(57)【要約】  本発明は、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入するよう対象を治療する、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態を治療又は予防する方法に関する。本発明はまた、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態を治療するか又は予防するためのベクター、組成物及びキットに関する。【選択図】図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態を治療又は予防する方法であって、
ａ．tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は
ｂ．対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入するよう対象を治療する方法。
【請求項２】
前記対象の治療が、
ａ．tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は
ｂ．対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記tauの１又は２以上のアミノ酸残基が、tauの２０５位でのトレオニン（Ｔ２０５）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤を投与することにより治療される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記剤が、ｐ３８γ又はその変異体、又は対象のニューロンにおいてｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記剤が、対象のニューロンにおいてｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸を含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
ｐ３８γが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｐ３８γの変異体が、ｐ３８γ（配列番号２）のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％ 又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｐ３８γの変異体が、ＰＤＺ相互作用モチーフを含む、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｐ３８γの変異体が、ｐ３８γの構成的活性変異体である、請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐ３８γの構成的活性変異体（ｐ３８γＣＡ）が、配列番号３を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記tau依存性シグナル伝達複合体が、ＰＳＤ−９５及びtauを含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記tau依存性シグナル伝達複合体が、ＰＳＤ−９５、tau及びＦＹＮを含む、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記神経学的状態が、アルツハイマー病、脳卒中及び癲癇からなる群から選択される、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態の治療又は予防方法であって、対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤を投与することを含む方法。
【請求項１６】
前記剤が、ｐ３８γ又はその変異体、又は対象のニューロンにおいてｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記剤が、対象のニューロンにおいてｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸を含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐ３８γの変異体が、ｐ３８γ（配列番号２）のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％ 又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｐ３８γの変異体が、ＰＤＺ相互作用モチーフを含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｐ３８γの変異体が、ｐ３８γの構成的活性変異体（ｐ３８γＣＡ）である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｐ３８γの構成的活性変異体（ｐ３８γＣＡ）が、配列番号３を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記tau依存性シグナル伝達複合体が、ＰＳＤ−９５及びtauを含む、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記tau依存性シグナル伝達複合体が、ＰＳＤ−９５、tau及びＦＹＮを含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経学的状態が、アルツハイマー病、脳卒中及び癲癇からなる群から選択される、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態を治療するか又は予防するためのベクターであって、
ａ．ｐ３８γ又はその変異体をコードする核酸配列；又は
ｂ．対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体をコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項２６】
前記核酸配列が、対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ又はその変異体、又はtauの変異体を発現するための調節配列に操作可能的に連結される、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
前記ベクターが、ウィルスベクターである、請求項２５又は２６に記載のベクター。
【請求項２８】
前記ウィルスベクターが、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０ 又はＡＡＶｃｙ５である、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態を治療するか又は予防するためのアデノ随伴ウィルスベクターであって、
ａ．ｐ３８γ又はその変異体をコードする核酸配列；又は
ｂ．対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体をコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項３１】
ｐ３８γ又はその変異体、又はtauの変異体をコードする核酸が、対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ又はその変異体、又はtauの変異体を発現するための調節配列に操作可能的に連結される、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
前記ｐ３８γの変異体が、ｐ３８γ（配列番号１）のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％ 又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｐ３８γの変異体が、ＰＤＺ相互作用モチーフを含む、請求項２５〜３２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４】
前記ｐ３８γの変異体が、ｐ３８γの構成的活性変異体である、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３５】
前記構成的活性変異体が、配列番号３を含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
前記tau依存性シグナル伝達複合体が、ＰＳＤ−９５及びtauを含む、請求項２５〜３５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３７】
前記tau依存性シグナル伝達複合体が、ＰＳＤ−９５、tau及びＦＹＮを含む、請求項２５〜３６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３８】
前記神経学的状態が、アルツハイマー病、脳卒中及び癲癇からなる群から選択される、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３９】
請求項２５〜３８のいずれか１項に記載のベクターを含む組成物。
【請求項４０】
ニューロンにおけるＰＳＤ−９５、tau及びＦＹＮを含むシグナル伝達複合体の破壊方法であって、
ａ．tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は
ｂ．対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤と前記ニューロンとを接触せしめることを含む方法。
【請求項４１】
tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すか、又はtau依存性シグナル伝達複合体の形成を低めるtauのアミノ酸残基が、tauの２０５位でのトレオニン（Ｔ２０５）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ニューロンが、ニューロンにおいてｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤と接触される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記剤が、ｐ３８γ又はその変異体、又はニューロンにおいて、ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記剤が、ニューロンにおいて、ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸を含む、請求項３９又は４２に記載の方法。
【請求項４５】
ｐ３８γが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｐ３８γの変異体が、ｐ３８γ（配列番号１）のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％ 又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ｐ３８γの変異体が、ＰＤＺ相互作用モチーフを含む、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ｐ３８γの変異体が、ｐ３８γの構成的活性変異体である、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ｐ３８γの構成的活性変異体（ｐ３８γＣＡ）が、ｐ３８γの１７９位でのアラニンへのアスパラギン酸のアミノ酸置換を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記ニューロンが、対象中に存在する、請求項３９〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
対象におけるアルツハイマー病の治療方法であって、
ａ．ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸；又は
ｂ．tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できる核酸を、対象のニューロンに導入することを含む方法。
【請求項５２】
対象における脳卒中の治療方法であって、
ａ．ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸；又は
ｂ．tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できる核酸を、対象のニューロンに導入することを含む方法。
【請求項５３】
対象における癲癇の治療方法であって、
ａ．ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸；又は
ｂ．tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できる核酸を、対象のニューロンに導入することを含む方法。
【請求項５４】
対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態の治療又は予防への使用のための、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤。
【請求項５５】
対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態の治療又は予防への使用のための、対象のニューロンにおいてｐ３８γ活性又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤。
【請求項５６】
ニューロンにおけるｐＳＤ−９５、tau及びＦＹＮを含むシグナル伝達複合体の破壊、又はその形成の低減への使用のための、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤。
【請求項５７】
対象におけるアルツハイマー病の治療への使用のための、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤。
【請求項５８】
対象における脳卒中の治療への使用のための、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤。
【請求項５９】
対象における癲癇の治療への使用のための、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態の治療又は予防方法、そのような神経学的状態の治療又は予防のためのベクター、及びそのような状態の治療のためのベクターを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロンの興奮毒性は、過剰な刺激により損傷されるか又は死滅される。そのような刺激は、グルタミン作動性受容体、例えばＮＭＤＡ型受容体（ＮＲ）が神経伝達物質、例えばグルタミン酸により過剰活性化される場合に起こる。興奮毒性はまた、興奮毒性、例えばアミロイド−β（Ａβ）によっても誘発され得る。
【０００３】
興奮毒性は、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型痴呆、ハンチントン病、パーキンソン病を含む種々の形の神経変性患者などの神経学的状態において顕著な役割を果たすと考えられている。興奮毒性はまた、癲癇、及び脳卒中後に生じる神経損傷にも関連している。
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、痴呆の最も一般的な形であり、そして最も一般的な神経変性疾患である。ＡＤは、６０歳以上の成人の１％にも影響を及ぼすと推定される。
【０００５】
ＡＤは、脳萎縮、神経喪失、細胞外Ａβ斑、及び異常にリン酸化されたtauを含有する細胞内神経原線維変化（ＮＦＴ）により特徴付けられる。
【０００６】
tauは、非病理学的条件下で、微小管安定性及び微小管依存性プロセスを調節する軸索タンパク質である。tauはまた、Ａβ誘発興奮毒性及び潜在的に他の興奮毒性を媒介するシナプス後シグナル伝達複合体に存在することが見出されている。ＡＤにおいて、tauは異常にリン酸化され、そしてニューロンの体細胞樹状細胞区画に蓄積し、凝集し、そして最終的に、神経原線維変化（ＮＦＴ）を形成する。脳全体中へのＮＦＴ病変の進行は、アルツハイマー病における疾患の進行と相関する。
【０００７】
ＡＤにおける一般的な理論は、Ａβがニューロンの機能不全及び死を引起すtauリン酸化を含む毒性事象を引起すことである。たぶん、tauの枯渇は、ＡＤマウス及び細胞培養モデルにおけるＡβ毒性を防止する。従って、ＡＤにおけるＡβ毒性は、ＡＤの病因におけるリン酸化されたtauにより媒介されることが当核技術分野において考慮されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＡＤ及び他の神経学的状態を治療する代替方法を提供することが有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、光核分野の教示とは反対に、特定のアミノ酸残基でのtauのリン酸化がtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し、そして興奮毒性及びＡβ誘発毒性を予防するか又は低減することを見出した。
【００１０】
第１の側面によれば、
（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は
（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入するよう対象を治療する、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態を治療又は予防する方法が提供される。
【００１１】
第２の側面によれば、
（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は
（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤を投与することを含む、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態を治療又は予防する方法が提供される。
【００１２】
別の第２の側面は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態の治療又は予防への使用のための、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤、又は対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態の治療又は予防のための医薬の製造への、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤の使用が提供される。
【００１３】
第３の側面よれば、対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤を投与することを含む、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態の治療又は予防方法が提供される。
【００１４】
別の第３の側面によれば、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態の治療又は予防への使用のための、対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤、又は対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態の治療又は予防のための医薬の製造への、対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤の使用が提供される。
【００１５】
第４の側面によれば、
（ａ）ｐ３８γ又はその変異体をコードする核酸配列；又は
（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体をコードする核酸配列を含む、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態を治療するか又は予防するためのベクターが提供される。
【００１６】
第５の側面によれば、
（ａ）ｐ３８γ又はその変異体をコードする核酸配列；又は
（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体をコードする核酸配列を含む、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態を治療するか又は予防するためのアデノ随伴ウィルスベクターが提供される。
【００１７】
第６の側面によれば、
（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は
（ｂ）、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤と前記ニューロンとを接触せしめることを含む、ニューロンにおけるＰＳＤ−９５、tau及びＦＹＮを含むシグナル伝達複合体の破壊、又はその形成の低減方法が提供される。
【００１８】
別の第６の側面によれば、ニューロンにおけるｐＳＤ−９５、tau及びＦＹＮを含むシグナル伝達複合体の破壊、又はその形成の低減への使用のための、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤、又はニューロンにおけるＰＳＤ−９５、tau及びＦＹＮを含むシグナル伝達複合体の破壊、又はその形成の低減のための医薬の製造のためへの、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤の使用が提供される。
【００１９】
第７の側面によれば、
（ａ）、tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は
（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤を投与することを含む、対象におけるアルツハイマー病の治療方法が提供される。
【００２０】
別の第７の側面によれば、対象におけるアルツハイマー病の治療への使用のための、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤、又は対象におけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造への、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤の使用が提供される。
【００２１】
第８の側面によれば、
（ａ）ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸；又は
（ｂ）tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できる核酸を、対象のニューロンに導入することを含む、対象におけるアルツハイマー病の治療方法が提供される。
【００２２】
別の第８の側面によれば、対象におけるアルツハイマー病の治療への使用のための、（ａ）ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸；又は（ｂ）tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できる核酸、又は対象におけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造への、（ａ）ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸；又は（ｂ）tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できる核酸の使用が提供される。
【００２３】
第９の側面によれば、
（ｃ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は
（ｄ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤を投与することを含む、対象における脳卒中の治療方法が提供される。
【００２４】
別の第９の側面によれば、対象における脳卒中の治療への使用のための、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤、又は対象における脳卒中の治療のための医薬の製造への、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤の使用が提供される。
【００２５】
第１０の側面によれば、
（ａ）ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸；又は
（ｂ）tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できる核酸を、対象のニューロンに導入することを含む、対象における脳卒中の治療方法が提供される。
【００２６】
別の第１０の側面によれば、対象における脳卒中の治療への使用のための、（ａ）ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸；又は（ｂ）tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できる核酸、又は対象における脳卒中の治療のための医薬の製造への、（ａ）ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸；又は（ｂ）tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できる核酸の使用が提供される。
【００２７】
第１１の側面によれば、
（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は
（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤を投与することを含む、対象における脳卒中の治療方法が提供される。
【００２８】
別の第１１の側面によれば、対象における癲癇の治療への使用のための、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤、又は対象における癲癇の治療のための医薬の製造への、（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤の使用が提供される。
【００２９】
第１２の側面によれば、
（ａ）ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸；又は
（ｂ）tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できる核酸を、対象のニューロンに導入することを含む、対象における癲癇の治療方法が提供される。
【００３０】
別の第１２の側面によれば、対象における癲癇の治療への使用のための、（ａ）ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸；又は（ｂ）tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できる核酸、又は対象における癲癇の治療のための医薬の製造への、（ａ）ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸；又は（ｂ）tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できる核酸の使用が提供される。
【００３１】
第１３の側面によれば、
（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は
（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤を含む、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態を治療又は予防するための組成物が提供される。
【００３２】
第１４の側面によれば、本明細書に記載されるベクターを含む組成物が提供される。
【００３３】
第１５の側面によれば、
（ａ）tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進し、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起し；又は
（ｂ）対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を導入する剤を含む、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態を治療又は予防するためのキットが提供される。
【００３４】
第１６の側面によれば、本明細書に記載されるベクターを含むキットが提供される。
【００３５】
第１７の側面によれば、トランスジェニック動物ｐ３８γ又はその変異体、又はtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体のニューロンにおいて発現できるトランスジェニック核酸配列を含むトランスジェニックの非ヒト動物が提供される。
【００３６】
第１８の側面によれば、神経学的状態が、本明細書に記載される方法により治療されるか、又は予防され得るかどうかを評価する方法が提供され、
（ａ）神経学的状態に罹患しているか、又は神経学的状態のモデルである表現型を示す試験動物を提供し；
（ｂ）試験動物とトランスジェニック動物とを交配させ子孫を得、ここでトランスジェニック動物は、前記動物ｐ３８γ又はその変異体、又はtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体のニューロンにおいて発現できるトランスジェニック核酸配列を含み；そして
（ｃ）トランスジェニック核酸配列を発現する子孫における神経学的状態の重篤度又は神経学的状態のモデルである表現型を評価する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１Ａは、類似度を示す樹状図を含むｐ３８ＭＡＰキナーゼのドメイン構造を示す模式図である。見られるように、ｐ３８γは、独特のＣ末端ＰＤＺ相互作用モチーフを有する。図１Ｂは、ｐ３８α、ｐ３８β、ｐ３８γ 及びｐ３８δについての標的対立遺伝子を有するマウス由来のゲノムＤＮＡに対するポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の結果を示す。ｆ、フロックスド（floxed）対立遺伝子、−、ノックアウト対立遺伝子、＋、野生型対立遺伝子。図１Ｃは、対照マウス（ｆ／ｆ又は＋／＋）の皮質抽出物のウェスターンブロットの結果を示し、ｐ３８α、ｐ３８β及びｐ３８γの発現が確認されたが、脳におけるｐ３８δは確認されなかった。抗体特異性が、個々のノックアウト又はｐ３８ＭＡＰＫを有するマウスの抽出物をプローブすることにより示された。Δneu、ｐ３８αのニューロン特異的ノックアウト。ＧＡＰＤＨは、等しい負荷を示した。ＢＭ、骨髄。
【００３８】
【図２−１】図２Ａは、３０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺを注射されたｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−マウスの低められた発作潜伏期（左）及び線形回帰勾配（右）を示すグラフである。平均発作重症度は、３０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺを注射されたｐ３８γ＋／＋マウスに比較して、ｐ３８γ−／−において顕著に高められた（＊＊Ｐ ＜ ０．０１; ＊＊＊＊Ｐ ＜ ０．０００１; ｎ=１０-１２）。
【００３９】
【図２−２】図２Ｂは、ニューロン中の前シナプスシナプトフィジン（Ｓｙｐ）ではなく、ｐ３８γ及び後シナプスＰＳＤ−９５（矢印）の共局在を示す写真である。スケールバー、１μｍ。
【００４０】
【図２−３】図２Ｃは、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝６２）における早期死亡率がＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−（ｎ＝４３）マウスにおいてさらに増大され、ところがｐ３８γ＋／＋（ｎ＝４９）及びｐ３８γ−／−（ｎ＝４８）マウスは正常な生存性を提供した（＊＊＊＊Ｐ ＜ ０．０００１、＊＊＊Ｐ ＜ ０．００１）ことを示すグラフである。
【００４１】
【図２−４】図２Ｄ−Ｆは、モリス−水−迷路（Morris-water-maze）(ＮＷＭ)を用いて、ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝１０）及びｐ３８γ−／−（ｎ＝１０）マウスに比較して、ＡＰＰ．ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝１０）において空間的作業記憶欠損を示し、そしてＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−（ｎ＝８）においてはより強かったことを示す（＊＊Ｐ ＜ ０．０１； ＊Ｐ ＜ ０．０５）。図２Ｄは、代表的ＭＷＭ経路トレースである。破線の四角形、隠れたプラットフォームの位置。
【００４２】
【図２−５】図２Ｄ−Ｆは、モリス−水−迷路（Morris-water-maze）(ＮＷＭ)を用いて、ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝１０）及びｐ３８γ−／−（ｎ＝１０）マウスに比較して、ＡＰＰ．ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝１０）において空間的作業記憶欠損を示し、そしてＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−（ｎ＝８）においてはより強かったことを示す（＊＊Ｐ ＜ ０．０１； ＊Ｐ ＜ ０．０５）。図２Ｅは、逃避潜伏期がＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋マウスにおいて高められ、そしてＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−においてはより高められが、しかしＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−に匹敵することを示すグラフである。
【００４３】
【図２−６】図２Ｄ−Ｆは、モリス−水−迷路（Morris-water-maze）(ＮＷＭ)を用いて、ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝１０）及びｐ３８γ−／−（ｎ＝１０）マウスに比較して、ＡＰＰ．ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝１０）において空間的作業記憶欠損を示し、そしてＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−（ｎ＝８）においてはより強かったことを示す（＊＊Ｐ ＜ ０．０１； ＊Ｐ ＜ ０．０５）。図２Ｆは、ｐ３８γ＋／＋、ｐ３８γ−／−、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋及びのＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−のＭＷＭ試験における象限の時間（秒）を示すグラフである。ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−マウスは、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋、ｐ３８γ＋／＋、及びｐ３８γ−／−と比較して、プローブ試験の間、標的化象限（Ｑ１）においてより少ない時間を費やし、そして反対の象限（Ｑ４）においてはより多くの時間を費やした。
【００４４】
【図２−７】図２Ｇは、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−、ｐ３８γ＋／＋、及びｐ３８γ−／−マウスの代表的ＥＥＧとレースを示し、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋、及びＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−マウスにおいては、ハイパーシンクロシティの発作（緑）を有するが、しかしｐ３８γ＋／＋マウスにおいては有さない。
【００４５】
【図２−８】図２Ｈは、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋マウスに比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−においては著しく高められた数のスパイク列を示すグラフである（ｎ＝６−８； ＊＊Ｐ ＜ ０．０１）。ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−記録においてはスパイク列は検出されなかった。図２Ｉは、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋マウスに比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−においては、スパイクの数が高められたが、しかしｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−においては希であることを示すがラフである（ｎ＝６−８； ＊＊＊Ｐ ＜ ０．００１ 、＊＊Ｐ ＜ ０．０１、 ＊Ｐ ＜ ０．０５）。
【００４６】
【図２−９】図２Ｊは、ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−マウスに比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋マウスにおける約８Ｈｚの低められたクロス周波数結合（ＣＣＦＣ）を示す、発作間海馬ＬＦＰ記録において計算された代表的な位相振幅コノドローグラムを示す。約８ＨｚでのＣＦＣは、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−マウスでは実質的に失われた。
【００４７】
【図２−１０】図２Ｋは、ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝６）及びｐ３８γ−／−（ｎ＝６）マウスに比較して、位相振幅分布において計算された変調指数は、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝８）において低められ、そしてＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−（ｎ＝８）においては、より低められたことを示すグラフである（＊＊＊Ｐ ＜ ０．００１、＊＊Ｐ ＜ ０．０１）。
【００４８】
【図３−１】図３Ａは、３０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの腹腔内投与後のｐ３８γ＋／＋、ｐ３８γ−／−、Ａｌｚ１７.ｐ３８γ＋/＋ 及びＡｌｚ１７.ｐ３８γ−/−マウスにおける発作潜伏期を示すグラフである。３０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの腹腔内投与に続く発作潜伏期のさらなる低下が、ｐ３８γ＋／＋及びＡｌｚ１７.ｐ３８γ＋/＋マウスに比較して、ｐ３８γ−／−においてすでに低められたそれらの潜伏期に比較して、Ａｌｚ１７．ｐ３８γ−／−マウスにおいて観察された（ｎ ＝ １０〜１２; ＊＊ Ｐ ＜０．０１； ＊ Ｐ ＜０．０５； ｎｓ、有意ではない）。図３Ｂは、（３Ａ）における発作潜伏期曲線の線形回帰分析を示すグラフである（ｎ ＝ １０〜１２； ＊＊＊ Ｐ ＜０．００１; ＊＊ Ｐ ＜０．０１）。図３Ｃは、ｐ３８γ＋／＋及びＡｌｚ １７．ｐ３８γ＋／＋マウスに比較して、Ａｌｚ１７．ｐ３８γ−／―マウスに３０ｍｇ／ｋｇのｐＴＺを投与した後、ｐ３８γ−／−においてすでに高められた発作重症度に比較して、さらに増強された平均発作重症度を示すグラフである（ｎ ＝ １０〜１２； ＊＊＊ Ｐ ＜０．００１、＊＊ Ｐ ＜０．０１、＊ Ｐ ＜０．０５）。
【００４９】
【図３−２】図３Ｄは、ｔａｕ＋／＋．ｐ３８γ＋／＋マウスに比較して、３０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの投与後、ｔａｕ＋／＋．ｐ３８γ−／−において著しく低められ、そしてｔａｕ−／−．ｐ３８γ＋／＋及びｔａｕ−／―．ｐ３８γ−／−マウスの両者において著しく高められたことを示すグラフである（ｎ ＝ １０〜１２； ＊＊ Ｐ ＜０．０１； ＊ Ｐ ＜０．０５）。図３Ｅは、発作潜伏期曲線の線形回帰分析を示すグラフである（ｎ ＝ １０〜１２; ＊＊ ＊Ｐ ＜０．０１； ＊＊ Ｐ ＜０．０５； ｎｓ、有意ではない）。図３Ｆは、平均発作重症度がｔａｕ＋／＋．ｐ３８γ＋／＋マウスに比較して、ｔａｕ＋／＋．ｐ３８γ−／−において高められたが、しかし３０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺ注射後、ｔａｕ−／−．ｐ３８γ＋／＋及びｔａｕ−／−．ｐ３８γ−／−マウスにおいては同様に低められたことを示すグラフである（ｎ ＝ １０−１； ＊＊＊ Ｐ ＜０．００１; ＊＊ Ｐ ＜０．０１； ＊ Ｐ ＜０．０５）。
【００５０】
【図３−３】図３Ｇは、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋/＋ｔａｕ−/− 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / −マウスに比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／―．tau−／−マウスの３００日間にわたる生存率を示すグラフである。図３Ｈは、モリス−水迷路（ＭＷＭ）試験の後、ｐ３８＋ / ＋、ｐ３８− / − 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋/−、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ− / − 、AＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋．tau− / − 及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ− / −．tau− / −マウスの逃避潜伏期を示すグラフである。図３Ｉは、ｐ３８＋ / ＋、ｐ３８− / − 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋/−、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ− / − 、AＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋．tau− / − 及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ− / −．tau− / −マウスについてのＭＷＭ試験中の象限の時間を示すグラフである。
【００５１】
【図４−１】図４Ａは、同等の合計レベルのｐＳＤ−９５、tau及びＦｙｎにもかかわらず、より多くのＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体が、Ａｌｚ１７．ｐ３８γ＋／＋脳よりもＡｌｚ１７．ｐ３８γ−／−から免疫沈澱されたことを示す写真である。ＧＡＰＤＨは、同等の負荷を確認した。図４Ｂは、（４Ａ）において検出されるＰＳＤ−９５に結合されるtau及びＦｙｎの定量を示すグラフである（ｎ ＝ ６； ＊＊＊ Ｐ ＜０．００１; ＊ Ｐ ＜０．０５）。
【００５２】
【図４−２】図４Ｃは、ＦＬＡＧ−ＰＳＤ−９５、tau及びＦｙｎによりトランスフェクトされた細胞からのＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体の免疫沈澱（ＩＰ）の結果を示す写真である。軽減された野生型ｐ３８γ（ＷＴ）及び構成的活性なｐ３８γ（ＣＡ）の同時トランスフェクションは、ＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ、相互作用を無効にした。図４Ｄは、（Ｃ）において検出されたＰＳＤ−９５に結合されたtau及びＦｙｎの定量を示すグラフである（ｎ ＝ ６； ＊＊＊ Ｐ ＜０．００１； ＊＊ Ｐ ＜０．０１； ＊ Ｐ ＜０．０５）。
【００５３】
【図４−３】図４Ｅは、ｐ３８γ  ＷＴ及びＣＡ  ｐ３８γが、ｐ３８阻害剤の存在下で細胞から免疫沈澱されたＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体を破壊しなかったことを示す。図４Ｆは、（Ｅ）において検出されたＰＳＤ−９５に結合されたtau及びＦｙｎの定量を示すグラフである（ｎ ＝ ６； ＊＊＊ Ｐ ＜０．００１； ＊＊ Ｐ ＜０．０１； ＊ Ｐ ＜０．０５）。
【００５４】
【図４−４】図４Ｇは、一貫してより多くのＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体が、３０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの注射の後、０、５及び１５分で、ｐ３８γ＋／＋マウスよりも、ｐ３８γ−／−マウスの皮質溶解物から免疫沈殿されたことを示す。図４Ｈは、（４Ｇ）において検出されたＰＳＤ−９５に結合されたtau及びＦｙｎの定量を示すグラフである（ｎ ＝ ６； ＊＊＊ Ｐ ＜０．００１； ＊＊ Ｐ ＜０．０１； ＊ Ｐ ＜０．０５）。
【００５５】
【図４−５】図４Ｉは、より多くのtau、Ｆｙｎ、ＮＭＤＡ受容体サブユニット１（ＮＲＩ）及び２Ｂ（ＮＲ２Ｂ）が、ｐ３８γ＋／＋マウスよりもｐ３８γ−／−の脳由来のＰＳＤ−９５を有する複合体において免疫沈澱されたことを示す。これは、ＡＰｐ２３．ｐ３８γ＋／＋マウスに比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−においてさらに増強された。しかしながら、ＡＰＰ（２２Ｃ１１）、ＰＳＤ−９５、tau、Ｆｙｎ、ＮＲ１、ＮＲ２Ｂ及びｐ３８γの合計レベルは、ｐ３８γ− / − 、ｐ３８γ＋ / ＋、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ− / − 及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋マウスにおいて同等であった。図４Ｊは、（４Ｉ）において検出されたＰＳＤ−９５に結合されたtau、Ｆｙｎ、ＮＲ１及びＮＲ２Ｂの定量を示すグラフである（ｎ ＝ ６−８； ＊＊＊ Ｐ ＜０．００１； ＊＊ Ｐ ＜０．０１； ＊ Ｐ ＜０．０５）。
【００５６】
【図５−１】図５Ａは、野生型（ＷＴ）又は構成的活性な（ＣＡ）ｐ３８γによりトランスフェクトされた細胞が、Ｔ２０５で主にリン酸化され、そしてＳ１９９でより低くリン酸化されるが、しかしＳ３９６及びＳ４０４で実質的にリン酸化されないことを示す。ＧＡＰＤＨは、同等の負荷を示した。
【００５７】
【図５−２】図５Ｂは、ＰＳＤ９５、Ｆｙｎ及び野生型又は突然変異ヒトtau（Ｓ１９９Ａ、Ｓ１９９Ｄ、Ｔ２０５Ａ、Ｔ２０５Ｅ）により同時トランスフェクトされた細胞由来のＰＳＤ９５／tau／Ｆｙｎ複合体の免疫沈澱の結果を示す。結果は、Ｔ２０５（Ｔ２０５Ｅ）でのリン酸化の模倣がＰＳＤ９５、Ｆｙｎ及びtauの相互作用を定量的に破壊し、ところがtau変異体Ｔ２０５Ａはそれを増大したことを示す。Ｓ１９９の突然変異は、ＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体に対して影響を及ぼさなかった。図５Ｃは、（図５Ｂ）において検出されたＰＳＤ−９５に結合されたtau及びＦｙｎの定量を示すグラフである（ｎ ＝ ６； ＊＊＊ Ｐ ＜０．００１；＊ Ｐ ＜０．０５；ｎｓ、有意ではない）。
【００５８】
【図５−３】図５Ｄは、ｐ３８γＣＡの有無にかかわらず、ＰＳＤ９５、Ｆｙｎ、野生型又は変異ヒトtauにより同時トランスフェクトされた細胞由来のＰＳＤ９５／tau／Ｆｙｎ複合体の免疫沈澱の結合を示す。ｐ３８γＣＡとのＰＳＤ−９５、Ｆｙｎ及びＷＴtauの同時発現は、ＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体の形成を無効にし、ところがＴ２０５Ａのトランスフェクションは、ＰＳＥ−９５／Ｔ２０５Ａ  tau／Ｆｙｎ相互作用に対するｐ３８γＣＡの効果を完全に妨げた。図５Ｅは、図５Ｄにおいて検出されたＰＳＤ−９５に結合されたtau及びＦｙｎの定量を示すグラフである（ｎ ＝４；＊＊＊ Ｐ ＜０．００１； ＊＊ Ｐ ＜０．０１）。
【００５９】
【図５−４】図５Ｆは、海馬ニューロンにおけるＬＤＨ放出により決定されるようなＡβ−誘発毒性に対するtau変異体の効果を示すグラフである。Ａβ（０．０５又は０．５μＭ）−誘発毒性（ＬＤＨ放出により測定される）は、ＷＴ及びＴ２０５Ａ  tau発現ニューロンに比較して、Ｔ２０５Ｅにおいて誘発された。Ｈ２Ｏ２（３μＭ）により誘発された細胞毒性は、全てのtau変異体で類似した（ｎ ＝６の独立した実験；＊＊ Ｐ ＜０．０１； ＊＊Ｐ ＜０．０５）。
【００６０】
【図５−５】図５Ｇは、培養された海馬ニューロンにおけるｐ３８γ及びｐ３８γＣＡの局在を示す画像である。内在性ｐ３８γと同様に、ＡＡＶ発現ＷＴ及び構成的活性（ＣＡ）ｐ３８γの両者が、培養された海馬ニューロン（β３Ｔｕｂ、β３チューブリン）の樹状突起棘に局在した（図２Ｂを参照のこと）。対照ニューロンは、ＡＡＶ１８  ＧＦＰを発現した。スケールバー、１μｍ。
【００６１】
【図５−６】図５Ｈは、ＬＤＨ放出により決定された、海馬ニューロンにおいて、Ａβ（０．０５又は０．５μＭ）により誘発されたが、しかしＨ２Ｏ２（３μｍＭ）によっては誘発されていない毒性を、ｐ３８γＷＴ及びｐ３８γＣＡの発現が低めたことを示すグラフである（ｎ ＝６の独立した実験；＊＊ ＊Ｐ ＜０．００１； ＊＊Ｐ ＜０．０１）。
【００６２】
【図５−７】図５Ｉは、ＡＡＶ−ＧＦＰを受けたマウスに比較して、Ｃ５７Ｂｌ／６脳におけるｐ３８γ及びｐ３８γＣＡの発現が、ＰＴＺ（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の投与の後、発作潜伏期を高めることを示すグラフである（ｎ ＝８−１０；＊＊ Ｐ ＜０．０１）。図５Ｊは、図５Ｉにおける発作潜伏期曲線の線形回帰分析の結果を示すグラフである（ｎ ＝８−１０；＊＊＊ Ｐ ＜０．００１； ＊＊ Ｐ ＜０．０１）。
【００６３】
【図５−８】図５Ｋは、５０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺを注射された個々のマウスにおけるｐ３８γ発現のレベルと正相関したＷＴ及びＣＡ  ｐ３８γの両者の発現により仲介される発作潜伏期（線形回帰勾配）の改善の程度を示すグラフである（ｎ ＝８−１０；＊＊ Ｐ ＜０．０５）。
【００６４】
【図６】５０ｍｇ／ｋｇ体重のペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）の腹腔内注射後に誘発された興奮毒性発作に対するｐ３８γ−／−ノックアウトマウス及びｐ３８γ＋／＋対照マウスの感受性を示すクラブである。発作潜伏期は、５０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの投与の後、対照（ｐ３８γ＋／＋）マウスに比較して、ｐ３８γノックアウト（ｐ３８γ−／−）において低められた（＊ Ｐ ＜０．０５；ｎ ＝９−１０）。図６Ｂは、図６Ａにおける発作潜伏期曲線の分析の線形回帰の結果を示すグラフである（＊＊＊ Ｐ ＜０．０００１；ｎ ＝９−１０）。図６Ｃは、５０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの腹腔内投与に続いてのｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−マウスにおける平均発作重症度を示すグラフである。平均発作重症度は、ｐ３８γ−／−マウスに比較して、ｐ３８γ＋／＋マウスにおいて低められた（＊ Ｐ ＜０．０５）。
【００６５】
【図７】３０ｍｇ／ｋｇ体重のＰＴＺの腹腔内注射後に誘発された興奮毒性発作に対するｐ３８γ−／−ノックアウトＡＰＰ２３マウス及びｐ３８γ＋／＋ＡＰＰ２３マウスの感受性を示すクラブである。ｐ３８γ−／−及びＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋は、ＰＴＺ注射の後の非トランスジェニックｐ３８γ＋／＋マウスに比較して、類似する低められた発作潜伏期を示した。発作潜伏期は、ＡＰＰ２８．ｐ３８ｒ−／−マウスにおいてさらに低められた（ｎ ＝１０−１２；＊＊ Ｐ ＜０．０１；＊ Ｐ ＜０．０５）。図７Ｂは、図７Ａにおける発作潜伏期曲線の線形回帰分析の結果を示すグラフである（ｎ ＝１０−１２；＊＊ ＊Ｐ ＜０．００．１；＊ Ｐ ＜０．０５）。図７Ｃは、ＰＴＺ投与（３０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）に続く平均発作重症度と示すグラフである。発作重症度は、非トランスジェニックｐ３８γ＋／＋マウスに比較して、ｐ３８γ−／−及びＡＰＰ．ｐ３８γ＋／＋において有意に高められた（ｎ ＝１０−１２；＊＊ ＊Ｐ ＜０．００．１；＊ Ｐ ＜０．０５）。ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−マウスは、発作をさらに増強する傾向を示した。
【００６６】
【図８】図８Ａは、記憶障害を評価するために、モリス−水−迷路（ＭＷＭ）におけるｐ３８γ＋ / ＋、ｐ３８γ − ／ − 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / −マウスの水泳経路の長さを示すグラフである。より長い水泳経路は、ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−マウスにおける正常な学習に比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋マウスにおいて記憶獲得欠損を示し、ＡＰｐ２３．ｐ３８γ−／−マウスにおいてはより悪かった（＊＊ Ｐ ＜０．０１；＊ Ｐ ＜０．０５；ｎｓ、有意でない）。図８Ｂは、逃避潜伏期を示すグラフであり、そして図８Ｃは、モリス−水−迷路（ＭＷＭ）におけるｐ３８γ＋ / ＋、ｐ３８γ − ／ − 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / −マウスの平均速度を示すグラフである。逃避潜伏期及び平均速度は、視覚的及び運動能力を確認し、視覚的に確認されたプラットフォームを用いて類似していた。
【００６７】
【図９−１】図９Ａは、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋/＋及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ− /−及び非トランスジェニック対照ｐ３８γ＋ / ＋及びｐ３８γ− / − マウスにおけるシータ（４−１２Ｈｚ）及びガンマ（２５−１００Ｈｚ）振動、ガンマ振幅エンベロープ及びシータ位相についてのバンドパスフィルタリングされたシグナルの代表的な生発作間脳波（ＬＦＰ）の図である。
【００６８】
【図９−２】図９Ｂは、発作間ＥＥＧのスペクトルパワー分析が、ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−記録（ｎ＝６）に比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋及びＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−における低いシータ頻度への移行を示したことを示すグラフである。点線のボックスは、低及び高シータバンドをマークする。図９Ｃは、ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−記録に比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋及びＡＰｐ２３．ｐ３８γ−／−（より高い）における低周波数シータ（４−８Ｈｚ）のスペクトルパワーの定量化（曲線下の面積、ＡＵＣ）を示すグラフである（＊＊＊ Ｐ ＜０．００１）。図９Ｄは、ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−記録に比較して、図９Ｂにおける高周波シータパワー（８−１２Ｈｚ）のスペクトルパワーが低められたことを示すグラフである（＊＊＊ Ｐ ＜０．００１；ｎｓ、有意ではない）。ＡＰＰ２３マウスにおける高周波イータ（８−１２Ｈｚ）の異常パワーは、ｐ３８γの欠失により影響されなかったことに留意すること。
【００６９】
【図９−３】図９Ｅは、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋、ＡＰｐ２３．ｐ３８γ−／−、ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−記載（ｎ＝６−８）における発作間ＥＥＧのガンマスペクトルパワー分析を示すグラフである。点線のボックスは、ガンマバンドを示す。図９Ｆは、図９Ｅに示されるグラフの定量化（ＡＵＣ）を示すグラフである。結果は、ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−記録に比較して、ＡＰｐ２３．ｐ３８γ＋／＋及びＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−におけるガンマ（２５−１００Ｈｚ）の高められたスペクトルパワーを示した（＊＊＊ Ｐ ＜０．００１）。
【００７０】
【図９−４】図９Ｇは、ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝６）及びｐ３８γ−／−（ｎ＝６）マウスに比較して、位相振幅カップリング（ＣＦＣ）のＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝８）における低下及びＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−（ｎ＝８）における欠損を示す発作間海馬ＬＦＰ記録について計算された位相振幅プロットを示すグラフである。
【００７１】
【図１０】図１０Ａは、全長（ＦＬ）ＷＴ及びＣＡ  ｐ３８γの両者が、ＰＳＤ−９５及びｐ３８γ変異体によりトランスフェクトされた細胞からＰＳＤ−９５と共に沈殿したイムノブロットを示す。注目すべきことには、ＷＴ及びＣＡ  ｐ３８γの両者におけるＣ末端ＰＤＺ結合モチーフ（ΔＰｍ）の欠失がＰＳＤ−９５との相互作用を無効にした。図１０Ｂは、ＷＴ及びＣＡ  ｐ３８γの両者が、Ｖ５標識tau及びｐ３８γ変異体によりトランスフェクトされた細胞から、tauと共に沈殿したイムノブロットを示す。ＧＡＰＤＨは、同等の負荷を確認した。図１０Ｃは、ＰＳＤ−９５及びtau（ｈ Ｔａｕ４０）によりトランスフェクトされた細胞からのＰＳＤ−９５／tau複合体の免疫沈澱（ＩＰ）を示す。緩和された野生型ｐ３８γ（ＷＴ）及び構成的活性なｐ３８γ（ＣＡ）の同時トランスフェクションは、ＰＳＤ−９５／tau相互作用を無効にした。ＧＡＰＤＨは、同等の負荷を確認した。図１０Ｃはまた、ＩＰにおいて検出されるようなＰＳＤ−９５に結合されたtauの定量を示すグラフを示す（ｎ ＝ ５； ＊＊＊ Ｐ ＜０．００１; ＊＊ Ｐ ＜０．０１）。図１０Ｄは、Ｖ５標識tau、Ｆｙｎ及びｐ３８γ変異体によりトランスフェクトされた細胞から、tauと共に沈殿された、Ｆｙｎ、及びＷＴ及びＣＡ  ｐ３８γの両者を示すイムノブロットである。ＧＡＰＤＨは、同等の負荷を確認した。
【００７２】
【図１１】図１１Ａは、tauドメイン、及び非−ＳＰ／ＴＰ及びＳＰ／ＴＰ部位を含む主要リン酸化部位の概略図である。Ｎ１／Ｎ２：エキソン２／３によりコードされるＮ末端挿入体；Ｐｒｏ：プロリンに富むドメイン；Ｒ１−４：微小管結合反復体。図１１Ｂは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の不在（−）又は存在（＋）下で、組換えtau及びｐ３８γを用いてのインビトロキナーゼアッセイの結果であり、続いて、ｐ３８γ、tau（Ｔａｕ１３）及びリン酸化部位特異的抗体についてのイムノブロティングは、Ｓ１９９、Ｔ２０５、Ｓ３９６及びＳ４０４でのtauのリン酸化を示したが、しかしｐ３８γにより試験された他の部位では検出されなかった。図１１Ｃは、ｐ３８γによるＳ１９９、Ｔ２０５、Ｓ３９６及びＳ４０４の部位特異的リン酸化を確認したＡＴＰの不在（−）又は存在（＋）下でアラニン及びｐ３８γに変異される、示されたセリン／トレオニンを有する組換え野生型tau又は変異体を用いてのインビトロキナーゼアッセイの結果である。
【００７３】
【図１２】図１２Ａは、０．０５μＭのＡβ４２又はビークルに暴露されたヒト野生型（ＷＴ）、Ｔ２０５Ａ又はＴ２０５Ｅ変異体tauのアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）媒介発現を伴う海馬ニューロンを示す。細胞毒性は、ＷＴ及びＴ２０５ＡにおけるＥｔｈＤ１取り込みにより２４時間後、検出されるが、しかしＴ２０５Ｅtau発現ニューロンでは検出されなかった。スケールバー、１０μｍ。図１２Ｂは、ＷＴ、Ｔ２０５Ａ及びＴ２０５Ｅtauの類似する発現が海馬ニューロンに観察されたイムノブロットを示す。ＧＡＰＤＨは、同等の負荷を確認した。
【００７４】
【図１３】図１３は、図５Ｇに示される細胞の低倍率を示す：内在性ｐ３８γ（図１参照）と同時に、ＡＡＶ発現ＷＴ及び構成的活性（ＣＡ）なｐ３８γの両者は、培養海馬ニューロン（β３Ｔｕｂ、β３−チューブリン）の樹状突起棘に局在した。対照ニューロンはＡＡＶ−ＧＦＰを発現した。スケールに、１０μｍ。破線は、図５Ｇにおいて高倍率で示される光学フィールドを示した。
【００７５】
【図１４】図１４Ａは、ＡＡＶコンストラクトにより感染されたマウスの前脳を示す。脳は、ＧＦＰ又はＨＡ−ｐ３８γの広範なＡＡＶ媒介性発現を示す。ＮＣ、負の対照。スケールバー、２５０μｍ。破線はインセットを示す。図１４Ｂは、ｐ３８γＣＡよりも高いｐ３８γ発現を示す、ＧＦＰ担持ＡＡＶ、ＨＡ標識ｐ３８γ又はＨＡ標識ｐ３８γＣＡにより頭蓋内注射されたマウスの皮質溶解物のイムノブロットである。ＧＡＰＤＨは、同等の負荷を確認した。Ｃｔｒｌ、  ＨＡ−ｐ３８γによりトランスフェクトされた細胞殻の溶解物。
【００７６】
【図１５】図１５は、平均発作重症度が、ＧＦＰ発現対照に比較して、ＰＴＺ（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与された、ｐ３８γＣＡのＡＡＶ媒介性発現を伴うＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて有意に低められたことを示すグラフである（ｎ ＝ ８〜１０； ＊ Ｐ ＜０．０５）。
【００７７】
【図１６】図１６−１８は、モリス−水−迷路（ＭＷＭ）を用いてのＡＰＰ２３.ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶｐ３８γＣＡ、及びＡＰＰ２３.ＡＡＶｐ３８γＣＡマウスにおける空間作業記憶欠損を示す。図１６Ａは、ＡＰＰ２３.ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶｐ３８γＣＡ、及びＡＰＰ２３.ＡＡＶｐ３８γＣＡについての代表的ＭＷＭ経路トレースである。破線の四角は隠れたプラットフォームの位置である。また、ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰマウスに比較して、逃避潜伏期がＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶｐ３８γＣＡ、及びＡＰＰ２３.ＡＡＶｐ３８γＣＡにおいて低められたことを示すグラフもまた示されている。
【００７８】
【図１７】図１６−１８は、モリス−水−迷路（ＭＷＭ）を用いてのＡＰＰ２３.ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶｐ３８γＣＡ、及びＡＰＰ２３.ＡＡＶｐ３８γＣＡマウスにおける空間作業記憶欠損を示す。図１７は、ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰマウスに比較して、プローブ試験の間、標的化（Ｑ１）でより長い時間を費やし、そして反対の象限（Ｑ４）でより短い時間を費やしたＡＡＶＢ３８γＣＡマウスを示すグラフである。
【００７９】
【図１８】図１６−１８は、モリス−水−迷路（ＭＷＭ）を用いてのＡＰＰ２３.ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶｐ３８γＣＡ、及びＡＰＰ２３.ＡＡＶｐ３８γＣＡマウスにおける空間作業記憶欠損を示す。図１８は、ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰマウスに比較して、ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶｐ３８γＣＡ、及びＡＰＰ２３.ＡＡＶｐ３８γＣＡにおいて３日以上の逃避潜伏期が低められたことを示すグラフである。
【００８０】
【図１９】図１９は、５０ｍｇ／ｋｇのＰＴＺの投与によるＰＴＺ誘発性発作の後、（Ａ）発作潜伏期及び発作グレード、（Ｂ）（（Ａ）の勾配の線形回帰）及び平均発作重症度に対する、tau − / − マウスにおけるtau野生型（tau − / − ．ＡＡＶtauＷＴ）、ＧＦＰ（tau − / −．ＡＡＶ ＧＦＰ）、tauＴ２０５Ａ（tau − / −．ＡＡＶtauＴ２０５Ａ）、又はtauＴ２０５Ｅ（tau − / −．ＡＡＶtauＴ２０５Ｅ）のＡＡＶ媒介発現の効果を示すグラフである。
【００８１】
【図２０】図２０は、（Ａ）交差周波数カップリング（ＣＦＣ）の画像であり；そして（Ｂ）は、ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶ ＧＦＰ、及びＡＡＶ.ｐ３８γＣＡに比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡマウスにおける変調指数を示すグラフである（ｎ＝５−６、左）。＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ:有意ではない。エラーバーはＳＥＭを示す。
【００８２】
【図２１】（Ａ）は、（Ｂ）におけるｐＰＡＬ試験に使用されたＢｕｓｓｅｙ−Ｓａｋｓｉｄａタッチスクリーンオペラントチャンバーにおける差動ペア関連学習（ｄＰＡＬ）タスク（differential paired associate learning task）における刺激画像−位置ペアリング可能性を示す。＋は、正しい画像位置ペアリングを示し、そして−は、間違ったペアリングを示す。６つの画像位置ペアリングが試験間で無作為化された；（Ｂ）は、タッチスクリーンオペラントチャンバー試験の間、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − 、ｐ３８γ＋ / ＋及びｐ３８γ − / −マウスにおける経時的な正しいｐＰＡＬ試験の数のグラフであり；そして（Ｃ）は、（Ｂ）における１分当たりの正確な試験の曲線分析下の面積を示すグラフである（ｎ＝８−１０）；＊＊＊ Ｐ ＜０．００１、＊＊ Ｐ ＜０．０１、＊ Ｐ ＜０．０５、ｎｓ：有意ではない；（左）二元配置ＡＮＯＶＡ：Ｆ（３，９４１）＝ ６０．９０; ａ ＝ ０．０５；Ｓｉｄａｋ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ; （右）一元配置ＡＮＯＶＡ：Ｆ（３，４１）＝ １１．４３； ａ ＝ ０．０５；Ｓｉｄａｋ 事後（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）。
【００８３】
【図２２】図２２Ａ−Ｃは、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−マウスにおける識別記憶の軽度の障害を示す、Ｂｕｓｓｅｙ−Ｓａｋｓｉｄａタッチスクリーンオペラントチャンバーにおけるペアワイズ識別タスクの結果を示す。（Ａ）は、ペアワイズ識別タスクの分析に使用された刺激を示し；（Ｂ）は、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − 、ｐ３８γ＋ / ＋及びｐ３８γ − / −マウスについての連続試験日についての１分当たりの正しい試験回数のグラフを示し（ｎ ＝ ８； ＡＰＰ２３．ｐ３８γ − / − 対ｐ３８γ − / −についての＊Ｐ ＜０．０５; α＝ ０．０５; Ｆ（３，１００）＝ ３．５６１;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験による二元配置ＡＮＯＶＡ）；そして（Ｃ）は、（Ｂ）における１分間の曲線当たりの正しい試験の曲線分析下の面積（ＡＵＣ）を示すグラフである（ｎ ＝ ８； ＡＰＰ２３．ｐ３８γ − / − 対ｐ３８γ − / −についての＊Ｐ ＜０．０５; α＝ ０．０５; Ｆ（３，２８）＝ ２．９８４;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。
【００８４】
【図２３】（Ａ）は、表３に記載される異なる神経病理学的病期（Ｂｒａａｋ−Ｉ−VI）でのヒト対照（Ｂｒａａｋ  ０）及びアルツハイマー病に罹患したヒトからの脳抽出物の代表的ウェスターンブロットの画像であり、（Ｂ）は、ＧＡＰＤＨに標準化された（Ａ）におけるウェスターンブロットにおけるｐ３８γのレベルを示すグラフであり、（Ａ）及び（Ｂ）の両者とも、ＡＤの進行と共にｐ３８γの著しく低められたレベル、及び早期病期での低減に向かう傾向を示す（ｎ ＝ ４−５/グループ；＊Ｐ ＜０．０５; ｎｓ、有意ではない；ａ＝０．０５；α＝ ０．０５; Ｆ（３，１３）＝ ５．４３５;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。
【００８５】
【図２４】図２は、生後４ヶ月の非トランスジェニック対照ｐ３８γ＋ / ＋及びｐ３８γ − / − 及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋．tau − / − 及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − ．tau − / −マウスにおける代表的ＥＥＧ（ＬＦＰ）トレースの画像である。tauの欠失は不在の過敏性活性をもたらすことを注意すること（灰色のボックス）。
【００８６】
【図２５】図２５は、ｐ３８γ＋ / ＋、ｐ３８γ − / − 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋．tau − / − 及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − ．tau − / −マウスにおける過敏性癲癇様活性の数（スパイク／分）を示すグラフである。ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋．tau − / − 及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − ．tau − / −マウスにおける過敏性癲癇様活性は、非トランスジェニック対照Ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−マウスに見られるレベルみに類似した（ｎ＝６−８；＊＊＊Ｐ ＜０．００１; ｎｓ、有意ではない；α＝ ０．０５; Ｆ（３，２２３）＝４５．１２;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。
【００８７】
【図２６】図２６は、（Ａ）ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋．tau − / −、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − ．tau − / −、ｐ３８γ＋ / ＋、及びｐ３８γ − / −記録の発作間区間におけるシータ周波数（４−１２Ｈｚ）のスペクトルパワー分析を示すグラフである（ｎ＝６−８）。ＡＰＰ２３記録における低いシータ周波数（４−８Ｈｚ）へのシータシフトは、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋．tau − / −、及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − ．tau − / −におけるtauの欠失の際に逆転されなかったことを留意すること。点線ボックスは、低及び高シータバンドをマークし；そして（Ｂ）ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋及びより多くのＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−の発作間区間のガンマスペクトルパワー（２５−１００Hz）は、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋．ｔａｕ−／―及びＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−．ｔａｕ−／−において、ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−記録のレベルに戻った（ｎ＝６−８）。点線のボックスは、ガンマバンドを示す。
【００８８】
【図２７】図２７は、発作間海馬ＬＦＰ記録の代表的な位相振幅コモドログラムの画像が、ｐ３８＋／＋及びｐ３８γー／−マウスに比較して、それぞれ、ＡＰｐ２３．ｐ３８γ＋／＋及びＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−における低められた及び実質的に失われた交差周波数カップリング（約８Ｈｚ）を示した画像である。tauの決失は、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋．ｔａｕ−／−及びＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−．ｔａｕ−／−記録の両者において、修復された交差周波数カップリングをもたらした（ｎ＝６−８）。
【００８９】
【図２８】図２８は、（Ａ）ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋．tau − / −、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − ．tau − / −、ｐ３８γ＋ / ＋、及びｐ３８γ − / −マウスからの記録におけるシータ相及びガンマ振幅のカップリングのための平均変調指数を示すグラフである（ｎ＝６−８；＊＊＊Ｐ ＜０．００１; ＊＊Ｐ ＜０．０１;ｎｓ、有意ではない；α＝ ０．０５; Ｆ（５，１１１）＝１７．３１;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。tauの決失は、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋．ｔａｕ−／−及びＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−．ｔａｕ−／−マウスの両者において、修復された及び類似する交差周波数カップリングをもたらし；そして（Ｂ）発作間海馬ＬＦＰについて計算されたしイータ相を通してのガンマ振幅の関係を示す位相−振幅プロットは、ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝６）及びｐ３８γ−／−（ｎ＝６）マウスに比較して、位相−振幅カップリング（ＣＦＣ）のＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋（ｎ＝８）における低下及びＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−（ｎ＝８）における欠失を示す。しかしながら、tauの決失は、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋．ｔａｕ−／−及びＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−．ｔａｕ−／−記録の両者においてシータ相を通しての回復されたカップリングをもたらす（α＝ ０．０５; Ｆ（５，２７９０）＝０．００３４１８;  相ビン（phase bin）当たりのＳｉｄａｋの複数比較事後試験による二元配置ＡＮＯＶＡ）。
【００９０】
【図２９】図２９Ａ−Ｃは、モリス−水−迷路パラダイム用いて、生後１２ヶ月のｐ３８γ＋ / ＋、ｐ３８γ − / − 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋．tau − / − 及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − ．tau − / −マウスにおける記憶障害に対するtauの遺伝子欠失の効果の詳細を示すグラフである。（Ａ）は、プローブ試験の間、すべての４つの水迷路象限（Ｑ１−４）における時間を示すグラフである（ｎ＝６−８；＊＊Ｐ ＜０．０１; ＊Ｐ ＜０．０５;ｎｓ、有意ではない；α＝ ０．０５; Ｆ（５，１８４）＝０．００２７８３;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験による二元配置ＡＮＯＶＡ）。（Ｂ）は、視覚的コンピテンシーを確認する、視覚的な手掛かりプラットフォーム試験の間、逃避潜伏期は類似したことを示すグラフである（ｎ＝６−８；＊＊Ｐ ＜０．０１（試験１におけるＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − ．tau − / −対ＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / −）; ｎｓ、有意ではない（Ｐ＝０．５０９２；試験３におけるＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − ．tau − / −対ＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / −）；ｎ＝６−１０；α＝ ０．０５; Ｆ（５，１４５）＝７．０９１;  試験当たりＳｉｄａｋの複数比較事後試験による二元配置ＡＮＯＶＡ）。（Ｃ）は、平均水泳速度が、運動能力を確認する、ＭＷＭ試験の間、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − 、ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋ / ＋．tau − / − 及びＡＰＰ２３.ｐ３８γ − / − ．tau − / −、ｐ３８γ＋ / ＋、及びｐ３８γ − / −マウス間で類似したことを示すグラフである（ｎ＝６−８；α＝ ０．０５; Ｆ（５，１６９）＝０．４６５１;Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。
【００９１】
【図３０】図３０（Ａ）は、Ｃ５７Ｂｌ／６卵母細胞中への前核注入によるｐ３８γＣＡマウスの生成のためのトランスジェニックコンストラクトの使用の概略図である。構成的に活性化するＤ１７９Ａ天然変異を含むＨＡ標識ｐ３８γが、ニューロン特異的ネズミＴｈｙ１．２（ｍＴｈｙ１．２）プロモーターの制御下で発現され、続いてウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｐＡ）配列が発現された。（Ｂ）非トランスジェニック（−）及びｐ３８γＣＡ．３（＋）トランスジェニックマウス系の皮質（ＣＴＸ）、海馬（ＣＨ）及び小脳（ＣＢ）脳抽出物のイムノブロットは、ＨＡ標識ｐ３８γＣＡの発現を確認した。２９３Ｔ細胞において発現されたＨＡ−ｐ３８γＣＡが、正の対照として使用された。（Ｃ）非トランスジェニック（−）及びトランスジェニックｐ３８γＣＡマウスのｐ３８γＣＡ（＋）脳からのｐ３８γの免疫沈殿を示す画像は、リン酸化ｐ３８に対する抗体により検出されるように、ｐ３８γＣＡサンプルのすべてにおいて活性ｐ３８γを示し、このことは、トランスジェニックが活性ｐ３８γを発現することを示している。
【００９２】
【図３１】図３は、（Ａ）ＰＳＤ−９５及びＦｙｎと共に個々のtau変異体を同時発現する、２９３Ｔ細胞におけるＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体による、突然変異されたtau変異体の同時免疫沈澱の代表的なウェスターンブロットである。Ｔ２０５Ｅtau変異体のみが、ＰＳＤ−９５及びＦｙｎとの複合体形成を無効にし；そして（Ｂ）は、（Ａ）に示されるような４つの独立した実験の定量を示すグラフである。ＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体形成は、Ｔ２０５Ｅtau変異体の存在下でのみ有意に破壊された（ｎ＝４； ＊Ｐ ＜０．０５（ＷＴ対Ｔ２０５Ｅについて）;ｎｓ、有意ではない；α＝ ０．０５;Ｆ（１８，７９）＝１．００３;Ｓｉｄａｋの複数比較試験によるＡＮＯＶＡ）。
【００９３】
【図３２】図３２は、（Ａ）ＡＡＶ送達ＷＴ  tau、Ｔ２０５Ａ及びＴ２０５Ｅ（示されるような）は、出生後０日で頭蓋内に注入された生後４ヶ月のtau／−マウスの皮質において広く発現されることを示す画像である。tauは、ＡＡＶ  ＧＦＰ（tau／−．ＡＡＶＧＦＰ）を注入されたｔａｕ−/−脳に検出されなかった。ＤＡＰＩ、核。スケールバー、５０μｍ；（Ｂ）は、マウスの脳におけるＧＦＰ又はＨＡ−ｐ３８γの広範なニューロンＡＡＶ介在性発現を示すＧＦＰ又はＨＡの染色を示す画像である。スケールバー、２５μｍ。（Ｃ）は、出生後０日で、ＡＡＶ担持のＧＦＰ、ＨＡ標識ｐ３８γ又はＨＡ標識ｐ３８γＣＡにより頭蓋内注射されたマウスの皮質溶解物のイムノブロットである。ＨＡ標識ｐ３８γは、ｐ３８γＣＡよりも高いｐ３８γの発現を示した。ＧＡＰＤＨは、同等の負荷を確認した。Ｃｔｒｌ、ＨＡ−ｐ３８γによりトランスフェクトされた細胞からの３つの溶解物。
【００９４】
【図３３】図３３は、ＡＡＶ送達ｐ３８γＣＡが、生後０日でＡＡＶを頭蓋内に注射された生後６ヶ月のＡＰＰ２３マウスのマウス皮質において広く発現されることを示す免疫蛍光画像である。ＨＡについての免疫蛍光染色は、皮質全体にＨＡ標識ｐ３８γＣＡの発現を示した。ＤＡＰＩ、核。スケールバー、５０μｍ。
【００９５】
【図３４】図３４は、ＡＡＶ送達ＧＦＰ又はｐ３８γＣＡを発現するＷＴ又はＡＰＰ２３マウスのモリス水迷路試験の結果を示すグラフであり、ここで（Ａ）は、マウスの象限の時間を示すグラフであり、そしてＡＡＶ送達ｐ３８γＣＡを発現するＡＰＰ２３マウス（ＡＰＰ２３．ＡＡｐ３８γＣＡ）が、ＭＷＭプローブ試験を実施する場合、対照ＡＡＶを発現するＡＰＰ２３（ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰ）と比較して、統合記憶を示すことを示すグラフである。プローブ試験（７日目）の間の４つの全ての水迷路象限（Ｑ１−４）の時間が、ＡＰＰ２３.ＡＡＶｐ３８γＣＡ、ＡＰＰ２３.ＡＡＶＧＦＰ及び非トランスジェニックＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶｐ３８γＣＡ対照について示される。ＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡマウスは、ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰマウスに比較して、標的象限Ｑ１において有意に多くの時間を費やす。ＡＡＶｐ３８γＣＡマウスは、ＡＡＶＧＦＰマウスと類似する記憶性能を示すことに留意すること（＊Ｐ ＜０．０５（Ｑ１におけるＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡ対ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰ；Ｆ（３，８４）＝３．４９４）; ｎ＝６−１０；α＝ ０．０５;Ｆ（３，１０８）＝４．４５４;象限当たりＳｉｄａｋの複数比較事後試験による二元配置ＡＮＯＶＡ）；（Ｂ）は、ＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡ、ＡＰＰ２３.ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶｐ３８γＣＡが、ＭＷＭにおける３つの視覚的合図の後、類似する逃避潜伏期を示したことを示し、これは、正常な視覚的機能及び運動協調能力を示す（＊Ｐ ＜０．０５（試験１におけるＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡ対ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰ；Ｆ（３，８４）＝３．４９４）; ｎｓ、有意ではない（Ｐ＝０．５０９２；試験３におけるＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡ対ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰ）；ｎ＝６−１０；α＝ ０．０５;Ｆ（３，８４）＝０．０７４７４;試験当たりＳｉｄａｋの複数比較事後試験による二元配置ＡＮＯＶＡ）；そして（Ｃ）は、ＭＷＭ試験の間、平均水泳速度が、ＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡ、ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶＧＦＰ及びＡＡＶｐ３８γＣＡマウス間で類似したことを示し、これは運動能力を確認する（ｐ＝０．８３８９；試験３におけるＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡ対ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰ）；ｎ＝６−１０；α＝ ０．０５;Ｆ（３，６８）＝０．２８１１Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。
【００９６】
【図３５】（Ａ）ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰマウスに比較して、ＡＰＰ２３．ＡＶｐ３８γＣＡマウスからのＥＥＧ記録における低められた自発的スパイク、及びＡＡＶｐ３８γＣＡ又はＡＡＶＧＦＰ処理野生型マウスからのＥＥＧ記録でのスパイクは生じなかったことを示し（ｎ＝５−６；＊Ｐ ＜０．０５;一元配置ＡＮＯＶＡ；Ｆ（３，６８）＝３０１．１; α＝ ０．０５;Ｓｉｄａｋの事後試験）；そして（Ｂ）は、ＡＡＶ.ＧＦＰ、ＡＡＶｐ３８γＣＡ、ＡＰＰ２３.ＡＡＶ.ＧＦＰ及びＡＰＰ２３.ＡＡＶｐ３８γＣＡマウスについてのスパイク／分を示すグラフであり、これは、ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰマウスに比較して、ＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡについての低められたスパイク／分を示す。
【００９７】
【図３６】図３６は、４−８Ｈｚ（Ｂ）及び８−１２Ｈｚ（Ｃ）でのＡＰＰ２３マウスのシータ振動力の変化が、ＡＡＶｐ３８γＣＡ発現により影響されず、ＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡ、及びＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰ記録におけるレベルに匹敵することを示す（＊Ｐ ＜０．０５; ｎ＝５−６；α＝ ０．０５; Ｆ（３，４７）＝ ３．０３８;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。
【００９８】
【図３７】図３７は、ＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡマウスの記録におけるガンマ発信力（２５−１００Ｈｚ）が、ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰマウス記録に比較して、有意に低められたことを示す（＊＊Ｐ ＜０．０１; ＊Ｐ ＜０．０５; ｎ＝５−６；α＝ ０．０５; Ｆ（３，２６）＝ ６．９３０;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。
【００９９】
【図３８】図３８は、ＡＡＶ送達ｐ３８γＣＡが、ＡＰＰ２３マウスのＥＥＧ記録において正常な交差周波数カップリングをもたらすことを示すグラフである。位相振幅相関は、ＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡ、及びＡＡＶＧＦＰ及びＡＡＶｐ３８γＣＡ記録において、シータ相に沿ったガンマ振幅の強いカップリングを示したが、ＡＰＰ２３．ＡＦＶＧＦＰマウスからの記録においてはそうではなかった（＊＊Ｐ ＜０．０１（ＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡ対ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰ）；α＝ ０．０５; Ｆ（３，２０）＝ ４．７９３; 相ビン（phase bin）当たりのＳｉｄａｋの複数比較事後試験による二元配置ＡＮＯＶＡ）。
【０１００】
【図３９−１】図３９Ａ−Ｅは、活性ニューロンｐ３８γが、モリス水迷路（ＭＷＭ）により試験されるように、損傷を受けた記憶機能を発症することからＡＰＰ２３マウスを保護することを示す。（Ａ）は、ＭＷＭ試験におけるＷＴ（非標識）、ｐ３８γＣＡ．３,ＡＰＰ２３及びＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡ．３マウスの水泳経路の代表的トレースであり、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡマウスが、ＡＰＰ２３マウスに比較して、モリス−水−迷路試験（５日目）において短い経路を泳ぎ、それらのマウスにおける障害のない学習／記憶を示している。ｐ３８γＣＡ単一トランスジェニックマウスが、非トランスジェニック対照に類似する水泳経路を示しており、これは、活性ニューロンｐ３８γが野生型バックグラウンドでの学習機能に影響を及ぼさないことを示唆している。代表的な水泳経路トレースが示されている（ｎ＝６−１２）。（Ｂ）は、６日間にわたる逃避潜伏期のグラフであり、そしてより短い水泳経路と一致して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡマウスにおける逃避潜伏期が、ＡＰＰ２３マウスにおいてよりも有意に低く、そしてｐ３８γＣＡ及び非トランスジェニックマウスにおいて見られる逃避潜伏期に類似することを示している（＊Ｐ ＜０．０５; ｎ＝６−１２；α＝ ０．０５; Ｆ（３，１６８）＝ ４．４５４;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験による二元配置ＡＮＯＶＡ）。（Ｃ）は、象限における時間のグラフであり、そしてＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡマウスが、ＡＰＰ２３マウスよりも、プローブ試験の間、標的象限において有意に多くの時間を費やし、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡマウスにおいて統合された記憶を示し、ＡＰＰ２３マウスにおいてはその記憶を示していないことを示している。ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡマウス、単一トランスジェニックｐ３８γＣＡ及び非トランスジェニックマウスは、標的象限において類似する時間を費やした（＊Ｐ ＜０．０５; ｎ＝６−１２；α＝ ０．０５; Ｆ（３，１１６）＝ ７．０２８;  象限当たりＳｉｄａｋの複数比較事後試験による二元配置ＡＮＯＶＡ）。
【０１０１】
【図３９−２】図３９Ａ−Ｅは、活性ニューロンｐ３８γが、モリス水迷路（ＭＷＭ）により試験されるように、損傷を受けた記憶機能を発症することからＡＰＰ２３マウスを保護することを示す。（Ｄ）は、すべての実験グループにおいて、３つの視覚的合図の後、逃避潜伏期が類似するレベルに収束し、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡ、ＡＰＰ２３、ｐ３８γＣＡ及び非トランスジェニックマウスにおいて正常な視覚−感覚機能及び運動−協調を示すことを示すグラフである（＊Ｐ ＜０．０５（試験１におけるＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡ対ＡＰＰ２３；Ｆ（３，８７）＝３．６９０）; ｎｓ、有意ではない（Ｐ＝０．７１９０；試験３におけるＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡ対ＡＰＰ２３）；ｎ＝６−１２；α＝ ０．０５;Ｆ（３，８７）＝０．３６９;試験当たりＳｉｄａｋの複数比較事後試験による二元配置ＡＮＯＶＡ）。（Ｅ）は、ＭＷＭ試験の間、平均水泳速度が、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡ、ＡＰＰ２３、ｐ３８γＣＡ、及び非トランスジェニックマウスにおいて類似し、運動能力を確認することを示すグラフである（ｐ＝０．３２２１；ｎ＝６−１２；α＝ ０．０５;Ｆ（３，６２）＝１．１８７;Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。
【０１０２】
【図４０−１】図４０は、（Ａ）ＷＴ（非標識）、ＡＰＰ２３、単一トランスジェニックｐ３８γＣＡ．３及びＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡ．３マウスからのＥＥＧ記録は、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡ．３マウスがＡＰＰ２３記録よりも著しく低い癲癇様活性を示したことを示した（ｎ＝４−５）。（Ｂ）は、ＡＰＰ２３記録に比較して、有意に少ない過敏性癲癇様放電がＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡマウスからの記録に見出されたことを示すグラフである。単一トランスジェニックｐ３８γＣＡ及び非トランスジェニック対照記録は、過敏性活性を示さなかった（＊Ｐ ＜０．０１；ｎ＝４−５；α＝ ０．０５; Ｆ（３，２２）＝ １１．３８;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。（Ｃ及びＤ）は、ＡＰＰ２３の高められたシータ振動力が、ＡＰｐ２３．ｐ３８γＣＡ記録におけるｐ３８γＣＡ及び非トランスジェニック記録のレベルに低められたことを示すがラフである。特に、ＡＰＰ２３パワースペクトルにおける４−８Ｈｚでのスペクトル分布ピークは、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡスペクトルにおいて有意に低かった（＊＊Ｐ ＜０．０１；＊Ｐ ＜０．０５；ｎ＝４−５；α＝ ０．０５; Ｆ（３，２６）＝６．９３０;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。
【０１０３】
【図４０−２】（Ｃ及びＤ）は、ＡＰＰ２３の高められたシータ振動力が、ＡＰｐ２３．ｐ３８γＣＡ記録におけるｐ３８γＣＡ及び非トランスジェニック記録のレベルに低められたことを示すがラフである。特に、ＡＰＰ２３パワースペクトルにおける４−８Ｈｚでのスペクトル分布ピークは、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡスペクトルにおいて有意に低かった（＊＊Ｐ ＜０．０１；＊Ｐ ＜０．０５；ｎ＝４−５；α＝ ０．０５; Ｆ（３，２６）＝６．９３０;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。（Ｅ及びＦ）は、ＡＰＰ２３の高められたガンマ振動力（２５−１００Ｈｚ）が、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡ記録におけるｐ３８γＣＡ及び非トランスジェニック記録のレベルに低められたことを示すグラフである（＊＊Ｐ ＜０．０１；＊Ｐ ＜０．０５；ｎ＝４−５；α＝ ０．０５; Ｆ（３，４７）＝４．７６１;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。
【０１０４】
【図４１】（Ａ）は、交差周波数カップリングのコモドログラム（comodulogram）分析が、ＡＰＰ２３記録とは対照的に、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡマウスの記録においてガンマ振幅へのシータ振動の影響されていないカップリングを示したことを示す画像である。代表的なコモドログラムが示されている（ｎ＝４−５）。（Ｂ）は、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡ及びｐ３８γＣＡ、及び非トランスジェニック記録において、位相振幅相関が、シータ相に沿ってガンマ振幅の強いカップリングを示したことを示すグラフである（＊＊Ｐ ＜０．０１（ＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡ対ＡＰＰ２３．ＡＡＶＧＦＰ）；ｎ＝４−５；α＝ ０．０５;Ｆ（３，１６２）＝３．２３８）; 相ビン（phase bin）当たりＳｉｄａｋの複数比較事後試験による二元配置ＡＮＯＶＡ）。（Ｃ）は、平均変調指数が、ＡＰＰ２３記録に比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γＣＡ記録において有意に高く、そして単一トランスジェニックｐ３８γＣＡ及び非トランスジェニック対照マウスからの記録と類似するレベルに達したことを示すグラフである（＊Ｐ ＜０．０５；ｎ＝４−５；α＝ ０．０５; Ｆ（３，９）＝６．３７０;  Ｓｉｄａｋの複数比較事後試験によるＡＮＯＶＡ）。
【０１０５】
【図４２】図４２は、非−ＰＳＤ画分ではなく、ｐ３８γ＋／＋シナプトソーム調製物のＰＳＤ画分においてＮＲ１及びＰＳＤ−９５により富化されたｐ３８γを示す海馬ニューロンの樹状突起棘からの抽出物のイムノブロットである（α−ｓｙｎ；α−シヌクレイン）。
【０１０６】
【図４３】図４３は、全長ヒト野生型ｐ３８γの（Ａ）核酸配列（配列番号１）及び（Ｂ）アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【０１０７】
【図４４】図４４は、ｐ３８γＣＡのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＤからＡへの突然変異（Ｄ１７９Ａ）の位置は、下線が引かれている。
【０１０８】
【図４５】図４５は、全長ヒトtauのアミノ酸配列（配列番号４）（上部）及びtauＴ２０５Ｅのアミノ酸配列（配列番号５）（低部）を示す。tauＴ２０５ＥにおけるＴからＥへの突然変異の位置は下線が引かれている。
【０１０９】
【図４６】図４６は、野生型ｐ３８γコード配列を含むアデノ随伴ウィルスベクターｐＡＭ−ＣＡＧの地図である。１．位置２００−１１２０、ＧＡＧ−プロモーター；２. 位置 １１７６−２３７２、３ｘＨＡ−p３８γ−ｗｔ コード配列; ３. 位置 ２３９５−２９７０、 ＷＰＲＥ; ４. 位置 ３０１１−３２３８、ｂＧＨ ＰＡ; ５. 位置 ３３４４−３４５３、 ＩＴＲ； ６. 位置 ３６５５−３４５９、ＳＶ４０ プロモーター; ７. 位置 ３６０８−３５３１、ＳＶ４０ ＯＲＩ; ８. 位置 ４６４４−４０１６、ＣｏｌＥ１起点; ９. 位置 ５４５５−４７９６、ＡｍｐＲ; １０. 位置 ５７２３−５６９５、Ａｍｐプロモーター; １１. 位置 ６５４６−６５６３、ＳＰ６。
【０１１０】
【図４７】図４７は、ｐ３８γＣＡ（Ｄ１７９Ａ）（ｐ３８γの構成敵活性な変異体）のコード配列を含むアデノ随伴ウィルスベクターｐＡＭ−ＣＡＧの地図である。１．位置２００−１１２０、ＧＡＧ−プロモーター；２. 位置 １１７６−２３７２、３ｘＨＡ−p３８γＣＡコード配列; ３. 位置 ２３９５−２９７０、 ＷＰＲＥ; ４. 位置 ３０１１−３２３８、ｂＧＨ ＰＡ; ５. 位置 ３３４４−３４５３、 ＩＴＲ； ６. 位置 ３６５５−３４５９、ＳＶ４０ プロモーター; ７. 位置 ３６０８−３５３１、ＳＶ４０ ＯＲＩ; ８. 位置 ４６４４−４０１６、ＣｏｌＥ１起点; ９. 位置 ５４５５−４７９６、ＡｍｐＲ; １０. 位置 ５７２３−５６９５、Ａｍｐプロモーター; １１. 位置 ６５４６−６５６３、ＳＰ６。
【０１１１】
【図４８−１】図４８は、野生型ｐ３８γコード配列を含むアデノ随伴ウィルスベクターｐＡＭ−ＣＡＧの核酸配列（配列番号６）である。
【０１１２】
【図４８−２】図４８は、野生型ｐ３８γコード配列を含むアデノ随伴ウィルスベクターｐＡＭ−ＣＡＧの核酸配列（配列番号６）である。
【０１１３】
【図４８−３】図４８は、野生型ｐ３８γコード配列を含むアデノ随伴ウィルスベクターｐＡＭ−ＣＡＧの核酸配列（配列番号６）である。
【０１１４】
【図４９−１】図４９は、ｐ３８γＣＡ（Ｄ１７９Ａ）（ｐ３８γの構成的活性変異体）のコード配列を含むアデノ随伴ウィルスベクターｐＡＭ−ＣＡＧの核酸配列（配列番号７）である。
【０１１５】
【図４９−２】図４９は、ｐ３８γＣＡ（Ｄ１７９Ａ）（ｐ３８γの構成的活性変異体）のコード配列を含むアデノ随伴ウィルスベクターｐＡＭ−ＣＡＧの核酸配列（配列番号７）である。
【０１１６】
【図４９−３】図４９は、ｐ３８γＣＡ（Ｄ１７９Ａ）（ｐ３８γの構成的活性変異体）のコード配列を含むアデノ随伴ウィルスベクターｐＡＭ−ＣＡＧの核酸配列（配列番号７）である。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
本発明は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態を治療又は予防する方法に関する。本発明者は、tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化の促進（ここで、前記アミノ酸配列残基のリン酸化は、対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起す）、又は対象のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体の導入が、tau依存性シグナル伝達複合体、例えばＡＤにより媒介される神経学的状態を治療又は予防するために使用され得ることを見出している。
【０１１８】
tau依存性シグナル伝達複合体は、ニューロンにおける興奮毒性を媒介することができる、典型的には、Ｎ−メチル−Ｄアスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ受容体）に関連する後シナプスシグナル伝達複合体である。シグナル伝達複合体は、細胞におけるシグナルの変換に関与するタンパク質の複合体である。tau依存性シグナル伝達複合体は、シグナルを変換するために、tauを必要とする。tau依存性シグナル伝達複合体は、典型的には、複合体中の成分としてtauを含む。
【０１１９】
興奮毒性は、ニューロンがグルタミン酸作動性受容体、例えばＮＭＤＡ受容体の過剰刺激により損傷されるか又は死滅され、そして後シナプス空間においてシグナル伝達複合体を介して媒介される工程を言及する。興奮毒性からのニューロン損傷は、多くの神経学的状態に関連している。脳卒中患者のニューロン損傷は、虚血性脳卒中直後に放出される過剰量の細胞外グルタミン酸によるグルタミン作動性受容体及び関連するシグナル伝達複合体の過剰活性化により、少なくとも部分的に引起されると思われる。癲癇におけるニューロン損傷はまた、癲癇発作の間、グルタミン酸の放出に続いてグルタミン作動性受容体及び関連するシグナル伝達複合体により引起される興奮毒性に起因すると思われる。
【０１２０】
tau依存性シグナル伝達複合体はまた、アルツハイマー病（ＡＤ）におけるアミロイド−β（Ａβ）毒性を媒介すると考えられている。アルツハイマー病（ＡＤ）においては、アミロイド−β（Ａβ）は、ＭＭＤＡ受容体、ＰＳＤ−９５、tau及びＦＹＮを含むシグナル伝達複合体を介してニューロンにおいて毒性を誘発することが示されている。
【０１２１】
tau依存性シグナル伝達複合体は典型的には、tauである。１つの実施形態によれば、tau依存性シグナル伝達複合体は、ＰＳＤ−９５及びtauを含む。１つの実施形態によれば、tau依存性シグナル伝達複合体は、ＰＳＤ−８５、ＦＹＮ及びtauを含む。典型的には、tau依存性シグナル伝達複合体は、ＮＭＤＡ受容体、ＰＳＤ−９５、tau及びＦＹＮを含む。
【０１２２】
神経学的状態は、tau依存性シグナル伝達複合体により媒介される任意の神経学的状態であり得る。典型的には、神経学的状態は、tau依存性シグナル伝達複合体の過剰活性化からのニューロン損傷により引起される。そのような状態の例は、例えばアルツハイマー病、前頭側頭型痴呆、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、脳卒中による神経損傷及び癲癇の神経損傷を包含する。
【０１２３】
１つの実施形態によれば、神経学的状態は、アルツハイマー病である。
【０１２４】
１つの実施形態によれば、神経学的状態は、脳卒中である。
【０１２５】
１つの実施形態によれば、神経学的状態は、癲癇である。
【０１２６】
１つの実施形態によれば、前記方法は、tauの１又は２以上のアミノ酸残基のリン酸化を促進するために対象を治療することを含み、ここで前記アミノ酸残基のリン酸化は、tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起す。本明細書において使用される場合、「tau依存性シグナル伝達複合体の破壊」とは、tau依存性シグナル伝達複合体が興奮毒性及びＡβ毒性を媒介するのを防止し、そしてシグナル伝達複合体の不安定化、解体又は防止を含む効果をいう。１つの実施形態によれば、tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すためにリン酸化されるtauの１又は２以上のアミノ酸残基は、ＭＡＰキナーゼｐ３８γによりリン酸化される１又は２以上のアミノ酸残基である。１つの実施形態によれば、tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すためにリン酸化されるtauの１又は２以上のアミノ酸残基は、位置２０５でのトレオニン（Ｔ２０５）である。１つの実施形態によれば、tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すためにリン酸化されるtauの１又は２以上のアミノ酸残基は、位置２０５でのトレオニン（Ｔ２０５）、及び位置１９９でのセリン（Ｓ１９９）、位置３９６でのセリン（Ｓ３９６）及び位置４０４でのセリン（Ｓ４０４）からなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸残基である。種々の実施形態によれば、tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すためにリン酸化されるtauの１又は２以上のアミノ酸残基は、以下である：（ａ）Ｔ２０５；（ｂ）Ｔ２０５、Ｓ１９９；（ｃ）Ｔ２０５、Ｓ１９９、Ｓ３９６；（ｄ）Ｔ２０５、Ｓ１９９、Ｓ３９６、Ｓ４０４；（ｅ）Ｔ２０５、Ｓ１９９、Ｓ４０４；（ｆ）Ｔ２０５、Ｓ３９６、Ｓ４０４；（ｇ）Ｔ２０５、Ｓ３９６； 又は（ｈ）Ｔ２０５、Ｓ４０４。
【０１２７】
１つの実施形態によれば、対象は、１又は２以上のアミノ酸残基でtauのリン酸化を促進するために治療され、ここでアミノ酸残基のリン酸化は、対象の脳のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起す。
【０１２８】
１つの実施形態によれば、対象は、１又は２以上のアミノ酸残基でリン酸化されたtauを高める剤を投与することにより治療され、ここでアミノ酸残基のリン酸化は、対象の脳のニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起す。
【０１２９】
前記剤は、例えば核酸配列、核酸類似体、タンパク質、ペプチド又は小分子を含むことができる。典型的には、剤の投与は、対象のニューロン中に剤を導入する。
【０１３０】
いくつかの実施形態によれば、剤は、対象のニューロン中に導入される核酸配列を含む。次に、その核酸はニューロンにおいて転写され、そして翻訳される。
【０１３１】
いくつかの実施形態によれば、血液−脳バリアを通過するか、又は血液−脳バリアを横切るように処方され得る。
【０１３２】
本明細書において使用される場合、「対象（subject）」とは、哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、又はニューロンにおけるtau依存性シグナル伝達複合体により媒介される神経学的状態に苦しんでいる任意の他の哺乳類であり得る。典型的には、対象はヒトである。
【０１３３】
１つの実施形態によれば、対象は、対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤の投与により治療される。ＥＲＫ６、ＳＡＰＫ３及びＭＡＰＫ１２としても知られているｐ３８γは、マイトジエン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰタンパク質）である。１つの実施形態によれば、ｐ３８γは哺乳類からである。例えば、ｐ３８γは、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ブtauシ、ラット、非ヒト霊長類、ヤギ、ヒツジからであり得る。典型的には、ｐ３８γは、ヒトｐ３８γである。野生型ｐ３８γは、モチーフＴＧＹにおけるチロシン及びトレオニン残基のリン酸化を通して活性化される。野生型ｐ３８γは、活性化に続いてtauをリン酸化する。ｐ３８γの活性化は、ＭＡＰＫキナーゼＭＡＰ３Ｋによるリン酸化に基いて活性化されるＭＡＰキナーゼＭＫＫ３及びＭＫＫ６により行われる。
【０１３４】
実施例に記載されるように、本発明者は、ｐ３８γによるtauのリン酸化が、アルツハイマー病のマウスモデルの培養されたニューロンにおけるＮＲ／ＰＳＤ−９５／tau／ＦＹＮ複合体の破壊をもたらし；アルツハイマー病のマウスモデルの培養されたニューロンにおけるＡβ−誘発毒性を制限し；そして興奮毒性及び癲癇のマウスモデルにおけるペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）誘発発作の重症度を低めることを見出した。本発明者は、マウスのニューロン中へのｐ３８γ、又はｐ３８γの構成的活性変異体を導入することにより、ニューロン中のＮＲ／ＰＳＤ−９５／tau／ＦＹＮ複合体が破壊され、そしてＡβ誘発された興奮毒性がアルツハイマー病のマウスモデルにおいて低められ、そして興奮毒性及び癲癇のマウスモデルにおけるペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）誘発性発作の重症度が低められることを示している。
【０１３５】
ニューロンにおいてｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤は、（ａ）
ニューロンにおいて、ｐ３８γの量、典型的には活性ｐ３８γの量を高め；そして（ｂ）ニューロンにおいて、ｐ３８γの変異体の量、典型的には、ｐ３８γの活性変異体の量を高め；そして／又はニューロンにおけるｐ３８γ活性化の量を高め；そして／又は（ｄ）変異体が活性変異体でない場合、ニューロンにおけるｐ３８γの変異体の活性化の量を高める剤であり得る。本明細書において使用される場合、「ｐ３８γ活性（ｐ３８γactivity）」とは、tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起す、活性化されたｐ３８γの活性である。典型的には、tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起す、活性化されたｐ３８γの活性は、Ｔ２０５でのtauのリン酸化であり、そして任意には、例えばＳ１９９、Ｓ３９６及びＳ４０４から成る群から選択された１又は２以上のアミノ酸残基でのtauのリン酸化である。「ｐ３８γの変異体の活性（activity of a variant of p38γ）」とは、ｐ３８γ活性と同じか、又は実質的に類似するｐ３８γの変異体の活性を言及する。ｐ３８γの変異体は、活性化しないで、ｐ３８γ活性を有することができ（例えば、活性変異体、例えば構成的活性変異体）、又は活性化に続いてｐ３８γ活性を示すことができる。ｐ３８γ活性は、処置の後、ニューロンにおけるｐ３８γ活性の量が、処置の前のニューロン中のｐ３８γ活性の量と比較して高められる場合、ニューロンにおいて高められる。ｐ３８γの変異体は、処置の後、ニューロンにおける変異体の活性の量が、処置の前ニューロン中の変異体の活性の量と比較して高められる場合、ニューロンにおいて高められる。ｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性は、以下を高める剤を投与することにより高められ得る：
（ａ）内在性ｐ３８γの発現（転写及び／又は翻訳）を高めるなどのニューロンにおける内在性ｐ３８γの量；及び／又は
（ｂ）ニューロンにおける外因性ｐ３８γの量；及び／又は
（ｃ）ニューロンにおけるｐ３８γの変異体の量；及び／又は
（ｄ）ニューロンにおける、内在性ｐ３８γ、外因性ｐ３８γ及び／又はｐ３８γの変異体の活性化。
【０１３６】
１つの実施形態によれば、ｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性は、ニューロンにおいて、外因性ｐ３８γ、又はその変異体の量を高める剤を投与することにより増強される。外因性ｐ３８γ又はその変異体の量は、ニューロン中にｐ３８γ又はその変異体を導入することにより、又はｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸をニューロン中に導入することにより増強され得る。
【０１３７】
従って、１つの実施形態によれば、対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤は、ｐ３８γタンパク質又はその変異体、又は対象のニューロンにおいてｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸を含むことができる。本明細書に記載される実施例に使用される、全長野生型ヒトｐ３８γのアミノ酸配列と共に、全長野生型ヒトｐ３８γをコードする核酸配列が、図４３に示される。ヒトｐ３８γの天然に存在するイソフォーム及び変異体もまた知られている（例えば、Genbank受託番号 ＮＰ_００１２９０１８１、ＣＲ４５６５１５）。tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauのアミノ酸残基でリン酸化するｐ３８γの天然のイソフォーム又は変異体が、本明細書に記載される方法に使用され得ることが想定される。
【０１３８】
１つの実施形態によれば、ｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤は、ｐ３８γ又はその変異体をコードする核酸を含む。当業者は、ｐ３８γ又はその変異体のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を決定することができるであろう。例えば、ｐ３８γをコードする核酸配列は、ヒトｐ３８γの野生型コード配列（配列番号１）に対して約６０％〜１００％同一の範囲にある核酸配列を含むことができる。例えば、ｐ３８γをコードする核酸は、標準パラメーターを用いて、本明細書に記載されるアラインメントプログラムの１つを使用して、ｐ３８γの野生型コード配列に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％９９％ 又は１００％の配列同一性を有することができる。当業者は、それらの値が、コドン縮重、リーディングフレーム位置決定などを考慮して、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調整され得ることを認識するであろう。
【０１３９】
１つの実施形態によれば、ｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤は、ｐ３８γの変異体を含む。１つの実施形態によれば、ｐ３８γ活性、又はｐ３８γの変異体の活性を高める剤は、ｐ３８γの変異体をコードする核酸を含む。本明細書において使用される場合、ｐ３８γの変異体は、１又は２以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失により野生型ヒトｐ３８γタンパク質とは異なり、そしてtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauのアミノ酸残基をリン酸化できるタンパク質である。典型的には、ｐ３８γの変異体は、残基Ｔ２０５で、及び任意には、Ｓ１９９、Ｓ３９６、Ｓ４０４から成る群から選択された１又は２以上の残基でtauをリン酸化する。１つの実施形態によれば、ｐ３８γの変異体は、野生型ヒトｐ３８γのアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態によれば、ｐ３８γの変異体は、配列番号２により表されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
本明細書において使用される場合、ポリペプチドに関して「％同一性（％identity）」又は「ポリペプチドのアミノ酸配列に対して％同一である（％identical to the amino acid sequence of a polypeptide）」とは、配列比較アルゴリズム又は視覚検査により測定されるように、特定の比較窓にわたって最大の一致のために整列された場合、同じである２つの配列における残基の％を示す。
【０１４１】
２つのポリペプチド間の％同一性を決定するための配列比較アルゴリズムは、当業界においては知られている。そのようなアルゴリズムの例は、以下である：Myers and Miller (1988)のアルゴリズム；Smith et al. (1981)の局所相同性アルゴリズム；Needleman and Wunsch (1970)の相同性アライメントアルゴリズム；Pearson and Lipman (1988)の類似性検索法；Karlin and Altschul(1993)のように修正されたPearson and Lipman (1988)のアルゴリズム。２つのポリペプチド間の％同一性を決定するためのそれらのアルゴリズムのコンピューター実装は以下を含む：例えばCLUSTAL (Intelligenetics, Mountain View, Calif.) (Pearson et al. (1994)から入手できる; ALIGN program (Version 2.0) and GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Version 8 (available from Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USA)。
【０１４２】
いくつかの実施形態によれば、ｐ３８γの変異体は、ｐ３８γの一部を含むことができる。１つの実施形態によれば、ｐ３８γの変異体は、ＰＤＺ相互作用モチーフを含む。ＰＳＤ−９５はＰＤＺモチーフを含み、そしてｐ３８γは、ＰＤＺ相互作用モチーフを通して少なくとも部分的に、ＰＳＤ−９５と相互作用すると考えられている。ｐ３８γのＰＤＺ相互作用モチーフは、ｐ３８γ分子のＣ末端部分における短いアミノ酸配列である（図１を参照のこと）。典型的には、ＰＤＺ相互作用モチーフは、アミノ酸配列ＥＴＰＬ又はＥＴＡＬを含む。種々の実施形態によれば、ｐ３８γの変異体は、以下から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む：ＥＴＰＬ （配列番号８）、ＫＥＴＰＬ （配列番号９）、ＳＫＥＴＰＬ （配列番号１０）、ＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号１１）、ＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号１２）、ＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号１３)、ＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号１４）、ＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号１５)、ＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号１６）、ＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号１７)、ＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号１８）、ＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号１９)、ＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号２０）、ＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号２１）、ＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号２２）、ＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号２３）、ＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号２４）、ＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号２５）、ＫＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号２６）、ＹＫＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ（配列番号２７）、ＴＹＫＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号２８）、ＶＴＹＫＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号２９）、ＲＶＴＹＫＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号３０）、ＫＲＶＴＹＫＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＳＫＥＴＰＬ （配列番号３１）、ＥＴＡＬ （配列番号３２）、ＫＥＴＡＬ （配列番号３３）、ＰＫＥＴＡＬ （配列番号３４）、ＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号３５）、ＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号３６）、ＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号３７）、ＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号３８）、ＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号３９)、ＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号４０）、ＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号４１）、ＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号４２）、ＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号４３）、ＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号４４）、ＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号４５）、ＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号４６）、ＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号４７）、ＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号４８）、ＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号４９）、ＫＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号５０）、ＹＫＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号５１）、ＴＹＫＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号５２）、ＶＴＹＫＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号５３）、ＲＶＴＹＫＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号５４）、及びＫＲＶＴＹＫＥＶＬＳＦＫＰＰＲＱＬＧＡＲＶＰＫＥＴＡＬ （配列番号５５）。
【０１４３】
いくつかの実施形態によれば、ｐ３８γの変異体はｐ３８γの一部を含むことができるが、しかしそうでなければ、野生型ｐ３８γとは異なる。これに関して、本発明者は、ｐ３８γの変異体が、ｐ３８γのＰＤＺ相互作用モチーフが他のキナーゼ、例えばＭＡＰキナーゼ又は他のセリン／トレオニンキナーゼ、又はそれらの活性を改変するために突然変異を担持する他のキナーゼの変異体のカルボキシ末端に融合されているタンパク質を含むことができることを想定する。例えば、ｐ３８γ変異体は、ｐ３８γ、ｐ３８β及びｐ３８δ、又はそれらの活性を改変するために突然変異を担持するｐ３８γ、ｐ３８β及びｐ３８δの変異体から成る群から選択されたキナーゼのカルボキシ末端に融合されたｐ３８γのＰＤＺ相互作用モチーフを含むことができる。
【０１４４】
１つの実施形態によれば、ｐ３８γの変異体は、ｐ３８γの活性変異体である。ｐ３８γの活性変異体は、ｐ３８γ活性を示すために、ＭＡＰキナーゼ、キナーゼＭＫＫ３及びＭＫＫ６による活性化を必要としない変異体である。１つの実施形態によれば、ｐ３８γの活性変異体は、ｐ３８γの構成的活性変異体である。ｐ３８γの構成的活性変異体は、構成的に活性であり、そして従って、ＭＡＰキナーゼ、キナーゼＭＫＫ３及びＭＫＫ６による活性化を必要としないｐ３８γの変異体である。典型的には、構成的活性変異体は、連続活性をもたらす１又は２以上のアミノ酸配列置換を含む。１つの実施形態によれば、ｐ３８γの構成的活性変異体は、Ｄ１７９Ａのアミノ酸置換を含む。ｐ３８γの構成的活性変異体の例のアミノ酸配列は、図４４に示される（配列番号３）。別の実施形態によれば、ｐ３８γの構成的活性変異体は、Ｆ３３０Ｌ／Ｓのアミノ酸置換を含むことができる。ｐ３８γにおけるＦ３３０Ｌ／Ｓの置換は、Ｐ３８α  Ｆ３２７Ｌ／Ｓの構成的活性変異体の置換に対応する。
【０１４５】
１つの実施形態によれば、対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ又はその変異体、典型的には、ｐ３８γの構成的活性変異体を発現する核酸配列を投与することを含む、対象におけるアルツハイマー病の治療方法が提供される。
【０１４６】
１つの実施形態によれば、対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ又はその変異体、典型的には、ｐ３８γの構成的活性変異体を発現する核酸配列を投与することを含む、対象における脳卒中の治療方法が提供される。
【０１４７】
１つの実施形態によれば、対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ又はその変異体、典型的には、ｐ３８γの構成的活性変異体を発現する核酸配列を投与することを含む、対象における癲癇の治療方法が提供される。
【０１４８】
１つの実施形態によれば、対象は、tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を、対象のニューロン中に導入する剤を投与することにより治療される。本明細書において使用される場合、「tauの変異体（variant of tau）」とは、全長野生型tauの１又は２以上のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含むtauタンパク質であり、ここで前記１又は２以上の欠失は、１００個以下の連続アミノ酸であり、典型的には９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０個以下の連続アミノ酸である。１つの実施形態によれば、tauの変異体は、野生型tauの１又は２以上のアミノ酸置換又は挿入を含む。１つの実施形態によれば、tauの変異体は、野生型tauの１又は２以上のアミノ酸置換を含む。１つの実施形態によれば、tauの変異体は、tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauのリン酸化模倣体である。本明細書において使用される場合、tauのリン酸化模倣体は、１又は２以上のアミノ酸置換を含むtauの変異体であり、そしてそれは、特定のアミノ酸での非置換tauのリン酸化の後、非置換tauのリン酸化模倣体と同じか又は実質的に同じ態様で機能する。リン酸化模倣体は、リン酸化模倣置換を含む。
【０１４９】
実施例に記載されるように、本発明者は、海馬ニューロン中へのtauのＴ２０５Ｅ変異体の導入が、ニューロンにおけるＡβ誘発毒性を低めたことを示した。tauのＴ２０５Ｅ変異体は、Ｔ２０５でリン酸化されたtauのリン酸化模倣体である。リン酸化模倣置換は、非置換タンパク質のリン酸化後、非置換タンパク質と同じか、又は実質的に同じ態様で機能するタンパク質をもたらすタンパク質におけるアミノ酸置換である。tauのリン酸化模倣置換は、典型的には、tauの部位で、野生型tauのリン酸化の後、野生型tauと同じか、又は実質的に同じ態様で機能するtauのタンパク質をもたらすそのtauの部位でのアミノ酸置換である。
【０１５０】
１つの実施形態によれば、前記方法は、tau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すか、又はその形成を低めるtauのリン酸化模倣置換を含むtauのリン酸化模倣体を導入するよう対象を処置することを含む。１つの実施形態によれば。１又は２以上のリン酸化模倣置換は、ｐ３８γによりリン酸化されるtauタンパク質のアミノ酸残基で存在する。１つの実施形態によれば、tauのリン酸化模倣置換は、tauの２０５位でのグルタミン酸に対するトレオニン（Ｔ２０５Ｅ）であり、アミノ酸番号は、４４１個のアミノ酸を含む最長のヒトtauイソフォームに基かれている。全長野生型ヒトtau（配列番号４）及びtauＴ２０５Ｅ（配列番号５）のアミノ酸配列は、図４５に示されている。
【０１５１】
典型的には、tauの変異体は、ヒトtauの変異体である。他の実施形態によれば、tauの変異体は、非ヒト哺乳類からのtauの変異体であり得る。例えば、tauの変異体は、マウス、イヌ、ネコ、ブtauシ、ラット、非ヒト霊長類、ヤギ、ヒツジからのtauの変異体であり得る。
【０１５２】
１つの実施形態によれば、対象のニューロンにおいて、２０５位でのグルタミンに対するトレオニンのアミノ酸置換（Ｔ２０５Ｅ）において野生型tauとは異なるtauを発現する核酸配列を投与することを含む、対象におけるアルツハイマー病の治療方法が提供される。
【０１５３】
１つの実施形態によれば、対象のニューロンにおいて、２０５位でのグルタミンに対するトレオニンのアミノ酸置換（Ｔ２０５Ｅ）において野生型tauとは異なるtauを発現する核酸配列を投与することを含む、対象における脳卒中の治療方法が提供される。
【０１５４】
１つの実施形態によれば、対象のニューロンにおいて、２０５位でのグルタミンに対するトレオニンのアミノ酸置換（Ｔ２０５Ｅ）において野生型tauとは異なるtauを発現する核酸配列を投与することを含む、対象における癲癇の治療方法が提供される。
【０１５５】
剤が、ｐ３８γ又はその変異体、又はtauの変異体を、対象のニューロンにおいて発現できる核酸を含む実施形態によれば、ｐ３８γ又はその変異体、又はtauの変異体をコードする核酸配列は、対象のニューロンにおいてｐ３８γ又はその変異体、又はtauの変異体の発現を指示するために調節配列に操作可能的に連結される。対象のニューロンにおいて、ｐ３８γ又はその変異体、又はtauの変異体を発現できる核酸は、ｐ３８γ又はその変異体、又はtauの変異体のコード配列を含む発現カセットを含むことができる。発現カセットは、コード配列によりコードされるタンパク質を、細胞において発現するために、一緒に作用するコード配列及び調節配列を含む核酸配列である。「コード配列（cording sequence）」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列を言及する。それは、「中断されていないコード配列」、すなわち、例えばｃＤＮＡにおいてイントロンを欠く配列を構成するか、又はそれは、適切なスプライスジャンクションにより境界が定められた１又は２以上のイントロンを含むことができる。
【０１５６】
発現カセットは典型的には、調節配列を含む。「調節配列（regulatary sequence）」とは、コード配列の上流（５′非コード配列）、内部又は下流（３′非コード配列）に位置し、そして関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセッシング又は安定性、又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列である。調節配列は、当業界において知られており、そして例えば、転写調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナル配列を含むことができる。コード配列は、典型的には、プロモーターに操作可能的に連結される。プロモーターは、特定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、そしてプロモーターの下流（３′方向）に通常位置するコード配列の転写を開始できるＤＮＡ領域である。コード配列はまた、終結シグナルに操作可能的に連結され得る。発現カセットはまた、コード配列の正しい翻訳のために必要とされる配列も含むことができる。コード配列を含む発現カセットは、キメラであり得る。「キメラ（chimeric）」ベクター又は発現カセットは、本明細書において使用される場合、少なくとも２つの異なった種からの核酸配列を含むベクター又はカセットを意味するか、又は「天然の（native）」又は野生型種には存在しない態様で連結又は会合される同じ種からの核酸配列を有する。発現カセットにおけるコード配列は、構成的プロモーター、又は特定の組織又は細胞型においてのみ又は宿主細胞が何らかの特定の刺激に暴露される場合、転写を開始する調節可能プロモーターの制御下にある。例えば、ｐ３８γをコードする核酸を含む発現カセットにおいては、コード配列は、ｐ３８γ遺伝子に対して天然ではないプロモーター、例えばニューロンにおいてコード配列を発現するか、又はニューロンにおいて誘発性であるプロモーターに操作可能的に連結され得る。適切な神経プロモーターの例は、シナプシン（ＳＹＮ）、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭＫＩＩ）、チューブリンαI（Ｔａ１）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子ベータ鎖（ＰＤＧＦ）、ＭｆＰ、ｄｏｘ、ＧＦＡＰ、プレプロケンファリン、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ｄβＨ）、プロラクチン、ニワトリβアクチン、プリオンタンパク質、ネズミＴｈｙ１．２、ミエリン塩基性プロモーター、又はエンハンサーと組合わされた上記のいずれか、例えば部分的なサイトメガロンウィルスプロモーターを包含する。ニューロンにおいて核酸配列を発現するために使用され得る他のプロモーターの例は、以下を包含する：ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター; アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）; 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーター、及び同様のもの。誘発性又は制御可能なプロモーターは、例えば転写活性が、ミフェプリストン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン又はタモキシフェンの存在又は不在下で改変されるプロモーターを包含する。
【０１５７】
タンパク質（コード配列）をコードする核酸は、細胞におけるそのタンパク質の発現を可能にするために、調節配列に対して配列されている場合、調節配列に操作可能的に連結される。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写の開始を助ける場合、コード配列に操作可能的に連結される。
【０１５８】
本明細書において使用される場合、核酸配列の「発現（expression）」とは、コード配列によりコードされるポリペプチドを生成するためのコード配列を含む核酸配列の転写及び翻訳を言及する。
【０１５９】
１つの実施形態によれば、剤はベクターである。そのようなベクターにおいては、ｐ３８γ又はその変異体、又はtauの変異体をコードする核酸配列、又はそのような配列を含む発現カセットは、適切なベクター配列中に挿入される。用語「ベクター（vector）」とは、宿主細胞、例えばニューロン中に遺伝子をトランスファーするために適切な核酸配列を言及する。用語「ベクター」は、プラスミド、コスミド、裸のＤＮＡ、ウィルスベクター等を含む。１つの実施形態によれば、ベクターは、プラスミドベクターである。プラスミドベクターは、追加の配列が挿入され得る二本鎖環状ＤＮＡ分子である。プラスミドは、発現ベクターであり得る。プラスミド及び発現ベクターは、当業界において知られており、そして例えばSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)に記載されている。
【０１６０】
いくつかの実施形態によれば、ベクターは、ウィルスベクターである。ウィルスベクターは、ウィルスベクターに依存して、ウィルス粒子生成及び宿主細胞ゲノム中への組込み、及び／又はウィルス複製を可能にするウィルス配列を含む。本明細書に記載される方法及び組成物に利用され得るウィルスベクターは、ニューロン、典型的には脳のニューロン中に核酸を導入できる任意のウィルスベクターを含む。ウィルスベクターの例は、アデノウイルスベクター; レンチウイルスベクター; アデノ随伴ウイルスベクター; ラビウスウイルスベクター; 単純ヘルペスウイルスベクター; ＳＶ４０; ポリオーマウイルスベクター; ポックスウイルスベクターを含む。
【０１６１】
１つの実施形態によれば、ウィルスベクターは、アデノ随伴ウィルスへのパッケージングするためのアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターである。１つの実施形態によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３及び ＡＡＶｃｙ５ベクター又はそれらの変異体から成る群から選択された血清型である。１つの実施形態によれば、ウィルスベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０ 又はＡＡＶｃｙ５である。１つの実施形態によれば、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ１である。別の実施形態によれば、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ１である。別の実施形態によれば、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ９である。別の実施形態によれば、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶｒｈ１０である。別の実施形態によれば、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶｃｙ５である。細胞中に核酸を導入するための組換えＡＡＶの使用は、当業界において知られており、そして例えば、米国特許第２０１６００３８６１３号; Grieger and Samulski (2005) Adeno-associated virus as a gene therapy vector: vector development, production and clinical applications（遺伝子治療ベクターとしてのアデノ随伴ウイルス：ベクターの開発、生産および臨床適用）, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 99: 119-145に記載されており; 組換えＡＡＶの産生のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えばHarasta et al (2015) Neuropsychopharmacology 40: 1969-1978に記載されている。ニューロン細胞においてｐ３８γを発現できるアデノ随伴ウィルスベクターの例は、図４６及び４８（配列番号６）に示されている。。ニューロン細胞においてｐ３８γを発現できるアデノ随伴ウィルスベクターの例は、図４７及び４９（配列番号７）に示されている。１つの実施形態によれば、ウィルスベクターは、配列番号６又は７を含む。１つの実施形態によれば、ウィルスベクターは、配列番号７を含む。
【０１６２】
別の実施形態によれば、ウィルスベクターは、レンチウィルスベクターである。レンチウィルスベクターの生成及び使用方法は、当業者において知られており、そして例えば、以下に記載されている：Naldini et al. (1996) In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector, Science, 272:263-267; Lois et al. (2002) Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors, Science,295:868-872; Vogel et al (2004), A single lentivirus vector mediates doxycycline-regulated expression of transgenes in the brain. Hum Gene Ther. 2004;15(2):157-165。
【０１６３】
アデノウィルスはまた、核酸剤の送達への使用も企画される。従って、別の実施形態によれば、ウィルスベクターは、アデノウィルスベクターである。アデノウィルスベクターは、当業界において知られており、以下に記載されている：Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993); Southgate et al. (2008) Gene transfer into neural cells in vitro using adenoviral vectors（アデノウイルスベクターを用いたインビトロでの神経細胞への遺伝子導入）、Current Protocols in Neuroscience,  Unit 4 23, Chapter 4; Akli et al. (1993)Transfer of a foreign gene into the brain using adenovirus vectors（アデノウイルスベクターを用いた外来遺伝子の脳への導入）. Nature genetics, 3(3): 224-228。
【０１６４】
別の側面は、本明細書に記載されるようなベクター、典型的には、本明細書に記載されるようなウィルスベクターを提供する。
【０１６５】
ウィルスベクターは典型的には、当業界において知られている方法を用いて、ウィルス粒子中にパッケージングされる。次に、ウィルス粒子は、神経細胞系、又は神経組織を含む細胞系を、インビトロ又はインビボでトランスファーするために使用され得る。従って、別の側面は、本明細書に記載されるベクターを含むウィルス粒子を提供する。
【０１６６】
さらなる側面は、本明細書に記載されるような剤を提供する。
【０１６７】
本明細書に記載される剤は、医薬組成物として製剤化され得る。従って、別の側面によれば、本明細書に記載される剤を含む医薬組成物が提供される。組成物は、医薬的に許容される担体に剤を含む。医薬的担体と共に剤を製剤化する方法は、当業界において知られており、そして例えば、以下に記載されている：Remington’s Pharmaceutical Science, (17th ed. Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1985);  Goodman & Gillman’s: The Pharmacological Basis of Therapeutics (11th Edition, McGraw-Hill Professional, 2005)。
【０１６８】
許容される担体、希釈剤及びアジュバントは、受容体にとって非毒性であり、そして好ましくは、使用される用量及び濃度で不活性であり、そしてリン酸、クエン酸又は他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン; 単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物; ＥＤＴＡなどのキレート剤; マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール; ナトリウムのような塩形成対イオン;
及び/又は非イオン性界面活性剤例えばツイーン、プルロニック又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０１６９】
対象への剤の投与は、頭蓋内、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内又は髄腔内注射によってであり得る。頭蓋内、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内又は髄腔内使用に適した組成物は、滅菌水溶液又は分散液、及ビ滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。医薬的に許容できる担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。
【０１７０】
剤がウィルス粒子にパッケージングされる実施形態によれば、医薬組成物は、剤を有効にする任意の濃度でウィルス粒子を含むことができる。そのような実施形態によれば、医薬組成物は、０．１重量％〜９９．９重量％の量でウィルス粒子を含むことができる。医薬的に許容できる担体は、水、緩衝された水、生理食塩水、例えば、通常の生理食塩水又は平衡塩類溶液、例えばハンクス又はアールの均衡溶液、グリシン、ヒアルロン酸などを含む。
【０１７１】
投与されるウィルス粒子の力価は、例えば使用される特定のベクター、投与様式、状態の程度、固体に依存して変化し、そして当業者において標準な方法により決定され得る。
【０１７２】
本明細書に記載される剤は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、微粒子衝撃、リポソーム取り込み、ナノ粒子ベースの送達などの非ウイルス法による神経細胞への導入のために処方することができる。
【０１７３】
１つの実施形態によれば、本明細書に記載される剤は、１又は２以上のリポソーム、リポプレックス又は脂質ナノ粒子において処方され得る。１つの実施形態によれば、本明細書に記載される剤は、リポソームにおいて処方され得る。リポソームは、親油性物質及び水性内部から形成された膜を有する単層又は多層の小胞である。水性部分は、送達されるべき組成物を含む。リポソーム設計は、例えばリポソームの組織への付着を改善するために、又は事象、例えばエンドサイトーシスを活性化するために、オプソニン又はリガンドを含むことができる。
【０１７４】
リポソームの形成は、以下人存在する：物理化学的特性、例えば剤及びリポソーム成分、脂質小胞が分散されている媒体の性質、作用物質の有効濃度、小胞の適用および/または送達中に関与する任意のさらなるプロセス、最適化サイズ、多分散性および意図された適用のための小胞の貯蔵寿命、及びバッチ間の再現性及び安全かつ効率的なリポソーム生成物の大規模生産の可能性。
【０１７５】
剤の送達のためのリポソーム及び脂質ナノ粒子の製造方法は、公知であり、そして例えば米国特許第５，２６４，２２１号に記載されている。
【０１７６】
用語「投与する（administering）」とは、治療を必要とする対象に化合物又は剤を提供することを意味すると理解されるべきである。
【０１７７】
任意の特定の対象についての特定の用量レベル及び投与頻度は、変えられ得、そして以下の種々の要因に依存するであろうことが理解されるであろう：使用される特定の化合物又は剤の活性、の化合物又は剤の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与のモード及び時間、薬物の組み合わせ、特定の状態の重篤度、及び治療を受けている宿主。
【０１７８】
また、剤を含む容器を含むキットも提供される。容器は、単に、非経口剤形で剤を含むボトルであり、各財形は、剤の単位用量を含む。キットはさらに印刷された説明書を含むであろう。製品は、本方法に従って対象の治療を示すラベル又は同様のものを含むであろう。１つの形で、製品は、非経口投与の形で剤を含む容器であり得る。例えば、剤は、使い捨て容器中の注射液の形であっても良い。
【０１７９】
本明細書において使用される場合、「治療する（treating）」とは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得るために対象、組織又は細胞に影響を及ぼすことを意味し、そしてその状態を阻害すること、すなわちその進行を抑制するか、又は状態の効果を軽減するか又は緩和することを包含し、すなわち状態の効果の逆転又は退行を引起す。
【０１８０】
本明細書において使用される場合、「予防する（preventing）」とは、状態を有する危険性がある可能性がある細胞又は対象において状態の発生を防ぐことを意味するが、しかし状態が最終的に進行しないか、又は対象が最終的に状態を発症しないことを必ずしも意味しない。予防は、細胞又は対象における状態の発症を遅らせることを包含する。
【０１８１】
本発明者は、ｐ３８γ又はtauの変異体が、神経患者が本明細書に記載される方法により治療されるかどうかを評価するためにトランスジェニック動物に使用され得ることを想定する。
【０１８２】
従って、さらなる側面は、トランスジェニック動物のニューロンにおいて、ｐ３８γ又はその変異体、又はtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体を発現できるトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【０１８３】
１つの実施形態によれば、トランスジェニック核酸配列は、ｐ３８γ又はその変異体を発現できる核酸である。１つの実施形態によれば、トランスジェニック核酸配列は、ｐ３８γの活性変異体を発現することができる。１つの実施形態によれば、ｐ３８γの活性変異体は、ｐ３８γの構成的活性変異体である。１つの実施形態によれば、ｐ３８γの構成的活性変異体は、ｐ３８γＣＡである。
【０１８４】
動物のニューロンにおいてトランスジーンを発現するための調節配列は、上記に記載されている。
【０１８５】
１つの実施形態によれば、トランスジェニック動物は、マウスである。しかしながら、トランスジェニック動物は、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ又はヤギを含む任意の動物であり得ることが理解されるであろう。
【０１８６】
別の側面によれば、
（ａ）神経学的状態に罹患しているか、又は神経学的状態のモデルである表現型を示す試験動物を提供し；
（ｂ）試験動物とトランスジェニック動物とを交配させ子孫を得、ここでトランスジェニック動物は、前記動物ｐ３８γ又はその変異体、又はtau依存性シグナル伝達複合体の破壊を引起すtauの変異体のニューロンにおいて発現できるトランスジェニック核酸配列を含み；そして
（ｃ）トランスジェニック核酸配列を発現する子孫における神経学的状態の重篤度又は神経学的状態のモデルである表現型を評価する工程を含む、神経学的状態が、本明細書に記載される方法により治療されるか、又は予防され得るかどうかを評価する方法が提供される。
【０１８７】
以下の特許請求の範囲及び本発明の前述の説明においては、文脈が明示的な言語又は必要な示唆のために別途必要とされる場合を除いて、用語「含む（comprise）」又は変形、例えば「含む（comprises）」又は「含む（comprising）」は、包括的な意味で使用され、すなわち記載される特徴の存在を特定するが、しかし本発明の種々の実施形態におけるさらなる特徴の存在又は追加を排除するものではない。
【０１８８】
本明細書で言及された全ての出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。当業者であれば、広範に記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示すように本発明に対して多数の変形及び/又は修正を行うことができることが理解されるであろう。従って、本実施形態は、すべての点で例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
【０１８９】
発明の性質をより明確に理解できるように本発明の性質を例示するために、以下の非限定的な例が提供される。
【実施例】
【０１９０】
材料及び方法
マウス：ニューロンにおいてヒトＫ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ変異体ＡＰＰを発現するＡＰＰ２３マウス（C Sturchler-Pierrat et al., Proc Natl Acad Sci U S A 94, 13287-92 (1997)）、ニューロンにおいてヒト非変異体tauを発現するＡｌｚ１７（A Probst et al., Acta Neuropathol 99, 469-81 (2000)）、ニューロン特異的Ｔｈｙ１．２−ｃｒｅトランスジェニックマウス（I Dewachter et al., J Neurosci 22, 3445-53 (2002)), tau-/- (KL Tucker, M Meyer, YA Barde, Nat Neurosci 4, 29-37 (2001)）、ｐ３８αｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ（FB Engel et al., Genes Dev 19, 1175-87 (2005)）、ｐ３８β−／−及びｐ３８γ−／−（AR Pogozelski et al., PLoS One 4, e7934 (2009)）、及びｐ３８δ−／−マウス（G Sumara et al., Cell 136, 235-48 (2009)）がこれまで記載されている。ｐ３８β、ｐ３８γ及びｐ３８δについてのノックアウトは、明らかな表現型のない包括的なものであり、ところがｐ３８α欠失は、包括的ｐ３８αノックアウトマウスの胚死亡のためにＣＮＳに限定されるべきであった。ｐ３８αΔｎｅｕマウスを得るために、ｐ３８αｌｏｘＰ／ｌｏｘＰを、Ｔｈｙ１．２−ｃｒｅ株と交配した。全ての系統を、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンド上で維持した。動物実験は、ニューサウスウェールズ大学の動物倫理委員会により承認された。鋳型として尾生検からのイソプロパノール−沈殿されたＤＮＡを用いて、ポリメラーゼ鎖反応により、マウスを遺伝子型決定した。ＰＣＲにより標的化された対立遺伝子及びトランスジーンを遺伝子型決定するためのオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の表１に列挙する：
【０１９１】
【表１】
2019510754.tif 000003
【０１９２】
トランスジェニックＴｈｙ１．２−ｐ３８γＣＡマウスの生成。
Ｄ１７９Ａ突然変異及びＮ末端ヘマグルチニン（ＨＡ）−タグを担持するヒトｐ３８γコード配列を、ＰＣＲにより増幅し、そしてＧｉｂｓｏｎアセンブリー（Gibson, et al. Nat. Methods 6, 343-345 (2009)(Fig. 30A)）を用いて、ニューロン発現のためのｍＴｈｙ１．２プロモーターを担持するプラスミドｐＥＸ１２（Ittner, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15997-16002) (2008)）のＸｈｏＩ部位中に挿入した。コンストラクトを、制限消化により除去し、そしてトランスジェニック創始マウスを、前核注射によりコンジェニックＣ５７Ｂ１／６バックグラウンド上で生成した（Ittner et al. Nat. Protoc. 2, 1206-1215 (2007)）。創始マウスからの尾ＤＮＡを、ゲノムトランスジーン挿入のためにＰＣＲによりスクリーニング、そして２種の創始系（ｐ３８γＣＡ．３及びｐ３８γＣＡ．４系の両者について、正常な生殖能、生存及びメンデリア導入遺伝子伝達が観察された。両系統は、明白な表現型を示さい。トランスジェニックマウス由来の皮質、海馬及び小脳抽出物のイムノブロットは、ＨＡタグ付きｐ３８γＣＡの発現を確認した（図３０Ｂ）。
【０１９３】
発作。
発作を、以前に記載されたように（LM Ittner et al., Cell 142, 387-97 (2010)）、ペンチレンテトラゾール（PTZ, Sigma-Aldrich）により誘発した。手短に述べると、ＰＴＺを、３０又は４０ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔内注射した。発作を以下のように等級化した：0、発作はない； 1、不動; 2、尾部延長；3、前肢のクローヌス; 4、一般化されたクローヌス; 5、バウンス発作；6、完全な拡張； 7、癲癇重積状態。
【０１９４】
空間学習／記憶試験。
空間学習／記憶を、モリス水迷路パラダイム（CV Vorhees, MT Williams, Nat Protoc 1, 848-58 (2006)）において試験した。手短に述べると、低光間接照明のある部屋において白色非反射性内面を有するマウスモリス水迷路（直径１２２ｃｍ、高さ５０ｃｍ）用の専用水槽に、希釈された非刺激性白色染料を含む水（１９−２０℃）により満たした。４つの異なる遠位キューを４つの象限を反映する垂直位置でタンクを取り囲んで配置した。標的象限においては、プラットフォーム（１０ｃｍ２）を、水面下１ｃｍに沈めた。ビデオを、ＣＣＤカメラで記録し、そしてＡｎｙＭａｚｅソフトウエアを用いて分析した。空間獲得のために、セッションごとに６０秒ごとに４回の試験を行った。開始位置は、すべての試験について開始象限の外側エッジに沿って無作為化された。参照メモリを試験するために、プラットフォームなしのプローブ試験を、６０秒の試験期間にわたって実施し、そして記録を各象限内で費やした時間について分析した。視覚的に支持された制御獲得（視覚障害を排除するために）のために、マーカーを、プラットフォームの上部に貼り付け、そして１セッション当たり４回の試験（６０秒）を行った。すべてのマウスは、年齢及び性別が一致し、そして生後４ヶ月で試験された。連続浮遊行動を示したマウスを排除した。遺伝子型は、スタッフ録音試験及びビデオトラック分析には盲目的であった。泳ぎ経路の追跡を、AnyMaze ソフトウェア（Stolting）を用いて行った。平均遊泳速度を、運動障害を排除するために決定した。
【０１９５】
タッチスクリーンオペラントチャンバー（Campden Instruments）を、２つ異なるパラダイムと共に、時空間記憶及び学習（差動ペアアソシエート学習、ｄＰＡＬ）又は認識記憶／識別学習（ペアワイズ識別タスク、ＰＤ）に対処するために使用した。前に記載されたタッチスクリーンチャンバープロトコルを使用した（Horner et al. Nat. Protoc. 8, 1961-1984 (2013)）。ｄＰＡＬスケジュールのマウスは、以下のように事前試験手順及び訓練を受けた：食料不足（初期体重の８５−９０％まで）及び取扱いへの適応（０日目−４日目）、タッチスクリーンボックスへの適応（４日目）、報酬収集（イチゴミルクシェーク、Nippy’s）（５日目−８日目）、報酬訓練を収集するためにパネルを押す（９日目）、初期刺激依存性タッチ訓練（１０日目）、刺激訓練に触れなければならない（１１日目−１６日目）、トライアルトレーニングを開始しなければならない（１７日目−２２日目）、誤ったタッチを罰する（２３日目−２６日目）、続いて、２１日間連続してｄＰＡＬ獲得（２日目−４９日目）又は対様識別タスク獲得（２７日目−３１日目）。セッションの最大時間を、６０分に設定した。最大試験回数を、３６に設定した。全てで訓練セッションを、次の訓練パラダイムが開始される前、マウスが基準に達するまで、反復した。基準は、６０分以内に３６回の試験（初期タッチ訓練、訓練に触れなければならない、訓練を開始しなければならない）、又は３６回の正しい試験のうち、２７回の試験（誤ったタッチを処罰する）として定義された。過剰体重減少のマウスを、このプロトコルから除外した。
【０１９６】
行動及び運動試験
新規性−誘発された歩行運動及び不安関連行動を、前に記載されたように、オープンフィールド試験パラダイムにおいて評価した（Ke, et al. Acta Neuropathol. 130, 661-678 (2015)）。手短に言うと、マウスを、４０×４０ｃｍ２のボックスに、個々に薄暗い遮音のエンクロージャ内に配置し、そして動きを１５分間、記録した。マウスは、前にオープンフィールドパラダイムにさらされていなかった。ボックスを、記録間で７０％エタノールにより拭いた。動きを、AnyMazeソフトウェア（Stolting）を用いて追跡した。分析は、記録期間全体にわたって蓄積されるか、又は１分間のビンに分割された。
【０１９７】
運動性能を、加速モード（５−６０ｒｐｍ）で、１２０（高齢）又は１８０（若い）秒にわたって５輪ローターロッドトレッドミル（Ugo Bosile）上で試験した（van Eersel, et al. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 41, 906-925 (2015)）。セッション当たり３回の試みのうち回し車上にとどまった各マウスの最長時間を記録した。グリップ強度を、前述のようにして決定した（Ke et al. (2015)）。手短に述べると、マウスを金属線から引き離すのに必要とされる力を、グリップ強度計（Chatillon, AMETEK）を用いて測定した。マウスを、それらが、メーターに取り付けられた細い金属ワイヤー上に二重グリップを有するよう、そしてそれが離れるまで水平方向にメーターから引き離され、そしてピークの力（Ｎ）が、マウスが離れる瞬間で記録されるよう配置した。３回の試みから最大の力を記録した。
【０１９８】
カルシニューリン活性アッセイ
ｐ３８γ−／１及びｐ３８γ＋／＋同腹子の皮質抽出物におけるカルシニューリン活性を、製造業者の説明書（Ａｂｃａｍ）に従って決定した。
【０１９９】
脳波検査
自由に動くマウスにおける海馬ＥＥＧ記録を、以前に記載されているようにして実施した（AA Ittner, A Gladbach, J Bertz, LS Suh, LM Ittner, Acta Neuropathol Commun 2, 149 (2014)）。手短に述べると、遠隔テレメトリトランスミッター（ＤＳＩ）のフイアＥＥＧ電極を、ケタミン／キシラジンにより麻酔されたマウスに移植した。頭を安定フレーム（Kopf instruments）に固定し、そしてブレグマを配置した。骨開口部を、骨マイクロドリル（Fine Science Tools, F.S.T.）を用いて、海馬について以前記載された位置（ブレグマを基準にして、ｘ  ２．０、ｙ  −２．０、ｚ  −２）で穿孔した。電極をこの位置で挿入し、そして参照電極を、小脳上に配置した（ブレグマからｘ  ０、ｙ  −６．０、ｚ  ０）。電極を、ポリアクリレートにより所定の位置に固定し、続いて創傷閉鎖及び再水和化を行った。手術からの回復の１０日後、ＥＥＧを、Dataquest A.R.T.記録ソフトウェアを用いて、増幅器マトリックスを備えたＤＳＩ無線受信機セットアップ（ＤＳＩ）により、５００Ｈｚのサンプリング速度で記録した（M Weiergraber, M Henry, J Hescheler, N Smyth, T Schneider, Brain Res Brain Res Protoc 14, 154-64 (2005)）。ＥＥＧ記録の完結の２日後、動物を、冷リン緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）により経心灌流し、そして脳を、生化学的及び組織学的分析のために抽出した。電極の正しい配置を、ヘマトキシリン−エオシンにより染色されたパラフィン包埋脳組織の連続切片により確認した。電極の正しい配置を有するマウスからの記録のみが、さらなる分析に含まれた。
【０２００】
2019510754.tif 000004
【０２０１】
【化１】
2019510754.tif 000005
【０２０２】
変調指数ＭＩは、下記として定義される：
【０２０３】
【化２】
2019510754.tif 000006
【０２０４】
位相−振幅分布及び変調指数を、１記録当たり８つの人工−及び非同期スパイクフリーシーケンスから決定した。
【０２０５】
シナプトソーム及びシナプス密度の調製
皮質組織からのシナプトソームの精製を、以前に記載されているようにして実施した（Ittner, et al. Cell 142, 387-397 (2010)）。手短に説明すると、皮質組織を計量し、そして３０ｍｇの組織／ｍｌで氷冷却スクロース緩衝液（0.32Ｍのスクロース、1ｍＭ のＮａＨＣＯ３、１ｍＭ のＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ のＣａＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤（ＥＤＴＡを含まない、Roche））において、前もって冷却されたダウンスホモジナイザーを用いて均質化した。遠心分離（１，４００ｇ、１０分、４℃）により均質物を除いた後、ペレットをスクロース緩衝液に再懸濁し、そして再び遠心分離した（１，４００ｇ、１０分、４℃）。組合わされた上清液を、再び遠心分離し、そして上清液（全脳均質物）を、４０℃で１０分間、１３，８００ｇで回転させた。ペレットを、スクロース緩衝液に再懸濁し、そして５％Ficoll（Sigma）の上に積層し、そして４℃で４５分間、４５，０００ｇで遠心分離した。界面（シナプトソーム）を回収し、５％Ficollにより希釈し、そして４℃で３０分間、４５，０００ｇで遠心分離した。上清液（非シナプス）を集め、そしてペレットを、ｐH８の緩衝液（２０ｍＭの Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ １００、１００ｍＭ のＮａＣｌ、１ｍＭ のＥＤＴＡ、１ｍＭ のＥＤＴＡ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、プロテアーゼ阻害剤（ＥＤＴＡフリー、Roche））に再懸濁した。４℃で３０分間、４０，０００ｇで遠心分離した後、ペレット（後シナプス密度）を、５％SDSに再懸濁した。上清液は、シナプス非PSD関連タンパク質を構成しtauェスターンブロットのためのサンプルの調製の前、異なる画分についてのタンパク質濃度を決定した。
【０２０６】
プラスミド。
ラットＰＳＤ９５（Wei-dong Yaoからの贈り物; Addgene プラスミド #15463）、Ｆｙｎキナーゼ（Filippo Giancottiからの贈り物; Addgene  プラスミド#16032）及びＮＲ２Ｂ（Robert Malinowからの贈り物; Addgeneプラスミド #23998）の発現のためのプラスミドを、Addgene寄託機関から入手した。生存細胞蛍光共焦点イメージングのために、ＰＳＧ−９５を、megaprime ＰＣＲ （Bryksinet al. Biotechniques 48, 463-465 (2010)）により、ＰＤＺドメイン２と３との間のｍCherryに内部標識し、そしてtau変異体を、ｐｅＧＦＰ−Ｃ１ (Clotoch)中へのクローニングによりｅＧＦＰにより標識した。ヒトｐ３８α、ヒトｐ３８β及びヒトｐ３８γについてのクローニング配列を、N末端HA標識を有するｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングした。ヒトｐ３８δについてのコード配列を、ｐｅＧＦＤ−Ｃ１にクローニングした。活性変異体の生成のためのｐ３８コード配列の突然変異（M Avitzour et al., FEBS J 274, 963-75 (2007)）及びＰＤＺモチーフを欠いているｐ３８γ（ΔＰＤＺｍ）を、Ｑ５部位特異的突然変異誘発キット（ＮＥＢ）を用いて生成した。ヒトtauのコード配列（４４１個のアミノ酸）を、ｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５−ＤＥＳＴ（Invitrogen）中にクローニングした。tauのリン酸化部位変異体を、Ｑ５部位特異的突然変異誘発キット（ＮＥＢ）を用いて生成した。分子クローニングのためのオリゴヌクレオチドプライマーが、表２に列挙されている。
【０２０７】
【表２】
2019510754.tif 000007
【０２０８】
野生型（図４６、図４８（配列番号６））、及び構成的活性（Ｄ１７９Ａ）ｐ３８γ（図４７、図４９（配列番号７））又はtauの変異体のニューロン発現（ｐＡＭ−ＣＡＧ）についてのアデノ随伴ウィルスベクター（von Jonquieres, et al. PLOS ONE 8, e65646 (2013)）を、従来の制限酵素クローニングによりクローニングした。すべてのプラスミドを、Ｅ．コリＤＨ５α 又はＸＬ-１ｂｌｕｅにおいて増幅した。組換え事象を回避するために、ＡＡＶベクターを、Ｅ．コリＳｔｂ１３において増殖した。コンストラクトを、配列決定により確認した。
【０２０９】
アデノ随伴ウィルス。
ｒＡＡＶ１ベクターのパッケージングを、記載されているようにして実施した（AE Harasta et al., Neuropsychopharmacology 40, 1969-78 (2015)）。力価を、定量的ポリメラーゼ鎖反応（ｑＰＣＲ）により決定した。ＡＡＶ−ＳＧ１−ＳｈＲ又はＡＡＶ−ｃｔｒ−ｓｈＲベクターのいずれか１μｌ（１×１０９個のウィルス粒子）を、記載されるようにして、凍結麻酔された新生子マウスの脳内に３箇所ずつ両側に注射した（G von Jonquieres et al., PLoS One 8, e65646 (2013)）。
【０２１０】
細胞培養。
我々の標準プロトコルを用いて、Ｅ１６．５マウス胚由来の初代海馬ニューロンを培養した（T Fath, YD Ke, P Gunning, J Gotz, LM Ittner, Nat Protoc 4, 78-85 (2009)）。細胞毒性を、市販のアッセイ（Promega）を用いて、ＬＤＨ放出を測定するか、又は４％ＰＦＡ／ＰＢＳによる固定化の５分前、細胞培養培地に添加されるＥｔｈＤ１（Thermo Fisher Scientific）の可視化により決定した。２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ / １０％ＦＢＳ / １％グルタミン酸/ １％Ｐ / Ｓ (Life Technologies)において培養し、そしてカルシウム沈殿によりトランスフェクトした（A Ittner et al., J Exp Med 209, 2229-46 (2012）。初代ニューロンを、ＡＡＶ感染により形質導入した（AE Harasta et al., Neuropsychopharmacology 40, 1969-78 (2015)）。
【０２１１】
生存細胞焦点イメージング及びＦＬＩＭ／ＦＲＥＴ分析
ＦＬＩＭ／ＦＲＥＴ測定を、時間が決められた、倒立共焦点蛍光顕微鏡（Microtime200, PicoQuant GmbH）を用いて実施した。ドナーＧＦＰの励起は、６３ｘ水対物レンズ（１．２５ＮＡ）を用いる単一光子フィーバー結合ピコ秒パルスダイオード４７３ｎｍレーザー（２０ＭＨｚの反復率、２ｍｓの滞留時間、２５６×２５６のピクセルアレイ）を介してであった。蛍光発光を、時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）のための高速タイミング・エレクトロニクスにカップリングされた単一光子アバランシェ・ダイオード（ＳＰＡＤ）上に５１０／３２Semrock BrightLineバンドパス発光フィルターを通して収集した。蛍光画像を、ＳｉｍＦＣＳソフトウェア（Globals Software, USA）を用いて、フェーザープロットにより分析した。手短に説明すると、各画素での減衰曲線のフーリエ変換を行い、そして得られる変換を、２Ｄヒストグラムとしてプロットした。ドナーのみのフェーザー位置を、受容体の不在下でドナーを測定することにより決定した。ＦＲＥＴサンプルを測定し、そしてクエンチング軌道に沿ったフェーザ位置を、従来のＦＲＥＴ効率計算に従って計算した：
【０２１２】
【化３】
2019510754.tif 000008
【０２１３】
ここで、ＥはＦＲＥＴ率であり、ｔＤは受容体の不在下でのドナーの蛍光寿命であり、そしてｔＤＡは受容体の存在下での蛍光寿命である。
【０２１４】
細胞免疫蛍光染色及び顕微鏡検査
細胞染色を、前記記載されているようにして実施した（LM Ittner et al., Cell 142, 387-97 (2010)）。手短に説明すると、細胞を、４％ＰＦＡにより１０分間、固定し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により洗浄し、０．０２％ＮＰ−４０により透過性にし、そしてブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、３％ウマ血清／１％ウシアルブミン）によりブロックした。ブロッキング緩衝液により希釈された一次抗体を、４℃で一晩、又は室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳによる洗浄の後、細胞核を可視化するためにＤＡＰＩを添加しているか、又は添加していないブロッキング緩衝液により希釈された二次抗体を、室温で１時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、そして抗−フェードマウント培地（Prolong Gold, Life Technologies）を用いてマウントした。使用される二次抗体を、Ａｌｅｘａ４８８、５５５、５６８又は６４７色素（Molecular Probes）にカップリングした。共焦点画像を、Plan-Apochromatic 100×  １．４ＮＡ対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ８８０Airyscan共焦点顕微鏡又はPlan-Apochromatic 100×１．４ＮＡ対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡で、Ｚｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて獲得した。落射蛍光イメージングをCellsensソフトウェア（Olympus）を用いて、DP70カラーカメラ（Olympus）を備えたＢＸ５１明視野／落射蛍光顕微鏡（UPlanFL N lenses [\/0.17/FN26.5]: 10x/0.3, 20x/0.5, 40x/0.75, 60x/1.25oil and 100x/1.3oil）上で行った。
【０２１５】
ヒト脳サンプル
ヒト嗅内皮質組織サンプルは、ニューサウスウェルズ大学、神経科学研究オーストラリア、及び総合失調症研究所により支援される、ニューサウスウェルズ脳組織リゾースセンター（シドニー大学）及びシドニー脳バンク（神経科学研究オーストラリア）から受領した。凍結組織を、回転ダウンスホモナイザーを用いて、リン酸緩衝生理食塩水（２０％ｗ／ｖ）において溶解し、続いて２０％パワー（Vibra Cell, Sonics）で５秒間の超音波破壊を行った。溶解物を、４℃で１０分間、３，０００ｘｇで遠心分離し、そして上清液を分析ために使用した。患者の詳細は、表３に提供されている。ヒト脳サンプルの使用は、ニューサウスウェルズ及びシドニー大学の人間研究倫理委員会によって承認された。
【０２１６】
【表３】
2019510754.tif 000009
【０２１７】
組織学的切片及び染色
マウスを、リン酸緩衝生理食塩水、続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により経鼻的に灌流し、続いて４％ＰＦＡに一晩、固定した。組織を、パラフィン包埋のためにＥｘｃｅｌｓｉｏｒ組織プロセッサー（Thermo）により処理した。アミロイドプラークを可視化するためのチオフラビンＳ染色を、標準プロトコルに従って実施した（LM Ittner et al., Cell 142, 387-97 (2010)）。筋肉断面を、以前に記載されたようにして、ラミニン（Ｓｉｇｍａ）に対する一次抗体により染色した（Ke, et al. Acta Neuropathol. 130, 661-678 (2015)）。ＡＡＶ注射されたマウスからの脳切片を、ウィルストランスジーン発現を可視化するために、tau（Ｔａｕ１３；Ａｂｃｏｍ）又はＨＡ−標識（ＨＡ−７；Sigma-Aldrich）により染色した。ヒト嗅内皮質サンプルの連続パラフィン切片を、ＮＳＷ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｎｋから入手し、そして標準Ｎｉｓｓｌプロトコルにより、数えるために染色した。神経細胞計数を、凝集眼（Ｕ１００Ｈ６；Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えたオリンパスＢＸ５１顕微鏡上で行った。切片の単一平面内に見られる核小体、核及び細胞質を有するニューロンを、計数すると考えられた。ＣＡフィールド（ＣＡ４−１）に関しては、３つのラングムで重複しない視野を選択した。嗅内皮質に関しては、皮質表面から灰白質物質接合部に伸びる皮質の３つの重複しないストリップを、計数のために印を付けた。次に、続く皮質計数を、皮下表面に垂直に広がる３つの隣接する視学的視野を通して実施した。次に、切片を通しての平均細胞数を、１ｍｍ２当たりニューロンの細胞密度値に標準化した。すべての組織切片を、ＤＰ７０カラーカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えたＢＸ５１明視野／落射蛍光顕微鏡（UPlanFL N lenses [\/0.17/FN26.5]: 10x/0.3、20x/0.5、40x/0.75、60x/1.25oil及び 100x/1.3oil）上で画像化した。
【０２１８】
ウェスターンブロット
ウェスターンブロットを、前に説明されたようにして実施した（A Ittner et al., J Exp Med 209, 2229-46 (2012)）。バンドを、Ｘ線フィルム又はChemiDoc MP (Biorad)上の化学発光により可視化しtauウェスターンブロットの結果の濃度測定は、ImageJ 2.0.0-rc-49/1.51d (NIH)を用いて実施した。この研究に使用される抗体は、以下である：抗−ＮＲ１ (Chemicon)、抗−ＮＲ２Ｂ (Santa Cruz)、 抗ホスホチロシン１４７３−ＮＲ２Ｂ (Affinity BioReagents)、 抗−PSD95 (Millipore)、 抗−Fyn (Santa Cruz)、 抗−ホスホ−Ｙ４１８ Ｆｙｎ (Invitrogen)、 抗−ホスホ−Ｙ５２９ Ｆｙｎ (Invitrogen)、 抗−ＡＰＰ (22C11)、 抗−Aβ (6E10)、 抗−tau(DAKO)、 抗−tau (tau1、 Millipore)、 抗−tau (tau13、 Abcam)、 抗−ホスホ−セリン１９９ tau(Abcam)、 抗−抗−ホスホ−セリン２０２ tau (Abcam)、 抗−ホスホ−トレオニン２０５ tau (Abcam)、 抗−ホスホ−トレオニン２１２tau(Abcam)、 抗−ホスホ−セリン２１４ tau (Millipore)、 抗−ホスホ−トレオニン２３１ tau (Abcam)、 抗−pホスホ−セリン２３５ tau (Abcam)、 抗−ホスホ−セリン３５６ tau (Abcam)、 抗−ホスホ−セリン３９６ tau (Abcam)、 抗−ホスホ−セリン４０４ tau (Millipore)、 抗−ホスホ−セリン４２２ tau (Millipore)、 ＰＨＦ−１ (ホスホ−セリン３９６−ホスホ−セリン４０４ tau; P. Daviesからの贈呈)、 抗−ｐ３８α (Cell Signaling)、 抗−ｐ３８β (Santa Cruz)、 抗−ｐ３８γ(R&D)、 抗−ｐ３８δ (R&D)、 抗−ホスホトレオニン１８０/Tチロシン１８２−ｐ３８ (Cell Signaling Technologies)、 抗−Ｆｌａｇ (M2、 Sigma)、 抗−ＨＡ７ (Sigma)、 抗−Ｖ５ (Invitrogen)、 抗−ＭＡＰ２ (マウス Abcam)、 抗−ＭＡＰ２ (chicken: Abcam)、 抗−β３ チュウブリン (Covance)、 抗−ＮｅｕＮ (Abcam)、 抗−Ｄｅｂｒｉｎ (Sigma)、 抗−シナプトフィジン (Abcam)、 抗−αシヌクレイン (Sigma)、 抗−グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ (抗−GAPDH、 Millipore)。
【０２１９】
免疫沈澱
免疫沈澱を、以前に記載されたように、細胞又は組織溶解物から実施した（LM Ittner et al., Cell 142, 387-97 (2010)）。手短に説明すると、細胞を、氷上でＰＴＮＮ緩衝液（２０ｍＭ のＴｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ のＮａＣｌ、１ｍＭ のＥＤＴＡ、１ｍＭの Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭの ＮａＦ、１ｍＭ のグリセロホスフェート、２．５ｍＭ のＮａ２Ｈ２Ｐ２Ｏ７、１ｍＭ のＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤(Complete、 Roche)、１％ ＮＰ−４０代替物(Sigma-Aldrich)）に溶解した。溶解物を、遠心分離（１６，０００ｘｇ／１０分／４℃）により清澄化した。タンパク質濃度を決定し（DC Protein Assay, BioRad）、そして２００μｇの溶解物を、抗体（１：４００）と共に３時間、４℃でのローター上でインキュベートした。平衡化され、そしてブロックされたタンパク質Ｇビーズ（Life  Technologies）を、４℃でローター上で４５分間、溶解物と共にインキュベートした。次に、ビーズを３回、洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前、９５℃で５分間、サンプル緩衝液においてインキュベートした。皮質又は海馬組織を、ＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ のＴｒｉｓ pH８．０、１５０ｍＭ のＮａＣｌ、１ｍＭ のＥＤＴＡ、１ｍＭの Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭの ＮａＦ、１ｍＭ のグリセロホスフェート、２．５ｍＭ のピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ のＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤(Complete、 Roche)、１％ ＮＰ−４０代替物(Sigma-Aldrich)、ＳＤＳ、デオキシコール酸ナトリウム）において均質化し、そして上記で概説されたように、免疫沈澱にゆだねた。定量的デンシトメトリー分析を、画像J2.0.0-rc-49/1.5ld (NIH)を用いて実施し、そしてＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体の免疫沈澱についてのレベルを、免疫沈澱されたＰＳＤ−９５タンパク質レベルと比較して表した。
【０２２０】
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）
tau変異体を、グルタチオン樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｅ．  コリBL21DE3pLys (Promega)からのＧＳＴ融合タンパク質として精製し、続いて、限外濾過回転カラム（１０，０００分子量カットオブ；Vivaspin, Sartorius）を用いて濃縮及び緩衝液交換を行った。ｅＧＦＰ−ＰＳＤ−９５を、２９３Ｔ細胞において、発現し、そして溶解物を、トランスフェクションの４８時間後、ＴＮＮ緩衝液（２０ｍＭ のＴｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ のＮａＣｌ、1％NP40代替物、オルトバナジウム酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、グリセロリン酸、フッ化ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤（Complete; Roche））において調製した。融合タンパク質の濃度を、モル吸光係数を用いて吸光度測定（Nanodrop 2000C; Thermo-Fisher）により決定した。ＧＦＰ−ＰＳＤ−９５の熱泳動を、Monolith NT115 (Nanotemper technologies)上で、ＧＳＴtau（開始濃度９ＭＭ）の連続希釈（１：１）で、５０％ＬＥＤパワー及び２０％ＭＳＴパワーを用いて、５秒間のプレＭＳＴ及び３０秒のＭＳＴ時間で決定した。３つの独立した実験からの熱泳動及び温度ジャンプ標準化蛍光曲線を、フルオロフォア標識タンパク質の結合状態の画分として表した（Wienken et al. Nat. Commun. 1, 100 (2010)）。熱泳動を、tau濃度の関数としてプロットし、そして実験平衡解離定数（ＫＤ）を決定するための非線曲線適合化を、平方和の最小化（sum-of-squares minimization）（Marquardt method; Graphpad Prism 6）を用いて実施した。
【０２２１】
キナーゼがアッセイ
組換えタンパク質を、以前に記載されたようにして、細菌において発現し、そして精製した（A Ittner et al., J Exp Med 209, 2229-46 (2012)）。タンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色により評価した。キナーゼアッセイ反応を、以前に記載されたようにして実施した（A Ittner et al., J Exp Med 209, 2229-46 (2012)）。手短に説明すれば、０．５μｇの組換えｐ３８γを、キナーゼ反応緩衝液（Promega）において１μｇの組換えヒトtauを共に混合し、そして３０℃で３０分間インキュベートした。キナーゼ反応を、サンプル緩衝液の添加及び９５℃での５分間のインキュベーションにより停止させた。
【０２２２】
質量分光測定
インビトロｐ３８γキナーゼ反応の後、tauのホスホ−ペプチドマッピングを、以前に記載されたようにして行った（Dolai, et al. Cancer Res. 76, 2766-2777 (2016), Thingholm, et al. Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006)）。手短に説明すると、キナーゼ処理された、tauを含むタンパク質抽出物を、３ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、５６℃、１０分）により還元し、６ｍＭのヨードアセトアミド（周囲温度、３０分）によりアルキル化し、緩衝液交換し、そして１００ｍＭの炭酸水素アンモニウム及び３ｋＤａ回転フィルター（Amicon Ultra-4 centrifugal filters, Merck KGaA, Darmstadt, Germany）を用いて濃縮し、続いて、トリプシン消化を行った（２５：１ｗ／ｗ  タンパク質：トリプシン比、１６時間、３７℃）。材料中のタンパク質を、ＴｉＯ２回転チップ（GL Sciences, Tokyo, Japan）と共にTitansphere Phos−TiOキットを用いて、製造業者のプロトコルに従って、ホスホペプチドについて富化した。ホスホペプチド富化された及び富化されていないサンプルと、ホスホペプチドの同定を最大にするために、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分光計（QExactive Plus上にCID及び ETD活性化モード 及びHCDを備えたLTQ-Orbitrap Velos: Thermo Electron, Bremen, Germany）を用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。クロマトグラフィー処理を、オートサンプラーシステム（Dionex, Amsterdam, Netherlands）を備えた＋／−ＬＣ（Dionex UltiMate 3000 HPLC, Thermo Scientific, Waltham, USA）により実施した。ペプチド（１−７μの注入）を、カラムヒーター（45oC, Sonation GmbH, Germany）内に支持される、Ｃ１８逆相パッキング（Reprosil-Pur, 1.9 μm, 200 Å, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Germany）を含むキャピラリーカラム（１０ｃｍ）に切替えて、Ｃ１８カートリッジ（Acclaim PepMap 100, 5μm 100 Å, Thermo Scientific Dionex, Waltham, USA）上に最初に捕獲した。ペプチドを、カラム入口で適用される高電圧を伴って、２００ｎＬ／分で、４５％緩衝液Ｂ（０．１％のギ酸を含む２０：８０のＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ）への緩衝液Ａ（０．１％のギ酸を含む９８：２のＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ）の４０分の勾配を用いて溶出した。質量分光計の設定は以下の通りであった：エレクトロスプレー電圧２０００Ｖ、キャピラリー温度２７５−３００℃、陽性イオンモード、取得されたサーベイスキャンを有するデータ依存性取得モード（ｍ／２  ３７５−１７５０）、及びＭＳ／ＭＳフラグメンテーション（ＣＩＤについて２５００以上、、ＥＴＤについて５００以上、及びＨＣＤについてＥＴＤについて５０００以上、及びＨＣＤについて８．０×１０４の強度閾値）のために単離された最大１０の多重電荷イオン（電荷状態≧２＋）。窒素を、ＥＴＤのためのＨＣＤ衝突ガス及びフルオランテン陰イオン試薬として使用した。ピークリストを、MASCOT Distiller (Matrix Science, London, England)を用いて生データから生成し、そしてホモサピエンス分類法を用いてＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（バージョン２．５、Matrix  Science）及びNCBIｎｒデータベース（２４−１０−１５をダウンロードした）により検索した。検索パラメーターは、CＩＤ及びＥＴＤについて±４ｐｐｍのペプチド耐性及び±０．４ＤａのＭｓ／ＭＳ耐性、又はＨＣＤについて±０．０５ＤａのＭＳ／ＭＳ耐性であり、可変修飾は、カルバミドメチルｃｙｓ、ｍｅｔ酸化、ホスホ（ＳＴ）及びホスホ（Ｙ）、２＋、３＋及び４＋のペプチド電化、許容できる最大３回までの誤った切断を伴う酵素特異的トリプシンであった。
【０２２３】
Ａβ調製
Ａβ４２（Bachem）を調製し、そして記載のようにして、１００μＭの濃度で予備凝集した（MP Lambert et al., Proc Natl Acad Sci U S A 95, 6448-53 (1998)）。手短に説明すると、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（Ｓｉｇｍａ）を溶解し、そして蒸発されたＡβを、５ｍＭでジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ）において再構成し、そして次に、フェノールレッドを含まないＦ−１２培地（Invitrogen）に希釈し、１００μＭの最終濃度にし、続いて短時間、ボルテックスし、そして４℃で２４時間インキュベートした。さらなる希釈を、培養培地において行った。
【０２２４】
Ａβレベル及び病理
Ａβ４０及びＡβ４２レベルを、前に記載されたようにして、ＥＬＩＳＡにより決定した（LM Ittner et al., Cell 142, 387-97 (2010)）。プラーク富化を、前に記載されたようにして決定した（LM Ittner et al., Cell 142, 387-97 (2010)）。
【０２２５】
統計学的分析
統計学的分析を、Graphpad Prizm Version 6.0 (Student’s t test or ANOVA)を用いて実施した。線形回帰及び相関分析は、二乗和の最小化によって行われた。生存データを対数ランクMantel-Cox試験によって分析した。全ての値は、平均±標準誤差（SEM）として示される。
【０２２６】
結果
ＡDに対するｐ３８キナーゼの分子的寄与を理解するために、最初に、ＡＤマウスモデルにおける興奮毒性を理解するのに役立つアプローチである、ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）による興奮毒性発作を誘発することにより、p３８α、 p３８β、 p３８γ又は p３８δ (Fig. 1)の個々の欠失を有するマウスにチャレンジした（７，８）。結果は、図２Ａ、６Ａ６Ｂ及び６Ｃに示される。驚くべきことには、ｐ３８αのニューロン欠失（ｐ３８αΔｎｅｕも、ｐ３８β又はｐ３８δのノックアウトのいずれも、ＰＴＺ投与の後、発作潜伏期及び重症度も変えず、このことは、それらが急性興奮毒性において調整的役割を有さないことを示唆する。対照的に、ｐ３８γ枯渇（ｐ３８γ−／−）は、ＰＴＺ誘発性発作に対する感受性を著しく増強した（図２Ａ及び図６、Ｂ及びＣ）。ｐａｎ−ｐ３８阻害は、ｐ３８γ−／−における変化と類似して、野生型マウスにおけるＰＴＺ誘発性発作の重症度を高め、そしてその潜伏期を短縮し、このことは、ｐ３８γを除いて、ｐ３８α／β／δが急性興奮毒性に寄与しないことを示唆する、後シナプスシグナル伝達における役割と一致して、ｐ３８γのみが、樹状突起棘、及び培養されたニューロンの後シナプス密度に局在した（図２Ｂ）。ｐ３８α及びｐ３８βは、体細胞及び樹状突起シャフトに見出されたが、ところが、ｐ３８δはニューロンに検出できなかった。まとめると、ｐ３８γのみが後シナプス区画に局在し、そしてＰＴＺ誘発性興奮毒性を制限する。
【０２２７】
ＰＴＺ誘発性発作に対するｐ３８γの効果がまた、ＡＤマウスモデルにおけるＡβ誘発性障害にも影響を及ぼすかどうかを試験するために、ｐ３８γ−／−マウスを、突然変異ＡＰＰ発現ＡＰＰ２３マウスと交配させた。それらのＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−マウスを、ＰＴＺの投与により発作感受性について評価した。結果は、図７に示される。ＰＴＺ誘発性発作に対するＡＰＰ２３マウスの高められた感受性は、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−マウスにおいて、さらに増大した（図７Ａ−Ｃ）。ＡＰＰ２３マウスを、早期死亡、記憶障害、癲癇様脳活性を伴う神経回路収縮、及びβプラーク病理により特徴づけた（Ittner et al., Cell 142, 387-397 (2010); ) Ittner, et al., Acta Neuropathol. Commun. 2, 149 (2014); Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 13287-13292 (1997)）。Ａβ形成及びプラーク病理は、ＡＰＰ２３.p３８γ-/- 及び ＡＰＰ２３.ｐ３８γ＋/＋マウスの脳において同等であったが、ｐ３８γの欠失は、ＡＰＰ２３マウスの早期死亡率を悪化させ、そしてＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−マウスの８２％が生後８ヶ月までに死亡した（図２Ｃ）。ｐ３８γ−／−マウスは、正常な生存率を示した（図２Ｃ）。ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−における記憶障害は、モリス−水迷路パラダイムにおいて（図２Ｄ−Ｆ、図８Ａ−Ｃ）、示差ペア・アソシエート・学習（ｄＰＡＬ）（図２１）、及び対様識別タスク（図２２）において評価されるように、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋マウスの記憶障害と比較して有意により重症であった。対照的に、ｐ３８γ−／−マウスは、野生型様記憶能力及び運動機能を示した。記憶障害は、ＡＰＰ２３（１４）を含む、ＡＰＰトランスジェニック系統（１０）におけるニューロン回路異常及び過同期性癲癇様脳活性と関連していた。ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−の脳波検査（ＥＥＧ）は、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／−記録よりもより頻繁な自発的発作スパイク列及び発作超音速放電を示した（図２Ｇ−Ｉ）。図２Ｇから分かるように、スパイク活性は、ｐ３８γ−／−及びｐ３８γ＋／＋マウスにおいては実質的に見られなかった。学習及び記憶に関連する海馬ネットワーク活性の重要な指標であるシータ（４−８ｈｚ）及びガンマ（２５−１００Ｈｚ）（１８、１９）は、ＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて変えられる（１４）。従って、シータスペクトルパワーは、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋及びＡＰＰ２３．ｐｐ３８γ−／−マウスにおいてより低い周波数（４−８Ｈｚ）にシフトされたが、ところがガンマスペクトルパワーは、ｐ３８γ−／−及びｐ３８γ＋／＋マウスに比較して高められた（図９Ａ−Ｇ）。ガンマパワーのシータ位相変調（１８）を通しての海馬交差周波数カップリング（ＣＦＣ）は、齧歯動物及びヒトにおいて記憶能力と相関し（２０，２１）、そしてＡＰＰ２３マウスでは障害を受ける（１４）。発作間ＥＥＧトレースは、ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−マウスにおいて約８Ｈｚで類似する大きさのＣＦＣを示したが、しかしＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋においては顕著な減損及びＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−同腹子においては仮想枯渇１を示し（図２Ｊ）、このことは、ｐ３８γ枯渇がさらに、ＡＰＰ２３マウスにおいて損傷を受けたＣＦＣを悪化させることを示唆する。同様に、ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−マウスと比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋マウスにおいては、位相振幅分布及びシータ位相の同時性が著しく低められ、そしてＡＰＰ２３．ｐ３８−／−マウスにおいては実質的に不在であった（図９）。結果的に、ＣＦＣのロバスト指標である変調指数（２１）は、ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−、又はさらにＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋に比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−記録において有意に低かった（図２Ｋ）。アルツハイマー病を有さないヒトの脳（Braak  ０）及びBraak  IからBraak VI（表３）に及ぶ異なる神経病理学的疾患段階を有するヒトからの抽出物において、ｐ３８γレベルを決定した。結果は、図２３A及び２３Bに示される。図２３A及び２３Bに見られ得るように、ｐ３８γレベルはADが進行するにつれて、ヒトにおいては著しく低められた。
【０２２８】
要約すると、ｐ３８γは、Aβの変化なしに、ＡＰＰ２３マウスにおいて興奮毒性、神経回路の同期性、早期死亡及び記憶障害を調節する。さらに、ｐ３８γレベルは、ＡＰＰ２３マウス、及びＡＤに罹患しているヒトにおいて低められる。
【０２２９】
tauのレベルがインビボでｐ３８γの興奮毒性制限効果に影響を及ぼすかどうかを決定するために、我々は、ＰＴＧでそれらのマウスに挑戦するために、非変異ヒトtau発現Ａｌｚ１７マウス（２２）を、ｐ３８γ−／１マウスと交配した。結果は、図３Ａ−Ｃに示される。図３Ａ−Ｃから見られるように、tau発現は、Ａｌｚ１７．ｐ３８γ＋／＋マウスにおける発作閾値に影響を及ぼさなかったが、ｐ３８γ−／−マウスと比較して、Ａｌｚ１７．ｐ３８γ−／−マウスは、有意に増強された発作進行及び重症度を提供した（図３Ａ−Ｃ）。結果的に、tau欠損ｔａｕ−／−マウスとｐ３８γ−／−との交配は、ｔａｕ−／−．ｐ３８γ−／−及びｔａｕ−／−．ｐ３８γ＋／＋マウスにおいて、ＰＴＺ誘発性発作からの類似する保護を示した（図３Ｄ−Ｆ）。ｐ３８γのＡβ毒性制限効果がtau依存性であるかどうかを決定するために、ＡＰ２３．ｐ３８γ−／−マウスを、ｔａｕ−／−マウスと交配し、そして得られる交配を、生存、記憶欠損及びニューロンネットワーク障害について評価した。結果は、図３Ｇ−３Ｉ、２４、２５、２６Ａ、２６Ｂ、１７、２８Ａ及びＢ、及び２９に示されている。ＡＰＰ２３マウスの低められた生存率、記憶障害及びニューロンネットワーク機能不全に対するｐ３８γ欠損の悪化の効果はＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−．ｔａｕ−／−マウスにおいては実質的に消滅した。それらのデータはまた、ＡＰＰ２３マウスに比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−動物は加齢と共に持続する記憶障害を悪化させたことも示している。対照的に、上記のように、ｐ３８γ−／−マウス（非変異tau発現Ａｌｚ１７マウスとの交配によりもたらされた）におけるtauレベルの上昇は、Ａｌｚ１７．ｐ３８γ−／−マウスにおいてＰＴＺ誘発性発作を有意に増強した。逆に、tau−／−.．ｐ３８γ＋／＋マウスに比較して、ｔａｕ−／−．ｐ３８γ−／−動物は、ＰＴＺ誘発性発作からの類似する保護を示した。まとめると、興奮毒性及びＡβ毒性に対するｐ３８γの効果は、tau依存性である。
【０２３０】
tauは、Ａβ誘発性興奮毒性を媒介するＦｙｎ及びＰＳＤ−９５との後シナプスシグナル伝達複合体に存在する（８）．Ａｌｚ１７．ｐ３８γ−／−脳におけるtau、Ｆｙｎ及びＰＳＤ９５の相互作用は、Ａｌｚ１７．ｐ３８γ＋／＋マウスと比較して増強され（図４Ａ、Ｂ）、これは、ＰＴＺ誘発性発作に対するそれらの増強された感受性と一致する。逆に、ＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体は、ｔａｕ−／−及びｔａｕ−／−．ｐ３８γ−／−脳から単離され得なかった。驚くべきことには、高められたｐ３８γレベルは損なわれ、そしてｐ３８γの構成的活性変異体（ｐ３８γＣＡ）の発現は、細胞におけるＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ相互作用を完全に破壊した（図４ＣＡ及びＤ）。Ｐａｎ−ｐ３８阻害は、ＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体のｐ３８γ及びｐ３８γＣＡ誘発性破壊を停止させ、さらに、ｐ３８γ活性が必要とされることを示唆した（図４Ｅ及びＦ）。ＰＳＤ−９５は、ｐ３８γ＋／＋脳よりもｐ３８γ−／−からのより多くのtau及びＦｙｎを共精製し、ｐ３８γの不在下でＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体形成の上昇を示唆する（図４Ｇ及びＨ）。ＰＴＺは、ｐ３８γ＋／＋動物及びさらにｐ３８γ−／−マウスにおいてＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体形成を一時的に高めた。同様に、ＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体形成は、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−脳に比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−において著しく高められた（図４Ｉ及びＪ。高められたＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体形成と一致して、ＰＳＤ−９５及びＨＢ２Ｂの相互作用を促進するＹ１４７２でのＮＲ２ＢのＦｙｎ媒介性リン酸化が、ｐ３８γ−／−脳において高められた。同様に、ｐ３８γ及びｐ３８γＣＡ発現は、ＮＲ２ＢのＹ１４７２−リン酸化を低めた。
【０２３１】
重要なことには、ｐ３８αＣＡ、ｐ３８βＣＡ 又はｐ３８δＣＡは、ＮＲ２Ｂリン酸化を低めず、このことは、ＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体の調節がｐ３８γの非冗長機能であることを示唆する。興味深いことには、ｐ３８γ及びｐ３８γＣＡの両者は、ＰＳＤ−９５と相互作用し（図４Ｃ）、前記ＰＳＤ−９５は、ｐ３８γ及びｐ３８γＣＡからのＣ末端ＰＤＺ相互作用モチーフの決失により無効にされた（図１０Ａ）。ｐ３８γ及びｐ３８γＣＡの両者はまた、tauと相互作用した（図１０Ｂ）。ｐ３８γ及びそれ以上のｐ３８γＣＡは、Ｆｙｎ過剰発現の不在下でｐＳＤ−９５／tau相互作用を破壊したが（図１０Ｃ）、しかしtau／Ｆｙｎ相互作用を破壊しなったので（図１０Ｄ）、ｐ３８γは、ｐＳＤ−９５／tau相互作用のレベルでＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体を調節するように見える。
【０２３２】
ｐ３８γは、長期インビトロキナーゼアッセイの間、複数のエピトープでtauをリン酸化し、たぶんtauの過剰リン酸化に寄与するが（２５）、興奮毒性を含む急性シグナル伝達におけるｐ３８γ誘発性tauリン酸化の一時的なプロファイルは、未知のままであった。短期インビトロキナーゼ反応に関する組換えtauを用いて、我々は、利用可能なリン酸化部位特異的抗体を使用して、一定範囲のＳＰ及びＴＰ部位のリン酸化を試験した（図１１Ａ）。tauは、セリン（Ｓ）１９９及びトレオニン（Ｔ）２０５で強くリン酸化され、そしてＳ３９６及びＳ４０４ではそれにより低くリン酸化されたが、しかし試験された他の部位ではリン酸化されなかった（図１１Ｂ）。部位特異性は、変異された部位でインビトロでｐ３８γ誘発性tauリン酸化を無効にする、Ｓ１９９，Ｔ２０５、Ｓ３９６及びＳ４０４をアラニンに個々に突然変異させることによ確認された（図１１Ｃ）。キナーゼ反応におけるtauの質量分光分析は、それらの４つの部位、及び追加の１４の低濃度部位を確認した。ｐ３８γ又はｐ３８γＣＡ及びtauの同時発現は、ｐ３８γはＴ２０５でtauを優先的にリン酸化し、そしてＳ１９９ではそれよりも低い程度であったが、しかし細胞においては、Ｓ３９６及びＳ４０４ではほとんどリン酸化しなかったことを示した（図５Ａ）。同様に、Ｔ２０５（及びそれよりも低いＳ１９９及びＳ３９６）は、ｐ３８γＣＡトランスジェニックマウスにおいてリン酸化された。リン酸化されたＴ２０５（ｐＴ２０５）は、ｐ３８γ＋／＋動物のＰＴＺ処置の後、上昇したが、しかしｐ３８γ−／−マウスにおいては実質的に消失し、ところがｐＳ１９９、ｐＳ３９６及びｐＳ４０４は、ｐ３８γ＋／＋及びｐ３８γ−／−の両マウスにおいて誘発された。同様に、ｐＴ２０５は、ＡＰｐ２３．ｐ３８γ＋／＋マウスに比較して、ＡＰＰ２３．ｐ３８γ−／−動物においては、著しく低められた。一貫して、初代ニューロンにおけるＴ２０５のリン酸化は、ｐａｎ−ｐ３８阻害剤により著しく低められたが、ところがＳ１１９リン酸化は影響されないままであった。まとめると、それらのデータは、Ｔ２０５がｐ３８γによるtauリン酸化における主要部位であることを示唆する。
【０２３３】
Ｓ１９９及びＴ２０５でのｐ３８γによるtauリン酸化の機能的関連性を決定するために、我々は、リン酸化模倣（Ｓ１９９Ｄ及びＴ２０５Ｅ）及びtau変異体の防止（Ｓ１９９Ａ及びＴ２０５Ａ）を行った。我々はまた、質量分析により同定されたすべての他の部位のリン酸化模倣変異体を調製し、そしてＰＳＤ−９５、tau及びＦｙｎと同時精製する能力についてすべての変異体を評価した。得られる結果は、図５Ｂ、５Ｃ及び図３１に示される。ＰＳＤ−９５は、Ｆｙｎ、及びＴ２０５Ｅを除くすべての変異体と同時精製した。この点に関して、Ｔ２０５Ｅは、非変異体及びＴ２０５Ａ  tauと比較して、ＰＳＤ−９５と有意に低く共沈したが、ところが、すべての他の同定された部位のすべての他のリン酸化模倣変異体は、ＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ相互作用に対する効果は有さなかった。インビトロでのマイクロスケール熱泳動及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−プルダウン、及び生存細胞における蛍光寿命イメージング顕微鏡法（ＦＬＩＭ）−蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析は、Ｔ２０５Ｅ  tauとＰＳＤ−９５との著しく損なわれた相互作用を確認した。Ｔ２０５突然変異は、tau／Ｆｙｎ相互作用を妨害しなかった。それらのデータは、Ｔ２０５でのtauのリン酸化が、ＰＳＤ−９５との相互作用を破壊するのに十分であることを示唆している。Ｔ２０５Ｅ及びＴ２０５Ａ突然変異は、tau／Ｆｙｎ相互作用を損なわなかった。重要なことには、ｐ３８γＣＡは、非変異体tauの存在下でＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体を破壊したが、しかしＴ２０５Ａtauが同時発現される場合、効果を有さなかった（図５Ｄ及びＥ）。対照的に、tauのＳ３９６又はＳ４０４変異体のホスホ模倣及び防止は、ＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ相互作用に対して効果を有さなかった（図５Ｃ）。まとめると、これは、ｐ３８γが、Ｔ２０５でのtauのリン酸化を介してＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体を調節することを示唆する。
【０２３４】
ＮＲ／ＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体の破壊は、初代ニューロン及びＡＰＰ２３マウスにおける興奮毒性及びＡβ誘発性毒性を防止した（８）。従って、Ｔ２０５でのtauのリン酸化は、Ａβ誘発性神経毒性を緩和又は軽減するはずである。これを試験するために、我々は、初代ニューロンにおいて同様のレベルで野生型、Ｔ２０５Ａ又はＴ２０５Ｅ  tauを発現するためにＡＡＶ媒介性遺伝子トランスファーを使用した（図１２）。Ａβによる挑戦は、野生型及びＴ２０５Ａにおいて細胞死を誘発したが、しかし高められたＬＤＨ放出（図５Ｆ）又はＥｔｈＤ１摂取（図１２Ａ）により示されるように、Ｔ２０５Ｅヒトtau発現海馬ニューロンにおいては、実質的ではなかった。Ｈ２Ｏ２処理は、発現されるtau変異体と無関係に、ニューロンにおいて同じレベルの細胞毒性を発揮した。ニューロンにおけるｐ３８γのレベル又は活性の上昇が同様に、Ａβ毒性からの保護を付与するかどうかを試験するために、我々は、初代ニューロンにおいてｐ３８γ、ｐ３８γＣＡ又はＧＦＰ対照を発現した（図５Ｇ及び図１３）。発現されたｐ３８γ及びｐ３８γＣＡの両者は、内在性ｐ３８γに類似して、樹状突起棘において富化した。ｐ３８γ及びより多くのｐ３８γＣＡを発現するニューロンは、対照に比較して、Ａβ誘発性細胞死に対して有意により耐性であった（図５Ｈ）。ｐ３８γもｐ３８γＣＡの発現も、Ｈ２Ｏ２−誘発性細胞死を制限しなかった。要約すると、Ｔ２０５Ｅ  tauを模倣するか、又はｐ３８γ活性を高める部位特異的リン酸化の発現は、海馬ニューロンにおけるＡβの毒性効果を緩和した。Ｔ２０ＳＥ  tau又はｐ３８γＣＡの存在下での残りのＡβ毒性は、たぶん、内在性tau、又は代替経路によるものであった（９）。
【０２３５】
高められたニューロンｐ３８γレベル及び／又は活性がインビボで興奮毒性を制限するかどうかを決定するために、我々は、新生児野生型マウスの前肢においてｐ３８γ、ｐ３８γＣＡ又はＧＦＰ対照を発現するためにＡＡＶ媒介性遺伝子トランスファーを使用し（図１４）、そして生後２ヶ月でＰＴＺによりそれらに挑戦した。インビボでのｐ３８γの発現は、ＧＦＰを発現するマウスに比較して、平均発作重症度の低下に向かう傾向を伴って、生後２ヶ月のマウスにおけるＰＴＺ誘発性発作の進行を、中程度ではあるが、有意に低められた（図５Ｉ、Ｊ及び図１５）。ｐ３８γＣＡ発現は、ＰＴＺ投与に反応して重度の発作を発症する潜伏期を大幅に高め、そして対照マウスに比較して、平均発作重症度を有意に低めた（図５Ｉ、Ｊ及び図１５）。ｐ３８γ及びｐ３８γＣＡの発現レベルは、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現から予想されるようにマウス間で変化し、そしてｐ３８γのレベルはｐ３８γＣＡのレベルよりも平均して高かった（図１４Ｂ）。興味あることには、ｐ３８γ及びｐ３８γＣＡの両者のレベル、及び発作潜伏期勾配は、正の線型相関を示し（ｐ３８γ: Ｒ２ ＝ ０．４８３、Ｐ ＝ ０．０８３２、 ｓ ＝ ６５．２３ ± ３０．２０； ｐ３８γＣＡ: Ｒ２ ＝ ０．７０７、Ｐ ＝ ０．００２３、ｓ ＝ ２１５．１ ± ４８．９６）、そしてｐ３８γ発現に対するｐ３８γＣＡの有意に明白なレベル依存性保護効果を有した（Ｆ ＝ ６．８４０７、Ｐ ＝ ０．０２１４）（図５Ｋ）。従って、インビボでの活性ｐ３８γキナーゼのレベルは、興奮毒性シグナルに対する感受性を決定する。ＡＰＰ２３．ＡＡＶｐ３８γＣＡにおける記憶障害は、モリス−水−迷路パラダイムにおいて評価される場合、ＡＡＰ２３．ＡＡＶＧＦＰマウスの記憶障害と比較して、有意に軽度であった（図１６−１８）。ＡＰＰ２３．ＡＡＶ３８γＣＡマウスは、野生型記憶能力（ＡＡＶＧＦＰ、ＡＡＶｐ３８γＣＡ）に類似する記憶能力を示した。Ｔ２０５Ｅ  tau又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）での発現ではなく、ｔａｕ−／−マウスの前頭葉におけるアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）介在性ＷＴ及びＴ２０Ａの発現は、ＰＴＺ誘発性発作を増強した（図１９）。対照的に、ＡＡＶを用いたＷＴマウス、又はＴｈｙ１．２−ｐ３８γＣＡトランスジェニックマウスにおけるｐ３８γＣＡの発現は、ＰＴＺ誘発性発作を低めた。ＡＰＰ２３マウスにおけるＡＡＶ媒介性ｐ３８γＣＡ発現は、記憶障害及びネットワーク異常を救済し（図３４−３８）；同じことが、ＡＰＰ２３とＴｈｙ．１．２−ｐ３８γＣＡトランスジェニックマウスとの交配についても真であった（図３９−４１）。要約すると、Ｔ２０５での活性ｐ３８γキナーゼ及びtauリン酸化のレベルは、興奮毒性及びＡβ毒性に対する感受性を決定した。
【０２３６】
tauは、ＡＰＰトランスジェニックマウスにおける欠損の重要なメディエーターであり（７，８）、そしてtauは、異常にリン酸化されるようになることによりニューロン中のＡβの有害なシグナルを伝達することが示唆されている（４、２７）。ここで、我々は、tauが、興奮毒性及びＡβ毒性を阻害するためにｐ３８γにより介在されるＴ２０５でのリン酸化を含む、固有の分子経路の一部であることを示す。我々は、ｐ３８γによりリン酸化されている、さらなる非試験部位を正式に除外することはできないが、Ｔ２０５Ａ／Ｅ  tauによる我々のデータは、Ｔ２０５でのリン酸化が後シナプスＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎ複合体の調節に重要であることを示唆している。tauは、ｐ３８γ枯渇がtau／−．ｐ３８γ−／−マウスにおける発作を悪化させなかったので、ｐ３８γの毒性制限効果のために必要とされる。他のキナーゼは、疾患において又は生理学的にtauとのＴ２０５を標的にするかも知れないが（２８―３０）、後シナプスでの複合体におけるＰＳＤ−９５、tau及びｐ３８γの非常に明確な局在化は、シナプスＮＲ活性化の下流のｐ３８γの特異的且つ空間的に区画化された役割を示す。
【０２３７】
異なる役割が他のｐ３８キナーゼについて特徴づけられて来たが、ｐ３８γの機能は依然として支持されてない。ここで、我々の研究は、ＡＤマウスにおけるtau媒介性Ａβ毒性、記憶障害及び生存性へのその関与を示すことにより、脳におけるｐ３８γの前例のない機能を示した。後シナプスにおけるその明確な空間的発現、及びニューロン発現されたｐ３８α／βに比較してのユニーク配列特徴は、ニューロンにおけるｐ３８γの非冗長機能に寄与する可能性が高い。ｐ３８α／βは、興奮性（１１）及びＡβ毒性（１２、１３）の下流のメディエーターとして記載されている。従って及び重用なことには、本明細書において我々が記載する興奮性及びＡβ毒性におけるｐ３８γ機能は、ｐ３８α／βとは異なり、且つそれとは反対である。
【０２３８】
要約すると、我々の研究は、Ｔ２０５でのtauのリン酸化がＡβ毒性阻害応答の一部であることを示唆している。それは、Ａβ毒性の下流のtauリン酸化が純粋に病理学的応答であるという現在の見解に反している（２７）。しかしながら、tauが、ＮＲシグナル伝達を含む可能性があるニューロンにおける正常な生理学的シグナル伝達事象に関与するという考えと一致する（９）。最終的に、我々は、tauの部位特異的リン酸化及び後シナプスＰＳＤ−９５／tau／Ｆｙｎに複合体の制御によりtau依存性興奮毒性を調節する、前例のないＡβ毒性制限因子としてｐ３８γを同定した。これは、早期ＡＤ病因に関与する後シナプスプロセスに新なる洞察を提供し、そして未来の薬物開発に寄与することができる。
【０２３９】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８−１】
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【図４８−２】
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【図４８−３】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【図４９−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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