトメトリーにより分析した、時間依存性ポリマー媒介式細胞送達の相対的なＭＦＩを示す図である。ＨｅＬａ細胞を、２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）と共に、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の不存在下（白いバー）又は０．５ｍｇ／ｍＬで存在下（黒いバー）、ｐＨ６．５において様々な時間インキュベートした。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１４】ＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）の異なる細胞型へのポリマー媒介式送達に関する共焦点顕微鏡画像を示す図である。すべての細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％、及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストランを用いて、ｐＨ６．５で同時処置した。処置時間は、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、及びＳＵ−ＤＨＬ−８細胞について３０分、Ａ５４９細胞について１８０分、及びＭＥＳ−ＳＡ、ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５、及びｈＭＳＣ細胞について６０分であった。スケールバー：２０μｍ。
【図１５Ａ−１】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す相対的なＭＦＩを示す図である。ＨｅＬａ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ＨｅＬａ細胞について３０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ａ−２】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す相対的なＭＦＩを示す図である。ＣＨＯ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ＣＨＯ細胞について３０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ａ−３】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す相対的なＭＦＩを示す図である。Ａ５４９細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、Ａ５４９細胞について１８０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ａ−４】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す相対的なＭＦＩを示す図である。ＳＵ−ＤＨＬ−８細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ＳＵ−ＤＨＬ−８細胞について３０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ａ−５】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す相対的なＭＦＩを示す図である。ＭＥＳ−ＳＡ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ＭＥＳ−ＳＡ細胞について５０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ａ−６】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す相対的なＭＦＩを示す図である。ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５細胞について５０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ａ−７】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す相対的なＭＦＩを示す図である。ｈＭＳＣ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ｈＭＳＣ細胞について５０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ｂ−１】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す代表的なヒストグラムプロットを示す図である。ＨｅＬａ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ＨｅＬａ細胞について３０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ｂ−２】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す代表的なヒストグラムプロットを示す図である。ＣＨＯ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ＣＨＯ細胞について３０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ｂ−３】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す代表的なヒストグラムプロットを示す図である。Ａ５４９細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ＳＵ−ＤＨＬ−８細胞について１８０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ｂ−４】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す代表的なヒストグラムプロットを示す図である。ＳＵ−ＤＨＬ−８細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ＳＵ−ＤＨＬ−８細胞について３０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ｂ−５】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す代表的なヒストグラムプロットを示す図である。ＭＥＳ−ＳＡ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ＭＥＳ−ＳＡ細胞について５０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ｂ−６】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す代表的なヒストグラムプロットを示す図である。ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５細胞について５０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１５Ｂ−７】ＦＩＴＣ−デキストランの異なる細胞型へのポリマー媒介式送達を表す代表的なヒストグラムプロットを示す図である。ｈＭＳＣ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び２００μＭのＦＩＴＣ−デキストラン（４ｋＤａ）を用いて、ｐＨ６．５で処置した。処置時間は、ｈＭＳＣ細胞について５０分であった。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１６Ａ】ポリマー濃度依存性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。ＨｅＬａ細胞を様々な濃度のＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を用いて、ｐＨ６．５（黒いバー）及びｐＨ７．４（白いバー）で１時間処置した。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１６Ｂ】時間依存性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。ＨｅＬａ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を用いて、ｐＨ６．５（黒いバー）及びｐＨ７．４（白いバー）で様々な時間処置した。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１６Ｃ】様々な細胞株に対するＰＬＰ−ＮＤＡ１８％のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＣＨＯ、ＭＥＳ−ＳＡ、ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５、及びｈＭＳＣを、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を用いて、ｐＨ６．５（黒いバー）及びｐＨ７．４（白いバー）で３時間処置した。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図１７】異なる濃度のＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を添加した０．３６Ｍのトレハロース溶液中での赤血球のトレハロースローディング（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を示す図である。［ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％］＝３００、４５０、６００、及び８００μｇ／ｍＬ；インキュベーション時間＝１５分、３０分、及び１時間；温度＝３７℃、及びｐＨ＝７．０５。細胞内トレハロース濃度を、アンスロン法により計算した。データは３回の繰り返しに由来する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１８】異なる濃度のＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を添加した０．３６Ｍのトレハロース溶液中での赤血球の溶血（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を示す図である。［ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％］＝３００、４５０、６００、及び８００μｇ／ｍＬ；インキュベーション時間＝１５分、３０分、及び１時間；温度＝３７℃、及びｐＨ＝７．０５。上清を収集し、そして吸光度をＵＶ−ＶＩＳ分光光度法により５４１ｎｍにおいて測定した。データは３回の繰り返しに由来する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１９】異なる濃度のＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を添加した０．３６Ｍのトレハロース溶液中での赤血球のトレハロースローディング（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を示す図である。［ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％］＝６００、８００，１２００μｇ／ｍＬ；インキュベーション時間＝１５分、温度＝３７℃、及びｐＨ＝７．０５、６．８、６．５、６．１、５．６。細胞内トレハロース濃度を、アンスロン法により計算した。データは３回の繰り返しに由来する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２０】異なる濃度のＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を添加した０．３６Ｍのトレハロース溶液中での赤血球の溶血（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を示す図である。［ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％］＝６００、８００，１２００μｇ／ｍＬ；インキュベーション時間＝１５分、温度＝３７℃、及びｐＨ＝７．０５、６．８、６．５、６．１、５．６。上清を収集し、そして吸光度をＵＶ−ＶＩＳ分光光度法により５４１ｎｍにおいて測定した。データは３回の繰り返しに由来する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２１】８００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を添加した０．３６Ｍのトレハロース溶液中での赤血球の時間依存性トレハロースローディング及び溶血（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を示す図である。温度＝３７℃、及びｐＨ＝６．１。細胞内トレハロース濃度を、アンスロン法により計算した。上清を収集し、そして吸光度をＵＶ−ＶＩＳ分光光度法により５４１ｎｍにおいて測定した。データは３回の繰り返しに由来する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２２】８００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を添加した０．３６Ｍのトレハロース溶液中での赤血球の温度依存性トレハロースローディング及び溶血（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を示す図である。インキュベーション時間＝１５分、及びｐＨ＝６．１。細胞内トレハロース濃度を、アンスロン法により計算した。上清を収集し、そして吸光度をＵＶ−ＶＩＳ分光光度法により５４１ｎｍにおいて測定した。データは３回の繰り返しに由来する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２３】細胞外トレハロース濃度が、８００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を添加したトレハロース溶液中での赤血球（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）のトレハロースローディング及び溶血に及ぼす影響を示す図である。インキュベーション時間＝１時間、温度＝３７℃、及びｐＨ＝６．１。細胞内トレハロース濃度を、アンスロン法により計算した。上清を収集し、そして吸光度をＵＶ−ＶＩＳ分光光度法により５４１ｎｍにおいて測定した。データは３回の繰り返しに由来する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２４】疎水性ペンダント鎖の長さがトレハロースローディングに及ぼす影響を示す図である。赤血球（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を、８００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＨＡＤ（７炭素鎖）、ＰＬＰ−ＮＤＡ（１０炭素鎖）、ＰＬＰ−ＴＤＡ（１４炭素鎖）、及びＰＬＰ−ＯＤＡ（１８炭素鎖）を含有する０．３６Ｍのトレハロース溶液中で処置した。インキュベーション時間＝１５分；温度＝３７℃、及びｐＨ＝６．１。細胞内トレハロース濃度を、アンスロン法により計算した。データは３回の繰り返しに由来する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２５】疎水性ペンダント鎖の長さが溶血に及ぼす影響を示す図である。８００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＨＡＤ（Ｃ７鎖）、ＰＬＰ−ＮＤＡ（Ｃ１０鎖）、ＰＬＰ−ＴＤＡ（Ｃ１４鎖）、及びＰＬＰ−ＯＤＡ（Ｃ１８鎖）を含有する０．３６Ｍのトレハロース溶液中で赤血球（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を処置した。インキュベーション時間＝１５分；温度＝３７℃、及びｐＨ＝６．１。上清を収集し、そして吸光度をＵＶ−ＶＩＳ分光光度法により５４１ｎｍにおいて測定した。データは３回の繰り返しに由来する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２６】疎水性ペンダント鎖ＮＤＡによるグラフティング度がトレハロースローディング及び溶血に及ぼす影響を示す図である。赤血球（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を、８００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡを含有する０．３６Ｍのトレハロース溶液中、グラフティング度３％、１０％、及び１８％で処置した。インキュベーション時間＝１５分；温度＝３７℃、及びｐＨ＝６．１。細胞内トレハロース濃度を、アンスロン法により計算した。上清を収集し、そして吸光度をＵＶ−ＶＩＳ分光光度法により５４１ｎｍにおいて測定した。データは３回の繰り返しに由来する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図２７】赤血球へのポリマー媒介式送達の共焦点顕微鏡画像を示す図である。赤血球（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を、８００μｇ／ｍＬのＰＰ５０（Ｌ−フェニルアラニンがグラフト結合したＰＬＰ）、又はＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の不存在下又は存在下で、０．３６Ｍのトレハロース及び０．１ｍＭのカルセインと共に、異なるｐＨにおいて１５分間、同時インキュベートした。温度＝３７℃。スケールバー：２μｍ。
【図２８】赤血球へのポリマー媒介式送達のフローサイトメトリー分析を示す図である。赤血球（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を、８００μｇ／ｍＬのＰＰ５０又はＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の不存在下又は存在下で、０．３６Ｍのトレハロース及び０．１ｍＭのカルセインと共に、異なるｐＨにおいて１５分間インキュベートした。温度＝３７℃。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。
【図２９】トレハロースローディング後の膜の完全性を表す共焦点顕微鏡画像を示す図である。（Ａ）赤血球を、ｐＨ６．１のＰＢＳバッファーに溶解した０．３６Ｍのトレハロースと共に１５分間インキュベートし、ｐＨ７．４のバッファーで２回洗浄し、そしてｐＨ７．４、１μＭのカルセインと共にインキュベートした。（Ｂ）赤血球を、８００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％、及びｐＨ６．１のＰＢＳバッファーに溶解した０．３６Ｍのトレハロースを用いて１５分間処置し、ｐＨ７．４のバッファーで洗浄し、そしてｐＨ７．４、１μＭのカルセインと共にインキュベートした。スケールバー：４μｍ。
【図３０−１】異なるポリマーで処置した赤血球膜表面のトポグラフィックＡＦＭ顕微鏡写真を示す図である（コントロール）。赤血球（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を、８００μｇ／ｍＬのＰＰ５０又はＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の不存在下又は存在下で、０．３６Ｍのトレハロース溶液と共に、ｐＨ６．１、３７℃で１５分間インキュベートした。細胞を、ポリリジンをコーティングした顕微鏡スライド上に固定し、グルタルアルデヒド（１％）中で架橋し、脱イオン水で３回洗浄し、次に空気乾燥した。ＡＦＭを、タッピングモードのＡｓｙｌｕｍ  ＭＦＰ−３Ｄ顕微鏡を使用して実施した。ナノセンサーＰＰＰ−ＮＣＨＲチップ（共振周波数＝約３２０ｋＨｚ（公称値）、チップ半径７ｎｍ（公称値）、ばね定数４２Ｎ／ｍ）を使用し、そして目標タッピング強度１〜２Ｖに調整した。
【図３０−２】異なるポリマーで処置した赤血球膜表面のトポグラフィックＡＦＭ顕微鏡写真を示す図である（ＰＰ５０）。赤血球（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を、８００μｇ／ｍＬのＰＰ５０又はＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の不存在下又は存在下で、０．３６Ｍのトレハロース溶液と共に、ｐＨ６．１、３７℃で１５分間インキュベートした。細胞を、ポリリジンをコーティングした顕微鏡スライド上に固定し、グルタルアルデヒド（１％）中で架橋し、脱イオン水で３回洗浄し、次に空気乾燥した。ＡＦＭを、タッピングモードのＡｓｙｌｕｍ  ＭＦＰ−３Ｄ顕微鏡を使用して実施した。ナノセンサーＰＰＰ−ＮＣＨＲチップ（共振周波数＝約３２０ｋＨｚ（公称値）、チップ半径７ｎｍ（公称値）、ばね定数４２Ｎ／ｍ）を使用し、そして目標タッピング強度１〜２Ｖに調整した。
【図３０−３】異なるポリマーで処置した赤血球膜表面のトポグラフィックＡＦＭ顕微鏡写真を示す図である（ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％）。赤血球（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を、８００μｇ／ｍＬのＰＰ５０又はＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の不存在下又は存在下で、０．３６Ｍのトレハロース溶液と共に、ｐＨ６．１、３７℃で１５分間インキュベートした。細胞を、ポリリジンをコーティングした顕微鏡スライド上に固定し、グルタルアルデヒド（１％）中で架橋し、脱イオン水で３回洗浄し、次に空気乾燥した。ＡＦＭを、タッピングモードのＡｓｙｌｕｍ  ＭＦＰ−３Ｄ顕微鏡を使用して実施した。ナノセンサーＰＰＰ−ＮＣＨＲチップ（共振周波数＝約３２０ｋＨｚ（公称値）、チップ半径７ｎｍ（公称値）、ばね定数４２Ｎ／ｍ）を使用し、そして目標タッピング強度１〜２Ｖに調整した。
【図３１】赤血球の凍結生存率（％）を示す図である。赤血球（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を、３０６ｍＯｓｍのＰＢＳバッファー（■）；ｐＨ７．０５、０．３６Ｍの細胞外トレハロース溶液（●）；及び８００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を含有する、ｐＨ＝６．１０、０．３６Ｍの細胞外トレハロース溶液（▲）に懸濁した。インキュベーション時間＝１５分、及び温度＝３７℃。トレハロースローディング後、赤血球を２ｍＬのクリオバイアルチューブに移し、その後液体窒素（−１９６℃）中に所定の時間浸漬した。赤血球を次に３７℃の水浴中で１５分間解凍した。データは３回の繰り返しに由来する。エラーバーは標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１８５】
表１  ＰＬＰ及びその誘導体の沈殿が始まるｐＨ値（ｐＨｐ）、疎水的会合が始まるｐＨ値（ｐＨｈ）、会合のｐＨ範囲、及び限界会合濃度（ＣＡＣ）。
【０１８６】
【表１】
2019531330.tif 000006
【０１８７】
表２．濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４におけるＰＬＰ及びその誘導体の平均流体力学的径。
【０１８８】
【表２】
2019531330.tif 000007
【０１８９】
表３．様々な濃度、ｐＨ７．４におけるＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の平均流体力学的径
【０１９０】
【表３】
2019531330.tif 000008
【０１９１】
表４．異なるポリマーで処置した赤血球の平均粗さ（Ｒａ）又は根二乗平均粗さ（ＲＭＳ）。赤血球（充填容積１５％、１ｍＬ当たり細胞３．５×１０９個）を、８００μｇ／ｍＬのＰＰ５０又はＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の不存在下、又は存在下で、０．３６Ｍのトレハロース溶液と共に、ｐＨ６．１、３７℃で１５分間インキュベートした。細胞を、ポリリジンをコーティングした顕微鏡スライド上に固定し、グルタルアルデヒド（１％）中で架橋し、脱イオン水で３回洗浄し、次に空気乾燥し、その後ＡＦＭ測定した。
【０１９２】
【表４】
2019531330.tif 000009
【０１９３】
材料及び方法
デシルアミン（ＮＤＡ）、ヘプチルアミン（ＨＤＡ）、テトラデシルアミン（ＴＤＡ）、オクタデシルアミン（ＯＤＡ）、塩化イソフタロイル、フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン、平均Ｍｗ  ４Ｋ、１０Ｋ、７０Ｋ、１５０Ｋ、及び２０００Ｋ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、ペニシリン、及びアンスロンは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｄｏｒｓｅｔ、英国）からを購入した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ピレン、Ν，Ν−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）、メタノール（≧９９．８％）、塩化ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、塩化カリウム、及びカリウム二水素オルトリン酸を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、英国）から取得した。リジンメチルエステルジヒドロクロリド、Ν，Ν’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ｔｒｉｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ニンヒドリン、及びＤ−（＋）−トレハロース二水和物（≧９９％）はＡｌｐｈａ  Ａｅｓａｒ社（Ｈｅｙｓｈａｍ、英国）からを購入した。無水エタノール、アセトン、塩酸、水酸化ナトリウム、クロロホルム、ジエチルエーテル、及び硫酸（≧９５％）を、ＶＷＲ社（Ｌｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、英国）から取得した。脱線維素ヒツジ赤血球（ＲＢＣ）を、ＴＣＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ社（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ、英国）からを購入し、４℃の冷蔵庫中で保管し、そして入手したら１週間以内に使用した。
【０１９４】
ポリ(プロピレングリコール）、ポリエチレン、及びポリスチレンに基づくポリマーは、Ｓｉｇｍａ社から入手可能である。脂肪酸は、３Ｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から入手可能である。下記の化合物：Ｎ−（２−ナフチル）−１−ナフチルアミン（７６２６６０）、ｃ−（２−ｐ−トリル−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル）−メチルアミン（ＣＤＳ００８３３０）、１，１−ビス（４−クロロフェニル）−２−［（２−フルオロベンジル）アミノ］−１−エタノール（ＣＤＳ０１８８７０）、４−テトラデシルアニリン（２３３５５２）、ビス［２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）エチル］アミン溶液（７３９０２２）、３−（Ｆｍｏｃ−アミノ）ベンゾニトリル（７５０３５２）、ｈ−ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ｎｈ２（ＣＤＳ０１８５５９）、１，７−ジベンジル−１，４，７、１０−テトラアザシクロドデカン（ＣＤＳ００１０４０）、２−（３−オキソ−デカヒドロ−キノキザリン−２−イル）−Ｎ−（４−フェノキシ−フェニル）−アセトアミド（ＣＤＳ０１８７９９）、ポンタシルカルミン２ｂ（ＣＤＳ０１０５３４）、２−［（２−アミノ−４−メチルフェニル）スルファニル］−Ｎ−（２−メチルフェニル）アセトアミド（ＣＤＳ０１５８６３）、４−ニトロフェネチルアミン塩酸塩（１８４８０２）、３−（エトキシジメチルシリル）プロピルアミン（５８８８５７）、デシルアミン（Ｄ２４０４）、オクタデシルアミン（７４７５０）、ジヘキシルアミン（１３１２０２）、ジオクタデシルアミン（４２３５８）、３−ブテニルアミン塩酸塩（５９７６７８）、オレイルアミン（Ｏ７８０５）は、Ｓｉｇｍａ社からを購入した。
【０１９５】
エチル（プロプ−２−エン−１−イル）アミン（ＭｏｌＰｏｒｔ−０００−００５−２７１）ブタ−３−イン−１−アミン塩酸塩（ＭｏｌＰｏｒｔ−００４−９６８−５８７）、ビス（ブタ−２−イン−１−イル）アミン（ＭｏｌＰｏｒｔ−００１−９９１−３０５）、及びビス［（２Ｚ）−３−クロロブタ−２−エン−１−イル］アミン（ＭｏｌＰｏｒｔ−０００−１６３−３４５）は、ＭｏｌＰｏｒｔ社から購入した。
【０１９６】
メチル［７−（メチルイミノ）ヘプタ−１，３，５−トリエン−１−イル］アミン（ＦＣＨ４０９９５９３）、３−フルオロ−２−メチルオクト−７−イン−１−アミン（ＢＢＶ−７０８３２８１０）、［４，４−ジメチル−２−（ペント−４−イン−１−イル）シクロヘキシル］メタンアミン（ＢＢＶ−４９７２２５５０）、（８−アミノオクタ−１，３，５，７−テトライン−１−イル）ボラン（ＦＣＨ１９５７３８３）、（１，２，３，６−テトラヒドロピリジン−４−イル）ホスホン酸は、ＥｎａｍｉｎｅＳｔｏｒｅ（ＥＮ３００−２９８５０９）から購入し、また（デカ−１−イン−４−イル）（プロピル）アミン（ＣＳＣ０１３７７６７９９）は、Ｃｈｅｍｓｐａｃｅ社から購入した。
【０１９７】
ポリマー合成
ポリ（リジンイソフタルアミド）（ＰＬＰ）の合成
ＰＬＰを、単相重合法を使用して合成した。代表的な手順では、リジンメチルエステル・２ＨＣｌ（０．１５モル）及び炭酸カリウム（０．６モル）を、脱イオン水７５０ｍＬに溶解し、そして氷浴中で撹拌した。これに、乾燥アセトンに溶解した無水塩化イソフタロイルの事前冷却溶液（０．２Ｍ）７５０ｍＬを急速に添加した。ポリ（リジンメチルエステルイソ−フタルアミド）（ＰＬＰメチルエステル）が沈殿するまで、反応を進行させた。ポリマーを脱イオン水で数回洗浄し、及び終夜乾燥した。
【０１９８】
無水エタノールに溶解した５ｗｔ％のＮａＯＨ溶液（ＰＬＰメチルエステルに対して２．５モル当量）を、いくつかの部分に分けて、同一容積の乾燥ＤＭＳＯに溶解したＰＬＰメチルエステルの溶液（０．５Ｍ）に添加した。加水分解生成物が２〜３分内に析出し、それを減圧濾過により収集し、そして脱イオン水に再溶解した。未精製のポリマー溶液を、ビスキングチューブビング膜（Ｍｅｄｉｃｅｌｌ社、ＭＷＣＯ１２〜１４ｋＤａ）中で脱イオン水に対して透析を行い、無機塩、残留有機溶媒、及び低分子量オリゴマーを取り除いた。固体不純物を減圧濾過により除去した。透明な溶液を濃縮し、ＮａＯＨ水溶液を使用してｐＨ約７．４に調整後、凍結乾燥してナトリウム塩形態のＰＬＰを生成させた。その中性形態を調製するために、透析済みのポリマー溶液を希ＨＣｌ溶液でｐＨ約３．０に酸性化した。析出物を減圧濾過により収集し、脱イオン水で３回洗浄し、そして凍結乾燥して微細な白色粉末にした。
【０１９９】
ＰＬＰ誘導体の合成
ＮＤＡ、ＨＤＡ、ＴＤＡ、又はＯＤＡを、ＤＣＣ／ＤＭＡＰカップリングにより、様々な置換度でＰＬＰ骨格にコンジュゲートさせた。要するに、ＰＬＰ（３ｇ）、ＤＭＡＰ（０．６ｇ、ＰＬＰの２０ｗｔ％）を、無水ＤＭＳＯ／ＤＭＦ（１：３ｖ／ｖ）中に溶解した。ＮＤＡ、ＨＤＡ、ＴＤＡ、又はＯＤＡをクロロホルムに溶解し、次に反応溶液に移した。無水ＤＭＦ中のＤＣＣ（デシルアミンの３モル当量）を一滴ずつ添加した。反応を、薄層クロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ｔｒｉｔｈｙｌａｍｉｎｅ＝８：２：０．２、ニンヒドリンを使用してアミンを可視化）によりモニタリングした。固体不純物を減圧濾過により除去し、そして反応溶液に無水エタノールに溶解した５ｗｔ％ＮａＯＨを添加し、そして５倍容積のジエチルエーテル中で急速に析出させた。析出物を収集し、そして脱イオン水中で再溶解した。０．２ＭのＨＣｌ溶液を溶液に添加してポリマー析出物を析出させた。これを減圧濾過により収集し、そして０．２ＭのＮａＯＨを含む脱イオン水に再溶解した。析出−濾過−再溶解プロセスを２回実施して無機塩及び残留有機溶媒を取り除いた。ビスキング透析チューブ（Ｍｅｄｉｃｅｌｌ社、ＭＷＣＯ  １２〜１４ｋＤａ）中で脱イオン水に対して透析を行い、ポリマーを更に精製した。透析後、ポリマー溶液のｐＨを、０．２ＭのＮａＯＨを使用して７．４まで漸増し、次に凍結乾燥した。酸性形態に調製するために、０．２ＭのＨＣｌを使用して、透析済みのポリマー溶液のｐＨを約３．０まで酸性化した。析出物を収集し、そして凍結乾燥した。
【０２００】
ＰＬＰ（３５．７ｋＤａ）のＭｗを、水性ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）システムにより決定した。その重合度（ｎ）の平均値は約１３０である。各ポリマーの置換度を、ｄ６−ＤＭＳＯ中、１Ｈ−ＮＭＲ分光法により決定した（図１Ａ）。７．４５〜７．６４ｐｐｍの積分値に対する０．７７〜０．９１ｐｐｍの積分値の比を、置換度を計算するのに使用した。ＰＬＰ−ＮＤＡ３％、１０％、及び１８％は、親骨格に沿って存在するカルボン酸基１００個当たりのＮＤＡグラフトの数を表す（ｍｏｌ％）。ＰＬＰの置換度及びＭｗを、次に疎水性ペンダント鎖を含有する誘導体の分子量を計算するのに使用した。
【０２０１】
更なるＰＬＰ誘導体は、上記のように、ＤＣＣ／ＤＭＡＰカップリングにより表４の化学物質をＰＬＰ骨格と反応させることにより取得可能である。
【０２０２】
【表５−１】
2019531330.tif 000010
【０２０３】
【表５−２】
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【０２０４】
【表５−３】
2019531330.tif 000012
【０２０５】
比濁法
ｐＨが異なるポリマー溶液の光学密度を、４８０ｎｍにおいてＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｇｅｎｅｙｓ  １０Ｓ  ＵＶ−Ｖｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、英国）で測定した。ポリマー溶液をｐＨの異なるバッファーを用いて調製し、そして４８時間平衡化した。
【０２０６】
蛍光分光法
ピレンは、水溶液中のポリマーについて、その立体構造変換を調査するためのプローブとして使用されている。無水メタノールに溶解した１．０ｍＭのピレン溶液を新たに調製し、そして各水性ポリマー溶液に添加して最終ピレン濃度６×１０−７Ｍとした。遮光しながらポリマー溶液を４８時間平衡化した。ポリマー溶液に溶解したピレンの波長３３８及び３３３ｎｍ（λｅｍ＝３９０ｎｍ）における励起強度を、分光蛍光光度計（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ、ＨＯＲＩＢＡ社、日本）上で記録した。蛍光強度の比Ｉ３３８／Ｉ３３３を計算した。ｐＨ及び濃度及び限界凝集濃度（ＣＡＣ）に応答した立体構造変換を次に確認した。
【０２０７】
動的光散乱
水溶液中のポリマーの流体力学的径及びサイズ分布について、動的光散乱法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ社、英国）を使用して調査した。ポリマー溶液を、所定のｐＨにおいてバッファー中で調製し、そして４８時間平衡化した。０．４５μｍフィルターを通過させてすべてのサンプルを濾過し、そしてサイズ測定を直径１０ｍｍのセル内、散乱角１３７°で実施し、各測定につき１１回繰り返した。
【０２０８】
溶血
ポリマーの脂質膜活性を、脱線維素ヒツジ赤血球（ＲＢＣ）の溶血アッセイを使用して調べた。要するに、ポリマーを、所定のｐＨの０．１Ｍのリン酸バッファー又は０．１Ｍのクエン酸バッファーに添加した。ＲＢＣを１５０ｍＭのＮａＣｌで少なくとも３回洗浄し、そしてポリマー溶液に再懸濁して、最終濃度をＲＢＣ１〜２×１０８個／ｍｌとした。陰性コントロール（ポリマーが存在しない）及び陽性コントロール（脱イオン水中で溶解させたＲＢＣ）を同一の細胞密度で調製した。サンプルを、振盪式の水浴（１２０ｒｐｍ）中、３７℃で所定時間インキュベートし、次に４０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。ヘモグロビンの放出を、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用して、５４０ｎｍにおける上清の吸光度を測定することにより調査した。相対的な溶血率（％）を下記の式を使用して計算した：
溶血率（％）＝［（サンプルの吸光度−陰性コントロールの吸光度）／（陽性コントロールの吸光度−陰性コントロールの吸光度）］×１００
【０２０９】
細胞培養
ＨｅＬａ接着上皮細胞（ヒト子宮頸がん細胞）及びＡ５４９接着上皮細胞（ヒト肺がん細胞）を、別途規定しない限り１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリンが補充されたＤＭＥＭ中で増殖させた。ＣＨＯ接着上皮細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）を、別途規定しない限り１％（ｖ／ｖ）の非必須アミノ酸、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンが補充されたＤＭＥＭ中で培養した。ＨｅＬａ、Ａ５４９、及びＣＨＯ細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを使用してトリプシン処理し、そして５％ＣＯ２、３７℃設定の加湿インキュベーター中で維持した。
【０２１０】
ＭＥＳ−ＳＡ接着上皮細胞（ヒト子宮がん細胞）及び対応する多剤耐性細胞ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５を、別途規定しない限り１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを含有するマッコイの５Ａ培地中で培養した。ＭＥＳ−ＳＡ及びＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５細胞をＥＤＴＡ溶液（０．８ｍＭの二ナトリウムＥＤＴＡ、６８．５ｍＭのＮａＣｌ、６．７ｍＭの重炭酸ナトリウム、５．６ｍＭのグルコース、及び５．４ｍＭのＫＣｌ）を用いて継代培養し、そして５％ＣＯ２、３７℃設定の加湿インキュベーター中で維持した。
【０２１１】
ＳＵ−ＤＨＬ−８懸濁Ｂリンパ球細胞（ヒトリンパ節細胞）を１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させ、そして５％ＣＯ２、３７℃設定の加湿インキュベーター中で保持した。
【０２１２】
間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ヒト骨髄由来）を、１０％のＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを含有するイーグル最小必須培地中で培養した。トリプシン−ＥＤＴＡを使用して細胞をトリプシン処理し、そして５％ＣＯ２、３７℃設定の加湿インキュベーター中で維持した。
【０２１３】
アラマーブルーアッセイ
ポリマーの細胞毒性を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイを使用して評価した。細胞を、培養培地（０．１ｍＬ／ウェル）を含有する９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国）に細胞１×１０４個／ウェルの密度で２４時間播種した。使用済み培地を、様々な濃度で０．２２μｍフィルター滅菌処理済みのポリマーを含有するサンプル溶液０．１ｍＬで置き換えた。所定の期間インキュベーションした後、ポリマー含有培地を、１０％（ｖ／ｖ）のａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）を含有するＤＭＥＭで置き換えた。製造業者の指示に基づき、プレートを更に４時間インキュベートし、そして次に各ウェルの蛍光を、分光蛍光光度計（ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）により、励起波長５２５ｎｍ、発光波長５８０〜６４０ｎｍにおいて測定した。細胞毒性効果を、蛍光の読み取り値から決定した。
【０２１４】
レーザー走査型共焦点顕微鏡法
細胞内に取り込まれた物質を細胞質に放出させるポリマーの能力を評価するのに、膜不透過性の蛍光物質であるカルセインを採用した。２ｍＬのＨｅＬａ、ＣＨＯ、又はＡ５４９細胞（細胞２×１０５個／ｍＬ）をガラス底培養皿（３５ｍｍ、ＭａｔＴｅｋ社、米国）に播種し、そして５％ＣＯ２、３７℃設定のインキュベーター中で培養した。２４時間後、使用済みの培地を除去し、そして０．５ｍｇ／ｍＬのポリマー及び２ｍｇ／ｍＬのカルセインを含有する０．２２μｍフィルター滅菌処理済みの無血清培地２ｍＬで置き換えた。コントロール実験では、細胞を、２ｍｇ／ｍＬのカルセイン単独と共にインキュベートした。所定の期間インキュベーションした後、培地を補充したＤ−ＰＢＳバッファーで細胞を３回洗浄した。細胞をレーザー走査型共焦点顕微鏡により画像化した。カルセインを４８８ｎｍのレーザーを使用して励起し、そして５３５ｎｍでの発光を収集した。
【０２１５】
幅広いサイズ範囲のＦＩＴＣ標識デキストラン（４〜２０００ｋＤａ）を送達する擬ペプチドポリマーの能力を、７つの異なる細胞系において試験した。全細胞数が２×１０５個の接着細胞をガラス底皿中、終夜培養し、その後、所定の濃度及びｐＨの擬ペプチドポリマー及びＦＩＴＣ−デキストランを含有するＰＢＳにより、所定の期間処置した。細胞を次にＤ−ＰＢＳで洗浄し、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ及びＨｏｅｃｈｓｔで染色し、そして上記のように画像化した。懸濁細胞（ＳＵ−ＤＨＬ−８）では、細胞を遠心分離し、そして最終細胞濃度４×１０５個／ｍＬとなるように、擬ペプチドポリマー及びＦＩＴＣ−デキストランを含有するＰＢＳバッファー１ｍＬを用いて再懸濁した。３０分インキュベーションした後、細胞を遠心分離して上清を取り除き、Ｄ−ＰＢＳを用いて３回再懸濁し、そしてＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ及びＨｏｅｃｈｓｔで染色した後、画像化した。
【０２１６】
フローサイトメトリー
ポリマー媒介式のペイロード送達を定量的に評価するのに、フローサイトメトリーを採用した。接着細胞を、６ウェルプレート（細胞３×１０５個／ウェル）中、終夜培養し、そして所定の濃度の擬ペプチド及びＦＩＴＣ−デキストランを含有するＰＢＳ、１ｍＬで所定の期間処置した。その後、細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、トリプシンを使用して引き剥がし、次に１０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを無血清培養培地中に再懸濁し、そして４０μｍのＦｌｏｗｍｉＴＭチップストレーナー（Ｂｅｌ−Ａｒｔ社、米国）を通じて濾過し、細胞凝集物を取り除いた。ＳＵ−ＤＨＬ−８懸濁細胞（細胞８×１０５個／ｍＬ）を、ポリマー及びＦＩＴＣ−デキストランを含有するＰＢＳで３０分間処置した。細胞を次に遠心分離して上清を取り除き、そして濾過した。ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞アナライザーを用いて、励起波長４８８ｎｍでフローサイトメトリーを実施した。
【０２１７】
細胞内糖送達
３０６ｍＯｓｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）を、１３６．８９ｍＭの塩化ナトリウム、８．１０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、２．６８ｍＭの塩化カリウム、及び１．４７ｍＭのカリウム二水素オルトリン酸を脱イオン水１Ｌに溶解して調製した。６６０ｍＯｓｍのＰＢＳバッファーを、２９７．７４ｍＭのＮａＣｌ、１７．６２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、５．８３ｍＭのＫＣｌ、及び３．２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４を脱イオン水１Ｌに溶解して作成した。
【０２１８】
糖溶液（ポリマー有り／無し）を所定量の糖をＰＢＳバッファーに溶解して調製し、そしてそのｐＨを所望の値に調整した。アンスロン１２５ｍｇを６６％（ｖ／ｖ）Ｈ２ＳＯ４に添加して、アンスロン溶液を調製した。
【０２１９】
ヒツジ赤血球を約１２００ｒｃｆで４分間遠心分離した。上清を除去した後、３０６ｍＯｓｍのＰＢＳバッファーを次に添加した。遊離のヘモグロビンを完全に取り除くために、このプロセスを３回繰り返した。糖溶液を、事前洗浄したＲＢＣに添加して、１５％血球充填容積（ＣＰＶ，cell packed volume）を実現した。細胞を溶液中に均一に再懸濁した。その後、ＲＢＣを、所望の温度で所定の期間インキュベートした。
【０２２０】
インキュベーション後、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計により５４１ｎｍにおける上清の吸光度測定を行うことにより溶血を調べた。細胞ペレットを等張のＰＢＳバッファー（６６０ｍＯｓｍ）で２回洗浄して細胞外糖分子を取り除いた。ＲＢＣを次に８０％メタノールにより、８５℃の水浴中、１時間溶解させ、そして約１１０００ｒｃｆで４分間遠心分離した。上清を１００℃のオーブン中に終夜配置して、水及びメタノールを完全に取り除き、その後脱イオン水２ｍＬを添加した。アンスロン法を次に実施して、細胞内糖濃度を定量した。具体的には、０．５ｍｌの上記溶液を、アンスロン溶液に添加し、その後１００℃で１５分間水浴に配置した。次に、吸光度をＵＶ−Ｖｉｓにより波長６２０ｎｍにおいて測定して、細胞内部にローディングされた糖分子の量を計算した。
【０２２１】
充填容積が１５％（ＲＢＣ３．５×１０９個／ｍｌ）のヒツジ赤血球（ＲＢＣ）を、２ｍＬ遠心管内に配置し、これに所定の濃度のポリマー及びトレハロースを含有する所望のｐＨのＰＢＳバッファー溶液を添加した。３７℃で所定の期間インキュベートした後、上記方法を使用して、細胞内にローディングされたトレハロースの量を測定した。血液溶液を次に２ｍｌポリプロピレンクライオバイアルに移した。クライオバイアルチューブを液体窒素（−１９６℃）中に所定の期間浸漬した。ＲＢＣを次に３７℃の水浴中で１５分間解凍した。細胞懸濁物を次に遠心分離し、そして細胞ペレットを溶解させて、溶解したＲＢＣ溶液の５４１ｎｍにおける吸光度から生存細胞の量を計算した。糖送達及び凍結−解凍プロセス期間中の溶血もまた測定し、そして凍結生存率を計算するのに使用した。
【０２２２】
ＲＢＣの共焦点顕微鏡法及びフローサイトメトリー
膜不透過性のカルセインを適用して、赤血球中へのポリマー媒介式送達を更に調査した。ＲＢＣ（１５％充填血球容積）を３回洗浄し、そして０．３６Ｍのトレハロース＋０．１ｍＭのカルセイン、０．３６Ｍのトレハロース＋０．１ｍＭのカルセイン＋０．８ｍｇ／ｍＬのＰＰ５０、又は０．３６Ｍのトレハロース＋０．１ｍＭのカルセイン＋０．８ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％をそれぞれ含有するＰＢＳバッファーと共に、３７℃の振盪式水浴（１２０ｒｐｍ）中、ｐＨ６．１で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを遠心分離によりＰＢＳバッファーを用いて２回洗浄し、そしてＬＳＭ−５１０反転式レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ）により３７℃で画像化した。カルセインを４８８ｎｍで励起し、そして５３５ｎｍにおける発光を収集した。フローサイトメトリー測定を、励起波長４８８ｎｍのＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞アナライザー（ＢＤ社、米国）を使用して実施した。
【０２２３】
トレハロースローディング及び洗浄後の膜透過性を評価するために、ＲＢＣを、ポリマーの不存在下又は存在下でトレハロースと共に、ｐＨ６．１、３７℃で１５分間インキュベートし、その後、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファーで２回洗浄した。次に処理済みのＲＢＣを、１μＭのカルセインを含有するｐＨ７．４のＰＢＳバッファーと共にインキュベートし、そしてこれまで記載したようにレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて画像化した。
【０２２４】
原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）
ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％により媒介されるトレハロース細胞内迅速ローディングの機構を更に試験するために、ＡＦＭを適用してポリマー−細胞相互作用について試験した。ＲＢＣを３回洗浄し、０．３６Ｍのトレハロース、０．３６Ｍのトレハロース＋０．８ｍｇ／ｍＬのＰＰ５０、又は０．３６Ｍのトレハロース＋０．８ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を含有するＰＢＳバッファーと共に、ｐＨ６．１で１５分間インキュベートし、そしてポリリジンがコーティングされた顕微鏡スライド上に固定した。細胞をグルタルアルデヒド（１％）中で１０分間架橋し、洗浄し、次に空気乾燥した。Ａｓｙｌｕｍ  ＭＦＰ−３Ｄ顕微鏡（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ａｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）をタッピングモードで使用して、ＡＦＭを実施した。共振周波数約３２０ｋＨｚ、チップ半径７ｎｍ、及びばね定数４２Ｎ／ｍのナノセンサーＰＰＰ−ＮＣＨＲチップを使用し、そして目標タッピング強度１〜２Ｖに調整した。
【実施例１】
【０２２５】
ＮＤＡ（Ｃ１０）、並びにＨＤＡ（Ｃ７）、ＴＤＡ（Ｃ１４）、及びＯＤＡ（Ｃ１８）を含むその他のペンダント疎水性鎖がグラフト結合したＰＬＰの形成を、１Ｈ−ＮＭＲ及びＦＴＩＲスペクトルを使用して確認した（図１）。
【実施例２】
【０２２６】
ＮＤＡの置換度（％）が異なるＰＬＰの水溶液について、そのｐＨ依存性の透過率（図２Ａ）、並びにｐＨ及び濃度依存性の疎水的会合（図２Ｂ及び図２Ｃ）を示す。示す通り、ＰＬＰ−ＮＤＡは、ｐＨ依存性の特性を呈した。析出（ｐＨｐ）及び疎水的会合（ｐＨｈ）開始時のｐＨの上昇、会合におけるｐＨ範囲の拡大、及びＣＡＣの減少が、ＰＬＰに疎水性ペンダント側鎖をグラフト結合させること、及び置換度の増加により実現した（表１）。
【実施例３】
【０２２７】
ポリマーＰＬＰ及びＰＬＰ−ＮＤＡのｐＨ及び濃度依存性の粒径分布を示す（図３、表２、及び表３）。疎水性ペンダント鎖による置換度が増加すると、より強い疎水的相互作用に起因して粒径減少を引き起こす可能性がある。
【実施例４】
【０２２８】
ＰＬＰ及びその誘導体で処置した赤血球の溶血は、ｐＨ、濃度、及びインキュベーション時間に依存することが判明した（図４）。ポリマーの膜活性は、疎水性側鎖の種類及び置換度により操作可能である。ｐＨ７．４では溶血レベルが低い又は無視し得ることが判明した一方、酸性化すると膜不安定化能力が高まった。疎水性ペンダント鎖の置換度を最大１８％まで上げると膜活性が強化された。
【実施例５】
【０２２９】
ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性を、ＨｅＬａ細胞（図５Ａ）、ＣＨＯ細胞（図５Ｂ）、及びＡ５４９細胞（図５Ｃ）において、様々なＰＬＰ−ＮＤＡ濃度で４時間（白色）、１２時間（灰色）、２４時間（黒色）、及び４８時間（斜線）試験した。１２時間処置したときのＨｅＬａに対するＰＬＰ−ＮＤＡ１８％のＩＣ５０は、２．９４±０．２８ｍｇ／ｍＬであった一方、２４時間及び４８時間処置した後は、１．５９±０．２２ｍｇ／ｍＬ及び１．０５±０．１４ｍｇ／ｍＬにそれぞれ減少した。ＣＨＯ細胞は、４８時間処置したとき、ＩＣ５０は２．８１±０．９５ｍｇ／ｍＬであり、ＨｅＬａ細胞よりも良好な許容度を示したが、一方Ａ５４９は、４８時間処置したとき、４．５１±０．０６ｍｇ／ｍＬの最高ＩＣ５０を示した。図５Ｄは、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ又はＰＬＰ−ＮＤＡ１８％で２４時間細胞を処置したとき、その種類が異なっても細胞生存率は有意に異ならなかったことを示す。
【実施例６】
【０２３０】
ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び膜不透過性のカルセインで処置したＨｅｌａ（図６Ａ）、ＣＨＯ（図６Ｂ）、及びＡ５４９細胞（図６Ｃ）は、カルセイン単独で処置した、又はＰＬＰ及びカルセインで処置した細胞と比較したとき、細胞内に取り込まれたカルセインが細胞質に放出されたことにより、蛍光シグナルの増加を示した。
【実施例７】
【０２３１】
ｐＨ６．５で３０分間インキュベートした後の、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％に支援された、分子量（Ｍｗ）が異なるＦＩＴＣ−デキストランのＨｅＬａ細胞への送達（図７Ａ）を示す。細胞を、ＦＩＴＣ−デキストランのみ（図７Ｂ）又はＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及びＦＩＴＣデキストラン（図７Ｃ）と共に、ｐＨ７．４でインキュベートしたとき、有意な輸送は検出されなかった。
【実施例８】
【０２３２】
効率的輸送は、ポリマー濃度に依存し（図８）、またＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の濃度が０．５〜２ｍｇ／ｍＬのとき最大であった。
【実施例９】
【０２３３】
長さが異なるアルキル鎖を含有するＰＬＰの誘導体は、ＦＩＴＣ−デキストラン送達を促進した（図９）。送達効率のランク付けは、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％＞ＰＬＰ−ＴＤＡ１８％＞ＰＬＰ−ＨＤＡ１８％＞ＰＬＰ−ＯＤＡ１８％の順番であった。細胞をＦＩＴＣ−デキストラン単独と共にｐＨ６．５でインキュベートしたとき、有意な細胞内送達は認められなかった。
【実施例１０】
【０２３４】
共焦点顕微鏡（図１０）及びフローサイトメトリー（図１１）により実証されるように、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％は、細胞外ｐＨに応答して細胞内ペイロードを媒介した。細胞をＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及びＦＩＴＣ−デキストランと共にｐＨ７．４で同時インキュベートしたとき、ＦＩＴＣ−デキストランの限定的な細胞内送達を検出した。送達効率はｐＨの低下と共に顕著に高まった。細胞外ｐＨが５．５〜６．５のとき最高送達効率を実現した。
【実施例１１】
【０２３５】
共焦点顕微鏡（図１２）及びフローサイトメトリー（図１３）測定より、ＨｅＬａ細胞を、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及びＦＩＴＣ−デキストランと共にｐＨ６．５で同時インキュベートしたとき、処置からたった１０分後に細胞内送達を開始したことが明らかとなった。インキュベーション時間を延長すると送達効率は高まった。
【実施例１２】
【０２３６】
共焦点顕微鏡（図１４）及びフローサイトメトリー測定（図１５）により、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％媒介式の細胞内送達の幅広い適用可能性が実証された。強い拡散性の緑色蛍光が、ＨｅＬａ接着上皮細胞（ヒト子宮頸がん細胞）、ＣＨＯ接着上皮細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、Ａ５４９接着上皮細胞（ヒト肺がん細胞）、ＳＵ−ＤＨＬ−８懸濁Ｂリンパ球細胞株（ヒトリンパ節細胞）、ＭＥＳ−ＳＡ接着上皮細胞株（ヒト子宮がん細胞）、ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５接着多剤耐性細胞株、及びヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ヒト骨髄由来）を含む、試験されたすべての細胞型に認められた。これより、櫛型ポリマーは、接着及び懸濁細胞、がん性及び非がん性細胞、多剤耐性細胞、リンパ球、及び幹細胞を含む様々な細胞型に高分子を効率的に送達可能であることが確認される。
【実施例１３】
【０２３７】
様々な細胞外ｐＨ、ポリマー濃度、及び期間において、異なる細胞型に対するＰＬＰ−ＮＤＡ１８％のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性を評価した（図１６）。酸性ｐＨ及び中性ｐＨの両方において、様々な期間インキュベートした後、幅広いポリマー濃度範囲において、ポリマーは様々な細胞型について良好な許容性を示した。
【実施例１４】
【０２３８】
赤血球のトレハロースローディング及び溶血を、異なる条件、例えばインキュベーション時間及びポリマー濃度等においてモニタリングした。細胞内トレハロース濃度の増加は、ｐＨ７．０５でＰＬＰ−ＮＤＡ１８％（３００〜８００μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートを行い、その１５分後に測定することができた。８００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％中で細胞を６０分間インキュベートした後に、細胞内トレハロース濃度２１５ｍＭを実現した（図１７）。赤血球の溶血が、ＰＬＰ−ＮＤＡポリマー濃度に比例して増加することが判明した（図１８）。
【実施例１５】
【０２３９】
トレハロースの取り込み量及び溶血は、ｐＨ依存性である。取り込み量は、６．１〜５．６のｐＨで処置を行い、その１５分後に増加し、また溶血は試験されたすべての濃度について低かった（図１９）。細胞を６００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡで処置したとき、このｐＨにおける溶血は低下した（図２０）。
【実施例１６】
【０２４０】
トレハロースローディング及び溶血は、ＰＬＰ−ＮＤＡインキュベーション時間（図２１）及び温度（図２２）に依存する。ｐＨ６．１、８００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を添加した０．３６Ｍのトレハロース溶液中の赤血球の細胞内トレハロース濃度は、ローディングから６０分後に最大約０．３Ｍの高レベルに達し、溶血は３０％未満であった。試験された温度範囲（３１〜４０℃）において、細胞内トレハロース及び溶血は３７℃においてピークに達した。
【実施例１７】
【０２４１】
トレハロースローディング及び溶血は細胞外トレハロース濃度に依存する。０．３６Ｍのトレハロース及び８００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％を含有する溶液中で細胞を１時間インキュベートすると、３０％未満の溶血及び３００ｍＭという高濃度の細胞内トレハロース濃度を実現した（図２３）。
【実施例１８】
【０２４２】
疎水性ペンダント鎖の長さ及び置換度が、細胞のトレハロースローディング（図２４及び図２６）及び溶血（図２５〜２６）に及ぼす影響をモニタリングした。ＮＤＡ（Ｃ７）により置換度１８％で置換されたＰＬＰは、最適な細胞内トレハロースローディングを示した。
【実施例１９】
【０２４３】
膜不透過性色素のカルセインをトレハロースと混合して、その細胞中への移行を共焦点顕微鏡（図２７）及びフローサイトメトリー（図２８）により追跡した。に示す通り、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％は、ペイロード（カルセイン及びトレハロース）の細胞内送達を、処置からたった１５分後に、９時間ほどかかることが報告されているＰＰ５０（疎水性アミノ酸のフェニルアラニンがグラフト結合したＰＬＰ）よりもはるかに迅速に誘発した。ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％により誘発された細胞内送達もまた、ＰＰ５０よりも顕著に効率的であった。ｐＨ７．４では、両ポリマーが媒介する細胞内送達は限定的であった。
【実施例２０】
【０２４４】
糖ローディング後の赤血球膜の完全性を評価した（図２９）。洗浄及びｐＨ７．４に調整後、カルセインは細胞膜を透過できなかったことから、赤血球膜は、糖ローディング後、ＰＬＰ−ＮＤＡ１８％の不存在下又は存在下で不透過性のまま留まった。これは、ポリマーは永続的な膜の障害を引き起こさなかったこと、及びポリマー媒介式の膜透過処理は可逆的であったことを示唆する。
【実施例２１】
【０２４５】
異なるポリマーが介在する赤血球の膜表面粗さを、トポグラフィックＡＦＭを使用して比較した（図３０、表５）。細胞表面粗さのランク付けは、ＰＬＰ−１８％＞ＰＰ５０＞コントロールの順番であり、ＰＬＰ−１８％は、ＰＰ５０と比較して、それより強い細胞膜との相互作用を促進したことを示唆する。
【実施例２２】
【０２４６】
８００μｇ／ｍＬのＰＬＰ−ＮＤＡ１８％及び０．３６Ｍのトレハロース溶液を用いて、赤血球（図３１）をｐＨ６．１で１５分間処置すると、約８５％の生存率を実現することができ、０．３６Ｍのトレハロース溶液のみで処置した細胞よりも有意に高かった。凍結保存期間を５分から１６８時間に延長しても、凍結生存率の変化は有意ではなかった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ−１】
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【図１５Ａ−２】
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【図１５Ａ−３】
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【図１５Ａ−４】
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【図１５Ａ−５】
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【図１５Ａ−６】
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【図１５Ａ−７】
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【図１５Ｂ−１】
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【図１５Ｂ−２】
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【図１５Ｂ−３】
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【図１５Ｂ−４】
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【図１５Ｂ−５】
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【図１５Ｂ−６】
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【図１５Ｂ−７】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３１】
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【国際調査報告】
2019531330.tif 000077
2019531330.tif 000078
2019531330.tif 000079