(57)【要約】  本開示は、新規抗ＣＤ４０抗体、前記新規抗体を含有する組成物、前記抗体をコードする核酸、及びそれらの製造方法と使用方法を提供する。
2019523221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）３個のＣＤＲを含むＶＨ鎖と、（ｉｉ）３個のＣＤＲを含むＶＬ鎖を含む抗ＣＤ４０抗体又は結合断片であって、ＶＨＣＤＲ＃１が、
【化１】
2019523221.tif 000021
から選択され、ＶＨＣＤＲ＃２が、
【化２】
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から選択され、ＶＨＣＤＲ＃３が、
【化３】
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から選択され、ＶＬＣＤＲ＃１が、
【化４】
2019523221.tif 000024
から選択され、ＶＬＣＤＲ＃２が、
【化５】
2019523221.tif 000025
から選択され、ＶＬＣＤＲ＃３が、
【化６】
2019523221.tif 000026
から選択される前記抗ＣＤ４０抗体又は結合断片。
【請求項２】
配列番号８、１８、３５、５８、６８及び８８の配列を有するＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗ＣＤ４０抗体又は結合断片。
【請求項３】
ヒト型又はヒト化型である、請求項１に記載の抗ＣＤ４０抗体又は結合断片。
【請求項４】
配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２又は１２３のいずれか１種に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０又は１７１のいずれか１種に対応する配列のＶＬ鎖を含む、請求項１に記載の抗ＣＤ４０抗体又は結合断片。
【請求項５】
配列番号１１７の配列に対応するＶＨ鎖と、配列番号１７０の配列に対応するＶＬ鎖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又は結合断片。
【請求項６】
ＩｇＧであり、任意にＩｇＧ１である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又は結合断片。
【請求項７】
ＩｇＧ１であり、アミノ酸置換Ｖ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙを含む変異型ＣＨ２領域を含む、請求項６に記載の抗ＣＤ４０抗体。
【請求項８】
ＩｇＧ１であり、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを含む変異型Ｆｃ領域を含む、請求項６又は７に記載の抗ＣＤ４０抗体。
【請求項９】
κ軽鎖定常領域を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体。
【請求項１０】
配列番号１３０〜１３５のいずれか１種の重鎖配列と、配列番号１４０〜１４２のいずれか１種の軽鎖配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体。
【請求項１１】
配列番号１３０又は１３１の重鎖配列と、配列番号１４０の軽鎖配列を有する、請求項１０に記載の抗ＣＤ４０抗体。
【請求項１２】
配列番号１３２又は１３３の重鎖配列と、配列番号１４１の軽鎖配列を有する、請求項１０に記載の抗ＣＤ４０抗体。
【請求項１３】
配列番号１３２又は１３３の重鎖配列と、配列番号１４２の軽鎖配列を有する、請求項１０に記載の抗ＣＤ４０抗体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又は結合断片と、薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項１５】
がんの治療方法であって、がんの治療を必要とする患者に請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体もしくは結合断片又は請求項１４に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又は結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターで形質転換された原核宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１７に記載のベクターで形質転換された真核宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１６に記載の核酸を発現するように操作された真核宿主細胞。
【請求項２１】
哺乳動物宿主細胞である、請求項２０に記載の真核宿主細胞。
【請求項２２】
抗ＣＤ４０抗体又はその結合断片の作製方法であって、（ａ）請求項１９又は２０に記載の宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）前記抗体又は結合断片を回収する工程を含む前記方法。
【請求項２３】
免疫系の活性化方法であって、免疫系の活性化を必要とする患者に、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体もしくは結合断片又は請求項１４に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願とのクロスリファレンス
本願は３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、２０１６年５月２７日付け米国仮出願第６２／３４２，４１７号の優先権を主張し、その開示内容全体を本願に援用する。
【０００２】
２．配列表
本願はＡＳＣＩＩフォーマットの電子形式で提出された配列表を含み、その全体を本願に援用する。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１７年５月１７日に作成され、ファイル名３８１４９３−２８５ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズ１０８，６７０バイトである。
【０００３】
３．技術分野
本願は特に、新規抗ＣＤ４０抗体、前記新規抗体を含有する組成物、前記抗体をコードする核酸、及びそれらの製造方法と使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
４．背景
がん治療法には外科手術、放射線療法及び化学療法をはじめとする広範な治療アプローチがある。これらの種々のアプローチにより、医師はがんを治療するために幅広い治療選択肢があるが、既存の治療法は、正常・健常細胞に優先してがん細胞を標的とする選択性を欠いていたり、がんが治療耐性を獲得する等の多数の欠点がある。
【０００５】
標的治療に基づく最近のアプローチは、がん細胞の細胞プロセスを正常細胞よりも優先的に妨害するものであり、放射線治療等の非標的療法に比較して副作用の少ない化学療法レジメンが得られるようになった。
【０００６】
既存の標準治療を補完するための有望な治療アプローチとしてがん免疫療法が出現し、特に、がん細胞の増殖を防ぐため又はがん細胞を死滅させるために宿主の免疫系のＴ細胞を活性化させる薬剤が開発されている。例えばＭｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２７，４３９−４４９（２０１５）参照。このような免疫療法アプローチとしては、免疫系を調節してがん細胞を死滅させるために使用される抗体が開発されている。例えば、切除不能又は転移性メラノーマや転移性非小細胞肺がん等の疾患を治療するために抗ＰＤ−１阻害抗体であるペムブロリズマブ（キイトルーダ（Ｒ））とニボルマブ（オプジーボ（Ｒ））とが米国とＥＵで開発されている。ＣＴＬＡ−４等の免疫抑制タンパク質を阻害するために研究が重ねられ、トレメリムマブ及びイピリムマブ（ヤーボイ（Ｒ））等の抗ＣＴＬＡ−４抗体が開発・臨床評価されるに至っている。
【０００７】
しかし、既存の標準治療を補完するための代替アプローチと追加的ながん治療法とが依然として必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２７，４３９−４４９（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
５．概要
ヒトＣＤ４０（配列番号４０）はＢ細胞、樹状細胞（ＤＣ）及び単球等の抗原提示細胞と、ある種の腫瘍細胞を含む非免疫細胞で発現される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーメンバー（ＴＮＦスーパーファミリーメンバー５）である。ヒトＣＤ４０リガンド（配列番号４１）により活性化されると、ヒトＣＤ４０は抗原提示細胞を活性化させ、自然免疫系と適応免疫系の双方から応答を誘導する。免疫系に腫瘍細胞の増殖を防止させ、及び／又は腫瘍細胞を死滅させ、その結果として固形腫瘍の有効な治療を提供するために、アゴニストＣＤ４０剤を使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示はヒトＣＤ４０（配列番号４０）と特異的に結合する抗ＣＤ４０抗体及びその結合断片を提供する。代表的な抗ＣＤ４０抗体の重鎖及び軽鎖の代表的なＣＤＲのアミノ酸配列と、ＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列については、後述する詳細な説明の欄に記載する。
【００１１】
本願に記載する抗ＣＤ４０抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）とＣＤ４０との結合相互作用と競合せずにＣＤ４０Ｌの存在下又は不在下でヒトＣＤ４０を活性化させることができる、アロステリックアゴニスト受容体応答を生じる。更に、本願の抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０と相互作用することにより、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の結合を強化することができる。
【００１２】
前記抗ＣＤ４０抗体は、当分野で公知の通り、半減期の延長、ＡＤＣＣの増減、又はアゴニスト活性の上昇等の抗体の特性を変化させる改変及び／又は突然変異を含むことができる。
【００１３】
本願は、本開示の抗ＣＤ４０抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び核酸を含むベクターも提供する。本願は更に、開示する抗ＣＤ４０抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された原核及び真核宿主細胞、及び前記ヌクレオチド配列を発現するように人工的に操作された真核（例えば哺乳動物）宿主細胞も提供する。宿主細胞を培養して抗体を回収することにより抗体を作製する方法も提供し、後述する詳細な説明の欄に詳細に説明する。
【００１４】
別の態様において、本開示は、本願に記載する抗ＣＤ４０抗体を含有する組成物を提供する。前記組成物は、一般に１種以上の本願に記載するような抗ＣＤ４０抗体及び／又はその塩と、１種以上の賦形剤、担体又は希釈剤を含有する。
【００１５】
本開示は、固形腫瘍を有すると診断されたヒト対象等の対象を抗ＣＤ４０抗体で治療する方法を提供する。前記方法は、一般に、治療効果を提供するために有効な量の本願に記載する抗ＣＤ４０抗体を前記対象に投与することを含む。前記対象は、多数の固形腫瘍のいずれか１種をもつと診断されればよく、新規に診断されたものでもよいし、再発でもよいし、再発・難治性でもよい。抗ＣＤ４０抗体は一般的に静脈内輸液又は腫瘍内注射として約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。抗ＣＤ４０抗体は一般的に静脈内輸液又は腫瘍内注射として１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、又は８週間に１回投与される。
【００１６】
前記抗ＣＤ４０抗体は、単独治療剤（単剤療法）として投与してもよいし、必ずしもそうでなくてもよいが、一般的には固形腫瘍の治療に使用されるものである他の治療剤の補助薬として投与してもよい。治療剤は、一般的に、その承認されている用量、投与経路及び投与頻度で使用されるが、用量を減らして使用してもよい。
【００１７】
抗ＣＤ４０抗体は、種々の投与経路又は投与方式で投与することができ、限定されないが、静脈内輸液及び／又は注射、皮下注射、並びに腫瘍内注射が挙げられる。投与量は当分野で周知の通り、投与経路、投与スケジュール、治療するがんの種類、治療するがんのステージ、及び患者の年齢や体重等の他のパラメーターにより異なる。治療効果を提供すると予想される特定の代表的な投与スケジュールについては、詳細な説明の欄に記載する。
【発明の効果】
【００１８】
本願に提示するデータによると、本願に記載する抗ＣＤ４０抗体は、固形腫瘍をもつと診断された対象に治療効果を提供すると予想される。
【００１９】
６．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ヒトＣＤ４０受容体（配列番号４０）及びヒトＣＤ４０リガンド（配列番号４１）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｇは、代表的なマウス及びヒト化抗ＣＤ４０抗体の、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。図２Ａは、ｍｕＡｂ１〜ｍｕＡｂ３のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｇは、代表的なマウス及びヒト化抗ＣＤ４０抗体の、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。図２Ｂは、ｍｕＡｂ４〜ｍｕＡｂ７のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｇは、代表的なマウス及びヒト化抗ＣＤ４０抗体の、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。図２Ｃは、ｍｕＡｂ８〜ｍｕＡｂ１０のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｇは、代表的なマウス及びヒト化抗ＣＤ４０抗体の、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。図２Ｄは、ｍｕＡｂ６及びｍｕＡｂ８のヒト化抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｅ】図２Ａ〜２Ｇは、代表的なマウス及びヒト化抗ＣＤ４０抗体の、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。図２Ｅは、ｍｕＡｂ８及びｍｕＡｂ９のヒト化抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示し、
【図２Ｆ】図２Ａ〜２Ｇは、代表的なマウス及びヒト化抗ＣＤ４０抗体の、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。図２Ｆは、ｍｕＡｂ９の他のヒト化抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｇ】図２Ａ〜２Ｇは、代表的なマウス及びヒト化抗ＣＤ４０抗体の、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。図２Ｇは、ｍｕＡｂ９の更に他のヒト化抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示す。
【図３】ヒトＣＤ４０におけるＣＤ４０Ｌと代表的な抗ＣＤ４０抗体との間の競合実験の結果を示す。左上はＣＤ４０Ｌと競合する代表的な抗ＣＤ４０抗体を示し、右上はＣＤ４０Ｌと有位に競合しない抗体を示し、左下はＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用を強化する抗体を示し、右下は抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ９Ａ２ＩとＣＰ−８７０，８９３の結果を示す。ｙ軸は６５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を表し、ｘ軸は抗体用量（「試料」）をμｇ／ｍＬで表す。
【図４】抗体ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ、ＣＰ−８７０，８９３、ヒトＩｇＧ１（「ｈｕＩｇＧ１」）アイソタイプ又はヒトＩｇＧ２（「ｈｕＩｇＧ２」）アイソタイプの量を増加させながら、ヒトＣＤ４０Ｌを発現するＪｕｒｋａｔ細胞に蛍光色素で標識したヒトＣＤ４０を１μｇ／ｍＬの一定濃度で加えた場合の結合を示す。ｙ軸は結合に相当する平均蛍光強度（「ＭＦＩ」）を表し、ｘ軸は抗体用量（「試料」）をμｇ／ｍＬで表す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｂは、ＨＥＫ２９３  ｂｌｕｅ  ＣＤ４０  ＮＦκＢレポーター細胞とＪｕｒｋａｔ  Ｄ１．１細胞との混合物（１：１比）からのＮＦκＢシグナルに及ぼす３μｇ／ｍＬの抗体用量（「試料」）又は培地のみの影響を示す。ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ、ＣＰ−８７０，８９３、ヒトＩｇＧ１（「ｈｕＩｇＧ１」）アイソタイプもしくはヒトＩｇＧ２（「ｈｕＩｇＧ２」）アイソタイプの各抗体又は培地のみを個々の試料に加えた。図５ＡはＣＤ４０Ｌ陰性（「ＣＤ４０Ｌ−」）Ｊｕｒｋａｔ  Ｄ１．１細胞を含む培養液中のＮＦκＢシグナルを示す。ｙ軸は６２５ｎｍにおけるＯＤを表し、ｘ軸は抗体又は培地のみの処理（「試料」）を表す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５ＢはＨＥＫ２９３  ｂｌｕｅ  ＣＤ４０  ＮＦκＢレポーター細胞とＪｕｒｋａｔ  Ｄ１．１細胞との混合物（１：１比）からのＮＦκＢシグナルに及ぼす３μｇ／ｍＬの抗体用量（「試料」）又は培地のみの影響を示す。ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ、ＣＰ−８７０，８９３、ヒトＩｇＧ１（「ｈｕＩｇＧ１」）アイソタイプもしくはヒトＩｇＧ２（「ｈｕＩｇＧ２」）アイソタイプの各抗体又は培地のみを個々の試料に加えた。図５ＢはＣＤ４０Ｌ陽性（「ＣＤ４０Ｌ＋」）Ｊｕｒｋａｔ  Ｄ１．１細胞を含む培養液中のＮＦκＢシグナルを示す。ｙ軸は６２５ｎｍにおけるＯＤを表し、ｘ軸は抗体又は培地のみの処理（「試料」）を表す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６ＢはＣＤ１６Ｆ、ＣＤ１６Ｖ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ又はＣＤ６４を発現するＣＨＯ細胞に、野生型ｈｕＩｇＧ１を示すｈｕＡｂ９−５、又はＶ２７３ＹもしくはＶ２７３Ｅ変異を示すｈｕＡｂ９−５、又はＣＰ−８７０，８９３をμｇ／ｍＬで表した抗体用量（「試料」）で加えた場合の結合を示す。図６ＡはＣＤ１６Ｆ（左上）、ＣＤ１６Ｖ（右上）、ＣＤ３２ａ（左下）又はＣＤ３２ｂ（右下）を発現するＣＨＯ細胞と抗ＣＤ４０抗体との結合を示す。ｙ軸は結合に相当する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表し、ｘ軸は抗体用量（「試料」）をμｇ／ｍＬで表す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６ＢはＣＤ１６Ｆ、ＣＤ１６Ｖ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ又はＣＤ６４を発現するＣＨＯ細胞に、野生型ｈｕＩｇＧ１を示すｈｕＡｂ９−５、又はＶ２７３ＹもしくはＶ２７３Ｅ変異を示すｈｕＡｂ９−５、又はＣＰ−８７０，８９３をμｇ／ｍＬで表した抗体用量（「試料」）で加えた場合の結合を示す。図６ＢはＣＤ６４を発現するＣＨＯ細胞と抗ＣＤ４０抗体との結合を示す。ｙ軸は結合に相当する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表し、ｘ軸は抗体用量（「試料」）をμｇ／ｍＬで表す。
【図７】野生型ヒトＩｇＧ１を示すｈｕＡｂ９−５と比較して、ＲＬ細胞における抗体ｈｕＡｂ９−５の定常領域変異体Ｖ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙの抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を示す。ｙ軸はＲＬ細胞における細胞傷害活性百分率を表し、ｘ軸は抗体用量（「試料」）をμｇ／ｍＬで表す。
【図８】野生型ヒトＩｇＧ１又は定常領域変異Ｖ２７３ＥもしくはＶ２７３Ｙを示す抗体ｈｕＡｂ６−１（左上）、ｈｕＡｂ９−５（左下）及びｈｕＡｂ８−１（右上）がＢ細胞増殖に及ぼす効果を示す。右下グラフはヒトＩｇＧ１Ｖ２７３Ｅ変異を含むｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ又はＣＰ−８７０，８９３のＢ細胞増殖効果を示す。ｙ軸はＢ細胞増殖を毎分カウント数（ＣＰＭ）で表し、ｘ軸は抗体用量（「試料」）をμｇ／ｍＬで表す。
【図９】野生型ヒトＩｇＧ１又は定常領域変異Ｖ２７３ＥもしくはＶ２７３Ｙを示す抗体ｈｕＡｂ６−１（左上）、ｈｕＡｂ９−５（左下）及びｈｕＡｂ８−１（右上）が樹状細胞（ＤＣ）活性化に及ぼす効果をＩＬ−１２ｐ７０産生量（ｐｇ／ｍＬ）により測定した結果を示す。右下グラフはヒトＩｇＧ１Ｖ２７３Ｅ変異を示すｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ又はＣＰ−８７０，８９３のＤＣ活性化を示す。ｙ軸はＩＬ−１２ｐ７０をｐｇ／ｍＬで表し、ｘ軸は抗体用量（「試料」）をμｇ／ｍＬで表す。
【図１０】ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ８−１又はｈｕＡｂ９−５のＶ２７３Ｙ変異体がＤＣとＴ細胞の共培養に及ぼす効果をインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生量（ｐｇ／ｍＬ）により測定した結果を示す。
【図１１】抗体ｈｕＡｂ６−１（上段）、ｈｕＡｂ９−５（中段）又はｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ（下段）がＰＣ３予防試験マウスモデルにおける腫瘍体積（ｍｍ３）に及ぼす効果を示す。
【図１２】両側に作製したＣＴ２６同系腫瘍をもつマウスモデルにおける抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０又はｍＩｇＧ１アイソタイプの腫瘍内（ＩＴ）又は腹腔内（ＩＰ）送達後のインビボ効果を示す。一方の脇腹の一方の腫瘍にＩＴ投与し、他方の脇腹の腫瘍には注射しなかった。
【図１３】０．６ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体、又は１Ｃ１０と抗ＰＤ−１抗体の併用をＣＴ２６同系マウスモデルに週２回投与後の腫瘍体積（ｍｍ３）に及ぼす効果を示す。
【図１４】抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０（「抗ＣＤ４０」）、抗ＰＤ−１抗体（「抗ＰＤ−１」）又は併用（「抗ＣＤ４０＋抗ＰＤ−１」）をＣＴ２６同系マウスモデルに投与してから２４時間後のＡＬＴ（左上）、ＴＮＦα（「ＴＮＦａ」、左下）又はＩＬ−６（右下）濃度を示す。右上グラフは投与から４日後の脾臓重量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
７．詳細な説明
本開示は、ヒトＣＤ４０（配列番号４０）と特異的に結合する抗体及び断片、前記抗体を含有する組成物、抗ＣＤ４０抗体をコードするポリヌクレオチド、前記抗体を産生することが可能な宿主細胞、前記抗体及び結合断片の作製に有用な方法及び組成物、並びにこれらの種々の使用方法に関する。
【００２２】
当業者に自明の通り、抗体は、本質的に「モジュール」構成である。本開示の随所で前記抗体を構成する種々の「モジュール」の種々の特定の実施形態について記載する。特定の非限定的な例として、ＶＨＣＤＲ、ＶＨ鎖、ＶＬＣＤＲ及びＶＬ鎖の種々の特定の実施形態について記載する。特定の実施形態の全てを相互に組合せることができるものとし、個々の特定の組合せを個別に明記しているものとみなす。
【００２３】
７．１．略号
本願に記載する抗体、結合断片、ＡＤＣ及びポリヌクレオチドは、多くの実施形態では夫々のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列により説明する。特に指定しない限り、ポリペプチド配列はＮ→Ｃ方向に記載し、ポリヌクレオチド配列は５’→３’方向に記載する。ポリペプチド配列については、下表１に記載するように、遺伝子にコードされるアミノ酸の従来の３文字又は１文字略号を使用する場合もある。
【００２４】
【表１】
2019523221.tif 000003
【００２５】
所定の配列については、所定の分類（例えば脂肪族、疎水性等）に属するアミノ酸残基を表す構造式により定義する。遺伝子にコードされるアミノ酸が属する分類として、本願で使用する種々の分類を下表２に示す。アミノ酸によっては２分類以上に属するものもある。スルフヒドリル基を含むシステインと、コンフォメーションが制限されているプロリンは分類に帰属しない。
【００２６】
【表２】
2019523221.tif 000004
【００２７】
本願に開示する種々の代表的な抗体に使用する略号を下表３に示す。
【００２８】
【表３】
2019523221.tif 000005
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【００２９】
７．２．定義
本願で特に定義しない限り、本開示に関連して使用する科学技術用語は、当分野における通常の知識をもつ者に広く理解されている意味とする。
【００３０】
７．３．抗ＣＤ４０抗体及び結合断片
１態様において、本開示は、ヒトＣＤ４０受容体（別称、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５、ＴＮＦＲＳＦ５、Ｂｐ５０及びＣＤ４０Ｌ受容体）と特異的に結合する抗体及び／又はその結合断片に関する。
【００３１】
本願で使用する「抗体（Ａｂ）」なる用語は、特定の抗原（ここではＣＤ４０）と特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。所定の実施形態において、本開示の抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＣＤ４０と結合することにより、免疫系を調節する（例えば活性化させる）。その結果として生じる免疫系応答は、腫瘍細胞等の細胞の増殖を抑制し、場合により、腫瘍細胞に対して細胞傷害性である。本開示の抗ＣＤ４０抗体は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との両方に相補性決定領域（ＣＤＲ）（別称、超可変領域）を含む。可変領域のうちで特に高度に保存された部分をフレームワーク（ＦＲ）と呼ぶ。当分野で公知の通り、抗体の超可変領域を区切るアミノ酸位置／境界は、文脈と当分野で公知の種々の定義とに応じて変動し得る。可変領域内の所定の位置は、ある基準下では超可変領域内にあるとみなすことができるが、別の基準下では超可変領域外にあるとみなされるという意味で、ハイブリッド超可変位置とみなすことができる。これらの位置の１個以上が拡大超可変領域に存在する場合もある。本開示はこれらのハイブリッド超可変位置に改変を含む抗体を提供する。天然重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々主にβシート構造をとることによりＦＲ領域４個を含み、これらを３個のＣＤＲにより相互に連結してループを形成し、βシート構造を相互に連結し、場合によってはその一部を形成する。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域により相互に近接して保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に、抗体の標的結合部位の形成に寄与する。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７）参照。本願で使用する免疫グロブリンアミノ酸残基のナンバリングは、特に指定しない限り、Ｋａｂａｔらの免疫グロブリンアミノ酸残基ナンバリングシステムに従う。
【００３２】
本開示の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子工学により作製された抗体及び／又は他の方法で本質的に改変された抗体とすることができ、限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、一本鎖抗体等が挙げられる。種々の実施形態において、前記抗体は、ある抗体の定常領域の全部又は一部を含む。所定の実施形態において、前記定常領域は、ＩｇＡ（例えばＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）、及びＩｇＭから選択されるアイソタイプである。特定の実施形態において、本願に記載する抗ＣＤ４０抗体は、ＩｇＧ１を含む。他の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、ＩｇＧ２を含む。更に他の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、ＩｇＧ４を含む。本願で使用する抗体の「定常領域」は、ヒトＩｇＧ１の天然定常領域、アロタイプ又は天然変異体（例えばＤ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍ、又はＡ４３１Ｇ）を含む。例えばＪｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，ＭＡｂｓ，１（４）：３３２−３３８（Ｊｕｌ−Ａｕｇ  ２００９）参照。
【００３３】
抗ＣＤ４０抗体の軽鎖定常領域は、軽鎖カッパ（κ）領域でもラムダ（λ）領域でもよい。軽鎖λ領域は、公知サブタイプのいずれか１種、例えばλ１、λ２、λ３又はλ４とすることができる。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、軽鎖カッパ（κ）領域を含む。
【００３４】
本願で使用する「モノクローナル抗体」なる用語は、ハイブリドーマ技術により作製される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当分野で利用可能であるか又は公知の任意の手段により、任意の真核クローン、原核クローン又はファージクローンを含む単一クローンから得られる。本開示で有用なモノクローナル抗体は、当分野で公知の多種多様な技術を使用して作製することができ、ハイブリドーマ技術、組換え技術及びファージディスプレイ技術、又はその組合せの使用が挙げられる。ヒトにおける抗ＣＤ４０抗体のインビボ使用を含む本開示の多くの用途では、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を適切に使用することができる。
【００３５】
本願で使用する「キメラ」抗体なる用語は、ラット又はマウス抗体等の非ヒト免疫グロブリンに由来する可変領域配列と、一般的にヒト免疫グロブリン鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を意味する。キメラ抗体の作製方法は、当分野で公知である。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（４７１９）：１２０２−７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４−２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号、４，８１６，５６７号及び４，８１６，３９７号参照。
【００３６】
「ヒト化」型の非ヒト（例えばマウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリンである。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、一般的には２個の可変領域の実質的に全部を含み、そのＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域に対応する。ヒト化抗体は、更に免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の少なくとも一部を含むことができる。抗体ヒト化方法は、当分野で公知である。例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−７；Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、５，５８５，０８９号、５，６９３，７６１号、５，６９３，７６２号及び６，１８０，３７０号；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９−９７３；並びに米国特許第５，５６５，３３２号参照。
【００３７】
「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、更にヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、又は１種以上のヒト免疫グロブリンを発現し且つ内在性の免疫グロブリンを発現しないトランスジェニック動物から単離された抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用してファージディスプレイ法を含む当分野で公知の種々の方法により作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号及び４，７１６，１１１号；並びにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９１／１０７４１参照。機能的な内在性の免疫グロブリンを発現することができず且つヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して、ヒト抗体を作製することもできる。例えばＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号、５，６２５，１２６号、５，６３３，４２５号、５，５６９，８２５号、５，６６１，０１６号、５，５４５，８０６号、５，８１４，３１８号、５，８８５，７９３号、５，９１６，７７１号及び５，９３９，５９８号参照。更に、上記と同様の技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供するように、ＬａｋｅＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）やＣｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ）等の企業に委託することができる。「ガイド選択法（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を使用し、選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体を作製することができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えばマウス抗体）を使用し、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導く（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３参照）。
【００３８】
「霊長類化抗体」は、サル可変領域とヒト定常領域を含む。霊長類化抗体の作製方法は当分野で公知である。例えば米国特許第５，６５８，５７０号、５，６８１，７２２号及び５，６９３，７８０号参照。
【００３９】
本開示の抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０、例えばヒトＣＤ４０（配列番号４０）と特異的に結合することが可能な全長（無傷の）抗体分子を含む。
【００４０】
ヒトＣＤ４０と特異的に結合することが可能な抗ＣＤ４０結合断片も開示する。抗体結合断片の例としては、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片及びシングルドメイン断片が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００４１】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常領域及び可変領域と、重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）及び可変領域とを含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域に由来する１個以上のシステインを含む数個の残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加されている点が、Ｆａｂ断片と相違する。Ｆ（ａｂ’）断片は、ペプシン消化物であるＦ（ａｂ’）２のヒンジシステインにおけるジスルフィド結合の切断により作製される。抗体断片のその他の化学的カップリングは、当分野における通常の知識をもつ者に公知である。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、無傷の抗体のＦｃ断片を含まず、動物の循環からより迅速に排出されるので、無傷の抗体よりも非特異的な組織結合が少ないと思われる（例えばＷａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６参照）。
【００４２】
「Ｆｖ」断片は、完全な標的認識・結合部位を含む抗体の最小断片である。この領域は、１個の重鎖可変領域と１個の軽鎖可変領域が緊密に非共有的に結合した二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）から構成される。この構造では、各可変領域の３個のＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に標的結合部位を形成する。多くの場合、６個のＣＤＲは前記抗体に標的結合特異性を付与する。しかし、場合によっては、１個の可変領域（又は標的に特異的なＣＤＲを３個だけ含むＦｖの半分）でも標的を認識して結合することができるが、その場合、親和性は完全な結合部位よりも低くなる。
【００４３】
「一本鎖Ｆｖ」即ち「ｓｃＦｖ」抗体結合断片は抗体のＶＨドメインとＶＬドメインを含み、これらのドメインが１本のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが標的結合に望ましい構造を形成できるように、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に更にポリペプチドリンカーを含む。
【００４４】
「シングルドメイン断片」は、ヒトＣＤ４０に対して十分な親和性を示す単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインから構成される。特定の実施形態において、シングルドメイン断片は、ラクダ化断片である（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５−３８参照）。
【００４５】
本開示の抗ＣＤ４０抗体は、誘導体化抗体を含む。例えば、限定するものではないが、誘導体化抗体は、一般的にグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解による切断、細胞リガンド又は他のタンパク質との連結により修飾される。公知技術により多数の化学修飾のうちのいずれを行うこともでき、このような技術としては、限定されないが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、チュニカマイシンの代謝合成等が挙げられる。更に、例えばＡｍｂｒｙｘ技術を使用して、誘導体に１個以上の非天然アミノ酸を付加することができる（例えばＷｏｌｆｓｏｎ，２００６，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３（１０）：１０１１−２参照）。
【００４６】
抗ＣＤ４０抗体又は結合断片は、定常領域による少なくとも１種の生物学的エフェクター機能を変化させるように配列を改変させた抗体又は断片でもよい。例えば、所定の実施形態では、定常領域による少なくとも１種の生物学的エフェクター機能を未改変抗体に比較して低下させるように抗ＣＤ４０抗体を改変することができ、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＢ等のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）の１種以上との結合を低減させる。ＦｃγＲ相互作用に必要な特定領域における抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることにより、ＦｃγＲとの結合を低減させることができる（例えばＣａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１；及びＬｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２参照）。抗体のＦｃγＲ結合能が低下すると、オプソニン化、貪食作用及び抗原依存性細胞傷害作用（「ＡＤＣＣ」）等のＦｃγＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能も低下させることができる。
【００４７】
本願に記載する抗ＣＤ４０抗体又は結合断片は、例えばＦｃγＲ相互作用を強化するために、定常領域による少なくとも１種の生物学的エフェクター機能を、未改変抗体に比較して獲得又は改善するように改変された抗体を含む（例えば米国特許出願第２００６／０１３４７０９号参照）。例えば、本開示の抗ＣＤ４０抗体は、対応する野生型定常領域よりも高い親和性でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＢと結合する定常領域をもつことができる。
【００４８】
したがって、本開示の抗体は、オプソニン化、貪食作用又はＡＤＣＣを増減させるように、生物活性を変化させることができる。このような変化は当分野で公知である。例えば、ＡＤＣＣ活性を低下させるように抗体を改変することは米国特許第５，８３４，５９７号に記載されている。代表的なＡＤＣＣ低下変異体は（ＥＵナンバリングを使用すると）２３４位と２３７位の残基をアラニンで置換した「突然変異体３」（米国特許第５，８３４，５９７号の図４に示され、別称「Ｍ３」）に対応する。多数の抗体アイソタイプ（例えばＩｇＧ２）で突然変異体３（別称「Ｍ３」）変異を使用することができる。
【００４９】
所定の実施形態において、本開示の抗ＣＤ４０抗体は、フコース濃度が低いか又はフコースを含まない。フコースを含まない抗体は、特に抗体用量が低いときにＡＤＣＣ活性の上昇に相関関係があるとされている。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−７３参照。フコースを含まない抗体の作製方法は、ラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）で増殖させる工程を含む。ＹＢ２／０細胞は、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素であるα−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８  ｍＲＮＡの発現レベルが低い。
【００５０】
本開示の抗ＣＤ４０抗体は、対応する野生型ＣＨ２又はＦｃ領域の結合に比較してＦｃγＲＩＩＢとの結合を増加及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡとの結合を低減させるアミノ酸置換を含む改変型（又は変異型）ＣＨ２ドメイン又は全Ｆｃドメインを含むことができる。変異型ＣＨ２又は変異型Ｆｃドメインは、米国特許出願第２０１４／０３７７２５３号に記載されている。変異型ＣＨ２又は変異型Ｆｃドメインは、一般的に２６３位、２６６位、２７３位及び３０５位に１種以上の置換を含み、Ｆｃドメインにおける残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスのナンバリングである。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、野生型ＣＨ２ドメインに対してＶ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５Ｋ及びＶ３０５Ｗから選択される１種以上の置換を含む。特定の実施形態において、ＣＨ２ドメインの前記１種以上の置換は、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインに対してＶ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ及びＶ２７３Ｙから選択される。例えば、ＩｇＧ１ＣＨ２ドメインの１種以上の置換は、Ｖ２７３Ｅとすることができる。別の特定の実施形態において、本開示の抗ＣＤ４０抗体は、アミノ酸置換Ｖ２６３Ｌを含む変異型ＩｇＧ１ＣＨ２領域を含む。
【００５１】
対応する野生型ＣＨ２又はＦｃ領域の結合に比較してＦｃγＲＩＩＢとの結合を増加及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡとの結合を低減させることができる変異型ＣＨ２又は変異型Ｆｃドメインの他の例としては、Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９（５），１０３５−１０４３（２０１３）に記載されているものが挙げられ、例えばヒトＩｇＧ１におけるＳ２６７ＥやＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆである。
【００５２】
所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体又は結合断片は、例えばＦｃＲｎ相互作用に関与する特定領域における免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることにより、胎児性Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対するそれらの結合親和性を増減させる改変を含む（例えばＷＯ２００５／１２３７８０参照）。特定の実施形態では、重鎖定常領域の２５０位、３１４位及び４２８位のアミノ酸残基の少なくとも１種を単独又は任意の組合せ（２５０位及び４２８位、又は２５０位及び３１４位、又は３１４位及び４２８位、又は２５０位及び３１４位及び４２８位）で２５０位及び４２８位の特定の組合せに置換するように、ＩｇＧクラスの抗ＣＤ４０抗体を突然変異させる。２５０位では、置換するアミノ酸残基はスレオニン以外の任意のアミノ酸残基とすることができ、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン又はチロシンが挙げられる。３１４位では、置換するアミノ酸残基はロイシン以外の任意のアミノ酸残基とすることができ、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンが挙げられる。４２８位では、置換するアミノ酸残基はメチオニン以外の任意のアミノ酸残基とすることができ、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンが挙げられる。Ｆｃエフェクター機能を改変させることが知られている代表的な置換は、Ｆｃ置換Ｍ４２８Ｌであり、Ｆｃ置換Ｔ２５０Ｑと組合せることができる。適切なアミノ酸置換のその他の特定の組合せは、米国特許第７，２１７，７９７号の表１に記載されている。このような突然変異は、ＦｃＲｎとの結合を強化し、抗体を分解から保護し、その半減期を延ばす。
【００５３】
抗ＣＤ４０抗体は、例えばＪｕｎｇ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：９，９５９−９６６；Ｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．１７（５）：４８１−９．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ａｕｇ  １７；及び米国特許出願第２００７／０２８０９３１号に記載されているように、そのＣＤＲの１個以上に１個以上のアミノ酸を挿入してもよい。
【００５４】
ヒトＣＤ４０に対して親和性をもつ抗ＣＤ４０抗体は、治療及び診断用途に望ましいと思われる。したがって、本開示は、ヒトＣＤ４０に対する結合親和性をもつ抗体を想定する。特定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、少なくとも約１０００ｎＭの親和性でヒトＣＤ４０と結合するが、これよりも高い親和性を示してもよく、例えば，少なくとも約９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ又は更に高くてもよい。所定の実施形態において、前記抗体は、約１ｐＭ〜１０００ｎＭの範囲の親和性、又は上記数値のいずれかを端点とする範囲の親和性でヒトＣＤ４０と結合する。
【００５５】
ヒトＣＤ４０に対する抗ＣＤ４０抗体の親和性は、当分野で周知の技術又は本願に記載する技術を使用して測定することができ、例えばＥＬＩＳＡ、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴法又は蛍光偏光アッセイが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
抗ＣＤ４０抗体は、一般に、本願では（Ｎ→Ｃの順に）ＶＨＣＤＲ＃１、ＶＨＣＤＲ＃２及びＶＨＣＤＲ＃３と呼ぶ３個の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有する可変領域（ＶＨ）を含む重鎖と、本願では（Ｎ→Ｃの順に）ＶＬＣＤＲ＃１、ＶＬＣＤＲ＃２及びＶＬＣＤＲ＃３と呼ぶ３個の相補性決定領域を有する可変領域（ＶＬ）を含む軽鎖とを含む。本願には、代表的な抗ＣＤ４０の重鎖及び軽鎖の代表的なＣＤＲのアミノ酸配列と、ＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列とを示す。抗ＣＤ４０抗体の特定の実施形態は、これらの代表的なＣＤＲ及び／又はＶＨ及び／又はＶＬ配列と、ヒトＣＤ４０との結合に関してこのような抗体と競合する抗体を含む。
【００５７】
所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列から選択される。
【００５８】
【表４】
2019523221.tif 000007
2019523221.tif 000008
【００５９】
所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体の各ＣＤＲは、相互に独立して、表３に示す抗体の夫々のＣＤＲに対応する配列となるように選択される。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、ＩｇＧであり、表３に示す抗体のＶＨ及びＶＬに対応する配列のＶＨ及びＶＬを有する。
【００６０】
所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９のいずれか１種に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９又は１６０のいずれか１種に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１０１に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１５１に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１０２に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１５２に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１０３に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１５３に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１０４に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１５４に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１０５に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１５５に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１０６に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１５６に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１０６に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１５７に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１０７に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１５８に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１０８に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１５９に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１０９に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６０に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。
【００６１】
本願では、上記ＣＤＲを有する抗ＣＤ４０抗体の特定の代表的な実施形態について記載する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１、１１、３１、５１、６１及び８１のＣＤＲを有する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号２、１２、３２、５２、６２及び８２のＣＤＲを有する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号３、１３、３３、５３、６３及び８３のＣＤＲを有する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号４、１４、３４、５４、６４及び８４のＣＤＲを有する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号５、１５、３５、５５、６５及び８５のＣＤＲを有する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号６、１６、３６、５６、６６及び８６のＣＤＲを有する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号６、１９、３６、５６、６６及び８６のＣＤＲを有する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号７、１７、３７、５７、６７及び８７のＣＤＲを有する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号７、２０、３７、５７、６７及び８７のＣＤＲを有する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号８、１８、３５、５８、６８及び８８のＣＤＲを有する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号９、２１、３５、５８、６８及び８８のＣＤＲを有する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１０、２２、３５、５８、６８及び８８のＣＤＲを有する。
【００６２】
所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、ヒトに投与するのに適している。特定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、ヒト化型である。別の特定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の配列から選択される。
【００６３】
【表５】
2019523221.tif 000009
【００６４】
所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２又は１２３のいずれか１種に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０又は１７１のいずれか１種に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１０に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６１に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１１に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６１に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１２に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６１に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１３に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６２に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１４に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６２に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１５に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６２に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１６に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６３に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１７に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６３に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１８に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６３に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１６に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６４に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１７に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６４に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１９に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６５に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１２０に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６５に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１２１に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６６に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１７に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６７に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１７に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６８に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１７に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６９に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１７に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１７０に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１７に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１７１に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１１８に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６４に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１２２に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６７に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１２２に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６８に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１２３に対応する配列のＶＨ鎖と、配列番号１６９に対応する配列のＶＬ鎖とを含む。
【００６５】
所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、インビトロアッセイでヒトＣＤ４０との結合に関して参照抗体と競合する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＣＤ４０を発現する細胞上のヒトＣＤ４０との結合に関して競合する。前記参照抗体は、本願に記載する抗ＣＤ４０抗体のいずれかとすることができる。所定の実施形態において、前記参照抗体は、表３に示す抗体である。特定の実施形態において、前記参照抗体は、抗体ＡＤ１６３．９．３（「ｍｕＡｂ１」）、抗体ＡＤ１６６．４．４（「ｍｕＡｂ２」）、抗体ＡＤ１７５．１４．１１（「ｍｕＡｂ３」）、抗体ＡＤ１６３．１０．７（「ｍｕＡｂ４」）、抗体ＡＤ１６５．１．２（「ｍｕＡｂ５」）、抗体ＡＤ１６３．１６２．１（「ｍｕＡｂ６」）、抗体ＡＤ１６３．２７．１２（「ｍｕＡｂ７」）、抗体ＡＤ１６３．７．２（「ｍｕＡｂ８」）、抗体ＡＤ１６４．１４．６（「ｍｕＡｂ９」）及び抗体ＡＤ１６４．７６．２（「ｍｕＡｂ１０」）から選択される。所定の実施形態において、前記参照抗体は、表３に示す抗体のヒト化型である。所定の実施形態において、前記参照抗体は、ｍｕＡｂ６、ｍｕＡｂ８又はｍｕＡｂ９のヒト化型である。特定の実施形態において、前記参照抗体は、ｈｕＡｂ９−２である。別の実施形態において、参照抗体は、ｈｕＡｂ９−５である。別の特定の実施形態において、前記参照抗体は、ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉである。
【００６６】
抗ＣＤ４０抗体の配列は翻訳後修飾を受けていてもよく、例えば抗体重鎖のＣ末端の１個以上（例えば１個、２個、３個又はそれ以上）のアミノ酸残基の切断が挙げられる。
【００６７】
所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１３０〜１３５のいずれか１種の重鎖と、配列番号１４０〜１４２の軽鎖とを含む。ある種の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１３０又は１３１の重鎖と、配列番号１４０の軽鎖とを含む。ある種の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１３２又は１３３の重鎖と、配列番号１４０の軽鎖とを含む。ある種の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１３４又は１３５の重鎖と、配列番号１４０の軽鎖とを含む。ある種の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１３２又は１３３の重鎖と、配列番号１４１の軽鎖とを含む。ある種の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、配列番号１３２又は１３３の重鎖と、配列番号１４２の軽鎖とを含む。
【００６８】
本願に記載する抗ＣＤ４０抗体は、一般にヒトＣＤ４０と特異的に結合する。前記抗体は、他の動物種（例えばサル、例えばカニクイザル）に由来するＣＤ４０との結合に関して交差反応性があるため、サル動物モデルで生物活性を試験できる等の利点が得られる。このような動物モデル試験を使用し、特性（例えば有利な薬物動態）について選択するために、抗ＣＤ４０抗体をスクリーニングすることができる。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、カニクイザルＣＤ４０と結合する。
【００６９】
競合アッセイとしては、限定されないが、放射性物質標識イムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイ及び表面プラズモン共鳴アッセイが挙げられる。
【００７０】
（動物種又はアイソタイプに関係なく）参照抗体と試験抗体との抗体競合アッセイを実施する際には、その後の同定を容易にするために、先ずフルオロフォア、ビオチン又は酵素（又は放射性）ラベル等の検出可能なラベルで参照抗体を標識する。本願の場合には、ヒトＣＤ４０を発現する細胞を未標識試験抗体と共にインキュベートし、標識した参照抗体を加え、結合した標識の強度を測定する。試験抗体がオーバラップするエピトープと結合することにより標識参照抗体と競合するならば、強度は試験抗体の不在下で実施した対照反応に比較して低下する。
【００７１】
このアッセイの特定の実施形態では、アッセイ条件（例えば特定の細胞密度）下で最大結合の８０％を生じる標識参照抗体の濃度(「ｃｏｎｃ８０％」）を先ず測定し、ｃｏｎｃ８０％の１０倍の未標識試験抗体とｃｏｎｃ８０％の標識参照抗体を使用して競合アッセイを実施する。
【００７２】
阻害は下式に従って計算される阻害定数即ちＫｉ：
Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［参照Ａｂ濃度］／Ｋｄ）
として表すことができ、式中、ＩＣ５０は参照抗体の結合を５０％低減させる試験抗体の濃度であり、Ｋｄは参照抗体の解離定数であり、ヒトＣＤ４０に対するその親和性の尺度である。本願に開示する抗ＣＤ４０抗体と競合する抗体は、本願に記載するアッセイ条件下で１０ｐＭ〜１０００ｎＭのＫｉをもつことができる。
【００７３】
種々の実施形態において、使用される特定のアッセイ条件下で最大結合の８０％を生じる参照抗体濃度と、参照抗体濃度の１０倍の試験抗体濃度とにおいて、試験抗体が参照抗体の結合を少なくとも約２０％以上、例えば少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくはそれ以上、又は上記数値のいずれかを端点とする範囲の百分率だけ低減させるならば、試験抗体は参照抗体と競合するとみなされる。
【００７４】
本願に記載する抗ＣＤ４０抗体は、少なくとも２種類の作用機序によってヒトＣＤ４０を活性化させることにより、ヒトＣＤ４０（配列番号４０）を作動させることが可能である。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体はＣＤ４０Ｌ（配列番号４１）の不在下でヒトＣＤ４０と結合し、ヒトＣＤ４０のシグナル伝達を強化する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＣＤ４０ＬとＣＤ４０との結合複合体に結合し、ヒトＣＤ４０のシグナル伝達を強化する。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＣＤ４０（配列番号４０）との結合に関して表３に挙げたヒト化抗体から選択される対照抗体と競合し、ヒトＣＤ４０リガンド（配列番号４１）から独立して、即ちＣＤ４０Ｌの有無に関係なく、ヒトＣＤ４０を活性化させる。
【００７５】
ヒトＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用に及ぼす抗ＣＤ４０抗体の効果は、実施例２に記載するＣＤ４０Ｌ競合アッセイ等の当分野で公知のアッセイにより判定することができる。ヒトＣＤ４０ＬとヒトＣＤ４０の結合に及ぼす抗ＣＤ４０抗体の効果を判定するためには、抗ＣＤ４０抗体を含む試料中で測定したＯＤ４５０とアイソタイプ対照抗体試料から得られたＯＤ４５０の比（「ＯＤ４５０比」）を使用することができる。ＯＤ４５０比が１であるならば効果はないと判断され、１未満であるならば、ＣＤ４０Ｌと競合すると判断され、１よりも大きいならば、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の結合が増大していると判断される。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体はＯＤ４５０比により判定した場合にヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号４１）とヒトＣＤ４０（配列番号４０）の結合を増加（即ち強化）する。ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の結合の増加をＯＤ４５０比で表すと、少なくとも約１．２であり、例えば約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２、２．４、２．５、２．６、２．８、３．０又はそれ以上である。
【００７６】
抗体が本願に記載するようにヒトＣＤ４０との結合に関して参照抗体と競合するか否かを評価するために有用な特定のアッセイ及びアッセイ条件については、実施例２に記載する。抗体競合は実施例２に記載するような表面プラズモン共鳴アッセイ又はセクション８．４．３に記載する競合結合プロトコールで判定することができる。
【００７７】
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、抗腫瘍効果を生じるように免疫系を活性化させるが、全細胞種に及ぶ広範な全身免疫活性化により望ましくない副作用を生じる可能性がある。したがって、所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、参照抗ＣＤ４０抗体と比較した場合に、樹状細胞による免疫応答をＢ細胞免疫応答よりも選択的に活性化させる。所定の実施形態において、前記参照抗ＣＤ４０抗体は、ＣＰ−８７０，８９３である。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、樹状細胞を活性化させる活性が同等であり、例えばセクション８．１．３に記載するアッセイにおいて所定用量でのＩＬ−１２ｐ７０産生量が同一用量の参照抗ＣＤ４０抗体でのＩＬ−１２ｐ７０産生量に比較して約２００％以内、例えば約１８０％以内、約１５０％以内、約１３０％以内、約１１０％以内、約１００％以内、約９０％以内、約８０％以内、約７０％以内、約６０％以内、約５０％以内、約４０％以内、約３０％以内、約２５％以内、約２０％以内、約１５％以内、約１０％以内又は約５％以内である。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、参照抗ＣＤ４０抗体に比較してＢ細胞を活性化させる効力が低い。セクション８．５．３に記載するアッセイにおいて、参照抗ＣＤ４０抗体に対する抗ＣＤ４０抗体のＢ細胞ＥＣ５０比は、約１．５超とすることができ、例えば約２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、３０、４０、５０又はそれ以上である。所定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、参照抗ＣＤ４０抗体と比較した場合に、樹状細胞を活性化させる活性が同等であり、Ｂ細胞を活性化させる効力が低い。
【００７８】
７．４．抗ＣＤ４０抗体をコードするポリヌクレオチド、発現システム及び前記抗体の作製方法
本開示は、抗ＣＤ４０抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子をコードする核酸分子、このような核酸を含むベクター、並びに本開示の抗ＣＤ４０抗体を産生することが可能な宿主細胞を包含する。
【００７９】
本開示の抗ＣＤ４０抗体は、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子を宿主細胞で組換え発現させることにより作製することができる。抗体を組換え発現させるためには、前記抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖が宿主細胞で発現され、任意に前記宿主細胞を培養する培地に分泌され、前記培地から前記抗体を回収できるように、前記軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ断片を含む１種以上の組換え発現ベクターを前記宿主細胞にトランスフェクトする。抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を取得し、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組込み、これらのベクターを宿主細胞に導入するためには、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９８９）及び米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている技術等の標準組換えＤＮＡ技術を使用する。
【００８０】
このような抗ＣＤ４０抗体をコードする核酸を作製するためには、先ず軽鎖及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を取得する。これらのＤＮＡは、例えばポリメラーゼ連作反応（ＰＣＲ）を使用して軽鎖及び重鎖可変領域配列をコードする生殖細胞系列ＤＮＡ又はｃＤＮＡの増幅と修飾により取得することができる。ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、当分野で公知である（例えば「ＶＢＡＳＥ」ヒト生殖細胞系列配列データベース参照；更にＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ），ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２Ｔ：１１６−１９８；及びＣｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６も参照し、各々その開示内容を本願に援用する）。
【００８１】
抗ＣＤ４０抗体に関連するＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片を取得後、例えば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、これらのＤＮＡ断片を標準組換えＤＮＡ技術により更に操作することができる。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片を、抗体定常領域又はフレキシブルリンカー等の別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片と機能的に連結する。この文脈で使用する「機能的に連結」なる用語は、２個のＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームに維持されるようにこれらの２個のＤＮＡ断片を相互に結合することを意味する。
【００８２】
単離したＶＨ領域をコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び任意にＣＨ４）をコードする別のＤＮＡ分子と機能的に連結することにより、前記ＶＨをコードするＤＮＡを全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で公知であり（例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，米国保健福祉省，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅法により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域とすることができるが、ある種の実施形態では、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子を得るには、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と機能的に連結することができる。
【００８３】
単離したＶＬ領域をコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子と機能的に連結することにより、前記ＶＬをコードするＤＮＡを全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で公知であり（例えばＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，米国保健福祉省，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅法により得ることができる。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域とすることができるが、ある種の実施形態では、κ定常領域である。ｓｃＦｖ遺伝子を作製するためには、ＶＨ配列とＶＬ配列とが連続した一本鎖タンパク質として発現され、ＶＬ領域とＶＨ領域とがフレキシブルリンカーにより結合されるように、ＶＨをコードするＤＮＡ断片及びＶＬをコードするＤＮＡ断片を、フレキシブルリンカーをコードする別の断片、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号２００）をコードする別の断片と機能的に連結する（例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４参照）。
【００８４】
本開示の抗ＣＤ４０抗体を発現させるためには、遺伝子が転写・翻訳調節配列と機能的に連結されるように、上記のように得られた部分的又は全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを、発現ベクターに挿入する。この文脈で「機能的に連結」なる用語は、ベクター内の転写・翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写・翻訳を調節するというそれらの目的とする機能を果たすように、抗体遺伝子をベクターにライゲーションすることを意味する。発現ベクター及び発現調節配列は、使用する発現宿主細胞と適合可能となるように選択される。抗体軽鎖遺伝子と抗体重鎖遺伝子とを別々のベクターに挿入することもできるが、より一般的には、両方の遺伝子を同一の発現ベクターに挿入する。
【００８５】
標準方法（例えば抗体遺伝子断片とベクター上の相補的制限部位とのライゲーション、又は制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）により、抗体遺伝子を発現ベクターに挿入する。抗ＣＤ４０抗体に関連する軽鎖又は重鎖配列を挿入する前に、発現ベクターに予め抗体定常領域配列を導入することができる。例えば、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に関連するＶＨ配列とＶＬ配列とを全長抗体遺伝子に変換する１つのアプローチは、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントと機能的に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントと機能的に連結されるように、夫々重鎖定常領域と軽鎖定常領域とを予めコードしている発現ベクターにこれらの配列を挿入する方法である。これに加えて又はこの代わりに、組換え発現ベクターは、抗体鎖を宿主細胞から分泌し易くするシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であってもよい。
【００８６】
抗体鎖遺伝子に加え、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を含む。「調節配列」なる用語は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現調節因子（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０に記載されている。当業者に自明の通り、調節配列の選択を含めて発現ベクターのデザインは、形質転換させる宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル等の因子に依存し得る。哺乳動物宿主細胞発現に適切な調節配列としては、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス性因子が挙げられ、例えばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーが挙げられる。ウイルス性調節因子及びその配列の更に詳細な説明については、例えばＳｔｉｎｓｋｉの米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらの米国特許第４，５１０，２４５号、及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらの米国特許第４，９６８，６１５号参照。
【００８７】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加え、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）及び選択マーカー遺伝子等の他の配列を含むことができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞を選択し易くする（例えばいずれもＡｘｅｌらの米国特許第４，３９９，２１６号、４，６３４，６６５号及び５，１７９，０１７号参照）。例えば、一般的に選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサート等の薬物に対する耐性を付与する。適切な選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ＤＨＦＲ−宿主細胞におけるメトトレキサート選択／増幅用）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。前記軽鎖及び重鎖を発現させるためには、前記重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。種々の語形の「トランスフェクション」なる用語は、外来ＤＮＡを宿主原核又は真核細胞に導入するために広く使用されている多種多様の技術を包含するものとし、例えばエレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等が挙げられる。
【００８８】
宿主原核又は真核細胞のいずれでも、本開示の抗体を発現させることが可能である。ある種の実施形態では、正しく折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を最適に分泌する真核細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）において抗体の発現を行う。本開示の組換え抗体を発現させるための代表的な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されているＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞と、例えばＫａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８２，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようなＤＨＦＲ選択マーカーの併用を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合には、前記抗体を前記宿主細胞で発現させるため又は前記宿主細胞を増殖させる培地に前記抗体を分泌させるために十分な時間にわたって前記宿主細胞を培養することにより、前記抗体を産生させる。標準タンパク質精製法を使用して、抗体を培地から回収することができる。無傷の抗体の一部（例えばＦａｂ断片やｓｃＦｖ分子）を産生させるために、宿主細胞を使用することもできる。当然のことながら、上記手順の変形も、本開示の範囲内に含まれる。例えば、本開示の抗ＣＤ４０抗体の軽鎖又は重鎖（但し、両方ではない）をコードするＤＮＡを、宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい場合もある。
【００８９】
ヒトＣＤ４０との結合に不要な軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために、組換えＤＮＡ技術を使用することもできる。このような短縮型ＤＮＡ分子から発現される分子も、本開示の抗体に含まれる。
【００９０】
本開示の抗ＣＤ４０抗体を組換え発現させるためには、本開示の２種類の発現ベクター、即ち重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターと、軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターとを、宿主細胞にコトランスフェクトすることができる。これらの２種類のベクターは、同一の選択マーカーを含むこともできるし、各々別の選択マーカーを含むこともできる。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの両方をコードする単一のベクターを使用することもできる。
【００９１】
抗ＣＤ４０抗体の１部分以上をコードする核酸を作製後、例えば異なるＣＤＲ配列を有する抗体、Ｆｃ受容体に対する親和性の低い抗体又は異なるサブクラスの抗体をコードする核酸を作製するために、更に改変又は突然変異をコーディング配列に導入することができる。
【００９２】
（例えばＳｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８４  Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌに記載されている方法により）化学合成により本開示の抗ＣＤ４０抗体を作製することもできる。無細胞プラットフォームを使用して変異型抗体を作製することもできる（例えばＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ  Ｎｏ．２，２００１（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及びＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７：４２０−４２６参照）。
【００９３】
本開示の抗ＣＤ４０抗体を組換え発現により産生させた後、免疫グロブリン分子精製方法として当分野で公知の任意の方法により精製することができ、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度差、又は任意の他の標準タンパク質精製技術により精製することができる。更に、精製し易くするために、本開示の抗ＣＤ４０抗体を本願に記載する異種ポリペプチド配列又は当分野で公知の異種ポリペプチド配列と融合することができる。
【００９４】
単離後、抗ＣＤ４０抗体を、所望により、例えば高性能液体クロマトグラフィー（例えばＦｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８０参照）又はＳｕｐｅｒｄｅｘ（ＴＭ）７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）でのゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製することができる。
【００９５】
７．５．医薬組成物
本願に記載する抗ＣＤ４０抗体は、前記抗体と１種以上の担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有する組成物の形態とすることができる。前記組成物は、獣医学用やヒト医薬用等の特定の用途に合わせて製剤化することができる。組成物の形態（例えば乾燥粉末、液体製剤等）と、賦形剤、希釈剤及び／又は担体は、目的とする抗体の用途と、治療用の場合には投与方式により異なる。
【００９６】
治療用では、薬学的に許容される担体を含有する滅菌医薬組成物の一部として、組成物を提供することができる。この組成物は、（対象、例えばヒト対象、即ち患者に投与する所望の方法に応じて）任意の適切な形態とすることができる。前記医薬組成物は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、髄腔内、局所又は局部等の種々の経路により対象に投与することができる。任意の所定の場合に最適な投与経路は、特定の抗体、対象、疾患の種類と重度、及び対象の健康状態により異なる。一般的に、前記医薬組成物は、静脈内又は皮下投与される。
【００９７】
医薬組成物は、１単位用量当たり規定量の本願に記載する抗ＣＤ４０抗体を含有する単位剤形にすると好都合である。単位用量に含まれる抗ＣＤ４０抗体の量は、当分野で周知の通り、治療する疾患と他の因子により異なる。このような単位剤形は、１回分の投与に適した量の抗体を含有する凍結乾燥粉末の形態でもよいし、液体の形態でもよい。乾燥粉末単位剤形は、シリンジと、適切な量の希釈剤及び／又は投与に有用な他の成分と共に、キットにパッケージングすることができる。液体形態の単位剤形は１回分の投与に適した量の抗ＣＤ４０抗体を、予め充填したシリンジの形態で提供すると、好都合である。
【００９８】
医薬組成物は、複数回の投与に適した量の抗ＣＤ４０抗体を含有するバルク形態で提供してもよい。
【００９９】
医薬組成物は、当分野で一般的に利用されている薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（本願では「担体」と総称する）、即ち緩衝剤、安定剤、保存剤、等張化剤、非イオン性デタージェント、酸化防止剤及びその他の添加剤を任意に使用し、所望の純度を有する抗体と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液として保存できるように製造することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｓｏｌ，ｅｄ．１９８０）参照。このような添加剤は、利用される投与量と濃度でレシピエントに非毒性でなければならない。
【０１００】
緩衝剤は、ｐＨを生理的条件に近似する範囲に維持するのに役立つ。緩衝剤は、種々の濃度で存在することができるが、一般的には、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で存在する。本開示で使用するのに適した緩衝剤としては、有機酸及び無機酸並びにその塩が挙げられ、例えばクエン酸緩衝液（例えばクエン酸一ナトリウムとクエン酸二ナトリウムとの混合物、クエン酸とクエン酸三ナトリウムとの混合物、クエン酸とクエン酸一ナトリウムとの混合物等）、コハク酸緩衝液（例えばコハク酸とコハク酸一ナトリウムとの混合物、コハク酸と水酸化ナトリウムとの混合物、コハク酸とコハク酸二ナトリウムとの混合物等）、酒石酸緩衝液（例えば酒石酸と酒石酸ナトリウムとの混合物、酒石酸と酒石酸カリウムとの混合物、酒石酸と水酸化ナトリウムとの混合物等）、リン酸緩衝液（例えばリン酸とリン酸一ナトリウムとの混合物、リン酸とリン酸二ナトリウムとの混合物、リン酸一ナトリウムとリン酸二ナトリウムとの混合物等）、グルコン酸緩衝液（例えばグルコン酸とグルコン酸ナトリウムとの混合物、グルコン酸と水酸化ナトリウムとの混合物、グルコン酸とグルコン酸カリウムとの混合物等）、蓚酸緩衝液（例えば蓚酸と蓚酸ナトリウムとの混合物、蓚酸と水酸化ナトリウムとの混合物、蓚酸と蓚酸カリウムとの混合物等）、乳酸緩衝液（例えば乳酸と乳酸ナトリウムとの混合物、乳酸と水酸化ナトリウムとの混合物、乳酸と乳酸カリウムとの混合物等）及び酢酸緩衝液（例えば酢酸と酢酸ナトリウムとの混合物、酢酸と水酸化ナトリウムとの混合物等）が挙げられる。更に、フマル酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液及び２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール（即ちＴｒｉｓ、ＴＨＡＭ又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）等のトリメチルアミン塩を使用することができる。
【０１０１】
等張化剤は、「安定剤」とも呼ばれ、本開示の液体組成物の等張性を確保するために添加することができ、多価糖アルコール類が挙げられ、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール又はマンニトール等の三価以上の糖アルコール類が挙げられる。安定剤とは、増量剤の機能に始まり、治療剤を可溶化させたり、変性又は容器壁への付着を防ぐのに役立つ添加剤に至るまでの機能に対応することができる、広義の賦形剤を意味する。典型的な安定剤としては、多価糖アルコール類（上記に挙げたもの）；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等のアミノ酸；ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール等の有機糖類又は糖アルコール類（イノシトール等のシクリトールを含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム等の含硫還元剤；低分子ポリペプチド（例えば１０残基以下のペプチド）；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース等の単糖類；ラクトース、マルトース、スクロース及びトレハロース等の二糖類；ラフィノース等の三糖類；並びにデキストラン等の多糖類を挙げることができる。安定剤は、抗ＣＤ４０抗体の重量当たり０．５〜１０重量％の量で添加することができる。
【０１０２】
糖タンパク質を可溶化し易くすると共に糖タンパク質を撹拌による凝集から保護するために、非イオン性界面活性剤即ちデタージェント（「湿潤剤」とも言う）を添加してもよく、その結果、タンパク質の変性を生じることなしに製剤を剪断表面応力に暴露することも可能になる。適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０等）、ポロキサマー（１８４、１８８等）及びプルロニックポリオールが挙げられる。非イオン性界面活性剤は約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲で添加することができる。
【０１０３】
静脈内輸液による投与に適した水性組成物の特定の代表的な実施形態は、１０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０抗体と、１５ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）と、８．０％（ｗ／ｖ）のスクロースと、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０とを含有する。ある種の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に記載するヒト化抗体のいずれか１種である。前記組成物は、滅菌水又は注射もしくは輸液に適した他の溶液（例えば０．９％生理食塩水、リンゲル液、乳酸リンゲル液等）２．０ｍＬで再構成することにより、上記水性組成物となる凍結乾燥粉末の形態でもよい。前記組成物又は他の実施形態の組成物は、抗ＣＤ４０抗体の１回分の投与に適した量の組成物を予め充填したシリンジ又は注射及び／もしくは輸液に適した他の装置の形態でもよい。
【０１０４】
７．６．使用法
７．６．１．治療効果
本願に提供するデータから明らかなように、腫瘍細胞の存在下でＣＤ４０を作動させる本願に記載する抗ＣＤ４０抗体は、これらの固形腫瘍に対してインビボで強力な抗腫瘍作用を発揮する。したがって、前記抗ＣＤ４０抗体、結合断片及び／又は前記抗ＣＤ４０抗体を含有する医薬組成物は、固形腫瘍を治療するために治療用として使用することができる。
【０１０５】
一般に、前記方法は、固形腫瘍をもつヒト患者に、ＣＤ４０を作動させて腫瘍細胞を死滅及び／又は増殖抑制する有効量の抗ＣＤ４０抗体を投与し、治療効果を提供することを含む。抗ＣＤ４０抗体で治療することができる固形腫瘍としては、限定されないが、副腎がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、大腸がん、食道がん、眼のがん、胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん（例えば非小細胞肺がん、中皮腫）、頭頸部がん（例えば頭頸部の扁平上皮がん）、リンパ腫（例えばＢ細胞リンパ腫）、メラノーマ（例えば進行期悪性メラノーマ、皮膚メラノーマ）、口腔がん、卵巣がん、陰茎がん、前立腺がん、膵臓がん、皮膚がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん及び膣がんが挙げられる。所定の実施形態において、前記固形腫瘍は頭頸部がん、肺がん、メラノーマ又は膵臓がんである。
【０１０６】
がんは、新規に診断され、治療経験のないものでもよいし、再発でも難治性でも再発・難治性でもよいし、転移型の固形腫瘍でもよい。実際に、マウスＰＣ３予防モデルにおけるインビボデータ（図１２）によると、抗ＣＤ４０抗体は、アイソタイプ抗体の投与に比較して腫瘍サイズの縮小に有効であることが分かる。
【０１０７】
理論により制限する意図はないが、抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０を作動させることにより免疫系を活性化させると考えられる。その結果として生じる免疫応答は、その後、ＣＤ４０発現レベルに関係なく、隣接する腫瘍細胞に抗腫瘍効果を発揮する。したがって、本開示の抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０陽性又はＣＤ４０陰性固形腫瘍に対して有効であると予想される。
【０１０８】
本開示の抗ＣＤ４０抗体は、単独（単剤療法）で投与してもよいし、他の抗がん療法及び／又は標的化もしくは非標的化抗がん剤の補助剤として投与してもよい。単剤療法として投与するか、あるいは他の療法又は治療剤の補助剤として投与するかに拘わらず、治療レジメン全体で治療効果が得られるような量の抗ＣＤ４０抗体を投与する。
【０１０９】
治療効果とは、患者におけるがんを治療するために抗ＣＤ４０抗体を使用する結果として、（必要に応じて）無治療又は公知標準治療に比較して何らかの臨床効果が実証されることを意味する。臨床効果は、当分野における通常の知識をもつ者に公知の方法により評価することができる。１実施形態では、（ＲＥＣＩＳＴ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１を使用して判定した）客観的奏効率（ＯＲＲ）、奏効期間（ＤＯＲ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び／又は全生存期間（ＯＳ）に基づいて臨床効果を評価する。所定の実施形態では、完全奏効が治療効果に相当する。所定の実施形態では、部分奏効が治療効果に相当する。所定の実施形態では、病勢安定が治療効果に相当する。所定の実施形態では、全生存期間の延長が治療効果に相当する。所定の実施形態において、治療効果は、病勢増悪の経時的改善及び／又は症状もしくはクオリティオブライフの改善を構成することができる。他の実施形態において、治療効果は、病勢コントロール期間の延長ではなく、症状負荷の顕著な改善によるクオリティオブライフの改善を意味する場合もある。当業者に自明の通り、治療効果は、抗ＣＤ４０抗体を単独（単剤療法）で使用して観察してもよいし、他の抗がん療法及び／又は標的化もしくは非標的化抗がん剤の補助剤として使用して観察してもよい。
【０１１０】
一般的に、治療効果は、新規がん治療に対する奏効を測定するように設計された標準臨床試験を使用して評価される。本願に記載する抗ＣＤ４０抗体の治療効果を評価するためには、以下の試験、即ち（１）Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１、（２）Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｔｕｓ、（３）免疫関連奏効判定基準（ｉｒＲＣ）、（４）腫瘍抗原の評価により評価可能な病勢、（５）適格と判断された患者の報告によるアウトカムスケール、及び／又は（６）全生存期間と無増悪生存期間のカプランマイヤー推定法の、１種又は組合せを使用することができる。
【０１１１】
腫瘍負荷の変化の評価は、がん療法の臨床評価の主眼である。腫瘍縮小（客観的奏効）及び病勢増悪に発展するまでの時間の両者が、がん臨床試験における重要なエンドポイントである。ＲＥＣＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ）として知られる標準化奏効判定基準が、２０００年に公表されている。２００９年には更新版（ＲＥＣＩＳＴ  １．１）が発表された。客観的奏効が主な試験エンドポイントである臨床試験と、病勢安定の評価、腫瘍増悪又は増悪までの時間の解析を行う試験とでは、これらのアウトカム測定が解剖学的な腫瘍負荷及び試験の経過に伴うその変化に基づくため、ＲＥＣＩＳＴ基準が一般的に使用されている。表４は本願に記載する抗ＣＤ４０抗体等の試験薬に対する客観的腫瘍奏効を判定するために、使用される奏効判定基準の定義を示す。
【０１１２】
【表６】
2019523221.tif 000010
【０１１３】
本願に記載する抗ＣＤ４０抗体の治療効果を判定するために使用することができる二次アウトカム尺度としては、客観的奏効率（ＯＲＲ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、全生存期間（ＯＳ）、全奏効期間（ＤＯＲ）及び奏効の深さ（ＤｐＲ）が挙げられる。ＯＲＲは、完全奏効（ＣＲ）又は部分奏効（ＰＲ）に達する参加者の割合として定義される。ＰＦＳは、抗ＣＤ４０抗体の初回投与日から病勢増悪又は死亡のどちらか早いほうまでの期間として定義される。ＯＳは、疾患を診断された患者が診断日又は疾患の治療開始から生存し続ける期間として定義される。ＤＯＲは、参加者の初期ＣＲ又はＰＲから病勢増悪時までの期間として定義される。ＤｐＲは、ベースライン腫瘍負荷と比較して最大奏効時点に観察される腫瘍縮小百分率として定義される。上記ＲＥＣＩＳＴ  １．１基準に基づいて、ＯＲＲ及びＰＦＳの両者の臨床エンドポイントを判定することができる。
【０１１４】
自分の身のまわりのことを行う能力、日常活動及び身体能力に関する患者の機能レベルを表すためには、表５に示すＥＣＯＧパフォーマンスステータススケールを使用する。このスケールは現在ではＥＣＯＧ−ＡＣＲＩＮ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐに属するＥａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）により作成され、１９８２年に公表された。
【０１１５】
【表７】
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【０１１６】
抗体によるがん治療等の免疫療法薬の奏効を完全に分類・判定するために使用することができる別の基準は、免疫関連奏効判定基準（ｉｒＲＣ）であり、２００９年に固形腫瘍の測定用に作成され、２０１３年に更新された（各々その開示内容全体を本願に援用するＷｏｌｃｈｏｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９；１５（２３）：７４１２−７４２０及びＮｉｓｈｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；１９（１４）：３９３６−３９４３）。更新版ｉｒＲＣ基準は、腫瘍負荷に及ぼす免疫療法薬（例えば本願に記載する抗ＣＤ４０抗体）の効果を評価するために一般的に使用され、表６に従って奏効を定義する。
【０１１７】
【表８】
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【０１１８】
単剤療法として投与するか、あるいは他の療法又は治療剤の補助剤として投与するかに拘わらず、固形腫瘍を治療するために本願に記載する抗ＣＤ４０抗体を使用することにより得られる１つの代表的な治療効果は、完全奏効である。単剤療法として投与するか、あるいは他の療法又は治療剤の補助剤として投与するかに拘わらず、固形腫瘍を治療するために本願に記載する抗ＣＤ４０抗体を使用することにより得られる別の代表的な治療効果は、部分奏効である。
【０１１９】
特定の報告システムにより各患者から提供される奏効を表すために、適格と判断された患者の報告に基づくアウトカムスケールを使用することもできる。このようなアウトカムスケールは、対象とする疾患よりも、慢性病態を管理しながら維持される機能について評価するものである。適格と判断された患者の報告に基づくアウトカムスケールの非限定的な１例は、米国国立衛生研究所（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のＰＲＯＭＩＳ（Ｒ）（Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｄ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；患者報告アウトカム測定情報システム）である。例えば、成人がん患者に関するＰＲＯＭＩＳ（Ｒ）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（身体機能評価尺度）は、上肢（例えば巧緻性）、下肢（例えば歩行又は移動性）及び中心部（例えば首、背中の動きやすさ）の機能の自己報告能力を評価することができ、使い走り等の日常活動を含む。
【０１２０】
抗ＣＤ４０抗体療法を施療中のがん患者の全生存期間及び無増悪生存期間を標準治療に比較して推定するためにカプランマイヤー曲線（Ｋａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｓｔａｔ．Ａｓｓｏｃ．１９５８；５３（２８２）：４５７−４８１）を使用することもできる。
【０１２１】
７．６．２．補助療法
抗がん性をもつ他の薬剤又は治療の補助療法として、抗ＣＤ４０抗体を使用してもよい。補助療法として使用する場合には、抗ＣＤ４０抗体と他の薬剤とを単一の併用医薬製剤として製剤化してもよいし、単一の調整された投与レジメン又は異なる投与レジメンで別々に製剤化・投与してもよい。抗ＣＤ４０抗体の補助薬として投与される薬剤は、抗ＣＤ４０抗体と他の薬剤とが相互に悪影響を与えないように、一般的に前記抗体に相補的な作用をもつ。
【０１２２】
抗ＣＤ４０抗体の補助薬として投与することができる薬剤としては、限定されないが、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗体、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害剤、抗増殖剤、抗ウイルス剤、オーロラキナーゼ阻害剤、アポトーシスプロモーター（例えばＢｃｌ−２ファミリー阻害剤）、細胞死受容体経路のアクチベーター、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導）抗体、抗体薬物コンジュゲート、生体応答調節剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、ＤＶＤ、白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＥｒｂＢ２）受容体阻害剤、成長因子阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）−９０阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ホルモン療法、免疫薬、アポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）、インターカレート抗生物質、キナーゼ阻害剤、キネシン阻害剤、Ｊａｋ２阻害剤、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴｏｒ）阻害剤、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、マイトジェン活性化細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ポリＡＤＰ（アデノシン二リン酸）−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、白金系化学療法剤、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤（例えばイブルチニブ、アカラブルチニブ）、ｐｏｌｏ様キナーゼ（Ｐｌｋ）阻害剤、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド／デルトイド、植物アルカロイド、短鎖阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、トポイソメラーゼ阻害剤、ユビキチンリカーゼ阻害剤等、及びこれらの薬剤の１種以上の組合せが挙げられる。
【０１２３】
免疫薬の例としては、限定されないが、インターフェロン、免疫チェックポイント阻害剤及び他の免疫強化剤が挙げられる。インターフェロンとしては、インターフェロンα、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ１ａ、ＡＣＴＩＭＭＵＮＥ（Ｒ）（インターフェロンγ１ｂ）又はインターフェロンγｎ１、その組合せ等が挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤としては、ＰＤ−１（例えばペムブロリズマブやニボルマブ）、ＰＤ−Ｌ１（例えばデュルバルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ及びＭＰＤＬ３２８０Ａ）及びＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４；例えばイピリムマブ、トレメリムマブ）を標的とする抗体が挙げられる。免疫強化剤としては、Ｔ細胞を活性化させる抗ＯＸ４０アゴニスト抗体が挙げられる。ある種の実施形態では、表３に示すヒト化抗ＣＤ４０抗体を、ペムブロリズマブの補助薬として投与する。他のある種の実施形態では、表３に示すヒト化抗ＣＤ４０抗体を、ニボルマブの補助薬として投与する。
【０１２４】
放射線療法の有効性を強化するために、抗ＣＤ４０抗体を使用してもよい。放射線療法の例としては、外部照射療法、内部照射療法（即ち小線源療法）及び全身照射療法が挙げられる。
【０１２５】
７．７．投与量及び投与レジメン
抗ＣＤ４０抗体の投与量は、種々の因子に依存し、限定されないが、治療する固形腫瘍の個々の種類、治療する固形腫瘍のステージ、投与方式、投与頻度、所望の治療効果に加え、患者の年齢、体重及び他の特徴等の他のパラメーター等が挙げられる。特定の投与方式及び投与頻度で治療効果を提供するために有効な投与量を決定することは、当業者がなし得る範囲内である。
【０１２６】
先ず、治療効果を提供するために有効な投与量をインビボ動物モデル又は臨床から推定することができる。広範な疾患に適切な動物モデルが当分野で公知である。
【０１２７】
本願に開示する抗ＣＤ４０抗体は、治療する病態に適した任意の経路で投与することができる。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。抗ＣＤ４０抗体は一般的に非経口投与され、即ち輸液、皮下、筋肉内、静脈内（ＩＶ）、皮内、髄腔内、ボーラス、腫瘍内（ＩＴ）注射又は硬膜外の各経路で投与される（Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９３（６）：１３９０−１４０２）。１実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、バイアルに収容した凍結乾燥粉末として提供される。バイアルは、抗ＣＤ４０抗体２１ｍｇを収容することができる。投与前に、凍結乾燥粉末を注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）又は他の適切な媒体で再構成し、１０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０抗体を含有する溶液とする。所定の実施形態では、再構成した溶液を、生理食塩水又は他の適切な媒体で更に希釈し、ＩＶ輸液により７日に２回、７日に１回、１４日に１回、２１日に１回、２８日に１回、３５日に１回、４２日に１回、４９日に１回、又は５６日に１回投与する。所定の実施形態では、初回サイクルで９０分間かけて輸液を行う。所定の実施形態では、６０分間かけてその後の輸液を行う。他の実施形態では、再構成した溶液を生理食塩水又は他の適切な媒体で更に希釈し、ＩＴ注射により７日に２回、７日に１回、１４日に１回、２１日に１回、２８日に１回、３５日に１回、４２日に１回、４９日に１回、又は５６日に１回投与する。
【０１２８】
代表的な１実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ又は４．０ｍｇ／ｋｇの用量で７日に１回ＩＶ輸液として投与する。
【０１２９】
別の代表的な実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ又は４．０ｍｇ／ｋｇの用量で１４日に１回ＩＶ輸液として投与する。
【０１３０】
別の代表的な実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ又は４．０ｍｇ／ｋｇの用量で２８日に１回ＩＶ輸液として投与する。
【０１３１】
別の代表的な実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ又は２．０ｍｇ／ｋｇの用量で７日に１回ＩＴ注射として投与する。
【０１３２】
別の代表的な実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ又は２．０ｍｇ／ｋｇの用量で１４日に１回ＩＴ注射として投与する。
【０１３３】
別の代表的な実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ又は２．０ｍｇ／ｋｇの用量で２８日に１回ＩＴ注射として投与する。
【０１３４】
他の化学療法剤等の他の薬剤の補助療法として投与する場合には、抗ＣＤ４０抗体を他の薬剤と同一のスケジュールで投与してもよいし、異なるスケジュールで投与してもよい。同一スケジュールで投与する場合には、抗ＣＤ４０抗体を他の薬剤の前に投与してもよいし、後に投与してもよいし、同時に投与してもよい。抗ＣＤ４０抗体を標準治療の補助療法として投与する所定の実施形態では、標準治療を開始する前、例えば標準治療を開始する１日前、数日前、１週間前、数週間前、１カ月前又は数カ月前に抗ＣＤ４０抗体を開始してもよい。
【０１３５】
代表的な１実施形態では、非小細胞肺がんを治療するためにニボルマブ（オプジーボ（Ｒ））の補助薬として抗ＣＤ４０抗体を使用する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ又は４．０ｍｇ／ｋｇの用量で７日に１回ＩＶ輸液により投与する。ニボルマブは、２週間に１回３ｍｇ／ｋｇの用量で６０分間かけて静脈内輸液により投与する。病勢増悪まで又は患者が耐えられなくなるまで前記補助薬抗ＣＤ４０抗体／ニボルマブ療法を続ける。
【０１３６】
別の代表的な実施形態では、非小細胞肺がんを治療するために、ニボルマブ（オプジーボ（Ｒ））の補助薬として抗ＣＤ４０抗体を使用する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ又は４．０ｍｇ／ｋｇの用量で１４日に１回ＩＶ輸液により投与する。ニボルマブは、２週間に１回３ｍｇ／ｋｇの用量で６０分間かけて静脈内輸液により投与する。病勢増悪まで又は患者が耐えられなくなるまで、前記補助薬抗ＣＤ４０抗体／ニボルマブ療法を続ける。
【０１３７】
別の代表的な実施形態では、非小細胞肺がんを治療するためにニボルマブ（オプジーボ（Ｒ））の補助薬として抗ＣＤ４０抗体を使用する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ又は４．０ｍｇ／ｋｇの用量で２８日に１回ＩＶ輸液により投与する。ニボルマブは、２週間に１回３ｍｇ／ｋｇの用量で６０分間かけて静脈内輸液により投与する。病勢増悪まで又は患者が耐えられなくなるまで、前記補助薬抗ＣＤ４０抗体／ニボルマブ療法を続ける。
【０１３８】
別の代表的な実施形態では、非小細胞肺がんを治療するためにニボルマブ（オプジーボ（Ｒ））の補助薬として抗ＣＤ４０抗体を使用する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ又は２．０ｍｇ／ｋｇの用量で７日に１回ＩＴ注射として投与する。ニボルマブは、２週間に１回３ｍｇ／ｋｇの用量で６０分間かけて静脈内輸液により投与する。病勢増悪まで又は患者が耐えられなくなるまで、前記補助薬抗ＣＤ４０抗体／ニボルマブ療法を続ける。
【０１３９】
別の代表的な実施形態では、非小細胞肺がんを治療するためにニボルマブ（オプジーボ（Ｒ））の補助薬として抗ＣＤ４０抗体を使用する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ又は２．０ｍｇ／ｋｇの用量で１４日に１回ＩＴ注射として投与する。ニボルマブは、２週間に１回３ｍｇ／ｋｇの用量で６０分間かけて静脈内輸液により投与する。病勢増悪まで又は患者が耐えられなくなるまで、前記補助薬抗ＣＤ４０抗体／ニボルマブ療法を続ける。
【０１４０】
別の代表的な実施形態では、非小細胞肺がんを治療するためにニボルマブ（オプジーボ（Ｒ））の補助薬として抗ＣＤ４０抗体を使用する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ又は２．０ｍｇ／ｋｇの用量で２８日に１回ＩＴ注射として投与する。ニボルマブは、２週間に１回３ｍｇ／ｋｇの用量で６０分間かけて静脈内輸液により投与する。病勢増悪まで又は患者が耐えられなくなるまで、前記補助薬抗ＣＤ４０抗体／ニボルマブ療法を続ける。
【０１４１】
別の代表的な実施形態では、非小細胞肺がんを治療するためにペムブロリズマブ（キイトルーダ（Ｒ））の補助薬として抗ＣＤ４０抗体を使用する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ又は４．０ｍｇ／ｋｇの用量で７日に１回ＩＶ輸液により投与する。ペムブロリズマブは、３週間に１回２ｍｇ／ｋｇの用量で３０分間かけて静脈内輸液により投与する。病勢増悪まで又は患者が耐えられなくなるまで、前記補助薬抗ＣＤ４０抗体／ペムブロリズマブ療法を続ける。
【０１４２】
別の代表的な実施形態では、非小細胞肺がんを治療するためにペムブロリズマブ（キイトルーダ（Ｒ））の補助薬として抗ＣＤ４０抗体を使用する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ又は４．０ｍｇ／ｋｇの用量で１４日に１回ＩＶ輸液により投与する。ペムブロリズマブは、３週間に１回２ｍｇ／ｋｇの用量で３０分間かけて静脈内輸液により投与する。病勢増悪まで又は患者が耐えられなくなるまで、前記補助薬抗ＣＤ４０抗体／ペムブロリズマブ療法を続ける。
【０１４３】
別の代表的な実施形態では、非小細胞肺がんを治療するためにペムブロリズマブ（キイトルーダ（Ｒ））の補助薬として抗ＣＤ４０抗体を使用する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ又は４．０ｍｇ／ｋｇの用量で２８日に１回ＩＶ輸液により投与する。ペムブロリズマブは、３週間に１回２ｍｇ／ｋｇの用量で３０分間かけて静脈内輸液により投与する。病勢増悪まで又は患者が耐えられなくなるまで、前記補助薬抗ＣＤ４０抗体／ペムブロリズマブ療法を続ける。
【０１４４】
別の代表的な実施形態では、非小細胞肺がんを治療するためにペムブロリズマブ（キイトルーダ（Ｒ））の補助薬として抗ＣＤ４０抗体を使用する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ又は２．０ｍｇ／ｋｇの用量で７日に１回ＩＴ注射として投与する。ペムブロリズマブは、３週間に１回２ｍｇ／ｋｇの用量で３０分間かけて静脈内輸液により投与する。病勢増悪まで又は患者が耐えられなくなるまで、前記補助薬抗ＣＤ４０抗体／ペムブロリズマブ療法を続ける。
【０１４５】
別の代表的な実施形態では、非小細胞肺がんを治療するためにペムブロリズマブ（キイトルーダ（Ｒ））の補助薬として抗ＣＤ４０抗体を使用する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ又は２．０ｍｇ／ｋｇの用量で１４日に１回ＩＴ注射として投与する。ペムブロリズマブは、３週間に１回２ｍｇ／ｋｇの用量で３０分間かけて静脈内輸液により投与する。病勢増悪まで又は患者が耐えられなくなるまで、前記補助薬抗ＣＤ４０抗体／ペムブロリズマブ療法を続ける。
【０１４６】
別の代表的な実施形態では、非小細胞肺がんを治療するためにペムブロリズマブ（キイトルーダ（Ｒ））の補助薬として抗ＣＤ４０抗体を使用する。所定の実施形態において、前記抗ＣＤ４０抗体は、表３に挙げるヒト化抗体のいずれか１種である。前記抗ＣＤ４０抗体を、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ又は２．０ｍｇ／ｋｇの用量で２８日に１回ＩＴ注射として投与する。ペムブロリズマブは、３週間に１回２ｍｇ／ｋｇの用量で３０分間かけて静脈内輸液により投与する。病勢増悪まで又は患者が耐えられなくなるまで、前記補助薬抗ＣＤ４０抗体／ペムブロリズマブ療法を続ける。
【０１４７】
当業者に自明の通り、患者奏効を最適化し、治療効果を最大にするように、上記の種々の薬剤の推奨投与量を調節することが必要な場合がある。
【実施例】
【０１４８】
８．実施例
以下の実施例では、本願に記載する抗ＣＤ４０抗体の代表的な実施形態の所定の特徴と特性について具体的に説明するが、これらの実施例は例証を目的とし、制限を目的とするものではない。
【０１４９】
［実施例１］マウス抗ヒトＣＤ４０抗体の作製
ヒトＣＤ４０を過剰発現するマウス３Ｔ１２細胞をＢａｌｂ／Ｃマウス又はＳＪＬマウスに腹腔内免疫することにより、モノクローナル抗体を作製した。脾臓を摘出し、脾細胞を多発性骨髄腫細胞株ＮＳ０と融合させた。アミノプテリンを使用して、ハイブリドーマを選択した。選択したハイブリドーマのうちでアゴニスト活性をもつ抗ＣＤ４０抗体を発現するものをスクリーニングしてサブクローニングし、個々のクローンを単離した。
【０１５０】
アゴニスト活性をもつ抗体をスクリーニングするには、ＮＦκＢ経路刺激、単球活性化、樹状細胞（ＤＣ）活性化及びＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）競合を含む一連の機能アッセイを実施した。これらのアッセイでは、抗ヒトＣＤ４０  Ｇ２８−５（マウスＩｇＧ１）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を陽性対照とし、アイソタイプを一致させたマウス抗体（ｍＩｇＧ１）を陰性対照とした。
【０１５１】
８．１．１．ＨＥＫ２９３  ｂｌｕｅ  ＣＤ４０  ＮＦκＢレポーターアッセイ
ＤＭＥＭ＋１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）にブラスチシジン３０μｇ／ｍＬとゼオシン１００μｇ／ｍＬとを添加し、ヒトＣＤ４０とＮＦκＢレポーター遺伝子を安定発現するＨＥＫ２９３  ｂｌｕｅ  ＣＤ４０細胞株（ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ）を保持した。ＨＥＫ２９３  ｂｌｕｅ  ＣＤ４０細胞の表面のＣＤ４０を活性化させてシグナル伝達カスケードを開始させ、ＮＦκＢを活性化させることにより、胎盤由来アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を分泌させた。アゴニスト抗ＣＤ４０を含むハイブリドーマ上清を、ＨＥＫ２９３  ｂｌｕｅ  ＣＤ４０細胞２．５×１０５個／ｍＬと共にインキュベートしてＳＥＡＰの産生を刺激し、酵素比色アッセイにより測定した。したがって、ＳＥＡＰ濃度は、ハイブリドーマ上清中の抗ＣＤ４０の活性に対応した。
【０１５２】
８．１．２．単球活性化アッセイ
単球系細胞株ＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ細胞（ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ）を使用して、単球活性アッセイを実施した。この細胞株は、ＮＦκＢとＡＰ−１により誘導されるＳＥＡＰレポーター遺伝子を安定発現するものであり、１０％熱不活化ＦＢＳとゼオシン２００μｇ／ｍＬとを添加したＲＰＭＩ  １６４０にこの細胞株を保持した。このアッセイでは、先ずＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ細胞５×１０５個／ｍＬをＩＦＮγ ４０ｎｇ／ｍＬで２４時間プライミングした後、被験試料と共に更に２４時間インキュベートした。アゴニスト抗ＣＤ４０により誘導されるＳＥＡＰ活性を酵素アッセイによりモニターした。
【０１５３】
８．１．３．一次樹状細胞ＩＬ−１２ｐ７０産生アッセイ
単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）を活性化させる能力についても抗ＣＤ４０クローンをスクリーニングした。ＩＬ−１２ｐ７０産生により活性化をモニターした。先ず、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ密度勾配で分離した。要約すると、健康なヒトドナーに由来する全血を等容量のＰＢＳで希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓをフリットの下（１５ｍＬ）まで入れたＬｅｕｃｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ）チューブに加えた。次に、ブレーキをオフにして血液を１，０００ｇで１５分間遠心した。ＰＢＭＣを採取し、ＰＢＳで１回洗浄し、室温にて１，３００ｒｐｍで５分間遠心し、ＲＰＭＩ  １６４０で１回洗浄した。細胞を培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％熱不活化ＦＢＳ）に再懸濁した。次に、ＳｔｅｍＣｅｌｌ社製エンリッチメントキットを使用してＰＢＭＣから単球を分離し、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦと２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４を添加したＳｔｅｍＳｅｐ無血清培地で３７℃、５％ＣＯ２にて６日間培養した。ＤＣ分化を維持し易くするために３日目に新鮮なＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を培養液に加えた。６日間培養後に、単球由来未成熟ＤＣをＦＡＣＳ解析し、未成熟ＤＣ表現型であるＬｉｎ−、ＣＤ８０／ＣＤ８６＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋又はＣＤ１１ｃ＋を確かめた。未成熟ｍｏＤＣをＩＦＮγでプライミングし、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を添加したＳｔｅｍＳｅｐ無血清培地中で抗ＣＤ４０抗体を含む試料により４８時間刺激した。培養上清を回収し、市販のＥＬＩＳＡキットによりＩＬ−１２ｐ７０産生についてアッセイした。スクリーニング結果と代表的な活性を表１−１にまとめる。
【０１５４】
表１−１は、単離したハイブリドーマ全体のアゴニスト抗ＣＤ４０活性の範囲を示す。全ての新規クローンは、文献に記載のＣＤ４０抗体Ｇ２８−５と同等の単球活性化を示した（例えばＢｉｓｈｏｐ，Ｇ．Ａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８８，４１２７−４１２９（２０１２）参照）。クローンＡＤ１６６．４．４及びＡＤ１７５．１４．１１は、単球活性化を実証したが、樹状細胞活性化を示さなかった。その他のクローンは、Ｇ２８−５と同等の単球活性化と、Ｇ２８−５に比較して強い樹状細胞活性化を示した。
【０１５５】
【表９】
2019523221.tif 000013
【０１５６】
標準ＰＣＲ技術を使用して、ハイブリドーマＡＤ１６３．９．３、ＡＤ１６６．４．４、ＡＤ１７５．１４．１１、ＡＤ１６３．１０．７、ＡＤ１６５．１．２、ＡＤ１６３．１６２．１、ＡＤ１６３．２７．１２、ＡＤ１６３．７．２、ＡＤ１６４．１４．６及びＡＤ１６４．７６．３から夫々１０種類のモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、標準ＤＮＡシーケンシング技術を使用して配列決定した。これらのＤＮＡによりコードされる対応する全長抗体アミノ酸配列を図２Ａ〜２Ｃに示す。
【０１５７】
［実施例２］マウス抗ヒトＣＤ４０抗体のエピトープ分類
ＢＩＡｃｏｒｅ解析とＥＬＩＳＡ法を使用し、ＣＤ４０との結合に関して相互間で又はＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）と競合する能力に基づいて、マウス抗ヒトＣＤ４０アゴニスト抗体を分類した。
【０１５８】
ＢＩＡｃｏｒｅ解析は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００装置を使用して１２℃で実施した。先ず、ヤギ抗マウスＦｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，ｃａｔ＃  ３１１７０）をＣＭ５センサーチップに固定化した後、第１の試験抗体を表面に捕捉させた。マウスアイソタイプ抗体カクテル５０μｇ／ｍＬによりブロッキング後、ヒトＣＤ４０（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＭａｒｔ，ｃａｔ＃  ＣＤ４０２２２１Ｈ）の可溶型の細胞外ドメインをフローセルに注入した。次に、第２の試験抗体又はＣＤ４０Ｌ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ｃａｔ＃  ０３０８１４５）を注入し、ＣＤ４０と第１の試験抗体との複合体に対する結合を測定した。表２−１に示すように、本開示の抗ＣＤ４０抗体は、３つのエピトープ群に分類された。エピトープ群１は、ＡＤ１６３．７．２（「ｍｕＡｂ８」）とＡＤ１７５．１４．１１（「ｍｕＡｂ３」）とに代表され、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との結合を阻害した。エピトープ群２は、クローンＡＤ１６３．１６２．１（「ｍｕＡｂ６」）とＡＤ１６３．２７．１２（「ｍｕＡｂ７」）とから決定され、ＣＤ４０Ｌ又はエピトープ群１の抗体と競合しなかった。第３のエピトープ群は、クローンＡＤ１６３．９．３（「ｍｕＡｂ１」）、ＡＤ１６６．４．４（「ｍｕＡｂ２」）及びＡＤ１６５．１．２（「ｍｕＡｂ５」）に代表され、ＣＤ４０との結合に関してＣＤ４０Ｌと競合しないが、エピトープ群１及び２の抗体と競合した。
【０１５９】
【表１０】
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【０１６０】
ヒトＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用に及ぼす抗ＣＤ４０抗体の効果を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。要約すると、ＣＤ４０−ヒトＦｃ（ｈｕＦｃ）融合タンパク質（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＭａｒｔ）を抗ＣＤ４０抗体又はアイソタイプ対照抗体と混合し、ＨＡタグ付きＣＤ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をコーティングした９６ウェルプレートに加えた。ＣＤ４０−ｈｕＦｃ複合体とプレートに固定化したＣＤ４０Ｌとの結合をＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により検出した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質で発色後に、プレートをＯＤ４５０で読取った。
【０１６１】
抗ＣＤ４０抗体を含む試料中のＯＤ４５０とアイソタイプ対照抗体を含む試料中のＯＤ４５０との比（「ＯＤ４５０比」）を計算することにより、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用に及ぼす抗ＣＤ４０抗体の効果を判定した。ＯＤ４５０比が≦０．１であるならば、ヒトＣＤ４０ＬとヒトＣＤ４０との結合が阻害されたと判断した。ＯＤ４５０比が０．１〜１であるならば、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との結合の部分的阻害を生じたと判断した。ＯＤ４５０比が＞１であるならば、ヒトＣＤ４０ＬとヒトＣＤ４０との結合が強化され、その結果、ＣＤ４０シグナル伝達が強化されたと判断した。
【０１６２】
データを表２−２にまとめる。抗体ｍｕＡｂ８及びｍｕＡｂ３は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの結合を阻害し、０．１未満の比を示した。抗体ｍｕＡｂ６及びｍｕＡｂ７は、約０．５の比を示し、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用に若干の効果があることが示唆された。抗体ｍｕＡｂ１、ｍｕＡｂ２、ｍｕＡｂ４、ｍｕＡｂ５、ｍｕＡｂ９及びｍｕＡｂ１０は、ＯＤ４５０比が約１又は１よりも大きく、効果がないか又はＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの結合を助長する効果があると判断された。
【０１６３】
【表１１】
2019523221.tif 000015
【０１６４】
［実施例３］マウス抗ヒトＣＤ４０抗体のヒト化
Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９；８６：１００２９−１００３３）に概説されているように、抗体Ｖ領域のヒト化を実施した。Ｈｕａｎｇら（Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５；３６：３５−４２）に従って、ＣＤＲのカノニカル構造を決定した。同一又はほぼ同様のＣＤＲカノニカル構造をもつヒト生殖細胞系列可変領域配列を同定し、抗ＣＤ４０可変領域のフレームワークを提供するために適切なヒトＶＨ、ＶＬ及びＪセグメント配列を選択した。コンピューターモデルによりＣＤＲとの有位接触が示唆されたフレームワーク位置で、元のヒトフレームワークアミノ酸をマウス抗ＣＤ４０Ｖ領域に由来するアミノ酸に置換した（復帰突然変異）。特に指定しない限り、天然変異Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを含む重鎖とκ軽鎖とをもつヒトＩｇＧ１の定常領域を使用した。ヒト化抗体のＶＨ領域とＶＬ領域との全長アミノ酸配列を、図２Ｄ〜２Ｇに示す。
【０１６５】
上記方法に従って抗ＣＤ４０クローンＡＤ１６３．１６２．１（「ｍｕＡｂ６」）をヒト化した。ヒト化型のｍｕＡｂ６をｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ６−２及びｈｕＡｂ６−３とした。抗体ｈｕＡｂ６−１には、ＶＨ（配列番号１１０）フレームワーク復帰突然変異Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ及びＡ７１Ｖを導入した。抗体ｈｕＡｂ６−２にはＶＨ（配列番号１１１）フレームワーク復帰突然変異Ｍ４８Ｉ及びＡ７１Ｖを導入した。抗体ｈｕＡｂ６−３にはＶＨ（配列番号１１２）フレームワーク復帰突然変異Ｍ４８Ｉ及びＡ７１Ｖを導入し、更にヒト生殖細胞系列配列との一致度を増すためにＶＨＣＤＲ生殖細胞系列置換Ｎ６０Ａ、Ｋ６４Ｑ及びＤ６５Ｇを導入した。抗体ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ６−２及びｈｕＡｂ６−３にはＶＬ（配列番号１６１）フレームワーク復帰突然変異Ａ４３Ｓ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ及びＦ７１Ｙを導入した。
【０１６６】
ヒト化型の抗ＣＤ４０クローンＡＤ１６３．７．２（「ｍｕＡｂ８」）をｈｕＡｂ８−１、ｈｕＡｂ８−２及びｈｕＡｂ８−３とした（図２Ｄ〜２Ｅ）。抗体ｈｕＡｂ８−１にはＶＨ（配列番号１１３）フレームワーク復帰突然変異Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｖ、Ｋ７３Ｒ、Ｙ９１Ｆ及びＲ９４Ｓを導入した。抗体ｈｕＡｂ８−２にはＶＨ（配列番号１１４）フレームワーク復帰突然変異Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｖ、Ｋ７３Ｒ、Ｙ９１Ｆ及びＲ９４Ｓと、ＶＨ  ＣＤＲ  Ｃ５９Ｓ突然変異を導入した。抗体ｈｕＡｂ８−３にはＶＨ（配列番号１１５）フレームワーク復帰突然変異Ｍ４８Ｉ、Ａ７１Ｖ及びＲ９４Ｓを導入した。抗体ｈｕＡｂ８−１、ｈｕＡｂ８−２及びｈｕＡｂ８−３にはいずれもＶＬ（配列番号１６２）フレームワーク復帰突然変異Ａ４３Ｓ及びＹ８７Ｆを導入した。
【０１６７】
抗ＣＤ４０クローンＡＤ１６４．１４．６（「ｍｕＡｂ９」）をヒト化し、ｈｕＡｂ９−１、ｈｕＡｂ９−２、ｈｕＡｂ９−３、ｈｕＡｂ９−４、ｈｕＡｂ９−５及びｈｕＡｂ９−６とした。抗体ｈｕＡｂ９−１及びｈｕＡｂ９−４は、ＶＨ（配列番号１１６）フレームワーク復帰突然変異Ｉ４８Ｍ、Ｖ６７Ｉ及びＶ７１Ｒを示した。抗体ｈｕＡｂ９−２及びｈｕＡｂ９−５にはＶＨ（配列番号１１７）フレームワーク復帰突然変異Ｉ４８Ｍ及びＶ７１Ｒを導入した。抗体ｈｕＡｂ９−３及びｈｕＡｂ９−６にはＶＨ（配列番号１１８）フレームワーク復帰突然変異Ｉ４８Ｍ及びＶ７１Ｒを導入し、ヒト生殖細胞系列配列との一致度を改善するために更に２カ所のＣＤＲ生殖細胞系列置換Ｔ３０Ｓ及びＮ６５Ｓを導入した。抗体ｈｕＡｂ９−１、ｈｕＡｂ９−２及びｈｕＡｂ９−３にはＶＬ（配列番号１６３）フレームワーク復帰突然変異Ｉ２Ａ、Ｙ３６Ｆ及びＹ８７Ｆを導入した。抗体ｈｕＡｂ９−４、ｈｕＡｂ９−５及びｈｕＡｂ９−６にはＶＬ（配列番号１６４）フレームワーク復帰突然変異Ｉ２Ａを導入した。ＶＬのフレームワーク復帰突然変異Ｉ２Ａを元に戻すことにより、軽鎖の２位に存在するシグナルペプチド切断部位を除去するようにクローンＡＤ１６４．１４．６を更に改変した。抗体ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ及びｈｕＡｂ９Ａ２ＶはＶＨ（配列番号１１７）と、夫々フレームワーク復帰突然変異Ａ２Ｉ（配列番号１７０）及びＡ２Ｖ（配列番号１７１）を導入したＶＬをもつようにし、望ましくない切断産物が形成されないようにした。
【０１６８】
本実施例のヒト化抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域とκ軽鎖定常領域とを含むように作製した。Ｃ末端リジンは、ヒトＩｇＧ１重鎖のタンパク質発現後に翻訳後プロセシングにより部分的に切断することができる。したがって、ｈｕＡｂ９−５は、配列番号１３０又は１３１の重鎖と、配列番号１４０の軽鎖とを有していた。抗体ｈｕＡｂ９−５には更に重鎖定常領域にＶ２７３Ｅ及びＶ２７３Ｙアミノ酸突然変異を導入し、夫々配列番号１３２又は１３３及び配列番号１３４又は１３５の重鎖と、配列番号１４０の軽鎖とを有するように作製した。抗体ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ及びｈｕＡｂ９Ａ２Ｖは、ヒトＩｇＧ１Ｖ２７３Ｅ重鎖定常領域を含むように作製した。したがって、ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉは、配列番号１３２又は１３３の重鎖と、配列番号１４１の軽鎖とを有していた。同様に、ｈｕＡｂ９Ａ２Ｖは配列番号１３２又は１３３の重鎖と、配列番号１４２の軽鎖とを有していた。
【０１６９】
［実施例４］ヒト化抗ヒトＣＤ４０抗体の特性決定
ヒト化抗ＣＤ４０抗体が親マウス抗体のアゴニスト特性及び他の望ましい特性を維持していることを検証するために、一連の特性決定アッセイを実施し、本開示のヒト化抗体のＮＦκＢ活性化、ＣＤ４０結合キネティクス、種間交差反応性及びエピトープ分類を判定した。
【０１７０】
８．４．１．ＮＦκＢ活性化
本発明のヒト化抗ＣＤ４０抗体によるＮＦκＢ活性化をＨＥＫ２９３  ｂｌｕｅ  ＣＤ４０  ＮＦκＢレポーター細胞において評価した。ＯＤ６５５で測定したＳＥＡＰ（胎盤由来分泌型アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子活性として活性化を表した。最大ＯＤ６５５測定値と、最大活性化の５０％（ＥＣ５０）の濃度を表４−１にまとめる。
【０１７１】
【表１２】
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【０１７２】
８．４．２．ＣＤ４０結合キネティクス及び種間交差反応性
本願に開示するヒト化抗ＣＤ４０抗体の結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ及びフローサイトメトリー解析により解析した。
【０１７３】
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００装置を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより、ＣＤ４０結合キネティクスを解析した。要約すると、ヤギ抗マウスＦｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，ｃａｔ＃  ３１１７０）又はヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，ｃａｔ＃３１１２５）をＣＭ５センサーチップに固定化した後、試験表面に抗ＣＤ４０抗体を捕捉させた。次に、ヒトＣＤ４０（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＭａｒｔ，ｃａｔ＃  ＣＤ４０２２２１Ｈ）又はカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ４０（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＭａｒｔ，ｃａｔ＃  ＣＤ４０−８８２４Ｃ）の可溶型の細胞外ドメインを注入し、結合と解離を測定した。
【０１７４】
表面プラズモン共鳴データによると、ヒト化抗体ｈｕＡｂ８−１、ｈｕＡｂ９−５、ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ及びｈｕＡｂ９Ａ２Ｖはその親クローンＡＤ１６３．７．２（「ｍｕＡｂ８」）又はクローンＡＤ１６４．１４．６（「ｍｕＡｂ９」）と同等の結合親和性（ＫＤ）を維持し、ヒト又はカニクイザルＣＤ４０に対して同等の結合を示した（表４−２）。
【０１７５】
【表１３】
2019523221.tif 000017
【０１７６】
ヒト又はカニクイザルＣＤ４０を安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞上と、カニクイザル又はヒトＰＢＭＣに由来するＢ細胞上の細胞表面ＣＤ４０との結合についてもヒト化抗ＣＤ４０抗体を評価した。トランスフェクションに供するＨＥＫ２９３細胞と共にヒト化抗ＣＤ４０抗体を１５分間氷上でインキュベートし、蛍光標識抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で結合を検出した。細胞のＦＡＣＳ解析によると、ヒト化抗体はヒト及びカニクイザルＣＤ４０安定細胞株と結合していることが確認された。一方、マウス、ラット又はイヌＣＤ４０で実施した同様の実験で結合は観察されなかった。
【０１７７】
ヒト及びカニクイザルＣＤ４０を発現する一次細胞と結合する能力についても、抗ＣＤ４０抗体を評価した。ヒト又はカニクイザル血液から分離したＰＢＭＣを、蛍光色素ＣＦ６４０Ｒで標識した抗ＣＤ４０抗体と共にインキュベートした。ＦＡＣＳ解析後、データをＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）ソフトウェアにより解析した。これらの結果によると、ヒト化抗体は、ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣの両者に由来するＣＤ４０陽性一次細胞と結合していることが判明した。
【０１７８】
８．４．３．エピトープ分類
フローサイトメトリー解析及びＥＬＩＳＡ法を使用し、ＣＤ４０との結合に関して相互間で又はＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）と競合する能力に基づいてヒト化アゴニスト抗ＣＤ４０抗体を分類した。
【０１７９】
抗体がヒトＣＤ４０との結合に関して別の抗体と競合するか否かを評価するために、フローサイトメトリー解析を実施した。このアッセイでは、完全ヒトＩｇＧ２抗ヒトＣＤ４０抗体クローン２１．４．１（Ｇｌａｄｕｅ，ＲＰ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１１；６０：１００９−１７及び米国特許第７，６１８，６３３号参照）から作製したＣＰ−８７０，８９３を参照抗体として使用した。ＣＰ−８７０，８９３の重鎖及び軽鎖は、夫々以下の通りであった。
【０１８０】
【化１】
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【０１８１】
ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ８−１、ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ及びＣＰ−８７０，８９３を含む全ての抗ＣＤ４０ヒト型又はヒト化抗体を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ＡＦ）−４８８で標識した。他の未標識抗ＣＤ４０抗体の量を０．５ｎｇ／ｍＬから５０μｇ／ｍＬまで増加させながら１μｇ／ｍＬの一定濃度の各蛍光標識抗体と混合し、ヒトＣＤ４０を安定発現するＨＥＫ２９３細胞と共にインキュベートした。次に、蛍光標識抗体の結合を、フローサイトメトリーによりモニターした。
【０１８２】
平均蛍光強度（ＭＦＩ）の用量依存的低下により同定した競合抗体と、ＭＦＩの安定により同定した非競合抗体とを、表４−３にまとめる。ｈｕＡｂ６−１はヒトＣＤ４０との結合に関してｈｕＡｂ８−１と競合しなかったが、ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ及びＣＰ−８７０，８９３はいずれもｈｕＡｂ６−１及びｈｕＡｂ８−１と競合した。更に、ｈｕＡｂ９Ａ２ＩとＣＰ−８７０，８９３は相互に競合した。
【０１８３】
【表１４】
2019523221.tif 000019
【０１８４】
実施例２に記載したように、抗ＣＤ４０抗体とＣＤ４０の複合体と、プレートに固定化したＣＤ４０Ｌとの結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイにより、本発明のヒト化抗体のエピトープ分類を更に確認した。このアッセイでは、上記のように作製したＣＰ−８７０，８９３を、参照抗ＣＤ４０抗体として使用した。抗ＣＤ４０抗体又はヒトＩｇＧ１（ｈｕＩｇＧ１）対照抗体の量を増しながら、１μｇ／ｍＬのＣＤ４０−ｈｕＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートし、ＣＤ４０Ｌをコーティングしたプレートに加えた。図３に示すように、ヒト化抗体ｈｕＡｂ８−１及びｈｕＡｂ８−３はＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの相互作用を阻害し（左上）、ｈｕＡｂ６−１及びｈｕＡｂ６−２はＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用に最低の効果を示し（右上）、ｈｕＡｂ９−５及びｈｕＡｂ９−６はＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの結合を助長した（左下）。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用に最低の効果を示したＣＰ−８７０，８９３と比較すると、ヒト化抗体ｈｕＡｂ９Ａ２ＩもＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの結合を助長した（右下）。
【０１８５】
結果は、ＣＤ４０Ｌを発現する細胞によるフローサイトメトリーアッセイで得られた結果と一致した（図４）。ＣＤ４０Ｌ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を蛍光色素Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識した１μｇ／ｍＬの一定濃度の可溶性ヒトＣＤ４０タンパク質と共にインキュベートした。蛍光色素で標識したＣＤ４０とＪｕｒｋａｔ細胞表面ＣＤ４０Ｌとの結合を、ヒト化抗体ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉと参照抗ＣＤ４０抗体ＣＰ−８７０，８９３の存在下でフローサイトメトリー解析により測定した。試料中のｈｕＡｂ９Ａ２Ｉの量が増加すると蛍光強度の増加が検出されたが、参照抗体ＣＰ−８７０，８９３では検出されなかった。これらの結果によると、ｈｕＡｂ９Ａ２ＩはＣＤ４０とＣＤ４０Ｌ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞との結合を助長するが、参照ＣＰ−８７０，８９３はこれを助長しないと思われた。
【０１８６】
ＣＤ４０を発現する細胞とＣＤ４０Ｌを発現する細胞とを含むアッセイにおいて、ＣＤ４０Ｌにより駆動されるＣＤ４０シグナル伝達に及ぼすｈｕＡｂ９Ａ２Ｉの機能的影響についても検討した。ＣＤ４０を発現する細胞（セクション８．１．１に記載したＨＥＫ２９３  ｂｌｕｅ  ＣＤ４０  ＮＦκＢレポーター細胞）を、ＣＤ４０Ｌ−Ｊｕｒｋａｔ細胞又はＣＤ４０Ｌ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞と１：１の比で混合し、３μｇ／ｍＬのｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ、ＣＰ−８７０，８９３又は対照抗体と共にインキュベートした。セクション８．４．１に記載したような比色アッセイを利用して、ＳＥＡＰレポーター活性によりＣＤ４０シグナル伝達を測定した。ＣＤ４０レポーター細胞を、ＣＤ４０Ｌ−Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養した処（図５Ａ）、ＣＤ４０シグナル伝達は、ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ又はＣＰ−８７０，８９３の添加後のみに有位に亢進したが、対照抗体で処理した場合又は無添加の場合には亢進しなかった。どちらの抗体もＣＤ４０を活性化させたが、これらの条件下でＣＤ４０の刺激においてｈｕＡｂ９Ａ２ＩはＣＰ−８７０，８９３よりも有意に強力ではなかった。ＣＤ４０レポーター細胞をＣＤ４０Ｌ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養した処（図５Ｂ）、ＳＥＡＰレポーター活性により判断すると、細胞表面ＣＤ４０ＬはＣＤ４０を活性化させた。ＣＰ−８７０，８９３で処理した場合にはＣＤ４０活性シグナル伝達はそれ以上亢進せず、ＳＥＡＰレポーター活性は、対照ｈｕＩｇＧ１又はｈｕＩｇＧ２アイソタイプ又は無抗体（培地のみ）による処理と同等であった。一方、ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉで処理すると、ＣＤ４０シグナル伝達は更に亢進し、レポーター活性はＣＰ−８７０，８９３及び対照による処理よりも有位に高かった（ｐ＜０．００１）。
【０１８７】
これらのデータによると、細胞表面ＣＤ４０を飽和量の細胞表面ＣＤ４０Ｌにより活性化させた場合、ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉは、等価量の公知抗ＣＤ４０抗体であるＣＰ−８７０，８９３と比較して下流のＮＦκＢシグナル伝達を強化することによりＣＤ４０活性化を更に亢進させることが分かった。
【０１８８】
［実施例５］抗ＣＤ４０抗体のＦｃ領域変異体
ＦｃγＲＩＩＢ結合を強化するようにＦｃ領域を改変することにより、ＣＤ４０のアゴニスト活性を増大させることができる（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１；３３３：１０３０−１０３４；及びＷｈｉｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１１；１８７：１７５４−１７６３）。ヒトＩｇＧ１定常領域の２７３位の２種類の突然変異Ｖ２７３Ｅ及びＶ２７３Ｙをヒト化抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ８−１、ｈｕＡｂ９−５及びｈｕＡｂ９Ａ２Ｉに導入した。Ｆｃγ受容体との結合に及ぼすＦｃ突然変異の影響をＦＡＣＳ解析と抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）によりモニターした。Ｆｃを改変したヒト化抗ＣＤ４０のアゴニスト活性をＮＦ−ｋＢレポーター、Ｂ細胞、単球由来ＤＣ及びＴ細胞の活性化によりモニターした。
【０１８９】
８．５．１．Ｆｃγ受容体結合及びＡＤＣＣ機能
抗ＣＤ４０ヒトＩｇＧ１抗体及びそれらのＦｃ変異体の量を増加させながら、Ｆ又はＶ多形をもつＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）及びＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）を含む種々のヒトＦｃγ受容体を安定発現するＣＨＯ細胞と共にインキュベートした。蛍光標識した抗ヒトＦ（ａｂ’）２特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により結合を検出した。突然変異Ｖ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）との結合を維持すると共にＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）又はＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）との結合を強化しながら、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ｆ又はＶ）との結合を低減させた（図６Ａ〜６Ｂ）。
【０１９０】
標準プロトコールを使用して、ヒト化抗ＣＤ４０抗体のＦｃ変異体のＡＤＣＣを測定した（Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：８３３１−８）。１例では、ＲＬ細胞において定常領域変異体Ｖ２７３Ｅ又はＶ２７３ＹのＡＤＣＣは抗体ｈｕＡｂ９−５の野生型ＩｇＧ１に比較して低下した（図７）。
【０１９１】
８．５．２．ＦｃγＲ結合によるアゴニスト活性上昇
抗ＣＤ４０のアゴニスト活性に及ぼすＦｃγ受容体結合の影響を評価するために、ｈｕＩｇＧ１Ｖ２７３Ｅ突然変異を加えたｈｕＡｂ９Ａ２Ｉを使用し、種々のヒトＦｃγ受容体を安定発現するＣＨＯ細胞と共培養したＨＥＫ２９３  ｂｌｕｅ  ＣＤ４０  ＮＦκＢレポーター細胞を処理し、ＮＦκＢ活性をモニターした。表５−１に示すように、ＮＦκＢ活性化の刺激におけるＣＰ−８７０，８９３のアゴニスト活性は、Ｆｃγ受容体結合に依存しなかったが、ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉのアゴニスト活性は、Ｆｃγ受容体結合に依存性であることが分かった。レポーター細胞を、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ又はＣＤ６４を発現するＣＨＯ細胞と共培養すると、Ｆｃγ受容体を発現しないか又はＣＤ１６ＶもしくはＣＤ１６Ｆを発現するＣＨＯ細胞と共培養した場合に比較して、ＮＦκＢ活性の刺激におけるｈｕＡｂ９Ａ２Ｉの効力は１０倍であった。
【０１９２】
【表１５】
2019523221.tif 000020
【０１９３】
８．５．３．Ｂ細胞増殖に及ぼすＦｃ変異体の影響
抗ＣＤ４０のアゴニスト活性に及ぼすＦｃＶ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙ突然変異の影響もＢ細胞増殖アッセイにより評価した。このアッセイでは、Ｂ細胞エンリッチメントキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してネガティブセレクションによりヒトＢ細胞を集積させた。９６ウェルプレートにＡＩＭ−Ｖ無血清培地（ＧＩＢＣＯ）を注ぎ、精製したＢ細胞をウェル当たり２００μＬとなるように５×１０５個／ｍｌの密度で播種した。系列希釈した抗ＣＤ４０抗体を加え、Ｂ細胞と共に６日間培養した。最後の１６時間の培養では、Ｈ３ＴｄＲ  １μＣｉを培養液の各ウェルに加え、Ｈ３ＴｄＲ取り込みによりＢ細胞増殖を判定した。Ｈ３ＴｄＲ取り込みに伴う放射能をシンチレーションカウンターにより毎分カウント（ＣＰＭ）として記録した。対応するヒトＩｇＧ１野生型抗体に比較して、抗ＣＤ４０（ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ８−１及びｈｕＡｂ９−５）ヒトＩｇＧ１Ｆｃ変異体Ｖ２７３Ｅ及びＶ２７３Ｙは、Ｂ細胞活性化の亢進を示した（図８）。一方、ＣＰ−８７０，８９３に比較した場合、ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ（ヒトＩｇＧ１Ｖ２７３Ｅ）は、Ｂ細胞増殖の刺激において約１０分の１の効力を示した（右下グラフ）。
【０１９４】
８．５．４．ＤＣ  ＩＬ−１２ｐ７０産生に及ぼすＦｃ変異体の影響
ＩＬ−１２ｐ７０を読取り値として使用して、抗ＣＤ４０のアゴニスト活性に及ぼすＦｃＶ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙ突然変異の影響を、ＤＣ活性化アッセイにより更に評価した。このアッセイでは、先ずヒトＰＢＭＣから精製した単球から未成熟ＤＣを誘導し、ＩＬ４とＧＭ−ＣＳＦで処理した。ＩＦＮγでプライミング後にＤＣ成熟とＩＬ−１２ｐ７０産生とを、抗ＣＤ４０により誘導した。Ｖ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙ  Ｆｃ突然変異体は、ＩＬ−１２ｐ７０産生を亢進させることによりＤＣ活性化の効力を増加した。図９に示すように、ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ変異体Ｖ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙを含むｈｕＡｂ６−１（左上）、ｈｕＡｂ８−１（右上）及びｈｕＡｂ９−５（左下）は、野生型ｈｕＩｇＧ１を示すそれらの対応する抗体に比較してＩＬ−１２ｐ７０産生の増加を示した。ｈｕＡｂ６−１及びｈｕＡｂ８−１では、ｈｕＩｇＧ１Ｖ２７３Ｙ突然変異を含む変異体は、Ｖ２７３Ｅ突然変異を含む変異体よりもインビトロＩＬ−１２ｐ７０産生を増加させるのに有効であった。ｈｕＡｂ９−５では、ｈｕＩｇＧ１Ｖ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙを含む変異体は、同等の効力を示した。ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ（右下グラフ）の場合には、ｈｕＩｇＧ１Ｖ２７３Ｅ突然変異を含む変異体はＤＣを刺激してＩＬ−１２ｐ７０を産生させるのにＣＰ−８７０，８９３と同等の効力を示した。
【０１９５】
８．５．５．同種ＤＣ及びＴ細胞共培養におけるＴ細胞活性化に及ぼすＦｃ変異体の影響
抗ＣＤ４０がＤＣ等の抗原提示細胞を刺激することによりＴ細胞活性化を駆動できることを実証するために、抗ＣＤ４０  Ｆｃ変異体を同種ＤＣ及びＴ細胞共培養で試験した。このアッセイでは、先ず上記方法を使用して樹状細胞（５×１０３個）を単球から誘導した後、別のドナーから精製したＴ細胞１×１０５個と混合した。野生型ヒトＩｇＧ１定常領域又はそのＦｃ変異体Ｖ２７３Ｙを含む抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ８−１又はｈｕＡｂ９−５を種々の量でＤＣとＴ細胞の共培養物に加えた。４日間インキュベーション後に、上清を採取し、ＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１９６】
図１０は、２組の異なるドナーペアに由来する細胞の共培養においてＩＦＮ−γ産生の増加を示した代表的な抗体を示す。各場合に、ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ８−１及びｈｕＡｂ９−５のＶ２７３Ｙ変異体はアイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１抗体と比較してＩＦＮ−γの有位な増加により明らかなようにＴ細胞活性化を示した。
【０１９７】
［実施例６］抗ＣＤ４０抗体のインビボ抗腫瘍活性
野生型ヒトＩｇＧ１又はＦｃ変異体を含むヒト化抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ９−５及びｈｕＡｂ９Ａ２Ｉが前立腺ＰＣ３腫瘍をもつＮＳＧマウスにおいてヒト免疫細胞の存在下で腫瘍成長を抑制する能力について評価した。
【０１９８】
ＮＳＧマウスにＰＣ３細胞（１×１０６個）と精製Ｔ細胞（５×１０５個）と自家ＤＣ（１×１０５個）との混合物を皮下接種した。接種直後に、抗ＣＤ４０抗体又は対照抗体を、１ｍｇ／ｋｇの用量で単回腹腔内注射した。腫瘍体積を、１日おきにキャリパーで測定した。ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ９−５、ｈｕＡｂ９Ａ２Ｉ及びそれらのＦｃ変異体Ｖ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙを含む抗ＣＤ４０抗体は、図１１に示すようにＰＣ３モデルでアイソタイプ対照抗体に比較して腫瘍成長を抑制した。
【０１９９】
［実施例７］マウス同系腫瘍モデルにおける概念実証試験
本開示の代表的な抗ＣＤ４０抗体はマウスＣＤ４０と結合しないため、マウスＣＤ４０アゴニスト抗体１Ｃ１０ｍｕＩｇＧ１を使用してマウスにおける薬理効果の評価を行った。上記ｈｕＩｇＧ１ＦｃＶ２７３Ｅ突然変異と同様に、マウスＩｇＧ１（ｍｕＩｇＧ１）Ｆｃを含む１Ｃ１０は、ｍｕＦｃγＲＩＩＢと強い結合を示し、ヒトＦｃγＲＩＩＩとの機能的等価物であるｍｕＦｃγＲＩ及びｍｕＦｃγＲＩＶとは最低の結合を示した。本開示の抗ＣＤ４０抗体と同様に、１Ｃ１０ｍｕＩｇＧ１は、マウス脾臓Ｂ細胞活性化をインビトロ及びインビボで刺激するのに効力を示した。そこで、マウスＩｇＧ１定常領域をもつ抗マウスＣＤ４０抗体１Ｃ１０を概念実証分子として使用し、腫瘍内送達又は抗ＰＤ−１抗体の同時投与による併用療法の使用を含む潜在的臨床開発の糸口を探った。
【０２００】
８．７．１．腫瘍内投与
マウスに両側皮下腫瘍を作製したＣＴ２６同系モデルを使用し、腫瘍内投与について検討した。０日目に雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスの左右後部脇腹に１匹当たり生存細胞（１×１０５個）を皮下接種した。１２日目に各群１０匹ずつランダムに分けた。投与開始時の右脇腹の平均腫瘍体積は、約８５ｍｍ３であった。最初の投与から２４時間後に、血清中ＡＬＴ値を評価するために各群３匹を屠殺した。残りの動物を両側の腫瘍の成長についてモニターした。週２回腫瘍体積を測定した。電子キャリパーにより腫瘍の長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）及び高さ（Ｈ）を測定し、次式：Ｌ×Ｗ×Ｈ／２に従って体積を計算した。抗体投与はランダム化の直後に開始した。
【０２０１】
片方の腫瘍に抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０を（３ｍｇ／ｋｇを週に２〜３回）直接注射すると、注射部位（「ＩＴ投与」）と遠位部位（「非ＩＴ投与」）の両方で腫瘍成長が抑制され、全身抗腫瘍免疫が生じたことが示唆された（図１２）。ＶｅｔＳｃａｎ（Ａｂａｘｉｓ  Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により肝酵素ＡＬＴを測定することにより肝毒性をモニターした。抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０の腫瘍内（ＩＴ）投与では全身腹腔内（ＩＰ）投与よりもＡＬＴ上昇が少なかった。
【０２０２】
８．７．２．抗ＰＤ−１抗体の同時投与による併用療法
０日目に雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの右脇腹に１匹当たり生存細胞１×１０５個を皮下接種することによりＣＴ２６腫瘍を作製した。１５日目に動物をランダムにグループ分けした。抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０（０．６ｍｇ／ｋｇ）を商業製品である抗ＰＤ１  ｍｕＩｇＧ２ａ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）と併用してＣＴ２６同系マウスモデルに週２回ＩＰ投与した。併用投与レジメンは、有意な抗腫瘍活性を示し（１０匹中の７匹が腫瘍退縮を示したが、対照では０匹、抗ＰＤ１又は抗ＣＤ４０投与群では各々１０匹中１匹）、この併用の成果を裏付けた（図１３）。
【０２０３】
このモデルで単剤療法の治療用量よりも低用量である０．６ｍｇ／ｋｇで、抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０の投与を行った。場合により、抗腫瘍効力レベルを各モノクローナル抗体のこのような用量に維持すると、例えば肝酵素濃度により実証されるように、毒性を低下させることができる。この実験では、併用投与により肝酵素濃度、脾臓重量、又はＴＮＦαやＩＬ−６等のサイトカイン濃度は増加しなかった（図１４）。肝酵素濃度はＶｅｔＳｃａｎにより測定し、サイトカイン濃度はＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  Ｍａｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｋｉｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で測定した。
【０２０４】
本願に引用する全ての刊行物、特許、特許出願及び他の文献はその内容全体を全目的で本願に援用するものであり、個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文献を全目的で援用すると個別に明示しているものとみなす。
【０２０５】
以上、種々の特定の実施形態について具体的に説明・記載したが、当然のことながら、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り、種々の変更を加えることができる。
【図１】
2019523221.tif 000027
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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