(57)【要約】本開示において開示されている方法は、ペプチドのＭＨＣタンパク質への定量化された交換を可能にする。これらの方法は、交換ペプチドを有するＭＨＣタンパク質が、細胞染色などさらなる応用に使用されることを可能にする。本方法は、複合体混合物中に存在するペプチドを定量化するのにも使用され得る。ＭＨＣタンパク質はクラスＩまたはクラスＩＩ分子であり、それらは任意の多量体状態、例えば単量体、４量体、８量体、または１２量体において交換され得る。
2019516792.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＨＣ分子においてペプチド交換を実施する方法であって、
第１のペプチドに結合している前記ＭＨＣ分子を提供するステップ、および
前記第１のペプチドに結合している前記ＭＨＣ分子を第２の結合パートナーと接触させるステップであって、第２のペプチドに結合しているＭＨＣ分子を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記接触させるステップがペプチド交換因子の存在下で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触させるステップがペプチド交換因子の不在下で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の結合パートナーが第２のペプチドである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第１のペプチドに結合している前記ＭＨＣ分子を提供するステップ、および
前記第１のペプチドに結合している前記ＭＨＣ分子を第２のペプチドと接触させるステップであって、前記第２のペプチドに結合しているＭＨＣ分子を生成するステップ
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩＩ分子である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記請求項のいずれか一項に記載のＭＨＣクラスＩ分子においてペプチド交換を実施する方法であって、
第１のペプチドに結合している前記ＭＨＣクラスＩ分子を提供するステップ、および
第１のペプチドに結合している前記ＭＨＣクラスＩ分子をペプチド交換因子の存在下で第２のペプチドと接触させるステップであって、前記第２のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項９】
前記第１のペプチドが第１の標識によって標識される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の標識がビオチン、ハプテン、またはタグである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の標識が第１のタグである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のタグがＤＮＰである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２のペプチドが標識されない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のペプチドがタグを表示しない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２のペプチドが第２の標識を表示し、さらに前記第１の標識が前記第２の標識と異なる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の標識がビオチン、ハプテン、またはタグである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の標識が第２のタグであり、さらに前記第１のタグが前記第２のタグと異なる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記請求項のいずれか一項に記載のＭＨＣ分子においてペプチド交換を実施する方法であって、
第１のペプチドに結合している第１の量のＭＨＣ分子を提供するステップ、ならびに
前記第１のペプチドに結合している前記ＭＨＣ分子に第２の量の第２の結合パートナーを添加するステップであって、それにより前記第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子、前記第２の結合パートナーに結合しているＭＨＣ分子、未結合の第１のペプチド、および未結合の第２の結合パートナーを含む混合物が形成されるステップ
を含む、方法。
【請求項１９】
前記添加するステップが、ペプチド交換因子を添加するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
添加するステップが、ペプチド交換因子を添加するステップを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の結合パートナーが第２のペプチドである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記請求項のいずれか一項に記載のＭＨＣ分子においてペプチド交換を実施する方法であって、
第１のペプチドに結合している第１の量のＭＨＣ分子を提供するステップ、ならびに
前記第１のペプチドに結合している前記ＭＨＣ分子に、ペプチド交換因子および第２の量の第２のペプチドを添加するステップであって、それにより前記第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子、前記第２のペプチドに結合しているＭＨＣ分子、未結合の第１のペプチド、および未結合の第２のペプチドを含む混合物が形成されるステップ
を含む、方法。
【請求項２３】
前記ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩＩ分子である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド交換を実施する方法であって、
第１のペプチドに結合している第１の量のＭＨＣクラスＩ分子を提供するステップ、ならびに
第１のペプチドに結合している前記ＭＨＣクラスＩ分子に、ペプチド交換因子および第２の量の第２のペプチドを添加するステップであって、それにより前記第１のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子、前記第２のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子、未結合の第１のペプチド、および未結合の第２のペプチドを含む混合物が形成されるステップ
を含む、方法。
【請求項２６】
前記第１のペプチドが第１の標識で標識される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の標識がビオチン、ハプテン、またはタグである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の標識が第１のタグである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１のタグがＤＮＰである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２のペプチドが標識されない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のペプチドがタグを表示しない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２のペプチドが第２の標識を表示し、さらに前記第１の標識が前記第２の標識と異なる、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２の標識がビオチン、ハプテン、またはタグから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の標識が、第２のタグであり、さらに前記第１のタグが前記第２のタグと異なる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子の量、前記第２のペプチドに結合しているＭＨＣ分子の量、未結合の第１のペプチドの量、または未結合の第２のペプチドの量の少なくとも１つを決定するステップをさらに含む、請求項１８から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のペプチドに結合している前記ＭＨＣクラスＩ分子の量と、前記第２のペプチドに結合している前記ＭＨＣクラスＩ分子の量の比を決定するステップを含む、請求項１８から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
未結合の第１のペプチドの量を決定するステップ、および未結合の第１のペプチドの量を前記第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子の前記第１の量と比較するステップをさらに含む、請求項１８から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
未結合の第１のペプチドの量を決定するステップ、および未結合の第１のペプチドの量を前記第１のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子の前記第１の量と比較するステップをさらに含む、請求項１８から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記決定するステップがイムノアッセイを実施するステップを含む、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記決定するステップがイムノアッセイを実施するステップによって達成される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記イムノアッセイがサンドイッチイムノアッセイである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記サンドイッチイムノアッセイを実施するステップが、
第１の抗体にコンジュゲートしている支持体を提供すること；
前記第１の抗体を、前記第１のペプチドに結合している前記ＭＨＣ分子および前記第２のペプチドに結合している前記ＭＨＣ分子に結合させること；
前記第１のペプチドに結合することができる第２の抗体を提供すること；
前記第２の抗体を、前記第１のペプチドに結合している前記ＭＨＣ分子に結合させることであって、それにより前記第２の抗体が前記支持体に結合されること；
前記支持体に結合している前記第２の抗体の量を決定すること
を含む、請求項４１から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記支持体が磁気ビーズまたは非磁気ビーズを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記サンドイッチイムノアッセイを実施するステップが、磁気を使用して、遠心分離によって、または吸引によってビーズをペレット化することを含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の抗体が抗ＭＨＣまたは抗ストレプトアビジン抗体である、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１のペプチドがＤＮＰで標識され、前記第２の抗体が抗ＤＮＰ抗体である、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第２の抗体がフルオロフォアまたは放射標識で標識される、請求項４２から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記第２の抗体がフルオロフォアで標識される、請求項４２から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
制御ペプチド交換を行うステップをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記混合物が、追加のペプチド、脂質、またはポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１８から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子を含む、ペプチド交換のためのキット。
【請求項５２】
ペプチド交換因子をさらに含む、請求項５１に記載のペプチド交換のためのキット。
【請求項５３】
前記第１のペプチドが第１の標識で標識される、請求項５１から５２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
前記第１の標識がビオチン、ハプテン、またはタグである、請求項５１から５３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
前記第１の標識が第１のタグである、請求項５１から５４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
前記第１のタグがＤＮＰである、請求項５１から５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
抗第１のタグ抗体をさらに含む、請求項５５から５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
抗ＭＨＣタンパク質抗体を含む捕捉システムをさらに含む、請求項５１から５７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
前記捕捉システムが磁気捕捉ビーズを含む、請求項５１から５８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６０】
前記第１のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子；および
ペプチド交換因子
を含む、請求項５１から５９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６１】
前記第１のペプチドが第１のタグを表示し、
抗第１のタグ抗体；および
抗ＭＨＣタンパク質抗体を含む捕捉システム
をさらに含む、請求項５１から６０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６２】
参照ペプチドをさらに含む、請求項５１から６１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６３】
前記ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子の単量体である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項６４】
前記ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ多量体の成分である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項６５】
前記多量体が４つのＭＨＣクラスＩ分子を含む、請求項６４に記載の方法またはキット。
【請求項６６】
前記多量体が６つのＭＨＣクラスＩ分子を含む、請求項６５に記載の方法またはキット。
【請求項６７】
前記多量体が１２個のＭＨＣクラスＩ分子を含む、請求項６６に記載の方法またはキット。
【請求項６８】
前記ＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ａ＊０２：０１である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項６９】
前記ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩＩ分子の単量体である、請求項１から６２のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項７０】
前記ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩＩ多量体の成分である、請求項１から６２のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項７１】
前記多量体が４つのＭＨＣクラスＩＩ分子を含む、請求項７０に記載の方法またはキット。
【請求項７２】
前記多量体が６つのＭＨＣクラスＩＩ分子を含む、請求項７１に記載の方法またはキット。
【請求項７３】
前記多量体が１２個のＭＨＣクラスＩＩ分子を含む、請求項７２に記載の方法またはキット。
【請求項７４】
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲ４である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項７５】
前記ペプチド交換因子がペプチド交換因子１である、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項７６】
前記第１のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶ、またはＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶと少なくとも７５％同一性を有するその機能的ホモログである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項７７】
前記第１のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶ、またはＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶと少なくとも８０％同一性を有するその機能的ホモログである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項７８】
前記第１のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶ、またはＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶと少なくとも９０％同一性を有するその機能的ホモログである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項７９】
前記第１のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、またはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項８０】
前記第２のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、もしくはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦ、またはＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、もしくはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦと少なくとも７５％同一性を有するその機能的ホモログである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項８１】
前記第２のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、もしくはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦ、またはＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、もしくはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦと少なくとも８０％同一性を有するその機能的ホモログである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項８２】
前記第２のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、もしくはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦ、またはＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、もしくはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦと少なくとも９０％同一性を有するその機能的ホモログである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項８３】
前記第２のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、またはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項８４】
前記第１のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＩＬＫＥＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶ、またはＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶと少なくとも７５％同一性を有するその機能的ホモログである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項８５】
前記第１のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＩＬＫＥＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶ、またはＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶと少なくとも８０％同一性を有するその機能的ホモログである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項８６】
前記第１のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＩＬＫＥＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶ、またはＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶと少なくとも９０％同一性を有するその機能的ホモログである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項８７】
前記第１のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＩＬＫＥＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、もしくはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項８８】
前記第２のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＩＬＫＥＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、もしくはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦ、またはＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、もしくはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦと少なくとも７５％同一性を有するその機能的ホモログである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項８９】
前記第２のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＩＬＫＥＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、もしくはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦ、またはＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、もしくはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦと少なくとも８０％同一性を有するその機能的ホモログである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項９０】
前記第２のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＩＬＫＥＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、もしくはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦ、またはＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、もしくはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦと少なくとも９０％同一性を有するその機能的ホモログである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項９１】
前記第２のペプチドが、ＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＩＬＫＥＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、またはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦである、前記請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年５月１３日に出願された米国仮出願番号第６２／３３６，１８９号、および２０１６年１１月１５日に出願された米国仮出願番号第６２／４２２，４０９号の利益を主張している。これら仮出願の各々の内容は、その全体が参考として本明細書中にすべてが援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
免疫応答の間、抗原提示細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の抗原特異的Ｔ細胞受容体との相互作用によりＴリンパ球を活性化し、これは次いでＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球増殖を誘発する。これらの抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の検出は、参照により本明細書に全体が組み込まれる、Ａｌｔｍａｎらの米国特許第５，６３５，３６３号に記載されるように、それぞれＭＨＣクラスＩＩおよびクラスＩの４量体の使用によって可能である。ＭＨＣクラスＩの４量体は、４つのビオチン化ＭＨＣペプチド単量体の蛍光色素コンジュゲートしたストレプトアビジンへの結合によって形成される。４量体を認識するＴ細胞受容体の能力は、ＭＨＣ対立遺伝子およびペプチド配列の両方に依存する。特定の抗原／対立遺伝子組合せに特異的なＣＤ８＋Ｔリンパ球の割合は、免疫蛍光マルチカラーアッセイに続くフローサイトメトリー分析における蛍光ＭＨＣクラスＩの４量体による白血球の染色によって決定され得る。ＭＨＣクラスＩの単量体はＭＨＣ重鎖、β２ミクログロブリン、および抗原ペプチドを含有する。ほとんどのＭＨＣクラスＩ分子に関して、ＭＨＣ−ペプチド複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフォールディングの成功は、重鎖へのペプチド結合に基づき、典型的にはナノモル範囲の親和性でペプチドが重鎖に結合している必要がある。生じる４量体は、ＭＨＣタンパク質に強く結合しているペプチドを有する安定な実体である。
【０００３】
ＭＨＣ複合体の完全性に影響せずに目的のペプチドまたはＭＨＣ結合分子によって容易に置き換えることができるように、フォールディングプロセス中に重鎖に強くは結合しないペプチドを含有するＭＨＣクラスＩ分子の作製が望まれる。小分子によるペプチド交換または置換は、異なる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の研究に使用され得るＭＨＣ由来試薬の作製を可能にする。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｐｒｉｎｇｅｒらの米国特許出願公開第２０１４／０３７０５２４号に記載されるように、ＭＨＣタンパク質におけるペプチド交換のためのいくつかの技術が公知である。しかしながら、ペプチド交換を定量化する技術が必要とされる。これは、例えばフローサイトメトリー染色において使用される４量体のために必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，６３５，３６３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１４／０３７０５２４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
一態様では、本開示は、ＭＨＣタンパク質において、例えば定量化されたペプチド交換などペプチド交換を実施する方法を提供する。ＭＨＣタンパク質はクラスＩまたはクラスＩＩ分子であり、それらは任意の多量体状態、例えば単量体、４量体、８量体、または１２量体において交換され得る。
【０００６】
別の態様では、本開示は、ペプチド交換能が高いＭＨＣクラスＩの４量体、およびそれを産生する方法を提供する。
【０００７】
別の態様では、本開示は、交換されたペプチドを有するＭＨＣクラスＩの４量体を提供する。
【０００８】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されている方法を実施するための組成物およびキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｆは、本明細書に記載の方法を行うための例示的なプロトコールを説明する。図１Ａは、単一のビーズの選択、ならびにダブレットおよびより大きな塊の除外を示す。図１Ｂは、第１の対数区間（約０．２〜０．３）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有するように、未使用のビーズに基づくＰＭＴ電圧およびゲインの設定を示す。図１Ｃは、ＦＩＴＣチャネルの蛍光色素の干渉を除去するＦＬ１チャネルでの補償を示す。図１Ｄは、０％タグ付きペプチド、すなわち１００％ペプチド交換の補正レベルを示す。図１Ｅは、１００％タグ付きペプチド、すなわち０％ペプチド交換の補正レベルを示す。図１Ｆは試料交換の例示的なデータを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｆは、本明細書に記載の方法を行うための例示的なプロトコールを説明する。図１Ａは、単一のビーズの選択、ならびにダブレットおよびより大きな塊の除外を示す。図１Ｂは、第１の対数区間（約０．２〜０．３）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有するように、未使用のビーズに基づくＰＭＴ電圧およびゲインの設定を示す。図１Ｃは、ＦＩＴＣチャネルの蛍光色素の干渉を除去するＦＬ１チャネルでの補償を示す。図１Ｄは、０％タグ付きペプチド、すなわち１００％ペプチド交換の補正レベルを示す。図１Ｅは、１００％タグ付きペプチド、すなわち０％ペプチド交換の補正レベルを示す。図１Ｆは試料交換の例示的なデータを示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｆは、本明細書に記載の方法を行うための例示的なプロトコールを説明する。図１Ａは、単一のビーズの選択、ならびにダブレットおよびより大きな塊の除外を示す。図１Ｂは、第１の対数区間（約０．２〜０．３）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有するように、未使用のビーズに基づくＰＭＴ電圧およびゲインの設定を示す。図１Ｃは、ＦＩＴＣチャネルの蛍光色素の干渉を除去するＦＬ１チャネルでの補償を示す。図１Ｄは、０％タグ付きペプチド、すなわち１００％ペプチド交換の補正レベルを示す。図１Ｅは、１００％タグ付きペプチド、すなわち０％ペプチド交換の補正レベルを示す。図１Ｆは試料交換の例示的なデータを示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｆは、本明細書に記載の方法を行うための例示的なプロトコールを説明する。図１Ａは、単一のビーズの選択、ならびにダブレットおよびより大きな塊の除外を示す。図１Ｂは、第１の対数区間（約０．２〜０．３）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有するように、未使用のビーズに基づくＰＭＴ電圧およびゲインの設定を示す。図１Ｃは、ＦＩＴＣチャネルの蛍光色素の干渉を除去するＦＬ１チャネルでの補償を示す。図１Ｄは、０％タグ付きペプチド、すなわち１００％ペプチド交換の補正レベルを示す。図１Ｅは、１００％タグ付きペプチド、すなわち０％ペプチド交換の補正レベルを示す。図１Ｆは試料交換の例示的なデータを示す。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｆは、本明細書に記載の方法を行うための例示的なプロトコールを説明する。図１Ａは、単一のビーズの選択、ならびにダブレットおよびより大きな塊の除外を示す。図１Ｂは、第１の対数区間（約０．２〜０．３）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有するように、未使用のビーズに基づくＰＭＴ電圧およびゲインの設定を示す。図１Ｃは、ＦＩＴＣチャネルの蛍光色素の干渉を除去するＦＬ１チャネルでの補償を示す。図１Ｄは、０％タグ付きペプチド、すなわち１００％ペプチド交換の補正レベルを示す。図１Ｅは、１００％タグ付きペプチド、すなわち０％ペプチド交換の補正レベルを示す。図１Ｆは試料交換の例示的なデータを示す。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｆは、本明細書に記載の方法を行うための例示的なプロトコールを説明する。図１Ａは、単一のビーズの選択、ならびにダブレットおよびより大きな塊の除外を示す。図１Ｂは、第１の対数区間（約０．２〜０．３）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有するように、未使用のビーズに基づくＰＭＴ電圧およびゲインの設定を示す。図１Ｃは、ＦＩＴＣチャネルの蛍光色素の干渉を除去するＦＬ１チャネルでの補償を示す。図１Ｄは、０％タグ付きペプチド、すなわち１００％ペプチド交換の補正レベルを示す。図１Ｅは、１００％タグ付きペプチド、すなわち０％ペプチド交換の補正レベルを示す。図１Ｆは試料交換の例示的なデータを示す。
【００１０】
【図２】図２Ａは、例示的なペプチド交換の概念図である。図２Ｂは、ペプチド交換によって得た４量体が、Ｍａｒｔ−１ペプチドで元々調製した４量体と同様に細胞を染色することを示す。
【００１１】
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイの概略図である。
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、本明細書に記載のサンドイッチイムノアッセイの概略図である。
【００１２】
【図４】図４は、フローサイトメトリーによって測定した抗ＤＮＰシグナルおよび実際の脱出ＤＮＰタグ付きペプチドレベルの間の直線的相関を示す。
【００１３】
【図５】図５は、フローサイトメトリーによって測定した抗ＤＮＰシグナルおよび捕捉した実際のＤＮＰ抗原の間の直線的相関を示す。
【００１４】
【図６】図６は、脱出ペプチドＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴおよびＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶ、ならびに様々な侵入ペプチドによるペプチド交換の結果を示す。
【００１５】
【図７】図７は、様々な濃度での脱出ペプチドＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶおよびＩＬＫＥＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ならびに侵入ペプチドＹＬＬＥＦＴＰＰＶによるペプチド交換実験の結果を示す。
【００１６】
【図８】図８は、それらの予測される親和性に対する様々なペプチドの測定したペプチド交換率をプロットする。
【００１７】
【図９】図９は、それらの測定したペプチド交換率に対する様々なペプチドの予測される親和性をプロットする。
【００１８】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｊは、複合体ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＱＹＤＰＶＡＡＬＦのＴ細胞受容体を発現する昆虫細胞を染色するために使用される天然のおよび交換された４量体の反応性を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｊは、複合体ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＱＹＤＰＶＡＡＬＦのＴ細胞受容体を発現する昆虫細胞を染色するために使用される天然のおよび交換された４量体の反応性を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｊは、複合体ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＱＹＤＰＶＡＡＬＦのＴ細胞受容体を発現する昆虫細胞を染色するために使用される天然のおよび交換された４量体の反応性を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜Ｊは、複合体ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＱＹＤＰＶＡＡＬＦのＴ細胞受容体を発現する昆虫細胞を染色するために使用される天然のおよび交換された４量体の反応性を示す。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜Ｊは、複合体ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＱＹＤＰＶＡＡＬＦのＴ細胞受容体を発現する昆虫細胞を染色するために使用される天然のおよび交換された４量体の反応性を示す。
【図１０Ｆ】図１０Ａ〜Ｊは、複合体ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＱＹＤＰＶＡＡＬＦのＴ細胞受容体を発現する昆虫細胞を染色するために使用される天然のおよび交換された４量体の反応性を示す。
【図１０Ｇ】図１０Ａ〜Ｊは、複合体ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＱＹＤＰＶＡＡＬＦのＴ細胞受容体を発現する昆虫細胞を染色するために使用される天然のおよび交換された４量体の反応性を示す。
【図１０Ｈ】図１０Ａ〜Ｊは、複合体ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＱＹＤＰＶＡＡＬＦのＴ細胞受容体を発現する昆虫細胞を染色するために使用される天然のおよび交換された４量体の反応性を示す。
【図１０Ｉ】図１０Ａ〜Ｊは、複合体ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＱＹＤＰＶＡＡＬＦのＴ細胞受容体を発現する昆虫細胞を染色するために使用される天然のおよび交換された４量体の反応性を示す。
【図１０Ｊ】図１０Ａ〜Ｊは、複合体ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＱＹＤＰＶＡＡＬＦのＴ細胞受容体を発現する昆虫細胞を染色するために使用される天然のおよび交換された４量体の反応性を示す。
【００１９】
【図１１】図１１は、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲ４におけるペプチド交換の結果を示す。
【００２０】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｅは、複合体混合物（ワクチン）のペプチド交換の結果を示し、細胞ベースのＴ２シフトアッセイおよび動物ベースのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を比較する。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｅは、複合体混合物（ワクチン）のペプチド交換の結果を示し、細胞ベースのＴ２シフトアッセイおよび動物ベースのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を比較する。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｅは、複合体混合物（ワクチン）のペプチド交換の結果を示し、細胞ベースのＴ２シフトアッセイおよび動物ベースのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を比較する。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｅは、複合体混合物（ワクチン）のペプチド交換の結果を示し、細胞ベースのＴ２シフトアッセイおよび動物ベースのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を比較する。
【図１２Ｅ】図１２Ａ〜１２Ｅは、複合体混合物（ワクチン）のペプチド交換の結果を示し、細胞ベースのＴ２シフトアッセイおよび動物ベースのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
一部の態様では、本開示は、ＭＨＣ分子においてペプチド交換を実施する方法であって、
第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子を提供するステップ、および
任意選択により第３の結合パートナーと組み合わせて、任意選択によりペプチド交換因子の存在下で、第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子を、第２の結合パートナーと接触させるステップであって、第２の結合パートナーおよび任意選択により第３の結合パートナーに結合しているＭＨＣ分子を生成するステップ
を含む、方法を提供する。
【００２２】
一部の実施形態では、ペプチド交換はＭＨＣ分子の量に基づいて実施される。これらの実施形態によれば、本方法は、
第１のペプチドに結合している第１の量のＭＨＣ分子を提供するステップ、および
第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子に、任意選択によりペプチド交換因子、および任意選択により第３の結合パートナーと組み合わせて、第２の量の第２の結合パートナーを添加するステップであって、それにより生じる、第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子または第２の結合パートナーおよび任意選択により第３の結合パートナーに結合しているＭＨＣ分子、ならびに未結合の第１のペプチドまたは未結合の第２の結合パートナーおよび任意選択により第３の結合パートナーを含む混合物が形成されるステップを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、第２の結合パートナーはペプチドである。一部の実施形態では、第２の結合パートナーはＭＨＣタンパク質の非ペプチドリガンドである。例えば、米国特許出願公開第２００８／００４４４０５号に記載のように、特定の新規の金属イオン含有化合物は、クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質と複合体を形成し、それらのペプチド結合能に干渉し得る。
【００２４】
一部の実施形態では、第２および第３の結合パートナーが提供される。これらの実施形態によれば、第２および第３の結合パートナーは共にＭＨＣに結合している。例えば、アバカビルはＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１に結合すると考えられ、これは、アバカビル結合ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１が非アバカビル結合ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１とは異なるペプチドに結合できるように結合溝を変更する。
【００２５】
一部の態様では、本開示は、ＭＨＣ分子においてペプチド交換を実施する方法であって、
第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子を提供するステップ、および
任意選択によりペプチド交換因子の存在下で、第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子を第２のペプチドと接触させるステップであって、第２のペプチドに結合しているＭＨＣ分子を生成するステップ
を含む、方法を提供する。
【００２６】
一部の実施形態では、ペプチド交換はＭＨＣ分子の量に基づいて実施される。これらの実施形態によれば、本方法は、
第１のペプチドに結合している第１の量のＭＨＣ分子を提供するステップ、および
第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子に、任意選択によりペプチド交換因子、および第２の量の第２のペプチドを添加するステップであって、それにより生じる、第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子または第２のペプチドに結合しているＭＨＣ分子、ならびに未結合の第１のペプチドまたは未結合の第２のペプチドを含む混合物が形成されるステップ
を含む。
【００２７】
上記の一部の実施形態では、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩ分子である。一部の実施形態では、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩＩ分子である。
【００２８】
一部の態様では、本開示は、ＭＨＣクラスＩ分子においてペプチド交換を実施する方法であって、
第１の（すなわち、脱出）ペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子を提供するステップ、および
任意選択によりペプチド交換因子の存在下で、第１のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子を第２の（すなわち、侵入）ペプチドと接触させるステップであって、第２のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子を生成するステップ
を含む、方法を提供する。
【００２９】
一部の実施形態では、ペプチド交換はＭＨＣクラスＩ分子の量に基づいて実施される。これらの実施形態によれば、本方法は、
第１のペプチドに結合している第１の量のＭＨＣクラスＩ分子を提供するステップ、および
第１のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子に、任意選択によりペプチド交換因子、および第２の量の第２のペプチドを添加するステップであって、それにより生じる、第１のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子または第２のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子、ならびに未結合の第１のペプチドまたは未結合の第２のペプチドを含む混合物が形成されるステップ
を含む。
【００３０】
一部の態様では、本開示は、ＭＨＣクラスＩＩ分子においてペプチド交換を実施する方法であって、
第１の（すなわち、脱出）ペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩＩ分子を提供するステップ、および
任意選択によりペプチド交換因子の存在下で、第１のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩＩ分子を第２の（すなわち、侵入）ペプチドと接触させるステップであって、第２のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩＩ分子を生成するステップ
を含む、方法を提供する。
【００３１】
一部の実施形態では、ペプチド交換はＭＨＣクラスＩＩ分子の量に基づいて実施される。これらの実施形態によれば、本方法は、
第１のペプチドに結合している第１の量のＭＨＣクラスＩＩ分子を提供するステップ、および
第１のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩＩ分子に、任意選択によりペプチド交換因子および第２の量の第２のペプチドを添加するステップであって、それにより生じる、第１のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩＩ分子または第２のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩＩ分子、ならびに未結合の第１のペプチドまたは未結合の第２のペプチドを含む混合物が形成されるステップ
を含む。
【００３２】
一部の実施形態では、第２の結合パートナー（例えば第２のペプチド）が第１のペプチドより過剰に添加される。一部の実施形態では、交換は完了し、生じる混合物は、ＭＨＣ分子、例えば第１のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子を含有しない。一部の実施形態では、交換は実質的に完了し、生じる混合物は、ＭＨＣ分子、例えば第１のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣ分子、例えば第２の結合パートナー（例えば第２のペプチド）に結合しているＭＨＣクラスＩ分子、未結合の第１のペプチド、および未結合の第２の結合パートナー（例えば第２のペプチド）を含む。一部の実施形態では、交換は９９％完了し、すなわち生じる混合物中で、９９％のＭＨＣクラスＩ分子が第２の結合パートナー（例えば第２のペプチド）に結合している。一部の実施形態では、交換は、９５％完了、９０％完了、８５％完了、８０％完了、７５％完了、７０％完了、６５％完了、６０％完了、５５％完了、５０％完了、４０％完了、３０％完了、２０％完了、または１０％完了である。
【００３３】
一部の実施形態では、第１のペプチドは第１の標識で標識される。標識は、当技術分野で公知の方法によってそれを識別可能または検出可能にするペプチドの任意の特徴であり得る。例えば、標識は、抗体、例えばエピトープタグ、またはフルオロフォアによって認識可能なアミノ酸配列であり得る。例示的な標識および検出方法は本明細書に開示される。一部の実施形態では、第１の標識は、エピトープタグ、蛍光タグ、クエンチャー、放射標識、または例えばリン酸化、グリコシル化、もしくは硫酸化などのアミノ酸修飾から選択される。一部の実施形態では、第１のペプチドが第１のエピトープタグを表示するように、第１の標識はエピトープタグである。一部の実施形態では、２つの異なる標識が脱出ペプチドの２つの異なる領域にコンジュゲートされる。これらの実施形態によれば、切断後の切断可能なペプチドの２つの生じる断片について、定量化は本明細書に開示されている方法によって実施され得る（切断は、例えばＵＶ照射によってまたは過ヨウ素酸によって実施され得る）。
【００３４】
一部の実施形態では、第２の結合パートナー（例えば第２のペプチド）は、第１の標識とは異なり得る第２の標識で標識される。一部の実施形態では、第２の標識は、エピトープタグ、蛍光タグ、クエンチャー、放射標識、または例えばリン酸化、グリコシル化、もしくは硫酸化などのアミノ酸修飾から選択される。一部の実施形態では、第１のペプチドが第１のエピトープタグを表示するように、第２の標識はエピトープタグである。一部の実施形態では、第２の結合パートナー（例えば第２のペプチド）は標識されない。
【００３５】
一部の実施形態では、本方法は、ペプチド交換の完全性を定量化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、これは以下の量の少なくとも１つを決定するステップを含む：第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子の量、第２の結合パートナー（例えば第２のペプチド）に結合しているＭＨＣ分子の量、未結合の第１のペプチドの量、または未結合の第２の結合パートナー（例えば第２のペプチド）の量。一部の実施形態では、本方法は、未結合の第１のペプチドの量を決定するステップ、および未結合の第１のペプチドの量を第１のペプチドに結合している、第１の量のＭＨＣ分子、例えばＭＨＣクラスＩ分子の量と比較するステップをさらに含む。一部の実施形態では、測定するステップはイムノアッセイを実施することによって達成される。一部の実施形態では、イムノアッセイはサンドイッチイムノアッセイである。
【００３６】
一部の実施形態では、サンドイッチイムノアッセイを実施するステップは、
第１の抗体にコンジュゲートしている支持体、例えばビーズまたはマイクロプレートウェルを提供するステップ；
第１の抗体を、第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子および第２の結合パートナー（例えば第２のペプチド）に結合しているＭＨＣ分子の両方に結合させるステップ；
第１のペプチドを結合することができる第２の抗体を提供するステップ；
第２の抗体を、第１のペプチドに結合しているＭＨＣ分子に結合させ、それにより第２の抗体が支持体、例えばビーズまたはマイクロプレートウェルに結合されるステップ；
支持体、例えばビーズまたはマイクロプレートウェルに結合している第２の抗体の量を決定するステップ
を含む。
【００３７】
この一般的な手順を図３Ａおよび３Ｂに図示する。一部の実施形態では、支持体はビーズを含む。一部のそのような実施形態では、サンドイッチイムノアッセイを実施するステップは、磁気を使用して、遠心分離によって、または吸引によってビーズをペレット化するステップを含む。一部の実施形態では、支持体はマイクロプレートウェルを含む。
【００３８】
一部の実施形態では、測定するステップは蛍光測定を実施するステップを含む。
【００３９】
一部の実施形態では、第１の抗体は抗ＭＨＣまたは抗ストレプトアビジン抗体である。
【００４０】
サンドイッチイムノアッセイで使用される第２の抗体は、第１のペプチド上のタグによって選択され得る。例えば、第１のペプチドはＤＮＰで標識され、第２の抗体は抗ＤＮＰ抗体であり得る。代わりに、タグおよび抗体は、本明細書に記載の通りであり得る。代わりの実施形態では、第２の抗体は、本明細書に記載のように、第１のペプチド上のタグに合うリガンドまたはレクチンによって置き換えられ得る。
【００４１】
第２の抗体は本明細書に記載のように、例えばフルオロフォアまたは放射標識によって標識され得る。
【００４２】
一部の実施形態では、本方法は対照ペプチド交換を行うステップをさらに含む。
【００４３】
一部の態様では、本開示は、第１のペプチドに結合しているＭＨＣクラスＩ分子およびペプチド交換因子を含むペプチド交換のためのキットを提供する。
【００４４】
一部の実施形態では、第１のペプチドは第１の標識で標識される。標識は、当技術分野で公知の方法によってそれを識別可能または検出可能にするペプチドの任意の特徴であり得る。例えば、標識は、抗体、例えばエピトープタグ、またはフルオロフォアによって認識可能なアミノ酸配列であり得る。例示的な標識および検出方法は本明細書に開示される。一部の実施形態では、第１の標識は、エピトープタグ、蛍光タグ、クエンチャー、または放射標識から選択される。一部の実施形態では、第１のペプチドが第１のエピトープタグを表示するように、第１の標識はエピトープタグである。
【００４５】
一部の実施形態では、第１のペプチドは第１のエピトープタグを表示し、キットは抗第１のエピトープタグ抗体をさらに含む。一部の実施形態では、第１のペプチドは第１のエピトープタグを表示し、キットは抗第１のタグ抗体を含む捕捉システムをさらに含む。
【００４６】
一部の実施形態では、キットは参照ペプチドをさらに含む。
【００４７】
一部の実施形態では、ＭＨＣタンパク質はＭＨＣクラスＩ分子である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は単量体である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は多量体の成分である。一部の実施形態では、多量体は４つのＭＨＣクラスＩ分子を含む。一部の実施形態では、多量体は６つのＭＨＣクラスＩ分子を含む。一部の実施形態では、多量体は１２個のＭＨＣクラスＩ分子を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１である。
【００４９】
一部の実施形態では、ＭＨＣタンパク質はＭＨＣクラスＩＩ分子である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は単量体である。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は多量体の成分である。一部の実施形態では、多量体は４つのＭＨＣクラスＩ分子を含む。一部の実施形態では、多量体は６つのＭＨＣクラスＩＩ分子を含む。一部の実施形態では、多量体は１２個のＭＨＣクラスＩＩ分子を含む。
【００５０】
一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子はＨＬＡ−ＤＲ４である。
【００５１】
一部の実施形態では、ペプチド交換因子が使用される。ペプチド交換因子は当技術分野で公知のいずれかであり得る。一部の実施形態では、ペプチド交換因子はペプチド交換因子１、グリシル−メチオニン、グリシル−シクロヘキシルアラニン、グリシル−ロイシン、グリシル−アルギニン、グリシル−リシン、グリシル−（ｔｅｒｔ）−ブチルアラニン、またはグリシル−ホモロイシンである。
【００５２】
一部の実施形態では、第１のペプチドは、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、またはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶである。一部の実施形態では、第１のペプチドは、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、またはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶと少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、または少なくとも９０％同一性を有するその機能的ホモログである。
【００５３】
一部の実施形態では、第２のペプチドは、ＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、またはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦである。一部の実施形態では、第１のペプチドは、ＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、またはＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦと少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、または少なくとも９０％同一性を有するその機能的ホモログである。
【００５４】
ＭＨＣタンパク質
本開示の方法で提供および使用されるＭＨＣタンパク質は、当技術分野で公知の任意の好適なＭＨＣ分子であってよく、元々ＭＨＣタンパク質が含有しているペプチドを別のペプチドと交換することが望ましい。一般に、それらは式（α−β−Ｐ）ｎを有し、ｎは少なくとも２、例えば２〜１０の間、例えば４である。αは、クラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質のα鎖である。βはβ鎖であり、本明細書ではクラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質のβ鎖またはＭＨＣクラスＩタンパク質のβ２ミクログロブリンとして定義される。Ｐはペプチド抗原である。
【００５５】
ＭＨＣタンパク質は任意の哺乳動物または鳥類の種、例えば霊長類種、特にヒト；マウス、ラット、およびハムスターを含むげっ歯類；ウサギ；ウマ、ウシ、イヌ、ネコ等由来であり得る。例えば、ＭＨＣタンパク質は、ヒトＨＬＡタンパク質またはマウスＨ−２タンパク質に由来し得る。ＨＬＡタンパク質は、クラスＩＩサブユニットＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＱα、ＨＬＡ−ＤＱβ、ＨＬＡ−ＤＲα、およびＨＬＡ−ＤＲβ、およびクラスＩタンパク質ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびβ２−ミクログロブリンを含む。Ｈ−２タンパク質は、クラスＩサブユニットＨ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｌ、およびクラスＩＩサブユニットＩ−Ａα、Ｉ−Ａβ、Ｉ−Ｅα、およびＩ−Ｅβ、ならびにβ２ミクログロブリンを含む。いくつかの代表的なＭＨＣタンパク質の配列は、Kabatら、Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest、NIH  Publication  No.  91-3242、７２４〜８１５頁に見出され得る。本発明での使用に好適なＭＨＣタンパク質サブユニットは、通常膜結合タンパク質の可溶型であり、これは、例えば膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの欠失により、当技術分野で公知のように調製される。
【００５６】
クラスＩタンパク質に関して、可溶型はα１、α２、α３ドメインを含む。可溶性クラスＩＩサブユニットは、αサブユニットにα１およびα２ドメインを、βサブユニットにβ１およびβ２ドメインを含む。
【００５７】
αおよびβサブユニットは別々に産生され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで会合して安定なヘテロ二本鎖複合体を形成させることができ、または両方のサブユニットは単一の細胞内で発現され得る。ＭＨＣサブユニットを産生する方法は、当技術分野で公知である。
【００５８】
ＭＨＣペプチド複合体を調製するため、サブユニットは抗原ペプチドと結合され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでフォールドされて、鎖内ジスルフィド結合しているドメインにより安定なヘテロ２量体複合体を形成し得る。ペプチドは最初のフォールディング反応に含まれ、または後のステップの空のヘテロ２量体に添加され得る。本発明の方法では、これは脱出ペプチドとなる。サブユニットとペプチドのフォールディングおよび会合を可能にする条件は当技術分野で公知である。一例として、ほぼ等モル量の可溶化したαおよびβサブユニットは、尿素の溶液中で混合され得る。再フォールディングは、尿素を含まない緩衝溶液への希釈または透析によって開始される。ペプチドは、約１〜３日、約ｐＨ５〜５．５で空のクラスＩＩヘテロ２量体へとロードされ、続いて中和、濃縮、および緩衝液交換される。しかしながら、具体的なフォールディング条件は本発明の実施に重要ではない。
【００５９】
単量体の複合体（α−β−Ｐ）（本明細書では単量体）は多量体化され得る。生じる多量体は、長期に渡って安定である。好ましくは、当技術分野で公知のように（例えば米国特許第５，６３５，３６３号に記載のように）、多量体は、単量体をαまたはβサブユニット上の特定の結合部位によって多価の実体に結合することによって形成され得る。それらの単量体または多量体形態のいずれかのＭＨＣタンパク質は、ビーズまたは任意の他の支持体にもコンジュゲートされ得る。
【００６０】
頻繁に、免疫染色もしくは当技術分野で公知の他の方法で使用される場合に直接検出可能なように多量体の複合体は標識され、または当技術分野で公知のようにおよび本明細書に記載のように、複合体を特異的に結合する二次標識した免疫試薬との組合せで使用される。例えば、標識は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ＴｅｘａｓＲｅｄ、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）４２１、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＵＶ（商標）３９５、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）４８０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）４２１（ＢＶ４２１）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（商標）５１５、ＡＰＣ−Ｒ７００、またはＡＰＣ−Ｆｉｒｅ７５０などのフルオロフォアであり得る。一部の実施形態では、多量体の複合体は、別の部分に特異的に結合することができる部分によって標識される。例えば、標識は、ビオチン、ストレプトアビジン、オリゴヌクレオチド、またはリガンドであり得る。目的の他の標識は、色素、酵素、化学発光体、粒子、放射線同位体、または他の直接または間接的な検出可能剤を含み得る。
【００６１】
本明細書に開示されている方法は、任意の好適なＭＨＣタンパク質においてペプチド交換を実施するために使用され得る。本方法において使用される、および本明細書に開示されているペプチドを伴う例示的なＭＨＣタンパク質は、Ｈ−２  Ｋｂ単量体、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１単量体、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２単量体、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ４量体、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ４単量体、およびＨ−２  Ｋｂ４量体を含む。しかしながら、任意のＭＨＣ対立遺伝子は、例えばＭＨＣ対立遺伝子へのペプチドの親和性を予測するための公知の技術に従って、適切な脱出ペプチドの選択において本明細書の方法に使用され得る。
【００６２】
ペプチド交換の定量化のための標識
本明細書に開示されている方法の一部の実施形態によれば、ＭＨＣタンパク質に結合しているままである脱出ペプチドの比率が、例えばサンドイッチイムノアッセイによって定量化され得るように、脱出ペプチド（すなわち交換されるペプチド）は標識される。
【００６３】
交換の定量化に特に適当な標識は、ペプチドがＭＨＣタンパク質に結合できなくさせないものであり、検出部分に特異的に結合することができる。例示的な特異的結合対は、ビオチンもしくはその変異体とストレプトアビジンもしくはその変異体、タグとそれらの相補的な抗体、リガンド、もしくはレクチン、ハプテンとそれらが結合するタンパク質、またはオリゴヌクレオチド配列とそれらの補体を含む。
【００６４】
したがって、一部の実施形態では、脱出ペプチドは、タグ、すなわち抗体、レクチン、または特異的なリガンドによって認識される部分で標識され得る。例示的なタグは、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、シアル酸、ニトロシル、硫酸糖、Ｏ−グリコシル化アミノ酸、Ｎ−グリコシル化アミノ酸、リン酸化セリン、リン酸化スレオニン、およびリン酸化チロシンを含む。
【００６５】
一部の実施形態では、脱出ペプチドはビオチン部分またはストレプトアビジンもしくはストレプトアビジン変異体に結合するための公知のビオチン変異体で標識され得る。例示的なビオチン変異体は、２−イミノビオチン、カルボキシビオチン、ビオシチン、またはイミノビオシチンである。
【００６６】
記載されたように標識した脱出ペプチドは、脱出ペプチド上の標識に特異的な結合パートナーと結合する。結合パートナーは、直接検出可能な部分、例えば蛍光部分もしくは放射標識、または非直接検出可能な部分、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）もしくはアルカリホスファターゼなどの酵素標識で標識され得る。次いで、交換されていないＭＨＣタンパク質−すなわち脱出ペプチドを保持するもの−が、例えば、抗ＭＨＣタンパク質抗体とコンジュゲートしている捕捉ビーズまたは任意の他の好適な支持体を使用してＭＨＣタンパク質を捕捉し、結合パートナーを使用して脱出ペプチドに依然として結合しているそれらのＭＨＣタンパク質を同定する、サンドイッチアッセイによって検出され得る。サンドイッチアッセイの結果は図３Ａに見ることができる。ＭＨＣタンパク質は、αサブユニット（１）およびβサブユニット（２）の組合せによって形成される。ＭＨＣタンパク質は、ストレプトアビジン（３）への結合によって４量体化される。４量体のＭＨＣ複合体は標識される（例えばフルオロフォアで）（４）。複合体中の各ＭＨＣタンパク質への結合は、脱出ペプチド（５）または侵入ペプチド（６）のいずれかである。ＭＨＣ４量体はＭＨＣ抗体（９）によってビーズまたは任意の他の好適な支持体（８）に結合される。脱出ペプチド（５）が依然としてＭＨＣタンパク質と会合している場合、標識した抗タグ抗体（１０）が結合する。侵入ペプチド（６）が脱出ペプチドを置き換える場合、標識した抗タグ抗体は結合しない。３Ｂに見られるように、高レベルの交換は、ＭＨＣタンパク質と会合したままの脱出ペプチドをもたらさず（上）、したがって抗タグ抗体は結合せず、低い蛍光シグナルが測定される。低レベルの交換は、脱出ペプチドの高い保持をもたらし（下）、より大量の抗タグ抗体が結合し、高い蛍光シグナルが観察される。
【００６７】
結合パートナーが酵素標識（ＨＲＰなど）によって標識される実施形態では、蛍光レベルの測定の代わりに、酵素の基質（例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、または２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ））が添加されて、検出可能な色を発生し得る。高レベルの交換は、ＭＨＣタンパク質と会合したままの脱出ペプチドをもたらさず、したがって抗タグ抗体は結合せず、酵素が存在せず、色が発生しない。低レベルの交換は、脱出ペプチドの高い保持をもたらし、大量の抗タグ抗体が結合し、大量の酵素が存在し、色が発生する。
【００６８】
結合パートナーを標識するために使用され得る例示的な蛍光部分（例えば抗体を標識するために使用してもよい）は、７−アミノ−４−メチル−クマリン（ＡＭＣ）、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、ローダミンＢ、ＴＡＭＲＡ、または任意の他の好適な蛍光部分を含む。
【００６９】
結合パートナーを標識するために使用され得る例示的な放射標識（例えば、抗体を標識するために使用され得る）は、３２Ｐ、３５Ｓメチオニン、および１２５Ｉを含む。抗体、レクチン、またはリガンドに関連してそのような放射標識を使用する方法は、当技術分野で公知である。
【００７０】
ペプチド交換因子
任意の好適なペプチド交換因子は、本明細書で提供される方法で使用され得る。例示的なペプチド交換因子は、グリシル−メチオニン、グリシル−シクロヘキシルアラニン、グリシル−ロイシン、グリシル−アルギニン、グリシル−リシン、グリシル−（ｔｅｒｔ）−ブチルアラニン、グリシル−ホモロイシンを含む。
【００７１】
脱出ペプチド
当業者は、多くの公知のＭＨＣ対立遺伝子のいずれか１つに好適な強度で結合するように適応された様々な標識および様々な配列を有する脱出ペプチドを含む、本明細書に記載のものに加えて脱出ペプチドを作製することができる。そのような脱出ペプチドは、特定のペプチドの特定のＭＨＣ対立遺伝子への親和性を予測する利用可能な手段によるなど、公知の技術によって設計され得る。それらは、本明細書に開示されているように任意選択により標識され得る。本明細書に開示されている例示的な脱出ペプチドは、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＩＬＫＥＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬ、ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴ、ＴＦＱＲＫ（ＤＮＰ）ＰＡＡＦまたはＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶを含む。他の例示的な脱出ペプチドは、前述のものと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するものである。
【００７２】
侵入ペプチド
当業者は、使用される脱出ペプチドより大きいまたは使用される脱出ペプチドに相当する結合強度など、多くの公知のＭＨＣ対立遺伝子のいずれか１つに好適な強度で結合するように適応される様々な標識および様々な配列を有する侵入ペプチドを含む、本明細書に記載のものに加えて侵入ペプチドを作製することができる。そのような侵入ペプチドは、特定のペプチドの特定のＭＨＣ対立遺伝子への親和性を予測する利用可能な手段によるなど、公知の技術によって設計され得る。それらは、本明細書に開示されているように任意選択により標識され得る。本明細書に開示されている例示的な侵入ペプチドは、ＩＬＫＥＫＫＶＨＧＶ、ＩＬＫＥＫＶＨＧＶ、ＳＩＩＮＫＥＫＬ、ＭＴＹＫＦＰＶＴ、ＹＴＶＫＦＡＬＶ、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＹＬＬＥＦＴＰＰＶ、ＫＡＦＳＰＥＶＩＰＭＦ、ＡＭＡＰＲＴＬＬＬ、ＡＴＤＡＬＭＴＧＹ、ＥＶＤＰＩＧＨＬＹ、ＦＬＳＥＬＴＱＱＬ、ＦＭＹＳＤＦＨＦＩ、ＧＬＡＤＱＬＩＨＬ、ＧＬＡＶＶＴＨＧＬ、ＧＹＳＬＫＬＳＫＬ、ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ、ＩＹＳＴＶＡＳＳＬ、ＬＮＭＡＤＫＫＥＴ、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、ＲＶＲＡＹＴＹＳＫ、ＲＹＭＲＷＴＹＲＦ、ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ、ＦＬＹＤＤＮＱＲＶ、ＧＬＡＤＱＬＩＨＬ、ＡＶＬＤＧＬＬＳＬ、ＧＬＡＶＶＴＨＧＬ、ＷＭＨＫＶＰＡＳＬ、ＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、ＷＭＨＨＮＭＤＬＩ、ＳＬＰＰＰＧＴＲＶ、ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、ＩＭＱＬＭＰＦＧＣ、ＩＭＱＩＭＰＹＧＣ、ＲＩＫＤＦＬＲＮＬ、ＡＬＬＡＶＧＡＴＫ、ＣＳＬＷＮＧＰＨＬ、ＥＹＩＬＳＬＥＥＬ、ＡＬＡＬＥＶＧＥＬ、ＳＹＶＰＳＡＥＱＩ、ＡＴＶＱＧＱＮＬＫまたはＩＲＬＲＰＧＧＫＫを含む。他の例示的な侵入ペプチドは、前述のものと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するものである。
【００７３】
交換のための媒体
本明細書に記載の方法は、任意の好適な媒体中で実施され得る。
【００７４】
一部の実施形態では、反応混合物は緩衝溶液中に試薬を含有する。したがって、反応混合物は、第１の（脱出）ペプチド、第２の（侵入）ペプチド、およびペプチド交換因子に結合しているＭＨＣ分子から本質的になり得る。これらの実施形態によれば、ＭＨＣ分子、第１のペプチド、第２の結合パートナー（第２のペプチドなど）、およびペプチド交換因子は全て、本明細書に記載した通りであり得る。
【００７５】
一部の実施形態では、反応混合物は溶液中に試薬を含有し、溶液は、他の種、例えば第１および第２のペプチド以外のペプチド、脂質、ポリヌクレオチド、または他の生物学的もしくは非生物学的な種などを含み得る。ある特定の実施形態では、溶液は、体液、正常もしくは異常組織からの組織抽出物、正常もしくは異常組織からの細胞抽出物、腫瘍からの細胞抽出物、または他の病理からの細胞抽出物を含み得る。ある特定の実施形態では、溶液は、ウイルス、細菌、寄生生物、またはイースト菌などの微生物の抽出物または溶解物を含み得る。ある特定の実施形態では、溶液は、環境水、空気、および土壌試料、またはその抽出物を含み得る。ある特定の実施形態では、溶液は、合成混合物、例えばタンパク質加水分解物、灌流、ワクチン、または合成組織培養媒体などを含み得る。これらの実施形態によれば、ＭＨＣ分子、第１のペプチド、第２の結合パートナー（例えば第２のペプチド）、およびペプチド交換因子は全て、本明細書に記載の通りである。
【００７６】
キット
一部の態様では、本開示はペプチド交換、例えば定量化されたペプチド交換のためのキットを提供する。キットは、ＭＨＣモジュール、ペプチド検出モジュール、交換因子モジュール、および／または参照ペプチドモジュールを含み得る、いくつかのモジュールを含み得る。キットの成分は、キットの使用者が本明細書に開示されている方法を行うために必要な成分の残りを調製できるように選択され得る。
【００７７】
ＭＨＣモジュールは通常、例えば、凍結乾燥したまたは溶液中の脱出ペプチドを含む、交換のためのＭＨＣタンパク質を含む（単量体または多量体形態で）。溶液は好都合に緩衝され、溶液を安定化する他の成分も含有し得る。例えば、溶液は、タンパク質安定化剤および／またはアジ化ナトリウムを含有し得る。ＭＨＣタンパク質と会合するペプチドは、通常、本明細書に記載のように標識される。ペプチドの配列は、キットのＭＨＣタンパク質の安定性および対象のペプチドに対する交換可能性を提供するために選択される。
【００７８】
ペプチド検出モジュールは、通常、ＭＨＣモジュールで提供される標識した交換可能なペプチドと適合する、任意の好適なペプチド検出システムを含有する。例えば、検出システムがサンドイッチ磁気ビーズイムノアッセイを考える場合、次いで検出モジュールは、ＭＨＣ捕捉抗体と結合された磁気ビーズを含むバイアル、および脱出ペプチド（タグ付きペプチドの場合）に対して反応性の蛍光タグ付き抗体を含むバイアルを含有し得る。
【００７９】
交換因子モジュールは、通常ペプチド交換因子を含有し、凍結乾燥または溶液中である。溶液は好都合に緩衝され、溶液を安定化する他の成分も含有し得る。例えば、溶液はタンパク質安定化剤および／またはアジ化ナトリウムを含有し得る。
【００８０】
定義
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は本明細書で使用されて、冠詞の文法的な対象の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例により、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
【００８１】
用語「アミノ酸」は、天然も合成も、全ての分子を包含することを意図し、これは、アミノ官能性および酸官能性の両方を含み、天然に存在するアミノ酸のポリマーに含まれ得る。例示的なアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸；その類似体、誘導体、および同類物；変異体側鎖を有するアミノ酸類似体；および前述のいずれかの全ての立体異性体を含み得る。
【００８２】
再編成されていない可変領域および／または再編成されていない可変領域遺伝子セグメント「に由来する」再編成された可変領域遺伝子に関して使用する場合、句「に由来する」は、再編成された可変領域遺伝子の配列を、再編成されて、可変ドメインを発現する遺伝子を形成する再編成されていない可変領域遺伝子セグメントのセットまでたどる能力を指す（適用可能な場合、スプライスの差異および体細胞突然変異を説明する）。例えば、体細胞突然変異を受けた再編成された可変領域遺伝子は、依然として再編成されていない可変領域遺伝子セグメント由来である。一部の実施形態では、内在性の遺伝子座が一般的な軽鎖または重鎖遺伝子座によって置き換えられる場合、用語「に由来する」は、配列が体細胞突然変異を受けたとしても、配列の起源を前記再編成された遺伝子座までたどる能力を指す。
【実施例】
【００８３】
本発明は、ここで、概して記載され、それは、本発明のある特定の態様および実施形態の例示の目的のためだけに含まれ、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。
【００８４】
（実施例１）
ペプチド置換の測定のための例示的なプロトコール
試薬：以下のストック溶液が調製または提供される：
タンパク質安定化剤および≦０．０９％アジ化ナトリウムを添加した緩衝溶液５０μｇ／ｍＬ（単量体含量によって測定した）中の脱出ペプチドを含む４量体（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１）。
【００８５】
≦０．０９％アジ化ナトリウムを加えた０．２５〜０．５Ｍ溶液中のペプチド交換因子（例えばペプチド交換因子１）。
【００８６】
タンパク質安定化剤および≦０．０９％アジ化ナトリウムを添加した緩衝溶液ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ６．５ｍＭ、ｐＨ７．１〜７．３５中の４量体捕捉抗体とコンジュゲートした磁気ビーズ。
【００８７】
タンパク質安定化剤および≦０．０９％アジ化ナトリウムを添加した緩衝溶液ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ６．５ｍＭ、ｐＨ７．１〜７．３５中の脱出ペプチドに対して反応性の蛍光タグ付き抗体（例えばＦＩＴＣによりタグ付け）。
【００８８】
水中で１ｍＭに希釈された、１０ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液中の参照交換ペプチド。
【００８９】
水中で１〜５ｍＭに希釈された、またはいくつかの場合では希釈されていない、１０ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液中の所望の交換ペプチド。
【００９０】
タンパク質安定化剤および≦０．０９％アジ化ナトリウムを添加したアッセイ緩衝溶液ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ６．５ｍＭ、ｐＨ７．１〜７．３５（１．５ｍＬ×普通キャップの１バイアル）。２〜８℃で保存。
【００９１】
ペプチド交換手順：５０μＬの４量体溶液を、１μＬのペプチド交換因子、例えばグリシルメチオニン、（５〜２０ｍＭの最終ペプチド交換因子濃度を生じる）および１μＬのペプチド溶液と組み合わせ、生じる溶液を混合し、次いで４時間室温でインキュベートする。
【００９２】
サンドイッチ磁気ビーズイムノアッセイ：２０μＬの捕捉ビーズを９６ウェルプレートのウェル１〜４にピペットで移す。５μＬアッセイ緩衝液をウェル２にピペットで移す。５μＬの交換された４量体をウェル４にピペットで移す。さらなる交換された４量体をウェル５およびそれ以上にピペットで移してもよい。プレートを光から保護し、５５０ｒｐｍｓ／分で４５分間振盪する。１５０μＬのアッセイ緩衝液を各ウェルに分注する。プレートをプレートマグネットに置き、ビーズを少なくとも５分間沈降させる。
【００９３】
別々に、ＦＩＴＣコンジュゲートした抗タグ抗体の調製物を１０μｇ／ｍＬで調製する。２５μＬのＦＩＴＣコンジュゲートした抗タグ抗体を、ウェル１を除く各ウェルにピペットで移し、プレートを再び光から保護し、５５０ｒｐｍｓ／分で４５分間振盪する。
【００９４】
１５０μＬのアッセイ緩衝液を各ウェルに分注し、プレートをプレートマグネットに置く。ビーズを少なくとも５分間沈降させる。ビーズは、シース液に再懸濁し、標識したフローサイトメーターチューブに移し（本明細書では、それらが取り出されたウェルの数を参照する）、次いでこれをフローサイトメーターによって分析する。
【００９５】
フローサイトメトリー分析：未使用の磁気ビーズを使用して、生存のゲートが単一のビーズを選択し、ダブレットまたはより大きな塊を除外するように、ＦＳＣ（前方散乱光）およびＳＳＣ（側方散乱光）電圧、ならびにゲインを設定する、図１Ａを参照。図１Ｂに見られるように、ＰＭＴ電圧およびゲインは、未使用のビーズに基づき、第１の対数区間（約０．２〜０．３）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有するように設定する。チューブ１は、ＦＩＴＣチャネルで蛍光色素の干渉を除去するためにＦＬ１での補正を実施するために実行する、図１Ｃ参照。ＦＬ１  ＭＦＩは、ビーズのみで得られたものの近くの第１の対数区間に設定する。４量体、したがってタグ付きペプチドを捕捉しないビーズを含有するチューブ２は、０％タグ付きペプチド、すなわち１００％ペプチド交換のレベルを補正するために実行する（図１Ｄ参照）。本明細書で提供する例示的なデータにおいて、ＭＦＩは０．２８７である。全ての４量体が元々のタグ付きペプチドを表示する溶液を含有するチューブ３は、１００％タグ付きペプチド、すなわち０％ペプチド交換のレベルを補正するために実行する（図１Ｅ参照）。本明細書で提供する例示的なデータにおいて、ＭＦＩは２０．４である。チューブ４およびそれ以上は、試料を評価するために実行する。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子へのそれらの結合親和性に依存して、ペプチド交換した４量体は様々な量のタグ付きペプチドを表示する。したがって、測定したＦＬ１  ＭＦＩは、チューブ２および３で得られたＭＦＩ値の間の中間である。図１Ｆを参照すると、本明細書で提供する例示的なデータにおいて、ＭＦＩは９．３７である。対照データは、次いで補間されて、表１に示すように試料中のタグ付きペプチドのパーセントを見出すことができる。
【００９６】
【表１】
2019516792.tif 000003
【００９７】
（実施例２）
ＦＩＴＣコンジュゲートしたＤＮＰ特異的抗体による脱出ペプチドの検出は、ペプチド交換を正確に測定する
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ４量体を、様々な比率のペプチドＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶおよびＩＬＫＥＰＶＨＧＶで構築した。それらを、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体コンジュゲートしたビーズで捕捉し、ＦＩＴＣコンジュゲートした抗ＤＮＰで染色した。ＦＬ１の平均蛍光強度をフローサイトメーターで回収し、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶのパーセンテージに対してプロットした。図４に示すように、結果は、フローサイトメトリーによって測定された抗ＤＮＰシグナルと実際の脱出ＤＮＰタグ付きペプチドレベルの間に直線的相関があることを示す。
【００９８】
（実施例３）
ＦＩＴＣコンジュゲートしたＤＮＰ特異的抗体によるＤＮＰの検出は、Ｈ−２  Ｋｂ  ４量体のペプチド交換を正確に測定する
Ｈ−２  Ｋｂ  ４量体を、様々な比率のペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬで構築した。それらを、抗Ｈ−２  Ｋｂ抗体コンジュゲートしたビーズで捕捉し、ＦＩＴＣコンジュゲートした抗ＤＮＰで染色した。ＦＬ１の平均蛍光強度を回収し、ＳＩＩＮＫ（ＤＮＰ）ＥＫＬのパーセンテージに対してプロットした。図５に示すように、結果は、フローサイトメトリーによって測定された抗ＤＮＰシグナルと捕捉された実際のＤＮＰ抗原の間に正確な直線的相関があることを示す。
【００９９】
（実施例４）
脱出ペプチド配列の選択
ペプチド交換を、ペプチドＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴおよびＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶで作製した、２つのＨ−２  Ｋｂ  ４量体を２８０μｇ／ｍＬで使用して実施した。交換は、１０μｇ／ｍＬの競合ペプチドの存在下で実施した。４量体は、抗Ｈ−２  Ｋｂ特異的抗体をコンジュゲートしたビーズで捕捉した。検出は、１０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣコンジュゲートした抗ＤＮＰ抗体で実施した。結果は図６に示し、脱出ペプチドは以下のように標識されている：
【表１Ａ】
2019516792.tif 000004
【０１００】
ＭＴＹＫ（ＤＮＰ）ＦＰＶＴで構築した４量体は、脱出ペプチドＹＴＶＫ（ＤＮＰ）ＦＡＬＶとは交換可能ではなかった広範なペプチドと交換された。
【０１０１】
（実施例５）
脱出ペプチド配列の比較
ペプチド交換を、ペプチドＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶおよびＩＬＫＥＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶで作製した、２つのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ４量体を２８０μｇ／ｍＬで使用して実施した。交換は、１０ｍＭのＧＭ（グリシン−メチオニン）ならびに１０および１μｇ／ｍＬの高親和性競合ペプチドＹＬＬＥＦＴＰＰＶの存在下で実施した。４量体は、１０μｇ／ｍＬの抗ＨＬＡ−ＡＢＣ特異的抗体をコンジュゲートしたビーズで捕捉した。図７に示した結果は、ＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶで構築した４量体がペプチド交換をよりよく実施することを示す。
【０１０２】
（実施例６）
細胞染色のための交換された４量体の使用
図２Ａに模式的に図示したように、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ４量体を、ペプチドＲＭＦＮＡＰＹＬ（本実施例に示した）ならびにペプチドＲＭＹＳＹＶＡＴＬで構築し、ＩＬＫＥＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶおよびＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶを、競合ペプチドＭａｒｔ−１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）１〜１００μｇ／ｍＬと、交換因子グリシン−メチオニン１０ｍＭと、４時間インキュベートした。ＭＨＣタンパク質は、αサブユニット（１）およびβサブユニット（２）の組合せによって形成する。ＭＨＣタンパク質は、ストレプトアビジン（３）への結合によって４量体化する。４量体ＭＨＣ複合体を標識する（ここではフルオロフォアにより）（４）。複合体中の各ＭＨＣタンパク質への結合は、脱出ペプチドである（５）。交換のため、侵入ペプチド（６）およびペプチド交換因子（７）を添加する。脱出ペプチド（５）を置き換える。生じる複合体は、ＭＨＣタンパク質に結合している侵入ペプチド（６）を含有する。交換された４量体を、次いで細胞染色のために使用し、Ｍａｒｔ−１ペプチドで元々フォールドされた４量体（すなわち、ペプチド交換無し）と比較した。図２Ｂに示したように、ペプチド交換によって得た４量体は、Ｍａｒｔ−１ペプチドで元々調製された４量体と同じように細胞を染色した。
【０１０３】
（実施例７）
異なるフルオロフォアによる交換率の比較
脱出ペプチドＴＦＱＲＫ（ＤＮＰ）ＰＡＡＦを有する５０μＬのＭＨＣ４量体（Ｈ−２  Ｋｂ  ＰＥ、Ｈ−２  Ｋｂ  ＡＰＣまたはＨ−２  Ｋｂ  ＢＶ４２１）を、１μＬの０．２５Ｍペプチド交換因子（グリシン−メチオニン）および１μＬの１ｍＭまたは０．１ｍＭ参照侵入ペプチド（ＳＩＹＲＹＹＧＬ）と混合した。混合物を、光から保護して、室温で４時間インキュベートした。
【０１０４】
２０μＬの磁気捕捉ビーズを、Ｖ底の９６ウェルプレートの各試験ペプチドのウェルと対照試料のウェルに添加した。各試験ウェルに、ペプチド交換試料から５μＬ入れた。プレートを、光から保護し、室温、５５０ｒｐｍで４５分間振盪した。ビーズをすすいだ後、ウェルに２５μＬの１×脱出ペプチド抗体を入れた。プレートを、光から保護し、室温、５５０ｒｐｍで４５分間振盪した。ビーズをすすぎ、１×アッセイ緩衝液中に再懸濁し、ＦＣ５００フローサイトメーターを実行した。単一のビーズを、ＦＳＣ対ＳＳＣでゲートをかけ、ＭＦＩを試験当たり５００回測定した。ペプチド交換率を、対照からのＭＦＩ値で生成した検量線を使用して算出した。結果は表２に示す：
【表２】
2019516792.tif 000005
【０１０５】
（実施例８）
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ペプチド交換定量化および予測される親和性の比較
予測されるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合親和性の異なるランダムペプチドを、最終濃度２０μＭで脱出ペプチドＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶを有する交換可能なＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ４量体に添加した。ペプチド交換データは、ペプチド（最終２０μＭ）を４量体と４時間インキュベートし、次いで抗ＨＬＡ−ＡＢＣビーズにより捕捉、および抗ＤＮＰ  ＦＩＴＣ抗体により染色した後に得られた。
【０１０６】
１ｎＭから１０００ｎＭまで変化する予測される親和性を有するペプチドは、高率（９０％の範囲）で取り換えられた。より低い結合親和性（＞１０００ｎＭ）のペプチドは、より低いペプチド交換を誘発した（６０〜２０％）。しかしながら、低い親和性が予測されるいくつかのペプチドは、高い交換率を示した。結果は表３および図８に表す。
【０１０７】
【表３−１】
2019516792.tif 000006
【表３−２】
2019516792.tif 000007
【０１０８】
本明細書で提供するペプチド交換定量化アッセイは、良いＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合ペプチドをスクリーニングし、高率のペプチド交換を確かめるために有用である。
【０１０９】
（実施例９）
脱出ペプチドＴＦＱＲＫ（ＤＮＰ）ＰＡＡＦとともに作製されたＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ４量体はペプチド交換に受け入れられる
予測されるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合親和性の異なるランダムペプチドを、最終濃度２０μＭで脱出ペプチドＴＦＱＲＫ（ＤＮＰ）ＰＡＡＦを有する交換可能なＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ４量体に添加した。ペプチド交換データは、ペプチド（最終２０μＭ）を４量体と４時間インキュベートし、次いで抗ＨＬＡ−ＡＢＣビーズにより捕捉、および抗ＤＮＰ  ＦＩＴＣ抗体により染色した後に得られた。
【０１１０】
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に対する予測されるペプチド結合親和性およびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ４量体のペプチド交換率は、図９および表４に示すように、少しの外れ値の除外と相関があった。
【０１１１】
【表４−１】
2019516792.tif 000008
【表４−２】
2019516792.tif 000009
【０１１２】
（実施例１０）
ペプチド交換によって生成されたＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ４量体は、フォールディングによって生成されたものと同じ細胞反応性を有する。
脱出ペプチドＴＦＱＲＫ（ＤＮＰ）ＰＡＡＦを有する５０μＬのＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ４量体を、１μＬの０．２５Ｍペプチド交換因子（グリシン−メチオニン）および１μＬの１ｍＭまたは０．１ｍＭ  ＣＭＶペプチドＱＹＤＰＶＡＡＬＦと混合した。混合物を、光から保護し、室温で４時間インキュベートした。複合体ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＱＹＤＰＶＡＡＬＦのためのＴ細胞受容体を発現するＳ２昆虫細胞を、０．２％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ中に、ｍＬ当たり５×１０６個の細胞で再懸濁した。１００μＬの細胞を、２．５または５μＬの４量体、陰性対照の４量体（ＰＮ  Ｔ０１０４４）、市販のＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ＣＭＶ  ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ  ＰＥ  ４量体（Ｔ０１０４３）またはペプチド交換によって得られたＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ＣＭＶ  ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ  ＰＥ  ４量体のいずれかと、室温で３０分間インキュベートした。０．２％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳによる洗浄後、細胞を、０．５％ホルムアルデヒドを含有する４００μＬのＰＢＳ中に再懸濁し、次いでＦＣ５００フローサイトメーターで分析した。図１０に表したデータは、市販のＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ＣＭＶ  ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ  ＰＥ  ４量体（Ｔ０１０４３）がペプチド交換によって得られたＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ＣＭＶ  ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ  ＰＥ  ４量体と区別できないことを示す。
【０１１３】
（実施例１１）
ＭＨＣクラスＩＩ  ４量体のペプチドの交換
脱出ペプチド配列Ｋ（Ｄｎｐ）ＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡＬＰＭを有するＰＥコンジュゲートしたＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲＢ１＊０４：０１  ４量体の５０μＬの試料を、２μＬの２４．１ｍＭ、１２．０５ｍＭ、および６．０２５ｍＭシスプラチンと、暗中、室温で３時間インキュベートした。シスプラチンで誘発されるペプチド置換の定量化は、フローサイトメトリーサンドイッチイムノアッセイで行った。２０μＬの抗ＨＬＡ  ＤＲコンジュゲートした磁気捕捉ビーズを、Ｖ底の９６ウェルプレートの各試験シスプラチン希釈物のウェルと対照試料のウェルに添加した。各試験ウェルに、シスプラチン処理試料から５μＬ入れた。プレートを、光から保護し、室温、５５０ｒｐｍで４５分間振盪した。ビーズをすすいだ後、ウェルに２５μＬの１×脱出ペプチド抗体を入れた。プレートを、光から保護し、室温、５５０ｒｐｍで４５分間振盪した。ビーズをすすぎ、１×アッセイ緩衝液中に再懸濁し、ＦＣ５００フローサイトメーターを実行した。単一のビーズを、ＦＳＣ対ＳＳＣでゲートをかけ、ＭＦＩを試験当たり５００回測定した。ペプチド交換率は、対照からのＭＦＩ値で生成した検量線を使用して算出した。結果は図１１に図示する。
【０１１４】
（実施例１２）
ワクチンの生物活性の決定
本明細書に記載の方法を評価し、それらがワクチンの生物活性を検出できたかどうか決定した。試験したワクチンは、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃであって、それぞれが異なるヒトクラスＩ対立遺伝子に制限されるいくつかのサバイビンペプチド抗原を含む卵巣がんワクチン候補であった。ワクチン中のペプチドの１つは、ＳｕｒＡ２．Ｍであって、ＨＬＡ−Ａ２−制限ペプチドであった。本研究に使用したペプチドは、ＩＥＤＢ人工神経ネットワーク法によって算出したＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの親和性と共に、表４に列挙する。
【０１１５】
【表５】
2019516792.tif 000010
【０１１６】
本明細書に記載した定量化されたペプチド交換を、ワクチンの生物活性を定量化する確立された方法と比較した。
【０１１７】
定量化されたペプチド交換アッセイ：脱出ペプチドＩＬＫＥＫＫ（ＤＮＰ）ＶＨＧＶを含有するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ４量体を調製した。ペプチド交換は、（ａ）個々に緩衝溶液中で調製したペプチドまたは（ｂ）水性製剤中で調製したＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃワクチンに対して実施した。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ４量体、およびペプチド交換因子グリシルメチオニンを各ペプチドと混合して、試験した。次いで、ペプチド交換を、磁気捕捉ビーズを使用するフローサイトメトリーサンドイッチイムノアッセイにより定量化した。
【０１１８】
図１２Ａに示したこの比較は、ＳｕｒＡ２．Ｍのこのペプチド交換率により、それぞれ緩衝溶液に溶解されるか、またはワクチンの他の成分と混合されるか統計的に区別できないことを示す。データは、３回の独立した繰り返しの平均±ＳＥＭとして示した。スチューデントのｔ検定を実施して、各濃度レベルでのＳｕｒＡ２．Ｍペプチドに対してＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃのペプチド交換のレベルを比較した：ｐ＜０．０５で統計的な違いは検出されなかった。
【０１１９】
この結果は、ＨＬＡ−Ａ２へのペプチドの親和性に依存し得る。したがって、個々のペプチドを使用して濃度曲線を最適化することによって、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＭＨＣタンパク質は、単純な溶液またはより複雑な製剤中のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドの濃度を定量化するのに使用され得る。
【０１２０】
Ｔ２  ＨＬＡ−Ａ２シフトアッセイ：Ｔ２細胞は、ＴＡＰタンパク質の欠損によりそれらの表面上に低レベルのＨＬＡ−Ａ２を発現するヒト細胞株である。ＨＬＡ−Ａ２に結合できるペプチドとのインキュベーションの際に、表面上のＨＬＡ−Ａ２の発現はペプチドが複合体を安定化するので増加する。フルオレセインコンジュゲートしたモノクローナル抗体（抗ＨＬＡ−Ａ２）を使用するＴ２細胞の免疫蛍光染色を使用して、抗原刺激後のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＬＡ−Ａ２の相対発現を定量化する。この研究において、Ｔ２細胞を様々な量のペプチドにより２４時間刺激した；ＨＬＡ−Ａ２の表面発現は、ＢＢ７．２−ＰＥ抗ＨＬＡ−Ａ２抗体を使用して検出し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを使用して定量化した。図１２Ｂに表した結果は、このアッセイの応答範囲が１０〜１１０μｇ／ｍＬの間であることを示す。データは３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表し、非刺激対照と比較して表す。
【０１２１】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス（ＨＨＤ、ｎ＝６）に、ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドＳｕｒＡ２．Ｍの用量を減らしてＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ製剤によりワクチン接種した。ワクチン接種の８日後、マウスを屠殺し、脾臓を回収した。脾臓細胞を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴプレート中で、培地（バックグラウンド）、無関係のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド、またはＳｕｒＡ２．Ｍペプチドにより刺激した。プレートを１８時間後に展開し、スポット形成単位（ＳＦＵ）をＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃ．Ｔ．Ｌ）を使用して定量化した。図１２Ｃに表した結果は、用量応答が観察されたことを示す。統計を実施して、一元ＡＮＯＶＡ、続いてＤｅｎｎｅｔｔ事後検定により、最大５０μｇまで各用量の応答を比較した；＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ワクチン中のＳｕｒＡ２．Ｍの９０％分解を検出できる。
【０１２２】
ペプチド交換アッセイとＴ２  ＨＬＡ−Ａ２シフトアッセイの比較。本明細書に記載のペプチド交換アッセイおよびＴ２  ＨＬＡ−Ａ２シフトアッセイを、反応毎に様々な量のペプチドで行った。結果は図１２Ｄ（Ｔ２  ＨＬＡ−Ａ２シフトアッセイ）および１２Ｅ（ペプチド交換アッセイ）に、ダイアモンド、四角、および三角で示される３回の独立した繰り返しで表す。Ｔ２シフトアッセイは、１０μｇ／反応から１１０μｇ／反応のＳｕｒＡ２．Ｍペプチドを含有する試料に適用された場合、高度な直線性を提供する。ペプチド交換アッセイは、０．２μｇ／反応未満の定量化の上限を有し、許容可能な程度の直線性を有する応答範囲は０．００４μｇ／反応から０．０４μｇ／反応であった。
【０１２３】
参照による組込み
各それぞれの刊行物または特許が具体的におよび個々に参照により組み込まれることが示されるかのように、本明細書に記載した全ての刊行物および特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書の任意の定義を含む本出願が制御する。
1.  Altman  JD,  Davis  MM.  MHC-peptide  tetramers  to  visualize  antigen-specific  T  cells.  Curr  Protoc  Immunol.  2003;17(17):13
2.  Toebes  M,  et  al.  (2006)  Design  and  use  of  conditional  MHC  class  I  ligands.  Nat  Med  12(2):246−251.
3.  Rodenko  B,  Toebes  M,  Celie  PH,  Perrakis  A,  Schumacher  TN:  Ovaa  H:  Class  I  major  histocompatibility  complexes  loaded  by  a  periodate  trigger.  J  Am  Chem  Soc  2009,  131:12305-12313.
4.  Saini  SK,  Schuster  H,  Ramnarayan  VR,  Rammensee  HG,  Stevanovic  S,  Springer  S.  Dipeptides  catalyze  rapid  peptide  exchange  on  MHC  class  I  molecules.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  2015  112(1):202-7.
5.  Luft,  T.  et  al.  Exogenous  peptides  presented  by  transporter  associated  with  antigen  processing  (TAP)-deficient  and  TAP-competent  cells:  intracellular  loading  and  kinetics  of  presentation.  J.  Immunol.  167,  2529−2537  (2001).
【０１２４】
等価物
対象の発明の具体的な実施形態が議論されるが、上記の明細書は例示であり、限定ではない。本発明の多くのバリエーションが、本明細書および以下の特許請求の範囲の検討により当業者には明らかである。本発明の全範囲は、それらの等価物の全範囲およびそのようなバリエーションを伴う明細書と共に、特許請求の範囲を参照することにより決定されるべきである。
【図１Ａ】
2019516792.tif 000011
【図１Ｂ】
2019516792.tif 000012
【図１Ｃ】
2019516792.tif 000013
【図１Ｄ】
2019516792.tif 000014
【図１Ｅ】
2019516792.tif 000015
【図１Ｆ】
2019516792.tif 000016
【図２】
2019516792.tif 000017
【図３Ａ】
2019516792.tif 000018
【図３Ｂ】
2019516792.tif 000019
【図４】
2019516792.tif 000020
【図５】
2019516792.tif 000021
【図６】
2019516792.tif 000022
【図７】
2019516792.tif 000023
【図８】
2019516792.tif 000024
【図９】
2019516792.tif 000025
【図１０Ａ】
2019516792.tif 000026
【図１０Ｂ】
2019516792.tif 000027
【図１０Ｃ】
2019516792.tif 000028
【図１０Ｄ】
2019516792.tif 000029
【図１０Ｅ】
2019516792.tif 000030
【図１０Ｆ】
2019516792.tif 000031
【図１０Ｇ】
2019516792.tif 000032
【図１０Ｈ】
2019516792.tif 000033
【図１０Ｉ】
2019516792.tif 000034
【図１０Ｊ】
2019516792.tif 000035
【図１１】
2019516792.tif 000036
【図１２Ａ】
2019516792.tif 000037
【図１２Ｂ】
2019516792.tif 000038
【図１２Ｃ】
2019516792.tif 000039
【図１２Ｄ】
2019516792.tif 000040
【図１２Ｅ】
2019516792.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月26日(2019.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019516792000001.app
【国際調査報告】
2019516792.tif 000042
2019516792.tif 000043