(57)【要約】ブリンシドフォビルを含む製剤を開示する。本製剤は静脈内投与用製剤であることができる。本製剤は、対象がブリンシドフォビルの経口投与に応答して胃腸問題を経験する場合に使用することができる。本製剤は、基礎疾患または不十分な経口吸収に対する懸念ゆえに薬物を経口投与できない場合にも使用することができる。2019519570.tif 000148
2019519570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブリンシドフォビル、
増量剤、
緩衝剤、および
水
を含み、pHが約8.0である、薬学的組成物。
【請求項２】
前記増量剤が、マンニトールまたはスクロースである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記増量剤が、マンニトールである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記緩衝剤が、リン酸ナトリウム、L-アルギニン、またはトロメタミンである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記緩衝剤が、L-アルギニンである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記ブリンシドフォビルが、約10.0mg/mLの濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記増量剤が、約2.5〜9％（w/v）の濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記増量剤が、約2.5％（w/v）の濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記増量剤が、約5％（w/v）の濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記緩衝剤が、約100〜200mMの濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記緩衝剤が、約100mMの濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記pHが、HClおよび/またはNaOHを用いて調節される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
約10.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、
約25〜50mg/mLの濃度のマンニトール、
約17.4mg/mLの濃度のL-アルギニン、および
水
を含み、pHが約8.0である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
約17.8mMの濃度のブリンシドフォビル、
約137.5〜275mMの濃度のマンニトール、
約100mMの濃度のL-アルギニン、および
水
を含み、pHが約8.0である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
水を除去するために凍結乾燥される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
約13〜19重量％のブリンシドフォビル、
約48〜65重量％のマンニトール、および
約22〜33重量％のアルギニン
を含む、凍結乾燥粉末。
【請求項１７】
pHが約8.0である、請求項16記載の凍結乾燥粉末。
【請求項１８】
ブリンシドフォビル、
増量剤、
緩衝剤、および
水性糖アルコール溶液、水性糖溶液、リンゲル液、または塩化ナトリウム溶液
を含む、水性薬学的組成物。
【請求項１９】
前記水性糖溶液が、約5重量％のデキストロースを含む溶液である、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記塩化ナトリウム溶液が、0.9重量％の塩化ナトリウムである、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、
約2.5〜5mg/mLの濃度のマンニトール
約1.74mg/mLの濃度のL-アルギニン、および
約50mg/mLの濃度のデキストロース
を含み、pHが約8.0である、請求項18記載の水性薬学的組成物。
【請求項２２】
約1.78mMの濃度のブリンシドフォビル、
約13.75〜27.5mMの濃度のマンニトール、
約10mMの濃度のL-アルギニン、および
約287mMの濃度のデキストロース
を含み、pHが約8.0である、請求項18記載の水性薬学的組成物。
【請求項２３】
約0.5mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、
約1.25〜2.5mg/mLの濃度のマンニトール
約0.87mg/mLの濃度のL-アルギニン、および
約50mg/mLの濃度のデキストロース
を含み、pHが約8.0である、請求項18記載の水性薬学的組成物。
【請求項２４】
約0.89mMの濃度のブリンシドフォビル、
約6.85〜13.7mMの濃度のマンニトール、
約5mMの濃度のL-アルギニン、および
約287mMの濃度のデキストロース
を含み、pHが約8.0である、請求項18記載の水性薬学的組成物。
【請求項２５】
前記水性糖アルコール溶液、水性糖溶液、リンゲル液、または水性塩化ナトリウム溶液の体積が、約100mLまたは約200mLである、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
約100mgのブリンシドフォビル、
約250〜500mgのマンニトール、
約174mgのアルギニン、
約5gのデキストロース、および
約100mLの水
を含み、pHが約8.0である、請求項18記載の水性薬学的組成物。
【請求項２７】
約200mgのブリンシドフォビル、
約500〜1000mgのマンニトール、
約348mgのアルギニン、
約10gのデキストロース、および
約200mLの水
を含み、pHが約8.0である、請求項18記載の水性薬学的組成物。
【請求項２８】
約50mgのブリンシドフォビル、
約125〜250mgのマンニトール、
約87mgのアルギニン、
約5gのデキストロース、および
約100mLの水
を含み、pHが約8.0である、請求項18記載の水性薬学的組成物。
【請求項２９】
約100mgのブリンシドフォビル、
約250〜500mgのマンニトール、
約174mgのアルギニン、
約10gのデキストロース、および
約200mLの水
を含み、pHが約8.0である、請求項18記載の水性薬学的組成物。
【請求項３０】
前記ブリンシドフォビル、前記増量剤、および前記緩衝剤が、予め凍結乾燥されている、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
静脈内投与に適している、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
無菌である、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
約0.5mg/mL〜約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約2.5mg/mL〜約5mg/mLの濃度の増量剤、約0.87mg/mL〜約1.74mg/mLの濃度の緩衝剤、および約50mg/mLの濃度のデキストロースを含み、pHが約8.0である、静脈内投与用の水性薬学的組成物。
【請求項３４】
ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量の請求項18または33記載の水性薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３５】
前記ウイルス感染が、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはそれらの組合せから選択される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
前記対象への投与が溶血をもたらさない、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
前記対象への投与が胃腸毒性をもたらさない、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、約0.5mg/mL〜約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約2.5mg/mL〜約5mg/mLの濃度の増量剤、約0.87mg/mL〜約1.74mg/mLの濃度の緩衝剤、および約50mg/mLの濃度のデキストロースを含み、pHが約8.0である静脈内投与用薬学的組成物を、該対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３９】
ある量のブリンシドフォビル、増量剤、および緩衝剤を水に溶解することで第1溶液を形成させる工程、
該第1溶液を凍結乾燥することで凍結乾燥粉末を形成させる工程、ならびに
該凍結乾燥粉末を水性糖アルコール溶液、水性糖溶液、リンゲル液、または塩化ナトリウム溶液に溶解することで薬学的製剤を形成させる工程
を含むプロセスによって調製される、ウイルス感染を処置するための水性薬学的製剤。
【請求項４０】
ウイルス感染を処置するための医薬の製造における、ブリンシドフォビル、増量剤、緩衝剤、および水性糖アルコール溶液または水性糖溶液を含む水性薬学的組成物の使用。
【請求項４１】
ウイルス感染の処置における、ブリンシドフォビル、増量剤、緩衝剤、および水性糖アルコール溶液または水性糖溶液を含む水性薬学的組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、以下の米国仮特許出願に基づく優先権およびその恩典を主張し、各米国仮特許出願の内容は、参照により、そのまま本明細書に組み入れられる: 2016年6月28日に出願された米国仮特許出願第62/355,844号、2016年9月14日に出願された米国仮特許出願第62/394,665号、2017年1月13日に出願された米国仮特許出願第62/446,213号、2017年2月28日に出願された米国仮特許出願第62/465,053号、2017年5月17日に出願された米国仮特許出願第62/507,397号および2017年5月31日に出願された米国仮特許出願第62/512,825号。
【０００２】
分野
本開示は、ブリンシドフォビルを含む薬学的組成物（例えば凍結乾燥組成物および/または水性組成物）ならびにそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ブリンシドフォビル（BCV、CMX001）は、活性な抗ウイルス薬シドフォビル二リン酸（CDV-PP）に細胞内で変換される、経口投与可能な（orally bioavailable）脂質非環状ヌクレオシドホスホネートである。ブリンシドフォビルは二本鎖DNAウイルスに対して広域スペクトルの抗ウイルス活性を有する。ブリンシドフォビルの構造を以下に示す。
2019519570.tif 000003
【発明の概要】
【０００４】
概要
本開示はブリンシドフォビルを含む組成物およびそれらを使用する方法を提示する。本組成物は長期保管用に（例えば粉末として）凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は（例えばそれを必要とする対象への）静脈内（IV）投与のための生体適合性製剤として（例えば水性糖溶液に）再構成することができる。
【０００５】
一局面において、本開示は、ブリンシドフォビル、増量剤、緩衝剤、および水を含む薬学的組成物であって、該組成物のpHが約8.0である、薬学的組成物を提供する。
【０００６】
いくつかの態様において、増量剤はマンニトールまたはスクロースである。いくつかの態様において、増量剤はマンニトールである。いくつかの態様において、緩衝剤は、リン酸ナトリウム、L-アルギニン、またはトロメタミンである。いくつかの態様において、緩衝剤はL-アルギニンである。いくつかの態様において、ブリンシドフォビルは約10.0mg/mLの濃度で存在する。いくつかの態様において、増量剤は約2.5〜9％（w/v）の濃度で存在する。いくつかの態様において、増量剤は約2.5％（w/v）の濃度で存在する。いくつかの態様において、増量剤は約5％（w/v）の濃度で存在する。いくつかの態様において、緩衝剤は約100〜200mMの濃度で存在する。いくつかの態様において、緩衝剤は約100mMの濃度で存在する。いくつかの態様において、pHはHClおよび/またはNaOHを用いて調節される。
【０００７】
いくつかの態様において、薬学的組成物は、約10.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約25〜50mg/mLの濃度のマンニトール、約17.4mg/mLの濃度のL-アルギニン、および水を含み、組成物のpHは約8.0である。
【０００８】
いくつかの態様において、薬学的組成物は、約17.8mMの濃度のブリンシドフォビル、約137.5〜275mMの濃度のマンニトール、約100mMの濃度のL-アルギニン、および水を含み、組成物のpHは約8.0である。
【０００９】
いくつかの態様において、液状の薬学的組成物は、例えば水を除去するために、凍結乾燥されて、凍結乾燥粉末を形成する。
【００１０】
別の一局面において、本開示は、約13〜23重量％のブリンシドフォビル、約48重量％〜65重量％のマンニトール、および約22〜40重量％のアルギニンを含む凍結乾燥粉末を提供する。
【００１１】
別の一局面において、本開示は、約13〜19重量％のブリンシドフォビル、約48重量％〜65重量％のマンニトール、および約22〜33重量％のアルギニンを含む凍結乾燥粉末を提供する。
【００１２】
いくつかの態様において、凍結乾燥粉末は、約19重量％のブリンシドフォビル、約48重量％のマンニトール、および約33重量％のアルギニンを含有する。いくつかの態様において、凍結乾燥粉末は、約13重量％のブリンシドフォビル、約65重量％のマンニトール、および約22重量％のアルギニンを含有する。
【００１３】
いくつかの態様において、凍結乾燥粉末のpHは約8.0である。
【００１４】
別の一局面において、本開示は、ブリンシドフォビル、増量剤、緩衝剤、および糖アルコール溶液、水性糖溶液、リンゲル液、または水性塩（例えば塩化ナトリウム）溶液を含む水性薬学的組成物を提供する。
【００１５】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、ブリンシドフォビル、マンニトール、L-アルギニン、およびデキストロースを含む。
【００１６】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、ブリンシドフォビル、マンニトール、L-アルギニン、およびデキストロースを含み、組成物のpHは約8.0である。
【００１７】
いくつかの態様において、水性糖溶液は、約5重量％のデキストロースを含む溶液である。いくつかの態様において、水性塩溶液は水性塩化ナトリウム溶液である。いくつかの態様において、塩化ナトリウム溶液の濃度は0.9重量％である。いくつかの態様において、水性薬学的組成物は追加の水をさらに含む。
【００１８】
いくつかの態様では、追加の水が（例えば、製剤の張性、濃度、またはpHを調節するために）加えられる。
【００１９】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約2.5〜5mg/mLの濃度のマンニトール、および約1.74mg/mLの濃度のL-アルギニン、および約50mg/mLの濃度のデキストロースを含む。いくつかの態様において、組成物のpHは、約8.0、約7.5、約7.0、約6.5、約6.0、または約6.0未満である。
【００２０】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約1.78mMの濃度のブリンシドフォビル、約13.75〜27.5mMの濃度のマンニトール、約10mMの濃度のL-アルギニン、および約287mMの濃度のデキストロースを含む。いくつかの態様において、組成物のpHは、約8.0、約7.5、約7.0、約6.5、約6.0、または約6.0未満である。
【００２１】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約0.5mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約1.25〜2.5mg/mLの濃度のマンニトール、および約0.87mg/mLの濃度のL-アルギニン、および約50mg/mLの濃度のデキストロースを含む。いくつかの態様において、組成物のpHは、約8.0、約7.5、約7.0、約6.5、約6.0、または約6.0未満である。
【００２２】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約0.89mMの濃度のブリンシドフォビル、約6.85〜13.7mMの濃度のマンニトール、約5mMの濃度のL-アルギニン、および約287mMの濃度のデキストロースを含む。いくつかの態様において、組成物のpHは、約8.0、約7.5、約7.0、約6.5、約6.0、または約6.0未満である。
【００２３】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約2.5〜5mg/mLの濃度のマンニトール、および約1.74mg/mLの濃度のL-アルギニン、および約50mg/mLの濃度のデキストロースを含み、組成物のpHは約8.0である。
【００２４】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約1.78mMの濃度のブリンシドフォビル、約13.75〜27.5mMの濃度のマンニトール、約10mMの濃度のL-アルギニン、および約287mMの濃度のデキストロースを含み、組成物のpHは約8.0である。
【００２５】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約0.5mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約1.25〜2.5mg/mLの濃度のマンニトール、および約0.87mg/mLの濃度のL-アルギニン、および約50mg/mLの濃度のデキストロースを含み、組成物のpHは約8.0である。
【００２６】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約0.89mMの濃度のブリンシドフォビル、約6.85〜13.7mMの濃度のマンニトール、約5mMの濃度のL-アルギニン、および約287mMの濃度のデキストロースを含み、組成物のpHは約8.0である。
【００２７】
いくつかの態様において、ブリンシドフォビルの凍結乾燥製剤を溶解するために使用される水性糖溶液、水性糖アルコール溶液、リンゲル液または水性塩溶液の体積は、約100mLまたは約200mLである。言い換えると、いくつかの態様において、ブリンシドフォビルを含む凍結乾燥粉末は、約100mLまたは約200mLの水性糖溶液、水性糖アルコール溶液、リンゲル液、水性塩溶液、または水に溶解される。いくつかの態様において、凍結乾燥粉末は、約100mL、約110mL、約120mL、約130mL、約140mL、約150mL、約160mL、約170mL、約180mL、約190mL、または約200mLに溶解される。例えばいくつかの態様において、本開示の凍結乾燥粉末は約100mLの5％デキストロース水溶液に溶解することができる。いくつかの態様において、本開示の凍結乾燥粉末は約200mLの5％デキストロース水溶液に溶解することができる。
【００２８】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約100mgのブリンシドフォビル、約250〜500mgのマンニトール、約174mgのアルギニン、約5gのデキストロース、および約100mLの水を含む。いくつかの態様において、組成物のpHは、約8.0、約7.5、約7.0、約6.5、約6.0、または約6.0未満である。
【００２９】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約200mgのブリンシドフォビル、約500〜1000mgのマンニトール、約348mgのアルギニン、約10gのデキストロース、および約200mLの水を含む。いくつかの態様において、組成物のpHは、約8.0、約7.5、約7.0、約6.5、約6.0、または約6.0未満である。
【００３０】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約50mgのブリンシドフォビル、約125〜250mgのマンニトール、約87mgのアルギニン、約5gのデキストロース、および約100mLの水を含む。いくつかの態様において、組成物のpHは、約8.0、約7.5、約7.0、約6.5、約6.0、または約6.0未満である。
【００３１】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約100mgのブリンシドフォビル、約250〜500mgのマンニトール、約174mgのアルギニン、約10gのデキストロース、および約200mLの水を含む。いくつかの態様において、組成物のpHは、約8.0、約7.5、約7.0、約6.5、約6.0、または約6.0未満である。
【００３２】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約100mgのブリンシドフォビル、約250〜500mgのマンニトール、約174mgのアルギニン、約5gのデキストロース、および約100mLの水を含み、組成物のpHは約8.0である。
【００３３】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約200mgのブリンシドフォビル、約500〜1000mgのマンニトール、約348mgのアルギニン、約10gのデキストロース、および約200mLの水を含み、組成物のpHは約8.0である。
【００３４】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約50mgのブリンシドフォビル、約125〜250mgのマンニトール、約87mgのアルギニン、約5gのデキストロース、および約100mLの水を含み、組成物のpHは約8.0である。
【００３５】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は、約100mgのブリンシドフォビル、約250〜500mgのマンニトール、約174mgのアルギニン、約10gのデキストロース、および約200mLの水を含み、組成物のpHは約8.0である。
【００３６】
いくつかの態様において、ブリンシドフォビル、増量剤、および緩衝剤のうちの1つまたは複数は、本明細書に記載する水性薬学的組成物に組み入れる前に、凍結乾燥されている。
【００３７】
いくつかの態様において、水性薬学的組成物は静脈内投与に適している。いくつかの態様において、水性薬学的組成物は無菌である。
【００３８】
別の一局面において、本開示は、ブリンシドフォビル、増量剤、緩衝剤、およびデキストロースを含む、静脈内投与用の無菌水性薬学的組成物を提供する。
【００３９】
別の一局面において、本開示は、ブリンシドフォビル、増量剤、緩衝剤、およびデキストロースを含み、pHが約8.0である、静脈内投与用の無菌水性薬学的組成物を提供する。
【００４０】
別の一局面において、本開示は、約0.5mg/mL〜約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約2.5mg/mL〜約5mg/mLの濃度の増量剤、約0.87mg/mL〜約1.74mg/mLの濃度の緩衝剤、および約50mg/mLの濃度のデキストロースを含む、静脈内投与用の水性薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物のpHは、約8.0、約7.5、約7.0、約6.5、約6.0、または約6.0未満である。
【００４１】
別の一局面において、本開示は、約0.5mg/mL〜約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約2.5mg/mL〜約5mg/mLの濃度の増量剤、約0.87mg/mL〜約1.74mg/mLの濃度の緩衝剤、および約50mg/mLの濃度のデキストロースを含み、pHが約8.0である、静脈内投与用の水性薬学的組成物を提供する。
【００４２】
別の一局面において、本開示は、ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、本明細書において示される薬学的組成物または薬学的製剤を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００４３】
別の一局面において、本開示は、ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、ブリンシドフォビル、増量剤、緩衝剤、およびデキストロースを含む静脈内投与用薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００４４】
別の一局面において、本開示は、ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、ブリンシドフォビル、増量剤、緩衝剤、およびデキストロースを含み、pHが約8.0である静脈内投与用薬学的組成物を、対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００４５】
別の一局面において、本開示は、ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、約0.5mg/mL〜約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約2.5mg/mL〜約5mg/mLの濃度の増量剤、約0.87mg/mL〜約1.74mg/mLの濃度の緩衝剤、および約50mg/mL％の濃度のデキストロースを含む静脈内投与用薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、組成物のpHは、約8.0、約7.5、約7.0、約6.5、約6.0、または約6.0未満である。
【００４６】
別の一局面において、本開示は、ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、約0.5mg/mL〜約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約2.5mg/mL〜約5mg/mLの濃度の増量剤、約0.87mg/mL〜約1.74mg/mLの濃度の緩衝剤、および約50mg/mL％の濃度のデキストロースを含み、pHが約8.0である静脈内投与用薬学的組成物を、対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００４７】
別の一局面において、本開示は、ある量のブリンシドフォビル、増量剤、および緩衝剤を任意の順序で水に溶解することで第1溶液を形成させる工程、第1溶液を凍結乾燥することで凍結乾燥粉末を形成させる工程、ならびに凍結乾燥粉末を水性糖アルコール溶液、水性糖溶液、リンゲル液、または塩化ナトリウム溶液に溶解することで水性薬学的製剤または水性薬学的組成物を形成させる工程を含むプロセスによって調製される、ウイルス感染を処置するための水性薬学的製剤または水性薬学的組成物を提供する。
【００４８】
別の一局面において、本開示は、ウイルス感染を処置するための医薬の製造における、ブリンシドフォビル、増量剤、緩衝剤、および水性糖アルコール溶液、水性糖溶液、リンゲル液、または塩化ナトリウム溶液を含む水性薬学的組成物の使用を提供する。
【００４９】
別の一局面において、本開示は、ウイルス感染の処置における、ブリンシドフォビル、増量剤、緩衝剤、および水性糖アルコール溶液、水性糖溶液、リンゲル液、または塩化ナトリウム溶液を含む水性薬学的組成物の使用を提供する。
【００５０】
上記局面のいずれか1つのいくつかの態様において、処置されるウイルス感染は、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス、サイトメガロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはそれらの組合せである。
【００５１】
いくつかの態様において、対象への本明細書に示す薬学的組成物の投与は溶血をもたらさない。いくつかの態様において、対象への本明細書に示す薬学的組成物の投与は胃腸毒性をもたらさない。
【００５２】
いくつかの態様において、静脈内投与用の水性製剤または水性組成物のいずれかのpHは、約8.0未満（例えば約8.0、約7.5、約7.0、約6.5、約6.0、約5.5、約5.0、約4.5、約4.0または約4.0未満）のpHを有することができる。いくつかの態様において、pHは、8.0より高くてもよい（例えば約8.5、約9.0、約9.5、約10.0、または約10.0超）。
【００５３】
理論に束縛されることは望まないが、経口ブリンシドフォビルの投与は、腸において、他の器官と比べて有意に高い曝露をもたらしうる。この曝露の増加は、ブリンシドフォビルの経口投与後のGI毒性につながりうる。本明細書に示すとおり、ブリンシドフォビルのIV投与は、（例えばBCVの経口投与と比較して）ブリンシドフォビルに対する消化管（例えば腸）の過剰曝露を防止して、胃腸（GI）忍容性を改善し、GI毒性を低減することができる。いくつかの態様において、ブリンシドフォビルのIV投与は、経口投与を使った場合に必要な用量より低い用量でさえ、血漿ならびに肝臓、腎および小腸などの器官に（例えば経口投与と比較して）同等な薬物曝露を送達することができる。
【００５４】
いくつかの態様において、IVブリンシドフォビルは、他の投与経路（例えば経口投薬）では到達することが困難な場合がある器官（例えば脳）に薬物を送達することができる。いくつかの態様において、IVブリンシドフォビルによる、CNS曝露の増加は、脳におけるウイルス感染（例えば新生児および成人におけるヘルペス脳炎、HHV-6脳炎、移植レシピエントまたは多発性硬化症の患者におけるJCウイルス/PML）を処置することができる。
【００５５】
静脈内投与用ブリンシドフォビルは、BCVの経口投与で観察されうるGI副作用を回避することができ、（例えばBCVの経口投与に関連するGI副作用を経験する患者において）DNAウイルス処置の機会を提供することができる。例えば、ブリンシドフォビルの経口投与のように、ブリンシドフォビルのIV投与は、毒性が限定された（例えば実質的にヘム毒性がなく腎毒性もない）広域スペクトル抗ウイルス剤として使用することができ、例えばアデノウイルスおよび痘瘡を処置するのに有効であることができる。加えて、ブリンシドフォビルのIV投与は、例えばサイトメガロウイルス、アデノウイルス、およびBKウイルスまたはJCウイルスを処置および防止するために使用することができる。例えば造血細胞移植患者において、これらの疾患を処置することができる。
【００５６】
他の特徴および利点は当業者には明白になるであろう。また、下記の発明の詳細な説明でも、それらを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
図面は、主に例示を目的としているのであって、本明細書に記載する発明の主題の範囲を限定しようとするものでないことは、当業者には理解されるであろう。図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、場合によっては、本明細書に開示する発明の主題のさまざまな局面が、異なる特徴の理解を容易にするために、図面では誇張または拡大されて示されることもありうる。図面において、類似する参照記号は、一般に、類似する特徴（例えば機能的に類似しかつ/または構造的に類似する要素）を指す。
【００５８】
上記の特徴およびさらなる特徴は、下記の詳細な説明を添付の図面と併せて解釈することで、より明瞭に理解されるであろう。
【００５９】
【図１】実施例4に示すとおり製品プローブによって記録された、製品温度プロファイルを示すグラフである。
【図２】加速安定性研究における貯蔵寿命の評価を表す一対のグラフである。
【図３】実施例9に示すとおり、15mg/kgまたは2mg/kgの目標用量での［14C］ブリンシドフォビルの単回2時間静脈内注入（IV）に続く、および15mg/kgでの単回経口（PO）投与後の、雄Sprague Dawley（SD）およびLong-Evans（LE）ラットに関して、放射能の血中濃度および血漿中濃度の時間経過を示すグラフである。
【図４】実施例9に示すとおり静脈内投与および経口投与された[14C]ブリンシドフォビルについての、小腸に関する組織中濃度対時間のプロットである。
【図５】実施例9に示すとおり静脈内投与および経口投与された[14C]ブリンシドフォビルについての、腎皮質に関する組織中濃度対時間のプロットである。
【図６】100mgの経口投与、10mgのIV投与および25mgのIV投与後の、ブリンシドフォビルの血漿中濃度のプロットである。
【図７】図7Aは、実施例10に示すとおりブリンシドフォビルを経口投与した後のラット腸のヒストグラムである。図7Bは、実施例10に示すとおりブリンシドフォビルをIV投与した後のラット腸のヒストグラムである。
【図８】IV BCV単回用量漸増（SAD）治験において観察された平均（±SE）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）レベルを示すグラフである。
【図９】コホート1〜4の対象に関する時間の関数としての平均血漿中ブリンシドフォビル濃度、およびBCVを経口投与された対象に関する時間の関数としての平均血漿中BCV濃度を表すグラフである。
【図１０】IVおよび経口BCV投与に続く時間の関数としての血漿中シドフォビル濃度の中央値を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本開示の詳細な説明
本開示は、ブリンシドフォビルを含む薬学的組成物（例えば凍結乾燥組成物または水性組成物）およびそれらの使用方法に関係する。本開示は、本明細書に記載する再構成された凍結乾燥薬学的組成物を含む薬学的製剤にも関係する。本組成物および製剤は静脈内投与用であることができる。いくつかの態様において、本開示の組成物または製剤のIV投与は溶血をもたらさない。本製剤は、例えば基礎疾患ゆえに、または不十分な経口吸収ゆえに、薬物の経口投与が可能でないか、実質的に不可能な場合にも、使用することができる。
【００６１】
本開示は、少なくとも3タイプのブリンシドフォビル組成物に関する。第1に、本開示は、保管に先だって凍結乾燥することができるブリンシドフォビルのバルク製剤（例えば本開示の液状製剤または本開示の凍結乾燥前製剤）に関する。凍結乾燥製剤（例えば粉末）は、長期間にわたって保管することができる。加えて、凍結乾燥製剤は、患者への、例えば処置を必要とする患者への、投与に先だって（例えば直前に）、（例えば糖溶液への溶解によって）再構成することができる。したがって本開示は、ブリンシドフォビルの凍結乾燥前製剤、凍結乾燥粉末、および投与用の再構成製剤（例えば薬学的製剤）を教示する。
【００６２】
本開示の製剤
凍結乾燥前製剤
いくつかの態様において、ブリンシドフォビルは凍結乾燥（例えば冷凍乾燥）に先だって水に溶解される。ブリンシドフォビルは、例えば増量剤および緩衝剤などと共に溶解することができる。構成成分の溶解は別々にまたは同時に行うことができ、任意の順序で行うことができる。
【００６３】
いくつかの態様において、本開示の凍結乾燥前組成物は緩衝剤を含む。いくつかの態様において、本開示の凍結乾燥前組成物は増量剤を含む。いくつかの態様において、本開示の凍結乾燥前製剤は緩衝剤および増量剤を含む。いくつかの態様において、ブリンシドフォビルの濃度は10mg/mLである。いくつかの態様において、溶液のpHはHClおよび/またはNaOHで調節される。
【００６４】
いくつかの態様において、緩衝剤は、リン酸ナトリウム、アルギニン、トロメタミン、およびpH調節水（pH-adjusted water）から選択される。いくつかの態様において、緩衝剤はリン酸ナトリウム、L-アルギニン、またはトロメタミンである。いくつかの態様において、緩衝剤はリン酸Naである。いくつかの態様において、緩衝剤はアルギニンである。いくつかの態様において、緩衝剤はL-アルギニンである。いくつかの態様において、緩衝剤はトロメタミンである。いくつかの態様において、緩衝剤はpH調節水である。いくつかの態様において、緩衝剤は約100mM〜約200mMの濃度で存在する。いくつかの態様において、緩衝剤は、約25mM、約50mM、約75mM、約100mM、約125mM、約150mM、約175mMまたは約200mMの量で存在する。
【００６５】
いくつかの態様において、増量剤はマンニトールまたはスクロースである。いくつかの態様において、緩衝剤はリン酸ナトリウム、アルギニン、またはトロメタミンである。いくつかの態様において、増量剤は約5〜9％（w/v）の濃度で存在する。いくつかの態様において、増量剤は約2.5〜9％（w/v）の濃度で存在する。いくつかの態様において、増量剤は約2.5％（w/v）、約5％（w/v）または約9％（w/v）の濃度で存在する。
【００６６】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、約10.0mg/mL、約6.4mg/mL、または約3.2mg/mLの濃度のブリンシドフォビルを含む。
【００６７】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、約10.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約25〜50mg/mLの濃度のマンニトール、約17.4mg/mLの濃度のL-アルギニン、および水を含み、pH＝8.0を有する。
【００６８】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、約17.8mMの濃度のブリンシドフォビル、約137.5〜275mMの濃度のマンニトール、約100mMの濃度のL-アルギニン、および水を含み、pH＝8.0を有する。
【００６９】
いくつかの態様において、本明細書に記載する凍結乾燥前製剤はいずれも、凍結乾燥することで（例えば保管のために）水を除去することができる。
【００７０】
いくつかの態様において、凍結乾燥前製剤は薬学的製剤として直接使用することができる（すなわち患者に直接与えることができる）。しかし、いくつかの態様において、これらの製剤は保管のために凍結乾燥され、その後、患者への投与のために（例えば5％デキストロース水溶液に）再構成される。
【００７１】
いくつかの態様において、ブリンシドフォビルの液状製剤は、注入媒体（例えば5％デキストロース）への希釈後に静脈内投与するためのものである。
【００７２】
いくつかの態様において、本開示の液状製剤（すなわち本開示の凍結乾燥前製剤）は、臨床の現場で使用される注入媒体および材料（例えば容器）と適合する。例えば本開示の液状製剤は、無菌フィルタ、バイアル、ストッパー、注入バッグ、またはIVシステムなどの材料と接触しても、外観、pH、またはブリンシドフォビルの回収率の有意な変化も、不純物の導入も示さない。いくつかの態様において、本開示の液状製剤は、シリンジフィルタを通して濾過しても、pHの有意な変化、ブリンシドフォビルの損失、不純物の導入を、いずれも起こさない。
【００７３】
凍結乾燥製剤
凍結乾燥前製剤を凍結乾燥することで、BCV、増量剤および緩衝剤の凍結乾燥製剤（例えば粉末）を生産することができる。凍結乾燥製剤は、長期間にわたって安定であることができ、患者への投与に先だって再構成することができる。いくつかの態様において、凍結乾燥製剤は無菌である。
【００７４】
いくつかの態様において、凍結乾燥は、冷凍、アニーリング、および凍結乾燥組成物の乾燥を含む。いくつかの態様において、乾燥は、一次乾燥および二次乾燥を含む。いくつかの態様において、冷凍およびアニーリングは、製剤を約5℃〜-50℃の温度に曝露する工程を含む。いくつかの態様において、一次乾燥は約35℃の温度で行われる。いくつかの態様において、二次乾燥は約20℃の温度で行われる。
【００７５】
いくつかの態様において、冷凍および/またはアニーリングは約16時間続く。いくつかの態様において、一次乾燥相は約20時間続く。さらなる態様において、二次乾燥は約22時間（例えば21.7時間）または約28時間（例えば27.7時間）かかる。
【００７６】
いくつかの態様において、本開示の液状製剤（例えばブリンシドフォビル、アルギニン、およびマンニトールを含む液状製剤）は、凍結乾燥中の泡立ちに悩まされた他の製剤とは対照的に、凍結乾燥プロセス中に泡立たない。
【００７７】
IV投与用の再構成された薬学的組成物
上で議論した凍結乾燥粉末は、患者へのIV投与に先だって、例えば水などの水性溶媒への溶解によって、再構成することができる。いくつかの態様において、水性溶媒は糖アルコールまたは糖（例えばデキストロース）を含有する水である。いくつかの態様において、水性溶媒は5％デキストロース水溶液である。水性溶媒もまた、（例えば無菌凍結乾燥製剤のように）無菌であることができ、それを必要とする患者への投与に適しうる。いくつかの態様において、本開示の凍結乾燥粉末の再構成は本開示の水性組成物を与える。
【００７８】
以下に示すとおり、本明細書に記載するIV投与用の薬学的組成物は、ブリンシドフォビルを経口投与する場合に必要な用量よりも低い用量のブリンシドフォビルを使って、治療上妥当なブリンシドフォビルの血漿中濃度を与えることができる。例えば本開示の製剤を使ったブリンシドフォビルのIV投与は、サイトメガロウイルス予防およびアデノウイルス処置に際して以前に抗ウイルス力価を示した血漿中ブリンシドフォビル濃度を、ヒトにおいて与えた。IV製剤に使用されるBCVの量（例えば、約10mgまたは約25mg）は、経口投与を使って同様の血漿中濃度を達成するのに要求されるBCVの量の約10分の1であった。
【００７９】
したがって、いくつかの態様において本開示は、ウイルス感染の処置を必要とする対象に、本明細書に示されるブリンシドフォビルのIV製剤を投与する工程を含む、ウイルス感染の処置を教示する。いくつかの態様において、IV用量は、類似する結果（例えば血漿中濃度、抗ウイルス活性など）を達成するのに必要なブリンシドフォビルの経口投与用量よりも少ない（例えば経口用量の約50％、経口用量の約40％、経口用量の約30％、経口用量の約20％または経口用量の約10％）。したがっていくつかの態様では、類似する（例えば実質的に同じ）臨床アウトカムを達成するために経口投与に使用される量よりも少ない量のIVブリンシドフォビルを使用することが可能である。加えて、IV投与では腸でのブリンシドフォビルの量が低くなるので、いくつかの態様において本開示は、胃腸毒性をもたらさないウイルス感染の処置も提供する。本開示は、薬物を経口投与することができない患者（例えば腸管が過敏な患者または経口薬を嚥下することができない人々）の処置を教示する。
【００８０】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約2.5〜5mg/mLの濃度のマンニトール、約1.74mg/mLの濃度のL-アルギニン、および約50mg/mLの濃度のデキストロースを含み、pH＝8.0を有する。
【００８１】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、約17.8mMの濃度のブリンシドフォビル、約13.75〜27.5mMの濃度のマンニトール、約10mMの濃度のL-アルギニン、および約287mMの濃度のデキストロースを含み、pH＝8.0を有する。
【００８２】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、約0.5mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約1.25〜2.5mg/mLの濃度のマンニトール、約0.87mg/mLの濃度のL-アルギニン、および約50mg/mLの濃度のデキストロースを含み、pH＝8.0を有する。
【００８３】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、約0.89mMの濃度のブリンシドフォビル、約6.85〜13.7mMの濃度のマンニトール、約5mMの濃度のL-アルギニン、および約287mMの濃度のデキストロースを含み、pH＝8.0を有する。
【００８４】
いくつかの態様において、本開示の薬学的組成物は糖をさらに含む。いくつかの態様において、糖は水性糖溶液に入っている。いくつかの態様において、水性糖溶液は5％デキストロース溶液である。いくつかの態様において、水性糖溶液の体積は約100mLまたは約200mLである。
【００８５】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、約100mgの量のブリンシドフォビル、約250mg〜約500mgの量のマンニトール、約174mgの量のアルギニン、約5gの量のデキストロースおよび約100mLの量の水を含み、pH＝8.0を有する。
【００８６】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、約200mgの量のブリンシドフォビル、約500mg〜約1000mgの量のマンニトール、約348mgの量のアルギニン、約10gの量のデキストロースおよび約100mLの量の水を含み、pH＝8.0を有する。
【００８７】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、約50mgの量のブリンシドフォビル、約125mg〜約250mgの量のマンニトール、約87mgの量のアルギニン、約5gの量のデキストロースおよび約100mLの量の水を含み、pH＝8.0を有する。
【００８８】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、約100mgの量のブリンシドフォビル、約250mg〜約500mgの量のマンニトール、約174mgの量のアルギニン、約10gの量のデキストロースおよび約200mLの量の水を含み、pH＝8.0を有する。
【００８９】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、100〜200mLの5％デキストロース溶液内に約0.1〜1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビルを含む。いくつかの態様において、本組成物は、10mgのブリンシドフォビル、100mMのアルギニン、および5％のマンニトール（w/v）を含み、pH＝8.0を有する。
【００９０】
いくつかの態様において、本開示の凍結乾燥組成物は、希釈後に注入によってIV投与するためのものである。
【００９１】
いくつかの態様において、緩衝剤は約200mMで存在する。いくつかの態様において、ブリンシドフォビルは予め凍結乾燥されている。いくつかの態様において、本開示の組成物は、水を除去するために凍結乾燥される。いくつかの態様において、ブリンシドフォビル、増量剤、および緩衝剤は、予め凍結乾燥されている。
【００９２】
いくつかの態様において、本開示は、ブリンシドフォビル、マンニトール、およびアルギニンを含む静脈内投与用の水性薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、本製剤のpHは約8.0である。いくつかの態様において、組成物のpHはHClおよび/またはNaOHを用いて調節される。
【００９３】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、脱イオン水による再構成に適している。いくつかの態様において、本開示の組成物は再構成時に泡立たない。いくつかの態様において、本開示の組成物は再構成時に泡立ち、泡は20分未満、10分未満、5分未満または1分未満で消失する。いくつかの態様において、100mM以上のアルギニンを含む組成物は、再構成時に、50mM以下のアルギニンを含む組成物よりも速い泡またはあぶくの消失を示す。
【００９４】
いくつかの態様において、本開示の凍結乾燥組成物は、例えばIV投与に先だって注入媒体（例えば5％デキストロース）で希釈したときに、外観、pH、またはブリンシドフォビル回収率の変化を起こさない。
【００９５】
いくつかの態様において、本開示の凍結乾燥組成物の再構成は、ブリンシドフォビルの損失をもたらさない。いくつかの態様において、本開示の凍結乾燥製剤は再構成後に透明かつ無色である。
【００９６】
賦形剤および薬学的に許容される担体
ブリンシドフォビル、緩衝剤および増量剤に加えて、本開示の薬学的組成物は、追加の薬学的に許容される担体を含有することができる。そのような薬学的に許容される担体には、所望する特定の剤形に応じて、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、または他の液状媒体、分散助剤もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固形結合剤、潤滑剤などを含めることができる。「Remington's Pharmaceutical Sciences」第16版、E.W.Martin（Mack Publishing Co、ペンシルバニア州イーストン、1980）には、薬学的組成物の製剤化に使用されるさまざまな担体およびそれらを調製するための公知の技法が開示されている。従来の担体媒質は、それが、例えば何らかの望ましくない生物学的効果を生むことまたは薬学的組成物の他の任意の構成成分と他の形で有害な相互作用をすることなどによって、活性化合物（すなわちブリンシドフォビル）と不適合でない限り、いずれも、その使用は本開示の範囲内にあると考えられる。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料のいくつかの例として、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末状トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤；ラッカセイ油、綿実油などの油；サフラワー油、ゴマ油；オリーブ油；トウモロコシ油およびダイズ油；グリコール；例えばプロピレングリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝化剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝剤溶液、ならびに他の非毒性適合性潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムが挙げられるが、それらに限定されるわけではなく、製剤者の判断に応じて、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味剤および芳香剤、保存剤および酸化防止剤も、組成物中に存在することができる。
【００９７】
使用方法
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本開示の組成物は、対象に静脈内投与される。
【００９８】
いくつかの態様において、本開示の製剤は、ある体積の濃縮無菌溶液（例えば希釈用）および/または凍結乾燥粉末（例えば再構成用）を含むことができる。いくつかの態様において、本製剤は少なくとも12ヶ月にわたって（例えば約25℃で）保管することができる。いくつかの態様において、本製剤は上下逆にして（例えば約24ヶ月または約36ヶ月にわたって）保管することができる。いくつかの態様において、本製剤は冷蔵庫に（例えば12ヶ月にわたって）保管することができる。いくつかの態様において、凍結乾燥粉末は（例えば再構成のために）液体に容易に溶解しうる。いくつかの態様において、液量は（例えば非経口投与のために）小さくすることができる。いくつかの態様において、本製剤は、許容できるフィルタおよび管適合性（filter and tubing compatibility）を示す。いくつかの態様において、本製剤は通常の蘇生輸液、例えば限定するわけではないが、D5W、NSおよびD5 1/2 NSと適合する。
【００９９】
患者集団
いくつかの態様において、本開示の組成物の投与は溶血をもたらさない。いくつかの態様において、本開示の組成物の投与は胃腸毒性をもたらさない。
【０１００】
したがって、いくつかの態様において本開示は、ブリンシドフォビルの経口投与に関連する望まれない副作用（例えば下痢、痛み、便秘などの胃腸副作用）を経験しうる患者へのブリンシドフォビルの投与を提供する。例えばいくつかの態様において、IV製剤は、例えば貧血、過敏性腸症候群、便秘、下痢、腸痛などの症状を持つ患者に使用することができる。また、いくつかの態様において本開示は、ブリンシドフォビルの持続的および/または反復的投与を必要とする対象への、ブリンシドフォビルの持続的および/または反復的投与を提供する。例えば幹細胞移植を受けた患者には、ブリンシドフォビル経口投与（例えば反復経口投与）に関連する胃腸副作用を防止するために、本開示のIV製剤を投与することができる。
【０１０１】
ウイルス適応症
いくつかの態様において、処置されるウイルス感染は、ポリオーマウイルス（BK、ジョン・カニングハム（John Cunningham）ウイルス（JCV）、メルケル細胞ウイルス（MCV）、KIポリオーマウイルス（KIV）、WUポリオーマウイルス（WUV）、シミアンウイルス40（SV40）を含む）、パピローマウイルス（ヒトパピローマウイルス、ワタオウサギパピローマウイルス、ウマパピローマウイルスおよびウシパピローマウイルスを含む）、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、アデノウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス（EBV）、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）またはそれらの組合せから選択される。
【０１０２】
いくつかの態様において、IV製剤は、危険な状態にある（例えばCMV血清陽性の）成人および小児の同種間造血幹細胞移植レシピエントにおける臨床上重大なサイトメガロウイルス感染を防止するために使用することができる。いくつかの態様において、本製剤は成人および小児の易感染性宿主におけるアデノウイルス感染の処置に使用することができる。いくつかの態様において、本製剤は、造血幹細胞移植患者または固形臓器移植患者に使用することができる。
【０１０３】
投薬計画
いくつかの態様において、本開示の製剤（例えばIV製剤）は、BCV約1mg〜1000mgの用量で投与される。例えば製剤は、BCV約10mg〜200mgの用量で投与することができる。いくつかの態様において、IV製剤は、約5mg、約10mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg、約60mg、約65mg、約70mg、約75mg、約80mg、約85mg、約90mg、約95mg、約100 約105mg、約110mg、約115mg、約120mg、約125mg、約130mg、約135mg、約140mg、約145mg、約150mg、約155mg、約160mg、約165mg、約170mg、約175mg、約180mg、約185mg、約190mg、約195mg、または約200mgのBCVで投与することができる。
【０１０４】
いくつかの態様において、本開示のIV製剤は、約5〜50mg、約10〜約50mg、約10〜約40mg、約10〜約30mg、約5〜約25mg、約10〜約25mg、および約15〜約25mgのBCVが送達されるように投与することができる。本製剤はヒト（例えば成人）に投与することができる。
【０１０５】
いくつかの態様において、本製剤は、約10mg〜100mg（例えば約10mgまたは約25mg）の用量で静脈内投与された場合に、安全であり、忍容性が高い。例えば、10mg用量および25mg用量の本開示のブリンシドフォビル製剤は、有害事象を伴わない有利な忍容性プロファイルを与えることができる。いくつかの態様において、本明細書に記載する製剤の約10mgおよび25mgの用量は、胃腸副作用を生じない。
【０１０６】
いくつかの態様において、本明細書において教示されるIV製剤は、1日あたり複数回投与するか、単回投与として投与することができる。例えばIV製剤は1日1回投与するか、1日2回投与することができる。いくつかの態様において、本開示の製剤は1週間に1回または1週間に2回投与することができる。いくつかの態様において、本開示の製剤は隔日に投与することができる。いくつかの態様において、本開示の製剤は隔週に投与することができる。いくつかの態様において、本開示の製剤は1ヶ月に1回または1ヶ月に2回投与することができる。当業者は患者にとって適当な投薬計画を決定することができるであろう。
【０１０７】
IVブリンシドフォビルの投与の（すなわち各投与についての）継続時間は、それを必要とする個々の対象または患者の必要性に応じてさまざまであることができ、対象にブリンシドフォビルを投与する時間の適当な量を決定することは、当業者（例えば看護師または医師などの臨床家）の専門的技術内である。例えばブリンシドフォビルのIV投与は、約15分、約30分、約45分、約60分、約75分、約90分、約105分、または約120分継続しうる。
【０１０８】
いくつかの態様において、本開示の製剤は、他の治療剤または処置と組み合わせて投与することができる。例えば他の治療剤は、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、イリノテカン、トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロン類、タモキシフェン、5-フルオロウラシル、メトトレキサート、テモゾロミド、シクロホスファミド、ロナファリブ（lonafarib）、ティピファルニブ、4-（（5-（（4-（3-クロロフェニル）-3-オキソピペラジン-1-イル）メチル）-1H-イミダゾール-1-イル）メチル）ベンゾニトリル塩酸塩、（R）-1-（（1H-イミダゾール-5-イル）メチル）-3-ベンジル-4-（チオフェン-2-イルスルホニル）-2,3,4,5-テトラヒドロ-1H-ベンゾジアゼピン-7-カルボニトリル、セツキシマブ、イマチニブ、インターフェロン・アルファ-2b、PEG化インターフェロン・アルファ-2b、アロマターゼの組み合わせ、ゲムシタビン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、フロクスウリジン、シタラビン、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、リン酸フルダラビン、ロイコボリン、オキサリプラチン、ペントスタチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン-C、L-アスパラギナーゼ、テニポシド17α-エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、17α-ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸ロイプロリド、フルタミド、クエン酸トレミフェン、酢酸ゴセレリン、カルボプラチン、ヒドロキシ尿素、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトキサントロン、レバミソール、ビノレルビン、アナストラゾール（anastrazole）、レトロゾール、カペシタビン、ラロキシフェン、ドロロキサフィン（droloxafine）、ヘキサメチルメラミン、ベバシズマブ、トラスツズマブ、トシツモマブ、ボルテゾミブ、イブリツモマブ・チウキセタン、三酸化ヒ素、ポルフィマーナトリウム、セツキシマブ、チオテパ、アルトレタミン、フルベストラント、エクセメスタン、リツキシマブ、アレムツズマブ、デキサメタゾン、ビカルタミド、クロラムブシル、またはバルルビシンであることができる。これらの作用物質は処置レジメンの一部として投与することができ、必ずしも同時に投与されるわけではなく、必ずしも同じスケジュールで投与されるわけでもない。
【０１０９】
定義
本明細書に記載する態様の理解を促進するために、好ましい態様と特別な術語への言及を使ってそれらを説明する。本明細書において使用される専門用語には、特定の態様を説明するという目的しかなく、本発明の範囲を限定する意図はない。この開示の全体を通して使用される単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば「組成物」（a composition）への言及は、単一の組成物だけでなく、複数のそのような組成物も包含し、「治療剤」（a therapeutic agent）または「活性化合物」（an active compound）への言及は、1種または複数種の治療剤および/または薬剤（例えばブリンシドフォビル）ならびに当業者に公知のそれらの等価物への言及である。本明細書において使用される百分率および比はすべて、別段の表示がある場合を除き、重量による。
【０１１０】
「約」（about）という用語は、本明細書では、およそ（approximately）、の付近（in the region of）、大まかに（roughly）または前後（around）を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲と一緒に使用される場合、それは、示された数値の上下に境界を延長することによって、当該範囲を変更する。一般に「約」という用語は、本明細書では、明示された値の上下に20％の差異で数値を変更するために使用される。
【０１１１】
本開示において使用される場合、請求項の移行区であれ本体部であれ、「含む」という用語は、非限定的（open-ended）な意味を有すると解釈されるものとする。すなわち、これらの用語は、「少なくとも有する」または「少なくとも含む」という語句と同義であると解釈されるものとする。 プロセスに関連して使用される場合、「含む」という用語は、そのプロセスが少なくとも具陳した工程を包含すること、そしてそのプロセスが追加の工程を包含しうることを意味する。分子、化合物、または組成物に関連して使用される場合、「含む」という用語は、その化合物または組成物が少なくとも具陳した特徴または構成成分を包含すること、そしてその化合物または組成物が追加の特徴または構成成分も包含しうることを意味する。
【０１１２】
「薬学的組成物」は、本開示の化合物（例えばブリンシドフォビル）を対象への投与に適した形態で含有する製剤である。「薬学的組成物」という用語は、哺乳動物、例えばヒトへの投与に適した調製物を包含する。薬学的組成物は、例えば静脈内投与用（IV）製剤または経口製剤であることができる。
【０１１３】
「単剤療法」という用語は、特定の傷害または疾患を処置するための単一薬物の使用を意味すると理解される。併用療法は特定の障害または疾患を処置するために少なくとも2種の薬物の併用を含むので、単剤療法は併用療法とは異なる。
【０１１４】
本明細書にいう「処置」または「処置する」とは、疾患、状態、または障害と戦うための患者の管理およびケアをいい、疾患、状態、または障害の症状または合併症を緩和するための、またはその疾患、状態もしくは障害を排除するための、本開示の活性化合物（すなわちブリンシドフォビル）の投与を包含する。「処置する」という用語はインビトロでの細胞の処置または動物モデルの処置も包含することができる。
【０１１５】
本明細書にいう「本開示の化合物」とは、活性化合物（例えばブリンシドフォビル）と非活性化合物（例えば増量剤、緩衝剤、甘味料など）の両方を指す。
【０１１６】
本開示の活性化合物（すなわちブリンシドフォビル）は、関連する疾患、状態、または障害を防止するためにも、そのような目的にとって適切な候補を同定するためにも、使用することができる。本明細書にいう「予防する」または「から保護する」とは、そのような疾患、状態、または障害の症状または合併症の発症を低減、改善、または排除することをいう。
【０１１７】
ブリンシドフォビルは、ウイルス感染症などの疾患の予防にも使用することができる。予防とは、疾患を防止するためにとられる行動を意味すると理解される。本開示との関連において、予防は、例えばブリンシドフォビルによる処置を意味しうる。
【０１１８】
本明細書にいう「治療有効量」とは、患者において臨床的に観察される改善をなすのに必要な量を意味する。いくつかの態様において、本開示の化合物は、それらが1種または複数種の望まれない副作用を引き起こさないであろう量を含むように、製剤化される。例えば「治療有効量」という用語は、特定された疾患または状態（例えばウイルス感染）を処置し、改善しまたは防止するための、または検出可能な治療効果または阻害効果を呈するための、任意の1種または複数種の薬剤（例えばブリンシドフォビル）の量を指す。効果は、当技術分野において公知である任意のアッセイ方法によって検出することができる。ある対象にとっての正確な有効量は、その対象の体重、サイズおよび健康状態、状態の性質および程度ならびに投与のために選択された治療薬の投与スケジュールに依存するであろう。
【０１１９】
所与の状況に対する治療有効量は、臨床家の技量と判断の範囲内である日常的な実験によって決定することができる。好ましい一局面において、処置される疾患または状態はウイルス感染である。さらにまた、薬剤の有効量とは、臨床家または他の適格な観察者が認める客観的に同定可能な改善を提供する量である。
【０１２０】
本明細書において使用する「薬学的に許容される」という語句は、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット/リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、化合物、材料、組成物、担体および/または剤形を指す。
【０１２１】
「薬学的に許容される賦形剤または担体」とは、一般に安全であり、非毒性であり、生物学的にも他の観点からも望ましくないものではない、薬学的組成物を調製するのに有用な賦形剤または担体を意味し、獣医学的使用ならびにヒトへの薬学的使用にとって許容されうる賦形剤を包含する。本明細書および特許請求の範囲にいう「薬学的に許容される賦形剤」は、1種および2種以上のそのような賦形剤をどちらも包含する。薬学的に許容される賦形剤および担体は上に列挙されている。
【０１２２】
本明細書にいう「対象」は「その必要がある対象」と相互可換的に使用され、それらはどちらも、ウイルス感染が関与する障害を有する対象（例えば患者）、または人口全体と比較してウイルス感染関連疾患もしくはウイルス感染関連障害を発症するリスクが増加している対象を指す。「対象」は哺乳動物を包含する。哺乳動物は、例えばヒトまたは適当な非ヒト哺乳動物、例えば霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジまたはブタなどであることができる。対象はトリまたは家禽であることもできる。一態様において、哺乳動物はヒトである。
【０１２３】
ブリンシドフォビルの代表的な「薬学的に許容される塩」としては、例えば、酢酸塩、アムソネート（amsonate）（4,4-ジアミノスチルベン-2,2-ジスルホン酸塩）、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、硫酸水素塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、カルシウム塩、エデト酸カルシウム塩、カンシレート、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラリエート（clavulariate）、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシレート、エストレート（estolate）、エシレート、フィウナレート（fiunarate）、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート（glycollylarsanilate）、ヘキサフルオロホスフェート、ヘキシルレゾルシネート（hexylresorcinate）、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、セチオネート（sethionate）、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、マグネシウム塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩、ナプレシート、硝酸塩、N-メチルグルカミンアンモニウム塩、3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモエート（1,1-メテン-ビス-2-ヒドロキシ-3-ナフトエート、アインボネート（einbonate））、パントテン酸塩、リン酸塩/二リン酸塩、ピクリン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリチル酸塩、スラメート（suramate）、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシレート、トリエチオジドおよび吉草酸塩などの、水溶性塩および水不溶性塩が挙げられる。いくつかの態様において、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩である。
【０１２４】
ブリンシドフォビル
シドフォビル（CDV）の脂質コンジュゲートであるブリンシドフォビル（CMX001、BCV）は、高いアンメットメディカルニーズがある二本鎖DNAウイルスが引き起こす感染および疾患の防止および処置に使用することができる。本開示は、ブリンシドフォビルのIV製剤を、経口薬を服用することができない患者にBCVを送達する方法としてだけでなく、経口投与で観察される有害GI事象を潜在的に低減または回避するための方法としても、教示する。
【０１２５】
本明細書において使用する「ブリンシドフォビル」という用語は、下記の中性化合物：
2019519570.tif 000004
ならびにその薬学的に許容される任意の塩を包含すると理解される。下記の例の一部では、ブリンシドフォビルを「試験物質」（test item）という。
【０１２６】
シドフォビル
シドフォビルは、CDVとしても公知であり、以下の構造を有する。
2019519570.tif 000005
【０１２７】
ブリンシドフォビル脱アミノ化生成物
いくつかの態様において、ブリンシドフォビルは、水性条件下で（例えば酸性pHにおいて）脱アミノ化されて、対応するウラシル誘導体を生成することができる。その脱アミノ化生成物を以下に示す。
2019519570.tif 000006
【０１２８】
本開示は、ブリンシドフォビルを含む水性製剤および凍結乾燥製剤ならびにそれらを使用する方法に関する。本明細書にいう「凍結乾燥製剤」は、溶媒（例えば水または糖溶液）に溶解される、ある量の固形凍結乾燥ブリンシドフォビルを含む製剤を意味する。「凍結乾燥製剤」は本開示の薬学的組成物であることができる。
【０１２９】
凍結乾燥前製剤の特徴
実施例4に示すとおり、緩衝剤としてアルギニンを含み、増量剤としてマンニトールを含む凍結乾燥前製剤は、白色の均一な固形物を与え、凍結乾燥時のメルトバックはごくわずかしかない。さらに、緩衝剤としてアルギニンを含み、増量剤としてマンニトールを含む凍結乾燥前製剤から得られる凍結乾燥製品は、試験した他の製剤とは対照的に、再構成時に、わずかな泡立ちしか示さなかった。例えば、緩衝剤としてリン酸ナトリウムまたはpH調節水を含む製剤は再構成時に泡立ちを示し、泡が消失するまでに一般的には数分（例えば30分超）を要した。同様に、増量剤としてスクロースを含む製剤も再構成時に泡立ちを呈することが見いだされ、泡が消失するまでに一般的には数分（例えば30分超）を要した。
【０１３０】
さらにまた、下記実施例4に示すとおり、マンニトールに基づく本開示の水性製剤は、他の製剤と比較して凍結乾燥時に、よりコンパクトで均一な凍結乾燥ケーキを与えることもわかった。例えばスクロース系製剤は、凍結乾燥時に、メルトバックの増加（例えば大規模なメルトバック）だけでなく、少なくとも部分的なケーキ崩壊（また場合によっては著しいケーキ崩壊）を呈した。しかし、マンニトール系水性製剤は、少ないケーキ崩壊および少ないメルトバックを呈することがわかった。
【０１３１】
加えて、いくつかの態様において、リン酸系緩衝剤は、緩衝剤としてアルギニンを使用した製剤とは対照的に、凍結乾燥プロセス中の冷凍時にpHシフトを示した。したがって本明細書に示す組成物は、試験した他の製剤と比較して望ましい特性を有する（例えば安定性が高く、使用しやすい）ことがわかった。
【０１３２】
液状製剤の安定性および材料適合性
実施例1に示すとおり、20％メタノールを含有するpH6.0〜8.0の50mMリン酸緩衝液中のブリンシドフォビル試料原液（50μg/mL）を2〜8℃で保管したところ、pH7.0以下の試料については、沈殿が観察された。しかし、それより高いpH（例えばpH＝7.5およびpH＝8.0）で調製された試料は、この実験の時間経過の全体を通して、外観に観察しうる変化を示さなかった（例えば沈殿は観察されなかった）。40℃で保管した試料については、どのpHの試料についても、外観の物理的変化は観察されず、40℃では試験したpH条件のいずれについても、ブリンシドフォビル濃度の変動はごくわずかしか観察されなかった。
【０１３３】
実施例1に提示する研究では、ブリンシドフォビル製剤のための媒体を、6.4mg/mLのブリンシドフォビル濃度で、5×リン酸ナトリウム緩衝液保存物（例えばpH6.0、6.5、7.0、7.5または8.0）、さまざまな等張化剤（tonicifier）（例えば66.5mM NaCl、68,8mMデキストロース、49.8mM MgCl2または35.7mM D-グルコン酸Ca）およびさまざまな賦形剤（例えばCremophor（登録商標）、エデト酸二ナトリウム（EDTA）、ヒドロキシプロピルベータ-シクロデキストリン（HPbCD）、ポリエチレングリコール（PEG）300、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール（PG）、N,N-ジメチルアセトアミド（DMA）、N-メチル-2-ピロリドン（NMP）、ポリソルベート80、アルブミン、もしくはベンジルアルコール、またはそれらの混合物）から調製した。理論に束縛されることは望まないが、等張化剤としてデキストロースまたはNaClを含み、賦形剤としてCremophor（登録商標）およびDMAを含む被験製剤は、6.5のpHで12日間にわたって沈殿せず、デキストロースを含むが賦形剤を含まない被験製剤は、8.0のpHで12日間にわたって沈殿しなかったが、それより低いpH値では沈殿した。同様に、そしてやはり理論に束縛されることは望まないが、NaCl、PEG300およびポリソルベート80を含む製剤ならびにNaCl、Cremophor（登録商標）およびエタノールを含む製剤は、12日間で、7のpHでは沈殿しなかったが、それより低いpH値では沈殿した。NaClおよびCremophor（登録商標）を含む製剤は、7のpHで沈殿しなかった。理論に束縛されることは望まないが、実施例1に示すHPLC回収率データは、保管条件下（2〜8℃）およびc(BCV)＝6.4mg/mLにおいて、一部の製剤が、ブリンシドフォビルを安定的に絶えず可溶化しておくには適していないことを示唆している。
【０１３４】
実施例2に示すとおり、100mMリン酸および69mMデキストロースを含む水性注入媒体におけるブリンシドフォビルの平衡溶解度は、pHが高くなると増加することがわかった。例えば、100mMリン酸および69mMデキストロースを含む水性注入媒体におけるブリンシドフォビルの平衡溶解度は、pH＝6.9では約25mg/mLであり、pH＝8.0では約270mg/mL超であると決定された。
【０１３５】
実施例5に示すとおり、10mg/mLブリンシドフォビル、100mMアルギニン、および5％（w/v）マンニトールを含む液状製剤を与える、5％デキストロース溶液への本開示の液状製剤の溶解度は、液状製剤の希釈後、少なくとも24時間にわたって100％であった。さらにまた、結果として生じた溶液は透明かつ無色のままであり、有意なpHシフトは観察されなかった。
【０１３６】
実施例5および実施例3に示すとおり、ブリンシドフォビルの液状製剤（例えば10mg/mLブリンシドフォビル、100mMアルギニン、および5％（w/v）マンニトールを含む製剤、10mg/mLまたは15mg/mLブリンシドフォビルおよび200nMリン酸ナトリウムを含む製剤、または2mg/mLブリンシドフォビルおよび4mMリン酸ナトリウムを含む製剤）を、注入媒体ならびに製造段階および臨床段階からくる一連の材料（例えば滅菌フィルタ、バイアルならびに正立および倒立条件でのストッパー、注入バッグおよび注入システム）との適合性について試験した。いくつかの例では、試験に先だって製剤を5％デキストロースで希釈した。理論に束縛されることは望まないが、沈殿、pHシフト、ブリンシドフォビル回収率の有意な損失は、研究の終了時に、どの製剤でも観察されなかった。
【０１３７】
ブリンシドフォビルの溶血能
いくつかの態様において、溶血を引き起こさないこと（すなわち赤血球を破壊しないこと）は、薬物（例えば静脈内投与用薬物）にとって有利である。
【０１３８】
収集したばかり（4時間以内）のヒト全血またはラット全血を使用し、シアンメトヘモグロビン法を使って溶血を評価することにより、ブリンシドフォビルの溶血能を、実施例7に記載する。この研究では、ブリンシドフォビルが赤血球を溶解する程度を決定するために、ブリンシドフォビルの存在下で赤血球から放出されたヘモグロビンを測定した。
【０１３９】
理論に束縛されることは望まないが、赤血球の溶解は、蜂窩織炎、静脈炎などの局所反応を引き起こして、器官機能に影響を及ぼす場合がある。本明細書に提示する結果は、ブリンシドフォビルのIV製剤が、静脈内投与された場合に、溶血反応を引き起こさないことを実証している。
【０１４０】
ラットおよびヒトの全血（K2EDTAで安定化したもの）を4匹のラットおよび1人の献血者から得た。ラットについては各濃度（0.2、0.5、および1.6mg/mL）のブリンシドフォビルをラット全血と1:4の比で別々に混合し、一方、ヒトについては、各濃度（0.2、0.5および1.6mg/mL）のブリンシドフォビルをヒト全血と1:4の比で別々に混合した。次に、すべての試料を37±1℃で20分間インキュベートした。次に、インキュベーションに続いて、BCVを含有する血液試料を、同様に調製した等張食塩水（陰性対照）、1％サポニン（陽性対照）、5％デキストロース（媒体対照）および無処理の全血対照試料と共に、遠心分離し、シアンメトヘモグロビン法を使って溶血（上清ヘモグロビン濃度）について分析した。代表的な等張食塩水中のBCV試料を分析することで、BCVが上清ヘモグロビン濃度の分析に干渉しないことを保証した。
【０１４１】
理論に束縛されることは望まないが、ブリンシドフォビルは、ラット全血において、濃度依存的であると思われる溶血能効果を示し、溶血の証拠は1.6mg/mLで観察された。しかしブリンシドフォビルは、ヒト全血中では、0.2、0.5、および1.6mg/mLの最終濃度に相当する試験した最高濃度まで、溶血能を有さないことがわかった。
【０１４２】
したがっていくつかの態様において、ブリンシドフォビルは、血液病（例えば貧血）を持つ患者を含めて、患者への投与に関して安全である。
【０１４３】
ラットにおける最大耐用量および7日間用量範囲探索（DRF）研究
ラットにおけるBCVに関する最大耐用量および7日間用量範囲探索研究（DRF）を、実施例8に提示する。提示した結果は、ラットにおける急性範囲探索研究を詳述している。いくつかの態様において、このデータは、さらなる毒性研究において投与すべき用量を合理的に設定することを可能にするための情報を生成させるために使用することができる。
【０１４４】
第1相
ラットへの静脈内注入（2時間）に続いてブリンシドフォビルの最大耐用量（MTD）を決定するために、第1相を計画した。第1相は、一般にBCVへの曝露から48±時間の期間内に全身の臨床徴候に現れうるあらゆる急性毒性（例えば「毒性症候群」（toxic syndrome））を評価するための単回用量漸増アームを包含した。理論に束縛されることは望まないが、この用量漸増アームでは、過量の明白な徴候または症状を、すべて同定することができる。
【０１４５】
この研究の第1相では、単回2時間IV注入によって投与した場合に、すべての用量が十分に忍容された。それゆえに、ブリンシドフォビルの最大耐用量は決定されなかった。ただし、0.75mg/mLを上回るブリンシドフォビル濃度での溶血を示すインビトロでの証拠に基づけば、ブリンシドフォビルの0.75mg/mL溶液の2時間IV注入によって送達された15mg/kgは、投与可能な最大用量（maximum feasible dose）に相当した。言い換えると、試験した投与可能な最大用量でさえ、（例えば平均体重または体重増加に対する）間接的効果は、ラットにおいて観察されなかった。さらに、眼科的パラメータ、血液学的パラメータ、臨床化学的パラメータ、尿検査パラメータのいずれにも、影響はなかった。経口投与で達成されうるレベルより高い投薬量レベルでさえ、ラットは明白な毒性も死亡も呈さないことがわかった。
【０１４６】
第2相
ブリンシドフォビルの毒性ならびにブリンシドフォビルおよびその代謝産物の一つであるシドフォビルの血漿毒物動態学的プロファイルを評価するために、反復用量範囲探索（DRF）相（第II相）である第2相を計画した。動物およびヒトに静脈内投与された場合、シドフォビルが腎毒性の原因になることは公知である。1日目、3日目、および7日目に静脈内注入（2時間）によって投与された2つの用量レベル（1mg/kgおよび15mg/kg）のブリンシドフォビルの最初と最後の投薬に続いて、毒物動態学的パラメータを評価した。
【０１４７】
この研究の第2相では、動物に、高（15mg/kg）または低（1mg/kg）BCV IV注入用量の短期間処置を与えた（9日にわたって3回）。理論に束縛されることは望まないが、この研究のこの第2相は、反復投与に伴って何らかの潜在的蓄積毒性が生じうるかどうかを決定するために使用された。理論に束縛されることは望まないが、第2相には、単回（1回目の投薬）および反復（最後の投薬）BCV IV注入投与に続いて確立されたIV毒物動態を決定するための毒物動態学的アームも含めた。
この研究の第2相において、ブリンシドフォビルのピーク濃度は、一般に、2時間IV注入の終了時に観察され、急速に減少した。一般に、平均ブリンシドフォビルCmaxおよび平均ブリンシドフォビルAUCは、1mg/kgから15mg/kgへの用量の増加にほぼ比例して増加した。ただし、1mg/kg投与後は、わずかな濃度値でAUCが決定された。7日目のブリンシドフォビルCmax値およびブリンシドフォビルAUClast値は、1日目と比較して7日目では値が低くなる傾向を示した（7日目/1日目蓄積比（AR）が0.44〜0.54）。さらに、ブリンシドフォビルTKパラメータに性差は観察されなかった。理論に束縛されることは望まないが、代謝産物シドフォビルへの曝露は、ブリンシドフォビル用量の増加に比例するほどには増加せず、TKパラメータに明白な性差も、反復投与後のTKパラメータの変化もなかった。この研究の条件下では、1日目、4日目および7日目の2時間IV注入による1mg/kgまたは15mg/kgブリンシドフォビルの単回投薬は、十分に忍容された。
【０１４８】
ブリンシドフォビル:14日回復期間を設けたラットにおける28日静脈内注入毒性研究
ラットにおけるIV BCVによる反復投与亜慢性研究を実施例10に詳述する。理論に束縛されることは望まないが、この研究では、ある範囲の用量で投与されたブリンシドフォビルの蓄積生物学的効果（例えば臨床、マクロおよびミクロ）を調査する。効果は、標的器官、効果の性質など、定性的である場合も、効果が観察される血漿中レベルまたは組織中レベルなど、定量的である場合もある。この研究では毒性および回復または進行の可能性を明らかにすることができる。
【０１４９】
実施例10に示すとおり、そして理論に束縛されることは望まないが、本研究ではどの動物も、下痢を経験しなかった。すべての動物が研究中にそれぞれに予期される重量増加を示した。最終剖検時に腸にGI所見はなかった。投与された最も高用量のIVブリンシドフォビル（15mg/kg）において、存命中の臨床所見はなかった。トランスアミナーゼ上昇は観察されなかった。
【０１５０】
理論に束縛されることは望まないが、ブリンシドフォビルの経口投与後は、腸絨毛における上皮の有意な喪失があることが、観察された。これに対して、ブリンシドフォビルのIV投与後に認められる単細胞効果はごくわずかでしかなかった。例えば図7Aは、ブリンシドフォビルの経口投与後のラット腸のヒストグラムのヒストグラムを示し、図7BはブリンシドフォビルのIV投与後のラット腸のヒストグラムを示す。これらの図が示すとおり、ブリンシドフォビルのIV投与の方が、腸では忍容性が高い。
【０１５１】
実施例10に示すとおり、Sprague-Dawley CD（登録商標）ラット（15匹/性別/群）に、ブリンシドフォビルを、0（2×リン酸ナトリウム緩衝液）、1、4または15mg/kg/投与で、2時間静脈内注入により、28日間にわたって、毎週2回投与した。14日間の投与後回復のために、最大5匹/性別/群をとっておいた。
【０１５２】
ブリンシドフォビルの投与は、≧4mg/kg/投与で、両性において、一部の動物に断続的な（一般に注入に続いて）臨床徴候（主に異常呼吸および背弯姿勢）をもたらし、雄および雌において、それぞれ≧1mg/kg/投与および15mg/kg/投与で、ごくわずかに減少した摂食量をもたらした。
【０１５３】
≧4mg/kg/投与では雄性生殖器官（精巣生殖細胞欠乏、精巣上体中の管腔細胞片および精嚢における上皮アポトーシスの増加）および腸管（単細胞壊死）に、また15mg/kg/投与では皮脂腺（萎縮）に、ブリンシドフォビル関連所見が存在した。ブリンシドフォビル関連所見はすべて完全に回復した。例外は、≧4mg/kg/投与での雄における精巣変化であり、理論に束縛されることは望まないものの、これは2週間で完全に回復するとは予想されないだろう。加えて、15mg/kg/投与が投与された数匹の動物では、回復の終了時に、骨髄細胞充実度の低下ならびに一側性または両側性に軟らかくかつ/または小さい精巣および精巣上体が見られた。
【０１５４】
この研究の条件下では、≧4mg/kg/投与での雄における精巣生殖細胞欠乏および15mg/kg/投与での1匹の雌における中等度の腸単細胞壊死に基づいて、ブリンシドフォビルの無毒性レベル（NOAEL）は、雄では1mg/kg/投与および雌では4mg/kg/投与であるとみなした。
【０１５５】
このように、いくつかの態様において、本研究は、ヒトにおける臨床研究の開始または継続的遂行のための裏付けを提供することができる。いくつかの態様において、本研究は、より長期の研究のための用量を確立するために使用することもできる。理論に束縛されることは望まないが、この研究は、より長期の研究を遂行する際に評価すべき動物の数などといったパラメータに関する指針を与えることもできる。この研究には最初の投薬および最後の投薬に続く毒物動態学的アームも含めた。
【０１５６】
[14C]ブリンシドフォビルの単回経口投与または単回静脈内投与に続く定量的全身オートラジオグラフィーによる物質収支、薬物動態および組織分布
[14C]ブリンシドフォビルの単回静脈内（IV、2時間注入）投与または経口（PO、胃管法）投与の施行に続いて、雄Sprague Dawley（SD）ラットおよびLong-Evans（LE）ラットにおける総放射能の組織分布を特徴づける研究を行った。加えて、[14C]ブリンシドフォビルの単回静脈内（IV、2時間注入）投与に続く雄Sprague Dawleyラットにおける総放射能の排泄の速度および程度（物質収支）ならびに薬物動態（PK）を検査した。
【０１５７】
[14C]ブリンシドフォビルを、15mg/kgの用量で、2時間IV注入または経口胃管法により、有色ラットおよび非有色ラットに投与した。定量的全身オートラジオグラフィーにより、投与後35日までの時点において、組織分布を決定した。
【０１５８】
放射能は、定性的にはIV投与後も経口投与後も類似する放射能分布パターンで、よく分布した。定量的には、IV投与後の小腸組織における組織中放射能濃度は、経口投与後の小腸組織における濃度のおよそ1/10であった。他の大半の組織では、一般に、経口胃管投与後よりもIV投与後の方が、組織放射能曝露が高かった。大半の組織における放射能のピーク濃度は、経口投与の4〜8時間後または2時間IV注入の終了時に生じた。放射能の濃度が最も高い組織は、投与経路とは関わりなく、クリアランスまたは排出の器官、例えば肝臓、腎臓および小腸と関連づけられた。これらの器官における組織対血漿比（T/P）は高く（＞30）、腎皮質および肝臓については、IV投与経路と経口投与経路の間で類似していた。放射能の濃度が最も低い組織は脳、脊髄、骨格筋、白色脂肪組織および骨であった。脳および脊髄における放射能の結びつきは、IV投与後の方が高かった（血漿中濃度の約20％、これに比べて経口投与後は約5％）。投与後35日の時点で、IV投与後は、骨髄、リンパ節、脾臓および副腎を除くすべての組織で、放射能は定量限界未満であり、これらは、経口投与後に残留濃度を持つ組織（腎皮質、肝臓および小腸）とは異なっていた。メラニン含有組織（眼、ぶどう膜）との特異的な結びつきの証拠は検出されなかった。
【０１５９】
経口経路と比較して、[14C]ブリンシドフォビルのIV投与ではBCV関連放射能の小腸濃度が低くなる。これは、ラットへの反復IV BCV投与後の毒性研究においてGI所見の発生率および重症度が低いことと合致する。
【０１６０】
いくつかの態様では、IV BCV注入に続いて、小腸および大腸における単細胞壊死を、時折、認めた。これらの軽微な可逆的GI所見は、[14C]ブリンシドフォビルのIV注入に続いて腸組織に見られる低い放射能濃度によって説明される。さらに、GI所見は、いかなる用量制限GI毒性（すなわち胃疾患、腸疾患または腸炎）ももたらさなかった。したがって本開示は、BCV関連GI障害を和らげるために使用することができるBCVのIV製剤およびIV BCV投与の方法を提供する。
【０１６１】
IV [14C]ブリンシドフォビル注入後の放射能の分布は、経口BCVと比べて、濃度が経口投与のおよそ1/10であった小腸を除くすべての組織において高かった。
【０１６２】
排泄および分布の要約
IV投与後の排泄
雄SDラットにおいて、15mg/kgでの[14C]ブリンシドフォビルの2時間IV注入後の放射能排出の主要経路は尿中であり、これは、168時間の収集期間で、投与した用量の平均51.2％を占めた。投与した用量の平均42.2％が糞便中に回収された。第1群雄ラットにおける尿と糞便を合わせた放射能の総回収率は、168時間の収集期間で、用量の平均93.5％であった。放射能の尿中排泄および糞便中排泄の大半（約86％）は、投与後最初の24時間に起こった。
【０１６３】
IV投与後の分布
15mg/kgでの雄SDラットへの2時間IV注入投与（第2群）後の血漿における[14C]ブリンシドフォビル総放射能のCmaxは10.3μg当量/mLであって、これは2時間のTmax（すなわち注入の終了時）に起こり、濃度は投与後72時間で0.045μg当量/mLまで減少した。[14C]ブリンシドフォビル総放射能のAUClastは64.4μg当量・時間/mL、t1/2は13.0時間であった。
【０１６４】
[14C]ブリンシドフォビル由来放射能は、15mg/kgでの2時間IV注入後に、白色および有色雄ラットの大半の組織によく分布していて、大半の組織は血漿よりもわずかに高い濃度を有し、特に排泄管組織および消化管組織では血漿よりもはるかに高かった（組織AUCall:血漿比＞1.9）。[14C]ブリンシドフォビル由来放射能のCmaxは、大半の組織では、投与後2時間（すなわち注入の終了時）に見いだされ、その時点でほとんどの組織が1.0〜6.0μg当量/gである濃度を有した。
【０１６５】
血液対血漿比は一般に、注入の開始後1〜24時間の期間にわたって0.89〜1.46の範囲にあり、[14C]ブリンシドフォビル由来放射能がラットへのIV注入後に同様に分布することを示した。72時間時点では、2mg/kgおよび15mg/kgの投与後に、それぞれ1.42および3.06の血液対血漿比が観察された。
【０１６６】
15mg/kgでの2時間IV注入後のそれぞれのTmaxにおいて最も高い濃度（＞20.0μg当量/g）を持つ白色および有色雄ラットの組織は、肝臓、腎皮質、小腸、腎髄質および膀胱に観察された。それぞれのTmaxにおいて最も低い濃度（＜1.0μg当量/g）を持つ組織は、脳、脊髄、白色脂肪、骨、骨格筋および眼水晶体であった。
【０１６７】
QWBAによって決定された、15mg/kgでの2時間IV注入後の最も高い総濃度（＞400μg当量/g）は、IV投与後の[14C]ブリンシドフォビル薬物由来放射能の排出経路を反映して、膀胱内容物、胆汁、および消化管の内容物に観察された。
【０１６８】
大半の組織において組織中濃度は着実に減少したが、投与後168時間において、薬物関連物質の排出は大半の組織において完了していなかった。ただし、放射能を含有する組織はすべて＜1.0μg当量/gである濃度を有した。投与後840時間（最後の試料採取時点）において、放射能は骨髄、リンパ節、脾臓および副腎にまだ存在していたが、これらの組織では、脾臓を除いて、LLOQに近づいていた。（十分なデータポイントと許容できるr2を持つ）すべての組織について、t1/2は血液（心臓）の14.2時間から膵臓の378時間までの範囲にあった。最も長いt1/2を持つ組織は脾臓（378時間）、リンパ節（345時間）、非有色皮膚（310時間）および骨髄（276時間）であった。840時間において定量可能な濃度を持つ組織に関するt1/2は254時間（副腎）〜378時間（脾臓）の範囲にあった。
【０１６９】
用量を2mg/kgに下げて2時間IV注入を行ったラットでも、類似する組織分布パターンが観察された。2mg/kg IV投与後の大半の組織中濃度は、15mg/kg投与と比較して、用量にほぼ比例して増加した（すなわち、7.5倍の用量増加で、4〜15倍の濃度変化）。しかし小腸では、2mg/kgから15mg/kgに用量を増加させると、比例的増加を上回る小腸中濃度の増加が見られた。
【０１７０】
経口後の分布
15mg/kgでの雄LEラットへのPO投与後の血漿における[14C]ブリンシドフォビル総放射能のCmaxは、8時間のTmaxにおいて、1.5μg当量/mLであり、濃度は投与後24時間で0.180μg当量/mLまで減少した。[14C]ブリンシドフォビル総放射能のAUClastは21.0μg当量・時間/mLであり、データポイントが不十分なため、t1/2は決定することができなかった。
【０１７１】
血液対血漿比は、[14C]ブリンシドフォビル由来放射能が、雄LEラットへの[14C]ブリンシドフォビルのPO投与後に、1時間から24時間まで、同様に分布すること（0.76〜1.13の範囲）を示した。
【０１７２】
[14C]ブリンシドフォビル由来放射能は、15mg/kgでのPO投与後に、有色および非有色雄ラットの大半の組織によく分布していて、大半の組織は血漿よりもわずかに高い濃度を有し、とりわけ排泄管組織および消化管組織でははるかに高かった（組織AUCall:血漿比＞4.1）。[14C]ブリンシドフォビル由来放射能のCmaxは、大半の組織では、投与後8時間において見いだされ（38中22の組織）、その時点でほとんどの組織が0.7〜17.8μg当量/gである濃度を有した。
【０１７３】
15mg/kgでのPO投与後にそれぞれのTmaxにおいて最も高い濃度（＞3.3μg当量/g）を持つ有色雄ラットの組織は、小腸、肝臓、腎皮質、胃（胃粘膜）、腎髄質、盲腸、食道、大腸に観察された。それぞれのTmaxにおいて最も低い濃度（＜1.0μg当量/g）を持つ組織は、脊髄、脳、骨、白色脂肪および眼水晶体であった。
【０１７４】
QWBAによって決定された、15mg/kgでのPO投与後の最も高い総濃度（＞36.0μg当量/g）は、PO投与後の[14C]ブリンシドフォビル薬物由来放射能の排出経路を反映して、膀胱内容物、胆汁、および消化管の内容物に観察された。
【０１７５】
有色雄ラットの大半の組織における組織中濃度は着実に減少したが、投与後168時間において、薬物関連物質の排出は大半の組織において完了していなかった。ただし、小腸（5.9μg当量/g）を除くすべての組織が、＜0.4μg当量/gである濃度を有した。投与後840時間（最後の試料採取時点）において、放射能は腎皮質、肝臓および小腸にまだ存在していたが、それらはLLOQに近づいていた。血漿に関するt1/2はおよそ5時間であった。（十分なデータポイントと許容できるr2を持つ）すべての組織について、t1/2は食道の37.2時間から脂肪（褐色）の234時間までの範囲にあった。最も長いt1/2を持つ組織は褐色脂肪（234時間）、脾臓（115時間）、下垂体（106時間）および肺（93時間）であった。840時間の時点で信頼できるt1/2と定量可能な濃度を持つ唯一の組織は、98.1時間の小腸だった。
【０１７６】
PO投与後および2時間IV注入後の組織への分布の比較
Long-EvansラットおよびSprague-Dawleyラットへの[14C]ブリンシドフォビルの2時間静脈内注入または経口胃管法後に、AUCall血液対血漿比は1.1〜1.4の範囲にあった。個々の時点については、血液対血漿比は0.64から1.5の範囲にあり、中央値は1.00であった。理論に束縛されることは望まないが、どちらの投与経路後でも、血液と血漿の間の放射能の分布が類似していることから、血漿から血球への[14C]ブリンシドフォビルの分布の制約はごくわずかであることが示された。
【０１７７】
[14C]ブリンシドフォビルが15mg/kgで単回経口投与されたラットの大半の組織は、観察される最大濃度に4時間または8時間で到達し、ピーク濃度は一般に2時間IV注入が行われたラットに観察されるピーク組織中濃度の約10〜25％であった。しかし小腸では、経口投与後にIV後と比較して6倍高いCmaxが観察された。放射能の経口バイオアベイラビリティ（AUCall PO/AUCall IV）は48％（血液）〜61％（血漿）であった。経口投与後はIV後と比較して、組織のおよそ1/3に低い組織AUC比（AUCpo/AUCIV＜25％）が観察され、中枢神経系、皮膚、骨格筋ならびに一部の内分泌組織および生殖組織では、それが顕著であった。どちらの経路でも、最も高濃度の放射能を持つ組織は排泄器官に関連した（すなわち肝臓、腎臓および腸）。これらの組織のそれぞれでは、組織対血漿比が高く（＞30）、腎皮質および肝臓では、組織/血漿比がIV投与経路と経口投与経路の間で類似していた。投与経路に基づいて予想されるとおり、経口投与後は小腸組織対血漿比が最も高かったが（T/P＝428）、IV注入後も顕著な放射能が小腸に関連づけられた（組織対血漿比32）。組織からの排出は経口投与後840時間において不完全であり、PO投与後は、2時間IV注入後の同じ時点で観察されたものとは異なる腎皮質、肝臓および小腸に、放射能が存在した。小腸において、168時間での残留濃度は、経口投与ラット（5.9μg当量/g）では、[14C]ブリンシドフォビルがIV注入によって投与されたラットの場合（組織中濃度BQL）よりも、かなり高かった。840時間において、残留濃度は、2時間IV注入後の血管/リンパ組織系では、PO投与後に観察された濃度（BQL）と比較して、はるかに高かった。
【０１７８】
有色組織における分布
非有色組織と有色組織との間で放射能の組織分布を比較したところ、有色組織（すなわち眼ぶどう膜系および有色皮膚）における濃度は、非有色組織に観察される濃度と類似していることが明らかになったことから、[14C]ブリンシドフォビル薬物由来放射能とメラニンとの特異的な結びつきはないことが示唆された。
【０１７９】
理論に束縛されることは望まないが、大半の組織では、IV投与後に、より高い濃度の放射能が観察された。これは、高い血中濃度を反映したものでありうる。一つの例外は胃腸組織であった。最も高い濃度を持つ組織は、最高から最低へと並べると、IV投与の場合は肝臓、腎皮質、小腸および腎髄質であり、経口投与の場合は小腸、肝臓、腎皮質、腎髄質および盲腸であった。840時間後に薬物が残留している組織は、IV投与の場合は副腎、脾臓、リンパ節および骨髄であり、経口投与の場合は小腸、肝臓および腎皮質であった。
【０１８０】
このように、いくつかの態様では、低用量のBCVを静脈内投与することによって、経口投与を使った場合に高用量で観察される血漿中濃度と類似する血漿中濃度を与えることができる。したがって本開示は、経口投与の場合に必要な用量よりも低い用量のBCVを使った、ウイルス感染の処置を必要とする対象におけるウイルス感染の処置を提供する。
【０１８１】
ブリンシドフォビルIV投与の薬物動態
下記実施例11に示すとおり、ブリンシドフォビルを健常対象に経口および静脈内の両方で投与した。IVブリンシドフォビル投与は、10mgで、経口投与された100mgのブリンシドフォビルと類似する曝露を与えることがわかった。したがって本開示は、ブリンシドフォビルの静脈内投与を教示する。いくつかの態様において、ブリンシドフォビルのIV投与時に、薬物関連有害事象（例えば胃腸事象）は観察されない。いくつかの態様では、段階的検査異常（graded lab abnormalities）（例えば溶血毒性および腎毒性）が観察されない。
【実施例】
【０１８２】
本開示は以下の実施例によってさらに例証されるが、これらの実施例が、この開示の範囲または要旨を本明細書に記載の具体的手順に限定すると解釈してはならない。実施例は一定の態様を例示するために提供されるのであって、本開示の範囲への限定を意図したものではないと理解すべきである。本開示の要旨および/または添付の請求項の範囲から逸脱することなく、当業者の念頭に浮かびうるそれらのさまざまな他の態様、変更形態および等価物に頼りうることも理解すべきである。
この項には、全体を通してよく使用されうる用語および概念の略号および定義を掲載する。
AUC          時間-濃度曲線下面積
AUCall       すべての時点を含む時間-濃度曲線下面積
AUCinf_obs   観測値を無限大に外挿した時間-濃度曲線下面積
AUClast      定量下限を上回るデータを持つ最後の時点を含む時間-濃度曲線下面積
BQL          定量限界未満
℃           摂氏度
c(BCV)       液状製剤または水性製剤におけるブリンシドフォビルの濃度
c(増量剤)    液状製剤または水性製剤における増量剤の濃度
ca           Circa（およそ）
Cmax         観測された最大濃度
cpm          カウント毎分
％CV         パーセント変動係数
DMA          N,N-ジメチルアセトアミド
dpm          壊変毎分
EDTA         エデト酸二ナトリウム
FVC          カニューレが挿入された大腿静脈
g            グラム
h            時間
HPLC         高速液体クロマトグラフィー
HPbCD        ヒドロキシプロピルベータ-シクロデキストリン
IV           静脈内
kg           キログラム
L            リットル
LE           Long-Evans
LLOQ         定量下限
LSC          液体シンチレーション計数
MB           物質収支
MBq          メガベクレル
mCi/mmol     ミリキュリー/ミリモル
MCID         MicroComputer Image Device
MDC          Molecular Dynamicsカウント
mg           ミリグラム
mSv          ミリシーベルト
μg equiv/g  マイクログラム当量/グラム組織
min          分
mL           ミリリットル
mm           ミリメートル
n            観測数
NA           該当なし（Not Applicable）
NI           同定せず（Not Identified）
NC           算出せず（Not Calculated）
NS           試料採取せず（Not Sampled）
NMP          N-メチル-2-ピロリドン
PEG          ポリエチレングリコール
PG           プロピレングリコール
PK           薬物動態
PO           per os（経口投与）
ROA          投与経路
SD           Sprague Dawleyまたは標準偏差
t1/2         最終排出半減期
Tmax         Cmaxの時刻
ULOQ         定量上限
QWBA         定量的全身オートラジオグラフィー
【０１８３】
実施例1-液状製剤開発
ブリンシドフォビルの静脈内投与用製剤を開発するために、さまざまな素の（plain）液状製剤（すなわち凍結乾燥前製剤またはバルク製剤）を調製し、試験した。
【０１８４】
ブリンシドフォビルのpH安定性: 20％メタノールを含有するpH6.0〜8.0の50mMリン酸緩衝液にブリンシドフォビル試料保存溶液（50μg/mL）を調製した。試料を小分けして、2つの温度（T＝2〜8℃およびT＝40℃）で保管し、2週間にわたる複数の時点においてpHおよびブリンシドフォビルの回収率をモニターした。どちらの条件でも、試料は実験の時間経過中はずっと、pHレベルを維持した。
【０１８５】
2〜8℃での保管: 2〜8℃で保管した試料の場合、pH6.0および6.5では、t＝2日において沈殿が観察された。pH7.0では、t＝4日において沈殿が観察された。さらに高い目標pH（pH＝7.5およびpH＝8.0）で調製した試料が、実験の時間経過中はずっと、外観に観察可能な変化を示さなかったのに対し、pH6.0、6.5および7.0で調製した試料は、最初の時点との比較でブリンシドフォビル濃度の有意な減少を示した。この減少は観察された沈殿に関係しうる。pH7.0の場合、変動はt＞8日で観察される。ピーク積分値に適用される設定された総ピーク面積閾を超える1つの不純物（RT＝4.7分）が検出された。総ピーク面積のパーセンテージは、pH6および6.5の試料については0.4％未満であり、それより高いpHの試料については0.1％未満であった。
【０１８６】
40℃での保管: 40℃で保管した試料の場合、外観の物理的変化はどのpHの試料についても観察されなかった。ブリンシドフォビル濃度の変動は、40℃で研究したpH条件のすべてについて、ごくわずかしか観察されなかった。ブリンシドフォビルの濃度は多少のゆらぎを示したものの、有意な傾向を観察することはできなかった。HPLCクロマトグラムの概観的表示（synoptic display）により、この実験の過程におけるさまざまなpH条件での不純物形成の相違が明らかになった。低pHの試料については、ブリンシドフォビルの脱アミノ化生成物に関連するピークが観察され、pH6.0では1.91、pH6.5では0.58の面積％に達した。分解生成物ピークは中性pH以上では観察されない。
2019519570.tif 000007
【０１８７】
ブリンシドフォビル製剤の調製および特徴づけ
媒体および製剤の調製:ブリンシドフォビル製剤用の媒体を、有機賦形剤、5×リン酸ナトリウム緩衝液保存物（pH6.0、6.5、7.0、7.5および8.0）ならびに等張化剤およびEDTAの保存溶液から調製した。固形ブリンシドフォビルを媒体に溶解してc(BCV)＝6.4mg/mLの濃度を得た。外観（2〜8℃で保管したときの沈殿を含む）を評価し、pHを測定した。この研究の結果を表1に要約する。
【０１８８】
（表１）媒体および製剤の沈殿状態およびpH。製剤＃30〜32を除くすべての製剤をリン酸Na緩衝液（100nM）で調製した。
2019519570.tif 000008
2019519570.tif 000009
1製剤は周囲温度で調製し、1日目の時点までは周囲温度に保った。1日目に溶血アッセイを実行した後、試料を2〜8℃で保管した。2N:沈殿は観察されなかった。3Y:沈殿が観察された。4N/A:該当なしまたは測定せず
【０１８９】
媒体は透明な無色の溶液であった。沈殿は媒体＃11および＃12で観察され、媒体＃29は透明な淡黄色溶液であった。製剤＃11および＃12はそれぞれの媒体から沈殿を引き継いだ。製剤＃18、＃30、＃31および＃32は調製後1日目に沈殿が観察された。2日目以降は製剤を2〜8℃で保管し、12日間にわたって外観をモニターした。
【０１９０】
ブリンシドフォビル回収率:表1のブリンシドフォビル製剤を調製後2日目および7日目にc(BCV)に関して分析した。初期沈殿を示した製剤は2日目に試験しなかった。7日目までに沈殿を示した製剤は遠心分離およびHPLC回収率分析に付した。結果を表2に要約する。
【０１９１】
（表２）ブリンシドフォビル製剤のHPLC回収率
2019519570.tif 000010
【０１９２】
媒体＃11および＃12は、製剤の調製（すなわちブリンシドフォビルの添加）時に、沈殿を形成することがわかった。低いpHを持つ製剤は、Cremophor（登録商標）、PEG300、ポリソルベート80およびエタノールなどの可溶化賦形剤の存在下で沈殿を形成し（製剤＃1、＃6、＃18および＃22）、一方、組成は同じだがpHが高い製剤（製剤＃2、＃7、＃19および＃24）はブリンシドフォビルを可溶化する能力を維持していた（表1）。純粋な有機製剤（製剤＃30、＃31および＃32）は、ブリンシドフォビルに対して限られた可溶化能を示した。
【０１９３】
HPLC回収率データは、保管条件（2〜8℃）下およびc(BCV)＝6.4mg/mLにおいて、一部の製剤が、ブリンシドフォビルを絶えず可溶化しておくには適していないことを証明している。さらにまた、これらのデータは、約8.0以上のpHを持つ製剤がブリンシドフォビルを可溶化できることを証明している。
【０１９４】
さらなる製剤（製剤＃33〜40および＃49〜56）を調製し、ブリンシドフォビルの平衡溶解度および濾過性について試験した。
【０１９５】
製剤媒体＃33〜40および＃49〜56をブリンシドフォビルで飽和させ、周囲温度で回転させた。試料上清中のブリンシドフォビルの回収率を異なる時点において決定することで、いつ溶解平衡に到達するかを確立した。
【０１９６】
平衡溶解度研究の飽和上清を濾過性評価に付した。そのために、約900μLの飽和溶液をシリンジフィルタ（25mm、0.2μm PESメンブレン）で濾過した。濾過の容易さを記録し、濾液中のpHを測定し、ブリンシドフォビル回収率をHPLC分析によって決定した。無菌濾過によって不純物が導入されるかどうかを評価するために、飽和製剤媒体のHPLCクロマトグラムを、濾過段階前と濾過段階後とで、定性的に比較した。それらを示す。製剤＃33〜40および＃49〜56のそれぞれの組成、ならびにそれらのpH、溶解平衡におけるc(BCV)および濾過の容易さを、表3に要約する。
【０１９７】
（表３）ブリンシドフォビルの溶解度および濾過性評価の要約。すべての製剤において緩衝液は100mMリン酸Naであった。
2019519570.tif 000011
【０１９８】
被験製剤におけるブリンシドフォビルの平衡溶解度は4〜30mg/mLの範囲にあり、見掛けのpH＝6.3〜6.9（周囲温度）の範囲内で平均溶解度はc(BCV)＝25mg/mLであった。いくつかの態様では、平衡溶解度試験において観察された相対的に高いブリンシドフォビル濃度が、媒体pHの有意なシフトにつながった。ブリンシドフォビルで飽和させた製剤の、選ばれたシリンジフィルタによる濾過は、濾過の容易さ、ブリンシドフォビルの損失、または不純物の導入に関して何の問題も示さなかった。
【０１９９】
実施例2-ブリンシドフォビル製剤試験
100mMリン酸および69mMデキストロースを含む製剤媒体（媒体/製剤＃57）を調製し、a）平衡溶解度およびb）濾過性に関してさらに試験した。
【０２００】
a）ブリンシドフォビル溶解度評価
媒体＃57の2つの試料をブリンシドフォビルで飽和させた。一方の試料媒体は、さらなるpH調節を行わずにブリンシドフォビルで飽和させ（これにより製剤pHは6.9になる）、もう一つの試料のpHは水酸化ナトリウム溶液（1N）を使ってpH＝8.0に再調節した。ブリンシドフォビルを溶解するとpHは低pH値に向かってドリフトし、次にそれが、ブリンシドフォビル溶解度を平衡に達するまで変化させた。結果として、さらにブリンシドフォビルを加えるには、pHを目標pHに近づける必要があった。pH調節した試料では、平衡溶解度条件でのブリンシドフォビルの濃度に到達しなかった。試料に約300mg/mLの追加ブリンシドフォビル固体を補足した後、固形ブリンシドフォビルの添加を停止した。
【０２０１】
両試料溶液/上清におけるブリンシドフォビルの回収率（HPLCアッセイ）を平衡時および24時間後に決定した。周囲温度で、製剤57におけるブリンシドフォビルの平衡溶解度は、pH＝6.9の見掛けのpHにおいて、c(BCV)＝25mg/mLであり、24時間後は26mg/mLであった。pH＝8の試料の場合、観察されたブリンシドフォビル濃度は24時間後で348mg/mLであり、平衡溶解度には到達せず、c(BCV)＞270mg/mLであった。
【０２０２】
b）濾過性評価
製剤＃57の濾過性をc(BCV)＝20、10および0.5mg/mLで試験した。c(BCV)＝20mg/mLの試験溶液はNaOH溶液（1N）を使ってpH＝8.0に調節し、D5Wによる希釈でそれより濃度の低い試験溶液を調製するために、保存溶液として応用した。試験溶液をシリンジフィルタ（25mm、0.2μm PESメンブレン）で濾過した（フィルタ通過量（filter pass）5mL）。濾過の容易さを観察し、pHおよびブリンシドフォビル回収率（HPLCアッセイ）を、濾過前段階および濾過後段階で記録した。有意なpHの変化、ブリンシドフォビルの損失または不純物の導入は、いずれも観察されなかった（表4）。
【０２０３】
（表４）製剤57媒体におけるブリンシドフォビルの濾過性評価
2019519570.tif 000012
【０２０４】
実施例3-製剤研究および評価
ブリンシドフォビル製剤を調製するための配合プロセスを開発し、等張化剤（デキストロース）非含有製剤について指定した。安定性研究および試験のために、以下のブリンシドフォビル製剤を最大0.5Lのスケールで調製した。
10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0、69mMデキストロース
15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0、69mMデキストロース
10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0（等張化剤非含有）
【０２０５】
等張化剤含有製剤（デキストロース入り）
等張化剤としてデキストロースを含有するブリンシドフォビル製剤を、安定性研究Iおよび注入媒体適合性評価に適用した。対応する製剤調製の概略は以下のとおりである。
1.対応するリン酸ナトリウム種をDI水にメスフラスコを使って溶解することにより、500mM（2.5×）一塩基性リン酸ナトリウム溶液および500mM（2.5×）二塩基性リン酸ナトリウム溶液を調製した。
2. pHを制御しながら500mM（2.5×）の一塩基性リン酸ナトリウム溶液と二塩基性リン酸ナトリウム溶液とを混合することで、pH＝8.0の500mM（2.5×）リン酸ナトリウム緩衝剤溶液を調製した。
3.固形デキストロースをpH＝8.0の500mM（2.5×）リン酸ナトリウム溶液に溶解し、適量の水を用いて、400mM（2×）リン酸ナトリウム、138mM（2×）デキストロース、pH＝8.0の媒体保存溶液を調製した。
4.ブリンシドフォビルを、媒体保存溶液（400mM（2×）リン酸ナトリウム、138mM（2×）デキストロース溶液、pH＝8.0）に、所望の最終濃度の2倍になるように、メスフラスコを使って溶解した。pHを制御しながら、水酸化ナトリウム溶液を加えることで、溶液をpH＝8.0に調節した。適量のDI水を用いて、pH＝8.0の、200mM（1×）リン酸ナトリウム、69mM（1×）デキストロースを含有する、所望のブリンシドフォビル濃度の製剤を得た。
【０２０６】
等張化剤非含有製剤（デキストロースなし）
安定性研究IIならびに吸着評価および材料適合性評価に関連する実験の大部分には、デキストロースを欠くブリンシドフォビル製剤を適用した。等張化剤非含有製剤は次のように調製した。
1.対応するリン酸ナトリウム種を水に溶解すること（メスフラスコ）によって、400mM（2×）一塩基性リン酸ナトリウム溶液および400mM（2×）二塩基性リン酸ナトリウム溶液を調製した。
2. pHを制御しながら400mM（2×）の一塩基性リン酸ナトリウム溶液と二塩基性リン酸ナトリウム溶液とを混合することで、pH＝8.0の400mM（2.5×）リン酸ナトリウム緩衝剤溶液（媒体溶液）を調製した。
3.ブリンシドフォビルを、媒体溶液（pH＝8.0の400mM（2×）リン酸ナトリウム）に、所望の最終濃度の2倍になるように、500mLメスフラスコを使って溶解した。1N水酸化ナトリウム溶液をVNaOH［mL］＝1.65×mBCV［g］の体積で加えた。適量のDI水を用いて、pH＝8.0の200mMリン酸ナトリウム緩衝剤中に所望のブリンシドフォビル濃度の製剤を得た。
4.より低いブリンシドフォビル濃度を調製するために、調製した製剤を対応する媒体で所望の強度まで希釈した。
【０２０７】
安定性研究I:等張化剤（デキストロース）を含有するブリンシドフォビル製剤
計画およびセットアップ:この研究では、製剤57の化学的安定性および物理的安定性を評価した。化学的分解の試験は、加速因子/ストレス因子として熱を適用する加速安定性研究セットアップにおいて行った。アレニウス分析を実行して、より低温でのAPI半減期および分解速度を得た。物理的安定性は所望の保管温度（2〜8℃）で評価し、ベンチマーク/リファレンス条件も、同様に研究に含めた。この研究のセットアップを以下に指定する。
試験溶液：
10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、69mMデキストロース、pH＝8.0、
15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、69mMデキストロース、pH＝8.0、
媒体対照1: 200mMリン酸ナトリウム、69mMデキストロース、pH＝8.0（75℃のみ）、
媒体対照2: 200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0（75℃のみ）。
安定性試験ステーション温度：
加速安定性研究: 50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、
物理的分解およびベンチマーク安定性研究: 2〜8℃、25℃。
時点：
加速安定性研究: 初期、2日、6日、9日、14日、
物理的分解およびベンチマーク安定性研究:初期、14日および28日、
媒体対照:初期、1日、5日、8日および14日。
試験：
ブリンシドフォビル製剤:外観、pH、c(BCV)回収率（HPLC）、純度（HPLC）および液中粒子計数（物理的分解およびベンチマーク安定性研究）、
媒体対照:外観およびpH。
【０２０８】
安定性試験結果（加速条件）、すなわち安定性研究の間のpHの変化およびブリンシドフォビル回収率の傾向を、10mg/mLおよび15mg/mLの製剤について、それぞれ表8および表9に要約する。強い二相性速度傾向を持つ加速安定性研究では、アレニウス分析ができず、ブリンシドフォビル半減期の計算も典型的保管条件での分解速度への外挿もできなかった。加速安定性研究における媒体対照に関する試験結果（75℃ステーションのみ）を表5に要約する。
【０２０９】
（表５）10mg/mLブリンシドフォビル製剤の加速安定性研究結果（研究I）
2019519570.tif 000013
2019519570.tif 000014
1溶液の黄色は0〜10の尺度で表した（0、無色；5、暗黄色；10、黄褐色）。23つの複製物の平均値。3BCV回収率＝c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100％。
【０２１０】
（表６）15mg/mLブリンシドフォビル製剤の加速安定性研究結果（研究I）
2019519570.tif 000015
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1溶液の黄色は0〜10の尺度で表した（0、無色；5、暗黄色；10、黄褐色）。23つの複製物の平均値。3BCV回収率＝c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100％。初期時点を100％と定義した。
【０２１１】
（表７）加速安定性研究:媒体対照の結果（研究I）
2019519570.tif 000017
1溶液の黄色は0〜10の尺度で表した（0、無色；5、暗黄色；10、黄褐色）。
【０２１２】
この研究は2週間の間に16％（50℃）〜22％（75℃）のブリンシドフォビルの分解を示した。ブリンシドフォビル回収率に多少の損失（アッセイ損失（assay loss））は観察されたが、ブリンシドフォビルの純度は、70℃までの温度については、それぞれ95％〜93％のままであった。75℃ステーションでは、16％までの不純物がどちらの出発濃度でも観察された。高温での分解は、低pH値への強いpHシフトと溶液の着色を伴った。pHシフトおよび分解速度は初期時点の方が高く、2日後には分解およびpHシフトが有意に減速した（一次分解（first-order decomposition）に従わない二相性傾向）。
【０２１３】
物理的分解およびベンチマーク安定性研究
両被験製剤に関する物理的/ベンチマーク安定性の結果を、それぞれ表11および表12に要約する。研究中に異なる温度および異なる時点で得られたクロマトグラムを比較することによって、異なる温度における製剤の純度を決定した。1ヶ月で6％（2〜8℃）および8％（25℃）の分解が観察されたが、その間、ブリンシドフォビルの純度は99％のままであった。これは、ブリンシドフォビルの質量欠損（mass deficit）を示す。
【０２１４】
（表８）10mg/mLブリンシドフォビル製剤の物理的分解およびベンチマーク安定性研究結果（研究I）
2019519570.tif 000018
13つの複製物の平均値。2積分領域: 2.00〜13.00分。3BCV回収率＝c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100％。初期時点を100％と定義した。
【０２１５】
（表９）15mg/mLブリンシドフォビル製剤の物理的分解およびベンチマーク安定性研究結果（研究I）
2019519570.tif 000019
13つの複製物の平均値。2積分領域: 2.00〜13.00分。3BCV回収率＝c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100％。初期時点を100％と定義した。
【０２１６】
光妨害測定:液中粒子計数用の試料を調製するために、最善の清浄条件下で、6本のセラムバイアル（充填量1.0mL）からの製剤試料を注意深く（泡立たないように）粒子非含有遠心分離チューブ中に合わせた。次に、チューブに蓋をして、1分間超音波処理してから、液中粒子計数に付した。1mLの4試料ストロークを分析した。液中粒子計数器の吸込速度（drawing rate）は10mL/分であった。研究の間、粒状物の有意な増加は観察されなかった。この試験の試験結果を表10に要約する。
【０２１７】
（表１０）10mg/mLおよび15mg/mLブリンシドフォビル製剤の液中粒子計数結果（研究I）
2019519570.tif 000020
【０２１８】
安定性研究II:等張化剤（デキストロース）を含まないブリンシドフォビル製剤
計画およびセットアップ:液状ブリンシドフォビル製剤の化学的および物理的分解特性を評価するために計画された安定性研究Iを、デキストロースの非存在下で繰り返した。溶液の変色（潜在的メイラード褐変）およびpHシフトはデキストロースの存在と相関する可能性があり、それが、ブリンシドフォビル分解に関して、分解経路に影響を及ぼし、観察された分解速度を損なったかもしれない。この反復分析のための研究セットアップでは、被験製剤および安定性試験ステーションパラメータに関して変更を加えた。厳密なパラメータを以下に指定する。
試験溶液：
15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0、
媒体対照1: 200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0。
安定性試験ステーション温度：
加速安定性研究: 50℃、60℃、70℃および75℃
物理的分解およびベンチマーク安定性研究: 2〜8℃および25℃。
時点：
加速安定性研究:初期、3日、6日、10日、14日、
物理的分解およびベンチマーク安定性研究:初期、14日および28日、
試験：
ブリンシドフォビル製剤:外観、pH、c(BCV)回収率（HPLC）、純度（HPLC）および液中粒子計数（物理的分解およびベンチマーク安定性研究試料のみ）、
媒体対照:外観、pHおよび液中粒子計数（物理的分解およびベンチマーク安定性研究試料のみ）。
【０２１９】
結果:被験製剤および媒体対照のブリンシドフォビル回収率および純度に関する安定性試験結果をそれぞれ表11および表12に要約する。
【０２２０】
（表１１）15mg/mLブリンシドフォビル製剤の加速安定性研究結果（研究II）
2019519570.tif 000021
2019519570.tif 000022
a3つの複製物の平均値。b積分領域: 0.00〜13.00分。cこの時点のデータは乾燥機の故障によって損なわれていたので、以下のグラフ表現または計算には含めなかった。
【０２２１】
（表１２）媒体対照の加速安定性研究結果（研究II）
2019519570.tif 000023
a該当なし。bこの時点のデータは乾燥機の故障によって損なわれていたので、以下のグラフ表現には含めなかった。
【０２２２】
ブリンシドフォビル回収率の値と純度に関する値は整合しないことがわかる。これは、少なくとも部分的には、クロマトグラフィートレースの注入ピーク面積（0.00〜2.1分）は積分されなかったが、積分されなかった保持時間面積には公知の分解生成物が含まれている可能性が高いので、それが、純度値を過大評価することになりうるという事実に起因する。加えて、ブリンシドフォビルとその脱アミノ化生成物との間のベースライン分離は、既存の方法では達成できず、それが、回収率値（分解）および純度値に影響を及ぼしたのかもしれない。
【０２２３】
得られた回収率データを応用して、アレニウス分析により、すなわちブリンシドフォビル回収率を時間の関数として対数プロットし、線形フィットによって速度定数を決定することによって、異なる温度における分解速度を決定した。デキストロース非含有15mg/mLブリンシドフォビル製剤に関する半減期は、こうして、5℃および25℃の安定性試験ステーション温度において、それぞれ729日および295日と決定された。そのアレニウス分析を図2に図解する。
【０２２４】
物理的分解およびベンチマーク安定性研究
研究対象の製剤および媒体対照に関する物理的/ベンチマーク安定性の結果を、それぞれ表13および表14に要約する。
【０２２５】
（表１３）15mg/mLブリンシドフォビル製剤の物理的分解およびベンチマーク安定性研究結果（研究II）
2019519570.tif 000024
13つの複製物の平均値。3BCV回収率＝c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100％。初期時点を100％と定義した。
【０２２６】
（表１４）媒体対照の物理的分解およびベンチマーク安定性研究結果（研究II）
2019519570.tif 000025
1該当なし。
【０２２７】
粒状物を分析するために、1本のセラムバイアル（充填量5.0mL）からの製剤試料を、バイアルのクリンプを外す（decrimping）前に、1分間超音波処理した。等張化剤非含有試料を、等張化剤含有製剤について上述したように、液中粒子計数に付した。この分析の結果を表15に要約する。
【０２２８】
（表１５）等張化剤非含有15mg/mLブリンシドフォビル製剤および媒体対照の液中粒子計数結果（研究II）
2019519570.tif 000026
【０２２９】
保管条件（2〜8℃および25℃）における等張化剤非含有製剤中のブリンシドフォビルの分解は、1ヶ月にわたって、無視できる程度であった。1％の名目分解はブリンシドフォビル定量の誤差内であり、質量欠損および粒状物はどちらも観察されなかった。
【０２３０】
バイアルおよびストッパーへのブリンシドフォビル吸着の評価
計画およびセットアップ:バイアルおよび/またはストッパーへのブリンシドフォビルの吸着について試験するために、ブリンシドフォビルに関する吸着評価を行った。そのために、影響があるかもしれないさまざまな保管条件（例えばバイアルの向き）を評価した。ブリンシドフォビルの溶液を製剤強度（10mg/mL）および低濃度（0.2mg/mL）で研究した。
【０２３１】
吸着について試験するために、吸着された材料を再び可溶化するのに適した有機溶媒（メタノール）による処理を、さまざまな時点で履行し、水による処理または無処理試料と比較した。メタノールを含有する試料において（希釈に関する標準化後に）より高いブリンシドフォビル濃度が観測されるのであれば、吸着効果が示されたことになるだろう。課される体積収縮の、適用した溶媒間での相違は考慮しない。この研究は、200mMリン酸ナトリウム（pH＝8.0）中の10mg/mLおよび0.2mg/mLのブリンシドフォビルの溶液を使って、2〜8℃および25℃の温度で行った。溶液の外観、pH、ブリンシドフォビル回収率（HPLC）および純度（HPLC）を、最初および1日後、2日後および7日後に試験した。一部の試料はメタノール（1.0mL）または水（1.0mL）の添加によってさらに処理した。この研究の結果を表16および表17に要約する。
【０２３２】
（表１６）吸着評価における10mg/mLブリンシドフォビル製剤の試験結果
2019519570.tif 000027
2019519570.tif 000028
1処理を受けた試料の3つの複製物の平均値。2BCV回収率＝c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100％。初期時点を100％と定義した。BCV回収率は、処理ありの試料および処理なしの試料について、初期時点を100.00％と定義した。3処理なしの試料については該当なし。4初期時点の試料はどの条件にも付さなかった。
【０２３３】
（表１７）吸着評価における0.2mg/mLブリンシドフォビル製剤の試験結果
2019519570.tif 000029
2019519570.tif 000030
a処理を受けた試料の3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100％。初期時点を100％と定義した。BCV回収率は、処理ありの試料および処理なしの試料について、初期時点を100.00％と定義した。c初期時点の試料はどの条件にも付さなかった。
【０２３４】
異なる処理を施した試料を比較しても吸着現象の証拠は何も示されなかった。研究したパラメータに有意差は観察されなかった。すなわち、外観または純度の有意な変化およびブリンシドフォビルの有意な損失は、いずれも観察されなかった。観察された質量欠損は複製調製物の標準偏差によって表される試料調製誤差の範囲内であった。
【０２３５】
製剤適合性評価
一連の材料を製剤との適合性について試験した。これには、製造段階、前臨床毒性材料学および臨床試験からの材料を試験することが含まれる。適用された適合性試験では、1）吸着または沈殿によるブリンシドフォビルの潜在的損失（外観、HPLCによるブリンシドフォビル回収率）および2）安定性を損ないうるpHのシフトを評価する。試験した材料には、注入媒体、滅菌用フィルタ、製品バイアルおよびストッパー、試験動物（ラット）のための注入システムならびに臨床応用のための注入バッグおよびIVシステムが含まれる。
【０２３６】
10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウムおよび69mMデキストロース（pH＝8.0）を含むブリンシドフォビル製剤を試験注入媒体（5％デキストロース溶液）で希釈することで、c(BCV)＝0.5mg/mLおよび1.0mg/mLの溶液を得た。これらの希釈溶液を周囲条件で保管し、まず実験の開始時に、そして2時間後、8時間後および24時間後に試料を収集し、外観、pHおよびc(BCV)の回収率（HPLCによる）について評価した。周囲条件で24時間にわたって、被験溶液では、外観、pHまたはc(BCV)のいずれにも、有意な変化は観察されなかった。この研究の詳細な結果を以下に要約する（表18）。
【０２３７】
（表１８）注入媒体適合性評価の結果
2019519570.tif 000031
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n時間目/c(BCV)0時間目×100％。初期時点の試料を100％と定義した。
【０２３８】
滅菌フィルタ適合性
本開示の製剤を滅菌フィルタ適合性について評価した。試験ブリンシドフォビル製剤のアリコートを、以下のように、対応するシリンジフィルタで濾過した。
A: フィルタ: 0.2μm、25mm、シリンジフィルタ、Supor（登録商標）メンブレン（PES）、無菌；試験溶液: 10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0；試験体積: 10mL。
B: フィルタ: 0.2μm、25mm、シリンジフィルタ、Posidyne（登録商標）メンブレン、無菌；試験溶液: 10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0；試験体積: 10mL。
C: フィルタ: 0.22μm、33mm、シリンジフィルタ、Durapore（登録商標）PVDFメンブレン、γ線照射品；試験溶液: 2mg/mLブリンシドフォビル、4mMリン酸ナトリウム、pH＝約8、およそ5％のデキストロース（5％デキストロース溶液を含む、10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0の50倍希釈液）；試験体積: 50mL。
【０２３９】
濾液の最初の10％と最後の10％を収集した。収集した濾液の試料を、濾過前製剤の試料と共に、それぞれの外観、pHおよびc(BCV)について評価した。
【０２４０】
（表１９）滅菌フィルタ適合性評価の結果
2019519570.tif 000032
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)濾過後/c(BCV)濾過前×100％；濾過前試料を100％と定義。
【０２４１】
濾過された溶液を対応する濾過前試料と比較したところ、外観、pHまたはc(BCV)に有意な変化は観察されず、濾過中に不純物が導入されることもなかった。
【０２４２】
薬物製品バイアルおよびストッパー適合性
本開示の製剤を滅菌フィルタ適合性について評価した。試験製剤（5mL、10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0）を、一組のAfton滅菌Ready-To-Fill（登録商標）バイアルに分注した。バイアルにWest NovaPure（登録商標）ストッパーで栓をして、Afton Ready-To-Fill（登録商標）滅菌シールでクリンプし、上向きおよび下向きに周囲条件で6時間保管した。充填溶液の試料を充填前およびそれぞれの条件下で6時間保管した後に収集した。収集した試料をそれぞれの外観、pHおよびc(BCV)について評価した。試験したバイアルおよびストッパーと6時間接触した後の被験製剤について、外観、pHまたはc(BCV)に有意な変化は観察されなかった。接触に続いて新たな不純物が導入されることはなかった。
【０２４３】
（表２０）薬物製品バイアルおよびストッパー適合性評価の結果
2019519570.tif 000033
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n時間目/c(BCV)充填前×100％。充填前試料を100％と定義した。
【０２４４】
前臨床材料適合性評価（ラット）
注入システムアセンブリ（ラット）
以下のブリンシドフォビル製剤の、ラットへの投与のための注入システムアセンブリ（シリンジ、テザー、カテーテルおよびシリンジポンプからなる）との適合性を試験した。
a）0.2mg/mLブリンシドフォビル、4mMリン酸ナトリウム、pH＝約8.0、およそ4.90％のデキストロース、
b）1.5mg/mLブリンシドフォビル、30mMリン酸ナトリウム、pH＝約8.0、およそ4.25％のデキストロース。
【０２４５】
どちらの溶液も、開発されたブリンシドフォビル製剤（10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0）を5％デキストロース溶液で希釈することによって調製した。試験手順は次のように要約することができる。
1. バルク試験溶液（0.2mg/mL BCV、4mMリン酸ナトリウム、pH＝約8.0、およそ4.90％のデキストロースおよび1.5mg/mL BCV、30mMリン酸ナトリウム、pH＝約8.0、およそ4.25％のデキストロース）の外観、pHおよびc(BCV)を接触前に評価した。
2. およそ5mLの試験溶液をシリンジに吸い込んでから、そのシリンジを、組み立てられた注入システム（Vascular Access Harness（VAH）テザーキット、ラットジャケット用VAHポートおよびカテーテル）に接続した。
3. 注入システムに、手動で試験溶液を充填した。およそ200μLの試験溶液を注入システムから押し出し、外観およびc(BCV)の評価のために、ライン端（end-of-line）試料として収集した（t0）。
4. 試験注入システムのシリンジをシリンジポンプにマウントし、2.4mLの総吐出体積に対して流速を1.2mL/時（20μL/分）に設定した（120分）。
5. 実験の間、フロースルー全体を収集した。各時点（t10min、t105min）において、ライン端試料（およそ200μL）を分析のために収集した。
6. バルクフロースルーのpHは実験の最後（t120min）に測定した。それ以前の時点で取得した試料の体積（200μL）は標準的なpH測定にとっては小さすぎたからである。
この研究の結果を表21に要約する。
【０２４６】
（表２１）前臨床注入システム適合性評価の結果
2019519570.tif 000034
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n分目/c(BCV)接触前×100％、接触前試料を100％と定義した。n.a.:データなしまたは該当なし。
【０２４７】
試験＃1（0.2mg/mLブリンシドフォビル）については、c(BCV)に10％の初期損失が観察されたが、これは試験注入システムへの吸収に帰することができる。低濃度で初期吸着効果（表面飽和）が観察されることは多く、この例の場合、観察された損失の完全な回収は試験中には観察されず、t＝105分で、6％のブリンシドフォビル損失が観察された。外観にもpHにも有意な変化は観察されなかった。試験＃2については、c(BCV)の有意な損失も外観もしくはpHの変化も、実験の間は観察されなかった。
【０２４８】
臨床材料評価
注入バッグ適合性
標準的ミニ注入バッグ（100mL）を以下の製剤との材料適合性試験に付した。
15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0。
注入バッグへの希釈後の被験製剤強度はおよそ次のとおりである：
0.1mg/mLブリンシドフォビル、5.3mMリン酸ナトリウム、pH≒8.0（5％デキストロース中）、
1.0mg/mLブリンシドフォビル、13.3mMリン酸ナトリウム、pH≒8.0（5％デキストロース中）。
試験臨床注入バッグを以下のとおり指定する。
注射用5％デキストロース（USP）、100mL VIAFLEX注入バッグ。
【０２４９】
開発されたブリンシドフォビル製剤（15mg/mLブリンシドフォビル、注入バックへの注入によって、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0）を、c(BCV)＝0.1mg/mLおよびc(BCV)＝1.0mg/mLに希釈した。次に注入バッグを周囲条件で保管し、外観、pHおよびc(BCV)の評価のために、各時点（t0、t1h、t8hおよびt24h）において注入バッグから試料を収集した。対照として、5％デキストロース溶液を別の注入バッグから取り出し、その5％デキストロース溶液による試験製剤のバック外での希釈（標準的な実験用ガラス器具）を、同一の希釈倍率を適用して行った。バッグ外で希釈した溶液の試料も同様に分析した。結果を表22に要約する。
【０２５０】
（表２２）臨床注入バッグ適合性評価の結果
2019519570.tif 000035
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n時間目/c(BCV)0時間目×100％。t0試料を100％と定義した。
【０２５１】
どちらのc(BCV)でも試験注入バック中の希釈溶液については、外観にもpHにもc(BCV)にも有意な変化は観察されなかった。バッグ外での希釈の方がブリンシドフォビル回収率が高いのは、おそらく、注入バッグは一般に過充填されている（100mLバッグで、105〜115mL、平均110mL-Baxterからの情報）という事実がもたらしたのだろう。同一の希釈倍率を適用し、t0時点を標準化に使用すれば（100％と定義）、バッグ外での希釈について決定された濃度は過大に見積もられている。単一注入バッグでのバッグ内研究で100mL注入バッグ中の注入溶液の体積を評価したところ、約109mLであった。
【０２５２】
臨床注入システム適合性
2種の注入システム（2つのインターリンク（INTERLINK）インジェクションサイト、雄ルアーロック（Luer-lok）アダプタを持つBaxter Non-DEHP CONTINUO-FLO溶液セット、および15ミクロンフィルタ、1つの非無針（non needle free）インジェクションサイトを持つBrown Rate Flow（登録商標）レギュレーターIVセット）を、以下の製剤との適合性について試験した。
15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0。
注入バッグへの希釈後の被験製剤強度はおよそ次のとおりである：
0.1mg/mLブリンシドフォビル、5.3mMリン酸ナトリウム、pH＝約8.0（5％デキストロース中）、1.0mg/mLブリンシドフォビル、13.3mMリン酸ナトリウム、pH＝約8.0（5％デキストロース中）。
【０２５３】
試験手順は次のように要約することができる。
1. 開発されたブリンシドフォビル製剤（15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH8.0）を、上述の注入バッグ（リザーバ機能）に注入することで、c(BCV)＝0.1mg/mLまたは1.0mg/mLの試験溶液を得た。c(BCV)（t24h, バッグ）の評価のために、試料を注入バッグから収集した。
2. 注入バッグを周囲温度で24時間インキュベート（「熟成」）してから、評価（外観、pH、c(BCV)）のために、別の試料（t0, バッグ）を注入バッグから収集した。
3. 被験注入システムを注入バッグに取り付け、手動で注入バッグから溶液を充填した。分析のためにおよそ1mL（3つ一組）の試験溶液をライン端（end-of-line）試料として収集した（t0, eol）。
4. 試験注入システムを閉じ、周囲温度で次の時点まで保管した。およそ17mLの試験溶液（注入システムの体積）を排液してから、もう一つのライン端試料（1mL、3つ一組）を分析のために収集した（t10min, eol、t3h, eolおよびt6h, eol）。
【０２５４】
（表２３）臨床注入システム適合性評価の結果
2019519570.tif 000036
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n時間目/c(BCV)0時間目×100％。
t0,バッグ試料を100％と定義した。
【０２５５】
低c(BCV)＝0.1mg/mLの試験溶液では、どちらの試験臨床注入システムでも、c(BCV)の初期損失（最大6％）が観察された。この観察結果は、おそらく、管材料の初期飽和吸着で説明することができるだろう。ブリンシドフォビル濃度は、実験の間（6時間）に、およそ100％まで回復した。どちらの被験注入システムでも外観、pHまたはc(BCV)に有意な全体的変化は観察されなかった。
【０２５６】
実施例4-凍結乾燥製剤および再構成製剤の安定性および特徴
凍結乾燥前製剤を下記表24に示すとおり調製し、凍結乾燥プロセスに付した。
【０２５７】
（表２４）凍結乾燥前製剤
2019519570.tif 000037
【０２５８】
表27の製剤1〜8のガラス転移温度Tg'（非晶質）、共晶融解温度Teu（結晶質）、融解開始温度T融解開始および凍結温度T凍結を、示差走査熱量測定（DSC）分析によって決定した。そのために、5μLの各製剤をアルミニウム製試料パンに分注して、密閉した。＋25℃→ −65℃→ ＋25℃の温度区間を5℃/分のランプ速度で、ダウンスキャンおよびアップスキャンすることによって、DSCスキャンを行った。被験製剤は、シャープな凝固点と明確な融解転移を示した。このDSC研究の結果を表25に要約する。
【０２５９】
（表２５）DSC分析の結果
2019519570.tif 000038
【０２６０】
凍結乾燥サイクル
DSC分析によって判明したパラメータを含むブリンシドフォビル製剤の凍結乾燥に、確率された凍結乾燥サイクルを適用した（表28参照）。このサイクルは、凍結工程、アニーリング工程、一次乾燥工程、および二次乾燥工程から構成された。例示的な凍結乾燥サイクルにおける設定温度、ランプ速度、各工程の工程時間、およびロード時間を表26に要約する。
【０２６１】
（表２６）凍結乾燥サイクルパラメータ（サイクル＃1）
2019519570.tif 000039
【０２６２】
試料バイアル（バイアルサイズ5mL、充填体積1mL）を、バイオセーフティキャビネット中、最善の清浄条件下で加工した。各製剤について、9個の試料を調製した。各製剤条件について、凍結乾燥サイクル全体にわたって凍結乾燥機の棚温度（T棚）と共に製品温度（T製品）をモニターするために、1つの試料バイアルに製品プローブを装着した。一次乾燥の終点は、T製品≒T棚が観測される時刻として決定した。凍結乾燥サイクルの最後に、試料バイアルに窒素（N2）を再充填し、栓をし、点検および分析のために凍結乾燥機から取り出した。
【０２６３】
一次乾燥相の工程時間は20時間に設定した。図1は、この工程中の製剤1〜8の製品温度プロファイルを示している。被験製剤では、真空ポンプの作動および16時間前後の総サイクル時間におけるT(製品)＜T(棚)への製品温度の低下後に、異なる製剤において15時間以内に温度ジャンプが観察された。この温度ジャンプは試料乾燥の成功を示すと解釈される。
【０２６４】
凍結乾燥製品を、凍結乾燥ケーキの構造および均一性に基づいて評価した。「メルトバック」または「ケーキ崩壊」の観察はランク付けの低下につながった。外観評価のために各製剤から4本のバイアルをランダムに選択した。その評価およびランク付けを表27に要約する。
【０２６５】
（表２７）凍結乾燥製品および再構成性能の評価
2019519570.tif 000040
【０２６６】
被験製剤のうち、マンニトール系製剤（製剤1、3、5、および7）は、よりコンパクトで均一な凍結乾燥ケーキを与え、スクロース系製剤（製剤2、4、6、および8）は部分的ケーキ崩壊および増加したメルトバックを示した。
【０２６７】
凍結乾燥製剤の再構成評価
再構成溶液の体積を決定するために、凍結乾燥製品バイアルを、凍結乾燥の前後に重量測定した。凍結乾燥製品をDI水で再構成した。溶媒の添加後に、バイアルを静かに旋回させ、再構成外観および再構成時間を記録した。再構成製品をそのpHおよびブリンシドフォビル回収率（HPLCによって決定）についてさらに分析した。再構成ランク付けのために、泡立ちの強さおよび泡消失時間を記録することによって、記載のパラメータを補完した。製剤1〜8に関する再構成評価の結果を表30に要約する。
【０２６８】
製剤3は再構成時に泡立ちがないことがわかった。また製剤7は異なる緩衝剤または注入媒体で再構成できることがわかった。
【０２６９】
実施例5-凍結乾燥プロセス開発
ブリンシドフォビルの凍結乾燥薬物製品を開発するために、5つの異なる作業を履行した: i）凍結乾燥実行可能性評価、ii）凍結乾燥プロセス開発、iii）短期安定性研究、iv）安定性試験のための薬物製品バッチの調製、およびv）材料適合性評価。
【０２７０】
各作業の目的、結果およびアウトカムを記録したプロジェクトの概要を表28に要約する。プロセス開発中の一定の凍結乾燥作業に関する凍結乾燥サイクルパラメータの詳細は表29に見いだすことができる。
【０２７１】
（表２８）プロジェクトの概要および判定の根拠
2019519570.tif 000041
【０２７２】
（表２９）凍結乾燥サイクルパラメータ（サイクル＃2、＃3、＃5、＃6）
2019519570.tif 000042
【０２７３】
i）実行可能性評価:配合および再構成
異なる凍結乾燥サイクルによる凍結乾燥に続く再構成後の製剤をさらに評価するために、液状充填溶液を調製し、以下に概説するように評価した。凍結乾燥サイクル＃1、＃2および＃5については
a）c(BCV)＝10mg/mL（pH＝8.0にpH調節）のブリンシドフォビル保存溶液、
b）10×緩衝剤保存溶液またはDI水（pH＝8.0にpH調節）および
c）12.5％（w/v）マンニトール保存溶液（pH＝8.0にpH調節）
d）DI水
を含む液状充填溶液を調製した。
【０２７４】
サイクル＃6および＃7については、
a）ブリンシドフォビル（固形物）、
b）マンニトール（固形物）、
c）10×アルギニン保存溶液（pH＝8.0にpH調節）、
d）NaOH溶液（1M）および
e）DI水
を含む液状充填溶液を調製した。
【０２７５】
サイクル＃1、＃2および＃5については、各製剤の凍結乾燥前後の製品バイアルの重量分析によって、適用する再構成体積を決定した。サイクル＃1および＃2の場合、測定された個別の体積を適用した。サイクル＃5の凍結乾燥製品の再構成には、すべての製剤に平均の再構成体積を適用した。凍結乾燥サイクル＃7の凍結乾燥製品については、予め決定された液体充填体積と再構成体積の差に応じて液体充填体積を調整した。
【０２７６】
各凍結乾燥サイクル後に凍結乾燥製品を、それぞれのケーキの構造、均一性および外観の欠陥について評価した。DI水による再構成に続いて、再構成中および再構成後の溶液の外観（例えば泡立ちの強さ、泡消失時間）、pHおよびブリンシドフォビルの回収率を評価した。ブリンシドフォビルの回収率はHPLC分析によって決定した。揮発物の分率は熱重量分析（TGA）によって決定した。再構成評価の結果を表30に要約する。
【０２７７】
（表３０）薬物製品および再構成プロセスの評価
2019519570.tif 000043
2019519570.tif 000044
*3本のバイアルの平均値。サイクル＃1〜2については、およその消失時間を記録した（常時観察）。サイクル＃5〜7については、泡立ちの強さを再構成の10分後、20分後および30分後に評価した。＜20は、泡立ち消失時間が10分区間と20分区間の間にあったことを示す。＜30は泡立ち消失時間が20分区間と30分区間の間にあったことを示す。泡立ちが30分を超えてもまだ続いている場合は、消失時間を＞30分で示した。
【０２７８】
ii）プロセス開発:凍結乾燥製剤の安定性研究-48時間研究
再構成された溶液の物理的および化学的安定性を評価するために、製剤1、3、3a、3b、3cおよび7のそれぞれの外観およびpHを、再構成時（t0）、1日後（t24h）および2日後（t48h）のc(BCV)の回収率と共に、周囲温度で評価した。c(BCV)の回収率はHPLCによって決定した。
【０２７９】
被験製剤（製剤＃1、3、3a、3b、3cおよび7）はいずれも外観は透明かつ無色であり、再構成後48時間以内はブリンシドフォビルの完全な回収を与えた（すなわち、ブリンシドフォビルの有意な損失はなく、回収率の変動は誤差範囲内にある）。製剤3および3aは、製剤3bおよび3cよりも速い泡/あぶくの消失を示すことがわかった（表33）。
【０２８０】
iii）短期間安定性研究:凍結乾燥製剤の安定性研究-2週間研究
各製剤の外観およびpHを、再構成時（t0）、2日後（t2日）、7日後（t7日）、10日後（t10日）および14日後（t14日）におけるc(BCV)の回収率と共に評価することにより、製剤1、3および3aの安定性を25℃および60℃で評価した。加えて、泡立ちの強さを再構成の10分後、20分後および30分後に評価した。
【０２８１】
ブリンシドフォビルの回収率はHPLCによって決定した。HPLCクロマトグラム中に観察された分解生成物は、シドフォビルのような脱アミノ化生成物および他の分解生成物と同定された。pHのシフトまたは変化は分解に付随しなかった。被験製剤のうち、製剤3aは、適用した条件下で最も少ない分解度を示し、60℃で14日後に99.2％の純度であった。この実験の結果を表31、表32および表36に要約する。
【０２８２】
（表３１）製剤1（200mMリン酸）の安定性研究結果
2019519570.tif 000045
*3本のバイアルの平均値。泡立ちの強さを、再構成の10分後、20分後および30分後に評価した。＜20は、泡立ち消失時間が10分区間と20分区間の間にあったことを示す。＜30は泡立ち消失時間が20分区間と30分区間の間にあったことを示す。泡立ちが30分を超えてもまだ続いている場合は、消失時間を＞30分で示した。
a処理を受けた試料の3つの複製物の平均値。
bBCV回収率＝c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100％。
**T＝25℃におけるt0用の試料とT＝60℃におけるt0用の試料とは同一である。注: HPLC試料の変動性は試料間のアッセイ変動性の説明になる。バイアル間の変動性は薬物製品バイアル間の変動性の説明になる。
【０２８３】
（表３２）製剤3（200mMアルギニン）の安定性研究結果
2019519570.tif 000046
*3本のバイアルの平均値。泡立ちの強さを、再構成の10分後、20分後および30分後に評価した。＜20は、泡立ち消失時間が10分区間と20分区間の間にあったことを示す。＜30は泡立ち消失時間が20分区間と30分区間の間にあったことを示す。泡立ちが30分を超えてもまだ続いている場合は、消失時間を＞30分で示した。a処理を受けた試料の3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100％。**T＝25℃におけるt0用の試料とT＝60℃におけるt0用の試料とは同一である。注: HPLC試料の変動性は試料間のアッセイ変動性の説明になる。バイアル間の変動性は薬物製品バイアル間の変動性の説明になる。
【０２８４】
（表３３）製剤＃3a（100mMアルギニン）の安定性研究結果
2019519570.tif 000047
a処理を受けた試料の3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100％。**T＝25℃におけるt0用の試料とT＝60℃におけるt0用の試料とは同一である。注: HPLC試料の変動性は試料間のアッセイ変動性の説明になる。バイアル間の変動性は薬物製品バイアル間の変動性の説明になる。
【０２８５】
iv）安定性試験のための薬物製品バッチの調製
凍結乾燥前製剤の調製:製剤3aを以下の手順に従って配合した。適量にする前に、pH制御下で、塩酸（35〜37％）を使って、DI水中のアルギニンの1M緩衝剤溶液のpHを、8に調節した。次に、マンニトールを緩衝剤溶液に加えてから、BCVを加えた。その結果生じた溶液のpHを水酸化ナトリウムを使って8に調節した。DI水を用いて、別のメスフラスコで、前記溶液を適量にした。次に、それら2つの溶液を混合し、無菌濾過することで、所望の製剤3aを得た。この手順により、9.9mg/mLのc(BCV)観測値を持つ製剤3aを得た。
【０２８６】
凍結乾燥製剤の調製:最善の清浄条件下で、上に概説した手順に従って作られた液状製剤3aのバイアルおよそ200本に、凍結乾燥ポジションで栓をして、凍結乾燥サイクル＃7に従って凍結乾燥に付した。その結果得られた凍結乾燥製品を、外観、再構成外観、pHおよびブリンシドフォビルの回収率について試験した。ブリンシドフォビルの回収率はHPLCおよび熱重量分析によって決定した。本明細書において概説する手順に従って調製された凍結乾燥製剤における外観、再構成外観およびブリンシドフォビルの回収率の試験の結果を表34に要約する。
【０２８７】
（表３４）凍結乾燥前および凍結乾燥後の製剤バッチの外観、再構成および回収率
2019519570.tif 000048
*3本のバイアルの平均値。泡立ちの強さを、再構成の10分後、20分後および30分後に評価した。＜20は、泡立ち消失時間が10分区間と20分区間の間にあったことを示す。＜30は泡立ち消失時間が20分区間と30分区間の間にあったことを示す。泡立ちが30分を超えてもまだ続いている場合は、消失時間を＞30分で示した。a走査範囲＝25℃〜150℃、ランプ速度＝10℃/分。b処理を受けた試料の3つの複製物の平均値。
【０２８８】
v）凍結乾燥製剤の適合性
凍結乾燥製剤3a用の液状充填溶液を、注入媒体ならびに製造段階および臨床段階からの一連の材料との適合性について試験した。注入媒体適合性試験の結果を表38に要約する。研究の終了時点で、沈殿、pHシフトおよび有意なブリンシドフォビル回収率の損失はいずれも観察されなかった。
【０２８９】
注入媒体適合性
製剤3aを注入媒体（5％デキストロース）溶液で希釈することで、c(BCV)＝0.5mg/mLおよび1.0mg/mLの溶液を得た。外観、pHおよびブリンシドフォビル回収率（HPLCによって決定）を、試験溶液を調製した時点（t0）ならびに2時間後（t2h）、8時間後（t8h）および24時間後（t24h）に評価した。
【０２９０】
（表３５）注入媒体適合性評価の結果
2019519570.tif 000049
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n時間目/c(BCV)0時間目×100％。t0におけるBCV回収率の値を100％と定義した。
【０２９１】
滅菌フィルタ適合性
液状製剤3aを、無菌的加工用の2種のシリンジフィルタとの適合性について試験した。10mLの液状製剤3aを、フィルタa（0.2μm、25mm、シリンジフィルタ、Posidyne（登録商標）メンブレン）またはフィルタb（0.2μm、25mm、シリンジフィルタ、Supor（登録商標）メンブレン（PES））のうちの一方で濾過し、濾液の最初と最後の10％を、外観、pHおよびブリンシドフォビルの回収率について評価した。
【０２９２】
この評価の結果を表36に要約する。沈殿、pHシフトおよびブリンシドフォビル回収率の有意な損失はいずれも観察されなかった。試料は透明かつ無色に見えた。分解生成物ピークは観察されなかった。
【０２９３】
（表３６）製剤3aの滅菌フィルタ適合性評価の結果
2019519570.tif 000050
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n時間目/c(BCV)充填前×100％。t0におけるBCV回収率の値を100％と定義した。
【０２９４】
薬物製品バイアルおよびストッパー適合性
液状製剤3aをバイアルおよびストッパーとの適合性について試験した。バイアルに5mLの液状製剤3aを充填し、栓をし、クリンプし、上向きおよび下向きにして周囲条件で6時間保管した。試験に使用したバイアルは透明な20mLクラスAホウケイ酸ガラス製セラムバイアルであり、ストッパーはFluroTec（登録商標）コーティングが施された20mm Novapure（登録商標）ストッパーである。
【０２９５】
この研究の結果を表37に要約する。この研究の全体を通して、沈殿、pHシフトおよびブリンシドフォビル回収率の有意な損失はいずれも観察されなかった。HPLCでは分解生成物ピークが観察されなかった。
【０２９６】
（表３７）薬物製品バイアルおよびストッパー適合性評価の結果
2019519570.tif 000051
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n時間目/c(BCV)充填前×100％。t0におけるBCV回収率の値を100％と定義した。
【０２９７】
注入バッグ適合性
液状製剤3aを100mL注入バッグとの適合性について調べた。5％デキストロース注入媒体中の製剤3aの溶液を、2つの異なる製剤強度（1.0mg/mLおよび0.1mg/mLブリンシドフォビル）で調製し、注入バッグに入れて周囲温度で保管した。注入バッグからの試料とバッグ外で希釈した標準からの試料とを、研究の開始時点（t0）、8時間後（t8h）および24時間後（t24h）において、外観、pHおよびブリンシドフォビル回収率（HPLCによって決定）について評価した。この注入バッグ適合性評価の結果を表38に要約する。
【０２９８】
（表３８）注入バッグ適合性評価の結果
2019519570.tif 000052
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n時間目/c(BCV)0時間目×100％。t0におけるBCV回収率の値を100％と定義した。
【０２９９】
試料は透明かつ無色に見えた。どちらの試料濃度についても、ブリンシドフォビル回収率の有意な損失は24時間にわたって観察されなかった。c(BCV)＝0.1mg/mLのバッグ複製物の一つについては、ブリンシドフォビルの見掛け上の損失（19％）が観察される。またさらに、c(BCV)＝0.1mg/mLの濃度を与える注入媒体へのブリンシドフォビル製剤の希釈が、pH＝7への著しいpHシフトを引き起こしたことも観察された。この実験では分解は観察されなかった。
【０３００】
注入システム適合性
ブリンシドフォビル製剤（10mg/mLブリンシドフォビル、100mMアルギニン、5％マンニトール、pH＝8.0）を、2種の注入システム（Baxter、Non-DEHP CONTINU-FLO；B Braun、Rate Flow（登録商標）レギュレーターIVセット）との適合性について試験した。液状製剤を既述のように注入バッグ中に希釈し（被験最終濃度: 1.0mg/mLおよび0.1mg/mL）、24時間後にブリンシドフォビル回収率の分析のために注入バッグからアリコートを収集した（t0,バッグ）。次に、注入システムを注入バッグに取り付け、手動で注入バッグから溶液を充填した。分析のためにアリコートをライン端試料（t0, eol）として収集した。時点間ではIVラインを閉じ、注入剤を注入システム中に留まらせ、周囲温度で保管した。試験時点では、およそ17mL（IVシステムのおよその容積）の注入剤溶液を排液することで、バッグリザーバからIVシステム中の溶液を置き換えた。この置き換えに続いて、新たなライン端試料を評価のために収集した（t10min, eol、t3h, eolおよびt6h, eol）。それらの試料を、外観、pH、およびブリンシドフォビル回収率について評価した。この注入システム適合性試験の結果を表42に要約する。
【０３０１】
低c(BCV)ではどちらのIVシステムについても、7〜11％のブリンシドフォビル回収率の損失によって示される、初期吸着/飽和効果が観察された。この損失は後続の6時間で部分的に回収された。分解生成物の出現はこの研究の間には観察されなかった。先に述べたとおり、c(BCV)＝0.1mg/mLの試料は、5％デキストロース溶液での希釈時にpH＝7へとおよそ1pH単位のpHシフトを示した。試料はこの研究の間は透明かつ無色に見えた。
【０３０２】
（表３９）注入システム適合性評価の結果
2019519570.tif 000053
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率＝c(BCV)n時間目/c(BCV)0時間目×100％。t0におけるBCV回収率の値を100％と定義した。
【０３０３】
実施例6-安定性試験
本開示のバルク液状製剤および凍結乾燥製剤を安定性についてさらに試験した。アルギニン、マンニトール、および10mg/mLの濃度のブリンシドフォビルを含む液状製剤を10mLガラス製バイアル中に保ち、栓をし（ゴム製ストッパーまたは20mmセラムストッパー）、シールし（アルミニウムシール）、最長12ヶ月にわたって約5℃または約25℃に保った。保管した製剤の外観、pHおよびブリンシドフォビル含量を、不純物および粒状物と共に、さまざまな時間区間（すなわち2週間後、1ヶ月後、2ヶ月後、3ヶ月後、6ヶ月後、9ヶ月後および12ヶ月後）でモニターした。不純物はHPLCによって評価した。それら不純物を、本明細書では、それぞれの相対保持時間によって同定する。10mg/mLのブリンシドフォビルを含む凍結乾燥粉末の溶液について、同じ実験を繰り返した。凍結乾燥製剤については、20mmゴム製ストッパー付きの20mLガラス製バイアルを使用した。さらにまた、凍結乾燥粉末（すなわち凍結乾燥ケーキ）の外観を記録した。
【０３０４】
5℃および25℃におけるバルク液状製剤の安定性研究の結果をそれぞれ表40Aおよび表40Bに要約する。5℃および25℃における凍結乾燥製剤の安定性研究の結果をそれぞれ表41A、表41Bおよび表42に要約する。
【０３０５】
（表４０Ａ）5℃（±3℃）における液状製剤の安定性
2019519570.tif 000054
【０３０６】
（表４０Ｂ）25℃（±2℃）および相対湿度60％（±相対湿度5％）における液状製剤の安定性
2019519570.tif 000055
【０３０７】
（表４１Ａ）5℃（±3℃）における凍結乾燥製剤の安定性
2019519570.tif 000056
2019519570.tif 000057
【０３０８】
（表４１Ｂ）25℃（±2℃）および相対湿度60％（±相対湿度5％）における凍結乾燥製剤の安定性
2019519570.tif 000058
2019519570.tif 000059
【０３０９】
（表４２）40℃（±2℃）および相対湿度60％（±相対湿度5％）における凍結乾燥製剤の安定性
2019519570.tif 000060
2019519570.tif 000061
【０３１０】
実施例7-ラット全血およびヒト全血における血液適合性の決定
序論
ラット用の試験物質の各濃度はラット全血と1:4の比で別々に混合し、一方、ヒト用の試験物質の各濃度はヒト全血と1:4の比で別々に混合した。これらの試料に加えて、対照試料［媒体対照（媒体＋全血、ラット用1およびヒト用1）、陽性対照（1％サポニン＋全血）、無処理全血対照および陰性対照（食塩水＋全血）を、溶血（上清ヘモグロビン濃度）について分析した。
【０３１１】
ラット全血試料およびヒト全血試料を、試験物質中または対照物質中、37±1℃で20分間インキュベートした後、直ちに（2分以内）に3500±100rpm（2740g）、室温で、5〜10分間、遠心分離した。上清を抜き取り、Siemens Advia 120血液分析装置上で使用されるシアンメトヘモグロビン法を使ったヘモグロビン分析に付した。試験物質が溶血を引き起こす潜在能力を有する場合は、溶解された赤血球から血漿上清に放出されるヘモグロビンを、シアン化カリウムの存在下で二価鉄から三価鉄へと酸化される溶液中のヘム鉄の反応によって定量することができる。この反応はメトヘモグロビンの形成をもたらし、次にそれがシアン化物と化合することで、安定なシアンメトヘモグロビンを形成する。分光光度法により546nmで測定した場合、シアンメトヘモグロビンの吸光度はベールの法則に従い、溶液中に放出されたヘモグロビンの濃度に正比例する。加えて、試験物質製剤がヘモグロビンのSiemens Advia測定と干渉しないことを保証するために、評価される各濃度の製剤化された試験物質を1:4の比で食塩水と混合してから、そのまま分析した。
【０３１２】
材料および方法
試験は以下に示す2相で行った。
【０３１３】
（表４３）第1相、ラット血液におけるブリンシドフォビル
2019519570.tif 000062
*チューブ1（各濃度用に個別のチューブ）およびチューブ3〜6に1.0mLを添加。
aチューブ1〜2（各濃度用に個別のチューブ）に250μLを添加。
bチューブ3に250μLを添加。
cチューブ4に250μLを添加。
dチューブ2に1.0mLを添加し、チューブ6に250μLを添加。
e溶血に関する試験物質アッセイ：
チューブ1Aは0.2mg/mLを含有。
チューブ1Bは0.5mg/mLを含有。
チューブ1Cは1.6mg/mLを含有。
f試験物質干渉対照：
チューブ2Aは0.2mg/mLを含有。
チューブ2Bは0.5mg/mLを含有。
チューブ2Cは1.6mg/mLを含有。
g溶血に関する媒体対照
h溶血に関する陽性対照；陽性対照として1％サポニンを使用した。
i溶血に関する無処理全血対照
j溶血に関する陰性対照
＋ チューブに添加
− チューブへの添加なし
注:各相のチューブ3〜6は、各相につき1回行った。
【０３１４】
（表４４）第2相、ヒト全血におけるブリンシドフォビル
2019519570.tif 000063
*チューブ1（各濃度用に個別のチューブ）およびチューブ3〜6に1.0mLを添加。
aチューブ1〜2（各濃度用に個別のチューブ）に250μLを添加。
bチューブ3に250μLを添加。
cチューブ4に250μLを添加。
dチューブ2に1.0mLを添加し、チューブ6に250μLを添加。
e溶血に関する試験物質アッセイ：
チューブ1Aは0.2mg/mLを含有。
チューブ1Bは0.5mg/mLを含有。
チューブ1Cは1.6mg/mLを含有。
f試験物質干渉対照：
チューブ2Aは0.2mg/mLを含有。
チューブ2Bは0.5mg/mLを含有。
チューブ2Cは1.6mg/mLを含有。
g溶血に関する媒体対照
h溶血に関する陽性対照；陽性対照として1％サポニンを使用した。
i溶血に関する無処理全血対照
j溶血に関する陰性対照
＋ チューブに添加
− チューブへの添加なし
注:各相のチューブ3〜6は、各相につき1回行った。
【０３１５】
対照物質（媒体）
投与製剤に関する対照物質は、2リン酸ナトリウム（2 sodium phosphate）緩衝剤溶液（400mM、pH＝8.0）、1.0N水酸化ナトリウム溶液、滅菌注射用水および5％デキストロース溶液とした。
【０３１６】
試験準備および分析
次の3工程を含め、保存溶液から配合して、ブリンシドフォビル注入可能液状保存製剤を、15mg/mLブリンシドフォビルになるように調製した:（1）2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液（400mM、pH＝8.0）を調製した；（2）1.0N水酸化ナトリウム溶液を購入した；固形ブリンシドフォビル、1.0N水酸化ナトリウム溶液、2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液およびWFI（注射用水）から、ブリンシドフォビル注入可能液状保存製剤（15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH＝8.0）を調製した。
【０３１７】
ブリンシドフォビル注入可能液状保存製剤は、冷蔵条件下（2〜8℃）で28日にわたって安定である。ブリンシドフォビル注入可能液状保存製剤を5％デキストロースで希釈することで、所望の投与濃度を得た。
【０３１８】
新鮮な投与製剤を試験日に一度調製した。使用時以外は投与製剤を冷蔵しておいた（2〜8℃）。
【０３１９】
試験日にサポニンを食塩水で適当な濃度に希釈した。
【０３２０】
試験系
ラットからの全血（約20mL）（試験のために4匹からの試料をプールした）をK2EDTA抗凝固剤の存在下で収集し、混合するために上下反転させた。
【０３２１】
この研究で使用するために一人のヒトボランティアからヒト全血（約20mL）をK2EDTAの存在下で収集した。
【０３２２】
血液試料は、この研究における溶血能試験に使用するために、収集後、4時間を超えて室温に置かないようにした。
【０３２３】
試験方法
ラット用の試験物質の各濃度はラット全血と1:4の比で別々に混合し、一方、ヒト用の試験物質の各濃度はヒト全血と1:4の比で別々に混合した。これらの試料に加えて、対照試料［媒体対照（媒体＋全血、ラット用1およびヒト用1）、陽性対照（1％サポニン＋全血）、無処理全血対照および陰性対照（食塩水＋全血）を、溶血（上清ヘモグロビン濃度）について分析した。
【０３２４】
ラット全血試料およびヒト全血試料を、試験物質中または対照物質中、37±1℃で20分間インキュベートした後、直ちに（2分以内）に3500±100rpm（2740g）、室温で、5〜10分間、遠心分離した。上清を抜き取り、Siemens Advia 120血液分析装置上で使用されるシアンメトヘモグロビン法を使ったヘモグロビン分析に付した。理論に束縛されることは望まないが、試験物質が溶血を引き起こす潜在能力を有する場合は、溶解された赤血球から血漿上清に放出されるヘモグロビンを、シアン化カリウムの存在下で二価鉄から三価鉄へと酸化される溶液中のヘム鉄の反応によって定量することができる。この反応はメトヘモグロビンの形成をもたらし、次にそれがシアン化物と化合することで、安定なシアンメトヘモグロビンを形成する。分光光度法により546nmで測定した場合、シアンメトヘモグロビンの吸光度はベールの法則に従い、溶液中に放出されたヘモグロビンの濃度に正比例する。
【０３２５】
加えて、試験物質製剤がヘモグロビンのSiemens Advia測定と干渉しないことを保証するために、評価される各濃度の製剤化された試験物質を1:4の比で食塩水と混合してから、そのまま分析した。
【０３２６】
試験は2つの相で行った。
【０３２７】
4匹の正常ラットおよび1人のヒトドナーからの全血を使って、1バッチを構成する2回の独立した分析ランを行った。バッチ前後にR&D Systems全血品質対照セット（whole blood quality control set）を実行することで、対照材料（control material）に関する明記された製造者の範囲に従い、この対照セットに関する確立された基準を使って、計器の操作性能を検証した。溶解状態のヘモグロビンを含有する低（Low）、中（Mid）および高（High）対照の独立した（Pointe Scientific）セットを、一回実行することで、溶液相中のヘモグロビンの測定の対照順位（control rank order）を検証した。陰性対照および陽性対照ならびに試験試料をシングレット（singlet）で実行した。
【０３２８】
溶血能基準
ラン基準：
1％サポニン陽性対照は、そのアッセイランを許容できるとみなすには、＞（陰性対照＋0.5g/dL）のヘモグロビン値を示さなければならない。
【０３２９】
無処理の全血は＜（陰性対照＋0.5g/dL）のヘモグロビン値を示さなければならない。
【０３３０】
食塩水＋無処理全血（陰性対照）は、＜0.5g/dLのヘモグロビン値を示さなければならない。
【０３３１】
R&D Systems全血対照セットは、所定の製造者の目標範囲内にあるべきである。
【０３３２】
Pointe Scientific液状ヘモグロビン対照には、ADVIA計器に関して、確立された目標範囲はないが、（濃度に基づいて）高＞中＞低の応答順位を示すべきである。
【０３３３】
試料分析基準
試験物質＋食塩水試料は、そのアッセイランが有効であるとみなされるには、＜（陰性対照＋0.5g/dL）のヘモグロビン値を示さなければならない。
【０３３４】
媒体対照試料は、そのアッセイが有効とみなされるには、＜（陰性対照＋0.5g/dL）のヘモグロビン値を示さなければならない。
【０３３５】
低、中および高濃度にわたるヒト赤血球から調製された溶血物を含有する（Pointe Scientific）液状QC対照セットを使って、Adviaシアンメトヘモグロビン法で液状溶血物を測定するAdviaの能力を検証した。第1相では、低、中および高液状対照が、Siemens Adviaで測定した場合に、それぞれ7.9、11.7および15.6g/dLの値を返した。第2相では、低、中および高液状対照が、Siemens Adviaで測定した場合に、それぞれ8.1、11.9および15.6g/dLの値を返した。対照セットの順位はプロトコール基準を満たしている。
【０３３６】
（R&D System）全血品質対照を使ってSiemens Advia 120血液計器の操作性能を検証した。生データで記録されたQC値は、Advia計器に関する製造者の許容範囲内にあった。
【０３３７】
コレステロールとの複合体を形成することで細胞膜二重層に細孔を形成して赤血球溶解を引き起こす両親媒性グリコシドであるサポニンを陽性溶血対照として利用した。ラット全血溶血およびヒト全血溶血に関する1％サポニン処理陽性対照は、それぞれ上清中に3.9g/dLおよび11.0g/dLの平均ヘモグロビン濃度を生成した（表47、48、49および50）。これらの値は、プロトコールで定義された＞（陰性対照＋0.5g/dL）というヘモグロビン濃度のアッセイ合格基準を満たした。
【０３３８】
第1相および第2相において、ラット全血およびヒト全血中の媒体対照（5％デキストロース）は、0.0g/dLの平均ヘモグロビン濃度を生成した（表47、48、49および50）。どちらの相でも、媒体対照は、プロトコールで定義された＜（陰性対照＋0.5g/dL）という試料分析基準を満たした。
【０３３９】
どちらの相でも、血漿および陰性対照は、0.0g/dLの平均ヘモグロビン濃度を呈した（表47、48、49および50）。これらの値は、プロトコールで定義された＜（陰性対照＋0.5g/dL）という無処理全血ヘモグロビン濃度および＜0.5g/dLという食塩水と無処理ヘモグロビン濃度とのアッセイ合格基準を満たした。
【０３４０】
媒体対照は陰性であり、方法対照は予想される目標値を与えた。すべての対照チェックは、第1相および第2相において許容できるランを示す。
【０３４１】
ブリンシドフォビル溶血能
ラット全血中のブリンシドフォビルは、0.2、0.5、および1.6mg/mLで、以下に要約するように、それぞれ0.0、0.25および1.35g/dLの平均ヘモグロビン濃度を呈した（表47、48、49および50）。
【０３４２】
（表４５）ラット全血におけるブリンシドフォビル溶血
2019519570.tif 000064
*（HgB血漿）/（正常HgB全血×希釈倍率）*100として算出。
13g/dL（本発明者らのHCDによる）の正常全血ラットヘモグロビン値に基づく。
【０３４３】
Point scientific対照は、溶液相中のヘモグロビンの測定を検証するためのシステム試験である。本明細書に示すとおり、ブリンシドフォビルは、ラット全血において濃度依存的と思われる溶血能効果を示した。この効果の推定的証拠は、0.5mg/mL濃度で観察され、1.6mg/mL濃度ではより明瞭な溶血の証拠が観察された。
【０３４４】
この研究において検出可能なヘモグロビンレベルに関する推定溶血率（％）は、ラット全血に関する平均正常ヘモグロビン濃度および適当な希釈倍率を使って算出することができる。例えば試験品による希釈について補正した13g/dLのラット全血正常ヘモグロビン値は、10.4g/dLの値（13×0.8）をもたらす。0.25g/dLおよび1.35g/dLのヘモグロビン値に対して算出された溶血率（％）はそれぞれ2.4％および13.0％であった。＜10％の溶血値を持つ製剤を非溶血性とみなし、＞25％の値は溶血のリスクがあるとみなした（Amin and Dannenfelser, 2006）。理論に束縛されることは望まないが、0.2mg/mL濃度は検出可能なヘモグロビンを示さなかったので、非溶血性とみなされる。0.5mg/mLおよび1.6mg/mLの濃度は、ラット全血において検出可能なヘモグロビンレベルをもたらしたが、認められたレベルは、溶血性リスクとはみなされなかった。
【０３４５】
第2相での2回（n＝2）の独立した分析ランの結果は、以下に要約するとおり、0.2mg/mLおよび0.5mg/mLおよび1.6mg/mLの濃度では、ヒト全血との血液適合性に関して、ブリンシドフォビルからの効果はないことを示した。
【０３４６】
（表４６）ヒト全血におけるブリンシドフォビル溶血
2019519570.tif 000065
*（HgB血漿）/（正常HgB全血×希釈倍率）*100として算出。
14g/dL（Mayoオンラインデータによる）の正常全血ヒト女性ヘモグロビン値に基づく。
【０３４７】
加えて、第1相でも第2相でもブリンシドフォビルはヘモグロビン濃度決定に干渉するとは認められなかった（表47、48、49および50）。試験物質対照は、第1相および第2相における許容できるランを示す、プロトコールで定義された試料分析基準を満たした。
【０３４８】
第1相での2回（n＝2）の独立した分析ランの結果は、理論に束縛されることは望まないが、ブリンシドフォビルが、ラット全血において、濃度依存的であると思われる溶血能効果を示すことを示した。理論に束縛されることは望まないが、この効果の推定的証拠は、0.5mg/mL濃度で観察され、1.6mg/mL濃度ではより明白な溶血の証拠が観察された。＜10％の溶血値を持つ製剤を非溶血性とみなし、＞25％の値は溶血のリスクがあるとみなした。0.2mg/mL濃度は検出可能なヘモグロビンを示さず、非溶血性とみなされる。0.5mg/mLおよび1.6mg/mLの濃度は、ラット全血において検出可能なヘモグロビンレベルをもたらしたが、認められたレベルは、溶血性リスクとはみなされなかった。
【０３４９】
第2相での2回（n＝2）の独立した分析ランの結果は、0.2mg/mL、0.5mg/mLまたは1.6mg/mLの濃度では、ヒト全血との血液適合性に関して、ブリンシドフォビルからの効果はないことを示した。
【０３５０】
理論に束縛されることは望まないが、すべての種が陽性溶血性試薬に対して同じように反応するわけではなく、それは、種間でのRBC脆弱性の相違を表しうる。
【０３５１】
（表４７）溶血能結果の要約；ラット血液中のブリンシドフォビル第1相
2019519570.tif 000066
*（HgB血漿）/（正常HgB全血×希釈倍率）*100として算出
13g/dL（本発明者らのHCDによる）の正常全血ラットヘモグロビン値に基づく。
【０３５２】
（表４８）溶血能結果の要約；ヒト血液中のブリンシドフォビル第2相
2019519570.tif 000067
*（HgB血漿）/（正常HgB全血×希釈倍率）*100として算出。
14g/dL（Mayo Clinicオンラインデータによる）の正常全血ヒト女性ヘモグロビン値に基づく。
【０３５３】
（表４９）溶血能結果（ヘモグロビン濃度:単位g/dL）:ラット血液中のブリンシドフォビル第1相
2019519570.tif 000068
【０３５４】
（表５０）溶血能結果（ヘモグロビン濃度:単位g/dL）:ヒト血液中のブリンシドフォビル第2相
2019519570.tif 000069
1A＝0.2mg/mLでの溶血に関する試験物質アッセイ
1B＝0.5mg/mLでの溶血に関する試験物質アッセイ
1C＝1.6mg/mLでの溶血に関する試験物質アッセイ
2A＝0.2mg/mLでの試験物質干渉対照
2B＝0.5mg/mLでの試験物質干渉対照
2C＝1.6mg/mLでの試験物質干渉対照
3＝溶血に関する媒体対照
4＝溶血陽性対照；1％サポニンを陽性対照として使用。
5＝溶血に関する無処理全血対照
6＝溶血に関する陰性対照
SD＝標準偏差
【０３５５】
実施例8-ラットにおける最大耐用量および7日用量範囲探索（DRF）研究
この2相研究の目的は、単回2時間静脈内注入によってラットに投与した場合のブリンシドフォビルの最大耐用量（MTD）を決定すること、ならびに1日目、4日目および7日目に2時間静脈内注入によってラットに投与した場合の、ブリンシドフォビルの単回および反復毒物動態学的プロファイルを評価することであった。
【０３５６】
この研究の結果は、後続の、静脈内注入によって投与した場合のブリンシドフォビルの毒性研究について、用量レベルに関する判断を可能にすることができる。
【０３５７】
研究計画には毒性研究に関する一般的規制ガイドラインの要素を組み入れた。
【０３５８】
要約
この研究は、2つの相から構成された。第1相は最大耐用量（MTD）研究であり、第2相は反復用量範囲探索（DRF）研究であった。
【０３５９】
第1相において評価したパラメータは生存率および臨床観察である。
【０３６０】
第1相では、Sprague-Dawley CD（登録商標）ラット（2匹/性別/用量区間）に、2、4、10または15mg/kgのブリンシドフォビルを1回、2時間IV注入によって投与した。投与可能な最大用量（MFD）は、投与溶液のブリンシドフォビルの濃度が1mg/mLを超えると溶血能が増加したことから、15mg/kgに制限された。投与体積はすべての用量区間について10mL/kg/時間とした。各投薬の後に2〜3日の観察期間をおいた。第1相処置期間の最後にすべての動物を安楽死させ、肉眼的検査なしで廃棄した。
【０３６１】
第2相において評価されたパラメータは生存率、臨床観察、体重、摂食量、血液学（投与終了時）、臨床化学（投与終了時）および肉眼的観察である。
【０３６２】
第2相では、Sprague-Dawley CD（登録商標）ラット（5匹/性別/群）に、1日目、4日目および7日目に、0［2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液（400mM、pH8.0±0.04）］、1または15mg/kgのブリンシドフォビルを2時間IV注入によって投与した。投与体積はすべての群で10mL/kg/時間とした。第2相処置期間の最後にすべての動物を安楽死させ、剖検した。第2相サテライト動物（3匹/性別/第1群および6匹/性別/第2〜3群）には同様に投薬し、ブリンシドフォビルおよびその代謝産物の一つであるシドフォビルの毒物動態学的分析のために、血液試料を1日目および7日目に収集した。
【０３６３】
略号および用語の定義の一覧
2019519570.tif 000070
【０３６４】
第1相
2、4、10または15mg/kgのブリンシドフォビルを2時間IV注入によって投与された動物はすべて、それぞれの予定された安楽死まで、生き残った。
【０３６５】
2、4または15mg/kgのブリンシドフォビルの投与は、一部の雄動物および雌動物に断続的な臨床徴候をもたらした。臨床徴候は、10mg/kgブリンシドフォビルを投与した動物には観察されなかった。断続的な臨床徴候は、立毛、部分閉眼および活動減少を伴うおよび伴わない頻呼吸および背弯姿勢、または不規則呼吸、または不規則呼吸、立毛および両側性部分閉眼を伴うもしくは伴わない活動減少からなった。徴候を示した第1群および第2群の動物では、臨床徴候は可逆的であり、注入の終了時または注入の終了後45分以内に解消した。徴候を示した第4群では、臨床徴候は可逆的であり、注入の終了後3時間以内および22分以内に解消した。
【０３６６】
この研究の条件下では、どの用量も忍容性が高かった。それゆえに、最大耐用量レベルは決まらず、15mg/kgを投与可能な最大容量（MFD）とみなした。
【０３６７】
第2相
1mg/kg/日および15mg/kg/日のブリンシドフォビルを7日間にわたって合計3回投与された動物はすべて、それぞれの予定された安楽死まで生き残った。
【０３６８】
1mg/kg/日または15mg/kg/日でのブリンシドフォビルの投与は、雄動物でも雌動物でもブリンシドフォビル関連臨床徴候を何ももたらさなかった。
【０３６９】
1日目および7日目の投与開始2時間後（第1群）、または1日目の投与開始1、2、8および24時間後ならびに7日目の投与前および投与開始2、8および24時間後（第2群および第3群）に、血漿試料（108）を収集し、LC/MS/MSによってブリンシドフォビルおよび代謝産物シドフォビルの濃度を決定するために分析した。
【０３７０】
ブリンシドフォビルのピーク濃度は一般に2時間IV注入の最後に観察され、急速に減少した。一般に、平均ブリンシドフォビルCmaxおよび平均ブリンシドフォビルAUCは、1mg/kgから15mg/kgへの用量の増加にほぼ比例して増加した。ただし、1mg/kg後のAUCは限られた濃度-時間データに基づいた。7日目のブリンシドフォビルCmax値およびブリンシドフォビルAUClast値は、1日目と比較すると、7日目では値が低くなる傾向を示した［7日目/1日目蓄積比（AR）が0.44〜0.54］。ブリンシドフォビルTKパラメータに性差は観察されなかった。全体として、代謝産物シドフォビルは、ブリンシドフォビル用量の増加に比例するほどには増加しなかった。シドフォビルTKパラメータに明白な性差はなく、反復投与後にTKパラメータの変化はなかった。
【０３７１】
ブリンシドフォビルに関連する血液学的所見は、15mg/kgのブリンシドフォビルを投与された雄および雌における網状赤血球のわずかな減少（それぞれ-33％および-30％対照；雄のみ統計学的に有意）に限られ、これには、雄での平均細胞ヘモグロビン濃度（MCHC）の増加（＋2.1％対照、統計学的に有意）が伴った。赤血球量（ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数）の減少は、7日間の投与相の終了時に無視できる程度であった（-4.2％対照まで）。
【０３７２】
15mg/kgのブリンシドフォビルを投与された雄（＋3.8％対照；統計学的に有意でない）および≧1mg/kgのブリンシドフォビルを投与された雌（＋4.9％対照；統計学的に有意）ではブリンシドフォビルに関連する総カルシウムのごくわずかな増加があり、15mg/kgを投与された雌では尿素（BUN）のごくわずかな増加（＋29％対照；統計学的に有意）があった。
【０３７３】
1日目、4日目および7日目における2時間IV注入による1mg/kg/日および15mg/kg/日のブリンシドフォビルの投与は、忍容性が高い。
【０３７４】
投与の経路、継続時間および頻度
第1相では、各動物に2時間静脈内注入によってブリンシドフォビルの単回投与を施行した。最大耐用量（MTD）を決定するために、各用量区間において、ナイーブ動物に漸増用量を投与した。MTDデータを使って第2相のための用量を選択した。
【０３７５】
第2相では、ブリンシドフォビルの反復投与の毒性を評価するために、また後続の毒性研究のための用量の選択を助けるために、選択された用量を1日目、4日目および7日目に2時間静脈内注入によって投与した。後続の反復投与GLP毒性研究のための用量を選択するために、7日間研究は適当であることができる。
【０３７６】
動物の数
この研究における動物の数は、統計学的理由、規制上の理由および科学的理由から、必要最小限であるとみなした。
【０３７７】
第1相（MTD）における動物の数（2匹/性別/用量区間）は、雄ラットおよび雌ラットにおける最大耐用量を決定するために要求されるであろう最小数であった。最大耐用量を決定するには、4つのブリンシドフォビル用量レベルで十分であると予想した。2〜3日の観察期間を設けたものの、最大耐容単回用量レベルの決定を混乱させうる反復投与の相加的効果の可能性を排除するために、各用量レベルで新しい動物を使用した。
【０３７８】
第2相（DRF）における主研究動物の数（5匹/性別/群）は、動物間に予想される変動性を考慮した最小数であった。陰性対照群および提唱されたヒト用量の低倍数または高倍数を投与した2つのブリンシドフォビル処置群は、ベースラインを確立し、ある範囲の効果を与え、さらなる反復投与研究のために結果を外挿することを可能にするのに必要な最小の群数とみなした。
【０３７９】
第2相（DRF）毒物動態学的評価におけるサテライト毒物動態学的研究動物の数（6匹/性別/処置群）は、分布、代謝および排泄プロセスの固有の変動性を考慮して、意味のあるデータを得るのに必要な最小数とみなした。性別ごとに3匹の対照群によって、ブリンシドフォビル曝露の欠如を確認した。
【０３８０】
用量選択
この研究の第1相の出発用量は2mg/kgとした。
【０３８１】
この研究の第2相のための低用量および高用量（1mg/kgおよび15mg/kg）は、本研究の第1相の研究結果に基づいて選択された。いくつかの態様において、この低用量および高用量は、本研究の第1相において15mg/kgを投与された動物における投与後観察期間中の臨床徴候の欠如によって選択された。
【０３８２】
実験の概略
第1相（MTD）では、最大4つの用量レベルのブリンシドフォビルを、ナイーブ雌雄ラットにおける漸増単回投与として静脈内注入（2時間）によって投与した。各投薬の後に2〜3日の観察期間をおいた。最大耐用量（MTD）が同定されるか、または事前に得られた15mg/kgの溶血の証拠に基づいて投与可能な最大容量（MFD）が達成されるまで、先の用量に対する応答に基づいて、それぞれ後続の用量レベルを増加させて、ナイーブ動物に投与した。
【０３８３】
（表５１）4つの用量区間からなる第1相（MTD）研究
2019519570.tif 000071
a用量は活性成分を表す。
【０３８４】
第2相（DRF）では、試験品および対照品を、1日目、4日目および7日目に、2時間静脈内（IV）注入によって、ラットに投与した。
【０３８５】
（表５２）第2相研究:1対照群および2処置群
2019519570.tif 000072
a用量は活性成分を表す。
b毒物動態学用採血にのみ使用されるサテライト動物
【０３８６】
適当な量の一塩基性リン酸ナトリウム溶液（400mM）と二塩基性リン酸ナトリウム溶液（400mM）とを混合することによって、2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液の媒体溶液（400mM、pH8.0±0.04）を調製した。必要な場合は、溶液のpHを一塩基性リン酸ナトリウム溶液（400mM）で調節した。層流フード下で、溶液を0.22μm Millex（登録商標）-GPフィルタを通して無菌容器に濾過した。
【０３８７】
媒体（対照品）は2〜8℃に冷蔵保管した。新鮮な媒体溶液を各相の前に一度調製し、調製から1ヶ月以内に使用した。
【０３８８】
適当な量のブリンシドフォビルを2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液、無菌注射用水（USP）および1N水酸化ナトリウム（NaOH）と混合することによって、15mg/mLのブリンシドフォビル保存物を調製した。その溶液を層流フード下で0.22μm Millex（登録商標）-GPフィルタを通して無菌容器に濾過した。
【０３８９】
層流フード下で適当な量のブリンシドフォビル保存物（15mg/mL）または保存溶液媒体（2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液）を適当な量の注射用5％デキストロース（USP）で無菌バイアル中に希釈し、10回上限反転させて混合することによって、第1相用および第2相用の投与製剤を調製した。第1相および第2相中は、各投与日に新鮮な投与製剤を調製し、使用時以外は2〜8℃に冷蔵保管し、遮光しておいた。
【０３９０】
投与の方法
経路
2時間での静脈内注入。20mL/kg/2時間の定用量での処置。注入カテーテル埋め込み手順。
【０３９１】
投薬のおよそ1〜2週間前に注入用のカテーテルを埋め込んだ。予備を含むすべての動物にカテーテルを外科的に埋め込んだ。
【０３９２】
手術部位を、無菌回復手術手技に関する試験施設のSOPに従って準備した。動物には予防的に鎮痛薬（フルニキシンメグルミン（USP）2mg/kg、皮下）を与えた。
【０３９３】
すべての動物を麻酔（イソフルラン）し、鼠径部および背部領域を剃毛した。小さな切開を施し、大腿静脈を単離した。その血管に小さな切開を行い、無菌カテーテルを血管内に入れた。大腿静脈を通してカテーテルを挿入し、下大静脈中に、腎臓のすぐ尾側まで逆行性に通した。カテーテルを縫合糸で固定し、うなじで体外化するように、皮下に通した。カテーテルのループが留まる小さなポケットを出口作製部位（exteriorization site）に作った。鼠径部領域を縫合糸によって閉じた。
【０３９４】
動物をジャケットに入れ、埋め込んだカテーテルを、フタ付きセプタムコネクターを持つピンに取り付けた。カテーテルをタウロリジンクエン酸塩ロッキング溶液でロックした。手術日に各動物にエンロフロキサシン5.0mg/kgを筋肉内投与した。
【０３９５】
注入カテーテル維持手順
動物を研究に供する前に、試験施設のSOPに従って、埋め込まれた大腿静脈カテーテルを開存性について評価した。
【０３９６】
体積用量（速度）
20mL/kg/2時間（10mL/kg/時間）。
【０３９７】
個々の投与濃度
個々の動物の濃度は、最も新しく記録された定期測定の体重から算出した。
【０３９８】
頻度および継続時間
第1相において、各動物は静脈内注入（2時間）によって投与される単回投与を受けた後、各用量区間後に、2〜3日の観察期間を設けた。単回静脈内（2時間）注入に続いて、動物からはそれぞれのジャケットおよび投与セットが取り除かれ、動物を食塩水維持には戻さなかった。
【０３９９】
第2相において、各動物は1日目、4日目および7日目に、静脈内注入（2時間）によるブリンシドフォビル投与を受けた。投与間は速度0.5mL/時間の無菌食塩水で動物を維持した。7日目の投薬の完了後に、カテーテルを結紮し、ジャケットを取り除き（カテーテルに結び目を作り、カテーテルを皮膚の下で後退させ）、ジャケットを除去した。
【０４００】
投与部位
大腿静脈/大静脈中の外科的に埋め込まれたカニューレ。
【０４０１】
投与手順
投与開始の1〜2日前に、ロック溶液を各動物に埋め込まれたカテーテルから（可能であれば）引き抜き、テザーおよび注入投与セットを接続する前に、カテーテルを食塩水でフラッシュした。動物のカテーテルを接続した後、1日目の投薬までは、動物に無菌食塩水（0.9％NaCl、USP）を、較正されたMedfusionシリンジポンプによって、0.5mL/時間の速度で注入した。
【０４０２】
注入ラインにブリンシドフォビルを送達し、全用量の送達を保証するために、食塩水フラッシュを注入した（カテーテルラインをフラッシュするために、さらに約0.5〜1mLの体積を、ブリンシドフォビルと同じ速度で投与した）。
【０４０３】
投与精度
各注入日についてアカウンタビリティー（投与された実際の用量の確認）を算出し、日々の調節のために精査した。各相で、投与開始に先だって、および投薬の終了後に、ポンプを精度についてチェックした。
【０４０４】
収集時間および動物の数
第2相ではブリンシドフォビルの血漿中濃度を決定するために血液試料を得た。
【０４０５】
（表５３）収集時間および動物の数
2019519570.tif 000073
1日目および7日目に、上記の時点において、毒物動態学的決定用の血液試料を得た。
【０４０６】
収集手順
各時点において各動物から尾静脈経由でおよそ0.4mLの全血を得た。動物は血液収集前に絶食させなかった。加工に先だち、施設SOPに従って、K2EDTA抗凝固剤が入っているチューブに血液を収集し、氷（wet ice）上に正立させた。遠心分離（およそ2000g、およそ2〜8℃で10分間）によって血漿を分離した。研究番号、動物番号、時点、試料採取の日および試料タイプを適当にラベルした1本のクライオチューブに、およそ0.10mLの血漿を移した。残りの血漿を第2のクライオチューブに移し、バックアップ試料としてとっておいた。各血液試料の収集後およそ2時間以内に、血漿をおよそ-80±10℃で、分析まで凍結しておいた。最終血液収集後に動物を安楽死（CO2吸入）させた。
【０４０７】
すべての血漿試料チューブを凍結（-80±10℃）保管し、分析のためにコロラド州コロラドスプリングスのPyxant Labに搬送（凍結、ドライアイス上）した。試料は収集から1ヶ月以内に搬送した。
【０４０８】
一般に、TKパラメータは、Phoenix WinNonLin（V6.3）を使って複合的採血計画から得られたブリンシドフォビルおよびシドフォビルの平均血漿中濃度を使って見積もった。
【０４０９】
ケージ中の動物を、死亡および重篤な毒性効果または薬理学的効果の徴候について毎日2回観察した。
【０４１０】
第1相投与観察については、注入期間中に観察された健康不良または毒性効果もしくは薬理学的効果の徴候（例えば全身状態、外観、活動、挙動、呼吸などの異常）を記録した。
【０４１１】
動物をそれぞれのケージから取り出し、試験前に一度検査した。
検査には、全身状態、皮膚および毛皮、眼、鼻、口腔、腹部および外生殖器の観察ならびに呼吸の評価を含めた。
【０４１２】
体重
第1相:動物をそれぞれのケージから取り出し、試験前に2回、および各投与前に、体重を測定した。
【０４１３】
第2相:動物をそれぞれのケージから取り出し、試験前に2回、各投与前、および7日目の午後に投与された最後の投与に続いて、体重を測定した。剖検の直前に最終空腹時体重を得た。
【０４１４】
第2相では投与の1週間前から毎週、摂食量を測定（重量測定）した。
【０４１５】
最終手順として眼窩静脈叢（眼球後静脈叢）から軽いイソフルラン麻酔下で得た血液を使って、投与終了時にすべての動物について、血液学的パラメータおよび臨床化学パラメータを分析した。血液収集前は動物を一晩絶食させた。血液収集後は動物を麻酔から回復させなかった。
【０４１６】
血液学
血液試料（およそ0.25mL）をK2EDTA抗凝固剤が入っているチューブに収集し、Siemens ADVIA 120血液分析装置を使って以下の項目について分析した:ヘモグロビン濃度（HGB）；ヘマトクリット（HCT）；赤血球数（RBC）；血小板数（PLT）；平均赤血球容積（MCV）；平均赤血球ヘモグロビン量（MCH）；平均赤血球ヘモグロビン量濃度（MCHC）；赤血球分布幅（RDW）；総白血球数（WBC）；網状赤血球数（RETIC）；白血球分画（検証のために手作業による白血球分画を行い、必要であれば絶対値を算出した）；好中球（ANEU）；リンパ球（ALYM）；好酸球（AEOS）；好塩基球（ABASO）；単球（AMONO）；大無染色細胞（ALUC）。
【０４１７】
各血液収集区間において各動物について末梢血塗抹標本を調製し、自動化された結果の確認および/または臨床病理学者が必要とみなした他の評価に利用できるようにした。
【０４１８】
臨床化学
血液試料（およそ1mL）を抗凝固剤が入っていないチューブに収集し、凝固させ、遠心分離することで血清を得て、Siemens ADVIA 1800化学分析装置を使って以下の項目について分析した:アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）（速度論的方法-改変Bergmeyer法）；アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）（速度論的方法-改変Bergmeyer法）；アルカリホスファターゼ（ALKP）（速度論的方法-Tietz法AMP緩衝剤）；血中尿素窒素（BUN）（酵素法-ウレアーゼによるRoch-Ramek法）；クレアチニン（CREAT）（Jaffe法アルカリ性媒質中のピクリン酸）；グルコース（GLU）（グルコースヘキソキナーゼII法）；コレステロール（CHOL）（酵素法エステラーゼ/オキシダーゼ-Trinder法エンドポイント）；トリグリセリド（TRIG）（Fossati三工程酵素法-Trinder法エンドポイント）；総タンパク質（TP）（ビウレット法）；アルブミン（ALB）（ブロモクレゾールグリーン法）；総ビリルビン（TBILI）（バナジン酸（Vandate）による酸化）；ナトリウム（NA＋）（イオン選択性電極）；カリウム（K＋）（イオン選択性電極）；塩化物（Cl-）（イオン選択性電極）；カルシウム（Ca＋＋）（Michaylova & Ilkova法、アルセナゾIII）；無機リン（PHOS）（リンモリブデン酸-UV法）。
【０４１９】
死後検査
第1相:観察期間の完了後はすべての動物を二酸化炭素吸入に続く瀉血によって安楽死させ、肉眼的検査なしで廃棄した。
【０４２０】
第2相:主DRF研究動物は、イソフルラン吸入に続く瀉血によって安楽死させ、TKサテライト動物は二酸化炭素吸入によって安楽死させた。
【０４２１】
第2相主研究動物では8日目に剖検を行った。剖検前に動物を一晩絶食させた。
【０４２２】
すべての第2相主研究動物に完全な肉眼的検査を行った。肉眼的検査には、肉眼的形態異常の存在に関する外表面およびすべての開口部；脳および脊髄の外表面；頭蓋腔、胸腔、腹腔、骨盤腔および首の器官および組織；ならびに屠殺体の残りの部分の検査を含めた。検査後は動物を廃棄し、組織は収集も保存もしなかった。
【０４２３】
血液学には以下の略号を使用した: CS:凝固検体；LA:検査室での事故；NVIM；ありそうにない結果ゆえに無効；CLSE:重度の血小板凝集が認められた；CLSL:わずかな血小板凝集が認められた；NCLP:凝集なし。
【０４２４】
血液化学:分析限界（＜0.2）未満のTBILI値は、計算から除外する。
グロブリン（GLOB）は、総タンパク質-アルブミンとして算出した。
アルブミン/グロブリン比（A/G）は、アルブミン/グロブリンとして算出した。
【０４２５】
統計分析はすべて、個々の動物を基本実験単位として使用して、雄および雌について別々に実行した。
【０４２６】
第2相では各時点において以下のデータタイプを別々に分析した:体重；区間間の体重変化；ベースラインからの累積体重変化体重；摂食量、血液学および臨床化学。分析すべきパラメータを連続的、離散的または二値と区別した。次に以下の手順を使ってブリンシドフォビル処置群を対照と比較した。
【０４２７】
生存中研究実施
研究実施に関する詳細を、限定するわけではないが試験動物、研究材料、研究計画、投与、観察および結果を含めて、下記表54に要約する。
【０４２８】
（表５４）実験計画研究要約（第2相）
2019519570.tif 000074
【０４２９】
試料採取
各ラットが試料採取日ごとに2回試料採取されるように、複合的採血計画を使用した。血液試料は表54に示すスキームに従って収集した。血液は、抗凝固剤が入っているチューブに、無麻酔の動物から尾静脈経由で収集し、氷上に正立させた。動物は血液収集前に絶食させなかった。遠心分離（およそ2〜8℃において、およそ2000gで10分間）によって血漿を分離し、個別にラベルしたクライオチューブに移した。収集した血液試料が入っているすべてのクライオチューブに、研究番号、動物番号、時点、試料採取の日および試料タイプに関して適当にラベルした。各血液試料の収集後およそ2時間以内にすべての血漿試料を得て、分析までおよそ-80℃（±10℃）で凍結しておいた。
【０４３０】
すべての血漿試料を凍結保管［およそ-80℃（±10℃）］し、分析のためにPyxant Laboratoriesに搬送（凍結、ドライアイス上）した。
【０４３１】
バイオアナリシス法
ラット血漿バイオアナリシスはPyxant Laboratoriesによって行われた。タンパク質沈殿抽出後のLC-MS/MS分析に基づく方法を使って、ブリンシドフォビルおよびシドフォビルの濃度について、血漿試料を分析した。ブリンシドフォビルおよびシドフォビルに関する較正範囲は、ラット血漿の50μLアリコートに関して、それぞれ1.00〜1500ng/mLおよび5.00〜750ng/mL（Pyxant研究番号3025）であった。ISRのための試料分析は、この非GLP研究の一部として行わなかった。
【０４３２】
データ分析
毒物動態分析
平均プロファイル（Mean Profile）を作成するために、定量限界未満（BLQ）である試料濃度はすべて0に設定した。
【０４３３】
これらの値を表61および表62に記録する。ここでは、元のBLQ結果が［濃度］と表示されたカラムに、また平均値を算出するための帰属値が［帰属濃度］と表示されたカラムに記録されている。
【０４３４】
NCAのための平均プロファイルBLQ値の処理を表63および表64に記録する。ここでは元の平均プロファイルBLQ結果を［平均濃度］と表示されたカラムに、またNCA分析に使用した帰属値を［帰属平均濃度］と表示されたカラムに記録する。初期時点（Tmax前）におけるBLQ値は0に設定し、Tmax後の時点におけるBLQは欠測（missing）に設定した。
【０４３５】
薬物動態パラメータ推定値はすべて、非コンパートメントモデル（IV注入投与用のモデル200-202）を使って揃えた。AUClastおよびAUCinfは線形アップ対数ダウン（linear up log down）台形公式を使って算出した。
統計解析は、算術平均、標準偏差、算術平均の％CVを含む記述統計解析に限定した。
【０４３６】
平均血漿中濃度の変動係数（％CV）は、ブリンシドフォビルの場合で（9.98〜173％CV）、シドフォビルの場合で（4.82〜173％CV）の範囲にあった。
【０４３７】
ブリンシドフォビルのピーク濃度は一般に2時間IV注入の最後に観察され、急速に減少して、1mg/kg投与の開始の8時間後および15mg/kg投与の24時間後には、ブリンシドフォビル濃度は定量下限（LLOQ、1ng/mL）またはほぼ定量下限であった。排出相を特徴づけるにはデータポイントが不十分であったので、最終半減期（t1/2）、CLおよびVssは決定することができなかった。一般に、平均ブリンシドフォビルCmaxおよび平均ブリンシドフォビルAUCは、1mg/kgから15mg/kgへの用量の増加にほぼ比例して増加した。ただし、1mg/kg投与後は、わずかな濃度値でAUCが決定された。7日目のブリンシドフォビルのCmax値およびAUClast値は、1日目と比較して7日目では値が低くなる傾向を示した（7日目/1日目蓄積比（AR）が0.44〜0.53）。さらに、ブリンシドフォビルTKパラメータに性差は観察されなかった。
【０４３８】
全体として、代謝産物シドフォビルへの曝露は、ブリンシドフォビル用量の増加に比例するほどには増加せず、TKパラメータに明白な性差も、反復投与後のTKパラメータの変化もなかった。
【０４３９】
ブリンシドフォビルおよびシドフォビル代謝産物シドフォビルの濃度を決定するために、第2相中にのみ収集した108個の血漿試料で、バイオアナリシスを行った。1日目および7日目に投与の開始後2時間の時点で（第1群）、または1日目に投与の開始後1、2、8および24時間の時点ならびに7日目に投与前および投与の開始後2、8および24時間の時点で（第2群および第3群）、血漿試料を収集し、LC/MS/MSによって分析した。
【０４４０】
ブリンシドフォビルおよびシドフォビルの血漿中濃度の毒物動態分析は第2相についてのみ行った。
【０４４１】
1日目および7日目に、ブリンシドフォビルCmaxは、用量にほぼ比例して増加するか（雌ラットの場合）、用量に比例するほどには増加しなかった（雄ラットの場合）。1mg/kgから15mg/kgに用量を15倍増加させた場合、Cmaxは雌では17.3〜18.2倍、雄では9.2〜18.6倍増加した。1日目および7日目に、ブリンシドフォビルAUClastは、ほぼ比例的に増加し（雌ラットの場合）、用量を15倍増加させた場合、AUClastは14.1〜16.1倍増加した。1mg/kg投与後の雄ラットではデータポイントが不十分であったため、AUClastの比例性を決定することができなかった。
【０４４２】
用量1mg/kgまたは15mg/kgでの1日目および7日目のブリンシドフォビルCmaxは、雌動物と雄動物との間で類似していた（54％以内の相違）。用量1mg/kgについては、雄でのAUCを算出するにはデータポイントが不十分であったため、ブリンシドフォビルAUClastを比較することができなかった。用量15mg/kgの場合、1日目および7日目のブリンシドフォビルAUClastは、雌動物と雄動物との間で類似していた（16％以内の相違）。
【０４４３】
1mg/kgのブリンシドフォビルを週2回投与した後の雌動物において、および15mg/kg後の雌雄両方の動物において、7日目のブリンシドフォビルCmax値およびブリンシドフォビルAUClast値は、1日目と比べて7日目の方がCmaxおよびAUClastが低くなる傾向を示した（7日目/1日目蓄積比（AR）が0.44〜0.53）。
【０４４４】
（表５５）ラットへの1日目、3日目、および7日目のブリンシドフォビルの単回および複数回2時間静脈内注入投与後のブリンシドフォビルTKパラメータ（第2相）
2019519570.tif 000075
NA、該当なし；NR、データポイントが不十分であったため報告できない
【０４４５】
表55および表56に示すとおり、1日目および7日目に、シドフォビルCmaxは一般に、用量に比例するほどには増加しなかった。ブリンシドフォビル用量を1mg/kgから15mg/kgに15倍増加させた場合、シドフォビルCmaxは雌では2.9〜4.1倍、雄では5.6〜16.8倍増加した。1日目および7日目に、シドフォビルAUClastは、雌動物の場合、用量に比例するほどには増加せず、ブリンシドフォビル用量を15倍増加させると、シドフォビルAUClastは9.4〜16.2倍増加した。1mg/kg投与後の雄ラットではデータポイントが不十分であったため、AUClastの比例性を決定することができなかった。
【０４４６】
15mg/kgのブリンシドフォビルを投与した後の1日目および7日目のシドフォビルのCmaxおよびAUClastは、雌動物と雄動物との間で類似していた（33％以内の相違）。
【０４４７】
1mg/kgのブリンシドフォビルを週2回投与した後の雌動物において、7日目のシドフォビルのCmaxおよびAUClastは、1日目と比較して7日目の方がCmaxおよびAUClastが高くなる傾向を示した（7日目/1日目ARは1.6〜1.9の範囲にあった）。しかし、15mg/kgを投与（3回）された雌雄どちらの動物でも、シドフォビルのCmaxおよびAUClastは類似していた（7日目/1日目ARは1.0〜1.1の範囲にあった）。
【０４４８】
雌動物について1日目にモルベースで算出したAUClastの代謝産物対親化合物（M/P）比は、1mg/kgおよび15mg/kgのブリンシドフォビル用量で、それぞれ0.190および0.661であった。雌動物の場合、7日目のM/P比は、1mg/kgおよび15mg/kgのブリンシドフォビル用量について、それぞれ0.193および0.444であった。
【０４４９】
1mg/kg投与後の雄ラットではデータポイントが不十分であったため、AUClastのM/P比を決定することができなかった。15mg/kgのブリンシドフォビル投与後の1日目および7日目のM/P比は、それぞれ0.126および0.307であった。
【０４５０】
（表５６）ラットへの1日目、3日目、および7日目のブリンシドフォビルの単回および複数回2時間静脈内注入投与に続くシドフォビルTKパラメータ
2019519570.tif 000076
【０４５１】
第1相および第2相では、すべての動物が予定された終了時点まで生き残った。
【０４５２】
臨床観察
第1相
用量1（2mg/kg）:どちらの雄動物でも臨床徴候は頻呼吸および背弯姿勢からなり、立毛、部分閉眼および活動減少は伴う場合も伴わない場合もあった。
【０４５３】
用量2（4mg/kg）；両方の雄および1匹の雌動物における臨床徴候は不規則呼吸からなった。
【０４５４】
用量3（10mg/kg）:雄動物にも雌動物にも臨床徴候は観察されなかった。
【０４５５】
用量4（15mg/kg）:両方の雄動物および1匹の雌動物における臨床徴候には、不規則呼吸、立毛および両側性部分閉眼を伴うまたは伴わない活動減少が含まれた。
【０４５６】
臨床徴候はすべて可逆的であり、注入の終了後まもなく解消した。
【０４５７】
第2相
1mg/kg/日または15mg/kg/日でのブリンシドフォビルの投薬は、雄動物でも雌動物でも、ブリンシドフォビル関連臨床徴候を何ももたらさなかった。ブリンシドフォビルによる処置に関連する体重（第2相のみ評価）または摂食量への影響はなかった。
【０４５８】
臨床病理学
ブリンシドフォビルに関連する血液学的所見は、15mg/kgでの雄および雌における網状赤血球のわずかな減少（それぞれ-33％および-30％対照；雄のみ統計学的に有意）に限られ、これには、雄での平均細胞ヘモグロビン濃度（MCHC）の増加（＋2.1％対照、統計学的に有意）が伴った。赤血球量（ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数）の減少は、7日間の投与相の終了時に無視できる程度であった（-4.2％対照まで）。赤血球量に対する網状赤血球減少の影響がごくわずかであるのは、ラットにおける赤血球の寿命（約45〜68日）が、網状赤血球（2〜5日）と比較して長いことが原因であると考えられた。赤血球量の減少は、継続投与によってさらに顕著になると予想されるだろう。網状赤血球の減少により、造血組織における赤血球生成の減少が示された。摂食量にも体重にも減少がなく、臨床状態の不良もないので、それらは、この薬物クラス（ヌクレオチド類似体）では予想外ではない赤血球生成のブリンシドフォビル関連抑制による可能性が高かった。
【０４５９】
15mg/kgの雄（＋3.8％対照；統計学的に有意でない）および≧1mg/kgの雌（＋4.9％対照；統計学的に有意）ではブリンシドフォビルに関連する総カルシウムのごくわずかな増加があり、15mg/kgの雌では尿素（BUN）のごくわずかな増加（＋29％対照；統計学的に有意）があった。どちらの所見も、変化した腎機能（尿排泄の減少）と共に観察することができる。加えて、理論に束縛されることは望まないが、総カルシウムの増加は、骨からの動員の増加または腸吸収の増加を反映しているのかもしれない。
【０４６０】
動物番号3048における変化（BUN、クレアチニンおよびリンのわずかな増加）は、ブリンシドフォビル関連ではないとみなされ、左腎臓がないこと（肉眼で確認）による糸球体濾過量の減少から派生したものであった。
【０４６１】
対照との他の相違はすべて、統計学的に有意でも、そうでなくても、それらの方向、規模が小さいこと、発生頻度が低いこと、用量との関連がないこと、関連エンドポイントと一致しないことから、かつ/または値が研究対照範囲と同等であることから、ブリンシドフォビル関連とはみなさなかった。
【０４６２】
病理学
肉眼的所見は数少なく、孤発的に発生し、対照動物における発生率と類似する発生率で発生するか、用量関係を欠くか、先天異常と考えられた（動物番号3048）ので、ブリンシドフォビル関連とはみなさなかった。雄動物番号3048は左精嚢も左腎臓も有しなかった。左腎臓が存在しないことは、この動物における血中尿素窒素（BUN）、クレアチニンおよびリンの上昇と相関した。
【０４６３】
第1相では、この研究の条件下で、単回2時間IV注入によって投与した場合に、すべての用量が十分に忍容された。それゆえに、ブリンシドフォビルの最大耐用量は決まらなかった。ただし、0.75mg/mLを上回るブリンシドフォビル濃度での溶血を示すインビトロでの証拠に基づけば、ブリンシドフォビルの0.75mg/mL溶液の2時間IV注入によって送達される15mg/kgは、投与可能な最大用量に相当する。
【０４６４】
第2相では、ブリンシドフォビルのピーク濃度は一般に2時間IV注入の最後に観察され、急速に減少した。
【０４６５】
一般に、平均ブリンシドフォビルCmaxおよび平均ブリンシドフォビルAUCは、1mg/kgから15mg/kgへの用量の増加にほぼ比例して増加した。ただし、1mg/kg投与後は、わずかな濃度値でAUCが決定された。7日目のブリンシドフォビルCmax値およびブリンシドフォビルAUClast値は、1日目と比較して7日目では値が低くなる傾向を示した（7日目/1日目蓄積比（AR）が0.44〜0.53）。さらに、ブリンシドフォビルTKパラメータに性差は観察されなかった。全体として、代謝産物シドフォビルへの曝露は、ブリンシドフォビル用量の増加に比例するほどには増加せず、TKパラメータに明白な性差も、反復投与後のTKパラメータの変化もなかった。この研究の条件下では、1日目、4日目、および7日目の2時間IV注入による1mg/kgまたは15mg/kgブリンシドフォビルの単回投薬は、十分に忍容された。
【０４６６】
血漿におけるブリンシドフォビルの濃度
1mg/kgおよび15mg/kgの単回投与および反復投与に続くブリンシドフォビルに関する濃度-時間データを、表59および表60に要約する。
【０４６７】
すべての対照血漿試料においてブリンシドフォビルおよびシドフォビルの濃度は、各分析物についてBLQであった（それぞれ＜1.0ng/mLおよび＜5.0ng/mL）。
【０４６８】
2時間にわたるブリンシドフォビルの単回IV注入投与に続いて、ブリンシドフォビルの血漿中濃度が、どちらの用量レベル（1mg/kgおよび15mg/kg）でも、第1試料（1時間）に検出された。週2回の投与（1日目、3日目、および7日目の3回）に続いて、7日目に、ブリンシドフォビルは、投与前試料ではBLQだったが、1回目の投与後試料（2時間、注入終了時）には検出された。ブリンシドフォビルのピーク濃度のメジアン時間（Tmax）は、単回および週2回の1mg/kg投与の2時間後、および単回15mg/kg投与の1時間後、および週2回の15mg/kg投与の2時間後に見いだされた。1mg/kg投与の8時間後に、すべての雄および一部の雌においてブリンシドフォビルの濃度はBLQに達し、15mg/kg投与の24時間後にはLLOQまたはほぼLLOQであった。ブリンシドフォビルの平均血漿中濃度に関する変動係数（％CV）は、雌動物については13.0〜173％の範囲にあり、雄動物については9.98〜28.1％の範囲にあった。一般に、最も高い％CVは、濃度がLLOQまたはほぼLLOQである遅い時点において観察された。
【０４６９】
血漿におけるブリンシドフォビルの毒物動態
Phoeneix WinNonlin分析のための入力ファイルに使用した平均血漿中ブリンシドフォビル濃度-時間情報は、表63に含まれている。ラットへの静脈内注入としてのブリンシドフォビルの単回投与および週2回投与に続くブリンシドフォビルのTKパラメータを表56に要約する。排出相を特徴づけるにはデータポイントが不十分であったため、最終半減期（t1/2）、CLおよびVssは決まらなかった。
【０４７０】
1日目および7日目に、ブリンシドフォビルCmaxは、用量にほぼ比例して増加するか（雌ラットの場合）、用量に比例するほどには増加しなかった（雄ラットの場合）。1mg/kgから15mg/kgに用量を15倍増加させた場合、Cmaxは雌では17.3〜18.2倍、雄では9.2〜18.6倍増加した。1日目および7日目に、ブリンシドフォビルAUClastは、ほぼ比例的に増加し（雌ラットの場合）、用量を15倍増加させた場合、AUClastは14.1〜16.1倍増加した。1mg/kg投与後の雄ラットではデータポイントが不十分であったため、AUClastの比例性を決定することができなかった。
【０４７１】
用量1mg/kgまたは15mg/kgでの1日目および7日目のブリンシドフォビルCmaxは、雌動物と雄動物との間で類似していた（54％以内の相違）。用量1mg/kgについては、雄でのAUCを算出するにはデータポイントが不十分であったため、ブリンシドフォビルAUClastを比較することができなかった。用量15mg/kgの場合、1日目および7日目のブリンシドフォビルAUClastは、雌動物と雄動物との間で類似していた（16％の相違）。
【０４７２】
1mg/kgのブリンシドフォビルを週2回投与した後の雌動物において、および15mg/kg後の雌雄両方の動物において、7日目のブリンシドフォビルCmax値およびブリンシドフォビルAUClast値は、1日目と比べて7日目の方がCmaxおよびAUClastが低くなる傾向を示した［7日目/1日目蓄積比（AR）が0.44〜0.53］。
【０４７３】
（表５７）ラットへの1日目、3日目、および7日目のブリンシドフォビルの単回および複数回2時間静脈内注入投与に続くブリンシドフォビルTKパラメータ
2019519570.tif 000077
【０４７４】
血漿におけるシドフォビルの濃度
1mg/kgおよび15mg/kgの単回投与および反復連日投与に続く、シドフォビルに関する濃度-時間データを、表59〜表60に要約する。
【０４７５】
ブリンシドフォビルの単回IV注入投与に続いて、雌動物では、1mg/kg投与の2時間後（2つ目の時点）または15mg/kg投与の1時間後（最初の時点）で、シドフォビルの血漿中濃度が検出された。ブリンシドフォビルの週2回投与に続いて、7日目に、シドフォビルの血漿中濃度は、投与前試料ではBLQだったが、すべての2時間試料（最初の投与後時点）に検出された。シドフォビルのメジアンTmaxは、単回および週2回の1mg/kgブリンシドフォビル投与の2時間後、ならびに単回および週2回の15mg/kgブリンシドフォビル投与の8時間後に見いだされた。
【０４７６】
ブリンシドフォビルの単回IV注入投与に続いて、雄動物では、シドフォビルの検出可能な血漿中濃度が、1mg/kg投与後は、8時間の一時点においてのみ観察された。しかし、15mg/kgの投与後は、シドフォビルが最初の試料（1時間）に検出された。ブリンシドフォビルの週2回投与に続いて、シドフォビルの血漿中濃度は、投与前試料および1回目の投与後試料（2時間）ではBLQであったが、1mg/kg投与後は、7日目の8時間試料、および15mg/kg投与後は、7日目の2時間試料（最初の投与後試料）に検出された。シドフォビルのメジアンTmaxは、単回または週2回の1mg/kgまたは15mg/kgブリンシドフォビル投与の8時間後に見いだされた。雄動物でも雌動物でも、シドフォビルの濃度は、1mg/kgブリンシドフォビルの単回投与および週2回投与に続いて、24時間までにBLQに達し、15mg/kgブリンシドフォビルの単回投与または週2回投与後は、24時間（最後の時点）までにBLQに到達しなかった。シドフォビルの平均濃度の％CVは、雌動物では4.82％から88.4％までの範囲にあり、雄動物では5.49％から173％までの範囲にあった。一般に、最も高い％CVは、シドフォビル濃度がLLOQまたはほぼLLOQである早い時点または遅い時点において観察された。
【０４７７】
血漿におけるシドフォビルの毒物動態
Phoenix WinNonlin分析のための入力ファイルに使用した平均血漿中シドフォビル濃度-時間情報は、表64に含まれている。ラットへの静脈内注入としてのシドフォビルの単回投与および週2回投与に続くシドフォビルのTKパラメータを表58に要約する。
【０４７８】
1日目および7日目に、シドフォビルCmaxは一般に、用量に比例するほどには増加しなかった。ブリンシドフォビル用量を1mg/kgから15mg/kgに15倍増加させた場合、シドフォビルCmaxは雌では2.9〜4.1倍、雄では5.7〜16.8倍増加した。1日目および7日目に、シドフォビルAUClastは、雌動物の場合、用量に比例するほどには増加せず、ブリンシドフォビル用量を15倍増加させると、シドフォビルAUClastは9.4〜16.2倍増加した。1mg/kg投与後の雄ラットではデータポイントが不十分であったため、AUClastの比例性を決定することができなかった。
【０４７９】
15mg/kgのブリンシドフォビルを投与した後の1日目および7日目のシドフォビルのCmaxおよびAUClastは、雌動物と雄動物との間で類似していた（33％以内の相違）。
【０４８０】
1mg/kgのブリンシドフォビルを週2回投与した後の雌動物において、7日目のシドフォビルのCmaxおよびAUClastは、1日目と比較して7日目の方がCmaxおよびAUClastが高くなる傾向を示した（7日目/1日目ARは1.6〜1.9の範囲にあった）。しかし、15mg/kgを投与（3回）された雌雄どちらの動物でも、シドフォビルのCmaxおよびAUClastは類似していた（7日目/1日目ARは1.0〜1.1の範囲にあった）。
【０４８１】
雌動物の場合、1日目のAUClastの代謝産物対親化合物（M/P）比は、1mg/kgおよび15mg/kgのブリンシドフォビル用量で、それぞれ0.190および0.661であった。雌動物の場合、7日目のM/P比は、1mg/kgおよび15mg/kgのブリンシドフォビル用量について、それぞれ0.193および0.444であった。
【０４８２】
1mg/kg投与後の雄ラットではデータポイントが不十分であったため、AUClastのM/P比を決定することができなかった。15mg/kgのブリンシドフォビル投与後の1日目および7日目のM/P比は、それぞれ0.126および0.307であった。
【０４８３】
（表５８）ラットへの1日目、3日目、および7日目のブリンシドフォビルの単回および複数回2時間静脈内注入投与に続くシドフォビルTKパラメータ
2019519570.tif 000078
【０４８４】
（表５９）雌雄ラットに1mg/kgの名目ブリンシドフォビル用量で1日目、3日目、および7日目に単回および複数回2時間静脈内注入投与した後のブリンシドフォビルおよびシドフォビルの血漿中濃度
2019519570.tif 000079
2019519570.tif 000080
2019519570.tif 000081
aバイオアナリシスの結果がBLQである試料にはゼロを帰属させた。
【０４８５】
（表６０）雌雄ラットに15mg/kgの名目ブリンシドフォビル用量で1日目、3日目、および7日目に単回および複数回2時間静脈内注入投与した後のブリンシドフォビルおよびシドフォビルの血漿中濃度
2019519570.tif 000082
2019519570.tif 000083
2019519570.tif 000084
aバイオアナリシスの結果がBLQである試料にはゼロを帰属させた。
【０４８６】
（表６１）平均生成のためのブリンシドフォビル濃度測定値および帰属値データ
2019519570.tif 000085
2019519570.tif 000086
【０４８７】
（表６２）平均生成のためのシドフォビル濃度測定値および帰属値データ
2019519570.tif 000087
2019519570.tif 000088
【０４８８】
（表６３）NCAのための平均および帰属ブリンシドフォビル濃度データ
2019519570.tif 000089
【０４８９】
（表６４）NCAのための平均および帰属シドフォビル濃度データ
2019519570.tif 000090
【０４９０】
実施例9-[14C]ブリンシドフォビルの単回経口投与または単回静脈内投与に続く定量的全身オートラジオグラフィーによる物質収支、薬物動態、および組織分布
この研究の目的は、[14C]ブリンシドフォビルの単回静脈内（IV、2時間注入）投与または単回経口（PO、胃管法）投与の施行に続いて、雄Sprague Dawley（SD）ラットおよびLong-Evans（LE）ラットにおける総放射能の組織分布を特徴づけることであった。加えて、[14C]ブリンシドフォビルの単回静脈内（IV、2時間注入）投与後の雄Sprague Dawleyラットにおける総放射能の排泄の速度および程度（物質収支）ならびに薬物動態（PK）を検査した。この研究で収集して残った血漿および排泄物は、異なるプロトコールで行われる代謝産物プロファイルおよび同定実験のために-70℃で保管した。
【０４９１】
材料および方法
この研究では、4群の雄SDラット（白色種）および3群の雄LEラット（有色種）、合計39匹を利用した。動物はすべてHilltop Lab Animals, Inc.（ペンシルバニア州スコットデール）から入手した。ラットは投与時点で体重が214〜265gであった。第1群、第2群、第3群および第4群のラットには、15mg/kgの目標用量で、[14C]ブリンシドフォビルの単回2時間（h）IV注入を施行した。第5群のラットには、2mg/kgの目標用量で[14C]ブリンシドフォビルの単回2時間IV注入を施行した。第6群および第7群のラットには、15mg/kgの目標用量で[14C]ブリンシドフォビルの単回経口胃管法投与を施行した。3種の投与製剤（1つは高用量IV用、1つは低用量IV用、そして1つはPO投与用）が、投与日に、QPSにおいて調製された。第1群、第2群、第3群および第4群のIV製剤は、pH8.0（±0.1）の5％デキストロース溶液中の10mMリン酸ナトリウム緩衝剤の媒体を含有した。第5群のIV製剤は、pH8.0（±0.1）の5％デキストロース溶液中の16mMリン酸ナトリウム緩衝剤の媒体を含有し、PO投与製剤は、pH8.0（±0.1）の12.5mMリン酸ナトリウム緩衝剤の媒体を含有した。第5群のIV投与製剤と、第6群および第7群のPO投与製剤とは、最終緩衝剤濃度がすべての投与製剤においておよそ10mMになるように、濃度の高い緩衝剤を含有した。
【０４９２】
試験動物
Hilltop Lab Animals, Inc.（ペンシルバニア州スコットデール）から入手した16匹の成体雄SDラットおよび23匹の成体雄LEラットを、この研究に供した。第1〜5群のラットは、IV注入用に留置大腿静脈カニューレ（FVC）を有するように、外科的に改変した。動物の体重範囲、供給源、ベンダーおよび受領日は生データに記録した。研究に供した動物に、尾に油性マーカーを使って固定識別番号を割り当て、使用しない予備の動物は、研究に供した動物の投薬が成功した後に、ストックに戻した。ランダム化はカニューレ開存性およびQPS SOPによって行った。
【０４９３】
表65および表66に投与および試料収集プロトコールを要約する。
【０４９４】
（表６５）生存中研究投与要約
2019519570.tif 000091
aカニューレを挿入した大腿静脈；b注入時間2時間
【０４９５】
（表６６）生存中試料収集要約
2019519570.tif 000092
ROA＝投与経路
NA＝該当なし
TBD＝未決定
aドライアイス上で収集した試料
【０４９６】
投薬
投与体積を決定するために使用した動物の体重は、投薬日の投与前に測定した。用量アッセイ結果、動物の体重および目標投与パラメータをDebra LIMSに入力し、各動物に関する目標投与体積をDebra LIMSによって決定した。動物には、15mg/kg（第1〜4群）または2mg/kg（第5群）の目標経口用量で[14C]ブリンシドフォビルの単回2時間IV注入を与えるか、15mg/kg（第6群および第7群）の目標経口用量で[14C]ブリンシドフォビルの経口胃管投与を行った。各ラットに投与された実際の用量は、個々の動物の体重データを使用するDebra LIMSにより、空の投与シリンジ/針または投与後の針/注入ラインの重量を投与前のシリンジ/針または針/注入ライン全体の重量から差し引くことによって、決定された。平均投与前放射能濃度（dpm/g投与溶液）に、投与された投与溶液の正味の重量をかけることで、各動物に投与された放射能の量を算出した。実際の用量を表67に提示する。
【０４９７】
（表６７）体重および雄Sprague Dawleyラット（第1群、第2群、第3群および第6群）ならびに雄Long-Evansラット（第4群、第5群および第7群）に投与された[14C]ブリンシドフォビルの用量
2019519570.tif 000093
2019519570.tif 000094
a経口（PO）製剤の比活性は14.2689μCi/mg [14C]ブリンシドフォビルであった。PO製剤の投与調製物活性は42.2151μCi/gであった。
b静脈内（IV）注入製剤の比活性は13.5694（15mg/kgの場合）および101.5100（2mg/kgの場合）μCi/mg [14C]ブリンシドフォビルであった。IV製剤の投与調製物活性は10.1074μCi/g（15mg/kgの場合）および82.8740μCi/g（2mg/kgの場合）であった。
c試料収集のためにIV注入中に終了させた動物。これらの動物は平均用量計算からは省いた。
d第4群において投与されたすべての動物に関する平均188.836μCi/kgを線量見積もりに使用した。注: SD＝標準偏差；MB＝物質収支；PK＝薬物動態；QWBA＝定量的全身オートラジオグラフィー
【０４９８】
試料収集
この研究中は、各群について以下に述べるように、尿、糞便、血液/血漿、ケージ残渣試料、および屠殺体を収集した。
【０４９９】
排泄物収集（第1群）
排泄物収集のために3匹の雄白色ラットを第1群（IV注入）に割り当てた。
【０５００】
尿試料は、投与前（一晩）ならびに0〜8時間の区間、8〜24時間の区間およびその後の24時間区間ごとに投与後168時間まで、各動物から、予めラベルしておいた尿収集チューブに収集した。すべての尿検体をドライアイス上で収集した。各尿収集物の総重量を記録し、試料をLSC分析までおよそ-70℃で保管した。分析後は試料をおよそ-70℃に維持し、別のプロトコールで行われるさらなる分析のためにとっておいた。
【０５０１】
糞便試料は、投与前（一晩）および168時間まで投与後24時間の間隔で、各動物から、予めラベルしておいた糞便収集チューブに収集した。糞便検体はドライアイス上で収集し、各糞便試料の総重量を記録した。糞便試料は、ホモジナイゼーションおよびLSC分析までおよそ-70℃で保管し、分析後は試料をおよそ-70℃に維持して、別のプロトコールで行われるさらなる分析のためにとっておいた。
【０５０２】
ケージ残渣検体を収集した。毎日の投与後排泄物収集に続いて、投与後24時間以降、ケージをおよそ30mLの脱イオン水ですすいだ。最後の排泄物収集に続いて、代謝ケージの内面におよそ90mLのWindex溶液（または等価な洗剤溶液）を噴霧し、ガーゼパッドで拭き取った。ケージすすぎ液検体およびケージ洗浄液検体を、予めラベルして風袋を量っておいた容器に収集した。各ケージすすぎ液および洗浄液の総重量を記録した。ケージすすぎ収集物、ケージ洗浄収集物およびケージ拭き取り収集物は、およそ-20℃で保管した。第1群および第2群の動物の屠殺体はおよそ-20℃に保った。排泄物中の放射能の回収率が＞90％だったので、屠殺体およびケージ残渣は分析しなかった。
【０５０３】
血漿薬物動態試料収集（第2群）
血漿および血液を分析するために、以下に列挙する時点において、第2群（IV注入）の各動物から血液を収集した。
【０５０４】
最終血液試料は、抗凝固剤としてK2EDTAが入っている予めラベルしておいた血液収集チューブに、心穿刺によって収集した。最終試料（1時点あたりN＝1）は、注入開始の0.5、1、2、4、8、24および72時間後に収集し、体積は限定しなかった。重量測定した3つ一組の血液アリコート（約0.100g）を取り出し、燃焼とそれに続くLSCを使って、総放射能について分析した。血液アリコートは分析までおよそ4℃に維持した。残りの血液試料は氷（およそ4℃）上に維持してから、血液収集時点から1時間以内に遠心分離して血漿を得た。遠心機の設定は研究ノートに記録した。2つ一組の血漿アリコート（0.050mL）を、LSCによる直接計数を使って放射能について分析し、残った血漿をおよそ-70℃で保管し、別の研究プロトコールで行われるかもしれない将来の分析のためにとっておいた。第2群ラットの残った赤血球および動物屠殺体は放射性廃棄物として廃棄した。
【０５０５】
QWBA（第3〜7群）
各動物を、それぞれの最終時点において、血液収集直後に、QWBA分析のために安楽死させた。以下に列挙するように、各群1時点あたり1匹のラットを安楽死させた。
第3群（IV）-2時間（注入終了時）、24時間および168時間
第4群（IV）-1時間、2時間（注入終了時）、4時間、8時間、24時間、72時間、96時間、168時間および840時間
第5群（IV）-2時間（注入終了時）、8時間、24時間および72時間
第6群（PO）-2時間、24時間および168時間
第7群（PO）-0.5時間、1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、72時間、96時間、168時間および840時間
【０５０６】
各ラットをイソフルラン麻酔によって深麻酔し、抗凝固剤としてK2EDTAが入っているチューブに心臓穿刺によって血液試料を収集し（およそ2mL）、ラットをヘキサン/固形二酸化炭素浴中で少なくとも15分間は凍結することによって安楽死させた。血液試料を氷（およそ4℃）で維持した後、遠心分離することで、血液収集時点から1時間以内に血漿を得た。遠心機の設定は研究ノートに記録した。2つ一組の血漿アリコート（0.050mL）を、LSCによる直接計数を使って放射能について分析し、残った血漿をおよそ-70℃で保管し、別の研究プロトコールで行われるかもしれない将来の分析のためにとっておいた。残った赤血球は放射性廃棄物として廃棄した。
【０５０７】
試料保管条件
屠殺体およびケージ残渣試料は、試料分析まで-20℃で保管し、残った血漿および排泄物は-70℃で凍結保管した。
【０５０８】
試料分析
血液、血漿および排泄物のLSC分析
糞便をホモジナイズし、総放射能含量について分析した。各ラットについて重量測定した糞便検体をおよそ3体積の水（糞便検体の重量のおよそ3倍）中でホモジナイズした。各ホモジネートの総重量を決定し、重量測定した3つ一組のアリコート（約0.5g）をPackardサンプルオキシダイザー中で燃焼させてから、LSC分析を行った。個々のアリコートの実際の重量およびホモジナイゼーションに使用した溶媒の量を記録した。前もって重量測定しておいた各糞便ホモジネートの一部を、Combusto-Pad（登録商標）が入っているCombusto-Cone（登録商標）に入れて、換気フード中で一晩乾燥させ、サンプルオキシダイザー中で完全に燃焼させた。
【０５０９】
重量測定した3つ一組の血液アリコートのアリコート（約0.100g）（第2群のみ）を、Packardサンプルオキシダイザー中で燃焼させてからLSC分析を行った。
【０５１０】
燃焼時に遊離した14CO2をCarbo-Sorb（登録商標）の溶液に捕捉し、Permafluor（登録商標）（シンチレーション液）を加え、LSCによって放射能を決定した。既知量の放射能（0.100mLのSpec-Chec（登録商標））が入っているブランクコーンを酸化し、非燃焼標準と比較することで、燃焼プロセスからの回収率（％）を決定した。これらの対照は3つ一組で分析され、これらの対照試料からの14Cの定量的回収を、各試料燃焼日に決定した。試料間の放射能キャリーオーバーを評価するために、ブランクコーン（放射能の添加なし）を燃やした。
【０５１１】
分析後は糞便ホモジネートをおよそ-70℃に維持し、別の研究プロトコールでのさらなる分析のためにとっておいた。
【０５１２】
尿検体（0.300mL）および血漿検体（0.050mL）を、必要なら融解してから、体積で2つ一組に小分けし、LSCで分析した。試料アリコートの体積または重量を研究記録に記録した。Ultima Goldシンチレーション液（5mL、PerkinElmer）を各尿および血漿アリコートに加え、アリコートをよく混合してから、放射能についてLSCで分析した。
【０５１３】
各試料中の放射能（カウント毎分）を、外部標準化および消光曲線を利用して、壊変毎分（dpm）に変換した。モデル2800TRまたはモデル2900TR液体シンチレーション分析装置（PerkinElmer）によって放射能含量を定量した。すべての試料を、少なくとも5分間、または少なくとも100,000カウント毎分（cpm）、カウントした。2つ一組の試料に関して、平均値から10％より大きく異なるLSC結果については、十分な体積を利用できるなら、再び小分けし、再分析した。3つ一組の試料に関してLSC結果が＞10％の％CVを有する場合は、十分な体積を利用できるなら、試料を再びホモジナイズして再分析した。500dpmを上回る平均放射能を有するすべての試料アリコートについては、これらの仕様を適用し、500dpmを下回る値はそのまま受け入れた。定量下限（LLOQ）は、バックグラウンド試料のカウント毎分（CPM）値の2倍に等しいデータに適用した。
【０５１４】
QWBA
耳介、肢遠位部、毛髪および尾を各凍結屠殺体から除去し、各凍結屠殺体を、およそ2％（w/v）カルボキシメチルセルロースの水性懸濁液に包埋し、ブロック状に凍結した。そのブロックをおよそ-20℃で保管してから薄切した。各ブロック状屠殺体を、およそ-20℃に維持された凍結ミクロトーム（Leica CM3600 Cryomacrocut（ドイツ国ヌスロッホ）およびVibratome 9800（ミズーリ州セントルイス））のオブジェクトステージにマウントし、薄切前に[14C]-グルコースが1つの濃度（およそ0.05μCi/mL）で添加された血漿である内部標準（3）を凍結ブロックに入れて、それらを切片の厚さの品質管理に使用した。-20℃に設定した全身凍結ミクロトームを使って、いくつかの全身切片（およそ40μm厚）を、矢状面に、関心対象のさまざまなレベルでとった。凍結屠殺体の矢状切片（20〜50μm厚）を、蛍光体イメージングプレートに曝露した。標準を使って組織中のイメージの領域を濃度に変換した。主要組織、器官および生体液のすべてが表された。切片は粘着テープ（Scotch 8210、米国3M Corp.）上に収集し、凍結ミクロトーム中で少なくとも48時間脱水してから、マウンティングおよび曝露のために取り出した。
【０５１５】
以下の組織および/または内容物について組織中濃度データを決定した:脂肪（褐色および白色）、副腎、胆汁（胆管内）、血液（心臓）、骨、骨髄、脳（大脳、小脳、延髄）、盲腸（および内容物）、大腸（および内容物）、精巣上体、食道、眼（ぶどう膜および水晶体）、ハーダー腺、心臓、腎臓（皮質および髄質）、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、下垂体、前立腺、唾液腺、精嚢、骨格筋、皮膚（有色および非有色）、小腸（および内容物）、胃（胃粘膜および内容物）、脾臓、脊髄、精巣、胸腺、甲状腺ならびに膀胱（および内容物）。
【０５１６】
各ラットについて一組の全身切片を厚紙裏材にマウントし、薄いプラスチックラップで覆い、10種の異なる濃度（0.0009595〜7.806μCi/g）で血液を混合した14C-グルコースである較正用標準と共に、14C感受性蛍光体イメージングプレート（Fuji Biomedical、コネティカット州スタンフォード）に曝露した。イメージングプレートおよび切片を、銅張鉛箱（copper-lined lead safe）中で、遮光性露出カセットに入れて、室温で4日間露出した。Typhoon 9410画像取得システム（GE/Molecular Dynamics、米国カリフォルニア州サニーベール）を使ってイメージングプレートを走査し、その結果得られた画像を専用のQPSコンピュータサーバーに格納した。定量は、MCID画像分析ソフトウェア（v.7.0、Interfocus Imaging Ltd）を使った画像デンシトメトリーおよび積分された応答［すなわちMolecular Dynamicsカウント毎平方ミリメートル（MDC/mm2）］と14C較正用標準の名目濃度とから構築された標準曲線によって行った。放射能の濃度は、試料1グラムあたりの[14C]ブリンシドフォビルのμg当量（μg当量/g）として表した。定量下限（LLOQ）をデータに適用した（セクション6.7.4参照）。
【０５１７】
LLOQに達しなかった組織中濃度は、定量限界未満（BQL）であると同定した。オートラジオグラフィー画像で可視化されなかった組織領域は試料なし（no sample）（NS）と同定し、BQLと報告した。オートラジオグラフ上で可視化される組織がなかった場合は、検量腺を作成せず、その動物についてはすべての組織中濃度をBQLと報告した。
【０５１８】
結果は、オートラジオグラフ一式から選択された元の電子デジタル画像に基づいている。
【０５１９】
動物の観察
この研究でのラットには目につく異常は観察されなかった。
【０５２０】
第1群-2時間静脈内注入後のラットにおける物質収支
第1群雄SDラットにおける総放射能に関する個々の動物の排泄データおよび平均排泄データの要約を表68に提示する。
【０５２１】
（表６８）15mg/kgの目標用量での雄Sprague Dawleyラットへの[14C]ブリンシドフォビルの2時間静脈内注入に続く総放射能の排泄（第1群）
2019519570.tif 000095
SD＝標準偏差
【０５２２】
雄ラットへの15mg/kgの[14C]ブリンシドフォビルの2時間IV注入後の放射能排出の主要経路は尿中であり、これは、168時間の期間で、投与した用量の平均51.2％を占めた。投与した用量の平均42.2％が糞便中に回収された。第1群雄ラットにおける尿と糞便を合わせた放射能の総回収率は、168時間の収集期間で、用量の平均93.5％であった。放射能の尿排泄の大半（用量の43.8％または尿中に排泄された放射能の86％）および放射能の糞便排泄の大半（用量の36.7％または糞便に排泄された放射能の87％）は、投与後、最初の24時間に起こった。
【０５２３】
第2群-15mg/kgのIV投与後のラットにおける血漿中薬物動態
第2群雄SDラットについて、血漿中総放射能濃度対時間データ、PKパラメータおよび血液対血漿比を、表69に報告する。
【０５２４】
（表６９）15mg/kgの[14C]ブリンシドフォビルの単回2時間静脈内注入後の雄Sprague Dawleyラットの血中および血漿中濃度ならびに薬物動態パラメータ（第2群）
2019519570.tif 000096
【０５２５】
15mg/kgでの雄ラットへの2時間IV注入投与後の血漿における[14C]ブリンシドフォビル総放射能のCmaxは、2時間のTmax（すなわち注入の終了時）において、10.3μg当量/mLであり、濃度は投与後72時間で0.045μg当量/mLまで減少した。血漿における[14C]ブリンシドフォビルのAUClastは64.4μg当量・時間/mLであり、t1/2は13.0時間であった。
【０５２６】
第2群SDラットの血液対血漿比は、[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能が最初は、0.5時間〜8時間において、ラット血の細胞部分に対して血漿中に優先的に分配するが（0.62〜0.81の範囲）、その後は、投与後24時間および72時間において、細胞相へのより多くの分配を示し、比はそれぞれ1.26〜1.27になることを明らかにした。
【０５２７】
第3〜7群-15mg/kg（IVおよびPO）および2mg/kg（IV）のIV投与およびPO投与後の白色ラットおよび有色ラットにおける血中対血漿中濃度比の比較
第3群〜第7群雄SDおよびLEラットに関する血中対血漿中濃度比を表70に報告する。第3〜7群から得られた血中および血漿中濃度対時間プロファイルの比較を、図3に提示する。
【０５２８】
（表７０）雄ラットにおける[14C]ブリンシドフォビルの単回2時間静脈内注入または経口胃管投与後の血液対血漿比（第3〜7群）
2019519570.tif 000097
ND＝未決定、血中および/または血漿中BQL
NS＝この時点で収集した試料なし
【０５２９】
第2群と同様に、[14C]ブリンシドフォビルをIV投与された他の動物群（SDラット、第3群；LEラット、第4群および第5群）でも、早い（まばらな）時点での比はほぼ1であったものの、後の時点ほど血液:血漿比が高くなる傾向が、観察された。[14C]ブリンシドフォビルの経口投与後は、血液:血漿比は0.64〜1.13の範囲にあり、後の時点ほど血液:血漿比が高くなるという傾向は（投与後24時間まで）観察されなかった。
【０５３０】
第3群および第4群-15mg/kgのIV投与後の白色および有色雄ラットにおけるQWBA組織分布
雄白色ラット（第3群；n＝3）および雄有色ラット（第4群；n＝9）における[14C]ブリンシドフォビルの組織分布の要約を、それぞれ表71および表72に提示する。
【０５３１】
（表７１）15mg/kgの目標用量で[14C]ブリンシドフォビルを単回2時間静脈内注入した後の雄Sprague Dawley（白色種、第3群）ラットの組織における放射能の濃度
2019519570.tif 000098
2019519570.tif 000099
BQL＝LLOQを下回る値；NI＝許容できる切片上に同定されない
LLOQ＝0.00048400μCi/g/0.0135694μCi/μg＝0.036μg当量/g組織
ULOQ＝20.97300000μCi/g/0.0135694μCi/μg＝1545.610μg当量/g組織
【０５３２】
（表７２）15mg/kgの目標用量で[14C]ブリンシドフォビルを単回2時間静脈内注入した後の雄Long-Evans（有色種、第4群）ラットの組織における放射能の濃度
2019519570.tif 000100
2019519570.tif 000101
【０５３３】
第3群-白色雄ラットにおけるQWBA組織分布（まばらな試料採取）
[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能は、15mg/kgでの2時間IV注入後に、白色雄ラットの大半の組織によく分布し（n＝1匹、投与開始の2時間、24時間および168時間後）、大半の組織が、注入の終了時点では血液/血漿中よりわずかに低いものの、その後の時点については血液/血漿中より高い濃度を有した。排泄管組織中濃度および消化管組織中濃度は、すべての時点において、血液/血漿中よりはるかに高かった。血液における[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能の最も高い濃度観測値は6.9μg当量/gであり、これは2時間時点（注入終了時およびこのまばらな試料採取群での最初の収集時点）で観察された。[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能のCmaxは、大半の組織（37中35の組織）において、投与後2時間（最初の試料採取時点）に見いだされ、その時点で、組織の大半が、1.0〜6.0μg当量/gである濃度を有した。
【０５３４】
それぞれのTmaxにおいて最も高い濃度（＞20.0μg当量/g）を持つ組織は、肝臓（229.4μg当量/g）、腎皮質（106.5μg当量/g）、小腸（43.7μg当量/g）、膀胱（36.0μg当量/g）および腎髄質（33.4μg当量/g）であった。それぞれのTmaxにおいて最も低い濃度（＜1.0μg当量/g）を持つ組織は脳、脊髄、白色脂肪、骨、骨格筋および眼水晶体であった。
【０５３５】
QWBAによって決定される最も高い総濃度は、2時間IV注入後の[14C]ブリンシドフォビル薬由来の放射能に関する排出経路を反映して、消化管の内容物（Cmaxは24時間での胃における26.4μg当量/gから2時間での小腸における95.9μg当量/gまでの範囲にあった）および膀胱内容物（2時間での47.0μg当量/g）に観察された。
【０５３６】
投与後168時間でも、薬物関連物質の排出は大半の組織において完了していなかったが、放射能を含有する組織は、＜1.0μg当量/gである濃度を有した。
【０５３７】
第4群-有色雄ラットにおけるQWBA組織分布
[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能は、15mg/kgでの2時間IV注入後に、有色雄ラットの大半の組織によく分布し（n＝1匹、投与開始から1時間後、2時間後、4時間後、8時間後、24時間後、72時間後、96時間後、168時間後、および840時間後）、大半の組織が、早い時点（注入開始後4時間まで）では血液/血漿中よりわずかに低いものの、その後の時点については血液/血漿中より高い濃度を有した。AUCに基づく組織:血漿（T/P）比（AUC組織:AUC血漿；表78）は、大半の組織について、血漿中より高い組織中濃度を表す＞1の値を示す。排泄管組織中濃度および消化管組織中濃度は、すべての時点において、血液/血漿中よりはるかに高かった。血液における[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能の最も高い濃度観測値は5.3μg当量/gであり、これは2時間時点（注入終了時およびこの頻回試料採取群での2つめの収集時点）で観察された。[14C]ブリンシドフォビル由来放射能のCmaxは、大半の組織（38中33の組織）では、投与後2時間において見いだされ、その時点でほとんどの組織が1.0〜6.0μg当量/gである濃度を有した。
【０５３８】
それぞれのTmaxにおいて最も高い濃度（＞20.0μg当量/g）を持つ組織は、肝臓（229.7μg当量/g）、腎皮質（97.3μg当量/g）、小腸（71.0μg当量/g）、腎髄質（27.0μg当量/g）および膀胱（22.8μg当量/g）であった。それぞれのTmaxにおいて最も低い濃度（＜0.5μg当量/g）を持つ組織は、脳（大脳および延髄）、脊髄、白色脂肪、前立腺、骨、骨格筋および眼水晶体であった。
【０５３９】
QWBAによって決定される最も高い総濃度は、2時間IV注入後の[14C]ブリンシドフォビル薬由来の放射能に関する排出経路を反映して、膀胱内容物（4時間での814.4μg当量/g）、胆汁（2時間での508.4μg当量/g）および消化管の内容物（Cmaxは8時間での胃における11.0μg当量/gから2時間での小腸における423.0μg当量/gまでの範囲にあった）に観察された。理論に束縛されることは望まないが、胆汁は、高濃度の放射能が早い時点で存在する腸内容物における高濃度の放射能の源泉であったであろう。胃における高濃度はこの観察結果を裏付けるであろう。胃は消化系への胆汁の入り口に近いからである。ただし、放射能が168時間の時点で胃粘膜に存在するという観察結果に基づいて、胃液分泌も考えうる。
【０５４０】
大半の組織において組織中濃度は着実に減少したが、投与後168時間において、薬物関連物質の排出は大半の組織において完了していなかった。放射能を含有する組織において、存在する濃度は＜1.0μg当量/gであった。投与後840時間（最後の試料採取時点）において、放射能は骨髄、リンパ節、脾臓および副腎にまだ存在していたが、これらの組織では、脾臓（0.270μg当量/g）を除いて、LLOQ（0.036μg当量/g）に近づいていた。
【０５４１】
SDラット（第3群）において検査されたまばらな時点では、同じ用量が投与されたLEラット（第4群）と比較して、組織中濃度の実質的な相違は観察されなかった。非有色組織（SDラット第3群）と有色組織（LEラット第4群）との間で放射能の組織分布を比較したところ、有色組織（すなわち眼ぶどう膜系および有色皮膚）における濃度は、非有色組織に観察される濃度と類似していることが明らかになったことから、[14C]ブリンシドフォビル薬物由来放射能とメラニンとの特異的な結びつきはないことが示唆された。
【０５４２】
第5群-2mg/kgでのIV投与後の有色雄ラットにおけるQWBA組織分布（まばらな試料採取）
2mg/kgの単回2時間IV注入を施行した雄有色ラットにおける[14C]ブリンシドフォビルの組織分布（n＝1匹、投与開始の2時間、8時間、24時間および72時間後）の要約を、表73に提示する。
【０５４３】
（表７３）2mg/kgの目標用量で[14C]ブリンシドフォビルを単回2時間静脈内注入した後の雄Long-Evans（有色種、第5群）ラットの組織における放射能の濃度
2019519570.tif 000102
2019519570.tif 000103
BQL＝値はLLOQ未満である。
LLOQ＝0.00048400μCi/g/0.10151μCi/μg＝0.005μg当量/g組織
ULOQ＝20.97300000μCi/g/0.10151μCi/μg＝206.610μg当量/g組織
【０５４４】
[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能は、2mg/kgでの2時間IV注入後に、有色雄ラットの大半の組織によく分布し、大半の組織が、注入の終了時点では血液/血漿中よりわずかに低いものの、その後の時点については血液/血漿中より高い濃度を有した。排泄管組織および消化管組織は、すべての時点において、血液/血漿よりはるかに高かった。血液における[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能の最も高い濃度観測値は、2時間時点（注入終了時およびこのまばらな試料採取群での最初の収集時点）で観察された0.771μg当量/gであり、15mg/kg投与後に観察された値の7分の1であった。[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能のCmaxは、大半の組織（38中35の組織）において、投与後2時間（最初の試料採取時点）に見いだされ、その時点で、組織の大半が、0.2〜0.7μg当量/gの濃度を有したが、これは、15mg/kgを投与したラットに観察された値の約10分の1であった。2mg/kgのIV投与後（第5群）の平均組織中濃度比を15mg/kgの場合（第4群）と比較したところ、血管リンパ組織、分泌/代謝組織、中枢神経組織、内分泌組織、分泌組織、脂肪組織、皮膚組織、生殖組織、骨格/筋組織および呼吸（肺）組織では、組織中濃度の増加がほぼ用量比例的である（すなわち7.5倍の用量増加で、組織中濃度比は4〜15倍になる）ことが示された（表74）。平均組織中濃度比は一般に小腸において大きく、用量が2mg/kgから15mg/kgに増加すると、小腸中濃度は比例的増加を上回る増加を示した。
【０５４５】
（表７４）第4群（15mg/kg）対第5群（2mg/kg）の個々の組織中濃度の[14C]ブリンシドフォビル比
2019519570.tif 000104
2019519570.tif 000105
2019519570.tif 000106
【０５４６】
それぞれのTmaxにおいて＞1.0μg当量/gの最も高い濃度を持つ組織は、肝臓（34.2μg当量/g）、腎皮質（11.0μg当量/g）、腎髄質（3.4μg当量/g）、小腸（2.5μg当量/g）および大腸（1.0μg当量/g）であった。それぞれのTmaxにおいて最も低い濃度（＜0.20μg当量/g）を持つ組織は、脳、脊髄、白色脂肪、前立腺、骨、骨格筋および眼水晶体であった。
【０５４７】
QWBAによって決定される最も高い非組織中総濃度は、2mg/kgでの2時間IV注入後の[14C]ブリンシドフォビル薬由来の放射能に関する排出経路を反映して、消化管の内容物（Cmaxは8時間での胃における0.051μg当量/gから2時間での小腸における63.3μg当量/gまでの範囲にあった）、胆汁（2時間時点での32.7μg当量/g）および膀胱内容物（2時間での22.9μg当量/g）に観察された。
【０５４８】
大半の組織において組織中濃度は着実に減少したが、投与後72時間（この群について分析した最後の時点）において、薬物関連物質はすべての組織に検出された。ただし、クリアランスの器官に関連しない大半の組織は、＜0.10μg当量/gである濃度を有した。
【０５４９】
第6群および第7群-15mg/kgでのPO投与後の白色雄ラットおよび有色雄ラットにおけるQWBA組織分布
雄白色ラット（第6群；n＝3）および雄有色ラット（第7群；n＝10）における[14C]ブリンシドフォビルの組織分布の要約を、それぞれ表75および表76に提示する。薬物動態パラメータを表77に記載する。
【０５５０】
（表７５）15mg/kgの目標用量で[14C]ブリンシドフォビルを単回経口投与した後の雄Sprague Dawley（白色種、第6群）ラットの組織における放射能の濃度
2019519570.tif 000107
2019519570.tif 000108
BQL＝値はLLOQ未満である。
LLOQ＝0.00048400μCi/g/0.01427μCi/μg＝0.034μg当量/g組織
ULOQ＝20.97300000μCi/g/0.01427μCi/μg＝1469.727μg当量/g組織
【０５５１】
（表７６）15mg/kgの目標用量で[14C]ブリンシドフォビルを単回経口投与した後の雄Long-Evans（有色種、第7群）ラットの組織における放射能の濃度
2019519570.tif 000109
2019519570.tif 000110
BQL＝値はLLOQ未満である。
LLOQ＝0.00048400μCi/g/0.01427μCi/μg＝0.034μg当量/g組織
ULOQ＝20.97300000μCi/g/0.01427μCi/μg＝1469.727μg当量/g組織
【０５５２】
（表７７）15mg/kgの目標用量で［14C］ブリンシドフォビルを単回経口投与した後のラット組織薬物動態パラメータ
2019519570.tif 000111
2019519570.tif 000112
ND＝未決定；データから値を決定することができない。
aこれらの組織/器官に関するt1/2値は、不十分なデータポイントから得られ、かつ/または結果として得られるr2値は許容基準（≧0.85）外であるため、これらの値は推定値とみなすべきである。
【０５５３】
第6群-投与後の白色雄ラットにおけるQWBA組織分布（まばらな試料採取）
[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能は、15mg/kgでの単回経口投与後に、白色雄ラットの大半の組織によく分布し（n＝1、投与後2時間、24時間および168時間）、大半の組織が、早い時点（投与後2時間）では血液/血漿中よりわずかに低いものの、その後の時点については血液/血漿中より高い濃度を有した。排泄管組織中濃度および消化管組織中濃度は、すべての時点において、血液/血漿中よりはるかに高かった。血液における[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能の最も高い濃度観測値は0.200μg当量/gであり、これは2時間時点（このまばらな試料採取群での最初の収集時点）で観察された。[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能のCmaxは、大半の組織（37中31の組織）において、投与後24時間（2回目の試料採取時点）に見いだされ、その時点で、組織の大半が、0.10〜0.50μg当量/gである濃度を有した。
【０５５４】
それぞれのTmaxにおいて最も高い濃度（＞7.0μg当量/g）を持つ組織は、小腸（236.3μg当量/g）、肝臓（20.6μg当量/g）、腎皮質（18.4μg当量/g）、膀胱（17.3μg当量/g）、胃（11.2μg当量/g）、腎髄質（7.9μg当量/g）および盲腸（7.5μg当量/g）であった。それぞれのTmaxにおいて最も低い濃度（＜0.10μg当量/g）を持つ組織は、脳、脊髄、白色脂肪、骨、骨格筋および眼水晶体であった。
【０５５５】
QWBAによって決定される最も高い総濃度は、投薬経路および/または15mg/kgで単回経口投与した後の[14C]ブリンシドフォビル薬由来の放射能に関する排出経路を反映して、消化管の内容物（Cmaxは24時間での盲腸における28.6μg当量/gから2時間での胃における877.5μg当量/gまでの範囲にあった）、膀胱内容物（24時間での39.9μg当量/g）および胆汁（2時間での9.7μg当量/g）に観察された。
【０５５６】
投与後168時間で、薬物関連物質の排出は完了しておらず、組織のおよそ半分に検出可能な濃度（＜0.60μg当量/g）があった。小腸では、168時間において、他の組織よりも高い残存濃度（2.7μg当量/g）が観察された。
【０５５７】
第7群-PO投与後の有色雄ラットにおけるQWBA組織分布
[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能は、15mg/kgでの単回経口投与後に、有色雄ラットの大半の組織によく分布し（n＝1匹、投与の0.5時間後、1時間後、2時間後、4時間後、8時間後、24時間後、72時間後、96時間後、168時間後、および840時間後）、大半の組織が、注射後24時間までの時点では血液/血漿中よりわずかに低いものの、その後の時点については血液/血漿中より高い濃度を有した。排泄管組織中濃度および消化管組織中濃度は、すべての時点において、血液/血漿中よりはるかに高かった。AUCに基づく組織:血漿（T/P）比（表78）は、大半の組織について、血漿中より高い組織中濃度を表す＞1の値を示す。血液における[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能の最も高い濃度観測値は1.1μg当量/gであり、これは8時間において観察された。[14C]ブリンシドフォビル由来放射能のCmaxは、大半の組織（38中20の組織）では、投与後8時間において見いだされ、その時点でほとんどの組織が0.20〜0.40μg当量/gである濃度を有した。
【０５５８】
（表７８）15mg/kgの目標用量での[14C]ブリンシドフォビルの単回2時間静脈内注入（第4群）または経口投与（第7群）に続く雄Long-Evansラットにおける総放射能の組織分布
2019519570.tif 000113
2019519570.tif 000114
2019519570.tif 000115
BQL＝定量限界未満
LLOQ＝0.036μg当量/g（第4群IV）
LLOQ＝0.034μg当量/g（第7群PO）
ND＝未決定、不十分なデータ
【０５５９】
図4および図5は、さまざまな組織におけるブリンシドフォビルの濃度の、時間および投与経路の関数としてのプロットを示している。図4は、小腸中のブリンシドフォビルの濃度を、経口投与およびIV投与に関して、時間の関数として比較している。図5は、腎皮質中のブリンシドフォビルの濃度を、経口投与およびIV投与に関して、時間の関数として比較している。
【０５６０】
それぞれのTmaxにおいて最も高い濃度（＞2.0μg当量/g）を持つ組織は、小腸（458.5μg当量/g）、肝臓（36.1μg当量/g）、腎皮質（17.8μg当量/g）、胃（12.0μg当量/g）、腎髄質（9.1μg当量/g）、盲腸（7.6μg当量/g）、膀胱（3.7μg当量/g）および大腸（3.3μg当量/g）であった。それぞれのTmaxにおいて最も低い濃度（＜0.10μg当量/g）を持つ組織は、脳、脊髄、白色脂肪、骨、骨格筋および眼水晶体であった。
【０５６１】
QWBAによって決定される最も高い総濃度は、投薬経路および/または単回経口投与後の[14C]ブリンシドフォビル薬由来放射能に関する排出経路を反映して、消化管の内容物（Cmaxは4時間での小腸における187.6μg当量/gから1時間での胃における1004.6μg当量/gまでの範囲にあった）、膀胱内容物（8時間での110.9μg当量/g）および胆汁（4時間での36.3μg当量/g）に観察された。
【０５６２】
大半の組織における組織中濃度は着実に減少したが、投与後168時間において、薬物関連物質はおよそ半分の組織に検出され、小腸（5.9μg当量/g）を除けば、大半の濃度は＜0.40μg当量/gであった。投与後840時間（最後の試料採取時点）でも、放射能は依然として小腸、腎皮質および肝臓に存在したが、濃度はすべての組織においてLLOQ（0.034μg当量/g）に近かった。
【０５６３】
雄SDラットにおいて、15mg/kgでの[14C]ブリンシドフォビルの2時間IV注入後の放射能排出の主要経路は尿中であり、これは、168時間の収集期間で、投与した用量の平均51.2％を占めた。投与した用量の平均42.2％が糞便中に回収された。放射能の尿中排泄および糞便中排泄の大半（約86％）は、投与後最初の24時間に起こった。
【０５６４】
2時間IV注入に続いて、大半の組織（小腸を除く）において、放射能は各時点において用量（2mg/kgから15mg/kg）に比例して増加した。小腸組織では、増加が、用量に対する比例的増加を上回った。経口投与後は放射能がすぐに吸収された。放射能はよく分布し、大半の組織（38中34）では、放射能のピーク濃度が、経口投与の4〜8時間後およびIV注入（2時間）の終了時に見いだされた。放射能の定量的分布パターンはIV投与後も経口投与後も類似しており、定量的には、組織放射能曝露は、放射能バイオアベイラビリティ（およそ50％）について調節すると、一般に経口胃管法後よりIV投与後の方が大きかった。最も高濃度の放射能を持つ組織は排泄器官に関連した（すなわち肝臓、腎臓および腸）。これらの組織のそれぞれでは、組織対血漿比が高く（＞30）、腎皮質および肝臓では、その比が、IV投与経路と経口投与経路の間で類似していた。投与経路に基づいて予想されるとおり、経口投与後は、小腸組織対血漿比が最も高かった（T/P＝428）。しかしIV注入後も小腸には注目に値する放射能が関連づけられた（組織対血漿比32）。胆管内の胆汁には高い濃度（Cmax）が関連づけられ、その濃度は、経口投与後（Cmax＝36μg当量/g）よりIV投与後（Cmax 508μg当量/g）の方が14倍高かったことから、IV投与後の高い小腸組織中濃度の考えうる源泉が示唆された。放射能の濃度が最も低い組織は脳、脊髄、骨格筋、白色脂肪組織および骨であった。脳および脊髄における放射能の結びつきは、IV投与後の方が高かった（血漿中Cmax濃度の約20％、経口投与後は血漿中Cmax濃度の約5％）。メラニン含有組織（眼、ぶどう膜）との特異的な結びつきの証拠は検出されなかった。
【０５６５】
100μCi経口投与後のヒトにおける予想曝露を4つの異なる方法（単一組織曝露推定および全身曝露推定を含む）によって見積もったところ、いずれも、FDAおよびICRP許容限度の4％以下であるヒト曝露をもたらした。
【０５６６】
この研究で起きたSOPおよび/またはプロトコール逸脱であって研究の質または整合性に有害な効果を有するものは観察されなかった。
【０５６７】
健常対象におけるIV BCV単回用量漸増研究
10mgおよび25mgのブリンシドフォビルを健常対象に投与した。IVブリンシドフォビル投与は、10mgで、経口投与された100mgのブリンシドフォビルと類似する曝露を与えることがわかった。 どちらのIVブリンシドフォビル用量（10mgおよび25mg）も一般的に安全であり、忍容性は高いことがわかった。薬物関連有害事象、胃腸有害事象および段階的検査異常（例えば溶血毒性および腎毒性）はいずれも観察されなかった。
【０５６８】
100mgおよび200mgでの経口BCVの単回投与は約5％例の下痢をもたらし、350mg用量は約20％例の下痢をもたらした。
【０５６９】
図6に、異なる100mg経口投与、10mg IV投与および25mg IV投与での血漿中ブリンシドフォビル濃度（AUCinf（ng*h/mL））のプロットを示す。図6に示すとおり、10mgブリンシドフォビルのIV投与は100mgブリンシドフォビルの経口投与と実質上同じ血漿中濃度を与え、一方、25mgブリンシドフォビルのIV投与は、IV 10mg投与および経口100mg投与のどちらよりも高い血漿中濃度を与えた。
【０５７０】
実施例10-ブリンシドフォビル:14日回復期間を設けたラットにおける28日静脈内注入毒性研究
要約
Sprague-Dawley CD（登録商標）ラット（15匹/性別/群）に、0（2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液）、1、4または15mg/kg/投与のブリンシドフォビルを、週に2回、2時間静脈内注入によって、29日間にわたって合計9回投与した。投与速度はすべての群で10mL/kg/時間とした。処置相の最後に、最大10匹/性別/群を安楽死させ、剖検に付した。残りの動物（最大5匹/性別/群）は、任意のブリンシドフォビル関連効果の進行または可逆性を決定する目的で、14日回復相のためにとっておいた。ブリンシドフォビルおよびブリンシドフォビル代謝産物（シドフォビル、CDV）の毒物動態学的分析のために、サテライト動物（最大3匹/性別/群）にも同様に投与を行い、1日目および29日目に、一連の血液試料を各動物から収集した。この研究中に評価したパラメータは、生存率、臨床観察、眼科学、体重、摂食量、臨床病理学（投与終結時および回復終了時）、器官重量、肉眼的観察および顕微鏡的病理学であった。
【０５７１】
ブリンシドフォビル曝露は、1日目および29日目に、用量の増加と共に増加し、AUClastは用量に対して比例的増加を上回る増加を示す傾向があった。理論に束縛されることは望まないが、一般に、この29日間の研究中に、ブリンシドフォビルの蓄積はなかった。ブリンシドフォビルに関する雄対雌比は、曝露に性差がないことを示した（CmaxおよびAUClastに基づく）。
【０５７２】
1日目および29日目には、ブリンシドフォビルの静脈内投与に続いて、CDVのCmax値およびAUClast値が、ブリンシドフォビル用量の増加（1mg/kgから15mg/kg）に伴って増加した。一般に、この研究の間はCDVの蓄積がほとんどなく、雄対雌比は一般にCDV曝露に性差がないことを示した。
【０５７３】
ブリンシドフォビル関連死はなかった。この研究では予定外の死が3例あり、毒性試験動物（toxicity animal）における2例の死はブリンシドフォビル関連ではないと決定され、TK用動物における1例の死については、原因を決定することができなかった。
【０５７４】
眼科学、体重、血液学、凝固、臨床化学または尿検査に対して、ブリンシドフォビル関連の効果はなかった。
【０５７５】
ブリンシドフォビルの投与は、≧4mg/kg/投与で、両性において、すべての動物にではなく一部の動物に、断続的な（一般に注入に続く）臨床徴候（頻呼吸および背弯姿勢であって、立毛、部分閉眼、活動減少、不規則呼吸および/または平坦姿勢（flattened posture）を伴うものおよび伴わないもの）を、また雄では≧1mg/kg/投与、雌では15mg/kg/投与で、摂食量のごくわずかな減少をもたらした。
【０５７６】
投与終了時点で、≧4mg/kg/投与では、雄性生殖器官（精巣、精巣上体および精嚢）ならびに腸管（十二指腸、空腸および/または回腸）に、また15mg/kg/投与では、雄および雌の皮膚（皮脂腺）に、ブリンシドフォビル関連所見が存在した。雄性生殖器官では、≧4mg/kgにおいて、精巣変化が、精巣重量の減少およびわずかな乃至は著しい生殖細胞欠乏によって特徴づけられ、15mg/kg/投与では、ごくわずかな精子細胞貯留（spermatid retention）およびセルトリ細胞液胞化を伴った。加えて、15mg/kg/投与の雄は、精巣上体におけるごくわずかな管腔細胞残渣および精嚢におけるごくわずかに増加した上皮アポトーシスを有した。腸管では、どちらの性でも、≧4mg/kg/投与での小腸（陰窩）および15mg/kg/投与での大腸（腺）において、単細胞壊死が観察された。15mg/kgでは雄および雌において、皮膚における皮脂腺萎縮が存在した。
【０５７７】
（表７９）経口投与および静脈内投与されたブリンシドフォビルの毒性の比較
2019519570.tif 000116
【０５７８】
14日回復期間後は、≧4mg/kg/投与での精巣重量の減少および生殖細胞欠乏を除いて、すべての所見が完全に回復していた。ただし、理論に束縛されることは望まないものの、生殖細胞欠乏は、2週間では完全には回復しないと予想されるだろう。加えて、15mg/kg/投与では、数匹の動物（雄5匹中3匹、雌5匹中2匹）が細胞充実度の低下した骨髄ならびに軟らかくかつ/または小さい精巣および精巣上体（雄）を有した。理論に束縛されることは望まないが、精巣における生殖細胞欠乏および精巣上体の頭部領域における精子の減少は、投与期間の終了時に観察された生殖細胞集団の喪失に続発する成熟欠乏の反映であった。
【０５７９】
この研究の条件下では、≧4mg/kg/投与での雄における精巣生殖細胞欠乏および15mg/kg/投与での1匹の雌における中等度の腸単細胞陰窩壊死に基づいて、ブリンシドフォビルの無毒性レベル（NOAEL）は、雄では1mg/kg/投与および雌では4mg/kg/投与であるとみなした。
【０５８０】
序論
この研究では以下の略号を使用する。
M           雄
F           雌
〜          およそ
mg/kg       体重1キログラムあたりの試験物質のミリグラム数
mL/kg       体重1キログラムあたりの投与製剤のミリリットル数
mL/kg/時間  1時間あたり体重1キログラムあたりの投与製剤のミリリットル数
mg/mL       投与製剤1ミリリットルあたりの試験物質のミリグラム数
IV          静脈内
MTD         最大耐用量
DRF         用量範囲探索
【０５８１】
この研究の目的は、週に2回、29日間で合計9回にわたってラットに静脈内注入（2時間）によって投与した場合の、ブリンシドフォビルの毒性および毒物動態学を評価すること、および14日間の処置後無投薬回復期間中のブリンシドフォビル効果の進行または可逆性を評価することであった。
【０５８２】
研究計画には、毒性研究の一般的規制ガイドラインの要素を組み入れる。
【０５８３】
この研究は、米国食品医薬品局Good Laboratory Practice Regulations（21CFRのPart 58）およびOECD Principles of Good Laboratory Practice（1997年改訂）、ENV/MC/CHEM（98）17に示されているとおり、優良試験所基準（Good Laboratory Practice）の原則に従って行われた。
【０５８４】
これらの原則は、欧州共同体、米国（EPAおよびFDA）および日本（MHLW、MAFFおよびMETI）ならびにOECDデータの相互受理協定（Mutual Acceptance of Data Agreement）の調印国である他の国々の規制当局によって指定された優良試験所基準と適合している。
【０５８５】
この研究は、動物福祉法（Animal Welfare Act）の規制の適当なパートのすべてに従った: 9 CFR Parts 1 and 2, Final Rules, Federal Register, Volume 54, No. 168, August 31, 1989, pp. 36112-36163（1989年10月30日施行）および9 CFR Part 3 Animal Welfare Standards; Final Rule, Federal Register, Volume 56, No. 32, February 15, 1991, pp. 6426-6505（1991年3月18日施行）。
【０５８６】
ヒトでの投与を裏付けるために、FDAなどの規制当局によって、2つ以上の種（1つは齧歯類、1つは非齧歯類）における前臨床研究が勧告されている。ラットは毒性研究によく利用される動物モデルである。加えて、比較評価のためにヒストリカルデータベース（historical data base）を利用することができる。
【０５８７】
週に2回まで、試験物質を静脈内投与した。
【０５８８】
この研究における動物の数は、統計学的理由、規制上の理由および科学的理由から、必要最小限であるとみなした。この研究の目的は、試験物質の毒性および効果の進行または可逆性についてモニターすることであった。ヒストリカルコントロールデータは、臨床検査室データ、器官重量データおよび組織の顕微鏡検査が、個々の動物間で変動することを示している。亜慢性研究において利用されるラットの数（10匹/性別/群）は規制ガイダンス文書によって勧告されており、動物間で予想される変動性を考慮した最小数とみなした。試験物質の潜在的効果の進行または可逆性を決定するために、追加の処置後（回復）動物（5匹/性別/群）を研究に含めた。提唱されたヒト用量の低、中および高倍数を投与した3つの試験物質処置群および陰性対照群は、ある範囲の効果を与えるために必要な最小の群数とみなされ、ヒトへの結果の外挿を可能にした。
【０５８９】
毒物動態学的評価のために選択された動物の数（3匹/性別/処置群）は、吸収、分布、代謝および排泄プロセスの固有の変動性を考慮して、意味のあるデータを得るのに必要な最小数とみなした。試験物質の非存在を評価するために、3匹/性別の対照群が必要であった。
【０５９０】
この研究での用量（0、1、4および15mg/kg/投与）は、最大耐用量（MTD）相では2時間で2、4、10または15mg/kg/投与とし、次に二組目の動物には、9日間にわたる用量範囲探索（DRF）相において、2時間での1または15mg/kg/投与を3回投与した。この2相研究で投与された高用量（15mg/kg）は、より高い濃度で観察された溶血に基づいて、投与可能な最大用量（MFD）であると決定された。
【０５９１】
注入カテーテルが後退したか、予定した投与日に使用できず、ラインを再配置または修復するのに十分な時間がなかったため、以下の動物には、29日目に、尾静脈への静脈内注入によって投与した:動物番号1511および1519では、28日目に、カテーテルの後退が見いだされ、動物番号4581では、29日目に、出口作製部位近くでの潰瘍形成が見いだされた。この手順中にこれらの動物を個々のプラスチックコーンに保定するのは2.25時間（投与部位準備活動に15分および投薬に2時間）以内とした。
【０５９２】
（表８０）実験の概略
2019519570.tif 000117
a用量は活性成分を表す。
b毒物動態試料は1日目および29日目に収集した。
【０５９３】
最初の投与日をこの研究の1日目と定義した。ブリンシドフォビルを白色粉末として用意し、室温で保管した。純度は99.8％と決定された。
【０５９４】
希釈剤は注射用5％デキストロース溶液（USP）であり、透明な液体（純度96.8％）として供給された。これは室温で保管した。
【０５９５】
2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液を対照として使用した。これは、白色結晶性粉末として供給され室温で保管した一塩基性リン酸ナトリウム（無水）（純度100％）から調製した。このリン酸塩緩衝剤（対照）溶液を無菌水に溶解し、水酸化ナトリウムでpHを調節した。
【０５９６】
投与製剤の調製
適当な量の一塩基性リン酸ナトリウム溶液（400mM）と二塩基性リン酸ナトリウム溶液（400mM）とを混合することによって、2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液の媒体溶液（400mM、pH8.0±0.04）を調製した。必要な場合は、溶液のpHを一塩基性リン酸ナトリウム溶液（400mM）で調節した。この溶液を、層流フード内で、0.22μm Millex（登録商標）-GP（PES）フィルタを通して無菌容器に濾過した。
【０５９７】
媒体（対照物質）は2〜8℃で冷蔵保管した。新鮮な媒体溶液を2回、すなわち1回目の投与前に一度および4回目の投与前にもう一度、調剤し、各製剤を調製から1ヶ月以内に使用した。
【０５９８】
適当な量のブリンシドフォビルを2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液、無菌注射用水（USP）および1N水酸化ナトリウム（NaOH）と混合することによって、15mg/mLのブリンシドフォビル保存物を調製した。その溶液を層流フード下で0.22μm Millex（登録商標）-GPフィルタを通して無菌容器に濾過した。ブリンシドフォビル保存物は、1回目の投与前に一度および4回目の投与前にもう一度調製し、2〜8℃で冷蔵保管した。
【０５９９】
層流フード下で適当な量のブリンシドフォビル保存物（15mg/mL）または保存物媒体（2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液）を適当な量の注射用5％デキストロース（USP）で無菌バイアル中に希釈し、10回上限反転させて混合することによって、投与製剤を調製した。新鮮な投与製剤を毎週調製し、使用時以外は2〜8℃に冷蔵保管した。
【０６００】
（表８１）投与
2019519570.tif 000118
【０６０１】
ブリンシドフォビル使用法の詳細な記録をとっておいた。製剤を調製するのに必要なブリンシドフォビルの量および実際に使用する量は、各調製時に決定した。
【０６０２】
安定性
安定性分析により、この研究で使用した濃度を挟む濃度（0.05mg/mLおよび2.0mg/mL）では、ブリンシドフォビル製剤は、室温で保管した場合に、24時間は安定であり、2〜8℃で冷蔵保管した場合には8日間安定であることが証明された。15.0mg/mLのブリンシドフォビル保存溶液は、室温（名目上20℃）で保管した場合は24時間、また2〜8℃で保管した場合は8、14および28日間、安定であった。
【０６０３】
確認分析
各週用に調製した各投与製剤（対照を含む）の中央領域から、調製日に、2つの試料（各5mL）を採取した。一方の試料は、用量確認分析のために、2つ一組にして分析し、一方の試料は冷蔵（2〜8℃）してとっておいた（初期結果が研究許容計画基準（名目の±10％）外であったため、第1週および第2週については、第2群のとっておいた試料を再分析した）。
【０６０４】
保管条件
すべての投与製剤試料を、分析または最終処分まで冷蔵（2〜8℃）保管した。
【０６０５】
ブリンシドフォビル投与
ブリンシドフォビルを2時間にわたる静脈内注入として投与した。動物を20mL/kg/2時間の定用量で処置した。
【０６０６】
注入カテーテル埋め込み手順
投薬のおよそ1〜3週間前に注入用のカテーテルを埋め込んだ。予備を含むすべての動物にカテーテルを外科的に埋め込んだ。
【０６０７】
手術部位を、無菌回復手術手技に関する試験施設のSOPに従って準備した。動物には予防的に鎮痛薬（フルニキシンメグルミン（USP）2mg/kg、皮下）を与えた。
【０６０８】
すべての動物を麻酔（イソフルラン）し、鼠径部および背部領域を剃毛した。小さな切開を施し、大腿静脈を単離した。その血管に小さな切開を行い、無菌カテーテルを血管内に入れた。大腿静脈を通してカテーテルを挿入し、下大静脈中に、腎臓のすぐ尾側まで逆行性に通した。カテーテルを縫合糸で固定し、うなじで体外化するように、皮下に通した。カテーテルのループが留まる小さなポケットを出口作製部位に作った。鼠径部領域を縫合糸によって閉じた。
【０６０９】
動物をジャケットに入れ、埋め込んだカテーテルを、フタ付きセプタムコネクターを持つピンに取り付けた。カテーテルをタウロリジンクエン酸塩ロッキング溶液でロックした。手術日に各動物にエンロフロキサシン5.0mg/kgを筋肉内投与した。
【０６１０】
カテーテル開存性を回復させるための外科的修復（限度は1匹につき1回の修復）を、試験前期間中は必要に応じて、また試験実施期間中は研究責任者の裁量で、行った。鎮痛薬を予防的に投与した（フルニキシンメグルミン2mg/kg（USP）、皮下）。外科的修復を受ける動物には、手術日に（試験施設の標準業務手順書に従って）適当な用量の抗生物質を与えた。
【０６１１】
回復直前の投薬の完了後に、カテーテルを結紮し、ジャケットを取り除き（カテーテルに結び目を作り、カテーテルを皮膚の下で後退させ）、ジャケットを除去した。
【０６１２】
注入カテーテル維持手順
動物を研究に供する前に、試験施設のSOPに従って、埋め込まれた大腿静脈カテーテルを開存性について評価した。
【０６１３】
体積用量（速度）
20mL/kg/2時間（10mL/kg/時間）。
【０６１４】
個々の投与濃度
個々の動物の濃度は、最も新しく記録された定期測定の体重から算出した。
【０６１５】
頻度および継続時間
試験/対照物質を、29日間にわたる合計9回の個別投与で週に2回、2時間静脈内注入によって投与した。試験/対照物質投与は、最終剖検の前日まで継続した。回復動物は、最後の投与後、14日間の観察期間のために保持した。
【０６１６】
投与部位
大腿静脈/大静脈中の外科的に埋め込まれたカニューレまたは末梢尾静脈経由。
【０６１７】
投与手順
投与開始の1〜2日前に、ロック溶液を各動物に埋め込まれたカテーテルから（可能であれば）引き抜き、テザーおよび注入投与セットを接続する前に、カテーテルを食塩水でフラッシュした。動物のカテーテルを接続した後、1日目の投薬までは、動物に無菌食塩水（0.9％NaCl、USP）を、較正されたMedfusionシリンジポンプによって、0.5mL/時間の速度で注入した。
【０６１８】
注入ラインに試験物質を送達し、全用量の送達を保証するために、食塩水フラッシュを注入した（カテーテルラインをフラッシュするために、さらに約0.5〜1mLの体積を、試験物質と同じ速度で投与した）。
【０６１９】
投薬間は動物を食塩水で維持した。食塩水シリンジを少なくとも4日ごとに取り換えた。
【０６２０】
使用できない/機能していないカテーテルを持つ動物は、可能な場合には、外科的に修復した。修復が不可能な場合は、これらの動物には、研究責任者の裁量で保定器に入れて末梢尾静脈経由で投与した。これらの動物を個々のプラスチックコーンに入れるのは、2.25時間（投与部位準備活動に15分および尾静脈注射による投薬に2時間）以内とした。
【０６２１】
29日目に、動物番号1511、1519および4581には、末梢尾静脈を介して9回目の投与を施行した。
【０６２２】
投与精度
各注入日についてアカウンタビリティー（投与された実際の用量の確認）を各シリンジの投与前の重量と投与後の重量とに基づいて算出し、日々の調節のために精査した。データは研究ファイルに保っておく。投与開始前に、ポンプを、研究と同じ速度で同じ長さの投与を使って、食塩水で精度についてチェックし、投与後アカウンタビリティーを、研究全体を通してポンプ性能をモニターするために使用した。
【０６２３】
動物
系統/種
白色ラット（非近交系）VAF/Plus（登録商標）；CD（登録商標）（Sprague-Dawley由来）［Crl:CD（登録商標）（SD）BR］
【０６２４】
動物の数
合計170匹（雄85匹および雌85匹）を受け取り、144匹（雄72匹および雌72匹）を試験に供した。
【０６２５】
試験前期間
試験前期間はおよそ4週間であった。研究に対する適性を確認するために試験前験期間中にすべての動物を検査した。動物を5日間安定化し終えるまでは試験前手順を行わなかった。
【０６２６】
処置開始時の主研究動物の齢
およそ10週
【０６２７】
処置開始時の主研究動物の重量範囲
雄: 290.6g〜422.4g。雌: 203.8g〜294.7g。
【０６２８】
割り当て
研究に必要な数よりも多くの動物を購入し、安定化した。試験前の理学的検査およびカテーテル開存性に基づいて研究に適していないとみなした動物は、群割り当てのためのランダム選択の前に排除した。研究に適しているとみなした動物を、各群の体重平均が同等になるように、コンピュータランダムソートプログラムによって、各性別につき18匹の4群に分布させた。試験前眼科所見ゆえに、数匹の毒性試験動物をサテライト動物と交換したが、同じ群内に残した。試験に供した個々の動物の重量は、性別ごとの平均重量の±20％以内であった。
【０６２９】
動物の同定
各ラットには、一意の番号でプログラムされたBMDS IMI-1000埋め込み型高周波トランスポンダ（マイクロチップ）を埋め込んだ。この番号を、試験施設によって割り当てられた動物番号と相互参照した。この番号＋研究番号は、各動物について一意の識別番号を含んだ。加えて、用量レベル識別用に色分けされていて、研究番号と施設が割り当てた動物番号情報とを含むケージカードを、各ケージに設けた。
【０６３０】
獣医学的ケア
動物を、獣医学的ケアを必要とする可能性がある任意の状態について技術スタッフがモニターし、必要に応じて処置した。種々の非試験物質関連獣医師評価は研究責任者によって精査され、研究ファイルに記録される。
【０６３１】
サテライト群の動物に対して行われる一連の観察は、臨床観察、体重、眼科学および摂食量に制限した。これらのデータは報告しない。
【０６３２】
ブリンシドフォビルおよびブリンシドフォビル代謝産物シドフォビルの血漿中濃度を決定するために、血液試料を得た。
【０６３３】
1日目および29日目に、下記の表に示した時点において、毒物動態学的決定のための血液試料を得た。
【０６３４】
（表８２）収集時間および動物の数
2019519570.tif 000119
【０６３５】
収集手順
およそ0.40mLの全血を各時点において各動物の尾静脈から得た。動物は血液収集前に絶食させなかった。血液をK2EDTA抗凝固剤が入っているチューブに収集し、氷上に正立させた。遠心分離（およそ2000g、およそ2〜8℃で10分間）によって血漿を分離した。研究番号、動物番号、時点、試料採取の日および試料タイプに関して適当にラベルした1本のクライオチューブに、およそ0.150mLの血漿を移した。残りの血漿を第2のクライオチューブに移し、バックアップ試料としてとっておいた。各血液試料の収集後およそ2時間以内に血漿を得て、およそ-80±10℃で分析まで凍結しておいた。最終血液収集後に動物を安楽死（CO2吸入）させた。
【０６３６】
試料の保管および手配
すべての試料チューブを凍結（-80±10℃）保管し、分析のためにコロラド州コロラドスプリングスのPyxant Labに搬送（凍結、ドライアイス上）した。
【０６３７】
分析/報告
バイオアナリシス用試料は、Pyxant Labsにおいて、バリデートされた液体クロマトグラフィー-トリプル四重極質量分析（LC-MS/MS）アッセイを使って分析された。
【０６３８】
血漿中濃度データの受領後は、ノースカロライナ州ダーラムのNuventra, Inc.によって、非コンパートメント毒物動態学的分析が行われた。
【０６３９】
毎日の観察
ケージ中の動物を、死亡および重篤な毒性効果または薬理学的効果の徴候について毎日2回観察した。健康状態が極端に悪いか、瀕死状態の疑いがある動物を、さらなるモニタリングおよび安楽死の可能性のために同定した。
【０６４０】
投与観察
投与完了の直後および2時間後に、健康不良または毒性効果もしくは薬理学的効果の任意の徴候（例えば全身状態、外観、活動、挙動、呼吸などの異常）について、観察を行った。
【０６４１】
徴候
動物をそれぞれのケージから取り出し、試験前に一度、そして研究期間中は週に1回、検査した。検査には、全身状態、皮膚および毛皮、眼、鼻、口腔、腹部および外生殖器の観察ならびに呼吸の評価を含めた。
【０６４２】
検眼鏡検査
試験前にすべての動物を検査した。生き残ったすべての毒性試験動物を、投与の終了時および回復の終了時に検査した。試験前検査で正常範囲内にあった動物だけを試験に供した。
【０６４３】
眼瞼、涙器および結膜を視覚的に検査した。角膜、前房、水晶体、虹彩、硝子体液、網膜および視神経円板を、間接的検眼鏡検査によって検査した。
【０６４４】
検査に先だち、トロピカミド点眼液を使って、各動物の瞳孔を拡張させた。
【０６４５】
体重
動物をそれぞれのケージから取り出し、試験前に2回、処置期間中は各投与の前日、および回復期間中は週に1回、体重を測定した。最終空腹時体重は予定の冒険区間の直前に得た。福祉上の理由で安楽死させた動物は剖検の前に重量を測定した。
【０６４６】
摂食量
処置の1週間前から毎週、摂食量を測定（重量測定）した。
【０６４７】
臨床病理学
眼窩静脈叢（眼球後静脈叢）から軽いイソフルラン麻酔下で得た血液を使って、投与終了時に最大10匹の毒性試験動物/性別/群について、および回復の終了時に最大5匹の回復動物/性別/群について、血液学、凝固および臨床化学パラメータを、分析した。各血液収集区間の前に、動物を一晩絶食させた。
【０６４８】
16時間の終夜収集期間によって得た尿を、投与終了時に最大10匹の毒性試験動物/性別/群について、および回復の終了時に最大5匹の回復動物/性別/群について、分析した。収集期間中は動物を絶食させたが、断水はしなかった。
【０６４９】
血液学
血液試料（およそ0.25mL）をK2EDTA抗凝固剤が入っているチューブに収集し、Siemens ADVIA 120血液分析装置を使って以下の項目について分析した:ヘモグロビン濃度（HGB）；ヘマトクリット（HCT）；赤血球数（RBC）；血小板数（PLT）；平均赤血球容積（MCV）；平均赤血球ヘモグロビン量（MCH）；平均赤血球ヘモグロビン量濃度（MCHC）；赤血球分布幅（RDW）；総白血球数（WBC）；網状赤血球数（RETIC）；白血球分画（検証のために手作業による白血球分画を行い、必要であれば絶対値を算出した）；好中球（ANEU）；リンパ球（ALYM）；好酸球（AEOS）；好塩基球（ABASO）；単球（AMONO）；および大無染色細胞（ALUC）。
【０６５０】
各血液収集区間において各動物について末梢血塗抹標本を調製し、自動化された結果の確認および/または必要とみなされた他の評価に利用できるようにした。
【０６５１】
凝固
血液試料（およそ1.0mL）をクエン酸ナトリウム抗凝固剤が入っているチューブに収集し、Diagnostica Stago ProductsのSTA Compact（登録商標）力学的凝固検出システムを使って、以下の項目について分析した:プロトロンビン時間（PT）および活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）。
【０６５２】
臨床化学
抗凝固剤を含まないチューブに血液試料（およそ1.0mL）を収集し、凝固させ、遠心分離することで血清を得て、Siemens ADVIA 1800化学分析装置を使って以下の項目について分析した。
【０６５３】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）（速度論的方法-改変Bergmeyer法）；アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）（速度論的方法-改変Bergmeyer法）；アルカリホスファターゼ（ALKP）（速度論的方法-Tietz法AMP緩衝剤）；血中尿素窒素（BUN）（酵素法-ウレアーゼによるRoch-Ramek法）；
クレアチニン（CREAT）（Jaffe法アルカリ性媒質中のピクリン酸）；グルコース（GLU）（グルコースヘキソキナーゼII法）；コレステロール（CHOL）（酵素法エステラーゼ/オキシダーゼ-Trinder法エンドポイント）；トリグリセリド（TRIG）（Fossati三工程酵素法-Trinder法エンドポイント）；総タンパク質（TP）（ビウレット法）；アルブミン（ALB）（ブロモクレゾールグリーン法）；総ビリルビン（TBILI）（バナジン酸（Vandate）による酸化）；ナトリウム（NA＋）（イオン選択性電極）カリウム（K＋）（イオン選択性電極）；塩化物（Cl-）（イオン選択性電極）；カルシウム（Ca＋＋）（Michaylova & Ilkova法、アルセナゾIII）；および無機リン（PHOS）（リンモリブデン酸-UV法）。
【０６５４】
尿検査
代謝ケージに収容した毒性研究用動物から、尿を一晩（およそ16時間）氷冷容器に収集した。
【０６５５】
Siemens Clinitek Advantusを使って解釈されるMultistix試薬ストリップを使って、尿試料を以下の項目について分析した：pH；タンパク質（PRO）；グルコース（GLU）；ケトン（KET）；ビリルビン（BIL）；および潜血（BLD）。
【０６５６】
手作業による方法を使って、試料を以下の項目についても分析した：
外観（APP）；比重（Sp.G.）（臨床屈折計Atago Uricon-N）；体積（VOL）。
【０６５７】
剖検
安楽死の方法
福祉上の理由で安楽死させた動物または予定の屠殺区間に入った動物は、イソフルラン吸入に続く瀉血によって安楽死させた。毒物動態学用動物はCO2吸入によって安楽死させた。
【０６５８】
予定された剖検
剖検は、動物を29日間処置した後に最大10匹の毒性研究動物/性別/群で行い、また14日間の無処置回復期間後に最大5匹の毒性研究動物/性別/群で行った。剖検前に動物を一晩絶食させた。剖検スケジュールは、各群から両性の動物の検査が、剖検期間全体を通して一日の類似する時間帯に行われることが保証されるように設定した。
【０６５９】
毒物動態学用動物は29日目に最後の血液収集に続いて安楽死させ、検査せずに廃棄した。
【０６６０】
肉眼的検査
完全な肉眼的検査をすべての動物に行った。肉眼的検査には、肉眼的形態異常の存在に関する外表面およびすべての開口部；脳および脊髄の外表面；頭蓋腔、胸腔、腹腔、骨盤腔および首の器官および組織；ならびに屠殺体の残りの部分の検査を含めた。
【０６６１】
TK用動物番号4107には肉眼的検査を行い、これを福祉上の理由で屠殺し、組織を保存したが、顕微鏡的検査は行わなかった。
【０６６２】
器官重量
以下に示す器官は、生き残った毒性研究動物および回復研究動物のすべてについて、予定の屠殺区間において重量測定した。重量測定に先だち、器官を注意深く切離し、脂肪および他の隣接組織を均一に除去するために、適正にトリミングした。乾燥を回避するために、器官は、切離後可能な限りすぐに、重量測定した。対器官は一緒に重量測定した。
【０６６３】
保存し組織病理学的に検査した組織
以下に列挙する組織をすべての動物から得て、保存した。加えて、表示した組織のスライドを調製し、顕微鏡で検査した。肉眼的検査では認められず組織学的加工中に見られた異常は、いずれも記録した。
【０６６４】
（表８３）重量測定し、保存し、顕微鏡検査した組織
2019519570.tif 000120
2019519570.tif 000121
a定性的検査（白血球分画なし）。
b直腸は顕微鏡検査しなかった。
c雄の乳腺およびGALTは、ルーチン切片中に存在する場合にのみ評価した。
d固定後に重量測定。
e前立腺と精嚢は一緒に重量測定した。
【０６６５】
保存剤
すべての組織を10％中性緩衝ホルマリン（NBF）中に保存した。眼および精巣はまず改変ダビッドソン液に入れてから、10％NBF中に保った。肺を10％NBFで満たしてから、より大きな体積の同じ固定液に浸漬した。大腿骨からのスメア調製物は風乾し、無水メタノール中で固定した。
【０６６６】
加工
固定後に、すべての動物からの組織および器官を通常どおりに加工し、パラフィンに包埋し、4〜7ミクロンのミクロトーム設定で切断し、ガラススライドにマウントし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡で検査した。骨はDecalcifier II（商標）中で脱灰した。
【０６６７】
生存中データおよび死後（post-life）データを収集するために使用したデータ収集システムは研究を複数の相に分割する。各相の最初は1日目/1週目から始まる。この報告で提示する相は以下のとおりである。
【０６６８】
処置前:動物が到着した日に始まる。相の日/週はP1、P2、P3などとラベルされる。この相中は動物への投与は行われておらず、それぞれの固定識別番号はまだ割り当てられていない。
【０６６９】
ランダム化:動物を群分けして、固定識別番号を割り当てた日に始まる。相の日/週はRa1、Ra2、Ra3などとラベルされる。この相中は動物への投与は行われていない。
【０６７０】
処置:動物ごとに、その動物が研究計画で指定された試験/対照物質の最初の投与を受けた時に始まる。
【０６７１】
回復:各指定動物がその指定用量を受けるのを止めた後に始まり、研究が完了するまで続く。相の日/週はR1、R2、R3などとラベルされる。
【０６７２】
使用される死亡コードは以下の意味を有する。
「FD」:死体で発見；「S1」:予定された安楽死1；「WE」:福祉上の理由で安楽死させた；「Z1」:回復安楽死1。
【０６７３】
臨床観察
徴候を示す各動物について臨床観察を提示して、徴候のタイプ、発生した日または週およびその徴候の持続時間に関する情報の詳細を、適宜、提供する。「AM」:午前の観察；「PM」:午後の観察；「Unsched」:予定外の観察；「投与後」:投与完了直後；「2時間PD」:投与完了2時間後。
【０６７４】
眼科検査
所見を示した各動物について観察結果を提示する。観察は別段の表示がある場合を除き、両側性であった。
【０６７５】
摂食量
摂食量（g/日）は
消費された食品のグラム数÷日数
として算出した。
【０６７６】
摂食量（g/動物/日）は、
消費された食品のグラム数÷動物日（animal day）a
として算出した。
a各消費期間について各動物がケージ中で終日生きていた日の和。動物が死んだ場合、その死亡日は動物日として数えない。例えば、4匹の動物が5日間ケージ中にいれば20動物日になり、1匹が3日目に死んだ場合は、動物日は1になる。
【０６７７】
血液学
以下の略号を使用した:「ACMO」:手作業による観察によって無効となった自動カウント；「CS」:凝固検体；「NSAD」:試料なし動物死亡（No sample animal died）。
【０６７８】
試料コメント（sample comment）（SCM1）は以下の略号を使って記述した:「CLSE」:重度の血小板凝集が認められた；「CLSL」:わずかな血小板凝集が認められた；「NCLP」:凝集なし。
【０６７９】
凝固
以下の略号を使用した:「CS」:凝固検体；「NS」:検体なし；「NSAD」:試料なし動物死亡；「NVIR」:結果に再現性がないため無効。
【０６８０】
試料コメント（SCM1）は以下の略号を使って記述した:「SLH」:わずかに溶血。
【０６８１】
血液化学
分析限界未満のBUN値（＜10）は計算から除外する。分析限界未満のTBILI値（＜0.2）は計算から除外する。
【０６８２】
以下の略号を使用した:「NS」:検体なし；「NSAD」:試料なし動物死亡；「1＋H」:ごくわずかな溶血。
【０６８３】
グロブリン（GLOB）は
総タンパク質-アルブミン
として算出した。
【０６８４】
アルブミン/グロブリン比（A/G）は
アルブミン÷グロブリン
として算出した。
【０６８５】
尿検査
体積、pHおよび比重についてのみ、群平均を提示する。
【０６８６】
その他、以下の略号を使用する:「NS」:検体なし。
【０６８７】
外観および色は以下の略号を使って記述した:「CLOU」:濁り；「CLR」:透明；「SLCL」:わずかに濁り；「STR」:わら色；「YELL」:黄色。
【０６８８】
（表８４）Multistix診断試薬の定性的結果は以下の表記方法に従って報告する。
2019519570.tif 000122
【０６８９】
器官重量
器官重量は、絶対値、剖検の日に記録された重量を用いる最終体重に対する相対値、および脳重量に対する相対値として提示した。
【０６９０】
病理学
組織学注記に別段の明記がある場合を除き、検査した器官/組織は、規定（required）の（ルーチン）切片であった。
【０６９１】
以下の略号を使用した:「B-」:良性；「Cath」:カテーテル；「GALT」:消化管関連リンパ組織；「注入」（Infuse）:注入；「LS」:縦,「M-」:悪性；「TS」:横。
【０６９２】
組織病理学所見は以下の尺度に従って等級分けした：
ごくわずか  変化は辛うじて認識できる程度であり、かつ/または極めて少ない/極めて小さい病巣または区域が冒されている。
わずか      変化は、より容易に目につくが、冒された少ない/小さい病巣または区域として明白であるに過ぎない。
中等度      変化は明らかに存在し、はっきりわかるサイズおよび/または数である。
顕著        変化は、切片の多くの区域に数多く存在し、かつ/または突出したサイズである。
重度        変化は組織のかなりの部分を冒し、かつ/またはサイズが大きい。
【０６９３】
統計分析はすべて、個々の動物を基本実験単位として使用して、雄および雌について別々に実行した。
【０６９４】
以下のデータタイプは時点ごとに別々に分析した:体重；区間ごとの体重変化；摂食量；血液学；凝固；臨床化学；尿検査；および器官重量。
【０６９５】
分析すべきパラメータを連続的、離散的または二値と区別した。次に、以下の手順を使って試験物質処置群を対照と比較した。
【０６９６】
研究計画からの逸脱
研究中には以下にあげる研究計画からの逸脱が起こった。しかし、理論に束縛されることは望まないものの、これらの逸脱は研究の妥当性または完全性を損なわなかったとみなした。
【０６９７】
1日目に、第2群〜第4群の投与後8時間の加工済毒物動態学用試料を、ドライアイス上で一晩放置した。翌朝、試料は凍結した状態で見いだされた。しかし所要温度（-80℃（±10℃））を一晩監視したわけではない。試料は直ちに名目-80℃（±10℃）のフリーザーSL301に移した。
【０６９８】
試験前13日目に、動物番号1015には、わずかな低体重ゆえに、手術が行われなかった。
【０６９９】
13日目に、予備動物において生存性チェックが行われなかった。しかし動物は、13日目の前日も13日目の翌日も、正常範囲内にあった。
【０７００】
動物番号1592（21日目）および4078（10日目）に関する外科的修復は、それぞれ修復の7日後および2日後まで、研究責任者に認知されていなかった。
【０７０１】
29日目に、動物番号2036（投与後8時間時点）および3050（投与後2時間時点）については、それぞれ動物が「出血しにくい」および「出血するのが遅い」という理由で、毒物動態学用試料のために収集された血液量が少なかった。
【０７０２】
動物番号4074については、下垂体組織を回復剖検時に収集したが、その後、固定後トリミング時に見つからないことがわかり、重量は得られなかった。
【０７０３】
29日目に、動物番号4580については、投与直後の観察が行われなかった。
【０７０４】
1日目に、動物番号1016および2036については、24時間毒物動態学用試料が、研究計画に指定された「2時間以内」を1分過ぎて加工された。
【０７０５】
最終剖検において、動物番号1004については、臨床病理学試料の収集部位が記録されなかった。
【０７０６】
23日目に、毒物動態学用動物番号4107は福祉上の理由から剖検に移されたが、この動物は適当な記録に記載されなかった。ただし検査は行われた。
【０７０７】
予備動物番号1015は、研究計画どおりに施設内コロニーに移すのではなく、安楽死させた。
【０７０８】
カテーテルを挿入された動物が手術後個別に収容されたことを証明する記載が手術記録上にない。
【０７０９】
19日目に、雌TK用動物番号1528については、媒体シリンジの交換のために、投与注入時間が14分間中断した。
【０７１０】
4日目と12日目の間は、食塩水シリンジ交換が、毒物動態学用動物に関する食塩水および注入キャップ交換記録（Saline and Injection Cap Change Record）に記録されなかった。
【０７１１】
雄動物番号4107を福祉上の理由で23日目に安楽死させたため、29日目に、毒物動態学用試料は、第4群では、3匹ではなく2匹の雄/群/時点しか収集されなかった。
【０７１２】
29日目に、以下の試料は、表示の時点後、±3分（SOPによって許容される時間）を超えて収集された。
2019519570.tif 000123
【０７１３】
さまざまな動物に関するトリミングまたは顕微鏡検査および剖検区間の時点で、さまざまな組織が見つからないことがわかった。
【０７１４】
有効性確認研究のタイミングゆえに、最初の投与日前に安定性が確立されていなかったかもしれないと予想されたので、製剤調製を、元の研究計画による週1回から毎日の調製に変更した。1日目の投与製剤を、投与日に、投与前に調製したことにより、その時点で有効であった研究計画からは逸脱していた。安定性が確証された後は、製剤を週1回の調製に戻した。
【０７１５】
いくつかの用量区間は、用量アカウンタビリティーに不一致があり、結果として、動物に投与された量が意図した用量より多いまたは少ないという点で、研究計画からの逸脱が生じた（表84A）。これらは、±10.0％である用量アカウンタビリティー基準範囲外になった場合も、ならなかった場合もある。
【０７１６】
（表８４Ａ）用量アカウンタビリティーに不一致がある試料
2019519570.tif 000124
＊TK用動物
A＝確認不可能な時間にわたる漏れがカテーテルに見いだされた。
B＝明白な理由なし。
C＝尾静脈カテーテル障害；福祉上の理由から投与停止。
【０７１７】
何匹かの動物については、投与が中断されるか、ポンプ設定の調節が必要にある場合があり、アカウンタビリティー記載に影響があった。しかし変動は所望の用量から10％未満の逸脱であった。加えて、動物番号1017（TK）には、最後の2分間の食塩水カテーテルフラッシュが行われなかった。
【０７１８】
最終剖検の日に、動物番号1010、3047、3048、3049、3057、2538、2539および2594には、26時間近い絶食の後、福祉上の理由から飼料を与えた。
【０７１９】
分析化学
予備混合物の分析により、試験物質は媒体中で室温（名目上20℃）において少なくとも24時間および2〜8℃（この研究において使用した保管条件下）において少なくとも8日間は安定であることが確認された。処置期間中に行った分析により、1日目の1mg/mL（第2群）製剤を除けば、適当な濃度の投与溶液が投与されたことが確認された。1日目の1mg/mL投与溶液は名目値の86.7％であった。理論に束縛されることは望まないが、メニスカスにおける相互作用により、投与製剤分析のために収集された体積が分析結果を低下させたと結論した。以後の週1回の調製物については分析のために収集する体積を増やし、適当な濃度であることを確認した。
【０７２０】
（表８５）平均分析濃度1日目
2019519570.tif 000125
【０７２１】
（表８６）平均分析濃度2週目
2019519570.tif 000126
【０７２２】
（表８７）平均分析濃度3週目
2019519570.tif 000127
【０７２３】
（表８８）平均分析濃度4週目
2019519570.tif 000128
【０７２４】
（表８９）平均分析濃度5週目
2019519570.tif 000129
【０７２５】
ブリンシドフォビル
1日目のブリンシドフォビル処置動物では、ブリンシドフォビルのピーク血漿中濃度は、注入開始後1〜2時間に見いだされ、1〜15mg/kgの範囲の用量に対して、平均濃度は215ng/mL〜3670ng/mLの範囲にあった。ブリンシドフォビルの血漿中濃度は、4mg/kg用量群および15mg/kg用量群については8時間時点でも定量可能なままであったが、1mg/kg用量群については2時間時点までしか定量可能でなかった。1日目に、ブリンシドフォビルの血漿中濃度は、用量が1mg/kgから15mg/kgまで増加するにつれて増加した。
【０７２６】
（表９０）ラット（TKパラメータ集団）における1日目の処置による複合雌雄血漿中ブリンシドフォビル毒物動態学的パラメータの要約
2019519570.tif 000130
NC＝算出せず；1mg/kg用量群については、定量可能な2つのデータポイントだけを使ってAUClast値が算出された。
【０７２７】
29日目のブリンシドフォビル処置動物では、ブリンシドフォビルのピーク血漿中濃度は、注入開始後1〜2時間に見いだされ、1〜15mg/kgの範囲の用量に対して、平均濃度は297ng/mL〜4500ng/mLの範囲にあった。ブリンシドフォビルの血漿中濃度は、8時間時点において、4mg/kg用量群および15mg/kg用量群では定量可能なままであり、1mg/kg用量群でも6匹中1匹で定量可能なままであった。1mg/kg用量群の場合、2時間時点では、すべての動物について血漿中濃度が定量可能であった。大半の動物では、48時間まで測定可能な濃度を示した4mg/kg用量群の1匹を除いて、どの用量で投与されても、24時間時点でも48時間時点でも、定量可能な濃度はなかった。29日目に、ブリンシドフォビルの血漿中濃度は、用量が1mg/kgから15mg/kgまで増加するにつれて増加した。
【０７２８】
（表９１）ラット（TKパラメータ集団）における29日目の処置による複合雌雄血漿中ブリンシドフォビル毒物動態学的パラメータの要約
2019519570.tif 000131
NC＝算出せず；1mg/kg用量群については、定量可能な2つのデータポイントだけを使ってAUClast値が算出された。
【０７２９】
ブリンシドフォビル代謝産物シドフォビル
1日目のブリンシドフォビル処置動物において、1mg/kg用量群（ラット6匹中0匹）および4mg/kg用量群（ラット6匹中1匹）では、一般に、投与開始後に収集された最初の試料（注入開始後1時間）で、代謝産物CDVの個々の血漿中濃度を定量することはできなかった。しかし、15mg/kg用量群では、ラット6匹中5匹で、1時間試料収集時点において、CDVの個々の血漿中濃度を定量することができた。
【０７３０】
29日目に、1mg/kg用量群（ラット6匹中1匹）では、一般に、投与開始後に収集された最初の試料（注入開始後1時間）で、代謝産物CDVの個々の血漿中濃度を定量することはできなかった。しかし、4mg/kg用量群ではラット6匹中4匹で、また15mg/kg用量群では、ラット5匹中5匹で、1時間試料収集時点において、CDVの個々の血漿中濃度を定量することができた。
【０７３１】
CDVの血漿中濃度は、一般に、4mg/kg投与動物については24時間時点において、また15m/kg投与動物については48時間時点において、定量可能なままであったが、1mg/kg用量群については、8時間時点までしか定量可能でなかった。CDVの血漿中濃度は、一般に、ブリンシドフォビル用量が1mg/kgから15mg/kgまで増加するにつれて増加した。
【０７３２】
（表９２）ラット（TKパラメータ集団）における1日目の処置による複合雌雄血漿中CDV毒物動態学的パラメータの要約
2019519570.tif 000132
NC＝算出せず；1mg/kg用量群については、定量可能な2つのデータポイントだけを使ってAUClast値を算出した。
【０７３３】
（表９３）ラット（TKパラメータ集団）における29日目の処置による複合雌雄血漿中CDV毒物動態学的パラメータの要約
2019519570.tif 000133
NC＝算出せず；1mg/kg用量群については、定量可能な2つのデータポイントだけを使ってAUClast値が算出された。
29日目でのTK試料の収集に先だって動物4107を安楽死させたので、15mg/kg用量群についてはN＝5。
【０７３４】
死亡
投与相
この研究では予定外の死が3例あったが、それらはいずれもブリンシドフォビル関連とはみなさなかった。2匹（毒性試験動物番号2595および1005）の死因は、ブリンシドフォビル関連ではないと決定された。3匹目（TK用動物番号4107）の死因は決定することができなかった。
【０７３５】
動物番号2595（1mg/kg/投与の毒性試験用の雌）は、偶発的外傷に関連する可能性が高い頭蓋腫脹ゆえに、23日目に福祉上の理由で安楽死させた。肉眼的に観察された頭蓋上の暗い区域は、顕微鏡的に多巣性出血と相関した。23日目に、このラットは触ると冷たく、活動減少および異常な（努力性および不規則）呼吸を示した。
【０７３６】
動物番号4107（15mg/kg/投与の毒物動態学用の雄）は23日目に福祉上の理由で安楽死させた。23日目に、このラットは触ると異常に冷たく、活動減少、眼瞼部分閉鎖およびどんよりした目、ならびに不規則呼吸を呈した。肝腫大および脾腫ならびに正しいカテーテル先端配置が肉眼的剖検時に認められた。肉眼的データからは死因を決定することができず、死因をさらに決定するための顕微鏡評価は行わなかった。
【０７３７】
動物番号1005（毒性試験用の雄対照）は27日目に死体で発見された。27日目に、この動物には活動減少と赤い水様の鼻汁があった。肉眼所見および顕微鏡所見は、カテーテル部位に起因して他の複数の器官に広まった細菌感染と合致した。
【０７３８】
回復相
ブリンシドフォビル関連死はなかった。
【０７３９】
臨床観察
投与相
4mg/kgおよび15mg/kgのブリンシドフォビルの投与は、一部の動物（両性）に断続的な臨床徴候をもたらした。断続的な臨床徴候は、頻呼吸および背弯姿勢からなり、立毛、部分閉眼、活動減少、不規則呼吸および/または平坦姿勢を伴う場合も伴わない場合もあった。検証のために手作業による白血球分画を行い、必要であれば絶対値を算出した。これらの徴候は一般に注入に続いて22日目と29日目の間に見られ、発生率は用量に関連した。
【０７４０】
回復相
処置相中に観察された臨床徴候はすべて、回復期間の最初の日までに完全に回復した。回復相中にブリンシドフォビル関連臨床徴候はなかった。
【０７４１】
眼科学
投与回復相の終了時に眼科学に対するブリンシドフォビル関連効果はなかった。
【０７４２】
体重
体重または体重変化に対するブリンシドフォビル関連効果はなかった。
【０７４３】
摂食量
投与相
1週目、2週目、3週目および/または4週目に≧1mg/kg/投与を投与された雄（4週目の-16％同時対照まで）および3週目および4週目に15mg/kg/投与を投与された雌（3週目の-9.8％同時対照まで）では、摂食量に、ごくわずかな統計学的に有意なブリンシドフォビル関連減少があった。摂食量の減少は体重または体重増加には影響がなかった。
【０７４４】
回復相
回復期間中はどの動物の摂食量にもブリンシドフォビル関連効果がなかったので、処置相中に観察された摂食量のブリンシドフォビル関連減少は、完全に可逆的であった。
【０７４５】
臨床病理学
血液学:投与相
試験物質に関連する血液学的変化はなかった。
【０７４６】
理論に束縛されることは望まないが、血液学的異常はすべて、注入手順に関連するとみなされ、明確な用量関連傾向は呈さなかった。これらには、網状赤血球の増加、血小板数の増加ならびに好中球数および/または単球数の増加を伴う赤血球量（ヘモグロビン、ヘマトクリットおよび赤血球数）のごくわずか〜わずかな減少が含まれた。これらの所見は、カテーテル静脈感染、炎症および血液損失または血液破壊の増加に対する適当な造血応答および免疫応答を反映しているとみなした。
【０７４７】
血液学:回復相
14日間の回復後に試験物質関連の血液学的所見はなかった。
【０７４８】
凝固:投与相
凝固時間に対する試験物質関連効果はなかった。
【０７４９】
理論に束縛されることは望まないが、対照との相違はすべて、統計学的に有意でも、そうでなくても、それらの方向、規模が小さいこと、発生頻度が低いこと、用量との関連がないこと、関連分析物間で一致しないことから、かつ/または値が研究対照範囲と同等であったことから、試験物質関連とはみなさなかった。
【０７５０】
凝固:回復相
14日間の回復後に、すべての値は対照と同等であった。
【０７５１】
臨床化学
投与相
試験物質関連臨床化学変化はなかった。
【０７５２】
理論に束縛されることは望まないが、異常はすべて、注入手順に関連するとみなされ、明確な用量関連傾向は呈さなかった。これらには、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アルカリホスファターゼ（ALKP）、血中尿素窒素（BUN）、クレアチニンおよびグロブリンのごくわずか〜中等度の増加ならびにアルブミンおよびアルブミン対グロブリン比の減少が含まれた。これらの所見は、肝臓における炎症、壊死、膿瘍および梗塞、腎臓における炎症、膿瘍、尿路上皮過形成、好塩基性尿細管（tubular basophilia）および好酸性細管球状物質（eosinophilic tubular globule）、ならびに他のさまざまな組織における一般的炎症の顕微鏡的証拠と相関した。
【０７５３】
回復相
14日間の回復後に試験物質関連の臨床化学所見はなかった。
【０７５４】
尿検査
投与相
尿検査に対する試験物質関連効果はなかった。
【０７５５】
対照との相違はすべて、統計学的に有意でも、そうでなくても、それらの方向、規模が小さいこと、発生頻度が低いこと、用量との関連がないこと、関連分析物間で一致しないことから、かつ/または値が研究対照範囲と同等であったことから、試験物質関連とはみなさなかった。
【０７５６】
回復相
14日間の回復後に、すべての値は対照と同等であった。
【０７５７】
器官重量
≧4mg/kg/投与を投与した雄では、対照と比較して、ブリンシドフォビルに関連する、ごくわずか〜軽度の用量依存的な精巣重量の低下が存在した（表94）。精巣重量の低下は顕微鏡的に生殖細胞欠乏と相関した。15mg/kg/投与の雄は、精巣上体重量がごくわずかに低下していた。しかし、理論に束縛されることは望まないが、相関する顕微鏡所見はなかったので、この重量低下は、偶発的であり、精巣における顕微鏡的変化とは無関係であるとみなした。
【０７５８】
（表９４）29日間にわたって週2回の投与を受けたラットにおけるブリンシドフォビル関連器官重量変化（対照との差異％）
2019519570.tif 000134
aブリンシドフォビル処置群についての平均値と対照群についての平均値との間に統計的有意差。− ＝CMX00関連ではない；NA＝該当なし。
【０７５９】
投与終了時における他の器官重量差はすべて、統計学的に有意でも、そうでなくても、顕微鏡的相関がなく、生物学的変動による偶発的な差であるとみなした。
【０７６０】
回復期間の終了時に、≧4mg/kg/投与を投与された雄における精巣重量（表95）は依然として対照より低く、その差異は投与終了時よりも大きかった。理論に束縛されることは望まないが、これらの変化は、理論に束縛されることは望まないが、投与期間の終了時に顕微鏡的に観察された生殖細胞ステージの喪失に続発する成熟欠乏の反映であった。
【０７６１】
（表９５）29日間にわたって週2回の投与を受けた後、14日間の回復期間を経たラットにおけるブリンシドフォビル関連器官重量変化（対照との差異％）
2019519570.tif 000135
aブリンシドフォビル処置動物についての平均値と対照動物についての平均値との間に統計的有意差。− ＝CMX00関連ではない；NA＝該当なし。
【０７６２】
他の器官重量差はすべて、顕微鏡的相関がなく、偶発的であって、生物学的変動によるものとみなした。
【０７６３】
病理学:肉眼
この研究の投与相中に予定外の死が3例あった。対照雄と1mg/kg/投与を投与した雌の2匹は、ブリンシドフォビルとは無関係な原因により、投与相中に死亡するか、安楽死させた。3匹目は、15mg/kg/投与を投与された毒物動態学用の雄であり、投与相中に安楽死させたが、死因は決定することができなかった。回復相中にブリンシドフォビル関連死はなかった。
【０７６４】
対照雄（動物番号1005）は27日目に死体で発見された。死因は敗血症であった。肉眼所見および顕微鏡所見は、カテーテル部位に起因して他の複数の器官に広まって顕微鏡的に炎症、膿瘍、血栓症、梗塞および壊死と相関する腫瘤を多くの器官にもたらした細菌感染と、合致した。炎症は、腫脹した体肢（左大腿脛骨関節）にも存在した。骨髄における細胞充実度の向上は感染に対する適応反応性応答であるとみなし、胸腺、脾臓およびリンパ節における細胞充実度の低下および/または壊死、副腎皮質過形成は生理的ストレスに関連するとみなした。
【０７６５】
1mg/kg/投与を投与された雌1匹（動物番号2595）は、偶発的外傷に関連する可能性が高い頭蓋腫脹ゆえに、23日目に安楽死させた。頭蓋には肉眼的に暗い区域が観察され、それらは顕微鏡的に多巣性出血と相関した。
【０７６６】
15mg/kg/投与を投与された毒物動態学用の雄1匹（動物番号4107）は23日目に安楽死させた。肝腫大および脾腫ならびに正しいカテーテル先端配置が肉眼的剖検時に認められた。肉眼的データからは死因を決定することができず、死因をさらに決定するための顕微鏡評価は行わなかった。
【０７６７】
最終屠殺
ブリンシドフォビル関連所見
投与期間の終了時にブリンシドフォビル関連肉眼所見は観察されなかった。
【０７６８】
手順関連所見
大半の肉眼所見は注入静脈における炎症に関連し、対照を含むすべての群に存在した。これらの所見には、カテーテル出口作製部位の痂皮または肥厚および注入静脈に関連する異常内容物、腫瘤、肥厚および/または浮腫、腎臓の異常色および腫瘤、肝臓の不規則表面または腫瘤ならびに肺における暗いまたは青白い区域および腫瘤が含まれた。顕微鏡的にはこれらの所見は炎症および壊死と相関した。リンパ節および脾臓の腫大および異常色は、顕微鏡的には、反応性リンパ系プロセス（reactive lymphoid process）（リンパ節および脾臓における濾胞細胞充実度の向上）、炎症部位からの血液の排液（リンパ節における赤血球増加/赤血球貪食）または髄外造血（脾臓）と相関した。これらの変化はすべて、注入部位/手順に関連する炎症に伴う全身性反応であるとみなした。
【０７６９】
理論に束縛されることは望まないが、他の肉眼所見はすべて散発的に発生するか、対照群において発生したものであり、偶発的であって、生物学的変動によるものとみなした。15mg/kg/投与の雄1匹（動物番号4063）における異常な色（青色）で軟らかい左精巣および小さな左精巣上体は、精巣生殖細胞欠乏のブリンシドフォビル関連変化とは無関係な偶発的で自然発生的なバックグラウンド所見とみなした。散発性片側性精巣精細管萎縮は、齧歯類では珍しくない。
【０７７０】
回復期屠殺
試験物質関連所見
回復期間の終了時に、ブリンシドフォビル関連肉眼所見は、15mg/kg/投与の雄における精巣および精巣上体に限定されていた。
【０７７１】
5匹の雄のうち2匹が軟らかくかつ/または小さい精巣および精巣上体を両側性に有した。理論に束縛されることは望まないが、これらの所見は、精巣における生殖細胞欠乏および精巣上体の頭部領域における精子の減少と相関した。これらの所見は、投与期間の終了時に顕微鏡的に観察された生殖細胞集団の喪失に続発する成熟欠乏の反映であった。1匹の雄（動物番号4071）は、片側性（左）に軟らかくかつ/または小さい精巣および精巣上体を有し、これらは精巣における細管萎縮および精巣上体全体での精子減少と相関した。この雄におけるこれらの片側性所見は、偶発的で自然発生的なバックグラウンド変化であるとみなした。
【０７７２】
手順関連所見
注入手順に関連する主な肉眼所見には、注入静脈の異常内容物、腫瘤、肥厚および/または浮腫、脾腫および腎リンパ節腫大が含まれた。これらの所見は、顕微鏡的には、注入静脈の炎症および膿瘍形成ならびにリンパ器官における濾胞性細胞充実度および形質細胞増加と相関した。副腎腫大は、皮質過形成（生理的ストレスに関連）と相関した。
【０７７３】
病理学:顕微鏡
ブリンシドフォビルに関連する顕微鏡所見は、≧4mg/kg/投与の雄における精巣、精巣上体および/または精嚢、≧4mg/kg/投与の雄および雌における腸管、ならびに15mg/kg/投与の雄および雌における皮脂腺に存在した。
【０７７４】
最終屠殺
ブリンシドフォビル関連所見
雄性生殖器官（精巣、精巣上体、精嚢）
≧4mg/kg/投与の雄の精巣にはブリンシドフォビルに関連する生殖細胞欠乏が存在した（表96）。これらの変化は両側性であり、4mg/kg/投与ではごくわずか〜わずか、15mg/kg/投与ではわずか〜中等度であり、重症度の等級分けは一般に、欠乏の影響を受ける細胞タイプの数を反映した。4mg/kg/投与では生殖細胞欠乏が、精原細胞から前細糸期精母細胞までの一様でない喪失を特徴とした。15mg/kg/投与では、生殖細胞欠乏が精原細胞から太糸期精母細胞までの一様でない喪失を特徴とし、後期細管（late stage tubule）における太糸期精母細胞の多少の残留および後期細管における生殖細胞の時折の活発な変性（occasional active degeneration）をしばしば伴った。
【０７７５】
15mg/kg/投与でのブリンシドフォビル関連所見には、対照と比較して、精巣上体におけるごくわずかな管腔細胞片および精嚢におけるごくわずかに増加した上皮アポトーシスも含まれた。後者の変化は、時折、有糸分裂像の増加を伴った。4mg/kg/投与を投与された雄4匹には、ごくわずかに増加した上皮アポトーシスも存在した。
【０７７６】
15mg/kg/投与の雄（動物番号4063）に観察された片側性細管萎縮は、実験用齧歯類において散発性に起こる偶発的バックグラウンド所見とみなした。
【０７７７】
（表９６）29日間にわたって週2回ブリンシドフォビルを投与されたラットの雄性生殖器官におけるブリンシドフォビル関連所見
2019519570.tif 000136
− ＝所見がない。NA＝該当なし。
【０７７８】
腸管
≧4mg/kg/投与において、雄および雌の小腸（十二指腸、空腸および/または回腸）には、陰窩上皮の単細胞壊死（ごくわずか〜中等度）が存在し、それは重症度および/または発生率に関して用量依存的であった（表97）。この変化は、時折、ごくわずかな陰窩上皮過形成を伴った。15mg/kg/投与の雄および雌の大腸（盲腸および/または結腸）の腺上皮にも、ごくわずかな単細胞壊死が存在した。
【０７７９】
（表９７）29日間にわたって週2回ブリンシドフォビルを投与されたラットの腸管におけるブリンシドフォビル関連所見
2019519570.tif 000137
a, b重症度グレードの発生数は十二指腸、空腸および回腸aならびに盲腸および結腸bについて記録された最も高いグレードを表す。
c十二指腸は1匹では自己融解し、読み取れなかった。
d発生数には予定外の死1例（動物番号2595）が含まれる。
− ＝所見がない。
【０７８０】
皮膚（皮脂腺）
15mg/kg/投与の雄および雌には皮脂腺萎縮（わずか〜顕著）が存在した（表98）。顕著な重症度は、顕微鏡的に皮脂腺の非存在を示し、残りの付属器（毛包）には変化がなかった。
【０７８１】
（表９８）29日間にわたって週2回ブリンシドフォビルを投与されたラットの皮膚におけるブリンシドフォビル関連所見
2019519570.tif 000138
a発生数には予定の死1例（動物番号2595）が含まれる。
− ＝所見がない。
【０７８２】
手順関連所見
媒体対照群およびブリンシドフォビルを投与した動物には、注入手順に関連する顕微鏡所見が観察された。理論に束縛されることは望まないが、多くの所見は、カテーテル周囲血栓、縫合糸肉芽腫およびカテーテル静脈における内膜増殖（Weber, 2011）ならびに肺における血管周囲好酸性炎症細胞浸潤（Morton, 1997）を含む、カテーテル挿入によく付随するものであった。一部の動物には、カテーテル静脈中の細菌コロニーによる慢性活動性炎症、膿瘍形成および血栓症、ならびにカテーテル出口作製部位における表皮壊死および/または炎症路（inflammatory tract）および膿瘍があった。慢性活動性炎症、膿瘍形成、梗塞および/または壊死は、他の器官、主として腎臓および肝臓にも、時折、存在した。理論に束縛されることは望まないが、これらの変化は、カテーテル静脈の細菌感染の結果である可能性が高かった。感染に対する免疫応答を示す所見には、骨髄における細胞充実度の総合的向上または顆粒球の増加、リンパ節における濾胞性細胞充実度の向上および形質細胞増加ならびに脾臓における濾胞性細胞充実度の向上、マクロファージの増加および/または髄外造血が含まれた。リンパ器官における他の所見、例えば細胞充実度の低下および壊死、ならびに副腎における皮質過形成および腟粘液分泌が、ストレスに関連するとみなした。
【０７８３】
他にも、胃（漿膜炎）、心臓（弁内皮過形成）および肺（肉芽腫、塞栓、マクロファージ凝集、肺胞炎、血管炎、および/または血管内膜増殖）に、手順関連顕微鏡所見が観察された。ごくわずかな限局性/多巣性心筋炎の症例も観察され、理論に束縛されることは望まないが、それらは、注入手順に続発したものであるか、実験用齧歯類における一般的なバックグラウンド所見に相当するものでありえた。
【０７８４】
その他の所見
腎臓
4mg/kg/投与の投与を受けた雄1匹（動物番号3048）および雌1匹（動物番号3560）において、腎臓の皮質尿細管上皮に好酸性球状物質が存在した。関連する炎症性または変性性の変化はなかった。これらの球状物質は、鉄に関するプルシアンブルーおよび赤血球に関する一般染色としてのマルチウス・スカーレット・ブルー（Martius Scarlet Blue）では、陰性染色を呈した。
【０７８５】
散発性に発生するか、対照群およびブリンシドフォビル群において類似する発生率および重症度で発生する他の顕微鏡所見については、理論に束縛されることは望まないものの、偶発的であって、生物学的変動によるものとみなした。これらには、4mg/kg/投与の雄1匹（動物番号3044）における唾液腺の低分化癌および15mg/kg/投与の雄1匹（動物番号4068）における腎尿細管腺腫が含まれた。理論に束縛されることは望まないが、これらの腫瘍は、ラットでは自然発生的に生じると報告されており、偶発的であって（Nishikawa 2010、Hardisty 2013）、ブリンシドフォビルとは無関係であるとみなした。
【０７８６】
14日間の回復期間後に、≧4mg/kg/投与の雄では精巣および/または精巣上体に顕微鏡所見が存在したままであり、15mg/kg/投与の雄および雌では骨髄に新しい所見が認められた。投与の終了時に観察された腸管および皮脂腺における顕微鏡所見はすべて完全に回復していた。回復期間の終了時にも注入手順関連所見は存在した。
【０７８７】
雄性生殖器官（精巣、精巣上体）
回復期間の終了時に、≧4mg/kg投与の雄では、精巣の成熟欠乏と共に、最終剖検動物において同定された細胞集団の継続的な欠乏があった（表99）。15mg/kg/投与では、この変化は、一般に伸長途上の精子細胞（elongating spermatid）だけを残す大半の生殖細胞集団の欠乏を特徴とし、しばしば多巣性細管萎縮を伴った。4mg/kg/投与では、初期段階細管からXIII期細管において、精原細胞、精母細胞および円形精子細胞の一様でない喪失があった。
【０７８８】
15mg/kg/投与の雄では、成熟欠乏に、精巣上体の頭部における精子の減少および管腔細胞片が伴った。15mg/kg/投与の雄1匹（動物番号4071）は、精巣に片側性細管萎縮を有し、精巣上体における精子減少と篩状変化（精子減少に関連する所見）を伴った。理論に束縛されることは望まないが、この雄におけるこれらの片側性所見は、自然発生的バックグラウンド変化であり、ブリンシドフォビルとは無関係であるとみなした。
【０７８９】
（表９９）29日間にわたって週2回ブリンシドフォビルを投与されてから14日の回復期間を経たラットの雄性生殖器官における試験物質関連所見
2019519570.tif 000139
− ＝所見がない。NA＝該当なし
【０７９０】
骨髄
15mg/kg/投与では、回復動物の雄および雌数匹が、骨髄における細胞充実度のごくわずか〜わずかな低下を有した（表100）。これは投与期間の終了時には観察されなかった所見である。
【０７９１】
（表１００）29日間にわたって週2回ブリンシドフォビルを投与されてから14日の回復期間を経たラットの骨髄における試験物質関連所見
2019519570.tif 000140
a重症度グレードの発生数は胸骨髄または大腿骨髄について記録された最も高いグレードを表す。
− ＝所見がない。
【０７９２】
手順関連所見
回復期間の終了時には、投与期間の終了時に観察された上述のものと類似する一連の手順関連顕微鏡観察結果が存在した。これらは注入カテーテルの感染に関連し、理論に束縛されることは望まないが、ブリンシドフォビルには関連しないとみなした。
【０７９３】
散発性に発生するか、対照群およびブリンシドフォビル群において類似する発生率および重症度で発生する他の顕微鏡所見はすべて、偶発的であって、生物学的変動によるものとみなした。
【０７９４】
Sprague-Dawley CD（登録商標）ラット（15匹/性別/群）に、ブリンシドフォビルを、0（2×リン酸ナトリウム緩衝液）、1、4または15mg/kg/投与で、2時間静脈内注入により、29日間にわたって、毎週2回投与した。14日間の投与後回復のために、最大5匹/性別/群をとっておいた。
【０７９５】
ブリンシドフォビルの投与は、≧4mg/kg/投与で、両性において、一部の動物に断続的な（一般に注入に続いて）臨床徴候（主に異常呼吸および背弯姿勢）をもたらし、雄および雌において、それぞれ≧1mg/kg/投与および15mg/kg/投与で、ごくわずかに減少した摂食量をもたらした。
【０７９６】
≧4mg/kg/投与では雄性生殖器官（精巣生殖細胞欠乏、精巣上体中の管腔細胞片および精嚢における上皮アポトーシスの増加）および腸管（単細胞壊死）に、また15mg/kg/投与では皮脂腺（萎縮）に、ブリンシドフォビル関連所見が存在した。ブリンシドフォビル関連所見はすべて完全に回復した。例外は、≧4mg/kg/投与での雄における精巣変化であり、これは2週間で完全に回復するとは予想されないだろう。加えて、15mg/kg/投与が投与された数匹の動物では、回復の終了時に、骨髄細胞充実度の低下ならびに一側性または両側性に軟らかくかつ/または小さい精巣および精巣上体が見られた。
【０７９７】
この研究の条件下では、≧4mg/kg/投与での雄における精巣生殖細胞欠乏および15mg/kg/投与での1匹の雌における中等度の腸単細胞壊死に基づいて、ブリンシドフォビルの無毒性レベル（NOAEL）は、雄では1mg/kg/投与および雌では4mg/kg/投与であるとみなした。
【０７９８】
実施例11-健常ヒト被験者におけるIV BCV用量漸増研究
要約
10mg、25mgおよび50mgのブリンシドフォビルを健常被験者に投与した。IVブリンシドフォビル投与は、10mgで、経口投与された100mgのブリンシドフォビルと類似する曝露を与えることがわかった。 どちらのIVブリンシドフォビル用量（10mgおよび25mg）も一般的に安全であり、忍容性は高いことがわかった。薬物関連有害事象、胃腸有害事象および段階的検査異常（例えば溶血毒性および腎毒性）はいずれも観察されなかった。
【０７９９】
この研究では、IVおよび経口懸濁液BCV投与に続くCDV-PPの末梢血単核球（PBMC）PKも評価した。BCVは、細胞内で、活性なシドフォビル二リン酸（CDV-PP）に変換される。
【０８００】
バックグラウンドとして、100mgおよび200mgでの経口BCVの単回投与は約5％例の下痢をもたらし、350mg用量は約20％例の下痢をもたらした。
【０８０１】
材料および方法
この二重盲検研究では、逐次単回用量漸増コホートにおいてIV BCVまたは偽薬を与えるために、被験者を3:1にランダム化した（下記表101および102）。血漿中PK試料を7日にわたって収集し、HPLC-MSによってアッセイした。血漿中BCV PKパラメータを非コンパートメント分析によって決定し、用量比例性を評価した。安全性評価を14日にわたって収集した。
【０８０２】
（表１０１）研究計画
2019519570.tif 000141
【０８０３】
（表１０２）被験者の人口統計
2019519570.tif 000142
男性をn/N（％）として提示する。
年齢を平均（最小-最大）として提示する。
【０８０４】
CDV-PPのPBMC PK
この分析のためのデータは健常被験者における2つの単回投与BCV研究によって得た。第1の研究は、24人の被験者が登録されて、各期間に1回、BCV経口懸濁液100mgの2つの製剤が絶食下で与えられる、2期間クロスオーバー生物学的同等性研究であった。PBMCが第1期間に収集された12人の被験者からのデータをこの分析に含めた。これらの被験者は100％女性、31〜59歳、58〜88kgであった。上に概説した第2の研究には40人の被験者が登録され、IV BCVまたは偽薬が投与された。2時間または4時間IV注入としてBCV 50mgが投与された18人の被験者からのデータをこの分析に含めた。これらの被験者は、100％男性、18〜46歳、64〜106kgであった。一連のPBMC試料を14日にわたって収集し、HPLC-MS-MSによってアッセイした。PBMC CDV-PP PKパラメータを非コンパートメント分析によって決定した。
【０８０５】
40人の健常雄被験者（18〜46歳、白人83％）が登録されて、この研究を完了した。血漿中BCVのCmaxおよびAUC∞は用量に比例して増加した（下記表103）。有害事象およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）上昇は、用量および注入継続時間に関連した。胃腸有害事象は軽度であった。有害事象およびALT上昇はすべて一過性であり、重篤有害事象は発生しなかった。偽薬とIV BCVとの間で、他の化学成分または血液学的パラメータに、有意差は観察されなかった。
【０８０６】
図6は、異なる100mg経口投与、10mg IV投与、および25mg IV投与での血漿中ブリンシドフォビル濃度（AUCinf（ng＊h/mL））のプロットを表す。図6に示すとおり、10mgブリンシドフォビルのIV投与は100mgブリンシドフォビルの経口投与と実質上同じ血漿中濃度を与え、一方、25mgブリンシドフォビルのIV投与は、IV 10mg投与および経口100mg投与のどちらよりも高い血漿中濃度を与えた。
【０８０７】
用量に関連する可逆的ALT増加がIV BCVで観察された。以前の研究では、ヒトでの研究および前臨床研究において、経口BCVに、可逆的な用量関連ALT増加があった。IV BCV SAD研究では、治療量のIV曝露（コホート1および2）において、グレード2以上のALT上昇は観察されなかった。治療量を上回る（supratherapeutic）曝露（コホート3および4）では、グレード2〜3の一過性ALT上昇がコホート4だけに認められた。グレード2以上のビリルビンはどのコホートにも観察されなかった。
【０８０８】
（表１０３）IV注入に続く血漿中BCV PKデータの予備的要約
2019519570.tif 000143
CmaxおよびAUC∞を幾何平均（％CVb）［最小-最大］として提示する。
Tmaxは、コホート1〜3（2時間注入）の場合で2時間、および2.5〜4時間（4時間注入）であった。
1. BCV 50mg 4時間注入被験者2人および偽薬被験者1人においてALT＞2×ULN；1例のALT上昇がAEとみなされた。
2.コホート3では、被験者4人に5例の薬物関連AE。
3.コホート4では、被験者5人に9例の薬物関連AE。
【０８０９】
（表１０４）IV BCV PKおよび安全性:グレード3またはグレード4の薬物関連有害事象
2019519570.tif 000144
【０８１０】
図9は、コホート1〜4の被験者について平均血漿中BCV濃度を時間の関数として表している。図9は、BCVの経口投与を受けた被験者についても、平均血漿中BCV濃度を時間の関数として表している。
【０８１１】
表105に、IV投与および経口投与（単回投薬）に続く血漿中BCV PKデータの要約を示す。
【０８１２】
（表１０５）IV投与および経口投与に続く血漿中BCV PKデータの要約
2019519570.tif 000145
データは幾何平均（CVb％）［最小,最大］として提示する。
研究CMX001-108についてはAUCinfの代わりにAUClastを提示する。
【０８１３】
表106は、コホート1〜4の予備的血漿中CDV PKデータの要約を表す。
【０８１４】
（表１０６）IV注入に続く血漿中CDV PKデータの予備的要約
2019519570.tif 000146
データを幾何平均（CVb％）［最小-最大］として提示する。
ND:大半のCDV濃度が定量下限未満であったので実施せず。
外挿されたAUCパーセントが高いので、AUCinfおよびt1/2は報告しない。
【０８１５】
図10は、IV BCV投与および経口BCV投与に続くメジアン血漿中CDV濃度を時間の関数として表している。
【０８１６】
CDV-PPのPBMC PK
2時間IV注入または4時間IV注入として投与されたBCV 50mgの単回投与は、BCV 100mg経口懸濁液に匹敵する細胞内CDV-PP曝露を送達した（表107）。PBMC CDV-PP曝露は注入継続時間に逆相関した（表107）。
【０８１７】
図8は、IV BCV SAD治験において観察された平均（±SE）ALTレベルを表す。
【０８１８】
（表１０７）BCVの経口投与およびIV投与に続くPBMC CDV-PP PKの要約
2019519570.tif 000147
【０８１９】
2時間IV注入として投与されるBCV 10〜50mgの単回投与は忍容性が高く、有意な臨床異常または検査異常とは関連しなかった。BCV IV 10mgおよびBCV IV 50mgは、BCV経口100mg錠剤で達成される値（Cmax＝251ng/mLおよびAUC∞＝1394ng・h/mL）と比較して、それぞれ同等および4.5倍の幾何平均血漿中BCV AUC∞を達成した。これらのデータは、健常被験者およびウイルス感染患者における反復投薬の評価を裏付けている。
【０８２０】
加えて、IV BCVは、経口BCVと比較した場合に、より低い用量で同等なPBMC CDV-PP曝露をもたらした。理論に束縛されることは望まないが、いくつかの態様において、これは、BCVの忍容性および効力の改善を可能にすることができる。
【０８２１】
等価物
本開示を上述の具体的態様との関連で説明したが、その数多くの代替態様、変更態様および他の変形は、当業者には明らかであるだろう。そのような代替態様、変更態様および変形はすべて、本開示の要旨および範囲に含まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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