(57)【要約】  本発明は、循環免疫細胞において、ヘパラン硫酸(HS)及び/又はヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼ(HSST)のレベル及び/又は細胞内分布を、前記循環免疫細胞を単離することから決定することによる、アルツハイマー病の予後診断及び/又は診断の方法に関する。
2019510221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における、アルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のin vitro方法であって、
a)前記対象から循環免疫細胞を単離する工程と、
b)前記循環免疫細胞におけるヘパラン硫酸(HS)及び/又はヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼ(HSST)のレベル及び/又は細胞内分布を決定する工程と、
c)
-  HS及び/若しくはHSSTの前記レベル及び/若しくは細胞内分布、又は
-  HSSTの前記レベルのHSの前記レベルに対する比を
既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの基準と比較する工程と
を含むin vitro方法。
【請求項２】
前記HSが、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸(3S-HS)であり、前記HSSTが、ヘパラン硫酸3-O-スルホトランスフェラーゼ(HS3ST)、優先的には、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3、HS3ST4、HS3ST5及び/又はHS3ST6、より優先的には、HS3ST2、HS3ST3A及び/又はHS3ST3Bから選択される、請求項1に記載のin vitro方法。
【請求項３】
前記循環免疫細胞が、循環T細胞、B細胞、単球及び/又は単球由来マクロファージ(MDM)、優先的には、循環単球及び/又はMDMである、請求項1又は2に記載のin vitro方法。
【請求項４】
前記工程a)の後に、RPMI 1640培地等の適当な培養培地において、前記循環免疫細胞の培養工程a1)を更に含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のin vitro方法。
【請求項５】
前記培養工程a1)が、前記単球及び/又はMDMがM0表現型を示すまで、M-CSFを補完した前記適当な培養培地内で、7〜10日の間、好ましくは10日間実施される、請求項4に記載のin vitro方法。
【請求項６】
前記培養工程が、前記工程a1)に続いて、前記M0マクロファージがM2マクロファージ表現型を示すまで、抗炎症因子、好ましくはIL4/IL10を更に含むか、又は前記M0マクロファージがM1マクロファージ表現型を示すまで、炎症促進因子、好ましくはToll様受容体(TLR)リガンド、LPS及びIFNγを更に含む、M-CSFを補完した前記適当な培養培地中で、2から3日間、好ましくは3日間の追加の培養工程a2)を含む、請求項5に記載のin vitro方法。
【請求項７】
免疫蛍光法、ウエスタンブロット、ELISA、質量分析、フローサイトメトリー方法、免疫組織化学方法、及びこれらの組合せから選択される方法によって、HS及びHSSTのいずれか1つの前記レベルを決定する、請求項1から6のいずれか一項に記載のin vitro方法。
【請求項８】
HS3STの前記レベル及び/又は前記細胞内の位置が変化する、請求項1から7のいずれか一項に記載のin vitro方法。
【請求項９】
HS若しくは3S-HSの前記レベルが変化し、及び/又はその細胞内の位置が変化して、本質的には細胞質ゾルに蓄積する、請求項1から7のいずれか一項に記載のin vitro方法。
【請求項１０】
HS及び/又はHSST、好ましくは、3S-HS及び/又はHS3STの少なくとも1つからなるアルツハイマー病に対する循環生物学的マーカーであって、アルツハイマー病に対する循環生物学的マーカーとして使用するために、前記HS3STが、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/又はHS3ST6、好ましくは、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/又はHS3ST5から優先的に選択される循環生物学的マーカー。
【請求項１１】
アルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のためのキットであって、循環免疫細胞、好ましくは単球及び/又は単球由来マクロファージ(MDM)の精製手段、並びにHS及び/又はHSST、好ましくは3S-HS及び/又はHS3STのレベル及び/又は細胞内分布の検出手段を含み、前記HS3STが、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/又はHS3ST6、好ましくはHS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/又はHS3ST5から優先的に選択されるキット。
【請求項１２】
-  前記HS及び/若しくはHSST、好ましくは3S-HS及び/若しくはHS3STを増幅するための少なくとも1つのプライマーの組合せであって、前記HS3STが、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/若しくはHS3ST6、好ましくはHS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/若しくはHS3ST5から優先的に選択されるプライマーの組合せ、並びに/又は
-  前記HS及び/若しくはHSST、好ましくは3S-HS及び/若しくはHS3STを検出するための核酸プローブ等の少なくとも1つのプローブであって、前記HS3STが、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/若しくはHS3ST6、好ましくはHS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/若しくはHS3ST5から優先的に選択されるプローブ、並びに/又は
-  前記HS及び/若しくはHSST、好ましくは3S-HS及び/若しくはHS3STの少なくとも1つの特異的抗体であって、前記HS3STが、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/若しくはHS3ST6、好ましくはHS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/若しくはHS3ST5から優先的に選択される特異的抗体
を含む、請求項11に記載のキット。
【請求項１３】
前記特異的抗体が、比色定量又は蛍光標識に連結した、コンジュゲートされた抗体である、請求項12に記載のキット。
【請求項１４】
前記精製手段が、循環免疫細胞、好ましくは循環単球及び/又は単球由来マクロファージ(MDM)を選択的に保持するフィルターを含む、請求項11から13のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
-  緩衝液、好ましくはリン酸緩衝食塩水、
-  請求項4に規定の適当な細胞培養培地、
-  M-CSF、
-  任意選択で、好ましくは、組換えヒトサイトカインIL4及びIL10、又はToll様受容体(TLR)リガンド、LPS及びIFNγから選択される炎症促進因子及び/又は抗炎症因子、並びに
-  1つ又は複数の細胞培養容器
を更に含む、請求項11から14のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離された循環免疫細胞におけるヘパラン硫酸(HS)及び/又はヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼ(HSST)のレベル及び/又は細胞内分布を決定することによる、前記単離された循環免疫細胞からのアルツハイマー病(AD)の予後診断及び/又は診断の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患、特に、ADは、患者の生命を強力に衰弱させる影響を有する。更に、これらの疾患は、健康的、社会的、且つ経済的に多大な負担となる。ADは、地球規模で最も広まった神経変性疾患であり、世界的に、2700万人を超える人が罹患していると推定される。ADは、臨床で診断された全ての認知症の少なくとも50〜70%を占め、おそらく、65歳の年齢を超える集団の約10%、及び85歳を超える最大50%が罹患する、最も破壊的な年齢性の神経変性状態である。ADの発生年齢は、50年の範囲内で様々であり得、早期発生のADは65歳の年齢未満の人で生じ、晩期発生のADは65歳を超える人で生じる。全症例の約10%が早期発生のADに罹り、1〜2%のみが家族性の、突然変異に基づく、遺伝性の症例であり、残りの98〜99%が、突然変異が疾患に関連しない散発性のものである。
【０００３】
臨床的に、ADは、記憶形成における初期の欠陥に関連し、最終的には高い認知機能の完全な崩壊をもたらす進行性の疾患である。認知障害として、とりわけ、記憶障害、失語症、失認及び実行機能の喪失が挙げられる。ADの病因の特徴的特性は、特定の脳領域及び神経細胞亜集団が、変性過程に対して選択的に脆弱になることである。具体的には、大脳皮質の側頭葉領域及び海馬が初期に影響を受け、疾患の進行中にはより重大な影響を受ける。現在、ADに対する治療法は存在せず、その進行を止める有効な処置も存在しない。今日までに、血液又は血漿サンプルからのADの予後診断及び診断は、依然として利用可能となっていない。
【０００４】
ADについてのバイオマーカー研究が近年著しく進歩している。脳脊髄液(CSF)、血漿、及び尿等の体液は、ADのバイオマーカー開発に対する重要な供給源と考えられている。今日まで、ADの診断を確立するための最も有効な方法は、臨床及び神経心理学的評価、CSF分析、並びに脳画像診断手順で始まる多様な経路によって定義される。現在、少なくとも6つの生化学的測定又は走査手順が評価されており、バイオマーカーとして使用されている。これらのゴールドスタンダードバイオマーカーは、以下の2つのカテゴリーに分類される:a)アミロイドβ42(Aβ42)、総タウタンパク質、及びリン酸化タウタンパク質のレベルについて脳脊髄液(CSF)の分析によって評価されるバイオマーカー、並びにb)神経画像処理手段-磁気共鳴画像(MRI)によって測定される海馬萎縮、ピッツバーグ化合物Bを用いるポジトロン断層法(PiB-PET)、又は他のF18トレーサーによって測定されるアミロイドの取り込み、及びPET(FDG-PET)によって測定されるフルオロデオキシグルコース(18F)の取り込みの減少(Cavedoら、2014)。
【０００５】
これらのマーカーは、AD認知症、ADに起因する軽度認知障害(MCI)、前駆AD及び前臨床ADの診断に関してこれらを使用して、国際的な専門家のワーキンググループ(international expert working group)によって評価されている。しかし、これらのマーカーは全て、予後診断/診断価値を有さず、治療に対するコスト及びアクセスについてかなりの障害があることを特徴とする。したがって、生物学的且つ神経画像処理に由来するバイオマーカーの発見に関する当技術分野の現状についてのいくつかの総説は、理想的な診断及び予後診断価値を有する強力且つ再生産できる、非侵襲性の、一般化可能な、血液に基づくバイオマーカーの開発及び検証の必要性に焦点を当てている(Cavedoら、2014.  Ritterら、2015)。しかし、ADの診断におけるCSFの適用は、複雑で、費用がかかり、且つ侵襲性の方法であることが短所である腰椎穿刺によって制限される。更に、ADの診断におけるCSFの適用は、サンプルの収集、輸送、保存に起因するデータ分析の不一致をもたらし、日常的診断としてのその使用は制限される。
【０００６】
血液に基づく手段であるバイオマーカーによって、中間形質の初期マーカーに対する侵襲性が最小限である選択肢がもたらされる。いくつかの手法によって、Aβ、タウ、及び/又は炎症のマーカーを含む血清又は血漿中のマーカータンパク質の研究について検討されている。他の手法では、ADの症例を対照と区別する際に、診断上の有用性を有する場合がある血液に基づくプロテオミックバイオマーカーが提案されている。しかし、診断上又は治験上の有用性についての再現可能な特性を特定するのに報告された成功例は限られている。
【０００７】
血漿、血清又は循環細胞による手法におけるリピドーム学又はメタボロミクスの特性は、確立されたADに対して有望であることが示されているが、これらは、前臨床又は前駆疾患を検出することはできていない(Bairdら、2015)。
【０００８】
血漿、血清、尿及び脳脊髄液等の末梢生体液、並びに単核細胞における、マイクロアレイ技術、次世代トランスクリプトームシーケンス、エピジェネティック分析、及びマイクロRNA(miRNA)の検出を含む、新たな有力な技術的ツールの出現は、新たなADマーカーを特定するのに役立つと期待されているが、今日、ADの予後診断又は診断に関するそれらの真の価値についての証拠はない(Bossuら;、2015;Mushtaqら、2015)。
【０００９】
ADにおける血液由来の単球、マクロファージ、及び樹状細胞を含む骨髄細胞の価値は、それらのADの予後診断価値についての情報は存在しないが、ADを有する患者において変化する血液由来の単球細胞による不完全なAベータの食作用について、フローサイトメトリー分析を実施することによって提案されている(Fialaら、2010)。
【００１０】
残念ながら、今日まで、現在利用可能なバイオマーカーは、それだけで、疾患の診断を達成することができておらず、2種以上のバイオマーカーを同時にモニタリングすることが、疾患進行を検出するのに適していることが示唆されている(Anoopら、2010)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、非侵襲性で、信頼でき、より早く結果を得ることができ、あまり費用がかからず、且つ日常的診断として使用することのできるADの予後診断及び/又は診断のための新たな生物学的マーカーに対する需要がある。
【００１２】
したがって、本発明の目的の1つは、免疫循環細胞におけるHS及びHSSTの細胞内での蓄積及び分布に基づくアルツハイマー病の予後診断及び/又は診断の方法を提供することである。
【００１３】
本発明の目的の1つは、単離された循環免疫細胞からのアルツハイマー病の予後診断及び/又は診断の方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、アルツハイマー病に対する循環生物学的マーカーとして使用するための、HS及び/又はHSST、好ましくは、3S-HS及び/又はHS3STを提供することである。優先的には、前記HS3STは、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4及びHS3ST5及びHS3ST6から選択され、好ましくは、前記HS3STは、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及びHS3ST5から選択される。
【００１５】
本発明によれば、アルツハイマー病の前記循環生物学的マーカーは、特異的な抗体、プライマーの組合せ又はプローブを用いて検出することができる。
【００１６】
本発明の別の目的は、アルツハイマー病の診断又は予後診断の前記方法の実施のためのキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、対象における、アルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のin vitro方法であって、
a)前記対象から循環免疫細胞を単離する工程と、
b)前記循環免疫細胞におけるヘパラン硫酸(HS)及び/又はヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼ(HSST)のレベル及び/又は細胞内分布を決定する工程と、
c)
-  HS及び/若しくはHSSTの前記レベル及び/若しくは細胞内分布、又は
-  HSSTの前記レベルのHSの前記レベルに対する比を
既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの基準と比較する工程と
を含むin vitro方法に関する。
【００１８】
有利には、本発明による方法の工程c)の、HSSTの前記レベルのHSの前記レベルに対する前記比は、3S-HSのレベルに対するHS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及びHS3ST5のレベル、優先的には、3S-HSのレベルに対するHS3ST3A又はHS3ST3Bのレベル、より優先的には、3S-HSのレベルに対するHS3ST3Bのレベルからなる。
【００１９】
本発明において、用語「危険性」、「感受性」及び「素質」は同等であり、神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー病を発症する可能性に関して使用される。用語「AD」は、アルツハイマー病を意味する。「AD型神経病理学」は、本明細書で使用する場合、本発明で説明され、最新の文献から通常知られているような、神経病理学的、神経生理学的、組織病理学的及び臨床的ホールマークを指す(Ballardら、2011)。
【００２０】
「対象」とは、ADを有するか又はADを有しやすい哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。優先的には、前記対象は、遺伝的突然変異と関連しない、家族性のAD又は突然変異に基づくADを有するか又は有しやすい。特定の実施形態では、用語「対象」は、家族性の、突然変異に基づく、遺伝性のADを有する対象を包含しない。
【００２１】
表現「ヘパラン硫酸」(HS)は、N-、2-O、及び6-O硫酸を保有するヘパラン硫酸を含む総ヘパラン硫酸を指す。用語「HS」は、特異的な硫酸化パターンに関係なく、ヘパラン硫酸を意味する。特に、3-O-硫酸を保有するヘパラン硫酸は、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸(3S-HS)とも呼ばれ、循環細胞で検出することもできる。用語「3S-HS」は、他の古典的なN-、6-O及び2-O硫酸化に加えて、グルコサミンHS部分の3位に少なくとも硫酸基を保有する3-O-硫酸化ヘパラン硫酸を意味する。3S-HSは、HS生合成の間の特異的経路から得られるHSの稀な形態である。構造的に、HS鎖は、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)に連結したウロン酸から構成される繰り返し二糖単位から形成される。生合成の間、伸長する二糖鎖に、ウロン酸(GlcA)をイズロン酸(IdoA)にC5エピメラーゼによって変換することによるエピマー化、並びにIdoAの2-O-位、GlcNの6-O-位又はGlcNの3-O-位にそれぞれ硫酸基を導入する、NDST(N-デアセチル-O-スルホトランスフェラーゼ)、HS2ST(2-OST)、HS6ST(6-OST)及びHS3ST(3-OST)を含む様々なスルホトランスフェラーゼ(Sandwallら、2010)によって確認される様々な領域選択的硫酸化を含むいくつかの改変を加える。様々なスルホトランスフェラーゼの十分に組織化された発現により、HS配列の十分に細胞により制御された多様性を生じる。
【００２２】
用語「高度に硫酸化されたHS」は、ここでは、以下の硫酸化位:N-硫酸化、2-O-、6-O-及び3-O-硫酸化の少なくとも3つを有する二糖配列を含むHSとして定義される。本発明による高度に硫酸化されたHS二糖として、以下が挙げられる:N-硫酸、2-O-、6-O-及び3-O-硫酸;N-硫酸、2-O-及び6-O-硫酸;N-硫酸、6-O-及び3-O-硫酸;N-硫酸、2-O-及び3-O-硫酸;N-アセチル、2-O-、6-O-及び3-O-硫酸;N、2-O、6-O-及び3-O-硫酸並びに/又はこれらの構造の少なくとも1つを含有するオリゴ糖若しくは多糖HS鎖の組合せ。
【００２３】
HSは、いくつかの増殖因子、マトリックスタンパク質、サイトカイン等を含む、ヘパリン結合タンパク質(HBP)として知られているタンパク質ファミリーの機能のレギュレーターとして、生物学的に重要な役割を果たすことが十分に認識されている。HSの構造及び調節活性は、N-2-O、及び6-O位で、HS鎖の特異的な硫酸化を介して基本的に発揮される。3-O-位は、抗凝固及びウイルス感染に直接的に関連するにすぎない。興味深いことに、これらのHS構造は、組織中で高度に一定であるが、組織によって異なり、それぞれの組織の機能に適当に適合する。AD及びダウン症候群(DS)に由来する脳の観察により、HSは、罹患した対象のニューロンにおいて、細胞内レベルで蓄積するが、対照の個体に由来するニューロンにおいては蓄積しないことが示されている(Snowら、1990;Goedertら、1996)。興味深いことに、DSの脳では、HSの細胞内での蓄積から数年後、アミロイド斑及び神経原線維タングル(NFT)が検出される(Snowら、1990)。
【００２４】
更に、成人期にADを発症するDSを有する若い対象に由来する脳の観察によれば、HSの細胞内での蓄積を提示する神経細胞が観察され、疾患発生の数十年前(Suら、1996)、並びに初期及び進行したADにおいて検出可能であった。
【００２５】
したがって、特定の実施形態では、ADの予後診断及び/又は診断のin vitro方法の前記工程b)は、前記循環免疫細胞の細胞サイズ及び/又は形態を決定することでもあり得、前記工程c)は、前記HS及び/又はHSSTを含有する循環免疫細胞の前記細胞サイズ及び/又は形態を比較することである。例えば、前記HS及び/又はHSSTを含有する細胞の前記細胞サイズ及び/又は形態(すなわち、粒度分析...)は、健康な患者の前記循環免疫細胞のサイズと比較して、約120〜200%、好ましくは150%のサイズ平均の増加を示し得る。有利には、細胞の形態を比較する前記工程c)はADの予後診断又は診断のために使用される。
【００２６】
優先的には、本発明によるアルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のin vitro方法は、工程b)において、HS及び/又はHSSTのレベル及び/又は細胞内分布を決定し、前記HSは、3-O-硫酸化ヘパラン硫酸(3S-HS)であり、前記HSSTは、ヘパラン硫酸3-O-スルホトランスフェラーゼ(HS3ST)、優先的には、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及びHS3ST6、より優先的には、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及びHS3ST5から選択される。
【００２７】
用語ヘパリン-グルコサミン3-O-スルホトランスフェラーゼ-n又はヘパラン硫酸(グルコサミン)3-O-スルホトランスフェラーゼ-nは、「n」が2〜6であり、同じ意味を有する。これらの酵素は、3-OST-n又は3OSTn、HS3STn、h3-OSTn;ヘパラン硫酸3-O-スルホトランスフェラーゼ-n;ヘパラン硫酸D-グルコサミニル3-O-スルホトランスフェラーゼ-n;ヘパラン硫酸グルコサミン3-O-スルホトランスフェラーゼ-nとも称され得る。
【００２８】
用語「バリアント」は、本明細書で使用する場合、1つ又は複数のアミノ酸が、付加されており、及び/又は本発明のネイティブのポリペプチド若しくはタンパク質のネイティブのアミノ酸配列の範囲内にある、本発明において開示されているポリペプチド及びタンパク質に関連する、任意のポリペプチド又はタンパク質を指す。更に、用語「バリアント」は、ポリペプチド又はタンパク質の任意のより短いか又はより長いバージョンを含み、「バリアント」は、HS3ST1(配列番号1;受託番号:AAH57803.1)、HS3ST2(配列番号2;受託番号:AAQ89453.1)、HS3ST3A(配列番号3;受託番号:Q9Y663.1)、HS3ST3B(配列番号4;受託番号:Q9Y662)、HS3ST4(配列番号5;受託番号:AAD30210.2)、HS3ST5(配列番号6;受託番号:EAW48251.1)及びHS3ST6(配列番号7;受託番号:NP_001009606)のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列も含むものである。タンパク質分子の「バリアント」は、例えば、高度保存領域における保存的アミノ酸置換を有するタンパク質を含む。本発明の「タンパク質及びポリペプチド」は、HS3ST1(配列番号1)、HS3ST2(配列番号2)、HS3ST3A(配列番号3)、HS3ST3B(配列番号4)、HS3ST4(配列番号5)、HS3ST5(配列番号6)及びHS3ST6(配列番号7)のアミノ酸配列を含むタンパク質のバリアント、断片及び化学的誘導体を含む。コドンが、代替の塩基配列に起因する別のコドンで置き換えられているが、DNA配列によって翻訳されたアミノ酸配列は変化しないままである配列のバリエーションも含まれる。当技術分野で公知のこの現象は、特異的なアミノ酸を翻訳する一連のコドンの冗長性と呼ばれる。アルギニンをリジンへ、バリンをロイシンへ、アスパラギンをグルタミンへ等の、機能性に影響を及ぼさないアミノ酸のこのような交換も含まれる。自然から単離することができるか又は組換え及び/若しくは合成手段によって生成されるタンパク質及びポリペプチドも含まれ得る。ネイティブのタンパク質又はポリペプチドは、天然に存在する切断又は分泌形態、天然に存在する形態(例えば、スプライスバリアント及び天然に存在する対立遺伝子バリアント)を指す。
【００２９】
用語「循環免疫細胞」は、本明細書で使用する場合、T細胞、B細胞、単球及び/又は単球由来マクロファージ(MDM)、多形核細胞(PMN)並びに樹状細胞(DC)から選択される末梢血単核細胞(PBMC)を指す。
【００３０】
好ましい実施形態では、本発明によるアルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のin vitro方法の工程a)において、対象由来の前記循環免疫細胞は、循環T細胞、B細胞、単球及び/又はMDM、優先的には、循環単球及び/又はMDMから選択される。
【００３１】
更に、HS及び/又はHSSTのレベル及び/又は細胞内分布は、前記循環免疫細胞が数日間培養された場合に増強されることが観察されている。HS及び/又はHSSTのこれらのレベル及び/又は細胞内分布は、前記単球及び/又はMDMが培養されてM0マクロファージ表現型に分化した場合に、更に、M1及びM2マクロファージ表現型に分化した場合でも、更に増強され得る。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明によるアルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のin vitro方法は、前記工程a)の後に、RPMI 1640培地等の適当な培養培地において、前記循環免疫細胞、好ましくは単球及び/又はMDMの培養工程a1)を更に含む。有利には、前記培養工程a1)は、前記単球及び/又はMDMがM0表現型を示すまで、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を補完した本発明による適当な培養培地内で、7〜10日の間、好ましくは10日間実施される。好ましくは、前記循環免疫細胞が、単球及び/又はMDMから選択され、前記培養工程a1)が、前記単球及び/又はMDMがM0表現型を示すまで、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を補完した本発明による適当な培養培地内で、7〜10日の間、好ましくは10日間実施される、本発明によるアルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のin vitro方法。
【００３３】
「適当な培養培地」とは、循環免疫細胞に適する任意の細胞培養培地を意味し、このような培地は当業者に公知であり、例えば、10%の男性のABヒト血清(HuS)及びペニシリン/ストレプトアビジン(P/S)を補充した又は補充していないRPMI 1640培地がある。
【００３４】
用語「M0表現型」は、M1又はM2マクロファージのいずれにも未だ分化していない、マーカープロファイルCD14+/CD68+/CD80-/CD163-/CD209-/CD206-(Mantovaniら、2012)によって特徴付けられる、単球由来のナイーブマクロファージ、CD16+及び/又はCD16-を指す。M0マクロファージ表現型を得るための適当な培養培地は、例えば、生物活性タンパク質M-CSFを含有する細胞培養培地である。
【００３５】
「培養工程」とは、本明細書では、単離された細胞がex vivoで増殖し、適当な温度の適当な培養培地、及び細胞インキュベーター中のガス混合物中で維持されることを意味する。培養条件がそれぞれの細胞種に対して幅広く変化することは、当業者には周知であり、したがって、当業者は、特定の細胞種にとって適当な培養条件を認識している。例えば、前記適当な培養培地は、10%のヒト血清(HuS、好ましくは男性)を含有するRPMI 1640培地である。
【００３６】
好ましい実施形態では、前記培養工程が、前記工程a1)に続いて、前記M0マクロファージがM2マクロファージ表現型を示すまで、IL4/IL10を含むか、又は前記M0マクロファージがM1マクロファージ表現型を示すまで、炎症促進因子、好ましくはToll様受容体(TLR)リガンド、LPS及びIFNγ、若しくはその他を含む本発明による適当な培養細胞培地中で、2から3日間、好ましくは3日間の追加の培養工程a2)を含む、本発明によるアルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のin vitro方法。
【００３７】
用語「M1表現型」又は「M1マクロファージ」は、バクテリアのリポ多糖(LPS)及びインターフェロン-γ(IFN-y)等の炎症促進因子によって活性化され、TNFα等の炎症促進性シグナル伝達分子及びエフェクター分子を多量に生成することを含む特徴を示すマクロファージのサブタイプを指すのに全体を通して使用される。通常承認されるM1マクロファージのマーカープロファイルは、CD14+/CD68+/CD80+/CD163-/CD209-/CD206-である(Mantovaniら、2012)。M1細胞の主な役割は、病原体の排除と組織の破壊である。M1マクロファージ表現型を得るために適当な培養培地は、例えば、炎症促進因子、好ましくはToll様受容体(TLR)リガンド、LPS及びIFNγを補完した10%のヒト血清(HuS、男性)及びM-CSFを含有するか又は含有しない、RPMI 1640培地である。
【００３８】
用語「M2表現型」又は「M2マクロファージ」は、抗炎症因子、好ましくはインターロイキン-4(IL-4)、IL-10、IL-13、又はその組合せによって活性化されたマクロファージのサブタイプを指すのに全体を通して使用され、M2マクロファージのマーカープロファイルは、CD14+/CD68+/CD80-/CD163+/CD209+/CD206+であり、M2表現型の多くのサブタイプは、この用語で包含され、これは例えば、IL-4/IL-13によって活性化されたM2a、免疫複合体によって活性化されたM2b及びIL-10によって活性化されたM2cである。これらは、当業者に公知である(例えば、Mantovaniら、2004、2012に記載されている)。これらの細胞は、多量の抗炎症性IL10、TGF、及びIL1受容体アンタゴニストを合成し、したがって、M1マクロファージの炎症促進効果に対抗する。したがって、M2細胞の主な役割は、炎症のシグナル伝達を抑制することであり、炎症の消散、及び組織の治癒を可能にする。M2マクロファージ表現型を得るために適当な培養培地は、例えば、組換えヒトサイトカイン(IL4/IL10)等の抗炎症因子を補完した10%のヒト血清(HuS、男性)及びM-CSFを含有する、RPMI 1640培地である。
【００３９】
しかし、当業者は、M0、M1又はM2マクロファージ表現型において、特定の単離された循環免疫細胞を分化させるのにこれらに適用するための適当な培養条件を認識している。
【００４０】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、対象における、アルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のin vitro方法であって、
a)前記対象から単球及び/又はMDMを単離する工程と、
a1)前記単球及び/又はMDMがM0マクロファージ表現型を示すまで、M-CSFを含む適当な培養培地中で前記単球及び/又はMDMを培養する工程と、
b)前記循環免疫細胞における3S-HS及び/又はHS3STのレベル及び/又は細胞内分布を決定する工程と、
c)
-  3S-HS及び/若しくはHS3STの前記レベル及び/若しくは細胞内分布、又は
-  HS3STの前記レベルの3S-HSの前記レベルに対する比を
既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの基準と比較する工程と
を含むin vitro方法にも関する。
【００４１】
好ましい実施形態では、本発明は、対象における、アルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のin vitro方法であって、
a.前記対象から単球及び/又はMDMを単離する工程と、
a1)前記単球及び/又はMDMがM0マクロファージ表現型を示すまで、M-CSFを含む適当な培養培地中で前記単球及び/又はMDMを培養する工程と、
a2)前記M0マクロファージがM2マクロファージ表現型を示すまで、IL4/IL10を含む適当な培養培地中で前記M0マクロファージを培養する工程と、
b.前記循環免疫細胞における3S-HS及び/又はHS3STのレベル及び/又は細胞内分布を決定する工程と、
c.
-  3S-HS及び/若しくはHS3STの前記レベル及び/若しくは細胞内分布、又は
-  HS3STの前記レベルの3S-HSの前記レベルに対する比を
既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの基準と比較する工程と
を含むin vitro方法にも関する。
【００４２】
特定の実施形態では、ADの予後診断及び/又は診断のin vitro方法の前記工程b)は、前記単離された単球及び/又はMDMの細胞サイズ及び/又は形態を決定することでもあり得、前記工程c)は、前記3S-HS及び/又はHS3STを含有する細胞の前記細胞サイズ及び/又は形態を比較することである。例えば、前記3S-HS及び/又はHS3STを含有する細胞の前記細胞サイズ及び/又は形態(すなわち、粒度分析...)は、DSにおけるように、健康な患者の前記循環免疫細胞のサイズと比較して、約120〜200%、好ましくは150%のサイズ平均の増加を示し得る。有利には、細胞の形態を比較する前記工程c)はADの初期の予後診断又は診断のために使用される。
【００４３】
特定の実施形態では、本発明によるアルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のin vitro方法は、免疫蛍光法、ウエスタンブロット、ELISA、質量分析、フローサイトメトリー方法、免疫組織化学方法、及びこれらの組合せから選択される方法によって、工程b)において、HS及び/又はHSSTのレベルを決定する。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明による、対象における、アルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のin vitro方法は、比較工程c)が、HS3STの前記レベル並びに/又は前記細胞内の位置及び/若しくは分布が変化することを示す場合、前記対象が前記アルツハイマー病を有することを決定する。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明による、対象における、アルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のin vitro方法は、比較工程c)が、前記レベル及び/又は前記細胞の形態が変化することを示す場合、前記対象が前記アルツハイマー病を有することを決定する。
【００４６】
用語「変化する」とは、細胞内のHS3STの量及び細胞の位置が、既知の健康状態を表すそれぞれの基準と比較して、増加するか又は減少することになり得ることを意味する。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明による予後診断及び/又は診断のin vitro方法は、比較工程c)によって、HS若しくは3S-HSの前記レベルが増加し、及び/又はその細胞内の位置が変化して、本質的には細胞質ゾルに蓄積するが核内にも蓄積すると結論される場合、対象がアルツハイマー病を有することを示す。
【００４８】
本発明の別の目的は、少なくとも1つのHS及び/又はHSST、優先的には、少なくとも1つの3S-HS及び/又はHS3STからなるアルツハイマー病に対する循環生物学的マーカーに関する。好ましい実施形態によれば、前記HS3STは、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/又はHS3ST6から、優先的には、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/又はHS3ST5から選択される。
【００４９】
本発明の別の目的は、アルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のためのキットであって、循環免疫細胞、好ましくは単球及び/又は単球由来マクロファージ(MDM)の精製手段、並びに前記HS及び/又はHSST、好ましくは3S-HS及び/又はHS3STのレベル及び/又は細胞内分布の検出手段を含み、前記HS3STが、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/又はHS3ST6、好ましくはHS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/又はHS3ST5から優先的に選択されるキットを対象とする。
【００５０】
「精製手段」とは、本発明者らは、本明細書において、生体液サンプルから循環免疫細胞を単離するのに適する任意の手段を指す。このような手段は、例えば、直径が20μmより上位の、好ましくは15μmより上位のサイズの細胞を選択的に保持するか、又は濃縮することができるフィルターである。
【００５１】
「検出手段」とは、本発明者らは、本明細書において、細胞サイズを特定し、並びに/又は目的のHS及び/若しくはHSSTに特異的に結合することができる検出マーカーでマークされた抗体、プローブ又はプライマーを指す。前記検出マーカーは、比色定量又は蛍光標識、例えば、PE-Cy5.5、PE-CF594、PE-Cy7、PE若しくはFITCから選択される蛍光色素から選択され得る。優先的には、HS及びHSSTの特異的マーカーは、様々な比色定量又は蛍光標識でマークされ、より優先的には、使用される特異的マーカーのそれぞれは、様々な比色定量又は蛍光標識でマークされている。有利には、HS及びHSSTの特異的マーカーは、様々な蛍光色素でマークされ、より優先的には、使用される特異的マーカーのそれぞれは、様々な蛍光色素でマークされている。
【００５２】
特定の実施形態では、本発明によるアルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のためのキットは、
-  前記HS及び/若しくはHSST、好ましくは3S-HS及び/若しくはHS3STを増幅するための少なくとも1つのプライマーの組合せであって、前記HS3STが、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/若しくはHS3ST6、好ましくはHS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/若しくはHS3ST5から優先的に選択されるプライマーの組合せ、並びに/又は
-  前記HS及び/若しくはHSST、好ましくは3S-HS及び/若しくはHS3STを検出するための核酸プローブ等の少なくとも1つのプローブであって、前記HS3STが、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/若しくはHS3ST6、好ましくはHS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/若しくはHS3ST5から優先的に選択されるプローブ、並びに/又は
-  前記HS及び/若しくはHSST、好ましくは高度に硫酸化されたHS若しくは3-O-硫酸化を保有するHS鎖(3S-HS)、及び/若しくはHS3STの少なくとも1つの特異的抗体であって、前記HS3STが、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/若しくはHS3ST6、好ましくはHS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/若しくはHS3ST5から優先的に選択される特異的抗体
を更に含む。
【００５３】
有利には、本発明によるアルツハイマー病の予後診断及び/又は診断のためのキットは、使用の注意書を更に含む。
【００５４】
用語「プローブ」は、標識の存在を評価することによって、プローブの存在、及びプローブが結合する任意の標的配列を検出することができるように、検出可能に標識された、例えば蛍光標識された核酸の混合物を指す。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドから構成される任意の長さのポリマー、又は2つの天然に存在する核酸と同様の配列特異的な方式で、天然に存在する核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン-クリック型の塩基対相互作用に関与することができる合成によって生成された化合物を記載するために、本明細書において、互換的に使用される。
【００５５】
好ましい実施形態では、本発明によるキットは、比色定量又は蛍光標識に連結した、特異的にコンジュゲートされた抗体を含む。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明によるキットは、循環免疫細胞、好ましくは循環単球及び/又はMDMを選択的に保持するフィルターからなる精製手段を含む。
【００５７】
本発明によるキットは、
-  緩衝液、好ましくはリン酸緩衝食塩水、
-  本発明による適当な細胞培養培地(例えば、血清)、
-  M-CSF、
-  任意選択で、好ましくは、組換えヒトサイトカインIL4及びIL10、又はToll様受容体(TLR)リガンド、LPS及びIFNγから選択される炎症促進因子及び/又は抗炎症因子、並びに
-  1つ又は複数の細胞培養容器
を更に含む。
【００５８】
用語「緩衝液」は、当業者によって通常使用される、特に、リン酸ナトリウムを含む、細胞培養に適する溶液を指す。このような緩衝液の例は、リン酸緩衝食塩水である。
【００５９】
本発明は、それを必要とする対象における、アルツハイマー病の処置の方法であって、
a)前記対象の循環免疫細胞、好ましくは循環単球及び/又はMDMから循環細胞を単離する工程と
b)任意選択で、適当な培養培地内で前記循環単球及び/又はMDMを培養する工程と、
c)前記HS及び/又はHSST、好ましくは3S-HS及び/又はHS3STのレベル及び/又は細胞内分布を決定する工程であり、前記HS3STが、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/又はHS3ST6、好ましくはHS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/又はHS3ST5から優先的に選択される工程と、
d)
-  HS及び/若しくはHSSTの前記レベル及び/若しくは細胞内分布、又は
-  HSSTの前記レベルのHSの前記レベルに対する比を
既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの基準と比較する工程と、
e)工程d)による前記HS及び/又はHSSTの異常なレベル及び/若しくは細胞内分布、又は比を示す対象を選択する工程と、
f)アルツハイマー病を処置するのに適する少なくとも1つの薬剤を、工程e)の前記選択された対象に投与する工程と
を含む方法にも関する。
【００６０】
特定の実施形態では、AD処置のin vitro方法の前記工程c)は、前記循環免疫細胞の細胞サイズ及び/又は形態を決定することでもあり得、前記工程d)は、前記3S-HS及び/又はHS3STを含有する細胞の前記細胞サイズ及び/又は形態(すなわち、粒度分析...)を比較することである。例えば、前記高度に硫酸化されたHS及び/又は3S-HS及び/又はHS3STを含有する細胞の前記細胞サイズは、DSにおけるように、健康な患者の前記循環免疫細胞のサイズと比較して約120〜200%、好ましくは150%のサイズ平均の増加を示すことができる。
【００６１】
「アルツハイマー病を処置するのに適する薬剤」とは、ADに罹患しているか、又は罹患しやすい患者に投与されやすい任意の適切な薬剤を意味し、アルツハイマー病を処置するのに適するこのような前記少なくとも1つの薬剤は、とりわけ、例えば、抗体ベースの療法(BIIB037、Aducanumab、Crenezumab、Ponezumab、Bapineuzumab等)、ワクチン(AFFITOPE、CAD106、ACC-001等)、セロトニン作用薬(Dimebon、Pimavanserin、Cerlapirdine、Citalopram等)、コリン作用薬(Dopenezil、Rivastugmine、Encenicline、rivastigmine等)、他の神経伝達物質とそれらの受容体の相互作用剤(Memantine、Acamprosate、Sifrol、Brexpiprazole、PXT00864等)、BACE阻害剤(MK-8931、E2609等)、ガンマ分泌酵素阻害剤(Begacestad、Semagacestat等)、キナーゼ阻害剤(Tideglusib、Bryotatin等)、抗てんかん薬/抗精神病薬(Quetiapine、NSA-789等)、抗炎症剤(AZD5213、GC021109、インドメタシン等)、ダイエットサプリメント(NeuroAD、L-Arginine、Simvastatin、テトラヒドロビオプテリン、ビタミン等)、細胞療法剤(Neurostem等)、脳刺激介入(Rtms)、抗タウ薬(TRx0237等)、抗タウ抗体、抗タウオリゴヌクレオチドから選択され得る。
【００６２】
本発明の別の目的は、対象の循環免疫細胞において、HS及びHSST、好ましくは高度に硫酸化されたHS及び3S-HS並びに/又はHS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及びHS3ST6から選択されるHS3STのレベル及び/又は細胞内分布を測定するためのin vitro方法であって、
a)前記対象の循環免疫細胞、好ましくは循環単球及び/又はMDMを単離する工程と、
b)任意選択で、適当な培養培地内で前記循環免疫細胞を培養して、M0、M1又はM2マクロファージ表現型を得る工程と、
c)前記HS及び/又はHSST、好ましくは3S-HS及び/又はHS3STのレベル及び/又は細胞内分布を決定する工程であり、前記HS3STが、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/又はHS3ST6、好ましくはHS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/又はHS3ST5から優先的に選択される工程と、
d)
-  工程c)のHS及び/若しくはHSSTの前記レベル及び/若しくは細胞内分布、又は
-  工程c)のHSSTの前記レベルのHSの前記レベルに対する比を
既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの基準と比較する工程と
を含み、
前記対象が、アルツハイマー病に罹っていることが疑われるか又はアルツハイマー病に罹っているin vitro方法を対象とする。
【００６３】
特定の実施形態では、循環免疫細胞において、HS及びHSST、好ましくは3S-HS並びに/又はHS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及びHS3ST6から選択されるHS3STのレベル及び/又は細胞内分布を測定するためのin vitro方法の前記工程c)は、前記循環免疫細胞の細胞サイズ及び/又は形態を決定することでもあり得、前記工程d)は、工程c)の前記HS及び/又はHSSTを含有する細胞の細胞サイズ及び/又は形態を比較することである。
【００６４】
本発明の更に別の目的は、対象がアルツハイマー病を発症する危険性があるか否かを決定するためのin vitro方法であって、
a.前記対象の循環免疫細胞、好ましくは循環単球及び/又はMDMを単離する工程と、
b.適当な培養培地内で前記循環免疫細胞を培養して、M0、M1又はM2マクロファージ表現型を得る工程と、
c.HS及び/又はHSST、好ましくは3S-HS及び/又はHS3STのレベル及び/又は細胞内分布を決定する工程であり、前記HS3STが、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5及び/又はHS3ST6、好ましくはHS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B及び/又はHS3ST5から優先的に選択される工程と、
d.
-  HS及び/若しくはHSSTの前記レベル及び/若しくは細胞内分布、又は
-  HSSTの前記レベルのHSの前記レベルに対する比を
既知の疾患又は健康状態を表すそれぞれの基準と比較する工程と
を含み、
前記対象が、アルツハイマー病を発症しやすいか又はアルツハイマー病に罹っているin vitro方法を対象とする。
【００６５】
特定の実施形態では、対象がアルツハイマー病を発症する危険性があるか否かを決定するためのin vitro方法の前記工程c)は、前記循環免疫細胞の細胞サイズ及び/又は形態を決定することでもあり得、前記工程d)は、工程c)の前記HS及び/又はHSSTを含有する細胞の前記細胞サイズ及び/又は形態を比較することである。
【００６６】
前述の内容は、本発明の方法及びキットを使用することができるいくつかの実施形態の単なる例にすぎず、限定することを意図するものではない。
【００６７】
本発明は、添付の図面を参照して更に説明及び例証される。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】血液サンプルから単球(CD14+細胞)を単離する方法を示す図である。PBMCは、当業者によって古典的に使用される方法、例えば、Ficollデバイス、磁気ビーズ又は細胞選択フィルターによってEDTA血液サンプルから単離される。単球は、当業者によって古典的に使用されるストラテジー、例えば、CD14-磁気ビーズを使用することによってPBMCから更に単離される。得られた単球(CD14+)は、直接分析に、又は初代培養に使用することができる。
【図２】M0、M1又はM2マクロファージ表現型を得るための単離された単球(CD14+)の培養と分化の方法を示す図である。培養条件は、当業者によって使用されるものである。例えば、単球は、10%のHuSを含有するRPMI 1640中で培養される。次いで、M-CSFの存在下で付着細胞を培養し、M0表現型を得る。M1表現型は、M0培養細胞の細胞培地に、炎症促進因子、例えば、IFNγ及びLPSを含めることによって得られる。M2表現型は、M0培養細胞の細胞培地に、抗炎症因子、例えば、IL4及びIL10を含めることによって得られる。化合物の濃度及び培養時間は、図に示されるものである。
【図３】患者1及び対照の個体1からのMDMのM0における3S-HS及びHS3ST2の蓄積及び細胞内分布を示す図である。ADの患者対対照の個体からのMDMのM0における3S-HS及びHS3ST2免疫染色の差次的な細胞内の蓄積と分布。細胞核は、DAPI染色によって示される。A)細胞基底付近のZ面における共焦点光学スライド、B)中央細胞レベルのZ面における共焦点光学スライド、C)細胞全体の全体の共焦点投影像、及びD)位相差。
【図４】ADの患者及び対照の個体からのMDMのM0における3S-HS及びHS3ST2の蓄積及び細胞内分布を示す図である。AD対対照の個体からのMDMのM0における3S-HS及びHS3ST2免疫染色の差次的な細胞内の蓄積と分布。細胞核は、DAPI染色によって示される。A)細胞基底付近のZ面における共焦点光学スライド、B)中央細胞レベルのZ面における共焦点光学スライド、C)細胞全体の全体の共焦点投影像、及びD)位相差。
【図５】アルツハイマー病対炎症性疾患である骨関節炎(OA)からのMDMのM0における3S-HSの蓄積を示す図である。図は、5名のアルツハイマー病(AD)の患者、5名の対照の個体及び5名の骨関節炎(OA)患者を示す。AD細胞からのMDMのM0の全体の投影像は、特徴的なAD免疫染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６９】
材料及び方法
循環免疫細胞の単離:
末梢血単核細胞(PBMC)の単離。K2-EDTA静脈血サンプルを使用して、PBMCを単離する。PBMC  -  最も具体的には、リンパ球及び単球を分離して単離するために、Ficoll方法を使用する。血液標本をFicoll-Paque Plus溶液の上面に注意深く層状に重ね、次いで、一時的に遠心分離して、異なる種類の細胞を含有する異なる層を形成する。底層は、Ficoll培地で採取されるか又は凝集される赤血球(red blood cell)(赤血球(erythrocyte))から構成され、完全に底に沈む。底から上の次の層は、主に、Ficoll-Paque Plus溶液からも下に移動する顆粒球である。上に向かって次の層は、典型的には血漿とFicoll溶液の間の界面にあり、単球及び血小板を伴うリンパ球である。これらの細胞を回収するために、Ficoll-Paque Plusの製造業者の指示書に従うが、これは、当業者によって非常によく知られている。
【００７０】
リンパ球及び単球の独立した単離及び特徴付け。PBMCのFicollによる単離の後、特異的なモノクローナル抗体を用いた表面マーカー選択に基づいて、免疫-磁気ビーズ(Myltenyi MACSマイクロビーズ)を使用することによって、リンパ球及び単球が独立して単離される。T細胞は、CD3+でコーティングされたビーズを使用することによって分離される。B細胞は、CD19+をコーティングされたビーズを使用することによって分離される。単球は、CD14+をコーティングされたビーズを使用することによって分離される。この技術は、当業者によってよく知られており、比較的短時間での細胞の分離を可能とする。細胞の純度は、当業者によって古典的に実施されるように、特異的抗体を用いるFACScan分析によって評価される。T細胞はCD3+であり、B細胞はCD19+であり、単球はCD14+及びCD68+である。細胞の純度は、フローサイトメトリーによって評価した場合、典型的には、少なくとも95%である。各実験は、単一のドナーから単離された細胞を用いて行い、いずれの場合も、異なるドナーに由来する細胞が組み合わされる。
【００７１】
マクロファージのM0、M1及びM2表現型への培養及び分化(図1):
MDMの表現型M0、M1及びM2への誘導。新たに単離された単球(CD14+細胞)を、10%ヒト血清(HuS、男性)を含有する完全「RPMI 1640培地(Gibco 21875-034)」で、古典的には、1cm2当たり0.2/1×106個の細胞で、培養する。細胞を、例えば、M-CSF(例えば、50ng/mL)で7〜10日間刺激して、MDMをM0表現型に誘導し、次いで、細胞を、例えば、炎症性サイトカイン若しくはToll様受容体(TLR)リガンド(例えば、LPS  10ng/mL;IFNγ  50ng/mL)と共にM-CSF(例えば、50ng/mL)で2〜3日間更に刺激して、M0マクロファージのM1表現型への極性化を誘導するか、又はM-CSF(例えば、50ng/mL)と組換えヒト抗炎症性サイトカイン(例えば、IL4  20ng/mL;IL10  20ng/mL)を用いて、M0マクロファージのM2表現型への極性化を誘導する。MDMのM0は、フローサイトメトリーによって、CD14+、CD68+、CD80-、CD163-、CD206-、及びCD209-として特徴付けられる。MDMのM1は、フローサイトメトリーによって、CD14+、CD68+、CD80+、CD163-、CD206-、及びCD209-として特徴付けられる。MDMのM2は、フローサイトメトリーによって、CD14+、CD68+、CD80-、CD163+、CD206+、及びCD209+として特徴付けられる。
【００７２】
免疫蛍光法。表現型が何であろうと(T細胞、B細胞、単球、又はMDMのM1、M2、若しくはM0)、培養したPBMCは、特異的抗体を用いて別々に標識される。細胞中のヘパラン硫酸は、HS-3Sを選択的に検出することができるファージディスプレイ抗体であるHS認識抗体HS4C3(3S-HS)で、又は3-O-硫酸を有するHSを選択的に検出することができる任意の他の抗体によって、又は任意の他の抗HS抗体によって、及び3-O-スルホトランスフェラーゼ(HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A、HS3ST3B、HS3ST4、HS3ST5、又はHS3ST6)認識抗体によって標識される。標識化は、蛍光プローブに連結した二次及び三次抗体を使用することによって当業者によって古典的に行われるように可視化される(ここでは、Alexa-Fluorプローブが古典的に使用される)。ファージディスプレイHS4C3抗体は、抗VSV抗体によって、及び蛍光三次抗体によって可視化される。
【００７３】
細胞の形態、HS及びHS3STのレベル並びに細胞内の局在化は、顕微鏡検査、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡検査によって、及び/又は共焦点蛍光顕微鏡検査によって評価される。
【００７４】
ウエスタンブロット、ELISA又は他の免疫学技術等の他の検出技術を使用することもできる。
【００７５】
(実施例1)
AD及び対照の個体からのM2のMDMにおけるHS3ST2及びHS-3Sの免疫標識化。
血液を対照及びADの対象から採取した。ADの患者を、当業者が行うように、ピッツバーグ化合物Bを用いるポジトロン断層法(PiB-PET)によって測定したアミロイドの取り込みによって、ADであると臨床的に特徴付けられ、前もって診断した。当業者が行うようにして、材料及び方法で記載したように、PBMCを単離した。単離したPBMCを使用して、単球を単離し(CD14+細胞)、次いで、10%のHuS(男性)を含有する完全RPMI 1640培地(Gibco 21875-034)で、1cm2当たり0.2/1×106個の細胞で、培養した。次いで、細胞を、M-CSF(50ng/mL)で10日間刺激して、MDMをM0表現型に誘導した。M0のMDMは、当業者が古典的に行うように、次の抗体CD14+、CD68+、CD80-、CD163-、CD206-、及びCD209-を用いるフローサイトメトリーによって特徴付けられた。次いで、培養したMDMのM0を、HS3ST2及びHS4C3に対して特異的な一次抗体で標識した。HS3ST2の標識化は、Alexa-Fluor 555で標識した二次抗体を使用することによって、当業者が古典的に行うように可視化した。ファージディスプレイHS4C3抗体を、抗VSV抗体によって、次いで、Alexa-Fluor 488で標識した三次抗体によって、可視化した。Orca Hamamatsu RCCDカメラに接続したスピニングディスク倒立共焦点顕微鏡(IX81 DSU Olympus、60N.A. 1.35)から、ソフトウェアCellSensを用いて、スタック画像を得た。画像を、ImageJソフトウェア(W. Rasband、National Institute of Health)で処理した。
【００７６】
結果
図3は、AD対対照の個体からのMDMのM0の細胞膜における且つその細胞内レベルにおける3S-HS及びHS3ST2の変化した細胞内蓄積及び変化した分布を示す。ADの患者において3S-HSによって増強された免疫染色が、細胞基底付近の(図3A1)、細胞の中央における(図3B1)、Z軸面における共焦点光学スライドの両方で観察され、細胞全体の全体の共焦点投影像によって反映される(図3C1)。HS3ST2の免疫染色は、変化した細胞内蓄積を示すが、対照の細胞において、HS3ST2は、細胞基底付近のラフリング領域において蓄積し(図3A2)、ADにおいて、HS3ST2は、拡散性の細胞質ゾルの分布が得られた(図3B2)。この細胞内の細胞の移転3S-HSは、細胞全体の全体の共焦点投影像でも観察される(図3C2)。
【００７７】
結論
対照のMDMのM0と比較して、ADは、形態学的に変化したMDMのM0を示し、これは、細胞内レベルで及び細胞膜において3S-HSを蓄積する。これは、HS3ST2の変化した細胞分布を伴い、HS3ST2は、ラフリング領域から消失して、AD細胞の細胞質ゾルに位置する。結論として、ADにおいて観察された差次的な3S-HSレベルと分布を使用して、患者がADに罹患しているか否かを決定することができる。
【００７８】
(実施例2)
AD及び対照の個体からのM0のMDMにおけるHS3ST2及びHS-3Sの免疫標識化
血液を第2の対照及び第2のADの対象から採取した。ADの患者を、当業者が行うように、ピッツバーグ化合物Bを用いるポジトロン断層法(PiB-PET)によって測定したアミロイドの取り込みによって、ADであると臨床的に特徴付けられ、前もって診断した。当業者が行うようにして、材料及び方法で記載したように、PBMCを単離した。単離したPBMCを使用して、単球を単離し(CD14+細胞)、次いで、10%のHuS(男性)を含有する完全RPMI 1640培地(Gibco 21875-034)で、1cm2当たり0.2/1×106個の細胞で、1mL当たり1×106個で培養した。次いで、細胞を、M-CSF(50ng/mL)で7日間刺激して、MDMをM0表現型に誘導した。M0のMDMは、当業者が古典的に行うように、次の抗体CD14+、CD68+、CD80-、CD163-、CD206-、及びCD209-を用いるフローサイトメトリーによって特徴付けられた。次いで、培養したMDMのM0を、一次抗体HS3ST2及びHS4C3で標識した。HS3ST2の標識化は、Alexa-Fluor 555で標識した二次抗体を使用することによって、当業者が古典的に行うように可視化した。ファージディスプレイHS4C3抗体を、抗VSV抗体によって、次いで、Alexa-Fluor 488で標識した三次抗体によって、可視化した。Orca Hamamatsu RCCDカメラに接続したスピニングディスク倒立共焦点顕微鏡(IX81 DSU Olympus、60N.A. 1.35)から、ソフトウェアCellSensを用いて、スタック画像を得た。画像を、ImageJソフトウェア(W. Rasband、National Institute of Health)で処理した。
【００７９】
結果
図4は、AD対対照の個体からのMDMのM0の細胞膜における且つその細胞内レベルにおける3S-HS及びHS3ST2の変化した細胞内蓄積及び変化した分布を示す。ADの患者において3S-HSによって増強された免疫染色が、細胞基底付近の(図4A1)、細胞の中央における(図4B1)、Z軸面における共焦点光学スライドの両方で観察され、細胞全体の全体の共焦点投影像によって反映される(図4C1)。HS3ST2の免疫染色は、変化した細胞内蓄積を示すが、対照の細胞において、HS3ST2は、細胞基底付近のラフリング領域において蓄積し(図4A2)、ADにおいて、HS3ST2は、拡散性の細胞質ゾルの分布が得られた(図4B2)。この細胞内の細胞の移転3S-HSは、細胞全体の全体の共焦点投影像でも観察される(図4C2)。
【００８０】
結論
対照のMDMのM0と比較して、ADは、形態学的に変化したMDMのM0を示し、これは、細胞内レベルで及び細胞膜において3S-HSを蓄積する。これは、HS3ST2の変化した細胞分布を伴い、HS3ST2は、ラフリング領域から消失して、AD細胞の細胞質ゾルに位置する。結論として、ADにおいて観察された差次的な3S-HSレベルと分布を使用して、患者がADに罹患しているか否かを決定することができる。
【００８１】
(実施例3)
5名のADの患者対5名の対照の個体及び5名の骨関節炎(OA)に罹患するが神経学的には正常である(いずれかの検出可能な認知症)患者の3S-HS免疫染色
OAの患者の年齢は、ADの患者の年齢と一致するように選択した。
【００８２】
5名の異なるADの患者及び5名の対照の個体及び5名の神経学的に正常であるOAの患者(全て同様の年齢)からの血液を採取し、処理して、MDMのM0細胞を得て、これを実施例1と同様に3S-HSについて免疫染色した。Orca Hamamatsu RCCDカメラに接続したスピニングディスク倒立共焦点顕微鏡(IX81 DSU Olympus、60N.A. 1.35)から、ソフトウェアCellSensを用いて、スタック画像を得た。画像を、ImageJソフトウェア(W. Rasband、National Institute of Health)で処理した。
【００８３】
結果
5名の異なるADの患者及び5名の対照の個体及び5名の神経学的に正常であるOAの患者(全て同様の年齢)からのMDMのM0において、3S-HSの細胞内の蓄積及び変化した分布を分析した。図5  3S-HSを免疫染色した細胞全体の全体の共焦点投影像。対照の個体及びAD表現型を示さなかったOA且つ対照の個体と比較して、ADからのMDMのM0の細胞内レベルで、且つその細胞膜において、3S-HSが蓄積した。
【００８４】
結論
対照及び対照の個体からのOAのMDMのM2と比較して、ADからのMDMのM2は、細胞内レベルで、且つ細胞膜において3S-HSを蓄積する形態学的に変化した細胞を示す。これは、HS3ST2の変化した細胞分布を伴い、HS3ST2は、ラフリング領域から消失して、AD細胞の細胞質ゾルに位置する。結論として、ADにおいて観察された差次的な3S-HSレベルと分布を使用して、患者がADに罹患しているか否かを決定することができる。OAの患者からの結果は、観察されたAD表現型が炎症関連状態に関連しないことを示す。
【００８５】
(実施例4)
5名のADの患者対5名の対照の個体における、細胞の直径、面積並びに3S-HS及びHS3ST2の免疫染色
5名の異なるADの患者及び5名の対照の個体からの血液を採取し、処理して、MDMのM0細胞を得て、これを実施例1と同様に3S-HSについて免疫染色した。Orca Hamamatsu RCCDカメラに接続したスピニングディスク倒立共焦点顕微鏡(IX81 DSU Olympus、60N.A. 1.35)から、ソフトウェアCellSensを用いて、スタック画像を得た。画像を、ImageJソフトウェア(W. Rasband、National Institute of Health)で処理して、異なるフィールドで観察された各ADの患者又は各対照の対象に対して50個の細胞の平均として細胞の直径を得た(当業者が古典的に行うように)。フィールドは無作為に選択した。結果をTable 1(表1)に示す(n=5)。Table 1(表1)は、2D画像で観察した50個の細胞の平均面積として計算した2D相互作用表面も示す。この面積は、μm2で表され、当業者が古典的に行うように、ImageJソフトウェアで計算した。これは、各ADの患者(n=5)又は対照の対象(n=5)からの50個の細胞について計算した平均面積を表す。3S-HS及びHS3ST2に対する蛍光強度は、任意単位(AU)で表され、各ADの患者(n=5)又は各対照の対象(n=5)に対する50個の細胞の分析から、ImageJソフトウェアによって得られた。蛍光は、集中した蛍光強度を集中する細胞の面積において測定した。フィールドは無作為に得た(Table 1(表1))。結果は、異なる観察フィールドと同様であり、一致した。
【００８６】
結果
Table 1(表1)は、アルツハイマー病患者からのMDMのM0は、直径及び2D相互作用表面の増加によって示されるように、サイズが増加したことを示す(Table 1(表1))。3S-HSの蛍光強度は、アルツハイマー病からのMDMのM0において、対照の個体で測定したものより3倍高かった。HS3ST2の蛍光強度は、2分の1低かった。3S-HS/HS3ST2の蛍光の比は、AD対対照の個体の間で有意な差を示す。この比は、アルツハイマー病のMDMのM0において6倍高い。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
結論
Table 1(表1)の結果は、細胞の直径、2D相互作用表面、3S-HS、HS3ST2、及び3S-HS/HS3ST2を使用して、MDMのM0細胞において、アルツハイマー病を特定することができることを示す。このことによって、アルツハイマー病の予後診断又は診断において、これらのパラメーターのいずれか、又はこれらの組合せの使用がオープンになる。
(参考文献)
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2019510221.tif 000005
【図１】
2019510221.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019510221.tif 000012