(57)【要約】  本開示は、特異ペプチド、および選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）質量分析の方法によって、ホルマリン固定されている生体試料においてＴＵＢＢ３タンパク質を直接定量化する上で特に有利なチューブリンベータ−３鎖タンパク質（ＴＵＢＢ３）由来のペプチドのイオン化特性を提供する。液体組織試薬およびプロトコルを用いて、生体試料からタンパク質試料を調製し、ＴＵＢＢ３タンパク質を試料のＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析により定量化し、特異ペプチドを定量化する。患者腫瘍試料中のＴＵＢＢ３の測定レベルを参照レベルと比較し、測定されたＴＵＢＢ３レベルが参照レベルより低い場合、患者をタキサンに基づく治療レジメンで治療する、治療方法が提供される。好適な参照レベルは、例えば、約７００ａｍｏｌ／μｇ組織である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルマリン固定組織のヒト生体試料におけるヒトＴＵＢＢ３タンパク質のレベルを測定する方法であって、質量分析を用いて前記ヒト生体試料から調製されたタンパク質消化物におけるＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量を検出および／または定量化すること、ならびに前記試料におけるＴＵＢＢ３タンパク質のレベルを算出することを含んでなり、ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドが配列番号１であり、前記レベルが相対レベルまたは絶対レベルである、方法。
【請求項２】
前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量を検出および／または定量化する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組織が腫瘍由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの定量化をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの定量化が、ある生体試料における前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量と、異なる別の生体試料における同じＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量とを比較することを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの定量化が、添加された既知量の内部標準ペプチドとの比較によって、生体試料における前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量を判定することを含んでなり、生体試料における前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドが、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較され、内部標準ペプチドが同位体標識されたペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質消化物における前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量の検出および／または定量化が、修飾または非修飾ＴＵＢＢ３タンパク質の存在および被験体における癌との関連性を示すものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量、または前記ＴＵＢＢ３タンパク質のレベルの前記検出および／もしくは定量化の結果を、癌の診断病期／グレード／状態と相関させることをさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量、または前記ＴＵＢＢ３タンパク質のレベルの前記検出および／もしくは定量化の結果を、癌の診断病期／グレード／状態と相関させることを、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量を多重形式で検出および／または定量化することと組み合わせて、癌の診断病期／グレード／状態に関する追加情報を提供する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体試料を採取した患者に対して治療的有効量の治療薬を投与することをさらに含んでなり、治療薬および／または治療薬の投与量が前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量またはＴＵＢＢ３タンパク質のレベルに基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
治療薬がＴＵＢＢ３タンパク質に結合する、および／またはその生物活性を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
癌に罹患している患者を治療する方法であって、
（ａ）患者から得た腫瘍試料から調製されたタンパク質消化物における特定のＴＵＢＢ３フラグメントペプチドのレベルを定量化すること、および質量分析を用いた選択的反応モニタリングにより、前記試料におけるＴＵＢＢ３ペプチドのレベルを算出すること；
（ｂ）前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドのレベルを参照レベルと比較すること；かつ
（ｃ）ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドのレベルが前記参照レベルより低い場合、タキサンに基づく化学療法レジメンで前記患者を治療すること；または
（ｄ）ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドのレベルが前記参照レベルより高い場合、有効量のタキサンを含まない治療レジメンで患者を治療すること、
を含んでなる、方法。
【請求項１５】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の７００ａｍｏｌ／μｇ、＋／−２５０ａｍｏｌ／μｇである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の７００ａｍｏｌ／μｇ、＋／−１５０ａｍｏｌ／μｇである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の７００ａｍｏｌ／μｇ、＋／−１００ａｍｏｌ／μｇである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の７００ａｍｏｌ／μｇ、＋／−５０ａｍｏｌ／μｇである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の７００ａｍｏｌ／μｇ、＋／−２５ａｍｏｌ／μｇである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料の前記タンパク質消化物が液体組織プロトコルにより調製される、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含んでなる、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
質量分析が、タンデム型質量分析、イオントラップ型質量分析、三連四重極型質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析、ＭＡＬＤＩ型質量分析、イオントラップ／四重極複合型質量分析および／または飛行時間型質量分析を含んでなる、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
使用する質量分析のモードが、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）および／または多重選択的反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
特定のＴＵＢＢ３ペプチドが、配列番号１として記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍試料が、細胞、細胞の集合または固形組織である、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記腫瘍試料がホルマリン固定固形組織である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
特定のＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの定量化が、添加された既知量の内部標準ペプチドとの比較によって、前記試料における前記ＴＵＢＢ３ペプチドの量を判定することを含んでなり、生体試料における天然ペプチドおよび内部標準ペプチドの双方が、配列番号１で示されるＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの同じアミノ酸配列に相当する、請求項１４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
内部標準ペプチドが同位体標識されたペプチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
同位体標識された内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはその組み合わせから選択される１つ以上の安定重同位体を含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
どの薬剤を治療に用いるかに関する治療の決定が、生体試料中の他のペプチド／タンパク質と組み合わせた特定のＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの特定のレベルに基づくように、特定のＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの検出および定量化を、他のタンパク質由来の他のペプチドを多重形式で検出および定量化することと組み合わせることができる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
患者が胃癌に罹患している、かつＴＵＢＢ３レベルが参照レベルより低い場合、前記患者をＦＯＬＦＩＲＩで治療した後、ドセタキセルおよびシスプラチン（ＣＤＤＰ）で治療する、請求項１４に記載の方法。
【請求項３３】
患者が胃癌に罹患している、かつＴＵＢＢ３レベルが参照レベルより高い場合、前記患者をＦＯＬＦＩＲＩまたは５−ＦＵ＋フォリン酸（ロイコボリン）で治療する、請求項１４に記載の方法。
【請求項３４】
患者が三種陰性乳癌に罹患している、かつＴＵＢＢ３レベルが参照レベルより低い場合、前記患者をＡＣＴ（アントラサイクリンおよびシトキサンの後にタキサン）で治療する、請求項１４に記載の方法。
【請求項３５】
患者が三種陰性乳癌に罹患している、かつＴＵＢＢ３レベルが参照レベルより高い場合、前記患者をＣＭＦ（シトキサン、メトトレキサートおよび５−ＦＵ）で治療する、請求項１４に記載の方法。
【請求項３６】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の８５０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−２５０ａｍｏｌ／μｇである、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の８５０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−１５０ａｍｏｌ／μｇである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の８５０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−１００ａｍｏｌ／μｇである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の８５０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−５０ａｍｏｌ／μｇである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の８５０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−２５ａｍｏｌ／μｇである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の９３０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−２５０ａｍｏｌ／μｇである、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の９３０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−１５０ａｍｏｌ／μｇである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の９３０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−１００ａｍｏｌ／μｇである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の９３０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−５０ａｍｏｌ／μｇである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記参照レベルが、分析される生体試料タンパク質の９３０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−２５ａｍｏｌ／μｇである、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、２０１６年９月７日に出願された米国仮出願第６２／３８４，２０２号および２０１６年９月３０日に出願された米国仮出願第６２／４０２，９８４号（双方とも発明の名称が「チューブリンベータ−３鎖（ＴＵＢＢ３）タンパク質に対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ」）に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の各仮出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【発明の背景】
【０００２】
緒言
癌は、増殖および分裂する細胞を死滅させるために種々の方法で機能する一群の治療薬で治療される。共通の群の化学療法薬が、個別または組み合わせのいずれかで数十年間使用されており、臨床腫瘍学の実践において伝統的かつルーチンな癌治療となっている。これらの薬剤は、典型的に、ほとんどの癌細胞の主な特性の１つである急速な分裂をするあらゆる細胞を死滅させることで、作用する。しかし、これらの薬剤は、増殖する正常細胞も死滅させるため、癌細胞を死滅させるための「標的」アプローチとは考えられていない。近年、癌細胞のみを特異的に標的とする大規模な群の癌療法が開発されており、その治療薬は、癌細胞によってのみ発現され、正常細胞では発現されていないタンパク質を特異的に攻撃する。このアプローチは、癌療法に対する「標的」アプローチと考えられている。より最近では、「標的」様式で癌細胞を死滅させる別のアプローチは、免疫系を特異的に調節して、癌細胞を死滅させる癌患者の免疫系の能力を亢進させるものとなっている。
【０００３】
チューブリンベータ−３鎖（「ＴＵＢＢ３」）を標的とする治療薬が、早期臨床試験において有望となっている。しかし、癌細胞が大量のＴＵＢＢ３タンパク質を発現している患者のみが、これらのＴＵＢＢ３標的治療薬を用いた治療からベネフィットを得られる可能性が最も高い。本明細書で説明する方法は、ＴＵＢＢ３は正常組織および／または正常上皮細胞には通常は発現しないため、ＴＵＢＢ３シグナル経路の活性化の関連尺度をもたらす定量的なプロテオミクスに基づくアッセイを提供する。特に、これらの方法は、癌患者由来のホルマリン固定組織におけるＴＵＢＢ３を定量化し、さらに癌療法に対する改善された治療の決定を可能とする質量分析アッセイを提供する。
【０００４】
ＴＵＢＢ３のサブ配列に由来する特異ペプチドが提供される。質量分析に基づく選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイ（多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイとも呼ばれることがあり、本明細書ではＳＲＭ／ＭＲＭと呼ぶ）には、このペプチドに対するペプチド配列および断片化／遷移イオンが有用である。ＴＵＢＢ３タンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭ定量分析へのこのペプチドの使用を説明する。
【０００５】
本ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＴＵＢＢ３タンパク質由来の特異ペプチドの相対または絶対定量レベルの測定に使用することができ、質量分析により生体試料から得られた特定のタンパク質調製物におけるＴＵＢＢ３タンパク質の量を測定する方法を提供する。
【０００６】
より具体的には、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ホルマリン固定された癌患者組織などの患者組織試料から得た細胞から調製された複雑なタンパク質ライセート試料において、ペプチドを直接測定することができる。ホルマリン固定組織からタンパク質試料を調製する方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されており、かかる特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。米国特許第７，４７３，５３２号に記載の方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（ロックビル、メリーランド州）から入手可能な液体組織試薬およびプロトコルを用いて好都合に実施し得る。
【０００７】
癌患者から最も広く得られる組織型は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織である。外科的に切除された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界的に圧倒的に最も一般的な癌組織試料の保存方法であり、標準的な病理学の実践において受け入れられている慣習である。ホルムアルデヒド水溶液はホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、ホルムアルデヒド（約４０容積％または３７質量％）の飽和水溶液からなり、酸化および重合度を制限するために、少量の安定剤（通常はメタノール）を含む。組織を保存する最も一般的な方法は、組織全体を含水ホルムアルデヒド（通常、１０％中性緩衝ホルマリンと呼ばれる）に長時間（８時間〜４８時間）浸漬した後、固定された組織全体をパラフィンろうに包埋し、室温で長時間保存する。よって、ホルマリン固定癌組織を分析する分子分析法は、癌患者組織を分析するために有用である。
【０００８】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの結果は、組織（生体試料）を採取および保存した患者または被験体の特定の組織試料（例えば、癌組織試料）内のＴＵＢＢ３タンパク質の正確かつ精密な定量レベルを相関させるために、使用することができる。これにより、癌に関する診断情報が得られるだけでなく、医師または他の医療従事者が患者に対する適切な治療法を決定することも可能となる。患部組織または他の患者試料におけるタンパク質発現のレベルに関する診断的および治療的に重要な情報を提供するこのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。例えば、このようなアッセイは、癌の病期または程度を診断し、患者が最も反応する可能性の高い治療薬を決定するようにデザインされ得る。
【発明の概要】
【０００９】
ホルマリン固定組織のヒト生体試料におけるヒトＴＵＢＢ３タンパク質のレベルを測定する方法であって、質量分析を用いて前記ヒト生体試料から調製されたタンパク質消化物におけるＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量を検出し、有利には定量化すること、ならびに前記試料におけるＴＵＢＢ３タンパク質のレベルを算出することを含んでなり、ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドが配列番号１であり、前記レベルが相対レベルまたは絶対レベルである、方法が提供される。前記タンパク質消化物は、前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量を検出および／または定量化する前に、分画してもよい。前記タンパク質消化物はプロテアーゼ消化物を含み得、一方、組織はパラフィン包埋組織、例えば、腫瘍から得た組織であり得る。
【００１０】
前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドは、ある生体試料における前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量と、異なる別の生体試料における同じＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量とを比較することによって、定量化してもよい。添加された既知量の内部標準ペプチドと比較することにより、前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドを定量化してもよく、生体試料における前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドは、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較され、内部標準ペプチドは同位体標識されたペプチドである。
【００１１】
タンパク質消化物における前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量の検出および／または定量化は、修飾または非修飾ＴＵＢＢ３タンパク質の存在および被験体における癌との関連性を示すために用いることができる。ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量、またはＴＵＢＢ３タンパク質のレベルの検出および／または定量化の結果は、癌の診断病期／グレード／状態と相関させることができる。ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量、またはＴＵＢＢ３タンパク質のレベルの検出および／または定量化の結果を癌の診断病期／グレード／状態と相関させることは、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量を多重形式で検出および／または定量化することと組み合わせて、癌の診断病期／グレード／状態に関する追加情報を提供してもよい。
【００１２】
上記のようにヒトＴＵＢＢ３のレベルを測定した後、生体試料を採取した患者を治療的有効量の治療薬で治療してもよく、治療薬および／または治療薬の投与量は、前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量またはＴＵＢＢ３タンパク質のレベルに基づく。前記治療薬は、例えば、ＴＵＢＢ３タンパク質に結合する、および／または生物活性を阻害する。
【００１３】
また、癌に罹患している患者を治療する方法であって、患者から得た腫瘍試料から調製されたタンパク質消化物における、配列番号１のペプチドなどの特定のＴＵＢＢ３フラグメントペプチドのレベルを定量化すること、および質量分析を用いた選択的反応モニタリングにより、前記試料におけるＴＵＢＢ３ペプチドのレベルを算出すること、前記ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドのレベルを参照レベルと比較すること、かつ（ｉ）ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドのレベルが前記参照レベルより低い場合、タキサンに基づく化学療法レジメンで前記患者を治療すること、または（ｉｉ）ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドのレベルが前記参照レベルより高い場合、有効量のタキサンを含まない治療レジメンで患者を治療すること、のいずれかを含んでなる方法も提供される。前記参照レベルは、例えば、分析される生体試料タンパク質の７００ａｍｏｌ／μｇ、＋／−２５０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−１５０ａｍｏｌ／μｇ、＋／−１００ａｍｏｌ／μｇ、＋／−５０ａｍｏｌ／μｇまたは＋／−２５ａｍｏｌ／μｇであり得る。前記生体試料の前記タンパク質消化物は、液体組織プロトコルにより調製されてもよく、トリプシン消化物などのプロテアーゼ消化物を含んでなり得る。
【００１４】
前記癌に罹患している患者は、胃癌に罹患していてもよく、前記患者は、ＴＵＢＢ３レベルがカットオフより低い場合、ＦＯＬＦＩＲＩの後にドセタキセルおよびシスプラチン（ＣＤＤＰ）で治療してもよく、または、ＴＵＢＢ３レベルがカットオフより高い場合、ＦＯＬＦＩＲＩもしくは５−ＦＵ＋フォリン酸（ロイコボリン）のいずれかで治療してもよい。
【００１５】
前記癌に罹患している患者は、三種陰性乳癌に罹患していてもよく、ＴＵＢＢ３レベルがカットオフより低い場合、ＡＣＴ（アントラサイクリンおよびシトキサンの後にタキサン）で治療してもよく、または、ＴＵＢＢ３レベルがカットオフより高い場合、ＣＭＦ（シトキサン、メトトレキサートおよび５−ＦＵ）で治療してもよい。
【００１６】
これらの方法のいずれにおいても、質量分析は、タンデム型質量分析、イオントラップ型質量分析、三連四重極型質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析、ＭＡＬＤＩ型質量分析、イオントラップ／四重極複合型質量分析および／または飛行時間型質量分析であり得る。使用する質量分析のモードは、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）および／または多重選択的反応モニタリング（ｍＳＲＭ）であり得る。
【００１７】
上記で説明した治療の方法において、腫瘍試料は細胞、細胞の集合または固形組織であり得、パラフィン包埋組織などのホルマリン固定固形組織であり得る。さらに、どの薬剤を治療に用いるかに関する治療の決定が、生体試料中の他のペプチド／タンパク質と組み合わせた特定のＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの特定のレベルに基づくように、特定のＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの検出および定量化を、他のタンパク質由来の他のペプチドを多重形式で検出および定量化することと組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、胃癌患者の全生存期間（ＯＳ）の中央値は、規定のカットオフより高いＴＵＢＢ３レベル（＞７００ａｍｏｌ／ｕｇ）を有する患者の方が、カットオフより低い（＜７００ａｍｏｌ／ｕｇ）患者よりも有意に短かったことを示す（１５６６日対８０１日、Ｐ＝０．０２８２）。
【図２】図２は、ＦＯＬＦＩＲＵの後に５−ＦＵ＋フォリン酸（ロイコボリン）で治療された患者に関して、規定のＴＵＢＢ３カットオフ（＞７００ａｍｏｌ／ｕｇ）より高い胃癌患者と低い胃癌患者のＯＳには、ほとんど差は認められなかったことを示す。
【図３】図３は、ＦＯＬＦＩＲＩの後にドセタキセル（タキソテール）およびシスプラチン（ＣＤＤＰ）で治療された患者と、ＦＯＬＦＩＲＵの後に５−ＦＵ＋フォリン酸（ロイコボリン）で治療された患者の比較において、規定のＴＵＢＢ３カットオフより高い（＞７００ａｍｏｌ／ｕｇ）胃癌患者のＯＳに有意差が認められたことを示す。
【図４】図４は、７００ａｍｏｌ／ｕｇのカットオフＴＵＢＢ３レベルより高い患者と低い患者に関して、ＡＣＴ（アントラサイクリンおよびシトキサンの後にタキサン）で治療された三種陰性乳癌患者の無再発生存期間（ＲＦＳ）に差が認められたことを示す。
【図５】図５は、８５０ａｍｏｌ／ｕｇのカットオフＴＵＢＢ３レベルより高い患者と低い患者に関して、ＡＣＴ（アントラサイクリンおよびシトキサンの後にタキサン）で治療された三種陰性乳癌患者のＲＦＳに差が認められたことを示す。
【図６】図６は、９３０ａｍｏｌ／ｕｇのカットオフＴＵＢＢ３レベルより高い患者と低い患者に関して、ＡＣＴ（アントラサイクリンおよびシトキサンの後にタキサン）で治療された三種陰性乳癌患者のＲＦＳに差が認められたことを示す。
【図７】図７は、９３０ａｍｏｌ／ｕｇのカットオフＴＵＢＢ３レベルより高い患者と低い患者に関して、ＡＣＴ（アントラサイクリンおよびシトキサンの後にタキサン）で治療された三種陰性乳癌患者のＯＳに差が認められたことを示す。
【発明の具体的説明】
【００１９】
本明細書で説明するアッセイは、ＴＵＢＢ３タンパク質に由来する特異的な非修飾ペプチドの相対または絶対レベルを測定する。ＴＵＢＢ３タンパク質の相対定量レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によって、例えば、異なる試料における個々のＴＵＢＢ３ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積（例えば、シグネチャーピーク面積または統合されたフラグメントイオンの強度）を比較することにより、判定することができる。代わりに、各ペプチドが独自の特異的なＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを有する、複数のＴＵＢＢ３シグネチャーペプチドの複数のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を比較して、ある生体試料における相対ＴＵＢＢ３タンパク質含量を判定し、それを１つ以上の追加のまたは異なる生体試料におけるＴＵＢＢ３タンパク質含量と比較することが可能である。このようにして、ＴＵＢＢ３タンパク質に由来する特定の１つまたは複数のペプチドの量、よってＴＵＢＢ３タンパク質の量を、同じ実験条件下で、２つ以上の生体試料における同じ１つまたは複数のＴＵＢＢ３ペプチドと比較して判定する。さらに、単一の試料内のＴＵＢＢ３タンパク質に由来する特定の１つまたは複数のペプチドに対する相対的定量化は、そのペプチドのシグネチャーピーク面積をＳＲＭ／ＭＲＭ法により、生体試料に由来する同じタンパク質調製物内の異なる１つまたは複数のタンパク質に由来する別の異なる１つまたは複数のペプチドのシグネチャーピーク面積と比較することによって、判定することができる。このように、ＴＵＢＢ３タンパク質に由来する特定のペプチドの量、よってＴＵＢＢ３タンパク質の量を、同じ試料内で互いに比較して判定する。
【００２０】
これらのアプローチによって、試料間および試料内の別の１つまたは複数のペプチドに対するＴＵＢＢ３タンパク質に由来する個々の１つまたは複数のペプチドの定量化がもたらされ、その定量化においては、生体試料に由来するタンパク質調製物におけるＴＵＢＢ３ペプチドの重量／容積または重量／重量の絶対量にかかわらず、シグネチャーピーク面積によって判定される量は、互いに比較される。異なる試料間の個々のシグネチャーピーク面積に関する相対定量データは、試料あたりに分析されたタンパク質の量に対して正規化される。相対的定量化は、単一の試料および／または多数の試料において、複数のタンパク質およびＴＵＢＢ３タンパク質に由来する多数のペプチドに対して同時に実施でき、他のペプチド／タンパク質に対するあるペプチド／タンパク質の相対タンパク質量に関する洞察を得ることができる。
【００２１】
ＴＵＢＢ３タンパク質の絶対定量レベルは、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によって判定することができ、ＳＲＭ／ＭＲＭ法では、ある生体試料におけるＴＵＢＢ３タンパク質由来の個々のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、添加された内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較する。一つの実施態様では、内部標準は、１つ以上の重同位体で標識された１つ以上のアミノ酸残基を含む同一の正確なＴＵＢＢ３ペプチドの合成バージョンである。同位体標識された内部標準は、質量分析により分析されたとき、天然ＴＵＢＢ３ペプチドのシグネチャーピークとは異なり、そのため比較ピークとして用いることができる予測可能なかつ一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを生成するように合成することができる。よって、内部標準を既知量で生体試料由来のタンパク質調製物に添加し、質量分析により分析する場合、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積が内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較され、この数値比較からは、生体試料由来の元のタンパク質調製物に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度および／または絶対重量のいずれかが示される。フラグメントペプチドに関する絶対定量データは、試料あたりに分析されたタンパク質の量に従って表示される。絶対的定量化は、単一の試料および／または多数の試料において多数のペプチド、よってタンパク質に対して同時に実施でき、個々の生体試料および個々の試料の全コホートにおける絶対タンパク質量に関する洞察を得ることができる。
【００２２】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法は、例えば、ホルマリン固定組織などの患者由来組織において直接癌の病期の診断を補助するため、およびその患者の治療に用いるのにどの治療薬が最も有利となるかの判定を補助するために使用することができる。部分的もしくは全体的な腫瘍の治療的切除などの手術、または疑われる疾患の存在もしくは非存在を判定するために実施される生検処置のいずれかを通じて患者から除去される癌組織は、特異タンパク質またはタンパク質がその患者組織に存在するか否か、ならびにどの型のタンパク質がその患者組織に存在するか否かを判定するために分析される。さらに、１つまたは複数のタンパク質の発現レベルを判定し、健常組織において認められる「正常」または参照レベルと比較することができる。健常組織において認められるタンパク質の正常または参照レベルは、例えば、癌を有さない１名以上の個人の関連組織に由来するものであってよい。あるいは、正常または参照レベルは、癌に罹患していない関連組織の分析によって、癌を有する個人に対して得たものであってもよい。
【００２３】
タンパク質レベル（例えば、ＴＵＢＢ３レベル）のアッセイは、ＴＵＢＢ３レベルを用いることにより、癌と診断された患者または被験体における癌の病期を診断するために用いることもできる。個々のＴＵＢＢ３ペプチドのレベルは、分析されたタンパク質ライセートの総量あたりのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより判定されたペプチドのモル量と定義される。よって、ＴＵＢＢ３タンパク質（またはＴＵＢＢ３タンパク質のフラグメントペプチド）のレベルを正常組織のレベルと相関させることで、癌の病期またはグレードを判定する補助となるよう、ＴＵＢＢ３に関する情報を使用することができる。一度癌細胞においてＴＵＢＢ３タンパク質の定量量が判定されていれば、その情報を、例えば、分析された１つまたは複数のタンパク質（例えば、ＴＵＢＢ３）の異常発現という特徴を有する癌組織を特異的に治療するために開発された治療薬（化学的および生物学的）の一覧と適合させることができる。
【００２４】
患者から得たホルマリン固定腫瘍組織の試料におけるＴＵＢＢ３レベルを測定して、その測定レベルを規定のカットオフレベルと比較することにより、癌治療の改善された方法も提供される。測定されたＴＵＢＢ３レベルが規定のカットオフより低い場合、患者をタキサンに基づく治療レジメンを含む治療レジメンで治療する。測定されたＴＵＢＢ３レベルがカットオフより高い場合、以下に詳細に説明する代替治療レジメンを実施する。有利には、代替治療レジメンは、タキサンに基づく治療レジメンを含まない。胃癌および三種陰性乳癌を治療する改善された方法が提供される。
【００２５】
ＴＵＢＢ３タンパク質アッセイから得られる情報を、例えば、ＴＵＢＢ３タンパク質または前記タンパク質を発現する細胞／組織を特異的に標的とする治療薬の一覧と適合させると、疾患を治療するための個別化医療アプローチと呼ばれているものが定義される。本明細書で説明するアッセイ法は、患者自身の組織に由来するタンパク質の分析を、診断および治療の決定のための源として用いることにより、個別化医療アプローチの基礎を形成する。
【００２６】
原則的に、例えば、特異性が既知のプロテアーゼ（例えば、トリプシン）で消化することにより調製されたＴＵＢＢ３タンパク質に由来するいずれの予測されるペプチドも、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて試料中のＴＵＢＢ３タンパク質の存在量を判定するための代替レポーターとして用いることができる。しかし、驚くべきことに、ＴＵＢＢ３タンパク質に由来する多数の潜在的なペプチド配列は、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに用いるには不適切であるまたは効果的ではないことが認められており、その理由は直ちに明白になるものではない。これは特に、ホルマリン固定組織に由来するペプチドに当てはまる。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに最も好適なペプチドを予測することは不可能であったため、実際の液体組織ライセートにおけるペプチドを実験的に同定して、ＴＵＢＢ３タンパク質に対する信頼性の高い正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発することが必要であった。いずれかの理論に縛られることは望んでいないが、一部のペプチドは、十分にイオン化しないか、他のタンパク質とは異なるフラグメントを産生しないため、例えば、質量分析により検出することが困難な可能性があると考えられている。また、ペプチドは、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）において十分に分解しないか、ガラス器具またはプラスチック器具に付着する可能性がある。
【００２７】
米国特許第７，４７３，５３２号に記載の液体組織プロトコルの使用など、種々の手段により、ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドを生成してもよい。液体組織プロトコルおよび試薬は、組織／生体試料におけるタンパク質のタンパク質消化によって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から、質量分析に適切なペプチド試料を産生することができる。液体組織プロトコルでは、組織／生体試料を緩衝液中で長時間（例えば、約８０℃〜約１００℃で約１０分〜約４時間）加熱し、タンパク質架橋を逆転または遊離させる。用いる緩衝液は、中性緩衝液（例えば、トリスベース緩衝液、または洗浄剤を含む緩衝液）である。加熱処理後、組織／生体試料を１つ以上のプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、ペプシンおよびエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃが挙げられるが、これらに限定されない）で、前記生体試料の組織および細胞構造を破壊する、ならびに前記試料を液化するのに十分な時間（例えば、３７℃〜６５℃の温度で３０分〜２４時間）処理する。加熱およびタンパク質分解の結果、液体で可溶性の希釈可能な生体分子ライセートが得られる。
【００２８】
以下に説明するＴＵＢＢ３ペプチドは、ホルマリン固定癌組織から得た細胞から調製された複雑な液体組織ライセート内の全タンパク質をプロテアーゼ消化することによって、ＴＵＢＢ３タンパク質から得たものであった。特に明記しない限り、各例におけるプロテアーゼはトリプシンであった。次に、液体組織ライセートを質量分析により分析し、質量分析により検出および分析されるＴＵＢＢ３タンパク質に由来するこれらのペプチドを判定した。質量分析に用いる特異的な好ましいサブセットのペプチドの同定は、１）液体組織ライセートの質量分析において、タンパク質に由来するどの１つまたは複数のペプチドがイオン化するかの実験的判定、ならびに２）液体組織ライセートの調製用いるプロトコルおよび実験条件をペプチドが乗り越えられる能力、に基づいている。
【００２９】
液体組織試薬を用いて、また、細胞を組織の顕微解剖を通じて試料へ採取した後、液体組織緩衝液中でその細胞を長時間加熱することを必要とする液体組織プロトコルを用いて、ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接得た細胞に由来するタンパク質ライセートを調製した。ホルマリンによって誘導された架橋が負の影響を受けたら、例えば、トリプシン（他のプロテアーゼを使用することもできるが）などのプロテアーゼを用いて、予測可能な様式で、組織／細胞を完全に消化させる。インタクトなポリペプチドをプロテアーゼで消化させることにより、各タンパク質ライセートをペプチドの集合にする。各液体組織ライセートを分析し（例えば、イオントラップ型質量分析により）、ペプチドの多重グローバルプロテオミクス解析を実施した（ここで、データは、各タンパク質ライセートに存在する全細胞タンパク質から質量分析によって同定できただけの数のペプチドの同定として示した）。イオントラップ型質量分析計、または、単一の複雑なタンパク質／ペプチドライセートからできる限り多くのペプチドを同定するためにグローバルプロファイリングを実施可能な別の型の質量分析計を用いる。しかし、イオントラップ型質量分析計が、ペプチドのグローバルプロファイリングを実施するために有利に用いられ得る。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ、イオントラップまたは三連四重極などのいずれの種類の質量分析計に対しても、有利には、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに用いられる三連四重極型機器プラットフォームに対して開発および実施し得る。この種の質量分析計は、１つの細胞内に含まれる全タンパク質に由来する数十万〜数百万の個々のペプチドからなり得る非常に複雑なタンパク質ライセート内にある単一の分離された標的ペプチドを分析するのに、適切な機器である。
【００３０】
使用した条件下で、単一のライセートの単一のＭＳ分析において、できる限り多くのペプチドが同定されたら、その後、その一覧のペプチドを集め、そのライセートにおいて検出されたタンパク質の判定に使用した。この工程を複数の液体組織ライセートに対して繰り返し実施し、非常に広範な一覧のペプチドを単一のデータセット内に集めた。この種のデータセットは、（プロテアーゼ消化後に）分析された種類の生体試料、具体的には生体試料の液体組織ライセートにおいて検出可能なペプチドを表し、よって、例えばＴＵＢＢ３タンパク質などの特異タンパク質に対する１つ以上のペプチドを含むとみなすことができる。
【００３１】
一つの実施態様では、ＴＵＢＢ３タンパク質の絶対量または相対量の判定に有用であるものとして同定されたＴＵＢＢ３トリプシンペプチドは、配列番号１のペプチドである。このペプチドは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から調製された液体組織ライセートにおいて、質量分析により検出されたものであった。このペプチドは、ホルマリン固定患者組織中のものを直接含む、ヒト生体試料におけるＴＵＢＢ３タンパク質に対する定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにおいて使用し得る。
【００３２】
配列番号１  ＩＳＶＹＹＮＥＡＳＳＨＫ
【００３３】
このＴＵＢＢ３トリプシンペプチドは、肺、結腸および乳房などの異なるヒト器官の複数の異なるホルマリン固定組織の複数の液体組織ライセートから検出されたものであった。このペプチドは、ホルマリン固定組織におけるＴＵＢＢ３タンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに対して有用である。さらなるデータ解析から、いずれの特定の器官部位由来のいずれの特異ペプチドにも好みは認められていないことが示されている。よって、配列番号１のペプチドは、いずれかの生体試料に由来するいずれかのホルマリン固定組織、または体内のいずれかの器官部位から得た液体組織ライセートでＴＵＢＢ３タンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実施するのに好適である。
【００３４】
配列番号１のペプチドに対してＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを最も効率的に実施するために、分析におけるペプチド配列に加え、情報を利用することが望ましい。その追加情報は、アッセイを効率的に実施できるように、特異標的ペプチドの正確かつ集中した分析を実施するために、質量分析計（例えば、三連四重極型質量分析計）の指導および指示に用いられ得る。
【００３５】
特異ＴＵＢＢ３ペプチドに関するこの追加情報は、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体の荷電状態、前駆体のｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオンおよび各遷移イオンのイオン型のうち１つ以上を含み得る。以下の表に、配列番号１のペプチドを使用するためのＴＵＢＢ３タンパク質に対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発に用いられ得る追加のペプチド情報を示す。
【表１】
2019529896.tif 000002
【００３６】
以下に説明する方法は、（１）ＴＵＢＢ３タンパク質に対する質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに用いることができるＴＵＢＢ３タンパク質由来の候補ペプチドの同定、（２）関係付けるためのＴＵＢＢ３タンパク質由来の標的ペプチドに対する個々の１つまたは複数のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発、ならびに（３）癌の診断および／または最適な治療法の選択への定量アッセイの適用、のために用いた。
【００３７】
アッセイ法
１．  ＴＵＢＢ３タンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭ候補フラグメントペプチドの同定
ａ．  １つまたは複数のプロテアーゼ（トリプシンを含んでも含まなくてもよい）を用いたホルマリン固定生体試料由来の液体組織タンパク質ライセートを調製し、タンパク質を消化する。
ｂ．  液体組織ライセート中の全タンパク質フラグメントをイオントラップタンデム型質量分析計で分析し、ＴＵＢＢ３タンパク質由来の全フラグメントペプチドを同定する（個々のフラグメントペプチドは、リン酸化またはグリコシル化などのいずれのペプチド修飾も含まない）。
ｃ．  液体組織ライセート中の全タンパク質フラグメントをイオントラップタンデム型質量分析計で分析し、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を有するＴＵＢＢ３タンパク質由来の全フラグメントペプチドを同定する。
ｄ．  全長ＴＵＢＢ３タンパク質全体に由来する特異消化法により生成された全ペプチドは、潜在的に測定し得るが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発に用いる好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複雑な液体組織タンパク質ライセートにおいて質量分析により直接同定されたペプチドである。
ｅ．  患者組織において特異的に修飾（リン酸化、グリコシル化など）されているペプチドであり、かつ、ホルマリン固定生体試料由来の液体組織ライセートを分析する際、イオン化し、よって質量分析計において検出されるペプチドを、ＴＵＢＢ３タンパク質のペプチド修飾を分析するための候補ペプチドとして同定する。
【００３８】
２．  ＴＵＢＢ３タンパク質由来のフラグメントペプチドに対する質量分析アッセイ
ａ．  液体組織ライセートにおいて同定された個々のフラグメントペプチドに対する三連四重極型質量分析計でのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、ＴＵＢＢ３タンパク質由来のペプチドに適用する。
ｉ．  ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは逆相高速液体クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない最適なクロマトグラフィー条件に対して、フラグメントペプチドの最適な保持時間を判定する。
ｉｉ．  各ペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドの前駆体の荷電状態、各ペプチドの前駆体のｍ／ｚ値、各ペプチドのｍ／ｚ遷移イオンおよび各フラグメントペプチドの各遷移イオンのイオン型を判定する。
ｉｉｉ．  次に、三連四重極型質量分析計で、（ｉ）および（ｉｉ）からの情報を用いて、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実施することができる。ここで、各ペプチドは、三連四重極型質量分析計で実施された独特のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを正確に規定する特徴的かつ独特なＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを有する。
【００３９】
ｂ．  ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析から得られる独特のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積の関数として、検出されるＴＵＢＢ３タンパク質のフラグメントペプチドの量が、特定のタンパク質ライセートにおけるタンパク質の相対量および絶対量の双方を示すことができるように、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を実施する。
ｉ．  相対的定量化は、以下によって達成することができる。
１．  あるホルマリン固定生体試料由来の液体組織ライセートにおいて検出された特定のＴＵＢＢ３ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、少なくとも第二、第三、第四またはそれ以降のホルマリン固定生体試料由来の少なくとも第二、第三、第四またはそれ以降の液体組織ライセートにおける同じＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの同じＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより、ＴＵＢＢ３タンパク質の存在の増加または減少を判定する。
２．  あるホルマリン固定生体試料由来の液体組織ライセートにおいて検出された特定のＴＵＢＢ３ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、異なる別の生体源由来の他の試料における他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから得られたＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより、ＴＵＢＢ３タンパク質の増加または減少を判定する。ここで、ペプチドフラグメントに対する２試料間のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積の比較を、各試料中の分析したタンパク質の量に対して正規化する。
３．  ＴＵＢＢ３タンパク質のレベルの変化を、種々の細胞条件下で発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに対して正規化するために、特定のＴＵＢＢ３ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、ホルマリン固定生体試料由来の同じ液体組織ライセート内の異なるタンパク質に由来する他のフラグメントペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより、ＴＵＢＢ３タンパク質の存在の増加または減少を判定する。
４．  これらのアッセイは、ＴＵＢＢ３タンパク質の非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドの双方に対して適用することができ、修飾は、リン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれらに限定されず、修飾ペプチドの相対レベルは、非修飾ペプチドの相対量の判定と同じ方法で判定する。
【００４０】
ｉｉ．  特定のペプチドの絶対的定量化は、個々の生体試料におけるＴＵＢＢ３タンパク質由来の特定のフラグメントペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、生体試料由来のタンパク質ライセートに添加したフラグメントペプチド内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより、達成し得る。
１．  前記内部標準は、調査中のＴＵＢＢ３タンパク質に由来するフラグメントペプチドの標識合成バージョンである。この標準を既知量の試料に添加し、ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積は、生体試料中のフラグメントペプチド内部標準および天然フラグメントペプチドの双方に対して別々に判定することができ、その後、両ピーク面積を比較する。
２．  これは、非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに対して適用することができ、修飾は、リン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれらに限定されず、修飾ペプチドの絶対レベルは、非修飾ペプチドの絶対レベルの判定と同じ方法で判定することができる。
【００４１】
３．  癌の診断および治療へのフラグメントペプチドの定量化の適用
ａ．  ＴＵＢＢ３タンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量化を実施し、癌の分野で十分理解されている、ＴＵＢＢ３タンパク質の発現と患者腫瘍組織における癌の病期／グレード／状態との以前に判定された関連性が認められることを示す。
ｂ．  ＴＵＢＢ３タンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量化を実施し、異なる治療戦略から得られる臨床成績との相関を示し、この相関は、すでにこの分野において実証されているか、患者コホートとそれらの患者の組織との間の相関研究を通じて将来実証され得る。以前に確立された相関または将来引き出された相関が本アッセイによって一度確認されれば、本アッセイ法を最適な治療戦略の判定に用いることができる。
【００４２】
イオントラップ型質量分析計および三連四重極型質量分析計の双方で全ＴＵＢＢ３ペプチドの分析をすることによって、特異ＴＵＢＢ３ペプチドの特異的かつ独特な特性を開発した。その情報には、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体の荷電状態、前駆体のｍ／ｚ値、前駆体の遷移ｍ／ｚ値および同定された各遷移のイオン型が含まれる。その情報は、ホルマリン固定試料／組織由来の液体組織ライセート中に直接含まれる各々のおよび全ての候補ＳＲＭ／ＭＲＭペプチドに対して実験的に判定しなければならない。その理由は、興味深いことに、本明細書で説明するように、ＳＲＭ／ＭＲＭを用いてそのようなライセートにおいてＴＵＢＢ３タンパク質に由来する全てのペプチドを検出できるわけではないからである。このことから、検出されないＴＵＢＢ３ペプチドは、ホルマリン固定試料／組織由来の液体組織ライセートにおけるペプチド／タンパク質の直接的な定量に使用するためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発のための候補ペプチドとみなすことはできないことが示されている。
【００４３】
特異ＴＵＢＢ３ペプチドの特定のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、三連四重極型質量分析計で実施する。特定のＴＵＢＢ３  ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで分析される実験試料は、例えば、ホルマリン固定およびパラフィン包埋されていた組織から調製された液体組織タンパク質ライセートである。そのようなアッセイから得たデータは、ホルマリン固定試料中のこのＴＵＢＢ３ペプチドに対する独特なＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークの存在を示す。
【００４４】
このペプチドの特異的な遷移イオン特性は、ホルマリン固定生体試料中の特定のＴＵＢＢ３ペプチドを定量的に測定するために使用される。これらのデータは、分析されたタンパク質ライセートの１μｇあたりのペプチドのモル量の関数として、このＴＵＢＢ３ペプチドの絶対量を示す。ホルマリン固定患者由来組織の分析に基づいた組織中のＴＵＢＢ３タンパク質レベルの評価は、各特定の患者に関する診断、予後および治療に関連する情報を提供し得る。一つの実施態様では、本開示は、生体試料におけるチューブリンベータ−３鎖タンパク質（ＴＵＢＢ３）のレベルを測定する方法であって、質量分析を用いて前記生体試料から調製されたタンパク質消化物におけるＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量を検出および／または定量化すること、ならびに前記試料におけるＴＵＢＢ３タンパク質のレベルを算出することを含んでなり、レベルが相対レベルまたは絶対レベルである方法を説明する。関連実施態様では、ＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの定量化は、添加された既知量の内部標準ペプチドとの比較によって、生体試料におけるＴＵＢＢ３フラグメントペプチドの量を判定することを含んでなり、内部標準ペプチドは同じアミノ酸配列を有する。一部の実施態様では、内部標準は同位体標識された内部標準ペプチドであり、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはその組み合わせから選択される１つ以上の安定重同位体を含んでなる。
【００４５】
本明細書で説明する生体試料中のＴＵＢＢ３タンパク質（またはその代替としてのフラグメントペプチド）のレベルを測定する方法は、患者または被験体における癌の診断指標として用い得る。一つの実施態様では、ＴＵＢＢ３タンパク質のレベルの測定結果は、組織において認められるＴＵＢＢ３タンパク質のレベルを正常組織および／または癌組織もしくは前癌組織において認められるそのタンパク質のレベルと相関（例えば、比較）することにより、癌の診断病期／グレード／状態を判定するのに用い得る。
【００４６】
当業者は、タキサン剤は、追加の薬剤または薬剤の組み合わせを含む治療レジメンの一部としても使用し得ることを認識するであろう。患者腫瘍試料におけるＴＵＢＢ３のレベルは、通常はａｍｏｌ／μｇで表されるが、他の単位を使用することもできる。当業者は、参照レベルは、中心値前後の範囲、例えば＋／−２５０、１５０、１００、５０または２５ａｍｏｌ／μｇで表し得ることを認識するであろう。以下に詳細に説明する胃癌の最初の具体例では、ＴＵＢＢ３タンパク質の好適な参照レベルは、７００ａｍｏｌ／μｇであることが認められた。三種陰性乳癌の２番目の例では、カットオフも７００ａｍｏｌ／μｇであることが認められたが、８５０および９３０ａｍｏｌ／μｇのカットオフも統計学的に有意であることが認められた。しかし、当業者は、臨床結果および経験に基づき、これらの参照レベルより高いまたは低いレベルを選択し得ることを認識するであろう。
【００４７】
ＴＵＢＢ３レベルが規定の参照レベルより低い場合、患者をタキサンに基づく治療レジメンで治療し、ＴＵＢＢ３レベルが規定の参照レベルより高い場合、患者を代替レジメンで治療する、改善された治療方法が提供される。以下に説明するように、胃癌の場合は、ＴＵＢＢ３レベルがカットオフより低い場合、ＦＯＬＦＩＲＩの後にドセタキセル（タキソテール）およびシスプラチン（ＣＤＤＰ）などのレジメンで患者を治療してもよいのに対し、ＴＵＢＢ３レベルがカットオフより高い場合は、ＦＯＬＦＩＲＩまたは５−ＦＵ＋フォリン酸（ロイコボリン）のいずれかで患者を治療してもよい。三種陰性乳癌の場合は、ＴＵＢＢ３レベルがカットオフより低い場合、患者をＡＣＴ（アントラサイクリンおよびシトキサンの後にタキサン）で治療してもよいのに対し、ＴＵＢＢ３レベルがカットオフより高い場合は、ＣＭＦ（シトキサン、メトトレキサートおよび５−ＦＵ）で患者を治療してもよい。
【００４８】
核酸およびタンパク質の双方とも、同じ液体組織生体分子調製物から分析できるため、タンパク質を分析した同じ試料中の核酸から、疾患の診断および薬物治療の決定に関する追加情報を生み出すことが可能である。例えば、ＴＵＢＢ３タンパク質が高いレベルで特定の細胞により発現している場合は、ＳＲＭで分析した場合、データは、細胞の状態およびその細胞が制御されない増殖をする可能性、最適な治療法の選択、ならびに薬剤耐性の可能性に関する情報を提供し得る。同時に、遺伝子ならびに／または核酸およびその遺伝子がコードするタンパク質の状態（例えば、ｍＲＮＡ分子およびその発現レベルまたはスプライスバリエーション）に関する情報を、同じ液体組織生体分子調製物中に存在する核酸から得ることができる。ＴＵＢＢ３タンパク質などのタンパク質のＳＲＭ  分析と同時に、核酸を評価することができる。一つの実施態様では、ＴＵＢＢ３タンパク質および／または１つ、２つ、３つまたはそれ以上の追加のタンパク質に関する情報は、それらのタンパク質をコードする核酸を調べることによって、評価し得る。それらの核酸は、例えば、シークエンシング法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限断片長多型分析、欠失、挿入の同定、および／または一塩基対多型、トランジション、トランスバージョンまたはその組み合わせを含むがこれらに限定されない変異の存在の判定のうち、１つ以上、２つ以上または３つ以上により、調べることができる。
【実施例】
【００４９】
ＴＵＢＢ３のプロテオミクス解析は、全摘出された胃腺癌におけるドセタキセル療法のベネフィットを予測する：ＩＴＡＣＡ−Ｓ試験からの試料の再評価
ＩＴＡＣＡ−Ｓ試験では、胃または食道胃接合部の切除可能な腺癌を有する患者を、ＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン１８０ｍｇ／ｍ２１日目、ＬＶ１００ｍｇ／ｍ２２時間注入および５−ＦＵ４００ｍｇ／ｍ２ボーラス投与、１日目および２日目の後に６００ｍｇ／ｍ２／日２２時間持続注入、ｑ１４を４サイクル）の後にドセタキセル７５ｍｇ／ｍ２１日目、シスプラチン７５ｍｇ／ｍ２１日目、ｑ２１を３サイクル（連続群）またはＤｅ  Ｇｒａｍｏｎｔレジメン（５−ＦＵ／ＬＶ群）のいずれかに無作為に割り付けた。この試験から導き出された最初の結論は、より強力なレジメンは、単独療法と比較して、無病生存期間およびＯＳにおいてベネフィットを示さなかった、というものであった。Ann Oncol. 25:1373-8 (2014)を参照。
【００５０】
以下に説明する分析は、クラスＩＩＩ  β−チューブリン（ＴＵＢＢ３）タンパク質の発現が低いことまたはみられないことが、タキサンに基づく治療法で治療された患者における生存率の向上を予測したことを示すための、上記で説明した質量分析（ＭＳ）に基づくプロテオミクスアッセイの使用を示す。
【００５１】
タキサンに基づく治療法の単一の予測バイオマーカーとしての７００ａｍｏｌ／μｇというＴＵＢＢ３のカットオフを、ＴＵＢＢ３に対するＭＳに基づくプロテオミクスアッセイの検出限界に基づいて確立した。タキサンに基づく化学療法を受けている転移性胃癌患者（ＩＴＡＣＡ−Ｓ試験）における予測バイオマーカーのカットオフは、臨床的に確証された。
【００５２】
タキサンに基づく化学療法を受けている転移性胃癌患者（ＩＴＡＣＡ−Ｓ試験）におけるプロスペクティブ・レトロスペクティブに公表されたＴＵＢＢ３カットオフは、臨床的に確証された。
全生存期間（ＯＳ）の中央値は、規定のカットオフより高いＴＵＢＢ３レベル（＞７００ａｍｏｌ／ｕｇ）を有する患者の方が、カットオフより低い（＜７００ａｍｏｌ／ｕｇ）患者よりも有意に短かった（１５６６日対８０１日、Ｐ＝０．０２８２）。図１参照。
【００５３】
興味深いことに、＞７００  ａｍｏｌ／μｇのＴＵＢＢ３を有する患者は、タキサン群の患者と比較し、タキサンに基づく化学療法で治療されなかった場合、有意に長いＯＳを示したことが認められた（１９９１日対８０１日、Ｐ＝０．０４８０）。＜７００ａｍｏｌ／ｕｇのＴＵＢＢ３を有する患者は、５−ＦＵ／ＬＶ群の患者と比較し、タキサンに基づく化学療法によりベネフィットが得られる（１５５６日対１２２７日）。図２および３参照。
【００５４】
ＴＵＢＢ３のプロテオミクス解析は、三種陰性乳癌におけるＡＣＴ療法のベネフィットを予測する：
三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）は、他の種類の乳癌と比較した場合、侵攻性の臨床経過をとり、局所再発および遠隔転移の率が高い異質な疾患である。Joensuu et al., Ann Oncol, 23 Suppl 6: p. vi40-5 (2012)。全身化学療法は、疾患の再発を予防するために推奨されることが多いが、多くの化学療法バイオマーカーが同定されてはいるが、スクリーニングはルーチンではなく、化学療法レジメンは、個々の腫瘍生物学を説明するように調整されてはいない。患者の個々の腫瘍の生物学に基づき、どの患者が治療法に反応するかを同定できる能力は、患者を不要な毒性から回避しながら、最も効果的な治療法を提供することを確実にできる可能性がある。
【００５５】
以下に説明する方法は、定量的プロテオミクスアプローチを用いた、標準治療（ＡＣＴ：ドキソルビシン、シクロホスファミドの後にドセタキセル）で治療されたＴＮＢＣ患者（ｎ＝９７）における腫瘍の分子プロファイルと生存率との関連性を示す。
【００５６】
方法：ＴＮＢＣ患者（ｎ＝９７）から得たホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロック由来の顕微解剖した腫瘍の領域を、液体組織（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ(登録商標））消化およびプロテオミクス解析に供した。多重ＳＲＭ−ＭＳアッセイを用いて、ＴＵＢＢ３を含む複数のタンパク質のレベルを定量化した。カプラン・マイヤー分析を用いて、補助療法後の生存率のベネフィットを予測する最適なタンパク質発現閾値を得た。
【００５７】
結果：ＴＵＢＢ３は、患者試料９７個中６９個（７１％）において、標的プロテオミクスにより検出でき、８．８倍の範囲の発現（７００〜６１６１．７ａｍｏｌ／μｇ）を測定した。ＴＵＢＢ３の高いタンパク質発現（ＴＵＢＢ３＞９３０ａｍｏｌ／μｇ）は、短い全生存期間（ＯＳ）および悪い無再発生存期間（ＲＦＳ）と相関していた。ＲＦＳおよび全生存期間（ＯＳ）は、ＴＵＢＢ３の発現が低い（ＴＵＢＢ３＜９３０ａｍｏｌ／μｇ）患者において統計学的に有意に優れていた。データは、カットオフは７００ａｍｏｌ／μｇであることが認められたが、８５０および９３０ａｍｏｌ／μｇのカットオフも統計学的に有意であることが認められたことを示す。図４〜７参照。
【００５８】
ＴＵＢＢ３の広範囲の発現は、特定の治療法が、バイオマーカーの発現に基づき、異なる反応を示すことを示す。ここに示した結果は、ＴＵＢＢ３のタンパク質発現を測定することにより、改善された治療方法が提供されること、および、ＴＵＢＢ３は、ＡＣＴで治療されたＴＮＢＣ患者におけるタキサンに基づく治療法に抵抗するための予測マーカーであることを実証している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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