(57)【要約】  本発明は、ムラサキフトモモ(S. cumini)葉からの植物ベースCNCの単離を含む。NCの形成のために、マトリックスとしてのCNC中へフィラーとしてAgNPをインサイツ含浸させるために還元剤としてムラサキフトモモLEを用いる環境に優しい新規の手法を報告する。1mM、5mM及び10mMの3つの異なる濃度の硝酸銀溶液を用いて、CNCマトリックス中にAgNPが組み込まれたNCを形成した。CNC及びNCをSEM、TEM、XRD、ゼータ電位、FT-IR、及びUV-Vis分光法を用いて特徴づけた。フィルム及び軟膏の形態で開発されたNCは、グラム陰性及びグラム陽性の両細菌に対して強力な抗菌活性を示した。NC創傷被覆材は、創傷滲出物を制御し、創傷に湿気を与えることができ、これが急性創傷のより速い治癒の原因となる。組織病理学的及び生化学的アッセイからの知見は、より少ない炎症、迅速な血管新生、早期のコラーゲン形成及び再上皮化速度向上のためNCが治癒を促進することを確証した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
銀ナノ粒子(AgNP)及びセルロースナノ結晶(CNC)を含むナノバイオコンポジット製剤(NC)であって、軟膏形態においてAgNPとCNCとの比が0.067%〜0.4%w/w(AgNP)：7〜8%w/w(CNC)の範囲内であることを特徴とする、ナノバイオコンポジット（NC）製剤。
【請求項２】
請求項1に記載のナノバイオコンポジット製剤の調製方法であって、下記工程：
a)  洗浄及び乾燥したムラサキフトモモ(Syzgium cumini)葉を3.0〜4.0の範囲のpHで2〜3時間の範囲の時間70〜100℃の範囲の温度で漂白剤を用いて処理して漂白された繊維材料を得る工程；
b)  工程(a)から得た漂白された繊維材料を濾過及び洗浄した後、22〜30℃の範囲の温度で16〜18時間の範囲の時間酸性化漂白剤溶液で処理して酸性化繊維材料を得る工程；
c)  工程(b)から得た酸性化繊維材料を洗浄した後、それを2〜18%の各塩基中で2〜5時間それぞれ70〜80℃にて連続的撹拌下で維持して繊維材料を得る工程；
d)  工程(c)からの繊維材料を0.6〜3%の亜塩素酸ナトリウム溶液で0.5〜3時間の範囲の時間80〜100℃の範囲の温度で処理した後、濾過及び洗浄して化学的処理繊維を得る工程；
e)  工程(d)から得た化学的処理繊維を、64〜67%(v/v)の酸を1:5〜1:9の範囲の比で用いて30〜120分の範囲の時間40〜80℃の範囲の温度にて連続的撹拌下で処理して酸性化化学的処理繊維を得る工程；
f)  工程(e)から得た酸性化化学的処理繊維を遠心分離機にかけ、水に対して透析して中性になるまで酸分を除去してセルロースナノ結晶CNCを得る工程；
g)  工程(f)から得たセルロースナノ結晶CNCを機械的に既知方法で4〜30mMの範囲の時間処理して前記繊維を個別化し、凍結乾燥させて白色固体CNCを得る工程；
h)  ムラサキフトモモ(Syzgium cumini)葉を20〜28時間の範囲の時間20〜30℃の範囲の温度で水に浸漬させた後、濾過し、4〜10℃の温度で貯蔵して生物学的還元剤として葉抽出物を得る工程；
i)  工程(g)から得たCNCを凍結乾燥させ、1mM、5mM及び10mM(1〜10mM)の各硝酸銀溶液を添加し、2〜5分間超音波処理して混合物を得る工程；
j)  工程(h)から得た10〜20%v/vのムラサキフトモモ(Syzgium cumini)葉抽出物を、工程(i)で得た各混合物に連続的撹拌下で4〜8時間の範囲の時間20〜30℃の範囲の温度で添加する工程；
k)  工程(j)で得た混合物を遠心分離機にかけてナノバイオコンポジットNC製剤を得る工程
を含む、前記方法。
【請求項３】
使用する漂白剤が、亜塩素酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム及び水酸化物過酸化物から成る群より選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
使用する酸が、硫酸、硝酸、塩酸又はその混合物の群から選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
使用する塩基が、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムの群から選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記NC製剤を細片又は軟膏の形態で創傷治癒のために使用する、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
NCペレットをワセリン基剤と1:1の比で直接混合して軟膏を得る、請求項2に記載のナノバイオコンポジット製剤の調製方法。
【請求項８】
前記NC製剤を水に溶かし、適切にボルテックスして水性懸濁液を得、これを型に流し込み、NC細片の形態でオーブン乾燥させる、請求項2に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、創傷治癒のためのナノバイオコンポジット製剤に関する。特に、本発明は、生物学的植物材料、すなわちムラサキフトモモ(Syzygium cumini)(ジャムン(Jamun))の葉からのセルロースナノ結晶(CNC)の化学機械的合成及び環境に良いナノバイオコンポジット(NC)の調製方法に関する。NCの2つの異なる形態、すなわち細片(strip)及び軟膏を実証した。さらに詳細には、本発明は、抗菌創傷治癒製品としてナノシルバーを含浸させた植物ナノセルロースのNCの開発及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、優れた殺菌及び創傷治癒効果を示すナノ銀を組み込んだ植物ベースセルロースナノ結晶マトリックスを含む創傷被覆材を想定する。本発明は、実質的には任意の形状又はサイズの細片／フィルムのみならず軟膏の形態のナノバイオコンポジット並びにその製造方法にも関する。
創傷治癒は、種々の生物学的経路を経て進む多くの細胞及び組織系列の統合活動から成る複合事象であり、まだ調査中の多数の因子に左右される。創傷は、下記種々のタイプに分類されている：開放及び閉鎖創傷；急性及び慢性創傷；切開及び切除創傷。創傷治癒の初期段階は、血餅形成及び炎症を伴う。対象の創傷が細菌感染の標的になった場合は炎症が大いに増強される。例えば、限定するものではないが、切創、第2度及び第3度熱傷(bum)、褥瘡、糖尿病性潰瘍、手術創、及び種々の皮膚剥削術等の創傷の処置は、微生物感染のため困難になる。炎症が鎮静するにつれて、増殖期が始まり、線維芽細胞が創傷部位に入り、創傷閉鎖及び組織再生に関与するコラーゲン原線維の形成につながる。創傷治癒障害は、皮膚の正常な構造及び機能を回復させることなく、長期の炎症、創傷組織端の分離、及び瘢痕組織の過剰形成を抑えようとする。創傷治癒障害／遅延に関連するこれらの問題を克服して、細菌感染を抑制し、線維芽細胞及び他の特殊細胞の成長を促進して、再上皮化及び最終的に組織再生の速度を高めるために多数の試みが既に提案されてきた。創傷滲出物の供湿及び吸湿能力も最適な創傷治癒に役割を果たすことを示唆する研究もあった。
【０００３】
理想的な被覆材は、創傷治癒を加速するのみならず、創傷からの体液の損失を減らし、痛み及び炎症を最小限にするのに役立ち、脆弱な皮膚に保護を与えることを意味し、創傷に非付着性でなければならない。これらの要求を満たし、患者により良い生活を与えるために種々の創傷被覆材が世界市場で入手可能である。治療すべき創傷の性質によってその適応性が決まる創傷被覆材の作製のために種々多様の材料が利用可能である。米国特許第6140257号は、吸収剤、すなわち、少なくとも40%の別の多糖が中に分散している10%から50%未満の水不溶性アルギナートのマトリックスを含む創傷被覆材としての複合繊維の使用について記載している。先行技術(U.S.20130330417 Al)に記載の創傷ケア製品に用いられる種々の他の吸水活性成分は、化学的に修飾されたセルロース繊維、ペクチン繊維、アルギナート繊維、コラーゲン繊維、キトサン繊維、ヒアルロン酸繊維又は他の多糖繊維である。
【０００４】
銀は、熟成(ages)用防腐剤として知られている。遠い過去から当技術分野では銀、銅、亜鉛が用いられている。より適切に言えば、創傷ケア製品をデザインするためのガーゼ、アルギナート、ハイドロコロイド及び泡にナノ結晶銀が含浸されている。これらの被覆材は、それらの利点に応じて特定タイプの創傷の治療に用いられる。被覆材として用いられるガーゼは、創傷表面に付着し、ガーゼの除去中に新生上皮に痛みと損傷をもたらす。創傷ケア製品に用いられるアルギナートが異物型反応を引き起こし得ると記載する報告もある。創傷ケアに用いられるハイドロコロイドは、重度の滲出性創傷のために必要を示されたことはなく、また悪臭を生じさせる。泡も過剰な悪臭のある排液を生じさせる可能性があり、被覆材の頻繁な交換を必要とする。米国特許第20120282348 Al号は、水分の授受による熱傷創の治療のための銀ハイドロゲルの使用を報告している。米国特許第5514657 Aは、特に熱傷創の創傷治癒のための銀スルファジアジン及びコラーゲンの局所抗菌適用について述べている。それらの利点にもかかわらず、製品は一般的に高価であり、少ない滲出物吸収を示す。
【０００５】
創傷治癒製品に用いるべく多数の合成及び天然ポリマーが市場に存在する。ポリウレタン、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリエチレンオキシド(PEO)及びポリビニルアルコール(PVA)等の合成ポリマーを他の合成又は天然ポリマーと併用して、治癒に最適な多くの特性、例えば保湿、再膨潤能力、及び創傷滲出物の吸収を達成することができる。創傷被覆材のためにコラーゲン及びアルギナートのような天然ポリマーが活用されている。これらは良い水の吸収／供与能力を有するけれども、それらの使用に関しては生体適合性及び費用の問題がある。
【０００６】
代替バイオポリマーであるセルロースも創傷治癒加速に関与する固有の特性を有する。それは、地球上に存在する最も豊富な最古の生体適合性の再生可能生物資源である。セルロースは、その固有の水素結合構造のため高い引張強度を有する。セルロースナノ結晶(CNC)又はナノ繊維は、ナノコンポシット、及び生物医学分野における強化剤として広範な用途を有する新分類のナノ材料として開発されている。植物、農業廃棄物、細菌、尾索類のような天然源は、セルロースの原材料と考えられている。CNCの単離のために早期に用いられた植物源としては、麦わら、穀皮、大豆皮、バナナ、竹、農業廃棄物、木材、一部の植物の 茎が挙げられる。EP 2513149 Alは、過硫酸アンモニウムを用いたフレックス(flex)及び麻等の植物性バイオマスからのCNCの単離について記載する。米国特許第2008/0108772は、微結晶性セルロースをHClで処理することによるセルロースナノウィスカーの製造プロセス、並びに強化有機ポリマー材料を製造するための新しい押出方法について記載する。HCl加水分解を用いるセルロースナノウィスカーの製造は純粋なセルロース由来材料(例えばMCC)を必要とし、結果として生じたセルロースナノウィスカーは大きいサイズ分布を有した。CNCを単離するための多数の方法、例えば化学的方法、機械的方法、酵素的方法、及び機械的方法と組み合わせた化学的方法が知られている。それでもこれらの単離されたCNCを生物医学分野、特に創傷ケアに利用するためには、セルロース由来でない不純物のない、狭いサイズ分布を有するCNCを製造するための適切な方法論を用いてプロセスパラメーターを最適化する必要がある。セルロース繊維及び綿繊維は、それらの優れた吸湿性、吸水性、及びフレキシビリティを考慮すると外科手術及び医学的処置に最も適している。細菌アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylinum)もセルロースを単離すると考えられている。細菌セルロースは、その高い吸水能及び純度による創傷治癒適用のために報告されている。米国特許第7704523 B2号は、慢性創傷の治療のための微生物由来セルロースの使用について記載する。米国特許第20130211308 Al号は、ナノ銀被覆細菌セルロースの吸水ポテンシャルに起因する創傷治癒のための使用を開示する。米国特許第7390499 B2号は、創傷治癒薬としてのセルロースと殺菌剤との混合物の使用について記載する。細菌セルロースの化学組成は植物セルロースとほとんど同様である。微生物セルロースの使用に伴う問題は、製造が困難かつ高価なことである。細菌株は、培養下でそれらの成長中にそれらのセルロース合成能力を失い、適用中にそれらの完全性を維持できない。さらに、微生物セルロースの製造、加工及び使用は、様々なタイプの創傷に用いられる創傷被覆材の連続的資源を提供できない。高い保水能力を有する細菌セルロースは、創傷部位周囲の過湿に起因する細菌感染の機会を増やすこともある。植物CNCを単離するための努力が必要である。植物セルロースは抽出しやすく、環境に優しく、自然界に大量にあり、再生可能であり、生体適合性であり、費用効率が良く、良い吸水能を有する。
【０００７】
先行技術は、最適な創傷治癒、湿気管理能力、抗菌活性、抗炎症活性、及び十分な生体適合性の集合的ポテンシャルを有する創傷被覆材を提供できなかった。本発明では、ムラサキフトモモ(Syzygium cumini)植物葉からのCNCの単離を試みた。創傷ケア製品に関連する上記問題を解決するため、植物CNC及びナノ結晶銀(AgNP)を含有するナノバイオコンポジットの設計について述べる。それは創傷治癒の促進に適した水分管理と抗菌作用の相乗的役割を有するので理想的創傷被覆材の基準を満たす。細片及び軟膏形態の本発明の生体適合性であり、費用効率の良い創傷被覆材は、炎症速度を低減させ、増殖及び顆粒化を促進し、瘢痕形成を減らし、上皮移動、早期コラーゲン形成を可能にし、創傷閉鎖速度を高め、究極的に再上皮化を増進することによって創傷治癒を助ける。ナノセルロースに組み込まれたナノ銀粒子は、抗菌、抗炎症作用を有し、かつ瘢痕化を最小限にするのにも役立つ。AgNPは、線維芽細胞の筋線維芽細胞への変換に役立ち、創傷閉鎖に影響を与える。これに加えて、本発明の創傷被覆材は、創傷部位で分解せず、如何なる残留物をも残さない。創傷被覆材は、創傷皮膚に付着せず、除去しても如何なる痛みをも引き起こさない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の目的
本発明の主目的は、ムラサキフトモモ(Syzygium cumini)の葉からの化学機械的方法によるセルロースナノ結晶(CNC)の単離及びそれらの特徴づけを提供することである。
本発明の別の目的は、CNCマトリックス上での銀ナノ粒子AgNPのインサイツ含浸を含むナノバイオコンポジット(NC)を開発するための環境に優しい(green)手法の採択を提供することである。創傷ケア製品としてのNCの薄片／フィルム及び軟膏の調製。
本発明のさらに別の目的は、開発したNCの抗菌及びインビボ急性創傷治癒ポテンシャルに関する評価を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
従って、本発明は、銀ナノ粒子(AgNP)及びセルロースナノ結晶(CNC)を含み、AgNPとCNCの比が、軟膏形態で0.067%〜0.4%w/w(AgNP)：7〜8%w/w(CNC)の範囲内であるナノバイオコンポジット製剤(NC)に関する。
本発明の実施形態では、新規製品ナノバイオコンポジットNCは、抗菌性急性創傷治癒薬として用いるためにAgNPを含浸したムラサキフトモモ(S. cumini)単離CNCマトリックスで構成され、ムラサキフトモモ(S. cumini)の葉抽出物を用いて合成された。
本発明の好ましい実施形態では、ナノバイオコンポジット製剤の調製方法であって、下記工程：
a)  洗浄及び乾燥したムラサキフトモモ(Syzgium cumini)葉を3.0〜4.0の範囲のpHで2〜3時間の範囲の時間70〜100℃の範囲の温度で漂白剤を用いて処理して漂白された繊維材料を得る工程；
b)  工程(a)から得た漂白された繊維材料を濾過及び洗浄した後、22〜30℃の範囲の温度で16〜18時間の範囲の時間酸性化漂白剤溶液で処理して酸性化繊維材料を得る工程；
c)  工程(b)から得た酸性化繊維材料を洗浄した後、それを2〜18%の各塩基中で2〜5時間それぞれ70〜80℃にて連続的撹拌下で維持して繊維材料を得る工程；
d)  工程(c)からの繊維材料を0.6〜3%の亜塩素酸ナトリウム溶液で0.5〜3時間の範囲の時間80〜100℃の範囲の温度で処理した後、濾過及び洗浄して化学的処理繊維を得る工程；
e)  工程(d)から得た化学的処理繊維を、64〜67%(v/v)の酸を1:5〜1:9の範囲の比で用いて30〜120mMの範囲の時間40〜80℃の範囲の温度にて連続的撹拌下で処理して酸性化化学的処理繊維を得る工程；
f)  工程(e)から得た酸性化化学的処理繊維を遠心分離機にかけ、水に対して透析して中性になるまで酸分を除去してセルロースナノ結晶CNCを得る工程；
g)  工程(f)から得たセルロースナノ結晶CNCを機械的に既知方法で4〜30mMの範囲の時間処理して繊維を個別化し、凍結乾燥させて白色固体CNCを得る工程；
h)  ムラサキフトモモ(Syzgium cumini)葉を20〜28時間の範囲の時間20〜30℃の範囲の温度で水に浸漬させた後、濾過し、4〜10℃の温度で貯蔵して生物学的還元剤として葉抽出物を得る工程；
i)  工程(g)から得たCNCを凍結乾燥させ、1mM、5mM及び10mM(1〜10mM)の各硝酸銀溶液を添加し、2〜5分間超音波処理して混合物を得る工程；
j)  工程(h)から得た10〜20%v/vのムラサキフトモモ(Syzgium cumini)葉抽出物を、工程(i)で得た各混合物に連続的撹拌下で4〜8時間の範囲の時間20〜30℃の範囲の温度で添加する工程；
k)  工程(j)で得た混合物を遠心分離機にかけてナノバイオコンポジットNC製剤を得る工程
を含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の実施形態では、本発明は、使用する漂白剤が、亜塩素酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム及び水酸化物過酸化物（hydroxide peroxide）から成る群より選択される方法を提供する。
本発明のさらに別の実施形態では、使用する酸が、硫酸、硝酸、塩酸又はその混合物の群から選択される方法を提供する。
本発明のさらに別の実施形態では、使用する塩基が水酸化カリウム、水酸化ナトリウムの群から選択され方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、細片又は軟膏の形態で創傷治癒のために用いるNC製剤を提供する。
本発明の別の実施形態では、ナノバイオコンポジット製剤の調製方法であって、NCペレットをワセリン塩基と1：1の比で直接混合して軟膏を得る方法を提供する。
本発明の別の好ましい実施形態では、NC製剤を水に溶かし、適切にボルテックスして水性懸濁液を得、これを型に鋳込み、NC細片の形態でオーブン乾燥させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ムラサキフトモモ(S. cumini)の(A)未処理破砕葉；(B)漂白処理後の化学的前処理葉繊維；(C)アルカリ処理後の化学的前処理葉繊維の走査型電子顕微鏡(SEM)画像を示す。
【図２】(A)4分；(B)8分；(C)12分；(D)20分；及び(E)30分の超音波処理でのムラサキフトモモ(S. cumini)セルロースナノ結晶(CNC)の水性懸濁液の透過型電子顕微鏡(TEM)画像を示す。
【図３】(A)CNCと1mM硝酸銀溶液から形成されたナノバイオコンポジット；(B)CNCと5mM硝酸銀溶液から形成されたナノバイオコンポジット；(C)CNCと10mM硝酸銀溶液から形成されたナノバイオコンポジットの透過型電子顕微鏡(TEM)画像を示す。
【図４】(A)ムラサキフトモモ(S. cumini)セルロースナノ結晶；(B)CNCと1mM硝酸銀溶液から形成されたナノバイオコンポジット；(C)CNCと5mM硝酸銀溶液から形成されたナノバイオコンポジット；(D)CNCと10mM硝酸銀溶液から形成されたナノバイオコンポジットの水性懸濁液のゼータ電位を示す。
【図５】ムラサキフトモモ(S. cumini)CNC、NC-1、NC-2及びNC-3の水性懸濁液のUV-Vis吸収スペクトルを示す。
【図６】(A)未処理ムラサキフトモモ(S. cumini)葉；(B)ムラサキフトモモ(S. cumini)のセルロースナノ結晶；(C)CNCと1mM硝酸銀溶液から形成されたナノバイオコンポジット；(D)CNCと5mM硝酸銀溶液から形成された ナノバイオコンポジット；及び(E)CNCと10mM硝酸銀溶液から形成されたナノバイオコンポジットのフーリエ変換赤外分光(FTIR)スペクトルを示す。
【図７】(A)未処理ムラサキフトモモ(S. cumini)葉；(B)化学的前処理葉繊維；(C)ムラサキフトモモ(S. cumini)のセルロースナノ結晶のX線粉末回折(XRD)スペクトル；(ID)NC-1、NC-2及びNC-3のXRDスペクトルのオーバーレイを示す。
【図８】ムラサキフトモモ(S. cumini)CNCの吸水能力を示すグラフである。
【図９】ウェル拡散法による(A)大腸菌(E. coli)、(B) 枯草菌(B. subtilis)に対するナノバイオコンポジットNC-1、NC-2及びNC-3軟膏の抗菌活性、ディスク拡散法による(C)大腸菌(E. coli)、(D)枯草菌(B. subtilis)に対するNC-1、NC-2及びNC-3細片の抗菌活性を示す。NCサンプル周囲の成長抑制の様子が強力な抗菌活性を表す。
【図１０】インビボ創傷治癒マウスモデルへの軟膏及び細片形態のNCの効果を示す。写真は、(A)ワセリン処置開放創傷(コントロール)；(B)NC-1-軟膏；(C)NC-2-軟膏；(D)NC-3-軟膏；(E)未処置閉鎖創傷(コントロール)；(F)NC-1-細片；(G)NC-2-細片；及び(H)NC-3-細片による創傷処置を示す。
【図１１】創傷後3、8及び14日目の各群のマウスの創傷収縮(wound contraction)面積の%を示すグラフである。測定値は、平均±標準偏差で表し、n=4匹のマウス／群。NC処置群とコントロール群との間の有意差をアスタリスク印、＊で示してある(p<0.05)。
【図１２】3、8及び14日目に(A)ワセリン処置開放創傷(コントロール)；(B)NC-1-軟膏；(C)NC-2-軟膏；(D)NC-3-軟膏；(E)未処置閉鎖創傷(コントロール)；(F)NC-1-細片；(G)NC-2-細片；及び(H)NC-3-細片から明視野顕微鏡下で見られる皮膚片のH&E染色画像を示す。各画像の下部のスケールバーはサイズを表す。
【図１３】8及び14日目の(A)ワセリン処置開放創傷(コントロール)；(B)NC-1-軟膏；(C)NC-2-軟膏；(D)NC-3-軟膏；(E)未処置閉鎖創傷(コントロール)；(F)NC-1-細片；(G)NC-2-細片；及び(H)NC-3-細片の処置マウスの皮膚組織のM&T染色スライドを示す明視野顕微鏡画像である。スケールバーは拡大率を示す。
【図１４】3、8及び14日目に各マウス群の血清サンプル中で測定されたヒドロキシプロリン含量を示す。
【図１５】ELISAキットを介して推定された各マウス群の血清サンプル中のIL-6(A)及びVEGF(B)のレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、創傷治癒用のナノバイオコンポジット製剤及びその調製方法に関する。本発明は、容易かつ安価に製造できることが分かっている制御された最適化化学機械的処理によりムラサキフトモモ(Syzygium cumini)の植物葉からセルロースナノ結晶を単離する方法について述べる。本発明は、ムラサキフトモモ(Syzygium cumini)の葉からのCNCの単離及び特徴づけ、CNCのみならずAgNPをも含むNCの形成を包含する。抗菌及び創傷治癒活性のために開発したNC(軟膏及び細片)の使用についても言及する。組織病理学及び血清生化学アッセイを行なって、創傷治癒の異なる段階、すなわち炎症、増殖及び再上皮化へのNCの効果を研究した。
【００１３】
ムラサキフトモモ(Syzygium cumini)の葉からのCNCの単離は、機械的処理を組み合わせた化学的方法を用いて行なわれる。ムラサキフトモモ(Syzygium cumini)は大きく、常緑、かつ多年生であり、至る所に広く分布し、薬効値を有するので、この植物葉の使用はCNCの単離にとって好ましい。ムラサキフトモモ(Syzygium cumini)葉は、地理的起源が32° 6’ 39.0960" N、76° 32’ 10.5108" Eであり、海抜が1300mであるCSIR-Institute of Himalayan Bioresource Technology (Council of Scientific & Industrial Research) Post Box No. 6, Palampur (H.P.) 176061-INDIAの構内で生育した植物から収集した。CNCの単離に用いられる他の植物バイオマスの例としては、限定するものではないが、コムギ、イネ、大豆皮、麻、竹、バナナ、カラムシ等の農業廃棄物が挙げられる。単離目的では、漂白剤及びアルカリ剤による化学処理後に酸加水分解する。適切な漂白剤の例としては、限定するものではないが、亜塩素酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム、及び過酸化水素が挙げられる。本発明に用いる好ましい漂白剤は、植物葉中に存在するリグニンを除去するため酸性化亜塩素酸ナトリウム溶液である。リグニンは、葉中に存在する発色団である。その後、アルカリ処理は、植物葉中に存在するペクチン、ヘミセルロースを可溶化するために水酸化カリウム(KOH)の使用を伴う。水酸化ナトリウム(NaOH)のような他のアルアカリ剤を使用してよい。植物中に存在するリグニン、ペクチン及びヘミセルロースの除去は、純粋なセルロース由来繊維を得るために必要である。植物葉からのセルロース由来でない不純物の迅速な可溶化のため全てのこれらの処理は80℃の高温で行なった。60〜120℃の高温範囲を使用してよい。持続時間及び使用する化学薬品の濃度も、セルロース由来でない不純物の除去に影響を与える。アルカリ処理の後に酸加水分解した。使用する酸のタイプ、使用する酸の濃度、酸処理の反応温度及び持続時間は、CNCのアスペクト比(長さ／直径)に影響を及ぼす、本発明では、セルロースの結晶領域間に存在する非晶質領域を破壊することによって繊維の長さを減じるため、塩酸、硝酸及びその混合物に比べて硫酸(H2SO4)を使用するのが好ましい。硫酸は、その硫酸イオンのため負電荷を繊維に与えて、繊維の安定性を増強するからである。化学処理の後にプローブ超音波処理による機械的処理を行なってさらに個別化し、単離CNCのサイズを減じる。超音波処理時間もCNCのサイズに影響を与える。酸加水分解後のCNCを4、8、12、20及び30分間超音波処理して、CNCのサイズへのその効果を分析した。さらに、この研究で特定の長さと直径のCNCを単離するためには12mMの超音波処理が好ましい。未処理葉繊維、化学的前処理繊維及び最終的に得られたCNCをゼータ電位測定、SEM、TEM、FTIR、XRD及びUV-Vis分光法で特徴づけして、サイズ、形状、表面電荷及び他の構造特質を推定する。
【００１４】
本発明の第2の態様は、硝酸銀溶液(1mM、5mM及び10mM)の還元によって形成されるムラサキフトモモ(S. cumini)CNC及びAgNPで構成される植物ベースNCの調製を考える。ヨウ化銀、臭化銀、クエン酸銀、酢酸銀及び塩化銀を銀塩として使用してもよい。ここでは、前駆体として硝酸銀、溶媒として水を使用する。硝酸銀溶液を還元するために化学的還元剤及び化学的安定剤を使用するのではなく、生物学的還元剤のみならず安定剤としてもムラサキフトモモ(S. cumini)LEを使用した。銀塩溶液の還元のためにクエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、エチレングリコール等のような多数の化学的還元剤を使用することができる。AgNPが凝集しないように使用する化学的安定剤としてはポリビニルピロリドン(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、デンプン、グルコース及びさらに多くのものがある。化学的還元剤は費用がかかり、環境、及び生物に大きな危害を加える。本発明で還元剤のみならず安定剤としても生物学的ムラサキフトモモ(S. cumini)LEを使用する理由は、それらの環境に優しい性質、人間及び動物に無毒であり、費用効率が良いことである。さらに、ムラサキフトモモ(S. cumini)LEは、創傷治癒のために開発されるNCに有利な利益を与え得る抗酸化、抗炎症及び抗菌のような薬効特性を有する。本発明は、植物ナノセルロースCNCに結合した金属形態のAgNPを含む新規ナノバイオコンポジットNC材料を提供する。NCは、ムラサキフトモモ(S. cumini)LEをCNCと硝酸銀溶液の混合物に滴加するインサイツ手法を用いて調製された。ムラサキフトモモ(S. cumini)LEは、硝酸銀溶液のAgNPへの環境に優しい還元に関与するいくらかの植物性化学物質を含有する。このLEは共安定剤としても作用してAgNPに安定性を与える。CNCの表面に存在するヒドロキシル基も硝酸銀溶液の還元を助ける。CNCマトリックス自体は、形成されるAgNPの分布を制限するためのバイオテンプレートとして作用する。本発明は、細片及び軟膏形態を含む創傷被覆材の2つの形態でNCを調製したことをも記述する。被覆材中に存在する植物ベースナノセルロースの組成は、創傷被覆材の調製方法及び最終用途に応じて変動し得る。いずれの所望形態にも成形されるNCの能力は、さらなる技術的利点の適応性を与える。軟膏形態のNCを利用するため、発明者らは、NCに不活性塩基を添加してNCを体表面に適用しやすくする必要性を感じた。PEG、ソルビトール、グリセリン、ワセリン、キトサン及びその混合物のような種々の不活性かつ無毒の塩基(界面活性剤)が医薬品市場で入手可能である。しかし、本発明は、好ましくは、NCに添加すべき安価で不活性かつ無毒の軟膏基剤としてワセリンの使用を扱う。細片形態のNCは、NCの水性懸濁液を所望のサイズと形状の型内で鋳造することによって調製し、25〜40℃の範囲の温度、好ましくは35℃で乾燥させた。植物セルロース繊維は乾燥し得るか又は金属銀NPの組み込み後でさえ乾燥し得なかった。
【００１５】
ナノ銀で機能化した植物ナノセルロースの関発したNCは、細菌群から選択されるグラム陰性菌、大腸菌(Escherichia coli)及びグラム陽性菌、枯草菌(Bacillus subtilis)に対して持続性で広範なスペクトルの抗菌活性を示す。これらの2つの細菌は至る所に一般的に見られ、創傷に感染を引き起こし得る。NC周囲の細菌の成長抑制は、NC材料から周囲へのAgNPの拡散に起因し、細菌成長の減衰につながる。この抗菌活性は、イオン銀に類似する金属銀成分に由来する。ナノ結晶性銀の使用は、抗菌剤としての銀が微生物において耐性を誘発しないという理由により通常の抗生物質の使用に比べて有利である。ナノ銀粒子のサイズが小さく、表面積が大きいほどその細菌活性を増強する。NC-1、NC-2及びNC-3に存在する異なるサイズ及び形状のAgNPは、殺菌活性にかなりの程度まで影響を与える。細菌抑制の背後にある正確な機構は未だに不明であり、広範な将来研究の問題とされる。
【００１６】
発明者が開示した本発明の他の進歩性は、スイスアルビノ(swiss albino)マウスモデルにおける急性創傷治癒のため、細片のみならず軟膏の両形態の植物ベースNCの3つの異なる全ての製剤の局所使用である。本発明の創傷被覆材製品は、熱傷(bum)及び熱傷関連皮膚感染、切開傷口、手術切断感染、腟炎、慢性創傷、及び糖尿病性潰瘍を有する患者の消毒及び治療にも使用可能である。
本発明の創傷被覆材は、吸湿能力を有し、創傷滲出物を制御することができる。これは、滲出している創傷を、本発明のナノバイオコンポジット創傷被覆材の適用によって局所的に治療できることを意味し、創傷から過剰の体液を吸収することになる。CNCマトリックス内部に組み込まれたAgNPが抗菌活性を示し、これが創傷部位周囲の細菌成長抑制の原因となる。治癒の持続時間は可変であり、創傷のタイプ(閉鎖又は開放、急性又は慢性、切開又は切除)、創傷の原因及びサイズ、患者の年齢及び栄養状態を含めたいくつかの因子によって決まる。本発明のNCは、安全、無毒かつ創傷治癒における局所使用に好適なことが分かる。
【００１７】
軟膏のみならず細片の両形態の本創傷被覆材は、コントロールの未処置マウス群に比べて可能な最短の時間でスイスアルビノマウスモデルの創傷治癒を示した。本発明の創傷ケア製品は、処置マウスの組織病理学及び生化学的血清評価から観察されたように、炎症の低減、血管新生の増加、増殖の増加、瘢痕化の最小化、迅速かつ早期のコラーゲン発生、創傷閉鎖速度の増強並びに究極的に速く多くの再上皮化によって創傷治癒を達成した。創傷被覆材は、生分解性、生体適合性であり、創傷皮膚にいかなる損傷及び痛みも与えずに創傷部位から容易に除去される。
植物ベースCNCは吸水能力を有するので、これらは有効な創傷被覆材として使用可能である。湿気の存在は、創傷治癒に必要とされる特定の成長因子の活性化に役立つ。創傷部位の湿気に起因する細菌感染に伴う最小限のリスクの機会がある。このリスクを克服し、抗菌活性を与えるため、環境に優しいAgNPをCNCマトリックスに組み込んだ。本発明で調製されるNCは、吸水のみならず抗菌という二重特性を有するので、創傷治癒に適した候補として振る舞う。NCは、その適用性に応じていずれの所望の形状(軟膏及び細片)でも形作ることが可能である。NCの3つの異なる製剤(細片及び軟膏)を調製した。これも、形成されるAgNPのサイズに及ぼす硝酸銀溶液濃度の効果並びに抗菌活性及び創傷治癒ポテンシャルに及ぼすさらなる効果をさらに研究するのに役立つ。閉鎖創傷と開放創傷における創傷治癒ポテンシャルに関する細片及び軟膏の2つの形態の同NC材料の有効性についても記述した。開発したNCは、グラム陰性及びグラム陽性の両細菌に対して強力な抗菌活性を示す。創傷被覆材としてのNCは、創傷部位周囲の含水量のバランスを保つことによって創傷治癒を加速する。
【実施例】
【００１８】
実施例
下記実施例は、例示として与えられ、本発明の範囲を限定するもの解釈すべきでない。
実施例1
CNC単離のためのムラサキフトモモ(S. cumini)葉の化学的前処理
洗浄し、空気乾燥させた小断片化ムラサキフトモモ(S. cumini)葉(4g)を50mlの漂白剤、すなわち3wt%亜塩素酸ナトリウム溶液(01=3.5)で3時間80℃にて処理した。繊維材料を濾過し、蒸留水で洗浄し、再び酸性化3%亜塩素酸ナトリウム溶液(pH=3.5)で25±2℃の室温にて一晩(16〜18時間)撹拌下で処理した。洗浄工程を上記のように繰り返した。次に材料を3%KOH及び5%KOHのそれぞれに2時間それぞれ80℃で撹拌下で入れた。再び繊維材料を3%亜塩素酸ナトリウム溶液で1時間80℃にて処理した。あらゆる処理後に濾過及び洗浄手順を繰り返した。この段階の繊維を化学的処理繊維と名付けた。
この段階の繊維をサイズ及び形状についてSEM画像化により特徴づけた。未処理繊維中に存在する化学官能基をFT-IR分光法で判定した。結晶化度指数を測定するため、XRD解析を行なった。SEM顕微鏡写真は、化学的処理繊維が未処理葉繊維の束に比べて直径が低減して滑らかであることを実証した。化学的処理繊維のFTIRスペクトルは、リグニン、ペクチン及びヘミセルロースに相当するピークが化学処理中に除去されたが、これらのピークは未処理葉繊維のFTIRスペクトルに存在することを示した。
【００１９】
実施例2
酸加水分解及び機械的処理によるCNCの単離
化学的前処理繊維を65%(v/v)の硫酸(1:9)で1時間45℃にて常に撹拌しながら処理した。材料を遠心分離機にかけ、水道水に対して透析して中性になるまで酸分を除去した。この段階の繊維をセルロースナノ結晶CNCとみなした。化学処理後、CNCにプローブ超音波処理を用いる機械的処理を4、8、12、20及び30分間与えて繊維を個別化し、繊維長に及ぼす超音波処理の効果を研究した。得られたCNCを特徴づけ、凍結乾燥させて白色固体CNCを得た。
【００２０】
実施例3
TEM、XRD、FT-IR、及びゼータ電位を用いるCNCの特徴づけ
形状及びサイズ評価のためTEMを用いてCNCを観察した。銅グリッド上にサンプルをマウントし、酢酸ウラニル(3wt%)で染色してから蒸留水で洗浄した。サンプル含有グリッドを空気乾燥させた。次に所望拡大率で画像を撮った。
X線回折解析を行なってナノセルロースの結晶化度指数を計算した。乾燥K13rを用いてサンプルペレットを形成することによってFT-IR解析を行なった。4000〜400cm-1の透過でスペクトルを記録して、セルロースの構造を定義する化学官能基の存在を確かめた。
Zeta sizer Nano ZSで使い捨てキュベット内でゼータ電位測定を行なってCNC上の表面電荷を調べた。
【００２１】
実施例4
ムラサキフトモモ(S. cumini)葉抽出物の調製
適切に洗浄し、細かく刻んだムラサキフトモモ(S. cumini)葉(4g)を50mlの蒸留水に入れ、室温で一晩維持した。次に材料をメッシュで濾過し、濾液をLEと呼び、これを生物学的還元剤としてさらに使用するために4℃で貯蔵した。
【００２２】
実施例5
NCの調製
インサイツ手法の採択によって、CNCを含有し、AgNPを組み込んだNCを調製した。このために、100mgの凍結乾燥したCNC(1wt%)を1mM、5mM及び10mMの各硝酸銀溶液10mlに加えて2分間超音波処理した。次に1ml(10%v/v)のムラサキフトモモ(S. cumini)LEを各混合物に滴加し、撹拌条件下で6時間室温で保った。ムラサキフトモモ(S. cumini)LEは、硝酸銀溶液をAgNPに還元させ、それらを安定化した。CNCの表面に存在するヒドロキシル基さえ作用して硝酸銀を還元し、AgNPのサイズ分布を制御した。その後、混合物を遠心分離機にかけ、上清を捨てた。ペレットを保持し、ナノバイオコンポジット(NC)と称した。最初に1mM、5mM及び10mMの硝酸銀溶液を用いて調製したNCの3つの各製剤のペレットを蒸留水に溶かし、それぞれNC-1、NC-2及びNC-3と称した。
【００２３】
実施例6
NCの軟膏及びフィルムの開発
各混合物のNCペレットを別々に蒸留水に溶かし、適切にボルテックスした。各NC-1、NC-2及びNC-3の水性懸濁液を型に流し込み、NC細片の形態でオーブン乾燥させた。軟膏として使用するためには、各NC-1、NC-2及びNC-3のペレットを、不活性で無毒の基剤として用いるワセリンと1:1の比で直接混合した。得られた6つの最終製品をNC-1-細片、NC-2-細片、NC-3-細片、NC-1-軟膏、NC-2-軟膏、及びNC-3-軟膏と名付けた。
【００２４】
実施例7
ナノバイオコンポジット(NC)の特徴づけ
種々の形態のNCについて約300〜800nmの波長でUV-Visスペクトルを記録した。1mlの希釈水性懸濁液を石英キュベットに入れ、スペクトルを記録した。蒸留水をブランクとした。CNCの水性懸濁液を参照とした。
各サンプル表面上の表面電荷を知るためにゼータ電位を記録した。このため、サンプルの水性懸濁液1mlを使い捨てゼータ電位キュベットに入れてから表面電荷を記録した。
3つの各NCの水性懸濁液を形状及びサイズについてTEMを用いて特徴づけた。サンプルを銅グリッド上にマウントし、蒸留水で洗浄した。サンプル含有グリッドを空気乾燥させた。次に所望拡大率でTEMにより画像を撮った。XRDを行なって各NC-1、NC-2及びNC-3についてCNCマトリックスに組み込まれたAgNPの存在を確認した。
乾燥KBrを用いてサンプルペレットを形成することによってFT-IRを行なった。4000〜400cm-1の透過でスペクトルを記録した。
【００２５】
実施例8
CNCフィルムの吸水能力の定量
CNC膜の初期重量を記録した。予備乾燥CNCフィルムを蒸留水含有容器に浸した。次に、一定重量が得られるまでフィルムを異なる時間間隔で水から取り出して吸水能力を計算した。フィルムの最終重量を書き留めた。
【００２６】
実施例9
NCの抗菌活性
3つ全てのNC、すなわちNC-1-細片、NC-2-細片及びNC-3-細片を大腸菌(E. coli)BL-21株及び枯草菌(B. subtilis)に対する抗菌活性についてディスク拡散法を用いて評価した。NC細片の円形ディスクを菌培養播種寒天プレート(108CFU/ml)上に置き、インキュベーター内で24時間37℃でインキュベートした。他のNC-1-軟膏、NC-2-軟膏及びNC-3-軟膏の3つの形態は、ウェル拡散法により大腸菌(E. coli)BL-21株及び枯草菌(B. subtilis)に対して抗菌活性について評価した。サンプル周囲で成長抑制ゾーンを測定してNCの抗菌活性を調べた。全ての場合にコントロールとしてCNCを使用した。
【００２７】
実施例10
NCのインビボ創傷治癒研究
開発した各NCの創傷治癒ポテンシャルをスイスアルビノマウスモデルで評価した。30〜35gの体重を有する6〜8週齢のマウスを処置に応じて8つの群に分類した(n=6マウス／群)。キシラジンとケタミンの混合物の腹腔内注射を用いてマウスを麻酔した。5%ポビドン／ヨウ素溶液を用いてマウスの背側表面を無菌化した。背側表面に直径8mmの円形全厚皮膚創傷を作製した。マウス群に適切にNC細片及び軟膏の局所処置を与えた。群1＝ワセリン処置開放創傷(コントロール)、群2＝NC-1-軟膏、群3＝NC-2-軟膏、群4＝NC-3-軟膏、群5＝未処置閉鎖創傷(コントロール)、群6＝NC-1-細片、群7＝NC-2-細片、群8＝NC-3-細片。各軟膏サンプルで毎日マウスの創傷を局所処置した(50mg/日/創傷)。粘着テープを用いて創傷周囲をNC細片で覆った。3日毎に被覆材を交換した。マウスのコントロール開放創傷は無菌化ワセリンで毎日処置したが、未処置閉鎖群の創傷には外科用ガーゼのみを巻き付けた。各群のマウスの創傷皮膚の%創傷収縮面積を3、8及び14日目に測定した。次いで3、8及び14日目に各群のマウスを安楽死させて皮膚組織内で起こっている創傷治癒事象を解析した。組織病理学解析用にマウスの皮膚組織を取った。
【００２８】
実施例11
創傷治癒メカニズムを研究するためのマウスの皮膚の組織病理学
皮膚組織を脱水し、厚さ5pmの切断部をヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色プロトコルで染色した。組織病理学的観察のため各処置群のマウスの染色皮膚組織片(5p.m)を3、8及び14日目に明視野顕微鏡下で解析した。また、各群のマウスの切断皮膚組織片(5pm)を8及び14日目にマッソンのトリクローム手順を用いて染色して、創傷治癒中のコラーゲン形成を解析した。
【００２９】
実施例12
ヒドロキシプロリン、IL-6及びVEGF含量の評価
創傷後3、8及び14日目の各処置群のマウスの血液から分離した血清をヒドロキシプロリン、IL-6及びVEGF含量についてELISAアッセイにより評価した。これらの時間間隔における量を計算するために特定波長で吸光度を記録して、コントロールマウス群と比較したNC処置の効果を研究した。表1に示すように本発明の有効性を比較できる。
【００３０】
表1.  各群のマウスの測定された%創傷収縮面積(平均＋標準偏差)
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【００３１】
本発明の利点
・植物ベースCNCの抽出は、微生物セルロースに比べて相対的に容易かつ安価である。微生物は、数日間培養及び維持するのが困難であり、細菌が耐性になることさえある。
・ムラサキフトモモ(S. cumini)LEは安定剤としても作用し、AgNPの凝集を防止する。本発明では追加の化学的安定剤を使用しなかった。
・NCの開発のため、CNCが含浸AgNPのサイズ分布を制御するためのバイオテンプレートとして作用するインサイツ手法を使用する。この手法は、硝酸銀溶液のAgNPへの還元のみならずCNCマトリックス内部のAgNPの含浸のためのワンポット合成を含み、均一性を与える。
・本発明は、CNCマトリックス上のAgNPの同時含浸を伴うAgNPのインサイツ単一容器合成法を記述する。この方法では、AgNO3溶液からのAgイオンが最初に静電気力又はファンデルワールス力によってCNC表面上に吸着し、次に生物学的還元剤としてムラサキフトモモ(S. cumini)葉抽出物を用いることによってAgNPに還元され、CNCマトリックスの内部のAgNPの組み込みを促進してNCが形成される。
・NC創傷被覆材は創傷に付着せず、創傷にいかなる痛み及び損傷を引き起こすことなく容易に除去される。
・NCは、炎症低減、線維芽細胞増殖増加、早期のコラーゲン形成、細菌感染との闘い、速い再上皮化及び組織再生によって創傷治癒を促進する。
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図１（Ｃ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月26日(2018.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
銀ナノ粒子(AgNP)及びセルロースナノ結晶(CNC)を含む、軟膏形態のナノバイオコンポジット製剤(NC)であって、AgNPとCNCとの比が0.067%〜0.4%w/w(AgNP)：7〜8%w/w(CNC)の範囲内であり、前記セルロースが、ムラサキフトモモ(Syzgium cumini)葉に由来することを特徴とするナノバイオコンポジット（NC）製剤。
【請求項２】
請求項1に記載の軟膏形態のナノバイオコンポジット製剤の調製方法であって、下記工程：
a)  洗浄及び乾燥したムラサキフトモモ(Syzgium cumini)葉を3.0〜4.0の範囲のpHで2〜3時間の範囲の時間、70〜100℃の範囲の温度で漂白剤を用いて処理して漂白された繊維材料を得る工程；
b)  工程(a)から得た前記漂白された繊維材料を濾過及び洗浄した後、22〜30℃の範囲の温度で16〜18時間の範囲の時間、酸性化漂白剤溶液で処理して酸性化繊維材料を得る工程；
c)  工程(b)から得た前記酸性化繊維材料を洗浄した後、それを2〜18%の塩基中で2〜5時間、70〜80℃にて連続的撹拌下で維持して繊維材料を得る工程；
d)  工程(c)からの前記繊維材料を0.6〜3%の亜塩素酸ナトリウム溶液で0.5〜3時間の範囲の時間80〜100℃の範囲の温度で処理した後、濾過及び洗浄して化学的処理繊維を得る工程；
e)  工程(d)から得た前記化学的処理繊維を、64〜67%(v/v)の酸を1:5〜1:9の範囲の比で用いて30〜120分の範囲の時間40〜80℃の範囲の温度にて連続的撹拌下で処理して酸性化化学的処理繊維を得る工程；
f)  工程(e)から得た前記酸性化化学的処理繊維を遠心分離機にかけ、水に対して透析して中性になるまで酸分を除去してセルロースナノ結晶CNCを得る工程；
g)  工程(f)から得た前記セルロースナノ結晶CNCを機械的に既知方法で4〜30mMの範囲の時間処理して前記繊維を個別化し、凍結乾燥させて白色固体CNCを得る工程；
h)  ムラサキフトモモ(Syzgium cumini)葉を20〜28時間の範囲の時間、20〜30℃の範囲の温度で水に浸漬させた後、濾過し、4〜10℃の温度で貯蔵して生物学的還元剤として葉抽出物を得る工程；
i)  工程(g)から得た前記CNCを凍結乾燥させ、1mM、5mM及び10mM(1〜10mM)の各硝酸銀溶液を添加し、2〜5分間超音波処理して混合物を得る工程；
j)  工程(h)から得た10〜20%v/vのムラサキフトモモ(Syzgium cumini)葉抽出物を、工程(i)で得た各混合物に連続的撹拌下で4〜8時間の範囲の時間、20〜30℃の範囲の温度で添加する工程；
k)  工程(j)で得た前記混合物を遠心分離機にかけてナノバイオコンポジットNC製剤を得る工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
使用する前記漂白剤が、亜塩素酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム及び水酸化物過酸化物から成る群より選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
使用する前記酸が、硫酸、硝酸、塩酸又はその混合物の群から選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
使用する前記塩基が、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムの群から選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記NC製剤を、軟膏の形態で創傷治癒のために使用する、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
NCペレットを、ワセリン基剤と1:1の比で直接混合して軟膏を得る、請求項2に記載のナノバイオコンポジット製剤の調製方法。
【国際調査報告】
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