(57)【要約】  本発明は、ＰＣＳＫ９阻害剤、ＰＣＳＫ９阻害剤を含む組成物、及びＰＣＳＫ９阻害剤を同定及び使用する方法を提供する。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のエピトープに結合するＰＣＳＫ９阻害剤であって、エピトープが配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも１つの残基を含む、ＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項２】
エピトープが、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも２つの残基を含む、請求項１に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項３】
エピトープが、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも３つの残基を含む、請求項１に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項４】
エピトープが、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも４つの残基を含む、請求項１に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項５】
エピトープが、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも５つの残基を含む、請求項１に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項６】
エピトープが、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも６つの残基を含む、請求項１に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項７】
エピトープが、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１１の残基を含む、請求項１に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項８】
式Ｉ：
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｘ４−Ｘ５−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｒ２
式Ｉ
の化合物
［式中、
Ｒ１はＣ１−Ｃ４アシルであるか、又はＲ１は存在せず；
Ｘ１は、ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ及びＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶから選択されるアミノ酸配列であるか、又はＸ１は存在せず；
Ｘ２は、グリシン及びセリンから選択される１から４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はＸ２は、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸及び１１−アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基であるか、又はＸ２は存在せず；
Ｘ３は、アラニン、２−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、３−ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン及びトリプトファンから選択される１から４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり；
Ｘ４は、アラニン、２，３−ジアミノプロピオン酸、グルタミン、グリシン、リジン及びバリンから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｘ５は、アルギニン及びホモアルギニンから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｘ６は、アラニン、アルギニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン及びトリプトファンから選択される１から５個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はＸ６は存在せず；かつ
Ｒ２はアミノであるか、又はＲ２は存在しない］
及び薬学的に許容されるその塩から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項９】
Ｒ１がＣ１−Ｃ４アシルである、請求項８に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項１０】
Ｒ１がアセチルである、請求項９に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項１１】
Ｒ１がバレリルである、請求項９に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項１２】
Ｒ１が存在しない、請求項８に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項１３】
Ｘ１がＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ及びＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶから選択されるアミノ酸配列である、請求項８から１２のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項１４】
Ｘ１がアミノ酸配列ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶである、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項１５】
Ｘ１がアミノ酸配列ＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶである、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項１６】
Ｘ１が存在しない、請求項８から１２のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項１７】
Ｘ２が、グリシン及びセリンから選択される１から４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である、請求項８から１６のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項１８】
Ｘ２が、ＳＧ、ＧＳＧ、ＧＧＳＧ、ＧＳＧＧ及びＳＧＳＧから選択されるアミノ酸配列である、請求項１７に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項１９】
Ｘ２が、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸及び１１−アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基である、請求項８から１６のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項２０】
Ｘ２がアミノ酸残基６−アミノヘキサン酸である、請求項１９に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項２１】
Ｘ２がアミノ酸残基７−アミノヘプタン酸である、請求項１９に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項２２】
Ｘ２がアミノ酸残基８−アミノオクタン酸である、請求項１９に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項２３】
Ｘ２が存在しない、請求項８から１６のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項２４】
Ｘ３が、Ｐ、ＭＰ、ＬＭＰ、ＡＬＭＰ、ＣＡＬＰ、ＣＦＩＰ、ＣＦＬＰ、ＣＲＡＰ、ＣＲＬ（Ｈｙｐ）、ＣＲＬＰ、ＤＡＭＰ、ＤＬＡＰ及びＤＬＭＰから選択されるアミノ酸配列である、請求項８から２３のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項２５】
Ｘ３が存在しない、請求項８から２３のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項２６】
Ｘ４がアミノ酸残基アラニンである、請求項８から２５のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項２７】
Ｘ４がアミノ酸残基２，３−ジアミノプロピオン酸である、請求項８から２５のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項２８】
Ｘ４がアミノ酸残基グルタミンである、請求項８から２５のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項２９】
Ｘ４がアミノ酸残基グリシンである、請求項８から２５のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項３０】
Ｘ４がアミノ酸残基リジンである、請求項８から２５のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項３１】
Ｘ４がアミノ酸残基バリンである、請求項８から２５のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項３２】
Ｘ５がアミノ酸残基アルギニンである、請求項８から３１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項３３】
Ｘ５がアミノ酸残基ホモアルギニンである、請求項８から３１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項３４】
Ｘ６が、Ｌ、Ｓ、ＬＬ、ＬＡＲ、ＬＧＣ、ＬＬＡ、ＬＬＣ、ＬＬＲ、ＬＰＣ、ＬＴＲ、ＳＱＧＣ、ＳＱＣＥＹ、ＳＱＣＷＦ及びＳＱＧＣＷから選択されるアミノ酸配列である、請求項８から３３のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項３５】
Ｘ６が存在しない、請求項８から３３のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項３６】
Ｒ２がアミノである、請求項８から３５のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項３７】
Ｒ２が存在しない、請求項８から３５のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項３８】
以下の化合物：
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬＧＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＧＳＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｏｃ）−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｐ）−ＫＬＷＮＬＧＲＶ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｘ）−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｐ）−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＳＧＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
ＳＧ−ＣＦＩＰＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２；
ＳＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
ＳＧ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ；
Ａｃ−ＳＧ−ＣＦＩＰＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＳＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＦＩＰＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＳＧ−ＣＲＬ（Ｈｙｐ）ＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧＧ−ＣＦＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣＷ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣＷ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＡＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＡＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＡＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＡＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＡ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＡＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＡＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＡＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＭＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＥＹ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＥＹ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＷＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＥＹ−ＮＨ２；
ＧＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＫＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＡＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＡＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＡＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＡＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＡＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＡＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＧＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬ（Ａｃｈ）ＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＣＬＷＮＬＡＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＦＣＬＷＮＬＡＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；
ＧＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；
ＷＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ；
Ａｃ−ＷＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｘ）−ＡＷＮＬＫＲＩＧＳ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｘ）−ＡＷＮＬＫＲＩＧ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＦＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＥＹ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＦＣＬＷＮＬＫＲＩＧＡＱＣＷＦ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬ（Ｄｐｒ）ＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬｐＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧｌＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬｑＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬｐＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲｌＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣｒＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ｃＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＴＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＴＴＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＴＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱ（ホモＲ）ＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＴＲ−ＮＨ２；及び
Ａｃ−ＰＷＮＬＶＲＩＧＬ−ＮＨ２
並びに薬学的に許容されるその塩から選択される、請求項８から３７のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項３９】
式ＩＩ：
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ７−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｘ４−Ｘ５−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｒ２
式ＩＩ
の化合物
［式中、
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４アシル、アリールカルボニル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルカルボニル、及びヘテロアリールカルボニルから選択され；各々は、それぞれ独立に以下から選択される１又は２の置換基：
Ｃ１−Ｃ４アルキル；
アミノ；
Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ハロ、及びヒドロキシから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいアリール；
アリール−Ｃ１−Ｃ４アルキル；
Ｃ１−Ｃ４アルキル及びＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルから選択される１の置換基で置換されていてもよいアリールカルボニル；
Ｃ１−Ｃ４アシル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ハロ、及びヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ４アルキルから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ；
アリール−Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される１の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ；
Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル；
Ｃ１−Ｃ４アルキル及びアミノから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール；
Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキルスルホニル、カルボキサミド、ヘテロアリール−Ｃ１−Ｃ４アルキル及びオキソから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル；
ヘテロシクリルカルボニル；並びに
ウレイド
で置換されていてもよく；
又はＲ１は存在せず；
Ｘ１は、ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ、ＴＶＦＴＳ（Ｗ６ｆｌ）ＥＥＹＬＤＷＶ及びＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶから選択されるアミノ酸配列であるか、又はＸ１は存在せず；
Ｘ２は、グリシン及びセリンから選択される１から４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はＸ２は、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸及び１１−アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基であるか、又はＸ２は存在せず；
Ｘ３は、アラニン、２−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、３−ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン及びチロシンから選択される１から６個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり；
Ｘ４は、アラニン、２，３−ジアミノプロピオン酸、グルタミン、グリシン、リジン及びバリンから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｘ５は、アルギニン及びホモアルギニンから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｘ６は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン及びトリプトファンから選択される１から５個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はＸ６は存在せず；
Ｘ７は、トリプトファン、６−フルオロトリプトファン、６−クロロトリプトファン、６−ブロモトリプトファン及び６−メチルトリプトファンから選択されるアミノ酸残基であり；かつ
Ｒ２はアミノであるか、又はＲ２は存在しない］
及び薬学的に許容されるその塩から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項４０】
Ｒ１がＣ１−Ｃ４アシルである、請求項３９に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項４１】
Ｒ１がアセチルである、請求項４０に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項４２】
Ｒ１がバレリルである、請求項４０に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項４３】
Ｒ１が存在しない、請求項３９に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項４４】
Ｒ１が、Ｃ１−Ｃ４アシル、アリールカルボニル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルカルボニル、及びヘテロアリールカルボニルから選択され、各々は、それぞれ独立に以下から選択される１又は２の置換基：
Ｃ１−Ｃ４アルキル；
アミノ；
メトキシ、アミノ、フルオロ、クロロ及びヒドロキシから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいアリール；
アリール−Ｃ１−Ｃ４アルキル；
メチル及びメチルスルホニルから選択される１の置換基で置換されていてもよいアリールカルボニル；
アセチル、メトキシ、メチル、エチル、ブロモ及びヒドロキシメチルから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ；
フェニルメチルから選択される１の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ；
Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル；
メチル及びアミノから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール；
メチル、メチルスルホニル、カルボキサミド、ピリジニルメチル及びオキソから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル；
ヘテロシクリルカルボニル；並びに
ウレイド
で置換されていてもよい、請求項３９に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項４５】
Ｒ１が、Ｃ１−Ｃ４アシル、アリールカルボニル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルカルボニル、及びヘテロアリールカルボニルから選択され、各々は、それぞれ独立に以下から選択される１又は２の置換基：
メチル及びｔ−ブチルから選択されるＣ１−Ｃ４アルキル；
アミノ；
メトキシ、アミノ、フルオロ、クロロ及びヒドロキシから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいフェニル；
フェニルメチル；
メチル及びメチルスルホニルから選択される１の置換基で置換されていてもよいベンゾイル；
アセチル、メトキシ、メチル、エチル、ブロモ及びヒドロキシメチルから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいフェノキシ；
フェニルメチルから選択される１の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ；
シクロヘキシル；
イミダゾリル、インドリル、ピラゾリル、ピリジニル及びトリアゾリルから選択されるヘテロアリールであって、各々が、それぞれ独立にメチル及びアミノから選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール；
モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピリミジニル、チオモルホリニルから選択されるヘテロシクリルであって、各々が、それぞれ独立にメチル、メチルスルホニル、カルボキサミド、ピリジニルメチル及びオキソから選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル；
モルホリニルカルボニル；並びに
ウレイド
で置換されていてもよい、請求項３９に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項４６】
Ｒ１が、アセチル、ｎ−プロピオニル、ｎ−ブタノイル、イソバレリル、バレリル、ベンゾイル、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル、インドリルカルボニル、ピラゾリルカルボニル及びピリジニルカルボニルから選択され、各々が、それぞれ独立に以下から選択される１又は２の置換基：
メチル及びｔ−ブチルから選択されるＣ１−Ｃ４アルキル；
アミノ；
メトキシ、アミノ、フルオロ、クロロ及びヒドロキシから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいフェニル；
フェニルメチル；
メチル及びメチルスルホニルから選択される１の置換基で置換されていてもよいベンゾイル；
アセチル、メトキシ、メチル、エチル、ブロモ及びヒドロキシメチルから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいフェノキシ；
フェニルメチルから選択される１の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ；
シクロヘキシル；
イミダゾリル、インドリル、ピラゾリル、ピリジニル及びトリアゾリルから選択されるヘテロアリールであって、各々が、それぞれ独立にメチル及びアミノから選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール；
モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピリミジニル、チオモルホリニルから選択されるヘテロシクリルであって、各々が、それぞれ独立にメチル、メチルスルホニル、カルボキサミド、ピリジニルメチル及びオキソから選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル；
モルホリニルカルボニル；並びに
ウレイド
で置換されていてもよい、請求項３９に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項４７】
Ｒ１が、アセチル、ｎ−ブタノイル、３−（１，１−ジオキシドチオモルホリノ）プロパノイル、２−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）シクロプロパン−１−カルボニル、３−（２−オキソピロリジン−１−イル）プロパノイル、１−（１−メチルピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニル、２−（１−（ピリジン−２−イルメチル）ピペリジン−４−イル）アセチル、３−（４−カルバモイルピペラジン−１−イル）プロパノイル、３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパノイル、２−（１−（メチルスルホニル）ピペリジン−４−イル）アセチル、６−モルホリノニコチノイル、３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）プロパノイル、３−モルホリノプロパノイル、３−（ピリジン−３−イル）プロパノイル、２−（１，１−ジオキシドテトラヒドロチオフェン−３−イル）アセチル、３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロパノイル、３−ウレイドプロパノイル、３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）プロパノイル、２−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）アセチル、３−ベンジルシクロブタン−１−カルボニル、［１，１’−ビフェニル］−４−カルボニル、５−フェニルペンタノイル、４−フェニルシクロヘキサン−１−カルボニル、５，５−ジメチルヘキサノイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイル、５−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル、３−シクロヘキシルプロパノイル、３−（４−アミノフェニル）プロパノイル、４−モルホリノブタノイル、４−（４−（メチルスルホニル）フェニル）−４−オキソブタノイル、３−（３−アミノフェニル）プロパノイル、４−オキソ−４−（ｐ−トリル）ブタノイル、３−（４−メトキシフェニル）プロパノイル、４−モルホリノ−４−オキソブタノイル、３−（３−ヒドロキシフェニル）プロパノイル、４−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）ブタノイル、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノイル、３−（６−アミノピリジン−３−イル）プロパノイル、４−（４−ブロモフェノキシ）ブタノイル、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタノイル、３−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボニル、３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパノイル、４−（１Ｈ−インドール−３−イル）ブタノイル、４−（４−フルオロフェニル）ブタノイル、３−（４−フルオロフェニル）プロパノイル、３−（４−クロロフェニル）プロパノイル、３−（３−メトキシフェニル）プロパノイル、３−（４−メトキシフェノキシ）プロパノイル、４−（４−（ヒドロキシメチル）−３−メトキシフェノキシ）ブタノイル、３−（４−アセチルフェノキシ）プロパノイル、４−（ｐ−トリルオキシ）ブタノイル、４−フェノキシブタノイル、４−（４−エチルフェノキシ）ブタノイル、３−（ｐ−トリルオキシ）プロパノイル、４−フェニルブタノイル、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパノイル、４−（４−ヒドロキシフェニル）ブタノイル、２−（ピリジン−３−イル）シクロプロパン−１−カルボニル、１Ｈ−インドール−６−カルボニル、２−アミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノイル、及び３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパノイルから選択される、請求項３９に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項４８】
Ｘ１がＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ、ＴＶＦＴＳ（Ｗ６ｆｌ）ＥＥＹＬＤＷＶ及びＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶから選択されるアミノ酸配列である、請求項３９から４７のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項４９】
Ｘ１がアミノ酸配列ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶである、請求項４８に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項５０】
Ｘ１がアミノ酸配列ＴＶＦＴＳ（Ｗ６ｆｌ）ＥＥＹＬＤＷＶである、請求項４８に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項５１】
Ｘ１がアミノ酸配列ＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶである、請求項４８に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項５２】
Ｘ１が存在しない、請求項３９から４７のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項５３】
Ｘ２が、グリシン及びセリンから選択される１から４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である、請求項３９から５２のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項５４】
Ｘ２が、Ｇ、ＧＧ、ＳＧ、ＧＳＧ、ＧＧＳＧ、ＧＳＧＧ及びＳＧＳＧから選択されるアミノ酸配列である、請求項５３に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項５５】
Ｘ２が、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸及び１１−アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基である、請求項３９から５４のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項５６】
Ｘ２がアミノ酸残基６−アミノヘキサン酸である、請求項５５に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項５７】
Ｘ２がアミノ酸残基７−アミノヘプタン酸である、請求項５５に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項５８】
Ｘ２がアミノ酸残基８−アミノオクタン酸である、請求項５５に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項５９】
Ｘ２が存在しない、請求項３９から５２のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項６０】
Ｘ３が、Ｐ、ＭＰ、ＬＭＰ、ＡＬＭＰ、ＣＡＬＰ、ＣＦＩ（Ｈｙｐ）、ＣＦＩＰ、ＣＦＬＰ、ＣＲＡＰ、ＣＲＬ（Ｈｙｐ）、ＣＲＬＰ、ＤＡＭＰ、ＤＬＡＰ、ＤＬＭＰ、ＤＳＹＰＧ、ＥＳＦＰＧ、ＥＳＹＰＧ、ＭＤＳＦＰＧ、ＭＥＳＦＰＧ及びＳＦＡＦＰＧから選択されるアミノ酸配列である、請求項３９から５９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項６１】
Ｘ３が存在しない、請求項３９から５９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項６２】
Ｘ４がアミノ酸残基アラニンである、請求項３９から６１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項６３】
Ｘ４がアミノ酸残基２，３−ジアミノプロピオン酸である、請求項３９から６１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項６４】
Ｘ４がアミノ酸残基グルタミンである、請求項３９から６１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項６５】
Ｘ４がアミノ酸残基グリシンである、請求項３９から６１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項６６】
Ｘ４がアミノ酸残基リジンである、請求項３９から６１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項６７】
Ｘ４がアミノ酸残基バリンである、請求項３９から６１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項６８】
Ｘ５がアミノ酸残基アルギニンである、請求項３９から６７のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項６９】
Ｘ５がアミノ酸残基ホモアルギニンである、請求項３９から６７のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項７０】
Ｘ６が、Ｌ、Ｓ、ＬＬ、ＬＡＲ、ＬＤＲ、ＬＥＲ、ＬＧＣ、ＬＧＲ、ＬＬＡ、ＬＬＣ、ＬＬＱ、ＬＬＲ、ＬＰＣ、ＬＰＲ、ＬＳＲ、ＬＴＲ、ＳＱＧＣ、ＳＱＣＥＹ、ＳＱＣＷＦ及びＳＱＧＣＷから選択されるアミノ酸配列である、請求項３９から６９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項７１】
Ｘ６が存在しない、請求項３９から６９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項７２】
Ｘ７がトリプトファンである、請求項３９から７１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項７３】
Ｘ７が６−フルオロトリプトファンである、請求項３９から７１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項７４】
Ｘ７が６−クロロトリプトファンである、請求項３９から７１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項７５】
Ｘ７が６−ブロモトリプトファンである、請求項３９から７１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項７６】
Ｘ７が６−メチルトリプトファンである、請求項３９から７１のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項７７】
Ｒ２がアミノである、請求項３９から７６のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項７８】
Ｒ２が存在しない、請求項３９から７６のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項７９】
以下の化合物：
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬＧＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＧＳＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｏｃ）−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｐ）−ＫＬＷＮＬＧＲＶ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｘ）−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｐ）−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＳＧＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
ＳＧ−ＣＦＩＰＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２；
ＳＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
ＳＧ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ；
Ａｃ−ＳＧ−ＣＦＩＰＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＳＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＦＩＰＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＳＧ−ＣＲＬ（Ｈｙｐ）ＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧＧ−ＣＦＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣＷ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣＷ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＡＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＡＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＡＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＡＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＡ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＡＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＡＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＡＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＭＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＥＹ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＥＹ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＷＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＥＹ−ＮＨ２；
ＧＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＫＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＡＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＡＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＡＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＡＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＡＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＡＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＧＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬ（Ａｃｈ）ＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＣＬＷＮＬＡＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＦＣＬＷＮＬＡＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；
ＧＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；
ＷＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ；
Ａｃ−ＷＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｘ）−ＡＷＮＬＫＲＩＧＳ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｘ）−ＡＷＮＬＫＲＩＧ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＦＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＥＹ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＦＣＬＷＮＬＫＲＩＧＡＱＣＷＦ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬ（Ｄｐｒ）ＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬｐＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧｌＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬｑＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬｐＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲｌＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣｒＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
Ａｃ−ｃＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＴＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＴＴＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＴＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱ（ホモＲ）ＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＴＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＰＷＮＬＶＲＩＧＬ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＳＧ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＰｒＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−Ｇ−ＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＧＧ−ＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
2019523235.tif 000050
2019523235.tif 000051
2019523235.tif 000052
2019523235.tif 000053
2019523235.tif 000054
2019523235.tif 000055
2019523235.tif 000056
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ；
Ａｃ−ＭＤＳＦＰＧＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＳＦＡＦＰＧＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＳＹＰＧＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＥＳＹＰＧＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＥＳＦＰＧＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＫＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＫＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＰＲ−ＮＨ２；
2019523235.tif 000057
2019523235.tif 000058
2019523235.tif 000059
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−（Ｗ６ｆｌ）ＮＬＶＲＩＧＬＴＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−（Ｗ６ｍｅ）ＮＬＶＲＩＧＬＴＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＴＲ；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＥＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＤＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＧＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＡＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＳＲ−ＮＨ２；
2019523235.tif 000060
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−（Ｗ６ｃｌ）ＮＬＶＲＩＧＬＴＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−（Ｗ６ｂｒ）ＮＬＶＲＩＧＬＴＲ−ＮＨ２；
2019523235.tif 000061
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
2019523235.tif 000062
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＬＲ；
2019523235.tif 000063
2019523235.tif 000064
2019523235.tif 000065
2019523235.tif 000066
2019523235.tif 000067
2019523235.tif 000068
2019523235.tif 000069
Ａｃ−ＥＳＦＰＧＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＳＦＡＦＰＧＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＭＥＳＦＰＧＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＤＳＹＰＧＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＥＳＹＰＧＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＳＦＡＦＰＧＷＮＬＫ（ホモＲ）ＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
Ａｃ−ＭＥＳＦＰＧＷＮＬＫ（ホモＲ）ＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＴＲ−ＮＨ２；
ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＴＲ；
ＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧ−ＮＨ２；
ＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＬＱ−ＮＨ２；
2019523235.tif 000070
Ａｃ−ＴＶＦＴＳ（Ｗ６ｆｌ）ＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；及び
Ａｃ−ＳＧ−ＣＦＩ（Ｈｙｐ）ＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２
並びに薬学的に許容されるその塩から選択される、請求項３９から７８のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤。
【請求項８０】
ＰＣＳＫ９に結合する請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む、阻害されたＰＣＳＫ９。
【請求項８１】
請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項８２】
請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の有効量とＰＣＳＫ９を接触させることを含む、ＰＣＳＫ９の活性を調節するための方法。
【請求項８３】
請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害するための方法。
【請求項８４】
請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるＬＤＬＲの利用能を増大させるための方法。
【請求項８５】
請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルを低下させるための方法。
【請求項８６】
請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む、必要とする個体における血清ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させるための方法。
【請求項８７】
請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるコレステロール関連障害の治療のための方法。
【請求項８８】
請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃの異常なレベルに関連する障害の治療のための方法。
【請求項８９】
請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃのレベルの上昇に関連する状態の治療のための方法。
【請求項９０】
請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む、必要とする個体における脂質異常症の治療のための方法。
【請求項９１】
請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物の治療的有効量を個体に投与することを含む、必要とする個体における高コレステロール血症の治療ための方法。
【請求項９２】
療法によるヒト又は動物の体の治療の方法における使用のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物。
【請求項９３】
ＰＣＳＫ９の活性を調節する方法における使用のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物。
【請求項９４】
ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する方法における使用のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物。
【請求項９５】
ＬＤＬＲの利用能を増大させる方法における使用のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物。
【請求項９６】
ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる方法における使用のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物。
【請求項９７】
血清ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる方法における使用のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物。
【請求項９８】
コレステロール関連の障害の治療方法における使用のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物。
【請求項９９】
ＬＤＬ−Ｃの異常なレベルに関連する障害の治療方法における使用のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物。
【請求項１００】
ＬＤＬ−Ｃレベルの上昇に関連する状態の治療方法における使用のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物。
【請求項１０１】
脂質異常症の治療方法における使用のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物。
【請求項１０２】
高コレステロール血症の治療方法における使用のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物。
【請求項１０３】
ＰＣＳＫ９の活性の調節のための医薬の製造のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用。
【請求項１０４】
ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害するための医薬の製造のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用。
【請求項１０５】
ＬＤＬＲの利用能を増大させるための医薬の製造のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用。
【請求項１０６】
ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させるための医薬の製造のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用。
【請求項１０７】
血清ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させるための医薬の製造のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用。
【請求項１０８】
コレステロール関連障害の治療のための医薬の製造のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用。
【請求項１０９】
ＬＤＬ−Ｃの異常なレベルに関連する障害の治療のための医薬の製造のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用。
【請求項１１０】
ＬＤＬ−Ｃレベルの上昇に関連する状態の治療のための医薬の製造のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用。
【請求項１１１】
脂質異常症の治療のための医薬の製造のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用。
【請求項１１２】
高コレステロール血症の治療のための医薬の製造のための、請求項１から７９のいずれか一項に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用。
【請求項１１３】
候補化合物を配列番号１のエピトープに結合するＰＣＳＫ９阻害剤であると同定するための方法であって、エピトープが配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも１つの残基を含み、方法が以下の工程：
ａ．  ＰＣＳＫ９を候補化合物と接触させること：
ｂ．  候補化合物のＰＣＳＫ９に対する結合アフィニティーを測定すること；
ｃ．  ＰＣＳＫ９Δヘリックスを候補化合物と接触させること；
ｄ．  候補化合物のＰＣＳＫ９Δヘリックスに対する結合アフィニティーを測定すること；及び
ｅ．  候補化合物のＰＣＳＫ９Δヘリックスに対する結合アフィニティーが、候補化合物のＰＣＳＫ９に対する結合アフィニティーよりも強いことを決定すること
を含み、前記決定が、候補化合物が配列番号１のエピトープに結合するＰＣＳＫ９阻害剤であることを示す、同定するための方法。
【請求項１１４】
エピトープが、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも２つの残基を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
エピトープが、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも３つの残基を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
エピトープが、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも４つの残基を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
エピトープが、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも５つの残基を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１８】
エピトープが、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも６つの残基を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１９】
エピトープが、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１１の残基を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２０】
ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスがセンサーチップ上に提供される、請求項１１３から１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
結合アフィニティーが表面プラズモン共鳴を用いて決定される、請求項１１３から１２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類における治療及び／又は予防に有用な有機化合物、特に、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）を阻害する化合物とそれらを同定するためのアッセイ、ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９阻害剤を含む複合体、並びに心血管疾患の治療に有用な、ＰＣＳＫ９を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム動脈硬化性心血管疾患（ＣＶＤ）は、世界的に死亡原因の主要な原因である（Mendis et al. (2011) World Health Organization, Geneva）。アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の代謝及び炎症変化の結果として起こり、マクロファージ媒介性のアテローム生成促進的な低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の内膜沈着を促進し、プラーク形成に寄与し、血流を重要な器官に限定し、アテローム血栓症及びアテローム塞栓症の後遺症のリスクを増加させる。脂質異常症は、ＣＶＤの一次及び二次予防の双方において標的となる重要なリスク因子となっている。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼを阻害するスタチンの出現により、ＬＤＬ−Ｃの持続的な削減が可能になった。大規模臨床試験では、ＬＤＬ−Ｃが４０ｍｇ／ｄＬ（１ｍｍｏｌ／Ｌ）減少すると、有害な心臓血管事象が２２％減少することが実証されている（Baigent et al., Lancet, 2010, 376(9753):1670-1681; Mihaylova et al., Lancet, 2012 380(9841):581-590）。スタチンは、その臨床効果及びコスト効率の圧倒的エビデンスによって、脂質異常症の第一選択治療として確立されるに至っている（Koo, Diabetes Metab J, 2014, 38(1):32-34）。しかし、最適なスタチン療法であっても、予防できるのは再発性心血管事象の半分にも満たない。実際、特定の患者においては、脂質低下療法．との組み合わせでさえ、脂質異常症の満足のいく制御はできていない。
【０００３】
追加の脂質管理戦略の必要性に迫られ、最近注目されているのは、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）阻害剤の新しいクラスである。これらは特に、例えば副作用又は薬物−薬物相互作用のためにスタチンを摂取することができない患者にとってかなり有望であることが実証されている（Corrao et al., Clin Ther, 2010 32(2):300-310）。ＰＣＳＫ９ベースの療法の発見は２００３年に開始され、ＦＨを引き起こすＬＤＬ受容体遺伝子（ＬＤＬＲ、ＦＨ欠陥の９５％を占める）、又はＬＤＬＲに結合するタンパク質をコードするアポリポタンパク質Ｂ遺伝子（ＡｐｏＢ、ＦＨ欠陥の４％を占める）の変異を同時に認めない、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）の特徴を示したフランス家系についての鋭い臨床観察がなされた（Abifadel et al., Nat Genet, 2003, 34(2):154-156; Graham et al., Atherosclerosis, 2005, 182(2):331-340）。これらの知見は、元々神経アポトーシス調節転換酵素１（ＮＡＲＣ−１）と称され、後にプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型と改名された、セリンプロテアーゼ酵素の活性を増加させる２つの新規のミスセンス変異の同定をもたらした（Seidah et al., Proc Natl Acad Sci, 2003, 100(3):928-933）。この発見は、脂質管理における新しい治療選択肢をもたらしている（Lambert et al., J Lipid Res, 2010, 53(12):2515-2524; Vogel, J Am Coll Cardiol, 2012, 59(25):2354-2355）。
【０００４】
最近、循環ＰＣＳＫ９に結合するモノクローナル抗体が、ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させて高コレステロール血症を制御するための治療的使用に認可された。アリロクマブ（プラルエント（登録商標）、サノフィ／リジェネロン）は、米国ではＦＤＡよって２０１５年６月に、欧州ではＥＭＡによって２０１５年９月に承認され（Robinson et al., N. Engl. J. Med., 372 (16) (2015 April 16), pp. 1489-1499）、一方、エボロクマブ（レパーサ（登録商標）、アムジェン）は欧州では２０１５年７月に、米国では２０１５年８月に承認された（M.S. Sabatine et al., N. Engl. J. Med., 372 (16) (2015 April 16), pp. 1500-1509）。もう一つの抗ＰＣＳＫ９抗体であるＹＷ５０８．２０．３３ｂ  （Ａｂ３３）は、米国特許第９２６６９６１に開示されている。開発中のその他のモノクローナル抗体としては、ボコシズマブ（bococizumab）（ＲＮ３１６、ファイザー／リナット）、ＬＧＴ−２０９（ノバルティス）及び１Ｄ０５−ＩｇＧ２（メルク）が含まれる。臨床及び前臨床評価中の他のクラスのＰＣＳＫ９阻害剤としては、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、例えばＡＬＮ−ＰＣＳ０２（Ａｌｎｙｌａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ｇｒｏｕｐ）；モノボディ、例えばＢＭＳ−９６２４７６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ／Ａｄｎｅｘｕｓ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｉｄｅｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；模倣ペプチド、例えばＬＤＬ−ＥＧＦ−ＡＢペプチド断片（シェリング・プラウ）；ワクチン、例えばＡＴＨ−０４及びＡＴＨ−０６（Ａｆｆｉｒｉｓ）が含まれます。ＰＣＳＫ９の小分子阻害剤、例えば以下のＰＣＴ特許公開番号：国際公開第２０１６０４０３０５号、国際公開第２０１６０２９０３７号、国際公開第２０１４１７０７８６号、国際公開第２０１４１５０３９５号、国際公開第２０１４１５０３２６号、国際公開第２０１４１３９００８号、国際公開第２０１４１２７３１６号、国際公開第２０１３１７７５３６号、及び国際公開第２０１１０５１９６１号に開示されているものも知られている。ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡのＰＣＳＫ９タンパク質への翻訳を選択的に阻害する化合物は、国際公開第２０１４１７０７８６号に開示されている。
【０００５】
種々の疾患及び障害においてＰＣＳＫ９の活性及びＰＣＳＫ９が果たす対応する役割を調節する代替療法へのニーズが存在する。本明細書に記載の化合物、組成物及び方法は、このような及びその他のニーズを満たすのに役立つ。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、配列番号１のエピトープに結合するＰＣＳＫ９阻害剤に関し、エピトープは配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも１つの残基を含む。
【０００７】
一態様において、本発明は、式Ｉ：
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｘ４−Ｘ５−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｒ２
式Ｉ
の化合物及び薬学的に許容されるその塩から選択されるＰＣＳＫ９阻害剤に関し、
上式中、
Ｒ１はＣ１−Ｃ４アシルであるか、又はＲ１は存在せず；
Ｘ１は、ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ及びＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶから選択されるアミノ酸配列であるか、又はＸ１は存在せず；
Ｘ２は、グリシン及びセリンから選択される１から４個のアミノ酸残基であるか、又はＸ２は、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸及び１１−アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基であるか、又はＸ２は存在せず；
Ｘ３は、アラニン、２−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、３−ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン及びトリプトファンから選択される１から４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり；
Ｘ４は、アラニン、２，３−ジアミノプロピオン酸、グルタミン、グリシン、リジン及びバリンから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｘ５は、アルギニン及びホモアルギニンから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｘ６は、アラニン、アルギニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン及びトリプトファンから選択される１から５個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はＸ６は存在せず；；かつ
Ｒ２はアミノであるか、又はＲ２は存在しない。
【０００８】
一態様において本発明は、ＰＣＳＫ９に結合した、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む阻害されたＰＣＳＫ９に関する。
一態様において、本発明は、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。
一態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を有効量の本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤と接触させることを含む、ＰＣＳＫ９の活性を調節するための方法に関する。
一態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害するための方法に関する。
一態様において、本発明は、療法によるヒト又は動物の体の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物に関する。
一態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９の活性を調節する方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物に関する。
一態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物に関する。
一態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９の活性を調節するための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用に関する。
一態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害するための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用に関する。
一態様において、本発明は、候補化合物を配列番号１のエピトープに結合するＰＣＳＫ９阻害剤であると同定するための方法に関し、該エピトープは、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも１つの残基を含み；該方法は、以下の工程：ａ）ＰＣＳＫ９を候補化合物と接触させる工程；ｂ）ＰＣＳＫ９Δヘリックスを候補化合物と接触させる工程；ｃ）候補化合物のＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスに対する結合アフィニティーを測定する工程；並びにｄ）候補化合物のＰＣＳＫ９Δヘリックスに対する結合アフィニティーが候補化合物のＰＣＳＫ９に対する結合アフィニティーよりも強いことを決定する工程を含み；前記決定は候補化合物が配列番号１のエピトープを結合するＰＣＳＫ９阻害剤であることの示唆である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｆａｂ３３：ＰＣＳＫ９複合体の結晶構造を示す。
【図２】Ｆａｂ３３：ＰＣＳＫ９複合体において、Ｆａｂ３３  ＣＤＲ−Ｈ２ループがＰＣＳＫ９のＮ末端溝に突き出て、ＰＣＳＫ９のＰ’ヘリックスがＮ末端溝から抜け出たことを示している。
【図３】Ｎ末端溝がＰＣＳＫ９のＰ’ヘリックスを有する、ＰＣＳＫ９の結晶構造（蛋白質構造データバンク  ＩＤ：２ＱＴＷ）を示す。
【図４】セルピンアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）と、程度は低いが、クニッツドメイン阻害剤であるアプロチニン（ＡＰ）が、Ｆａｂ３３：ＰＣＳＫ９複合体（ＰＣＳＫ９  １３．２ｍｇ／ｍＬ、Ｆａｂ３３  １９．８ｍｇ／ｍＬ）のＰ’ヘリックスのタンパク質分解切断を防ぐことができたことを示す。セルピンアルファ１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）は、切断を阻害しなかった。切断は、ＰＣＳＫ９  Ｎ末端ペプチド（１５３ＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡ１６８）に対して育てたポリクローナルウサギ抗体を使用するイムノブロッティングにより検出した。
【図５】図４のイムノブロットに対応する、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。左の２レーンは、ＤＭＳＯ非存在及び存在下でのコントロールである。
【図６】Ｆａｂ３３：ＰＣＳＫ９複合体と共にインキュベートした場合、セリンプロテアーゼであるＦＸＩａ及びヘプシンがＰ’ヘリックスを切断することを示す。試験したプロテアーゼには、ヘプシン、α−トロンビン、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ及び活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）が含まれる。ＦＸＩａ及びヘプシンのみが、Ｐ’ヘリックスにおいてＰＣＳＫ９を切断することができた。それらはまた、〜５５ｋＤａバンドの出現によって示されるように、プロテアーゼ−感受性残基Ｒ２１５及びＲ２１８を含む「フリン切断ループ」においても切断した。遮断抗体３Ｄ５（Lipari et al. J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91）の添加によりこの後者の切断が防止された。
【図７】ＰＣＳＫ９変異体ＰＣＳＫ９−Ｒ２１５Ａ：Ｒ２１８Ａ（Ｋ９−ＡＡ）及びＰＣＳＫ９−Ｒ１６７Ａ：Ｒ２１５Ａ：Ｒ２１８Ａ（Ｋ９−ＡＡＡ）のＬＤＬＲへの結合アフィニティーを決定するための生物層干渉法実験を示す。センサーグラムは、固定化したＬＤＬＲ外部ドメインに対する被検質（ＰＣＳＫ９変異体）の会合及び解離相を示す。ＰＣＳＫ９−ＡＡ及びＰＣＳＫ９−ＡＡＡについて決定されたＫｄ値は、それぞれ２６０ｎＭ、２１４ｎＭであった。
【図８】ＰＣＳＫ９−Ｒ１６７Ａ：Ｒ２１５Ａ：Ｒ２１８Ａ（Ｋ９−ＡＡＡ）のＦＸＩａによる経時的切断を示す。Ｋ９−ＡＡＡは、実験期間中にゆっくりと切断され、４８時間で完全切断が達成された。各時点でのＮ末端配列決定は、Ｒ１６０−Ｉ１６１アミド結合での切断を確認した。
【図９】Ｆａｂ３３との複合体におけるＫ９−ＡＡＡのＦＸＩａによる経時的切断を示す。ａｂ３３の存在が切断反応を加速した。
【図１０】ＥＧＦＡ−Ｆｃとの複合体におけるＫ９−ＡＡＡのＦＸＩａによる経時的断を示す。ＥＧＦＡ−ＦｃによるＮ末端溝におけるＰ’ヘリックスの安定化がＰｅｐ２−８を切断を防いだ。
【図１１】Ｐｅｐ２−８との複合体におけるＫ９−ＡＡＡのＦＸＩａによる経時的切断を示す。Ｐｅｐ２−８によるＮ末端溝におけるＰ’ヘリックスの安定化が切断を防いだ。コントロールペプチド（Ｐｅｐ２−８−ｃｔｒｌ）は切断を防がなかった。
【図１２】「イン」と「アウト」の立体構造の状態間を遷移することができる、本質的に不安定なＰ’ヘリックスの「平衡モデル」を示す。「アウト」状態では、Ｐ’ヘリックスは、例えばＦＸＩａによるタンパク質分解切断を受けやすくなる非へリックス構造をとる。このモデルは、Ｎ末端溝が、例えばペプチド又は有機分子などの化合物にとってアクセス可能でありうることを意味する。溝に結合すると、このような化合物は、Ｐ’ヘリックスを「放出された（ｅｊｅｃｔｅｄ）」立体構造中に維持することができる。Ｎ末端溝はＬＤＬＲ結合部位の近位であるため、溝結合化合物は、化合物とＬＤＬＲ−ＥＧＦＡドメインとの間の立体的衝突のために、ＰＣＳＫ９に結合するＬＤＬＲを直接アンタゴナイズすることによって、競合阻害剤となりうる。
【図１３】Ｐｅｐ２−８又はＰｅｐ２−８（Ｖ２Ａ）をディスプレイするファージのＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスへの結合を示す。バリン２のアラニンへの単一の突然変異は、双方のＰＣＳＫ９構築物に対する結合アフィニティーを減少させた。ＰＣＳＫ９へのＰｅｐ２−８（Ｖ２Ａ）の、減少したが依然として検出可能な結合は、ＧＳＧリンカーを介してペプチド伸長ライブラリーをＣ末端に結合させるためのアンカーペプチドとしてのその使用に適していた。
【図１４】Ｐｅｐ２−８（Ｖ２Ａ）との融合ペプチドとして、ファージスポットＥＬＩＳＡアッセイにおいてＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスへの改善された結合を与えた伸長ペプチドの配列を示す。ＧＳＧリンカーは示されていない。
【図１５】Ｐｅｐ２−８（Ｖ２Ａ）との融合ペプチドとして、ファージスポットＥＬＩＳＡアッセイにおいてＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスへの改善された結合を与えた、付加的伸長ペプチドの配列を示す。ＧＳＧリンカーは示されていない。
【図１６】リンカー中の最初のＧｌｙとアンカー配列（Ｐｅｐ２−８Ｖ２Ａ）を欠失させることによって図１４及び１５に示した融合ペプチドを再フォーマットした後の、ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスへの結合を保持する１７の伸長ペプチド配列を示す。ファージスポットＥＬＩＳＡアッセイの結果を右側に示す。
【図１７】図１６に示した１７の伸長ペプチドをプールしたソフトランダム化ライブラリーのアフィニティー成熟実験から得られた強い結合シグナルを有する１０個の陽性クローンの配列を示す。ファージスポットＥＬＩＳＡアッセイの結果を右側に示す。２つの最も左側の残基は、融合ペプチド中のＧＳＧリンカーの一部であった。
【図１８】図１７のリストから合成された６つの合成ペプチドを有する標準的なファージ競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。４種のペプチドは、ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスへの結合についてファージディスプレイされたペプチドと競合し、ＩＣ５０値はマイクロモル以下又は低マイクロモルの範囲であった。しかし、これら４種の合成ペプチドのいずれも、ファージディスプレイされたＰｅｐ２−８結合（グラフ）と競合しておらず、それらがＰＣＳＫ９上のＰｅｐ２−８結合部位に結合しないことを示している。ポジティブコントロールとして、濃度依存的にＰＣＳＫ９へのファージ提示Ｐｅｐ２−８結合を阻害する合成Ｐｅｐ２−８を使用した。ｎ．ｄ．＝阻害不検出
【図１９】２種の合成３０アミノ酸融合ペプチドの競合結合実験からのＩＣ５０値を示す。図１８に示した２種のペプチド、Ｋ９ｇｖｐｅｐ４及びＫ９ｇｖｐｅｐ７をＧＳＧリンカーを介してＰｅｐ２−８に融合させ（Ｋ９ｇｖｐｅｐ４及びＫ９ｇｖｐｅｐ７の２つのＮ末端残基は「ＧＳＧ」リンカーの「ＳＧ」部分である）、合成ペプチドＰｅｐ２−８＿Ｋ９ｇｖｐｅｐ４及びＰｅｐ２−８＿Ｋ９ｇｖｐｅｐ７を作製した。これらの２種の融合ペプチドは、ペプチドＫ９ｇｖｐｅｐ４及びＰｅｐ２−８を提示するファージのＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスへの結合を１桁のナノモル範囲のＩＣ５０値で阻害した。
【図２０】ＧＳＧリンカーを介して伸長ペプチドＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣに連結されたＰｅｐ２−８からなる結合融合ペプチド化合物２を有するＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの結晶構造を示す。
【図２１】ＧＳＧリンカー（非決定 ）（not resolved）を介して伸長ペプチドＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲに連結されたＰｅｐ２−８からなる結合融合ペプチド化合物２０を有するＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの結晶構造を示す。
【図２２】アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）リンカーを介して伸長ペプチドＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣに連結されたＰｅｐ２−８からなる結合融合ペプチド化合物１７を有するＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの結晶構造を示す。
【図２３】Ｐｅｐ２−８と共結晶化した結合伸長ペプチド化合物２６を有するＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの結晶構造を示す。
【図２４】Ｐｅｐ２−８（Ｗ６ｆｌ）（化合物３）と共結晶化した結合伸長ペプチド化合物２６を有するＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの結晶構造を示す。
【図２５】Ｐｅｐ２−８と共結晶化した結合伸長ペプチド化合物２１を有するＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの結晶構造を示す。
【図２６】Ｐｅｐ２−８と共結晶化した結合伸長ペプチド化合物３０を有するＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの結晶構造を示す。
【図２７】Ｐｅｐ２−８と共結晶化した結合伸長ペプチド化合物３１を有するＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの結晶構造を示す。
【図２８】Ｐｅｐ２−８と共結晶化した結合伸長ペプチド化合物３２を有するＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの結晶構造を示す。
【図２９】ＨｅｐＧ２細胞上のＬＤＬＲ修復に対する融合ペプチド化合物１９（Ｐｅｐ２−８ｐ４）の効果を示す。組換えＰＣＳＫ９（Ｐ）へのＨｅｐＧ２細胞の曝露は、ＦＡＣＳによって測定して、表面曝露ＬＤＬＲのレベルを約７５％低下させた。化合物１９（０．１−５．０μＭ）を添加すると、濃度依存的にＬＤＬＲレベルが１００％に回復し、ＥＣ５０値は約０．５μＭであった。この実験には、コントロールペプチドＰｅｐ２−８（１．０−５０μＭ）及びＦａｂ３３（１．０−５０μＭ）が含まれていた。
【図３０】ＨｅｐＧ２細胞上のＬＤＬＲ修復に対する融合ペプチド化合物２０（Ｐｅｐ２−８ｐ７）の効果を示す。組換えＰＣＳＫ９（Ｐ）へのＨｅｐＧ２細胞の曝露は、ＦＡＣＳによって測定して、表面曝露ＬＤＬＲのレベルを約８０％低下させた。化合物２０（１．０−５０μＭ）を添加すると、濃度依存的にＬＤＬＲレベルが１００％に回復し、ＥＣ５０値は約１−５μＭであった。両実験には、コントロールペプチドＰｅｐ２−８（１．０−５０μＭ）及びＦａｂ３３（１．０−５０μＭ）が含まれていた。
【図３１】ＰＣＳＫ９−Ｒ１６７Ａ：Ｒ２１５Ａ：Ｒ２１８Ａ（Ｋ９−ＡＡＡ）のＦＸＩａ介在性切断に対する２つの溝結合ペプチド、化合物２６及び化合物２９の効果を示す。条件は、Ｋ９−ＡＡＡの最小切断がＦＸＩａ単独によって起こるように選択した（第２のレーンから左へ）。両ペプチドは、Ｆａｂ３３の結果と同様に、ポリクローナル抗Ｎ末端ペプチド抗体による減少したシグナルによって示されるように、Ｐ’へリックスの切断を強く加速した。ＦＸＩａの非存在下での２つのペプチドとのＫ９−ＡＡＡのインキュベーションは効果がなかった（右の２つのレーン）。
【図３２】ペプチド化合物１１２中のアルギニン残基のホモアルギニン（化合物１１８）による置換がＦＸＩａによるペプチド開裂を妨げることを実証するためのＬＣ−ＭＳ結果を示す。ＰＣＳＫ９−Ｒ１６７Ａ：Ｒ２１５Ａ：Ｒ２１８Ａ（Ｋ９−ＡＡＡ）を化合物１１８と共にインキュベートし、ＦＸＩａで１時間及び６時間処理した。試料をＬＣ−ＭＳで分析し、インタクトなペプチドピークの消失によってペプチド切断を定量化した。化合物１１８の切断は６時間まで検出されなかった。
【図３３】化合物１１２がＦＸＩａによって切断されることを実証するための液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）結果を示す。ＰＣＳＫ９−Ｒ１６７Ａ：Ｒ２１５Ａ：Ｒ２１８Ａ（Ｋ９−ＡＡＡ）を化合物１１２と共にインキュベートし、ＦＸＩａで１時間及び６時間処理した。試料をＬＣ−ＭＳで分析し、インタクトなペプチドピークの消失によってペプチド切断を定量化した。化合物１１２を１時間で３４％、６時間で７６％切断した。
【図３４】ホモアルギニン含有ペプチド化合物１１８が、ペプチド化合物１１２と比較してＫ９−ＡＡＡのＰ’へリックスのＦＸ１ａ媒介性切断に強い影響を及ぼすことを示す。Ｆａｂ３３及びＰｅｐ２−８をネガティブコントロールとして使用した。
【図３５】ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスに２．２０Åの分解能で結合した化合物２０及び化合物１９２の結晶構造を示す。他の伸長ペプチド及び天然Ｐ’ヘリックスにおける化合物２０及びそのアナログのＡｒｇ２５は、ＰＣＳＫ９  Ａｌａ３４１のカルボニル酸素原子を非最適なジオメトリと接触させる。化合物１９２中のホモＡｒｇ５は、１個の炭素原子がより長い側鎖を有する。結果として、この側鎖は、最適に近いジオメトリを有するＰＣＳＫ９  Ａｓｐ３４３と塩橋を形成する。
【図３６】カウンタースクリーニングを干渉することなく、ＰＣＳＫ９に結合するＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃ及びＬＤＬＲ−Ｆｃ、並びに「開口溝」ＰＣＳＫ９Δヘリックスに結合するＡｂ２０の化合物２２９による阻害を示すＴＲ−ＦＲＥＴアッセイの結果を示す。
【図３７】ＨｅｐＧ２細胞アッセイにおけるＬＤＬＲ分解の化合物２２９による濃度依存的阻害を示す。
【図３８】２８４ＫでＨ２Ｏ／ＣＤ３ＣＮ（７０：３０）中の化合物１９２及び２２９について観察されたシーケンシャル及び中距離ＮＯＥを示す。バーの厚さは、ＮＯＥ信号の強度に比例する。弱い中程度のＮＯＥの検出は、ＭＥＳＦＰＧＷＮＬ（ｈＲ）ＩＧＬＬＲペプチドの残基Ｗ７−Ｌ１４及びＷＮＬ（ｈＲ）ＩＧＬＬＲペプチドの残基Ｗ１−Ｌ８のらせん傾向を示す。
【図３９】ＰＣＳＫ９Δヘリックスに結合した化合物２２９の構造を示す。ＰＣＳＫ９への水素結合が点で示されている。残基ＦＰＧＷは、Ｆ４とＷ７との間の主鎖水素結合を有するＩ型ｂターンを形成する。
【図４０】ＰＣＳＫ９Δヘリックスに結合した化合物２２９の構造を示す。新しい残基Ｍ１及びＦ４、並びに残基Ｗ７、Ｖ１０及びｈＲ１１からの側鎖を伴う疎水性接触は、Ｎ末端伸長の立体構造を決定するのに役立つ。これらの側鎖からの炭素（及び硫黄）原子は点状の表面で示されている。
【図４１】ＰＣＳＫ９Δヘリックスに結合した化合物１９２及び２２９の構造を示す。化合物２２９の拮抗作用は、ＥＧＦ（Ａ）のＰ５残基とＬ２９８−Ｄ２９９−Ｎ３００セグメントとの間の予測される立体的衝突に起因する。化合物２２９のヘリカルセグメントは、本質的に変化しない化合物１９２と結合する。
【図４２】ＰＣＳＫ９Δヘリックスに結合した化合物２２９の原子のサブセットについて示された、１倍ｒｍｓｄで輪郭を描かれた電子密度２ｍＦｏ−ＤＦｃマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
明確さのために別々の実施態様において説明されている本発明のある特徴も、単一の実地態様として提供されうることを理解されたい。逆に、簡潔さのために単一の実施態様で説明されている本発明の様々な実施態様は、別々又は任意の適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【００１１】
定義
別に規定されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語は複数形を含み、その逆の場合も同じである。本明細書で用いる用語は、特定の実施態様を説明するためのものであり、限定することを目的としていないことを理解すべきである。
【００１２】
用語「Ｃ１−Ｃ４アシル」は、本明細書で用いられる場合、Ｃ１−Ｃ４アルキル−Ｃ（Ｏ）−基を指す。
【００１３】
一般的に「結合アフィニティー」は、本明細書で用いられる場合、分子の単一結合部位とその結合パートナーとの間の非共有結合的な相互作用の総計の強度を意味する。特に断らない限り、本明細書で使用する「結合アフィニティー」は、結合対のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合アフィニティーを指す。通常、分子ＸのそのパートナーＹに対するアフィニティーは、解離定数（ｋｄ）によって表される。アフィニティーは、本明細書中に記載のものも含め、当該技術分野で既知の一般的な方法により測定することができる。
【００１４】
用語「Ｃ１−Ｃ４アルコキシ」は、本明細書で用いられる場合、Ｃ１−Ｃ４アルキル−Ｏ−基を指し、Ｃ１−Ｃ４アルキルは本明細書で定義されているとおりである。
【００１５】
本明細書で使用される用語「Ｃ１−Ｃ４アルキル」は、１〜４個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状の炭化水素基を指す。
【００１６】
本明細書で使用される用語「Ｃ１−Ｃ４アルキルスルホニル」は、Ｃ１−Ｃ４アルキル−Ｓ（Ｏ）２−を指す。
【００１７】
本明細書で使用される用語「アミノ」は、基−ＮＨ２を指す。
【００１８】
本明細書で使用される用語「アンカーペプチド」は、ＰＣＳＫ９に結合し、ペプチド伸長ライブラリー又は「伸長ペプチド」がＣ末端に結合しているペプチドを指す。いくつかの実施態様において、伸長ペプチドは、リンカーを介してアンカーペプチドに結合されうる。いくつかの実施態様では、リンカーはＧＳＧリンカーである。いくつかの実施態様では、アンカーペプチドはＰｅｐ２−８である。いくつかの実施態様では、アンカーペプチドはＰｅｐ２−８Ｖ２Ａである。
【００１９】
本明細書で使用される用語「アリール」は、縮合環を含む系を含めた単環式、二環式又は三環式炭素環系を指し、系中の少なくとも１つの環は芳香族である。用語「アリール」は、用語「アリール環」と互換的に使用されうる。一実施態様では、アリールは、６〜２０個の炭素原子を有する基（Ｃ６−Ｃ２０アリール）を含む。別の実施態様では、アリールは、６−１０個の炭素原子を有する基を含む（Ｃ６−Ｃ１０アリール）。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ビフェニリル、フェナントレニル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、１Ｈ−インデニル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデニル（インダニル）等が含まれる。いくつかの実施態様では、アリールはフェニルである。いくつかの実施態様では、アリールはインダニルである。
【００２０】
本明細書で使用される用語「アリールカルボニル」は、アリール−Ｃ（Ｏ）−を指す。
【００２１】
本明細書で使用される用語「アリール−Ｃ１−Ｃ４アルキル」は、「アリール−Ｃ１−Ｃ４アルキル−」を指す。
【００２２】
本明細書で使用される用語「アリールオキシ」はアリール−Ｏ−を指す。
【００２３】
本明細書で使用される個体における「ベースライン」レベル（例えば、ＬＤＬ−Ｃレベルのベースラインレベルなど）という用語は、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を個体に投与する前のレベルを指す。特定の実施態様において、ベースラインは、ＰＣＳＫ９阻害剤の投与前に得られた２つ以上の測定値の平均値又は代表値であってもよい。
【００２４】
本明細書で使用される「接触させること」という用語は、ＰＣＳＫ９阻害剤とＰＣＳＫ９の間の相互作用を指す。いくつかの実施態様において、この相互作用は、１つ以上の水素結合、共有結合、イオン結合、疎水性接触及び／又はファンデルワールス 接触を含む。いくつかの実施態様において、１つ以上の水素結合、共有結合、イオン結合、疎水性接触及び／又はファンデルワールス接触は、ＰＣＳＫ９阻害剤とＰＣＳＫ９の間の距離が１０Å以下、９Å以下、８Å以下、７Å以下、６Å以下、５Å以下、４Å以下、３Å以下又は２Å以下のところで起こる。
【００２５】
本明細書で使用される「カルボキサミド」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を指す。
【００２６】
本明細書で使用される「カルボキシアミノ」という用語は、−ＮＨＣＯ２Ｈを指す。
【００２７】
本明細書で使用される「Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル」という用語は、３から７個の炭素を有する飽和環基を指す。いくつかの実施態様は３から６個の炭素を含む。いくつかの実施態様は３から５個の炭素を含む。いくつかの実施態様は５から７個の炭素を含む。いくつかの実施態様は３から４個の炭素を含む。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル等が含まれる。
【００２８】
本明細書で使用される「Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルカルボニル」という用語は、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−を指す。
【００２９】
本明細書で使用される「Ｃｙｓリッチドメイン」（ＣＲＤ）という用語は、配列番号１の４５５−６９２残基からなる、ＰＣＳＫ９のシステインリッチＣ末端ドメインを指す（Holla et al., J Lipid Res. 2011 Oct; 52(10): 1787-1794）。
【００３０】
本明細書で使用される「脂質異常症）という用語は、患者が異常な量の脂質を血液中に有する状態（又は状態の群）を指す。大半の脂質異常症は、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高リポタンパク血症及び複合型高脂血症を含む高脂血症である。脂質異常症は、血液中の総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ及び中性脂肪の増加と、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの減少によって現れる。
【００３１】
薬剤（例えば薬学的製剤）の「有効量」という用語は、本明細書で用いられる場合、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【００３２】
本明細書で使用される「伸長ペプチド」という用語は、アンカーペプチドにＣ末端で結合され、Ｎ末端のＰ’ヘリックスを通常有するＰＣＳＫ９のＮ末端溝に結合するペプチドを指す。
【００３３】
本明細書で使用される「Ｆａｂ３３」という用語は、米国特許第９２６６９６１号に開示されている抗ＰＣＳＫ９抗体ＹＷ５０８．２０．３３ｂの抗原結合断片を指す。
【００３４】
本明細書で使用される「ＦＡＭ」という用語は、５−カルボキシフルオセインを指す。
【００３５】
本明細書で使用される「Ｆｍｏｃ」という用語は、フルオレニルメチルオキシカルボニルを指す。
【００３６】
本明細書で使用される「融合ペプチド」という用語は、ＰＣＳＫ９に結合し、「アンカーペプチド」にＣ末端で結合される「伸長ペプチド」を含むペプチドを指す。いくつかの実施態様において、伸長ペプチドは、リンカーを介してアンカーペプチドに結合されうる。いくつかの実施態様では、リンカーはＧＳＧリンカーである。いくつかの実施態様では、アンカーペプチドはＰｅｐ２−８である。いくつかの実施態様では、アンカーペプチドはＰｅｐ２−８Ｖ２Ａである。
【００３７】
用語「ハロ」及び「ハロゲン」は、本明細書で用いられる場合、フッ素（フルオロ、−Ｆ）、塩素（クロロ、−Ｃｌ）、臭素（ブロモ、−Ｂｒ）及びヨウ素（ヨード、−Ｉ）から選択される原子を指す。
【００３８】
用語「ヘテロアリール」は、本明細書で用いられる場合、５から１４個の環原子を有する、縮合環を含めた系を含む単環式、二環式又は三環系を指し、少なくとも１つの環が芳香族であり、少なくとも１つの環原子がヘテロ原子である。ヘテロ原子の例としては、窒素、酸素及び硫黄が含まれる。いくつかの実施態様では、ヘテロアリールは、１つ以上の環原子が窒素、酸素又は硫黄である、５−６員単環式芳香族基を含む。いくつかの実施態様では、ヘテロアリール基は、ヘテロアリール環が１−２０個の炭素原子を含み、残りの環原子が１つ以上の窒素、硫黄又は酸素原子を含むＣ１−Ｃ２０ヘテロアリール基である。窒素原子は、任意選択的に酸化されていてもよい（例えばＮＯ）。ヘテロアリール基の例には、チエニル、フリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、テトラゾリル、チアトリアゾリル、オキサトリアゾリル、ピリジニル、ピリジニルＮ−オキシド、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、テトラジニル、テトラゾロ［１，５−ｂ］ピリダジニル、イミダゾール［１，２−ａ］ピリミジニル、プリニル、ベンゾオキサゾリル、２−オキソ−２，３−ジヒドロベンゾ［ｄ］オキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、インドリニル、１，３−チアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，３，４−トリアゾリル、１，３−オキサゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、１Ｈ−テトラゾリル、ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジニル、イソインドリル、イソインドリニル、１−オキソ−イソインドリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、１−オキソ−イソキノリニル、１−オキソ−３，４−ジヒドロ−イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル及びテトラヒドロイソキノリニルが含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される用語「ヘテロアリール−Ｃ１−Ｃ４アルキル」は、「ヘテロアリール−Ｃ１−Ｃ４アルキル−」を指す。
【００４０】
本明細書で使用される用語「ヘテロアリールカルボニル」は、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−を指す。
【００４１】
本明細書で使用される用語「ヘテロシクリル」は、３から２０個の環原子を有する、単環式、二環式又は三環式飽和又は部分不飽和の非芳香環系を指し、少なくとも１つの環原子がヘテロ原子である。ヘテロ原子の例としては、窒素、酸素及び硫黄が含まれる。いくつかの実施態様では、ヘテロシクリルは、飽和環系、例えば３から１２員飽和ヘテロシクリル環系又は３から８員飽和ヘテロシクリル環系を指す。いくつかの実施態様では、ヘテロシクリルは、５から８員飽和ヘテロシクリル環系を指す。いくつかの実施態様では、ヘテロシクリルは、５から６員飽和ヘテロシクリル環系を指す。いくつかの実施態様では、ヘテロシクリルは、１から４個のヘテロ原子である。いくつかの実施態様では、ヘテロシクリルは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１つ以上のヘテロ原子を有する３から７員単環を含む。いくつかの実施態様では、ヘテロシクリルは、窒素、酸素及び硫黄から選択されるｉ１つ以上のヘテロ原子を有する４から６員単環を含む。別の例では、ヘテロシクリルには、３員単環が含まれる。別の例では、ヘテロシクリルには、４員単環が含まれる。別の例では、ヘテロシクリルには、５−６員単環が含まれる。一例では、ヘテロシクリル基には、０から３個の二重結合が含まれる。例示的なヘテロシクリルには、オキシラニル、アジリジニル、チイラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、１，２−ジチエタニル、１，３−ジチエタニル、ピロリジニル、ジヒドロ−１Ｈ−ピロリル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオフェニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、ヘキサヒドロチオピラニル、ヘキサヒドロピリミジニル、オキサジナニル、チアジナニル、チオキサニル、ホモピペラジニル、ホモピペリジニル、アゼパニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、オキサゼパニル、ジアゼパニル、１，４−ジアゼパニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、チアゼパニル、テトラヒドロチオピラニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、オキサゾリジノニル、テトラヒドロベンゾイミダゾリル、チアジニル、オキサジニル、チアジアジニル、オキサジアジニル、ジチアジニル、ジオキサジニル、オキサチアジニル、チアトリアジニル、オキサトリアジニル、ジチアジアジニル、イミダゾリニル、ジジヒドロピリミジニル、テトラヒドロピリミジニル、ピロリニル、ピロリニル、チアピラニル、ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニルピラゾリジニル、ジチアニル、１，３−ジチオラニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３，６−ジアザビシクロ［３．１．１］ヘプタニル、６−アザビシクロ［３．１．１］ヘプタニル、３−アザビシクロ［３．１．１］ヘプタニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、アザビシクロ［２．２．２］ヘキサニル、２−アザビシクロ［３．２．１］オクタニル、８−アザビシクロ［３．２．１］オクタニル、２−アザビシクロ［２．２．２］オクタニル、８−アザビシクロ［２．２．２］オクタニル、７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン、アザスピロ［３．５］ノナニル、アザスピロ［２．５］オクタニル、アザスピロ［４．５］デカニル、アザスピロ［５．５］ウンデカニル、テトラヒドロインドリル、オクタヒドロインドリル、テトラヒドロイソインドリル、テトラヒドロインダゾリル等が含まれる。
【００４２】
本明細書で使用される「ヘテロシクリルカルボニル」という用語は、ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）−を指す。
【００４３】
本明細書で使用される用語「ヒドロキシ」は、−ＯＨを指す。
【００４４】
本明細書で使用される用語「ヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ４アルキル」は、−Ｃ１−Ｃ４アルキル−ＯＨを指す。
【００４５】
本明細書で使用される用語「高コレステロール血症」は、コレステロールのレベルが所望のレベルを超えて上昇した状態を指す。特定の実施態様では、ＬＤＬコレステロールのレベルが所望のレベルを超えて上昇している。特定の実施態様では、血清ＬＤＬコレステロールのレベルが所望のレベルを超えて上昇している。
【００４６】
「個体」又は「対象」という用語は、本明細書で用いられる場合、哺乳動物を指す。哺乳動物は、限定されるものではないが、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えばヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）を含む。特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
【００４７】
本明細書で用いられる「Ｎ末端溝」という用語は、Ｎ末端Ｐ’ヘリックスを通常有するＰＣＳＫ９触媒ドメインのＮ末端溝を指す。
【００４８】
用語「オキソ」は、本明細書で用いられる場合、＝Ｏを指す。
【００４９】
本明細書で用いられる「Ｐ’ヘリックス」又は「Ｎ末端Ｐ’ヘリックス」という用語は、Bottomley et al., J Biol Chem. 2009 Jan 9;284(2):1313-23に定義されているＰＣＳＫ９触媒ドメインのＮ末端アルファヘリックスを指す。いくつかの実施態様では、Ｐ’ヘリックスは、ＰＣＳＫ９のＳ１５３−Ｔ１６２残基からなる。
【００５０】
「添付文書」という用語は、本明細書で用いられる場合、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指す。
【００５１】
用語「ＰＣＳＫ９阻害剤」は、本明細書で用いられる場合、「ＣＤ７９ｂに結合する抗体」は、ＰＣＳＫ９を標的とするうえで診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分なアフィニティーでＰＣＳＫ９に結合することができる有機化合物を指す。一実施態様において、ＰＣＳＫ９阻害剤の、無関係な非ＰＣＳＫ９タンパク質への結合の程度は、本明細書に記載されているものを含む当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定して、ＰＣＳＫ９阻害剤のＰＣＳＫ９への結合の約１０％未満である。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９に結合するＰＣＳＫ９阻害剤は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００５２】
本明細書で用いられる用語「ＰＣＳＫ９Δヘリックス」は、本明細書で定義されているＰ’ヘリックスを欠いているＰＣＳＫ９を指す。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックス」は、本明細書で定義されているＣｙｓリッチドメイン及びＰ’ヘリックスを欠いているＰＣＳＫ９を指す。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「Ｐｅｐ２−８」は、次の配列：Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＮＨ２を有するペプチドを指す。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「Ｐｅｐ２−８−ｃｔｒｌ」は、次の配列：Ａｃ−ＴＶＡＴＳＡＥＥＹＬＬＷＶ−ＮＨ２を有するペプチドを指す。
【００５６】
本明細書で用いられる用語「Ｐｅｐ２−８Ｖ２Ａ」は、次の配列：Ａｃ−ＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＮＨ２を有するペプチドを指す。
【００５７】
本明細書で用いられる用語『薬学的製剤」又は「薬学的組成物」は、その中に含有されている活性成分の生物活性を許容するような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である更なる成分を含まない調製物を指す。
【００５８】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的製剤中の活性成分以外の成分であって、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、緩衝剤、添加剤、安定剤又は保存剤が含まれる。
【００５９】
特に断らない限り、本明細書で使用される用語「プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型」、「ＰＣＳＫ９」又は「ＮＡＲＣ−１」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＰＣＳＫ９を指す。この用語は、「完全長」の、未処理のＰＣＳＫ９並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＰＣＳＫ９又はその断片を包含する。この用語はまた、天然に存在するＰＣＳＫ９の変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。いくつかの実施態様において、ＰＣＳＫ９は、配列番号１の配列を有するヒトＰＣＳＫ９を有する。
【００６０】
本明細書で使用される用語「ＰＣＳＫ９活性」又はＰＣＳＫ９の「生物活性」は、ＰＣＳＫ９の任意の生物学的効果を指す。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９活性は、基質又は受容体に相互作用するか又は結合するＰＣＳＫ９の能力を含む。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９の生物活性は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）に結合するＰＣＳＫ９の能力である。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲに結合し、ＬＤＬＲを必要とする反応を触媒する。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９活性には、ＬＤＬＲの利用能を低減又は低下させるＰＣＳＫ９の能力が含まれる。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９の生物活性は、対象においてＬＤＬの量を増加させるＰＣＳＫ９の能力を含む。ある実施態様において、ＰＣＳＫ９の生物学的活性は、対象においてＬＤＬに結合するために利用可能であるＬＤＬＲの量を減少させるＰＣＳＫ９の機能を含む。ある実施態様において、ＰＣＳＫ９の生物学的活性は、ＬＤＬに結合するために利用可能であるＬＤＬＲの量を減少させるＰＣＳＫ９の機能を含む。ある実施態様において、ＰＣＳＫ９の生物学的活性は、ＰＣＳＫ９のシグナル伝達から生じる任意の生物学的活性を含む。
【００６１】
本明細書で使用する「ウレイド」という用語は、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２を指す。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程において実施されうる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な任意の病理学的帰結の縮小、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。いくつかの実施態様において、本発明のＰＣＳＫ９阻害剤は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【００６３】
本明細書で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に指示がない限り、複数形の参照を含む。本明細書で用いられる「約」という用語は、この技術分野における当業者に容易に知られているそれぞれの値についての通常の誤差範囲を意味する。本明細書における「およそ」の値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体に関する実施態様を含む（記載する）。本明細書に記載される本発明の態様及び実施態様は、態様及び実施態様「を含む」、「からなる」及び／又は「から本質的になる」を含む。
【００６４】
アミノ酸の略称
別途指示がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの向きで左から右に書かれている。
2019523235.tif 000003
＊大文字＝Ｌ−アミノ酸；小文字＝Ｄ−アミノ酸
【００６５】
ＰＣＳＫ９の構造及び機能
ＰＣＳＫ９は、染色体１ｐ３２に見出され、２２ｋｂの長さであり、６９２アミノ酸タンパク質をコードする１２個のエクソンを有する（Artenstein and Opal, N Engl J Med, 2011, 365(26):2507-2518）。それはプロテイナーゼＫ様酵素であり、分泌サブチラーゼファミリーに属し、主に肝細胞により合成され、分泌される（Maxwell and Breslow, Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(18):7100-7105; Seidah and Prat, Nat Rev Drug Discovery, 2012, 11(5): 367-383）。ＣＳＫ９の合成は、遺伝子のプロモーター領域内のステロール調節エレメントに結合することによってＰＣＳＫ９発現を調節する転写因子である、ステロール調節エレメント結合タンパク質２（ＳＲＥＢＰ−２）によってアップレギュレートされる（Jeong et al., J 脂質 Res 49(2):399-409）。ＳＲＥＢＰ−２はまた、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む、コレステロール恒常性に関与する重要な酵素をコードする遺伝子の活性を介して、ＬＤＬＲ及びコレステロール合成を増加させる（Goldstein and Brown (2009) Arterioscler Thromb Vasc Biol 29(4):431-438）。それは、低い細胞内コレステロール濃度によって活性化される。コレステロールが豊富な食餌を与えた絶食マウスでは、ＳＲＥＢＰ−２及びＰＣＳＫ９発現は抑制される（Kosenko et al. (2013) J Biol Chem 288(12):8279-8288）。しかし、動物及びヒトにおける長期の絶食はまた、ＰＣＳＫ９及びＳＲＥＢＰ−２活性の低下を引き起こす（Browning and Horton (2010) J Lipid Res 51(11):3359-3363）。更に、ｉｎ  ｖｉｖｏのエビデンスは、インスリンがＰＣＳＫ９の発現を増加させる役割を担っている可能性を示唆している（Costet et al. (2006) J Biol Chem 281(10):6211-6218）。
【００６６】
ＰＣＳＫ９タンパク質産物は、Ｎ末端シグナルペプチド、プロドメイン、触媒ドメイン、ヒンジ、及びシステインリッチＣ末端ドメインからなる（Seidah and Prat (2012) Nat Rev Drug Discovery 11(5): 367-383; Benjannet et al. (2004) J Biol Chem 279(47):48865-48875）。シグナルペプチドドメインの除去後、ＰＣＳＫ９は、〜７４ｋＤａの酵素前駆体として合成され、小胞体において自己触媒的切断を受けて、互いに強く会合したままのプロドメイン断片及び〜６２ｋＤａの成熟タンパク質を生成する（Park et al. (2004) J Biol Chem 279(48):50630-50638; Nassoury et al.(2007) Traffic 8(6):718-732; Lambert (2007) Current opinion in lipidology 18(3):304-309）。
【００６７】
ＰＣＳＫファミリーの最初の８つのメンバーであるＰＣＳＫ１-８は、不活性前駆体タンパク質のプロセシングに関与するセリンプロテアーゼであり、成長及び代謝の調節に重要な役割を果たす機能性及び生理活性ペプチド、ポリペプチド及びホルモンを生成する（Turpeinen et al. (2013) Current genomics 14(7):453; Desai et al.(2013) Circulation 128(9):962-969; Couture et al. (2011) Biomol Concepts 2(5):421-438）。これに対して、ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲリサイクルの調節において重要な役割を果たす（Cariou et al. (2011) Atherosclerosis 216(2):258-265）。ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲの上皮増殖因子Ａ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインに結合する。エンドサイトーシスに際し、ＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ複合体は、分解のためにリソソームに向けられ、結果としてＬＤＬＲレベルが低下し、循環ＬＤＬ−Ｃのクリアランスが減少する。ＰＣＳＫ９の肝外作用には、カイロミクロン分泌の増強及び腸細胞コレステロールバランスの調節が含まれる（Seidah and Prat, Nat Rev Drug Discovery, 2012, 11(5): 367-383）。更に、実験モデルからのデータは、ＰＣＳＫ９の役割が脂質恒常性を超えて拡大し、グルコース代謝、肝臓再生及びＣ型肝炎ウイルス感染に対する感受性の調節因子として関与していることを示唆している（Levy et al. (2013) Atherosclerosis 227(2):297-306 28; Farnier (2014) Archives of cardiovascular diseases 107(1):58-66 29; Farnier (2013) Curr Opin Lipidol 24(3): 251-258 30; and Bridge et al. (2015) J Hepatol 62(4):763-770）。
【００６８】
マウスモデルでは、大動脈アテローム性動脈硬化病変におけるコレステリルエステルの蓄積が、ＰＣＳＫ９不活性化によって著しく減少した（Denis et al. (2012) Circulation 125(7):894-901）。逆に、ＰＣＳＫ９の過剰発現は、アテローム性動脈硬化症の過剰な負荷を誘発した。ＬＤＬＲ欠損マウスにおいて、ＰＣＳＫ９のノックダウン又は過剰発現は、コレステリルエステル蓄積又はアテローム性プラークサイズに有意な影響を及ぼさなかった。この研究は、ＰＣＳＫ９がアテローム性動脈硬化症を増強するプロセスがＬＤＬＲに対するその作用によって主に媒介されることを強く示唆した（Denis et al. (2012) Circulation 125(7):894-901）。
【００６９】
ヒトの研究では、ＰＣＳＫ９機能喪失変異がＬＤＬ−Ｃ及び心臓血管事象の減少と関連していた（Cohen et al. (2006) N Engl J Med 354(12):1264-1272)。逆に、PCSK9の機能獲得変異は、LDLR変異に起因して表現型的にFHと区別できない、常染色体優性高コレステロール血症の重症形態と関連している(Cohen et al. (2006) N Engl J Med 354(12):1264-1272）。
【００７０】
ＰＣＳＫ９濃度は、平均値から±１５％の変化を有し、コレステロール合成に同期した概日周期を示す（Persson et al. (2010) Arterioscler Thromb Vasc Biol 30(12):2666-2672）。ＰＣＳＫ９合成はまた、げっ歯類においては、インスリンによって誘導され、グルカゴンによって抑制される（Costet et al. 2006. Jeffery, Food Chem. 281, 10, 6211-6218）。健康なヒトでは、ＰＣＳＫ９レベルが絶食で明らかに低下し（３６時間にわたり６０％減少）、食後に増加したが、これは同様の効果を示している（Persson et al. (2010) Arterioscler Thromb Vasc Biol 30(12):2666-2672; Browning and Horton (2010) J Lipid Res 51(11):3359-3363）。更に、ＰＣＳＫ９は、オキシステロールにより活性化される肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）によって正に制御される（Costet et al. (2006) J Biol Chem 281(10):6211-6218; Maxwell et al. (2003) J Lipid Res 44(11):2109-2119）。
【００７１】
ＰＣＳＫ９は３つの主要形態で血漿中を循環する（Tavori et al. (2013) Circ Res 113(12):1290-1295）。分泌されると、ＰＣＳＫ９は単量体として存在するが、触媒ドメインによって促進される二量体及び三量体複合体に自己会合することができる。ＰＣＳＫ９は、ヒト血漿中に遊離型及びタンパク質結合型で存在し、循環ＰＣＳＫ９の４０％がＬＤＬに排他的に関連している（Kosenko et al. 2013. Jeffery, Food Chem. 288, 12, 8279-8288）。ＬＤＬ結合ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲ結合活性を減少させた。これは、ＬＤＬのより高い血漿濃度がＬＤＬに結合されたＰＣＳＫ９のより大きな割合をもたらし、それによってＬＤＬＲのＰＣＳＫ９媒介分解を阻害することによる調節機構であることが提示されている(Kosenko et al. 2013. Jeffery, Food Chem. 288, 12, 8279-8288）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏのエビデンスは、自己会合二量体／三量体が、単量体形態と比較して、ＬＤＬＲ結合及び分解活性を増強することを示している（Fan et al. (2008) Biochemistry 47(6):1631-1639）。ＰＣＳＫ９はまた、６２ｋＤａタンパク質の切断から生じる５５ｋＤａのフリン切断不活性断片として循環する。成熟ＰＣＳＫ９タンパク質の突然変異は、フリン切断に対する感受性の増加又は減少と関連しており、ＰＣＳＫ９の機能喪失及び機能獲得表現型をもたらす（Lambert (2007) Current opinion in lipidology 18(3):304-309）。
【００７２】
ＰＣＳＫ９は、主に可溶性タンパク質として働き、リソソーム経路への経路変更を介した細胞外結合による膜結合型ＬＤＬＲの分解を目的とする（Horton et al. (2007) Trends Biochem Sci 32(2):71-77）。分子レベルでは、ＰＣＳＫ９は、伸びた（開いた）立体構造においてＬＤＬＲをブロックする。これは、ＰＣＳＫ９の触媒ドメイン（ａａ１５３−４２１）及びＬＤＬＲのＥＧＦ−Ａドメイン（ａａ３１４−３５５）が結合するときに達成される（Leren (2014) Atherosclerosis 237(1):76-81）。受容体が閉じた立体構造をとるこの失敗は、原形質膜へのリサイクル及びその後の分解の遅れをもたらす。ＬＤＬＲは、ＰＣＳＫ９と同じく、血漿ＬＤＬのクリアランスを担う主要な器官である肝臓に特に豊富である。肝細胞の表面上のＬＤＬＲの数が血流からのＬＤＬ除去の速度を決定するため、ＰＣＳＫ９は、脂質恒常性を有益に調節する魅力的な標的を提示した。
【００７３】
いくつかの機構論的研究によって示されるように、２つの別々のＬＤＬＲ分解経路がＰＣＳＫ９によって誘導される。「ＬＤＬＲ分解の細胞内経路」において、新たに形成されたＰＣＳＫ９はＬＤＬＲに結合し、次にそれを分解のためにトランスゴルジネットワークからリソソームに向ける。この経路の存在は、トランスゴルジネットワークからリソソームへの細胞内輸送を切断するクラスリン軽鎖低分子干渉ＲＮＡが、外因性ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ分解を増強する能力に影響を与えずにＰＣＳＫ９依存的にＬＤＬＲレベルを急速に増加させる、ＨｅｐＧ２細胞の研究によって示されている（Poirier et al., J. Biol. Chem. 284 (42) (2009 October 16) 28856-28864）。
【００７４】
ＬＤＬＲ分解の第２の経路において、分泌されたＰＣＳＫ９は、細胞表面のＬＤＬＲの第１の表皮増殖因子様反復（ＥＧＦＡ）に結合して、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ複合体の内部移行を誘導する。内部移行後、ＬＤＬＲのエンドサイトーシス再循環は、双方のタンパク質のリソソーム分解を促進する結合ＰＣＳＫ９によって阻害される（Lo et al., EMBO Rep. 12 (12) (2011 December) 1300-1305）。ＰＣＳＫ９に対するモノクローナル抗体（ｍＡＢ）は、ＥＧＦＡドメインにおけるＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用を切断し、第２の又は細胞表面の経路がヒトにおける肝ＬＤＬＲレベルに主要な効果を及ぼすことを示す（Stein et al., Curr. Atheroscler. Rep. 15 (3) (2013 March) 310）。
【００７５】
Ｔａｖｏｒｉらによる研究（Circulation 127 (24) (2013 June 18) 2403-2413）は、ＬＤＬＲがＰＣＳＫ９の主要な除去経路として作用し、これらの２つのタンパク質間の相互制御機構が血清ＰＣＳＫ９レベル、肝臓におけるＬＤＬＲ発現、血清ＬＤＬ−Ｃレベルを制御することを示す。
【００７６】
ＰＣＳＫ９阻害はまた、リポタンパク質（ａ）レベルを低下させる可能性がある。高レベルのリポタンパク質（ａ）は、低ＬＤＬ−Ｃを有するスタチン処置患者においてさえ、心臓血管死亡率の独立した予測因子である（Khera et al. 2014/129/6 (635-642）。ＰＣＳＫ９阻害剤は、リポタンパク質（ａ）を約３０％減少させる。このような効果は、スタチン又はエゼチミブ介したＬＤＬＲ活性のアップレギュレーションでは観察されない（Rader et al. (1994) J Clin Invest 93(6):2758-2763）。したがって、治療戦略としてのＰＣＳＫ９阻害は、ＬＤＬ−Ｃ低下以外の理論的利点を有し、心血管転帰が更に有利でありうる可能性を高める。
【００７７】
組成物及び方法
一態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９阻害剤で得られた実験結果に一部基づいている。得られた結果は、ＰＣＳＫ９阻害剤でＰＣＳＫ９の生物活性をブロックすることがＬＤＬＲの減少の防止につながることを示している。更に、結果は、ＰＣＳＫ９阻害剤の投与が対象において総ＬＤＬ−Ｃレベルを減少させることを示している。したがって、本明細書に記載の本発明のＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９に関連する病理学的状態、例えばコレステロール関連障害の標的化における使用のための重要な治療剤及び診断剤を提供する。
【００７８】
特定の実施態様において、「コレステロール関連障害」には、高コレステロール血症、心疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病、冠動脈性心疾患、脳卒中、心血管疾患、アルツハイマー病、並びに総血清コレステロールの上昇、ＬＤＬの上昇、中性脂肪の上昇、ＶＬＤＬの上昇及び／又は低ＨＤＬによって現れる通常の脂質異常症のうちの１つ以上が含まれる。１種以上の他の薬剤と組み合わせて又は単独でＰＣＳＫ９阻害剤，を用いて治療可能な原発性及び続発性脂質異常症の非限定的ないくつかの例としては、メタボリックシンドローム、糖尿病、家族性複合型高脂血症、家族性高中性脂肪血症、ヘテロ接合性高コレステロール血症、ホモ接合性高コレステロール血症、家族性アポリポタンパクＢ−１００異常症を含む家族性高コレステロール血症；多遺伝子性高コレステロール血症；レムナント除去病（remnant removal disease）、肝性リパーゼ欠損症；食あたり、甲状腺機能低下症、エストロゲン及びプロゲスチン療法を含む薬物、ベータ遮断薬、並びにチアジド系利尿薬のいずれの後の続発性脂質異常症；ネフローゼ症候群、慢性腎性不全、下垂体好塩基細胞腺腫、原発性胆汁性肝硬変、グリコーゲン蓄積症、肝がん、胆汁鬱滞、先端巨大症、インスリノーマ、成長ホルモン単独欠損症及びアルコール誘発性高中性脂肪血症が含まれる。本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤はまた、例えば冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳卒中（虚血性及び出血性）、狭心症又は脳血管疾患及び急性冠動脈症候群、心筋梗塞などのアテローム性動脈硬化性疾患を予防又は治療するのに有用ありうる。特定の実施態様において、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤は、非致死性心臓発作、致死性及び非致死性脳卒中、ある種の心臓手術、心不全による入院、心臓病患者の胸痛、並びに／又は、例えば以前の心臓発作、以前の心臓手術及び／若しくは動脈の詰まりの兆候を伴う胸痛などの確立された心疾患に起因する心臓血管イベントのリスクを低下させるのに有用である。特定の実施態様において、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤及び方法は、心臓血管イベントの再発のリスクを減らすために使用することができる。
【００７９】
ＰＣＳＫ９阻害剤
特定の実施態様では、ＰＣＳＫ９又はその断片に結合するＰＣＳＫ９阻害剤が提供され、ＰＣＳＫ９阻害剤はＰＣＳＫ９の断片内のエピトープに結合する。特定の実施態様では、ＰＣＳＫ９又はその断片に結合するＰＣＳＫ９阻害剤が提供され、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの以下の部分、すなわちＡ２３９−Ｖ２４１、Ｔ３３９−Ｄ３４３、Ｐ３６４−Ｉ３６８、Ｈ３９１及びＶ４４１−Ｌ４４４によって囲まれたポケットの中で結合する。いくつかの実施態様では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも１つの残基を含む、配列番号１のピトープに結合する。いくつかの実施態様では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも２つの残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも３つの残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも４つの残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも５つの残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも６つの残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１の残基Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１１の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１２の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１３の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１４の残基を含む。いくつかの実施様態��は、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１５の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１６の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１の残基Ａ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１１の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１２の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１３の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１４の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１４の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１６の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１７の残基を含む��いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１の残基Ａ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＴ３３９を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＤ３４３を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＰ３６４を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ４４２を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ４４３を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＬ４４４を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＴ３３９と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＤ３４３と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＰ３６４と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ４４２と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ４４３と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＬ４４４と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２及びＡ４４３からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつか��実施様態では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＴ３３９と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＤ３４３と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＰ３６４と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ４４２と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、
Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ４４３と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＬ４４４と、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２及びＡ４４３からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９と、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＧ２４０と、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＮ３４０と、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ３４１と、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＥ３６６と、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＤ３６７と、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＩ３６８と、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＩ３６９と、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＧ３７０と、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＨ３９１と、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、以下の残基、すなわち配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は全てを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、以下の残基、すなわち配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４のうちの１１、１２、１３、１４、１５、１６又は全てを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、以下の残基、すなわち配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４のうちの１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は全てを含む。いくつかの実施様態では、ＰＣＳＫ９阻害剤とエピトープ中の配列番号１の残基との間の距離は、１０Å以下、９Å以下、８Å以下、７Å以下、６Å以下、５Å以下、４Å以下、３Å以下又は２Å以下である。
【００８０】
いくつかの実施様態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、式Ｉ：
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｘ４−Ｘ５−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｒ２
式Ｉ
の化合物及び薬学的に許容されるその塩から選択され、
上式中、
Ｒ１はＣ１−Ｃ４アシルであるか、又はＲ１は存在せず；
Ｘ１は、ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ及びＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶから選択されるアミノ酸配列であるか、又はＸ１は存在せず；
Ｘ２は、グリシン及びセリンから選択される１から４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はＸ２は、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸及び１１−アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基であるか、又はＸ２は存在せず；
Ｘ３は、アラニン、２−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、３−ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン及びトリプトファンから選択される１から４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり；
Ｘ４は、アラニン、２，３−ジアミノプロピオン酸、グルタミン、グリシン、リジン及びバリンから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｘ５は、アルギニン及びホモアルギニンから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｘ６は、アラニン、アルギニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン及びトリプトファンから選択される１から５個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はＸ６は存在せず；かつ
Ｒ２はアミノであるか、又はＲ２は存在しない。
いくつかの実施態様では、Ｒ１はＣ１−Ｃ４アシルである。
いくつかの実施態様では、Ｒ１はアセチルである。
いくつかの実施態様では、Ｒ１はバレリルである。
いくつかの実施態様では、Ｒ１は存在しない。
いくつかの実施態様では、Ｘ１は、ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ及びＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、Ｘ１は、アミノ酸配列ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶである。
いくつかの実施態様では、Ｘ１は、アミノ酸配列ＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶである。
いくつかの実施態様では、Ｘ１は存在しない。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は、グリシン及びセリンから選択される１から４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は、ＳＧ、ＧＳＧ、ＧＧＳＧ、ＧＳＧＧ及びＳＧＳＧから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸及び１１−アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基である。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は、アミノ酸残基６−アミノヘキサン酸である。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は、アミノ酸残基７−アミノヘプタン酸である。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は、アミノ酸残基８−アミノオクタン酸である。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は存在しない。
いくつかの実施態様では、Ｘ３は、Ｐ、ＭＰ、ＬＭＰ、ＡＬＭＰ、ＣＡＬＰ、ＣＦＩＰ、ＣＦＬＰ、ＣＲＡＰ、ＣＲＬ（Ｈｙｐ）、ＣＲＬＰ、ＤＡＭＰ、ＤＬＡＰ及びＤＬＭＰから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、Ｘ３は存在しない。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、アミノ酸残基アラニンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、アミノ酸残基２，３−ジアミノプロピオン酸である。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、アミノ酸残基グルタミンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、アミノ酸残基グリシンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、アミノ酸残基リジンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、検出試薬で修飾されたアミノ酸残基リジンである。いくつかの実施態様では、検出試薬はビオチンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、アミノ酸残基バリンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ５は、アミノ酸残基アルギニンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ５は、アミノ酸残基ホモアルギニンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ６は、Ｌ、Ｓ、ＬＬ、ＬＡＲ、ＬＧＣ、ＬＬＡ、ＬＬＣ、ＬＬＲ、ＬＰＣ、ＬＴＲ、ＳＱＧＣ、ＳＱＣＥＹ、ＳＱＣＷＦ及びＳＱＧＣＷから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、Ｘ６は存在しない。
いくつかの実施態様では、Ｒ２はアミノである。
いくつかの実施態様では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、表１に示す以下のペプチドから選択される化合物である。
表１
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2019523235.tif 000005
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2019523235.tif 000008
【００８１】
いくつかの実施態様では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、以下から選択される化合物及び薬学的に許容されるそれらの塩である：Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬＧＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＧＳＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｏｃ）−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｐ）−ＫＬＷＮＬＧＲＶ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｘ）−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｐ）−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＳＧＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；ＳＧ−ＣＦＩＰＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２；ＳＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；ＳＧ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ；Ａｃ−ＳＧ−ＣＦＩＰＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＳＧ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＦＩＰＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＳＧ−ＣＲＬ（Ｈｙｐ）ＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧＧ−ＣＦＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＬＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣＷ−ＮＨ２；Ａｃ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬＫＲＩＧＳＱＧＣＷ−ＮＨ２；Ａｃ−ＤＬＭＡＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＤＬＡＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＤＡＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＡＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬ−ＮＨ２；Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬ−ＮＨ２；Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧ−ＮＨ２；Ａｃ−ＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＬＡ−ＮＨ２；Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＬＡＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＶＲＩＧＡＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＤＬＭＰＷＮＬＡＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＭＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＥＹ−ＮＨ２；Ａｃ−ＤＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＥＹ−ＮＨ２；Ａｃ−ＷＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＥＹ−ＮＨ２；ＧＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＫＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＡＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＡＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＡＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＡＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＡＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＡＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＧＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＧＧＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬ（Ａｃｈ）ＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＧＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；Ａｃ−ＧＣＬＷＮＬＡＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；Ａｃ−ＦＣＬＷＮＬＡＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；ＧＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；ＷＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ−ＮＨ２；Ａｃ−ＧＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ；Ａｃ−ＷＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＷＦ；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｘ）−ＡＷＮＬＫＲＩＧＳ−ＮＨ２；Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−（Ａｈｘ）−ＡＷＮＬＫＲＩＧ−ＮＨ２；Ａｃ−ＦＣＬＷＮＬＫＲＩＧＳＱＣＥＹ−ＮＨ２；Ａｃ−ＦＣＬＷＮＬＫＲＩＧＡＱＣＷＦ−ＮＨ２；Ａｃ−ＧＳＧ−ＣＷＮＬ（Ｄｐｒ）ＲＩＧＳＱＧＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬｐＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧｌＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬｑＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬｐＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲｌＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣｒＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；Ａｃ−ｃＲＬＰＷＮＬＱＲＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ−ＮＨ２；ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＴＲ−ＮＨ２；ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＴＴＲ−ＮＨ２；ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＴＬＲ−ＮＨ２；Ａｃ−ＣＲＬＰＷＮＬＱ（ホモＲ）ＩＧＬＰＣ−ＮＨ２；ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＴＲ−ＮＨ２、及びＡｃ−ＰＷＮＬＶＲＩＧＬ−ＮＨ２。
【００８２】
いくつかの実施様態では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、式ＩＩ：
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ７−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｘ４−Ｘ５−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｒ２
式ＩＩ
の化合物及び薬学的に許容されるそれらの塩から選択され；上式中、
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４アシル、アリールカルボニル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルカルボニル及びヘテロアリールカルボニルから選択され；各々は、それぞれ独立に以下から選択される１又は２の置換基：
Ｃ１−Ｃ４アルキル；
アミノ；
Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ハロ及びヒドロキシから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいアリール；
アリール−Ｃ１−Ｃ４アルキル；
Ｃ１−Ｃ４アルキル及びＣ１−Ｃ４アルキルスルホニルから選択される１の置換基で置換されていてもよいアリールカルボニル；
Ｃ１−Ｃ４アシル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ハロ及びヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ４アルキルから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ；
アリール−Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される１の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ；
Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル；
Ｃ１−Ｃ４アルキル及びアミノから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール；
Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキルスルホニル、カルボキサミド、ヘテロアリール−Ｃ１−Ｃ４アルキル及びオキソから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル；
ヘテロシクリルカルボニル；並びに
ウレイド
で置換されていてもよく；
又はＲ１は存在せず；
Ｘ１は、ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ、ＴＶＦＴＳ（Ｗ６ｆｌ）ＥＥＹＬＤＷＶ及びＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶから選択されるアミノ酸配列であるか、又はＸ１は存在せず；
Ｘ２は、グリシン及びセリンから選択される１から４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はＸ２は、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸及び１１−アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基であるか、又はＸ２は存在せず；
Ｘ３は、アラニン、２−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、３−ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン及びチロシンから選択される１から６個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり；
Ｘ４は、アラニン、２，３−ジアミノプロピオン酸、グルタミン、グリシン、リジン及びバリンから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｘ５は、アルギニン及びホモアルギニンから選択されるアミノ酸残基であり；
Ｘ６は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン及びトリプトファンから選択される１から５個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はＸ６は存在せず；
Ｘ７は、トリプトファン、６−フルオロトリプトファン、６−クロロトリプトファン、６−ブロモトリプトファン及び６−メチルトリプトファンから選択されるアミノ酸残基であり；かつ
Ｒ２はアミノであるか、又はＲ２は存在しない。
いくつかの実施態様では、Ｒ１はＣ１−Ｃ４アシルである。
いくつかの実施態様では、Ｒ１はアセチルである。
いくつかの実施態様では、Ｒ１はバレリル
である。
いくつかの実施態様では、Ｒ１は存在しない。
いくつかの実施態様では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４アシル、アリールカルボニル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルカルボニル及びヘテロアリールカルボニルから選択され、各々は、それぞれ独立に以下から選択される１又は２の置換基：
Ｃ１−Ｃ４アルキル；
アミノ；
メトキシ、アミノ、フルオロ、クロロ及びヒドロキシから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいアリール；
アリール−Ｃ１−Ｃ４アルキル；
メチル及びメチルスルホニルから選択される１の置換基で置換されていてもよいアリールカルボニル；
アセチル、メトキシ、メチル、エチル、ブロモ及びヒドロキシメチルから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ；
フェニルメチルから選択される１の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ；
Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル；
メチル及びアミノから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール；
メチル、メチルスルホニル、カルボキサミド、ピリジニルメチル及びオキソから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル；
ヘテロシクリルカルボニル；並びに
ウレイド
で置換されていてもよい。
【００８３】
いくつかの実施態様では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４アシル、アリールカルボニル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルカルボニル及びヘテロアリールカルボニルから選択され、各々は、それぞれ独立に以下から選択される１又は２の置換基：
メチル及びｔ−ブチルから選択されるＣ１−Ｃ４アルキル；
アミノ；
メトキシ、アミノ、フルオロ、クロロ及びヒドロキシから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいフェニル；
フェニルメチル；
メチル及びメチルスルホニルから選択される１の置換基で置換されていてもよいベンゾイル；
アセチル、メトキシ、メチル、エチル、ブロモ及びヒドロキシメチルから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいフェノキシ；
フェニルメチルから選択される１の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ；
シクロヘキシル；
イミダゾリル、インドリル、ピラゾリル、ピリジニル及びトリアゾリルから選択されるヘテロアリールであって、各々が、それぞれ独立にメチル及びアミノから選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール；
モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピリミジニル、チオモルホリニルから選択されるヘテロシクリルであって、各々が、それぞれ独立にメチル、メチルスルホニル、カルボキサミド、ピリジニルメチル及びオキソから選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル；
モルホリニルカルボニル；並びに
ウレイド
で置換されていてもよい。
【００８４】
いくつかの実施態様では、Ｒ１は、アセチル、ｎ−プロピオニル、ｎ−ブタノイル、イソバレリル、バレリル、ベンゾイル、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル、インドリルカルボニル、ピラゾリルカルボニル及びピリジニルカルボニルから選択され、各々が、それぞれ独立に以下から選択される１又は２の置換基：
メチル及びｔ−ブチルから選択されるＣ１−Ｃ４アルキル；
アミノ；
メトキシ、アミノ、フルオロ、クロロ及びヒドロキシから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいフェニル；
フェニルメチル；
メチル及びメチルスルホニルから選択される１の置換基で置換されていてもよいベンゾイル；
アセチル、メトキシ、メチル、エチル、ブロモ及びヒドロキシメチルから各々独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいフェノキシ；
フェニルメチルから選択される１の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ；
シクロヘキシルから選択され；
イミダゾリル、インドリル、ピラゾリル、ピリジニル及びトリアゾリルから選択されるヘテロアリールであって、各々が、メチル及びアミノからそれぞれ独立に選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール；
モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピリミジニル、チオモルホリニルから選択されるヘテロシクリルであって、各々が、それぞれ独立にメチル、メチルスルホニル、カルボキサミド、ピリジニルメチル及びオキソから選択される１又は２の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル；
モルホリニルカルボニル；並びに
ウレイド
で置換されていてもよい。
【００８５】
いくつかの実施態様では、Ｒ１は、アセチル、ｎ−ブタノイル、３−（１，１−ジオキシドチオモルホリノ）プロパノイル、２−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）シクロプロパン−１−カルボニル、３−（２−オキソピロリジン−１−イル）プロパノイル、１−（１−メチルピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニル、２−（１−（ピリジン−２−イルメチル）ピペリジン−４−イル）アセチル、３−（４−カルバモイルピペラジン−１−イル）プロパノイル、３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパノイル、２−（１−（メチルスルホニル）ピペリジン−４−イル）アセチル、６−モルホリノニコチノイル、３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）プロパノイル、３−モルホリノプロパノイル、３−（ピリジン−３−イル）プロパノイル、２−（１，１−ジオキシドテトラヒドロチオフェン−３−イル）アセチル、３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロパノイル、３−ウレイドプロパノイル、３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）プロパノイル、２−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）アセチル、３−ベンジルシクロブタン−１−カルボニル、［１，１’−ビフェニル］−４−カルボニル、５−フェニルペンタノイル、４−フェニルシクロヘキサン−１−カルボニル、５，５−ジメチルヘキサノイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイル、５−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル、３−シクロヘキシルプロパノイル、３−（４−アミノフェニル）プロパノイル、４−モルホリノブタノイル、４−（４−（メチルスルホニル）フェニル）−４−オキソブタノイル、３−（３−アミノフェニル）プロパノイル、４−オキソ−４−（ｐ−トリル）ブタノイル、３−（４−メトキシフェニル）プロパノイル、４−モルホリノ−４−オキソブタノイル、３−（３−ヒドロキシフェニル）プロパノイル、４−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）ブタノイル、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノイル、３−（６−アミノピリジン−３−イル）プロパノイル、４−（４−ブロモフェノキシ）ブタノイル、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタノイル、３−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボニル、３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパノイル、４−（１Ｈ−インドール−３−イル）ブタノイル、４−（４−フルオロフェニル）ブタノイル、３−（４−フルオロフェニル）プロパノイル、３−（４−クロロフェニル）プロパノイル、３−（３−メトキシフェニル）プロパノイル、３−（４−メトキシフェノキシ）プロパノイル、４−（４−（ヒドロキシメチル）−３−メトキシフェノキシ）ブタノイル、３−（４−アセチルフェノキシ）プロパノイル、４−（ｐ−トリルオキシ）ブタノイル、４−フェノキシブタノイル、４−（４−エチルフェノキシ）ブタノイル、３−（ｐ−トリルオキシ）プロパノイル、４−フェニルブタノイル、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパノイル、４−（４−ヒドロキシフェニル）ブタノイル、２−（ピリジン−３−イル）シクロプロパン−１−カルボニル、１Ｈ−インドール−６−カルボニル、２−アミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノイル、及び３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパノイルから選択される。
【００８６】
いくつかの実施態様では、Ｘ１は、ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ、ＴＶＦＴＳ（Ｗ６ｆｌ）ＥＥＹＬＤＷＶ及びＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、Ｘ１は、アミノ酸配列ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶである。
いくつかの実施態様では、Ｘ１は、アミノ酸配列ＴＶＦＴＳ（Ｗ６ｆｌ）ＥＥＹＬＤＷＶである。
いくつかの実施態様では、Ｘ１は、アミノ酸配列ＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶである。
いくつかの実施態様では、Ｘ１は存在しない。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は、グリシン及びセリンから選択される１から４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は、Ｇ、ＧＧ、ＳＧ、ＧＳＧ、ＧＧＳＧ、ＧＳＧＧ及びＳＧＳＧから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸及び１１−アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基である。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は、アミノ酸残基６−アミノヘキサン酸である。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は、アミノ酸残基７−アミノヘプタン酸である。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は、アミノ酸残基８−アミノオクタン酸である。
いくつかの実施態様では、Ｘ２は存在しない。
いくつかの実施態様では、Ｘ３は、Ｐ、ＭＰ、ＬＭＰ、ＡＬＭＰ、ＣＡＬＰ、ＣＦＩ（Ｈｙｐ）、ＣＦＩＰ、ＣＦＬＰ、ＣＲＡＰ、ＣＲＬ（Ｈｙｐ）、ＣＲＬＰ、ＤＡＭＰ、ＤＬＡＰ、ＤＬＭＰ、ＤＳＹＰＧ、ＥＳＦＰＧ、ＥＳＹＰＧ、ＭＤＳＦＰＧ、ＭＥＳＦＰＧ及びＳＦＡＦＰＧから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、Ｘ３は存在しない。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、アミノ酸残基アラニンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、アミノ酸残基２，３−ジアミノプロピオン酸である。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、アミノ酸残基グルタミンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、アミノ酸残基グリシンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、アミノ酸残基リジンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ４は、アミノ酸残基バリンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ５は、アミノ酸残基アルギニンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ５は、アミノ酸残基ホモアルギニンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ６は、Ｌ、Ｓ、ＬＬ、ＬＡＲ、ＬＤＲ、ＬＥＲ、ＬＧＣ、ＬＧＲ、ＬＬＡ、ＬＬＣ、ＬＬＱ、ＬＬＲ、ＬＰＣ、ＬＰＲ、ＬＳＲ、ＬＴＲ、ＳＱＧＣ、ＳＱＣＥＹ、ＳＱＣＷＦ及びＳＱＧＣＷから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、Ｘ６は存在しない。
いくつかの実施態様では、Ｘ７はトリプトファンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ７は６−フルオロトリプトファンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ７は６−クロロトリプトファンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ７は６−ブロモトリプトファンである。
いくつかの実施態様では、Ｘ７は６−メチルトリプトファンである。
いくつかの実施態様では、Ｒ２はアミノである。
いくつかの実施態様では、Ｒ２は存在しない。
【００８７】
いくつかの実施態様では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、表１Ａに示す化合物及び薬学的に許容されるそれらの塩から選択される。
表１Ａ
2019523235.tif 000009
2019523235.tif 000010
2019523235.tif 000011
2019523235.tif 000012
2019523235.tif 000013
2019523235.tif 000014
2019523235.tif 000015
2019523235.tif 000016
2019523235.tif 000017
【００８８】
特定の実施態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９に結合した本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む阻害されたＰＣＳＫ９を提供する。
【００８９】
一態様において、本発明は、候補化合物を配列番号１のエピトープに結合するＰＣＳＫ９阻害剤であると同定するための方法に関し、該エピトープは、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも１つの残基を含み；該方法は、以下の工程：ａ）ＰＣＳＫ９を候補化合物と接触させる工程；ｂ）ＰＣＳＫ９Δヘリックスを候補化合物と接触させる工程；ｃ）候補化合物のＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスに対する結合アフィニティーを測定する工程；並びにｄ）候補化合物のＰＣＳＫ９Δヘリックスに対する結合アフィニティーが候補化合物のＰＣＳＫ９に対する結合アフィニティーよりも強いことを決定する工程を含み；前記決定は候補化合物が配列番号１のエピトープを結合するＰＣＳＫ９阻害剤であることの示唆である。
【００９０】
候補化合物を配列番号１のエピトープに結合するＰＣＳＫ９阻害剤であると同定するための方法であって、該エピトープが、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも１つの残基を含み；該方法は、以下の工程：ａ）ＰＣＳＫ９を候補化合物と接触させる工程；ｂ）候補化合物のＰＣＳＫ９に対する結合アフィニティーを測定する工程；ｃ）ＰＣＳＫ９Δヘリックスを候補化合物と接触させる工程；ｄ）候補化合物のＰＣＳＫ９Δヘリックスに対する結合アフィニティーを測定する工程；並びにｅ）候補化合物のＰＣＳＫ９Δヘリックスに対する結合アフィニティーが候補化合物のＰＣＳＫ９に対する結合アフィニティーよりも強いことを決定する工程を含み；前記決定は候補化合物が配列番号１のエピトープを結合するＰＣＳＫ９阻害剤であることの示唆である、方法。
【００９１】
いくつかの実施態様では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも２つの残基を含む。
いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも３つの残基を含む。
いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群より選択される少なくとも４つの残基を含む。
いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも５つの残基を含む。
いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＶ２４１、Ｔ３３９、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも６つの残基を含む。
いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号１のＡ２３９、Ｇ２４０、Ｖ２４１、Ｔ３３９、Ｎ３４０、Ａ３４１、Ｄ３４３、Ｐ３６４、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ｈ３９１、Ａ４４２、Ａ４４３及びＬ４４４からなる群から選択される少なくとも１１の残基を含む。
いくつかの実施態様では、ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスがセンサーチップ上に提供される。
いくつかの実施態様において、結合アフィニティーは表面プラズモン共鳴を用いて決定される。
【００９２】
薬学的組成物
別の実施態様は、本発明の化合物及び治療上不活性な担体、希釈剤又は添加剤を含有する薬学的組成物又は医薬、並びにそのような組成物及び医薬を調製するための、本発明の化合物の使用方法を提供する。一例では、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤は、周囲温度で、適切なｐＨ及び所望の純度で、生理学的に許容される担体、すなわち、用いる用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性の担体と混合することによりガレヌス（ｇａｌｅｎｉｃａｌ）投与形態に製剤化されうる。製剤のｐＨは主に、特定の用途及び化合物の濃度に依存するが、好ましくは約３から約８までの範囲である。一例では、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤は、酢酸緩衝液中ｐＨ５で製剤化される。別の実施態様において、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤は無菌である。該化合物は、例えば、固体又は非晶質組成物として、凍結乾燥製剤として、又は水溶液として保存されてもよい。
【００９３】
組成物は、医療実施基準（good medical practice）にかなう方式で製剤化され、用量化され、投与される。この観点において考慮すべき要因は、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。投与される化合物の「有効量」又は「治療的有効量」は、そのような考慮事項によって決まり、ＰＣＳＫ９の立体構造を変化させて、それにより肝細胞によるＬＤＬの内部移行が増加して循環ＬＤＬ−Ｃのレベルが低下するように、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９  ＬＤＬＲ結合部位のアフィニティーを減少させるのに必要な最小量である。例えば、そのような量は、正常な細胞又は哺乳動物全体にとって毒性である量より少ないであろう。
【００９４】
一例では、１回投与当たり非経口投与での本発明の化合物の薬学的有効量は、１日あたり、患者の体重１ｋｇあたり約０．００１から１０００（例えば０．０１−１００）ｍｇ、あるいは１日あたり約０．１から２０ｍｇ／ｋｇであり、使用される化合物の典型的な初期範囲は０．３から１５ｍｇ／ｋｇ／日である。別の実施態様において、錠剤及びカプセルなどの経口単位剤形は、好ましくは約１から約１０００（例えば２５−１００）ｍｇの本発明の化合物を含有する。
【００９５】
本発明の化合物は、経口、局所（口腔及び舌下を含む）、直腸内、膣内、経皮、非経口、皮下、腹腔内、肺内、皮内、髄腔内及び硬膜外及び鼻腔内、並びに、必要に応じて局所治療、病巣内投与を含む任意の適切な方法により投与されうる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。
【００９６】
本発明の化合物は、例えば錠剤、粉末、カプセル、溶液、分散液、懸濁液、シロップ、スプレー、坐剤、ジェル、乳剤、パッチ等の任意の簡便な投与形態で投与することができる。このような組成物は、薬学的調製物における一般的な成分、例えば希釈剤、担体、ｐＨ調整剤、甘味料、増量剤及び追加の活性剤を含有しうる。
【００９７】
典型的な製剤は、本発明の化合物と担体又は添加剤とを混合することにより調製される。適切な担体及び添加剤は当業者によく知られており、例えばAnsel, Howard C., et al., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; Gennaro, Alfonso R., et al. Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; 及びRowe, Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Chicago, Pharmaceutical Press, 2005に詳細な記載がある。製剤はまた、薬物（すなわち本発明の化合物又はその薬学的組成物）を見栄え良く提供するため又は薬学的製品（すなわち医薬）の製造を補助するための、１種以上の緩衝液、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、平滑剤、乳化剤、懸濁化剤、保存料、酸化防止剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色料、甘味料、香料、香味料、希釈剤及びその他既知の添加剤を含んでもよい。
【００９８】
適切な経口剤形の一例は、約１０から約１０００（例えば９０−３００）ｍｇの無水ラクトース、約１から−１００（例えば５−４０）ｍｇのクロスカルメロースナトリウム、約１から１００（例えば５−３０）ｍｇのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）Ｋ３０、及び約０．１から１００（例えば１−１０）ｍｇのステアリン酸マグネシウムを配合した本発明の化合物を約１から約１０００（例えば２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ又は５００ｍｇ）含有する錠剤である。粉末成分は最初に混ぜ合わせ、次にＰＶＰの溶液と混合する。得られた組成物は、乾燥させ、顆粒化し、ステアリン酸マグネシウムと混合し、一般的な装置を使用して錠剤の形態に圧縮することができる。エアロゾル製剤の一例は、例えばリン酸緩衝液などの適切な緩衝液中に例えば１から１０００（例えば５−４００ｍｇ）の本発明の化合物を溶解させ、例えば塩化ナトリウムなどの塩といった等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）を必要に応じて添加することによって調製することができる。この溶液を、不純物及び混入物を除去するために、例えば０．２ミクロンのフィルターを用いて濾過してもよい。
【００９９】
したがって、ある実施態様には、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的組成物又は薬学的に許容されるその塩が含まれる。更なる実施態様では、薬学的に許容される担体又は添加剤と共に、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的組成物又は薬学的に許容されるその塩が含まれる。
【０１００】
別の実施態様には、療法によるヒト又は動物の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的組成物が含まれる。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬＲ利用能を増大させる方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施態様において、本発明は、血清ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施態様において、本発明は、コレステロール関連障害の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施態様では、本発明は、ＬＤＬ−Ｃの異常なレベルに関連する障害の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明は、ＬＤＬ−Ｃのレベルの上昇に関連する状態の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施態様では、本発明は、脂質異常症の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施態様において、本発明は、高コレステロール血症の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的組成物を提供する。
【０１０１】
適応症及び治療法
本発明の化合物は、ＰＣＳＫ９に結合するＰＣＳＫ９阻害剤である。いくつかの実施態様では、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９  ＬＤＬＲ結合部位のアフィニティーを減少させ、ＬＤＬの、例えば肝細胞による、内部移行が増加する。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の化合物、組成物及び方法は、循環ＬＤＬ−Ｃのレベルを下げるため、並びに高レベルの循環ＬＤＬ−Ｃに関連する疾患及び障害（例えば高コレステロール血症及び心血管疾患）を治療するために有用である。
【０１０２】
本明細書で提供されるＰＣＳＫ９阻害剤は、治療方法に使用されうる。
【０１０３】
一態様では、医薬としての使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤が提供される。別の態様では、コレステロール関連障害と関連する状態の治療における使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤が提供される。特定の実施態様において、ＬＤＬ−Ｃのレベルの上昇に関連する状態の治療における使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤が提供される。特定の実施態様において、治療の方法における使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤が提供される。特定の実施態様において、本発明は、個体に有効量のＰＣＳＫ９阻害剤を投与することを含む、ＬＤＬ−Ｃのレベルの上昇に関連する状態を有する個体を治療する方法にける使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法及び使用は、少なくとも１の付加的治療剤、例えばスタチンの有効量を個体に投与することを更に含む。特定の実施態様において、本発明は、対象におけるＬＤＬ−Ｃレベルを減少させることにおける使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。更なる実施態様において、本発明は、対象における血清ＬＤＬ−Ｃレベルを下げることにおける使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、対象におけるＬＤＬＲの利用能を増大させることにおける使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、対象におけるＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害することにおける使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬ−Ｃレベルを減少させるために個体に有効量のＰＣＳＫ９阻害剤を投与することを含む、個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルを減少させる方法における使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、血清ＬＤＬ−Ｃレベルを下げるために個体に有効量のＰＣＳＫ９阻害剤を投与することを含む、個体における血清ＬＤＬ−Ｃレベルを下げる方法における使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬＲの利用能を増大させるために個体に有効量のＰＣＳＫ９阻害剤を投与することを含む、個体におけるＬＤＬＲの利用能を増大させる方法における使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害するために個体に有効量のＰＣＳＫ９阻害剤を投与することを含む、個体におけるＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する方法における使用のためのＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。
【０１０４】
本明細書に記載の実施態様による「個体」又は「対象」は、好ましくはヒトである。
【０１０５】
更なる実施態様では、本発明は、医薬の製造又は調製におけるＰＣＳＫ９阻害剤の使用を提供する。一実施態様において、本医薬は、コレステロール関連障害の治療のためのものである。特定の実施態様において、コレステロール関連障害は、高コレステロール血症である。別の実施態様において、本医薬は、高コレステロール血症を有する個体に、本医薬の有効量を投与することを含む、高コレステロール血症を治療する方法における使用のためのものである。
【０１０６】
特定の実施態様では、本発明は、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を有効量の本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤と接触させることを含む、ＰＣＳＫ９の活性を調節するための方法を提供する。特定の実施態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害するための方法を提供する。特定の実施態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるＬＤＬＲの利用能を増大させるための方法を提供する。特定の実施態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルを下げる方法を提供する。特定の実施態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物を個体に投与することを含む、必要とする個体における血清ＬＤＬ−Ｃレベルを下げるための方法を提供する。特定の実施態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるコレステロール関連障害の治療のための方法を提供する。特定の実施態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃの異常なレベルに関連する障害の治療のための方法を提供する。特定の実施態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルの上昇に関連する状態の治療のための方法を提供する。特定の実施態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物を個体に投与することを含む、必要とする個体における脂質異常症の治療のための方法を提供する。特定の実施態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤又はその薬学的組成物を個体に投与することを含む、必要とする個体における高コレステロール血症の治療のための方法を提供する。特定の実施態様において、本発明は、療法によるヒト又は動物の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９の活性を調節する方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬＲ利用能を増大させる方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、血清ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、コレステロール関連障害の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様では、本発明は、ＬＤＬ−Ｃの異常なレベルに関連する障害の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施形態では、本発明は、ＬＤＬ−Ｃのレベルの上昇に関連する状態の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、脂質異常症の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、高コレステロール血症の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９の活性を調節するための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害するための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬＲの利用能を増大させるための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させるための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用を提供する。特定の実施態様において、本発明は、血清ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させるための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用を提供する。特定の実施態様において、本発明は、コレステロール関連障害の治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬ−Ｃの異常なレベルに関連する障害の治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＬＤＬ−Ｃレベルの上昇に関連する状態の治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用を提供する。特定の実施態様において、本発明は、脂質異常症の治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用を提供する。特定の実施態様において、本発明は、高コレステロール血症の治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤の使用を提供する。
【０１０７】
特定の実施態様において、治療される障害は、ＰＣＳＫ９活性の除去、阻害又は削減によって改善、寛解、阻害又は予防される任意の疾患又は障害である。特定の実施態様では、スタチンの使用により一般に対処可能（治療可能又は予防可能）な疾患又は障害もまた治療することができる。特定の実施態様において、コレステロール合成又はＬＤＬＲ発現の増加から恩恵を受けることが可能である障害又は疾患もまた、本発明のＰＣＳＫ９阻害剤により治療することができる。特定の実施態様において、本発明のＰＣＳＫ９阻害剤及び治療方法によって治療可能な個体には、ＬＤＬアフェレーシスが必要である個体、ＰＣＳＫ９活性化突然変異を有する個体（機能突然変異の獲得、「ＧＯＦ」）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症（ｈｅＦＨ）を有する個体、原発性高コレステロール血症を有する、スタチン不耐性又はスタチン非制御性の個体、及び予防的に処置されうる、高コレステロール血症を発症するリスクのある個体が含まれる。他の適応症には、２型糖尿病、胆汁うっ滞性肝疾患（原発性胆汁性肝硬変）、ネフローゼ症候群、甲状腺機能低下症、肥満などの二次的原因と関連する脂質異常症、並びにアテローム性動脈硬化症及び循環器系疾患の予防と治療が含まれる。特定の実施態様において、本明細書に記載のＰＣＳＫ９阻害剤及び治療方法によって治療可能な個体には、９０−２５０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ−Ｃレベルを有する個体、及び冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）又はＣＨＤリスク同等物を有する個体が含まれる。
【０１０８】
特定の実施態様において、本明細書に記載の方法は、冠状動脈性心疾患に罹患している個体にＰＣＳＫ９阻害剤を投与することを含む。特定の実施態様において、冠状動脈性心疾患を有する個体は、心筋梗塞の病歴を有する。特定の実施態様において、冠動脈性心疾患を有する個体は、過去に冠動脈血管再建術（例えば経皮的冠動脈インターベンション又は冠動脈バイパス術）を受けた個体を指す。特定の実施態様において、冠動脈性心疾患を有する個体とは、（例えば侵襲的冠動脈造影を含む冠動脈造影検査又は心臓コンピュータ断層撮影冠動脈造影（cardiac computed tomography coronary angiography） によって決定される）５０％の直径狭窄を有する少なくとも１つの冠動脈硬化性病変を有する個体を指す。
【０１０９】
特定の実施態様において、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つのＣＨＤリスク同等物を有する個体にＰＣＳＫ９阻害剤を投与することを含む。特定の実施態様において、ＣＨＤリスク同等物を有する個体は、臨床（clinical） 動脈硬化性疾患の１つ以上の形態、例えば末梢動脈疾患（例えば＜０．８５の足首／上腕血圧比、過去の経皮的又は外科的抹消動脈再建術、過去の末梢動脈疾患による下肢の非外傷性切断、又は過去の血管造影で≧５０％の直径狭窄）、頸動脈疾患（例えば≧５０％の直径狭窄を有する頸動脈硬化性病変、又は過去の皮膚（cutaneous）若しくは外科的頸動脈血管再建術）、過去虚血性脳卒中又は腹部大動脈瘤を有する個体である。特定の実施態様において、ＣＨＤリスク同等物を有する個体は、ＩＩ型糖尿病を持つ個体である。特定の実施態様において、ＣＨＤリスク同等物を有する個体は、臓器障害（例えば微量アルブミン尿を含む網膜症又は腎症）を伴うＩ型糖尿病を有する個体である。特定の実施態様において、ＣＨＤリスク同等物を有する個体は、中度から重度の慢性腎疾患を有する個体である。
【０１１０】
特定の実施態様において、本明細書に記載の方法は、次のリスク因子のうち１つ以上を有する個体にＰＣＳＫ９阻害剤を投与することを含む：年齢（男性４５歳以上、女性５５歳以上）、喫煙（１か月以内）、高血圧症（最高血圧１４０ｍｍＨｇ以上、最低血圧９０ｍｍＨｇ，以上又は降圧薬服用）、低ＨＤＬコレステロール（４０ｍｇ／ｄＬ未満）、又は早期ＣＨＤの家族歴。
【０１１１】
特定の実施態様において、本明細書に記載の方法及び使用は、少なくとも１の付加的治療剤、例えばスタチンの有効量を個体に投与することを更に含む。特定の実施態様において、本発明は、アテローム性動脈硬化症及び／又は循環器疾患を予防及び／又は治療するためである。特定の実施態様において、付加的治療剤は、心血管系イベントの再発のリスクを低減する方法における使用のためのものである。特定の実施態様において、付加的治療剤は、対象におけるＨＤＬコレステロールのレベルを上昇させるためのものである。
【０１１２】
更なる態様において、本発明は、例えば上述の任意の治療方法における使用のための、本明細書で提供される任意のＰＣＳＫ９阻害剤を含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される任意のＰＣＳＫ９阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される任意のＰＣＳＫ９阻害剤と、少なくとも１の付加的治療剤（例えばスタチン）とを含む。
【０１１３】
本発明のＰＣＳＫ９阻害剤は、単独で又は他の薬剤と組み合わせて治療において使用することができる。例えば、本発明のＰＣＳＫ９阻害剤は、少なくとも１の付加的治療剤と共投与されうる。特定の実施態様において、このような付加的治療剤は、ＬＤＬＲのレベルを上昇させる。特定の実施態様において、付加的治療剤は、ＬＤＬ−Ｃ低下薬、例えばスタチン（例えばアトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン）又はこれらの任意の組み合わせ（例えばバイトリン（登録商標）、アドビコール（登録商標）又はシムコ−ル（登録商標））である。特定の実施態様において、付加的治療剤は、ＨＤＬコレステロール上昇薬である。
【０１１４】
上記のこのような組み合わせ療法は、併用投与（２種以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）及び個別投与（本発明のＰＣＳＫ９阻害剤の投与が付加的治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時及び／又は投与の後に起きうる）を包含する。
【０１１５】
特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースラインから少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％又は少なくとも約６０％低下する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースラインから少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％又は少なくとも約６０％低下し、最後の投与後少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月又は３ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、初回投与から約１週間、約１０日又は約２週間以内にベースラインから少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％又は少なくとも約６０％低下する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、初回投与から約１週間、約１０日又は約２週間以内にベースラインから少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％又は少なくとも約６０％低下し、最後の投与後少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月又は３ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、少なくとも約４５％低下し、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間又は少なくとも約１．５ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、初回投与から約１週間以内に少なくとも約４５％低下し、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間又は少なくとも約１．５ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、少なくとも約５０％低下し、少なくとも約４週間又は少なくとも約１ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、初回投与から約１０日以内に少なくとも約５０％低下し、少なくとも約４週間又は少なくとも約１ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、少なくとも約５０％低下し、少なくとも約８週間又は少なくとも約２ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、初回投与から約１０日以内に少なくとも約５０％低下し、少なくとも約８週間又は少なくとも約２ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、少なくとも約５５％低下し、少なくとも約２週間にわたって低下したレベルを維持する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、初回投与から約２週間以内に少なくとも約５５％低下し、少なくとも約２週間にわたって低下したレベルを維持する。
【０１１６】
特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースラインから少なくとも約６０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも約７０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも約７５ｍｇ／ｄＬ、少なくとも約８０ｍｇ／ｄＬ又は少なくとも約９０ｍｇ／ｄＬ低下する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースラインから少なくとも約６０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも約７０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも約７５ｍｇ／ｄＬ、少なくとも約８０ｍｇ／ｄＬ又は少なくとも約９０ｍｇ／ｄＬ低下し、最後の投与後少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月又は３ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、初回投与から約１週間、約１０日間又は約２週間以内にベースラインから少なくとも約６０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも約７０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも約７５ｍｇ／ｄＬ、少なくとも約８０ｍｇ／ｄＬ又は少なくとも約９０ｍｇ／ｄＬ低下する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、初回投与から約１週間、約１０日間、又は約２週間以内にベースラインから少なくとも約６０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも約７０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも約７５ｍｇ／ｄＬ、少なくとも約８０ｍｇ／ｄＬ又は少なくとも約９０ｍｇ／ｄＬ低下し、最後の投与後少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月又は３ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、少なくとも約６０ｍｇ／ｄＬ又は７０ｍｇ／ｄＬ低下し、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間又は少なくとも約１．５ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、初回投与から約１週間以内に少なくとも約６０ｍｇ／ｄＬ又は７０ｍｇ／ｄＬ低下し、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間又は少なくとも約１．５ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、少なくとも約８０ｍｇ／ｄＬ低下し、少なくとも約４週間又は少なくとも約１ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、初回投与から約１０日以内に少なくとも約８０ｍｇ／ｄＬ低下し、少なくとも約４週間又は少なくとも約１ヶ月間にわたって低下したレベルを維持する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、少なくとも約９０ｍｇ／ｄＬ低下し、少なくとも約２週間にわたって低下したレベルを維持する。特定の実施態様において、本明細書に記載の方法により治療される個体におけるＬＤＬ−Ｃレベルは、初回投与から約２週間以内に少なくとも約９０ｍｇ／ｄＬ低下し、少なくとも約２週間にわたって低下したレベルを維持する。
【０１１７】
特定の実施態様において、ＬＤＬ−Ｃレベルの低下は、投与と投与の間一定の範囲内に維持される。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９阻害剤の１回分を投与すると、ＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースラインから少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％又は少なくとも約６０％の最下点まで低下し、ＰＣＳＫ９阻害剤の次の投与前にベースライン以下約４０％、４５％、５０％、５５％又は６０％を超えて増加することはない。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９阻害剤の１回分を投与すると、ＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースラインから少なくとも約４５％の最下点まで低下し、ＰＣＳＫ９阻害剤の次の投与前にベースライン以下約４０％又は４５％を超えて増加することはない。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９阻害剤の１回分を投与すると、ＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースラインから少なくとも約５０％の最下点まで低下し、ＰＣＳＫ９阻害剤の次の投与前にベースライン以下約４０％、４５％又は５０％を超えて増加することはない。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９阻害剤の１回分を投与すると、ＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースラインから少なくとも約５５％の最下点まで低下し、ＰＣＳＫ９阻害剤の次の投与前にベースライン以下約４０％、４５％、５０％又は５５％を超えて増加することはない。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９阻害剤の１回分を投与すると、ＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースラインから少なくとも約６０％の最下点まで低下し、ＰＣＳＫ９阻害剤の次の投与前にベースライン以下約４０％、４５％、５０％、５５％又は６０％を超えて増加することはない。
【０１１８】
特定の実施態様において、ＬＤＬ−Ｃレベルの低下は、投与と投与の間一定の範囲内に維持される。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９阻害剤の１回分を投与すると、ＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースラインから少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％又は少なくとも約６０％の最下点まで低下し、ＰＣＳＫ９阻害剤の次の投与前にベースライン以下約４０％、４５％、５０％、５５％又は６０％を超えて増加することはない。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９阻害剤の１回分を投与すると、ＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースライン以下少なくとも約６０ｍｇ／ｄＬの最下点まで低下し、ＰＣＳＫ９阻害剤の次の投与前にベースライン以下約５５ｍｇ／ｄＬ又は６０ｍｇ／ｄＬを超えて増加することはない。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９阻害剤の１回分を投与すると、ＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースライン以下少なくとも約７０ｍｇ／ｄＬの最下点まで低下し、ＰＣＳＫ９阻害剤の次の投与前にベースライン以下約５５ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、６５ｍｇ／ｄＬ又は７０ｍｇ／ｄＬを超えて増加することはない。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９阻害剤の１回分を投与すると、ＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースライン以下少なくとも約７５ｍｇ／ｄＬの最下点まで低下し、ＰＣＳＫ９阻害剤の次の投与前にベースライン以下約５５ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、６５ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ又は７５ｍｇ／ｄＬを超えて増加することはない。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９阻害剤の１回分を投与すると、ＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースライン以下少なくとも約８０ｍｇ／ｄＬの最下点まで低下し、ＰＣＳＫ９阻害剤の次の投与前にベースライン以下約５５ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、６５ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、７５ｍｇ／ｄＬ又は８０ｍｇ／ｄＬを超えて増加することはない。特定の実施態様において、ＰＣＳＫ９阻害剤の１回分を投与すると、ＬＤＬ−Ｃレベルは、ベースライン以下少なくとも約９０ｍｇ／ｄＬの最下点まで低下し、ＰＣＳＫ９阻害剤の次の投与前にベースライン以下約５５ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、６５ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、７５ｍｇ／ｄＬ、８０ｍｇ／ｄＬ又は９０ｍｇ／ｄＬを超えて増加することはない。
【０１１９】
製造品及びキット
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品又はキットが提供される。特定の実施態様において、製造品又はキットは、本明細書に記載の１以上のＰＣＳＫ９阻害剤又は組成物を収容する容器を備える。特定の実施態様において、製造品又はキットは、容器と容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書とを備える。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されていてよい。容器は、単独の組成物、又は状態の治療、予防及び／若しくは診断に有用な別の組成物と組み合わせた組成物を保持する。該組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明のＰＣＳＫ９阻害剤である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示す。更に、製造品又はキットは、（ａ）本発明のＰＣＳＫ９阻害剤を含む組成物を中に収容する第１の容器、及び（ｂ）更なる治療剤含む組成物を中に収容する第２の容器を備えうる。特定の実施態様において、第２の容器は第２の治療剤を含み、ここで第２の治療剤は「スタチン」クラスのコレステロール低下薬である。特定の実施態様において、スタチンは、アトルバスタチン（例えばリピトール（登録商標）又はトルバスト（Ｔｏｒｖａｓｔ））、フルバスタチン（例えばレスコール）、ロバスタチン（例えばメバコール（登録商標）、オルトコール（ＡＬＴＯＣＯＲ）TM又はオルトプレブ（ＡＬＴＯＰＲＥＶ）（登録商標））、メバスタチン（ピタバスタチン（例えばリバロ（登録商標）又はピタバ（登録商標））、プラバスタチン（例えばプラバコール（登録商標）、セレクチン（登録商標）、リポスタット（ＬＩＰＯＳＴＡＴ）（登録商標））、ロスバスタチン（例えばクレストール（登録商標））、シンバスタチン（例えばゾコル（登録商標）、リペックス（登録商標））、又はこれらの組み合わせ、例えばバイトリン（登録商標）、アドビコールアドビコール（登録商標）若しくはシムコ−ル（登録商標）であり、かつ／又はこれらを含む。
【０１２０】
本発明の本実施態様における製造品又はキットは、組成物を用いて特定の状態を治療することができることを示す添付文書を更に含んでいてもよい。
【実施例】
【０１２１】
本発明は以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。但し、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１２２】
実施例１：ＬＤＬＲ結合部位に隣接する、ＣＳＫ９触媒ドメイン上のアクセス可能な溝（「Ｎ末端溝」）の同定
[Ｆａｂ３３：ＰＣＳＫ９複合体の結晶構造]
Ｆａｂ３３：ＰＣＳＫ９複合体の結晶構造は、Ｗｕら（米国特許第９２６６９６１号）によって報告された。それは、Ｆａｂ３３がその重及び軽鎖を介してＬＤＬＲ結合部位に結合することを示している（図１）。具体的には、ＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２、−Ｈ３、−Ｌ１及び−Ｌ３からの１つ以上のアミノ酸残基は、ＰＣＳＫ９の原子の４Å以内にある。更に、重鎖残基Ｔｈｒ７３もＰＣＳＫ９の４Å以内に見出される。ａｂ３３の任意の原子の４Å以内のＰＣＳＫ９アミノ酸残基のセットは、ＬＤＬＲのＥＧＦＡドメインの４Å以内にもある残基を含む（Kwon et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 12; 105(6): (1820-1825）。Ｆａｂ３３  ＣＤＲ−Ｈ２ループは、ＰＣＳＫ９のＥＧＦＡ結合部位  と相互作用しない（Kwon et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 12; 105(6): 1820-1825）（重鎖残基Ａｒｇ５０を除く）が、図３に示すように、ＰＣＳＫ９触媒ドメインのＮ末端ヘリックスである「Ｐ’ヘリックス」（およそＳ１５３−Ｔ１６２残基）を通常有するＰＣＳＫ９のＮ末端溝（図２）へと延びる。蛋白質構造（ＰＤＢ）に寄託されたＰＣＳＫ９の構造は、同じ立体構造（例えばＰＤＢ  ２Ｐ４Ｅ、２ＰＭＷ、２ＱＴＷ、３ＢＰＳ、ＧＣＷ、３ＧＣＸ、Ｈ４２、３ＳＱＯ、４Ｋ８Ｒ）でＮ末端溝に収納されているＰ’ヘリックスを揃って示す。Ｆａｂ３３：ＰＣＳＫ９構造では、Ｐ’ヘリックスの電子密度は見つからなかった。しかし、Ｐ’ヘリックスが通常位置するスペースの一部を占めるＦａｂ３３  ＣＤＲ−Ｈ２ループには、明らかな電子密度があった。この観察結果は、Ｆａｂ３３がいったんＰＣＳＫ９に結合されると、大きな立体衝突のためにＰ’ヘリックスがもはやＮ末端溝に結合することができないことを明確に示した。Ｆａｂ３３はＰ’へリックスを置換し、高い結合アフィニティーでＰＣＳＫ９と結合することができたため、Ｐ’へリックスは、Ｎ末端溝にしっかりと結合していないことが更に示唆された。抗体３３／ＰＣＳＫ９の解離定数（Ｋｄ）値は、０．４ｎＭ（米国特許第９２６６９６１号）であった。Ｎ末端溝の方を向くＣＤＲ−Ｈ２ループは、結合エネルギーに寄与しているようには見えなかった。最も近いＰＣＳＫ９溝残基はＨ３９１であり、ＣＤＲ−Ｈ２残基Ｎ５４から３．８Å離れており、この距離は水素結合とみなすには大きすぎる。分子解析プログラムＰＹＭＯＬＴＭを用いて、４Åの基準を適用した。Ｆａｂ３３の任意の部分の４Å以内のＰＣＳＫ９残基をエピトープとして決定した。分析に基づいて、エピトープは、ヒトＰＣＳＫ９の残基Ｒ１９４、Ｅ１９５、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｇ２４０、Ａ３４１、Ｑ３４２、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｉ３６９、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９及びＨ３９１の１つ又は複数を含む。
【０１２３】
[混入プロテアーゼによるＰ’ヘリックスの切断]
結晶化条件が再現された生化学的アッセイでは、混入しているプロテアーゼがＦａｂ３３：ＰＣＳＫ９複合体のＰ’ヘリックスを切断することがわかった。この切断は、４８時間のインキュベーション時間にわたって高濃度のＦａｂ３３：ＰＣＳＫ９複合体でのみ起こり、ＰＣＳＫ９それ自体は切断されなかったため、Ｆａｂ３３の存在に依存した。切断部位はＮ末端配列決定によってＲ１６５−Ｙ１６６と同定され、これは、混入プロテアーゼが例えばトリプシン折り畳みセリンプロテアーゼファミリーのメンバーのようにＡｒｇ特異性を有することを示唆する。したがって、セリンプロテアーゼ阻害剤を切断条件下で試験した。切断を容易に決定するために、合成Ｎ末端ペプチド１５３ＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡ１６８に対して産生させたポリクローナルウサギ抗体を用いて、ウェスタンブロット法を実施した。この抗体は、インタクトなＮ末端ペプチド配列のみを検出し、切断型は検出しなかった。切断はセルピンアンチトロンビンＩＩＩ（セルピンＣ１）によって防がれ、クニッツドメイン阻害剤アプロチニンによってある程度防がれたことが見出された（図４及び５）。よりエラスターゼ特異的なアルファ１−アンチトリプシン（セルピンＡ１）は切断を阻害しなかった（図４及び５）。
【０１２４】
Ａｂ３３は、Ｐ’ヘリックスの切断が観察される濃度をはるかに下回る濃度（表２では＞１４．５ｍｇ／ｍＬ  Ｆａｂ３３＝２９０μＭ）でＰＣＳＫ９に結合する（Ｋｄ  ０．４ｎＭ；米国特許第９２６６９６１号）。したがって、Ｆａｂ３３の結合はＰ’ヘリックスの切断に依存しているわけでも、それに続いて起こるわけでもないと結論付けられた。むしろ結果は、Ｐ’へリックスの切断がＦａｂ３３結合の結果であり、その前提条件ではないことを示唆した。この発見は更に、Ｐ’へリックスが本質的に不安定であり、溝結合（「イン」の）立体構造と放出（「アウト」の）立体構造との間で遷移する可能性があることを意味していた。
【０１２５】
[ＦＸＩａ切断アッセイ]
Ｐ’ヘリックスの固有の不安定性についての更なるエビデンスを提供するために、生化学的アッセイが設定された。トリプシン様セリンプロテアーゼパネルを試験し、結晶化条件下で観察されたものと同様の、Ｐ’ヘリックスを切断することができるプロテアーゼを同定した。プロテアーゼを抗体３Ｄ５の存在下又は非存在下で低濃度のＦａｂ３３：ＰＣＳＫ９複合体と共にインキュベートした。３Ｄ５  Ａｂは、ＰＣＳＫ９の「フリン切断ループ」に結合し、プロテアーゼ切断に非常に敏感な２つのアルギニン残基、Ｒ２１５とＲ２１８における切断を防止する（Lipari et al. J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91）。〜５５ｋＤａバンドの出現によって示されるように、プロテアーゼヘプシン及びＦＸＩａが「フリン切断ループ」を切断すること、また、この切断は３Ｄ５によって妨げられたことが見出された（図６）。更に３Ｄ５の存在下では、ＦＸＩａとヘプシンの双方が、イムノブロットで示されるように、Ｐ’ヘリックス又はその近辺で切断した（図６）。
【０１２６】
更なる実験において、前述のＰＣＳＫ９突然変異体ＰＣＳＫ９−Ｒ２１５Ａ：Ｒ２１８Ａ（＝ＰＣＳＫ９−ＡＡ）（Lipari et al. J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91）（ここで「フリン切断ループ」残基はアラニンに変更されている）が、感受性残基Ｒ２１５及びＲ２１８でのプロテアーゼ切断を防ぐために使用された。Ｆａｂ３３：ＰＣＳＫ９−ＡＡ複合体と共にインキュベートした場合、実はＦＸＩａはもはや「フリン切断ループ」を切断しないことが見出された。Ｎ末端配列決定により、ＦＸＩａはＲ１６０−Ｉ１６１のＰ’ヘリックス内及びＲ１６７−Ａｌａ１６８のＰ’ヘリックス下流で切断することが明らかになった。したがって、ＦＸＩａ切断を特異的にＰ’アルファヘリックス残基Ｒ１６０に向けるために、三重変異体ＰＣＳＫ９−Ｒ１６７Ａ：Ｒ２１５Ａ：Ｒ２１８Ａ（＝ＰＣＳＫ９−ＡＡＡ）が作製された。ＬＤＬＲ外部ドメイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対するＰＣＳＫ９−ＡＡＡとＰＣＳＫ９−ＡＡの結合アフィニティーは、記載のようにバイオレイヤー干渉法によって決定した（Lipari et al. J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91）。ＰＣＳＫ９−ＡＡＡは、ＰＣＳＫ９−ＡＡについて測定された２６０ｎＭのＫｄと同様の、２１４ｎＭのＫｄ値で結合した（図７）。これらの値は、同じバイオレイヤー干渉法を用いて、野生型ＰＣＳＫ９について以前に報告された１３０ｎＭ及び１７０ｎＭのＫｄ値（Lipari et al. J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91）に近かった。ゆえに、３つの突然変異の導入は、ＬＤＬＲ結合を有意に損なわなかった。
【０１２７】
ＰＣＳＫ９−ＡＡＡを用いたＦＸＩａアッセイでは、Ｐ’ヘリックスは時間依存的に切断され、４８時間後に完全な切断が達成された（図８）。Ｎ末端配列決定により、切断がＲ１６０−Ｉ１６１で起こったことが確認された。更に、ＰＣＳＫ９−ＡＡＡは、ＦＰＲ−クロロメチルケトンでの処理によって不活性化されていたＦＸＩａによって切断されず、活性ＦＸＩａ形態を用いたＲ１６０−Ｉ１６１での観察された切断が特異的であったことを示している。Ｒ１６０のＰ１残基としての認識（Schechter and Berger, Biochem Biophys Res Commun. 1968 Sep 6;32(5):898-902による命名法）は、トリプシン折り畳みセリンプロテアーゼとしての既知のＦＸＩａ特異性と一致した。ＰＣＳＫ９結晶構造（例えばＰＤＢ  ２ＱＴＷ）は、Ｒ１６０がＰ’ヘリックス内にあり、かつ、部分的に埋め込まれており、したがってＦＸＩａの活性部位にアクセスできないことを示す。したがって、ＦＸＩａがＲ１６０−Ｉ１６１切断を触媒するためには、Ｐ’へリックスが溝から出て完全に異なる立体構造をとる必要がある。トリプシン折り畳みセリンプロテアーゼの確立された基質認識の概略図によれば、基質Ｐ４−Ｐ１残基、すなわちＰＣＳＫ９の場合には１５７ＮＬＥＲ１６０は、伸びたベータ鎖立体構造で活性部位に提示され、Ｐ１−Ｐ４残基がベータ鎖Ｈ結合とプロテアーゼＳ１−Ｓ４サブサイトとの相互作用に関与する（Perona and Craik, Protein Sci. 1995 Mar;4(3):337-60）。この相互作用は、触媒的切断のために、切断しやすい結合、すなわちＰＣＳＫ９中のＲ１６０−Ｉ１６１を適切に配置するのに役立つ。これは、Ｐ’ヘリックスが一度溝の外に出ると、ＦＸＩａの活性部位と相互作用するときに伸びた非ヘリックス構造をとることができることを意味する。
【０１２８】
更に、ＰＣＳＫ９−ＡＡＡへのＦａｂ３３の添加は、ＦＸＩａによる切断反応を劇的に加速した。切断は０．５時間でほぼ完了し、６時間で完了した（図９）。Ｆａｂ３３：ＰＣＳＫ９複合体の構造は、この結果を説明するための基礎を提供する。すなわち、Ｎ末端の溝部位をＣＤＲ−Ｈ２ループで占領する際に、結合したＦａｂ３３はしたがって、タンパク質分解性に感受性のある「アウト」の立体構造でＰ’ヘリックスを保つ。直交法では、ＰＣＳＫ９−ＡＡＡをＦＸＩａへの曝露の前にＥＧＦＡ−Ｆｃ又はＰｅｐ２−８と共にインキュベートした。ＥＧＦＡドメインとＰｅｐ２−８の双方がＰ’へリックスとの結合相互作用に関与し、その安定化をもたらす。ＰＣＳＫ９−Ｓｅｒ１５３はＥＧＦＡ−Ａｓｐ２９９側鎖と２．９Åの塩橋相互作用をし、ＰＣＳＫ９−Ｐｒｏ１５５はＥＧＦＡ−Ｌｅｕ２９８とファンデルワース接触をする（Bottomley et al., J Biol Chem. 2009 Jan 9;284(2):1313-23; Kwon et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 12; 105(6): (1820-1825）。同様に、Ｐｅｐ２−８残基Ｗ６は、ＰＣＳＫ９−Ｐｒｏ１５５とファンデルワース接触をする（Zhang et al., J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55）。したがって、堆積結晶構造（例えばＰＤＢ  ２Ｐ４Ｅ、２ＰＭＷ、２ＱＴＷ、３ＢＰＳ、３ＧＣＷ、３ＧＣＸ、３Ｈ４２、３ＳＱＯ、４Ｋ８Ｒ）に見られるように、溝結合「イン」立体構造のＰ’ヘリックスを安定化することによって、ヘリックス残基Ｒ１６０は、部分的に埋められたままであるため、ＦＸＩａ切断に対して抵抗性がある。実際、どちらの試薬もＦＸＩａによるＰ’ヘリックスの切断の大部分を妨げた（図１０及び１１）。４８時間インキュベートしても、ＰＣＳＫ９の大部分は依然インタクトなままであった（図１０及び１１）。コントロールペプチドは、切断を阻害せず、緩衝液コントロール、すなわち試薬添加なしのＦＸＩａ単独と同様の結果を与えた（図１１）。
【０１２９】
図１２のモデルに示すように、この知見は、Ｐ’ヘリックスが本質的に不安定であり、「イン」と「アウト」の状態の間で平衡状態にあるという見解をサポートしている。ＦＸＩａによる切断を受けやすくなるのは、「アウト」の立体構造である。ＦＸＩａはそれ自体では遅い速度ではあるがＲ１６０−Ｉ１６１ペプチド結合においてＰ’へリックスを切断することができ、平衡は主に「イン」状態にあることを示唆している。しかしながら、Ｆａｂ３３を添加することによって平衡を「アウト」状態にシフトさせることは、切断反応の速度を劇的に増加させた。重要なことに、このモデルは、Ｎ末端溝が例えばペプチド又は有機分子などの化合物にアクセス可能であり得ることを意味する。溝に結合すると、このような化合物は、Ｆａｂ３３について観察されたように、Ｐ’ヘリックスを「放出された」立体構造中に維持することができる。Ｐ’へリックス領域に変異を有するＰＣＳＫ９変異体のＬＤＬＲ結合の減少によって証明されるように、これはＬＤＬＲ結合の不安定化をもたらす可能性があった（Bottomley et al., J Biol Chem. 2009 Jan 9;284(2):1313-23）。重要なことに、Ｎ末端溝はＬＤＬＲ結合部位の近位であるため、溝結合化合物は、化合物とＬＤＬＲ−ＥＧＦＡドメインとの間の立体的衝突のために、ＰＣＳＫ９に結合するＬＤＬＲを直接アンタゴナイズすることによって、競合阻害剤となりうる（図１２）。
【０１３０】
方法
[結晶化条件下でのＰＣＳＫ９切断及びアンチトロンビンＩＩＩによる阻害]
（表２に示すように）３つの異なる濃度のＦａｂ３３：ＰＣＳＫ９複合体又はＰＣＳＫ９単独を５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール中で室温で４８時間インキュベートした。試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ＿の後、ＰＣＳＫ９触媒ドメインとＣｙｓリッチドメイン（ＣＲＤ）とを含む６０ｋＤａのバンドをＮ末端配列決定によって分析し、結果を表２に報告した。
表２
2019523235.tif 000018
【０１３１】
阻害実験のために、Ｆａｂ３３：ＰＣＳＫ９複合体（１９．８ｍｇ／ｍＬのＦａｂ３３、１３．２ｍｇ／ｍＬのＰＣＳＫ９）を、セルピンアンチトロンビンＩＩＩ及びアルファ１−アンチトリプシン（各１５０μＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共に、又は５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール中クニッツドメイン阻害剤アプロチニン（１．５ｍＭ）（ロッシュ）と共に室温で９日間インキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ｉＢｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてニトロセルロース膜に転写した。その後タンパク質を、ｉＢｉｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ＰＣＳＫ９Ｎ末端ペプチド（１５３ＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡ１６８）に対して産生させたポリクローナルウサギ抗体（１：３０００）、続いてＨＲＰコンジュゲートロバ抗ウサギ抗体（１：５０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でプローブした。ＰＣＳＫ９シグナルをＥＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって検出し、オートラジオグラフィーによって可視化した。ＰＣＳＫ９Ｎ末端ペプチド１５３ＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡ１６８に対するポリクローナルウサギ抗体は、ＫＬＨへのコンジュゲーションのためにＮ末端に余分のＣｙｓ残基を含む合成ペプチドＣＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡでウサギを免疫することによって生成された。樹脂固定化ペプチドＣＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡ（カリフォルニア州サンフランシスコのＹｅｎＺｙｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＬＬＣ）でのアフィニティークロマトグラフィーを用いてウサギ血清からポリクローナル抗体ＩｇＧを精製した。
【０１３２】
[セリンプロテアーゼパネルによるＰＣＳＫ９切断]
プロテアーゼヘプシン（Lipari et al. J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91）、アルファ−トロンビン、ＦＸａ、ＦＸＩａ、活性化プロテインＣ（バーモント州のＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＦＸＩＩａ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＣａＣｌ２中、抗体Ｄ５（４μＭ）の有無にかかわらず、Ｆａｂ３３（４μＭ）と複合体を形成した３μＭのＰＣＳＫ９と共に室温で６時間、５０ｎＭの濃度でインキュベートした。３Ｄ５抗体は、Ｌｉｐａｒｉらによって記載されており（J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91）、２つの残基Ｒ２１５及びＲ２１８を含む、ＰＣＳＫ９の表面に露出した「フリン切断ループ」に結合する。これらの２つの残基は、例えばフリン及びヘプシなどのＡｒｇ特異的プロテアーゼによる切断をうけやすい（Lipari et al. J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91）。この部位におけるいかなる切断も防ぐために、３Ｄ５抗体をこの実験に含めた。試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、６０ｋＤａのＰＣＳＫ９バンドをＮ末端配列決定により分析し、ウェスタンブロット法を上記のようにＰＣＳＫ９Ｎ末端ペプチド抗体を用いて実施した。
【０１３３】
[ＦＸＩａ切断アッセイ]
ＰＣＳＫ９−Ｒ１６７Ａ：Ｒ２１５Ａ：Ｒ２１８Ａ（＝ＰＣＳＫ９−ＡＡＡ）は、変異体ＰＣＳＫ９−Ｒ２１５Ａ：Ｒ２１８Ａ（Lipari et al. J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91）に基づき、部位特異的突然変異誘発を用いて突然変異Ｒ１６７Ａを加えることにより構築された。コンストラクトをＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、公表されている手順に従って精製した（Zhang et al. J. Mol. Biol. 422: 685-96, 2012; Zhang et al. J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014）。ＥＧＦＡ−Ｆｃの発現及び精製は、ZhangらJ. Mol. Biol. 422: 685-96, 2012に記載された。ペプチドＰｅｐ２−８（Ａｃ−ＴＶＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＮＨ２）及びコントロールペプチドＰｅｐ２−８−ｃｔｒｌ（Ａｃ−ＴＶＡＴＳＡＥＥＹＬＬＷＶ−ＮＨ２）は、Ｚｈａｎｇらにより2012J. Mol. Biol. 422: 685-96, 2012に記載されている。
【０１３４】
ＰＣＳＫ９−ＡＡＡ変異体（２．６μＭ）をトリス緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）中５０ｎＭ  ＦＸＩａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に、示されている期間、室温でインキュベートした。Ｆａｂ３３、ＥＧＦＡ−Ｆｃ及びＰｅｐ２−８を用いた実験では、５．２μＭのＰＣＳＫ９−ＡＡＡを、Ｆａｂ３３（８μＭ）又はＥＧＦＡ−Ｆｃ（８μＭ）又はＰｅｐ２−８（８μＭ）又はトリス緩衝液中コントロールペプチドＰｅｐ２−８−ｃｔｒｌ（８μＭ）のいずれかの存在下で、示されている期間インキュベートした。試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ｉＢｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。その後タンパク質を、ｉＢｉｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ＰＣＳＫ９Ｎ末端ペプチド（１５３ＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡ１６８）に対して産生させたポリクローナルウサギ抗体（１：３０００）、続いてＨＲＰコンジュゲートロバ抗ウサギ抗体（１：５０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でプローブした。ＰＣＳＫ９シグナルをＥＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって検出し、オートラジオグラフィーによって可視化した。
【０１３５】
実施例２：ファージディスプレイによるＰＣＳＫ９溝結合ペプチドの操作
結果
以前は、ＰＣＳＫ９触媒ドメインの最初の１３残基であり、溝結合Ｐ’ヘリックスを含むＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲ（Ｎ１３と称される）のナイーブファージペプチドライブラリー又はソフトランダム化ファージペプチドライブラリーのいずれかを用いてＰＣＳＫ９Δヘリックスに対してパンニングすることが試みられた。しかしながら、こうしたあらゆる努力も、ＰＣＳＫ９又はＰＣＳＫ９Δヘリックスに結合することができるいかなる溝結合ペプチドリガンドも生じさせることはできなかった。
【０１３６】
ＰＣＳＫ９のＮ末端溝に結合するペプチドを見出すための別のアプローチでは、ＰＣＳＫ９上のＬＤＬＲ結合部位に結合する、以前に発見されたＰｅｐ２−８に基づいて伸長ペプチド戦略が追求された。Ｐｅｐ２−８は、ＥＧＦ（Ａ）ドメインとＰＣＳＫ９の間の相互作用を模倣するミニマリスト（minimalist）ペプチドリガンドである（Zhang et al. J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014）。ＰＣＳＫ９上のＮ末端溝はＥＧＦ（Ａ）結合部位のすぐ隣にある。Ｐｅｐ２−８のＣ末端は、Ｎ末端溝の方向を向き、Ｐｅｐ２−８のＣ末端とＰＣＳＫ９触媒ドメイン（Ｓ１５３）のＮ末端の間の距離は、〜９Åである。Ｐｅｐ２−８を使用して、アミノ酸リンカーによってＰｅｐ２−８のＣ末端に融合した完全にランダム化されたファージペプチドライブラリーを用い、溝内へのペプチド伸長を見出した。Ｐｅｐ２−８とペプチドライブラリーとの間の最適なリンカーは、「ＧＳＧ」の３残基のストレッチであることがわかった（データは示さず）。
【０１３７】
Ｐｅｐ２−８は０．７μＭのＫｄでＰＣＳＫ９に結合する（Zhang et al. J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014）。ファージディスプレイされたＰｅｐ２−８（ｐ８上）は、ＰＣＳＫ９とＰＣＳＫ９Δヘリックスの双方に非常に強く結合し、拡張ライブラリーとのアフィニティー改善の余地を残さなかった。相互作用を弱めるために、単一のバリン２からアラニンへの突然変異（Ｐｅｐ２−８Ｖ２Ａ）がＰｅｐ２−８に導入されたが、これは、アフィニティーを約１０分の１に低下させることが既に分かっていた（Zhang et al. J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014）。一致して、ファージディスプレイされたＰｅｐ２−８Ｖ２Ａは、低いアフィニティーでＰＣＳＫ９に結合し、アフィニティー改善を検出するための十分な余地を残した（図１３）。しかしながら、このファージは、ＰＣＳＫ９Δヘリックスには結合しなかった（図１３）。そのため、Ｐｅｐ２−８Ｖ２Ａをファージライブラリーのアンカー配列として使用した。ファージライブラリーは、「ＧＳＧ」リンカーを介してＰｅｐ２−８Ｖ２ＡのＣ末端に融合した８−１６アミノ酸の範囲の長さを有する完全にランダム化されたペプチドライブラリーであった（ＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶ−ＧＳＧ−（ＮＮＫ）８−１６）。
【０１３８】
溶液選別のための標準的なプロトコールに従って、ファージライブラリーをＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスの双方に対して４ラウンドパンニングした（Zhang et al. J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014）。Ｐｅｐ２−８Ｖ２Ａ単独と比較して改善されたアフィニティーを有する何百もの結合剤が見出された。これらのペプチドは、配列モチーフの保存に基づいて複数のカテゴリーに分類することができた（図１４及び１５）。１つのモチーフカテゴリーは、Ｎ１３と高度に相同性であった（図１４）。
【０１３９】
アンカー配列（Ｐｅｐ２−８Ｖ２Ａ）とリンカー中の最初のＧｌｙを欠失させることによって１００を超えるファージ融合結合剤を再フォーマットし、それらをＭ１３ファージメジャーコートタンパク質ｐ８上にディスプレイした。これらのファージクローンのほとんどは、ＰＣＳＫ９とＰＣＳＫ９Δヘリックスの双方への結合シグナルを失った。１７個のファージ由来ペプチドは、ＰＣＳＫ９とＰＣＳＫ９Δヘリックスの双方に対して弱い結合を保持した（図１６）。これらのペプチドは、前述のソフトランダム化戦略を用いて更にアフィニティー成熟した。１７のペプチド全てについてのソフトランダム化ライブラリーをプールし、標準的プロトコールに従ってＰＣＳＫ９とＰＣＳＫ９Δヘリックスの双方に対してパンニングした（Tonikian et al. Nat Protoc. 2007;2(6):1368-86）。４ラウンドのパンニングの後、５倍の濃縮が観察され、強い結合シグナルを有する１０個の陽性クローンをスポットファージＥＬＩＳＡスクリーニングによって同定することができた（図１７）。これらの１０個のペプチドのうち７個はＮ１３のコア配列に相同なＰＷＮＬＸＲＩＸモチーフを含み、これらの融合ペプチドの改善された結合アフィニティーは確かに伸長ペプチドにより新たに創出された溝相互作用によるものであることを示唆する。また、１０個のヒットのうち７つのヒットは、ジスルフィド結合を含んでいた。
【０１４０】
これらのペプチドのうちの６つ（図１８のＫ９ｇｖｐｅｐ１、４、５、６、７及び８）を合成し、標準的なファージ競合ＥＬＩＳＡで試験した。保存されたＰＷＮＬＸＲＩＸモチーフを有する４つのペプチドは、ＰＣＳＫ９とＰＣＳＫ９Δヘリックスの双方に対して、低いμＭ又はμＭ以下の範囲のＩＣ５０でそれらのファージ対応物と競合することができた（図１８）。Ｎ末端溝へのそれらの予測された結合と一致して、これら４つのペプチド（Ｋ９ｇｖｐｅｐ１、Ｋ９ｇｖｐｅｐ４、Ｋ９ｇｖｐｅｐ７、Ｋ９ｇｖｐｅｐ８）はＰＣＳＫ９へのファージディスプレイされたＰｅｐ２−８の結合と競合しなかった（図１８）。
【０１４１】
２つのファージ由来ペプチドを、Ｎ末端Ｐｅｐ２−８とＧＳＧリンカーとを有する３０残基融合ペプチドとして合成した。これらのペプチド（Ｐｅｐ２−８＿Ｋ９ｇｖｐｅｐ４及びＰｅｐ２−８＿Ｋ９ｇｖｐｅｐ７）は双方とも、伸長ペプチドＫ９ｇｖｐｅｐ４をディスプレイするファージ及びＰｅｐ２−８をディスプレイするファージのＰＣＳＫ９結合を強力に阻害し、ＩＣ５０値は低いナノモル範囲であった（図１９）。これは、表面プラズモン共鳴実験において決定されたこれら２つの合成ペプチド（化合物１９＝Ｐｅｐ２−８＿Ｋ９ｇｖｐｅｐ４；化合物２０＝Ｐｅｐ２−８＿Ｋ９ｇｖｐｅｐ７）の低いｎＭ及びｎＭ以下のＫｄ値と一致する（実施例４、表７）。これら２つの融合ペプチドはまた、ＨｅｐＧ２細胞アッセイにおいてＬＤＬＲを強力にレスキューすることができた（実施例５、図２９及び３０）。これらのペプチドの１つである化合物２０の結晶構造を実施例３、図２１に示す。
【０１４２】
方法
[ＰＣＳＫ９Δヘリックスの構築、発現及び精製]
操作されたＴＥＶ部位（残基欠失Ｙ１６６、Ｒ１６７；Ｒ１６５とＡ１６８間の挿入ＥＮＬＹＦＱＳ配列、ＤＮＡ７５０３６４）を有するヒトＰＣＳＫ９コンストラクトＭ１−Ｑ６９２を哺乳動物発現ベクター（ｐＲＫ５）にクローニングした。発現タンパク質を含有する１０リットルのＣＨＯ培地を、１００００分子量カットオフ膜を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ接線流濃縮器を使用して濃縮した。濃縮物を２×１リットルのＰＢＳを用いて２回濾過（ｄｉ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）した。最終容量は０．８Ｌ．であった。３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセロール中で平衡化し、０．３Ｍのイミダゾール、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）を用いて溶出する５ｍＬ  Ｎｉカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＰＣＳＫ９（２５０ｍＬ×４）を精製した。ＰＣＳＫ９を、０．１５ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１０％グリセロール中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。（４回に分けて実行）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて画分をアッセイした。
【０１４３】
その後、１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１０％のグリセロール及び３ｍＭの還元型グルタチオン／０．３ｍＭの酸化型グルタチオンに対して、透析（Ｓｌｉｄｅｌｙｚｅｒ  １０Ｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて、４℃で２４時間、ＰＣＳＫ９をＴＥＶプロテアーゼ（タンパク質１０ｍｇ当たり２．５ｍｇ／ｍＬで１００μＬ）で処理した。ＴＥＶプロテアーゼ切断ＰＣＳＫ９を２ｍＬに濃縮し、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１０％のグリセロール中でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラムに通した。ＰＣＳＫ９Δヘリックスに対応する画分をプールし、質量分析及びＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて特徴付けた。このタンパク質は、均一であり、予想した質量を有し、これはＮ末端配列１５３ＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲ１６５（ＥＮＬＹＦＱはＴＥＶ切断配列である）の喪失と一致していた。ＰＣＳＫ９触媒ドメインの新しいＮ末端は、Ｓ１６８Ａ（セリンはＴＥＶ切断配列由来である）であり、これはＭＳによって確認された。従って、ＰＣＳＫ９Δヘリックスコンストラクトは、その天然のＮ末端配列（１５３ＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲ１６７）の最初の１５残基を欠いており、露出した「開いた」Ｎ末端溝を有していた。
【０１４４】
[ライブラリー構築]
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、標準的なクンケル突然変異誘発法を用いて構築された（Kunkel et al., Methods Enzymol 154, 367-82）。ランダム化ペプチドをアンカーペプチドＰｅｐ２−８Ｖ２Ａ及びＧＳＧリンカー（ＴＡＦＴＳＷＥＥＹＬＤＷＶＧＳＧ）のＣ末端に融合させることによって、融合ペプチドライブラリーを構築した。ファージディスプレイライブラリーを作成するための標準的なプロトコールに従って融合ペプチドライブラリーをＭ１３メジャーコートタンパク質のＮ末端にディスプレイした（Tonikian et al. Nat Protoc. 2007;2(6):1368-86）。拡張プールは、連続した縮重コドン（Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔで、Ｋ＝Ｇ／ＴであるＮＮＫ）によりコードされた長さ８、１０、１２、１４、１６アミノ酸を有するランダムペプチドから構成された。長さの異なるライブラリーを個別に構築し、それぞれについて同じ濃度で一緒にプールした。ライブラリーの最終的な多様性は、１．３×１０１０であった。
【０１４５】
野生型塩基が過剰であるヌクレオチド塩基の７０−１０−１０−１０混合物で合成された縮重オリゴヌクレオチドを用いて、ソフトランダム化ライブラリーを構築した。これにより、野生型アミノ酸が標的位置に約５０％の頻度で生じる。
【０１４６】
[ＰＣＳＫ９に対する融合リガンドの選択及び選択されたペプチドライブラリークローンのアフィニティー成熟]
融合ライブラリーのファージプールを、前述のように溶液中のビオチン化ＰＣＳＫ９及びビオチン化ＰＣＳＫ９Δヘリックスによる数ラウンドの結合選択を通して循環させた（Zhang et al. J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014）。ソフトランダム化ライブラリーのパンニングは、ラウンド２、３及び４に、それぞれ１０ｎＭ、５ｎＭ及び２ｎＭのビオチン化ＰＣＳＫ９及びビオチン化ＰＣＳＫ９Δヘリックスを使用したことを除いて、同じ方法で実施された。
【０１４７】
４ラウンドの結合選択の後、標的としてプレート固定化ＰＣＳＫ９を使用して個々のファージクローンをハイスループットスポットファージＥＬＩＳＡで分析した（Tonikian et al. Nat Protoc. 2007;2(6):1368-86）。同じファージ粒子のニュートラアビジンへの結合シグナルは、非特異的結合ノイズとして検出された。０．５を超える標的に対するファージ結合シグナル及び５を超えるシグナル／ノイズ比を有するクローンを陽性クローンとみなし、ＤＮＡ配列分析に供した。
【０１４８】
[ファージ競合ＥＬＩＳＡによるＰＣＳＫ９ペプチドリガンドのＩＣ５０分析]
選択したクローンの配列を、クンケル突然変異誘発法を用いてＭ１３メジャーコートタンパク質（ｐ８）のＮ末端に融合させた（Kunkel et al., Methods Enzymol 154, 367-82）。得られたコンストラクトを大腸菌に形質転換した。ＸＬ１ブルーの単一コロニーを、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン及びＭ１３    ＫＯ７ヘルパーファージを補充した１ｍＬの２ＹＴ中、３７℃で２時間増殖させ、カナマイシンを２５μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、増殖を３７℃で６時間継続させた。培養物を５０μｇ／ｍＬカルベニシリン及び２５μｇ／ｍＬカナマイシンを補充した３０ｍＬの２ＹＴに移し、３７℃で一晩増殖させた。翌日、ファージを回収し、標準的なプロトコールを用いて精製した（Tonikian et al. Nat Protoc. 2007;2(6):1368-86）。連続希釈したファージ溶液を、予め５μｇ／ｍＬのニュートラアビジンでコーティングし、ブロック緩衝液でブロックした３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ  ＩｍｍｕｎｏＰｌａｔｅに１５分間固定化したビオチン化ＰＣＳＫ９及びビオチン化ＰＣＳＫ９Δヘリックスに適用した。プレートを４℃で１時間インキュベートし、ＰＴ緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）で１０回洗浄した。結合したファージを抗Ｍ１３−ＨＲＰで検出し、ＥＬＩＳＡシグナルをＯＤ４５０ｎｍで読み取った。バックグラウンドは、ファージがニュートラアビジンコートプレートに直接結合したＥＬＩＳＡシグナルであった。データをプロットし、曲線をＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈに当てはめた。最大結合シグナルの８０％を与えた飽和以下のファージ濃度を結合曲線により決定した。
【０１４９】
一定飽和濃度以下のペプチドディスプレイファージを、ＰＢＴ緩衝液中の合成ペプチドの段階希釈物と混合することによって、ＩＣ５０測定を行った。混合物をＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスでコーティングしたプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。その後プレートをＰＢＴ緩衝液で１０回洗浄し、結合ファージを抗Ｍ１３−ＨＲＰによって検出した。データをプロットし、曲線を当てはめ、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈの使用によりＩＣ５０を導き出した。全ての測定を個別に３回繰り返した。
【０１５０】
実施例３：溝結合ペプチドの結晶構造
Ｘ線結晶解析をＰＣＳＫ９  Ｎ末端溝結合ペプチドの研究に適用するために、当該ペプチドが「Ｎ末端溝」を占めるのに十分な空間を結晶格子に提供することが知られている結晶系を選択する必要があった。空間群Ｐ３２２１のＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックス／Ｐｅｐ２−８の結晶が選択された。このような結晶は製造するのが比較的容易であり、比較的高い分解能で回折し、さもなければ「Ｎ末端溝」に隣接するバルク溶媒によってのみ占められる実質的な体積を提供する。したがって、このような結晶中のＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックス：Ｐｅｐ２−８複合体の結晶充填は溝結合ペプチドを収納することができると予想された。
【０１５１】
ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスと複合体を形成しているペプチドの合計９個の結晶構造が、１．９から２．９Åの間の良好な分解能で決定された。それらは、３つの融合ペプチド（図２０−２２）及びＰｅｐ２−８と共結晶化した５つの溝結合ペプチド（図２３及び２５−２８）を含む。更に、フルオロ−Ｗ６を有する修飾Ｐｅｐ２−８（化合物３）と共結晶化した溝結合ペプチドの構造を解明した（図２４）。Ｘ線構造の結果を表３−５に示す。
【０１５２】
化合物２について得られた構造（図２０）は、融合ペプチドの結合様式を明確に示している。融合ペプチドのＰｅｐ２−８部分は、以前に報告されたＰｅｐ２−８：ＰＣＳＫ９複合体の構造と同じように、ＰＣＳＫ９表面上の同じ位置を占める（Zhang et al., J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55；ＰＤＢアクセション番号４ＮＭＸ）。特に、Ｆ３のペプチド骨格は、ＰＣＳＫ９  Ｆ３７９の骨格と２つの水素結合相互作用を形成し；ペプチドＶ２の側鎖は、ＰＣＳＫ９  Ｃ３７８及びＶ３８０の側鎖に対して非結合接触を形成し；ペプチドＷ６の側鎖は、ＰＣＳＫ９  Ｄ２３８、Ａ２３９及びＦ３７９の側鎖に対して非結合接触を形成し、ペプチドＹ９の側鎖は、ＰＣＳＫ９  Ｉ３６９の側鎖に対して非結合接触を形成する。図２０に示された構造のタンパク質座標を４ＮＭＸのタンパク質座標と重ね合わせると、Ｐｅｐ２−８に対応するペプチド部分の骨格原子は、座標位置の二乗平均平方根変化が０．３６Åであった。
【０１５３】
化合物２のＣ末端融合部分に目を向けると、Ｇ１４−Ｓ１５−Ｇ１６リンカーは大きく伸びており、ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスと特異的な接触を形成しない。２つのシステイン残基（Ｃ１７及びＣ２８）は、明らかにジスルフィド結合しており、ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスへの接触を形成しないが、ペプチドのＰｅｐ２−８部分に対するファンデルワールス充填に関与している（Ｗ６及びＹ９）。化合物２の残基Ｗ１８−Ｉ２３は、これらの残基の側鎖が水素結合相互作用（Ｗ１８Ｎε１ＨとＮ１９側鎖ＣＯＮＨ２）、イオン相互作用（Ｒ２２グアニジン）及びＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスへのファンデルワールス接触（Ｗ１８、Ｎ１９、Ｌ２０及びＩ２３）を形成することを可能にするへリックス構造をとる。融合ペプチドのこの部分は、野生型ＰＣＳＫ９構造においてＮ末端ペプチドが通常占めるのと同じ部位を明らかに占める。この新たに形成されたポケットは、ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの以下の部分によって囲まれている：Ａ２３９−Ｖ２４１、Ｔ３３９−Ｄ３４３、Ｐ３６４−Ｉ３６８、Ｈ３９１、及びＶ４４１−Ｌ４４４。このポケットに対する融合ペプチドの特異的相互作用を表６に列挙する。Ｇｌｙ２４の主鎖二面角（正のファイ角を含む）は、ペプチド部分をＧ２４からＣ２８に向けてＣ１７に戻す。この領域は大きく伸びており、ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリっクスとは接触しない。したがって、ジスルフィド結合を含む融合ペプチドのＣ末端部分は、立体構造の柔軟性を制限し、介在部分（Ｗ１８−Ｉ２３）とＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスとの特異的接触を促進するためのテザーとして作用すると思われる。
【０１５４】
ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックス化合物１７の間の複合体についても構造が得られた（図２２）。このペプチドは、６−アミノヘキサン酸によって置換された化合物２の「ＧＳＧ」リンカーを有する。Ｐｅｐ２−８及びこの融合の伸長部分とＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスとの相互作用は、化合物２と全く同じである。この場合も、６−アミノヘキサン酸リンカーはタンパク質と直接接触しない。
【０１５５】
化合物２０はまた、ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスとの共結晶化にも適していた（図２１）。リンカー残基Ｇ１４、Ｓ１５、Ｇ１６、Ｄ１７及びＬ１８について明確な電子密度は存在しなかったが、このペプチドに関する電子密度は、Ｎ末端部分（Ｐｅｐ２−８に対応する）及びＣ末端伸長Ｍ１９−Ｒ２９を明確に画定した。ＰＣＳＫ９のＮ末端溝部位との重要な相互作用は、ペプチド伸長において残基Ｗ２１、Ｎ２２、Ｌ２３、Ｒ２５及びＩ１６によって起こる。これらの残基への非結合接触は、表面上は化合物２と同じである（表６）。更なるファンデルワールス相互作用が、ＰＣＳＫ９のペプチド残基Ｐ２０とＩ３６９の側鎖との間、及びＰＣＳＫ９のペプチド残基Ｌ２８とＬ４４４の側鎖との間に観察される。このペプチドはジスルフィド結合を含まないが、（ＰＣＳＫ９から離れて）ペプチドの上面に密集し、Ｃ末端伸長ペプチドの折り畳みの核形成又は安定化を担いうる一群の疎水性残基（Ｍ１９、Ｖ２４及びＬ２９）が存在し、これによりＰＣＳＫ９に対するペプチドの結合アフィニティーが改善される。
【０１５６】
伸長ペプチドによって利用される配列モチーフと相互作用は、Ｐ’へリックスとＮ末端の溝との本来の相互作用によく似ている。例えば、化合物２０において、伸長ペプチド残基Ｐ２０、Ｗ２１、Ｎ２２、Ｌ２３、Ｒ２５及びＩ２６は、天然のＰＣＳＫ９  Ｐ’ヘリックスのＰ１５５、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｒ１６０及びＩ１６１にまさに対応する。化合物２０と複合体を形成しているＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの座標が野生型ＰＣＳＫ９のものと重なっている場合、これら６個のアミノ酸に対応する骨格原子は、座標位置において０．１８Åの二乗平均平方根の変化を有する。これは、天然のＰ’ヘリックス又はこの部位を占める他の外因性リガンドを介して、ＰＣＳＫ９のＮ末端の溝と相互作用するための「ＰＷＮｘＬＲＩ」モチーフの重要性を示している。ペプチドについては、ペプチド鎖をＮ末端に戻すことができるように（化合物２０について上に挙げたジスルフィド結合又は疎水性クラスターを形成するために）、Ｃ末端グリシン残基がこのモチーフへの重要な付加であり；このジオメトリに必要とされる主鎖ファイ角（backbone phi angle）の正の値は、非グリシン残基についてはエネルギー的に好ましくない。
【０１５７】
Ｐｅｐ２−８と複合体を形成しているＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスによって形成された結晶格子もまた、追加のペプチドがＮ末端溝部位を占有する結晶を形成する可能性を与えた。その一例が化合物２１であり（図２５）、この１２残基ペプチドは、化合物１７及び化合物２のＣ末端部分に対応する。Ｐｅｐ２−８ペプチドへの共有結合テザーの非存在下でさえ、化合物２１はＮ末端溝部位と同じ非結合接触を作ることができた。実際、ＰＣＳＫ９の座標が化合物２１と化合物２の共結晶構造の間で重なった場合、ＰＣＳＫ９と接触するペプチド残基の位置は、０．３Å未満だけ異なり、これらの残基の主鎖のｒｍｓｄは０．０７Åであった。化合物２１の非接触残基（例えばＳ９、Ｑ１０及びＧ１１）のいくつかの原子は、化合物２の等価原子と比較して２Åもシフトしたが、これは、非接触残基がペプチド立体構造を抑制するための柔軟なリンカーを形成することを補強している。化合物２１とＰｅｐ２−８との間に共有結合はないが、前者のシステイン残基から後者のＷ６及びＹ９へのファンデルワールス接触はあった。更に、化合物２１のＮ末端アミンからＰｅｐ２−８のＹ９のフェノール性水酸基への水素結合が観察された。
【０１５８】
結晶分析によってＮ末端溝部位に結合することが示されているペプチドのもう１つのセットは、中に２つのＮ末端残基及び２つのＣ末端残基が隣接するＰＷＮＬｘＲＩＧモチーフであるジスルフィド拘束大環状分子を含む（例えば化合物２６、図２３；化合物３０、図２６；化合物３１、図２７、及び化合物３２、図２８）。化合物３１のＬ７に対応する疎水性残基は、ペプチドの他の残基とのファンデルワールス接触に関与していたため、結合立体構造を安定させるのを助けた可能性がある。化合物３１のＬ１２に対応するロイシン残基は、ＰＣＳＫ９との疎水性接触に関与していた（Ｖ２４１及びＬ４４４）。化合物３１のＬ１３に対応する残基は、ＰＣＳＫ９と特異的に接触しなかった。この残基及び両システイン残基について観察された多様な立体構造は、ＰＷＮＬｘＲＩＧモチーフの立体構造を抑制するためのリンカーとしての役割を示唆している。
【０１５９】
化合物２６は、Ｎ末端アセチル基を「ＳＧ」で置き換えたこと以外は、化合物３１と同一である。化合物２６をＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックス及び化合物３、すなわちＷ６が６−フルオロトリプトファン残基で置換されたＰｅｐ２−８の改変型と共結晶化した場合、化合物３１とＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスとの間に見出される同じ相互作用が化合物２６とＰＣＳＫ９の間でも観察された（図２４）。フッ素の添加は、おそらくフッ素とＰＣＳＫ９のＡ２３９、Ｉ３６９及びＰ１５５との間の更なる疎水性接触の結果、Ｐｅｐ２−８と比較して化合物３のＰＣＳＫ９への結合を約３倍改善した（表７）。
【０１６０】
方法
[ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの発現、精製及び結晶化]
操作されたＴＥＶ部位（残基欠失Ｙ１６６、Ｒ１６７；Ｒ１６５とＡ１６８の間の挿入ＥＮＬＹＦＱＳ配列、ＤＮＡ７６６２８１、ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤＴＥＶ７）を有するヒトＰＣＳＫ９コンストラクトＲ２９−Ｇ４５２を有する組換えバキュロウイルスを、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭシステム使用して、製造者（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による記載の通りに生成した。発現は、１０リットルのＷａｖｅ（登録商標）バイオリアクター内のバキュロウイルス培地中のＳｆ９細胞内で７２時間実施されたた。発現タンパク質を含有する培地を１ｍＭ塩化ニッケル、２ｍＭ塩化カルシウムで処理し、水酸化ナトリウムを使用してｐＨ７．５に調整した。生じた沈殿物を低速遠心分離により除去した。上清を１０ｋＤａ膜上のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ接線流を用いて濃縮し、緩衝液を１０％グリセロールを含むＰＢＳに交換して最終容量を１リットルにした。ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤＴＥＶ７を、１０％グリセロールを含むＰＢＳで平衡化したＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒで５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤＴＥＶ７を、０．２５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、１０％グリセロール中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直接装填した１０ｍＬの０．３Ｍイミダゾール／ＰＢＳ／１０％グリセロールで溶出した。
【０１６１】
その後ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤＴＥＶ７を、０．１５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１０％のグリセロール及び３ｍＭの還元型グルタチオン／０．３ｍＭの酸化型グルタチオンを比較する透析（Ｓｌｉｄｅｌｙｚｅｒ  １０Ｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて４℃で２４時間、ＴＥＶプロテアーゼで処理（タンパク質１０ｍｇ当たり２．５ｍｇ／ｍＬで１００μＬ）した。得られたＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックス  ＰＣＳＫ９を２ｍＬに濃縮し、１ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）中でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５  １６／６０カラムに通した。タンパク質を質量分析及びＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いてアッセイした。その後、最終プールを０．２ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、５％のグリセロールに緩衝液交換し（ＮＡＰ５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、結晶化試験のために１０ｋＤａカットオフスピン濃縮器を用いて１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【０１６２】
ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックス及び１つ又は２つのペプチドを用いた共結晶化試験は、ストックＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスタンパク質を２倍モル過剰のペプチドと共に４℃で一晩インキュベートすることによって開始された。結晶化追跡には、市販のスパースマトリックススクリーン及びＭｏｓｑｕｉｔｏリキッドハンドラー（Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用した。最良の結晶は、０．２Ｍの酢酸カルシウム、０．１Ｍのトリス（ｐＨ８．０）及び２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ６０００を使用し、１８℃でのシッティングドロップ法で、薄い六角形のプレートとして成長した。収集した結晶を、３０％（ｖ／ｖ）グリセロールを補充した結晶化リザーバーで処理し、データ収集の前に液体窒素に一気に浸した。
【０１６３】
[ペプチドとの複合体中のＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの構造決定]
切断型ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスの全てのペプチド複合体は空間群Ｐ３２２１において結晶化した。各ケースにおいて、回折データは、波長約１ÅのＸ線を使用して１１０Ｋで単一の凍結保存結晶から収集され（表３−５）、ＨＫＬ２０００（Otwinowski and Minor, Methods in Enzymol, 1997. 276: p. 307-326)又はXDS (Kabsch, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 2): p. 125-32; Vonrhein et al., Acta. Crystallogr., 2011. D67: p. 293-302）のいずれか及びＣＣＰ４スイートの要素を使用して縮小された。第１の構造は、探索プローブであるＰＤＢアクセションコード４ＮＭＸ中の短形の（ｓｈｏｒｔ−ｆｏｒｍ）ＰＣＳＫ９（ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤ）による分子置換を用いて解明された。ＲＦＲＥＥの計算のための精密化から除外された一組の反射を全ての構造に対して使用した。精密化（Murshudov et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011. 67: p. 355-367; Adams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 2): p. 213-21; Bricogne et al., BUSTER version 2.11.2. 2011, Global Phasing Ltd.: Cambridge, United Kingdom）には、高分解能構造のための水の自動配置及び置換係数のＴＬＳ処理が含まれる。Ｃｏｏｔを用いて電子密度マップのモデル構築と検査を行った（Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 4): p. 486-501）。
表３
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表４
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表５
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表６
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【０１６４】
実施例４：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した溝結合ペプチドの結合アフィニティー
結果
Ｐｅｐ２−８溝結合融合ペプチド、化合物２、化合物１７、化合物１９及び化合物２０は、ＰＣＳＫ９とＰＣＳＫ９Δヘリックスの双方に高アフィニティーで結合した（表７）。ＰＣＳＫ９Δヘリックス結合についてのナノモル以下の範囲のＫｄ値に達する高アフィニティー（化合物１７、化合物１９及び化合物２０；表７）は、融合ペプチドのＰｅｐ２−８及び溝結合ペプチドの双方がＰＣＳＫ９と相互作用するということを示した構造的結果と一致している（図２０の化合物２；図２２の化合物１７；図２１の化合物２０）。
表７に示した溝結合ペプチドは全て、μＭ又はμＭ以下の範囲のＫｄ値でＰＣＳＫ９Δヘリックスに結合した。ＰＣＳＫ９Δヘリックスに対して最も高いアフィニティーを有する２つのペプチドは、化合物３２（Ｋｄ０．２１μＭ）及び化合物７３（Ｋｄ０．１６７μＭ）であった。一般に、ＰＣＳＫ９Δヘリックスに対する結合アフィニティーは、ＰＣＳＫ９と比較してより強く、これはＰＣＳＫ９Δヘリックスコンストラクト中にＰ’ヘリックスが存在しないためであり、ＰＣＳＫ９中のＰ’ヘリックスと競合することなくペプチドによる溝への直接アクセスを可能にする。更に、Ｐｅｐ２−８におけるＷ６のフルオロ−Ｗ６への置換（表７の化合物３）は、ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスに対する結合アフィニティーを数倍増加させた。
結果は、溝結合ペプチドがμＭ及びμＭ以下の範囲の結合アフィニティーでＰＣＳＫ９およびＰＣＳＫ９Δヘリックスの双方に結合することができることを実証している。
表７
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【０１６５】
方法
[バイオセンサーに基づくアフィニティー分析]
全てのアッセイは、２０℃の分析温度で行われた。ＰＣＳＫ９タンパク質の変性を防ぐために、試料を試料架内で１０℃に保持した。ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅのｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００及びＳｅｎｓｉＱ  Ｐｉｏｎｅｅｒ  ＦＥを使用した。特記しない限り、全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手したものである。同等のアフィニティー／速度パラメーターを報告すると予想される３つの密接に関連したバイオセンサープロトコールを使用して、フルセットのペプチドを分析した。複数のプロトコールの必要性は、いくつかのペプチドの潜在的凝集能力に関連していた。緩衝液組成物は、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１０ｋＤａのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及び１０ｋＤａのカルボキシメチル化デキストラン（ＣＭデキストラン）などの可溶化剤の添加以外は、大部分保存された。
【０１６６】
方法１
方法１を用いて、Ｐｅｐ２−８、並びに化合物１９、２０、２６及び２８を分析した。Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＮＴＡセンサーチップをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００バイオセンサーシステムにドッキングした。このシステムをランニング緩衝液（すなわち５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴ２０、ｐＨ７．５）中でプライミングした。ヘキサヒスチジンタグ化タンパク質（すなわちＰＣＳＫ９又はＰＣＳＫ９Δヘリックス）を、参照センシング表面として適用するために、少なくとも１つのセンシング表面がコーティングされていないままである別々のセンシングチャネル上にアフィニティー捕捉した。化合物試料をランニング緩衝液中で調製し、インジェクションした。その後、次の試料を試験するために、各タンパク質を再充填する前に、全てのアフィニティー結合複合体を除去した。したがって、各試料サイクルは、以下のように各試験試料について繰り返された５回の連続インジェクションから成っていた。
インジェクション１
０．２５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を、全てのセンシングチャネル上に３０μＬ／分の流速で３分間インジェクションした。この曝露は、ポリヒスチジンとＮｉ−ＮＴＡ錯体との間のキレート結合を介して結合している全てのアフィニティー結合複合体を除去し、またあらゆる混入金属イオンも除去する。
インジェクション２
ニッケル溶液（脱イオン超純水中の１ｍＭのＮｉ）を、３０秒間、３０μＬ／分の流速で全てのセンシングチャネル上にインジェクションした。Ｎｉイオンは、ヒドロゲルベースのセンシング表面内に予め結合しているニトリロ三酢酸と錯体を形成する。Ｎｉを充填させると、得られる金属−ＮＴＡ錯体は、ポリヒスチジンタグ付きタンパク質への高アフィニティー結合を可能にする。
インジェクション３
ランニング緩衝液中３μｇ／ｍＬの調製ＰＣＳＫ９Δヘリックスタンパク質を、単一のＮｉ−ＮＴＡ活性化センシングチャネル上に３０μＬ／分の流速で８０秒間インジェクションした。
インジェクション４
ランニング緩衝液中５μｇ／ｍＬの調製ＰＣＳＫ９を、単一のＮｉ−ＮＴＡ活性化センシングチャネル上に３０μＬ／分の流速で２０秒間インジェクションした。試料をインジェクションする前に、ベースラインを５分間安定化させた。
インジェクション５
高水準インジェクションモードを使用して、試料をインジェクションした。化合物１９及び化合物２０を、６つの連続２倍希釈物として調製し、各々を５０μＬ／分の流速で１００秒間、全てのセンシングチャネル上に９００秒の解離でインジェクションした。Ｐｅｐ２−８、化合物２６及び化合物２８を、８つの連続２倍希釈物として調製し、各々を５０μＬ／分の流速で１００秒間、全てのセンシングチャネル上に９００秒の解離でインジェクションした。これらの化合物について、５回の連続インジェクションからなる全試料サイクルを各希釈物について繰り返した。この試料サイクルは、試料テーブルの各試料に対して得られる反復配列だった。
【０１６７】
方法２
方法２を用いて、化合物２、化合物２３及び化合物１７を分析した。この方法は、単一化合物希釈物インジェクションを濃度上昇を伴う５回連続インジェクションに置き換えることによって各試料サイクル中に全希釈系列を完成させることを可能にする、単一サイクル速度と呼ばれる（製造業者による命名）代替インジェクションモードを用いた以外は、方法１と同じであった。得られたセンサーグラム（すなわち応答曲線）は、各々がインジェクションされた各化合物希釈物と会合した５つの結合−解離相を含んでいた。活性化、捕捉、及び再生インジェクションは、変化しないままだった。化合物１７については１００ｎＭから、他の全ての化合物については１００μＭから化合物を希釈して、５つの連続２倍希釈物を作製した。表面への非特異的結合を更に低下させるために、アッセイ中の全ての緩衝液に、ＣＭデキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  製品番号８６５２４）も２ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。しかし、このペプチドには非特異的結合が存在しないために必要とされなかったＣＭデキストランの省略以外は、同じ単一サイクル速度及び同じプロトコールを用いて、化合物１７を分析した。記録された全ての結合曲線は、自動的に二重参照され、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅのＢＩＡ評価分析ソフトウェアを用いて１：１モデルに当てはめられた。
【０１６８】
方法３
化合物３１、化合物３２、化合物３３、化合物３４、化合物３、化合物７３、化合物５０、化合物５２、化合物５１、化合物５５、化合物８２、化合物４５、化合物９６、化合物５３及び化合物９７を、方法３を用いて分析した。いくつかのペプチドが凝集する傾向を考えると、ＳｅｎｓｉＱ  Ｐｉｏｎｅｅｒ  ＦＥとして市販されているもう一つのバイオセンサー技術を使用することによって、ペプチド分析が更に改善されるであろうと決定された。この機器は、表面化学、フローインジェクション分析及び使用できる方法論の点でＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢバイオセンサーに類似しているが、センシング表面上で化合物を滴定する方法も提供する点が異なる。滴定は、キャピラリー（Quinn, Analytical Biochemistry 421: 391, 2012; Quinn, Analytical Biochemistry 421: 401, 2012）を使用して形成され、従来の表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサーと同様に結合速度及びアフィニティーを報告する結合応答曲線を生成するが、他の技術異なり、分子量に対する化合物勾配プロファイルの依存性のために化合物凝集の記述子を報告する。
【０１６９】
この場合、ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスの双方を、製造業者の推奨に従って標準的な直接アミンカップリングによってＣＯＯＨＶセンサーチップ上に固定化して、各々２０００ＲＵを超える、別々のセンシングチャネルへの共有結合を得た。センシング表面への凝集及び非特異的結合を更に低減させるために、ランニング緩衝液を再調製し、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍｇ／ｍＬのＰＶＰ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、１ｍｇ／ｍＬのＣＭデキストラン及び５％のＤＭＳＯを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含有させた。各化合物をランニング緩衝液中で２０μＭで調製し、１５分間超音波処理し、その後最終試料のジメチルスルホキシドの濃度をランニング緩衝液の濃度と一致させることに注意して、各５μＭの試料を調製した。各化合物の２０μＭ及び５μＭ希釈物の双方をグラジエントインジェクション（gradient injection）により分析した。インジェクションは、ＯｎｅＳｔｅｐインジェクションモードを用いて、流速１００μＬ／分で２００秒の解離時間で行った。全ての結合曲線は、速い速度を示し、結合曲線が定常状態の応答を表すことを示唆している。したがって、記録された全ての結合曲線を二重参照し、ＳｅｎｓｉＱ  Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｉｎｃ．のＱｄａｔデータ分析ソフトウェアを用いて、１：１アフィニティーモデルに当てはめた。
【０１７０】
実施例５：溝結合ペプチドはＨｅｐＧ２細胞上のＬＤＬＲをレスキューする。
結果
ＰＣＳＫ９受容体によるＨｅｐＧ２細胞の処理が、ＬＤＬＲ表面レベルを約７５％減少させた（図２９及び３０）。Ｐｅｐ２−８はそれ自体で、約５−１０μＭの濃度でＬＤＬＲレベルを５０％まで回復することができた。Ｆａｂ３３はより強力であり、０．１−０．２μＭの濃度で５０％のＬＤＬＲ回復を達成した。２つの溝結合ペプチドＰｅｐ２−８ｐ４（化合物１９：Ac-T V F T S W E E Y L D W V G S G C R L P W N L Q R I G L P C-NH2）及びＰｅｐ２−８ｐ７（化合物２０：Ac-T V F T S W E E Y L D W V G S G D L M P W N L V R I G L L R-NH2）は、Ｐｅｐ２−８よりはるかに強力で、それぞれ約０．５μＭの濃度、１−５μＭの濃度で、ＬＤＬＲレベルを５０％まで回復させた（図２９及び３０）。
【０１７１】
方法
[ＨｅｐＧ２細胞を用いた細胞表面ＬＤＬＲアッセイ]
ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ；バージニア州マナッサス）を、２ｍＭのグルタミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）及び１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ；ミズーリ州セントルイス）を含有する高グルコース培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ；カリフォルニア州カールスバッド）中、１ウェル当たり１×１０５細胞で４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；ニューヨーク州コーニング）播種し、一晩インキュベートした。その後、培地を１０％リポタンパク質欠乏血清（ＬＰＤＳ、Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭに交換した。２４時間後、１５μｇ／ｍＬのＰＣＳＫ９をペプチド又はＦａｂ３３と共に３０分間インキュベートし、細胞に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて脱離させた。遠心分離後、再懸濁細胞を１：２０の抗ＬＤＬＲ抗体（Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ；ドイツ、ハイデルベルグ）と共に氷上で１０分間インキュベートした。その後試料をＰＢＳで洗浄し、１：２００希釈ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州カールスバッド）と共に氷上で５分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を２．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含有するＰＢＳに再懸濁させ、デュアルレーザーフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；ニュージャージー州フランクリンレイクス）で分析した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を用いて、ＨｅｐＧ２細胞表面上のＬＤＬＲ発現レベルを定量した。細胞表面ＬＤＬＲレベルは、ＰＣＳＫ９（＝コントロール）の非存在下で測定されたＬＤＬＲレベルのパーセントとして表した。
【０１７２】
実施例６：溝結合ペプチドはＰ’へリックスのＦＸＩａ媒介性タンパク質分解を増加させる。
結果
溝結合ペプチド化合物２６と化合物２９は、遊離Ｎ末端（化合物２６）又はアセチル化Ｎ末端（化合物２９）を有することのみが異なる。化合物２６（実施例３）の決定された結晶構造は、ペプチドがＰＣＳＫ９のＮ末端溝に結合することを示している（図２３）。このペプチドは、ＳＰＲ実験において決定されたように２９μＭのＫｄ値でＰＣＳＫ９に結合した（実施例４、表７）。図３１の結果は、Ｆａｂ３３と同様に、双方の溝結合ペプチドが切断反応を加速させ、Ｐ’へリックスのほぼ完全な切断をもたらすことを示している。ＦＸＩａの非存在下では、２つのペプチドは効果がなかった（図３１）。
別の実験では、直鎖状ペプチド化合物１１２（ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶＲＩＧＬＴＲ−ＮＨ２）及びその誘導体化合物１１８（ｎ−ＢｕＣ（Ｏ）−ＷＮＬＶ（ホモＲ）ＩＧＬＴＲ−ＮＨ２）（これはアルギニンの代わりにホモアルギニンを有する）を使用した。ＦＸＩａのＳ１ポケットは修飾又は非天然アルギニン残基を収納することができないため、ホモアルギニンが、ＦＸＩａによる切断を防ぐために導入された。実際、ＦＸＩａ切断の経時変化は、ホモアルギニン含有ペプチド化合物１１８が、ＬＣ−ＭＳによって決定された通り、６時間にわたってインタクトなままであることを示した（図３２）。対照的に、アルギニン含有ペプチド化合物１１２は、時間依存的に切断された。すなわち、ＬＣ−ＭＳによって定量された通り、１時間後に３４％、６時間後に７６％が切断された（図３３）。図３４は、ペプチド化合物１１２と比較して、切断不可能なペプチド化合物１１８と共にＫ９−ＡＡＡをインキュベートすると、ＦＸＩａによるより高度のＰ’へリックス切断がもたらされたことを示す。
これらの結果は、試験したペプチド化合物２６、化合物２９、化合物１１２及び化合物１１８が、Ｆａｂ３３について示したのと同様に、Ｒ１６０−Ｉ１６１でのＰ’へリックスのＦＸＩａ媒介切断を増加させることができたことを示す。これらのペプチドのうちの１つの結晶構造（化合物２６：図２３）は、ペプチドが通常Ｐ’へリックスを有するＮ末端の溝部位を占めることを示している。したがって、Ｆａｂ３３と同様に、これらのペプチドは、放出された「アウト」立体構造（ejected “out” conformation）でＰ’へリックスを維持し、これはＦＸＩａ切断を受けやすくなる。これは、図１２に示されているメカニズムと一致している。
【０１７３】
方法
[ＦＸＩａ切断アッセイ]
２．６μＭのＰＣＳＫ９−Ｒ１６７Ａ：Ｒ２１５Ａ：Ｒ２１８Ａ（ＰＣＳＫ９−ＡＡＡ）を、５０ｎＭのＦＸＩａと５０μＭの化合物２６、５０μＭの化合物２９、５０μＭの化合物１１２又は５０μＭの化合物１１８のいずれかとを含むトリス緩衝液中でインキュベートした。Ｆａｂ３３（２μＭ）又はＰｅｐ２−８（４μＭ）をコントロールとして使用した。室温でのインキュベーションの２０時間後（化合物２６及び化合物２９）又は６時間後（化合物１１２及び化合物１１８）、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ｉＢｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてニトロセルロース膜に転写した。その後タンパク質を、ｉＢｉｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ＰＣＳＫ９Ｎ末端ペプチド（１５３ＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡ１６８）に対して産生させたポリクローナルウサギ抗体（１：３０００）、続いてＨＲＰコンジュゲートロバ抗ウサギ抗体（１：５０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でプローブした。ＰＣＳＫ９シグナルをＥＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって検出し、オートラジオグラフィーによって可視化した。
[溝結合ペプチドの切断を決定するための液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）]
ペプチド化合物１１２中のアルギニンの後ろ又はペプチド化合物１１８中のホモアルギニンの後ろのＦＸＩａ媒介性切断を決定するために、ＦＸＩａ切断アッセイ（上記参照）からの１０μｌの反応試料を０、１、６時間目に採取し、ＰＬＲＰ−Ｓ逆相カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステムでの分析用ＬＣ−ＭＳにより分析した。計算された分子量を使用することにより、かつ、曲線下面積を測定することによりペプチド切断を決定した。
【０１７４】
実施例７：溝結合ペプチドの合成とＴＲ‐ＦＲＥＴに基づくアッセイにおける活性
結果
ＬＤＬＲ結合部位及びＮ末端結合溝への分子の結合を測定するためのアッセイを確立した。前者は、ＬＤＬＲのＥＧＦ（Ａ）ドメインのＰＣＳＫ９への会合を測定するためのＴＦ−ＦＲＥＴアッセイ（「ＰＣＳＫ９／ＥＧＦ（Ａ）結合アッセイ」）に基づき、後者は、ＰＣＳＫ９ΔヘリックスへのＡｂ２０の結合を測定するＴＲ−ＦＲＥＴアッセイに基づいた（「ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０結合アッセイ」）。Ｎ末端にＨｉｓタグを有し、Ｃ末端にＦｃドメインを有するＥＧＦ（Ａ）タンパク質を使用するカウンタースクリーニングアッセイにおいて、分子の非特異的結合効果についても試験し（「Ｈｉｓ−ＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃカウンタースクリーニング」）た。ＰＣＳＫ９への結合の真の阻害剤は、カウンタースクリーニングにおいてＴＲ−ＦＲＥＴのいかなる減少も示さないはずである。
アンカーペプチド、リンカー、及びＣ末端伸長ペプチドを含有するファージ由来ペプチド配列を再現するために、ペプチドを最初に合成した。化合物１によって例示される連鎖（表８Ａ）は、ＰＣＳＫ９／ＥＧＦ（Ａ）結合アッセイにおいてＰｅｐ２−８と同等の活性を有するが、ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０結合アッセイにおいては勝った活性を有し、これは、Ｃ末端伸長がＮ末端溝部位を占めていることを示す。このペプチドの切断（化合物４−７））は、ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０結合アッセイにおける効力を徐々に減少させたが、これは、Ｎ末端溝とのより弱い相互作用を示す。ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０結合アッセイにおける効力を維持しながら、様々なペプチド及び非ペプチドリンカーを用いてアンカー及び伸長ペプチドを連結した。
ペプチド化合物２０は、ファージディスプレイにより同定された異なる配列を例示する。この場合、ＰＣＳＫ９／ＥＧＦ（Ａ）結合アッセイにおける阻害は、Ｐｅｐ２−８と比較して有意に改善され、ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０結合アッセイにおける阻害は、低ナノモル濃度で生じた。
ジスルフィド結合Ｃ末端伸長を有するアンカーペプチドもまたアッセイした（表８Ｂ）。Ｎ末端システインと「ＰＷＮＬｘＲＩＧ」モチーフとの間に２残基を有するペプチド（化合物１９、化合物２５及び化合物３８）は全て、ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０結合アッセイにおいて強力な阻害剤であったが、これは、実施例３に記載のＮ末端溝部位との相互作用がこれらのペプチドの結合に寄与していることを示す。化合物１９はまた、ＰＣＳＫ９／ＥＧＦ（Ａ）結合アッセイの強力な阻害剤でもある。Ｎ末端システイン残基のすぐ後に続く「ＷＮＬｘＲＩＧ」モチーフを有するペプチドも、表８Ｂに記載されている。４アミノ酸リンカー（化合物１３及び化合物１４）を用いた例は、ＰＣＳＫ９／ＥＧＦ（Ａ）及びＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０アッセイフォーマットにおける強力な阻害剤であった。非ペプチドリンカーは、両アッセイにおいて効力を維持した（化合物１５、化合物１７及び化合物２４）。この連鎖では、ジスルフィド結合の除去がＣ末端切断の生成を促進し、これがＰＣＳＫ９／ＥＧＦ（Ａ）アッセイにおける活性を低下させたが、ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０アッセイにおける活性は、ＷＮＬｘＲＩＧモチーフのイソロイシンを超える切断まで維持された。
Ｃ末端伸長ペプチドもまた、Ｐｅｐ２−８アンカー成分なしで合成し、生化学アッセイでも試験した。直鎖状伸長ペプチドを表８Ｃに列挙する。１４残基ペプチド化合物３５は、この連鎖の前駆体であり、５０μＭまで結合するＰＣＳＫ９／ＥＧＦ（Ａ）アッセイにおいて阻害を全く示さないが、ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０アッセイにおいては４．８μＭのＩＣ５０で阻害する。このペプチドにおける個々のアミノ酸のアラニンでの置換は、ＷＮＬｘＲＩＧモチーフの重要性を強調した。すなわち、これらのアラニン置換の全てが阻害を阻止した。同様に、このペプチドのＮ又はＣ末端のいずれかからの切断は、切断がＷＮＬｘＲＩＧモチーフに近づくと、阻害レベルを劇的に減少させた。キャッピングアセチルを吉草酸部分で置換することにより、Ｎ末端切断において阻害を改善することができた。したがって、１０残基ペプチド化合物１１１及び化合物１１２は双方とも、ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０において１０μＭ未満のＩＣ５０値で阻害する。ＷＮＬｘＲＩＧモチーフ中のアルギニン側鎖をホモアルギニンで置換すると、阻害が５倍増強された（化合物１１８；ｖのＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０  ＩＣ５０）。
ジスルフィド環化伸長ペプチドもまた、ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０結合アッセイにおいて測定可能な阻害を示した（表８Ｄ）。したがって、化合物３２（Ｎ末端システインとＷＮＬｘＲＩＧモチーフの間に３残基を有する伸長ペプチド連鎖の例）は、ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０アッセイにおいて〜１μＭのＩＣ５０を有した。この連鎖で行われたアラニン置換スキャンはまた、強力な阻害を維持するためのＷＮＬｘＲＩＧモチーフ中の残基の重要性を示した。ＷＮＬｘＲＩＧモチーフ内のＤ立体化学のアミノ酸による置換もまた、阻害の喪失をもたらす。リジン残基はＷＮＬｘＲＩＧモチーフの「ｘ」位で許容され（化合物６７；ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０  ＩＣ５０  ０．７μＭ）、ホモアルギニンによるこのモチーフの「Ｒ」の置換もまた、阻害の改善をもたらす（化合物１１７；ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０  ＩＣ５０  ０．３３μＭ）。ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０アッセイにおいて、Ｃ末端システインの前の４残基の有機リンカーでの置換は阻害を除去する（化合物８３、化合物８４、化合物８５及び化合物８６）が、一方、Ｃ末端システインの前の３残基の有機リンカーでの置換は、弱いが検出可能な阻害を与える（化合物１１６、化合物１２１）。
【０１７５】
Ｎ−末端システインとＷＮＬｘＲＩＧモチーフの間に単一の残基を有する一連の「ジスルフィド環化ペプチドもまた、ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０アッセイにおいて、低マイクロモルの範囲のＩＣ５０値で阻害することが見出された（例えば化合物６３参照）。この連鎖からの化合物は、Ｈｉｓ−ＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃカウンタースクリーニングアッセイにおいても幾分弱い応答を示すが、適切な環外置換を用いると、これらの化合物は、ＰＣＳＫ９／ＥＧＦ（Ａ）アッセイにおいても弱い阻害を示し（例えば化合物８８；ＰＣＳＫ９／ＥＧＦ（Ａ）アッセイ  ＩＣ５０  １７．９μＭ）、これは、これらの効果に対する非特異的結合のいくつかの要素が存在する可能性を示唆する。
最後に、Ｎ末端システインとＷＮＬｘＲＩＧモチーフの間に残基を介在させない一連のジスルフィド環化ペプチドでは、ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０アッセイにおける阻害は、適切なＮ末端置換を用いて観察される（例えば化合物９８；ＰＣＳＫ９Δｈｅｌｉｘ／Ａｂ２０アッセイ  ＩＣ５０  ３．６μＭ）。
【０１７６】
表８Ａ
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表８Ｂ
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表８Ｃ
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表８Ｄ
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＊ＩＣ５０の当てはめを可能にするのに十分ではないが、最高濃度でいくらかの阻害が見られた。
追加の化合物を調製し、表８Ｅに示すように試験した。
表８Ｅ
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【０１７７】
方法
[ペプチド合成方法]
当業者に既知の標準的なフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）／ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）固相法を用いて、ペプチドを合成及び精製した（Chan, W. C., White, P. D., Eds. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach; Oxford University Press: New York, 2000.; Albericio, Fernando; Tulla-Puche, Judit; Kates, Steven A. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry Volume 3, Pages 349-369, 2011）。
[ＰＣＳＫ９  ＴＲ−ＦＲＥＴ結合アッセイ法]
化合物がＰＣＳＫ９への結合を阻害する能力を、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）結合アッセイのパネルを用いて評価した。ＰＣＳＫ９／ＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃ結合アッセイは、Ｈｉｓタグ付き全長ＰＣＳＫ９への結合についてＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃと競合する化合物の能力を評価した。ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ａｂ２０結合アッセイは、Ｈｉｓタグ付きＰＣＳＫ９Δヘリックスコンストラクト中のＮ末端溝領域への結合についてＡｂ２０と競合する化合物の能力を評価した。Ａｂ２０は、アフィニティー成熟Ａｂ  ＹＷ５０８．２０．３３の低アフィニティー前駆体抗体ＹＷ５０８．２０である（Ｗｕら、米国特許第９２６６９６１号）。Ｈｉｓ−ＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃ結合アッセイは、アッセイ検出システムに干渉する化合物を同定するためのカウンタースクリーンとして役立った。ＰＣＳＫ９結合アッセイにおけるシグナル発生は、ＰＣＳＫ９上のＨｉｓタグとリガンド上のＦｃタグとを極めて接近させるための結合相互作用に依存していた。抗Ｈｉｓ−ＡＰＣはＨｉｓタグに結合し、抗Ｆｃ−ユーロピウムはＦｃタグに結合した。これら２つの抗体が近接していて３４０ｎｍの光を照射されたとき、ユーロピウムは励起され、６１５ｎｍのエネルギーを放出した。このエネルギーはＡＰＣによって吸収され、６６５ｎｍの光として放出された。リガンドと競合した化合物は、エネルギー移動を、すなわち６６５ｎｍで発光を減少させた。カウンタースクリーニングにおｊけるＨｉｓ−ＥＧＦＡ−Ｆｃ分子では２つのタグは常に近接していたため、６６５ｎｍでの発光の減少は検出システムとの干渉によるものだった。
化合物を可溶化し、希釈物をＤＭＳＯ中で調製した。４０ナノメートルの試験化合物、参照化合物又はＤＭＳＯコントロールを１５３６ウェルＣＯＣアッセイプレート（黒）（Ａｕｒｏｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ、モンタナ州ホワイトフィッシュ）に加え、続いて２μＬの試験タンパク質（ＰＣＳＫ９、ＰＣＳＫ９Δヘリックス又はＨｉｓ−ＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃ）と、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．１％のウシガンマグロブリン及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）中４０ｎＭの抗Ｈｉｓ−ＡＰＣ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を加えた。プレートを遠心分離してウェルの内容物を混合し、３０分間インキュベートした。その後、４ｎＭの抗Ｆｃ−ユーロピウム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含む２μＬのリガンド（アッセイ緩衝液中ＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃ若しくはＡｂ２０又はカウンタースクリーニング用に緩衝液単独）を加え、プレートを２時間インキュベートし、続いて短い遠心分離でウェル内容物混合した。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを、３４０ｎｍでの励起と６１５及び６６５ｎｍでの発光を用い、励起と発光の測定との間に５０μ秒の時間遅延を設けて、ＶｉｅｗＬｕｘリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。ＴＲ−ＦＲＥＴ比率は、６６５ｎｍでの蛍光発光を６１５ｎｍでの蛍光発光で除して計算した。正規化ＴＲ−ＦＲＥＴ比率を化合物濃度の関数としてプロットし、ＩＣ５０値を４パラメーターロジスティック回帰を用いて決定した。特定のアッセイパラメーターを表９にまとめる。
表９
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【０１７８】
実施例８：溝結合ペプチドのＰＣＳＫ９アンタゴニストへの変換
化合物３５の最初の３残基（Ａｓｐ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ）の欠失は、Ａｂ２０アッセイ及びＳＰＲによって決定されるようにＰＣＳＫ９Δヘリックスへの結合にほとんど影響を及ぼさず（表１０、化合物５０〜５２）、化合物２０の結晶構造中のＡｓｐ／Ｌｅｕの無秩序状態と一致する（図２１）。
表１０
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重要なＥＧＦ（Ａ）安定化残基Ｐｒｏ  ４の更なる除去は、１０分の１に減少した結合アフィニティーを有する１０残基ペプチドをもたらした（表１０、化合物５３）。ホモアルギニン置換は、結合アフィニティーを１４倍改善させた（表１０、化合物１９２）。２．２０Åの分解能でＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスに結合した化合物１９２の結晶構造は、ホモＡｒｇによるアフィニティーの改善を説明した（図３５）。化合物２０の天然Ａｒｇ残基及び天然Ｐ’−ヘリックスと比較して、ホモＡｒｇ側鎖が反転しており、グアニジニウム基がＰＣＳＫ９残基Ａｓｐ３４３との塩橋に係合するように最適に位置していた。
化合物５３のＮ末端Ｔｒｐから３−６アミノ酸伸長を有するファージライブラリーを構築した。Ｎ末端Ｔｒｐに先行するＥＧＦ（Ａ）安定化Ｐｒｏ残基の出現を回避し、そして伸長配列に最大の柔軟性を提供するために、Ｔｒｐ残基に先行するこの最初の位置をＧｌｙ又はＳｅｒ残基として固定した。ペプチドディスプレイファージをＰＣＳＫ９Δヘリックスに対してパンニングし、５及び６個の伸長残基を有する、アフィニティーが改善された複数の結合剤を同定した。これらは全て、３つのアミノ酸モチーフＰｈｅ／Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを共有していた。ホモ−Ａｒｇ置換を用いて５つのペプチドを合成し、それらの阻害効力を決定した（表１１）。
表１１
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化合物１９２と比較して、化合物２２７−２３１は、Ａｂ２０アッセイの結果とＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃに対する阻害活性に基づいて、結合アフィニティーが改善されていた（表１１）。化合物２２８及び２２９は最も強力であり、ＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃ及びＬＤＬＲ−Ｆｃ結合を阻害した（図３６、表１１）。化合物２２９のより優れた力価は、ＳＰＲ実験において決定されたＰＣＳＫ９に対するそのより強い結合アフィニティーと一致していた（化合物２２９及び２２８についてそれぞれＫＤ０．９４±０．０１μＭ  ｖｓ  ＫＤ２．８±０．０５μＭ）。ＨｅｐＧ２細胞において、化合物２２９は、濃度依存的にＰＣＳＫ９媒介性ＬＤＬＲ分解を阻害し、表面ＬＤＬＲレベルを最大７０％まで回復させた（図３７）。不完全な活性は、おそらく化合物の溶解度限界によるものであった。親ペプチド（化合物１９２）と比較して、ＭＥＳＦＰＧ伸長（化合物２２９）は、ＰＣＳＫ９Δヘリックスに対するアフィニティーを６倍以上改善し（表１１）、これはすなわちＰＣＳＫ９Δヘリックスとの更なる相互作用によるか又はＷＮＬＶ（ｈＲ）ＩＧＬＬＲペプチド部分のヘリックス構造による増加であるが、結合に対するエントロピーペナルティを減少させるであろう。この仮説を試験するために、溶液中の化合物１９２及び２２９双方の立体配座優先性を核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を用いて調べた。化合物２２９は溶液中で好ましい立体配座を採用しなかったが、残基７ＷＮＬＶ（ｈＲ）ＩＧＬ１４にまたがる領域にαヘリックス構造を形成する傾向があるようであった。αヘリックス構造の特徴的な少数の弱い中距離ＮＯＥ接触、ｄＮα（ｉ，ｉ＋３）及びｄαβ（ｉ，ｉ＋３）の検出は、化合物２２９の小集団のみがこの配列のこの領域にあるαヘリックスを形成する傾向にあり、したがって弱い中距離ＮＯＥの検出に貢献していることを示した（図３８）。化合物１９２についても同様のＮＯＥパターンが観察され（図３８）、これは、ＭＥＳＦＰＧ伸長部がなくても化合物１９２がαヘリックス構造を形成する傾向を保持し、化合物２２９で観察されたアフィニティーの改善が恐らくＭＥＳＦＰＧとＰＣＳＫ９Δヘリックスの間の追加の接触に由来していたことを示している。
アフィニティー増加に対するＭＥＳＦＰＧ伸長部の役割及びその拮抗特性を理解するために、結合ペプチドの結晶構造を、ＰＣＳＫ９Δヘリックス及びＣＲＤ結合Ｆａｂ７Ｇ７を用いたもう一つの結晶化系を使用することによって得た（図３９−４１）。この系内で成長した結晶はＰｅｐ２−８が存在せず、ペプチドが溝部位に結合するのを妨げる分子間接触もなかった。２．９０Å構造は、６つのＮ末端残基ＭＥＳＦＰＧが、「直線」方式でＥＧＦ（Ａ）に向かって延びるのではなく、同定された「ＦＰＧ」モチーフの３つの残基及びコアペプチドのそれに続くＴｒｐについてＩ型αターンを採用したことを示した。Ｍｅｔ１残基の主鎖カルボニル酸素原子からＧｌｎ３４２へ、及びＳｅｒ３側鎖からＡｓｐ３６７へと、ＰＣＳＫ９との２つの新しいＨ結合があった（図３９）。更に、化合物２２９のＮ末端部分は、Ｍｅｔ１、Ｐｈｅ４、Ｔｒｐ７、Ｖａｌ１０及びｈＡｒｇ１１由来の側鎖によって提供されるペプチド内疎水性接触の集積を含み、それは結合配座（bound conformation）を安定化した可能性があり（図４０）、その全ては電子密度によって明確に示された（図４２）。Ｍｅｔ１の２つの役割（Ｈ結合、疎水性コア）は、Ｎ末端Ｍｅｔ残基が存在しない、より短い化合物２２７の、およそ３分１に下がった阻害活性を説明しうる（表１１）。ペプチドの拮抗作用はＰｒｏ残基に由来し、これはモデル化実験に基づくＥＧＦ（Ａ）残基Ｌｅｕ２９８、Ａｓｐ２９９及びＡｓｎ３００と立体的に衝突すると予測される（図４１）。４つの更なる拮抗ペプチド中のＦＰＧ又はＹＰＧモチーフの存在は、それらが全てＭＥＳＰＦＧペプチドについて記載されたのと同じメカニズムによってＰＣＳＫ９に結合する類似のαターン立体構造及び拮抗ＥＧＦ（Ａ）を採用することを示した。
【０１７９】
方法
[ファージディスプレイ融合ペプチドライブラリーの構築及び結合選択]
ライブラリーは、標準的なクンケル突然変異誘発法を用いて構築された（Kunkel et al., Methods Enzymol 154, 367-82 (1987）。ＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ融合ペプチドライブラリーは、２−５残基の範囲のランダム化ペプチドをペプチド（Ｇ／Ｓ）ＷＮＬＶＲＬＧＬＬＲのＮ末端に融合させることによって構築された。ランダム化ペプチドは、連続的な縮重コドンＮＮＫによってコードされ、Ｇｌｙ／ＳｅｒはＲＧＴによってコードされた（Ｒ＝Ａ／Ｇ）。ライブラリーの最終的な多様性は、２．５×１０１０であった。ＷＮＬＶＲＩＧＬＬＲ  Ｎ末端伸長ライブラリーのファージプールをビオチン化ＰＣＳＫ９Δヘリックスに対してパンニングした。４ラウンドの結合選択の後、標的としてプレート固定化ＰＣＳＫ９又はＰＣＳＫ９Δヘリックスを使用して個々のファージクローンをハイスループットスポットファージＥＬＩＳＡで分析した（Tonikianet al., Nat Protoc 2, 1368-86 (2007)）。同じファージ粒子のニュートラアビジンへの結合シグナルは、非特異的結合ノイズとして考慮された。ＰＣＳＫ９又はＰＣＳＫ９Δヘリックスへの結合シグナルが０．４以上で、かつ、シグナル：ノイズ比が＞２であるファージクローンを陽性とみなし、ＤＮＡ配列分析に供した。
[その他のタンパク質試薬]
ＬＤＬＲ−Ｆｃ及びＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃ融合タンパク質をＺｈａｎｇら、Biol Chem 289, 942-55 (2014)及びZhangら, J Mol Biol 422, 685-96 (2012)に記載の通りに調製した。
[細胞表面ＬＤＬ受容体を測定するためのＨｅｐＧ２アッセイ]
ＰＣＳＫ９媒介性ＬＤＬ受容体分解に対する化合物２２９の効果を、以前に記載されたようにＨｅｐＧ２細胞アッセイにおいて測定した（Zhang et al., J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55）。細胞に添加する前に、様々な濃度のペプチドを、０．５％  ＤＭＳＯの存在下で１５μｇ／ｍＬのＰＣＳＫ９と３０分間プレインキュベートした。４時間インキュベートした後、細胞を記載のようにフローサイトメトリーによりＬＤＬ受容体表面レベルの測定のために処理した（Zhang et al., J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55) (図37）。
[時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイ]
黒色の１５３６ウェルアッセイプレート（ＭａＫＯ、Ａｕｒｏｒａ（登録商標）  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ、モンタナ州ホワイトフィッシュ）において、ＤＭＳＯ中４０ｎＬのペプチドを、アッセイ緩衝液  （５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０、０．１％のウシガンマグロブリン及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）中Ｈｉｓタグ付きＰＣＳＫ９及び抗Ｈｉｓ−アロフィコシアニン２μＬと共に３０分間プレインキュベートした。その後、アッセイ緩衝液中Ｆｃタグ付きリガンド及び抗Ｆｃ−ユーロピウム２μＬを加え、２時間インキュベートした。各アッセイのＰＣＳＫ９及びリガンド条件は以下の通り：ＥＧＦ（Ａ）アッセイについては、１０ｎＭのＣ末端（Ｈｉｓ）８タグ付きＰＣＳＫ９及び１２ｎＭのＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃ、ＬＤＬＲアッセイについては、１０ｎＭのＣ末端（Ｈｉｓ）８タグ付きＰＣＳＫ９及び２．５ｎＭのＬＤＬＲ−Ｆｃ、Ａｂ２０アッセイについては、１．２５ｎＭのＣ末端（Ｈｉｓ）８タグ付きＰＣＳＫ９Δヘリックス及び０．７５ｎＭのＡｂ２０、カウンタースクリーニングについては、２ｎＭのＨｉｓ−ＥＧＦ（Ａ）−Ｆｃ単独。全てのアッセイにおいて、抗Ｈｉｓ−アロフィコシアニン及び抗Ｆｃ−ユーロピウムをそれぞれ２０ｎＭ、２ｎＭで使用した。３４０ｎｍでの励起及び６７１ｎｍでの発光で蛍光度を測定した。ＴＲ−ＦＲＥＴ比率は、６７１ｎｍの蛍光／６１８ｎｍの蛍光として計算された。この比率をコントロールに対して正規化し、ペプチド濃度に対してプロットしてＩＣ５０値を決定した（Ｓｃｒｅｅｎｅｒ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、スイス、バーゼル）。ペプチドをアッセイ当たり３回の別々の実験で１０点滴定及び濃度当たりｎ＝２で評価した。示された値は、３回の独立した実験の平均±標準偏差である。
[ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ｆａｂ７Ｇ７の構造決定]
Ｆａｂ７Ｇ７は、標準的な技術を使用するパパイン切断により抗体７Ｇ７（Lipari et al., J Biol Chem 287, 43482-91 (2012)）から調製され、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製された。Ｆａｂ７Ｇ７及びＰＣＳＫ９Δヘリックスを等モル濃度で混合し、複合体をＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００サイズ排除クロマトグラフィーを用いて単離した。濃縮したＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ｆａｂ７Ｇ７複合体（５ｍｇ／ｍＬ）をハイスループット結晶化スクリーニングに供した。２．８ＭのＮａＯＡｃ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．０）を含有する高塩条件から成長する結晶が観察された。１８℃でのシッティングドロップにおける最適条件は、２μＬの複合体から４Ｍ酢酸アンモニウム、０．１Ｍトリス（ｐＨ８．５及び３％（ｖ／ｖ）１，８ジアミノオクタン２μＬを使用した。その後、ＰＣＳＫ９Δヘリックス／Ｆａｂ７Ｇ７の結晶を、化合物２２９で飽和させたリザーバー溶液に５日間浸した。結晶を３．４Ｍのマロン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の溶液に通してスワイプし、液体窒素に急速に浸すことによって、データ収集用に保存した。ＡＬＳビームライン５．０．２で１．００００ÅのＸ線を使用して、１１０Ｋで回折データを収集し、標準的な方法によって２．９０Åに縮小させた（表１２）。
表１２
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構造は、ＰＤＢからのＰＣＳＫ９（ＰＤＢ  アクセション  ２ＱＴＷ）及びマウスＦａｂ（アクセションコード５ＥＯＱ）を用いる分子置換によって空間群Ｉ２２２において解明され（McCoy et al., J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007)）、非対称単位に単一の複合体を含んでいた。ハイブリドーマ細胞由来のＤＮＡ配列を使用して、数個のコドンを定常領域に伸長させるＦａｂ７Ｇ７可変ドメイン配列を決定した。この配列及び電子密度の指標により、抗体７Ｇ７をＩｇＧ２ｂ／Ｖκとして割り当てることができた。Ｆａｂ７Ｇ７は、Ｃ末端システインリッチドメイン（ＣＲＤ）においてＰＣＳＫ９Δヘリックスに結合する。明確な電子密度によりペプチドの添加及び精製が可能になった（Bricogne, G. et al. BUSTER version 2.11.2. (Global Phasing Ltd., Cambridge, United Kingdom, 2011)）（表１２）。最終的な精密化モデルは、最も好ましいラマチャンドラン空間で主鎖のねじれ角の９６％を有していた。
[ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスとのペプチド複合体の構造決定]
ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、ＰＣＳＫ９Δヘリックスに関して上述したように、前述のバキュロウイルスコンストラクトＰＣＳＫ９  Ｑ３１−Ｇ４５２（ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤ）に操作して入れた（Zhang et al., J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55）。このコンストラクトを記載されているように（Zhang et al., J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55）実質的に発現させて精製し、その後、ＰＣＳＫ９Δヘリックスについて上述したようにＴＥＶプロテアーゼにより処理して、Ｐ’−ヘリックスを欠くＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックスを生成した。ＰＣＳＫ９ΔＣＲＤΔヘリックス（０．２ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、５％グリセロール中１０ｍｇ／ｍＬ）及びペプチド（２倍モル過剰）を用いる共結晶化試験を、市販のスパースマトリックススクリーンで実施した。最良の結晶は、０．２Ｍの酢酸カルシウム、０．１Ｍのトリス（ｐＨ８．０）及び２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ６０００を使用し、１８℃でのシッティングドロップ法で、薄い六角形のプレートとして成長した。収集した結晶を、３０％（ｖ／ｖ）グリセロールを補充した結晶化リザーバーで処理及び液体窒素への急速浸漬によってデータ収集用に保存した。
化合物１９２との複合体について、ビームラインＳＳＲＬ１２−２で０．９７９４６ÅのＸ線を使用して、１１０ＫＤで単一の凍結保存結晶から回折データを収集し（表１２）、ＨＫＬ２０００（Otwinowski et al., Methods in Enzymol 276, 307-326 (1997)）又はＸＤＳ（Kabsch, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 125-32 (2010); Vonrhein et al., Acta. Crystallogr. D67, 293-302 (2011)）のいずれか及びＣＣＰ４スイートの要素（Winn et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011. 67(Pt 4): p. 235-242）を使用して縮小した。探索プローブであるＰＤＢアクセションコード４ＮＭＸ中のＰＣＳＫ９ΔＣＲＤでの分子置換（McCoy et al., J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007)）を用いて構造を解明した。ＲＦＲＥＥの計算のための精密化から隔離された一組の反射を使用した。精密化（Murshudov et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67, 355-367 (2011); Bricogne et al., BUSTER version 2.11.2. (Global Phasing Ltd., Cambridge, United Kingdom, 2011); Delaglio et al., J Biomol NMR 6, 277-93 (1995)）には、高分解能構造のための水の自動配置及び置換係数のＴＬＳ処理が含まれる。最終的な精密化モデルは、最も好ましいラマチャンドラン空間で主鎖のねじれ角の９７％を有していた。Ｃｏｏｔを用いて電子密度マップのモデル構築と検査を行った（Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 486-501 (2010)）。
[表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９Δヘリックスへのペプチド結合のアフィニティー測定]
ＢｉａｃｏｒｅＴＭ  Ｔ１００又はＢｉａｃｏｒｅＴＭ  ８Ｋを２０℃に調整した。このシステムを、潜在的な非特異的結合を減らすために、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．２ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンから成り、任意選択的に０．１％（ｗ／ｖ）カルボキシメチル化デキストラン（平均ＭＷ１０ｋＤａ）及び０．２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ（平均ＭＷ  ３４５０Ｄａ）を含有するアッセイ緩衝液中でプライミングした。各結合再生サイクルの後、ヒスチジンタグ及びＮＴＡセンサーチップを利用することで新鮮なＰＣＳＫ９又はＰＣＳＫ９Δヘリックスを捕捉することにより、ペプチドをアッセイした。表面を（Ｈｉｓ）８タグ付きＰＣＳＫ９で充填した（およそ８００ＲＵを捕捉）。化合物１９及び化合物２０を除いて、ペプチドの５つの連続３倍希釈物を、比較的低い効力のペプチドについては１００μＭから、強力なペプチドについては２５μＭからアッセイ緩衝液中で調製した。化合物１９及び化合物２０を１００ｎＭから３．１ｎＭの６つの連続２倍希釈物でアッセイした。低濃度から高濃度までのペプチド希釈物の連続注入（１分間に５０μＬ／分）によって、全てのペプチドを二連で分析した。その後、０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を注入することによって、表面から標的を取り除いた。この配列を各ペプチド結合サイクル及びブランクコントロールサイクルについて繰り返した。
ＳＡセンサーチップ（製造者によりストレプトアビジンでプレコートされている）を用いた不可逆的捕捉は、化合物１９及び化合物２０を除く全てのペプチドについてインタクトなＰＣＳＫ９（化学的ビオチン化形態）を試験するときに、より頑強であることが証明された。極めて低いフィッティングエラーを生じた２つの融合ペプチドを除いて、全てのＳＰＲデータを５つ以上の連続希釈物について二重に記録した。多サイクルデータ（すなわち各濃度について別々の曲線）及び単一サイクルデータ（すなわち各濃度の連続注入を伴う単一曲線）を二重参照し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて相互作用モデルに当てはめた。ＰＣＳＫ９へのペプチド結合は、Ｋｄの決定のために二状態モデルの適用を必要とする単純な１：１結合相互作用モデルからの逸脱を生じ、一方、ＰＣＳＫ９Δヘリックスとの相互作用は単純な１：１結合にうまく一致した。速度論的曲率（kinetic curvature）は、迅速に解離するペプチドについてはあまり定義されておらず、その場合、Ｋｄは定常状態の用量反応プロットから推定された。Ｋｄ値は、関連する標準誤差、そのパラメーター値における信頼度の尺度と共に報告された。
[ペプチド合成]
ペプチドは、標準的なフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）／ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）固相法を用いて合成された。ジスルフィド含有ペプチドについては、粗直鎖状ペプチドをヨウ素及び酢酸の存在下で環化した。この溶液を亜鉛粉末で処理して、過剰のヨウ素を除去した。溶液を水で希釈し、凍結乾燥させて粗環状ペプチドを得た。対イオンとしてトリフルオロ酢酸を使用するＣ１８カラムでの分取ＨＰＬＣにより、粗ペプチドを分析用ＬＣ−ＭＳにより決定した＞８５％の純度まで精製した。
[ＮＭＲ分光法]
核磁気共鳴実験は、三重共鳴凍結プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−６００で行われた。ＮＭＲの試料は、化合物１９２及び２２９をＨ２Ｏ／ＣＤ３ＣＮ（７０：３０）に最終濃度それぞれ０．５２及び１．５ｍＭ，まで溶解することによって調製した。全てのＮＭＲスペクトルは２８４Ｋで収集され、内部的にＤＳ
Ｓ（４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−スルホン酸）を基準とした。プロトン共鳴の割り当ては、２Ｄ  ＴＯＣＳＹ、２Ｄ  ＤＱＦＣＯＳＹ及び２Ｄ  ＮＯＥＳＹ実験の組み合わせを用いて達成された。ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹスペクトルの混合時間は、それぞれ６０及び２５０ｍｓであった。ＮＭＲデータは、ＴＯＰＳＰＩＮ及びＮＭＲＰｉｐｅ／ＮＭＲＤｒａｗパッケージを用いて処理し（Delaglio et al., J Biomol NMR 6, 277-93 (1995))、NMRViewJ (Johnson et al., J Biomol NMR 4, 603-14 (1994））で分析した。
当業者であれば、本明細書に記載の例示的な実施例に対する様々な修正、追加、置換及び変形を本発明の主旨から逸脱することなく行うことができ、したがってそれらは本発明の範囲内と見なされることを認識するであろう。
【０１８０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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