(57)【要約】キメラポリオウイルスは、抗原提示細胞を活性化することができる。この抗原提示細胞の活性化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏであってもよい。活性化抗原提示細胞は、単独で、又は抗原若しくはワクチンと共に投与され得る。活性化抗原提示細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで抗原担持して、抗原担持活性化抗原提示細胞を形成し得る。これらは、治療的に投与され得る。抗原提示細胞の治療的投与は、他の治療法に対するアジュバントとして使用され得る。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞を活性化するための方法であって、
抗原提示細胞と、抗原提示細胞を活性化するために有効な量のキメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡとを接触させる段階
を含み、
前記接触させる段階が、ｅｘ  ｖｉｖｏで又は経皮的に行われる、方法。
【請求項２】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原提示細胞と抗原とを接触させる段階を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
単離された抗原提示細胞と、前記抗原提示細胞を活性化するために有効な量のキメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡとをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる段階を含む、抗原提示細胞を活性化するための方法。
【請求項８】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子と接触させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡと接触させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原提示細胞と抗原とを接触させる段階を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原提示細胞を、キメラポリオウイルスとの接触に先立って、抗原と接触させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原提示細胞を、抗原との接触に先立って、キメラポリオウイルスと接触させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原提示細胞と、キメラポリオウイルス及び抗原とを同時に接触させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
免疫療法を行う方法であって、
抗原を担持している活性化抗原提示細胞を個体に投与する段階
を含み、
抗原提示細胞と、前記抗原提示細胞を活性化するために有効な量のキメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡとを接触させることによって、前記抗原提示細胞が作製される、方法。
【請求項１７】
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子と接触させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡと接触させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗原が病原体に由来し、前記病原体が細菌、ウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原が、前記抗原提示細胞に対するｍＲＮＡの導入によって担持される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原が、前記抗原提示細胞と前記抗原とを接触させることによって担持され、前記抗原がタンパク質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原が、前記抗原に対する結合特異性を有する抗体に結合されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗原を含む細胞溶解物が前記樹状細胞の負荷に使用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
疾患を治療する方法であって、
抗原提示細胞と、前記抗原提示細胞を活性化するために有効な量の（ａ）キメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡ、及び（ｂ）抗原とを接触させることによって作製される活性化抗原提示細胞を個体に投与する段階
を含む、方法。
【請求項２７】
前記樹状細胞を、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子と接触させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡと接触させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原が病原体に由来し、前記病原体が細菌、ウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗原が核酸分子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸分子がｍＲＮＡを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗原がタンパク質を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記タンパク質が、前記抗原に対する結合特異性を有する抗体に結合されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
抗原が細胞溶解物に含まれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患が感染性疾患を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患ががんである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
細菌性病原体の抗原、病原性寄生生物の抗原、非ポリオウイルスの抗原、及び腫瘍抗原からなる群から選択される抗原と、
キメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡを含むアジュバントと
を含む、免疫原性組成物。
【請求項４０】
前記アジュバントが、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子を含む、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
前記アジュバントが、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡを含む、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項４１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
前記抗原が病原体に由来し、前記病原体が細菌、非ポリオウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
前記抗原が核酸分子を含む、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
前記核酸分子がｍＲＮＡを含む、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
前記抗原がタンパク質を含む、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
前記タンパク質が、前記抗原に対する結合特異性を有する抗体に結合されている、請求項４７に記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
抗原が細胞溶解物に含まれる、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
ワクチンにおける使用のための、請求項５０に記載の免疫原性組成物。
【請求項５２】
請求項３９に記載の免疫原性組成物を個体に投与する段階を含む、免疫応答を誘発する方法。
【請求項５３】
前記免疫原性組成物が薬学的に許容可能な担体と共に投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫原性組成物が経皮投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗原提示細胞をヒト対象に投与する段階を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項５６】
前記接触させる段階がｅｘ  ｖｉｖｏで行われ、前記方法が、前記抗原提示細胞をヒト対象に投与する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
粘膜又は皮膚において抗原提示細胞を活性化するのに有効な量のキメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡを、ヒトの粘膜又は皮膚に直接送達する段階
を含む、抗原提示細胞を活性化するための方法。
【請求項５８】
送達が前記粘膜に対するものであり、前記粘膜が前記ヒトの肺にある、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
送達が前記粘膜に対するものであり、前記粘膜が前記ヒトの胃にある、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
送達が前記粘膜に対するものであり、前記粘膜が前記ヒトの鼻にある、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
送達が前記粘膜に対するものであり、前記粘膜が前記ヒトの腸にある、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
送達が前記粘膜に対するものであり、前記粘膜が細胞学的に正常な粘膜である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
送達が前記皮膚に対するものであり、前記皮膚が細胞学的に正常な皮膚である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記ヒトが、多病巣性又は転移性の病変を有する、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年６月２９日付で出願された米国特許出願第６２／３５６，０１２号の利益を主張する。その特許出願の内容は、本明細書に明確に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、感染しかつ抗原提示細胞を活性化することができる、弱毒化キメラポリオウイルスに関する。より具体的には、本発明は、免疫応答を賦活化するための治療的な組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
樹状細胞及びマクロファージ等の抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）は、生得免疫及び獲得免疫の誘導において重要な役割を果たす。樹状細胞は最も強力なＡＰＣであり、獲得免疫応答においてＴ細胞応答及びＢ細胞応答を調和させる。樹状細胞の活性化及び成熟のための刺激、並びに樹状細胞の活性化の種類は、活性化樹状細胞によって誘導される免疫応答の持続性及び種類を含む、樹状細胞の抗原提示機能に直接影響する。現在、樹状細胞ワクチンは、血液からＣＤ３４＋前駆細胞を濃縮すること、未熟な樹状細胞を形成するためｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々なサイトカインの組み合わせ（例えば、ＴＮＦαとＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦα）と該細胞をインキュベートすること、未熟な樹状細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々なサイトカインカクテル（例えば、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６及びＰＧＥ２；又はＩＦＮγ；又はＰＧＥ２、ＴＮＦα、及びガラクトシルセラミド）と共にインキュベートして成熟樹状細胞を生成すること、並びに成熟樹状細胞と抗原をｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートして樹状細胞ワクチンを含む抗原担持樹状細胞を産生することを含む。
【０００４】
当該技術分野において、樹状細胞及び他の抗原産生細胞を活性化して、強力で永続的な獲得免疫応答を誘導するワクチンを産生する他の手段が今も必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
マクロファージ及び樹状細胞等の抗原提示細胞は、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ、又はＮｅｃｌ−５、又はＣＤ１５５として知られている）を発現し、ポリオウイルスの１型株、及びセービン１ワクチン株に非常に感染しやすい。ウイルスの最大細胞結合性力価は、感染後数時間以内に起こる。細胞死及び溶解が続いて起こる（例えば、感染後２４時間〜３６時間）。しかしながら、そのクローバーリーフ構造とオープンリーディングフレームの間の、ポリオウイルスの５’非翻訳領域に挿入された外来ヌクレオチド配列（すなわち、ポリオウイルス以外の起源に由来する）を有するキメラポリオウイルス、例えばポリオウイルスのセービン型Ｉ株は、異なって作用する。驚いたことに、感染する抗原提示細胞に対して細胞病原性である野生型１型ポリオウイルス及びセービン１ワクチン株と異なり、ＰＶＳＲＩＰＯによって例示されるキメラポリオウイルスは、感染して、細胞毒性なしに抗原提示細胞（成熟を含む）を活性化することが発見された。
【０００６】
抗原提示細胞を活性化するための方法及び組成物を提供する。
【０００７】
活性化抗原提示細胞を使用して免疫応答を誘導するための方法及び組成物を提供する。
【０００８】
本発明の一態様は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで、活性化抗原提示細胞を含む組成物であり、活性化抗原提示細胞はキメラポリオウイルスを含む。そのクローバーリーフ構造とオープンリーディングフレームの間の、ポリオウイルスの５’非翻訳領域中にヒトライノウイルス２型配列内リボソーム進入部位を有するキメラポリオウイルスは、任意で、ポリオウイルスのセービンＩ型株を含み得る。活性化抗原提示細胞は、キメラポリオウイルスに感染してもよく、又はキメラポリオウイルスに由来するＲＮＡで形質導入されてもよい。
【０００９】
本発明の一態様は、単離された抗原提示細胞にキメラポリオウイルスを導入することを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞を活性化する方法である。一態様では、キメラポリオウイルスは、そのクローバーリーフ構造とオープンリーディングフレームの間の、ポリオウイルスの５’非翻訳領域中にヒトライノウイルス２型配列内リボソーム進入部位を有する、ポリオウイルスのセービンＩ型株を含む。抗原提示細胞へのキメラポリオウイルスの導入は、ウイルスとしてキメラポリオウイルスによる感染によってもよく、又はキメラポリオウイルスに由来するＲＮＡによる形質導入によってもよい。当該技術分野において抗原提示細胞の成熟について先に知られている方法であることから、サイトカインカクテルにおける抗原提示細胞の成熟は必要ではない。
【００１０】
本発明の一態様は、活性化抗原提示細胞及び抗原を含む、組成物又は組み合わせであり、活性化抗原提示細胞は、キメラポリオウイルスを含む抗原提示細胞を含む。一態様では、キメラポリオウイルスは、そのクローバーリーフ構造とオープンリーディングフレームの間の、ポリオウイルスの５’非翻訳領域中にヒトライノウイルス２型配列内リボソーム進入部位を有する、ポリオウイルスのセービンＩ型株を含む。抗原は免疫原を含み得る。キメラポリオウイルスは、感染性のウイルスを含んでもよく、又はキメラポリオウイルスから単離されたＲＮＡを含んでもよい。
【００１１】
本発明の一態様は、抗原又は免疫原性薬剤、及びキメラポリオウイルスを含むアジュバントを含む皮膚送達用組成物である。キメラポリオウイルスは、そのクローバーリーフ構造とオープンリーディングフレームの間の、ポリオウイルスの５’非翻訳領域中にヒトライノウイルス２型配列内リボソーム進入部位を有する、ポリオウイルスのセービンＩ型を含み得る。該組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含み得る。皮膚の送達は、任意で蓄積注射を含んでもよく、任意で、上記組成物がそこから周辺組織によって徐々に吸収される、油、エマルジョン、ゲル、半固形、粘稠液、ポリマー、マイクロ粒子等を含む薬学的に許容可能な担体を利用してもよい。これらの担体は、蓄積注射ではない注射と比較して、抗原提示細胞が抗原性又は免疫原性の薬剤に曝露される時間を延長し得る。キメラポリオウイルスを含むアジュバントは、抗原提示細胞に感染することができ、抗原の存在下で、抗原に対して免疫応答が生成されるように（生体又は抗原を持つ細胞を含む）、それらを活性化することができる。組成物を経皮投与する方法は、抗原に関してレシピエントにワクチン接種し得る。
【００１２】
本発明の一態様は、個体において免疫原性組成物に対する免疫応答を誘発する方法である。該方法は、個体の皮膚の皮膚コンパートメントへ免疫原性組成物を送達することを含む。免疫原性組成物は、キメラポリオウイルスを含む抗原及びアジュバントを含む。一態様では、キメラポリオウイルスは、そのクローバーリーフ構造とオープンリーディングフレームの間の、ポリオウイルスの５’非翻訳領域中にヒトライノウイルス２型配列内リボソーム進入部位を有する、ポリオウイルスのセービンＩ型株を含む。一態様では、免疫原性組成物はワクチンである。
【００１３】
本発明の一態様は、その後、共に製剤化されて免疫原性組成物を産生し得る別々の成分として抗原及びキメラポリオウイルスを含むアジュバントを含む、免疫原性組成物である。一態様では、そのクローバーリーフ構造とオープンリーディングフレームの間の、ポリオウイルスの５’非翻訳領域中にヒトライノウイルス２型配列内リボソーム進入部位を有するキメラポリオウイルスは、ポリオウイルスのセービンＩ型株を含む。一態様では、免疫原性組成物はワクチン組成物である。単離された免疫原性組成物は、その成分をｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで合わせることにより産生され得る。
【００１４】
本発明の一態様は、本明細書に記載される本発明の免疫原性組成物を備えるキットである。幾つかの態様では、本発明は、本発明の組成物の１以上の成分、例えば、抗原及び／又はキメラポリオウイルスを含むアジュバントで充填された１以上の容器を備えるキットを提供する。別の態様では、キットは、２つの容器を備え、１つは抗原を含み、他方はキメラポリオウイルスを含むアジュバントを含む。キットは、経皮投与デバイス及び皮膚ワクチン製剤を更に含んでもよい。キットは、該キットの内容物の再構成、投与、輸送、又は使用を容易にするための１以上の成分を更に含んでもよい。
【００１５】
本発明の一態様は、抗原提示細胞を活性化し抗原担持させる方法である。抗原提示細胞は、抗原及びキメラポリオウイルスと接触される。一態様ではキメラポリオウイルスは、そのクローバーリーフ構造とオープンリーディングフレームの間の、ポリオウイルスの５’非翻訳領域中にヒトライノウイルス２型配列内リボソーム進入部位を有する、ポリオウイルスのセービンＩ型株を含む。キメラポリオウイルスは、感染性ウイルス（ウイルス粒子）を含んでもよく、又はキメラポリオウイルスに由来するＲＮＡを含んでもよい。活性化され、抗原を担持している抗原提示細胞は、個体において免疫応答を誘導する手段として、又は抗原が関連する疾患の治療の手段として個体に投与され得る。
【００１６】
本発明の一態様は、個体に有効な量の免疫原性組成物を投与することを含む、個体を治療する方法である。免疫原性組成物は、抗原及びキメラポリオウイルスを含む。一態様では、そのクローバーリーフ構造とオープンリーディングフレームの間の、ポリオウイルスの５’非翻訳領域中にヒトライノウイルス２型配列内リボソーム進入部位を有するキメラポリオウイルスは、ポリオウイルスのセービンＩ型株を含む。キメラポリオウイルスは感染性ウイルスを含んでもよく、又はキメラポリオウイルスに由来するポリオウイルスＲＮＡを含んでもよい。一態様では、免疫原性組成物の成分は、同時に又は順次に投与され得る。一態様では、治療はワクチン接種を含む。別の態様では、免疫原性組成物はワクチン組成物を含む。
【００１７】
本明細書に定起用される方法及び組成物について、上記抗原は腫瘍抗原、又は病原体抗原（例えば細菌抗原、寄生虫抗原、ウイルス性抗原）、又は自己免疫疾患抗原を含み得る。幾つかの実施の形態においてウイルス抗原は、ポリオウイルス抗原ではなく、他の非ポリオウイルス抗原である。
【００１８】
個体の治療を含む方法及び組成物について、個体は、疾患を予防するために治療され得るか、又は疾患を治療し得る。疾患は、がん病原性感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、ウイルス感染又は自己免疫疾患であってもよい。典型的には、疾患は灰白髄炎ではない。
【００１９】
抗原提示細胞を含む組成物が個体に投与される方法に対して、抗原提示細胞は個体に対して適合性であるか、又は処理されて適合性となる。典型的には、細胞は自己由来であるが、同種異型であるか、そうでなければ免疫学的に適合するように作製される。
【００２０】
本発明の一態様は、腫瘍を有する若しくは腫瘍を有することが疑われる、又は腫瘍を発症するリスクが高い個体において抗腫瘍免疫応答を含む免疫応答を誘発する、強化する、又は誘導する方法である（例えば、腫瘍の予測リスクについて、商業的に入手可能な遺伝子検査を使用して特定される）。上記方法は、個体に、キメラポリオウイルスを含有する抗原提示細胞を含む、有効な量の組成物を投与することを含む。一態様では、キメラポリオウイルスは、そのクローバーリーフ構造及びオープンリーディングフレームの間の、ポリオウイルスの５’非翻訳領域中にヒトライノウイルス２型配列内リボソーム進入部位を有する、ポリオウイルスのセービンＩ型株を含む。抗原提示細胞は、腫瘍抗原（腫瘍関連抗原を含む）を担持している抗原提示細胞を更に含む。
【００２１】
本発明の他の態様、目的及び特徴は以下の記載から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】そのクローバーリーフ構造（「クローバーリーフ」）とオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」、黒色太線）の間の、ポリオウイルスの５’非翻訳領域中にヒトライノウイルス２型配列内リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）を有する、セービン型Ｉ株のポリオウイルスを含むキメラポリオウイルスの概略図である。
【図２Ａ】指定の感染多重度（ＭＯＩ）のキメラポリオウイルスで感染した後７２時間に亘る、ヒト腫瘍細胞株ＤＭ６（▲）及びＭＤＡ−ＭＢ２３１（▼）、並びにヒト樹状細胞（「ＤＣ」；●、■）の溶解の割合（％）を示すグラフである。
【図２Ｂ】指定の感染多重度（ＭＯＩ）のキメラポリオウイルスで感染した後７２時間に亘る、ヒト腫瘍細胞株ＤＭ６（▲）及びＭＤＡ−ＭＢ２３１（▼）、並びにヒト樹状細胞（「ＤＣ」；■）のウイルス産生（プラーク形成単位；ｐｆｕ）を示すグラフである。
【図２Ｃ】キメラポリオウイルスで感染した後、８時間、２４時間、４８時間及び７２時間における、様々なタンパク質（ｅＩＦ４Ｇ、２ＢＣ、２Ｃ、ＭＤＡ５、ｐ−ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、ＳＴＡＴ１、ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５、ＴＡＰ１、ＣＤ４０、ＰＤ−Ｌ１及びチューブリン）の発現を示すヒト樹状細胞の免疫ブロット法である。
【図３Ａ】処理なし（Ｍ）、又はキメラポリオウイルス（「ＰＶ」；ＭＯＩ＝１０）、又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、又はポリ（Ｉ：Ｃ）（「ｐＩＣ」（１０μｇ／ｍｌ））、又は成熟サイトカインカクテル（「ＣＣ」、ＴＮＦ−α、１０ｎｇ／ｍｌ；  ＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−６、１０００Ｕ／ｍｌ；及びＰＧＥ２、１μｇ／ｍｌ）による処理の後、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、８６時間及び１２０時間における様々なタンパク質（ｐ−ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、ＳＴＡＴ１、ＩＦＩＴ１、ＴＡＰ１及びチューブリン）の発現を示す、ヒト樹状細胞溶解物の免疫ブロットである。
【図３Ｂ】処理なし（Ｍ、●）、又はキメラポリオウイルス（ＰＶＲＩＰＯ、★）、又はＬＰＳ（▲）、又はポリ（Ｉ：Ｃ）（「ｐＩＣ」（■））による処理の後、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、８６時間及び１２０時間における、ＥＬＩＳＡによって測定される、ヒト樹状細胞によって分泌されたＩＦＮ−βの濃度を示すグラフである。
【図３Ｃ】処理なし（Ｍ、●）、又はキメラポリオウイルス（ＰＶＲＩＰＯ、★）、又はＬＰＳ（▲）、又はポリ（Ｉ：Ｃ）（「ｐＩＣ」（■））による処理の後、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、８６時間及び１２０時間における、ＥＬＩＳＡによって測定される、ヒト樹状細胞によって分泌されたＩＬ−１２の濃度を示すグラフである。
【図３Ｄ】処理なし（Ｍ、●）、又はキメラポリオウイルス（ＰＶＲＩＰＯ、★）、又はＬＰＳ（▲）、又はポリ（Ｉ：Ｃ）（「ｐＩＣ」（■））による処理の後、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、８６時間及び１２０時間における、ＥＬＩＳＡによって測定される、ヒト樹状細胞によって分泌されたＴＮＦ−αの濃度を示すグラフである。
【図３Ｅ】処理なし（Ｍ、●）、又はキメラポリオウイルス（ＰＶＲＩＰＯ、★）、又はＬＰＳ（▲）、又はポリ（Ｉ：Ｃ）（「ｐＩＣ」（■））による処理の後、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、８６時間及び１２０時間における、ＥＬＩＳＡによって測定される、ヒト樹状細胞によって分泌されたＩＬ−１０の濃度を示すグラフである。
【図４Ａ】ＤＭ６メラノーマ細胞（ＤＭ６ＣＭ）から採取された細胞培養培地又は細胞培養培地単独において４８時間インキュベートされ、その後処理なし（モック）、又はキメラポリオウイルス（ＰＶＳＲＩＰＯ）若しくはポリ（Ｉ：Ｃ）で処理されたヒト樹状細胞によって、細胞活性化マーカーＣＤ８６（黒色バー）、ＣＤ８０（白色バー）及びＣＤ４０（斜線バー）を発現する樹状細胞の割合（％）を示す棒グラフである。
【図４Ｂ】ＤＭ６メラノーマ細胞（ＤＭ６ＣＭ）から採取された細胞培養培地又は細胞培養培地単独において４８時間インキュベートされ、その後、処理なし（モック）、又はキメラポリオウイルス（ＰＶＳＲＩＰＯ）若しくはポリ（Ｉ：Ｃ）で処理されたヒト樹状細胞から分泌された、ＥＬＩＳＡによって測定されるＩＦＮ−βの量を示す棒グラフである。
【図４Ｃ】ＤＭ６メラノーマ細胞（ＤＭ６ＣＭ）から採取された細胞培養培地又は細胞培養培地単独において４８時間インキュベートされ、その後、処理されない（モック）か、又はキメラポリオウイルス（ＰＶＳＲＩＰＯ）若しくはポリ（Ｉ：Ｃ）で処理されたヒト樹状細胞によって分泌された、ＥＬＩＳＡによって測定されるＩＬ−１２の量を示す棒グラフである。
【図４Ｄ】ＤＭ６メラノーマ細胞（ＤＭ６ＣＭ）から採取された細胞培養培地又は細胞培養培地単独において４８時間インキュベートされ、その後、処理されない（モック）か、又はキメラポリオウイルス（ＰＶＳＲＩＰＯ）若しくはポリ（Ｉ：Ｃ）で処理されたヒト樹状細胞から分泌された、ＥＬＩＳＡによって測定されるＴＮＦ−αの量を示す棒グラフである。
【図５Ａ】処理なし（Ｍ）、又はキメラポリオウイルス（「ＰＶ」；ＭＯＩ＝１０）による処理、又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ／ｍｌ）の組み合わせ（「ＬＰＳ＋ｐＩＣ」）による処理の後、２４時間及び７２時間における、様々なタンパク質（ｅＩＦ４Ｇ、＊ｅＩＦ４Ｇ（Ｃｔ）、２ＢＣ、２Ｃ、ＭＤＡ５、ｐ−ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）、ＳＴＡＴ１、ＩＦＩＴ１、ＴＡＰ１、ＩＬ１−β、ＣＤ３６、及びチューブリン）の発現を示す、マクロファージコロニー刺激因子（「ＭＣＳＦ」）単独であるいはＭＣＳＦ＋ＩＬ１０、ＩＬ−４、ＴＧＦ−βによって分化したマクロファージの溶解物の免疫ブロットである。
【図５Ｂ】処理なし（「モック」；黒色バー）、又はキメラポリオウイルス（「ＰＶＳＲＩＰＯ」；ＭＯＩ＝１０；斜線バー）による処理、又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ／ｍｌ）の組み合わせ（「ポリ（ＩＣ）＋ＬＰＳ」；白色バー）による処理の後、２４時間及び７２時間における、マクロファージコロニー刺激因子（「ＭＣＳＦ」）単独であるいはＭＣＳＦ＋ＩＬ１０、ＩＬ４、ＴＧＦ−βによって分化したマクロファージからＥＬＩＳＡによって測定される、分泌されたＩＦＮ−βの量を示す棒グラフである。
【図５Ｃ】処理なし（「モック」；黒色バー）、又はキメラポリオウイルス（「ＰＶＳＲＩＰＯ」；ＭＯＩ＝１０；斜線バー）による処理、又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ／ｍｌ）の組み合わせ（「ポリ（ＩＣ）＋ＬＰＳ」；白色バー）による処理の後、２４時間及び７２時間における、マクロファージコロニー刺激因子（「ＭＣＳＦ」）単独であるいはＭＣＳＦ＋ＩＬ１０、ＩＬ４、ＴＧＦ−βによって分化したマクロファージからＥＬＩＳＡによって測定される、分泌されたＴＮＦ−αの量を示す棒グラフである。
【図６Ａ】自己由来（樹状細胞に関して）又はＭＨＣが一致した（腫瘍細胞に関して）ＳＭ１４９の腫瘍溶解物パルス−自己由来ＤＣで刺激したエフェクターヒトＴ細胞によって媒介される、ＳＵＭ１４９ヒト腫瘍細胞（斜線バー）、ＥＧＦＲ  ＲＮＡ（陽性対照；（黒色バー））をトランスフェクトした自己由来ヒト樹状細胞（「ＤＣ」）、及びＰＳＡ  ＲＮＡ（陰性対照；（白色バー））をトランスフェクトした自己由来ヒト樹状細胞（「ＤＣ」）の、溶解の割合（％）を示す棒グラフである。
【図６Ｂ】自己由来（樹状細胞に関して）又はＭＨＣが一致した（腫瘍細胞に関して）ＬＮＣａＰの腫瘍溶解物パルス−自己由来ＤＣで刺激したエフェクターヒトＴ細胞によって媒介される、ＬＮＣａＰヒト腫瘍細胞（斜線バー）、ＰＳＡ  ＲＮＡ（陽性対照；（黒色バー））をトランスフェクトした自己由来ヒト樹状細胞（「ＤＣ」）、及びＥＧＦＲ  ＲＮＡ（陰性対照；（白色バー））をトランスフェクトした自己由来ヒト樹状細胞（「ＤＣ」）の、溶解の割合（％）を示す棒グラフである
【図６Ｃ】自己由来（樹状細胞に関して）又はＭＨＣが一致した（腫瘍細胞に関して）ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍溶解物パルス−自己由来ＤＣで刺激したエフェクターヒトＴ細胞によって媒介される、ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト腫瘍細胞（斜線バー）、ＣＥＡ  ＲＮＡをトランスフェクトした自己由来ヒト樹状細胞（「ＤＣ」）（陽性対照；（黒色バー））、及びＭＡＲＴ  ＲＮＡをトランスフェクトされた自己由来のヒト樹状細胞（「ＤＣ」）（陰性対照；（白色バー））の、溶解の割合（％）を示す棒グラフである。
【図６Ｄ】自己由来（樹状細胞に関して）又はＭＨＣが一致した（腫瘍細胞に関して）ＳＭ１４９腫瘍溶解物パルス−自己由来ＤＣで刺激したエフェクターヒトＴ細胞によって媒介される、ＤＭ６ヒト腫瘍細胞（斜線バー）、ＭＡＲＴ  ＲＮＡをトランスフェクトした自己由来ヒト樹状細胞（「ＤＣ」）（陽性対照；（黒色バー））、及びＣＥＡ  ＲＮＡをトランスフェクトした自己由来ヒト樹状細胞（「ＤＣ」）（陰性対照；（白色バー））の、溶解の割合（％）を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の明細書の説明において使用される用語は薬学の分野における当業者によって十分に理解されると考えられるが、本発明の説明を容易にし、該用語の使用に対する実例を提供するため、本明細書に提供される定義を述べる。
【００２４】
本明細書で使用される「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、明らかに単数が指示されない限り、「１以上」を意味する（例えば、単数は、例えば「単一の製剤」の句で明白に指示される）。
【００２５】
本明細書で使用される用語「第１」及び「第２」は、明細書からより明確になるように、２つの化合物、又は２つの組成物を区別する目的である。
【００２６】
本明細書で使用される用語「キット」は、キメラポリオウイルス又は抗原等が包装された成分の組み合わせを指し、キットの成分の再構成、投与、送達、又は使用を容易にするための１以上の成分を更に含み得る。
【００２７】
本明細書で使用される用語「誘発する」、「強化する」、「促進する」、又は「誘導する」は、治療後の免疫応答等の治療効果を増加させること又は媒介することを意味するために使用される。例えば、本明細書で提供される組成物による治療は、組成物の単一の成分による単剤療法と比較した場合に、より大きな治療効果を媒介、促進、又は誘導し得る。
【００２８】
キメラポリオウイルスは、そのクローバーリーフ構造とオープンリーディングフレームの間の、ポリオウイルス５’非翻訳領域中に、ヒトライノウイルス配列内リボソーム進入部位に由来するセグメントを含む、任意のポリオウイルスである。かかるキメラポリオウイルスは、セービンワクチン株のように、安全のため弱毒化され、神経毒性を欠くことが好ましい。配列内リボソーム進入部位は、任意のヒトライノウイルス又は他の好適なウイルスに由来し得る。また、樹状細胞等の抗原提示細胞に感染した場合に、細胞毒性が欠如していることも好ましい。
【００２９】
ウイルスは、そのネイキッドゲノム核酸、その処理されたゲノム核酸、そのトランスクリプトーム（ｍＲＮＡからなる）、又はそのウイルス粒子形態を使用して標的細胞に投与され、送達され、又はそれと接触され得る。感染は、抗原提示細胞を活性化するのに必要とされ得るように思われる。しかしながら、感染に満たない状態が必要とされる場合には、キメラポリオウイルスのプロテオームが有効な場合がある。
【００３０】
任意の形態のウイルスＲＮＡを使用して細胞にトランスフェクトし得る。ＲＮＡは、二本鎖ゲノム（複製形態）、一本鎖ゲノム、又はサブゲノムのＲＮＡであってもよい。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子として処理され得る。ＲＮＡは、変更されたコドン、例えば、最適化されているがなおもウイルスタンパク質をコードするコドンを有し得る。上記方法で使用されるＲＮＡは、ウイルス粒子から得られるＲＮＡ、又はウイルス粒子中にパッケージされない細胞において産生されるＲＮＡであってもよい。
【００３１】
本明細書で使用される、投与又は組成物によるワクチン接種に関する用語「皮膚の」及び「経皮的（に）」は、皮膚の１以上の層又はコンパートメントへの導入を意味するために使用される。かかる投与は、典型的には、表皮若しくは真皮のいずれかに対し、又は表皮層と真皮層の間に対する。これは、限定されないが、注射プロセスを含む当該技術分野で知られている任意の方法による投与、又は局所塗布によって行われ得る。例えば局所塗布に関し、当該技術分野で知られている方法を使用して、微量の剥離処置は表皮層を除去して、治療領域へのＤＣを動員するのに十分な炎症を生成し得る。本明細書に提供される組成物は、その後、本明細書に提供されるワクチン接種若しくは免疫化のプロセスにおいて、又は免疫応答の誘導において治療領域に局所塗布され得る。一態様では、経皮投与される免疫原性組成物は、個体皮膚の皮内コンパートメントに対して、好ましくは選択的且つ特異的な、免疫原性組成物の標的指向的な送達に対して設計される。
【００３２】
皮膚、又は例えば鼻、胃、肺若しくは腸の粘膜への投与は、直接的な又は標的指向的な方法によって遂行され得る。かかる投与は全身投与ではなく、むしろ身体の標的部位における医薬（キメラポリオウイルス等）の直接的な点滴注入を含み得る。上記投与は、代替的には、局所、皮内又は皮下の投与を含む。直接の又は標的指向的な投与は、例えば、鼻内スプレーによって、内視鏡によって、又は気管支鏡によって遂行され得る。抗原提示細胞、特に樹状細胞を有する身体の他の部位もまた標的指向され得る。血液中の抗原提示細胞に接近するため、キメラポリオウイルス又はキメラポリオウイルスを使用して作製された等の医薬は、全身投与され得る。全身投与は、例えば、多巣性又は転移性の病変にアクセスするために使用され得る。他の播種性疾患もまた、この方法で治療され得る。
【００３３】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容可能な担体」は、本明細書に記載される組成物又は組み合わせの投与、送達、製剤化、保存、安定性のいずれか１以上において有用な任意の化合物又は組成物又は担体媒質を意味する。これらの担体は、当該技術分野で知られており、限定されないが、薬学技術において広く知られている希釈剤、水、生理食塩水、好適なビヒクル（例えば、リポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子、エマルジョン、カプセル）、バッファー、トラッキング剤、医療用非経口ビヒクル、賦形剤、水溶液、懸濁液、溶媒、乳剤、洗浄剤、キレート剤、可溶化剤、塩、着色剤、ポリマー、ヒドロゲル、界面活性剤、乳化剤、浸透剤、アジュバント、増量剤、防腐剤、安定剤、油、バインダー、崩壊剤、吸収剤、香料等が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用される用語「がん」又は「腫瘍」は、哺乳動物（例えばヒト）に見られる全ての種類のがん、新生物又は悪性腫瘍を指し、限定されないが、白血病、リンパ腫、癌腫及び肉腫が挙げられる。腫瘍抗原は、周囲の正常組織よりも高いレベルの、腫瘍における発現と特異的に関連するものである。代替的には、使用される腫瘍抗原は、腫瘍における体細胞突然変異によって生み出されるもの等の、腫瘍に独自に存在する抗原であってもよい。他の有用な腫瘍抗原は、ＨＰＶ等のウイルスによって引き起こされる腫瘍において発現されるウイルス抗原であってもよい。
【００３５】
本明細書で使用される用語「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒト、又は本明細書に記載される組成物、方法、治療、又は医薬を必要とするヒトを指して使用される。幾つかの実施形態では、ヒトは脳腫瘍を有しない。
【００３６】
本明細書で使用される用語「抗原」は、本明細書において免疫応答を誘導することができる分子を指す。一態様では、該分子は免疫原を含み得る。上記分子は、多糖、炭水化物、脂質、タンパク質（例えば、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、そのフラグメント（ペプチド）、又は組み換えタンパク質）、又は抗原をコードする核酸分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、発現ベクター）であってもよい。抗原は、限定されないが、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）種（結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）又はＢＣＧ等のそれと交差反応性抗原を含む種）に由来する抗原（例えば３２Ａ、３９Ａ、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ及びＴＢ１０．４）、及びボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種（例えばボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）及びボレリア・マヨニイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｍａｙｏｎｉｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅｌｉｉ）及びボレリア・ガリニイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉ））に由来する抗原（例えば外表面プロテインＡ（ＯｓｐＡ）ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、ＤｐｂＡ及びＢｂｋ３２）を含む、細菌腫に由来する抗原、放射線照射された細菌又は加熱不活性化された細菌、並びに化学的に不活性化された細菌であってもよい。抗原は、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス由来の抗原（例えばｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｒｅｖ、ｖｐｒ）、ＲＳ（呼吸器合胞体）ウイルス由来の抗原（例えばＦ糖タンパク質、Ｇ糖タンパク質）、インフルエンザウイルス由来の抗原（例えばノイラミニダーゼ、ヘマグルチニン）、単純ヘルペスウイルス（例えばｇＢ、ｇＣ、ｇＤ及びｇＥ等の糖タンパク質）由来の抗原、パピローマウイルス由来の抗原（例えばＬ１、Ｅ６、Ｅ７）、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ）由来の抗原、ジカウイルス由来の抗原（例えばＮＳ−１、Ｅ）、チクングニヤウイルス由来の抗原（例えばＮＳ１、Ｅ１、Ｅ２、Ｃ）、放射線照射されたウイルス又は加熱不活性化されたウイルス、及び化学的に不活性化されたウイルスを含むウイルスに由来し得る。抗原は寄生生物に由来してもよく、限定されないが、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種（例えばＭＳＰ−１、ＣＳＰ、ＴＲＡＰ、ＣｙＲＰＡ）、放射線照射された又は加熱不活性化された寄生生物、及び化学的に不活性化された寄生生物を含む。抗原は、突然変異遺伝子の生成物；腫瘍細胞上に過剰発現される又は異常発現される細胞表面タンパク質；腫瘍ウイルスの生成物；腫瘍胎児性抗原；異常なグリコシル化を伴う細胞表面糖脂質又は糖タンパク質；腫瘍細胞溶解物（腫瘍溶解物）；排出された腫瘍抗原（例えば、培養腫瘍細胞の細胞培養培地から収集される若しくはそこに排出された、又は腫瘍周辺の体液から収集される）、腫瘍細胞に由来するエクソソーム；腫瘍細胞から精製されたＲＮＡ；又は腫瘍抗原をコードする核酸分子を含む腫瘍抗原であってもよい。かかる抗原の例は、ＭＵＣ−１、アルファフェトプロテイン、卵巣がん抗原（ＣＡ１２５）、がん胚抗原（ＣＥＡ）、ルイス抗原、ガングリオシドＮ−グリコリル−ＧＭ３、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＥＧＦＲｖ��ｉｉ、ＲＡＧＥ−１、ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）及びＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１を含むことが当該技術分野でよく知られている。中枢神経系へ遊走する樹状細胞の能力に照らして、抗原は、アルツハイマー病（例えばＡβ１〜４２、Ａβ１〜６、Ａβ１〜４２、タウペプチドＣ−２９４〜３０５、ＡＶ−１９５９Ｒ、ＡＶ−１９８０Ｒ、ＡＶ−１９５３Ｒのペプチド）等の神経炎症性疾患等の自己免疫性疾患に関連する抗原を含み得る。使用される抗原は、典型的には、ポリオウイルス、又はポリオウイルスのセービン株、又はＰＶＳＲＩＰＯとして知られているキメラポリオウイルスの一部ではないものである。
【００３７】
本明細書で使用される用語「抗原担持」は、抗原と抗原提示細胞を互いに接触させ、抗原提示細胞による更なる処理のため抗原提示細胞への抗原の取り込みを促進するプロセスのことを指す。抗原担持のための技術は、限定されないが、抗原を有する樹状細胞をパルスすること（例えば、それとの接触又はインキュベーションによる）；並びに、抗原をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ若しくはｍＲＮＡを、電気穿孔する、トランスフェクトする、形質導入する、或いは導入すること、及び免疫複合体の担持（その抗原に結合特異性を有する抗体に結合された抗原）を含むことが当業者に知られている。
【００３８】
本明細書で使用される、感染多重度、すなわち用語「ＭＯＩ」は、感染の間、１個の細胞あたりに添加されるウイルス粒子の数を指す。例えば、１００万個のウイルス粒子が１００万個の細胞に添加される場合、ＭＯＩは１である。亜致死量（ＭＯＩ）は、標的細胞への細胞毒性を誘導しない用量である。亜致死量は、上記方法で利用される活性化を遂行するために使用され得る。何が正確なレベルか個々のキメラウイルスによって変化し得るし、細胞型によっても更に変化し得る。しかしながら、致死量以下のレベルの決定は、当該技術分野で知られている単純な方法を使用して、当業者の技術の範囲に十分含まれる。幾つかの実施形態では、致死レベルは１超、１０超、又は１００超のＭＯＩであってもよい。幾つかの実施形態では、亜致死レベルは、１未満、０．５未満、０．１未満、０．０５未満、又は０．０１未満のＭＯＩであってもよい。
【００３９】
用語「樹状細胞」は、活性化によって免疫応答を誘導することができる抗原提示細胞（ＡＰＣ）を意味することが当該技術分野で知られている。樹状細胞は単離された樹状細胞を含み得、肺、胃、鼻及び腸由来の粘膜を含む非リンパ系器官、末梢血、皮膚、及び他の組織等の樹状細胞を含む任意の供給源から単離された、樹状細胞を濃縮した又は精製された樹状細胞を含む組成物であってもよい。樹状細胞は少なくとも３つの異なった部分集団で構成され、２つは骨髄細胞系列であり、１つはリンパ／形質細胞血統である。骨髄樹状細胞は、真皮、表皮（「ランゲルハンス細胞」と称される）、胃腸粘膜、呼吸粘膜、及び脈管器官の間質を含む、ほとんどの非リンパ系臓器で見られる。皮膚の樹状細胞又は皮膚樹状細胞を指す場合、ランゲルハンス細胞（典型的にはＣＤ１Ｑｈｉｇｈ）、ＣＤ１４１ｈｉｇｈ皮膚樹状細胞及びＣＤ１ｃ＋樹状細胞が含まれる。形質細胞様樹状細胞は血液中で循環し、末梢リンパ器官に見られる。形質細胞様樹状細胞は、末梢血単核球の０．４％未満を構成し、骨髄造血幹細胞から発生する。樹状細胞は、ポリオウイルス感染に対する受容体であるＣＤ１５５を発現する。炎症性刺激に対する曝露の後、樹状細胞は、未熟な樹状細胞から成熟した樹状細胞への移行を特徴づける表現型及び機能の変化を経る。その点に関して、樹状細胞の活性化及び成熟は、共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の上方制御、ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩの細胞表面発現の増加、並びに特異的樹状細胞マーカーＣＤ８３の上方制御を特徴とする。ＣＤ８０  ＣＤ８６等の共刺激分子の発現増加はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を増幅し、Ｔ細胞活性化を促進する。樹状細胞成熟のプロセスもまた、ケモカイン、サイトカイン、及びプロテアーゼの分泌、並びに接着性分子及びケモカイン受容体の表面発現を含む。例えば、樹状細胞は、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞をＴｈ１表現型へと導くのを支援するシグナルであるＩＬ−１２を迅速に産生し始める。ケモカイン応答性の調節及び産生もまた、末梢組織から、活性化樹状細胞が、それらが抗原提示機能を発揮して獲得免疫の発生において重大な段階を提供する二次リンパ組織及び臓器へと活性化樹状細胞が遊走する能力を担う。限定されないが、樹状細胞等の抗原提示細胞は、組織又は体液から単離され得た後、本明細書に記載されるアジュバント又は免疫原性組成物を使用して活性化され得る。プロフェッショナル抗原提示細胞であるか否かにかかわらず、他の抗原提示細胞が使用され得る。プロフェッショナル抗原提示細胞としてマクロファージ及びＢ細胞が挙げられる。
【００４０】
抗原又は組成物を指して本明細書で使用される用語「免疫応答」は、個体において、抗原又は組成物中に存在する抗原に対する免疫応答の発生である。誘発される免疫応答は、液性免疫応答、細胞性免疫応答、獲得免疫応答、又はそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。免疫応答の誘発のため本明細書で提供される治療の方法は、免疫療法と称される場合がある。免疫応答を誘発するため本明細書で提供される組成物は、本明細書において、免疫原性組成物と称される場合がある。
【００４１】
本明細書で使用される用語「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、予防（予防的）、治療的（緩和の）の１つ以上の処置を包含する。病原性疾患又は感染性疾患について治療される個体として、限定されないが、細菌、ウイルス、寄生生物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される病原体によって引き起こされる感染症の治療が挙げられる。
【００４２】
本明細書で使用される「有効な量」は、かかる組成物又は組み合わせを必要とする個体に対する投与の後、所望の治療効果をもたらす組成物又は組み合わせの量を意味する。免疫療法では、治療効果は免疫応答の誘導によって表される場合がある。かかる誘導は、誘導される免疫応答の種類（複数の場合がある）（例えば液性及び／又は細胞性の免疫応答）に応じて、抗体価の増加、１以上のＴ細胞部分集団（ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞）の増加、活性化樹状細胞の増加、又は他の関連する細胞集団（例えば、Ｂ細胞、マクロファージ）における変化によって測定され得、これらは当業者に知られている方法を使用して測定され得る（例えば、検出可能なマーカーによる標識に続く免疫アッセイ又はフローサイトメトリー分析）。代替的には、免疫応答は、調節性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋、ＣＤ４＋の細胞）の数又は機能の減少によっても測定され得る。したがって、一態様では、治療効能は臨床成績、すなわち、治療前又は治療がない場合の数と比較した活性化Ｔ細胞の数の増加、抗原に対する抗体の血清力価の増加等によって判定され得る。がんの治療では、治療効果として、限定されないが、（ａ）全腫瘍負荷に対する免疫関連完全応答又は免疫関連部分応答として当業者に知られている免疫関連応答、及び（ｂ）当業者に知られている適切な応答判定基準を使用して、また治療されるがんの種類に応じた従来の全奏効率のうち１つ以上が挙げられる（例えば、リンパ腫に関してＣｈｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３２（２７）：３０５９−３０６７；固形腫瘍に関してＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）を参照されたい）。
【００４３】
本明細書に提供される組成物及び治療法のいずれかにおいて、抗原及びキメラポリオウイルスの投与量又は量は、投与様式、投与用製剤、免疫療法の種類、抗原の免疫原性、かかる組成物を受ける個体の大きさ、健康及び免疫適格性、並びに治療に適切な投薬量を決定する当業者である医療従事者によって考慮され得る他の因子等の因子に依存する。例えば、本明細書で提供される治療の方法に対して、キメラポリオウイルスは、約１×１０４ＴＣＩＤ〜約１×１０１０ＴＣＩＤ（組織培養物感染量）の範囲の投薬量、又は約０．０１〜約１０の範囲のＭＯＩで投与され得る。当業者は、本明細書に提供される治療方法において使用される組成物又は組み合わせの治療的に有効な量を決定するための前臨床及び臨床研究において、試験される投薬量の可能性のある範囲を確認するため、既知の原理、並びに薬物送達及び薬物動態のモデルを適用することができる。本明細書に提供される治療方法において有用な組成物又は組み合わせは、保管、製剤安定性、投与、及び送達の１以上を容易にするための薬学的に許容可能な担体を更に含み得る。担体は、組成物又は組み合わせが、例えば粉末又は固体の形態となり得るように、微粒子であってもよい。担体は、組成物又は組み合わせが注射され、塗布され、或いは投与され得るように、半固形、ゲル、又は液体の処方であってもよい。本明細書に提供される治療方法において有用な組成物又は組み合わせの、それを必要とする個体（ヒト等）に対する投与様式は、医薬組成物を送達するのに適した、特に免疫療法による治療に適した、当該技術分野で知られている任意の様式であってもよい。免疫療法の種類に応じて、投与は、限定されないが、腫瘍内、皮膚、皮内、腔内、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、灌流による、及び蠕動の技術によるものが含まれ得る。
【００４４】
本明細書に記載される組成物に関して、頻度、投与の順、用量及び投薬レジメンは、医学文献、個体の健康、年齢及び性別、免疫療法の種類、組成物又は組み合わせ又は治療法の投与様式及び投薬スケジュール、及び他の関連する注意事項を考慮して、内科医によって決定され得る。本明細書で提供される治療方法では、免疫原性組成物は、免疫応答を誘導するのに有効となるように好適な頻度で個体に投与され得る。例えば、免疫化又はワクチン接種は、１回の投与でもよく、又は一連の投与であってもよい。例えば、キメラポリオウイルスは、１回投与され得る、抗原と同じ頻度で投与され得る、又は抗原と異なる頻度で投与され得る。本明細書で提供される免疫原性組成物を使用する治療方法では、一例では、抗原の投与は、キメラポリオウイルスの投与に先行する。本明細書で提供される免疫原性組成物を使用する治療方法の別の例では、抗原の投与は、キメラポリオウイルスの投与と同時であるか、又は並行する。本明細書で提供される免疫原性組成物を使用する治療方法の別の例では、抗原の投与は、キメラポリオウイルスの投与に先行する。
【実施例】
【００４５】
実施例１
図１は、そのクローバーリーフ構造及びオープンリーディングフレームの間の、ポリオウイルスの５’非翻訳領域中にヒトライノウイルス２型配列内リボソーム進入部位を有する、ポリオウイルスのセービンＩ型株を含むキメラポリオウイルスのコンストラクトを示す。この図示される、ＰＶＳＲＩＰＯとしても知られているキメラポリオウイルスは、再発性膠芽腫を有する個体の第Ｉ相試験においてポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）を発現する腫瘍の治療で効能を示した。例えば、ＰＶＳ−ＲＩＰＯで治療された再発性膠芽腫を有する個体は、（２０１７年３月１日時点の）再発性膠芽腫の歴史的な対照に関する４％の３６ヶ月生存率と比較して、２１．１％の３６ヶ月生存率（９５％信頼区間）を有する。治療から５年後の再発性腫瘍の形跡がないように見える、２名の個体が存在する。ＰＶＳ−ＲＩＰＯを含むが、これに限定されない、キメラポリオウイルスを製造する方法は、当該技術分野で知られている（例えば国際公開第２０１６／２０１２２４号を参照されたい）。したがって、キメラポリオウイルスは、特にヒトでは、個体の治療での安全性を実証し、ＧＭＰ及びＦＤＡの規格に従って製造に成功している。
【００４６】
樹状細胞の単離
未熟な樹状細胞は、当該技術分野で知られている方法を使用して組織又は末梢血から単離され得る。本明細書に解説される実施例における使用のため、未熟な樹状細胞を以下のように生成した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヒト血液から単離した後、凍結した。凍結したＰＢＭＣを融解し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、Ｔ−１５０培養フラスコ中の培養培地に２×１０８細胞で再懸濁した。細胞は、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で１時間インキュベートした。非接着細胞を、培養フラスコを左右に揺り動かして細胞を移動させることによって採取した。接着細胞は、８００Ｕ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦ及び５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含む培養培地３０ｍｌで補充した後、３７℃でインキュベートした。７日間の培養期間の後、ＤＣの接着性が緩いクラスタを、フラスコを強くタッピングすることにより移動させた。接着性ＤＣは冷ＰＢＳで洗浄し、解離バッファーで処理し、１５分間〜２０分間、３７℃でインキュベートし、フラスコを強くタッピングした後、激しくピペット操作を行って採取した。採取したＤＣ調製物を合わせ、洗浄し、ペレット化し、再懸濁して未熟なＤＣの調製物をもたらした。未熟なＤＣは、フローサイトメトリー染色及び分析によってＣＤ１５５＋であることが示された。
【００４７】
キメラポリオウイルスによる樹状細胞の感染
ＣＤ１５５を発現する抗原提示細胞は、ポリオウイルスによるウイルス生産及び致死性感染に弱い。ＣＤ１５５を発現する腫瘍細胞のキメラポリオウイルス（例えばＰＶＳＲＩＰＯ）による感染が、致死性感染をもたらし、結果的に腫瘍溶解をもたらす。したがって、この実施例において示されるように、キメラポリオウイルス（例えばＰＶＳＲＩＰＯ）による樹状細胞及びマクロファージ等の抗原提示細胞の感染は、致死性感染をもたらさない（感染した樹状細胞は、キメラポリオウイルスによって殺傷されない）ことは予想外であった。さらに、本明細書の実施例２で示されるように、キメラポリオウイルスによるＤＣの感染は、感染したＤＣの活性化をもたらした。
【００４８】
この実施例では、ＣＤ１５５＋ヒト腫瘍細胞系統ＤＭ６（デュークメラノーマ６）及びＭＤＡ−ＭＢ２３１（ヒト乳腺がん）、及び未熟なヒトＤＣに各々キメラポリオウイルスを感染させた。５０万個の細胞を３５ｍｍディッシュに蒔き、細胞培養培地にキメラポリオウイルス（ＰＶＳＲＩＰＯ）を添加することによって、指定の感染多重度（「ＭＯＩ」；図２に示される）で感染させた。感染後８時間、２４時間、４８時間及び７２時間に、細胞溶解及びウイルス産生について細胞を分析した。細胞溶解は、比色測定法を使用して、培地中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の量を測定することにより評価した（ＬＤＨは、細胞死の際にのみ培養細胞の培地中に放出される細胞内酵素であり、すなわち、ＬＤＨは細胞死マーカーとして使用される）。ウイルス産生の測定のため、当該技術分野で知られている標準的なプラークアッセイを使用して、プラーク形成単位を決定した。
【００４９】
図２Ａに示され、ＬＤＨ放出によって測定されるように、ＣＤ１５５＋ヒト腫瘍細胞（▲、▼）の感染は細胞死及び溶解をもたらしたのに対し、ヒト樹状細胞（■、●）の感染は細胞死又は溶解の形跡を示さなかった。図２Ｂに示されるように、ＣＤ１５５＋ヒト腫瘍細胞（▲、▼）の感染は感染性キメラポリオウイルスの産生をもたらしたのに対し、ヒト樹状細胞（■）の感染は感染性キメラポリオウイルスの産生が最も少なかった。その後、キメラポリオウイルスに感染したヒトＤＣをゲル電気泳動法及びイムノブロッティングに供した。ウイルス細胞毒性ではなく、キメラポリオウイルスによるＤＣの感染の最も顕著な効果は、図２Ｃに示されるように、ＳＴＡＴ１のＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）リン酸化及びＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）の誘導（ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５；図２Ｃ）によって示される、ロバストで永続的なＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）反応であった。また、ＩＦＮ−βによって誘導可能である、細胞におけるＭＨＣクラスＩ拘束性抗原処理に必要とされるタンパク質、ＴＡＰ１の本質的な上方制御（図２Ｃ）が観察された。また、増強されたＤＣ活性化状態を示すこれらの変化には、ＣＤ４０の誘導が付随した（図２Ｃ）。（ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ４０等の）Ｔ細胞活性化において供受容体として作用する、キメラポリオウイルスに感染したＤＣ上の細胞表面受容体の上方制御は、免疫応答の誘導においてこれらの活性化ＤＣがＴ細胞を活性化する能力を大いに増強する。
【００５０】
本明細書では、予想外なことに、キメラポリオウイルス（例えばＰＶＳＲＩＰＯ）によるＤＣの感染は致死性の感染をもたらさず、更にキメラポリオウイルスによるＤＣの感染は、Ｉ型ＩＦＮ反応による感染したＤＣの活性化をもたらしたことが実証される。
【００５１】
実施例２
キメラポリオウイルスによる抗原提示細胞の活性化
実施例１において本明細書で提示される証拠に加えて、この実施例では、キメラポリオウイルスで感染させたＤＣの活性化の更なる証拠を解説する。ＤＣは、ナイーブ免疫細胞を刺激することができ抗原特異性免疫応答をもたらすプロフェッショナル抗原提示細胞である。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかでのＤＣの活性化が、ワクチン接種戦略の成功を強化することが示された。ＤＣワクチン又は免疫原性組成物の成功を決定する要因として、（例えば、Ｔｈ２免疫応答又はＴｈ１免疫応答を促進するため）ＤＣ活性化／炎症の継続期間と並んで、ＤＣ活性化の種類が挙げられる。ＤＣの活性化に対する現在の標準的な方法は、いずれかのサイトカインカクテル、すなわちポリ（Ｉ：Ｃ）等のＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲ３を活性化する二本鎖ＲＮＡ模倣物；又はＴＬＲ４を活性化する細菌細胞壁成分であるリポ多糖類（ＬＰＳ）への曝露を含む。これらの方法は、それらが、病原体感染と同発する更なる炎症性コンテキストを提供せずに固有の受容体１つのみを人為的に活性化することからまた、それらが一時的にのみＤＣの活性化を誘導することから、免疫応答の誘導において最適以下であってもよい。
【００５２】
ＤＣに対するキメラポリオウイルスのアジュバント効果を、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）による、又はＤＣ系ワクチンの臨床応用で使用される成熟サイトカインカクテルによる、ＴＬＲ刺激経路を介してヒトの未熟なＤＣを成熟させ活性化する標準的方法と比較した。この比較のため、未熟なヒト樹状細胞を処理しない（モック）、又はキメラポリオウイルス（ＰＶＳＲＩＰＯ；ＭＯＩ＝１０）、又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、又はポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ／ｍｌ）、又は成熟サイトカインカクテル（ＴＮＦ−α、１０ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−６、１０００Ｕ／ｍｌ；及びＰＧＥ２、１μｇ／ｍｌ）で処理した。細胞及び上清は、処理後、２４、４８、７２、９６及び１２０に採取した。細胞溶解物を、ＩＦＮ応答及びＤＣ活性化タンパク質に対する免疫ブロットによって分析した。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＤＣ上清処理後のＩＦＮ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１０を測定した（データは指定の時間点における累積的なサイトカイン放出を表す）。図３Ａに示されるように、ＴＬＲ刺激（ＬＰＳ及びポリ（Ｉ：Ｃ）、「ｐＩＣ」）によるＤＣの処理、若しくはモック処理した細胞（「Ｍ」）、又は成熟サイトカインカクテルで処理した細胞（「ＣＣ」）と比較して、キメラポリオウイルス（「ＰＶ」）によるＤＣの感染は、５日間の測定の間、強力で持続的なＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）リン酸化、及びインターフェロンによって刺激される遺伝子の誘導によって特徴付けられた。図３Ｂに示されるように、ＤＣ活性化において試験した全ての他の薬剤を超えるレベルでＩＦＮ−β放出と同時に起こった強力な１型インターフェロン応答は、ポリ（Ｉ：Ｃ）又はＬＰＳで処理したＤＣにおいては、ＩＦＮ−β放出と同様に、最小又は検出不可能のいずれかであった。また、ＤＣのキメラポリオウイルス感染は、モックのＤＣ、又はポリ（Ｉ：Ｃ）若しくはＬＰＳで処理されたＤＣと比較して、より高レベルで持続的なＩＬ−１２（図３Ｃ）及びＴＮＦ−α（図３Ｄ）と並んで、より高レベルのＩＬ−１０（図３Ｅ）の産生をもたらした。カクテルがＴＮＦ−αを含むことから、この実験においてＣＣで刺激されたＤＣはサイトカイン産生について分析しなかったが、図３Ａは、サイトカインカクテル（「ＣＣ」）で処理されたＤＣがＩ型ＩＦＮ活性を誘導する能力を欠くことを示す。
【００５３】
免疫抑制環境における抗原提示細胞の活性化
病原体は、ＤＣ成熟を干渉することによって未熟なＤＣを損なう場合がある。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの未熟なヒトＤＣの１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）感染は、それらの成熟を阻害すること、したがって、抗ウイルス性免疫応答を誘導するそれらの能力を示した。同様に、寄生生物はＤＣの成熟を干渉する場合がある。例えば、マラリア原虫である、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に感染した赤血球は、ＤＣの成熟、したがって、抗寄生生物免疫応答においてＴ細胞を活性化するそれらの能力を調節する。また、ボレリア・スピロヘータ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ）に対するＤＣ応答は、ＤＣの成熟に影響を及ぼすため獲得免疫応答を損なうダニシスタチンによって影響を受ける。また、樹状細胞活性化は、腫瘍微小環境の免疫抑制性の環境で妨げられる。この実施例では、キメラポリオウイルス（ＰＶＳＲＩＰＯ）を、免疫抑制条件に供された未熟なＤＣを活性化するそれらの能力に関して、ポリ（Ｉ：Ｃ）と比較した。
【００５４】
ヒトの未熟樹状細胞を、培養培地単独で又はがん細胞順化培地（培養４８時間後にＤＭ６メラノーマ細胞から採取した細胞培養培地；「ＤＭ６ＣＭ」）において２４時間培養した。ＤＭ６ＣＭは、抗原提示細胞の抑制及び他の免疫細胞機能に関係する、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｍ−ＣＳＦ、ＣＣＬ２  ＣＸＣＬ１及び可溶性ＩＬ−６Ｒを含む一連のサイトカインを含んだ。ＤＭ６ＣＭ中でインキュベートした未熟なＤＣは、細胞培養培地単独においてインキュベートした未熟なＤＣと比較して、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の基礎レベルの減少を示した。樹状細胞活性化及び成熟のかかる免疫抑制にもかかわらず、キメラポリオウイルスに感染した、ＤＭ６ＣＭに曝露された未熟なＤＣは、細胞培養培地単独（「プレーンＡＩＭ  Ｖ培地」）において培養され、キメラポリオウイルス（「ＰＶＳＲＩＰＯ」）で感染させた未熟な樹状細胞によって誘導されたものに匹敵するレベルの活性化マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現の増強を示した（図４Ａ）。対照的に、ポリ（Ｉ：Ｃ）処理によるＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤβ８６の発現は、細胞培養培地単独で培養されかつポリ（Ｉ：Ｃ）で処理した未熟なＤＣと比較して、ＤＭ６ＣＭ培養ＤＣでは著しく減少した（図４Ａ）。ポリ（Ｉ：Ｃ）刺激ではなく、キメラポリオウイルスによる未熟なＤＣの感染のみが、ＤＭ６ＣＭ曝露された未熟なＤＣにおける強力で持続的なＩＦＮ−β放出をもたらした（図４Ｂ）。興味深いことに、ＤＭ６ＣＭ中で培養されたＤＣは、ポリ（Ｉ：Ｃ）処理の後では顕著な量のＩＦＮ−β（図４Ｂ）、ＩＬ−１２（図４Ｃ）又はＴＮＦ−α（図４Ｄ）を産生しなかったが、キメラポリオウイルス感染の後ではＩＦＮ−β（図４Ｂ）、ＩＬ−１２（図４Ｃ）又はＴＮＦ−α（図４Ｄ）の放出を保持した。キメラポリオウイルス感染によって誘導されたＩＦＮ−β及びＩＬ−１２の産生はＤＭ６ＣＭ培養ＤＣで抑制されたが、細胞培養培地単独に対して曝露させ、キメラポリオウイルスで感染させたＤＣによる産生と比較して、ＴＮＦ−α産生は免疫抑制性状態で実際に増強された（図４Ｄ）。これらのデータは、免疫抑制されたＤＣがポリ（Ｉ：Ｃ）刺激に抵抗性であることを示唆し、それらは、キメラポリオウイルスによる感染によって媒介された活性化に対する感受性を保持する。言いかえれば、キメラポリオウイルスは免疫抑制が存在する状態であっても、ＤＣを活性化する。
【００５５】
腫瘍と同様に病原体も、マクロファージ等の他の抗原提示細胞の免疫抑制を誘導することができる。例えば、ボレリア属は、一部分ＩＬ−１０産生の誘導により、ＴＬＲ受容体を通して活性化刺激に対してヒトマクロファージを脱感作することができる。また、マクロファージ活性化はマラリア感染において抑制され、マラリアを有するヒトにおいて観察される免疫抑制に寄与する。腫瘍関連マクロファージは、腫瘍免疫抑制に関連づけられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージに対するキメラポリオウイルス（例えばＰＶＳＲＩＰＯ）感染の効果を調べた。
【００５６】
精製されたヒト単球（ＰＢＭＣから単離）を、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ；２５ｎｇ／ｍｌ）単独、又はＭＣＳＦに加えＴＧＦ−β、ＩＬ−１０及びＩＬ−４（いずれも２０ｎｇ／ｍｌ）で、７日間、マクロファージに分化させた。これらの追加のサイトカインは、ＩＦＩＴ１、ＴＡＰ１、及びマクロファージ活性と関連するスカベンジャー受容体であるＣＤ３６の基礎発現の減少と関連して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫抑制性の表現型を誘導する。マクロファージをキメラポリオウイルス（ＭＯＩ  １０）で処理するか、又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ／ｍｌ）の組み合わせで、２４時間又は７２時間のいずれかに亘って処理した。ＤＣの場合と同様に、キメラポリオウイルス（「ＰＶ」）によるマクロファージの感染は、その後、キメラポリオウイルスによって感染させた免疫抑制されたマクロファージ（図５Ｂ及び図５Ｃ、ＭＣＳＦ＋ＩＬ１０、ＩＬ４、ＴＧＦ−β）において逆説的に増強された、ロバストなＩ型ＩＦＮ応答（図５Ａ及び図５Ｂ）及びＴＮＦ−α産生（図５Ｃ）を生じた。ウイルス翻訳又は細胞変性は、ＭＣＳＦのみによって由来したキメラポリオウイルスに感染したマクロファージにおいては検出されなかったが（図５Ａ）、免疫抑制されたマクロファージにおいてはＩＦＮ−β放出を増加させ（図５Ｂ）、長期間の感染によって増強されたウイルス翻訳及び明らかな細胞変性（図５Ａ、ｅＩＦ４Ｇ切断、チューブリン喪失）と相関した。ポリ（Ｉ：Ｃ）及びＬＰＳ（「ポリ（ＩＣ）＋ＬＰＳ」）のマクロファージの併用処理は、ＭＣＳＦ由来マクロファージにおいてＩＬ１−β（図５Ａ）、ＩＦＮ−β（図５Ｂ）及びＴＮＦ−α（図５Ｃ）の応答を誘導した。しかしながら、７２時間におけるポリ（Ｉ：Ｃ）＋ＬＰＳで併用処理されたマクロファージと比較して、免疫抑制されたマクロファージのポリ（Ｉ：Ｃ）＋ＬＰＳによる併用処理は、７２時間においてＩＬ１−β（図５Ａ）、ＩＦＮ−β（図５Ｂ）、及びＴＮＦ−α（図５Ｃ）の産生の減少をもたらした。分化を伴わないヒト単球の分析は、ＭＣＳＦ由来マクロファージにおけるようにキメラポリオウイルス感染に対する同様のＩ型ＩＦＮ応答を明らかにした。これらの知見は、マクロファージ（及び単球）のキメラポリオウイルス感染が、逆説的であるが、免疫抑制性マクロファージ表現型によって増強されるＩ型ＩＦＮ優位の活性化を生じることを示唆する。言いかえれば、キメラポリオウイルスは、免疫抑制が存在する状態であっても、マクロファージを活性化する。
【００５７】
実施例３
この実施例は、免疫応答を促進する際に活性化されるＤＣの使用を示す。抗原は、キメラポリオウイルスによる活性化と同時に、並行して又は順次にＤＣと接触され得る。ＤＣへの抗原の担持に関する技術は当業者に知られており、限定されないが、抗原（例えば、精製された抗原又は抗原を含む細胞溶解物）で（それと共にインキュベーションすることにより）樹状細胞をパルスすること；抗原をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ若しくはｍＲＮＡを、電気穿孔する、トランスフェクトする、形質導入する、或いは導入すること；又は免疫複合体の担持（その抗原に対して特異的な結合を有する抗体に対して結合された抗原）が挙げられる。
【００５８】
免疫原性物質をコードするＲＮＡの作製
６４個のＡ−Ｔ塩基対を含むオリゴヌクレオチドの後に、プラスミドｐＧＥＭ４Ｚ／Ａ６４を作製するためｐＧＥＭ４ＺのＥｃｏＲＩとＮａｒＩの部位の間に配置されたＳｐｅＩ制限酵素部位を付加することによって、ｐＳＰ７３−Ｓｐｈ／Ａ６４を作製した。ｐＧＥＭ４Ｚ／Ａ６４のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩフラグメントをｐＳＰ７３にクローニングし、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｄｅＩで消化してｐＳＰ７３／Ａ６４を作製した。ＳｐｈＩでｐＳＰ７３／Ａ６４を消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで末端を充填した後、再ライゲーションしてｐＳＰ７３−Ｓｐｈを作製した。ｐＳＰ７３−Ｓｐｈ／Ａ６４／Ｎｏｔは、ＳｐｅＩ部位に近接してＮｏｔＩ制限酵素部位を含む。全長腫瘍抗原（ＰＳＡ、ＭＡＲＴ−Ａ２７Ｌ及びＣＥＡ）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニングを使用してｐＳＰ７３−Ｓｐｈ／Ａ６４プラスミドに挿入した。Ａ２７Ｌ突然変異を有するＭＡＲＴ−１をコードするｃＤＮＡを産生するため、ナイーブＭＡＲＴ−１のＤＮＡをＤＮＡテンプレートとして使用した。オーバーラッピングＰＣＲを行って、２７番アミノ酸をコードするコドンをＧＣＣアラニンからＣＴＣロイシンに置換した。その後、増幅されたオーバーラップする突然変異したＰＣＲ産物を、ｐＳＰ７３−Ｓｐｈ／Ａ６４プラスミドにクローニングした。腫瘍抗原ＥＧＦＲをコードするＯＲＦを、ＰＣＲクローニングを使用してｐｃＤＮＡ３．１／Ａ６４プラスミドに挿入した。この改変ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドは、６４−アデノシン合成ポリ（Ａ）尾部セグメントがマルチクローニングサイトの３’末端に挿入される挿入部位に対して５’に、Ｔ７プロモーターを含む。ＳｐｅＩ制限酵素部位は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ転写に先立つＤＮＡの直線化のため、ｐｃＤＮＡ３．１／Ａ６４プラスミドの６４−アデノシンセグメントの３’末端に位置する。ＲＮＡは、ＳｐｅＩ直線化プラスミドを使用して、製造業者の指示書に従って、商業的な入手可能なキットを使用して産生され、商業的に入手可能なミニキットを使用してｍＲＮＡを精製した。腫瘍抗原ＴＲＰ−２、ＯＶＡ及びＧＦＰをコードするｍＲＮＡのクローニング及び生成を同様の方法を使用して行った。
【００５９】
ｍＲＮＡの電気穿孔を使用する抗原担持
２００μｌの培養培地中に懸濁したＤＣ（２×１０６）を、２ｍｍキュベットにおいて２５μｇ／ｍｌのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡと混合し、エレクトロポレーターを使用して５００μ秒間３４０Ｖで電気穿孔した。
【００６０】
免疫原性物質でパルスすることによる抗原担持
この実例では、ヒトのＣＤ１５５＋、ＨＬＡ−Ａ２＋、ＭＨＣクラスＩ発現腫瘍細胞系統ＳＵＭ１４９炎症性乳がん、ＭＤＡ−ＭＢ２３１三種陰性乳がん、ＤＭ６黒色腫及びＬＮＣａＰ前立腺がんを使用した。細胞培養培地中、７５％コンフルエントの１００ｍｍディッシュにウイルス（ＭＯＩ＝０．１）を添加し、４８時間インキュベートした後、細胞片を除去し、ＤＣ処理用の上清を収集するために遠心分離することによって、ＤＣに負荷する際の使用のためのがん細胞溶解物（腫瘍溶解物）を調製した。モック対照を、ウイルスの添加をせずに同様に生成した。使用したキメラポリオウイルス、ＰＶＳＲＩＰＯは、腫瘍細胞に感染し、複製してより多くのキメラポリオウイルスを産生した後、感染した腫瘍細胞を溶解することができるため、キメラポリオウイルスを含有する腫瘍細胞溶解物が生成する。キメラポリオウイルス腫瘍溶解物を負荷したＤＣを生成するため、溶解物１ｍｌを１×１０６個の未熟なＤＣに添加し、次いで培養物中で２４時間インキュベートした。
【００６１】
抗原を担持し、活性化されている抗原提示細胞による免疫応答の誘導
キメラポリオウイルス含有腫瘍溶解物に曝露されたヒトＤＣを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＣ−Ｔ細胞賦活化アッセイを使用して、自己由来Ｔ細胞をプライムする、細胞溶解物（例えば、腫瘍溶解物）中の腫瘍抗原を担持する能力について調べた。ＰＶＳＲＩＰＯ腫瘍溶解物で処理したＤＣによるＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの賦活化のため、ＰＢＭＣを解凍し、１時間インキュベートし、非接着性細胞を採取した。次いで、非接着性細胞を、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下において、１０：１の、応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｃｅｌｌ） 対 刺激因子ＤＣの比率で、キメラポリオウイルス誘導性腫瘍溶解物を負荷したＤＣで賦活化した。全ての刺激を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び５×１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ  １６４０（細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）刺激培地）で行った。キラー細胞濃度は２×１０６細胞／ｍｌであった。ＩＬ−２を３日目に１００Ｕ／ｍｌで、４日毎〜５日毎に５０Ｕ／ｍｌ添加した。Ｔ細胞を、ＣＴＬ刺激培地において１〜２×１０６細胞／ｍｌで維持した。幾つかのアッセイでは、Ｔ細胞を、７日後に、１０：１の応答物質 対 刺激因子の比率で、キメラポリオウイルス含有腫瘍溶解物負荷ＤＣによって再度賦活化した。Ｔ細胞を１２日目〜１４日目に採取し、計数し、ＣＴＬアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。ＣＴＬアッセイでは、上述のヒト腫瘍細胞系統及びＲＮＡを電気穿孔したＤＣを標的として使用した。細胞を採取し、洗浄して微量の培地を全て除去し、次いで、当該技術分野で知られている方法を使用してユーロピウム（Ｅｕ）標識した。１万のＥｕ標識標的（Ｔ）及びエフェクター細胞（Ｅ）の段階希釈を、変動するＥ：Ｔ比で、抗生物質を含まない２００μｌのＣＴＬ刺激培地中で９６ウェルＶ底プレートにおいてインキュベートした。プレートを遠心分離し、４時間インキュベートした。上清（５０μｌ）を採取し、９６ウェル平底プレート中の増強溶液（１５０μｌ；Ｅｕ３＋の定量における使用が意図される酸性キレート洗浄剤）に添加し、ＶＩＣＴＯＲ３  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して、時間分解蛍光法によりＥｕ放出を測定した。
特異的細胞毒性活性は、式：
特異的放出（％）＝［（実験的放出−自発的放出）／（全放出−自発的放出）］×１００
を使用して決定した。
【００６２】
標的細胞における自発的な放出は、洗浄剤によって全放出の２５％未満であった。Ｔ細胞を含まない培地中で標的細胞をインキュベートすることによって、標的細胞における自発的な放出を特定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＣ：Ｔ細胞共培養から１２日後〜１４日後、細胞を収集し、上に記載される、標準的な４時間のユーロピウム（Ｅｕ）−放出ＣＴＬアッセイを使用して腫瘍抗原特異的な細胞毒性反応性についてアッセイした。ＣＴＬ反応性を評価するため、Ｔ細胞（エフェクター）を、以下のＥｕ標識標的細胞と共に培養した：（ｉ）ＤＣへの負荷に使用したキメラポリオウイルスを含有する腫瘍溶解物を生じる腫瘍細胞系統；（ｉｉ）腫瘍細胞系統によって発現されることが知られている腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣ（アッセイの陽性対照）；又は（ｉｉｉ）腫瘍細胞系統によって発現されない無関係な腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣ（アッセイの陰性対照）。自己由来の抗原発現ＤＣの陽性及び陰性の対照標的としての使用は、Ｔ細胞と標的細胞の間のＭＨＣミスマッチを排除することによって、既知の腫瘍抗原に対する特異的なＣＴＬ反応性の特定を可能とした。標的細胞のＣＴＬ媒介殺傷を、上清中のＥｕ放出を測定することによって評価した。
【００６３】
Ｔ細胞を、腫瘍溶解物でパルスした自己由来ＤＣと共培養した後、賦活化されたエフェクターＴ細胞を採取し、対応する腫瘍細胞（図６Ａ〜図６Ｄ；斜線バー）、関連する腫瘍抗原をコードするＲＮＡをトランスフェクトした自己由来ＤＣ（図６Ａ〜図６Ｄ；黒色バー；陽性対照）、標的指向された腫瘍に関連するものとは無関係な腫瘍抗原をコードするＲＮＡをトランスフェクトした自己由来ＤＣ（図６Ａ、ＰＳＡ；図６Ｂ、ＥＧＦＲ；図６Ｃ、ＭＡＲＴ；及び図６Ｄ、ＣＥＡ；白色バー；陰性対照）に対するＣＴＬアッセイにおいて試験した。各バーは、３組の試料の平均の特異的溶解（％）及び標準偏差（ＳＤ）を表す。図６Ａ〜図６Ｄの各々に対して、関連する腫瘍抗原又は無関係の腫瘍抗原のいずれかを発現する自己由来ＤＣを比較する統計学的有意性を、対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して行った。０．０５未満（ｐ＜０．０５）の確率を統計学的に有意とした：図６Ａ、ＳＵＭ１４９  ＤＣ標的、ｐ＝０．０４；図６Ｂ、ＬＮＣａＰ  ＤＣの標的、ｐ＝０．０００８；図６Ｃ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１  ＤＣ標的、ｐ＝０．０１；及び図６Ｄ、ＤＭ６  ＤＣ標的、ｐ＝０．０１。キメラポリオウイルス含有腫瘍溶解物で処理したＤＣは、陽性対照（関連する腫瘍抗原を発現するＤＣ；図６Ａ〜図６Ｄ、黒色バー）と同様に、本来のがん系統を効果的に溶解するＣＴＬ応答をもたらしたが（図６Ａ〜図６Ｄ、斜線バー）、陰性対照（無関係な腫瘍抗原を発現するＤＣ；図６Ａ〜図６Ｄ、白色バー）ではＣＴＬ応答を生じなかった。驚くべきことには、キメラポリオウイルス含有腫瘍溶解物処理ＤＣによる抗原提示は、かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてエフェクターＴ細胞の賦活化に必要であり、慣例的に使用される、サイトカインカクテル（ＣＣ）による追加の成熟工程を必要としなかった。結論は、この例においてＤＣ成熟／活性化は、腫瘍溶解物中に存在するキメラポリオウイルスによる、ＤＣの感染によるものであるということである。腫瘍溶解物が腫瘍の全レパートリー腫瘍抗原を表すことから、腫瘍溶解物で賦活化したＴ細胞は複数の腫瘍抗原を標的指向する可能性があり、これは、１つのみの選択された腫瘍抗原を発現する標的ＤＣと比べてより高いレベルの腫瘍抗原溶解を説明し得る。ＳＵＭ１４９乳がん腫瘍溶解物で賦活化したＴ細胞は、ＬＮＣａＰ前立腺がん細胞を溶解せず、その逆も同様であったことは注目に値する。さらに、モック感染細胞に由来する上清を負荷したＤＣは、標的細胞の最小の溶解によって示されるように、抗原特異的Ｔ細胞を刺激しなかった。
【００６４】
併せると、これらの知見は、キメラポリオウイルスに感染し活性化されたＡＰＣが、（１）共刺激分子発現を誘導すること；（２）抗原の処理及び提示によって抗原を担持することができること；並びに（３）かかる抗原を発現する細胞に対してＴ細胞の細胞毒性を媒介することを含む、かかる抗原に対する免疫応答を誘導することができることを示している。
【００６５】
実施例４
この実施例では、本明細書で提供される組成物及び方法の使用を解説する。本明細書で提供される組成物は、（ａ）キメラポリオウイルス及び抗原を含む単離された免疫原性組成物と；（ｂ）（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ又は皮膚で）キメラポリオウイルスで活性化された抗原提示細胞（例えば樹状細胞又はマクロファージ）と；（ｃ）（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ又は皮膚で）キメラポリオウイルスで活性化され、抗原を担持している抗原提示細胞と、を含む。これらの組成物のうちのいずれもが個体を治療する方法において使用され得る。具体的には、組成物中の抗原が腫瘍抗原を含む場合、かかる組成物は腫瘍を有する、腫瘍を有していると疑われる、又は腫瘍を発症するリスクの高い（例えば、予測リスクに対する遺伝子検査によって判定される）個体を治療するために使用され得る。
【００６６】
具体的には、組成物中の抗原が病原体抗原を含む場合、かかる組成物は、例えば、病原性感染症、例えば寄生虫感染症、細菌性感染症、又はウイルス性感染症を治療する方法において（治療的に又は予防的に）使用され得る。例えば、上記組成物は、個体において保護免疫応答を誘発するため、感染に先立って投与されてもよく、又は感染症と戦うため免疫応答を誘導するように個体の免疫系を賦活化するために感染後に投与されてもよい。
【００６７】
組成物を投与するために、上記組成物は、医薬組成物又は医薬を製造するため、薬学的に許容可能な担体を更に含む。上記組成物は、組成物の成分として樹状細胞を含む一つの態様では、樹状細胞はまず、所望の樹状細胞を含む組織又は体液から単離され、次いで、単離された樹状細胞を、キメラポリオウイルス、又はキメラポリオウイルス及び抗原、のいずれかと接触させる。その後、得られた活性化樹状細胞を、当該技術分野で知られている投与の方法によって、例えば皮膚から、治療が必要な個体に投与され得る。皮内、筋肉内、皮下、静脈内、鼻腔内、又はリンパ節への直接注入による。所望又は最適な投与経路及び投与される量は、例えば、治療される個体の年齢、体重、免疫状態及び健康と並んで治療される疾患に応じて、任意の特定の個体について熟練した医療従事者によって決定され得る。
【００６８】
一態様では、本明細書で提供される組成物は、好ましくは、個体の皮膚の皮内コンパートメントへ選択的に及び特異的に抗原の標的指向的な送達に対して設計される皮膚ワクチン製剤として使用され得る。したがって、一態様では、免疫原性組成物は、皮膚の皮内コンパートメントに対して直接的に標的指向される。キメラポリオウイルスを含む免疫原性組成物中のアジュバント成分は、抗原提示細胞を活性化し、それが、抗原に対する免疫応答を誘発する際に、免疫原性組成物の抗原性成分と接触させた場合、免疫細胞への抗原の提示及び／又は利用性を増強する。経皮投与用の免疫原性組成物を含む医薬組成物又は医薬は、免疫原性組成物の有効性を増強する組成物を更に含み、かかる組成物は、デポ効果又は経皮吸収促進剤を生み出す薬剤からなる。デポ効果を生み出すための薬剤は、投与部位、例えば、誘発された免疫応答を強化し得る皮膚コンパートメントで抗原提示細胞に対する免疫原性組成物の１以上の成分の曝露を延長するように、投与部位で免疫原性組成物中の１以上の成分の放出を遅延させる。かかる組成物は、油、粘性物質、ゲル剤及びポリマーを含むことが当業者に知られている。経皮吸収促進剤は、皮膚コンパートメントへの吸収を促進するために、又は免疫原性組成物の送達が望ましい部位に到達するように、皮膚の１以上の皮膚コンパートメントに若しくはそれを越えて、免疫原性組成物の浸透若しくは輸送を増強するために使用され得る任意の分子である。浸透剤又は経皮吸収促進剤は、限定されないが、脂肪酸、ポリマー、胆汁酸塩及び洗浄剤を含むことが当業者に知られている。
【００６９】
皮膚コンパートメントへ本明細書で提供される免疫原性組成物を投与する送達デバイスは、パッチ、注射器、マイクロニードルに基づく注射、注入システム、無針又は針なしのバリスティック注射（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、マントー型皮内注射、又は所望の皮膚コンパートメントを標的とする任意の他の手段を含み得る。
【図１】
2019519589.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2019519589.tif 000005
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2019519589.tif 000007
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2019519589.tif 000009
【図３Ｄ】
2019519589.tif 000010
【図３Ｅ】
2019519589.tif 000011
【図４Ａ】
2019519589.tif 000012
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
2019519589.tif 000014
【図４Ｄ】
2019519589.tif 000015
【図５Ａ】
2019519589.tif 000016
【図５Ｂ】
2019519589.tif 000017
【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月6日(2019.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗原提示細胞と、前記抗原提示細胞を活性化するために有効な量のキメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡとをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる段階を含む、抗原提示細胞を活性化するための方法。
【請求項２】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子と接触させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡと接触させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原提示細胞と抗原とを接触させる段階を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原提示細胞を、キメラポリオウイルスとの接触に先立って、抗原と接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原提示細胞を、抗原との接触に先立って、キメラポリオウイルスと接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原提示細胞と、キメラポリオウイルス及び抗原とを同時に接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
抗原を担持している活性化抗原提示細胞を作製する方法であって、
抗原提示細胞と、前記抗原提示細胞を活性化するために有効な量のキメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡとをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる段階を含む、方法。
【請求項１１】
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子と接触させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡと接触させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原が病原体に由来し、前記病原体が細菌、ウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗原が、前記抗原提示細胞に対するｍＲＮＡの導入によって担持される、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原が、前記抗原提示細胞を前記抗原と接触させることにより担持され、前記抗原が核酸分子を含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸分子がmRNAを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗原が、前記抗原提示細胞と前記抗原とを接触させることによって担持され、前記抗原がタンパク質である、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗原が、前記抗原に対する結合特異性を有する抗体に結合されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗原を含む細胞溶解物が前記抗原提示細胞の担持に使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
抗原を担持している活性化抗原提示細胞を含む、免疫治療のための医薬組成物であって、前記活性化抗原提示細胞が請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の方法により作製される、医薬組成物。
【請求項２３】
抗原を担持している活性化抗原提示細胞を含む、疾患を治療するための医薬組成物であって、前記活性化抗原提示細胞が請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の方法により作製される、医薬組成物。
【請求項２４】
前記疾患が感染性疾患を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記疾患ががんである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
細菌性病原体の抗原、病原性寄生生物の抗原、非ポリオウイルスの抗原、及び腫瘍抗原からなる群から選択される抗原と、
キメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡを含むアジュバントと
を含む、免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記アジュバントが、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子を含む、請求項２６に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
前記アジュバントが、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡを含む、請求項２６に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項２８に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
前記抗原が病原体に由来し、前記病原体が細菌、非ポリオウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
前記抗原が核酸分子を含む、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
前記核酸分子がｍＲＮＡを含む、請求項３２に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
前記抗原がタンパク質を含む、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
前記タンパク質が、前記抗原に対する結合特異性を有する抗体に結合されている、請求項３４に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
抗原が細胞溶解物に含まれる、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項２６〜３６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
ワクチンにおける使用のための、請求項３７に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
前記免疫原性組成物が経皮投与用である、請求項２６〜３８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
キメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡを含む、抗原提示細胞を活性化するための医薬組成物であって、粘膜又は皮膚において抗原提示細胞を活性化するのに有効な量で、キメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡをヒトの粘膜又は皮膚に直接送達するように使用される、
医薬組成物。
【請求項４１】
送達が前記粘膜に対するものであり、かつ
(i) 前記粘膜が前記ヒトの肺にある、
(ii) 前記粘膜がヒトの胃にある、
(iii) 前記粘膜がヒトの鼻にある、
(iv) 前記粘膜がヒトの腸にある、または
(v) 前記粘膜が細胞学的に正常な粘膜である、
請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
送達が前記皮膚に対するものであり、前記皮膚が細胞学的に正常な皮膚である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記ヒトが、多病巣性又は転移性の病変を有する、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
[本発明1001]
抗原提示細胞を活性化するための方法であって、
抗原提示細胞と、抗原提示細胞を活性化するために有効な量のキメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡとを接触させる段階
を含み、
前記接触させる段階が、ｅｘ  ｖｉｖｏで又は経皮的に行われる、方法。
[本発明1002]
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子と接触させる、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡと接触させる、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記抗原提示細胞と抗原とを接触させる段階を更に含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
単離された抗原提示細胞と、前記抗原提示細胞を活性化するために有効な量のキメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡとをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる段階を含む、抗原提示細胞を活性化するための方法。
[本発明1008]
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子と接触させる、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡと接触させる、本発明1007の方法。
[本発明1011]
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記抗原提示細胞と抗原とを接触させる段階を更に含む、本発明1007の方法。
[本発明1013]
前記抗原提示細胞を、キメラポリオウイルスとの接触に先立って、抗原と接触させる、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記抗原提示細胞を、抗原との接触に先立って、キメラポリオウイルスと接触させる、本発明1012の方法。
[本発明1015]
前記抗原提示細胞と、キメラポリオウイルス及び抗原とを同時に接触させる、本発明1012の方法。
[本発明1016]
免疫療法を行う方法であって、
抗原を担持している活性化抗原提示細胞を個体に投与する段階
を含み、
抗原提示細胞と、前記抗原提示細胞を活性化するために有効な量のキメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡとを接触させることによって、前記抗原提示細胞が作製される、方法。
[本発明1017]
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子と接触させる、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡと接触させる、本発明1016の方法。
[本発明1019]
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記抗原が病原体に由来し、前記病原体が細菌、ウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、本発明1016の方法。
[本発明1021]
前記抗原が腫瘍抗原である、本発明1016の方法。
[本発明1022]
前記抗原が、前記抗原提示細胞に対するｍＲＮＡの導入によって担持される、本発明1016の方法。
[本発明1023]
前記抗原が、前記抗原提示細胞と前記抗原とを接触させることによって担持され、前記抗原がタンパク質である、本発明1016の方法。
[本発明1024]
前記抗原が、前記抗原に対する結合特異性を有する抗体に結合されている、本発明1023の方法。
[本発明1025]
抗原を含む細胞溶解物が前記樹状細胞の負荷に使用される、本発明1023の方法。
[本発明1026]
疾患を治療する方法であって、
抗原提示細胞と、前記抗原提示細胞を活性化するために有効な量の（ａ）キメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡ、及び（ｂ）抗原とを接触させることによって作製される活性化抗原提示細胞を個体に投与する段階
を含む、方法。
[本発明1027]
前記樹状細胞を、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子と接触させる、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記抗原提示細胞を、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡと接触させる、本発明1026の方法。
[本発明1029]
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記抗原が病原体に由来し、前記病原体が細菌、ウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、本発明1026の方法。
[本発明1031]
前記抗原が腫瘍抗原である、本発明1026の方法。
[本発明1032]
前記抗原が核酸分子を含む、本発明1026の方法。
[本発明1033]
前記核酸分子がｍＲＮＡを含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記抗原がタンパク質を含む、本発明1026の方法。
[本発明1035]
前記タンパク質が、前記抗原に対する結合特異性を有する抗体に結合されている、本発明1034の方法。
[本発明1036]
抗原が細胞溶解物に含まれる、本発明1026の方法。
[本発明1037]
前記疾患が感染性疾患を含む、本発明1026の方法。
[本発明1038]
前記疾患ががんである、本発明1026の方法。
[本発明1039]
細菌性病原体の抗原、病原性寄生生物の抗原、非ポリオウイルスの抗原、及び腫瘍抗原からなる群から選択される抗原と、
キメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡを含むアジュバントと
を含む、免疫原性組成物。
[本発明1040]
前記アジュバントが、前記キメラポリオウイルスのウイルス粒子を含む、本発明1039の免疫原性組成物。
[本発明1041]
前記アジュバントが、前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡを含む、本発明1039の免疫原性組成物。
[本発明1042]
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、本発明1041の免疫原性組成物。
[本発明1043]
前記抗原が病原体に由来し、前記病原体が細菌、非ポリオウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、本発明1039の免疫原性組成物。
[本発明1044]
前記抗原が腫瘍抗原である、本発明1039の免疫原性組成物。
[本発明1045]
前記抗原が核酸分子を含む、本発明1039の免疫原性組成物。
[本発明1046]
前記核酸分子がｍＲＮＡを含む、本発明1039の免疫原性組成物。
[本発明1047]
前記抗原がタンパク質を含む、本発明1039の免疫原性組成物。
[本発明1048]
前記タンパク質が、前記抗原に対する結合特異性を有する抗体に結合されている、本発明1047の免疫原性組成物。
[本発明1049]
抗原が細胞溶解物に含まれる、本発明1039の免疫原性組成物。
[本発明1050]
薬学的に許容可能な担体を更に含む、本発明1039の免疫原性組成物。
[本発明1051]
ワクチンにおける使用のための、本発明1050の免疫原性組成物。
[本発明1052]
本発明1039の免疫原性組成物を個体に投与する段階を含む、免疫応答を誘発する方法。
[本発明1053]
前記免疫原性組成物が薬学的に許容可能な担体と共に投与される、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記免疫原性組成物が経皮投与される、本発明1053の方法。
[本発明1055]
前記抗原提示細胞をヒト対象に投与する段階を更に含む、本発明1007の方法。
[本発明1056]
前記接触させる段階がｅｘ  ｖｉｖｏで行われ、前記方法が、前記抗原提示細胞をヒト対象に投与する段階を更に含む、本発明1001の方法。
[本発明1057]
粘膜又は皮膚において抗原提示細胞を活性化するのに有効な量のキメラポリオウイルス又は前記キメラポリオウイルスをコードするＲＮＡを、ヒトの粘膜又は皮膚に直接送達する段階
を含む、抗原提示細胞を活性化するための方法。
[本発明1058]
送達が前記粘膜に対するものであり、前記粘膜が前記ヒトの肺にある、本発明1057の方法。
[本発明1059]
送達が前記粘膜に対するものであり、前記粘膜が前記ヒトの胃にある、本発明1057の方法。
[本発明1060]
送達が前記粘膜に対するものであり、前記粘膜が前記ヒトの鼻にある、本発明1057の方法。
[本発明1061]
送達が前記粘膜に対するものであり、前記粘膜が前記ヒトの腸にある、本発明1057の方法。
[本発明1062]
送達が前記粘膜に対するものであり、前記粘膜が細胞学的に正常な粘膜である、本発明1057の方法。
[本発明1063]
送達が前記皮膚に対するものであり、前記皮膚が細胞学的に正常な皮膚である、本発明1057の方法。
[本発明1064]
前記ヒトが、多病巣性又は転移性の病変を有する、本発明1057の方法。
本発明の他の態様、目的及び特徴は以下の記載から明らかになる。
【国際調査報告】
2019519589.tif 000023