(57)【要約】  本発明は、熱エネルギーの結果として生じる放出を伴う赤外線放射での励起に敏感な金ナノ粒子がロードされた内皮細胞前駆の亜集団からの細胞に関し、複数のこれらの細胞を含む組成物に関し、そして、腫瘍塊中の組成物の選択的局在化のおかげで固形腫瘍の診断及び治療でのそれらの使用に関し、それは、適切なマーキング剤で細胞をマーキングすることによって診断目的でこうして容易に確認できるか、又は、標的とされて高度に有効な治療作用のための腫瘍塊の完全な焼灼までパルスレーザービームでの刺激によって処理できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のナノ粒子を含む細胞であって、
前記細胞が、内皮群体形成細胞であり、
前記ナノ粒子が、１００ｎｍよりも小さい直径及び近赤外での吸光度ピークを有する、コーティング剤によって安定化された金のコアを持つナノ粒子である、前記の細胞。
【請求項２】
前記コーティング剤が、キトサン及びそれらの誘導体、ポリビニルピロリドン、及びポリエチレングリコール及びそれらの誘導体から成る群から選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ナノ粒子の前記コーティング剤がキトサンである、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記ナノ粒子が、４〜５０ｎｍの間の範囲の直径を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
前記ナノ粒子の形態で約５０〜３００ｐｇの金を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
９９Ｔｃと１１１Ｉｎとの間から選択されるマーキング剤を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
前記マーキング剤が１１１Ｉｎである、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
複数の内皮群体形成細胞を含む組成物であって、前記細胞の少なくとも９０％が、請求項１〜７で定義されるものである、前記の組成物。
【請求項９】
診断薬及び／又は治療薬及び／又は造影剤を更に含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
１００ｎｍよりも小さい直径及び近赤外での吸光度ピークを有する、コーティング剤で安定化された金コアを持つナノ粒子の水溶液での、内皮群体形成細胞の単層のインキュベーションの工程を含む、請求項８〜９で定義される組成物の調製方法。
【請求項１１】
前記溶液中の前記ナノ粒子の濃度が、５０〜１５０μＭの間を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
固形腫瘍の及びそれらの可能な転移の診断及び／又は治療における診断薬及び／又は治療薬として使用するための、請求項８〜９で定義される組成物。
【請求項１３】
前記固形腫瘍が黒色腫である、請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
記述
発明の分野
本発明は、一般に、医薬分野に関し、より正確には、金ナノ粒子がロードされマーキング剤でマークされた前駆の内皮細胞の亜集団（subpopulation；下位個体群）に関し、そして、黒色腫の及びその可能な転移の及び他の固形腫瘍の診断及び治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術水準
腫瘍学において克服するべき最も重要な挑戦の１つは、現在、特定の腫瘍分子標的の確認である、なぜなら、ガン細胞の表現型は、正常な細胞のそれとしばしば同様であり（しばしば、存在する相違は、質的であるというよりむしろより量的である）、そして、異なるタイプの腫瘍の間で、大きく変動する変化が存在するからである。
【０００３】
細胞及び分子バイオテクノロジーの分野における最近の科学的な進歩は、特に腫瘍である、有効な治療が必ずしも存在するとは限らない様々な病気の治療のために、体細胞遺伝子治療及びナノメディシンなどの新しい進歩的な治療境界を開いてきた。悪性腫瘍の最も攻撃的な形態の１つは黒色腫であり、その発生率は、連続的に増加している：１年当り３−７％の発生率の増加と共に、１年当り約２％の死亡率の増加が近年観察された。
【０００４】
発生率の増加は、「薄い」形態の黒色腫（予後良好の厚さ＜１ｍｍ）の初期診断の増加と密接に関連しており、その一方で、死亡率の増加は、「厚い」形態（予後不良の厚さ＞１ｍｍ）の減少に欠けることに主に起因するように見える。初期に診断された黒色腫は、外科的切除で効率的に治療され得る一方で、進行期は、従来の治療では難治性であることが公知である。それ故に、腫瘍増殖の抑制及び黒色腫の腫瘍の進行の抑制を得るために「代替療法」を見つけて、こうして患者を最も適切な治療に導くことは必須である。
【０００５】
代替療法の中でもとりわけ、大きな展開があるのは、近赤外スペクトルを吸収しそして熱を発現しレーザービーム刺激に続くことが可能な、特に金ナノ粒子である金属ナノ粒子の治療薬としての使用に基づくいわゆる「ナノメディシン」である。これらの特性及びそれらは健全な組織に対して有毒ではないという事実のおかげで、これらのナノ粒子は、現在、腫瘍との戦いにおける最も興味のある用途の１つである。なぜなら、それらは、近赤外の光を照射した時に、多くのタイプのガンにおいて「熱アブレーション」を引き起こし得るからである。
【０００６】
しかし、腫瘍治療におけるそのようなナノ粒子の現実の使用では、それらが注入される被検者におけるそれらの生体内分布に主に関する、そして、それ故に熱アブレーションにかけるべき腫瘍塊内部でのそれらの漸増に関する、克服するべき多くの障害が依然として存在する。この点について、腫瘍脈管の浸透性の増加とリンパ腺腫瘍システムによる有効なドレイニッジの欠乏との両方に帰因して組織中に染み込んだ物質の局部的な蓄積に通じるいわゆる増強浸透性及び滞留（Enhanced Permeability and Retention）（ＥＰＲ）効果に起因して腫瘍塊中では金属ナノ粒子が受動的に蓄積するということが、科学的な団体において一般に承認されている。実際、ナノ粒子は、様々な健康な臓器及び組織中にも分布し、そして、ほんの低いパーセンテージの接種された「ありのままの」ナノ粒子が腫瘍中に位置できるということが、示されてきた（例えば、Maeda H. et al., “The EPR Effect of macromolecular drug delivery to solid tumors: Improvement of tumor absorption, lowering of systemic toxicity and distinct tumor imaging in vivo” Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65: 71-9を参照）。それらから、周囲の健全な組織に関してそのような組織におけるそれらの存在を豊かにするようにナノ粒子をいくつかの腫瘍組織に運ぶことができる分子でのナノ粒子機能化の様々な戦略が引き出される（Sun T. et al., “Engineered nanoparticles for drug delivery in cancer therapy”, Angew Chem Int. : 12320-64）。
【０００７】
しかし、現在まで、組織及び健康な臓器中への金属ナノ粒子の分布に起因する金属ナノ粒子のオフターゲット毒性の問題は、解決されてきたということはできない。なぜなら、内分泌腺、腸、膵臓及び腎臓糸球体などのいくつかの臓器においては、ナノ粒子は、有窓内皮の存在に起因してそのような健康な臓器中に分布し得ること、又は、小胞液胞細胞小器官（ＶＶＯ）の形成、又は、内皮トランスサイトーシスなどの複数のメカニズムを通して健全な組織及び臓器中でそのようなナノ粒子は、分布し得るという事実があるからである。骨髄、リンパ節、脾臓及び肝臓に存在する洞様毛細血管は、細胞の継目に存在する開口を通して、ナノ粒子を含む物質の通過をも可能にする。最終的に、生理的条件で及び様々な組織及び臓器において、マクロファージ系ＭＰＳ（単核食細胞系）によって果たされた重要な役割は、ナノ粒子を食細胞でき、こうして、これらの健全な組織及び臓器におけるそれらの蓄積を決定できる。
【０００８】
オフターゲット毒性に加えて、まだ克服されない他のもう１つの問題は、それらの診断及び／又は治療作用が一旦完了した時の金属ナノ粒子クリアランスである。ヒトにおけるナノ粒子の使用を可能にするために、長期の毒性を次々に発生させてそして放射線使用などの他の診断技術との干渉を引き起こし得る身体中の金属の蓄積の形成を避けるために妥当な期間で身体からそれらは完全に取り除かれることが必要である。
【０００９】
近年の科学的な団体において形成される大きな期待にもかかわらず、上で説明した全ての理由のために、金属ナノ粒子は、動物モデルでの使用から実際のヒトへの使用へ、診断薬及び／又は治療薬としてまだ転換されてきていない。他方では、黒色腫などのいくつかの腫瘍形態の発生率の増加を前提とすると、及び、腫瘍学分野における診断薬及び／又は治療薬としてナノ粒子によって示される否定できない興味をそそる特性を前提とすると、オフターゲット毒性のリスクだけでなくナノ粒子の不十分な又は遅い排出による身体中の蓄積に含むリスクをも低減することを可能にする、黒色腫及びそれらの転移などの標的腫瘍に金属ナノ粒子をデリバリーするための有効な戦略を見つける必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
さて、発明者は、有機体中に一旦注入されると黒色腫の腫瘍塊中に局在化してそして細胞中に取り込まれる近赤外での吸光度ピークを有する金ナノ粒子用の最適のキャリヤーである、頭文字ＥＣＦＣ（内皮群体形成細胞）として以下でも示される、内皮形成群体細胞と名付けられた前駆の内皮細胞の亜集団を驚くべきことに確認した。その上、肝臓及び腎臓などの主な臓器中でのナノ粒子がロードされたＥＣＦＣの永久性は、一時的であることがわかった。
【００１１】
本発明によるナノ粒子がロードされた細胞は、特に細胞の適切なマーキングのおかげで、有機体中のマーキング剤を検出するために適切な技術によって黒色腫腫瘍塊を確認し及び診断分析を実施することを可能にし；そして、同時に、腫瘍塊中に一旦局在化すると、それらは、「セラノスティックな」として全体として定義できるアプローチで、すなわち、二重の診断及び治療効果を有する、熱アブレーションによって腫瘍を焼灼することを可能にする。
【００１２】
それ故に、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の請求項１で定義される必須の特徴を有する１つ以上のナノ粒子を含む細胞である。
【００１３】
本発明の更なる主題は、添付の請求項８で定義される必須の特徴を有する複数の細胞を含む組成物；添付の請求項１０におけるようなそのような組成物の調製方法；及び、添付の請求項１２で定義される固形腫瘍の診断及び／又は治療用の診断薬及び／又は治療薬として使用される上記の前記組成物である。
【００１４】
本発明による細胞、組成物、診断薬及び／又は治療薬として使用される組成物の更なる重要な特徴は、添付の引用形式の請求項で定義され、以下の詳細な記述で例証される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図面の簡単な記述
【図１】図１は、実施例１で記述するように調製された金ナノ粒子の５つの異なる溶液で記録された５つのＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを同じグラフ中で重ねたものを示す。
【図２】図２は、実施例１で記述するようにまさに調製された金ナノ粒子の溶液と、調製から３週間後の同じ溶液とで記録された２つのＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを同じグラフ中で重ねたものを示す。
【図３】図３は、以下の実施例２で記述するような同じコロイド溶液の異なる条件下での照射に続く温度の増加を示す。
【図４】図４は、実施例２で記述するような、異なる条件下での照射後のコロイド溶液と、比較として非照射の同じ溶液との、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを同じグラフ中で重ねたものを示す。
【図５】図５は、以下の実施例４で記述するように得られた、異なる濃度で金ナノ粒子がロードされたＥＣＦＣ細胞の異なるサンプルの光学顕微鏡で取得した画像を示す。
【図６】図６は、３つの異なる濃度で、実施例４におけるような金ナノ粒子がロードされたＥＣＦＣ細胞中での金の取り込み量を、棒グラフの形態で示す。
【図７】図７は、以下の実施例５で記述する条件下で、近赤外（ＮＩＲ）での発光ピークを有するレーザー照射の照射前後での、金ナノ粒子がロードされた及びロードされないＥＣＦＣ細胞のサンプルの光学顕微鏡画像を示す。
【図８】図８は、以下の実施例５で記述する実験にいつも関して、照射の前後で対照に関して生存可能な細胞のパーセンテージを、棒グラフの形態で示す。
【図９】図９は、実施例５で記述するように、対照のＥＣＦＣのありのままの細胞上への、及び、金ナノ粒子がロードされた同じ細胞への照射後の赤外線カメラＦＬＩＲによって記録された画像を示す。
【図１０】図１０は、以下の実施例６に記述する条件下での照射後の、黒色腫細胞及び本発明による金ナノ粒子でロードされた及びロードされないＥＣＦＣ細胞での混合細胞の培養で達した表面温度のプロファイルを示す。
【図１１】図１１は、実施例６のＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ染色を使用する細胞生存度評価で記録された光学顕微鏡画像を示す。
【図１２】図１２は、以下の実施例６でいつも記述する細胞生存度評価から得られたデータによる、本発明のサンプル及びナノ粒子がロードされていない対照のＥＣＦＣ細胞の、生きている及び死んでいる細胞のパーセンテージを、棒グラフの形態で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の詳細な記述
内皮群体形成細胞（以下では、ＥＣＦＣ）の亜集団は、高い増殖可能性によって特徴付けられるとして公知であり、そして、それらは、インビトロでの継代後の二次及び三次群体の形成で１００を超えるインビトロでの複製に達し得るのであり、それらは、黒色腫などの固形腫瘍中で選択的に局在化する能力によって及びインビトロでの血管を形成する（脈管形成）能力によっても、特徴付けられる。しかし、出願人が気付いている限りでは、ナノ粒子用のキャリヤーとしてのこれらの細胞の使用は、現在まで、決して開示されなかった。それに対して、これとは反対に、ナノ粒子をヒト身体中の標的臓器に運ぶための特に間葉幹細胞である幹細胞の使用は、文献中に記述された。
【００１７】
発明者は、１００ｎｍよりも小さい直径及び近赤外での吸収ピークを有する、コーティング剤で安定化された金コアを有するナノ粒子がロードされたＥＣＦＣ細胞が、黒色腫などの固形腫瘍の腫瘍塊中でのこれらの後者用の及びそれらの局在化用の最適のキャリヤーであることを、予想外にも見出した。これとは反対に、コーティングされた金コアを持つ同じナノ粒子がロードされた間葉幹細胞は、ナノ粒子の取り込みに関してましてやなおさら効き目がないことがわかったのであり、これらの幹細胞は本発明の診断及び／又は治療の範囲の主題用に実際に使用することはできなかった。
【００１８】
発明者は、本発明のナノ粒子がロードされたＥＣＦＣ細胞が、ナノ粒子なしの同じＥＣＦＣ細胞に関して腫瘍塊によってとられるより大きな能力を有することをも予想外に見出した、というだけではない。理論に拘束されることを望まないが、ＥＣＦＣ細胞中に一旦取り込まれると、腫瘍塊中の細胞取込みにおける鍵の役割を有する或る受容体の、細胞それ自身の表面上の、発現の増加のナノ粒子の能力に、この挙動を結合する実験的な証拠を、発明者は集めた。より具体的には、Western Blottingの方法により、ナノ粒子がロードされていない「ありのままの」同じ細胞に関して本発明の金ナノ粒子がロードされた時、ＥＣＦＣ細胞の表面上へのＣＸＣＲ４受容体の発現の増加が、発明者によって示された。その上、ボイデン室での実験での証拠により、腫瘍塊中で典型的に生産された受容体ＣＸＣＲ４のリガンド、ＳＤＦ１の勾配に向ってのＥＣＦＣ細胞取込みの数約２５０％の増加で本発明の金ナノ粒子の如何なるロードが判明した。細胞の数のそのような増加が、腫瘍塊中に生産されたリガンドＳＤＦ１と細胞表面上の受容体ＣＸＣＲ４との間の相互作用を抑制できる抗体の使用によってブロックされるということが、最終的に観察された。
【００１９】
本発明の細胞のナノ粒子は、好ましくは４〜５０ｎｍを含む１００ｎｍよりも小さい寸法を典型的に有し、金から実質的に成り、そして、例えばキトサン及びそれらの誘導体、例えば、カルボキシメチルキトサン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール及びそれらの誘導体、例えば、チオール化ポリエチレングリコール単官能の又は二官能の（ＰＥＧ−ＳＨ）又はポリエチレングリコールオルトピリジルジスルフィド（ＰＥＧ−ＯＰＳＳ）の中から選択される安定化剤によってコーティングされる。キトサンが、本発明のナノ粒子に使用される好ましいコーティング剤である。それは、ナノ粒子のコロイド溶液を安定にする大きな能力を持つ、市場に出ている多くの誘導体の品種で入手可能な低コストで高度に生体適合性の有機高分子である。
【００２０】
本発明の細胞においてロードされるべきナノ粒子は、非常に簡易で迅速な公知手順によって調製でき、それに加えて再現可能であり、水溶液中のチオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）での処理によって、例えばテトラクロロ金酸（ＨＡｕＣｌ４）である金塩を還元して、その後にキトサンの安定化溶液を添加することを含む。こうしてコロイド溶液が得られ、いかなる界面活性剤の添加なしでさえ、１５週間まで完全に安定である。最終のコロイド溶液中の金の濃度は、試薬の出発量を変えることによって、容易に制御でき、そして、それは、典型的には約１．４ｍＭと同等であり、こうしてとにかく約３ｍＭまで到達する。その上、金とチオ硫酸ナトリウムとの間のモル比は、赤外線消光バンドを調整するように変えることができ、本発明によれば、そのようなモル比は、約１．８（例えば３ｍＭの金／１．７ｍＭのチオ硫酸ナトリウム）〜約３（例えば３ｍＭの金／１ｍＭのチオ硫酸ナトリウム）の間を含むことができる。
【００２１】
こうして生産されたコロイド溶液は、一般に、ナノ粒子の２つの集団の混合物から成り、１つは非球面タイプで１つは回転楕円タイプである。非球面ナノ粒子は、約８１０ｎｍのピークを持つ近赤外での消光スペクトルバンドの形成に実質的に寄与する一方で、回転楕円ナノ粒子は、それらの寸法がほぼ５ｎｍ程度である限りは、約５２０ｎｍのピークを持つバンドに寄与できる。何人かの著者は、以下のことを報告した：５ｎｍよりも大きな寸法を有する回転楕円ナノ粒子は、金コア及び金スルフィドの表面シェル（それらは以後、「金−硫化金ナノ粒子」、又は「ＧＧＳ−ＮＰｓ」と呼ぶ）から成ることができ、それ故に、この場合は、それらは近赤外における強い吸収をも示す。近赤外において活性ではない回転楕円ナノ粒子の無視できない塊の存在にもかかわらず、本発明のナノ粒子のコロイド溶液は、以下の実験例で示されるように、優れたサーモトランスダクティブパワーを原料にとにかく提供することを可能にする。とにかく、インビボで腫瘍塊中に局在化してＥＣＦＣ細胞中にロードされたナノ粒子によるレーザー放射の吸収によって引き起こされた熱的な損傷を最大にするために、上記の方法によって得られたナノ粒子の混合物は、近赤外における特定の特性の吸収を有するナノ粒子の豊かになったコロイド溶液を得るように、回転楕円ナノ粒子の集団を濾過して取り除くことによって処理することもできる。
【００２２】
本発明の特定の形態によれば、ＥＣＦＣ細胞は、ここで定義するようにナノ粒子がロードされ、ロードされた細胞がヒト身体中に一旦導入されると免疫系の応答に向かう安定化及びスクリーン機能を有する例えばチオール化分子（すなわち、末端基−ＳＨを有する）で（特にポリエチレングリコールチオール化（ＰＥＧ−ＳＨ）で）の機能化を更に含むが、それは、その目的が腫瘍細胞の選択的なマーキングである腫瘍標識付けなどの特定の生物学的な作用などの活性な機能をも有することができる。典型的に、マーキングを達成するために、ナノ粒子は、抗ＨＥＲ２、抗ＵＰＡＲ又は抗ＥＧＦＲ抗体として、腫瘍の細胞による過剰発現受容体用の特定のリガンドと生体共役する。他のもう１つの特定の生物学的な機能は、ｌ’光学追跡であり、そこでは、ナノ粒子は、その存在が組織の自己蛍光からの最小の干渉でインビボで検出できる近赤外において励起可能なラマン活性なレポーター分子と共役する。
【００２３】
本発明によるＥＣＦＣ細胞は、誘導結合プラズマ原子発光分析（ＩＣＰ−ＡＥＳ）によって定量化される細胞当りの金を例えば約５０〜約３００ｐｇを含む。金ナノ粒子がロードされたＥＣＦＣ細胞は、好ましくはindio111である例えばtecnezio99とindio111との間で選択されるマーキング剤を少なくとも更に含むことができる（例えばRodriguez M. et al. “Labelling of platelets with indium-111 oxine and technetium-99 hexamethylpropylene amine oxime: Suggested methods” Eur. J. Nucl. Med. 1999; 26:1614-1616を参照）。
【００２４】
上述の前記マーキング剤で（特にIn111で）マークされてナノ粒子がロードされた本発明のＥＣＦＣ細胞は、単陽電子放射型コンピューター断層撮影法（Single Positron Emission Computed Tomography）(SPECT)によって、腫瘍塊中に一旦蓄積すると、検出されることができる。それ故に、それらは、病気の展開及び治療の進歩的な効果に同時に続くことを可能にする、熱アブレーション治療による腫瘍塊の標的治療に加えて、主要な腫瘍及びそれらの可能な転移の局在化の強力な診断方法を表す。
【００２５】
本発明によるナノ粒子がロードされたＥＣＦＣ細胞は、ここに記述するようなナノ粒子のコロイド溶液を、好ましくは５０〜１５０μＭの間を含む濃度で、例えば約２４〜約４８時間の間を含む時間、インキュベートすることによって、得ることができ、当業者に公知の手順によって単離されたＥＣＦＣ細胞の単層を持つ。細胞内に取込まれなかったナノ粒子を取り除くために洗浄にかけて得られた細胞の原料は、ナノ粒子がロードされた細胞の少なくとも約９６％を好ましくは含む９０％よりも高いパーセンテージで、ナノ粒子がロードされたＥＣＦＣ細胞を含む。
【００２６】
本発明のＥＣＦＣ細胞は、血液循環において内皮細胞の放出を引き起こすことができる適切なサイトカインでの造血骨髄の刺激後に、腫瘍を持つ患者の血液から直接に有利に得ることもできる。このようにして、カスタマイズされた又は「標的治療」は、各々の単一の患者の細胞の成分の使用に基づいて達成することもできる。活性な増殖下では全ての細胞を総括的に攻撃する伝統的な抗細菌発育性の化学療法とは異なり、この治療アプローチは、腫瘍細胞を選択的に及び特定的に攻撃して、こうして毒性を低減してそして治療の有効性を増加することを可能にする。
【００２７】
当業者に公知の手順によって、そのように得られた細胞の組成物は、例えば更なる診断薬及び／又は治療薬及び／又は造影剤を含める目的で、更に変性することができる。これらの追加の薬剤なしでも、本発明によるナノ粒子がロードされた細胞の組成物は、腫瘍塊において局在化したナノ粒子の、パルスレーザービームでの刺激によって同じ腫瘍の治療用と同様に、特に黒色腫及びその可能な転移である固形腫瘍の診断用に有用である。
【００２８】
本発明の組成物は、初期の及び／又は転移性の黒色腫に苦しむ患者の血液循環中に注入された、適切なマーキング剤でマークされた、ＥＣＦＣ細胞中にロードされたナノ粒子の刺激による初期の及び転移性の黒色腫の熱アブレーションが後に続く局在化の診断を可能にする。本発明の組成物は、黒色腫に限定されずに、リガンドＳＤＦ１を放出する能力が判明した一般に固形腫瘍である広範囲のヒト腫瘍にも拡張するそのような有用性を有する。
【００２９】
本発明の非限定的な例証として、以下の実施例が提供される。
【００３０】
実施例
実施例１−金ナノ粒子の合成
室温（２５℃）で、０．５ｍｌのＮａ２Ｓ２Ｏ３の水溶液が、２．６の金／チオ硫酸塩モル比で、２．５ｍｌのＨＡｕＣｌ４の水溶液に、速やかに添加された。溶液は、ボルテックススターラー中で２０秒間維持され、その後、約１０分間の沈降におかれ、その間に、黄色から茶色に暗赤色に色の変化が観察された。３０分後に、その後に１０分の更なる間隔で、溶液のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを記録することによって、反応の終了が確認された。こうして得られた溶液には、その後、１％（ｖ／ｖ）の酢酸中の高分子量キトサン（〜１０６Ｄａ；脱アセチル化の程度７９％）の０．１％（ｗ／ｖ）溶液０．０９ｍｌが添加された。最終の金濃度は、１．４ｍＭであった。こうして得られたコロイド溶液は、その後、オートクレーブで処理する前に、遅い撹拌下に６−１２時間おかれた。
【００３１】
金／チオ硫酸塩モル比を変化させることによって、特に１．８；２；２．４；２．６；２．８；３の金／チオ硫酸塩比を使用することによって、上記の調製が繰り返された。
【００３２】
上記の合成の方法は、以下の実験から完全に再現可能なことがわかった。合成方法の再現性の重要なインジケーターとして、溶液のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度スペクトルの類似物が選ばれた。２．６と同等の金／チオ硫酸塩モル比で上記と同じ合成方法を５回繰り返すことによって、同じ環境条件下で調製された５つの溶液のＵＶ−Ｖｉｓ  ＵＶスペクトルを記録することによって、使用される方法の再現性のサインである、５つの生成物の吸光度スペクトルは基本的に重ねることが出来ることを確認するのが可能であった。図１は、５つの溶液で得られた吸収スペクトルを例証する。
【００３３】
実施例２−キトサン及び金ナノ粒子の溶液の特徴付け
実施例１で上記のように得られたコロイド溶液は、連続的な照射下での光熱安定性、サーモトランスダクティブパワー、及び、時間安定性を評価するために、検討された。
【００３４】
新しく調製された及び３週間熟成時間後の同じ溶液で記録されたＵＶ−Ｖｉｓ吸光度スペクトルを基準としてさえ、上記のように調製された溶液の時間安定性を確認することが可能であった。こうして、図２に示される基本的に重ねることが出来るスペクトルを得た。調製後１５週までコロイド溶液の熟成時間を延ばすことによって、同様な結果が得られた。
【００３５】
その上、レーザー照射の２つの異なるレベルの強度（すなわち、１Ｗ／ｃｍ２及び２Ｗ／ｃｍ２）で波長８０８ｎｍのレーザーの溶液への照射によって、及び、照射された溶液の温度の増加を測定することによって、実施例１の金ナノ粒子溶液のサーモトランスダクティブパワーが、確認された。図３では、２つの異なる強度の照射で２．６の金／チオ硫酸塩モル比を持つ金ナノ粒子のコロイド溶液で、及び、比較として２Ｗ／ｃｍ２の強度で照射されたナノ粒子を含有しない溶液で、時間とともに温度の変化が観察できる。データは、１０ｍｍと同等の厚さの溶液で、記録された。図３のグラフから観察できるように、低いレベルの照射強度（１Ｗ／ｃｍ２）でも、ナノ粒子を含有する溶液のみで、数分の照射後に、高熱値に達する（温度＞４５℃）。
【００３６】
０．３、１及び３Ｗ／ｃｍ２という３つの異なる値の強度で波長８０８ｎｍで発光するレーザーダイオードでキュベット中のコロイド（溶液の厚さ：２ｍｍ）を連続的に照射することによって、光熱安定性の光学密度ＯＤ＝０．７試験を有する同じコロイド溶液もまた、実施された。図４は、上記の条件下で照射された溶液、及び、比較として照射されない同じ溶液で記録されたＵＶ−Ｖｉｓ吸光度スペクトルを示す。図４では、スペクトルの形状の実質的な維持が観察でき、照射に続く本発明のコロイド溶液の高い光熱安定性を示す。
【００３７】
実施例３−間葉幹細胞（ＭＳＣ）の及びＥＣＦＣ細胞の遊離
イタリアの法律に従って、母親の書面で自由なフォームドコンセントの後に、＜１．３×１０９（the Careggi Umbilical Cords Bank in Florence, Italyによって設立された病院バンクでのコードの包含の適合性の閾値）の有核細胞の合計数で、臍帯血ユニット（以下ＵＢＣという）が、使用された。Margheri F. et al. Blood. 2011; 118: 3743-55に記述される手順に従って、ＥＣＦＣ細胞がＵＢＣから単離された。細胞は、選択マーカーの発現で特徴付けられた：フローサイトメトリーによって観測された特定の内皮マーカー（ＫＤＲ、ＣＤ１４４、ＣＤ１４１、ＣＤ１０５、ＶＷＦ、ＣＤ３１）の出現及びＣＤ４５の不存在、ＣＤ１３３、ＣＤ３４。
【００３８】
以下の実施例で比較として使用されたＭＳＣｓは、自由でよく説明してもらった書面の同意を提供した患者の造血髄（以後ＢＭ）の吸引から得られた。ＢＭサンプルからの有核細胞（ＴＮＣｓ）の合計フラクションは、ＳＥＰＡＸ  Ｓ−１００計器（Biosafe, Eysins, Switzerland）での自動化手順によって得られた。（Ｐで示される）継代Ｐ０及びＰ６では、細胞レートは、脂肪及び骨組織への分化能力の試験に使用され、そして、同時に、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ２９及びＣＤ４４などの表面抗原の発現を評価するために、細胞蛍光分析にかけた。２０％動物血清及びピルビン酸ナトリウムが添加された、適切な培地、ＤＭＥＭ低グルコースを使用することによって、機能ロス及び表現型の明らかなロスなしで、ＭＳＣｓは、インビトロで拡張できる。
【００３９】
実施例４−細胞への金ナノ粒子のローディング
実施例３で上記のように単離されたＥＣＦＣ細胞は、２４時間又は４８時間、異なる濃度で、実施例１で上記のように調製された、キトサンで安定化された金ナノ粒子のコロイド溶液で、及び、比較としてキトサンの添加前の金ナノ粒子で、単層の融合細胞をインキュベーションすることによって、金ナノ粒子がロードされた。実施例３で上述されＥＣＦＣｓ用に採用された同じ実験プロトコルを使用することによって単離されたＭＳＣｓでも、同じ実験が繰り返された。インキュベーション後、全ての細胞は、新鮮な培地で洗浄され、切り離され、そして、下で記述するように、それらの生物学的な及び機能的な特性が特徴付けられた。
【００４０】
細胞中へのナノ粒子の実際の取り込みは、電子透過顕微鏡でのＴＥＭ分析によってまず第一に確認された。それは、キトサンの存在が、ナノ粒子の細胞中への取込みの高い増加を如何に引き起こすか、及び、５０μＭの濃度を有するナノ粒子の溶液で如何にすでに金ナノ粒子のかなりの取り込みが存在するかを、強調した。
【００４１】
図５は、合成の最後にナノ粒子が再懸濁されたキャリヤー、すなわち、水で処理された細胞を対照として使用することによって、５０、１００及び１５０μＭの濃度のキトサンでの金ナノ粒子のコロイド溶液及びＥＣＦＣ細胞上のメイ・グリュンバルト染色で、光学顕微鏡によって取得された画像を例証する。これらの画像は、ＥＣＦＣ細胞が線量依存性力学でナノ粒子を如何に取り込むかを強調する。２４時間のインキュベーション後に実際に取り込まれた金の量は、その後、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって定量化された；図６には、こうして得られた値が、棒グラフの形態で示され、ＥＣＦＣ細胞の線量依存性富化を示し、ここで、５０、１００及び１５０μＭと同等の金濃度を含有するナノ粒子の溶液から出発して、細胞当りそれぞれ６０、１００及び２５０ｐｇの金が取り込まれている。
【００４２】
同等の濃度のナノ粒子溶液及びインキュベーション条件では、実施例３で上記のように単離されたＭＳＣ細胞は、ＥＣＦＣ細胞と比較してナノ粒子のより低い取込み（約７０％と同等）を示した。これは、幹細胞に関してでさえ、後者の予期しない優秀性を示すものである。
【００４３】
実施例５−金ナノ粒子がロードされた細胞の評価
様々な濃度の溶液から出発して実施例４で上記のように得られた金ナノ粒子がロードされた細胞は、ミトコンドリア酵素力を測定する３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾニウムブロマイド（又はＭＴＴ）の活性に基づく代謝評価、及び、トリパンブルー評価にかけた。こうして、ナノ粒子の取り込み後でさえ、細胞生存度が基本的に維持されたことが、見出された。これらの評価は、近赤外の光での照射（いわゆる組織透明度の窓に相当する、範囲７００−１１００ｎｍの波長）にもかけられ、埋め込まれたナノ粒子を持つ細胞に関しても、維持された同じ結果の細胞の生存度で、繰り返された。
【００４４】
ＥＣＦＣｓのインビトロでの毛細管形態形成は、ナノ粒子取込みの結果として変性されない、ということも、それらの侵襲的な能力は変化しないで残るということと同様に、確認された。
【００４５】
最終的に、金ナノ粒子がロードされたＥＣＦＣ細胞のサーモトランスダクティブ応答が、波長８０８ｎｍでの発光のピークを有するレーザー源でのインビトロでの照射によって、及び、ＦＬＩＲサーモカメラを持つＩＲサーモグラフィによるこうして発生した温度の増加のリアルタイムの測定によって、評価された。この検討は、対照としてナノ粒子なしのＥＣＦＣｓを使用することによって、１５０μＭの金濃度を有するナノ粒子の溶液で２４時間インキュベートされたＥＣＦＣ細胞で、実行された。この実験では、（円内エネルギー＝９７％に相当する）４ｍｍ直径照明スポットで媒介された出力密度は、３Ｗ／ｃｍ２〜５Ｗ／ｃｍ２で変え、一方で、暴露時間は５分で固定された。ナノ粒子がロードされた細胞では、温度は、細胞死を引き起こすには十分だった５０．６℃から６２℃までの範囲の生理的閾値の限界を超えて観察された。トリパンブルー（図８）と同様にメイ・グリュンバルト染色（図７）での形態素解析の結果であったように、近赤外の光での照射は、ナノ粒子を含有しない対照細胞の生存度を変えず、そして、照射はそれらの温度を増加させなかった（図９）。
【００４６】
実施例６−黒色腫細胞を持つ混合培養でのナノ粒子がロードされたＥＣＦＣ細胞の熱アブレーション効率の評価
金ナノ粒子がロードされたＥＣＦＣｓの「抗腫瘍」治療可能性を評価するために、ナノ粒子がロードされたＥＣＦＣとインビトロでの安定化ヒト黒色腫の細胞Ａ３７５とから成る細胞の懸濁液に、近赤外の光が照射された。懸濁液の腫瘍細胞の細胞死を評価するために、照射前Ａ３７５細胞は、細胞性膜を通して自由に拡散できる、親油性蛍光分子、カルボキシフルオレセイン  スクシンイミジル  エステル（以下のＣＦＳＥでは、カルボキシフルオレセイン  スクシンイミジル  エステル）でマークされた。生きている細胞によって一旦取り込まれると、細胞の機能性の損傷なしでは、ＣＦＳＥは、膜をもはやクロスすることはできず、そして、数週間は細胞の細胞質に残る。混合細胞の溶液が、ナノ粒子がロードされない及びロードされた５×１０４のＥＣＦＣ細胞及びＣＦＳＥでマークされた１×１０６のＡ３７５細胞を構成して調製された。上記の１５０μｌの細胞溶液が、適切なたまりに配置され、そして、その後、赤外線レーザービームでの照射に暴露された。いくつかの試験が、異なる時間の暴露及び異なる出力密度で実施され、そして、各々の実験的変化では、ナノ粒子の吸収に起因する温度の増加がトレースされ、そして、上記のようなサーモカメラＦＬＩＲでリアルタイムで記録された。図１０には、実験条件での混合細胞の培養によって達した表面温度のプロファイルが報告される。照射混合培養に存在する黒色腫細胞の細胞死は、その後、生存可能な細胞の存在にのみ言及できる蛍光を測定することによる細胞蛍光分析によって、及び、形態素解析（メイ・グリュンバルト染色）（図１１）によって、評価された。ナノ粒子がロードされたＥＣＦＣ細胞の存在下では、蛍光のほとんど完全なロスが観察された。そして、これは、腫瘍細胞の約９３％が殺されたことを示す。これとは反対に、ナノ粒子がロードされないＥＣＦＣ細胞を含有するする共培養の照射に続いて、Ａ３７５細胞の生存度は７５％を超える。得られたデータは、図１２において棒グラフの形態で例証される。
【００４７】
実施例７−ナノ粒子がロードされた細胞のマーキング
ナノ粒子がロードされたＥＣＦＣ細胞は、Gholamrezanezhad A., et al. “In vivo tracking of 111In-oxine labeled mesenchymal stem cells following infusion in patients with advanced cirrhosis” Nucl Med.Biol 2011;38: 961-967に記述する手順をフォローして、マーク（マーキング）された。簡単に言えば、ＥＣＦＣ細胞は、室温で３０分間、１００μＣｉの１１１Ｉｎ  ８−オキシキノリン／１０６細胞を含有する培地中に、再懸濁された。それらは、その後、動物への注入による以下に記述の実験で使用される前に、洗浄されて遠心分離された。
【００４８】
実施例８−転移性黒色腫の動物モデルの設計
実験動物のケア及び維持のためのイタリアのガイドライン及び法定の命令に従って、及び、イタリア労働省の動物福祉事務所の倫理委員会によって承認された国のガイドラインに従って、動物を含む全ての以下の手順が実施された。インビトロでの安定化ヒト黒色腫の以下のラインが使用され、the American Type Culture Collection (ATCC)によって購入された：Ａ３７５（悪性ヒト黒色腫の皮膚生検から）及び転移性肺結節から実験的に得られた細胞を培養することによる親ラインＡ３７５から由来するＡ３７５−Ｍ６。細胞は、５％のＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃で、１０％の胎児の子牛血清（ＦＣＳ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ変性Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ  ４５００、Ｇｉｂｃｏ）中で培養された。インビボの実験が、生後６〜８週間のマウスＳＣＩＤ  ｂｇ／ｂｇ（ナチュラルキラーリンパ球ｂｇ／ｂｇの発現の追加の突然変異を持つ、重症複合型免疫不全症）で実施された。そして、実施例３で上記のように得られたＭＳＣｓと一緒に共同注入して又は単独で、１．５又は２×１０６の生存可能なＡ３７５又はＡ３７５  Ｍ６を皮下注入することによって、固形腫瘍が得られた。腫瘍の直径を測定することによって、腫瘍発達が通常の間隔で監視された（各々の実験点で１０マウスのグループ、各々の実験で合計６０動物）。腫瘍を持つマウスは、移植後２５日で犠牲にされ、組織学的分析のために腫瘍が除去されて処理された。腫瘍内の脈管形成が、抗ＣＤ３１抗体を持つ免疫組織化学的染色による微小血管密度を基準として決定され、そして、管／顕微鏡視野の数として表現された。
【００４９】
転移性腫瘍のこのモデルによるマウスにおいて、それらの腫瘍が直径０．５ｃｍに達した時、実施例７で上記のように得られた１１１Ｉｎでマークされてナノ粒子がロードされた細胞が約１×１０６、動物の尾静脈に注入された。１１１Ｉｎでのマーキングは、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）による注入された細胞の局在化をフォローすることを可能にした。こうして、注入から１８時間後、ナノ粒子がロードされてマークされた細胞は、黒色腫中に局在化したことが観察された。ここでは、それらは、注入後２５日で依然として存在した。ＰＥＴによって示された局在化を基準として、黒色腫は、腫瘍塊の完全な焼灼まで、パルスレーザービームでの刺激にかけた。レーザー針電極及び光ファイバーの両方によって達した、転移の熱アブレーションで、同じ手順が使用された。これらの動物では、ＰＥＴによっていつも、ナノ粒子がロードされてマークされた細胞は、腎臓中に濃縮され、腎臓中での出現後３時間以内で消滅し、腎臓から比較的迅速な排出を示す、ということが、更に観察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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