(57)【要約】  ヒト患者の炎症症状の阻害および治療のための、Ｓ１００９ＡとＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）との間の相互作用を特異的にブロックするＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の阻害剤、より具体的にはＳ１００Ａ９タンパク質に対するヒト化抗体が提供される。特に、このヒト化抗体は、Ｓ１００Ａ９タンパク質とＴＬＲ−２受容体との間の相互作用のブロックに特異的である。【選択図】図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１００９ＡとＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）との間の相互作用を特異的にブロックする、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の阻害剤。
【請求項２】
Ｓ１００Ａ９タンパク質のエピトープと特異的に結合する抗体である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
前記Ｓ１００Ａ９タンパク質のＴＬＲ２への結合を阻害するのに適する、請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項４】
抗Ｓ１００Ａ９抗体である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項５】
前記抗Ｓ１００Ａ９抗体がマウス抗体である、請求項４に記載の阻害剤。
【請求項６】
前記抗Ｓ１００Ａ９抗体がヒト化されている、請求項４に記載の阻害剤。
【請求項７】
前記抗Ｓ１００Ａ９抗体が、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）またはＦ（ａｂ’）２からなる群から選択されるエピトープ結合断片を含む、請求項４から６までのいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項８】
前記抗体が、Ｓ１００Ａ９タンパク質のＣ末端領域またはヒンジ領域と結合するエピトープを含む、請求項４から７までのいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項９】
前記抗体が、Ｓ１００Ａ９タンパク質のＣ末端領域の最後の１０アミノ酸と結合するエピトープを含む、請求項４から８までのいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１０】
前記抗体が、エピトープ結合単鎖抗体を含む、請求項４から９までのいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１１】
前記抗体が、ＬＧｘｘＴｘ（配列番号７０）として定義されるＳ１００Ａ９分子上のユニークなエピトープを認識する、請求項４から１０までのいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１２】
前記エピトープが、ＬＧＥｘＴＰ（配列番号７１）として定義される、請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項１３】
前記エピトープが、ＰＧＬＧＥｘＴＰ（配列番号７２）として定義される、請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項１４】
前記エピトープが、ＰＧＬＧＥＧＴＰ（配列番号６７）として定義される、請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項１５】
前記抗体が、配列番号２、２１、２２、２３、２５および４１からなる群から選択される鎖を含む、請求項６に記載の阻害剤。
【請求項１６】
前記抗体が、配列番号２および２５からなる群から選択されるものを含む、請求項６に記載の阻害剤。
【請求項１７】
前記抗体が、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の阻害剤。
【請求項１８】
配列番号２、２１、２２、２３、２５および４１からなる群から選択される鎖を含む抗体。
【請求項１９】
配列番号２および２５からなる群から選択される鎖を含む、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
配列番号４２のアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項２１】
配列番号４３のアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項２２】
配列番号４４のアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項２３】
配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項２４】
配列番号４６のアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項２５】
配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項２６】
配列番号４８のアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項２７】
請求項１から１７までのいずれか１項に記載の阻害剤、または請求項１８から２６までのいずれか１項に記載の抗体と、生理的もしくは薬学的に許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項２８】
炎症症状を治療するための、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１から１７までのいずれか１項に記載の阻害剤、請求項１８から２６までのいずれか１項に記載の抗体、または請求項２７に記載の組成物の、炎症症状を治療するための使用。
【請求項３０】
請求項１から１７までのいずれか１項に記載の阻害剤、請求項１８から２６までのいずれか１項に記載の抗体、または請求項２７に記載の組成物の、炎症症状の治療剤の製造のための使用。
【請求項３１】
炎症症状を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の阻害剤、請求項１８から２６までのいずれか１項に記載の抗体、または請求項２７に記載の組成物を有効量で投与するステップを含む方法。
【請求項３２】
前記炎症症状が、慢性関節リウマチ、喘息、痛風、Ｉ型糖尿病、クローン病、紅斑性狼蒼、多発性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、慢性炎、乾癬および癌転移からなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物、請求項２９もしくは３０に記載の使用または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記炎症症状が、慢性炎症性疾患である、請求項２８に記載の組成物、請求項２９もしくは３０に記載の使用または請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記慢性炎症性疾患が、化膿性関節炎、壊疽性膿皮症、無呼吸症候群、成人発症型スチル病および全身型若年性特発性関節炎である、請求項３３に記載の組成物、使用または方法。
【請求項３５】
前記炎症症状が、慢性関節リウマチである、請求項２８に記載の組成物、請求項２９もしくは３０に記載の使用または請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体が、哺乳動物に投与される、請求項３１から３５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体が、皮下、静脈内、筋肉内、関節内または腹腔内に投与される、請求項３１から３７までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、Ｓ１００Ａ９とＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）との間の相互作用を特異的にブロックするＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節炎は、末梢関節の炎症を特徴とする慢性的症候群である。疾患の重症度は広い範囲にわたり、多くの患者は全体的なパターンとして、徐々に進行する関節破壊および変形を伴う断続的な再発および寛解の過程をたどる。持続的な炎症が徴候であり、組織に損傷を与え、軟骨の喪失、骨実質の浸食および関節の不全脱臼を生じさせる。この結果、罹患率が上昇し、患者の日常生活が妨げられる。関節炎の診断は、典型的には血液中のリウマチ因子、および放射線を用いた末梢関節の変化の決定により行われる。
関節炎の一次治療には、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキセートなどの、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）と分類される痛みおよび炎症のコントロールのための第一選択薬剤が含まれる。二次治療には、コルチコステロイド、遅効性抗リウマチ剤（ＳＡＡＲＤ）またはペニシリンアミン、シクロホスファミド、塩化金酸ナトリウム、アゾチオプリン、レバミゾール、メトトレキセートなどの疾患修飾薬（ＤＭ）が含まれる。
上記製品はいずれも様々な中毒性副作用を示し、それらのほとんどは細胞毒性を有する。これらの薬剤は利点が限られ、またそれらが効果を示す期間は概ね短い。それらがもたらす胃の浸食などの副作用、ならびに腎臓および肝臓に対する悪影響は、長期間のそれらの使用を物語るものである。さらに、主に使用される製品は高コストであり、また利益／危険の率が低い。
炎症反応の調節のための適度なコストで、安全で、効率的で、また従来の製品の必要性がなく、それらに関連する、特に長期にわたる日常的使用による副作用のない、代替的療法、方法、組成物または化合物に対するニーズは未だに存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
以上に鑑み、Ｓ１００Ａ９とＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）との間の相互作用を特異的にブロックする、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の阻害剤を提供する。
一実施形態では、阻害剤は、Ｓ１００Ａ９タンパク質のエピトープと特異的に結合する抗体である。
他の実施形態では、阻害剤は、前記Ｓ１００Ａ９タンパク質のＴＬＲ２への結合を阻害するのに適する。
さらなる実施形態では、ＴＬＲ２の阻害剤は抗Ｓ１００Ａ９抗体である。
補足的な実施形態では、抗Ｓ１００Ａ９抗体はマウス抗体である。
さらなる実施形態では、抗Ｓ１００Ａ９抗体はヒト化されている。
他の実施形態では、抗Ｓ１００Ａ９抗体は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）またはＦ（ａｂ’）２からなる群から選択されるエピトープ結合断片を含む。
一実施形態では、抗体は、Ｓ１００Ａ９タンパク質のＣ末端領域またはヒンジ領域と結合するエピトープを含む。
さらなる実施形態では、抗体は、Ｓ１００Ａ９タンパク質のＣ末端領域の最後の１０アミノ酸と結合するエピトープを含む。
さらなる実施形態では、抗体はエピトープ結合単鎖抗体を含む。
他の実施形態では、抗体は、ＬＧｘｘＴｘ（配列番号７０）として定義されるＳ１００Ａ９分子上のユニークなエピトープを認識する。
他の実施形態では、エピトープは、ＬＧＥｘＴＰ（配列番号７１）として定義される。
他の実施形態では、エピトープは、ＰＧＬＧＥｘＴＰ（配列番号７２）として定義される。
他の実施形態では、エピトープは、ＰＧＬＧＥＧＴＰ（配列番号６７）として定義される。
【０００４】
一実施形態では、抗体は、配列番号２、２１、２２、２３、２５および４１からなる群から選択される鎖を含む。
一実施形態では、抗体は、配列番号２および２５からなる群から選択されるものを含む。
他の実施形態では、抗体は、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
また、配列番号２、２１、２２、２３、２５および４１からなる群から選択される鎖を含む抗体も提供される。
一実施形態では、抗体は、配列番号２および２５からなる群から選択される鎖を含む。
また、配列番号４２のアミノ酸配列を含む抗体、配列番号４３のアミノ酸配列を含む抗体、配列番号４４のアミノ酸配列を含む抗体、配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体、配列番号４６のアミノ酸配列を含む抗体、配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体および／または配列番号４８のアミノ酸配列を含む抗体もさらに提供される。
また、本明細書に記載の阻害剤または本明細書に記載の抗体と、生理的もしくは薬学的に許容できる賦形剤とを含む組成物も提供される。
【０００５】
他の実施形態では、組成物は、炎症症状の治療用である。
さらに炎症症状を治療するために、本明細書において記載されている阻害剤、本明細書において提供される抗体または本明細書において記載されている組成物の使用も提供される。
また、炎症症状の治療剤を製造するための、本明細書に記載の阻害剤、本明細書に記載の抗体または本明細書に記載の組成物の使用も提供される。
また、炎症症状を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、本明細書に記載の阻害剤、本明細書で提供される抗体、または本明細書に記載の組成物を有効量で投与するステップを含む、方法も提供される。
一実施形態では、炎症症状は、慢性関節リウマチ、喘息、痛風、Ｉ型糖尿病、クローン病、紅斑性狼蒼、多発性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、慢性炎、自己炎症性症候群、乾癬および癌転移からなる群から選択される。
他の実施形態では、炎症症状は慢性炎症性疾患である。慢性炎症性疾患には、限定されないが、化膿性関節炎、壊疽性膿皮症、無呼吸症候群、成人発症型スチル病および全身型若年性特発性関節炎が含まれる。
他の実施形態では、炎症症状は慢性関節リウマチである。
【０００６】
さらなる実施形態では、抗体は哺乳動物に投与される。
他の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
さらなる実施形態では、抗体は皮下、静脈内、筋肉内、関節内または腹腔内に投与される。
本明細書で用いられる用語「阻害」または「阻害すること」とは、反応（例えば炎症反応または症状）を低減させることを意味するものとする。阻害は、好ましくは治療でありうる。
本明細書で用いられる用語「炎症症状」とは、限定されないが、慢性関節リウマチ、喘息、痛風、Ｉ型糖尿病、クローン病、紅斑性狼蒼、多発性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、慢性炎および乾癬、自己炎症性疾患などを意味する。また、本明細書に包含される炎症症状は、慢性炎症性疾患を意味する。慢性炎症性疾患には、限定されないが、化膿性関節炎、壊疽性膿皮症、無呼吸症候群、成人発症型スチル病および全身型若年性特発性関節炎が含まれる。
【０００７】
本明細書で用いられる「治療」には、例えば炎症性リウマチ性またはリウマチ様疾患、プロセス、症状またはイベントなどの炎症の緩和、改善またはコントロールのための全身的な使用が含まれる。それにはまた、炎症の後遺症または徴候の、例えば（細胞、上皮または組織などの）退化、または、特に腫脹、滲出もしくは流出、または痛みの緩和、改善またはコントロールのための介入が含まれる。この文脈において、用語「治療」とはさらに、疾患を改変する効果のための使用を含む、あらゆる指定の疾患、プロセス、症状、イベント等の進行を逆転、制限、またはコントロールするための使用を包含するものとして、理解されるものとする。もし上記の疾患、プロセス、症状またはイベントが痛みと関連する場合、用語「治療」は好ましくは、痛みに加えて、例えば腫脹、流出、滲出、硬直、関節の柔軟性欠如または退化、より好ましくは全ての徴候、最も好ましくはそれぞれの疾患、刺激または顕在化の全体的臨床像などの、少なくとも一つのさらなる後遺症または徴候の緩和、改善またはコントロール（一時的または永久的な除去を含む）を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒトおよびマウスＳ１００Ａ９タンパク質に対するモノクローナル抗体６Ｂ４の特異性を示す。組換え型ヒトおよびマウスのＳ１００Ａタンパク質（１００μｌ中１〜１０００ｎｇ）および精製ヒトカルプロテクチンを、高結合型９６ウェルプレートにロードし、標準的なＥＬＩＳＡを行った。
【図２】ヒトＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９およびＳ１００Ａ１２タンパク質に対するモノクローナル抗体６Ｂ４の特異性を示す。組換え型Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ１２、ｍＳ１００Ａ８（マウスＳ１００Ａ８）、ｍＳ１００Ａ９（マウスＳ１００Ａ９）、精製ヒトカルプロテクチンおよび好中球の粗抽出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）上にロードし、ニトロセルロース膜上に転写し、６Ｂ４  ｍＡｂを用いたウエスタンブロットにより検出した。
【図３】マウスおよびヒト化変異体−１における、６Ｂ４可変ドメインの分子モデルを示す。置換されたフレームワークの残基を、ボール＆スティックモデルで示す。ヒト化抗体において保存されているマウス残基にラベルを付し、ボール＆スティックモデルで示す。重鎖および軽鎖のＣＤＲループに、ラベルを付す（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。
【図４】復帰突然変異の標的とした領域を強調した、マウスおよびヒト化６Ｂ４可変ドメインのオーバレイモデルを示す。差込み部において、マウス残基に復帰突然変異したヒトフレームワーク残基をスティックモデルで強調する。
【図５】マウスおよびヒト化６Ｂ４抗体の軽鎖Ｖドメイン配列のアラインメントを示す。
【図６】マウスおよびヒト化６Ｂ４抗体の重鎖Ｖドメイン配列のアラインメントを示す。
【図７】６Ｂ４がＳ１００Ａ９のＣ末端ペプチドを認識することを示す。組換え型Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９（１μｇ）、ＰＢＳ１ｘ、Ｎ末端（Ｎ）、ヒンジ（Ｈ）およびＣ末端（Ｃ）のペプチド（１０および５０μｇ）をＰＶＤＦ膜上に載置し、ｍＡｂ  ６Ｂ４を用いたドットブロット解析を行った。
【図８】６Ｂ４がＣ末端領域ｆ  Ｓ１００Ａ９（ペプチドＣ７）の最後の１０アミノ酸を認識することを示す。２．５μｇの組換え型Ｓ１００Ａ９の、Ｃ末端のＣ１〜Ｃ７ペプチド、組換え型マウスＳ１００Ａ９およびマウスＳ１００Ａ９のＣ末端をＰＶＤＦ膜上に載置し、ｍＡｂ  ６Ｂ４を用いたドットブロット解析を行った。
【図９】６Ｂ４およびポリクローナル抗Ｓ１００Ａ９抗体が、概ねＳ１００Ａ９のＣ末端領域の最後の１０アミノ酸（ペプチドＣ７）を認識することを示す。９６ウェル高結合型プレートを、漸増濃度のＳ１００Ａ９ペプチドでコーティングした。非特異的結合部位をＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ／２％  ＢＳＡでブロッキングし、（Ａ）６Ｂ４（２μｇ／ｍｌ）または（Ｂ）ｐＡｂ  ａ−Ａ９（１μｇ／ｍｌ）を含有する溶液をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。十分な洗浄の後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体をプレートに添加し、１時間室温でインキュベートした。ＴＭＢＳを添加して反応を行わせ、Ｈ2ＳＯ4で停止させた。光学密度を４５０ｎｍで測定した。Ｓ１００Ａ９に対する他の３つのｍＡｂもまた、図１０に示すようにＣ７ペプチドと結合する。
【図１０】全ての抗Ｓ１００Ａ９モノクローナル抗体がＳ１００Ａ９のＣ末端領域の最後の１０アミノ酸（ペプチドＣ７）と結合することを示す。９６ウェル高結合型プレートを、漸増濃度のＳ１００Ａ９ペプチドでコーティングした。非特異的結合部位をＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ／２％  ＢＳＡでブロッキングし、１μｇ／ｍｌの６Ｂ４、２Ｈ１１、４Ｅ８、４Ｂ６、２Ｂ４または１Ｆ８（抗Ｓ１００Ａ８をネガティブコントロールとして使用）を含有する溶液をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。十分な洗浄の後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体をプレートに添加し、１時間室温でインキュベートした。ＴＭＢＳを添加して反応を行わせ、Ｈ2ＳＯ4で停止させた。光学密度を４５０ｎｍで測定した。
【図１１】６Ｂ４によって認識される連続エピトープがＰＧＬＧＥＧＴＰ（Ｃ７ａ）であることを示す。９６ウェル高結合型プレートを、漸増濃度のＳ１００Ａ９ペプチドでコーティングした。非特異的結合部位をＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ／２％  ＢＳＡでブロッキングし、６Ｂ４（１μｇ／ｍｌ）を含有する溶液をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ネガティブコントロールとして、一部のウェルを、ＰＢＳのみでインキュベートした（２ｅ  Ａｂ）。十分な洗浄の後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体をプレートに添加し、１時間室温でインキュベートした。ＴＭＢＳを添加して反応を行わせ、Ｈ2ＳＯ4で停止させた。光学密度を４５０ｎｍで測定した。
【図１２】Ｌ１０９、Ｇ１１０、Ｔ１１３、また程度は低いがＥ１１１およびＰ１１４は、６Ｂ４のＳ１００Ａ９のＣ末端領域に局在化するエピトープへの結合において重要であることを示す。９６ウェル高結合型プレートを、漸増濃度のＳ１００Ａ９ペプチドでコーティングした。非特異的結合部位をＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ／２％  ＢＳＡでブロッキングし、６Ｂ４（１μｇ／ｍｌ）を含有する溶液をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。十分な洗浄の後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体をプレートに添加し、１時間室温でインキュベートした。ＴＭＢＳを添加して反応を行わせ、Ｈ2ＳＯ4で停止させた。光学密度を４５０ｎｍで測定した。
【図１３】ヒト化６Ｂ４がＳ１００Ａ９のＣ末端ペプチドを認識することを示す。組換え型ヒト（Ｓ１００Ａ９）、マウスＳ１００Ａ９（Ｍｕ１４）（１μｇ）、ＰＢＳ１ｘおよびＣ末端Ｓ１００Ａ９ペプチド（２μｇ）をＰＶＤＦ膜上に載置し、ヒト化６Ｂ４  Ｈｈ＋ＬｈまたはＨｃ＋Ｌｈを用いたドットブロット解析を行った。
【図１４】Ｓ１００Ａ９がＴＬＲ２のリガンドであることを示す。ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１のコントロール下で、分泌型胎生期アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を発現するレポーター構築物を含有するＴＨＰ−Ｂｌｕｅ細胞を、中和抗ＴＬＲ２（５μｇ／ｍｌ）、イソタイプマッチ抗体（５μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳ１ｘと共に３７℃で１時間インキュベートし、次に、３７°Ｃで２４時間、示される濃度のＳ１００Ａ９により活性化した。次に、上清を回収し、製造業者の説明書に従いＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ基質と共にインキュベートし、光学密度を６５０ｎｍで測定した。結果は、３回の独立実験のうちの１つの代表的な実験の、２回の反復試験からの平均＋／−ＳＥＭである。
【図１５】ＴＬＲ２に対する遮断抗体が、ＴＨＰ−Ｂｌｕｅ細胞においてＳ１００Ａ９により誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害することを示す。ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１のコントロール下で、分泌型胎生期アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を発現するレポーター構築物を含有するＴＨＰ−Ｂｌｕｅ細胞を、中和抗ＴＬＲ２（５μｇ／ｍｌ）、イソタイプマッチ抗体（５μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳ１ｘと共に３７℃で１時間インキュベートし、次に、３７°Ｃで２４時間、示される濃度のＳ１００Ａ９により活性化した。次に、上清を回収し、製造業者の説明書に従いＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ基質と共にインキュベートし、光学密度を６５０ｎｍで測定した。結果は、３回の独立実験のうちの１つの代表的な実験の、２回の反復試験からの平均＋／−ＳＥＭである。
【図１６】ブロック用ウサギｍＡｂが、Ｓ１００Ａ９のヒンジ領域またはＣ末端ペプチドを認識することを示す。ＰＢＳ１ｘ、組換え型Ｓ１００Ａ９、Ｎ末端、ヒンジおよびＣ末端ペプチド（５０ｎｇ／ウェル）で９６ウェルプレートをコーティングした。１１のブロック用ウサギ抗Ｓ１００Ａ９抗体の細胞培養上清１００μｌをウェルに添加した。ｍＡｂの結合を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて明らかにした。ｍＡｂ  １Ｂ５および７Ａ８は、Ｓ１００Ａ９のＣ末端領域と結合する。ｍＡｂ  ６Ｃ１は、ヒンジ領域と結合する。
【図１７】ｍＡｂ  １Ｂ５および７Ａ８がＳ１００Ａ９のＣ末端領域の最後の１０アミノ酸（ペプチドＣ７）と結合することを示す。ＰＢＳ１ｘ、組換え型Ｓ１００Ａ９、Ｃ末端およびＣ１−Ｃ７のペプチドペプチド（５０ｎｇ／ウェル）で９６ウェルプレートをコーティングした。１１のブロック用ウサギ抗Ｓ１００Ａ９抗体の細胞培養上清１００μｌをウェルに添加した。ｍＡｂの結合を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて明らかにした。いずれのｍＡｂもＣ７ペプチドと結合する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書では、Ｓ１００９ＡとＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）との間の相互作用を特異的にブロックするＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の阻害剤を提供する。
一態様では、Ｓ１００Ａ９とＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）との間の相互作用を特異的にブロックする抗体を提供する。
Ｓ１００Ａ９タンパク質上の、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）との相互作用に関係するエピトープと特異的に結合する抗体により、さらなる態様が提供される。
さらなる態様では、Ｓ１００Ａ９タンパク質のＴＬＲ２への結合の阻害に適する抗体が提供される。
【００１０】
Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）は、Ｔｏｌｌ様受容体ファミリーのメンバーであり、免疫系において役割を果たす。ＴＬＲ２は、特定の細胞の表面に発現し、外来物質を認識する膜タンパク質である。ＴＬＲ２の係合は、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１の活性化をもたらし、幾つかの例を挙げれば、例えば慢性関節リウマチ、狼瘡およびクローン病などの自己免疫疾患につながるＩＬ−１、ＴＮＦおよびＩＬ−６等のサイトカインを分泌させる。
本明細書において開示される治療化合物は、Ｓ１００Ａ９タンパク質（その断片、アナログおよび誘導体、ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）と結合する抗体（その断片、アナログおよび誘導体を含む）を含むが、これらに限定されない。特に、抗体は、Ｓ１００タンパク質とＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）との間の相互作用を特異的にブロックする。より具体的には、抗体は、Ｓ１００Ａ９タンパク質上の、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）との相互作用に関係するエピトープと特異的に結合する。さらに最も具体的には、抗体は、ＴＬＲ２へのＳ１００タンパク質の結合の阻害に適する。
特に、抗体は抗Ｓ１００Ａ９抗体である。
【００１１】
代替の実施形態では、Ｓ１００タンパク質と抗体との相互作用は、Ｓ１００タンパク質のＣａ+2および／またはＺｎ+2の存在に依存する。
Ｓ１００Ａ９、別名カルグラニュリンＢおよび骨髄関連タンパク質−１４（ＭＲＰ−１４）は、Ｓ１００タンパク質ファミリーに属するカルシウムおよび亜鉛結合タンパク質である。Ｓ１００Ａ９は、骨髄細胞系譜により高度に発現され、炎症症状の間、細胞外環境に見出される。Ｓ１００Ａ９は、Ｓ１００ファミリーの他のメンバーであるＳ１００Ａ８とヘテロダイマーを形成する。しかしながら、Ｓ１００Ａ９は、特定の機能を発揮する単量体を形成することもある。ヒトＳ１００Ａ９は約１３ｋＤａの分子量を有し、１１４アミノ酸残基から構成される。Ｓ１００Ａ８／Ａ９タンパク質は、炎症活性化の後、Ｓ１００Ａ９のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用を通じて、または、Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体の、内皮細胞により排他的に発現されるカルボキシル化Ｎ−グリカンとの相互作用を通じて、内皮と結合することができる。
Ｓ１００Ａ９タンパク質は、非共有結合的に結合したホモダイマーとしてアレンジされる。加えて、カルシウムの存在下では、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９またはカルプロテクチンと呼ばれる、細胞内のカルシウム濃度コントロールに関係すると推定される、非共有結合性のヘテロダイマーを形成する。
【００１２】
Ｓ１００Ａ９タンパク質は分泌され、血清中および自己免疫疾患患者の炎症部位において見出される。Ｓ１００Ａ９は、β２インテグリンＭａｃ−１を活性化することにより、好中球および単球の炎症部位への遊走を刺激し、これらの細胞が内皮細胞に接着し、その内部全体を遊走することを可能にする（Anceriz et al., 2007, Biochemical and biophysical research communications, 354: 84-89）。Ｓ１００Ａ９はまた、ＮＦ−κＢおよびインフラマソームを活性化することによって、例えばヒトの単球およびプライミングされた好中球による、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６などのサイトカイン分泌を誘導する（Simard et al., 2013, PloS one 8: e72138）。
【００１３】
Ｓ１００Ａ９は、好中球および単球による、食作用、脱顆粒の強力なインデューサ、ならびに反応性酸素種の生産の軽度のインデューサである（Simard et al., 2013, PloS one 8: e72138）。Ｓ１００Ａ９はまた、ＮＦ−κＢおよびインフラマソームを活性化することにより、単球による、例えばＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαなどのサイトカインの分泌を誘導する（Simard et al., 2013, PloS one 8: e72138）。ＴＮＦαなどのサイトカインは次々に好中球を刺激してさらにＳ１００Ａ９を放出させ、それにより、際限なく継続されるサイクルを生じさせる。Ｓ１００ａ９-/-マウスは、少なくとも部分的にはＣＤ８  Ｔ細胞活性化が低いことにより、アジュバントにより誘導される関節炎および全身性エリテマトーデスに対する抵抗性を有する（Loser et al., 2010, Nature medicine, 16: 713-717）。さらに、Ｓ１００Ａ９に対するｍＡｂは、コラーゲンにより誘導される関節炎モデルにおいて、炎症および関節破壊を防止する（Cesaro et al., 2012, PloS one 7: e45478）。これは、炎症部位への白血球の遊走ならびにＴＮＦαおよびＩＬ−６の分泌が低減することと関連する。マウスＳ１００Ａ９は、骨髄由来の樹状細胞（Riva et al., 2012, Immunology, 137: 172-182）およびマクロファージ（Pouliot et al., 2008, J Immunol, 181: 3595-3601）による一酸化窒素（ＮＯ）の放出を誘導する。これらのデータは、Ｓ１００Ａ９が、食細胞の遊走を促進し、炎症誘導性サイトカインの分泌、ならびに組織分解酵素およびＲＯＳの放出を誘導することにより炎症を促進することを示す。
【００１４】
本明細書においては、Ｓ１００Ａ９タンパク質に対する抗体の投与が炎症症状、特に慢性関節リウマチに対する効果的な治療でありうることを開示する。
さらなる態様では、本開示は、本明細書に記載の抗体を、生理的または薬学的に許容できる賦形剤との混合物として含む組成物を提供する。
さらなる態様では、炎症症状の治療方法であって、それを必要とする被験者に、本明細書で定義される抗体または本明細書で定義される組成物を有効量で投与するステップを含む方法が提供される。
さらなる態様では、免疫療法の方法であって、それを必要とする被験者に、本明細書で定義される抗体または本明細書で定義される組成物を有効量で投与するステップを含む方法が提供される。
さらなる態様では、ＴＬＲ−２神経変性疾患の治療方法であって、それを必要とする被験者に、本明細書で定義される抗体または本明細書で定義される組成物を有効量で投与するステップを含む方法が提供される。
さらなる態様では、細胞、組織、器官または動物のＴＬＲ−２−関連症状を診断または治療する方法であって、それを必要とする前記細胞、組織、器官または動物に、本明細書で定義される抗体または本明細書で定義される組成物を有効量で投与するステップを含む方法を提供する。
本発明は、ヒト化抗体、ならびに、非ヒトの種由来のタンパク質配列を修飾して、天然にヒトで産生される抗体変異体との類似性を高めた抗体に関する。特異的抗体の開発プロセスが、非ヒトの（例えばマウスの）免疫系の生成を伴うとき、ヒト化が必要となりうる。抗体のヒト化方法は、ヒトに適用したときに免疫原性が最小となる分子が得られ、一方で、親の非ヒト抗体の特異性および親和性が維持されるよう設計される。このようにして産生される抗体のタンパク質配列は、ヒトで天然に得られる相同な抗体とは部分的に異なり、ゆえに、ヒト患者に投与されるときには潜在的に免疫原性である。
【００１５】
ヒト化はこれまで、治療剤としての抗体の顕著な進展において不可欠な役割を果たしていた。例えばファージディスプレイなどの富化技術による、または、ヒト抗体遺伝子レパートリーを担持するトランスジェニックマウスの免疫によるヒト抗体のインビトロ発見は、ヒト抗体を産生させる強力な手段をもたらした。
より具体的には、抗体はＳ１００Ａ９上のエピトープと特異的に結合し、このエピトープはＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）との相互作用をブロックする。さらに最も具体的には、抗体は、ＴＬＲ２へのＳ１００タンパク質の結合を阻害する。さらに最も具体的には、抗体は、ＴＬＲ２の活性化をブロックする。
特定の実施形態では、抗体は、Ｆｖおよび／またはＦ（ａｂ’）および／またはＦ（ａｂ’）２から選択されるエピトープ結合断片を含む。具体的には、抗体は、エピトープ結合単鎖抗体を含む。
特定の実施形態では、抗体は、ＴＬＲ２と相互作用するＳ１００タンパク質の領域と重複するエピトープを担持する。具体的には、抗体は、ＬＧｘｘＴｘ（配列番号７０）と定義されるＳ１００Ａ９分子上のユニークなエピトープを認識する。より具体的には、エピトープは、ＬＧＥｘＴＰ（配列番号７１）、またはＰＧＬＧＥｘＴＰ（配列番号７２）、または、ＰＧＬＧＥＧＴＰ（配列番号６７）として定義される。
【００１６】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号２、２１、２２、２３、２５または４１、より具体的には配列番号２または２５から選択される鎖を含む。
本明細書に記載の抗Ｓ１００  Ａｂは、適切な生理的または薬学的担体との組み合わせにおいて使用できる。かかる組成物は、治療的有効量の抗体と、生理的にまたは薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。かかる担体としては、生理食塩液、緩衝生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。投与形態に適合する形で処方を行うべきである。
Ｓ１００タンパク質の阻害剤またはアンタゴニストとして作用する、本明細書で定義される抗体は、単独で投与してもよく、または、限定されないが、他のＳ１００ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの他の補完的な目標を標的とする他の抗体との組み合わせで投与してもよい。
本開示に従い、炎症症状の治療のための方法および組成物が提供される。
【００１７】
骨髄関連タンパク質（ＭＲＰ）が炎症部位への好中球の遊走プロセスにおいて役割を果たすことを、本明細書において記載する。
抗体は、本明細書に包含されるポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患、障害または症状、例えば限定されないが、本明細書に記載の炎症性疾患、障害または症状の一つまたは複数の治療、阻害または予防に用いることができる。抗Ｓ１００タンパク質の発現および／または活性と関連する炎症性疾患、障害または症状の治療および／または予防には、限定されないが、それらの疾患、障害または症状と関連する徴候を緩和することが含まれる。抗Ｓ１００抗体は、当技術分野で公知のように、または本明細書に記載のように、薬学的に許容される組成物において提供することができる。
本明細書に記載の抗体を治療的に使用する方法をまとめると、局所的または全身的にＳ１００ポリペプチドと結合させること、または、例えば補体（ＣＤＣ）により、もしくはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介される該抗体の直接の細胞毒性を利用するもの、がありうる。これらの方法の幾つかを、以下にさらに詳細に記載する。
本明細書に包含される抗体は、他のモノクローナルもしくはキメラ抗体との、またはリンホカインとの組み合わせにより有利に利用できる。前記抗体は、単独で、または、他のタイプの治療剤（例えば放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与することができる。通常、患者の種と同じ種の起源または種の反応性（抗体の場合）を有する生成物の投与が好ましい。すなわち、好ましい実施形態では、ヒト抗体（断片、誘導体、アナログまたは核酸）が、治療または予防のために、ヒトまたは動物の患者に投与される。
【００１８】
本明細書に包含される、Ｓ１００ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、その断片または領域に対する、高親和性および／または強力なインビボ阻害および／または中和抗体を、Ｓ１００ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（その断片を含む）に関連する障害の治療のために用いるのが好ましい。かかる抗体（断片または領域）は、本明細書に包含されるＳ１００ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（その断片を含む）に対する親和性を好ましくは有する。
Ｓ１００ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性の阻害または低減は、免疫細胞の増殖、分化または動員（走化性）を阻害することにより、免疫系の疾患、障害および／または症状の治療に有用でありうる。これらの免疫疾患、障害および／または症状の病因は、遺伝子的である場合も、癌または一部の自己免疫疾患、障害および／または症状のように身体的である場合も、後天的である場合も（例えば化学療法または毒素による）または伝染的である場合もある。さらに、抗Ｓ１００  Ａｂは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーまたはディテクターとして用いることができる。
【００１９】
同様に、例えば喘息（特にアレルギー性喘息）などのアレルギー反応および症状、または他の呼吸系疾患は、Ｓ１００ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの阻害剤、またはＳ１００ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアンタゴニストにより、治療、予防および／または診断することができる。さらに、これらの分子を用いてアナフィラキシー、抗原分子に対する過敏症、または血液型不適合性を治療することができる。
Ｓ１００タンパク質の阻害は、Ｓ１００タンパク質の、結合部位またはそれにより活性化するあらゆる活性化部位に対して結合し、またはアクセスをブロックする抗体を用いて行うことができる。具体的には、結合部位または活性化部位は、多くの細胞に存在するＴＬＲ−２（Ｔｏｌｌ様受容体２）である。
【００２０】
Ｓ１００に対する抗体（すなわちＳ１００Ａ９）は、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患および感染症において、マクロファージおよびそれらの前駆体の、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球および一部のＴ細胞サブセット（活性化およびＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞）の、走化性および活性化を阻害するために使用できる。自己免疫疾患の例としては、慢性関節リウマチ、多発性硬化症およびインスリン依存型糖尿病が挙げられる。幾つかの感染症には、珪肺、サルコイドーシス、単核食細胞の漸増および活性化の防止により生じる特発性肺線維症、好酸球の産生および遊走の防止により生じる特発性高好酸球症候群、マクロファージの遊走の防止により生じるエンドトキシンショック、および本明細書に包含されるケモカインポリペプチドのそれらによる産生が含まれる。慢性的炎症の例としては、過剰カルプロテクチン血症および自己炎症性症候群が挙げられる。アンタゴニストを用いて動脈壁への単球の浸潤を防止することにより、アテローム硬化症を治療することもできる。
抗Ｓ１００  Ａｂを用いて、創傷領域への単球の誘引を防止することにより、炎症を治療することもできる。急性および慢性の炎症性肺疾患は、肺の単核食細胞の隔離と関連するため、それらは通常の肺マクロファージ集団の調整に用いることもできる。
抗Ｓ１００  Ａｂを用いて患者の関節液への単球の誘引を防止することにより、慢性関節リウマチを治療することもできる。好中球および単球の流入および活性化は、変性および炎症性関節症の病因において重要な役割を果たす。
抗Ｓ１００  Ａｂを用いて、ＩＬ−１およびＴＮＦに主に起因する有害なカスケードを妨害することができ、それにより他の炎症性サイトカインの生合成を防止する。このように、アンタゴニストは炎症の予防に使用できる。またアンタゴニストを用いて、Ｓ１００ケモカインにより誘導されるプロスタグランジンから独立した発熱を阻害することもできる。
【００２１】
あるいは、例えば限定されないがクローン病または潰瘍性大腸炎などの炎症を起こした部位での好中球遊走の下方調整に関係するＩＬ−１０との組み合わせで、抗Ｓ１００  Ａｂを用いることができる。
抗Ｓ１００  Ａｂを用いて、骨髄不全（例えば無形成性貧血および骨髄異形成症候群）のケースの治療を行うこともできる。あるいは、抗Ｓ１００  Ａｂを用いて移植片拒絶を治療または予防することができる。また抗Ｓ１００  Ａｂを用いて、肺への好酸球の蓄積の防止により喘息およびアレルギーを治療することもできる。アンタゴニストは、例えば後述するように、薬学的に許容される担体を有する組成物中で用いることができる。
特に本発明では、炎症症状の治療方法であって、それを必要とする被験者に、本明細書で定義される抗体または本明細書で定義される組成物を有効量で投与するステップを含む方法が提供される。
特に、炎症症状は、慢性関節リウマチ、喘息、痛風、Ｉ型糖尿病、クローン病、紅斑性狼蒼、多発性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、慢性炎、乾癬または癌転移から選択されうる。より具体的には、炎症症状は慢性関節リウマチである。他の実施形態では、炎症症状は慢性炎症性疾患である。慢性炎症性疾患には、限定されないが、化膿性関節炎、壊疽性膿皮症、無呼吸症候群、成人発症型スチル病および全身型若年性特発性関節炎が含まれる。
【００２２】
あるいは本発明では、免疫療法の方法であって、それを必要とする被験者に、本明細書で定義される抗体または本明細書で定義される組成物を有効量で投与するステップを含む方法が提供される。
代替的な実施形態では、本発明では、ＴＬＲ−２神経変性疾患の治療方法であって、それを必要とする被験者に、本明細書で定義される抗体または組成物を有効量で投与するステップを含む方法が提供される。特に、ＴＬＲ−２神経変性疾患は、パーキンソン病またはアルツハイマー病である。
あるいは本発明では、細胞、組織、器官または動物のＴＬＲ−２−関連症状を診断または治療する方法であって、それを必要とする前記細胞、組織、器官または動物に、本明細書で定義される抗体または組成物を有効量で投与するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、開示される疾患、障害または症状の一つまたは複数を治療するために、動物、好ましくは哺乳動物および最も好ましくはヒト患者に対し、Ｓ１００タンパク質に特異的な抗体を投与することを含む、抗体ベースの療法が提供される。
具体的には、本明細書で定義される抗体は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内または腹腔内に投与される。
【実施例】
【００２３】
（例１）マウスモノクローナル抗体６Ｂ４の産生
精製された３０μｇの組換え型Ｓ１００Ａ９を含む５０μｌの内毒素フリーのＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を、等体積の完全フロイントアジュバントと混合し、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢）にｉ．ｐ．注入して免疫化した。１４日後に、不完全フロイントアジュバントを用い、Ｓ１００Ａ９を注入して抗体反応を増強し、タンパク質のみにより２８日目に最終ブーストを行った。３１日目に、免疫されたマウスの脾臓細胞を、ＳＰ２マウス骨髄腫細胞と融合し、ヒポキサンチン／アメトプテリン／チミジン選択培地で培養した。
【００２４】
０．１Ｍ  炭酸緩衝剤（ｐＨ９．６）中の１μｇ／ｍｌの組換え型タンパク質でコーティングしたプレートを用い、ハイブリドーマの培養上清をＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。陽性のハイブリドーマ細胞を、限界希釈法によってクローニングした。ｍＡｂクローン６Ｂ４は、最も顕著な組換え型タンパク質Ｓ１００Ａ９の認識を示したものであり、またＩｇＧ１κとしてアイソタイプ同定された。６Ｂ４  ｍＡｂの特異性を、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット解析により確認した（図１および２）。
【００２５】
（例２）マウスモノクローナル抗体６Ｂ４のヒト化
相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフト化パラダイムの範囲内のインシリコモデリングを用いて、マウス６Ｂ４  ｍＡｂをヒト化した。マウス６Ｂ４モノクローナル抗体の可変領域の３次元モデリングのステップを実施した。
この作業は、ホモロジーモデリングによって実施した。マウス６Ｂ４可変配列に最も類似する鋳型構造を、ＰＤＢ（タンパク質データバンク）に対するＢＬＡＳＴ検索によって同定した。マウス６Ｂ４可変領域の最初のモデルを構築するため、鋳型構造（ＰＤＢコード）：軽鎖では１ＱＯＫ（鎖Ａ）および重鎖では１Ｉ３Ｇ（鎖Ｈ）を用いた。他の適切な鋳型は、軽鎖ではＰＤＢエントリー１ＳＹ６、３ＩＸＹ、２Ｗ９Ｄ、３ＮＣＹ、３Ｉ５０および１ＦＩＧ、重鎖ではＰＤＢエントリー１Ｈ８Ｓ、２ＮＴＦ、１ＣＩＣ、１Ｈ８Ｎおよび１Ｚ３Ｇに見出される。マウス６Ｂ４配列に基づき、これらの鋳型構造に、１ＱＯＫ軽鎖では１５の突然変異、１Ｉ３Ｇ重鎖では１８の突然変異、のように必要な突然変異を操作した。それぞれの鋳型構造の重鎖および軽鎖を重ね合わせることにより、マウス６Ｂ４可変ドメインの重鎖および軽鎖に対応する突然変異構造を、２鎖状の抗体構造として組立てた。組立てられた６Ｂ４可変ドメインの構造を最初に、ＡＭＢＥＲ力場によるエネルギー極小化、および、最初にＣＤＲループを弛緩させ、最終の段階においてようやくフレームワーク領域の主鎖の重い原子を完全に弛緩させる、制約の段階的解除によりリファインした。次に、各抗体可変ドメイン構造のＣＤＲ−Ｈ３ループを、Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ−極小化（ＭＣＭ）立体構造サンプリングによりリファインし、その際、ＣＤＲ−Ｈ３領域の上反角を各ＭＣＭサイクルにおいてサンプリングし、続いてＣＤＲ−Ｈ３ループの最初の立体構造の周辺１０Åの所定の領域のエネルギー極小化を行った。マウス６Ｂ４抗体のモデル化された可変領域を図３（左パネル、図５のアラインメントを参照）に表す。また、各６Ｂ４可変配列と最も類似するヒトまたはヒト化可変配列の構造をＰＤＢから同定し、マウス６Ｂ４可変ドメインのモデル化された構造に重ね合わせた。これらの構造には、軽鎖ではＰＤＢエントリー３ＮＦＰ、１ＡＤ０、３Ｌ５Ｘ、２Ｖ７Ｎおよび３ＧＩＺ、重鎖ではＰＤＢエントリー１Ｉ９Ｒ、３ＮＦＰ、１ＵＪ３、３ＧＫＷおよび１ＷＴ５が含まれる。これらの構造を用いて、フレームワーク領域の突然変異モデリングを支援し、モデル化されたマウスの３次元構造からのヒト化３次元構造の構築を行った。
【００２６】
マウス６Ｂ４アミノ酸配列およびモデル化された構造の特徴解析：
このステップを実施して、ヒト化インデックス、抗原接触傾向インデックスを推定し、ＣＤＲ、標準的残基、鎖間パッキング（ＶＨ／ＶＬ境界残基）、可変／定常領域パッキング（ＶＨ／ＣＨおよびＶＬ／ＣＬ境界残基）、非典型的なフレームワーク残基、潜在的ＮおよびＯグリコシル化部位、埋没する残基、バーニアゾーン残基およびＣＤＲ付近を詳細に解析した。インターネットで利用できるリソースおよびローカルソフトウェアを用いてこれらの特性を評価した。
マウスＣＤＲに対する最適なヒト軽鎖および重鎖フレームワークの選択：
このステップは、ヒト生殖細胞系データベース（ＶＢＡＳＥ）のローカルコピーに対して、他の配列ライブラリ（ＧｅｎｂａｎｋおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）に対して、ならびにヒトフレームワークのコンセンサス配列の組に対して、標準的な配列ホモロジー比較をすることにより実施した。ＢＬＡＳＴ検索を実施し、ＣＤＲループの長さをマッチさせつつ、（ＣＤＲを除去した）フレームワーク領域のみの最も高いホモロジーにマッチする配列を検索した。６Ｂ４抗体の軽鎖および重鎖として同定されたヒトフレームワークは、それぞれκ３およびｈ１クラスに対応する。これらのクラスのヒトコンセンサス配列に加え、６Ｂ４フレームワーク配列と最も類似するいくつかのヒト生殖細胞系フレームワーク配列が保存されていた（図５および６のアラインメント参照）。
【００２７】
復帰突然変異および様々なヒト化変異体の設計のための、フレームワーク残基の同定：
このステップは、対応するヒト配列に突然変異させるべきアミノ酸残基にフラグを立てる重要なステップであり、特に注意が必要である。これらの残基は、親和性を損失する場合には、マウス配列への復帰突然変異をすべき主要な候補を表わす。それは、標準型、ＣＤＲ−Ｈ３、バーニアゾーン、非典型的、ＣＤＲ付近（５Å以内）、鎖間パッキングおよびグリコシル化部位の残基のカテゴリーのうちの一つまたは複数の残基の同定に依存する。かかる残基は、直接または間接的に抗原結合部位および親和性に影響を及ぼしうる。抗原接触傾向インデックス、ならびにヒト生殖細胞系データベースにおける各位置のアミノ酸の出現も、特定の残基がマウス配列からヒト配列に安全に突然変異させることができるか否かを決定する際には極めて重要である。６Ｂ４抗体の軽鎖を、その提案されたヒト化フレームワークとして１００％ヒト化フレームワークとするには、２６の突然変異が必要である。６Ｂ４抗体の重鎖を、その提案されたヒト化フレームワークとして１００％ヒト化フレームワークとするには、１８の突然変異を必要とする。最もヒト化の度合いが高かった６Ｂ４配列は、それぞれの最も近いヒトフレームワークに対して９８．８％のヒト化度を示し（図５および６のアラインメント参照）、６Ｂ４−ＶＬ＿ヒト化−１（配列番号２）および６Ｂ４−ＶＨ＿ヒト化−１（配列番号２５）と表示する。さらに、慎重な構造的解析および配列比較解析に基づき、６Ｂ４マウス配列由来のいくつかの残基のうち、これらの位置に突然変異を導入した場合に抗原結合親和性が変化する確率が高い追加の残基が保存された、追加のヒト化配列も設計した。これらの配列を、６Ｂ４−ＶＬ＿ヒト化−２（配列番号２１）、６Ｂ４−ＶＬ＿ヒト化−３（配列番号２２）、６Ｂ４−ＶＬ＿ヒト化−４（配列番号２３）、６Ｂ４−ＶＨ＿ヒト化−２（配列番号４１）と表示する。４つのヒト化軽鎖および２つのヒト化重鎖配列から、８つのヒト化抗体を組立てることができる。
［配列表］
６Ｂ４  軽鎖（κ）ヒト化変異体１  （配列番号４２）
2019527212.tif 000003
６Ｂ４  軽鎖（κ）ヒト化変異体２  （配列番号４３）
2019527212.tif 000004
６Ｂ４  軽鎖（κ）ヒト化変異体３  （配列番号４４）
2019527212.tif 000005
６Ｂ４  軽鎖（κ）ヒト化変異体４  （配列番号４５）
2019527212.tif 000006
６Ｂ４  重鎖（Ｉｇｇ４）ヒト化変異体１  （配列番号４６）
2019527212.tif 000007
６Ｂ４  重鎖（Ｉｇｇ４）ヒト化変異体２  （配列番号４７）
2019527212.tif 000008
６Ｂ４  重鎖（Ｉｇｇ４）キメラ  （配列番号４８）
2019527212.tif 000009
シグナル配列は黒字（ヒト）
可変領域はイタリック（ヒト化またはマウス）
定常領域は太字（ヒト）
【００２８】
マウス６Ｂ４可変領域の３次元モデルからのホモロジーモデリングにより構築した、６Ｂ４−ＶＬ＿ヒト化−１（配列番号２）：６Ｂ４−ＶＨ＿ヒト化−１（配列番号２５）のペアの分子モデルを図３（右パネル）に表わす。
軽鎖６Ｂ４−ＶＬ＿ヒト化−２配列の場合（配列番号２１）、さらにマウス配列におけるフレームワーク残基Ｔｒｐ−Ｌ４７、Ｌｙｓ−Ｌ４５およびＶａｌ−Ｌ５８を保存したが、その理由は、残基Ｔｒｐ−Ｌ４７については、それがＣＤＲ−Ｌ２を支持するバーニアゾーンの部分であり、また、Ｌｅｕに対する突然変異がこのループの立体構造上の問題を含みうるからであり、また残基Ｌｙｓ−Ｌ４５およびＶａｌ−Ｌ５８については、それがＴｒｐ−Ｌ４７と直接接触し、またこの残基と共に突然変異させなければならない場合があるからである。残基Ｔｒｐ−Ｌ４７およびＶａｌ−Ｌ５８は埋没し、免疫原性を有するはずがない一方で、残基Ｌｙｓ−Ｌ４５はＣＤＲ−Ｈ３の付近に位置する。また、位置４５のＬｙｓおよび位置５８のＶａｌは、ヒトフレームワーク中に存在する。
【００２９】
軽鎖６Ｂ４−ＶＬ＿ヒト化−３配列（配列番号２２）は、６Ｂ４−ＶＬ＿ヒト化−２配列に基づいており、また、マウス残基Ａｓｎ−Ｌ６９およびＴｙｒ−Ｌ７１を導入するための２つの復帰突然変異が追加されているが、それらはＣＤＲ−Ｌ１を支持するバーニアゾーンの一部であり、Ｔｙｒ−Ｌ７１は部分的に埋没され、抗原結合性傾向を有している。
軽鎖６Ｂ４−ＶＬ＿ヒト化−４配列（配列番号２３）は、６Ｂ４−ＶＬ＿ヒト化−３（すなわちＳｅｒ−Ｌ４３およびＡｓｐ−Ｌ７０）に、さらに２つの復帰突然変異を追加したものである。位置７０の残基の突然変異は、ＣＤＲ−Ｌ１からあまり遠くない表面における総電荷を変化させる。残基Ｓｅｒ−Ｌ４３は、重鎖と接触する。位置４３のセリンは、ヒトフレームワーク中に存在する。
【００３０】
重鎖６Ｂ４−ＶＨ＿ヒト化−２配列の場合（配列番号４１）、フレームワーク残基Ｉｌｅ−Ｈ４８、Ａｌａ−Ｈ６７、Ｌｅｕ−Ｈ６９およびＶａｌ−Ｈ７１がさらに、マウス配列のものに保存されており、それはＣＤＲ−Ｈ２を支持する４つのバーニアゾーン残基に復帰させるものであって、ヒト化抗体の抗原結合親和性を維持するために幾つかの場合において重要であることが示されているものである。なお、これらの残基は全て埋没するものであり、位置７１のＶａｌはヒトフレームワークに存在する。
ヒト化変異体に対応する全ての復帰突然変異のまとめおよびクローズアップを、表１および図４に示す。
【００３１】
【表１】
2019527212.tif 000010
（例３）抗Ｓ１００Ａ９モノクローナル抗体クローン６Ｂ４により認識されるエピトープの局在化
ヒトＳ１００Ａ９タンパク質の３つの領域、すなわちＮ末端、ヒンジおよびＣ末端を選抜し、エピトープマッピングを開始した。配列を以下の通り示す：
ヒトＳ１００Ａ９の完全配列
2019527212.tif 000011
領域の配列
2019527212.tif 000012
ドットブロットを最初に実施し、これらのＳ１００Ａ９の領域を認識するｍＡｂ  ６Ｂ４の能力を検証した。簡潔には、１μｇの組換え型Ｓ１００Ａ９またはＳ１００Ａ８（ネガティブコントロール）、ならびに１０および５０μｇのＳ１００Ａ９ペプチドをＰＶＤＦ膜に堆積した。膜を乾燥させ、次に、穏やかに振とうさせながら室温で３０分間ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ／ミルク５％でブロッキングし、１μｇ／ｍｌの６Ｂ４  ｍＡｂにより室温で１時間標識した。ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで膜を十分に洗浄し、次に穏やかに振とうさせながら室温で１時間、ブロッキング緩衝剤中のヤギ抗マウス抗体（１／２００００）で標識させた。次に膜を十分に洗浄し、製造業者（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）の説明書に従い、強化された化学発光（ＥＣＬ）により可視化した。
【００３２】
次に、Ｃ末端領域を下記の通り７つのペプチドに分割した。
2019527212.tif 000013
上記の通りドットブロットを実施し、Ｃ末端部分のどの領域が６Ｂ４によって認識されるかを検証した（図７および８）。
【００３３】
次に、ドットブロットアッセイの結果をダイレクトＥＬＩＳＡにより確認した。簡潔に述べると、０．１ＭのＮａＨＣＯ3（ｐＨ９．６）中、ペプチドを漸増濃度にて、９６ウェル高結合型プレートに載置し、４℃で一晩置いた。プレートをＰＢＳ１×／０．１％Ｔｗｅｅｎで十分洗浄し、室温でＰＢＳ１×／０．１％Ｔｗｅｅｎ／２％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。３回の洗浄後、２μｇ／ｍｌの６Ｂ４を含有する１００μｌの溶液をウェルに添加し、室温で１時間置いた。プレートを洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（１／１００００）を含有する溶液１００μｌをウェルに添加し、室温で１時間置いた。プレートを洗浄し、製造業者の説明書に従い、ＨＲＰ基質（ＴＭＢＳ）を添加することにより検出した。Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止させ、蛍光分光光度計を用いて４５０ｎｍで測定した（図９）。
このように、Ｓ１００Ａ９に対するｍＡｂは、図１０に示すようにＣ７ペプチドと結合する。図１６に示すように、ブロック用ウサギｍＡｂは、Ｓ１００Ａ９のヒンジ領域またはＣ末端ペプチドを認識する。ｍＡｂ  １Ｂ５および７Ａ８は、Ｓ１００Ａ９のＣ末端領域と結合する。ｍＡｂ  ６Ｃ１はヒンジ領域に結合する。
より具体的には、ｍＡｂ  １Ｂ５および７Ａ８は、Ｓ１００Ａ９のＣ末端領域の最後の１０アミノ酸と結合する（ペプチドＣ７、図１７を参照）。
【００３４】
次に、Ｃ６およびＣ７領域を、下記の通り小型のペプチドに分割し、６Ｂ４  ｍＡｂの結合エピトープの決定を行った。
2019527212.tif 000014
【００３５】
次に、６Ｂ４  ｍＡｂの結合にとって必須のアミノ酸の決定を行った。選択したアミノ酸をアラニンで置換したペプチドを設計した。図１１に示すように、Ｌ１０９、Ｇ１１０、Ｔ１１３、また程度は低いがＥ１１１およびＰ１１４は、６Ｂ４のＳ１００Ａ９のＣ末端領域に局在化するエピトープへの結合において重要であった。図１２は、アラニンによるＰ１０７の置換が６Ｂの結合を増加させた一方で、Ｇ１０８およびＧ１１２は６Ｂ４の結合にとって必須でないことを示す。
その結果、エピトープ配列を以下の通りと決定した：ＰＧＬＧＥＧＴＰ（配列番号６７）、必須アミノ酸を太字で、結合を制限するアミノ酸をイタリックで示す。これに基づき、ヒト化６Ｂ４抗体が、以下に示しうるＳ１００Ａ９分子上のユニークなエピトープを認識することが決定されうる：ＬＧｘｘＴｘ（配列番号７０）、ＬＧＥｘＴＰ（配列番号７１）、またはＰＧＬＧＥｘＴＰ（配列番号７２）。
図１３に示すように、ヒト化６Ｂ４は、Ｓ１００Ａ９およびそのＣ末端領域を認識する同様の能力を有する。
【００３６】
（例４）抗Ｓ１００Ａ９抗体はＴＬＲ−２受容体の活性化をブロックする：
ＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ（商標）細胞（１×１０5）を、３７℃で１０分間、Ｆｃブロック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で前処理した。次に細胞を、１０μｇ／ｍｌの抗ＴＬＲ２、抗ＴＬＲ４、抗ＲＡＧＥ抗体、またはそれぞれのアイソタイプコントロールの有無において、漸増濃度のＳ１００Ａ８またはＳ１００Ａ９と共に２４時間インキュベートした。次に細胞を遠心分離し、上清を回収し、Ｑｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（商標）と共にインキュベートしたが、それはアルカリホスファターゼの分泌の存在する場合に紫色に変化する。分泌されたアルカリホスファターゼのレベルを、６５０  ｎｍで分光測定した。
【００３７】
最初に、ＴＬＲ２に対するＳ１００Ａ９の結合を、ＴＬＲ４およびＲＡＧＥ（これらのタンパク質の２つの推定受容体）と比較した。ＴＬＲ２、ＴＬＲ４またはＲＡＧＥに対する抗体（１００μｇ／ｍｌ）の有無において、ＴＨＰ１−Ｘｂｌｕｅ細胞を１０μｇ／ｍｌのＳ１００Ａ９により刺激した。抗ＲＡＧＥは、ＴＨＰ−１ｂｌｕｅ細胞の刺激を阻害しなかったが、抗ＴＬＲ４は、レポーター遺伝子であるアルカリホスファターゼの発現を幾らか阻害した（図１４）。対照的に、抗ＴＬＲ２は、Ｓ１００Ａ９に応答して、アルカリホスファターゼの分泌を約５０％減少させた。抗体と刺激剤との比を１０：１に増加し、細胞の刺激に用いたとき（１μｇ／ｍｌのＳ１００Ａ９、図１５）、この阻害は８５％超に増加した。予想通りに、４０μｇ／ｍｌより低い濃度のＳ１００Ａ１２では、ＴＨＰ１−Ｘｂｌｕｅ細胞は刺激されなかった。これらの結果は、ＴＬＲ２がＳ１００Ａ９の主要な受容体であることを示す。
【００３８】
本開示をその特定の実施形態に関連して記載したが、それはさらに修飾することができ、また、本願が本発明のいかなるバリエーション、使用または適宜調整をも網羅するものであることが理解され、そのような本開示からの変更形態としては、公知の範囲内での、または本発明に関連する技術における慣習的実施の範囲内での変形、また上記の基本的特徴に適用されうる変形、また添付の特許請求の範囲内での変形が含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月15日(2019.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１００９ＡとＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）との間の相互作用を特異的にブロックする、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の阻害剤。
【請求項２】
Ｓ１００Ａ９タンパク質のエピトープと特異的に結合する抗体である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
前記Ｓ１００Ａ９タンパク質のＴＬＲ２への結合を阻害するのに適する、請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項４】
抗Ｓ１００Ａ９抗体である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項５】
前記抗Ｓ１００Ａ９抗体がマウス抗体またはヒト化抗体である、請求項４に記載の阻害剤。
【請求項６】
前記抗体が、Ｓ１００Ａ９タンパク質のＣ末端領域またはヒンジ領域と結合するエピトープを含む、請求項４または５に記載の阻害剤。
【請求項７】
前記抗体が、Ｓ１００Ａ９タンパク質のＣ末端領域の最後の１０アミノ酸と結合するエピトープを含む、請求項４から６までのいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項８】
前記抗体が、ＬＧｘｘＴｘ（配列番号７０）、ＬＧＥｘＴＰ（配列番号７１）、ＰＧＬＧＥｘＴＰ（配列番号７２）またはＰＧＬＧＥＧＴＰ（配列番号６７）として定義されるＳ１００Ａ９分子上のユニークなエピトープを認識する、請求項４から７までのいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項９】
前記抗体が、配列番号２、２１、２２、２３、２５および４１からなる群から選択される鎖を含む、請求項５に記載の阻害剤。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の阻害剤。
【請求項１１】
配列番号２、２１、２２、２３、２５、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項１２】
請求項１から１０までのいずれか１項に記載の阻害剤、または請求項１１に記載の抗体を含む組成物。
【請求項１３】
炎症症状を治療するための、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記炎症症状が、慢性関節リウマチ、喘息、痛風、Ｉ型糖尿病、クローン病、紅斑性狼蒼、多発性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、慢性炎、乾癬および癌転移からなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記炎症症状が、慢性炎症性疾患である、請求項１３に記載の組成物。
【国際調査報告】
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