(57)【要約】  本発明は、新規な有糸細胞分裂阻害剤であるインドール誘導体；その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩；それらの治療剤としての使用；それらを含む組成物および当該組成物を用いた治療方法；並びにそれらの合成方法に関する。本発明によると、インドール誘導体、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩は、有糸分裂の間、アポトーシスを誘導するためにチューブリンの重合を阻害し、多剤耐性を有する癌細胞においてもまた、良好な抗癌作用を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Ｉ：
【化１】
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で表されるインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
以下の式Ｉ：
【化２】
2019509273.tif 000011
で表されるインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を活性成分として含む、癌の予防または治療のための医薬組成物。
【請求項３】
癌が直腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、白血病、神経膠腫、皮膚癌および子宮頸癌から成る群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
以下の式Ｉ：
【化３】
2019509273.tif 000012
で表されるインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を活性成分として含む、癌の予防または改善のための食品組成物。
【請求項５】
以下の式Ｉ：
【化４】
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で表されるインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を含む、皮膚癌の予防または改善のための化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なインドール誘導体化合物およびそれを含む抗癌組成物に関する。具体的には、本発明は良好な抗癌作用、低い毒性、および良好な溶解度を示す、新規なインドール誘導体化合物およびそれを含む抗癌組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
微小管は細胞遊走、細胞分裂、細胞骨格保持、および細胞内輸送などの多くの細胞機能を果たす。微小管の主なタンパク質成分はチューブリンである。癌細胞の急速な成長は、チューブリンの重合／脱重合に大きく依存するため、チューブリンは抗癌剤の開発において良好な標的である。チューブリンの重合の阻害、または微小管の分解の阻害による、微小管会合への介入によって、中期で回収された細胞数が増加し、最終的にアポトーシスが引き起こされる。チューブリン標的薬剤を用いて微小管の機能を阻害することは、化学療法において認められた方法である。
【０００３】
微小管を標的とする薬剤は、作用機構に従って２つの群に分類することができる：微小間安定化剤および脱安定化剤である。微小管安定化剤としては、微小管の脱重合の阻害、および微小管の重合の促進の機能を有する、タキサン、パクリタキセル、ドセタキセルなどが挙げられる。ほとんどの微小管安定化剤は、タキサン結合部位またはβ−チューブリンの重複部位のいずれかに結合する。第二の群、微小管脱安定化剤としては、微小管の重合を阻害し、ほとんどがコルヒチン結合部位またはビンカ結合部位に結合する、コルヒチン、ビンカアルカロイドなどが挙げられる。さらに、微小管を標的にする２つの群の薬剤は、微小管重合体に作用する薬物よりも低い濃度で機能する。
【０００４】
しかしながら、ほとんどのチューブリン阻害剤は薬物耐性の問題を有し、これが癌患者の長期間応答または生存率の向上における主な障害である。さらに、神経毒性の問題並びに耐性の問題は、複雑な天然物に由来するチューブリン阻害剤の主な副作用の１つであり、これらは癌患者のクオリティ・オブ・ライフに影響する。さらに、低い経口バイオアベイラビリティによって、快適な経口投与に制限が生じる。そのため、近年、低い副作用であるが、優れた経口バイオアベイラビリティを示し、容易に薬物耐性を生じない新規なチューブリン阻害剤を開発することが急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、抗癌作用を示す新規なチューブリン阻害剤、およびそれを含む抗癌組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、優れた抗癌作用、低い毒性、および優れた溶解度を示す新規なチューブリン阻害剤、並びにそれを含む抗癌組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的を達成するために、本発明はチューブリン阻害活性を有する新規なインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。本発明はまた、本発明のインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を活性成分として含む、抗癌組成物を提供する。以下に本発明を詳細に説明する。
【０００７】
新規なインドール誘導体化合物
本発明は以下の式Ｉ：
【化１】
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で表されるインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【０００８】
本発明において、薬学的に許容可能な塩は、一般に製薬業において用いられる塩をいう。薬学的に許容可能な塩の例としては、カルシウム、カリウム、ナトリウム、マグネシウムなどと形成される無機イオン塩；塩酸、硝酸、リン酸、臭素酸、ヨウ素酸、過塩素酸、硫酸などと形成される無機酸塩；酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、炭酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸などと形成される有機酸塩；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などと形成される硫酸塩；グリシン、アルギニン、リシンなどと形成されるアミノ酸塩；トリメチルアミン、トリエチルアミン、アンモニア、ピリジン、ピコリンなどと形成されるアミン塩が挙げられる。しかしながら、本発明の塩の種類は、前記で列挙される塩に限定されない。
【０００９】
式Ｉによって表される化合物は、１つ以上の非対称な炭素原子を有していてもよく、そのため、ラセミ体、ラセミ混合物、単一のエナンチオマー、ジアステレオマー性混合物、および個々のジアステレオマーの形態で存在しうる。式Ｉの化合物は、当技術分野において既知の方法、例えばカラムクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣによって、そのような異性体に分離することができる。あるいは、式Ｉの化合物の立体異性体は、光学的に純粋な出発物質、および／または既知の配置の試薬を用いて、立体特異的合成によって合成されうる。
【００１０】
本発明に記載の式Ｉによって表されるインドール誘導体、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩は、有糸細胞分裂の間のチューブリンの重合を阻害することによって、細胞のアポトーシスを誘導し、多剤耐性を有する癌細胞においてもまた、良好な抗癌作用を有し、そのため抗癌剤として有効に使用することができる。
さらに、本発明に記載の式Ｉで表されるインドール誘導体、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩は、良好なインビボ安定性、および良好な溶解度を示し、そのため、良好なバイオアベイラビリティを発揮する。
【００１１】
新規インドール誘導体化合物を含む抗癌組成物、その使用、およびそれを用いた治療方法
本発明はまた、式Ｉで表されるインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を活性成分として含む、抗癌組成物を提供する。
式Ｉで表されるインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩は、様々な癌細胞株において、多剤耐性を示す癌細胞株においても、抗増殖性活性を示した。したがって、式Ｉで表されるインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を活性成分として含む組成物は、癌の予防および治療のための医薬組成物として用いることができる。
【００１２】
本発明において、癌は直腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、白血病、神経膠腫、皮膚癌および子宮頸癌から成る群から選択されうる。しかしながら、本発明はこれらに限定されない。
本発明の医薬組成物はさらに、抗癌活性を有する少なくとも１つの活性成分を含みうる。
【００１３】
本発明の医薬組成物はさらに、薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、ラクトース、ポビドン、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、タフィ、アラビアゴム、アルファ化デンプン、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、カルボキシメチルデンプンナトリウム、カルナバ蝋、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白色糖、デキストロース、ソルビトール、タルクなどを含むことができる。本発明の薬学的に許容可能な賦形剤は、好ましくは、これに限定はされないが０．１から９０重量部の分量で組成物に加えられる。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、実際の臨床投与のための経口または非経口製剤として製剤化されてもよく、そのような場合、一般に用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤、または賦形剤が用いられうる。経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸薬、散剤、顆粒、カプセルなどが挙げられ、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトースまたはゼラチンなどの少なくとも１つ賦形剤との混合によって製剤化されうる。さらに、単純な賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクなどの滑沢剤を用いてもよい。経口投与のための液体製剤の例としては、懸濁液、体内使用のための液体、エマルジョン、シロップなどが挙げられる。水および液体パラフィンなどの一般に用いられる希釈剤に加えて、湿潤剤、甘味剤、香味剤、防腐剤などの様々な賦形剤を含むことができる。非経口投与のための製剤の例としては、滅菌溶液、非水性溶媒、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥製剤、および坐薬が挙げられる。非水性溶媒および懸濁化溶媒として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注入可能なエステルが用いられうる。坐薬の基質として、ウィテップゾール、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ ６１、カカオ脂、ラウリニウム、グリセロゼラチンなどが用いられうる。
【００１５】
本発明の組成物は、目的の方法に応じて経口投与または非経口投与されうる。非経口投与として、皮膚局所投与、腹腔内投与、直腸内投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、または胸腔内投与法が、好ましくは用いられる。用量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態および食生活、投与時間、投与方法、排出率、および疾患の重症度によって変化しうる。
【００１６】
本発明に記載の組成物は、薬学的な有効量で投与される。本発明において、「薬学的な有効量」は、薬物治療に適応することができる合理的な利益／リスク比で、疾患を治療するのに十分な分量をいう。有効な用量は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物感受性、投与時間、投与経路、排出率、治療期間、および同時使用薬物などの因子、並びに医薬品分野において周知の他の因子に応じて決定されうる。本発明の組成物は、別個の治療剤として投与されてもよく、あるいは、他の治療剤との組み合わせにおいて投与されてもよい。また、本発明の組成物は、順次または同時に、従来の治療剤に加えてもよく、組成物を単一または複数投与に用いてもよい。前記の全ての因子を考慮して、副作用を生じずに最大の効果をもたらしうる最小用量を投与することが重要であり、用量は当業者によって容易に決定されうる。
【００１７】
特に、本発明に記載される化合物の有効量は、患者の年齢、性別、および体重によって変化しうる。一般に、体重１ｋｇあたり０．１ｍｇから１００ｍｇ、および好ましくは、０．５ｍｇから１０ｍｇが、毎日、または１日おき、または１日に１から３回投与されうる。しかしながら、用量を投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などに応じて増加、または減少させてもよく、そのため、前記の用量は本発明の範囲を決して限定するものではない。
【００１８】
本発明はまた、癌の予防または治療に用いるための、式Ｉで表されるインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。
本発明はまた、癌の予防または治療のための薬物の製造において用いるための、式Ｉで表されるインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。
【００１９】
本発明はまた、治療上の有効量の式Ｉのインドール誘導体化合物、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を、癌の予防または治療が必要な対象に投与することを特徴とする、癌の予防または治療のための方法を提供する。本発明において、「対象」としては、哺乳動物、特にヒトが挙げられる。
【００２０】
さらに、本発明に記載の式Ｉによって表されるインドール誘導体、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩は良好な抗増殖性活性を示し、そのため活性成分としてそれを含む組成物は、癌の予防または改善のための食品組成物として有効に用いられうる。
本発明の食品組成物はさらに、他の食品組成物、機能性健康食品または飲料に用いられる従来の賦形剤を含みうる。
【００２１】
例えば、本発明の食品組成物は、スクロース、顆粒フルクトース、グルコース、Ｄ−ソルビトール、マンニトール、イソマルトオリゴ糖、ステビオシド、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、スクラロースなどの甘味剤、無水クエン酸、ＤＬ−リンゴ酸、コハク酸およびその塩などの酸性化薬、安息香酸およびその誘導体などの防腐剤、様々な栄養補助食品、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成および天然風味剤などの風味剤、着色剤、調味剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭化剤などを含むことができる。また、本発明の食品組成物は、天然果汁および野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。これらの賦形剤の比は、本発明の食品組成物の１００重量部に基づき、約２０重量部以下の範囲内に決定することができる。
【００２２】
本発明の食品組成物が飲料である場合、一般に飲料に含まれる風味剤または天然炭化水素をさらに含むことができる。天然炭化水素は、グルコースおよびフルクトースなどの単糖、マルトースおよびスクロースなどの二糖、デキストリンおよびシクロデキストリンなどの多糖、キシリトール、ソルビトールおよびエリトリトールなどの糖アルコールでありうる。さらに、風味剤は、タウマチン、ステビア抽出物（レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど）などの天然風味剤、またはサッカリン、アスパルテームなどの合成香味剤でありうる。食品組成物が飲料として調製されている場合、天然炭化水素を一般に、１００ｍＬの組成物に基づき、約１から２０ｇ、好ましくは約５から１２ｇの分量で含むことができる。
【００２３】
本発明の食品組成物は、散剤、顆粒、錠剤、カプセル剤、または飲料の形態で製造されることができ、食品、飲料、ガム、茶、ビタミン複合体、および健康補助食品として用いることができる。
さらに、本発明に記載される式Ｉで表されるインドール誘導体、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩は、ヒト由来の皮膚癌細胞株（Ａ４３２）移植マウスモデルにおいて良好な抗癌活性を示し、それを活性成分として含む組成物は、皮膚癌の予防または改善のための化粧品組成物として有効に用いることができる。
【００２４】
本発明の組成物は、当技術分野で一般に製剤化される任意の形態、例えば、これらに限定はされないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、散剤、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳化ファンデーション、ワックスファンデーション、スプレーなどに製剤化することができる。さらに具体的には、本発明の組成物は、軟ローション、栄養ローション、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジング水、パック、スプレー、またはパウダーとして製剤化することができる。
【００２５】
本発明に記載の化粧品組成物がペースト、クリーム、またはゲルとして製剤化される場合、動物油、植物油、蝋、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、亜鉛オキシドなどが、担体成分として用いられうる。
本発明に記載の化粧品組成物が散剤またはスプレーとして製剤化される場合、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミド散剤が用いられうる。特に、散剤はさらに、クロロフルオロ炭化水素、プロパン／ブタン、またはジメチルエーテルなどの噴射剤を含みうる。
【００２６】
本発明に記載の化粧品組成物が溶液またはエマルジョンとして製剤化される場合、溶媒、可溶化剤、または乳化剤が担体成分として用いられうる。例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、脂肪族グリセロールエステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルが用いられうる。
【００２７】
本発明に記載の化粧品組成物が懸濁液として製剤化される場合、水、エタノールまたはプロピレングリコールなどの液体希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの懸濁化剤、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、トラガカントなどが担体成分として用いられうる。
【００２８】
本発明に記載の化粧品組成物が、界面活性剤含有クレンザーとして製剤化される場合、脂肪族アルコール硫酸塩、脂肪族アルコールエーテル硫酸塩、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウラート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテル硫酸塩、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物油、ラノリン誘導体、エトキシ化グリセロール脂肪酸エステルなどが、担体成分として用いられうる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明に記載のインドール誘導体、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩は、有糸細胞分裂の間に微小管の脱重合によって細胞のアポトーシスを誘導し、多剤耐性を有する癌細胞においても良好な抗癌作用を有する。さらに、本発明のインドール誘導体、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩は、良好なインビボ安定性および良好な溶解度を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、蛍光免疫染色によって観察した、化合物の濃度に依存した、有糸分裂細胞の紡錘糸および染色体に対する、実施例１（ＷＣＩ−１０３１）の化合物の影響を示す。
【図２】図２は、ヒト由来皮膚癌細胞株（Ａ４３１）移植ヌードマウスモデルにおける、化合物による治療後の体重の変化を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒト由来皮膚癌細胞株（Ａ４３１）移植ヌードマウスモデルにおける、化合物による治療後の腫瘍の大きさの変化を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒト由来皮膚癌細胞株（Ａ４３１）移植ヌードマウスモデルにおける、化合物による治療後の最終日（Ｄａｙ ２３）におけるマウスの腫瘍の大きさを示す写真を提示する。
【図５】図５は、ヒト由来皮膚癌細胞株（Ａ４３１）移植ヌードマウス移植モデルにおける、化合物による治療後の腫瘍の重量を示すグラフである。
【図６】図６は、ヒト由来皮膚癌細胞株（Ａ４３１）移植ヌードマウスモデルにおける、化合物による治療後の最終日（Ｄａｙ ２３）における、マウスから単離した腫瘍を示す写真を提示する。
【図７】図７は、実施例１（ＷＣＩ−１０３１）の化合物の静脈内投与後の、血漿濃度の経時変化を示すグラフである。
【図８】図８は、ｐＨ６．５における実施例１（ＷＣＩ−１０３１）の化合物の溶解度曲線である。
【図９】図９は、ｐＨ７．４における実施例１（ＷＣＩ−１０３１）の化合物の溶解度曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の形態
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。以下の実施例は、その範囲を限定することなく本発明をさらに説明することを意図している。
【００３２】
＜実施例１＞メチル （Ｅ）−２−（２−メチル−３−（（２−（ナフト［２，１−ｂ］フラン−２−カルボニル）ヒドラゾノ）メチル）−１Ｈ−インドール−１−イル）アセテート（ＷＣＩ−１０３１）の合成
ナフト［２，１−ｂ］フラン−２−カルボヒドラジド（１００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、およびメチル ２−（３−ホルミル−２−メチル−１Ｈ−インドール−１−イル）アセテート（１０２ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、および触媒量の酢酸（０．１ｍｌ）のエタノール（５ｍｌ）溶液を、９０℃で２時間攪拌した。出発物質が消費されたことをＴＬＣによって確認した後、反応混合物を室温に冷却し、氷水に加えた。分離した固体を濾過し、水で洗浄し、次いで乾燥させた。このように生成された残留物を、混合比１：１のヘキサンおよび酢酸エチルの混合物を用いて、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、目的の化合物、メチル （Ｅ）−２−（２−メチル−３−（（２−（ナフト［２，１−ｂ］フラン−２−カルボニル）ヒドラゾノ）メチル）−１Ｈ−インドール−１−イル）アセテート（１７４ｍｇ、９０％）を淡黄色の固形物として得た。
ESIMS 観測値: m/z 440.36[M+H]+, 879.16[2M+H]+.
【００３３】
＜試験実施例１＞本発明のインドール誘導体の抗増殖性活性試験
＜１−１＞ＨｅＬａ細胞株における抗増殖性活性試験
以下の実験は、本発明のインドール誘導体の抗増殖性活性を調べるために行った。
ヒト子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を、２ｘ１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに分注し、細胞をＤＭＳＯまたは本発明のインドール誘導体で処理し、次いで４日間生育させた。次いで、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）試薬を１０μｌ／ウェルでウェルに加えた。２時間後、吸光度を「ＯＤ ４５０」で測定し、ｐｌｉｚｍ６プログラムを用いて統計値を得た。データは２回の反復アッセイの結果の平均値を表す（表１）。
【表１】
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表１に示すように、本発明のインドール誘導体はＨｅＬａ細胞株（子宮頸癌細胞株）において良好な抗増殖性活性を有することが発見された。
【００３４】
＜１−２＞他の癌細胞株における抗増殖性活性試験
以下の実験は、本発明のインドール誘導体が他の癌細胞株、並びにＨｅＬａ細胞株（子宮頸癌細胞株）において、抗増殖性活性を示すかどうかを確認するために行った。
特に、様々な癌細胞株をマイクロタイタープレート（１−３ｘ１０３細胞／ウェル）上で培養し、細胞を本発明のインドール誘導体で処理し、４日間培養した。試験実施例１−１と同様の方法で細胞毒性をＭＴＴアッセイによって測定し、ＩＣ５０をｌｏｇ−用量応答曲線によって得た。データは３回の反復アッセイの結果の平均値を表す（表２）。
【表２】
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表２に示すように、本発明のインドール誘導体は様々な癌細胞株においてもまた良好な抗増殖性活性を有することが分かった。
【００３５】
＜１−３＞多剤耐性を示す癌細胞における抗増殖性活性試験
以下の実験は、本発明のインドール誘導体が多剤耐性を示す癌細胞に有効であるかどうかを調べるために行った。
具体的には、Ｋ５６２およびＭＣＦ７(Bio Evaluation Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea)、並びにＫ５６２／ＡＤＲおよびＭＣＦ７／ＡＤＲ(Bio Evaluation Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea)は、それぞれ前記の細胞株の多剤耐性細胞株であり、１−３ｘ１０３細胞／ウェルでマイクロタイタープレート上に培養した。次いで、細胞をＷＣＩ−１０３１（実施例１の化合物）、本発明のインドール誘導体、タキソール、ドキソルビシン、ビンブラスチン、またはコルヒチンで処理し、４日間培養した。細胞毒性を試験実施例１−１と同様の方法で、ＭＴＴアッセイにより試験し、ＩＣ５０をｌｏｇ−用量応答曲線（単位：ｎＭ）から得た。データは３回の反復アッセイの結果の平均値を表す（表３および４）。
多剤耐性を示す細胞株の耐性ファクターは、非耐性の親細胞株のＩＣ５０に対する、多剤耐性細胞株のＩＣ５０の比である。
【表３】
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【表４】
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【００３６】
表３および４に示すように、多剤耐性細胞株は従来の抗癌剤に対して強い耐性を示し、耐性ファクターは数十から数百の範囲であった。しかしながら、実施例１の化合物、本発明のインドール誘導体に対する耐性ファクターは、０．３６から０．６０の範囲であり、本発明のインドール誘導体が多剤耐性を示す癌細胞に対して、従来の抗癌剤と比較して強い細胞毒性効果を有することが示された。
【００３７】
＜試験実施例２＞本発明のインドール誘導体の細胞周期の進行への影響の試験
いくつかの癌細胞株を１２ウェルプレート上で培養し（３ｘ１０４細胞／ウェル）、ＤＭＳＯまたは本発明のインドール誘導体であるＷＣＩ−１０３１で１７時間処理し、次いでヨウ化プロピジウム色素を加えて細胞内ＤＮＡを染色し、ＦＡＣＳを用いた測定に付した。Ｇ２／Ｍ期で回収された細胞の濃度、およびパーセントで表示された細胞数を示す（表５）。
【表５】
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本発明のインドール誘導体であるＷＣＩ−１０３１に関して、表５に示すように、０．５から１．０μＭの濃度で細胞はＧ２／Ｍ期で回収され、細胞の数は５０％以上であった。そのため、本発明のインドール誘導体は細胞周期をＧ２およびＭ期で抑制することが分かった。
【００３８】
＜試験実施例３＞本発明のインドール誘導体のチューブリン重合に対する影響の試験
本発明のインドール誘導体の細胞内微小管に対する影響を試験するために、ＨｅＬａ細胞をＤＭＳＯまたはＷＣＩ−１０３１（０．１μＭ、０．５μＭ、および１．０μＭ）で１６時間処理した。細胞を固定化し、抗チューブリン抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で染色し、抗中心体抗体およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄで染色し、次いで、細胞の核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用いて抗体染色し、α−チューブリン、中心体およびＤＮＡを観察した（図１）。
図１に示すように、細胞を本発明のインドール誘導体で処理した場合、誘導体の濃度が高くなるほど、ＤＭＳＯ対照と比較して、チューブリンの形態が緩く、短くなった。さらに、中心アレイから逸脱するＤＮＡパターンの上昇が見られた。
そのため、本発明のインドール誘導体は微小管を脱重合させる製剤であることが分かった。
【００３９】
＜試験実施例４＞ヒト由来皮膚癌細胞（Ａ４３１）移植モデルにおける、抗癌作用試験
＜４−１＞癌細胞の培養および癌細胞の移植
液体窒素中で凍結保存したヒト癌細胞株Ａ４３１を解凍し、細胞培養を行った。細胞をＣＯ２インキュベーター（Ｆｏｒｍａ，ＵＳＡ）中、３７℃、５％ＣＯ２で、適切な期間培養した。
培養最終日に、全ての癌細胞を回収し、計測し、無血清培地を用いて細胞濃度を１ｘ１０７細胞／ｍｌに調整した。このように用意した培養溶液を、肩甲骨と胸壁の間の腋窩領域に、ＢＡＬＢ／Ｃのメスのヌードマウス（５週齢、Ｎａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）ごとに０．３ｍｌの分量（３ｘ１０６細胞／マウス）で皮下注射した。
【００４０】
＜４−２＞サンプルの調製および投与の方法
本発明のインドール誘導体化合物であるＷＣＩ−１０３１（実施例１）を試験物質として用い、５−ＦＵおよびコルヒチンを陽性対照物質として用いた。
化合物は、投与の直前に、ＤＭＡＣ（ジメチルアセトアミド）２０％＋Ｔｗｅｅｎ８０ ５％＋２０％ ＨＰｂＣＤ（２−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン） ７５％に溶解させて適切な濃度とした後に用いた。陽性対照物質として用いた５−ＦＵおよびコルヒチンを、それぞれ通常の食塩水およびＰＢＳを用いて、２および０．００７ｍｇ／ｍｌの濃度で使用するために調製した。
調製した物質を以下の用量スケジュールに従って、２０ｇのマウスに対して０．２ｍｌ（１０ｍｌ／ｋｇ）で腹腔内投与および経口投与を繰り返し行った。
−担体、ＷＣＩ−１０３１（１０、２０ｍｇ／ｋｇ）、コルヒチン（０．０７ｍｇ／ｋｇ）：Ｄａｙ ０−２３
−５−ＦＵ：Ｄａｙ ０−２、５−９、１２−１６、１９−２３
【００４１】
＜４−３＞全身症状および体重変化の確認
Ａ４３１癌細胞移植ヌードマウスへの、ＷＣＩ−１０３１の反復腹腔内投与の毒性の程度を調べるために、投与期間の間、動物の全身症状および体重の変化を観察した。
その結果、全ての薬物処理群で、溶媒対照群と比較して統計的に有意な体重の減少は観察されず、試験期間中に有意な全身症状は観察されなかった（図２）。
【００４２】
＜４−４＞腫瘍の大きさ変化の試験
癌細胞の移植の後、腫瘍の平均の大きさが５７．０ｍｍ３に達した時から２３日目まで、合計１１回、ノギスを用いてそれぞれの動物の腫瘍の大きさを３方向で測定し、長さ×幅×高さ／２の式で表した。
最終日（Ｄａｙ ２３）に、ＷＣＩ−１０３１をそれぞれ１０および２０ｍｇ／ｋｇで投与した群では、溶媒投与対照群と比較して、９．３％および３７．２％（ｐ＜０．００１）の腫瘍の成長阻害が観測された。陽性対照群である、５−ＦＵおよびコルヒチン投与群の腫瘍の成長阻害は、それぞれ２０．７％（ｐ＜０．０１）および１７．６％（ｐ＜０．０５）であった（図３および４）。
【００４３】
＜４−５＞腫瘍の重量変化の試験
薬物投与開始後のＤａｙ ２３に、最後の投与から２時間後、マウスの眼静脈から血液を採取し、ＣＯ２ガスを用いてマウスを犠死させた。次いで、マウスを撮影し、腫瘍を単離して、化学天秤で秤量した。写真撮影後、それぞれの腫瘍を半分に分け、得られた腫瘍を液体窒素とホルマリンでそれぞれ固定化した。
薬物投与開始後のＤａｙ １６に、Ａ４３１腫瘍を切除し、秤量した。ＷＣＩ−１０３１をそれぞれ１０および２０ｍｇ／ｋｇで投与した群において、１０．７％および３８．０％（ｐ＜０．００１）の腫瘍の重量の減少が観察された。陽性対照群である、５−ＦＵおよびコルヒチン投与群における腫瘍の重量の減少は、それぞれ２０．８％（ｐ＜０．０５）および１７．６％（ｐ＜０．０５）であった（図５および６）。
【００４４】
＜試験実施例５＞血漿中の本発明のインドール誘導体の安定性試験
本発明のインドール誘導体のインビボでの安定性を試験するために、実施例１（ＷＣＩ−１０３１）の化合物を静脈内投与し、経時的な血漿濃度を観測した（図７）。
図７に示すように、血漿中のＷＣＩ−１０３１の安定性は良好であることが分かった。
【００４５】
＜試験実施例６＞本発明のインドール誘導体の溶解度試験
本発明のインドール誘導体の溶解度を試験するために、実施例１（ＷＣＩ−１０３１）の化合物の溶解度をｐＨ６．５またはｐＨ７．４で試験した。
具体的には、試験物質の固体サンプル（〜１ｍｇ）をＷｈａｔｍａｎ Ｓｙｒｉｎｇｅｌｅｓｓ ｆｉｌｔｅｒ（ＰＶＤＦ膜、０．４５μｍ 細孔径）に置き、０．５ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５または７．４）と混合した。混合物を１５分間超音波処理し、１時間室温でボルテックスした。平衡化した混合物を濾過し、濾液を多波長ＵＶプレートリーダーで分析した（図８および９）。
ＷＣＩ−１０３１の溶解度などのデータを以下の表６に示す。
【表６】
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（Ｋａ：腸管吸収速度定数
ＳＩＷＶ：小腸内水量（〜２５０ｍｌ）
ＳＩＴＴ：小腸通過時間（〜２７０分）
ＭＡＤ：ヒトの最大吸収用量）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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