(57)【要約】  本発明は、卵巣癌のイン・ビトロ診断方法と、卵巣癌の予防または治療のための組成物および方法とに関するものであって、前記組成物が、プロガストリンに結合する抗体を含み、前記方法は、プロガスリンに結合する抗体の使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における卵巣癌のイン・ビトロ診断方法であって、
ａ）前記対象からの生物サンプルを少なくとも１つのプロガストリン結合分子と接触させる工程と、
ｂ）前記サンプル中における前記プロガストリン結合分子とプロガストリンとの結合を検出する工程とを含み、前記結合は前記対象における卵巣癌の存在を示唆するものである、方法。
【請求項２】
工程ｂ）が、前記プロガストリンの濃度を決定することをさらに含み、前記生物サンプル中においてプロガストリンの濃度が少なくとも５ｐＭであることは、前記対象における卵巣癌の存在の示唆である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｃ）参照サンプル中における参照のプロガストリンの濃度を決定する工程と、
ｄ）前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度を前記参照のプロガストリンの濃度と比較する工程と、
ｅ）工程ｄ）での比較から、卵巣癌の存在を判断する工程とをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記プロガストリン結合分子が、抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、Ｎ末端の抗プロガストリンモノクローナル抗体およびＣ末端の抗プロガストリンモノクローナル抗体から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
プロガストリンに結合する前記抗体が、
・それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号７、８および９のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号１０、１１および１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号１３、１４および１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号１６、１７および１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号１９、２０および２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号２２、２３および２４のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号２５、２６および２７のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号２８、２９および３０のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号３１、３２および３３のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体；並びに
・それぞれ配列番号３４、３５および３６のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物サンプルが、プロガストリンの第一の部分に結合する第一の分子と、プロガストリンの第二の部分に結合する第二の分子とに接触させられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生物サンプルが、血液、血清および血漿から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生物サンプルが血漿であり、プロガストリンの濃度が少なくとも５ｐＭであることが、前記対象における卵巣癌の存在の示唆である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
卵巣癌の予防または治療用組成物であって、前記組成物が、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片を含む、組成物。
【請求項１１】
前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片が、ヒト化抗体、単鎖抗体、ラクダ化抗体、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体およびＩｇＭ抗体から選択される、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片が、Ｎ末端の抗プロガストリン抗体およびＣ末端の抗プロガストリン抗体から選択される、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記プロガストリン結合分子またはその抗原結合性断片が、中和抗体である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記プロガストリン結合分子が、
・それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号７、８および９のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、抗体
・それぞれ配列番号１０、１１および１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号１３、１４および１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、抗体
・それぞれ配列番号１６、１７および１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号１９、２０および２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、抗体
・それぞれ配列番号２２、２３および２４のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号２５、２６および２７のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、抗体
・それぞれ配列番号２８、２９および３０のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号３１、３２および３３のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、抗体；並びに
・それぞれ配列番号３４、３５および３６のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、抗体
から選択されるヒト化抗体である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
卵巣癌のイン・ビトロ診断のための、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のプロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌のイン・ビトロ診断、予防および治療に関するものであり、さらに詳細には、卵巣癌のイン・ビトロ診断方法、ならびに、卵巣癌の予防または治療のための方法および組成物に関する。この発明による組成物は、プロガストリン結合分子、特に抗ｈＰＧ抗体を含み、一方この発明による方法は、プロガストリン結合分子、特に抗ｈＰＧ抗体の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
卵巣癌は、咽喉および胃間の路において、卵巣細胞から生じるものであり、８番目に多い癌であるといわれており、女性よりも男性への影響が大きく、その割合は国によって大きく異なる。
【０００３】
卵巣癌の２つの最も多い型は、卵巣扁平上皮癌および卵巣腺癌である。より稀な亜型もまたいくつか知られている。卵巣扁平上皮癌は食道の上皮細胞から生じ、一方、腺癌は食道の下方部に存在する腺細胞から生じる。
【０００４】
臨床診断は生検に基づき、通常ＣＴスキャンまたは超音波のもとに行われる。この疾患の不良転帰は、特に診断の遅れに起因し、特に初期の兆候および症状がないことに起因する。これまで、卵巣癌の広範な臨床行為に置き換えられるような分子バイオマーカーはなかった（Kaz et al, Cancer Letters, 2014）。治療は、癌の進行に左右されるが、小さい局所的な腫瘍については、外科手術、または、ことによっては放射線療法と組み合わせた化学療法を通常含む。
【０００５】
従って、卵巣癌の予防または治療のための新規の組成物および方法が未だ要望されているように、素早く、信頼でき、費用対効果の高い卵巣癌の診断を可能にする方法が未だ要望されている。
【発明の概要】
【０００６】
このことが、本発明の目的である。
【０００７】
ここで、本発明は、卵巣癌のイン・ビトロ診断方法を提供するものであって、前記方法は対象からの生物サンプル中におけるプロガストリンの検出を含む。好ましくは、前記サンプル中におけるプロガストリンの量を決定することで、プロガストリンの定量を可能にする。本発明はまた、卵巣癌の予防または治療用組成物であって、プロガストリンに結合する抗体を含む前記組成物と、プロガストリンに結合する抗体を含む組成物の、単独での使用または卵巣癌に対するその他の公知の予防法もしくは治療法と組み合わせての使用を含む、卵巣癌の予防または治療の方法とを提供する。
【０００８】
ヒトプレプロガストリンである、１０１アミノ酸のペプチド（アミノ酸配列リファレンス：ＡＡＢ１９３０４．１）は、ガストリン遺伝子の一次翻訳産物である。プロガストリンは、プレプロガストリンからはじめの２１のアミノ酸（シグナルペプチド）を切断することによって形成される。プロガストリンの８０アミノ酸鎖は、切断および修飾酵素によって、いくつかの生物活性ガストリンホルモン形態である、プロガストリンの３８〜７１のアミノ酸を含むガストリン３４（Ｇ３４）およびグリシン伸長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）、プロガストリンの５５〜７１のアミノ酸を含むガストリン１７（Ｇ１７）およびグリシン伸長ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）とに、さらにプロセシングされる。
【０００９】
抗ヒトプロガストリン（抗ｈＰＧ）モノクローナル抗体および診断または治療へのそれらの用途は、以下の文献に記載されている：結腸直腸癌に関して国際公開第２０１１／０８３０８８号、乳癌に関して国際公開第２０１１／０８３０９０号、膵癌に関して国際公開第２０１１／０８３０９１号、結腸直腸癌および消化器癌に関して国際公開第２０１１／１１６９５４号、ならびに、肝臓病変に関して国際公開第２０１２／０１３６０９号および国際公開第２０１１／０８３０８９号。
【００１０】
本発明は、本明細書の発明の詳細な説明および添付の図面からさらによく理解されるようになるが、それらは説明の目的のためのみに与えられるものであって、この発明の意図した範囲を限定するものではない。
【発明の具体的説明】
【００１１】
第一の側面においては、本発明は、卵巣癌の存在の危険性についてのイン・ビトロ評価の方法に関するものであって、前記方法は対象からの生物サンプル中におけるプロガストリンを検出する工程を含む。サンプル中におけるプロゲスチンの存在が、卵巣癌の存在の危険性があることを示唆するものである。本発明者らにより、健常対象者においてよりも卵巣癌患者において、プロガストリンのレベルがより高いということが、はじめて証明された。一方で、これまでの研究では、卵巣ガストリン発現の生理学的意義は、評価が困難であると結論付けられた（von Solinge et al., Cancer Res., 1993, 53(8): 1823-1828）。
【００１２】
このため、第一の態様においては、この発明は、対象における卵巣癌の存在の危険性のイン・ビトロ評価方法に関するものであって、前記方法は、
ａ）前記対象からの生物サンプルを少なくとも１つのプロガストリン結合分子と接触させる工程と、
ｂ）前記サンプル中における前記プロガストリン結合分子とプロガストリンとの結合を検出する工程とを含み、前記結合は卵巣癌の存在の危険性を示唆するものである。
【００１３】
プロガストリン結合分子の結合は、当業者にとって利用可能である様々なアッセイによって検出することができる。該アッセイを実施する任意の好適な手段は、この発明の範囲に含まれるものであるが、特にＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロットおよびＩＨＣを挙げることが可能である。
【００１４】
好ましい態様においては、対象における卵巣癌の存在の危険性のイン・ビトロ評価のためのこの発明による方法は、
ａ）前記生物サンプルを少なくとも１つのプロガストリン結合分子と接触させる工程と、
ｂ）前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度を決定する工程とを含み、前記生物サンプル中においてプロガストリンの濃度が少なくとも５ｐＭであることは卵巣癌の存在の危険性の示唆である。
【００１５】
サンプル中に存在するプロガストリンの濃度を決定すると、その結果を、対照のサンプルの濃度と比較することが可能であり、該対照のサンプルは試験サンプルと同様の手法で取得されるが、卵巣癌に罹患していないことがわかっている個人から取得されるものとする。試験サンプル中においてプロガストリンの濃度が有意に高いほど、そのサンプルが得られた対象は卵巣癌を有する尤度が高いということが結論付けられ得る。
【００１６】
そのため、より好ましい態様においては、この発明の方法は、
ｃ）参照サンプル中における参照のプロガストリンの濃度を決定する工程と、
ｄ）前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度を前記参照のプロガストリンの濃度と比較する工程と、
ｅ）工程ｄ）での比較から、卵巣癌の存在の危険性を評価する工程とである、さらなる工程を含む。
【００１７】
他の側面によれば、この発明は、対象における卵巣癌を診断するイン・ビトロ方法であって、前記方法は、
ａ）前記対象からの生物サンプルを少なくとも１つのプロガストリン結合分子と接触させる工程と、
ｂ）前記サンプル中における前記プロガストリン結合分子とプロガストリンとの結合を検出する工程とを含み、前記結合は前記対象における卵巣癌の存在を示唆するものである。
【００１８】
好ましい態様においては、本発明は、対象における卵巣癌のイン・ビトロ診断方法であって、
ａ）前記生物サンプルを少なくとも１つのプロガストリン結合分子と接触させる工程と、
ｂ）前記生物サンプル中におけるプロガストリンのレベルまたは濃度を決定する工程を含み、前記生物サンプル中においてプロガストリンの濃度が少なくとも５ｐＭであることは、前記対象における卵巣癌の存在の示唆である。
【００１９】
この発明による方法のさらに特定の態様においては、前記生物サンプル中においてプロガストリンの濃度が少なくとも５ｐＭ、１０ｐＭ、少なくとも２０ｐＭ、少なくとも３０ｐＭであることは、前記対象における卵巣癌の存在の示唆である。
【００２０】
より好ましい態様においては、この発明の方法は、
ｃ）参照サンプル中における参照のプロガストリンの濃度を決定する工程と、
ｄ）前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度を前記参照のプロガストリンのレベルまたは濃度と比較する工程と、
ｅ）工程ｄ）での比較から、卵巣癌の存在を診断する工程とである、さらなる工程を含む。
【００２１】
他の側面によれば、この発明は、対象における転移した卵巣癌を診断するイン・ビトロ方法であって、前記方法は、
ａ）前記対象からの生物サンプルを少なくとも１つのプロガストリン結合分子と接触させる工程と、
ｂ）前記サンプル中における前記プロガストリン結合分子とプロガストリンとの結合を検出する工程とを含み、前記結合は前記対象における転移した卵巣癌の存在を示唆するものである。
【００２２】
好ましい態様においては、本発明は、対象の生物サンプルからの、前記対象における転移した卵巣癌のイン・ビトロ診断方法であって、
ａ）前記生物サンプルを少なくとも１つのプロガストリン結合分子と接触させる工程と、
ｂ）前記生物サンプルにおけるプロガストリンのレベルまたは濃度を生化学アッセイによって決定する工程とを含み、前記生物サンプルにおいてプロガストリンの濃度が少なくとも５ｐＭより高いことは、前記対象における転移した卵巣癌の存在の示唆である。
【００２３】
この発明による方法のさらに特定の態様においては、前記生物サンプル中において、プロガストリンの濃度が少なくとも５ｐＭ、１０ｐＭ、少なくとも２０ｐＭ、少なくとも３０ｐＭ、少なくとも４０ｐＭまたは少なくとも５０ｐＭであることは、前記対象における転移した卵巣癌の存在の示唆である。
【００２４】
より好ましい態様においては、この発明の方法は、
ｃ）参照サンプル中における参照のプロガストリンの濃度を決定する工程と、
ｄ）前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度を前記参照のプロガストリンのレベルまたは濃度と比較する工程と、
ｅ）工程ｄ）での比較から、転移した卵巣癌の存在を診断する工程とである、さらなる工程を含む。
【００２５】
特定の態様においては、本発明は、対象における卵巣癌のイン・ビトロ診断方法であって、生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度の決定と、その得られた値を参照サンプル中におけるプロガストリンの濃度と比較することとを含む。
【００２６】
さらに特定の態様においては、本発明による卵巣癌の診断の方法では、前記対象の生物サンプルを少なくとも１つのプロガストリン結合分子と接触させるものであって、前記プロガストリン結合分子は、抗体またはその抗原結合性断片である。
【００２７】
「対象における卵巣癌の存在の危険性を評価すること」という表現は、参照の対象または値と比較したときに、所与の対象について、卵巣癌に罹患していることの相対的な蓋然性を決定するということを示している。この発明による方法は、臨床検査、生検などの他の方法または指標、および、公知の卵巣癌のバイオマーカーのレベルの決定と組み合わせる、前記危険性の評価の際のツールを表している。
【００２８】
特定の態様によれば、本発明は、対象からの生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度の決定を含む、卵巣癌のイン・ビトロ診断方法であって、前記対象は、卵巣癌の少なくとも１つの臨床症状を示しているものである。卵巣癌の臨床症状としては、体重減少、痛みを伴う嚥下または嚥下困難、咳、消化不良および胸やけを含む。
【００２９】
他の特定の態様によれば、本発明は、対象からの生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度の決定を含む、卵巣癌のイン・ビトロ診断方法に関するものであって、前記対象は、癌のおよび／または転移の臨床症状を少なくとも１つ示しているものである。
【００３０】
「イン・ビトロ診断」と言う表現は、対象が、特定の疾患に罹患しているか否かを判断することを意味する。
【００３１】
したがって、本発明による、卵巣癌のイン・ビトロ診断方法は、診断プロセスにおけるツールとみなすことが可能である。
【００３２】
さらに特定の態様においては、本発明は、対象における卵巣癌のイン・ビトロ診断方法であって、前記生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度の決定と、公知の卵巣癌のバイオマーカーの決定とを含む。
【００３３】
「プロガストリン」という語は、哺乳動物のプロガストリンペプチドであって、特にヒトプロガストリンを示している。誤解を避けるために、いずれの特定がなければ、「ヒトプロガストリン」という表現は、配列番号１の配列に示されるヒトＰＧをいう。ヒトプロガストリンは、上記した生物活性なガストリンホルモンの形態には存在しない、Ｎ末端およびＣ末端のドメインを顕著に含む。好ましくは、前記Ｎ末端のドメインの配列は、配列番号２で表される。他の好ましい態様においては、前記Ｃ末端のドメインの配列は、配列番号３で表される。
【００３４】
この発明による方法において、プロガストリンの濃度の決定は、生化学分野の当業者に公知である任意の方法によって行われる。
【００３５】
好ましくは、サンプル中のプロガストリンのレベルを決定することは、前記サンプルをプロガストリン結合分子と接触させることと、前記プロガストリン結合分子とプロガストリンとの結合を測定することとを含む。
【００３６】
発現のレベルをタンパク質レベルで測定する場合、例えば抗体などの特異的プロガストリン結合分子を用いることによって、特に、ビオチン標識、または、特異的な抗体での免疫沈降法、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡもしくはＥＬＩＳＰＯＴ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、免疫蛍光法（ＩＦ）、抗体マイクロアレイもしくは免疫組織化学と組み合わせた組織マイクロアレイが後に続く他の同等の技術を用いて染色した細胞膜などの周知の技術を用いることによって、顕著に行われ得る。他の好適な技術としては、単一または多重励起波長を用い、かつ、電気化学的方法（ボルタンメトリーおよびアンペロメトリー技術）などの適合する光学的方法、原子間力顕微鏡、ならびに、例えば多極の共鳴分光法である高周波法、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、および、複屈折率または屈折率（例えば、表面プラズモン共鳴法、偏光解析法、共振ミラー法、グレーティングカプラ導波管法、または、干渉法）の共焦点検出および非共焦点検出、細胞ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ、ラジオアイソトープの磁気共鳴画像法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；ＨＰＬＣ−質量分析；液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による分析のうちのいずれかを適用する、ＦＲＥＴもしくはＢＲＥＴのシングルセルの顕微鏡的方法または組織化学的方法を含む。これら技術の全てはこの分野で周知であるため、ここでのさらなる詳述は不要である。これら様々な技術を用いて、プロガストリンのレベルを測定することが可能である。
【００３７】
前記方法は、特に、免疫検出に基づく方法、ウエスタンブロットに基づく方法、質量分析に基づく方法、クロマトグラフィーに基づく方法、および、フローサイトメトリに基づく方法から選択してよい。このアッセイを実施するための任意の好適な手段がこの発明の範囲内に含まれるが、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、およびＩＨＣなどの方法が、この発明の方法を実施するために特に有用である。
【００３８】
さらに特定の態様においては、この発明による卵巣癌のイン・ビトロ診断方法は、免疫酵素アッセイを用いて、好ましくはＲＩＡおよびＥＬＩＳＡから選択される技術に基づいて、対象からの生物サンプルをプロガストリン結合分子と接触させることを含む。
【００３９】
ここで、「生物サンプル」は、例えば卵巣癌のタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは転写物の核酸またはポリペプチドを含む、生物組織または生体液のサンプルである。こうしたサンプルは、プロガストリンの発現レベルの決定を可能にするはずである。プロガストリンは、分泌タンパク質であることが知られている。このため、プロガストリンタンパク質のレベルを決定するのに好ましい生物サンプルには、生体液が含まれる。ここで、「生体液」は、生物由来の物質を含むあらゆる液体を意味する。本発明で用いるのに好ましい生体液には、例えば哺乳類である動物、好ましくはヒト対象の、体液が含まれる。この体液は、任意の体液であってよく、血液、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、汗、および、尿を含むが、これに限定されない。好ましくは、前記好ましい液体である生物サンプルは、例えば血液サンプル、血漿サンプル、または、血清サンプルなどのサンプルを含む。より好ましくは、生物サンプルは血液サンプルである。実際に、こうした血液サンプルは、患者より収集した完全に害を受けていない血液によって取得することができるため、対象の腫瘍が成長することとなる危険性に関して非侵襲的な評価が可能になる。
【００４０】
ここで、「生物サンプル」はまた、癌が固形癌である場合、試験対象の患者の固形癌サンプルを含む。こうした固形癌サンプルにより、当業者は、この発明のバイオマーカーのレベルのあらゆるタイプの測定を行うことが可能となる。一部の場合において、この発明による方法は、患者から固形癌サンプルを得る事前工程をさらに含み得る。「固形癌サンプル」は、腫瘍の組織サンプルを指すものである。癌患者であっても、腫瘍の部位である組織は、非腫瘍の健常組織をなお含んでいる。そのため、「癌サンプル」は、患者から得た腫瘍組織に限定されるべきである。前記「癌サンプル」は、生検標本であるかまたは外科的な切開療法より得たサンプルであり得る。
【００４１】
生物サンプルは典型的に真核生物より、最も好ましくは哺乳類、または、鳥、爬虫類、または、魚より取得したものである。実際に、本明細書に記載の方法に供され得る「対象」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、イノシシ・ブタ（swine）、ヒツジおよびサルを含む哺乳動物、または鳥、爬虫類、または、魚のいずれかであり得る。好ましくは、対象はヒトであり、ヒト対象は「患者」ともいう。
【００４２】
「生物サンプルを取得すること」は、本明細書では、この発明に記載の方法で使用する生物サンプルを取得することを意味する。ほとんどの場合、これは動物から細胞サンプルを取り出すことによってなされることとなるが、予め単離しておいた（例えば、別の時点でおよび／または別の目的で、別の人物によって単離された）細胞を用いるか、または、生体内でこの発明の方法を行うことによって、達成することもまた可能である。治療歴または転帰歴を有する記録保管された組織は、特に有用となる。
【００４３】
このサンプルは、当業者にとって公知の方法に従って取得され得、必要であれば調製され得る。特に、空腹時の対象よりサンプルを取得するべきであることは、この分野において周知である。
【００４４】
プロガストリンの濃度の決定は、サンプルの既知の体積中にあるプロガストリンの量の決定と関係している。プロガストリン濃度は、例えば割合または百分率として、参照サンプルに対して相対的に表すことができる。この濃度はまた、前記濃度の決定に用いられる方法に応じて、信号の強度または局在として表現されてもよい。好ましくは、サンプル中のある化合物の濃度は、前記サンプル中の関連化合物の総濃度を標準化した後で表されるものであって、例えば、サンプル中のタンパク質の総濃度を標準化した後で、あるタンパク質のレベルまたは濃度が表される。
【００４５】
好ましくは、前記対象が卵巣癌に罹患しているという危険性は、前記生物サンプル中で測定されたプロガストリンのレベルを参照レベルと比較することによって決定される。
【００４６】
ここで、「参照レベル」という語は、検討中の卵巣癌マーカー、すなわちプロガストリンの、参照サンプル中での発現レベルをいう。ここで、「参照サンプル」は、対象であって、好ましくは疾患に罹患していないことがわかっている２以上の対象よりか、または、代替として母集団より取得したサンプルを意味する。好適な参照のプロガストリン発現レベルは、いくつかの好適な対象における前記マーカーの発現レベルを測定することによって決定することが可能であり、こうした参照レベルは、特定の対象集団に応じて調整することが可能である。参照の値または参照レベルは、絶対値；相対値；上限もしくは下限を有する値；ある範囲の値；平均値（average value）；中央値、中間値（mean value）または特定の対照もしくはベースライン値と比較した値、であることが可能である。参照値は、個々のサンプル値、例えば試験されている対象からのサンプルであるが、時期的には初期の時点でのサンプルから取得した値に基づくことが可能である。参照値は、例えば暦年齢が合致する群の対象の集団からのサンプルなどの大量のサンプルに基づくか、または、試験対象のサンプルを含んだまたは除外したサンプルのプールに基づくことが可能である。
【００４７】
有利には、「参照レベル」は、癌に関する公知の特定の状態にある対象からの生物サンプルから取得した、所定のプロガストリンレベルである。特定の態様においては、工程（ｂ）での試験サンプルとの比較に用いられる参照レベルは、健常な対象からの生物サンプルからか、または、癌に罹患している対象からの生物サンプルから取得していたものであり得、参照の発現プロファイルはまた、健常な対象の生物サンプルのプールからか、または、癌を有する対象からのサンプルのプールから取得することも可能であるということが理解される。
【００４８】
この発明の方法の特定の態様においては、参照サンプルは、あらゆる癌に、好ましくはあらゆる病理に関与しない対象より収集する。参照サンプルは、患者より収集した生物サンプルの性質にもとづいて、前記生物サンプルと同じ性質の生物サンプルであることとなるということを理解されたい。
【００４９】
プロガストリンのレベルは、本方法において、プロガストリン結合分子が、好ましくはプロガストリンを認識する抗体が結合したプロガストリンの量を決定することによって、決定する。
【００５０】
「プロガストリン結合分子」は、本明細書において、プロガストリンを結合させるが、ガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ３４）、グリシン伸長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）またはグリシン伸長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）を結合させない、任意の分子を指すものである。本発明のプロガストリン結合分子は、例えば抗体分子または受容体分子などの、任意のプロガストリン結合分子であり得る。好ましくは、プロガストリン結合分子は、抗プロガストリン抗体またはその抗原結合性断片である。
【００５１】
「結合性」、「結合している」等は、抗体またはその抗原結合性断片が、生理的条件下で、比較的安定である抗原と複合体を形成するということを意味するものである。２つの分子が結合しているか否かを判断する方法は、この分野において周知であり、例としては、平衡透析、表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。特定の態様においては、前記抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＳＡまたはカゼインなどである非特異的分子に結合する自身の親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性をもつプロガストリンに結合する。さらに特定の態様においては、前記抗体またはその抗原結合性断片は、プロガストリンにのみ結合する。
【００５２】
特定の態様においては、この発明による卵巣癌の診断の方法では、対象からの生物サンプルを、少なくとも１つのプロガストリン結合分子と接触させるものであって、プロガストリンに対する前記分子の親和性が、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも９０ｎＭ、少なくとも８０ｎＭ、少なくとも７０ｎＭ、少なくとも６０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも４０ｎＭ、少なくとも３０ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも１０ｐＭ、または、少なくとも１ｐＭであり、例えば上記したような方法によって決定される。
【００５３】
特定の態様においては、本発明は、卵巣癌の診断の方法であって、対象からの生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度の検出を含むものであって、前記生物サンプルを、抗ｈＰＧ抗体またはその抗原結合性断片と接触させる。
【００５４】
ここで、「抗体」という語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むことを意味している。抗体（または「免疫グロブリン」）は、ジスルフィド結合によって互いに連結した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含む糖タンパク質からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと省略する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＬＣＶＲまたはＶＬと省略する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬの領域は、主に抗原のエピトープを結合することについて一義的な責任を有する、超可変性の「相補性決定領域」（ＣＤＲ）または「高頻度可変領域」と称される領域と、より保たれる領域を点在させた、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域とに、さらに細分することが可能である。抗体の軽鎖および重鎖内のＣＤＲを同定し、かつ、それらの配列を決定する方法は、当業者にとって周知である。誤解を避けるために、本文中に反対の示唆が何もなければ、ＣＤＲという表現は、ＩＭＧＴで定義されているような抗体の重鎖および軽鎖の超可変性領域を意味するものであって、ＩＭＧＴ固有ナンバリングにより、フレームワーク領域と、相補性決定領域であるＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８、ＣＤＲ２とについての、標準化された境界決定が提供されている。
【００５５】
ＩＭＧＴ固有ナンバリングは、抗原受容体、鎖の型または種が何であろうと可変ドメイン同士を比較するように定義された（Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997)／Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)／Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)）。ＩＭＧＴ固有ナンバリングにおいては、保存アミノ酸は常に同じ位置を有し、例えばシステインでは２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファンでは４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸では８９、システインでは１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファンでは１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）である。ＩＭＧＴ固有ナンバリングにより、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：位置１〜２６、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８）と相補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７とについての、標準化された境界決定が提供されている。空隙は占有されていない位置を表しているため、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（例えば［８．８．１３］のように角括弧内にドットで区切って示される）が、重大な情報となる。ＩＭＧＴ固有ナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓ［Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)／Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)］として示される、二次元のグラフィカル図と、ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ［Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)］における三次元構造とにおいて用いられる。
【００５６】
ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲにより構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ、次の順で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、宿主組織またはファクターとの免疫グロブリンの結合を媒介し得、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一の成分（Ｃｌｑ）を含む。抗体は、様々なアイソタイプのもの（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）とすることが可能である。
【００５７】
さらに特定の態様においては、前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ラクダ化抗体、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、および、ＩｇＭ抗体からなる群から選択する。
【００５８】
「ポリクローナル抗体」は、複数の他の同一でない抗体の中でまたは存在下で産生された抗体である。概して、ポリクローナル抗体は、あるＢ細胞から、同一でない抗体を産生するいくつかの他のＢ細胞の存在下で産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫動物から直接取得される。
【００５９】
「モノクローナル抗体」という語は、ほぼ同質の抗体の集団から生じた抗体を示すものであって、集団は、最小限の割合で観察可能であるいくつかの可能性のある天然の突然変異を除外した、同一の抗体を含む。モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマなどの単一の細胞のクローンの増殖より生じ、１つのクラスおよびサブクラスの重鎖と、１つの型の軽鎖とによって特徴付けられる。
【００６０】
ある抗体の「抗原結合性断片」という表現は、前記抗体のターゲット（概して、抗原とも称される）に、概してそのエピトープに結合する能力を保持し、かつ、前記抗体のアミノ酸配列の、少なくとも５個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１５個の隣接アミノ酸残基、少なくとも２０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも２５個の隣接アミノ酸残基、少なくとも４０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも５０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも６０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも７０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも８０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも９０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１００個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１２５個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１５０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１７５個の隣接アミノ酸残基、または、少なくとも２００個の隣接アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を示すことを意味する。
【００６１】
特定の態様においては、前記抗原結合性断片は、それが由来する抗体の少なくとも１個のＣＤＲを含む。さらに好ましい態様においては、前記抗原結合性断片は、それが由来する抗体の２、３、４または５個のＣＤＲ、より好ましくは６個のＣＤＲを含む。
【００６２】
「抗原結合性断片」は、限定することなく、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは単鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃの断片もしくは二重特異性抗体、または、ＸＴＥＮ（伸長組換えポリペプチド）もしくはＰＡＳモチーフなどの不規則ペプチドとの融合タンパク質、または、ポリ（エチレン）グリコールなどのポリ（アルキレン）グリコールの添加（「ペグ化（PEGylation）」）（ペグ化された断片を、Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと称する）（“ＰＥＧ”はポリ（エチレン）グリコール）などの化学的修飾によって、もしくは、この発明による抗体の特有のＣＤＲのうち少なくとも１つを有する前記断片をリポソーム中に取り込むことによって、その半減期が増加することとなる任意の断片、からなる群から選択することが可能である。好ましくは、前記「抗原結合性断片」は、その由来である抗体の可変の重鎖または軽鎖の部分的な配列で構成されることとなるまたは含むこととなるものであって、前記部分的な配列は、ターゲットに対して、それが系統を引いている抗体と同様の結合特異性と十分な親和性、好ましくはそれが系統を引いている抗体の親和性の少なくとも１／１００と同等、より好ましくは少なくとも１／１０である親和性とを保持するのに十分なものである。
【００６３】
他の特定の態様においては、この発明による卵巣癌の診断の方法では、対象からの生物サンプルをプロガストリンに結合する抗体と接触させるものであって、前記抗体は、当業者に公知の免疫法によって取得されたものであり、免疫原として、そのアミノ酸配列がプロガストリンのアミノ酸配列の全体または一部を含んでいるペプチドを用いるものである。さらに詳細には、前記免疫原は、
・そのアミノ酸配列が、完全長プロガストリンのアミノ酸配列、特に配列番号１に示される完全長ヒトプロガストリンを含むまたはからなる、ペプチド
・そのアミノ酸配列が、プロガストリンのアミノ酸配列、特に配列番号１に示される完全長ヒトプロガストリンの一部に対応する、ペプチド
・そのアミノ酸配列が、プロガストリンのＮ末端部分のアミノ酸配列の一部または全体に対応するペプチド、特にアミノ酸配列：ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号２）を含むまたはからなる、ペプチド
・そのアミノ酸配列が、プロガストリンのＣ末端部分のアミノ酸配列の一部または全体に対応するペプチド、特にアミノ酸配列：ＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号３）を含むまたはからなる、ペプチド
・そのアミノ酸配列がプロガストリンのＣ末端部分のアミノ酸配列の一部に対応するペプチド、特にプロガストリンの７１〜８０のアミノ酸に対応するアミノ酸配列ＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号４０）を含む、ペプチドから選択されるペプチドを含む。
【００６４】
当業者は、こうした免疫法を用いて、所望により、ポリクローナル抗体かモノクローナル抗体かのいずれかを生成することができるということを認識するだろう。これらの抗体の型のそれぞれを取得する方法は、この分野において周知である。そのため、当業者は、任意の所与の抗原に対するポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体を生成する方法を容易に選択して実施するであろう。
【００６５】
ヒトプロガストリンの１〜１４のアミノ酸配列（Ｎ末端の端）に対応する、アミノ酸配列“ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ”を含む免疫原を用いることによって生成したモノクローナル抗体の例としては、以下の表１から表４に記載するように、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ１６およびｍＡｂ１９およびｍＡｂ２０として示されるモノクローナル抗体が挙げられるが、これに限定されない。他のモノクローナル抗体が既に説明されているが、これら抗体が実際にプロガストリンに結合するか否かは不明である（国際公開第２００６／０３２９８０号）。エピトープマッピングの実験結果は、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ１６およびｍＡｂ１９およびｍＡｂ２０が、前記ｈＰＧのＮ末端のアミノ酸配列内のあるエピトープを特異的に結合するということを示している。配列番号２で表すプロガストリンのＮ末端内のあるエピトープを特異的に認識するポリクローナル抗体が、この分野において説明されている（例えば、国際公開第２０１１／０８３０８８号を参照のこと）。
【００６６】
【表１】
2019502923.tif 000002
【００６７】
【表２】
2019502923.tif 000003
【００６８】
【表３】
2019502923.tif 000004
【００６９】
【表４】
2019502923.tif 000005
【００７０】
ヒトプロガストリンの５５〜８０のアミノ酸配列に対応する、アミノ酸配列“ＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ”（プロガストリンのＣ末端部分）を含む免疫原を用いることによって生成することが可能であるモノクローナル抗体の例としては、以下の表５および６に、ｍＡｂ８およびｍＡｂ１３として示される抗体が挙げられるが、これに限定されない。エピトープマッピングの実験結果は、ｍＡｂ１３が、前記ｈＰＧのＣ末端のアミノ酸配列内のあるエピトープを特異的に結合するということを示している。
【００７１】
【表５】
2019502923.tif 000006
【００７２】
【表６】
2019502923.tif 000007
【００７３】
他の例としては、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含む免疫原を用いて生成された抗ｈＰＧモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体が挙げられる。
【００７４】
さらに特定の態様においては、この発明による方法では、前記生物サンプルを、抗ｈＰＧ抗体またはその抗原結合性断片と接触させるものであって、前記抗ｈＰＧ抗体は、Ｎ末端の抗ｈＰＧ抗体およびＣ末端の抗ｈＰＧ抗体から選択される。
【００７５】
「Ｎ末端の抗ｈＰＧ抗体」および「Ｃ末端の抗ｈＰＧ抗体」という語は、それぞれ、ｈＰＧのＮ末端部分に位置するアミノ酸を含むエピトープまたはｈＰＧのＣ末端部分に位置するアミノ酸を含むエピトープに結合する抗体を示している。好ましくは、「Ｎ末端の抗ｈＰＧ抗体」という語は、配列番号２で表される配列をもつプロガストリンのドメイン内に位置するエピトープに結合する抗体をいう。他の好ましい態様においては、「Ｃ末端の抗ｈＰＧ抗体」という語は、配列番号３で表される配列をもつプロガストリンのドメイン内に位置するエピトープに結合する抗体をいう。
【００７６】
「エピトープ」という語は、抗体が結合する抗原のある領域をいう。エピトープは、構造または機能として規定されてもよい。機能的なエピトープは、概して、構造的なエピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与するそれらアミノ酸を有する。エピトープはまた、立体構造であってもよい。或る態様においては、エピトープは、アミノ酸、糖の側鎖、リン酸基またはスルホニル基などの、分子の化学的に活性表面の分類である決定因子を含んでよく、また或る態様においては、特定の三次元構造的な特性および／または特定の電荷特性を有してよい。抗体が結合するエピトープの決定は、当業者に公知である、任意のエピトープマッピング技術によって行うことができる。あるエピトープは、タンパク質のアミノ酸配列内に連続的に配置される、様々なアミノ酸を含み得る。あるエピトープはまた、タンパク質のアミノ酸配列内に連続的に配置されない、アミノ酸を含み得る。
【００７７】
特定の態様においては、前記抗体は、
・それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号７、８および９のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号７、８および９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号１０、１１および１２のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号１０、１１および１２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号１３、１４および１５のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号１３、１４および１５と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号１６、１７および１８のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号１６、１７および１８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号１９、２０および２１のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号１９、２０および２１と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号２２、２３および２４のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号２２、２３および２４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号２５、２６および２７のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号２５、２６および２７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号２８、２９および３０のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号２８、２９および３０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号３１、３２および３３のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号３１、３２および３３と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体；並びに
・それぞれ配列番号３４、３５および３６のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号３４、３５および３６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号３７、３８および３９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
からなる群から選択されるモノクローナル抗体である。
【００７８】
ここで、核酸またはアミノ酸の２つの配列間における「同一性の百分率」または「〜％の同一性」は、好適なアラインメント後に取得される、比較対象の２つの配列間で一致しているヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率を意味し、この百分率は、純粋に統計的なものであり、この２つの配列間における差異が、それらの長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、従来、それらを最適に配列した後で該配列を比較することによって実施されるが、前記比較は、セグメントによってかまたは「アラインメントウィンドウ」を用いることによって行うことが可能である。比較のための配列の最適なアラインメントは、人手による比較に加えて、当業者による公知の方法によって実施することが可能である。
【００７９】
参照のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列に関して、好ましい例としては、該参照配列や、或る修飾であって特に少なくとも１つのアミノ酸の削除、付加もしくは置換や、切断、または、伸長を含むアミノ酸配列が挙げられる。１つまたは複数の連続または非連続のアミノ酸を置換する場合、置換されたアミノ酸が、「同等」のアミノ酸で置き換わるような置換が好ましい。ここで、「同等のアミノ酸」という表現は、構造上のアミノ酸のうちのひとつを置換しようとするものであるが、対応する抗体の生物活性および以下に規定する具体的な例の生物活性を変えることのないように置換される、任意のアミノ酸を示すことを意味する。
【００８０】
同等のアミノ酸は、置換されるアミノ酸との構造的な相同性か、または、生成しようとする種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果のいずれかにおいて決定することが可能である。
【００８１】
他の特定の態様では、この発明の方法で用いられる抗体は、ヒト化抗体である。
【００８２】
ここで、「ヒト化抗体」という表現は、非ヒト由来の抗体から生じたＣＤＲ領域を含む抗体を意味し、抗体分子のその他の部分は、１つまたはいくつかのヒト抗体から生じたものである。また、骨格セグメントの残基（フレームワークのＦＲと称される）の一部は、当業者による公知の技術に従って、修飾されて、結合親和性を維持することが可能である（Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986）。ヒト化の目指すところは、完全な抗原結合親和性と、抗体の特異性とを維持しながら、ヒトへの導入のために、例えばマウス抗体などの外因性の抗体の免疫原性を減少させることである。
【００８３】
この発明のヒト化抗体またはそれらの断片は、当業者にとって公知の技術によって調製することが可能である（例えば、Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992の文献に記載のものなど）。こうしたヒト化抗体は、イン・ビトロ診断または生体内での予防的および／または治療的な治療に関与する方法におけるそれらの使用に関して好ましいものである。他のヒト化技術もまた、当業者にとって公知である。実際に、抗体は、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第０４５１２６１号；欧州特許第０６８２０４０号；欧州特許第０９３９１２７号；欧州特許第０５６６６４７号；米国特許第５，５３０，１０１号；米国特許第６，１８０，３７０号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６１号；米国特許第５，６３９，６４１号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第５，８８６，１５２号；および米国特許第５，８７７，２９３号）、ベニアリング（veneering）またはリサーフェイシング（resurfacing）（欧州特許第０５９２１０６号；欧州特許第０５１９５９６号；Padlan E. A., 1991 , Molecular Immunology 28(4/5): 489-498；Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814；Roguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 91:969-973）およびチェーンシャッフリング（chain shuffling）（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、様々な技術を用いてヒト化することが可能である。ヒト抗体は、ファージディスプレイ法を含む、この分野で公知の様々な方法によって作製することが可能である。米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号、第５，５４５，８０６号および５，８１４，３１８号、ならびに、国際特許出願公開番号、国際公開第９８／４６６４５号、国際公開第９８／５０４３３号、国際公開第９８／２４８９３号、国際公開第９８／１６６５４号、国際公開第９６／３４０９６号、国際公開第９６／３３７３５号および国際公開第９１／１０７４１号もまた参照されたい。
【００８４】
さらに特定の態様においては、前記抗体は、
・それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号７、８および９のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号７、８および９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、ヒト化抗体
・それぞれ配列番号１０、１１および１２のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号１０、１１および１２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号１３、１４および１５のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号１３、１４および１５と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、ヒト化抗体
・それぞれ配列番号１６、１７および１８のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号１６、１７および１８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号１９、２０および２１のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号１９、２０および２１と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、ヒト化抗体
・それぞれ配列番号２２、２３および２４のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号２２、２３および２４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号２５、２６および２７のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号２５、２６および２７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、ヒト化抗体
・それぞれ配列番号２８、２９および３０のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号２８、２９および３０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号３１、３２および３３のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号３１、３２および３３と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、ヒト化抗体；並びに
・それぞれ配列番号３４、３５および３６のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号３４、３５および３６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む重鎖と、それぞれ配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列であるか、または、最適なアライメント後にそれぞれ配列番号３７、３８および３９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性をもつ配列である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは３つを含む軽鎖とを含む、ヒト化抗体
からなる群から選択されるヒト化抗体であって、
前記抗体はまた、ヒト抗体から生じた軽鎖および重鎖の定常領域を含む。
【００８５】
第一の態様においては、この発明による方法は、生物サンプルを、ｈＰＧのエピトープであって、ｈＰＧのＣ末端部分内に位置する前記エピトープにまたはｈＰＧのＮ末端部分内に位置するエピトープに結合する抗ｈＰＧ抗体と接触させることを含む。
【００８６】
さらに具体的な態様においては、この発明による方法は、生物サンプルを、ｈＰＧのエピトープであって、ｈＰＧの１０〜１４のアミノ酸、ｈＰＧの９〜１４のアミノ酸、ｈＰＧの４〜１０のアミノ酸、ｈＰＧの２〜１０のアミノ酸、および、ｈＰＧの２〜１４のアミノ酸に対応するアミノ酸配列から選択される、プロガストリンのＮ末端部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む前記エピトープに結合する抗ｈＰＧ抗体と接触させることを含み、上記ｈＰＧのアミノ酸配列は、配列番号１である。
【００８７】
さらに具体的な態様においては、この発明による方法は、生物サンプルを、ｈＰＧのエピトープであって、ｈＰＧの７１〜７４のアミノ酸、ｈＰＧの６９〜７３のアミノ酸、ｈＰＧの７１〜８０のアミノ酸（配列番号４０）、ｈＰＧの７６〜８０のアミノ酸、およびｈＰＧの６７〜７４のアミノ酸に対応するアミノ酸配列から選択される、プロガストリンのＣ末端部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む前記エピトープに結合する抗ｈＰＧ抗体と接触させることを含み、上記ｈＰＧのアミノ酸配列は、配列番号１である。
【００８８】
第一の態様においては、この発明による組成物は、プロガストリンのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むエピトープを認識する抗体を含む。
【００８９】
さらに具体的な態様においては、この発明による組成物は、プロガストリンのエピトープであって、プロガストリンのＮ末端部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む前記エピトープを認識する抗体を含み、前記アミノ酸配列は、ｈＰＧの１０〜１４の残基、ｈＰＧの９〜１４の残基、ｈＰＧの４〜１０の残基、ｈＰＧの２〜１０の残基、または、ｈＰＧの２〜１４の残基を含み得、上記ｈＰＧのアミノ酸配列は、配列番号１である。
【００９０】
さらに具体的な態様においては、この発明による組成物は、プロガストリンのエピトープであって、プロガストリンのＣ末端部分のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む前記エピトープを認識する抗体を含み、前記アミノ酸配列は、ｈＰＧの７１〜７４の残基、ｈＰＧの６９〜７３の残基、ｈＰＧの７１〜８０の残基（配列番号４０）、ｈＰＧの７６〜８０の残基、またはｈＰＧの６７〜７４の残基を含み得、上記ｈＰＧのアミノ酸配列は、配列番号１である。
【００９１】
この発明による卵巣癌のイン・ビトロ診断方法の特定の態様においては、前記方法は、対象からの生物サンプルを、プロガストリンの第一の部分に結合する第一の分子と、プロガストリンの第二の部分に結合する第二の分子とに接触させる工程を含む。さらに特定の態様においては、前記プロガストリン結合分子は抗体であり、対象からの生物サンプルを、プロガストリンの第一のエピトープと結合する抗体と、プロガストリンの第二のエピトープと結合する第二の抗体とに接触させる。
【００９２】
好ましい態様において、卵巣癌の診断の本発明の方法は、ヒト対象からの生物サンプル中におけるプロガストリンの検出を含む。
【００９３】
より好ましい態様においては、卵巣癌の診断の本発明の方法は、ヒト対象からの生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度の検出を含む。
【００９４】
他の特定の態様においては、卵巣癌の診断の本発明の方法は、ヒト対象からの生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度の検出を含むものであって、前記生物サンプルは、血液、血清および血漿から選択する。
【００９５】
さらに好ましい態様においては、本発明の方法は、前記対象からのサンプルを上記したような抗ｈＰＧ抗体と接触させることを含むものであって、上記サンプル中における前記抗ｈＰＧ抗体の結合は、前記対象における卵巣癌の存在を示唆する。
【００９６】
さらに特定の態様においては、本発明の方法は、前記対象からのサンプルを上記したような抗ｈＰＧ抗体と接触させることを含むものであって、前記サンプル中においてプロガストリンの濃度が５ｐＭを超えていることは、前記対象における卵巣癌の存在の示唆である。
【００９７】
より好ましくは、本発明の方法は、前記対象からのサンプルを上記したような抗ｈＰＧ抗体と接触させることを含むものであって、前記サンプル中においてプロガストリンの濃度が５ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、３０ｐＭまたは４０ｐＭを超えていることは、前記対象における卵巣癌の存在の示唆である。
【００９８】
さらにより好ましくは、本発明の方法は、前記対象からのサンプルを上記したような抗ｈＰＧ抗体と接触させることを含むものであって、前記血漿中においてプロガストリンの濃度が５ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、３０ｐＭ、４０ｐＭを超えていることは、前記対象における転移した卵巣癌の存在の示唆である。
【００９９】
本発明はまた、例えば化学療法、生物学的療法、免疫療法または抗体療法などの患者における卵巣癌の治療の有効性を、卵巣癌の治療前に患者より取得した体液または卵巣癌の生検などである第一のサンプル中におけるプロガストリンの濃度を決定することと、その後第一のサンプル中におけるプロガストリンの濃度を、治療後の同じ患者より取得した第二のサンプル中におけるプロガストリンの濃度と比較することとによって、モニタリングする方法に関するものであって、前記第一のサンプルと比較した前記第二のサンプル中におけるプロガストリンの濃度の減少が、治療が有効であったことを示唆するものである。
【０１００】
特定の態様においては、この発明による方法は、患者より取得した生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度を、サンプル中におけるプロガストリンの濃度についての所定の値と比較することを含み、さらに特定の態様においては、前記所定の値は、卵巣癌でない集団における値の中間（mean）または平均（average）の決定に基づく、サンプル値の中間または平均、上記患者が卵巣癌でないことがわかった場合に取得されるプロガストリンの濃度の値、から選択する。
【０１０１】
特定の態様においては、卵巣癌のイン・ビトロ診断のこの発明による方法は、前記患者からのサンプル中におけるプロガストリンの濃度の決定と、卵巣癌の第二の診断の試験とを含む。さらに特定の態様においては、卵巣癌のイン・ビトロ診断のこの発明による方法は、前記患者からのサンプル中におけるプロガストリンの濃度の決定と、卵巣癌の第二の診断の試験とを含む。
【０１０２】
この発明の特定の態様においては、本発明による方法は、卵巣癌を治療したまたは治療している患者からのサンプル中における経時的なプロガストリンのレベルの決定を含む。
【０１０３】
他の側面においては、本発明の主題は、卵巣癌の予防または治療用組成物に関するものであって、前記組成物は、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片を含む。
【０１０４】
この発明の方法で用いる抗体組成物は、限定するものではないが、非経口、くも膜下腔内、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、点滴または急速投与を含む様々な経路で投与する、水性懸濁液を含むがこれに限定されない様々な剤形として調製することが可能である。いくつかの態様においては、組成物は、非経口投与用に処方され、またいくつかの具体的な態様においては、点滴による静脈内注射用とされる。
【０１０５】
特定の態様においては、この発明による、卵巣癌の予防または治療用組成物は、０．００１ｍｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇの範囲をとる有効量のこの発明の抗プロガストリン抗体を含むものであって、それは一回投与かまたは複数回にわたる間隔を空けた投与で与えることができる。
【０１０６】
特定の態様においては、この発明による、卵巣癌の予防または治療用組成物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ラクダ化抗体、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、および、ＩｇＭ抗体から選択される、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片を含む。好ましくは、前記抗体は上述した抗体である。より好ましくは、前記抗体はヒト化抗体である。
【０１０７】
さらに特定の態様においては、この発明による、卵巣癌の予防または治療用組成物は、例えば上述した方法によって決定されるような、少なくとも５０００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、１００ｎＭ、８０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ、または、少なくとも０．１ｐＭである、プロガストリンに対する親和性を有するプロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片を含む。
【０１０８】
さらにより特定の態様においては、卵巣癌の予防または治療用組成物は、プロガストリン結合抗体を含むものであって、前記プロガストリン結合分子またはその抗原結合性断片は、中和抗体である。
【０１０９】
「中和抗ＰＧ抗体」という表現は、ＰＧを結合して、ＰＧ依存性信号伝達をブロックし、結果的に腫瘍細胞中での、特に卵巣腫瘍細胞中でのＰＧ誘発反応を抑制するものである、抗体を示す。卵巣細胞のＰＧ誘発反応の抑制は、細胞分化の抑制、細胞死の抑制、および／または、細胞増殖の刺激によって媒介させることができる。
【０１１０】
他の特定の態様においては、卵巣癌の予防または治療用組成物は、プロガストリン結合抗体を含むものであって、前記プロガストリン結合分子またはその抗原結合性断片は、ヒト化抗体である。
【０１１１】
特定の態様においては、卵巣癌の予防または治療用組成物は、プロガストリン結合抗体を含むものであって、前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片は、細胞毒性剤が結合されている。
【０１１２】
他の特定の態様においては、患者の卵巣癌の予防または治療用組成物は、プロガストリン結合抗体を含むものであって、前記患者は本発明による方法によって卵巣癌と診断されたものであり、プロガストリンの濃度が、参照サンプル中よりも前記患者からの生物サンプル中でより高いものである。
【０１１３】
さらに特定の側面においては、本発明は、この発明による卵巣癌の予防または治療用組成物に関するものであって、前記プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片は、Ｎ末端の抗プロガストリン抗体およびＣ末端の抗プロガストリン抗体から選択される。
【０１１４】
他の側面においては、本発明は、この発明による卵巣癌の予防または治療用組成物を含む薬剤組成物と、薬剤的に許容される担体とに関する。さらに具体的には、この発明による卵巣癌の予防または治療用薬剤組成物は、上述したような抗体と、薬剤的に許容される担体とを含む。
【０１１５】
さらに特定の側面においては、本発明は、この発明による卵巣癌の予防または治療用組成物を含む薬剤組成物と薬剤的に許容される担体とに関するものであって、前記抗プロガストリン抗体は、０．００１ｍｇ／ｋｇから２５０ｍｇ／ｋｇの用量で、好ましくは少なくとも０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の側面においては、本発明は、この発明による卵巣癌の予防または治療用組成物と、抗癌治療分子とを含むパーツのキットに関する。
【０１１６】
実際には、本明細書に記載するような抗ＰＧモノクローナル抗体による治療は、他の治療法と組み合わせるかまたは他の治療法を補助することが可能である。他の治療法の非限定的な例としては、化学療法による治療、放射線治療、外科的切除術および抗体療法が挙げられる。
【０１１７】
他の側面においては、本発明は、この発明による卵巣癌の予防または治療用組成物と、化学療法分子、標的療法分子から選択される抗癌治療分子とを含むパーツのキットに関する。
【０１１８】
特定の態様においては、本発明は、同時投与、連続投与または別々の投与のための、この発明による卵巣癌の治療のための組成物および化学療法分子を含む、パーツのキットに関する。この目的に有用である化学療法分子としては、葉酸拮抗剤、プリン拮抗剤、ピリミジン拮抗剤、ＤＮＡアルキル化分子、ＤＮＡ架橋剤、抗生物質、白金錯体、プロテアソーム阻害剤、有糸分裂紡錘体毒、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびその他のものが挙げられるが、これに限定されない。
【０１１９】
他の特定の態様においては、本発明は、同時投与、連続投与または別々の投与のための、この発明による組成物と他の標的療法分子を含む組成物とを含む、パーツのキットに関する。こうした標的療法分子には、セツキシマブまたはパニツムマブなどの、ＥＧＦＲを標的とする抗体、ベバシズマブなどの、ＶＥＧＦを標的とする抗体、トラスツズマブまたはペルツズマブなどの、ＨＥＲ２を標的とする抗体、ペンブロリズマブなどの、ＰＤ−１およびＰＤＬ−１を標的とする抗体、イピリムマブなどの、ＣＴＬＡ−４を標的とする抗体、エルロチニブなどの、ＥＧＦＲを標的とする小分子薬剤、ベムラフェニブまたはダブラフェニブなどの、ＢＲＡＦを標的とする小分子薬剤、アフリベルセプトなどの、ＶＥＧＦを標的とする組換え融合タンパク質が含まれるが、これに限定されない。
【０１２０】
他の特定の側面においては、本発明は、卵巣癌の診断のための、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片の使用に関する。
【０１２１】
他の特定の側面においては、本発明は、卵巣癌の予防または治療のための、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片の使用に関する。
【０１２２】
さらに特定の側面においては、本発明は、患者の卵巣癌の予防または治療のための、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片の使用に関するものであって、前記患者の生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度が決定されて、参照の生物サンプルのプロガストリンの濃度よりも高いものである。
【０１２３】
さらに特定の側面においては、本発明は、患者の卵巣癌の予防または治療のための、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片の使用に関するものであって、前記患者に転移が認められる。
【０１２４】
さらにより特定の側面においては、本発明は、患者の卵巣癌の予防または治療のための、プロガストリン結合抗体またはその抗原結合性断片の使用に関するものであって、前記患者に転移が認められ、前記患者の生物サンプル中におけるプロガストリンの濃度が決定されて、参照の生物サンプルのプロガストリンの濃度よりも高いものである。
【０１２５】
組み合わせにより最大の効能が獲得されるように、組み合わせて構成される成分を、同時に、別々に、または、連続的に投与してよいものであり、投与毎に急速投与から連続灌流までその持続時間を変更することが可能である。
【０１２６】
ここで、「同時に投与」は、組成物の２つの化合物を単一かつ固有の製剤で投与することをいう。ここで、「別々に投与」は、この発明による組成物の２つの化合物を、別個の製剤で、同時に投与することをいう。ここで、「連続投与」は、この発明による組成物の２つの化合物を、それぞれ別個の製剤で、立て続けに投与することをいう。
【０１２７】
ここで、「治療効果量」は、疾患の症状を予防、緩和、軽減もしくは改善するかまたは治療中の患者の生存時間を延ばすのに有効である、ある化合物（または化合物）の最小濃度または最小量をいう。
【０１２８】
この発明の態様の特徴は、以下の実施例についての続く詳細な説明よりさらに明らかになることとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、卵巣癌患者（ｎ＝８）と対照患者（ｎ＝１０３）とにおける、プロガストリンの血漿濃度の中央値である。
【図２】図２は、２０μｇ／ｍｌのヒト化対照抗体（抗ヒトＦｃＧ１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）（ＣＴ  Ｈｚ）での、または、２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  Ｈｚ（ＰＧ  Ｈｚ）での、４８時間の治療後のＳＫ−ＯＶ−３細胞の細胞計数である。両側ｔ検定、＊：ｐ＜０．０５。
【図３】図３は、超低接着条件下の、対照（ＣＴ  Ｈｚ）での、または、抗ＰＧヒト化抗体（ＰＧ  Ｈｚ）での、続く治療で形成されたＳＫ−ＯＶ−３スフィアの数である。両側ｔ検定、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【実施例】
【０１３０】
実施例１：ポリクローナル抗体を用いた、血漿のプロガストリンの濃度の検出
血漿のプロガストリンのレベルを、２つの特異的な抗プロガストリン抗体を用いてＥＬＩＳＡによって定量した。捕捉抗体をプレートのウェル上に被覆させて、一方、顕色抗体（revelation antibody）を用いてプロガストリンを検出し、シグナルの顕色を媒介させるようにする。
【０１３１】
本実施例において、定量は、反応することで光を発する基質を用いることで、捕捉抗体に保持される抗原に結合する抗体の発光量に比例する値を割り当てることを可能にする、ＥＬＩＳＡ法に基づく。
【０１３２】
材料
表７に、試薬および装置を列記する。
【０１３３】
【表７】
2019502923.tif 000008
【０１３４】
ポリクローナル抗体は、標準プロトコルに従って、Ｎ末端プロガストリン（配列番号２）で、または、ｈＰＧの７１〜８０のアミノ酸に対応し、かつ、配列ＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号４０）を有するＣ末端プロガストリンで、ウサギを免疫することによって取得した。
【０１３５】
このアッセイで用いるプロガストリンに対するポリクローナル抗体の結合特性は、次のとおりである：Ｇ３４−Ｇｌｙ、Ｇ３４、Ｇ１７−Ｇｌｙ、Ｇ１７に結合せず、完全長のプロガストリンに結合する。
【０１３６】
９６ウェルプレートを、１００ｍｌのミリＱ水に１カプセルの内容物を溶解させることによって、５０ｍＭ、ｐＨ９．６の炭酸塩すなわち重炭酸ナトリウムの溶液を調製して被覆した。プロガストリンのＣ末端、ＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号４０）を用いることによって取得されるポリクローナル抗体に対応する、捕捉抗体の溶液（３μｇ／ｍｌ）を、炭酸塩バッファー中で調製する。１００マイクロリットルの抗体溶液を各ウェルに加え、４℃で１６時間（一晩）インキュベートする。その後プレートを、抗体溶液を除去することによってブロックし、３００μｌの１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄して、その後１ウェル当たり２００μｌのブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／０．１％ＢＳＡ）を加えて、２２℃で２時間インキュベートする。その後ブロッキングバッファーを除去して、ウェルを３００μｌの１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄する。
【０１３７】
血漿の希釈は、次のとおり行う：血漿は純粋なものを使用し、１／２、１／５および１／１０に希釈する。希釈液は、純粋な血漿から１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／０．１％ＢＳＡ中で調製する。
【０１３８】
対照試験である、プロガストリンの濃度が既知であるＥＬＩＳＡに関しては、プロガストリンの希釈は次のとおりに調製される：ストック組換えＰＧ（フランス国パリ、パスツール研究所からの、大腸菌中で産生し、グルタチオンアガロース／タグ除去（Ｔｅｖ）／ＩＭＡＣカウンター精製／透析でアフィニティ精製された完全長ヒトプロガストリン）を、０．４５ｍｇ／ｍｌ（４５マイクロＭ）の濃度に三つ組で調製する。プロガストリンの濃度の範囲は、次のとおりに調製した：
・溶液Ａ：１／１０の事前希釈、２μｌのストック＋１８μｌのバッファー
・溶液Ｂ：１／１００の事前希釈、１０μｌのＡ＋９０μｌのバッファー
・溶液Ｃ：１／１０００の事前希釈、１０μｌのＢ＋９０μｌのバッファー
・溶液Ｄ：５００ｐＭ、５．５５μｌのＣ＋４９４．５μｌの希釈液
・溶液Ｅ：２５０ｐＭ、２５０μｌのＤ＋２５０μｌの希釈液
・溶液Ｆ：１００ｐＭ、２００μｌのＥ＋３００μｌの希釈液
・溶液Ｇ：５０ｐＭ、２５０μｌのＦ＋２５０μｌの希釈液
・溶液Ｈ：２５ｐＭ、２００μｌのＧ＋２００μｌの希釈液
・溶液Ｉ：１０ｐＭ、１００μｌのＨ＋１５０μｌの希釈液
【０１３９】
組換えＰＧの範囲は線形であり、そのため使用する抗体に応じて、多少広範囲となることがある。
【０１４０】
試験サンプルの調製のため、各サンプルおよそ５００μｌを取り分け、結果物を分析（および必要であれば確認）するまで保存しておく。この範囲の各点および／または血漿について１００μｌを、純粋な、１／２、１／５および１／１０に希釈したものをアッセイし、プレート上で２２℃で２時間インキュベートする。
【０１４１】
この試験の顕色のため、プレートを、３００μｌの１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄する。ポリクローナルウサギ抗プロガストリン抗体の溶液であって、前記抗体が、免疫原としてプロガストリンのＮ末端部を用いて取得され、ビオチンに結合した、０．５μｇ／ｍｌとなるものである、ポリクローナルウサギ抗プロガストリン抗体の溶液を、１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／０．１％ＢＳＡで希釈することによって調製する。この溶液１００μｌを、各ウェルに加える。２２℃で１時間、インキュベーションを行う。ストレプトアビジン−ＨＲＰでの顕色は、検出抗体を除去することと、３００μｌの１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄することと、その後１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／０．１％ＢＳＡ中で希釈した２０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＨＲＰの溶液を調製することとによって行うものであって、１００Ａｄｄの１００μｌのこの溶液を、２２℃で１時間のインキュベーション前に、各ウェルに加える。
【０１４２】
この検出は、ストレプトアビジン−ＨＲＰを除去することと、３００μｌの１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０での３回の洗浄と、その後１ウェル当たり１００μｌの化学発光基質溶液を加えることとからなる。この基質溶液は、使用の３０分前に、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏキットの２つの溶液を、２０ｍｌ＋２０ｍｌで当量で混合することによって調製し、暗闇中、室温で保存する。暗闇中、室温でのインキュベーションの５分後に、発光を読み取る。
【０１４３】
各条件について、試験は三つ組で行い、各範囲の結果は、プロガストリンの濃度に応じて発光における変化を示すグラフとして表されることとなる。血漿の希釈液毎に、プロガストリンの濃度を、対応する範囲（１／１０番とした範囲は１／１０で希釈されたサンプル）の線形回帰直線の式を用いて決定する。
【０１４４】
方法および結果
卵巣癌（ｎ＝８）を有する患者のプロガストリンの血漿濃度の中央値は、８．４５ｐＭであるのに対し、対照の患者（ｎ＝１０３）のプロガストリンの血漿濃度の中央値は０ｐＭである（図１）。これらのデータは、卵巣癌を有する患者は、彼らの血漿中のプロガストリンの濃度が健常対照の個人と比べて高いということを示している。
【０１４５】
これらのデータは、卵巣癌を有する患者は、彼らの血漿中のプロガストリンのレベルが健常対照の個人と比べて高いということを示している。
【０１４６】
実施例２：モノクローナル抗プロガストリン抗体を用いたプロガストリンの濃度の検出
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳＯＲＰ９６ウェルプレートのウェルを、次のとおり第一のプロガストリン特異性抗体で被覆する。プロガストリンのカルボキシ末端領域に特異的である抗プロガストリンモノクローナル抗体を、５０ｍＭ、ｐＨ９．６の炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウムバッファーのミリＱ水溶液で、３μｇ／ｍｌの濃度に希釈する。
【０１４７】
その後、合計１００μｌの抗体溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えて、４℃で一晩インキュベートした。結合後、抗体溶液をウェルから取り除き、その後ウェルを１００μｌ洗浄バッファー（１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄する。その後、合計１００μｌのブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／０．１％ＢＳＡ）を各ウェルに加えて、２２℃で２時間インキュベートする。その後、ブロッキングバッファーを取り除き、ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄した。その後、患者より単離した血漿または血清サンプルを、典型的には１：１、１：２、１：５および１：１０の希釈液となる希釈系列で、１００μｌの容量でウェルに加え、その後２２℃で２時間インキュベートする。血漿または血清サンプルは、デュプリケートで分析する。
【０１４８】
アッセイはまた、２つの標準曲線を含む。第一の標準曲線は、１ウェル当たり、最終量１ｎｇ、０．５ｎｇ、０．２５ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０５ｎｇ、０．０１ｎｇおよび０ｎｇの組換えプロガストリンの希釈液を用いて作製する。陰性の対照として機能する第二の標準曲線は、試験サンプルと同じ希釈液で、すなわち１：１、１：２、１：５および１：１０で、ブロッキングバッファーで希釈したプロガストリン陰性のヒト血清より作製する。あるいは、血漿サンプルがアッセイされている場合、陰性の対照として機能する第二の曲線は、試験サンプルと同じ希釈液で、すなわち１：１、１：２、１：５および１：１０で、ブロッキングバッファーで希釈したプロガストリン陰性のヒト血漿より作製する。
【０１４９】
血漿または血清サンプルとのインキュベーションの完了後、ウェルの内容物を取り出し、ウェルを１００μｌ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄し、その後、次のように、プロガストリンが第一の抗体に結合したことを、プロガストリンに対して特異的である第二の抗体を用いて検出する。
【０１５０】
プロガストリンのアミノ末端領域に対して特異的であるビオチン結合抗プロガストリンモノクローナル抗体を、抗体に応じて、０．１から１０μｌ  ｇ／ｍｌの濃度にブロッキングバッファーで希釈する。その後、合計１００μｌの抗体溶液を各ウェルに加えて、２２℃で１時間インキュベートした。
【０１５１】
第二の抗体の結合の完了後、プレートを１００μｌ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄し、その後１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液（ブロッキングバッファー中２５ｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに加えて、２２℃で１時間インキュベートする。ストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液とのインキュベーションの完了後、プレートを１００μｌ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄する。その後、Ｐｉｅｒｃｅ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ化学発光基質キットを用いて調製した１００μｌの化学発光基質を、ウェルごとに加えて、暗闇中、室温で５分間インキュベートし、その後ルミノメーターで読み取る。
【０１５２】
ルミノメーターでの記録に基づいて、線形回帰分析を用いて、標準曲線のデータに対応する直線の式を導く。この式を用いて、その後、様々な患者のサンプル中におけるプロガストリンの濃度を算出する。
【０１５３】
卵巣癌を有する患者におけるプロガストリンの血漿濃度の中央値を算出し、対照の患者の血漿中におけるプロガストリンの血漿濃度の中央値と比較する。これらのデータは、卵巣癌を有する患者は、彼らの血漿中におけるプロガストリンのレベルが健常対照の個人と比べて高かったということを示している。
【０１５４】
実施例３：癌細胞株における抗ｈＰＧ抗体の中和活性
３．１．抗ｈＰＧモノクローナル抗体の中和活性
ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３、ＳＷ６２６、ＥＳ−２およびＳＫ−ＯＶ−３は、卵巣癌の研究に通常用いられる細胞株であり、プロガストリンを産生および分泌する。ＰＧに対するモノクローナル抗体は、これら様々な細胞株中での増殖を阻害するそれらの能力に関して試験される。様々な抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて、Ｃａｏｖ−３、ＥＳ−２、ＳＫ−ＯＶ−３、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＡＧＳおよびＭＧＣ−８０３の各細胞株からの細胞の生存が試験される。
【０１５５】
実験毎に、５０，０００個の細胞を、６ウェルプレート内に、ウシ胎児血清含有培地に播種し、８時間インキュベートする。細胞は、一晩血清飢餓状態にし、播種後２４時間で開始するものとし（時間“Ｔ０”）、細胞を、ウシ胎児血清のない状態で、４８時間で１２時間毎に、１〜２０μｇ／ｍｌのモノクローナル対照抗体（モノクローナル抗体の抗ピューロマイシン）（ＣＴ  ｍＡｂ）で、または、１〜２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  ｍＡｂで、六つ組で処理するものであって、前記ｍＡｂは、Ｃ末端の抗ｈＰＧモノクローナル抗体またはＮ末端の抗ｈＰＧモノクローナル抗体である。
【０１５６】
前記ｍＡｂは、Ｃ末端の抗ｈＰＧ抗体であり、
・配列番号２８、２９および３０のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖と、配列番号３１、３２および３３のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖とを含む、抗体
・配列番号３４、３５および３６のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖と、配列番号３７、３８および３９のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖とを含む、抗体
から選択される。
または、Ｎ末端の抗ｈＰＧ抗体であり、
・それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖と、配列番号７、８および９のアミノ酸配列のであるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖とを含む、モノクローナル抗体
・それぞれ配列番号１０、１１および１２のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖と、それぞれ配列番号１３、１４および１５のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖とを含む、抗体
・それぞれ配列番号１６、１７および１８のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖と、それぞれ配列番号１９、２０および２１のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖とを含む、抗体
・それぞれ配列番号２２、２３および２４のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖と、それぞれ配列番号２５、２６および２７のアミノ酸配列であるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖とを含む、抗体
から選択される。
実験毎に、Ｔ０での対照ウェル中の細胞数を計数する。
【０１５７】
具体的には、４８時間目に、対照のウェルと、抗ｈＰＧ  ｍＡｂで処理したウェルとの両方にある生細胞数を計数し、その後、各細胞計数とＴ０で決定した細胞計数との間の差異を算出する。その後、得られた抗ｈＰＧ  ｍＡｂで処理した細胞の数を、対照のｍＡＢで処理した細胞の数の百分率として表す。
【０１５８】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体での処理は、対照の抗体での処理と比べて、細胞数が減少する。統計的有意性は、テューキーのポストホック検定により一元配置ＡＮＯＶＡを用いて決定した：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、および、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。各細胞株において、抗ｈＰＧ抗体が、細胞の生存を減少させる。
【０１５９】
３．２．細胞生存における抗ｈＰＧヒト化抗体の中和活性
ＰＧに対するヒト化抗体は、ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３、ＳＷ６２６、ＥＳ−２およびＳＫ−ＯＶ−３の細胞株の増殖を阻害するそれらの能力に関して試験される。ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３、ＳＷ６２６、ＥＳ−２およびＳＫ−ＯＶ−３の細胞株からの細胞の生存が、様々な抗ｈＰＧヒト化抗体を用いて試験される。
【０１６０】
実験毎に、８０，０００個の細胞を、６ウェルプレート内に、ウシ胎児血清含有培地に播種し、８時間インキュベートする。細胞は、一晩血清飢餓状態にし、播種後２４時間で開始するものとし（時間“Ｔ０”）、細胞は、ウシ胎児血清のない状態で、４８時間で１２時間毎に、２０μｇ／ｍｌのヒト化対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社製、抗ヒトＦｃＧ１）（ＣＴ  Ｈｚ）で、または、２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  Ｈｚ（ＰＧ  Ｈｚ）で、六つ組で処理するものであって、前記Ｈｚは、Ｃ末端の抗ｈＰＧヒト化抗体またはＮ末端の抗ｈＰヒト化抗体である。実験毎に、Ｔ０での対照ウェル中の細胞数を計数する。
【０１６１】
具体的には、４８時間目に、対照ウェルと、抗ｈＰＧ  Ｈｚで処理したウェルとの両方にある生細胞数を計数し、その後、各細胞計数とＴ０で決定した細胞計数との間の差異を算出する。
【０１６２】
抗ｈＰＧ  Ｈｚ抗体での処理は、対照の抗体での処理と比べて、細胞数が減少する。
【０１６３】
３．３．癌幹細胞頻度における抗ｈＰＧモノクローナル抗体の中和活性
ＰＧに対するモノクローナル抗体は、Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｌｉｍｉｔｉｎｇ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＤＡ）を用いて、ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３、ＳＷ６２６、ＥＳ−２およびＳＫ−ＯＶ−３の細胞株における癌幹細胞（ＣＳＣ）の頻度を減少させるそれらの能力が試験される。ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３、ＳＷ６２６、ＥＳ−２およびＳＫ−ＯＶ−３の各細胞株からのＣＳＣ頻度が、様々な抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて試験される。
【０１６４】
実験毎に、細胞は、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメーターを用いて、１ウェル当たり決まった細胞濃度で、超低接着（ＵＬＡ（ultra-low attachment））Ｐ９６（９６ウェルプレート）に播種し、濃度の範囲としては、１ウェル当たり１個から５００個の細胞を用いる。該細胞は、最大１１日間ＵＬＡプレート内でＭ１１培地（Macari et al, Oncogene, 2015）で培養し、１〜２０μｇ／ｍｌのモノクローナル対照抗体（モノクローナル抗体の抗ピューロマイシン）（ＣＴ  ｍＡｂ）で、または、１〜２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  ｍＡｂで、３または４日毎に処理するものであって、前記ｍＡｂは、Ｃ末端の抗ｈＰＧモノクローナル抗体またはＮ末端の抗ｈＰＧモノクローナル抗体である。
【０１６５】
具体的には、インキュベーション段階の最後に、プレートを位相差顕微鏡で観察し、細胞濃度当たりの陽性ウェル数を評価する。最後に、ＥＬＤＡのウェブツール（http://www.bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）を用いて各治療群のＣＳＣ頻度を算出し、群間のあらゆる統計上の差異を試験する（修正カイ二乗検定）。
【０１６６】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体での処理は、対照の抗体での処理と比べて、ＣＳＣ頻度が低下する。
【０１６７】
３．４．癌幹細胞頻度における抗ｈＰＧヒト化抗体の中和活性
・スフィア形成アッセイ
ＰＧに対するヒト化抗体は、スフィア形成アッセイを用いて、Ｃａｏｖ−３、ＥＳ−２およびＳＫ−ＯＶ−３の細胞株における癌幹細胞（ＣＳＣ）頻度を低下させるそれらの能力に関して試験される。
【０１６８】
実験毎に、５００個の細胞を、超低接着（ＵＬＡ）の２４ウェル中に播種する。該細胞は、最大１０日間ＵＬＡプレート内でＭ１１培地（Macari et al, Oncogene, 2015）で培養し、２０μｇ／ｍｌのヒト化対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社製、抗ヒトＦｃＧ１）（ＣＴ  Ｈｚ）で、または、２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  Ｈｚ（ＰＧ  Ｈｚ）で、３または４日毎に処理するものであって、前記Ｈｚは、Ｃ末端の抗ｈＰＧヒト化抗体またはＮ末端の抗ｈＰＧヒト化抗体である。
【０１６９】
具体的には、インキュベーション段階の最後に、ウェルを明視野顕微鏡を介して撮影し、その写真を分析し、平均直径が３０μｍを超えるスフィアを計数する。
【０１７０】
抗ｈＰＧヒト化抗体での処理は、対照の抗体での処理と比べて、ＣＳＣ頻度が低下する。
・Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｌｉｍｉｔｉｎｇ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ
【０１７１】
ＰＧに対するヒト化抗体は、Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｌｉｍｉｔｉｎｇ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＤＡ）を用いて、ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３、ＳＷ６２６およびＳＫ−ＯＶ−３の細胞株における癌幹細胞（ＣＳＣ）頻度を低下させるそれらの能力に関して試験される。ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３、ＳＷ６２６およびＳＫ−ＯＶ−３の各細胞株からのＣＳＣ頻度が、様々な抗ｈＰＧヒト化抗体を用いて試験される。
【０１７２】
実験毎に、細胞は、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメーターを用いて、１ウェル当たり決まった細胞濃度で、超低接着（ＵＬＡ）Ｐ９６（９６ウェルプレート）に播種し、濃度の範囲としては、１ウェル当たり１個から５００個の細胞を用いる。該細胞は、最大１１日間ＵＬＡプレート内でＭ１１培地（Macari et al, Oncogene, 2015）で培養し、１〜２０μｇ／ｍｌのヒト化対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社製、抗ヒトＦｃＧ１）（ＣＴ  Ｈｚ）で、または、１〜２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  Ｈｚで、３または４日毎に処理するものであって、前記Ｈｚは、Ｃ末端の抗ｈＰＧヒト化抗体またはＮ末端の抗ｈＰＧヒト化抗体である。
【０１７３】
具体的には、インキュベーション段階の最後に、プレートを位相差顕微鏡で観察し、細胞濃度当たりの陽性ウェル数を評価する。最後に、ＥＬＤＡのウェブツール（http://www.bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）を用いて各治療群のＣＳＣ頻度を算出し、群間のあらゆる統計上の差異を試験する（修正カイ二乗検定）。
【０１７４】
抗ｈＰＧヒト化抗体での処理は、対照の抗体での処理と比べて、ＣＳＣ頻度が低下する。
【０１７５】
３．５．ＷＮＴ／βカテニン経路上の抗ｈＰＧモノクローナル抗体の中和活性
ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３、ＳＷ６２６、ＥＳ−２およびＳＫ−ＯＶ−３は、卵巣癌の研究に通常用いられる細胞株であり、プロガストリンを産生および分泌する。ＰＧに対するモノクローナル抗体は、読出しとして、周知のＷＮＴ／βカテニン経路の標的遺伝子であるタンパク質サバイビンの発現を用いて、これら様々な細胞株におけるＷＮＴ／βカテニン経路を阻害するそれらの能力に関して試験される。ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３、ＳＷ６２６、ＥＳ−２およびＳＫ−ＯＶ−３の各細胞株からのサバインビンの発現が、様々な抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて試験される。
【０１７６】
実験毎に、５０，０００個の細胞を、６ウェルプレート内に、ウシ胎児血清含有培地に播種し、８時間インキュベートする。細胞は、一晩血清飢餓状態にし、播種後２４時間で開始し、細胞を、ウシ胎児血清のない状態で、７２時間で１２時間毎に、１〜２０μｇ／ｍｌのモノクローナル対照抗体（モノクローナル抗体の抗ピューロマイシン）（ＣＴ  ｍＡｂ）で、または、１〜２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  ｍＡｂで、四つ組で処理するものであって、前記ｍＡｂは、Ｃ末端の抗ｈＰＧモノクローナル抗体またはＮ末端の抗ｈＰＧモノクローナル抗体である。
【０１７７】
具体的には、処理の７２時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡバッファーを用いて全タンパク質を抽出する。その後、ＣＴ  ｍＡｂでまたは抗ｈＰＧ  ｍＡｂで処理した細胞からの同量のタンパク質を、抗サバイビン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、モノクローナル抗体、＃２８０２）およびローディングコントロールとしての抗アクチン抗体（シグマ社製、モノクローナル抗体、＃Ａ４７００）を用いたウエスタンブロットに供する。Ｓｙｎｇｅｎｅ社製、ＧＢＯＸ  ｃｈｅｍｉ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、定量する。
【０１７８】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体での処理は、対照の抗体での処理と比べて、サバイビンの発現が低減する。統計的有意性は、独立スチューデントｔ検定を用いて決定される：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、および＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【０１７９】
３．６．ＷＮＴ／βカテニン経路上の抗ｈＰＧヒト化抗体の中和活性
ＰＧに対するヒト化抗体は、読出しとして、周知のＷＮＴ／βカテニン経路標的遺伝子であるタンパク質サバイビンの発現を用いて、ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３、ＳＷ６２６、ＥＳ−２およびＳＫ−ＯＶ−３の細胞株におけるＷＮＴ／βカテニン経路を阻害するそれらの能力に関して試験される。ＰＡ−１、Ｃａｏｖ−３、ＳＷ６２６、ＥＳ−２およびＳＫ−ＯＶ−３の各細胞株からのサバイビンの発現が、様々な抗ｈＰＧヒト化抗体を用いて試験される。
【０１８０】
実験毎に、５０，０００個の細胞を、６ウェルプレート内に、ウシ胎児血清含有培地に播種し、８時間インキュベートする。細胞は、一晩血清飢餓状態にし、播種後２４時間で開始し、細胞を、ウシ胎児血清のない状態で、７２時間で１２時間毎に、１〜２０μｇ／ｍｌのヒト化対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社製、抗ヒトＦｃＧ１）（ＣＴ  Ｈｚ）で、または、１〜２０μｇ／ｍｌの抗ｈＰＧ  Ｈｚで、四つ組で処理するものであって、前記Ｈｚは、Ｃ末端の抗ｈＰＧヒト化抗体またはＮ末端の抗ｈＰヒト化抗体である。
【０１８１】
具体的には、処理の７２時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡバッファーを用いて全タンパク質を抽出する。その後、ＣＴ  Ｈｚでまたは抗ｈＰＧ  Ｈｚで処理した細胞からの同量のタンパク質を、抗サバイビン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、モノクローナル抗体、＃２８０２）およびローディングコントロールとしての抗アクチン抗体（シグマ社製、モノクローナル抗体、＃Ａ４７００）を用いたウエスタンブロットに供する。Ｓｙｎｇｅｎｅ社製、ＧＢＯＸ  ｃｈｅｍｉ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、定量する。
【０１８２】
抗ｈＰＧヒト化抗体での処理は、対照の抗体での処理と比べて、サバイビンの発現が低減する。統計的有意性は、独立スチューデントｔ検定を用いて決定される：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、および＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図１】
2019502923.tif 000009
【図２】
2019502923.tif 000010
【図３】
2019502923.tif 000011
【配列表】
2019502923000001.app
【国際調査報告】
2019502923.tif 000012
2019502923.tif 000013
2019502923.tif 000014