(57)【要約】  本明細書では、インタクトなＩＩＩ型プロコラーゲンのＮ−プロテアーゼ開裂によって作られるＰＩＩＩＮＰのＣ末端のネオエピトープをそれぞれ含む鎖間架橋によって一緒に接続したＰＩＩＩＮＰの少なくとも２つの鎖を有する架橋ＰＩＩＩＮＰを検出するためのサンドイッチイムノアッセイが提供される。架橋ＰＩＩＩＮＰを含む生体サンプルを、第１の表面結合したモノクローナル抗体と接触させ、次いで、第２のモノクローナル抗体と接触させ、両方ともＰＩＩＩＮＰのＣ末端のネオエピトープと特異的に反応し、次いで、第２のモノクローナル抗体の結合を決定する。また、イムノアッセイを介してリシルオキシダーゼを標的とするアンタゴニスト薬の効能を評価する方法、および第１のモノクローナル抗体に結合する固体支持体を含み、第２のモノクローナル抗体を含有するキットも提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルにおいて架橋ＰＩＩＩＮＰを検出するためのサンドイッチイムノアッセイであって、前記架橋ＰＩＩＩＮＰが、鎖間架橋によって一緒に接続したＰＩＩＩＮＰの少なくとも２つの鎖を含み、この方法が、
前記架橋ＰＩＩＩＮＰを含む前記生体サンプルと、ある表面に結合した第１のモノクローナル抗体とを接触させることであって、架橋ＰＩＩＩＮＰに含まれるそれぞれのＰＩＩＩＮＰ鎖が、インタクトなＩＩＩ型プロコラーゲンのＮ−プロテアーゼ開裂によって生成するＰＩＩＩＮＰのＣ末端ネオエピトープを有する、接触させることと、
第２のモノクローナル抗体を加えることと、
前記第２のモノクローナル抗体の結合量を決定することとを含み、
前記第１のモノクローナル抗体および前記第２のモノクローナル抗体は、両方とも、ＰＩＩＩＮＰの前記Ｃ末端ネオエピトープに特異的に反応し、前記ネオエピトープは、Ｃ末端アミノ酸配列ＣＰＴＧＸＱＮＹＳＰ−ＣＯＯＨを含み、ＸはＧｌｙまたはＰｒｏである、サンドイッチイムノアッセイ。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、ＣＰＴＧＸＱＮＹＳＰＱＺ−ＣＯＯＨである前記Ｃ末端アミノ配列の伸長形態を実質的に認識しないか、または実質的に結合せず、ここで、Ｚは、存在しないか、またはＩＩＩ型コラーゲンの配列の１つ以上のアミノ酸である、請求項１に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項３】
前記サンドイッチイムノアッセイを使用し、前記生体サンプル中の架橋ＰＩＩＩＮＰの量を定量する、請求項１または２に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項４】
前記方法によって決定された架橋ＰＩＩＩＮＰの量と、既知の疾患重篤度の標準的な線維性疾患サンプルとを関連づけて線維性疾患の重篤度を評価することをさらに含む、請求項３に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項５】
前記線維性疾患が肝疾患である、請求項４に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項６】
前記生体サンプルが、生体液である、請求項３〜５のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項７】
前記生体液が、血清、血漿、尿、羊水、組織上清または細胞上清である、請求項６に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項８】
前記サンドイッチイムノアッセイが、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着法である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項９】
前記第２のモノクローナル抗体が、標識されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項１０】
前記第２のモノクローナル抗体が、酵素結合抗体である、請求項９に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項１１】
前記酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、請求項１０に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項１２】
前記第２のモノクローナル抗体が、放射性標識されているか、またはフルオロフォアに結合している、請求項９に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項１３】
前記第２のモノクローナルを認識するさらに標識された抗体を使用し、前記第２のモノクローナル抗体の結合量を決定する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のサンドイッチイムノアッセイ。
【請求項１４】
リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とするアンタゴニスト薬の効能を評価するための方法であって、請求項１に記載のサンドイッチイムノアッセイを用い、少なくとも２つの生体サンプル中の架橋ＰＩＩＩＮＰの量を定量することを含み、前記生体サンプルが、対象に対してアンタゴニスト薬を投与する期間中、第１の時間点と少なくとも１つのその後の時間点で対象から得られたものであり、アンタゴニスト薬を投与する期間中、第１の時間点から少なくとも１つのその後の時間点までに架橋ＰＩＩＩＮＰの量が減少することは、ＬＯＸを標的とする有効なアンタゴニスト薬の指標である、方法。
【請求項１５】
前記方法が、ＬＯＸＬ２を標的とするアンタゴニスト薬の効能を評価する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
サンドイッチアッセイで使用するためのキットであって、
請求項１に記載の第１のモノクローナル抗体に結合する固体支持体と、
請求項１に記載の第２のモノクローナル抗体とを含み、前記第２のモノクローナル抗体が標識を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体サンプルにおいて架橋ＰＩＩＩＮＰを検出するためのサンドイッチイムノアッセイ、およびリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とする薬剤の効能を評価する際のその使用に関する。本発明は、サンドイッチイムノアッセイを実施するためのキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
線維性疾患（表１に列挙されているものを含む）は、例えば硬変の罹患率および死亡率の主因であり、世界中で１年に８０万人が死亡している（１）。
【０００３】
【表１】
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【０００４】
「線維性疾患」は、主症状または副症状のいずれかとして、線維症を引き起こす任意の疾患である。線維症は、持続的な感染、自己免疫反応、アレルギー反応、化学物質による傷害、放射線、および組織損傷を含む様々な刺激によって誘発される慢性炎症反応の最終的な結果である。線維症は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の蓄積および再編成によって特徴付けられる。明らかな病因の差異および臨床的な差異を有するにもかかわらず、ほとんどの慢性線維性障害には、成長因子、タンパク質分解酵素、血管新生因子および線維形成性サイトカインの産生を維持する共通の永続的な刺激物があり、これらが合わさって結合組織要素（特にコラーゲンおよびプロテオグリカン）の蓄積を刺激し、正常な組織構造を次第にリモデリングし、破壊してしまう（３、４）。ヒトの健康に大きな影響を与えているにもかかわらず、現時点で、線維症の機構を直接的に標的とする承認された治療法は存在しない（５）。
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）
【０００５】
ＥＣＭは、タンパク質の凝集体を形成する能力を有する超分子構造であり、これにより、三次元網目構造で細胞を連結する動的な足場を形成する。この足場は、プロテアーゼのアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションによって、細胞−マトリックスの相互作用と、細胞の運命を制御する（６）。ＥＣＭは、種々の量および組み合わせでのコラーゲン、ラミニン、プロテオグリカンおよび他の糖タンパク質からなり、それによって個々の組織の必要性を満たす特定の機能を有する足場を生成するためにプロテアーゼによって改変することができる種々の生体構成要素を与える（７）。
【０００６】
Ｉ型およびＩＩ型のコラーゲンは、人体における主要な構造タンパク質である。ＩＩＩ型コラーゲンは、心血管系および他の器官におけるＩ型コラーゲンの原線維形成に必須である（８、９）。原線維集合の間、ＩＩＩ型プロコラーゲンのＮ末端プロペプチド（３個の同一のα鎖からなり、全分子量が４２ｋＤａ）が、ＥＣＭの成熟コラーゲンに組み込まれる前に、特異的なＮ−プロテアーゼによって開裂する。開裂したプロペプチドは、ＥＣＭ中に保持されてもよく、または循環系へと放出されてもよい。しかし、プロペプチドの開裂は、不完全なときがあり、プロペプチドが分子に結合させたまま残ることがある。これにより、異常な架橋を有する細いフィブリルが生成し、その結果、異常な分子は迅速な代謝ターンオーバーを起こしやすくなる（１０、１１）。したがって、適切なサンプル中のＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）のレベルは、ＩＩＩ型コラーゲンの形成および／または分解のマーカーであり得る。
【０００７】
ＥＣＭの改変された構成要素および非コード改変が、組織の剛直性と、インタクトなＥＣＭおよびそのフラグメントのシグナル電位の変化を引き起こすため、ＥＣＭのリモデリングは、種々の疾患の病因において、重要な役割を果たす。ＥＣＭのリモデリングは、組織の機能および修復にとって重要な前提条件であり、ＥＣＭの合成および分解を担う酵素によって厳密に制御されている。
【０００８】
線維性疾患などの病的な事象の間、ＥＣＭの形成と分解のバランスが乱れ、ＥＣＭの組成が変化する。このような変化は、組織機能の変化を引き起こす（１２、１３）。ＰＩＩＩＮＰを、いくつかの線維性疾患のバイオマーカーとして使用可能であることが示唆されている（例えば、肺傷害（１４）、ウイルス性および非ウイルス性の肝炎（１５）、全身性強皮症（１６）、血管リモデリング（１７）および腎疾患（１８））。
【０００９】
骨格筋組織におけるＥＣＭリモデリングには、あまり注目されていなかった。ラットモデルでは、運動後の大腿四頭筋および前脛骨筋において、増加したコラーゲン遺伝子発現および生合成が実証されている（１９、２０）。さらに、運動後の臨床試験において、ＰＩＩＩＮＰの血清レベルの上昇が実証されている（２１）。したがって、骨格筋タンパク質のリモデリングは、循環中のＰＩＩＩＮＰの量を増加させ、初期の筋肉同化を検出するためのバイオマーカーとして役立ち得る。ＰＩＩＩＮＰの血清レベルは、テストステロン（２２）、組換えヒト成長ホルモン（２３）またはそれらの組み合わせ（２４、２５）に対する筋肉組織応答のバイオマーカーとして以前から示唆されている。
【００１０】
肝線維症では、Ｉ型およびＩＩＩ型の線維状コラーゲンが高度にアップレギュレーションされている（２６、２７）。ＩＩＩ型コラーゲンは、線維症の初期で支配的であり、一方、Ｉ型コラーゲンのアップレギュレーションは、線維症の後期に関係がある。肝臓で起こる線維症によって、コラーゲンの沈着およびプロペプチド（主にＰＩＩＩＮＰ）の放出が起こる。結果として、ＰＩＩＩＮＰは、線維形成について最もよく研究されたマーカーの１つである（２８、２９、３０）。何年にもわたり、ＰＩＩＩＮＰの定量化のために、いくつかのラジオイムノアッセイが開発されており、硬変の検出について、感度が９４％まで、特異性が８１％まで達している（３１、３２）。しかし、従来のアッセイはいずれもネオエピトープ特異性ではない。さらに、ＰＩＩＩＮＰを定量するための現在市販されているアッセイは、プロコラーゲンまたはプロペプチドの内部配列を標的とするポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を利用し、ＩＩＩ型コラーゲンの形成および／または分解を特異的に区別するものではない（３１、３２）。
【００１１】
したがって、ＩＩＩ型コラーゲンの形成と分解を区別するために、本願発明者らは、形成過程でのみ産生されるネオエピトープフラグメント（すなわち、ＩＩＩ型コラーゲンの形成において産生されるが、ＩＩＩ型コラーゲンの分解において産生されないフラグメント）を決定し、検出することが必要であると考えている。
【００１２】
国際公開第２０１４／１７０３１２号は、Ｃ末端アミノ酸配列ＣＰＴＧＸＱＮＹＳＰ−ＣＯＯＨ（配列番号４）の末端アミノ酸に含まれるＣ末端ＰＩＩＩＮＰネオエピトープに特異的なモノクローナル抗体を開示し、ここで、Ｘは、ＧｌｙまたはＰｒｏであってもよい。
【００１３】
Ｂｒｏｃｋｓ（３１）は、改変されたウシＣ末端ＰＩＩＩＮＰ配列ＩＣ＊ＱＳＣＰＴＧＧＥＮＹＳＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１）（Ｃ＊＝アセトアミド保護されたＣｙｓ；ＧｌｎがＧｌｕで置き換えられている（Ｅ））を対象とするポリクローナル抗体を開示しているが、この抗体は、ウシＰＩＩＩＮＰのＣ末端配列ＩＣＱＳＣＰＴＧＧＱＮＹＳＰ−ＣＯＯＨ（配列番号２）の末端アミノ酸に対して非特異的であり、さらに、この抗体は、ヒトＰＩＩＩＮＰを認識しない。
【００１４】
Ｂａｙｅｒ（３３）は、配列Ｈ２Ｎ−ＧＳＰＧＰＰＧＩＣＱＳＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰ−ＣＯＯＨ（配列番号３）に向けられた検出モノクローナル抗体を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡを開示しているが、結合エピトープは定義されていない。
【００１５】
本出願人は、国際公開第２０１４／１７０３１２号に開示されるＰＩＩＩＮＰのＣ末端ネオエピトープに向けられたネオエピトープに特異的な抗体を利用する特異的サンドイッチイムノアッセイが、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とする薬物、特に、ＬＯＸアンタゴニスト薬の効能を評価するのに有用であり得ることを発見した。ＬＯＸによる酵素的コラーゲン架橋およびプロコラーゲンの処理は、組織の成熟および安定性にとって重要である。臓器線維症の患者では、コラーゲンは高度に架橋されるようになるため、線維症の解消が起こりにくい。ＬＯＸＬ２は、特殊なＬＯＸであり、線維性組織における病態生理学的なコラーゲン架橋の主要因であり、新規なＬＯＸＬ２アンタゴニストは、現在臨床試験中である。したがって、ＬＯＸアンタゴニストなどのＬＯＸを標的とする薬物の効能を評価するために使用可能なアッセイは、明らかに製薬産業にとって有用なツールであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１７０３１２号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｒｉｓｋｓ，Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｌｉｆｅ．Ｐｅｄｕｃｉｎｇ  Ｒｉｓｋｓ，Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｌｉｆｅ，Ｇｅｎｅｖａ：ＷＨＯ，２００２：１−２３０。
【非特許文献２】Ｗｙｎｎ  ＴＡ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００８；２１４：１９９−２１０。
【非特許文献３】Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＳＬ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２００４；１：９８−１０５。
【非特許文献４】Ｔｏｍａｓｅｋ  ＪＪ，Ｇａｂｂｉａｎｉ  Ｇ，Ｈｉｎｚ  Ｂ，Ｃｈａｐｏｎｎｉｅｒ  Ｃ，Ｂｒｏｗｎ  ＲＡ．Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｏ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００２；３：３４９−３６３。
【非特許文献５】Ｗｙｎｎ  ＴＡ．Ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｄ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｆｉｂｒｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７；１１７：５２４−５２９。
【非特許文献６】Ｂｏｓｍａｎ，Ｆ．Ｔ．およびＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．２００３．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００：４２３−４２８。
【非特許文献７】Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｐ．２０１０．Ｓｕｐｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｃｅｓ：ｐａｒａｄｉｇｍｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．３３９：７−１８。
【非特許文献８】Ｂａｏ  Ｘ，Ｚｅｎｇ  Ｙ，Ｗｅｉ  Ｓ，Ｗａｎｇ  Ｇ，Ｌｉｕ  Ｃ，Ｓｕｎ  Ｙ，Ｃｈｅｎ  ＱおよびＬｉ  Ｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｌ３ａ１  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｐｉｇｓ．Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００７；  ３４（３）：２２３−２２８。
【非特許文献９】Ｊｅｎｓｅｎ  ＬＴ  ａｎｄ  Ｈｏｓｔ  ＮＢ．Ｃｏｌｌａｇｅｎ：ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｒ  ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  １９９７；３３（３）：５３５−５３９。
【非特許文献１０】Ｎｉｅｍｅｌａ  Ｏ，Ｒｉｓｔｅｌｉ  Ｌ，Ｐａｒｋｋｉｎｅｎ  ＪおよびＲｉｓｔｅｌｉ  Ｊ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９８５；２３２（１）：１４５−１５０。
【非特許文献１１】Ｗａｎｇ  ＷＭ，Ｇｅ  Ｇ，Ｌｉｍ  ＮＨ，Ｎａｇａｓｅ  ＨおよびＧｒｅｅｎｓｐａｎ  ＤＳ．ＴＩＭＰ−３  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｎ−ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ＡＤＡＭＴＳ−２．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２００６；３９８（３）：５１５−５１９。
【非特許文献１２】Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｓｔｅｅｎ  ＰＥ，Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ  Ｇ，Ｗｏｒｍａｌｄ  ＭＲ，Ｄｗｅｋ  ＲＡおよびＲｕｄｄ  ＰＭ．Ｍａｔｒｉｘ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ，ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００１；１５２８（２−３）：６１−７３。
【非特許文献１３】Ｃｕｚｎｅｒ  ＭＬおよびＯｐｄｅｎａｋｋｅｒ  Ｇ．Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；９４（１−２）：１−１４。
【非特許文献１４】Ｍｅｄｕｒｉ  ＧＵ，Ｔｏｌｌｅｙ  ＥＡ，Ｃｈｉｎｎ  Ａ，Ｓｔｅｎｔｚ  ＦおよびＰｏｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ  Ａ．Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩＩ  ａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １９９８；１５８（５  Ｐｔ  １）：１４３２−１４４１。
【非特許文献１５】Ｔｅａｒｅ  ＪＰ，Ｓｈｅｒｍａｎ  Ｄ，Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ  ＳＭ，Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｊ，Ｂｒａｙ  Ｇ，Ｃａｔｔｅｒａｌｌ  ＡＰ，Ｍｕｒｒａｙ−Ｌｙｏｎ  ＩＭ，Ｐｅｔｅｒｓ  ＴＪ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＲおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ  ＲＰ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＰＧＡ  ｉｎｄｅｘ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｌａｎｃｅｔ  １９９３；３４２（８８７６）：８９５−８９８。
【非特許文献１６】Ｓｃｈｅｊａ  Ａ，Ａｋｅｓｓｏｎ  ＡおよびＨｏｒｓｌｅｖ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｋ．Ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９９２；２１（１）：５−９。
【非特許文献１７】Ｌｉｎ  ＹＨ，Ｈｏ  ＹＬ，Ｗａｎｇ  ＴＤ，Ｌｉｕ  ＣＰ，Ｋａｏ  ＨＬ，Ｃｈａｏ  ＣＬ，Ｃｈｉｅｎ  ＫＬ，Ｈｕｎｇ  ＣＳ，Ｗｕ  ＶＣ，Ｔｓａｉ  ＩＪ，Ｙｅｎ  ＲＦ，Ｓｈｉａｕ  ＹＣおよびＣｈｅｎ  ＷＪ．Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００６；３９（９）：８６１−８６６。
【非特許文献１８】Ｔｅｐｐｏ  ＡＭ，Ｔｏｒｎｒｏｔｈ  Ｔ，Ｈｏｎｋａｎｅｎ  ＥおよびＧｒｏｎｈａｇｅｎ−Ｒｉｓｋａ  Ｃ．Ｕｒｉｎａｒｙ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ（ＰＩＩＩＮＰ）ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００３；７５（１２）：２１１３−２１１９。
【非特許文献１９】Ｈａｎ  ＸＹ，Ｗａｎｇ  Ｗ，Ｋｏｍｕｌａｉｎｅｎ  Ｊ，Ｋｏｓｋｉｎｅｎ  ＳＯ，Ｋｏｖａｎｅｎ  Ｖ，Ｖｉｈｋｏ  Ｖ，Ｔｒａｃｋｍａｎ  ＰＣおよびＴａｋａｌａ  ＴＥ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｋｅｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｄｏｗｎｈｉｌｌ  ｒｕｎｎｉｎｇ．Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ  １９９９；４３７（６）：８５７−８６４。
【非特許文献２０】Ｋｏｓｋｉｎｅｎ  ＳＯ，Ａｈｔｉｋｏｓｋｉ  ＡＭ，Ｋｏｍｕｌａｉｎｅｎ  Ｊ，Ｈｅｓｓｅｌｉｎｋ  ＭＫ，Ｄｒｏｓｔ  ＭＲおよびＴａｋａｌａ  ＴＥ．Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｏｒｃｅｄ  ｅｃｃｅｎｔｒｉｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ  ２００２；４４４（１−２）：５９−７２。
【非特許文献２１】Ｃｒａｍｅｒｉ  ＲＭ，Ｌａｎｇｂｅｒｇ  Ｈ，Ｔｅｉｓｎｅｒ  Ｂ，Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ  Ｐ，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ＨＤ，Ｏｌｅｓｅｎ  ＪＬ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＣＨ，Ｋｏｓｋｉｎｅｎ  Ｓ，Ｓｕｅｔｔａ  ＣおよびＫｊａｅｒ  Ｍ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｆｔｅｒ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｏｕｔ  ｏｆ  ｅｃｃｅｎｔｒｉｃ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ  ２００４；２３（４）：２５９−２６４。
【非特許文献２２】Ｃｈｅｎ  Ｆ，Ｌａｍ  Ｒ，Ｓｈａｙｗｉｔｚ  Ｄ，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ＲＣ，Ｏｐｉｔｅｃｋ  ＧＪ，Ｗｉｓｈｅｎｇｒａｄ  Ｄ，Ｌｉａｗ  Ａ，Ｓｏｎｇ  Ｑ，Ｓｔｅｗａｒｔ  ＡＪ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＣＥ，Ｂｅａｌｓ  Ｃ，Ｙａｒａｓｈｅｓｋｉ  ＫＥ，Ｒｅｉｃｉｎ  Ａ，Ｒｕｄｄｙ  Ｍ，Ｈｕ  Ｘ，Ｙａｔｅｓ  ＮＡ，Ｍｅｎｅｔｓｋｉ  ＪおよびＨｅｒｍａｎ  ＧＡ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎａｂｏｌｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ．Ｊ  Ｃａｃｈｅｘｉａ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  Ｍｕｓｃｌｅ  ２０１１；２（１）：４５−５６。
【非特許文献２３】Ｌｏｎｇｏｂａｒｄｉ  Ｓ，Ｋｅａｙ  Ｎ，Ｅｈｒｎｂｏｒｇ  Ｃ，Ｃｉｔｔａｄｉｎｉ  Ａ，Ｒｏｓｅｎ  Ｔ，Ｄａｌｌ  Ｒ，Ｂｏｒｏｕｊｅｒｄｉ  ＭＡ，Ｂａｓｓｅｔｔ  ＥＥ，Ｈｅａｌｙ  ＭＬ，Ｐｅｎｔｅｃｏｓｔ  Ｃ，Ｗａｌｌａｃｅ  ＪＤ，Ｐｏｗｒｉｅ  Ｊ，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＪＯおよびＳａｃｃａ  Ｌ．Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＨ）ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ＧＨ  ａｂｕｓｅ  ｉｎ  ｓｐｏｒｔｓ：ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ  ＧＨ−２０００  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２０００；８５（４）：１５０５−１５１２。
【非特許文献２４】Ｂｈａｓｉｎ  Ｓ，Ｈｅ  ＥＪ，Ｋａｗａｋｕｂｏ  Ｍ，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ＥＴ，Ｙａｒａｓｈｅｓｋｉ  Ｋ，Ｏｐｉｔｅｃｋ  ＧＪ，Ｒｅｉｃｉｎ  Ａ，Ｃｈｅｎ  Ｆ，Ｌａｍ  Ｒ，Ｔｓｏｕ  ＪＡ，Ｃａｓｔａｎｅｄａ−Ｓｃｅｐｐａ  Ｃ，Ｂｉｎｄｅｒ  ＥＦ，Ａｚｅｎ  ＳＰおよびＳａｔｔｌｅｒ  ＦＲ．Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｓ  ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ａｎａｂｏｌｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＧＨ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００９；９４（１１）：４２２４−４２３３。
【非特許文献２５】Ｎｅｌｓｏｎ  ＡＥ，Ｍｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｕ，Ｈａｎｓｅｎ  ＪＬ，Ｗａｌｋｅｒ  ＩＨ，Ｓｔｏｎｅ  Ｇ，Ｈｏｗｅ  ＣＪ，Ｌｅｕｎｇ  ＫＣ，Ｓｅｉｂｅｌ  ＭＪ，Ｂａｘｔｅｒ  ＲＣ，Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ  ＤＪ，Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ  ＲおよびＨｏ  ＫＫ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｂｕｓｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｒｅｃｒｅａｔｉｏｎａｌ  ａｔｈｌｅｔｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００８；９３（６）：２２１３−２２２２。
【非特許文献２６】Ｚａｃｈａｒｉａｅ  Ｈ，Ｈｅｉｃｋｅｎｄｏｒｆｆ  ＬおよびＳｏｇａａｒｄ  Ｈ．Ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ａ  １０−ｙｅａｒ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００１；１４４（１）：１００−１０３。
【非特許文献２７】Ｇｒｅｓｓｎｅｒ  ＡＭおよびＷｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ  Ｒ．Ｍｏｄｅｒｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｓｕｇｇｅｓｔ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ａｓ  ｍａｊｏｒ  ｐｌａｙｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００６；１０（１）：７６−９９。
【非特許文献２８】Ｊａｒｃｕｓｋａ  Ｐ，Ｊａｎｉｃｋｏ  Ｍ，Ｖｅｓｅｌｉｎｙ  Ｅ，Ｊａｒｃｕｓｋａ  ＰおよびＳｋｌａｄａｎｙ  Ｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ２０１０；４１１（１５−１６）：１００９−１０１７。
【非特許文献２９】Ｆｒｅｉ  Ａ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ＡおよびＷｅｉｇａｎｄ  Ｋ．Ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｆｌｅｃｔｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９８４；４（５）：８３０−８３４。
【非特許文献３０】Ｆａｂｒｉｓ  Ｐ，Ｍａｒｒａｎｃｏｎｉ  Ｆ，Ｂｏｚｚｏｌａ  Ｌ，Ｂｉａｓｉｎ  ＭＲ，Ｄｅ  Ｌａｚｚａｒｉ  Ｆ，Ｐｌｅｂａｎｉ  Ｍ，Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ  Ｐ，Ｔｏｓｉｔｔｉ  Ｇ，Ｐｅｌｌｉｚｚｅｒ  Ｇ，Ｓｔｅｃｃａ  Ｃおよびｄｅ  ＬＦ．Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｅｒｕｍ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａ−ＩＦＮ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １９９９；３４（３）：３４５−３５０。
【非特許文献３１】Ｂｒｏｃｋｓ  ＤＧ，Ｓｔｅｉｎｅｒｔ  Ｃ，Ｇｅｒｌ  Ｍ，Ｋｎｏｌｌｅ  Ｊ，Ｎｅｕｂａｕｅｒ  ＨＰおよびＧｕｎｚｌｅｒ  Ｖ．Ａ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｒａｔ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐｅｒｆｕｓｅｄ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ．Ｍａｔｒｉｘ  １９９３；１３（５）：３８１−３８７。
【非特許文献３２】Ｒｏｈｄｅ  Ｈ，Ｖａｒｇａｓ  Ｌ，Ｈａｈｎ  Ｅ，Ｋａｌｂｆｌｅｉｓｃｈ  Ｈ，Ｂｒｕｇｕｅｒａ  ＭおよびＴｉｍｐｌ  Ｒ．Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９７９；９（６）：４５１−４５９。
【非特許文献３３】Ｂａｙｅｒ  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ．（１９９９）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ＰＩＩＩＮＰ。特許協力条約出願ＷＯ９９／６１４７７号。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、生体サンプルにおいて架橋ＰＩＩＩＮＰを検出するためのサンドイッチイムノアッセイに関し、ここで、架橋ＰＩＩＩＮＰは、鎖間架橋によって一緒に接続したＰＩＩＩＮＰの少なくとも２つの鎖を含む。この方法は、架橋ＰＩＩＩＮＰを含む生体サンプルと、ある表面に結合した第１のモノクローナル抗体とを接触させることであって、架橋ＰＩＩＩＮＰに含まれるそれぞれのＰＩＩＩＮＰ鎖が、インタクトなＩＩＩ型プロコラーゲンのＮ−プロテアーゼ開裂によって生成するＰＩＩＩＮＰのＣ末端ネオエピトープを有する、接触させることと、第２のモノクローナル抗体を加えることとを含む。両モノクローナル抗体は、ＰＩＩＩＮＰのＣ末端ネオエピトープと特異的に反応し、前記ネオエピトープは、Ｃ末端配列ＣＰＴＧＸＱＮＹＳＰ−ＣＯＯＨを含み、ＸはＧｌｙまたはＰｒｏである。この方法は、第２のモノクローナル抗体の結合量を決定することをさらに含む。
【００１９】
本発明は、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とするアンタゴニスト薬の効能を評価するための方法にも関する。この方法は、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを用い、対象に対してアンタゴニスト薬を投与する期間中、第１の時間点と少なくとも１つのその後の時間点で対象から得られた少なくとも２つの生体サンプル中の架橋ＰＩＩＩＮＰの量を定量することを含む。アンタゴニスト薬を投与する期間中、第１の時間点から少なくとも１つのその後の時間点までに架橋ＰＩＩＩＮＰの量が減少することは、ＬＯＸを標的とする有効なアンタゴニスト薬の指標である。
【００２０】
本発明は、さらに、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイに使用するためのキットにも関する。キットは、上述の第１のモノクローナル抗体に結合する固体支持体と、本明細書に記載の標識された第２のモノクローナル抗体とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ヒト種の標的とされるＰＩＩＩＮＰα１鎖配列（配列番号１４）およびラット種の標的とされるＰＩＩＩＮＰα１鎖配列（配列番号１５）のアラインメント（四角によって強調される）。ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドのα１鎖内の対応するヒト配列の位置（直線）およびラット配列の位置（波線）。アラインメントは、ＮＬＰ  ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアを用いて行われた。
【図２】モノクローナル抗体ＮＢ６１Ｎ６２（レーン１および３）およびＮＢ６１Ｎ６２＋選択ペプチド（レーン２＋４）によって認識される（ａ）ラットおよび（ｂ）ヒトに由来する羊水中のＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド型コラーゲンのＮ末端プロペプチドの特異的なバンドを示すウェスタンブロット。ラットでは、５２〜６０ｋＤＡ付近の２つのバンドが観察されたが、ヒトでは１つのバンドが観察された。選択ペプチドを添加すると、ラットおよびヒトの両方についてバンド強度が弱くなった。
【図３Ａ】ヒト、げっ歯類およびマウスの材料に対する典型的な検量線および天然の反応性を示す、ＰＲＯ−Ｃ３  ＥＬＩＳＡの試行。健康なヒト血清、血漿および羊水（ＡＦ）を用いた、競合ＰＲＯ−Ｃ３  ＥＬＩＳＡの検量線および阻害。検量線は、７６．３１ｎｇ／ｍＬから２倍に希釈され、一方、天然物質は、（−−）で示されているように、１：２から１：１６まで希釈された。
【図３Ｂ】ヒト、げっ歯類およびマウスの材料に対する典型的な検量線および天然の反応性を示す、ＰＲＯ−Ｃ３  ＥＬＩＳＡの試行。健康なラット血清、血漿およびＡＦを用いた、競合ＰＲＯ−Ｃ３  ＥＬＩＳＡの較正曲線および阻害。検量線は、２００ｎｇ／ｍＬから２倍に希釈され、一方、天然物質は、（−−）で示されているように、未希釈から１：８まで実施された。
【図３Ｃ】ヒト、げっ歯類およびマウスの材料に対する典型的な検量線および天然の反応性を示す、ＰＲＯ−Ｃ３  ＥＬＩＳＡの試行。健康なマウス血清および血漿を用いた、競合ＰＲＯ−Ｃ３  ＥＬＩＳＡの検量線および阻害。検量線は、２００ｎｇ／ｍＬから２倍に希釈され、一方、天然物質は、（−−）で示されているように、未希釈から１：４まで実施された。
【図３Ｄ】ヒト、げっ歯類およびマウスの材料に対する典型的な検量線および天然の反応性を示す、ＰＲＯ−Ｃ３  ＥＬＩＳＡの試行。伸長されたペプチド（すなわち、Ｃ末端の１つのさらなるアミノ酸を用いた較正ペプチドのペプチド配列）を用いた、ＰＩＩＩＮＰネオエピトープ特異性抗体のネオエピトープ特異性。検量線、伸長されたペプチドおよびナンセンスペプチドを７６．３１ｎｇ／ｍＬから２倍に希釈した。シグナルは、ペプチド濃度の関数として６５０ｎｍでのバックグラウンドを差し引いた４５０ｎｍでの光学密度として見られる。
【図４】肺線維芽細胞のインビトロモデルの結果（「ｓｃａｒ−ｉｎ−ａ−ｊａｒ」）。
【図５】ケロイドからの抽出と、正常皮膚からの抽出におけるＰｒｏ−Ｃ３Ｘレベルの比較。
【図６Ａ】肝線維症を有する患者の試験結果。
【図６Ｂ】肝線維症を有する患者の試験結果。
【図７】Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘアッセイの図的記述。
【図８】アルコール性脂肪性肝炎患者の試験結果。
【図９】Ｓｃａｒ−ｉｎ−ａ−Ｊａｒモデルから１０日目に採取した上清中のＰｒｏ−Ｃ３Ｘレベル。有意性は、それぞれの条件をＴＧＦ−β単独と比較したダネットの多重比較試験を用い、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによって評価した。データは、ＳＤを伴う平均として示す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＢＡＰＮ、β−アミノプロピオニトリル；ＴＧＦ−β、トランスフォーミング増殖因子β。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「ネオエピトープ」という用語は、ポリペプチドの端（すなわち、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端）にあるＮ末端またはＣ末端のペプチド配列を指し、その一般的な方向を意味するものと解釈されるべきではない。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「競合ＥＬＩＳＡ」という用語は用語は、競合酵素結合免疫吸着法を指し、当業者に公知の技術である。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「サンドイッチイムノアッセイ」という用語は、サンプル中の抗原を検出するために少なくとも２つの抗体を使用することを指し、当業者に公知の技術である。
【００２５】
本明細書で使用される場合、モノクローナル抗体ＮＢ６１Ｎ−６２という用語は、ＰＩＩＩＮＰのＣ末端ネオエピトープに対する、ネオエピトープに特異的な抗体を指し、このネオエピトープは、Ｃ末端配列ＣＰＴＧＸＱＮＹＳＰ−ＣＯＯＨ（配列番号４）を含み、Ｘは、ＧｌｙまたはＰｒｏである。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ＰＲＯ−Ｃ３」という用語は、本明細書に記載されるＰＩＩＩＮＰアッセイを、ＰＩＩＩＮＰに由来するネオエピトープの特異的な結合に基づかない当該技術分野で公知のＰＩＩＩＮＰアッセイと区別するために使用される。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ＰＲＯ−Ｃ３Ｘ」アッセイという用語は、架橋ＰＩＩＩＮＰを検出し、定量するための本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを指す。
【００２８】
本発明の方法における使用に適したモノクローナル抗体は、国際公開第２０１４／１７０３１２号に開示されており、ＰＩＩＩＮＰのＣ末端ネオエピトープと特異的に反応し、このネオエピトープは、Ｃ末端アミノ酸配列ＣＰＴＧＸＱＮＹＳＰ−ＣＯＯＨ（配列番号４）を含み、Ｘは、ＧｌｙまたはＰｒｏであり、このモノクローナル抗体は、ＣＰＴＧＸＱＮＹＳＰＱＺ−ＣＯＯＨ（配列番号５）である前記Ｃ末端アミノ配列の伸長形態を実質的に認識しないか、または実質的に結合せず、ここで、Ｚは、存在しないか、またはＩＩＩ型コラーゲンの配列の１つ以上のアミノ酸である。
【００２９】
好ましくは、このモノクローナル抗体は、ヒトＰＩＩＩＮＰにおけるネオエピトープのＣ末端配列ＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰ−ＣＯＯＨ（配列番号６）に特異的に反応し、この配列は、ヒトＰＩＩＩＮＰのアミノ酸Ｐ１５３−Ｑ１５４間のＰｒｏ−Ｇｌｎ結合にあるインタクトなＩＩＩ型プロコラーゲンからのＰＩＩＩＮＰのＮ−プロテアーゼ開裂によって作られる。
【００３０】
または、このモノクローナル抗体は、げっ歯類ＰＩＩＩＮＰにおけるネオエピトープのＣ末端配列ＣＰＴＧＧＱＮＹＳＰ−ＣＯＯＨ（配列番号７）に特異的に反応してもよく、このネオエピトープは、げっ歯類ＰＩＩＩＮＰのアミノ酸Ｐ１５４−Ｑ１５５間のＰｒｏ−Ｇｌｎ結合にあるインタクトなＩＩＩ型プロコラーゲンからのＰＩＩＩＮＰのＮ−プロテアーゼ開裂によって作られる。
【００３１】
好ましくは、アミノ酸配列ＣＰＴＧＸＱＮＹＳＰ−ＣＯＯＨ（配列番号４）に対するモノクローナル抗体のアフィニティと、伸長されたアミノ酸配列ＣＰＴＧＸＱＮＹＳＰＱＺ−ＣＯＯＨ（配列番号５）に対する同じモノクローナル抗体のアフィニティの比率は、少なくとも１０対１、好ましくは少なくとも１００対１、より好ましくは少なくとも１，０００対１、より好ましくは少なくとも１０，０００対１、より好ましくは少なくとも１００，０００対１、最も好ましくは少なくとも１，０００，０００対１である。
【００３２】
好ましくは、モノクローナル抗体は、ＰＩＩＩＮＰのＣ末端ネオエピトープを認識しないか、またはこれに結合せず、この短くなったネオエピトープは、アミノ酸配列ＣＰＴＧＸＱＮＹＳ（配列番号８）を有する。
【００３３】
好ましくは、アミノ酸配列ＣＰＴＧＸＱＮＹＳＰ−ＣＯＯＨ（配列番号４）に対するモノクローナル抗体のアフィニティと、短くなったアミノ酸配列ＣＰＴＧＸＱＮＹＳ（配列番号８）に対する同じモノクローナル抗体のアフィニティの比率は、少なくとも１０対１、好ましくは少なくとも１００対１、より好ましくは少なくとも１，０００対１、より好ましくは少なくとも１０，０００対１、より好ましくは少なくとも１００，０００対１、最も好ましくは少なくとも１，０００，０００対１である。
【００３４】
本発明は、生体サンプルにおいて架橋ＰＩＩＩＮＰを検出するためのサンドイッチイムノアッセイであって、前記架橋ＰＩＩＩＮＰが、鎖間架橋によって一緒に接続したＰＩＩＩＮＰの少なくとも２つの鎖を含み、この方法が、
前記架橋ＰＩＩＩＮＰを含む前記生体サンプルと、ある表面に結合した第１のモノクローナル抗体とを接触させることであって、架橋ＰＩＩＩＮＰに含まれるそれぞれのＰＩＩＩＮＰ鎖が、インタクトなＩＩＩ型プロコラーゲンのＮ−プロテアーゼ開裂によって生成するＰＩＩＩＮＰのＣ末端ネオエピトープを有する、接触させることと、
第２のモノクローナル抗体を加えることと、
前記第２のモノクローナル抗体の結合量を決定することとを含み、
前記第１のモノクローナル抗体および前記第２のモノクローナル抗体は、両方とも、ＰＩＩＩＮＰの前記Ｃ末端ネオエピトープに特異的に反応し、前記ネオエピトープは、Ｃ末端アミノ酸配列ＣＰＴＧＸＱＮＹＳＰ−ＣＯＯＨを含み、ＸはＧｌｙまたはＰｒｏである、サンドイッチイムノアッセイに関する。
【００３５】
好ましくは、モノクローナル抗体は、ＣＰＴＧＸＱＮＹＳＰＱＺ−ＣＯＯＨである前記Ｃ末端アミノ配列の伸長形態を実質的に認識しないか、または実質的に結合せず、ここで、Ｚは、存在しないか、またはＩＩＩ型コラーゲンの配列の１つ以上のアミノ酸である。
【００３６】
本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイは、捕捉抗体および検出抗体といった両抗体と同じ抗体を使用するため、二本鎖ペプチド（すなわち、架橋したもの）を、このアッセイによって認識することができる。
【００３７】
好ましくは、サンドイッチイムノアッセイを用い、生体液中の架橋ＰＩＩＩＮＰの量を定量し、前記生体液は、限定されないが、血清、血漿、尿、羊水、組織上清または細胞上清であってもよい。
【００３８】
サンドイッチイムノアッセイは、限定されないが、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着法であってもよい。
【００３９】
好ましい実施形態では、第２のモノクローナル抗体の結合量を決定するために、第２のモノクローナル抗体が標識されてもよい。
【００４０】
好ましくは、第２のモノクローナル抗体は、酵素結合抗体であってもよい。酵素は、限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であってもよい。
【００４１】
好ましくは、第２のモノクローナル抗体は、放射性標識されていてもよく、フルオロフォアに結合していてもよい。
【００４２】
これらは、本発明と共に使用される好ましい標識であるが、限定されないが、ＤＮＡレポーターまたは電気化学発光タグなどの任意の適切な標識システムを使用してもよいことが想定される。
【００４３】
または、第２のモノクローナルを認識するさらに標識された抗体を使用し、第２のモノクローナル抗体の結合量を決定してもよい。さらに標識された抗体は、上述のような標識を用いて標識されてもよい。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、サンドイッチイムノアッセイは、前記方法によって決定された架橋ＰＩＩＩＮＰの量と、線維性疾患の重篤度を評価するための既知の疾患重篤度の標準的な線維性疾患サンプルとを関連づけることをさらに含んでいてもよい。このような線維性疾患は、限定されないが、肝疾患であってもよい。
【００４５】
さらなる態様では、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とする薬剤（例えば、ＬＯＸを標的とするアンタゴニスト薬）の効能を評価するための方法に使用してもよい。
【００４６】
したがって、本発明は、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を標的とするアンタゴニスト薬の効能を評価するための方法であって、この方法が、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイを用い、少なくとも２つの生体サンプル中の架橋ＰＩＩＩＮＰの量を定量することを含み、前記生体サンプルが、対象に対してアンタゴニスト薬を投与する期間中、第１の時間点と少なくとも１つのその後の時間点で対象から得られたものであり、アンタゴニスト薬を投与する期間中、第１の時間点から少なくとも１つのその後の時間点までに架橋ＰＩＩＩＮＰの量が減少することは、ＬＯＸを標的とする有効なアンタゴニスト薬の指標である、方法にも関する。
【００４７】
好ましくは、この方法は、アンタゴニスト薬の有効性を定量する。
【００４８】
好ましくは、この方法は、ＬＯＸＬ２を標的とするアンタゴニスト薬の効能を評価する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイに使用するためのキットであって、このキットが、上述の第１のモノクローナル抗体に結合する固体支持体と、上述の標識された第２のモノクローナル抗体とを含む、キットに関する。
【実施例】
【００５０】
材料と一般的な考慮事項
実験で使用した全ての試薬は、Ｍｅｒｃｋ（ホワイトハウスステーション、ＮＪ、ＵＳＡ）製およびＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）製の高級化学品であった。モノクローナル抗体製造およびバリデーションに使用される合成ペプチドは、（１）免疫原性ペプチド：オボアルブミン（ＯＶＡ）−ＣＧＧ−ＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰ（配列番号１０）、（２）スクリーニングペプチド：ビオチン−ＣＧＧ−ＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰ（配列番号１１）および（３）選択ペプチド：ＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰ（配列番号６）であった。全ての合成ペプチドは、中国北京のＣｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。
実施例１−モノクローナル抗体ＮＢ６１−Ｎ６２
モノクローナル抗体の生成
【００５１】
ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドの配列は、ヒト、ラットおよびマウスの種間でアライメントされ、種間の相同性と、タンパク質ブラスティングによる他のＥＣＭタンパク質の中の固有性から選択された。α１鎖ＰＩＩＩＮＰ中のアミノ酸配列１４５’−ＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰ−’１５３（配列番号６）は、ヒトとラットの間で１００％相同性である（図１）。モノクローナル抗体の生成は、フロイントの不完全アジュバントを用い、２００μｌの乳化した抗原と５０μｇのＰＩＩＩＮＰネオエピトープＣ末端配列（ＯＶＡ−ＣＧＧ−ＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰ（配列番号１０））を用いた４〜５週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの皮下免疫化によって開始した。安定した血清力価レベルに達するまで、２週間ごとに免疫化を繰り返した。最も高い血清力価を有するマウスを、融合のために選択した。マウスを１ヶ月間休憩させ、次いで、１００μｌの０．９％ＮａＣｌ溶液中５０μｇのＰＩＩＩＮＰネオエピトープネオエピトープＣ末端配列のを３日間静脈内投与して免疫性を高めた後、脾臓を単離した。脾臓細胞をＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合させ、（３４）に記載されるようにハイブリドーマを作成し、半媒体方法を用いて培養皿内でクローニングした。このクローンを、確実にモノクローナルを増殖させるために限定希釈方法を用いてさらに増殖させるために、９６ウェルマイクロタイタープレートに蒔いた。上清を、ストレプトアビジンコーティングしたプレートを用いた間接ＥＬＩＳＡにおいて、較正ペプチドおよび天然物質に対する反応性についてスクリーニングした。ビオチン−ＣＧＧ−ＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰ（配列番号１１）をスクリーニングペプチドとして使用し、一方、遊離ペプチドＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰ（配列番号６）をキャリブレーターとして使用し、クローンのさらなる特異性を試験した。
クローンのキャラクタライゼーション
【００５２】
ストレプトアビジンコーティングされたマイクロタイタープレート上、２ｎｇ／ｍｌのビオチン化ペプチドを用い、増殖させたモノクローナルハイブリドーマ細胞からの上清を用いた予備的ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトおよびラット両方からの尿、血清および羊水（ＡＦ）などの異なる生体材料を用い、ペプチドの天然の反応性およびアフィニティを評価した。ヒトＡＦは、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌで２ヶ月間にわたって選択的な下部帝王切開を受けた３０人の女性から得られた。切開直後に１００〜２００ｍｌのＡＦを採取し、使用するまで、この液体を−２０℃で保存した。地元の倫理委員会は、この試験を承認し、全ての女性には、採取前に書面による同意を得た。妊娠したＷｉｓｔａｒラットの子宮から、予想出産日の２日前にラットＡＦを採取した。抗体特異性を、除外ペプチドおよび伸長されたペプチド（すなわち、それぞれ、１０個のアミノ酸置換を有する較正ペプチドと、開裂部位に１個のさらなるアミノ酸を含む較正ペプチド）を用いた予備アッセイで試験した。モノクローナル抗体のアイソタイプを、Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰキット、カタログ番号５３００−０５（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、バーミングハム、ＡＬ、ＵＳＡ）を用いて決定した。
抗体のキャラクタライゼーション
【００５３】
ウェスタンブロッティングの前に、ヒトおよびラットのＡＦの総タンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイを製造者の指示に従って使用して測定した。簡単に言うと、ＢＣＡを２ｍｇ／ｍｌからＰＢＳで２倍に希釈し、サンプルの計算のための標準的な列を作成した。サンプルを１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１：４に希釈し、２５μｌのサンプルを２００μｌの作業試薬（試薬ＡおよびＢを５０：１の比率で混合したもの）と共にマイクロタイタープレートに添加した。内容物をプレートシェーカー上で３０秒間混合し、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後、プレートを室温まで冷却し、ＥＬＩＳＡリーダーで、５６２ｎｍで吸光度を測定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）。その後、ラットまたはヒトのＡＦをサンプルバッファー（２倍）および還元剤（１０倍）と混合し、７０℃で１０分間加熱し、４〜２０％のトリス−グリセリンドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ｐａｇｅ）にかけ、１８０Ｖで１時間実施した。製造業者の指示に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｉ−Ｂｌｏｔゲル転移システムを用いてタンパク質バンドをニトロセルロース膜上にブロッティングした。膜をブロッキングバッファー（Ｔｗｅｅｎを含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中の５％スキムミルク（ＴＢＳＴ））中、４℃で一晩かけてブロッキングし、１μｇ／ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が接合したＰＩＩＩＮＰのネオエピトープに特異的なモノクローナル抗体ＮＢ６１Ｎ−６２と共に２時間インキュベートした。ＰＩＩＩＮＰのネオエピトープに特異的なモノクローナル抗体の特異性を、過剰なＰＩＩＩＮＰネオエピトープ較正ペプチドと抗体を１０：１の比率で加え、１時間プレインキュベートした後、一晩インキュベートするために膜に添加することによって観察した。インキュベートの後、膜をＴＢＳＴで４×１０分間洗浄し、４ｍｌの化学発光検出キット（ＥＣＬ）と共にインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍを用いて現像した。
クローンの選択とキャラクタライゼーション
【００５４】
サブタイプは、ＩｇＧ１サブタイプであると判定された。ウェスタンブロット分析から、ＰＩＩＩＮＰのネオエピトープに特異的なモノクローナル抗体ＮＢ６１Ｎ−６２は、ラット羊水中で約５２〜６０ｋＤａの分子量を有する２つのバンドを認識したが、ヒト羊水中では５２ｋＤａ前後のバンドは１つしか検出されなかったことがわかった。さらに、シグナルはラットの選択ペプチドによって部分的に阻害され、ヒトにおいて阻害された（図２）。天然の反応性は、ＥＬＩＳＡにおいてＮＢ６１Ｎ−６２抗体を用いて観察された。天然の反応性は、ヒト血清、血漿およびＡＦ、げっ歯類の血清、血漿およびＡＦに対して見られた（図３Ａ〜図３Ｃ）。このシグナルは、マウス血清および血漿に対してわずかに阻害された。競合ＥＬＩＳＡのシグナルは、ヒト、げっ歯類およびマウスの天然物質においてそれぞれ１：２から１：１６、未希釈から１：８まで、または未希釈から１：４までを用いて阻害された。天然物質の希釈は、３種全てについて、ほぼ検量線と同じ希釈パターンに従った。ヒトＡＦは、シグナルを１００％まで阻害し、ラットＡＦでは８０％、ヒト血清および血漿、ラット血清では７０％、ラット血漿では４４％、マウス血清および血漿では３５％まで阻害した。伸長されたペプチド（ＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰＱ（配列番号６））およびナンセンスペプチド（ＧＳＰＧＫＤＧＶＲＧ（配列番号１２））を用い、ゼロ阻害を観察した（図３Ｄ）。
実施例２−ＮＢ６１Ｎ−６２を用いたＰＲＯ−Ｃ３  ＥＬＩＳＡ
【００５５】
抗体を産生するハイブリドーマからの上清を回収し、ＨｉＴｒａｐアフィニティカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、リトルチャルフォント、バッキンガムシャー、ＵＫ）を用いてモノクローナル抗体を精製し、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（商標）ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、バブラハム、ケンブリッジ、ＵＫ）を用い、製造業者の指示に従って、ＨＲＰで標識した。
【００５６】
ＰＲＯ−Ｃ３競合ＥＬＩＳＡの手順は、以下の通りであった。Ｒｏｃｈｅ製の９６ウェルストレプトアビジンコーティングされたＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号１１９４０２７９）を、コーターバッファー（５０ｍＭ  ＰＢＳ−ＢＴＥ＋１０％ソルビトール、ｐＨ７．４）中に溶解させたビオチン化ペプチドＢｉｏｔｉｎ−ＣＧＧ−ＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰ（配列番号１１）でコーティングし、暗所で、２０℃で３０分間インキュベートし、その後、洗浄バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄した。その後、２０μｌのペプチドキャリブレーターまたはサンプルを適切なウェルに加え、その後、１００μｌのＨＲＰが接合したモノクローナル抗体ＮＢ６１Ｎ−６２をインキュベーションバッファー（５０ｍＭ  ＰＢＳ−ＢＴＢ＋１０％ＬｉｑｕｉｄＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ７．４）に溶解し、プレートを４℃で２０時間インキュベートし、洗浄した。最後に、１００μｌのテトラメチルベンジニジン（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃカタログ番号：４３８ＯＨ）を加え、暗所で、プレートを２０℃で１５分間インキュベートし、反応を止めるために、１００μｌの停止溶液（１％Ｈ２ＳＯ４）を加え、プレートをＥＬＩＳＡリーダーで、６５０ｎｍをリファレンスとして４５０ｎｍで分析した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）。検量線は、４パラメータ数学フィッティングモデルを用いてプロットされた。
技術的評価
【００５７】
ヒトおよびラットからの健康な血清および血漿サンプルの２倍希釈を用いて直線性を決定し、１００％サンプルの回収率％として計算した。抗体特異性は、１００％の較正ペプチド（ＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰ（配列番号：６））、伸長されたペプチド（ＣＰＴＧＰＱＮＹＳＰＱ（配列番号１３））、ナンセンスペプチド（ＧＳＰＧＫＤＧＶＲＧ（配列番号１２））の回収率％として計算された。検出下限（ＬＬＯＤ）は、標準Ｋ（すなわち、バッファー）の２１回の測定値からのブランクの平均＋３×標準偏差（ＳＤ）として計算された。検出上限（ＵＬＯＤ）は、標準Ａの１０回の測定値の平均−３ｘＳＤとして決定された。定量下限（ＬＬＯＱ）は、３０％未満の精度で再現可能に測定された最低濃度として測定された。アッセイ内変動およびアッセイ間変動は、８ＱＣサンプルの１０回の独立した試行によって決定され、各試行は、サンプルの２回ずつの決定からなっていた。サンプルの正確さを、標準曲線またはヒト羊水を有意な濃度で添加した健康なヒト血清サンプルで測定し、理論血清量の回収率％として計算した。干渉を、ヘモグロビン、脂肪血およびビオチンを有意な濃度で添加した健康なヒト血清中で測定し、理論血清量の回収率％として計算した。
結果
【００５８】
ヒトＰＲＯ−Ｃ３  ＥＬＩＳＡの測定範囲は、ＵＬＯＤおよびＬＬＯＱを計算することによって決定され、０．８６７〜６０．１ｎｇ／ｍｌの範囲が与えられ、ＬＬＯＤは０．６０６ｎｇ／ｍｌであった。ＰＲＯ−Ｃ３  ＥＬＩＳＡの技術的性能は、アッセイ間変動およびアッセイ内変動が平均でそれぞれ１１．０３％および４．１１％であり（表１）、許容範囲はそれぞれ１５％未満および１０％未満であった。
【００５９】
【表２】
2019510210.tif 000004
【００６０】
ヒト、ラットおよびマウスに由来する健康な血清サンプルおよび血漿サンプルを用い、希釈回収率を実施した。希釈回収率は、許容可能な１００±２０％の回収率の範囲内であった（表２）。さらに希釈すると、ＬＬＯＱよりも低い測定値が得られた。
【００６１】
【表３】
2019510210.tif 000005
【００６２】
血清中または血漿中の較正ペプチドの添加によって、それぞれ５６％および５５％の平均回収率を得た（表３）。
【００６３】
【表４】
2019510210.tif 000006
【００６４】
しかし、１：２から出発して２倍希釈したヒトＡＦを健康なヒト血清または血漿に添加すると、平均回収率はそれぞれ１００％および１１１％であった。異なる濃度のヘモグロビン、ビオチンおよび脂肪血を添加した血清では、干渉は観察されなかった（表４）。
【００６５】
【表５】
2019510210.tif 000007
【００６６】
検体の安定性は、１回の凍結／解凍サイクルと比較して、１００±２０％の回収率で４回までの凍結／解凍サイクルが許容範囲であった（表５）。
【００６７】
【表６】
2019510210.tif 000008
実施例３−結合アフィニティ比の決定
【００６８】
標的配列に対するモノクローナル抗体の結合アフィニティと、伸長された配列または短くなった配列に対するモノクローナル抗体の結合アフィニティとの比を決定するために、それぞれの配列を合成し、実施例２に記載されるＰＲＯ−Ｃ３  ＥＬＩＳＡにおける較正ペプチドとして使用した。得られた検量線を用いて、各配列／抗体の組み合わせのＩＣ５０値を決定する。ＩＣ５０［標的］／ＩＣ５０［伸長したもの、または短くなったもの］の比は、結合アフィニティの比を規定する。
実施例４−ＰＲＯ−Ｃ３Ｘアッセイ
【００６９】
上述のように、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）による酵素的コラーゲン架橋およびプロコラーゲンの処理は、組織の成熟および安定性にとって重要である。したがって、酵素処理の前にＩＩＩ型プロコラーゲンの鎖間架橋を監視することは、ＬＯＸのインビボ活性を監視するために有用であると考えられる。これは、架橋ＰＩＩＩＮＰ（すなわち、酵素によるプロコラーゲン処理の前に、ＩＩＩ型プロコラーゲンのＬＯＸによって作られる鎖間架橋によって一緒に結合したＰＩＩＩＮＰの２つ以上の鎖）を検出し、定量することによって達成することができる。循環系で検出されたより高いレベルの架橋ＰＩＩＩＮＰは、より大きなＬＯＸ活性の指標となるだろう。したがって、ＬＯＸアンタゴニストなどのＬＯＸを標的とする薬物の薬物試験中に架橋ＰＩＩＩＮＰのレベルを監視することで、前記薬物の有用な効能データを提供することができる。
ＥＬＩＳＡ
【００７０】
ストレプトアビジンコーティングされたプレートを１μｇ／ｍｌのビオチン化捕捉抗体（ビオチン結合したＮＢ６１−Ｎ６２）を用い、１００μｌ／ウェルでコーティングし、２０℃、３００ｒｐｍで３０分間振盪しつつインキュベートした。プレートを洗浄バッファー（２０ｎＭ  ＴＲＩＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。サンプル、標準またはコントロール（２０μｌ）を添加し、すぐに１００μｌのアッセイバッファーを添加し、４℃、３００ｒｐｍで２０時間振盪しつつインキュベートした。インキュベートの後、プレートを洗浄バッファーで５回洗浄した。１μｇ／ｍｌ  ＨＲＰ標識された検出抗体（ＨＲＰ結合したＮＢ６１−Ｎ６２）を１００μｌ／ウェルで加え、２０℃、３００ｒｐｍで１時間振盪しながらインキュベートした。インキュベートの後、プレートを洗浄バッファーで５回洗浄した。容積１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加え、暗所で、２０℃で１５分間インキュベートした。ＴＭＢの酵素反応を停止させるために、１００μｌの０．１％硫酸を添加した。次いで、酵素反応を、二次曲線フィッティングを用い、ＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。各ＥＬＩＳＡプレートには、アッセイ間変動を監視するためのキットコントロールおよび社内品質コントロールサンプルの両方が含まれていた。全てのサンプルを、特異的アッセイの範囲内で測定した。下限定量化レベル（ＬＬＯＱ）未満の全てのサンプルに、ＬＬＯＱの値を割り当てた。
【００７１】
【表７】
2019510210.tif 000009
結果
瘢痕組織
【００７２】
肺線維芽細胞のインビトロモデル（「ｓｃａｒ−ｉｎ−ａ−ｊａｒ」）を用いた予備試験は、ＬＯＸファミリーの酵素が、ＰＩＩＩＮＰの架橋を担っていることを強く示唆している（ＴＧＦ−βは、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）酵素活性を高めることが当該技術分野で知られている）。簡単に言うと、混み合った状態で、ＴＧＦ−β刺激下、肺線維芽細胞を５日間培養することによって、Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘ（すなわち、架橋ＰＩＩＩＮＰ）を作成した。Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘは、ＴＧＦ−βと共に培養して１２日後に有意に上昇したが、ＴＧＦ−β非存在下では、観察されたＰｒｏ−Ｃ３Ｘは、無視できる量であった（図４）。同様に、Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘは、正常な皮膚に由来する抽出物と比較した場合、ケロイドからの抽出物では上昇した（図５）。
肝線維症
【００７３】
肝線維症の患者の試験を、「Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘ」アッセイを用いて行い、本明細書に記載の「Ｐｒｏ−Ｃ３」競合ＥＬＩＳＡと比較した。Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘは、線維症がより重篤な場合には、疾患の後期で有意に増加し、疾患の初期には健康なコントロールと同様のレベルであることがわかった（図６Ａ）。これと比較して、Ｐｒｏ−Ｃ３レベルは、疾患の全段階で異なっていた（図６Ｂ）。
【００７４】
Ｐｒｏ−Ｃ３ＸアッセイとＰｒｏ−Ｃ３Ｘアッセイとの選択性の違いは、Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘが架橋ＰＩＩＩＮＰのみを認識し、一方、Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘアッセイは、架橋ＰＩＩＩＮＰと架橋していないＰＩＩＩＮＰの両方を認識することに起因する。図７は、Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘアッセイを示し、この結論の背後にある理由のための図による説明を示す。
【００７５】
Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘアッセイ：架橋ＰＩＩＩＮＰが存在する場合、第１の抗体は、ＰＩＩＩＮＰの第１の鎖上の遊離エピトープに結合し、続いて第２の抗体は、ＰＩＩＩＮＰの第２の鎖上の遊離エピトープに結合する。しかし、架橋していないＰＩＩＩＮＰが存在する場合、表面結合抗体は、架橋していないＩＩＩ型コラーゲンの遊離エピトープに結合するが、第２の抗体は、結合エピトープが既に占有されているので結合することができず、そのため、第２の抗体を添加しても、シグナルを生成することができない。したがって、Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘアッセイからのシグナルは、もっぱら架橋ＰＩＩＩＮＰの検出に起因するものである。
【００７６】
これとは逆に、Ｐｒｏ−Ｃ３アッセイの実質的に全ての抗体は、ＰＩＩＩＮＰが架橋しているかどうかにかかわらず、遊離結合エピトープを含むＰＩＩＩＮＰの鎖に結合する。したがって、Ｐｒｏ−Ｃ３アッセイから得られたシグナルは、架橋ＰＩＩＩＮＰと架橋していないＰＩＩＩＮＰの凝集物のシグナルである。
【００７７】
したがって、ＬＯＸを標的とする薬物の効能を評価するためのＰｒｏ−Ｃ３Ｘアッセイの使用を促すのはこの選択性である。上述のように、対象への薬物投与の期間中のＬＯＸ活性の結果であると示唆されているＰＩＩＩＮＰ架橋のレベルを監視することは、薬物活性、したがって該薬物の効能を監視するために使用され得る。
アルコール性脂肪性肝炎
【００７８】
アルコール性脂肪性肝炎患者の試験を、「Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘ」アッセイを用いて実施し、本明細書に記載の「Ｐｒｏ−Ｃ３」アッセイと比較した。アルコール性脂肪性肝炎では、Ｐｒｏ−Ｃ３およびＰｒｏ−Ｃ３Ｘの両方が、この疾患の後期に上昇した（Ｍｅｔａｖｉｒ  ２−４）。しかし、硬変患者について、Ｐｒｏ−Ｃ３は、ＭＥＬＤ（末期肝疾患モデル）スコアと相関がなく（Ｐ＝０．５２７）、一方、Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘは、強く相関関係があった（ｃｏｒｒ係数３．３４、Ｐ＜０．００１）。さらに、ＰｒｏＣ３のみがアルブミンと負の相関があり、ＰｒｏＣ３Ｘは、アルブミン、ビリルビンおよびガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）と相関関係にあった（図８）。Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘが後期に増加するのは、ＰＩＩＩＮＰの架橋の増加を示唆し、これは、肝臓の瘢痕の増加（すなわち、増加したＬＯＸ活性）に一致するだろう。
実施例５  Ｓｃａｒ−ｉｎ−ａ−ＪａｒモデルにおけるＰｒｏ−Ｃ３Ｘの評価
【００７９】
背景：線維症は罹患組織内の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の蓄積であり、臓器不全および最終的に死に至る可能性がある。例えばトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−βによる刺激の後、線維芽細胞は、ＥＣＭタンパク質、特にコラーゲンの過剰な蓄積の原因となる主な細胞型である。ここでは、Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘ  ＥＬＩＳＡと組み合わせて、線維形成中のコラーゲン形成および架橋を調べるために、ＥＣＭおよび架橋を生成することが知られているインビトロモデル「Ｓｃａｒ−ｉｎ−ａ−Ｊａｒ」の使用について説明する。このツールは、これらの線維化プロセスの調節を評価することによって新規な抗線維性化合物の研究に使用することができる。
【００８０】
方法：健康なヒト肺線維芽細胞（Ｌ２４８）をコンフルエント状態になるまで増殖させた後、３０，０００細胞／ウェルの密度で接種した。０．４％のＦＣＳ、２２５ｍｇ／ｍＬのフィコール７０、１５０ｍｇ／ｍＬのフィコール４００、１％のアスコルビン酸を含むＤＭＥＭ培地中で細胞を１８日間増殖させた。細胞は、クロスリンクの形成を阻害するために、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）阻害剤β−アミノプロピオニトリル（ＢＡＰＮ；０．０２ｍＭまたは０．２ｍＭ）を含むか、または含まない１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βで刺激された。刺激を与えなかった細胞またはフィコールを含有しない培地中で増殖させた細胞をコントロールとして使用した。３日目、６日目、１０日目および１４日目に培地を交換した。線維芽細胞生存率を、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを用いて評価した。上述のＰｒｏ−Ｃ３ＸサンドイッチＥＬＩＳＡを用い、採取した上清中のＰｒｏ−Ｃ３Ｘレベルを評価した。
【００８１】
結果：ＴＧＦ−β刺激は、３日目からＰｒｏ−Ｃ３Ｘの放出を誘発し、１０日目のＰｒｏ−Ｃ３Ｘレベルのピークは刺激を受けていない細胞と比較して１４倍の増加を示した（ｐ＜０．０００１；図９）。０．０２ｍＭ  ＢＡＰＮを用いた治療は有意な効果がなかったが、０．２ｍＭ  ＢＡＰＮは、ＴＧＦ−β刺激のみの場合と比較してＰｒｏ−Ｃ３Ｘレベルの有意な減少を誘発した（０．５９倍の変化、ｐ＜０．０００１；図９）。
【００８２】
結論：ＬＯＸ阻害剤であるＢＡＰＮは、０．２ｍＭの濃度でＰｒｏ−Ｃ３Ｘレベルを有意に減少させ、このことは、Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘ  ＥＬＩＳＡが架橋エピトープを評価していることを示した。したがって、Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘ  ＥＬＩＳＡを用いて線維芽細胞の活性を評価し、潜在的な抗線維性化合物をスクリーニングするために使用することができる。ＴＧＦ−β刺激は、架橋されたＩＩＩ型コラーゲンプロペプチドのマーカーであるＰｒｏ−Ｃ３Ｘの放出を誘発した。
【００８３】
結論として、Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘアッセイは、ＩＩＩ型コラーゲンプロペプチドの開裂ネオエピトープと分子内架橋の存在とを組み合わせた第２世代のアッセイである。したがって、このアッセイは、線維症のタイムラインにおける異なる過程を記述するため、Ｐｒｏ−Ｃ３の測定にさらなる情報（すなわち、瘢痕内のコラーゲン分子の架橋結合）を提供する。したがって、ＬＯＸ阻害剤の使用が架橋ＰＩＩＩＮＰバイオマーカーの存在を減少させることが示されているので、Ｐｒｏ−Ｃ３Ｘアッセイは、ＬＯＸを標的とする薬剤、特にＬＯＸアンタゴニスト／阻害剤の効能を試験するために使用することができる。
【００８４】
本明細書では、明示的に別段の指示がない限り、「または」との単語は、条件の１つだけが満たされることが必要な「排他的なまたは」との演算子とは対照的に、述べられている条件の一方または両方が満たされたときに真の値を返す演算子の意味で使用される。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」との用語は、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を意味するのではなく、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で使用される。上で認められた全ての従来の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。ここで既に公開された文書が、その日時に、その教示がオーストラリアまたは他の場所での共通する一般的な知識であったことを認めるものである、または表すものであることを承認するものではない。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列表１
＜２２３＞従来技術のペプチド
＜２２３＞アセトアミド保護されたＣｙｓ
配列表２  ＜２２３＞ウシＰＩＩＩＮＰのＣ末端配列
配列表３  ＜２２３＞Ｃ末端ＰＩＩＩＮＰ配列
配列表４
＜２２３＞抗体エピトープ
＜２２３＞ＸａａはＰｒｏまたはＧｌｙであってもよい
配列表５
＜２２３＞伸長されたエピトープペプチド
＜２２３＞ＸａａはＰｒｏまたはＧｌｙであってもよい
＜２２３＞Ｘａａは存在しなくてもよく、またはＩＩＩ型コラーゲンの配列の１つ以上のアミノ酸であってもよい
配列表６  ＜２２３＞ヒトＰＩＩＩＮＰネオエピトープＣ末端配列
配列表７  ＜２２３＞げっ歯類ＰＩＩＩＮＰネオエピトープＣ末端配列
配列表８
＜２２３＞短くなったエピトープペプチド
＜２２３＞ＸａａはＰｒｏまたはＧｌｙであってもよい
配列表９
＜２２３＞Ｘａａは存在しないか、またはビオチン化−Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙである
＜２２３＞ビオチン化ペプチド
＜２２３＞Ｘａａが存在しない場合、Ｃｙｓはビオチン化されている
配列表１０
＜２２３＞ＣｙｓはＮ末端に結合したオボアルブミンを含む
＜２２３＞結合したオボアルブミン
配列表１１
＜２２３＞ＣｙｓはＮ末端がビオチン化されている
＜２２３＞ビオチン化ペプチド
配列表１２  ＜２２３＞ナンセンスペプチド
配列表１３  ＜２２３＞伸長されたペプチド
【００８６】
以下の参考文献を本明細書で引用する。
１．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｒｉｓｋｓ，Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｌｉｆｅ．Ｐｅｄｕｃｉｎｇ  Ｒｉｓｋｓ，Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｌｉｆｅ，Ｇｅｎｅｖａ：ＷＨＯ，２００２：１−２３０。
２．Ｗｙｎｎ  ＴＡ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００８；２１４：１９９−２１０。
３．Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＳＬ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２００４；１：９８−１０５。
４．Ｔｏｍａｓｅｋ  ＪＪ，Ｇａｂｂｉａｎｉ  Ｇ，Ｈｉｎｚ  Ｂ，Ｃｈａｐｏｎｎｉｅｒ  Ｃ，Ｂｒｏｗｎ  ＲＡ．Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｏ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００２；３：３４９−３６３。
５．Ｗｙｎｎ  ＴＡ．Ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｄ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｆｉｂｒｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７；１１７：５２４−５２９。
６．Ｂｏｓｍａｎ，Ｆ．Ｔ．およびＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ，Ｉ．２００３．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００：４２３−４２８。
７．Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｐ．２０１０．Ｓｕｐｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｃｅｓ：ｐａｒａｄｉｇｍｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．３３９：７−１８。
８．Ｂａｏ  Ｘ，Ｚｅｎｇ  Ｙ，Ｗｅｉ  Ｓ，Ｗａｎｇ  Ｇ，Ｌｉｕ  Ｃ，Ｓｕｎ  Ｙ，Ｃｈｅｎ  ＱおよびＬｉ  Ｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｌ３ａ１  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｐｉｇｓ．Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００７；  ３４（３）：２２３−２２８。
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１０．Ｎｉｅｍｅｌａ  Ｏ，Ｒｉｓｔｅｌｉ  Ｌ，Ｐａｒｋｋｉｎｅｎ  ＪおよびＲｉｓｔｅｌｉ  Ｊ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９８５；２３２（１）：１４５−１５０。
１１．Ｗａｎｇ  ＷＭ，Ｇｅ  Ｇ，Ｌｉｍ  ＮＨ，Ｎａｇａｓｅ  ＨおよびＧｒｅｅｎｓｐａｎ  ＤＳ．ＴＩＭＰ−３  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｎ−ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ＡＤＡＭＴＳ−２．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２００６；３９８（３）：５１５−５１９。
１２．Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｓｔｅｅｎ  ＰＥ，Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ  Ｇ，Ｗｏｒｍａｌｄ  ＭＲ，Ｄｗｅｋ  ＲＡおよびＲｕｄｄ  ＰＭ．Ｍａｔｒｉｘ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ，ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００１；１５２８（２−３）：６１−７３。
１３．Ｃｕｚｎｅｒ  ＭＬおよびＯｐｄｅｎａｋｋｅｒ  Ｇ．Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；９４（１−２）：１−１４。
１４．Ｍｅｄｕｒｉ  ＧＵ，Ｔｏｌｌｅｙ  ＥＡ，Ｃｈｉｎｎ  Ａ，Ｓｔｅｎｔｚ  ＦおよびＰｏｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ  Ａ．Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩＩ  ａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １９９８；１５８（５  Ｐｔ  １）：１４３２−１４４１。
１５．Ｔｅａｒｅ  ＪＰ，Ｓｈｅｒｍａｎ  Ｄ，Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ  ＳＭ，Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｊ，Ｂｒａｙ  Ｇ，Ｃａｔｔｅｒａｌｌ  ＡＰ，Ｍｕｒｒａｙ−Ｌｙｏｎ  ＩＭ，Ｐｅｔｅｒｓ  ＴＪ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＲおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ  ＲＰ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ＰＧＡ  ｉｎｄｅｘ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｌａｎｃｅｔ  １９９３；３４２（８８７６）：８９５−８９８。
１６．Ｓｃｈｅｊａ  Ａ，Ａｋｅｓｓｏｎ  ＡおよびＨｏｒｓｌｅｖ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｋ．Ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９９２；２１（１）：５−９。
１７．Ｌｉｎ  ＹＨ，Ｈｏ  ＹＬ，Ｗａｎｇ  ＴＤ，Ｌｉｕ  ＣＰ，Ｋａｏ  ＨＬ，Ｃｈａｏ  ＣＬ，Ｃｈｉｅｎ  ＫＬ，Ｈｕｎｇ  ＣＳ，Ｗｕ  ＶＣ，Ｔｓａｉ  ＩＪ，Ｙｅｎ  ＲＦ，Ｓｈｉａｕ  ＹＣおよびＣｈｅｎ  ＷＪ．Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００６；３９（９）：８６１−８６６。
１８．Ｔｅｐｐｏ  ＡＭ，Ｔｏｒｎｒｏｔｈ  Ｔ，Ｈｏｎｋａｎｅｎ  ＥおよびＧｒｏｎｈａｇｅｎ−Ｒｉｓｋａ  Ｃ．Ｕｒｉｎａｒｙ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ（ＰＩＩＩＮＰ）ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００３；７５（１２）：２１１３−２１１９。
１９．Ｈａｎ  ＸＹ，Ｗａｎｇ  Ｗ，Ｋｏｍｕｌａｉｎｅｎ  Ｊ，Ｋｏｓｋｉｎｅｎ  ＳＯ，Ｋｏｖａｎｅｎ  Ｖ，Ｖｉｈｋｏ  Ｖ，Ｔｒａｃｋｍａｎ  ＰＣおよびＴａｋａｌａ  ＴＥ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｋｅｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｄｏｗｎｈｉｌｌ  ｒｕｎｎｉｎｇ．Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ  １９９９；４３７（６）：８５７−８６４。
２０．Ｋｏｓｋｉｎｅｎ  ＳＯ，Ａｈｔｉｋｏｓｋｉ  ＡＭ，Ｋｏｍｕｌａｉｎｅｎ  Ｊ，Ｈｅｓｓｅｌｉｎｋ  ＭＫ，Ｄｒｏｓｔ  ＭＲおよびＴａｋａｌａ  ＴＥ．Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｏｒｃｅｄ  ｅｃｃｅｎｔｒｉｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ  ２００２；４４４（１−２）：５９−７２。
２１．Ｃｒａｍｅｒｉ  ＲＭ，Ｌａｎｇｂｅｒｇ  Ｈ，Ｔｅｉｓｎｅｒ  Ｂ，Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ  Ｐ，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ＨＤ，Ｏｌｅｓｅｎ  ＪＬ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＣＨ，Ｋｏｓｋｉｎｅｎ  Ｓ，Ｓｕｅｔｔａ  ＣおよびＫｊａｅｒ  Ｍ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｆｔｅｒ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｏｕｔ  ｏｆ  ｅｃｃｅｎｔｒｉｃ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ  ２００４；２３（４）：２５９−２６４。
２２．Ｃｈｅｎ  Ｆ，Ｌａｍ  Ｒ，Ｓｈａｙｗｉｔｚ  Ｄ，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ＲＣ，Ｏｐｉｔｅｃｋ  ＧＪ，Ｗｉｓｈｅｎｇｒａｄ  Ｄ，Ｌｉａｗ  Ａ，Ｓｏｎｇ  Ｑ，Ｓｔｅｗａｒｔ  ＡＪ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＣＥ，Ｂｅａｌｓ  Ｃ，Ｙａｒａｓｈｅｓｋｉ  ＫＥ，Ｒｅｉｃｉｎ  Ａ，Ｒｕｄｄｙ  Ｍ，Ｈｕ  Ｘ，Ｙａｔｅｓ  ＮＡ，Ｍｅｎｅｔｓｋｉ  ＪおよびＨｅｒｍａｎ  ＧＡ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎａｂｏｌｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ．Ｊ  Ｃａｃｈｅｘｉａ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  Ｍｕｓｃｌｅ  ２０１１；２（１）：４５−５６。
２３．Ｌｏｎｇｏｂａｒｄｉ  Ｓ，Ｋｅａｙ  Ｎ，Ｅｈｒｎｂｏｒｇ  Ｃ，Ｃｉｔｔａｄｉｎｉ  Ａ，Ｒｏｓｅｎ  Ｔ，Ｄａｌｌ  Ｒ，Ｂｏｒｏｕｊｅｒｄｉ  ＭＡ，Ｂａｓｓｅｔｔ  ＥＥ，Ｈｅａｌｙ  ＭＬ，Ｐｅｎｔｅｃｏｓｔ  Ｃ，Ｗａｌｌａｃｅ  ＪＤ，Ｐｏｗｒｉｅ  Ｊ，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＪＯおよびＳａｃｃａ  Ｌ．Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＨ）ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ＧＨ  ａｂｕｓｅ  ｉｎ  ｓｐｏｒｔｓ：ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ  ＧＨ−２０００  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２０００；８５（４）：１５０５−１５１２。
２４．Ｂｈａｓｉｎ  Ｓ，Ｈｅ  ＥＪ，Ｋａｗａｋｕｂｏ  Ｍ，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ＥＴ，Ｙａｒａｓｈｅｓｋｉ  Ｋ，Ｏｐｉｔｅｃｋ  ＧＪ，Ｒｅｉｃｉｎ  Ａ，Ｃｈｅｎ  Ｆ，Ｌａｍ  Ｒ，Ｔｓｏｕ  ＪＡ，Ｃａｓｔａｎｅｄａ−Ｓｃｅｐｐａ  Ｃ，Ｂｉｎｄｅｒ  ＥＦ，Ａｚｅｎ  ＳＰおよびＳａｔｔｌｅｒ  ＦＲ．Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｓ  ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ａｎａｂｏｌｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＧＨ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００９；９４（１１）：４２２４−４２３３。
２５．Ｎｅｌｓｏｎ  ＡＥ，Ｍｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｕ，Ｈａｎｓｅｎ  ＪＬ，Ｗａｌｋｅｒ  ＩＨ，Ｓｔｏｎｅ  Ｇ，Ｈｏｗｅ  ＣＪ，Ｌｅｕｎｇ  ＫＣ，Ｓｅｉｂｅｌ  ＭＪ，Ｂａｘｔｅｒ  ＲＣ，Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ  ＤＪ，Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ  ＲおよびＨｏ  ＫＫ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｂｕｓｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｒｅｃｒｅａｔｉｏｎａｌ  ａｔｈｌｅｔｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００８；９３（６）：２２１３−２２２２。
２６．Ｚａｃｈａｒｉａｅ  Ｈ，Ｈｅｉｃｋｅｎｄｏｒｆｆ  ＬおよびＳｏｇａａｒｄ  Ｈ．Ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ａ  １０−ｙｅａｒ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００１；１４４（１）：１００−１０３。
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３０．Ｆａｂｒｉｓ  Ｐ，Ｍａｒｒａｎｃｏｎｉ  Ｆ，Ｂｏｚｚｏｌａ  Ｌ，Ｂｉａｓｉｎ  ＭＲ，Ｄｅ  Ｌａｚｚａｒｉ  Ｆ，Ｐｌｅｂａｎｉ  Ｍ，Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ  Ｐ，Ｔｏｓｉｔｔｉ  Ｇ，Ｐｅｌｌｉｚｚｅｒ  Ｇ，Ｓｔｅｃｃａ  Ｃおよびｄｅ  ＬＦ．Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｅｒｕｍ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａ−ＩＦＮ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １９９９；３４（３）：３４５−３５０。
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【図１】
2019510210.tif 000010
【図２】
2019510210.tif 000011
【図３】
2019510210.tif 000012
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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