(57)【要約】  １つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種する際に使用するためのフラビウイルスエンベロープ二量体エピトープ（ＥＤＥ）であって、ＥＤＥは、安定化組換えフラビウイルス、任意に、デングウイルスおよび／またはジカエンベロープ糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（ｓＥ）二量体であり、二量体は、２つのｓＥ単量体間で少なくとも１つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化される、ならびに／または各単量体の二量体界面で、またはドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、少なくとも１つのｓＥ単量体のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって、非共有結合的に安定化され、２つのｓＥ単量体間で少なくとも１つのスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化される、ならびに／または任意に、ｓＥ配列を分離する、リンカー領域、任意に、グリシンセリンリッチリンカー領域を有する単一ポリペプチド鎖として形成されることによって共有結合的に安定化される、ならびに／または改変糖類を介して２つのｓＥ単量体を連結することによって共有結合的に安定化される、ならびに／または、二量体は、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４、ジカ、または他のフラビウイルスのうちのいずれか１つまたは２つからの天然および／または変異エンベロープポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、１つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、ＥＤＥ。ＥＤＥは、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４、およびジカのうちのいずれか１つまたは２つからの天然および／または変異エンベロープポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＥＤＥに対する単離された中和抗体またはその抗原結合断片であって、任意に、当該抗体またはその断片が、残基６７〜７４、残基９７〜１０６、残基３０７〜３１４、残基１４８〜１５９、および残基２４３〜２５１、またはフラビウイルスもしくはジカウイルス糖タンパク質Ｅ細胞外ドメインの対応する残基からなるか、あるいはジカＰＦ１３残基６７〜７７、残基９７〜１０６、残基３１３〜３１５、残基２４３〜２５３、残基Ｋ３７３、またはフラビウイルス糖タンパク質Ｅ細胞外ドメインの対応する残基からなる、デングウイルス糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（ｓＥ）の５つのポリペプチドセグメントに結合し、任意に、結合が、デングＮ１５３（ジカＮ１５４）グリカンまたは対応する残基の存在もしくは不在によって影響を受けず、１つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および／または治療のための方法における使用のためのものであり、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、単離された中和抗体またはその抗原結合断片。【選択図】図１、図２
2019523647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種する際に使用するためのフラビウイルスエンベロープ二量体エピトープ（ＥＤＥ）であって、前記ＥＤＥが、安定化組換えフラビウイルス、任意にデングウイルスおよび／またはジカ、エンベロープ糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（ｓＥ）二量体であり、前記二量体が、前記２つのｓＥ単量体間で少なくとも１つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化される、ならびに／または各単量体の二量体界面またはドメインＩ（ＤＩ）／ドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）リンカーにおいて、少なくとも１つのｓＥ単量体のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって非共有結合的に安定化され、前記２つのｓＥ単量体間で少なくとも１つのスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化される、ならびに／または、任意に、前記ｓＥ配列を分離する、リンカー領域、任意に、グリシンセリンリッチリンカー領域を有する単一ポリペプチド鎖として形成されることによって共有結合的に安定化される、ならびに／または、改変糖類を介して前記２つのｓＥ単量体を連結することによって共有結合的に安定化される、ならびに／または、前記二量体が、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４、ジカ、もしくは他のフラビウイルスのうちのいずれか１つもしくは２つからの天然および／もしくは変異エンベロープポリペプチドのホモ二量体もしくはヘテロ二量体であり、前記１つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、ＥＤＥ。
【請求項２】
前記二量体が、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４、およびジカのうちのいずれか１つまたは２つからの天然および／または変異エンベロープポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体である、請求項１に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項３】
前記二量体が、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、およびＤＥＮＶ−４のうちのいずれか１つまたは２つからの天然および／または変異エンベロープポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体である、請求項１に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項４】
前記組換えｓＥ単量体が、ジカウイルス（ＺＩＫＶ、ＫＪ７７６７９１、Ｈ−ＰＦ−２０１３＿Ｆｒｅｎｃｈ＿Ｐｏｌｙｎｅｓｉａ株）配列番号１；
デングウイルス血清型１（ＤＥＮＶ−１、ＮＣ＿００１４７７）配列番号２；
デングウイルス血清型２（ＤＥＮＶ−２、ＮＣ＿００１４７４）配列番号３；
デングウイルス血清型３（ＤＥＮＶ−３、ＮＣ＿００１４７５）配列番号４；
デングウイルス血清型４（ＤＥＮＶ−４、ＮＣ＿００２６４０）配列番号５；
他のフラビウイルス：
セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ、ＮＣ＿００７５８０）配列番号６；
日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ、ＮＣ＿００１４３７、配列番号７；
マリーバレー脳炎ウイルス（ＭＶＥＶ、ＮＣ＿０００９４３）配列番号８；
ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ、ＮＣ＿００１５６３）配列番号９；
ＷＯ２０１６／０１２８００の配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５；および表Ｍを含む変異の項に記載される変異＃１〜＃１３の中から選択される少なくとも１つの変異を有する変異体ｓＥ；ならびに任意に、表Ｍを含む変異の節に記載される変異＃１４〜＃１８の中から選択される少なくとも１つの変異、からなる群から選択される、請求項１、２、または３に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項５】
前記二量体が、ＤＥＮＶ−２の６７位に対応する位置で、および任意に、各ｓＥ単量体のＤＥＮＶ−２の１５３位またはジカＰＦ１３のＮ１５４に対応する位置でグリコシル化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項６】
前記二量体が、前記２つのｓＥ単量体間で少なくとも１つ、２つ、または３つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項７】
前記二量体が、ＤＥＮＶ−２のＡ２５９Ｃ／ジカＰＦ１３のＡ２６４Ｃに対応する変異＃２、またはＤＥＮＶ−２のＳ２５５Ｃ／ジカＰＦ１３のＳ２６０Ｃに対応する変異＃１をそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体であり、２５９Ｃ／２６４Ｃまたは２５５Ｃ／２６０Ｃに対応する残基が、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に連結されている、請求項６に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項８】
前記二量体が、ＤＥＮＶ−２のＡ２５９Ｃ／ジカＰＦ１３のＡ２６４Ｃに対応する変異＃２を有する変異体ｓＥと、ＤＥＮＶ−２のＳ２５５Ｃ／ジカＰＦ１３のＳ２６０Ｃに対応する変異＃１を有する変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、２５９Ｃ／２６４Ｃおよび２５５Ｃ／２６０Ｃに対応する残基が、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に連結されている、請求項６に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項９】
前記二量体が、ＤＥＮＶ−２のＦ１０８ＣおよびＴ３１５Ｃ／ジカＰＦ１３のＦ１０８ＣおよびＴ３２１Ｃに対応する変異＃４をそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体、またはＤＥＮＶ−２およびジカＰＦ１３のＬ１０７ＣならびにＤＥＮＶ−２のＡ３１３Ｃ／ジカＰＦ１３のＡ３１９Ｃに対応する変異＃３をそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体であり、１０８Ｃおよび３１５Ｃ／３２１Ｃに対応する残基、または１０７Ｃおよび３１３Ｃ／３１９Ｃに対応する残基が、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に連結されている、請求項６に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項１０】
前記二量体が、ＤＥＮＶ−２およびジカＰＦ１３のＦ１０８Ｃ、ＤＥＮＶ−２のＡ３１３Ｃ／ジカＰＦ１３のＡ３１９Ｃに対応する変異を有する変異体ｓＥと、ＤＥＮＶ−２およびジカＰＦ１３のＬ１０７ＣならびにＤＥＮＶ−２のＴ３１５Ｃ／ジカＰＦ１３の３２１Ｃに対応する変異を有する変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、１０８Ｃおよび３１３Ｃ／３１９Ｃに対応する残基が、前記２つのｓＥ単量体間でジスルフィド鎖間結合を介して３１５Ｃ／３２１Ｃおよび１０７Ｃに対応する残基にそれぞれ連結されている、請求項６に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項１１】
前記二量体が、ＤＥＮＶ−２のＡ２５９Ｃ／ジカＰＦ１３のＡ２６４Ｃに対応する変異＃２と、ＤＥＮＶ−２およびジカＰＦ１３のＦ１０８ＣならびにＤＥＮＶ−２のＴ３１５Ｃ／ジカＰＦ１３のＴ３２１Ｃに対応する変異＃４とをそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体、ＤＥＮＶ−２のＳ２５５Ｃ／ジカＰＦ１３のＳ２６０Ｃに対応する変異＃１と、ＤＥＮＶ−２およびジカＰＦ１３のＦ１０８ＣならびにＤＥＮＶ−２のＴ３１５Ｃ／ジカＰＦ１３のＴ３２１Ｃに対応する変異＃４とをそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体、ＤＥＮＶ−２のＡ２５９Ｃ／ジカＰＦ１３のＡ２６４Ｃに対応する変異＃２と、ＤＥＮＶ−２およびジカＰＦ１３のＬ１０７ＣならびにＤＥＮＶ−２のＡ３１３Ｃ／ジカＰＦ１３のＴ３１９Ｃに対応する変異＃３とをそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体、ならびにＤＥＮＶ−２のＳ２５５Ｃ／ジカＰＦ１３のＳ２６０Ｃに対応する変異＃１と、ＤＥＮＶ−２およびジカＰＦ１３のＬ１０７ＣならびにＤＥＮＶ−２のＡ３１３Ｃ／ジカＰＦ１３のＴ３１９Ｃに対応する変異＃３とをそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体、からなる群から選択され、２５９Ｃ／２６４Ｃ、２５５Ｃ／２６０Ｃ、１０８Ｃ、３１５Ｃ／３２１Ｃ、１０７Ｃおよび３１３Ｃ／３１９Ｃに対応する前記残基が、ジスルフィド鎖間結合を介して、前記残基２５９Ｃ／２６４Ｃ、２５５Ｃ／２６０Ｃ、３１５Ｃ／３２１Ｃ、１０８Ｃ、３１３Ｃ／３１９Ｃおよび１０７Ｃにそれぞれ連結されている、請求項６に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項１２】
前記二量体が、ＤＥＮＶ−２のＡ２５９Ｃ／ジカＰＦ１３のＡ２６４Ｃに対応する変異＃２、ＤＥＮＶ−２およびジカＰＦ１３のＦ１０８ＣならびにＤＥＮＶ−２のＴ３１５Ｃ／ジカＰＦ１３のＴ３２１Ｃに対応する変異＃４を有する変異体ｓＥと、ＤＥＮＶ−２のＳ２５５Ｃ／ジカＰＦ１３のＳ２６０Ｃに対応する変異＃１、ＤＥＮＶ−２およびジカＰＦ１３のＦ１０８ＣならびにＤＥＮＶ−２のＴ３１５Ｃ／ジカＰＦ１３のＴ３２１Ｃに対応する変異＃４を有する変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、前記残基２５９Ｃ／２６４Ｃ、１０８Ｃ、および３１５Ｃ／３２１Ｃが、ジスルフィド鎖間結合を介して、前記残基２５５Ｃ／２６０Ｃ、３１５Ｃ／３２１Ｃ、および１０８Ｃにそれぞれ連結されている、請求項６に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項１３】
前記二量体が、請求項１１に記載の変異Ｓ２５５Ｃ／２６０Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、およびＡ３１３Ｃ／３１９Ｃを有する変異体ｓＥと、請求項１１に記載の変異Ａ２５９Ｃ／２６４Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、およびＡ３１３Ｃ／３１９Ｃを有する変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、前記残基２５５Ｃ／２６０Ｃ、１０７Ｃ、および３１３Ｃ／３１９Ｃが、ジスルフィド鎖間結合を介して前記残基２５９Ｃ／２６４Ｃ、３１３Ｃ／３１９Ｃ、および１０７Ｃにそれぞれ連結されている、請求項６に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項１４】
前記二量体が、前記ｓＥ単量体間で少なくとも１つ、２つ、または３つのスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項１５】
前記スルフヒドリル反応性架橋剤が、マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、アルキルハライド、またはアジリジン化合物、アクリロイル誘導体、アリール化剤、またはチオール−ジスルフィド交換試薬からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項１６】
前記マレイミドスルフヒドリル反応性架橋剤が、ＢＭＯＥ、ＢＭＢ、ＢＭＨ、ＴＭＥＡ、ＢＭ（ＰＥＧ）２、ＢＭ（ＰＥＧ）３、ＢＭＤＢ、ＤＴＭＥ、好ましくはＢＭＨ、ＢＭ（ＰＥＧ）２、およびＢＭ（ＰＥＧ）３からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項１７】
前記二量体が、ＤＥＮＶ−２のＴ２６２ＣまたはＤＥＮＶ−２のＴ２６５Ｃに対応する変異をそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体であり、２６２Ｃまたは２６５Ｃに対応する残基が、スルフヒドリル反応性架橋剤を介して一緒に連結されている、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項１８】
前記二量体が、ＤＥＮＶ−２のＴ／Ｓ２６２Ｃに対応する変異を有する変異体ｓＥと、ＤＥＮＶ−２のＴ／Ａ２６５Ｃに対応する変異を有する変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、２６２Ｃおよび２６５Ｃに対応する残基が、スルフヒドリル反応性架橋剤を介して一緒に連結されている、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項１９】
前記二量体が、変異体ｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、ＤＥＮＶ−２  ｓＥのアミノ酸残基１〜９、２５〜３０、２３８〜２８２、９６〜１１１、および３１１〜３１８に対応する前記アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、システインおよび変異体ｓＥに変異し、ＤＥＮＶ−２  ｓＥのアミノ酸残基１〜９、２５〜３０、２３８〜２８２、９６〜１１１、および３１１〜３１８に対応するアミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、システインに変異し、前記変異したシステイン残基が、スルフヒドリル反応性架橋剤を介して一緒に連結されている、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項２０】
前記組換えｓＥまたは前記２つの組換えｓＥのうちの１つが、ＤＥＮＶ−２のＨ２７Ｆ、Ｈ２７Ｗ、Ｈ２４４Ｆ、Ｈ２４４Ｗ、およびＬ２７８Ｆに対応する変異からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項２１】
前記組換えｓＥまたは前記２つの組換えｓＥのうちの１つが、ＤＥＮＶ−２のＬ２９２ＦおよびＬ２９４Ｎに対応する変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項２２】
前記二量体が、変異体ｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、一方のｓＥ単量体が、グリコシル化部位を導入する少なくとも１つの変異を有し、前記変異したアミノ酸残基が、Ｘ官能基を担持する改変糖でグリコシル化され、−他方のｓＥ単量体が、グリコシル化部位を導入する少なくとも１つの変異を有し、前記変異したアミノ酸残基が、Ｙ官能基を担持する改変糖でグリコシル化され、両方の変異した残基が、具体的にはクリック化学によって、第１のｓＥ単量体の糖のＸ官能基を他方のｓＥ単量体の糖のＹ官能基と反応させることによって、前記改変糖類を介して一緒に結合している、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項２３】
前記ＥＤＥが、安定化された組換えデングウイルスエンベロープ糖タンパク質細胞外ドメイン（ｓＥ）二量体、エンベロープタンパク質の二量体、またはその抗原性部分、または任意に、単量体間での共有結合および／または非共有結合のレベルが増加する場合、任意に、前記ＥＤＥが改善されたＥＤＥである場合、異種骨格タンパク質内に保持された、前記エンベロープポリペプチド二量体の連続もしくは非連続残基を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項２４】
前記ＥＤＥが、前記ＤＥＮＶ−１もしくはＤＥＮＶ−２ポリペプチド配列の、Ｅ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２（ＤＥＮＶ−１；Ｋ１２２  ＤＥＮＶ−２）、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２（ＤＥＮＶ−１；Ｉ１６２  ＤＥＮＶ−２）、Ｐ１６９（ＤＥＮＶ−１；Ｓ１６９  ＤＥＮＶ−２）、Ｔ２００（ＤＥＮＶ−１；Ｑ２００  ＤＥＮＶ−２）、Ｋ２０２（ＤＥＮＶ−１；Ｅ２０２  ＤＥＮＶ−２）、Ｅ２０３、Ｌ３０８（ＤＥＮＶ−１；Ｖ３０８もしくはＩ３０８  ＤＥＮＶ−２＿、Ｋ３１０、Ｑ３２３（ＤＥＮＶ−１；Ｒ３２３  ＤＥＮＶ−２）、Ｗ３９１、Ｆ３９２；ジカＰＦ１３のＴ４９、Ｓ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｓ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５４、Ｔ１５６、Ｋ１６６  Ｔ２０５、Ｎ２０７、Ｎ２０８、Ｆ３１４、Ｋ３１６、Ｅ３１９、Ｗ４００、Ｈ４０１に対応する位置のうちの１つ以上；またはフラビウイルス、任意に、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基；
ならびに／あるいは
ジカＰＦ１３のＲ２、Ｍ６８、Ａ６９、Ｓ７０、Ｄ７１、Ｓ７２、Ｒ７３、Ｃ７４、Ｑ７７、Ｄ８３、Ｖ９７、Ｄ９８、Ｒ９９、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｃ１０５、Ｇ１０６、Ｌ１１３、Ｋ２５１、Ｒ２５２、Ｑ２５３、Ｔ３１５、Ｋ３１６、Ｑ３３１、Ｋ３７３に対応する位置のうちの１つ以上、例えばジカＰＦ１３のＴ３１５、Ｋ３７３、Ｓ７０、Ｓ７２、Ｑ７７、Ｒ９９、Ｇ１０４、Ｍ６８、Ｒ２５２、Ｄ８３、Ｑ２５３に対応する位置のうちの１つ以上、ならびに／あるいは、前記ＤＥＮＶ−２もしくはＤＥＮＶ−４ポリペプチド配列の、Ａ７１、Ｃ１０５、Ｃ７４、Ｄ１５４、Ｄ２４９、Ｄ２７１、Ｄ３０９、Ｄ３６２、Ｄ９８、Ｅ１４８、Ｅ３１１、Ｅ４４、Ｅ７１、Ｅ８４、Ｇ１０２、Ｇ１０４、Ｇ１０６、Ｇ１５２、Ｇ１５６、Ｇ２８、Ｇ２９、Ｇ３７４、Ｈ１５８、Ｈ２７、Ｉ１１３、Ｉ３０８、Ｉ４６、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｋ３１０、Ｋ３２３、Ｋ３２５、Ｋ４７、Ｌ１１３、Ｌ４５、Ｌ８２、Ｍ２７８、Ｎ１０３、Ｎ１５３、Ｎ３６２、Ｎ６７、Ｎ８３、Ｑ２４８、Ｑ２７１、Ｑ３２５、Ｑ７７、Ｒ２、Ｒ２４７、Ｒ３２３、Ｒ７３、Ｒ９９、Ｓ７２、Ｓ８１、Ｔ１１５、Ｔ１５５、Ｔ３６１、Ｔ４６、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｔ７２、Ｖ１１３、Ｖ１１４、Ｖ２５０、Ｖ３０９、Ｖ３２４、Ｖ９７、Ｗ１０１、に対応する位置のうちの１つ以上、またはフラビウイルス、任意に、ジカまたはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基、を含み、任意に、ＤＥＮＶ−２／Ｎ１５４ジカＰＦ１３のＮ１５３および／またはＤＥＮＶ−２のＮ６７に対応する位置が、グリコシル化され、任意に、前記ＥＤＥが、位置Ｗ１０１および少なくとも１つの他の位置を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項２５】
特定の残基が、エンベロープタンパク質の天然の二量体における前記残基と実質的に同様の空間配置にある、請求項１〜２４のいずれかに記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項２６】
前記ＥＤＥが、ドメインＩＩ側上のｂストランド、およびドメインＩ側（前記二量体界面の向かいの）上の「１５０ループ」によって形成されたくぼみの中心に置かれた領域を含み、前記１５０ループが残基１４８〜１５９に広がり、ドメインＩのｂストランドＥ０およびＦ０を接続し、Ｎ１５３グリカンを担持し、これは前記二量体における前記パートナーサブユニットの融合ループを覆い、任意に、前記領域が、前記ｂストランド（前記Ｎ６７グリカンを担持する残基６７〜７４）、すぐ上流の前記融合ループおよび残基（残基９７〜１０６）、ならびに前記参照サブユニットの前記ｉｊループ  （残基２４６〜２４９）を含み、前記参照サブユニットが、前記融合ループに寄与する前記サブユニットであり、任意に、前記ＥＤＥが、第２のサブユニットの前記１５０ループおよび前記Ｎ１５３グリカン鎖をさらに含み、任意に、一方または両方の領域が天然領域と実質的に同様の空間配置にあるか、または前記ＥＤＥが、ドメインＩＩのジカＰＦ１３ベータストランドｂ、ｂｃｄベータ−シート端部、融合ループ主鎖、融合ループＲ９９側鎖、Ｑ７７側鎖、Ｃ７４とＣ１０５との間のジスルフィド結合、ベータストランドＥ、Ｋ３７３、ドメインＩの荷電残基、ドメインＩＩのｋｌループ、またはそれに対応する領域を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項２７】
前記ＥＤＥが、ビリオンまたはサブウイルス粒子、またはウイルス様粒子もしくはナノ粒子、任意に、自己組織化ナノ粒子の一部として提示される、請求項１〜２６のいずれかに記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項２８】
前記ＥＤＥが、一旦、対象、好ましくはヒトに投与されると、抗体を作り出すことができ、前記抗体が、１種を超える血清型のフラビウイルス、任意に、デングウイルスおよびジカウイルスに結合することができ、任意に、４種すべての血清型のデングウイルスおよびジフウイルスに結合することができ、１種を超える血清型のフラビウイルス、任意に、デングウイルスおよびジカウイルスを中和することができ、任意に、４種すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを中和することができ、かつ前記抗体が、任意に、４種すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを８０、９０、または１００％中和することができ、任意に、ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られるウイルスを中和することができ、好ましくは、ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られる４種すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを８０、９０、または１００％中和することができる、請求項１〜２７のいずれかに記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項２９】
前記ＥＤＥが、単一ポリペプチドとして表され、任意に、前記２つのエンベロープ単量体が、リンカーによって分離され、任意に、前記リンカーが、グリシンおよび／またはセリンリッチである、請求項１〜２８のいずれかに記載の使用のためのＥＤＥ。
【請求項３０】
１つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種する際に使用するための、または１つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および／または治療のための方法における使用のための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＥＤＥをコードする核酸であって、前記１つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、核酸。
【請求項３１】
１つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種する際に使用するための、または１つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および／または治療のための方法における使用のための組成物であって、
ａ）請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＥＤＥ、
ｂ）請求項３０に記載の核酸、
ｃ）請求項３０に記載の核酸を含むベクター、
ｄ）請求項３０に記載の核酸、または請求項３０に記載の核酸を含むベクターを含む、宿主細胞であって、任意に、前記宿主細胞が、Ｃ６／３６昆虫細胞、ヒト樹状細胞、ＣＨＯ細胞、またはピキア・パストリス細胞である、宿主細胞、のうちのいずれか１つ以上を含み、前記１つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、組成物。
【請求項３２】
ａ）請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＥＤＥ、
ｂ）請求項３０に記載の核酸、
ｃ）請求項３０に記載の核酸を含むベクター、
ｄ）請求項３０に記載の核酸を含む宿主細胞、または請求項３０に記載の核酸を含むベクターが、１種を超える、任意に２種、任意に３種、任意に４種の血清型のデングウイルスおよび／またはジカウイルスからのものであるか、またはそれらの前記ＥＤＥをコードする、請求項３１に記載の使用のための組成物。
【請求項３３】
ａ）請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＥＤＥ、
ｂ）請求項３０に記載の核酸、
ｃ）請求項３０に記載の核酸を含むベクター、
ｄ）請求項３０に記載の核酸を含む宿主細胞、または請求項３０に記載の核酸を含むベクターが、４種すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを中和する抗体を産生することができる単一のＥＤＥであるか、またはそれをコードし、任意に、４種すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを完全に中和することができ、任意に、昆虫細胞およびヒト細胞における４種すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを完全に中和することができる、請求項３１または３２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３４】
前記個体が、妊娠中の女性、任意に、例えばデングウイルスに感染したことが分かっている、または疑われることを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている１人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、妊娠中の女性、または、出産年齢の女性、任意に、例えば、デングウイルスに感染していることが分かっている、または疑わしいことを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている１人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、出産年齢の女性である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の使用のための、ＥＤＥ、核酸、または組成物。
【請求項３５】
ジカウイルスに対するワクチンのために好適な抗原を選択することを補助するための方法であって、候補抗原に応答して対象において作製された１つ以上の抗体の特性決定を含み、任意に、前記候補抗原が、請求項１〜２９のいずれかに記載のＥＤＥに結合することが知られている抗体のパネルに結合することがこれまでに見出されている、方法。
【請求項３６】
前記抗体が、前記候補抗原に曝露された対象の分類された単一形質細胞から得られる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記主要抗体（複数可）が、任意に、ウエスタンブロットにおいて、前記デングエンベロープタンパク質を含む直線状エピトープを認識する場合、前記候補抗原がジカワクチン抗原として適していないと見なされる、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記主要抗体（複数可）が、請求項１〜２９のいずれかに記載のＥＤＥに結合する場合、前記候補抗原が、ジカワクチン接種における使用に潜在的に適していると考えられる、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体が、２種以上の異なる血清型のデングウイルス／ジカウイルスの、請求項１〜２９のいずれかに記載のエンベロープタンパク質またはＥＤＥに対する交差反応性について評価される、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記候補抗原が、任意に、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のフラビウイルスエンベロープタンパク質の安定化二量体である、請求項３５〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
ジカウイルスワクチン接種に対する患者の必要性を評価するための方法であって、前記対象における抗ＥＤＥ抗体および抗融合ループ抗体のレベルの特定を含み、前記ＥＤＥが、請求項１〜２９のいずれかに記載されるとおりである、方法。
【請求項４２】
前記患者が、抗ＥＤＥ抗体を有すると判定される場合、ワクチン接種が不要である可能性があると特定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記患者が、抗ＥＤＥ抗体を有すると判定される場合、前記患者は、ブースト投与に供されるように選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記患者が、抗ＥＤＥ抗体を有しない場合、前記患者は、全ワクチン接種のために選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＥＤＥに対する単離された中和抗体またはその抗原結合断片であって、任意に、前記抗体またはその断片が、前記残基６７〜７４、残基９７〜１０６、残基３０７〜３１４、残基１４８〜１５９、および残基２４３〜２５１、または前記フラビウイルスもしくはジカウイルス糖タンパク質Ｅ細胞外ドメインの対応する残基からなるか、あるいはジカＰＦ１３残基６７〜７７、残基９７〜１０６、残基３１３〜３１５、残基２４３〜２５３、残基Ｋ３７３、または前記フラビウイルス糖タンパク質Ｅ細胞外ドメインの対応する残基からなる、前記デングウイルス糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（ｓＥ）の５つのポリペプチドセグメントに結合し、任意に、結合が、デングＮ１５３（ジカＮ１５４）グリカンまたは対応する残基の存在もしくは不在、によって影響を受けず、１つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および／または治療のための方法における使用のためのものであり、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、単離された中和抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４６】
前記個体が、妊娠中の女性、任意に、例えばデングウイルスに感染したことが分かっている、または疑われることを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている１人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、妊娠中の女性、または、出産年齢の女性、任意に、例えば、デングウイルスに感染していることが分かっている、または疑わしいことを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている１人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、出産年齢の女性である、請求項４５に記載の使用のための、抗体またはその断片。
【請求項４７】
フラビウイルス、任意に、ジカまたはデングウイルスのビリオン依存性（サブウイルス粒子またはウイルス様粒子を含む）エピトープ（複数可）を単独に認識する、請求項４５または４６に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項４８】
Ｆａｂ断片である、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の断片。
【請求項４９】
前記抗体または断片が、表Ａに特定される抗体ＥＤＥ１  Ｃ８またはＥＤＥ１  Ｃ１０からの、任意に、配列番号１５〜２６および前記配列番号１５〜２６のいずれか１つから３０、２０、１５、または１０％以下の改変を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ領域を含む、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項５０】
前記ＥＤＥが、前記ドメインＩＩ側上のｂストランド、および（前記二量体界面の向かいにある）ドメインＩ側上の「１５０ループ」によって形成されたくぼみの中心に置かれた領域を含み、前記１５０ループが残基１４８〜１５９に広がり、ドメインＩのｂストランドＥ０およびＦ０を接続し、前記Ｎ１５３グリカンを担持し、前記二量体において前記パートナーサブユニットの融合ループを覆い、任意に、前記領域が、前記ｂストランド（前記Ｎ６７グリカンを担持する残基６７〜７４）、すぐ上流の前記融合ループおよび残基（残基９７〜１０６）、ならびに前記参照サブユニットの前記ｉｊループ（残基２４６〜２４９）を含み、前記参照サブユニットが、前記融合ループに寄与する前記サブユニットであり、任意に、前記ＥＤＥが、第２のサブユニットの前記１５０ループおよび前記Ｎ１５３グリカン鎖をさらに含み、任意に、一方または両方の領域が、天然領域と実質的に同様の空間配置にあるか、または前記ＥＤＥが、ドメインＩＩのジカＰＦ１３ベータストランドｂ、ｂｃｄベータ−シート端部、融合ループ主鎖、融合ループＲ９９側鎖、Ｑ７７側鎖、Ｃ７４とＣ１０５との間のジスルフィド結合、ベータストランドＥ、Ｋ３７３、ドメインＩの荷電残基、ドメインＩＩのｋｌループ、またはそれに対応する領域を含む、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項５１】
前記抗体またはその断片が、１種以上の血清型のデングウイルスおよび／またはジカウイルスを中和し、任意に、１種以上の血清型のデングウイルスおよび／またはジカウイルスを８０％または９０％または９８％または１００％中和する、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項５２】
前記抗体またはその断片が、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを中和し、任意に、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを８０％または９０％または９８％または１００％中和し、任意に、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを１００％に中和し、任意に、すべての血清型のデングウイルスを同じ濃度の抗体または断片で１００％中和する、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項５３】
前記抗体またはその断片が、１つ以上の血清型のデングウイルスおよび／またはジカウイルスを０．５〜０．０１μｇ／ｍｌの濃度で８０、９０、９８、または１００％中和する、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項５４】
前記抗体またはその断片が、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを、０．５〜０．０１μｇ／ｍｌの濃度で８０、９０、９８、または１００％中和する、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項５５】
前記断片が、Ｆｖ断片、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、もしくはＦ（ａｂ）２断片）；またはドメイン抗体であるか、または前記抗体が、モノクローナル抗体または組換え抗体である、請求項４５〜５４のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項５６】
前記抗体が、ポリクローナル抗体またはその抗原結合部分である、請求項４５〜５４のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項５７】
前記抗体またはその断片が、混合物または抗体、任意に、
ａ）モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、または
ｂ）ポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、または
ｃ）混合物、またはモノクローナルおよびポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分、を含む組成物の一部として使用するためのものである、請求項４５〜５６のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。
【請求項５８】
１つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および／または治療のための方法における使用のための、請求項４５〜５７のいずれかに記載の抗体またはその断片をコードする核酸であって、前記１つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、核酸。
【請求項５９】
前記抗体もしくはその断片または核酸が、上述の１つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および／または治療のための方法における使用のためのものであり、前記治療が、抗体依存性増強（ＡＤＥ）を減少させるためである、請求項４５〜５７のいずれか一項に記載の使用のための抗体もしくはその断片、または請求項５８の使用のための核酸。
【請求項６０】
対象における１つ以上のフラビウイルスによる感染の診断またはモニタリングする際に使用するための、請求項１〜５９のいずれか一項に記載のＥＤＥまたはその抗体もしくはその断片であって、前記１つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、ＥＤＥまたはその抗体もしくはその断片。
【請求項６１】
１つ以上のフラビウイルスによる感染に対してワクチン接種された対象における１つ以上のフラビウイルスによる感染に対するワクチン接種プロトコルの成功をモニタリングするためのインビトロ方法であって、
ａ）前記対象からの適切な生物学的試料を、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＥＤＥとインビトロで接触させるステップと、
ｂ）前記生物学的試料中の前記二量体を対象とする中和抗体の量を判定するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において判定された量を、前記対象に対して以前に得られた前記二量体を対象とする抗体の量と比較するステップと、を含み、
前記二量体を対象とする中和抗体の量の有意な増加が、前記ワクチン接種プロトコルの成功のマーカーを構成し、
前記１つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、インビトロ方法。
【請求項６２】
１つ以上のフラビウイルスによる感染を患っている患者を、請求項４５〜５７のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、または請求項５８に記載の核酸での治療、あるいはその用量の増加を必要とする可能性が高いとして特定するための方法であって、前記対象における抗ＥＤＥ抗体および抗融合ループ抗体のレベルの決定を含み、前記ＥＤＥが、請求項１〜２９のいずれかに記載のとおりであり、前記１つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、方法。
【請求項６３】
前記対象が主に抗融合ループ抗体を有する場合、前記対象が前記抗体、断片、または核酸で治療、任意に高用量でそれを必要とする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象が抗ＥＤＥ抗体を有しないか、または特に低レベルの抗ＥＤＥ抗体を有する場合、前記対象が、高用量の前記抗体、断片、または核酸を必要としていると見なされる、請求項６２または６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビウイルス感染の治療および予防の分野ならびに関連化合物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルスの負担
フラビウイルス属のウイルスは、最も重要な節足動物媒介性のヒト病原体であり、予防的治療や治癒的治療が利用できない南米における現在のジカ爆発などのますます深刻な蔓延を引き起こしている。ジカＶの現在のメディアへの影響に加えて、社会に最も高い報酬を課すフラビウイルス疾患は、アミノ酸配列が３０〜３５％異なる血清型ＤＥＮＶ１〜４と呼ばれる４つの異なるウイルスによって引き起こされるデング熱である。世界の年間発生率は、３億９０００万の症例であり、このうち、９６００万人は、臨床的に明らかであり１、約２５０００人が死亡していると推定されている。グローバリゼーション、Ａｅｄｅｓ蚊ベクターの広がり、都市計画の不十分な計画、最近まで認可されたワクチンまたは抗デング治療薬がなかったことなど、いくつかの要因がパンデミックを引き起こしている２。ジカＶはまた、Ａｅｄｅｓ蚊によっても広がり、フラビウイルスの中でそのエンベロープタンパク質は他のフラビウイルスよりもＤＥＮＶ（４２〜４６％発散、図１Ａ）のアミノ酸配列に最も近い。
【０００３】
重度のデング疾患の特徴は、毛細血管の浸透性を高め、血漿漏出および出血を引き起こし、血流力学的妥協およびデングショック症候群をもたらす。未治療の重度の疾患は、死亡率が最大２０％になり得るが、専門家の管理、主に補液により、これは、１％未満に減らすことができる２。デング熱は爆発的な蔓延を引き起こし、風土病国の医療制度に大きなストレスを与え、いくつかのデング熱管理戦略が評価されているが、一般的に、すべての年齢層に有効なワクチンが疾患の負担に深刻に参入することが必要である。ジカウイルスの場合、ほぼ７０年前に発見されたが、最近になって、ミコセファリーおよびギランバレー症候群を含む重度の神経学的後遺症が記載されている３〜６。
【０００４】
フラビウイルスビリオン
フラビウイルスは、カプシド（Ｃ）前駆体膜タンパク質（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）、ならびに７つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５）の３つの構造タンパク質を有する直径５０ｎｍである、比較的単純なポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスである（図１Ｂ）。ＥおよびｐｒＭは、ウイルスの糖タンパク質の殻を形成し、Ｅは宿主細胞の結合および細胞への侵入７に関与する。ウイルス粒子の組み立ておよび成熟は、ＤＥＮＶについて最も徹底的に研究されている。小胞体中の粒子の形態形成中、Ｅの１８０個のコピーは、１：１の様式で、ｐｒＭの１８０個のコピーと会合して、「未成熟ビリオン」をそれらの特徴となるスパイク状の外観７〜９を与える、６０三量体（ヘテロ六量体）スパイクを形成する（図２Ａ）。トランスゴルジネットワーク内のｐｒＭは、それが分泌されるまで、ビリオンと会合したままの状態で膜アンカー型Ｍの切り株およびＰＲを生成し、宿主がコードされたフリンプロテアーゼによって切断される８、１０、１１。宿主細胞から分泌されると、ｐｒは、離れて、「成熟ビリオン」を残し、Ｅの１８０個のコピーを含む平滑な構造は、２、３、および５倍軸の周りに２０面体対称を有する９０ヘッドトゥーテール二量体に配置される（図２Ｂ）。
【０００５】
ＤＥＮＶでは、ｐｒＭの切断は、すべてのビリオンにおいて完全ではなく、割合の中間体の状態のままで、ウイルス粒子が様々な量の切断された、かつ切断されないｐｒＭ１２〜１５を含む。ｐｒＭの切断は、昆虫細胞またはベロなどの腫瘍細胞株で産生されるウイルスと比較して、ある特定の細胞型、特に樹状細胞などの初代ヒト細胞でより効率的である１６、１７。
【０００６】
免疫増強
１種の血清型のデングによる感染は、その血清型との再感染への終生免疫の世代をもたらすが、他の血清型ではもたらさない１８〜２０。４種すべてのデング血清型がしばしば共循環するか、または周期的に互いに置き換わるので、複数の感染が流行国では典型的である。十分に管理された疫学研究は、大部分の重度のデング熱感染が、二次的または連続的なデング熱感染を経験している個体において生じることを示している２１〜２３。
【０００７】
抗体依存性増強（ＡＤＥ）の理論は、一次感染に対して生成された既存の異種抗体が、二次的に遭遇するウイルスを中和するのに十分な結合活性または濃度ではないことを仮定しており、エンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、３０〜３５％変化し得る。その代わりに、ウイルスは、インビボでＤＥＮＶ複製の主要部位である、単球およびマクロファージなどのＦｃ受容体（ＦｃＲ）を担持する細胞に取り組むために、オプソニン化および標的化され、そのため、ウイルス産生の増加をもたらし得る２４〜２７。
【０００８】
デングワクチン
過去数十年にわたるデング熱感染の指数関数的増加は、デングワクチンの探索を必要であるが、この目標を達成することは非常に困難であることを示している。成功したワクチンは、デング熱にさらされていないか、またはこれまでにデング熱感染を経験している個体において、４種すべてのデング血清型、好ましくは１または２用量で保護的で耐久性のある免疫応答を誘導する必要があるであろう。同時に、ワクチンは上記の増強または病原性免疫応答を誘発することを避ける必要があり得る。
【０００９】
初回のデング熱感染が他の３つのウイルス血清型の再感染に対する長期的な予防を与えないため１８、１９、ワクチンは四価製剤を要求する４種すべての血清型に対して防御型特異的応答を誘導する必要があると一般に認められている。ワクチン開発の取り組みは、タイで始まったおよそ５０年間、４種の血清型を表すウイルス株の連続継代によって生きた弱毒化デングワクチン（ＬＡＴＶ）を産生する作業を追求されてきた２８。特定の課題は、過度に弱毒化されていない顕性デング疾患を誘発し、防御免疫応答を誘発することができない弱毒化形態のウイルスを開発することであった。別の課題は、４つすべてのウイルスが一緒に送達される、四価製剤を生産し、均等に複製し、いくつかの血清型に対して良好な応答であるが、１種以上の血清型に対して不良な応答をもたらした血清型間の競合ではなく、４種すべての血清型に対してバランスのとれた応答を誘導することであった。
【００１０】
最先端のデングワクチンは、Ｓａｎｏｆｉ  ＰａｓｔｅｕｒワクチンＣＹＤ−ＴＤＶである。これは、黄熱病１７Ｄワクチン株を骨格とし、デングｐｒＭおよびＥ遺伝子を黄熱病のものに置き換えたキメラである。ワクチンは、各血清型（ＣＹＤ１〜４）を表す４種の組換えウイルスの混合物を含む２９〜３２。最初の臨床試験は、ワクチンに対する良好な血清反応が示され、血清陽性率は６６．５〜１００％であった。アジアおよびラテンアメリカにおけるこのワクチンの第ＩＩＩ相試験は、３５〜７８％の準最適有効性を示し、デング２に対する有効性は最も低かった３０、３２。
【００１１】
さらなる分析により、ワクチンはワクチン接種前にすでに１種以上の血清型に対して既に免疫されたワクチンに対してより良好な保護を与えたことが明らかになった。最近、最初の２〜３年の長期追跡調査の暫定的結果が発表され、有効性が立証されたが、プラセボと比較して９歳未満のワクチン接種群で増加した入院デング熱病に関するシグナルが明らかになった３３。ワクチンプライミングによる免疫増強が不完全な防御をもたらす可能性があるという強い疑いがあり、これは予防接種時に未熟なデング熱の若いワクチンでおそらく起こる。しかしながら、このワクチンは、いくつかのデング熱帯諸国で認可されているが、９〜４５歳に制限されており、リスクのある個人の大半が適格ではないことを意味する。ＴａｋｅｄａおよびＮＩＨのＬＡＴＶのうち２つ以上のＬＡＴＶが第ＩＩＩ相評価に近く、これらが優れた有効性を達成するかどうかが決定されるであろう。
【００１２】
デングエピトープが、最もヒト中和抗体の標的物であるかについては、これまでのところ明らかではなく、例えば、ｄｅ  Ａｌｗｉｓ（ｄｅ  Ａｌｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９：７４３９−７４４４）は、エピトープが形成のためにウイルスの組み立てを必要とすることを示唆しているが、一方、Ｒｅｙ（Ｒｅｙ  ２０１３  Ｎａｔｕｒｅ  ４９７：４４３−４４４）は、エンベロープ二量体自体が標的物であると示唆している。
【００１３】
本発明者らが関与する以前の研究は、デングエンベロープ二量体の一部を標的とするヒト中和抗体を同定する。例えば、ＷＯ２０１６／０１２８００、Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，１０９−１１３、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，１７０−１７７を参照されたく、これらは、４種の血清型のデングウイルス（ＤＥＮＶ）に対する強力な交差中和ヒト抗体の単離および構造的特徴付けに関連する。これらの抗体は、Ｅ−二量体−エピトープ（ＥＤＥ）と呼ばれる高度に保存されたエピトープに結合する。
【００１４】
Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ１９，１−９は、融合ループエピトープを認識するフラビウイルス広範な防御抗体として記載されている抗体とのジカウイルスエンベロープタンパク質およびその複合体の構造を報告している。Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）は、５頁、第２欄に
「ＥＤＥ特異的中和抗体の構造研究により、融合ループの露出した主鎖および２つの保存されたグリカン鎖（Ｎ６７およびＮ１５３結合グリカン）を含む、認識決定基がＥ二量体界面で血清型不変部位に見出されることが明らかになったことを言及する（Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。これらの２つのグリコシル化部位は、他のフラビウイルスにおいて高度に保存されていない。さらに、ＺＩＫＶは、Ｎ６７結合グルシレーション部位を持たず、Ｎ１５４結合グリコシル化部位（ＤＥＮＶのＮ１５３結合グリコシル化部位と同等）は、単離されたＺＩＫＶ株の一部には存在しない（表Ｓ２）。さらに、ＤＥＮＶ  ＥＤＥ  ｍＡｂ結合にとって重要なｂストランド、１５０ループ、ｉｊループ、およびＡ鎖のいくつかの残基は、ＺＩＫＶおよび他のフラビウイルスにおいて保存されていない（図Ｓ２）。重要なことに、ＺＩＫＶ  ｓＥ構造は、ＥＤＥ抗体の結合領域に独自に正電荷のパッチを示すので（図Ｓ１）、ＥＤＥ特異的抗生物質はＺＩＫＶ感染に対して効果的でない可能性がある。しかしながら、高度に保存された融合ループを標的とする他
の既知のフラビウイルスＦＬＥ特異的抗体は、２Ａ１−Ｇ６の中和プロファイルによって確認されるように、ＺＩＫＶを中和することができる。」
【００１５】
Ｄａｉら（２０１６）に記載された結論とは対照的に、本発明者らは、デングウイルスを越えてフラビウイルスが強力に中和され、例えばＤａｉら（２０１６）に報告されているよりもはるかに強力な中和など、ジカＶの強力な中和をもたらす、デングウイルスを越えて、例えばジカウイルス（ジカＶ）においてもＥＤＥが保存されると判定されている。ＥＤＥエピトープの保存は、フラビウイルス、例えばジカウイルスによって引き起こされる疾患の治療および予防に幅広く影響を及ぼす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
以下に記載の本発明は、デングウイルスを越えて新たに同定されたＥＤＥの保存に関して、方法、使用、ワクチン、化合物、および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、本発明の異なる態様の様々な実施形態に関して以下に記載されよう。明確にするために、個別の実施形態の文脈に記載される本発明のある特定の特性はまた、１つ以上の実施形態または単一の実施形態において組み合わせても提供されてもよいことが理解される。反対に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈に記載される本発明の様々な特性はまた、個別にまたは任意の適当なサブコンビネーションで提供されてもよい。これらの実施形態のすべての組み合わせは、あたかも各々およびすべての組み合わせが個別におよび明示的に開示されたかのように、本発明によって具体的に包含され、本明細書で開示されている。加えて、すべてのサブコンビネーションはまた、あたかも各々およびすべてのこのようなサブコンビネーションが個別におよび明示的に本明細書で開示されたかのように、本発明によって具体的に包含され、本明細書で開示されている。
【００１８】
したがって、本発明の第１の態様は、１つ以上のフラビウイルスの感染の予防および／または治療のための方法における使用のために、１種を超える血清型のフラビウイルス、例えば１種を超える血清型のデングウイルスおよび／またはジフウイルスを中和する化合物を提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本化合物は、以下でさらに論じられるように、抗体またはその抗原結合断片であり得る。したがって、一実施形態では、本発明は、以下に定義されるＥＤＥに対する単離された中和抗体またはその抗原結合断片を提供し、任意に、当該抗体またはその断片は、残基６７〜７４、残基９７〜１０６、残基３０７〜３１４、残基１４８〜１５９、および残基２４３〜２５１、またはフラビウイルスもしくはジカウイルス糖タンパク質Ｅ細胞外ドメインの対応する残基からなるか、あるいはジカＰＦ１３残基６７〜７７、残基９７〜１０６、残基３１３〜３１５、残基２４３〜２５３、残基Ｋ３７３、またはフラビウイルス糖タンパク質Ｅ細胞外ドメインの対応する残基からなる、デングウイルス糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（ｓＥ）の５つのポリペプチドセグメントに結合し、任意に、結合が、デングＮ１５３（ジカＮ１５４）グリカンまたは対応する残基の存在もしくは不在によって影響を受けず、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【００２０】
個体は、妊娠中の女性、任意に、例えばデングウイルスに感染したことが分かっている、または疑われることを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている１人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、妊娠中の女性、または出産年齢の女性、任意に、例えば、デングウイルスに感染していることが分かっている、または疑わしいことを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている１人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、出産年齢の女性である。
【００２１】
化合物、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、結果が特に重篤である可能性がある妊婦におけるジカ感染の可能性、ウイルス負荷、または重症度／影響を低減するのに特に有用であると考えられる。
【００２２】
ジカウイルス糖タンパク質細胞外ドメイン（ｓＥ）については、結合セグメントは、実施例２、例えば「ＥＤＥ１Ｃ８複合体」と記載された節に示されているように、ならびに実施例２の図３および４を参照してもよい。抗体とジカｓＥとの相互作用は、ＣＤＲからの側鎖（例えば、水素結合ドナー（ＮＨ基）およびｂｄｃベータシート端（実施例２の図３ｂおよび３ｃ）の受容体（主鎖カルボニル）を認識するＨ２、Ｈ３、およびＬ３など）を有するドメインＩＩのベータストランドｂを含み得る。融合ループ主鎖（いくつかのグリシン残基を含む）およびＣｙｓ７４とＣｙｓ１０５との間のジスルフィド結合は、ＣＤＲ  Ｌ１およびＬ３（実施例２のＥＤ図１）の残基の芳香族側鎖によって枠を付けることができる。これらの２つのＣＤＲからの残基は、例えば、融合ループの保存された側鎖カイン、例えばＡｒｇ９９または近くに、例えばＧｌｎ７７も認識し得る。二量体界面を横断して、ベータストランドＥ、例えばＬｙｓ３７３は、例えば、直接または水媒介水素ボディのネットワーク（例えば、実施例２のＥＤ図４ｂおよび４ｃを参照のこと）のようなＣＤＲｓ  Ｌ１およびＬ２と相互作用することができる。ドメインＩおよびドメインＩＩの近くのｋｌループからの荷電残基は、例えば、ＣＤＲ  Ｈ２およびＨ３などの重鎖への結合に寄与し得る（実施例２のＥＤ図４ｅおよび４ｆ）。実施例２のＥＤ表４および５は、例えば、ＥＤＥ１  Ｃ８とＺＩＫＶ  ｓＥとの間の極性相互作用を示す。したがって、ドメインＩＩにおけるｂストランドおよび融合ループとの接触は、例えば、二量体界面を横断するか、または相互作用を安定化させるＤＥＮＶのＮ６７グリカンを介して、他の寄与とともに主要な結合決定因子であり得る。
【００２３】
好ましくは、本化合物は、１種または２種の血清型のデングウイルス、より好ましくは３種のデングウイルス、および最も好ましくは４種の血清型のデングウイルスのデングウイルスすなわち、４種すべての血清型のデングウイルスを中和する、例えば、ジカウイルス、ならびにＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、およびＤＥＮＶ−４を含む一覧表からの１種、２種またはそれ以上の血清型のデングウイルスを中和する。
【００２４】
化合物とは、１種を超える血清型のフラビウイルス、例えばジカおよびデングウイルスを中和することができる任意の化合物を意味する。本化合物は、例えば、小分子、ポリペプチド、またはタンパク質（これらの用語は、本明細書で同義に使用される）であってもよく、これには、糖タンパク質、核酸、炭水化物、脂肪、原子、例えば、金属が含まれる。好ましい実施形態では、本化合物は、ポリペプチド、好ましくは抗体またはその抗原結合部分である。この抗原結合部分は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、もしくはｓｃＦｖ断片）、またはドメイン抗体であってもよい。この抗原結合部分は、無傷抗体に存在する線状アミノ酸配列に由来し得るか、または一連の非連続的なアミノ酸を含み得るか、任意に他のアミノ酸と散在され得、例えば、エピトープとの接触に必要とされる特定のアミノ酸を含み得るが、例えば、場合によっては、例えば異種骨格タンパク質によって置き換えられ得る、天然抗体のフレームワークに必要とされるアミノ酸を含み得ない。本発明に従う抗体は、例えば、当業者に周知であろう、ヒト、サル、ウサギ、またはマウスなどの哺乳動物に免疫性を与えるステップを含む方法によって、および／または例えば、ファージディスプレイ選択ステップを含む、インビトロ方法によって得られる。
【００２５】
抗体とは、実質的に無傷の抗体分子、ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体（少なくとも１つのアミノ酸が非ヒト抗体に対して変異である、例えば、天然非ヒト抗体または非ヒト抗体配列から組み立てられた抗体）、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体またはヘテロ二量体、ならびにその抗原結合部分および誘導体の意味を含む。
【００２６】
本化合物がタンパク質、例えば、抗体またはその断片であり、ヒト対象に投与されるとき、およびこの抗体がヒト抗体またはその断片ではない場合、ヒトにおける免疫原性を低減させるためにヒト化され得る。ヒト化抗体またはその断片を産生するための方法は、当該技術分野で既知である（Ｖｉｎｃｋｌｅら、２００９）。
【００２７】
さらに、本発明に従う抗体またはその断片のバイオアベイラビリティは、中和抗体またはその断片をアルブミン（Ｃｏｐｐｉｅｔｅｒｓら、２００６）または免疫グロブリン（Ｈａｒｍｓｅｎら、２００５）などの不活性担体に接合することによって改善され得る。
【００２８】
抗体という用語はまた、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｄＤ、およびＩｇＥを含む、すべてのクラスの抗体も含む。抗体という用語はまた、任意の定義された抗体およびその抗原結合部分の変異体、融合体、および誘導体も含む。
【００２９】
本化合物は、代替的には、例えば、ＭＩＬＬＷＡＲＤ  ＳＴＥＶＥＮ  Ｗ  ＥＴ  ＡＬ：“Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ”，ＡＣＳ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｌ．２，ｎｏ．９，１  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００７（２００７−０１−０１），ｐａｇｅｓ  ６２５−６３４，ＸＰ００２６１６２９２，ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＳＯＣＩＥＴＹ，ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ，ＤＣ，ＵＳ  ＩＳＳＮ：１５５４−８９２９，ＤＯＩ：１０．１０２１／ＣＢ７００１１２６、ＨＥＩＮＩＳ  ＣＨＲＩＳＴＩＡＮ  ＥＴ  ＡＬ：“Ｐｈａｇｅ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｂｉｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ”ＮＡＴＵＲＥ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｌ．５，ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ  ２００９（２００９−０７），ｐａｇｅｓ  ５０２−５０７，ＸＰ００７９１３１８１に記載されるように、環状ペプチド、例えば、多環状ペプチド、例えば、二環状ペプチドであり得る。例えば、ＷＯ２００９／０９８４５０も参照されたい。必要とされる結合特性を有する二環状ペプチドは、例えば、ファージ提示法によって選択され得る。
【００３０】
中和するとは、今までに感染していない細胞を感染させるウイルスの能力を低減させることを意味する。
【００３１】
当業者は、化合物の能力を中和するウイルスを観察するために適当な技術を十分承知しているであろう。かかる方法の一例は、ＷＯ２０１６／０１２８００の実施例３に詳述されており、１種以上の血清型のデングウイルスが潜在性のある宿主細胞集団を感染させることができ、アッセイ下での化合物をウイルスと混合させ、次いで、混合物を潜在性のある宿主細胞でインキュベートする。化合物の中和能力、すなわち、感染を予防する化合物の能力の基準を得る、感染した細胞数がアッセイされる。ある特定の例では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分を中和する可能性は、感染した病巣の数の低減が対照（化合物なし）と比較する場合に、フォーカス低減中和試験（ＦＲＮＴ）を用いて判定され得る（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２８：７４５−７４８）。簡潔に言えば、本化合物をウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、混合物をベロ細胞（アフリカミドリザルからの腎臓上皮細胞株）に移し、３日間インキュベートする。フォーカス形成アッセイは、抗Ｅ  ｍＡｂ（４Ｇ２）を用いて行われ、続いて、ＨＲＰ共役されたウサギ抗マウスＩｇＧを用いて行うことができる。この反応は、ＤＡＢ基質の添加によって可視化することができる。フォーカス低減の割合は、各化合物について計算される。５０％のＦＲＮＴ値は、ＳＰＳＳパッケージからのプロビットプログラムを用いて、低減率対化合物の濃度のグラフから決定され得る。典型的には、このアッセイは、試験化合物の不在下で、例えば、コンフルエントな細胞、例えばちょうどコンフルエントな細胞を含む９６ウェルプレートウェル中で約１００の病巣が存在するように行われ得る。
【００３２】
例えばフォーカス低減中和試験（ＦＲＮＴ）、プラーク低減中和試験（ＰＲＮＴ；ＷＨＯ文書ｈｔｔｐ：／／ｗｈｑｌｉｂｄｏｃ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｈｑ／２００７／ｗｈｏ＿ｉｖｂ＿０７．０７＿ｅｎｇ．ｐｄｆを参照；ＦＲＮＴ、フローサイトメトリーを用いた、マウスおよびサルなどのインビボでの技術のような、他のかかる例は、当業者には既知であろう。例えば、ＦＲＮＴおよびフローサイトメトリー方法の例については、ＷＯ２０１６／０１２８００の図３０を参照されたい。本明細書の実施例も参照されたい。
【００３３】
一実施形態では、本化合物は、ウイルスを少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、および最も好ましくは１００％中和する。さらに好ましい実施形態では、本化合物は、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを中和し、任意に、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを８０％または９０％または９８％または１００％中和し、任意に、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを同じ濃度の抗体または断片で１００％中和する。
【００３４】
このウイルスは、昆虫細胞によってまたはヒト癌細胞株（典型的には、以下にさらに論じられるように、高いｐｒ−Ｍ含有ウイルスを産生すると見なされる）において、またはあるいは、ヒト初代細胞、例えば初代ヒト樹状細胞において、またはフリンを過剰発現する細胞株（低ｐｒ−Ｍ含有ウイルスを作製すると見なされる）において産生され得る。
【００３５】
本化合物は、１種以上の血清型のデングウイルスおよび／またはジカウイルスを０．５〜０．０１μｇ／ｍｌの濃度で８０、９０、９８、または１００％中和させ得る。本化合物は、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを０．５〜０．０１μｇ／ｍｌの濃度で８０、９０、９８、または１００％中和させ得る。
【００３６】
上掲のＤａｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ  １９，１−９は、融合ループエピトープを標的としたｍＡｂ  ２Ａ１０Ｇ６については、プラーク減少アッセイにおいて２４９μｇ／ｍｌの５０％プラーク減少中和力価（ＰＲＮＴ５０）を報告している（図３Ａならびに３頁および４頁にわたる一節）。
【００３７】
特定のレベルまで中和するとは、所与の濃度の化合物に対して特定のレベルまで中和することを意味することを含む。所与の化合物の適切な濃度は、実際の化合物に応じて異なり得ることが理解されよう。例えば、上記のアッセイにおいて使用される、例えば、所与の化合物の濃度は、１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、もしくは１ｎＭ；０．０１μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０６μｇ／ｍｌ、０．０７５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、１．７５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、２．７５μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、３．２５μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、３．７５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、４．２５μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、４．７５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５．２５μｇ／ｍｌ、５．５μｇ／ｍｌ、５．７５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、６．５μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、８．５μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、９．５μｇ／ｍｌ、もしくは１０μｇ／ｍｌ以下、または０．０１μｇ／ｍｌ未満であり得る。典型的には、化合物、例えば抗体の濃度は、例えば、１μｇ／ｍｌ未満であり得る。
【００３８】
例えば、化合物（例えば、抗体）は、０．１μｇ／ｍｌの化合物濃度で１種以上の血清型のウイルスを８０％中和させ得、１μｇ／ｍｌの化合物濃度で１種以上の血清型のウイルスを少なくとも９８％、例えば１００％中和させ得る。本化合物（例えば抗体）は、０．０５μｇ／ｍｌの濃度で１種以上の血清型のウイルスを８０％中和するか、または０．５μｇ／ｍｌの濃度で１種以上の血清型のウイルスを少なくとも９８％、例えば１００％中和する。
【００３９】
化合物の所与の濃度に対して観察された中和のレベルがアッセイにおけるウイルス粒子の数によって異なり得ることも理解されよう。例えば、化合物の所与の濃度については、アッセイにおけるウイルス粒子の数が２倍である場合、中和のレベルは、（所与の宿主細胞集団に対して）低減し得ることが予測され得る。アッセイにおけるウイルス粒子の数は、典型的には、試験化合物の不在下で、例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートウェル中で、例えばコンフルエントな細胞、例えばちょうどコンフルエントな細胞を用いておよそ１００フォーカスを提供するようなものであろう。
【００４０】
例えば、一実施形態では、本化合物は、ウイルス濃度が、試験化合物の不在下で、例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートウェル中で、例えばコンフルエントな細胞、例えばちょうどコンフルエントな細胞を用いておよそ１００フォーカスを提供するのに十分である場合に、１μｇ／ｍｌまたは０．０５ｕｇ／ｍｌもしくはそれ以下の濃度で１種以上の血清型のウイルスを少なくとも８０％のレベルまで、または１００％のレベルまで中和する。
【００４１】
ウイルスによって感染され得るアッセイにおける細胞の数はまた、見かけレベルの中和反応を影響し得る。例えば、少数の細胞は、大きな細胞集団よりも１細胞当たり表される、より大きな感染率を示し得る。したがって、化合物、ウイルス、および宿主細胞数の比率はまた、重要であり得る。アッセイにおいて使用される細胞は、コンフルエントであり得る。アッセイは、マイクロタイターウェルプレート中で、例えば９６ウェルマイクロタイタープレート中で行われ得る。細胞は、マイクロタイタープレートウェル中で、例えば９６ウェルマイクロタイタープレートウェル中で、容器中でコンフルエント、例えば、ちょうどコンフルエントであり得る。
【００４２】
好ましくは、本化合物は、昆虫細胞、例えばＣ６／３６昆虫細胞、またはヒト腫瘍細胞株（典型的には、高いｐｒ−Ｍ含有ウイルスを産生し得る）およびヒト細胞、例えば初代ヒト細胞、例えば初代ヒト樹状細胞、またはフリンを過剰発現する細胞（低いｐｒ−Ｍ含有ウイルスを作製すると見なされる）の両方において作られるウイルスを中和することができる。異なる細胞型におけるウイルス粒子、サブウイルス粒子、またはウイルス様粒子の産生は、当業者に周知であろう。例えば、ウイルスを中和する化合物の能力は、上述のように、および実施例において試験することができる。一実施形態では、化合物は、初代ヒト細胞、例えば初代ヒト樹状細胞、または昆虫細胞で作られるウイルスを中和することができる。別の実施形態では、本化合物は、初代ヒト細胞および昆虫細胞で作られるウイルスを同じレベルまで中和することができる。同じレベルまでとは、所与の濃度の化合物および／または所与の濃度のウイルスおよび／または所与の数の潜在性のある宿主細胞については、本化合物に起因する中和反応のレベルは、昆虫細胞および初代ヒト細胞の両方で作られるウイルスにとっては有意に異ならないか、または本化合物に起因する中和反応のレベルは、昆虫細胞および初代ヒト細胞の両方からのウイルスにおいて、特定の閾値を超える、例えば８０％超、９０％、９５％、または９８％の中和反応であるという意味を含む。例えば、所与の濃度のウイルス粒子、および所与の数の潜在性のある宿主細胞については、５０％ＦＲＮＴは、昆虫細胞および初代ヒト細胞で作られたウイルスについては同じであり（有意に異ならない）、例えば、０．０５μｇ／ｍｌ以下、または０．５μｇ／ｍｌ以下、または１μｇ／ｍｌ以下、または５μｇ／ｍｌ以下である。好ましい実施形態では、本化合物は、初代ヒト細胞および昆虫細胞で作られた、好ましくは２種の血清型、好ましくは３種の血清型、より好ましくは４種の血清型、またはすべての血清型、１種を超える血清型のジカおよびデングウイルスを中和することができる。最も好ましい実施形態では、本化合物は、昆虫細胞および初代ヒト細胞の両方で作られたすべての血清型のジカおよびデングウイルスを完全に（すなわち１００％）中和することができる。例えば、本化合物は、上で論じられるように、０．０５μｇ／ｍｌの化合物濃度で約１００フォーカスを得るのに十分なウイルス濃度で初代ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られるウイルスを１００％中和することができる。初代ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られるとは、初代ヒト細胞（例えば）中で独立して作られるウイルス、同じ手順で、初代ヒト細胞および昆虫細胞の両方を用いて産生されているウイルス粒子の特定の集団よりも昆虫細胞中で独立して作られるウイルスを意味することを含む。
【００４３】
本発明において使用される交差反応性のある高度に中和する化合物は、ウイルス形成を独立して、エンベロープタンパク質の無傷ウイルスおよび二量体の両方において見出され得る特定のエピトープに結合することが見出された。それ故に、本発明の使用のための化合物は、この特定のエピトープに結合するそれらの能力に関して定義され得る。
【００４４】
エンベロープ二量体エピトープ（ＥＤＥ）に結合する化合物とは、１種以上の血清型のフラビウイルス（例えば、ジカまたはデングウイルス）のＥＤＥに結合することができる任意の化合物を意味する。本化合物は、小分子、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂肪、原子、例えば金属であり得る。好ましい実施形態では、本化合物は、ポリペプチド、好ましくは抗体またはその抗原結合部分である。本化合物についての選好は、前述されたとおりである。
【００４５】
４種の血清型のデングウイルス、ならびに他のフラビウイルス、例えば当業者に周知のまたは図１に示し、実施例１、２、および３で論じたようなジカウイルスなどがある。それ故に、本化合物が、１種の血清型のフラビウイルス、例えば、ジカウイルスまたはデングウイルスのＥＤＥに結合し得ることが理解されよう。好ましい実施形態では、本化合物は、１種を超える血清型のフラビウイルス、例えば、１種を超える血清型のデングウイルスまたはジカウイルスのＥＤＥに結合し、上記の、ジカウイルスおよび／または１種、２種の血清型のデングウイルス、または３種の血清型のデングウイルス、または４種の血清型のデングウイルスに結合する、すなわち、すべての血清型のデングウイルスであると見なされるであろう。
【００４６】
「結合する」とは、本発明の使用のための化合物とエピトープまたは分子または巨大分子または化合物との間の任意の形態の非共有結合の意味を含み、当該技術分野で通常の方法により評価される、ＥＤＥへの結合のあらゆる有意な度合いの意味を含む。好ましい実施形態では、本化合物は、ＥＤＥに選択的に結合する。ＥＤＥに選択的に結合するとは、本化合物がＥＤＥ以外のフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルスまたはエンベロープタンパク質に結合しない、またはそれらに有意に結合しないという意味を含む。また、本化合物が、ＥＤＥを提示するもの以外の別の化合物または分子または巨大分子に結合しない、またはそれらに有意に結合しないという意味も含む。本化合物がＥＤＥに結合するかどうかを決定することは、十分に当業者の技量内にあるであろう。例えば、当業者に周知であるような、ＥＬＩＳＡタイプのアッセイを使用してもよい。本化合物がＥＤＥと結合するかどうか判定するための方法のある非限定的な例は、デングウイルスのうちの１つ以上、好ましくはすべての血清型のフラビウイルス、例えばジコもしくはデングウイルスの無傷ウイルス、および／またはデングウイルスのうちの１つ以上、好ましくはすべての血清型のフラビウイルス、例えばジコもしくはデングウイルスのエンベロープ二量体、および／または本明細書に記載の定義のうちのいずれかに従うＥＤＥ、例えば安定化エンベロープ二量体、または異種骨格内に保持されるエンベロープタンパク質からの残基を含むＥＤＥであり、偽物の非感染の上清は、固体支持体、例えば、抗Ｅ  Ａｂ（４Ｇ２）でコーティングしたＭＡＸＩＳＯＲＰ免疫プレート（ＮＵＮＣ）上に別々に捕捉される。次いで、捕捉ウェルを、本化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分、例えば、ヒトモノクローナル抗体、例えば、１ｕｇ／ｍｌのヒトｍＡｂでインキュベートし、続いて、レポーターに共役した二次抗体（化合物に結合する）、例えばＡＬＰ共役抗ヒトＩｇＧでインキュベートする。この反応を、例えば、適切な基質、例えばＰＮＰＰ基質の添加によって可視化し、ＮａＯＨで停止する。ＡＬＰ／ＰＮＰＰについては、吸光度は、４０５ｎｍで測定する。
【００４７】
ＥＤＥに結合する化合物とは、感染していない上清を含むウェルに結合する背景のレベルを上回る任意の度合いまで、ウイルスまたはＥＤＥ、例えば安定化した可溶性タンパク質Ｅ二量体を含むウェルに結合する任意の化合物の意味を含む。好ましくは、ウイルスまたはＥＤＥに得られる結合レベル、例えば安定化された可溶性タンパク質Ｅ二量体は、感染していない上清ウェルに結合する背景のレベルの２倍、好ましくは４倍、好ましくは６倍、より好ましくは１０倍である。この化合物がＥＤＥ以外の部位でウイルスまたはエンベロープタンパク質に結合するかどうか判定するために、変性または単量体または組換えエンベロープタンパク質に結合する化合物の能力を評価してもよい。この化合物が有意なレベルまで変性または単量体または組換えエンベロープタンパク質に結合する場合、ＥＤＥ以外の部位でウイルスまたはエンベロープタンパク質に結合すると見なされる。この化合物が任意の他の分子または巨大分子または化合物以外のＥＤＥに選択的に結合するかどうかを判定するために、ＥＤＥに結合する化合物の能力は、上述の方法を用いて、分子または巨大分子または化合物に結合する化合物の能力と比較することができる。化合物は、別の分子または巨大分子または化合物、例えば、変性または単量体エンベロープタンパク質に結合するよりも有意に広い範囲までＥＤＥに結合する場合、例えば、この化合物が別の分子、巨大分子、または化合物、例えば、変性または単量体または組換えエンベロープタンパク質に結合するよりも少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍大きな親和性を有するＥＤＥに結合する場合、ＥＤＥに選択的に結合する。
【００４８】
ＥＤＥは、エンベロープタンパク質の二量体に広がる無傷ウイルス粒子上、または２つのポリペプチドに広がるエンベロープタンパク質の遊離二量体、例えば可溶性エンベロープタンパク質の遊離二量体上に形成されると見なされるエピトープである。エンベロープタンパク質配列は、図２９中、ならびにＷＯ２０１６／０１２８００の配列番号２９、３１、３３、および３５に詳述されており、例えば、以下の「配列」の節にも論じられている。
【００４９】
好ましい実施形態では、本発明の化合物は、無傷ウイルスまたは遊離エンベロープ二量体（すなわち、エンベロープポリペプチド単量体の２倍の分子量を有する）、または上述および以下にさらに論じられるようなＥＤＥを提供する他の構造上のいずれかでＥＤＥに結合し、単量体エンベロープタンパク質または変性エンベロープタンパク質に結合しない。一実施形態では、本化合物が単量体エンベロープタンパク質または変性エンベロープタンパク質に結合する場合、それは有用な化合物と見なされず、本発明の使用のための化合物ではない。したがって、化合物が本発明のこの実施形態の使用のための化合物であるかどうかを特定する１つの非限定的な方法は、例えば、ウエスタンブロットでは変形エンベロープタンパク質、および／または、例えばＥＬＩＳＡでは組換え（単量体）エンベロープタンパク質、ならびに例えばＥＬＩＳＡでは無傷ウイルス粒子、および／または、エンベロープタンパク質の二量体（例えば可溶性エンベロープタンパク質の二量体）に結合するその能力について、例えば、化合物、例えば抗体またはその抗原結合部分をアッセイすることによるものである。本発明の使用のための好ましい化合物は、無傷ウイルスまたは非変性二量体に結合すると見なされるが、変性または単量体エンベロープタンパク質に結合しない（または有意により少ない程度に）と見なされる。結合の度合いは、上述のように評価され得る。
【００５０】
融合ループに結合するが、ＥＤＥに結合しない化合物は、本発明の使用のための化合物であると見なされない。融合ループは、上述のまたは古典的な融合ループエピトープ（ＦＬ）を定義する（デング）１０１Ｗの内外の制限的な残基セットである。融合ループでは、残基１０１−ＷＧＮＧ−１０４は、二量体界面の向かいにあるドメインＩＩＩに向かってＷ１０１側鎖を突出する歪んだαらせん回転を作る。化合物がエンベロープ単量体または変性エンベロープタンパク質に結合する場合（例えば、上記のように決定される）、融合ループに結合すると考えられ得るが、代わりに抗体がエンベロープポリペプチドの異なる部分に結合し得る（融合ループ領域において変異したエンベロープポリペプチドに結合することによって確認することができる）。
【００５１】
別の実施形態では、融合ループに結合する化合物は、エンベロープタンパク質における以下の残基、特に、ＤＥＮＶ−１：Ｅ４９、Ｑ７７、Ｉ１６１、Ｔ２００、Ｗ３９１、またはＦ３９２のうちの任意の１つ以上で変異によって影響を受けない（または有意に影響を受けない）ものである。
【００５２】
一実施形態では、融合ループに結合する化合物は、上記のＤａｉら（２０１６）、例えば、図４を参照して、表題「Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ２Ａ１０Ｇ６  Ａｎｔｉｂｏｄｙ」の節の４頁に記載される、融合ループおよびｂｃループを介して垂直な角度で、フィンガー様ドメインＩＩの先端に結合するものであり得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明の使用のための化合物は、変性ＥＤＥまたは変性エンベロープタンパク質に結合しない。
【００５４】
一実施形態では、ＥＤＥは、フラビウイルス、例えば、ジカおよび／またはデングウイルスのポリペプチド、エンベロープポリペプチド二量体、例えば可溶性エンベロープポリペプチド二量体に広がると見なされる。特定の実施形態では、ＥＤＥは、エンベロープポリペプチド二量体のドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの領域を含む。ＥＤＥが、１種以上の血清型のフラビウイルス、例えば、１種以上の血清型のジカおよび／またはデングウイルスのエンベロープタンパク質の二量体界面で四次構造依存性のエピトープを含むことが理解されよう。
【００５５】
異なるフラビウイルス、例えば、ジカおよび／またはデング血清型からのエンベロープタンパク質がハイブリッド二量体を形成する、二量化し得ることが理解されよう。一実施形態では、本化合物が結合するＥＤＥは、異なるフラビウイルス、例えばジカおよび／またはデング血清型由来のエンベロープ単量体で作られ、したがって、ＥＤＥは、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含み得る。
【００５６】
エンベロープタンパク質の二量体が無傷ビリオンまたはウイルス様粒子に見出されるように、ＥＤＥが、ビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子の一部として化合物に提示され得ることも理解されよう。ＥＤＥがビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子の一部として提示される場合に、本発明の化合物は、無傷ビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子に結合するが、単量体または変性エンベロープタンパク質に結合しないものである。
【００５７】
あるいは、ＥＤＥは、ビリオンの一部としてではない化合物に提示され得、例えば、２つのエンベロープタンパク質の二量体から形成されるＥＤＥは、遊離二量体として、または、例えば実施例３でさらに論じるように、ナノ粒子、例えば自己組織化ナノ粒子の形態で化合物に提示され得る。それ故に、一実施形態では、本発明の化合物は、ＥＤＥがエンベロープまたは可溶性エンベロープ（ｓＥ）タンパク質の遊離二量体で、または、例えば実施例３でさらに論じるように、ナノ粒子、例えば自己組織化ナノ粒子の形態である場合に、ＥＤＥに結合する化合物である。別の実施形態では、本発明の化合物は、ＥＤＥがエンベロープまたはｓＥタンパク質の安定化された二量体である場合に、ＥＤＥに結合する化合物であり、これもまた、例えば実施例３でさらに論じるように、ナノ粒子、例えば自己組織化ナノ粒子の形態であってもよい。
【００５８】
あまり好ましくない実施形態では、遊離二量体は、タンパク質の二量化を安定化させる要素を含む組成物の一部として提示され得る。例えば、タンパク質会合を促進すると見なされる特定の緩衝液成分を、使用してもよい。あるいは、エンベロープタンパク質は、二量体形成を促進する高濃度で提示され得る（ＷＯ２０１６／０１２８００の実施例７を参照のこと）。
【００５９】
より好ましい実施形態では、エンベロープタンパク質は、二量体構成において安定性が増大するように操作され得る。例えば、二量体は、
−２つのエンベロープまたはｓＥ単量体間で少なくとも１つ、任意に、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０もしくはそれ以上のジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化され得る、ならびに／または
−２つのｓＥ単量体間で少なくとも１つ、任意に、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０もしくはそれ以上のスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化され得る、ならびに／または
−各単量体の二量体界面またはドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、少なくとも１つのエンベロープまたはｓＥ単量体のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって非共有結合的に安定化され得る、ならびに／または
−改変糖類を介して２つのエンベロープまたはｓＥ単量体を連結することによって共有結合的に安定化され得る。
【００６０】
フラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルス、エンベロープ糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（ｓＥ；可溶性エンベロープポリペプチド／糖タンパク質）は、例えば、実施例２  ＥＤ  図７に示すように、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルスの血清型１、２、および４のエンベロープ糖タンパク質Ｅの１〜３９５のアミノ酸断片、デングウイルスの血清型３のエンベロープ糖タンパク質Ｅの１〜３９３のアミノ酸断片、およびジカウイルスのエンベロープ糖タンパク質Ｅの１〜４０４のアミノ酸断片を指す。
【００６１】
本化合物は、ＥＤＥに結合し、このＥＤＥはｓＥの安定化二量体であり、組換えフラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（組換えｓＥ）単量体は、ＷＯ２０１６／０１２８００の、配列番号１３２のＤＥＮＶ−１  ｓＥ、配列番号１３３のＤＥＮＶ−２  ｓＥ、配列番号１３４のＤＥＮＶ−３  ｓＥ、配列番号１３５のＤＥＮＶ−４  ｓＥ、ならびにＨ２７Ｆ、Ｈ２７Ｗ、Ｌ１０７Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、Ｈ２４４Ｆ、Ｈ２４４Ｗ、Ｓ２５５Ｃ、Ａ２５９Ｃ、Ｔ／Ｓ２６２Ｃ、Ｔ／Ａ２６５Ｃ、Ｌ２７８Ｆ、Ｌ２９２Ｆ、Ｌ２９４Ｎ、Ａ３１３Ｃ（ＤＥＮＶ−３ではＳ３１３Ｃ）、およびＴ３１５Ｃに対応する残基の中から選択される少なくとも１つの変異（置換）を有するその突然変異体ｓＥからなる群から選択される。これらの変異は、下述のように、二量体配置において増加した安定性に寄与すると見なされる。
【００６２】
特定の残基に対応する残基の概念は、当業者に周知であり、例えば、当業者によく知られているように、配列アラインメントを考慮して容易に判定することができることが理解されよう。
【００６３】
任意に、その当該変異体ｓＥは、さらに、Ｑ２２７Ｎ、Ｅ１７４ＮおよびＤ３２９Ｎの中から選択される少なくとも１つの変異（置換）、好ましくは３つの変異Ｑ２２７Ｎ、Ｅ１７４Ｎ、およびＤ３２９Ｎを有する。これらの変異は、適切でない免疫原性領域を覆い、対象において、本発明の安定化組換えｓＥ二量体が、複数のフラビウイルスの血清型、例えば、ジカウイルスおよび１つ以上、例えば、４種すべてのデングウイルス血清型を対象とする中和抗体を優先的に引き起こすことが可能であると見なされる。
【００６４】
有用なものと考えられる変異（例えば、ジカｓＥの番号付けを指摘する）およびそれらの論理的根拠については、以下の突然変異の節でさらに論じる。
【００６５】
さらなる実施形態では、化合物はＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、特許請求の範囲に記載される使用のためにＥＤＥを対象とする特許請求の範囲に記載されているとおりである。
【００６６】
したがって、例えば、組換えｓＥ単量体は、ジカウイルス（ＺＩＫＶ、ＫＪ７７６７９１、Ｈ−ＰＦ−２０１３＿Ｆｒｅｎｃｈ＿Ｐｏｌｙｎｅｓｉａ株）配列番号１；デングウイルス血清型１（ＤＥＮＶ−１、ＮＣ＿００１４７７）配列番号２；デングウイルス血清型２（ＤＥＮＶ−２、ＮＣ＿００１４７４）配列番号３；デングウイルス血清型３（ＤＥＮＶ−３、ＮＣ＿００１４７５）配列番号４；デングウイルス血清型４（ＤＥＮＶ−４、ＮＣ＿００２６４０）配列番号５；他のフラビウイルス：セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ、ＮＣ＿００７５８０）配列番号６；日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ、ＮＣ＿００１４３７、配列番号７；マリーバレー脳炎ウイルス（ＭＶＥＶ、ＮＣ＿０００９４３）配列番号８；ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ、ＮＣ＿００１５６３）配列番号９；ＷＯ２０１６／０１２８００の配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５；および表Ｍを含む変異の項に記載される変異＃１〜＃１３の中から選択される少なくとも１つの突然変異を有する変異体ｓＥ；ならびに任意に、表Ｍを含む変異の節に記載される変異＃１４〜＃１８の中から選択される少なくとも１つの変異、からなる群から選択され得る。
【００６７】
変異を誘発するｓＥ二量体の上述の変異誘発は、架橋によって安定化を提供するための二量体の接触でのシステイン変異を含む、その免疫原性を妨げないが、より高い二量体親和性を提供する変異を導入する、かつ／あるいはクリック化学によって、および／または二量体を安定化するために、各単量体の二量体界面もしくはドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、空洞を充填するために、少なくとも１つのｓＥ単量体のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって、二量体における隣接糖類間での化学的架橋を可能にする新しいグリコシル化部位を導入する。
【００６８】
特に特定されない限り、このアミノ酸残基位置は、ＷＯ２０１６／０１２８００の図１５中に示されるｓＥアミノ酸配列アライメントに従って番号付けされる。ＤＥＮＶ−２の場合、番号付けは、配列番号３に示されるとおり、および／または以下の配列の節に記載される実施例２のＥＤ図７に示されるとおりであり得る。ＺＩＫＶの場合、番号付けは、以下の配列の節で論じられるように、および／または実施例２のＥＤ図７に示されるように、配列番号１に示されるとおりであり得る。何らかの疑いがある場合には、図面および実施例をさらに参照することによって、言及されたあらゆる残基の同一性を解決することができると考えられる。
【００６９】
ＷＯ２０１６／０１２８００の、配列番号１３２のＤＥＮＶ−１  ｓＥ、配列番号１３３のＤＥＮＶ−２  ｓＥ、配列番号１３４のＤＥＮＶ−３  ｓＥ、配列番号１３５のＤＥＮＶ−４  ｓＥをコードする核酸配列はそれぞれ、ＷＯ２０１６／０１２８００において配列番号１３６、１３７、１３８、および１３９として表される。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、「組換え」という用語は、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン、本発明の使用のためまたはそれに関連する抗体または抗体断片を産生するための遺伝子操作方法（クローニング、増幅）の使用を指す。
【００７１】
二量体は、上に定義される２つの同一の組換えｓＥのホモ二量体、または上に定義される２つの異なる組換えｓＥのヘテロ二量体であり得、この二量体は、好ましくはホモ二量体である。二量体は、例えば、ＺＩＫＶ組換え変異型ｓＥの二量体であってもよい。
【００７２】
さらなる例として、それは、上に定義されるＤＥＮＶ−１  ｓＥおよびＤＥＮＶ−２  ｓＥのヘテロ二量体であり得る。これは、ＤＥＮＶ−１  ｓＥと、上に定義されるＤＥＮＶ−１  ｓＥの変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり得る。
【００７３】
一実施形態では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥはｓＥの安定化二量体であり、エンベロープまたは組換えｓＥの安定化二量体は、２つのｓＥ単量体間で少なくとも１つ、２つ、または３つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化される。
【００７４】
有利には、当該安定化二量体は、単一鎖間ジスルフィド結合をもたらす、二量体の２倍の分子軸によって位置付けられる単一のシステイン変異体ｓＥ、または２倍の分子軸から離れて複数の（例えば、２つの）ジスルフィド結合を作製し得る複数の（例えば、二重の）システイン変異体ｓＥを含む。当該ジスルフィド結合は、酸性条件下で、例えば、ＤＭＳＯ溶液（Ｏ．Ｋｈａｋｓｈｏｏｒら、２００９）を用いてまたはＣｄＣｌ２もしくはＣｕＳＯ４などの酸化剤を用いて合成され得る。したがって、当該安定化二量体は、二量体の（ほぼ）２倍の分子軸によって各単量体の一方のアミノ酸残基がシステインで置換される、単量体からなり得る。当該安定化二量体はまた、二量体の２倍の分子軸から離れた各単量体の２つのアミノ酸残基がシステインで置換される、単量体からもなり得る。当該安定化二量体はまた、二量体の２倍の分子軸から離れた各単量体の３つのアミノ酸残基がシステインで置換される、単量体からもなり得る。
【００７５】
かかる配置が、ＦＬＥ領域への接近を制限し得、そのために、ＷＯ２０１６／０１２８００の実施例１７、および下の「突然変異」の節においてさらに論じられるように、抗ＦＬＥ反応を作り出す分子の能力を低減するように、１つを超える鎖間ジスルフィド結合があり得ることが望ましいものであり得る。
【００７６】
別の実施形態では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、ｓＥの安定化二量体であり、エンベロープまたは組換えｓＥの安定化二量体は、上に定義される変異Ａ２５９ＣまたはＳ２５５Ｃをそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体であり、残基２５９Ｃまたは２５５Ｃはジスルフィド鎖間結合を介して一緒に連結されている。
【００７７】
別の実施形態では、ＥＤＥが組換えｓＥの安定化二量体を含む場合に、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される変異Ａ２５９Ｃを有する変異体ｓＥと、上に定義される変異Ｓ２５５Ｃを有する変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基２５９Ｃおよび２５５Ｃは、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に連結されている。
【００７８】
別の実施形態では、ＥＤＥが組換えｓＥの安定化二量体を含む場合に、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される変異Ｆ１０８ＣおよびＴ３１５Ｃをそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体、または上に定義される変異Ｌ１０７ＣおよびＡ３１３Ｃをそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体であり、残基１０８Ｃおよび３１５Ｃ、または残基１０７Ｃおよび３１３Ｃは、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に連結されている。
【００７９】
一実施形態では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、ｓＥの安定化二量体であり、エンベロープまたは組換えｓＥの安定化二量体は、上に定義される変異Ｆ１０８ＣおよびＡ３１３Ｃを有する変異体ｓＥと、上に定義される変異Ｌ１０７ＣおよびＴ３１５Ｃを有する変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基１０８Ｃおよび３１３Ｃは、２つのｓＥ単量体間でジスルフィド鎖間結合を介して残基３１５Ｃおよび１０７Ｃにそれぞれ連結されている。
【００８０】
別の実施形態では、ＥＤＥが組換えｓＥの安定化二量体を含む場合に、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される、変異Ａ２５９Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、およびＴ３１５Ｃをそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体、変異Ｓ２５５Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、およびＴ３１５Ｃをそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体、変異Ａ２５９Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、およびＡ３１３Ｃをそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体、ならびに変異Ａ２５５Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、およびＡ３１３Ｃをそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体を含み、残基２５９Ｃ、２５５Ｃ、１０８Ｃ、３１５Ｃ、１０７Ｃ、および３１３Ｃは、ジスルフィド鎖間結合を介して残基２５９Ｃ、２５５Ｃ、３１５Ｃ、１０８Ｃ、３１３Ｃ、および１０７Ｃにそれぞれ連結されている。
【００８１】
別の実施形態では、化合物、例えば抗体またはその抗原結合断片は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、組換えｓＥの安定化二量体を含み、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される変異Ａ２５９Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、およびＴ３１５Ｃを有する変異体ｓＥと、上に定義される変異Ｓ２５５Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、およびＴ３１５Ｃを有する変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基２５９Ｃ、１０８Ｃ、および３１５Ｃは、ジスルフィド鎖間結合を介して残基２５５Ｃ、３１５Ｃ、および１０８Ｃにそれぞれ連結されている。
【００８２】
別の実施形態では、ＥＤＥが組換えｓＥの安定化二量体を含む場合に、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される変異Ｓ２５５Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、およびＡ３１３Ｃを有する変異体ｓＥと、上に定義される変異Ａ２５９Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、およびＡ３１３Ｃを有する変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基２５５Ｃ、１０７Ｃ、および３１３Ｃは、ジスルフィド鎖間結合を介して残基２５９Ｃ、３１３Ｃ、および１０７Ｃにそれぞれ連結されている。
【００８３】
安定化組換えｓＥ二量体に関する実施形態のさらなる例については、例えば、変異体ｓＥがジカウイルスｓＥ配列に基づく場合、以下の変異の節、および特許請求の範囲に記載の使用のためのＥＤＥに関連する特許請求の範囲を参照のこと。
【００８４】
ジスルフィド結合による安定化と同様に、安定化はまた、スルフヒドリル反応性架橋剤によっても達成され得ることを理解されよう。それ故に、一実施形態では、ＥＤＥは、組換えｓＥの安定化二量体を含み、安定化組換えｓＥ二量体は、ｓＥ単量体間で少なくとも１つ、２つ、または３つのスルフヒドリル反応性架橋剤（チオール反応性架橋剤とも呼ばれる）によって共有結合的に安定化される。
【００８５】
タンパク質の化学的架橋は、当該技術分野で周知である（概要については、Ｈｅｍａｐｒａｂｈａ，（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  １，２２−２６を参照のこと）。
【００８６】
当然ながら、ｓＥ二量体は、２つの異なる面を有し、一方は、抗体が結合する細胞外培地に曝露され、他方は、ウイルス膜に曝露される。
【００８７】
有利には、当該安定化組換えｓＥ二量体は、ウイルス膜に曝露されるｓＥの面に存在する候補アミノ酸残基を含み、それ故に、エピトープの部分ではない。各単量体の各候補アミノ酸残基の一方は、システインに変異（置換）され、適切な長さのスルフヒドリル反応性架橋剤の標的物である遊離スルフヒドリル基を産生する。
【００８８】
Ｔｈｒ／Ｓｅｒ２６２およびＴｈｒ／Ａｌａ２６５は、候補残基である。二量体の文脈においてそれらの間の距離は、それぞれ、１２Åおよび２２Åである。さらに、これらの残基（Ｔｈｒ／Ｓｅｒ２６２、Ｔｈｒ／Ａｌａ２６５）は、完全には保存されない。故に、それらは、点突然変異に耐性があり得る。
【００８９】
好ましい実施形態では、本化合物は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、組換えｓＥの安定化二量体を含み、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される変異Ｔ／Ｓ２６２ＣまたはＴ／Ａ２６５Ｃをそれぞれ有する変異体ｓＥのホモ二量体であり、残基２６２Ｃまたは２６５Ｃは、スルフヒドリル反応性架橋剤によって一緒に連結されている。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、ＥＤＥが組換えｓＥの安定化二量体を含む場合、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される変異Ｔ／Ｓ２６２Ｃを有する変異体ｓＥと、上に定義される変異Ｔ／Ａ２６５Ｃを有する変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基２６２Ｃおよび２６５Ｃは、スルフヒドリル反応性架橋剤を介して一緒に連結されている。
【００９１】
エピトープの一部であると見なされず、架橋され得る組換えｓＥの領域は、ｓＥの残基１〜９からなる領域Ａ、ｓＥの残基２５〜３０からなる領域Ｂ、ｓＥの残基２３８〜２８２からなる領域Ｃ、ｓＥの残基９６〜１１１からなる領域Ｄ、およびｓＥの残基３１１〜３１８からなる領域Ｅである。単量体のこれらの５つの領域（Ａ〜Ｅ）の残基のうちのいずれかは、組換えｓＥ二量体において他の単量体の他の残基の２５〜３０Å未満であり、それ故に、これらの残基は架橋され得る。
【００９２】
有利には、各単量体のこれらの５つの領域における候補アミノ酸残基のうちの１つまたはいくつかは、システインに変異（置換）され、上に定義される適切な長さのスルフヒドリル反応性架橋剤の標的物である遊離スルフヒドリル基を産生する。
【００９３】
別の実施形態では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、組換えｓＥの安定化二量体を含み、安定化組換えｓＥ二量体は、変異体ｓＥのホモ二量体、またはｓＥのアミノ酸残基１〜９、２５〜３０、２３８〜２８２、９６〜１１１、３１１〜３１８のうちの少なくとも１つが、システインに変異（置換）される変異体ｓＥと、ｓＥのアミノ酸残基１〜９、２５〜３０、２３８〜２８２、９６〜１１１、３１１〜３１８のうちの少なくとも１つが、システインに変異（置換）される変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、変異されたシステイン残基は、スルフヒドリル反応性架橋剤を介して一緒に連結されている。
【００９４】
スルフヒドリル反応性架橋剤は、好ましくは、同一または非同一の反応基を含むホモ二官能性試薬であり、２つの単量体間での分子間架橋の構築を可能にする。ホモ二官能性架橋剤は、スペーサーアームのいずれかの末端で同一の反応基を有し、一般に、それらは、１ステップの反応手順において使用され得る。本発明のスルフヒドリル反応性架橋剤は、マレイミド、ハロアセチル（好ましくは、ブロモ−またはヨード−アセチル）、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、ハロゲン化アルキル、またはアジリジン化合物、アクリロイル誘導体、アリール化剤、またはチオール−ジスルフィド交換試薬（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０１３）、Ｈｅｍａｐｒａｂｈａ，２０１２）、例えばビス（メタンチオスフホネート）（Ｈａｂｅｒｚ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００６，８，１２７５−１２７８）であり得る。
【００９５】
異なる長さのスペーサーを有する、本発明に従うマレイミドホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤の例としては、ＢＭＯＥ（１，２−ビス−マレイミドエタン）、ＢＭＢ（１，４−ビス−マレイミドブタン）、ＢＭＨ（１，６−ビス−マレイミドヘキサン）、ＴＭＥＡ（トリス−（２−マレイミドエチル）アミン）、ＢＭ（ＰＥＧ）２（１，８−ビスマレイミドジエチレングリコール）、ＢＭ（ＰＥＧ）３（１，１１−ビスマレイミドトリエチレングリコール）、ＢＭＤＢ（１，４−ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン）、ＤＴＭＥ（ジチオ−ビス−マレイミドエタン）、ならびに好ましくはＢＭＨ、ＢＭ（ＰＥＧ）２、およびＢＭ（ＰＥＧ）３が挙げられる。
【化１】
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【００９６】
スルフヒドリル基と特異的に反応するマレイミド基は、架橋反応による構造シフトの程度を最小にするために、穏やかな緩衝液およびｐＨ条件下で実施される。好ましくは、反応混合物のｐＨは６．５〜７．５であり、可逆的ではない安定なチオ−エーテル結合が形成される（この結合は、還元剤で切断され得ない）。
【００９７】
ジスルフィド結合およびスルフヒドリル反応性架橋剤を介した安定化に加えて、安定化は、改変糖類による２つの単量体の結合によって得られ得ることが理解されよう。この目的を達成するために、グリコシル化部位は、それらに挿入され、クリック化学によってそれらを連結するために、改変糖類と反応させる。
【００９８】
この実施形態に従って、本化合物は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、組換えｓＥの安定化二量体を含み、安定化組換えｓＥ二量体は、変異体ｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、
−一方のｓＥ単量体が、グリコシル化部位を導入する少なくとも１つの変異を有し、変異したアミノ酸残基が、Ｘ官能基を担持する改変糖でグリコシル化され、
−他方のｓＥ単量体が、グリコシル化部位を導入する少なくとも１つの変異を有し、変異したアミノ酸残基が、Ｙ官能基を担持する改変糖でグリコシル化され、
両方の変異した残基が、具体的にはクリック化学によって、第１のｓＥ単量体の糖のＸ官能基を他方のｓＥ単量体の糖のＹ官能基と反応させることによって、改変糖類を介して一緒に結合している。
【００９９】
Ｘ官能基とは、Ｙ官能基と反応し、クリック化学によって共有結合を形成することができる糖によって運ばれる化学基を意味し、当該Ｙ官能基は、好ましくはアジド官能基である。
【０１００】
Ｙ官能基とは、Ｘ官能基と反応し、クリック化学によって共有結合を形成することができる糖によって運ばれる化学基を意味し、当該Ｘ官能基は、好ましくは末端アルキン官能基である。
【０１０１】
改変糖類は、Ｌａｕｇｈｌｉｎら、２００７によって記載されるように、ｓＥ単量体において合成され、導入され、Ｓｐｅｅｒら、２００３によって記載されるように、一緒に結合され得る。
【０１０２】
二量体を安定化させる上述の共有結合方法に加えて、非共有結合手段もまた使用してもよい。それ故に、ＥＤＥが組換えｓＥの安定化二量体を含む別の実施形態では、この二量体は、二量体界面で当該二量体の空洞を充填させることによって、１つまたは２つの単量体、好ましくは２つの単量体のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸を、かさ高い側鎖アミノ酸と置換することによって非共有結合的に安定化される。この実施形態に従って、組換えｓＥ二量体の四元立体構造に特有の空洞は、単量体において操作された疎水性置換によって特定され、充填される。
【０１０３】
この実施形態に従って、安定化組換えｓＥ二量体は、二量体界面でまたは各単量体のドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、空洞を形成する領域内で、少なくとも１つのｓＥ単量体のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸と置換することによって非共有結合的に安定化される。かかる置換は、２つのｓＥ単量体間での疎水性相互作用を増加させることができる。
【０１０４】
ＥＤＥが組換えｓＥの安定化された二量体を含む実施形態では、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される２つの組換えｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体、好ましくはホモ二量体であり、組換えｓＥのうちの１つまたは２つの組換えｓＥが、Ｈ２７Ｆ、Ｈ２７Ｗ、Ｈ２４４Ｆ、Ｈ２４４Ｗ、およびＬ２７８Ｆからなる群から選択される少なくとも１つの変異（置換）を有する。変異Ｈ２７Ｆ、Ｈ２７Ｗ、Ｈ２４４Ｆ、Ｈ２４４Ｗ、およびＬ２７８Ｆは、組換えｓＥ二量体のＦ２７９周辺の空洞を安定化させ、二量体界面を強化し、ビリオン中のＦ２７９の立体構造を模倣することを可能にする。
【０１０５】
二量体を非共有結合的に安定化させる他の手段は、例えば、各単量体のドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、１つまたは２つの、好ましくは２つの単量体のアミノ酸配列中のアミノ酸を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸と置換することによる非共有結合性安定化を含む。
【０１０６】
好ましい実施形態では、本化合物は、ＥＤＥに結合し、上に定義される２つの組換えｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体、好ましくはホモ二量体であり、組換えｓＥのうちの１つまたは２つの組換えｓＥが、Ｌ２９２ＦおよびＬ２９４Ｎからなる群から選択される少なくとも１つの変異（置換）を有する。この変異Ｌ２９２Ｆ、Ｌ２９４Ｎは、ｓＥ二量体立体構造におけるＤ１−Ｄ３リンカーの安定化を可能にすると考えられる。
【０１０７】
さらなる実施形態、特にジカｓＥ二量体安定化に関しては、特許請求の範囲および以下の変異の節に記載されている。
【０１０８】
ＥＤＥが操作によって二量体配置において安定化される好ましい実施形態では、上述のような操作は、二量体の全体の３Ｄ構造の変化をもたらさないか、または全体の３Ｄ構造を実質的に変化せず、天然の二量体における残基は、操作された二量体に空間的に対応する。天然二量体が操作された二量体に空間的に対応する場合、このことは、操作された二量体（またはその部分、例えば、ＥＤＥを特徴付ける際の特に重要な残基、例えば、ＷＯ２０１６／０１２８００の表２中に示されるおよび／または以下にさらに論じられる残基に反映させること）の３Ｄモデルが天然二量体の３Ｄモデルに重ね合わされる場合に、天然二量体における骨格原子の空間的位置を特徴付ける配位が、操作された二量体の類似した骨格原子を特徴付ける配位とは約１０オングストローム未満異なることを意味する。骨格原子は、ペプチド骨格を形成するアミノ酸の骨格原子であるか、または３Ｄ折り畳みパターンは、すなわち、側鎖原子のいくつかまたはすべての位置が同様に有意に変化しない場合があるが、側鎖原子を含まない。３Ｄ構造は、ＶＤＥまたはＥＤＥの免疫原性であるかどうかの鍵であり、したがって、好ましい実施形態では、操作は、減少した免疫原性を有する二量体をもたらさない。一実施形態では、操作は、異なる３Ｄ立体構造を有する二量体をもたらす。好ましくは、操作は、増加した免疫原性を有する二量体をもたらす。このようなアプローチは、Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  ＰＮＡＳ  １３７０１−１３７０６で使用されている。それ故に、一実施形態では、本化合物は、上述のような操作されたＥＤＥに結合する。
【０１０９】
天然二量体の３Ｄモデルは、例えば、上述の受入番号１ＯＡＮ、１ＯＫ８、１ＵＺＧ、および３ＵＡＪの下で、タンパク質データバンクにおいて入手可能な、デングウイルス血清型、例えば、血清型２、３、および４からのエンベロープ糖タンパク質細胞外ドメインにおける結晶構造に関する情報を使用するために形成され得る。
【０１１０】
特定の突然変異または修飾が３Ｄ構造を変化させるまたは実質的に変化させるかどうかは、ＶＤＥに結合することが知られている本明細書に記載の抗体が操作されたバージョンのＶＤＥに依然として結合することができるかどうかをモニタリングすることを含む、異なる技術によって評価され得る。
【０１１１】
当業者は、例えば、潜在的な安定化させる修飾の特定に役立つようなコンピュータプログラムを使用することができる
【０１１２】
ＥＤＥの免疫原性における操作の効果は、操作されたおよび操作されていないＥＤＥを投与される場合に対象における抗体反応を比較することによって、または既知の抗ＥＤＥ抗体への結合を比較することによって評価され得る。
【０１１３】
あるいは、改変されたエンベロープタンパク質は、デングウイルスまたはジカウイルスまたは他のフラビウイルスにおいて発現され、ウイルスを中和する化合物の能力が評価され得る。
【０１１４】
安定化したＥＤＥを提示するために、それぞれのＥＤＥ（骨格タンパク質と称される）に類似の三次元構造を有する非ＥＤＥ異種タンパク質は、改変タンパク質がＥＤＥを保持することができる適切な残基を含有するように改変することができる。それ故に、一実施形態では、本化合物はＥＤＥに結合し、このＥＤＥは、エピトープ骨格タンパク質の一部として提示される。エピトープ骨格タンパク質は、異種の「受容体」骨格タンパク質に融合されるエピトープ配列を含むキメラタンパク質である。エピトープ骨格の設計は、例えば、エピトープが異種骨格タンパク質に融合される場合に、エピトープの天然構造および立体構造を保存する様式でコンピュータ的に行われる。かかる骨格タンパク質の使用は、当該技術分野で周知であり、かかる方法および技術は、ＷＯ２０１１／０５０１６８およびＷＯ２０１６／０１２８００、ならびに参考文献ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２，５９２−５９８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１ｆ６７２８３（２０１３）、Ｏｆｅｋ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  ＰＮＡＳ  １０７：１７８８０−１７８８７、Ｂｕｒｔｏｎ  ２０１０  ＰＮＡＳ  １０７：１７８５９−１７８６０に記載されており、当業者はそこに記載の方法に従い、それらを本発明に適用することができる。
【０１１５】
したがって、一実施形態では、ＥＤＥは、エピトープ骨格タンパク質の一部を含み、この骨格タンパク質は、エンベロープ二量体エピトープに共有結合している異種骨格タンパク質を含む。骨格タンパク質は、本化合物がタンパク質、任意に抗体またはその抗原結合部分である場合に、かかる残基と化合物の間、例えば化合物の接触残基間の相互作用を促進するために適切な空間的配向においてＥＤＥの接触残基を保持するという点で、本発明のＥＤＥを作製するのに有用である。接触残基は、別の分子のアミノ酸と直接または間接的に相互作用する（例えば、塩橋を通して直接的または間接的にイオン結合を形成する）分子に存在する任意のアミノ酸である。少なくともＤＥＮＶ−１において、ＥＤＥに結合する化合物において潜在的に重要であると見なされているエンベロープタンパク質の残基は、ＷＯ２０１６／０１２８００の表２中に詳細されている。骨格タンパク質は、全二量体を示し得るか、または上の選択された残基のみ示し得る。天然二量体またはその一部の３Ｄモデルは、例えば、上述の受入番号１ＯＡＮ、１ＯＫ８、１ＵＺＧ、および３ＵＡＪの下で、タンパク質データバンクにおいて入手可能な、デングウイルス血清型、例えば、血清型２、３、および４からのエンベロープ糖タンパク質細胞外ドメインにおける結晶構造に関する情報を使用するために形成され得る。
【０１１６】
変異分析は、本発明の使用において特定される抗体への結合において重要であるＤＥＮＶ１およびＤＥＮＶ２の特定の残基を示した。これらの残基は、ＤＥＮＶ１：Ｅ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２；ＤＥＮＶ２：Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｋ３１０である。これらの残基のすべては、結合、およびＱ７７、Ｗ１０１、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｋ３１０に重要であると見なされる。
【０１１７】
したがって、一実施形態では、化合物は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは骨格タンパク質の一部であり、この骨格タンパク質は、ＤＥＮＶ−２エンベロープタンパク質のＥ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２のうちの１つ以上に対応する少なくとも残基、またはフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質、具体的にはＤＥＮＶ−１およびＤＥＮＶ−２に対して等価残基を保持する。ある特定の残基は、より重要であると見なされ、したがって、ＥＤＥのさらなる実施形態は、エンベロープタンパク質のＱ７７、Ｗ１０１、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｋ３１０に対応する残基のうちの少なくとも１つ以上、またはフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質、具体的には、ＤＥＮＶ−１およびＤＥＮＶ−２の等価残基を保持する骨格タンパク質を含む。
【０１１８】
デングウイルスにおけるエピトープに接触するのに重要であると見なされるエンベロープタンパク質の残基は、ＷＯ２０１６／０１２８００の図３１中に示され、例えば、ＷＯ２０１６／０１２８００に論じられる。例えば、Ｃ１０抗体は、残基Ｒ２、Ｈ２７、Ｇ２８、Ｅ４４、Ｌ４５、Ｉ４６、Ｋ４７、Ｎ６７、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｅ７１、Ｓ７２、Ｒ７３、Ｃ７４、Ｑ７７、Ｓ８１、Ｌ８２、Ｎ８３、Ｅ８４、Ｖ９７、Ｒ９９、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｃ１０５、Ｇ１０６、Ｌ１１３、Ｔ１１５、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｑ２４８、Ｑ２７１、Ｖ３０９、Ｋ３１０、Ｒ３２３、Ｑ３２５、Ｄ３６２でＤＥＮＶ２  ＥＤＥに接触すると見なされており、Ｃ１０抗体は、残基Ｒ２、Ｈ２７、Ｇ２８、Ｇ２９、Ｅ４４、Ｌ４５、Ｔ４６、Ｎ６７、Ｔ６９、Ｔ７０、Ａ７１、Ｔ７２、Ｒ７３、Ｃ７４、Ｑ７７、Ｖ９７、Ｒ９９、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｃ１０５、Ｇ１０６、Ｖ１１３、Ｒ２４７、Ｑ２４８、Ｄ２４９、Ｄ２７１、Ｍ２７８、Ｄ３０９、Ｋ３１０、Ｖ３２４、Ｋ３２３、Ｋ３２５、Ｔ３６１、Ｎ３６２でＤＥＮＶ４  ＥＤＥに接触すると見なされており、Ｃ８抗体は、残基Ｎ６７、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｅ７１、Ｓ７２、Ｒ７３、Ｃ７４、Ｑ７７、Ｎ８３、Ｅ８４、Ｖ９７、Ｄ９８、Ｒ９９、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｃ１０５、Ｇ１０６、Ｌ１１３、Ｅ１４８、Ｈ１５８、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｑ２４８、Ｄ２４９、Ｉ３０８、Ｋ３１０、Ｅ３１１、Ｒ３２３、Ｄ３６２、Ｇ３７４でＤＥＮＶ２  ＥＤＥに接触すると見なされている。
【０１１９】
したがって、化合物、具体的にはＤＥＮＶ２およびＤＥＮＶ４への結合において重要であると見なされているエンベロープタンパク質の残基は、Ｋ４７、Ｔ６８、Ｓ８１、Ｌ８２、Ｎ８３、Ｅ８４、Ｔ１１５、Ｋ２４６、Ｋ、Ｖ３０９、Ｒ２、Ｈ２７、Ｇ２８、Ｇ２９、Ｅ４４、Ｌ４５、Ｔ４６、Ｎ６７、Ｔ６９、Ｔ７０、Ａ７１、Ｔ７２、Ｒ７３、Ｃ７４、Ｑ７７、Ｖ９７、Ｒ９９、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｃ１０５、Ｇ１０６、Ｖ１１３、Ｒ２４７、Ｑ２４８、Ｄ２４９、Ｄ２７１、Ｍ２７８、Ｄ３０９、Ｋ３１０、Ｖ３２４、Ｋ３２３、Ｋ３２５、Ｔ３６１、Ｎ３６２、Ｄ９８、Ｅ１４８、Ｈ１５８、Ｋ２４６、Ｉ３０８、Ｅ３１１、Ｇ３７４、またはフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基である。
【０１２０】
化合物、具体的にはＤＥＮＶ１または２またはジカウイルスへの結合において重要であると見なされている残基は、ＤＥＮＶ−１もしくはＤＥＮＶ−２ポリペプチド配列の、Ｅ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２（ＤＥＮＶ−１；Ｋ１２２  ＤＥＮＶ−２）、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２（ＤＥＮＶ−１；Ｉ１６２  ＤＥＮＶ−２）、Ｐ１６９（ＤＥＮＶ−１；Ｓ１６９  ＤＥＮＶ−２）、Ｔ２００（ＤＥＮＶ−１；Ｑ２００  ＤＥＮＶ−２）、Ｋ２０２（ＤＥＮＶ−１；Ｅ２０２  ＤＥＮＶ−２）、Ｅ２０３、Ｌ３０８（ＤＥＮＶ−１；Ｖ３０８もしくはＩ３０８  ＤＥＮＶ−２＿、Ｋ３１０、Ｑ３２３（ＤＥＮＶ−１；Ｒ３２３  ＤＥＮＶ−２）、Ｗ３９１、Ｆ３９２；ジカＰＦ１３のＴ４９、Ｓ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｓ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５４、Ｔ１５６、Ｋ１６６  Ｔ２０５、Ｎ２０７、Ｎ２０８、Ｆ３１４、Ｋ３１６、Ｅ３１９、Ｗ４００、Ｈ４０１；またはフラビウイルス、任意に、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基；ならびに／あるいは、ジカＰＦ１３のＲ２、Ｍ６８、Ａ６９、Ｓ７０、Ｄ７１、Ｓ７２、Ｒ７３、Ｃ７４、Ｑ７７、Ｄ８３、Ｖ９７、Ｄ９８、Ｒ９９、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｃ１０５、Ｇ１０６、Ｌ１１３、Ｋ２５１、Ｒ２５２、Ｑ２５３、Ｔ３１５、Ｋ３１６、Ｑ３３１、Ｋ３７３に対応する位置のうちの１つ以上、例えば、ジカＰＦ１３のＴ３１５、Ｋ３７３、Ｓ７０、Ｓ７２、Ｑ７７、Ｒ９９、Ｇ１０４、Ｍ６８、Ｒ２５２、Ｄ８３、Ｑ２５３に対応する位置のうちの１つ以上である。これら（Ｋ３７３まで）は、ＥＤＥ１  Ｃ８抗体と接触する実施例２のＥＤ図２に示される残基であると考えられる。さらなる残基（Ｔ３１５で始まる）は、実施例２のＥＤ表４および５に記載されているものと考えられる。
【０１２１】
骨格タンパク質は、ＤＥＮＶ−２のＥ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２、Ａ７１、Ｃ１０５、Ｃ７４、Ｄ１５４、Ｄ２４９、Ｄ２７１、Ｄ３０９、Ｄ３６２、Ｄ９８、Ｅ１４８、Ｅ３１１、Ｅ４４、Ｅ７１、Ｅ８４、Ｇ１０２、Ｇ１０４  Ｇ１０６、Ｇ１５２、Ｇ１５６、Ｇ２８、Ｇ２９、Ｇ３７４、Ｈ１５８、Ｈ２７、Ｉ１１３、Ｉ３０８、Ｉ４６、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｋ３２３、Ｋ３２５  Ｋ４７、Ｌ１１３、Ｌ４５、Ｌ８２、Ｍ２７８、Ｎ１０３、Ｎ３６２、Ｎ６７、Ｎ８３、Ｑ２４８、Ｑ２７１、Ｑ３２５、Ｒ２、Ｒ２４７、Ｒ３２３、Ｒ７３、Ｒ９９、Ｓ７２、Ｓ８１、Ｔ１１５、Ｔ３６１、Ｔ４６、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｔ７２、Ｖ１１３、Ｖ１１４、Ｖ２５０、Ｖ３０９  Ｖ３２４、Ｖ９７；ジカＰＦ１３のＲ２、Ｍ６８、Ａ６９、Ｓ７０、Ｄ７１、Ｓ７２、Ｒ７３、Ｃ７４、Ｑ７７、Ｄ８３、Ｖ９７、Ｄ９８、Ｒ９９、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｃ１０５、Ｇ１０６、Ｌ１１３、Ｋ２５１、Ｒ２５２、Ｑ２５３、Ｔ３１５、Ｋ３１６、Ｑ３３１、Ｋ３７３、例えば、ジカＰＦ１３のＴ３１５、Ｋ３７３、Ｓ７０、Ｓ７２、Ｑ７７、Ｒ９９、Ｇ１０４、Ｍ６８、Ｒ２５２、Ｄ８３、Ｑ２５３に対応する１つ以上の位置、またはフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基の、これらの一連の残基から選択される１つ以上の残基を示し得るか、またはこれらのうちの少なくとも１つ以上、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはそのすべてを示し得る。
【０１２２】
加えて、骨格タンパク質は、前述のように、二量体配置の安定性を増加させると見なされている残基：Ｈ２７Ｆ、Ｈ２７Ｗ、Ｌ１０７Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、Ｈ２４４Ｆ、Ｈ２４４Ｗ、Ｓ２５５Ｃ、Ａ２５９Ｃ、Ｔ／Ｓ２６２Ｃ、Ｔ／Ａ２６５Ｃ、Ｌ２７８Ｆ、Ｌ２９２Ｆ、Ｌ２９４Ｎ、Ａ３１３Ｃ、およびＴ３１５Ｃ（またはフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基）のセットのうちの任意の１つ以上またはそのすべてを示し得る。
【０１２３】
骨格タンパク質は、二量体、または二量体の断片を保持し得、免疫原性に必須であると見なされている上記の改変のうちのいずれかを含み得、および／または増加した二量体の安定性、例えば増加したジスルフィド結合をもたらし得る。
【０１２４】
さらに、この骨格は、改善されたＥＤＥが示されるような骨格であり得る。一実施形態では、本化合物は、したがって、改善されたＥＤＥに結合する。例えば、以下ならびにＷＯ２０１６／０１２８００の実施例２および５に記載されるように、デング熱感染を有する患者は、有用な抗体であると見なされるＶＤＥに向けて進められる抗体、または有用であると見なされない融合ループ（抗ＦＬ抗体）に向かって配向される抗体のいずれかを有する傾向がある。それ故に、骨格は、ＥＤＥのみが提示されるように、かつ、化合物、例えば、ＦＬに作り出される、抗体またはその抗原結合部分の可能性を排除するような方法で提示されるように操作され得る。したがって、ある好ましい実施形態では、ＥＤＥは、任意に骨格タンパク質に組み込むことによって、抗体をＦＬではなく、ＥＤＥに作り出すことができる。
【０１２５】
骨格タンパク質とは無関係に、エンベロープタンパク質は、改善されたＥＤＥが生成されるように操作され得る。上述のように、抗ＦＬ抗体によって認識することができず、かかる抗体を作り出すことができないＥＤＥは、改善されたＥＤＥであると見なされる。これは、エンベロープタンパク質において１つ以上の変異、欠失、もしくは挿入によって、またハイブリッドタンパク質を生成することによって達成され得、特異的エピトープは、抗ＦＬ抗体を作り出し得るいかなる抗原も用いることなく、骨格タンパク質に融合される。例えば、実施例３で論じたような二量体の「呼吸」を減少させる安定化などの二量体の安定化は、抗ＦＬ抗体の上昇を減少させる可能性があり、したがって改善されたＥＤＥを表すと考えられる。
【０１２６】
一実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＮまたはＯ結合型グリカン配列を添加することによって、（ウイルスの内側に突出する）二量体の内部表面を改変し、それをより少ない免疫原性にすることによって操作される。
【０１２７】
二量体に新しい表面をつける広範囲の変異原性は、残基の変異および／またはグリカンの添加によって非ＥＤ準最適反応の生成をさらに低減するのに有用であり得る。
【０１２８】
一例として、Ｌ２７８Ｆ変異は、ｋｌループを再形成し、ビリオン様の立体構造を模倣すると見なされる。
【０１２９】
さらなる議論のために、例えば、以下の変異の節および本明細書にける実施例３を参照のこと、ならびに例えばＷＯ２０１６／０１２８００、例えば実施例１７および１８における議論が含まれる。
【０１３０】
コアＥＤＥエピトープのモデリングおよび最適化はまた、所望のＥＤＥ反応を誘発するために最適な配列を生成し、結合抗体および中和抗体を提供するためにも有用であり得る。
【０１３１】
ＥＤＥが、増加した二量体の安定性に影響を及ぼす骨格内に保持される天然のエンベロープタンパク質であり得ることが理解されよう。ＥＤＥはまた、いかなる骨格とも無関係に二量体の安定性を増加するように操作され得る。この２つは、一実施形態では、ＥＤＥは、異種骨格タンパク質内に保持されたエンベロープタンパク質が二量体配置において改善された安定性を有するように操作される二量体を含むように組み合わせられ得る。あるいは、エンベロープタンパク質は、タンパク質の関連部分のみが存在するように操作され得、これが異種骨格タンパク質において保持され得る。
【０１３２】
二量体立体構造は、例えば、２つのエンベロープポリペプチドドメインを含む単一のポリペプチド鎖として表される２つのエンベロープ単量体間に、長いリンカー、例えばグリシン−セリンリッチなライナーを作製することによって安定化させてもよい。あるいはまたは加えて、二量体構造は、二量体の内部に面する表面または二量体と関連するタグに結合する任意の抗体（例えば）によって安定化させてもよい。
【０１３３】
エンベロープタンパク質、ｓＥ、ｓＥ二量体、またはエンベロープタンパク質二量体への任意の言及はまた、その範囲内に、骨格タンパク質または構造も含み、ＥＤＥを作製し、適当なＥＤＥを示すために、特定の立体構造において保持される特定の残基を含む。
【０１３４】
エンベロープヌクレオチド配列は、このエンベロープタンパク質が変異、挿入、または欠失のうちのいずれか１つ以上を有するように操作され得る。ヌクレオチド配列は、特定のエンベロープタンパク質（またはその部分）の天然配列に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同性を有するようなものであり得る。
【０１３５】
さらなる実施形態では、エンベロープタンパク質は、別の血清型のフラビウイルス、例えば、ジカウイルスまたはデングウイルスからのエンベロープタンパク質（またはその部分（複数可）、例えば、少なくとも８、９、または１０の連続的なアミノ酸のうちの１つ以上の部分）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同性を有するように操作され得る。好ましい実施形態では、エンベロープタンパク質は、すべての血清型のデングウイルスおよび／またはジカウイルスからの２つの異なるエンベロープタンパク質（またはその部分（複数可）、例えば、少なくとも８、９、または１０の連続的なアミノ酸のうちの１つ以上の部分）、より好ましくは４つの異なるエンベロープタンパク質（またはその部分（複数可）、例えば、少なくとも８、９、または１０の連続的なアミノ酸のうちの１つ以上の部分）、最も好ましくはすべてのエンベロープタンパク質（またはその部分（複数可）、例えば、少なくとも８、９、または１０の連続的なアミノ酸のうちの１つ以上の部分）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同性を有するように操作され得る。
【０１３６】
上記のように、エンベロープタンパク質は、実際には、天然エンベロープタンパク質に対して非常に低い相同性を有するように操作され得るが、ＥＤＥの完全性および立体構造が維持されるか、またはＥＤＥが改善される、例えば、抗ＦＬ抗体を育てることができないような方法で改変される。それ故に、配列相同性のレベルは、必ずしも、３Ｄ構造相同性または機能的相同性を表示しない。例えば、ＥＤＥを含む構造をコードする特定の配列は、実際には、天然エンベロープタンパク質に対して非常に低いレベルの相同性を有し得るが、それでもなお、本発明に関して有用な化合物と見なされ得る。例えば、タンパク質は、天然エンベロープタンパク質に対して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％相同性を有し得、この構造をコードするヌクレオチド配列は、天然エンベロープ配列に対応して低い配列同一性を有し得る。
【０１３７】
例えば、異なるエンベロープタンパク質中のＥＤＥを形成する残基間のアミノ酸側鎖に相違がある場合、例えば、ジカおよびデングウエンベロープタンパク質ＥＤＥを構成するアミノ酸の間に差がある場合であっても、ＥＤＥを形成する骨格立体配座は、抗ＥＤＥ抗体によって広く認識される可能性があると考えられる。
【０１３８】
好ましい実施形態では、ＥＤＥを含むエンベロープタンパク質または構造は、フラビウイルス、例えば、ジカウイルスまたはデングウイルスエンベロープタンパク質（またはその部分（複数可）、例えば、少なくとも８、９、または１０の連続的なアミノ酸のうちの１つ以上の部分）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同性、またはすべての血清型のフラビウイルス、例えば、ジカウイルスまたはデングウイルスからの２つの異なるエンベロープタンパク質（またはその部分（複数可）、例えば、少なくとも８、９、または１０の連続的なアミノ酸のうちの１つ以上の部分）、より好ましくは４つの異なるエンベロープタンパク質、最も好ましくはすべてのエンベロープタンパク質に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同性を有するか、またはＥＤＥを含むタンパク質または構造は、１種以上の血清型のジカまたはデングウイルスの天然エンベロープタンパク質に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％相同性を有し、このタンパク質は、Ｅ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２、ならびに／あるいは、ジカＰＦ１３のＲ２、Ｍ６８、Ａ６９、Ｓ７０、Ｄ７１、Ｓ７２、Ｒ７３、Ｃ７４、Ｑ７７、Ｄ８３、Ｖ９７、Ｄ９８、Ｒ９９、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｃ１０５、Ｇ１０６、Ｌ１１３、Ｋ２５１、Ｒ２５２、Ｑ２５３、Ｔ３１５、Ｋ３１６、Ｑ３３１、Ｋ３７３、例えば、ジカＰＦ１３のＴ３１５、Ｋ３７３、Ｓ７０、Ｓ７２、Ｑ７７、Ｒ９９、Ｇ１０４、Ｍ６８、Ｒ２５２、Ｄ８３、Ｑ２５３に対応する１つ以上の位置、またはフラビウイルス、例えばジカウイルスもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基のうちの１つ以上、または任意にこれらのすべてを含む。
【０１３９】
これらの残基のいくつかは、その他よりも重要であると見なされ、したがって、ＥＤＥ、エンベロープタンパク質、またはＥＤＥを含む構造のさらなる実施形態では、ＤＥＮＶ−２のＱ７７、Ｗ１０１、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｋ３１０、またはジカＰＦ１３のＴ３１５、Ｋ３７３、Ｓ７０、Ｓ７２、Ｑ７７、Ｒ９９、Ｇ１０４、Ｍ６８、Ｒ２５２、Ｄ８３、Ｑ２５３、またはフラビウイルス、例えばジカウイルスもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基のうちの１つ以上、または任意にこれらのすべてを含む。
【０１４０】
エンベロープタンパク質残基Ｅ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、
Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２（ＤＥＮＶ−２）、またはジカＰＦ１３のＴ３１５、Ｋ３７３、Ｓ７０、Ｓ７２、Ｑ７７、Ｒ９９、Ｇ１０４、Ｍ６８、Ｒ２５２、Ｄ８３、Ｑ２５３、またはフラビウイルス、例えばジカウイルスもしくはデングウイルスの等価残基のうちの１つ以上は、ＥＤＥへの化合物の結合に必要であると考えられる。それ故に、一実施形態では、ＥＤＥを含むエンベロープタンパク質または構造は、これらの残基のうちの１つ以上、またはこれらのすべてを含む。
【０１４１】
抗ＦＬ抗体は、ほとんどの場合、アラニン走査分析において変異した残基の中から残基Ｗ１０１のみを必要とするように思われ（ＷＯ２０１６／０１２８００の実施例２）、他の残基のうちのいずれかの変異によって影響を受けないが、一方、抗ＥＤＥ抗体は、はるかに大きなエピトープを必要とし、抗ＦＬ抗体が必要とするように残基Ｗ１０１の存在を必要とするが、多くの他の残基での変異によって影響を受ける。したがって、一実施形態では、ＥＤＥは、エンベロープ二量体エピトープにおいて残基Ｗ１０１および位置Ｅ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２（ＤＥＮＶ−２）、またはジカＰＦ１３のＴ３１５、Ｋ３７３、Ｓ７０、Ｓ７２、Ｑ７７、Ｒ９９、Ｇ１０４、Ｍ６８、Ｒ２５２、Ｄ８３、Ｑ２５３、またはエンベロープ二量体エピトープの等価残基が化合物の結合に必要であるエピトープとして定義される。
【０１４２】
特定の実施形態では、エンベロープ二量体エピトープは、ジカＰＦ１３のドメインＩＩＩ残基Ｋ３１０（ＤＥＮＶ−２）またはＴ３１５、Ｋ３７３、Ｓ７０、Ｓ７２、Ｑ７７、Ｒ９９、Ｇ１０４、Ｍ６８、Ｒ２５２、Ｄ８３、Ｑ２５３、またはフラビウイルス、例えば、ジカウイルスもしくはデングウイルスタンパク質の等価残基を含む。
【０１４３】
一実施形態では、ＥＤＥは、例えば、各エンベロープ、例えば、ｓＥ、単量体の６７位（Ａｓｎ６７グリカン）でおよび／または１５３位（Ａｓｎ１５３グリカン、ジカにおいては１５４位）で、好ましくは各単量体の少なくとも６７位（Ａｓｎ６７グリカン）でグリコシル化される。Ａｓｎ６７は、ジカエンベロープタンパク質中に存在するとは考えられていない。
【０１４４】
ある実施形態に従って、本発明の化合物は、エンベロープタンパク質二量体のＮ６７グリカン鎖またはエンベロープタンパク質二量体のＮ１５３／Ｎ１５４（ジカ）グリカン鎖に接触する。本化合物は、エンベロープタンパク質二量体のＮ６７（存在する場合）およびＮ１５３グリカン鎖の両方に接触することができると理解されよう。
【０１４５】
特定の例では、本化合物は、ＣＤＲ  Ｈ２がエンベロープタンパク質のＮ６７グリカン鎖と相互作用する抗体である。
【０１４６】
一実施形態では、本化合物は、１種以上の血清型のデングウイルス、存在する場合、好ましくはすべての血清型のデングウイルスエンベロープタンパク質、例えば、ＤＥＮＶ−２またはＤＥＮＶ−４におけるＡ７１、Ｃ１０５、Ｃ７４、Ｄ１５４、Ｄ２４９、Ｄ２７１、Ｄ３０９、Ｄ３６２、Ｄ９８、Ｅ１４８、Ｅ３１１、Ｅ４４、Ｅ７１、Ｅ８４、Ｇ１０２、Ｇ１０４  Ｇ１０６、Ｇ１５２、Ｇ１５６、Ｇ２８、Ｇ２９、Ｇ３７４、Ｈ１５８、Ｈ２７、Ｉ１１３、Ｉ３０８、Ｉ４６、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｋ３１０、Ｋ３２３、Ｋ３２５  Ｋ４７、Ｌ１１３、Ｌ４５、Ｌ８２、Ｍ２７８、Ｎ１０３、Ｎ１５３、Ｎ３６２、Ｎ６７、Ｎ８３、Ｑ２４８、Ｑ２７１、Ｑ３２５、Ｑ７７、Ｒ２、Ｒ２４７、Ｒ３２３、Ｒ７３、Ｒ９９、Ｓ７２、Ｓ８１、Ｔ１１５、Ｔ１５５、Ｔ３６１、Ｔ４６、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｔ７２、Ｖ１１３、Ｖ１１４、Ｖ２５０、Ｖ３０９  Ｖ３２４、Ｖ９７、Ｗ１０１のうちの任意の１つ以上でＥＤＥに接触する。
【０１４７】
一実施形態では、エンベロープ二量体エピトープは、ドメインＩＩ側上のｂストランド、および（二量体界面の向かいにある）ドメインＩ側上の「１５０ループ」（例えば、図２９を参照のこと）によって形成されたくぼみの中心に置かれた領域を含み、１５０ループが残基１４８〜１５９に広がり、ドメインＩのｂストランドＥ０およびＦ０を接続し、Ｎ１５３残基またはＮ１５３グリカンを担持し、これは二量体におけるパートナーサブユニットの融合ループを覆う。１５０ループは、配列番号１４８の１５０ループのＤｅｎｖ−１  ＱＨＱＶＧＮＥＴＴＥＨＧ、配列番号１１４９の１５０ループのＤｅｎｖ  ２  ＥＨＡＶＧＮＤＴＧＫＨＧ、配列番号１５０の１５０ループのＤｅｎｖ  ３  ＱＨＱＶＧＮＥＴＱＧ、配列番号１５１の１５０ループのＤｅｎｖ  ４  ＴＨＡＶＧＮＤＩＰＮＨＧを含むと見なされる。
【０１４８】
場合によっては、エンベロープ二量体エピトープは、ドメインＩＩのエンベロープタンパク質を含み、任意に、ドメインＩＩの以下の特性、ｂ鎖（残基６７〜７４）、すぐ上流の融合ループおよび残基（残基９７〜１０６）、ならびにｉｊループ（残基２４６〜２４９）、ならびに残基２４３〜２５１および残基３０７〜３１４のうちの任意の１つ以上をさらに含む。
【０１４９】
一実施形態では、ＥＤＥは、残基６７〜７４、残基９７〜１０６、残基１４８〜１５９、残基２４３〜２５１、および残基３０７〜３１４からなる、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルス糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（ｓＥ）の５つのポリペプチドセグメントを含む。
【０１５０】
それ故に、一実施形態では、本発明はまた、上述のように使用するための化合物、例えば、上に定義される安定化組換えｓＥ二量体に対する、上述のように使用するための単離された中和抗体またはその抗原結合断片も提供し、当該抗体またはその断片は、残基６７〜７４、残基９７〜１０６、残基１４８〜１５９、残基２４３〜２５１、および残基３０７〜３１４からなる、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルス糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（ｓＥ）の５つのポリペプチドセグメントに結合する。
【０１５１】
化合物が結合するＥＤＥは、ドメインＩＩのジカＰＦ１３ベータストランドｂ、床ベータシート端部、融合ループ主鎖、融合ループＲ９９側鎖、Ｑ７７側鎖、Ｃ７４とＣ１０５との間のジスルフィド結合、ベータストランドＥ、Ｋ３７３、ドメインＩの荷電残基、ドメインＩＩのｋｌループ、またはそれに対応する領域を含み得、
および／または、ジカＰＦ１３残基６７〜７７、残基９７〜１０６、残基３１３〜３１５、残基２４３〜２５３、残基Ｋ３７３またはフラビウイルス糖タンパク質Ｅ細胞外ドメインの対応する残基からなり得、任意に、結合は、デングＮ１５３（ジカＮ１５４）グリカンまたは対応する残基の存在または不在によって影響を受けない。
【０１５２】
例えば、ポリペプチドセグメントまたはアミノ酸残基に対する本発明に従う使用のための、抗体断片の結合の特徴付けは、例えば、以下の実施例および／またはＷＯ２０１６／０１２８００に記載される結晶化試験によって行われ得る。
【０１５３】
好ましくは、ＥＤＥへの結合に加えて、本化合物は、ウイルスを中和することができる。好ましい実施形態では、本化合物は、すべての血清型のフラビウイルス、または例えば、すべての血清型のジカおよび／もしくはデングウイルスを、好ましくは少なくとも９０％または少なくとも９８％、例えば１００％中和することができ、好ましくは昆虫細胞およびヒト細胞の両方で作られるすべての血清型のジカおよび／もしくはデングウイルスを少なくとも９０％または少なくとも９８％、例えば１００％中和する。中和反応および中和アッセイ技術についての選好は、前述されたとおりである。
【０１５４】
一実施形態では、ＥＤＥは、完全長エンベロープタンパク質の二量体を含む。別の実施形態では、ＥＤＥは、エンベロープ細胞外ドメイン（ｓＥ）の二量体を含む。さらなる実施形態では、エンベロープタンパク質は、エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの（上で論じられるように、約）４００のアミノ末端残基を含む。例えば、ＷＯ２０１６／０１２８００の図２８を参照されたい。上記の完全長エンベロープタンパク質の二量体の安定性についての選好はまた、エンベロープタンパク質の切断型細胞外ドメインにも適用する。したがって、エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの二量体は、操作を通して安定化され得るか、または骨格タンパク質に組み込むことによって安定化され得るか、またはハイブリッド二量体を含み得る。
【０１５５】
さらなる実施形態では、本発明の使用のための化合物は、酸性ｐＨでインキュベートされる、デングウイルスまたはビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子に結合しないであろうものである。酸性ｐＨは、エンベロープタンパク質が三量体配置を不可逆的に導入するようにする。本発明者らは、本発明の使用のための化合物が低いｐＨでウイルス粒子に結合しないことを見出した（ＷＯ２０１６／０１２８００の実施例４を参照のこと）。したがって、一実施形態では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分は、酸性ｐＨでインキュベートされる、デングウイルスまたはビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子に結合しない。酸性ｐＨとは、７より低い任意のｐＨ、好ましくはｐＨ５．５を意味する。
【０１５６】
したがって、当業者は、特定の化合物が本発明のこの実施形態に従う本発明の使用のための化合物であるかどうか、本化合物が、ａ）フリン活性を欠いている細胞で作られるビリオンもしくはサブウイルス粒子もしくはウイルス様粒子、ｂ）高い割合のｐｒＭタンパク質を有するビリオンもしくはサブウイルス粒子もしくはウイルス様粒子、および／またはｃ）酸性条件下でインキュベートされるビリオンもしくはサブウイルス粒子もしくはウイルス様粒子、のうちの１つ以上に結合することができないかどうかを単に特定することによって容易に特定することができる。
【０１５７】
上述のビリオン、サブウイルス粒子、またはウイルス様粒子に対する本化合物の結合能力をアッセイするための方法は、ＥＤＥに結合する本化合物の能力をアッセイすることに関しては前述に提供され、ＷＯ２０１６／０１２８００の実施例４に詳述されており、概して、本化合物が結合することができるかどうかをアッセイするために、特定のビリオンまたはウイルス様粒子に対してＥＬＩＳＡを単に含む。本化合物は、天然ＥＤＥまたはビリオンまたはウイルス様粒子に結合するか、または有意に結合する場合、ならびにａ）フリン活性を欠いている細胞で作られる、ｂ）高い割合のｐｒＭタンパク質を有する、および／またはｃ）酸性条件下でインキュベートされる、ビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子に結合しない場合、有用であると見なされる。
【０１５８】
本発明は、上記の使用のための特定の化合物をさらに含む。例えば、一実施形態では、本化合物は、重鎖配列番号１１および軽鎖配列番号１３、または重鎖配列番号１２および軽鎖配列番号１４の配列を含む抗体である。抗体が含んでいてもよい軽鎖、重鎖、およびＣＲＤ配列のさらなる例は、下記の抗体の節に記載されている。本発明はまた、これらの抗体の切断および変異に関し、そのため、使用のための化合物はその抗原結合部分であることが理解されよう。少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列または可変領域配列全体、または抗体配列全体において、上記の配列に対して少なくとも８０、９０％、または少なくとも９５％相同性の配列相同性を有する抗体は、本発明の使用のために含まれる。抗体、軽鎖および重鎖の特定の配列は、配列番号１〜４、３７〜１４１、１４１〜１４７、および例えばＷＯ２０１６／０１２８００の図２９に記載されている。
【０１５９】
ＷＯ２０１６／０１２８００、Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，  １０９−１１３、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，１７０−１７７、の群「ＥＤＥ１」として特徴付けられる抗体が、特にジカウイルスに関連する使用に関連して、特に価値があり得る。ＥＤＥ群１抗体は、Ｎ１５３（または等価残基）グリコシル化の存在または不在によって影響を受けない結合によって特徴付けられると考えられる。
【０１６０】
ジカおよびデングウイルスに関連する広範な中和抗体として特に有用であり得る抗体は、以下の抗体の節に論じられるように、７５２−２  Ｃ８またはＥＤＥ１  Ｃ８であり得る（ＷＯ  ２０１６／０１２８００、Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，  １０９−１１３、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，  １７０−１７７にあるような用語）、または７５３（３）  Ｃ１０  ＥＤＥ  Ｃ１０（ＷＯ２０１６／０１２８００、Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，  １０９−１１３、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，  １７０−１７７にあるような用語）。
【０１６１】
ジカエンベロープタンパク質二量体に対して高い親和性を有し得るが、中和にはあまり有用でなく、抗体依存性増強（ＡＤＥ）を促進し得る抗体は、ＤＥＮＶ結合のために１５３位にグリコシル化部位を必要とすると思われるが、ジカエンベロープ二量体上の１５４グリカン（存在する場合）と同じ相互作用をしない、ＥＤＥ２  Ａ１１であり得る（ＷＯ２０１６／０１２８００、Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，  １０９−１１３、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，  １７０−１７７にあるような用語）。実施例２を参照のこと。
【０１６２】
以下の実施例２においてさらに論じられるように、ジカ株は、１５４位でのグリコシル化に関して異なる場合がある。アフリカジカ株ＨＤ７８７８８は、長年にわたり、マウスの脳をサックインする細胞培養に適合し継代されており、Ｅグリコシル化がないと考えられている。２０１３年にフランス領ポリネシアで単離されたＰＦ１３株は、１５０ループ、１５４位でグリコシル化されたＥタンパク質を有する。ＥＤＥ１群抗体、例えば、ＥＤＥ１  Ｃ８はグリコシル化されていないアフリカ系統ＨＤ７８７８８をグリコシル化ＰＦ１３株よりも良好に中和することができるが、ＥＤＥ１群抗体はこれらのジカ株の両方をＤＥＮＶ株と同等またはそれよりも中和することができる。
【０１６３】
ＥＤＥ２抗体、例えばＥＤＥ２  Ａ１１は、これらのジカ株間で差異を示さないかもしれないが、ＥＤＥ１抗体としていずれかの株を中和するほど強力ではないかもしれない。
【０１６４】
特定の重鎖および軽鎖の特定の残基は、実施例、特に実施例２および実施例２のＥＤ図３でさらに論じるように、ＥＤＥへの結合に重要であると考えられる。したがって、当業者は、どの残基がどのような方法で改変を許容する可能性が高いかを決定することができるであろう。改変は、当業者には明らかであり本明細書に記載されるように、ＥＤＥ結合能力またはウイルス中和能力に対する効果を試験することによって試験され得る。
【０１６５】
抗体は、軽鎖および重鎖からなり、各軽鎖および重鎖内に３つの可変領域がある。これらの領域のそれぞれの最も可変の部分は、相補性決定領域であり、抗原結合および認識には最も不可欠であると見なされる。したがって、一実施形態では、本化合物は、以下のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有しない、１つまたは２つアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する以下のアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む：
以下の抗体の節の表Ａで同定されたＣＤＲ配列、
または以下の抗体の節で同定される、例えば、ＥＤＥ１抗体として同定される抗体のための、ＷＯ２０１６／０１２８００からのＣＲＤ配列。
【０１６６】
タンパク質骨格における抗原性ＥＤＥの提示に関して上述のように、本化合物、例えばタンパク質、例えば抗体はまた、例えばタンパク質骨格内に保持される、より大きな構造の一部であってもよい。この骨格についての選好は、前述されたとおりである。例えば、一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、より大きなポリペプチド内にある。
【０１６７】
好ましい実施形態では、本化合物は、抗体またはその抗原結合部分である。抗原結合部分は、Ｆｖ部分、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ）２断片）、またはドメイン抗体であってもよい。
【０１６８】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、モノクローナル抗体であるか、または、モノクローナル抗体由来である。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ポリクローナル抗体であるか、または、ポリクローナル抗体由来である。さらなる実施形態では、本化合物は、
ａ）モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、または
ｂ）ポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、または
ｃ）モノクローナルおよびポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、を含む、抗体またはその抗原結合部分の混合物を含む組成物であり、例えば、モノクローナル抗体対ポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の比率は、１０：１、８：１、６：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、または１：１０である。
【０１６９】
本化合物は、組換えタンパク質、例えば、組換え抗体またはその抗原結合部分であってもよいことが理解されよう。本化合物はまた、合成的に作製されてもよい。本化合物は、組換え的および合成的に産生された組み合わせであってもよい。
【０１７０】
このような化合物、例えばタンパク質、例えば抗体またはその抗原結合部分を作製する手段を提供する。
【０１７１】
本化合物が組換え手段によって産生され得る、例えば本化合物、例えばポリペプチド、例えば、抗体またはその抗原結合部分は、
ａ）ヒト細胞株、任意に、ＣＨＯ細胞、または
ｂ）哺乳動物、任意に、ヒト、または
ｃ）微生物、または
ｄ）昆虫細胞株、を含む、様々な生物から産生および単離または精製され得る。
【０１７２】
単離または精製されるとは、この薬剤は、その自然環境から除去され、この薬剤が精製される程度に反映しないことを意味する。
【０１７３】
したがって、本発明は、ヒト細胞株、任意にＣＨＯ細胞、または哺乳動物、任意にヒト、または微生物、または昆虫細胞株を含む、様々な生物からの本発明の使用のための化合物の単離または精製を提供する。
【０１７４】
本化合物が、ポリペプチド、例えば、抗体またはその抗原結合部分であるか、または例えば、タンパク質骨格に含まれる場合には、この化合物は、核酸によってコードされてもよい。核酸とは、一本または二本鎖のおよびすべてのそれらの様々な形態でＤＮＡおよびＲＮＡの両方の意味を含む。本発明の使用のためのまたは本発明に関連してタンパク質性化合物のうちのいずれかをコードする核酸を提供する。特に、ＷＯ２０１６／０１２８００の配列番号４１〜４８は、本発明に関連して有用であり得る。本明細書の考察から明らかなように、ＷＯ２０１６／０１２８００の他の配列も有用であり得る。前述の可能性のいずれかを含む配列、例えば、抗体配列のいずれかをコードする部分を含む核酸配列またはそれに対して少なくとも８０、９０、９５、または９５％の相同性を有する配列であるような、サイレント変異をもたらし得る変異を含む、例えば、ＷＯ２０１６／０１２８００の配列番号４１〜４８に由来するかまたはそれを含む任意の配列、または本明細書に開示される他の配列が、含まれる。
【０１７５】
核酸は、イントロンを含んでも、含まなくてもよい。核酸はまた、その後の翻訳ポリペプチドの精製を可能にするために修飾されてもよく、例えば、目的とするポリペプチドのオープンリーディングフレームは、その後の精製を可能にするためにタグ、例えばｍｙｃタグまたはｈｉｓタグを組み込むように修飾されてもよい。
【０１７６】
核酸はまた、例えば、最終ポリペプチド配列に影響を及ぼすことなく、翻訳されるべき生物によってより良好に翻訳されるように最適化されたコドンに修飾されてもよい。
【０１７７】
本開示の核酸は、当業者に既知の多くの方法、例えば、古典的な変異誘発、化学的処理、制限消化、ライゲーション、およびＰＣＲを用いて産生または修飾され得る。
【０１７８】
本発明の一態様は、個体に１つ以上のフラビウイルスにワクチン接種する際に使用するための、または１つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および／もしくは治療のための方法における使用のための、本発明の先の態様に関して定義される抗体またはその断片をコードする核酸を提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０１７９】
本発明の一態様は、本発明の第１の態様に従う使用のための抗体もしくはその断片、または本発明の先の態様の使用のための核酸を提供し、抗体もしくはその断片または核酸は、上述の１つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および／または治療のための方法における使用のためのものであり、この治療は、抗体依存性増強（ＡＤＥ）を減少させるためである。
【０１８０】
本発明に関連して、例えば、本発明の使用においてまたは本発明の使用のための化合物を調製することに関連して有用な核酸は、ベクターに組み込まれてもよい。したがって、本発明は、例えば、核酸を含むベクターの使用に関連し得る。ベクターとは、核酸の増幅のクローニングのための、または標的生物への挿入のためのビヒクルを意味し、例えば、ベクターは、標的生物に、例えば標的生物のゲノムに本発明の核酸を標的とするために使用される、プラスミドであっても、核酸であってもよい。ベクターは、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドの発現のために必要とされるヌクレオチド配列をさらに含んでもよく、例えば、プロモーター配列または終止配列は、本発明の使用のためのまたは本発明に関連して有用な核酸に動作可能に連結されてもよく、レポーター遺伝子、例えば抗生物質抵抗性カセットを含んでもよい。ベクターは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、線状であっても、環状であってもよい。一実施形態では、ベクターはプラスミドである。
【０１８１】
上述のＥＤＥに結合することができる化合物を提供することに加えて、本発明はまた、以下に定義されるＥＤＥ化合物も提供する。核酸またはベクターを含む宿主細胞に加えて、本発明の使用のためのＥＤＥ化合物をコードする、核酸またはベクターを提供する。例えば、上述の核酸およびベクターについての選好はまた、当業者には明らかであるような、本発明の本態様に関連してもよい。それ故に、本発明は、以下に定義される使用のためのＥＤＥ化合物、またはそのようなＥＤＥ化合物をコードする核酸、または当該核酸を含むベクター、または以下に記載される使用のための当該核酸もしくはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１８２】
本発明の一態様は、１つ以上のフラビウイルスに対して、個人にワクチン接種する際に使用するための、フラビウイルスエンベロープ二量体エピトープ（ＥＤＥ）を提供し、ＥＤＥが、安定化組換えフラビウイルス、任意に、デングウイルスおよび／またはジカ、エンベロープ糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（ｓＥ）二量体であり、この二量体は、
２つのｓＥ単量体間で少なくとも１つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化される、ならびに／または
各単量体の二量体界面またはドメインＩ（ＤＩ）／ドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）リンカーにおいて、少なくとも１つのｓＥ単量体のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって非共有結合的に安定化され、２つのｓＥ単量体間で少なくとも１つのスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化される、ならびに／または
任意に、ｓＥ配列を分離する、リンカー領域、任意に、グリシンセリンリッチリンカー領域を有する単一ポリペプチド鎖として形成されることによって共有結合的に安定化される、ならびに／または
改変糖類を介して２つのｓＥ単量体を連結することによって共有結合的に安定化される、ならびに／または、
二量体は、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４、ジカ、もしくは他のフラビウイルスのうちのいずれか１つもしくは２つからの天然および／または変異エンベロープポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０１８３】
本発明のさらなる態様は、１つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種するための方法を提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択され、本方法は、本発明の上述の態様に関して定義されるＥＤＥを投与することを含む。
【０１８４】
本発明のさらなる態様はまた、１つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種するための医薬の製造における、本発明の上述の態様に関して定義されるＥＤＥの使用も提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０１８５】
実施形態は、特許請求の範囲に記載されており、さらなる好ましいものは、ＥＤＥに関して、および治療される個体に関して他の箇所で記載されている。典型的には、ワクチン接種される個体は、フラビウイルス感染またはジカウイルス感染を有するか、または有する可能性が高いと判断されていない者であり得る。
【０１８６】
ＥＤＥ化合物は、エンベロープ依存性エピトープとして上述のエピトープを提供するよう意図されている。ＥＤＥ化合物は、本発明の使用のための１つ以上のＥＤＥ特異的抗体、例えば上記の好ましい中和抗体、または本実施例もしくはＷＯ２０１６／０１２８００の実施例に例示されるように特異的に結合し得る。ＥＤＥ化合物は、典型的には、ポリペプチドであるか、またはポリペプチドを含む。一実施形態では、ＥＤＥ化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ細胞外ドメイン、またはエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの４００アミノ末端残基である。本明細書で使用される「４００アミノ末端残基」とは、約４００アミノ末端残基、例えば、上述のおよび当業者には明らかであろう、３５０〜４５０残基、３２０〜４７０残基、または３３０〜４８０残基（もしくはその組み合わせ）、例えば３８０〜４２０残基、例えば３９０〜４１０残基、例えば３９５または３９３残基が含まれる。エンベロープタンパク質は、フラビウイルス、例えば、ジカ、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−３、およびＤＥＮＶ−４、（ＷＯ２０１６／０１２８００の配列番号２９、３１、３３、もしくは３５、または以下の配列の節に記載される配列）からのエンベロープタンパク質、またはＷＯ２０１６／０１２８００の配列番号２９、３１、３３、または３５の配列に少なくとも９０％の相同性を有するタンパク質のうちのいずれかであってもよい。この二量体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体であってもよい。好ましい実施形態では、この二量体は、無傷ウイルス粒子、またはサブウイルス粒子、またはウイルス様粒子に組み込まれないが、典型的には、例えば、単量体エンベロープポリペプチドの分子量の２倍の分子量を有する遊離二量体の形態で、またはナノ粒子、例えば、自己組織化ナノ粒子の形態であってもよい。例えば、タンパク質骨格の一部として、本明細書に記載のＥＤＥまたはＥＤＥ化合物、例えば、操作されたエンベロープタンパク質のうちのいずれかの形態が、ウイルス、ウイルス様粒子、またはサブウイルス粒子の一部として潜在的に提示されてもよいことが理解されよう。
【０１８７】
別の実施形態では、ＥＤＥ化合物は、二量体配置において増加した安定性を有するように操作されている、例えば、二量体間の共有および／または非共有結合の増加したレベルを有するように操作されている、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基を含む。
好ましい一実施形態では、ＥＤＥ化合物は、本発明の上述の態様に関連して記載される、安定化組換えフラビウイルス、例えば、ジカおよび／またはデングウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（組換えｓＥ）二量体であり、例えば、安定化組換えジカおよび／またはデングウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（組換えｓＥ）二量体であり、この二量体は、
−２つのｓＥ単量体間で少なくとも１つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化される、ならびに／または
−２つのｓＥ単量体間で少なくとも１つのスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化される、ならびに／または
−改変糖を介して２つのｓＥ単量体を連結することによって共有結合的に安定化される、ならびに／または、
−各単量体の二量体界面でまたはドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、少なくとも１つのｓＥ単量体のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって、非共有結合的に安定化される。
【０１８８】
フラビウイルス、ジカまたはデングウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ細胞外ドメイン（ｓＥ）は、例えば、実施例２  ＥＤ  図７に示すように、デングウイルスの血清型１、２、および４のエンベロープ糖タンパク質Ｅの１〜３９５のアミノ酸断片、デングウイルスの血清型３のエンベロープ糖タンパク質Ｅの１〜３９３のアミノ酸断片、およびジカウイルスのエンベロープ糖タンパク質Ｅの１〜４０４のアミノ酸断片を指す。
【０１８９】
ＥＤＥ化合物の選択は、上述に、および安定化二量体に関する特許請求の範囲に記載されている。
【０１９０】
一実施形態では、ＥＤＥ化合物は、ウイルス、ウイルス様粒子、またはサブウイルス粒子内の天然に存在するエンベロープ二量体を超える改善されたエピトープを提示する。改善されたエピトープとは、無傷ウイルス粒子に天然に提示された改善されてあらゆるエピトープを超えるという意味を含む。改善されたとは、天然無傷デングウイルス粒子よりもより有益な免疫反応を引き起こすことができるという意味を含む。例えば、上述、および特許請求の範囲に記載される改変を介して、二量体配置において増加した安定性を有するＥＤＥ化合物は、改善されたエピトープであると見なされる。ＥＤＥ化合物は、ＦＬが、それ自体で、化合物、例えばポリペプチド、例えば抗体またはその抗原部分によって認識されることができないように操作されているか、または骨格に挿入されているＥＤＥであってもよく、例えば、ＥＤＥは、ＦＬが、融合ループの直接的隣接からの単離において抗体によって認識することができない、すなわち誘導ループは、四次組織から独立している文脈において認識することができない（または、例えば、融合ループを認識する反応を引き起こすことができる）ように操作される。
【０１９１】
一実施形態では、ＥＤＥ化合物は、１種を超える血清型のフラビウイルス、例えば、ジカおよび／またはデングウイルスにわたってアミノ酸および空間的位置の両方において保存される残基、好ましくは、すべての血清型のフラビウイルス、例えば、ジカおよび／またはデングウイルスにわたって、つまり、ジカウイルスおよび４種の血清型のデングウイルスにわたってアミノ酸および空間的位置の両方において保存される残基を含む。
【０１９２】
ＥＤＥ化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ細胞外ドメイン、またはエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの（約）４００アミノ末端残基を含んでもよく、これは、二量体配置において増加した安定性を有し、また、上述のタンパク質骨格内に保持されるように操作される。
【０１９３】
好ましい実施形態では、ＥＤＥ化合物は、一旦、対象、好ましくはヒトに投与されると、抗体を作り出すことができ、これらの抗体は、好ましくは、すべてのフラビウイルス、またはジカおよび／もしくはデングウイルス、例えば、ジカおよび４種の血清型のデングウイルスに結合することができ、任意に、少なくともジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスを中和することができ、好ましくは、ジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスを１００％中和することができ、任意に、ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られるウイルスを中和することができ、好ましくは、ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られる４種すべての血清型のデングウイルスを中和することができる。
【０１９４】
ＥＤＥ／ＶＤＥ化合物は、当業者に周知であるように、例えば、ＷＯ２０１６／０１２８００の実施例において示されるように、本明細書で提供される高親和性／中和抗体のうちの１つ以上に対して開発された、抗イディオタイプ抗体（もしくはその断片、または上で論じられるように、結合特異性を共有する分子）であってもよい。
【０１９５】
ＥＤＥが本発明の使用のための安定化組換えｓＥ二量体である、ＥＤＥの合成のための方法を提供し、本方法は、
ａ）上に定義される２つの単一または複数のシステイン変異体ｓＥを、酸化条件下で接触させるステップ、および／または
ｂ）２つのｓＥ単量体を、上に定義される少なくとも１つ、２つ、または３つのスルフヒドリル反応性架橋剤と接触させるステップ、および／または
ｃ）上に定義されるグリコシル化部位を有する２つのｓＥ単量体を、クリック化学によって接触させるステップ、および／または
ｄ）少なくとも１つのｓＥ単量体のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基を、上に定義されるかさ高い側鎖アミノ酸で置換する２つのｓＥ単量体と接触させるステップ、のうちの少なくとも１つを含む。
【０１９６】
本発明は、上に定義される方法によって得られる安定化組換えｓＥ二量体を使用してもよい。
【０１９７】
本発明に従う使用のための安定化組換えｓＥ二量体の適切な形成を確実にするために、以下に記載の抗体に対する親和性は、（共有結合的および非共有結合的に安定化した二量体については）ＥＬＩＳＡによって、または（共有結合的に安定化した二量体については）表面プラズモン共鳴によって測定され得る。
【０１９８】
本発明の使用のための、または本発明に関して有用な核酸、または本発明の使用のためのベクター、例えば、ＥＤＥ化合物または本発明の使用のための化合物をコードする核酸の一部を含む核酸またはベクターのうちのいずれかを含む宿主細胞を提供する。例えば、ベクター、例えばプラスミドを含む、異種タンパク質の発現に有用であることが知られている任意の宿主細胞、例えば、Ｃ６／３６昆虫細胞、ヒト樹状細胞、ＣＨＯ細胞、または微生物、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を提供する。宿主細胞はまた、任意に、ゲノム、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意の他のＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクターへの核酸を標的とするためのウイルスベクターの使用によって宿主細胞のゲノムに組み込まれている、本発明の使用のための、または本発明に関連する核酸を含んでもよい。
【０１９９】
本発明の使用のための核酸または本発明の使用のためのベクター、または本発明の使用のための宿主細胞によって、例えば、ＥＤＥ化合物または本発明の使用のための化合物をコードする核酸の一部を含む核酸またはベクターによって形質転換される少なくとも１つの細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物も提供する。
【０２００】
本発明の使用のための化合物、好ましくはポリペプチド、好ましくは抗体もしくはその抗原結合部分、または本発明の使用のためのＥＤＥ化合物の産生のためのプロセスが、本明細書に提供される。このプロセスは、以下の段階：
ｉ）上記のような宿主細胞の適切な培地における培養、
ｉｉ）当該化合物、好ましくは産生された抗体またはその抗原結合部分、または当該ＥＤＥ化合物の回収、を含み、当該回収は培養培地または当該培養細胞のいずれかからである。
【０２０１】
ポリペプチドの精製または単離については、例えば、本化合物がポリペプチドである、またはＥＤＥ化合物がポリペプチドである場合に、当業者であれば、精製に役立つヌクレオチドを含む、例えば、エピトープタグの親和性タグを含むようにヌクレオチドコーディング配列を容易に操作し得ることを理解されよう。それ故に、一実施形態では、本発明の使用のための化合物またはＥＤＥ化合物の産生のためのプロセスは、本化合物もしくはＥＤＥ化合物をコードするヌクレオチド配列を含み、本化合物もしくはＥＤＥ化合物、または本化合物もしくはＥＤＥ化合物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターの精製に有用な一部分をコードするヌクレオチドをさらに含み、本化合物もしくはＥＤＥ化合物の精製に有用な一部分をコードするヌクレオチドをさらに含む、宿主細胞の培養を含む。
【０２０２】
本化合物が、ポリペプチド、例えば抗体またはその抗原結合部分であり、同様に、組換え手段によって作製される場合に、ポリペプチド産生は、対象への上の実施形態のいずれかに定義されるＥＤＥ、任意に上に定義されるＥＤＥ化合物の投与によって引き起こされ得ることが理解されよう。ＥＤＥ（随意的にＥＤＥ化合物）の投与後、天然宿主反応は、対象の血液から回収され得る抗体を産生し得る。好ましくは、ＥＤＥは、無傷ウイルス、ウイルス様粒子、またはサブウイルス粒子の一部として提示されない。好ましくは、ＥＤＥは、上で論じられるエンベロープポリペプチド二量体、または上もしくは下で論じられる他のＥＤＥ化合物である。
【０２０３】
例えば、本発明の使用のための本発明の化合物の産生方法を提供し、本方法は、
ａ）哺乳動物を、免疫原性組成物の形態であり得る本発明の使用に関連して定義される、安定化組換えｓＥ二量体と接触させるステップと、
ｂ）当該哺乳動物由来の１つ以上の血清試料中の当該ｓＥ二量体を対象とする抗体の存在を検出するステップと、
ｃ）当該哺乳動物から膵臓細胞を採取するステップと、
ｄ）ハイブリドーマ細胞を産生するために、当該膵臓細胞を骨髄腫細胞と融合させるステップと、
ｅ）当該抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞を特定するステップと、
ｆ）当該抗体を産生することができる当該ハイブリドーマ細胞を培養するステップと、
ｇ）任意に、当該抗体を単離するステップと、を含む。
【０２０４】
本発明は、上に定義される方法のうちのいずれかによって得られる抗体を使用し得る。
【０２０５】
上に定義される方法によって得られるハイブリドーマ細胞も提供する。
【０２０６】
上に定義される当該二量体を対象とする中和抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞の調製のための本発明の使用に関連して定義される安定化組換えｓＥ二量体の使用も提供する。
【０２０７】
好ましい実施形態では、本ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、高度に交差反応性があり、強力に中和する抗体を作り出すことができると既に判断されているようなものである。ＷＯ２０１６／０１２８００の実施例（実施例１〜６）で同定された抗体は、デングウイルスの自然感染において無傷のウイルスに作り出された。より特異的かつ改善された抗体は、本発明に関連して定義されるＥＤＥ化合物であり得る、特異的なＥＤＥ抗原の投与によって作り出すことができると見なされる。例えば、自然感染では、何人かの患者は、抗ＥＤＥ抗体を作り出さず、その代わりに、あまり有用でないと見なされ、あまり交差反応性がなく、あまり中和しない抗ＦＬ抗体を産生した。ＥＤＥ抗原の投与は、有用な抗ＥＤＥ抗体を作り出す可能性がより高いと見なされる。上述のように、いくつかの実施形態では、本ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、二量体配置において増加した安定性を有するように操作され、これは、対象内で作られる抗ＶＤＥ抗体の機会を増すと見なされる。加えて、いくつかの実施形態では、本ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、例えば、エンベロープタンパク質内でそれ自体が突然変異、または改善されたエピトープを提示するための骨格タンパク質の使用によって、例えば、抗ＦＬ抗体が作られる可能性が低いように融合ループを隠すことによって操作されている。すべての血清型のデングウイルス、またはジカおよびすべての血清型のデングウイルスに共通しているＥＤＥまたはＥＤＥ化合物の投与は、高度に交差反応性があり、強力に中和する抗体を作り出す可能性が高い。これらの抗体は、例えば、対象から回収され、さらなる分析のために使用され得るか、またはジカおよび／もしくはデング熱の治療、またはジカおよび／もしくはデング熱臨床試験において使用され得る。
【０２０８】
したがって、一実施形態は、本化合物がポリペプチド、または抗体もしくはその抗原結合部分である、本発明に従う使用のための化合物の産生のためのプロセスを提供し、当該プロセスは、以下の段階：
ａ．対象への、前述の実施形態のうちのいずれかにおいて定義されるエンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物の投与、
ｂ．対象の血液からの当該抗体またはその抗原結合部分の回収および単離、を含む。
【０２０９】
対象にＥＤＥまたはＥＤＥ化合物を投与することを含む、本発明の使用のための、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分を産生する上記の方法はまた、ワクチンのために適当な抗原を選択する方法の一部としても使用することができることを理解されよう。現行のワクチンは、弱毒化したバージョンの４種すべての血清型のデングを利用しており、特に効果的ではない。そのようなワクチンはまた、有用ではない抗ＦＬ抗体の産生を引き起こすこともできよう。好ましいワクチンは、すべての血清型のデングウイルスに対して免疫反応を引き起こすことができる単一の抗原を含み得、この免疫反応は、ジカウイルスおよびすべての血清型のデングウイルスを中和することができる、すなわち、４種の血清型のデングウイルスであると見なされる。
【０２１０】
本発明の発明者らは、ジカウイルスも認識する、高度に交差反応性があり、強力に中和する抗体、ならびにそれらが結合する特定のエピトープ（ＥＤＥ）を初めて特定した。それ故に、ジカ、またはジカおよび他のフラビウイルス、例えば、ジカおよびデングウイルスのためのワクチンにおけるこのエピトープの使用は、現行のワクチン戦略より好ましい可能性が高い。
【０２１１】
一態様では、本発明は、ジカウイルスに対するワクチンのために好適な抗原を選択することを補助するための方法を提供し、当該方法は、候補抗原に応答して対象において作製された１つ以上の抗体の特性決定を含み、任意に、当該候補抗原が、本発明の前述の態様に関連して定義されるＥＤＥに結合することが知られている抗体のパネルに結合することがこれまでに見出されている。
【０２１２】
フラビウイルス、例えば、ジカまたはデング抗原を投与されている対象における高度に交差反応性があり、強力に中和する抗体の特定は、ワクチンに有用である可能性が高い抗原を示している。本発明者らは、例えば、デング抗原が、ジカに対して強力に中和する抗体を作り出すのに有用であり得ることを見出した。一実施形態では、この抗原は、無傷ウイルスの一部として提示されない。好ましい実施形態では、この抗原は、任意に骨格タンパク質の一部として、上述の実施形態のうちのいずれかに定義されるＥＤＥ化合物、好ましくはエンベロープタンパク質の二量体、好ましくは安定化した二量体である。好ましい実施形態では、この抗原は、例えば、本実施例およびＷＯ２０１６／０１２８００の実施例において特定される、ＥＤＥに結合することができる高度に交差反応性があり、強力に中和する抗体、例えば、本発明の使用のための抗体に結合することができることが既に判断されているようなものである。抗原は、本明細書に記載されるように、安定化され、任意に、そうでなければ、変異されたジカエンベロープタンパク質の二量体であってもよい。
【０２１３】
高度に有用な抗体と結合することができることが知られているそのような抗原を投与することによって、対象において抗原に応答して作られる抗体が特徴付けられ得る。そのような抗原は、対象内にそのような有用な抗体の産生をもたらし、そのため、ワクチン組成物で用いるための適当な候補抗原である可能性が高い。特徴付けとは、これらの抗体が、例えば、線状または変性または組換えエンベロープタンパク質に結合する抗体の能力、例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにおいてエンベロープタンパク質に結合する能力、およびエンベロープタンパク質の二量体、または前述の実施形態において上述のＥＤＥもしくはＥＤＥ化合物に結合する抗体の能力を判定することによって、融合ループと結合すると見なされるかどうかを判定するという意味を含む。ジカおよび／または４種すべての血清型のデングウイルスに結合する抗体の能力はまた、ジカおよび／または４種すべてのデングウイルスを中和する抗体の能力を評価し得るように、評価され得る。抗体の中和能力を判定するための方法は、前述されている。ヒトおよび昆虫細胞の両方で作られたジカおよび／またはデングウイルスを中和する抗体の能力はまた、上述の、ならびに本実施例およびＷＯ２０１６／０１２８００の実施例において記載されるように、判定され得る。
【０２１４】
一実施形態では、抗原が、主に抗ＦＬ抗体を作り出す場合、ワクチンとして有用であると見なされない。例えば、抗原は、ＦＬに対して作り出された抗体とＥＤＥに対して作り出された抗体の比率が、１：２、１：４、１：５、１：１０、１：５０、１：１００、１：５００、１：１０００以下である場合、有用であると見なされる。抗ＦＬ抗体および抗ＥＤＥ抗体の相対量は、当業者に周知の方法、例えばＥＬＩＳＡに基づいた技術を用いることによって判定され得る。抗原は、１種を超える血清型のフラビウイルス、例えば、ジカウイルス、および少なくとも１種の血清型のデングウイルス、好ましくは４種すべてのデングウイルスのＥＤＥと結合することができる抗体を作り出す場合、有用であると見なされる。抗原は、１種を超えるフラビウイルス、例えばジカウイルスおよび少なくとも１種の血清型のデングウイルス、好ましくは１種を超える血清型のデングウイルスを中和する抗体を産生し、好ましくは４種すべてのデングウイルスを、好ましくは１００％中和することができる場合、有用であると考えられる。また、抗原がヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られたジカウイルスおよびデングウイルスを中和することができる抗体を、好ましくは同じレベルまで（上で論じられるように）作り出す、好ましくはウイルスを少なくとも９５％または少なくとも９８％、例えば１００％中和する場合、有用であると見なされる。抗原は、
ａ）抗ＦＬ抗体を作り出さない、または有意に作り出さない場合、および
ｂ）ジカウイルス、好ましくは４種すべての血清型のデングウイルスとかなり有意な程度まで結合する場合、および
ｃ）ジカウイルス、好ましくはヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られた４種すべての血清型のデングウイルスをかなり有意な程度まで１００％中和する場合、最も有用であると見なされる。
【０２１５】
さらに、別の実施形態では、作り出された抗体が上述の実施形態において定義されるＥＤＥに結合することができる場合、この抗原は、ワクチン接種で用いるのに適していると見なされる。
【０２１６】
さらなる実施形態では、対象に投与される抗原は、抗体が融合ループに作り出されるのを防ぐのに役立つようにさらなる薬剤を含んでもよい。
【０２１７】
抗原に曝露される対象によって産生される抗体は、対象の分類された単一の形質細胞から得られてもよい。
【０２１８】
初めてまたは高度に交差反応性があり、フラビウイルス、特に、ジカウイルスおよびデングウイルスを強力に中和する抗体の特定は、フラビウイルス、特に、ジカウイルスおよびデングウイルス疾患を治療または予防することができる特有の機会を与えることが理解されよう。加えて、本発明まで、試験中に生じた感染を確実に治療する方法がなかったため、生ジカまたはデングウイルスを含む臨床試験を行うことが可能であろう。したがって、本発明のさらなる態様は、対象におけるフラビウイルス、例えば、ジカデングウイルス感染を治療または予防する方法を提供する。
【０２１９】
それ故に、本発明は、１つ以上のフラビウイルスによる感染の治療のための方法を提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。本方法は、個体に、本発明の前述の態様に関連して定義されるＥＤＥに対する単離された中和抗体またはその抗原結合断片を投与するステップを包含し得る。
【０２２０】
本方法は、本発明による使用のための１つ以上の化合物、例えば、本発明の前述の態様に関連して定義されるＥＤＥ−結合化合物、好ましくはポリペプチド、好ましくは本発明の前述の態様に関連して定義される抗体またはその断片の投与を含み得る。本発明はまた、１つ以上のフラビウイルスによる感染の治療方法のための医薬の製造における、本発明の前述の態様に関連して定義される化合物、好ましくはポリペプチド、好ましくは本発明の前述の態様に関連して定義される抗体またはその断片の使用を提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。選好および実施態様は、感染の治療に用いるＥＤＥ結合化合物に関する、本発明の第１の態様について述べたとおりである。
【０２２１】
投与については、本化合物は、組成物、例えば薬学的組成物の一部であってもよいことが理解されよう。この組成物は、感染を治療するのにそれ自体が有用であると見なされる１つ以上の他の治療剤、例えば、さらなる抗ウイルス剤、またはフラビウイルス、例えば、ジカまたはデング熱感染の症状を治療するのに有用であると見なされる１つ以上の薬剤をさらに含んでもよい。
【０２２２】
「治療する」という用語は、本発明の使用のための化合物、例えば、本発明の使用のための化合物、本発明の使用のためのＥＤＥ化合物、ワクチン組成物、抗体、安定化組換えｓＥ二量体、または本発明の免疫原性組成物のうちのいずれかを、フラビウイルス感染またはフラビウイルス感染の症状もしくはその症状のパターン、例えばジカウイルス感染またはジカウイルス感染の症状もしくはその症状のパターン、またはデングウイルス感染またはデングウイルス感染の症状もしくはその症状のパターン、を有する患者に、フラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルス感染および／またはフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデング熱感染の症状を治す、治癒する、緩和する、軽減する、変化させる、救済する、向上させる、改善する、または影響を及ぼすという目的で投与することを含む。フラビウイルス、例えば、ジカまたはデング熱感染の症状のうちのいずれか１つ以上を治療するを緩和するという意味を含む。治療はまた、新たな細胞が感染するのを防ぐという意味も含む。患者がうまく治療されているかどうかは、当業者には明らかであろう。例えば、ウイルス量は減少し得る。抗体依存性増強（ＡＤＥ）の兆候は、本明細書の他の箇所で論じられているように、低減され得る。
【０２２３】
「予防する」という用語は、フラビウイルス、例えばジカまたはデングウイルス感染の進行が減速されるおよび／もしくは排除される、またはフラビウイルス、例えばジカまたはデングウイルス感染の発症を遅らせるまたは排除されることを意味する。
【０２２４】
デングウイルス感染およびデング熱の症状は、例えばＷＨＯファクトシート番号１１７で提示されている。そこに記述されるように、デング熱は、重症のインフルエンザ様疾患であり、乳児、幼児、および成人が罹患するが、死亡することはめったにない。高熱（４０℃／１０４°Ｆ）が、激しい頭痛、眼の奥の痛み、筋痛と関節痛、悪心、嘔吐、腺の腫脹、または発疹のうち２つ以上の症状を伴う場合には、デング熱を疑うべきである。症状は、感染蚊に刺された後４〜１０日の潜伏期間後、通常２７日間持続する。重症型のデング熱は、血漿漏出、体液貯留、呼吸困難、重度の出血、臓器不全などによる死に至る可能性のある合併症である。危険な兆候は、初発症状から３７日後に起こり、同時に体温低下（３８℃／１００°Ｆ以下）と併せて、激しい腹痛、連続する嘔吐、呼吸促迫、歯肉の出血、倦怠感、不穏、吐血を含む。危篤状態の２４〜４８時間後に死亡することがあり、合併症や死亡するリスクを避けるために適切な医学的治療が必要である。
【０２２５】
ジカウイルス感染の徴候および症状も当業者に知られており、本明細書の他の箇所でも議論されている。
【０２２６】
本化合物または本化合物を含む組成物の投与は、本化合物が予防的に使用される場合に細胞の感染の阻害、あるいは、治療目的で使用される場合に細胞のさらなる感染の阻害をもたらす、および／または疾患の兆候および／もしくは症状を軽減する、ある量、例えば治療有効量の投与である。
【０２２７】
治療有効量は、他の症状（複数を含む）の主観的軽減または臨床医もしくは資格のある観察者によって言及されるように客観的に識別できる改善をもたらす量である。
【０２２８】
フラビウイルス、例えば、ジカまたはデング熱感染を予防するとは、任意の有意な程度まで感染のレベルを低減するという意味を含む。一実施形態では、本発明の化合物は、フラビウイルス、例えば、ジカウイルスまたは１種の血清型のデングウイルスによる感染を３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは１００％予防する。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、ジカ、および２種の血清型のデングウイルス、３種の血清型のデングウイルス、４種すべての血清型のデングウイルスによる感染を３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは１００％予防する。最も好ましい実施形態では、本発明の化合物は、すべての見出された血清型のジカおよびデングウイルスによる感染を完全に予防する。これは、当業者に周知の技術によって、例えばウイルス量を測定することによって評価されてもよい。
【０２２９】
本発明は、動物（非ヒト）、好ましくは哺乳動物、例えば、サル、ウサギ、マウス、またはラクダ科動物（例えば、ラマ）に免疫性を与えるための、ＥＤＥ、好ましくは安定化組換えｓＥ二量体、または本発明に従う使用のために記載される免疫原性組成物の使用を提供する。
【０２３０】
さらなる実施形態は、例えば、感染を終結させることを意図して、生フラビウイルス、例えば、ジカまたはデングワクチン試験で用いるために、本発明に従う使用のために記載される１つ以上の化合物、好ましくはポリペプチド、好ましくは抗体もしくはその断片を提供する。
【０２３１】
好ましくは、本発明の化合物は、昆虫細胞およびヒト細胞の両方で作られるジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスを少なくとも９５％または少なくとも９８％、例えば１００％中和することができるものである。ウイルスへの曝露前の化合物の事前投与は、ウイルス感染を予防するであろうと見なされている。
【０２３２】
例えば、上述のジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスを中和することができる、本発明に従う化合物、例えば、抗体もしくはその断片は、上述のウイルスへの曝露前に投与してもよく、例えば、旅行者または大発生または１人以上以上の感染した人々の発生または密接な接触、例えば、蚊に刺された可能性が高い人々の近隣もしくは住宅でのいずれかにおける予防薬として使用されてもよいか、またはジカ感染に接触するリスクがある妊娠中の女性に使用されてもよい。あるいはまたは加えて、本化合物は、患者が初めに発熱を示す場合、または症状が重症になる場合に投与されてもよい。
【０２３３】
それ故に、例えば、本発明の使用のための、ＥＤＥ、核酸、または組成物は、使用のためのものであり得、個体は、例えば、妊娠中の女性、任意に、例えばデングウイルスに感染したことが分かっている、または疑われることを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている１人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、妊娠中の女性、または
出産年齢の女性、任意に、例えば、デングウイルスに感染していることが分かっている、または疑わしいことを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている１人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、出産年齢の女性である。
【０２３４】
本化合物についてのすべての選好は、本発明の実施形態において上述されるとおりである。
【０２３５】
本発明の化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分が、さらなる治療剤、例えば、１つ以上のＴ細胞ワクチン、または他の抗ウイルス剤とともに投与されてもよいことが理解されよう。これらは、本発明の化合物と同じ組成物の一部として投与されてもよく、または別々に投与されてもよい。例えば、Ｔ細胞ワクチンは、インフルエンザ８５に対する保護のために提案されている。
【０２３６】
本発明の化合物は、１回、２回、または数回投与されてもよい。投与は、１日、２日、１週間、２週間、１カ月、６カ月、１年間またはそれ以上にわたって行ってもよい。感染後の治療については、より短期間、例えば最長１カ月が、適切であり得る。予防については、より長期間、例えば１年のうちの６カ月またはそれ以上が、適切であり得る。
【０２３７】
化合物、例えば、１つ以上のフラビウイルスによる感染の予防または治療の際に使用するための抗体またはその抗原結合部分であって、１つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、抗体またはその抗原結合部分は、本発明の方法を用いて選択され得る。それ故に、本発明は、１つ以上のフラビウイルスによる感染の予防または治療に用いるための適切な抗体またはその断片の選択方法を提供し、１つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択され、当該方法は、任意の上述の実施形態において定義されるエンベロープ二量体エピトープを含む抗原に応答して対象において作製された抗体またはその断片の特徴付けを含む。
【０２３８】
上述の実施形態のうちのいずれかに記載のＥＤＥ化合物は、対象へのＥＤＥの投与後に適当な抗体を作り出すことができる可能性が高い。それ故に、かかる対象において作られた抗体は、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデング熱感染の治療または予防で有用である可能性が高い。
【０２３９】
好ましい実施形態では、ＥＤＥは、任意に骨格タンパク質の一部として、本発明の使用のためのＥＤＥ化合物、例えば、エンベロープタンパク質の二量体、好ましくは安定化した二量体である。好ましい実施形態では、抗原／ＥＤＥ化合物は、ＥＤＥに結合することができる高度に交差反応性があり、強力に中和する抗体、例えば、本発明の使用のための抗体に結合することができることが既に周知であるようなものである。好ましい実施形態では、この抗原は、例えば、交差反応性のあるおよび潜在的に中和する抗ＥＤＥ抗体を作り出すのに必要とされる特定の配置において残基を含むが、抗ＦＬ抗体を作り出す残基または特定の立体構造の残基を含まないことによって、天然エンベロープ二量体を上回って改善されると見なされる。
【０２４０】
別の実施形態では、ＥＤＥ、任意にＥＤＥ化合物の投与と同様に、対象に、例えば、抗ＦＬ抗体の形成を遮断する化合物または薬剤を投与する。例えば、安定化したｓＥ二量体は、有用であり得る。
【０２４１】
特徴付けとは、これらの抗体が、例えば、線状または変性または組換えエンベロープタンパク質に結合する抗体の能力、例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにおいてエンベロープタンパク質に結合する能力、およびエンベロープタンパク質の二量体、または前述の実施形態において上述のＥＤＥもしくはＥＤＥ化合物に結合する抗体の能力を判定することによって、融合ループと結合すると見なされるかどうかを判定するという意味を含む。ジカおよび／または４種すべての血清型のデングウイルスに結合する抗体の能力はまた、ジカおよび／または４種すべてのデングウイルスを中和する抗体の能力を評価し得るように、評価され得る。抗体の中和能力を判定するための方法は、前述および実施例およびＷＯ２０１６／０１２８００において詳述されている。ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られたジカおよび／またはデングウイルスを中和する抗体の能力もまた、判定され得る。
【０２４２】
一実施形態では、抗体が、ＦＬに結合する場合、有用であると見なされない。この抗体が、１種を超える血清型のフラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルス、好ましくはジカおよび４種の血清型のデングウイルスに結合することができる場合、または前述の実施形態のうちのいずれかに記載の１種を超える血清型のＥＤＥに結合することができる場合、有用であると見なされる。この抗体が、１種を超える血清型のフラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルス、任意に２種の血清型のデングウイルス、任意に３種の血清型のデングウイルスを中和することができる場合、好ましくは４種の血清型のデングウイルスを、好ましくは少なくとも９５％または少なくとも９８％、例えば１００％中和することができる場合、有用であると見なされる。また、この抗体が、ヒト細胞、任意に樹状細胞、および昆虫細胞、任意にＣ６／３６細胞の両方で作られたジカまたはデングウイルスを、好ましくは同じレベルまで中和することができる場合、好ましくはウイルスを少なくとも９５％または少なくとも９８％、例えば１００％中和する場合、有用であると見なされる。この抗体が、
ａ）抗ＦＬ抗体を作り出さない、または有意に作り出さない場合、および
ｂ）ジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスとかなり有意な程度まで結合する場合、および
ｃ）ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られたジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスをかなり有意な程度まで１００％中和する場合、最も有用であると見なされる。
【０２４３】
本発明者らは、デング熱感染に罹患している患者が、例えば、有用な抗ＥＤＥ抗体または有用でない抗ＦＬ抗体のいずれかを産生することを見出したため、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデング熱感染を治療または予防するために有用であり得る抗体を特定するさらなる方法は、その変性型または線状型のエンベロープタンパク質に結合することができないそれらの抗体を単に特定することである。これらのエンベロープタンパク質に結合することができない任意の抗体は、本発明の使用のための有用な化合物である可能性が高い。
【０２４４】
患者はまた、ポリペプチド、好ましくは抗体またはその抗原結合部分を発現する核酸、ベクター、または宿主細胞で治療してもよいことを理解すべきである。例えば、ポリペプチドをコードする核酸は、本化合物が治療される患者内に内因的に発現するように、適当な送達システム、例えばウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意の他のＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクターに挿入されてもよい。
【０２４５】
本発明はまた、本発明の１つ以上の化合物で治療または予防的治療を受けるような推定の必要性に従って患者を階層化するための方法も提供する。したがって、１つ以上のフラビウイルスによる感染を患っている患者を、例えば、前述の実施形態のいずれか１つに従う化合物もしくは組成物、例えば、前述の実施形態のいずれか１つに従う記載される抗体もしくはその断片、または前述の実施形態に関連して記載される核酸での治療、あるいはその用量の増加を必要とする可能性が高いとして特定するための方法が、本明細書において提供され、本方法は、対象における抗ＥＤＥ抗体および抗融合ループ抗体のレベルの決定を含み、ＥＤＥが、前述の実施形態に関連して記載されるとおりであり、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０２４６】
本発明者らによって特定されるように、デング熱感染に罹患している患者は、抗ＥＤＥ抗体または抗ＦＬ抗体を主に産生する。抗ＦＬ抗体は、有用であると見なされないが、一方、抗ＥＤＥ抗体は、有用であると見なされる。対象が抗ＥＤＥ抗体を有するが、一方、本発明の化合物によるいくつかのさらなる治療法を依然として必要とし得る場合、主に抗ＦＬ抗体を有する対象は、先天性の有用な抗体を有しないため、より高い用量を必要とする可能性が高い。それ故に、抗ＦＬ抗体のみを有する患者は、本発明の化合物による治療を必要とする可能性が高い患者であると見なされる。抗ＥＤＥ抗体を既に産生している患者は、治療を必要としないかもしれない。加えて、抗ＥＤＥ抗体を産生せず、抗ＦＬ抗体のみを産生する患者は、抗ＥＤＥ抗体を有する患者よりも高い用量の治療を必要とする可能性が高い。また、患者は、抗ＥＤＥ抗体を低いレベルのみ作り出し得、それ故に、より高い用量の化合物を必要とし得る。
【０２４７】
より高い用量とは、この患者は、抗ＥＤＥ抗体を産生する患者が必要とするよりも２、３、４、５、１０、２０、５０倍の用量の本発明の化合物を必要とすることを意味する。
【０２４８】
「抗ＶＤＥ抗体を低いレベルで作り出す」とは、抗ＥＤＥ抗体を作り出す他の患者と比較して、この患者が、平均よりも低いレベルの抗ＥＤＥ抗体を有することを意味する。
【０２４９】
抗体がＥＤＥに結合するかどうかを同定する手段は、前述および実施例またはＷＯ２０１６／０１２８００に記載されるとおりであり、例えば抗体が無傷のデングウイルスまたはジカウイルスまたはＥＤＥに結合し、変性または線状エンベロープタンパク質に結合しないかどうかを判定する。エンベロープタンパク質が増加した二量体の安定性を有するように操作されている場合、またはエンベロープタンパク質またはその残基が骨格の一部として提示されている場合に、そのタンパク質に結合する抗体の能力を評価することができる。
【０２５０】
対象内の抗ＦＬ抗体および抗ＥＤＥ抗体のレベルはまた、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルスワクチン接種のためのその対象の必要性を評価するために使用することもできる。それ故に、さらなる実施形態では、デングウイルスワクチン接種のための患者の必要性を評価するための方法が提供され、当該方法は、抗エンベロープ二量体エピトープ抗体および抗融合ループ抗体のレベルの特定を含み、このエンベロープ二量体エピトープは、前述の実施形態のうちのいずれかに記載のとおりである。本発明の化合物、またはより高い用量の本化合物による治療を必要とする患者の基準と同様に、患者が抗エンベロープ二量体エピトープ抗体を有すると判定される場合、ワクチン接種が必要でない可能性が高い。
【０２５１】
さらに、この患者が抗エンベロープ二量体エピトープ抗体を有すると判定される場合、この患者に、ブースト投与が供され得る。
【０２５２】
別の実施形態では、この患者が抗エンベロープ二量体エピトープ抗体を有しない場合、全ワクチン接種が必要とされる。
【０２５３】
本発明はまた、感受性のある哺乳動物対象、例えばヒトにおける１つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および／または治療を目的とする予防的または治療的免疫原性（またはワクチン）組成物を調製するための、上に定義される安定化組換えｓＥ二量体（抗原として使用される）の使用も提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０２５４】
有意には、本発明者らは、上述のように、今まで知られていなかった高度に交差反応性があり、ジカウイルスならびに他のフラビウイルスにおける強力に中和する抗体によって認識される特異的なエピトープを特定した。このエピトープは、例えば、フラビウイルス、特にジカウイルスおよびデングウイルスに対するワクチン接種のための特に有効な抗原を提供すると考えられ、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。フラビウイルス、例えば、ジカウイルスまたはジカおよびデングウイルスに対するワクチン接種に用いるのに適した抗原を選択するための方法は、前述の実施形態に記載されている。したがって、本発明は、感受性のある哺乳動物対象、例えばヒトにおける１つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および／または治療を目的とする予防的または治療的免疫原性（またはワクチン）組成物を調製するために用いるための、フラビウイルスのエンベロープ二量体エピトープ、任意にＥＤＥ化合物を提示する組成物を提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択され、エンベロープ二量体エピトープおよびＥＤＥ化合物は、前述の実施形態のうちのいずれかに定義され、前述の方法に従って特定されるとおりであり、例えば、ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、ワクチンで用いるために適当な抗原を選択する方法を提示する前述の実施形態において、例えば、対象への潜在性のあるワクチン候補ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物の投与後に作られる抗体を特徴付けることによって特定され得る。これは、当業者の権限内で十分であり得る。あるいは、ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、前述の実施形態において提示されるとおりであり得、例えば、一実施形態では、ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基である。エンベロープタンパク質は、ジカ、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−３、およびＤＥＮＶ−４からのエンベロープタンパク質、または（例えば、以下の配列の節に記載される）配列に少なくとも９０％の相同性を有するタンパク質のうちのいずれかであってもよい。この二量体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体であってもよい。好ましい実施形態では、この二量体は、無傷ウイルス粒子、またはサブウイルス粒子、またはウイルス様粒子に組み込まれないが、むしろ、遊離二量体であるか、またはナノ粒子、例えば、本明細書で他の箇所に記載の自己組織化ナノ粒子の形態である。例えば、タンパク質骨格の一部として、本明細書に記載のＥＤＥまたはＥＤＥ化合物、例えば、操作されたエンベロープタンパク質のうちのいずれかの形態が、ウイルス、ウイルス様粒子、またはサブウイルス粒子、またはナノ粒子の一部として提示されてもよいことが理解されよう。好ましい実施形態では、ＥＤＥ化合物は、前述の実施形態において記載される、安定化組換えｓＥ二量体である。前述の実施形態および選好が適用される。
【０２５５】
好ましい実施形態では、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、一旦、対象、好ましくはヒトに投与されると、抗体を作り出すことができるように、これらの抗体は、好ましくは、ジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスに結合することができ、任意に、ジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスを中和することができ、好ましくは、ジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスを１００％中和することができ、任意に、ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られるウイルスを中和することができ、好ましくは、ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られるジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスを１００％中和することができる。
【０２５６】
上述の安定化組換えｓＥ二量体を含むＥＤＥを含む免疫原性組成物は、当該対象において、
−エンベロープ二量体エピトープ（ＥＤＥ）を単独に認識する（ＥＬＩＳＡ試験において組換えＥタンパク質単量体への結合を示さない）、
−交差反応性がある、および
−４種の血清型（ＤＥＮＶ１〜４）からのジカおよびデングウイルスを中和する、中和抗体を引き起こすのに特に適している。
本発明はまた、治療有効量の上に定義される安定化され組換えｓＥ二量体（抗原として使用される）を含むフラビウイルス免疫原性組成物も提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０２５７】
本組成物は、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物それ自体を含んでもよいか、またはそれはワクチン接種される対象内にＥＤＥ／ＥＤＥ化合物を発現するための手段を含んでもよい。例えば、本発明は、１つ以上のフラビウイルスによる感染に対するワクチン接種で使用するための、エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物をコードする核酸を含み、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択され、エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物は、前述の実施形態のいずれかで定義されるとおりである。さらに、核酸は、ベクターの一部であってもよい。ベクターおよびベクター成分についての選好は、上述されたとおりである。
【０２５８】
例えば、ワクチン接種が、例えばプラスミドＤＮＡによる直接免疫を介して、特定の抗原をコードする核酸を用いて実行され得ることは当該技術分野で周知である。かかる核酸は、リポソームおよび免疫刺激構築物を介して送達され得る。あるいは、弱毒化したウイルス宿主またはベクターまたは細菌性ベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意の他のＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクターを使用され得る。
【０２５９】
１つ以上のフラビウイルスによる感染に対するワクチン接種で用いるための組成物が核酸である場合に、核酸は、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意の他のＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクターにおいて、患者に送達され得る。
【０２６０】
１つ以上のフラビウイルスによる感染に対するワクチン接種で用いるための、
ａ）エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物、
ｂ）ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物をコードする核酸、
ｃ）核酸を含むベクター、
のうちの任意に１つ以上を含む組成物であって、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択され、エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物は、前述の実施形態のいずれかで定義されるとおりであり、本発明の一部でもある。
【０２６１】
一実施形態では、
ａ）エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物、
ｂ）ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物をコードする核酸、
ｃ）核酸を含むベクター、
は、１種を超える、任意に２種、任意に３種、任意に４種の血清型のジカおよび／またはデングウイルスであるか、またはそれらをコードする。
【０２６２】
好ましい実施形態では、
ａ）エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物、
ｂ）ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物をコードする核酸、
ｃ）核酸を含むベクター、
は、ジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスを中和する、好ましくはジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスを１００％中和することができる抗体を作り出すことができる単一エピトープであるか、または単一エピトープの産生をもたらす。
【０２６３】
フラビウイルスウイルスに対するワクチン接種における本発明の組成物の使用は、フラビウイルス、例えばジカウイルスおよびデングウイルスによる感染を低減または防止することを意図している。
【０２６４】
フラビウイルス、例えばジカおよび／またはデング熱感染を低減または予防することにより、感染のレベルをある程度低下させるという意味が含まれる。一実施形態では、本発明の化合物は、１種の血清型のフラビウイルス、例えばジカまたはデングウイルスによる感染を３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは１００％低減する。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、２種の血清型のジカおよびデングウイルス、３種の血清型のデングウイルス、４種すべての血清型のデングウイルスによる感染を３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは１００％低減する。最も好ましい実施形態では、本発明の化合物は、すべての見出された血清型のジカおよびデングウイルスによる感染を完全に予防する。
【０２６５】
例えば、ジカおよびデングウイルス感染に対する中和抗体を誘発する、本発明の、ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物、例えば安定化組換えｓＥ二量体は、フラビウイルス、例えば、ジカおよびデングウイルスによる感染の期間の範囲で、重症度を防ぐまたは弱毒化するのに十分な量で哺乳動物対象、好ましくはヒトに投与される。
【０２６６】
治療有効量は、その他の要因の中で、治療される対象、治療される対象の年齢および全身状態、抗体を合成するための対象の免疫反応の容量、所望の保護の度合い、治療される状態の重症度、特定のＥＤＥ化合物、例えば選択された特定の安定化組換えｓＥ二量体および投与の様式に応じて異なる。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。治療有効量は、定期的な試験を通して決定され得る比較的に広範な範囲に収まるであろう。
【０２６７】
より具体的には、ＥＤＥ化合物、例えば本発明の安定化組換えｓＥ二量体は、１〜１０００μｇの二量体、好ましくは１〜５０μｇを含む治療有効量で投与される。
【０２６８】
特定のワクチンに対する最適量は、対象における抗ｓＥ二量体の抗体力価を測定することを含む標準研究によって確かめられ得る。
【０２６９】
本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含むまたは含まずに投与されてもよい。アジュバントは、免疫原性組成物に直接添加され得るか、またはワクチンの投与と同時にまたは投与直後に、別々に投与され得る。かかるアジュバントとしては、アルミニウム塩（水酸化アルミニウム）、ムラミルペプチドなどの特定の刺激剤を含むまたは含まない水中油型乳剤製剤、サポニンアジュバント、サイトカイン、コレラ毒素、百日咳毒素、もしくは大腸菌易熱性毒素などの細菌毒素の解毒された突然変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７０】
本発明の免疫原性組成物は、他の免疫原または免疫調節剤、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカインとともに投与されてもよい。
【０２７１】
ワクチン接種プログラムは、しばしば、ブースト戦略を含む。初期ワクチン接種後、対象は、当業者によって決定される適切な間隔で１つまたは２つのブースター注射を受けてもよい。一実施形態では、ワクチン接種は、プライム、続いて、１つ以上のブーストを含むことができる。抗原の発現をもたらす、抗原、組成物、核酸、またはベクターが、フラビウイルス、例えば、ジカおよびデングウイルス感染に対するワクチン接種のためのブースト戦略で用いるために、本発明において含まれ、任意に、この抗原、化合物、核酸、ベクター、または組成物は、ジカおよびデングウイルス、任意に、弱毒化したジカおよびデングウイルス、ならびに／またはジカおよびデングウイルス様粒子の（プライム）投与前または（ブースト）投与後の投与のためのものであり、このジカもしくはデングウイルスまたはジカもしくはデングウイルス様粒子は、１種以上の血清型のジカおよびデングウイルスの一群であり得、ＥＤＥ、例えば、上述の非天然ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物を含んでも、提示してもよい。さらなる例として、黄熱病を伴うキメリバックスなどの異種フラビウイルスは、例えば、二量体、ＤＮＡ、ワクシニア、アデノウイルスのうちの１つ以上によって使用してもよく、当業者には明らかであるように、異なる抗原および／または抗原をコードする核酸の投与の異なる順序およびタイミングが可能であってもよく、本発明は、投与のいかなる特定の組み合わせまたは順序に限定されない。
【０２７２】
本発明はまた、１つ以上のフラビウイルスに対する予防を提供するためのワクチン接種戦略も含み、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択され、ワクチン接種戦略は、例えば、
ａ）前述の実施形態のうちのいずれかに記載の、ジカおよび４種すべてのデング血清型に対して抗体を作り出すことができるエンベロープ二量体エピトープもしくはＥＤＥ化合物、または前述の実施形態に従うワクチン組成物、またはワクチン接種で用いるための核酸、またはワクチン接種で用いるためのベクターの単回投与、任意に、続いて、弱毒化したジカまたはデングウイルスの投与、あるいは
ｂ）前述の実施形態のうちのいずれかに記載の、２種の血清型からの２つのエンベロープ二量体エピトープもしくはＥＤＥ化合物の投与、続いて、その他の２種の血清型からのエンベロープ二量体エピトープもしくはＥＤＥ化合物の投与、任意に、続いて、弱毒化したジカまたはデングウイルスの投与、または
ｃ）弱毒化したジカまたはデングウイルスの投与、続いて、前述の実施形態のうちのいずれかに記載の、ジカおよび４種すべてのデング血清型に対して抗体を作り出すことができる、エンベロープ二量体エピトープの投与、あるいは
ｄ）弱毒化したジカまたはデングウイルスの投与、続いて、前述の実施形態のうちのいずれかに記載の、２種の血清型からの２つのエンベロープ二量体エピトープもしくはＥＤＥ化合物の投与、続いて、その他の２種の血清型からのエンベロープ二量体エピトープもしくはＥＤＥ化合物の投与、を含む。
【０２７３】
本発明に従ってワクチン接種を受けた患者が、ジカまたはデングの、例えば感染を治療または予防するために用いるための本発明に従う化合物または組成物によるその後の治療を依然として必要とし得ることも想定される。
【０２７４】
それ故に、本発明の化合物は、フラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングワクチン接種をこれまでに受けたことがある患者、またはラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングワクチン接種をこれまでに受けたことがない患者において、フラビウイルス、例えば、ジカ感染を治療または予防するために用いるためのものである。
【０２７５】
このワクチン接種が１種を超える血清型のフラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルスに対する保護を与える、好ましくはジカおよび４種すべての血清型のデングウイルスに対する保護を与えると見なされるため、ワクチン接種は、患者が既にフラビウイルス、例えば、ジカまたはデング熱感染に罹患している場合、依然として有用であると見なされるが、このワクチンは、好ましくは、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデング熱感染の症状の前に、または患者がフラビウイルス、例えば、ジカまたデング熱感染に罹患していることが分かる前に投与される。１種を超えるフラビウイルス型の感染が存在する可能性があるか、または同時に起こり得ることがあり、しばしば検出されない／認識されないことがあることは理解されよう。
【０２７６】
それ故に、このワクチン接種は、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデング熱にこれまでに感染したことがない患者、およびフラビウイルス、例えば、ジカまたはデング熱に今のところ感染していない、ワクチンの投与時に感染していない患者に用いるためのものである。あるいは、このワクチン接種は、１種以上の血清型のフラビウイルス、例えば、ジカまたはデング熱感染にこれまでに感染したことがあるが、ワクチンの投与時に感染していないと見られる患者に用いるためのものであるか、またはこのワクチン接種は、１種以上の血清型のフラビウイルス、例えば、ジカまたはデング熱感染にこれまでに感染したことがあり、ワクチンの投与時に１種以上の血清型のフラビウイルス、例えば、ジカまたはデング熱に現在感染していると見られる患者に用いるためのものである。
【０２７７】
このワクチン接種はまた、本発明の化合物でこれまでに治療したことがあるが、本発明の化合物で現在治療していない患者に用いるためのものであり、これはまた、本発明の化合物でこれまでに治療したことがあり、本発明の化合物で現在治療している患者に用いるためのものである。このワクチン接種はまた、本発明の化合物で初めて治療する患者に用いるためのものである。
【０２７８】
本発明はまた、薬剤用として、好ましくは１つ以上のフラビウイルスによる感染を予防および／または治療するために、上に定義される、ＥＤＥ化合物、例えば安定化組換えｓＥ二量体または免疫原性組成物も提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０２７９】
本発明はまた、薬剤の、好ましくは１つ以上のフラビウイルスによる感染に対する予防もしくは治療ワクチンの製造のために、上に定義される、ＥＤＥ化合物、例えば安定化組換えｓＥ二量体または免疫原性組成物も提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０２８０】
本発明はまた、１つ以上のフラビウイルスによる感染を予防および／または治療するための方法も提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択され、この方法は、予防および／または治療を必要とする対象に、感受性細胞のフラビウイルス感染を阻害するのに十分な量の、上に定義される、ＥＤＥ化合物、例えば安定化組換えｓＥ二量体または免疫原性組成物を投与し、それによって感染を予防または治療することを含む。
【０２８１】
本発明はまた、本発明のＥＤＥ化合物、例えば、安定化組換えｓＥ二量体、または本発明の化合物、例えば、本発明に従う抗体もしくはその断片を含むか、またはそれらからなる診断用薬剤も提供する。
【０２８２】
当該診断用薬剤の一実施形態では、この化合物、例えば、本発明に従う抗体もしくはその断片は、検出可能なマーカーに直接的もしくは間接的に、共有結合的もしくは非共有結合的に結合している。
【０２８３】
検出可能なマーカーは、この化合物、例えば抗体もしくはその断片に、当該抗体もしくはその断片の末端（ＮまたはＣ末端）のうちの１つ、または当該抗体もしくはその断片のアミノ酸のうちの１つの側鎖のいずれかに、直接的におよび共有結合的に結合し得る。検出可能なマーカーはまた、当該抗体もしくはその断片に、接続アーム（すなわち、架橋結合試薬）を通して、当該抗体もしくはその断片の末端のうちの１つ、または当該抗体もしくはその断片のアミノ酸のうちの１つの側鎖のいずれかに、直接的におよび共有結合的に結合し得る。ペプチドまたは抗体への対象となる化合物の結合方法は、当該技術分野で周知である。
【０２８４】
有利に、当該検出可能なマーカーは、
−西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、またはベータ−ガラクトシダーゼなどの酵素、
−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、スペクトルの紫外線（ＵＶ）部分での波長で励起された青色蛍光色素（例えば、ＡＭＣＡ（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０）、青色光によって励起された緑色蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、Ｃｙ２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８）、緑色光によって励起された赤色蛍光色素（例えば、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素５４６、５６４、および５９４）、または電子検出器（ＣＣＤカメラ、光電子増倍管）で視覚化される遠赤外光によって励起された色素（例えば、Ｃｙ５）などの蛍光色素分子、
−ユーロピアム、ランタン、またはイットリウムなどの重金属キレート、
−［１８Ｆ］フルオロデオキシグルコース、１１Ｃ−、１２５Ｉ−、１３１Ｉ−、３Ｈ−、１４Ｃ−、３５Ｓ、または９９Ｔｃ−標識化化合物などの放射性同位体、からなる群から選択される。
【０２８５】
本発明はまた、１つ以上のフラビウイルスによる感染を診断またはモニタリングするために、本発明に従う、ＥＤＥ化合物、例えば、安定化組換えｓＥ二量体、抗体もしくはその断片、または診断用薬剤の使用も提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０２８６】
本発明はまた、１つ以上のフラビウイルスによる感染を診断するためのインビトロ方法も提供し、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択され、
ａ）当該対象からの適切な生体試料を、抗体もしくはその断片、または本発明に従う抗体もしくはその断片を含むまたはそれからなる診断薬剤とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）当該生体試料中のフラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの存在または不在を判定するステップと、を含み、
当該フラビウイルスウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの存在は、当該対象がフラビウイルス感染を有することを示す。
【０２８７】
ステップｂ）は、抗体−抗原複合体（すなわち、フラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ−フラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ複合体に向けられた抗体）の存在または不在を判定することによって実行され得る。
【０２８８】
本発明はまた、対象からの適切な生体試料中で１つ以上のフラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの存在を判定するためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの当該適切な生体試料を、抗体もしくはその断片、または本発明に従う抗体もしくはその断片を含むまたはそれからなる診断薬剤、および当該生体試料中のフラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅを、インビトロで接触させるステップを含む。
【０２８９】
本発明はまた、対象における１つ以上のフラビウイルス感染を診断するためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの適切な生体試料を、本発明に従う安定化組換えｓＥ二量体とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）当該生体試料中の当該二量体を対象とする抗体の存在または不在を判定するステップと、を含み、
当該抗体の存在は、当該対象がフラビウイルス感染を有することを示す。
【０２９０】
本発明はまた、対象からの適切な生体試料中で１つ以上のフラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅを対象とする抗体の存在を判定するためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの当該適切な生体試料を、本発明に従う安定化組換えｓＥ二量体とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）当該生体試料中の当該二量体を対象とする抗体の存在または不在を判定するステップと、を含む。
【０２９１】
上述の態様では、本発明の他の態様であるように、１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０２９２】
本発明はまた、対象における１つ以上のフラビウイルスによる感染の進行または回帰をモニタリングするためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの適切な生体試料を、抗体もしくはその断片、本発明に従う抗体もしくはその断片を含むまたはそれからなる診断薬剤とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）当該生体試料中のフラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの量を判定するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において判定された量を、当該対象に対して以前に得られたフラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの量と比較するステップと、を含み、
フラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの量の有意な増加が当該フラビウイルス感染の進行のマーカーを構成し、フラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの有意な減少が当該フラビウイルス感染の回帰のマーカーを構成し、
１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０２９３】
本明細書に使用される場合、「有意な増加」および「有意な減少」という用語は、当該からの適切な生体試料中のフラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの量と比較して、既に決定され、参照量として使用された、適切な生体試料中のそれぞれ、より高い量またはより低い量のフラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅを指す。
【０２９４】
ステップｂ）は、抗体−抗原複合体（すなわち、フラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ−フラビウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ複合体に向けられた抗体）の存在または不在を判定することによって実行され得る。
【０２９５】
本発明はまた、対象における１つ以上のフラビウイルスによる感染の発生の良好な予後を予測するためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの適切な生体試料を、本発明に従う安定化組換えｓＥ二量体とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）当該生物学的試料中の当該二量体を対象とする中和抗体の量を判定するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において判定された量を、当該対象に対して以前に得られた当該二量体を対象とする抗体の量と比較するステップと、を含み、
当該二量体を対象とする中和抗体の量の有意な増加は当該フラビウイルス感染の発生の良好な予後のマーカーを構成し、
１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０２９６】
本発明はまた、１つ以上のフラビウイルスに対してワクチン接種された対象における１つ以上のフラビウイルス感染に対するワクチン接種プロトコルの成功をモニタリングするためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの適切な生体試料を、本発明に従う安定化組換えｓＥ二量体とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）当該生物学的試料中の当該二量体を対象とする中和抗体の量を判定するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において判定された量を、当該対象に対して以前に得られた当該二量体を対象とする抗体の量と比較するステップと、を含み、
当該二量体を対象とする中和抗体の量の有意な増加が、当該ワクチン接種プロトコルの成功のマーカーを構成し、
１つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。
【０２９７】
当該適切な生体試料は、血液、血清、尿、または肝生検、好ましくは血液であり得る。
【０２９８】
タンパク質または抗体の量を検出および決定するための免疫学的方法は、当該技術分野で周知である。例として、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または免疫蛍光試験は、使用することができる。
【０２９９】
本発明に従うポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術および／または化学ＤＮＡ合成の周知の方法によって得られ得る。
【０３００】
本発明に関して有用な部品のいくつかのキットを提供する。ある実施形態は、安定化組換えｓＥ二量体、または本発明に従う抗体もしくはその断片、および適切な診断用試薬を含む、対象におけるフラビウイルス感染を診断またはモニタリングするためのキットを提供する。
【０３０１】
適切な診断用試薬は、対象におけるデングウイルス感染を診断またはモニタリングするためのアッセイを行うために必要である。適切な診断試薬は、溶媒、緩衝液、染料、抗凝固剤であり得る。
【０３０２】
このキットはまた、マイクロタイタープレートも包含し得る。
【０３０３】
一実施形態では、部品のキットは、本発明の化合物による治療を必要とする、または前述の実施形態に従う、より高い用量の本発明の化合物を必要とする患者を特定するための手段を含む。このキットは、抗ＥＤＥ抗体および抗ＦＬ抗体の存在または不在を特定するための方法を提供してもよく、例えば、このキットは、マイクロタイタープレートを含んでもよく、任意に、マイクロタイタープレートは、線状もしくは変性エンベロープタンパク質でコーティングされ、前述の実施形態のうちのいずれかに従う、ＥＤＥエピトープでコーティングされ、かつ／またはＥＬＩＳＡ試験、任意に棒上の比色試験を実行するための試薬も含み得る。好ましくは、このキットは、好ましくは、固体支持体上の抗体の存在または不在を単に特定するための手段を包含する。このキットはまた、フラビウイルス感染を治療または予防するために用いるための本発明の化合物または組成物をさらに含み得る。
【０３０４】
ワクチン接種を必要とする患者を特定するための手段を含むさらなる部品のキットもまた、提供される。患者は、抗ＥＤＥ抗体および抗ＦＬ抗体の存在および不在、ならびにそれらのレベルに基づいて、ワクチン接種を必要すると見なされる。したがって、このキットは、抗ＥＤＥ抗体および抗ＦＬ抗体の存在または不在を特定するための方法を提供してもよく、例えば、このキットは、マイクロタイタープレートを含んでもよく、任意に、マイクロタイタープレートは、線状もしくは変性エンベロープタンパク質でコーティングされ、前述の実施形態のうちのいずれかに従う、ＥＤＥエピトープでコーティングされ、かつ／またはＥＬＩＳＡ試験、任意に棒上の比色試験を実行するための試薬も含み得る。好ましくは、このキットは、好ましくは、固体支持体上の抗体の存在または不在を単に特定するための手段を包含する。このキットはまた、前述の実施形態に記載される、ワクチン接種で用いるための組成物をさらに含み得る。
【０３０５】
さらなるキットは、デング熱感染を治療または予防する手段を包含し、ＥＤＥに結合する本発明の１つ以上の化合物、またはＥＤＥに結合する本発明の化合物を含む組成物を含み、任意に、さらなる治療剤、例えばさらなる抗ウイルス剤を含む。
【０３０６】
本明細書に言及される任意の化合物または組成物または抗原または抗体は、組成物の一部であってもよいことが理解されよう。この組成物は、ＰＥＧなどの安定化剤を含んでもよい。ポリペプチド成分が、例えば、当該技術分野で周知のように、共有結合的に修飾または共役、例えばＰＥＧ化されてもよいことが理解されよう。
【０３０７】
それ故に、例えば、デング熱感染を治療または予防で用いるための任意の化合物もしくは抗体、または任意のポリペプチドもしくは抗原、またはこの抗原もしくは抗体をコードする核酸もしくはベクターは、１つ以上のさらなる構成要素に共役してもよく、例えばレポーター部分に共役してもよく、または１つ以上のさらなる治療剤に共役してもよい。
【０３０８】
あるそのようなさらなる治療剤は、Ｆｃ受容体結合を防ぐための薬剤である。フラビウイルス、例えば、デングウイルスが抗体依存性増強を招くことは周知であり、このことが、このウイルスに結合するが、中和することができないある特定の抗体の産生が原因であると考えられている。このことにより、Ｆｃ受容体を介して抗原の内面化をもたらし、再感染時に増大した反応をもたらす。Ｆｃ受容体結合を遮断し得る薬剤が抗体依存性増強を防ぎ得ると考えられている。かかる薬剤かかる薬剤の例は、デング熱感染を治療または予防するために用いるための本発明の化合物、およびワクチン接種で用いるための抗原とともに（または別々に）投与する場合に有用であると見なされている。また、当業者に周知のように、Ｆｃ受容体との相互作用が軽減するような抗体分子を修飾または選択することにも有用であり得る。
【０３０９】
本明細書に記載の任意の薬剤の投与が、典型的に、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、アジュバント、または担体と一緒に薬学的組成物の一部として投与される。それ故に、化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞に関する任意の言及、およびさらなる治療剤の任意の言及は、化合物、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、および／またはさらなる治療剤（例えば、製剤）を含む薬学的に許容される組成物に同等に適用する。
【０３１０】
この化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸は、ナノ粒子の一部であり得る。
【０３１１】
投与の経路は、当業者に周知であろう。例えば、本発明の薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤）は、即時、遅延、または制御放出性の適用のために、香料剤または着色剤を含み得る錠剤、カプセル、胚珠、エリキシル、溶液、または懸濁液の形態で、経口、口内、または舌下に投与することができる。本発明の化合物はまた、静脈内注射によって投与してもよい。本発明に従う化合物ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤は、哺乳動物対象、好ましくはヒトに経口投与することができる。それらはまた、当該対象に、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、または皮下注射などの注射によって投与することができる。
【０３１２】
薬剤は、活性成分を含む薬学的薬剤の形態で、任意に非毒性有機または無機、酸または基、添加塩の形態で、薬学的に許容される剤形で、経口または何らかの非経口経路によって投与され得る。治療される疾患や患者および投与の経路に応じて、薬剤は、異なる投薬量で投与され得る。
【０３１３】
好ましくは、製剤は、１日用量または単位、１日サブ用量またはその適切な断片、週１回の用量、月１回の用量、または６カ月に１回の用量の薬剤または活性成分を含有する単位投薬量である。
【０３１４】
ヒト治療法では、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤さらなる治療剤）は、単独で投与することができるが、一般に、意図される投与経路および標準的な薬学的実践に関して選択される、適当な薬学的賦形剤希釈剤、または担体と混和して投与されるであろう。
【０３１５】
錠剤は、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸水素カルシウム、およびグリシンなどの賦形剤、デンプン（好ましくはコーン、ポテト、またはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムなどの崩壊剤、ある種の錯体ケイ酸塩、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、サクロース、ゼラチン、およびアカシアなどの顆粒結合剤を含有してもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、およびタルクなどの潤滑剤が含まれてもよい。カプセルまたは錠剤はまた、胃の安定性を高めるためにコーティングされた腸溶性であってもよい。
【０３１６】
同様の種類の固体組成物はまた、ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。これに関して好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量のポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液および／またはエリキシルについては、本発明の化合物は、様々な甘味剤または香味剤、着色剤または色素、乳化剤および／または懸濁化剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコール、およびグリセリンなどの希釈剤、ならびにこれらの組み合わせと混合してもよい。
【０３１７】
薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）はまた、非経口的に、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、または皮下に投与することができるか、またはそれらは、注入技術によって投与してもよい。それらは、無菌水溶液の形態で使用するのが最も良く、この無菌水溶液は、その他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有してもよい。この水溶液は、必要ならば適当に緩衝化（好ましくはｐＨ３〜９に）しなくてはならない。無菌条件下の適当な非経口用製剤の調製は、当業者には周知の標準的な薬学的技術によって容易に達成される。
【０３１８】
非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を対象とする受容者の血液と等張の状態にする溶質を含有してもよい水性および非水性無菌注射液、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性無菌注射液を含む。製剤は、単位用量または多用量容器、例えば密封されたアンプルやバイアルの中で提示されてもよく、使用直前に無菌の液体担体、例えば注射用蒸留水の添加だけを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。即席の注射液および懸濁液は、以前に記載した種類の無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製され得る。
【０３１９】
ヒト対象への経口および非経口投与のために、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）の１日投与量レベルは、通常、１成人につき１〜５０００ｍｇであり、単回または分割した用量で投与されよう。
【０３２０】
それ故に、例えば、本発明の化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチンを含む錠剤またはカプセルは、必要に応じて、一度に、単回または２回もしくはそれ以上の投与のために、活性化合物の１ｍｇ〜１０００ｍｇ（すなわち、約６０〜１２０ｍｇ／ｍ２）を含有してもよい。いずれにしても、医師は、任意の個々の対象に最も適しているであろう実際の投与量を決定し、投与量は、特定の対象の年齢、体重、および反応に応じて異なるであろう。上の投与量は、平均的な症例を例示するものである。当然ながら、より高いまたはより低い投与量の範囲が有利である個々の事例があり、このようなものは、本発明の範囲内である。
【０３２１】
薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）はまた、鼻腔内または吸入により、投与することもでき、適当な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ３または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ３）などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、またはその他の適当なガス、を使用する加圧容器、ポンプ、スプレー、または噴霧器からの乾燥粉末吸入器、またはエアロゾルスプレー提供物の形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合には、投与量単位は、計測量を送達するためのバルブを装備することによって決定してもよい。加圧容器、ポンプ、スプレー、または噴霧器は、例えば溶媒としてエタノールと高圧ガスとの混合物を使用する、化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチンの溶液または懸濁液を入れることができ、これは、潤滑剤、例えばソルビタントリオレエートをさらに含有してもよい。吸入器または注入器中で使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製）は、本発明の化合物とラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤との粉末混合物を含有するように製剤化されてもよい。
【０３２２】
エアロゾルまたは乾燥粉末製剤は、各計測された用量または「パフ」が、対象への送達のために、少なくとも１ｍｇの薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）を含有するように、好ましくは、準備される。エアロゾルを用いた全体の１日投与量が、対象毎に異なり、単回用量、またはより一般には、１日を通して分割された用量で投与され得ることが理解されよう。
【０３２３】
あるいは、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）は、坐剤またはペッサリーの形態で投与することができるか、またはそれらは、ローション、溶液、クリーム、軟膏、または散布剤の形態で局所適用されてもよい。本発明の化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチンはまた、例えば、皮膚用パッチの使用により経皮的に投与されてもよい。それらはまた、具体的には、眼の疾患を治療するために、眼の経路によって投与されてもよい。
【０３２４】
眼に使用するためには、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）は、等張の、ｐＨ調整した、無菌食塩水中の超微粉懸濁液として、または好ましくは等張の、ｐＨ調整した、無菌食塩水中の溶液として、場合により塩化ベンジルアルコニウムなどの防腐剤と組み合わせて、製剤化することができる。あるいは、それらは、ワセリンなどの軟膏中に製剤化してもよい。
【０３２５】
皮膚に局所的に適用するためには、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）は、例えば、以下のもの：鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ロウ、および水、のうちの１つ以上との混合物中に懸濁または溶解させた活性化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチンを含有する適当な軟膏として製剤化することができる。あるいは、それらは、例えば、以下のもの：鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルロウ、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水のうちの１つ以上の混合物中に懸濁または溶解させた適当なローションまたはクリームとして製剤化することができる。
【０３２６】
口内での局所投与に適した製剤には、芳香基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性成分を含むトローチ剤、ゼラチンおよびグリセリンなどの不活性基剤、またはスクロースおよびアカシア中に活性成分を含む香錠、ならびに適当な液体担体中に活性成分を含む口内洗浄液が含まれる。
【０３２７】
概して、ヒトにおける、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）の経口または局所投与は、最も都合がよい好ましい経路である。受容者が嚥下障害または経口投与後の薬物吸収の低下に苦しんでいる状況では、薬物は、非経口で、例えば、舌下または頬側に投与されてもよい。
【０３２８】
家畜への使用のために、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）は、通常の獣医学診療に従って適切に許容される製剤であり、獣医は、特定の動物に最も適切であろう投与の投与レジメンおよび経路を決定するであろう。
【０３２９】
便宜上、この製剤は、薬学的製剤である。この製剤は、獣医学製剤であってもよい。
【０３３０】
１つ以上の抗体またはその断片を含む組成物については、例えば、静脈内投与経路が適切であり得ることが理解されるであろう。
【０３３１】
投与という用語は、１回の投与に制限されないことが理解されよう。投与という用語は、単回投与、長期間にわたる複数回投与、長期間にわたる可変の投与量の投与、長期間にわたる投与の可変手段、１つ以上のさらなる治療剤と併せた投与のうちのすべてを網羅することを含むが、これらに限定されない。投与は、当該技術分野で周知の任意の手段によるものであり得、投与には、経口、静脈内、腫瘍に対して直接的に局所、舌下、または坐薬が含まれるが、これらに限定されない。
【０３３２】
本明細書で明らかに先に公表された文書のリストまたは議論は、その文書が最新技術の一部であるか、または共通の一般知識であることを認めるものと必ずしも解釈されるべきではない。
【０３３３】
本発明の所与の態様、特徴、またはパラメータにおける選好および選択肢は、特に文脈に示されない限り、本発明のすべての他の態様、特徴、およびパラメータにおける任意のおよびすべての選好および選択肢と組み合わせて開示されているよう見なされるべきである。例えば、ＥＤＥについての様々な定義は、本発明のすべての態様に関連しており、例えば、１つ以上のフラビウイルスによる感染に対するワクチン接種で用いるためのＥＤＥを含むエピトープは、エピトープ骨格タンパク質のうちの任意の１つ以上を含み得、骨格タンパク質は、例えば、エンベロープ依存性エピトープに共有結合的に結合する異種骨格タンパク質；少なくともＱ７７、Ｗ１０１、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｋ３１０のエンベロープタンパク質；または任意に、ドメインＩＩの以下の特性、ｂ鎖（残基６７〜７４）、すぐ上流の融合ループおよび残基（残基９７〜１０６）、ならびにｉｊループ（残基２４６〜２４９）のうちの任意の１つ以上をさらに含むドメインＩＩのエンベロープタンパク質のうちの任意の１つ以上を含み得る。
【０３３４】
配列
例示的な野生型フラビウイルスエンベロープ細胞外ドメイン配列には、以下が含まれる。本明細書で使用される番号付けは、これらの例示的な野生型フラビウイルス配列に関連すると考えられる。さらなるフラビウイルス配列は、当業者に周知であろう。フラビウイルス配列、変異フラビウイルス配列、および本発明に関連する抗体配列は、ＷＯ２０１６／０１２８００にも記載されている。
【０３３５】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ、ＫＪ７７６７９１、Ｈ−ＰＦ−２０１３＿Ｆｒｅｎｃｈ＿Ｐｏｌｙｎｅｓｉａ株）エンベロープ部分のポリタンパク質配列；配列番号１；
ＩＲＣＩＧＶＳＮＲＤＦＶＥＧＭＳＧＧＴＷＶＤＶＶＬＥＨＧＧＣＶＴＶＭＡＱＤＫＰＴＶＤＩＥ  ＬＶＴＴＴＶＳＮＭＡＥＶＲＳＹＣＹＥＡＳＩＳＤＭＡＳＤＳＲＣＰＴＱＧＥＡＹＬＤＫＱＳＤＴＱＹＶＣＫＲＴＬＶＤＲＧＷＧ  ＮＧＣＧＬＦＧＫＧＳＬＶＴＣＡＫＦＡＣＳＫＫＭＴＧＫＳＩＱＰＥＮＬＥＹＲＩＭＬＳＶＨＧＳＱＨＳＧＭＩＶＮＤＴＧＨＥＴ  ＤＥＮＲＡＫＶＥＩＴＰＮＳＰＲＡＥＡＴＬＧＧＦＧＳＬＧＬＤＣＥＰＲＴＧＬＤＦＳＤＬＹＹＬＴＭＮＮＫＨＷＬＶＨＫＥＷＦ  ＨＤＩＰＬＰＷＨＡＧＡＤＴＧＴＰＨＷＮＮＫＥＡＬＶＥＦＫＤＡＨＡＫＲＱＴＶＶＶＬＧＳＱＥＧＡＶＨＴＡＬＡＧＡＬＥＡＥ  ＭＤＧＡＫＧＲＬＳＳＧＨＬＫＣＲＬＫＭＤＫＬＲＬＫＧＶＳＹＳＬＣＴＡＡＦＴＦＴＫＩＰＡＥＴＬＨＧＴＶＴＶＥＶＱＹＡＧ  ＴＤＧＰＣＫＶＰＡＱＭＡＶＤＭＱＴＬＴＰＶＧＲＬＩＴＡＮＰＶＩＴＥＳＴＥＮＳＫＭＭＬＥＬＤＰＰＦＧＤＳＹＩＶＩＧＶＧ  ＥＫＫＩＴＨＨＷＨＲＳＧ
デングウイルス血清型１（ＤＥＮＶ−１、ＮＣ＿００１４７７）エンベロープ部分のポリタンパク質配列；配列番号２；
ＭＲＣＶＧＩＧＮＲＤＦＶＥＧＬＳＧＡＴＷＶＤＶＶＬＥＨＧＳＣＶＴＴＭＡＫＤＫＰＴＬＤＩＥＬＬＫＴＥＶＴＮＰＡ  ＶＬＲＫＬＣＩＥＡＫＩＳＮＴＴＴＤＳＲＣＰＴＱＧＥＡＴＬＶＥＥＱＤＴＮＦＶＣＲＲＴＦＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＳ  ＬＩＴＣＡＫＦＫＣＶＴＫＬＥＧＫＩＶＱＹＥＮＬＫＹＳＶＩＶＴＶＨＴＧＤＱＨＱＶＧＮＥＴＴＥＨＧＴＴＡＴＩＴＰＱＡＰＴ  ＳＥＩＱＬＴＤＹＧＡＬＴＬＤＣＳＰＲＴＧＬＤＦＮＥＭＶＬＬＴＭＫＫＫＳＷＬＶＨＫＱＷＦＬＤＬＰＬＰＷＴＳＧＡＳＴＳＱ  ＥＴＷＮＲＱＤＬＬＶＴＦＫＴＡＨＡＫＫＱＥＶＶＶＬＧＳＱＥＧＡＭＨＴＡＬＴＧＡＴＥＩＱＴＳＧＴＴＴＩＦＡＧＨＬＫＣＲ  ＬＫＭＤＫＬＩＬＫＧＭＳＹＶＭＣＴＧＳＦＫＬＥＫＥＶＡＥＴＱＨＧＴＶＬＶＱＶＫＹＥＧＴＤＡＰＣＫＩＰＦＳＳＱＤＥＫＧ
ＶＴＱＮＧＲＬＩＴＡＮＰＩＶＴＤＫＥＫＰＶＮＩＥＡＥＰＰＦＧＥＳＹＩＶＶＧＡＧＥＫＡＬＫＬＳＷＦＫＫＧ
デングウイルス血清型２（ＤＥＮＶ−２、ＮＣ＿００１４７４）エンベロープ部分のポリタンパク質配列；配列番号３；
ＭＲＣＩＧＭＳＮＲＤＦＶＥＧＶＳＧＧＳＷＶＤＩＶＬＥＨＧＳＣＶＴＴＭＡＫＮＫＰＴＬＤＦＥＬＩＫＴＥＡＫＱＰＡ  ＴＬＲＫＹＣＩＥＡＫＬＴＮＴＴＴＥＳＲＣＰＴＱＧＥＰＳＬＮＥＥＱＤＫＲＦＶＣＫＨＳＭＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＧ  ＩＶＴＣＡＭＦＲＣＫＫＮＭＥＧＫＶＶＱＰＥＮＬＥＹＴＩＶＩＴＰＨＳＧＥＥＨＡＶＧＮＤＴＧＫＨＧＫＥＩＫＩＴＰＱＳＳＩ  ＴＥＡＥＬＴＧＹＧＴＶＴＭＥＣＳＰＲＴＧＬＤＦＮＥＭＶＬＬＱＭＥＮＫＡＷＬＶＨＲＱＷＦＬＤＬＰＬＰＷＬＰＧＡＤＴＱＧ  ＳＮＷＩＱＫＥＴＬＶＴＦＫＮＰＨＡＫＫＱＤＶＶＶＬＧＳＱＥＧＡＭＨＴＡＬＴＧＡＴＥＩＱＭＳＳＧＮＬＬＦＴＧＨＬＫＣＲ  ＬＲＭＤＫＬＱＬＫＧＭＳＹＳＭＣＴＧＫＦＫＶＶＫＥＩＡＥＴＱＨＧＴＩＶＩＲＶＱＹＥＧＤＧＳＰＣＫＩＰＦＥＩＭＤＬＥＫ  ＲＨＶＬＧＲＬＩＴＶＮＰＩＶＴＥＫＤＳＰＶＮＩＥＡＥＰＰＦＧＤＳＹＩＩＩＧＶＥＰＧＱＬＫＬＮＷＦＫＫＧ
デングウイルス血清型３（ＤＥＮＶ−３、ＮＣ＿００１４７５）エンベロープ部分のポリタンパク質配列；配列番号４；
ＭＲＣＶＧＶＧＮＲＤＦＶＥＧＬＳＧＡＴＷＶＤＶＶＬＥＨＧＧＣＶＴＴＭＡＫＮＫＰＴＬＤＩＥＬＱＫＴＥＡＴＱＬＡ  ＴＬＲＫＬＣＩＥＧＫＩＴＮＩＴＴＤＳＲＣＰＴＱＧＥＡＶＬＰＥＥＱＤＱＮＹＶＣＫＨＴＹＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＳ  ＬＶＴＣＡＫＦＱＣＬＥＰＩＥＧＫＶＶＱＹＥＮＬＫＹＴＶＩＩＴＶＨＴＧＤＱＨＱＶＧＮＥＴＱＧＶＴＡＥＩＴＰＱＡＳＴＴＥ  ＡＩＬＰＥＹＧＴＬＧＬＥＣＳＰＲＴＧＬＤＦＮＥＭＩＬＬＴＭＫＮＫＡＷＭＶＨＲＱＷＦＦＤＬＰＬＰＷＡＳＧＡＴＴＥＴＰＴ  ＷＮＲＫＥＬＬＶＴＦＫＮＡＨＡＫＫＱＥＶＶＶＬＧＳＱＥＧＡＭＨＴＡＬＴＧＡＴＥＩＱＮＳＧＧＴＳＩＦＡＧＨＬＫＣＲＬＫ  ＭＤＫＬＥＬＫＧＭＳＹＡＭＣＴＮＴＦＶＬＫＫＥＶＳＥＴＱＨＧＴＩＬＩＫＶＥＹＫＧＥＤＡＰＣＫＩＰＦＳＴＥＤＧＱＧＫＡ  ＨＮＧＲＬＩＴＡＮＰＶＶＴＫＫＥＥＰＶＮＩＥＡＥＰＰＦＧＥＳＮＩＶＩＧＩＧＤＮＡＬＫＩＮＷＹＫＫＧ
デングウイルス血清型４（ＤＥＮＶ−４、ＮＣ＿００２６４０）エンベロープ部分のポリタンパク質配列；配列番号５；
ＭＲＣＶＧＶＧＮＲＤＦＶＥＧＶＳＧＧＡＷＶＤＬＶＬＥＨＧＧＣＶＴＴＭＡＱＧＫＰＴＬＤＦＥＬＴＫＴＴＡＫＥＶＡＬ  ＬＲＴＹＣＩＥＡＳＩＳＮＩＴＴＡＴＲＣＰＴＱＧＥＰＹＬＫＥＥＱＤＱＱＹＩＣＲＲＤＶＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＧＶ  ＶＴＣＡＫＦＳＣＳＧＫＩＴＧＮＬＶＱＩＥＮＬＥＹＴＶＶＶＴＶＨＮＧＤＴＨＡＶＧＮＤＴＳＮＨＧＶＴＡＭＩＴＰＲＳＰＳＶ  ＥＶＫＬＰＤＹＧＥＬＴＬＤＣＥＰＲＳＧＩＤＦＮＥＭＩＬＭＫＭＫＫＫＴＷＬＶＨＫＱＷＦＬＤＬＰＬＰＷＴＡＧＡＤＴＳＥＶ  ＨＷＮＹＫＥＲＭＶＴＦＫＶＰＨＡＫＲＱＤＶＴＶＬＧＳＱＥＧＡＭＨＳＡＬＡＧＡＴＥＶＤＳＧＤＧＮＨＭＦＡＧＨＬＫＣＫＶ  ＲＭＥＫＬＲＩＫＧＭＳＹＴＭＣＳＧＫＦＳＩＤＫＥＭＡＥＴＱＨＧＴＴＶＶＫＶＫＹＥＧＡＧＡＰＣＫＶＰＩＥＩＲＤＶＮＫＥ
ＫＶＶＧＲＩＩＳＳＴＰＬＡＥＮＴＮＳＶＴＮＩＥＬＥＰＰＦＧＤＳＹＩＶＩＧＶＧＮＳＡＬＴＬＨＷＦＲＫＧ
他のフラビウイルス：
セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ、ＮＣ＿００７５８０）エンベロープ部分のポリタンパク質配列；配列番号６；
ＦＮＣＬＧＴＳＮＲＤＦＶＥＧＡＳＧＡＴＷＩＤＬＶＬＥＧＧＳＣＶＴＶＭＡＰＥＫＰＴＬＤＦＫＶＭ  ＫＭＥＡＴＥＬＡＴＶＲＥＹＣＹＥＡＴＬＤＴＬＳＴＶＡＲＣＰＴＴＧＥＡＨＮＴＫＲＳＤＰＴＦＶＣＫＲＤＶＶＤＲＧＷＧＮＧ  ＣＧＬＦＧＫＧＳＩＤＴＣＡＫＦＴＣＫＮＫＡＴＧＫＴＩＬＲＥＮＩＫＹＥＶＡＩＦＶＨＧＳＴＤＳＴＳＨＧＮＹＳＥＱＩＧＫＮ  ＱＡＡＲＦＴＩＳＰＱＡＰＳＦＴＡＮＭＧＥＹＧＴＶＴＩＤＣＥＡＲＳＧＩＮＴＥＤＹＹＶＦＴＶＫＥＫＳＷＬＶＮＲＤＷＦＨＤ  ＬＮＬＰＷＴＳＰＡＴＴＤＷＲＮＲＥＴＬＶＥＦＥＥＰＨＡＴＫＱＴＶＶＡＬＧＳＱＥＧＡＬＨＴＡＬＡＧＡＩＰＡＴＶＳＳＳＴ  ＬＴＬＱＳＧＨＬＫＣＲＡＫＬＤＫＶＫＩＫＧＴＴＹＧＭＣＤＳＡＦＴＦＳＫＮＰＴＤＴＧＨＧＴＶＩＶＥＬＱＹＴＧＳＮＧＰＣ  ＲＶＰＩＳＶＴＡＮＬＭＤＬＴＰＶＧＲＬＶＴＶＮＰＦＩＳＴＧＧＡＮＮＫＶＭＩＥＶＥＰＰＦＧＤＳＹＩＶＶＧＲＧＴＴＱＩＮ
ＹＨＷＨＫＥＧ
日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ、ＮＣ＿００１４３７）エンベロープ部分のポリタンパク質配列；配列番号７；
ＦＮＣＬＧＭＧＮＲＤＦＩＥＧＡＳＧＡＴＷＶＤＬＶＬＥＧＤＳＣＬＴＩＭＡＮＤＫＰＴ  ＬＤＶＲＭＩＮＩＥＡＳＱＬＡＥＶＲＳＹＣＹＨＡＳＶＴＤＩＳＴＶＡＲＣＰＴＴＧＥＡＨＮＥＫＲＡＤＳＳＹＶＣＫＱＧＦＴＤ  ＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＳＩＤＴＣＡＫＦＳＣＴＳＫＡＩＧＲＴＩＱＰＥＮＩＫＹＥＶＧＩＦＶＨＧＴＴＴＳＥＮＨＧＮＹＳ  ＡＱＶＧＡＳＱＡＡＫＦＴＩＴＰＮＡＰＳＩＴＬＫＬＧＤＹＧＥＶＴＬＤＣＥＰＲＳＧＬＮＴＥＡＦＹＶＭＴＶＧＳＫＳＦＬＶＨ  ＲＥＷＦＨＤＬＡＬＰＷＴＳＰＳＳＴＡＷＲＮＲＥＬＬＭＥＦＥＥＡＨＡＴＫＱＳＶＶＡＬＧＳＱＥＧＧＬＨＱＡＬＡＧＡＩＶＶ  ＥＹＳＳＳＶＫＬＴＳＧＨＬＫＣＲＬＫＭＤＫＬＡＬＫＧＴＴＹＧＭＣＴＥＫＦＳＦＡＫＮＰＡＤＴＧＨＧＴＶＶＩＥＬＳＹＳＧ  ＳＤＧＰＣＫＩＰＩＶＳＶＡＳＬＮＤＭＴＰＶＧＲＬＶＴＶＮＰＦＶＡＴＳＳＡＮＳＫＶＬＶＥＭＥＰＰＦＧＤＳＹＩＶＶＧＲＧＤＫＱＩＮＨＨＷＨＫＡＧマリーバレー脳炎ウイルス（ＭＶＥＶ、ＮＣ＿０００９４３）エンベロープ部分のポリタンパク質配列；配列番号８；ＦＮＣＬＧＭＳＳＲＤＦＩＥＧＡＳＧＡＴＷＶＤＬＶＬＥＧＤＳＣＩＴＩＭＡＡＤＫＰＴＬＤ  ＩＲＭＭＮＩＥＡＴＮＬＡＬＶＲＮＹＣＹＡＡＴＶＳＤＶＳＴＶＳＮＣＰＴＴＧＥＳＨＮＴＫＲＡＤＨＮＹＬＣＫＲＧＶＴＤＲＧ  ＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＳＩＤＴＣＡＫＦＴＣＳＮＳＡＡＧＲＬＩＬＰＥＤＩＫＹＥＶＧＶＦＶＨＧＳＴＤＳＴＳＨＧＮＹＳＴＱ  ＩＧＡＮＱＡＶＲＦＴＩＳＰＮＡＰＡＩＴＡＫＭＧＤＹＧＥＶＴＶＥＣＥＰＲＳＧＬＮＴＥＡＹＹＶＭＴＩＧＴＫＨＦＬＶＨＲＥ  ＷＦＮＤＬＬＬＰＷＴＳＰＡＳＴＥＷＲＮＲＥＩＬＶＥＦＥＥＰＨＡＴＫＱＳＶＶＡＬＧＳＱＥＧＡＬＨＱＡＬＡＧＡＩＰＶＥＦ  ＳＳＳＴＬＫＬＴＳＧＨＬＫＣＲＶＫＭＥＫＬＫＬＫＧＴＴＹＧＭＣＴＥＫＦＴＦＳＫＮＰＡＤＴＧＨＧＴＶＶＬＥＬＱＹＴＧＳ  ＤＧＰＣＫＩＰＩＳＳＶＡＳＬＮＤＭＴＰＶＧＲＭＶＴＡＮＰＹＶＡＳＳＴＡＮＡＫＶＬＶＥＩＥＰＰＦＧＤＳＹＩＶＶＧＲＧＤＫＱＩＮＨＨＷＨＫＥＧウエストナイルウイルス（ＷＮＶ、ＮＣ＿００１５６３）エンベロープ部分ポリタンパク質配列；配列番号９；ＦＮＣＬＧＭＳＮＲＤＦＬＥＧＶＳＧＡＴＷＶＤＬＶＬＥＧＤＳＣＶＴＩＭＳＫＤＫＰＴＩＤＶＫ  ＭＭＮＭＥＡＡＮＬＡＤＶＲＳＹＣＹＬＡＳＶＳＤＬＳＴＲＡＡＣＰＴＭＧＥＡＨＮＥＫＲＡＤＰＡＦＶＣＫＱＧＶＶＤＲＧＷＧ  ＮＧＣＧＬＦＧＫＧＳＩＤＴＣＡＫＦＡＣＴＴＫＡＴＧＷＩＩＱＫＥＮＩＫＹＥＶＡＩＦＶＨＧＰＴＴＶＥＳＨＧＫＩＧＡＴＱＡ  ＧＲＦＳＩＴＰＳＡＰＳＹＴＬＫＬＧＥＹＧＥＶＴＶＤＣＥＰＲＳＧＩＤＴＳＡＹＹＶＭＳＶＧＥＫＳＦＬＶＨＲＥＷＦＭＤＬＮ  ＬＰＷＳＳＡＧＳＴＴＷＲＮＲＥＴＬＭＥＦＥＥＰＨＡＴＫＱＳＶＶＡＬＧＳＱＥＧＡＬＨＱＡＬＡＧＡＩＰＶＥＦＳＳＮＴＶＫ  ＬＴＳＧＨＬＫＣＲＶＫＭＥＫＬＱＬＫＧＴＴＹＧＶＣＳＫＡＦＫＦＡＲＴＰＡＤＴＧＨＧＴＶＶＬＥＬＱＹＴＧＴＤＧＰＣＫＶ  ＰＩＳＳＶＡＳＬＮＤＬＴＰＶＧＲＬＶＴＶＮＰＦＶＳＶＡＴＡＮＳＫＶＬＩＥＬＥＰＰＦＧＤＳＹＩＶＶＧＲＧＥＱＱＩＮＨＨ
ＷＨＫＳＧ
【０３３６】
これらの配列には変異体が存在することは理解されよう。例えば、本明細書の実施例２に記載の構造研究で使用されたＤＥＮＶ−２株のエンベロープ細胞外ドメインの配列は、例えば実施例２のＥＤ図７に示されており、上述のデングウイルス血清型２（ＤＥＮＶ−２、ＮＣ＿００１４７４）配列番号３の配列とわずかに異なると考えられる。例えば、３０８位の残基は、実施例２のＥＤ図７（配列番号１０）に示される配列中のＩであり、ＤＥＮＶ−２、ＮＣ＿００１４７４の配列番号３のＶである。その変動はＥＤＥエピトープに有意な影響を及ぼさないと考えられる。構造的には、例えば、残基３０８がＶまたはＩであるかどうかは、エンベロープ二量体と相互作用する抗体との間でなされる接触において大きな差を生じることは期待されないと考えられる。
【０３３７】
例えば、本明細書に記載の変異ポリペプチドを調製する際に使用され得る他の菌株はまた、配列番号３の配列または配列番号１０の配列とわずかに異なる可能性がある。例えば、異なるＤＥＮＶ−２配列間の、または他のＤｅｗｎｇｕｅ血清群内の相違は、例えば、野生株またはその後の実験室培養期間から得られるもののいずれかで、典型的には約１５％までであり得る。
【０３３８】
変異
有用であると考えられるＥタンパク質変異の例は、ＤＥＮＶおよびＺＩＫＶ  Ｅ配列との関連で示される。対応する変異はまた、他のフラビウイルスＥタンパク質のバックグラウンド、例えば他のＺＩＫＶまたはＤＥＮＶ配列、または他のフラビウイルスＥタンパク質配列、例えば上記の配列の節に記載される配列に潜在的に有用であると考えられる。
【表１】
2019523647.tif 000004
2019523647.tif 000005
2019523647.tif 000006
2019523647.tif 000007
【０３３９】
抗体配列
ＷＯ２０１６／０１２８００、Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，  １０９−１１３、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，  １７０−１７７で同定されたＥＤＥ１抗体は、フラビウイルス、例えばジカウイルスを中和するのに一般に有用であると考えられている。例えば、ＷＯ２０１６／０１２８００、Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉら（２０１５）、および／またはＤｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉら（２０１５）において同定された抗体ＥＤＥ  １  ７５２−２  Ｃ８（ＥＤＥ１  Ｃ８とも呼ばれる）およびＥＤＥ１  ７５３（３）Ｃ１０（ＥＤＥ１  Ｃ１０とも呼ばれる）  は、フラビウイルス、例えばジカウイルスを中和するのに有用であると考えられている。ＥＤＥ１  Ｃ８およびＥＤＥ１  Ｃ１０の配列を以下の表Ａに示す。ＣＲＤアミノ酸配列は、配列番号１５〜２６として示される。
【表２】
2019523647.tif 000008
【０３４０】
有用であると考えられる他のＥＤＥ１抗体は、結合として実施例１の図７に示したもの、およびその変異体である。抗体は、ＷＯ２０１６／０１２８００で使用される用語を用いて示される。
【０３４１】
したがって、有用であると考えられるＥＤＥ１抗体には、以下が含まれる：
７５２  Ｂ１０
７５２  Ｂ１１
７５２−２  Ａ２
７５２−２  Ａ９
７５２−２  Ａ９
７５２−２  Ｂ２
７５２−２  Ｂ３
７５２−２  Ｂ４
７５２−２  Ｂ１１
７５２−２  Ｃ４
７５２−２  Ｃ８
７５２  Ｃ９
７５２（２）Ａ７
７５２（２）Ａ８
７５２（２０Ｃ２
７５２（２）Ｄ４
７５３（３）Ｃ１０
７５３（３）Ｂ１０
７５８  Ｐ６Ａ１
７５８  Ｐ６Ａ３
７５８  Ｐ６Ｂ４
７５８  Ｐ６Ｂ５
７５８  Ｐ６Ｃ４
配列はＷＯ２０１６／０１２８００に示されており  、表の関連する部分が下に挿入されている。ＷＯ２０１６／０１２８００において論じられるように、バリアントも有用であり得る
【表３】
2019523647.tif 000009
2019523647.tif 000010
2019523647.tif 000011
2019523647.tif 000012
2019523647.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０３４２】
【図１】実施例１  図１．ＤＥＮＶ免疫血漿はＺＩＫＶと交差反応する。  （ａ）捕捉ＥＬＩＳＡによって測定されたＺＩＫＶ株ＰＦ１３およびＨＤ７８７８８およびＤＥＮＶに対する６つの代表的なＤＥＮＶ血清の結合力価曲線（前の急性感染に対応するＤＥＮＶ血清型を用いた６カ月の回復期血漿）。
【図２】（ｂ）捕捉ＥＬＩＳＡ（ｎ＝１８）によって判定されたＺＩＫＶ（株ＰＦ１３およびＨＤ７８７８８）およびＤＥＮＶに対するＤＥＮＶ血漿の終点力価。小さな水平線は中央値を示す。
【図３】図２．ＤＥＮＶ免疫血漿によるＺＩＫＶの中和。  （ａ）２つのＺＩＫＶ株ＰＦ１３およびＨＤ７８７８８およびＤＥＮＶを用いた６つの代表的なＤＥＮＶ血清に対するベロ細胞において決定されたＺＩＫＶの中和（最近の感染に対応するＤＥＮＶ血清型を用いた６カ月の回復期血漿）。プールされたＤＥＮＶ陰性血清（ＰＮＤ）を陰性対照として用いた。
【図４】（ｂ）ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ感染（ｎ＝１８）に対するＤＥＮＶ血漿のＮＴ５０値。
【図５】図３．ＤＥＮＶ血漿はＺＩＫＶ感染を増強する。  （ａ）連続希釈したＤＥＮＶ血漿の存在下で、ＺＩＫＶ株ＰＦ１３およびＨＤ７８７８８およびＤＥＮＶに感染したＵ９３７細胞の６つの代表的なＡＤＥ曲線（最近の感染に対応するＤＥＮＶ血清型を用いた６カ月の回復期血漿）。プールされた陰性血清（ＰＮＤ）を陰性対照として用いた。
【図６】（ｂ）ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ（ｎ＝１８）に対するＤＥＮＶ血漿のピーク倍増。
【図７】図４．抗ＤＥＮＶヒトモノクローナル抗体は、ＺＩＫＶに結合する。  （ａ）抗ＥＤＥ１、ＥＤＥ２、ＦＬＥ、および非ＦＬＥ  ｍＡｂの３３、１７、４５、３７によるＺＩＫＶ株ＰＦ１３およびＨＤ７８７８８およびＤＥＮＶ血清型１の１０ｕｇ／ｍｌでの結合は、これは３つの別々の実験を表す。矢印は、図４ｂ、５、および６で使用されたｍＡｂを示した。
【図８】（ｂ）９つの代表的なｍＡｂ（抗ＥＤＥ１、ＥＤＥ２、およびＦＬＥ  ｍＡｂについて、それぞれ３つ）についての結合力価曲線。アッセイは捕捉ＥＬＩＳＡによって行い、３回の独立した実験から平均±２標準誤差として示した。
【図９】（ｂ）９つの代表的なｍＡｂ（抗ＥＤＥ１、ＥＤＥ２、およびＦＬＥ  ｍＡｂについて、それぞれ３つ）についての結合力価曲線。アッセイは捕捉ＥＬＩＳＡによって行い、３回の独立した実験から平均±２標準誤差として示した。
【図１０】図５．抗ＤＥＮＶヒトモノクローナル抗体は、ＺＩＫＶ感染を増強する。  ＺＩＫＶ株ＰＦ１３およびＨＤ７８７８８における９つの抗ＤＥＮＶ  ｍＡｂ（抗ＥＤＥ１  ｍＡｂについて、３つ）の感染増強曲線。Ｕ９３７細胞を標的細胞として使用した。データは、２回の独立した実験から平均±２標準誤差として示される。
【図１１】図５．抗ＤＥＮＶヒトモノクローナル抗体は、ＺＩＫＶ感染を増強する。  ＺＩＫＶ株ＰＦ１３およびＨＤ７８７８８における９つの抗ＤＥＮＶ  ｍＡｂ（抗ＥＤＥ１  ｍＡｂについて、３つ）の感染増強曲線。Ｕ９３７細胞を標的細胞として使用した。データは、２回の独立した実験から平均±２標準誤差として示される。
【図１２】図５．抗ＤＥＮＶヒトモノクローナル抗体は、ＺＩＫＶ感染を増強する。  ＺＩＫＶ株ＰＦ１３およびＨＤ７８７８８における９つの抗ＤＥＮＶ  ｍＡｂ（抗ＥＤＥ１  ｍＡｂについて、３つ）の感染増強曲線。Ｕ９３７細胞を標的細胞として使用した。データは、２回の独立した実験から平均±２標準誤差として示される。
【図１３】図６．抗ＥＤＥ１ヒトモノクローナル抗体は、ＤＥＮＶ血漿のＡＤＥを阻害する。  ＺＩＫＶ株ＰＦ１３およびＨＤ７８７８８における９つの抗ＤＥＮＶ  ｍＡｂ（抗ＥＤＥ１、ＥＤＥ２、およびＦＬＥ  ｍＡｂについて、それぞれ３つ）の阻害曲線。Ｕ９３７細胞を、連続希釈された抗ＤＥＮＶ  ｍＡｂと一緒に、１：１０００のプールされた回復期デング血清（ピーク増強を与える希釈）の存在下でＺＩＫＶに感染させた。抗インフルエンザｍＡｂ、２８Ｃは、陰性対照として使用した。データは、３つの独立した実験を表す。
【図１４】図６．抗ＥＤＥ１ヒトモノクローナル抗体は、ＤＥＮＶ血漿のＡＤＥを阻害する。  ＺＩＫＶ株ＰＦ１３およびＨＤ７８７８８における９つの抗ＤＥＮＶ  ｍＡｂ（抗ＥＤＥ１、ＥＤＥ２、およびＦＬＥ  ｍＡｂについて、それぞれ３つ）の阻害曲線。Ｕ９３７細胞を、連続希釈された抗ＤＥＮＶ  ｍＡｂと一緒に、１：１０００のプールされた回復期デング血清（ピーク増強を与える希釈）の存在下でＺＩＫＶに感染させた。抗インフルエンザｍＡｂ、２８Ｃは、陰性対照として使用した。データは、３つの独立した実験を表す。
【図１５】図６．抗ＥＤＥ１ヒトモノクローナル抗体は、ＤＥＮＶ血漿のＡＤＥを阻害する。  ＺＩＫＶ株ＰＦ１３およびＨＤ７８７８８における９つの抗ＤＥＮＶ  ｍＡｂ（抗ＥＤＥ１、ＥＤＥ２、およびＦＬＥ  ｍＡｂについて、それぞれ３つ）の阻害曲線。Ｕ９３７細胞を、連続希釈された抗ＤＥＮＶ  ｍＡｂと一緒に、１：１０００のプールされた回復期デング血清（ピーク増強を与える希釈）の存在下でＺＩＫＶに感染させた。抗インフルエンザｍＡｂ、２８Ｃは、陰性対照として使用した。データは、３つの独立した実験を表す。
【図１６】図７．ジカウイルス株ＰＦ１３およびＨＤ７８７８８に結合するＥＤＥ１抗体。抗体の名称は、ＷＯ２０１６／０１２８００に用いられているとおりである。
【図１７】実施例２  図１：ＺＩＫＶ／ＤＥＮＶ  Ｅタンパク質の系統発生およびＤＥＮＶ誘発抗体との反応性。  ａ）Ｅタンパク質（左パネル）およびポリメラーゼＮＳ５タンパク質（右パネル）のアミノ酸配列に基づく主要ヒト病原性フラビウイルスの系統樹。節足動物ベクターは、背景色によって区別される。  ｂ）ヒト組換えＩｇＧ  ｍＡｂ  ＦＬＥ  Ｐ６Ｂ１０、ＥＤＥ１  Ｃ８、およびＥＤＥ２  Ａ１１とのＺＩＫＶ  ｓＥ反応性。左パネル：結合特性を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でのＢｉｏｌａｙｅｒ干渉計によってモニタリングした。推測された平衡における正規化された応答値を、異なるＺＩＫＶ  ｓＥ濃度でモニタリングされた結合の個々の感覚像から推定した（ＥＤＥ１  Ｃ８の右パネルを参照）。結合部位占有率の割合として表される応答値を、対数尺度で示されるＺＩＫＶ  ｓＥ二量体の濃度に対してプロットする。線は、Ｋｄ評価に使用されるグローバル曲線適合を示す（濃度依存性飽和適合を示す線形濃度範囲についてはＥＤ図１を参照）。右パネル：抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ捕捉バイオセンサー上に固定化されたヒトＩｇＧ１  Ｃ８に対する溶液中のＺＩＫＶ  ｓＥ二量体の結合および解離動態；（示されるように）ＺＩＫＶ  ｓＥの２倍連続希釈の個々のセンサーグラムが示されている。ＥＤ  図１ａも参照のこと。
【図１８】図２：ＦＬＥ、ＥＤＥ１、およびＥＤＥ２の３つのサブセットからそれぞれ３つの抗体を用いた中和曲線。結果は、ＰＦ１３については三重に、ＨＤ７８７８８株については二重に、それぞれ、４回の独立した実験の平均を表す。２つのＺＩＫＶ株は、明るい色、赤色、および青色である。４つのＤＥＮＶ血清型（淡い色）の中和データは、参考文献２７から得、ここでは比較のために与えられる。対応するＩＣ  ５０値を表１に示す。使用したＤＥＮＶ４株は、Ｎ１５３グリコシル化部位を欠いている天然の分離株であったことに留意されたい。
【図１９】図３：ＥＤＥ１  Ｃ８／ＺＩＫＶ  ｓＥ複合体。  ａ）ドメイン（ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩは、それぞれ、赤色、黄色、および青色、融合ループはオレンジ色）によって着色されたｓＥ部分を有する複合体の全体図であり、抗体は、それぞれ、軽鎖をグレーで、重鎖を濃緑色で着色される。ＣＤＲは、対応する色（Ｈ１ライトブルー、Ｈ２サンド、Ｈ３ピンク、Ｌ１ライトグレー、Ｌ２レッド、Ｌ３オレンジ）でｂで標識された異なる色によって区別される。挿入図は、対応するＤＥＮＶ−２複合体との比較を示す。抗体は黄色で、ｓＥはグレーである。明確にするために、ＤＥＮＶ２−Ｃ８複合体のＣ８  Ｆａｂ断片の可変領域を、ＺＩＫＶ  ｓＥと複合体を形成してｓｃＦｖ上に重ね、Ｆａｂ軸を描き、結合角をより良好に示した。これらの角度は、２つの結晶構造における曲率の違いのために異なって見える。  ｂ）ＥＤＥ１のＣ８／ｓＥ相互作用を拡大してｂストランドの認識を示す。水素結合を点線で示し、界面に固定された水分子は赤い球として示す。  ｃ）ＤＥＮＶ−２  ｓＥ／Ｃ８  Ｆａｂ複合体上の同じ領域。ＤＥＮＶ上のＮ６７グリカンも抗体と相互作用することに留意されたい。  ｄ）ＥＤＥ１  Ｃ８のフットプリントは、表面に露出したアミノ酸の保存に応じて着色された表面表現（ビリオンの外側から見た）で示されるＺＩＫＶ  ｓＥ二量体で概説される。保存された側鎖からの主鎖原子および原子をオレンジ色に着色し、非常に類似した側鎖は黄色であり、他のすべての原子は白色である。  ｅ、ｆ）ピンク色で示されたＺＩＫＶ  ｓＥ（ｅ）およびＤＥＮＶ２  ｓＥ（ｆ）の表面表現上のＥＤＥ１  Ｃ８のフットプリント。明瞭にするために、二量体中のｓＥの２つのプロトマーは、明暗の灰色である。関連する抗原性ｓＥ領域が標識される。ＤＥＮＶ２、例えば、Ｎ６７グリカンよりもＺＩＫＶ  ｓＥ二量体においてより制限された相互作用表面がＺＩＫＶ  ｓＥには存在しないことに留意されたい。
【図２０】図４：ＥＤＥ２  Ａ１１／ＺＩＫＶ  ｓＥ複合体。色分けは図３にあるとおりである。  ａ）結晶充填により、ｓＥ二量体当たり１つのＦａｂのみが結合した複合体の全体図。破線の楕円は、失われたＡ１１  Ｆａｂの位置を表す。挿入図は、ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ−２におけるｓＥ二量体に対する結合角を比較する。  ｂ）ＺＩＫＶにおけるｂストランドにおける相互作用（左パネル）およびｃ）ＤＥＮＶ−２（右パネル）におけるｂストランドにおける相互作用。抗体（抗体は両パネルにおける同じ配向に厳密である）に関してｂストランドの異なる角度を留意されたい。ｄ、ｅ）主に記載される糖残基番号を有する、ＺＩＫＶ  ｓＥ（ｄ）およびＤＥＮＶ−２  ｓＥ（ｅ）に対して１５０ループ上のグリカンの拡大図。ＤＥＮＶ−２構造の場合のように、ＣＤＲ  Ｈ３ヘリックスはグリカンと相互作用するには余りにも離れている（ＥＤの図３および６ｂを参照）。
【図２１】表１
【図２２】ＥＤの図１：組換えＺＩＫＶタンパク質に結合する抗体。  ａ）線状スケールでプロットされたバイオフィルム干渉計実験。抗体をバイオセンサーチップ上に固定化し、ＺＩＫＶ  ｓＥタンパク質を指示濃度で溶液にした。使用した抗体を各プロットに示す。横目盛が、３つの抗体では異なることに留意されたい。推定された解離定数（Ｋｄ）および推定された解離速度（Ｋｏｆｆ）が示される。  ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーは、単離されたｓＥ、単離されたＦａｂ断片、およびＺＩＫＶ  ｓＥ＋Ｆａｂ断片を示す。
【図２３】ＥＤ  図２．ｂｎＡＢ／抗原相互作用に関与する残基。ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ−２  ｓＥのアミノ酸配列アラインメントに対する抗体の接触。赤い背景は同じ残基を強調表示する。二次構造要素は、その配列の上方（ＺＩＫＶ）および下方（ＤＥＮＶ−２）の標識とともに示される。ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ−２  ｓＥのドメイン構成は、配列上で着色した棒（ドメインＩ赤色、ドメインＩＩ黄色、ドメインＩＩＩ青色、および融合ループ橙色）によって象徴される。極性およびファンデルワールスタンパク質−タンパク質接触に関与する残基は、それぞれ、ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ−２  ｓＥのアライメントの上下に表示される挿入キーに示されるように、青色および緑色の記号を用いてそれぞれ印をつける。完全な記号および空の記号は、ｓＥの参照サブユニット（エピトープへの融合ループに寄与するものとして定義される）およびｓＥの反対のサブユニット上の抗体接触にそれぞれ対応する。重鎖または軽鎖のみと接触した残基は、それぞれ正方形または三角形で標識され、抗体鎖の両方によって円で標識された残基が標識される。アミノ酸接触の詳細は、ＥＤ表４および５に列挙されている。配列上の点は、ＺＩＫＶ  ｓＥ配列上の１０残基ごとに印をつける。ジスルフィド架橋は、配列の上に緑色で番号が付けられている。
【図２４】ＥＤ  図３．黒棒で示されたフレームワーク（ＦＲＷ）および薄い破線でＩＭＧＴ  ＣＤＲ領域を有するｂｎＡｂ  ＥＤＥ１  Ｃ８（上）およびＥＤＥ２  Ａ１１（下）の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（ｖＨおよびｖＬ）のアミノ酸配列。Ｉｇ  ｖＨおよびｖＬβバレルの二次構造要素は、配列上に示される。体細胞変異は赤色であり、Ｖ−Ｄ−Ｊ接合部での組換えにより生じる残基は緑色である。配列の上および下の記号は、それぞれ、ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ−２  ｓＥとの接触に関与する残基を、キーに示されているようにｓＥ内の接触した部位についてコードしている（最下部の挿入図）。極性およびファンデルワールス接触はそれぞれ、青色と緑色で示される。参照ｓＥサブユニット（融合ループをエピトープに寄与するものとして定義される）と接触する抗体残基は、空の着色の記号によって二量体界面を横切って接触するものであるが、無色の記号によって印を付けられる。赤色のボックスは、ＤＥＮＶ−２  ｓＥ複合体に見出され、ＺＩＫＶ  ｓＥ複合体には存在しない接触部を強調し、Ｎ６７グリカン、ｋｌおよび１５０ループを含む。極性接触の詳細は、拡張データ表４および５（図３ｅおよび３ｆも参照）に記載される。予測されるｖＨおよびｖＬ生殖系列対立遺伝子は、対応するＣＤＲ長で示される（参考文献３０の表１を参照）。
【図２５】ＥＤ  図４．二量体界面を横断するＥＤＥ１  Ｃ８  ｂｎＡｂ接触の詳細。  ａ）ＺＩＫＶ  ｓＥ／ＥＤＥ１  Ｃ８  ｓｃＦｖ複合体の全体図。ボックスは、ｂで拡大した領域を示す。ｂ）二量体界面を横断するドメインＩＩＩとのＣ８軽鎖の相互作用の詳細。ｃ）ＥＤＥ１  Ｃ８／ＤＥＮＶ−２複合体の同じ領域。関与したｓＥ残基は異なることに留意されたい。ｄ）ｉｊループ内の相互作用を示すために、複合体を１２０度回転させて（矢印で示すように）、ｅで拡大される。ｅ）ｉｊループは、主鎖と抗体との相互作用を示すためにスティック状に表示される。サブユニットのドメインＩＩは、参照サブユニットのドメインＩＩと区別するために緑色に着色されている。示されたアルギニンのための破線のスティックは、結晶中の電子密度が低いことを示すことである。  ｆ）ＤＥＮＶ−２との複合体の同じ図。抗体に接触する二量体界面を横断する残基は異なることに留意されたい。種々のＣＤＲ中の残基は、それらの標識色に一致するように着色コードされている（図３および４のように）。
【図２６】ＥＤ  図５．免疫複合体のオープンブック表現における表面静電ポテンシャル。静電ポテンシャルは、下のバーに沿って着色される。抗体のフットプリントは緑色で概説される。Ｃ８（左パネル）との複合体における不規則な１５０ループは、エピトープの一方の端に正の表面パッチをもたらし、これは右側のパネルに示されるように、このループは順序付けられるＡ１１との複合体において１５０ループ中の残基によって相殺される。
【図２７】ＥＤ  図６．１５０ループ上のグリカンとのＡ１１相互作用の詳細。ａ）白色の成熟ビリオン１８（ＰＤＢコード５ＩＲＥ）の低温ＥＭ構造からのＥタンパク質上のＺＩＫＶ  ｓＥ／Ａ１１複合体（色における）の重ね合わせ。Ｅタンパク質は、参照サブユニットのドメインＩＩの先端に、反対のサブユニットからのドメインＩＩＩとともに重ね合わされた。これは、１５０ループが本質的に同じコンフォメーションを採用するが、抗体の非存在下ではより少ない糖残基が見えることを示す。ｂ）Ａ１１／ＤＥＮＶ  ｓＥ複合体（白色）上のＡ１１／ＺＩＫＶ複合体（色）の重ね合わせ。２つの構造からの抗体の可変ドメインを互いに重ね合わせた。ＤＥＮＶ−２では、グリカンがＣＤＲ  Ｈ３のα−ヘリックスに対してパックするが、ＺＩＫＶ  ｓＥではグリカンが同じ相互作用を行うには離れすぎていることに留意されたい。ｃ）Ｃ８／ＺＩＫＶ  ｓＥ複合体（ピンク色）をＺＩＫＶ／Ａ１１複合体（色）に重ね合わせて、Ｃ８軽鎖とグリカンとの衝突を示し、それが途中で移動して乱れるようにした。重ね合わせはまた、ＥＤＥ１  Ｃ８が、ドメインＩＩＩと同様に、隣接するサブユニットのｉｊループおよびｋｌループと接触することにさらに到達することを示す。ａ）と同様に、二量体中の参照サブユニットのドメインＩＩの先端および隣接するサブユニットのドメインＩＩＩの先端をアンカーとして用いて重ね合わせを行った。２つの黒色のアスタリスクは、１５０ループの電子密度が失われた場所に印をつけ、短いヘリックスのＣ８／ｓＥ結晶内の密度もグリカンの密度もない。
【図２８】実施例２−１
【図２９】実施例２−２
【図３０】実施例２−３
【図３１】実施例２−４
【図３２】実施例２−５
【図３３】ＥＤ  図７．配列アライメントｓＥ  ＺＩＫＶ−ＤＥＮＶ−２
【図３４】実施例３    図１．（Ａ）ジカとデングとの間に近い類似性を示す異なるフラビウイルス間のＥタンパク質配列の相同性；ジカ−ＤＶ３−５８％、ＤＶ１−５７％、ＤＶ４−５６％、ＤＶ２−５４％である。（Ｂ）宿主プロテアーゼ、フリン、およびシグナルアーゼ、およびウイルスプロテアーゼ、ＮＳ３／２Ｂにより３つの構造タンパク質および７つの非構造タンパク質に切断される単一のポリタンパク質に翻訳されたデングゲノムの略図。  図２．デングウイルス構造を中性ｐＨでＡ）未成熟デング粒子の構造はＥおよびｐｒＭの配列をｓｉｒｍｅｒｃ（ヘテロ六量体スパイク）に示す。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ２００４  １０：Ｓ９８  Ｂ）成熟デングウイルスは、ｐｒＭの切断後に平滑なウイルス粒子内に配置されたＥの９０ヘッドトゥーテール二量体を示す。Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ  ２００２  １０８：７１７。  図３．抗ＥＤＥ抗体のエピトープを示す抗ＥＤＥ−ｍＡＢとの複合体中のＤＥＮＶ−２の構造は、二量体内の２Ｅを横切って存在する。Ａ）側面図およびＢ）上面図。Ｅタンパク質のドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩは、赤色、黄色、および青色で示される。上面図において、灰色および緑色の楕円は、抗ＥＤＥ  ｍＡｂの重鎖および軽鎖の結合領域を示す。Ｃ）エピトープ中の曝露された主鎖原子。ビリオンの外から見られるＤＥＮＶ−２  ｓＥを表す表面、曝露された主鎖原子橙色（上）、または主鎖原子＋保存された側鎖（橙色）、および高度に類似した側鎖（黄色）（下）。２つのＥＤＥ  ｍＡｂのエピトープを示す。  図４．ＥＬＩＳＡにより主に単量体の形態（青色）である野生型Ｅに対して、操作されたジスルフィド安定化二量体（赤色）に対するＥＤＥおよびＦＬＥｍｂのパネルの結合。Ａ）抗ＥＤＥ  ｍＡｂは、二量体に結合するが、単量体には結合しない。Ｂ）ほとんどの抗ＦＬＥ結合ｍＡｂは、単量体に比べて二量体への結合の減少を示す。
【図３５】図５．４匹のマウスからの中和アッセイは、野生型単量体ＤＥＮＶ２または変異体ジスルフィド結合結合Ｅ−二量体のいずれかでプライミングおよびブーストして、二量体Ｅとの中和力価を増加させた。  図６．リサーフェシング戦略のフローチャート。  図７．Ｅ二量体は、一方のサブユニットを白色で、他方のサブユニットを灰色で表す表面で示し、融合ループ領域を黄色で示す。ＥＤＥの輪郭は黒色である。リサーフェシングの候補残基は、明るい色、つまり、血清型可変残基および保存された残基をそれぞれ、緑色および赤色で表示される。
【図３６】実施例４の図１  ＡＧ１２９マウスモデルにおけるＣ１０のインビボ有効性。ＡＧ１２９マウス（雌、８〜１０週齢；Ｎ＝３）を、方法の節に記載されるように、５０または２００μｇの精製されたＣ１０または２−８Ｃにより腹腔内で処置した。マウスに、ＺＩＫＶ  ＰＥ２４３を含む、２００μＬの１．２×１０２ＦＦＵ／マウスを抗体処置から２４時間後に、腹腔内で感染させた。（Ａ）Ｃ１０抗体（赤色および青色の記号）または２−８Ｃアイソタイプ対照（緑色および紫色の記号）で処置したＺＩＫＶ感染マウスの元の体重曲線の割合を、ＰＢＳで処置した未感染マウス（黒色の記号）と比較してプロットした。データは、１つの実験からの結果を表し、感染した群当たり３匹のマウスからの平均＋／−重量測定値としてプロットされている。（Ｂ）感染後２日目および４日目に個々のマウスから単離した血漿サンプルからウイルス力価を測定した。血漿１ｍｌ当たりの病原体形成単位として計算されたウイルス力価は、個々のマウスにおける血漿ウイルス力価の平均＋／−  標準誤差として表されている。
【０３４３】
実施例１
デング血清反応活性は、ジカウイルス感染の抗体依存性増強を引き起こす。
【０３４４】
ジカウイルスは１９４７年に発見され、比較的軽度の疾患につながると考えられた。最近の南米におけるジカの爆発的発生は、ギランバレー症候群から小頭症に至るまでの神経学的後遺症の報告に広く関心を集めている。ジカは、ジカに密接に関連したフラビウイルスをデングの経路で追跡している。ここで、２つのウイルス間の血清学的交差反応を調べる。デング免疫血漿は、ジカと実質的に交差反応し、ジカ感染の抗体依存性増強を引き起こすことができる。ヒト抗デングモノクローナル抗体のパネルを用いて、デングエンベロープタンパク質に反応するほとんどの抗体もまた、ジカ、および免疫優性融合ループエピトープを含む線状エピトープに対する抗体に反応するが、ジカへの結合はウイルスを中和するが、ＡＤＥを促進することができないことを示す。これらのデータは、デング免疫感受性がより高いジカ複製を引き起こし、病因および将来のジカおよびデングワクチンプログラムに影響を及ぼす可能性があることを示す。
【０３４５】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）は、フラビウイルス科に属するアルボウイルスであり、Ａｅｄｅｓ蚊によってヒトに感染する１。ＺＩＫＶは、１９４７年にウガンダのジカ森林のセンチネルアカゲザルから最初に単離され、続いて蚊およびヒトで見つかった２、３。最近まで、ＺＩＫＶは感染の大部分が無症候性であるため、特に重要な病原体とは見なされていなかった。ＺＩＫＶの症候性症例は、発熱、筋肉痛、関節痛、頭痛、結膜炎、および発疹とデング熱の軽度のケースに似ている
【０３４６】
最近まで症例は、主にアフリカや東南アジアでは散発的であり、流行の活動は観察されていなかった１、８、９、１０、１１。ＺＩＫＶの大流行は、２００７年に西太平洋でのヤップ島に発生し、オセアニアを介して広がると、それは急速に他の南米諸国を巻き込み広がり、２０１５年にはブラジルに達した１、７、１２、１３、１４。
【０３４７】
これまでに、ＺＩＫＶ感染が重大な神経学的合併症を引き起こすことが明らかになっており、ギランバレー症候群の症例の増加は、２０１３年にフランス領ポリネシアで発生した後に初めて報告された１５。ＺＩＫＶ感染の大幅な増加と同時に発生した、ブラジル北東部に起源する小頭症の発生率の劇的な増加は、２０１５年後半に報告された１６、１７。ギランバレー症候群および小頭症のこれらの増加は、世界保健機関（ＷＨＯ）が２０１６年２月にＺＩＫＶを公衆衛生上の緊急事態と宣言することとなった１８。
【０３４８】
ＺＩＫＶは、様々なＡｅｄｅｓ蚊によって実施することができるが、現在の流行に関与する主要な種がＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉであると考えられている１、５。Ｂｒａｚｉｌ  Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉの部分でもＺＩＫＶと同時にＤＥＮＶとおよびチクングニアウイルスを広げている１９、２０、２１、２２、２３、２４。過去２０年間で、ＤＥＮＶは、南米の分野に広がっており、ＺＩＫＶによって影響を受けた一部の地域でＤＥＮＶの血清陽性率は９０％で超える２５、２６、２７。
【０３４９】
ＤＥＮＶは、アミノ酸配列が３０〜３５％異なる４つの血清型として存在し、ＤＥＮＶ血清型は、同様にＺＩＫＶとは４１〜４６％（Ｅタンパク質）異なる２８。最近の報告では、血清学的にウイルス間の抗原性の類似度を暗示するＤＥＮＶ感染症およびＺＩＫＶ感染症を区別する際に問題を示す７、２９、３０。
【０３５０】
初回ＤＥＮＶ感染後、個体は感染血清型に対する生涯免疫を発症するが、他の血清型では発症しない３１、３２。ＤＥＮＶ流行地域では、４種すべてのウイルスがしばしば共循環または循環的に置き換えられ、複数の連続感染が共通する３３。ＤＥＮＶ感染の興味深い特徴の１つは、デング熱出血熱につながる生命を脅かす合併症が、一次感染ではなく二次感染後に一般的であることである２８。これを説明する１つの理論は、抗体依存性増強（ＡＤＥ）である２８。ＡＤＥ仮説は、一次感染に対して生成された抗体が、アミノ酸配列が３０〜３５％異なる二次感染ＤＥＮＶを中和するのに十分な濃度または結合活性を有しないことを示唆している。しかしながら、それらは依然として二次ウイルスをオプソニン化し、ＤＥＮＶ複製の主要部位である単球およびマクロファージなどの骨髄細胞へのＦｃ受容体媒介性エンドサイトーシスのために標的化し、ウイルス負荷を高める可能性がある。ＡＤＥはインビトロで容易に実証され、動物モデルにおいてより高いデングウイルス負荷を引き起こすことも示されている３４、３５、３６、３７。
【０３５１】
ここでは、ＤＥＮＶ感染個体から生成された１３２のヒトモノクローナル抗体のパネルを利用して、ＤＥＮＶとＺＩＫＶとの間の実質的な交差反応性を実証する。ほとんどの抗ＤＥＮＶモノクローナル抗体もＺＩＫＶに結合するが、主要線状融合ループエピトープ（ＦＬＥ）を認識する抗体は非中和性である。ＤＥＮＶ血漿およびｍＡｂは、ＺＩＫＶ感染を強力に増強することができ、既存のＤＥＮＶ免疫がＺＩＫＶ複製を増加させる可能性を示唆している。
【０３５２】
結果
ＤＥＮＶ血漿はＺＩＫＶと交差反応する
血清型１〜４による二次ＤＥＮＶ感染後６ヶ月に採取した個体からの血漿を、捕捉ＥＬＩＳＡによってＺＩＫＶおよびＤＥＮＶへの結合について試験した。すべての場合において、ＤＥＮＶ免疫血漿は、ＤＥＮＶおよびＺＩＫＶの両方に結合した（図１ａ）。アフリカ（ＨＤ７８７８８）またはフランスポリネシア（ＰＦ１３）に由来するウイルス株への結合には、顕著な差はなかった（図１ｂ）。
【０３５３】
次に、回復期のＤＥＮＶ血漿によるＺＩＫＶの中和を試験した。すべての回復期のＤＥＮＶ血漿は、１：５０の最低希釈率で使用してＤＥＮＶ感染をほぼ１００％中和することができた（図２ａ）。しかしながら、ＺＩＫＶの中和は、ほとんどの血清が顕著な中和を示さないので、かなり効率的ではなかった（図２ａおよびｂ）。抗ＤＥＮＶ血漿がＺＩＫＶと実質的に交差反応するという所見は、ＡＤＥを促進することができるかどうかを決定するように促した。
【０３５４】
ＤＥＮＶ血漿はＡＤＥを強力に誘導する
ＤＥＮＶ感染の特徴の１つは、二次感染時の病気の重篤度の増加である。これの説明の１つは、前のＤＥＮＶ感染を対象にする既存の抗体がオプソニン作用するが、二次感染を中和しない抗体依存性増強である。オプソニン化ウイルスは、より高いウイルス複製を引き起こす単球およびマクロファージなどのＦｃ受容体発現骨髄細胞による取り込みの標的となる。
【０３５５】
本発明者らは、ＡＤＥの非存在下でＤＥＮＶによる感染に対して比較的耐性である骨髄系細胞株Ｕ９３７におけるＡＤＥを促進するＤＥＮＶ血漿の能力を試験し、Ｕ９３７はまた、ＡＤＥの非存在下でＺＩＫＶ感染に対してほとんど許容されないことを示す。ＺＩＫＶを、２週間で得られたプールされた回復期の抗デング血漿の滴定と予めインキュベートし、次いでＵ９３７細胞を感染させるために使用した。プールされた回復期血漿は、ジカウイルスの両方に対して１００倍超の感染の実質的な増強をもたらし、プールされた対照の非デング血清は感染を増強しなかった（図３ａ）。次に、急性二次的デング熱感染から６カ月後に得られた回復期血漿パネルを試験した。一例を除くすべてにおいて、ＤＥＮＶ血漿はＺＩＫＶ感染を増加させ、ＨＤ７８７８８感染の中央値は１２倍増加した（図３ｂ）。要約すると、これらの結果は、交差反応性の抗ＤＥＮＶ抗体がＺＩＫＶのＡＤＥを促進することができるが、中和が不十分であることを示している。
【０３５６】
抗ＤＥＮＶモノクローナル抗体の交差反応
ＤＥＮＶ感染患者から単離された形質膜芽細胞から生成された、ＤＥＮＶエンベロープタンパク質に反応する１４５のヒトモノクローナル抗体のプールを以前に作成した３４。これらの抗体の詳細なエピトープマッピングは３つの広い反応性を示した。十分に記載された融合ループエピトープ（ＦＬＥ）に反応する約１／３の抗体は、１／３は明確にマッピングされなかったが、融合ループ抗体のように、それらはウエスタンブロットによりエンベロープタンパク質に反応した（これらはエンベロープ残基Ｗ１０１の変異に対して感受性ではなかったため、非ＦＬＥと称される）。最後に、約４０の抗体群はウエスタンブロットによってエンベロープタンパク質に反応せず、無傷ウイルス粒子にのみ結合した。これらの抗体は、凍結電子顕微鏡法およびＸ線結晶学によって、基本のヘッドトゥーテール二量体を構成する２つのエンベロープタンパク質単量体の界面に形成された立体配座の四次エピトープに結合することが示されており、その９０はＤＥＮＶ糖タンパク質殻に正２０面体対称で配置されている３４、３８。この新しいエピトープをＥ二量体エピトープ（ＥＤＥ）と称し、これは、Ｅ中のＮ結合型グリカンＮ１５３の除去に対して感受性に基づいてＥＤＥ１およびＥＤＥ２の２つの群に細分された（ＥＤＥ２結合はＮ１５３の除去によって減少したが、ＥＤＥ１は減少しなかった）。いくつかのＥＤＥ抗体は、４種すべてのＤＥＮＶ血清型に対して完全に交差反応性であり、ピコモル範囲の感染を中和することができた。
【０３５７】
ＺＩＫＶに対する抗ＤＥＮＶモノクローナル抗体のパネルの結合を、捕捉ＥＬＩＳＡによって試験し、ＤＥＮＶへの結合と比較した（図４ａ）。アフリカ（ＨＤ７８７８８）株とフランスポリネシアン（ＰＦ１３）株との間の結合のプロファイルは非常に類似しており、融合ループ抗体がすべて、ＺＩＫＶと交差反応し、非融合ループ抗体の３６／３７が交差反応したが、ＥＤＥ抗体の交差反応は２７／３３  ＥＤＥ１および８／１７  ＥＤＥ２で可変である。結合曲線は、ＥＤＥ１に対するＥＤＥ２抗体の結合の結合力が低く、ＥＤＥ１  ｍＡｂ  ７５２−２Ｂ２の結合力が低いことを示した（図４ｂ）。
【０３５８】
ＤＥＮＶに対して生成されたほとんどすべてのｍＡｂが、以前の研究で生成した１４５のヒトモノクローナル抗体のすべてを含むＡＤＥを促進することが以前に実証されている３４。ＤＥＮＶ  ｍＡｂとＺＩＫＶとの交差反応性のために、我々は次に、抗ＤＥＮＶモノクローナル抗体がＺＩＫＶウイルス感染のＡＤＥを促進する能力を試験した（図５）。まず、ＺＩＫＶに対して中和活性を示さない３つの融合ループ抗体を試験した。これらの抗体のすべては、抗体または無関係の対照ｍＡｂとともにインキュベートしたＺＩＫＶと比較して、ＨＤ７８７８８の感染を増強するＡＤＥを５４〜７８倍促進した。予想どおりに、ＺＩＫＶを中和するＥＤＥ  ｍＡｂは、中和濃度で添加した場合にＺＩＫＶのＡＤＥも促進したが、ピーク増強は融合ループｍＡｂよりも低い濃度で見られた。これは、いくつかの異なる特異性を有するデング熱感染患者から単離されたモノクローナル抗体が、ＺＩＫＶに対して広い交差反応性を有することを実証する。
【０３５９】
ＥＤＥ  ｍＡｂは、ＤＥＮＶ血漿のＡＤＥを阻害することができる
融合ループおよびＥＤＥ  ｍＡｂは、ＥＤＥのフットプリントが融合ループ領域も網羅するため、重複するエピトープを有する。ＥＤＥ抗体がポリクローナル抗ＤＥＮＶ血漿により誘発されたＡＤＥを克服することができるかどうかを試験するために、抗ＤＥＮＶ血漿の濃度を高めてインキュベートしたＺＩＫＶに抗ＤＥＮＶ  ＥＤＥ１  ｍＡｂの滴定を加えた（図６）。融合ループ抗体は効果を示さなかったが、ＺＩＫＶの結合力が低い７５２−２Ｂ２を除くＥＤＥ１  ｍＡｂは、７５２−２Ｃ８および７５３（３）Ｃ１０をそれぞれ０．０９１±０．００７および０．０３４±０．００６μｇ／ｍｌの力価で５０％阻害を生じるＰＦ１３感染のＡＤＥを強力に阻害することができた。ＥＤＥ１  ｍＡｂよりもＺＩＫＶの結合力が低いＥＤＥ２  ｍＡｂは、このアッセイにおいてＡＤＥを阻害することができなかった。これらの研究は、ＥＤＥ１抗体がＺＩＫＶ  ＡＤＥを強力に阻害することができ、存在する場合、十分なレベルでインビボで保護し得ることを実証する。
【０３６０】
考察
南アメリカにおけるＺＩＫＶウイルス感染の、関連するギランバレー症候群および小頭症を伴う最近の爆発は大きな懸念である１５、１６、１７。ギランバレー症候群は、比較的まれな合併症であり、ＺＩＫＶに感染した個体の０．０２４％に影響を及ぼすと推定されるが、ＺＩＫＶ流行の規模のために、これは依然として多数の症例につながる１５。多くの研究は、依然として小頭症の正確な原因を理解するために実行する必要があるが、これが発達中の脳の子宮内感染によって引き起こされることがますます明らかになっている１７、３９、４０、４１、４２。ジカは、動物モデルにおいて、胎盤に感染し、成長を妨げることを示し、胎盤を通過して脳に感染し得ることも示されている４３、４４、４５。さらに、インビトロＺＩＫＶは、神経細胞培養に感染し、神経球の発達を破壊し得る４６、４７。母体の感染後の神経学的損傷の正確なリスクは依然として決定されていないが、初期の研究では、フランス領ポリネシアからの他の報告は約１％のリスクがあるが、これは最初の３カ月間で最大２２％であり得ることを示唆している４８、４９。
【０３６１】
ＺＩＫＶはＡｅｄｅｓ蚊により広がり、現在南アメリカではこれらの蚊がＤＥＮＶウイルスおよびチクングンヤウイルスの流行の拡大も促進している１９  。ＺＩＫＶにより影響を受けた多くの地域では、ＤＥＮＶに対する血清陽性は非常に高く、このような地域では、血清学的にＺＩＫＶ感染とＤＥＮＶ感染を区別する際に大きな問題がある２６、２７、３０。この論文では、ＺＩＫＶに対する抗ＤＥＮＶ血清反応の実質的な交差反応性を実証している。大部分の抗ＤＥＮＶ血漿はＺＩＫＶをほとんど中和しないが、それでも、ＡＤＥを強力に誘導することができる。
【０３６２】
関連する実施例において、抗ＤＥＮＶヒトモノクローナル抗体によるＺＩＫＶの中和が研究されている。興味深いことに、ＤＥＮＶ感染２８における抗体応答の主要部分を形成する抗融合ループ抗体は、ＡＤＥを促進し、感染を中和することができないことを示す。融合ループに反応する抗体は、多くのフラビウイルスにおいて幅広く反応することが知られているが、しばしばＥＬＩＳＡ法による強い交差反応にもかかわらず、恐らくそれらのエピトープが天然ウイルス粒子にほとんど曝露されないため、交差中和活性をほとんど示さない５０。加えて、ＥＤＥ１  ｍＡｂがＤＥＮＶの中和と同様のピコモル範囲で強力な中和を示したが、ＥＤＥ２  ｍＡｂもＺＩＫＶを中和するが、ＥＤＥ１  ｍＡｂほど強力ではないことを示す。これらの結果は、ＺＩＫＶエンベロープと複合体を形成するＥＤＥ１およびＥＤＥ２  ＦａｂのＸ線結晶構造とともに提示される。
【０３６３】
抗体依存性の増強は、約５０年前に初めてＤＥＮＶ感染について認識され、ＤＥＮＶの特徴である二次感染の重篤度を高める要因の１つであると考えられている３６。ＡＤＥのリスクは、特にＤＥＮＶワクチンの開発を困難にしている。Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒによって製造された最先端のＤＥＮＶワクチンＤｅｎｇｖａｘｉａ（ＣＹＤ−ＴＤＶ）は、いくつかの国で承認され、感染からいくらか保護されており、流行国で展開されている場合、３０年間にわたって疾病の負担を１０〜３０％削減すると推定されている５１。
【０３６４】
Ｄｅｎｇｖａｘｉａは、ＤＥＮＶの糖タンパク質殻を構成する前駆体膜タンパク質およびエンベロープタンパク質をコードする配列が弱毒化１７Ｄ黄熱病ワクチン株からの非構造配列と組み合わされた４価生弱毒化ワクチンである２８。Ｄｅｎｇｖａｘｉａは、これまでにＤＥＮＶに感染したことがある個人に保護を与えるが、ＤＥＮＶナイーブワクチン接種を与えられたときに、有効性が低いように見える２８、５１。
【０３６５】
Ｄｅｎｇｖａｘｉａのワクチン試験の最近の長期間の分析により、いくつかの安全性に対する懸念が提起されている２８。９歳未満の年齢群では、ＤＥＮＶ感染による入院は、ワクチン接種を受けていない対照群よりもワクチン接種を受けた小児において高かった。これは、研究試験の開始時にＤＥＮＶナイーブであり、初回抗原投与されているがワクチンによって保護されていない小児における抗体依存性の増強を示し得る。この理由から、ワクチンは９歳未満の子供の使用を認可されておらず、さらに、ワクチン接種される年齢群におけるこれまでのＤＥＮＶ曝露の血清陽性率が７０％以上である集団においてのみ使用することが推奨されている５１。
【０３６６】
現在、ＺＩＫＶに対するワクチンを製造するのに大きな負荷があり、この点に関して、ＤＥＮＶとＺＩＫＶとの広範な交差反応を血清学的に考慮する必要がある。ＤＥＮＶ血清陽性率の高い地域にワクチンを展開し、デノボを上げる必要がある可能性が高く、このような環境でＺＩＫＶの中和反応は困難である可能性がある。また、ＤＥＮＶナイーブ対象におけるＺＩＫＶ予防接種がＤＥＮＶのＡＤＥを促進し得、ＺＩＫＶ感染のＡＤＥを促進し得る可能性がある。
【０３６７】
ここに記載される結果は、ＤＥＮＶとＺＩＫＶとの間の複雑な血清学的相互作用を示す。ブラジルでのＺＩＫＶ感染とその合併症の爆発の正確な理由は完全に決定する必要があるが、既存のＤＥＮＶ免疫が感染した個体のウイルス複製を促進し、蚊の感染および感染拡大を促進し、合併症のリスクが高くなる可能性がある。ＡＤＥがＺＩＫＶの経胎盤移植を補助する可能性も研究する必要がある。交差反応する防御免疫および増強免疫がＤＥＮＶ感染後に経時的に変化し得るので、ＤＥＮＶ感染対ＺＩＫＶ感染のタイミングもまた重要であり得る。
【０３６８】
要約すると、ＺＩＫＶはＤＥＮＶとは配列が約４１〜４６％（Ｅタンパク質）異なるが、抗ＤＥＮＶ抗体とＺＩＫＶとの交差反応を可能にし、抗体依存性増強を引き起こすには十分の類似性がある。この点において、ＺＩＫＶは、これらの２つのウイルスに対するワクチンアプローチにおいて考慮されなければならない因子である、ＤＥＮＶ血清型の第５のメンバーと見なされ得る。
【０３６９】
方法
試料
書面によるインフォームドコンセントと、タイのＫｈｏｎ  ＫａｅｎおよびＳｉｒｉｒａｊ病院の倫理委員会と英国のＫｈｏｎ  Ｋａｅｎ  ａｎｄ  Ｓｉｒｉｒａｊ倫理委員会の承認を得て血液サンプルを収集した。ＤＥＮＶ感染の血清型は、ウイルスゲノムのＲＴ−ＰＣＲ検出によって決定した。デング熱病の回復から６ヵ月後にサンプルを採取した。
【０３７０】
細胞、試薬、および抗体
ベロ細胞（ＡＦＲＩＭＳからの贈呈品）、２９３Ｔ、およびＵ９３７細胞を、それぞれ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、およびＲＰＭＩ−１６４０中、３７℃で培養した。Ｃ６／３６細胞（ＡＦＲＩＭＳからの贈呈品）を、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５中、２８℃で増殖させた。すべての培地は、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有した。すべての細胞株は、マイコプラズマ汚染がなかった。
【０３７１】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）−  コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ａ９５４４）および西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｐ０２１４）は、それぞれ、ＳｉｇｍａおよびＤａｋｏから購入した。マウスモノクローナル抗ＤＥＮＶ  Ｅ、４Ｇ２は、ＡＦＲＩＭＳからの贈呈品であった。ＲＰＭＩ−１６４０（Ｒ８７５８）、ＤＭＥＭ（Ｄ５０４６）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ、Ｎ２７７０−５０）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ａ７０３０）、ジアミノベンジジン（Ｄ５９０５）、およびポリエチレンイミン（４０８７２７；Ｓｉｇｍａ）は、Ｓｉｇｍａからのものであった。ＭＥＭ（３１０９５）およびＬｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５（１１４１５）は、Ｇｉｂｃｏからのものであり、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ−ＰＦ（１２−７２７Ｆ）はＬｏｎｚａからのものであった。
【０３７２】
ウイルスストック。
すべてのウイルスは、Ｃ６／３６細胞で増殖させた。ＺＩＫＶ株ＨＤ７８７８８（アフリカ系統）は、Ａｎａｖａｊ  Ｓａｋｕｎｔａｂｈａｉによって提供された。ＺＩＫＶ株ＰＦ１３／２５１０１３−１８（ＰＦ１３）は、２０１３年にフランスポリネシアでＺＩＫＶ発生中に患者から単離された。ＤＥＮＶ−１（ハワイ）、ＤＥＮＶ−２（１６６８１）、ＤＥＮＶ−３（Ｈ８７）、およびＤＥＮＶ−４（１−００９３）は、ＡＦＲＩＭＳからの贈呈品であった。上清を含むウイルスを、−８０℃で保存する前に、４℃、２０００ｒｐｍでの遠心分離によって清澄化した。ウイルス力価は、ベロ細胞のフォーカス形成アッセイによって決定した３４。すべてのウイルスストックは、マイコプラズマ汚染がなかった。
【０３７３】
ヒトモノクローナル抗ＤＥＮＶ  Ｅ抗体の発現
免疫グロブリンＧ１の重鎖および軽鎖を含む一対のプラスミドをポリエチレンイミン法により２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションし、無タンパク質培地で培養した。抗体を含む培養上清を５日後に採取した。
【０３７４】
ＥＬＩＳＡによる抗ＤＥＮＶ抗体のＺＩＫＶ交差反応性の判定
ＭＡＸＩＳＯＲＰイムノプレート（４４２４０４；ＮＵＮＣ）を、マウス抗Ｅタンパク質、４Ｇ２（ＺＩＫＶに交差反応する融合ループマウスＡｂ）でコーティングした。プレートを、３％ＢＳＡで１時間ブロックし、続いてウイルス上清でインキュベートした。１時間後、１０μｇ／ｍｌの抗ＤＥＮＶ  ｈｕｍＡｂまたは連続希釈血漿を添加した。この反応は、ＡＬＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａ９５４４；Ｓｉｇｍａ）およびＰＮＰＰ基質によって可視化した。ＮａＯＨで反応を停止させ、吸光度を４０５ｎｍで測定した。エンドポイント力価（ＥＰＴ）は、擬似抗原で得られた平均ＯＤ値の２倍に相当する相反的な血漿希釈として定義された。
【０３７５】
中和アッセイ。
フォーカス減少中和アッセイ（ＦＲＮＴ）を用いて、抗体の中和能を判定した。ウイルスを３７℃で１時間、抗体または血漿サンプルの段階希釈物とともにインキュベートした。次いで、混合物をベロ細胞に添加し、２日間（ＺＩＫＶの場合）または３日間（ＤＥＮＶの場合）インキュベートした。次いで、記載されるように、フォーカス形成アッセイを実施した３４。簡潔に述べると、ベロ細胞を、抗Ｅ  ｍＡｂ  ４Ｇ２で染色し、続いてペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇ（Ｐ００４７；  Ｓｉｇｍａ）で染色した。病巣（感染細胞）は、ペルオキシダーゼ基質、ＤＡＢを添加することによって可視化した。フォーカス減少率を計算し、５０％のＦＲＮＴは、ＳＰＳＳパッケージからのプロビットプログラムを用いて計算した。
【０３７６】
抗体依存性増強アッセイ。
連続希釈された抗体または血漿サンプルを、Ｕ９３７細胞に添加する前に、３７℃で１時間、ウイルスとともにインキュベートした。インキュベーション２（ＺＩＫＶの場合）または３日後（ＤＥＮＶの場合）、上清を採取し、ウイルス力価をフォーカス形成アッセイによって測定した。倍数増加は、抗体の存在下／非存在下でのウイルス力価との比較によって計算した。
【０３７７】
ヒトｍＡｂによるＡＤＥ阻害は、上述のＡＤＥアッセイを行う前に、連続希釈した抗体で１：１０，０００希釈（ピーク増強希釈）でプールした回復期のデング高度免疫血清を予め混合することによって行った。
【０３７８】
参考文献
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１４．Ｃａｍｐｏｓ，  Ｇ．Ｓ．，  Ｂａｎｄｅｉｒａ  Ａ．Ｃ．，  Ｓａｒｄｉ  Ｓ．Ｉ．  Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｏｕｔｂｒｅａｋ，  Ｂａｈｉａ，  Ｂｒａｚｉｌ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２１，  １８８５−１８８６（２０１５）。
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３２．Ｓａｂｉｎ，  Ａ．Ｂ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  ｄｅｎｇｕｅ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗａｒ  ＩＩ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  １，  ３０−５０（１９５２）。
３３．Ｇｕｚｍａｎ，  Ｍ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｎｇｕｅ：  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ  ｇｌｏｂａｌ  ｔｈｒｅａｔ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８，  Ｓ７−１６（２０１０）。
３４．Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ，  ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒｅｍｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，  １７０−１７７（２０１５）。
３５．Ｈａｌｓｔｅａｄ，  Ｓ．Ｂ．，  Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ  Ｅ．Ｊ．Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ．Ｉ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｎｏｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １４６，  ２０１−２１７．（１９７７）。
３６．Ｈａｌｓｔｅａｄ，  Ｓ．Ｂ．，  Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ  Ｅ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２６５，  ７３９−７４１（１９７７）。
３７．Ｚｏｍｐｉ，  Ｓ．，  Ｈａｒｒｉｓ  Ｅ．  Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｕｓｅｓ  ４，６２−８２（２０１２）。
３８．Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ，（２０１５）。
３９．Ｃａｌｖｅｔ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  Ｚｉｋａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ  ｏｆ  ｆｅｔｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｙ  ｉｎ  Ｂｒａｚｉｌ：  ａ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，（２０１６）。
４０．Ｍａｒｔｉｎｅｓ，  Ｒ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆｉｅｌｄ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｔｗｏ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｌｙ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｎｅｗｂｏｒｎｓ  ａｎｄ  Ｔｗｏ  Ｆｅｔａｌ  Ｌｏｓｓｅｓ  −  Ｂｒａｚｉｌ，  ２０１５．ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  ６５，  １５９−１６０（２０１６）。
４１．Ｍｅａｎｅｙ−Ｄｅｌｍａｎ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ａｍｏｎｇ  Ｕ．Ｓ．  Ｐｒｅｇｎａｎｔ  Ｔｒａｖｅｌｅｒｓ  −  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１５−Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１６．ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  ６５，２１１−２１４（２０１６）。
４２．Ｓａｒｎｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｌｌｂｉｒｔｈｓ：  Ａ  Ｃａｓｅ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｐｓ  Ｆｅｔａｌｉｓ，  Ｈｙｄｒａｎｅｎｃｅｐｈａｌｙ  ａｎｄ  Ｆｅｔａｌ  Ｄｅｍｉｓｅ．ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  １０，ｅ０００４５１７（２０１６）。
４３．Ｃｕｇｏｌａ，  Ｆ．Ｒ．，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  Ｉ．Ｒ．，  Ｒｕｓｓｏ  Ｆ．Ｂ．，  Ｆｒｅｉｔａｓ  Ｂ．Ｃ．Ｔｈｅ  Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  Ｚｉｋａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｂｉｒｔｈ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ，（２０１６）。
４４．Ｍｉｎｅｒ，  Ｊ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ
ｉｎ  Ｍｉｃｅ  Ｃａｕｓｅｓ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  Ｆｅｔａｌ  Ｄｅｍｉｓｅ．Ｃｅｌｌ  １６５，１−１１（２０１６）。
４５．Ｌｉ，  Ｃ．，  Ｘｕ  Ｄ．，  Ｙｅ  Ｑ．，  Ｈｏｎｇ  Ｓ．，  Ｊｉａｎｇ  Ｙ．  Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄｉｓｒｕｐｔｓ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １９，１−７（２０１６）。
４６．Ｄａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄｅｐｌｅｔｅｓ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＬＲ３．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，（２０１６）。
４７．Ｇａｒｃｅｚ，  Ｐ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．Ｚｉｋａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｎｄ  ｂｒａｉｎ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０１６）。
４８．Ｂｒａｓｉｌ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｒｅｇｎａｎｔ  Ｗｏｍｅｎ  ｉｎ  Ｒｉｏ  ｄｅ  Ｊａｎｅｉｒｏ  −  Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｒｅｐｏｒｔ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，（２０１６）。
４９．Ｃａｕｃｈｅｍｅｚ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｚｉｋａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｙ  ｉｎ  Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｏｌｙｎｅｓｉａ，  ２０１３−１５：  ａ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ，（２０１６）。
５０．Ｓｔｉａｓｎｙ，  Ｋ．，  Ｋｉｅｒｍａｙｒ  Ｓ．，  Ｈｏｌｚｍａｎｎ  Ｈ．，  Ｈｅｉｎｚ  Ｆ．Ｘ．Ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｉｔｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０，  ９５５７−９５６８（２００６）。
５１．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  （ＷＨＯ）  Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｔｓ．Ｄｅｎｇｕｅ  ｖａｃｃｉｎｅ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ／ｓａｇｅ／ｍｅｅｔｉｎｇｓ／２０１６／ａｐｒｉｌ／ＳＡＧＥ＿Ａｐｒｉｌ＿２０１６＿Ｍｅｅｔｉｎｇ＿Ｗｅｂ＿ｓｕｍｍａｒｙ．ｐｄｆ？ｕａ＝１．（２０１６）。
【０３７９】
実施例２：ジカウイルスとデングウイルスとの間の強力な交差中和の構造的基礎
ジカウイルスは、ブラジルの新生児における小頭症およびフランスのポリネシアの成人におけるギランバレー症候群に関連していた最近の大発生まで、ヒトの重症疾患に関連していなかったフラビウイルス属の一員である。ジカウイルスはデングウイルスに関連しており、デング患者から単離され、立体配座エピトープを標的とする抗体のカテゴリーがジカウイルスを強力に中和することを本明細書に報告している。ジカウイルスのエンベロープタンパク質と複合体を形成するこれらの抗体の２つの結晶構造は、保存されたエピトープの詳細を明らかにし、これはウイルス成熟中のエンベロープタンパク質二量体と前駆体ｐｒＭタンパク質との相互作用部位でもある。ジカおよびデングウイルスの免疫複合体の比較は、ジカおよびデングウイルスを同時に防御する強力な中和抗体を誘発できるユニバーサルワクチンの合理的でエピトープを焦点する設計の基礎をなす。
【０３８０】
最近導入されたブラジルおよび他の中南米諸国におけるジカウイルス（ＺＩＫＶ）の爆発的な広がりは、小頭症例の増加と関連していた１〜４。また、２０１３年から２０１４年のフランスポリネシア流行５では、ギランバレー症候群がＺＩＫＶ感染症と関連しており、世界保健機関がこれらの神経疾患を２０１６年２月１日に国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態と宣言している６。近年の流行に先立ち、ＺＩＫＶは軽度または自己限定性疾患のみを引き起こすと考えられた７。胎児感染および神経学的合併症に至る生理学的プロセスは未解決であり、特定の治療的または予防的介入は現在利用可能ではない。ＺＩＫＶ病因の洞察を得るために、特に安全かつ保護的なワクチンを開発するために、他のフラビウイルスとのウイルス中和および交差反応性の構造的基礎を理解することが不可欠である。
【０３８１】
ヒト間でのＺＩＫＶの伝染および流行の広がりは、Ａｅｄｅｓ蚊によって主に維持されているが、性感染の報告もある８〜１０。ＺＩＫＶは、フラビウイルス科フラビウイルス属に属する節足動物媒介性エンベロープウイルスであり、これには、ヒト病原黄熱病、デング熱、西ナイル脳炎およびダニ媒介性脳炎ウイルスも含まれる１１。フラビウイルスは、感染細胞の小胞体（ＥＲ）にヘテロ二量体を形成し、ＥＲ内腔への棘状の未成熟ビリオンの出芽を促進する２つの構造糖タンパク質ｐｒＭおよびＥ（それぞれ前駆体膜およびエンベロープタンパク質に対して）を有する。その後、出芽した粒子は、細胞の分泌経路を通過して輸送され、その過程でｐｒＭは、トランスゴルジ常在フリンプロテアーゼによってタンパク質分解成熟を受ける１２〜１４。この成熟プロセスは、感染性のために必要であり、ビリオン表面でのＥの再編成をもたらす。感染細胞から放出され、成熟した粒子は、「ヘリンボーン」パターンに２０面体対称で編成されたビリオンの外表面をコーティングする９０のＥ二量体を有する滑らかな側面を有する１５、１６。
【０３８２】
成熟したＺＩＫＶ粒子の三次元クライオＥＭ構造は、最近、デングウイルス（ＤＥＮＶ）などの既知の構造の他のフラビウイルスと本質的に同じ組織を持っていることを示す、ほぼ原子分解能（３．８Å）であることが報告され１７、１８、これに対して、３．５ÅクライオＥＭの再構築が、これまでに報告され１６、西ナイルウイルスも報告された１９，２０。Ｅタンパク質は、約５００アミノ酸長であり、４００個のＮ末端残基が外部ドメインを形成し、Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩと名付けられた３つのドメインを有するβシートとして本質的に折り畳まれ、中心にドメインＩと一列に並んで整列する。高度に保存された融合ループは、Ｅ二量体界面に埋もれているドメインＩＩの棒の末端にある。Ｃ末端には、２つのＣ末端膜貫通α−  ヘリックスに連結するウイルス膜（「幹」ヘリックス）上に平らに横たわる２つのα−ヘリックスを特徴とする、いわゆる「幹」が続く。ＺＩＫＶビリオンの主な際立った特徴は、ビリオン表面１７、１８から突出する、Ｅのグリコシル化ループ（「１５０」ループ）における挿入である。
【０３８３】
フラビウイルスは、ポリクローナル免疫血清２１を用いた交差中和研究に基づいて血清複合体に分類されている。Ｅタンパク質は、中和抗体の主な標的である。Ｅはウイルス侵入中に膜融合を担うので、ウイルスエンベロープとエンドソーム膜との融合を誘発するように立体配座の変化を引き起こすように準安定性の立体配座で維持され、それによりウイルス遺伝子物質を細胞質に放出する。Ｅ二量体のこの準安定性の１つの結果は、それが二量体界面内に通常埋め込まれた領域を曝露するように、「呼吸」２２と呼ばれる動的挙動を示すことである。そのような領域の１つは、主要な交差反応性抗原部位２３である融合ループエピトープ（ＦＬＥ）である。この部位に対する抗体は、マウスモデル２４の西ナイルウイルスについて示されるように、補体介在機構によって防御的であり得るが、中和が不十分であり、抗体依存性増強（ＡＤＥ）  ２５〜２９をもたらし、これにより悪化させ、安全かつ効果的なワクチンの開発を複雑にしていることが示されている。
【０３８４】
最近、デング熱患者から単離された抗体のパネルの単離および構造的特徴付けを報告した２７、３０。これらの抗体の大部分は、ＦＬＥを標的としたが、二量体の２つのＥサブユニット間の界面で、ビリオン上のＥタンパク質の曝露した表面で容易に接近可能な四次部位を標的としたものもあった。「Ｅ二量体エピトープ」についてＥＤＥと呼ばれるこれらの広く中和する抗体（ｂｎＡｂ）は、４種すべての血清型のＤＥＮＶを強力に中和する。それらの結合部位は、細胞のゴルジ装置を通して未成熟ウイルス粒子を輸送する間に、ｐｒＭとＥ二量体との相互作用部位でもあるため、血清型間で保存されている。ＥＤＥ  Ｍａｂの２つのサブセットがあり、結合のための１５０ループ上のグリコシル化の差別的要件を特徴とした。ＥＤＥ１  ｂｎＡｂは、グリカンの非存在下でより良好に結合するが、グリカンが存在する場合、ＥＤＥ２  ｂｎＡｂは、より良好に結合する。
【０３８５】
この実施例では、ＥＤＥ  ＭａｂがＤＥＮＶを中和するほど強力にＺＩＫＶを中和することを確認した。また、ＤＥＮＶを中和するＦＬＥ抗体（ＥＤＥ  Ｍａｂｓほど強力ではないが）が、組換えＺＩＫＶ  Ｅタンパク質に対する非常に高い親和性にもかかわらず、１μＭまでの濃度でＺＩＫＶを中和しないことも見出した。ＥＤＥ１  Ｃ８およびＥＤＥ２  Ａ１１と複合して、それらの結合決定基を同定する、ＺＩＫＶ  Ｅタンパク質二量体の結晶構造をさらに記載する。結合のためにＤＥＮＶの１５３位にグリコシル化部位を必要とするＥＤＥ２  Ａ１１が、ｎＭ  ＩＣ５０にもかかわらず、その結合能を強く減少させる、ＺＩＫＶ  ｓＥ上の１５４グリカンと同じ相互作用を起こすことができないことを示しており、このことは、実施例１に記載されるように、ＡＤＥを増加させたことを示す。
【０３８６】
ＺＩＫＶ−ＤＥＮＶスーパー血清群
ウイルスＲＮＡポリメラーゼＮＳ５のアミノ酸配列を用いた主要なヒト病原性フラビウイルスの系統発生解析は、蚊媒介性脳炎ウイルス群とのＺＩＫＶのクラスタリングを示している（図１ａ）。興味深いことに、このクラスター化は、Ｅタンパク質のアミノ酸配列が考慮され、ＺＩＫＶがＤＥＮＶ群で分岐する場合には異なる。このクラスタリングが抗体との相互作用に反映されるかどうかを調べるために、昆虫細胞において産生される組換え可溶性ＺＩＫＶ細胞外ドメイン（ＺＩＫＶ  ｓＥ）に対して不十分な中和、交差反応性ＦＬＥ、および強力に中和するＥＤＥ  ＭＡｂの親和性を測定するために、Ｏｃｔｅｔ装置を用いたバイオ層干渉法（ＢＬＩ）を使用した（オンライン方法を参照のこと）。ＤＥＮＶ  ｓＥとは対照的に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってモニタリングされるように溶液中で本質的に単量体であり、ＥＤＥ抗体断片３０による結合の際に二量体に変換されたＺＩＫＶ  ｓＥは、ＳＥＣで二量体として挙動した（ＥＤ．図１ｂ）。
【０３８７】
ＢＬＩ実験は、３つの抗体、ＥＤＥ１  Ｃ８、ＥＤＥ２  Ａ１１、および代表的なＦＬＥ抗体、Ｐ６Ｂ１０を用いて行った。ＦＬＥ  Ｍａｂは、ＥＤＥ１  Ｃ８（１．５ｎＭ対９ｎＭ）に対してほぼ１対数のより高い親和性で結合し、μＭ範囲に近い解離定数を有するＥＤＥ２  Ａ１１よりも約３対数高かった（図１ｂおよびＥＤ  図１ａ）。それらの結合親和性と一致して、ＳＥＣによりＺＩＫＶ  ｓＥ／Ｃ８  Ｆａｂ複合体を単離することができたが、Ａ１１についてはそのような複合体は観察されなかった（ＥＤ  図１ｂ）。これらおよび３つの抗体サブセットの他のメンバーを用いたアフリカミドリザル（ベロ）細胞における中和アッセイは、ＥＤＥ１抗体がＺＩＫＶを強く中和したのに対して、ＥＤＥ２は少なくとも１対数の効力が低いことを示した。その強力な結合親和性にもかかわらず、Ｐ６Ｂ１０は使用濃度範囲で中和せず、２つの他のＦＬＥ抗体のいずれも試験しなかった（図２）。ＥＤＥ１  Ｍａｂは、長年にわたり、乳児期マウスの脳を細胞培養に適合し継代されており、Ｅグリコシル化を欠いているアフリカ系統ＨＤ７８７８８をより良好に中和した。しかし、２０１３年にフランス領ポリネシアで単離され、１５０ループの１５４位でＥタンパク質がグリコシル化されたＰＦ１３株は、４種の血清型のＤＥＮＶに匹敵する（しばしばより低い）ＩＣ５０を有するＥＤＥ１  Ｍａｂによって中和された（表１の要約を参照）。ＥＤＥ２  Ｍａｂは、２つの菌株の中和に差異を示さず、ＺＩＫＶ  Ｅタンパク質中のＮ１５４グリカンの存在がＤＥＮＶに反して相互作用を増強しなかったことを示唆している。
【０３８８】
ＥＤＥ  ｂｎＡｂとのＺＩＫＶの免疫複合体
結晶化条件、得られた結晶、および構造決定は、オンライン法の節に記載され、ＥＤ表１に要約されている。ＺＩＫＶ  ｓＥとＥＤＥ１  Ｃ８およびＥＤＥ２  Ａ１１との複合体の結晶は、それぞれ、ｓｃＦｖおよびＦａｂ断片で得られた。構造の平均分解能は、非配位ＺＩＫＶ  ｓＥ二量体の構造に対して２．７Åおよび２．９Å（それぞれ）および３．１Åである。回折パターンは、３つの結晶において異方性であり、３つの直交方向の分解能限界は、ＥＤ表１に引用されている。非配位ＺＩＫＶの構造では、溶液中の単量体として挙動する、細菌で産生され、インビトロで再折りたたまれたＺＩＫＶ  ｓＥの最近決定された構造に反して、１５０ループが順序付けられ３１、グリカンがループの構造に役立ち、ＳＥＣの二量体を観察したので、ｓＥ二量化も促進することを示す。
【０３８９】
予想されるように、抗体は、前述の３０ＤＥＮＶ血清型２（ＤＥＮＶ−２）ＳＥ二量体を認識するのと同じ方法で、ＺＩＫＶ  ＳＥ二量体で四次エピトープを認識する。ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ−２  ｓＥアラインメント上のＥアミノ酸ごとの抗体接触は、ＥＤ図２に表示され、一方、抗体の配列上のＥタンパク質接触は、ＥＤ図３に示されている。予想どおりに、このパターンは、非常に似ており、少数の領域を有し、図の赤枠で様々にハイライト表示されている。占有されていないエピトープと非占有のエピトープの立体配座は類似しているが、Ｃ８を用いた複合体の場合には、ｓＥ二量体の両方のエピトープが占有され（図３）、Ａ１１の場合には１つの部位のみが占有されることが見出された（図４）  。結晶環境の検査により、結晶中の隣接する複合体と衝突することなく、第２のＦａｂをこの位置にドッキングすることができないことが示された。この観察は、Ａ１１の低い親和性によって促進される単一のＦａｂが結合したｓＥ二量体の取り込みのために選択された結晶成長を示す。
【０３９０】
ＺＩＫＶ  ｓＥに対するＭＡｂの結合角は、ＤＥＮＶ−２  ｓＥと比較して異なる（図３および図４の挿入図を参照のこと）。Ｃ８複合体の場合、角度の差は、主にｓＥ二量体の変化した曲率に起因する。抗体と複合したＺＩＫＶ  ｓＥの立体配座は、７９０Ｃα原子についておよそ１．５Åの標準偏差（ＲＭＳＤ）を有するウイルス粒子に適合するものと非常に類似していることに留意する（ＥＤ  表２を参照のこと）。ここで結晶化した非結合ＺＩＫＶ  ｓＥは、より遠い立体配座（両方のビリオンＺＩＫＶ  ＥといずれかのｓＥ抗体複合体と比較するとき、２．５ÅのＲＭＳＤ）を示し、抗体がウイルス粒子の立体配座により近い立体配座を安定化することを示唆している。対照的に、ＤＥＮＶ−２  ｓＥに対して単独でまたは抗体と複合して行った同様の比較は、クライオＥＭによって観察されたビリオン上のその立体配座に関して５〜７ÅのＲＭＳＤ値をもたらす。これらの構造では、ｓＥ二量体の湾曲は、ビリオン上のもの（図３および図４の挿入図）、基礎的なステムα−ヘリックスおよびビリオン上のＭタンパク質（フリン切断後の膜結合した残基のｐｒＭ）との相互作用の不在に関連する可能性が高い特徴と著しく異なる。
【０３９１】
比較のために、ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ−２からのビリオンＥの細胞外ドメインの重ね合わせは、同様の１．５ÅＲＭＳＤをもたらし、それらはおおよそ同じ方法で提示されるが、ＤＥＮＶ  ｓＥは溶液中でより変形可能であることを示す。この展性は、ＤＥＮＶ  Ｅについて報告された高次構造の呼吸に反映し得る２２。対照的に、ＺＩＫＶにおけるＥ細胞外ドメインの構造はより安定しているようであり、ビリオン上でさらなる相互作用がない場合でも依然として同じである。この特性は、最近説明されたＺＩＫＶビリオンのより高い安定性に連結し得る１７。
【０３９２】
ＥＤＥ１  Ｃ８複合体
ＺＩＫＶ  ＳＥとの複合体におけるＥＤＥ１の総埋没表面積（ＢＳＡ）は、ＤＥＮＶ−２  ＳＥ複合体における約１３００Å２と比較して約９００Å２である（ＥＤ表３）。エピトープ領域の保存を図３ｄに示し、図３ｅおよび３ｆは、ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ  ｓＥ上のＣ８フットプリントを比較する。ＤＥＮＶ−２  ｓＥ構造で順序付けされたＮ６７位のグリカン（図３ｃ）は、フットプリント面積の全体的な差の約３分の２を占める。Ｎ６７グリカンは、重鎖のフレームワーク領域２（ＦＲＨ２）と相互作用し、ＺＩＫＶ  ｓＥ中に存在しないことは、これらの接触が結合に必須ではないことを示す。維持される相互作用の主な集団は、ドメインＩＩのβストランドｂを中心とし、ＣＤＲ  Ｈ２、Ｈ３、およびＬ３からの側鎖はすべて、水素結合ドナー（ＮＨ原子）およびｂｄｃβシート端部の受容体（主鎖カルボニル）を認識する（図３ｂおよび３ｃ）。さらに、融合ループの主鎖（いくつかのグリシン残基を含む）およびＣｙｓ７４とＣｙｓ１０５との間のジスルフィド結合は、ＣＤＲ  Ｌ１およびＬ３の芳香族側鎖によって囲まれている（ＥＤ図１も参照のこと）。これらの２つのＣＤＲからの残基はまた、融合ループの厳密に保存された側鎖（Ａｒｇ  ９９）または近く（Ｇｌｎ  ７７）も認識する。
【０３９３】
二量体界面を横断して、ＤＥＮＶ２との複合体と同様に、１５０ループは部分的に不規則であり、Ｎ１５４グリカンに対して検出可能な密度はない。ＥＤ図４に示すように、二量体界面を横断するドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩとの相互作用は、配列の違いのため、異なり、ＤＥＮＶ−２  ｓＥ複合体において、これらの接触は、βストランドＡおよびＢでなされ、ＺＩＫＶにおいては、それらは主に、直接または水媒介水素結合のネットワークを有する、ＣＤＲ  Ｌ１およびＬ２と相互作用するβストランドＥからのＬｙｓ  ３７３を含む（ＥＤ図４ｂおよび４ｃ）。同様に、ドメインＩ中のおよび界面を横断するドメインＩＩの近くのｋｌループからの多数の荷電残基が結合に寄与し、重鎖ＣＤＲ  Ｈ２およびＨ３と相互作用する（ＥＤ図４ｅおよびｆ）。Ｃ８とＺＩＫＶ  ｓＥとの間の極性相互作用はすべて、ＥＤ表４および５に列挙され、エピトープの静電表面がＥＤ図５の左側パネルに表示される。要約すると、これらの観察は、Ｃ８の主な結合決定因子としてドメインＩＩのｂストランドおよび融合ループとの接触の保存された集団に置き、二量体界面を横断するか、またはＤＥＮＶのＮ６７グリカンからのさらなる接触は、相互作用をさらに安定化させるが、相互作用を決定しない。
【０３９４】
ＥＤＥ２  Ａ１１複合体
Ａ１１抗体は、ＤＥＮＶ−２  ｓＥで見られたものとは非常に異なる角度で結合し、ｓＥ二量体の湾曲の差異を説明する。ｂストランドに沿った接触は保存されるが、抗体はこのストランドに対して異なる角度を作る（図４ｂ）。Ｃ８と比較して、ｂストランドはその末端（残基７１および７３）でのみ認識されるが、Ｃ８は残基６８（またはＤＥＮＶでは６７）からすべて認識する。１５０ループ上のグリカンとの接触もまた結合にとって重要であるため、Ａ１１の観察された傾斜結合は、ＤＥＮＶにおける１５３グリカンと比較して１５４グリカンのシフトした位置に関連している可能性が高い。水素結合相互作用の詳細は、３．８Åのより限定された分解能のため、ＤＥＮＶ−２  ｓＥとの複合体ではあまり明確に定義されていない。しかし、グリカンとは一連の異なる接触があることは明らかである（図４ｃおよびＥＤ図６ｂ）。ＤＥＮＶ２  ｓＥ／Ａ１１複合体において、グリカンは長いＣＤＲ３ループ中のα−ヘリックスによって認識される。ＺＩＫＶ  ｓＥの場合には、グリカン部位の前に挿入が存在し、ＣＤＲＨ３αヘリックスと同じ相互作用をすることができないように、約６〜７Åのシフトを生じる。重要なことに、ビリオン上のＺＩＫＶの構造または非結合グリコシル化ＺＩＫＶ  ｓＥとの比較は、１５０ループが良好に規則化していること（ＥＤ図６ａ）、およびＤＥＮＶ２ウイルスの場合と同様に、ＥＤＥ１抗体によって不規則に誘導されることを示す。ＥＤ図６ｃは、グリカン鎖が所定の位置に残留し得るＣ８との衝突を示す。
【０３９５】
考察
これらの結果は、ジカウイルスとデングウイルスとの間に強力な交差中和のこれまでに認識されていない連結を提供し、したがって、伝統的な血清複合体を越えて抗原性フラビウイルス集団を同定する四次エピトープの構造的詳細を同定する。この関係は、ポリクローナル血清２１を用いて認識されなかった保存されたエピトープによる強力な交差中和に基づいて、スーパー血清群を定義する。したがって、この研究は、この群のすべてのウイルスを防御できるユニバーサルワクチンの合理的な設計の基礎を築いている。
【０３９６】
デングウイルスに対するワクチン設計は、ＤＥＮＶ粒子の異種性および４種すべての血清型３２、３３に対して免疫性を与えるための多価式の使用の必要性によって妨げられてきた。ＤＥＮＶの特徴の１つは、多くの細胞型においてｐｒＭの不完全なフリン成熟切断を受け、片側に未成熟のスパイク状パッチを有し、反対側３４に平滑な成熟様領域を有する不均一なモザイク粒子を生じることである。これらの粒子は、平滑で成熟した面を介して細胞膜と融合することができるので、感染性である。ＦＬＥが未成熟領域３５に曝露されているため、ＤＥＮＶ感染患者における圧倒的な抗体応答はそれ３６に対して向けられる。これらの高度に交差反応性の抗体は、粒子を本質的に「未成熟側」  ３５にコーティングするので弱い中和であり、成熟した感染側３７〜３９に結合して中和するＥ二量体の「呼吸」効果に依存する。Ｍａｂ  Ｐ６Ｂ１０（図１）によって例示されるような、Ｅタンパク質に対するＦＬＥ抗体の高い結合力、およびそれが非中和または非常に中和されていないという事実（図２）は、  ＺＩＫＶ粒子上の未成熟なパッチにのみ結合する可能性が高いことを示唆している。低中和活性のＦＬＥ特異的Ｍａｂとの複合体における単量体ジカｓＥの最近公開された構造は、実際に、その結合部位が成熟感染性ビリオン上の二量体Ｅタンパク質において閉塞されることを示している３１。Ｍａｂ  Ｐ６Ｂ１０および他のＦＬＥ抗体が、依然としてＤＥＮＶ２７を中和するという観察は、ＺＩＫＶの高い熱安定性により示唆されるように、成熟したパッチは、ＤＥＮＶでは速く、ＺＩＫＶでは遅いという異なる「呼吸」速度を持つことを示唆しており、観察はそれをできるように、最近報告されたＺＩＫＶの高度な熱安定性１７によって、ＤＥＮＶにおいて成熟したパッチをより迅速にコーティングするのを可能にするが、ＺＩＫＶでは中和しないことを示唆してる。
【０３９７】
これらのデータは、ＺＩＫＶ／ＤＥＮＶスーパー血清群に対するエピトープ重視ワクチンを開発することが実行可能なアプローチであることを示唆している。ＥＤＥ１  ｂｎＡｂによって標的とされるエピトープが、ＦＬＥとの著しい対照に、不十分な中和および強力な感染を増強する抗体２６〜２８を誘導する、この目的に最も適していることは、結果から明らかである。ＥＤＥ２抗体はまた、ｓＥ二量体（図１）のためのそれらの不良な結合力と一致して、ＡＤＥ２６を誘導することも示された。ＥＤＥ１は、ＥＤＥ２よりもＥ表面上に伸びており（ＥＤ図５の比較を参照）、グリカンの存在に依存せず、ＺＩＫＶにおける１５４グリカンのシフトは、それがあまり結合しない可能性が高い理由である。対照的に、ＥＤＥ１  Ｍａｂは結合するために二量体を必要とするが、二量体の隣接するサブユニットの接触点は、相互作用の重要な決定因子であるとは思われないが、但し、それらがＭａｂ結合と不適合ではないならば、実際の決定因子は、ｂストランドおよび融合ループの要素のみに曝露される、高度に保存されたＥ二量体を中心とする。主鎖が厳密に保存されており、いかなるフラビウイルスにおけるｂストランドの領域内のポリペプチド鎖においてアミノ酸挿入も欠失も認められないため、このアプローチを他のフラビウイルスに拡張する可能性は高い。このようなアプローチは、臨床試験において限られた成功を収めてきたＤＥＮＶ集団に対するマルチ免疫原アプローチの強力な代替案となり得る４０。最後に、本発明者らの研究はまた、エフェクター部位４１に「ＬＡＬＡ」変異を有し、残りのＡＤＥ効果をすべて排除するＥＤＥ１抗体が、ＺＩＫＶ感染に罹患するリスクのある妊娠中の女性に対する免疫予防に有用であり得ることも示唆している。
【０３９８】
参考文献
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３５  Ｃｈｅｒｒｉｅｒ，  Ｍ．  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ａ  ｆｕｓｉｏｎ−ｌｏｏｐ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２８，  ３２６９−３２７６，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｅｍｂｏｊ．２００９．２４５（２００９）。
３６  Ｂｅｌｔｒａｍｅｌｌｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓ  ｄｏｍｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｎｄｏｗｅｄ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ８，  ２７１−２８３，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０１０．０８．００７（２０１０）。
３７  Ｄｏｗｄ，  Ｋ．  Ａ．，  Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，  Ｓ．，  Ｋｕｈｎ，  Ｒ．Ｊ．＆  Ｐｉｅｒｓｏｎ，  Ｔ．  Ｃ．  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ  ｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８８，  １１７２６−１１７３７，  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０１１４０−１４（２０１４）。
３８  Ｌｅｅ，  Ｐ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｍｐａｃｔｓ  ｔｈｅ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８７，  １３７２９−１３７４０，  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２３４０−１３（２０１３）。
３９  Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８８，  ７２１０−７２２０，  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０３６９０−１３（２０１４）。
４０  Ｃａｐｅｄｉｎｇ，  Ｍ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  Ａｓｉａ：  ａ  ｐｈａｓｅ  ３，  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，  ｏｂｓｅｒｖｅｒ−ｍａｓｋｅｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ３８４，  １３５８−１３６５，  ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０−６７３６（１４）６１０６０−６（２０１４）。
４１  Ｈｅｓｓｅｌｌ，  Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４９，  １０１−１０４，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６１０６（２００７）。
【０３９９】
方法
ＺＩＫＶ  ｓＥタンパク質の組換え産生。組換えジカウイルスｓＥタンパク質（菌株Ｈ／ＰＦ／２０１３、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＪ７７６７９１）は、前述４２、４３のように、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でタンデムＳｔｒｅｐタグを用いて産生された。ジカｓＥ配列（アミノ酸１〜４０８）を含む化学的に合成されたＤＮＡ断片（ＧｅｎｅＡｒｔ）を、輸出シグナル配列ＢＩＰ、エンテロキナーゼ切断部位、およびｓｔｒｅｐタグをコードする発現ベクターｐＴ３８９４４にクローニングした。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞を、選択のためにブラストサイジンを用いて安定にトランスフェクトした。タンパク質発現は、ＣｕＳＯ４の添加によって誘導され、上清は誘導から７〜１０日後に収穫した。抗原は、製造業者の指示に従って、ストレプトアクチンカラム（ＩＢＡ）を用いた親和性クロマトグラフィーによって精製した。最終精製ゲル濾過工程は、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、５００ｍＭのＮａＣｌで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ２００  １０／３００  ＧＬカラムを使用した。
【０４００】
ｂｎＡｂの抗原結合性（Ｆａｂ）および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片の産生。ｂｎＡｂ断片を、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞においてＦａｂ４５およびｓｃＦｖ４６としての発現のためにプラスミドにクローニングした。構築物は、親和性精製のためにＣ末端（Ｆａｂの場合には重鎖のみ）に融合されたタンデムｓｔｒｅｐタグを含む。精製プロトコルは、上記のようにゲル濾過を行った後、ストレプトアクチン親和性カラムを含んだ。
【０４０１】
免疫複合体の形成および単離。精製されたＺＩＫＶ  ｓＥタンパク質を、標準緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ  ｐＨ８．０）中でＦａｂ  Ａ１１またはｓｃＦｖ  Ｃ８（約２倍モル過剰）と混合した。体積を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １０ｋＤａカットオフで遠心分離により０．５ｍｌにし、４℃で３０分間インキュベートした後、ＺＩＫＶ  ｓＥおよびｓｃＦｖ  Ｃ８のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、過剰のＦａｂまたはｓｃＦｖから複合体を分離した。ＺＩＫＶ  ｓＥおよびＦａｂ  Ａ１１については、ＳＥＣにおいて見かけの複合体形成は見られず、したがって、１．５ｍｇ／ｍｌの濃度のｓＥおよび３ｍｇ／ｍｌの濃度のＦａｂ  Ａ１１を含む溶液（約１：２の抗原：抗体のモル比に相当）を結晶化に直接使用した。すべての場合において、緩衝液を、結晶化試験のために１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８に交換した。２８０ｎｍで吸光度を測定し、アミノ酸配列から推定される減衰係数を用いることによって決定される、結晶化のために使用されるタンパク質濃度を、拡張データ表１に列挙する。
【０４０２】
リアルタイムバイオ層干渉分光結合アッセイ。精製ＺＩＫＶ  Ｅタンパク質とＭａｂ  ＩｇＧ  ＦＬＥ  Ｐ６Ｂ１０、ＩｇＧ  ＥＤＥ１  Ｃ８、ＩｇＧ  ＥＤＥ２  Ａ１１、および対照Ｍａｂ  ＩｇＧ  ２８Ｃ（抗インフルエンザウイルス）およびＩｇＧ  Ｋ９（抗Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａウイルス）との相互作用を、  バイオ層干渉分光Ｏｃｔｅｔ−Ｒｅｄ  ３８４デバイス（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてリアルタイムでモニタリングした。抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ捕捉バイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ＋ｔｗｅｅｎ０．０１％）中の５μｇ／ｍｌの抗体を用いて１０００ｒｐｍ振盪速度で１０分間負荷した。結合していない抗体を、アッセイ緩衝液中で１分間洗い流した。次いで、アッセイ緩衝液中の２倍連続希釈ＺＩＫＶ  ｓＥタンパク質濃度の非存在下および存在下で、ＩｇＧ負荷センサーを１５分間、１２００ｒｐｍでインキュベートした。モル濃度は、二量体形態のｓＥタンパク質について計算した。Ｍａｂ  ＦＬＥ  Ｐ６Ｂ１０、ＥＤＥ１  Ｃ８、およびＥＤＥ２  Ａ１１について、以下のＺＩＫＶ  ｓＥ濃度範囲は、それぞれ、５０〜０．７８ｎＭ、２００〜３．１２５ｎＭおよび３２００〜５０ｎＭ使用した。参照結合実験は、対照ＩｇＧ（２８ＣおよびＫ９）を負荷したセンサー上で並行して行った。次いで、形成された複合体の解離を、アッセイ緩衝液のみにセンサーを浸漬することによって１０分間モニタリングした。動作温度は、２５℃で維持した。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）およびＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、リアルタイムデータを分析した。特定のシグナルは、ダブルリファレンス、すなわち、非特異的ＩｇＧ負荷センサーで測定された非特異的シグナルおよび特異的ＩｇＧ負荷センサー上の緩衝液シグナルを差し引くことによって得られた。１：１結合モデルを仮定して、定常状態シグナル対濃度曲線と同様に、会合および解離プロファイルを適合させた。
【０４０３】
結晶化およびＸ線構造決定。回折データ収集における結晶化および冷凍冷却条件を、拡張データ表１に列挙する。結晶化試験は、４００ｎｌのシッティングドロップにおいて行われた。滴下は、Ｍｏｓｑｕｉｔｏロボットを用いて９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒプレート中の等体積のタンパク質およびリザーバー溶液を混合することによって形成し、Ｒｏｃｋ−Ｉｍａｇｅｒによってモニタリングした。結晶は、４００ｎｌのシッティングドロップまたはハンギングドロップ上のロボット化したＭａｔｒｉｘ  ＭａｋｅｒおよびＭｏｓｑｕｉｔｏ設定を用いて、または２〜３μｌのハンギングドロップを用いて２４ウェルプレート中で手動で最適化した。
【０４０４】
結晶の異方性が強いことから（拡張データ表１の異方性の結果を参照）、重要な結晶数を、異なるシンクロトロン（ＳＯＬＥＩＬ、Ｓｔ  Ａｕｂｉｎ、Ｆｒａｎｃｅ；ＥＳＲＦ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ；ＳＬＳ、Ｖｉｌｌｉｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でいくつかのビームラインで試験した。異方性回折データの少ない結晶は、ＳＯＬＥＩＬシンクロトロンでのビームラインＰＲＯＸＩＭＡ−１およびＰＲＯＸＩＭＡ−２、ならびにＥＳＲＦでのビームラインＩＤ２３−２で収集した。データセットは、ＸＤＳ４７およびＡＩＭＬＥＳＳ４８を使用して索引付け、統合、スケーリング、およびマージされた。ＺＩＫＶ  ｓＥタンパク質の予備モデルを、構造相同性モデリングサーバＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ４９を用いて、ＤＥＮＶ−２  ｓＥ（４ＵＴＡ）構造から構築した。次いで、複合体の構造を、拡張データ表１に列挙されている検索モデルを使用して、ＰＨＡＳＥＲ５０による分子置換によって決定した。ＡＩＭＬＥＳＳおよびＰＨＡＳＥＲプログラムは、ＣＣＰ４スイート５１内で使用された。
【０４０５】
Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  Ｌｔｄによって開発されたＤＥＢＹＥおよびＳＴＡＲＡＮＩＳＯプログラムは、ＳＴＡＲＡＮＩＳＯサーバ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｒａｎｉｓｏ．ｇｌｏｂａｌｐｈａｓｉｎｇ．ｏｒｇ／）を使用して、解像度の切り捨てなしにＡＩＭＬＥＳＳスケーリングされたデータに適用された。これらのソフトウェアは、構造振幅のベイズ推定を用いて合成された強度データの異方性カットオフを実行し、データに異方性補正を適用する。次いで、これらの修正異方性振幅は、ＢＵＳＴＥＲ／ＴＮＴ５２との両方の構造のさらなる改良のために使用された。拡張データ表１は、ＳＴＡＲＡＮＩＳＯサーバによって計算された異方性補正なしで、ｈ、ｋ、またはｌ軸に沿った最高の高解像度、ＡＩＭＬＥＳＳから出力された値で切り捨てられた全反射セットの精密化統計を示すことに留意する。
【０４０６】
次いで、モデルは、代わりに手動で修正およびＣＯＯＴ５３を使用して完了し、異方性について補正振幅に対してＢＵＳＴＥＲ／ＴＮＴを使用して精密化した。精密化は、非結晶学的対称性を用いて制約された（拡張データ表１を参照）。精密化された構造ＺＩＫＶ  ｓＥ／ＥＤＥ２  Ａ１１  Ｆａｂ、ＺＩＫＶ  ｓＥ／ＥＤＥ１  Ｃ８  ｓｃＦｖおよびＺＩＫＶ  ｓＥは、それぞれ、２１．８／２３．８および１８．７／２２．０および２２．９／２７．５の最終Ｒｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅ（％）を有する。
【０４０７】
原子モデルの分析および説明各複合体は、プログラムのＣＣＰ４スイート群で分析され、極性接触はＰＩＳＡウェブサイト５４で計算された。拡張データ図４および６および拡張データ表４および５に示される分子間相互作用に関して、使用された最大カットオフ距離は、それぞれ、極性およびファンデルワールス接点について４Åおよび４．７５Åであった。ＥＢＩサーバ５６上のＣｌｕｓｔａｌ  ＷおよびＣｌｕｓｔａｌ  Ｘバージョン２５５を使用して、複数の配列アラインメントを計算した。すべてのタンパク質構造図は、ＥＳＰｒｉｐｔ５７およびＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍのバージョン１．５．０．４（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）（ｐｙｍｏｌ．  ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を用いて準備した。
【０４０８】
系統樹。ＰｈｙＭＬ５８で利用可能なＬＧモデルおよびＳＰＲ＋ＮＮＩブランチスワッピングの組み合わせを利用して、フラビウイルスエンベロープタンパク質ＥまたはＲＮＡポリメラーゼＮＳ５タンパク質の１２の代表的なアミノ酸配列を用いて最尤系統樹を推定した。ブートストラップ値は、１００ブートストラップ複製から計算された。木は、Ｆｉｇｔｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｔｒｅｅ．ｂｉｏ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｆｉｇｔｒｅｅ／）を使用して可視化された。樹で使用される配列の受入コード：ジカウイルス（ＺＩＫＶ、ＫＪ７７６７９１、Ｈ−ＰＦ−２０１３＿Ｆｒｅｎｃｈ＿Ｐｏｌｙｎｅｓｉａ株）；デングウイルス血清型１（ＤＥＮＶ−１、ＮＣ＿００１４７７）；デングウイルス血清型２（ＤＥＮＶ−２、ＮＣ＿００１４７４）。デングウイルス血清型３（ＤＥＮＶ−３、ＮＣ＿００１４７５）；デングウイルス血清型４（ＤＥＮＶ−４、ＮＣ＿００２６４０）；セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ、ＮＣ＿００７５８０）；日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ、ＮＣ＿００１４３７；マリーバレー脳炎ウイルス（ＭＶＥＶ、ＮＣ＿０００９４３）；ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ、ＮＣ＿００１５６３）；黄熱病ウイルス（ＹＦＶ、ＮＣ＿００２０３１）；ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ、ＮＣ＿００１６７２）  ；ポーワッサンウイルス（ＰＯＷＶ、ＮＣ＿００３６８７）。
【０４０９】
ウイルスストック。アフリカ系統ジカＨＤ７８７８８は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒコレクションから得られ、アジア系統ジカＰＦ１３はＤＥＮＦＲＥＥ（ＦＰ７／２００７−２０１３）コンソーシアムを通じて２０１３年にフランス領ポリネシアでＺＩＫＶ発生時に患者から単離された。４℃で３０００ｇでの遠心分離によって清澄化し、フォーカス形成アッセイによりベロ細胞で滴定した感染Ｃ６／３６細胞の上清からウイルスストックを調製した。ストックは使用するまで−８０℃に保った。
【０４１０】
中和アッセイ。試験したヒト抗体によるウイルス中和を、フォーカス減少中和試験（ＦＲＮＴ）を用いて評価した。ウイルスストックからの約１００ｆｆｕ（フォーカス形成ユニット）を、抗体の連続希釈液とともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物をベロ細胞に加え、病巣を１．５％メチルセルロースの存在下で２日間発育させた。次いで、抗Ｅ  ４Ｇ２抗体および抗マウスＨＲＰコンジュゲート二次抗体を用いて、４％ホルムアルデヒドで固定した後、病巣を染色した。病巣をＤＡＢ染色によって視覚化し、プレートをＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｓ６アナライザー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＣＴＬ）を用いて計数した。中和曲線および５０％ＦＲＮＴは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算した。
【０４１１】
方法の参考文献
４２  Ｖｒａｔｓｋｉｋｈ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９，  ｅ１００３４５８，  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００３４５８  （２０１３）。
４３  Ｊａｒｍｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８８，  １３８４５−１３８５７，  ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２０８６−１４  （２０１４）。
４４  ＤｕＢｏｉｓ，  Ｒ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｉｎｓｉｇｈｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ１．Ｎａｔｕｒｅ  ４９３，  ５５２−５５６，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１７４１（２０１３）。
４５  Ｂａｃｋｏｖｉｃ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｙｉｅｌｄｓ  ｏｆ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２３，  １６９−１７４，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｐ０８８（２０１０）。
４６  Ｇｉｌｍａｒｔｉｎ，  Ａ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２５，  ５９−６６，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｒ０５８（２０１２）。
４７  Ｋａｂｓｃｈ，  Ｗ．  Ｘｄｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６６，  １２５−１３２，  ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ０９０７４４４９０９０４７３３７（２０１０）。
４８  Ｅｖａｎｓ，  Ｐ．  Ｒ．＆  Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，  Ｇ．  Ｎ．  Ｈｏｗ  ｇｏｏｄ  ａｒｅ  ｍｙ  ｄａｔａ  ａｎｄ  ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ？Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６９，  １２０４−１２１４，  ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ０９０７４４４９１３００００６１（２０１３）。
４９  Ｂｉａｓｉｎｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ：  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ａｎｄ  ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｕｓｉｎｇ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４２，  Ｗ２５２−２５８，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ３４０（２０１４）。
５０  ＭｃＣｏｙ，  Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ４０，  ６５８−６７４，  ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ００２１８８９８０７０２１２０６（２００７）。
５１  Ｗｉｎｎ，  Ｍ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６７，  ２３５−２４２，  ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ０９０７４４４９１００４５７４９（２０１１）。
５２  Ｂｌａｎｃ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅｌｙ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｉｎ  ＢＵＳＴＥＲ−ＴＮＴ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６０，  ２２１０−２２２１，  ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ０９０７４４４９０４０１６４２７（２００４）。
５３  Ｅｍｓｌｅｙ，  Ｐ．，  Ｌｏｈｋａｍｐ，  Ｂ．，  Ｓｃｏｔｔ，  Ｗ．  Ｇ．＆  Ｃｏｗｔａｎ，  Ｋ．  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｏｔ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６６，  ４８６−５０１，  ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ０９０７４４４９１０００７４９３（２０１０）。
５４  Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ，  Ｅ．＆  Ｈｅｎｒｉｃｋ，  Ｋ．  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｓｔａｔｅ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７２，  ７７４−７９７，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００７．０５．０２２  （２００７）。
５５  Ｌａｒｋｉｎ，  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ａｎｄ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３，  ２９４７−２９４８，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｍ４０４（２００７）。
５６  Ｇｏｕｊｏｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｅｗ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ａｔ  ＥＭＢＬ−ＥＢＩ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８，  Ｗ６９５−６９９，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ３１３（２０１０）。
５７  Ｇｏｕｅｔ，  Ｐ．，  Ｃｏｕｒｃｅｌｌｅ，  Ｅ．，  Ｓｔｕａｒｔ，  Ｄ．  Ｉ．＆  Ｍｅｔｏｚ，  Ｆ．  ＥＳＰｒｉｐｔ：  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ＰｏｓｔＳｃｒｉｐｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５，  ３０５−３０８（１９９９）。
５８  Ｇｕｉｎｄｏｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ：  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ＰｈｙＭＬ  ３．０．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ５９，  ３０７−３２１，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｓｙｓｂｉｏ／ｓｙｑ０１０（２０１０）。
【０４１２】
実施例３：フラビウイルスエンベロープ糖タンパク質二量体の安定性を増加させて、強力かつ広範に中和する抗体応答を誘発する。
４種の血清型のデングウイルス（ＤＥＮＶ）に対するヒト抗体を強力に交差中和することが、最近単離され、構造的に特徴付けられている。例えば、ＷＯ２０１６／０１２８００、Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，  １０９−１１３、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，  １７０−１７７を参照のこと。これらの抗体は、これまでに発見されたＥ−二量体エピトープ（ＥＤＥ）と呼ばれる高度に保存されたエピトープに結合し、これはジカウイルス（ＺｉｋａＶ）においても保存されており、ＺｉｋａＶを強力に中和することも示されている。成熟したＤＥＮＶ粒子は、強力な「呼吸」挙動を有する準安定なＥ二量体の集合体であり、中和性ではないが疾病を増強する多くの抗体の生成を促進することを意味する。不完全に中和させる抗体応答の生成を最小限に抑えながら、安定化Ｅ−タンパク質二量体の生成に基づいてフラビウイルス、例えばフラビウイルスのジカ−デング群に対する防御免疫応答を惹起することができる抗原を開発するための逆ワクチン学アプローチを記載する。
【０４１３】
本発明者らは、免疫病原性を理解し、ワクチン設計を知らせるために、ＤＥＮＶ感染に対する免疫応答を研究した。これには、感染に対するヒト抗体応答の研究が含まれる。
【０４１４】
これらの研究は、前駆体膜タンパク質に対する抗体の考慮を含んでいる。ＰｒＭ特異的抗体は、デング熱に対する記憶Ｂ細胞応答の主要な構成要素であり、これらの抗体は、高濃度１６、３４〜３７でも不完全な中和を示す（最大３０〜５０％）。  ｐｒＭ特異的抗体は、ｐｒＭを含有しない完全に成熟したビリオンに結合しないが、多くの部分的に成熟した粒子は、中和させるのに十分高い濃度のｐｒＭを含有しないが、  ＡＤＥ１６、３８を促進するのに十分であり得る。本発明者らは、ｐｒＭの非効率的な切断は、免疫回避／増強戦略であり、ｐｒＭに向けられた不完全な弱い中和抗体の生成をもたらすと推測している。ｐｒＭに向けられた抗体の高い頻度、低い効力、および高いＡＤＥ潜在性は、ワクチン設計に影響を及ぼし、開発の進んだ段階で弱毒化されたワクチンはすべてｐｒＭを含み、理想的なワクチンはＥに応答を集中させ、ワクチン中のＡＤＥの可能性を低減するならば応答のｐｒＭ成分を最小限にする。
【０４１５】
第２の一連の実験において、最近、デング熱に感染した患者からの抗ＥｍＡｂの大きなパネルのクローニングを記載されている１７。抗体の３分の１は、組換えＥタンパク質に結合せず、立体構造的に感受性の４次エピトープを示唆し、これらの抗体の多くは４種すべてのデング血清型の広範な中和を示した。ｂｎＡｂ抗デングｍＡｂ（ｂｎＡｂ）は、今までに最も強力であり、ビリオン表面格子を構成する塩基性反復エンベロープ二量体に、我々がＥ−二量体エピトープＥＤＥ（図３ＡおよびＢ）と名付けた部位に結合する１７  、３９。さらに、本発明者らは、いくつかのＥＤＥ抗体によって認識されるエピトープも、少なくともジカＶ  Ｅ−二量体において保存され、等しく強力な中和をもたらし、ＥＤＥもデング以外のフラビウイルス、例えば、ジカにおいて潜在的な標的となることを同定した（実施例１）。
【０４１６】
これらの抗体の構造的特徴付けは、それらがビリオン３９の表面に存在するヘッドトゥーテール二量体の２つのＥサブユニットの間に形成された谷に結合することを示している。抗体は、融合ループの主鎖の原子を含むがその側鎖は含まない（図３Ｃ）二量体表面の保存された表面パッチと接触する。この構造部位はまた、ウイルス成熟中のＥ−二量体とｐｒＭとの相互作用を担い、フラビウイルス（例えば、デング−ジカ）群におけるその保存を説明する。広範な中和能に加えて、抗ＥＤＥ  ｍＡｂはまた、昆虫および初代ヒト細胞で産生されるウイルスを効率的に中和する１７。後者は、感染したヒト宿主において産生され、低レベルのｐｒＭを含み、中和するのが最も困難であるウイルスの推定代理物である。
【０４１７】
ＥＤＥの発見は、デングワクチン研究におけるいくつかの興味深い将来の可能性を開く。現在のワクチン接種戦略は、４種すべての血清型に対して単一の血清型特異的反応を作り出す目的で四価製剤を使用する。強力なｂｎＡｂが少なくともジカＶを強力に中和することができるデング熱感染で産生されるという実証は、そのような抗体の生成が次世代ワクチンの目標であることを意味する。重要なことは、応答がＥ二量体に限定されるので、Ｅ二量体のみからなるサブユニットワクチンを可能にし、さらに、この応答を達成するために多価製剤ではなく単一の普遍的な免疫原を設計することが可能であり得る。あるいは、異種プライムブースト戦略を使用して、潜在的にＬＡＴＶプライミング後にＥＤＥに応答を集中させることができる。
【０４１８】
デングワクチンは、今や重要な転機であり、大規模な第ＩＩＩ相試験は、期待を下回り、感染の増強に関する安全性信号を与えられている。免疫原からｐｒＭを除去し、融合ループエピトープ（ＦＬＥ）に対する免疫優勢応答のような不完全に中和する抗体の生成をさらに減少させて、Ｅ−二量体を安定化させることができると考える。本発明者らは、ＥＤＥに対する強力なｂｎＡｂ応答を引き起こすことを目的としたサブユニットフラビウイルス（例えば、デングまたはジカ）ワクチンもまた、デング熱を超えるフラビウイルス感染（例えば、ＺｉｋａＶ感染）に対して、またはデング熱およびＺｉｋａＶ感染の両方に対して、またはデング熱、ＺｉｋａＶおよび他のフラビウイルス感染症に対して有用性を有すると考える。。
【０４１９】
可能な実験計画
デングおよび／または他のフラビウイルスに対するサブユニットワクチンを設計するために、逆ワクチン学アプローチをとることができる。これは、例えば、ＷＯ  ２０１６／０１２８００、Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，  １０９−１１３、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，  １７０−１７７に記載されているように、ＥＤＥのような構造エピトープ、ならびにＦＬＥおよびｐｒＭなどの線状エピトープを標的とする組換え抗体のパネルに基づくｂｎＡｂ  ＥＤＥエピトープの生成および構造的特徴付けを利用することができる。この計画の一般的な目的は、Ｅ二量体の安定したバージョンを生成し、反復構造／モデリングに基づいた設計プロセスを使用して、抗ＥＤＥ応答の生成を特異的に標的とする免疫原を開発し、二量体の非ＥＤＥ関連領域がより少ない防御性であるが感染を増強する抗体の生成を減少させることである。免疫原性は、ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウス（例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ３２（４），３５６−３６３に記載されているマウスまたはＥＰ１３６０２８７もしくはＥＰ２２６４１６３に記載されているようなマウス）において試験することができ、インビボでの中和は、例えば、ＤＥＮＶ感染のマウスモデルにおいて試験することができる。
【０４２０】
Ｅ二量体の安定化。Ｅ二量体は、Ｅの予備融合形態であり、これは、準安定構造のビリオン表面に提示される４０。このメタ安定性は、Ｅ二量体間の側方相互作用によって形成されたウイルス膜を包む糖タンパク質殻を、早期エンドソームの軽度の酸性環境下で解離させるために重要である。次いで、得られたＥ単量体は、融合ループをエンドソーム膜７、４１に挿入することができる。その後の酸で誘発される不可逆的なＥの構造変化は、分子４１の基底状態である非常に安定な「融合後」のＥ三量体を導く。高エネルギー、Ｅの二量体状態とその最低エネルギー構造（融合後三量体）との間のこの移行において放出されるエネルギーは、脂質合体を促進し、細胞の細胞質ゾルへのウイルスゲノムの放出を可能にするために使用される。そのメタ安定性のために、Ｅは、標準的な条件（中性ｐＨ）下でビリオン表面にかなりの「呼吸」を示し、抗体中和に関連しない免疫系領域に曝露することが示されている４２〜４４  。
【０４２１】
組換えＤＥＮＶ  ｓＥ（すなわち、デング「可溶性−Ｅ」、幹および膜貫通セグメントを欠いている）は、マイクロモル範囲の解離定数を有する溶液中で主として単量体である。免疫原設計のために、ｓＥ二量体をできるだけ安定にし、それを不活性化し、ビリオン表面で観察される動的呼吸を示さないようにすることが目的である。さらに、目的は、血清型特異的抗体の誘発の程度を制限するために、ＥＤＥの外側の領域上のＥ二量体表面を改変（再表面化）することである。現在、ジカＶ−ｓＥが溶液中の二量体として安定であることを同定されているが、ＥＤＥを保存する重要な数の変異を提供しているが、全く異なる状況では、糖タンパク質の残りの部分はＤＥＮＶの残りの部分に対して十分異なり、そのため、交差反応性がＥＤＥに限定され得る。
【０４２２】
他のウイルス性疾患については、準安定、融合前の構造（すなわち、ビリオンの活性型）における四次構造の捕捉および安定化は、現在、いくつかのサブユニット抗ウイルスワクチンアプローチの重要な目的である。呼吸器合胞体ウイルスでは、Ｆタンパク質の三量体前融合構造に対する強力な中和抗体が、Ｆタンパク質前融合三量体を安定化させる新規免疫原の設計をもたらした４５、４６。ＨＩＶでは、Ｅｎｖの融合前の構造に結合したｍＡｂの最近の構造決定は、潜在的なＨＩＶサブユニットワクチンのための融合前ウイルス中間体を安定化させる努力を推進する４７。インフルエンザＨＡに対する同様のアプローチは、組換え安定化三量体ストーク断片がウイルスに対する交差反応性抗体を誘発できることを示した４８、４９。
【０４２３】
二量体を安定化するために２つの主なクラスの変異体を開発することができる：
Ａ．ジスルフィド安定化変異体：ｓＥ二量体の安定性を改善するために、ジスルフィド結合形成のために可能な対の変異をトリアージするために構造ベースのアプローチ５０を使用した。ＤＥＮＶからの二量体の結晶構造の分析は、二量体界面を横断する４．５Å下でＣβ−Ｃβ距離で互いに対向する残基のペアの数を明らかにした。したがって、本発明者らは、一対のシステイン（そのうちの２つは、ｓＥ二量体の分子の２倍軸を横断する互いに対向する残基であり、システインに対する単一の置換のみを必要とする）による置換の６つの位置を同定した。変異体のうちの３つは、既に成功した共有結合ＤＥＮＶ  ｓＥ二量体発現をもたらし、ＥＤＥを繰り返し、ＥＤＥ−ｍＡｂのパネルに結合しており（図４）、予備実験では免疫マウスの単量体Ｅと比較してより高い中和抗体力価を誘導する（図５）。ジカＶ  ｓＥ二量体は４つのＤＥＮＶのＥ二量体よりも安定であるが、ＦＬＥ（融合ループエピトープ）抗体は依然としてジカＶに結合し、これまでのデング熱感染による抗体がジカ病を増強する可能性があることを示唆している。したがって、ＦＬＥが曝露されないように、ジカＶ  ｓＥ二量体をさらに安定化させることが重要である。これより、ジカＶタンパク質に同じシステイン変異を導入し、例えば、ジカＶ−ｓＥおよびＤＥＮＶ−ｓＥジスルフィド安定化変異体を用いて免疫試験を並行して行うことができる。
【０４２４】
Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）  ＮＡＴＵＲＥ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ｜  ８：１５４１１  ｜  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５４１１
「Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｍｅｒｓ  ｒｅｄｕｃｅ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｌｏｏｐ  ｅｐｉｔｏｐｅ」はまた、
サブユニット間のジスルフィド結合によって、Ｘ線結晶学によって、およびこれらの操作された二量体がＦＬＥを曝露しないが、ＥＤＥの曝露を保持するヒト抗体のパネルに結合することによってロックされたＥ二量体の本発明者らの操作も報告する。
【０４２５】
Ｂ．空洞充填および再浮上変異体：ロゼッタソフトウェア５１を用いて、ｓＥ二量体の構造における疎水性空洞、および二量体を安定化するためにこれらの空洞を満たすために置換され得る残基を同定している。これらの変異は、一般的な回転異性体を使用して、衝突を最小限にするか、またはロゼッタソフトウェアで手動で設計される。特に、二量体中のパートナーサブユニットの融合ループのための結合ポケットを作り出すドメインＩ／ＩＩＩ界面が適切であろう。ドメインＩとの相互作用からドメインＩＩＩを解放することは、融合ループを曝露する鍵であり、したがってドメインＩ／ＩＩＩ相互作用を凍結することは重要な目標である。代替的にまたは並行して、例えば、記載されているようなデノボの計算による再表面化を使用することができる５２、５３。このデノボアプローチにより、より多様な潜在的な解決策が試験される可能性がある。あるいはまたは加えて、例えば、計算上のアプローチが不十分である場合、哺乳動物のディスプレイ指向の進化を用いて再表面化を実施することができる。再表面化したアプローチに関する概要については、例えば、Ｃｈａｐｍａｎ＆ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ（２０１６）Ｃｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３，５４３−５５３を参照されたい。
【０４２６】
選択された再表面化した遺伝子のさらなる変異誘発は、ＥＤＥ抗体への結合を妨害しないＥＤＥの領域内の生存可能な置換の決定を可能にすると考えられる。これまでのアラニンスキャニング変異誘発（例えば、ＷＯ  ２０１６／０１２８００、Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，  １０９−１１３、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，  １７０−１７７を参照）からの情報を有し、抗体との立体的な衝突を引き起こし得るかさばる側鎖を導入しない限り、結合決定基ではない残基を置換することができる。同様に、追加のＮ結合型グリコシル化部位を、ＥＤＥ−ｍＡｂの結合を妨げずに、血清型特異的エピトープをマスクするように設置されている戦略的に導入することができる。全体で、二量体の安定化および再表面化のプロセスは、最良に機能する最初の再表面化した遺伝子について約１００個の変異をスクリーニングすることを必要とすると推定される。
【０４２７】
全体で、例えば、ＤＥＮＶ２（例えば）血清型およびジカＶ−ｓＥバックグラウンド（例えば、上記の変異の節を参照）の両方で試験することができるｓＥの初期の１００個の変異を同定している。予備データは、ＤＥＮＶ２が最も安定なｓＥ二量体を有し、呼吸しやすいことを示唆しているが、ジカＶ  ｓＥタンパク質は最も安定である。すべての変異体を発現、二量体化、および抗体反応性について試験することができる。最良に機能する変異体は、反復して試験することができる変異体の対の組み合わせとして用いることができる。
【０４２８】
分析用超遠心分離を使用して、溶液中の二量化定数を決定することができる。示差走査熱量測定法に伴う熱蛍光測定法を用いて、カオトロープ＋／−ＥＤＥ／Ａｂを加熱または不安定化する際の安定化変異体の変性プロファイルを決定することができる。選択された変異体のサブセットと異なるｐＨ条件下でＥＤＥ／ＦＬＥ−ｍＡｂのパネルとの間のＫｏｎ値およびＫｏｆｆ値を決定するために、表面プラズモン共鳴、Ｂｉｏｌａｙｅｒ干渉法、および等温熱量測定を使用することができる。安定化ｓＥ変異体はまた、野生型ｓＥと比較して、リポソームの存在下での浮遊アッセイによって試験され得る。融合ループがリポソームと相互作用するために利用可能であってはならないので、安定化二量体が酸性化に際して浮遊性を損なう可能性があると考える。最後に、高い熱化学的安定性、広く交差反応性のＥＤＥ−Ａｂに対する高い親和性、ＦＬＥ−ｍＡｂに対する低い親和性、ならびに血清型特異的ＥＤＥ−Ａｂおよび他の血清型特異的Ａｂに対する低い親和性を示す安定化二量体変異体のサブセットが、Ｘ線結晶学によるさらなる構造研究に対して選択され得る。
【０４２９】
ハイスループットの発現戦略。組換えｓＥは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現系で産生することができ、これは、特に、複数のＥ変異体の特徴付けに有用であり得る。ｐｒＭ／Ｅをコードするベクターの一過性トランスフェクションを通じてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生するように２９３Ｔをこれまで使用している。エンベロープ上に表面残基に１００個超のアラニン置換の大きなパネルは、エピトープマップ抗デングｍＡｂ１７に使用した変異体ＶＬＰを産生することを可能にした。さらに、一過性トランスフェクションによって２９３ＴでｓＥまたはＥ二量体を産生する哺乳動物系を開発した。これは、例えば、ｓｔｒｅｐタグ付きｓＥ変異体を産生するために使用することができ、さらなる特徴付けのためにＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞における一過性トランスフェクションによって有望な候補を高レベルで発現させることができる。
【０４３０】
本発明者らは、そのような計画、すなわち、約１５０のヒト抗デングｍＡｂのパネルに有用な多量の供給源を生成した（例えば、ＷＯ２０１６／０１２８００、Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，  １０９−１１３、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，  １７０−１７７を参照のこと）。約１／３がＥＤＥに、１／３がＦＬＥに、１／３がまだ決定されていないエピトープに結合する１７。不十分に中和する抗デングｍＡｂの結合に影響を及ぼす構造決定基を理解するために、低温ＥＭおよび結晶学を用いて、そのようなｍＡｂパネルから採取した抗体の結合決定基を決定することができる。これらの結果は、ＥＤＥを保存しながらこれらの望ましくないエピトープを操作するためのさらなるモデリングおよび変異誘発を通知することができる。興味深いことに、本発明者らの安定化した二量体のうちの１つを用いた予備的結果は、重複エピトープを有するＥＤＥ対ＦＬＥの認識を操作する可能性を強調する抗ＦＬＥ  ｍＡｂに対するさらに低下した反応性を示す（図４）。
【０４３１】
３．一般的なデング熱／ジカ免疫原。構造的特徴付けは、４種のデング血清型およびジカＶのそれぞれからのｂｎＡｂの決定基およびＥとの相互作用を見抜くために使用され得る。Ｘ線結晶学および低温ＥＭは、安定化したｓＥ変異体と複合体化した選択された広範に中和する抗ＥＤＥ  ｍＡｂを分析することために使用することができる。抗ＥＤＥ  ｍＡｂのレパートリー内で、いくつかの制限された血清型交差反応性またはモノ特異性も示し、これらは広範な特異性を決定するものを理解するために特徴付けられ得る。Ｓｈｅ−Ｍｅｉ  Ｌｏｋ５４によって報告されたＤｅｎｖ２ビリオンと複合体化したｍＡｂ−２Ｄ２２の低温ＥＭ構造は、この点で有益であり、結合するためにＥ二量体を必要とする２Ｄ２２は、血清型２ウイルスに対して特異的であり（すなわち広い特異性を示さない）、ＥのドメインＩＩＩ上にさらに残基を接触するように思われることを除いて、報告されているＥＤＥ−１  ｂｎＡｂのフットプリントと同様のフットプリントを有する。
【０４３２】
要約すると、この節の結果は、ｓＥ二量体を再表面化するためのさらなる変異誘発を導き、ＥＤＥの同定された交差反応性要素を組み込んだ単一の免疫原を開発し、血清型特異的反応性を生じ得るものを排除するのに役立ち得る。これらの再表面化した免疫原は、ＥＤＥに対して応答を集中させるために必要とされ得る異種プライムブースト戦略に有用であると考えられる。
【０４３３】
最後に、一度、１つまたは最も適切な安定化された表面改変ｓＥ二量体が同定されたら、この配列は、その免疫原性を増加させるために、表面において、対応するＥ二量体の複数のコピーを提示するがｐｒＭを欠くＶＬＰを産生する試みにおいて使用され得る。ＥのみのＶＬＰの開発に代わるものとして、その表面上に安定化されたｓＥ二量体を提示する自己組織化ナノ粒子は、例えば、ＨＩＶおよびインフルエンザワクチン開発５３、５５〜５８のために開発されたナノ粒子に類似し開発され得る６６。ナノ粒子は、例えば、ｓＥ二量体と既存の粒子との遺伝的融合または化学的共役のいずれかによって産生され得る。粒子は、例えば、フェリチンを含み得る。遺伝子融合の場合、多様なナノ粒子への融合を可能にするために一本鎖二量体が作製され得るか、または融合は、例えば、好適な二重対称軸を有する粒子に限定され得る。要するに、改善された免疫原性およびエピトープ集束のために、ナノ粒子上に安定したｓＥ二量体を提示するための多くの選択肢が存在し、異なる潜在的な道が探究され得る。
【０４３４】
５．トランスジェニックマウス、例えば完全ヒトＩｇマウスにおける試験免疫原。ワクチン評価に有用なトランスジェニックマウスは、例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ３２（４），３５６−３６３に記載されているように開発されている。このようなマウスは、例えば、抗体の可変領域がヒトであることを除いて、完全に正常な免疫系を有し得る。
【０４３５】
そのようなマウスモデル系を使用することは、多くの理由から有用であると考えられる：１）最も重要なことに、例えば、上記のＬｅｅらに記載されているようなそのようなモデルは、おそらく、抗体応答に関してヒト免疫の前臨床モデルに我々が近付くことができる最も近いものである。２）一次免疫グロブリンレパートリーは、種間で著しく発散しており、このため、ある種の特異的抗体応答は、両方の可変領域の使用、したがって、エピトープ選択が異なり、結果的にある種から別の種への外挿機能は信頼性がない。デング熱に対するネズミ抗体応答は、ヒトとは異なり、特に、ＥドメインＩＩＩに対する抗体は、マウスではかなり優勢であるが、ヒトではそれほど顕著ではないという証拠が既に存在する。３）レパートリーおよび完全ヒトｍＡｂは、それぞれ、ディープシーケンシング、対合単一細胞クローニング、ネットワーク分析、および高スループット発現により、免疫マウスから迅速に作製することができる。４）このプロセスにおいてさらに強力な広範に中和するヒト抗ＥＤＥ  ｍＡｂを生成する可能性もあり、これは、現在入手可能なものよりも優れている可能性がある。
【０４３６】
抗原は、様々な異なるフォーマットで送達することができ、これは、ヒトにおいて正当化され得るものよりはるかに大きいスループット抗原試験を可能にする。作業は、以下の３つの段階を介して進められ得る。
ａ）高スループットポリクローナル分析。
【０４３７】
これは、サブセットを選択してさらに反復することができる多数の抗原（例えば、ｎ＝５０、操作効率のためにバッチ処理された）の分析を含むことができる。例えば、５つのジスルフィド安定化変異体、５つの空洞充填変異体、および２０の再表面化された変異体ｓＥ二量体、および２０の異種のプライムブーストの組み合わせを検査することができる。異なる抗原の数が多いので、免疫されたマウスの数は、抗原当たり５つに制限され得る。例えば、抗原プライミング、ならびに適切な連続および最終採血を伴う２回のブーストを行うことができる。効率を最大にするために、必要に応じて、後で回収および検査することができる形式で、各動物から組織を預けることができる。下方選択プロセスは、以下のように、ポリクローナル血清に基づいて、続けることができる：
・ネイティブ抗原を使用した、＞１０−４の力価を有する４／５または５／５マウスにおけるポリクローナルＥＬＩＳＡ陽性応答。
・＞１０−３のインビトロ中和５０％力価
・例えば、４つのウイルス血清型とＺｉｋａとの間の反応の交差反応性
・変異体抗原ＶＬＰおよび抗体競合アッセイを使用した結合部位分析。
【０４３８】
ｂ）抗体レパートリーのディープシーケンシング、ｍＡｂ発現、および機能的スクリーニング。１０の最も有効な免疫化条件が、ディープ免疫レパートリーシーケンシング、および抗原選別Ｂ細胞からのｍＡｂ産生のために選択され得る。全Ｉｇ重鎖免疫レパートリーは、ＮＧＳを使用して産生され得、高スループット法を使用して、免疫原当たり約５００ｍＡｂを産生することができ、これは、ｓＥ二量体への結合に関して、および中和アッセイにおいて、試験することができる。デングＥＤＥ結合に対する一般的なＢＣＲ溶液は、非免疫化動物に見られるよりも大きな頻度で、４／５または５／５動物におけるＩｇ−Ｈ＆Ｌファミリー頻度を判定することによって判定することができる。異なるＢＣＲ発生溶液を表すが、ｓＥ二量体ＥＤＥに結合するトランスジェニックマウス生成ｍＡｂのサブセットは、インビトロおよびインビボでの特徴付けのためにより多く生成され得る。
【０４３９】
６．インビボ中和。Ｉ型およびＩＩ型インターフェロン受容体（ＡＧ１２９）欠損マウスは、ＤＥＮＶ感染および病因のインビボモデルである５９〜６２。ＤＥＮＶに感染すると、動物は、複数の器官において急速にウイルス血症を発症する６３。感染は、体重減少、血小板減少症、および血管漏出と関連付けられる６４、６５。ＡＧ１２９マウスは、マウス適合デング−２株Ｄ２Ｓ１０でのチャレンジの前に、インビトロでＤＥＮＶに結合して中和することが示された血清または個々のＫｙｍｏｕｓｅ  ｍＡｂ（もしくはｍＡｂのカクテル）を、ＡＧ１２９マウスに注射することにより、上記マウス免疫からの中和抗体の存在を実証するために使用され得る。
【０４４０】
７．プライムブースト戦略。初期の研究により、１）ＥＤＥへの集中的な応答を得ることが可能であるかどうか、および２）単一の免疫原を使用してｂｎＡｂ応答を生成することができるか知ることができる。本発明者らは、単一の普遍的な免疫原の設計、およびＦＬＥに対するもののような望ましくない応答に対するエピトープを破壊するためのＥタンパク質二量体の非ＥＤＥ関連部分の再表面化など、これを達成するための多数の戦略を記載した。しかしながら、ｂｎＡｂ応答をＥＤＥに集中させることの困難性は、異種プライムブースト戦略がこれを達成するために必要とされ得ることを意味し得る。
【０４４１】
異種プライムブーストは、ＥＤＥにおける応答の集束を増加させ、広い反応性を促進すると考えられている。これらの目的を達成するために、例えば、以下のような様々な異なる実験的アプローチを使用することができる。
・プライムブーストの組み合わせにおいて、異なるＤｅｎＶ血清型からの、およびＺｉｋａＶからのｓＥ二量体を使用して、広い反応性を促進する
・野生型二量体とのプライムブーストの組み合わせにおいて、ＥＤＥのみを含む完全に再表面化されたｓＥ二量体を使用する。
・組換えｓＥ二量体およびＶＬＰを使用するプライムブースト戦略。
・弱毒化ウイルスとｓＥ二量体とのプライムブーストの組み合わせ。
【０４４２】
結論として、本発明者らは、他のフラビウイルス疾患、例えば、ジカ病に有用であると考えられる、デング熱に対する新規サブユニットワクチンの実現可能性を探索するための模範的な計画を提示した。ＬＡＴＶの進歩にもかかわらず、このアプローチがすべての年齢層において使用することができる安全かつ効果的な製品を提供することはまだ明らかではない。それまでは、ＬＡＴＶに対する代替的かつ潜在的に相乗的な技術の前臨床開発が追求されるべきである。このプログラムへの成功した結論は、例えば、霊長類に対する使用またはさらなる評価、および早期臨床評価に好適である、免疫原の産生につながると考えられる。
【０４４３】
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【０４４４】
実施例４  インビボ保護
抗ＥＤＥ１  ｍＡｂクローン７５３（３）Ｃ１０（Ｃ１０）を、ＡＧ１２９マウスモデルにおいて、Ｚｉｋａ感染からの保護を付与する能力について試験した。ＡＧ１２９マウスをＢ＆Ｋ（Ｈｕｌｌ，ＵＫ）から入手し、Ｉｍｐｅｒｉａｌ  ＣｏｌｌｅｇｅのＣＢＳ施設で飼育した。すべての動物実験は、英国本社の認可の下、Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅの倫理委員会のガイドラインに従って、収容レベル３施設で実施された。ウイルスストックを上記のように産生し、マウスモデルでの使用の前にＶｅｒｏ細胞で滴定した。インターフェロン（ＩＦＮ）−α／βおよびＩＦＮ−γ受容体（ＡＧ１２９マウス、雌、８〜１０週齢）の両方が欠損した雌１２９／Ｓｖマウスに、ジカウイルス（ブラジリアン株ＰＥ２４３）による感染の２４時間前に、精製ヒト抗ＥＤＥ−１クローンＣ１０またはアイソタイプ対照２−８Ｃを、２００または５０μｇ／マウスのいずれかで、腹腔内（腹腔内；２００μＬ）投与した。マウスを、１．２×１０２ＦＦＵ／マウスのジカＰＥ２４３で腹腔内感染させた。ＰＢＳのみを投与したマウスを、実験対照として使用した。毎日の体重測定およびウイルス誘発性疾患の発症によって、マウスをモニタリングした。感染後２日目および４日目に、血液試料を採取した。血漿試料を、Ｖｅｒｏ細胞単層上のフォーカス形成アッセイを使用して、ウイルス負荷について滴定した。マウスは、人道的エンドポイントとしてプロジェクト認可の下で指定された、２０％に近い体重減少および／または重度の病気の前に安楽死させた。元の体重の百分率は、感染直前の０日目の体重に基づいて計算した。体重測定値は、各実験群において３匹のマウスの平均＋／−  ＳＥＭとして表される。この実験を１回実施し、モノクローナル抗体Ｃ１０によって保護されたことを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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