(57)【要約】  本発明は、追加の癌治療と同時に又は連続的に投与される、癌の治療に有用なＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、並びに癌の治療又は予防のための方法における使用のためのＰＤ−Ｌ１ペプチド断片に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：Ｘ１ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＸ２
[式中、
Ｎ末端のＸ１は、Ｌ、ＨＬ、ＴＨＬ、ＲＴＨＬ（配列番号７９）、ＥＲＴＨＬ（配列番号８０）、ＮＥＲＴＨＬ（配列番号８１）から成る群から選択され、又は存在せず、
Ｃ末端のＸ２は、Ｆ、ＦＲ、ＦＲＬ、ＦＲＬＲ（配列番号８２）、ＦＲＬＲＫ（配列番号８３）、ＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）、ＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号８５）、ＦＲＬＲＫＧＲＭ（配列番号８６）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭ（配列番号８７）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号８８）から成る群から選択され、又は存在せず、
ただし、Ｘ１が存在しない場合Ｘ２はＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）ではなく、
Ｃ末端のアミノ酸はまた、アミドを含んでもよく、
任意でペプチド断片は、Ｃ末端アミノ酸又はアミドを含むＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号５２）のアミノ酸配列を有する]
を有する、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ−ＯＨ（配列番号７７）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号７７）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＯＨ（配列番号５２）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号５２）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＯＨ（配列番号６７）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号６７）、
ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＯＨ（配列番号２）、
ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号２）、
から選択される請求項１に記載のペプチド断片、又はそれらの薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ−ＯＨ（配列番号７７）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＯＨ（配列番号５２）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号５２）
から選択される請求項１に記載のペプチド断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片を、任意で薬学的に許容可能な添加剤及び／又は保存料と共に含む組成物。
【請求項５】
薬剤としての使用のための、
ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、及び
ｂ）アジュバント
を含む、免疫療法組成物。
【請求項６】
腫瘍形成癌疾患等の癌；感染性疾患等の感染症、例えば細胞内感染、例えばＬ．モノサイトゲネス（L. monocytogenes）及びマラリア原虫（plasmodium）から成る群から選択される病原体の細胞内感染、ウイルス感染、例えばＨＩＶ及び肝炎から成る群から選択されるウイルス感染；糖尿病、ＳＬＥ、及び硬化症等の自己免疫疾患、から選択される疾患、障害又は状態の治療又は予防のための方法における使用のための、請求項５に記載の免疫療法組成物。
【請求項７】
アジュバントが、細菌ＤＮＡに基づくアジュバント、オイル／界面活性剤に基づくアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡに基づくアジュバント、イミダゾキニリン（imidazochinilines）、モンタナイド（Montanide）ＩＳＡアジュバントから成る群から選択される、請求項４〜５のいずれか１項に記載の免疫療法組成物。
【請求項８】
以下を含むキット；
ａ）請求項４〜６のいずれか１項に記載の免疫療法組成物、及び
ｂ）インターロイキン等の免疫刺激化合物、例えばＩＬ−２及び／又はＩＬ−２１、化学療法剤等の抗癌剤、例えば、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イリノテカン、レナリドミド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニボルマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、レブラミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン、から選択される少なくとも１種の第２活性成分を含む組成物。
【請求項９】
提供された組成物が同時に又は連続的に投与されるものである、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ＰＤ−Ｌ１の発現を特徴とする臨床状態を治療する方法であって、前記臨床状態を患う個体に有効量の請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド断片、請求項４〜６のいずれか１項に記載の組成物、又は請求項７〜８のいずれか１項に記載のキットを投与することを含む方法。
【請求項１１】
ＰＤ−Ｌ１の発現を特徴とする臨床状態の治療又は予防のための免疫療法組成物又はワクチン等の薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド断片の使用。
【請求項１２】
治療される臨床状態がＰＤ−Ｌ１が発現している癌疾患である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
臨床状態が感染性疾患及び自己免疫疾患から成る群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
サイトカイン療法、Ｔ細胞療法、ＮＫ療法、免疫系チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線治療、免疫刺激物質、遺伝子治療、抗体及び樹状細胞等の追加の癌治療と同時にまたは連続的に投与される、癌の治療又は予防のための方法における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド断片、若しくは一般式：ＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬ（配列番号８９）（ここで、Ｃ末端アミノ酸はまた、アミドを含む）を含むＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、又はそれらの薬学的に許容可能な塩。
【請求項１５】
前記断片が、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＰＤ−Ｌ１断片から選択される、請求項１４に記載のペプチド断片。
【請求項１６】
前記断片が、一般式：ＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬ（配列番号８９）（ここで、Ｃ末端アミノ酸はまた、アミドを含む）を有するＰＤ−Ｌ１断片から選択される、請求項１４に記載のペプチド断片。
【請求項１７】
チェックポイント遮断抗体が、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イリノテカン、レナリドミド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニボルマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、レブラミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン、から選択される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のペプチド断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、並びにこのペプチド断片を含む組成物、用途及びキットに関する。さらに、本発明は、追加の癌治療と同時に又は連続的に投与される、癌の治療又は予防のための方法における使用のためのＰＤ−Ｌ１ペプチド断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は新生細胞を認識し破壊する能力を有する。しかしながら、悪性形質転換は免疫原性抗原の発現と関連しているという事実にも関わらず、免疫系がこの抗原に効果的に応答することができないことがよくある。免疫系はこの抗原に対し寛容となる。これが起きると、新生細胞は制御できずに増殖し、発生した個体にとって予後不良である悪性癌の形成がもたらされる。癌免疫療法が成功するためには、獲得される寛容状態が克服されなければならない。いくつかの筋の証拠によると、癌細胞に対する免疫応答においてＴ細胞が主要なエフェクターであることが示唆される。インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（indoleamine 2,3-dioxygenase、IDO）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（Cytotoxic T lymphocyte antigen 4、CTLA-4）及びプログラム細胞死１リガンド１（Programmed cell death 1 ligand 1、PD-L1）のような免疫調節タンパク質は、抗癌免疫応答の免疫抑制及び免疫寛容の誘導において重要な役割を果たす。ＣＴＬＡ−４はＴ細胞応答の重要な負の調節因子であり、抗腫瘍免疫応答を制限し得る。最近では、抗ＣＴＬＡ−４抗体であるイピリムマブが、第３相臨床試験において効果を示した後、黒色腫の治療についてＦＤＡ及びＥＭＥＡにより承認された。腫瘍特異免疫に対抗し有効な抗癌免疫療法を妨げる他の主要機構には、寛容性樹状細胞（ＤＣ）が免疫応答を有効な免疫でなくするのに不可欠な役割を果たす特定の環境が必要となる。
【０００３】
プログラム細胞死‐１（ＰＤ１）は、同種抗原（cognate antigen）に対するＴ細胞の機能的沈黙（functional silence）を維持するのに重要な阻害シグナルを伝達する調節表面分子である。そのリガンドは、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２、又はＢ７−Ｈ１及びＢ７−Ｈ２として知られ、炎症微小環境で見られるＡＰＣ、腫瘍細胞、胎盤細胞、及び非造血細胞上で発現されている。ＰＤ−１又はそのリガンドＰＤ−Ｌ１を阻害すると抗腫瘍免疫が増大する。ＰＤ−Ｌ１の上方調節が、癌が宿主の免疫系を回避するのに利用することのできる機構であることは明らかである。腫瘍上のＰＤ−Ｌ１の発現は、膵臓、腎細胞、卵巣、頭頸部、及び黒色腫を含む多くの癌について臨床転帰が悪いことと関連する(Hamanishi等, 2007, Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 104:3360-3365; Nomi等, 2007, Clin. Cancer Res. 13:2151-2157; Hino等, 2010, Cancer. 116:1757-1766）。従って、腎細胞癌の患者から採取した１９６個の腫瘍試料を分析すると、ＰＤ−Ｌ１の高い腫瘍での発現が腫瘍の攻撃性が増大すること及び死のリスクが４．５倍増大することと関連していることが分かった(Thompson等, 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101:17174-17179)。ＰＤ−Ｌ１の発現が高い卵巣癌患者は、ＰＤ−Ｌ１の発現が低い患者よりも予後が有意に悪かった。ＰＤ−Ｌ１発現と上皮内ＣＤ８＋Ｔリンパ球数との間には逆相関が見られ、それにより腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１は抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制し得ることが示唆された(Hamanishi等, 2007、上記参照)。
【０００４】
樹状細胞（ＤＣ）は最も強力な抗原提示細胞であり、特定の免疫応答を効果的に刺激することが示されている１。ＤＣワクチンは一般的に、ＤＣに成熟する末梢血単球から成り、注入される前にインビトロで抗原をパルスされる。ＤＣに基づく癌ワクチンは過去１０年間にわたって、大きな注目を集めてきた。しかしながら、多くのＤＣワクチン接種試験が行われてきたが、大多数の患者にとって臨床的利益は限定されている。現在のワクチン接種戦略では、誘導されるＴ細胞の頻度は優れたものではなく、Ｔ細胞応答を増大させるのを助けるために追加の方法が必要とされる。従って、ＤＣの生成及び表現型を最適化してその「完全武装された」Ｔ細胞を誘導する能力を向上させ、最適な投与経路を決定し、追加治療との理想的な組み合わせを特定するため、更なる研究が必要とされている。
【０００５】
プログラム細胞死１（ＰＤ−１）はＴ細胞の表面上に発現される抑制分子である。ＰＤ−１リガンドであるＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４又はＢ７−Ｈ１としても知られる）は、単球、ＤＣ及びＴ細胞等のリンパ球様細胞上に構成的に発現され、内皮及び上皮細胞等の非造血細胞上にも存在する２，３。ＰＤ−Ｌ１は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ依存的と思われる方法で、ＩＦＮ調節因子−１（IFN regulatory factor-1、IRF-1）を通してＩ型及びＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）により上方調節され得る４。一般的に、Ｔ細胞上のＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用により、通常の免疫応答の間、末梢性細胞寛容の誘導及び維持が制御される５。ＰＤ−Ｌ１は、自己免疫疾患の誘導及びエフェクター段階の両方の間、自己反応性Ｔ細胞の重要な負の調節因子であり、様々な方法でその抑制機能を発揮する。ＰＤ−１に対するリガンドであるのに加え、ＰＤ−Ｌ１はＢ７−１（ＣＤ８０）に結合し、Ｂ７−１共刺激を妨げる。ＩＬ−１０は、ＰＤ−Ｌ１が結合すると生成され、活性化Ｔ細胞のアポトーシスを増大させると考えられる６。免疫系は常に外来の病原体、及び癌細胞等の異常な細胞を探索している。そのため、癌が成長し続けるためには、免疫系から身を隠し破壊を回避しなければならない。ＰＤ−１及びそのリガンドは、末梢性寛容を維持し自己免疫を防ぐのに中心的な役割を果たすが、癌細胞はこの系を利用して抑制微小環境を作り、従って免疫により媒介される死滅から自身を保護することができる。実際、ＰＤ−Ｌ１発現は多数の癌において高いことが分かっており７，８、ＰＤ−Ｌ１発現は最初、腎細胞癌における腫瘍の攻撃性の指標として説明されていた９。さらに、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１発現は、卵巣癌及び膵臓癌を含む多数の固形癌における予後因子として提案されている１０，１１。
【０００６】
モノクローナル抗体によるＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１の遮断は優れた臨床反応をもたらし１２，１３、抗ＰＤ１抗体であるペンブロリズマブ及びニボルマブは最近、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により転移性黒色腫の治療について承認された（それぞれ２０１４年９月及び１２月）。最近のＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の発見は、免疫系自体がＰＤ−１及びそのリガンドの効果に対抗する機構を有することを示唆する１４，１５。実際、末梢血におけるＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞応答は癌患者において健康なドナーよりも高い頻度で発生することが示された１４，１５。それに続き、このＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞は、黒色腫細胞及び非悪性のＤＣを含むＰＤ−Ｌ１発現細胞を溶解させることが分かった１４，１６。さらにＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の活性化はウイルス抗原に対する免疫応答を増強する１７。これらの発見により、免疫ホメオスタシスにおけるＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞についての自己反応性機能が示唆される。さらに、それにより、ＰＤ−Ｌ１由来のペプチドでの刺激は、微小環境における免疫バランスを変えて免疫抑制を低下させることにより、既存の又はワクチンにより生成された免疫応答を促進できることが暗示される。
【０００７】
我々は最近、ステージＩＶの悪性黒色腫の患者においてワクチン試験を行った（Borch等、準備中）。当該試験では、腫瘍関連抗原であるｐ５３、サバイビン及びテロメラーゼをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣを用いて患者にワクチン接種した（当該ワクチンは本明細書において「ＤＣｖａｃｃ」と称される）。しかしながら、臨床的利益は限定されており、患者の免疫学的モニタリングにより、患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はＤＣｖａｃｃに対し限定された反応性しか有しないことが明らかとなった。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者等は、優れた溶解度を有し、凝集せず、βシートを形成しやすいものでなく、それ自体が、例えばアジュバントを共に有するワクチンに適した、新たなヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）の断片を特定した。配列番号９１のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片（本明細書に参照により組み込まれるＷＯ２０１３０５６７１６に記載のＰＤｌｏｎｇ２）は極めて疎水性であり、非常にβシートを形成しやすく、それゆえ溶解度が低い。さらにこのペプチドは遊離ＳＨを含んでおり、ダイマー形成を防ぐために低ｐＨで扱わなければならない。
【０００９】
さらに、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片である配列番号９１及び８９（ＷＯ２０１３０５６７１６及び本明細書において、それぞれＰＤｌｏｎｇ２及びＰＤｌｏｎｇ１と称される）で共刺激すると、樹状細胞に基づく癌ワクチンの免疫原性が増大することが示された（下記参照）。このため、これら２つのＰＤ−Ｌ１の断片のいずれか１つによりＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞を活性化させると、ＤＣワクチンの免疫原性が直接調節され得る。従って、ＰＤ−Ｌ１エピトープを追加することは、癌ワクチン及び他の免疫療法剤の有効性を増大させるために容易に適用できる魅力的な選択肢であり得る。従って、配列番号９１から成るＰＤ−Ｌ１ペプチド断片又は配列番号８９から成るＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、並びにこれらを含むより長い配列は本明細書に示される効果を有すると考えられる。
【００１０】
一態様において本発明は、一般式：
Ｘ１ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＸ２（配列番号７８）
［式中、
Ｎ末端のＸ１は、Ｌ、ＨＬ、ＴＨＬ、ＲＴＨＬ（配列番号７９）、ＥＲＴＨＬ（配列番号８０）、ＮＥＲＴＨＬ（配列番号８１）から成る群から選択され、又は存在せず、
Ｃ末端のＸ２は、Ｆ、ＦＲ、ＦＲＬ、ＦＲＬＲ（配列番号８２）、ＦＲＬＲＫ（配列番号８３）、ＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）、ＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号８５）、ＦＲＬＲＫＧＲＭ（配列番号８６）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭ（配列番号８７）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号８８）から成る群から選択され、又は存在せず、
ただし、Ｘ１が存在しない場合Ｘ２はＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）ではなく、
Ｃ末端のアミノ酸はまた、アミドを含む］
を有するＰＤ−Ｌ１ペプチド断片又はその薬学的に許容可能な塩に関する。言い換えると、Ｃ末端のアミノ酸は対応するアミドにより置換されても良い。Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に利用可能な選択肢から選択され得る。
【００１１】
Ｃ末端残基のアミノ酸形態が存在する場合、これは本明細書においてＸ−ＯＨという表記で示され得る。一方、アミド形態が存在する場合、これはＸ−ＮＨ２という表記で示され得る。いずれの表記も使用されない場合、Ｃ末端残基のアミノ酸形態もアミド形態も包含されることが理解されるだろう。従って、本発明のペプチド又はその薬学的に許容可能な塩は、任意でＣ末端アミノ酸が対応するアミド形態により置換される、表Ａに列挙されるアミノ酸配列のいずれか１つを含んでも良い、又はそれから成っても良い。
【００１２】
【表１】
2019527676.tif 000002
2019527676.tif 000003
【００１３】
「開始位置（Start pos）」及び「終止位置（End pos）」列は、配列番号１の配列内の各々のペプチドの開始位置と終止位置を示す。表から理解されるように、本発明のペプチドは配列番号１のＰＤ−Ｌ１配列の１７〜３３個の連続アミノ酸を含む、又はそれから成る。本明細書に記載のように、安定性を改善するために追加の残基がＮ及び／又はＣ末端に追加され得る。配列番号１の連続アミノ酸は、好ましくは、少なくとも配列番号１の位置２４２〜２５８に対応するアミノ酸を含み、Ｃ末端に配列番号１の位置２５９〜２６８に対応する１０個までの追加アミノ酸、及び／又はＮ末端に配列番号１の位置２３６〜２４１に対応する６個までの追加アミノ酸を有する。特に好ましいのは、配列番号１の位置２３８〜２６５に対応するアミノ酸配列ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号５２）を含む、又はそれから成るペプチドである。このペプチドは本明細書においてＩＯ１０４．１と呼ばれ得る。この配列のＣ末端残基は対応するアミド形態に置換されても良く、同様に好まれ得る。Ｃ末端がアミノ酸である断片はＩＯ１０４．１−ＯＨと呼ばれ得る。Ｃ末端にアミドを有する断片は、本明細書においてＩＯ１０４．１−ＮＨ２と呼ばれ得る。１、２、３、４、又は５個の保存的置換が表Ａの配列のどの１つになされても良く、結果として生じる配列は依然として本発明のペプチドであると考えられるが、前記ペプチドは好ましくは、ＰＤＬ１１１というＨＬＡ−Ａ２エピトープ（配列番号９２として提供される配列）に特異的なＴ細胞により認識され得る。最も好ましくは、前記保存的置換は、ＰＤＬ１１１エピトープのアミノ酸配列である配列番号１の位置２５０〜２５８に対応するアミノ酸を変えない。
【００１４】
一実施形態では、本発明のペプチド断片は、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号７７）
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号７７）
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号５２）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号５２）
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ（配列番号６７）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号６７）、
ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ（配列番号２）、
ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号２）、
又はその薬学的に許容可能な塩から選択される。典型的には、ペプチド断片は、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号７７）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号５２）、及び
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号５２）
から選択される。
【００１５】
更なる態様では、本発明は、任意で薬学的に許容可能な添加剤と共に、本発明のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片を含む組成物に関する。
【００１６】
なお更なる態様では、本発明は、医薬としての使用のための、
ａ）本発明のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、及び
ｂ）アジュバント
を含む、ワクチン等の免疫療法組成物に関する。
【００１７】
一実施形態では、本発明の免疫療法組成物は、腫瘍形成癌疾患等の癌；感染性疾患等の感染症、例えば細胞内感染（例えばＬ．モノサイトゲネス（L. monocytogenes）及びマラリア原虫（plasmodium）から成る群から選択される病原体の細胞内感染）、ウイルス感染（例えばＨＩＶ及び肝炎から成る群から選択されるウイルスの感染）；糖尿病、ＳＬＥ、及び硬化症等の自己免疫疾患、から選択される疾患、障害若しくは状態の治療又は予防のための方法における使用のためのものである。
【００１８】
更なる実施形態では、アジュバントは、細菌ＤＮＡに基づくアジュバント、オイル／界面活性剤に基づくアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡに基づくアジュバント、イミダゾキニリン（imidazochinilines）、モンタナイド（Montanide）ＩＳＡアジュバントから成る群から選択される。
【００１９】
更なる態様では、本発明は、以下を含むキットに関する；
ａ）本発明の免疫療法組成物、及び
ｂ）インターロイキン等の免疫刺激化合物、例えばＩＬ−２及び／又はＩＬ−２１、化学療法剤等の抗癌剤、例えば、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イリノテカン、レナリドミド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニボルマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、レブラミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン、から選択される少なくとも１種の第２活性成分を含む組成物。一実施形態では、提供される組成物は同時に又は連続的に投与すべきである。
【００２０】
なお更なる態様では、本発明は、ＰＤ−Ｌ１の発現を特徴とする臨床状態を治療する方法であって、前記臨床状態を患う個体に有効量の本発明のペプチド断片、本発明の組成物、又は本発明のキットを投与することを含む方法に関する。
【００２１】
更なる態様では、本発明は、ＰＤ−Ｌ１の発現を特徴とする臨床状態の治療又は予防のための免疫療法組成物又はワクチン等の医薬の製造のための、本発明のペプチド断片の使用に関する。一実施形態では、治療される臨床状態はＰＤ−Ｌ１が発現している癌疾患である。別の実施形態では、臨床状態は感染性疾患及び自己免疫疾患から成る群から選択される。
【００２２】
なお更なる態様では、本発明は、サイトカイン療法、Ｔ細胞療法、ＮＫ療法、免疫系チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線治療、免疫刺激物質、遺伝子治療、抗体及び樹状細胞等の追加の癌治療と同時にまたは連続的に投与される、癌の治療又は予防のための方法における使用のための、一般式：
Ｘ１ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＸ２
[式中、
Ｎ末端のＸ１は、Ｌ、ＨＬ、ＴＨＬ、ＲＴＨＬ（配列番号７９）、ＥＲＴＨＬ（配列番号８０）、ＮＥＲＴＨＬ（配列番号８１）から成る群から選択され、又は存在せず、
Ｃ末端のＸ２は、Ｆ、ＦＲ、ＦＲＬ、ＦＲＬＲ（配列番号８２）、ＦＲＬＲＫ（配列番号８３）、ＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）、ＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号８５）、ＦＲＬＲＫＧＲＭ（配列番号８６）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭ（配列番号８７）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号８８）から成る群から選択され、又は存在せず、
ただし、Ｘ１が存在しない場合Ｘ２はＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）ではなく、
Ｃ末端のアミノ酸はまた、アミドを含む]
を有する、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、又はその薬学的に許容可能な塩に関する。ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、任意でＣ末端アミノ酸が対応するアミド形態により置換されている、表Ａに開示の任意のペプチド断片又はその薬学的に許容可能な塩から選択されても良い。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号７７）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号７７）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号５２）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号５２）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ（配列番号６７）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号６７）、
ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ（配列番号２）、
ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号２）
又はそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される。典型的には、ペプチド断片は、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号７７）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号５２）、及び
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号５２）
から選択される。
【００２３】
更なる態様では、本発明は、サイトカイン療法、Ｔ細胞療法、ＮＫ療法、免疫系チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線治療、免疫刺激物質、遺伝子治療、抗体及び樹状細胞等の追加の癌治療と同時にまたは連続的に投与される、癌の治療又は予防のための方法における使用のための、
一般式：
ＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬ（配列番号８９）（ここで、Ｃ末端アミノ酸はまた、アミドを含む）
を含むＰＤ−Ｌ１ペプチド断片又はその薬学的に許容可能な塩に関する。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、一般式：ＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬ（配列番号８９）（ここで、Ｃ末端アミノ酸はまた、アミドを含む）を有するＰＤ−Ｌ１断片から選択される。更なる実施形態では、追加の癌治療は免疫系チェックポイント阻害剤から選択され、前記阻害剤は、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イリノテカン、レナリドミド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニボルマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、レブラミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン、から選択されるチェックポイント遮断抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】ＰＤ−Ｌ１由来エピトープでの共刺激により樹状細胞ワクチンに対し反応性のＴ細胞の頻度が向上する。（図１Ａ）ＤＣｖａｃｃを用いて、患者から得たＰＢＭＣ（５×１０６）をインビトロで２回刺激した。その翌日、培養物を１又は２個の長いＰＤ−Ｌ１エピトープで共刺激し、又は無関係なＨＩＶ対照ペプチドと共にインキュベートした。ペプチド刺激の翌日にすべての培養物をＩＬ２で刺激した。細胞内ＴＮＦα／ＩＮＦγ染色により１６〜２０日後にＤＣｖａｃｃに反応性のＴ細胞について培養物を調べた。
【図１Ｂ】ＰＤ−Ｌ１由来エピトープでの共刺激により樹状細胞ワクチンに対し反応性のＴ細胞の頻度が向上する。（図１Ｂ〜Ｅ）細胞内ＴＮＦα／ＩＮＦγ染色により測定されるように、ＤＣｖａｃｃに対するＴ細胞の免疫性がＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の同時活性化により有意に増大した、３人の黒色腫患者から得たＰＢＭＣ培養物の例。（図１Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞はＤＣｖａｃｃに応答してＴＮＦαのみを放出した。
【図１Ｃ】ＰＤ−Ｌ１由来エピトープでの共刺激により樹状細胞ワクチンに対し反応性のＴ細胞の頻度が向上する。（図１Ｂ〜Ｅ）細胞内ＴＮＦα／ＩＮＦγ染色により測定されるように、ＤＣｖａｃｃに対するＴ細胞の免疫性がＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の同時活性化により有意に増大した、３人の黒色腫患者から得たＰＢＭＣ培養物の例。（図１Ｃ）ＰＤ−Ｌ１ペプチド共刺激は、ＤＣｖａｃｃへの応答においてＴＮＦα／ＩＦＮγ二重陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導した。
【図１Ｄ】ＰＤ−Ｌ１由来エピトープでの共刺激により樹状細胞ワクチンに対し反応性のＴ細胞の頻度が向上する。（図１Ｂ〜Ｅ）細胞内ＴＮＦα／ＩＮＦγ染色により測定されるように、ＤＣｖａｃｃに対するＴ細胞の免疫性がＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の同時活性化により有意に増大した、３人の黒色腫患者から得たＰＢＭＣ培養物の例。（図１Ｄ、Ｅ）ＰＤ−Ｌ１エピトープでの共刺激により、ＤＣｖａｃｃに対し応答するＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方の細胞の数が増大した。
【図１Ｅ】ＰＤ−Ｌ１由来エピトープでの共刺激により樹状細胞ワクチンに対し反応性のＴ細胞の頻度が向上する。（図１Ｂ〜Ｅ）細胞内ＴＮＦα／ＩＮＦγ染色により測定されるように、ＤＣｖａｃｃに対するＴ細胞の免疫性がＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の同時活性化により有意に増大した、３人の黒色腫患者から得たＰＢＭＣ培養物の例。（図１Ｄ、Ｅ）ＰＤ−Ｌ１エピトープでの共刺激により、ＤＣｖａｃｃに対し応答するＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方の細胞の数が増大した。
【図２Ａ】ＰＤＬｏｎｇ１及び樹状細胞ワクチンでのＰＢＭＣの共刺激。１６〜２０日目、２回のＤＣｖａｃｃでの刺激、及び２回の無関係の対照ペプチド又はＰＤＬｏｎｇ１ペプチドでの刺激の後、ＤＣｖａｃｃに応答してＴＮＦα／ＩＦＮγを放出した細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより特定した。ワクチン接種の前（基準）及び４回のワクチン接種の後に８人の黒色腫患者から採取したＰＢＭＣの培養物における、ＤＣｖａｃｃ反応性のＣＤ４＋Ｔ細胞（図２Ａ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図２Ｂ）のパーセンテージ。
【図２Ｂ】ＰＤＬｏｎｇ１及び樹状細胞ワクチンでのＰＢＭＣの共刺激。１６〜２０日目、２回のＤＣｖａｃｃでの刺激、及び２回の無関係の対照ペプチド又はＰＤＬｏｎｇ１ペプチドでの刺激の後、ＤＣｖａｃｃに応答してＴＮＦα／ＩＦＮγを放出した細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより特定した。ワクチン接種の前（基準）及び４回のワクチン接種の後に８人の黒色腫患者から採取したＰＢＭＣの培養物における、ＤＣｖａｃｃ反応性のＣＤ４＋Ｔ細胞（図２Ａ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図２Ｂ）のパーセンテージ。
【図３Ａ】ＰＤＬｏｎｇ１及びＰＤＬｏｎｇ２に対する天然のＴ細胞応答。（図３Ａ）ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴを用いて、黒色腫患者から得た腫瘍浸潤リンパ球におけるＰＤＬｏｎｇ１及びＰＤＬｏｎｇ２に対するＴ細胞応答を測定した。１２人の黒色腫患者から得た５×１０４個の細胞において、ＰＤＬｏｎｇ１又はＰＤＬｏｎｇ２に応答してＩＦＮαを放出する細胞の平均の数を測定した。
【図３Ｂ】ＰＤＬｏｎｇ１及びＰＤＬｏｎｇ２に対する天然のＴ細胞応答。（図３Ｂ）ＰＤＬｏｎｇ１又はＰＤＬｏｎｇ２ペプチドを加え、又はこれらを加えずに、２人の黒色腫患者から得たＴＩＬを用いて行ったＥＬＩＳＰＯＴウェルの例。
【図３Ｃ】ＰＤＬｏｎｇ１及びＰＤＬｏｎｇ２に対する天然のＴ細胞応答。（図３Ｃ）細胞内ＩＦＮγ／ＴＮＦα染色について分析する前に、ＰＤＬｏｎｇ１又はＰＤＬｏｎｇ２を加え、又は加えずに、腫瘍浸潤リンパ球を５時間培養した。
【図３Ｄ】ＰＤＬｏｎｇ１及びＰＤＬｏｎｇ２に対する天然のＴ細胞応答。（図３Ｄ）ペプチドなし、又はＰＤＬｏｎｇ１若しくはＰＤＬｏｎｇ２有りに対する応答における、黒色腫患者から得た腫瘍浸潤リンパ球のＩＦＮγ／ＴＮＦα染色の例。
【図４】ＤＣワクチンと、ＰＤＬｏｎｇ１＋ＰＤＬｏｎｇ２での患者ＰＢＭＣの刺激。１６〜２０日目、２回のＤＣｖａｃｃでの刺激、及び２回の無関係の対照ペプチド又はＰＤＬｏｎｇ１＋ＰＤＬｏｎｇ２ペプチドでの刺激の後、ＤＣｖａｃｃに応答してＴＮＦα／ＩＦＮγを放出した細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより特定した。ワクチン接種の前（基準）及び４回のワクチン接種の後に８人の黒色腫患者から採取したＰＢＭＣの培養物における、ＤＣｖａｃｃ反応性のＣＤ４＋Ｔ細胞（図４Ａ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図４Ｂ）のパーセンテージ。
【図５Ａ】４人の患者由来の細胞培養物から得られた上清におけるサイトカイン分泌の比較。ＩＦＮγ（図５Ａ）、ＩＬ−６（図５Ｂ）、又はＴＧＦβ（図５Ｃ）の存在を測定できるよう、無関係な対照ペプチドで又はＰＤＬｏｎｇ１＋ＰＤＬｏｎｇ２で共刺激した培養物から得た上清をＤＣｖａｃｃ反応性のＴ細胞の分析の日に回収した。
【図５Ｂ】４人の患者由来の細胞培養物から得られた上清におけるサイトカイン分泌の比較。ＩＦＮγ（図５Ａ）、ＩＬ−６（図５Ｂ）、又はＴＧＦβ（図５Ｃ）の存在を測定できるよう、無関係な対照ペプチドで又はＰＤＬｏｎｇ１＋ＰＤＬｏｎｇ２で共刺激した培養物から得た上清をＤＣｖａｃｃ反応性のＴ細胞の分析の日に回収した。
【図５Ｃ】４人の患者由来の細胞培養物から得られた上清におけるサイトカイン分泌の比較。ＩＦＮγ（図５Ａ）、ＩＬ−６（図５Ｂ）、又はＴＧＦβ（図５Ｃ）の存在を測定できるよう、無関係な対照ペプチドで又はＰＤＬｏｎｇ１＋ＰＤＬｏｎｇ２で共刺激した培養物から得た上清をＤＣｖａｃｃ反応性のＴ細胞の分析の日に回収した。
【図５Ｄ】４人の患者由来の細胞培養物から得られた上清におけるサイトカイン分泌の比較。ＩＦＮγ（図５Ａ）、ＩＬ−６（図５Ｂ）、又はＴＧＦβ（図５Ｃ）の存在を測定できるよう、無関係な対照ペプチドで又はＰＤＬｏｎｇ１＋ＰＤＬｏｎｇ２で共刺激した培養物から得た上清をＤＣｖａｃｃ反応性のＴ細胞の分析の日に回収した。（図５Ｄ）さらに、ＨＩＶ又はＰＤＬｏｎｇ１＋ＰＤＬｏｎｇ２エピトープで２回目の刺激をした後、細胞の総数を計数した。
【図６】無関係の対照ペプチドと対比したＩＯ１０４．１−ＯＨ及びＩＯ１０４．１−ＮＨ２に対する応答における、黒色腫患者の腫瘍浸潤リンパ球におけるＩＦＮγ放出細胞の測定。
【図７】ＰＤＬｏｎｇ２、ＩＯ１０４．１−ＯＨ、ＩＯ１０４．１−ＮＨ２、ＰＤＬ１１１、及び無関係な対照ペプチドに対するＰＤＬ１１１特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答のＥｌｉｓｐｏｔ比較。
【図８Ａ】マウスＰＤＬ１特異的Ｔ細胞は、マウスにおいて自然に発生している。（図８Ａ）実施例３に記載の実験についての時系列を示す。
【図８Ｂ】マウスＰＤＬ１特異的Ｔ細胞は、マウスにおいて自然に発生している。（図８Ｂ）エキソビボで５つのペプチド候補のうちの１つで刺激した脾細胞についてのＥｌｉｓｐｏｔの結果。
【図８Ｃ】マウスＰＤＬ１特異的Ｔ細胞は、マウスにおいて自然に発生している。（図８Ｃ）最も効果的なペプチド（ｍＬｏｎｇ１）で刺激した脾細胞についての、代表的なＥｌｉｓｐｏｔウェル及び結果。ｎ＝５〜１０マウス／群。
【図９Ａ】アレルゲン２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）により引き起こされる局所的炎症は、マウスにおいてＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞応答を誘発する。図９Ａは実施例４に記載の実験についての時系列を示す。
【図９Ｂ】アレルゲン２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）により引き起こされる局所的炎症は、マウスにおいてＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞応答を誘発する。（図９Ｂ）エキソビボでｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１又はｍＰＤ−Ｌ１ｓｈｏｒｔで刺激した脾臓及びｄＬＮ由来の細胞についてのＥｌｉｓｐｏｔ結果。
【図９Ｃ】アレルゲン２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）により引き起こされる局所的炎症は、マウスにおいてＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞応答を誘発する。（図９Ｃ）対照に比べて最も応答が高かったＤＮＦＢ処理マウスのうち１匹の代表的なＥｌｉｓｐｏｔウェル。ｎ＝１２マウス／群。
【図１０Ａ】ｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１を用いたワクチン接種により、マウスにおいてＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の集団が増殖する。図１０Ａは、実施例５に記載の実験についての時系列を示す。
【図１０Ｂ】ｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１を用いたワクチン接種により、マウスにおいてＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の集団が増殖する。（図１０Ｂ）エキソビボでｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１又はｍＰＤ−Ｌ１ｓｈｏｒｔで刺激した脾細胞についてのＥｌｉｓｐｏｔ結果。
【図１０Ｃ】ｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１を用いたワクチン接種により、マウスにおいてＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の集団が増殖する。（図１０Ｃ）各群の代表的なマウスのＥｌｉｓｐｏｔウェル。ｎ＝３〜４マウス／群。
【図１１Ａ】ｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１を用いたワクチン接種は、マウスにおいて抗腫瘍効果を示す。（図１１Ａ）は、実施例６に記載の実験についての時系列を示す。
【図１１Ｂ】ｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１を用いたワクチン接種は、マウスにおいて抗腫瘍効果を示す。（図１１Ｂ）各マウスについての腫瘍体積の経時変化（Ｍ１〜Ｍ３にはモンタナイドのみを用いてワクチン接種した；Ｍ４〜Ｍ５にはｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１＋モンタナイドを用いてワクチン接種した）。
【図１１Ｃ】ｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１を用いたワクチン接種は、マウスにおいて抗腫瘍効果を示す。（図１１Ｃ）カプランマイヤー生存曲線。
【図１１Ｄ】ｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１を用いたワクチン接種は、マウスにおいて抗腫瘍効果を示す。（図１１Ｄ）各群についての平均腫瘍体積の経時変化。ｎ＝３マウス／群。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
配列の説明
配列番号１は、ヒト（ｈ）ＰＤ−Ｌ１の全長アミノ酸配列である。
配列番号２〜７７は、本発明の例示的ペプチドのアミノ酸配列であり、そのすべてがｈＰＤ−Ｌ１の断片である。
配列番号７８は、本発明のペプチドに相当する一般式を表すアミノ酸配列である。
配列番号７９〜８１は、配列番号７８の一般式に加えられても良い、様々なＮ末端アミノ酸配列である。
配列番号８２〜８８は、配列番号７８の一般式に加えられても良い、様々なＣ末端アミノ酸配列である。
配列番号８９は、本発明の他の例示的ペプチドであり、ｈＰＤ−Ｌ１の断片である。
配列番号９０は、配列番号８９に含まれるＴ細胞エピトープ配列である。
配列番号９１は、本明細書に開示されるｈＰＤＬ１の断片のアミノ酸配列である。
配列番号９２は、ＰＤＬ１１１と称されるＨＬＡ−Ａ２エピトープのアミノ酸配列（ｈＰＤＬ１の位置２５０〜２５８に相当する）である。
配列番号９３及び９４は、実施例において対照として用いられる特定のペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号９５は、マウス（ｍ）ＰＤ−Ｌ１の全長のアミノ酸配列である。
配列番号９６〜１００は、実施例に記載のマウスモデル実験において、本発明のペプチドの類似物として用いられる、ｍＰＤ−Ｌ１由来のペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１０１は、配列番号９６に含まれるＴ細胞エピトープ配列である。
【００２６】
癌免疫抑制の問題はＷＯ２０１３０５６７１６において解決された。ＷＯ２０１３０５６７１６ではヒトＰＤ−Ｌ１全長（配列番号１）のＰＤ−Ｌ１断片は、癌患者におけるＰＤ−Ｌ１発現細胞に対する自発的な細胞傷害性免疫応答という、発明者等による驚くべき発見に基づいていた。これらの発見は、癌疾患の制御において一般的に適用可能となり得る、新たな治療及び診断アプローチへの道を切り開く。興味深いことに、当該発見は癌に限定されず、ＰＤ−Ｌ１を発現する望ましくない細胞が存在することを特徴とする他の臨床状態においても有益である。
【００２７】
ＷＯ２０１３０５６７１６に開示されている発明は、ＰＤ−Ｌ１を発現する癌細胞を直接死滅させることにより、及びＰＤ−Ｌ１を発現する制御性細胞を死滅させることにより、癌疾患を標的とする。これは、Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１発現細胞を認識することができるようにすることにより、行われる。同様に、臨床状態が感染症である場合、Ｔ細胞はＰＤ−Ｌ１を発現するＡＰＣ／ＤＣを死滅させることができるようにされる。従って、これらのＰＤ−Ｌ１発現細胞を標的とする本発明の方法の適用に当たり、癌細胞及びＡＰＣにおいて免疫抑制酵素ＰＤ−Ｌ１の発現は陽性である。このアプローチは、特にＡＰＣ／ＤＣの死滅を伴うため、当該分野における一般的な見解に逆行する。一般的な見解では、効果的な免疫応答を開始するために必要と考えられるＡＰＣ／ＤＣを保護しつつ、これらの細胞周辺の寛容環境（tolerating milieu）を取り除くために、一般的にＰＤ−Ｌ１を阻害することが試みられている。さらに、ＰＤ−Ｌ１発現細胞に対する自発的な細胞傷害性免疫応答の発見は、特に驚くべきものである。なぜなら、ＰＤ−Ｌ１発現細胞は他の免疫療法アプローチの所望の効果を打ち消すからである。このように、ＰＤ−Ｌ１及び腫瘍を標的とする免疫療法の組み合わせは非常に相乗的である。インビボでのＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞応答の存在により、癌患者がＰＤ−Ｌ１ペプチドの存在に応答してインビボでＰＤ−Ｌ１に対するＴ細胞応答を生じさせることができることが実証される。このため、Ｔ細胞応答を生じさせるための２つの条件が満たされる：Ｔ細胞が癌患者に存在し、かつ、それが増殖する能力を有する（それらは本出願において示される）。免疫学分野における一般常識から当然であるように、追加のＰＤ−Ｌ１タンパク質又はＰＤ−Ｌ１ペプチドを与えるとＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞応答が生じる。抗原のみを認識できるＢ細胞上の膜結合型抗体とは対照的に、Ｔ細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と称されるタンパク質に結合した抗原ペプチドを含む、複合体リガンドを認識する。ヒトにおいてこの分子はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）として知られる。クラスＩ  ＨＬＡ分子は、細胞内のタンパク質分解からペプチドを得て、細胞表面でこれをＴ細胞に提示する。従って、それによりＴ細胞は細胞の変化を精査することができる。Ｔ細胞はＨＬＡ分子の存在下で抗原に出会うと、クローン性増殖し、記憶Ｔ細胞及び様々なエフェクターＴ細胞に分化する。このため、自発的免疫応答の特定は抗原がＴ細胞の標的であるという証拠となる。それにより、特異的Ｔ細胞が既にインビボで活性化され増殖していることが実証される。
【００２８】
配列番号９１のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片（ＷＯ２０１３０５６７１６においてＰＤＬｏｎｇ２として記載される）は、極めて疎水性であり、非常にβシートを形成しやすく、それ故溶解度が低い。さらに、このペプチドは遊離ＳＨを含んでおり、ダイマー形成を防ぐために低ｐＨで扱わなければならない。このため、配列番号９１のアミノ酸配列、又はＣ末端から６個までのアミノ酸を欠く当該配列の一部を少なくとも含む、より溶解しやすく扱いやすいＰＤ−Ｌ１ペプチド断片が必要である。
【００２９】
広い態様では、本発明は、一般式：
Ｘ１ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＸ２
[式中、
Ｎ末端のＸ１は、Ｌ、ＨＬ、ＴＨＬ、ＲＴＨＬ（配列番号７９）、ＥＲＴＨＬ（配列番号８０）、ＮＥＲＴＨＬ（配列番号８１）から成る群から選択され、又は存在せず、
Ｃ末端のＸ２は、Ｆ、ＦＲ、ＦＲＬ、ＦＲＬＲ（配列番号８２）、ＦＲＬＲＫ（配列番号８３）、ＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）、ＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号８５）、ＦＲＬＲＫＧＲＭ（配列番号８６）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭ（配列番号８７）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号８８）から成る群から選択され、又は存在せず、
ただし、Ｘ１が存在しない場合Ｘ２はＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）ではなく、
Ｃ末端のアミノ酸はまた、アミドを含む]
を有する、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、又はその薬学的に許容可能な塩に関する。ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、任意でＣ末端アミノ酸が対応するアミド形態により置換されている、表Ａに開示の任意のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片又はその薬学的に許容可能な塩から選択され得る。本明細書で使用される場合、示される任意のアミノ酸配列はＣ末端アミノ酸において改変されアミド形態であっても良く（−ＣＯＮＨ２）、また、酸形態であっても良い（−ＣＯＯＨ）。このように、これらはいずれも好ましい実施形態であり、−ＮＨ２又は−ＯＨにより特定されない限り、Ｉ、Ｆ、Ｒ、Ｌ、Ｋ、Ｇ、Ｍ、Ｄ等の任意のＣ末端アミノ酸はアミド及び酸形態の両方を含むことが意図される。
【００３０】
更なる実施形態では、Ｘ１はＲＴＨＬ（配列番号７９）及びＮＥＲＴＨＬ（配列番号８１）から成る群から選択される。
【００３１】
なお更なる実施形態では、Ｘ２はＦＲＬＲＫＧＲ−ＯＨ（配列番号８５）、ＦＲＬＲＫＧＲ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号８５及びＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ−ＯＨ（配列番号８８）から成る群から選択される。
【００３２】
一実施形態では、本発明のペプチド断片は、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ−ＯＨ（配列番号７７）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号７７）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＯＨ（配列番号５２）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号５２）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＯＨ（配列番号６７）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号６７）、
ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＯＨ（配列番号２）、
ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号２）、
又はその薬学的に許容可能な塩
から選択される。典型的には、ペプチド断片は、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ−ＯＨ（配列番号７７）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＯＨ（配列番号５２）、及び
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号５２）
から選択される。
【００３３】
更なる態様では、本発明は、任意で薬学的に許容可能な添加剤と共に、本発明のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片を含む組成物に関する。更なる実施形態では、本発明のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、広い態様に関する上記のいずれか１つから選択される。典型的には、薬学的に許容可能な添加剤が存在する。一実施形態では、組成物はワクチン組成物である。更なる実施形態では、添加剤は、担体、賦形剤、希釈剤、及びアジュバントから選択され、典型的にはアジュバントである。このようなアジュバントは、細菌ＤＮＡに基づくアジュバント、オイル／界面活性剤に基づくアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡに基づくアジュバント、イミダゾキニリン、モンタナイドＩＳＡアジュバントから成る群から選択され得る。
【００３４】
なお更なる態様では、本発明は、医薬としての使用のための、
ａ）本発明のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、及び
ｂ）アジュバント
を含む、免疫療法組成物に関する。更なる実施形態では、本発明のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、広い態様に関する上記のいずれか１つから選択される。更なる実施形態では、アジュバントは、細菌ＤＮＡに基づくアジュバント、オイル／界面活性剤に基づくアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡに基づくアジュバント、イミダゾキニリン、モンタナイドＩＳＡアジュバントから成る群から選択され得る。これらのアジュバントの各々、又はアジュバントの群は、個別の実施形態を構成する。
【００３５】
一実施形態では、本発明の免疫療法組成物は、腫瘍形成癌疾患等の癌；感染性疾患等の感染症、例えば細胞内感染（例えばＬ．モノサイトゲネス（L. monocytogenes）及びマラリア原虫（plasmodium）から成る群から選択される病原体の細胞内感染）、ウイルス感染（例えばＨＩＶ及び肝炎から成る群から選択されるウイルスの感染）；糖尿病、ＳＬＥ、及び硬化症等の自己免疫疾患、から選択される疾患、障害又は状態の治療又は予防のための方法における使用のためのものである。疾患、障害若しくは状態の各々、又は疾患、障害若しくは状態のグループは、個別の実施形態を構成する。
【００３６】
更なる態様では、本発明は、以下を含むキットに関する；
ａ）本発明の免疫療法組成物、及び
ｂ）インターロイキン等の免疫刺激化合物、例えばＩＬ−２及び／又はＩＬ−２１、化学療法剤等の抗癌剤、例えば、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イリノテカン、レナリドミド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニボルマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、レブラミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン、から選択される少なくとも１種の第２活性成分を含む組成物。一実施形態では、提供される組成物は同時に投与すべきである。別の実施形態では、提供される組成物は、連続的に投与すべきである。ａ）の免疫療法組成物に関して、本発明のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片の更なる実施形態は、広い態様に関する上記のいずれか１つから選択される。更なる実施形態では、アジュバントは、細菌ＤＮＡに基づくアジュバント、オイル／界面活性剤に基づくアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡに基づくアジュバント、イミダゾキニリン、モンタナイドＩＳＡアジュバントから成る群から選択され得る。これらのアジュバントの各々、又はアジュバントの群は、個別の実施形態を構成する。ｂ）の第２活性成分に関して、第２活性成分の更なる実施形態は、個別の実施形態を構成する上記のいずれか１つから選択される。
【００３７】
更なる態様では、本発明は、以下を含むキットに関する；
ａ）本発明の免疫療法組成物、及び
ｂ）免疫系チェックポイントを遮断又は阻害する免疫調節剤（そのチェックポイントは、ａ）の組成物がその構成要素を含むチェックポイントと同一でも良く、又は異なっても良い）。言い換えると、それはＰＤ１とＰＤＬ１との間の相互作用を含むチェックポイントと同一でも、又は異なっても良い。
【００３８】
一実施形態では、当該チェックポイントは、以下から選択される：
ａ）ＩＤＯ１とその基質との間の相互作用；
ｂ）ＰＤ１とＰＤＬ１、及び／又はＰＤ１とＰＤＬ２との間の相互作用；
ｃ）ＣＴＬＡ４とＣＤ８６、及び／又はＣＴＬＡ４とＣＤ８０と間の相互作用；
ｄ）Ｂ７−Ｈ３及び／又はＢ７−Ｈ４と、それら各々のリガンドとの間の相互作用；
ｅ）ＨＶＥＭとＢＴＬＡとの間の相互作用；
ｆ）ＧＡＬ９とＴＩＭ３との間の相互作用；
ｇ）ＭＨＣクラスＩ又はＩＩとＬＡＧ３との間の相互作用；及び
ｈ）ＭＨＣクラスＩ又はＩＩとＫＩＲとの間の相互作用。
【００３９】
更なる実施形態では、免疫調節剤は、前記免疫系チェックポイントの成分に結合する抗体又は小分子阻害剤（ＳＭＩ）である。
【００４０】
更なる実施形態では、薬剤はＩＤＯ１の小分子阻害剤であり、任意で前記阻害剤はエパカドスタット（ＩＮＣＢ２４３６０）、インドキシモド、ＧＤＣ−０９１９（ＮＬＧ９１９）、又はＦ００１２８７であり、或いは、前記薬剤はＣＴＬＡ４又はＰＤ１に結合する抗体であり、任意でＣＴＬＡ４に結合する前記抗体はイピリムマブであり、ＰＤ１に結合する前記抗体はペムブロリズマブである。
【００４１】
なお更なる態様では、本発明は、ＰＤ−Ｌ１の発現を特徴とする臨床状態を治療する方法であって、前記臨床状態を患う個体に有効量の本発明のペプチド断片、本発明の組成物、又は本発明のキットを投与することを含む方法に関する。
【００４２】
なお更なる態様では、本発明は、ＰＤ−Ｌ１の発現を特徴とする臨床状態を治療する方法であって、前記臨床状態を患う個体に有効量の一般式：
Ｘ１ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＸ２
[式中、
Ｎ末端のＸ１は、Ｌ、ＨＬ、ＴＨＬ、ＲＴＨＬ（配列番号７９）、ＥＲＴＨＬ（配列番号８０）、ＮＥＲＴＨＬ（配列番号８１）から成る群から選択され、又は存在せず、
Ｃ末端のＸ２は、Ｆ、ＦＲ、ＦＲＬ、ＦＲＬＲ（配列番号８２）、ＦＲＬＲＫ（配列番号８３）、ＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）、ＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号８５）、ＦＲＬＲＫＧＲＭ（配列番号８６）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭ（配列番号８７）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号８８）から成る群から選択され、又は存在せず、
ただし、Ｘ１が存在しない場合Ｘ２はＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）ではなく、
Ｃ末端のアミノ酸はまた、アミドを含む]
を有するＰＤ−Ｌ１ペプチド断片又はその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む方法に関する。ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、任意でＣ末端アミノ酸が対応するアミド形態に置換される、表Ａに開示の任意のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、又はその薬学的に許容可能な塩から選択され得る。
【００４３】
更なる態様では、本発明は、ＰＤ−Ｌ１の発現を特徴とする臨床状態の治療又は予防のための免疫療法組成物又はワクチン等の医薬の製造のための、本発明のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片の使用に関する。本発明のペプチド断片の使用の一実施形態では、医薬は免疫療法組成物である。本発明のペプチド断片の使用の他の実施形態では、医薬はワクチンである。一実施形態では、治療される臨床状態は、ＰＤ−Ｌ１が発現している癌疾患である。別の実施形態では、臨床状態は感染性疾患及び自己免疫疾患から成る群から選択される。更なる実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、一般式：
Ｘ１ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＸ２
[式中、
Ｎ末端のＸ１は、Ｌ、ＨＬ、ＴＨＬ、ＲＴＨＬ（配列番号７９）、ＥＲＴＨＬ（配列番号８０）、ＮＥＲＴＨＬ（配列番号８１）から成る群から選択され、又は存在せず、
Ｃ末端のＸ２は、Ｆ、ＦＲ、ＦＲＬ、ＦＲＬＲ（配列番号８２）、ＦＲＬＲＫ（配列番号８３）、ＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）、ＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号８５）、ＦＲＬＲＫＧＲＭ（配列番号８６）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭ（配列番号８７）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号８８）から成る群から選択され、又は存在せず、
ただし、Ｘ１が存在しない場合Ｘ２はＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）ではなく、
Ｃ末端のアミノ酸はまた、アミドを含む]
又はその薬学的に許容可能な塩を有する。ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、任意でＣ末端アミノ酸が対応するアミド形態に置換される、表Ａに開示の任意のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、又はその薬学的に許容可能な塩から選択され得る。
【００４４】
なお更なる態様では、本発明は、追加の癌治療と同時に又は連続的に投与される、癌の治療又は予防のための方法における使用のための、一般式：
Ｘ１ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＸ２
[式中、
Ｎ末端のＸ１は、Ｌ、ＨＬ、ＴＨＬ、ＲＴＨＬ（配列番号７９）、ＥＲＴＨＬ（配列番号８０）、ＮＥＲＴＨＬ（配列番号８１）から成る群から選択され、又は存在せず、
Ｃ末端のＸ２は、Ｆ、ＦＲ、ＦＲＬ、ＦＲＬＲ（配列番号８２）、ＦＲＬＲＫ（配列番号８３）、ＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）、ＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号８５）、ＦＲＬＲＫＧＲＭ（配列番号８６）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭ（配列番号８７）、ＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号８８）から成る群から選択され、又は存在せず、
ただし、Ｘ１が存在しない場合Ｘ２はＦＲＬＲＫＧ（配列番号８４）ではなく、
Ｃ末端のアミノ酸はまた、アミドを含む]
を有するＰＤ−Ｌ１ペプチド断片又はその薬学的に許容可能な塩に関する。ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、任意でＣ末端アミノ酸が対応するアミド形態に置換される、表Ａに開示の任意のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、又はその薬学的に許容可能な塩から選択され得る。追加の癌治療はサイトカイン療法、Ｔ細胞療法、ＮＫ療法、免疫系チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線治療、免疫刺激物質、遺伝子治療、抗体及び樹状細胞であり得る。サイトカイン療法、Ｔ細胞療法、ＮＫ療法、免疫系チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線治療、免疫刺激物質、遺伝子治療、抗体及び樹状細胞である追加の癌治療の各々は、個別の実施形態を構成する。例えば、更なる実施形態では、追加の癌治療は免疫系チェックポイント阻害剤から選択され、当該阻害剤は、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イリノテカン、レナリドミド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニボルマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、レブラミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン、から選択されるチェックポイント遮断抗体である。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号７７）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号７７）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号５２）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号５２）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ（配列番号６７）、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号６７）、
ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ（配列番号２）、
ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号２）、
又はそれらの薬学的に許容可能な塩から選択される。典型的には、ペプチド断片は、
ＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤ（配列番号７７）、
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ（配列番号５２）、及び
ＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲ−ＮＨ２（Ｃ末端にアミドを有する配列番号５２）
から選択される。
【００４５】
更なる態様では、本発明は、サイトカイン療法、Ｔ細胞療法、ＮＫ療法、免疫系チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線治療、免疫刺激物質、遺伝子治療、抗体及び樹状細胞等の追加の癌治療と同時にまたは連続的に投与される、癌の治療又は予防のための方法における使用のための、
一般式：
ＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬ（配列番号８９）（ここで、Ｃ末端アミノ酸はまた、アミドを含む）
を含むＰＤ−Ｌ１ペプチド断片又はその薬学的に許容可能な塩に関する。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、配列番号１の配列の３５個までの連続アミノ酸、例えば３０個又は２５個、から成り、一般式：ＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬ（配列番号８９）を有するＰＤ−Ｌ１断片を含む。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、一般式：ＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬ（配列番号８９）（ここで、Ｃ末端アミノ酸はまた、アミドを含む）を有するＰＤ−Ｌ１断片から選択される。更なる実施形態では、追加の癌治療は免疫系チェックポイント阻害剤から選択され、当該阻害剤は、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イリノテカン、レナリドミド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニボルマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、レブラミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン、から選択されるチェックポイント遮断抗体である。
【００４６】
本明細書に開示のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）等の標準的なペプチド合成により作製される。ＳＰＰＳは、実験室でペプチドを合成するための標準的な方法である。ＳＰＰＳにより、細菌で発現させるのが困難な天然ペプチドの合成、非天然アミノ酸の組み込み、ペプチド／タンパク質骨格の改変、及びＤ−アミノ酸から成るＤ−タンパク質の合成が可能となる。小多孔質ビーズを、機能ユニット（「リンカー」）により処理し、ペプチド鎖がその上に生成され得る。ペプチドは、無水フッ化水素又はトリフルオロ酢酸等の試薬によりビーズから切断されるまで、ビーズに共有結合している。従って、ペプチドは固相に固定され、液相試薬及び合成副産物が洗い流される濾過過程の間、保持され得る。ＳＰＰＳの一般的原理は、脱保護−洗浄−カップリング−洗浄という繰り返しサイクルの１つである。固相に結合されたペプチドの遊離Ｎ末端アミンは一つのＮ−保護アミノ酸ユニットにカップリングされる。その後このユニットは脱保護され、新たなＮ末端アミンを露呈し、そこに更なるアミノ酸が結合され得る。この技術が優れているのは、全ての伸長中の目的ペプチドが不溶性樹脂に共有結合したままの状態で、各反応後に洗浄サイクルを行い余分な試薬を取り除くことができるというところに一部ある。ＳＰＰＳには２つの主な使用形態、Ｆｍｏｃ及びＢｏｃ、がある。リボソームタンパク質合成と異なり、固相ペプチド合成はＣ末端からＮ末端に進行する。アミノ酸モノマーのＮ末端は、これら２つの基のいずれかにより保護され、脱保護されたアミノ酸鎖に付け加えられる。多くの研究グループは手作業でＳＰＰＳを行い続けているが、どちらの方法でも自動合成装置が利用できる。さらに、当業者は、上述及び後述の工程において、中間化合物の官能基は保護基により保護される必要があり得ることを理解するだろう。
【００４７】
本明細書に開示の化合物及び医薬組成物が上述の治療のために使用される場合、治療有効量の少なくとも１つの化合物が前記治療を必要とする哺乳動物に投与される。
【００４８】
本明細書に使用される場合、アミノ酸は、当業者に既知であり便宜のために以下の表に示される一又は三文字の略号により、特定される。
【００４９】
【表２】
2019527676.tif 000004
【００５０】
本明細書で使用される「治療」及び「治療すること」との用語は、疾患又は障害等の状態と闘うための患者の管理及び看護を意味する。当該用語は、患者が患う所与の症状についてのあらゆる治療、例えば、症状若しくは合併症を軽減するための、疾患、障害若しくは状態の進行を遅らせるための、症状及び合併症を軽減若しくは緩和するための、及び／又は疾患、障害、若しくは状態を治し除去するための、並びに状態を予防するための活性化合物の投与等、を含むことが意図されている。ここで、予防は、疾患、状態又は障害と闘うための、患者の管理及び看護と理解するべきであり、症状又は合併症の発症を予防するための活性化合物の投与を含む。治療は急性的に又は慢性的に行われ得る。治療される患者は好ましくは哺乳類である；特にヒトであるが、それにはイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、及びブタ等の動物もまた含まれ得る。
【００５１】
本明細書に使用される、本発明のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片又は本明細書に開示のペプチド断片の「治療有効量」との用語は、所与の疾患及びその合併症の臨床症状を治し、軽減し、又は抑えるのに十分な量を意味する。これを達成するのに適切な量が「治療有効量」と定義される。各用途のための有効量は疾患又は負傷の重症度、並びに対象の体重及び全身状態に依存するだろう。適切な投与量の決定は、値のマトリクスを作成しマトリクス内の様々な点を試験することにより、通常の実験を用いて達成され得、それはすべて熟練の医師又は獣医の通常技術の範囲内であることは理解されるだろう。
【００５２】
なお更なる態様では、本発明は、本発明のＰＤ−Ｌ１ペプチド断片、及び任意で担体又は賦形剤等の薬学的に許容可能な添加剤を含む医薬組成物に関する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な添加剤」は、限定されないが、当業者が医薬組成物を作るために本発明の化合物を製剤化する際使用することを検討するだろう担体、賦形剤、希釈剤、アジュバント、着色料、香料、保存料等を含むことが意図されている。
【００５４】
本発明の組成物に使用され得るアジュバント、希釈剤、賦形剤、及び／又は担体は、一般式（１）の化合物及び医薬組成物の他の成分と混合可能であり、その投与を受ける者に対し有害でないという意味で、薬学的に許容可能でなければならない。好ましくは、当該組成物はアレルギー反応等の有害反応を引き起こし得る如何なる物質も含んではならない。本発明の医薬組成物に使用され得るアジュバント、希釈剤、賦形剤及び担体は当業者に周知である。
【００５５】
アジュバントとは、それを組成物に混合すると、組成物により誘発される免疫応答が増大する、又はそうでなければ改変される任意の物質である。広義ではアジュバントは、免疫応答を促進する物質である。アジュバントはまた、好ましくは、デポー効果を有し、投与部位からの活性剤の徐放、または持続放出をもたらし得る。アジュバントの一般的な議論は、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (第２版, 1986)、61-63頁に与えられる。
【００５６】
アジュバントは、以下から成る群から選択され得る：AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)、シリカ、アラム、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、N-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン(thr-DMP)、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(ＣＧＰ  １１６８７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも称される）、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(CGP 19835A、MTP-PEとも称される)、２％  スクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０（登録商標）エマルション中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リピドＡを含むリポ多糖及びその多様な誘導体、完全フロイントアジュバント（Freund's Complete Adjuvant、FCA)、不完全フロイントアジュバント（Freund's Incomplete Adjuvants）、Ｍｅｒｃｋアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣ及びポリＡＵ酸）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のワックスＤ、コリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）、百日咳菌（Bordetella pertussis）及びブルセラ属構成種に見出される物質、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＡＬＵＮ（ＵＳ  ５８７６７及び５，５５４，３７２を参照）、リピドＡ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリックス又はＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、モンタナイドＩＳＡ−５１及びＱＳ−２１。様々なサポニン抽出物が免疫原性組成物においてアジュバントとして有用であることもまた示唆されている。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）もまたアジュバントとして使用され得る。
【００５７】
本発明で使用される好ましいアジュバントには、オイル／界面活性剤に基づくアジュバント、例えばモンタナイドアジュバント（ベルギーのＳｅｐｐｉｃから入手可能）、好ましくはモンタナイドＩＳＡ−５１、が含まれる。他の好ましいアジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を含むアジュバント等の細菌ＤＮＡに基づくアジュバントである。さらに他の好ましいアジュバントは、ポリＩ：Ｃ等のウイルスｄｓＲＮＡに基づくアジュバントである。ＧＭ−ＣＳＦ及びイミダゾキニリンもまた好ましいアジュバントの例である。
【００５８】
アジュバントは、最も好ましくは、モンタナイドＩＳＡアジュバントである。モンタナイドＩＳＡアジュバントは、好ましくはモンタナイドＩＳＡ５１又はモンタナイドＩＳＡ７２０である。
【００５９】
Goding、Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (第２版、1986)、61-63頁には、目的抗原が低分子量である又は免疫原性が低い場合、免疫原性の担体に連結することが推奨されることもまた言及されている。本発明の免疫療法組成物のポリペプチド又は断片は、担体に連結され得る。担体はアジュバントと独立に存在し得る。担体の機能は、例えば、活性又は免疫原性を増大させるため、安定性を与えるため、生物活性を増大させるため、又は血清半減期を増大させるために、ポリペプチド断片の分子量を増大させることであり得る。さらに、担体はＴ細胞にポリペプチド又はその断片を提示するのに役立ち得る。従って免疫原性組成物では、ポリペプチド又はその断片は下述の担体等の担体と関連させ得る。
【００６０】
担体は、当業者に知られている任意の適切な担体、例えば、タンパク質又は樹状細胞（ＤＣ）等の抗原提示細胞であり得る。担体タンパク質には、キーホールリンペットヘモシアニン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリン若しくはオボアルブミン、免疫グロブリン等の血清タンパク質、又はインスリン等のホルモン、又はパルミチン酸が含まれ得る。或いは、担体タンパク質は破傷風トキソイド又はジフテリアトキソイドであっても良い。或いは、担体はセファロース等のデキストランであっても良い。担体はヒトに対し生理学的に許容可能で安全でなければならない。
【００６１】
免疫療法組成物は任意で薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。賦形剤は、組成物の他の成分と混合可能でありその投与を受ける者に対し有害でないという意味で、「許容可能」でなければならない。賦形剤には、湿潤剤又は乳化剤、及びｐＨ緩衝物質等の補助物質が存在し得る。これらの賦形剤及び補助物質は一般的に、組成物を投与される個体において免疫応答を誘導しない薬剤であり、過度の毒性なく投与され得る。薬学的に許容可能な賦形剤には、限定されないが、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、及びエタノール等の液体が含まれる。そこには薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩等の鉱酸塩等もまた含まれ得る。薬学的に許容可能な賦形剤、媒体、及び補助物質の詳細な議論は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)で入手できる。
【００６２】
免疫療法組成物は、ボーラス投与又は持続投与に適した形態で調製され、包装され、又は販売され得る。注射可能な組成物は、アンプル等の単位投薬形態において、又は保存料を含む複数回投与用容器（multi-dose containers）において調製され、包装され、又は販売され得る。組成物には、限定されないが、懸濁液、溶液、油性又は水性媒体中のエマルション、ペースト、及び埋め込み可能な持続放出性又は生分解性の製剤が含まれる。組成物の一実施形態では、有効成分が乾燥形態（粉末又は顆粒）で与えられ、適切な媒体（例えば、無菌のパイロジェンフリーの水）で再構成された後、再構成された組成物が投与される。組成物は、無菌の注射可能な水性又は油性の懸濁液又は溶液の形態で調製され、包装され、又は販売され得る。この懸濁液又は溶液は、既知の技術に従い製剤化されても良く、有効成分に加え、本明細書に記載のアジュバント、賦形剤、及び補助物質等の追加成分を含んでも良い。このような無菌の注射製剤は、非毒性で非経口的に許容可能な希釈剤又は溶液、例えば水又は１，３−ブタンジオール等、を用いて調製されても良い。他の許容可能な希釈剤及び溶液には限定されないが、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、及び合成モノグリセリド又はジグリセリド等の固定油が含まれる。
【００６３】
有用な他の組成物には、微晶質形態において、リポソーム製剤において、又は生分解性ポリマー系の成分として、活性成分を含む組成物が含まれる。持続放出又は埋め込み用の組成物は、エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、難溶性塩等の薬学的に許容可能なポリマー材料又は疎水性材料を含み得る。或いは、組成物の活性成分は微粒子担体にカプセル化され、吸着し、又は結合し得る。適切な微粒子担体には、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来する微粒子担体、並びにポリ（ラクチド）及びポリ（ラクチド−co−グリコリド）由来のＰＬＧ微小粒子が含まれる。例えば、Jeffery等(1993) Pharm. Res. 10:362-368を参照。他の微粒子系及びポリマー、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン等のポリマー、並びにこれらの分子のコンジュゲート、もまた使用され得る。
【００６４】
上述のように、本明細書に開示される組成物、特に免疫療法組成物は、本明細書に開示の化合物に加え、少なくとも１種の薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、賦形剤及び／又は担体をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１〜９９重量％の前記少なくとも１種の薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、賦形剤及び／又は担体、並びに１〜９９重量％の本明細書に開示の化合物を含む。活性成分と薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、賦形剤及び／又は担体とを合わせた量は、組成物、特に医薬組成物の１００重量％を超えなくても良い。本明細書に記載の任意の組成物、ワクチン、又はキットは、保存料を追加で含んでも良く、それにより、溶液において又は凍結乾燥物として保存される際、本発明の成分ペプチド断片の安定性が改善され得る。適切な保存料は当該分野において周知であり、好ましくは薬学的に許容可能である。いくつかの場合では、ペプチド断片の安定性は、Ｎ末端、Ｃ末端、又は両末端に追加の末端残基を組み入れることにより増大し得る。このような残基は典型的には、親水性アミノ酸残基又は対応するアミドであろう。典型的には、ペプチド断片はＮ及び／又はＣ末端にそのような残基を追加で１、２又は３個含み得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の１つの化合物のみが上述の用途のために使用される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の２個以上の化合物が上述の用途のために組み合わせて使用される。
【００６７】
上述の化合物を含む組成物、特に免疫療法組成物は、経口投与、静脈内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与、口腔投与、舌下投与、若しくは皮下投与、又は、例えばエアロゾル若しくは空気懸濁微粉末形態での、気道を通した投与に適合させ得る。従って、医薬組成物は例えば、錠剤、カプセル、粉末、ナノ粒子、結晶、非晶質物質、溶液、経皮貼付剤、又は坐剤の形態であっても良い。
【００６８】
工程の更なる実施形態は本明細書の実験の節で説明され、個別の工程並びに各々の出発物質は、実施形態の一部を形成し得る実施形態を構成する。
【００６９】
上述の実施形態は、本明細書に記載の任意の態様（「治療のための方法」、「免疫療法組成物」、「医薬としての使用のための化合物」、又は「方法における使用のための化合物」等）並びに本明細書に記載の任意の実施形態に言及していると考えるべきである。ただし、ある実施形態が本発明の特定の一態様又は複数態様に関することが特定されている場合を除く。
【００７０】
本明細書で引用される、出版物、特許出願及び特許を含むすべての参照文献は、各参照文献が参照により組み込まれることが個別にかつ具体的に示されており本明細書にその全体が説明されている場合と同程度に、本明細書に参照により組み込まれる。
【００７１】
すべての題目、副題は便宜のために本明細書で使用されるだけであり、決して本発明を限定すると解釈すべきでない。
【００７２】
考えられる上述の要素の変形形態すべてにおける、上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書で別段示されるか、そうでなければ明らかに文脈に矛盾する場合を除いて、本発明に包含される。
【００７３】
本発明を説明する文脈において使用される「a」、「an」、「the」及び同様の指示物は、本明細書で別段示されるか、或いは明らかに文脈に矛盾する場合を除いて、単数及び複数の両方を包含すると解釈すべきである。
【００７４】
本明細書で別段示されない限り、本明細書における値の範囲の記載は、その範囲に含まれる個々の値各々を個別に示す簡単な方法として働くことを目的とするだけであり、個々の値各々はそれが本明細書に個別に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。他に述べない限り、本明細書で与えられるすべての正確な値は対応する近似値の代表である（例えば、特定の要素又は測定値に関して与えられたすべての正確な例示値は、適切な場合、「約」により修飾される対応する近似の測定値をも与えると考えられ得る）。
【００７５】
本明細書で別段示されるか、そうでなければ明らかに文脈に矛盾する場合を除いて、本明細書に記載のすべての方法は任意の適切な順序で行われ得る。
【００７６】
本明細書で与えられる任意の及びすべての例、又は例示的な用語（例えば、「等」）の使用は、本発明をより明確にすることを目的としているだけであり、別段示されない限り、本発明の範囲を限定しない。明確に記述されない限り、本明細書のどの用語も、任意の要素が本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈すべきでない
【００７７】
本明細書における特許文献の引用及び組み込みは便宜のためにのみ行われ、このような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使可能性という観点をまったく反映しない。
【００７８】
別に述べられるか、そうでなければ明らかに文脈に矛盾する場合を除いて、一要素又は複数要素に関して「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、又は「含む（containing）」等の用語を用いる、本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書における記載は、その特定の要素又は複数要素「から成る」、「から本質的に成る」、又は「を実質的に含む」本発明の同様の態様又は実施形態をサポートするよう意図されている（例えば、特定の要素を含むと本明細書で記載される組成物は、別に述べられるか明らかに文脈に矛盾する場合を除いて、その要素から成る組成物をも記載していると理解すべきである）。
【００７９】
本発明は、適用法により許される最大限の範囲で、本明細書に提示される態様又は請求項に記載の主題のすべての変更形態及び均等物を含む。
【００８０】
本発明は下記の実施例によりさらに説明されるが、下記の例は保護範囲を制限すると解釈すべきでない。前述の記載及び下記の実施例において開示される特徴は、別々でもその任意の組み合わせでも、本発明をその様々な形態で実現するための材料となり得る。
【実施例】
【００８１】
[実施例１]
＜材料と方法＞
患者とドナー
２６人のステージＩＶの黒色腫患者が、非盲検化非ランダム化第Ｉ／ＩＩ相試験に参加した（EudraCT番号 2009-010194-20; Clinicaltrials.gov識別番号: NCT00978913）。その手順は、デンマーク首都圏の科学倫理委員会（H-A-2009-013）、デンマーク医薬品庁（2612-4030）、デンマークデータ保護局により承認され、ヘルシンキ宣言の規定に従い行われた。試験参加の前に患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。臨床結果及び免疫学的結果は他の場所で報告されるだろう（Borch等、準備中）。簡単に言うと、患者に自己ＤＣワクチンを２週間に１度６回皮内注射した後、進行するまで４週間に１度皮内注射した。同時に、２週間に１度規則正しいシクロホスファミド投薬計画（１日２回５０ｍｇ）で患者を治療した。
【００８２】
免疫をモニタリングする目的で、樹状細胞ワクチン（ＤＣｖａｃｃ）の接種の前、４回及び６回の接種の後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を患者から集めた。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ分離を用いてＰＢＭＣを単離し、ＨＬＡタイピングし、１０％ＤＭＳＯを含むＦＣＳ中で凍結した。以前記載されたようにＤＣワクチンを生成し２４、デンマーク医薬品庁により承認されている適正製造規範（ＧＭＰ）に従ってすべての手順を行った。簡単に言うと、白血球アフェレーシスにより自己ＰＢＭＣを単離し、単球をさらに単離し、８日間培養した。６日目にＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６、及びＰＧＥ２を用いてＤＣの成熟を行った。自動凍結保存を用いて１ｘ１０７個のＤＣのアリコートを凍結した。腫瘍関連抗原であるｐ５３、サバイビン及びｈＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡで成熟したＤＣをトランスフェクトしてＤＣｖａｃｃを生成した。
【００８３】
ペプチド
ＰＤ−Ｌ１由来の１９アミノ酸長のポリペプチドを合成した（ＴＡＧコペンハーゲン、コペンハーゲン、デンマーク）：ＰＤＬｏｎｇ１：ＰＤＬ１９−２８、ＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬ−配列番号８９。ＰＤＬｏｎｇ１は９ｍｅｒのＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチド配列（本明細書で「ＰＤ−Ｌ１０１」と称される）ＰＤＬ１１５−２３を含んでいた；インターネットで利用可能なエピトープ予測データベース「ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ」を用いて特定され分析された（ＬＬＮＡＦＴＶＴＶ−配列番号９０）２５。ＰＤ−Ｌ１０１はＳＹＦＰＥＩＴＨＩアルゴリズムでスコア３０をとり、最上のエピトープ候補であることが判明した。
【００８４】
さらにＰＤ−Ｌ１由来の２３アミノ酸長を合成した（ＴＡＧコペンハーゲン、コペンハーゲン、デンマーク）：ＰＤＬｏｎｇ２：ＰＤＬ１２４２−２６４、ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧ（配列番号９１）。この長いペプチドは、www.syfpeithi.deで入手可能なRammensee等により開発されたアルゴリズムにより予測される、多数の１５’ｍｅｒのＨＬＡクラスＩＩ拘束性エピトープ並びに最小クラスＩ拘束性エピトープであり得るものを含む２５。特にそれはＰＤＬ１１１（ＰＤＬ１２５０−５８、ＣＬＧＶＡＬＴＦＩ−配列番号９２）と称されるＨＬＡ−Ａ２エピトープを含む。２０ｍｅｒ長のペプチド（本明細書で「無関係な対照」と称される）ＧＡＲＶＥＲＶＤＦＧＮＦＶＦＮＩＳＶＬＷ−配列番号９３−を対照ペプチドとして用い、同様にＨＬＡ−Ａ２の高親和性結合エピトープであるＨＩＶ−１  ｐｏｌ４７６−４８４（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ−配列番号９４）を無関係な対照として用いた。
【００８５】
共刺激アッセイ
悪性黒色腫患者から採取したＰＢＭＣを、１：１０のＤＣｖａｃｃ：ＰＢＭＣの比率で、自己ＤＣｖａｃｃで刺激した。刺激の１日後、培養物を分割し、２５μｇ／ｍＬのＰＤＬｏｎｇ１：ＰＤＬ１９−２８、[ＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬ−配列番号８９]、ＰＤＬｏｎｇ２：ＰＤＬ１２４２−２６４、[ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧ−配列番号９１]、又は対照の共刺激として無関係な長いペプチド[ＧＡＲＶＥＲＶＤＦＧＮＦＶＦＮＩＳＶＬＷ−配列番号９３]のいずれかのペプチドで共刺激した。７日目に２回目のＤＣｖａｃｃでの刺激を行い、その後８日目にペプチド共刺激を行った。各ペプチド共刺激の１日後にＩＬ−２（１２０Ｕ／ｍＬ）を添加した。２回目のペプチド共刺激の１週間後、細胞内サイトカイン染色を用いて培養物のＤＣｖａｃｃ応答を分析した。
【００８６】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
サイトカイン（ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α）を産生する細胞亜集団を検出するために、２週間ＤＣｖａｃｃで刺激しペプチドで共刺激したＰＭＢＣを、５％ＣＯ２、３７℃で５時間ＤＣｖａｃｃ（１：１０のＤＣｖａｃｃ：ＰＢＭＣの比率）で刺激した。培養開始から１時間後に１：２００の希釈度でＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ）を添加した。さらに４時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、表面マーカーに対する蛍光色素結合抗体で染色した（ＣＤ３−Ａｍｃｙａｎ、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ及びＣＤ８−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、すべてＢＤ製）。細胞をさらに一回洗浄し、その後製造業者の使用説明書に従い固定／透過処理及び透過処理バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により固定及び透過処理した。その後、細胞内サイトカインに対する蛍光色素結合抗体で細胞を染色した。以下の組み合わせを用いた：ＩＦＮ−γ−ＰＥ−ＣＹ７（ＢＤ）、ＴＮＦ−α−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。正確な補正を可能とし抗体の特異性を確認するために、関連するアイソタイプ対照を用いた。染色した細胞を、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを用いて分析し、ＢＤ  ＦａｃｓＤｉｖａソフトウェアを用いてさらに分析を行った。
【００８７】
ＰＤ−Ｌ１応答を測定するために、培養物をＰＤＬｏｎｇ１、ＰＤＬｏｎｇ２（０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）又は無関係のペプチドで５時間刺激した。その後、細胞を表面及び細胞内抗体で染色し、さらにＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩにおいて分析した。
【００８８】
ＥＬＩＳＰＯＴ
本研究では、ＣＩＰにより提供されるガイドラインに従ってＥＬＩＳＰＯＴを行った(http://cimt.eu/cimt/files/dl/cip_guidelines.pdf)。簡潔に言うと、底部がニトロセルロースの９６ウェルプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＭＡＩＰ  Ｎ４５；  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を関連する抗体で一晩コーティングした。ウェルを洗浄し、Ｘ−ｖｉｖｏ培地によりブロッキングし、可能なら三連、そうでなければ二連で、様々な細胞濃度で、ペプチドとともに又はペプチドなしで、細胞を加えた。プレートを４時間培養した。次に、培地を捨て、ウェルを洗浄し、関連するビオチン化二次抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）を添加し、その後アビジン−酵素複合体（ＡＰ−アビジン；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、最後に酵素基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２．０分析装置（ＣＴＬ分析装置）を用いてスポットを計数した。
【００８９】
ＣＢＡ
ＤＣｖａｃｃ刺激及びペプチド共刺激した（ＰＤＬｏｎｇ１及びＰＤＬｏｎｇ２又はＨＩＶペプチド）培養物におけるサイトカイン分泌の変化を測定するために、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１７Ａについて、ＢＤ(商標)  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  （ＣＢＡ）  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔsを用いて細胞培養物の上清を分析した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１０についてのＦｌｅｘ  Ｓｅｔは組み合わせたが、ＩＬ−１７Ａ及びＴＧＦ−β１は別に分析した。分析は製造業者の推奨に従って行った。ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてサンプルを得て、ＦＣＡＰ  Ａｒｒａｙ(商標)  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ３．０．１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを分析した。
【００９０】
＜結果＞
長いＰＤ−Ｌ１ペプチドでの共刺激により、ＤＣｖａｃｃに対するＴ細胞の反応性が増強される
一般的に、患者におけるＤＣｖａｃｃに対する免疫性はワクチン接種の前でも後でも弱いことが観察されていた。本研究では、ＤＣｖａｃｃ特異的Ｔ細胞応答に対するＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の補助的効果を調査することを計画した。従って、ワクチン接種前の基準時に、並びに４回のＤＣｖａｃｃ接種後、何人かの患者については６回のＤＣｖａｃｃ接種後に、黒色腫患者からＰＢＭＣを単離した。図１Ａに示すように、対照のＨＩＶエピトープ又はＰＤ−Ｌ１ペプチドと組み合わせてＤＣｖａｃｃで２回ＰＢＭＣを刺激した。全般的に、ＤＣｖａｃｃは主にＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激することが分かった。最初に、以前記載されたＰＤ−Ｌ１由来の長いＴ細胞エピトープ（「ＰＤＬｏｎｇ１」［ＰＤＬ１９−２７、ＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬ］  配列番号８９）の効果を調査した１８。ＰＤＬｏｎｇ１はＨＬＡ−Ａ２拘束性のＰＤ−Ｌ１由来ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（ＰＤＬ１１５−２３、ＬＬＮＡＦＴＶＴＶ−配列番号９０）を含む。ＰＢＭＣをＰＤＬｏｎｇ１と共に培養した場合、対照のＨＩＶエピトープと共に培養した場合と比較すると、ＤＣｖａｃｃに対し反応性を示すＰＢＭＣの数が増加することが認められた。図１Ｂ〜Ｅには、ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の同時活性化によりＤＣｖａｃｃに対するＴ細胞の免疫性が有意に増大したという、３人のドナーから得た培養物の結果が示されている。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、共刺激なしでＤＣｖａｃｃに応答してＴＮＦαのみを放出した（図１Ｂ）。ＴＮＦα／ＩＮＦγ二重陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１ペプチド共刺激を伴うＤＣｖａｃｃにより誘導された（図１Ｃ）。反応性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞数の両方が、ＰＤ−Ｌ１ペプチド共刺激を伴うＤＣｖａｃｃに応答して増加した（図１Ｄ及びＥ）。
【００９１】
ワクチン接種前のＰＢＭＣの培養物において、ＰＤＬｏｎｇ１で共刺激すると、ドナー８人のうち６人でＤＣｖａｃｃに対するＣＤ４＋Ｔ細胞の反応性が増大し(P = 0.312)、ドナー８人のうち７人でＣＤ８＋Ｔ細胞の反応性が増大した(P = 0.039)（それぞれ図２Ａ及びＢ）。４回のワクチン接種後、すべてのドナーにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞の反応性が増大したが(P = 0.016)（図２Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応性はドナー８人のうち５人のみで増大した(P = 0.313)（図２Ｂ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、ＰＤＬｏｎｇ１ペプチドで共刺激した培養物において、対照ペプチドで共刺激した培養物と比較して有意に高くＤＣｖａｃｃに対し応答した(それぞれP = 0.02及びP = 0.05)。
【００９２】
新たな長いＰＤ−Ｌ１エピトープに対する自発的免疫応答
ＰＤ−Ｌ１に対する免疫応答が共刺激により増大するかさらに調査するために、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用い、追加のＰＤ−Ｌ１由来エピトープ（ＰＤＬｏｎｇ２  ［ＰＤＬ１２４２−２６４、ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧ（配列番号９１）］）に対するＴ細胞の反応性について、１２人の黒色腫患者から採取した腫瘍浸潤リンパ球を調べた。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＰＤＬｏｎｇ２と共に培養された腫瘍浸潤リンパ球においてＴ細胞応答が増加することが明らかとなった（図３Ａ及びＢ）。この応答の増大は細胞内サイトカイン染色により確認された（図３Ｃ及びＤ）。
【００９３】
２つの長いＰＤ−Ｌ１ペプチドでの共刺激により、ＤＣｖａｃｃに対するＴ細胞の反応性が増強される
次に、８人のワクチン接種された黒色腫患者から採取したＰＢＭＣを調べ、ＰＤＬｏｎｇ１とＰＤＬｏｎｇ２の両方での共刺激の効果を測定した（図４Ａ及びＢ）。両方のＰＤＬｏｎｇエピトープで共刺激された培養物では、対照ペプチドで共刺激された培養物と比較して、ＤＣｖａｃｃに対して応答するＣＤ４＋Ｔ細胞の数が有意に増加したことが観察された(基準時P = 0.008であり、４回のワクチン接種後P = 0.008)。従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞の反応性は、両方の時点ですべてのドナーにおいて増大した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応性も同様に、一人のドナーを除く全ドナーにおいて、基準時(P = 0.008)及び４回のワクチン接種後(P = 0.055)で有意に増大した。
【００９４】
１又は２個のＰＤ−Ｌ１エピトープで刺激したすべての培養物を対照ペプチドと共にインキュベートした培養物と比較すると、マン−ホイットニー検定により、ＰＤ−Ｌ１共刺激はＴ細胞応答に対し有意な効果を有することが明らかとなった。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答：基準時P = 0.012、４回目のワクチン接種後P = 0.002、６回目のワクチン接種後P = 0.095。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答：基準時P = 0.01、４回目のワクチン接種後P = 0.076、６回目のワクチン接種後P = 0.31。
【００９５】
ＰＤ−Ｌ１エピトープでの共刺激はＩＬ−６の産生を誘導する
サイトカイン調節環境の変化を調べるため、ＢＤ(商標)  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔアッセイを使用して、４人のドナーから得られたＰＢＭＣ培養物の上清におけるサイトカイン分泌を比較した。ＰＤＬｏｎｇエピトープで共刺激したＰＢＭＣ培養物は、対照の培養物と比較して、高濃度の炎症性サイトカインＩＮＦγ及びＩＬ６を示した。基準時及び４回目のワクチン接種後の、４人の患者のうち３人から得られた培養物では、対照の培養物と比較してＩＦＮγレベルが高いことが観察された（図５Ａ）。さらに、両方のＰＤＬｏｎｇペプチド（Ｌｏｎｇ  １＋２）での共刺激後では、対照ペプチドでのインキュベーションと比較すると、両方の時点で４人の患者全員においてＩＬ−６レベルが大きく増大することが観察された（図５Ｂ）。両方のＰＤＬｏｎｇペプチドで共刺激した培養物では、対照と比較すると、調節性サイトカインＴＧＦβのレベルが低いこともまた観察された（図５Ｃ）。このような低レベルのＴＧＦβは、基準時では４人の患者のうち２人、４回目のワクチン接種／共刺激後では４人の患者全員から得られたＰＢＭＣ培養物において見られた。ＴＮＦα、ＩＬ１０、及びＩＬ１７等の他のサイトカインを測定したが、それらは調べた上清いずれにも検出することができなかった（データ不掲載）。サイトカインプロファイルの変化に加え、ＰＤ−Ｌ１エピトープで共刺激した培養物のほとんどでは、対照の培養物と比較して細胞数が多かった（図５Ｄ）。基準時では４人の患者のうち３人、４回目の刺激後では４人の患者全員から得られた培養物において、細胞数の増大が観察された。
【００９６】
＜考察＞
癌における免疫抑制を標的とするいくつかの潜在的な治療戦略、例えばモノクローナル抗体での阻害経路の遮断等、が現在研究されている１９。我々が採用している代替戦略は、免疫抑制を標的とする特異的Ｔ細胞を利用することである２０。本研究では、ＰＤ−Ｌ１由来の長いペプチドエピトープを用いたＤＣに基づくワクチンの共刺激の免疫原性に対する効果を調べた際、我々はワクチンに対するＴ細胞の反応性が有意に増大することを発見した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の反応性は最も増強されたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応性もまた共刺激により有意に増強された。
【００９７】
一般的に、我々は、エキソビボでは患者から得られたＰＢＭＣでＤＣｖａｃｃに対する反応性が全くないか非常に限定されていることを観察しただけだった（Borch等、準備中）。従って、ＤＣｖａｃｃを接種した患者においてインビボでのＴ細胞の頻度の誘導は限定されていた。これは、おそらくＤＣにより増強さえもされ得る様々な免疫抑制機構が存在するためであろう。ＰＤ−Ｌ１の上方調節等の調節性フィードバック機構は、免疫応答の強さ及び範囲を制限するために不可欠であるが、別の面では宿主に害を及ぼし得る。しかしながら、この免疫回避は癌免疫治療の場面では有害である。従って、免疫抑制機構が治療効果を抑制し得る場合、１つ以上の免疫抑制経路を標的とすることは、抗癌免疫療法との組み合わせにおいて、有益となり得る。
【００９８】
本研究の結果は、癌ワクチンへのＰＤ−Ｌ１エピトープの添加によりインビボでのワクチンに対する免疫応答が強化され得ることを示唆する。これらの方法は、ＰＤ−Ｌ１の局所発現により腫瘍微小環境に引き寄せられる炎症性ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞を同時活性化することより、エフェクターＴ細胞を増強し得る。先行研究では、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）をＩＬ−６及び他の炎症性サイトカインに暴露すると、成熟Ｔｒｅｇのリプログラミングが誘導され炎症性Ｔｈ１７細胞に類似する表現型が得られることが報告されている２１〜２３。本研究では、ＰＤ−Ｌ１エピトープで共刺激した培養物において、ＩＬ−６レベルが有意に高かった。従って、ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞は、直接的にも間接的にも炎症性サイトカインを放出することにより、並びにＰＤ−１陽性Ｔ細胞を阻害するＰＤ−Ｌ１発現調節性免疫細胞を直接除去することにより、免疫応答のエフェクター段階を効果的に増強し得る。ＰＤ−Ｌ１の免疫調節効果を直接抑制することに加え、ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞はその同族の（cognate）標的細胞により媒介される他の免疫抑制経路を阻害し得る。
【００９９】
ＰＤ−１経路の遮断の初期の成功により、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１を標的とするモノクローナル抗体を開発することに商業的関心が生じ、製薬会社間の競争が起きている。ワクチンは免疫エフェクター細胞を腫瘍微小環境にリクルートすることが示されているため、ワクチン接種と組み合わされたＰＤ−１経路遮断は、有望な代替的アプローチとなる。ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞を増強すると免疫調節が直接調整され寛容が変更され得るため、ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の誘導により免疫調節を標的とすることは、免疫療法剤の免疫原性を増強するための魅力的な選択肢となる。ワクチン接種とＰＤ−１経路の遮断との組み合わせは容易に実施可能であり相乗的であるはずである。抗体によりＰＤ−Ｌ１を遮断すると、ＰＤ−Ｌ１発現標的細胞は、ワクチンにより誘導されるＴ細胞にとってより攻撃しやすい標的となるだろうからである。ＰＤ−Ｌ１由来エピトープでのＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の共刺激を含む投薬計画の安全性、忍容性、及び有効性を確認するために、今後の研究が必要とされる。
【０１００】
[実施例２]
＜ヒト患者におけるＩＯ１０４．１に対する自発的免疫応答＞
まず、黒色腫患者から得られた腫瘍浸潤Ｔ細胞においてＩＯ１０４．１の２つのバージョンに対する免疫応答を分析した。次に、ＰＤＬ１１１特異的Ｔ細胞がＩＯ１０４．１を認識できるか否か分析した。
【０１０１】
＜材料と方法＞
ペプチド
ＰＤＬ１１１＝ＣＬＧＶＡＬＴＦＩ（最小エピトープ−配列番号９２）
ＩＯ１０４（ＰＤＬｏｎｇ２）＝ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧ（配列番号９１）
ＩＯ１０４．１−ＯＨ＝Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ（Ｃ末端酸）（配列番号５２）
ＩＯ１０４．１−ＮＨ２＝Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ２（Ｃ末端アミド）（Ｃ末端にアミドを有する配列番号５２）
【０１０２】
＜ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ＞
ＥＬＩＳＰＯＴ技術により、比較的少ないＴ細胞しか利用できなくても、Ｔ細胞が認識するか否かについて多数のペプチド抗原をスクリーニングすることが可能となった。我々はＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用し、実施例１に記載のように、ペプチド特異的な、ＩＦＮ−γを分泌するエフェクター細胞を定量化した。アッセイは、癌免疫療法の免疫ガイドプログラム（immunoguiding program、CIP；http://cimt.eu/cimt/files/dl/cip_guidelines.pdf）により与えられたガイドラインに従って行った。Ｔ細胞の反応性を測定するために、底部がニトロセルロースの９６ウェルプレート(MultiScreen MSIPN4W; Millipore)を関連する抗体で一晩コーティングした。ウェルを洗浄し、Ｘ−ｖｉｖｏ培地で２時間ブロッキングした。ＰＤ−Ｌ１ペプチド又は対照ペプチドとともに３連ウェルで様々な細胞濃度で腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を加えて一晩インキュベートした。翌日、ウェルを洗浄し、関連するビオチン化二次抗体（Mabtech）を添加し、その後アビジン−酵素複合体（AP-Avidin; Calbiochem/Invitrogen Life Technologies）を添加した。最後に可視化のために酵素基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ(Invitrogen Life Technologies)を添加した。現像されたＥＬＩＳＰＯＴプレート上のスポットを、ＣＴＬ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｓ６  Ｕｌｔｉｍａｔｅ−Ｖ分析装置でＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔソフトウェアｖ５．１を用いて分析した。
【０１０３】
＜結果＞
ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、ＩＯ１０４．１ペプチドに対するＴ細胞の反応性について、７人の黒色腫患者から得られた腫瘍浸潤リンパ球を調査した。当該ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、３人の患者由来のＩＯ１０４．１ペプチドと共に培養した腫瘍浸潤リンパ球においてＴ細胞応答が明らかとなった。図６参照。
【０１０４】
次に、最小エピトープＣＬＧＶＡＬＴＦＩ（ＰＤＬ１１１−配列番号９２、ＩＯ１０４．１内に位置する）に特異的なＣＤ８Ｔ細胞がＩＯ１０４．１の両方のバージョンを認識することができるどうか、ＥＬＩＳＰＯＴにより調査した。ＰＤＬ１１１、ＰＤＬ１２４２−２６４（ＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧ−ＰＤＬｏｎｇ２、配列番号９１），ＩＯ１０４．１（−ＯＨ）、及びＩＯ１０４．１（ＮＨ）に対する反応性を分析した。Ｔ細胞はＩＯ１０４．１の両方のバージョンに対し応答することができた。図７を参照。
【０１０５】
＜結論＞
ＩＯ１０４．１特異的Ｔ細胞は、ヒト黒色腫患者の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の中に天然に存在する。ＩＯ１０４．１ペプチドはまた、ＩＯ１０４．１の配列内に含まれる既知のＰＤ−Ｌ１エピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される。
【０１０６】
[実施例３]−マウスにおいてＰＤＬ１特異的Ｔ細胞は天然に生じている
我々は、ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞が天然に生じているならば、それらは炎症に応答して活性化及び増殖するはずであるという仮説を立てた。
【０１０７】
＜材料と方法＞
Ｃ５６ＢＬ／６マウスに、２日間間隔を空けて（ｄａｙ  ０＋２）２００μｌＰＢＳ中の１μｇＩＦＮγ（ＩＦＮｙ）を腹腔内に注射し、（又は対照のために注射せず）、炎症を模倣した。ＩＦＮγ−Ｅｌｉｓｐｏｔによりさらに分析するために、５日目にマウスを犠牲死させ、摘出された脾臓の単一細胞溶液（single cell solution）を作製した。
【０１０８】
Ｅｌｉｓｐｏｔプレートにおいて、５μｇ／ｍｌのマウス（ｍ）ＰＤＬ１由来のペプチドで１８〜２０時間、９×１０５個脾細胞／ウェルをエキソビボで刺激した。ペプチド刺激されたウェルについてのスポット数からバックグラウンド（ペプチド刺激なしでのウェルのスポット数）を差し引いた。
【０１０９】
ＰＤＬ１由来のペプチドは下記の理由に基づき選択した。
ｍＰＤ−Ｌ１の配列は以下である：
2019527676.tif 000005
【０１１０】
この配列はヒト（ｈ）ＰＤＬ１の配列と著しく異なるため、ヒトにおいて行ったようにマウスにおいて試験するために同一のペプチドを使用することはできない。しかしながら、我々は、ＰＤＬｏｎｇ１及びＰＤＬｏｎｇ２の配列が由来するｈＰＤＬ１内領域におおよそ相当するｍＰＤＬ１内領域から意図的にペプチドを選択した（実施例１及び２を参照）。即ち、ｍＰＤＬ１のＮ末端／シグナル配列及びＣ末端／膜貫通領域から選択した。
【０１１１】
以下のペプチドを選択した。
2019527676.tif 000006
【０１１２】
ｍＬｏｎｇ１及び２は、上でボールド体で示されるｍＰＤＬ１の領域から選択された、重なり合う配列である；ｍＬｏｎｇ３、４及び５は、上で下線で示されるｍＰＤＬ１の領域から選択された、重なり合う配列である。ｍＬｏｎｇ１は、ＰＤｌｏｎｇ１のヒトペプチドに最も近いマウスの相当物であると考えられる。ｍＬｏｎｇ３は、ＰＤｌｏｎｇ２のヒトペプチドに最も近いマウスの相当物であると考えられる。
【０１１３】
＜結果と結論＞
ＥＬＩＳＰＯＴの結果を図８に示す。５つのマウスペプチドはすべて、ＩＦＮγでの前刺激後Ｔ細胞により認識された。従ってこれにより、これらの配列内のエピトープに特異的なＴ細胞は、ワクチン接種をしなくてもマウスにおいて天然に存在することが示される。最も良好な結果はｍＬｏｎｇ１及びｍＬｏｎｇ３で得られた。以降のマウス実験では、単純にするためにｍＬｏｎｇ１のみを用いたが、少なくともｍＬｏｎｇ３では同様の結果が予測されるだろう。
【０１１４】
[実施例４]−マウスにおける天然のＰＤＬ１特異的Ｔ細胞についての更なる証拠
実施例３における結果を考慮し、ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞はまた、アレルゲンに対する炎症反応等の局所的刺激に応答して活性化及び増殖するはずであるとの仮説を立てた。
【０１１５】
＜材料と方法＞
１：４のオリーブオイル／アセトン（ＯＯＡ）中の０．１５％２、４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ；アレルゲン）の溶液（又は対照としてＯＯＡのみ）を、３日間連続で（０〜２日目）、Ｃ５６ＢＬ／６マウスの両耳の裏に、塗布した。５日目にマウスを犠牲死させ、ＩＦＮγ−Ｅｌｉｓｐｏｔによりさらに分析するために、摘出した脾臓及び流入領域リンパ節（ｄＬＮ）の単一細胞溶液を作製した。
【０１１６】
Ｅｌｉｓｐｏｔプレートにおいて、５μｇ／ｍＬのｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１（実施例３のｍＬｏｎｇ１）又はｍＰＤ−Ｌ１ｓｈｏｒｔ（配列ＧＩＩＦＴＡＣＣＨＬ（配列番号１０１）を有するｍＬｏｎｇ１ペプチドの一部）で１８〜２０時間、８〜９×１０５個細胞／ウェルをエキソビボで刺激した。ペプチド刺激したウェルについてのスポット数からバックグラウンド（ペプチド刺激なしでのウェルのスポット数）を差し引いた。
【０１１７】
＜結果と結論＞
Ｅｌｉｓｐｏｔの結果を図９に示す。脾細胞及びｄＬＮは、ＤＮＦＢで処理したマウスにおいて長いペプチド及び短いペプチドの両方を認識したが、対照のマウスでは認識しなかった。これにより、天然のＰＤＬ１特異的Ｔ細胞が局所的なアレルゲン刺激に応じて実際に活性化及び増殖することが確認された。長いペプチド及び短いペプチド両方に対する応答は、当該応答がおそらくＣＤ８＋及びＣＤ４＋の両方のＴ細胞に起因することを示す。短いペプチドはＭＨＣクラスＩだけに結合しそれにより提示されるはずであるため、ＣＤ８＋Ｔ細胞のみ刺激し得る。長いペプチドは（プロセシング後に）ＭＨＣクラスＩ及びＩＩに結合しそれらにより提示され得るため、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋の両方のＴ細胞を刺激するだろう。
【０１１８】
[実施例５]−マウスにおけるＰＤＬ１特異的応答は、ＰＤＬ１ペプチドを用いたワクチン接種により増大する
＜材料と方法＞
０日目に、アジュバントとしてモンタナイドと共に又はモンタナイドなしで、１００μｇのｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１（実施例３のｍＬｏｎｇ１）（対照としてモンタナイドのみ）を用いて、Ｃ５６ＢＬ／６マウスの腰部皮下に（ｓ．ｃ．）ワクチン接種した。７日目にマウスを犠牲死させ、ＩＦＮγ−Ｅｌｉｓｐｏｔによりさらに分析するために摘出した脾臓の単一細胞溶液を作製した。
【０１１９】
Ｅｌｉｓｐｏｔプレートにおいて、５μｇ／ｍＬのｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１又はｍＰＤ−Ｌ１ｓｈｏｒｔで１８〜２０時間、９×１０５個脾細胞／ウェルをエキソビボで刺激した。ペプチド刺激したウェルについてのスポット数からバックグラウンド（ペプチド刺激なしでのウェルのスポット数）を差し引いた。
【０１２０】
＜結果と結論＞
Ｅｌｉｓｐｏｔの結果を図１０に示す。アジュバントだけを用いてワクチン接種したマウスと比較して、ペプチド−ワクチン接種したマウスの脾臓及び流入領域リンパ節（ＤＬＮ）では、強いＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞応答が見られた。ｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ及びより短いバージョンのｍＰＤ−Ｌ１ｓｈｏｒｔの両方を用いたエキソビボでの刺激は、ＩＦＮγＥｌｉｓｐｏｔにより見られるように、ｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇをワクチン接種したマウスにおいてＰＤ−Ｌ１特異的応答の増大を示した。
【０１２１】
[実施例６]−ｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１を用いたワクチン接種はマウスにおいて抗腫瘍効果を示す。
＜材料と方法＞
Ｃ５６ＢＬ／６マウスに２×１０５個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を腰部一側面の皮下に（ｓ．ｃ．）接種した（０日目）。腫瘍細胞は接種前２４時間、インビトロでＩＦＮγを用いて事前に刺激した。０日目及び７日目に、アジュバントとしてのモンタナイドと共に、１００μｇのｍＰＤ−Ｌ１ｌｏｎｇ１を用いて（対照としてモンタナイドのみ）、マウス腰部の他側面皮下にワクチン接種した。１週間に３回、腫瘍のサイズを測定し、腫瘍が大きくなりすぎるたところでマウスを犠牲死させた。
【０１２２】
＜結果と結論＞
結果を図１１に示す。ペプチド＋モンタナイドでワクチン接種したマウスは、モンタナイドのみでワクチン接種したマウスよりも腫瘍成長の減少及び良好な生存率を示した。従って、当該ワクチン接種により増殖及び活性化された抗−ＰＤＬ１Ｔ細胞は抗腫瘍効果を有する。
【０１２３】
実施例３〜７（インビボ試験）についての総体的結論
我々は、ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞は、ＩＦＮγの注射（実施例３）及びアレルゲンでの局所的刺激（実施例４）により増殖することを述べているが、これにより、ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞は既に存在しており、炎症部位で同族の標的（即ち、プロフェッショナル抗原提示細胞）から強い活性化シグナルを受けて活性化され増殖することが示唆される。また我々は、ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞はワクチン接種により容易に増殖し、抗腫瘍効果が生じることを実証している。従って、ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞は、癌細胞により利用される免疫抑制機構に対し直接反応することにより適用免疫応答に影響を与える免疫系の能力の中で、とりわけ興味深い例である。ＰＤＬ１ペプチドを用いたワクチン接種はインビボで直接的な利益を有することが示された。
【０１２４】
Ｅｌｉｓｐｏｔ方法論についての全般的な詳細
・マウスを犠牲死させた後、脾臓（及び流入領域リンパ節（ｄＬＮ））を摘出した。
・脾臓及びｄＬＮを７０μＭセルストレーナーに通して破砕し、培地（ＲＰＭＩ＋１０％  ＦＣＳ＋１％  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）入りの５０ｍｌチューブに回収し、３００Ｇで５分間洗浄し、それをｄＬＮについて繰り返した。脾細胞を１分間ＲＢＣ溶解バッファーで溶解し、培地で２回洗浄した。
・細胞を計数し、９×１０５個細胞／ウェルの細胞数でＩＦＮγ  ＡｂコーティングされたＥｌｉｓｐｏｔプレートに移した。コーティング抗体：抗マウスＩＦＮ−ｇ  ｍＡｂ  ＡＮ１８（Ｍｅｂｔｅｃｈカタログ番号３３２１−３−１０００）。
・刺激ペプチドを５μｇ／ｍＬの濃度で指定されたウェルに添加した。対照のウェルは、ペプチドで刺激しなかった。
・１８〜２０時間後Ｅｌｉｓｐｏｔプレートを現像した。
・検出抗体は、抗マウスＩＦＮ−ｇ  ｍＡｂ  Ｒ４−６Ａ２−ビオチン（Ｍｅｂｔｅｃｈカタログ番号３３２１−６−１０００）。アビジン−酵素複合体（ＡＰ−Ａｖｉｄｉｎ；  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び酵素基質、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を可視化のために使用。
・ペプチド刺激されたウェルについてのスポット数から、ペプチド刺激されていない対応するウェル（バックグラウンド）を常に差し引いた。
・負の値は０とした。
【０１２５】
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【０１２６】
文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019527676.tif 000043
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