(57)【要約】本発明は、ポリマーと環状ペプチドリガンドとを含むスキャフォールドを提供する。該ペプチドリガンドは、該スキャフォールドへの内皮細胞および／または前駆細胞の付着を増大させる。本発明はまた、提供される該スキャフォールドを含む操作された組織も提供する。本発明はまた、コーティングポリマーと環状ペプチドリガンドとを含むコーティングも提供する。本発明はまた、提供されるスキャフォールドを移植する工程による、対象における組織再生のために内皮細胞および／または前駆細胞の内皮化および血管新生を改善する方法、ならびに対象における骨欠損を修復する方法も提供する。2019519256.tif 000010
2019519256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーと、
該ポリマーの表面上に共有結合的に固定化されており、スキャフォールドへの内皮細胞および／または内皮前駆細胞の付着を増大させ、かつ式I：
2019519256.tif 000008
の化合物である、ペプチドリガンドと
を含む、スキャフォールドであって、
式中、
X2、X6、およびX7は各々独立してアミノ酸であり、X2、X6、およびX7のうちの少なくとも1つはD-アミノ酸であり；
R1は、H、C1-6アルキル、-C(O)R1a、およびL-Aからなる群より選択され；
R1aは、C1-6アルキル、C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルキル-NH2、C1-6アルキル-C(O)N(H)-C1-6ヘテロアルキル、シクロアルキル、C1-6アルキル-シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、C1-6アルキル-ヘテロシクロアルキル、アリール、C1-6アルキル-アリール、ヘテロアリール、およびC1-6アルキル-ヘテロアリールからなる群より選択され、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、およびアリール基は、ハロゲン、-NO2、-OH、-CN、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロアルキル、およびC1-6ハロアルコキシからなる群より選択されるメンバーで置換されていてもよく；
R2は、H、C1-6アルキル、およびL-Aからなる群より選択され；
Lはリンカーであり；かつ
Aは活性物質である、スキャフォールド。
【請求項２】
R1およびR2が各々独立して、H、C1-6アルキル、およびL-Aからなる群より選択され；
Lがリンカーであり；
Aが活性物質であり；
X2が、Gly、Ala、Sar、およびβ-アラニン、ならびにそれらの立体異性体からなる群より選択され；
X6が、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Asp、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Trp、Pro、Aad、Bec、Bmc、Bmp、Phe(4COOH)、Hyp、HoSer、Tha、Ahch、Actp、Akch、Tyr(diI)、Trp、Thz、2Thi、3Thi、Cit、HoCit、Aib、Nglu、およびFua、ならびにそれらの立体異性体からなる群より選択され；かつ
X7が、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Asp、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Trp、Pro、Bmp、HoSer、Nglu、HoCit、Bec、Aad、Hyp、Ahch、Phe(4COOH)、Akch、Aecc、Abu、Phe(3,4-diOMe)、Cpa、2-Thi、Thz、Phg、Phe(4-NO2)、Nle、(NMe)Phe、Aic、Chg、Bta、Bpa、Nal2、Nal1、Tic、Ppca、Cha、Bipa、Deg、Dpg、Acpc、Bmc、Cit、Sar、Tha、Pra、Actp、Aib、Agl、Acbc、Fua、Nva、Thi、Trp、Bug、Ach、(NMe)Val、Cpeg、(CαMe)Phe、Tyr(diI)、Phe(2-Cl)、Bua、HoPhe、HoLeu、Sta、Ing、Phe(4-CF3)、Oic、Dpa、Phe(4-t-Bu)、HoCha、およびPhe(3,4-diCl)、ならびにそれらの立体異性体からなる群より選択される、請求項1に記載のスキャフォールド。
【請求項３】
前記ペプチドリガンドが、式Ia：
2019519256.tif 000009
の化合物であり、
式中、
X6およびX7は各々独立してD-アミノ酸であり；
R1は、H、C1-6アルキル、および-C(O)R1aからなる群より選択され；
R1aは、C1-6アルキル、C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルキル-NH2、C1-6アルキル-C(O)N(H)-C1-6ヘテロアルキル、シクロアルキル、C1-6アルキル-シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、C1-6アルキル-ヘテロシクロアルキル、アリール、C1-6アルキル-アリール、ヘテロアリール、およびC1-6アルキル-ヘテロアリールからなる群より選択され、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、およびアリール基は、ハロゲン、-NO2、-OH、-CN、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロアルキル、およびC1-6ハロアルコキシからなる群より選択されるメンバーで置換されていてもよく；かつ
R2は、HおよびC1-6アルキルからなる群より選択される、請求項1に記載のスキャフォールド。
【請求項４】
R1およびR2が各々独立して、HおよびC1-6アルキルからなる群より選択される、請求項3に記載のスキャフォールド。
【請求項５】
X6が、DSer、DAsp、DGlu、およびDCitからなる群より選択され；かつ
X7が、DPhe、DGlu、DSer、DBug、DBta、DVal、DAgl、DPra、D(NMe)Val、D(CαMe)Val、DAbu、DIng、DIle、DTha、DAsp、およびDNal1からなる群より選択される、請求項3に記載のスキャフォールド。
【請求項６】
X6が、DAspおよびDSerからなる群より選択され；かつ
X7が、DGlu、DPhe、DSer、DVal、DBug、およびDBtaからなる群より選択される、請求項3に記載のスキャフォールド。
【請求項７】
前記ペプチドリガンドが、cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDd-DBug-c、cGRGDd-DBta-c、cGRGDdvc、Ac-cGRGDdvc、(β-アラニン)-cGRGDdvc、(Ebes)-cGRGDdvc、cGRGDd-DAgl-c、cGRGDd-DPra-c、cGRGDd-DBug-c、cGRGDd-D(NMe)Val-c、cGRGDd-D(CαMe)Val-c、cGRGDd-DAbu-c、cGRGDd-DNal1-c、cGRGDd-DNal2-c、およびcGRGDd-DBta-cからなる群より選択される、請求項3に記載のスキャフォールド。
【請求項８】
前記ペプチドリガンドが、cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDdvc、cGRGDd-DBug-c、およびcGRGDd-DBta-cからなる群より選択される、請求項3に記載のスキャフォールド。
【請求項９】
前記ペプチドリガンドがcGRGDdvc（LXW7）である、請求項3に記載のスキャフォールド。
【請求項１０】
前記ペプチドリガンドが、前記細胞上のインテグリンαvβ3に結合する、請求項1に記載のスキャフォールド。
【請求項１１】
前記ポリマーが、ポリ(L-乳酸)（PLLA）、ポリカプロラクトン（PCL）、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）、ヒドロキシアパタイト（HA）、ラクチド-ε-カプロラクトン共重合体（PLCL）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載のスキャフォールド。
【請求項１２】
前記ポリマーがコーティングをさらに含み、かつ前記ペプチドリガンドが該コーティングに共有結合的に付着している、請求項1に記載のスキャフォールド。
【請求項１３】
前記コーティングがパリレンポリマーである、請求項12に記載のスキャフォールド。
【請求項１４】
内皮細胞、内皮前駆細胞、および／または骨形成原細胞が、前記スキャフォールド上に播種されている、請求項1に記載のスキャフォールド。
【請求項１５】
請求項1に記載のスキャフォールドを含む、操作された組織。
【請求項１６】
コーティングポリマーと、
該コーティングポリマーに共有結合的に付着している、請求項1に記載のペプチドリガンドと
を含む、コーティング。
【請求項１７】
前記ペプチドリガンドがcGRGDdvc（LXW7）である、請求項16に記載のコーティング。
【請求項１８】
前記コーティングポリマーがパリレンポリマーである、請求項16に記載のコーティング。
【請求項１９】
請求項1に記載のスキャフォールドを対象中に移植する工程を含む、該対象における組織再生のために内皮細胞および／または内皮前駆細胞の内皮化および血管新生を改善するための方法。
【請求項２０】
前記ペプチドリガンドが、前記スキャフォールドへの内皮細胞および／または内皮前駆細胞の動員を増大させる、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドリガンドが、前記スキャフォールド上での内皮細胞および／または内皮前駆細胞の増殖を増大させる、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
請求項1に記載のスキャフォールドを対象中に移植する工程を含む、該対象における骨欠損を修復するための方法。
【請求項２３】
内皮細胞および骨形成原細胞が、移植の前に前記スキャフォールド上に播種される、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
コーティングポリマーに官能基を付与する工程；
該コーティングポリマーを表面に接着させる工程；および
ペプチドリガンドを、該コーティングポリマーに共有結合的に付着させる工程であって、該ペプチドリガンドが、請求項1に記載のペプチドリガンド、または官能基を付与されたその誘導体である、工程
を含む、該表面をコーティングする方法。
【請求項２５】
前記ペプチドリガンドが、cGRGDdvc（LXW7）、または官能基を付与されたその誘導体である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記コーティングポリマーがパリレンポリマーである、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
前記コーティングポリマーの官能基付与が、該コーティングポリマーへのアルキン官能基の導入を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
前記ペプチドリガンドが、アジド官能基を用いて官能基を付与されている、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記表面がスキャフォールドポリマーを含む、請求項24に記載の方法。
【請求項３０】
前記スキャフォールドポリマーが、ポリ(L-乳酸)（PLLA）、ポリカプロラクトン（PCL）、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）、ヒドロキシアパタイト（HA）、ラクチド-ε-カプロラクトン共重合体（PLCL）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記表面への前記コーティングポリマーの接着が化学蒸着（CVD）を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項３２】
前記表面への前記コーティングポリマーの接着の前に、該表面を活性化する工程
をさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項３３】
前記表面の活性化が、マイクロ波プラズマの適用を含む、請求項32に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年3月11日に出願された米国特許仮出願第62/307,050号の恩典を主張し、その開示は、すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
過去数十年の間、組織工学は、宿主組織機能を維持する、回復する、または改善する組織代用物および移植可能な器官の開発において相当な進歩をしてきている（Langer (2000) Mol Therapy 1:12）。局所内皮細胞（EC）および循環内皮前駆細胞（EPC）が、これらの操作された組織構築物の血管新生において極めて重要な役割を果たし、新生組織形成物の長期生存および機能に影響を及ぼす（Carmeliet and Jain (2011) Nature 473:298；Yoder and Ingram (2009) Curr Opinion Hematology 16:269）。この血管新生プロセスは、操作された組織生成物のトランスレーションの成功のための、主要な課題および限定要因として特定されている（Santos and Reis (2010) Macromol Biosci 10:12）。
【０００３】
生体材料ベースのスキャフォールドは、移植されたかまたは原位置に動員されたかいずれかの細胞に対して構造的支持を提供し、細胞が付着し、増殖し、新たな血管網を形成することを可能にするように、組織工学応用において幅広く使用されている（Gong and Niklason (2006) 16:153；Zhang et al. (2007) J Cell Mol Med 11:945）。天然の細胞外マトリクス（ECM）上に存在する生理活性モチーフは、そのような細胞および組織の接着、成長、および機能のための細胞結合部位を提供する上で重要である（Frantz et al. (2010) J Cell Sci 123:4195；Hynes (2009) Science 326: 1216）。合成材料は、種々の高性能の生体工学アプローチを介してECMの物理的構造を模倣するように正確に設計することができるが、それらの応用は、天然のECM上に存在する生理活性モチーフの欠如のために限定されている。天然のECMを模倣するための合成材料表面上の機能的生理活性コーティングの作製は、人工スキャフォールドの生物学的機能を有意に改善することができた（Jordan and Chaikof (2007) J Vascular Surgery 45:104；Rose et al. (2004) Biomaterials 25:5125；Williams (2008) Biomaterials 29:2941）。種々の機能性生体分子および戦略が、生体材料ベースのスキャフォールドを修飾して、スキャフォールドにおける内皮化および血管新生を改善するために使用されている（Yoder (2009); He et al. (2005) Biomaterials 26:7606；Lee et al. (2012) Biomaterials 33:8343；Yu et al. (2012) Biomaterials 33: 8062；Zeng et al. (2012) Biomaterials 33:473；Zeng et al. (2010) Biomaterials 31:1636；Zheng et al. (2012) Biomaterials 33:2880）。しかし、これらの生体分子の大部分は、それらの不安定な構造、非特異的な細胞結合親和性、およびECと機能的に相互作用できないことのために、トランスレーショナル応用において限定されている。望ましくない（「オフターゲットの」）細胞タイプ、例えば血小板（Klinger and Jelkmann (2002) J Interferon Cytokine Res 22:913；Stokes and Granger (2012) J Physiol 590:1023；Wagner and Burger (2003) Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology 23:2131）および炎症性細胞（Qin (2012) Atherosclerosis 221:2；Shi and Palmer (2011) Nat Rev: Immunol 11:762）に対する非特異的結合は、移植されたスキャフォールドに対する有害な身体応答を引き起こす場合がある。そのため、種々の供給源由来のEPCおよびECと特異的に相互作用することができる強力な、安定な、生理活性分子が、組織工学応用のために緊急に必要とされている。
【０００４】
血管の発生および再生のプロセスにおいて、細胞表面上に存在するヘテロ二量体受容体のファミリーであるインテグリンと、ECM中のそれらのリガンドとの間の相互作用は、血管の接着、遊走、増殖、生存、および分化において重要な役割を果たす（Francis (2006) Methods Mol Biol 330:331；Malinin et al. (2012) Curr Opinion Hematology 19:206）。以前の報告により、16種類のインテグリンが血管生物学に関与していること、およびそれらのうちの8種類（α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、αvβ3、およびαvβ5）が、様々な時にEPCおよびEC上に発現していることが示された（Rupp and Little (2001) 89:566；Caiado and Dias (2012) Fibrogenesis Tissue Repair 5:4）。したがって、EPCおよびEC上に発現しているインテグリンに結合するリガンドは、天然のECMのものに類似した生理活性表面を作製して、EPCおよびECの付着および血管新生を改善するための良好な候補に相当する。例として、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）モチーフは、多くのECMタンパク質およびディスインテグリン内で見出される最も一般的なインテグリン結合配列である（Curly et al. (1999) Cell Mol Life Sci 56:427；D'Souza et al. (1991) Trends Biochem Sci 16:246；Jin and Varner (2004) British J Cancer 90:561；Ruoslahti and Pierschbacher (1986) Cell 44:517；Brooks et al. (1994) Science 264:569）。しかし、様々なインテグリンが、多様なRGD含有天然タンパク質およびペプチドを認識するため、RGDモチーフは、特異性が欠如していることが見出されている（Goodman et al. (2002) 45:1045)）。したがって、EPCおよびECのために、高い結合特異性および親和性で特異的なインテグリンを標的とする新規リガンドを特定する、重要な必要性がある。さらに、操作された組織の血管形成および内皮化を改善する、これらの新規リガンドを適用するスキャフォールドおよび方法を開発する必要性がある。本発明は、驚くべきことに、これらのおよび他の必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００５】
概して、改善された血管形成および内皮化のための組成物および方法が、本明細書において提供される。これらの組成物および方法での医療機器またはスキャフォールドの作製は、血管、血管内、血液接触、または組織の工学応用のための新規の治療可能性を有する。
【０００６】
1つの提供されるスキャフォールドは、ポリマーと、該ポリマーの表面上に共有結合的に固定化されたペプチドリガンドとを含む。ペプチドリガンドは、スキャフォールドへの内皮細胞および／または内皮前駆細胞の付着を増大させ、式I：
2019519256.tif 000003
の化合物である。X2、X6、およびX7は各々独立してアミノ酸であることができ、X2、X6、およびX7のうちの少なくとも1つはD-アミノ酸である。式IのR1は、H、C1-6アルキル、-C(O)R1a、またはL-Aであることができる。R1aは、C1-6アルキル、C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルキル-NH2、C1-6アルキル-C(O)N(H)-C1-6ヘテロアルキル、シクロアルキル、C1-6アルキル-シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、C1-6アルキル-ヘテロシクロアルキル、アリール、C1-6アルキル-アリール、ヘテロアリール、またはC1-6アルキル-ヘテロアリールであることができ、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、およびアリール基は、ハロゲン、-NO2、-OH、-CN、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロアルキル、またはC1-6ハロアルコキシであることができるメンバーで置換されていてもよい。R2は、H、C1-6アルキル、またはL-Aであることができる。Lはリンカーであり、Aは活性物質である。
【０００７】
また、ポリマーと、該ポリマーの表面上に共有結合的に固定化された式Iのペプチドリガンドとを含むスキャフォールドを含む、操作された組織も提供される。
【０００８】
また、コーティングポリマーと、該コーティングポリマーに共有結合的に付着した式Iのペプチドリガンドとを含むコーティングも提供される。
【０００９】
また、ポリマーと、該ポリマーの表面上に共有結合的に固定化された式Iのペプチドリガンドとを含むスキャフォールドを移植する工程を含む、対象における組織再生のために内皮細胞および／または内皮前駆細胞の内皮化および血管新生を改善するための方法も提供される。
【００１０】
また、ポリマーと、該ポリマーの表面上に共有結合的に固定化された式Iのペプチドリガンドとを含むスキャフォールドを移植する工程を含む、対象における骨欠損を修復するための方法も提供される。いくつかの態様において、骨欠損は、頭蓋冠骨欠損である。
【００１１】
また、コーティングポリマーに官能基を付与する工程、および該コーティングポリマーを表面に接着させる工程を含む、表面をコーティングする方法も提供される。方法は、さらに、式Iのペプチドリガンドをコーティングポリマーに共有結合的に付着させる工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】医療機器が、インテグリンリガンドでのコーティング、および任意で移植前の細胞の播種によって作製される態様を例証する。医療機器は、危険なサイズの頭蓋冠骨欠損または他の骨欠損を修復するために使用することができ、インテグリンリガンドコーティングは、スキャフォールドへの移植された細胞の付着または内因性細胞の動員を増大させるように機能する。
【図２】リガンドLXW7-N3についての合成スキームを示す。
【図３】リガンドのEPC/EC結合親和性を試験するための、オンビーズ細胞結合アッセイ由来の画像を示す。HECFC（a〜c）、HCAEC（d〜f）、およびTHP-1単球（g〜i）を、LXY30（左パネル）、LLP2A（中央パネル）、およびLXW7（右パネル）を提示する樹脂ビーズとインキュベートした。スケールバー＝50μm。
【図４】図3のオンビーズ細胞結合アッセイ由来の結果のグラフである。様々なタイプのリガンドを提示するビーズ上に結合した細胞の数を定量して、統計解析を行った。データを、平均値±標準偏差として表した：＊＊p＜0.01（n＝3）。
【図５】様々な濃度（0nM、25nM、50nM、100nM）のLXW7で30分間修飾したPLCL膜上への播種後の、接着EPCの核画像を示す。
【図６】図5の膜上に付着したEPCの数のグラフである。
【図７】1日および1週間での、PLCL膜（対照およびLXW7 50nM）上の接着細胞画像を示す。倍率20×。
【図８】EPC/ECに対するLXW7の結合特異性のアッセイ由来の画像を示す。LXW7を提示するビーズを、HECFC（a〜c）、HCAEC（d〜f）、HMVEC（g〜i）、THP-1単球（j〜l）、または血小板（m〜o）と10分間（左パネル）、30分間（中央パネル）、または2時間（右パネル）インキュベートした。LXW7は、EPC/EC付着（a〜i）を効率的に支持したが、THP-1単球（j〜l）または血小板（m〜o）の有効な付着を支持しなかった。スケールバー＝50μm。
【図９】図8の結合特異性アッセイ由来の結果のグラフである。LXW7を提示する各ビーズ上に結合した様々なタイプの細胞の数を定量して、統計解析を行った。データを、平均値±標準偏差として表した：＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（n＝3）。
【図１０】様々な細胞タイプに対するLXW7およびGRGDの結合親和性のアッセイ由来のフローサイトメトリーデータを示す。試験は、様々な供給源由来のEPC/ECを含み、HECFC（A）、HCAEC（B）、HMVEC（C）、およびTHP-1単球（D）、血小板（E）、ならびに、αvβ3を高発現するように操作されたK562細胞（αvβ3-K562、F）およびαIIbβ3を高発現するように操作されたK562細胞（αIIbβ3-K562、G）を含んだ。細胞を、LXW7-bio、GRGD-bio、またはD-ビオチンペプチドとインキュベートし、その後、ストレプトアビジン-フィコエリトリンとインキュベートした。フローサイトメトリー解析を行って、リガンドの結合親和性を測定した。D-ビオチンで処理した試料を、陰性対照として使用した。
【図１１】LXW7処理表面およびGRGD処理表面への細胞および血小板の付着のアッセイ由来の画像を示す。画像は、D-ビオチン（a〜c）（対照）、LXW7（d〜f）、またはGRGD（g〜i）により処理された表面上に付着したHCAEC（左パネル）、THP-1単球（中央パネル）、および血小板（右パネル）のものである。a、b、d、e、g、およびhについてのスケールバーは、50μmである。c、f、およびiについてのスケールバーは、20μmである。
【図１２】図11の付着アッセイ由来の結果のグラフである。様々な処理表面上に付着した細胞または血小板の数を定量して、統計解析を行った。データを、平均値±標準偏差として表した：＊＊p＜0.01（n＝4）。
【図１３】MTSアッセイによって評価した際の、LXW7処理表面およびD-ビオチン処理表面（対照）上でのECの増殖を示すグラフである。データを、平均値±標準偏差として表した：＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001（n＝4）。
【図１４】ECの生物学的機能に対するLXW7の効果を示す、追加的なデータを示す。VEGFR2（Tyr1175）のリン酸化およびERK1/2のリン酸化に対するLXW7の効果の、ウェスタンブロット解析（左パネル）およびデンシトメトリー測定（右パネル）由来の結果を示す。データを、平均値±標準偏差として表した：＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（n＝4）。
【図１５】様々な濃度のLXW7で48時間処理した後のEPC上の、VEGFR-2（A）およびEGFR（B）のmRNAレベルのグラフを示す。＊P＜0.05対対照、#P＜0.05対25nM（群あたりn＝10）。
【図１６】クリックケミストリーによるLXW7で修飾された電界紡糸マイクロファイバー状スキャフォールドの構造の、SEM解析由来の画像である。
【図１７】LXW7およびLXW7-N3の化学構造を示す。
【図１８】電界紡糸マイクロファイバー状スキャフォールド表面に対するLXW7の連結に関与する化学プロセスの模式図を示す。
【図１９】無処理の、PEGのみで修飾された、およびPEG-LXW7で修飾されたスキャフォールドを伴う膜のATR-FTIRスペクトルのグラフである。
【図２０】2時間のインキュベーション後の、無処理ナノファイバー状膜表面（a）およびLXW7修飾ナノファイバー状膜表面（b）上に接着した、CD31染色HCAECの代表的な免疫細胞化学画像を示す。スケールバー＝50μm。
【図２１】図20のCD31免疫染色画像由来の、接着した細胞の定量および相関統計解析のグラフである。データを、平均値±標準偏差として表した：＊＊p＜0.01（n＝3）。
【図２２】2日間、無処理膜表面（a、c）およびLXW7修飾ナノファイバー状膜表面（b、d）上で成長したECのSEM画像を示す（a、bにおけるスケールバー：250μm、c、dにおけるスケールバー：50μm）。
【図２３】図22のSEM画像由来の、細胞で覆われた領域の定量および相関統計解析のグラフである。データを、平均値±標準偏差として表した：＊＊p＜0.01（n＝3）。
【図２４】外植されたグラフトの検討由来の結果を示す。移植後6週間の、無処理グラフトおよびLXW7処理グラフトの外側の周囲の新たな毛細血管形成の画像を示す。また、内皮細胞（EC）マーカーCD31についてのLXW7処理グラフトの横断面の免疫染色された画像も示す。提示されたグラフは、種々の時点でのグラフトの開存性をプロットし、各時点の各群は、6匹の動物を含む。
【図２５】図24の外植されたグラフトの管腔表面の正面DAPI染色の画像を示す。DAPI染色は、LXW7処理グラフト（右パネル）よりも対照グラフト（左パネル）の管腔表面上にあった細胞が、より少なかったことを示す。移植後の3種類の時点を、並行して比較した（1週間、2週間、6週間）。
【図２６】グラフトの近位部分、中央部分、および遠位部分のCD31およびCD34についての正面免疫染色の画像を示す。移植後1週間の無処理グラフト（A〜C）、LXW7処理グラフト（D〜F）。（G〜L）移植後2週間の無処理グラフト（G〜I）、LXW7処理グラフト（J〜L）。（M〜R）移植後6週間の無処理グラフト（M〜O）、LXW7処理グラフト（P〜R）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
I．全般
本発明は、ポリマーと環状ペプチドリガンドとを含むスキャフォールドを提供する。ペプチドリガンドは、スキャフォールドへの内皮細胞および／または前駆細胞の付着を増大させる。本発明はまた、提供されるスキャフォールドを含む操作された組織も提供する。本発明はまた、提供されるスキャフォールドを移植する工程による、対象における組織再生のために内皮細胞および／または前駆細胞の内皮化および血管新生を改善する方法、ならびに対象における骨欠損を修復する方法も提供する。
【００１４】
II．定義
「スキャフォールド」という用語は、細胞培養、組織工学、または組織再生に適している三次元構造を提供するマトリクスを指す。スキャフォールドの構造は、例えば、ステント、シャント、パッチ、グラフト、またはインプラントの形態を有することができる。スキャフォールドは、細胞の動員、接着、または増殖を促進するように修飾することができる。例示的な修飾は、1種類または複数種類の細胞接着促進物質、表面コーティング、または官能基の組み込みを含むが、それらに限定されない。
【００１５】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するα-アミノ酸およびそれらの立体異性体、ならびに非天然アミノ酸およびそれらの立体異性体を指す。アミノ酸の「立体異性体」とは、L-アミノ酸またはD-アミノ酸などの、アミノ酸の鏡像異性体を指す。例えば、天然に存在するアミノ酸の立体異性体は、天然に存在するアミノ酸の鏡像異性体、すなわち、D-アミノ酸を指す。
【００１６】
アミノ酸は、IUPAC-IUB生化学命名法委員会（Biochemical Nomenclature Commission）によって推奨される、それらの一般に知られている三文字略号または一文字略号のいずれかにより、本明細書において言及され得る。例えば、L-アミノ酸は、その一般に知られている三文字略号（例えば、L-アルギニンについてArg）、または大文字一文字アミノ酸略号（例えば、L-アルギニンについてR）により、本明細書において表され得る。D-アミノ酸は、接頭語として「D」を有する、その一般に知られている三文字略号（例えば、D-アルギニンについてDArg、D-Arg、もしくはDArg）、または小文字一文字アミノ酸略号（例えば、D-アルギニンについてr）により、本明細書において表され得る。
【００１７】
アミノ酸は、いくつかの特性のうちの少なくとも1つを特徴とすることができる。例えば、アミノ酸は、塩基性、酸性、極性、または疎水性であることができる。塩基性アミノ酸は、pKaよりも下のpH値で塩基性のまたは正電荷を持つ側鎖を有するものであり、Lys、Arg、HoArg、Agp、Agb、Dab、Dap、およびOrn、ならびにそれらの立体異性体を含むが、それらに限定されない。酸性アミノ酸は、生理学的pHで酸性のまたは負電荷を持つ側鎖を有するものであり、Asp、Glu、Aad、Bec、およびそれらの立体異性体を含むが、それらに限定されない。塩基性アミノ酸は、概して、略号「X+」により、および酸性アミノ酸は、「X-」により言及することができる。極性アミノ酸は、概して、極性および無電荷の側鎖を有するものを指し、Asn、Ser、Thr、Glnを含むが、それらに限定されない。同様に、疎水性アミノ酸は、概して、疎水性側鎖を有するものを指し、Val、Leu、Ile、Met、およびPheを含むが、それらに限定されない。他の塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸が当技術分野において公知であることを、当業者はわかっているであろう。
【００１８】
アミノ酸配列に関して、コードされた配列において単一アミノ酸または小さなパーセンテージのアミノ酸を変更する、付加する、または欠失させる、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、付加、または欠失は、変更が化学的に類似しているアミノ酸でのアミノ酸の置換を結果としてもたらす「保存的に修飾されたバリアント」であることを、当業者は認識しているであろう。化学的に類似しているアミノ酸は、非限定的に、L-アミノ酸などの天然に存在するアミノ酸、D-アミノ酸などの天然に存在するアミノ酸の立体異性体、ならびに、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣物、合成アミノ酸、N-置換グリシン、およびN-メチルアミノ酸などの非天然アミノ酸を含む。
【００１９】
機能的に類似しているアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。例えば、脂肪族アミノ酸（例えば、G、A、I、L、またはV）が群の別のメンバーで置換される置換が、行われてもよい。同様に、C、S、T、M、N、またはQなどの脂肪族極性無電荷群が、群の別のメンバーで置換されてもよく；塩基性残基、例えば、K、R、またはHが、互いに置換されてもよい。いくつかの態様において、酸性側鎖を有するアミノ酸、例えば、EまたはDは、それぞれ、その無電荷のカウンターパート、例えば、QまたはNで置換されてもよく；またはその逆であってもよい。以下の8種類の群の各々は、互いに保存的置換である他の例示的なアミノ酸を含有する：
（1）アラニン（A）、グリシン（G）；
（2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
（3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
（4）アルギニン（R）、リジン（K）；
（5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
（6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
（7）セリン（S）、スレオニン（T）；および
（8）システイン（C）、メチオニン（M）
（例えば、Creighton、Proteins、1984を参照されたい）。
【００２０】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合により連結された、Dアミノ酸もしくはLアミノ酸の単鎖、またはDアミノ酸およびLアミノ酸の混合物から構成された化合物を指す。概して、ペプチドは、約2〜約50アミノ酸長である。好ましくは、本発明のペプチドは、約2〜約25アミノ酸長、より好ましくは3〜20アミノ酸長、および最も好ましくは3〜10アミノ酸長である。
【００２１】
「バイオポリマー」という用語は、天然に存在するポリマー、または、生物システムと適合性であるか、もしくは天然に存在するポリマーを模倣する合成ポリマーのいずれかを指す。例えば、限定としてではなく、本発明のバイオポリマーは、オリゴ糖、タンパク質、ポリケチド、ペプトイド、ヒドロゲル、ポリ(エチレングリコール)などのポリ(グリコール)、およびポリラクタートを含む。
【００２２】
「リガンド」という用語は、別の特異的な分子または分子の特異的な部分に対して、共有結合的または非共有結合的に、選択的に結合する分子を指す。
【００２３】
「結合する」という用語は、永久的または一時的であり得る、任意の物理的または化学的な付着または密接な会合を含む。
【００２４】
「非共有結合性相互作用」という用語は、共有結合を形成しない、極めて近接した2つの種の相互作用を指す。非共有結合性相互作用のタイプは、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、配位、pi-pi相互作用、疎水性相互作用、および親水性相互作用を含む。
【００２５】
「共有結合性相互作用」という用語は、共有結合を形成する、極めて近接した2つの種の相互作用を指す。
【００２６】
「αvβ3インテグリン」という用語は、ビトロネクチンの受容体を指す。αvβ3インテグリンは、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）トリペプチド配列を提示する様々な細胞外マトリクスタンパク質に対する受容体として働く。これらのタンパク質は、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、コラーゲン、フォン・ウィルブランド因子を含む。
【００２７】
「対象」という用語は、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含むがそれらに限定されない、哺乳動物などの動物を指す。ある特定の態様において、対象はヒトである。
【００２８】
「アルキル」という用語は、示された数の炭素原子を有する、直鎖または分岐の、飽和脂肪族ラジカルを指す。例えば、C1-C6アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどを含むが、それらに限定されない。他のアルキル基は、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどを含むが、それらに限定されない。アルキルは、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6、および5-6などの任意の数の炭素を含むことができる。アルキル基は、典型的には一価であるが、例えばアルキル基が2つの部分を一緒に連結する場合に、二価であることができる。
【００２９】
「アルコキシ」という用語は、アルキル基を付着の点に接続する酸素原子を有するアルキル基を指す。アルコキシ基は、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、2-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどを含む。アルコキシ基は、さらに、中に記載されている様々な置換基で置換されることができる。例えば、アルコキシ基は、「ハロ-アルコキシ」基を形成するようにハロゲンで置換されることができる。
【００３０】
本明細書において使用される際、「ヘテロアルキル」という用語は、N、O、およびSなどの1〜3個のヘテロ原子を有するアルキル基を指す。B、Al、Si、およびPを含むがそれらに限定されない追加的なヘテロ原子もまた、有用であることができる。ヘテロ原子はまた、酸化されることもでき、-S(O)-および-S(O)2-などであるが、それらに限定されない。例えば、ヘテロアルキルは、エーテル、チオエーテル、およびアルキル-アミンを含むことができる。
【００３１】
本明細書において使用される際、「ハロアルキル」という用語は、水素原子のうちのいくつかまたはすべてがハロゲン原子で置換されている、上記で定義されたとおりのアルキルを指す。ハロゲン（ハロ）は、好ましくは、クロロまたはフルオロを表すが、ブロモまたはヨードであってもよい。例えば、ハロアルキルは、トリフルオロメチル、フルオロメチル、1,2,3,4,5-ペンタフルオロ-フェニルなどを含む。「パーフルオロ」という用語は、フッ素で置換された少なくとも2個の利用可能な水素を有する化合物またはラジカルを定義する。例えば、パーフルオロフェニルは、1,2,3,4,5-ペンタフルオロフェニルを指し、パーフルオロメタンは、1,1,1-トリフルオロメチルを指し、パーフルオロメトキシは、1,1,1-トリフルオロメトキシを指す。
【００３２】
本明細書において使用される際、「ハロ-アルコキシ」という用語は、少なくとも1個のハロゲンを有するアルコキシ基を指す。ハロ-アルコキシは、水素原子のうちのいくつかまたはすべてがハロゲン原子で置換されている、アルコキシについて定義されているとおりである。アルコキシ基は、1、2、3個、またはそれよりも多いハロゲンで置換されることができる。水素がすべてハロゲンで、例えばフッ素によって置き換えられている場合、化合物は、全置換、例えば、全フッ素置換されている。ハロ-アルコキシは、トリフルオロメトキシ、2,2,2,-トリフルオロエトキシ、パーフルオロエトキシなどを含むが、それらに限定されない。
【００３３】
本明細書において使用される際、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を指す。
【００３４】
本明細書において使用される際、「シクロアルキル」という用語は、3〜12個の環原子、または示された数の原子を含有する、飽和または部分的に不飽和の、単環式、融合二環式、または架橋多環式の環アセンブリを指す。単環式の環は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロオクチルを含む。二環式および多環式の環は、例えば、ノルボルナン、デカヒドロナフタレン、およびアダマンタンを含む。例えば、C3-8シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、およびノルボルナンを含む。
【００３５】
本明細書において使用される際、「アルキル-シクロアルキル」という用語は、アルキル構成要素およびシクロアルキル構成要素を有し、該アルキル構成要素が該シクロアルキル構成要素を付着の点に連結するラジカルを指す。アルキル構成要素は、該アルキル構成要素が、シクロアルキル構成要素におよび付着の点に連結するために少なくとも二価であることを除いて、上記で定義されたとおりである。いくつかの例において、アルキル構成要素は、存在しなくてもよい。シクロアルキル構成要素は、中で定義されたとおりである。アルキル-シクロアルキルの例は、とりわけ、メチレン-シクロヘキサンを含む。
【００３６】
本明細書において使用される際、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、3環員から約20環員、ならびに、N、O、およびSなどの1〜約5個のヘテロ原子を有する環系を指す。B、Al、Si、およびPを含むがそれらに限定されない追加的なヘテロ原子もまた、有用であることができる。ヘテロ原子はまた、酸化されることもでき、-S(O)-および-S(O)2-などであるが、それらに限定されない。例えば、ヘテロ環は、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、モルホリノ、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、インドリニル、キヌクリジニル、および1,4-ジオキサ-8-アザ-スピロ[4.5]デカ-8-イルを含むが、それらに限定されない。
【００３７】
本明細書において使用される際、「アルキル-ヘテロシクロアルキル」という用語は、アルキル構成要素およびヘテロシクロアルキル構成要素を有し、該アルキル構成要素が該ヘテロシクロアルキル構成要素を付着の点に連結するラジカルを指す。アルキル構成要素は、該アルキル構成要素が、ヘテロシクロアルキル構成要素におよび付着の点に連結するために少なくとも二価であることを除いて、上記で定義されたとおりである。いくつかの例において、アルキル構成要素は、存在しなくてもよい。ヘテロシクロアルキル構成要素は、上記で定義されたとおりである。アルキル-ヘテロシクロアルキルの例は、とりわけ、メチレン-ピペリジニルを含む。
【００３８】
本明細書において使用される際、「アリール」という用語は、6〜16個の環炭素原子を含有する、単環式、または融合二環式、三環式、もしくはそれよりも大きい、芳香族環アセンブリを指す。例えば、アリールは、フェニル、ベンジル、またはナフチルであってもよく、好ましくはフェニルである。「アリレン」とは、アリール基に由来する二価ラジカルを意味する。アリール基は、アルキル、アルコキシ、アリール、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、アミノ-アルキル、トリフルオロメチル、アルキレンジオキシ、およびオキシ-C2-C3-アルキレンから選択される1、2、または3個のラジカルによって一置換、二置換、または三置換されていることができ；それらのすべては、さらに、例として上文に定義されたとおりに置換されていてもよく；または、1-もしくは2-ナフチル；または、1-もしくは2-フェナントレニルである。アルキレンジオキシは、フェニルの2個の隣接した炭素原子に付着した二価の置換基であり、例えば、メチレンジオキシまたはエチレンジオキシである。オキシ-C2-C3-アルキレンはまた、フェニルの2個の隣接した炭素原子に付着した二価の置換基であり、例えば、オキシエチレンまたはオキシプロピレンである。オキシ-C2-C3-アルキレン-フェニルの例は、2,3-ジヒドロベンゾフラン-5-イルである。
【００３９】
アリールとして好ましいのは、ナフチル、フェニル、または、アルコキシ、フェニル、ハロゲン、アルキル、もしくはトリフルオロメチルによって一置換もしくは二置換されたフェニル、特に、フェニル、または、アルコキシ、ハロゲン、もしくはトリフルオロメチルによって一置換もしくは二置換されたフェニル、とりわけフェニルである。
【００４０】
Rとして置換されたフェニル基の例は、例えば、4-クロロフェン-1-イル、3,4-ジクロロフェン-1-イル、4-メトキシフェン-1-イル、4-メチルフェン-1-イル、4-アミノメチルフェン-1-イル、4-メトキシエチルアミノメチルフェン-1-イル、4-ヒドロキシエチルアミノメチルフェン-1-イル、4-ヒドロキシエチル-(メチル)-アミノメチルフェン-1-イル、3-アミノメチルフェン-1-イル、4-N-アセチルアミノメチルフェン-1-イル、4-アミノフェン-1-イル、3-アミノフェン-1-イル、2-アミノフェン-1-イル、4-フェニル-フェン-1-イル、4-(イミダゾール-1-イル)-フェン-イル、4-(イミダゾール-1-イルメチル)-フェン-1-イル、4-(モルホリン-1-イル)-フェン-1-イル、4-(モルホリン-1-イルメチル)-フェン-1-イル、4-(2-メトキシエチルアミノメチル)-フェン-1-イルおよび4-(ピロリジン-1-イルメチル)-フェン-1-イル、4-(チオフェニル)-フェン-1-イル、4-(3-チオフェニル)-フェン-1-イル、4-(4-メチルピペラジン-1-イル)-フェン-1-イル、ならびに、ヘテロ環において置換されていてもよい 4-(ピペリジニル)-フェニルおよび4-(ピリジニル)-フェニルである。
【００４１】
本明細書において使用される際、「アルキル-アリール」という用語は、アルキル構成要素およびアリール構成要素を有し、該アルキル構成要素が該アリール構成要素を付着の点に連結するラジカルを指す。アルキル構成要素は、該アルキル構成要素が、アリール構成要素におよび付着の点に連結するために少なくとも二価であることを除いて、上記で定義されたとおりである。いくつかの例において、アルキル構成要素は、存在しなくてもよい。アリール構成要素は、上記で定義されたとおりである。アルキル-アリール基の例は、ベンジルを含むが、それに限定されない。
【００４２】
本明細書において使用される際、「ヘテロアリール」という用語は、5〜16個の環原子を含有し、該環原子のうちの1〜4個が各々N、O、またはSのヘテロ原子である、単環式、または融合二環式もしくは三環式の芳香族環アセンブリを指す。例えば、ヘテロアリールは、ピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、フラニル、ピロリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、または、例えば、アルキル、ニトロ、もしくはハロゲンによって置換された、特に一置換もしくは二置換されたいずれかの他のラジカルを含む。ピリジルは、2-、3-、または4-ピリジルを表し、有利には、2-または3-ピリジルを表す。チエニルは、2-または3-チエニルを表す。キノリニルは、好ましくは、2-、3-、または4-キノリニルを表す。イソキノリニルは、好ましくは、1-、3-、または4-イソキノリニルを表す。ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニルは、好ましくは、それぞれ、3-ベンゾピラニルまたは3-ベンゾチオピラニルを表す。チアゾリルは、好ましくは、2-または4-チアゾリルを表し、最も好ましくは、4-チアゾリルを表す。トリアゾリルは、好ましくは、1-、2-、または5-(1,2,4-トリアゾリル)である。テトラゾリルは、好ましくは、5-テトラゾリルである。
【００４３】
好ましくは、ヘテロアリールは、ピリジル、インドリル、キノリニル、ピロリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、インダゾリル、または、置換された、特に一置換もしくは二置換されたラジカルのいずれかである。
【００４４】
同様に、アリール基およびヘテロアリール基についての置換基は、芳香族環系上の0から開放性の原子価の総数にわたる数において、様々であり、-ハロゲン、-OR’、-OC(O)R’、-NR'R''、-SR'、-R'、-CN、-NO2、-CO2R'、-CONR'R''、-C(O)R'、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR''C(O)2R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NH-C(NH2)=NH、-NR'C(NH2)=NH、-NH-C(NH2)=NR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-N3、-CH(Ph)2、パーフルオロ(C1-C4)アルコキシ、およびパーフルオロ (C1-C4)アルキルから選択され、ここで、R'、R''、およびR'''は独立して、水素、(C1-C8)アルキルおよびヘテロアルキル、無置換アリールおよびヘテロアリール、(無置換アリール)-(C1-C4)アルキル、ならびに(無置換アリール)オキシ-(C1-C4)アルキルから選択される。
【００４５】
本明細書において使用される際、「アルキル-ヘテロアリール」という用語は、アルキル構成要素およびヘテロアリール構成要素を有し、該アルキル構成要素が該ヘテロアリール構成要素を付着の点に連結するラジカルを指す。アルキル構成要素は、該アルキル構成要素が、ヘテロアリール構成要素におよび付着の点に連結するために少なくとも二価であることを除いて、上記で定義されたとおりである。いくつかの例において、アルキル構成要素は、存在しなくてもよい。ヘテロアリール構成要素は、中で定義されたとおりである。アルキル-ヘテロアリールの例は、とりわけ、メチレン-ピリジルを含む。
【００４６】
III．スキャフォールド
本発明は、内皮細胞および／または内皮前駆細胞の付着を促進するいくつかのスキャフォールドを提供する。スキャフォールドは、ポリマーと、該ポリマーの表面上に共有結合的に固定化されたペプチドリガンドとを含む。ペプチドリガンドは、スキャフォールドへの内皮細胞および／または内皮前駆細胞の付着を増大させるように選択され、式I：
2019519256.tif 000004
の化合物である。X2、X6、およびX7は各々独立してアミノ酸であることができ、X2、X6、およびX7のうちの少なくとも1つはD-アミノ酸である。式IのR1は、H、C1-6アルキル、-C(O)R1a、またはL-Aであることができる。R1aは、C1-6アルキル、C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルキル-NH2、C1-6アルキル-C(O)N(H)-C1-6ヘテロアルキル、シクロアルキル、C1-6アルキル-シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、C1-6アルキル-ヘテロシクロアルキル、アリール、C1-6アルキル-アリール、ヘテロアリール、またはC1-6アルキル-ヘテロアリールであることができ、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、およびアリール基は、ハロゲン、-NO2、-OH、-CN、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロアルキル、またはC1-6ハロアルコキシで置換されていてもよい。R2は、H、C1-6アルキル、またはL-Aであることができる。ラジカルLはリンカーであり、ラジカルAは活性物質である。
【００４７】
式Iの化合物は、正電荷を持つ側鎖を有するものなどの、塩基性アミノ酸を含むことができる。塩基性アミノ酸の非限定的な例は、Lys、Arg、HoArg、Agp、Agb、Dab、Dap、およびOrn、ならびにそれらの立体異性体である。式Iの化合物はまた、負電荷を持つ側鎖を有するものなどの、酸性アミノ酸も含むことができる。酸性アミノ酸の非限定的な例は、Asp、Glu、Aad、およびBec、ならびにそれらの立体異性体である。塩基性アミノ酸は、概して、略号「X+」により、および酸性アミノ酸は、「X-」により言及することができる。他の塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸が当技術分野において公知であることを、当業者はわかっているであろう。
【００４８】
本発明の化合物において有用なアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、ならびに、その後修飾されているそれらのアミノ酸、例えば、γ-カルボキシグルタマートおよびO-ホスホセリン、ならびに非天然アミノ酸を含む。天然に存在するα-アミノ酸は、非限定的に、アラニン（Ala、A）、システイン（Cys、C）、アスパラギン酸（Asp、D）、グルタミン酸（Glu、E）、フェニルアラニン（Phe、F）、グリシン（Gly、G）、ヒスチジン（His、H）、イソロイシン（Ile、I）、アルギニン（Arg、R）、リジン（Lys、K）、ロイシン（Leu、L）、メチオニン（Met、M）、アスパラギン（Asn、N）、プロリン（Pro、P）、グルタミン（Gln、Q）、セリン（Ser、S）、スレオニン（Thr、T）、バリン（Val、V）、トリプトファン（Trp、W）、およびチロシン（Tyr、Y）を含む（対応する3文字表記および単一文字表記で示される）。天然に存在するα-アミノ酸の立体異性体は、非限定的に、D-アラニン（DAla、a）、D-システイン（DCys、c）、D-アスパラギン酸（DAsp、d）、D-グルタミン酸（DGlu、e）、D-フェニルアラニン（DPhe、f）、D-ヒスチジン（DHis、h）、D-イソロイシン（DIle、i）、D-アルギニン（DArg、r）、D-リジン（DLys、k）、D-ロイシン（DLeu、l）、D-メチオニン（DMet、m）、D-アスパラギン（DAsn、n）、D-プロリン（DPro、p）、D-グルタミン（DGln、q）、D-セリン（DSer、s）、D-スレオニン（D-Thr、t）、D-バリン（D-Val、v）、D-トリプトファン（DTrp、w）、およびD-チロシン（DTyr、y）を含む。
【００４９】
非天然アミノ酸は、非限定的に、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する、L-配置またはD-配置のいずれかの、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣物、合成アミノ酸、N-置換グリシン、およびN-メチルアミノ酸を含む。例えば、「アミノ酸類似体」は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基に結合しているα炭素を有するが、修飾されたR（すなわち、側鎖）基を有する、非天然アミノ酸である。適している非天然アミノ酸は、非限定的に、α-アミノヘキサン二酸（Aad）、α-アミノ酪酸（Abu）、3-アミノ安息香酸（3Abz）、アゼチジン-2-カルボン酸（Aca）、1-アミノシクロブタン-1-カルボン酸（Acb）、α-アミノ-3-クロロ-4,5-ジヒドロ-5-イソアゾール酢酸（Acdi）、4-アミノ-4-カルボキシ-1,1-ジオキソ-テトラヒドロチオピラン（Acdt）、1-アミノ-1-シクロヘキサンカルボン酸（Ach）、1-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸（Acp）、1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（Acpc）、4-アミノ-4-カルボキシテトラヒドロピラン（Actp）、8-アミノ-1,4-ジオキサスピロ [4.5]デカン-8-カルボン酸（Aecc）、(S)-2-アミノ-4-グアニジノ-ブタン酸（Agb）、アリルグリシン（Agl）、(S)-2-アミノ-3-グアニジノ-プロパン酸（Agp）、2-アミノヘプタン酸（Aha）、1-アミノ-1-(4-ヒドロキシシクロヘキシル)カルボン酸（Ahch）、α-アミノイソ酪酸（Aib）、2-アミノインダン-2-カルボン酸（Aic）、1-アミノ-1-(4-ケトシクロヘキシル)カルボン酸（Akch）、2-アミノオクタン酸（Aoa）、2-アミノ-2-ナフチル酢酸（Ana）、1-アミノ-1-(3-ピペリジニル)カルボン酸（3Apc）、1-アミノ-1-(4-ピペリジニル)カルボン酸（4Apc）、2-アミノ-3-(4-ピペリジニル)プロピオン酸（4App）、ホモアルギニン（HoArg）、Nα-メチル-アルギニン（(NMe)Arg）、Nα-メチル-アスパラギン酸（(NMe)Asp）、α-アミノオクタン二酸（Asu）、(R)-2-アミノ-3-(2-カルボキシエチルスルファニル)プロパン酸（Bec）、4,4'-ビフェニルアラニン（Bipa）、(R)-2-アミノ-3-(カルボキシメチルスルファニル)プロパン酸（Bmc）、4-カルボキシメトキシフェニルアラニン（Bmp）、4-ベンゾイルフェニルアラニン（Bpa）、3-ベンゾチエニルアラニン（Bta）、5H-チアゾロ[3,2-a]ピリジン-3-カルボン酸（Btd）、β-t-ブチル-アライン（β-t-butyl-alaine）（Bua）、α-tert-ブチルグリシン（Bug）、4-シアノ-2-アミノ酪酸（Cab）、シクロブチルアラニン（Cba）、シクロヘキシルアラニン（Cha）、ホモシクロヘキシルアラニン（HoCha）、α-シクロヘキシルグリシン（Chg）、シトルリン（Cit）、ホモシトルリン（HoCit）、シクロプロピルアラニン（Cpa）、シクロペンチルグリシン（Cpeg）、3-カルボキシメチル-1-フェニル-1,3,8-トリアザスピロ[4,5]デカン-4-オン（Cptd）、ホモシステイン（HoCys）、α,γ-ジアミノ酪酸（Dbu）、ジエチルグリシン（Deg）、3,3-ジフェニル-アラニン（Dpa）、ジ-n-プロピルグリシン（Dpg）、α,β-ジアミノプロピオン酸（Dap）、α,γ-ジアミノ酪酸（Dab）、2-フリル-アラニン（Fua）、ホモアルギニン（HoArg）、ヒドロキシプロリン（Hyp）、O-ベンジル-ヒドロキシプロリン（Hyp(Bzl)）、ホモロイシン（HoLeu）、2-インダニルグリシン（Ing）、メチオニンスルホキシド（Met(O)）、メチオニンメチルスルホニウム（Met(S-Me)）、3-(1-ナフチル)アラニン（Nal1）、3-(2-ナフチル)アラニン（Nal2）、3-(カルボキシメチルアミノ)プロパン酸（Nglu）、ニペコ酸（Nip）、イソニペコ酸（IsoNip）、ノルロイシン（Nle）、ノルバリン（Nva）、オクタヒドロインドール-2-カルボン酸（Oic）、オルニチン（Orn）、2-ピリジルアラニン（2Pal）、3-(3-ピリジル)アラニン（3Pal）、3-(4-ピリジル)アラニン（4Pal）、ペニシラミン（Pen）、ホモフェニルアラニン（HoPhe）、Nα-メチル-フェニルアラニン（(NMe)Phe）、2-クロロ-フェニルアラニン（Phe(2Cl)）、α-メチル-フェニルアラニン（(CαMe)Phe）、3,4-ジメトキシ-フェニルアラニン（Phe(3,4-di OMe)）、4-カルボキシフェニルアラニン（Phe(4COOH)）、4-ニトロ-フェニルアラニン（Phe(4-NO2)）、4-トリフルオロメチル-フェニルアラニン（Phe(4-CF3)）、4-tert-ブチル-フェニルアラニン（Phe(4-tBu)）、3,4-ジクロロ-フェニルアラニン（Phe(3,4-diCl)）、フェニルグリシン（Phg）、(2S,5R)-5-フェニルピロリジン-2-カルボン酸（Ppca）、プロパルギルグリシン（Pra）、ホモプロリン（HoPro）、β-ホモプロリン（βHoPro）、2-キノイルアラニン（2Qal）、Nα-メチルグリシン（Sar）、ホモセリン（HoSer）、3-スチリル-アラニン（Sta）、タウリン（Tau）、4-チアゾイルアラニン（Tha）、3-(2-チエニル)アラニン（2Thi）、3-(3-チエニル)アラニン（3Thi）、チアゾリジン-4-カルボン酸（Thz）、チアゾリジン-2-カルボン酸（Thz(2-COOH)）、テトラヒドロ-イソキノリン-3-カルボン酸（3Tic）、(R)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸（Tic）、3,5-ジニトロチロシン（Tyr(3,5di NO2)）、3-ニトロチロシン（Tyr(3-NO2)）、3,5-ジヨードチロシン（Tyr(diI)）、およびNα-メチル-バリン（(NMe)-Val）、フェニルアラニン類似体、リジンの誘導体、ならびにそれらの立体異性体を含む（Liu and Lam, Anal. Biochem., 295:9-16 (2001)を参照されたい）。そのように、非天然α-アミノ酸は、非天然L-α-アミノ酸、非天然D-α-アミノ酸、またはそれらの組み合わせのいずれかとして存在する。
【００５０】
アミノ酸はまた、塩基性、酸性、疎水性、および／または極性として分類することもできる。本発明のいくつかの適している塩基性アミノ酸は、Lys、Arg、HoArg、Agp、Agb、Dab、Dap、Orn、およびそれらの立体異性体である。いくつかの適している酸性アミノ酸は、Asp、Glu、Aad、Bec、およびそれらの立体異性体である。疎水性アミノ酸は、Val、Leu、Ile、Met、およびPhe、ならびにそれらの立体異性体を含むが、それらに限定されない。極性アミノ酸は、Asn、Ser、Gln、Thr、およびそれらの立体異性体を含むが、それらに限定されない。
【００５１】
適しているフェニルアラニン類似体は、非限定的に、ホモフェニルアラニン（HoPhe）、フェニルグリシン（Phg）、3,3-ジフェニルアラニン（Dpa）、4-アミノフェニルアラニン（Phe(4-NH2)）、2-メチルフェニルアラニン（Phe(2-Me)）、3-メチルフェニルアラニン（Phe(3-Me)）、4-メチルフェニルアラニン（Phe(4-Me)）、4-アジドフェニルアラニン（Phe(4-N3)）、2-フルオロフェニルアラニン（Phe(2-F)）、3-フルオロフェニルアラニン（Phe(3-F)）、4-フルオロフェニルアラニン（Phe(4-F)）、2-クロロフェニルアラニン（Phe(2-Cl)）、3-クロロフェニルアラニン（Phe(3-Cl)）、4-クロロフェニルアラニン（Phe(4-Cl)）、2-ブロモフェニルアラニン（Phe(2-Br)）、3-ブロモフェニルアラニン（Phe(3-Br)）、4-ブロモフェニルアラニン（Phe(4-Br)）、2-ヨードフェニルアラニン（Phe(2-I)）、3-ヨードフェニルアラニン（Phe(3-I)）、4-ヨードフェニルアラニン（Phe(4-I)）、2-トリフルオロメチルフェニルアラニン（Phe(2-CF3)）、3-トリフルオロメチルフェニルアラニン（Phe(3-CF3)）、4-トリフルオロメチルフェニルアラニン（Phe(4-CF3)）、2-メトキシフェニルアラニン（Phe(2-OMe)）、3-メトキシフェニルアラニン（Phe(3-OMe)）、2-ニトロフェニルアラニン（Phe(2-NO2)）、3-ニトロフェニルアラニン（Phe(3-NO2)）、4-ニトロフェニルアラニン（Phe(4-NO2)）、2-シアノフェニルアラニン（Phe(2-CN)）、3-シアノフェニルアラニン（Phe(3-CN)）、4-シアノフェニルアラニン（Phe(4-CN)）、3,4-ジメトキシフェニルアラニン（Phe(3,4-di OMe)）、3,4-ジフルオロフェニルアラニン（Phe(3,4-di F)）、3,5-ジフルオロフェニルアラニン（Phe(3,5-di F)）、2,4-ジクロロフェニルアラニン（Phe(2,4-diCl)）、3,4-ジクロロフェニルアラニン（Phe(3,4-diCl)）、4-ベンゾイルフェニルアラニン（Bpa）、4-カルボキシフェニルアラニン（Phe(4COOH)）、4,4'-ビフェニルアラニン（Bip）、2,3,4,5,6-ペンタフルオロフェニルアラニン（Phe(F5)）、3,4,5-トリフルオロフェニルアラニン（Phe(F3)）、4-クロロフェニルグリシン（Phg(4-Cl)）、2-クロロフェニルグリシン（Phg(2-Cl)）、3-クロロフェニルグリシン（Phg(3-Cl)）、4-ブロモフェニルグリシン（Phg(4-Br)）、2-ブロモフェニルグリシン（Phg(2-Br)）、3-ブロモフェニルグリシン（Phg(3-Br)）、4-エチルフェニルアラニン（Phe(4-Et)）、4-エトキシフェニルアラニン（Phe(4-OEt)）、4-ブトキシフェニルアラニン（Phe(4-OBu)）、O-メチルチロシン（Tyr(Me)）、O-ベンジルチロシン（Tyr(Bzl)）、3,5-ジブロモチロシン（Tyr(diBr)）、3,5-ジヨードチロシン（Tyr(diI)）、ホモチロシン（HoTyr）、3-クロロチロシン（Tyr(3-Cl)）、それらの立体異性体、およびそれらの組み合わせを含む。
【００５２】
適しているリジン（Lys）、オルニチン（Orn）、およびDbuの誘導体は、非限定的に、Lys38、Lys27、Lys73、Lys55、Lys28、Lys72、Lys12、Lys123、Lys63、Lys124、Lys82、Lys31、Lys15、Lys125、Lys43、Lys24、Lys5、Lys4、Lys50、Lys81、Orn38、Orn27、Orn73、Orn55、Orn28、Orn72、Orn12、Orn123、Orn63、Orn124、Orn82、Orn31、Orn15、Orn125、Orn43、Orn24、Orn5、Orn4、Orn50、Orn81、Dbu38、Dbu27、Dbu73、Dbu55、Dbu28、Dbu72、Dbu12、Dbu123、Dbu63、Dbu124、Dbu82、Dbu31、Dbu15、Dbu125、Dbu43、Dbu24、Dbu5、Dbu4、Dbu50、Dbu81、それらの立体異性体、およびそれらの組み合わせを含む。リジン誘導体の各々についての構造の説明は、表1を参照されたい。OrnおよびDbuの誘導体は、それぞれ、OrnおよびDbuの側鎖に付着した対応するカルボン酸を有するリジン誘導体に類似している。
【００５３】
適しているN-メチルアミノ酸は、N-メチル-Ala、N-メチル-Cys、N-メチル-Asp、N-メチル-Glu、N-メチル-Phe、N-メチル-Gly、N-メチル-His、N-メチル-Ile、N-メチル-Arg、N-メチル-Lys、N-メチル-Leu、N-メチル-Met、N-メチル-Asn、N-メチル-Gln、N-メチル-Ser、N-メチル-Thr、N-メチル-Val、N-メチル-Trp、N-メチル-Tyr、N-メチル-Acp、N-メチル-Acb、N-メチル-Acpc、N-メチル-Cit、N-メチル-HoCit、N-メチル-Aad、N-メチル-4-Pal、N-メチル-3-Pal、N-メチル-Pra、N-メチル-Aib、N-メチル-Abu、N-メチル-Nva、N-メチル-Dpr、N-メチル-Dbu、N-メチル-Nle、N-メチル-Nal-2、N-メチル-Nal-1、N-メチル-Cha、N-メチル-Cpa、N-メチル-Hle、N-メチル-HoSer、N-メチル-Har、N-メチル-Hcy、N-メチル-Chg、N-メチル-Bta、N-メチル-2-Thi、N-メチル-3-Thi、N-メチル-Asu、N-メチル-Acdt、N-メチル-Ahch、N-メチル-Akch、N-メチル-Actp、N-メチル-Tyr(3-NO2)、N-メチル-Ach、N-メチル-3-Apc、N-メチル-4-Apc、N-メチル-4-App、N-メチル-Tha、N-メチル-Aoa、N-メチル-Aha、N-メチル-Orn、N-メチル-Aca、N-メチル-Agl、N-メチル-Cab、N-メチル-2-Pal、N-メチル-Cba、N-メチル-HoPhe、N-メチル-Phg、N-メチル-Phe(4-NH2)、N-メチル-4-Phe(4-Me)、N-メチル-Phe(4-F)、N-メチル-Phe(4-Cl)、N-メチル-Phe(2-Br)、N-メチル-Phe(3-Br)、N-メチル-Phe(4-Br)、N-メチル-Phe(3-CF3)、N-メチル-Phe(4-CF3)、N-メチル-Phe(4-NO2)、N-メチル-Phe(4-CN)、N-メチル-Bpa、N-メチル-Phg(4-Cl)、N-メチル-Phg(4-Br)、N-メチル-Tyr(Me)、N-メチル-Lys38、N-メチル-Lys27、N-メチル-Lys73、N-メチル-Lys55、N-メチル-Lys28、N-メチル-Lys72、N-メチル-Lys12、N-メチル-Lys123、N-メチル-Lys63、N-メチル-Lys124、N-メチル-Lys82、N-メチル-Lys31、N-メチル-Lys15、N-メチル-Lys125、N-メチル-Lys43、N-メチル-Lys24、N-メチル-Lys5、N-メチル-Lys4、N-メチル-Lys50、N-メチル-Lys81、N-メチル-Orn38、N-メチル-Orn27、N-メチル-Orn73、N-メチル-Orn55、N-メチル-Orn28、N-メチル-Orn72、N-メチル-Orn12、N-メチル-Orn123、N-メチル-Orn63、N-メチル-Orn124、N-メチル-Orn82、N-メチル-Orn31、N-メチル-Orn15、N-メチル-Orn125、N-メチル-Orn43、N-メチル-Orn24、N-メチル-Orn5、N-メチル-Orn4、N-メチル-Orn50、N-メチル-Orn81、N-メチル-Dbu38、N-メチル-Dbu27、N-メチル-Dbu73、N-メチル-Dbu55、N-メチル-Dbu28、N-メチル-Dbu72、N-メチル-Dbu12、N-メチル-Dbu123、N-メチル-Dbu63、N-メチル-Dbu124、N-メチル-Dbu82、N-メチル-Dbu31、N-メチル-Dbu15、N-メチル-Dbu125、N-メチル-Dbu43、N-メチル-Dbu24、N-メチル-Dbu5、N-メチル-Dbu4、N-メチル-Dbu50、N-メチル-Dbu81、それらの立体異性体、およびそれらの組み合わせを含む。
【００５４】
アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する化学化合物である。適しているアミノ酸模倣物は、非限定的に、β-アミノ酸およびγ-アミノ酸を含む。β-アミノ酸においては、アミノ基とカルボキシル基との間に2個の炭素原子が存在するように、アミノ基が、カルボキシル基のβ-炭素原子に結合している。γ-アミノ酸においては、アミノ基とカルボキシル基との間に3個の炭素原子が存在するように、アミノ基が、カルボキシル基のγ-炭素原子に結合している。β-アミノ酸またはγ-アミノ酸に適しているR基は、天然に存在するアミノ酸および非天然アミノ酸中にある側鎖を含むが、それらに限定されない。
【００５５】
N-置換グリシンは、アミノ酸側鎖がグリシン窒素原子に付着している、グリシンに基づく非天然アミノ酸である。適しているアミノ酸側鎖（例えば、R基）は、天然に存在するアミノ酸中にある側鎖、およびアミノ酸類似体などの非天然アミノ酸中にある側鎖を含むが、それらに限定されない。本発明における使用に適しているN-置換グリシンの例は、非限定的に、N-(2-アミノエチル)グリシン、N-(3-アミノプロピル)グリシン、N-(2-メトキシエチル)グリシン、N-ベンジルグリシン、(S)-N-(1-フェニルエチル)グリシン、N-シクロヘキシルメチルグリシン、N-(2-フェニルエチル)グリシン、N-(3-フェニルプロピル)グリシン、N-(6-アミノガラクトシル)グリシン、N-(2-(3'-インドリルエチル)グリシン、N-(2-(p-メトキシフェニルエチル))グリシン、N-(2-(p-クロロフェニルエチル)グリシン、およびN-[2-(p-ヒドロキシフェニルエチル)]グリシンを含む。本明細書において「ペプトイド」と呼ばれるN-置換グリシンオリゴマーは、プロテアーゼ耐性であることが示されている（Miller et al., Drug Dev. Res., 35:20-32 (1995)）。そのように、少なくとも1つの非天然α-アミノ酸、D-アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含有するペプトイドは、本発明の範囲内である。
【００５６】
さらに他の態様において、式IのラジカルR1およびR2は各々独立して、H、C1-6アルキル、またはL-Aであることができる。そして、ラジカルLはリンカーであることができ、ラジカルAは活性物質であることができる。
【００５７】
さらに他の態様において、R1は、アセチル、3-アミノプロパノイル、Ebes、イソブチリル、バレリル、シクロヘキシルアセチル、5-ブロモ-2-フロイル、3-フェニルプロピオニル、p-クロロフェニルアセチル、4-ニトロベンゾイル、3,5-ジヒドロキシベンゾイル、4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル、2-メチルチアゾール-4-カルボニル、ニコチニル、2-ナフトイル、またはビフェニル-4-カルボニルであることができる。
【００５８】
本発明において有用なリンカーは、ペプチドなどの部分のキレート物質に対する共有結合的付着を可能にする、1種類または複数種類の様々な反応性官能基を保有するものを含む。連結部分は、2種類またはそれ以上の異なる反応性官能基を保有する。いくつかの場合において、多価リンカーを使用することができ、本発明の複数のRGDペプチドおよび／または複数の活性物質を、リンカーを介して連結することができる。適しているリンカーは、非限定的に、Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL)から入手可能であるものを含む。本発明の好ましい態様において、リンカーは、キレート物質の付着のためのカルボキシル基と、ペプチドの付着のためのアミノ基とを提供する。しかし、任意の反応性官能基が、それが共有結合的に付着されるべき部分上の官能基と適合性である限り、リンカー上に存在し得ることを、当業者は理解する。本明細書において使用される際、「キレート物質-リンカーコンジュゲート」という用語は、リンカーに共有結合的に付着したキレート物質を指す。そのようなキレート物質-リンカーコンジュゲートを、リンカー上に存在する官能基を介して、ペプチドに付着させることができる。いくつかの適しているリンカーは、β-アラニン、2,2'-エチレンジオキシビス(エチルアミン)モノスクシンアミド（Ebes）、およびビス(Ebes)-Lysを含むが、それらに限定されない。他の適しているリンカーは、ビオチンを有するものを含む。追加的なリンカーを、Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, 2d ed., 2008（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）において見出すことができる。
【００５９】
前記リンカーは、特定の条件の存在下または特定の環境での切断のために設計された、切断可能なリンカーであることができる。そのようなリンカーの切断は、例えば、特定の病理学的シグナルによってまたは特異的な酵素によって、増強されるかまたは影響を受けることができる。特定の条件のために設計された切断可能なリンカーの選択により、そのような条件が存在する特異的な場所に対するターゲティングが可能になり得る。切断可能なリンカーは、例えば、塩基性pH条件、酸性pH条件、プロテアーゼ活性、メタロプロテイナーゼ活性、または還元条件に対して感受性であることができる。いくつかの態様において、リンカーは、例えば、ジスルフィド還元、光切断、またはタンパク質消化によって切断することができる。
【００６０】
活性物質であるAは、広く選択することができる。いくつかの態様において、活性物質は、薬物、抗生物質などの抗微生物物質、ワクチン、アプタマー、ヒトAドメインスキャフォールドに基づくアビマースキャフォールド、ダイアボディ、ラクダ科（camelid）、サメIgNAR抗体、修飾された特異性を有するフィブロネクチンIII型スキャフォールド、抗体、抗体断片、ビタミンおよび補因子、多糖、炭水化物、ステロイド、脂質、脂肪、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ならびに核酸（例えば、mRNA、tRNA、snRNA、RNAi、マイクロRNA、DNA、cDNA、アンチセンス構築物、リボザイムなど、およびそれらの組み合わせ）から選択することができる。1つの態様において、活性物質は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、可溶性または細胞結合性、細胞外または細胞内、キネシン、分子モーター、酵素、細胞外マトリクス物質、およびそれらの組み合わせから選択することができる。別の態様において、活性物質は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸（例えば、mRNA、tRNA、snRNA、RNAi、DNA、cDNA、アンチセンス構築物、リボザイムなど、およびそれらの組み合わせ）から選択することができる。別の態様において、活性物質は、ステロイド、脂質、脂肪、およびそれらの組み合わせから選択することができる。例えば、活性物質は、活性物質がヒアルロン酸である時などに、細胞外マトリクスに結合することができる。他の活性物質は、薬物、放射標識、イメージング物質、化学療法剤、およびナノ粒子などの、診断用または治療用作用物質を含む。いくつかの態様において、活性物質はビオチンであることができる。
【００６１】
イメージング物質は、対象において腫瘍、器官、または組織をイメージングするために、本発明の化合物に付着している標識を指す。イメージング部分は、共有結合的または非共有結合的に、化合物に付着させることができる。本発明における使用に適しているイメージング部分の例は、非限定的に、放射性核種、ビオチン、蛍光体、例えばフルオレセイン、ローダミン、Texas Red、Cy2、Cy3、Cy5、またはCy5.5、Alexa 350、Alexa 405、Alexa 488、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 568、Alexa 594、Alexa 633、Alexa 647、Alexa 680、R-フィコエリトリン、抗体、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、それらの誘導体、およびそれらの混合物を含む。本発明の化合物を、ビオチンコンジュゲートとしてまたはDOTAコンジュゲートとして合成するための例示的な方法を、それぞれ、実施例12および13において提供する。当業者は、特定のイメージング部分を本発明の化合物にコンジュゲートするための他の適している方法を知っているであろう。
【００６２】
放射標識とは、放射活性を呈する核種を指す。「核種」とは、炭素14（14C）などの、その原子番号、原子質量、およびエネルギー状態によって特定される原子のタイプを指す。「放射活性」とは、放射性物質によって放出される、α粒子、β粒子、核子、電子、陽電子、ニュートリノ、およびγ線を含む放射線を指す。本発明における使用に適している放射性核種は、フッ素18（18F）、リン32（32P）、スカンジウム47（47Sc）、コバルト55（55Co）、銅60（60Cu）、銅61（61Cu）、銅62（62Cu）、銅64（64Cu）、銅67（67Cu）、ガリウム66（66Ga）、ガリウム67（67Ga）、ガリウム68（68Ga）、ルビジウム82（82Rb）、イットリウム86（86Y）、イットリウム87（87Y）、イットリウム90（90Y）、ストロンチウム89（89Sr）、ロジウム105（105Rh）、銀111（111Ag）、インジウム111（111In）、ヨウ素123（123I）、ヨウ素124（124I）、ヨウ素125（125I）、ヨウ素131（131I）、スズ117m（117mSn）、テクネチウム99m（99mTc）、プロメチウム149（149Pm）、サマリウム153（153Sm）、ホルミウム166（166Ho）、ルテチウム177（177Lu）、レニウム186（186Re）、レニウム188（188Re）、タリウム201（201Tl）、アスタチン211（211At）、およびビスマス212（212Bi）を含むが、それらに限定されない。本明細書において使用される際、117mSnおよび99mTcにおける「m」は、メタ（meta）状態を意味する。追加的に、典型的には放射性同位体の混合物を表す、ウラニウム、ラジウム、およびトリウムなどの天然に存在する放射性元素は、放射性核種の適している例である。67Cu、131I、177Lu、および186Reは、β線およびγ線を放出する放射性核種である。212Biは、α線およびβ線を放出する放射性核種である。211Atは、α線を放出する放射性核種である。32P、47Sc、89Sr、90Y、105Rh、111Ag、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、および188Reは、β線を放出する放射性核種の例である。67Ga、111In、99mTc、および201Tlは、γ線を放出する放射性核種の例である。55Co、60Cu、61Cu、62Cu、66Ga、68Ga、82Rb、および86Yは、陽電子を放出する放射性核種の例である。64Cuは、β線および陽電子を放出する放射性核種である。
【００６３】
本発明において有用なナノ粒子は、1〜1000 nmにわたるサイズを有する粒子を含む。ナノ粒子は、ビーズ、金属粒子を含むがそれらに限定されないか、または、いくつかの場合において、ミセル、リポソームもしくは他のベシクル、またはデンドリマーであることができる。他のナノ粒子は、カーボンナノチューブおよび量子ドットを含む。ナノ粒子は、診断用および／または治療用作用物質を詰めることができる。
【００６４】
いくつかの態様において、式IのラジカルX2は、Gly、Ala、Sar、またはβ-アラニン、およびそれらの立体異性体であることができる。同様に、ラジカルX6は、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Asp、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Trp、Pro、Aad、Bec、Bmc、Bmp、Phe(4COOH)、Hyp、HoSer、Tha、Ahch、Actp、Akch、Tyr(diI)、Trp、Thz、2Thi、3Thi、Cit、HoCit、Aib、Nglu、またはFua、およびそれらの立体異性体であることができる。加えて、ラジカルX7は、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Asp、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Trp、Pro、Bmp、HoSer、Nglu、HoCit、Bec、Aad、Hyp、Ahch、Phe(4COOH)、Akch、Aecc、Abu、Phe(3,4-diOMe)、Cpa、2Thi、3Thi、Thz、Phg、Phe(4-NO2)、Nle、(NMe)Phe、Aic、Chg、Bta、Bpa、Nal2、Nal1、Tic、Ppca、Cha、Bipa、Deg、Dpg、Acpc、Bmc、Cit、Sar、Tha、Pra、Actp、Aib、Agl、Acbc、Fua、Nva、Trp、Bug、Ach、(NMe)Val、Cpeg、(CαMe)Phe、Tyr(diI)、Phe(2-Cl)、Bua、HoPhe、HoLeu、Sta、Ing、Phe(4-CF3)、Oic、Dpa、Phe(4-t-Bu)、HoCha、またはPhe(3,4-diCl)、およびそれらの立体異性体であることができる。他の態様において、ラジカルX2、X6、およびX7の各々は、D-アミノ酸であることができる。
【００６５】
他の態様において、本発明のスキャフォールドのペプチドリガンドは、式Ia：
2019519256.tif 000005
を有することができる。式IaのラジカルR1およびR2は、上記のとおりである。いくつかの態様において、ラジカルX6は、DSer、DAsp、Ahch、Bmp、DGlu、Nglu、またはDCitであることができ、ラジカルX7は、DPhe、DGlu、DSer、DBug、DBta、DVal、DAgl、DPra、D(NMe)Val、D(CαMe)Val、DAbu、DIng、DIle、Actp、DTha、DAsp、DNal1、またはPpcaであることができる。いくつかの他の態様において、ラジカルX6は、DAspまたはDSerであることができ、ラジカルX7は、DGlu、DPhe、DSer、DVal、DBug、またはDBtaであることができる。
【００６６】
式IaのR1およびR2は各々独立して、HまたはC1-6アルキルであることができる。いくつかの態様において、R1はHである。いくつかの態様において、R2はHである。いくつかの態様において、R1およびR2は両方ともHである。
【００６７】
式IaのX6は、DSer、DAsp、DGlu、またはDCitであることができる。式IaのX7は、DPhe、DGlu、DSer、DBug、DBta、DVal、DAgl、DPra、D(NMe)Val、D(CαMe)Val、DAbu、DIng、DIle、DTha、DAsp、またはDNal1であることができる。いくつかの態様において、X6は、DAspおよびDSerである。いくつかの態様において、X7は、DGlu、DPhe、DSer、DVal、DBug、またはDBtaである。
【００６８】
別の態様において、本発明のペプチドリガンドは、cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDd-DBug-c、cGRGDd-DBta-c、cGRGDd-DBta-c、cGRGDdvc、CGRGDdvc、cGRGDdvC、CGRGDdvC、DPen-GRGDdv-DPen、DPen-GRGDdvc、cGRGDdv-DPen、Ac-cGRGDdvc、(β-アラニン)-cGRGDdvc、(Ebes)-cGRGDdvc、caRGDdvc、c-Sar-RGDdvc、c-β-アラニン-RGDdvc、cG-HoArg-GDdvc、cG-Agp-GDdvc、cG-Agp-GEdvc、cGRGDd-DAgl-c、cGRGDd-DPra-c、cGRGDd-DBug-c、cGRGDd-D(NMe)Val-c、cGRGDd-D(CαMe)Val-c、cGRGDd-DAbu-c、CGRGDd-DIng-c、c-Sar-RGD-Ahch-ic、c-Sar-RGD-Ahch-DBug-c、cGRGDd-DAgl-C、C-Sar-RGDd-DPra-C、C-Sar-RGDd-Actp-C、c-Sar-RGDd-DPra-C、c-Sar-RGDd-Actp-C、CGRGDd-DTha-C、cGRGDd-DPra-C、cGRGDd-Actp-C、c-Sar-RGD-Ahch-iC、c-Sar-RGD-Ahch-DBug-C、C-Sar-RGD-Bmp-dC、CGRGDe-Ppca-c、cGRGD-Nglu-Ppca-c、cGRGDd-DNal1-c、またはcGRGDd-DBta-cであることができる。他の態様において、本発明の化合物は、cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDdvc、cGRGDd-DBug-c、またはcGRGDd-DBta-cであることができる。
【００６９】
別の態様において、本発明のペプチドリガンドは、cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDdvc、CGRGDdvc、cGRGDdvC、CGRGDdvC、caRGDdvc、c-Sar-RGDdvc、c-β-アラニン-RGDdvc、cGRGDd-DAgl-c、cGRGDd-DPra-c、cGRGDd-DBug-c、DPen-GRGDdv-DPen、DPen-GRGDdvc、cGRGDdv-DPen、cGRGDd-D(NMe)Val-c、cGRGDd-D(CαMe)Val-c、cGRGDd-DAbu-C、cGRGDdic、CGRGDd-DIng-c、c-Sar-RGD-Ahch-ic、c-Sar-RGD-Ahch-DBug-c、cGRGDd-DAgl-C、C-Sar-RGDd-DPra-C、C-Sar-RGDd-Actp-C、c-Sar-RGDd-DPra-C、c-Sar-RGDd-Actp-C、CGRGDd-DTha-C、cGRGDd-DPra-C、cGRGDd-Actp-C、c-Sar-RGD-Ahch-iC、c-Sar-RGD-Ahch-DBug-C、C-Sar-RGD-Bmp-dC、CGRGDe-Ppca-c、CGRGD-Nglu-Ppca-c、CGRGDd-DNal1-C、CGRGD-D3Thi-Ppca-c、cGRGDd-DBta-c、cG-HoArg-GDdvc、cG-(NMe)Arg-GDdvc、cGR-Sar-Ddvc、cGRG-(NMe)Asp-dvc、cG-Agp-GDdvc、cG-Agp-GEdvc、cGRGDsdC、cGRGDd-DIng-c、cGRGDd-DNal1-c、cGRGDd-DNal2-c、cGRGDd-D3Thi-c、cGRGDd-D2Thi-c、cGRGDdwc、cGRGDd-DTha-c、cGRGD-DCit-Ppca-c、cGRGDe-Ppca-c、cGRGD-NGlu-Ppca-c、cGRGD-DCit-DBta-c、cGRGD-DBec-Ahch-c、またはcGRGD-DBec-DPra-cであることができる。いくつかの態様において、ペプチドリガンドは、cGRGDdvc（LXW7）である。
【００７０】
スキャフォールドのペプチドリガンドは、内皮細胞および／または内皮前駆細胞の付着を増大させるように機能する。ペプチドリガンドは、細胞表面インテグリンに対する親和性を有することができる。インテグリンは、細胞の保持、可動化、血管新生、または内皮化を調節することができる。いくつかの態様において、ペプチドリガンドは、インテグリンα4β1、α5β1、α6β1、αvβ3、およびαvβ5のうちの1種類または複数種類に結合する。いくつかの態様において、ペプチドリガンドは、細胞上のインテグリンαvβ3に結合する。
【００７１】
提供されるスキャフォールドは、好ましくは、良好な生体適合性、容易な成形、良好な分解、骨伝導性、妥当な孔サイズおよび有孔性、ならびに適している機械的強度の望ましい特徴を有する。スキャフォールド材料を、容易に立体的に形作るかまたは成形して、様々なサイズおよび形状に加工処理することが、有益である。スキャフォールドの分解産物が、移植対象に対して可能な限り少ししか負の副作用を与えないならば、また有利である。適切な孔サイズおよび有孔性を有することにより、移植された細胞によって必要とされる栄養素および他の因子の良好な大量輸送が可能になり得る。適している機械的強度は、周囲の組織または線維性組織の内殖によるスキャフォールドへの損傷を阻止することができる。スキャフォールドは、例えば、リン酸化カルシウムセラミックまたはポリマーであることができる。スキャフォールドは、各々が異なる組成および機能を有する、複数の層を含むことができる。
【００７２】
前記スキャフォールドは、生体適合性ポリマーまたはバイオポリマーを含むことができる。スキャフォールドは、医療機器であることができ、スキャフォールドのポリマーは、医療機器の構成要素または機器自体であることができる。スキャフォールドまたは機器は、腔内または腔外の位置決めまたは操作に適していることができる。いくつかの態様において、ポリマーはヒドロキシアパタイトである。いくつかの態様において、スキャフォールドのポリマーは、ポリ(L-乳酸)（PLLA）、ポリカプロラクトン（PCL）、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）、ヒドロキシアパタイト（HA）、ラクチド-ε-カプロラクトン共重合体（PLCL）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、ポリマーはePTFEである。いくつかの態様において、ポリマーは、ハイブリッドポリマーまたはコポリマーである。
【００７３】
本発明において有用なバイオポリマーは、多数の類似した官能基の存在下で相補的な官能基との化学選択的ライゲーションを受け得る、官能基を有することができる。例えば、限定としてではなく、第一級アルコールは、第二級アルコールの存在下で選択的に反応させることができる。類似した様式において、ポリアミンバイオポリマーは、第一級アミンおよび第二級アミンの両方を有することができ、第一級アミンのみが、適切な相補的官能基と化学選択的ライゲーションを受ける。他を上回って1つに対して反応性の好みを有する他の類似した官能基は、アルデヒドおよびケトンであることができよう。いくつかの場合において、バイオポリマーは、それ自体は化学選択的ライゲーションのための官能基を含まないが、その後、化学選択的ライゲーションのために官能基で誘導体化されることができる。
【００７４】
前記スキャフォールドのポリマーは、さらに、コーティングを含むことができる。ペプチドリガンドを、コーティングに共有結合的に付着させることができる。いくつかの態様において、コーティングはパリレンポリマーである。パリレンポリマーは、蒸着プロセスによってポリマー上にコンフォーマルコーティングすることができる。いくつかの態様において、ポリマーを、パリレンでのコーティングの前に、マイクロ波プラズマまたは紫外線を用いて活性化する。いくつかの態様において、パリレンポリマーは、パリレンA、パリレンC、パリレンD、パリレンHT、またはパリレンNである。パリレンポリマーはまた、トリシクロ[8.2.2.24,7]ヘキサデカ-4,6,10,12,13,15-ヘキサエン-5-カルボキシアルデヒド（CAS: 729-30-6）、トリシクロ[8.2.2.24,7]ヘキサデカ-4,6,10,12,13,15-ヘキサエン-5-アミン（CAS: 10122-95-9）、トリシクロ[8.2.2.24,7]ヘキサデカ-4,6,10,12,13,15-ヘキサエン-5-カルボン酸（CAS: 18931-39-0）、または、アルデヒド基、エステル基、アルコール基、無水物基、アルキン基、フェニルアセチル基、もしくは他の官能基のうちの1種類もしくは複数種類を用いて官能基を付与された他のパリレンなどの、官能基を付与されたパリレンであることもできる。医療機器およびインプラントにおけるパリレンコーティングのさらなる説明は、例えば、Kuppusami and Oskouei (2015) Universal J. Biomed. Eng. 2015:9、およびTan and Craighead (2010) Materials 3:1803において見出すことができ、これらは両方とも、すべての目的でそれらの全体が組み入れられる。
【００７５】
細胞を、対象における移植の前または後に、スキャフォールド上に播種することができる。いくつかの態様において、内皮細胞、内皮前駆細胞、および／または骨形成原細胞を、スキャフォールド上に播種する。いくつかの態様において、スキャフォールドに、脂肪幹細胞（ASC）に由来する細胞を接種する。いくつかの態様において、ASC由来の内皮細胞および骨芽細胞を、スキャフォールドに連続的に播種するために使用する。ASC由来の内皮細胞は、スキャフォールドの骨構築物内に血管網を形成することができ、他方、ASC由来の骨芽細胞は、骨再生を増大させることができる。
【００７６】
IV．操作された組織
組織工学法は、所望の細胞タイプが播種されている、インビトロ生体適合性を有するスキャフォールドを、正常組織細胞上に吸着させる工程を含むことができる。そのような多孔性スキャフォールドは、その後分解し、身体によって吸収され得る。このプロセスの結果は、複合生分解性物質とともに身体の損傷部位中に送達された細胞の移植を含むことができる。スキャフォールドなどの物質はまた、移植された細胞の成長、複製、および／または分化も促進することが好ましい。これは、操作された組織が、損傷を受けた組織および器官に対する代替物として作用し、リハビリテーションおよび再構成の目的を達成するために必要な形態および機能の漸進的形成を可能にすることができる。いくつかの態様において、本発明は、本発明のスキャフォールドを含む操作された組織を提供する。
【００７７】
V．内皮化および血管新生を改善する方法
本発明は、操作された組織について内皮化および血管新生を改善するいくつかの方法を提供する。方法は、本発明のスキャフォールドを対象中に移植する工程を含む。細胞は、内皮細胞および／または内皮前駆細胞を含むことができる。いくつかの態様において、方法は、スキャフォールドへの内皮細胞および／または内皮前駆細胞の動員を増大させるペプチドリガンドを有するスキャフォールドを移植する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、スキャフォールド上の移植された内皮細胞および／または内皮前駆細胞の増殖および組み込みを増大させるペプチドリガンドを有するスキャフォールドを移植する工程を含む。
【００７８】
VI．骨欠損を修復する方法
骨欠損は、患者に対して大きな不便をかけ、患者の日常生活に重大な影響を及ぼすため、骨欠損の処置は、非常に一般的な臨床問題である。臨床処置法は、典型的には自家骨グラフトまたはアログラフトを含むが、後者には、ドナーによる疾患伝播および免疫拒絶の限定されたリスクがある。骨代用物を調製するための組織工学法の使用は、これらの問題のうちのいくつかを回避して、骨欠損の処置のために骨再生を促進することができる。
【００７９】
大きなかつ複雑な骨欠損は、身体の再生する能力を超える場合があり、そのような欠損の外科的修復は、特に課題のままである。大きな骨欠損の現在の外科的処置は、自己骨グラフトまたは無生物材料のいずれかの使用を含む。これらのアプローチは、大部分成功しているが、固有の不利点が付随している。例えば、無生物材料は、拒絶、感染での問題を有し、自己骨グラフトは、しばしば、利用可能性およびドナー部位の病的状態で限定される。したがって、骨修復のために現在利用可能な技法に対する適している代替物が、差し迫って必要なままである。組織工学で作られた骨構築物は、現在の方法の短所を克服する潜在能力を有する。しかし、大きなかつ複雑な構築物の生存は、効率的なかつ即時の栄養素送達のための、高性能の血管網に依拠する。血管網の非存在下では、血液供給から遠い接種細胞は死に、究極的に全構築物の生存を危険にさらす。
【００８０】
本発明は、対象における骨欠損を修復するいくつかの方法を提供する。方法は、本発明のスキャフォールドを対象中へ移植する工程を含む。いくつかの態様において、骨欠損は、頭蓋冠骨欠損である。いくつかの態様において、内皮細胞および／または骨形成原細胞を、スキャフォールドの対象中への移植の前に、スキャフォールド上に播種する。いくつかの態様において、内皮細胞および／または骨形成原細胞を、スキャフォールドの対象中への移植の後に、スキャフォールド上に播種する。
【００８１】
VII．コーティング
本発明はまた、スキャフォールドおよび医療機器の修飾のためのいくつかのコーティングも提供する。コーティングは、それが適用されている表面の内皮化を促進し、それにより、スキャフォールド上の細胞の再生能力または成長能力を増大させることができる。コーティングされる表面は、ポリマー、プラスチック、金属、またはガラスを含む、任意の物質であることができる。例として、スキャフォールドは、血管グラフトの形態にあることができ、血管グラフトのコーティングは、グラフト管腔表面上の自己複製可能な内皮の生成を可能にすることができる。コーティングはまた、心臓弁およびカテーテルを含む、広範な血管内機器に適用されることもできる。
【００８２】
コーティングされた生成物は、機能的な血管アクセスが必要な手順である、血液透析のために使用することができる。血管透析血管アクセスの最も一般的な現在の形態は、動静脈PTFE透析グラフトの使用を含む。しかし、これらのグラフトは、血栓症、狭窄、および感染などの合併症のために、高い失敗率を有し得る。グラフトスキャフォールドへの機能的内皮の形成を促進することにより、提供されるコーティングは、グラフトのいくつかの有益な特性を添加するかまたは改善することができる。これらは、抗接着特性、抗炎症および免疫応答、細胞増殖促進、平滑筋緊張の媒介、および恒常性調節分子の産生を含む。
【００８３】
提供されるコーティングは、上記のペプチドリガンドのいずれかを含む。いくつかの態様において、コーティングは、リガンドLXW7を含む。コーティングは、さらに、パリレンポリマーなどのポリマーを含む。パリレンは、柔軟性、およびインプラント表面に対する長く続くインビボ接着性の点で優秀な機械特性を保有するため、移植可能な医療機器およびグラフトに関連する最新のコーティングポリマーである。パリレンは、化学蒸着（CVD）プロセスによって、不規則な基質上にコンフォーマルコーティングすることができ、化学的に不活性、非生分解性、および本質的に基質非依存性である。FDAは、パリレンを、それらの生体適合性のために、医療機器のコーティング用のクラスVIポリマーとして認可している。いくつかの態様において、パリレンポリマーは、パリレンC、パリレンD、パリレンHT、またはパリレンNである。いくつかの態様において、機器またはスキャフォールドを、最初にパリレンポリマーでコーティングする。パリレンは、コーティングを適用した前または後のいずれかに、官能基を付与されることができる。パリレンの官能基付与後に、それを、LXW7などのリガンドとコンジュゲートすることができる。いくつかの態様において、コーティングポリマーをスキャフォールドまたは機器をコーティングするために使用する前に、リガンドをこのポリマーにコンジュゲートする。いくつかの態様において、スキャフォールドまたは機器の表面を、コーティングの前にマイクロ波プラズマを用いて活性化する。いくつかの態様において、スキャフォールドまたは機器の表面を、紫外線に曝露して、表面とコーティングとの光化学的共有結合性カップリングを誘導する。いくつかの態様において、コーティングされる表面を、コーティングの適用後に、例えば、上昇した温度または紫外線への曝露によって硬化させる。いくつかの態様において、コーティングの前に行う活性化プロセスにおいて、スキャフォールドまたは機器の表面に官能性を付加する。次いで、グラフトポリマーは、官能基を付与された表面に付加され、さらなるポリマーの成長を支持するために使用され、それによりコーティングポリマーを生成する。
【００８４】
前記コーティングまたは前記スキャフォールドポリマーは、ポリマーの互いに対する、または、リガンドもしくは付着したリンカーのポリマーのいずれかに対する共有結合性の付着を容易にするために、任意の適している化学を用いて官能基を付与されることができる。例えば、ポリマーは、リガンドまたはリンカー上の第一級アミンと反応することができるアルデヒド基を用いて官能基を付与されることができる。ポリマーは、リガンドまたはリンカー上のアミンと反応することができるグリシドキシ基を用いて官能基を付与されことができる。ポリマーは、リガンドまたはリンカー上のアミンと架橋することができるスクシンイミジル基を用いて官能基を付与されることができる。ポリマーは、リガンドまたはリンカー上のアミンに共有結合的にライゲーションすることができるイソシアナート基を用いて官能基を付与されることができる。ポリマーは、リガンドまたはリンカー上のチオールと反応することができるマレイミド基を用いて官能基を付与されることができる。ポリマーは、リガンドまたはリンカー上のアルコール基に共有結合的に付着することができる塩素基を用いて官能基を付与されることができる。ポリマーは、オキシム結合またはチアゾリジン環形成を介してリガンドまたはリンカーに共有結合的に付着することができるグリオキシリル基を用いて官能基を付与されることができる。ポリマーは、リガンドまたはリンカーのN-末端システインとアミド結合を結合することができるチオエステル基を用いて官能基を付与されることができる。ポリマーは、リガンドまたはリンカー中に導入されたシクロジエンと反応することができるキノン基を用いて官能基を付与されることができる。他の適している化学を、同様に適用して、リガンドまたはリンカーをポリマーに共有結合的にコンジュゲートすることができる。
【００８５】
前記コーティングポリマーの官能基付与は、アルキン官能基の導入を含むことができる。いくつかの態様において、コーティングのパリレンポリマーを修飾して、アルキン官能基を付与されたパリレンを産出し、次いで、クリックケミストリーを介してLXW7-リンカー-アジドに共有結合的にライゲーションする。いくつかの態様において、スキャフォールドおよび機器のポリマーベース（例えば、ePTFE）を、アルキン官能基を付与されたコーティングポリマー（例えば、パリレン）でコーティングする前に、（例えば、マイクロ波プラズマによって）活性化する。このコーティングは、例えば、CVDプロセスを通すことができる。リガンド-リンカー-アジド（例えば、LXW7-リンカー-N3）を、次いで、表面上に固定化して、コーティングを完了することができる。代替的な態様において、リガンド-リンカー-アジドと、官能基を付与されたコーティングポリマーとを、スキャフォールドまたは機器へのコーティングの適用前に、コンジュゲートする。
【実施例】
【００８６】
VIII．実施例
本発明を、具体例によってより詳細に説明する。以下の実施例は、例証目的でのみ提供され、いかなる様式においても本発明を限定するようには意図されない。当業者は、本質的に同じ結果を生じるように変更または修飾され得る様々な重要でないパラメータを、容易に認識するであろう。
【００８７】
実施例1．細胞培養および血小板単離
発芽（outgrowth）内皮細胞（OEC）ともしばしば呼ばれるEPCのサブタイプである内皮コロニー形成細胞（ECFC）を、以前に記載されているとおりに、ヒト臍帯血から単離した（Williams et al. (2015) PloS One 10:e0123437；Ingram et al. (2004) Blood 104:2752）。ヒト臍帯血（10 Uヘパリン／mL血液）を、UC Davis Umbilical Cord Blood Collection Program（UCBCP）から取得して、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水（PBS）、pH 7.2（Hyclone）で1:1希釈した。15 mLのFicoll-Paque PLUS（Amersham Biosciences）を、20 mLの希釈した血液の底部に置き、2000 rpmで30分間、室温で遠心分離した。Ficollと血清との間の界面に位置する単核細胞（MNC）の濁った層を収集し、10 mL EBM-2（Lonza）を含有する50mL コニカルチューブ中に分配して、1500 rpmで10分間、室温で遠心分離した。上清を注意深く吸引して、沈殿を、赤血球溶解緩衝液（eBioscience, Inc.）で処理し、次いで、CD34マイクロビーズ磁気選別（Miltenyi Biotec GmbH）により製造業者の説明書にしたがって選別した。CD34＋細胞を、ラット尾部コラーゲンI（BD Biosciences Discovery）コーティング組織培養プレート上に播種して、EGM-2（Lonza）中で培養した。24時間後、非接着細胞を除去して、培地を、7日目まで毎日、その後は1日おきに交換した。ECFC由来のコロニーは、典型的な内皮敷石パターンを有し、培養の4日目〜7日目の間に現れた。個々のコロニーを単離して増大させ、最初の継代の前に80％〜90％コンフルエントまで成長させた。ECFCは、すべての実験についてP3〜P5の間で使用した。
【００８８】
ヒト冠動脈内皮細胞（HCAEC）は、ATCCから購入した。ヒト心臓微小血管内皮細胞（HMVEC）は、Lonzaから購入した。THP-1単球は、Pamela Lein博士（University of California, Davis）から取得した。ヒトインテグリンαvβ3遺伝子をトランスフェクトされた骨髄性白血病K562細胞（αvβ3-K562細胞）は、Yoshikazu Takada博士から提供され、ヒトインテグリンαIIbβ3遺伝子をトランスフェクトされたK562細胞（αIIbβ3-K562細胞）は、Jennifer Cochran博士（Stanford University）から提供された。
【００８９】
HECFC、HCAEC、およびHMVECは、EC増大培地EGM-2中で培養し、THP-1単球は、10％胎児ウシ血清（FBS, Hyclone）および0.05mM 2-メルカプトエタノール（Sigma）を補給したRPMI培地1640（Gibco）中で培養した。αvβ3-K562細胞およびαIIbβ3-K562細胞は、RPMI培地1640＋10％ FBS中で培養した。多血小板血漿（PRP）を、UC Davis Medical Center（Sacramento, CA）から取得した。新鮮なPRP（260×103血小板／μL）を遠心分離し、沈殿を、2 mM CaCl2およびMgCl2を含有するダルベッコのリン酸緩衝食塩水（DPBS；Hyclone）中に再懸濁して、1×108血小板／mLの最終濃度にした。
【００９０】
実施例2．EPC/EC-ビーズおよび血小板-ビーズ結合アッセイ
HECFC、HCAEC、HMVEC、およびTHP-1単球を、実施例1に記載されているとおりに、それぞれの成長培地中で培養した。細胞ビーズ結合アッセイのために、2 mLのそれぞれの培養培地中の6×105個のHECFC、HCAEC、HMVEC、またはTHP-1単球を、超低付着35mmペトリディッシュ（Corning Incorporated）に添加し、その後樹脂ビーズを添加した（Lam et al. (1991) Nature 354:82）。ディッシュを、振盪インキュベーション中、37℃、5％ CO2で、種々の時点にわたって40 rpmでインキュベートした。血小板ビーズ結合アッセイのためには、実施例1に記載されているとおりに単離した血小板を、超低付着35mmペトリディッシュに添加し、細胞-ビーズ結合アッセイについて記載されているとおりに振盪インキュベーター中で樹脂ビーズとインキュベートした。位相差画像を、Olympus IX81顕微鏡を用いて様々な時点で撮った。
【００９１】
実施例3．ECおよび血小板の付着アッセイ
リガンドLXW7、LXY30、およびLLP2Aを、米国特許第9,073,974号におけるとおりに合成した。ビオチン化LXW7（LXW7-bio）およびビオチン化GRGD（GRGD-bio）を、確立された固相ペプチド合成プロトコールを用いて合成した（Xiao et al. (2010) Mol Cancer Therapeutics 9:2714）。ペプチド-bioは、ペプチドとLys（ビオチン）との間の2つの親水性リンカーで、Lysの側鎖に付着したビオチンを有するように設計した。培養表面をリガンドで修飾するために、24ウェルプレート中の標的培養ウェルを、500μLの20μg/mLアビジン（Thermo Fisher Scientific）でコーティングし、1時間、37℃でインキュベートした。アビジンコーティングしたウェルを、DPBSで3回リンスして、500μLモル当量（2μM）のD-ビオチン（Thermo Fisher Scientific）、LXW7-bio、またはGRGD-bioで処理した。1時間後、ウェルを、DPBSで3回洗浄して、1％ウシ血清アルブミン（BSA；Thermo Fisher Scientific）で1時間ブロッキングした。ウェルをDPBSで3回リンスした後、細胞付着アッセイのために、それぞれの維持培地中に懸濁した5×104個のHCAECおよびTHP-1単球を、ウェルに添加して、それぞれ、37℃、5％ CO2で10分間または16時間インキュベートした。各時点後に、ウェルをDPBSで3回洗浄して、接着した細胞を、10％ホルマリン（Azer Scientific）中で20分間固定した。血小板付着アッセイのためには、PRPを遠心分離して、血小板沈殿を、2 mM CaCl2および1 mM MgCl2を含む1％ BSA中に再懸濁して1×108血小板／mLの最終濃度を達成し、5×107血小板／cm2の密度でウェルに添加して、37℃、5％ CO2で16時間インキュベートした。ウェルを、DPBSで3回洗浄して、接着した細胞を、10％ホルマリン中で20分間固定した。HCAECのウェルを、再びDPBSで洗浄し、1％ BSAで1時間ブロッキングした。追加の洗浄を行い、プレートを、1％ BSA中のマウス抗PECAM-1抗体（1:100；Abcam）と4℃で一晩インキュベートした。ウェルを、洗浄して、1％ BSA中のヤギ抗マウスAlexa Fluor 594コンジュゲート（1:500；Life Technologies）と室温で1時間インキュベートし、次いで、核を、4',6-ジアミノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色した。DPBSでの3回の洗浄後に、細胞を、Olympus IX81顕微鏡を用いてイメージングした。5枚の画像を、各試料から無作為に撮り、画像の定量を、Image Jソフトウェア（NIH）を用いて行った。
【００９２】
実施例4．リガンド-細胞結合親和性のフローサイトメトリー解析
LXW7-bio（1μM）を、結合緩衝液（10％ FBSを含有するHEPES）中の3×105個のHECFC、HCAEC、HMVEC、αvβ3-K562およびαIIbβ3-K562細胞、およびTHP-1単球、ならびに1×108個の血小板と、氷上で30分間インキュベートした。試料を、1％ FBSを含有するDPBSで3回洗浄して、2μg/mlのストレプトアビジン-フィコエリトリンと氷上で30分間インキュベートし、次いで、DPBSで洗浄した。試料を、BD Fortessa LSR Cell Analyzer上で解析し、さらなるデータ解析およびゲーティングを、FlowJoソフトウェア（Treestar, Inc.）を用いて行った。
【００９３】
実施例5．LXW7上でのEC増殖のMTSアッセイ
実施例3由来の96ウェルプレートを、1μMアビジン溶液で1時間、室温で処理した。アビジンコーティングしたウェルを、DPBSで3回リンスして、LXW7-bio（1μM）、対照として働くD-ビオチン（1μM）で処理した。1時間後、ウェルを、DPBSで3回洗浄し、1％ BSAで1時間ブロッキングした。3×103個の生存可能なHCAECを、ウェルあたりに播種して、EGM-2培地中で5日間培養した。MTSアッセイを、製造業者の説明書（Interchim）にしたがって各々の日に行い、SpectraMax-3プレートリーダー（Molecular Devices）上で解析した。
【００９４】
実施例6．ウェスタンブロット解析
実施例2由来の100mmディッシュを、実施例5に記載されているとおりに、アビジンで、その後LXW7-bioまたはD-ビオチンで処理した。8×105個のHCAECを、ディッシュあたりに播種して、EGM-2培地中で4日間培養した。細胞を、Extraction Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて溶解し、タンパク質濃度を、BCA Protein Assay（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。15μgの各試料を、4-12％ Bis-Tris NuPAGEゲル（Thermo Fisher Scientific）を用いて、ロードして分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を、TBST（0.5％ Tween-20を含むTris緩衝食塩水）中5％ BSAにおいてブロッキングし、その後、1％ BSAにおいて、すべてCell Signaling Technologiesから購入した、一次抗体の抗VEGF受容体2、抗ホスホ-VEGF受容体2、抗p44/42 MAPK（Erk1/2）、および抗ホスホ-p44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）と、4℃で一晩インキュベートした。TBSTで3回洗浄した後、膜を、TBST中1％脱脂粉乳（BioRad）においてそれぞれのセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体と室温で1時間インキュベートした。洗浄した後、タンパク質のバンドを、West Dura Substrate（Thermo Fisher Scientific）を用いて可視化し、Image Jソフトウェアを用いて定量した。
【００９５】
実施例7．LXW7修飾生体材料スキャフォールドの調製
ポリ(L-乳酸)（PLLA）（MW 67,400、Sigma Aldrich）およびポリカプロラクトン（PCL、MW 2,000、Polysciences）を使用して、電界紡糸マイクロファイバー状生体材料スキャフォールドを製作した。ポリマーブレンド（例えば、19％ PLLAおよび5％ PCL；w/v）を、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール（HFIP、Aladdin）中に完全に溶解した。約200μmの厚さを有するマイクロファイバー状膜を、ポリマー繊維を回転ドラムコレクター上へ電界紡糸することによって調製した。高電圧発生器（Gamma High Voltage）を用いることによって、4.5 kVの負電圧を心棒に印加し、4 kVの正電圧を紡糸突起に印加した。
【００９６】
LXW7を、3工程を通してPLLA/PCL膜表面上にグラフトした。膜を、0.01N水酸化ナトリウム中で10分間インキュベートして、表面上のカルボキシル基を曝露した。次いで、膜を、0.5 Mモルホリノエタンスルホン酸（MES）緩衝液（pH 5.5、Thermo Fisher Scientific）中の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC）およびN-ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ-NHS）（Thermo Fisher Scientific）の溶液において30分間、さらにインキュベートした。DPBSで短時間洗浄した後、膜を、DPBS中のH2N-PEG-アルキン（MP 5000、Polysciences, Inc.）の溶液において2時間、振盪機上でインキュベートした。最後に、LXW7-bioと類似したアプローチを介して合成されたがリジンの側鎖に付着した5-アジドペンタン酸を有する、アジド誘導体化LXW7（LXW7-N3）（図2）を、水系において6日間、5μM CuSO4・5H2O、50 μM アスコルビン酸ナトリウム、Cu粉末、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（すべてSigma由来）の存在下で、クリックケミストリーを介してアルキン装飾膜にコンジュゲートした（Nandivada et al. (2006) Angewandte Chemie 45:3360）。
【００９７】
膜の構造を、走査型電子顕微鏡（SEM、Hitachi TM-1000）で特徴決定した。無処理の膜、PEGのみで修飾された膜、およびPEG-LXW7で修飾された膜の減衰全反射スペクトルを、減衰全反射-フーリエ変換赤外（ATR-FTIR）分光計（PerkinElmer）を用いて取得した。
【００９８】
実施例8．LXW7で修飾された生体材料スキャフォールドで支持されたECの付着および伸展
LXW7修飾された電界紡糸マイクロファイバー状膜および無処理の対照膜を、35mm組織培養ディッシュに置いた。膜を、DPBSでリンスして、5×104細胞／cm2の密度の、EGM-2培地中のHCAECとインキュベートした。2時間のインキュベーション後に、培地を吸引して、付着していない細胞を、DPBSで3回洗い流した。接着した細胞を、10％ホルマリン中で固定し、抗PECAM-1抗体（1:100；Abcam）で免疫染色して、Olympus IX81顕微鏡を用いてイメージングした。細胞試料のいくつかを、EGM-2培地中で2日間さらに培養して、マイクロファイバー状スキャフォールド表面上の細胞形態および伸展を、SEMで特徴決定した。細胞で覆われた領域を、Image Jソフトウェアを用いて定量した。
【００９９】
実施例9．統計解析
2つの試料の比較のためには、スチューデントのt検定を使用した。複数の試料の比較のためには、異なる処理を伴う群の間に有意な差が存在したか否かを検出するために分散分析（ANOVA）を行い、チューキーの多重比較検定を、事後解析のために使用した。0.05またはそれ未満のp値が、比較する試料の間の有意な差を示すことになる。
【０１００】
実施例10．オンビーズ全細胞結合アッセイを用いた、EPC/ECとのインテグリンターゲティングペプチドリガンドの結合親和性の測定
3種類のインテグリンターゲティングリガンド‐LXY30（α3β1）、LLP2A（α4β1）、およびLXW7（αvβ3）‐を、EPCおよびECに対するそれらの結合活性について試験した。2時間のインキュベーション後に、結果は、LXY30が、HCAECのみに結合した（図3、d）が、HECFCまたはTHP-1単球には結合しなかった（図3、aおよびg）ことを示した。LLP2Aは、HECFCおよびTHP-1単球の両方に結合した（図3、bおよびh）が、HCAECには結合しなかった（図3、e）。LXW7は、HECFCおよびHCAECの両方に結合した（図3、cおよびf）が、THP-1単球には結合しなかった（図3、i）。各ビーズ上に結合した細胞の数の定量により、異なるタイプのリガンドで修飾された各ビーズ上に結合した異なるタイプの細胞の間に、有意な差があったことが示された（図4）。LXY30は、ECのみに結合し、EPCには結合しなかった。LLP2Aは、EPCのみに結合し、ECには結合しなかった。LXW7は、EPCおよびECの両方に十分に結合した。これらの結果に基づいて、本発明者らは、LXW7を最適候補リガンドとして選択し、以下の実験においてLXW7をさらに特徴決定した。
【０１０１】
実施例11．細胞接着に対するLXW7濃度の効果
EPC接着に対する様々なLXW7濃度の修飾の効果を最適化するために、1×105個の細胞を、PLCLおよび様々な濃度のLXW7によって修飾された表面上に播種した。蛍光画像により、PLCL表面には細胞付着がほぼ無かった（図5、A）が、細胞はLXW7-PLCL表面上に接着し、50nMが最良の付着表面であった（図5、B〜D；図6、図7）ことが示された。
【０１０２】
実施例12．EPC/ECに対するLXW7の結合特異性の試験
EPC/ECに対して高い結合特異性を有するリガンドは、迅速な細胞付着を支持するだけではなく、他の「オフターゲットの」細胞、血小板、およびタンパク質の付着に潜在的に抵抗する。EPC/ECに対するLXW7の結合特異性を確認するために、LXW7を提示する樹脂ビーズを、様々な供給源由来のEPC/EC（HECFC、HCAEC、およびHMVEC）、THP-1単球、ならびに血小板とインキュベートした。インキュベーション後の様々な時点（10分、30分、または2時間）で、細胞-ビーズ結合親和性を測定するために、位相差画像を撮った。本発明者らは、LXW7が様々な供給源由来のEPC/ECの付着を効率的に支持したこと、および、LXW7ビーズに付着した細胞の数は経時的に増加したことを見出した（図8、a〜i）。著しく、LXW7は、THP-1単球（図8、j〜l）または血小板（図8、m〜o）の有効な付着を支持しなかった。各ビーズ上に結合した細胞および血小板の数の定量により、LXW7を提示するビーズ上に、THP-1単球および血小板と比較した際に有意により多い、様々な供給源由来のEPC/EC（HECFC、HCAEC、およびHMVEC）があったことが示された（図9）。これらの結果は、LXW7が、EPC/ECに対する強い結合特異性を保有することを実証する。
【０１０３】
実施例13．LXW7およびRGDの結合特異性および親和性の比較
従来のトリアミノ酸配列、アルギニン-グリシン-アスパルタート、または「RGD」は、細胞付着を改善するために生体材料分野において接着性ペプチドとして幅広く使用されてきている。しかし、従来のRGDは、数多くのタイプの細胞に結合し、EPC/ECに対する特異的な結合親和性を有さない（Barber et al. (2007) J Biomed Mat Res 80:306；Hynes (2002) Cell 110:673；Rammelt et al. (2006) Biomaterials 27:5561）。LXW7がEPC/ECに対してより高い特異性を保有するか否かを調査するために、LXW7のEC結合特異性および親和性を従来のGRGDペプチドのものと、フローサイトメトリーによって比較した。結果は、LXW7が、従来のGRGDペプチドよりも高い、様々なタイプのEPC/ECとの結合親和性を有したことを示した（図10、A〜C）。リガンドは両方とも、THP-1単球に結合しなかった（図10、D）。本発明者らの以前の結果と一貫して、LXW7は、非常に低い血小板との結合親和性を有していたが、GRGDは、血小板に対して強い結合を示した（図10、E）。リガンドが実際にインテグリンαvβ3を標的としていたか否かを確認するために、インテグリンαvβ3を高発現するαvβ3-K562細胞を使用して、GRGDおよびLXW7に対するそれらの結合親和性を試験した。本発明者らは、GRGDおよびLXW7は両方とも、αvβ3-K562細胞に十分に結合したが、LXW7がGRGDよりも高い結合親和性を有していたことを見出した（図10、F）。
【０１０４】
インテグリンαIIbβ3の発現は、血小板などの巨核球系統の細胞に制限されており、血小板凝集物のαIIbβ3媒介性形成が、循環において血栓症を引き起こすことが示されている（Bennett (2005) J Clinical Investigation 115:3363；Lefkovits et al. (1995) New England J Med 332:1553）。リガンドが、インビボで血栓症を引き起こし得る血小板に結合したか否かを調査するために、その表面上にαIIbβ3を高発現するように操作されたαIIbβ3-K562細胞を使用した。本発明者らは、LXW7は、αIIbβ3-K562細胞に対して非常に低い結合を示したが、GRGDは、非常に強い結合を示したことを見出した（図10、G）。
【０１０５】
これらの結果は、LXW7が、従来のRGDペプチドよりも、インテグリンαvβ3に対してより高い結合親和性を保有するが、インテグリンαIIbβ3に対してはより低い結合親和性を保有することを実証した。これは、LXW7が、より強い、かつより特異的なEPC/EC結合を支持するその能力に関して、従来のRGDペプチドよりも優れた潜在能力を有することを示す。
【０１０６】
フローサイトメトリー解析由来の結果を確認するために、生細胞培養アッセイを使用して、細胞-リガンド結合親和性を測定した。LXW7-bioまたはGRGD-bio（陰性対照としてのD-ビオチン）を用いて培養表面を処理し、培養表面上のHCAEC、THP-1単球、および血小板の選択的付着を調査した。HCAECは、10分以内にLXW7処理表面およびGRGD処理表面の両方に結合した（図11、dおよびg）が、対照表面には結合しなかった（図11、a）。付着した細胞の数を定量して、LXW7処理表面は、GRGD修飾表面よりも多くのHCAECを引きつけたことが示され（図12）、LXW7が、ECとの結合に関してGRGDよりも性能が優れていることがさらに確認された。追加的に、LXW7処理表面およびGRGD処理表面は両方とも、THP-1単球の付着を支持しなかった（図11、b、e、およびh、ならびに図12）。さらに、LXW7処理表面は、限定された血小板接着を示したが、GRGD処理表面は、有意により高い数の血小板が付着することを可能にした（図11、c、f、およびi、ならびに図12）。これによってさらに、LXW7が、従来のGRGDペプチドよりも、より強いEC付着を支持したが、有意により弱い血小板付着を支持したという本発明者らの以前の結果が確認された。
【０１０７】
実施例14．ECの生物学的機能を改善するLXW7の能力
EC増殖に対するLXW7の効果を、様々な時点でMTSアッセイによって試験した。結果は、D-ビオチン処理表面（対照）と比較した場合に、LXW7処理表面が、培養において48時間後に、EC増殖を有意に促進したこと、および、この傾向が、実験の期間全体にわたって維持されたことを示した（図13）。LXW7処理表面上で96時間培養したECを、ウェスタンブロット解析のために収集した。D-ビオチン処理表面（対照）と比較した場合に、LXW7処理表面は、ECにおいて、VEGFR2（Tyr1175）のリン酸化およびその下流シグナル伝達分子ERK1/2のリン酸化を有意に増大させた（図14）。また、VEGFR2およびEGFRのmRNAレベルの増加は、LXW7での処理時間に依存していることが見出された（図15）。いかなる特定の理論にも束縛されず、LXW7誘導性のEC増殖は、LXW7が、インテグリンαvβ3を活性化し、そのために、VEGFR2およびERK1/2のリン酸化を増強して、EC増殖を誘導したという事実に帰する可能性がある。
【０１０８】
実施例15．LXW7を用いた生体材料スキャフォールド表面の修飾
ECMは、細胞付着ならびに組織の成長および機能のために、三次元構造および天然のリガンドを提供する（Wang et al. (2009) Nat Rev 10:75）。ECM構造を模倣するために、電界紡糸技術を使用して、PLLAおよびPCLのポリマーブレンドを用いたマイクロファイバー状スキャフォールドを産出した。SEM画像は、電界紡糸スキャフォールドが、天然のECMに形態が類似した、マイクロファイバーの多孔性構造を有していたことを示した（図16）。これらのスキャフォールドは、通常ECM上に存在するインテグリンリガンドなどの生理活性モチーフが欠如している点で、ECMを上回る不利点を有し、したがって、機能的なリガンドでの人工ECMの修飾が、その生物学的機能を改善することができた。マイクロファイバー状スキャフォールドの生物学的機能を改善するために、本発明者らは、クリックケミストリーを介してLXW7によりポリマー表面に官能基を付与するプロトコールを開発した（図18）。LXW7は最初に、アジド基を用いて官能基を付与された（図17）。マイクロファイバー状膜は、H2N-PEG-アルキンを用いることにより、PEGを用いて官能基を付与された。H2N-PEG-アルキンを、EDCおよびスルホ-NHSを用いて、マイクロファイバー上のカルボキシル基に共有結合的に付着させた（図18）。次いで、クリックケミストリーによって、H2N-PEG-アルキン官能基を付与されたマイクロファイバーに、LXW-N3を付着させた（図18）。固体表面上のアミド結合を検出するための強力なツールであることが判明しているATR-FTIRスペクトル解析（Lin et al. (2001) Artificial Organs 25:617）を、本研究において使用して、スキャフォールド表面上のLXW7の固定化を確認した。無処理表面および修飾表面のATR-FTIRスペクトルを、図19に示す。PEG-LXW7で修飾された膜の典型的なスペクトルは、LXW7-N3の構造に多数分布していた、アミドI基に帰するピーク（1647 cm-1）の強度における明らかな上昇によって表された（図17）。PEGのみによって修飾された膜のスペクトルは、少数のアミドI基のみが、膜がPEGリンカーのみで修飾された後に形成されたため、無処理膜のスペクトルと比較した場合に、1630および1670 cm-1あたりの小さな進展のみを示した（図18）。1647 cm-1で、PEG-LXW7で修飾された膜のスペクトルとPEGのみで修飾された膜のスペクトルとの間には有意な差があり、大量のアミドI基が、LXW7が修飾された後に膜上に導入されたことが示された（図19）。これらのデータはすべて、LXW7が膜表面上に成功裡に固定化されていたことを確認した。
【０１０９】
実施例16．LXW7で修飾された生体材料スキャフォールド表面によって支持されたECの付着および伸展
HCAECを、LXW7を伴ってまたは伴わずに修飾されたPLLA/PCLマイクロファイバー状膜の上に播種して、EGM-2培地中で2時間培養した。洗浄した後、LXW7修飾膜（図20、b）および無処理膜（図20、a）上に付着したHCAECを固定し、CD31抗体で染色した。CD31陽性細胞の定量により、無処理膜と比較した場合に有意により多い、LXW7修飾膜に接着したHCAECがあったことが示された（図21）。2時間で膜表面上に接着したHCAECを、2日間、培養に保った。SEM解析により、ECは、無処理膜（図22、aおよびc）と比較して、LXW7修飾膜（図22、bおよびd）上でずっと良好に成長および伸展したことが示された。細胞で覆われた領域の定量により、無処理膜上のものと比較した場合に有意により大きい、細胞で覆われた領域が、LXW7修飾膜上にあったことが示された（図23）。これらの結果は、LXW7の機能が、化学修飾後に十分に維持されており、LXW7修飾生体材料が、ECの優秀な付着および伸展を支持したことを実証した。
【０１１０】
実施例17．血管グラフトのインビボ評価
内皮化を促進するLXW7の能力を試験するために、ポリマーベースの小さな直径の血管グラフト（ID 1mm）は、クリックケミストリーを介してLXW7を用いて官能基を付与され、ラット頸動脈バイパスモデルにおいて評価された。雄のSprague-Dawleyラット（重量、350〜400g）を、Charles River動物施設から購入した。ラットを、2.0％イソフルランで麻酔し、それらの深部体温を、加温パッドを用いて37.5℃で維持した。ラットの左総頸動脈を、自由に切開し、近位端および遠位端でクランプした。総頸動脈を切った後、グラフトを、10-0針を用いることによる端々吻合術で行い、注意深い脱気の後に循環を回復させた。6週間までの様々な時点で、ラットを安楽死させて、グラフトの開存性を確かめた。動物を次いで屠殺し、血管グラフトを外植した。グラフトの横断面の組織学的解析を使用して、開存性を確認した。
【０１１１】
組織学的検討のための試料を、最適切削温度（OCT）化合物において急速凍結し、クリオスタットを用いて10μmの厚さの切片にした。免疫組織化学染色を用いて、組織切片を、CD31（550300、マウス、BD Biosciences）およびCD34（AF4117、ラット、R&D）一次抗体で解析した。免疫組織化学画像を、Canon共焦点顕微鏡で捕捉した。
【０１１２】
グラフトを外植して、4％パラホルムアルデヒドで30分間固定した。マイクロ剪刀を用いることにより、各グラフトを、縦方向に4枚のスライスに切った。試料を、PBSで洗浄し、1％ウシ血清アルブミンでブロッキングして、EPCマーカーのCD34、ECマーカーのCD31に対する一次抗体とインキュベートし、次いで、Alexa-Fluor 488またはAlexa-Fluor 546標識二次抗体とインキュベートして、その後共焦点顕微鏡観察を行った。
【０１１３】
外植されたグラフトの上記の検討由来の結果を、図24、図25、および図26に示す。LXW7修飾グラフトは、対照グラフトよりも有意により高い開存率を有することが見出された。移植の6週間後に、6つのLXW7修飾グラフトのうちの5つが開存していたのに対し、6つの対照グラフトのうちの1つのみが開存していた（図24）。6週間で、LXW7修飾グラフトの全長を通して成熟ECが存在しており、他方、対照グラフトの中央セグメントにおいて、限定された数のECのみが特定された（図26）。これにより、合成血管グラフトの管腔表面上のLXW7コーティングは、「生きている」内皮を生成できることが確認される。
【０１１４】
前述の発明を、理解の明瞭さの目的で例証および実施例としていくらか詳細に説明してきたが、当業者は、ある特定の変更および修飾が、添付の特許請求の範囲内で実施されてもよいことがわかっているであろう。加えて、本明細書において提供される各参照文献は、あたかも各参照文献が個々に参照により組み入れられたのと同じ程度まで、その全体が参照により組み入れられる。本出願と本明細書において提供される参照文献との間に矛盾が存在する場合には、本出願が支配することになる。
【０１１５】
IX．例示的な態様
現在開示されている主題にしたがって提供される例示的な態様は、特許請求の範囲および以下の態様を含むが、それらに限定されない。
1.  ポリマーと、該ポリマーの表面上に共有結合的に固定化されており、スキャフォールドへの内皮細胞および／または内皮前駆細胞の付着を増大させ、かつ式I：
2019519256.tif 000006
の化合物である、ペプチドリガンドとを含む、スキャフォールドであって、
式中、X2、X6、およびX7は各々独立してアミノ酸であり、X2、X6、およびX7のうちの少なくとも1つはD-アミノ酸であり；R1は、H、C1-6アルキル、-C(O)R1a、およびL-Aからなる群より選択され；R1aは、C1-6アルキル、C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルキル-NH2、C1-6アルキル-C(O)N(H)-C1-6ヘテロアルキル、シクロアルキル、C1-6アルキル-シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、C1-6アルキル-ヘテロシクロアルキル、アリール、C1-6アルキル-アリール、ヘテロアリール、およびC1-6アルキル-ヘテロアリールからなる群より選択され、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、およびアリール基は、ハロゲン、-NO2、-OH、-CN、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロアルキル、およびC1-6ハロアルコキシからなる群より選択されるメンバーで置換されていてもよく；R2は、H、C1-6アルキル、およびL-Aからなる群より選択され；Lはリンカーであり；かつAは活性物質である、スキャフォールド。
2.  R1およびR2が各々独立して、H、C1-6アルキル、およびL-Aからなる群より選択され；Lがリンカーであり；Aが活性物質であり；X2が、Gly、Ala、Sar、およびβ-アラニン、ならびにそれらの立体異性体からなる群より選択され；X6が、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Asp、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Trp、Pro、Aad、Bec、Bmc、Bmp、Phe(4COOH)、Hyp、HoSer、Tha、Ahch、Actp、Akch、Tyr(diI)、Trp、Thz、2Thi、3Thi、Cit、HoCit、Aib、Nglu、およびFua、ならびにそれらの立体異性体からなる群より選択され；かつX7が、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Asp、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Trp、Pro、Bmp、HoSer、Nglu、HoCit、Bec、Aad、Hyp、Ahch、Phe(4COOH)、Akch、Aecc、Abu、Phe(3,4-diOMe)、Cpa、2-Thi、Thz、Phg、Phe(4-NO2)、Nle、(NMe)Phe、Aic、Chg、Bta、Bpa、Nal2、Nal1、Tic、Ppca、Cha、Bipa、Deg、Dpg、Acpc、Bmc、Cit、Sar、Tha、Pra、Actp、Aib、Agl、Acbc、Fua、Nva、Thi、Trp、Bug、Ach、(NMe)Val、Cpeg、(CαMe)Phe、Tyr(diI)、Phe(2-Cl)、Bua、HoPhe、HoLeu、Sta、Ing、Phe(4-CF3)、Oic、Dpa、Phe(4-t-Bu)、HoCha、およびPhe(3,4-diCl)、ならびにそれらの立体異性体からなる群より選択される、態様1に記載のスキャフォールド。
3.  前記ペプチドリガンドが、式Ia：
2019519256.tif 000007
の化合物であり、
式中、X6およびX7は各々独立してD-アミノ酸であり；R1は、H、C1-6アルキル、および-C(O)R1aからなる群より選択され；R1aは、C1-6アルキル、C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルキル-NH2、C1-6アルキル-C(O)N(H)-C1-6ヘテロアルキル、シクロアルキル、C1-6アルキル-シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、C1-6アルキル-ヘテロシクロアルキル、アリール、C1-6アルキル-アリール、ヘテロアリール、およびC1-6アルキル-ヘテロアリールからなる群より選択され、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、およびアリール基は、ハロゲン、-NO2、-OH、-CN、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、C1-6ハロアルキル、およびC1-6ハロアルコキシからなる群より選択されるメンバーで置換されていてもよく；かつR2は、HおよびC1-6アルキルからなる群より選択される、態様1に記載のスキャフォールド。
4.  R1およびR2が各々独立して、HおよびC1-6アルキルからなる群より選択される、態様3に記載のスキャフォールド。
5.  X6が、DSer、DAsp、DGlu、およびDCitからなる群より選択され；かつX7が、DPhe、DGlu、DSer、DBug、DBta、DVal、DAgl、DPra、D(NMe)Val、D(CαMe)Val、DAbu、DIng、DIle、DTha、DAsp、およびDNal1からなる群より選択される、態様3に記載のスキャフォールド。
6.  X6が、DAspおよびDSerからなる群より選択され；かつX7が、DGlu、DPhe、DSer、DVal、DBug、およびDBtaからなる群より選択される、態様3に記載のスキャフォールド。
7.  前記ペプチドリガンドが、cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDd-DBug-c、cGRGDd-DBta-c、cGRGDdvc、Ac-cGRGDdvc、(β-アラニン)-cGRGDdvc、(Ebes)-cGRGDdvc、cGRGDd-DAgl-c、cGRGDd-DPra-c、cGRGDd-DBug-c、cGRGDd-D(NMe)Val-c、cGRGDd-D(CαMe)Val-c、cGRGDd-DAbu-c、cGRGDd-DNal1-c、cGRGDd-DNal2-c、およびcGRGDd-DBta-cからなる群より選択される、態様3に記載のスキャフォールド。
8.  前記ペプチドリガンドが、cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDdvc、cGRGDd-DBug-c、およびcGRGDd-DBta-cからなる群より選択される、態様3に記載のスキャフォールド。
9.  前記ペプチドリガンドがcGRGDdvc（LXW7）である、態様3に記載のスキャフォールド。
10.  前記ペプチドリガンドが、前記細胞上のインテグリンαvβ3に結合する、態様1〜9のいずれかに記載のスキャフォールド。
11.  前記ポリマーが、ポリ(L-乳酸)（PLLA）、ポリカプロラクトン（PCL）、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）、ヒドロキシアパタイト（HA）、ラクチド-ε-カプロラクトン共重合体（PLCL）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、態様1〜10のいずれかに記載のスキャフォールド。
12.  前記ポリマーがコーティングをさらに含み、かつ前記ペプチドリガンドが該コーティングに共有結合的に付着している、態様1〜11のいずれかに記載のスキャフォールド。
13.  前記コーティングがパリレンポリマーである、態様12に記載のスキャフォールド。
14.  内皮細胞、内皮前駆細胞、および／または骨形成原細胞が、前記スキャフォールド上に播種されている、態様1〜13のいずれかに記載のスキャフォールド。
15.  態様1〜14のいずれかに記載のスキャフォールドを含む、操作された組織。
16.  コーティングポリマーと、該コーティングポリマーに共有結合的に付着している、態様1〜9のいずれかに記載のペプチドリガンドとを含む、コーティング。
17.  前記ペプチドリガンドがcGRGDdvc（LXW7）である、態様16に記載のコーティング。
18.  前記コーティングポリマーがパリレンポリマーである、態様16または17に記載のコーティング。
19.  態様1〜14のいずれかに記載のスキャフォールドを対象中に移植する工程を含む、該対象における組織再生のために内皮細胞および／または内皮前駆細胞の内皮化および血管新生を改善するための方法。
20.  前記ペプチドリガンドが、前記スキャフォールドへの内皮細胞および／または内皮前駆細胞の動員を増大させる、態様19に記載の方法。
21.  前記ペプチドリガンドが、前記スキャフォールド上での内皮細胞および／または内皮前駆細胞の増殖を増大させる、態様19または20に記載の方法。
22.  態様1〜13のいずれかに記載のスキャフォールドを対象中に移植する工程を含む、該対象における骨欠損を修復するための方法。
23.  内皮細胞および骨形成原細胞が、移植の前に前記スキャフォールド上に播種される、態様22に記載の方法。
24.  コーティングポリマーに官能基を付与する工程；該コーティングポリマーを表面に接着させる工程；およびペプチドリガンドを、該コーティングポリマーに共有結合的に付着させる工程であって、該ペプチドリガンドが、態様1〜9のいずれかに記載のペプチドリガンド、または官能基を付与されたその誘導体である、工程を含む、該表面をコーティングする方法。
25.  前記ペプチドリガンドが、cGRGDdvc（LXW7）、または官能基を付与されたその誘導体である、態様24に記載の方法。
26.  前記コーティングポリマーがパリレンポリマーである、態様24または25に記載の方法。
27.  前記コーティングポリマーの官能基付与が、該コーティングポリマーへのアルキン官能基の導入を含む、態様24〜26のいずれかに記載の方法。
28.  前記ペプチドリガンドが、アジド官能基を用いて官能基を付与されている、態様27に記載の方法。
29.  前記表面がスキャフォールドポリマーを含む、態様24〜28のいずれかに記載の方法。
30.  前記スキャフォールドポリマーが、ポリ(L-乳酸)（PLLA）、ポリカプロラクトン（PCL）、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）、ヒドロキシアパタイト（HA）、ラクチド-ε-カプロラクトン共重合体（PLCL）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、態様29に記載の方法。
31.  前記表面への前記コーティングポリマーの接着が化学蒸着（CVD）を含む、態様24〜30のいずれかに記載の方法。
32.  前記表面への前記コーティングポリマーの接着の前に、該表面を活性化する工程をさらに含む、態様24〜31のいずれかに記載の方法。
33.  前記表面の活性化が、マイクロ波プラズマの適用を含む、態様32に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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