(57)【要約】  本発明は、ヒトＰＤＥ１阻害薬としての使用のための、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。                                    2019526567.tif 000020
2019526567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物
【化１】
2019526567.tif 000018
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
以下である、請求項１に記載の化合物。
【化２】
2019526567.tif 000019
【請求項３】
慢性腎臓病を治療することを必要とする患者へ、有効量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、患者の慢性腎臓病を治療する方法。
【請求項４】
糖尿病性腎臓病を治療することを必要とする患者へ、有効量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、患者の糖尿病性腎臓病を治療する方法。
【請求項５】
療法における使用のための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
慢性腎臓病の治療における使用のための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
糖尿病性腎臓病の治療における使用のための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、医薬組成物を調製するためのプロセス。
【請求項１０】
慢性腎臓病を治療することを必要とする患者へ、有効量の請求項２に記載の化合物を投与することを含む、患者の慢性腎臓病を治療する方法。
【請求項１１】
糖尿病性腎臓病を治療することを必要とする患者へ、有効量の請求項２に記載の化合物を投与することを含む、患者の糖尿病性腎臓病を治療する方法。
【請求項１２】
慢性腎臓病の治療における使用のための、請求項２に記載の化合物。
【請求項１３】
糖尿病性腎臓病の治療における使用のための、請求項２に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある特定のヒトＰＤＥ１阻害薬、この化合物を含む医薬組成物、この化合物を使用して生理学的障害を治療する方法、ならびにこの化合物の合成に有用な中間体およびプロセスに関する。
【０００２】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰが加水分解される速度を制御することによって、これらの環状ヌクレオチドの細胞内レベルを調節する酵素である。カルシウムおよびカルモジュリン依存性ＰＤＥであるＰＤＥ１は、少なくとも１１ある既知のＰＤＥファミリーの１つである。ＰＤＥ１は、脳、心臓、肺、腎臓、および平滑筋を含む多くの組織において発現する。さらに、ＰＤＥ１は、ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１Ｂ、およびＰＤＥ１Ｃという３つの既知のアイソフォームのファミリーからなる。
【０００３】
糖尿病に罹患している患者は、糖尿病性腎臓病（または糖尿病性腎症）と呼ばれる慢性腎臓病の一種をしばしば発症する。糖尿病性腎臓病は、糖尿病患者の４０％程度に影響を及ぼし得ると推定されている。糖尿病性腎臓病の治療の選択肢は限られており、血圧を下げる薬剤の使用、血糖値、食事、および体重の管理、ならびに定期的な身体活動の実施を含む。したがって、慢性腎臓病、特に糖尿病性腎臓病に罹患している患者のためのさらなる治療選択肢の必要性がある。
【０００４】
米国特許第８，２９９，０８０号は、排尿痛および高血圧などの種々の障害を治療するのに有用なＰＤＥ９阻害活性を有するある特定のキノキサリン誘導体を開示している。さらに、欧州特許第００４０４０１号は、降圧活性を有するある特定の置換トリアゾロキノキサリン−４−オンを開示している。
【０００５】
本発明は、ヒトＰＤＥ１の阻害剤である、ある特定の新規の化合物を提供する。さらに、本発明は、ＰＤＥ２Ａ、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＥ６ＡＢ、ＰＤＥ７Ｂ、ＰＤＥ８Ａ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＥ１０ＡおよびＰＤＥ１１Ａなどの他のヒトＰＤＥと比較して、ヒトＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１Ｂ、およびＰＤＥ１Ｃの選択的阻害薬である、ある特定の新規の化合物を提供する。さらに、本発明は、降圧作用を有し得、また腎血流を改善し得るある特定の新規の化合物を提供する。さらに、本発明の化合物は腎線維症を軽減し得る。
【０００６】
したがって、本発明は、式Ｉの化合物
【化１】
2019526567.tif 000003
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００７】
本発明はまた、患者における慢性腎臓病を治療する方法であって、このような治療を必要としている患者へ、有効量の式Ｉの化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【０００８】
本発明はまた、患者における糖尿病性腎臓病を治療する方法であって、このような治療を必要としている患者へ、有効量の式Ｉの化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、患者における高血圧を治療する方法であって、このような治療を必要としている患者へ、有効量の式Ｉの化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、療法における使用のための、式Ｉの化合物を提供する。本発明はさらに、慢性腎臓病の治療における使用のための式Ｉの化合物を提供する。さらに、本発明は、糖尿病性腎臓病の治療における使用のための式Ｉの化合物を提供する。さらに、本発明は高血圧の治療における使用のための式Ｉの化合物を提供する。さらに、本発明は、慢性腎臓病の治療用の薬剤の製造のための式Ｉの化合物の使用を提供する。さらに、本発明は、糖尿病性腎臓病の治療用の薬剤の製造のための式Ｉの化合物の使用を提供する。本発明はさらに、高血圧の治療用の薬剤の製造のための式Ｉの化合物の使用を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、式Ｉの化合物を１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物を提供する。本発明はさらに、式Ｉの化合物を１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、医薬組成物を調製するためのプロセスを提供する。本発明はまた、式Ｉの化合物の合成のための新規の中間体およびプロセスを包含する。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「治療すること」、「治療」、または「治療する」という用語は、既存の症状または障害の進行または重症度を妨げること、抑制すること、遅延させること、停止させること、または逆転させることを含む。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「患者」という用語は、マウス、モルモット、ラット、イヌ、またはヒトなどの哺乳類を指す。好ましい患者がヒトであることは理解される。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、患者への単回用量または複数回用量の投与の際に、診断または治療の下にある患者における所望の効果を提供する、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の量または用量を指す。
【００１５】
有効量は、既知の技術を用いる当業者によって、および類似の状況下で得られた結果を観察することによって、容易に判断することができる。患者のための有効量を判断する上で、患者の大きさ、年齢、および全身レベルの健康状態、関与する具体的な疾患または障害、疾患または障害の程度または関与もしくは重症度、個々の患者の応答、投与される特定の化合物、投与の様式、投与される製剤の生物学的利用率の特徴、選択された投与レジメン、付随する薬剤の使用、ならびにその他の関連する状況を含むが、これらに限定されない、多数の要因が当業者によって考慮される。
【００１６】
式Ｉの化合物は概して、広い薬用量範囲にわたって有効である。例えば、１日当たりの薬用量は通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／体重ｋｇの範囲内に収まる。いくつかの場合においては、上述の範囲の下限値を下回る薬用量レベルが十分過ぎることがあるのに対し、他の場合においては、許容され得る副作用を伴って、さらに多い用量が採用されることがあり、それゆえ、先の薬用量範囲は、いかなる方法においても本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００１７】
本発明の化合物は、好ましくは、経口経路および経皮経路を含む、この化合物を生体利用可能にするいかなる経路によっても投与される医薬組成物として製剤される。最も好ましくは、このような組成物は経口投与用である。このような医薬組成物およびこの医薬組成物の調製方法は、当該技術分野において十分に既知である。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい）。
【００１８】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、当該技術分野で十分に既知の標準的な条件下での本発明の化合物の適切な遊離塩基および適切な薬学的に許容される酸の、適切な溶媒中での反応によって形成され得る。このような塩の形成は、当該技術分野で十分に既知であり、理解されている。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，“Ｓａｌｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１−２１７（１９８６）、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｓａｌｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｔｉｔｉｅｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７−４３５（２０００）、およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９，（１９７７）を参照されたい。
【００１９】
ある特定の略語は次のように定義される。「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指し、「ＡｃＯＨ」は氷酢酸を指し、「ＤＢＵ」は１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンを指し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンまたは塩化メチレンを指し、「ＤＩＰＥＡ」はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを指し、「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＥＤＣＩ」は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを指し、「ＥＳ／ＭＳ」はエレクトロスプレー質量分析を指し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し、「Ｅｔ２Ｏ」はジエチルエーテルを指し、「ＥｔＯＨ」はエタノールを指し、「ＨＭＤＳ」はヘキサメチルジシラザンを指し、「ＨＯＢＴ」はヒドロキシベンゾトリアゾールを指し、「ｈｒ」は１時間または複数時間を指し、「ＩＣ５０」は薬剤について可能な最大阻害応答の５０％を生じるこの薬剤の濃度を指し、「μｍｏｌ」は１つまたは複数のマイクロモルを指し、「ｍｉｎ」は１分間または複数分間を指し、「ＭｅＯＨ」はメタノールまたはメチルアルコールを指し、「ＭＴＢＥ」はメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルを指し、「ＮｉＮＴＡ」は、キレート剤としてニトリロ三酢酸で官能化されたアガロース固定相を用いるクロマトグラフィーを指し、「ＰＯＣｌ３」はオキシ塩化リンを指し、「ＲＴ」は室温を指し、「ＳＮＡｒ」は求核芳香族置換を指し、「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し、「トリス」は、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオールを指し、「Ｕ／ｍｌ」はミリリットル当たりの単位を指し、「ｗｔ」は重量を指す。
【００２０】
本発明の化合物は、当業者に既知の種々の手順によって調製することができ、この化合物のうちのいくつかは、後述のスキーム、調製、および実施例において説明される。当業者は、説明される経路のそれぞれについての具体的な合成ステップが、本発明の化合物を調製するために、異なる方法で、または異なるスキームからのステップと共に、組み合わせることができることを認識している。以下のスキームにおけるそれぞれのステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、磨砕、および結晶化を含む、当該技術分野で十分に既知の従来法によって回収することできる。以下のスキームにおいて、置換基はすべて、別段の記載がない限り、すでに定義された通りである。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。本発明の範囲を制限することなく、以下のスキーム、調製、および実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【化２】
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【００２１】
スキーム１は、式Ｉの化合物の合成を図示する。スキーム１のステップＡにおいて、種々の求核試薬を用いて達成される３−フルオロ−２−ニトロピリジンのＳＮＡｒ反応は、当該技術分野において十分に認識されている。例えば、約１当量の３−フルオロ−２−ニトロピリジンを、ＥｔＯＨのような適切な極性溶媒中で約３当量のブタン−１−アミンと反応させる。次いで、この生成物を、抽出等の当該技術分野で周知の技術を用いることによって単離することができる。例えば、反応混合物を、水で希釈し、ＥｔＯＡｃのような適切な極性有機溶媒を用いて抽出することができる。有機抽出物を一緒にし、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、次のステップでの使用に十分な純度のステップＡの生成物であるＮ−ブチル−２−ニトロ−ピリジン−３−アミンを、さらなる精製なしで提供することができる。
【００２２】
その後のニトロ基の還元は、当該技術分野において十分に既知である。スキーム１のステップＢにおいて、例えば、約１当量のステップＡの生成物Ｎ−ブチル−２−ニトロ−ピリジン−３−アミンを、パラジウム炭素のような適切な遷移金属触媒の存在下で、ＭｅＯＨのような種々の有機溶媒中で水素化することができる。次いで、この還元した生成物を、濾過および抽出のような当該技術分野で十分に既知の技術を利用することによって単離することができる。例えば、粗反応混合物を珪藻土床で濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、さらなる精製なしでの次のステップにおける使用に十分な純度の、スキーム１のステップＢの生成物Ｎ３−ブチルピリジン−２，３−ジアミンを得ることができる。
【００２３】
スキーム１のステップＣのジオン生成物への環化は、ＥｔＯＨのような適切な有機溶媒中のシュウ酸ジエチルを用いた熱アシル化条件下で達成することができる。例えば、約１当量のＮ３−ブチルピリジン−２，３−ジアミンを、約１００℃の密封したチューブ中のＥｔＯＨのような適切な極性有機溶媒中の約５当量のシュウ酸ジエチルで処理することができる。次いで、沈殿および濾過のような当該技術分野で十分に既知の技術を利用して、環化した生成物を単離することができる。例えば、この反応混合物を約−１０〜０℃へ冷却してもよく、その後の沈殿物を濾過およびジエチルエーテルによる洗浄によって収集して、追加の精製なしでの次のステップにおける使用に十分な純度の、スキーム１のステップＣの生成物１−ブチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオンを得ることができる。
【００２４】
ヒドラジンのような求核試薬を用いた活性化カルボニルの脱水は、当該分野において十分に認識されている。例えば、約１当量のスキーム１の工程Ｃの生成物１−ブチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオンは、加圧したチューブ内で約１００℃の約５当量のヒドラジン一水和物で処理することができる。次いで、この生成物を沈殿および濾過のような当該技術分野で十分に既知の技術を利用することで単離することができる。例えば、粗反応混合物を約０℃へ冷却することができ、結果として生じる沈殿物を濾過およびジエチルエーテルによる洗浄によって回収して、さらなる精製なしで次の工程で使用するのに十分な純度のスキーム１のステップＤの生成物１−ブチル−３−ヒドラジノ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンを得ることができる。
【００２５】
その後のステップＤのヒドラジン生成物のアルキル化は、当該技術分野において十分に既知の種々の還元的アミノ化技術の下で達成することができる。例えば、約１当量のスキーム１のステップＤの生成物１−ブチル−３−ヒドラジノ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンを、約ＲＴの触媒量のＡｃＯＨなどの適切な酸を含有するＭｅＯＨなどの適切なアルコール溶媒中で、１−メチルシクロプロパンカルボアルデヒド（ＣＡＳ＃４５１５−８９−３、Ｅｎａｍｉｎｅ  ＬＬＣ，米国）などの約２当量の適切に置換されたアルキルアルデヒドで処理して還元してもよい。次いで、この生成物は、結晶化および濾過のような当該技術分野で十分に既知の技術を利用して単離することができる。例えば、粗反応混合物を減圧下で濃縮することができ、この生成物は、ヘキサンのような適切な有機溶媒を用いて結晶化して、続く濾過でスキーム１のステップＥの生成物１−ブチル−３−［２−［（１−メチルシクロプロピル）メチレン］ヒドラジノ］ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンを収集することができる。
【００２６】
式１の化合物の調製は、超原子価ヨウ素仲介性酸化的環化（Ｒ．Ａｇｇａｒｗａｌ  ＆  Ｇ．Ｓｕｍｒａｎ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，３６：１８７３−１８７６，２００６）を置換イミン１−ブチル−３−［２−［（１−メチルシクロプロピル）メチレン］ヒドラジノ］ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン上で、０℃からＲＴの範囲の温度で、ＤＣＭなどの適切な有機溶媒中で用いることで達成することができる。例えば、約１当量のスキーム１のステップＥの生成物１−ブチル−３−［２−［（１−メチルシクロプロピル）メチレン］ヒドラジノ］ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンは、ＤＣＭに溶解し、約０℃からＲＴの約２当量のヨードソベンゼンジアセタート（ｉｏｄｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）（ＣＡＳ＃３２４０−３４−４）で処理することができる。次いで、抽出およびクロマトグラフィーのような、当該技術分野で十分に既知の技術を利用して、生成物を単離することができる。例えば、反応混合物を水で希釈して、ＤＣＭで抽出することができる。層は分離することができ、有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で連続的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣を、ＥｔＯＡｃおよびヘキサンのような適切な溶媒混合物の勾配を使用して、シリカ上でのクロマトグラフィーによって精製して、スキーム１のステップＦの生成物である式Ｉの化合物を得ることができる。
【化３】
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【００２７】
スキーム２は、式Ｉの化合物の代替的な合成を図示する。スキーム２のステップＡにおいて、スキーム１のステップＣの生成物１−ブチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオンは、当該技術分野で周知のようなクロロ化合物へ、ＲＴから還流温度までの範囲の温度で、触媒量のＤＭＦを含有するＤＣＭまたはＡＣＮのような適切な有機溶媒中で、ＰＯＣｌ３、ＳＯＣｌ２、塩化オキサリル、またはＰＣｌ５のような適切な塩素化剤を用いて変換することができる。例えば、約１当量のスキーム１のステップＣの生成物１−ブチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオンを、ＤＭＦ含有ＡＣＮ中に溶解することができ、得られた反応混合物は、約３当量の塩化チオニルで処理し、約３時間加熱還流することができる。反応混合物を大気温へ冷却した後に減圧下で濃縮して、さらなる精製なしでその後に使用するのに適しているスキーム２のステップＡの生成物１−ブチル−３−クロロ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンを提供する。
【００２８】
スキーム２のステップＢにおいて、塩化物置換は、約１当量のスキーム２のステップＡの生成物１−ブチル−３−クロロ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンを、ＴＨＦのような極性非プロトン性溶媒中で、ＲＴで約８〜２４時間、約４当量のヒドラジン一水和物水溶液で処理することによって達成することができる。次いで、生成物は、抽出および共沸蒸留のような、当該技術分野において十分に既知の技術を利用して単離することができる。例えば、反応混合物は、水で希釈し、濾過することができ、濾過ケークは、トルエンまたはＭＴＢＥのような高沸点の適切な有機溶媒を用いて洗浄することができ、得られた水を、２−メチル−テトラヒドロフランのような適切な高沸点溶媒を用いた減圧下の回転式蒸発器上での単純な共沸蒸留によって二相混合物から除去して、スキーム２のステップＢの生成物１−ブチル−３−ヒドラジノ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンを得ることができる。
【００２９】
ステップＢの生成物のアシル化は、当該技術分野で十分に既知の種々のアミドカップリング技術を用いて、適切なカルボン酸を用いて達成することができる。例えば、約１当量のスキーム２のステップＢの生成物１−ブチル−３−ヒドラジノ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オンを、約１．５当量の１−メチルシクロプロパン−カルボン酸と、約１．５当量のＥＤＣＩと１．５当量のＨＯＢＴとを含有するＴＨＦ、ＤＭＦ、またはＤＭＳＯのような適切な有機溶媒中でカップリングさせ、続いて、約３〜５当量のＤＩＰＥＡまたはＴＥＡのような非求核性有機塩基を添加することができる。次いで、この生成物は、抽出のような当該技術分野で十分に既知の技術を利用して単離することができる。例えば、反応混合物を水で希釈したＨＣｌ水溶液のような適切な鉱酸で中和し、ＤＣＭ、ＥｔＯＡｃ、ＭＴＢＥ、またはＥｔ２Ｏのような適切な有機溶媒を用いて洗浄することができる。層は分離することができ、得られた水層をＫ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、またはＮａ２ＨＳＯ３のような適切なアルカリ性固体でｐＨ約７〜８に塩基性化し、続いてＤＣＭ、ＥｔＯＡｃ、またはＥｔ２Ｏのような適切な有機溶媒で抽出することができる。有機層を水、飽和ＮａＣｌ水溶液で連続的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、スキーム２のステップＣの生成物Ｎ’−（１−ブチル−２−オキソ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−１−メチル−シクロプロパンカルボヒドラジドを得ることができる。
【００３０】
スキーム２のステップＤにおいて、式１の化合物は、当該技術分野において十分に既知の温熱条件またはマイクロ波条件の下での環化によって達成することができる。例えば、約１当量のＮ’−（１−ブチル−２−オキソ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−１−メチル−シクロプロパンカルボヒドラジドを、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンのような約０．２当量の適切な非求核性有機塩基を含有するヘキサメチルジシラザンのような適切な溶媒中で、還流下で約２〜１２時間加熱することができる。次いで、この生成物は、希釈、濾過、摩砕、およびクロマトグラフィーのような、当該技術分野で十分に既知の技術を利用して単離することができる。例えば、反応混合物を水中へ注ぐことができ、得られた沈殿物を濾過により集め、続いて集めた固体をＤＣＭのような有機溶媒の適切な非混和性混合物と水との間に分画することができる。有機層を分離し、水および飽和ＮａＣｌ水溶液で連続して洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮することができる。得られた残渣を、ＥｔＯＡｃのような適切な熱有機溶媒または沸騰中の有機溶媒で約１時間摩砕することができ、得られた固体を冷却の際の濾過によって回収することができる。この固体を、ＥｔＯＡｃおよびＤＣＭのような適切な溶媒混合物の勾配を用いるシリカ上でのクロマトグラフィーによってさらに精製して、スキーム２のステップＤの生成物である式Ｉの化合物を得てもよい。
【００３１】
調製１
Ｎ−ブチル−２−ニトロ−ピリジン−３−アミン
【化４】
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スキーム１のステップＡ：３−フルオロ−２−ニトロピリジン（５．０ｇ、３５．２ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（３０ｍＬ）に溶解し、この混合物を氷浴中で０℃に冷却する。ブタン−１−アミン（７．７ｇ、１０５．６ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、この混合物をＲＴへ加温し、ＲＴで２時間撹拌する。この混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮して、さらなる精製なしでの使用に適した表題化合物（６．２ｇ、収率９０％）を黄色の油として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  １９６．１（Ｍ＋１）。
【００３２】
調製１の代替手順
約２０〜２５℃のＥｔＯＨ（５５２ｍＬ）中の３−フルオロ−２−ニトロピリジン（９２ｇ、０．６５ｍｏｌ）を添加する。この混合物を氷浴中で０℃に冷却する。ブタン−１−アミン（１１８．４ｇ、１．６１８７ｍｏｌ）を約０〜５℃で４０分かけて滴下する。約２０〜２５℃に加温し、１６時間撹拌する。この反応混合物に水（８００ｍＬ）を添加し、ＥｔＯＡｃ（２×６００ｍＬ）で抽出し、層を分離し、一緒にした有機層を水（２×１Ｌ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（２×５００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、３５℃で減圧下で濃縮して、さらなる精製なしで使用するのに適した表題化合物（１２０．００ｇ、９５％収率）を深黄色の油として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  １９６．１（Ｍ＋１）。
【００３３】
調製２
Ｎ３−ブチルピリジン−２，３−ジアミン
【化５】
2019526567.tif 000007
スキーム１のステップＢ：ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に溶解したＮ−ブチル−２−ニトロ−ピリジン−３−アミン（６．０ｇ、３０．７ｍｍｏｌ）の溶液にＮ２下で５％Ｐｄ／Ｃ（３．０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加する。この混合物をＲＴでＨ２バルーン下で８時間撹拌する。珪藻土パッドで混合物を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、濾液を減圧下で濃縮して、さらなる精製なしでの使用に適した表題化合物（５．０ｇ、収率９８％）を黒色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  １６６．１（Ｍ＋１）。
【００３４】
調製２の代替手順
約２０〜２５℃のＭｅＯＨ（１０２４ｍＬ）中にＮ−ブチル−２−ニトロ−ピリジン−３−アミン（１２８．０ｇ、０．７ｍｏｌ）を添加する。約２０〜２５℃の５％湿Ｐｄ／Ｃ（６４ｇ、５０％負荷）を添加する。得られた混合物を３気圧のＨ２の下で約２０〜２５℃で３時間撹拌する。この反応混合物を珪藻土で濾過し、濾過ケークをＭｅＯＨ（５×５００ｍＬ）で洗浄し、濾液を減圧下で濃縮して、さらなる精製なしでの使用に適した表題化合物（１０１．９ｇ、収率９４％）を黒色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  １６６．１（Ｍ＋１）。
【００３５】
調製３
１−ブチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオン
【化６】
2019526567.tif 000008
スキーム１のステップＣ：シュウ酸ジエチル（２０．１ｍＬ、１４８．３ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（３０ｍＬ）中のＮ３−ブチルピリジン−２，３−ジアミン（４．９ｇ、２９．６５ｍｍｏｌ）の混合物に添加する。密封したチューブ中でこの混合物を１００℃で１４時間加熱する。この反応混合物を０℃に冷却し、得られた固体を濾過により単離する。この固体をＥｔ２Ｏで洗浄し、４０℃で真空乾燥させて、さらなる精製なしでの使用に適した表題化合物（３．３ｇ、収率５１％）を緑色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２１９．８（Ｍ＋１）。
【００３６】
調製３の代替手順
約２０〜２５℃のＥｔＯＨ（５５０ｍＬ）中にＮ３−ブチルピリジン−２，３−ジアミン（８１．４ｇ、０．５ｍｏｌ）を添加する。約２０〜２５℃で、ＥｔＯＨ中の３０重量％ＮａＯＥｔ（４２７．４ｇ、１．０ｍｏｌ）を一度に添加する。シュウ酸ジエチル（８７．１ｇ、０．６ｍｏｌ）を約２０〜３０℃で滴下し、ＲＴで２．５時間撹拌する。この反応混合物を０．５ＭのＨＣｌ／ＤＣＭ水溶液（１６００ｍＬ／１２００ｍＬ）の混合物中に撹拌しながら約０〜１０℃で注ぐ。２層に分離し、水層をＤＣＭ（２×８００ｍＬ）で抽出し、水（２×１６００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（１６００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮する。得られた固体残渣を約２０〜２５℃で３０分間、ＡＣＮ（２００ｍＬ）中でスラリーにし、得られた固体を濾過により単離して、さらなる精製なしでの使用に適した表題化合物（７０．０ｇ、収率６５％）を緑色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２２０．１（Ｍ＋１）。
【００３７】
調製４
１−ブチル−３−ヒドラジノ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン
【化７】
2019526567.tif 000009
スキーム１のステップＤ：ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中の１−ブチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオン（３．２ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）の混合物にヒドラジン一水和物（３．５５ｍＬ、７３．０ｍｍｏｌ）を添加する。密封したチューブ中にこの混合物を１００℃で１４時間加熱する。この反応混合物を０℃に冷却し、固体を濾過により単離する。この固体をＥｔ２Ｏで洗浄し、４５℃で真空乾燥して、さらなる精製なしでの使用に適した表題化合物（２．８ｇ、収率８２％）を緑色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２３４．２（Ｍ＋１）。
【００３８】
調製５
１‐ブチル‐３‐［２−［（１‐メチルシクロプロピル）メチレン］ヒドラジノ］ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン
【化８】
2019526567.tif 000010
スキーム１のステップＥ：１−メチルシクロプロパンカルボアルデヒド（１．１５ｍＬ、１３．７ｍｍｏｌ）およびＡｃＯＨ（３９．３μＬ）を、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の１−ブチル−３−ヒドラジノ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン（１．６ｇ、６．９ｍｍｏｌ）の混合物に添加する。この混合物をＲＴで１時間撹拌する。この混合物を減圧下で濃縮し、生成物をヘキサン（５０ｍＬ）から再結晶する。この固体を濾過により単離し、ヘキサンで洗浄して、さらなる精製なしでの使用に適した表題化合物（１．３０ｇ、収率６３％）を黒色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３００．２（Ｍ＋１）。
【００３９】
調製６
１−ブチル−３−クロロ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン
【化９】
2019526567.tif 000011
スキーム２のステップＡ：１−ブチル−４Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２，３−ジオン（６０．８ｇ、０．３ｍｏｌ）を約２０〜２５℃でＡＣＮ（１０ｍＬ／ｇ、６００ｍＬ）中に溶解する。ＤＭＦ（４．２ｍＬ）を添加し、ＳＯＣｌ２（９９．０ｇ、０．８ｍｏｌ）を一度に添加する。得られた混合物を約７５〜８０℃で２．５時間加熱還流する。この反応混合物を減圧下で濃縮乾固して、さらなる精製なしでの使用に適した粗製の表題化合物（９３．０ｇ、収率９９％超）を黒色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２３８．１（Ｍ＋１）。
【００４０】
調製７
１−ブチル−３−ヒドラジノ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン
【化１０】
2019526567.tif 000012
スキーム２のステップＢ：ＲＴでＴＨＦ（９００ｍＬ）をヒドラジン一水和物（４８ｇ、１．５ｍｏｌ）の８５％（重量／重量％）水溶液に添加する。１−ブチル−３−クロロ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン（９０．０ｇ、０．４ｍｏｌ）を添加してスラリーを形成し、ＲＴで１６時間撹拌する。この反応混合物に水（１００ｍＬ）を添加し、２０分間撹拌する。濾過し、濾過ケークを水（２×４００ｍＬ）、続いてＭＴＢＥ（２×４００ｍＬ）で洗浄する。減圧下で２−メチル−ＴＨＦ（３×６００ｍＬ）と共沸させることによって水を除去して、さらなる精製なしでの使用に適した表題化合物（５０．０ｇ、収率７５％）を緑色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２３４．１（Ｍ＋１）。
【００４１】
調製８
Ｎ’−（１−ブチル−２−オキソ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−１−メチル−シクロプロパンカルボヒドラジド
【化１１】
2019526567.tif 000013
スキーム２のステップＣ：１−メチルシクロプロパンカルボン酸（３０．９ｇ、０．３ｍｏｌ）をＲＴでＤＭＦ（３５０ｍＬ）へ添加し、この混合物を０℃に冷却する。約−５〜０℃で、ＥＤＣＩ（６１．０ｇ、０．３ｍｏｌ）、続いてＨＯＢＴ（４１．７５ｇ、０．３ｍｏｌ）を添加する。約−１０〜０℃で、ＴＥＡ（６２．４７ｇ、０．６ｍｏｌ）を４０分かけて滴下し、得られた混合物を約−５〜０℃で２０分間撹拌する。１−ブチル−３−ヒドラジノ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン（４８．０ｇ、０．２ｍｏｌ）を約０〜５℃で一度に添加し、ＲＴへ加温し、得られたスラリーを１６時間撹拌する。この反応混合物を０．６ＭのＨＣｌ水溶液（１６００ｍＬ）に注ぎ入れ、ＭＴＢＥ（３×５００ｍＬ）で洗浄し、層を分離し、ＭＴＢＥ層を廃棄し、水層にＤＣＭ（１０００ｍＬ）を添加する。固体ＮａＨＣＯ３（１４０ｇ）でｐＨ約７〜８に調整し、層を分離し、水層をＤＣＭ（３×６００ｍＬ）で抽出し、一緒にした有機層を水（３×１０００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（２×１０００ｍＬ）で連続して洗浄する。減圧下で蒸発させて、さらなる精製なしでの使用に適した表題化合物（４５．０ｇ、収率６９％）を黒色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３１６．２（Ｍ＋１）。
【００４２】
実施例１
５−ブチル−９−（１−メチルシクロプロピル）ピリド［３，２−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−６（５Ｈ）−オン
【化１２】
2019526567.tif 000014
スキーム１のステップＦ：１−ブチル−３−［２−［（１−メチルシクロプロピル）メチレン］−ヒドラジノ］ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−２−オン（１．３ｇ、４．３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５ｍＬ）へ添加し、この溶液を氷浴中で０℃に冷却する。この溶液にヨードソベンゼンジアセタート（ｉｏｄｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）（２．９ｇ、８．７ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物をＲＴで１時間撹拌する。この反応混合物を水でクエンチし、ＤＣＭで抽出する。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、得られた残渣をＥｔＯＡｃ：ヘキサン（３：１）で溶出するシリカ上でのクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（１．１ｇ、収率８５％）をオフホワイト色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２９８．２（Ｍ＋１）。
【００４３】
実施例１の代替手順
スキーム２のステップＤ：ＲＴのＨＭＤＳ（３６０ｍＬ）中のＮ’−（１−ブチル−２−オキソ−ピリド［２，３−ｂ］ピラジン−３−イル）−１−メチル−シクロプロパンカルボヒドラジド（４５．０ｇ、０．１ｍｏｌ）をスラリーにする。ＤＢＵ（４．３４ｇ、２８．５ｍｍｏｌ）を添加し、１２５℃に加熱する。得られた溶液を還流下で６時間撹拌する。この反応混合物をＲＴへ冷却し、この混合物を水（８００ｍＬ）に注ぎ入れ、得られた固体を濾過および回収する。この固体をＤＣＭ（４００ｍＬ）／Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）中に溶解し、得られた層を分離し、有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、残渣を得る。ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）を用いて４０〜５０℃で１時間摩砕し、得られた固体（２２．０ｇ、ＬＣＭＳにより決定すると純度９８％）を濾過により単離する。この２２．０ｇのバッチを別のバッチの材料（１０．０ｇ、ＬＣＭＳにより決定すると純度１００％）と一緒にし、ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ（１：１）で溶出するシリカゲル上でのクロマトグラフィーによってさらに精製して、溶媒蒸発後に残渣を得る。得られた残渣を熱ＥｔＯＡｃで３０分間摩砕し、得られた固体を濾過により単離して、表題化合物（２５．７０ｇ、収率４２％）を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２９８．２（Ｍ＋１）。
【００４４】
ＰＤＥタンパク質の生成
全長ヒトＰＤＥ１Ａ（ＮＰ＿００１００３６８３．１）、ＰＤＥ１Ｃ（ＮＰ＿００５０１１．１）、ＰＤＥ５Ａ（ＮＰ＿００１０７４．２）、ＰＤＥ７Ｂ（ＮＰ＿０６１８１８．１）およびＰＤＥ９Ａ（ＮＰ＿００２５９７．１）をコードするヌクレオチド配列を、Ｎ末端ＨＩＳタグ付きのｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入する。全長ヒトＰＤＥ４Ｄ（ＮＰ＿００６１９４．２）をおよびＰＤＥ３Ａ（ＮＰ＿０００９１２．３）の触媒ドメイン（残基６４１〜１１４１）をコードするヌクレオチド配列を、Ｃ末端ＨＩＳタグ付きｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入する。全長ヒトＰＤＥ８Ａ（ＮＰ＿００２５９６．１）およびＰＤＥ１１Ａ（ＡＡＩ１２３９４．１）をコードするヌクレオチド配列を、Ｎ末端Ｆｌａｇタグ付きｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入する。全長ヒトＰＤＥ１０Ａ（ＡＡＤ３２５９５．１）をコードするヌクレオチド配列を、Ｃ末端Ｆｌａｇ−Ｈｉｓタグ付きｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入する。全長ヒトＰＤＥ６Ａ（ＮＰ＿０００４３１．２）およびＰＤＥ６Ｂ（ＡＡＨ００２４９．１）をコードするヌクレオチド配列を、ＰＤＥ６Ａ／６Ｂ二量体の産生のために、それぞれＮ末端ＨＩＳタグおよびＮ末端Ｆｌａｇタグ付きのｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに挿入する。Ｓｆ９細胞におけるバキュロウイルス生成およびタンパク質発現を、ＢａｃからＢａｃへのバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルにより行う。全長ヒトＰＤＥ１Ｂ（ＮＰ＿０００９１５．１）およびＰＤＥ２Ａ（ＮＰ＿００２５９０．１）をコードするヌクレオチド配列を、Ｃ末端ＨＩＳタグ付きｐＩＥＸ４（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入し、Ｓｆ９細胞における両タンパク質の産生を販売元のプロトコル（Ｎｏｖａｇｅｎ）によって行う。Ｈｉｓタグ付きＰＤＥタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）、続いて貯蔵緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）中のＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製する。ＰＤＥ６Ａ／６Ｂを含むＦｌａｇタグ付きＰＤＥタンパク質を、ＮｉＮＴＡカラムクロマトグラフィーによる精製後に、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２−アガロース（Ｓｉｇｍａ）を用いて精製し、保存緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌのＦｌａｇペプチド）中で溶出する。精製したタンパク質はすべて、小分けして−８０℃で保存する。
【００４５】
ホスホジエステラーゼ酵素アッセイ
３’，５’環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）酵素活性はすべて、ＳＰＡ検出システムに基づく放射分析酵素アッセイ（シンチレーション近接アッセイ）を用いて測定する。試験する化合物を、１０点濃度応答曲線を用いて純粋なジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に希釈する。反応混合物中の最大化合物濃度は、１０μＭまたは１００μＭのいずれかである。基質の添加により反応を開始する前に、適切な濃度の化合物をいずれかのＰＤＥ酵素と共に３０分間プレインキュベートする。反応は室温で６０分間進行させておく。次に、ＳＰＡビーズの添加によって反応を停止させる。試料は、１２時間後にＭＩＣＲＯＢＥＴＡ（商標）ＴＲＩＬＵＸ（登録商標）カウンターで読み取る。「ＩＣ５０」は、化合物について起こり得る最大阻害応答の５０％を生じるその化合物の濃度を指す。ＩＣ５０値は、正規化データ対ｌｏｇ［化合物］をプロットし、４パラメータロジスティック方程式を用いてデータを当てはめることによって計算する。
【００４６】
Ｃａ２＋−カルモジュリン依存性ＰＤＥ酵素アッセイ
ＰＤＥ１Ｂ、ＰＤＥ１Ａ、およびＰＤＥ１Ｃは、標準的なタンパク質生成手順に従ってクローン化および精製する。アッセイ緩衝液は、アッセイにおいてｐＨ７．５で、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ウシ血清アルブミンおよび水中で６Ｕ／ｍｌのカルモジュリンの終濃度を与えるように調製する。酵素の終濃度は、ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１ＢおよびＰＤＥ１Ｃについてそれぞれ、０．２５ｎＭ、０．０７４ｎＭおよび０．００１２ｎＭである。反応は、４７ｎＭの終濃度を得るために、基質［３Ｈ］ｃＡＭＰの添加によって始まる。
【表１】
2019526567.tif 000015
【００４７】
表１のデータは、実施例１の化合物が試験管内でのヒトＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１Ｂ、およびＰＤＥ１Ｃ酵素活性を阻害することを実証している。
【００４８】
基質として［３Ｈ］ｃＡＭＰを用いたＰＤＥ酵素アッセイ
以下のホスホジエステラーゼ、すなわちヒトＰＤＥ３Ａ（触媒ドメイン）、ヒトＰＤＥ４Ｄ、ヒトＰＤＥ７ＢおよびヒトＰＤＥ８Ａの活性は、反応基質として［３Ｈ］ｃＡＭＰを用いて測定する。これらの酵素はすべて、標準的な手順に従ってクローン化および精製する。アッセイ緩衝液は、アッセイ中の終濃度がｐＨ７．５で５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、８．３ｍＭのＭｇＣｌ２、１．７ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および０．１％のウシ血清アルブミンとなるように調製する。酵素の終濃度は、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ７ＢおよびＰＤＥ８Ａについてそれぞれ、０．００８ｎＭ、０．０２１ｎＭ、０．５ｎＭおよび０．０６ｎＭである。反応は、４７ｎＭの終濃度を得るために、基質［３Ｈ］ｃＡＭＰの添加によって始まる。
【表２】
2019526567.tif 000016
【００４９】
基質として［３Ｈ］ｃＧＭＰを用いたＰＤＥ酵素アッセイ
以下のホスホジエステラーゼ、すなわちヒトＰＤＥ２Ａ、ヒトＰＤＥ５Ａ、ヒトＰＤＥ６Ａ／６Ｂ、ヒトＰＤＥ９Ａ、ヒトＰＤＥ１０ＡおよびヒトＰＤＥ１１Ａの活性は、反応基質として［３Ｈ］ｃＧＭＰを用いて測定する。ヒトＰＤＥ６の触媒活性形態は、α（ヒトＰＤＥ６Ａ）とβサブユニット（ヒトＰＤＥ６Ｂ）とからなる二量体である。ヒトＰＤＥ６Ａ／６Ｂの二量体は、２つの精製ステップ、すなわち、ＮｉＮＴＡおよび抗ＦＬＡＧセファロースクロマトグラフィーを使用して、発現および精製の戦略によって産生する。残りの酵素は、標準的な手順に従って実験室内でクローン化および精製する。アッセイ緩衝液は、ｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、８．３ｍＭのＭｇＣｌ２、１．７ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％のウシ血清アルブミンの終濃度を得るように調製する。酵素の終濃度は、ヒトＰＤＥ２Ａ、ヒトＰＤＥ５Ａ、ヒトＰＤＥ６ＡＢ、ヒトＰＤＥ９Ａ、ヒトＰＤＥ１０ＡおよびヒトＰＤＥ１１Ａについてそれぞれ、０．２ｎＭ、０．００２ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．０３ｎＭおよび０．０３ｎＭである。ヒトＰＤＥ２Ａ、ヒトＰＤＥ１０Ａ、ヒトＰＤＥ５Ａ、ヒトＰＤＥ６ＡＢおよびヒトＰＤＥ１１Ａのアッセイの場合には８０ｎＭの終濃度を得るために、基質［３Ｈ］ｃＧＭＰを添加して反応を開始させるのに対し、ヒトＰＤＥ９Ａについては２０ｎＭの［３Ｈ］ｃＧＭＰを使用する。
【表３】
2019526567.tif 000017
【００５０】
表１、表２、および表３のデータは、実施例１の化合物が、試験管内でヒトＰＤＥ２Ａ、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＥ６ＡＢ、ＰＤＥ７Ｂ、ＰＤＥ８Ａ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＥ１０Ａ、およびＰＤＥ１１Ａと比較してヒトＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１ＢおよびＰＤＥ１Ｃの選択的阻害剤であることを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月22日(2019.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物
【化１】
2019526567.tif 000021
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
以下である、請求項１に記載の化合物。
【化２】
2019526567.tif 000022
【請求項３】
請求項１に記載の化合物または薬学的に許容される塩を含む、患者の慢性腎臓病を治療するための医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物または薬学的に許容される塩を含む、患者の糖尿病性腎臓病を治療するための医薬組成物。
【請求項５】
療法における使用のための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
慢性腎臓病の治療における使用のための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
糖尿病性腎臓病の治療における使用のための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、医薬組成物を調製するためのプロセス。
【請求項１０】
請求項２に記載の化合物を含む、患者の慢性腎臓病を治療するための医薬組成物。
【請求項１１】
請求項２に記載の化合物を含む、患者の糖尿病性腎臓病を治療するための医薬組成物。
【請求項１２】
慢性腎臓病の治療における使用のための、請求項２に記載の化合物。
【請求項１３】
糖尿病性腎臓病の治療における使用のための、請求項２に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【国際調査報告】
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