(57)【要約】  機能性ＲＮＡと複合体形成した小分子薬を含む治療用複合体が本出願で開示される。さらに、キャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子と、を含むナノ粒子を含む組成物であって、キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、組成物、ならびに、当該ナノ粒子を作製する方法および使用する方法が本出願で開示される。さらに、癌を有する対象を治療する方法であって、キャリアポリペプチドと、小分子の化学療法薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子と、を含むナノ粒子を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含み、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、方法が説明される。また、説明されるナノ粒子を含む、医薬組成物、製品、およびキットも説明される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子を含む組成物であって、前記機能性ＲＮＡ分子が標的タンパク質の発現を調節する、組成物。
【請求項２】
小分子薬がインターカレートした少なくとも１つの相補領域を含む機能性ＲＮＡ分子を含む、組成物。
【請求項３】
前記機能性ＲＮＡ分子が、標的タンパク質の発現を調節する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記機能性ＲＮＡ分子と前記小分子薬とを含むリポソームを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記リポソームが、細胞標的化セグメントを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
キャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子と、を含むナノ粒子を含む組成物であって、前記キャリアポリペプチドが、細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、組成物。
【請求項７】
前記組成物におけるキャリアポリペプチド対機能性ＲＮＡ分子のモル比が、約３：１〜約８：１である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記小分子薬が、前記機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされており、前記機能性ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの相補領域を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞透過性セグメントが、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチド結合セグメントが、正に荷電している、請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチド結合セグメントが、ポリリジンを含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチド結合セグメントが、デカリジンを含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物中のナノ粒子の大きさの平均が、約１００ｎｍ以下である、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメントをさらに含む、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞標的化セグメントが、癌細胞と結合する、請求項５または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞標的化セグメントが、細胞の表面上の受容体と結合する、請求項５、１４および１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記細胞標的化セグメントが、ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴと結合する、請求項５および１４〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞標的化セグメントが、
ｉ．ヘレグリン配列もしくはそのバリアント、または
ｉｉ．インターナリンＢ配列もしくはそのバリアント
を含む、請求項５および１４〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞標的化セグメントが、ヘレグリンαの受容体結合ドメインを含む、請求項５および１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記機能性ＲＮＡ分子の少なくとも一部が、二本鎖である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記機能性ＲＮＡ分子が、一本鎖であり、少なくとも１つの自己相補的な領域を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記機能性ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記機能性ＲＮＡ分子が、約１０ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記機能性ＲＮＡ分子が、免疫チェックポイントタンパク質の発現を減少させる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物における機能性ＲＮＡ分子対小分子薬のモル比が、約１：１〜約１：６０である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物における機能性ＲＮＡ分子対小分子薬のモル比が、約１：５〜約１：６０である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記小分子薬が、化学療法剤である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記小分子薬が、アントラサイクリン、アルキル化剤、またはアルキル化様作用剤である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記小分子薬が、ドキソルビシンである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物が無菌である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物が、凍結乾燥されている、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物を含む医薬組成物であって、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物をバイアル内に含む、製品。
【請求項３４】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物または請求項３３に記載の製品と、使用説明書と、を含むキット。
【請求項３５】
対象において癌を治療する方法であって、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３６】
標的タンパク質の発現の調節と細胞の増殖の阻害とを同時に行う方法であって、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物の有効量を前記細胞に投与することを含む、方法。
【請求項３７】
癌を有する対象において免疫応答の刺激と癌細胞の殺滅とを同時に行う方法であって、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３８】
小分子薬を機能性ＲＮＡ分子と組み合わせることを含む、組成物を作製する方法であって、前記小分子薬が前記機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする、方法。
【請求項３９】
キャリアポリペプチド、機能性ＲＮＡ分子、および小分子薬を組み合わせることを含む、ナノ粒子組成物を作製する方法であって、前記キャリアポリペプチドが、細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、方法。
【請求項４０】
前記機能性ＲＮＡ分子を前記小分子薬と組み合わせて、前記小分子薬を前記機能性ＲＮＡ分子と複合体形成させることと、
前記キャリアポリペプチドを、前記小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子と組み合わせることと、
を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記小分子薬が前記機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
結合していない小分子薬を除去することを含む、請求項３９〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ナノ粒子組成物を凍結乾燥することをさらに含む、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件との相互参照
本出願は、２０１６年１０月３日に出願された「ＤＲＵＧ−ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥＳ  ＷＩＴＨ  ＲＮＡ  ＡＮＤ  ＳＭＡＬＬ−ＭＯＬＥＣＵＬＥ  ＣＡＲＧＯＳ」なる表題の米国仮出願第６２／４０３，５９５号に対する優先権の利益を主張するものであり、この仮出願は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
以下のＡＳＣＩＩテキストファイルでの提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７６１５４２０００８４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ：記録日：２０１７年１０月３日、サイズ：１４ＫＢ）。
【０００３】
発明の分野
本発明は、癌の治療のための方法およびナノ粒子組成物に関する。本発明はさらに、核酸−薬物複合体に関する。
【背景技術】
【０００４】
ターゲッティング療法の現在の戦略には、抗体で標的化された化学療法剤（すなわちイムノコンジュゲート）、ターゲットトキシン（targeted toxins）、シグナル遮断抗体、および抗体で標的化されたリポソーム（すなわちイムノリポソーム）が包含される。たとえば、トラスツズマブは、ＨＥＲ２／ｎｅｕシグナリングを妨害するモノクローナル抗体であり、一般にＨＥＲ２＋乳癌の治療に使用されている。しかしながら、治療の開始後にトラスツズマブ耐性癌が生じる可能性もあり、この治療薬の有効性が制限されている。
【０００５】
ドキソルビシンなどの小分子化学療法薬もまた、特定の癌を治療するために一般的に使用されている。しかし、ドキソルビシンはまた、心筋症および癌の耐性という大きなリスクを有している。リポソーム（ＬｉｐｏＤｏｘなど）の使用を介したドキソルビシンなどの小分子薬の送達は、特定の癌に対する薬物の投与の有効性を向上させている。それでも、多くの抗癌剤の毒性のせいで、有効な低用量治療薬が、差し迫って必要とされている。
【０００６】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００７】
一部の態様では、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子を含む組成物であって、機能性ＲＮＡ分子が標的タンパク質の発現を調節する、組成物を提供する。
【０００８】
別の態様では、小分子薬がインターカレートした少なくとも１つの相補領域を含む機能性ＲＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、標的タンパク質の発現を調節する。
【０００９】
上記の組成物の一部の実施形態では、組成物は、機能性ＲＮＡ分子と小分子薬とを含むリポソームを含む。一部の実施形態では、リポソームは、細胞標的化セグメントを含む。
【００１０】
別の態様では、キャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子と、を含むナノ粒子を含む組成物であって、上記キャリアポリペプチドが細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、細胞標的化セグメントをさらに含む。
【００１１】
一部の実施形態では、小分子薬が、ＲＮＡ分子にインターカレートされる。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の少なくとも一部は、二本鎖である。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は一本鎖であり、少なくとも１つの自己相補的な領域を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ（Ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｔｓＲＮＡ（ｔｏｘｉｃ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）、またはリボザイムである。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの三リン酸の５’末端を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物におけるＲＮＡ分子対小分子薬のモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、組成物における機能性ＲＮＡ分子対小分子薬のモル比は、約１：５〜約１：６０である。
【００１２】
一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、免疫チェックポイントタンパク質の発現を減少させる。
【００１３】
一部の実施形態では、小分子薬は、化学療法剤である。一部の実施形態では、小分子薬は、アントラサイクリンである。一部の実施形態では、小分子薬はドキソルビシンである。一部の実施形態では、小分子薬はアルキル化剤またはアルキル化様作用剤（alkylating-like agent）である。一部の実施形態では、小分子薬は、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、プロカルバジン、またはチオテパである。
【００１４】
一部の実施形態では、組成物におけるキャリアポリペプチド対ＲＮＡ分子のモル比は、約３：１〜約８：１である。一部の実施形態では、組成物におけるキャリアポリペプチド対ＲＮＡ分子のモル比は、約４：１〜約５：１である。一部の実施形態では、組成物におけるキャリアポリペプチド対ＲＮＡ分子のモル比は、約４：１である。
【００１５】
一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、哺乳類細胞と結合する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、疾患状態の細胞と結合する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、癌細胞と結合する。一部の実施形態では、この癌細胞はＨＥＲ３＋癌細胞またはｃ−ＭＥＴ＋癌細胞である。一部の実施形態では、この癌細胞は、頭頸部癌細胞、膵癌細胞、乳癌細胞、グリアの癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、胃癌細胞、皮膚癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、または甲状腺癌細胞である。
【００１６】
一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、細胞の表面上の標的分子と結合する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、細胞の表面上の受容体と結合する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴと結合する。
【００１７】
一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、細胞の表面上に発現した受容体に特異的に結合するリガンドを含む。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、ヘレグリン配列もしくはそのバリアント；またはインターナリンＢ（Internalin B）配列もしくはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、ヘレグリンαの受容体結合ドメインを含む。
【００１８】
一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電している。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、ポリリジンを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、デカリジンを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。
【００２１】
一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下である。
【００２２】
一部の実施形態では、組成物は、無菌である。一部の実施形態では、組成物は、液体の組成物である。一部の実施形態では、組成物は、乾燥した組成物である。一部の実施形態では、組成物は、凍結乾燥されている。
【００２３】
別の態様では、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含むキャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子と、を含むナノ粒子を含む医薬組成物であって、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
別の態様では、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含むキャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子と、を含むナノ粒子を含む組成物をバイアル内に含む製品を提供する。一部の実施形態では、このバイアルは密閉されている。
【００２５】
別の態様では、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含むキャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子と、を含むナノ粒子を含む組成物ならびに使用説明書を含むキットを提供する。
【００２６】
別の態様では、対象において癌を治療する方法であって、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含むキャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子と、を含むナノ粒子を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、この癌は、ＨＥＲ３＋癌またはｃ−ＭＥＴ＋癌である。一部の実施形態では、この癌は、頭頸部癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、グリアの癌、子宮頸癌、胃癌、皮膚癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌細胞、または甲状腺癌である。
【００２７】
別の態様では、標的タンパク質の発現の調節と細胞の増殖の阻害とを同時に行う方法であって、上述の組成物のいずれかを上記細胞に投与することを含む方法を提供する。
【００２８】
別の態様では、癌を有する対象において免疫応答の刺激と癌細胞の殺滅とを同時に行う方法であって、上述の組成物の有効量を上記対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、免疫チェックポイントタンパク質の発現を減少させる。
【００２９】
別の態様では、小分子薬を機能性ＲＮＡ分子と組み合わせることを含む、組成物を作製する方法であって、上記小分子薬が機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする、方法を提供する。一部の実施形態では、キャリアポリペプチド、機能性ＲＮＡ分子、および小分子薬を組み合わせることを含む、ナノ粒子組成物を作製する方法であって、キャリアポリペプチドが細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＲＮＡ分子を小分子薬と組み合わせて、小分子薬を機能性ＲＮＡ分子と複合体形成させることと、キャリアポリペプチドを、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子と組み合わせることと、を含む。一部の実施形態では、本方法は、結合していない小分子薬を除去することを含む。一部の実施形態では、小分子薬は、ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、本方法は、ナノ粒子組成物を滅菌ろ過することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、ナノ粒子組成物を凍結乾燥することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、細胞標的化ドメイン、細胞透過性ドメイン、およびオリゴヌクレオチド結合ドメインを含むキャリアポリペプチドの概略図を例示する。キャリアポリペプチドを、小分子薬に結合した機能性ＲＮＡ分子と組み合わせると、ナノ粒子が形成される。
【図２】図２は、ろ過前のｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ１複合体およびｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ２複合体の試料（レーン２および３）、ならびに１０Ｋ  ＭＷＣＯフィルターを使用したろ過後の残余分（レーン５および６）およびろ過物（レーン７および８）をローディングした１％のアガロースゲルを示す。ろ過前の複合体および残余分はｓｉＲＮＡを含むのに対し、ろ過物はこれを含んでいない。
【図３】図３は、１０Ｋ  ＭＷＣＯフィルターでのろ過後の、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ１複合体（上部）およびｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ２複合体（下部）由来の残余分およびろ過物の吸収スペクトルを示す。両複合体の残余分は、約４８０ｎｍに最大ピークを有し、ドキソルビシンが残余分に存在していたことを表している。ろ過物は、４８０ｎｍに有意なピークを有しておらず、ろ過物にドキソルビシンがほとんどないことを表している。
【図４】図４は、１０Ｋ  ＭＷＣＯフィルターでのろ過後の、ｄｏｘ：ｓｉＳｃｒｍ１複合体、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ１複合体、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ２複合体、およびｄｏｘ：ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏ複合体由来の残余分およびろ過物の吸収スペクトルを示す。４つすべての複合体の残余分は、約４８０ｎｍに最大ピークを有し、ドキソルビシンが残余分に存在していたことを表している。ろ過物は、４８０ｎｍに有意なピークを有しておらず、ろ過物にドキソルビシンがほとんどないことを表している。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｃは、３つの異なる用量のｓｉＳｃｒｍ１、ｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２、ｄｏｘ：ｓｉＳｃｒｍ１複合体、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ１複合体、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ２複合体、ｄｏｘ：ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏ複合体、またはドキソルビシン単独でトランスフェクトしてから２４時間後（図５Ａ）、４８時間後（図５Ｂ）、または７２時間後（図５Ｃ）の、ＪＩＭＴ１細胞の細胞生存率を示す。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図６Ａ】図６Ａは、３つの異なる濃度のｓｉＳｃｒｍ１、ｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２、ｄｏｘ：ｓｉＳｃｒｍ１複合体、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ１複合体、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ２複合体、ｄｏｘ：ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏ複合体、またはドキソルビシン単独でＪＩＭＴ１（トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍｂ）耐性ヒト乳癌）細胞をトランスフェクトしてから２４時間後の、ｓｉＲＮＡ１の標的のｍＲＮＡ（ｑＰＣＲにより測定）の相対的なｍＲＮＡのノックダウンを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、３つの異なる濃度のｓｉＳｃｒｍ１、ｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２、ｄｏｘ：ｓｉＳｃｒｍ１複合体、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ１複合体、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ２複合体、ｄｏｘ：ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏ複合体、またはドキソルビシン単独でＪＩＭＴ１細胞をトランスフェクトしてから２４時間後の、ｓｉＲＮＡ２の標的のｍＲＮＡ（ｑＰＣＲにより測定）の相対的なｍＲＮＡのノックダウンを示す。
【図７】図７は、１０Ｋ  ＭＷＣＯフィルターでのろ過後のｄｏｘ：ｓｉＳｃｒｍ２複合体およびｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ３複合体由来の残余分およびろ過物の吸収スペクトルを示す。両複合体の残余分は、約４８０ｎｍに最大ピークを有し、ドキソルビシンが残余分に存在していたことを表している。ろ過物は、４８０ｎｍに有意なピークを有しておらず、ろ過物にドキソルビシンがほとんどないことを表している。
【図８】図８は、３つの異なる用量のｓｉＳｃｒｍ２、ｓｉＲＮＡ３、ｄｏｘ：ｓｉＳｃｒｍ２複合体、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ３複合体、またはドキソルビシン単独でのトランスフェクトから２４時間後の、４Ｔ１−Ｆｌｕｃ−Ｎｅｏ／ｅＧＦＰ−Ｐｕｒｏ細胞の細胞生存率を示す。４Ｔ１−Ｆｌｕｃ−Ｎｅｏ／ｅＧＦＰ−Ｐｕｒｏ細胞は、ＦｌｕｃおよびｅＧＦＰを安定して発現するマウスの乳房腫瘍細胞株である。４Ｔ１細胞株は、トリプルネガティブ乳癌細胞株とみなされている。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書中で、小分子薬（化学療法剤など）と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子（二本鎖機能性ＲＮＡ分子  ｓｉＲＮＡ分子など）を含む治療用複合体を、提供する。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。この治療用複合体は、細胞を標的とし得るリポソームまたはナノ粒子の送達ビヒクルの使用を介するなどした統合型の単一送達パッケージとして、細胞に送達することができる。たとえば、一部の態様では、治療用複合体は、細胞に当該複合体を（すなわちリポフェクションを介して）送達することができるリポソームに含まれている。特定の態様では、キャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物を提供する。このキャリアポリペプチドは、細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含み、治療用複合体と組み合わせると自然にナノ粒子になることができる。一部の態様では、ナノ粒子組成物または治療用複合体の有効量は、癌を治療するため癌を有する対象に投与される。
【００３２】
細胞（癌細胞など）に機能性ＲＮＡ分子および小分子薬の両方を同時に送達することは、幅広い全身性の免疫応答などの望ましくない副作用を限定しながら有効な疾患の治療を可能にする。小分子薬および機能性ＲＮＡ分子の共送達は、腫瘍増殖の遅延、またはさらには腫瘍の退縮をもたらすように相乗的に作用し得る。従来のｓｉＲＮＡおよびドキソルビシンの送達のためのシステム、たとえばＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ａｎｄ  ｓｉＲＮＡ  ｂｙ  ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ａ  ｄｒｕｇ  ｃａｒｒｉｅｒ，  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，  ｖｏｌ．  １２６，  ｐｐ．  ５３１−５４０  （２０１５）に記載されるものなどは、ドキソルビシンを、ＣＧＡ反復を含む特異的に設計したＤＮＡオリゴヌクレオチド（すなわちＣＧＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド）にインターカレートすること、ならびにｄｏｘ：ＤＮＡ複合体をＰＥＩ、ＣＭＣＳ−ＰＥＧ−ＮＧＲ、およびｓｉＲＮＡと混合して、二重の積み荷（ｄｕａｌ−ｃａｒｇｏ）粒子（すなわちｄｏｘ：ＤＮＡの積み荷および機能性ＲＮＡの積み荷）を形成することに依存していた。本明細書中さらに詳述されるように、ドキソルビシンなどの小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートすることができ、この複合体は、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬の両方の機能的な特性を保持することが見いだされている。さらに、機能性ＲＮＡ分子と複合体化した小分子薬は、単独で投与される小分子薬と比較して、小分子薬の効力が増大する。この予期せぬ知見は、小分子薬が、注意深く設計したＣＧＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド以外の核酸分子と結合できることを示している。この知見が小分子薬のＲＮＡ分子への直接的な結合を可能にしているため、ＲＮＡ分子は、たとえばタンパク質発現を調節（すなわち増大もしくは減少）する、および／または生物学的な作用（抗癌作用など）を有するように、機能的であるように設計することができる。さらに、小分子薬が機能性ＲＮＡ分子と直接結合できるとの知見により、ｄｏｘ：ＤＮＡ複合体およびｓｉＲＮＡの混合物よりも単純な、一つの複合体の送達が可能となる。
【００３３】
一部の実施形態では、複合体は、キャリアポリペプチドを用いて細胞に送達され、これらはナノ粒子となり得る。たとえば、本明細書中で、キャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、ナノ粒子組成物を提供する。ナノ粒子のキャリアポリペプチドは、癌細胞などの標的の細胞に対して、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬を保護、輸送、および標的化することができる。キャリアポリペプチドは、細胞の内部への機能性ＲＮＡ分子および小分子薬の送達を可能にする、細胞透過性セグメントを含む。よって、本ナノ粒子は、効率的な治療用複合体の標的化した送達を確保して、対象へ投与される有効な用量を少なくすることができる。さらに、キャリアポリペプチドは、細胞外ヌクレアーゼまたは機能性ＲＮＡ分子を分解し得る他の因子から機能性ＲＮＡ分子を保護する。
【００３４】
一部の実施形態では、標的タンパク質の発現の調節および細胞増殖の阻害を同時に行う方法であって、小分子薬（化学療法薬など）と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子を含む組成物の有効量を上記細胞に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡなど）である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００３５】
一部の実施形態では、標的タンパク質の発現の調節および細胞増殖の阻害を同時に行う方法であって、キャリアポリペプチドと、小分子薬（化学療法薬など）と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物の有効量を上記細胞に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡなど）である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００３６】
一部の実施形態では、細胞を殺滅する方法であって、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬（化学療法薬など）を含む複合体で上記細胞をトランスフェクトするステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡなど）である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００３７】
一部の実施形態では、細胞を殺滅する方法であって、キャリアポリペプチドと、小分子薬（化学療法薬など）と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物を上記細胞に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡなど）である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００３８】
一部の実施形態では、細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬を含む複合体で上記細胞をトランスフェクトするステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は化学療法剤である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００３９】
一部の実施形態では、細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、キャリアポリペプチドと、小分子薬（化学療法薬など）と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物を上記細胞に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は化学療法剤である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００４０】
一部の実施形態では、細胞の壊死を誘導する方法であって、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬を含む複合体で上記細胞をトランスフェクトするステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、化学療法剤である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００４１】
一部の実施形態では、細胞の壊死を誘導する方法であって、キャリアポリペプチドと、小分子薬（化学療法薬など）と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物を上記細胞に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は化学療法剤である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００４２】
一部の実施形態では、癌細胞を化学療法薬に感作させる方法であって、キャリアポリペプチドと、化学療法薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物を上記癌細胞に投与するステップを含み、上記機能性ＲＮＡ分子が、化学療法薬に対する癌細胞の感受性を上げる、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡなど）である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、薬物排出、化学療法薬の耐性、または化学療法薬の感受性に関連するタンパク質の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、化学療法薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００４３】
一部の実施形態では、癌細胞を化学療法薬に感作させる方法であって、機能性ＲＮＡ分子および化学療法薬を含む複合体で上記細胞をトランスフェクトするステップを含み、上記機能性ＲＮＡ分子が、化学療法薬に対する癌細胞の感受性を上げる、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡなど）である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、薬物排出、化学療法薬の耐性、または化学療法薬の感受性に関連するタンパク質の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、化学療法薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００４４】
一部の実施形態では、免疫応答の調節および癌細胞の殺滅を同時に行う方法であって、キャリアポリペプチドと、小分子薬（化学療法薬など）と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物の有効量を上記細胞に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡなど）である。たとえば、一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、免疫チェックポイントタンパク質の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００４５】
一部の実施形態では、免疫応答の調節および癌細胞の殺滅を同時に行う方法であって、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬（化学療法薬など）を含む複合体で上記細胞をトランスフェクトするステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡなど）である。たとえば、一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、免疫チェックポイントタンパク質の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００４６】
一部の実施形態では、癌を有する対象において、免疫応答の調節および癌細胞の殺滅を同時に行う方法であって、キャリアポリペプチドと、小分子薬（化学療法薬など）と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物の有効量を上記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡなど）である。たとえば、一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、免疫チェックポイントタンパク質の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００４７】
一部の実施形態では、癌を有する対象において、免疫応答の調節および癌細胞の殺滅を同時に行う方法であって、キャリアポリペプチドと、小分子薬（化学療法薬など）と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物の有効量を上記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子である。たとえば、一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、免疫チェックポイントタンパク質の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、化学療法剤である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００４８】
一部の実施形態では、対象の癌を治療する方法であって、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬を含む複合体の有効量を上記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は化学療法剤である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。一部の実施形態では、この複合体は、リポソーム、ナノ粒子、またはキャリアポリペプチドなどの担体を使用して、輸送される。
【００４９】
一部の実施形態では、対象の癌を治療する方法であって、キャリアポリペプチドと、小分子薬（化学療法薬など）と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物の有効量を上記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は化学療法剤である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされている。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明らかに文脈が他の意味を表さない限り複数形を含む。
【００５１】
本明細書中の「約」の値またはパラメータに対する言及は、当該値またはパラメータ自体を対象とする変分を含む（および変分を表す）。たとえば、「約Ｘ」を表す説明は、「Ｘ」の説明を含む。さらに、「約Ｘ〜Ｙ」との言及は、「約Ｘ〜約Ｙ」に相当し、「約Ｘ〜ＹまたはＹ〜Ｚ」は、「約Ｘ〜約Ｙ、または約Ｙ〜約Ｚ」に相当する。さらに、「約Ｘ、Ｙ、またはＺ以下」との言及は、「約Ｘ以下、約Ｙ以下、または約Ｚ以下」に相当し、「約Ｘ、Ｙ、またはＺ以上」との言及は、「約Ｘ以上、約Ｙ以上、または約Ｚ以上」に相当する。
【００５２】
用語「有効な」は、他の意味が示されていない限り、これを使用する文脈の中で使用する場合に、当該結果が感染症もしくは疾患状態の治療に関連するかまたは本明細書中他で記載されているものかどうかにかかわらず、意図する結果をもたらすまたは生じさせる量の化合物または成分を説明するために、本明細書中で使用されている。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、用語「薬学的に許容される」は、本化合物または本組成物が、疾患の重症度および本明細書中に記載の治療の必要性の観点から過度に有害な副作用をもたらすことなく当該治療を達成するように、ヒトの対象を含む対象への投与に適していることを意味している。
【００５４】
用語「対象」または「患者」は、哺乳類を説明するように本明細書中同義で使用されている。対象の例として、ヒトまたは動物（限定するものではないが、イヌ、ネコ、げっ歯類（マウス、ラット、もしくはハムスターなど）、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ロバ、ウサギ、または霊長類（サル、チンパンジー、オラウータン、ヒヒ、もしくはマカクなど）を含む）が、挙げられる。
【００５５】
用語「〜を治療する（ｔｒｅａｔ）」、「〜を治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔ）」は、少なくとも１つの症状の緩和、阻害、抑制、もしくは排除、疾患進行の遅延、疾患再発の遅延、または疾患の阻害を介した病態の改善を含む、疾患状態または病態を罹患した対象に有益性を提供するいずれかの作用を表すように、本明細書中同意語として使用されている。
【００５６】
特定のタンパク質に関してアップレギュレートした発現（たとえばＨＥＲ３＋またはｃ−ＭＥＴ＋）を呈する細胞は、当該細胞が、当該タンパク質に関してアップレギュレートしていない細胞と比較して多くのタンパク質を提示する場合に、アップレギュレートされていると言われる。
【００５７】
本明細書中記載の本発明の態様およびバリエーションは、当該態様およびバリエーション「を構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」ものを含むことが理解されている。
【００５８】
本明細書中記載の様々な実施形態の特性のうちの１つ、一部、またはすべてを組み合わせて本発明の他の実施形態を形成することが可能であることを、理解すべきである。
【００５９】
本明細書中使用されるセクションの見出しは、単に効率化のためのものであり、記載の主題を限定すると解釈すべきではない。
【００６０】
機能性ＲＮＡおよび小分子薬の複合体
本治療用複合体は、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子を含む。小分子薬は、たとえば、静電相互作用により、または機能性ＲＮＡ分子にインターカレートすることにより、機能性ＲＮＡ分子と複合体形成することができる。
【００６１】
機能性ＲＮＡ分子は、たとえばタンパク質発現の阻害（たとえばＲＮＡｉ経路を介する）、タンパク質発現の増大（たとえば、機能性ＲＮＡ分子としてのｍＲＮＡの使用を介する）、または１つ以上のサイトカイン（Ｉ型インターフェロン（たとえばＩＦＮ−α、ＩＮＦ−β）、ＩＬ−６、もしくはＩＬ−８）など）の発現の変化を引き起こすといった、生物学的な機能を提供することができる。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、抗ＨＥＲ２のｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、腫瘍細胞により発現した免疫系チェックポイントのタンパク質（たとえばＰＤ−Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｎｄ  １）、またはＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、またはＣＴＬＡ−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４））の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、免疫系チェックポイントのタンパク質の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、薬物排出または薬物耐性に関連するタンパク質（モノカルボン酸トランスポーター（ＭＣＴ）、多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ）、Ｐ糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）、ペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ）、またはＮａ＋リン酸トランスポーター（ＮＰＴ）など）の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、薬物排出または薬物の耐性に関連するタンパク質（モノカルボン酸トランスポーター（ＭＣＴ）、多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ）、Ｐ糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）、ペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ）、またはＮａ＋リン酸トランスポーター（ＮＰＴ）など）の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、ＭＡＤＤ（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）タンパク質、Ｓｍａｄ３、またはＳｍａｄ４などの、薬剤の感受性の減少に関連するタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、ＭＡＤＤ（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）タンパク質、Ｓｍａｄ３、またはＳｍａｄ４などの、薬剤の感受性の減少に関連するタンパク質の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、上記の活性のいずれかを伴う機能性ＲＮＡ分子は、化学療法的な効果を提供する。
【００６２】
小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子は、機能性ＲＮＡ分子の機能的な活性を保持している。一部の実施形態では、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子は、小分子薬と複合体形成していない機能性ＲＮＡ分子の活性の約５０％以上（たとえば約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％以上）を保持している。
【００６３】
例示的な機能性ＲＮＡ分子として、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ（Ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｔｓＲＮＡ（ｔｏｘｉｃ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）、またはリボザイムが挙げられる。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、アンチセンスのＲＮＡ分子である。機能性ＲＮＡ分子は、機能性ＲＮＡの機能的な構成要素の５’末端または３’末端に結合し得る、機能的ではない構成要素を含むことができる。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、抗癌剤、たとえば遺伝子発現を調節すること、１つ以上の免疫系チェックポイントのタンパク質を制御することにより免疫応答を調節すること、またはサイトカインの発現を制御することにより機能し得る抗癌剤である。
【００６４】
一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は二本鎖である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、一本鎖であり、少なくとも１つの自己相補的な領域を含む。機能性ＲＮＡ分子は、たとえばステムループ構造を含み、ここでＲＮＡ分子のステム部分が自己相補的な領域を含む。二本鎖の機能性ＲＮＡ分子は、完全な対形成を必要としておらず、一部の実施形態では、１つ以上のバルジ、ループ、ミスマッチ、または他の二次的な構造を含む。一部の実施形態では、本ヌクレオチドの約８０％以上が対形成されているか、本ヌクレオチドの約８５％以上が対形成されているか、本ヌクレオチドの約９０％以上が対形成されているか、本ヌクレオチドの約９５％が対形成されているか、または本ヌクレオチドの約１００％が対形成されている。
【００６５】
一部の実施形態では、機能性ＲＮＡは、Ｔ７転写したＲＮＡなどの、１つ以上の三リン酸の５’末端を含む。三リン酸の５’末端は、Ｉ型インターフェロンの内在的な発現をもたらすことができ、これにより癌細胞死をさらに高めることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡは、合成的に産生されるか、または１つ以上の三リン酸の５’末端を含まない。
【００６６】
一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、約１０〜１００ヌクレオチド長、たとえば約１０〜３０、２０〜４０、３０〜５０、４０〜６０、５０〜７０、６０〜８０、７０〜９０、または８０〜１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、約２５〜３５ヌクレオチド長、たとえば約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約２５〜３５ヌクレオチド長、たとえば約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチド長である。
【００６７】
機能性ＲＮＡ分子は、化学療法剤などの小分子薬と複合体形成している。例示的な小分子薬として、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシンなど）、またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤（カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、プロカルバジン、もしくはチオテパなど）が挙げられる。一部の実施形態では、小分子の化合物は、約１５００ダルトン以下、たとえば約１０００ダルトン、９００ダルトン、８００ダルトン、７００ダルトン、６００ダルトン、５００ダルトン、４００ダルトン、または３００ダルトン以下である。一部の実施形態では、小分子の化合物は、約１００〜１５００ダルトン（約１００〜２００ダルトン、２００〜３００ダルトン、３００〜４００ダルトン、４００〜５００ダルトン、５００〜６００ダルトン、６００〜７００ダルトン、７００〜８００ダルトン、８００〜９００ダルトン、９００〜１０００ダルトン、１０００〜１１００ダルトン、１１００〜１２００ダルトン、１２００〜１３００ダルトン、１３００〜１４００ダルトン、または１４００〜１５００ダルトンなど）である。
【００６８】
一部の実施形態では、小分子薬は、約５０ｍｇ／ｍＬ以下（たとえば約２５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．００２５ｍｇ／ｍＬ、または０．００１ｍｇ／ｍＬ以下）の溶解度（約２５℃、ｐＨ７の水で測定）を有する。一部の実施形態では、小分子薬は、約０．０００１〜５０ｍｇ／ｍＬ（約０．０００１〜０．０００５ｍｇ／ｍＬ、０．０００５〜０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００１〜０．００２５ｍｇ／ｍＬ、０．００２５〜０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．００５〜０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０１〜０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０２５〜０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０５〜０．１ｍｇ／ｍＬ、０．１〜０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬ、０．５〜１ｍｇ／ｍＬ、１〜２ｍｇ／ｍＬ、２〜５ｍｇ／ｍＬ、５〜１０ｍｇ／ｍＬ、１０〜２５ｍｇ／ｍＬ、または２５〜５０ｍｇ／ｍＬなど）の溶解度（約２５℃、ｐＨ７の水で測定）を有する。
【００６９】
一部の実施形態では、治療用複合体における小分子薬の機能性ＲＮＡ分子に対するモル比は、約６０：１以下、たとえば約５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１以下である。一部の実施形態では、治療用複合体における小分子薬の機能性ＲＮＡ分子に対するモル比は、約１：１〜約６０：１、たとえば約１：１〜１０：１、５：１〜２０：１、１０：１〜３０：１、２０：１〜４０：１、３０：１〜５０：１、または４０：１〜６０：１である。一部の実施形態では、治療用複合体における小分子薬の機能性ＲＮＡ分子に対するモル比は、約１：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、または６０：１である。
【００７０】
小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子と複合体形成している。一部の実施形態では、小分子薬は、静電相互作用、共有結合（ジスルフィド結合など）により、またはＲＮＡにインターカレートすることにより、機能性ＲＮＡ分子と複合体形成している。機能性ＲＮＡ分子に対する小分子薬の複合体形成は、配列に特異的ではない。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、相補的ＲＮＡ（たとえば二本鎖のＲＮＡまたは自己相補的な部分を有する一本鎖のＲＮＡにおける相補的ＲＮＡ）に対して対形成しており、これにより、対となる塩基間での小分子薬のインターカレーションが可能となる。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子における塩基対あたりの小分子薬のモル比の平均は、約１：１〜１：１２０（たとえば、約１：２〜１：１２０、１：２〜１：４、１：４〜１：８、１：８〜１：１６、１：１６〜１：３２、１：３２〜１：６４、１：６４〜１：１００、または１：１００〜１：１２０）である。塩基およびその相補体が、機能性ＲＮＡ分子における塩基対あたりの小分子薬のモル比を考慮する場合に、２つの塩基対とみなされることが理解されている。
【００７１】
一部の実施形態では、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡ分子など）を含む複合体を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、１つ以上のタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの相補領域を含むか、または二本鎖のＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１０〜約１：６０である。一部の実施形態では、小分子薬は、化学療法剤、たとえばアントラサイクリン（たとえばドキソルビシン）またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【００７２】
一部の実施形態では、治療用複合体を含むリポソームであって、上記治療用複合体が、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡ分子など）を含む、リポソームを提供する。一部の実施形態では、リポソームは、このリポソームがある細胞（癌細胞など）を標的とすることができる、標的化セグメントを含む。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、１つ以上のタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの相補領域を含むか、または二本鎖のＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１０〜約１：６０である。一部の実施形態では、小分子薬は、化学療法剤、たとえばアントラサイクリン（たとえばドキソルビシン）またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【００７３】
治療用複合体は、小分子薬（化学療法剤など）と機能性ＲＮＡ分子を組み合わせることにより形成することができ、これにより、配列に特異的ではない方法で、小分子薬を機能性ＲＮＡ分子に結合またはインターカレートすることができる。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、二本鎖のＲＮＡ分子であり（または二本鎖のセグメントを含む）、小分子薬は、二本鎖の機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、小分子薬および機能性ＲＮＡ分子は、約６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１以下の比（小分子薬：機能性ＲＮＡ分子）で組み合わせられている。一部の実施形態では、小分子薬および機能性ＲＮＡ分子は、約１：１〜約６０：１、たとえば約１：１〜１０：１、５：１〜２０：１、１０：１〜３０：１、２０：１〜４０：１、３０：１〜５０：１、または４０：１〜６０：１の比（小分子薬：機能性ＲＮＡ分子）で組み合わせられている。一部の実施形態では、小分子薬および機能性ＲＮＡ分子は、約１：１、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、または１：６０の比（小分子薬：機能性ＲＮＡ分子）で組み合わせられている。
【００７４】
機能性ＲＮＡ分子および小分子薬を組み合わせた後、この混合物をインキュベートすることができ、これによって、たとえば小分子薬を機能性ＲＮＡ分子にインターカレートさせることにより、小分子薬および機能性ＲＮＡ分子を複合体にすることができる。結合していない小分子薬は、たとえばろ過膜を使用して複合体を遠心分離することにより、複合体から分離することができる。残余分は複合体を含み、これは保持することができ、対してろ過物は、結合していない小分子薬を含む。
【００７５】
一部の実施形態では、治療用複合体は、たとえば滅菌性のフィルターを使用することにより、滅菌されている。一部の実施形態では、治療用複合体は、凍結乾燥されている。一部の実施形態では、凍結乾燥した治療用複合体は、投与用に製剤化する前または担体（たとえばリポソームもしくはナノ粒子）と共に製剤化する前に、再構成されている。
【００７６】
形成した治療用複合体は、リポソームまたはナノ粒子などの担体に充填することができる。よって、一部の実施形態では、治療用複合体を含むリポソームを含む組成物であって、上記治療用複合体が、機能性ＲＮＡおよび小分子薬を含む、組成物を提供する。本リポソームは、陽イオン性脂質（リポフェクタミンなど）を含み得、これは、治療用複合体の機能性ＲＮＡ分子の負の電荷に結合することができる。一部の実施形態では、治療用複合体は、ナノ粒子の中、たとえば細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含むキャリアポリペプチドを含むナノ粒子の中に、充填されている。一部の実施形態では、この担体は、抗体または受容体結合ドメインなどの標的化セグメントを含む標的の担体である。
【００７７】
機能性ＲＮＡおよび小分子薬を含む治療用複合体は、細胞（たとえば癌細胞）の殺滅、細胞（たとえば癌細胞）のアポトーシスの誘導、または患者の癌の治療に、有用であり得る。
【００７８】
一部の実施形態では、細胞（たとえば癌細胞）に治療用複合体を送達する方法であって、機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡ分子など）および小分子薬を含む複合体で上記細胞をトランスフェクトするステップを含む、方法が存在する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、１つ以上のタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの相補領域を含むか、または二本鎖のＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１０〜約１：６０である。一部の実施形態では、小分子薬は、化学療法剤、たとえばアントラサイクリン（たとえばドキソルビシン）またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【００７９】
一部の実施形態では、細胞（たとえば癌細胞）に治療用複合体を送達する方法であって、治療用複合体を含むリポソームを含む組成物と上記細胞を接触させるステップを含み、上記治療用複合体が、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡ分子など）を含む、方法が存在する。一部の実施形態では、リポソームは、このリポソームが上記細胞を標的とすることができる、標的化セグメントを含む。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、１つ以上のタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの相補領域を含むか、または二本鎖のＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１０〜約１：６０である。一部の実施形態では、小分子薬は、化学療法剤、たとえばアントラサイクリン（たとえばドキソルビシン）またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【００８０】
一部の実施形態では、細胞（たとえば癌細胞）を殺滅する方法であって、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬（たとえば化学療法薬）を含む複合体で上記細胞をトランスフェクトするステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、１つ以上のタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの相補領域を含むか、または二本鎖のＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１０〜約１：６０である。一部の実施形態では、小分子薬は、化学療法剤、たとえばアントラサイクリン（たとえばドキソルビシン）またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【００８１】
一部の実施形態では、細胞（たとえば癌細胞）を殺滅する方法であって、治療用複合体を含むリポソームを含む組成物を上記細胞と接触させるステップを含み、上記治療用複合体が、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡ分子など）を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、リポソームは、このリポソームが上記細胞を標的とすることができる、標的化セグメントを含む。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、１つ以上のタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの相補領域を含むか、または二本鎖のＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１０〜約１：６０である。一部の実施形態では、小分子薬は、化学療法剤、たとえばアントラサイクリン（たとえばドキソルビシン）またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【００８２】
一部の実施形態では、細胞（たとえば癌細胞）のアポトーシスを誘導する方法であって、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬を含む複合体で上記細胞をトランスフェクトするステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、１つ以上のタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの相補領域を含むか、または二本鎖のＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１０〜約１：６０である。一部の実施形態では、小分子薬は、化学療法剤、たとえばアントラサイクリン（たとえばドキソルビシン）またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【００８３】
一部の実施形態では、細胞（たとえば癌細胞）のアポトーシスを誘導する方法であって、治療用複合体を含むリポソームを含む組成物と上記細胞を接触させるステップを含み、上記治療用複合体が、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子（二本鎖のｓｉＲＮＡ分子など）を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、リポソームは、このリポソームが上記細胞を標的とすることができる、標的化セグメントを含む。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、１つ以上のタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの相補領域を含むか、または二本鎖のＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１０〜約１：６０である。一部の実施形態では、小分子薬は、化学療法剤、たとえばアントラサイクリン（たとえばドキソルビシン）またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【００８４】
一部の実施形態では、対象の癌を治療する方法であって、機能性ＲＮＡ分子および小分子の化学療法薬を含む複合体の有効量を上記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、１つ以上のタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの相補領域を含むか、または二本鎖のＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子の化学療法薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１０〜約１：６０である。一部の実施形態では、小分子の化学療法薬は、アントラサイクリン（たとえばドキソルビシン）、アルキル化剤またはアルキル化様作用剤である。一部の実施形態では、癌の治療に使用するための治療用複合体であって、上記治療用複合体が、小分子の化学療法薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子を含む、治療用複合体を提供する。さらに本明細書中において、癌の治療用の医薬の製造に使用するための治療用複合体であって、上記治療用複合体が、小分子の化学療法薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子を含む、治療用複合体を提供する。
【００８５】
一部の実施形態では、対象の癌を治療する方法であって、治療用複合体を含むリポソームを含む組成物の有効量を上記対象に投与するステップを含み、上記治療用複合体が、小分子の化学療法薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、１つ以上のタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの相補領域を含むか、二本鎖のＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、小分子の化学療法薬は、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１０〜約１：６０である。一部の実施形態では、小分子の化学療法薬は、アントラサイクリン（たとえばドキソルビシン）、アルキル化剤またはアルキル化様作用剤である。一部の実施形態では、癌の治療に使用するためのリポソームであって、上記リポソームが、小分子の化学療法薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子を含む治療用複合体を含む、リポソームを提供する。さらに本明細書中において、癌の治療用の医薬の製造に使用するためのリポソームを含む組成物であって、上記リポソームが、小分子の化学療法薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子を含む治療用複合体を含む、組成物を提供する。
【００８６】
ナノ粒子組成物
本明細書中記載のナノ粒子組成物は、細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含むキャリアポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書中記載のナノ粒子組成物は、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含むキャリアポリペプチドを含む。さらにナノ粒子は、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子を含む。機能性ＲＮＡ分子は、キャリアポリペプチドのオリゴヌクレオチド結合セグメントと結合することができる。機能性ＲＮＡ分子にキャリアポリペプチドが結合すると、ナノ粒子が自然に形成する。
【００８７】
機能性ＲＮＡ分子は、たとえばタンパク質発現の阻害（たとえばＲＮＡｉ経路を介する）、タンパク質発現の増大（たとえば、機能性ＲＮＡ分子としてのｍＲＮＡの使用を介する）、または１つ以上のサイトカイン（Ｉ型インターフェロン（たとえばＩＦＮ−α、ＩＮＦ−β）、ＩＬ−６、もしくはＩＬ−８）など）の発現の変化を引き起こすといった、生物学的な機能を提供することができる。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、抗ＨＥＲ２のｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、腫瘍細胞により発現した免疫系チェックポイントのタンパク質（たとえばＰＤ−Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｎｄ  １）、またはＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、またはＣＴＬＡ−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４））の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、免疫系チェックポイントのタンパク質の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、薬物排出または薬物耐性に関連するタンパク質（モノカルボン酸トランスポーター（ＭＣＴ）、多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ）、Ｐ糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）、ペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ）、またはＮａ＋リン酸トランスポーター（ＮＰＴ）など）の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、薬物排出または薬物の耐性に関連するタンパク質（モノカルボン酸トランスポーター（ＭＣＴ）、多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ）、Ｐ糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）、ペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ）、またはＮａ＋リン酸トランスポーター（ＮＰＴ）など）の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、ＭＡＤＤ（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）タンパク質、Ｓｍａｄ３、またはＳｍａｄ４などの、薬剤の感受性の減少に関連するタンパク質の発現を調節する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、ＭＡＤＤ（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）タンパク質、Ｓｍａｄ３、またはＳｍａｄ４などの、薬剤の感受性の減少に関連するタンパク質の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、上記の活性のいずれかを伴う機能性ＲＮＡ分子は、化学療法的な効果を提供する。
【００８８】
例示的な機能性ＲＮＡ分子として、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ（Ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｔｓＲＮＡ（ｔｏｘｉｃ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）、またはリボザイムが挙げられる。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、アンチセンスのＲＮＡ分子である。機能性ＲＮＡ分子は、機能性ＲＮＡ分子の機能的な構成要素の５’末端または３’末端に結合し得る、非機能的な構成要素を含むことができる。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、抗癌剤、たとえば遺伝子発現を調節することまたはサイトカインの発現を制御することにより機能できる抗癌剤である。
【００８９】
小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子は、機能性ＲＮＡ分子の機能的な活性を保持している。一部の実施形態では、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子は、小分子薬と複合体形成していない機能性ＲＮＡ分子の活性の約５０％以上（たとえば約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％以上）を保持している。
【００９０】
一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は二本鎖である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、一本鎖であり、少なくとも１つの自己相補的な領域を含む。機能性ＲＮＡ分子は、たとえばステムループ構造を含み、ここでＲＮＡ分子のステム部分が自己相補的な領域を含む。二本鎖の機能性ＲＮＡ分子は、完全な対形成を必要としておらず、一部の実施形態では、１つ以上のバルジ、ループ、ミスマッチ、または他の二次的な構造を含む。一部の実施形態では、本ヌクレオチドの約８０％以上が対形成されているか、本ヌクレオチドの約８５％以上が対形成されているか、本ヌクレオチドの約９０％以上が対形成されているか、本ヌクレオチドの約９５％が対形成されているか、または本ヌクレオチドの約１００％が対形成されている。
【００９１】
一部の実施形態では、機能性ＲＮＡは、Ｔ７転写したＲＮＡなどの、１つ以上の三リン酸の５’末端を含む。三リン酸の５’末端は、Ｉ型インターフェロンの内在的な発現をもたらすことができ、これにより癌細胞死をさらに高めることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡは、合成的に産生されるか、または１つ以上の三リン酸の５’末端を含まない。
【００９２】
一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長、たとえば約１０〜１００ヌクレオチド長、たとえば約１０〜３０、２０〜４０、３０〜５０、４０〜６０、５０〜７０、６０〜８０、７０〜９０、または８０〜１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約２５〜３５ヌクレオチド長、たとえば約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１５〜２５ヌクレオチド長、たとえば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。
【００９３】
ナノ粒子における機能性ＲＮＡ分子は、化学療法剤などの小分子薬と複合体形成している。小分子薬は、たとえば静電相互作用により、または機能性ＲＮＡ分子にインターカレートすることにより、機能性ＲＮＡ分子と複合体形成することができる。例示的な小分子薬として、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシンなど）、またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤（カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、プロカルバジン、もしくはチオテパなど）が挙げられる。一部の実施形態では、小分子の化合物は、約１５００ダルトン以下、たとえば約１０００ダルトン、９００ダルトン、８００ダルトン、７００ダルトン、６００ダルトン、５００ダルトン、４００ダルトン、または３００ダルトン以下である。一部の実施形態では、小分子の化合物は、約１００〜１５００ダルトン（約１００〜２００ダルトン、２００〜３００ダルトン、３００〜４００ダルトン、４００〜５００ダルトン、５００〜６００ダルトン、６００〜７００ダルトン、７００〜８００ダルトン、８００〜９００ダルトン、９００〜１０００ダルトン、１０００〜１１００ダルトン、１１００〜１２００ダルトン、１２００〜１３００ダルトン、１３００〜１４００ダルトン、または１４００〜１５００ダルトンなど）である。
【００９４】
一部の実施形態では、小分子薬は、約５０ｍｇ／ｍＬ以下（たとえば約２５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．００２５ｍｇ／ｍＬ、または０．００１ｍｇ／ｍＬ以下）の溶解度（約２５℃、ｐＨ７の水で測定）を有する。一部の実施形態では、小分子薬は、約０．０００１〜５０ｍｇ／ｍＬ（約０．０００１〜０．０００５ｍｇ／ｍＬ、０．０００５〜０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００１〜０．００２５ｍｇ／ｍＬ、０．００２５〜０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．００５〜０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０１〜０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０２５〜０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０５〜０．１ｍｇ／ｍＬ、０．１〜０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬ、０．５〜１ｍｇ／ｍＬ、１〜２ｍｇ／ｍＬ、２〜５ｍｇ／ｍＬ、５〜１０ｍｇ／ｍＬ、１０〜２５ｍｇ／ｍＬ、または２５〜５０ｍｇ／ｍＬなど）の溶解度（約２５℃、ｐＨ７の水で測定）を有する。
【００９５】
一部の実施形態では、治療用複合体における小分子薬の機能性ＲＮＡ分子に対するモル比は、約６０：１以下、たとえば約５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１以下である。一部の実施形態では、治療用複合体における小分子薬の機能性ＲＮＡ分子に対するモル比は、約１：１〜約６０：１、たとえば約１：１〜１０：１、５：１〜２０：１、１０：１〜３０：１、２０：１〜４０：１、３０：１〜５０：１、または４０：１〜６０：１である。一部の実施形態では、治療用複合体における小分子薬の機能性ＲＮＡ分子に対するモル比は、約１：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、または６０：１である。
【００９６】
小分子薬は、機能性ＲＮＡ分子と複合体形成している。一部の実施形態では、小分子薬は、静電相互作用、共有結合（ジスルフィド結合など）により、またはＲＮＡにインターカレートすることにより、機能性ＲＮＡ分子と複合体形成している。たとえば、機能性ＲＮＡは、相補的ＲＮＡ（たとえば二本鎖のＲＮＡまたは自己相補的な部分を有する一本鎖のＲＮＡにおける相補的ＲＮＡ）に対して対形成することができ、これにより、塩基対間での小分子薬のインターカレーションが可能となる。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子における塩基対あたりの小分子薬のモル比の平均は、約１：１〜１：１２０（たとえば、約１：２〜１：１２０、１：２〜１：４、１：４〜１：８、１：８〜１：１６、１：１６〜１：３２、１：３２〜１：６４、１：６４〜１：１００、または１：１００〜１：１２０）である。塩基およびその相補体が、機能性ＲＮＡ分子における塩基対あたりの小分子薬のモル比を考慮する場合に、２つの塩基対とみなされることが理解されている。
【００９７】
細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントは、１つのキャリアポリペプチドにまとめて融合している。本明細書中記載のセグメントは、モジュール状であり、様々な組み合わせで組み合わせることができる。すなわち、キャリアポリペプチドは、記載の細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、またはオリゴヌクレオチド結合セグメントのいずれかを含むことができる。図１は、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを伴うキャリアペプチドを例示する。図１にさらに示されているように、機能性ＲＮＡ分子とキャリアペプチドを組み合わせることにより、ナノ粒子の形成がもたらされる。任意選択で、機能性ＲＮＡ分子は、ナノ粒子を形成する前に、小分子薬とあらかじめ結合している。
【００９８】
本ナノ粒子は、機能性ＲＮＡ分子とキャリアポリペプチドを組み合わせることにより、形成することができる。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドを、機能性ＲＮＡ分子と、約８：１以下（たとえば約３：１〜８：１、３：１〜３．５：１、３．５：１〜４：１、４：１〜４．５：１、４．５：１〜５：１、５：１〜５．５：１、５．５：１〜６：１、６：１〜６．５：１、６．５：１〜７：１、７：１〜７．５：１、または７．５：１〜８：１）のモル比で組み合わせることにより、ナノ粒子組成物を形成する。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、約４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、または８：１のモル比で機能性ＲＮＡ分子と組み合わせられている。よって、一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、約８：１以下（たとえば約３：１〜８：１、３：１〜３．５：１、３．５：１〜４：１、４：１〜４．５：１、４．５：１〜５：１、５：１〜５．５：１、５．５：１〜６：１、６：１〜６．５：１、６．５：１〜７：１、７：１〜７．５：１、または７．５：１〜８：１）のモル比で、キャリアポリペプチドおよび機能性ＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、約４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、または８：１のモル比で、機能性ＲＮＡ分子と組み合わせられている。
【００９９】
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、キャリアポリペプチド：機能性ＲＮＡ分子が均一なモル比であるナノ粒子を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、または３：１のモル比でキャリアポリペプチドおよび機能性ＲＮＡ分子を含む。
【０１００】
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のナノ粒子は、約１００ｎｍ以下（たとえば約９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、または４０ｎｍ以下）の大きさの平均を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍ（たとえば約３０〜４０ｎｍ、４０〜５０ｎｍ、５０〜６０ｎｍ、６０〜７０ｎｍ、７０〜８０ｎｍ、８０〜９０ｎｍ、または９０〜１００ｎｍ）の大きさの平均を有する。
【０１０１】
細胞標的化セグメントは、細胞の表面に存在する標的の分子に結合することができる。この細胞標的化セグメントによる分子の結合により、ナノ粒子は細胞を標的とすることができる。よって、細胞に存在する標的の分子は、標的の細胞に依存し得る。一部の実施形態では、標的の分子は、癌抗原などの抗原である。一部の実施形態では、癌細胞は、標的分子の発現がアップレギュレートされている。アップレギュレートした発現は、約１０％、２０％、３０％、４０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上の増大であり得る。一部の実施形態では、標的の分子は、細胞表面の受容体、たとえばＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴである。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、４−ＩＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、αフェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴ０８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエクストラドメイン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｅｘｔｒａ  ｄｏｍａｉｎ）−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒト散乱因子受容体キナーゼ（ｈｕｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ）、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧｌ、Ｌｌ−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様増殖因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンανβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒ  ａ、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ  ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦ  β２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、インターナリンＢ、細菌のインベイシン（Ｉｎｖ）のタンパク質、またはそれらのフラグメントに結合する。
【０１０２】
一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、または一本鎖の可変性（ｓｃＦｖ）フラグメントなど）、サイトカイン、または受容体リガンドを含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、細胞の表面上に発現した受容体に特異的に結合するリガンドを含む。例示的なリガンドとして、ヘレグリン配列（もしくはそのバリアント）、またはインターナリンＢ配列（もしくはそのバリアント）が挙げられる。ヘレグリン配列は、たとえば、ヘレグリンα配列、たとえばヘレグリンαの受容体結合ドメインとすることができる。ヘレグリンαの受容体結合ドメインは、ＩＧ様ドメインおよびＥＧＦ様ドメインを含む。リガンドのバリアントは、標的の分子に対する特異的な結合性を保持している。ヘレグリン（「Ｈｅｒ」と呼ぶことができる）は、ＨＥＲ３と特異的に結合することができる。配列番号２は、例示的な野生型のＨｅｒ配列であり、ヘレグリンαの受容体結合配列のＩｇ様ドメインおよびＥＧＦ様ドメインを含む。インターナリンＢは、ｃ−ＭＥＴと特異的に結合することができ、「ＩｎｌＢ」と呼ぶこともできる。
【０１０４】
一部の実施形態では、細胞標的化セグメントにより標的化された細胞は、哺乳類の細胞、たとえばヒトの細胞である。一部の実施形態では、この細胞は、疾患状態にある細胞、たとえば癌細胞である。一部の実施形態では、この細胞は、ＨＥＲ３＋癌細胞またはｃ−ＭＥＴ＋癌細胞である。一部の実施形態では、この細胞は、頭頸部癌細胞、膵癌細胞、乳癌細胞、グリアの癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、胃癌細胞、皮膚癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、または甲状腺癌細胞である。細胞標的化セグメントは、標的の細胞の表面に存在する分子と結合することができ、よって標的の細胞がナノ粒子の標的となる。
【０１０５】
キャリアポリペプチドの細胞透過性セグメントは、細胞標的化セグメントにより標的化された細胞へのナノ粒子の侵入を促進する。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベース（「ＰＢ」）タンパク質またはそのバリアントを含む（および一部の実施形態では、ペントンベースタンパク質またはそのバリアントである）。例として、一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のペントンベースタンパク質を含む（および一部の実施形態では、当該タンパク質である）。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、アミノ酸の差異または欠失を伴うペントンベースタンパク質を含む（および一部の実施形態では当該タンパク質である）。アミノ酸の差異は、保存的な変異とすることができる。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、切断型のペントンベースタンパク質である。
【０１０６】
細胞透過性セグメントは、キャリアポリペプチドの細胞内での局在化を高める１つ以上のバリアントを含むことができる。たとえば、一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、キャリアポリペプチドを、細胞質または核に優先的に局在させる１つ以上のバリアントを含む。キャリアポリペプチドが機能性ＲＮＡ分子（それ自体が小分子薬と複合体形成している）に結合している実施形態では、バリアントの細胞透過性セグメントは、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬を細胞質または核に優先的に局在させる。優先的な細胞内への局在化は、特定の小分子薬にとって特に好適であり得る。たとえば、多くの化学療法剤は、癌細胞の核に局在するＤＮＡに結合することにより、機能する。核を優先的に標的とすることにより、結合した薬物が、機能する位置に集中する。他の小分子薬は、細胞質で機能し得、細胞質を優先的に標的とすることにより、薬物の効力を高めることができる。
【０１０７】
細胞内での局在化を高める例示的な細胞透過性セグメントの変異は、国際特許公開公報第２０１４／０２２８１１号に論述されている。ペントンベースタンパク質におけるＬｅｕ６０Ｔｒｐの変異は、細胞の細胞質に優先的に局在化することが示されている。よって、一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、Ｌｅｕ６０Ｔｒｐ変異を含むペントンベースタンパク質である。Ｌｙｓ３７５Ｇｌｕ、Ｖａｌ４４９Ｍｅｔ、およびＰｒｏ４６９Ｓｅｒの変異は、細胞の核に優先的に局在化することが示されている。よって、一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、Ｌｙｓ３７５Ｇｌｕ、Ｖａｌ４４９Ｍｅｔ、またはＰｒｏ４６９Ｓｅｒの変異を含むペントンベースタンパク質である。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、Ｌｙｓ３７５Ｇｌｕ、Ｖａｌ４４９Ｍｅｔ、およびＰｒｏ４６９Ｓｅｒの変異を含むペントンベースタンパク質である。アミノ酸の番号付けは、野生型のペントンベースポリペプチドである配列番号１に準拠してなされている。
【０１０８】
オリゴヌクレオチド結合セグメントは、本ナノ粒子の機能性ＲＮＡ分子の構成要素と結合する。オリゴヌクレオチド結合セグメントは、たとえば静電結合、水素結合、またはイオン結合を介して、機能性ＲＮＡ分子と結合することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、ＲＮＡ結合ドメインまたは二本鎖のＲＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、陽イオン性の（すなわち正に荷電した）ドメインである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合ドメインは、ポリリジン配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、約３〜約３０個の長さのアミノ酸、たとえば約３〜約１０、約５〜約１５、約１０〜約２０、約１５〜約２５、または約２０〜約３０個の長さのアミノ酸である。１つの例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、デカリジン（すなわち、１０個の連続したリジンのアミノ酸、または配列番号４に示される「Ｋ１０」）を含む（一部の実施形態では、デカリジンである）。
【０１０９】
例示的なキャリアポリペプチドは、Ｈｅｒ（またはそのバリアント）、ペントンベース（またはそのバリアント）、および正に荷電したオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、Ｈｅｒ、ペントンベースのセグメント、およびポリリジンのオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、Ｈｅｒ、ペントンベースのセグメント、およびデカリジンのオリゴヌクレオチド結合セグメント、たとえばＨｅｒＰＢＫ１０（配列番号３）を含む。他の例示的な実施形態は、ＩｎｌＢ、ペントンベース（またはそのバリアント）、および正に荷電したオリゴヌクレオチド結合セグメント、たとえばＩｎｌＢＰＢＫ１０を含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、動的散乱法により測定される場合、直径約５０ｎｍ以下（たとえば約４５ｎｍ、４０ｎｍ、３５ｎｍ、または３０ｎｍ以下）である。一部の実施形態では、ナノ粒子は、動的散乱法により測定される場合、直径約２５〜５０ｎｍ、２５〜３０ｎｍ、３０〜３５ｎｍ、３５〜４０ｎｍ、または４５〜５０ｎｍである。
【０１１１】
一態様では、キャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物であって、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物における機能性ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、本組成物におけるキャリアポリペプチドの機能性ＲＮＡ分子に対するモル比は、約３：１〜約８：１（約４：１など）である。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、疾患状態の細胞（癌細胞など）であり得る哺乳類の細胞に結合する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、細胞の表面にある標的分子と結合し、この標的分子は受容体（ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴなど）であり得る。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、本組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。
【０１１２】
別の態様では、キャリアポリペプチドと、機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされた小分子薬とを含むナノ粒子を含む組成物であって、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物における機能性ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、本組成物におけるキャリアポリペプチドの機能性ＲＮＡ分子に対するモル比は、約３：１〜約８：１（約４：１など）である。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、疾患状態の細胞（癌細胞など）であり得る哺乳類の細胞に結合する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、細胞の表面にある標的分子と結合し、この標的分子は受容体（ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴなど）であり得る。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、本組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。
【０１１３】
別の態様では、キャリアポリペプチドと、二本鎖のｓｉＲＮＡ分子にインターカレートした小分子薬とを含むナノ粒子を含む組成物であって、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物におけるｓｉＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、本組成物におけるキャリアポリペプチドのｓｉＲＮＡ分子に対するモル比は、約３：１〜約８：１（約４：１など）である。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、疾患状態の細胞（癌細胞など）であり得る哺乳類の細胞に結合する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、細胞の表面にある標的分子と結合し、この標的分子は受容体（ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴなど）であり得る。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、本組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。
【０１１４】
別の態様では、キャリアポリペプチドと、二本鎖のｓｉＲＮＡ分子にインターカレートした小分子薬とを含むナノ粒子を含む組成物であって、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含み、ｓｉＲＮＡが、少なくとも１つの５’三リン酸の末端を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物におけるｓｉＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、本組成物におけるキャリアポリペプチドのｓｉＲＮＡ分子に対するモル比は、約３：１〜約８：１（約４：１など）である。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、疾患状態の細胞（癌細胞など）であり得る哺乳類の細胞に結合する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、細胞の表面にある標的分子と結合し、この標的分子は受容体（ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴなど）であり得る。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、本組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。
【０１１５】
別の態様では、キャリアポリペプチドと、二本鎖のｓｉＲＮＡ分子にインターカレートした小分子の化学療法剤とを含むナノ粒子を含む組成物であって、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含み、ｓｉＲＮＡが、少なくとも１つの５’三リン酸の末端を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物におけるｓｉＲＮＡ分子の化学療法剤に対するモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、本組成物におけるキャリアポリペプチドのｓｉＲＮＡ分子に対するモル比は、約３：１〜約８：１（約４：１など）である。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、疾患状態の細胞（癌細胞など）であり得る哺乳類の細胞に結合する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、細胞の表面にある標的分子と結合し、この標的分子は受容体（ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴなど）であり得る。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、本組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。一部の実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン（ドキソルビシンなど）、またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【０１１６】
別の態様では、キャリアポリペプチドと、二本鎖のｓｉＲＮＡ分子にインターカレートした小分子の化学療法剤とを含むナノ粒子を含む組成物であって、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含み、ｓｉＲＮＡが、少なくとも１つの５’三リン酸の末端を含み、細胞標的化セグメントが、ＨＥＲ３＋癌細胞を標的とする、組成物を提供する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物におけるｓｉＲＮＡ分子の化学療法剤に対するモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、本組成物におけるキャリアポリペプチドのｓｉＲＮＡ分子に対するモル比は、約３：１〜約８：１（約４：１など）である。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、本組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。一部の実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン（ドキソルビシンなど）、またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、ヘレグリン配列またはそのバリアントを含む。
【０１１７】
別の態様では、キャリアポリペプチドと、二本鎖のｓｉＲＮＡ分子にインターカレートした小分子の化学療法剤とを含むナノ粒子を含む組成物であって、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含み、ｓｉＲＮＡが、少なくとも１つの５’三リン酸の末端を含み、細胞標的化セグメントが、ｃ−ＭＥＴ＋癌細胞を標的とする、組成物を提供する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物におけるｓｉＲＮＡ分子の化学療法剤に対するモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、本組成物におけるキャリアポリペプチドのｓｉＲＮＡ分子に対するモル比は、約３：１〜約８：１（約４：１など）である。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、本組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。一部の実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン（ドキソルビシンなど）、またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、インターナリンＢ配列またはそのバリアントを含む。
【０１１８】
別の態様では、ＨｅｒＰＢＫ１０と、二本鎖のｓｉＲＮＡ分子にインターカレートした小分子の化学療法剤とを含むナノ粒子を含む組成物であって、ｓｉＲＮＡが、少なくとも１つの５’三リン酸の末端を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物におけるｓｉＲＮＡ分子の化学療法剤に対するモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、本組成物におけるキャリアポリペプチドのｓｉＲＮＡ分子に対するモル比は、約３：１〜約８：１（約４：１など）である。一部の実施形態では、本組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。一部の実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン（ドキソルビシンなど）、またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【０１１９】
ナノ粒子の作製
本明細書中記載のナノ粒子は、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬と複数のキャリアポリペプチドを組み合わせることにより、生産することができる。一部の実施形態では、キャリアポリペプチド、機能性ＲＮＡ分子、および小分子薬をまとめてインキュベートして、本ナノ粒子を形成する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子を、キャリアポリペプチドと組み合わせる前に、小分子薬とあらかじめインキュベートする。キャリアポリペプチドおよび機能性ＲＮＡ分子を組み合わせると、本ナノ粒子は自然に構築する。
【０１２０】
一部の実施形態では、一本鎖の相補的（または部分的に相補的または自己相補的）なＲＮＡ分子をアニーリングして、本ナノ粒子を形成するために使用される機能性ＲＮＡ分子を形成する。オリゴヌクレオチドのアニーリングは、たとえばＲＮＡ分子を組み合わせ、ＲＮＡ分子を（たとえば約８０℃以上に）加熱し、この混合物を（たとえば室温で）冷却することにより、起こり得る。
【０１２１】
小分子薬は、小分子薬および機能性ＲＮＡ分子を組み合わせることにより、機能性ＲＮＡ分子に結合する。一部の実施形態では、小分子薬および機能性ＲＮＡ分子を、約６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１以下のモル比で組み合わせる。一部の実施形態では、小分子薬および機能性ＲＮＡ分子を、約１：１〜約６０：１、たとえば約１：１〜１０：１、５：１〜２０：１、１０：１〜３０：１、２０：１〜４０：１、３０：１〜５０：１、または４０：１〜６０：１のモル比で組み合わせる。一部の実施形態では、小分子薬および機能性ＲＮＡ分子を、約１：１、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、または１：６０のモル比で組み合わせる。小分子薬は、アニーリング工程の前、間、または後で、ＲＮＡ分子と混合することができる。小分子薬および機能性ＲＮＡ分子を組み合わせた後、小分子薬は、たとえば機能性ＲＮＡ分子にインターカレートすることにより、または静電相互作用により、機能性ＲＮＡ分子に結合する。
【０１２２】
機能性ＲＮＡ分子および小分子薬（あらかじめまとめて複合体形成されていてもよい）を、キャリアペプチドと組み合わせて、本ナノ粒子を形成する。一部の実施形態では、キャリアペプチドおよび機能性ＲＮＡ分子を、約８：１以下（たとえば約３：１〜８：１、３：１〜３．５：１、３．５：１〜４：１、４：１〜４．５：１、４．５：１〜５：１、５：１〜５．５：１、５．５：１〜６：１、６：１〜６．５：１、６．５：１〜７：１、７：１〜７．５：１、または７．５：１〜８：１）のモル比で組み合わせる。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドおよび機能性ＲＮＡ分子を、約４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、または８：１のモル比で組み合わせる。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドおよび機能性ＲＮＡ分子を、約４℃〜約２２℃、たとえば約４〜１５℃、または４〜１０℃でインキュベートする。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドおよび機能性ＲＮＡ分子を、約３０分未満、約３０分以上、約１時間以上、または約２時間以上の間、インキュベートする。機能性ＲＮＡ分子とキャリアポリペプチドを組み合わせた後、本ナノ粒子は自然に形成する。
【０１２３】
一部の実施形態では、過剰なオリゴヌクレオチド、小分子薬、またはキャリアポリペプチドを、ナノ粒子を含む組成物から除去する。たとえば、一部の実施形態では、ナノ粒子組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーなどの精製ステップに供する。一部の実施形態では、結合していない構成要素を、超遠心分離法によりナノ粒子から分離する。たとえば、一部の実施形態では、本組成物を、約１００ｋＤ、８０ｋＤ、７０ｋＤ、６０ｋＤ、５０ｋＤ、４０ｋＤ、３０ｋＤ、２０ｋＤ、１０ｋＤ、または５ｋＤ以下の分子量カットオフを伴う遠心分離フィルターに加える。
【０１２４】
任意選択で、結果として得られたナノ粒子組成物を、たとえば透析、超遠心分離、またはタンジェンシャルフローろ過によるバッファー交換に供する。一部の実施形態では、本ナノ粒子を、たとえば超遠心分離法により、濃縮する。
【０１２５】
本ナノ粒子組成物に、さらなる処理ステップを行うことができる。たとえば一部の実施形態では、ナノ粒子組成物を、たとえば滅菌ろ過により、滅菌する。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物を、バイアルに分注する（その後密閉されてもよい）。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物を、凍結乾燥し、これにより、乾燥ナノ粒子組成物を形成する。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物を、たとえば１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を添加することにより、医薬組成物を形成するように製剤化する。
【０１２６】
一態様では、ナノ粒子組成物を作製する方法であって、キャリアポリペプチド、機能性ＲＮＡ分子、および小分子薬を組み合わせるステップを含み、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、小分子薬は、ＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物を滅菌ろ過するか、または凍結乾燥する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬を、約１：１〜約１：６０のモル比で準備する。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドおよび機能性ＲＮＡ分子を、約３：１〜約８：１（約４：１など）のモル比で準備する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、疾患状態の細胞（癌細胞など）であり得る哺乳類細胞に結合するように構成されている。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、受容体（ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴなど）であり得る、細胞の表面にある標的分子に結合するように構成されている。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、結果として得られるナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。
【０１２７】
別の態様では、ナノ粒子組成物を作製する方法であって、小分子薬と機能性ＲＮＡ分子を組み合わせて、小分子薬−ＲＮＡ分子を複合体形成するステップと、小分子薬と複合体形成したＲＮＡ分子とキャリアポリペプチドを組み合わせるステップとを含み、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、小分子薬をＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物を、滅菌ろ過または凍結乾燥する。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子および小分子薬を、約１：１〜約１：６０のモル比で準備する。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドおよび機能性ＲＮＡ分子を、約３：１〜約８：１（約４：１など）のモル比で準備する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、疾患状態の細胞（癌細胞など）であり得る哺乳類細胞に結合するように構成されている。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、受容体（ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴなど）であり得る、細胞の表面にある標的分子に結合するように構成されている。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、結果として得られるナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。
【０１２８】
別の態様では、ナノ粒子組成物を作製する方法であって、小分子薬と二本鎖のｓｉＲＮＡ分子を組み合わせて、小分子薬−ｓｉＲＮＡ分子を複合体形成するステップと、小分子薬と複合体形成したｓｉＲＮＡ分子とキャリアポリペプチドを組み合わせるステップとを含み、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、小分子薬をｓｉＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物を、滅菌ろ過または凍結乾燥する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子および小分子薬を、約１：１〜約１：６０のモル比で準備する。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドおよびｓｉＲＮＡ分子を、約３：１〜約８：１（約４：１など）のモル比で準備する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、疾患状態の細胞（癌細胞など）であり得る哺乳類細胞に結合するように構成されている。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、受容体（ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴなど）であり得る、細胞の表面にある標的分子に結合するように構成されている。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、結果として得られるナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。
【０１２９】
別の態様では、ナノ粒子組成物を作製する方法であって、小分子の化学療法剤と二本鎖のｓｉＲＮＡ分子を組み合わせて、化学療法剤−ｓｉＲＮＡ分子を複合体形成するステップと、小分子の化学療法剤と複合体形成したｓｉＲＮＡ分子とキャリアポリペプチドを組み合わせるステップとを含み、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、化学療法剤を、ｓｉＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物を、滅菌ろ過または凍結乾燥する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子および小分子の化学療法剤を、約１：１〜約１：６０のモル比で準備する。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドおよびｓｉＲＮＡ分子を、約３：１〜約８：１（約４：１など）のモル比で準備する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、疾患状態の細胞（癌細胞など）であり得る哺乳類細胞に結合するように構成されている。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、受容体（ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴなど）であり得る、細胞の表面にある標的分子に結合するように構成されている。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、結果として得られるナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。一部の実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン（ドキソルビシンなど）、またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【０１３０】
別の態様では、ナノ粒子組成物を作製する方法であって、小分子の化学療法剤と、少なくとも１つの５’三リン酸の末端を含む二本鎖のｓｉＲＮＡ分子を組み合わせて、化学療法剤−ｓｉＲＮＡ分子を複合体形成するステップと、小分子の化学療法剤と複合体形成したｓｉＲＮＡ分子とキャリアポリペプチドを組み合わせるステップとを含み、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、化学療法剤を、ｓｉＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物を、滅菌ろ過または凍結乾燥する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子および小分子の化学療法剤を、約１：１〜約１：６０のモル比で準備する。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドおよびｓｉＲＮＡ分子を、約３：１〜約８：１（約４：１など）のモル比で準備する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、疾患状態の細胞（癌細胞など）であり得る哺乳類細胞に結合するように構成されている。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、受容体（ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴなど）であり得る、細胞の表面にある標的分子に結合するように構成されている。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、結果として得られるナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。一部の実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン（ドキソルビシンなど）、またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【０１３１】
別の態様では、ナノ粒子組成物を作製する方法であって、小分子の化学療法剤と、二本鎖のｓｉＲＮＡ分子を組み合わせて、化学療法剤−ｓｉＲＮＡ分子を複合体形成するステップと、小分子の化学療法剤と複合体形成したｓｉＲＮＡ分子とＨｅｒＰＢＫ１０を組み合わせるステップとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、化学療法剤を、ｓｉＲＮＡ分子にインターカレートする。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物を、滅菌ろ過または凍結乾燥する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子および小分子の化学療法剤を、約１：１〜約１：６０のモル比で準備する。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドおよびｓｉＲＮＡ分子を、約３：１〜約８：１（約４：１など）のモル比で準備する。一部の実施形態では、結果として得られるナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。一部の実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン（ドキソルビシンなど）、またはアルキル化剤もしくはアルキル化様作用剤である。
【０１３２】
癌治療
本明細書中記載の治療用複合体または本明細書中記載のナノ粒子組成物を含む組成物は、ナノ粒子を含む組成物の有効量を対象に投与することにより癌細胞を殺滅することによって、当該対象の癌の治療に有用とすることができる。キャリアポリペプチドの細胞標的化セグメントは、癌細胞の表面にある分子を標的とし、これにより化学療法剤（たとえば機能性ＲＮＡ分子および小分子薬）を癌細胞に送達することができる。一部の実施形態では、この癌は転移性である。一部の実施形態では、治療用複合体またはナノ粒子組成物は、癌の治療のための医薬の製造に使用される。
【０１３３】
一部の実施形態では、この癌はＨＥＲ３＋癌である。Ｈｅｒ細胞標的化セグメントは、たとえば、本ナノ粒子の標的が癌細胞となるために、ＨＥＲ３＋癌細胞の表面に存在するＨＥＲ３と結合することができる。一部の実施形態では、この癌は、ｃ−ＭＥＴ＋癌である。ＩｎｌＢ細胞標的化セグメントは、たとえば、本ナノ粒子が癌細胞を標的とするために、ｃ−ＭＥＴ＋癌細胞の表面に存在するｃ−ＭＥＴと結合することができる。
【０１３４】
一部の実施形態では、本ナノ粒子を含む組成物の有効量を、頭頸部癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、グリアの癌、子宮頸癌、胃癌、皮膚癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、または甲状腺癌を治療するために対象に投与する。多くの癌は、特定の細胞表面分子に関する発現がアップレギュレートされている。このようなアップレギュレートされた分子のうちの１つ以上は、キャリアタンパク質の細胞標的化セグメントにとって好ましい標的である。
【０１３５】
一部の実施形態では、癌を有する対象を治療する方法は、さらに、放射線療法または外科手術などの二次的な治療を含む。よって、一部の実施形態では、本明細書中記載のナノ粒子を含む組成物は、ネオアジュバント療法として、癌を有する対象に投与される。
【０１３６】
一部の実施形態では、対象は、本明細書中記載のナノ粒子の投与の前に、化学療法または放射線療法を経験していない。一部の実施形態では、対象は、化学療法または放射線療法を経験している。
【０１３７】
一部の実施形態では、本明細書中記載のナノ粒子組成物を、対象に投与する。一部の実施形態では、本ナノ粒子組成物を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける標的の細胞への送達のために、対象に投与する。一般的に、本ナノ粒子組成物の用量および投与経路は、対象の大きさおよび状態により、標準的な医薬の実務にしたがい、決定される。一部の実施形態では、本ナノ粒子組成物を、経口投与、経皮投与、吸入による投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、創傷部位への直接的な塗布、外科部位への適用、腹腔内投与、坐薬による投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、噴霧療法による投与、胸膜内投与、脳室内投与、関節内投与、眼内投与、または脊髄内投与を含むいずれかの経路を介して、対象に投与する。一部の実施形態では、本組成物を、静脈内投与により、対象に投与する。
【０１３８】
一部の実施形態では、本ナノ粒子組成物の投与は、単回投与または反復投与である。一部の実施形態では、この投与は、１日に１回、１日に２回、１日に３回、または１日に４回以上、対象に提供される。一部の実施形態では、１週間に約１回以上（たとえば約２、３、４、５、６、または７回以上）の投与を提供する。一部の実施形態では、本組成物を、１週間に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、３週間のうち２週間の間は週に１回、または４週間のうち３週間の間は週に１回、投与する。一部の実施形態では、数日、数週間、数か月、または数年の治療課程にわたり、複数回の投与を提供する。一部の実施形態では、治療課程は、約１回以上の投与（たとえば約２、２、３、４、５、７、１０、１５、または２０回以上の投与）である。
【０１３９】
一部の実施形態では、投与される本ナノ粒子組成物の用量は、小分子薬が約２００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、またはｍｇ／ｍ２またはそれ以下である。
【０１４０】
一態様では、対象の癌を治療する方法であって、キャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物の有効量を上記対象に投与するステップを含み、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、この癌は、頭頸部癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、グリアの癌、子宮頸癌、胃癌、皮膚癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、腎臓癌、または甲状腺癌である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、本ナノ粒子組成物における機能性ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、本組成物におけるキャリアポリペプチドの機能性ＲＮＡ分子に対するモル比は、約３：１〜約８：１（約４：１など）である。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、癌細胞と結合する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、癌細胞の表面にある標的分子と結合し、この標的分子は受容体（ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴなど）であり得る。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、本組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。
【０１４１】
一態様では、対象のＨＥＲ３＋癌を治療する方法であって、キャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物の有効量を上記対象に投与するステップを含み、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、この癌は、頭頸部癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、グリアの癌、子宮頸癌、胃癌、皮膚癌、結腸癌、または直腸癌である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、本ナノ粒子組成物における機能性ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、本組成物におけるキャリアポリペプチドの機能性ＲＮＡ分子に対するモル比は、約３：１〜約８：１（約４：１など）である。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、ＨＥＲ３＋癌細胞と結合する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、ＨＥＲ３と結合する。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、キャリアポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０である。一部の実施形態では、本組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。
【０１４２】
一態様では、対象のｃ−ＭＥＴ＋癌を治療する方法であって、キャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物の有効量を上記対象に投与するステップを含み、上記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメント、細胞透過性セグメント、およびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、この癌は、頭頸部癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、腎臓癌、または甲状腺癌である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、本ナノ粒子組成物における機能性ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、本組成物におけるキャリアポリペプチドの機能性ＲＮＡ分子に対するモル比は、約３：１〜約８：１（約４：１など）である。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、ｃ−ＭＥＴ＋癌細胞と結合する。一部の実施形態では、細胞標的化セグメントは、ｃ−ＭＥＴと結合する。一部の実施形態では、細胞透過性セグメントは、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合セグメントは、正に荷電しており、たとえばポリリジンである。一部の実施形態では、本組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。
【０１４３】
一態様では、対象のＨＥＲ３＋癌を治療する方法であって、ＨｅｒＰＢＫ１０と、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子とを含むナノ粒子を含む組成物の有効量を上記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、この癌は、頭頸部癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、グリアの癌、子宮頸癌、胃癌、皮膚癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、または直腸癌である。一部の実施形態では、機能性ＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、本ナノ粒子組成物における機能性ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比は、約１：１〜約１：６０である。一部の実施形態では、本組成物におけるキャリアポリペプチドの機能性ＲＮＡ分子に対するモル比は、約３：１〜約８：１（約４：１など）である。一部の実施形態では、本組成物中のナノ粒子の大きさの平均は、約１００ｎｍ以下（約６０ｎｍ以下または約５０ｎｍ以下など）である。
【０１４４】
医薬組成物
一部の実施形態では、本明細書中記載の組成物は、本明細書中記載の複数のナノ粒子および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として、製剤化されている。
【０１４５】
一部の実施形態では、医薬組成物は、散剤などの固体である。この散剤は、たとえば本ナノ粒子を含む液剤を凍結乾燥することにより、形成することができる。この散剤は、たとえば、当該散剤を水系の液体（たとえば水またはバッファー）と混合することにより、再構成することができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、液体、たとえば水系の溶液（生理食塩水またはリンガー液など）に懸濁されたナノ粒子である。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、たとえば充填剤、結合剤、コーティング剤、保存剤、潤滑剤、香料、甘味剤、着色剤、溶媒、緩衝剤、キレート剤、または安定剤を含む。
【０１４６】
薬学的に許容される充填剤の例として、セルロース、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム、結晶セルロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、マルトール、アルファ化デンプン、コーンスターチ、またはポテトスターチが挙げられる。薬学的に許容される結合剤の例として、ポリビニルピロリドン、デンプン、ラクトース、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ゼラチン、スクロース、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、またはセルロースが挙げられる。薬学的に許容されるコーティング剤の例として、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、シェラック、トウモロコシタンパク質のゼイン、またはゼラチンが挙げられる。薬学的に許容される崩壊剤の例として、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、またはグリコール酸でん粉ナトリウムが挙げられる。薬学的に許容される潤滑剤の例として、ポリエチレングリコール、ステアリン酸マグネシウム、またはステアリン酸が挙げられる。薬学的に許容される保存剤の例として、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、またはソルビン酸が挙げられる。薬学的に許容される甘味剤の例として、スクロース、サッカリン、アスパルテーム、またはソルビトールが挙げられる。薬学的に許容される緩衝剤の例として、炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、または酒石酸塩が挙げられる。
【０１４７】
製品およびキット
本明細書中記載の組成物を適切なパッケージングで含む製品も提供される。本明細書中記載の組成物に適切なパッケージングは、当該分野で知られており、たとえば、バイアル（密閉されたバイアルなど）、容器、アンプル、ビン、ジャー、可塑性パッケージ（たとえば密閉されたマイラーまたはプラスチックのバッグ）などが挙げられる。これらの製品は、さらに滅菌および／または密閉されていてもよい。
【０１４８】
また本発明は、本明細書中記載の組成物（または製品）を含むキットを提供し、本明細書中記載の使用などの本組成物を使用する方法に関する説明書をさらに含み得る。本明細書中記載のキットは、商業的観点およびユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよく、これは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、および本明細書中記載のいずれかの方法を行うための説明書を伴う添付文書を含む。
【０１４９】
例示的な実施形態
実施形態１．小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子を含む組成物であって、前記機能性ＲＮＡ分子が、標的タンパク質の発現を調節する、組成物。
【０１５０】
実施形態２．小分子薬がインターカレートした少なくとも１つの相補領域を含む機能性ＲＮＡ分子を含む、組成物。
【０１５１】
実施形態３．前記機能性ＲＮＡ分子が、標的タンパク質の発現を調節する、実施形態２に記載の組成物。
【０１５２】
実施形態４．前記機能性ＲＮＡ分子と前記小分子薬とを含むリポソームを含む、実施形態１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【０１５３】
実施形態５．前記リポソームが、細胞標的化セグメントを含む、実施形態４に記載の組成物。
【０１５４】
実施形態６．キャリアポリペプチドと、小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子と、を含むナノ粒子を含む組成物であって、前記キャリアポリペプチドが細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、組成物。
【０１５５】
実施形態７．前記組成物におけるキャリアポリペプチドの機能性ＲＮＡ分子に対するモル比が、約３：１〜約８：１である、実施形態６に記載の組成物。
【０１５６】
実施形態８．前記小分子薬が、前記機能性ＲＮＡ分子にインターカレートされており、前記機能性ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの相補領域を含む、実施形態１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【０１５７】
実施形態９．前記細胞透過性セグメントが、ペントンベースポリペプチドまたはそのバリアントを含む、実施形態６〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【０１５８】
実施形態１０．前記オリゴヌクレオチド結合セグメントが、正に荷電している、実施形態６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【０１５９】
実施形態１１．前記オリゴヌクレオチド結合セグメントが、ポリリジンを含む、実施形態６〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【０１６０】
実施形態１２．前記オリゴヌクレオチド結合セグメントが、デカリジンを含む、実施形態６〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【０１６１】
実施形態１３．前記組成物中のナノ粒子の大きさの平均が、約１００ｎｍ以下である、実施形態６〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【０１６２】
実施形態１４．前記キャリアポリペプチドが、細胞標的化セグメントをさらに含む、実施形態６〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【０１６３】
実施形態１５．前記細胞標的化セグメントが、哺乳類細胞と結合する、実施形態５または１４に記載の組成物。
【０１６４】
実施形態１６．前記細胞標的化セグメントが、疾患状態の細胞と結合する、実施形態５、１４、または１５のいずれか１項に記載の組成物。
【０１６５】
実施形態１７．前記細胞標的化セグメントが、癌細胞と結合する、実施形態５、および１４〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【０１６６】
実施形態１８．前記癌細胞が、ＨＥＲ３＋癌細胞またはｃ−ＭＥＴ＋癌細胞である、実施形態１７に記載の組成物。
【０１６７】
実施形態１９．前記癌細胞が、頭頸部癌細胞、膵癌細胞、乳癌細胞、グリアの癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、胃癌細胞、皮膚癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、または甲状腺癌細胞である、実施形態１７または１８に記載の組成物。
【０１６８】
実施形態２０．前記細胞標的化セグメントが、細胞の表面にある標的分子と結合する、実施形態５、および１４〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【０１６９】
実施形態２１．前記細胞標的化セグメントが、細胞の表面にある受容体と結合する、実施形態５、および１４〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【０１７０】
実施形態２２．前記細胞標的化セグメントが、ＨＥＲ３またはｃ−ＭＥＴと結合する、実施形態５、および１４〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【０１７１】
実施形態２３．前記細胞標的化セグメントが、細胞の表面に発現した受容体に特異的に結合するリガンドを含む、実施形態５、および１４〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【０１７２】
実施形態２４．前記細胞標的化セグメントが、
ｉ．ヘレグリン配列もしくはそのバリアント、または
ｉｉ．インターナリンＢ配列もしくはそのバリアント
を含む、実施形態５、および１４〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【０１７３】
実施形態２５．前記細胞標的化セグメントが、ヘレグリンαの受容体結合ドメインを含む、実施形態５、および１４〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【０１７４】
実施形態２６．前記機能性ＲＮＡ分子の少なくとも一部が、二本鎖である、実施形態１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【０１７５】
実施形態２７．前記機能性ＲＮＡ分子が、一本鎖であり、少なくとも１つの自己相補的な領域を含む、実施形態１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【０１７６】
実施形態２８．前記機能性ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ（Ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｔｓＲＮＡ（ｔｏｘｉｃ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）、またはリボザイムである、実施形態１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【０１７７】
実施形態２９．前記機能性ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である、実施形態１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【０１７８】
実施形態３０．前記機能性ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの三リン酸の５’末端を有する、実施形態１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【０１７９】
実施形態３１．前記機能性ＲＮＡ分子が、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である、実施形態１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【０１８０】
実施形態３２．前記組成物における機能性ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比が、約１：１〜約１：６０である、実施形態１〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【０１８１】
実施形態３３．前記組成物における機能性ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比が、約１：５〜約１：６０である、実施形態１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【０１８２】
実施形態３４．前記組成物における機能性ＲＮＡ分子の小分子薬に対するモル比が、約１：１０〜約１：６０である、実施形態１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【０１８３】
実施形態３５．前記小分子薬が、化学療法剤である、実施形態１〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
【０１８４】
実施形態３６．前記小分子薬が、アントラサイクリンである、実施形態１〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【０１８５】
実施形態３７．前記小分子薬が、ドキソルビシンである、実施形態１〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【０１８６】
実施形態３８．前記小分子薬が、アルキル化剤またはアルキル化様作用剤である、実施形態１〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【０１８７】
実施形態３９．前記小分子薬が、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、プロカルバジン、またはチオテパである、実施形態１〜３６および３８のいずれか１項に記載の組成物。
【０１８８】
実施形態４０．前記組成物が無菌である、実施形態１〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【０１８９】
実施形態４１．前記組成物が液体の組成物である、実施形態１〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【０１９０】
実施形態４２．前記組成物が、乾燥した組成物である、実施形態１〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【０１９１】
実施形態４３．前記組成物が、凍結乾燥されている、実施形態４２に記載の組成物。
【０１９２】
実施形態４４．薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態１〜４３のいずれか１項に記載の組成物を含む医薬組成物。
【０１９３】
実施形態４５．バイアル内に実施形態１〜４４のいずれか１項に記載の組成物を含む製品。
【０１９４】
実施形態４６．前記バイアルが密閉されている、実施形態４５に記載の製品。
【０１９５】
実施形態４７．実施形態１〜４４のいずれか１項に記載の組成物と、使用説明書とを含むキット。
【０１９６】
実施形態４８．対象の癌を治療する方法であって、実施形態１〜４４のいずれか１項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【０１９７】
実施形態４９．前記癌が、ＨＥＲ３＋癌またはｃ−ＭＥＴ＋癌である、実施形態４８に記載の方法。
【０１９８】
実施形態５０．前記癌が、頭頸部癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、グリアの癌、子宮頸癌、胃癌、皮膚癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、または甲状腺癌である、実施形態４８または４９に記載の方法。
【０１９９】
実施形態５１．組成物を作製する方法であって、機能性ＲＮＡ分子と小分子薬を組み合わせるステップであって、前記小分子薬は、前記機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする、ステップを含む、方法。
【０２００】
実施形態５２．ナノ粒子組成物を作製する方法であって、キャリアポリペプチド、機能性ＲＮＡ分子、および小分子薬を組み合わせるステップを含み、前記キャリアポリペプチドが、細胞透過性セグメントおよびオリゴヌクレオチド結合セグメントを含む、方法。
【０２０１】
実施形態５３．前記小分子薬と前記機能性ＲＮＡ分子を組み合わせて、前記小分子薬−前記機能性ＲＮＡ分子を複合体形成するステップと、
前記小分子薬と複合体形成した機能性ＲＮＡ分子と、前記キャリアポリペプチドを組み合わせるステップと
を含む、実施形態５２に記載の方法。
【０２０２】
実施形態５４．前記小分子薬を、前記機能性ＲＮＡ分子にインターカレートする、実施形態５２または５３に記載の方法。
【０２０３】
実施形態５５．結合していない小分子薬を除去するステップを含む、実施形態５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【０２０４】
実施形態５６．前記ナノ粒子組成物を滅菌ろ過するステップをさらに含む、実施形態５１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【０２０５】
実施形態５７．前記ナノ粒子組成物を凍結乾燥するステップをさらに含む、実施形態５１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【０２０６】
実施形態５８．標的タンパク質の発現の調節および細胞増殖の阻害を同時に行う方法であって、実施形態１〜４４のいずれか１項に記載の組成物の有効量を前記細胞に投与するステップを含む、方法。
【０２０７】
実施形態５９．細胞を殺滅する方法であって、実施形態１〜４４のいずれか１項に記載の組成物の有効量を前記細胞に投与するステップを含む、方法。
【０２０８】
実施形態６０．免疫応答の刺激および細胞の殺滅を同時に行う方法であって、実施形態１〜４４のいずれか１項に記載の組成物の有効量を前記細胞に投与するステップを含み、前記機能性ＲＮＡ分子が、免疫チェックポイントタンパク質の発現を調節する、方法。
【０２０９】
実施例
本明細書中提供される実施例は、単に説明のために含まれており、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。
【０２１０】
実施例１：ナノ粒子の構築
キャリアポリペプチド、機能性ＲＮＡ分子、および小分子薬（ドキソルビシンなど）を含むナノ粒子は、以下の方法を使用して構築することができる。
【０２１１】
一本鎖のｓｉＲＮＡおよびその相補的ＲＮＡ分子を、各オリゴヌクレオチドを等モル比で、沸騰水において５分間インキュベートすることにより、アニーリングすることができる。次に、オリゴヌクレオチドを、室温で３０分間冷却することができる。
【０２１２】
次に、二本鎖のアニーリングしたｓｉＲＮＡ分子を、ドキソルビシン  ＨＣｌと、１：４０（ＲＮＡ：Ｄｏｘ）のモル比で、室温で３０分間インキュベートすることができる。
【０２１３】
次に、ドキソルビシンと結合したｓｉＲＮＡ分子を、Ｈｅｒ細胞標的化セグメント、ＰＢ細胞透過性セグメント、およびデカリジン（「Ｋ１０」）オリゴヌクレオチド結合セグメントを含むキャリアポリペプチド（ＨｅｒＰＢＫ１０など）と、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）において４：１（ＨｅｒＰＢＫ１０：ｓｉＲＮＡ−ドキソルビシン）のモル比（よって、４：１：４０（ＨｅｒＰＢＫ１０：ｓｉＲＮＡ：ドキソルビシン）のモル比）でインキュベートすることができる。キャリアポリペプチドおよびドキソルビシンと結合したｓｉＲＮＡの混合物を、氷上で２時間振とうすることにより、ナノ粒子を形成することができる。
【０２１４】
結果得られるナノ粒子を、超遠心分離法に供することができる。具体的には、滅菌性ＨＢＳ１２ｍＬを、滅菌性の１０％のグリセロールにおいて２４時間プレインキュベートすることができるカットオフが５０ｋＤのＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５）に添加することができる。このナノ粒子混合物を、遠心フィルターにおける冷却したＨＢＳに添加することができる。フィルターチューブを、最終的な体積が２００μＬ〜５００μＬとなるまでＢｅｃｋｍａｎのＪ６−ＨＣ遠心分離器で、２５００ＲＰＭ（５０００×ｇ）で１０〜２０分間回転させることができる。次に、濃縮したナノ粒子を、１．７ｍＬのマイクロチューブに移すことができる。
【０２１５】
ナノ粒子薬を含まないナノ粒子を、小分子薬と複合体形成していないｓｉＲＮＡとＨｅｒＰＢＫ１０をインキュベートすることにより調製することができる（たとえば米国特許出願第２０１２／０００４１８１号参照）。他の比較上のナノ粒子を、たとえば小分子薬と複合体形成している二本鎖のＤＮＡとＨｅｒＰＢＫ１０をインキュベートすることにより形成することができる（たとえば米国特許第９，０７８，９２７号参照）。
【０２１６】
実施例２：癌細胞および化学療法薬耐性癌細胞を殺滅するためのナノ粒子の使用
ドキソルビシンと結合したｓｉＲＮＡを含むナノ粒子、ｓｉＲＮＡを含むがドキソルビシンを含まないナノ粒子、またはドキソルビシンと結合したｄｓＤＮＡを含むナノ粒子を、様々な種類の癌細胞を殺滅するこれらの特性に関して、比較することができる。
【０２１７】
様々な用量のナノ粒子を、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ヒト癌）細胞、ＢＴ４７４（ヒト乳癌）細胞、Ｕ２５１（ヒトグリオーマ）細胞、ＳＫＯＶ３（ヒト卵巣癌）細胞、ＬＮＣａＰ−ＧＦＰ（ヒト前立腺癌）細胞、またはＲＡＮＫＬ（ヒト骨転移性前立腺癌）細胞のいずれかと共に、インキュベートすることができる。
【０２１８】
記載の組成物へ曝露した後の相対的な細胞生存を、細胞生存率アッセイを使用して測定することができる。この細胞を、壁が黒く底が透明な９６ウェルプレートに載置することができる。４８時間後に、培地を吸引し、完全培地および指定の濃度のナノ粒子と、最終体積４０μＬで交換することができる。プレートを５％のＣＯ２下、３７℃で４時間振とうすることができ、次に完全培地６０μＬを各ウェルに添加して、最終体積を１００μＬにすることができ、インキュベーションを、振とうすることなく、５％ＣＯ２下、３７℃で４４時間続行した。インキュベーション終了時に、相対的な細胞生存率を、製造社の指示にしたがいＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を介して決定することができる。具体的には、培地をウェルから除去することができ、１００μＬの新鮮な完全培地を各ウェルに添加することができる。調製したＭＴＳ試薬２０μｌを各ウェルに添加することができる。次に、プレートを、振とうしながら、５％のＣＯ２下、３７℃でインキュベートすることができ、分光光度計にて１時間目、２時間目、および３時間目に、４９０ｎｍでプレートの読み取りを行った。この結果を、以下の比率：未処置の群で生存した細胞の数で除算した処置群で生存した細胞の数の観点から、示すことができる。よって、１．０の細胞生存は、処置した細胞および未処置の細胞が同じ度合で生存したことを表しており、対して０．２の比率は、未処置の細胞の群と比較して、処置した細胞の２０％のみが生存したことを意味している。
【０２１９】
実施例３：二本鎖ｓｉＲＮＡにインターカレートされたドキソルビシンを伴う治療用複合体の構築
２つの異なる治療用複合体を、二本鎖のｓｉＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ１」（２１塩基長）、および「ｓｉＲＮＡ２」（２１塩基長））とドキソルビシンを組み合わせることにより形成した。第１の治療用複合体では、１０μＬのドキソルビシン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；１０ｍＭの保存溶液）および５．２μＬのｓｉＲＮＡ１（０．４８ｍＭの保存溶液）を、４６５μＬのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）と組み合わせた。第２の治療用複合体では、１０μＬのドキソルビシン（１０ｍＭの保存溶液）および２５μＬのｓｉＲＮＡ１（０．１ｍＭの保存溶液）を、４８４．８μＬのＨＢＳと組み合わせた。各治療用複合体の試料を、振とうしながら室温で３０分間インキュベートした後に、１０Ｋ  ＭＷＣＯフィルターを使用して遠心分離を行い、未結合のドキソルビシンを除去した。対照として、１０μＬのドキソルビシン（１０ｍＭの保存溶液）を、４９０μＬのＨＢＳに添加したが、フィルターを通さなかった。ろ過前の治療用複合体、残余分（ｒｅｎｔｅｎｔａｔｅ）、およびろ過物の試料（１０μＬ）を、図２に示すように、１％のアガロースゲル上で解析した。レーンおよび対応する試料を、表１に表す。
【表１】
2019529571.tif 000003
【０２２０】
図２に示されているように、ｓｉＲＮＡは、レーン２、３、５、および６で検出されているが、レーン７および８では検出されていない。このことは、両複合体（Ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ１およびＤｏｘ：ｓｉＲＮＡ２）のｓｉＲＮＡが、残余分に保持されており、フィルターを介してろ過物へと通らなかったことを表している。
【０２２１】
また、各試料の残余分（retantate）（１００μＬ）およびろ過物（filtrate）（１００μＬ）に関して、４００ｎｍ〜７００ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果を図３に示す（黒丸は残余分を表し、白丸はろ過物を表す）。Ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ１複合体およびＤｏｘ：ｓｉＲＮＡ２複合体の両方において、残余分は、約４８０ｎｍで約０．２１の最大吸光度を有し、これはドキソルビシンに関する吸光度の最大値である。対照的に、Ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ１およびＤｏｘ：ｓｉＲＮＡ２の複合体のろ過物は、約４９０ｎｍに有意なピークを有さなかった。このことは、試料におけるドキソルビシンは、残余分で保持されており、よって、ｓｉＲＮＡと複合体形成したことを表している。
【０２２２】
実施例４：治療用複合体を使用した遺伝子のサイレンシングおよび細胞生存率の減少
ドキソルビシンと複合体形成した、寄せ集めた非機能性の二本鎖のＲＮＡ分子（「ｓｉＳｃｒｍ１」（２１塩基長））、二本鎖の機能性ｓｉＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ１」（２１塩基長）、もしくは「ｓｉＲＮＡ２」（２１塩基長））、または二本鎖ＤＮＡ（「ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏ」（３０塩基長））を含む複合体を、２．５ｎｍｏｌのＲＮＡまたはＤＮＡとドキソルビシン１００ｎｍｏｌを組み合わせることにより形成した。第１の複合体では、１０μＬのドキソルビシン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；１０ｍＭの保存溶液）および２５μＬのｓｉＳｃｒｍ１（０．２ｍＭの保存溶液）を、３６５μＬのＨＢＳと組み合わせた。第２の複合体では、１０μＬのドキソルビシン（２０ｍＭの保存溶液）および５．２μＬのｓｉＲＮＡ１（０．４８ｍＭの保存溶液）を、３８４．８μＬのＨＢＳと組み合わせた。第３の複合体では、１０μＬのドキソルビシン（２０ｍＭの保存溶液）および２５μＬのｓｉＲＮＡ２（０．１ｍＭの保存溶液）を、３６５μＬのＨＢＳと組み合わせた。第４の複合体では、１０μＬのドキソルビシン（２０ｍＭの保存溶液）および２．５μＬのＤＮＡ  ｏｌｉｇｏ（１ｍＭの保存溶液）を、３８７．５μＬのＨＢＳと組み合わせた。各試料を、振とうしながら室温で３０分間インキュベートした後、１０Ｋ  ＭＷＣＯフィルターを使用して遠心分離を行い、未結合のドキソルビシンを除去した。各試料の残余分（ｒｅｔａｎｔａｔｅ）（１００μＬ）およびろ過物（１００μＬ）に関して、４００ｎｍ〜７００ｎｍの吸光度を同様に測定した。これらの結果を、図４に示す（黒色の記号は残余分を表し、白色の記号は、ろ過物を表す）。各残余分の試料は、約４８０ｎｍに吸光度のピークを有した（Ｄｏｘ：ｓｉＳｃｒｍ１の最大吸光度  〜０．９；Ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ１の最大吸光度  〜０．７；Ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ２の最大吸光度  〜１．４；Ｄｏｘ：ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏの最大吸光度  〜１．１）。各試料のろ過物は、有意なピークを有しておらず、これは、実質的な量のドキソルビシンがないことを表している。ドキソルビシンは、ＤＮＡまたはＲＮＡと複合体化した残余分において、検出された。ドキソルビシンおよびＤＮＡまたはＲＮＡに関する収量を、表２に示すように計算した。ドキソルビシンの収量を、ドキソルビシンの標準曲線を使用して４８０ｎｍでの吸光度に基づき決定した。核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の収量を、試料を８５℃に加熱した後の２６０ｎｍでの吸光度に基づき決定した。
【表２】
2019529571.tif 000004
【０２２３】
細胞生存率に関するこれら複合体の効果を測定するために、形成した複合体を、ＪＩＭＴ１細胞（トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍｂ）耐性ヒト乳癌）にトランスフェクトした。ウェルあたり約１０，０００個の細胞を、９６ウェルプレートにプレーティングし、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０培地において、５％のＣＯ２下、３７℃で維持した。２４時間後に、培養培地を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ血清低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。ＲＮＡｉＭａｘリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ｓｉＲＮＡ、Ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ複合体、およびＤｏｘ：ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏ複合体の送達のための担体として使用した。対照の試料に、ドキソルビシンを、リポフェクタミンを用いずに投与した。トランスフェクションから３時間後に、各試料の培地を完全培養培地と交換した。２４時間後、４８時間後、または７２時間後に、相対的な細胞生存率を、製造社の指示にしたがいＣｅｌｌｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＴＰを定量化することにより、決定した。実験を３重に行った。結果を図５Ａ（２４時間）、５Ｂ（４８時間）、および５Ｃ（７２時間）に示す。
【０２２４】
ＲＮＡ単独（ｓｉＳｃｒｍ１、ｓｉＲＮＡ１、またはｓｉＲＮＡ２のいずれか）は、細胞生存率にほとんどまたは全く効果がなかった。７２時間後に、細胞生存率が小さく減少したが、これは用量依存的ではなく、実験課程の間の自然な細胞死が原因である。ドキソルビシンと複合体形成した二本鎖のＲＮＡ、またはドキソルビシン単独は、２４時間後、４８時間後、および７２時間後に、用量依存的な細胞生存率の減少を示した。予想外なことに、ｓｉＲＮＡおよびドキソルビシンを含む治療用複合体は、ドキソルビシン単独と比較して有意な細胞生存率の減少をもたらした（特に４８時間目および７２時間目の時点で視認可能）。このことは、細胞に投与したＤｏｘ：ｓｉＲＮＡ２複合体のドキソルビシンの用量が、ドキソルビシン単独の用量と比較して実質的に低かったことを考慮すると、さらに驚くべきものである（０．３／０．９／３．０ｎｍｏｌと比較して、０．０５／０．２／０．９ｎｍｏｌ）。さらに、Ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ複合体は、低い用量のドキソルビシンを投与した場合であっても、少なくともＤｏｘ：ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏ複合体と同様の細胞生存率の減少をもたらした。
【０２２５】
ドキソルビシンと複合体形成したｓｉＲＮＡが、トランスフェクション後に機能性を保持していたことを確かにするために、ｓｉＲＮＡ分子のＲＮＡ標的を、ｑＰＣＲを使用して定量化した。総ＲＮＡを、ＴｒｉＺｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、トランスフェクションから２４時間後に、トランスフェクトしたＪＩＭＴ１細胞から抽出した。製造社の指示にしたがいｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、逆転写を、総ＲＮＡ１μｇで行った。特定のプライマー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎのセットを、増幅に使用した。ｑＰＣＲ反応を、以下（９５℃で３０秒、次に、９５℃で１０秒および６０℃で３０秒を４０サイクル）の通りに、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ（商標）の器具（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で行った。この反応の特異性を、融解曲線分析により検証した。試料を、ΔΔＣｔ法を使用してＨＰＲＴ１に対して正規化した。結果を、図６Ａ（ｓｉＲＮＡ１）および６Ｂ（ｓｉＲＮＡ２）に示す。
【０２２６】
予測されるように、ｓｉＳｃｒｍ１およびｓｉＲＮＡ２は、ｓｉＲＮＡ１の標的のｍＲＮＡの値を減少させず、対して、ｓｉＲＮＡ１は、ｍＲＮＡの値を減少させている。さらに、ｄｏｘ：ｓｉＳｃｒｍ１、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ２、およびｄｏｘ：ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏの複合体は、ｓｉＲＮＡ１の標的のｍＲＮＡの値に影響を与えていない。対照的に、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ１複合体は、ｓｉＲＮＡ１の標的のｍＲＮＡの値の有意な減少を引き起こしており、これは、ｓｉＲＮＡ分子がドキソルビシンと複合体形成していたとしても、複合体におけるｓｉＲＮＡ１が機能的なままであることを表している。図６Ｂは、ｓｉＲＮＡ２の標的のｍＲＮＡに関して同様の結果を示しており、ｓｉＲＮＡ２分子単独およびｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ２複合体のみが、ｓｉＲＮＡ２の標的のｍＲＮＡのより完全なサイレンシングをもたらしている。
【０２２７】
これら組み合わせの結果は、ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ複合体が形成されていること、およびｓｉＲＮＡおよびドキソルビシンが、細胞に投与した後でも機能的なままであることを表している。
【０２２８】
実施例５：治療用複合体を使用した遺伝子のサイレンシングおよび細胞生存率の減少
ドキソルビシンと複合体形成した、寄せ集めた非機能性の二本鎖のＲＮＡ分子（「ｓｉＳｃｒｍ２」（２１塩基長））、または二本鎖の機能性ｓｉＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ３」（２１塩基長））を含む複合体を、２．５ｎｍｏｌのＲＮＡとドキソルビシン１００ｎｍｏｌを組み合わせることにより形成した。第１の複合体では、２０μＬのドキソルビシン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；５ｍＭの保存溶液）および５０μＬのｓｉＳｃｒｍ２（０．０５ｍＭの保存溶液）を、３５０μＬのＨＢＳと組み合わせた。第２の複合体では、２０μＬのドキソルビシン（５ｍＭの保存溶液）および５０μＬのｓｉＲＮＡ３（０．０５ｍＭの保存溶液）を、３５０μＬのＨＢＳと組み合わせた。各試料を、振とうしながら室温で３０分間インキュベートした後に、１０Ｋ  ＭＷＣＯフィルターを使用して遠心分離を行い、未結合のドキソルビシンを除去した。各試料の残余分（ｒｅｔａｎｔａｔｅ）（１００μＬ）およびろ過物（１００μＬ）に関して、４００ｎｍ〜７００ｎｍの吸光度を、同様に測定した。これらの結果を、図７に示す（黒色の記号は残余分を表し、白色の記号はろ過物を表す）。各残余分の試料は、約４８０ｎｍに吸光度のピークを有していた（Ｄｏｘ：ｓｉＳｃｒｍ２の最大吸光度  〜０．９５；Ｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ３の最大吸光度  〜０．８５）。各試料のろ過物は、有意なピークを有しておらず、このことは、実質的な量のドキソルビシンがないことを表している。残余分で検出されたドキソルビシンは、ＤＮＡまたはＲＮＡと複合体形成していた。ドキソルビシンおよびＲＮＡの収量を、表３に示すように計算した。ドキソルビシンの収量を、ドキソルビシンの標準曲線を使用して４８０ｎｍでの吸光度に基づき決定した。ＲＮＡの収量を、試料を８５℃に加熱した後の２６０ｎｍでの吸光度に基づき、決定した。
【表３】
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【０２２９】
細胞生存率に関するこれら複合体の効果を測定するために、形成した複合体を、４Ｔ１−Ｆｌｕｃ−Ｎｅｏ／ｅＧＦＰ−Ｐｕｒｏ細胞（安定してＦＬｕｃおよびｅＧＦＰを発現するマウスの乳癌細胞）にトランスフェクトした。ウェルあたり約１０，０００個の細胞を、９６ウェルプレートにプレーティングし、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０培地において、５％ＣＯ２下、３７℃で維持した。２４時間後に、培養培地を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ血清低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。ＲＮＡｉＭａｘリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ｓｉＳｃｒｍ２、ｄｏｘ：ｓｉＳｃｒｍ２、ｓｉＲＮＡ３、またはｄｏｘ：ｓｉＲＮＡ３の送達のための担体として使用した。対照の試料に、ドキソルビシンを、リポフェクタミンを用いずに投与した。トランスフェクションから３時間後に、各試料の培地を、完全培養培地と交換した。２４時間後に、相対的な細胞生存率を、製造社の指示にしたがいＣｅｌｌｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＴＰを定量化することにより、決定した。実験を３重に行った。結果を図８に示す。
【０２３０】
ＲＮＡ単独（ｓｉＳｃｒｍ２またはｓｉＲＮＡ３）は、細胞生存率にほとんどまたは全く効果がなかった。ドキソルビシンと複合体形成した二本鎖のＲＮＡ、またはドキソルビシン単独は、２４時間後に、用量依存的な細胞生存率の減少を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月5日(2019.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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