(57)【要約】  本発明は、タンパク質の凝集に対するファーマコフォア及び阻害剤を特定する方法に関する。また、本発明は、アルツハイマー病の治療剤のファーマコフォア自体及び医療用途も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝集性タンパク質の凝集に対するファーマコフォアを作成する方法であって、前記方法は、
（a）前記タンパク質の凝集の少なくとも1つの阻害剤を提供することと、
（b）前記少なくとも1つの阻害剤から阻害剤の骨格を生成することと
（c）前記阻害剤の骨格の少なくとも1つの構成要素に少なくとも1つの化学的置換を導入し、かつ前記凝集性タンパク質の凝集反応速度の前記少なくとも1つの化学的置換の効果を解析することを有し、前記凝集反応速度に対する効果を解析することは、少なくとも1つの化学的置換を有する化合物の非存在下と存在下における前記タンパク質の反応速度プロフィールを作成することと、置換が陽性結果であるとの特定を前記置換が前記反応速度プロフィールにおいてシフトを起こす場合に行うことを有し、かつ前記方法は、
（d）  反応速度アッセイからの前記陽性結果を整列させることにより凝集性タンパク質の凝集に対するファーマコフォアを作成すること
を有する方法。
【請求項２】
タンパク質の凝集の阻害剤を特定するための方法であって、前記方法において前記タンパク質は凝集性タンパク質であり、前記方法は、
-  既知のまたは予測される阻害剤と同一の結合相手及び／または関連性の強い結合相手に結合する少なくとも1つの化合物を特定することを有し、前記特定することにおいて、前記少なくとも1つの化合物は前記既知のまたは予測される阻害剤と同一の結合部位または結合ポケットに結合し、かつ、前記方法は、
-  前記凝集性タンパク質の凝集反応速度に対する前記少なくとも1つの化合物の効果を解析することと、
-  前記少なくとも1つの化合物が前記凝集性タンパク質の凝集反応速度に影響する場合に、前記化合物を阻害剤として選択すること
を有する方法。
【請求項３】
前記方法は、更に、既知のまたは予測される阻害剤を特定することと、前記阻害剤の結合相手を特定しかつ特徴づけることを有する、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質の凝集は、複数の、好ましくは少なくとも3つの、一次核形成、二次核形成及び伸長である微視的段階に区分することができ、かつ前記阻害剤は、これらの段階の少なくとも1つを阻害する、請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害剤は、少なくとも一次及び／または二次核形成を阻害する、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記凝集性タンパク質の凝集反応速度の前記少なくとも1つの化合物の効果を解析することは、前記少なくとも1つの化合物の非存在下と存在下における前記タンパク質の反応速度プロフィールを作成することを有するものであって、かつ、前記化合物が前記反応速度プロフィールにおいてシフトを起こす場合には前記化合物は阻害剤として特定される、請求項2〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記反応速度プロフィールはS字型曲線であって、前記曲線は、一次核形成プロセスと、二次核形成プロセスと、伸長プロセスとに由来する、少なくとも誘導期と、成長期と、安定期とを有するものであって、かつ、前記少なくとも1つの化合物はこれらのプロセスの少なくとも1つを変更する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
以下の式：
2019502711.tif 000026
を使って前記曲線のフィッテイングを行うことによって前記反応速度プロフィールから速度パラメータが得られる、請求項7に記載の方法。
（式中、反応速度パラメータB±、C±、κ、
2019502711.tif 000027
及び
2019502711.tif 000028
は、微視的速度定数の2種類の組合せk+k2及びknk2の関数であり、ここで、kn、k+及びk2は、それぞれ、一次核形成、伸長及び二次核形成の速度定数である。）
【請求項９】
前記凝集性タンパク質はアミロイドタンパク質である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記アミロイドタンパク質は、Aβ42、α-シヌクレイン、タウ、ハンチンチン、アトロフィン1、アタキシン（1,2,3,6,7,8,12,17）、アミリン、プリオンタンパク質、（プロ）カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、アポリタンパク質AI、アポリタンパク質AII、アポリタンパク質AIV、血清アミロイド、メディン、（アポ）血清AA、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、β-2ミクログロブリン、フィブリノゲンα鎖、ゲルゾリン、ケラトプテリン、β-アミロイド、シスタチン、ABriPP免疫グロブリン軽鎖AL、免疫グロブリン重鎖、S-IBM、膵島アミロイドポリペプチド、インスリン、ラクトアドヘリン、角化上皮、ラクトフェリン、tbn、白血球走化性因子-2、AbriPP、ADanPP、肺表面活性タンパク質、ガレクチン7、コルネオデスモシン、ラクトアドヘリン、ケラトエピテリウム、歯原性エナメル芽細胞関連（ODAM）タンパク質、セメノゲリン1及びエンフュービルタイドから選ばれる、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質はAβ42である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記既知のまたは予測される阻害剤は、それ自体が前記凝集性タンパク質の凝集反応速度に対する前記阻害剤の効果を解析することにより特定されるものであって、前記阻害剤は、それが前記反応速度プロフィールにおいてシフトを起こす場合に阻害剤であると特定される、請求項2〜11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項2〜12に記載の方法によって得られるまたは得られ得る、タンパク質の凝集阻害剤。
【請求項１４】
凝集性タンパク質の凝集に対するファーマコフォアを作成する方法であって、前記方法は、
（a）請求項2〜12のいずれかに規定される方法を使用してタンパク質の凝集の少なくとも1つの阻害剤を特定することと、
（b）前記少なくとも1つの阻害剤から阻害剤の骨格を生成し、かつ、請求項1に規定する方法を使用してファーマコフォアを作成すること
を有する方法。
【請求項１５】
前記阻害剤の骨格は、前記少なくとも1つの阻害剤から、及びそれに加えて、前記既知のまたは予測される阻害剤から生成される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項1、14または15のいずれかに記載の方法によって得られるまたは得られ得るファーマコフォア。
【請求項１７】
Aβ42の凝集を阻害するファーマコフォアであって、前記ファーマコフォアは、少なくとも9つの特徴を有し、前記特徴は、2つの水素結合受容体と、カルボン酸基を表す末端の負に帯電した1つの特徴と、5つの疎水性の特徴に付加された1つの芳香族性の特徴である、ファーマコフォア。
【請求項１８】
前記ファーマコフォアは、末端疎水基から他方の極性末端まで9.22オングストロームの水平距離を有する、請求項17に記載のファーマコフォア。
【請求項１９】
アルツハイマー病の治療のための方法であって、前記方法は、その治療が必要な患者にレチノイド受容体モジュレータを投与することを有するものであって、前記モジュレータは、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237であるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる、方法。
【請求項２０】
アルツハイマー病の治療において使用するためのレチノイド受容体モジュレータであって、前記モジュレータは、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237であるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる、レチノイド受容体モジュレータ。
【請求項２１】
アルツハイマー病の治療に使用するための医薬の製造におけるレチノイド受容体モジュレータの使用であって、前記モジュレータは、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237であるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる、レチノイド受容体モジュレータの使用。
【請求項２２】
凝集性タンパク質の凝集を阻害するための方法であって、前記凝集性タンパク質はAβ42であり、前記方法は、好ましくは、その阻害が必要な患者にタンパク質の凝集を阻害する量で、レチノイド受容体モジュレータを投与することを有するものであって、前記モジュレータは、タミバロテン、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237及びベキサロテンから選ばれるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる、凝集性タンパク質の凝集を阻害するための方法。
【請求項２３】
タンパク質の凝集は、複数の、好ましくは少なくとも3つの、一次核形成、二次核形成及び伸長である微視的段階に区分することができ、かつ前記レチノイド受容体モジュレータは、これらの段階の少なくとも1つを阻害する、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記レチノイド受容体モジュレータは、一次及び／または二次核形成を阻害する、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記モジュレータは、全ての微視的段階を阻害するものであり、かつ、前記モジュレータは、MM11253、BMS493、アダパレン、CD1530及びLE135から選ばれる、請求項23または24に記載の方法。
【請求項２６】
凝集性タンパク質の凝集を阻害するためのレチノイド受容体モジュレータの使用であって、前記凝集性タンパク質はAβ42であり、かつ、前記モジュレータは、タミバロテン、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237及びベキサロテンから選ばれるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる、レチノイド受容体モジュレータの使用。
【請求項２７】
タンパク質の凝集は、複数の、好ましくは少なくとも3つの、一次核形成、二次核形成及び伸長である微視的段階に区分することができ、かつ前記レチノイド受容体モジュレータは、これらの段階の少なくとも1つを阻害する、請求項26に記載の使用。
【請求項２８】
前記レチノイド受容体モジュレータは、一次及び／または二次核形成を阻害する、請求項27に記載の使用。
【請求項２９】
前記モジュレータは、凝集の全ての微視的段階を阻害するものであり、かつ、前記モジュレータは、MM11253、BMS493、アダパレン、CD1530及びLE135から選ばれる、請求項27または28に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、タンパク質凝集の新規阻害剤を特定するための反応速度論に基づく方法に関し、特に、人における折りたたみ不全疾患と関連するアミロイドタンパク質の凝集を阻害する阻害剤に関する。また、本発明は、タンパク質の凝集に対するファーマコフォアを設計し生成する方法にも関わる。本発明の技術的範囲には、アルツハイマー病の治療のための組成物及び方法、及びその他のタンパク質折りたたみ不全疾患におけるタンパク質の凝集を阻害するための組成物及び方法も含まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞内タンパク質の折りたたみ不全または凝集は、タンパク質疾患（proteinopathies）と呼ばれる多くの遅発性神経変性疾患の特徴である。それらの疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、タウ・タンパク質異常症（tauopathies）、及びハンチントン病やSCA3のような各種の脊髄小脳失調症（SCAs）等のポリグルタミン伸長疾患が含まれる。
【０００３】
今のところ、これらの疾患が人にもたらす神経変性を遅らせるまたは防ぐ有効な戦略はない。むしろ、アルツハイマー病（以下、「AD」ともいう。）の発生率は、世界人口の高齢化に伴い急速に増加している。現在およそ4千4百万人もの人々がADを患っており、その数は2050年までに1億3千5百万人を超えると見込まれている（1）。
【０００４】
ADは、可溶性タンパク質の折りたたみ不全とそれに続くアミロイド線維への変換を特徴とする40を超える関連疾患（2）の1つである（3-9）。ADの基礎にある重要な分子経路はAβ42の凝集であり、このAβペプチドの42残基型は、アミロイド前駆体タンパク質（APP）のタンパク質分解切断によって生ずる断片である（3-5,8,9）。Aβ42は、AD患者の脳に見られる線維状凝集体へと自己集合する（5,9）天然変性ペプチド（10）である。したがって、Aβ42の自己集合を阻害することがADに対する非常に有望な治療戦略として浮上するようになった（11-20）のであるが、この効果を達成するように設計された小分子はいまだ臨床的有効性を示すに至っていない（21）。
【０００５】
そのような臨床段階の失敗は、少なくとも部分的に、毒性種発生の基礎にある分子機構及び小分子がAβ42の凝集経路に介入しうるプロセスについての知見が不完全であることに起因している。加えて、成熟アミロイド線維や成熟アミロイド斑よりもむしろ、前線維性オリゴマー種がAD及びその他の神経変性病態における主要病原因子であることがいよいよ明らかになってきた（3,22-27）。したがって、有効な治療戦略の要素は、Aβ42線維形成を非特異的に抑制することではなく、むしろ、複雑なAβ42の凝集プロセス中の特定の微視的ステップ（microscopic steps）における制御された介入の中で、特定種を標的とすることである（28）。
【０００６】
このタイプの治療戦略は、アミロイド形成の基礎にある分子プロセスの解明を我々が最近大きく躍進させたことで、これを利用することにより今や提案が可能になった。これらの躍進は、タンパク質の凝集の研究に反応速度論を革新的に応用して得られた成果である（29,30）。チオフラビンT（ThT）蛍光（31）に基づく反応速度測定から得られた再現性の高いデータが入手できるようになったことで、我々は最近になってAβ42の凝集機構をその基礎にある分子事象の観点から定義できるようになった（30）。そうして、単量体の一次核形成を通して小さいが決定的意味を持つAβ42凝集体の濃縮がいったん発生すると、表面触媒性二次核形成が支配的なプロセスとなり、それによって、形成されてしまった線維の表面が、毒性オリゴマー種発生の触媒部位として機能することを観測した（30）。これらのオリゴマーはその後成長し更なる線維へと変換し得るので、この極めて有効な触媒サイクルにおいて更に別の毒性種の形成をも促進する（30）。
【０００７】
これらの成果は、治療分子によるAβ42の凝集プロセスの阻害機構を究明する可能性を提供するので、更なる成果に繋がり得る（28,29,32）。反応速度論を用いる手法は、毒性種の捉えにくい構造の予備知識を必要とせず、また、凝集性タンパク質（aggregation-prone proteins）への小分子の強力な結合を要するという制約もなしに、凝集プロセスに対する有力な治療分子の効果の定量的検出のための高感度の方法を提供する。この戦略を採用することにより、FDA承認済み抗がん剤であるベキサロテンが、Aβの自己集合における一次核形成ステップを特異的に標的とすること、神経芽腫細胞における毒性種の形成を遅らせること、及びC.elegansモデルにおいてAβ媒介毒性のAβ凝集とその病理学的効果を完全に抑制することを示すことが可能になった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、タンパク質の凝集に対する既知のまたは予測される阻害剤が作用する、全体的な凝集プロセスの発生源たる特定の微視的ステップ（即ち、一次核形成、二次核形成、伸長及び断片化）を特定することに留まらず、タンパク質の凝集に対する新たな阻害剤を特定し、そして更には、可溶性毒性オリゴマーの形成、即ち、一次及び／または二次核形成、に影響する主要な微視的段階を特異的に標的とする、合理的に特定または選択され得る新たな阻害剤を特定することまでも要求されている。本発明は、この要求に取り組む方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載するような、速度論に基づく創薬手法は、酵素や受容体等の標的タンパク質の原子構造に基づく伝統的な手法とは根本的に異なる。対象が「安定な」（例、過渡的でない）状態であれば、そのような構造ベースの創薬は適切である。例えば、結晶学を用いれば、リガンドが標的とどのように相互作用するのかを構造的に決定した上で、その相互作用に基づく新規な構造を導き得る。しかし、そのような構造ベースの創薬は、過渡的にしか存在しない標的、例えばタンパク質が凝集する間に存在し得る標的に対しては適切ではない。それゆえ、本発明に従えば、タンパク質の凝集に対する新たな阻害剤は、関数に基づいて、即ち、速度論によって、決定される。
【００１０】
これらの速度論的手法は、タンパク質の凝集等の運動現象を標的とするためには必要不可欠である。
【００１１】
発明の概要
本発明の第1の側面において、凝集性タンパク質の凝集に対するファーマコフォアを作成する方法が提供され、該方法は、
（a）タンパク質の凝集の少なくとも1つの阻害剤を提供することと、
（b）該少なくとも1つの阻害剤から阻害剤の骨格を生成することと、
（c）該阻害剤の骨格の少なくとも1つの構成要素に少なくとも1つの化学的置換を導入し、かつ該凝集性タンパク質の凝集反応速度の該少なくとも1つの化学的置換の効果を解析することを有し、ここで、凝集反応速度に対する効果を解析することは、少なくとも1つの化学的置換を有する化合物の非存在下と存在下における該タンパク質の反応速度プロフィールを作成することと、置換が陽性結果であるとの特定を該置換が反応速度プロフィールにおいてシフトを起こす場合に行うことを有し、かつ該方法は、
（d）反応速度アッセイからの該陽性結果を整列させることにより凝集性タンパク質の凝集に対するファーマコフォアを作成することを有する。
【００１２】
また、本発明は、タンパク質の凝集の阻害剤を特定するための方法を提供し、該方法において、該タンパク質は凝集性タンパク質であり、該方法は、
-  既知のまたは予測される阻害剤と同一の結合相手及び／または関連性の強い結合相手に結合する少なくとも1つの化合物を特定することを有し、ここで、該少なくとも1つの化合物は既知のまたは予測される阻害剤と同一の結合部位または結合ポケットに結合し、かつ、該方法は、
-  凝集性タンパク質の凝集反応速度に対する該少なくとも1つの化合物の効果を解析することと、
-  該少なくとも1つの化合物が該凝集性タンパク質の凝集反応速度に影響する場合に、該化合物を阻害剤として選択することを有する。
【００１３】
ある実施態様において、上記方法は、更に、既知のまたは予測される阻害剤を特定することと、該阻害剤の結合相手を特定しかつ特徴づけることを有する。好ましくは、タンパク質の凝集は、複数の、好ましくは3つの、一次核形成、二次核形成及び伸長である微視的段階に区分することができ、かつ、ここで、阻害剤は、これらの段階の少なくとも1つを阻害する。より好ましくは、阻害剤は、少なくとも一次及び／または二次核形成を阻害する。
【００１４】
ある実施態様において、凝集性タンパク質の凝集反応速度に対する少なくとも1つの化合物の効果を解析することは、単数または複数の化合物の非存在下と存在下における該タンパク質の反応速度プロフィールを作成することを有するものであって、ここで、前記単数または複数の化合物は、それが反応速度プロフィールにおいてシフトを起こす場合には阻害剤として特定される。好ましくは、反応速度プロフィールはS字型曲線であって、該曲線は、一次核形成プロセスと、二次核形成プロセスと、伸長プロセスとに由来する、少なくとも誘導期と、成長期と、安定期とを有するものであって、ここで、該少なくとも1つの化合物はこれらのプロセスの少なくとも1つを変更する。より好ましくは、以下の式
2019502711.tif 000002
を使って前記曲線のフィッティングを行うことによって反応速度プロフィールから速度パラメータが得られる。
（式中、反応速度パラメータB±、C±、κ、
2019502711.tif 000003
及び
2019502711.tif 000004
は、微視的速度定数の2種類の組合せk+k2及びknk2の関数であり、ここで、kn、k+及びk2は、それぞれ、一次核形成、伸長及び二次核形成の速度定数である。）
【００１５】
他の実施態様において、既知のまたは予測される阻害剤は、それ自体が凝集性タンパク質の凝集反応速度に対する阻害剤の効果を解析することによって特定されるものであって、ここで、該阻害剤は、反応速度プロフィールにおいてシフトを起こす場合に阻害剤であると特定される。
【００１６】
本発明の更なる側面において、上記の方法によって得られるまたは得られ得るタンパク質の凝集阻害剤が提供される。
【００１７】
本発明の他の側面において、凝集性タンパク質の凝集に対するファーマコフォアを作成する方法が提供され、該方法は、
-  上記の方法を使用してタンパク質の凝集の少なくとも1つの阻害剤を特定することと、
-  該少なくとも1つの阻害剤から阻害剤の骨格を生成し、かつ上記の方法を使用してファーマコフォアを作成することを有する。
【００１８】
阻害剤の骨格は、少なくとも1つの阻害剤から生成されてもよく、それに加えて上述の方法において記載した既知のまたは予測される阻害剤から生成されてもよい。
【００１９】
本発明の更なる側面において、本明細書に記載の方法によって得られるまたは得られ得るファーマコフォアが提供される。
【００２０】
本発明の他の側面において、Aβ42の凝集を阻害するファーマコフォアが提供され、該ファーマコフォアは、少なくとも9つの特徴を有し、ここで、該特徴は、2つの水素結合受容体と、カルボン酸基を表す末端の負に帯電した1つの特徴と、5つの疎水性の特徴に付加された1つの芳香族性の特徴である。
【００２１】
ファーマコフォアは、末端疎水基から他方の極性末端まで9.22オングストロームの水平距離を有していてもよい。
【００２２】
本発明の更なる側面において、アルツハイマー病の治療のための方法が提供され、該方法は、その治療が必要な患者にレチノイド受容体モジュレータを投与することを有するものであって、ここで、該モジュレータは、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237であるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる。
【００２３】
本発明の他の側面において、アルツハイマー病の治療において使用するためのレチノイド受容体モジュレータが提供され、ここで、該モジュレータは、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237であるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる。
【００２４】
本発明の更なる側面において、アルツハイマー病の治療に使用するための医薬の製造におけるレチノイド受容体モジュレータの使用が提供され、ここで、該モジュレータは、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237であるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる。
【００２５】
本発明のまた更なる側面において、凝集性タンパク質の凝集を阻害するための方法が提供され、ここで、該凝集性タンパク質はAβ42であり、該方法は、好ましくは、その阻害が必要な患者にタンパク質の凝集を阻害する量で、レチノイド受容体モジュレータを投与することを有するものであって、ここで、該モジュレータは、タミバロテン、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237及びベキサロテンから選ばれるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる。
【００２６】
本発明の最後の側面において、凝集性タンパク質の凝集を阻害するためのレチノイド受容体モジュレータの使用が提供され、ここで、該凝集性タンパク質はAβ42であり、かつ該モジュレータは、タミバロテン、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237及びベキサロテンから選ばれるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる。
【００２７】
上述した方法または使用のいずれかのある実施態様において、タンパク質の凝集は複数の微視的段階、好ましくは、一次核形成、二次核形成及び伸長である少なくとも3つの微視的段階に区分することができ、ここで、該レチノイド受容体モジュレータは、これらの段階の少なくとも1つを阻害する。好ましくは、レチノイド受容体モジュレータは、一次及び／または二次核形成を阻害する。より好ましくは、該モジュレータは、全ての微視的段階を阻害し、かつ、ここでは、該モジュレータは、MM11253、BMS493、アダパレン、CD1530及びLE135から選ばれる。
【００２８】
全ての上記側面のある実施態様において、凝集性タンパク質はアミロイドタンパク質である。好ましくは、アミロイドタンパク質は、Aβ42、α-シヌクレイン、タウ、ハンチンチン、アトロフィン1、アタキシン（1,2,3,6,7,8,12,17）、アミリン、プリオンタンパク質、（プロ）カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、アポリタンパク質AI、アポリタンパク質AII、アポリタンパク質AIV、血清アミロイド、メディン、（アポ）血清AA、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、β-2ミクログロブリン、フィブリノゲンα鎖、ゲルゾリン、ケラトプテリン（keratopthelin）、β-アミロイド、シスタチン、ABriPP免疫グロブリン軽鎖AL、免疫グロブリン重鎖、S-IBM、膵島アミロイドポリペプチド、インスリン、ラクトアドヘリン、角化上皮（kerato-epithelium）、ラクトフェリン、tbn、白血球走化性因子-2、AbriPP、ADanPP、肺表面活性タンパク質、ガレクチン7、コルネオデスモシン、ラクトアドヘリン、ケラトエピテリウム（kerato-epitelium）、歯原性エナメル芽細胞関連（ODAM）タンパク質、セメノゲリン1及びエンフュービルタイド（enfurvitide）から選ばれる。好ましくは、アミロイドタンパク質は、Aβ42、α-シヌクレイン、タウ及びハンチンチンから選ばれる。より好ましくは、アミロイドタンパク質はAβ42である。
【００２９】
更に本発明を以下の非限定的な図面により説明する。
図面
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本明細書に記載する創薬戦略の概略図。本戦略は次の4つのステップからなる：（1）FDA承認済み分子を他の医薬用途に利用することを含む、凝集性の系（ここではAβ42）と相互作用する小分子の特定を可能にする断片ベースの手法、（2）毒性種発生の原因となるAβ42の凝集機構における特定の分子ステップを特定する、インビトロの反応速度論解析、（3）（1）で特定した分子に関連する阻害機構を決定するための更なる反応速度論解析、及び（4）生体内の毒性種の形成に対する、これらの分子の効果の評価。特に、一次核形成の阻害は、凝集プロセスによって生成されたオリゴマーの総数に影響することなく凝集だけを遅らせると予測されているが、伸長の阻害は毒性オリゴマーの数を増加させ、二次核形成の阻害はこれを減少させると予測されている。
【図２】ベキサロテンはAβ42線維構造の形成を遅延させるがトラミプロセートは遅延させない。（a）4倍過剰トラミプロセート非存在下または存在下における濃度3μM（白丸）及び4μM（白四角）の静止条件下のAβ42凝集の反応速度プロフィール。（b）4倍過剰ベキサロテン非存在下または存在下における濃度3μM（白丸）及び4μM（白四角）の静止条件下のAβ42凝集の反応速度プロフィール。（c）4倍過剰ベキサロテン非存在下または存在下における初期単量体濃度の関数としての凝集反応の平均半濃度時間。
【図３】ベキサロテンは無標識環境におけるAβ42線維形成を遅延させる。（a）4倍過剰ベキサロテン非存在下と存在下における静止条件下の2μMAβ42の凝集反応速度プロフィール。グラフ下の表は、これを凝集進行中の2μMペプチド溶液からAβ42の等分量（aliquots）を取り出した（グラフ中に黒の実線で示す）時単位の異なる時点について示す。（b）4倍過剰ベキサロテン非存在下と存在下におけるAβ42種のAFM画像。画像は、1.2時及び2.1時の時点において凝集反応から取り出したAβ42溶液の等分量について、タッピングモードで空気中で得られた。なお、線維状構造はベキサロテン非存在下においてのみ2.1時経過後に観察できた。（c）抗体結合によって評価された2μMAβ42の線維形成の経時変化。配列特異的W0-2抗体によって検出されたAβ42ペプチドの量（上のパネル）は、（溶液中または凝集体としての）Aβ42全量の反応の経時変化の全期間中変化しなかった。一方、線維特異的OC抗体（下のパネル）は、ベキサロテン存在下よりも非存在下において早く形成されたとみられる線維状構造だけを検出している。観察された遅延の程度（赤色で示す）は、（a）に示す凝集プロフィールと完全に一致している。（d）線維特異的OC抗体のドットブロット検出強度によるAβ42線維質量濃度依存度の較正。（上）ThT蛍光による4μMAβ42の反応速度プロフィール。タッピングモードにより空気中で得た、pH8で形成された典型的な成熟Aβ42線維のAFM画像。（下）新鮮な4μMAβ42単量体を3時間インキュベート後回収したAβ42線維の段階希釈溶液に線維特異的OC抗体を結合させて得たドットブロット検出強度。線維濃度は4μM〜0.1μMの範囲であった。
【図４】ベキサロテンはAβ42の一次核形成を特異的に標的とする。（a〜c）Aβ42に対する濃度比が1：1または5：1の（異なる色で示す）ベキサロテン非存在下または存在下における5μMAβ42の凝集反応の反応速度プロフィール。実線は、二次核形成（a）、線維伸長（b）、または一次核形成（c）のいずれかがベキサロテンによって阻害されるときに生ずる反応プロフィールの予測を示す。一次核形成のみが阻害されるときの予測だけがベキサロテンの実験データと整合している。（d）ベキサロテンの濃度比の増加に伴う見かけの反応速度定数の変化（knは一次核形成速度、k+は伸長速度及びk2は二次核形成速度であり、Kは各場合におけるknk+またはk2k+のいずれかを示す。）。なお、ベキサロテンの濃度が増加するにつれて、二次経路k2k+と比べ一次経路knk+において有意に減少している。（e）2倍、5倍、7倍及び10倍過剰ベキサロテン（異なる記号で示す）非存在下または存在下において10%の予め形成した種子線維を添加しない場合と添加した場合の2μMAβ42の反応速度プロフィール。予め形成した種子線維の存在下の方が、予め形成した種子線維を添加しない場合に比べて凝集反応の傾きの増加が急であることが分かる。（f）5%の予め形成した線維種子存在下における2μMAβ42サンプルの凝集プロフィールについて、一次核形成事象が貢献する場合と無視できる場合で同一の曲線を示すシミュレーション。（g）5%の予め形成した線維種子存在下における2μMAβ42サンプルの凝集反応速度に対する0.5倍及び5倍過剰ベキサロテンの効果。（h）（g）の凝集反応速度から得られるような表面触媒性二次核形成の速度（K2）に対する0.5倍及び5倍過剰ベキサロテンの効果。
【図５】ベキサロテンは神経芽腫細胞におけるAβ42毒性種の形成を遅らせる。20倍過剰ベキサロテン非存在下と存在下における0.5μMAβ42溶液の反応プロフィール（a）及び核形成速度（b）の数値シミュレーション。実線は、ベキサロテン非存在下における対照の凝集反応に対応し、反応速度定数は、k2＝1.106 1/M/s、k+＝3.106 1/M/s及びkn＝1.104 1/M/sである。点線は、ベキサロテン存在下における挙動を示し、ここで、核形成速度定数knは1.102 1/M/sに減少している。総核形成速度（即ち一次及び二次核形成の両方）の変化に遅延が確認できる。（c〜f）ヒトの神経芽腫細胞株（SH-SY5Y）に対するAβ42種の細胞毒性効果の指標としての活性カスパーゼ3の量であり、蛍光値は正規化されている（「方法」を参照）。10μMベキサロテン非存在下と存在下における0.5μMAβ42の等分量を0時（c）、0.3時（d）、4時（e）及び7時（f）における凝集反応から取り出した。ベキサロテン非存在下と存在下におけるAβ42の蛍光値のパーセント差（丸印）。これらの結果は、ベキサロテンによるAβ42毒性種形成の遅延と一致して、37°Cにおける7時間のインキュベート後になって初めてベキサロテン存在下において検知可能な量の毒性のAβ42種が形成されることを示している。
【図６】ベキサロテンはAβ凝集を妨げることによってAβ媒介毒性のC.elegansモデルの運動性を回復させる。（a）C.elegansのGMC101（即ち、Aβ線虫）及びCL2122（即ち、対照線虫）の両モデルにおける体を曲げる頻度及び凝集体の量に対するベキサロテンの効果の測定のための実験手順。ベキサロテンをL1及びL4幼虫期の線虫に与えた。（b）Aβ線虫モデルにおける体を曲げる頻度に対するベキサロテンの効果を5〜10μMの範囲で濃度を増加させて測定。第0日目に対する正規化値を示す。実験データは単一の実験の結果にみえるが、個別に行った3回の実験の各回におけるデータを示している。Aβ線虫モデルの運動性の完全な回復が10μMベキサロテンにおいて確認できる。小さい方のグラフは成虫の第3日目におけるAβ線虫に対するベキサロテンの効果の用量依存性を示す。（c）10μMベキサロテン非存在下と存在下におけるアミロイド特異的染料NIAD-4を使用して着色した凝集体の生体内画像。明確にするため、第6日目及び第9日目の画像のみを示す。（d）1μMベキサロテン非存在下と存在下におけるAβ線虫モデルにおいて形成されたアミロイド凝集体の反応の経時変化。蛍光強度の定量化はImageJソフトウェアを使用して行った（「方法」を参照）。全てのパネルにおいて、エラーバーはSEMを示す。（e）Aβ及びα-チューブリンの免疫検出時のベキサロテン存在下と非存在下におけるC.elegansからのタンパク質抽出物の不溶性画分（「方法」を参照）。
【図７−１】実施例IIにおいて採用した創薬戦略の概略図。本戦略は、2つの主要ステップから成る。（1）第1のステップは、準構造ベースの創薬戦略（quasi-structure-based drug discovery strategy; QSBDD）であり、これは、Aβ42凝集の一次核形成を優先的に阻害することを示した特定前のヒット（即ち、ベキサロテン）の当初受容体（即ち、RXR）の構造に基づき有力な分子を特定することから主に構成される。この戦略の論理的根拠は、Aβ42オリゴマーが不安定かつ過渡的な性質を有しているために、その特徴づけとその先の構造に基づく医薬開発を難題にしてしまっていることである。続いて、RXRの結合ポケットとAβ42オリゴマーの間で構造的類似性が生ずるという仮説に基づいて、RXR（即ち、ベキサロテンの当初受容体）の全てのアゴニスト及びアンタゴニストをこの研究において考慮した。全分子の構造を示す。また、RXRとの高い構造的類似性を前提として、RARのアゴニスト及びアンタゴニストも含むように本戦略を拡張した。合計で、ベキサロテンを含む13種の分子を試験した。左上のパネルは増加量（即ち、1〜5倍過剰）のベキサロテン存在下における5μMAβ42の凝集（黒色）の反応速度を示す。RARの構造（PDB：1XDK）をRXR受容体との二量体として示す。RXRサブユニットを結合ポケット（PDB：4K6I）にベキサロテンを有するRXRの構造と共に示す。結合ポケットの拡大図も示す。
【図７−２】（2）第2のステップは、反応速度論ベースの創薬戦略（KBDD）から成る。このステップは、微視的レベルで小分子の効果を評価する。実に、分子は、単量体、一次核、二次核、線維または多くの種の組合せに結合することができ、従って凝集反応速度の理論的フィッティングを使って定量的に特徴づけ得る異なる微視的ステップに影響する。実線は、阻害剤なしのAβ42の凝集反応速度に対応する。点線は、阻害剤存在下におけるAβ42の反応速度に対応し、この後者が単一の微視的ステップに影響する。
【図８】RARリガンド及びRXRリガンドは異なる程度でAβ42凝集に影響する。（a）3倍過剰RARリガンド及びRXRリガンドの非存在下と存在下におけるAβ42の2μM溶液の凝集の反応速度プロフィールをそれぞれ異なる記号で示したもの。なお、Aβ42は13種の分子のうち5種の存在下において10時間以内に凝集せず、それらは平坦な線で示されている。（b）（a）において平坦な線で示す5種の分子の非存在下と化学量論的量未満の存在下における2μMAβ42の凝集反応速度プロフィール。（c）（a）のAβ42の凝集反応の半濃度時間をヒストグラムとして示し、かつ、1%DSMO存在下における凝集反応の1.6時と2時の正規化ドットブロット検出強度の相関関係を白丸として示すプロット。分子は、Aβ42の凝集において誘発した遅延の程度に基づいて評価し、各々の有効性に従い2組に分類した。A組（青で示す）は、1%DMSOの分子に類似する効果を示す分子を含む（1%DSMO存在下におけるAβ42凝集の半濃度時間を黒色の点線で示す）。B組（緑で示す）は、ベキサロテンの分子と同等以上の効果を示す分子を含む（ベキサロテン存在下におけるAβμ2凝集の半濃度時間を赤色の点線で示す）。（d）（b）のAβ42の凝集反応の半濃度時間をヒストグラムとして示し、かつ、1%DSMO存在下における凝集反応の1.5時と2.5時の正規化ドットブロット検出強度の相関関係を白丸として示すプロット。この分子はC組（淡橙で示す）として分類した。（e）Aβ42の凝集反応の半濃度時間に対するB組分子の用量依存的効果を示すプロット。（f）凝集反応の半濃度時間に対するC組分子の用量依存的効果を示すプロット。
【図９】静止条件下におけるAβ42凝集に対するB組分子の効果。（a〜e）1%DMSO（○）または0.2倍（・）、0.5倍（◇）、1倍（+）、2倍（＞）、3倍（＊）、及び5倍過剰（▽）のベキサロテン（a）、タミバロテン（b）、TTNPB（c）、BMS195614（d）、Ch55（e）、SR11237（f）及びUVI3003（g）のいずれかの非存在下と存在下におけるAβ42の2μM溶液の凝集反応速度プロフィール。実線は、実験データにフィッティングしたA！42凝集の積分形反応速度式を示す。円内に示す構造の全てのB組分子が、ドットブロットで得た結果と同様のAβ42凝集における有意な遅延を誘発した。
【図１０】静止条件下におけるAβ42の凝集に対するC組分子の効果。（a〜e）1%DMSO（黒）または0.2倍（赤）、0.5倍（シアン）、1倍（青）、2倍（黄色）、及び3倍（緑）のいずれかのMM11253（a）、アダパレン（b）、BMS493（c）、CD1530（d）及びLE135（e）の非存在下と存在下におけるAβ42凝集の2μM溶液の凝集反応速度プロフィール。実線は、実験データにフィッティングしたA！42凝集の積分形反応速度式を示す。円内に示す構造の全てのC組分子が、化学量論的量未満において、ドットブロットで得た結果と同様のAβ42凝集における有意な遅延を誘発した。
【図１１】Aβ42凝集に対するB組分子の効果の特徴づけ。（a〜g）図10のフィッティングした凝集反応から得られたような、分子の濃度の増加に伴う見かけの反応速度定数の変化（knは一次核形成速度、k+は伸長速度、及びk2は二次核形成速度であり、Kはそれぞれの場合におけるknk+（一次経路）またはk2k+（二次経路）を示す。）。一次経路knk+の減少と比較すると、分子の濃度が上昇するにつれて二次経路k2k+が僅かに減少していることが分かる。（h〜j）一次経路が無視できる程度である場合の播種条件下におけるAβ42凝集に対するB組分子の効果。（h）5倍過剰ベキサロテン、TTNPB及びUVI3003の非存在下または存在下における10%の予め形成した種子の存在下のAβ42の2μM溶液の凝集の反応速度プロフィール。これらの条件下では、線維の伸長が支配的機構である。（i）10%の予め形成した種子線維の存在下における（h）の近似曲線から派生した正規化成長速度。これらの結果はB組分子が伸長速度に影響しないことを示している。（j）表面触媒性二次核形成の速度（k2）に対する0.5倍及び5倍過剰ベキサロテン、TTNPB及びUVI3003の効果。速度は、1%、2%及び5%の予め形成した種子の存在下における2μMAβ42溶液の凝集反応速度から得たものであり（図13）、ここで一次核形成は無視できる程度であり、表面触媒性二次核形成は、形成された線維の総量のそれぞれ、およそ35%、60%及び80%に貢献する。定量的パラメータは図13の近似曲線から得た。伸長は影響を受けていないので、得られた効果は、表面触媒性二次核形成の速度の減少だけに起因し得る。
【図１２】Aβ42凝集に対するC組分子の効果の特徴づけ。（a〜g）図10のフィッティングした凝集反応から得られたような、分子の濃度の増加に伴う見かけの反応速度定数の変化（knは一次核形成速度、k+は伸長速度、及びk2は二次核形成速度であり、Kはそれぞれの場合におけるknk+（一次経路）またはk2k+（二次経路）を示す。）。一次経路knk+の減少と比較すると、分子の濃度が上昇するにつれて二次経路k2k+が僅かに減少していることが分かる。（f〜j）一次経路が無視できる程度である場合の播種条件下におけるAβ42凝集に対するC組分子の効果。（f）5倍過剰MM11253、アダパレン及びBMS493の非存在下または存在下における10%の予め形成した種子の存在下のAβ42の2μM溶液の凝集の反応速度プロフィール。これらの条件下では、線維の伸長が支配的機構である。（g）10%の予め形成した種子線維の存在下における（f）の近似曲線から派生した正規化成長速度。これらの結果はC組分子はAβ42凝集の伸長速度に5倍過剰で影響することを示す。（h）0.5倍過剰MM11253、アダパレン及びBMS493の非存在下または存在下において、10%の予め形成した種子の存在下におけるAβ42の2μM溶液の凝集の反応速度プロフィール。これらの条件下では、線維の伸長が支配的機構である。（i）10%の予め形成した種子線維の存在下における（h）の近似曲線から派生した正規化成長速度。これらの結果はC組分子はAβ42凝集の伸長速度に0.5倍過剰で影響しないことを示す。（j）表面触媒性二次核形成の速度（k2）に対する0.5倍過剰MM11253、アダパレン及びBMS493の効果。速度は、1%、2%及び5%の予め形成した種子の存在下における2μMAβ42溶液の凝集反応速度から得たものであり（図15）、ここで一次核形成は無視できる程度であり、表面触媒性二次核形成は、それぞれ、形成された線維の全量のおよそ35%、60%及び80%に貢献する。定量的パラメータは図15の近似曲線から得た。0.5倍過剰において伸長は影響を受けていないので、得られた効果は、表面触媒性二次核形成の速度の減少だけに起因し得る。
【図１３】1%、2%及び5%の予め形成した種子線維の存在下におけるAβ42の凝集反応速度に対するB組分子の効果の解析。（a〜c）1%DMSO、または0.5倍及び5倍過剰ベキサロテン（a,d,g）、TTNPB（b,e,h）及びUVI3003（c,f,i）のいずれかの存在下において、予め形成した線維種子の増加濃度の存在下における2μMAβ42溶液の凝集の反応速度プロフィール。なお、凝集反応速度に対するB組分子の濃度依存的効果に留意すべき。
【図１４】1%、2%及び5%の予め形成した種子線維の存在下におけるAβ42の凝集反応速度に対するC組分子の効果の解析。（a〜c）1%DMSO、または0.5倍及び5倍過剰MM11253（a,d,g）、アダパレン（b,e,h）及びBMS493（c,f,i）のいずれかの存在下において、予め形成した線維種子の増加濃度の存在下における2μMAβ42溶液の凝集の反応速度プロフィール。なお、凝集反応速度に対するC組分子の濃度依存的効果に留意すべき。
【図１５】クラステリン存在下におけるAβ42の凝集反応速度に対するB組分子の効果の解析。（a〜c）10%の予め形成した種子線維、10%クラステリン及び0.5倍及び5倍過剰ベキサロテン（a）、TTNPB（b）及びUVI3003（c）の存在下における2μMAβ42溶液の凝集反応速度の反応プロフィール。これらの実験の論理的根拠は、Aβ42の予め形成した線維の端部をクラステリンでブロッキングすることによる表面触媒性二次核形成に対するB組分子の効果を評価することである。クラステリン非存在下において、10%の予め形成した線維種子の存在下における支配的機構は伸長である。10%クラステリンの存在は、伸長速度を60%減少させ、それ故、表面触媒性二次核形成を40%に回復させる。なお、クラステリンを添加した際の凝集反応速度に対するB組分子の用量依存的効果は、表面触媒性二次核形成に対する効果と符合することが分かる。（d）（a〜c）における近似曲線から算出し、かつ5%の予め形成した線維種子の存在下において比較した見かけの表面触媒性二次核形成の反応速度。
【図１６】クラステリン存在下におけるAβ42の凝集反応速度に対するC組分子の効果の解析。（a〜c）10%の予め形成した種子線維、10%クラステリン及び0.5倍及び5倍過剰MM11253（a）、アダパレン（b）及びBMS493（c）の存在下における2μMAβ42溶液の凝集反応速度の反応プロフィール。これらの実験の論理的根拠は、Aβ42の、予め形成した線維の端部をクラステリンでブロッキングすることによる表面触媒性二次核形成に対するC組分子の効果を評価することである。クラステリン非存在下において、10%の予め形成した線維種子存在下における支配的機構は伸長である。10%クラステリンの存在は、伸長速度を60%減少させ、それ故、表面触媒性二次核形成を40%に回復させる。なお、クラステリンを添加した際の凝集反応速度に対するC組分子の用量依存的効果は、表面触媒性二次核形成に対する効果と符合することが分かる。（d）（a〜c）における近似曲線から算出し、かつ5%の予め形成した線維種子存在下において比較した見かけの表面触媒性二次核形成の反応速度。
【図１７−１】小分子による標的種の特定。（a）Aβ42の凝集の微視的ステップに対する全ての分子の効果と標的種をまとめた表。
【図１７−２】（b、上）1%DMSO（黒）または1倍過剰の全てのC組分子及びUVI（即ち、B組）のいずれかの存在下における25μMの単量体15N-Aβ42の1H-15N HSQCスペクトルを重ねたもの。スペクトルは1H周波数700MHｚかつ278Kにおいて得られた。（b、下）スペクトル（b）から派生した25μM単量体1H-15N-Aβ42の化学シフト（棒グラフ）及び正規化強度（点線）は、1%DMSO存在下においてAβ42について観察したものと類似している。
【図１７−３】（b、上）1%DMSO（黒）または1倍過剰の全てのC組分子及びUVI（即ち、B組）のいずれかの存在下における25μMの単量体15N-Aβ42の1H-15N HSQCスペクトルを重ねたもの。スペクトルは1H周波数700MHｚかつ278Kにおいて得られた。（b、下）スペクトル（b）から派生した25μM単量体1H-15N-Aβ42の化学シフト（棒グラフ）及び正規化強度（点線）は、1%DMSO存在下においてAβ42について観察したものと類似している。
【図１８−１】小分子の骨格の化学解析。（a）構造‐反応速度活性相関（S-KAR；Structure-Kinetics Activity Relationship）を通して反応速度論を使用する、ベキサロテンの構造の3つの構成要素の、Aβ42凝集に対する効果への貢献度の解析。（上）親水性構成要素（左）、疎水性構成要素（右）及びリンカー構成要素（中央）の効果を調べるため、ベキサロテンの骨格に単一の置換を導入した。（下）該単一の置換を有する分子の非存在下と存在下における2μMAβ42溶液の反応速度の凝集プロフィール。（b）整列した（alignment）全ての陽性分子からのファーマコフォアの生成。該ファーマコフォアは、およそ9.22オングストローム隔てた疎水性の部分と親水性の部分という2つの主要構成要素からなる。
【図１８−２】（c）小分子の親油性、ファンデルワールス体積及び芳香族性と、該分子の有効性に対するそれらの効果との間の相関関係を示すプロット。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
以下、本発明を更に説明する。以下の記載において、本発明の異なる側面がより詳細に規定される。各側面は、反対の明示がない限り、他の単数または複数の側面と組み合わせて規定されてもよい。特に、好ましいまたは有利であると示される任意の特徴は、いずれも、好ましいまたは有利であると示される他の単数または複数の特徴のいずれと組み合わせてもよい。
【００３２】
本発明は、アミロイドタンパク質等の凝集性タンパク質の凝集を阻害するように作用し得る新規な化合物を特定するための方法に関する。特に、本発明は、1または複数の特定の微視的事象、特に、タンパク質の凝集プロセスの基礎にある一次核形成及び二次核形成を阻害し得る化合物を特定する方法に関する。
【００３３】
参照することにより本明細書に組み込まれるArosioら（2014年）（28）に記載されるように、タンパク質の凝集は、単量体のタンパク質のプールから小さなオリゴマーを発生させる核形成ステップから始まる複数ステップのプロセスと考えられる。そのようなオリゴマーは、反応性が高く、準安定性（metastable）であり、それゆえ単量体を付加して原線維、そしてさらに線維へと急速に伸長する。しかしほとんどの場合、凝集速度はその後、新しい反応性核の形成や二次核形成プロセスにおける非常に高い見かけの共働性をもたらす、線維断片化や表面触媒性核形成等の二次核形成のプロセスによって指数関数的に加速する。
【００３４】
これらの微視的プロセスや、そのようなプロセスの標的阻害剤の効果は、線維形成の肉眼的な反応速度論を研究することにより解析され得る。Arosioら（28）が説明するように、線維形成の微視的な反応速度論は、まず誘導期に始まり、次いで急成長期、そして単量体の枯渇により達する安定期を含む、特徴的なS字形プロフィールに従う。凝集プロセスにおいて阻害剤が作用する時点の解明が、標的阻害剤の非存在下と存在下における反応速度プロフィールを調べることによって達成され得るが、それは異なる期を阻害すると異なる肉眼的凝集プロフィールをもたらすからである。例えば、一次核形成速度の減少は、図7に示すように、概して成長期の前の誘導期の期間を増加させる。この情報は、タンパク質の凝集を阻害する阻害剤の有効性を決定し、そして究極的には疾病予防の見地からその潜在的な治療上の有用性を決定するために用いられ得る。より高毒性の種は可溶性オリゴマーであることが一般的に受け入れられているけれども、阻害剤が異なればこれらのオリゴマーに対して異なる効果を有し得る。例えば、一次核形成の阻害は、オリゴマーの全負荷を減少又は抑制させるというよりは毒性の可溶性オリゴマーの形成を遅延させるにすぎないと予測されるが、二次核形成の阻害は、オリゴマーの負荷を減少させると予測される。逆に、伸長の阻害は、可溶性の毒性オリゴマーの総数を増加させると予測される。そのため、少なくとも一次核形成及び／または二次核形成を標的とし得る阻害剤は、最も有望な医薬候補になり得ることが明らかである。
【００３５】
そのような情報は、上述のように、既に特定された阻害剤の潜在的な治療上の有用性を評価したり、あるいは凝集の特定の微視的ステップを標的とし得る阻害剤の論理的な選択を可能にするには恐らく有用であろうが、そのような情報単独では新たな阻害剤、特に、一次及び／または二次核形成に特異的に影響する阻害剤の特定は可能にならない。しかもこれらの特定の微視的段階を標的とする新たな阻害剤の特定は、一次核及び二次核が不安定で、豊富に存在せず、かつ、凝集プロセス中に過渡的にしか発生しないために、更に難題である。これらの特徴のために、従来の生物物理学的手法を使用して構造的な特徴づけをすることはできない。しかしながら本発明者らは、既存の特定済みヒットから出発する（ことも任意選択として可能な）、凝集性タンパク質の凝集を阻害し得る新たな阻害剤を特定することを可能にする戦略を開発した。
【００３６】
したがって、1つの側面において、タンパク質の凝集の阻害剤を特定するための方法が提供され、該方法において該タンパク質は、凝集性タンパク質であり、該方法は、
-  該タンパク質の既知のまたは凝集の予測される阻害剤と同一の結合相手及び／または関連性の強い結合相手に結合する化合物を特定することを有し、ここで、該少なくとも1つの化合物は既知のまたは予測される阻害剤と同一の結合部位または結合ポケットに結合し、かつ、該方法は、
-  凝集性タンパク質の凝集反応速度に対する少なくとも1つの更なる化合物の効果を解析することと、
-  該少なくとも1つの化合物が該タンパク質の凝集反応速度に影響する場合に、該化合物を阻害剤として選択することまたは特定することを有する。
【００３７】
好ましくは、前記方法は、まず第一にタンパク質の凝集の既知のまたは予測される阻害剤を特定することと、阻害剤の結合相手を特定しかつ特徴づけることを有する。
【００３８】
ある実施態様において、阻害剤（既知のまたは予測される阻害剤及び少なくとも1つの更なる化合物）は、例えば、基質、酵素阻害剤、賦活剤及び神経伝達物質を含むがこれらに限定されない、リガンドとして作用する。
【００３９】
ある実施態様において、タンパク質の凝集は、複数の微視的ステップであって、好ましくは少なくとも3つの、一次核形成、二次核形成及び伸長である微視的ステップに区分することができる。好ましくは、既知のまたは予測される阻害剤はこれらの段階の少なくとも1つを阻害する。好ましくは、特定され得る阻害剤は、これらのステップの少なくとも1つもまた阻害する。更なる実施態様において、少なくとも一次及び／または二次核形成が阻害される。更に好ましい実施態様において、一次核形成、二次核形成及び伸長である凝集の全ステップが阻害される。
【００４０】
「一次核形成」というとき、単量体サブユニットからのオリゴマーの生成を意味する。
【００４１】
「二次核形成」というとき、線維の断片化、及び／または更なる毒性オリゴマー種の生成のための触媒部位を形成する、表面触媒性の核形成を意味する。
【００４２】
「伸長」というとき、原線維及び線維を生成する、単量体単位のオリゴマーへの付加を意味する。
【００４３】
「結合部位または結合ポケット」というとき、リガンドが化学結合を（即ち、非共有結合によって）形成し得るタンパク質またはその断片上の領域を意味する。通常、そのような部位は側鎖原子を有するタンパク質における疎水性のポケットであるか、またはそれらは該リガンドの極性部分と相互作用し得る水素結合の受容体／ドナーが関与し得る。結合部位を特定するための手法は、本技術分野において数多く存在しており、当業者に周知であり得る。この場合における代表例は、X線結晶学を利用して標的タンパク質と医薬の複合体の構造を決定することである。この場合において、結合部位の決定は容易な作業ではなく、また、ここでも、上述した理由と同一の理由により、不安定かつ結合構造の過渡的な性質のためにそれらの構造的な特徴づけをすること、及びそれゆえに正確な結合部位を特定することができない。このことは、ここでもまた、更なる阻害剤を特定するためにそのような知識が要求されないという、後述するこの手法の優れた能力を裏付けている。
【００４４】
上述の方法の更なる実施態様において、初期阻害剤（既知のまたは予測される阻害剤）は、以下の方法を用いて特定し得る。凝集性タンパク質に結合すると文献に報告されている約10〜100の既知の（または予測される）阻害剤の小規模のプールを出発点として、標的断片のライブラリを生成する。好ましくは、そのような断片の分子量（MW）は300Da未満である。これらの断片を更にスクリーニングして凝集性タンパク質への結合親和性が低い断片を特定する。好ましくは、選択された断片のKDは、100マイクロモル〜10ミリモルの範囲である。ある実施態様において、選択された断片は、既知のデータベースの化学的に関係する化合物に対してスクリーニングされる。好ましくは、データベースは、ChEMBL（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）、PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、ZINC（http://zinc.docking.org/）及び／またはDrugBank（http://www.Drugbank.ca/）から選ばれる。代替的に、データベースは、製薬のパートナーや外注研究機関等の第三者によって提供されてもよい。任意選択的に、特定済み化合物は、FDA承認済み、または代替的に、フェーズI臨床試験を成功裏に完了した化合物について更にスクリーニングされる。いずれの場合においても、既知の（または予測される）FDA承認済みまたは未承認の、阻害剤のライブラリが作成される。更なるステップにおいて、阻害剤ライブラリからの少なくとも1つの既知の（または予測される）阻害剤の効果を解析して、阻害剤が標的とする凝集の微視的段階を決定する。したがって、更なる実施態様において、該方法は、後述するような、凝集性タンパク質の凝集反応速度に対する既知の（または予測される）阻害剤の効果を解析することを含む。更なる実施態様において、該方法は、一次及び／または二次核形成を阻害する既知のまたは予測される阻害剤を選択することを有する。
【００４５】
ひとたび小分子を特定すれば、その後は、本明細書において提案した上記の手法（「準構造ベースの創薬」（QBSDD）ともいう。実施例IIを参照）の他に、例えば上述のようなデータベースの仮想スクリーニングを阻害剤の骨格を使用して行い得る。
【００４６】
ある実施態様において、高度に関係する結合相手は、結合相手と類似の構造及び／または類似のまたは同一の生物学的機能を有し、及び／または結合相手と同一のリガンドと作用する。例えば、レチノイド受容体RAR及びRXRは、両者ともレチノイドに結合する。ある実施態様において、「類似の構造」というとき、結合相手が少なくとも1つの同一の保存構造のドメインまたはモチーフを有することを意味することがある。代替的に、結合相手はヌクレオチドまたはアミノ酸配列の高い同一性を有していてもよく、好ましくは、少なくとも互いに対して、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性または類似性を有していてもよい。
【００４７】
Arosioら（28）が説明するように、反応速度論解析がまず最初に適用されるのは、全化合物の非存在下における、検討中の凝集性タンパク質の凝集機構の解明である。次いで、この解析を少なくとも1つの化合物の存在下において繰り返し、反応速度プロフィールに対する該化合物の効果を特定する。
【００４８】
したがって、好ましい実施態様において、凝集性タンパク質の凝集反応速度の、少なくとも1つの化合物の効果を解析することは、該化合物の非存在下と存在下におけるタンパク質の反応速度プロフィールを作成することを有する。そうして該化合物が反応速度プロフィールの相対的速度にシフトまたは変化を起こす場合は、該化合物は阻害剤として特定される。上述のように、好ましくは、反応速度プロフィールは、S字型曲線であって、該曲線は、少なくとも、一次核形成、二次核形成及び伸長のそれぞれを表す、誘導期とそれに続く成長期、更にそれに続く安定期を有し、かつ、該少なくとも1つの化合物は、これらの期の少なくとも1つを変化させる。ある実施態様において、阻害剤は、誘導期の長さを増加させ、成長期の傾きの勾配を減少させ、及び／または安定期の開始を遅延させる。
【００４９】
上記の方法のある実施態様において、反応速度プロフィールは、下記の式を用いて作成される。
【００５０】
総線維質量濃度の経時変化「M(t)」が、下記の積分形反応速度式によって記述される：
2019502711.tif 000005
（式中、反応速度パラメータB±、C±、κ、
2019502711.tif 000006
及び
2019502711.tif 000007
は、微視的速度定数の2種類の組合せk+k2及びknk2の関数であり、ここでkn、k+及びk2は、それぞれ、一次核形成速度定数、伸長速度定数及び二次核形成速度定数である。）
【００５１】
分子は、1以上の個別の微視的反応を阻害することによって凝集プロセスを妨げ得る。我々は、高度に再現性のある実験を行った後、上記の式を適用して肉眼的な凝集プロフィールを記述し、かつ、小分子の非存在下と存在下における線維形成の経時変化の記述に要求される微視的速度定数「k+k2」及び「knk2」のセットを比較することによって、化合物によって阻害される微視的事象を特定し得る。
【００５２】
上述の方法において、「凝集性タンパク質」は、任意のアミロイドタンパク質であると考えてよい。「アミロイドタンパク質」というとき、アミロイド症として知られる症状に起因するタンパク質の折りたたみの連続的な変化の結果として、主に器官や組織の細胞外の空間において不溶性線維として蓄積されるタンパク質を意味する。染色した蓄積物を偏光顕微鏡で見ると、アミロイド線維タンパク質は、直径がおよそ10nmで、コンゴレッドに結合して緑色、黄色またはオレンジ色の複屈折を示す硬直した非分岐性の線維として、組織蓄積物内に発生している。組織から単離してX線回折で解析すると、線維は特徴的なβ回折パターンを示す（54）。「アミロイドタンパク質」もまた本技術分野における標準的な用語であり、アミロイドとして分類されるタンパク質は、参照することにより本明細書中に組み込まれるISAアミロイド線維タンパク質命名リスト（ISA Amyloid Fibril Protein Nomenclature List）中に見つけることができる。
【００５３】
好ましい実施態様において、アミロイドタンパク質は、Aβ42、α-シヌクレイン、タウ、ハンチンチン、アトロフィン1、アタキシン（1,2,3,6,7,8,12,17）、アミリン、プリオンタンパク質、（プロ）カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、アポリタンパク質AI、アポリタンパク質AII、アポリタンパク質AIV、血清アミロイド、メディン、（アポ）血清AA、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、β-2ミクログロブリン、フィブリノゲンα鎖、ゲルゾリン、ケラトプテリン（keratopthelin）、β-アミロイド、シスタチン、ABriPP免疫グロブリン軽鎖AL、免疫グロブリン重鎖、S-IBM、膵島アミロイドポリペプチド、インスリン、ラクトアドヘリン、角化上皮（kerato-epithelium）、ラクトフェリン、tbn、白血球走化性因子-2、AbriPP、ADanPP、肺表面活性タンパク質、ガレクチン7、コルネオデスモシン、ラクトアドヘリン、ケラトエピテリウム（kerato-epitelium）、歯原性エナメル芽細胞関連（ODAM）タンパク質、セメノゲリン1及びエンフュービルタイド（enfurvitide）から選ばれる。好ましくは、アミロイドタンパク質は、Aβ42、α-シヌクレイン、タウ及びハンチンチンから選ばれる。より好ましくは、アミロイドタンパク質はAβ42である。
【００５４】
本発明の他の側面において、上記の方法によって得られるまたは得られ得るタンパク質の凝集阻害剤が提供される。
【００５５】
本発明の更なる側面において、凝集性タンパク質の凝集に対するファーマコフォアを作成する方法が提供され、該方法は、
‐  タンパク質の凝集の少なくとも1つの阻害剤を提供することと、
‐  該少なくとも1つの阻害剤から阻害剤の骨格を生成することと、
‐  該阻害剤の骨格、及び任意選択的に該阻害剤、の少なくとも1つの構成要素に少なくとも1つの化学的置換を導入し、かつ、凝集性タンパク質の凝集反応速度の該少なくとも1つの化学的置換の効果を解析することを有し、ここで、凝集反応速度に対する効果を解析することは、少なくとも1つの化学的置換を有する阻害剤の骨格または阻害剤の非存在下と存在下における該タンパク質の（本明細書中に記載するような）反応速度プロフィールを作成することと、置換が陽性結果であるとの特定を該置換が反応速度プロフィールにおいてシフトを起こす（本明細書中において「シフト」と記載される）場合に行うことを有し、かつ該方法は、
‐  反応速度アッセイからの該陽性結果を整列させることにより凝集性タンパク質の凝集に対するファーマコフォアを作成することを有する。
【００５６】
本方法の第1のステップにおける阻害剤は、本明細書に記載の方法によって特定され得る。本方法の第2のステップは、阻害剤の骨格を生成する際に、付加的に、（タンパク質の凝集の阻害剤を特定する方法のために上述したような）既知のまたは予測される阻害剤を使用してもよい。
【００５７】
用語「ファーマコフォア」は、特定の生物学的標的との最適な超分子相互作用を確実にするため及びその生物学的反応を誘発（またはブロック）するために必要な、立体配置に関する特徴及び電子的特徴の集合と定義される。この文脈において、本発明者らは、凝集性タンパク質に対する（即ち、凝集性タンパク質の凝集を阻害する）ファーマコフォアを作成する方法を開発した。ある実施態様において、凝集性タンパク質はアミロイドタンパク質であり、好ましくはAβ42である。ひとたび生成してしまえば、上述の方法により作成されるファーマコフォアは無数の用途を有する。例えば、ファーマコフォアは、化学的に多様な化合物のライブラリをスクリーニングして、該ファーマコフォアに一致する類似の生化学的特徴を有する、そしてそれゆえにタンパク質の凝集の有力な阻害剤である化合物を特定するために使用され得る。したがって、タンパク質凝集の少なくとも1つの更なる阻害剤を特定するための、上記方法により特定されたファーマコフォアを使用して化合物のライブラリをスクリーニングする方法であって、該タンパク質は凝集性タンパク質である方法もまた、提供される。
【００５８】
ファーマコフォアは、各種の医薬化学計算用ソフトウェアのコードを使用して特定され得る。本発明者らは、本件において、まず最初に、（参照することにより本明細書に組み込まれる）CORINA（55）を使用して各化合物（即ち、阻害剤）の3D配座（conformation）を生成した。CORINA（Coordinates）は、自動2D/3D変換ソフトウェアであり、（接続表または線形符号を通して表現されるような）分子の構造のみから分子の原子に必要な3次元座標を生成する。標準的な結合距離および結合角を有する単心性の（mono-centric）断片を（小分子の結晶構造における配座優先性の統計的解析を通じて決定される）適切な二面角とともに複数組み合わせることによって、CORINAは、大きな環または金属を有する複合体であっても、堅牢で信頼性の高い結果を導くことができる。したがって、ある実施態様において、例えば、CORINA等の本技術分野において既知のプログラムを用いて阻害剤の3D配座を生成することによって、阻害剤の骨格が導かれ得る。
【００５９】
これらの配座は、その後、（参照することにより本明細書に組み込まれる）PharmaGistソフトウェア（56）への入力として使用した。PharmaGistは、標的受容体に結合することが知られている医薬様の分子1組から3Dファーマコフォアを解明する。そして、受容体の構造が不明であり、その受容体と相互作用することが確認されたリガンド1組の情報しか入手できない場合は、この解明を間接的な方法を介して行う。このような間接的な方法を難しくする側面の1つはリガンドの特定の配座に起因し、特に、受容体と相互作用している場合である。PharmaGistは、この難題にリガンドの複数の柔軟性のある配列（アラインメント）を通して取り組むが、この取り組みにおいて、柔軟性を配列のプロセスにおいて明示的に、かつ決定論的な手法で取り扱う。これは、分子のサブセット内の共通のファーマコフォアの発見を可能にするほか、外れ値の分子を検出する能力も有しつつ、ファーマコフォアの高速かつ信頼性の高い検出を可能にする。PharmaGistが採用するアルゴリズムは、1つのリガンドを要（かなめ；pivot）として用いて残りのリガンドを並べることが関わる。ペアごとの配列の計算を特徴を重ね合わせてゆくことで行い、全ての配列を組み合わせて複数の配列にする。できる限り多くのペアごとの配列にマッチングさせた要の特徴の有意なサブセットを特定する。この場合において、生成されたファーマコフォアの特徴は、入力として使用した全てのリガンドとマッチングさせる。
【００６０】
RAR／RXRモジュレータの特定の骨格に関して、リンカー構成要素を修飾しても、異なる程度ではあるが、化合物の阻害活性の保持が可能であることに留意を要する。例えば、アルケンの位置を（ベキサロテンからTTNPBに）変更してリンカーの長さを僅かに増やすと、阻害活性の増加をもたらしたが、アルケン置換基をアミド結合に変更しても有意な活性の変化をもたらさなかった。しかも、更に疎水基を化合物の疎水性領域に付加することを含む延長戦略もまた、阻害活性の増強に有用であることを確認した。タミバロテンのリンカーの位置を交換して、非常に大きな疎水性領域を有するようにすると、化合物BMS195614の一次核形成阻害活性が大きく増加した。同一の効果は、TTNPBのリンカーにアルキル置換基の軽微な変更を行い、はるかに大きい疎水性領域を有する化合物BMS493を得るようにしても確認し得る。したがって、化学的置換は当業者に知られている任意の種類の置換を包含し得、そこではそのような置換は、阻害剤の骨格の任意の領域に導入される。実に、任意の阻害剤の骨格における化学的置換は、当該化合物の阻害活性を保持し、かつ、立体配置観察や電荷相互作用等からなし得る任意の置換であってよい。そのような適切な置換は、当業者が容易に決定し得る。
【００６１】
凝集性タンパク質は、上記に定義されている。
【００６２】
更なる実施態様において、上述の方法によって得られるまたは得られ得るファーマコフォアが提供される。
【００６３】
本発明の他の側面において、Aβ42の凝集を阻害するファーマコフォアが提供され、該ファーマコフォアは、9つの特徴を有するものであって、該特徴とは、2つの水素結合受容体と、カルボン酸基を表す末端の負に帯電した1つの特徴と、5つの疎水性の特徴に結合した1つの芳香族の特徴である。9.22オングストロームの水平距離も、図18bに示すような末端疎水基から他方の極性末端までから予測される。
【００６４】
本発明の更なる側面において、タンパク質の凝集の阻害剤を特定するための化合物のライブラリをスクリーニングするための方法が提供され、該方法において、タンパク質は凝集性タンパク質であり、該方法は、該ライブラリをスクリーニングすることと、少なくとも高い親油性（ゴース／クリッペンのオクタノール／水分配係数；Ghose-Crippenocanol-Water coefficient）とかさ高さ（ファンデルワールス体積）を有する化合物を特定することを有するものであって、ここで親油性は4〜8であり、より好ましくは4.6〜7.4であり、更により好ましくは4.648〜7.351であって、かつ、かさ高さは30〜41であり、より好ましくは31.7〜40.81である。更なる実施態様において、該方法は更に、高い芳香族比率を有する化合物を追加的にスクリーニングすることを有し、ここで好ましくは該比率は0.3〜0.7であり、より好ましくは0.35〜0.61であり、更により好ましくは0.353〜0.606である。好ましくは、阻害剤は、Aβ42凝集の阻害剤である。更にいっそう好ましくは、化合物はRAR／RXRモジュレータである。
【００６５】
ある実施態様において、タンパク質の凝集は、一次核形成、二次核形成及び伸長である少なくとも3つの微視的段階に分けることができ、ここでは阻害剤は、少なくとも一次及び二次核形成を阻害する。この実施態様において、そのような阻害剤は、一次核形成、二次核形成及び伸長を阻害するために使用され得る。
【００６６】
本発明の更なる側面において、アルツハイマー病の治療のための方法が提供され、該方法は、その治療が必要な患者にレチノイド受容体モジュレータを投与することを有するものであって、ここで、該モジュレータは、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237であるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる。
【００６７】
本発明の他の側面において、アルツハイマー病の治療において使用するためのレチノイド受容体モジュレータが提供され、ここで、該モジュレータは、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237であるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる。
【００６８】
本発明のまた更なる側面において、アルツハイマー病の治療に使用するための医薬の製造におけるレチノイド受容体モジュレータの使用が提供され、ここで、該モジュレータは、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237であるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる。
【００６９】
ある実施態様において、レチノイド受容体モジュレータの構造は以下の通りである。
【００７０】
【化１】
2019502711.tif 000008
【００７１】
【化２】
2019502711.tif 000009
【００７２】
【化３】
2019502711.tif 000010
【００７３】
【化４】
2019502711.tif 000011
【００７４】
【化５】
2019502711.tif 000012
【００７５】
【化６】
2019502711.tif 000013
【００７６】
【化７】
2019502711.tif 000014
【００７７】
【化８】
2019502711.tif 000015
【００７８】
【化９】
2019502711.tif 000016
【００７９】
【化１０】
2019502711.tif 000017
【００８０】
「治療」は、医療的または外科的手段を通じた患者の管理を意味する。治療は、アルツハイマー病の少なくとも1つの症状を改善または軽減するが、治癒を提供することは要求されない。治療は、更に、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン及びメマンチンを含むアルツハイマー病に対する任意の既知の治療を包含し得る。
【００８１】
他の側面において、本発明は、臨床的活性量のレチノイド受容体モジュレータ及び医薬的に許容される担体を有する医薬組成物に関する。ある実施態様において、該モジュレータは、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237であるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる。更なる側面において、該モジュレータは、タンパク質の凝集の少なくとも1つの段階、好ましくは（上記に定義したような）一次及び二次核形成、より好ましくは一次核形成、二次核形成及び伸長を阻害する。
【００８２】
医薬的に許容される担体及び／または希釈剤は、あらゆる溶媒、分散媒、被膜、抗菌剤及び／または抗真菌剤、等張性剤及び吸収遅延剤等を含んでいてもよい。そのような医薬的活性物質用の培地及び剤の使用は本分野において周知である。任意の従来の培地または剤が有効成分に不適合である場合を除いて、治療用組成物におけるその使用は想定されている。
【００８３】
本発明の更なる側面において、凝集性タンパク質の凝集を阻害するための方法が提供され、ここで、該凝集性タンパク質はAβ42であり、該方法は、好ましくは、その阻害が必要な患者に、タンパク質の凝集を阻害する量のレチノイド受容体モジュレータを投与することを有するものであって、ここで、該モジュレータは、タミバロテン、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237及びベキサロテンから選ばれるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる。代替的な実施態様において、該モジュレータは、例えば、凝集性タンパク質を含む細胞培養物に、インビトロでタンパク質凝集を阻害するために添加される。
【００８４】
他の側面において、凝集性タンパク質の凝集を阻害するためのレチノイド受容体モジュレータの使用が提供され、ここで、該凝集性タンパク質はAβ42であり、かつ該モジュレータは、タミバロテン、アダパレン、CD1530、TTNPB及びCh55から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アゴニスト、BMS195614、LE135、MM11253及びBMS493から選ばれるレチノイドA受容体（RAR）アンタゴニスト、SS11237及びベキサロテンから選ばれるレチノイドX受容体アゴニスト及びUVI3003であるレチノイドX受容体アンタゴニストからなる群から選ばれる。
【００８５】
完全を期すために、タミバロテン及びベキサロテンの構造を以下に示す。
【００８６】
【化１１】
2019502711.tif 000018
【００８７】
【化１２】
2019502711.tif 000019
【００８８】
上述の方法または使用のある実施態様において、タンパク質の凝集は、一次核形成、二次核形成及び伸長である少なくとも3つの微視的ステップに区分することができ、かつ、レチノイド受容体モジュレータは、これらのステップの少なくとも1つを阻害する。好ましい実施態様において、レチノイド受容体モジュレータは、一次及び／または二次核形成を阻害する。更に好ましい実施態様において、該モジュレータは、全ての微視的段階を阻害し、かつ、該モジュレータは、MM11253、BMS493、アダパレン、CD1530及びLE135から選ばれる。
【００８９】
上記の開示は、この発明を作りかつ使用する方法及びその最良の形態を含む、本発明の技術範囲に包含される主題の一般的な説明を提供するものであるが、後述する実施例は、更に当業者がこの発明を実施できるようにするために提供され、かつ、その文書による完全な説明を提供しようとするものである。しかしながら、当業者これらの実施例の詳細は本発明を限定すると解釈すべきではなく、その技術的範囲はこの明細書に添付される特許請求の範囲及びその均等物から理解されるべきであることを理解するであろう。本発明の更なる様々な側面及び実施態様は、本明細書の開示を考慮すれば当業者に明らかであろう。
【００９０】
本明細書において、「及び／または」という文言は、2つの特定された特徴または構成要素の各々を他方を伴うまたは他方を伴わない具体的な開示として理解される。例えば、「A及び／またはB」という文言は、（i）A、（ii）B及び（iii）A及びBのそれぞれの具体的な開示として、あたかもそれぞれが個別に本明細書に記載されているかのように理解すべきである。
【００９１】
文脈による別段の指示がない限り、上述の特徴の説明および定義は、本発明のいずれかの特定の側面または実施態様に限定されず、かつ、記載される全ての側面及び実施態様に等しく適用される。
【００９２】
上述の出願、及びそこに引用されるまたはその審査過程（以下、「出願に記載した引用文献」）で引用される全ての文献及び配列登録番号（sequence accession numbers）、及び出願に記載した引用文献において引用されたまたは参照された全ての文献、及び本明細書において引用されたまたは参照された全ての文献（以下、「本明細書中の引用文献」）、及び本明細書中の引用文献において引用されたまたは参照された全ての文献は、本明細書において言及された製品があればその製品の製造メーカーによる使用上の注意書、説明書、製品仕様書、及び製品データシートも含み、それらは全て、参照されることにより本明細書に組み込まれ、かつ、本発明の実施において採用され得る。より具体的には、参照された文献は全て、あたかもそれぞれの個別の文献について参照されることにより組み込まれることが個別具体的に示されたかのように、同一の範囲において参照することにより組み込まれる。
【００９３】
本発明は、下記の限定されない実施例において更に説明される。
【００９４】
実施例
実施例I
この実施例において、Aβ42の凝集を標的とする新規な医薬を特定するための創薬戦略を説明する。この戦略は4つの主要ステップからなる（図1）。最初のステップは、Aβの凝集を妨げうる小分子を特定するために、断片ベースの手法を適用する（図1、ステップ1）。断片ベースの医薬設計手法は、限られた数の小分子のスクリーニングに基づき、典型的にはKD値を用いて、高いマイクロモル〜ミリモルの範囲において低い結合親和性の断片を特定する（33,34）。これらの断片のいくつかは、組み合わせた場合に、初期断片よりも目的の標的とより強く結合する複数の有利な相互作用を含む分子となる。この戦略を実施するために、Aβ42との相互作用が文献に報告された88個の化合物から派生した、164個の断片のセットを生成した。そしてこれらの断片を4種類の小分子データベース（ChEMBL、PubChem、ZINC及びDrugBank）において化学的に関係する化合物についてスクリーニングした結果、16,850個の分子を特定した。この断片ベースのライブラリは、臨床前のリード開発の有効な候補となる可能性のある386件のFDA承認済み医薬を含む。実に、そのような手法は、新規医薬の創薬手法を経由するよりも臨床へのより迅速なルートを提供するという恩恵とともに、現存する承認済み治療用化合物をADという別用途に使用するための絶好の機会を提示する（35,36）。
【００９５】
この戦略を試すため、このライブラリから、異なる化学的骨格を有する化合物を2個、即ち、ベキサロテンとトラミプロセート、を選択した（図1、ステップ1）。AD臨床試験のフェーズ3で成功に至らなかったトラミプロセート（識別子：NCT0088673）は、臨床前開発段階においては、可溶性Aβ種に結合すること、可溶性Aβ種を非線維型に維持すること、Aβ誘発性神経毒性を減少させること及びマウスにおけるアミロイド血小板と脳内Aβ濃度を減少させることが報告されていた（37）。対照的に、ベキサロテンは、未だフェーズ2臨床試験段階にある（識別子：NCT01782742）。この小分子は、皮膚T細胞性リンパ腫の治療用のFDA承認済みのレチノイドX受容体（RXR）アゴニストであり、ADにおいてある程度の認知機能の回復能力を示していた（38〜44）。この活性はアポリポタンパク質Eの濃度の増強、そしてそれゆえAβ42のクリアランスの増強に関与すると報告されているが、矛盾する報告も発表されており、詳細な作用機序は未解明なままである（38〜44）。実は、この分子はAβ42への結合に関してコレステロールと競合し、よってコレステロール誘発性オリゴマー化を阻害するとも報告されている（45）。
【００９６】
我々の総合的戦略における次のステップは、目的のタンパク質の凝集の機構を解明するために反応速度論を適用することである（図1、ステップ2）。Aβ42という特定の場合においては、本明細書の導入部において説明したように、我々は最近、機構の包括的な説明を提供した（32）。そして、反応速度論解析を選択した化合物の存在下において繰り返し、特異的に阻害される微視的事象を特定し、よってその化合物が相互作用する相手の種を定義する（図1、ステップ3）。実際に、有力な医薬候補は単量体、オリゴマー、または線維表面または線維端に結合し得るので、異なる微視的ステップが影響を受け得る。単量体の分離が全ての微視的事象の速度（即ち、一次核形成のkN、二次核形成のk2及び伸長のk+）の減少をもたらし得るが、オリゴマーの分離はkN及びk2に影響すると期待される。他方で、線維を標的とすると、阻害剤が線維端または線維表面のいずれに結合するかによって、それぞれ、k+またはk2のいずれかを減少させ得る（28）。
【００９７】
最後のステップでは、生体内の毒性種の形成に対する分子の観察された効果を評価する（図1、ステップ4）。Aβ42の凝集における特定の微視的ステップの阻害は、毒性オリゴマーの生成に対して異なる効果を有すると期待される（28）。より具体的には、一次核形成を阻害すると凝集反応を大幅に遅延させるが、反応中に生成する毒性オリゴマーの総負荷に影響することはない。しかしながら、毒性オリゴマーの数の増加または減少は、それぞれ、伸長または二次核形成のいずれかの抑制によりもたらされると予想されている（28）。伸長を阻害すると凝集反応の方向を再び二次核形成に向け直すと考えられているので、後者のこれら2つのプロセスは、互いに置き換え可能な経路を表し、毒性オリゴマーの数を結果として増加させ、またその逆も同様であろう（28）。
【００９８】
ベキサロテンはAβ42線維形成を遅延させるがトラミプロセートは遅延させない
この研究のために選択された2つの小分子による、Aβ42の凝集プロセスの基礎にある個別の微視的ステップに対する効果を調べるため、Aβ42と2つの化合物の各々の両者について、順次、異なる濃度で得られた凝集プロフィールのグローバル解析を行った（図2）。高度に再現性のある上述のThTに基づくプロトコルを用いて（31）、トラミプロセート及びベキサロテンのそれぞれの非存在下と存在下においてインビトロのAβ42線維形成をモニターした。先の報告（37）とは異なり、20倍過剰存在下ですらAβ42の凝集に対するトラミプロセートの効果を全く確認しなかった（図2a）。対照的に、ベキサロテンの濃度増加に伴うAβ42の凝集における累進的な遅延を確認した（図2b,c）。総タンパク質濃度の関数としての、そのような反応プロフィールにおける半濃度時間のスケーリングは、指数が肉眼的な凝集挙動の基礎にある微視的事象の重要な情報を含む、べき乗則に従う（32）。ベキサロテンの存在下において、濃度が上昇するにつれて凝集反応の遅延時間は増加するが、スケーリング指数は影響を受けない。この結果は、これらの条件下において、ベキサロテンは一次核形成を阻害することにより凝集反応を遅らせるが、全体的な凝集反応に対する一次及び二次核形成の相対的な貢献度には影響しないことを示唆している。
【００９９】
これらの実験は、Aβ42の凝集に対するベキサロテンの効果が本質的なものであることを示している。4倍過剰ベキサロテンをAβ42の2μMのサンプルに添加すると、凝集反応が半分完成するまでの時間をAβ42単独の場合に比べて2倍増加させた（即ち、Aβ42単独について2.30±0.02時間、及びベキサロテンの存在下におけるAβ42について4.50±0.06時間（図3a）。この効果を更に調べるため、かつ、Aβ42線維へのThTの結合およびその結果としての蛍光に対してベキサロテンが起こし得るいかなる干渉も排除するため、一連の異なる時点における溶液の等分量を取り出し、かつ、原子間力顕微鏡法（AFM）と免疫化学を使用して線維形成の程度を測定することにより、ThTが存在しない条件下における線維形成をモニターした（図3b〜d）。画分は、Aβ42の凝集の3つの期（即ち、誘導、成長及び飽和）の間における事象をできる限り完全にモニターするために全反応を通じて収集した。AFM画像は、ベキサロテンの非存在下においては2.1時経過後に線維状構造が目視可能になったが、その存在下ではそうではないことを示し、したがって、ベキサロテン誘発性線維形成遅延について独立した証拠を提供している（図3b）。これらの結果から更に、配列感受性のW0-2一次抗体または線維感受性のOC一次抗体を使用して凝集中の9つの異なる時点におけるAβ42の量を調べた（図3c）（「方法」を参照）。W0-2抗体は、凝集した種のいずれについても疎水性のコアに関係しないとみられる4〜10残基に渡る配列（即ち、N末端）を認識し、したがって全ての種類のAβ種に結合する。W0-2抗体は、凝集反応中の異なる時点におけるAβ42の同様の量の存在を示した（図3c、上のパネル）が、線維状の種のみを認識する線維特異的OC抗体（図3c、下のパネル）は、反応速度論解析及びAFM画像に一致して、凝集プロセスの半分完成に要求される時間に2時間の遅延を示した。
【０１００】
更に、OC線維の抗体を使用して、ドット強度をAβ42線維の濃度4μM〜0.1μMの範囲で行ったドットブロットアッセイと比較し、線維に変換されたAβ42の量を調べた（図3d）。線維はAβ42単量体の新しく調製した4μM溶液を3時間インキュベートした後に収集し（図3d、下のパネル）、その後、溶液を希釈して濃度範囲4μM〜0.1μMの12個のサンプルを作成した（図3d、下のパネル）。ドットブロットデータの解析は、ベキサロテンの非存在下と存在下における、反応半濃度時間において形成された2μMAβ42サンプルの線維の量が、実際に、1μM濃度のAβ42サンプルの凝集反応中に形成されたものと非常によく似ていたことを示しており（図3c、下のパネル、6時点及び7時点）、凝集反応に対するThTの干渉がないことと整合する（図3d、下のパネル）。
【０１０１】
ベキサロテンはAβ42凝集の一次核形成を特異的に阻害する
次いで、線維の量の肉眼的な経時変化を異なる微視的事象の速度定数と関連させるマスター方程式から得られた、速度式に基づく凝集プロフィールとマッチングさせることにより、ベキサロテンの効果の定量的解析を行った（28,29）。この手法において、阻害剤の存在下における凝集プロフィールは、阻害剤の非存在下において評価された微視的速度定数の各々に適切な摂動（perturbation）を速度式に導入することによって記述される。そして、異なる濃度の阻害剤の存在下における凝集プロフィールの記述に必要とされる速度定数の修正が、化合物の存在に影響される特定のプロセスを示す。5μM〜25μMの範囲のベキサロテンの濃度存在下における5μMAβ42の凝集プロフィールは、一次核形成速度定数knが特異的に減少したときに実験データが特によく記述されていることを示す。対照的に、実験データは、二次核形成速度定数または伸長速度定数、即ち、k2及びk+、を変更して行った予測とは整合していない（図4a〜c）。したがって、データから、これらの条件下において、ベキサロテンが、凝集反応における二次経路（即ち、k2k+）に対する検知可能な効果なしに（又はほんのわずかの効果で）、一次核形成経路（即ち、knk+）を特異的に修正することが明らかになった（図4d）。
【０１０２】
これらの結論を更に強化するために、予め形成した線維（即ち、種子）の反応混合物への導入によって一次核形成ステップを迂回する条件下において、Aβ42の凝集反応速度の更なる一連の測定を行った。そのような状況においては、可溶性ペプチドの成熟線維への変換は種子によって促進される二次核形成反応及び伸長反応によって強く加速されるため、反応速度論に対する一次核形成の貢献は無視できる程度である（22）。予め形成した線維種子の伸長が支配的な機構である10%線維種子の存在下においては、10倍過剰ベキサロテンでさえも、2μMAβ42の凝集反応速度に対する効果は確認されなかった（図4e）が、播種なしの条件下における対応する凝集プロセスは15時間完全に阻害された。更にまた、5%の予め形成した線維種子の存在下におけるAβ42の2μMサンプルの凝集反応速度も測定した。これらの条件下において、一次核形成は、完全に迂回されるが、表面触媒性二次核形成及び伸長の両方とも、全体的な反応速度に有意に貢献する（図4f）。これらの実験は、表面触媒性二次核形成の速度減少に匹敵する濃度依存的ベキサロテン誘発性遅延を示す（図4g,h）。これらの実験の成果は、線維の伸長は基本的にベキサロテンによる影響を受けないが、この化合物はAβ42の核形成に対して選択性の強い大きな効果を有し、その効果は、二次核形成よりも一次核形成に対してより明確に向けられていることを示している。
【０１０３】
ベキサロテンが一次及び二次核形成の両方を特異的に摂動させることによってAβ42の凝集を阻害するとの観察結果は、原則として、ベキサロテンの、Aβ42の単量体と、または一次及び二次オリゴマーと、またはむしろ単量体とオリゴマーの両方、との相互作用から導かれうる（図4f）。しかしながら、単量体への結合は、本明細書中で調べた条件下の全体的な反応における全ての微視的ステップの速度に影響し得る（28）ので、我々は、ベキサロテンが第一次的にAβ42のオリゴマーと特異的に相互作用すると結論付けることができる。この結論は、更に、NMR分光法による測定によっても裏付けられており、該測定では、5倍過剰ベキサロテンの添加前後で、25μMの15N標識単量体Aβ42のHSQCスペクトルにおける化学的シフトの有意な摂動が確認されず、単量体型のAβ42への結合は無視できる程度であり得ることを示した。更にまた、これらの発見は、一次核及び二次核は類似の構造的特徴を有し得るので、同様の方法でベキサロテンと相互作用をし得ること、及びAβ42の同一の残基が一次及び二次核形成の両方の事象に関係し得ることを示唆しており、Aβ42の一次及び二次オリゴマーの構造的特徴に対する新たな洞察を提供する。
【０１０４】
一次核形成を標的とするとAβ42毒性種の形成を遅延させる
次に、Aβ42凝集における異なる微視的ステップの摂動が、毒性オリゴマーの生成速度に対して異なる効果を有する（28）ことから、我々は、ベキサロテンによる一次核形成の阻害に起因するAβ42線維形成の遅延が、神経毒性種の形成の遅延に関連があるか否かを検証した。よって、例えば、一次核形成速度の減少は、全体的な凝集反応を遅延させるが、反応中に生成する毒性オリゴマーの総数には影響しないと予測される（28）。しかしながら、毒性オリゴマーの数の増加または減少は、それぞれ、伸長または二次核形成の抑制によってもたらされる可能性が高い（28）。
【０１０５】
この問題を調べるため、20倍過剰ベキサロテンの非存在下と存在下におけるAβ42の0.5μM溶液の凝集反応における一次プロセス及び二次プロセスの両方から、オリゴマー形成全速度の数値シミュレーションを行った（「方法」を参照）。ベキサロテンは一次核形成を優先的に標的とするので、凝集プロセス全体を遅らせる、即ち、毒性種の量を必ずしも減少させる必要なく毒性種の生成を遅らせると期待される。これまでに得た成果に基づけば、一次核形成は、小さいが決定的な意味を持つ種子の濃縮がいったん形成された後は二次核形成によって直接的に迂回される、非常に急速なプロセスである（22）。このことから、我々は、凝集が確認され得るAβ42の最低濃度を使用して（31）、できる限り強く一次核形成ステップを阻害するために高濃度のベキサロテンの存在下における、その凝集をモニターした。シミュレーションは、ベキサロテンの存在下においてAβ42の一次核形成を遅延させることによりAβ42オリゴマーの形成に遅延が生ずるが、凝集プロセスの経時変化全体を通じて形成されるオリゴマーの総量は減少しないことを示している（図5a,b）。実際に、オリゴマーの形成は、ベキサロテンの存在下で数が増加し始めた時点においてAβ42単独の凝集中に形成されたオリゴマーの数が減少し始めるという点において、放物線状の変化をたどる。
【０１０６】
これらの予測を検証するため、アポトーシスの初期マーカーであるカスパーゼ3の濃度を評価することによって、20倍過剰（即ち、10μM）のベキサロテンの非存在下と存在下における0.5μMAβ42の凝集に起因するヒトの神経芽腫細胞（SH-SY5Y）における細胞毒性を計測した（「方法」を参照）。実に、カスパーゼ9は、その不活性のプロ型を切り離してアポトーシスカスケードを開始させることにより、ミトコンドリア損傷後のアポトーシス経路を仲介し、カスパーゼ3等のエフェクターカスパーゼを開始させる開始酵素である。スタウロスポリンは、アポトーシス経路を開始させることで知られる広域スペクトルキナーゼ阻害剤であるが、これを陽性対照として使用した（「方法」を参照）。Aβ42溶液の等分量をベキサロテンの非存在下と存在下における、凝集反応の誘導期中の異なる時点において取り出し、SH-SY5Y神経芽腫細胞でインキュベートした。その単量体型において（インキュベーション前、図5c）、Aβ42は、ベキサロテンの存在に関わらず検知可能な毒性を示さなかった。ベキサロテンの非存在下、0.3時間（図5d）及び4時間の（図5e）のインキュベーションの後形成された種は、ベキサロテンの存在下におけるものよりも65±5%高い毒性レベルを示した。しかしながら、7時間インキュベートしたサンプルについては、ベキサロテンの存在下で発生した毒性レベルは非存在下で確認されたものと同様の値に上昇したが、Aβ単独の毒性は減少した。これは、細胞におけるAβ42毒性種の形成のベキサロテン誘発性遅延を更に裏付けている（図5f）。
【０１０７】
ベキサロテンはC.elegansモデルにおけるAβ42媒介機能不全を救済する
更に、GMC101で示されるAβ42媒介機能不全のC.elegansモデル（Aβ線虫モデル）における毒性Aβ42種の形成に対するベキサロテンの効果を検証し（46）、これをAβ42を含まない対照線虫モデルCL2122において確認したベキサロテンの添加がもたらす効果と比較した（「方法」を参照）。GMC101モデルにおいて、凝集体を形成し重度の加齢進行性まひをもたらす体壁筋細胞内でAβ42の発現が見られた（46）。5μM〜10μMの範囲に高めたベキサロテンの濃度に線虫を暴露し、筋細胞の状態を示す体を曲げる頻度を計測し、線虫体内のAβ42凝集体の量も測定した（図6）（「方法」を参照）。ベキサロテンの非存在下、Aβ線虫モデルの体を曲げる頻度は、対照線虫モデルでは同様の運動性の減少が9日後になって初めて確認されたのに対し、ほんの2日経過後に有意に減少した（図6b）。そのような差異と整合的に、アミロイド特異的染料NIAD-4の蛍光強度を使用してモニターした凝集体の濃度（47）は、ベキサロテンの存在下におけるAβ線虫モデルでは同日の成虫において凝集体が実質的に検知されず、2つの線虫モデルで劇的に異なっている（図6c,d）。
【０１０８】
次いで、C.elegansのライフサイクルの幼虫期において添加したベキサロテンの濃度増加の効果を調べ（図6a）、Aβ線虫モデルの運動性の濃度依存的維持を観察した。実際に、Aβ線虫の運動性は、L1及びL4幼虫期における2回の10μMのベキサロテンの添加後すぐに完全に維持された、即ち、対照線虫において確認されたレベルに達した（図4a,b）。加えて、画像解析（「方法」を参照）は、Aβ線虫への10μMのベキサロテンの添加が成虫期の9日間にわたってAβ42線維の形成を抑制したことを示した（図6,d）。Aβ線虫におけるAβ42の発現レベルは、ベキサロテンの非存在下と存在下で非常によく似ていることが分かった（図6e）。この結果は、Aβ線虫における運動性の維持がベキサロテンによるAβ42の凝集を妨げることで達成され得ることを示している。この結論に一致して、ベキサロテンの添加は対照線虫モデルでは何の効果も示さなかった。ベキサロテンの存在下においてAβ線虫について正常な運動性が観察されたことは、2つの異なるシナリオと整合し得る。1つの可能性は、一次核形成における強い遅延であり、これがAβ42の凝集を大幅に遅延させ、ゆえにAβ線虫モデルの運動性を対照線虫の運動性と類似の値に維持するというシナリオである。もう1つの可能性は、これらの結果は、一次及び二次核形成に対する複数の効果の組合せに起因しているというシナリオである。この後者の可能性が特に関連があり、なぜなら、ベキサロテンは一次核形成を優先的に阻害するけれども、過剰に存在する場合には二次核形成にも影響し得るからである。実際に、我々が行った5%未満の種子の実験は、ベキサロテンが表面触媒性二次核形成に対しても作用する能力があることを示している（図4f〜h）。更にまた、ベキサロテンを第2日目に添加してもAβ線虫の運動性に対する検知可能な効果を何も示さなかったことも確認しているが、これは、ベキサロテンがAβ42の凝集における核形成事象に特異的に影響するというインビトロの実験から得た結果が、生体内の場合にも当てはまることを示唆するものである。
【０１０９】
考察
これまで、小分子を使ってAβ42の凝集を標的とすることを目的とする創薬戦略について説明した。この戦略は、Aβ特異的断片ベースのライブラリから化合物を特定すること、及びその後の、阻害の分子機構を根本的に理解するために反応速度論を適用することが関わる（図1）。我々は、トラミプロセートはAβ42の凝集に対する効果を有しないが、ベキサロテンは、一次核形成速度を低下させることによってAβ42の凝集の初期の段階に特異的に干渉することを突き止めた。また、この効果は、ベキサロテンが細胞内及びC.elegansの両方で毒性種の形成を抑制することを我々が突き止めたことで、インビトロだけでなく細胞内及び生体内においても、全体的な凝集反応の速度を有意に阻害することも確認した。更にまた、C.elegansのライフサイクルの初期の段階において与えたベキサロテンの濃度が十分であれば、Aβ42発現のない線虫に匹敵するレベルでAβ42を発現する線虫の運動性を維持し得ることを示したが、これはこの分子の予防的効果もまた裏付けている（48-50）。
【０１１０】
我々は、本明細書においてこれまで説明した戦略により、Aβ42の凝集を阻害する能力のある更なる化合物を特定し、各々の化合物に影響される特定の微視的ステップ（即ち、一次核形成、二次核形成または伸長）を定義することが可能になると考えている。これらの結果は、まずはインビトロにおいて、次いで生体内において、凝集の開始及びその進行の速度を制御し変更する広範な化合物の特定を可能にするというべきである。加えて、本研究における上述の成果は、ベキサロテン及びその他の一次核形成の阻害剤が、我々が本来有する抵抗力のメカニズムがより高年齢に対しても有効であり続けるように、凝集のレベル（即ち、一次核が形成されて増殖する蓋然性）を下げる有効な手段となる可能性があることも示している。実際に、我々は、本明細書に提示した戦略と、コレステロールレベル及び心臓病のリスクを下げるスタチンを使用する戦略との間で推論を導いたが、更にそのような分子は「神経スタチン」として効果的に作用し得ることを提案する。予防目的のベキサロテン等の分子の使用に加えて、毒性種発生の主要な原因である二次核形成を標的とすること（30）が、ADの進行速度を低下させる治療の開発の基礎を形成すると推測することも可能である。
【０１１１】
結論
我々は、この研究における有効な抗AD薬を特定するための包括的な戦略の開発と適用について説明した。この戦略は、阻害プロセスの分子詳細を理解することに基づいており、最終的にADと戦う有効な医薬へと導き得る合理的な方法で有効な治療剤を特定する機会を創出するものである。最後に、タンパク質の凝集現象の一般論を前提として、本戦略は、他の形態の神経変性障害を標的とするための新規な治療法の合理的な設計及び評価のための枠組みを提示する。
【０１１２】
実施例Iの材料及び方法
Aβペプチドの調製
組換えAβ（M1〜42）ペプチド（MDAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA（配列番号1）、以下「Aβ42」という。）は、上記のものに僅かな修飾を加えて、大腸菌BL21-Gold（DE3）株（Stratagene社、米国カリフォルニア州）において発現され精製される（51）。要するに、精製手順には大腸菌細胞の超音波処理、8M尿素への封入体の溶解、及びジエチルアミノエチルセルロース樹脂を用いたバッチモードのイオン交換と凍結乾燥が含まれる。凍結乾燥された画分は、Superdex75HR26/60カラム（GE Healthcare社、英国バッキンガムシャー）を使用して更に精製され、溶出液はSDS-PAGEを使用して所望のタンパク質生成物の存在について解析された。組換えタンパク質を含有する画分が混合され、液体窒素を用いて冷凍され、再度凍結乾燥された。
【０１１３】
同位体で標識された15N-Aβ42を形質転換大腸菌BL21-Gold（DE3）株（Stratagene社、米国カリフォルニア州）を500mLの最少M9バッチ培地を用いて1Lのフラスコで37°Cで培養して調製した。要するに、100μg/Lのアンピシリンを含有するLB培地において一晩培養して飽和させた20mLの前培養物を2YT培地において1/25まで希釈し、100μg/Lのアンピシリンを添加して37°Cで培養した。600nmにおけるODが0.5に達した時点で細胞を収穫し、最少培地において洗浄し、100μg/Lのアンピシリンを含有する初期最少M9培地の培養液量の1/4で接種し、15NH4Cl（2g/L）（Cambridge Isotopes Laboratories社）を添加した。誘導前に細胞を37°Cで2時間培養した。その後、IPTGを1mMの最終濃度に添加し、細胞を37°Cで一晩培養した。上述のように15N-Aβ42の精製を行った。ベキサロテン及びトラミプロセートを含む化学物質ををSigma-Aldrich社から得たが、それらは入手可能なものの中で最高純度のものであった。
【０１１４】
反応速度実験のためのサンプルの調製
凍結乾燥されたAβ42ペプチドを6MのGuHClに溶解させて単量体ペプチドの溶液を調製した。Superdex7510/300GLカラム（GE Healthcare社）を使用して流速0.5mL/minで潜在的オリゴマー種と塩から単量体形態を生成し、200μMのEDTA及び0.02%NaN3を添加したpH8の20mMリン酸ナトリウム緩衝液中に溶出させた。ピークの中央を回収し、ペプチド濃度は、ε280＝1400 lmol-1cm-1を使用してピーク領域の積分値の吸収度から決定した。得られた単量体を緩衝液で希釈して所望の濃度とし、20μMチオフラビンT（ThT）を1mMストックから添加した。全てのサンプルは、氷の上でサンプルが結合しにくいエッペンドルフチューブ内で、気泡を入れないように慎重にピペット操作を行って調整した。その後、各々のサンプルをピペットで複数の、即ち、ハーフエリア96ウェルの、サンプルが結合しにくい、透明底の、PEG被膜のウェルプレート（Corning 3881）に1ウェルあたり80μLを入れた。
【０１１５】
播種実験のため、予め形成した線維を実験の直前に調製した。反応速度実験を上述した200μMのEDTA、0.02%NaN3及び20μMのThTを添加したpH8の20mMリン酸ナトリウム緩衝液中の4μMAβ42サンプルの場合と同様に設定した。線維の形成を検証するためThT蛍光を3時間モニターした。
【０１１６】
次いで、サンプルをウェルから回収して低結合力のチューブに移し、室温の超音波浴内で超音波処理を2分間行った。既に考慮した条件下（即ち、4μMAβ42）において、単量体の濃度は平衡状態で無視できる程度である（31）。単量体当量の線維最終濃度は、初期単量体の濃度に等しいと考えられた。次いで、線維最終濃度5%または10%のいずれかに達するように、線維を新たに調製した単量体に添加した。
【０１１７】
全ての場合において、ベキサロテンをまず100%DMSOに溶解して5mMの濃度とし、次いでペプチド溶液に希釈してDMSO最終濃度が最大で1%となるようにした。反応混合物に1%DMSOを添加しても、Aβ42の凝集に対して全く効果がないことを検証した。
【０１１８】
反応速度アッセイ
96ウェルプレートをプレートリーダー（Fluostar Omega、Fluostar OptimaまたはFluostar Galaxy、BMGLabtech社、ドイツ国オッフェンブルク）内において37°Cで静止条件とし、アッセイを開始した。ThT蛍光をプレートの底を通して、440nmの励起用フィルター及び480nmの蛍光用フィルタを使用して計測した。各サンプルにつき3度繰り返してThT蛍光を観測した。
【０１１９】
理論的解析
総線維質量濃度の経時変化「M(t)」が、下記の積分形反応速度式によって記述される（30,32）：
2019502711.tif 000020
（式中、反応速度パラメータB±、C±、κ、
2019502711.tif 000021
及び
2019502711.tif 000022
は、微視的速度定数の2種類の組合せk+k2及びknk2の関数であり、ここでkn、k+及びk2は、それぞれ、一次核形成速度定数、伸長速度定数及び二次核形成速度定数である。）
【０１２０】
ベキサロテンは、1以上の個別の微視的反応を阻害することによって凝集プロセスを妨げ得る。我々は、上記の式を適用して図4に示す肉眼的な凝集プロフィールを記述し、かつ、ベキサロテンの非存在下と存在下における線維形成の経時変化の記述に要求される微視的速度定数「k+k2」及び「knk2」のセットを比較することによって、化合物によって阻害される微視的事象を特定し得る。図4に示すように、播種なしの凝集反応において、化合物の存在は一次核形成速度を主に摂動させている。
【０１２１】
図5a及びbに記す数値シミュレーションは、方程式1に従って行ったベラトキセン（beratoxene）の存在下と非存在下におけるシミュレーションの反応プロフィールを示す。
【０１２２】
核形成速度r(t)の経時変化について、下記の式に従ってシミュレーションを行った：
r(t) = k2M(t)m(t)2 + knm(t)2
【０１２３】
図4fにおけるモデルシミュレーションは、5%の予め形成した種子線維で播種した2μMAβ42溶液について、パラメータ「K+」及び「K2」を固定することによって行った。そしてパラメータ「Kn」を無視できる程度の値（およそ0）にまで下げた。これは、一次核形成プロセスが起こらない場合に、反応プロフィールに対してほんの僅かな摂動を示した。
【０１２４】
AFMによる画像作成
Aβ42のサンプルを凝集反応から取り出し、切断したばかりのマイカ表面に直接堆積させ、た30分間自然乾燥させた。次いでサンプルをMilli-Q水で洗浄してから窒素で乾燥させた。VEECO社のDimension3100原子間力顕微鏡法（Brucker）とJPK社のNanowizardソフトウェア（英国ケンブリッジ）を使用して、AFM画像を得た。この装置の操作は、n型シリコンカンチレバーを使用して65kHz〜130kHzの共鳴周波数でタッピングモードで空気中で行った。
【０１２５】
ドットブロットアッセイ
Aβ42線維特異的抗体（OC、Millipore社）またはAβ42配列特異的抗体（W0-2、Millipore社）のいずれかを用いてブロッティングを行った。4倍過剰ベキサロテンの非存在下と存在下における2μMAβ42の凝集の経時変化中において（図3）、4μL及び2μLのAβ42の等分量をそれぞれ、OCまたはW0-2のいずれかのブロッティングの異なる時点において混合物から取り出した。Aβ42の等分量をニトロセルロース膜（0.2μM、Whatman社）に滴下し、次いで膜を乾燥させてから免疫検出の前にBlocking One（Nacalai tesque社）でブロッキングした。OC及びW0-2は、製造メーカーの使用説明書に従って使用した。Alexa Fluor（登録商標）488コンジュゲート二次抗体（Life technologies社）をその後添加し、Typhoon Trio Imager（GE Healthcare社）を使用して蛍光検出を行った。DMSOで溶解したベキサロテンを1%DMSO最終濃度でAβ42に添加した。較正曲線（図3d）について、新しく調製したAβ42線維について4μM〜0.1μMの異なる濃度で希釈し、4μL等分量をOC線維特異的抗体について使用したものと同様に同一のニトロセルロース膜（0.2μm、Whatman社）上に堆積させた。なお、オリゴマー特異的A11抗体も、ベキサロテンの非存在下と存在下におけるAβ42オリゴマー形成の変化の検出に使用した。ただし、これらの条件下において、オリゴマーについては、20μLもの量まで膜上に堆積させた場合でさえ、Aβ42の凝集中のその濃度の低さのため、検出することはできなかった。
【０１２６】
NMR実験
NMR解析のため、緩衝液を50mM酢酸アンモニウムとしてpH8.5でゲル濾過を行った点を除き、上述したように15N-Aβ42を精製した。15N-Aβ42の凍結乾燥粉末をおよそ1mMの濃度で0.2%（v/v）アンモニウム溶液に溶解後回収して、使用時まで等分量を-80°Cで保存した。NMRサンプルは、2.5%DMSOにおいて5倍過剰ベキサロテンの存在下と非存在下10%（v/v）の2H2Oを含んで、20mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）に凍結乾燥粉末を濃度25μMで溶解することにより調製した。混合物のpHは、ベキサロテンの添加により起こり得るpHのばらつきがないか確認したが、変化はなかった。NMRスペクトル測定は、極低温プローブを装備したBruker社製AVANCE-500分光計で行った。プローブの温度は278Kに設定した。1H-15N異種核一量子相関分光法（HSQC）スペクトルを1Hの観測周波数500MHzにおいて128（t1）x1,024（t2）個の複合体ポイント及びt1の1増分あたり32走査で記録した。スペクトル幅は15N次元につき1,216Hz、1H次元につき6,010Hzであった。1H-15NHSQCスペクトルを使って単量体Aβ42に対するベキサロテンのモル比上昇における化学シフト摂動（CSP）及び強度変化をモニターした。化合物なしのDMSOの参照サンプルも滴定してAβ42サンプルに添加した。DMSOの添加によるCSP及び強度比は、化合物での滴定中に観測されたものから控除した。CSPはΔδ=（（ΔδN/5）2+（ΔδH）2）1/2として計算した。NMRスペクトルはTopSpin2.1（Bruker社製）で処理した。共鳴割当て及び強度計算は、Sparkyプログラム（https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/）で行った。サンプル調製プロトコル及び低いNMRプローブの温度（5°C）を選択して、データ獲得中全体を通してAβ42ペプチドが確実に単量体のまま保たれるようにした。HSQCスペクトルは、共鳴周波数があまり分散しない天然変性ペプチドの典型であった。
【０１２７】
カスパーゼ-3細胞毒性アッセイ
Aβ42オリゴマーは、細胞への毒性で知られており、アポトーシス及び細胞死へと導く。ベキサロテンの存在下と非存在下においてAβ42でインキュベートしたときの、アポトーシスの初期マーカーであるカスパーゼ3の神経芽腫細胞株における活性を評価することによって、細胞毒性アッセイを行った（52）。SH-SY5Yヒトの神経芽腫細胞を標準条件下、5%CO2加湿インキュベータにて37°Cで培養した。細胞を1ウェルあたり25,000個の密度で、白色壁透明底の96ウェルのウェルプレートに播種してMEM/F12（1:1）/10%ウシ胎児血清（Fatal Bovine Serum （FBS）；Gibco社）で24時間培養した。次いでその培地を予め温めた、ペプチドサンプルまたはNaPO4緩衝液を1:1で希釈したフェノールレッドを含まない、FBS無しDMEMと交換した。およそ0.5μMのAβサンプルを単独でまたは20倍過剰ベキサロテンの存在下で1%DMSO最終濃度において、進行中の凝集反応から異なる時点（0時、0.3時、4時及び7時）において取り出し、これをThT蛍光の方法で並行して観測した。凝集反応を緩衝液からNaN3をその毒性のため取り除いた点以外は、上述したように設定した。なお、10μMにおいて、DMSO溶解ベキサロテンは全く毒性を示さず、従って、対照の値に匹敵するものであった。凝集の初期の段階の阻害をモニタするために、特定された全ての時点は誘導期におけるAβ42に対応している。Aβ単独またはベキサロテンの存在下における25個の複製物を有して各時点毎に1枚の個別のプレートを使用した。細胞は、細胞毒性効果が測定されるまで、ペプチド、緩衝液及び培地の存在下において更に24時間培養した。
【０１２８】
媒地及びベキサロテンの固有の蛍光を評価するため、これらの実験において使用した同一の緩衝液で希釈した細胞培地を同じウェルのいくつかに入れた。
【０１２９】
陰性対照として、細胞をベキサロテンの調製に用いた緩衝液（1%DMSO含有リン酸緩衝液）で希釈した細胞媒地に添加した。陽性対照としては、スタウロスポリン（1μM）を細胞に2時間添加した。カスパーゼ-3/7活性をApo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay（Promega社）を使用して測定した。蛍光性カスパーゼ-3/7の基質であるローダミン110、ビス-（N-CBZ-L-アスパルチル-L-グルタミル-L-バリル-アスパラギン酸アミド）を溶解緩衝液で1:100に希釈して提供し、細胞培地に1:1比で添加した。Optima FluoStarプレートリーダーで蛍光を励起480nm/蛍光520nmにて測定した。使用したプレートの各々において、陰性対照及び陽性対照に従い毒性を評価した。
【０１３０】
異なるプレート間の比較の目的で、時間の関数としてのオリゴマーの変化に対応する蛍光値を放物型方程式（y = axb）を使って正規化した。陰性対照及び陽性対照をそれぞれ、1及び10に設定した。これらの計算に従えば、ベキサロテンの非存在下と存在下におけるAβ42の毒性は、1と10の間の正規化値を有し、ゆえに異なるプレート間で比較し得る。統計的解析は、GraphPadプリズム6.0を使用して行った。結果は「平均±標準誤差」として表現する。統計的解析をスチューデントのt検定または一元配置分散分析（One way ANOVA）にて、次いでテューキー（Tuckey）の事後検定にて行った。
【０１３１】
C.elegans実験
標準条件下でCaenorhabditis elegansを20°Cで増殖させた（53）。要するに、動物を次亜塩素酸塩漂白により同調させ、M9緩衝液において一晩孵化させ、次いで大腸菌株OP50で播種した線虫成長培地（NGM、USP寒天）プレート上で培養した。OP50の飽和培養物をOP50を含む50mLのLB培地で接種して増殖させ、培養物を37°Cで16時間インキュベートした。NGMプレートにバクテリアを播種して350μlの飽和OP50を各々のプレートに添加し、プレートを2〜3日室温で放置した。同調から3日目に、子の成長を阻害するため動物を5-フルオロ-2'デオキシ-ウリジン（FUDR；特に明示のない限り75mM）を含有するNGMプレートに置いた。
【０１３２】
使用した株は次の通り：dvIs100[unc-54p::A-beta-1-42::unc-54 3'-UTR + mtl-2p::GFP]（GMC101）。mtl-2p::GFPは腸細胞におけるGFPの構成性発現を産生する。unc-54p::A-beta-1-42は体壁筋細胞において生体内で凝集する全長ヒトAβ42ペプチドを発現する。L4または青年期の動物を20C°から25C°にシフトさせてGMC101に対する対照株として麻痺vIs15[pPD30.38（unc-54ベクター） + mtl-2::GFP（pCL26）]（CL2122）を生成する（57）。表現型は明らかにWT. C.elegans var Bristol（N2）。発生時間は約3日。卵の大きさは約350。英国ブリストル付近のキノコ堆肥から単離。ベキサロテンのストック（100%DMSOで5mM）を適切な濃度で使用して9cmのNGMプレートに播種した。プレートを層流フード内に室温（22°C）で1時間置いて乾燥した。C.elegans培養物を20°Cで64〜72時間L1の幼虫として化合物と共に媒地に移した。次いで培養物を9cmのプレートに移して青年期として新しく播種し、全実験について23°Cまたは25°Cでインキュベートした。実験は1%DMSOで5μM〜10μMの範囲の異なるベキサロテン濃度で行った。対照として、1%DMSOだけで播種したプレートを使用した。
【０１３３】
C.elegansの運動アッセイ
全集団を20°Cで培養し、4時間の産卵から発達的に同調させた。64〜72時に産卵後（ゼロ時）の個体を23°Cまたは25°Cにシフトさせ、図に示す通り体の動きの経時変化を評価した。異なる年齢にて、動物をM9でプレートから洗い流し、播種していない6cmのプレート上に広げた後で、それら動物の運動を自家製の微視的設定を使用して0.75倍の倍率で30秒間または1分間30fpsで記録した。特に明示がない限り、1実験あたり200匹の動物をカウントした。全ての実験を3セット行った上で1つの代表的な実験からのデータを示す。統計的解析をGraphpad Prismソフトウェア（GraphPad Software社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して行った。
【０１３４】
ImageJ（アメリカ国立衛生研究所（NIH）、米国メリーランド州ベセスダ）を使用して精巧なビデオを作成し、ジェスパー・ソンダーガード・ペデルセン（Jesper Sondergaard Pedersen）によって開発されたwrMTrckプラグイン（http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html）を使用して体を曲げる動きを定量化した。
【０１３５】
生きているC.elegansの染色及び顕微鏡観測
生きたトランスジェニック動物を様々な濃度及び時間に渡ってNIAD-4でインキュベートし、1μMのNIAD-4（M9緩衝液中0.1%DMSO）を用いて生きている動物を室温で4時間インキュベートすると、ロバストかつ再現性のある染色が得られることを観察に基づき決定した。染色後、動物をNGMプレート上に約24時間かけて回収させ、正常な代謝を経て染色を取り除いた。染色した動物を画像形成のため、ガラス製顕微鏡スライド上の麻酔剤として40mMのNaN3を含有する2%アガロースパッド上に置いた。Zeiss Axio Obserber（D1）蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Microscopy GmbH社、ドイツ国ジェナ）に、20倍対物レンズ及び49004ET-CY3/TRITCフィルタ（Chroma Technology Corp社、米国バーモント州べロウズフォールズ）を使って画像を取り込んだ。蛍光強度をImageJソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所（NIH）、米国メリーランド州ベセスダ）を使って計算し、次いで補正された全細胞蛍光（corrected total cell fluorescence；CTCF）として正規化した。内蔵のバックグラウンドシグナルが強かったため、頭部の領域だけを考慮した。全ての実験を3セット行った上で1つの代表的な実験からのデータを示す。統計的有意性はt検定を使って決定した。
【０１３６】
ウェスタンブロッティング解析
ベキサロテンの非存在下と存在下におけるAβ発現レベルの比較のため、約3000匹の成虫をS-basal中に（10）3セット採取し、液体N2に入れて凍らせた。次いでサンプルをRIPA緩衝液（50mMトリスpH8、150mMNaCl、5mMEDTA、0.5%SDS、0.5%SDO、1%NP-40、1mMPMSF、Roche Complete阻害剤1倍）（Roche Holding AG社、スイス・バーゼル）に抽出し、超音波処理で破壊し、16,000rpm、4°Cで10分間遠心分離を行った。その後ペレットと上清を分離した。ペレットは尿素/SDS緩衝液（8M尿素、2%SDS、50mMトリス）を使用して溶解した。サンプルを適切濃度でNuPAGE（登録商標）LDSサンプル緩衝液（1X）及びNuPAGE（登録商標）サンプル還元剤（1X）（Life Technologies社、米国カリフォルニア州カールスバッド）に添加し、70°Cで10分間加熱した。材料をNuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）4-12%Bis-Tris Protein Gels（Life Technologies社、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使って分離し、iBlot（登録商標）Dry Blotting System（Life Technologies社、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用してニトロセルロース膜に移し、5%牛血清アルブミン（BCA）中で4°Cで一晩ブロッキングした。次いで膜をMABN10抗Aβ抗体、クローンW0-2（Millipore社、米国マサチューセッツ州ビレリカ）を使って室温で検索し、1:500まで希釈した。ブロットを抗α-チューブリン、クローンB-5-1-2（Sigma-Aldrich社、米国モンタナ州セントルイス）で再検索し、1:5000まで希釈して総タンパク質負荷を標準化した。Alexa488コンジュゲート二次抗体を検出に使用した。
【０１３７】
実施例II
上記実施例では、FDA承認済み抗がん剤ベキサロテンを特定し、これが一次核形成ステップを優先的に阻害することによってAβ42の凝集を大幅に遅延させることを突き止めた。この成果は、Aβ42の凝集における特定の微視的ステップの速度に対する小分子の効果を量的に解析するという、新規な反応速度論の手法を創薬に応用することにより達成し得たものである。確かに、静止条件下においてベキサロテンは、濃度依存的方法でAβ42の凝集を遅延させたが、この遅延は一次核形成ステップに対する極めて特異的な効果と整合する（図7左上）。興味深いことに、緩やかな播種条件下、即ち、予め形成した線維種子が5%存在する条件下において、ベキサロテンは濃度依存的方法で二次経路の速度を有意に減少させた。これらの条件下において、一次核形成ステップは完全に迂回されるが、表面触媒性二次核形成と伸長は起こる。しかしながら、観測された減少は、伸長速度ではなく、表面触媒性二次核形成速度の特異的減少と整合している。なぜなら、伸長が支配的な機構である、より高濃度の播種条件下、即ち、予め形成した線維種子が10%存在する条件下において、ベキサロテンのAβ42の凝集に対する効果を全く観測でなきかったからである。
【０１３８】
このように、ベキサロテンは、一次核及び二次核に結合することにより起こり得るこの効果のために、Aβ42の凝集における一次及び二次核形成ステップの両方の阻害に有効な分子であることが明らかとなった。実際、NMR分光法ではAβ42の単量体種に対するベキサロテンの効果は観測できなかった。重要なことは、Aβ42の凝集に対するベキサロテンのインビトロの効果は、細胞においても、またAβ媒介毒性のC.elegansモデルにおいても、同様であることが分かったことである。実際に、我々は、ベキサロテンによる核形成ステップの阻害に起因するAβ42 線維形成の遅延が、神経芽腫細胞における神経毒性種の形成の遅延、及びAβ線虫におけるAβ42の沈着とその結果の完全な抑制に関係していることを示した。これらの結果は、ベキサロテン等の化合物によってAβ42の核形成を妨げることがアルツハイマー病の発症のリスクを下げる可能性があること、そしてより一般的には、我々の反応速度論ベースの創薬戦略が、神経変性障害に対する候補薬物の範囲を合理的に特定するための一般的枠組みを提供することを示唆した。
【０１３９】
II-準構造ベースの創薬（QSBDD）戦略を通じたAβ42の凝集に対する小分子の特定
Aβ42の凝集に対する小分子を更に特定するために、我々は準構造ベースの創薬（QSBDD）戦略を開発した。この手法は、ベキサロテンが相互作用する一次核及び二次核が不安定で、豊富に存在せず、かつAβ42の凝集経路中に過渡的に発生するということを論理的根拠にしている。したがって、それらの動的かつ過渡的な性質のゆえに、従来の生物物理学的手法を用いてそれらを構造的に特徴づけることはできず、その先の構造ベースの創薬戦略の応用を難題にしてしまっている。この限界を克服するため、我々は、一次核と二次核が同じ構造的特徴を有するためベキサロテンとの相互作用を可能にし、かつ、ベキサロテンが当初結合する構造的ポケットと同一の構造的特徴を有している可能性が非常に高いという仮説に基づく、QSBDDと名付けた新規な戦略を適用する。ベキサロテンは、皮膚T細胞リンパ腫の治療用のFDA承認済みのレチノイドX受容体（RXR）アゴニストである。RXR及びその結合相手に結合するリガンドであるレチノイドA受容体（RAR）は、受容体の細胞内環境との情報伝達を調節し、それは本質的に、受容体-タンパク質及び受容体-DNAまたは受容体-クロマチン相互作用を必然的に伴う。受容体は、それらのリガンドの化学構造においてコードされる情報の仲介者であり、結果として、入力出力の両方向の情報プロセッサとしての役割を果たす。RAR-RXR異種二量体（図7上、中央）は、天然リガンドの生理的機能を仲介すると考えられており、それゆえに、創薬の魅力的な標的である。過去数年間の飛躍的大発見は、リガンド構造を単に修正するだけで集団的にまたは個別的に取組み得る情報伝達プロセスが、非常に多様に存在していることを認識したことである。加えて、ベキサロテンの非存在下と存在下におけるレチノイドA及びX受容体の両者の3D構造が解明されており（図7上、中央及び右）、リガンドがRAR及びRXRの結合ドメイン（LBD）に結合する機構が十分に理解されて医薬的に利用されている。i）LBDの原子構造、及びii）RAR及びRXRの入手可能なアゴニスト及びアンタゴニストの化学的性質に関する、入手可能なデータをうまく活用して、我々はQSBDDを応用し、かつ12種類の入手可能なアゴニスト及びアンタゴニストをその分子がベキサロテンと同様にAβ42の凝集を阻害するとの考えに基づき収集した。実際に、我々は、5種類のRARアゴニスト（即ち、タミバロテン、BMS753、アダパレン、CD1530、TTNPB、Ch55）、4種類のRARアンタゴニスト（即ち、BMS195614、LE135、MM11253、BMS493）、ベキサロテン及びSS11237を含む2種類のRXRアゴニスト、及び1種のRXRアンタゴニスト（即ち、UVI3003）を我々のThTベースの反応速度論アッセイにおいて試験した。その後、Aβ42の凝集における異なる微視的ステップに対するそれらの効果をベキサロテンのものと比較した（図7下）。
【０１４０】
RXR/RAR受容体の構造とAβ42の構造とを関連させる既存のデータはない。実際に、QBSDDの論理的根拠において、小分子は過渡的かつ不安定な構造のAβ42に結合するが、構造的見地から特徴づけるのは非常に困難である。このことが、本明細書において説明するQBSDDのような新規な阻害剤を特定する新しい技術の開拓を促した主な理由であった。したがって、この手法は、異なる折りたたみ不全疾患の原因である他のタンパク質系に作用する阻害剤を特定することにも拡張され得る。
【０１４１】
III-  RXR及びRARリガンドは異なる程度でAβ42の凝集を遅延させる
Aβ42の凝集プロセスの基礎にある個別の微視的ステップに対する選択されたRXRリガンド及びRARリガンドの効果を調べるため、小分子の非存在下と存在下におけるインビトロのAβ42の線維形成をモニターした。小分子の疎水性の性質のため、これらのうちの後者を1%DMSO最終濃度において調製した。したがって、Aβ42の凝集に対する1%DMSOの一切の効果を排除するため、ドットブロット及びThTベースの反応速度論を使ってDMSOの非存在下と存在下で並行して実験を観測した。Aβ42に対するDMSOの効果は全く観測されなかった。線維感受性のOC一次抗体を使用して凝集反応中の異なる12時点においてAβ42の量を調べた後、ドットの強度を定量化した。線維状の種のみを認識する線維特異的OC抗体は、1%DMSOの非存在下と存在下においてAβ42と類似の凝集プロフィールを示した。これらの結果を更に1%DMSOの非存在下と存在下において同一のS字型曲線を示したThTベースの反応速度論を使って確認した。興味深いことに、凝集反応の半濃度時間はThTまたは1%DMSOの存在と無関係に類似することが分かったので、Aβ42の凝集反応速度に対するThT及び1%DMSOの一切の効果を排除する。
【０１４２】
3倍過剰の12種類の小分子をAβ42の2μM溶液に添加した直後から、Aβ42の凝集において異なる遅延を観測したが、遅延はBMS753を除く全ての小分子について有意義であった（図8a）。観測した遅延は、ほとんどの場合において、ベキサロテンのものよりも強かったが、これよりも興味深いのは、12種類の分子のうちの5種類、即ち、MM11253、BMS493、アダパレン、CD1530及びLE135は、10〜15時間以内にAβ42の凝集を完全に阻害したことである（図8a）。
【０１４３】
この効果を更にモニタして、ThTのAβ42線維への結合及びその結果としての蛍光に対する小分子の一切の干渉の可能性を排除するため、上記と同様に、1%DMSOまたは小分子の存在下において線維感受性のOC一次抗体を使用して、凝集反応中の異なる12時点において線維に変換されたAβ42の量を調べた。ドットブロットアッセイにおいて小分子によって誘発された遅延は、ThTベースの反応速度論アッセイにおいて観測されたものと同一であることが分かり、したがって、タンパク質の凝集の阻害における小分子の効果の評価において反応速度論アッセイが果たす極めて重要な役割を更に裏付けている。同調して、ThTベースのアッセイにおいて観察された効果と同様に、同じ5つの分子が凝集反応を10〜15時間以内に完全に阻害した。これらの後者の分子によるAβ42凝集を阻害する機構をよりよく理解するために、我々は同じアッセイ、即ち、ドットブロット及びThTベースの反応速度論のアッセイを化学量論的量未満の小分子で行った（図8b）。興味深いことに、Aβ42の凝集が化学量論的量未満の小分子の存在下において大きく遅延したことから、これらの分子は極めて有効であることが分かった。
【０１４４】
IV-  Aβ42の凝集の阻害における有効性に基づくRARリガンド及びRXRリガンドの格付け
RXRリガンド及びRARリガンドは、Aβ42の凝集を異なる程度で遅延させることが、2つの無関係な定量的手法、即ち、ThTベースの反応速度アッセイ及び無標識ドットブロット反応速度アッセイを使って判明した。このことから、これら分子は凝集反応の阻害におけるその有効性に基づいて分類し得る。ドットブロットからのドットの強度を定量化し、かつ対応する値を1%DMSOの存在下におけるAβ42の値に対して正規化した。その結果、凝集反応における初期の2つの時点の値をThTベースの反応速度論に由来する半濃度時間に対してプロットした（図8c,d）。興味深いことに、ドットブロット強度と半濃度時間の値との間に線形相関が観測できたが、このことは更に我々のアッセイ間の一貫性を裏付けている。この相関関係は、Aβ42の凝集においてそれらが誘発する遅延の程度に従ってRARリガンド及びRXRリガンドを分子の組として分類することを可能にした。
【０１４５】
3組の分子に分類し得る（図8c,d）。A組は、凝集に対する効果を示さなかった1種類の分子BMS753からなり（図8b）、B組は、3倍過剰でベキサロテンと同等以上の効果を示した全ての分子からなり（図8b）、C組は、3倍過剰で凝集を完全に阻害し、かつその効果が更に化学量論的量未満で解析されたた小分子からなる（図8d）。加えて、B組及びC組の分子の各組において、同組の化合物間の格付けも可能であり、B組では、UVI3003がベキサロテンに比べて大幅に凝集を遅延させるので最も有効な分子であり、C組では、Aβ42の2μMのサンプルの凝集を0.5倍過剰で少なくとも3倍遅延させたMM11253とアダパレンが最も有効な分子である。加えて、RARリガンド及びRXRリガンドは、ほんの0.2倍程度の低過剰で有意に凝集を阻害し得るC組分子と共に、Aβ42の凝集反応を濃度依存的な方法で阻害した（図8e,f）。なお、BMS753、即ち、A組は、5倍もの過剰でさえAβ42の凝集反応速度に対する効果を示さなかったことに留意すべきである。
【０１４６】
驚いたことは、RAR／RXRのアゴニスト／アンタゴニストについて、それらに対応する受容体の活性を増強するまたは阻害する初期の機能と、Aβ42の凝集の阻害におけるそれらの有効性との間に何の相関関係も認められなかったことである。例えば、B組分子はRAR及びRXRの両者のアゴニスト及びアンタゴニストからなり、C組分子はRARのアゴニスト及びアンタゴニストからなる。
【０１４７】
V-  Aβ42の凝集における特定の微視的ステップに対するRARリガンド及びRXRリガンドの効果の反応速度論による比較解析
次いで、線維の量の肉眼的な時間変化を異なる微視的事象の速度定数と関連させるマスター方程式から得られた、速度式に基づく凝集プロフィールとマッチングさせることにより、B組及びC組の分子の効果の定量的解析を行った。この手法において、阻害剤の存在下における凝集プロフィールは、阻害剤の非存在下において評価された微視的速度定数の各々に適切な摂動を速度式に導入することによって記述される。そして、異なる濃度の阻害剤の存在下における凝集プロフィールの記述に必要とされる速度定数の修正が、化合物の存在に影響される特定のプロセスを示す。そのため、濃度を増加させつつ、小分子の存在下で一次経路（knk+）と二次経路（k2k+）の速度定数の変化を比較しつつモニターした。
【０１４８】
a-  静止条件下におけるAβ42の凝集に対するB組及びC組分子の効果
濃度範囲2μM〜10μMのB組及びC組分子の存在下におけるAβ42の2μM溶液の凝集プロフィールは、一次経路knk+をB組について3倍未満過剰、かつC組について0.5倍〜1倍未満過剰で減少させたとき、実験データを極めて良好に記述することを示している。対照的に、小分子がより高い過剰倍にあるとき、実験データは、一次経路、即ち、knk+、及び二次経路、即ち、k2k+、の両方の速度定数の減少と整合する。これらの実験により、B組及びC組分子がAβ42の凝集反応における両方の経路に影響し得ること、及びその効果が小分子が高濃度のときに有意であることが明らかになった（図9〜図10、図11a〜g、図12a〜e）。興味深いことに、この効果は、観測した反応速度の肉眼的なプロフィールに小分子が特徴的な方法で影響する、図9〜図10における反応速度曲線の形状（即ち、曲線が、小分子の非存在下においてAβ42に対してより高い過剰倍で異なる傾きを示すこと）から既に予測し得たものである。
【０１４９】
b-  Aβ42の伸長速度に対するB組及びC組分子の効果
二次経路の個別の微視的ステップに対する小分子の効果（即ち、表面触媒性二次核形成と伸長との比較）を明らかにするため、一次及び二次核形成ステップを迂回する条件下である、反応混合物に対して10%の予め形成した線維種子の存在下において、小分子の存在下におけるAβ42の凝集反応速度の更なる一連の測定を行った。そのような状況においては、可溶性ペプチドの成熟線維への変換は、種子によって促進される伸長反応によって大きく加速される。10%線維種子の存在において、B組分子からは、5倍過剰でさえAβ42の2μM溶液の凝集反応速度に対する効果は観測されないが（図11h）、播種なし条件下における対応する凝集プロセスは少なくとも3倍遅延した（図8e）。このことは、B組分子の非存在下と存在下において反応速度曲線からAβ42の成長速度を得ることにより定量的に確認した（図11i）。しかしながら、興味深いことに、C組分子は5倍過剰で成長速度を25%減少させており（図12f,g）、このことは、B組分子に比較したC組分子のより高い有効性を説明するものである。なお、0.5倍過剰において、Aβ42線維の伸長に対するC組分子からの効果を観測しなかったので、伸長ステップを阻害するには、核形成ステップよりもより高濃度の小分子を必要とすることを示していることに留意すべきである（図12h,i）。
【０１５０】
c-  Aβ42の凝集の表面触媒性二次核形成速度に対するB組及びC組の分子の効果
Aβ42の凝集に対するB組及びC組分子の効果について完全な比較評価を得るために、表面触媒性二次核形成ステップに対する小分子の効果を明らかにする目的で、異なる種子条件（即ち、1%〜5%）の存在下においてAβ42の2μMサンプルの凝集反応速度の測定も行った（図13〜図14）。実際に、一次核形成を早期に完全に迂回して…%の予め形成した種子を溶液に導入した。他方で、表面触媒性二次核形成と伸長は共に、全体的な反応速度論に主に貢献するが、種子濃度が高いほど伸長の貢献度がより有意となる。興味深いことに、中程度の種子濃度（即ち、1%〜5%種子濃度）下において行われた実験は、B組及びC組の分子の両者の存在下におけるAβ42の凝集の二次経路（即ち、k2k+）の濃度依存的阻害を示す。B組分子の場合は、5倍もの高過剰でさえ線維の伸長（即ち、k+）に対する効果が観測されなかったため、0.5倍及び5倍過剰における減少は、表面触媒二次核形成の速度（即ち、k2）の減少のみが原因であり得る（図11h,i）。速度は、反応速度曲線から得ることができ、0.5倍及び5倍過剰B組分子の存在下において、それぞれ、少なくとも50%及び75%減少することが分かった。これらの発見が示しているのは、線維の伸長は基本的にB組分子による影響を受けないが、これらの化合物はAβ42の凝集における核形成ステップに対する大きな、かつ選択性の高い効果を有していることと、分子が低濃度でも有意に速度を減少させるのに十分であったことからこの効果が二次核形成に向けられているということである。この観測は、表面触媒性二次核形成が、Aβ42の凝集の触媒サイクルの促進における支配的な機構として主要な役割を果たすことを更に裏付けている。他方、C組分子の場合は、表面触媒性二次核形成の速度に対する効果は、伸長が影響を受けない条件下において（即ち、小分子の0.5倍過剰存在下において）定量化しうる。C組分子は、Aβ42の凝集における表面触媒性二次核形成プロセスの阻害において、0.5倍過剰にて75%も減少させており、B組よりも遥かにより有効であることが分かったことから、B組分子に比べてC組分子がより高い有効性を有することを更に確認するものである。
【０１５１】
Aβ42凝集における表面触媒性二次核形成ステップに対するB組及びC組の分子の効果を更に調べるため、更なる実験を行い、分子シャペロンのクラステリンの存在下において、10%種子条件下の小分子の効果をモニターした。これらの実験の論理的根拠は、10%種子条件下では、既存の線維は線維端に単量体を付加して伸長することにある。しかしながら、分子シャペロンのクラステリンの存在下という条件は、Aβ42線維の伸長ステップを特異的に阻害することが知られており、線維端はブロッキングされ、したがって表面触媒性二次核形成は、表面触媒性二次核形成の速度に対する小分子の影響を評価することで検出できるレベルまで回復すると予測される。実際、Aβ42に対して10%のクラステリンは、Aβ42の線維成長速度をおよそ40%減少させることが分かったが、これは線維端の半分近くがクラステリンによってブロッキングされ、それにより10%の予め形成した線維種子が、5%種子を含む溶液と同様にAβ42の凝集反応速度に影響すると予測されることを示している。Aβ42の凝集に対するB組及びC組分子の効果を、その後、10%の予め形成した線維種子と10%のクラステリンの存在下においてモニターした。興味深いことに、これらの実験は、B組分子は濃度依存的方法で凝集を遅延させることを示したが、クラステリンなしで行った対応する反応では、効果は観測されなかった（図15a〜c）。したがって、観測された遅延は、表面触媒性二次核形成の速度減少と整合する。これらの結果は、更に、1つのステップを阻害すれば凝集反応が他のステップに方向転換されるという、表面触媒性二次核形成経路と伸長経路の機構の互いの互換性を裏付けるものである。B組分子によって誘発される速度減少は、定量化されて、5%の予め形成した線維種子の存在下におけるものと比較され得る（図15d）。興味深いことに、B組分子の0.5倍過剰において、10%種子条件下かつクラステリン存在下におけるAβ42の凝集に対する効果は、5%種子条件下で観測されたものに非常によく似ている。しかしながら、意外にも、分子の5倍過剰において、表面触媒性二次核形成の速度減少は、クラステリンと小分子の両者がその効果に貢献するときに、より明確になる。この発見は、シャペロンが存在する生体内条件下では小分子がより強く凝集に影響すると予測されることを前提とすれば、非常に重要なものである。このより高い効果は、凝集したAβ42種と分子シャペロンから得られる複合体への小分子の高い親和性の結果である可能性が高い。10%種子条件下かつクラステリンの存在下におけるAβ42の凝集に対する同じ用量依存的効果が、C組分子の存在下においても観測された（図16a〜c）。加えて、伸長ステップが影響を受けないC組分子の0.5倍過剰における、表面触媒性二次核形成の速度減少が、B組分子と同様に、5%種子の存在下において観測されたものと比べて、クラステリンの存在下において高くなることが明らかとなった（図16d）。興味深いことに、0.5倍過剰C組分子の存在下において観測された表面触媒性二次核形成の速度減少は、5倍過剰B組分子について観測されたものに類似しており、このことは、B組分子と比較して、Aβ42の凝集の表面触媒性二次核形成ステップに対するC組分子のより高い有効性、即ち、少なくとも10倍高い有効性を更に確認するものである。
【０１５２】
d-  小分子が相互作用し得る標的種の特定
B組及びC組分子がAβ42の凝集における異なる微視的ステップに影響するという観測は、原則として、小分子が凝集経路に沿って異なるAβ42種と相互作用する結果であり得る（図17a）。
【０１５３】
確かに、一次及び表面触媒性二次核形成の両方を阻害することは、小分子が一次核及び二次核及び／または線維表面に結合する結果であり得る。他方、C組分子による3つの微視的ステップの阻害は、3つの微視的ステップに単量体が関わるので、小分子がAβ42の単量体種に結合する状況に対応する。興味深いことに、NMR分光法測定は、全てのC組分子と最も有効なB組分子のUVI3003の添加前後で、15N標識単量体Aβ42の25μMサンプルのHSQCスペクトルにおいて、化学的シフトと強度に有意な摂動を示さなかった（図17b）。このことは、C組分子が一次核及び二次核及び／または線維表面及び線維端に結合し得ることを示している（図17a）。
【０１５４】
これらの発見を全て総合すると、Aβ42の一次核及び二次核は、B組及びC組分子の両者と相互作用することができ、それゆえAβ42の同一の残基が一次及び二次核形成事象の両方に関わっている可能性があるため、類似の構造的特徴を有している可能性が高いことを示唆する。逆に、Aβ42凝集における伸長ステップを阻害するには、C組分子だけに存在する更なる化学的特徴が要求される可能性が高い。実際に、最も有効なB組分子のUVI3003は、Aβ42の表面触媒性二次核形成ステップに対する効果について、C組分子が示した効果と同等の有意性（即ち、0.5倍過剰におけるk2の75%の減少）を示したが、5倍過剰でさえ伸長ステップに対する効果は観測されなかった。更にまた、これらの実験は、小分子に選択的で優先的な逐次結合が起きている可能性が高いこと、それゆえ、小分子が一次経路から二次経路に順次3つのステップに影響し、伸長ステップに対する効果よりも有利な効果を表面触媒性二次核形成に対して有することを示唆する。この発見を更に裏付けるのは、全ての分子が一次核形成の高い阻害性を示し、これがこのステップに関わる種に対する優先的結合性を反映していることと、より高用量においてのみAβ42の二次経路に対する効果が観測し得ることを示したことである。加えて、これらの実験は、小分子が低濃度であれば、一次核形成ステップよりも表面触媒性二次核形成ステップをより優位に阻害することができることを示した。これらの発見は、適切な臨床試験を設定するために極めて重要な情報を提供するので、創薬にとって非常に重要である。
【０１５５】
VI-  構造-反応速度活性相関（S-KAR）
ベキサロテンの骨格内の異なる化学的特徴による、活性に対する相対的な貢献を理解するために、我々は、凝集プロセスの阻害における小分子の各々の化学的構成要素の役割の謎を解くことを可能にする、新規な反応速度論ベースの構造-活性相関（Structure-Activity Relationship）の手法を導入し、これを構造-反応速度活性相関（Structure-Kinetics Activity Relationship; SKAR）と名付けた。実は、典型的なSAR研究は、リガンドとタンパク質の間の解離定数（KD）（即ち、結合親和性）の値を比較することからなる。しかし、この手順をタンパク質折りたたみ不全疾患の場合において適用するとなると、結合種が非常に多様で不安定であるという前提ではKD値を直接測定できないことから、かなりの難題である。そのため、我々は、凝集するタンパク質の反応速度論に対する小分子の効果を小分子自身の化学構造に関連させる新規なSKARアプローチを開発した。SKARは、小分子と共存する凝集タンパク質との間の弱い結合事象について、その検出を凝集反応における単一の微視的ステップの速度に対応するその出力（これがKD値からなるSARとは異なり）とともに行うことを可能にする。
【０１５６】
3種類の小分子がベキサロテンの骨格に単一の化学的置換を有するように設計され、その効果を我々の反応速度論ベースのアッセイを使って、そこにもたらされる微視的な速度変化を定量化することによって評価した。SKAR研究は、ベキサロテンの骨格内の、親水基、中央のリンカー、及び疎水基という3つの構成要素（図18a）を集合的に取り扱う。興味深いことに、反応速度論の実験は、ベキサロテンの親水性かつ疎水性の性質を弱めることを目的として末端部分に（即ち、親水基及び疎水基に）導入した修飾は、該化合物を完全に不活性にしたが、中央のリンカーをアルケンからカルボニル基に修正するとその活性を奪わないことを示した。しかしながら、この後者の修飾によりベキサロテンに対しては分子の有効性が低下した（図18a）。これらの結果は、ベキサロテンの疎水性かつ親水性という二面性がAβ42の凝集の阻害に決定的重要性を有するが、リンカー構成要素は恐らく標的のポケットに末端部分を配向することで阻害の程度に影響することを示唆するという点において極めて重要である。これらの結果を更に裏付けるものとして、全てのB組及びC組の分子が、リンカーによって分離される親水性かつ疎水性という二面性を示す。しかも、SKARの結果と更に一致して、TTNPB、タミバロテン、及びSR11237（即ち、B組の3つの分子）は、ベキサロテンと比べればリンカー部分にのみ異なる置換を有するが、これらは異なる程度でAβ42の凝集を遅延させた。これらの発見は、我々のSKAR戦略が、i）小分子の個別の化学的構成要素の役割を理解し、ii）タンパク質の凝集に対する有効な分子を設計するために決定的重要性を持つこと、そして、iii）より一般的には、折りたたみ不全疾患に関わるタンパク質の凝集に対する小分子の効果の評価にこの戦略を一般的に使用し得ることを示唆している。
【０１５７】
VII-  Aβ42の凝集に対する具体的なファーマコフォアの生成
これらの全ての実験に基づいて、Aβ42の凝集に対する具体的なファーマコフォアが、B組及びC組の全ての陽性分子の骨格から計算され得る（図18b）（「方法」を参照）。興味深いことに、生成したファーマコフォアは、S-KAR研究からの発見と完全に整合する特徴を示した（図18b）。実際、リンカー構成要素は、主要な特徴として特定されず、リンカーはAβ42の凝集の阻害に必要不可欠ではないという発見を裏付けている。他方、疎水基と親水基は、凝集プロセスの阻害に主要な役割を果たすものとして存在する。しかも、ベキサロテンの骨格に存在した親水性の末端基内の芳香族環は、生成したファーマコフォアの一部ではなく、これは、芳香族環を持たないUVI3003の構造と整合する（図7）。
【０１５８】
VIII-  小分子の有効性に関与する小分子の化学的特徴
RARモジュレータ及びRXRモジュレータは、Aβ42の凝集における異なる微視的ステップを阻害することが分かった。実際に、B組分子とは異なり、C組分子は、一次及び二次核形成ステップに対して、B組分子よりも大きな効果で、3つのステップを阻害することが分かった。したがって、これらの差異を説明し得る化学的特徴を特定することと、それに続いて、Aβ42の凝集における特定の微視的ステップに影響を与えることができる分子を設計することが極めて重要であった。小分子の構造の記述子と分子特性を計算し、ゴース／クリッペンのオクタノール／水分配係数（Ghose-Crippen octanol-water coefficient）を通して表現される「親油性」と、原子ファンデルワールス体積の和を通して表現される「かさ高さ」という2つの独立したパラメータを評価した。興味深いことに、これらの2つのパラメータ間の線形相関は既に特定できており、この相関関係を使って全ての小分子の有効性を説明できる（図18c）。実際に、親油性とファンデルワールス値が大きいものほど小分子の有効性は高く、値が小さすぎるとBMS753の場合のように小分子の効果の完全な無効化をもたらす。驚いたことに、B組で最も有効な分子であるUVI3003は、得られた相関関係に従って、C組分子と類似の有効性を有することが分かった（図18c）実際に、UVI3003の構造は、C組分子と同様の親油性とファンデルワールス値によって特徴づけられる。興味深いことに、反応速度論アッセイにおいて、UVI3003は、Aβ42の凝集における伸長ステップに対する効果は観測されなかったが、C組分子と同様に一次及び二次核形成ステップの阻害を示した。これは、小分子が一次及び二次核形成ステップに対しては効果を有するが伸長ステップに対しては効果がないことを親油性とファンデルワールス体積が説明し得ることを示唆する。伸長ステップの阻害に関与する小分子の化学的特徴の謎を解くために、我々は、小分子の相対的な芳香族性値を更なるパラメータとして考慮した。興味深いことに、図18cに示すように、Aβ42の伸長の阻害には、高い芳香族性値が必要不可欠であることが分かった。実際に、全てのC組分子は、B組分子よりも高い芳香族性値を有している。
【０１５９】
これらの発見は、これらの3つのパラメータを用いれば、当業者はAβ42の凝集の微視的ステップに対する小分子の効果を解明できることを示唆している。このように、仮想ベースのスクリーニング方法は、今や更なる小分子を特定する目的でデータベースのスクリーニングに使用することができ、かつ、究極的には、Aβ42の凝集を特異的に阻害する小分子の多様なライブラリを作ることができるのである。
【０１６０】
実施例IIの材料及び方法
Aβペプチドの調製
組換えAβ（M1〜42）ペプチド（MDAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA（配列番号1）、以下「Aβ42」という。）は、既に説明されたものに僅かな修正を加えて、大腸菌BL21-Gold（DE3）株（Stratagene社、米国カリフォルニア州）において発現され精製される（51）。要するに、精製手順には、大腸菌細胞の超音波処理、8M尿素への封入体の溶解、及びジエチルアミノエチルセルロース樹脂を用いたバッチモードのイオン交換と凍結乾燥が含まれる。凍結乾燥された画分は、Superdex75HR26/60カラム（GE Healthcare社、英国バッキンガムシャー）を使用して更に精製され、溶出液はSDS-PAGEを使用して所望のタンパク質生成物の存在について解析された。組換えタンパク質を含有する画分が混合され、液体窒素を用いて冷凍され、再度凍結乾燥された。
【０１６１】
同位体で標識された15N-Aβ42を形質転換大腸菌BL21-Gold（DE3）株（Stratagene社、米国カリフォルニア州）を500mLの最少M9バッチ培地を用いて1Lのフラスコで37°Cで培養して調製した。要するに、100μg/Lのアンピシリンを含有するLB培地において一晩培養して飽和させた20mLの前培養物を2YT培地において1/25まで希釈し、100μg/Lのアンピシリンを添加して37°Cで培養した。600nmにおけるODが0.5に達した時点で細胞を収穫し、最少培地において洗浄し、100μg/Lのアンピシリンを含有する初期最少M9培地の培養液量の1/4で接種し、15NH4Cl（2g/L）（Cambridge Isotopes Laboratories社）を添加した。誘導前に細胞を37°Cで2時間培養した。その後、IPTGを1mMの最終濃度に添加し、細胞を37°Cで一晩培養した。上述のように15N-Aβ42の精製を行った。
【０１６２】
反応速度実験のためのサンプルの調製
凍結乾燥されたAβ42ペプチドを6MのGuHClに溶解させて単量体ペプチドの溶液を調製した。Superdex7510/300GLカラム（GE Healthcare社）を使用して流速0.5mL/minで潜在的オリゴマー種と塩から単量体形態を生成し、200μMのEDTA及び0.02%NaN3を添加したpH8の20mMリン酸ナトリウム緩衝液中に溶出させた。ピークの中央を回収し、ペプチド濃度は、ε280＝1400 lmol-1cm-1を使用してピーク領域の積分値の吸収度から決定した。得られた単量体を緩衝液で希釈して所望の濃度とし、20μMチオフラビンT（ThT）を1mMストックから添加した。全てのサンプルは、氷の上でサンプルが結合しにくいエッペンドルフチューブ内で、気泡を入れないように慎重にピペット操作を行って調整した。その後、各々のサンプルをピペットで複数の、即ち、ハーフエリア96ウェルの、サンプルが結合しにくい、透明底の、PEG被膜のウェルプレート（Corning 3881）に1ウェルあたり80μLを入れた。
【０１６３】
播種実験のため、予め形成した線維を実験の直前に調製した。反応速度実験を上述した200μMのEDTA、0.02%NaN3及び20μMのThTを添加したpH8の20mMリン酸ナトリウム緩衝液中の4μMAβ42サンプルの場合と同様に設定した。線維の形成を検証するためThT蛍光を3時間モニターした。
【０１６４】
次いで、サンプルをウェルから回収して低結合力のチューブに移した。既に考慮した条件下（即ち、4μMAβ42）において、単量体の濃度は平衡状態で無視できる程度である（31）。単量体当量の線維最終濃度は、初期単量体の濃度に等しいと考えられた。次いで、線維最終濃度1%、2%、5%または10%のいずれかに達するように、線維を新たに調製した単量体に添加した。
【０１６５】
全ての場合において、ベキサロテンをまず100%DMSOに溶解して5mMの濃度とし、次いでペプチド溶液に希釈してDMSO最終濃度が最大で1%となるようにした。反応混合物に1%DMSOを添加しても、Aβ42の凝集に対して全く効果がないことを検証した。
【０１６６】
反応速度アッセイ
96ウェルプレートをプレートリーダー（Fluostar Omega、Fluostar OptimaまたはFluostar Galaxy、BMGLabtech社、ドイツ国オッフェンブルク）内において37°Cで静止条件とし、アッセイを開始した。ThT蛍光をプレートの底を通して、440nmの励起用フィルター及び480nmの蛍光用フィルタを使用して計測した。各サンプルにつき3度繰り返してThT蛍光を観測した。
【０１６７】
理論的解析:
総線維質量濃度の経時変化「M(t)」が、下記の積分形反応速度式によって記述される：
2019502711.tif 000023
（式中、反応速度パラメータB±、C±、κ、
2019502711.tif 000024
及び
2019502711.tif 000025
は、微視的速度定数の2種類の組合せk+k2及びknk2の関数であり、ここでkn、k+及びk2は、それぞれ、一次核形成速度定数、伸長速度定数及び二次核形成速度定数である。1%DMSOにおけるAβ42単独をまず最初にモデル化し、k+k2及びknk2を組み合わせた微視的速度定数を得た。）
【０１６８】
異なる小分子を導入することで、凝集プロセスは1以上の個別の微視的反応によって阻害され得る。微視的速度定数k+k2及びknk2を分子の存在下において得た上でAβ42単独の初期値と比較した。この比較により、化合物間の（それらの微視的速度の相対的変化による）相対的有効性だけでなく、いずれの速度が主に摂動するかを理解することができる。
【０１６９】
ファーマコフォアの3Dモデルの生成
陽性化合物の3D配座をまず最初にCORINAを使って生成した。（mol2フォーマットにおける）これらの配座をデフォルトの選択肢とともに入力値として使用し、その後PharmaGist用のアルゴリズムを使ってファーマコフォアモデルを生成した。計算したファーマコフォアの特徴を入力値として使用した全ての分子とマッチングした。
【０１７０】
小分子の物理化学的特性の計算
E-Dragon 1.0ソフトウェアを使って、構造の記述子と分子特性を計算した。分子の親油性をゴース／クリッペンのオクタノール／水分配係数を通して表現し、かさ高さを原子ファンデルワールス体積の和を通して表現し、芳香族性を芳香族性比を通して表現した。
【０１７１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【国際調査報告】
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