(57)【要約】  ゲノム編集初代Ｂ細胞、ゲノム編集初代Ｂ細胞の作製方法、初代Ｂ細胞に導入することができる治療用カセットならびにゲノム編集初代Ｂ細胞および治療用カセットの使用方法。【選択図】図５
2019526270.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項２】
ＣＤ１９、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ２７＋、ＣＤ２１＋およびＣＸＣＲ５＋のうちの少なくとも１つのものを発現する細胞を含む、請求項１に記載のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項３】
末梢血、臍帯細胞、腹水または固形腫瘍から単離された細胞を含む、請求項１または２のいずれかに記載のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項４】
非クローン性細胞を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項５】
増殖性細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項６】
哺乳動物細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項７】
内在遺伝子が欠失している、請求項１〜６のいずれか１項に記載のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項８】
内在遺伝子が点変異を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項９】
外来遺伝子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項１０】
前記内在遺伝子および前記外来遺伝子のうちの少なくとも一方が、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の少なくとも一部分をコードする核酸を含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項１１】
非ゲノム編集初代Ｂ細胞に比して内在性Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の発現の減少を示す、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項１２】
ＣＤ１９の発現または活性を変化させる修飾を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項１３】
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸と過剰発現させる遺伝子をコードする核酸とを含む治療用カセットを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【請求項１４】
対象に請求項１〜１３のいずれか１項に記載のゲノム編集初代Ｂ細胞を含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１５】
対象の疾患を治療または予防することを含み、前記疾患が、酵素異常症、癌、前癌状態、病原体による感染症またはウイルス感染症を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸と、過剰発現させる遺伝子をコードする核酸とを含む、治療用カセット。
【請求項１７】
前記過剰発現させる遺伝子が、酵素をコードする核酸を含む、請求項１６に記載の治療用カセット。
【請求項１８】
前記酵素が、酵素異常症を有する対象に欠如している酵素を含む、請求項１７に記載の治療用カセット。
【請求項１９】
前記ＢＣＲをコードする核酸と前記過剰発現させる遺伝子をコードする核酸が、転写的に結合しているか、翻訳的に結合しているか、またはその両方である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の治療用カセット。
【請求項２０】
前記ＢＣＲをコードする核酸および前記過剰発現させる遺伝子をコードする核酸の転写を駆動するプロモーターを含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の治療用カセット。
【請求項２１】
請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の治療用カセットを含む、ベクター。
【請求項２２】
レンチウイルスベクターを含む、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】
ＢａＥＶ−偽型レンチウイルスベクター、ＶＳＶｇ−偽型レンチウイルスベクター、ＦＡＭ１レンチウイルスベクターおよびＦＡＭ２レンチウイルスベクターのうちの少なくとも１つのものを含む、請求項２１または２２のいずれかに記載のベクター。
【請求項２４】
請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の治療用カセットを含む、細胞。
【請求項２５】
初代Ｂ細胞を含む、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
対象に請求項２４または２５のいずれかに記載の細胞を投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記対象に抗原を投与することをさらに含み、前記治療用カセットの前記ＢＣＲが前記抗原に特異的なものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
初代Ｂ細胞のゲノムを編集することを含む方法であって、前記初代Ｂ細胞が、ＣＤ１９、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ２７＋、ＣＤ２１＋およびＣＸＣＲ５＋のうちの少なくとも１つのものを発現する細胞を含む、方法。
【請求項２９】
前記初代Ｂ細胞に外来性のタンパク質または核酸を導入することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞のエレクトロポレーションを含む、請求項２８または２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
標的化ヌクレアーゼまたは標的化ヌクレアーゼをコードする核酸を導入することを含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記初代Ｂ細胞を活性化、刺激および増殖の段階のうち少なくとも１つのものに供することをさらに含む、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記初代Ｂ細胞を活性化、刺激および増殖の段階のうち少なくとも１つのものに供することと、
前記初代Ｂ細胞に外来性タンパク質または外来性核酸を導入するための前記細胞のエレクトロポレーションと
を含む、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（継続出願データ）
本願は、２０１６年９月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／３９３，５１２号の利益を主張するものであり、上記出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表）
本願には、大きさが９０．３キロバイトであり２０１７年９月１２日に作成された「１１０−０５４６０２０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂから電子形式で米国特許商標庁に提出された配列表が含まれる。配列表を電子形式で出願することによって、電子形式で提出された配列表は、３７  ＣＦＲ  １．８２１（ｃ）により義務付けられている紙面コピーおよび１．８２１（ｅ）により義務付けられているＣＲＦの両方の役割を果たす。配列表の含まれている情報は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
Ｂリンパ球は、特異的抗原性エピトープを認識するクローン的に多様な細胞表面免疫グロブリン（Ｉｇ）受容体を発現する細胞集団であるとされる適応免疫系の構成要素のひとつである。Ｂ細胞成熟の過程は、大部分がヒトとマウスとの間で保存されている。正常なＢ細胞発生に調節異常があると、先天性免疫不全、自己免疫疾患、さらには白血病またはリンパ腫を引き起こすことがある。Ｂ細胞は、最初に抗原に曝露してから数十年にわたって持続する防御的抗体を産生することができる。免疫感作後、長期生存形質細胞が生じることによって、抗原反応性Ｉｇが何年もの間にわたって検出される。この長期生存形質細胞は、増殖しない長期生存抗体産生細胞、または抗体成熟の段階で胚中心から生じる細胞から生じ得る。このような形質細胞は何年もの間生存し、さらには数十年もの間生存する可能性があると考えられている。
【発明の概要】
【０００４】
本開示には、ゲノム編集初代Ｂ細胞、ゲノム編集初代Ｂ細胞の作製方法、初代Ｂ細胞に導入することができる治療用カセットならびにゲノム編集初代Ｂ細胞および治療用カセットの使用方法が記載される。
【０００５】
一態様では、本開示にはゲノム編集初代Ｂ細胞が記載される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ１９、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ２７、ＣＤ２１およびＣＸＣＲ５のうち少なくとも１つのものを発現する細胞を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、末梢血、臍帯細胞、腹水または固形腫瘍から単離される細胞を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、非クローン性細胞、増殖性細胞、哺乳動物細胞および／またはヒト細胞を含む。
【０００７】
ゲノム編集初代Ｂ細胞のいくつかの実施形態では、内在遺伝子が欠失しており、ある遺伝子が点変異を含み、かつ／または細胞が外来遺伝子を含む。遺伝子は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の少なくとも一部分をコードする核酸を含み得る。
【０００８】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、非ゲノム編集初代Ｂ細胞に比して内在性Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の発現の減少を示す。
【０００９】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ１９の発現または活性を変化させる修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、ゲノムの非コード領域の修飾を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、非ゲノム編集初代Ｂ細胞に比して生存能の増大を示す。
【００１１】
別の態様では、本開示には、対象にゲノム編集初代Ｂ細胞を含む組成物を投与することを含む方法が記載される。いくつかの実施形態では、この方法は、対象の疾患を治療または予防することを含み、疾患は、例えば、酵素異常症、癌、前癌状態、病原体による感染症またはウイルス感染症を含み得る。
【００１２】
別の態様では、本開示には、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸と、過剰発現させる遺伝子をコードする核酸とを含む、治療用カセットが記載される。Ｂ細胞受容体は膜貫通領域を含み得る。過剰発現させる遺伝子は酵素をコードする核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、酵素は、酵素異常症を有するか、酵素異常症であると診断された対象に欠如している酵素を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＲをコードする核酸と過剰発現させる遺伝子をコードする核酸は、転写的に連結しているか、翻訳的に連結しているか、またはその両方である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、治療用カセットは、ＢＣＲをコードする核酸および過剰発現させる遺伝子をコードする核酸の転写を駆動するプロモーターを含む。
【００１４】
別の態様では、本開示には、治療用カセットを含む細胞が記載される。いくつかの実施形態では、細胞はＢ細胞および／または長期生存形質細胞を含む。細胞は、内在性Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸の修飾を含み得る。
【００１５】
さらなる態様では、本開示には、治療用カセットを含む細胞を投与することを含む、方法が記載される。いくつかの実施形態では、この方法は、対象に抗原を投与することも含むものであり得、治療用カセットのＢＣＲは抗原に特異的なものである。
【００１６】
さらに別の態様では、本開示には、初代Ｂ細胞のゲノムを編集することを含む方法が記載される。初代Ｂ細胞は、ＣＤ１９を発現する細胞；ＩｇＭもしくはＩｇＤまたはその組合せを発現する細胞；ＣＤ２７＋細胞；ＣＤ２１＋細胞；ならびに／あるいはＣＸＣＲ５＋細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、初代Ｂ細胞は、末梢血、臍帯細胞、腹水もしくは固形腫瘍から単離された細胞；非クローン性細胞；増殖性細胞；哺乳動物細胞；および／またはヒト細胞を含み得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、この方法は、初代Ｂ細胞に外来性のタンパク質または核酸を導入することを含む。この方法は、細胞のエレクトロポレーションを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、標的化ヌクレアーゼまたは標的化ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードする核酸を含む）を導入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入することを含む。ｇＲＮＡは化学修飾されたｇＲＮＡを含み得る。化学修飾されたｇＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホロチオアート（ＭＳ）または２’−Ｏ−メチル−３’−チオホスホノアセタート（ＭＳＰ）を含み得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、この方法は、ナトロノバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ）アルゴノート（ＮｇＡｇｏ）およびガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を導入することを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ゲノムを編集することは、例えばＣＤ１９をコードする核酸を含む遺伝子を編集すること；Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の一部分をコードする核酸を編集すること；および／またはゲノムの非コード領域を編集することを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、この方法は、Ｂ細胞を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ゲノムを編集した後に選択を実施する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞を編集されたゲノムに関して選択する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、この方法は、初代Ｂ細胞を活性化、刺激および増殖の段階のうち少なくとも１つのものに供する。
【００２２】
「好ましい」および「好ましくは」という単語は、特定の状況下で特定の利益をもたらし得る本発明の実施形態を指す。ただし、同じまたは別の状況下でそれ以外の実施形態が好ましい場合もある。さらに、１つまたは複数の好ましい実施形態が記載される場合、それは他の実施形態が有用ではないことを意味するのではなく、また他の実施形態を本発明の範囲から除外することを意図するものではない。
【００２３】
「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」（「含む」）という用語およびその変化形は、それらの用語が説明および請求項に見られる場合に限定的な意味を有するものではない。
【００２４】
特に明記されない限り、「ａ」、「ａｎ」（以上、１つの）、「ｔｈｅ」（その）および「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ」（少なくとも１つの）は互換的に使用され、１つまたは２つ以上という意味である。
【００２５】
本明細書ではほかにも、数値の範囲が終点によって記載される場合、その範囲内に含まれるあらゆる数値が含まれる（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などが含まれる）。
【００２６】
本明細書に開示される個別の段階を含むいずれの方法に関しても、実行可能な順序で諸段階を実施してよい。また、適宜、２つ以上の段階を任意に組み合わせて同時に実施してもよい。
【００２７】
見出しはいずれも読者の便宜を図ったものであり、特に明記されない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために用いるべきものではない。
【００２８】
特に明示されない限り、明細書および請求項で使用される成分、分子量などの量を表すあらゆる数値は、いかなる場合も「約」という用語が修飾しているものと理解されるべきである。したがって、特にそうでないことが明示されない限り、明細書および請求項に記載される数値パラメータは近似値であり、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得るものである。よくても、請求項の範囲に対する均等論を制限しようとするものではないが、各数値パラメータは少なくとも、報告される有効数字の数値を考慮に入れ、通常の丸め法を適用することによって解釈されるべきである。
【００２９】
本発明の広い範囲を記載する数値の範囲およびパラメータは近似値ではあるが、具体例に記載される数値は可能な限り正確に報告される。ただし、いかなる数値にも本来、その各試験測定値にみられる標準偏差から必然的に生じる範囲が含まれている。
【００３０】
上の本発明の概要は、開示される本発明の各実施形態または本発明のあらゆる実施を記載することを意図するものではない。以下の説明では、例示的実施形態をさらに具体的に例示する。本願全体を通じていくつかの箇所では、例のリストにより指針が示され、その例を様々な組合せで用いることができる。いずれの場合も、記載されるリストは単に代表的なグループとしての役割を果たすものであって、排他的なリストとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】刺激初代ヒトＢ細胞へのｅＧＦＰをコードするｍＲＮＡの送達を示す図である。（Ａ）生存細胞にゲートをかけた後のｅＧＦＰ陽性Ｂ細胞のパーセントを示すヒストグラム。（Ｂ）パネルＡに示されるＢ細胞の生存率をＡＰＣ  ｅ−Ｆｌｕｏｒ  ７８０  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅに基づき定量化したフロープロット。
【図２】化学修飾ｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡまたはタンパク質で処理し刺激した初代ヒトＢ細胞から得たｓｕｒｖｅｙｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅアッセイの例示的結果を示す図である。トランスフェクションから３日後にＤＮＡを抽出した。遺伝子修飾率の記載されてないレーンには簡略化のため表示されていないが、編集が０％であったことを示している。各レーンには、用いた条件を示すキーとともに（左から右へ）１〜５の番号が付されている。各画像の下には標的遺伝子が括弧内に記されている。
【図３】ＢＣＲ重鎖遺伝子座での標的化遺伝子組込みのいくつかの例示的実施形態の模式図を示す図である。（Ａ）エンハンサー、Ｄ、Ｊおよび定常エクソンを示すＢＣＲ重鎖遺伝子座の略図。導入遺伝子組込みに提案される部位が示されている。（Ｂ）ＢＣＲ重鎖遺伝子座での遺伝子送達のためのカーゴ設計の２つの実施形態の略図。Ｐ２Ａ：ｃＤＮＡを転写的に連結するリボソームスキップ配列、ｐＡ：ポリアデニル化配列、スプライスａｃｃ：強力なスプライスアクセプターエレメント。
【図４】初代ヒトＢ細胞のレンチウイルス形質導入の例示的結果を示す図である。等高線図は、ＡＰＣ  ｅ−Ｆｌｕｏｒ７８０  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅに基づき生存細胞にゲートをかけた後のｅＧＦＰ発現Ｂ細胞のパーセントを示している。実施例２に記載される通りに、急性刺激したＢ細胞培養物（上の行）、慢性刺激したＢ細胞培養物（中央の行）および未刺激のＢ細胞培養物（下の行）でＢａＥＶ−偽型（Ｆｕｓｉｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，２３（１１）：１７３４−４７）（左の列）、ＶＳＶｇ−偽型（中央の列）およびレンチウイルス無しの対照（右の列）を試験した。いずれの条件でも、ＢａＥＶ偽型ウイルスを用いた場合に、標準的なＶＳＶｇ偽型で形質導入した細胞よりも効率的にＢ細胞に形質導入された。
【図５】初代ヒトＢ細胞培養物のＣＤ１９遺伝子をノックアウトした後の例示的なＣＤ１９タンパク質の細胞表面発現を示す図である。刺激したＢ細胞にＮＥＯＮトランスフェクションシステム（１４００ボルト、１０ミリ秒（ｍｓ）、３パルス）を用いてＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび化学修飾ｇＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ社）をエレクトロポレートすることにより、ＣＤ１９遺伝子座を標的化した。ＣＤ１９の対照レベルを示すため、ｇＲＮＡを加えないＣａｓ９  ｍＲＮＡの試料およびエレクトロポレーション無しの試料を含めた。エレクトロポレーションから５日後、フローサイトメトリーによりＣＤ１９発現を測定した。（Ａ）Ｃａｓ９＋ｒＲＮＡで処理した細胞（実線）でのＣＤ１９発現をＣａｓ９単独で処理した細胞（破線）および無エレクトロポレーション対照（灰色無地の背景）に対して示したヒストグラム。（Ｂ）ＣＤ１９の細胞表面発現が、Ｃａｓ９単独で処理した細胞および無エレクトロポレーション対照の９６〜９８％からＣａｓ９とＣＤ１９  ｇＲＮＡで処理したＢ細胞の３８％に減少した。
【図６Ａ−Ｂ】初代ヒトＢ細胞を操作して抗体を発現させるのに用いた治療用カセットをコードするプラスミドの例示的ベクター構築物を示す図である。これらのプラスミドは、Ｂ細胞の成熟状態に応じて膜結合Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）または分泌抗体を発現させる。（Ａ）ＭＮＤプロモーターの制御下で抗ＰＥの重鎖および軽鎖ならびにコドン最適化アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ｃｏＩＤＵＡ）を発現するよう構築したレンチウイルスベクターの模式図。Ｐ２Ａペプチド配列を導入することにより、重鎖、軽鎖およびｃｏＩＤＵＡを同時発現させた。配列を表３に示す。（Ｂ）抗ＰＥ  Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）／抗体を発現するよう修飾したＦＡＭ１レンチウイルスベクターおよびＦＡＭ２レンチウイルスベクター（原型はＦｕｓｉｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，２３（１１）：１７３４−４７に記載されている）の模式図。配列を表６および８に示す。（Ｃ）ＭＮＤプロモーターの制御下でＢ１２の重鎖および軽鎖ならびにコドン最適化ＩＤＵＡ（ｃｏＩＤＵＡ）を発現するよう構築したレンチウイルスベクターの模式図。Ｐ２Ａペプチド配列を導入することにより、重鎖、軽鎖およびｃｏＩＤＵＡを同時発現させた。配列を表４に示す。（Ｄ）Ｂ１２  Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）／抗体を発現するよう修飾したＦＡＭ１レンチウイルスベクターおよびＦＡＭ２レンチウイルスベクター（原型はＦｕｓｉｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，２３（１１）：１７３４−４７に記載されている）の模式図。配列を表５および７に示す。
【図６Ｃ−Ｄ】初代ヒトＢ細胞を操作して抗体を発現させるのに用いた治療用カセットをコードするプラスミドの例示的ベクター構築物を示す図である。これらのプラスミドは、Ｂ細胞の成熟状態に応じて膜結合Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）または分泌抗体を発現させる。（Ａ）ＭＮＤプロモーターの制御下で抗ＰＥの重鎖および軽鎖ならびにコドン最適化アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ｃｏＩＤＵＡ）を発現するよう構築したレンチウイルスベクターの模式図。Ｐ２Ａペプチド配列を導入することにより、重鎖、軽鎖およびｃｏＩＤＵＡを同時発現させた。配列を表３に示す。（Ｂ）抗ＰＥ  Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）／抗体を発現するよう修飾したＦＡＭ１レンチウイルスベクターおよびＦＡＭ２レンチウイルスベクター（原型はＦｕｓｉｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，２３（１１）：１７３４−４７に記載されている）の模式図。配列を表６および８に示す。（Ｃ）ＭＮＤプロモーターの制御下でＢ１２の重鎖および軽鎖ならびにコドン最適化ＩＤＵＡ（ｃｏＩＤＵＡ）を発現するよう構築したレンチウイルスベクターの模式図。Ｐ２Ａペプチド配列を導入することにより、重鎖、軽鎖およびｃｏＩＤＵＡを同時発現させた。配列を表４に示す。（Ｄ）Ｂ１２  Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）／抗体を発現するよう修飾したＦＡＭ１レンチウイルスベクターおよびＦＡＭ２レンチウイルスベクター（原型はＦｕｓｉｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，２３（１１）：１７３４−４７に記載されている）の模式図。配列を表５および７に示す。
【図７】ＮＥＯＮトランスフェクションシステムを用いて初代ヒトＢ細胞にｅＧＦＰをコードするＤＮＡまたはＲＮＡをトランスフェクトする効果に対する例示的エレクトロポレーションの設定の影響を示す図である。（Ａ）試験した条件、すなわち、電圧（ボルト）；幅（ミリ秒（ｍｓ））およびパルス回数のリストを示している。（Ｂ）ＧＦＰをコードするプラスミド（左の列）またはＧＦＰをコードするｍＲＮＡ（右の列）を用いて、トランスフェクションの効果（上の行）、細胞生存率（中央の行）および総細胞カウント数（下の行）に対するエレクトロポレーション条件の影響を試験した。
【図８】実施例２に記載される通りにＡｌｔ−Ｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いたＢＣＬ２遺伝子座でのインデル形成の例示的結果を示す図である。ＮＥＯＮトランスフェクションシステム（１４００ボルト、１０ｍｓ、３パルス）を用いて、初代ヒトＢ細胞にＢＣＬ−２遺伝子座を標的とするＡｌｔ−Ｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、コーラルビル、アイオワ州）をエレクトロポレートした。ＴＩＤＥプログラム（ｔｉｄｅ．ｎｋｉ．ｎｌのワールドワイドウェブで利用可能）を用いたシーケンシング解析により、総編集効率が１１．３％であることがわかった（Ｒ２＝０．８９）。編集の大部分には１ヌクレオチドの挿入または９ヌクレオチドの欠失が含まれているのが観察された。
【図９】末梢血単核球から単離したＣＤ１９＋細胞由来の成熟ナイーブ様Ｂ細胞をＣＤ４０Ｌ架橋抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）およびＩＬ−４で活性化させた後の増殖および拡大に対する細胞密度の影響を示す図である。ＨＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）に高密度の濃度（１×１０６細胞／ｍＬ）で播いた細胞は、第１４日までの拡大が、低密度の濃度（２×１０５細胞／ｍＬ）で播いた細胞で観察された３０倍の増加と比較して最小限のものであった。
【図１０−Ａ】実施例２に詳細に記載されるエレクトロポレーションから３日後のＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の例示的（Ａ）細胞内ＩＤＵＡ活性および（Ｂ）分泌ＩＤＵＡ活性を示す図である。
【図１０−Ｂ】実施例２に詳細に記載されるエレクトロポレーションから３日後のＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の例示的（Ａ）細胞内ＩＤＵＡ活性および（Ｂ）分泌ＩＤＵＡ活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（詳細な説明）
Ｂ細胞は、長期生存型になることができ、本来大量のタンパク質（すなわち、抗体）を産生する能力を有することから、例えば酵素異常症の治療を含めた遺伝子治療に理想的なプラットフォームになるものと思われる。Ｂ細胞はまた、末梢血中に容易に得ることができ（白血球全体の１〜７％を占める）、細胞を拡大する方法も容易に利用することができる。さらに、データから、細胞はタンパク質よりも容易に血液脳関門を通過し、このため、脳に及ぶ酵素異常症には酵素補充療法よりも細胞療法の方が望ましいものとなる可能性が示唆されている。しかし、ゲノム工学法を用いるＢ細胞への治療遺伝子の送達も、任意の標的化ヌクレアーゼの初代ヒトＢ細胞への使用もこれまで報告されていない。
【００３３】
本開示には、ゲノム編集初代Ｂ細胞；ゲノム編集初代Ｂ細胞の作製方法；および例えば細胞の投与を含めたゲノム編集初代Ｂ細胞の使用方法が記載される。本開示にはさらに、初代Ｂ細胞に導入することができる治療用カセット、治療用カセットの作製方法、治療用カセットを含むＢ細胞の作製方法および治療用カセットの使用方法が記載される。
【００３４】
Ｂ細胞
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞はＣＤ１９＋細胞であり得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は初代Ｂ細胞であり得る。本明細書で使用される「初代Ｂ細胞」は非不死化Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、「初代Ｂ細胞」は新たに単離したＢ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離したものであり得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞はｉＰＳＣから誘導したものであり得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞はＣＤ３４＋細胞の集団から誘導したものであり得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、「初代Ｂ細胞」は、単離してから最大５回の複製もしくは分裂、単離してから最大１０回の複製もしくは分裂、単離してから最大１５回の複製もしくは分裂、単離してから最大２０回の複製もしくは分裂、単離してから最大２５回の複製もしくは分裂、単離してから最大３０回の複製もしくは分裂、単離してから最大３５回の複製もしくは分裂、または単離してから最大４０回を経たＢ細胞である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、「初代Ｂ細胞」は、誘導してから最大５回の複製もしくは分裂、誘導してから最大１０回の複製もしくは分裂、誘導してから最大１５回の複製もしくは分裂、誘導してから最大２０回の複製もしくは分裂、誘導してから最大２５回の複製もしくは分裂、誘導してから最大３０回の複製もしくは分裂、誘導してから最大３５回の複製もしくは分裂、または誘導してから最大４０回を経たＢ細胞である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、初代Ｂ細胞は非クローン性細胞である。いくつかの実施形態では、初代Ｂ細胞は増殖性細胞である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞をＣＤ４０Ｌの存在下で培養するのが好ましい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞はナイーブＢ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、「ナイーブＢ細胞」は、ＣＤ１９＋、ＩｇＤ＋、ＩｇＭ＋、ＣＤ２７−、ＣＤ２１＋および／またはＣＸＣＲ５＋である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は記憶Ｂ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、「記憶Ｂ細胞」は、ＣＤ１９＋、ＩｇＤ−、ＣＤ２７＋、ＣＤ２１＋および／またはＣＸＣＲ５＋である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は活性化記憶Ｂ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、「活性化記憶Ｂ細胞」は、ＣＤ１９＋、ＩｇＤ−、ＣＤ２７＋、ＣＤ２１−および／またはＣＸＣＲ５＋である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は天然のエフェクターＢ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、「天然のエフェクターＢ細胞」は、ＣＤ１９＋、ＩｇＤ＋、ＩｇＭ＋および／またはＣＤ２７＋である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は形質芽球であり得る。いくつかの実施形態では、「形質芽球」は、ＣＤ１９＋、ＣＸＣＲ５−、ＣＤ３８＋、ＣＤ２７−および／またはＣＤ２０−である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、クラススイッチ組換えを経たＢ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、クラススイッチ組換えを経ていないＢ細胞であり得る。
【００４０】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞はヒト細胞であるのが好ましい。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞はマウス細胞である。
【００４１】
ゲノム編集初代Ｂ細胞
初代Ｂ細胞が、そのゲノムに非ゲノム編集Ｂ細胞と比較して修飾を含む場合、その初代Ｂ細胞は「ゲノム編集された」ものである。いくつかの実施形態では、非ゲノム編集Ｂ細胞は野生型Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、非ゲノム編集Ｂ細胞は新たに単離したＢ細胞である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、ゲノムの非コード領域および／またはゲノムのコード領域（例えば、遺伝子）に修飾を含む。いくつかの実施形態では、ゲノムの非コード領域は、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含めた小型の調節非コードＲＮＡの配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ゲノムの非コード領域は、Ｂ細胞の機能、活性化および／または生存の調節に関与するものであるのが好ましい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ゲノム情報の一部分および／または遺伝子を欠失させ得る。いくつかの実施形態では、ゲノム情報の一部分および／または遺伝子を付加し得る。いくつかの実施形態では、付加するゲノム情報および／または遺伝子は外来性である。いくつかの実施形態では、「外来性の」ゲノム情報または「外来性の」遺伝子は、非Ｂ細胞由来のゲノム情報または遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、「外来性の」ゲノム情報または「外来性の」遺伝子は、Ｂ細胞中に既に存在するゲノム情報または遺伝子の追加のコピーであり得る。いくつかの実施形態では、「外来性の」ゲノム情報または「外来性の」遺伝子は、修飾するＢ細胞とは別の種の細胞由来のゲノム情報または遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、「外来性の」ゲノム情報または「外来性の」遺伝子は、例えばキメラ抗原受容体をコードする核酸を含めた人為的に作製したものであり得る。いくつかの実施形態では、ゲノム情報の一部分および／または遺伝子を例えば点変異によって変化させ得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、ゲノム編集初代Ｂ細胞の発現または活性を非ゲノム編集初代Ｂ細胞に比して変化させる修飾を含むのが好ましい。例えば、いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、のちにさらに説明するように、治療用カセットを含み得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、内在性Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸の修飾を含むのが好ましい。いくつかの実施形態では、この修飾が内在性ＢＣＲの発現に修飾をもたらす。例えば、内在性ＢＣＲの発現が非ゲノム編集初代Ｂ細胞に比して抑制され得る。いくつかの実施形態では、内在性ＢＣＲの発現が非ゲノム編集初代Ｂ細胞に比して増強され得る。いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、ＣＤ１９をコードする核酸の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、軽鎖をコードする核酸の修飾を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、サイトカインをコードする核酸の修飾を含む。サイトカインは、例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−６もしくはＩＦＮ−γまたはその組合せを含み得る。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、例えばｂｃｌ−２様タンパク質４としても知られるＢＡＸおよびｂｃｌ−２を含めたＢｃｌ−２ファミリーのメンバーをコードする核酸の修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーをコードする核酸の修飾によって、ゲノム編集初代Ｂ細胞の生存能の増大、例えば培養時の生存能の増大が可能になる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、例えばＦＣγＲＩＩ、ＣＤ２２、ＰＤ−１、ＣＤ５、ＣＤ６６ａ、ＬＡＩＲ１、ＩＬＴ２もしくはＣＤ７２またはその組合せを含めたＢ細胞抑制性受容体をコードする核酸の修飾を含む。いくつかの実施形態では、この修飾によって抑制性受容体の発現または活性が非ゲノム編集初代ＮＫ細胞に比して変化する。例えば、抑制性受容体の発現が減少し得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、Ｂ細胞が親和性成熟を経る頻度または速度に影響を及ぼす修飾を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、ＢＣＬ６および／またはＢＬＩＭＰ１をコードする核酸の修飾を含む。ＢＣＬ６はＢＬＩＭＰ１発現を阻害し、ＢＬＩＭＰ１発現はＢＣＬ６発現を阻害する。ＢＣＬ６発現はＢ細胞を胚中心にとどまらせることができ、そこでＢ細胞が親和性成熟し続ける。ＢＬＩＭＰ１は、Ｂ細胞を形質細胞（短期生存型および長期生存型の両方）に分化させる。いくつかの実施形態では、ＢＣＬ６および／またはＢＬＩＭＰ１をコードする核酸の修飾を用いて、親和性成熟を経るＢ細胞の頻度または速度に影響を及ぼすことが可能である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、その最初の分化過程でカスパーゼ依存性細胞死の一過性阻止の下、例えばＩＲＥ１、ＰＥＲＫもしくはＡＴＦ６またはその組合せを含めた小胞体（ＥＲ）ストレス応答経路のメンバーをコードする核酸の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲストレス応答経路のメンバーをコードする核酸の修飾は、ゲノム編集初代Ｂ細胞の生存能に影響を及ぼし得る、例えば、培養時の生存能を増大させ得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は、ゲノム編集初代Ｂ細胞の生存能を非ゲノム編集初代Ｂ細胞に比して変化させる修飾を含むのが好ましい。いくつかの実施形態では、遺伝子編集初代Ｂ細胞は、非ゲノム編集初代Ｂ細胞に比して拡大する能力の増大を示す。拡大は、例えばｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏであり得る。いくつかの実施形態では、拡大は、サイトカイン、抗体、抗原、抗原を発現する細胞またはその組合せとの共培養後にｉｎ  ｖｉｔｒｏであり得る。
【００５２】
Ｂ細胞のゲノム編集
本開示には、ゲノム編集初代Ｂ細胞を含めたゲノム編集Ｂ細胞の作製方法も記載される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、この方法は、初代Ｂ細胞にタンパク質または核酸を導入する技術を含む。タンパク質または核酸を導入する任意の適切な方法を用い得る。いくつかの実施形態では、この方法は、初代Ｂ細胞に例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡを含めた遺伝物質を導入するエレクトロポレーションを含むのが好ましい。本明細書で使用されるエレクトロポレーションはヌクレオフェクションを含み得る。いくつかの実施形態では、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）などを含めたウイルスによる形質導入を介して遺伝物質を導入し得る。アデノ随伴ウイルスは、例えばＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６などを含めた任意の適切な血清型を含み得る。プラスミドＤＮＡはＢ細胞に対して毒性を示す可能性があるため、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡまたはタンパク質をベースとするゲノム編集方法が好ましい。いくつかの実施形態では、タンパク質または核酸を導入する技術は、エレクトロポレーション；マイクロインジェクション；ウイルス送達；エキソソーム；リポソーム；微粒子銃；ジェットインジェクション；ハイドロダイナミックインジェクション；超音波；磁場による遺伝子導入；電気パルスによる遺伝子導入；例えば脂質系ナノ粒子を含めたナノ粒子の使用；エンドソーム溶解剤とのインキュベーション；細胞透過性ペプチドの使用などによりタンパク質または核酸を導入することを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、ＮＥＯＮトランスフェクションシステムを用いる初代Ｂ細胞のエレクトロポレーションを含むのが好ましい。
【００５４】
いくつかの実施形態では、この方法は遺伝子を編集することを含む。遺伝子を編集することは、遺伝子の１つもしくは複数のコピーを導入すること、遺伝子を変化させること、遺伝子を欠失させること、遺伝子の発現をアップレギュレートすること、遺伝子の発現をダウンレギュレートすること、遺伝子を変異させること、遺伝子をメチル化すること、遺伝子を脱メチル化すること、遺伝子をアセチル化すること、および／または遺伝子を脱アセチル化することを含み得る。遺伝子を変異させることは、活性化変異を導入すること、不活性化および／または阻害変異を導入すること、ならびに／あるいは点変異を導入することを含み得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、この方法は、初代Ｂ細胞のゲノム内に二本鎖切断を誘導することを含むのが好ましい。二本鎖切断は、例えば転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼなどを含めた標的化ヌクレアーゼを用いて導入し得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて二本鎖切断を導入するのが好ましい。いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９および／またはＣｐｆ１を含む）またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む）を導入することを含むのが好ましい。この方法は、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入することを含み得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、この方法は、ＤＮＡ誘導型ＤＮアーゼを導入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法はナトロノバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ）アルゴノート（ＮｇＡｇｏ）を導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＮｇＡｇｏをＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとして使用し得る。（Ｇａｏら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３５４．）。この方法は、例えばガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を導入することをさらに含み得る。
【００５７】
ｇＲＮＡの標的またはｇＤＮＡの標的は任意の適切な標的を含み得る。いくつかの実施形態では、標的は、例えば遺伝子または遺伝子の一部分を含めたＢ細胞ゲノムの一部分を含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子または同遺伝子の一部分はＢ細胞機能を増強する。例えば、ｇＲＮＡの標的またはｇＤＮＡの標的は、例えば重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子もしくはＣＤ７９を含めたＢ細胞受容体；ＣＤ１９；例えばＢＬＩＭＰ１もしくはＢＣＬ６を含めたＢ細胞発生調節因子；アデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）；Ｂ細胞抑制性受容体（例えば、ＦＣｙＲＩＩ、ＣＤ２２、ＰＤ１、ＣＤ５、ＣＤ６６ａ、ＬＡＩＲ１、ＩＬＴ２、ＣＤ７２など）；および／またはＥＲストレス応答経路のメンバー（例えば、ＩＲＥＩ、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６など）を含み得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、トランスフェクションを用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達し得る場合、ｇＲＮＡは、化学修飾ｇＲＮＡを含むのが好ましくあり得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対する化学修飾は、細胞がＲＮＡを分解する能力を低下させるものであるのが好ましい。いくつかの実施形態では、化学修飾ｇＲＮＡは、以下の修飾：２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホロチオアート（ＭＳ）および／または２’−Ｏ−メチル−３’−チオホスホノアセタート（ＭＳＰ）のうちの１つまたは複数のものを含む。いくつかの実施形態では、化学修飾ｇＲＮＡは、Ｈｅｎｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３３（９）：９８５−９８９またはＲａｈｄａｒら，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２（５１）：Ｅ７１１０−７に記載されているｇＲＮＡおよび／または化学修飾を含み得る。
【００５９】
このような実施形態では、ゲノム編集は、相同組換え（ＨＲ）および／または例えばマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）によるものを含めた非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介して起こり得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、この方法はＢ細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子を編集した後に選択を実施する。Ｂ細胞は、いくつかの実施形態では、以下の方法：フローソーティング（例えば、ＧＦＰ発現に関するものを含む）；磁気ビーズ分離（例えば、細胞表面マーカーを標的とすることを含む）；一過性薬物耐性遺伝子発現（例えば、抗生物質耐性を含む）のうちの１つまたは複数のものを用いて選択し得る。いくつかの実施形態では、選択は、編集されたゲノムを有するＢ細胞に関するものであり得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、この方法は編集されたＢ細胞を拡大することを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞を選択した後に拡大を実施し得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体によって認識される抗原またはＢ細胞受容体によって認識される抗原を発現する細胞との共インキュベーションによりＢ細胞を拡大し得る。いくつかの実施形態では、例えばＣＤ４０Ｌおよび／またはＩＬ−４を含めたサイトカインまたはリガンドとの共インキュベーションによりＢ細胞を拡大し得る。
【００６２】
トランスフェクション法
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションまたはトランスフェクションを実施する際の初代Ｂ細胞は、刺激した細胞、すなわち、活性化、刺激および／または増殖の段階に供した細胞であるのが好ましい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞を少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間または少なくとも７日間刺激し得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞を最大１日間、最大２日間、最大３日間、最大４日間、最大５日間、最大６日間、最大７日間、最大８日間、最大９日間、最大１０日間、最大１２日間、最大１４日間、最大３週間、最大４週間または最大２か月間刺激し得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞を１４日間刺激するのが好ましい。
【００６４】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞をサイトカインで刺激し得る。サイトカインは、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１および／またはＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）を含み得る。いくつかの実施形態では、例えば（例えば、ＣＤ４０Ｌまたは抗ＣＤ４０抗体により連結および／または架橋された）ＣＤ４０を含めた細胞表面受容体を架橋することによりＢ細胞を刺激し得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞をエレクトロポレーションによりトランスフェクトするのが好ましい。例えば反応１回当たりのＢ細胞数（例えば、細胞１０万個、５０万個、１００万個、２００万個、３００万個、４００万個または５００万個）、パルス回数（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回または８回）、電圧（例えば、１０００ボルト、１１００ボルト、１２００ボルト、１３００ボルト、１５００ボルトまたは１６００ボルト）、核酸量（例えば、０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇまたは５０μｇ）およびパルス（１つまたは複数）の持続時間（例えば、２ｍｓ、５ｍｓ、７ｍｓ、９ｍｓ、１０ｍｓ、１１ｍｓ、１３ｍｓまたは１５ｍｓ）を変化させることなどによりエレクトロポレーションのプロトコルを最適化し得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＡＭＡＸＡ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒまたはＮＥＯＮシステムを用いてＢ細胞にエレクトロポレートし得る。いくつかの実施形態では、反応１回当たり１００万個のＢ細胞にＮＥＯＮプラットフォーム、ｍＲＮＡ  ２５μｇならびにパルス３回、１４００ボルトおよび持続時間１０ｍｓのプロトコルを用いてエレクトロポレートし得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、トランスフェクションから４８時間後にトランスフェクションレベルを試験するのが好ましい。いくつかの実施形態では、トランスフェクションから７２時間後にトランスフェクションレベルを試験するのが好ましい。いくつかの実施形態では、ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡのトランスフェクションを用い、トランスフェクションから４８時間後および／または７２時間後にフローサイトメトリー解析を実施してｅＧＦＰ発現レベルおよび細胞生存率を評価することによりトランスフェクションレベルを試験するのが好ましい。
【００６８】
一実施形態では、初代ヒトＢ細胞へのｍＲＮＡ送達の効率および毒性を試験するため、標準的フィコール−Ｐａｑｕｅ分離を用いてロイコパックから末梢血単核球を単離した。次いで、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１９  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー、カナダ）を用いてＰＢＭＣからＢ細胞を単離し、１０％ヒト血清を含むＸ−ＶＩＶＯ  ２０培地（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ社、アレンデール、ニュージャージー州）で培養した。ＡＭＡＸＡまたはＮＥＯＮエレクトロポレーションプラットフォームを用いて、Ｂ細胞にｅＧＦＰをコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）をエレクトロポレートした。この方法を用いた予備結果は、エレクトロポレーションから４８時間後にフローサイトメトリー解析による測定で検出されたＥＧＦＰ＋Ｂ細胞が６％未満であるという不本意なものであった。
【００６９】
これとは対照的に、エレクトロポレーションの前に初代Ｂ細胞を例えばＩＬ−４およびＣＤ４０Ｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）とともに７日間培養することなどを用いて刺激し拡大した場合、エレクトロポレーションから７２時間後、ＥＧＦＰ＋Ｂ細胞が最大９７．６％というｅＧＦＰ陽性細胞の割合の増加が観察され、生存率も最大６８．６％であった。
【００７０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の適用に対する主な障壁の１つが、トランスフェクトが困難な細胞、種々の初代細胞およびクローン化する（すなわち、単一の単離細胞から増殖させる）ことができない他の細胞を含めた一部のタイプの細胞では遺伝子修飾率が低くなることである。例えば、最初に未修飾ｇＲＮＡを用いて試みたところ、初代ヒトＴ細胞にもＣＤ３４＋細胞にも検出可能な二本鎖切断を誘導することができなかった。
【００７１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いればＢ細胞への標的化遺伝子送達遺伝子送達が可能になるかどうかを明らかにするため、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路による二本鎖切断（ＤＳＢ）誘導を検討した。５’末端および３’末端に直列２−Ｏ−メチル−３−ホスホロチオアート修飾塩基を３つ含むＲＮＡオリゴヌクレオチドとして合成したｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡまたはタンパク質用いて遺伝子修飾を誘導した（図２）。これらのデータは、Ｂ細胞に標的化二本鎖切断を誘導することができることを示している。
【００７２】
治療用カセット
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞は治療用カセットを含み得る。いくつかの実施形態では、治療用カセットは、ＢＣＲをコードする核酸と、過剰発現させる遺伝子をコードする核酸とを含むのが好ましい。いくつかの実施形態では、過剰発現させる遺伝子は、酵素をコードする核酸を含むのが好ましい。ＢＣＲをコードする核酸と過剰発現させる遺伝子をコードする核酸は、転写的かつ／または翻訳的に連結されているのが好ましい。
【００７３】
いくつかの実施形態では、内在性ＢＣＲがＢＣＲ導入遺伝子の機能に干渉する可能性があるため、それを不活性化することが望まれ得る。いくつかの実施形態では、内在性ＢＣＲの重鎖遺伝子座に治療用カセットを挿入するのが好ましくあり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるトランスフェクション法により内在性ＢＣＲを編集するのが好ましくあり得る。ＶＤＪ組換えによって内在性の重鎖遺伝子座の一部の領域が除去されるため、いくつかの実施形態では、例えば治療用カセットの挿入を含めたゲノム編集を定常領域にみられるエンハンサー付近に標的化し得る。いくつかの実施形態では、ほぼあらゆる重鎖組換え事象で保持される領域である図３Ａに示される領域に治療用カセットを標的化し得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、治療用カセットは、ＢＣＲをコードする核酸を含むのが好ましい。いくつかの実施形態では、ＢＣＲは、免疫感作により対象に投与することができる抗原に特異的なものである。いくつかの実施形態では、ＢＣＲは膜貫通領域および／または膜結合抗体を含むのが好ましい。本明細書で使用されるＢＣＲは、膜アンカー型ＢＣＲもしくは可溶性Ｉｇまたはその両方を含み得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、治療用カセットは重鎖をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、重鎖をコードする核酸の転写は内在性プロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態では、重鎖をコードする核酸の転写は外来性プロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、ＭＮＤプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１Ａプロモーター、ＦＥＥＫプロモーターなどを含み得る。いくつかの実施形態では、重鎖をコードする核酸は、単一の可変セグメント、単一の多様性セグメント、単一の結合セグメントおよび単一のＣ領域をコードするのが好ましい。いくつかの実施形態では、重鎖をコードする核酸は、例えばＭ１および／またはＭ２ドメインを含めた膜貫通領域をコードするのが好ましい。
【００７６】
いくつかの実施形態では、治療用カセットは軽鎖をコードする核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードする核酸の転写は内在性プロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードする核酸の転写は外来性プロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、ＭＮＤプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１Ａプロモーター、ＦＥＥＫプロモーターなどを含み得る。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードする核酸は、単一の可変セグメント、単一の結合セグメントおよび単一のＣ領域をコードするのが好ましい。
【００７７】
いくつかの実施形態では、軽鎖をコードする核酸の発現は、例えば内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド配列、「２Ａ様」配列、リボソームスキッピングおよび／またはＣＨＹＳＥＬ（シス作用性加水分解酵素エレメント）配列などにより、重鎖をコードする核酸の発現と転写的または翻訳的に連結され得る。２Ａペプチド配列は、リボソームスキッピングの機序により正常なペプチド結合形成を障害し、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）も追加のプロモーターも導入せずに２つ以上のタンパク質の発現を可能にする。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、ブタテッショウウイルス−１（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）またはトセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）に由来するものであり得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、治療用カセットの重鎖および／または軽鎖は、免疫感作により対象に投与することができる抗原に特異的なものである。例えば、いくつかの実施形態では、重鎖および／または軽鎖はフィコエリトリン（ＰＥ）に特異的なものであり得る。また別の例では、いくつかの実施形態では、重鎖および／または軽鎖は、抗ＨＩＶエンベロープタンパク質であるＢ１２に特異的なものであり得る。
【００７９】
治療用カセットは、過剰発現させる遺伝子をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、過剰発現させる遺伝子をコードする核酸の転写は、ＢＣＲの重鎖または軽鎖のうちの少なくとも一方の転写を駆動するプロモーターと同じプロモーターによって駆動されるのが好ましい。いくつかの実施形態では、過剰発現させる遺伝子をコードする核酸の転写は、ＢＣＲの重鎖または軽鎖のうちの少なくとも一方の転写を駆動するプロモーターと異なるプロモーターによって駆動され得る。
【００８０】
例えば、過剰発現させる遺伝子をコードする核酸の転写がＢＣＲの重鎖または軽鎖のうちの少なくとも一方の転写を駆動するプロモーターと同じプロモーターによって駆動される場合、対象を外来性ＢＣＲによって認識される抗原に対して免疫感作させることにより遺伝子の過剰発現を制御することができる。さらに、いくつかの実施形態では、治療用カセットが膜アンカー型のＢＣＲまたは可溶性Ｉｇ型のＢＣＲのいずれを産生するかは、治療用カセットを標的化するＢ細胞の成熟状態に左右される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、治療用カセットは、図３Ｂに示される構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、治療用カセットは、図３Ｂに示されるように配置された構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、治療用カセットは、図６の少なくとも１つのパネルに示される構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、治療用カセットは、図６の少なくとも１つのパネルに示されるように配置された構成要素を含み得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、酵素をコードする核酸の発現は、例えば内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド配列、「２Ａ様」配列、リボソームスキッピングおよび／またはＣＨＹＳＥＬ（シス作用性加水分解酵素エレメント）配列などによりＢＣＲ発現と転写的または翻訳的に連結され得る。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプター法または構成的プロモーターを用いて、治療用酵素をコードする核酸と連結したＢＣＲをコードする核酸を駆動し得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、過剰発現させる遺伝子は酵素および／または治療用酵素を含むのが好ましい。治療用酵素は、例えば、酵素異常症を有する対象に欠如している酵素を含み得る。酵素異常症は、例えば、ゴーシェ病、ファブリー病、ＭＰＳ  Ｉ、ＭＰＳ  ＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳ  ＶＩ、ＩＩ型糖尿病、アデノシンデアミナーゼ欠損症またはポンペ病を含み得る。いくつかの実施形態では、治療用酵素は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に不可欠な酵素であるアルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）を含む。治療用酵素は、上記のものに加えて、またはこれに代えて、例えば、発現が対象の健康を向上させる酵素を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、治療用カセットは、例えばＧＦＰの遺伝子または薬物耐性の遺伝子を含めたマーカー遺伝子をコードする核酸を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、重鎖をコードする核酸、軽鎖をコードする核酸および過剰発現させる遺伝子をコードする核酸が治療用カセットに含まれており、転写的に連結している。いくつかの実施形態では、治療用カセットは、重鎖をコードする核酸、軽鎖をコードする核酸および治療用酵素と転写的に連結した１つまたは複数の２Ａペプチドをさらに含む。
【００８６】
治療用カセットはベクター構築物によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ベクター構築物はプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えばＢａＥＶ−偽型レンチウイルスベクター、ＶＳＶｇ−偽型レンチウイルスベクター、ＦＡＭ１レンチウイルスベクターおよび／またはＦＡＭ２レンチウイルスベクター（Ｆｕｓｉｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，２３（１１）：１７３４−４７を参照されたい）を含めたレンチウイルスベクターを含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えばウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）の転写後調節エレメントをコードする遺伝子、マウス槽内Ａ型粒子をコードする遺伝子、様々なサルレトロウイルスに由来する構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）をコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーなどを含めたシス作用性ＤＮＡエレメントを含み得る。
【００８７】
ゲノム編集形質細胞およびゲノム編集初代Ｂ細胞をゲノム編集形質細胞に分化させる方法
本開示はさらに、ゲノム編集形質細胞およびゲノム編集初代Ｂ細胞を長期生存形質細胞に分化させる方法を提供する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞およびゲノム編集形質細胞は、内在性Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸の修飾を含むのが好ましい。いくつかの実施形態では、内在性ＢＣＲの発現が非ゲノム編集初代Ｂ細胞に比して抑制され、外来性ＢＣＲの発現が非ゲノム編集初代Ｂ細胞に比して増強される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞のＢＣＲは、免疫感作により対象に投与することができる抗原に特異的なものである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体はフィコエリトリン（ＰＥ）に特異的なものであり得る。また別の例では、いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体は、抗ＨＩＶエンベロープタンパク質であるＢ１２に特異的なものであり得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞を含む対象をＢＣＲによって認識される抗原に曝露する。いくつかの実施形態では、ゲノム編集初代Ｂ細胞のＢＣＲがある抗原に特異的なものである場合、その抗原を免疫感作により対象に投与することによって長期生存形質細胞が生じる。ＢＣＲの抗原結合部位が抗原と結合する場合、ＢＣＲはその抗原に特異的であると考えられる。
【００９１】
内在性Ｂ細胞受容体を特異性が既知のＢ細胞受容体に置き換えることにより、Ｂ細胞受容体の構成要素と同じプロモーターの下で核酸の転写を調節することが可能になる。
【００９２】
例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）に特異的なＢ細胞受容体を含み、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードする核酸を含むゲノム編集初代Ｂ細胞を対象に導入し得る。対象はＩＤＵＡ欠損症であり得る。対象をＰＥで免疫感作することによって、ゲノム編集初代Ｂ細胞から長期生存形質細胞への分化およびＩＤＵＡをコードする核酸の転写が起こり、それにより患者のゲノム編集Ｂ細胞および全身でのＩＤＵＡ発現が増大し、疾患の交差是正が起こり得る。他の実施形態では、Ｂ細胞の特異性を変化させ、かつ／または過剰発現させる遺伝子をコードする核酸を修飾し得る。
【００９３】
投与
本開示はさらに、本明細書に記載されるゲノム編集初代Ｂ細胞を使用する方法を提供する。例えば、ゲノム編集初代Ｂ細胞を用いて、対象の疾患を治療または予防し得る。ある方法は、本明細書に記載されるゲノム編集初代Ｂ細胞または本明細書に記載される方法により作製されるゲノム編集初代Ｂ細胞を含む組成物を対象に投与することを含み得る。疾患は、例えば、酵素異常症、癌、前癌状態、病原体（例えば、マラリアを含む）による感染症またはウイルスによる感染症を含み得る。
【００９４】
ゲノム編集初代Ｂ細胞を単独で、または１つもしくは複数の他の治療法と併用して対象に投与し得る。例えば、ゲノム編集初代Ｂ細胞を活性薬剤と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物と併用して、かつ／または例えばキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を含めた細胞療法と併用して、対象に投与し得る。Ｂ細胞は、所望の効果を得るのに有効な量で患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与し得る。Ｂ細胞は、例えば静脈内、腫瘍内、動脈内、経皮、カテーテルまたはステントによる局所送達によるもの、針またはその他の腫瘍内注射用の装置によるもの、皮下などを含めた様々な経路によって投与し得る。Ｂ細胞は１回または複数回投与し得る。通常の技術を有する医師であれば、ゲノム編集初代Ｂ細胞および任意選択で必要な医薬組成物の有効な量および投薬を決定し処方することができる。
【００９５】
癌としては、例えば、骨癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、喉頭癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、脊椎癌、胃癌、子宮癌、造血系癌および／またはリンパ系癌などが挙げられる。造血系癌および／またはリンパ系癌としては、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキン病および／または多発性骨髄腫が挙げられる。癌は転移性癌であり得る。
【００９６】
さらなる態様では、ゲノム編集初代Ｂ細胞を投与して、対象の腫瘍の成長を阻害し得る。いくつかの実施形態では、腫瘍は固形腫瘍を含み得る。
【００９７】
ウイルスとしては例えば、例えばＣＭＶ、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）もしくはカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）を含めたヘルペスウイルス；例えばデングウイルスもしくはジカウイルスを含めたフラビウイルス科のウイルス；または例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含めたレンチウイルスが挙げられる。
【００９８】
酵素異常症は、いくつかの実施形態では、現時点で酵素補充療法によって治療される、例えばゴーシェ病、ファブリー病、ＭＰＳ  Ｉ、ＭＰＳ  ＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳ  ＶＩ、ＩＩ型糖尿病、アデノシンデアミナーゼ欠損症またはポンペ病を含めた酵素異常症を含み得る。酵素異常症は、いくつかの実施形態では、現時点で遺伝子治療によって治療される酵素異常症を含み得る。
【００９９】
ゲノム編集初代Ｂ細胞を他の治療の実施前、実施時および／または実施後に投与または調製し得る。このような併用療法は、ゲノム編集初代Ｂ細胞を他の抗癌剤、他の抗ウイルス剤または他の抗癌剤と他の抗ウイルス剤の組合せの使用前、使用時および／または使用後に投与することを含み得る。このような薬剤としては、例えば，サイトカイン；ケモカイン；例えば抗親和性抗ＣＭＶ  ＩｇＧ抗体を含めた治療用抗体；例えばＢｉＫＥもしくはＴＲｉＫＥを含めたＮＫ細胞受容体リガンド；アジュバント；抗酸化剤；化学療法剤；および／または放射線が挙げられる。ゲノム編集初代Ｂ細胞の投与または調製は、他の抗癌剤および／または他の抗ウイルス剤の投与と時間単位、日単位、または場合によって週単位で時間的に分離し得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、投与または調製を他の生物学的に活性な薬剤または様式、例えば、特に限定されないが、抗悪性腫瘍剤および特に限定されないが外科手術などの非薬物療法などと組み合わせ得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、対象をＢ細胞受容体によって認識される抗原で免疫感作する前に、特異性が既知のＢ細胞受容体を含むゲノム編集初代Ｂ細胞を対象に投与し得る。このような実施形態では、抗原で免疫感作することにより、Ｂ細胞受容体の構成要素と同じプロモーターの下で核酸の転写調節を可能にし得る。
【０１０１】
例えば、ある抗原に特異的なＢ細胞受容体を含み、ある酵素をコードする核酸を含むゲノム編集初代Ｂ細胞を対象に導入し得る。対象は酵素欠損症であり得る。対象を抗原で免疫感作することにより、ゲノム編集初代Ｂ細胞から長期生存形質細胞への分化および酵素をコードする核酸の転写が起こり、それによりゲノム編集Ｂ細胞での酵素の発現が増大することが予想される。
【０１０２】
ゲノム編集初代Ｂ細胞の例示的実施形態
１．ゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１０３】
２．ＣＤ１９を発現する細胞を含む、実施形態１のゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１０４】
３．ＩｇＭもしくはＩｇＤまたはその組合せを発現する細胞を含む、実施形態１または２のいずれかのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１０５】
４．ＣＤ２７＋細胞を含む、実施形態１〜３のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１０６】
５．Ｂ細胞がＣＤ２１＋細胞を含む、実施形態１〜４のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１０７】
６．ＣＸＣＲ５＋細胞を含む、実施形態１〜５のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１０８】
７．末梢血、臍帯細胞、腹水または固形腫瘍から単離された細胞を含む、実施形態１〜６のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１０９】
８．非クローン性細胞を含む、実施形態１〜７のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１１０】
９．増殖性細胞を含む、実施形態１〜８のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１１１】
１０．哺乳動物細胞である、実施形態１〜９のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１１２】
１１．ヒト細胞である、実施形態１〜１０のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１１３】
１２．ゲノム編集初代Ｂ細胞の内在遺伝子が欠失している、実施形態１〜１１のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１１４】
１３．ゲノム編集初代Ｂ細胞の内在遺伝子が点変異を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１１５】
１４．外来遺伝子を含む、実施形態１〜１３のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１１６】
１５．遺伝子が、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の少なくとも一部分をコードする核酸を含む、実施形態１２〜１４のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１１７】
１６．非ゲノム編集初代Ｂ細胞に比して内在性Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の発現の減少を示す、実施形態１〜１５のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１１８】
１７．ＣＤ１９の発現または活性を変化させる修飾を含む、実施形態１〜１６のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１１９】
１８．ゲノムの非コード領域の修飾を含む、実施形態１〜１７のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１２０】
１９．非ゲノム編集初代Ｂ細胞に比して生存能の増大を示す、実施形態１〜１８のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１２１】
２０．Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸と過剰発現させる遺伝子をコードする核酸とを含む治療用カセットを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞。
【０１２２】
２１．対象の疾患を治療または予防する方法であって、対象に実施形態１〜２０のいずれか１つのゲノム編集初代Ｂ細胞を含む組成物を投与することを含む、方法。
【０１２３】
２２．疾患が、酵素異常症、癌、前癌状態、病原体による感染症またはウイルス感染症を含む、実施形態２１の方法。
【０１２４】
例示的な治療用カセットの実施形態
１．Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸と、過剰発現させる遺伝子をコードする核酸とを含む、治療用カセット。
【０１２５】
２．ＢＣＲが膜貫通領域を含む、実施形態１の治療用カセット。
【０１２６】
３．過剰発現させる遺伝子が、酵素をコードする核酸を含む、実施形態１または実施形態２の治療用カセット。
【０１２７】
４．酵素が、酵素異常症を有する対象に欠如している酵素を含む、実施形態３の治療用カセット。
【０１２８】
５．酵素がアルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）を含む、実施形態４の治療用カセット。
【０１２９】
６．ＢＣＲをコードする核酸と過剰発現させる遺伝子をコードする核酸が、転写的に結合しているか、翻訳的に結合しているか、またはその両方である、実施形態１〜５のいずれか１つの治療用カセット。
【０１３０】
７．ＢＣＲをコードする核酸および過剰発現させる遺伝子をコードする核酸の転写を駆動するプロモーターを含む、実施形態１〜６のいずれか１つの治療用カセット。
【０１３１】
８．ＢＣＲがフィコエリトリン（ＰＥ）に特異的なＢＣＲを含む、実施形態１〜７のいずれか１つの治療用カセット。
【０１３２】
９．ＢＣＲがＢ１２に特異的なＢＣＲを含む、実施形態１〜７のいずれか１つの治療用カセット。
【０１３３】
１０．実施形態１〜９のいずれか１つの治療用カセットを含む、ベクター。
【０１３４】
１１．レンチウイルスベクターを含む、実施形態１０のベクター。
【０１３５】
１２．ＢａＥＶ−偽型レンチウイルスベクター、ＶＳＶｇ−偽型レンチウイルスベクター、ＦＡＭ１レンチウイルスベクターおよびＦＡＭ２レンチウイルスベクターのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１０または実施形態１１のいずれかのベクター。
【０１３６】
１３．シス作用性ＤＮＡエレメントを含む、実施形態１０〜１２のいずれか１つのベクター。
【０１３７】
１４．実施形態１〜９のいずれか１つの治療用カセットを含む、細胞。
【０１３８】
１５．実施形態１０〜１３のいずれか１つのベクターを含む、細胞。
【０１３９】
１６．内在性Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸の修飾を含む、実施形態１４または実施形態１５のいずれかの細胞。
【０１４０】
１７．修飾が、内在性ＢＣＲの発現を減少させる修飾を含む、実施形態１６の細胞。
【０１４１】
１８．Ｂ細胞を含む、実施形態１５〜１７のいずれか１つの細胞。
【０１４２】
１９．長期生存形質細胞を含む、実施形態１５〜１８のいずれか１つの細胞。
【０１４３】
２０．対象に実施形態１４〜１９のいずれか１つの細胞を投与することを含む、方法。
【０１４４】
２１．対象に抗原を投与することをさらに含み、治療用カセットのＢＣＲが抗原に特異的なものである、実施形態２０の方法。
【０１４５】
初代Ｂ細胞のゲノムを編集する方法の例示的実施形態
１．初代Ｂ細胞のゲノムを編集することを含む、方法。
【０１４６】
２．初代Ｂ細胞が、ＣＤ１９を発現する細胞を含む、実施形態１の方法。
【０１４７】
３．初代Ｂ細胞が、ＩｇＭもしくはＩｇＤまたはその組合せを発現する細胞を含む、実施形態１または２のいずれかの方法。
【０１４８】
４．初代Ｂ細胞がＣＤ２７＋細胞を含む、実施形態１または３のいずれかの方法。
【０１４９】
５．初代Ｂ細胞がＣＤ２１＋細胞を含む、実施形態１〜４のいずれか１つの方法。
【０１５０】
６．初代Ｂ細胞がＣＸＣＲ５＋細胞を含む、実施形態１〜５のいずれか１つの方法。
【０１５１】
７．初代Ｂ細胞が、末梢血、臍帯細胞、腹水または固形腫瘍から単離された細胞を含む、実施形態１〜６のいずれか１つの方法。
【０１５２】
８．初代Ｂ細胞が非クローン性細胞を含む、実施形態１〜７のいずれか１つの方法。
【０１５３】
９．初代Ｂ細胞が増殖性細胞を含む、実施形態１〜８のいずれか１つの方法。
【０１５４】
１０．初代Ｂ細胞が哺乳動物細胞である、実施形態１〜９のいずれか１つの方法。
【０１５５】
１１．初代Ｂ細胞がヒト細胞である、実施形態１〜１０のいずれか１つの方法。
【０１５６】
１２．初代Ｂ細胞に外来性のタンパク質または核酸を導入することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つの方法。
【０１５７】
１３．細胞のエレクトロポレーションを含む、実施形態１〜１２のいずれか１つの方法。
【０１５８】
１４．標的化ヌクレアーゼまたは標的化ヌクレアーゼをコードする核酸を導入することを含む、実施形態１〜１３のいずれか１つの方法。
【０１５９】
１５．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入することを含む、実施形態１〜１４のいずれか１つの方法。
【０１６０】
１６．ｇＲＮＡが、化学修飾ｇＲＮＡを含む、実施形態１５の方法。
【０１６１】
１７．化学修飾ｇＲＮＡが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホロチオアート（ＭＳ）または２’−Ｏ−メチル−３’−チオホスホノアセタート（ＭＳＰ）を含む、実施形態１６の方法。
【０１６２】
１８．ナトロノバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ）アルゴノート（ＮｇＡｇｏ）およびガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を導入することを含む、実施形態１〜１７のいずれか１つの方法。
【０１６３】
１９．ゲノムを編集することが、ＣＤ１９の遺伝子を編集することを含む、実施形態１〜１８のいずれか１つの方法。
【０１６４】
２０．ゲノムを編集することが、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の一部分をコードする核酸を編集することを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つの方法。
【０１６５】
２１．ゲノムを編集することが、ゲノムの非コード領域を編集することを含む、実施形態１〜２０のいずれか１つの方法。
【０１６６】
２２．Ｂ細胞を選択することをさらに含む、実施形態１〜２１のいずれか１つの方法。
【０１６７】
２３．ゲノムを編集した後に選択を実施する、実施形態２２の方法。
【０１６８】
２４．Ｂ細胞を編集されたゲノムに関して選択する、実施形態２２または２３のいずれかの方法。
【０１６９】
２５．初代Ｂ細胞を活性化、刺激および増殖の段階のうち少なくとも１つのものに供することをさらに含む、実施形態１〜２４のいずれか１つの方法。
【０１７０】
２６．初代Ｂ細胞を活性化、刺激および増殖の段階のうち少なくとも１つのものに供することが、Ｂ細胞をサイトカインに曝露することを含む、実施形態２５の方法。
【０１７１】
２７．初代Ｂ細胞を活性化、刺激および増殖の段階のうち少なくとも１つのものに供することが、Ｂ細胞をＣＤ４０Ｌに曝露することを含む、実施形態２５または２６のいずれかの方法。
【０１７２】
２８．初代Ｂ細胞に外来性のタンパク質または核酸を導入する前に、初代Ｂ細胞を活性化、刺激および増殖の段階のうち少なくとも１つのものに供する、実施形態２５〜２７のいずれか１つの方法。
【０１７３】
２９．初代Ｂ細胞にＢ細胞受容体（ＢＣＲ）をコードする核酸と過剰発現させる遺伝子をコードする核酸とを含む治療用カセットを導入することをさらに含む、実施形態１〜２８のいずれか１つの方法。
【０１７４】
本発明を以下の実施例により説明する。具体的な例、材料、量および手順は、本明細書に記載される本発明の範囲および趣旨に従って広く解釈されるべきであることを理解するべきである。
【０１７５】
（実施例）
実施例１
培地
培養培地：
−Ｘ−ＶＩＶＯ  ２０（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ社、アレンデール、ニュージャージー州）
−１０％ヒト血清
または
−ＨＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ  ＸＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、サンディエゴ、カリフォルニア州
−５％ヒト血清
凍結培地：
−ウシ胎児血清（ＦＢＳ）４５ｍＬ（熱不活化したもの）
−ＤＭＳＯ  ５ｍＬ
【０１７６】
方法
ガイドＲＮＡの設計および構築
ＣＲＩＳＰＲ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｚｈａｎｇ  Ｌａｂ、ＭＩＴ  ２０１５）を用いて、表１に示すガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を遺伝子の所望の領域に対して設計した。オフターゲット位置により求めた最高順位の数値に基づき複数のｇＲＮＡを選択した。ｇＲＮＡをオリゴヌクレオチド対、すなわち、５’−ＣＡＣＣＧ−ｇＲＮＡ配列−３’および５’−ＡＡＡＣ−逆相補的ｇＲＮＡ  配列−Ｃ−３’の形で順番に並べた。改変した標的配列クローン化プロトコル（Ｚｈａｎｇ  Ｌａｂ、ＭＩＴ）を用いてｇＲＮＡを一緒にクローン化した。サーモサイクラーでＴ４  ＰＮＫ（ＮＥＢ社）および１０×Ｔ４  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ社）を用い、３７℃で３０分、９５℃で５分、次いで５℃／分で２５℃まで段階的に低下させるプロトコルでオリゴヌクレオチド対を一緒にリン酸化しアニールさせた。ライゲーション反応にはＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  ＢｂｓＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）、ＦａｓｔＡＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）および１０×Ｆａｓｔ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｂｕｆｒｅｒで消化したｐＥＮＴＲ１ベクターを用いる。Ｔ４  ＤＮＡ  ＬｉｇａｓｅおよびＢｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）を用いて、消化ｐＥＮＴＲ１ベクターと、前段階でリン酸化しアニールさせたオリゴ二本鎖（希釈比１：２００）とをライゲートした。ライゲーション物を室温で少なくとも１時間インキュベートし、次いで形質転換し、ミニプレップした（ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）．プラスミドにシーケンシングを実施して適切な挿入を確認した。
【０１７７】
【表１】
2019526270.tif 000003
【０１７８】
ｇＲＮＡの検証
２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの密度で播いた。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地１５０μＬにｇＲＮＡプラスミド１．５μｇ、Ｃａｓ９プラスミド１．５μｇおよびＧＦＰ１００ｎｇを混ぜ合せた。また別のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１５０μＬにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）５μを混ぜた。これらの溶液を混ぜ合わせ、室温で１０分〜１５分間インキュベートした。２４ウェルプレートの１つのウェルにＤＮＡ−脂質複合体を滴加した。細胞を３７℃で３日間インキュベートし、次いで、ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてゲノムＤＮＡを収集した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  Ｄｉｇｅｓｔ、ゲル電気泳動およびデンシトメトリーによりｇＲＮＡの活性を定量化した（Ｇｕｓｃｈｉｎら．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０，６４９：２４７−５６）。
【０１７９】
ロイコパックからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離
ヒトＰＢＭＣ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー、カナダ）を冷却した１×ＰＢＳで３：１に希釈した。５０ｍＬのコニカルチューブに入ったＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー、カナダ）１５ｍＬの上に希釈血液を（極めてゆっくりと）滴加した。細胞を４００×ｇで２５分間、ブレーキ無し遠心した。バフィーコートを取り出し、新たなコニカルチューブに入れた。細胞を冷却した１×ＰＢＳで洗浄し、４００×ｇで１０分間遠心した（ブレーキ有り）。上清を除去し、細胞を凍結培地に再懸濁させ、カウントし、凍結させた。
【０１８０】
ＣＤ１９＋Ｂ細胞の単離
ＰＢＭＣを解凍してカウントし、細胞密度を１×１０８細胞／ｍＬに調整し、細胞を１４ｍＬのポリスチレン製丸底チューブに移した。ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１９  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー、カナダ）を製造業者のプロトコル通りに用いてＢ細胞を選択した。収集した細胞を４００×ｇで５分間遠心し、増殖培地に再懸濁させた。
【０１８１】
ＣＤ１９＋Ｂ細胞の活性化および刺激
Ｂ細胞を刺激するため、単離ＣＤ１９＋Ｂ細胞をカウントし、２４ウェルプレートに１×１０６細胞／ｍＬの密度で播いた。製造業者のプロトコル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）に従い、細胞をＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４とともに播いた。細胞を３７℃で１週間インキュベートし、次いで、血球計数器を用いてカウントした。
【０１８２】
ＣＤ１９＋Ｂ細胞のＮＥＯＮトランスフェクション
ＮＥＯＮ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（１００μＬ  Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を下に記載する任意の変更以外は製造業者の指示通りに用いて、未刺激のＢ細胞または刺激したＢ細胞にエレクトロポレートした。細胞をカウントし、１００μＬのＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔに１×１０６細胞の密度で再懸濁させた。細胞混合物にＧＦＰプラスミドもしくはｍＲＮＡ  ５μｇまたはＣａｓ９  １５μｇおよびプラスミドもしくはｍＲＮＡ  ｇＲＮＡ  １０μｇ（分子水中）を加えた。細胞に１４００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスでエレクトロポレートした。トランスフェクション後、細胞を６ウェルプレートの培養培地２ｍＬに播いた。
【０１８３】
ＡＭＡＸＡ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲおよびＨｕｍａｎ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ  Ｃｏｌｏｇｎｅ社、ケルン、ドイツ）を用いて、未刺激のＢ細胞または刺激したＢ細胞を製造業者の指示通りにヌクレオポレートした。
【０１８４】
フローサイトメトリー
トランスフェクションから２４〜７２時間時間後、エレクトロポレートしたＢ細胞のＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより解析した。細胞を０．５％ＦＢＳを含む冷却した１×ＰＢＳで洗浄することによって調製し、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｏｕｒ  ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）で染色した。ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ）およびＦｌｏｗＪｏ  ｖ．９を用いて細胞を解析した。
【０１８５】
ＣＤ１９＋Ｂ細胞の相同組換え
刺激したＣＤ１９＋Ｂ細胞にＮＥＯＮトランスフェクションシステム（１００μＬ  Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いてエレクトロポレートした。細胞をカウントし、１００μＬのＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔに１．０〜３．０×１０６細胞の密度で再懸濁させた。ｍＲＮＡ  Ｃａｓ９（ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）１５μｇ、ｍＲＮＡ  ｇＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）１０μｇ  および相同組換え（ＨＲ）標的化ベクター１０μｇを用いてＨＲを検討した。ＨＲ標的化ベクター１０μｇ単独またはＣａｓ９  １５μｇとｍＲＮＡ  ｇＲＮＡ  １０μｇを対照として用いた。エレクトロポレーション後、細胞を６ウェルプレートの培養培地２ｍＬに播いた。３日毎にＣｏｕｎｔｅｓｓ  ＩＩ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用い細胞をカウントして、上記の様々な条件下での増殖をモニターした。ＨＲをモニターするため、細胞をフローサイトメトリーにより解析し、ＰＣＲにより試験した。フローサイトメトリーでは、細胞を週１回で３週間解析した。Ｂ細胞をＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンディエゴ）で染色した。ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州）およびＦｌｏｗＪｏ  ｖ．９を用いて細胞を解析した。ＰＣＲによりＨＲを試験するため、Ｂ細胞からｇＤＮＡを単離し、ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＣＣＲ５遺伝子およびＨＲ標的化ベクターの両端の両方に対し表２に示すプライマーを設計して、適切な相同組換えを探した。
【０１８６】
【表２】
2019526270.tif 000004
【０１８７】
結果を図１〜２に示す。
【０１８８】
実施例２
方法
ｇＲＮＡの検証
２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの密度で播いた。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地１５０マイクロリットル（μＬ）にｇＲＮＡプラスミド１．５マイクログラム（μｇ）、Ｃａｓ９プラスミド１．５μｇおよびＧＦＰ  １００ナノグラム（ｎｇ）を混ぜた。また別のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１５０μＬにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバド、カリフォルニア州；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールスバド、カリフォルニア州）５μＬを混ぜた。これらの溶液を混ぜ合わせ、室温で１０〜１５分間インキュベートした。２４ウェルプレートの１つのウェルにＤＮＡ−脂質複合体を滴加した。細胞を３７℃で３日間インキュベートし、次いで、ＧｅｎｅＪＥＴ  ゲノムＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いてゲノムＤＮＡを収集した。
【０１８９】
図５および８では、Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｄｅｌｓ  ｂｙ  Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＩＤＥ）アルゴリズム（ｔｉｄｅ．ｎｋｉ．ｎｌのワールドワイドウェブで利用可能）によりｇＲＮＡの活性を定量化した。簡潔に述べれば、編集した領域をＰＣＲにより領域特異的プライマーを用いて増幅し、ＡＣＧＴ社（ホイーリング、イリノイ州）に送付してＳａｎｇｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇに供した。ＡＣＧＴ社から返送されたクロマトグラムファイルをＴＩＤＥウェブサイトにアップロードして編集効率を解析した。
【０１９０】
レンチウイルスベクターの作製および力価測定
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を製造業者の指示通りに用いた２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより、ＢａＥＶ−偽型レンチウイルスベクターおよびＶＳＶｇ−偽型レンチウイルスベクターを作製した。ＢａＥＶ糖タンパク質（Ｆｕｓｉｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，２３（１１）：１７３４−４７）１５μｇまたはＶＳＶ糖タンパク質１５μｇにｇａｇｐｏｌパッケージングプラスミドおよびカーゴプラスミド２０μｇを混ぜて、それぞれＢａＥＶ−偽型ウイルスまたはＶＳＶｇ−偽型ウイルスを構築した。トランスフェクションから１８時間後、培地を１０％ＦＢＳおよび１×ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に入れ替えた。２４時間後、ウイルス力価を得、ろ過して細胞残屑を除去した。ｑＰＣＲ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社、バンクーバー、カナダ）を製造業者の指示通りに用いてレンチウイルス力価を求めた。結果を図４に示す。
【０１９１】
さらに２種類のレンチウイルスベクターを構築して、ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する修飾ＭｏＭｕＬＶ  ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモーター）の制御下でＢ１２の重鎖および軽鎖または抗ＰＥの重鎖および軽鎖ならびにコドン最適化ＩＤＵＡ（ｃｏＩＤＵＡ）を発現させた。Ｐ２Ａペプチド配列を導入することにより、重鎖、軽鎖およびｃｏＩＤＵＡを同時発現させた。これらのベクターは、ｍＲＮＡ転写物の選択的スプライシングを用いて成熟ナイーブＢ細胞の機能的ＢＣＲまたは形質細胞の機能的可溶性抗体の発現を誘導するものであり、このため、ＢＣＲまたは可溶性抗体の発現はＢ細胞の成熟状態に左右される。ベクターの模式図を図６に示す。ベクターの配列を表３〜８に示す。
【０１９２】
Ｂ細胞の急性活性化および慢性活性化
ＣＤ４０の架橋によりＢ細胞を活性化させるＢ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）で急性活性化Ｂ細胞および慢性活性化Ｂ細胞の両方を活性化させた。急性に活性化させる細胞は、レンチウイルス構築物を加える前に１２時間刺激し、慢性に活性化させる細胞は、レンチウイルス構築物を加える前に１４日間活性化させた。
【０１９３】
ＣＤ１９発現の標的化ノックアウト
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、初代ヒトＢ細胞のＣＤ１９発現をノックアウトした。ＮＥＯＮ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（１４００ボルト、１０ｍｓ、３パルス）を用いて、慢性活性化Ｂ細胞にＣａｓ９タンパク質をコードする化学修飾ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）１．５μｇおよび化学修飾ＣＤ１９  ｇＲＮＡ４  ｏｌｉｇｏ１（ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）１μｇをトランスフェクトした。Ｃａｓ９タンパク質とＣＤ１９  ｇＲＮＡとを組み合わせることにより二本鎖切断が生じ、それにより、遺伝子発現およびタンパク質レベルを打ち消すインデル形成およびフレームシフト変異が生じる。
【０１９４】
ＣＤ１９発現の評価
エレクトロポレーションから５日後、操作した初代ヒトＢ細胞をＡＰＣ  ｅ−Ｆｌｕｏｒ７８０  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ＤｙｅおよびＢＶ４２１コンジュゲート抗ＣＤ１９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）で染色した。細胞をＬＳＲＩＩフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にかけ、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社、アシュランド、オレゴン州）を用いてデータを解析した。結果を図５に示す。
【０１９５】
Ｂ細胞でのエレクトロポレーション条件の検討
１４日間活性化させたＢ細胞に様々な電圧、幅およびパルス設定の下、ＮＥＯＮトランスフェクションでｅＧＦＰをコードするプラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡをエレクトロポレートした（図７Ａ）。エレクトロポレーションから２日間後、ｅＧＦＰ発現によりトランスフェクションのパーセントを求め、ＬＳＲＩＩフローサイトメータで測定した。トリパンブルー排除法により細胞カウント数および細胞生存率を求めた。結果を図７Ｂに示す。
【０１９６】
ＣＤ１９＋Ｂ細胞の遺伝子ノックアウト
刺激したＣＤ１９＋Ｂ細胞にＮＥＯＮ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバド、カリフォルニア州）を用いてエレクトロポレートした。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（コーラルビル、アイオワ州）のＡｌｔ−Ｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９試薬を用いてＢＣＬ２遺伝子座での遺伝子編集（ｇＲＮＡ６  Ｏｌｉｇｏ１）を実施した。簡潔に述べれば、２００ｕＭのＡｌｔ−Ｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｃｒＲＮＡ  １．１ｕＬ、Ａｌｔ−Ｒ  ｔｒａｃｒＲＮＡ  １．１ｕＬおよび無ヌクレアーゼ二本鎖緩衝液２．８ｕＬを９５℃で５分間インキュベートし、次いで、室温（ＲＴ）で冷却してｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を形成させた。２２ピコモル（ｐｍｏｌ）のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖０．５ｕＬおよび１８ｐｍｏｌのＡｌｔ−Ｒ  Ｃａｓ９酵素０．５ｕＬをＲＴで２０分間インキュベートしてＡｌｔ−Ｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを形成させた。このＡｌｔ−Ｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムにエレクトロポレーションエンハンサー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバド、カリフォルニア州）を混ぜ、次いで慢性活性化Ｂ細胞３６０，０００個に加え、Ｔ緩衝液で最終体積１２μＬとした。１０μＬのピペットチップを用いて細胞に１４００ボルト、１０ｍｓ、３パルスでエレクトロポレートした。エレクトロポレートした細胞を５日間培養した後、上に記載した通りにＴＩＤＥ解析を用いて遺伝子編集を測定した。結果を図８に示す。
【０１９７】
Ｂ細胞の拡大
Ｂ細胞拡大キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を製造業者のプロトコル通りに用いて、分取したＣＤ１９＋Ｂ細胞を１４日間拡大した。低密度の開始Ｂ細胞濃度（１×１０５細胞／ｍＬ）および高密度の開始Ｂ濃度（１×１０６細胞／ｍＬ）の両方を試験した。トリパンブルー排除法を用いて、示される時点での細胞カウント数を求めた。結果を図９に示す。
【０１９８】
ＩＤＵＡ活性
ＮＥＯＮ  Ｓｙｓｔｅｍ（１４００ボルト、１０ｍｓ、３パルス）を用いて、２９３Ｔ細胞にＧＦＰ  ｍＲＮＡ単独（対照）またはＧＦＰ  ｍＲＮＡとｐＬＬ  ＭＮＤ  Ｂ１２−ＩＤＵＡ発現プラスミドをエレクトロポレートした。ｐＬＬ  ＭＮＤ  Ｂ１２−ＩＤＵＡ発現プラスミドには、図６Ｃに示される発現カセットが含まれている。
【０１９９】
細胞内ＩＤＵＡ活性を測定するため、エレクトロポレーションから３日後に細胞を回収した。Ｏｕら，２０１４，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ．，２０１４；１１１（２）：１１３−５に記載されているＩＤＵＡアッセイを用いてＩＤＵＡ活性（ｎｍｏｌ／（時・ｍｇタンパク質））を測定した。ｐＬＬ  ＭＮＤ  Ｂ１２−ＩＤＵＡ発現プラスミドを導入したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の方が対照よりも有意に高い細胞内ＩＤＵＡ活性（４０倍）を示した。結果を図１０Ａに示す。
【０２００】
細胞培地のＩＤＵＡ活性を測定するため、エレクトロポレーションから３日後に培地を収集した。Ｏｕら，２０１４，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ．，２０１４；１１１（２）：１１３−５に記載されているＩＤＵＡアッセイを用いてＩＤＵＡ活性（ｎｍｏｌ／（時・ｍＬ））を測定した。ｐＬＬ  ＭＮＤ  Ｂ１２−ＩＤＵＡ発現プラスミドを導入したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞が含まれていた培地の方が対照よりも有意に高いＩＤＵＡ活性（１４倍）を示した。結果を図１０Ｂに示す。
【０２０１】
本明細書に引用されている特許、特許出願および刊行物ならびに電子的に入手可能な資料（例えば、例えばＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑのヌクレオチド配列提出物および例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢのアミノ酸配列提出物ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑの注釈付きコード領域からの翻訳物を含む）はいずれも、開示全体が参照により組み込まれる。本願の開示と参照により本明細書に組み込まれる任意の文献の開示（１つまたは複数）との間に何らかの不一致が存在する場合、本願の開示の方が適用されるものとする。上記の詳細な説明および実施例は、単に明確な理解を目的に記載したものである。そこから理解されるべき不必要な限定は一切ない。本発明は、当業者に明らかな変形形態が請求項によって定められる本発明の範囲内に含まれることから、図示および記載されている正確な詳細に限定されることはない。
【０２０２】
【表３−１】
2019526270.tif 000005
【表３−２】
2019526270.tif 000006
【表３−３】
2019526270.tif 000007
【表３−４】
2019526270.tif 000008
【表３−５】
2019526270.tif 000009
【表３−６】
2019526270.tif 000010
【０２０３】
【表４−１】
2019526270.tif 000011
【表４−２】
2019526270.tif 000012
【表４−３】
2019526270.tif 000013
【表４−４】
2019526270.tif 000014
【表４−５】
2019526270.tif 000015
【表４−６】
2019526270.tif 000016
【０２０４】
【表５−１】
2019526270.tif 000017
【表５−２】
2019526270.tif 000018
【表５−３】
2019526270.tif 000019
【表５−４】
2019526270.tif 000020
【表５−５】
2019526270.tif 000021
【表５−６】
2019526270.tif 000022
【表５−７】
2019526270.tif 000023
【０２０５】
【表６−１】
2019526270.tif 000024
【表６−２】
2019526270.tif 000025
【表６−３】
2019526270.tif 000026
【表６−４】
2019526270.tif 000027
【表６−５】
2019526270.tif 000028
【表６−６】
2019526270.tif 000029
【表６−７】
2019526270.tif 000030
【０２０６】
【表７−１】
2019526270.tif 000031
【表７−２】
2019526270.tif 000032
【表７−３】
2019526270.tif 000033
【表７−４】
2019526270.tif 000034
【表７−５】
2019526270.tif 000035
【表７−６】
2019526270.tif 000036
【表７−７】
2019526270.tif 000037
【０２０７】
【表８−１】
2019526270.tif 000038
【表８−２】
2019526270.tif 000039
【表８−３】
2019526270.tif 000040
【表８−４】
2019526270.tif 000041
【表８−５】
2019526270.tif 000042
【表８−６】
2019526270.tif 000043
【表８−７】
2019526270.tif 000044
【図１】
2019526270.tif 000045
【図２】
2019526270.tif 000046
【図３】
2019526270.tif 000047
【図４】
2019526270.tif 000048
【図５】
2019526270.tif 000049
【図６Ａ−Ｂ】
2019526270.tif 000050
【図６Ｃ−Ｄ】
2019526270.tif 000051
【図７】
2019526270.tif 000052
【図８】
2019526270.tif 000053
【図９】
2019526270.tif 000054
【図１０−Ａ】
2019526270.tif 000055
【図１０−Ｂ】
2019526270.tif 000056
【配列表】
2019526270000001.app
【国際調査報告】
2019526270.tif 000057
2019526270.tif 000058