(57)【要約】本明細書に記載される実施形態は、組成物、基質、キット、包帯材料、および物品を含む創傷、例えば、慢性創傷または感染性創傷の検出のための化合物、ならびにそのような化合物を含有するシステムに関する。さらなる実施形態は、組成物中に含有される特異的基質の酵素的変換に基づく、診断アッセイにおいて、かつ慢性創傷もしくは感染性創傷の診断および／もしくは検出において、これらの組成物、キットおよびシステムを使用する方法に関する。さらなる実施形態は、複数のマーカーの発現に基づいて創傷を特徴付け、かつ慢性創傷または感染性創傷を罹患している患者を治療、管理、および追跡するためにそのような情報を使用する方法に関する。【選択図】図１４
2019509853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、
【化１】
2019509853.tif 000075
式Ｉ
式中、
Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、
Ｒが、レポーター分子であり、
Ｌが、存在しないかまたは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＲとを繋ぐ、創傷包帯対材料。
【請求項２】
前記Ｌが、存在しない、請求項１に記載の創傷包帯材料。
【請求項３】
前記Ｍが、Ｒと共有結合的または非共有結合的に接合している、請求項２に記載の創傷包帯材料。
【請求項４】
Ｌが、存在する、請求項１に記載の創傷包帯材料。
【請求項５】
前記リンカーＬが、互いに独立して、ＭおよびＲと共有結合的または非共有結合的に接合している、請求項４に記載の創傷包帯材料。
【請求項６】
前記レポーターが、酵素基質を含む、請求項１に記載の創傷包帯材料。
【請求項７】
前記酵素基質が、糖、多糖類、核酸、アミド、ペプチド、プロテイン、脂質、またはそれらの誘導体もしくはそれらの組み合わせである、請求項６に記載の創傷包帯材料。
【請求項８】
前記酵素基質が、糖、多糖類、アミド、ペプチド、プロテイン、またはそれらの誘導体もしくはそれらの組み合わせである、請求項７に記載の創傷包帯材料。
【請求項９】
前記ゲル形成ポリマーが、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ペクチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、多糖類、もしくはガム由来ポリマー、またはそれらの誘導体、あるいはそれらの任意の混合物もしくは組み合わせから選択される、請求項１に記載の創傷包帯材料。
【請求項１０】
前記ゲル形成ポリマーが、カルボキシメチルセルロースまたはその塩である、請求項９に記載の創傷包帯材料。
【請求項１１】
前記ゲル形成ポリマーが、約２００〜約４０００個のモノマー単位を含む、請求項９に記載の創傷包帯材料。
【請求項１２】
前記ゲル形成ポリマーが、約５００〜約２０００個のモノマー単位を含む、請求項１１に記載の創傷包帯材料。
【請求項１３】
Ｌが、エトキシル化多価アルコール、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはそれらのエーテル、アミド、もしくはエステルである中性ポリマーを含む、請求項１に記載の創傷包帯材料。
【請求項１４】
Ｌが、エトキシル化多価アルコール、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはそれらのエーテル、アミド、もしくはエステルの２〜１０個のモノマー単位を含む中性ポリマーである、請求項１３に記載の創傷包帯材料。
【請求項１５】
Ｌが、少なくとも１つのポリプロピレングリコール亜単位を含む、請求項１３に記載の創傷包帯材料。
【請求項１６】
前記レポーター分子が、検出可能な標識を含む、請求項１に記載の創傷包帯材料。
【請求項１７】
前記検出可能な標識が、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、蛍光消光剤、脂質、着色分子、放射性同位体、シンチラント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、および酵素からなる群から選択される、請求項１６に記載の創傷包帯材料。
【請求項１８】
前記レポーター分子が、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｃｙ−７、テキサスレッド、ファーレッド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フルオレセインアミン、エオシン、ダンシル、ウンベリフェロン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、ｒ−アミノ−Ｎ−（３−ビニルスルホニル）フェニルナフタルイミド−３，５、ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（クマリン１５１）、シアノシン、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリンジエチレントリアミンペンタアセタート、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアネート、エチジウム、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、フルオレサミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリスリン、ｏ−フタルジアルデヒド、ピレン、酪酸ピレン、スクシンイミジル１−酪酸ピレン、リアクティブレッド４、リサミンローダミンＢスルホニルクロライド、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸ、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体、テトラメチルローダミン、リボフラビン、ロゾール酸、およびテルビウムキレート誘導体からなる群から選択される蛍光分子を含む、請求項１５に記載の創傷包帯材料。
【請求項１９】
前記レポーターが、検出可能な標識および消光剤分子を含む、請求項１６に記載の創傷包帯材料。
【請求項２０】
前記消光剤分子を含む前記レポーターが、酵素またはその生成物によって活性化される、請求項１９に記載の創傷包帯材料。
【請求項２１】
前記レポーター分子またはその一部分が、酵素との相互作用の際に放出される、請求項１６に記載の創傷包帯材料。
【請求項２２】
前記レポーターが、創傷特異的酵素に特異的な基質を含む、請求項１６に記載の創傷包帯材料。
【請求項２３】
前記創傷特異的酵素が、プロテアーゼである、請求項２２に記載の創傷包帯材料。
【請求項２４】
前記レポーターが、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストメリシン１）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、カテプシンＧ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、およびリゾチームからなる群から選択される創傷特異的酵素に特異的な基質を含む、請求項２２に記載の創傷包帯材料。
【請求項２５】
前記レポーターが、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９またはそれらの組み合わせに特異的な基質を含む、請求項２４に記載の創傷包帯材料。
【請求項２６】
請求項１に記載の包帯材料を含み、かつ担体をさらに含む、組成物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組成物を含む薬学的組成物であって、前記担体が、薬学的に許容される担体である、薬学的組成物。
【請求項２８】
抗生物質化合物または創傷治癒ペプチドをさらに含む、請求項２７に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記抗生物質が、β−ラクタム、フルオロキノロン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、グリシルサイクリン、およびポリミキシンからなる群から選択される、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記創傷治癒ペプチドが、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）または血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
創傷の状態を診断する方法であって、
前記創傷を請求項１に記載の創傷包帯材料と接触させて、前記レポーター分子の検出可能な信号への変換を可能にするステップと、
信号を検出するステップと、を含む、方法。
【請求項３２】
前記レポーター分子の検出可能な信号への変換が、創傷特異的プロテアーゼによって実行される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記創傷特異的プロテアーゼが、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストメリシン１）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、カテプシンＧ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、およびリゾチームからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
慢性創傷または感染性創傷の存在または非存在を判定するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
慢性創傷または感染性創傷の存在または非存在を判定する前記ステップが、前記創傷におけるパラメータを測定するステップと、前記測定されたパラメータを閾値レベルと比較するステップと、前記創傷における前記パラメータのレベルが前記閾値レベルよりも高い場合、前記創傷が、慢性もしくは感染性であると判定するステップと、を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記パラメータが、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストメリシン１）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、カテプシンＧ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、およびリゾチームからなる群から選択される創傷特異的プロテアーゼの量または活性である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
慢性創傷もしくは感染性創傷を治療する方法であって、請求項１に記載の包帯材料を前記対象に投与することを含み、前記包帯材料が、前記創傷に局所的もしくは経皮的に適用される、方法。
【請求項３８】
Ｌが、存在せず、前記ゲル形成ポリマーＭをレポーター領域Ｒに接合させて、それにより式Ｍ−Ｒの化合物を生成することを含み、ＭおよびＲが、各々個々に、請求項１に記載されるとおりである、請求項１に記載の式Ｉの化合物を作製する方法。
【請求項３９】
Ｌが、存在し、前記ゲル形成ポリマーＭをリンカーＬに接合させて、それにより前駆体化合物Ｍ−Ｌを生成することと、前記前駆体化合物Ｍ−Ｌをレポーター領域Ｒに接合させて、それにより式Ｍ−Ｌ−Ｒの化合物を生成することと、を含み、Ｍ、Ｌ、およびＲが、各々個々に、請求項１に記載されるとおりである、請求項１に記載の式Ｉの前記化合物を作製する方法。
【請求項４０】
Ｌが、存在し、前記リンカーＬをレポーター領域Ｒに接合させて、それにより前駆体化合物Ｌ−Ｒを生成することと、前記前駆体化合物Ｌ−Ｒをゲル形成ポリマーＭに接合させて、それにより式Ｍ−Ｌ−Ｒの化合物を生成することと、を含み、Ｍ、Ｌ、およびＲが、各々個々に、請求項１に記載されるとおりである、請求項１に記載の式Ｉの前記化合物を作製する方法。
【請求項４１】
以下、
【化２】
2019509853.tif 000076
、
【化３】
2019509853.tif 000077
、
【化４】
2019509853.tif 000078
、
【化５】
2019509853.tif 000079
、
【化６】
2019509853.tif 000080
、
【化７】
2019509853.tif 000081
、
【化８】
2019509853.tif 000082
、
【化９】
2019509853.tif 000083
、
【化１０】
2019509853.tif 000084
、
【化１１】
2019509853.tif 000085
、
【化１２】
2019509853.tif 000086
、
【化１３】
2019509853.tif 000087
からなる群から選択される創傷包帯材料であって、ｎ＝２００〜４０００である、創傷包帯材料。
【請求項４２】
式ＩＩの化合物を含む創傷包帯材料であって、
【化１４】
2019509853.tif 000088
式ＩＩ
式中、
Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、
ＰＥＰが、ペプチドおよび少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｌが、存在しないかまたは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＰＥＰとを繋ぐ、創傷包帯材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月３０日に出願された、米国仮特許出願第６２／３１５，５６７号の利益を主張するものであり、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす。
【０００２】
本明細書に記載される実施形態は、概して、創傷治癒に関し、具体的には、創傷の検出および治療のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物において、皮膚損傷は、治癒した創傷を生じる細胞性事象および生化学的事象の構成された複雑なカスケードを誘発する。創傷治癒は、複雑な動的過程であり、解剖学的連続性および機能の回復をもたらし、理想的に治癒した創傷は、正常な解剖学的構造、機能、および外観に戻った創傷である。典型的な創傷は、「滲出性」期、増殖期、修復期、および上皮成熟（Ｈａｔｚら、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｏｕｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｍｕｎｉｃｈ、１９９４）、または止血期、炎症期、増殖期、および再構成期（Ｎｗｏｍｅｈら、Ｃｌｉｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．１９９８、２５、３４１）の４つの段階からなるモデルを介して治癒する。
【０００４】
残念なことに、慢性創傷および「感染性」創傷は、典型的には、治癒が困難である。慢性創傷には、例えば、静脈脚潰瘍、糖尿病性足潰瘍、および褥瘡が含まれる（Ｋｒａｓｎｅｒら、Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ：Ａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｓ、ＨＭＰ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００１）。慢性創傷を有する患者は、多大な注意を必要とし、創傷は、生活の質の低下につながることが多く、慢性創傷は、一部の患者が残りの人生にわたって対処しなければならない問題となり得る。患者の同時罹患率はまた、創傷治癒過程に有意な影響を及ぼし、その過程を制限し、さらには停止させ、ならびに生活の質の低下に寄与する因子となり得る。治癒が困難な創傷につながり得る因子には、病態生理学的問題、微生物による感染、非生存組織の存在、組織灌流不良、慢性炎症状態、および糖尿病等の他の根底にある状態が含まれる（Ｂｏｗｌｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００２、３４、４１９−４２７）。
【０００５】
多くの場合、慢性創傷は、細菌叢ならびに／または真菌およびウイルス等の病原体によってコロニー形成され、その場合、それらが感染する可能性がある。細菌による創傷の感染は、細菌が酵素および毒素を生成し、また創傷の治癒に必須の活性を有するマクロファージおよび線維芽細胞と栄養素および酸素を競合するので、治癒過程を遅延させる。したがって、感染は、侵入した細菌に有利な宿主／細菌平衡の乱れの徴候である。これは、全身敗血症反応を誘発し、また、創傷治癒に関与する複数の過程を阻害する。治癒の顆粒化期は、感染が沈静化した後にのみ開始されるだろう。
【０００６】
炎症期は、創傷治癒過程にとって特に重要であり、創傷部位における生化学反応は、治癒を促進するが、過剰プロテアーゼの生成による組織破壊も引き起こす。プロテアーゼは死んだ組織を破壊する上で重要な役割を果たすが、過剰では、生存組織に有害な影響も与え、さらなる炎症を引き起こす。
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、エラスターゼ、およびカテプシンＧ等のこれらのプロテイン分解酵素の放出は、好中球の過剰な刺激に関連することが多い。
【０００７】
プロテアーゼ活性の上昇は、創傷修復の遅延に関与しているようであり、創傷感染を予測する可能性がある。例えば、細胞によって分泌された細胞外分子の集合体である細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、周囲細胞に対する構造的かつ生化学的な支持を提供し、過剰プロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ）活性により創傷部位で頻繁に枯渇し、フィブリノーゲンレベルの減衰により付随的に枯渇する。プロテアーゼ活性の増加はまた、成長因子の分解をもたらし、よって、治癒過程を阻害する。したがって、感染および他の問題は、慢性創傷において悪化し、創傷は、治療することが困難なままである（Ｙａｇｅｒら、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ  １９９７、５、２３−３２；Ｗｉｄｇｅｒｏｗら、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ  ２０１１、１９、２８７−２９１）。
【０００８】
創傷を評価する現在の方法は、医師の訓練および経験に依存する。創傷は、視覚的に評価される可能性があり、長さおよび深さの測定が行われ、デジタル写真は、創傷の視覚的状態およびサイズを追跡するために利用可能な場合に使用され得る（Ｋｒａｓｎｅｒら、上記）。臨床診療では、感染の診断は、局所的な痛み、熱、腫脹、排出、および赤みの存在等の間接的なパラメータに基づいている。炎症および排出等のこれらの臨床指標の多くは、創傷における感染の予測価値が低い。病院検査室での微生物学検査に続く創傷のスワブは、正しい抗生物質治療を処方するために、細菌のコロニー形成および菌株の同定を確認するための選択肢である。しかしながら、この過程は、時間がかかり、労働集約的である。感染の診断の遅延は、抗生物質の投与を遅延させる可能性があり、敗血症発症のリスクを高める可能性がある。
【０００９】
さらに、創傷治癒の測定のための客観的な技術は、ほとんどない。治癒創傷内の液体と比較した場合、ＭＭＰプロテアーゼレベルおよび活性が、慢性創傷の液体中に存在するという報告があるが（Ｌｉｕら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２００９、３２、１１７−１１９；Ｂｕｌｌｅｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９５、１０４、２３６−２４０）、これらの報告は、創傷が慢性になる限界を示唆していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
よって、感度の高い特定の試薬および／またはキットを、科学的研究のために、また臨床応用において、例えば、そのような創傷によって特徴付けられる疾患、例えば、静脈性潰瘍、褥瘡褥瘡、および糖尿病性潰瘍の効率的かつ正確な診断および治療において、使用することを含む、ヒトおよび動物の対象内の慢性創傷および感染性創傷を同定するための、そのような特定の試薬、キット、およびアッセイ技術に対する、差し迫っているが満たされていない必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書に開示される技術は、感染性創傷および／または慢性創傷を検出する組成物および方法を提供する。開示される技術は、感染性創傷の検出の感度、精度、および特異性を高めることと、定性的および定量的測定の能力を提供することと、感染性創傷の検出速度をその場で、かつ実時間で増加させることと、によって既存のアッセイを改善する。本明細書に記載されるアッセイおよび方法は、感染性創傷もしくは慢性創傷内に存在するバイオマーカーおよび／もしくはプローブを検出する特異的試薬の使用に部分的に基づいている。検出過程は、感染性創傷内に存在するが、非感染性創傷もしくは非慢性創傷ではないマーカーに特異的な試薬の使用を伴い得、検出ステップは、プローブがマーカーによって作用される場合に生成される信号（複数可）の定性的測定もしくは定量的測定を伴い得る。検出方法が創傷内に存在する酵素の検出を伴う実施形態では、プローブは、好ましくは、任意選択的に増幅され得る信号を生成する酵素に特異的な修飾酵素基質を含む。これにより、検出の効率および特異性が大幅に改善される。さらに、１つ以上の標的、例えば、創傷に特異的な酵素に各々特異的な複数の検出プローブを用いてもよい。これは、偽陽性（例えば、非特異的相互作用および／または標的冗長性による）の発生を最小にしながら、診断アッセイの効率および正確性の両方を最大にするのに大いに役立つ。さらに、本明細書中に開示される実験結果は、新規プローブおよびそれらに基づくアッセイ技術が、様々な種類の創傷を検出および特徴付けることができることを確認している。最後に、開示される技術の試薬は、慢性創傷の治療および管理を観察および評価するために、抗生物質、抗真菌剤等の治療分子と共に使用され得る。
【００１２】
一実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、存在しないかまたは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＲとを繋ぐ、創傷包帯材料を本明細書に提供する。
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｒを含む化合物であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子である、化合物を本明細書に提供する。
【００１３】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｒを含む化合物であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｍが、Ｒと共有結合的または非共有結合的に接合している、化合物を本明細書に提供する。
【００１４】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、互いに独立してＭおよびＲと共有結合的または非共有結合的に接合しているリンカーである、創傷包帯材料を本明細書に提供する。
【００１５】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、リンカーであり、レポーターＲが、酵素基質を含む、化合物を本明細書に提供する。
【００１６】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、リンカーであり、レポーターＲが、糖、多糖類、核酸、アミド、ペプチド、プロテイン、脂質、またはそれらの誘導体もしくはそれらの組み合わせである酵素基質を含む、創傷包帯材料を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、基質は、糖、多糖類、アミド、ペプチド、もしくはプロテイン、またはそれらの誘導体である。特にこの実施形態の下では、基質は、アミノ酸または複数のアミノ酸を含むペプチドを含むペプチド基質（ＰＥＰ）である。
【００１７】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、存在しないかもしくは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＲとを繋ぎ、Ｍが、セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ペクチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、多糖類、もしくはガム由来ポリマー、またはそれらの誘導体、あるいはそれらの任意の混合物もしくは組み合わせから選択される、創傷包帯材料を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、ポリマーは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）またはその塩である。
【００１８】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、存在しないかまたは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＲとを繋ぎ、Ｍが、約２００〜約４０００個のモノマー単位を含む、創傷包帯材料を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、Ｍは、約５００〜約２０００個のモノマー単位を含む。
【００１９】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、存在しないかもしくは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＲとを繋ぎ、Ｌが、エトキシル化多価アルコール、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはそれらのエーテル、アミド、もしくはエステルである、モノマーもしくは中性ポリマーを含む、創傷包帯材料を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、Ｌは、エトキシル化多価アルコール、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、またはそれらのエーテル、アミド、もしくはエステルの１〜１０個のモノマー単位を含む。より具体的には、この実施形態の下では、Ｌは、少なくとも１つのポリプロピレングリコール亜単位を含む。
【００２０】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、存在しないかまたは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＲとを繋ぎ、Ｒが、検出可能な標識を含む、創傷包帯材料を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、検出可能な標識は、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、蛍光消光剤、脂質、着色分子、放射性同位体、シンチラント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、および酵素からなる群から選択される。
【００２１】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、存在しないかまたは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＲとを繋ぎ、Ｒが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｃｙ−７、テキサスレッド、ファーレッド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フルオレセインアミン、エオシン、ダンシル、ウンベリフェロン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシルフルオレセイン（ＪＯＥ）、６  カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、ｒ−アミノ−Ｎ−（３−ビニルスルホニル）フェニルナフタルイミド−３，５、ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（クマリン１５１）、シアノシン、４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’、５’’−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（プロムピロガロールレッド）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリンジエチレントリアミンペンタアセテート、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアネート、エチジウム、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、フルオレサミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、ｏ−フタルジアルデヒド、ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート、リアクティブレッド４、リサミンローダミンＢスルホニルクロライド、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸ、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロライド誘導体、テトラメチルローダミン、リボフラビン、ロゾール酸、およびテルビウムキレート誘導体からなる群から選択される、蛍光分子を含む、創傷包帯材料を本明細書に記載する。
【００２２】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、存在しないかまたは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＲとを繋ぎ、Ｒが、検出可能な標識および消光剤分子を含む、創傷包帯材料を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、消光剤分子を含むレポーターは、酵素またはその生成物によって活性化される。
【００２３】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、存在しないかもしくは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＲとを繋ぎ、レポーター分子もしくはその一部分が、酵素との相互作用の際に放出される、創傷包帯材料を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、レポーター分子は、酵素との相互作用の際に放出される検出可能な標識を含む。
【００２４】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、存在しないかまたは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＲとを繋ぎ、レポーター分子が、酵素によって作用されると生成物を形成する創傷特異的酵素に特異的な基質を含む、創傷包帯材料を本明細書に記載する。特にこの実施形態の下では、創傷特異的酵素は、プロテアーゼである。より具体的には、この実施形態の下では、レポーターは、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストメリシン１）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、カテプシンＧ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、およびリゾチームからなる群から選択される創傷特異的酵素に特異的な基質を含む。特にこの実施形態の下では、レポーターは、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９またはそれらの組み合わせに特異的な基質を含む。
【００２５】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を含む担体および創傷包帯材料を含む組成物であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、Ｒが、レポーター分子であり、Ｌが、存在しないかまたは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＲとを繋ぐ、組成物を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、組成物は、薬学的組成物である。より具体的には、この実施形態の下では、薬学的組成物は、抗生物質化合物または創傷治癒ペプチドを含む。特にこの実施形態の下では、抗生物質は、β−ラクタム、フルオロキノロン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、グリシルサイクリン、およびポリミキシンからなる群から選択され、かつ／または創傷治癒ペプチドは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）もしくは血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）である。
【００２６】
別の実施形態では、本明細書の上に記載されるような創傷包帯材料を含む物品を含む組成物を提供する。
【００２７】
別の実施形態では、本明細書で提供されるものは、診断を必要とする対象における創傷の状態を診断する方法であって、本明細書の上に記載されるような創傷包帯材料に創傷を接触させて、レポーター分子の検出可能な信号への変換を可能にすることと、信号を検出することと、を含む、方法を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、レポーター分子の検出可能な信号への変換は、創傷特異的プロテアーゼ、例えば、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストメリシン１）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、カテプシンＧ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、およびリゾチームによって実行される。特にこの実施形態の下では、本方法は、慢性創傷または感染性創傷を診断することを含む。
【００２８】
別の実施形態では、診断を必要とする対象における創傷の状態を診断する方法であって、本明細書の上に記載されるような創傷包帯材料に創傷を接触させて、レポーター分子の検出可能な信号への変換を可能にすることと、創傷内の創傷特異的酵素の活性もしくはレベルであるパラメータを評価することと、パラメータを閾値レベルと比較することと、創傷内のパラメータのレベルが閾値レベルよりも高い場合、創傷が慢性もしくは感染性であると判定することと、を含む、方法を本明細書に記載する。この実施形態では、パラメータは、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストメリシン１）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、カテプシンＧ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、およびリゾチームからなる群から選択される創傷特異的プロテアーゼの量または活性である。特にこの実施形態の下では、診断方法は、その場で実施される。
【００２９】
別の実施形態では、治療を必要とする対象における創傷を治療する方法であって、本明細書の上に記載されるような創傷包帯材料に創傷を接触させることを含む、方法を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、包帯材料は、創傷の部位に局所的または経皮的に適用される。
【００３０】
別の実施形態では、前述による式Ｉの化合物を作製するための方法であって、Ｌが、存在せず、ゲル形成ポリマーＭをレポーター領域Ｒに接合することを含み、ＭおよびＲが、各々個々に、先に記載されるとおりである、方法を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、ゲル形成ポリマーＭは、ペプチド結合、グリコシド結合、エステル結合、オキシエステル結合、アミデ結合、アミド結合、オキシアミド結合、エーテル結合、スルホニル結合、スルフィニル結合、スルホンアミド結合、アルコキシ結合、アルキルチオ結合、アルキルアミノ結合、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される共有結合を介してレポーター領域Ｒに接合している。特にこの実施形態の下では、ゲル形成ポリマーＭは、グリコシド結合またはペプチド結合を介してレポーター領域Ｒに接合している。
【００３１】
別の実施形態では、前述による式Ｉの化合物を作製するための方法であって、Ｌが、存在し、ゲル形成ポリマーＭをリンカーＬに接合して、前駆体分子Ｍ−Ｌを生成することと、前駆体分子Ｍ−Ｌをレポーター領域Ｒに接合することと、を含み、Ｍ、Ｌ、およびＲが、各々個々に、先に記載されるとおりである、方法を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、ゲル形成ポリマーＭは、リンカーＬに接合し、かつ／またはリンカーＬは、エステル結合、オキシエステル結合、アミデ結合、アミド結合、オキシアミド結合、エーテル結合、スルホニル結合、スルフィニル結合、スルホンアミド結合、アルコキシ結合、アルキルチオ結合、アルキルアミノ結合、またはそれらの組み合わせから選択される共有結合を介してレポーター領域Ｒに接合する。
【００３２】
別の実施形態では、前述による式Ｉの化合物を作製するための方法であって、Ｌが、存在し、リンカーＬをレポーターＲに接合して、前駆体分子Ｌ−Ｒを生成することと、前駆体分子Ｌ−Ｒをゲル形成ポリマーＭに接合することと、を含み、Ｍ、Ｌ、およびＲが、各々個々に、先に記載されるとおりである、方法を本明細書に提供する。特にこの実施形態の下では、ゲル形成ポリマーＭは、リンカーＬに接合し、かつ／またはリンカーＬは、エステル結合、オキシエステル結合、アミデ結合、アミド結合、オキシアミド結合、エーテル結合、スルホニル結合、スルフィニル結合、スルホンアミド結合、アルコキシ結合、アルキルチオ結合、アルキルアミノ結合、またはそれらの組み合わせから選択される共有結合を介してレポーター領域Ｒに接合する。
【００３３】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−ＰＥＰ（式ＩＩ）を含む化合物を含む創傷包帯材料であって、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、ＰＥＰが、ペプチドおよび少なくとも１つのアミノ酸であり、Ｌが、存在しないかまたは存在するかのいずれかのリンカーであり、Ｌは、存在する場合、ＭとＰＥＰとを繋ぐ、創傷包帯材料を本明細書に提供する。
【００３４】
別の実施形態では、以下、
【化１】
2019509853.tif 000003
、
【化２】
2019509853.tif 000004
、
【化３】
2019509853.tif 000005
、
【化４】
2019509853.tif 000006
、
【化５】
2019509853.tif 000007
、
【化６】
2019509853.tif 000008
、
【化７】
2019509853.tif 000009
、
【化８】
2019509853.tif 000010
、
【化９】
2019509853.tif 000011
、
【化１０】
2019509853.tif 000012
、
【化１１】
2019509853.tif 000013
、
【化１２】
2019509853.tif 000014
からなる群から選択され、
ｎ＝２００〜４０００である、創傷包帯材料を本明細書に提供する。
【００３５】
本主題技術の他の実施形態および構成は、以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろうが、本主題技術の様々な構成が、実施例または例証として示され、かつ記載されることが理解される。実現されるように、本主題技術は、他の異なる構成が可能であり、それらのいくつかの詳細は、全て本主題技術の範囲から逸脱することなく、様々な他の点において変更可能である。したがって、図面および詳細な説明は、本質的に例証的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
本開示を理解するために、本開示の実施形態および実施例が例証され、以下の説明と共に、本開示の原理を説明するのに役立つ添付の図面を参照して、実施例によってこれより説明されるだろう。
【００３７】
【図１】蛍光に基づく研究を使用したポリマー１２の酵素効力の定量化を示す。
【図２】図１の蛍光に基づく研究において使用されるポリマー１２サンプルの画像を示す。
【図２Ａ】周囲光の下で見られるようなサンプルを示す。
【図２Ｂ】ＵＶ光の下で見られるようなサンプルを示す。
【図２Ｃ】個々のサンプルの標識化を示す。
【図３】蛍光に基づく研究：ＰＢＳ浸漬期間後の溶出液を使用したポリマー１７（ＰＢＳにより前処理された）の酵素効力の定量化を示す。
【図４】蛍光に基づく研究：最初のＰＢＳ浸漬期間後にＰＢＳに再懸濁された固体を使用したポリマー１７（ＰＢＳにより前処置された）の酵素効力の定量化を示す。
【図５】患者Ａ、Ｆ、およびＧ由来の細胞株に対するスクラッチモデル試験中の平均閉鎖時間（エラーバーはＳＤを示す）を示す。赤いバーは、サンプルを繊維の形態で強調表示し、青色のバーは、粉末形態でのサンプルを表す。
【図６】１２、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２粉末、患者Ａ、０．０６６ｍｇ／ｍＬスクラッチアッセイについての共焦点顕微鏡写真を示す。赤い点線は、スクラッチ領域を表し、線維芽細胞の増殖は、Ｔ＝１ｈ（チャネル内に細胞が存在しない）とＴ＝６８ｈ（細胞がチャネルを充填している）との間で観察され得る。
【図６Ａ】１時間で観察される線維芽細胞の増殖を示す。
【図６Ｂ】３０時間で観察される線維芽細胞の増殖を示す。
【図６Ｃ】５０時間で観察される線維芽細胞の増殖を示す。
【図６Ｄ】６８時間で観察される線維芽細胞の増殖を示す。
【図７】１２、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２粉末、患者Ａ、０．６６ｍｇ／ｍＬスクラッチアッセイについての共焦点顕微鏡写真を示す。赤い点線は、スクラッチ領域を表し、線維芽細胞の増殖は、Ｔ＝１ｈ（チャネル内に細胞が存在しない）とＴ＝６８ｈ（細胞がチャネルを充填している）との間で観察され得る。
【図７Ａ】１時間で観察される線維芽細胞の増殖を示す。
【図７Ｂ】３０時間で観察される線維芽細胞の増殖を示す。
【図７Ｃ】５０時間で観察される線維芽細胞の増殖を示す。
【図７Ｄ】６８時間で観察される線維芽細胞の増殖を示す。
【図８】コラーゲンマトリックスモデルによる研究の結果を示し、プロットは、７日間にわたる格子径を示す−患者Ａ。
【図９】コラーゲンマトリックスモデルによる研究の結果を示し、プロットは、７日間にわたる格子径を示す−患者Ｆ。
【図１０】コラーゲンマトリックスモデルによる研究の結果を示し、プロットは、７日間にわたる格子径を示す−患者Ｇ。
【図１１】コラーゲンマトリックスモデルによる研究の結果を示し、写真は、３日目および７日目の格子径における差を示す−患者Ａ。
【図１２】コラーゲンマトリックスモデルによる研究の結果を示し、写真は、３日目および７日目の格子径における差を示す−患者Ｆ。
【図１３】コラーゲンマトリックスモデルによる研究の結果を示し、写真は、３日目および７日目の格子径における差を示す−患者Ｇ。
【図１４】プロテアーゼの検出のための可能性のあるペプチド修飾ＣＭＣおよびＬＣシステムについての概略図を示し、（ａ）は、ホモトロピックＬＣ整列（交差偏光レンズの下で見ると暗い）を示す最初のシステム設定を示し、（ｂ）は、進行中の脂質を放出するペプチドの切断を示し、（ｃ）は、ＬＣと接触する切断された脂質を示し、平面ＬＣ再整列を開始する（交差偏光レンズの下で見ると着色されている）。
【図１５】ＣＭＣゲルの適用時の液晶４’−ｎ−ペンチル−４−シアノ−ビフェニル（５ＣＢ）充填ＴＥＭ（透過電子顕微鏡法）グリッドを示す顕微鏡写真を示す。
【図１５Ａ】ＣＭＣヒドロゲル−ホメオトロピックＬＣ整列の適用前の５ＣＢ充填ＴＥＭグリッドを示す。
【図１５Ｂ】Ｔ＝０でのＣＭＣヒドロゲルの適用後の５ＣＢ充填ＴＥＭグリッド、平面ＬＣ整列への変化を示す。
【図１５Ｃ】Ｔ＝２分でのＣＭＣヒドロゲルの適用後（平面ＬＣ整列）（左パネル）およびＴ＝５分でのＣＭＣヒドロゲルの適用後（平面ＬＣ整列）（右パネル）の５ＣＢ充填ＴＥＭグリッドを示す。
【図１５Ｄ】Ｔ＝１０分でのＣＭＣヒドロゲルの適用後（平面ＬＣ整列が保持されている）（左パネル）およびＴ＝９０分でのＣＭＣヒドロゲルの適用後（平面ＬＣ整列が保持されている）（右パネル）の５ＣＢ充填ＴＥＭグリッドを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、様々な態様を、より詳細にこれより説明しよう。しかしながら、そのような態様は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載される実施形態に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が十分かつ完全であり、それらの範囲を当業者に完全に伝達するように提供されている。
【００３９】
この開示全体を通して、様々な特許、特許出願、および刊行物を参照している。これらの特許、特許出願、および刊行物の開示は、それらの全体において、本開示の日付現在のその当業者に知られているような先行技術をより完全に記載するために、参照によりこの開示内に組み込まれる。この開示は、引用される特許、特許出願、および刊行物とこの開示との間にいかなる矛盾がある場合に適用されるだろう。
【００４０】
Ｉ．定義
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各々の介在値およびその記載される範囲内の任意の他の記載値または介在値は、本開示内に包含されることが意図される。例えば、１μｍ〜８μｍの範囲が記載されている場合、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、および７μｍ、ならびに１μｍ以上の範囲の値および８μｍ以下の範囲の値も明示的に開示されていることが意図される。
【００４１】
単数形の「１つ」、「１つ」、および「その」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリマー」への言及は、単一のポリマーならびに２つ以上の同じもしくは異なるポリマーを含み、「賦形剤」への言及は、単一の賦形剤ならびに２つ以上の同じもしくは異なる賦形剤を含む等である。
【００４２】
数値の直前の「約」という単語は、本開示の文脈上他に指示されないか、もしくはそのような解釈と矛盾しない限り、その値のプラスもしくはマイナス１０％の範囲を意味し、例えば、「約５０」は、４５〜５５を意味し、「約２５，０００」は、２２，５００〜２７，５００等を意味する。例えば、「約４９、約５０、約５５等の数値のリストにおいて、「約５０」は、前の値と後の値との間の間隔（複数可）の半分未満に延びる範囲、例えば、４９．５超〜５２．５未満を意味する。さらに、「約〜未満」の値または「約〜より大きい」値という語句は、本明細書で提供される「約」という用語の定義に鑑みて理解されるべきである。
【００４３】
「実質的に」もしくは「本質的に」とは、略全体的にもしくは完全に、例えば、ある所与の量の重量もしくは体積当たり、８０％〜９５％以上、例えば、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、もしくはそれより大きい％、または測定される任意の他のパラメータを意味する。「実質的に含まない」とは、ある所与の量の重量もしくは体積当たり、約１％〜約２０％未満、例えば、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、もしくはそれ未満の％、または測定される任意の他のパラメータのレベルで存在する等、ある所与の量の略全体的にもしくは完全に存在しないことを意味する。いくつかの実施形態では、「実質的に含まない」とは、薬学的組成物の１〜５重量％以下のレベルで存在することを意味する。
【００４４】
ＩＩ．創傷包帯に使用するための組成物およびシステム
創傷および創傷管理の治療および診断のための創傷包帯に使用されるべき変性された創傷包帯材料であって、使用時の創傷包帯材料が、その場での創傷内の上昇酵素レベルの存在を示す、修飾創傷包帯材料を本明細書に提供する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「創傷」は、組織構造の連続性または完全性の物理的破壊を指す。「創傷治癒」は、組織の完全性の回復を指す。これは、組織の完全性の部分的または完全な回復を指し得ることが理解されるであろう。よって、創傷の治療は、創傷治癒過程に関連する１つ以上の段階もしくは過程の促進、改善、進行、加速、もしくは別様に、進歩を指す。
【００４６】
創傷は、急性または慢性であり得る。褥瘡、静脈脚潰瘍、および糖尿病性足潰瘍を含む慢性創傷は、単に治癒しない創傷として記載され得る。慢性創傷の正確な分子病因は完全には理解されていないが、多因子性であると認められている。急性損傷中の常在細胞および移動細胞の正常な反応が損なわれると、これらの創傷は、炎症反応の延長、創傷細胞外マトリックス（ＥＣＭ）再構成の不全、および再上皮化の障害によって特徴付けられる。
【００４７】
創傷は、例えば、打撲傷もしくは内部潰瘍等の皮膚の外部構造的完全性が維持されている任意の内部創傷、または外部創傷、特に皮膚創傷であり得、その結果、組織は、任意の内部もしくは外部の身体組織であり得る。一実施形態では、組織は、皮膚（例えば、ヒトの皮膚）であり、すなわち、創傷は、真皮創傷または表皮創傷等の皮膚創傷である。
【００４８】
ヒトの皮膚は、表皮および真皮の２つの異なる層から構成され、その下には皮下組織がある。皮膚の主な機能は、外的な外傷および病原性感染、感覚、および体温調節から内部器官および内部組織を保護することである。
【００４９】
皮膚の最外層である表皮は、およそ０．０４ｍｍの厚さで、無血管であり、４つの細胞型（ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、およびメルケル細胞）から構成され、いくつかの上皮細胞層に層別化される。表皮の最内上皮層は、基底膜であり、基底膜は、真皮と直接接触し、表皮を真皮に固定する。皮膚に発生する全ての上皮細胞分裂は、基底膜で起こる。細胞分裂後、上皮細胞は、表皮の外部表面に向かって移動する。この移動中に、細胞は、角質化として知られる過程を受け、それにより核が失われ、細胞は、丈夫で平らで耐性のある非生存細胞へと形質転換される。細胞が最外表皮構造、角質層、根底にある組織の乾燥を防止するのに役立つ乾燥した防水性扁平細胞層に到達すると、移動が完了する。死んだ上皮細胞のこの層は、連続的に剥がされ、基底膜から表面に移動する角化細胞によって置換される。表皮上皮は無血管であるため、基底膜は、その栄養供給のために真皮に依存する。
【００５０】
真皮は、表皮に栄養を供給する高度に血管新生された組織層である。さらに、真皮は、神経終末、リンパ管、コラーゲンプロテイン、および結合組織を含有する。真皮は、およそ０．５ｍｍの厚さであり、主に線維芽細胞およびマクロファージから構成される。これらの細胞型は、皮膚を含む全ての動物の結合組織に見られるプロテインであるコラーゲンの生成および維持に大きく関与している。コラーゲンは、主に皮膚の弾性の伸縮性質に関与している。コラーゲンが豊富な真皮の真下に見られる皮下組織は、皮膚の移動性、断熱性、カロリー保存性、およびその上の組織に対する血液を提供する。
【００５１】
創傷は、部分的な厚さの創傷または完全な厚い創傷である２つの一般的なカテゴリーのうちの１つに分類され得る。部分的な厚さの創傷は、真皮血管に損傷を与えない表皮および表在性真皮に限定される。完全な厚さの創傷は、真皮の破壊を伴い、真皮血管の破壊を伴う、より深い組織層に延びる。部分的な厚さの創傷の治癒は、上皮組織の単純な再生によって起こるだろう。完全な厚さの創傷における創傷治癒は、より複雑である。本明細書で企図される皮膚創傷は、部分的な厚さまたは完全な厚さの創傷のいずれかであり得る。
【００５２】
本明細書で企図される創傷には、切傷および裂傷、外科的切開もしくは創傷、穿刺、擦り傷、引っかき傷、圧迫創傷、擦傷、摩擦創傷（例えば、おしゃぶり、摩擦疱疹）、褥瘡潰瘍（例えば、圧力もしくは褥瘡）；熱効果創傷（直接もしくは伝導のいずれか、対流、もしくは放射線を通した冷熱源および熱源による、ならびに電源による火傷）、化学的創傷（例えば、酸性もしくはアルカリ性の火傷）、または開いたもしくは無傷の腫物、皮膚発疹、染み、およびニキビを含む病原性の感染（例えば、ウイルス性、細菌性、もしくは真菌性）、潰瘍、慢性創傷、（下脚潰瘍および足潰瘍、静脈性脚潰瘍、および褥瘡等の糖尿病関連創傷を含む）、皮膚グラフト／移植ドナーおよびレシピエント部位、免疫反応状態、例えば、乾癬および湿疹、胃もしくは腸の潰瘍、口の潰瘍、損傷した軟骨もしくは骨、切断創傷および角膜病変を含む口腔創傷が含まれる。
【００５３】
創傷包帯材料およびそれらの製剤：
本明細書に記載される実施形態は、慢性創傷を診断および／または治療するために使用され得る変性された創傷包帯を提供する。包帯剤は、ゲル形成ポリマー、非ゲル形成繊維、またはそれらの組み合わせを含み得る。本明細書に記載される創傷包帯材料は、哺乳動物の創傷における１つ以上の酵素のレベルを検出する方法において使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される創傷包帯材料は、哺乳動物の慢性創傷を診断する方法において使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される創傷包帯材料は、哺乳動物の感染性創傷を診断する方法において使用される。他の実施形態では、本明細書に記載される創傷包帯材料は、哺乳動物の創傷を治療する方法において使用される。さらなる実施形態では、本明細書に記載される創傷包帯材料は、哺乳動物の慢性創傷を治療する方法において使用される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、創傷包帯材料は、式Ｉの構造を有し、
【化１３】
2019509853.tif 000015
式Ｉ
式中、Ｍがゲル形成ポリマーである場合、Ｒは、レポーター分子を含む領域であり、Ｌは、ＭとＲとを繋ぐリンカーである。一実施形態では、リンカー（Ｌ）が存在する。別の実施形態では、リンカー（Ｌ）は存在せず、この場合、創傷包帯材料は、式Ｍ−Ｒの化合物を含み、ＭおよびＲは、各々個々に、上に記載されるとおりである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、創傷包帯材料は、式ＩＩの構造を有し、
【化１４】
2019509853.tif 000016
式ＩＩ
式中、Ｍは、ゲル形成ポリマーであり、ＰＥＰは、レポーター分子および少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド領域であり、Ｌは、ＭとＰＥＰとを繋ぐリンカーである。一実施形態では、リンカー（Ｌ）が存在する。別の実施形態では、リンカー（Ｌ）は存在せず、この場合、創傷包帯材料は、式Ｍ−Ｒの化合物を含み、ＭおよびＲは、各々個々に、上に記載されるとおりである。
【００５６】
特定の実施形態では、式Ｉもしくは式ＩＩの創傷包帯材料は、リンカーを含有せず、レポーター（Ｒ）もしくはペプチド（ＰＥＰ）は、共有結合的もしくは非共有結合的のいずれかでゲル形成ポリマーと直接関連する。当該技術分野で理解されているように、共有結合は、結合した原子間での電子の共有を伴う。対照的に、非共有結合は、例えば、イオン相互作用、静電相互作用、水素結合相互作用、物理化学的相互作用、ファンデルワールス力、ルイス酸／ルイス塩基相互作用、またはそれらの組み合わせを含み得る。特に、リンカーが存在しないこのような場合、ペプチドは、共有結合相互作用を介してゲル形成ポリマーに付着または接合する。
【００５７】
「ペプチド」という用語は、ペプチドならびにペプチドの薬学的に許容される塩を含む。典型的には、ペプチドは、共有結合、例えば、ペプチド結合を介して互いに結合される複数のアミノ酸残基、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、８個、１０個以上のアミノ酸残基を含む。「アミノ酸残基」は、本開示のペプチドに組み込まれる個々のアミノ酸単位を意味する。本明細書中で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するもしくは合成されたアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体、立体異性体、およびアミノ酸模倣物を意味する。この定義には、次のような天然アミノ酸が含まれる：１。ヒスチジン（Ｈｉｓ）２。イソロイシン（Ｉｌｅ）３。ロイシン（Ｌｅｕ）４。リジン（Ｌｙｓ）５。メチオニン（Ｍｅｔ）６。フェニルアラニン（Ｐｈｅ）７。スレオニン（Ｔｈｒ）８。トリプトファン（Ｔｒｐ）９。バリン（Ｖａｌ）１０。アルギニン（Ａｒｇ）１１。システイン（Ｃｙｓ）１２。グルタミン（Ｇｌｎ）１３。グリシン（Ｇｌｙ）１４。プロリン（Ｐｒｏ）１５。セリン（Ｓｅｒ）１６。チロシン（Ｔｙｒ）１７。アラニン（Ａｌａ）１８。アスパラギン（Ａｓｎ）１９。アスパラギン酸（Ａｓｐ）２０。グルタミン酸（Ｇｌｕ）２１。セレノシステイン（Ｓｅｃ）；非天然アミノ酸：シトルリン；シスチン；ガマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）；オルニチン；テアニンおよびベタイン等のアミノ酸誘導体；カルニチン；カルノシンクレアチン；ヒドロキシトリプトファン；ヒドロキシプロリン；Ｎ−アセチルシステイン；Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ−ｅ）；タウリン；チラミン。例えば、システイン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸／アスパラギン、グルタミン酸／グルタミン、グリシン、アラニン等の反応性側鎖を含有するアミノ酸が特に用いられ、
【００５８】
特定の実施形態では、ペプチドは、例えば、１つ以上のアミノ酸の追加、欠失、置換を介して、１つ以上のアミノ酸の誘導体化、または環化等を介して、修飾され得る。具体的には、ペプチドは、１つ以上のアミノ酸を追加、欠失、または置換することによって、カルボキシ末端（Ｃ末端）もしくはアミノ末端（Ｎ末端）で修飾される。具体的には、ペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸、特に、反応性側鎖を含有するアミノ酸、例えば、システイン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸／アスパラギン、グルタミン酸／グルタミン、グリシン、アラニン等を追加することによって、Ｃ末端で修飾され、反応性側鎖は、色素等の標識との接合に用いられ得る。特にこの実施態様の下では、ペプチドは、Ｃ末端に追加のシステインもしくはセリン残基を含有するように修飾され、システインの硫黄基もしくはセリンのヒドロキシル基は、蛍光色素とカップリングするために使用される。
【００５９】
特定の実施形態では、反応性側鎖、例えば、システインのＳＨ基を含む追加のアミノ酸を含有するペプチドは、クリック化学反応によって色素にカップリングされ得る。ここで、１，２−アミノチオールと２−シアノベンゾチアゾール（ＣＢＴ）との反応は、蛍光であるルシフェリンを作製するために使用され得る。次に、ルシフェリン蛍光は、洗浄後の分光測定によって定量化され得、１，２−アミノチオールを担持する分子の相対的存在を判定するために使用され得る。非１，２−アミノチオール担持プロテインの定量化が望ましい場合、対象となるプロテインを切断して、２−ＣＢＴに対して脆弱なＮ’Ｃｙｓを有する断片を得ることができる。Ｌｉａｎｇら、Ｊ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．、Ｉｎｔ．Ｅｄ．、４８，９６５，２００９を参照されたい。
【００６０】
ゲル形成ポリマー（Ｍ）：
式Ｉもしくは式ＩＩの創傷包帯材料のいくつかの実施形態では、ゲル形成ポリマーは、セルロース、化学修飾セルロース、ペクチン、アルギン酸塩、キトサン、修飾キトサン、ヒアルロン酸、多糖類、もしくはガム由来ポリマー、またはそれらの誘導体、あるいはそれらの任意の混合物もしくは組み合わせから選択される化合物である。
【００６１】
式Ｉまたは式ＩＩの創傷包帯材料のいくつかの実施形態では、ゲル形成ポリマーは、セルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、酸化セルロース（もしくはその誘導体）、セルロースエチルスルホネート（ＣＥＳ）、ペクチン、アルギン酸塩、キトサン、修飾キトサン、ヒアルロン酸、多糖類、またはガム由来ポリマー、またはそれらの任意の組合せもしくは混合物を含む。
【００６２】
式Ｉまたは式ＩＩの創傷包帯材料のいくつかの実施形態では、ゲル形成ポリマーは、セルロースまたは化学修飾セルロース、例えば、カルボキシメチルセルロース、酸化セルロースまたはその誘導体、セルロースエチルスルホネートである。
【００６３】
一実施形態では、ゲル形成ポリマーは、ポリマー化合物の誘導体、例えば、セルロース誘導体である。本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、ゲル形成ポリマーの塩、アミド、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物、またはプロドラッグを含む。例えば、ポリマーがセルロースである場合、セルロースのヒドロキシル基（−ＯＨ）は、有用な特性を有する誘導体、例えば、セルロースエステルおよびセルロースエーテル（−ＯＲ）を形成するように、様々な試薬と部分的または完全に反応され得る。一実施形態では、セルロースの誘導体は、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、メチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースから選択される。そのような誘導体は、そのような誘導体化のための既知の方法を使用する当業者によって容易に調製され得る。特定の実施形態では、誘導体は、実質的な毒性作用を伴わずに動物もしくはヒトに投与することができ、薬学的に活性であるか、もしくはプロドラッグであるかのいずれかである。セルロース誘導体の代表的な種類は、米国特許第７，５４４，６４０号および同第９，５６１，１８８号に記載されている。
【００６４】
別の実施形態では、誘導体は、ポリマー化合物の塩、例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、またはＢａ２＋、好ましくは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋の塩である。ナトリウムまたはカルシウム塩等のセルロース、セルロースエステル、およびセルロースエーテルの塩は、当該技術分野において知られている。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ゲル形成ポリマー化合物は、前述の化合物のうちの１つ以上の組み合わせまたは混合物を含有し得る。「組み合わせ」という用語には、１つ超の構成要素を含有する化合物が含まれ、これらは、互いに接合し得るか、または接合していなくてもよい。一実施形態では、ゲル形成ポリマー化合物は、例えば、共有結合または非共有結合相互作用を介して、互いに接合する前述の化合物のうちの１つ以上の組み合わせを含む。具体的な例として、ゲル形成ポリマーは、ペクチンとカルボキシメチルセルロースとの組み合わせを含み得る。Ｎｉｎａｎら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｐｏｌｙｍ．２０１３  Ｏｃｔ  １５；９８（１）：８７７−８５；ＰＭＩＤ：２３９８７４２４を参照されたい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、化合物は、前述のポリマー化合物の混合物を含む。「混合物」という用語は、それらが個々の特性を失う反応の発生を伴わない、２つ以上の物質の混ざり合った物を指す。例えば、化合物Ａと化合物Ｂとの混合物は、化合物Ａおよび化合物Ｂの任意の重量比を含む場合があり、その結果、混合物の総重量は、総計１００％に達し、例えば、化合物Ａ／化合物Ｂの重量比が、９９：１であるか、または化合物Ａ／化合物Ｂの重量比が、１：９９である。典型的な混合物は、前述のポリマー化合物を約２個、３個、４個、５個以上含有し得る。
【００６７】
式Ｉもしくは式ＩＩの創傷包帯材料のいくつかの実施形態では、ゲル形成ポリマーは、粉末もしくは繊維の形態、またはそれらの組み合わせである。式Ｉまたは式ＩＩの創傷包帯材料のいくつかの実施形態では、ゲル形成ポリマーは、繊維の形態である。ゲル形成繊維は、吸湿性繊維であり、創傷滲出物の取り込み時に湿潤で、滑りやすく、またはゼラチン状になり、よって、周囲繊維が創傷に付着する傾向を低下させる。ゲル形成繊維は、滲出液の吸収時にそれらの構造的完全性を保持する種類のものであり得るか、またはそれらの繊維状形態を失って、構造のないゲルになる種類のものであり得る。ゲル形成繊維は、好ましくは、繊維１グラム当たり、少なくとも２グラムの０．９％生理食塩水の吸収性（自由膨潤法によって測定されるような）を有する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、創傷包帯材料は、非ゲル形成繊維を含み得る。いくつかの実施形態では、非ゲル形成繊維は、セルロース繊維（例えば、綿もしくはリヨセル／テンセル）、ポリエステル、ナイロン、ビスコース、アラミド、アクリル、エラスタン（ＬＹＣＲＡ）、ポリオレフィン、ポリラクチド、シルク、および天然もしくは合成ウールから選択される。いくつかの実施形態では、創傷包帯材料は、ゲル形成ポリマーおよび非ゲル形成繊維を含む。
【００６９】
式Ｉまたは式ＩＩの創傷包帯材料のいくつかの実施形態では、ゲル形成ポリマーは、粉末の形態である。式Ｉまたは式ＩＩの創傷包帯材料の特定の実施形態では、粉末ゲル形成ポリマーの置換度（ＤｏＳ）が高いため、粉末ゲル形成ポリマーが、繊維状ゲル形成繊維よりも好ましい。式Ｉまたは式ＩＩの創傷包帯材料のいくつかの実施形態では、繊維状ゲル形成繊維が、粉末ゲル形成ポリマーよりも好ましい。
【００７０】
式Ｉもしくは式ＩＩの創傷包帯材料のいくつかの実施形態では、ゲル形成ポリマーは、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも２．０以上のＤｏＳを有する。ＤｏＳという用語は、当該技術分野において理解されている。例えば、各アンヒドログルコース（β−グルコピラノース）単位が３つの反応（ヒドロキシル）基を有するセルロース化学の状況では、したがって、ＤｏＳは、ゼロ（セルロース）〜３つ（完全に置換されたセルロース）の範囲であり得る。
【００７１】
リンカー（Ｌ）：
創傷包帯材料がリンカーを含むいくつかの実施形態では、リンカーは、ゲル形成ポリマーに共有結合的または非共有結合的に付着され得る。当該技術分野で理解されているように、共有結合は、電子の共有を伴う。対照的に、非共有結合は、例えば、イオン相互作用、静電相互作用、水素結合相互作用、物理化学的相互作用、ファンデルワールス力、ルイス酸／ルイス塩基相互作用、またはそれらの組み合わせを含み得る。特に、リンカーは、共有結合相互作用を介してゲル形成ポリマーに付着または接合する。
【００７２】
一実施形態では、化学的リンカーは、２〜１０個の炭素原子、具体的には４〜８個の炭素原子、または特に約４〜６個の炭素原子を有するカルボン酸である。
【００７３】
別の実施形態では、リンカーは、エトキシル化多価アルコール、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、それらのエーテル、アミド、およびエステルを含むポリアミンからなる群から選択されるモノマーまたは中性ポリマーである。
【００７４】
一実施形態では、中性ポリマーは、ポリプロピレンであるが、プロピレンを含むそのモノマーも使用され得る。ポリプロピレン（ＰＰ）は、その密度が低く、作製費用が低く、設計の柔軟性およびリサイクル性が高いため、マトリックス材料として最も重要で広く使用されているポリオレフィンのうちの１つである。ポリプロピレンは疎水性であるため、セルロース等の極性表面との相溶性がない場合がある。この問題は、ポリ（プロピレン−グラフト−無水マレイン酸）（ＰＰ−ｇ−ＭＡ）等の官能化ポリプロピレンを複合体内に組み込むことによって解決することができ、カルボン酸無水物基は、セルロースに共有結合を提供し得る。Ｓｐｏｌｊａｒｉｃら、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ：Ｐａｒｔ  Ａ  ４０、７９１−７９９、２００９を参照されたい。
【００７５】
一実施形態では、中性ポリマーリンカーは、ポリアルキレングリコールであるが、アルキレングリコールを含むそのモノマーも使用し得る。「ポリアルキレングリコール」という用語は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリブチレングリコール等の直鎖または分岐ポリアルキレングリコールポリマーを指す。ポリアルキレングリコール亜単位は、単一のポリアルキレングリコール単位である。例えば、ポリエチレングリコール亜単位の例は、鎖末端に水素で末端封鎖されたエチレングリコール、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、またはプロピレングリコール、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であろう。ポリ（アルキレングリコール）の他の例には、限定されないが、ＰＥＧ、メトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）等のＰＥＧ誘導体、ポリ（エチレンオキシド）、ＰＰＧ、ポリ（テトラメチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド−コ−プロピレンオキシド）等のＰＥＧ誘導体、またはそれらのコポリマーおよび組み合わせが含まれる。
【００７６】
別の実施形態では、中性ポリマーは、ポリアミンであるが、アミンを含むそのモノマーも使用することができる。「ポリアミン」という用語は、ポリアルキレンイミンのように、主鎖に組み込まれているか、またはポリビニルアミンのように、ペンダント基に組み込まれているかのいずれかの、モノマー単位中にアミン官能基を有するポリマーを指す。
【００７７】
特に、リンカーは、ＰＥＧ、もしくはメトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ＰＰＧ、ポリ（テトラメチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド−コ−プロピレンオキシド）等のＰＥＧ誘導体、またはそれらのコポリマーおよび組み合わせである。
【００７８】
別の実施形態では、他の親水性もしくは疎水性リンカーもまた、それらが可撓性である限り、リンカー、例えば、二重結合もしくは環状構造を含有するか、または数個のみの二重結合もしくは環状構造を含有するリンカーとして使用され得る。代表的な例には、例えば、約２〜約２０個の鎖原子の鎖長を有するポリアルキレン、ポリヒドロキシアルキレン、ポリアルキレンコハク酸塩、ポリラクチド等が含まれる。ポリアルキレングリコールの鎖長は、最低３単位（ＭＷ約１５０Ｄａ）から最大、例えば、約１００（ＭＷ約５０００）まで変動し得る。多糖類に対するポリアルキレングリコールの相対量は、必要な厚さおよび製品の必要な可撓性に依存して、約１／２００〜約１／１、特に約１／５０〜約１／１．５まで変化し得る。米国特許第９，０８９，６１４号および米国特許出願公開第２００５／００７９１５５号を参照されたい。
【００７９】
式Ｉもしくは式ＩＩの創傷包帯材料のいくつかの実施形態では、リンカーＬは、例えば、天然ポリマーの１〜約２０個のモノマー単位、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上のモノマー単位を含む。特定の実施形態では、リンカーは、１〜約５のエチレングリコール単位もしくはそれらの誘導体、２〜約５のエチレングリコール単位もしくはそれらの誘導体、２〜約８のエチレングリコール単位もしくはそれらの誘導体、２〜約１０のエチレングリコール単位もしくはそれらの誘導体、または５〜約１０個のエチレングリコール単位もしくはそれらの誘導体を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、リンカーＬは、求核反応の生成物である化学的部分を含む。概して、「求核試薬」という用語は、単分子（「ＳＮ１」として知られる）または二分子（「ＳＮ２」）反応として脂肪族化学において一般的に起こるような脱離基（一般的に別の求核試薬）を置換することによって化合物と反応する反応性電子対を有する化学基を意味するものと当該技術分野で認識されている。求核試薬の例には、アミン、メルカプタン、およびアルコール等の非荷電化合物、ならびにアルコキシド、チオール、チオレート、カルバニオン、および様々な有機および無機アニオン等の荷電基が含まれる。例示的なアニオン性求核試薬には、とりわけ、アジド、シアン化物、チオシアン酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、またはクロロギ酸塩等の単純アニオン、ならびに重亜硫酸塩が含まれる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、リンカーＬは、マレイミド−チオール付加物を含む。マレイミドは、チオール含有物質、例えば、システイン等のチオール含有アミノ酸への接合に特に有用である。チオール基は、二重結合にわたって追加されることによってマレイミドと反応して、チオエーテルを形成する。マレイミドは、メチオニン、ヒスチジン、またはチロシンよりもシステインのチオールに対して選択的である。マレイミドとアミンとの反応は、通常、マレイミドとチオールとの反応よりも高いｐＨを必要とする。マレイミドの加水分解は、具体的にはｐＨ８を超えるチオール修飾と著しく競合する。米国特許出願公開第２００７／００８７４４６号を参照されたい。
【００８２】
いくつかの実施形態では、Ｌは、ハロアセトアミド−チオール接合生成物を含む。ハロアセトアミド、例えば、ヨードアセトアミドまたはブロモアセトアミドもまた、アミノ酸のチオール基、例えば、システインと共有結合するために使用され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、リンカーＬは、マレイミドと同様に使用することができる、チオールまたはジスルフィドを含有する化合物を含む。Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．６，１５０−１６５，１９９５；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１７、１０１−１６１、２０００；およびＨｅｒｍａｎら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９５，２０３−２０９，１９９４を参照されたい。また、米国特許第７，４３２，３３０号も参照されたい。
【００８４】
レポーターおよびマーカー：
いくつかの実施形態では、創傷包帯材料は、レポーター分子を含む領域を含む。具体的には、レポーターは、１つ以上の創傷特異的マーカー、例えば、創傷環境に見られる酵素に対する基質である。本明細書中で使用される場合、「創傷特異的酵素」は、創傷において差異的に発現される酵素である。「差異的発現」とは、酵素のレベルもしくは活性が、他の部位、例えば、正常組織もしくは周囲組織と比較して、創傷微小環境において、より高いかもしくは低いことを意味する。具体的には、差異的発現は、正常もしくは未損傷組織と比較して、創傷微小環境における酵素の発現もしくは活性のより高いレベルを示唆する。酵素の差異的発現は、慣例的手段によって分析することができる。例えば、サンプル中の酵素のレベルは、ＥＬＩＳＡアッセイまたは他の免疫アッセイによって分析することができる。酵素の活性は、例えば、質量分析またはＨＰＬＣを使用して、基質の損失速度および／または生成物の形成速度を測定することによって分析することができる。そのような技術は、当該技術分野で知られており、実施例の項に記載されている。
【００８５】
一実施形態では、マーカーは、加水分解酵素、プロテアーゼ、エステラーゼ、およびペルオキシダーゼからなる群から選択される酵素である。
【００８６】
一実施形態では、マーカーは、加水分解酵素である。本明細書で使用される場合、「加水分解酵素」または「加水分解酵素」は、化学的結合の加水分解を触媒する酵素、例えば、エステラーゼおよびヌクレアーゼ（破壊エステル結合）、グリコラーゼ（グリコシドリンカーを破壊する）、ペプチダーゼ（ペプチド結合を破壊する）等である。
【００８７】
一実施形態では、マーカーは、プロテアーゼ酵素である。プロテアーゼは、配列特異的プロテアーゼまたは一般的プロテアーゼであり得る。具体的には、「配列特異的プロテアーゼ」という用語は、その消化のためのペプチドの特異的配列（例えば、カスパーゼ）を認識するプロテアーゼを意味し、ペプチドをその一端から順次分解するか、またはペプチドを配列非特異的な方法で消化する、一般的なプロテアーゼ（例えば、トリプシン）とは区別される。配列特異性については、ペプチド基質のアミノ酸配列は、４つ以上のアミノ酸（ａ．ａ．）残基を含み得る。認識部位および消化部位は、互いに近接していてもよい。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「プロテアーゼに対する基質ペプチド」という用語は、そのプロテアーゼ活性に対する基質として、例えば、１つ以上の生成物へと切断され得る基質として、プロテアーゼによって認識されるプロテインのアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、創傷包帯材料は、複数のアミノ酸を含むペプチド配列を含むペプチド領域を含む。「複数」という用語は、２つ以上の単位、例えば、アミノ酸を意味するが、個々の単位は、構造的および／または機能的に異なる必要はない。
【００８９】
一実施形態では、ペプチドは、天然アミノ酸を含む。他の実施形態では、１つ以上の非天然アミノ酸を含む合成ペプチドもまた、使用され得る。
【００９０】
特定の実施形態では、それらの各々が特定の酵素に対して特異的である、複数の基質を使用し得る。特定の実施形態では、複数の基質であって、それらの各々が特定の酵素に対して特異的である、複数の基質を使用し得る。
【００９１】
一実施形態では、プロテアーゼ酵素は、エキソペプチダーゼまたはエンドペプチダーゼである。エキソペプチダーゼは、ペプチド鎖の末端付近の構造のみを分解し、エンドペプチダーゼは、ペプチド内の内部結合を切断することができる。これらのクラスはまた、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ等の部分基にも分割される。各々は、ペプチド結合の加水分解によって特異的プロテイン結合を消化することができる。
【００９２】
一実施形態では、プロテアーゼは、創傷に特異的である。本明細書中で使用される場合、「創傷特異的プロテアーゼ」は、創傷において差異的に発現されるプロテアーゼである。「差異的発現」とは、プロテアーゼのレベルもしくは活性が、他の部位、例えば、正常組織もしくは周囲組織と比較して、創傷微小環境において、より高いかもしくは低いことを意味する。具体的には、差異的発現は、創傷微小環境におけるプロテアーゼの発現または活性のレベルが、非創傷組織と比較して、より高いことを示唆する。プロテアーゼの差異的発現は、慣例的手段によって分析され得る。例えば、サンプル中のプロテアーゼのレベルは、ＥＬＩＳＡアッセイまたは他の免疫アッセイによって分析され得る。プロテアーゼの活性は、例えば、質量分析もしくはＨＰＬＣを使用して、ペプチド基質の損失速度および／もしくは生成物の形成速度を測定することによって分析され得る。そのような技術は、当該技術分野で知られており、実施例の項に記載されている。
【００９３】
一実施形態では、創傷特異的プロテアーゼは、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストメリシン１）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、カテプシンＧ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、およびリゾチームからなる群から選択される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、基質は、コラゲナーゼに特異的なペプチド配列である。いくつかの実施形態では、基質は、ＭＭＰ−２に特異的なペプチド配列である。いくつかの実施形態では、基質は、ＭＭＰ−３に特異的なペプチド配列である。いくつかの実施形態では、基質は、好中球コラゲナーゼに特異的なペプチド配列である。いくつかの実施形態では、基質は、ゼラチナーゼに特異的なペプチド配列である。いくつかの実施形態では、基質は、ヒト好中球エラスターゼに特異的なペプチド配列である。いくつかの実施形態では、基質は、カテプシンＧに特異的なペプチド配列である。いくつかの実施形態では、基質は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に特異的なペプチド配列である。いくつかの実施形態では、基質は、リゾチームに特異的なペプチド配列である。いくつかの実施形態では、基質は、リゾチームによって切断される糖である。
【００９５】
特定の一実施形態では、創傷特異的プロテアーゼは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ−９（コラゲナーゼ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）である。ＭＭＰ−１（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０３９５６［ヒト］およびＱ９ＥＰＬ５［マウス］）は、間質性コラゲナーゼおよび線維芽細胞コラゲナーゼとしても知られている。ＭＭＰ−２（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０８２５３［ヒト］およびＰ３３４３４［マウス］）は、ゼラチナーゼとしても知られている。ＭＭＰ−８（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ２２８９４［ヒト］およびＯ７０１３８［マウス］）は、ＰＭＮＬコラゲナーゼ（ＭＮＬ−ＣＬ）としても知られている。ＭＭＰ−９（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ１４７８０［ヒト］およびＰ４１２４５［マウス］）は、ゼラチナーゼＢ（ＧＥＬＢ）としても知られている。
【００９６】
特定の一実施形態では、ＭＭＰは、ＭＭＰ−２もしくはＭＭＰ−９、またはそれらの組み合わせである。
【００９７】
いくつかの実施形態では、例えば、約６Ｕ／ｍＬ、約７Ｕ／ｍＬ、約８Ｕ／ｍＬ、約９Ｕ／ｍＬ、約１０Ｕ／ｍＬ、約１１Ｕ／ｍＬ、約１２Ｕ／ｍＬ、約１３Ｕ／ｍＬ、約１４Ｕ／ｍＬ、約１５Ｕ／ｍＬ、約１６Ｕ／ｍＬ、約１７Ｕ／ｍＬ、約１８Ｕ／ｍＬ、約１９Ｕ／ｍＬ、約２０Ｕ／ｍＬ、約２１Ｕ／ｍＬ、約２２Ｕ／ｍＬ、約２３Ｕ／ｍＬ、約２４Ｕ／ｍＬ、約２５Ｕ／ｍＬ以上の間の全ての値を含む、約５Ｕ／ｍＬ〜約３０Ｕ／ｍＬのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）活性レベルは、慢性創傷感染を示す。当該技術分野で理解されているように、活性の単位（Ｕ）は、典型的には、酵素触媒活性を記載するために使用され、単位（Ｕ）は、１マイクロモル（μｍｏｌｅ）の基質の１分当たりの変換を触媒する酵素の量を指す。よって、１酵素単位（Ｕ）＝１μｍｏｌ／分であり、μｍｏｌは、変換された基質の量を指す。
【００９８】
特定の一実施形態では、ＭＭＰは、ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９であり、少なくとも１０．５Ｕ／ｍＬのＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９活性レベルは、慢性創傷感染を示す。
【００９９】
ＭＭＰによって切断可能な任意のペプチドは、本明細書に記載される実施形態により使用され得る。例えば、この主題事項に対する参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１４８，１９４号の表１を参照されたい。
【０１００】
表１は、様々な基質およびヒトＭＭＰの異なるアイソフォームに対するそれらの特異性を示す。データは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｇａｓｅら（「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＭＭＰｓ」、ｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｃｌｅｎｄｅｎｉｎｎ＆Ａｐｐｅｌｔ  Ｅｄｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｄｉａ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１）の表３に提示されている。
表１
【表１】
2019509853.tif 000017
【表２】
2019509853.tif 000018
＊ＮＤ：判定されず。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明の創傷特異的プロテアーゼは、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０８２４６［ヒト］およびＱ３ＵＰ８７［マウス］）であり、キモトリプシンと同じファミリーのセリンプロテイナーゼであり、かつ広い基質特異性を有する。これは、炎症中に好中球およびマクロファージによって分泌され、細菌および宿主組織を破壊する。一実施形態では、ＨＮＥを検出するための基質は、コア配列アラニン−アラニン−プロリン−バリン（ＡＡＰＶ）を有する。別の実施形態では、ＨＮＥに対する基質は、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ／Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ（ＡＰＥＥＩ／ＭＲＲＱ）（Ｋａｓｐｅｒｋｉｅｗｉｃｚら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１１１（７）：２５１８−２５２３，２０１４；Ｋｏｒｋｍａｚら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、８４４：１２５−１３８、２０１２）である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、例えば、約６Ｕ／ｍＬ、約７Ｕ／ｍＬ、約８Ｕ／ｍＬ、約９Ｕ／ｍＬ、約１０Ｕ／ｍＬ、約１１Ｕ／ｍＬ、約１２Ｕ／ｍＬ、約１３Ｕ／ｍＬ、約１４Ｕ／ｍＬ、約１５Ｕ／ｍＬ、約１６Ｕ／ｍＬ、約１７Ｕ／約１８Ｕ／ｍＬ、約１９Ｕ／ｍＬ、約２０Ｕ／ｍＬ、約２１Ｕ／ｍＬ、約２２Ｕ／ｍＬ、約２３Ｕ／ｍＬ、約２４Ｕ／ｍＬ、約２５Ｕ／ｍＬ以上の間の全ての値を含む、約５Ｕ／ｍＬ〜約３０Ｕ／ｍＬのヒト好中球エラスターゼ活性レベルは、慢性創傷感染を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも９．６のヒト好中球エラスターゼ活性レベルは、慢性創傷感染を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも２２．９Ｕ／ｍＬのヒト好中球エラスターゼ活性レベルは、慢性創傷感染を示す。
【０１０３】
ＭＭＰおよびＨＮＥ部分基は、創傷内のプロテインと相互作用するときに異なる機構を有し、したがって、予想されるように、各々が、創傷治癒の異なる阻害方法を有する。
【０１０４】
別の実施形態では、創傷特異的酵素は、リゾチームである。リゾチーム（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ６１６２６［ヒト］およびＰ０８９０５［マウス］）は、グリコシド加水分解酵素であり、その主な機能は、細菌の細胞壁を破壊することである。これは、ペプチドグリカン中のＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基との間の、また、キトデキストリン中のＮ−アセチル−Ｄグルコサミン残基間の、（１→４）−β−結合を加水分解する。リゾチームの天然基質は、細菌細胞壁のペプチドグリカン層である。しかしながら、ムレーン分解生成物を含む様々な低分子量基質、ならびに合成化合物が、様々な測光、同位体、および免疫学的リゾチームアッセイに対して使用されている。Ｈｏｌｔｊｅら、ＥＸＳ、７５：１０５−１０、１９９６。以下の低分子量リゾチーム基質は、米国ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ：４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−Ｎ、Ｎ’、Ｎ’’−トリアセチル−キトトリオシド（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ５６３９）および４−ニトロフェニルβ−Ｄ−Ｎ、Ｎ’、Ｎ’’−トリアセチル−キトトリオシド（シグマカタログ番号Ｎ８６３８）から市販されている。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、例えば、約１１００Ｕ／ｍＬ、約１２００Ｕ／ｍＬ、約１３００Ｕ／ｍＬ、約１４００Ｕ／ｍＬ、約１５００Ｕ／ｍＬ、約１６００Ｕ／ｍＬ、約１７００Ｕ／ｍＬ、約１８００Ｕ／ｍＬ、約１９００Ｕ／ｍＬ、約２０００Ｕ／ｍＬ、約２１００Ｕ／ｍＬ、約２２００Ｕ／ｍＬ、約２３００Ｕ／ｍＬ、約２４００Ｕ／ｍＬ、約２５００Ｕ／ｍＬ、約２６００Ｕ／ｍＬ、約２７００Ｕ／ｍＬ、約２８００Ｕ／ｍＬ、約２９００Ｕ／ｍＬ、約３０００Ｕ／ｍＬ、約３２５０Ｕ／ｍＬ、約３５００Ｕ／ｍＬ、約３７５０Ｕ／ｍＬ、約４０００Ｕ／ｍＬ、約４２５０Ｕ／ｍＬ、約４５００Ｕ／ｍＬ、約４７５０Ｕ／ｍＬ、約５０００Ｕ／ｍＬ、約５２５０Ｕ／ｍＬ、約５５００Ｕ／ｍＬ、約５７５０Ｕ／ｍＬ、約６０００Ｕ／ｍＬ以上の間の全ての値を含む、約１０００Ｕ／ｍＬ〜約１００００Ｕ／ｍＬのリゾチーム活性レベルは、慢性創傷感染を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも４８００Ｕ／ｍＬのリゾチーム活性レベルは、慢性創傷感染を示す。
【０１０６】
またさらなる実施形態では、創傷特異的酵素は、ペルオキシダーゼ、より具体的には、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）である。ＭＰＯ（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０５１６４［ヒト］およびＰ１１２４７［マウス］）は、好中球顆粒球中に見られるペルオキシダーゼである。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）およびハロゲン化物（最も一般的には塩化物）の存在下で、次亜塩素酸塩、一重項酸素（１Ｏ２）、塩素（Ｃｌ２）、およびヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）を生成する。ＭＰＯは、テトラメチルベンジジンまたは４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジメトキシアニリンを使用して検出することができる。Ａｎｄｒｅｗｓら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２７（２）：３４６−５０，１９８２；Ｋｌｅｂａｎｏｆｆら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．、７７、５９８−６２５、２００５を参照されたい。
【０１０７】
またさらなる実施形態では、創傷特異的酵素は、アズロフィル顆粒内に保存されるキモトリプシンファミリーの３つのセリンプロテアーゼのうちの１つであるカテプシンＧ（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０８３１１［ヒト］およびＰ２８２９３［マウス］）である。カテプシンＧ特異的基質は、配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＰｈｅまたはＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｓ７３８８およびＭ７７７１）を有する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、例えば、約１５Ｕ／ｍＬ、約２０Ｕ／ｍＬ、約２５Ｕ／ｍＬ、約３０Ｕ／ｍＬ、約３５Ｕ／ｍＬ、約４０Ｕ／ｍＬ、約４５Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ、約５５Ｕ／ｍＬ、約６０Ｕ／ｍＬ、約６５Ｕ／ｍＬ、約７０Ｕ／ｍＬ、約７５Ｕ／ｍＬ、約８０Ｕ／ｍＬ、約８５Ｕ／ｍＬ、約９０Ｕ／ｍＬ、約９５Ｕ／ｍＬ、約１００Ｕ／ｍＬ、約１１０Ｕ／ｍＬ、約１２０Ｕ／ｍＬ以上の間の全ての値を含む、約１０Ｕ／ｍＬ〜約１００Ｕ／ｍＬのカテプシンＧ活性レベルは、慢性創傷感染を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも５０Ｕ／ｍＬ、少なくとも４０Ｕ／ｍＬ、少なくとも３０Ｕ／ｍＬ、少なくとも２０Ｕ／ｍＬ、少なくとも１５Ｕ／ｍＬ、または少なくとも１０Ｕ／ｍＬのカテプシンＧ活性レベルは、慢性創傷感染を示す。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、創傷特異的酵素は、細胞外マトリックスの分解およびおそらく腫瘍細胞の移動および増殖に関与するセリンプロテアーゼであるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ００７４９［ヒト］およびＰ０６８６９［マウス］）である。ウロキナーゼに特異的な基質は、基本モチーフＡｒｇ−ＶａｌまたはＬｙｓ−Ｖａｌを有する。Ｒｉｊｋｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、１７４（２）：４３２−８，１９９１を参照されたい。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の酵素は、エステラーゼである。エステラーゼは、水と化学反応して、エステルを酸およびアルコールに分離する加水分解酵素である。特定の一実施形態では、エステラーゼの基質は、フルオレセインジアセテート−５−マレイミドである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の酵素、例えば、前述の酵素の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個以上を検出することができる基質を含む。そのような組成物は、例えば、同じゲルポリマーまたは異なるゲルポリマーに接合した複数の基材を含み得る。
【０１１２】
特定の実施形態では、基質は、標識される。本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、エピトープ結合剤または他の基質物質に付着された任意の物質を指し、物質は、検出方法によって検出可能である。好適な標識の非限定的な例には、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、蛍光消光剤、着色分子、放射性同位体、シンチラント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体もしくはそれらの断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、および酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびルシフェラーゼを含む）が含まれる。そのような方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【０１１３】
特定の実施形態では、基質は、検出可能な標識である標識により標識される。検出可能な標識は、その存在が直接的または間接的に確認され得る部分である。概して、標識の検出は、例えば、エネルギーの放出等の検出可能な信号の生成を伴う。標識は、化学的、ペプチド的、または核酸的性質のものであり得るが、これに限定されるものではない。使用される標識の性質は、実施される分析の性質、使用されるエネルギー源および検出器の種類、ならびにポリマー、分析物、プローブ、および一時的および二次的分析物特異的結合パートナーの種類を含む、様々な因子に依存するだろう。標識は、それが結合される成分と立体的かつ化学的に適合するべきである。
【０１１４】
標識は、例えば、特定の波長の電磁放射線を放出および／または吸収するその能力によって、直接検出され得る。標識は、例えば、それ自体が特定の波長の光（例えば、ＦＬＡＧエピトープ等のエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素タグ等）を放出または吸収し得る別の部分を結合、回復、および場合によっては、切断するその能力によって、直接検出され得る。概して、検出可能な標識は、蛍光分子（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｃｙ−７、テキサスレッド、ファーレッド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フルオレセインアミン、エオシン、ダンシル、ウンベリフェロン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、５−（２’−（アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、ｒ−アミノ−Ｎ−（３−ビニルスルホニル）フェニルナフタルイミド−３，５、ジスルホン酸（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（クマリン１５１）、シアノシン、４’、６−ジアミジン（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリンジエチレントリアミンペンタアセテート、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアネート、エチジウム、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、フルオレサミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルソクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリスリン、ｏ−フタルジアルデヒド、ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート、リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ３Ｂ−Ａ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロライド、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸ、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロライド誘導体、テトラメチルローダミン、リボフラビン、ロゾール酸、お��びテルビウムキレート誘導体）、化学発光分子、生物発光分子、発色分子、放射性同位体（例えば、Ｐ３２もしくはＨ３、１４Ｃ、１２５Ｉおよび１３１Ｉ）、電子スピン共鳴分子（例えば、ニトロキシルラジカル等）、光学もしくは電子密度分子、電荷変換もしくは移動分子、電磁もしくは常磁性ビーズもしくは粒子等の電磁分子、半導体ナノ結晶もしくはナノ粒子（例えば、米国特許第６，２０７，３９２号に記載されており、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＥｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている量子ドット）、コロイド金属、コロイド金ナノ結晶、核磁気共鳴分子等の直接検出可能な標識からなる群から選択され得る。
【０１１５】
検出可能な標識はまた、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ等のルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）；グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の糖質酸化酵素；ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、もしくはマイクロペルオキシダーゼ）等の色素前駆体を酸化するために過酸化水素を使用する酵素にカップリングされたウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ等の複素環オキシダーゼ、酵素基質、アフィニティ分子、リガンド、レセプター、ビオチン分子、アビジン分子、ストレプトアビジン分子、抗原（例えば、ＦＬＡＧもしくはＨＡエピトープ等のエピトープタグ）、ハプテン（例えば、ビオチン、ピリドキサール、ジゴキシゲニンフルオレセイン、およびジニトロフェノール）、抗体、抗体断片、マイクロビーズ等の間接的に検出可能な標識からなる群から選択され得る。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｄ、およびＣＤＲ３領域を含む抗体断片が含まれる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、基質は、ＦＲＥＴ対を形成する、それぞれ、ドナーおよび受容体フルオロフォアと接合する。特定の二次抗体が結合されるか否かを判定するために、それが結合する分析物の同一性にかかわらず、ＦＲＥＴを、例えば、アレイ形式で使用することができる。代替的に、二次結合パートナーは、一次結合パートナーの標識化なしに、検出可能に標識され得る。二次的結合パートナーの標識化は、それに付着した核酸の配向を確立するためにも有用である。ＦＲＥＴ単独では、一般に、１つの励起源（よって、波長）、および通常は１つの検出器のみが必要である。検出器は、ドナーまたは受容体フルオロフォアのいずれかの発光スペクトルに設定され得る。ＦＲＥＴがドナー蛍光の消光によって検出された場合、それは、ドナーフルオロフォア発光スペクトルに設定される。代替的に、受容体フルオロフォアの発光によってＦＲＥＴが検出された場合、それは、受容体フルオロフォア発光スペクトルに設定される。いくつかの実施形態では、ドナーおよび受容体フルオロフォアの両方のＦＲＥＴ放出を検出することができる。さらに他の実施形態では、ドナーは偏光で励起され、両方の発光スペクトルの偏光が検出される。
【０１１７】
一実施形態では、検出可能な標識は、ＦＲＥＴに基づくアッセイと適合する。ＦＲＥＴは、ＦＲＥＴフルオロフォア対の使用を必要とする。ＦＲＥＴフルオロフォア対は、互いに近接して位置付けられた場合に検出可能な信号を生成または除去するためにＦＲＥＴを受けることができる２つのフルオロフォアである。ドナーの例には、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５４６、ＢＯＤＩＰＹ４９３、Ｏｙｓｔｅｒ５５６、Ｆｌｕｏｒ（ＦＡＭ）、Ｃｙ３およびＴＭＲ（Ｔａｍｒａ）が含まれる。受容体の例には、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７、およびＯｙｓｔｅｒ６５６が含まれる。Ｃｙ５は、一例として、Ｃｙ３、ＴＭＲまたはＡｌｅｘａ  ５４６を有するドナーとして機能し得る。ＦＲＥＴは、互いに５０〜１００ｎｍ離間した蛍光最大値を有する任意のフルオロフォア対により可能であるべきである。
【０１１８】
基質は、本明細書で考察されるバーコード標識化に加えて、配列非特異的な方法で標識され得る。例えば、ポリマーがＤＮＡ等の核酸である場合、その主鎖は、主鎖標識により染色され得る。核酸を配列非特異的な方法で標識する主鎖染色の例には、フェナントリジンおよびアクリジン等のインターカレーティング色素（例えば、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジド、ジヒドロエチジウム、エチジウムホモダイマー−１および−２、エチジウムモノアジド、ならびにＡＣＭＡ）；インドールおよびイミダゾールのマイナーグローブバインダー（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３４５８０、およびＤＡＰＩ）；アクリジンオレンジ（またインターカレートすることができる）、７−ＡＡＤ、アクチノマイシンＤ、ＬＤＳ７５１、およびヒドロキシスチルバミジン等の種々の核酸染色が含まれる。前述の核酸染色の全ては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ等の供給業者から市販されている。
【０１１９】
核酸染色のさらに他の例には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製の以下の色素：ＳＹＴＯＸ  ＢＬＵＥ、ＳＹＴＯＸ  ＧＲＥＥＮ、ＳＹＴＯＸ  ＯＲＡＮＧＥ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＪＯＪＯ−１、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ、ＯＬＩＧＲＥＥＮ、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ、ＳＹＢＲ  ＧＯＬＤ、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉ、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＩＩ、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＴＯ−４０、−４１、−４２、−４３、−４４、−４５（ＢＬＵＥ）、ＳＹＴＯ−１３、−１６、−２４、−２１、−２３、−１２、−１１、−２０、−２２、−１５、−１４、−２５（緑色）、ＳＹＴＯ−８１、−８０、−８２、−８３、−８４、−８５（オレンジ色）、ＳＹＴＯ−６４、−１７、−５９、−６１、−６２、−６０、−６３（赤色）等のシアニン色素が含まれる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、レポーター分子は、発色団またはフルオロフォアを含む。さらなる実施形態では、発色団は、アゾ部分、ニトロ部分、トリアリールメタン部分、メチン、アントラキノン、ポリエン部分、またはフタロシアニンである。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、色素である。色素は、限定されないが、ローダミン、クマリン、シアニン、キサンテン、ポリメチン、ピレン、ジピロメテンボロンジフルオリド、ナフタルイミド、フィコビリプロテイン、ペリジニウムクロロフィルプロテイン、それらの接合、およびそれらの組み合わせであり得ることが想定される。色素の非限定的な例には、フルオレセイン、６−ＦＡＭ、ローダミン、テキサスレッド、カリフォルニアレッド、ｉＦｌｕｏｒ５９４、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン６Ｆ、カルボキシロードル、カルボキシローダミン１１０、カスケードブルー、カスケードイエロー、クマリン、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ、ＤｙＬｉｇｈｔ３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ８００、フィコエリスリン、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィル−ａプロテイン）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’、５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＮＥＤ、ＲＯＸ（５−（および−６−）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＨＥＸ、ルシファーイエロー、マリンブルー、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、それらの接合、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）またはダブシル誘導体である。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、またはフルオレセイン含有化合物である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、レポーター分子は、脂質である。いくつかの実施形態では、脂質は、合成リン脂質誘導体である。いくつかの実施形態では、合成リン脂質誘導体は、ＤＤＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、またはＤＥＰＣである。いくつかの実施形態では、合成リン脂質誘導体は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、またはＤＰＰＣである。いくつかの実施形態では、合成リン脂質誘導体は、ＤＬＰＣである。いくつかの実施形態では、合成リン脂質誘導体は、ＤＭＰＣである。いくつかの実施形態では、合成リン脂質誘導体は、ＤＰＰＣである。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、レポーター分子は、酵素との接触時に創傷包帯材料から切断される検出可能な断片内に含まれる。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、酵素との接触時に創傷包帯材料から切断される断片内に含まれない。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、裸眼によって視覚化される。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、ＵＶ光下で視覚化される。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、蛍光灯を使用して視覚化される。
【０１２３】
式Ｉの創傷包帯材料のいくつかの実施形態では、Ｒは、任意選択的に、消光剤断片を含む。いくつかの実施形態では、消光剤断片は、レポーター分子が蛍光を発するのを防止する。いくつかの実施形態では、消光剤断片は、保護基である。いくつかの実施形態では、消光剤断片は、アセテート基である。
【０１２４】
特定の実施形態では、１つ以上の酵素の標的配列を含有する変性された創傷包帯材料を本明細書に開示する。いくつかの実施形態では、酵素触媒切断は、検出可能な断片を放出する。検出可能な断片は、レポーター分子を含み得る。検出可能な断片のレベルの定性的もしくは定量的測定により、創傷における感染の存在もしくは非存在を判定することができる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、酵素触媒切断は、検出不能な断片を放出する。いくつかの実施形態では、創傷包帯材料との酵素相互作用は、消光剤断片を切断し、創傷包帯材料に結合されたレポーター分子が蛍光を発することを可能にする。蛍光の定性的もしくは定量的測定は、創傷における感染の存在もしくは非存在の判定を可能にする。
【０１２６】
特定の実施形態では、１つ以上のプロテアーゼの標的配列を含有するペプチド変性された創傷包帯材料を本明細書に開示する。酵素触媒切断は、検出可能な断片を放出する。検出可能なペプチド断片は、レポーター分子を含む。検出可能なペプチド断片のレベルの定性的もしくは定量的測定により、創傷における上昇プロテアーゼの存在もしくは非存在の判定が可能になる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、酵素触媒切断は、検出不能な断片を放出する。いくつかの実施形態では、創傷包帯材料との酵素相互作用は、消光剤断片を切断し、創傷包帯材料に結合されたレポーター分子が蛍光を発することを可能にする。蛍光の定性的もしくは定量的測定は、創傷における感染の存在もしくは非存在の判定を可能にする。
【０１２８】
式Ｉの創傷包帯材料のいくつかの実施形態では、Ｒは、消光剤断片を含む。いくつかの実施形態では、消光剤断片は、レポーター分子が蛍光を発するのを防止している。いくつかの実施形態では、消光剤断片は、保護基である。いくつかの実施形態では、消光剤断片は、アセテート基である。式Ｉの創傷包帯材料のいくつかの実施形態では、Ｒは、求核反応生成物である化学的部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、マレイミド−チオール付加物を含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、ハロアセトアミド−チオール接合生成物を含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、ハロアセトアミド接合生成物を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、創傷包帯材料は、式Ｉａの構造を有し、
【化１５】
2019509853.tif 000019
式Ｉａ
式中、Ｒは、レポーター分子を含む領域であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０以上であり、ｎは、例えば、２０１、２０２、２０３等の間の全ての単位値を含む、２００〜４０００、例えば、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００から選択される整数である。さらなる実施形態では、ｎは、３００〜３５００から選択される整数である。またさらなる実施形態では、ｎは、４００〜３２００から選択される整数である。いくつかの実施形態では、Ｒは、レポーター分子および少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド領域である。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、創傷包帯材料は、式Ｉｂの構造を有し、
【化１６】
2019509853.tif 000020
式Ｉｂ
式中、Ｒは、レポーター分子を含む領域であり、ｎは、例えば、２０１、２０２、２０３等の間の全ての単位値を含む、２００〜４０００、例えば、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００から選択される整数である。さらなる実施形態では、ｎは、３００〜３５００から選択される整数である。またさらなる実施形態では、ｎは、４００〜３２００から選択される整数である。いくつかの実施形態では、Ｒは、レポーター分子および少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド領域である。いくつかの実施形態では、Ｒは、レポーター分子および１つのアミノ酸を含むペプチド領域である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、創傷包帯材料は、式ＩＩａの構造を有し、
2019509853.tif 000021
式ＩＩａ
式中、Ｍは、セルロース、化学修飾セルロース、ペクチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、多糖類、もしくはガム由来ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるゲル形成ポリマーであり、ＰＥＰは、レポーター分子および少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド領域であり、Ｌは、ＭとＰＥＰとを繋ぐリンカーであり、Ｌは、１つ以上のポリエチレングリコール亜単位もしくはポリプロピレン亜単位を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、創傷包帯材料は、式ＩＩｂの構造を有し、
【化１７】
2019509853.tif 000022
式ＩＩｂ
式中、ＰＥＰは、レポーター分子および少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド領域であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０以上であり、ｎは、２００〜４０００から選択される整数である。さらなる実施形態では、ｎは、３００〜３５００から選択される整数である。またさらなる実施形態では、ｎは、４００〜３２００から選択される整数である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、創傷包帯材料は、式ＩＩｃの構造を有し、
【化１８】
2019509853.tif 000023
式ＩＩｃ
式中、ＰＥＰは、レポーター分子および少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド領域であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０それ以上であり、ｎは、例えば、２０１、２０２、２０３等の間の全ての単位値を含む、２００〜４０００、例えば、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００から選択される整数である。さらなる実施形態では、ｎは、３００〜３５００から選択される整数である。またさらなる実施形態では、ｎは、４００〜３２００から選択される整数である。
【０１３４】
組成物：
本明細書に記載される実施形態は、さらに、式Ｉまたは式ＩＩの化合物を含有する組成物に関する。このような組成物は、従来の方法を使用して調製され得る。
【０１３５】
いったん処方されると、式Ｉまたは式ＩＩの化合物の得られたストック組成物は、従来の方法を使用して、例えば、担体、ゲル化剤、皮膚軟化剤、界面活性剤、湿潤剤、粘度増強剤、乳化剤等を使用して、所望の形態、例えば、ゲル、バーム、ローション、クリーム、ペースト、軟膏等へとさらに改変され得る。例えば、ＷＯ２０１１／１２６３８４およびＷＯ２０１３／００４９５３を参照されたい。
【０１３６】
組成物中に使用するための担体には、限定されないが、水、グリセリン、ジグリセリン、グリセリン誘導体、グリコール、グリコール誘導体、糖、エトキシル化および／またはプロポキシル化エステルおよびエーテル、尿素、ＰＣＡナトリウム、アルコール、エタノール、イソプロピルアルコール、ならびにそれらの組み合わせが含まれ得る。一実施形態では、担体は、プロピレングリコールである。典型的には、組成物は、組成物の約１重量％〜組成物の約９９．９重量％、より典型的には、組成物の約２重量％〜組成物の約９５重量％、より典型的には、組成物の約５重量％〜組成物の約９０重量％の量で担体を含有する。
【０１３７】
熱可逆性ゲル化剤は、５０℃等の昇温で親水性担体に可溶性、部分的に可溶性、または混和性である成分として定義され、本薬剤は、２５℃に冷却されたときに担体を増粘する能力を有するが、基質への適用が必要な場合、５０℃では粘性が低くなるだろう。好適な親水性担体には、水、グリコール、例えば、プロピレングリコールが含まれる。組成物中に使用するための熱可逆性ゲル化剤は、ステアリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸カリウム等の脂肪酸の塩を含み得る。これらの塩は、組成物に追加され得るか、または脂肪酸を追加し、かつ適切な塩基で中和することによって、その場で生成され得る。組成物のその場での形成の例は、ステアリン酸および水酸化ナトリウムを提供して、ステアリン酸ナトリウムを生成することである。他の一般的な熱可逆性ゲル化剤には、例えば、ＰＥＧ−２０、ＰＥＧ−１５０ジステアレート、ＰＥＧ−１５０ペンタエリスリチルテトラステアレート、ジステアレス−７５ＩＰＤＩ、ジステアレス−１００ＩＰＤＩ、脂肪アルコール、例えば、セチルアルコール、ステアリン酸等の脂肪酸、ヒドロキシステアリン酸、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの組み合わせ等のポリエチレングリコールおよび誘導体が含まれ得る。
【０１３８】
担体および熱可逆性ゲル化剤に加えて、組成物は、様々な他の成分および構成要素を含有し得る。組成物内に含まれ得る他の成分の例は、皮膚軟化剤、ステロールもしくはステロール誘導体、天然および合成脂肪もしくは油、粘度増強剤、レオロジー改変剤、ポリオール、界面活性剤、アルコール、エステル、シリコン、粘土、デンプン、セルロース、微粒子、保湿剤、フィルム形成剤、スリップ改変剤、表面改変剤、皮膚保護剤、湿潤剤、日焼け止め剤等である。
【０１３９】
薬学的組成物および／または調製物：
本明細書に記載される実施形態は、さらに、式Ｉもしくは式ＩＩの前述の化合物のうちの１つ以上および担体を含む、薬学的組成物および／もしくは調製物に関する。「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合う、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わない、ヒトおよび／もしくは他の哺乳動物の組織と接触して使用するのに好適な化合物、塩、組成物、剤形等を指すために本明細書で用いられる。いくつかの態様では、「薬学的に許容される」とは、連邦もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または哺乳動物（例えば、動物）、より具体的には、ヒトにおいて使用するための米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。
【０１４０】
薬学的組成物は、当該技術分野で知られている任意の好適な手段によって調製され得る。このような組成物の例には、（ａ）局所適用、例えば、物品（例えば、ガーゼ、パッド、スワブ、包帯）、クリーム、軟膏、ゲル、ローション等、（ｂ）非経口投与、例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液としての皮下、筋肉内、もしくは静脈内注射、（ｃ）経口投与、外部適用（例えば、水性および非水性溶液もしくは懸濁液を含むドレン）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、飼料との混合のためのペレット、舌への適用のためのペースト等のために適合されるものが含まれる。
【０１４１】
特定の実施形態では、薬学的組成物は、１つ以上の抗生物質を含み得る。本明細書で使用される場合、「抗生物質」または「抗菌剤」という用語は、微生物の成長を阻害するか、または微生物を破壊する物質を指す。好ましくは、抗生物質は、感染因子の病原性を抑制し、かつ／または感染性疾患を治療するのに有用である。抗生物質はまた、微生物、例えば、酵母または真菌によって生成される天然形態が構造的に修飾された半合成物質を指す。
【０１４２】
好ましくは、抗生物質は、β−ラクタム（β−ラクタマーゼ阻害剤およびセファロスポリンを含む）、フルオロキノロン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、および／もしくはグリシルサイクリン、および／もしくはポリミキシンからなる群から選択される。抗微生物剤の任意の組み合わせ、例えば、少なくとも１つのβ−ラクタムおよび少なくとも１つのフルオロキノロン；少なくとも１つのアミノグリコシドおよび１つのセファロスポリン；少なくとも１つのβ−ラクタムおよび１つのβ−ラクタマーゼ阻害剤はまた、任意選択的にアミノグリコシド等と共に、用いられ得る。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「β−ラクタム」阻害剤という用語には、天然および半合成ペニシリンおよびペニシリン誘導体、例えば、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、プロカインペニシリンおよびオキサシリン、メチシリン、ジクロキサシリンおよびフルクロキサシリン；テモシリン；アモキシシリンおよびアンピシリン；アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリンおよびピペラシリン；ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネムおよびＰＺ−６０１；セファレキシン、セファロチン、セファゾリン、セファクロール、セフロキシム、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セフォタキシム、およびセフポキシム；セフェピムおよびセフピロム；セファドロキシル、セフィキシム、セフプロジル、セファレキシン、セファロチン、セフロキシム、セファマンドール、セフェピムおよびセフピロム；セフォキシチン、セフォテタン、セフメタゾールおよびフロモキセフ；チゲモナム、ノカルジシンＡおよびタブトキシン；クラブラン酸、モクサラクタムおよびフロモキセフが含まれる。フルオロキノロンには、シプロフロキサシン、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、およびモキシフロキサシンが含まれる。アミノグリコシドには、例えば、カナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシンＢ、ネオマイシンＣ、ネオマイシンＥ（パロモマイシン）、および合成誘導体クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンを含むストレプトマイシンが含まれる。テトラサイクリンには、天然に生じる化合物（例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン）または半合成剤（例えば、ライムサイクリン、メクロシン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン）が含まれる。グリシルサイクリン（例えば、ミノサイクリン／チゲサイクリン）は、テトラサイクリンに由来する。ポリミキシンには、例えば、ポリミキシンＢおよびポリミキシンＥ（コリスチン）が含まれる。
【０１４４】
特定の実施形態では、組成物は、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、２２ｍｇ／ｍＬ、２３ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２６ｍｇ／ｍＬ、２７ｍｇ／ｍＬ、２８ｍｇ／ｍＬ、２９ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３１ｍｇ／ｍＬ、３２ｍｇ／ｍＬ、３３ｍｇ／ｍＬ、３４ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、３６ｍｇ／ｍＬ、３７ｍｇ／ｍＬ、３８ｍｇ／ｍＬ、３９ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４１ｍｇ／ｍＬ、４２ｍｇ／ｍＬ、４３ｍｇ／ｍＬ、４４ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で抗体物質を含有し得る。例えば、イミペネムおよびエルタペネムは、５０、３０、２０、１５、１０、５、および１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用され得る。
【０１４５】
創傷包帯：
特定の実施形態では、本明細書に記載されるような創傷包帯材料、例えば、式Ｉまたは式ＩＩの化合物を含む創傷包帯を本明細書に開示する。いくつかの実施形態では、創傷包帯は、本明細書に記載される創傷包帯材料、例えば、式Ｉまたは式ＩＩの化合物から本質的になる。
【０１４６】
一実施形態では、本明細書に開示される創傷包帯は、生体適合性、生分解性、非免疫原性であり、かつ商業的に容易に入手可能である。
【０１４７】
一実施形態では、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物は、任意選択的に、医薬品を含有する、繊維粒子もしくは粉末粒子等の粒子の形態で提供される。具体的には、材料は、好ましくは、ＣＭＣ繊維を含有する。
【０１４８】
組成物は、好ましくは、包帯材料と他の化合物との緊密な混合物を含み得る。例えば、一実施形態では、緊密な混合物は、包帯材料と、溶媒等の好適な賦形剤との混合溶液もしくは分散液、またはこのような溶液もしくは分散液から溶媒を除去することによって生成される固体組成物を含む。この実施形態の下では、包帯材料は、材料の少なくとも５重量％、より好ましくは少なくとも１０重量％、２０重量％、３０重量％、５０重量％、７５重量％、９０重量％以上を構成する。特定の好ましい実施形態では、材料は、包帯材料から本質的になる。
【０１４９】
材料の他の構成要素は、１つ以上の他の生体適合性多糖類、例えば、アルギン酸ナトリウムもしくはアルギン酸カルシウム等のアルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム等のデンプン誘導体、メチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、またはヒアルロン酸もしくはその塩、コンドロイチン硫酸もしくはヘパラン硫酸等のグリコサミノグリカンの０〜２５重量％、例えば、約１〜約２０重量％を含み得る。材料はまた、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、１つ以上の構造プロテインの最大約２５重量％、例えば、約１〜約２０重量％を含み得る。好ましくは、プロテインは、コラーゲンを含み、より好ましくは、コラーゲンから本質的になる。材料はまた、最大約２０重量％、好ましくは、約２重量％〜約１０重量％の水を含み得る。材料はまた、可塑剤、好ましくは、グリセロールまたはソルビトール等の多価アルコールの０〜４０重量％、例えば、約５〜約２５重量％を含有し得る。
【０１５０】
特定の実施形態では、材料はまた、非ステロイド抗炎症剤（例えば、アセトアミノフェン）、ステロイド、局所麻酔剤、抗菌剤、もしくは成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子もしくは血小板由来成長因子）等の１つ以上の治療創傷治癒剤の最大約１０重量％、例えば、約０．０１〜約５重量％、典型的には、約０．１〜約２重量％を含み得る。抗菌剤は、例えば、消毒剤、抗生物質、またはそれらの混合物を含み得る。好ましい抗生物質には、テトラサイクリン、ペニシリン、テラマイシン、エリスロマイシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリマイシンＢ、ムピロシン、クリンダマイシン、およびそれらの混合物が含まれる。好ましい防腐剤には、コロイド銀、材料を構成するアニオンポリマーのうちの１つ以上の塩を含む銀塩、スルファジアジン銀、クロルヘキシジン、ポビドンヨード、トリクロサン、スクラルファート、第４級アンモニウム塩、およびそれらの混合物を含む銀を含む。本発明によるこれらの薬用創傷包帯材料は、使用時に創傷包帯材料が破壊されたときに、治療剤の持続放出を提供する。
【０１５１】
上の百分率の全ては、乾燥重量に基づいている。好ましくは、創傷包帯材料と他の補助剤および材料との重量比は、約１：９９〜約９９：１である。より好ましくは、重量比は、約１：９〜約９：１の範囲であり、より好ましくは、約４：１〜約１：４の範囲であり、さらにより好ましくは、約２：１〜約１：２の範囲である。
【０１５２】
材料は、粉末、マイクロスフェア、フレーク、マット、またはフィルム等の任意の便利な形態であり得る。
【０１５３】
特定の実施形態では、材料は、局所適用のための半固体またはゲル軟膏の形態である。
【０１５４】
特定の実施形態では、材料は、慢性創傷への適用のための凍結乾燥または溶媒乾燥された生体吸収性スポンジの形態である。好ましくは、スポンジの平均細孔サイズは、１０〜５００μｍ、より好ましくは、約１００〜３００μｍの範囲である。好適なスポンジは、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物を含む水性分散液を、好適な治療剤と共に凍結乾燥もしくは溶媒乾燥させることによって作製されている。
【０１５５】
さらに他の実施形態では、材料は、連続的または断続的（例えば、穿孔）であり得る、可撓性フィルムの形態である。可撓性フィルムは、好ましくは、グリセロール等の可撓性にするための可塑剤を含む。
【０１５６】
ある範囲の制御可能な特性を有する両方のゲル形成ポリマー、例えば、セルロース誘導体の利用可能性は、本発明の組成物の特性が例外的な程度にまで制御され得ることを意味する。特に、材料の生物学的吸収速度、多孔度、および密度を制御することができる。
【０１５７】
一実施形態では、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物を含む組成物の活性層を含む、シート形態での創傷包帯材料を本明細書に提供する。活性層は、通常、使用時には創傷接触層であるが、いくつかの実施形態では、液体透過性トップシートによって創傷から分離され得る。一実施形態では、活性層の面積は、約１ｃｍ２〜約４００ｃｍ２、具体的には、約４ｃｍ２〜約１００ｃｍ２である。
【０１５８】
別の実施形態では、創傷包帯材料は、活性層の創傷対面側とは反対側の活性層上に延在する裏当てシートをさらに含む。好ましくは、裏当てシートは、活性層の周りに幅１ｍｍ〜５０ｍｍ、好ましくは、５ｍｍ〜２０ｍｍの周辺領域が延在して、いわゆるアイランド包帯を形成するように、活性層よりも大きい。そのような場合には、裏当てシートは、好ましくは、少なくともその周辺領域に感圧性の医療グレードの接着剤により被覆される。
【０１５９】
包帯材料が裏当てシートを含む実施形態では、バックシートは、実質的に液体不透過性である。別の実施形態では、裏当てシートは、半透過性であり、例えば、裏当てシートは、好ましくは、水蒸気に対して透過性であるが、液体の水または創傷滲出物に対して透過性ではない。好ましくは、裏当てシートは、微生物不透過性でもある。好適な連続適合性裏当てシートは、好ましくは、３７．５℃で、相対湿度差１００％〜１０％で、３００〜５０００ｇ／ｍ２／２４時間、好ましくは、５００〜２０００ｇ／ｍ２／２４時間の単独での裏当てシートの水蒸気透過速度（ＭＶＴＲ）を有するだろう。裏当てシートの厚さは、好ましくは、１０〜１０００マイクロメートル、より好ましくは、１００〜５００マイクロメートルの範囲である。
【０１６０】
開口シートが包帯を通る水分移動を部分的に妨げるため、包帯全体のＭＶＴＲは、裏張りシートのみのＭＶＴＲよりも低い。
【０１６１】
裏張りシートを形成するのに好適なポリマーには、ポリウレタンならびにポリアルコキシアルキルアクリレートおよびメタクリレートが含まれる。好ましくは、裏当てシートは、主に独立気泡である高密度ブロックポリウレタン発泡体の連続層を含む。好適な裏当てシート材料は、ポリウレタンフィルムである。
【０１６２】
接着剤を含む裏当て層を含む創傷包帯では、接着剤層は、水蒸気透過性であり、かつ／または水蒸気の通過を可能にするようにパターン化されるべきである。接着剤層は、好ましくは、アイランド型創傷包帯に対して従来から使用されている種類の連続的な水蒸気透過性の感圧接着剤層、例えば、アクリレートエステルコポリマー、ポリビニルエチルエーテル、およびポリウレタンに基づく感圧接着剤である。ポリウレタンに基づく感圧接着剤は、選択的に使用され得る。
【０１６３】
別の実施形態では、包帯は、活性層と保護シートとの間に構築され得る、多層吸収性物品のさらなる層を含み得る。例えば、これらの層は、使用中の活性層のための支持体を提供するために、開口プラスチックフィルムを含む場合があり、この場合、フィルム内の開口部は、好ましくは、ヒドロゲル層内の開口部と整合する。
【０１６４】
またさらに、他の実施形態では、特に包帯が滲出創傷に使用される場合、包帯は、活性層と保護シートとの間に吸収層を含み得る。任意選択的な吸収層は、ガーゼ、不織布、超吸収剤、ヒドロゲル、およびそれらの混合物を含む、創傷治癒技術における創傷液、血清、または血液を吸収するために従来から使用されている層のうちのいずれかであり得る。好ましくは、吸収層は、開放気泡親水性ポリウレタン発泡体等の吸収性発泡体の層を含む。他の実施形態では、吸収層は、不織繊維ウェブ、例えば、ビスコースステープル繊維のカーディングされたウェブであり得る。
【０１６５】
特定の実施形態では、創傷包帯は、取り外し可能なカバーシートによって保護され得る。カバーシートは、通常、可撓性熱可塑性材料から形成される。好適な材料には、ポリエステルおよびポリオレフィンが含まれる。好ましくは、カバーシートの接着剤に面する表面は、剥離面である。すなわち、カバーシートからのヒドロゲル層の剥離を助けるための、活性層に弱く付着しているのみの表面および裏当てシート上の接着剤。例えば、カバーシートは、フルオロポリマー等の非接着性プラスチックから形成され得るか、またはシリコンもしくはフルオロポリマー剥離被覆等の剥離被覆を備え得る。
【０１６６】
一実施形態では、創傷包帯は、滅菌され、微生物不透過性容器内に包装される。
【０１６７】
キット：
特定の実施形態では、開示される技術は、１つもしくは別個の区画内に、任意選択的に賦形剤、担体、もしくは油と共に、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物を含むキットを提供する。キットは、１つ以上の区画内に、追加の成分、例えば、ゲル化剤、皮膚軟化剤、界面活性剤、湿潤剤、粘度増強剤、乳化剤等をさらに含み得る。キットは、任意選択的に、創傷、例えば、慢性創傷もしくは感染性創傷を診断、検出、もしくは治療するための物品を処方するための説明書を含み得る。キットはまた、創傷の治療において、個々にまたは共にのいずれかで、構成要素を使用するための説明書を含み得る。
【０１６８】
関連する実施形態では、開示される技術は、包装体、および前述の組成物を含む少なくとも１つの吸収性物品（上に記載される）を含むキットを提供する。代わりに、キットは、別々に、任意選択的に二次情報と共に、包装体内または包装体と共に使用可能な個々の構成要素を含み得る。
【０１６９】
本明細書に開示される他の実施形態は、創傷の治療用の包帯の調製のための組成物の使用に関する。好ましくは、創傷は、慢性創傷、例えば、静脈性潰瘍、褥瘡褥瘡、および糖尿病性潰瘍からなる群から選択される創傷である。
【０１７０】
表面：
開示される技術の実施形態は、式Ｉもしくは式ＩＩの前述の化合物を含む表面をさらに提供し、レポーターもしくはペプチドは、パートナー、例えば、酵素への結合を可能にするように配向される。好ましくは、表面は、固体支持体の表面である。多数の多様な固体支持体が、当業者に知られている。有用な固体支持体には、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換および架橋グアーガム、特に硝酸およびカルボン酸とのセルロースエステル、混合セルロースエステル、およびセルロースエーテル等の天然ポリマー炭水化物およびそれらの合成修飾、架橋、もしくは置換誘導体；架橋もしくは修飾ゼラチンを含むプロテインおよび誘導体等の窒素を含有する天然ポリマー；ラテックスおよびゴム等の天然炭化水素ポリマー；ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、およびそれらの部分的に加水分解された誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレートを含むビニルポリマー、ポリエステル、ポリアミド等の上の重縮合物のコポリマーおよびターポリマー、ならびにポリウレタンもしくはポリエポキシド等の他のポリマー等の好適な多孔構造により調製され得る合成ポリマー；硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルカリおよびアルカリ土類金属のケイ酸塩、アルミニウムおよびマグネシウムを含むアルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩もしくは炭酸塩等の多孔無機材料；および粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル、もしくはガラス（これらの材料は、上のポリマー材料と共にフィルターとして使用され得る）等のアルミニウムまたはシリコン酸化物もしくは水和物；ならびに既存の天然ポリマー上の合成ポリマーのポリマー化を初期化することによって得られるグラフトコポリマー等の上のクラスの混合物もしくはコポリマーが含まれる。
【０１７１】
一実施形態では、支持体は、アレイプレートのウェル、例えば、マイクロアレイである。そのようなアレイを構築するための方法は、当該技術分野、例えば、Ｃａｏら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７７（２３）：８２１９−８２２５、２０１１において知られている。式Ｉもしくは式ＩＩの各化合物（もしくはレポーター単独）は、アレイ中の物理的欠陥に起因する不規則なデータを除去するために三重にスポットされ得る。
【０１７２】
システム：
開示される技術の実施形態は、前述の組成物および／またはキットを含む診断システムをさらに提供する。
【０１７３】
診断システムの様々な構成要素は、様々な形態で提供され得る。例えば、式Ｉまたは式ＩＩの化合物（例えば、ペプチドレポーターを含有する化合物）は、凍結乾燥された試薬として提供され得る。これらの凍結乾燥された試薬は、凍結乾燥の前に予備混合され得、その結果、再構成されたときに、それらは、アッセイ中に使用する準備ができた構成要素の各々の適切な比率による完全な混合物を形成する。さらに、本発明の診断システムは、キットの凍結乾燥された試薬を再構成するための再構成試薬を含有し得る。
【０１７４】
本明細書に記載される実施形態は、さらに、ＬＣ検出システムに関する。ＬＣ検出システムは、検出方法として５ＣＢ液晶（ＬＣ）の整列の変化の観察を利用する。このＬＣ検出システムをＣＭＣ構造に適合させるために、切断されるペプチド配列の部分に、脂質が追加される。いったん放出された脂質は、５ＣＢの整列変化を引き起こす。５ＣＢの整列は、交差偏光レンズを通して検出することができ、暗から明への変化を示し、システムは、使用点まで正しい整列でのＬＣの含有を含み、また、検出および／または視覚化のための交差偏光レンズおよび顕微鏡の使用も伴い得る。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、創傷包帯は、式Ｉａの構造を有する創傷包帯材料を含み、
【化１９】
2019509853.tif 000024
式Ｉａ
式中、Ｒは、レポーター分子を含む領域であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０であり、ｎは、２００〜４０００から選択される整数である。さらなる実施形態では、ｎは、３００〜３５００から選択される整数である。またさらなる実施形態では、ｎは、４００〜３２００から選択される整数である。いくつかの実施形態では、Ｒは、レポーター分子および少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド領域である。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、創傷包帯は、式Ｉｂの構造を有する創傷包帯材料を含み、
【化２０】
2019509853.tif 000025
式Ｉｂ
式中、Ｒは、レポーター分子を含む領域であり、ｎは、２００〜４０００から選択される整数である。さらなる実施形態では、ｎは、３００〜３５００から選択される整数である。またさらなる実施形態では、ｎは、４００〜３２００から選択される整数である。いくつかの実施形態では、Ｒは、レポーター分子および少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド領域である。いくつかの実施形態では、Ｒは、レポーター分子および１つのアミノ酸を含むペプチド領域である。
【０１７７】
別の態様では、式ＩＩの構造を有する創傷包帯材料であって、
【化２１】
2019509853.tif 000026
式ＩＩ
式中、Ｍが、ゲル形成ポリマーであり、ＰＥＰが、レポーター分子および少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド領域であり、Ｌは、ＭとＰＥＰとを繋ぐリンカーである、創傷包帯材料を含む創傷包帯を本明細書に提供する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、創傷包帯は、式ＩＩａの構造を有する創傷包帯材料を含み、
【化２２】
2019509853.tif 000027
式ＩＩａ
式中、Ｍは、セルロース、化学修飾セルロース、ペクチン、アルギン酸塩、キトサン、修飾キトサン、ヒアルロン酸、多糖類、もしくはガム由来ポリマー、ＣＥＳ、酸化セルロース（もしくはその誘導体）、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるゲル形成ポリマーであり、ＰＥＰは、レポーター分子および少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド領域であり、Ｌは、ＭとＰＥＰとを繋ぐリンカーであり、Ｌは、１つ以上のポリエチレングリコール亜単位もしくはポリプロピレン亜単位を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、創傷包帯は、式ＩＩｂの構造を有する創傷包帯材料を含み、
【化２３】
2019509853.tif 000028
式ＩＩｂ
式中、ＰＥＰは、レポーター分子および少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド領域であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０であり、ｎは、２００〜４０００から選択される整数である。さらなる実施形態では、ｎは、３００〜３５００から選択される整数である。またさらなる実施形態では、ｎは、４００〜３２００から選択される整数である。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、創傷包帯は、式ＩＩｃの構造を有する創傷包帯材料を含み、
【化２４】
2019509853.tif 000029
式ＩＩｃ
式中、ＰＥＰは、レポーター分子および少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド領域であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０であり、ｎは、２００〜４０００から選択される整数である。さらなる実施形態では、ｎは、３００〜３５００から選択される整数である。またさらなる実施形態では、ｎは、４００〜３２００から選択される整数である。
【０１８１】
式Ｉもしくは式ＩＩの化合物を作製する方法：
本明細書で提供される実施形態は、さらに、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物であって、それらの前駆体を含む式Ｉもしくは式ＩＩの化合物を作製する方法に関する。「前駆体」という用語は、中間生成物または最終生成物を生成するための反応物として用いられる任意の化合物を含む。
【０１８２】
一実施形態では、構造Ｍ−Ｒを含む式Ｉの化合物を作製する方法であって、Ｍが、セルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、酸化セルロース（もしくはその誘導体）、セルロースエチルスルホネート（ＣＥＳ）、ペクチン、アルギン酸塩、キトサン、修飾キトサン、ヒアルロン酸、多糖類、もしくはガム由来ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせもしくは混合物からなる群から選択される複数のモノマーを含むゲル形成ポリマーであり、Ｒが、例えば、共有結合を介して、ゲル形成ポリマーをレポーター分子に接合することを含む、レポーター分子である、方法を本明細書に提供する。一実施形態では、レポーターＲは、創傷特異的マーカー、例えば、先に記載されるように、加水分解酵素等の創傷特異的酵素、より具体的には、プロテアーゼに対する基質である。この実施形態の下では、創傷特異的マーカーに対する基質は、例えば、アミノ酸、糖、ペプチド、多糖類、核酸、脂質、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１８３】
一実施形態では、ゲル形成ポリマーは、ペプチド、グリコシド、アミド、エステル、エーテル、無水物、または同様の結合を介してレポーター分子に接合する。本明細書で使用される場合、「ペプチド結合」は、一方の酸部分が他方のアミノ部分と反応して、２つのアミノ酸間のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を生成する、２つのアミノ酸間の縮合反応によって形成される。本明細書で使用される場合、「グリコシド結合」は、単糖類（もしくは単糖類に由来する分子）のヘミアセタールもしくはヘミケタール基と、アルコール等のいくつかの化合物のヒドロキシル基との間に形成される。グリコシド結合を含む物質は、グリコシドである。「グリコシド」という用語は、糖のヘミアセタール（もしくはヘミケタール）基と、−ＳＲ（チオグリコシド）、−ＳｅＲ（セレノグリコシド）、−ＮＲ１Ｒ２（Ｎ−グリコシド）、もしくはさらには−ＣＲ１Ｒ２Ｒ３（Ｃ−グリコシド）等のヒドロキシル以外のいくつかの化学基との間に形成される結合を有する化合物も含むように、これより延長される。本明細書で使用される場合、「アミド」という用語は、−Ｎ（Ｒ１）−−Ｃ（＝Ｏ）−−または−−Ｃ（＝Ｏ）−−Ｎ（Ｒ１）−−のいずれかを指し、Ｒ１は、水素ならびに他の基を含むように本明細書で定義される。「置換アミド」という用語は、Ｒ１が水素ではない状況を指し、「未置換アミド」という用語は、Ｒ１が水素である状況を指す。「エステル」という用語は、少なくとも１つのヒドロキシル基がアルコキシ基で置換された酸（有機または無機）に由来する化合物を指す。エステルは、一般式−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ１またはＲ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−を有し、Ｒ１は、水素ならびに他の基を含むように定義される。「エステル」の代表的な種類には、限定されないが、カルボン酸、リン酸、ホスフィン酸、ホスホン酸、スルホン酸、スルフィン酸、およびボロン酸を含む、限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキル、および酸性基のヘテロシクリルエーテルが含まれる。「スルホニル」という用語は、式−ＳＯ２−アルキルもしくは−ＳＯ２−アリールの基を表し、式中、「アルキル」は、直鎖部分、分岐部分、もしくは環状部分、またはそれらの組合せを有する飽和一価炭化水素基を含み、１〜２０個の炭素原子、好ましくは、１〜５個の炭素原子を含有し、「アリル」は、ハロゲン基、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ニトロ、シアノ、アシル、アシルオキシ、スルホニル、スルフィニル、アルキルアミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、アミド、スルホン酸、スルホンアミド、アルキルチオ、オキシエステルから独立して選択される、１〜５個の置換基によって任意選択的に置換される、フェニルもしくはナフチル等の１つの水素の除去による芳香族炭化水素に由来する有機ラジカルを含む。「スルフィニル」という用語は、式−ＳＯ−アルキルまたは−ＳＯ−アリールの基を表し、式中、「アルキル」および「アリール」は上で定義されている。「スルホンアミド」という用語は、式−ＳＯ２ＮＨ２の基を表す。「オキシエステル」という用語は、式−Ｏ−ＣＯＯ−アルキルまたは−Ｏ−ＣＯＯ−アリールの基を意味し、式中、「アルキル」および「アリール」は、上で定義されている。「エーテル」という用語は、式アルキル−Ｏ−アルキルもしくはアルキル−Ｏ−アリールもしくはアリール−Ｏ−アリールの基を意味し、式中、「アルキル」および「アリール」は、上で定義されている。「アミド」という用語は、式−ＣＯＮＲＲ’の基を意味し、式中、ＲおよびＲ’は、水素、「アルキル」、または「アリール」から独立して選択される。「オキシアミド」という用語は、式−Ｏ−ＣＯＮＲＲ’の基を意味し、式中、ＲおよびＲ’は、水素、「アルキル」、または「アリール」から独立して選択される。本明細書で使用される場合、「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−アルキル基を含み、「アルキル」は、上で定義されている。本明細書で使用される場合、「アルキルチオ」という用語は、アルキル基を含み、「アルキル」は、上で定義されている。本明細書で使用する場合、「アルキルアミノ」という用語は、−ＮＨアルキルまたは−Ｎ（アルキル）２基を含み、「アルキル」は、上で定義されている。
【０１８４】
グリコシド、ペプチド、エステル、オキシエステル、アミド、アミド、オキシアミド、エーテル、スルホニル、スルフィニル、スルホンアミド、またはアルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ等の他の結合を生成するための反応性部分を接合するための方法は、当該技術分野で知られており、実施例にさらに記載される。
【０１８５】
別の実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを含む式Ｉの化合物を作製する方法であって、式中、ＭおよびＲが、各々、先に記載されるとおりであり、Ｌが、中性ポリマーのモノマーもしくはポリマー、例えば、エトキシル化多価アルコール、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、ならびにそれらのエーテル、アミド、およびエステルからなる群から選択されるポリマーであるリンカーである、方法を本明細書に提供する。
【０１８６】
一実施形態では、Ｍは、第１のエステル、オキシエステル、アミド、アミド、オキシアミド、エーテル、スルホニル、スルフィニル、スルホンアミド、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、または同様の結合を介して、Ｌに接合する。同様に、この実施形態の下では、リンカーＬは、第２のエステル、オキシエステル、アミド、アミド、オキシアミド、エーテル、スルホニル、スルフィニル、スルホンアミド、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、または同様の結合を介して、レポーター領域Ｒに接合する。２つの結合は、同一であり得るか、または異なっていてもよく、例えば、Ｍは、エステル結合を介してＬに接合し得、Ｌは、ペプチド結合を介してＲに接合し得る。
【０１８７】
一実施形態では、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを有する式Ｉの化合物は、最初にゲル形成ポリマーＭをリンカーＬに接合して、前駆体Ｍ−Ｌを生成し、次に前駆体Ｍ−Ｌをレポーター領域Ｒに接合して、式Ｉの化合物を生成することによって合成される。
【０１８８】
代わりに、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを有する式Ｉの化合物は、最初にリンカーＬをレポーター領域Ｒに接合して、前駆体Ｌ−Ｒを生成し、次にこれをゲル形成ポリマーＭに接合して、式Ｉの化合物を生成することによって合成される。
【０１８９】
またさらに、構造Ｍ−Ｌ−Ｒを有する式Ｉの化合物は、単一の反応チャンバまたは複数の反応チャンバ内で合成され得る。
【０１９０】
式Ｉの化合物の合成に用いられる可能性のある反応スキームの代表的な逆合成の概要を以下に提示する：
【０１９１】
逆合成スキームＩ
【化２５】
2019509853.tif 000030
【０１９２】
診断および治療方法：
一実施形態では、本明細書に記載される組成物、包帯材料、物品、キット、およびシステムは、創傷、特に慢性創傷もしくは感染性創傷の診断もしくは治療に有用である。任意の種類の創傷を診断および／または治療することができるが、実施形態は、創傷液を滲出させる創傷の診断および治療に特に好適である。例えば、創傷は、慢性創傷または急性創傷であり得る。慢性創傷の代表的な例には、例えば、静脈性潰瘍、褥瘡、褥瘡潰瘍、糖尿病性潰瘍、および未知病因の慢性潰瘍が含まれる。急性創傷の代表的な例には、おそらく意図的な手術切開の結果としての、例えば、急性外傷性裂傷が含まれる。
【０１９３】
本明細書で使用される場合、「創傷液」という用語は、創傷の表面に存在するか、または吸引、吸収、もしくは洗浄によって創傷表面から除去される任意の創傷滲出液もしくは他の液体（好適には実質的に血液を含まない）を指す。判定、測定、もしくは定量化は、患者の体から除去された創傷液に対して好適に実行されるが、創傷液に対してその場で実施することもできる。「創傷液」という用語は、通常、創傷部位から離れた血液または組織の血漿を意味しない。創傷液は、哺乳動物の創傷液、好適にはヒトの創傷液である。
【０１９４】
一実施形態では、診断方法は、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物、そのような化合物を含む包帯材料、そのような材料もしくは化合物を含む物品、そのような材料もしくは化合物を含むキット、または本明細書に記載されるそのような材料もしくは化合物を含むシステムを含む、少なくとも１つの組成物と創傷を接触させることと、創傷に関連するパラメータを測定することと、を含む。特定の実施形態では、測定されるパラメータは、創傷特異的加水分解酵素のレベルまたは活性である。具体的には、測定されるパラメータは、加水分解酵素の活性である。
【０１９５】
前述の実施形態では、測定は、その場でまたはその場以外のいずれかで行うことができる。本明細書で使用される場合、「その場で」という用語は、周囲環境を含むシステムもしくはデバイスの文脈内で存在するか、もしくは起こる過程、事象、対象、もしくは構成要素、例えば、組成物、物品、システム、もしくはデバイスが接触している生物学的材料を指す。一例として、その場での反応は、ヒトの皮膚組織によって提供される構成要素（例えば、酵素を含有する創傷滲出液）を含む、デバイス（例えば、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物）内に存在する様々な構成要素の反応を指し得る。用語は、外部環境を指す、その場以外とは対照的である。
【０１９６】
第２の実施形態では、測定は、例えば、本発明の装置またはデバイスにおける分析のために創傷から液体を除去する等、その場以外で実施される。
【０１９７】
好適には、その場で測定が行われる。
【０１９８】
１つの診断的実施形態では、本方法は、レポーター、例えば、創傷特異的酵素によって作用される基質の生成物のレベルを判定することを含む。より具体的には、本方法は、加水分解酵素生成物のレベルを判定することを含む。本明細書で使用される場合、「判定する」という用語は、当該加水分解酵素の活性もしくはレベルの数値を測定することと、活動もしくはレベルが所定の範囲を上回るか、もしくは下回るかを確立することと、および／または活動もしくはレベルの数値を対照標準と比較することと、を含む。対照標準は、非創傷部位もしくは健常な対象から得られた生検材料中の加水分解酵素のレベルもしくは活性を判定することを含み得る。
【０１９９】
特定の一実施形態では、「判定する」という用語は、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストメリシン１）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、カテプシンＧ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、およびリゾチーム、もしくはそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの創傷特異的プロテアーゼのパラメータ（例えば、活性もしくはレベル）を測定することと、当該パラメータが第１の所定の閾値を超えた場合に確立することと、および／またはパラメータの数値を対照標準と比較することと、を含む。対照標準は、非創傷部位または健常な対象から得られた生検材料中のプロテアーゼのパラメータを判定することを含み得る。関連する実施形態では、「判定する」という用語は、複数の前述のプロテアーゼに関連するパラメータの加重平均（加重合計）が当該加重平均の所定の閾値を超えたかどうかを確立することを含む。
【０２００】
特定の一実施形態では、パラメータは、創傷液中の分析物（例えば、プロテアーゼ）の活性レベルである。典型的には、個々の分析物の活性は、単位／ｍＬの言葉で表現される。
【０２０１】
別の実施形態では、パラメータは、創傷液中の分析物（例えば、プロテアーゼ）のレベルである。典型的には、量という用語はまた、特定の分析物の活性を示す。
【０２０２】
本明細書で使用される場合、「合わせ量」または「合わせ活性」という用語は、複数の値、例えば、多数の個々の分析物について得られた量に対する数学的関数の適用から生じる単一の数値を指す。例えば、「合わせ量」もしくは「合わせ活性」という用語は、個々の値の群の合計もしくは積を指し得る。典型的には、「合わせ量」または「合わせ活性」という用語は、個々の値の群の合計を指す。例えば、好適な実施形態では、エラスターゼの量は、エラスターゼ状活性（例えば、Ｕ／ｍＬ）を指し、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の量は、それぞれの分析物の全濃度（例えば、ｎｇ／ｍＬでの）を指す。
【０２０３】
本明細書で使用される場合、「定量化する」という用語は、実験誤差の限度内で、サンプル中の特定の分析物（複数可）または基質（複数可）の絶対的な数量を測定することを指す。
【０２０４】
「マーカー」もしくは「分析物」という用語は、本明細書で定義される装置、デバイス、キット、もしくは方法を使用して同定もしくは判定される任意の化学物質を指す。本発明の装置、デバイス、キット、もしくは方法によって判定もしくは同定されたマーカーもしくは分析物は、前述の酵素の切断生成物である。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、「所定の範囲」という用語は、患者の特定のサブクラスを示す、当業者が理解するであろうデータ範囲またはプロファイルを指す。例えば、所定の範囲は、抗生物質治療等の特定の創傷治療に良好に反応するであろう創傷に典型的なデータ範囲またはプロファイルであり得る。代替的に、所定の範囲は、抗生物質治療等の特定の創傷治療に良好に反応しないであろう創傷に典型的なデータ範囲を好適に指し得る。
【０２０６】
本明細書で使用される場合、「所定の閾値」という用語は、例えば、上でさらに説明されるように、既知の治癒創傷および非治癒創傷に対して判定されたレベルの統計的分析に基づく非治癒創傷を示す、当業者が判定するであろう最小レベルを指す。試験が臨床的に有用であるためには、高いプロテアーゼ活性を有する非治癒創傷が正しく同定されるように、閾値を適切なレベルに設定しなければならない。閾値を上げると、非治癒創傷のみが閾値を上回る可能性が高くなるだろう。しかしながら、閾値が過度に高いと、高レベルのプロテアーゼに起因する非治癒創傷は、同定されず、臨床的にはこれは、必要なプロテアーゼ調節治療を受けないことを意味するだろう。
【０２０７】
本明細書で使用される場合、「対照標準」もしくは「対照群」という用語は、別のデータ点もしくはデータセットを定義もしくは正規化するために、参照もしくは比較として使用され得るデータセットもしくはプロファイルを指す。例えば、「対照群」もしくは「対照標準」という用語は、患者の特定のサブクラスを示すデータセットもしくはプロファイルであり得る。好適には、対照標準は、治癒創傷状態もしくは非治癒創傷状態を示すデータセットもしくはプロファイルであり得る。
【０２０８】
好適には、本発明の他の態様もしくは実施形態では、「対照群」もしくは「対照標準」は、当業者が、創傷が抗生物質治療等の創傷治療に反応性もしくは非反応性である可能性が高いかどうかを判定することを可能にするための比較ツールとして使用することができるデータセットもしくはプロファイルであり得る。一実施形態では、対照標準は、創傷治療に良好に反応しない患者を示すデータセットまたはプロファイルである。典型的には、対照標準は、創傷治療に良好に反応する患者を示すデータセットまたはプロファイルである。本明細書に開示されるような創傷治療に良好に反応する傾向がある患者は、治療に良好に反応しない傾向がある患者よりも低い加水分解酵素の合わせ量または合わせ活性を示す。例えば、本明細書に開示されるような創傷治療に良好に反応する傾向がある患者は、少なくとも１つの創傷特異的加水分解酵素のより低い合わせ量を示す。
【０２０９】
一実施形態では、閾値マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）活性は、例えば、約６Ｕ／ｍＬ、約７Ｕ／ｍＬ、約８Ｕ／ｍＬ、約９Ｕ／ｍＬ、約１０Ｕ／ｍＬ、約１１Ｕ／ｍＬ、約１２Ｕ／ｍＬ、約１３Ｕ／ｍＬ、約１４Ｕ／ｍＬ、約１５Ｕ／ｍＬ、約１６Ｕ／ｍＬ、約１７Ｕ／ｍＬ、約１８Ｕ／ｍＬ、約１９Ｕ／ｍＬ、約２０Ｕ／ｍＬ、約２１Ｕ／ｍＬ、約２２Ｕ／ｍＬ、約２３Ｕ／ｍＬ、約２４Ｕ／ｍＬ、約２５Ｕ／ｍＬ以上の間の全ての値を含む、約５Ｕ／ｍＬ〜約３０Ｕ／ｍＬであり、慢性創傷感染を示す。当該技術分野で理解されているように、活性の単位（Ｕ）は、典型的には、酵素触媒活性を記載するために使用され、単位（Ｕ）は、１マイクロモル（μｍｏｌｅ）の基質の１分当たりの変換を触媒する酵素の量を指す。よって、１酵素単位（Ｕ）＝１μｍｏｌ／分であり、μｍｏｌは、変換された基質の量を指す。
【０２１０】
一実施形態では、閾値ヒト好中球エラスターゼ活性は、例えば、約６Ｕ／ｍＬ、約７Ｕ／ｍＬ、約８Ｕ／ｍＬ、９Ｕ／ｍＬ、約１０Ｕ／ｍＬ、約１１Ｕ／ｍＬ、約１２Ｕ／ｍＬ、約１３Ｕ／ｍＬ、約１４Ｕ／ｍＬ、約１５Ｕ／ｍＬ、約１６Ｕ／ｍＬ、約１７Ｕ／ｍＬ、約１８Ｕ／ｍＬ、約１９Ｕ／ｍＬ、約２０Ｕ／ｍＬ、約２１Ｕ／ｍＬ、約２２Ｕ／ｍＬ、約２３Ｕ／ｍＬ、約２４Ｕ／ｍＬ、約２５Ｕ／ｍＬ以上の間の全ての値を含む、約５Ｕ／ｍＬ〜約３０Ｕ／ｍＬであり、慢性創傷感染を示す。
【０２１１】
特定の一実施形態では、少なくとも９．６の閾値ヒト好中球エラスターゼ活性レベルは、慢性創傷感染を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも２２．９Ｕ／ｍＬのヒト好中球エラスターゼ活性レベルは、慢性創傷感染を示す。
【０２１２】
一実施形態では、例えば、約１１００Ｕ／ｍＬ、約１２００Ｕ／ｍＬ、約１３００Ｕ／ｍＬ、約１４００Ｕ／ｍＬ、約１５００Ｕ／ｍＬ、約１６００Ｕ／ｍＬ、約１７００Ｕ／ｍＬ、約１８００Ｕ／ｍＬ、約１９００Ｕ／ｍＬ、約２０００Ｕ／ｍＬ、約２１００Ｕ／ｍＬ、約２２００Ｕ／ｍＬ、約２３００Ｕ／ｍＬ、約２４００Ｕ／ｍＬ、約２５００Ｕ／ｍＬ、約２６００Ｕ／ｍＬ、約２７００Ｕ／ｍＬ、約２８００Ｕ／ｍＬ、約２９００Ｕ／ｍＬ、約３０００Ｕ／ｍＬ、約３２５０Ｕ／ｍＬ、約３５００Ｕ／ｍＬ、約３７５０Ｕ／ｍＬ、約４０００Ｕ／ｍＬ、約４２５０Ｕ／ｍＬ、約４５００Ｕ／ｍＬ、約４７５０Ｕ／ｍＬ、約５０００Ｕ／ｍＬ、約５２５０Ｕ／ｍＬ、約５５００Ｕ／ｍＬ、約５７５０Ｕ／ｍＬ、約６０００Ｕ／ｍＬ以上の間の全ての値を含む、約１０００Ｕ／ｍＬ〜約１００００Ｕ／ｍＬの閾値リゾチーム活性レベルは、慢性創傷感染を示す。特定の一実施形態では、少なくとも４８００Ｕ／ｍＬのリゾチーム活性レベルは、慢性創傷感染を示す。
【０２１３】
一実施形態では、例えば、約１５Ｕ／ｍＬ、約２０Ｕ／ｍＬ、約２５Ｕ／ｍＬ、約３０Ｕ／ｍＬ、約３５Ｕ／ｍＬ、約４０Ｕ／ｍＬ、約４５Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ、約５５Ｕ／ｍＬ、約６０Ｕ／ｍＬ、約６５Ｕ／ｍＬ、約７０Ｕ／ｍＬ、約７５Ｕ／ｍＬ、約８０Ｕ／ｍＬ、約８５Ｕ／ｍＬ、約９０Ｕ／ｍＬ、約９５Ｕ／ｍＬ、約１００Ｕ／ｍＬ、約１１０Ｕ／ｍＬ、約１２０Ｕ／ｍＬ以上の間の全ての値を含む、約１０Ｕ／ｍＬ〜約１００Ｕ／ｍＬの閾値カテプシンＧ活性レベルは、慢性創傷感染を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも５０Ｕ／ｍＬ、少なくとも４０Ｕ／ｍＬ、少なくとも３０Ｕ／ｍＬ、少なくとも２０Ｕ／ｍＬ、少なくとも１５Ｕ／ｍＬ、または少なくとも１０Ｕ／ｍＬのカテプシンＧ活性レベルは、慢性創傷感染を示す。
【０２１４】
本明細書に開示される実施形態は、本明細書に記載される組成物、材料、物品、包帯、キット、および／もしくはシステムを使用する慢性創傷もしくは感染性創傷の治療に関する。治療的実施形態は、本発明の組成物、材料、物品、包帯、キット、システム、またはデバイスを、それらを必要とする対象に接触させることを含む。任意選択的に、本方法は、対象が治療に反応しているかどうかの判定を含み得る。
【０２１５】
当業者であれば、創傷が「治療に反応性である」か否かを容易に識別することができるだろう。具体的には、当業者であれば、創傷治療、具体的には酸化セルロースを含む創傷包帯による治療に対する良好な反応もしくは不良な反応を予測するか、もしくは示す、本特許請求の範囲において同定されるプロテアーゼのレベルを容易に判定することができるだろう。本明細書で使用される場合、「反応性」および「反応物（複数可）」という用語は、創傷治療、具体的には薬剤、例えば、抗生物質による治療に良好に反応すると考えられる創傷を指す。同様に、「非反応性」および「非反応物（複数可）」は、創傷治療、具体的には薬剤、例えば、抗生物質による治療に良好に反応するとは考えられない創傷を指す。例えば、創傷治療の４週間後に５０％より良好な創傷閉鎖を示す患者は、当該治療に反応性であると考えられる。
【０２１６】
特定の実施形態では、患者は、本明細書に記載される組成物、物品、システム、またはデバイスにより同時に診断および治療され得る。本明細書で使用される場合、「同時に」という用語は、記載される目的、例えば、診断および治療を共に実施することを意味する。
【０２１７】
特定の実施形態では、患者は、本明細書に記載される組成物、物品、システム、またはデバイスにより順次診断および治療され得る。本明細書で使用される場合、「順次」という用語は、記載される目的、例えば、診断および治療が、時間的もしくは空間的に分離されること、例えば、治療前の診断もしくは治療後の診断、またはそれらの組み合わせ、例えば、１番目の診断＝＝＞治療＝＝＞２番目の診断を意味する。
【０２１８】
本明細書に記載される実施形態は、さらに、介護者または患者が、創傷が治癒していない可能性が高いかどうかを迅速かつ信頼可能に判定し、この判定に基づいて適切な治療を選択することを可能にする。例えば、非治癒創傷は、治癒を促進するために、特定の治療剤を含む創傷包帯等の特異的創傷包帯の適用を必要とする場合がある。したがって、本明細書に記載される実施形態は、創傷、例えば、慢性創傷もしくは感染性創傷の治療方法であって、創傷が治癒しているか、もしくは治癒していないかどうかを判定することと、続いて、治癒していない場合、治療剤を含む創傷包帯を創傷に適用することと、を含む、方法をさらに提供する。
【０２１９】
本明細書に記載される実施形態は、感染性創傷の診断または検出のための方法およびアッセイを提供する。本方法は、細菌性感染因子の検出に好適である。一実施形態では、創傷をグラム陰性細菌に感染させる。典型的なグラム陰性細菌には、大腸菌、サルモネラ、シュードモナス、およびヘリコバクター、ならびに藍色細菌が含まれる。薬剤に関連して分類される場合、それらには、呼吸器系の障害を引き起こす緑膿菌およびインフルエンザ菌、泌尿器系の障害を引き起こす大腸菌およびミラビリス変形菌、および髄膜炎菌、カタラリス菌、および淋菌等の消化系および小球菌の障害を引き起こすピロリ菌およびゲルトネル菌が含まれる。
【０２２０】
別の実施形態では、創傷をグラム陽性細菌に感染させる。「グラム陽性細菌」とは、テイコ酸（例えば、リポタイコ酸および／もしくは壁テイコ酸）または機能的に等価な糖ポリマー（例えば、ラムノ多糖類、テイクロン酸、アラビノガラクタン、リポマンナン、およびリポアラビノマンナン）を細菌の細胞壁中に含有する細菌もしくは複数の細菌を意味する。機能的に等価なグリコポリマーの非限定的な例は、Ｗｅｉｄｅｎｍａｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、６：２７６−２８７、２００８に記載されている。
【０２２１】
細菌には、哺乳動物宿主（例えば、ウシ、ネズミ、ウマ、霊長類、ネコ、イヌ、およびヒトの宿主）に感染する病原性細菌が含まれる。このような病原性細菌の例には、例えば、バクテロイデス、クロストリジウム、ストレプトコッカス、ブドウ球菌、シュードモナス、ヘモフィルス、レジオネラ、抗酸菌、エシェリキア、サルモネラ、シゲラ、ビブリオ、またはリステリア等の細菌種のメンバーが含まれる。ヒト宿主中に疾患を引起こす病原性細菌のいくつかの臨床的に関連する例には、限定されないが、炭疽菌、セレウス菌、百日咳菌、ライム病ボレリア、ウシ流産菌、イヌ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、カンピロバクター・ジエジユニ、クラミジア・ニューモニエ、オウム病クラミジア、クラミジア・トラコマチス、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシレ、ウェルシュ菌、破傷風菌、ジフテリア菌、大便連鎖球菌、バンコマイシン耐性腸球菌、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、病原性大腸菌、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、野兎病菌、インフルエンザ菌、ピロリ菌、レジオネラ・ニューモフィラ、病原性レプトスピラ、リステリア菌、ハンセン菌、ヒト型結核菌、マイコプラズマ・ニューモニエ、淋菌、髄膜炎菌、プロテウス、緑膿菌、リケッチア・リケッチイ、チフス菌、ネズミチフス菌、ソンネ赤痢菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＳＡ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、梅毒トレポネーマ、ビブリオコレラ、およびエルシニア・ペスティスが含まれる。
【０２２２】
別の実施形態では、感染性細菌は、クロストリジウム・ディフィシル、カルバペネム耐性腸内細菌（ＣＲ−クレブシエラ属種；ＣＲ−Ｅ大腸菌）、および淋菌からなる群から選択される。別の実施形態では、感染性細菌は、多剤耐性アシネトバクター、薬剤耐性カンピロバクター、拡張スペクトルβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）生成腸内細菌科、バンコマイシン耐性腸球菌、多剤耐性緑膿菌、薬剤耐性非チフス性サルモネラ、薬剤耐性チフス菌、薬剤耐性シゲラ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、薬剤耐性肺炎連鎖球菌、および薬剤耐性結核からなる群から選択される。別の実施形態では、感染性細菌は、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、エリスロマイシン耐性Ａ群ストレプトコッカス、クリンダマイシン耐性Ｂ群ストレプトコッカスからなる群から選択される。
【０２２３】
特定の実施形態では、慢性創傷または感染性創傷は、宿主対象中に見られる。好ましくは、宿主は、哺乳動物、例えば、げっ歯類、ヒト、家畜動物、コンパニオン動物、または非家畜もしくは野生動物である。一実施形態では、対象は、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、モルモット等であり得る。別の実施形態では、対象は、家畜動物であり得る。好適な家畜動物の非限定的な例には、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、およびアルパカが含まれ得る。また別の実施形態では、対象は、コンパニオン動物であり得る。コンパニオン動物の非限定的な例には、イヌ、ネコ、ウサギ、およびトリ等のペットが含まれ得る。また別の実施形態では、対象は、動物園動物であり得る。本明細書で使用される場合、「動物園動物」は、動物園で見られ得る動物を指す。そのような動物には、非ヒト霊長類、大きなネコ、オオカミ、およびクマが含まれ得る。例示的な実施形態では、対象は、ヒトである。
【０２２４】
一態様では、哺乳動物の創傷における１つ以上の酵素のレベルを検出する方法であって、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料を１つ以上の参照サンプルと視覚的に比較するステップと、（ｃ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定性的判定を得るステップと、を含む、方法を本明細書に提供する。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、哺乳動物の創傷における１つ以上の酵素のレベルを検出する方法は、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料を１つ以上の参照サンプルと視覚的に比較するステップと、（ｃ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定性的判定を得るステップと、から本質的になる。
【０２２６】
別の態様では、哺乳動物の創傷における１つ以上の酵素のレベルを検出する方法であって、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定量的判定を得るステップと、（ｃ）定量的判定を１つ以上の参照サンプルと比較するステップと、を含む、方法を本明細書に提供する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、哺乳動物の創傷における１つ以上の酵素のレベルを検出する方法は、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定量的判定を得るステップと、（ｃ）定量的判定を１つ以上の参照サンプルと比較するステップと、から本質的になる。
【０２２８】
一態様では、哺乳動物の創傷における１つ以上のプロテアーゼのレベルを検出する方法であって、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料を１つ以上の参照サンプルと視覚的に比較するステップと、（ｃ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定性的判定を得るステップと、を含む、方法を本明細書に提供する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、哺乳動物の創傷における１つ以上のプロテアーゼのレベルを検出する方法は、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料を１つ以上の参照サンプルと視覚的に比較するステップと、（ｃ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定性的判定を得るステップと、から本質的になる。
【０２３０】
別の態様では、哺乳動物の創傷における１つ以上のプロテアーゼのレベルを検出する方法であって、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定量的判定を得るステップと、（ｃ）定量的判定を１つ以上の参照サンプルと比較するステップと、を含む、方法を本明細書に提供する。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、哺乳動物の創傷における１つ以上のプロテアーゼのレベルを検出する方法は、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定量的判定を得るステップと、（ｃ）定量的判定を１つ以上の参照サンプルと比較するステップと、から本質的になる。
【０２３２】
別の態様では、哺乳動物の慢性創傷を診断するための方法であって、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料を１つ以上の参照サンプルと視覚的に比較するステップと、（ｃ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定性的判定を得るステップと、を含む、方法を本明細書に提供する。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、哺乳動物の慢性創傷を診断するための方法は、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料を１つ以上の参照サンプルと視覚的に比較するステップと、（ｃ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定性的判定を得るステップと、から本質的になる。
【０２３４】
別の態様では、哺乳動物の慢性創傷を診断するための方法であって、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定量的判定を得るステップと、（ｃ）定量的判定を１つ以上の参照サンプルと比較するステップと、を含む、方法を本明細書に提供する。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、哺乳動物の慢性創傷を診断するための方法は、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定量的判定を得るステップと、（ｃ）定量的判定を１つ以上の参照サンプルと比較するステップと、から本質的になる。
【０２３６】
別の態様では、哺乳動物の創傷を治療するための方法であって、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料を１つ以上の参照サンプルと視覚的に比較するステップと、（ｃ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定性的判定を得るステップと、（ｄ）哺乳動物に医療処置を施すステップであって、医療処置が、哺乳動物の創傷が慢性であることをレポーター分子の濃度が示す場合にのみ抗菌薬治療を含む、施すステップと、を含む、方法を本明細書に提供する。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、哺乳動物の創傷を治療するための方法は、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料を１つ以上の参照サンプルと視覚的に比較するステップと、（ｃ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定性的判定を得るステップと、（ｄ）哺乳動物に医療処置を施すステップであって、医療処置が、哺乳動物の創傷が慢性であることをレポーター分子の濃度が示す場合にのみ抗菌薬治療を含む、施すステップと、から本質的になる。
【０２３８】
別の態様では、哺乳動物の創傷を治療するための方法であって、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定量的判定を得るステップと、（ｃ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料を１つ以上の参照サンプルと比較するステップと、（ｄ）哺乳動物に医療処置を施すステップであって、医療処置が、哺乳動物の創傷が慢性であることをレポーター分子の濃度が示す場合にのみ抗菌薬治療を含む、施すステップと、を含む、方法を本明細書に提供する。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、哺乳動物の創傷を治療するための方法は、（ａ）本明細書に記載される創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させて配置するステップと、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料中のレポーター分子の濃度の定量的判定を得るステップと、（ｃ）哺乳動物の創傷と接触している創傷包帯材料を１つ以上の参照サンプルと比較するステップと、（ｄ）哺乳動物に医療処置を施すステップであって、医療処置が、哺乳動物の創傷が慢性であることをレポーター分子の濃度が示す場合にのみ抗菌薬治療を含む、施すステップと、を含む、方法から本質的になる。
【０２４０】
好ましくは、診断および治療は、その場で実施される。したがって、本明細書に記載される実施形態は、容易で非侵襲的な方法で創傷の診断および治療を可能にする。例えば、診断は、実時間で行うことができ、治療は、感染性創傷もしくは患者に（全身的に）適用することができ、創傷治療の進行、例えば、創傷治癒に起因するレポーター分子によって生成される信号の消散を、実時間にわたって観察することができる。
【実施例】
【０２４１】
本明細書に記載される構造、材料、組成物、および方法は、本発明の代表的な例であることが意図されており、本発明の範囲は、実施例の範囲によって限定されないことが理解されるだろう。当業者であれば、本発明は開示される構造、材料、組成物、および方法の変形例により実施される場合があり、そのような変形例は本発明の範囲内にあるものとみなされることを認識するだろう。
【０２４２】
略語のリスト：
上でおよび本発明の説明の全体にわたって使用される場合、以下の略語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする：
【表３】
2019509853.tif 000031
【表４】
2019509853.tif 000032
【０２４３】
以下の実施例に示すポリマーについて、ｎは、４００〜３２００から選択される整数である。
【０２４４】
実施例１：ポリマー１の調製（ＣＭＣ繊維を使用して）
【化２６】
2019509853.tif 000033
【０２４５】
カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＮａＣＭＣ）繊維（４４３ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を脱イオン水（４４ｍｌ）中に溶解して、１％溶液を得た。酸性化ＣＭＣ（ＣＭＣ−Ｈ）を提供するために、Ｄｏｗｅｘ６５０Ｃ単層イオン交換樹脂を追加した。単層を濾過により除去し、次にｐＨが８〜９になるまで水酸化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＨ）４０％（水溶液）を追加した。得られた溶液を３０分間撹拌した後、一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥した材料（０．３８ｇ）を４０ｍｌの乾燥ＤＭＦ中に窒素下で撹拌し、およそ１時間にわたって穏やかに加熱しながら溶解した。得られた溶液は曇っており、灰白色であった。溶液をおよそ４℃に冷却した。この撹拌溶液に、２−クロロ−Ｎ−メチルピリジニウムアイオダイド（ＣＭＰ−１）（０．３３ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を追加した。この直後に、化合物１−ｂ（０．５ｇ、２ｍｍｏｌ）も、３滴の乾燥ＤＣＭおよび数滴の乾燥トリエチルアミンと共に追加した。反応混合物を４℃に保持し、３時間撹拌した後、反応混合物は、より暗い略褐色になった。９５％アセトン（水溶液）（８０ｍｌ）をゆっくり追加し、４℃で２０分間撹拌し、次に４℃で一晩保持した。得られた白色沈殿物を褐色溶液から濾過した。次に、材料を以下の方法によってアセトンで５回洗浄し、９９．５％アセトンを４０ｍｌ追加し、混合して、およそ１分間超音波処理し、アセトンを濾過して、固体生成物を回収した。これにより、固体で灰白色のスポンジ状の材料が生成された。残りのアセトンを減圧下で除去した。固体をエタノール（２０ｍｌｘ１）で、続いてアセトン（２０ｍｌｘ３）で洗浄した。各洗浄中、洗浄溶液を１分間超音波処理した後、濾過して固体を回収した。固体（化合物１−ｃ）を高真空ロータリーエバポレーター上に４５分間配置した。重量＝０．２８８ｇ。ＦＴＩＲ：３３６０、３３２０（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８７５（Ｃ−Ｈ）、肩部を有する１６５０（ＢＯＣのアミドＣ＝Ｏ）、１５９０（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）。
【０２４６】
化合物１−ｃの溶解度を評価するために、以下の方法を行った：
化合物１−ｃを質量分析バイアルに秤量した（〜０．００１３ｇ／バイアル）。およそ１ｍｌの必要な溶媒をバイアルに追加した。最初に、サンプルを、４０℃で１分間穏やかに加熱した後、１０秒間超音波処理した後、かつ室温で一晩放置した後に、以下の時点での溶解度について視覚的に評価した。データを以下に示す：ｘは、不溶性材料を示す。
【表５】
2019509853.tif 000034
【０２４７】
化合物１−ｃ（０．０５ｇ、０．１１０８９ｍｍｏｌ）を秤量し、できるだけ小断片に切断した。ＤＣＭ中の１０％ＴＦＡを追加し（１０ｍｌ）、混合物を室温で１時間撹拌した。高真空ロータリーエバポレーターを使用して、揮発性溶媒および試薬を除去した。残りの固体を３回共沸混合物に供し、その沸点を低下させることによってあらゆる残りのＴＦＡを除去し、トルエン（１０ｍｌｘ３）を固体生成物に追加し、撹拌した後、高真空ロータリーエバポレーターを使用して除去し、ポリマー１を灰白色の固体として提供した。重量＝０．０５２４ｇ。ＦＴＩＲ：３３２６（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８９１（Ｃ−Ｈ）、１６６８（Ｃ＝Ｏウレタン伸縮）。元素分析（ＴＦＡ塩）：炭素：予想約４３％、実際＝３８．９０％。水素：予想約５．８％、実際＝５．４３％。窒素：予想約４．４％、実際＝０．２８％。置換度は、０．２８／４．３８＝０．０６である。
【０２４８】
ポリマー１の溶解度を、化合物１−ｃと同様の方法で測定した。データを以下に示す：ｘは、不溶性材料を示す。
【表６】
2019509853.tif 000035
【０２４９】
ポリマー１のアミノ化の定性的判定を、ニンヒドリンに基づくカイザー試験を使用して評価した。３つの試薬を調製した：（１）１０ｍｌのＥｔＯＨ中の５００ｍｇ（０．５ｇ）のニンヒドリン、（２）２０ｍｌのＥｔＯＨ中の８０ｇのフェノール、および（３）ピリジンにより１００ｍＬに希釈した２ｍｌの０．００１Ｍ  ＫＣＮ。ポリマー１のサンプル（１０〜２０ｍｇ）を丸底フラスコ内に配置した。各試薬３〜５滴をフラスコに追加した。フラスコを油浴および還流冷却器を使用して１００℃に加熱し、５分間撹拌した。任意の色の変化が、視覚的に観察された。アミンの存在を示す、濃い青色／紫色が検出された。
【０２５０】
実施例２：ポリマー２の調製
【化２７】
2019509853.tif 000036
【０２５１】
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（０．０２６７ｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．０２６２ｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．０１５ｍｌ、０．０９０ｍｍｏｌ）、および乾燥ＤＭＦ（０．８２ｍｌ）の溶液を調製した。１５ｍｌのプラスチック分離カラムを１０μｍのポリエチレンフリットで設定し、ルアーチップを付着させた。ポリマー１（０．０３４ｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）を、続いてアミノ酸溶液を、カラムに追加した。蓋をカラム上に配置し、さらにパラフィルムで密封した。カラムを血液ローター上に室温で一晩配置した。減圧を使用して溶液を排出し、固体生成物をＥｔＯＨで洗浄して、ポリマー２を白色固体として提供した。重量＝０．０２６６ｇ。カイザー試験を使用して、末端アミンが存在しないことを確認した。ＦＴＩＲ：３３２４（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、３２８１（Ｏ−Ｈ）、２８９８（Ｃ−Ｈ）、１７２０（芳香族Ｃ＝Ｏ）、１６６６（Ｃ＝Ｏウレタン伸縮）、１６６０、（ＦｍｏｃのＣ＝Ｏアミド伸縮）。
【０２５２】
ポリマー２の溶解度を、化合物１−ｃと同様の方法で測定した。データを以下に示す：ｘは、不溶性材料を示す。
【表７】
2019509853.tif 000037
【０２５３】
実施例３：ポリマー３の調製
【化２８】
2019509853.tif 000038
【０２５４】
ポリマー２をピペリジン：ＤＭＦ（１：４ｖ／ｖ、６ｍｌ）の溶液中におよそ２時間配置した。次に、得られた脱保護生成物をＥｔＯＨで洗浄した後、カイザー試験を実施して、遊離アミンの存在を確認した。この脱保護生成物（０．０８０ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を、１０μｍのポリエチレンフリットおよびルアーチップで設定した１５ｍｌのプラスチック分離カラムに追加した。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（０．０６３ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．０６２ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．２３ｍｌ、１．８ｍｍｏｌ）、および乾燥ＤＭＦ（６ｍｌ）の溶液を調製し、カラムに追加した。蓋をカラム上に配置し、さらにパラフィルムで密封した。カラムを血液ローター上に室温で一晩配置した。減圧を使用して溶液を排出し、固体生成物をＥｔＯＨ（１０ｍｌｘ３）で洗浄して、カップリング生成物を赤色固体として提供した。重量＝０．０６９１ｇ。カイザー試験を使用して、末端アミンが存在しないことを確認した。カップリング生成物をＤＣＭで洗浄した。ＦＴＩＲ：３３１５（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８６６（Ｃ−Ｈ）、１７３０（芳香族Ｃ＝Ｏ）、１６５１＋肩部（Ｃ＝Ｏ、Ｆのアミド）および／または（Ｆ−ＦｍｏｃのＣ＝Ｏアミド伸縮）、１５８７（Ｃ＝Ｏウレタン伸縮）。
【０２５５】
Ｆｍｏｃ基を除去するために、カップリング生成物をピペリジン：ＤＭＦ（１：４ｖ／ｖ、６ｍｌ）の溶液中におよそ２時間配置した。次に、得られた脱保護生成物をＥｔＯＨ（１０ｍｌｘ３）およびＤＣＭ（１０ｍｌ）で洗浄して、ポリマー３を脆い赤色固体として提供した。重量＝０．０６３８ｇ、収率＝６２％。カイザー試験を使用して、末端アミンの存在を確認した。ＦＴＩＲ：３３１５（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８６６（Ｃ−Ｈ）、１７３０極小ピーク（芳香族Ｃ＝Ｏ）、１６５１肩部なし（Ｃ＝Ｏ、Ｆのアミド）、１５８７（Ｃ＝Ｏウレタン伸縮）。［注：ＦＴＩＲは、少量のＦｍｏｃが最終生成物上に残っていることを示唆する］。
【０２５６】
実施例４：ポリマー４の調製
中間体４−ｃの合成
【化２９】
2019509853.tif 000039
【０２５７】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ・ＨＣｌ（０．０４０５ｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ中に配置し、１，４−ジオキサン：１０％Ｋ２ＣＯ３（水溶液）（３ｍｌ）の５：２混合物を滴下で追加した。混合物を撹拌し、塩化メチレン（０．０３３ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を混合物に追加し、次に室温で一晩雰囲気に開放した。溶液を１５０ｍｌの水で希釈した。層を分離し、水層をジエチルエーテル（１０ｍｌｘ３）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ、濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（１０：９０のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を使用して、粗材料を精製し、化合物４−ｃを提供した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤを滴下したＣＤＣｌ３）８．５５、７．７９、７．６５、７．５２、７．２６、７．１７、６．６９、６．５９、５．１９、５．０６、４．７８、４．２８、４．１７、４．０８、３．９７、３．５７、３．５５、３．３５、３．０５、２．８７、２．１４、１．９９、１．６３、１．４１、１．２１、０．８３、０．０３。
【０２５８】
ポリマー４の合成
【化３０】
2019509853.tif 000040
【０２５９】
化合物４−ｃ（０．０１６０ｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．００９２５ｇ、０．０２４４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．２３ｍｌ、１．８ｍｍｏｌ）、および乾燥ＤＭＦ（６ｍｌ）の溶液を調製した。１５ｍｌのプラスチック分離カラムを、１０μｍのポリエチレンフリットおよびルアーチップで設定した。ポリマー３（０．０２３０ｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）を、続いてアミノ酸溶液を、カラムに追加した。蓋をカラム上に配置し、さらにパラフィルムで密封した。カラムを血液ローター上に室温で一晩配置した。減圧を使用して溶液を排出し、固体生成物をＥｔＯＨ（１０ｍｌｘ３）で洗浄して、カップリング生成物を赤色固体として提供し、これをＤＣＭで洗浄した。カイザー試験を使用して、末端アミンが存在しないことを確認した。ＦＴＩＲ：３３４６（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９１２（Ｃ−Ｈ）、１７３０（ＤａｂｓｙｌのＣ＝Ｃ芳香族）、１６５２（Ｃ＝Ｏ、アミノ酸のアミド）、１５９１（Ｃ＝Ｏウレタン）。
【０２６０】
カップリング生成物をピペリジン：ＤＭＦ（１：４ｖ／ｖ）（６ｍｌ）の溶液中におよそ２時間配置した。次に、得られた脱保護生成物をＥｔＯＨ（１０ｍｌｘ３）で、続いてＤＣＭ（１０ｍｌ）で、洗浄して、ポリマー４を赤色／褐色の脆い固体として提供した。重量＝０．０３６８ｇ、収率＝５６％。カイザー試験を実施して、末端アミンの存在を確認した。ＦＴＩＲ：３３３５（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９１８（Ｃ−Ｈ）、１６５１（Ｃ＝Ｏ、アミノ酸のアミド、またはＦｍｏｃ）、１５８９（Ｃ＝Ｏウレタン）。
【０２６１】
実施例５：ポリマー５の調製（粉末ＣＭＣを使用）
【化３１】
2019509853.tif 000041
【０２６２】
ＤｏＳ  ０．７（２．０ｇ、８．３３ｍｍｏｌ）のナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＮａＣＭＣ）を脱イオン水（１８０ｍＬ）中に溶解して、１％溶液を得た。Ｄｏｗｅｘ６５０Ｃ単層イオン交換樹脂を、１０分間撹拌しながら追加した。単層を濾過によって除去した後、ｐＨが８〜９（３．５ｍＬ、３６．１４ｍｍｏｌ）になるまで、水酸化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＨ）４０％（水溶液）を、０．１ｍＬのアリコート中に追加した。得られた溶液を３０分間撹拌した後、７日間凍結乾燥した。
【０２６３】
凍結乾燥した材料を窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（２４０ｍＬ）中に溶解し、撹拌して、およそ２時間にわたって穏やかに加熱することが必要であった。溶液をおよそ４℃に冷却した後、激しく撹拌しながら、２−クロロ−Ｎ−メチルピリジニウムアイオダイド（ＣＭＰ−１）（１．５ｇ、５．８ｍｍｏｌ）を追加した。２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１．３５６７ｇ、９．１７ｍｍｏｌ）を、乾燥トリエチルアミン（５ｍＬ）と共に反応物に追加した。反応物を４℃に保持し、最低３時間撹拌した後、９５％エタノール（水溶液）（８０ｍＬ）を追加して、４℃で１０分間撹拌した。９９％アセトン（２００ｍＬ）を撹拌しながらゆっくり追加して、生成物を沈殿させ、これを濾過し、アセトン（３ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。生成物を真空中で濃縮して、灰白色の固体を得た。重量＝１．９０８ｇ、収率＝６８％。ＦＴＩＲ：（ｖ最大／ｃｍ−１）３２６７（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９１６／２８７３（Ｃ−Ｈ）、１７３９（アセトン）、１６５０（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８８（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４０１／１３１４／１２５７／１０３７。１３Ｃ  ＣＰ  ＭＡＳ  ＮＭＲ：ＣＭＣ  ０．７  ＤｏＳ（出発物材料）：δＣ（１３，０００Ｈｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）６１．７（Ｃ６）、７４．５（Ｃ７、Ｃ２、Ｃ５）、８２．５（肩部、Ｃ３）、９７．０（Ｃ４）、１０３．３（Ｃ１）、１７７（Ｃ＝Ｏ）；ＣＭＣ−ＰＥＧジアミン：δＣ（１３，０００Ｈｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）１３．４（Ｃ１４）、２０．１（割り当てなし）、２３．４（割り当てなし）、３０．６（Ｃ９）、６１．７（Ｃ６）、７０（肩部、Ｃ７）、７４．５（Ｃ２、Ｃ５）、８２．５（Ｃ３）、９５（Ｃ４）、１０３．３（Ｃ１）、１１３（割り当てなし）、１４２（割り当てなし）、１５２（割り当てなし）、１６９．７（リンカーのＣ＝Ｏ）、１７７．１（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）。元素分析：原料のＤｏＳが０．７：質量３０６ｇ／ｍｏｌであった場合の生成物の予想：Ｃ  ４５％、Ｈ  ７％、Ｎ  ６％；（ｄ）実際：Ｃ  ４３％、Ｈ  ７％、Ｎ  ４％。したがって、全てのモノマーのうちのおよそ４７％が置換され、これよりリンカー基を含有する。定性的カイザー試験：陽性であり、遊離アミンの存在を示す。５７０ｎｍで得られたＵＶデータは、バリンに基づく較正曲線によると、４．６μｍｏｌのアミンと等価であった。
【０２６４】
ポリマー５の溶解度を、化合物１−ｃと同様の方法で測定した。データを以下に示す：ｘは、不溶性材料を示す
【表８】
2019509853.tif 000042
【０２６５】
実施例６：ポリマー６の調製
2019509853.tif 000043
【０２６６】
ポリマー５を乾燥ＤＭＦ（６ｍＬ）中に２０分間濾過管に浸漬した。化合物４−ｃ（０．０４１６ｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（０．２８９３ｇ、０．８５７１ｍｍｏｌ）をＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ、０．８５７１ｍｍｏｌ）と共に追加した。管を固定し、実験用ミキサーで室温で一晩回転させた。上清を濾過し、残りの固体をＤＭＦ（３ｘ３ｍＬ）およびメタノール（３ｘ５ｍＬ）で洗浄した後、真空中で乾燥させた。重量＝０．１２８５ｇ（収率４５％）。カイザー試験を使用して、遊離アミンの存在を確認した。ＦＴＩＲ：３３１３（Ｎ−Ｈ、Ｏ−Ｈ）、２８６２（Ｏ−Ｈ）、１７４７（アミドのＣ＝Ｏ）、１５８７（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４０４／１３１５／１０２３。元素分析：炭素：予想５１％、実際＝４０％。水素：予想５％、実際＝６％。窒素：予想５％、実際＝４％。
【０２６７】
ポリマー６の溶解度を以下の方法で検査した。少量のポリマー６を２つの別個のガラス底ペトリ皿内に配置した。材料をｐＨ４の一般実験用緩衝液またはｐＨ９のＫ２ＨＰＯ４／ＭｇＣｌ２緩衝液（各２０μＬ）のいずれかで飽和させた。各々を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ光学顕微鏡ｘ１０倍光学レンズ＋眼球上の倍率１０倍の下で見た。
【０２６８】
両方のサンプルとも、緩衝液と接触してヒドロゲルを形成した。顕微鏡下で、粉末凝集体は、ゲル化しており、Ｄａｂｓｙｌの赤色を含有するようであった。いくつかの領域は、他の領域よりも色が濃縮されていたが、色分布は、サンプルにわたって見られた。この実験を、出発材料化合物４−ｃおよびポリマー５について繰り返した。ポリマー５のサンプル中には色が見えず、ヒドロゲル粉末構造が観察された。化合物４−ｃのサンプルは、全体にわたって赤色であり、ヒドロゲルを形成しなかった。
【０２６９】
実施例７：ポリマー７の調製
【化３２】
2019509853.tif 000044
【０２７０】
脱イオン水（２００ｍＬ）中に、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＮａＣＭＣ）粉末（２．０ｍｇ、８．３ｍｍｏｌ、ＤｏＳ＝０．７）を、撹拌しながら６０秒間超音波処理し、穏やかに３０分間かけて加熱しながら溶解した。撹拌しながら、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．９２ｇ、１０．０１ｍｍｏｌ）を溶液に追加した。ｐＨは８であることが判明し、１．０Ｍ  ＨＣｌ（３滴）を追加して、ｐＨ＝６に調節した。Ｌ−システイン（０．５０ｇ、４．１ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら反応物に追加した。次に、ｐＨは８であることが判明し、再びｐＨ６（約１ｍＬ）に到達するように、ＨＣｌを使用して調節した。反応物を撹拌して一晩放置した後、１Ｍ  ＨＣｌ（７００ｍＬ）、次に１Ｍ  ＨＣｌ＋１％ＮａＣｌ（７００ｍＬ）、次に０．５Ｍ  ＨＣｌ（７００ｍＬ）に対して透析を実施し（１２−１４ＫＤａ  Ｍｅｄｉｃｅｌｌ透析膜）、それらの各々を１０℃で６０分間暗所で実施した。得られた溶液を凍結乾燥して、ポリマー７を提供した。ＦＴＩＲ：３２９６（Ｎ−Ｈ、Ｏ−Ｈ）、２９７２／２９３０（Ｃ−Ｈ）、２７３３（小）、２５２２（ＣのＳ−Ｈ）、２０８９（ｖ小）、１７３０（ＣｙｓのＣ＝Ｏ酸）、１６８１（アミド）、１６３３（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４６９（肩部）、１３８２／１３４６／１２２１／１１０７、１０５１。１３Ｃ  ＣＰ  ＭＡＳ  ＮＭＲ：１４（Ｃ１１）、１８（割り当てなし）、２４（割り当てなし）、４３（Ｃ９）、５８（割り当てなし）、６２（Ｃ６）、７４（Ｃ２、３、５、７）、８２（Ｃ４）、１０３（Ｃ１）、１７３（アミドのＣ８カルボニル）。元素分析：原料のＤｏＳが０．７：質量２９９ｇ／ｍｏｌであった場合の生成物の予想：Ｃ  ４０％、Ｈ  ６％、Ｎ  ３％、Ｓ  ６％、実際：Ｃ  ３４％、Ｈ  ８％、Ｎ  ８％、Ｓ  １．４％。したがって、全てのモノマーのうちの約１６％は、リンカー基を含有する。
【０２７１】
ポリマー７の溶解度を、化合物１−ｃと同様の方法で測定した。ポリマー７は、水、ＤＭＦ、アセトン、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、およびＤＣＭ中に不溶性であることが判明した。
【０２７２】
実施例８：ポリマー８の調製
【化３３】
2019509853.tif 000045
【０２７３】
ポリマー５（１．００ｇ、２．８６ｍｍｏｌ）を微粉に粉砕し、ＤＭＦ（２５ｍｌ）と２０分間混合した。室温で撹拌しながら、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ（３．７ｇ、８．６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２．８７ｇ、８．５７ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１．１０ｍｌ、８．５７ｍｍｏｌ）を追加し、空気に開放した（一晩の混合を促進するために、遠心管および実験用ローターを使用した）。混合物を３０秒間超音波処理した後、一晩撹拌することを可能にした。固体を濾過し、ＤＣＭ（２０ｍＬｘ５）およびＭｅＯＨ（２０ｍＬｘ５）で洗浄した。得られた生成物を真空中で乾燥させて、化合物８−ｂを灰白色の固体として提供した。１３Ｃ  ＣＰ  ＭＡＳ  ＮＭＲ：２０（割り当てなし）、３０（Ｃ９）、３２（Ｃ１９）、３９（Ｃ１０、１１、１２、１３）、４７（Ｃ１８、２２）、５５（Ｃ１６）、６１（Ｃ６）、７０−７４（広い、Ｃ２、３、５、７）、８２（肩部、Ｃ４）、９２（Ｃ１７）、９６（割り当てなし）、１０３（Ｃ１）、１２０（Ｃ２４）、１２７（Ｃ２５、２６、２７  ）、１４１（Ｃ２８）、１４５（肩部、Ｃ２３）、１５７（Ｃ２０、Ｃ＝Ｏカルバメート）、１７１（アミドのＣ８カルボニル）、１７７（ＣＭＣのＣ８カルボニル）、１９１（割り当てなし）、２２１／２２７（可能な汚染物質）。
【０２７４】
化合物８−ｂ（０．５ｇ）をピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ｖ／ｖ）（１０ｍｌ）の溶液中の実験用ローター上におよそ２時間配置した。次に、得られた脱保護生成物を、ＥｔＯＨ（５０ｍＬｘ３）およびＤＣＭ（５０ｍＬｘ３）で洗浄して、灰白色の固体として化合物８−ｃを提供した。この過程を繰り返して、Ｆｍｏｃ基を完全に除去した。
【０２７５】
化合物８−ｃ（０．３０ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに追加し、窒素ガスでパージした。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（０．３０７ｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を脱イオン水（１．３ｍｌ）中に溶解し、ＭｅＯＨ（２．６ｍｌ）と共に撹拌しながら反応物に追加した。本システムを室温で１時間撹拌しながら窒素下で保持した後、濾過し、以下の溶液：２：１ＭｅＯＨ／水（９０ｍｌ）、１：２ＭｅＯＨ／水（９０ｍｌ）、１００％水（９０ｍｌ）、１００％ＭｅＯＨ（９０ｍｌ）で洗浄した。得られた固体を真空中で乾燥させて、ポリマー８を灰白色の固体として提供した。この過程を繰り返して、ジスルフィドを完全に還元した。１３Ｃ  ＣＰ  ＭＡＳ  ＮＭＲ：３０（Ｃ９、１９）、３９（Ｃ１０、１１、１２、１３）、４７（Ｃ１８、２２）、５４（Ｃ１６）、６０（Ｃ６）、７０−７４（広い、Ｃ２、３、５、７）、８２（肩部、Ｃ４）、９２（Ｃ１７）、９７（割り当てなし）、１０２（Ｃ１）、１２０（Ｃ２４）、１２７（Ｃ２５、２６、２７）、１４１（Ｃ２８）、１５６（Ｃ２０、Ｃ＝Ｏカルバメート）、１７１（アミドのＣ８カルボニル）、１７７（ＣＭＣのＣ８カルボニル）、１９１（割り当てなし）、２２１（割り当てなし）。元素分析：原料のＤｏＳが０．７：質量３９０ｇ／ｍｏｌであった場合の生成物の予想：Ｃ  ４３％、Ｈ  ６％、Ｎ  ６％、Ｓ  ５％、実際：Ｃ  ４６％、Ｈ  ７％、Ｎ  ４％、Ｓ  ３．５％。したがって、全てのモノマーのうちのおよそ５０％は、リンカー基を含有する。
【０２７６】
実施例９：ポリマー９の調製
2019509853.tif 000046
【０２７７】
ポリマー５（１．０ｇ、２．７１４ｍｍｏｌ）を穏やかに加熱し、撹拌し、超音波処理しながら、ＰＢＳ（２５ｍＬ）に分散させた。反応容器を窒素ガスでパージした。Ｔｒａｕｔ試薬（０．６００ｇ、４．３０４ｍｍｏｌ）のＰＢＳ（５０ｍＬ）中の溶液に、ＥＤＴＡ（０．０４４ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を追加した。いったん完全に溶解したら、この溶液を反応混合物に追加し、これを窒素雰囲気下で室温で１時間撹拌した。得られた生成物を濾過によって分離し、ＰＢＳ（３ｘ１０ｍＬ）およびメタノール（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。次に、白色／灰白色の粉末状固体生成物を真空中で乾燥させ、窒素下で保存した。重量＝１．２４１３ｇ（９１％）。Ｅｌｌｍａｎ試験からの黄色は、いくらかの遊離チオールが未反応の残りの出発物質中にまだ存在していたことを示す。定量性試験では、およそ０．０６ｍｍｏｌ／ｇのＳ−Ｈ基が存在した。ＦＴＩＲ：３３１５（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９５７／２９３４／２８７０（Ｃ−Ｈ）、１６４４（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５９３（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４１２／１３２２／１０２２。２０５９ｃｍ−１でのＳ−Ｈに対して、非常に小さいピークがあった。δＣ（１３，０００Ｈｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）：１７６．７（Ｃ８、ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１７２．２（Ｃ８、アミドのＣ＝Ｏ）、１５６．０（Ｃ１５、小ピーク）１２１．０、１０３．０（Ｃ１）、８１．３（Ｃ７、肩部）、７４．４（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５）、６１．７（Ｃ６）、３８．９＋肩部（Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４）。元素分析：原料のＤｏＳが０．７：質量４１４ｇｍｏｌ−１であった場合の生成物の予想：Ｃ  ４３％、Ｈ  ７％、Ｎ  ６％、Ｓ  ４％。実際：Ｃ  ４０％、Ｈ  ７％、Ｎ  ４％。したがって、全てのモノマーのうちのおよそ４７％は、リンカー基を含有する。
【０２７８】
実施例１０：ポリマー１０の調製
【化３４】
2019509853.tif 000047
【０２７９】
ポリマー９（０．１５０ｇ、０．３１６ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに秤量し、窒素でパージした。エルマン試薬（０．３７５ｇ、０．９４７ｍｍｏｌ）をＰＢＳ（２０ｍＬ）中に溶解し、ポリマー９に追加した。反応物を室温で２時間撹拌した。中間体のジスルフィド生成物１０−ａを濾過し、ＰＢＳ（３ｘ２０ｍＬ）およびメタノール（１ｘ２０ｍＬ）で洗浄した後、真空中で乾燥させて、中間体１０−ａを淡白／黄色粉末状固体として生成した。重量＝０．１３３ｇ（収率６０％）。Ｅｌｌｍａｎ試験からの黄色は、いくらかの遊離チオールが未反応の残りの出発物質中にまだ存在していたことを示す。定量的試験では、およそ０．３３ｍｍｏｌ／ｇのＳ−Ｈ基が存在した。ＦＴＩＲ：３３１０（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９１１／２８７５（Ｃ−Ｈ）、１７２７（Ｃ＝Ｏカルボン酸）、１６４８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５９２（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）。およそ２０５９ｃｍ−１でのＳ−Ｈに対して、非常に小さいピークがあった。δＣ（１０，０００Ｈｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）：２２２．３７（スピニング側バンド）、１７２．５の肩部（Ｃ８、ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１７２．５（Ｃ８、アミドのＣ＝Ｏ、エルマン試薬上の酸基のいくらかの可能性もある）、１５６．０（Ｃ１５、小ピーク）１２３．７（スピニング側バンド）、１４４．５（エルマン試薬の芳香族領域）、１０３．０（Ｃ１）、９６．７９、８２．２５（Ｃ７、肩部）、７４．５（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５）、６１．４（Ｃ６）、３９．３＋肩部（Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４）、３２．２鋭いピーク（汚染物質の可能性あり）。元素分析：原料のＤｏＳが０．７：質量５５３ｇｍｏｌ−１であった場合の予想：Ｃ  ４３％、Ｈ  ６％、Ｎ  ６％、Ｓ  ６％。実際：Ｃ  ３９％、Ｈ  ６％、Ｎ  ４％、Ｓ  １．４５％。したがって、全てのモノマーのうちのおよそ１７％は、リンカー基を含有する。
【０２８０】
中間体のジスルフィド生成物１０−ａ（０．１ｇ、０．１４２２ｍｍｏｌ）、メルカプト安息香酸（０．１１ｇ、０．７１１２ｍｍｏｌ）およびメタノール：水（４：１の比、５ｍＬ）を合わせ、窒素雰囲気下室温で２時間撹拌した。得られた生成物を濾過し、メタノール（３ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄し、さらにメタノール（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄した後、真空中で乾燥させて、ポリマー１０を黄色固体粉末として生成した。重量＝０．０８２１ｇ（収率８７％）。Ｅｌｌｍａｎ試験からの強い黄色は、いくらかの遊離チオールが未反応の残りの出発物質中にまだ存在する可能性があることを示す。定量的試験では、およそ２．９７ｍｍｏｌ／ｇのＳ−Ｈ基が存在した。ＦＴＩＲ：３２９３（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９１０／２８８１／２８４９（Ｃ−Ｈ）、１７１８（Ｃ＝Ｏカルボン酸）、１６３８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８６（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１５５３。δＣ（１０，０００Ｈｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）：１７７．４（Ｃ８、ＣＭＣのＣ８、Ｃ＝Ｏ）、１７１．９（Ｃ８、アミドのＣ＝Ｏ、安息香酸の酸基のうちのいくらかである可能性もある）、１３０／１４３の小さく広いピーク、１０２．７（Ｃ１）、９６．７９、８１．６（Ｃ７、肩部）、７４．１（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５）、６２．５（Ｃ６）、３９．０＋肩部（Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４）、３２．１鋭いピーク（汚染物質の可能性あり）。元素分析：原料のＤｏＳが０．７：質量５２０ｇｍｏｌ−１であった場合の生成物の予想：Ｃ  ４４％、Ｈ  ６％、Ｎ  ６％、Ｓ  ６％。実際：Ｃ  ３７％、Ｈ  ６％、Ｎ  ３％。
【０２８１】
さらなる洗浄シーケンスを水中で実施し、膨潤した（ヒドロゲル状の）状態で任意の副生物が構造体から確実に洗浄されるようにした。ｐＨ９リン酸緩衝液（１００ｍＬ）、脱イオン水（２０ｍＬ）、ｐＨ９リン酸緩衝液（５ｍＬ）、および最後にメタノール（２０ｍＬ）を使用して、固体を洗浄し、次にこれを真空中で乾燥させて、ポリマー１０を白色／クリーム色の固体粉末として提供した。重量＝０．０４８２ｇ（収率５１％）。Ｅｌｌｍａｎ試験からの淡黄色は、いくらかの遊離チオールが未反応の残りの出発物質中にまだ存在する可能性があることを示す。定量的試験では、およそ０．３１ｍｍｏｌ／ｇのＳ−Ｈ基が存在した。ＦＴＩＲ：３２６７（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９０４／２８６６（Ｃ−Ｈ）、２１１９小ピーク（Ｓ−Ｈ）、１６３８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８７（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１５４７。元素分析：原料のＤｏＳが０．７：質量５２０ｇｍｏｌ−１であった場合の生成物の予想：Ｃ  ４４％、Ｈ  ６％、Ｎ  ６％、Ｓ  ６％。実際：Ｃ  ３８％、Ｈ  ６％、Ｎ  ３％、Ｓ  ０．６５％。
【０２８２】
ポリマー９および１０の溶解度を、化合物１−ｃと同様の方法で測定した。データを以下に示す：ｘは、不溶性材料を示す
【表９】
2019509853.tif 000048
【０２８３】
実施例１１：ポリマー１１の調製
【化３５】
2019509853.tif 000049
【０２８４】
撹拌子を用いて２５ｍＬのＲＢＦにアミノフェニルフルオレセイン（０．００５ｇ、０．０１８０ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．０１３６ｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）、およびポリマー５（０．０１３ｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を追加し、Ｎ２（ｇ）でパージした。乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）を追加し、この反応物を、光から保護するために、箔で覆って一晩室温で撹拌した。反応溶液を濾過管を通して濾過し、ＤＭＦで数回洗浄した。上清は、オレンジ色を維持し、それを洗浄物と共に保持し、真空中で乾燥させた。固体生成物を回収し、真空下で乾燥させた。カップリングを最大にするために、上清および洗浄液がいくらかオレンジ色を帯びることを仮定して、上清および洗浄液から回収した固体を使用して、反応を繰り返した。重量＝０．０１２ｇ（収率４３％）。ＦＴＩＲ：３３６７（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９３２（Ｃ−Ｈ）、１７０２、１６５５（Ｃ＝Ｏ、アミド）、１５５５肩部（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４９４（ＡＰＦの芳香族Ｃ−Ｃ）、１４３７／１４１３／１３８７／１３０８、１１９４（Ｃ−Ｃ）、１１０６（ＡＰＦのＣ−Ｏ）、８３８（平面Ｃ−Ｈ曲げ外の芳香族）。
【０２８５】
実施例１２：ポリマー１２の調製
【化３６】
2019509853.tif 000050
【０２８６】
最初に、形成された任意のジスルフィド結合を脱カップリングするために、ポリマー８をＴＣＥＰで処理した。ＴＣＥＰ（０．０２４３ｇ、０．０８４８ｍｍｏｌ、４当量）を水１ｍＬに溶解し、ポリマー８（０．０１ｇ、０．０２１２ｍｍｏｌ）に追加し、室温で３０分間撹拌した。固体を濾過し、水（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄し、凍結乾燥させて固体の灰白色／クリーム色の粉末を得、次にこれをＤＭＦ（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。
【０２８７】
化合物１２−ａ（０．０１０８ｇ、０．０２１２ｍｍｏｌ、１当量）を３ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解し、Ｎ２（ｇ）でパージしたポリマー８に追加した。この反応物を、光から保護するために、箔で覆って一晩室温で撹拌した。一晩撹拌した後、反応混合物は、赤色になり、濾過すると、非常に少量の白色固体材料（０．００２２ｇ）のみが回収された。溶液相を真空中で濃縮して、粗ポリマー１２を赤色ワックス状固体として提供した。
【０２８８】
生成物および出発材料が粗ポリマー１２中に存在する可能性があり、したがって粗材料をさらに精製するために、洗浄液が必要であった。混合物は、ヘキサン、エタノール、およびクロロホルム中に不溶性であった。しかしながら、脱イオン水に浸漬し、穏やかに加熱し、超音波処理すると、上清は、オレンジ色になり、おそらく出発材料化合物１２−ａであった。この溶液を、以下のステップ５回：（１）脱イオン水（５ｍＬ）の追加、（２）撹拌しながらの穏やかな加熱、（３）１分間の超音波処理の３回の繰り返し、および（４）濾過カラムおよびフリットフィルターを通した濾過、に供した。さらに５０ｍＬの脱イオン水を固体サンプルを通して洗浄した。次にこれを濾過し、一晩凍結乾燥させて水を除去した。生成物の重量：０．０１７０１ｇ（収率８５％）。ＦＴＩＲ：３３４７（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９１５／２８５１（Ｃ−Ｈ）、１７５６（エステルのＣ＝Ｏ／フルオレセインのＣ＝Ｏ）、１７１６（エステルのＣ＝Ｏ／フルオレセインのＣ＝Ｏ）、１６４３（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１６０８（ＣＭＣのＣ＝Ｏ／芳香族Ｃ＝Ｃ伸縮）、１４９２（芳香族Ｃ＝Ｃ伸縮）、１３６９（エステルのＣ−Ｏ伸縮）、１２４６（Ｃ−Ｏ伸縮）、１１５２（ｔ−ＯＨ）、１１１０（エステルのＣ−Ｏ／−ＯＨ）、８４２（平面Ｃ−Ｈ曲げ外の芳香族）。
【０２８９】
ポリマー１２の酵素効率
酵素効力を、ＰＢＳ（０．９９ｍＬ）中の純粋なエステラーゼ（０．０１ｍＬ）を混合することによって到達されるエステラーゼ（約５０単位／ｍＬで検査した。
【０２９０】
蛍光顕微鏡法は、ポリマー１２のサンプルと対照サンプル（酵素を含まないＰＢＳ中のポリマー１２）との間に明確な観察可能な蛍光の差を示し、付着したフルオレセインからエステル基を放出するための酵素によるポリマーへの活性があることを実証した。
【０２９１】
共焦点顕微鏡の使用は、ポリマー１２と対照サンプルとの間の蛍光の差の視覚化をもたらした。顕微鏡設定：スマートゲイン＝７１６ｖ、スマートオフセット＝−２．１％、倍率＝ｘ２０、ピンホールサイズ＝１０５．０５μｍ。
【０２９２】
酵素効力を定量化し、正確に判定するために、９６ウェルプレートおよびプレートリーダー（励起を４８５ｎｍに設定し、発光を５９０ｎｍに設定し、かつゲインを１５００に設定した、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ  ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、さらなる実験を設定した。ポリマー１２を３２０μＬのＰＢＳ中に分散させ、ボルテックス混合した。４０μＬの懸濁液を８個のウェルに分注し、測定値をベースライン読み取り値とした。以下の溶液：ＰＢＳ（弱酵素溶液）中のエステラーゼ５８単位／ｍＬ、ＰＢＳ（強酵素溶液）中のエステラーゼ１１６単位／ｍＬ、１Ｍ  ＮａＯＨ（水溶液）を調製した。
【０２９３】
Ｎ＝２ウェルは、４０μＬのＰＢＳを試験分散液内に追加（対照群）しただけであった。
【０２９４】
Ｎ＝２ウェルは、４０μＬの弱酵素溶液を試験分散液内にピペット注入した。
【０２９５】
Ｎ＝２ウェルは、４０μＬの強酵素溶液を試験分散液内にピペット注入した。
【０２９６】
Ｎ＝２ウェルは、４０μＬの１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を試験分散液内にピペット注入した。
【０２９７】
最後のウェルに追加した直後に、別の蛍光読み取り値を記録し、その後、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０分後に記録を行った。次に、２４時間後の読み取り値を得るために、プレートを覆い、一晩放置した。しかしながら、蛍光検出器は、その限界に到達しており、したがってこの時点で有意な結果に到達されなかった。表２および図１は、各時点での蛍光読み取り値からベースライン読み取り値を引いたもの（粒子懸濁液のみ）を示す。
表２
【表１０】
2019509853.tif 000051
【０２９８】
陰性対照群によって放出される蛍光は、１時間にわたってわずかに増加する。
【０２９９】
予想どおり、弱エステラーゼ溶液および強エステラーゼ溶液に対する蛍光は、経時的に増加する。強エステラーゼ溶液は、約３０分（機械の飽和点は、６５０００）で機器によって測定することができる最大蛍光強度に到達しているようである。図１は、最大３０分間の強エステラーゼのプロットを示し、６０分間全体にわたるこれおよび弱エステラーゼの傾向線をプロットしている。
【０３００】
この実験の後、各溶液（ｎ＝１のみ）をそのウェルからピペットで取り出し、裸眼で検査するために、ガラス底の顕微鏡内にピペット注入した。また、それを長い波長設定に設定されたＵＶチャンバ内に配置し、画像を捕捉した（図２ａ〜ｃ）。
【０３０１】
まとめると、この証拠は、合成方法が成功し、酵素切断ステップが、蛍光分光法によって定量化できる陽性反応を与えることを示唆する。ポリマー１２のサンプルは、エステラーゼを追加しなくても蛍光を発しており、これはおそらく、カップリングが少し過度になされたことを示唆する。
【０３０２】
実施例１３：ポリマー１３の調製（ＣＭＣ繊維を使用）
【化３７】
2019509853.tif 000052
【０３０３】
ＤｏＳがおよそ０．２−０．３（１．９７ｇ、８．３３ｍｍｏｌ）のＮａＣＭＣ繊維（２ｘＡＱＵＡＣＥＬ包帯１０ｘ１０ｃｍ）を手で小さく開いた繊維に分割し、エタノール／脱イオン水（８０：２０ｖ／ｖ）（１８０ｍＬ）中に分散させた。酸性化ＣＭＣ（ＣＭＣ−Ｈ）を提供するために、Ｄｏｗｅｘ６５０Ｃ単層イオン交換樹脂を追加し、およそ３０分間混合した。単層を濾過によって注意深く除去し、次にｐＨが８〜９になるまで、水酸化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＨ）４０％（水溶液）を追加した。得られた溶液を３０分間撹拌した後、真空中で濃縮した。乾燥した材料を乾燥ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中に窒素下で溶解した。一晩撹拌することが必要であり、得られた溶液は、透明／黄色で非常に粘性であった。粘度を低下させるために、乾燥ＤＭＦ（１００ｍＬ）をさらに追加し、混合物を約４℃に冷却し、撹拌した後、２−クロロ−Ｎ−メチルピリジニウムアイオダイド（ＣＭＰ−１）（１．４８７５ｇ、５．８ｍｍｏｌ）を追加した。この後直ぐに、乾燥トリエチルアミン（５ｍＬ）と共に、化合物５−ｂ（１．３５６７ｇ、９．１７ｍｍｏｌ）を追加した。反応物を４℃に保持し、一晩撹拌した。固体を濾過し、次にアセトン（３ｘ１００ｍＬ）、次にＤＭＦ（３ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、洗浄ステップ中に、繊維が洗浄溶液中に分散するのを促進するために、超音波処理を実施した。固体を真空中でさらに乾燥して、ポリマー１３を灰白色のふわふわした／粉末繊維として得た。重量＝１．８３６５ｇ（収率６０％）。カイザー試験を使用して、末端アミンの存在を確認した（３．０８μｍｏｌのアミンに相当する５７０ｎｍでの読み取り値）。ＳＳ  ＮＭＲ：δ（１０，０００Ｈｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）１７６．９（Ｃ＝Ｏ）１５３．４、１４２．４、１０４．１（Ｃ１）、９６．８（Ｃ４）、８３．６（Ｃ３）、７４．２（Ｃ７、Ｃ２、Ｃ５）、６９．４（Ｃ６）、６１．９（Ｃ６、肩部）。ＦＴＩＲ：３３２５（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８７２（Ｃ−Ｈ）、１６４８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８９（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１５４３、１４０８／１３６７／１２６５／１０２２。元素分析：原料のＤｏＳが０．７：質量３１８ｇｍｏｌ−１であった場合の生成物の予想：Ｃ  ４５％、Ｈ  ７％、Ｎ  ６％。実際：Ｃ  ４２．５％、Ｈ  ７％、Ｎ  ３％。したがって、全てのモノマーのうちのおよそ３５％は、リンカー基を含有する。
【０３０４】
ポリマー１３の溶解度を、化合物１−ｃと同様の方法で測定した。データを以下に示す：ｘは、不溶性材料を示す。
【表１１】
2019509853.tif 000053
【０３０５】
実施例１４：ポリマー１４の調製
【化３８】
2019509853.tif 000054
【０３０６】
ポリマー１３（０．２５０ｇ、１．３９６ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下でＲＢフラスコ中に配置した。化合物１４−ａ（９０ｍｇ、０．６７９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解し、撹拌しながらポリマー１３に追加した。反応混合物を、窒素雰囲気下で室温で９０分間撹拌した後、濾過し、ＤＭＦ（５ｘ５ｍＬ）およびメタノール（５ｘ５ｍＬ）で洗浄した。生成物を真空中で濃縮して、ポリマー１４を灰白色の粉末状の固体として得た。重量＝０．１８５２ｇ（収率５２％）。カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）試験を使用して、末端アミンの存在を確認した（１．８６μｍｏｌのアミンに相当する５７０ｎｍでの読み取り値）。ＦＴＩＲ：３２５１（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９１５／２８７４（Ｃ−Ｈ）、１６４９（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８３（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４０５／１３１６／１２６２／１０２０。元素分析：原料のＤｏＳが０．７：質量５１９ｇｍｏｌ−１であった場合の生成物の予想：Ｃ  ４８％、Ｈ  ５．８％、Ｎ  ５．６％。実際：Ｃ  ４２．８％、Ｈ  ６．９５％、Ｎ  ４．２５％。したがって、全てのモノマーのうちのおよそ５３％は、リンカー基を含有する。
【０３０７】
ポリマー１４の溶解度を、化合物１−ｃと同様の方法で測定した。データを以下に示す：ｘは、不溶性材料を示す。
【表１２】
2019509853.tif 000055
【０３０８】
実施例１５：ポリマー１５の調製
【化３９】
2019509853.tif 000056
【０３０９】
ポリマー５−ａ（２．０ｇのＮａＣＭＣを使用して、実施例５と同様に調製）を、窒素下で乾燥ＤＭＦ（１５０ｍＬ）に溶解した。透明な溶液を提供するために、１分間の超音波処理の複数回のサイクルに加えて、約２時間にわたって〜５０℃までの撹拌および加熱が必要であった。この溶液を〜４℃に冷却し、撹拌した後、２−クロロ−Ｎ−メチルピリジニウムアイオダイド（ＣＭＰ−１）（１．４８７５ｇ、５．８ｍｍｏｌ）を追加した。この溶液は、ビスコース「ゼリー」となって、激しく混合され、さらに２０ｍＬの乾燥ＤＭＦが追加され、これはゲルを分解および希釈した。この直後に、乾燥トリエチルアミン（５ｍＬ）と共に、４、７、１０−トリオキサ−１、１３−トリデカンジアミン（１２．０２ｇ、２．０２ｍＬ、９．１７ｍｍｏｌ）を追加した。反応物を４℃に保持し、一晩撹拌した。アセトン（１００ｍＬ）を４℃に冷却し、反応混合物を、撹拌しながらゆっくりと滴下した。混合物を２０ｍＬのアリコートで濾過して、透明な白色ゲル状の固体を得た。この固体をアセトン（３ｘ１００ｍＬ）、エタノール（３ｘ１００ｍＬ）、水（１ｘ１００ｍＬ）、ヘキサン（１ｘ１００ｍＬ）、次に再び水（１ｘ１００ｍＬ）で洗浄した後、およそ１５分間濃縮した。得られた生成物を３日間にわたって凍結乾燥して、ポリマー５−ａを軽くふわふわした固体として提供した。重量＝１．７９４ｇ（収率４９％）。カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）試験を使用して、末端アミンの存在を確認した（１．８６μｍｏｌのアミンに相当する５７０ｎｍでの読み取り値）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、なし）δ１７６．５１（Ｃ８，ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１７１．０９（Ｃ８、アミドのＣ＝Ｏ）、１６３．７９（新規ピーク）、１５３．１５、１４３、１２、１０３．４０（Ｃ１）、８２．３９（Ｃ７）、７５．８１／７３．９９／７０．０７（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５）、６０．８１（Ｃ６）、４２．５４／３６．８４（Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６）、３１．４５（Ｃ９、Ｃ１４）、２８．２５。ＦＴＩＲ：３２３９（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８６５（Ｃ−Ｈ）、１６５０（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８６（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４０４／１３８８／１３１５／１２５６／１０５３でのピーク。元素分析：原料のＤｏＳが０．７：質量３６９ｇｍｏｌ−１であった場合の生成物の予想：Ｃ  ４７．５％、Ｈ  ７％、Ｎ  ４％。実際：Ｃ  ４５．５％、Ｈ  ７．４％、Ｎ  ５．１％。したがって、全てのモノマーのうちのおよそ８７．５％は、リンカー基を含有する。
【０３１０】
実施例１６：ポリマー１６の調製
【化４０】
2019509853.tif 000057
【０３１１】
ポリマー１５（１．０００ｇ、２．２７３ｍｍｏｌ）を微粉に粉砕し、ＤＭＦ（１５ｍＬ）と２０分間混合した。室温で撹拌しながら、化合物８−ａ（１．１４ｇ、２．６３９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２．５９ｇ、６．８２ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１．１９ｍＬ、６．８２ｍｍｏｌ）を追加し、空気に開放した（一晩の混合を促進するために、遠心管および実験用ローターを使用した）。混合物を３０秒間超音波処理した後、一晩撹拌することを可能にした。固体を濾過し、ＤＣＭ（５ｘ２０ｍＬ）およびメタノール（５ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。得られたカップリングした中間体を真空中で乾燥させた。この中間体（８５０ｍｇ）を、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ｖ／ｖ）（２０ｍＬ）の溶液に追加し、混合物を１時間撹拌するために、窒素ガスでバブリングした後、固体を濾過し、エタノール（３ｘ５０ｍＬ）およびＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。次に、この過程を繰り返し、アミン中間体を真空中で乾燥させた。このアミン中間体をＲＢフラスコに追加し、窒素ガスでパージした。ＴＣＥＰ（４２８ｍｇ）を脱イオン水（２．６ｍＬ）中に溶解し、撹拌しながらアミン中間体に追加し、続いてメタノール（５．２ｍＬ）を追加した。このシステムを、室温で１時間撹拌しながら窒素下で保持した後、濾過し、以下の溶液：２：１メタノール：水（９０ｍＬ）、１００％水（９０ｍＬ）、１：２メタノール：水（９０ｍＬ）、１００％水（９０ｍＬ）、１００％メタノール（９０ｍＬ）で洗浄した。得られた固体を真空中で乾燥させて、ポリマー１６を灰白色の粉末状の固体として提供した。重量＝０．３５３７ｇ（収率３０％）。Ｅｌｌｍａｎ試験からの黄色は、遊離チオールが存在していたことを示す。ＦＴＩＮ：３３４９（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９１７／２８７２（Ｃ−Ｈ）、１７１６（アセトン）、１６５０（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５９３（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１５３９，１４３８／１３１３／１２５５／１０２８。δＣ（１０，０００Ｈｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）：１７１．８（Ｃ８、Ｃ１９）１５６．５（Ｆｍｏｃの残留Ｃ＝Ｏ）、１４２．３（Ｆｍｏｃの残留ＣＨＡｒ）、１２７．９（Ｆｍｏｃの残留ＣＨＡｒ）、１２０．０８、１０３，３（Ｃ１）、８２．６（Ｃ７）、７４．５（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５）、６９．９（ｘ）、６１．５（Ｃ６）、４９．５（Ｃ２０）、３６．３７（Ｃ９、Ｃ１８、Ｃ２１）、２９．５２（Ｃ１０−１８）元素分析：原料のＤｏＳが０．７：質量４４０．７ｇｍｏｌ−１であった場合の生成物の予想：Ｃ  ４５％、Ｈ  ７％、Ｎ  ５．４％、Ｓ  ４．１％。実際：Ｃ  ４７．１％、Ｈ  ６．７４％、Ｎ  ４．１１％、Ｓ  ０．８０％。したがって、全てのモノマーのうちのおよそ２０％は、リンカー基を含有する。
【０３１２】
溶解度評価は、ポリマー１６がｐＨ９緩衝液（Ｋ２ＨＰＯ４／ＭｇＣｌ２）中にヒドロゲルを形成することを示す。
【０３１３】
実施例１７：ポリマー１７の調製
【化４１】
2019509853.tif 000058
【０３１４】
最初に、形成された任意のジスルフィド結合を脱カップリングするために、ポリマー１６をＴＣＥＰで処理した。ＴＣＥＰ（０．１６８５ｇ、０．１９６ｍｍｏｌ、４当量）を、水１ｍＬ中に溶解し、ポリマー１６（０．０７５４ｇ、０．１４７ｍｍｏｌ）に追加し、室温で３０分間撹拌した。固体を濾過し、水（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄し、凍結乾燥させて固体の灰白色／クリーム色の粉末を得、次にこれをＤＭＦ（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。
【０３１５】
化合物１２−ａ（０．０２５０ｇ、０．０４９ｍｍｏｌ、１当量）を２ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解し、Ｎ２（ｇ）でパージしたポリマー１６に追加した。この反応物を、光から保護するために、箔で覆って一晩室温で撹拌した。一晩撹拌した後、反応は、色を変化させなかった。灰白色の固体粉末を濾過し、以下のように、各ステップ：（１）脱イオン水（５ｍＬ）の追加、（２）撹拌しながらの穏やかな加熱、（３）１分間の超音波処理を３回、（４）濾過カラムおよびフリットフィルターを通した濾過、および（５）脱イオン水（２０ｍＬ）でのさらなる洗浄、を各５回繰り返した。得られた固体を濾過し、３時間凍結乾燥させて、ポリマー１７を灰白色生成物として提供した。重量＝０．０６３ｇ（収率４４％）。ＦＴＩＲ：３３１５（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９１１／２８６９（Ｃ−Ｈ）、１９２２、１７５６（エステルのＣ＝Ｏ／フルオレセインのＣ＝Ｏ）、１７２０（エステルのＣ＝Ｏ／フルオレセインのＣ＝Ｏ）、１６４７（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５９１（ＣＭＣのＣ＝Ｏ／芳香族Ｃ＝Ｃ伸縮）、１４２０（芳香族Ｃ＝Ｃ伸縮）、１３６６（エステルのＣ−Ｏ伸縮）、１２４８（Ｃ−Ｏ伸縮）、１０５０（エステルのＣ−Ｏ／−ＯＨ）、８９４（平面Ｃ−Ｈ結合外の芳香族）。δＣ（１０，０００Ｈｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）：１７１．０（Ｃ８、Ｃ１９、Ｃ４０）１５３．１（Ｃ２２、Ｃ３７）、１４１．７（Ｃ−ＣＡｒ）、１２７．０（Ｃ−ＣＡｒ）、１０２．４（Ｃ１）、８１．９（Ｃ７、Ｃ３３）、７４．５（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５）、６８．６（Ｃ２３、Ｃ３４）、６１．５（Ｃ６）、４６．７（Ｃ２０）、３６．５（Ｃ９、Ｃ１８）、３２．１（Ｃ２１）、２９．５（Ｃ１０−１７）元素分析：原料のＤｏＳが０．７：質量７９７．７ｇｍｏｌ−１であった場合の生成物の予想：Ｃ  ５２％、Ｈ  ５％、Ｎ  ３．５％、Ｓ  ２．１％。実際：Ｃ  ４２．８％、Ｈ  ６．９５％、Ｎ  ４．０２％、Ｓ  ０．５２％。したがって、全てのモノマーのうちのおよそ２５％は、リンカー基を含有する。
【０３１６】
ポリマー１７の酵素効率
酵素効力は、エステラーゼ（純粋なエステラーゼ（０．０１ｍＬ）をＰＢＳ（０．９９ｍＬ）中に混合することによって達成される〜５８単位／ｍＬ）で検査した。
【０３１７】
酵素効力を定量化し、正確に判定するために、９６ウェルプレートおよびプレートリーダー（励起が４８５ｎｍに設定され、発光が５９０ｎｍに設定され、ゲインが１５００に設定された、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ  ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、実験を設定した。サンプルの調製：０．４ｍｇのポリマー１７を、６４０μＬのＰＢＳ中に２４時間浸漬した。浸漬後、ＰＢＳ溶液は変化せず、透明なままであった。混合物を遠心分離して、固体の大部分を除去し、この時点で、ポリマー１７のサンプルは、ヒドロゲルになったようであった。次に、溶出液を濾過および分析し、追加の実験のために、固体ヒドロゲルを脇に保持した。各アリコートの前に、４０μＬの溶出液を、十分に混合しながらウェルに分注した。測定値をベースライン読み取り値とした。以下の溶液：ＰＢＳ（弱酵素溶液）中のエステラーゼ５８単位／ｍＬ、ＰＢＳ（強酵素溶液）中のエステラーゼ１１６単位／ｍＬを調製した。
【０３１８】
Ｎ＝４ウェルは、４０μＬのＰＢＳを試験分散液内にのみ追加（対照群）した。
【０３１９】
Ｎ＝４ウェルは、４０μＬの弱酵素溶液を試験分散液内にピペット注入した。
【０３２０】
Ｎ＝４ウェルは、４０μＬの強酵素溶液を試験分散液内にピペット注入した。
【０３２１】
最後のウェルに追加した直後に、別の蛍光読み取り値を記録し、その後、６０秒毎に１６０分間記録を行った。図３は、各時点での蛍光読み取り値からベースライン値を引いたもの（粒子懸濁液のみ）を示す。機器は、この実験中に、以前と同じように飽和点に到達しなかった。予想どおり、弱エステラーゼ溶液および強エステラーゼ溶液の蛍光は、経時的に増加した。
【０３２２】
陰性対照サンプル（酵素を含まないサンプル、ＰＢＳのみ）の蛍光は、経時的にわずかに増加した。
【０３２３】
上の実験に加えて、固体の濾液を使用して、追加の対照実験を実施した。固体を、６４０μＬのＰＢＳに追加し、ボルテックス混合し、良好な分散が観察されるまで超音波処理した。上に記載される同じ速度論的方法を使用して、溶液を分析した（結果については図４を参照のこと）。まとめると、この証拠は、合成方法が成功し、酵素切断ステップが、蛍光分光法によって定量化できる陽性反応を与えることを示唆する。ポリマー１７は、エステラーゼの非存在下ではポリマー１２ほど蛍光性ではなく、ポリマーに蛍光標識がより付着していないことを示す。
【０３２４】
実施例１８：ポリマー１８の調製
【化４２】
2019509853.tif 000059
【０３２５】
最初に、形成された任意のジスルフィド結合を脱カップリングするために、ポリマー８をＴＣＥＰで処理した。ＴＣＥＰ（０．０２４３ｇ、０．０８４８ｍｍｏｌ、４当量）を水１ｍＬ中に溶解し、ポリマー８（０．０１ｇ、０．０２１２ｍｍｏｌ）に追加し、室温で３０分間撹拌した。固体を濾過し、水（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄し、凍結乾燥させて、固体の灰白色／クリーム色の粉末を得、次にこれをＤＭＦ（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。
【０３２６】
メトキシポリエチレングリコールマレイミド（化合物１８−ａ）（０．０１ｇ、０．０５４３ｍｍｏｌ、２．５当量）を、２ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解し、Ｎ２（ｇ）でパージしたポリマー８に追加した。この反応物を、光から保護するために、箔で覆って一晩室温で撹拌した。一晩撹拌した後、反応混合物は、赤色になり、濾過すると、固相は存在しなかった。フィルターをＤＭＦ（５ｍＬ）ですすぎ、溶液を合わせ、真空中で還元して、透明／黄色油（重量＝０．０１０６ｇ）を得た。冷却した脱イオン水（２ｍＬ）を、油中に４℃でゆっくりと滴下し、次に凍結乾燥させて、灰白色／ピンクのワックス状固体としてポリマー１８を得た。重量＝６．４２ｍｇ。非定量的カイザー試験は、遊離アミンが存在しないことを示した。ＦＴＩＲ：〜３３５０（小、Ｎ−Ｈ、Ｏ−Ｈ）、２８８１（Ｃ−Ｈ）、２７４０（Ｃ−Ｈ）、１９６４、１７１０（５員環ケトン）、１６６５（Ｃ＝Ｏ、アミド）、１３５９（エステルのＣ−Ｏ伸縮）１２４０（Ｃ−Ｏ伸縮）、１１４５／１１００（エステルのＣ−Ｏ／−ＯＨ）、８４２（平面Ｃ−Ｈ曲げ外の芳香族。
【０３２７】
溶解度の評価は、クロロホルム、ＰＢＳ、およびＤＭＦ中に容易に溶解することを示した。
【０３２８】
実施例１９：ポリマー１９の調製
【化４３】
2019509853.tif 000060
【０３２９】
ポリマー５（３００ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を微粉に粉砕し、ＤＭＦ（２０ｍＬ）と２０分間混合した。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１．００ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１．８４ｇ、４．８６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１００ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（６．２ｍＬ、４．８６ｍｍｏｌ）を、大きな遠心管に追加し、窒素でパージした。一晩の混合を促進するために、実験用ローターを使用した。固体を濾過し、ＤＣＭ（５ｘ２０ｍＬ）およびメタノール（５ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。得られた生成物を乾燥して、ポリマー１９−ａを灰白色の粉末として提供した。重量＝０．２９３２ｇ。陽性カイザー試験は、不完全なカップリングを示した。ＦＴＩＲ：３３００（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８５０（Ｃ−Ｈ）、１７４８（アミド）、１６４８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８９（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４０３／１０２２、８９６。
【０３３０】
ポリマー１９−ａ（２０７ｍｇ）を、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ｖ／ｖ）（２０ｍＬ）の溶液中に配置し、窒素ガスでパージし、１時間撹拌した後、固体を濾過し、エタノール（３ｘ５０ｍＬ）およびＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。次に、この過程を繰り返し、生成物を乾燥させて、ポリマー１９を灰白色の粉末として提供した。重量＝０．３４５ｇ（収率６０％）。陽性カイザー試験結果は、遊離アミンの存在を確認した。ＦＴＩＲ：３３００（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８５０（Ｃ−Ｈ）、１７４８（アミド）、１６４８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８９（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４０３／１０２２、８９６。
【０３３１】
実施例２０：ポリマー２０の調製
【化４４】
2019509853.tif 000061
【０３３２】
ポリマー１９（２００ｍｇ、０．４７０ｍｍｏｌ）を微粉に粉砕し、ＤＭＦ（２０ｍＬ）と２０分間混合した。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（０．４３９ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．５３９ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２７０ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．０１８ｍＬ、１．４１ｍｍｏｌ）を、大きな遠心管に追加し、窒素でパージした。一晩の混合を促進するために、実験用ローターを使用した。固体を濾過し、ＤＣＭ（５ｘ２０ｍＬ）およびメタノール（５ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。得られた生成物を乾燥して、ポリマー２０−ａを灰白色の粉末として提供した。重量＝０．１５７６ｇ。陽性カイザー試験結果は、不完全なカップリングを示した。ＦＴＩＲ：３３００（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９００／２８５０（Ｃ−Ｈ）、１７４８（アミド）、１６４８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８４（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１５４２（）、１４４５／１４０３／１０２２、８９９でのピーク。
【０３３３】
ポリマー２０−ａ（１５８ｍｇ）を、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ｖ／ｖ）、（２０ｍＬ）の溶液中に配置し、窒素ガスでパージし、１時間撹拌した後、固体を濾過し、エタノール（３ｘ５０ｍＬ）およびＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。次に、この過程を繰り返し、生成物を乾燥させて、ポリマー２０を灰白色の粉末として提供した。重量＝０．１３９１ｇ（収率５８％）。陽性カイザー試験結果は、遊離アミンの存在を確認した。ＦＴＩＲ：３３００（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９００／２８５０（Ｃ−Ｈ）、１７４８（アミド）、１６４８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８４（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４０３／１０２５、９００でのピーク。
【０３３４】
実施例２１：ポリマー２１の調製
【化４５】
2019509853.tif 000062
【０３３５】
ポリマー２０（１５０ｍｇ、０．２７８５ｍｍｏｌ）を微粉に粉砕し、ＤＭＦ（２０ｍＬ）と２０分間混合した。Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（０．２８２ｇ、０．８３６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．３１７ｇ、０．８３５６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１６０ｍｇ、０．８３６ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．２０ｍＬ、０．８３６ｍｍｏｌ）を濾過カラム管に追加して、密封した。一晩の混合を促進するために、実験用ローターを使用した。固体を濾過し、ＤＣＭ（５ｘ２０ｍＬ）およびメタノール（５ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。得られた生成物を乾燥させて、ポリマー２１−ａを灰白色の粉末として提供した。重量＝０．１０９６７ｇ。陽性カイザー試験結果は、未反応アミンの存在を示した。ＦＴＩＲ：３３００（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８５０（Ｃ−Ｈ）、１７４８（アミド）、１６４８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８４（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４０３／１０２５でのピーク。
【０３３６】
ポリマー２１−ａ（１００ｍｇ）を、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ｖ／ｖ）、（２０ｍＬ）の溶液中に配置し、１時間撹拌した後、固体を濾過し、エタノール（３ｘ５０ｍＬ）およびＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。次に、この過程を繰り返し、生成物を乾燥させて、ポリマー２１を灰白色の粉末として提供した。重量＝０．０８０２０ｇ（収率４７％）。陽性カイザー試験結果は、遊離アミンの存在を示した。ＦＴＩＲ：３３００（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８５０（Ｃ−Ｈ）、１７４８（アミド）、１６４８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８４（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４５３／１４０３／１０２４、９６２／９０６／８４１でのピーク。
【０３３７】
実施例２２：ポリマー２２の調製
【化４６】
2019509853.tif 000063
【０３３８】
ポリマー２１（１００ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）を微粉に粉砕し、ＤＭＦ（１０ｍＬ）と２０分間混合した。Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（０．１６７ｇ、０．４９４ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．１８７ｇ、０．４９４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（９５ｍｇ、０．４９４ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．０６４ｍＬ、０．４９４ｍｍｏｌ）を、濾過カラム管に追加して、密封した。一晩の混合を促進するために、実験用ローターを使用した。固体を濾過し、ＤＣＭ（５ｘ２０ｍＬ）およびメタノール（５ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。得られた生成物を乾燥させて、ポリマー２２−ａを灰白色の粉末として提供した。重量＝０．０６０３ｇ。陽性カイザー試験結果は、未反応アミンの存在を示した。
【０３３９】
ポリマー２２−ａ（６０ｍｇ）を、ピペリジン：ＤＭＦ（２０：８０ｖ／ｖ）、（２０ｍＬ）の溶液中に配置し、１時間撹拌した後、固体を濾過し、エタノール（３ｘ５０ｍＬ）およびＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。次に、この過程を繰り返し、生成物を乾燥させて、ポリマー２２を灰白色の粉末として提供した。重量＝０．０５５３ｇ（収率４８％）。陽性カイザー試験結果は、遊離アミンの存在を示した。ＦＴＩＲ：３３００（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８５０（Ｃ−Ｈ）、１７４８（アミド）、１６４８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８５（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４５３／１４０３／１０２４／１０９５／１０５８、９６１、８４１でのピーク。
【０３４０】
実施例２３：ポリマー２３の調製
【化４７】
2019509853.tif 000064
【０３４１】
ポリマー２２（５０ｍｇ、０．７０７ｍｍｏｌ）を微粉に粉砕し、ＤＭＦ（１０ｍＬ）と２０分間混合した。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ（７１６ｍｇ、２．１２２ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（８０５ｍｇ、２．１２２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（４０７ｍｇ、２．１２２ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．２７４ｍＬ、２．１２２ｍｍｏｌ）を、濾過カラム管に追加して、密封した。一晩の混合を促進するために、実験用ローターを使用した。固体を濾過し、ＤＣＭ（５ｘ２０ｍＬ）およびメタノール（５ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。得られた生成物を乾燥させて、ポリマー２３−ａを灰白色の粉末として提供した。重量＝０．０２５３ｇ。陽性カイザー試験結果は、未反応アミンの存在を示した。ＦＴＩＲ：３３００（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８５０（Ｃ−Ｈ）、１７４８（アミド）、１６４８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８５（Ｃ＝ＯのＣＭＣ）、１４５３／１４０３／１０２４／１０９５／１０５８／９６１、８４１。
【０３４２】
ポリマー２３−ａ（２５ｍｇ）をＴＣＥＰの水（５ｍＬ）溶液中に配置し、室温で２時間撹拌した後、固体を濾過し、エタノール（３ｘ５０ｍＬ）およびＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。次に、この過程を繰り返し、生成物を乾燥させて、ポリマー２３を灰白色の粉末として提供した。陽性カイザー試験結果は、遊離アミンの存在を示した。この材料を、さらなる特徴付けをせずに、実施例２４で使用した。
【０３４３】
実施例２４：ポリマー２４の調製
【化４８】
2019509853.tif 000065
【０３４４】
ＴＣＥＰ（０．０３５７ｇ、０．１２５ｍｍｏｌ、４当量）を１ｍＬの水中に溶解し、ポリマー２３（２５．３ｍｇ、０．０３１２ｍｍｏｌ）に追加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。固体を濾過し、水（１０ｍＬｘ３）で洗浄し、凍結乾燥させて、固体の灰白色／クリーム色の粉末を得、次にこれをＤＭＦ（１０ｍＬｘ３）で洗浄した。
【０３４５】
フルオレセインジンアセテート−５−マレイミド（化合物１２−ａ）（０．０１６ｇ、０．０３１２ｍｍｏｌ、１当量）を、３ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解し、Ｎ２（ｇ）でパージした前処理ポリマー２３に追加した。この反応物を、光から保護するために、箔で覆って一晩室温で撹拌した。一晩の混合を促進するために、実験用ローターを使用した。固体を濾過し、ＤＣＭ（５ｘ２０ｍＬ）、水（５ｘ２０ｍＬ）、およびメタノール（５ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。得られた生成物を乾燥させて、ポリマー２４を灰白色の粉末として提供した。重量＝０．０１５６ｇ（収率３２％）。ＦＴＩＲ：（ｖ最大／ｃｍ−１）３２８６（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８７２（Ｃ−Ｈ）、１７２２（アセトン）、１６４７（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５８９（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１５４５（Ｃ−Ｃ  Ａｒ．フルオレセイン）、１４０９／１３１７／１２５０／１０２４／８９４。１３Ｃ  ＣＰ  ＭＡＳ  ＮＭＲ：ＣＭＣ  ０．７  ＤｏＳ（出発物材料）：δＣ（１３，０００Ｈｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）６１．７（Ｃ６）、７４．５（Ｃ７、Ｃ２、Ｃ５）、８２．５（肩部、Ｃ３）、９７．０（Ｃ４）、１０３．３（Ｃ１）、１７７（Ｃ＝Ｏ）；ＣＭＣ−ＰＥＧジアミン：δＣ（１３，０００Ｈｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）１３．４（Ｃ１４）、２０．１（割り当てなし）、２３．４（割り当てなし）、３０．６（Ｃ９）、６１．７（Ｃ６）、７０（肩部、Ｃ７）、７４．５（Ｃ２、Ｃ５）、８２．５（Ｃ３）、９５（Ｃ４）、１０３．３（Ｃ１）、１１３（割り当てなし）、１４２（割り当てなし）、１５２（割り当てなし）、１６９．７（リンカーのＣ＝Ｏ）、１７７．１（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）。
【０３４６】
実施例２５：ポリマー２５の調製（繊維）
【化４９】
2019509853.tif 000066
【０３４７】
ポリマー１３をＤＭＦ（３０ｍＬ）と２０分間混合した。室温で撹拌しながら、Ｆｍｏｃ−Ｃ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ（１．５ｇ、３．５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３．０９ｇ、８．１４ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１．０５ｍＬ、８．１４ｍｍｏｌ）を追加し、空気に開放した（一晩の混合を促進するために、遠心管および実験用ローターを使用した）。一晩回転させた後、固体を濾過し、ＤＣＭ（５ｘ５０ｍＬ）、メタノール（５ｘ５０ｍＬ）、および再びＤＣＭ（５ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。得られた生成物を乾燥させて、ポリマー２５を提供し、次の実施例（実施例２６）で直接使用した。
【０３４８】
実施例２６：ポリマー２６の調製
【化５０】
2019509853.tif 000067
【０３４９】
ポリマー２６は、実施例１２に記載されるものと類似の手順を使用して、調製した。外観：灰白色、粉末／固体。重量＝１．２５８ｇ（収率５９％）。ＦＴＩＲ：３３３９（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２８７２（Ｃ−Ｈ）、１７３６（アセトン）、１６４８（Ｃ＝Ｏ、カップリング生成物のアミド）、１５４９（ＣＭＣのＣ＝Ｏ）、１４１９、１３６３、１３１３、１２０１。δＣ（１０，０００Ｈｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）：３０（Ｃ９、１９）、３９（Ｃ１０、１１、１２、１３）、４７（Ｃ１８、２２）、５４（Ｃ１６）、６０（Ｃ６）、７０−７４（広い、Ｃ２、３、５、７）、８３（肩部、Ｃ４）、９２（Ｃ１７）、９７、１０４（Ｃ１）、１２０（Ｃ２４）、１２８（Ｃ２５、２６、２７）、１４２（Ｃ２８）、１５６（小、Ｃ２０、Ｃ＝Ｏカルバメート）、１７１（アミドのＣ８カルボニル）。元素分析：原料のＤｏＳが１であり、リンカー基への完全変換：質量７８１ｇｍｏｌ−１であった場合の生成物の予想：Ｃ  ５５％、Ｈ  ７％、Ｎ  ５％、Ｓ  ８％。実際：Ｃ  ４６％、Ｈ  ７％、Ｎ  ２％、Ｓ（実施されていない）。Ｓの態様をとり、リンカー基の％Ｎ可能（２／３．５）＝５７％のカップリング上に存在する％Ｎを計算する。Ｓの態様をとり、リンカー基の％Ｎ可能（２／３．５）＝５７％のカップリング上に存在する％Ｎを計算する。したがって、全てのモノマーのうちの〜４０％は、リンカー基を含有する。
【０３５０】
実施例２７：ポリマー２７の調製
【化５１】
2019509853.tif 000068
【０３５１】
乾燥ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中のアミノフェニルフルオレセイン（５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１４ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）の溶液を調製した。ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２（５−ａ）（０．１３ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を反応混合物に追加し、箔カバーを使用して光から保護して、およそ２４時間室温で撹拌した。生成物を濾過し、エタノール（１０ｍＬｘ３）およびＤＭＦ（５ｘ１０ｍＬ）で洗浄し、その後、真空中で濃縮して、固体の赤色／オレンジ色の生成物（２７）（１２．０ｍｇ、４３％）を得た。ＦＴＩＲ（ｖｍａｘ／ｃｍ−１）３３６７（Ｎ−Ｈ／Ｏ−Ｈ）、２９３２（Ｃ−Ｈ）、１７０２（ＡＰＦのアミド）、１６５５（ＣＯＮＨ、カップリング生成物のアミド）、１５５５（ＨＮＣＯ、ＣＭＣ）、１４９４、１４３７、１４１３、１３８７（Ａｒ．Ｃ＝Ｃ曲げ）、１１０６（ＯＣＨＲ、アルコキシＡＰＦ）、８３８、７５９、７２２、５５７（ａｒ．ＣＨ曲げ）。
【０３５２】
実施例２８：ポリマー２８の調製
【化５２】
2019509853.tif 000069
【０３５３】
任意の不要なジスルフィド結合を脱カップリングするために、ＤＩ水（１ｍＬ）中のＴＣＥＰ（１６．８ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ、４当量）と共に、ＣＭＣ−Ｃｙｓ（７）（１０ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ  １当量）を室温で１時間撹拌した。固体を濾過し、水（１０ｍＬｘ３）で洗浄し、凍結乾燥させ、次にＤＭＦ（１０ｍＬｘ３）で再び洗浄した。フルオレセインジアセテート−５−マレイミド（１２−ａ）（１１ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ、１当量）を、乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解し、窒素雰囲気下でＣＭＣ−ＣＹＳに追加した。反応物を、一晩室温で撹拌し、光から保護した。生成物を、水（３ｘ１００ｍＬ）およびＤＭＦ（１ｘ１００ｍＬ）で洗浄して、不透明なワックス状の固体（２８）（０．０１７ｇ、８５％）を得た。ＦＴＩＲ（ｖｍａｘ／ｃｍ−１）３３６５（Ｏ−Ｈ）、２９７１／２９１０、（Ｎ−Ｈ、ＣＨ）２８８３（ＳＨ）、１７２８（ＣＯＯＨ、酸）、１６７７（ＣＯＮＨ、アミド）、１６４０（ＨＮＣＯ、ペプチド）、１５９８（ＨＮＣＯＯ、ＣＭＣ）、１４０９、１３７１（ＣＯＯ）、１３０７（ａｒ．Ｃ＝Ｃ曲げ）、１２１６、１０１９（ＣＮ、第３級アミン）；水中に不溶性である溶解度、ｐＨ９リン酸緩衝液、および一般的な実験用溶媒（アセトン、メタノール、エタノール、ＴＨＦ、ＤＣＭ、およびＤＭＦ）。
【０３５４】
実施例２９：ポリマー２９の調製
【化５３】
2019509853.tif 000070
【０３５５】
ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２（１５）（１．０００ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）を微粉に粉砕し、ＤＭＦ（１５ｍＬ）と２０分間混合した。室温で撹拌しながら、Ｆｍｏｃ−Ｃ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ（１．１４ｇ、２．６３９ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＨＢＴＵ（２．５９ｇ、６．８１８１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１．１９ｍＬ、６．８１８１ｍｍｏｌ）を追加し、一晩放置した。生成物を濾過し、ＤＣＭ（５ｘ２０ｍＬ）およびメタノール（５ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、次に真空中で還元した。次に、保護された生成物をＳｔＢｕ脱保護し、各脱保護ステップを各々３回繰り返した後、真空中で還元して、白色固体粉末（２９−ａ）（０．２３６ｇ、５％）を得た。固体状態の１３Ｃ  ＮＭＲ（１０，０００ＭＨｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）１７６．５２（ＣＭＣ比のＣ−８）、１７１．８４（Ｃ−８、Ｃ−１９）、１５６．４５、１４２．３２、１２７．８５−１２０．０８（Ｃ−Ａｒ、Ｆｍｏｃ）、１１３．９３、１０３．２６（Ｃ−１）、８２．６０（Ｃ−４）、７４．５０（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−５）、６９．９２（Ｃ−７）、６１．４５（Ｃ−６）、５４．９３（Ｃ−２０）  ４９．５２、４７．３０、４１．５８、３８．７２−２３．０８（Ｃ−９、Ｃ−１０、Ｃ−１１、Ｃ−１２、Ｃ−１３、Ｃ−１４、Ｃ−１５、Ｃ−１６、Ｃ−１７、Ｃ−１８、Ｃ−２０）；ＦＴＩＲ（ｖｍａｘ／ｃｍ−１）３３１０（Ｏ−Ｈ）、２９１５（Ｎ−Ｈ、Ｃ−Ｈ）、２８６８（Ｓ−Ｈ）、１７３１（ＣＯＯＨ、酸）、１６５０（ＣＯＮＨ、カップリング生成物のアミド）、１５９２（ＨＮＣＯＯ、ＣＭＣ）、１５３８（ＨＮＣＯＯ、ペプチド）、１４４１、１４１７、１３６１（ＣＯＯ）、１３１０（ａｒ．Ｃ＝Ｃ曲げ）、１２５２（アミドＣＯ伸縮）、１０３１（ＣＮ、第３級アミン）、８４１；脱保護生成物に対するＥＡ予想Ｃ：４５．３％、Ｈ：７．５％、Ｎ：４．７％、Ｓ：７．１％、判明Ｃ：４７．１％、Ｈ：７．８％、Ｎ：６．７％、Ｓ：１０．１％、したがって、カップリング収率は、１１％；水および一般的な実験用溶媒（アセトン、メタノール、エタノール、ＴＨＦ、ＤＣＭ、およびＤＭＦ）中に不溶性であり、経時的にｐＨ９リン酸塩緩衝液中に可溶性である溶解度；Ｅｌｌｍａｎｓ試験陽性。
【０３５６】
任意の不要なジスルフィド結合を脱カップリングするために、中間体（２９−ａ）（７５．４ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ、３当量）を、ＤＩ水（１ｍＬ）中のＴＣＥＰ（１６８．５ｍｇ、０．１９６ｍｍｏｌ、４当量）と共に、室温で１時間撹拌した。固体を濾過し、水（１０ｍＬｘ３）で洗浄し、凍結乾燥させ、次にＤＭＦ（１０ｍＬｘ３）で再び洗浄した。フルオレセインジアセテート−５−マレイミド（１２−ａ）（２５．０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ、１当量）を、乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中に溶解し、窒素雰囲気下でＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＹＳ（２９−ａ）に追加した。反応物を、一晩室温で撹拌し、光から保護した。反応混合物を真空中で還元し、生成物を、水（〜７５ｍＬ）で５回洗浄し、凍結乾燥させて、灰白色の粉末（２９）（６３．０ｍｇ、４４％）を得た。固体状態の１３Ｃ  ＮＭＲ（１０，０００ＭＨｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）１７６．３８（ＣＭＣ比のＣ−８）、１７１．００（Ｃ−８、Ｃ−１９、Ｃ−３８）、１５３．１２（Ｃ−２２）、１４１．６７、１３５．４９−、１１９．８０  （Ｃ−Ａｒ、フルオレセイン）、１０２．４３（Ｃ−１）、８１．９２（Ｃ−４）、７４．４７（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−５）、７０．３０（Ｃ−７）、６８．６１、６１．４５（Ｃ−６）、４６．７３（Ｃ−４２）、３６．４７−２９．４８（Ｃ−９、Ｃ−１０、Ｃ−１１、Ｃ−１２、Ｃ−１３、Ｃ−１４、Ｃ−１５、Ｃ−１６、Ｃ−１７、Ｃ−１８、Ｃ−２０）；ＦＴＩＲ（ｖｍａｘ／ｃｍ−１）３３１５（Ｏ−Ｈ）、２９１１（Ｎ−Ｈ、Ｃ−Ｈ）、２８６９（Ｓ−Ｈ）、１９２２、１７２０（ＣＯＯＲ、接合エステル、フルオレセイン）、１６４７（ＣＯＮＨ、カップリング生成物のアミド）、１５９１（ＨＮＣＯＯ、ＣＭＣ）、１５４２（ＣＯＮＨ、ペプチド）、１４２０、１３６６／１３０９、（Ａｒ．Ｃ＝Ｃ曲げ）、１２４８（Ｃ−Ｏ伸縮）、１２１３，１０５０（ＣＮ、第３級アミン）、８４２，５８１（ａｒ．ＣＨ曲げ）；ＥＡ予想Ｃ：５１．１％、Ｈ：５．８％、Ｎ：３．７％、Ｓ：２．１％、判明Ｃ：４２．８％、Ｈ：７．０％、Ｎ：４．０％、Ｓ：０．５％であり、したがって、カップリング収率は、２４％である。
【０３５７】
実施例３０：ポリマー３０の調製（繊維）
【化５４】
2019509853.tif 000071
【０３５８】
ＤｏＳ０．３（２．０ｇ、８．３３ｍｍｏｌ）のＮａＣＭＣ繊維を、エタノール：脱イオン水（８０：２０ｖ／ｖ）（１８０ｍＬ）の溶液中に分散させて、１％懸濁液を得た。Ｄｏｗｅｘ６５０Ｃ単層イオン交換樹脂を、３０分間撹拌しながら追加した。単層を濾過により除去した後、ｐＨが８〜９（３．０ｍＬ、１．１６ｍｍｏｌ）になるまで、水酸化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＨ）４０％（水溶液）を０．１ｍＬアリコートで追加した。得られた溶液を３０分間撹拌した後、真空中で還元した。フィルム状の材料を窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１００ｍＬ）中に溶解し、撹拌し、一晩温和な加熱を必要とし、均一な質感を有する粘性のゲル状溶液を得た。溶液をおよそ４℃に冷却し、ＣＭＰ−Ｉ（１．４８ｇ、５．８ｍｍｏｌ）を、激しく撹拌しながら追加した。乾燥トリエチルアミン（３ｍＬ）と共に、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１．３６ｇ、９．１７ｍｍｏｌ）を反応物に追加した。反応物を４℃に保持し、最低３時間撹拌した後、固体を濾過し、９９％アセトン（３ｘ１００ｍＬ）およびＤＣＭ（３ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、各洗浄サイクル中に１分間超音波処理を実施し、繊維塊が任意の汚染物質を解きほぐして放出するのを促した。生成物を真空中で還元して、白色繊維状の固体（３０−ａ）（１．８ｇ、６０％）を得た。固体状態の１３Ｃ  ＮＭＲ（１０，０００ＭＨｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）１７６．９３（ＣＭＣ比のＣ−８）、１７１．９６（Ｃ−８）、１５３．４１、１４２．４０、１０４．１１、（Ｃ−１）、９６．８０、８３．５５（Ｃ−４）、７４．１８（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−５）、６９．３９（Ｃ−７）、６１．８９（Ｃ−６）、４０．４８（広い、Ｃ−１０、Ｃ−１１、Ｃ−１２、Ｃ−１３、Ｃ−１４）；  ＦＴＩＲ（ｖｍａｘ／ｃｍ−１）３３２５（Ｏ−Ｈ）、２８７２（Ｎ−Ｈ、Ｃ−Ｈ）、１６４８（ＣＯＮＨ、カップリング生成物のアミド）、１５８９（ＨＮＣＯＯ、ＣＭＣ）、１５４３、１４０８、１３６７（ＣＨＯ）、１３１４、１２６５（アミドＣＯ伸縮）、１０２２（ＣＮ、第３級アミン）、８９６；ＥＡ予想Ｃ：４１．７％、Ｈ：７．０％、Ｎ：２．３％、判明Ｃ：４２．６％、Ｈ：６．３％、Ｎ：２．９％であり、したがって、カップリング収率は、１２７％であり、水および一般的な実験用溶媒（アセトン、メタノール、エタノール、ＴＨＦ、ＤＣＭ、およびＤＭＦ）中に不溶性であり、経時的にｐＨ９のリン酸緩衝液およびＰＢＳ中に可溶性である、溶解度；カイザー試験陽性、３．０８μｍｏｌのアミン。
【０３５９】
繊維形態でのＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２（３０−ａ）（１．０ｇ、２．８６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３０ｍＬ）と２０分間混合した。Ｆｍｏｃ−Ｃ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ（１．５ｇ、３．５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３．０９ｇ、８．１４ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１．１０ｍＬ、８．５７ｍｍｏｌ）を、室温で撹拌しながら追加した。生成物を濾過し、ＤＣＭ（５ｘ５０ｍＬ）、メタノール（５ｘ５０ｍＬ）、再びＤＣＭ（５ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、次に真空中で還元して、白色固体粉末（３０−ｂ）（１．２３ｇ、５９％）を得た。注：保護された生成物は、この段階では、ＦｍｏｃまたはＳｔＢｕ脱保護されていなかった。固体状態の１３Ｃ  ＮＭＲ（１０，０００ＭＨｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）１７６．３８（小ピーク、ＣＭＣ比のＣ−８）、１７１．９３（Ｃ−８、Ｃ−１５）、１５６．２８（Ｃ−２０）、１４１．７３、１２７．６１−１２０．０１（Ｃ−Ａｒ、Ｆｍｏｃ）、１０４．１７（Ｃ−１）、９６．８１、８７．２７、８２．８６（Ｃ−４）、７４．２９（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−５）、６９．１７（Ｃ−７）、６２．１７（Ｃ−６）、６０．００（Ｃ−２１）、５４．２２（Ｃ−１６）、４６．８７（Ｃ−２２）、４６．８７、３９．３６−２９．４９（Ｃ−１０、Ｃ−１１、Ｃ−１２、Ｃ−１３、Ｃ−１４、Ｃ−１７、Ｃ−１９）；ＦＴＩＲ（ｖｍａｘ／ｃｍ−１）３３３９（Ｏ−Ｈ）、２８７２（Ｎ−Ｈ、Ｃ−Ｈ）、１７３６（ＣＯＯＨ、酸）、１６４８（ＣＯＮＨ、カップリング生成物のアミド）、１５４９（ＨＮＣＯＯ、ＣＭＣ）、１４１９、１３６３（ＣＯＯ）、１２０１、１０３１（ＣＮ、第３級アミン）、８４１；  ＥＡ予想Ｃ：４４．６％、Ｈ：６．７％、Ｎ：１．６％、Ｓ：２．５％、判明Ｃ：４６．０％、Ｈ：６．５％、Ｎ：２．２％、Ｓ：十分な材料が入手できず、水および一般的な実験用溶媒（アセトン、メタノール、エタノール、ＴＨＦ、ＤＣＭ、およびＤＭＦ）中に不溶性であり、経時的にｐＨ９リン酸塩緩衝液に可溶性である、溶解度；Ｅｌｌｍａｎｓ試験陽性。
【０３６０】
任意の不要なジスルフィド結合を脱カップリングするために、繊維形態でのＣＭＣ−ＰＥＧ−Ｃｙｓ（Ｆｍｏｃ）ＳｔＢｕ（３０−ｂ）（０．５９６５ｇ、１．２６５ｍｍｏｌ）を、ＤＩ水（３ｍＬ）中のＴＣＥＰ（１．４５ｇ、５．０６０ｍｍｏｌ、４当量）と共に、室温で３０分間撹拌した。固体を濾過し、水（１０ｍＬｘ３）で洗浄し、凍結乾燥させ、次にＤＭＦ（１０ｍＬｘ３）で再び洗浄した。フルオレセインジアセテート−５−マレイミド（１２−ａ）（０．１２５ｇ、０．２４０ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）中に溶解し、窒素雰囲気下でＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＹＳに追加した。反応物を、一晩室温で撹拌し、光から保護した。反応混合物を真空中で還元し、生成物をＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）、メタノール（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、真空中で還元した。次に、灰白色の固体繊維を、穏やかに加熱し、撹拌し、超音波処理しながら水（５×７５ｍＬ）で洗浄した後、濾過し、凍結乾燥して、灰白色の固体繊維（３０）（１．１０ｇ、７２％）を得た。固体状態の１３Ｃ  ＮＭＲ（１０，０００ＭＨｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）１７４．８８（ＣＭＣ比のＣ−８）、１７２．３０（Ｃ−８、Ｃ−１５、Ｃ−３４）、１４１．３６，１２９．３４−１２６．６５（Ｃ−Ａｒ、Ｆｍｏｃ、フルオレセイン）、１０４．５８（Ｃ−１）、８６．９４、８２．５２（Ｃ−４）、７８．５６−７２．９６（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−５、Ｃ−７）、６９．７４、６１．４５、６０．３５（Ｃ−６）、３８．６９−２１．０２（Ｃ−９、Ｃ−１０、Ｃ−１１、Ｃ−１２、Ｃ−１３、Ｃ−１４）；ＦＴＩＲ（ｖｍａｘ／ｃｍ−１）３３１５（Ｏ−Ｈ）、２８６８（Ｎ−Ｈ、Ｃ−Ｈ）、１７２８（ＣＯＯＲ、接合エステル、フルオレセイン）、１６４７（ＣＯＮＨ、カップリング生成物のアミド）、１５４２（ＣＯＮＨ、ペプチドカップリングのアミド、ＮＨＣＯＯ  ＣＭＣ）、１４１９、１３６４（Ａｒ．Ｃ＝Ｃ曲げ）、１２６４（Ｃ−Ｏ伸縮）、１１５２（ＯＣＨＲ）、１０１８（ＣＮ第３級アミン）、８７９；ＥＡ予想Ｃ：５０．９％、Ｈ：６．９％、Ｎ：５．５％、Ｓ：１．０％；判明Ｃ：３０．８％、Ｈ：８．６％、Ｎ：１．３％、Ｓ：＜０．３％であり、したがって、カップリング収率は、２４％である。
【０３６１】
実施例３０：ポリマー３１の調製
【化５５】
2019509853.tif 000072
【０３６２】
任意の不要なジスルフィド結合を脱カップリングするために、粉末形態でのＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＡＡＰＶＣ（Ｆｍｏｃ）ＳｔＢｕ（２３−ａ）（５２５ｍｇ、４３９ｍｍｏｌ）を、ＤＩ水中のＴＣＥＰ（５０３．４ｍｇ、０．１７５６ｍｍｏｌ、４当量）と共に、室温で３０分間撹拌した。固体を濾過し、水（５０ｍＬｘ３）、メタノール（５０ｍＬｘ３）、エタノール（５０ｍＬｘ３）、次に再び水（５０ｍＬｘ３）で洗浄した後、凍結乾燥させ、次に再びＤＭＦ（５０ｍＬｘ３）で洗浄した。フルオレセイン−５−マレイミド（２５ｍｇ、５９ｍｍｏｌ、０．１当量）を、乾燥ＤＭＦ（７０ｍＬ）中に溶解し、窒素雰囲気下でＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＡＡＰＶＣ（Ｆｍｏｃ）に追加した。反応物を室温で３時間撹拌し、光から保護した。反応混合物を真空中で還元して、ＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）、メタノール（３ｘ５０ｍＬ）、ＤＩ水（３ｘ５０ｍＬ）、再びＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）で、再びメタノール（３ｘ５０ｍＬ）およびメタノール（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、真空中で還元して、灰白色の固体（３１）（４３６ｍｇ、６８％）を得た。固体状態の１３Ｃ  ＮＭＲ（１０，０００ＭＨｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）１７６．７０（ＣＭＣ比のＣ−８、Ｃ−３９、Ｃ−４１）、１７１．３９（Ｃ−８、Ｃ−１５、Ｃ−１８、Ｃ−２１、Ｃ−２６、Ｃ−３０、Ｃ−４５）、１５３．３７（Ｃ−３３、Ｃ−５１）、１４２．１９（Ｃ−３６、Ｃ−３７、Ｃ−Ａｒ）、１２７．５７−１２０．４８（Ｃ−Ａｒ）、１０３．８５、（Ｃ−１）、１０２．６３（Ｃ−Ａｒ）、９７．５５、８２．３１（Ｃ−４）、７４．３４（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−５、Ｃ−７）、６９．８５（Ｃ−２３）、６０．８０（Ｃ−６、Ｃ−２７）、５２．２３−４８．３７（Ｃ−１６、Ｃ−１９、Ｃ−２５、Ｃ−３５）、４２．１０（Ｃ−９、Ｃ−１４、Ｃ−３８）、３８．７０−２５．０５（Ｃ−９、Ｃ−１０、Ｃ−１１、Ｃ−１２、Ｃ−１３、Ｃ−１４）、１８．４５（Ｃ−１７、Ｃ−２０、Ｃ−２９）、１４．１１；ＦＴＩＲ（ｖｍａｘ／ｃｍ−１）３３４０／３２９４（Ｏ−Ｈ）、２９１４／２８６２（Ｎ−Ｈ、Ｃ−Ｈ）、１７３７（ＣＯＯＨ、酸）、１６４５（ＣＯＮＨ、カップリング生成物のアミド／ＣＯＯＲ、接合エステル、フルオレセイン）、１５９３（ＨＮＣＯＯ、ＣＭＣ）、１５４３（ＣＯＮＨ、ペプチド）、１４１４、１３７５（ＣＯＯ）、１３４３（ａｒ．Ｃ＝Ｃ曲げ）、１２６２（Ｃ−Ｏ伸縮）、１２３０、１０５６（ＣＮ、第３級アミン／ＯＣＨＲ）、８９７、８４１、７６４、５５６（ａｒ．ＣＨ曲げ）；ＥＡ予想Ｃ：５３．４％、Ｈ：６．０％、Ｎ：５．４％、Ｓ：１．５％、判明Ｃ：４７．１％、Ｈ：６．７％、Ｎ：４．１％、Ｓ：０．８％であり、したがって、カップリング変換率は、５２％である。
【０３６３】
実施例３２：ポリマー３２の調製
【化５６】
2019509853.tif 000073
【０３６４】
任意の不要なジスルフィド結合を脱カップリングするために、粉末形態でのＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＡＡＰＶＣ（Ｆｍｏｃ）ＳｔＢｕ（２３−ａ）（１７５ｍｇ、１４６ｍｍｏｌ）を、ＤＩ水（２３ｍＬ）中のＴＣＥＰ（１６８ｍｇ、５８５ｍｍｏｌ、４当量）と共に、室温で３０分間撹拌した。固体を濾過し、水（５０ｍＬｘ３）、メタノール（５０ｍＬｘ３）、エタノール（５０ｍＬｘ３）、次に再び水（５０ｍＬｘ３）で洗浄した後、凍結乾燥させ、次に再びＤＭＦ（５０ｍＬｘ３）で洗浄した。Ｎ−ブロモフェニルマレイミド（３７ｍｇ、０１４６ｍｍｏｌ、１当量）を、乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、窒素雰囲気下でＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＡＡＰＶＣ（Ｆｍｏｃ）に追加した。反応物を室温で３時間撹拌し、光から保護した。反応混合物を真空中で還元して、ＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）、メタノール（３ｘ５０ｍＬ）、ＤＩ水（３ｘ５０ｍＬ）、再びＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）、再びメタノール（３ｘ５０ｍＬ）およびメタノール（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、真空中で還元して、灰白色の固体（３２）（１２９ｍｇ、６９％）を得た。固体状態の１３Ｃ  ＮＭＲ（１０，０００ＭＨｚ、ＣＰ  ＭＡＳ）１７１．１６（Ｃ−８、Ｃ−１５、Ｃ−１８、Ｃ−２１、Ｃ−２６、Ｃ−３０、Ｃ−３８、Ｃ−３９）、１５３．３３（Ｃ−３２）、１４２．０３、１２７．４５−１１３．０３（Ｃ−Ａｒ、Ｆｍｏｃ、フルオレセイン）、１０２．７４（Ｃ−１）、９７．０９、８２．１５（Ｃ−４）、７４．３９（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−５、Ｃ−７）、６９．８４、６１．２１、５７．４２（Ｃ−６、Ｃ−３１）、４７．９１（Ｃ−１６、Ｃ−１９、Ｃ−２７）、３８．７６−２２．５６（Ｃ−９、Ｃ−１０、Ｃ−１１、Ｃ−１２、Ｃ−１３、Ｃ−１４）１８．３３−１４．１６（Ｃ−１７、Ｃ−２０、Ｃ−２９）；ＦＴＩＲ（ｖｍａｘ／ｃｍ−１）３３２２（Ｏ−Ｈ）、２９０１／２８７２（Ｎ−Ｈ、Ｃ−Ｈ）、２１０３、１７８８（ＣＯＯＨ、酸）、１６４４（ＣＯＮＨ、カップリング生成物のアミド／ＣＯＯＲ、接合エステル、フルオレセイン）、１５９４（ＨＮＣＯＯ、ＣＭＣ）、１５４４／１５１４（ＣＯＮＨ、ペプチド）、１３４９／１３０４（ａｒ．Ｃ＝Ｃ曲げ）、１２５１（Ｃ−Ｏ伸縮）、１２３０、１０２５（ＣＮ、第３級アミン／ＯＣＨＲ）、８９８、８４３、７３８、５５６（ａｒ．ＣＨ曲げ）；ＥＡ予想Ｃ：５０．０％、Ｈ：６．１％、Ｎ：６．１％、Ｓ：１．８％、Ｂｒ：４．３％、判明Ｃ：４６．３％、Ｈ：６．７％、Ｎ：５．２％、Ｓ：０．３３％、Ｂｒ：検出されず、したがって、カップリング変換率は、１７％である。
【０３６５】
実施例３３
プロテアーゼ／ペプチドの酵素切断
トリプシン、キモトリプシン、およびサーモリシン等の他のプロテアーゼを含む創傷特異的プロテアーゼの活性をアッセイした。トリプシンは、Ｐ１がＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｐ１’が非特異的である、Ｐ１−Ｐ１’を切断する（プロリンが続く場合を除く）。キモトリプシンは、Ｐ１が任意の芳香族アミノ残基、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅであり、Ｐ１’が非特異的である、Ｐ１−Ｐ１’を切断する。サーモリシンは、Ｐ１が非特異的であり、Ｐ１’がＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａであり、Ｐ２’がＰｒｏではない、Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’を切断するメタロエンドペプチダーゼである。
【０３６６】
エステラーゼは、カルボン酸エステルのエステル結合を加水分解し、したがって、アミノ酸配列を特異的に加水分解するプロテアーゼとは異なる挙動を示す。酵素アッセイに使用される基質は、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｄａｂｓｙｌ）であり、酵素活性を、ＵＶ可視に基づく方法を使用して判定した。Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｄａｂｓｙｌ）配列は、キモトリプシンによって加水分解されるべきである。トリプシンは、この配列を切断すべきでないので、陰性対照群として使用された。
【０３６７】
基質ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ｃｙｓ−マレイミドフルオレセインジアセテート上の酵素活性を、共焦点蛍光顕微鏡法を使用して分析した。固体粒子を、最初に単独で、次にエステラーゼ溶液（約５０単位／ｍＬ）の追加後に見た。顕微鏡画像は、酵素溶液をサンプルに追加したときに観察される蛍光の増加を実証している。この方法を使用する利点は、粒子を可視化し、フルオレセインジアセテートとＣＭＣポリマーとのカップリングを確認した酵素溶液の追加時の蛍光強度の差を観察できることである。代わりに、複数プレートリーダーを使用して、基質の切断を評価し、その結果をＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ動力学を用いて定量化し得る。
【０３６８】
１つの実験では、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ｃｙｓ−マレイミド−フルオレセインジアセテート粉末に対するエステラーゼの効果を測定した。まず、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ｃｙｓ−マレイミド−フルオレセインジアセテート粉末（０．２ｍｇ）をＰＢＳ（３２０μＬ）中に分散させた。化合物を分散させるためには、超音波処理、ボルテックス混合、および穏やかな加熱が必要であった。４０μＬの基質懸濁液を、９６ウェルプレートのウェルに追加し、次に、弱エステラーゼ溶液（５８Ｕ／ｍＬ）、強エステラーゼ溶液（１１６Ｕ／ｍＬ）、またはＰＢＳ（陰性対照群）のいずれかを追加した（ウェル当たり４０μＬ）。２時間にわたる５分間のサイクル期間を、蛍光測定のために選択した。
【０３６９】
２つの異なる強度のエステラーゼ溶液を使用して、反応速度の任意の差を分析できることは興味深かった。蛍光強度の変化を、その後の各時点からのゼロ時点での読み取り値（ベースライン）を差し引くことによって計算した。
【０３７０】
弱エステラーゼ溶液（５８Ｕ／ｍＬ）および強エステラーゼ溶液（１１６Ｕ／ｍＬ）と共にインキュベートされたサンプルにおいて、増加した蛍光が観察され、これは経時的に増加した。強エステラーゼ溶液は、弱エステラーゼ溶液の速度の３．５倍の増加を示した後、約３０分（４５０００単位の強度）で飽和点に到達した。
【０３７１】
スペーサー長の効果
エステラーゼアッセイにおけるより長いＰＥＧ鎖長の効果を調査するために、蛍光測定値を、７７（ＣＭＣ−「より長い」ＰＥＧ−ＮＨ−Ｃｙｓ（Ｆｍｏｃ）−マレイミドフルオレセインジアセテート）について記録した。この試験では、サンプル当たり４回の複製を実施し、２時間の期間にわたる１分間のサイクルを記録した。より短い基質と同様に、より長い基質（７７）をエステラーゼと共にインキュベートすると、蛍光が検出される。１１６Ｕ／ｍＬ（強）エステラーゼサンプルは、４０分後にピークに到達し、５８Ｕ／ｍＬ（弱）エステラーゼサンプルは、８０分後にピークに到達した。１１６Ｕ／ｍＬエステラーゼ反応の速度は、５８Ｕ／ｍＬサンプルの速度の２倍であり、したがって、酵素濃度の倍増により、速度が倍増した。反応速度は、より短いＰＥＧリンカー等価物の反応速度よりも有意に低かった。ペプチドのＣＭＣへの装荷がより低かったので、この減少は、予想された。
【０３７２】
繊維形態でのＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ｃｙｓ（Ｆｍｏｃ）−マレイミドフルオレセインジアセテート（８２）をエステラーゼと共にインキュベートすることによっても、同様の結果が得られ、両方のエステラーゼ溶液（５８および１１６Ｕ／ｍＬ）によると、より大きな酵素濃度での蛍光生成物の生成の時間およびより大きい速度で蛍光が増加する。
【０３７３】
エラスターゼによるＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＡＡＰＶＣ−マレイミドフルオレセイン（粉末、アルギン酸繊維および親水コロイド形態）の切断：ＡＡＰＶペプチド配列は、ＡｌａおよびＶａｌのＰ１に予測される切断部位を有するエラスターゼに対する基質である。このＡＡＰＶ配列を含有した化合物について、エステラーゼアッセイと同様の方法で、エラスターゼアッセイを実施した。３つの形態：（ａ）粉末形態、（ｂ）繊維形態での化合物を含む湿式紡糸アルギン酸塩、および（ｃ）０．８％または８％のいずれかの化合物を含有する親水コロイドゲルの基質を試験した。
【０３７４】
化合物単独でのエラスターゼとのインキュベーションは、経時的な蛍光の明らかな増加を示した。また、粉末形態でのＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＡＡＰＶＣ−マレイミドフルオレセインを０．８％および８％装荷した親水コロイドゲルにエラスターゼ溶液を追加する効果を評価するために、同じ実験を実施した。結果は、対照群（親水コロイドゲルのみ）と比較した場合、修飾ＣＭＣ装荷親水コロイドゲルに対する経時的な蛍光の増加を示した。より高い装荷レベル（８％）は、より低い装荷（０．８％）サンプルよりも有意に蛍光性であった。２つの異なる酵素強度を試験し、この場合、強エラスターゼ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）を弱エラスターゼ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）と比較して使用したときに、サンプルの蛍光は、わずかしか増加しなかった。これは、エラスターゼが０．１ｍｇ／ｍＬでも過剰であり、修飾ＣＭＣの使用が、蛍光反応に対してより有意な効果を有することを示唆する。
【０３７５】
切断断片のＬＣ−ＭＳ分析
エラスターゼを粉末形態でのＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＡＡＰＶＣ−マレイミドフルオレセインに追加するときに生成された断片を特徴付ける試みで、実験を設定した。エラスターゼ（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍＬ）を７８に追加し、３７℃でインキュベートし、アリコートをいくつかの時点（１分〜３時間）にわたって回収し、液体窒素中で直ちに凍結することによって保存した。各解凍されたアリコートに対してＨＰＬＣを実施して、断片を分離し、次に質量分析法を実施して、その質量を分析した。分析は、エラスターゼとのインキュベーション中に切断された予想される断片の存在を確認した。予測どおり、切断部位は、ＡｌａおよびＶａｌのＰ１にあった。さらに、Ｐｒｏ断片のいくつかの証拠があったが、これは、ＰｒｏのＰ１位置にさらなる切断部位があることを示唆する。この結果は、蛍光光度計アッセイ中に記録された蛍光の増加と一致し、システムが特定の酵素を検出して、検出可能な信号を与えることができるという証拠をさらに構築する。
【０３７６】
実施例３４
細胞研究−医療デバイスの生体適合性
医療デバイスを設計する際に考えるべき重要な点は、その生物学的安全性、および細胞傷害性、感作性、血液適合性、発熱原性、移植性、遺伝毒性、発がん性、生殖・発生毒性、生分解性等の他の因子である。新規の材料とインビトロで成長した細胞との間の相互作用の研究は、これらの材料の毒性の良好な指標を与えることができ、したがって、これらの方法のアレイが使用される（Ｅｉｓｅｎｂｒａｎｄら、ＦｏｏｄＣｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００２、４０、１９３−２３６）。デバイスの最終用途に関連する身体の領域および機能に適した試験を行うためには、好適な細胞型を選択しなければならない。本方法は、定量的または純粋に視覚的であり得、現代の技術は、顕微鏡を介した細胞の経時的ビデオ撮像の使用等、細胞相互作用の洗練された視点を可能にする。
【０３７７】
創傷治癒に関連する細胞：線維芽細胞は、創傷治癒過程において重要である。それらは、炎症期の後期段階中の損傷のおよそ２４時間後に、創傷床に向かって移動し始める。それらは、ＭＭＰのようなプロテアーゼを含むメディエーターの生成によって、増殖期および上皮形成期全体にわたって創傷環境を改変する。最後に、線維芽細胞のレベルは、再構成段階で正常レベルに戻り、いったん新規の創傷細胞外マトリックスは、十分な強度に達成した（Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅら、Ｊ．Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ  ２０１３、２２、４０７−４０８）。したがって、線維芽細胞は、創傷治癒過程を模倣するときに好適な細胞株である。
【０３７８】
使用されるインビトロ方法論では、生体適合性の初期の考え方に対してペプチド修飾ＣＭＣ材料をスクリーニングするために、２つのインビトロ細胞方法を使用した。
【０３７９】
ヒト真皮線維芽細胞の源および培養：ヒト真皮線維芽細胞は、先に適切な状態下で単離および保存されていた。
【０３８０】
患者からインフォームドコンセントを得て、正常な線維芽細胞の培養物を得た。糖尿病、全身免疫抑制、または局所感染の証拠を有する患者は、研究から除外した。３つの患者細胞株：患者Ａ、Ｆ、およびＧが、この研究に対して利用可能であった。６ｍｍの生検を、患者の大腿部から採取した。培養物は、標本の酵素分解後の単一細胞懸濁技術によって確立された。簡単に述べると、組織をディスパーゼ（２ｍｇ／ｍＬ、英国ルイス所在のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）で一晩インキュベートして、皮膚組織から表皮組織を分離した。真皮組織標本を、細菌性クロストリジウムヒストリチカムＡコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を利用して、一晩解離させた。線維芽細胞培養物を、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、非必須アミノ酸（１ｘ）、抗生物質（１００Ｕ／ｍＬのペニシンＧ、１００ｍｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢ）、および１％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含有する線維芽細胞血清含有培地（Ｆ−ＳＣＭ）中で維持した。培養物を、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気中で維持した。コンフルエントに、線維芽細胞をトリプシン処理し、再播種した（Ｔ７５フラスコ当たり１．５ｘ１０５個の細胞）。
【０３８１】
線維芽細胞スクラッチアッセイ方法論：
スクラッチアッセイは、繊維芽細胞のコンフルエントな単層を平らな表面上で成長させ、次に、この表面を「引っかく」か、または「創傷を付けて」、繊維芽細胞の２つの領域を分離するチャネルを作製する技術である。サンプル溶液を細胞の頂部に追加し、細胞がどのように反応するかを見るために、共焦点顕微鏡法を使用して、経時的にチャネルを観察する（Ｌｉａｎｇら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２００７、２、３２９−３３３）。サンプルを含有する周囲領域が細胞を受け入れやすい場合、細胞は増殖および移動して、時間の経過中にチャネルを充填し、サンプルが受け入れられない場合、細胞は、移動せずに死滅するだろう。
【０３８２】
ヒト真皮線維芽細胞を２４ウェル組織培養プレート（１ウェル当たり２ｘ１０４細胞）中に播種し、８０〜９０％コンフルエントに培養し、２００μＬピペットチップを用いて組織培養プラスチックの表面に沿って引っかくことによって、単層に創傷を付けた。単層をＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ中に０．６６ｍｇ／ｍＬまたは０．０６６ｍｇ／ｍＬで、化合物を追加した。次に、細胞にＦ−ＳＣＭを再供給し、Ｃｅｌｌ−ＩＱシステムを有する共焦点顕微鏡の電動、加熱、およびガス処理段階での標準培養状態下で、インキュベートした。
【０３８３】
画像は、２０分毎に回収され、映像は、Ｃｅｌｌ−ＩＱソフトウェアを利用して作製された。各細胞株、患者Ａ、Ｆ、およびＧについて、アッセイを３回完了した。
【０３８４】
コラーゲンマトリックスモデル方法論：
コラーゲンマトリックスモデルは、治癒の再構成期中の真皮を表すインビトロツールである。ここでは、一連の線維芽細胞集団コラーゲン格子（ＦＰＣＬ）を使用して、コラーゲンマトリックスの再構成に対するそれらの効果に関して、ペプチド修飾セルロースを対照群と比較した。正常な状態下では、線維芽細胞の再構成によりＦＰＣＬの直径が減少することが予想され、これは、細胞過程が正常に進行しており、「治癒」が起こり得ることを示す（Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．２００４、１２、１３４−１４７）。
【０３８５】
トリプシン処理による培養由来の線維芽細胞を利用して、線維芽細胞集団コラーゲン格子（ＦＰＣＬ）を構築した。Ｉ型ラット尾部コラーゲンは、Ｆｉｒｓｔ  Ｌｉｎｋから購入した。１．５ｘ１０５の線維芽細胞（７５０μＬのＦ−ＳＣＭ中）を、２ｘＤＭＥＭ（４０部の１０ｘＤＭＥＭ、１０部分のＮａＨＣＯ３（７．５％（ｗ／ｖ））、４部のＬ−グルタミン（２００ｍＭ）、４部の非必須アミノ酸（１００ｘ）、１４０部のＨ２０および５部のＮａＯＨ（１Ｍ）、３ｍＬ）、０．１Ｍ  ＮａＯＨ（７５０μＬ）、ＦＣＳ（７５０μＬ）、２．２５ｍＬのＩ型コラーゲン（１．７ｍｇ／ｍＬ）、および試験化合物（０．６６ｍｇ／ｍＬ）を含有する６０ｍｍの細菌学的プレートに追加した。コラーゲンのポリマー化を可能にするために、プレートを３７℃で６０分間インキュベートした。次に、それらをプレートの縁から取り外し、２ｍＬのＦ−ＳＣＭを追加した。ＦＰＣＬを、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気中で維持した。
【０３８６】
ＦＰＣＬ再構成過程中に、円形が保持され、ＦＰＣＬの直径を３日目および７日目に測定することが可能になった。各サンプルについて、３つの異なる患者サンプル（ｎ＝３）由来の細胞に対して、実験を実施した。
【０３８７】
７つの修飾ＣＭＣ材料を、ベースラインとしてＣＭＣ粉末およびＣＭＣ繊維と共に試験した（表３）。
【０３８８】
表３：インビトロ細胞試験中に分析される化合物
【表１３】
2019509853.tif 000074
【０３８９】
線維芽細胞スクラッチアッセイの結果：
概して、試験期間中、線維芽細胞は、生存したままであり、増殖して、スクラッチチャネルを充填した。結果（図５）は、繊維芽細胞がスクラッチチャネルを完全に閉鎖するのに要した時間を示す。図５に示すように、全てのサンプルは、７０時間以内にチャネルを閉鎖した。ＣＭＣ粉末サンプルは、これが創傷接触用途に使用するのに安全であると知られているので、参照として使用した。ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２繊維は、対照群よりも短い時間で引っかき傷が閉鎖した唯一のサンプルであった。ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２粉末の引っかき傷の閉鎖時間は、他の修飾ＣＭＣサンプル（約４０〜６０時間）と略等価であり、これは、細胞が繊維形態でのサンプルの物理的構造に対して何らかの選好性を有し得ることを示唆する。
【０３９０】
０．０６６ｍｇ／ｍＬの１２、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２粉末を含有する患者Ａに対する引っかき傷（図６）、および０．６６ｍｇ／ｍＬの１２、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２粉末を含有する患者Ａに対する引っかき傷（図７）は、両方とも、線維芽細胞が複製してチャネル内に移動したので、経時的に閉鎖した。これらの画像は、線維芽細胞がサンプルの不溶性またはより高濃度のサンプルによる影響を受けず、修飾ＣＭＣ中およびその周りでなお繁殖することができることを示す。図６および図７は、患者Ａ、Ｆ、およびＧ由来の全てのサンプルおよび細胞株にわたって実施された試験の略全ての観察結果を表している。３人の異なる患者から得られた試料を用いて試験を繰り返した場合、ＣＭＣ−より長いＰＥＧ−ＮＨ２粉末（＃８３）は、１つの研究で異常な結果を生じたが、線維芽細胞は、増殖および移動した。
【０３９１】
実施例３５：コラーゲンマトリックスモデル
コラーゲンマトリックスモデル研究中、線維芽細胞は、全てのサンプルにわたって生存したままであった。対照群と比較して、修飾ＣＭＣサンプルについて、８３のＣＭＣ−より長いＰＥＧ−ＮＨ２粉末を除いて、わずかに少ない再構成のみが観察され、これは、他のサンプルと比較して、試験を通して限定された線維芽細胞の再構成のみを示した（図８、図９、および図１０）。化合物８３（ＣＭＣ−より長いＰＥＧ−ＮＨ２粉末、７日目に約４０ｍｍ〜６０ｍｍの格子径）と化合物１２（ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２粉末、７日目に約１５ｍｍ〜３５ｍｍの格子径）との間に、有意な差が観察され、その結果は、図８〜１０から明らかである。図１１〜１３の写真から明らかな生データは、それぞれ、患者Ａ（図１１）、Ｂ（図１２）、およびＣ（図１３）から得られた細胞サンプル中の３日目および７日目での化合物１２、８３、８１、７４、７８、８０、ＣＭＣ粉末、およびＣＭＣ繊維の各々の格子径に対する効果を実証している。
【０３９２】
結論
本研究は、修飾ＣＭＣ材料が線維芽細胞に対して有毒ではないことを実証している。また、繊維および粉末形態、より長いもしくはより短いＰＥＧスペーサーリンカー、またはペプチドおよび検出可能な断片の追加の間に差異はなかった。線維芽細胞は、コラーゲンマトリックスモデル中の全ての場合において生存し、他の化合物と比較して減衰した効果を示した８３のＣＭＣ−より長いＰＥＧ−ＮＨ２粉末を除いて、サンプルの大部分について、再構成は、対照群よりもわずかに低いのみであった。
【０３９３】
実施例３６  液晶（ＬＣ）研究
液晶実験設定
ＣＭＣゲルが５ＣＢ液晶上に配置された間、研究を実施し、偏光顕微鏡を使用して、アンカーリングを経時的に観察した。ＬＣ研究を設定するためには、ＬＣを設定領域内に保持することを可能にし、偏光顕微鏡を使用して視覚化することを可能にするために、チャンバを作製する必要がある。５ＣＢのＴＥＭグリッド閉じ込めは、公開された研究（Ｎａｚａｒｅｎｋｏら、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｅ  １９９９、６０、Ｒ３４９５−Ｒ３４９７；Ｂｒａｋｅら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００３、１９、６４３６−６４４２）に従って実施された。
【０３９４】
５ＣＢ−ＴＥＭグリッド実験システムを作製するために、第１に、ベースとして使用されるガラススライドは、好ましくは、グリース等の不純物を含まない。ガラスから全ての有機物を除去する強酸化剤であるピラニア溶液を使用して、洗浄を実施した。ピラニア溶液の強酸化性質のため、皮膚との接触を回避し、さらには爆発を避けるために、適切な安全予防措置が講じられた。
【０３９５】
洗浄すべきガラスを含有する容器に、濃縮された硫酸（約３０ｍＬ、９８％グレード）を追加し、続いて過酸化水素（約１０ｍＬ、３０％）をゆっくり追加して、室温で１時間放置した。ピラニア溶液を注ぎ出し、ガラスを水およびアルコールで十分に洗浄した。最後に、ピラニア廃液を注意深く中和した。次に、ガラスをオクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）で被覆した。ＯＴＳは、ガラススライド表面を被覆して、これを疎水性にするであろう、長鎖自己組織化両親媒性分子である。よって、５ＣＢは、チャンバの基部に沿ってホメオトロピックアンカーリングと整列される。ＴＥＭグリッドをＯＴＳ被覆ガラス上に配置して、ＬＣ溶液用のグリッドを内部に保持した。キャピラリー管を使用して、ＴＥＭグリッドに５ＣＢを注意深く追加し、グリッドの頂部に溶液のドームを形成するように、各グリッドが十分に充填されているが、過剰充填されないことを確実にした。ＴＥＭグリッドに５ＣＢを追加する際、光学顕微鏡の交差偏光レンズを使用して、５ＣＢ整列をチェックした。５ＣＢは、この段階ではホメオトロピックであるが、これは、ＯＴＳ被覆ガラススライドとのＬＣの整列によるものである。
【０３９６】
酵素検出の原理は、脂質、例えば、ＤＬＰＣの放出時のＬＣ配向の変化に依存する。このようにしてペプチド修飾ＣＭＣおよびＬＣを使用した、可能性のあるシステムを、図１４に示す。この目的のために、図１５は、ＣＭＣゲルの適用時の５ＣＢ充填ＴＥＭグリッドを示す顕微鏡写真を示す。
【０３９７】
他の実施形態
前の実施例は、先の実施例で使用されたものに対して、開示された技術の一般的もしくは具体的に記載される反応物および／もしくは動作状態を置換することによって、繰り返すことができる。
【０３９８】
前述の説明から、当業者は、開示された技術の本質的な特徴を容易に確認することができ、その主旨および範囲から逸脱することなく、開示された技術を様々な用途および状態に適合させるために、様々な変更および改変を行うことができる。
【０３９９】
別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。開示された技術の実施もしくは試験において、本明細書に記載される方法および材料と同様もしくは等価な方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料は、前述の段落に記載されている。さらに、材料、方法、および実施例は、単なる例示的なものであり、限定することを意図するものではない。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先されるだろう。
【０４００】
本明細書で引用される全ての米国特許および公開または非公開の米国特許出願は、参考により組み込まれる。本明細書で引用される全ての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される全ての公開された参考文献、文書、写本、科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用されるＮＣＢＩ、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＢＩ、ＰＵＢＭＥＤデータベースに関する全ての識別子および受託番号は、参照により本明細書に組み込まれる。
開示された技術の好ましい実施形態が本明細書に示され、かつ説明されているが、そのような実施形態が単なる例示として提供されていることは、当業者に明らかであろう。当業者には、数多くの変形例、変更例、および置換例が、これより生じるであろう。本明細書に記載される開示された技術の実施形態に対する様々な代替例が、開示された技術の実施において用いられ得ることが、理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、開示された技術の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物が、それによって含まれることが意図される。
【図１】
2019509853.tif 000089
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2019509853.tif 000099
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【国際調査報告】
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