(57)【要約】  本明細書に記載するのは、グリコシル化されたタンパク質をインビトロ及びインビボで産生する方法である。この方法は、グリコシル化されたタンパク質を産生するために宿主細胞を使用することを含む。本明細書に記載するのはまた、こうした方法を使用して産生されたグリコシル化されたタンパク質、及びその使用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(ii)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するアミノ酸残基にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、及び(iii)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む宿主細胞。
【請求項２】
前記標的タンパク質が、宿主細胞にとって異種である、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記NGTが、宿主細胞にとって異種である、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼが、宿主細胞にとって異種である、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記NGTが、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGT、ヘモフィルスの種のNGT、マンヘイミアの種のNGT、ビベルスティニアの種のNGT、又はエルシニアの種のNGTである、請求項1〜4のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼが、ガラクトシルトランスフェラーゼである、請求項1〜5のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記ガラクトシルトランスフェラーゼが、髄膜炎菌のLgtB、淋菌のLgtB、髄膜炎菌のLgtE、カンピロバクター・ジェジュニのCgtB、大腸菌のWaaX、ヘリコバクター・ピロリのHP0826、又は真核生物β4Gal-T1である、請求項6記載の宿主細胞。
【請求項８】
シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記シアリルトランスフェラーゼが、1以上のシアル酸残基を前記ガラクトースに付加する、請求項8記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記シアリルトランスフェラーゼが、宿主細胞にとって異種である請求項8又は9記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記シアリルトランスフェラーゼが、カンピロバクター・ジェジュニのCstII、カンピロバクター・ジェジュニのCstI、髄膜炎菌のLst、又は淋菌のLstである、請求項8〜10のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１２】
ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸をさらに含む、請求項1〜11のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記polySTが、ポリシアル酸を合成する、請求項12記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記ポリシアル酸が、少なくとも10個、少なくとも25個、少なくとも50個、少なくとも75個、又は少なくとも100個のシアル酸残基を含む、請求項13記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記polySTが、宿主細胞にとって異種である、請求項12〜14のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記polySTが、髄膜炎菌のpolyST若しくはその相同体、大腸菌K1のpolyST若しくはその相同体、マンヘイマニア・ヘモリチカ(Mannheimania haemolytica) のpolyST若しくはその相同体、又はモラクセラ・ノンリキファシエン(Moraxella nonliquifacien)のpolyST若しくはその相同体である、請求項12〜15のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記polySTが、髄膜炎菌血清型B株のpolyST又はその相同体である、請求項16記載の宿主細胞。
【請求項１８】
CMP-Neu5Acシンテターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項1〜17のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記CMP-Neu5Acシンテターゼが、宿主細胞にとって異種である、請求項18記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記CMP-Neu5Acシンテターゼが、髄膜炎菌のSynBである、請求項18又は19記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、原核生物宿主細胞である、請求項1〜20のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞が、大腸菌である、請求項21記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、エシェリキア種、シゲラ種、クレブシエラ種、
キサントモナス(Xhantomonas)種、サルモネラ種、エルシニア種、ラクトコッカス種、ラクトバシラス種、シュードモナス種、コリネバクテリウム種、ストレプトマイセス種、ストレプトコッカス種、スタフィロコッカス種、バシラス種、又はクロストリジウム種である、請求項21記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、真核生物宿主細胞である、請求項1〜20のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、キネトプラスト目細胞、又は哺乳類細胞である、請求項24記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記標的タンパク質が、細菌タンパク質である、請求項1〜25のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記標的タンパク質が、真核生物タンパク質である、請求項1〜25のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記標的タンパク質が、治療用タンパク質である、請求項1〜27のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記治療用タンパク質が、酵素、サイトカイン、ホルモン、成長因子、阻害剤タンパク質、タンパク質受容体、タンパク質受容体と結合するリガンド、又は抗体である、請求項28記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記酵素又は阻害剤が、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第VIIa因子、アンチトロンビンIII(AT-III)、プロテインC、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)及びtPAバリアント、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ-α、ラロニダーゼ(α-L-イズロニダーゼ)、イデュルスルファーゼ(Idursulphase)(イズロン酸-2-スルファターゼ)、ガルスルファーゼ(Galsulphase)、アガルシダーゼ-β(ヒトα-ガラクトシダーゼA)、ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、ヒトDNAse-I、ヒアルロニダーゼ、パパイン、L-アスパラギナーゼ、ウリカーゼ(尿酸オキシダーゼ)、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ(グルカルピダーゼ)、α1プロテアーゼ阻害剤(α1アンチトリプシン)、ラクターゼ、膵酵素(リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ)、又はアデノシンデアミナーゼである、請求項29記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記サイトカインが、インターフェロン-α(INF-α)、インターフェロン-β(INF-β)、インターフェロン-γ(INF-γ)、インターロイキン-2(IL2)、キメラジフテリア毒素-IL-2(デニロイキンジフチトクス)、インターロイキン-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受容体アンタゴニスト(アナキンラ)、又は腫瘍壊死因子α(TNF-α)である、請求項29記載の宿主細胞。
【請求項３２】
前記抗体が、アダリムマブ(ヒュミラ)及びレミケード(インフリキシマブ);レオプロ(アブシキシマブ);リツキサン(リツキシマブ);シムレクト(バシリキシマブ);シナジス(パリビズマブ);ハーセプチン(トラスツズマブ);マイロターグ(ゲムツズマブオゾガマイシン);キャンパス(アレムツズマブ);ゼヴァリン(イブリツモマブチウキセタン);ゾレア(オマリズマブ);ベキサール(トシツモマブ-I-131);アービタックス(セツキシマブ);アバスチン(ベバシズマブ);タイサブリ(ナタリズマブ);アクテムラ(トシリズマブ);ベクティビックス(パニツムマブ);ルセンティス(ラニビズマブ);ソリリス(エクリズマブ);シムジア(セルトリズマブペゴル);シンポニー(ゴリムマブ);イラリス(カナキヌマブ);ステラーラ(ウステキヌマブ);アーゼラ(オファツムマブ);プロリア(デノスマブ);ヌマックス(モタビズマブ);アブスラックス(ラキシバクマブ);ベンリスタ(ベリムマブ);ヤーボイ(イピリムマブ);アドセトリス(ブレンツキシマブベドチン);パージェタ(ペルツズマブ);カドサイラ(Ado-トラスツズマブエムタンシン);又はガジヴァ(オビヌツズマブ)である、請求項29記載の宿主細胞。
【請求項３３】
前記ホルモン又は成長因子が、インスリン、プラムリンタイド、成長ホルモン(GH)、インスリン様成長因子(IGF1)、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、グルカゴン様ペプチド-1アゴニスト(GLP-1)、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、ヒト骨形成タンパク質2(hBMP2)、ヒト骨形成タンパク質7(hBMP7)、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細胞増殖因子7(FGF7)、線維芽細胞増殖因子20(FGF20)、線維芽細胞増殖因子21(FGF21)、上皮成長因子(EGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、ニューロトロフィン-3、ヒト卵胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、ルトロピン-α、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)である、請求項29記載の宿主細胞。
【請求項３４】
前記宿主細胞が、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)を含まない、請求項1〜33のいずれか1項記載の宿主細胞。
【請求項３５】
N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在する、アミノ酸残基に組みつけられたグルコースを含む(ここでは、前記グルコースは、単糖に結合されている)グリコシル化標的タンパク質を産生するための方法であって、(i)請求項1〜34のいずれか1項記載の宿主細胞を、タンパク質産生に適した条件下で培養することと、(ii)前記標的タンパク質を単離することとを含む前記方法。
【請求項３６】
前記グリコシル化標的タンパク質がN-グリコシル化されている、請求項35記載の宿主細胞。
【請求項３７】
シアル酸付加された標的タンパク質を産生するための方法であって、(i)請求項8〜36のいずれか1項記載の宿主細胞を、タンパク質産生に適した条件下で培養することと、(ii)前記シアル酸付加された標的タンパク質を単離することとを含む前記方法。
【請求項３８】
ポリシアル酸付加された標的タンパク質を産生するための方法であって、(i)請求項12〜36のいずれか1項記載の宿主細胞を、タンパク質産生に適した条件下で培養することと、(ii)前記ポリシアル酸付加された標的タンパク質を単離することとを含む前記方法。
【請求項３９】
前記宿主細胞が、Neu5Acが添加された培地で培養される、請求項37又は38記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物中の前記タンパク質の前記少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%が、シアル酸付加又はポリシアル酸付加されている、請求項37〜39のいずれか1項記載の方法によって産生されたタンパク質を含む組成物。
【請求項４１】
前記タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%が、結合されたグルコースを含む、請求項35〜39のいずれか1項記載の方法によって産生されるタンパク質。
【請求項４２】
前記タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%が、同一の結合された多糖を含む、請求項35〜39のいずれか1項記載の方法によって産生されるタンパク質。
【請求項４３】
前記組成物中のタンパク質の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%が、前記NGTによってN-グリコシル化されている、請求項35〜39のいずれか1項記載の方法によって産生されるタンパク質を含む組成物。
【請求項４４】
前記組成物中に存在する各タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%が、結合されたグルコースを含む、請求項43記載の組成物。
【請求項４５】
前記組成物中に存在する各タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%が、同一の結合された多糖を含む、請求項43又は44記載の組成物。
【請求項４６】
グルコースが、N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するアミノ酸残基に結合されている、前記N-グリコシル化コンセンサス配列を含むN-グリコシル化されたタンパク質であって、以下の方法によって産生される前記タンパク質:
(i)タンパク質産生に適した条件下で宿主細胞(ここでは、前記宿主細胞は、(a)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(b)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するアミノ酸残基にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、及び(c)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む)を培養することと、
(ii)前記宿主細胞によって産生されたN-グリコシル化されたタンパク質を単離すること。
【請求項４７】
前記タンパク質が、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、又は少なくとも20個の前記N-グリコシル化コンセンサス配列を含む、請求項46記載のN-グリコシル化されたタンパク質。
【請求項４８】
前記N-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%が、前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基に結合されたグルコースを含む、請求項47記載のN-グリコシル化されたタンパク質。
【請求項４９】
前記タンパク質中に存在する前記N-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%が、同一の結合された多糖を含む、請求項47又は48記載のN-グリコシル化されたタンパク質。
【請求項５０】
請求項41、42、又は46〜49のいずれか1項記載のタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項５１】
産生された標的タンパク質が、その非グリコシル化状態にある前記標的タンパク質と比較して改善された薬物動態を有する、請求項37〜39のいずれか1項記載の方法。
【請求項５２】
前記組成物中の標的タンパク質が、その非グリコシル化状態にある前記標的タンパク質と比較して改善された薬物動態を有する、請求項40、43〜45、又は50のいずれか1項記載の組成物。
【請求項５３】
前記標的タンパク質が、その非グリコシル化状態にある前記標的タンパク質と比較して改善された薬物動態を有する、請求項41、42、又は46〜49のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項５４】
治療の必要のある対象において疾患又は障害を治療する方法であって、請求項40、43〜45、50、又は52のいずれか1項記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項５５】
前記疾患又は障害が、対象における欠損型の標的タンパク質の存在、対象における標的タンパク質の非存在、対象における標的タンパク質の発現低下、標的タンパク質によって結合されている受容体、又は標的タンパク質によって結合されているリガンドによって引き起こされる、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が、ヒトである、請求項54又は55記載の方法。
【請求項５７】
請求項1〜34のいずれか1項記載の宿主細胞を含むキット。
【請求項５８】
請求項40、43〜45、又は50のいずれか1項記載の組成物を含むキット。
【請求項５９】
請求項41、42、又は46〜49のいずれか1項記載のタンパク質を含むキット。
【請求項６０】
前記N-グリコシル化コンセンサス配列が、アスパラギン(Asn)-X-セリン(Ser)/トレオニン(Thr)(ここでは、Xは、プロリン(Pro)以外のあらゆるアミノ酸であり得る)である、請求項1〜59のいずれか1項記載の宿主細胞、方法、タンパク質、組成物、又はキット。
【請求項６１】
前記N-グリコシル化コンセンサス配列が、Y-X-Z(ここでは、Yは、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、又はセリン(Ser)であり得、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得、Zは、あらゆるアミノ酸であり得る)である、請求項1〜59のいずれか1項記載の宿主細胞、方法、タンパク質、組成物、又はキット。
【請求項６２】
Yが、Asnである、請求項61記載の宿主細胞、方法、タンパク質、組成物、又はキット。
【請求項６３】
Yが、Glnである、請求項61記載の宿主細胞、方法、タンパク質、組成物、又はキット。
【請求項６４】
Yが、Serである、請求項61記載の宿主細胞、方法、タンパク質、組成物、又はキット。
【請求項６５】
Zが、Ser、Thr、グリシン(Gly)、バリン(Val)、アラニン(Ala)、又はアスパラギン酸(Asp)である、請求項61〜64のいずれか1項記載の宿主細胞、方法、タンパク質、組成物、又はキット。
【請求項６６】
グリコシル化された組換え型標的タンパク質を宿主細胞中で産生するための方法であって、前記細胞におけるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)又は化学的結合の使用を含まない前記方法。
【請求項６７】
グリコシル化された組換え型標的タンパク質を宿主細胞中で産生するための方法であって、前記細胞において標的タンパク質及びN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)を培養することを含む前記方法。
【請求項６８】
前記標的タンパク質が、少なくとも1つの末端グリコシル化タグを含む、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
前記標的タンパク質が、少なくとも1つの埋め込み型グリコシル化タグを含む、請求項67記載の方法。
【請求項７０】
前記標的タンパク質が、少なくとも1つの末端グリコシル化タグと少なくとも1つの埋め込み型グリコシル化タグを含む、請求項67記載の方法。
【請求項７１】
前記末端グリコシル化タグが、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、又は少なくとも20個のN-グリコシル化コンセンサス配列を含む、請求項68又は70記載の方法。
【請求項７２】
前記埋め込み型グリコシル化タグが、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、又は少なくとも20個のN-グリコシル化コンセンサス配列を含む、請求項69又は70記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、それぞれその内容全体が本明細書に組み込まれる、2015年11月30日に出願された米国仮特許出願第62/260,725号、及び2016年11月3日に出願された米国仮特許出願第62/416,853号の優先権利益を主張する。
【０００２】
(1.導入)
本明細書に記載するのは、グリコシル化されたタンパク質をインビトロ及びインビボで産生する方法である。この方法は、グリコシル化されたタンパク質を産生するために宿主細胞を使用することを含む。本明細書に記載するのはまた、こうした方法を使用して産生されたグリコシル化されたタンパク質、及びその使用である。
【背景技術】
【０００３】
(2.背景)
グリコシル化は、真核生物における分泌タンパク質の最も目立った翻訳後修飾である。定義された構造をもつ糖タンパク質のインビボ合成は、その生物活性の理解及び利用に対する未だに大きな障害であり、組換え型タンパク質のグリコシル化操作は、新規の治療用薬剤及び研究ツールの開発への大きな可能性を有している。N-糖タンパク質合成のための当技術分野で公知の利用可能な戦略としては、困難な化学合成、真核生物又は原核生物における古典的なN-グリコシル化経路を介する及び生合成が挙げられる。タンパク質グリコシル化の新規かつ改良されたシステム、特に、グリコシル化されたタンパク質をインビボで産生することが可能な宿主細胞の必要性が、当技術分野で依然として存在する。
【発明の概要】
【０００４】
(3.概要)
本願は、標的タンパク質の修飾(例えば、組換え型標的タンパク質上での部位特異的な修飾)を触媒するグリコシルトランスフェラーゼ(例えば、原核生物のグリコシルトランスフェラーゼ)からなる、人工の生合成経路を使用する、宿主細胞(例えば細菌細胞)内、例えば宿主細胞の細胞質内での直接的なN-結合型グリカンのボトムアップ合成のためのプラットフォームを記載する。本明細書に記載したN-グリコシル化プラットフォームは、タンパク質のグリコシル化を実現するために、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ又は化学的結合の使用を必要としない(例えば、宿主細胞が、組換え型タンパク質を発現した)。その代わりに、本明細書に記載した生合成経路は、N-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)を使用して、単糖を標的タンパク質のN-グリコシル化コンセンサス配列に直接的に転移させる。次いで、追加の単糖が、N-結合型単糖に直接的に付加され、それによって、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ又は化学的結合を必要とせずに、標的タンパク質上に直接的にN-結合型グリコシル化が生成される。
【０００５】
N-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)は、N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するアミノ酸にグルコースを付加することが可能である。例えば、NGTは、N-グリコシル化コンセンサス配列Asn-X-Ser(Thr)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る)内に存在するアスパラギン(Asn)残基をN-グリコシル化することができる。NGTはまた、他のN-グリコシル化コンセンサス配列をN-グリコシル化することができる。セクション5.1を参照のこと。本明細書に開示する通り、単糖、例えばガラクトースが、NGTによって付加されたグルコースに結合される場合に、得られるAsn-グルコース-単糖(例えばガラクトース)が、オリゴ糖/多糖の合成のためのプライマーとして働き、グリコシル化されたタンパク質の産生をもたらすことができることが、本発明者らによって発見されている。この発見は、本明細書で集合的に「標的タンパク質」と称される、選択タンパク質(ペプチド及びポリペプチドが含まれる)の、インビボ又はインビトロでのグリコシル化を可能にする。詳細には、様々なグリコシルトランスフェラーゼを選択し、NGT、及び1以上のN-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質と組み合わせて、(i)コンセンサス配列内のアスパラギン(Asn)(又は他の該当残基)へのグルコシル化(グルコースの付加);(ii)グルコースへの単糖(例えばガラクトース)の結合;及び(iii)グルコース-単糖プライマー上でのオリゴ糖又は多糖の構築をもたらすことができる。さらに、グリコシル化のための前駆体を生成する様々な酵素(例えば、SynBなどのCMP-Neu5Acシンテターゼ)を選択し、NGT、標的タンパク質、及び前記様々なグリコシルトランスフェラーゼと組み合わせることができる。したがって、本明細書で提供されるのは、グリコシル化標的タンパク質を産生する方法であって、(i)NGTを使用して、1以上のN-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質にグルコースを付加することと;(ii)グリコシルトランスフェラーゼ(例えばガラクトシルトランスフェラーゼ)を使用して、前記グルコースに単糖(例えばガラクトース)を付加することと;(iii)1以上の追加のグリコシルトランスフェラーゼを使用して、グルコース-単糖プライマー上でオリゴ糖又は多糖を生成することとを含む前記方法である。
【０００６】
重要なことには、本明細書に記載したN-グリコシル化のシステムを、宿主細胞に組み込み、宿主細胞の細胞質におけるグリコシル化標的タンパク質の産生をもたらすことができることが発見されている。したがって、一態様では、本明細書で提供されるのは、グリコシル化されたタンパク質、例えば、N-グリコシル化されたタンパク質を産生することが可能な宿主細胞である。本明細書で提供される宿主細胞は、特に、(i)N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加することが可能であるN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸と、(ii)NGTによって付加されたグルコースへの、単糖、例えばガラクトースの付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸とを含む。本明細書で提供される宿主細胞は、インビボでのタンパク質グリコシル化(ここでは、グリコシル化されたタンパク質は、宿主細胞の細胞質で産生される)のための新規のシステムを提供する。重要なことには、本明細書で提供される宿主細胞は、現在存在するインビボグリコシル化プラットフォームの制約である周辺質中で、グリコシル化されたタンパク質を産生する必要性を回避する。
【０００７】
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、グリコシル化された組換え型標的タンパク質を宿主細胞中で産生するための方法であって、前記細胞におけるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)又は化学的結合の使用を含まない前記方法である。
【０００８】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、グリコシル化標的タンパク質を宿主細胞中で産生するための方法であって、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とNGTをコードするヌクレオチド配列を含む細胞を培養することを含む前記方法である。ある種の実施態様では、こうした宿主細胞は、1以上の追加のグリコシルトランスフェラーゼをコードする、さらなるヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
ある種の実施態様では、標的タンパク質をコードするこうしたヌクレオチド配列は、N-グリコシル化コンセンサス配列(例えば、Asn-X-Ser(Thr)、ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る)を含む。具体的実施態様では、N-グリコシル化コンセンサス配列は、標的タンパク質に内在する。他の具体的実施態様では、N-グリコシル化コンセンサス配列は、標的タンパク質にとって異種である。ある種の実施態様では、コンセンサス配列は、N-グリコシル化コンセンサス配列を含む異種配列が標的タンパク質に付加されるように、異種配列に埋め込まれる。具体的実施態様では、N-グリコシル化コンセンサス配列を含む異種配列が、標的タンパク質のN末端若しくはC末端、又はN末端とC末端の両方に付加され、ここでは、N-グリコシル化コンセンサス配列を含む異種配列は、末端グリコシル化タグと定義される。他の具体的実施態様では、N-グリコシル化コンセンサス配列を含む異種配列が、タンパク質の一次構造内のいずれかの場所に導入又は挿入され、ここでは、N-グリコシル化コンセンサス配列を含む異種配列は、埋め込み型グリコシル化タグと定義される。ある種の実施態様では、前記末端グリコシル化タグ又は埋め込み型グリコシル化タグは、違った様式で折り畳まれた標的タンパク質の表面にある。ある種の実施態様では、前記末端グリコシル化タグ又は前記埋め込み型グリコシル化タグは、標的タンパク質の三次元構造の一部ではなく、折り畳まれないままである。セクション5.1を参照のこと。
【００１０】
別の具体的実施態様では、こうした宿主細胞は、NGT及び/又は他のグリコシルトランスフェラーゼに対する1以上の糖基質を合成することが可能なタンパク質(例えば、UDP-グルコースを合成することが可能なタンパク質)をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。具体的実施態様では、前記タンパク質は、CMP-Neu5Acシンテターゼを含む。別の具体的実施態様では、前記CMP-Neu5Acシンテターゼは、SynBである。他の実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ又はシアル酸シンターゼをコードする。
【００１１】
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、(i)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(ii)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、及び(iii)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む宿主細胞である。具体的実施態様では、前記標的タンパク質は、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質、前記NGT、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼ、のそれぞれが、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌(E.coli)である。
【００１２】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、(i)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(ii)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、(iii)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;及び(iv)シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む宿主細胞である。具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、1以上のシアル酸残基を前記ガラクトースに付加する。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質は、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質、前記NGT、前記シアリルトランスフェラーゼ、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼ、のそれぞれが、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。
【００１３】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、(i)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(ii)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、(iii)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;(iv)シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸;及び(v)ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸を含む宿主細胞である。具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、1以上のシアル酸残基を前記ガラクトースに付加し、前記polySTは、ポリシアル酸を合成し、前記宿主細胞による、改善された薬物動態特性をもつポリシアル酸付加されたタンパク質の産生を可能にする。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質は、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記polySTは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質、前記NGT、前記シアリルトランスフェラーゼ、前記polyST、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼのそれぞれが、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。
【００１４】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、(i)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(ii)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、(iii)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;(iv)シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸;(v)ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸;及び(vi)CMP-Neu5Acシンテターゼをコードする核酸を含む宿主細胞である。具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、1以上のシアル酸残基を前記ガラクトースに付加し、前記polySTは、ポリシアル酸を合成し、前記宿主細胞による、改善された薬物動態特性をもつポリシアル酸付加されたタンパク質の産生を可能にする。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質は、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記polySTは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記CMP-Neu5Acシンテターゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質、前記NGT、前記シアリルトランスフェラーゼ、前記polyST、前記CMP-Neu5Acシンテターゼ、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼのそれぞれが、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。
【００１５】
具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、アクチノバシラス(Actinobacillus)の種のNGTをコードする核酸を含む。具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・プルロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)(配列番号:1、アミノ酸配列;表2参照)のNGTである。例えば、Choiらの文献、PLoS ONE(2010)を参照のこと。別の具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・スイス(Actinobacillus suis)、アクチノバシラス・サクシノゲネス(Actinobacillus succinogenes)、アクチノバシラス・ミノー(Actinobacillus minor)、又はアクチノバシラス・カプスラツス(Actinobacillus capsulatus)のNGTである。
【００１６】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、ヘモフィルス(Haemophilus)の種、例えば、ヘモフィルス・エジプチウス(Haemophilus aegyptius)、ヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・ヘモリティクス(Haemophilus haemolyticus)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・パラヘモリティカス(Haemophilus parahaemolyticus)、ヘモフィルス・ピットマニアエ(Haemophilus pittmaniae)、又はヘモフィルス・スプトラム(Haemophilus sputorum)のNGTをコードする核酸を含む。
【００１７】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、マンヘイミア(Mannheimia)の種、例えば、マンヘイミア・グラニュロマティス(Mannheimia granulomatis)、マンヘイミア・ヘモリチカ(Mannheimia haemolytica)、マンヘイミア・サクシニプロデュセンス(Mannheimia succiniproducens)、又はマンヘイミア・バリゲナ(Mannheimia varigena)のNGTをコードする核酸を含む。
【００１８】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、ビベルスティニア(Bibersteinia)の種、例えば、ビベルスティニア・トレハロシ(Bibersteinia trehalosi)のNGTをコードする核酸を含む。
【００１９】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、エルシニア(Yersinia)の種、例えば、エルシニア・ベルコビエリ(Yersinia bercovieri)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・フレデリクセニイ(Yersinia frederiksenii)、エルシニア・インターメディア(Yersinia intermedia)、エルシニア・クリステンシイ(Yersinia kristensii)、エルシニア・モラレッティイ(Yersinia mollaretii)、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)、エルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)、エルシニア・ローデイ(Yersinia rhodei)、又はエルシニア・シミリス(Yersinia similis)のNGTをコードする核酸を含む。
【００２０】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞で使用されるNGTは、アクチノバシラス(例えば、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGT)、ヘモフィルス、マンヘイミア、ビベルスティニア、又はエルシニアのうちのいずれか1つのNGTと相同であるものである。例えば、本明細書で提供される宿主細胞は、アクチノバシラス(例えば、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGT)、ヘモフィルス、マンヘイミア、ビベルスティニア、又はエルシニアのNGTをコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である核酸を含むことができる。
【００２１】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する、前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする。具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、ナイセリア(Neisseria)の種のLgtBである。具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、髄膜炎菌(N.meningitidis)のLgtBである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、淋菌(N.gonorrhoeae)のLgtBである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、髄膜炎菌のLgtEである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ(C.jejuni)のCgtBである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、大腸菌のWaaXである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)のHP0826である。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、真核生物β4Gal-T1である。
【００２２】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞で使用されるガラクトシルトランスフェラーゼは、ナイセリア、カンピロバクター(Campylobacter)、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリのガラクトシルトランスフェラーゼ、又は真核生物のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、本明細書で提供される宿主細胞は、ナイセリアの種のLgtB(例えば、髄膜炎菌のLgtB、淋菌のLgtB、又は髄膜炎菌のLgtE)をコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である;カンピロバクター・ジェジュニのCgtBをコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である;大腸菌のWaaXをコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である;ヘリコバクター・ピロリのHP0826をコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である;又は真核生物β4Gal-T1をコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である核酸を含むことができる。
【００２３】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞が、シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む場合、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクターの種由来である。具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCstIIである。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCstIである。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、髄膜炎菌のLstである。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、淋菌のLstである。
【００２４】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞で使用されるシアリルトランスフェラーゼは、ナイセリア又はカンピロバクターのシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、本明細書で提供される宿主細胞は、カンピロバクター・ジェジュニのCstII、カンピロバクター・ジェジュニのCstI、髄膜炎菌のLst、又は淋菌のLstをコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である核酸を含むことができる。
【００２５】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞が、ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸を含む場合、前記polySTは、髄膜炎菌のpolySTである。具体的実施態様では、前記髄膜炎菌のpolySTは、髄膜炎菌血清型B株のpolySTである。
【００２６】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞が、ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸を含む場合、前記polySTは、大腸菌K1、マンヘイマニア・ヘモリチカ(Mannheimania haemolytica)、又はモラクセラ・ノンリキファシエン(Moraxella nonliquifacien)のpolySTである。
【００２７】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞で使用されるポリシアリルトランスフェラーゼは、ナイセリアの種、マンヘイマニア(Mannheimania)の種、モラクセラ(Moraxella)の種、又は大腸菌のポリシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、本明細書で提供される宿主細胞は、髄膜炎菌血清型B株のpolyST、マンヘイマニア・ヘモリチカのpolyST、モラクセラ・ノンリキファシエンのpolyST、又は大腸菌のpolySTをコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である核酸を含むことができる。
【００２８】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞が、CMP-Neu5Acシンテターゼをコードする核酸を含む場合、前記CMP-Neu5Acシンテターゼは、髄膜炎菌のSynBである。別の具体的実施態様では、CMP-Neu5Acシンテターゼをコードする核酸を含む本明細書で提供される宿主細胞は、CMP-Neu5Acシンテターゼ基質(例えば、シアル酸)と共にインキュベートされる。
【００２９】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞で使用されるCMP-Neu5Acシンテターゼは、ナイセリアの種のCMP-Neu5Acシンテターゼと相同であるものである。例えば、本明細書で提供される宿主細胞は、髄膜炎菌のSynBをコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である核酸を含むことができる。
【００３０】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、原核生物宿主細胞である。例示的な原核生物宿主細胞としては、限定はされないが、エシェリキア(Escherichia)種、シゲラ(Shigella)種、クレブシエラ(Klebsiella)種、キサントモナス(Xhantomonas)種、サルモネラ(Salmonella)種、エルシニア種、ラクトコッカス(Lactococcus)種、ラクトバシラス(Lactobacillus)種、シュードモナス(Pseudomonas)種、コリネバクテリウム(Corynebacterium)種、ストレプトマイセス(Streptomyces)種、ストレプトコッカス(Streptococcus)種、スタフィロコッカス(Staphylococcus)種、バシラス(Bacillus)種、及び
クロストリジウム(Clostridium)種が挙げられる。具体的実施態様では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌である。
【００３１】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。例示的な真核生物宿主細胞としては、限定はされないが、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、キネトプラスト目(kinetoplastida)細胞、及び哺乳類細胞が挙げられる。
【００３２】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する標的タンパク質をコードする核酸は、治療用タンパク質、すなわち、疾患又は障害の治療において使用されるタンパク質をコードする。例えば、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する標的タンパク質をコードする核酸は、酵素、サイトカイン、受容体、リガンド、成長因子、阻害剤として作用するタンパク質、又は抗体をコードすることができる。標的タンパク質の非限定的リストは、下のセクション5.4に提供される。
【００３３】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する標的タンパク質をコードする核酸は、GFPをコードしない。
【００３４】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、グリコシル化標的タンパク質を産生するための方法であって、(i)本明細書で提供される宿主細胞を、タンパク質産生に適した条件下で培養することと、(ii)前記標的タンパク質を単離することとを含む前記方法である。具体的実施態様では、前記宿主細胞は、(a)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(b)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、及び(c)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含み、ここでは、前記標的タンパク質、前記NGT、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも1つ、2つ、又はすべては、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGTである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する、前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする前記核酸は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えば、髄膜炎菌のLgtBをコードする。
【００３５】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、改善された薬物動態特性をもつシアル酸付加された標的タンパク質を産生するための方法であって、(i)本明細書で提供される宿主細胞を、タンパク質産生に適した条件下で培養することと、(ii)前記標的タンパク質を単離することとを含む前記方法である。具体的実施態様では、前記宿主細胞は、(a)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(b)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、(c)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;及び(d)シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を含み、ここでは、前記標的タンパク質、前記NGT、前記シアリルトランスフェラーゼ、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼのうちの1つ、2つ、3つ、又はすべては、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGTである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する、前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする前記核酸は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えば、髄膜炎菌のLgtBをコードする。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCstIIである。
【００３６】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、改善された薬物動態特性をもつポリシアル酸付加された標的タンパク質を産生するための方法であって、(i)本明細書で提供される宿主細胞を、タンパク質産生に適した条件下で培養することと、(ii)前記標的タンパク質を単離することとを含む前記方法である。具体的実施態様では、前記宿主細胞は、(a)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(b)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、(c)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;(d)シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸;及び(e)ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸を含む。具体的実施態様では、前記標的タンパク質、前記NGT、前記シアリルトランスフェラーゼ、前記polyST、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又はすべては、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGTである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する、前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする前記核酸は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えば、髄膜炎菌のLgtBをコードする。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCstIIである。別の具体的実施態様では、前記polySTは、髄膜炎菌のpolyST(例えば、髄膜炎菌血清型B株のpolyST)である。
【００３７】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、ポリシアル酸付加された標的タンパク質を産生するための方法であって、(i)本明細書で提供される宿主細胞を、タンパク質産生に適した条件下で培養することと、(ii)前記標的タンパク質を単離することとを含む前記方法である。具体的実施態様では、前記宿主細胞は、(a)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(b)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、(c)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;(d)シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸;(e)ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸;及び(f)CMP-Neu5Acシンテターゼをコードする核酸を含む。具体的実施態様では、前記標的タンパク質、前記NGT、前記シアリルトランスフェラーゼ、前記polyST、前記CMP-Neu5Acシンテターゼ、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又はすべては、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGTである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する、前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする前記核酸は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えば、髄膜炎菌のLgtBをコードする。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCstIIである。別の具体的実施態様では、前記polySTは、髄膜炎菌のpolyST(例えば、髄膜炎菌血清型B株のpolyST)である。別の具体的実施態様では、前記CMP-Neu5Acシンテターゼは、髄膜炎菌のSynBである。
【００３８】
ある種の実施態様では、シアル酸付加及び/又はポリシアル酸付加されたタンパク質を産生するために本明細書で提供される宿主細胞が使用される場合、宿主細胞は、N-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)が添加された培地で培養される。Antoineらの文献、Chem.Bio.Chem.4,406-412(2003)を参照のこと。
【００３９】
ある種の実施態様では、提供される宿主細胞によって産生される標的タンパク質は、治療用タンパク質、すなわち、疾患又は障害の治療において使用されるタンパク質である。例えば、本明細書で提供される宿主細胞によって産生される標的タンパク質は、酵素、サイトカイン、又は抗体であり得、ここでは、前記標的タンパク質は、グリコシル化、例えば、シアル酸付加されている。標的タンパク質の非限定的リストは、下のセクション5.4に提供される。
【００４０】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される宿主細胞によって産生されたグリコシル化された(例えば、シアル酸付加された/ポリシアル酸付加された)標的タンパク質を含む、組成物、例えば医薬組成物である。下のセクション5.5を参照のこと。
【００４１】
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載した宿主細胞を使用して産生されたグリコシル化されたタンパク質を含む組成物であり、ここでは、前記タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)に結合されたグルコースを含む。
【００４２】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載した宿主細胞を使用して産生されたグリコシル化されたタンパク質を含む組成物であり、ここでは、前記タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)に結合された同一の付着された多糖を含む。
【００４３】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載した宿主細胞を使用して産生されたグリコシル化されたタンパク質を含む組成物であり、ここでは、前記組成物中のタンパク質の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、前記宿主細胞のNGT、例えば、前記宿主細胞中に存在する異種核酸によってコードされたNGTによってN-グリコシル化されている。具体的実施態様では、前記組成物中に存在する各タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)に結合されたグルコースを含む。別の具体的実施態様では、前記組成物中に存在する各タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)に結合された同一の付着された多糖を含む。
【００４４】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載した宿主細胞を使用して産生されたシアル酸付加されたタンパク質を含む組成物である。具体的実施態様では、前記組成物中の前記タンパク質の少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%は、シアル酸付加又はポリシアル酸付加されている。別の具体的実施態様では、前記組成物中の前記タンパク質の100%が、シアル酸付加又はポリシアル酸付加されている。別の具体的実施態様では、前記組成物中に存在する各タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)での同一のシアル酸付加パターンを含む。
【００４５】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、対象、例えばヒト対象を治療する方法であって、本明細書に記載した有効量の組成物(例えば医薬組成物)を対象に投与することを含む前記方法である。下のセクション5.6を参照のこと。
【００４６】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される宿主細胞、タンパク質、及び/又は組成物を含むキットである。
【００４７】
(3.1 用語法)
用語「約」とは、数と共に使用される場合、言及された数の±1、±5、又は±10%以内のあらゆる数をいう。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「N-グリコシル化コンセンサス配列」とは、N-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)がグルコースを付加することが可能である、標的タンパク質中に存在する配列をいう。具体的実施態様では、N-グリコシル化コンセンサス配列は、アスパラギン(Asn)-X-セリン(Ser)/トレオニン(Thr)であり、ここでは、Xは、プロリン(Pro)以外のあらゆるアミノ酸であり得る。別の具体的実施態様では、N-グリコシル化コンセンサス配列は、Y-X-Zであり、ここでは、Yは、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、又はセリン(Ser)であり得、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得、Zは、あらゆるアミノ酸であり得る。具体的実施態様では、Zは、Ser、Thr、グリシン(Gly)、バリン(Val)、アラニン(Ala)、又はアスパラギン酸(Asp)である。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」とは、対象に治療法(例えば、本明細書に記載した組成物)を施すという文脈において、予防及び/又は治療効果(1又は複数)を有する治療法の量をいう。ある種の実施態様では、「有効量」とは、次の効果:(i)疾患/障害又はそれに伴う症状の重症度を軽減又は改善する;(ii)疾患/障害又はそれに伴う症状の期間を短縮する;(iii)疾患/障害又はそれに伴う症状の進行を妨げる;(iv)疾患/障害又はそれに伴う症状の退行を引き起こす;(v)疾患/障害又はそれに伴う症状の発生又は発症を予防する;(vi)疾患/障害又はそれに伴う症状の再発を予防する;(vii)疾患/障害に伴う臓器不全を低下させる;(viii)疾患/障害を有する対象の入院を減少させる;(ix)疾患/障害を有する対象の入院期間を短縮する;(x)疾患/障害を有する対象の生存を向上させる;(xi)対象における疾患/障害を取り除く;及び/又は(xii)別の治療法の予防又は治療効果(1又は複数)を増強又は向上させる;のうちの1、2、3、4、又はそれ以上を実現するのに十分である治療法の量をいう。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「対象」とは、動物(例えば、鳥類、爬虫類、及び哺乳類)をいう。別の実施態様では、対象は、非霊長類(例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス)、及び霊長類(例えば、サル、チンパンジー、及びヒト)を含めた哺乳類である。ある種の実施態様では、対象は、非ヒト動物である。いくつかの実施態様では、対象は、家畜又はペット(例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ロバ、又はニワトリ)である。具体的実施態様では、対象は、ヒトである。用語「対象」と「患者」は、本明細書では交換可能に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
(4. 図面の簡単な説明)
【図１】細菌の細胞質におけるタンパク質のN-結合型ポリシアル酸付加のための、代謝的に操作された経路を示す図である。標的タンパク質の最初の部位特異的な修飾は、Asn-X-Ser(Thr)コンセンサスシークオン内に単一のN-結合型グルコースを付加するApNGTによって実現する。グルコースの連続的伸長は、ガラクトシルトランスフェラーゼ(LgtB)、シアリルトランスフェラーゼ(CstII)、及びポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)によって実現する。ドナー分子CMP-Neu5Acは、Neu5Acの外来性供給から(スカベンジャー経路)、又はUDP-GlcNAcからのNeu5Acの内在性の合成を用いて(新生経路)合成される。グリカンは、機能グライコミクスコンソーシアム(Consortium for Functional Glycomics)のガイドラインに従って描いている。
【００５２】
【図２】scAtaC上でのシアリルラクトースの構築を示す図である。人工のグリコシル化経路を、標的タンパク質としてscAtaCを使用して試験した。scAtaCコンストラクトは、オートトランスポーターの、細胞質によって保持される断片(aa1866-2428)であり、合計13個の潜在的グリコシル化部位と、6xHisタグを含有する。このscAtaCコンストラクトを、完全なシアリルラクトース経路(レーン5)と共に、又はApNGTコンストラクト(レーン3)のみ、若しくはApNGTとLgtBコンストラクト(レーン4)を含有する切断されたグリコシル化経路と共に、大腸菌JM107 ΔnanA::kan内で共発現させた。対照株は、グリコシルトランスフェラーゼ無し(レーン1)、又はApNGT無し(レーン2)を発現した。タンパク質発現は、28℃で20時間実施し、何度かに分ける形式でNiNTAビーズを使用して、scAtaCを濃縮した。溶出されたタンパク質を、SDS-PAGE上で分離し、6xHisタグに対する(上パネル)、又はN-結合型グルコースに対するイムノブロットを介して(下パネル)、scAtaCを検出した。
【００５３】
【図３】scAtaC上でのN-結合型シアリルラクトースの構築は、nanoLC-MS/MSによって確認される。このscAtaCコンストラクトを、完全なシアリルラクトース経路と共に、大腸菌JM107 ΔnanA::kan内で共発現させ、次いでNiNTAビーズを介して精製した。精製されたタンパク質を、直接的にトリプシン消化にかけ、nano-LC-MS/MSによって分析した。(A)scAtaC由来のあるトリプシンペプチド、
【化１】
2019502401.tif 000002
(N:潜在的N-グリコシル化部位;配列番号:4)の抽出イオンクロマトグラム(XIC)。その対応するグリコフォームは、各クロマトグラムにおいて示す。各シアル酸のペプチドへの付加は、逆相クロマトグラフィーでの保持時間を増大させる。m/z 758.3485 (z=2)(B)、903.8954(z=2)(C)、及び1049.4428(z=2)(D)というHCD MS/MSスペクトルは、連続するペプチドフラグメントイオン及びグリカン中性損失を示した。シアル酸付加された糖ペプチドについては、(C)及び(D)において、[NeuAc-H2O+H]+及び[NeuAc+H]+のオキソニウムイオンが観察された。糖記号は、機能グライコミクスコンソーシアム(Consortium for Functional Glycomics)ガイドラインに従う。
【００５４】
【図４】scAtaC上でのポリシアル酸の構築を示す図である。人工のグリコシル化経路を、標的タンパク質としてscAtaCを使用して試験した。このscAtaCコンストラクトを、完全なポリシアル酸付加経路(レーン3)と共に、大腸菌JM107 ΔnanA::kan内で共発現させた。対照株は、ApNGT無し(レーン1)、又はpolyST無し(レーン2)を発現した。タンパク質発現は、28度で20時間実施し、何度かに分ける形式でNiNTAビーズを使用して、scAtaCを濃縮した。溶出されたタンパク質を、SDS-PAGE上で分離し、ポリシアル酸特異的モノクローナル抗体を使用するイムノブロットを介して(下パネル)、ポリシアル酸を検出した。
【００５５】
【図５】GFPのポリシアル酸付加を示す図である。(a)「GlycoTag-GFP」(配列番号:5)及び「GlycoLoop-GFP」(配列番号:6)の漫画的表現。各コンストラクトは、それぞれC末端伸長及びループ挿入内に、単一のAsn-Ala-Thrグリコシル化シークオン(下線)を含有する。標的アスパラギン残基は、下線を引いたAsn-Ala-Thrグリコシル化シークオン内の、下線を引いたAsn内にある。GlycoTag-GFPは、下線を引いたグリコシル化シークオンの下流に、C末端Strep-タグをさらに含む。(b)グルコシル化を伴う及び伴わない、精製されたGlycoTag-及びGlycoLoop-GFPコンストラクトのゲル及びイムノブロット分析。各GFPコンストラクトは、ApNGTの存在下又は非存在下で、28℃で20時間発現させた。これらのGFPを、NiNTA及びStreptactin Sepharoseビーズを介して、二重(double)アフィニティ精製した。精製されたタンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、クーマシー染色して(上パネル)、又はイムノブロットによって分析して(下パネル)、ヒト血清MS1413を使用してN-結合型グルコースを検出した。(c)ポリシアル酸付加されたGlycoTag-GFPの精製から得られた画分のゲル及びイムノブロット分析。タンパク質を、完全なポリシアル酸付加経路と共に、28℃で20時間、共発現させた。全GFPを、NiNTAアフィニティクロマトグラフィーを介して精製し、次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーを介して、低、中程度、及び高濃度の[NaCl]溶出画分に分割した。この試料を、低濃度の塩緩衝液に交換し、SDS-PAGEによって分離し、クーマシー染色して(上パネル)、又はイムノブロットによって分析して(下パネル)、polySiaを検出した。(d)インタクトな糖タンパク質のUPLC分析による、ポリマー長の決定。精製されたオリゴ-及びポリシアル酸付加されたGlycoTag-GFPを、(グリコシル化機構の非存在下で発現させた)改変されていないタンパク質と比較した。各試料を、ProPac SAXカラム上で、50から600mMまでのNaCl(20mM Tris pH7.0中)のリニアグラジエントで、1.2ml/分の流速で、15分かけて分離した。GFPグリコフォームの溶出を、オンライン蛍光検出(Ex.385/Em.410)によって観察した。選択されたピークについて、重合度(DP)を示す。GFP上のα2,8-結合型polySia酸の化学的同一性は、特異的な解重合酵素、エンドシアリダーゼNFでの多糖の消化によって確認した。
【００５６】
【図６】NanoLC-MS/MSは、GlycoLoop-GFP上でのN-結合型シアリルラクトースの構築を実証する。このGlycoLoop-GFPコンストラクトを、シアリルラクトース経路と共に、大腸菌JM107 ΔnanA::kan内で共発現させ、次いで、NiNTAビーズを介して濃縮した。濃縮されたタンパク質を、直接的にトリプシン消化及びnano-LC-MS/MS分析にかけた。その対応するグリコフォームを有するGlycoLoop-GFP由来のトリプシンペプチド(配列番号:7)を含有するグリコサイト(glycosite)のペプチド配列(最上部)及び抽出イオンクロマトグラム(XIC)を、各クロマトグラムにおいて示す。糖記号は、機能グライコミクスコンソーシアム(Consortium for Functional Glycomics)ガイドラインに従う。
【００５７】
【図７】GlycoTag-GFPのポリシアル酸付加のための、振とうフラスコ培養条件の最適化。ポリシアル酸付加経路とGlycoTag-GFPのための発現プラスミドを保有する大腸菌JM107 ΔnanA::kan 株を、100mlフラスコ中で培養及び発現させた。各培養は、(a)にまとめた通りの標準の発現条件に対する変形を用いて実施した。細胞抽出物全体を、10%アクリルアミドゲル上でのSDS-PAGEによって分離し、GFPのポリシアル酸付加を、GFP上の10xHisタグ(左パネル)又はpolySia(右パネル)を対象とするイムノブロット分析によって観察した(b)。
【００５８】
【図８】分取強陰イオン交換クロマトグラフィーを介するGlycoTag-GFPグリコフォームの分割を示す図である。全GFPを、NiNTAアフィニティクロマトグラフィーを介して精製した。濃縮された溶出液を、MonoQ強陰イオン交換カラムに直接的に搭載し、0〜1M NaCl(20mM Tris pH7.0中)のグラジエントで(上のパネル)、1ml/分の流速で分離した。GFP含有画分を、目視検査によって特定し、各画分の蛍光(Ex.485nm/Em.520nm、下のパネル)を測定することによって確認した。示されている画分「GFP」、「GFPオリゴシアル酸(oligoSia)」、及び「GFPポリシアル酸(polySia)」を収集し、緩衝液を交換し、さらなる分析のために保持した(図5c及びd参照)。
【００５９】
【図９】VEGF-A拮抗DARPinのポリシアル酸付加を示す図である。(a)ポリシアル酸付加されたGlycoTag-DARPinの精製から得られた画分のゲル及びイムノブロット分析。このGlycoTag-DARPinタンパク質を、完全なポリシアル酸付加経路と共に、28℃で20時間、共発現させた。全GlycoTag-DARPinを、NiNTAアフィニティクロマトグラフィーを介して精製し、次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーを介して、低、中程度、及び高NaCl濃度の溶出画分に分割した。最終のサイズ排除クロマトグラフィーステップの後、この試料を、SDS-PAGEによって分離し、クーマシーによって染色して(左パネル)、又はイムノブロットによって分析して(右パネル)、polySiaを検出した。(b)HPSECによる、精製されたタンパク質の分析。精製されたポリシアル酸付加されたGlycoTag-DARPin調製物(短鎖、中鎖、及び長鎖polySiaで修飾されている)を、(グリコシル化機構の非存在下で発現させた)改変されていないタンパク質と比較した。各試料を、Agilent Bio SEC-5カラム上で分離し、215nmでの吸光度を、オンラインで観察した。ゲル濾過スタンダードは、次の構成要素:(1)サイログロブリン(ウシ) MW=670kDa、(2)γ-グロブリン(ウシ) MW=158kDa、(3)オボアルブミン(ニワトリ) MW=44kDa、(4)ミオグロビン(ウマ) MW=17kDa、及び(5)ビタミンB12 MW=1.35kDaを含有していた。
【００６０】
【図１０】CMP-Neu5Acの生合成のための新生経路を使用するGFPのポリシアル酸付加を示す図である。GlycoTag-GFPを、CMP-Neu5Acの新規合成のための遺伝子、siaABC(レーン2)をコードする完全なポリシアル酸付加経路と共に、大腸菌W3110 ΔlacZ ΔnanA ΔnanK内で共発現させた。対照株は、Neu5Acの外来性供給を伴う完全なポリシアル酸付加経路(レーン4)、polyST無し(レーン1)、又はグリコシル化経路無し(レーン3)を発現した。タンパク質発現は、28℃で20時間実施し、何度かに分ける形式でNiNTAビーズを使用して、GFPを濃縮した。溶出されたタンパク質を、SDS-PAGE上で分離し、クーマシーによって染色して(左パネル)、又はイムノブロットによって分析して(右パネル)、polySiaを検出した。
【００６１】
【図１１】polyST相同体を使用するGFPのポリシアル酸付加を示す図である。GlycoTag-GFPを、CMP-Neu5Acの新規合成のための遺伝子、siaABC、及びΔ20polySTMh(レーン3)、又はMalE-Δ20polySTMh融合バリアント(レーン4)をコードする完全なポリシアル酸付加経路と共に、大腸菌W3110 ΔlacZ ΔnanA ΔnanK内で共発現させた。対照株は、完全な新生シアリルラクトース経路(レーン2)、又はグリコシル化経路無し(レーン1)を発現した。タンパク質発現は、28℃で20時間実施し、何度かに分ける形式でNiNTAビーズを使用して、GFPを濃縮した。(a)濃縮されたGlycoTag-GFPのゲル及びイムノブロット分析。試料を、SDS-PAGEによって分離し、クーマシーによって染色して(左パネル)、又はイムノブロットによって分析して(右パネル)、polySiaを検出した。(b)インタクトな糖タンパク質のHPAE分析による、ポリマー長の決定。濃縮されたGlycoTag-GFP試料を、ProPac SAXカラム上で、50から600mMまでのNaCl(20mM Tris pH7.0中)のリニアグラジエントで、1.2ml/分の流速で、16分かけて分離した。GFPグリコフォームの溶出を、オンライン蛍光検出(Ex.385/Em.410)によって観察した。選択されたピークについて、重合度(DP)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
(5. 詳細な説明)
N-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)は、N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するアミノ酸にグルコースを付加することが可能である。例えば、NGTは、N-グリコシル化コンセンサス配列Asn-X-Ser(Thr)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る)内に存在するアスパラギン(Asn)残基をN-グリコシル化することができる。NGTはまた、他のN-グリコシル化コンセンサス配列をN-グリコシル化することができる。セクション5.1を参照のこと。本明細書に開示する通り、単糖、例えばガラクトースが、NGTによって付加されたグルコースに結合される場合に、得られるAsn-グルコース-単糖(例えばガラクトース)が、オリゴ糖/多糖の合成のためのプライマーとして働き、グリコシル化されたタンパク質の産生をもたらすことができることが、本発明者らによって発見されている。この発見は、本明細書で集合的に「標的タンパク質」と称される、選択タンパク質(ペプチド及びポリペプチドが含まれる)のインビボ又はインビトロでのグリコシル化を可能にする。具体的には、様々なグリコシルトランスフェラーゼを選択し、NGT、及び1以上のN-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質と組み合わせて、(i)コンセンサス配列内のアスパラギン(Asn)(又は他の該当残基)へのグルコシル化(グルコースの付加);(ii)グルコースへの単糖(例えばガラクトース)の結合;及び(iii)グルコース-単糖プライマー上でのオリゴ糖又は多糖の構築をもたらすことができる。したがって、本明細書で提供されるのは、グリコシル化標的タンパク質を産生する方法であって、(i)NGTを使用して、1以上のN-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質にグルコースを付加することと;(ii)グリコシルトランスフェラーゼ(例えばガラクトシルトランスフェラーゼ)を使用して、前記グルコースに単糖(例えばガラクトース)を付加することと;(iii)1以上の追加のグリコシルトランスフェラーゼを使用して、グルコース-単糖プライマー上でオリゴ糖又は多糖を生成することとを含む前記方法である。
【００６３】
グリコシル化標的タンパク質の産生のための機構を含む宿主細胞は、セクション5.1に記載する。グリコシル化機構を本明細書に記載した宿主細胞に導入するための方法は、セクション5.2に提供する。グリコシル化標的タンパク質を産生する方法は、セクション5.3に提供する。本明細書で提供される宿主細胞に組み込むことができ、したがって、本明細書に記載した宿主細胞及び方法を使用してグリコシル化され得る具体的な標的タンパク質は、セクション5.4に詳述する。組成物は、セクション5.5に提供する。例えば疾患の治療において、本明細書で提供される組成物を使用する方法は、セクション5.6に提供する。
【００６４】
(5.1宿主細胞)
一態様では、本明細書で提供されるのは、グリコシル化されたタンパク質、例えば、N-グリコシル化されたタンパク質を産生することが可能な宿主細胞である。本明細書で提供される宿主細胞は、特に、(i)N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加することが可能であるN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸と、(ii)NGTによって付加されたグルコースへの、単糖、例えばガラクトースの付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸とを含む。本明細書で提供される宿主細胞は、インビボでのタンパク質グリコシル化(ここでは、グリコシル化されたタンパク質は、宿主細胞の細胞質で産生される)のための新規のシステムを提供する。重要なことには、本明細書で提供される宿主細胞は、現在存在するインビボグリコシル化プラットフォームの制約である周辺質中で グリコシル化されたタンパク質を産生する必要性を回避する。
【００６５】
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、(i)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(ii)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、及び(iii)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む宿主細胞である。具体的実施態様では、前記標的タンパク質は、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質、前記NGT、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼ、のそれぞれが、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。
【００６６】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、(i)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(ii)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、(iii)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;及び(iv)シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む宿主細胞である。具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、1以上のシアル酸残基を前記ガラクトースに付加する。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質は、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質、前記NGT、前記シアリルトランスフェラーゼ、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼ、のそれぞれが、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。
【００６７】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、(i)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(ii)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、(iii)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;(iv)シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸;及び(v)ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸を含む宿主細胞である。具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、1以上のシアル酸残基を前記ガラクトースに付加し、前記polySTは、ポリシアル酸を合成し、前記宿主細胞による、改善された薬物動態特性をもつポリシアル酸付加されたタンパク質の産生を可能にする。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質は、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記polySTは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質、前記NGT、前記シアリルトランスフェラーゼ、前記polyST、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼ、のそれぞれが、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。
【００６８】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、(i)N-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質をコードする核酸;(ii)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、(iii)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;(iv)シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸;(v)ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸;及び(vi)CMP-Neu5Acシンテターゼをコードする核酸を含む宿主細胞である。具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、1以上のシアル酸残基を前記ガラクトースに付加し、前記polySTは、ポリシアル酸を合成し、前記宿主細胞による、改善された薬物動態特性をもつポリシアル酸付加されたタンパク質の産生を可能にする。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質は、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記polySTは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記CMP-Neu5Acシンテターゼは、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記標的タンパク質、前記NGT、前記シアリルトランスフェラーゼ、前記polyST、前記CMP-Neu5Acシンテターゼ、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼ、のそれぞれが、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。
【００６９】
具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、アクチノバシラスの種のNGTをコードする核酸を含む。具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGT(配列番号:1)である。例えば、Choiらの文献、PLoS ONE(2010)を参照のこと。別の具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・スイス、アクチノバシラス・サクシノゲネス、アクチノバシラス・ミノー、又はアクチノバシラス・カプスラツスのNGTである。
【００７０】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、ヘモフィルスの種、例えば、ヘモフィルス・エジプチウス、ヘモフィルス・デュクレイ、ヘモフィルス・ヘモリティクス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・パラインフルエンザ、ヘモフィルス・パラヘモリティカス、ヘモフィルス・ピットマニアエ、又はヘモフィルス・スプトラムのNGTをコードする核酸を含む。
【００７１】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、マンヘイミアの種、例えば、マンヘイミア・グラニュロマティス、マンヘイミア・ヘモリチカ、マンヘイミア・サクシニプロデュセンス、又はマンヘイミア・バリゲナのNGTをコードする核酸を含む。
【００７２】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、ビベルスティニアの種、例えば、ビベルスティニア・トレハロシのNGTをコードする核酸を含む。
【００７３】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、エルシニアの種、例えば、エルシニア・ベルコビエリ、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・フレデリクセニイ、エルシニア・インターメディア、エルシニア・クリステンシイ、エルシニア・モラレッティイ、エルシニア・ペスティス、エルシニア・シュードツベルクロシス、エルシニア・ローデイ、又はエルシニア・シミリスのNGTをコードする核酸を含む。
【００７４】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞で使用されるNGTは、アクチノバシラス(例えば、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGT)、ヘモフィルス、マンヘイミア、ビベルスティニア、又はエルシニアのうちのいずれか1つのNGTと相同であるものである。例えば、本明細書で提供される宿主細胞は、アクチノバシラス(例えば、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGT)、ヘモフィルス、マンヘイミア、ビベルスティニア、又はエルシニアのNGTをコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である核酸を含むことができる。
【００７５】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する、前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする。具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、ナイセリアの種のLgtBである。具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、髄膜炎菌のLgtBである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、淋菌のLgtBである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、髄膜炎菌のLgtEである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCgtBである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、大腸菌のWaaXである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、ヘリコバクター・ピロリのHP0826である。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、真核生物β4Gal-T1である。
【００７６】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞で使用されるガラクトシルトランスフェラーゼは、ナイセリア、カンピロバクター、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリのガラクトシルトランスフェラーゼ、又は真核生物のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、本明細書で提供される宿主細胞は、ナイセリアの種のLgtB(例えば、髄膜炎菌のLgtB、淋菌のLgtB、又は髄膜炎菌のLgtE)をコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である;カンピロバクター・ジェジュニのCgtBをコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である;大腸菌のWaaXをコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である;ヘリコバクター・ピロリのHP0826をコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である;又は真核生物β4Gal-T1をコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である核酸を含むことができる。
【００７７】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞が、シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む場合、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクターの種由来である。具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCstIIである。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCstIである。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、髄膜炎菌のLstである。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、淋菌のLstである。
【００７８】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞で使用されるシアリルトランスフェラーゼは、ナイセリア又はカンピロバクターのシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、本明細書で提供される宿主細胞は、カンピロバクター・ジェジュニのCstII、カンピロバクター・ジェジュニのCstI、髄膜炎菌のLst、又は淋菌のLstをコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である核酸を含むことができる。
【００７９】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞が、ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸を含む場合、前記polySTは、髄膜炎菌のpolySTである。具体的実施態様では、前記髄膜炎菌のpolySTは、髄膜炎菌血清型B株のpolySTである。
【００８０】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞が、ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸を含む場合、前記polySTは、大腸菌K1、マンヘイマニア・ヘモリチカ、又はモラクセラ・ノンリキファシエンのpolySTである。
【００８１】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞で使用されるポリシアリルトランスフェラーゼは、ナイセリアの種、マンヘイマニアの種、モラクセラの種、又は大腸菌のポリシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、本明細書で提供される宿主細胞は、髄膜炎菌血清型B株のpolyST、マンヘイマニア・ヘモリチカのpolyST、モラクセラ・ノンリキファシエンのpolyST、又は大腸菌のpolySTをコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である核酸を含むことができる。
【００８２】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞が、CMP-Neu5Acシンテターゼをコードする核酸を含む場合、前記CMP-Neu5Acシンテターゼは、髄膜炎菌のSynBである。
【００８３】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞で使用されるCMP-Neu5Acシンテターゼは、ナイセリアの種のCMP-Neu5Acシンテターゼと相同であるものである。例えば、本明細書で提供される宿主細胞は、髄膜炎菌のSynBをコードする核酸と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である核酸を含むことができる。
【００８４】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、原核生物宿主細胞である。例示的な原核生物宿主細胞としては、限定はされないが、エシェリキア種、シゲラ種、クレブシエラ種、キサントモナス種、サルモネラ種、エルシニア種、ラクトコッカス種、ラクトバシラス種、シュードモナス種、コリネバクテリウム種、ストレプトマイセス種、ストレプトコッカス種、スタフィロコッカス種、バシラス種、及びクロストリジウム種が挙げられる。具体的実施態様では、本明細書で使用される宿主細胞は、大腸菌である。
【００８５】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。例示的な真核生物宿主細胞としては、限定はされないが、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、キネトプラスト目細胞、及び哺乳類細胞が挙げられる。
【００８６】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する標的タンパク質をコードする核酸は、治療用タンパク質、すなわち、疾患又は障害の治療において使用されるタンパク質をコードする。例えば、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する標的タンパク質をコードする核酸は、酵素、サイトカイン、受容体、リガンド、成長因子、阻害剤として作用するタンパク質、又は抗体をコードすることができる。標的タンパク質の非限定的リストは、下のセクション5.4に提供される。
【００８７】
当技術分野で公知の任意のタンパク質をコードする核酸を、本明細書に記載した宿主細胞に組み込むことができる。したがって、本明細書で提供される宿主細胞を利用して、当技術分野で公知のグリコシル化された(シアル酸付加及びポリシアル酸付加が含まれる)型のあらゆるタンパク質を産生することができる。具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、シアル酸付加された型のタンパク質を産生するために使用される。別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、ポリシアル酸付加された型のタンパク質を産生するために使用される。本明細書に記載した宿主細胞を使用して産生することができる例示的なタンパク質は、セクション5.4に提供される。本明細書で提供される宿主細胞は、セクション5.4に記載するタンパク質のいずれかをコードする核酸を含むように操作することができ、したがって、こうしたタンパク質を発現することが可能である。
【００８８】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する標的タンパク質は、プラスミド、すなわち、対象となる特定の標的タンパク質をコードする遺伝子を含有するプラスミドを使用して、宿主細胞に導入されている核酸から発現される。
【００８９】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する標的タンパク質は、改変された宿主細胞のゲノムに組み込まれている核酸から発現される、すなわち、標的タンパク質をコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込まれている。
【００９０】
ある種の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する標的タンパク質をコードする核酸は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個の、又は(例えば、その天然の/自然の、例えば「野生型」状態で、標的タンパク質に伴われるグリコシル化部位の数と比較して)標的タンパク質に通常伴われるであろうよりも多いグリコシル化部位(N-グリコシル化コンセンサス配列)を含むように改変されている。
【００９１】
具体的実施態様では、グリコシル化部位の導入は、タンパク質の一次構造内のいずれかの場所へのN-グリコシル化コンセンサス配列(例えばAsn-X-Ser(Thr)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る))の挿入によって達成される。いくつかの実施態様では、コンセンサス配列は、N-グリコシル化コンセンサス配列を含む異種配列が標的タンパク質に埋め込まれるように、異種配列に埋め込まれ、ここでは、前記異種配列は、埋め込み型グリコシル化タグと定義される。グリコシル化部位の導入は、例えば、タンパク質の一次構造に新たなアミノ酸を付加する(すなわち、グリコシル化部位が完全に又は部分的に付加される)ことによって、又は、グリコシル化部位を生成するためにタンパク質内の既存のアミノ酸を変異させる(すなわち、タンパク質にアミノ酸は付加されないが、タンパク質の選択されたアミノ酸が、グリコシル化部位を形成するように変異される)ことによって、達成することができる。当分野の技術者は、タンパク質のアミノ酸配列を、当技術分野で公知の手法、例えば、タンパク質をコードする核酸配列の改変を含む組換え手法を使用して容易に改変できることを認識するであろう。具体的実施態様では、N-グリコシル化コンセンサス配列が、タンパク質のN又はC末端の、及び/又はタンパク質の土台でのジスルフィド架橋によって安定化されるループ内の、標的タンパク質の特定の領域、例えば、タンパク質の表面構造に導入される。ある種の実施態様では、前記埋め込み型グリコシル化タグは、違った様式で折り畳まれた標的タンパク質の表面にある。ある種の実施態様では、前記埋め込み型グリコシル化タグは、標的タンパク質の三次元構造の一部ではないが、折り畳まれないままである。そのため、理論には拘泥されないが、N-グリコシル化コンセンサス配列は、N-グリコシルトランスフェラーゼに、より接近されやすいままである。
【００９２】
具体的実施態様では、グリコシル化部位の導入は、タンパク質のN末端若しくはC末端、又はN末端とC末端の両方への、N-グリコシル化コンセンサス配列(例えばAsn-X-Ser(Thr)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る))の付加によって達成される。いくつかの実施態様では、コンセンサス配列は、N-グリコシル化コンセンサス配列を含む異種配列が標的タンパク質に付加されるように、異種配列に埋め込まれ、ここでは、N末端又はC末端に付着される前記異種配列は、末端グリコシル化タグと定義される。ある種の実施態様では、前記末端グリコシル化タグは、違った様式で折り畳まれた標的タンパク質の表面にある。ある種の実施態様では、末端グリコシル化タグは、標的タンパク質の三次元構造の一部ではないが、折り畳まれないままである。そのため、理論には拘泥されないが、N-グリコシル化コンセンサス配列は、N-グリコシルトランスフェラーゼに、より接近されやすいままである。
【００９３】
別の具体的実施態様では、標的タンパク質をコードする核酸は、埋め込み型グリコシル化タグ又は末端グリコシル化タグを含む。別の具体的実施態様で標的タンパク質をコードする核酸は、埋め込み型グリコシル化タグと末端グリコシル化タグとの両方を含む。
【００９４】
ある種の実施態様では、本明細書に記載した宿主細胞を使用して産生された標的タンパク質は、「タグ」、すなわち、本明細書に記載した宿主細胞によるその産生後に標的タンパク質の単離及び/又は同定を可能にするアミノ酸の配列を含む。例えば、タグを本明細書に記載した標的タンパク質に付加することは、そのタンパク質の精製において有用であり得る。本明細書で使用することができる例示的なタグとしては、限定はされないが、ヒスチジン(HIS)タグ(例えば、ヘキサヒスチジン-タグ、又は6XHis-タグ)、FLAG-タグ、及びHAタグが挙げられる。ある種の実施態様では、タグは、本明細書に記載した通りの埋め込み型又は末端グリコシル化タグをさらに含む。ある種の実施態様では、本明細書で使用されるタグは、除去可能である、例えばタンパク質が精製された後に、もはや必要ではなくなると、例えば化学薬品によって又は酵素的手段によって除去される。
【００９５】
(グリコシル化機構)
(N-グリコシルトランスフェラーゼ)
N-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)は、N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するアミノ酸にグルコースを付加することが可能である。例えば、NGTは、N-グリコシル化コンセンサス配列Asn-X-Ser(Thr)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る)内に存在するアスパラギン(Asn)残基をN-グリコシル化することができる。NGTはまた、アスパラギン(Asn)残基(N-グリコシル化コンセンサス配列Asn-X-Ala(Asp、Gly、又はVal)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る)内に存在する)をN-グリコシル化することができる。NGTはまた、N-グリコシル化コンセンサス配列Ser-X-Ser(Thr)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る)内に存在するセリン(Ser)残基、及び、N-グリコシル化コンセンサス配列Gln-X-Ser(Thr)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る)内に存在するグルタミン(Gln)残基をN-グリコシル化することができる。一般に、野生型NGTは、緩いペプチド基質特異性及び緩いドナー基質特異性を有する:野生型NGTは、UDP-Glc、並びにUDP-Gal、UDP-Xyl、GDP-Glc、及びGDP-Manを使用することができる(Naegeliらの文献、2014、The Journal Of Biological Chemistry 289(35):24521-24532を参照のこと)。
【００９６】
N-グリコシル化コンセンサス配列内のAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加することが可能な、任意のNGT又はこれをコードする核酸を、本明細書に記載した方法に従って使用することができ、例えば、本明細書に記載した宿主細胞に組み込むことができる。
【００９７】
具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、アクチノバシラスの種のNGTをコードする核酸を含む。具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGT(配列番号:1)である。例えば、Choiらの文献、PLoS ONE(2010)を参照のこと。別の具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・スイス、アクチノバシラス・サクシノゲネス、アクチノバシラス・ミノー、又はアクチノバシラス・カプスラツスのNGTである。
【００９８】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、ヘモフィルスの種、例えば、ヘモフィルス・エジプチウス、ヘモフィルス・デュクレイ、ヘモフィルス・ヘモリティクス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・パラインフルエンザ、ヘモフィルス・パラヘモリティカス、ヘモフィルス・ピットマニアエ、又はヘモフィルス・スプトラムのNGTをコードする核酸を含む。
【００９９】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、マンヘイミアの種、例えば、マンヘイミア・グラニュロマティス、マンヘイミア・ヘモリチカ、マンヘイミア・サクシニプロデュセンス、又はマンヘイミア・バリゲナのNGTをコードする核酸を含む。
【０１００】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、ビベルスティニアの種、例えば、ビベルスティニア・トレハロシのNGTをコードする核酸を含む。
【０１０１】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、エルシニアの種、例えば、エルシニア・ベルコビエリ、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・フレデリクセニイ、エルシニア・インターメディア、エルシニア・クリステンシイ、エルシニア・モラレッティイ、エルシニア・ペスティス、エルシニア・シュードツベルクロシス、エルシニア・ローデイ、又はエルシニア・シミリスのNGTをコードする核酸を含む。
【０１０２】
ある種の実施態様では、本明細書に記載した方法に従って使用される、例えば、本明細書に記載した宿主細胞に組み込まれるNGTは、アクチノバシラス(例えば、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGT)、ヘモフィルス、マンヘイミア、ビベルスティニア、又はエルシニアのうちのいずれか1つのNGTと相同であるものである。例えば、NGT又はこれをコードする核酸は、アクチノバシラス(例えば、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGT)、ヘモフィルス、マンヘイミア、ビベルスティニア、又はエルシニアのNGTと、約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同であり得る。
【０１０３】
他の実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、アグリゲイティバクター(Aggregatibacter)、例えば、アグリゲイティバクター・アフロフィルス(Aggregatibacter aphrophilus);ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium);バークホルデリア(Burkholderia)、例えば、バークホルデリア・ブリオフィラ(Burkholderia bryophila)、バークホルデリア・カレドニカ(Burkholderia caledonica)、バークホルデリア・カリベンシス(Burkholderia caribensis)、バークホルデリア・ディルワーティ(Burkholderia dilworthii)、バークホルデリア・フンゴルム(Burkholderia fungorum)、バークホルデリア・グラミニス(Burkholderia graminis)、バークホルデリア・グリミアエ(Burkholderia grimmiae)、バークホルデリア・フェノーリルプトリックス(Burkholderia phenoliruptrix)、バークホルデリア・フィマタム(Burkholderia phymatum)、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、バークホルデリア・テラエ(Burkholderia terrae)、及びバークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans);コンチフォルミビウス(Conchiformibius)、例えば、コンチフォルミビウス・スティーデ(Conchiformibius steedae);カプリアビダス(Cupriavidus)、例えば、カプリアビダス・メタリダランス(Cupriavidus metallidurans);エドワージエラ、例えば、エドワージエラ・ホシナエ(Edwardsiella hoshinae);腸内細菌科(Enterobacteriaceae);グラシエコーラ(Glaciecola)、例えば、グラシエコーラ・アークティカ(Glaciecola arctica);グロエオバクター(Gloeobacter)、例えば、グロエオバクター・キラウエンシス(Gloeobacter kilaueensis);ヘルバスピリラム(Herbaspirillum)、例えば、ヘルバスピリラム・フリシンゲンセ(Herbaspirillum frisingense)、ヘルバスピリラム・ルシタナム(Herbaspirillum lusitanum)、ヘルバスピリラム・ルブリスバルビカンス(Herbaspirillum rubrisubalbicans)、又はヘルバスピリラム・セロペディカエ(Herbaspirillum seropedicae);キンゲラ(Kingella)、例えば、キンゲラ・キンゲ(Kingella kingae);コーディイモナス(Kordiimonas)、例えば、コーディイモナス・クァンヤンゲンシス(Kordiimonas gwangyangensis);レプトリンビア(Leptolyngbya);リムノバクター(Limnobacter);ナイセリア、例えば、ナイセリア・フラベッセンス(Neisseria flavescens);パスツレラ(Pasteurella)、例えば、パスツレラ・ダグマティス(Pasteurella dagmatis)、又はパスツレラ・ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica);フェニロバクテリウム(Phenylobacterium)、例えば、フェニロバクテリウム・ズシネウム(Phenylobacterium zucineum);ポラロモナス(Polaromonas);プロビデンシア(Providencia)、例えば、プロビデンシア・レットゲリ(Providencia rettgeri);シュードアナベナ(Pseudanabaena)、例えば、シュードアナベナ・バイセプス(Pseudanabaena biceps);シュードモナス、例えば、シュードモナス・アガリシ(Pseudomonas agarici)、シュードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina)、シュードモナス・シュードアルカリゲネス(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、又はシュードモナス・トラーシイ(Pseudomonas tolaasii);レインヘイメラ(Rheinheimera);サルモネラ、例えば、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica);又はスルフリモナス(Sulfurimonas) の種のNGT、又はその相同体をコードする核酸を含む。
【０１０４】
(単糖をグルコースに付加するグリコシルトランスフェラーゼ)
ある種の実施態様では、本明細書で提供される方法は、標的タンパク質のN-グリコシル化コンセンサス配列内のAsn残基(又は他の該当残基)に、NGTによって付加されたグルコース残基への単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼを利用する。例えば、本明細書で提供される宿主細胞は、標的タンパク質のN-グリコシル化コンセンサス配列内のAsn残基(又は他の該当残基)に、NGTによって付加されたグルコース残基への単糖の付加を触媒する触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含むことができる。単糖を前記グルコースに付加することが可能な、任意のグリコシルトランスフェラーゼ又はこれをコードする核酸は、本明細書に記載した方法に従って使用することができる。
【０１０５】
ある種の実施態様では、単糖付加グリコシルトランスフェラーゼは、β-1,4-結合を介してラクトースを付加し、ラクトース-タンパク質複合体をもたらす。ある種の実施態様では、単糖付加グリコシルトランスフェラーゼは、β-1,3-結合を介してラクトースを付加する。
【０１０６】
具体的実施態様では、単糖付加グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。ガラクトースを前記グルコースに付加することが可能な任意のガラクトシルトランスフェラーゼ又はこれをコードする核酸を、本明細書に記載した方法に従って使用することができる。
【０１０７】
具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、ナイセリアの種のLgtBである。具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、髄膜炎菌のLgtBである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、淋菌のLgtBである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、髄膜炎菌のLgtEである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCgtBである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、大腸菌のWaaXである。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、ヘリコバクター・ピロリのHP0826である。別の具体的実施態様では、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、真核生物β4Gal-T1である。
【０１０８】
ある種の実施態様では、ガラクトシルトランスフェラーゼは、ナイセリア、カンピロバクター、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリのガラクトシルトランスフェラーゼ、又は真核生物のガラクトシルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ又はこれをコードする核酸は、ナイセリアの種のLgtB(例えば、髄膜炎菌のLgtB、淋菌のLgtB、若しくは髄膜炎菌のLgtE)、カンピロバクター・ジェジュニのCgtB、大腸菌のWaaX、ヘリコバクター・ピロリのHP0826、又は真核生物β4Gal-T1と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同であり得る。
【０１０９】
(シアリルトランスフェラーゼ)
1以上のシアル酸残基を、N-グリコシル化コンセンサス配列、例えばAsn-X-Ser(Thr)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る)内のAsn残基(又は他の該当残基)に結合された、グルコースに結合された単糖(例えばガラクトース)に付加することが可能な、任意のシアリルトランスフェラーゼ又はこれをコードする核酸を、本明細書に記載した方法に従って使用することができる、例えば、本明細書に記載した宿主細胞に組み込むことができる。
【０１１０】
ある種の実施態様では、シアリルトランスフェラーゼは、α-2,3-結合型又はα-2,6-結合型Neu5Acを含む標的タンパク質を産生する。
【０１１１】
具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクターの種由来である。具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCstIIである。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCstIである。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、髄膜炎菌のLstである。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、淋菌のLstである。
【０１１２】
ある種の実施態様では、シアリルトランスフェラーゼは、ナイセリア又はカンピロバクターのシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、シアリルトランスフェラーゼ又はこれをコードする核酸は、カンピロバクター・ジェジュニのCstII、カンピロバクター・ジェジュニのCstI、髄膜炎菌のLst、又は淋菌のLstと約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である。
【０１１３】
(ポリシアリルトランスフェラーゼ)
ポリシアル酸を(例えば、出発点としてシアリルトランスフェラーゼによって付加されるシアル酸残基を使用して)合成することが可能な任意のポリシアリルトランスフェラーゼ又はこれをコードする核酸を、本明細書に記載した方法に従って使用することができる、例えば、本明細書に記載した宿主細胞に組み込むことができる。
【０１１４】
具体的実施態様では、前記polySTは、髄膜炎菌のpolySTである。具体的実施態様では、前記髄膜炎菌のpolySTは、髄膜炎菌血清型B株のpolySTである。別の具体的実施態様では、前記polySTは、大腸菌K1、マンヘイマニア・ヘモリチカ、又はモラクセラ・ノンリキファシエンのpolySTである。
【０１１５】
ある種の実施態様では、ポリシアリルトランスフェラーゼは、ナイセリアの種、マンヘイマニアの種、モラクセラの種、又は大腸菌のポリシアリルトランスフェラーゼと相同であるものである。例えば、ポリシアリルトランスフェラーゼ又はこれをコードする核酸は、髄膜炎菌血清型B株のpolyST、マンヘイマニア・ヘモリチカのpolyST、モラクセラ・ノンリキファシエンのpolyST、又は大腸菌のpolySTと約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である。
【０１１６】
(CMP-Neu5Acシンテターゼ)
当技術分野で公知の任意のCMP-Neu5Acシンテターゼ又はこれをコードする核酸を、本明細書に記載した宿主細胞及び方法に従って使用することができる。具体的実施態様では、CMP-Neu5Acシンテターゼは、髄膜炎菌のSynBである。
【０１１７】
ある種の実施態様では、CMP-Neu5Acシンテターゼは、ナイセリアの種のCMP-Neu5Acシンテターゼと相同であるものである。例えば、CMP-Neu5Acシンテターゼ、又はこれをコードする核酸は、髄膜炎菌のSynBと約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%相同である。
【０１１８】
(付属(accessory)酵素)
ある種の実施態様では、1以上の付属酵素をコードする核酸が、本明細書に記載した改変された宿主細胞に導入される。1以上の付属酵素をコードするこうした核酸は、プラスミドによって運ばれてもよいし、本明細書に記載した宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。例示的な付属酵素としては、限定はされないが、エピメラーゼ(例えば、国際特許出願公開WO 2011/062615を参照のこと)、分枝、修飾、アセチル化、ホルミル化、重合酵素が挙げられる。
【０１１９】
(遺伝的背景)
ある種の実施態様では、宿主細胞の遺伝的背景は、例えば、1以上の遺伝子の欠失又は機能的不活性化によって改変される。
【０１２０】
宿主細胞において欠失/不活性化させる(また、場合によっては、他の所望される核酸配列と置き換えられる)ことができる例示的な遺伝子としては、nanA及びlacZが挙げられる。
【０１２１】
具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、nanAの欠失又は機能的不活性化を含む。別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、lacZの欠失又は機能的不活性化を含む。別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞は、nanA及びlacZの欠失又は機能的不活性化を含む。
【０１２２】
(5.2 核酸の宿主細胞への導入)
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、核酸(例えば、遺伝子又はオペロン)を、宿主細胞、例えば大腸菌に導入することができる。
【０１２３】
具体的実施態様では、異種核酸が、プラスミドを使用して、本明細書に記載した宿主細胞に導入される。例えば、異種核酸は、プラスミド(例えば発現ベクター)によって、宿主細胞内で発現され、プラスミドは、電気穿孔、熱ショックによる化学的形質転換、自然形質転換、ファージ形質導入、又は結合によって、改変された宿主細胞に導入される。
【０１２４】
(5.3 グリコシル化標的タンパク質産生の方法)
本明細書で提供されるのは、シアル酸付加された及びポリシアル酸付加されたタンパク質を含めたグリコシル化標的タンパク質を、インビボとインビトロとの両方で産生するための方法である。
【０１２５】
一実施態様では、本明細書で提供されるのは、グリコシル化標的タンパク質をインビトロで産生する方法であって、(i)NGTを使用して、1以上のN-グリコシル化コンセンサス配列を含む標的タンパク質にグルコースを付加することと;(ii)グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ)を使用して、前記グルコースに単糖(例えば、ガラクトース)を付加することと;(iii)1以上の追加のグリコシルトランスフェラーゼを使用して、グルコース-単糖プライマー上にオリゴ糖又は多糖を生成することとを含む前記方法である。
【０１２６】
別の実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載した宿主細胞を使用して、グリコシル化標的タンパク質をインビボで産生する方法である。具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、グリコシル化標的タンパク質を産生するための方法であって、(i)本明細書で提供される宿主細胞を、タンパク質産生に適した条件下で培養することと、(ii)前記標的タンパク質を単離することとを含む前記方法である。具体的実施態様では、前記宿主細胞は、(a)N-グリコシル化コンセンサス配列、例えばAsn-X-Ser(Thr)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る)を含む標的タンパク質をコードする核酸;(b)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、及び(c)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含み、ここでは、前記標的タンパク質、前記NGT、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも1つ、2つ、又はすべては、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGTである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する、前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする前記核酸は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えば、髄膜炎菌のLgtBをコードする。
【０１２７】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、シアル酸付加された標的タンパク質を産生するための方法であって、(i)本明細書で提供される宿主細胞を、タンパク質産生に適した条件下で培養することと、(ii)前記標的タンパク質を単離することとを含む前記方法である。具体的実施態様では、前記宿主細胞は、(a)N-グリコシル化コンセンサス配列、例えばAsn-X-Ser(Thr)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る)を含む標的タンパク質をコードする核酸;(b)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、(c)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;及び(d)シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を含み、ここでは、前記標的タンパク質、前記NGT、前記シアリルトランスフェラーゼ、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼのうちの1つ、2つ、3つ、又はすべては、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGTである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する、前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする前記核酸は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えば、髄膜炎菌のLgtBをコードする。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCstIIである。
【０１２８】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、ポリシアル酸付加された標的タンパク質を産生するための方法であって、(i)本明細書で提供される宿主細胞を、タンパク質産生に適した条件下で培養することと、(ii)前記標的タンパク質を単離することとを含む前記方法である。具体的実施態様では、前記宿主細胞は、(a)N-グリコシル化コンセンサス配列、例えばAsn-X-Ser(Thr)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る)を含む標的タンパク質をコードする核酸;(b)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、(c)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;(d)シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸;及び(e)ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸を含む。具体的実施態様では、前記標的タンパク質、前記NGT、前記シアリルトランスフェラーゼ、前記polyST、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又はすべては、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGTである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する、前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする前記核酸は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えば、髄膜炎菌のLgtBをコードする。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCstIIである。別の具体的実施態様では、前記polySTは、髄膜炎菌のpolyST(例えば、髄膜炎菌血清型B株のpolyST)である。
【０１２９】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、ポリシアル酸付加された標的タンパク質を産生するための方法であって、(i)本明細書で提供される宿主細胞を、タンパク質産生に適した条件下で培養することと、(ii)前記標的タンパク質を単離することとを含む前記方法である。具体的実施態様では、前記宿主細胞は、(a)N-グリコシル化コンセンサス配列、例えばAsn-X-Ser(Thr)(ここでは、Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり得る)を含む標的タンパク質をコードする核酸;(b)前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)にグルコースを付加するN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)をコードする核酸、(c)前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸;(d)シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸;(e)ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)をコードする核酸;及び(f)CMP-Neu5Acシンテターゼをコードする核酸を含む。具体的実施態様では、前記標的タンパク質、前記NGT、前記シアリルトランスフェラーゼ、前記polyST、前記CMP-Neu5Acシンテターゼ、及び前記グルコースへの単糖の付加を触媒する前記グリコシルトランスフェラーゼのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又はすべては、宿主細胞にとって異種である。別の具体的実施態様では、前記宿主細胞は、大腸菌である。別の具体的実施態様では、前記NGTは、アクチノバシラス・プルロニューモニエのNGTである。別の具体的実施態様では、本明細書で提供される宿主細胞中に存在する、前記グルコースへの単糖の付加を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする前記核酸は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えば、髄膜炎菌のLgtBをコードする。別の具体的実施態様では、前記シアリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター・ジェジュニのCstIIである。別の具体的実施態様では、前記polySTは、髄膜炎菌のpolyST(例えば、髄膜炎菌血清型B株のpolyST)である。別の具体的実施態様では、前記CMP-Neu5Acシンテターゼは、髄膜炎菌のSynBである。
【０１３０】
ある種の実施態様では、シアル酸付加及び/又はポリシアル酸付加されたタンパク質を産生するために本明細書で提供される宿主細胞が使用される場合、宿主細胞は、Neu5Acが添加された培地で培養される。
【０１３１】
ある種の実施態様では、提供される宿主細胞によって産生される標的タンパク質は、治療用タンパク質、すなわち、疾患又は障害の治療において使用されるタンパク質である。例えば、本明細書で提供される宿主細胞によって産生される標的タンパク質は、酵素、サイトカイン、又は抗体であり得、ここでは、前記標的タンパク質は、グリコシル化、例えば、シアル酸付加されている。標的タンパク質の非限定的リストは、下のセクション5.4に提供される。
【０１３２】
(5.4 標的タンパク質)
当技術分野で公知の任意のタンパク質(又は該タンパク質に相当するペプチド/ポリペプチドを、本明細書に記載した方法に従って、標的タンパク質として使用することができる。当業者は、公知のタンパク質、並びに新たに同定されたタンパク質の核酸配列が、当技術分野で公知の方法を使用して簡単に推定でき、したがって、対象となるあらゆるタンパク質をコードする核酸を本明細書で提供される宿主細胞に(例えば、発現ベクター、例えばプラスミドを介して)導入することが、当業者が十分に対応できる範囲内であろうことを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載した方法を使用して、例えば、本明細書で提供される宿主細胞を使用してインビボで、又はインビトロでグリコシル化された標的タンパク質が、(例えば、改善された薬物動態のおかげで)治療効果を有し、したがって、グリコシル化された(例えば、ポリシアル酸付加された)標的タンパク質での治療から恩恵を受けることとなる疾患/障害を有する対象の治療において使用できることを、さらに認識するであろう。特に、対象における欠損型の標的タンパク質の存在、対象における標的タンパク質の非存在、対象における標的タンパク質の発現低下によって引き起こされる疾患及び障害を、本明細書に記載した方法を使用して産生されたグリコシル化された(例えば、ポリシアル酸付加された)標的タンパク質を使用して治療又は予防することができる。さらに、本明細書に記載した方法を使用して産生された標的タンパク質によって結合される受容体によって媒介される、又は本明細書に記載した方法を使用して産生された標的タンパク質によって結合されるリガンド(例えば、ここでは、標的タンパク質は、リガンドに対する受容体である)によって媒介される疾患を、本明細書に記載した方法を使用して産生されたグリコシル化された(例えば、ポリシアル酸付加された)標的タンパク質を使用して治療することができる。
【０１３３】
具体的実施態様では、本明細書に記載した方法及び宿主細胞に従って使用される標的タンパク質は、治療用タンパク質である。例示的な治療用タンパク質としては、酵素、サイトカイン、ホルモン、成長因子、阻害剤タンパク質、タンパク質受容体、タンパク質受容体と結合するリガンド、及び抗体が挙げられる。
【０１３４】
具体的実施態様では、本明細書に記載した方法及び宿主細胞に従って使用される標的タンパク質は、酵素又は阻害剤である。標的タンパク質として使用することができる例示的な酵素及び阻害剤としては、限定はされないが、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、第VIIa因子、アンチトロンビンIII(AT-III)、プロテインC、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)及びtPAバリアント、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ-α、ラロニダーゼ(α-L-イズロニダーゼ)、イデュルスルファーゼ(Idursulphase)(イズロン酸-2-スルファターゼ)、ガルスルファーゼ(Galsulphase)、アガルシダーゼ-β(ヒトα-ガラクトシダーゼA)、ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、ヒトDNAse-I、ヒアルロニダーゼ、パパイン、L-アスパラギナーゼ、ウリカーゼ(尿酸オキシダーゼ)、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ(グルカルピダーゼ)、α1プロテアーゼ阻害剤(α1アンチトリプシン)、ラクターゼ、膵酵素(リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ)、及びアデノシンデアミナーゼが挙げられる。
【０１３５】
具体的実施態様では、本明細書に記載した方法及び宿主細胞に従って使用される標的タンパク質は、サイトカインである。標的タンパク質として使用することができる例示的なサイトカインとしては、限定はされないが、インターフェロン-α(INF-α)、インターフェロン-β(INF-β)、インターフェロン-γ(INF-γ)、インターロイキン-2(IL2)、キメラジフテリア毒素-IL-2(デニロイキンジフチトクス)、インターロイキン-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受容体アンタゴニスト(アナキンラ)、及び腫瘍壊死因子α(TNF-α)が挙げられる。
【０１３６】
具体的実施態様では、本明細書に記載した方法及び宿主細胞に従って使用される標的タンパク質は、ホルモン又は成長因子である。標的タンパク質として使用することができる例示的なホルモン及び成長因子としては、限定はされないが、インスリン、プラムリンタイド、成長ホルモン(GH)、インスリン様成長因子(IGF1)、ヒト副甲状腺ホルモン、カルシトニン、グルカゴン様ペプチド-1アゴニスト(GLP-1)、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、ヒト骨形成タンパク質2(hBMP2)、ヒト骨形成タンパク質7(hBMP7)、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細胞増殖因子7(FGF7)、線維芽細胞増殖因子20(FGF20)、線維芽細胞増殖因子21(FGF21)、上皮成長因子(EGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、ニューロトロフィン-3、ヒト卵胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、ルトロピン-α、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)が挙げられる。
【０１３７】
具体的実施態様では、本明細書に記載した方法及び宿主細胞に従って使用される標的タンパク質は、抗体である。標的タンパク質として使用することができる例示的な抗体としては、限定はされないが、TNF-αと結合する抗体、例えば、アダリムマブ(ヒュミラ)及びレミケード(インフリキシマブ);レオプロ(アブシキシマブ);リツキサン(リツキシマブ);シムレクト(バシリキシマブ);シナジス(パリビズマブ);ハーセプチン(トラスツズマブ);マイロターグ(ゲムツズマブオゾガマイシン);キャンパス(アレムツズマブ);ゼヴァリン(イブリツモマブチウキセタン);ゾレア(オマリズマブ);ベキサール(トシツモマブ-I-131);アービタックス(セツキシマブ);アバスチン(ベバシズマブ);タイサブリ(ナタリズマブ);アクテムラ(トシリズマブ);ベクティビックス(パニツムマブ);ルセンティス(ラニビズマブ);ソリリス(エクリズマブ);シムジア(セルトリズマブペゴル);シンポニー(ゴリムマブ);イラリス(カナキヌマブ);ステラーラ(ウステキヌマブ);アーゼラ(オファツムマブ);プロリア(デノスマブ);ヌマックス(Numax)(モタビズマブ);アブスラックス(ABThrax)(ラキシバクマブ);ベンリスタ(ベリムマブ);ヤーボイ(イピリムマブ);アドセトリス(ブレンツキシマブベドチン);パージェタ(ペルツズマブ);カドサイラ(Ado-トラスツズマブエムタンシン);及びガジヴァ(Gazyva)(オビヌツズマブ)が挙げられる。
【０１３８】
具体的実施態様では、本明細書に記載した方法及び宿主細胞に従って使用される標的タンパク質は、受容体である。標的タンパク質として使用することができる例示的な受容体としては、限定はされないが、ヒトCTLA4の細胞外ドメイン(例えば、Fcと融合)、及び可溶性TNF受容体(例えば、Fcと融合)が挙げられる。
【０１３９】
(5.5 組成物)
(宿主細胞を含む組成物)
一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載した宿主細胞を含む組成物(セクション5.1参照)である。こうした組成物は、本明細書に記載したグリコシル化標的タンパク質(セクション5.4参照)を生成するための方法において使用することができ、例えば、宿主細胞を含む組成物を、タンパク質の産生に適した条件下で培養することができる。続いて、グリコシル化標的タンパク質を、当技術分野で公知の方法を使用して、宿主細胞を含む前記組成物から単離することができる。
【０１４０】
本明細書で提供される宿主細胞を含む組成物は、本明細書に記載した宿主細胞の維持及び生存に適した追加の成分を含むことができ、宿主細胞によるタンパク質の産生に必要とされる又は有益な追加の成分、例えば、誘導性プロモーターのためのインデューサー、例えばアラビノース、IPTGなどもさらに含むことができる。
【０１４１】
(グリコシル化標的タンパク質を含む組成物)
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載した1以上のグリコシル化標的タンパク質を含む組成物(例えば医薬組成物)(セクション5.4参照)である。本明細書に記載した組成物は、対象(例えばヒト対象)における疾患/障害の治療及び/又は予防において有用である。セクション5.6を参照のこと。
【０１４２】
具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載した宿主細胞を使用して産生されたグリコシル化されたタンパク質を含む組成物であり、ここでは、前記タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)に結合されたグルコースを含む。
【０１４３】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載した宿主細胞を使用して産生されたグリコシル化標的タンパク質をを含む組成物であり、ここでは、前記タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)に結合された同一の付着された多糖を含む。
【０１４４】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載した宿主細胞を使用して産生されたグリコシル化標的タンパク質を含む組成物であり、ここでは、前記組成物中のタンパク質の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、前記宿主細胞のNGT、例えば、前記宿主細胞中に存在する異種核酸によってコードされたNGTによってN-グリコシル化されている。具体的実施態様では、前記組成物中に存在する各タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)に結合されたグルコースを含む。別の具体的実施態様では、前記組成物中に存在する各タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)に結合された同一の付着された多糖を含む。
【０１４５】
別の具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載した宿主細胞を使用して産生されたシアル酸付加されたタンパク質を含む組成物である。具体的実施態様では、前記組成物中の前記タンパク質の少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%は、シアル酸付加又はポリシアル酸付加されている。別の具体的実施態様では、前記組成物中の前記タンパク質の100%が、シアル酸付加又はポリシアル酸付加されている。別の具体的実施態様では、前記組成物中に存在する各タンパク質中に存在するN-グリコシル化コンセンサス配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%は、前記N-グリコシル化コンセンサス配列内に存在するAsn残基(又は他の該当残基)での同一のシアル酸付加パターンを含む。
【０１４６】
ある種の実施態様では、本明細書に記載した組成物(例えば医薬組成物)は、本明細書に記載したグリコシル化標的タンパク質(セクション5.4参照)を含むことに加えて、医薬として許容し得る担体を含む。本明細書で使用する場合、用語「医薬として許容し得る」は、動物における、より具体的にはヒトにおける使用のために、米国連邦若しくは州政府の規制機関によって承認されること、又は米国薬局方又は他の一般に認められている薬局方においてリストアップされることを意味する。用語「担体」とは、医薬として許容し得る担体という文脈において本明細書で使用する場合、医薬組成物がそれと共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルをいう。生理食塩水及びデキストロース水溶液及びグリセロール溶液も、特に注射可能溶液のための、液体担体として用いることができる。適切な賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜(chalk)、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。適切な医薬担体の例は、E.W.Martinの文献「レミントンの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」に記載されている。
【０１４７】
ある種の実施態様では、本明細書に記載した組成物は、対象への意図される投与経路に適切であるように製剤化される。例えば、本明細書に記載した組成物は、皮下、非経口、経口、皮内、経皮、結腸直腸、腹腔内、及び直腸内投与に適切であるように製剤化することができる。具体的実施態様では、該医薬組成物は、静脈内、経口、腹腔内、鼻腔内、気管内、皮下、筋肉内、局所、皮内、経皮、又は経肺投与のために製剤化することができる。
【０１４８】
ある種の実施態様では、本明細書に記載した組成物は、1以上の緩衝液緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、及びスクロース・リン酸・グルタミン酸緩衝液をさらに含む。他の実施態様では、本明細書に記載した組成物は、緩衝液を含まない。
【０１４９】
ある種の実施態様では、本明細書に記載した組成物は、1以上の塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、及びアルミニウム塩(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン(硫酸アルミニウムカリウム)、又はこうしたアルミニウム塩の混合物)をさらに含む。他の実施態様では、本明細書に記載した組成物は、塩を含まない。
【０１５０】
本明細書に記載した組成物は、投与のための説明書と共に、キット、容器、パック、又はディスペンサー内に含めることができる。
【０１５１】
本明細書に記載した組成物は、使用まで保管することができる。例えば、該組成物は、(例えば、約-20℃で又は約-70℃で)冷凍保管する;冷蔵状態で(例えば、約4℃で)保管する;又は室温で保管することができる。
【０１５２】
(5.6 予防及び治療的使用)
一態様では、本明細書で提供されるのは、対象における疾患又は障害を治療する方法であって、本明細書に記載したグリコシル化標的タンパク質(セクション5.4参照)又はその組成物(セクション5.5参照)を対象に投与することを含む前記方法である。別の態様では、本明細書で提供されるのは、対象における疾患又は障害を予防する方法であって、本明細書に記載したグリコシル化標的タンパク質(セクション5.4参照)又はその組成物(セクション5.5参照)を対象に投与することを含む前記方法である。具体的実施態様では、本明細書で提供されるのは、対象における疾患又は障害を治療又は予防するための方法であって、本明細書に記載した方法に従って産生されたポリシアル酸付加された標的タンパク質を対象に投与することを含む前記方法である。
【実施例】
【０１５３】
(6.実施例)
(6.1 材料及び方法)
プラスミド設計及び構築。宿主細胞におけるNGT介在性のタンパク質グリコシル化のために必要とされる種々の構成要素を組み込んだプラスミドを作製した。詳細には、アクチノバシラス・プルロニューモニエngt(ApNGT)、髄膜炎菌(MC58)のlgtB、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)(菌株OH4382/84、C-末端32-アミノ酸欠失とI53S変異を含有(Chiu C.P.らの文献、Nat Struct Mol Biol. 2004 Feb;11(2):163-70を参照のこと))のcstII、siaB(若しくはsynB、CMP-Neu5Acシンターゼ)単独で、又はsiaA(若しくはsynX、UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ)及びsiaC(若しくはsynC、シアル酸シンターゼ)をさらに伴って(すべて髄膜炎菌(MC58)由来)、及び/又は髄膜炎菌血清型B株由来のpolyST(F116-polySTF460T、Keys T.G.らの文献、Nat Chem Biol. 2014 Jun;10(6):437-42を参照のこと、N-末端Strep-タグを伴う)又はマンヘイミア・ヘモリチカ由来のpolyST(20アミノ酸のN末端欠失を伴う、Lindhoutらの文献、PLoS One 2013 8(7):e69888. doi:10.1371/journal.pone.0069888を参照のこと)を有するプラスミドを構築した。N-グリコシル化効率を評価するために、様々な組み合わせを生成した。表1及び以下を参照のこと。
【０１５４】
経路における各タンパク質のアミノ酸配列を、GENEiusウェブサイトのGENEiusサーバーを使用して逆翻訳し、(DNA2.0によって公開されたFreq-A、-B、及び-Cの平均を概算し(Welchらの文献、PLoS ONE 4,e7002(2009)を参照のこと)、かつ、共通の制限部位及び一塩基反復伸長を避ける)コドンバイアスを与えるように設計されたコドン出現頻度(codon usage)を使用してコドン最適化した(表2参照)。シアリルラクトース経路における遺伝子を、lacオペレーターを含めたlacUV5プロモーター(Deuschleらの文献、EMBO J.5,2987-2994(1986)を参照のこと)の制御下に配置された各遺伝子と、およそ50,000a.u.の目標翻訳開始速度を用いてSalis LabウェブサイトのSalis Lab RBS Calculatorによって設計されたカスタムリボソーム結合部位と共に、仮(pseudo-)オペロン構造(Xu P.らの文献、ACS Synth.Biol.1,256-266(2012)、Xu P.らの文献、Nat.Commun.4,1409(2013)、及びHe W.らの文献、Metab.Eng.27 92-100(2015)を参照のこと)に統合した(Espah Borujeni Aらの文献、Nucleic Acid Res,42(4),2646-59(2014)及びFarasat Iらの文献、Mol Syst Biol,10,731(2014)を参照のこと)。siaABC遺伝子は、髄膜炎菌血清型B株においてポリシアル酸莢膜の生合成をコードするポリシストロニック・オペロンの一部として存在する。これらの遺伝子を、その天然のRBSと共に、まとまりとみなし、lacオペレーターを含めたlacUV5プロモーターの制御下に配置した。このオペロンの後に、単一の翻訳停止部位が続く。相補的なオーバーハングを残す2セットのアイソコーダマー(isocaudamer)制限部位を使用して、各遺伝子を隣接させて、遺伝子の欠失及び調節エレメントの交換を含めた経路の容易な改変を可能にした。NGT介在性のタンパク質グリコシル化経路をコードするコンストラクトを合成し(GENEWIZ社)、pUC57ベクター又はpACYC-Duetベクター(Novagen社)、又はpCDF-Duetベクター(Novagen社)に導入した。別のプラスミドバックボーンへのサブクローニング、並びに遺伝子及びタグの挿入及び欠失を含めたさらなるプラスミド操作は、標準の分子生物学技術を使用して実施した。すべてのコンストラクトを配列決定して、所望される改変を確認した。
【０１５５】
細菌株及び生育条件。プラスミドDNAの維持及び増殖のために、大腸菌DH5α株を使用した。グリコシル化実験のための宿主株として、大腸菌K12誘導体JM107ΔnanA::kan株(Priemらの文献、Glycobiology.12,235-240(2002)を参照のこと)を使用した。別段の言及がない限り、細菌は、振とうフラスコ内のLuria-Bertani(LB)培地内で、又は1.5%(w/v)寒天を含有するLBプレート上で生育させた。必要に応じて、培地には、次の濃度の抗生物質:アンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール35μg/ml、スペクチノマイシン50μg/ml、及びトリメトプリム50μg/mlを添加した。SiaBのみを発現する細菌株を使用する、すなわち、CMP-Neu5Ac生合成のためのスカベンジャー経路(図1参照)を使用する、(ポリ)シアル酸付加されたタンパク質の産生のために、培地には、5mM Neu5Acを添加した。培養物は、およそ1.0(又はタンパク質のポリシアル酸付加については1.8〜2.0)のOD600まで、37℃で生育させ、1mM IPTG及び0.4% L-アラビノースの添加によって発現を誘導した。培養物は、誘導試薬の存在下で、28℃でさらに20〜24時間、生育させた。遠心分離によって細胞ペレットを回収し、次いで、PBSで1回洗浄した後、さらなる処理まで-20℃で保管した。
【０１５６】
CMP-Neu5Acの新規合成のための遺伝子をコードする経路コンストラクト、siaABC(pLMTB4250)を用いるグリコシル化実験のための宿主として、大腸菌K12誘導体W3110 ΔlacZ ΔnanA ΔnanKを使用した。図1を参照のこと。別段の言及がない限り、細菌は、先に記載した通りに培養したが、培地にはNeu5Acを添加せず、培養物がおよそ0.6〜1.0のOD600まで生育した時に、発現を誘導した。
【０１５７】
グリコシル化分析のための小規模調製及びタンパク質の濃縮。10ml発現培養物からの細胞ペレットを、およそ650μlの溶解緩衝液(60mM Tris pH8.0、1mM MgCl2)に再懸濁し、1mg/mlのリゾチーム及び20μg/mlのDNaseIを添加した。細胞を、i)液体N2で急速凍結させること、ii)室温の超音波浴の中で5分、融解させること、及びiii)室温で15分、からなる3サイクルの凍結-融解-超音波処理によって溶解させた。細胞破壊片を20,000gandでペレット化し、上清(細胞を含まない抽出液)を、直接的に分析した、又は対象のタンパク質を、次の通りにNiNTAビーズ及び/又はStrepTactin Sepharoseを介して濃縮した。
【０１５８】
scAtaCの濃縮のために、上清に、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma社)を添加し、20mM Tris pH8.0、300mM NaCl、及び6M尿素(結合緩衝液)(2mlの最終体積中)に調節した。この6xHisでタグ付けされたAtaC試料を、何度かに分けてNiNTAビーズに結合させ、次いで、ミニカラムに搭載し、30mMイミダゾール(結合緩衝液中)で洗浄し、200mMイミダゾール(結合緩衝液中)で溶出した。溶出液を、30kDaカットオフを用いる遠心濃縮器(Amicon社)を使用して、およそ200μlに濃縮した。
【０１５９】
GFPコンストラクトの濃縮のために、細胞溶解物に、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma社)を添加し、何度かに分ける形式で、NiNTAビーズに直接的に結合させた。ビーズをミニカラムに搭載し、30mMイミダゾール(60mM Tris pH8.0中)で洗浄し、250mMイミダゾール(60mM Tris pH8.0中)で溶出した。溶出液を、あらかじめ平衡化したStrepTactin Sepharoseビーズに直接的に搭載し、60mM Tris pH8.0で洗浄し、2.5mMデスチオビオチンで溶出した。試料を濃縮し、保管のために緩衝液をPBSに交換した。
【０１６０】
試料を、SDS-PAGE、それに続いて、抗His4抗体(Qiagen社)、N-ヘキソース反応性ヒト血清MS14(Naegeliらの文献、J. Biol.Chem.289、2170-2179(2014);及びLolliらの文献、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102,10273-10278(2005)を参照のこと)、及び抗ポリシアル酸モノクローナル抗体735(Absolute Antibody社)を用いるイムノブロットによって分析した、又は、トリプシン消化、それに続く、nano-LC-ESI-MS/MSによって分析した。
【０１６１】
ポリシアル酸付加されたGFPの精製。1リットル発現培養物(およそ13g(湿重量))からの細胞ペレットを、35mlのLysis緩衝液(20mM Tris pH7.0、2mM βメルカプトエタノール、1mM MgCl2、100μg/ml DNaseI、プロテアーゼ阻害剤カクテル)に再懸濁した。細胞を、フレンチプレス(French Press)への3回の通過によって溶解し、20,000gでの4℃、30分間の遠心分離によって清澄化した。上清を、NiNTAカラムに通過させ、20mMイミダゾール(20mM Tris pH7.0、2mM βメルカプトエタノール中)で洗浄し、250mMイミダゾール(同じ緩衝液中)で溶出した。溶出液を濃縮し、緩衝液A(20mM Tris pH7.0、2mM βメルカプトエタノール)であらかじめ平衡化した2ml MonoQカラムに直接的に搭載し、15分間洗浄し、次いで、0〜100%緩衝液B(1M NaCl、20mM Tris pH7.0、2mM βメルカプトエタノール)のグラジエントで、1ml/分の流速で、70分かけて溶出した。280nmでのUV吸収を、オンラインで観察し、GFP含有画分を、マイクロタイタープレート蛍光分光計を使用して各画分の蛍光(Ex.485nm/Em.520nm)を測定することによって特定した。3つのGFP含有画分(低、中程度、及び高濃度の塩)をプールし、保管緩衝液(60mM Tris pH7.0、100mM NaCl、2mM βメルカプトエタノール、及び10%グリセロール)に交換し、濃縮し、さらなる分析のために凍結させた。タンパク質濃度は、BCAアッセイ(Pierce社)及びGFP蛍光測定によって決定した。
【０１６２】
ポリシアル酸付加されたVEGF-A拮抗設計されたアンキリン反復タンパク質(DARPin)の精製。500,000のOD600に相当するバイオマスを、3000mlの結合緩衝液(10mMイミダゾール、30mM Tris pH7.0、500mM NaCl)に再懸濁した。細胞を、20,000 PSIでのマイクロフルイダイザー(Microfluidizer)LM20への1回の通過によって溶解し、10,000gでの4℃、1時間の遠心分離によって清澄化した。上清を、10ml/分の流速でToyopearl AF-Chelate-650M(Tosoh社)樹脂を充填した200ml XK50/20カラム(GE社)に搭載した。カラムを、40カラム体積(CV)のエンドトキシン除去緩衝液(10mMイミダゾール、30mM Tris pH8.0、500mM NaCl、0.1% Triton X-114)、それに続いて40CVの洗浄緩衝液(10mMイミダゾール、30mM Tris pH7.0、500mM NaCl)で洗浄し、最後に、10mMから500mMまでのイミダゾール(30mM Tris pH7.0、100mM NaCl中)のグラジエントで、10ml/分の流速で、15CVにわたって溶出した。ポリシアル酸付加されたDARPinを含有する画分をプールし、Source15Q樹脂(GE社)を充填した30ml X16 HiScaleカラム(GE社)に搭載した。続いて、カラムを、5CVの洗浄緩衝液(30mM Tris pH7.0、100mM NaCl)で洗浄し、100mMから350mMまでのNaCl(30mM Tris pH7.0中)のグラジエントで、40CVにわたって溶出した。3つのDARPin含有画分(低、中程度、及び高濃度の塩に相当する)をプールし、濃縮し、2.5ml/分の流速の1xPBS pH7.5で、318ml Superdex 200 26/60調製グレードカラムに搭載した。最終のサイズ排除クロマトグラフィーステップから得られる、DARPinを含有する画分を、(BCAアッセイ(Pierce社)によって決定された)2mg/mlに濃縮し、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を添加し、濾過によって滅菌し、次いで、さらなる分析のために凍結させた。
【０１６３】
分析用陰イオン交換クロマトグラフィー。精製された糖タンパク質を、20mM Tris pH7.0で、1mg/mlに希釈した。およそ4μgのタンパク質を、ProPac SAXカラム(Dionex社)に直接的に搭載し、50から600mMまでのNaCl(20mM Tris pH7.0中)のグラジエントで、1.2ml/分の流速で、15分かけて分離した。280nmでの吸光度、及びGFP蛍光(Ex.485nm/Em 520 nm)を、オンラインで観察した。
【０１６４】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー。精製されたタンパク質を、1xPBS pH7.5で、100μg/mlに希釈した。およそ5μgのタンパク質を、Agilent Bio SEC-5カラムに直接的に搭載した。試料を、1xPBS pH7.5で、0.6ml/分の流速で、均一溶媒で流した。215nmでの吸光度を、オンラインで観察した。Bio-Rad社のゲル濾過スタンダード(カタログ#151-1901)を使用した。
【０１６５】
表面プラズモン共鳴分光法。VEGF-結合剤の動態パラメータを、25℃でBiacore T200装置を使用して測定した。ベイトリガンド(組換え型ヒトVEGF165、Acro Biosystems社)を、センサーチップC1表面上に、3つの異なる密度で共有結合的に固定化した。プレイ分析物(異なるDARPin、又は陽性対照として、組換え型ヒトVEGF-R1(Acro Biosystems社))を、50μl/分の流速の10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% Tween 20中で、マルチサイクルカイネティクスを使用して分析した。
【０１６６】
Nano-LC-ESI-MS/MS分析。フィルター援用(filter aided)方法(Wisniewskiらの文献、Nat.Methods 6,359-362(2009)を参照のこと)を使用する質量分析のために、試料を調製し、ペプチドを濃縮し、C18 ZipTip(Millipore社)を用いて脱塩した。試料分析は、Nano-HPLC(Eksigent Technologies社)と連結した、較正されたLTQ-Orbitrap Velos質量分析計(ThermoFischer Scientific社)を用いて実施した。ペプチドを、2.5%アセトニトリル、0.1%ギ酸(FA)に再懸濁し、逆相C18材料(ReproSil-Pur 120 C18-AQ、1.9μm、Dr.Maisch社、Germany)を充填した自作のフリット装着したカラム(75μm×150mm)に搭載し、3段階のリニアグラジエントステップ:22分の3%から30%までのアセトニトリル、25分の30%から50%までのアセトニトリル、及び27分の50%から97%までのアセトニトリル(0.1%ギ酸は一定)を使用して、300nl/分の流速で溶出した。1スキャンサイクルは、フルスキャンMSサーベイスペクトル、それに続く、2000の閾値を超える最も強いシグナルに対する最大10回の連続的HCD MS/MSから構成されていた。フルスキャンMSスペクトル(500〜2000m/z)は、FT-Orbitrapにおいて、m/z400で60,000の分解能で得た。HCD MS/MSスペクトルは、Orbitrap(目標値1e5、衝突エネルギー35V)において、m/z400で15,000の分解能で記録した。自動利得制御(AGC)目標値は、フルFTMSスキャンについては1×106、及びHCD MS/MSスキャンについては1×105であった。すべての実験について、1回の反復数、15秒の反復期間、及び60秒の排除期間を用いる、ダイナミック排除(dynamic exclusion)を使用した。
【０１６７】
修飾された残基のデータベース分析及び同定。MS及びMS/MSデータを、Cysでのカルバミドメチル化、Metでの酸化、及びAsnでの1個/2個のヘキソースを考慮して、Mascotエンジン(バージョン2.4)を通じてSwissprotデータベース(バージョン201504)と照合した。2+又はそれ以上の荷電ペプチドのモノアイソトピック質量を、フラグメントイオンについて、8ppmのペプチド許容差及び0.25DaのMS/MS許容差を用いて検索した。MS/MSスペクトルにおけるNeuAc(292.10)及びNeuAc-H2O(274.09)に対するオキソニウムイオンの存在を使用して、1回のLC実行で、シアル酸付加された糖ペプチドを探し出した。ペプチドの配列決定は、手動で実施した。
表1:使用した細菌株及びプラスミド
【表１】
2019502401.tif 000003
表2:ApNGT配列
【表２】
2019502401.tif 000004
2019502401.tif 000005
【０１６８】
(6.2 実施例1:細胞質タンパク質グリコシル化が可能な宿主細胞の生成)
細胞質のN-グリコシル化システムが、近年、ガンマプロテオバクテリアのいくつかの種において明らかになった(Grassらの文献、PLoS Pathogen 6,e1000919(2010)、及びChoiらの文献、PLoS ONE 5,e15888(2010))。これらの細菌では、細胞質のN-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)が、Asn-X-Ser(Thr)シークオン内のアスパラギン残基を修飾し、また、ドナー基質として単純なヌクレオチド糖UDP-グルコース(UDP-Glc)を確かに使用する。得られるGlc β1-Asn改変は、真核生物のN-グリカンコア構造の単純な分子擬態である(Schwarzらの文献、J.Biol.Chem.286,35267-35274(2011))。アクチノバシラス・プルロニューモニエ(ApNGT)由来のNGTを使用して、大腸菌の細胞質における異種タンパク質を改変できることが、以前に実証されている(Naegeliらの文献、J.Biol.Chem.289,2170-2179(2014))。この例では、ApNGTが標的タンパク質をグルコース付加する(ここでは、細菌の細胞質における直接的な新規のN-結合型グリカンのボトムアップ合成のための部位特異的なきっかけ(例えばプライマー)を提供するために、N-結合型グルコースを使用することができる)能力が実証された。詳細には、ポリシアル酸付加のためのプライマーとしてN-結合型グルコースを使用して、大腸菌細胞質ゾルにおいてポリシアル酸付加されたタンパク質を生成する能力が実証された。
【０１６９】
α2,8-結合型ポリシアル酸(polySia)は、独特な生体機能及び広い生物工学的可能性をもつ線状ホモポリマーである。ヒト中枢神経系では、polySiaは、特定のタンパク質のN-グリカンに付着され、ここで、polySiaは、その抗接着特性を介して可塑性を高める(Rutishauserらの文献、Nat Rev Neurosci 9,26-35(2008)及びHildebrandtらの文献、Top.Curr.Chem.(2013).Doi:10.1007/128_2013_446を参照のこと)。さらに、脂質が結びついたpolySiaは、神経浸潤性の細菌性病原体のいくつかの菌株の細胞外莢膜を形成する。細菌のα2,8-結合型多糖は、ヒトpolySiaと化学的かつ免疫学的に同一であり、抗原豊富な細菌表面を隠し、かつ免疫回避を促進する、分子擬態として働く(Troy F.A.らの文献、Glycobiology 2,5-23(1992)を参照のこと)。これらの生体機能を踏まえると、polySiaは、多くの生物工学的用途を有する。注目すべきことには、治療用タンパク質のポリシアル酸付加は、免疫原性及びタンパク質分解を低下させ、かつ循環半減期を増大させ、したがって、治療用タンパク質のPEG化(ポリエチレングリコール鎖の化学的付着)に対する天然の生分解性代替物としての大きな可能性をもつ(Constantinouらの文献、Bioconjug.Chem.19,643-650(2008)及びLindhoutらの文献、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,7397-7402(2011)を参照のこと)。しかし、タンパク質のポリシアル酸付加のための利用可能な戦略は、既存のN-グリカンの化学的酵素的伸長(Lindhoutらの文献、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,7397-7402(2011)を参照のこと)、又は精製され官能基をもたせた多糖との化学的結合(Smirnovらの文献、Glyco-Engineering(Castilho,A.編)389-404(Springer New York,2015))に限られる。真核生物のポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)は、一握りのタンパク質標的にしか顕著な特異性を呈さないので、生合成は可能ではなかった(see Muhlenhoffらの文献、Neurochem.Res.1-10 doi:10.1007/s11064-013-0979-2を参照のこと)。この点は、Kallolimathらによる最近の植物内糖鎖工学研究によって強調されている(Kallolimathらの文献、Proc.Natl.Acad.Sci.(2016).doi:10.1073/pnas.1604371113)。彼らは、単一のα2,3-及びα2,6-結合型シアル酸残基を、多様な治療用タンパク質に付加することができるが、polySiaは、天然にポリシアル酸付加されるタンパク質、すなわち神経細胞接着分子(NCAM)のドメインに付加することのみが可能であることを示した。
【０１７０】
図1に描写した、この実施例で使用される生合成経路は、連続的に働いて、細菌の細胞質内のタンパク質標的上にpolySiaを構築する、4種の原核生物グリコシルトランスフェラーゼからなる。この経路におけるグリコシルトランスフェラーゼは、インビボ及びインビトロでの遊離のオリゴ糖の合成におけるその有用性について、また、そのアクセプター基質無差別性について選択された。選択されたガラクトシルトランスフェラーゼ、髄膜炎菌(MC58)のLgtBを、N-結合型グルコースの最初の伸長のために使用して、(N-結合型グルコースにガラクトースを結合させることによって)N-結合型ラクトースを形成した。LgtBは、ガラクトースを多様なグルコシドに転移させることが公知である(Lauらの文献、Chem.Commun.46,6066-6068(2010)を参照のこと)が、タンパク質-又はペプチド-結合型アクセプターを用いて試験されたことはない。N-結合型ラクトースは、カンピロバクター・ジェジュニ、CstII由来の二機能性のα2,3/α2,8オリゴシアリルトランスフェラーゼ(これは、α2,3、それに続いて最大3個のα2,8結合型Neu5Ac残基を付加することが可能である)の基質として働く(例えば、Antoineらの文献、Angew.Chem.117,1374-1376(2005);Blixtらの文献、Carbohydr.Res.340,1963-1972(2005);及びGilbertらの文献、J.Biol.Chem.275,3896-3906(2000)を参照のこと)。さらに、二機能性のシアリルトランスフェラーゼCstIIは、細菌のポリシアリルトランスフェラーゼによる伸長のためにラクトシドを刺激するための選択酵素として十分に確立されている(Lindhoutらの文献、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,7397-7402(2011)及びAntoineらの文献、Angew.Chem.117,1374-1376(2005))。使用した具体的なCstIIは、カンピロバクター・ジェジュニ(OH4382/84)由来のCstIIΔ32I53Sであり、これは、野生型タンパク質と比較して増大された溶解度、安定性、及びα2,8活性を有する(Chiuらの文献、Nat.Struct.Mol.Biol.11,163-170(2004)を参照のこと)。
【０１７１】
ジシアリルラクトースは、ポリシアリルトランスフェラーゼ(polyST)によって伸長させることができる。髄膜炎菌血清型B株のpolySTは、100を超えるα2,8-結合型Neu5Ac残基によって、ジシアリルラクトースを伸長させることができる(Lindhoutらの文献、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,7397-7402(2011)、Lindhoutらの文献、PLoS ONE 8,e69888(2013);及びFreibergerらの文献、Mol.Microbiol.65,1258-1275(2007)を参照のこと)。この実施例において生成される経路で使用した具体的なpolySTは、髄膜炎菌血清型B株由来のF116-polySTF460Tであった。これは、合計14個の変異、25アミノ酸のN末端切断、及びN末端Strep-タグを含み、これらは共に、polySTの溶解度及び安定性を増大させ、短鎖オリゴシアル酸アクセプターに対する増大された活性をもたらす(Keysらの文献、Nat.Chem.Biol.10,437-442(2014);及びKeysらの文献、Anal.Biochem.427,60-68(2012)を参照のこと)。
【０１７２】
この実施例において生成される生合成経路の各構成要素を、大腸菌宿主細胞に組み込み、タンパク質(ポリ)シアル酸付加に関与するタンパク質(グリコシルトランスフェラーゼ)を産生するのに不可欠な関連遺伝子を含む大腸菌宿主細胞をもたらした。二機能性のシアリルトランスフェラーゼCstIIとpolySTはどちらも、タンパク質をシアル酸付加するために、活性化されたドナー糖、CMP-Neu5Acを必要とする。この基質が宿主細胞によって産生されることを確実にするために、CMP-Neu5Acシンテターゼ、髄膜炎菌(MC58)の SiaBを宿主細胞に組み込み、培地には、内在するサルベージ経路を介して取り込まれるNeu5Acを添加した(Antoine Tらの文献、ChemBioChem 4,406-412(2003)を参照のこと)。
【０１７３】
使用した具体的な大腸菌の素性は、β-ガラクトシダーゼ(LacZ)及びシアル酸アルドラーゼ(NanA)活性(これらがあると、それぞれ、ラクトース及びシアル酸を分解する可能性がある)を欠く、大腸菌K12 JM107ΔnanA::kan株(Priemらの文献、Glycobiology 12,235-240(2002)を参照のこと)であった。経路酵素の発現を均衡化する、また、宿主株に対する代謝負荷を低下させるために、ApNGT、LgtB、CstII、polyST、及びSiaBをコードする遺伝子を、コドン最適化し(Welchらの文献、PLoS ONE 4、e7002(2009)を参照のこと)、ApNGT、LgtB、CstII、及びSiaBを、誘導性lacUV5プロモーター(Deuschleらの文献、EMBO J. 5、2987-2994(1986)を参照のこと)によって制御される各遺伝子の発現と、中程度の速度での翻訳の開始を誘導するように設計されたカスタマイズされたリボソーム結合部位(Salis,H.M.の文献、Methods in Enzymology内(Voigt,C.編)498,19-42(Academic Press,2011)を参照のこと)と共に、仮オペロン(Xu P.らの文献、ACS Synth.Biol.1,256-266(2012)、Xu P.らの文献、Nat.Commun.4,1409(2013)、及びHe W.らの文献、Metab.Eng.27 92-100(2015)を参照のこと)に統合した。表1、コンストラクトpMA991を参照のこと。polySTは、T5プロモーター及び強力なリボソーム結合部位の制御下に配置した。表1、コンストラクトpMA1059を参照のこと。
【０１７４】
Asn-X-Ser/Thr部位(1又は複数)を含有する、宿主細胞において(ポリ)シアル酸付加されたこととなる選択された標的タンパク質を、pBADプロモーターの制御下に配置した。表1、コンストラクトpMA885、pMA1045、及びpLMTB3724を参照のこと。
【０１７５】
(6.3 実施例2:相同タンパク質:ポリシアル酸付加されたscAtaCのグリコシル化)
この実施例では、標的タンパク質としてscAtaCを選択した。scAtaCは、アクチノバシラス・プルロニューモニエ由来のオートトランスポーターアドヘシンの、細胞質によって保持される可溶性断片であり、これは、ApNGTの天然の基質であり、また、高密度のAsn-X-Ser(Thr)部位を含有する(Naegeliらの文献、J.Biol.Chem.289,2170-2179(2014)を参照のこと)。
【０１７６】
操作されたグリコシル化経路における各ステップを試験するために、中間体グリカン構造の合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコードする一連のコンストラクトを生成した。次いで、これらの経路コンストラクトを、His6でタグ付けされたscAtaCと共発現させた。培養後、改変された標的タンパク質を濃縮し、SDS-PAGE及びイムノブロットによって分析した。図2を参照のこと。この経路へのApNGT、LgtB、及びCstIIの連続的追加は、標的タンパク質の見かけの分子量の連続的増大をもたらし、これは、シアリルラクトースが標的タンパク質に付加されたことを示唆していた。
【０１７７】
ガラクトース及びNeu5Acが、N-結合型グルコースに転移したことを確認するために、Glcβ1-Asnエピトープを検出するヒト血清、MS14を使用した。ApNGTのみが標的タンパク質と共発現される場合、MS14において顕著なバンドが認められた。図2、レーン3を参照のこと。下流のグリコシルトランスフェラーゼ、LgtB及びCstIIの追加は、このエピトープのかなりのマスキングをもたらし、これは、N-結合型グルコースが、連続的ガラクトース及びNeu5Ac転移のための基質であることを示している。
【０１７８】
経路へのApNGT及びLgtBの追加が、それぞれ、標的タンパク質の見かけのサイズに対する小さな増大をもたらしたのに対して、CstIIの追加は、見かけの分子量の大きな増大及び質量範囲の広幅化をもたらした。図2、レーン5を参照のこと。広範な質量範囲は、糖タンパク質に典型的であり、様々なグリコフォームの存在を示す。様々なグリコフォームは、変動する部位占有率に、また、最大3個のα2,8結合型Neu5Ac残基を付加するCstIIによるシアル酸付加の変動する量に起因する可能性がある(Blixtらの文献、Carbohydr.Res.340,1963-1972(2005)を参照のこと)。重要なことには、経路からのApNGTの欠失は、標的タンパク質の改変を廃止し、これは、ガラクトース及びNeu5Ac残基が、呼び水となるN-結合型グルコースに成功裡に転移したことを実証する。図2、レーン2を参照のこと。
【０１７９】
標的タンパク質上のシアリルラクトースの存在を確認するために、濃縮及びトリプシン処理したscAtaC試料に対して、LC-MS/MSを実施した。9つのscAtaCペプチドの改変が認められ、そのうちの7つは、古典的なAsn-X-Ser/Thr部位を含有しており、2つのペプチドは、他のシークオンで修飾されたように見えた。9部位のうちの8部位は、モノ-、ジ-、又はトリ-シアリルラクトースで修飾された。大部分の部位では、グリコシル化中間体の存在が認められた。図3は、N-結合型グルコースからトリシアリルラクトースまでの各中間体についての1つのペプチドの抽出イオンクロマトグラム、及び対応するMS/MSスペクトルを示す。
【０１８０】
別の実験、すなわち、シアリルラクトース経路(pMA991)の残りの構成要素と組み合わせたpolyST(pMA1059)の発現では、ポリシアル酸の合成が認められた。図4、レーン3を参照のこと。対照的に、ポリシアル酸は、polyST発現がない場合には(すなわち、pMA991のみが発現される場合には)検出できなかった。図4、レーン2を参照のこと。さらに、ポリシアル酸の量は、LgtB、CstII、及びSiaBを含むがApNGTを含まないプラスミドpMA1075が、polyST(pMA1059)と共に発現された場合に、劇的に低下した。図4、レーン1を参照のこと。
【０１８１】
標的タンパク質、scAtaCが、ポリシアル酸付加されたことを確認するために、ポリシアル酸陽性の無細胞抽出液に対して、LC-MS/MS分析を直接的に実施した。この結果は、scAtaC上の、最大でDP20のポリシアル酸鎖の存在を実証した。観察されたm/z種は、最大でDP9の改変されていないポリシアル酸の存在と、最大でDP20の大規模な分子内ラクトン化を伴うポリシアル酸鎖の両方を示す。表3を参照のこと。ラクトン化は、LC-MS分析のために使用される低pHで生じる、ポリシアル酸の可逆的改変であり、中性pHでは存在することが見込まれない。低pHでは、ラクトン化に加えて、ポリシアル酸の大規模な加水分解が予測される可能性があり、したがって、この分析において観察される多糖の長さは、scAtaC上で合成される鎖長よりも著しく小さく見積もられる可能性が高い。そうは言っても、scAtaCのポリシアル酸付加は、確実に明らかであった。
表3:ポリシアル酸付加されたscAtaCペプチドのLC-MS/MS分析
【表３】
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【０１８２】
(6.4 実施例3:異種タンパク質のグリコシル化:ポリシアル酸付加されたsfGFP)
この実施例では、異種標的タンパク質のグリコシル化を実証した。短いAsn-X-Ser(Thr)シークオンを利用して、単一の操作されたグリコシル化部位をもつ、2つのスーパーフォルダー(superfolder)緑色蛍光タンパク質(GFP)(Pedelacqらの文献、Nat.Biotechnol.20,927-932(2002))コンストラクトを生成した。グリコシル化部位を、C末端タグとして、又はループ内に(残基194〜195の間に)付加して、それぞれ、「GlycoTag-」及び「GlycoLoop-」コンストラクトを生成した。図5aを参照のこと。グルコシル化は、N-Glc特異的血清を使用するイムノブロットによって、最初に探索した。図5bを参照のこと。結果は、どちらのGFPも、ApNGTと共発現させた場合にグルコース付加されることを立証した。定量的MS分析は、GlycoLoop-及びGlycoTag-部位の、それぞれおよそ86%及び97%グリコシル化占有率を示した。対照的に、グリコシル化部位を欠くGFPコンストラクトは、修飾されなかった。ペプチドLC-MS/MSによって、LgtB及びCstIIが、N-結合型グルコースを伸長させて、GlycoLoop-GFP上にシアリルラクトースプライマーを構築することが可能であることも実証された。図6を参照のこと。
【０１８３】
次の実験では、改変されたコンストラクト、GlycoTag-GFPを使用して、タンパク質ポリシアル酸付加を試験した。細菌polySTは、多糖合成を刺激するために、最小限のジシアリルラクトースを必要とする(Lindhoutらの文献、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,7397-7402(2002))。ポリメラーゼが、タンパク質-結合型シアリルラクトースプライマーを伸長できるかどうかを試験するために、本発明者らは、JM107 ΔnanA::kan細胞において、GlycoTag-GFPコンストラクト(pMA1045)と共に、ポリシアル酸付加経路全体(pMA991及びpMA1059)を共発現させた。最初、本発明者らは、少量のpolySiaのみを観察したが、振とうフラスコ培養条件の最適化によって、収率がかなり改善され、より高いMWへのGFPのスメアリング(smearing)がもたらされ、これは、多糖を伴うGFPの改変を示唆していた。図7を参照のこと。ポリシアル酸付加を確認するために、NiNTAアフィニティクロマトグラフィーを介して全GFPを精製し、分取陰イオン交換クロマトグラフィーを介して異なるグリコフォームを分離した。図8を参照のこと。ポリシアル酸付加されたGFPは、各シアル酸単位によって保有される負電荷に起因して、カラム上に保持されることが予想された。これらの予想に一致し、全GFPを、低、中程度、及び高濃度の塩で溶出される3つの画分(それぞれ、修飾されない、オリゴで修飾された、及びpoly-Siaで修飾されたGFPに対応する)に分けることができた。図5c及びdを参照のこと(polySiaは、ここでは＞10残基の鎖と定義される)。GFPに付加されたポリマーの正確な長さ及び分布を、インタクトな糖タンパク質の分析用陰イオン交換クロマトグラフィーによって決定した。ポリシアル酸付加されたGFP画分は、長さおよそ10から80のシアル残基を含むポリマーで修飾されたが、より短い鎖が最も豊富であった。ポリマーのα2,8-結合を、エンドシアリダーゼNFでの消化に対する修飾の感受性を試験することによって確認した(Stummeyerらの文献、Nat.Struct.Mol.Biol.12、90-96(2005))。さらなる最適化を行わずに、この生合成経路は、1リットルのLB培地から、全GFPの5〜10%に相当する、3mgのポリシアル酸付加されたGFPをもたらした。経路エレメントの発現を均衡化する、また、CMP-Neu5Acの供給を改良することによって、収率のさらなる向上が実現することとなる。
【０１８４】
(6.5 実施例4:異種タンパク質のグリコシル化:ポリシアル酸付加されたDARPin)
この実施例では、第2の異種標的タンパク質のポリシアル酸付加を試験した。先の実施例と類似して、短いAsn-X-Ser(Thr)シークオンを、C末端タグとして、強力なVEGF-A拮抗設計されたアンキリン反復タンパク質(DARPin)に付加し(Stahlらの文献、Angiogenesis 16,101-111(2013))、GlycoTag-DARPinコンストラクト(pLMTB3724)を生成した。
【０１８５】
JM107 ΔnanA::kan細胞において、GlycoTag-DARPinコンストラクト(pLMTB3724)と共に、ポリシアル酸付加経路全体(pMA991及びpMA1059)を共発現させた。
【０１８６】
NiNTAアフィニティクロマトグラフィーを介して全DARPinを精製し、分取陰イオン交換クロマトグラフィーを介して異なるグリコフォームを分離した。ポリシアル酸付加されたDARPinは、各シアル酸単位によって保有される負電荷に起因して、カラム上に保持されることが予想された。これらの予想に一致し、全DARPinを、低、中程度、及び高濃度の塩で溶出される3つの画分(それぞれ、短鎖、中鎖、及び長鎖polySia鎖で修飾されたDARPinに対応する)に分けることができた。図9aを参照のこと。
【０１８７】
精製された(purified)タンパク質を、高性能サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)を使用して分析した。タンパク質グリコシル化機構を欠くJM107 ΔnanA::kan細胞において産生された、グリコシル化されていないDARPin、及び様々なポリシアル酸付加されたDARPin調製物のクロマトグラムを、図9bに示す。ゲル濾過スタンダードを使用して、ポリシアル酸付加された種の分子量(MW)を決定した。HPSECによって決定された糖タンパク質のMWは、主に、糖タンパク質の流体力学的体積を大幅に増大させるpolySia鎖のポリアニオン的性質に起因して、SDS-PAGEを使用するタンパク質サイズ推定値と比較して、かなり高かった。表4を参照のこと。
【０１８８】
表面プラズモン共鳴(SPR)研究では、DARPin調製物とVEGF165との相互作用の結合特性及び動態を分析し、VEGF受容体(組換え型ヒトVEGF-R1)とVEGF165との相互作用と比較した。動態パラメータの決定については、BCAアッセイ(Pierce社)を使用してプローブの濃度を測定し、飽和条件で測定されたSPRシグナル(Rmax)を介して分子量を決定した。SPRを介して決定されたMWについては、表4を参照のこと。各プローブは、3つの異なる密度の共有結合的に固定化された組換え型ヒトVEGF165を用いて、センサー表面上で2回測定した。測定値の速度定数を、表5にまとめて示す。rhVEGF-R1のKDは、2桁のナノモルの範囲内である。修飾されていないDARPinは、Stahlらの文献(Angiogenesis 16,101-111(2013))によって報告された通り、ヒトVEGF165に対する1桁のピコモルの親和性を有する。重要なことには、すべてのDARPin調製物が類似のKD値を有するので、ポリシアル酸での修飾は、DARPinの、VEGFに対する親和性を低下させない。
表4:SDS-PAGE、HPSEC、及びSPRによる、グリコシル化されていないかつポリシアル酸付加されたDARPin調製物の分子量決定。
【表４】
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表5:VEGF165と結合するVEGF結合タンパク質(DARPin及びVEGF受容体)の速度定数
【表５】
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【０１８９】
(6.6 実施例5:細胞質タンパク質グリコシル化が可能な宿主細胞の生成:CMP-Neu5Acの新規生合成のための経路の操作)
先の実施例では、CMP-Neu5Ac生合成のための内在性のスカベンジャー経路を利用して、標的タンパク質のグリコシル化のための前駆体を産生した。この経路は、大腸菌が、Neu5Acを異化し、かつシアル酸パーミアーゼ、NanTを有することができるという事実を生かしている。しかし、CMP-Neu5Acに対する細菌polySTのKMは比較的高い(1〜5mMの範囲内である)ので、単一のタンパク質のポリシアル酸付加のために、最大100当量のCMP-Neu5Acが必要とされる(Lindhoutらの文献、PLos One 8 2013 doi:10.1371/journal.pone.0069888)。したがって、ドナー分子、CMP-Neu5Acは、ポリシアル酸付加されたタンパク質の生合成のための制限反応物である可能性がある。
【０１９０】
【０１９１】
この実施例では、ドナー分子CMP-Neu5Acの内在性プールを増強するために、CMP-Neu5Ac合成のための新生経路を、大腸菌K12誘導体W3110に導入した。使用した戦略は、ゲノム的にコードされているNeu5Ac異化酵素(nanAK)の欠失と、髄膜炎菌血清型B株由来のCMP-Neu5Ac生合成酵素siaABCの異種発現とを含んでいた(図1、Keysらの文献、Anal Biochem.427,60-68(2012)、Fierfort及びSemainの文献、J Biotechnol.134,261-5(2008)、及びRichardらの文献、Glycobiology.26,723-31(2016)を参照のこと)。siaABC遺伝子は、髄膜炎菌血清型B株においてポリシアル酸莢膜の生合成をコードするポリシストロニック・オペロンの一部として存在する。これらの遺伝子を、その天然のRBSと共に、まとまりとみなし、誘導性プロモーター(lacUV5)の後ろに配置し、「シアリルラクトース経路」コンストラクトに導入して、pLMTB4250を生じた。表1を参照のこと。
【０１９２】
CMP-Neu5Ac生合成のための新生経路が機能性であるかどうかを試験するために、StLMTB10758(W3110 ΔlacZ ΔnanA ΔnanK)において、GlycoTag-GFPコンストラクト(pMA1045)と共に、グリコシル化経路コンストラクトを共発現させた。全GFPを、NiNTAビーズを介して濃縮し、試料を、SDS-PAGE、それに続いてクーマシー染色によって分析した。図10を参照のこと。ポリシアル酸付加は、polySia特異的モノクローナル抗体を使用するイムノブロットによって探索した。結果は、pLMTB4250(すなわち、CMP-Neu5Ac(siaABC)の新規合成のための髄膜炎菌血清型B株遺伝子を含むシアリルラクトース経路を発現する)と、polyST(pMA1059)とを共発現させた場合に、GFPがポリシアル酸付加されることを立証した。図10、レーン2を参照のこと。CMP-Neu5Ac生合成のためのスカベンジャー経路を使用する宿主細胞において産生された、濃縮されたGFP試料、すなわち、Neu5Acが添加されており、かつSiaBのみを発現する細胞培養物では、より弱いpolySiaシグナルが検出された。図10、レーン4を参照のこと。pLMTB4250との共発現は、GlycoTag-GFPの見かけの分子量の増大をもたらし、これは、シアリルラクトースが、標的タンパク質に付加されたことを示唆していた。図10、レーン1を参照のこと。予想通り、GlycoTag-GFPが、グリコシル化経路を発現しない宿主細胞から精製された場合には、polySiaは検出されなかった。図10、レーン3を参照のこと。
【０１９３】
(6.7 実施例6:細胞質タンパク質グリコシル化が可能な宿主細胞の生成:polyST相同体を使用する標的タンパク質のインビボでのポリシアル酸付加)
先の実施例では、標的タンパク質のインビボでのポリシアル酸付加のために、髄膜炎菌血清型B株由来のpolySTを使用した。使用した具体的なバリアント、F116-polySTF460Tは、合計14個の変異、25アミノ酸のN末端切断、及びN末端Strep-タグを含む。これらの改変は共に、polySTの溶解度及び安定性を増大させ、短鎖オリゴシアル酸アクセプターに対する増大された活性をもたらす(Keysらの文献、Nat.Chem.Biol.10,437-442(2014);及びKeysらの文献、Anal.Biochem.427,60-68(2012)を参照のこと)。この実施例は、polyST相同体が、タンパク質ポリシアル酸付加のための操作された経路において、F116-polySTF460Tの代わりとなることができることを実証する。最近、いくつかの好都合な生化学的特性を組み合わせた、マンヘイミア・ヘモリチカ由来の新規のpolySTが記載されている(Lindhoutらの文献、PLoS One 2013 8(7):e69888.doi:10.1371/journal.pone.0069888を参照のこと)。先の実施例に従って、20アミノ酸のN末端欠失を含有するマンヘイミア・ヘモリチカ由来のpolyST(Δ20polySTMh)を、N末端マルトース結合タンパク質融合を有する又は有しないpCDF-DUET発現プラスミドにクローン化した。それぞれ、表1内のpLMTB3961及びpLMTB3962を参照のこと。Δ20polySTMhバリアントが、タンパク質-結合型シアリルラクトースプライマーを伸長できるかどうかを試験するために、StLMTB10758(W3110 ΔlacZ ΔnanA ΔnanK)において、GlycoTag-GFPコンストラクト(pMA1045)と共に、ポリシアル酸付加経路全体を共発現させた。全GFPを、NiNTAビーズを介して濃縮し、試料を、SDS-PAGE、それに続いて特異的抗polySiaモノクローナル抗体を用いるイムノブロットによって分析した。図11aを参照のこと。結果は、Δ20polySTMhコンストラクト(pLMTB3961又はpLMTB3962)を、pLMTB4250と共に共発現させた場合に、GlycoTag-GFPがポリシアル酸付加されることを立証した。図11a、レーン3及び4を参照のこと。予想通り、グリコシル化経路を発現しない宿主細胞において産生された、濃縮されたGFP試料においては、polySiaシグナルは検出されなかった。図11a、レーン1を参照のこと。シアリルラクトース経路(pLMTB4250)との共発現は、GlycoTag-GFPの見かけの分子量の増大をもたらし、これは、シアリルラクトースが標的タンパク質に付加されたことを示唆していた。図11a、レーン2を参照のこと。GFPに付加されたポリマーの正確な長さ及び分布を、インタクトな糖タンパク質の分析用陰イオン交換クロマトグラフィーによって決定した。図11bを参照のこと。シアリルラクトース経路(pLMTB4250)との共発現は、DP4までの短鎖オリゴシアル酸の構築をもたらし、これは、CstIIの報告された活性と一致している(Blixtらの文献、Carbohydr.Res.340,1963-1972(2005)を参照のこと)。ポリシアル酸付加経路全体(pLMTB4250及びpLMTB3961/pLMTB3962)を共発現させると、ポリシアル酸付加されたGFPが検出された。さらなる最適化を行わずに、Δ20polySTMhコンストラクト(pLMTB3961)を含む生合成経路は、全GFPの20〜25%の、ポリシアル酸(DP≧10と定義される)での修飾をもたらした。
【０１９４】
(6.8 結論)
これらの実施例は、大腸菌細胞質ゾル内で共発現されたグリコシルトランスフェラーゼが、タンパク質グリコシル化のためのプライマーとして、N-結合型グルコースを使用することができることを実証する。特に、これらの実施例は、大腸菌において発現された場合に標的タンパク質のポリシアル酸付加をもたらす、合成のポリシアル酸付加経路を生成することができることを実証する。この発見は、そのポリシアル酸付加されていない同等物と比較して半減期が延長されたポリシアル酸付加されたタンパク質(治療用タンパク質など)を生成するために、宿主細胞(大腸菌など)の使用を可能にするので、極めて重要である。
【０１９５】
本開示は、本明細書に記載した具体的実施態様による範囲に限定されるべきではない。実際、記載したものに加えて、本明細書で提供される主題の様々な改変が、先の説明及び添付の図から、当業者に明らかとなるであろう。こうした改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０１９６】
様々な刊行物、特許、及び特許出願を、本明細書に引用し、その開示の全体を、参照によって組み込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月1日(2018.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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