(57)【要約】本開示は、１種または複数種のＲＮＡ分解／プロセシング遺伝子の発現が変更された、または開始コドンが改変された、新規の細菌株を提供する。本開示のＲＮＡ分解遺伝子は、異種プロモーターによって制御される。本開示は、ＲＮＡ分解／プロセシング遺伝子に作動可能に連結した異種プロモーター配列を含む微生物株を生成するための方法をさらに記載する。一部の実施形態では、本開示の方法は、ｍＲＮＡの定常状態をモジュレートし、宿主株のバイオマスまたは産物性能の改善をもたらす。
2019519243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．異種プロモーターポリヌクレオチドと、
ｂ．ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドと
を含む、増強された工業的性能を有する遺伝子操作された宿主細胞であって、
該異種プロモーターポリヌクレオチドが、該ＲＮＡ分解遺伝子をコードする該ポリヌクレオチドに作動可能に連結している、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項２】
前記ＲＮＡ分解遺伝子が内在性遺伝子である、請求項１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項３】
前記異種プロモーターが、配列番号２、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターである、請求項１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４】
前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である、請求項３に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５】
前記異種プロモーターが、配列番号２、配列番号１、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、請求項１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項６】
前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１０）、ｂ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｃ−（配列番号１：：配列番号１８）、ｄ−（配列番号１：：配列番号２０）、ｅ−（配列番号２：：配列番号１１）、ｆ−（配列番号２：：配列番号１８）、ｇ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｈ−（配列番号２：：配列番号１８）、ｉ−（配列番号２：：配列番号１７）、ｊ−（配列番号２：：配列番号１９）、ｋ−（配列番号３：：配列番号１１）、ｌ−（配列番号３：：配列番号１４）、ｍ−（配列番号３：：配列番号１２）、ｎ−（配列番号３：：配列番号１５）、ｏ−（配列番号３：：配列番号１７）、ｐ−（配列番号３：：配列番号１９）、ｑ−（配列番号５：：配列番号１４）、ｒ−（配列番号５：：配列番号１１）（配列番号６：：配列番号１３）、ｓ−（配列番号６：：配列番号１９）、ｔ−（配列番号８：：配列番号２１）、ｕ−（配列番号８：：配列番号１４）、ｖ−（配列番号６：：配列番号２０）、ｗ−（配列番号６：：配列番号１１）、ｘ−（配列番号８：：配列番号９）、およびｙ−（配列番号８：：配列番号１８）からなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項７】
前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｂ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｃ−（配列番号３：：配列番号１１）、ｄ−（配列番号３：：配列番号１４）、ｅ−（配列番号６：：配列番号１１）、およびｆ−（配列番号８：：配列番号９）からなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項８】
前記異種プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、請求項１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項９】
前記異種プロモーターが、配列番号６のヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、請求項１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１０】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項１から９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１１】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１２】
前記増強された工業的性能が飽和バイオマスであり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約５％高い飽和バイオマスを呈する、請求項１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１３】
前記増強された工業的性能が飽和バイオマスであり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約１０％高い飽和バイオマスを呈する、請求項１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１４】
前記増強された工業的性能が飽和バイオマスであり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約２０％高い飽和バイオマスを呈する、請求項１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１５】
アミノ酸、有機酸、およびアルコールからなる群から選択される生体分子を産生する、請求項１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１６】
前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンである、請求項１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１７】
前記有機酸が、スクシネート、ラクテート、またはピルベートである、請求項１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１８】
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１９】
前記増強された工業的性能が産物収率であり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約２％高い収率の前記生体分子を産生する、請求項１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項２０】
前記増強された工業的性能が産物収率であり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約３％高い収率の前記生体分子を産生する、請求項１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項２１】
前記増強された工業的性能が産物収率であり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約６％高い収率の前記生体分子を産生する、請求項１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項２２】
生体分子を産生する方法であって、該生体分子を産生するのに適した条件下で請求項１から２１のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２３】
生体分子収率を増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、
ａ．該宿主細胞のゲノムに異種プロモーターポリヌクレオチドを導入することによって、遺伝子操作された宿主細胞を作製するステップであって、前記異種プロモーターポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、ステップ
を含み、該遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養された対照宿主細胞の生体分子収率と比較してより高い該生体分子収率をもたらし、該対照宿主細胞は、該異種プロモーターポリヌクレオチドを含まない、方法。
【請求項２４】
飽和バイオマスを増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、
ａ．該宿主細胞のゲノムに異種プロモーターポリヌクレオチドを導入することによって、遺伝子操作された宿主細胞を作製するステップであって、該異種プロモーターポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、ステップ
を含み、該遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養された対照宿主細胞の飽和バイオマスと比較して増加した該飽和バイオマスを呈し、該対照宿主細胞は、該異種プロモーターポリヌクレオチドを含まない、方法。
【請求項２５】
前記ＲＮＡ分解遺伝子が内在性遺伝子である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記異種プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号２：：配列番号１７）、ｂ−（配列番号３：：配列番号１７）、ｃ−（配列番号６：：配列番号２０）、ｄ−（配列番号６：：配列番号１１）、およびｆ−（配列番号８：：配列番号９）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号６：：配列番号１１）、およびｆ−（配列番号８：：配列番号９）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記異種プロモーターポリヌクレオチドが配列番号６であり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１０）、ｂ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｃ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｄ−（配列番号２：：配列番号１８）、ｅ−（配列番号２：：配列番号１７）、ｆ−（配列番号２：：配列番号１９）、ｇ−（配列番号３：：配列番号１１）、ｈ−（配列番号３：：配列番号１４）、ｉ−（配列番号３：：配列番号１９）、ｊ−（配列番号５：：配列番号１４）、ｋ−（配列番号６：：配列番号１３）、ｌ−（配列番号６：：配列番号１９）、ｍ−（配列番号８：：配列番号２１）、およびｎ−（配列番号８：：配列番号１４）からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｂ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｃ−（配列番号３：：配列番号１１）、およびｄ−（配列番号３：：配列番号１４）からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記異種プロモーターポリヌクレオチドが配列番号１であり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項２３から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項２３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記生体分子が、アミノ酸、有機酸、およびアルコールからなる群から選択される、請求項２３および２５から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記有機酸が、スクシネート、ラクテート、またはピルベートである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
ａ．ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、
ｂ．（ａ）の該ポリヌクレオチドの開始コドンにおける変異と
を含む、増強された工業的性能を有する遺伝子操作された宿主細胞であって、
該変異が、異なる開始コドンでの該ポリヌクレオチドの内在性開始コドンの置き換えをもたらす、宿主細胞。
【請求項４２】
前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される、請求項４１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４３】
前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号１９である、請求項４１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４４】
内在性の前記ＲＮＡ分解遺伝子の前記開始コドンが、「ＡＴＧ」または「ＧＴＧ」から「ＴＴＧ」に変化している、請求項４２に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４５】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４６】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項４１から４５のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４７】
アミノ酸、有機酸、およびアルコールからなる群から選択される生体分子を産生する、請求項４１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４８】
前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンである、請求項４７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４９】
前記有機酸が、スクシネート、ラクテート、またはピルベートである、請求項４７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５０】
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項４７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５１】
同一培養条件下で、異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも２％高い収率の前記生体分子を産生する、請求項４７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５２】
生体分子収率を増加させることまたは飽和バイオマスを増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、
ａ．該宿主細胞を遺伝的に改変するステップであって、該改変するステップは、内在性ＲＮＡ分解遺伝子の開始コドンを変異させることを含み、該改変により、遺伝子操作された宿主細胞が生成される、ステップ
を含み、該遺伝子操作された宿主細胞は、対照宿主細胞の生体分子収率と比較して増加した該生体分子収率を有するか、または該遺伝子操作された宿主細胞は、該対照宿主細胞の飽和バイオマスと比較してより高い該飽和バイオマスを達成し、該対照宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞の開始コドン変異を含まず、該遺伝子操作された宿主細胞および該対照宿主細胞は、同一条件下で培養される、方法。
【請求項５３】
前記内在性ＲＮＡ分解遺伝子が、配列番号１７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＲＮＡ分解遺伝子が、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む遺伝子である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記内在性ＲＮＡ分解遺伝子の開始コドンが、「ＡＴＧ」または「ＧＴＧ」から「ＴＴＧ」に変化している、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項５２から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記生体分子が、アミノ酸、有機酸、およびアルコールからなる群から選択される、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記有機酸が、スクシネート、ラクテート、またはピルベートである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも２％高い収率の前記生体分子を産生する、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年７月５日に出願された米国仮出願第６２／３５８，２０１号の優先権の利益を主張し、その内容全体（すべての記載、参照、図面および特許請求の範囲）が、すべての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
【０００２】
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名：ＺＹＭＲ＿００７＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１７年６月２１日、ファイルサイズ１１３キロバイト）。
【０００３】
本開示は、微生物ゲノム操作を対象とする。ＲＮＡデグラドソーム撹乱のための本開示の方法、組成物、およびキットは、選択されたｍＲＮＡの定常状態のモジュレーションを容易にし、研究者が細菌株の産生効率を改善することを支援する。
【背景技術】
【０００４】
細菌遺伝子発現の調節は、転写制御、すなわち所与の遺伝子からのｍＲＮＡの合成の制御；翻訳制御、すなわちリボソームによってｍＲＮＡがポリペプチド配列に翻訳される効率の調節；およびｍＲＮＡ安定性、すなわち細胞内の所与のｍＲＮＡ集団がプロセシングされ不活性になる効率を含め、多くのレベルで起こる。
【０００５】
ｍＲＮＡの転写レベルを変更するための方法は広く研究されてきたが、ｍＲＮＡの翻訳後定常状態を最適化するための他の技法は依然として理解しにくいままである。
【０００６】
一部の実施形態では、本開示は、例えば遺伝子配列および反応条件を変更することでＲＮＡ安定性をモジュレートすることにより、工業用株の効率を改善するための方法を教示する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、工業用宿主生物の性能を改善するための新規方法を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、ｍＲＮＡの定常状態をモジュレートし、宿主株のバイオマスまたは産物性能の改善をもたらす。
【０００８】
一部の実施形態では、本開示は、増強された工業的性能を有する遺伝子操作された宿主細胞であって、ａ）異種プロモーターポリヌクレオチドと、ｂ）ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドとを含み、異種プロモーターポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドに作動可能に連結している、宿主細胞を教示する。
【０００９】
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分解遺伝子は内在性遺伝子である。本開示の他の実施形態では、宿主細胞は、外因性ＲＮＡ分解酵素に作動可能に連結した異種プロモーターポリヌクレオチドを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、外因性コードポリヌクレオチドは、異なる種に由来する遺伝子である。他の実施形態では、外因性コードポリヌクレオチドは、変異された内在性遺伝子である。
【００１１】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞のＲＮＡ分解酵素のうちの１つまたは複数の開始コドンを変異させることを教示し、ここでＲＮＡ分解遺伝子の変異していない開始コドンは、「ＡＴＧ」または「ＧＴＧ」から「ＴＴＧ」に変化する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、ＡＴＧ開始コドンをＴＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＡＴＧ開始コドンをＧＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＧＴＧ開始コドンをＡＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＧＴＧ開始コドンをＴＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＴＧ開始コドンをＡＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＴＧ開始コドンをＧＴＧで置き換えることを教示する。
【００１２】
一部の実施形態では、本開示は、ＲＮＡ分解遺伝子に作動可能に連結した異種プロモーターを含む遺伝子操作された宿主細胞であって、異種プロモーターが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、宿主細胞を教示する。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示の異種プロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される配列を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、異種プロモーターポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号６からなる群から選択される。一部の実施形態では、異種プロモーターポリヌクレオチド配列は、配列番号１である。一部の実施形態では、異種プロモーターポリヌクレオチド配列は、配列番号２である。一部の実施形態では、異種プロモーターポリヌクレオチド配列は、配列番号３である。一部の実施形態では、異種プロモーターポリヌクレオチド配列は、配列番号６である。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターを含む遺伝子操作された宿主細胞であって、ＲＮＡ分解遺伝子が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される、宿主細胞を教示する。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターを含む遺伝子操作された宿主細胞であって、ＲＮＡ分解タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７からなる群から選択される、宿主細胞を教示する。
【００１７】
一部の実施形態では、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、および配列番号２０からなる群から選択される。
【００１８】
一部の実施形態では、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４５からなる群から選択される。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターの組合せを含む遺伝子操作された宿主細胞であって、前記組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１０）、ｂ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｃ−（配列番号１：：配列番号１８）、ｄ−（配列番号１：：配列番号２０）、ｅ−（配列番号２：：配列番号１１）、ｆ−（配列番号２：：配列番号１８）、ｇ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｈ−（配列番号２：：配列番号１８）、ｉ−（配列番号２：：配列番号１７）、ｊ−（配列番号２：：配列番号１９）、ｋ−（配列番号３：：配列番号１１）、ｌ−（配列番号３：：配列番号１４）、ｍ−（配列番号３：：配列番号１２）、ｎ−（配列番号３：：配列番号１５）、ｏ−（配列番号３：：配列番号１７）、ｐ−（配列番号３：：配列番号１９）、ｑ−（配列番号５：：配列番号１４）、ｒ−（配列番号５：：配列番号１１）（配列番号６：：配列番号１３）、ｓ−（配列番号６：：配列番号１９）、ｔ−（配列番号８：：配列番号２１）、ｕ−（配列番号８：：配列番号１４）、ｖ−（配列番号６：：配列番号２０）、ｗ−（配列番号６：：配列番号１１）、ｘ−（配列番号８：：配列番号９）、およびｙ−（配列番号８：：配列番号１８）からなる群から選択される、宿主細胞を教示する。
【００２０】
一部の実施形態では、ＲＮＡ分解遺伝子は配列番号１１である。一部の実施形態では、ＲＮＡ分解遺伝子は配列番号１２である。一部の実施形態では、ＲＮＡ分解遺伝子は配列番号１３である。一部の実施形態では、ＲＮＡ分解遺伝子は配列番号１４である。一部の実施形態では、ＲＮＡ分解遺伝子は配列番号１７である。一部の実施形態では、ＲＮＡ分解遺伝子は配列番号２０である。
【００２１】
一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、任意の種の宿主細胞生物に適合する。一部の実施形態では、本開示の方法は、原核宿主細胞に適用される。一部の実施形態では、本開示の方法は、細菌宿主細胞に適用される。一部の実施形態では、本開示の方法は、真核宿主細胞に適用される。
【００２２】
一部の実施形態では、本開示の方法は、操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属することを教示する。一部の実施形態では、本開示の方法は、遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍであることを教示する。
【００２３】
一部の実施形態では、本開示は、生体分子を産生する方法であって、生体分子を産生するのに適した条件下で本開示の宿主細胞を培養することを含む、方法をさらに教示する。
【００２４】
一部の実施形態では、本開示の生体分子は、アミノ酸、有機酸、またはアルコールである。
【００２５】
一部の実施形態では、本開示は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、およびリシンからなる群から選択されるアミノ酸を産生する方法を教示する。
【００２６】
一部の実施形態では、本開示は、スクシネート、ラクテート、およびピルベートからなる群から選択される有機酸を産生する方法を教示する。
【００２７】
一部の実施形態では、本開示は、エタノールまたはイソブタノールなどのアルコールを産生する方法を教示する。
【００２８】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも２％高い力価の生体分子を産生することができる。
【００２９】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも３％高い力価の生体分子を産生することができる。
【００３０】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも６％高い力価の生体分子を産生することができる。
【００３１】
一部の実施形態では、本開示は、炭素消耗時の力価を測定して、遺伝子操作された宿主の収率を決定する。よって、一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された宿主株は、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約２％〜１０％高い収率の生体分子を産生する。
【００３２】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約５％高い飽和バイオマスを呈する。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約１０％高い飽和バイオマスを呈する。
【００３３】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約２０％高い飽和バイオマスを呈する。
【００３４】
一部の実施形態では、本開示は、生体分子の産生を増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、宿主細胞のゲノムに異種プロモーターポリヌクレオチドを導入することによって、遺伝子操作された宿主細胞を作製するステップであって、異種プロモーターポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、ステップを含み、遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養された対照宿主細胞の生体分子収率と比較してより高い生体分子収率をもたらし、対照宿主細胞は、異種プロモーターポリヌクレオチドを含まない、方法を教示する。
【００３５】
一部の実施形態では、本開示は、飽和バイオマスを増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、宿主細胞のゲノムに異種プロモーターポリヌクレオチドを導入することにより、遺伝子操作された宿主細胞を作製するステップであって、異種プロモーターポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、ステップを含み、遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養された対照宿主細胞の飽和バイオマスと比較して増加した飽和バイオマスを呈し、対照宿主細胞は、異種プロモーターポリヌクレオチドを含まない、方法を教示する。
【００３６】
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分解遺伝子は内在性遺伝子である。本開示の他の実施形態では、宿主細胞は、ＲＮＡ分解酵素をコードする外因性コードポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターポリヌクレオチドを含む。
【００３７】
さらに他の実施形態では、本開示は、増強された工業的性能を有する遺伝子操作された原核宿主細胞を教示し、前記宿主細胞は、ａ）ＲＮＡ分解遺伝子をコードするコードポリヌクレオチドと、ｂ）（ａ）のコードポリヌクレオチドの開始コドンにおける変異とを含み、変異が、異なる開始コドンでのコードポリヌクレオチドの開始コドンの置き換えをもたらす。
【００３８】
よって、一部の実施形態では、本開示は、生体分子の産生を増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、宿主細胞を遺伝的に改変するステップであって、改変するステップは、内在性ＲＮＡ分解遺伝子の開始コドンを変異させることを含み、改変により、ＲＮＡ分解遺伝子を発現する遺伝子操作された宿主細胞が生成される、ステップを含み、遺伝子操作された宿主細胞は、対照宿主細胞から産生される生体分子の量と比較して増加した量の生体分子を産生し、対照宿主細胞が変異した開始コドンを含まない、方法を教示する。
【００３９】
一部の実施形態では、本開示は、生体分子収率を増加させることまたは飽和バイオマスを増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、宿主細胞を遺伝的に改変するステップであって、改変するステップは、内在性ＲＮＡ分解遺伝子の開始コドンを変異させることを含み、改変により、遺伝子操作された宿主細胞が生成される、ステップを含み、遺伝子操作された宿主細胞は、対照宿主細胞の生体分子収率と比較して増加した生体分子収率を有するか、または遺伝子操作された宿主細胞は、対照宿主細胞の飽和バイオマスと比較してより高い飽和バイオマスを達成し、対照宿主細胞は、遺伝子操作された宿主細胞の開始コドン変異を含まず、遺伝子操作された宿主細胞および対照宿主細胞は、同一条件下で培養される、方法を教示する。
【００４０】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される、ＲＮＡ分解遺伝子を変異させることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１９を変異させる。
【００４１】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞培養物のバイオマスを改善するように設計された、特定の異種プロモーター：：ＲＮＡ分解遺伝子の組合せを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、配列番号１：：配列番号２０、配列番号１：：配列番号１４、配列番号２：：配列番号１３、配列番号２：：配列番号１８、配列番号２：：配列番号１７、配列番号２：：配列番号１９、配列番号３：：配列番号１１、配列番号３：：配列番号１９、配列番号３：：配列番号１４、配列番号５：：配列番号１８、配列番号５：：配列番号１４、配列番号６：：配列番号１３、配列番号６：：配列番号１９、配列番号８：：配列番号２１、および配列番号８：：配列番号１４からなる群から選択される、異種プロモーター：：ＲＮＡ分解遺伝子の組合せを教示する。
【００４２】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞培養物における産物産生を改善するように設計された、特定の異種プロモーター：：ＲＮＡ分解遺伝子の組合せを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、配列番号２：：配列番号１７、配列番号３：：配列番号１７、配列番号６：：配列番号２０、配列番号６：：配列番号１１、および配列番号８：：配列番号９からなる群から選択される、異種プロモーター：：ＲＮＡ分解遺伝子の組合せを教示する。
【００４３】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞培養物のバイオマスを改善するように設計された、ＲＮＡ分解遺伝子の特定の開始コドンの置き換えを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、配列番号２１のＧＴＧからＴＴＧ、配列番号１４のＡＴＧからＴＴＧ、配列番号１９のＧＴＧからＴＴＧ、および配列番号１７のＡＴＧからＴＴＧからなる群から選択される、ＲＮＡ分解遺伝子の開始コドンの置き換えを教示する。
【００４４】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞培養物の産物産生を改善するように設計された、ＲＮＡ分解遺伝子の特定の開始コドンの置き換えを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、配列番号２１のＧＴＧからＴＴＧ、配列番号１０のＡＴＧからＴＴＧからなる群から選択される、ＲＮＡ分解遺伝子の開始コドンの置き換えを教示する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、本開示の形質転換プラスミドアセンブリー、および宿主生物中へのそのプラスミドの組込みを示す。挿入断片ＤＮＡ（insert  DNA）を、アセンブリー反応において１つまたは複数の合成オリゴを組み合わせることによって生成する。所望の配列を含有するＤＮＡ挿入断片に、ゲノムの標的領域に相同なＤＮＡの領域を隣接させる。これらの相同領域は、ゲノムの組込みを促進し、一旦組み込まれると、続くステップでベクター骨格のＤＮＡをループアウトするように設計されたダイレクトリピート領域を形成する。アセンブルされたプラスミドは、挿入断片ＤＮＡを含有し、任意選択で、１つまたは複数の選択マーカーも含有する。
【００４６】
【図２】図２は、選択された、宿主株に由来するＤＮＡの領域をループアウトするための手順を示す。挿入されたＤＮＡおよび宿主ゲノムのダイレクトリピート領域は、組換え事象において「ループアウトする」ことができる。選択マーカーについて対抗選択された細胞は、ダイレクトリピート領域が隣接するループＤＮＡの欠失を含有する。
【００４７】
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、本開示の方法による、いくつかのＲＮＡ分解遺伝子撹乱実験の結果を示す。選択されたＲＮＡ分解酵素遺伝子に作動可能に連結した異種プロモーターを含む、遺伝子操作された処置宿主細胞の性能を決定した。グラフのバーは、遺伝子操作された宿主細胞の飽和バイオマスまたは産物収率の対照培養物に対するパーセント変化を表す。対照培養物は、本開示の作動可能に連結した異種プロモーターを欠くことを除いては、遺伝的に改変された培養物と遺伝的に同一であった。エラーバーは、２標準偏差を表す。結果は、データのサイズに適応するために図３Ａおよび図３Ｂに分けてある。
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、本開示の方法による、いくつかのＲＮＡ分解遺伝子撹乱実験の結果を示す。選択されたＲＮＡ分解酵素遺伝子に作動可能に連結した異種プロモーターを含む、遺伝子操作された処置宿主細胞の性能を決定した。グラフのバーは、遺伝子操作された宿主細胞の飽和バイオマスまたは産物収率の対照培養物に対するパーセント変化を表す。対照培養物は、本開示の作動可能に連結した異種プロモーターを欠くことを除いては、遺伝的に改変された培養物と遺伝的に同一であった。エラーバーは、２標準偏差を表す。結果は、データのサイズに適応するために図３Ａおよび図３Ｂに分けてある。
【００４８】
【図４】図４は、本開示の方法による、いくつかのＲＮＡ分解遺伝子撹乱実験の結果を示す。選択されたＲＮＡ分解酵素に変異開始コドンを含む、遺伝子操作された処置宿主細胞の性能を決定した。グラフのバーは、遺伝子操作された宿主細胞の飽和バイオマスまたは産物収率の対照培養物に対するパーセント変化を表す。対照培養物は、本開示の変異した開始コドンを欠くことを除いては、遺伝的に改変された培養物と遺伝的に同一であった。エラーバーは、２標準偏差を表す。
【００４９】
【図５】図５は、本開示の方法による、いくつかのＲＮＡ分解遺伝子撹乱実験の産物収率結果を示す。選択されたＲＮＡ分解酵素に作動可能に連結した異種プロモーターを含む、遺伝子操作された処置宿主細胞の性能を決定した。グラフ上のバーは、遺伝子操作された宿主細胞の産物収率の対照培養物に対するパーセント変化を表す。対照培養物は、本開示の作動可能に連結した異種プロモーターを欠くことを除いては、遺伝的に改変された培養物と遺伝的に同一であった。エラーバーは、２標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
定義
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。
【００５１】
用語「ａ」または「ａｎ」は、そのエンティティの１つまたは複数を指し、すなわち、複数形の指示対象を指すことができる。したがって、用語「ａ」または「ａｎ」、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用される。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による「要素」への言及は、文脈により唯一の要素が存在することが明確に要求されない限り、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「細胞生物」、「微生物（microorganism）」、または「微生物（microbe）」は、広く解釈されるべきである。これらの用語は、互換的に使用され、これらに限定されないが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌を含む。一部の実施形態では、本開示は、本開示内に存在するリスト／表および図面の「微生物（microorganism）」または「細胞生物」または「微生物（microbe）」に言及する。この特徴付けは、表および図面の同定された分類学的な属だけでなく、同定された分類学的な種、ならびに前記表または図面内の任意の生物体の様々な新規のおよび新しく同定または設計された株も参照することができる。同じ特徴付けが、実施例などの本明細書の他の部分におけるこれらの用語の記述にも当てはまる。
【００５３】
用語「原核生物」は、当技術分野で認識されており、核または他の細胞小器官を含有しない細胞を指す。原核生物は一般に、２つのドメイン、細菌および古細菌の１つに分類される。古細菌と細菌ドメインの生物体間の決定的な差異は、１６ＳリボソームＲＮＡ内のヌクレオチド塩基配列の基本的な差異に基づく。
【００５４】
「真核生物」は、細胞が、膜内に囲まれた核および他の小器官を含有する任意の生物である。真核生物は、分類群ＥｕｋａｒｙａまたはＥｕｋａｒｙｏｔａに属する。真核細胞を原核細胞（上記の細菌および古細菌）から分離する決定的なフィーチャは、これらが膜結合型小器官、特に、遺伝物質を含有し、核膜によって囲まれている核を有することである。
【００５５】
用語「古細菌」は、Ｍｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ門の生物体のカテゴリー分類を指し、典型的には、珍しい環境内で見つかり、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如を含めたいくつかの判定基準によって原核生物の残りと区別される。ｓｓｒＲＮＡ分析に基づいて、古細菌は、２つの系統学的に別個の群：ＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａからなる。これらの生理機能に基づいて、古細菌は、３つのタイプ：メタン生成菌（メタンを産生する原核生物）；高度好塩菌（非常に高濃度の塩（ＮａＣｌ）で生きる原核生物）；および高度（超）好熱菌（thermophilus）（非常に高温で生きる原核生物）へと整理することができる。古細菌を細菌と区別する統一的古細菌フィーチャ（すなわち、細胞壁内にムレインが無いこと、エステル連結膜脂質など）に加えて、これらの原核生物は、これらをその特定の生息環境に適応させるユニークな構造的または生化学的属性を呈する。Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａは、超好熱性硫黄依存性原核生物から主になり、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａは、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。
【００５６】
「細菌」または「真正細菌」は、原核生物体のドメインを指す。細菌は、以下の少なくとも１１の別個の群を含む：（１）２つの主要な亜門：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、その他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）が存在するグラム陽性（グラム＋）細菌；（２）Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む）；（３）ラン藻類、例えば、酸素発生型光合成生物；（４）スピロヘータおよび関連種；（５）Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ；（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ；（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も）；（１０）放射線抵抗性ミクロコッカスおよび類縁体；（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。
【００５７】
用語「遺伝的に改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、および「組換え株」は、本明細書で互換的に使用され、本開示のクローニングおよび形質転換方法によって遺伝的に改変された微生物を指す。よって、この用語は、宿主細胞（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞、ＣＨＯ、ヒト細胞など）であって、それが由来した自然に存在する微生物と比較して、それが変更された、改変された、または異なる遺伝子型および／または表現型（例えば、遺伝子改変が微生物のコーディング核酸配列に影響するとき）を呈するように遺伝的に変更、改変、または操作された、宿主細胞を含む。この用語は、問題の特定の組換え微生物だけでなく、このような微生物の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。
【００５８】
用語「遺伝子操作された（genetically engineered）」は、宿主細胞のゲノムの任意の操作（manipulation）（例えば、核酸の挿入または欠失による）を指すことができる。
【００５９】
用語「株改善プログラム」は、宿主細胞培養物を改善するための任意の方法を指す。例えば、本開示は、改善した性能を呈するように宿主細胞を遺伝子操作するための方法を教示する。
【００６０】
用語「野生型」は、自然に存在する細胞または多細胞生物、すなわち、遺伝的に改変されていない細胞を記述する。
【００６１】
用語「対照」または「対照宿主細胞」は、遺伝子改変または実験処置の効果を判定するための適切な比較宿主細胞を指す。一部の実施形態では、対照宿主細胞は、野生型細胞である。他の実施形態では、対照宿主細胞は、処置宿主細胞を識別する遺伝子改変を除いて、遺伝的に改変された宿主細胞と遺伝的に同一である。よって、ＲＮＡ分解遺伝子に作動可能に連結した異種プロモーター配列を含む、本開示の遺伝的に改変された生物の対照は、異種プロモーターを含まない遺伝的に同一の生物であり得る。
【００６２】
用語「ＲＮＡ分解遺伝子」または「ＲＮＡデグラドソーム」は、広く解釈されるべきである。これらの用語は、互換的に使用され、これらに限定されないが、ｉｎ  ｖｉｖｏのＲＮＡ分解、ｍＲＮＡ転写物プロセシング、もしくはｍＲＮＡ安定性のモジュレーションをもたらす他の機能に関連する、任意の原核生物遺伝子または真核生物遺伝子を含む。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分解遺伝子は、表１に開示されるタンパク質配列によってコードされるポリペプチド配列をコードする任意のポリヌクレオチドを含む。
【００６３】
一部の実施形態では、本開示は、本開示内に存在するリスト／表および図面の「ＲＮＡデグラドソーム遺伝子」または「ＲＮＡ分解遺伝子」に言及する。この特徴付けは、表および図面の特定の遺伝子だけでなく、これらの相同体、オルソログ、パラログ、またはバリアントも参照することができる。同じ特徴付けが、実施例などの本明細書の他の部分におけるこれらの用語の記述にも当てはまる。例えば、一部の実施形態では、本開示は、表１２に開示されるＲＮＡ分解ポリヌクレオチドおよびポリペプチドも包含する。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「表現型」は、個々の遺伝子構造（すなわち、遺伝子型）と環境との間の相互作用から生じる個々の細胞、細胞培養物、生物体、または生物体の群の観察可能な特性を指す。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「キメラの」または「組換えの」は、核酸配列またはタンパク質配列を記述するとき、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドもしくは２つの異種ポリペプチドを連結して単一の巨大分子にする、または少なくとも１つの天然の核酸もしくはタンパク質配列の１つもしくは複数のエレメントを再編成する核酸またはタンパク質配列を指す。例えば、用語「組換えの」は、例えば、化学合成による、または遺伝子操作技法による核酸の単離セグメントの操作による、配列の２つの別の方法で分離されたセグメントの人工の組合せを指すことができる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、天然に存在することが知られていない、または天然に存在しないヌクレオチド配列である。一般に、このような合成ヌクレオチド配列は、任意の他の天然に存在するヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも１つのヌクレオチド差異を含む。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはこれらの類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造を指し、よって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。これは、修飾核酸、例えば、メチル化および／またはキャッピングされた核酸、修飾塩基、主鎖修飾を含有する核酸なども含む。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用される。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連したＤＮＡの任意のセグメントを指す。よって、遺伝子は、これらに限定されないが、コード配列および／またはこれらの発現に要求される調節配列を含む。遺伝子は、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含み得る。遺伝子は、目的の源からのクローニング、または公知のもしくは予測された配列情報からの合成を含めた、様々な源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含み得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「相同の」または「相同体」または「オルソログ」は、当技術分野で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指す。用語「相同性」、「相同の」、「実質的に同様の」、および「実質的に対応する」は、本明細書で互換的に使用される。これらは、核酸断片であって、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介し、またはある特定の表現型を生じさせる核酸断片の能力に影響しない、核酸断片を指す。これらの用語は、本開示の核酸断片の修飾、例えば、最初の無修飾断片と比べて得られる核酸断片の機能的性質を実質的に変更しない１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入も指す。したがって、当業者が十分に理解するように、本開示は、具体的な例示的な配列より多くを包含することが理解される。これらの用語は、１つの種、亜種、種類、栽培品種、または株内に見出される遺伝子と、別の種、亜種、種類、栽培品種、または株内の対応するまたは等価な遺伝子との間の関係を記述する。本開示の目的に関して、相同配列が比較される。「相同配列」または「相同体」または「オルソログ」は、機能的に関連していると見なされ、考えられ、または知られている。機能的関係は、これらに限定されないが、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じもしくは同様の生物学的機能を含めた、いくつかのやり方のいずれか１つにおいて示され得る。好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方が示される。相同性は、当技術分野で容易に利用可能なソフトウェアプログラム、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（F.M.  Ausubelら編、１９８７年）補遺３０、セクション７．７１８、表７．７１に論じられたものなどを使用して決定することができる。いくつかの整列プログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、およびＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。別の整列プログラムは、デフォルトパラメータを使用するＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を指す。例えば、変異は、サイレント置換、付加、または欠失を生じさせるが、コードされるタンパク質の性質もしくは活性、またはタンパク質が作製される方法を変更しない変更を含有する。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質修飾」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸修飾、欠失、および／または挿入を指す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」は、このような配列の最小限のサイズ特性を有する部分、または最大で全長分子の、および全長分子を含めた、全長分子の任意のより大きい断片を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物活性部分をコードすることができる。遺伝子調節エレメントの生物活性部分は、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの１つの部分を単離し、本明細書に記載の活性を評価することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの部分は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであり得、最大で全長ポリペプチドまで伸び得る。使用される部分の長さは、特定の用途に依存する。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の部分は、１２ヌクレオチドという短さであり得；一部の実施形態では、それは、２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの部分は、４アミノ酸という短さであり得る。完全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの部分は一般に、４アミノ酸より長いはずである。
【００７３】
本明細書に開示のポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に関して、オリゴヌクレオチドプライマーを、目的の任意の生物体から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応で使用するのに設計することができる。ＰＣＲプライマーを設計しＰＣＲクローニングするための方法は、当技術分野で一般に公知であり、Sambrookら（２００１年）、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual（３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Plainview、New  York）に開示されている。Innisら編（１９９０年）、PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications（Academic  Press、New  York）；InnisおよびGelfand編（１９９５年）、PCR  Strategies（Academic  Press、New  York）；ならびにInnisおよびGelfand編（１９９９年）PCR  Methods  Manual（Academic  Press、New  York）も参照。ＰＣＲの公知の方法としては、これらに限定されないが、対プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを使用する方法が挙げられる。
【００７４】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、増幅標的にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼを結合させ、それによって、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための作用物質の存在下で、かつ適当な温度およびｐＨで配置されたとき、ＤＮＡ合成の開始点として機能を果たすことができるオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは、好ましくは、増幅の効率を最大にするために一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための作用物質の存在下で伸長産物の合成をプライムするのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、プライマーの温度および組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含有量）を含めた多くの因子に依存する。一対の双方向性プライマーは、ＰＣＲ増幅などのＤＮＡ増幅の技術分野で一般に使用されるように、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーからなる。
【００７５】
用語「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度など、ハイブリッドの安定性に影響するハイブリダイゼーション条件を指す。これらの条件は、プライマーまたはプローブのその標的核酸配列への特異的な結合を最大にし、非特異的な結合を最小限に抑えるように、経験的に最適化される。使用されるこれらの用語には、プローブまたはプライマーが、他の配列よりも検出可能に高い程度（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）まで、その標的配列とハイブリダイズする条件への言及が含まれる。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱的融点（Ｔｍ、thermal melting point）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度およびｐＨ下で）相補性標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブまたはプライマーとハイブリダイズする温度である。典型的に、ストリンジェントな条件とは、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３においてＮａ＋イオン約１．０Ｍ未満、典型的にはＮａ＋イオン濃度（または他の塩）が約０．０１〜１．０Ｍであり、短いプローブまたはプライマー（例えば１０〜５０ヌクレオチド）の場合は温度が少なくとも約３０℃であり、長いプローブまたはプライマー（例えば５０ヌクレオチド超）の場合は少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の付加により達成することもできる。例示的な低ストリンジェント条件または「ストリンジェンシーの低い条件」には、３０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳの緩衝溶液を用いた３７℃のハイブリダイゼーション、および４０℃の２×ＳＳＣでの洗浄が含まれる。例示的な高ストリンジェンシー条件には、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳにおける３７℃のハイブリダイゼーション、および６０℃の０．１×ＳＳＣでの洗浄が含まれる。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野で周知であり、例えば、Ausubelら、１９９８年およびSambrookら、２００１年に記載されている。一部の実施形態では、ストリンジェントな条件は、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５〜２０％（例えば０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）中で４５℃のハイブリダイゼーションに続いて、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５×ＳＳＣでの５５℃〜６５℃での洗浄である。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなる場合があり、後者のエレメントは、エンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの元からあるエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来する場合があり、または自然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成される場合があり、または合成ＤＮＡセグメントを含むことさえできる。一部の実施形態では、本開示は、本開示内に存在するリスト／表および図面のプロモーターに言及する。この特徴付けは、特定のプロモーターだけでなく、そのバリアントも参照することができる。同じ特徴付けが、実施例などの本明細書の他の部分におけるこれらの用語の記述にも当てはまる。一部の実施形態では、本開示は、特定のプロモーター：：遺伝子の組合せの使用を教示する。
【００７７】
本明細書で使用される場合、用語「異種」または「異種プロモーター」は、特定の生物において自然に見出されない核酸配列を指す。配列は、その正常な配列関係の外にそれが配置されている場合にも、異種であり得る。よって、本開示で使用される「異種プロモーター」は、異なる種もしくは株から供給されたプロモーターであってもよく、または、同じ種から供給されているが、遺伝子操作された宿主細胞内の異なる遺伝子座に挿入されたプロモーター配列であってもよい。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「内在性の」、「内在性遺伝子」、または「内在性ＲＮＡ分解遺伝子」は、遺伝子の自然に存在するコピーであって、それが宿主細胞ゲノム内に見出される場所における遺伝子の自然に存在するコピーを指す。本開示との関連で、異種プロモーターを内在性ＲＮＡ分解遺伝子に作動可能に連結することは、ＲＮＡ分解遺伝子が自然に存在する場所において、その遺伝子の前に異種プロモーター配列を遺伝的に挿入することを意味する。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「外因性の」は、用語「異種の」と互換的に使用され、その天然源以外の何らかの源に由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性遺伝子」は、非天然の源または場所由来であり、生物系に人工的に供給されたタンパク質または遺伝子を指す。内在性遺伝子の人工的に変異したバリアントは、本開示の目的に関しては「外因性」と見なされる。
【００８０】
本明細書で使用される場合、語句「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書で互換的に使用される。組換えコンストラクトは、核酸断片の人工の組合せ、例えば、天然に一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む。例えば、キメラコンストラクトは、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが、天然に見出されるものと異なる様式で配列されている調節配列およびコード配列を含み得る。このようなコンストラクトは、それ自体で使用することができ、またはベクターと併せて使用することができる。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本開示の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を順調に形質転換、選択、および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントをよく知っている。当業者は、異なる独立した形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Jonesら（１９８５年）、EMBO  J.、４巻：２４１１〜２４１８頁；De  Almeidaら（１９８９年）、Mol.  Gen.  Genetics、２１８巻：７８〜８６頁）、よって、所望の発現レベルおよびパターンをディスプレイする系（line）を得るために、複数の事象がスクリーニングされなければならないことも認識する。このようなスクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析によってなしとげることができる。ベクターは、自発的に複製する、または宿主細胞の染色体内に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロ−ウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自律複製していない裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡなどでもあり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟）の産生を指す。
【００８１】
用語「作動可能に連結した」は、本文脈において、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、前記さらなるポリヌクレオチドの転写をもたらす連鎖配列（sequential arrangement）を意味する。一部の実施形態では、本開示のプロモーター配列は、遺伝子の５’ＵＴＲまたはオープンリーディングフレームのすぐ前に挿入される。他の実施形態では、本開示の作動可能に連結したプロモーター配列および遺伝子配列は、１つまたは複数のリンカーヌクレオチドによって隔てられている。
【００８２】
用語「炭素源」は一般に、細胞成長のための炭素の源として使用されるのに適した物質を指す。炭素源としては、これらに限定されないが、バイオマス加水分解物、デンプン、スクロース、セルロース、ヘミセルロース、キシロース、およびリグニン、ならびにこれらの基質のモノマーコンポーネントが挙げられる。炭素源は、これらに限定されないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含めた様々な形態での様々な有機化合物を含み得る。これらとしては、例えば、様々な単糖、例えば、グルコース、デキストロース（Ｄ−グルコース）、マルトース、オリゴ糖、多糖、飽和もしくは不飽和脂肪酸、スクシネート、ラクテート、アセテート、エタノールなど、またはこれらの混合物が挙げられる。光合成生物は、光合成の産物として炭素源をさらに産生することができる。一部の実施形態では、炭素源は、バイオマス加水分解物およびグルコースから選択され得る。
【００８３】
用語「供給材料」は、他の産物が作られ得る微生物または発酵プロセスに供給される原料または原料の混合物として定義される。例えば、バイオマスまたはバイオマスに由来する炭素化合物などの炭素源は、発酵プロセスにおいて目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）を産生する微生物の供給材料である。しかし、供給材料は、炭素源以外の栄養分を含有し得る。
【００８４】
本明細書で使用される用語「目的の産物」または「生体分子」は、供給原料から微生物によって産生される任意の産物を指す。一部の場合では、目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコールなどであり得る。例えば、目的の産物または生体分子は、任意の一次または二次細胞外代謝産物であり得る。一次代謝産物は、とりわけ、エタノール、クエン酸、乳酸、グルタミン酸、グルタメート、リシン、トレオニン、トリプトファン、および他のアミノ酸、ビタミン、多糖などであり得る。二次代謝産物は、とりわけ、ペニシリンのような抗生物質化合物、またはシクロスポリンＡのような免疫抑制剤、ジベレリンのような植物ホルモン、ロバスタチンのようなスタチン薬、グリセオフルビンのような殺真菌薬などであり得る。目的の産物、または生体分子は、微生物によって産生される任意の細胞内コンポーネント、例えば、カタラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼ、および多くのその他を含めた微生物酵素でもあり得る。細胞内コンポーネントとして、組換えタンパク質、例えば、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなども挙げることができる。
【００８５】
用語「体積生産性」または「生産速度」は、単位時間当たり、媒体の体積当たりに形成される産物の量として定義される。体積生産性は、１時間当たり１リットル当たりのグラム（ｇ／Ｌ／ｈ）で報告することができる。
【００８６】
用語「比生産性」は、産物の形成の速度として定義される。発酵プロセス固有のパラメータではなく微生物に固有のパラメータとして生産性を説明するため、生産性は、１時間当たり細胞乾燥重量（ＣＤＷ）１グラム当たりの産物のグラム（ｇ／ｇ  ＣＤＷ／ｈ）での比生産性として本明細書でさらに定義される。所与の微生物のＯＤ６００に対するＣＤＷの関係を使用して、比生産性を、１時間当たり６００ｎｍにおける培養ブロスの光学密度（ＯＤ）当たり培養培地１リットル当たりの産物のグラム（ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ）として表現することもできる。
【００８７】
用語「収率」は、原料の単位重量当たりに得られる産物の量として定義され、基質１ｇ当たりの産物のｇ（ｇ／ｇ）（「産物収率」）として表現することができる。収率は、理論的収率に対する実際の収率のパーセンテージ（「パーセント収率」）として表現することができる。「理論的収率」は、産物を作製するのに使用される代謝経路の化学量論によって決まる所与の量の基質あたりに生成され得る産物の最大量として定義される。
【００８８】
用語「力価（ｔｉｔｒｅ）」または「力価（ｔｉｔｅｒ）」は、溶液の強度または溶液中の物質の濃度として定義される。例えば、発酵ブロス中の目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）の力価は、発酵ブロス１リットル当たりの溶液中の目的の産物のｇ（ｇ／Ｌ）として記述される。一部の実施形態では、本開示は、培養物のバイオマスが任意の時点で測定され得ること（例えば、所定の培養時間後または炭素消耗時の力価測定）を教示する。炭素消耗時の測定された力価はまた、これらの条件下の培養物の収率を反映するものと見なされる。
【００８９】
用語「総力価」は、プロセスにおける初期体積またはプロセスにおける操作体積に対する、プロセスから取り出され、回収される溶液中の目的の産物、適用可能な場合、気相中の目的の産物、および任意の目的の産物を含むがこれらに限定されない、プロセスにおいて産生されるすべての目的の産物の和として定義される。
【００９０】
用語「バイオマス」は、培養物の細胞密度を指す。一部の実施形態では、本開示の培養物のバイオマスは、６００ｎｍのスペクトルにおけるそれらの培養物の光学密度から対応する生物を含まない対照培地の光学密度を差し引いたものによって決定される。他の実施形態では、「バイオマス」は、他の測定基準、例えば細胞密度によって（例えば、血球計数器を介して）、または細胞をその培養培地から分離した後の培養物の重量によって測定され得る。一部の実施形態では、本開示は、培養物のバイオマスが任意の時点で測定され得ることを教示する。
【００９１】
用語「飽和バイオマス」は、所与のセットの条件下で宿主細胞によって達成されるピークバイオマスを指す。例えば一部の実施形態では、飽和質量（saturation mass）とは、特定の温度および光条件における特定の成長培地中の培養物によって達成される最大バイオマスを指す場合がある。一部の実施形態では、本開示は、飽和バイオマスにおけるあらゆる差が、試験される微生物間の基礎をなす遺伝子の差に起因するように、改変された様々な微生物の飽和バイオマスを同一の成長条件下で比較する。
遺伝子発現の最適化
【００９２】
一部の実施形態では、本開示は、細胞遺伝子発現のモジュレーションによって宿主細胞生産性を改善する方法を教示する。遺伝子発現は、ＲＮＡ合成の転写制御、ｍＲＮＡ安定性、タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳、およびタンパク質安定性を含む、マルチレベルの調節プロセスの測定可能な出力である。多くの関心が、遺伝子の転写モジュレーションを通じた（例えば、プロモーターを変更すること、または調節転写因子を誘導することによる）遺伝子発現の制御に注がれているが、望ましい遺伝子の転写後調節の理解に向けては比較的少ない取り組みが行われている。
【００９３】
一部の実施形態では、本開示は、生物のＲＮＡ分解遺伝子（例えば、ＲＮＡデグラドソーム）を撹乱することによって望ましい遺伝子の細胞発現を改善する方法を教示する。ＲＮＡデグラドソームは、ｍＲＮＡを含む細胞内ＲＮＡの分解を担い、したがって、細胞内のＲＮＡの定常状態濃度において重要な役割を果たす。
【００９４】
一部の実施形態では、本発明は、望ましい遺伝子の転写速度の増加が必ずしも所望のタンパク質の発現の増加につながるとは限らないという本発明者の認識に部分的に基づく。原核生物では、転写と翻訳との間の密な連関がｍＲＮＡ安定性のために重要である。例えば、原核生物ｍＲＮＡが高速のＴ７  ＲＮＡＰによる転写増加を通じて過剰発現すると、長く伸びたリボソームなしのメッセージが生じ、未翻訳ｍＲＮＡが不安定になる。（Makarova, O. V.ら（１９９５年）、「Transcribing ofEscherichia coli genes with mutant T7 RNA polymerases: stability of lacZ mRNAinversely correlates with polymerase speed」、Proc NatlAcad Sci USA、９２巻：１２２５０〜１２２５４頁）。
【００９５】
いずれか１つの理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、細胞のＲＮＡ分解遺伝子のモジュレーションにより、選択された目的の遺伝子のｍＲＮＡ安定性を最適化することで細胞効率を改善することができると考える。定常状態ＲＮＡ濃度は、ｍＲＮＡの場合はタンパク質産生のための鋳型として機能を果たすこと、または非コード（ｎｃ）ＲＮＡを介してｍＲＮＡ産生を調節することを含む様々な機構により、いくつかの細胞表現型に影響を及ぼす。デグラドソームはＲＮＡ分解のハブとして働き、異なるタイプのＲＮＡに様々な程度に働く様々な異なるタンパク質から構成されているため、デグラドソームにおける遺伝子の系統的撹乱は、複雑なトランスクリプトームワイドの影響、ひいては表現型に対する複雑な影響を及ぼす可能性がある。ハイスループットにおける目的の表現型に対する各撹乱の影響を決定する方法と相俟って、本発明は、様々な表現型にわたる微生物の性能改善をもたらす撹乱の発見およびスタッキングを可能にする。
ＲＮＡデグラドソームおよびＲＮＡ分解遺伝子
【００９６】
一部の実施形態では、本開示は、ＲＮＡ分解およびプロセシング遺伝子を教示する。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分解遺伝子は、ＲＮＡデグラドソームの一部である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＲＮＡデグラドソームは、ＲＮａｓｅ  Ｅの精製および特徴付けを行う取り組みの間に発見された多酵素複合体である（Carpousis, A. J.ら（１９９４年）、「Copurification ofE.coli RNAase E and PNPase: evidence for a specific association between twoenzymes important in RNA processing and degradation」、Cell、７６巻：８８９〜９００頁；Carpousis, A. J.ら（１９９９年）、「mRNAdegradation  A tale of poly(A) and multiprotein machines」、Trends Genet、１５巻：２４〜２８頁；Miczak, A.ら（１９９６年）、「Proteins associated with RNase E in a multicomponent ribonucleolyticcomplex」、Proc Natl Acad Sci USA、９３巻：３８６５〜３８６９頁）。
【００９７】
ＲＮａｓｅ  Ｅは一本鎖特異的エンドヌクレアーゼであり、Ｅ．ｃｏｌｉメッセンジャーＲＮＡ崩壊における主要なエンドヌクレアーゼであると考えられている（Regnier, P.およびArraiano, C. M.（２０００年）、「Degradation of mRNA in bacteria: emergence of ubiquitous features」、Bioessays、２２巻：２３５〜２４４頁）。ＲＮａｓｅ  Ｅは大きな１０６１残基のタンパク質であり、その核酸分解活性はタンパク質のＮ末端側の半分に存在する。このタンパク質のＣ末端側の半分は、プロリンリッチリンカー、アルギニンリッチＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、およびデグラドソームの他のコンポーネントとのタンパク質間相互作用のための足場である領域を含有する（Carpousis, A.J.、２００７年、「The RNA Degradosomeof Escherichia coli: An mRNA-Degrading Machine Assembled on RNase E」、Annu. Rev. Microbiol.、６１巻：７１〜８７頁）。
【００９８】
ＲＮａｓｅ  Ｅに関連するタンパク質は、真正細菌界全体および一部の植物に見出される（Condon,C.ら（２００１年）、「Identification of the gene encoding the 5Sribosomal RNA maturase in Bacillus subtilis: mature 5S rRNA is dispensable forribosome function」、RNA、７巻：２４２〜２５３頁）。植物相同体は、真正細菌起源の小器官である葉緑体に存在すると推定される。最近、ＲＮａｓｅ  ＥベースのデグラドソームがＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓにおいて同定された（Jager, S.ら（２００１年）、「An mRNA degrading complexin Rhodobacter capsulatus」、Nucleic Acids Res、２９巻：４５８１〜４５８８頁）。
【００９９】
このＲＮＡｓｅ  Ｅ複合体は、２つのＤＥＡＤタンパク質および転写終結因子Ｒｈｏ、ならびにＰＮＰａｓｅおよびエノラーゼを含有すると考えられている（Carpousis, A.J.、２００７年、「The RNA Degradosomeof Escherichia coli: An mRNA-Degrading Machine Assembled on RNase E」、Annu. Rev. Microbiol.、６１巻：７１〜８７頁）。Ｅ．ｃｏｌｉはまた、現在はＲＮａｓｅ  Ｇとして公知のＲＮａｓｅ  Ｅのパラログをコードする（Li, Z.ら（１９９９年）、「RNase G (CafA protein) andRNase E are both required for the 5' maturation of 16S ribosomal RNA」、Embo J、１８巻：２８７８〜２８８５頁）。これは、ＲＮａｓｅ  ＥのＮ末端触媒ドメインと有意な相同性を有するが、Ｃ末端側の半分を欠くため、より小さい。よって、「ＲＮａｓｅ  Ｅ／Ｇ」ファミリーのタンパク質は、デグラドソームを形成することができる大きなＲＮａｓｅ  Ｅ様酵素と、単独で機能すると見られる小さなＲＮａｓｅ  Ｇ様酵素との、２つのグループに分けることができる。
【０１００】
デグラドソームの他の不可欠なコンポーネントは、エノラーゼ、ＲＮＡヘリカーゼ（ＲｈｌＢ）、およびポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰａｓｅ）である。ＲｈｌＢは、ＲＮＡヘリカーゼのＤＥＡＤボックスファミリーのメンバーである（Schmid, S. R.およびLinder, P.（１９９２年）、「D-E-A-D protein family of putative RNA helicases」、Mol Microbiol、６巻：２８３〜２９１頁）。ＰＮＰａｓｅは一本鎖特異的エキソヌクレアーゼであり、３’→５’ＲＮＡ分解酵素のＲＮａｓｅ  ＰＨファミリーのメンバーである（Deutscher, M. P.およびLi, Z.（２００１年）、「Exoribonucleases and their multiple roles in RNA metabolism」、Prog Nucleic Acid Res Mol Biol、６６巻：６７〜１０５頁；Symmons,M., Williamsら（２００２年）、「Running rings around RNA: asuperfamily of phosphate-dependent RNases」、TrendsBiochem. Sci.、２７巻：１１〜１８頁）。両ファミリーのメンバーは、広い範囲の原核生物および真核生物に見出される。
【０１０１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により、デグラドソームのＲｈｌＢが、ＰＮＰａｓｅによる構造化ＲＮＡの分解を促進することが実証された（Coburn, G. A.ら（１９９９年）、「Reconstitution of aminimal RNA degradosome demonstrates functional coordination between a 3'exonuclease and a DEAD-box RNA helicase」、Genes Dev、１３巻：２５９４〜２６０３頁；Py, B.ら（１９９６年）、「A DEAD-box RNA helicase inthe Escherichia coli RNA degradosome」、Nature、３８１巻：１６９〜１７２頁）。
【０１０２】
Ｒｈｏ  Ｉ酵素（Ｒｈｏ因子）は、ｍＲＮＡ発現およびＲｈｏ依存性転写終結の別の重要な調節因子である。よって、一部の実施形態では、本開示は、Ｒｈｏ  Ｉを撹乱する方法を教示する。Ｒｈｏ依存性転写終結は、Ｅ．ｃｏｌｉの転写される遺伝子のすべてのうち約半分の調節を担う。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発見された他の終結因子には、ＴａｕおよびｎｕｓＡが含まれる（Sandy B. PrimroseおよびRichard Twyman（２００６年）、「Principles of Gene Manipulation and Genomics」、John Wiley & Sons ISBN 1-4051-3544-1を参照されたい）。Ｒｈｏは、六量体全体の周りに広がる単一のくぼみの周りに核酸を巻きつけることによって機能するＡＴＰ依存性六量体ヘリカーゼファミリーのメンバーである。ＲｈｏはＲＮＡに結合した後、エネルギー供給のためにそのＡＴＰａｓｅ活性を使用して、ＲＮＡ−ＤＮＡヘリックス領域に達するまでＲＮＡに沿って移動し、この領域でハイブリッド二本鎖構造を巻き戻し、転写終結をもたらす。
【０１０３】
一部の実施形態では、本開示は、ストレス条件下での遺伝子発現と関連付けられている（Oun,S.ら、「The CshA DEAD-box RNA helicase is important inquorum sensing control in Staphylococcus aureus.」、RNABiol.、２０１３年１０巻（１号）：１５７〜１６５頁；Hunger, K.ら、「Cold-Induced Putative DEAD Box RNA Helicases CshA and CshB AreEssential for Cold Adaptation and Interact with Cold Shock Protein B inBacillus subtilis」、J Bacteriol.、２００６年１８８巻（１号）：２４０〜２４８頁）ＣｓｈＡといった他のＤＥＡＤボックスヘリカーゼの使用も教示する。
【０１０４】
ＲＮＡ定常状態に対する調節効果を有する他のヘリカーゼも、本開示の範囲内である。例えば、本開示は、ｒｈｌＥ遺伝子の撹乱を教示する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＲｈｌＥ  ＲＮＡヘリカーゼは、リボソームアセンブリー中に関連するＲＮＡヘリカーゼの機能を調節する（Jain, C.、「The E.coli RhlE RNA helicaseregulates the function of related RNA helicases during ribosome assembly」、RNA.、２００８年１４巻（２号）３８１〜３８９頁）。
【０１０５】
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分解酵素は、選択されたタンパク質シャペロン遺伝子を含む。例えば、一部の実施形態では、本開示は、ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＬ２遺伝子を教示する。ＧｒｏＥＬは、熱ショックタンパク質のｈｓｐ６０ファミリーのメンバーである。ＧｒｏＥＬは、各単量体サブユニットがおよそ５７ｋＤの分子量を有する十四量体である。ＧｒｏＥＬは、いくつかのタンパク質の折り畳みを次の２つの機構によって促進する。（１）ＧｒｏＥＬは、部分的に折り畳まれたタンパク質に結合し（Goloubinoff Pら（１９８９年）、Nature、３４２巻：８８４〜８８９頁；Zahn RおよびPluickthun A（１９９２年）、Biochemistry、２１巻：３２４９〜３２５５頁）、次いでこのタンパク質がＧｒｏＥＬ上で再度折り畳まれて天然様状態になることにより凝集を防止する（Zahn RおよびPlueckthun A（１９９２年）、Biochemistry、２１巻：３２４９〜３２５５頁；Gray T EおよびFersht A R（１９９３年）、J Mol Biol L：１１９７〜１２０７頁）。また（２）ＧｒｏＥＬは、誤って折り畳まれたタンパク質を再折り畳みが再び開始できる状態までほどくことにより、これらを連続的にアニールする（Zahn Rら（１９９６年）、Science、２７１巻：６４２〜６４５頁）。アピカルドメインにおけるいくつかの変異によりポリペプチド結合の減少がもたらされ（Fenton W Aら（１９９４年）、Nature、３７１巻：６１４〜６１９頁）、このドメインがポリペプチドの結合に関与していることが示唆された。
【０１０６】
他の実施形態では、本開示は、ＤｎａＫの撹乱を教示する。ＤｎａＫは、シャペロンタンパク質ＤｎａＫならびにＤｎａＪおよびＧｒｐＥなどの様々なコシャペロンタンパク質を含む多タンパク質細菌シャペロン系における中心タンパク質であることが実証されている。コシャペロンタンパク質は、自然および不自然の両方の基質の効率的な生理学的プロセシングに必須である。このシャペロン系の役割の１つは、熱ショック応答におけるこの系の役割から明らかであるように、細菌の折り畳まれていないタンパク質あるいは誤って折り畳まれたタンパク質の再折り畳みを触媒することである。ＤｎａＫシャペロン系のさらなる役割は、特定のＲＮＡポリメラーゼサブユニットのプロセシングによる遺伝子発現の調節である。
【０１０７】
一部の実施形態では、遺伝子発現に関与する他の遺伝子が本開示の範囲内である。例えば、一部の実施形態では、本開示は、ｇｐｓＩを教示する。ＧｐｓＩは、グアノシン五リン酸合成およびポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼに関与する推定上の多機能酵素である。Ｅ．ｃｏｌｉポリヌクレオチドホスホリラーゼ、すなわち精製されたＧＰＳＩは、ＡＤＰの重合およびポリ（Ａ）の加リン酸分解を触媒することが示された（Jones, G.およびBibb, M.、「Guanosine Pentaphosphate Synthetase from Streptomyces antibioticusIs Also a Polynucleotide Phosphorylase」、J. of Bact.、１９９６年７月、４２８１〜４２８８頁）。
【０１０８】
他の実施形態では、本開示は、エノラーゼ（ｅｎｏ）を教示する。ホスホピルビン酸ヒドラターゼとしても公知のエノラーゼは、解糖の９番目かつ最後から２番目のステップである、２−ホスホグリセリン酸（２−ＰＧ）からホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）への変換の触媒を担う金属結合酵素である。（例えば、米国特許第７，１１８，９０４号を参照されたい）。
【０１０９】
一部の実施形態では、本発明は、１種または複数種のＲＮＡ分解遺伝子を撹乱することにより宿主細胞の遺伝子発現をモジュレートすることを教示する。当業者は、本開示のＲＮＡ分解遺伝子撹乱が、一部の実施形態では、特定の細胞表現型を最適化する目的で、ＲＮＡデグラドソームのメンバーであるタンパク質の改変のための任意の方法を含み得ることを認識する。一部の実施形態では、ＲＮＡ分解遺伝子の撹乱は、遺伝子配列自体の指向遺伝子変異またはランダム遺伝子変異を含み得る。他の実施形態では、ＲＮＡ分解遺伝子の撹乱は、変異した内在性または外因性のプロモーターを用いて発現をモジュレートすることを含み得る。
【０１１０】
本開示のＲＮＡ分解遺伝子の非網羅的なリストを以下の表１に提供する。
【表１】
2019519243.tif 000003
【０１１１】
一部の実施形態では、本発明のＲＮＡ分解遺伝子は、表１の遺伝子（ｃＤＮＡまたはタンパク質のいずれか）と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、または７５％の配列同一性を呈する。
プロモーター
【０１１２】
一部の実施形態では、本開示は、最適な発現性質を有するプロモーターを選択して、ＲＮＡ分解機能をモジュレートし、全体的な宿主株生産性に対して有益な効果を生じさせる方法を教示する。
【０１１３】
プロモーターは、遺伝子が転写される速度を調節し、様々なやり方で転写に影響を与えることができる。例えば、一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度（例えば、以下に論じられるプロモーターラダー）、または優れた調節性質（すなわち、選択された遺伝子のより厳格な調節制御）を呈する、宿主細胞内の１つもしくは複数のプロモーターを同定し、かつ／または１つもしくは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を教示する。
【０１１４】
構成的プロモーターは、例えば、内部または外部の細胞条件にかかわらず、定速でこれらの関連する遺伝子の転写を指示し、一方、調節可能プロモーターは、内部および／または外部の細胞条件、例えば、成長速度、温度、具体的な環境化学物質に対する応答などに応じて遺伝子が転写される速度を増減する。プロモーターは、これらの正常な細胞コンテクストから単離することができ、操作されて、実質的に任意の遺伝子の発現を調節することができ、細胞成長、産物収率、および／または目的の他の表現型の有効な改変を可能にする。
【０１１５】
一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度（例えば、以下に論じられるプロモーターラダー）、または優れた調節性質（すなわち、選択された遺伝子のより厳格な調節制御、または特定の条件に対する応答性）を呈する、宿主細胞内の１つもしくは複数のプロモーターを同定し、かつ／または１つもしくは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を教示する。これらの同定および／または生成されたプロモーターの特定の組合せは、以下でより詳細に説明されるＲＮＡ分解撹乱実験において使用するためのプロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０１１６】
一部の実施形態では、プロモーターラダーは、目的の標的遺伝子と関連がある、一連の発現強度を有する自然、天然、または野生型プロモーターを同定することによって作製される。これらの同定されたプロモーターは、プロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０１１７】
一部の実施形態では、プロモーターラダーは、目的の標的遺伝子と関連がある自然、天然、または野生型プロモーターを同定し、次いで、前記プロモーターを変異させて、複数の変異プロモーター配列を誘導することによって作製される。これらの変異プロモーターのそれぞれは、標的遺伝子の発現に対する効果について試験される。一部の実施形態では、編集されたプロモーターは、様々な条件にわたって発現活性について試験され、その結果、各プロモーターバリアントの活性がデータベース内に記録され／特徴付けられ／アノテートされ、かつ記憶される。結果として生じる編集されたプロモーターバリアントは、引き続いて組織化されて、これらの発現の強度に基づいて配列されたプロモーターラダーにされる（例えば、頂部付近に高度発現バリアントおよび底部付近に減弱された発現を有し、したがって、用語「ラダー」をもたらす）。
【０１１８】
一部の実施形態では、本開示は、同定された自然に存在するプロモーターおよび変異されたバリアントプロモーターの組合せであるプロモーターラダーを教示する。
【０１１９】
一部の実施形態では、本開示は、以下の判定基準：１）構成的プロモーターのラダーを表した；および２）短いＤＮＡ配列、理想的には１００塩基対未満によってコードされ得る、の両方を満たした自然、天然、または野生型プロモーターを同定する方法を教示する。一部の実施形態では、本開示の構成的プロモーターは、２つの選択された成長条件（典型的には、工業的な培養中に経験した条件の間で比較した）にわたって一定の遺伝子発現を呈する。一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、約６０塩基対のコアプロモーターおよび長さが２６から４０塩基対の間の５’ＵＴＲからなる。
【０１２０】
一部の実施形態では、上記の同定した自然に存在するプロモーター配列の１つまたは複数が、遺伝子編集のために選択される。一部の実施形態では、自然のプロモーターは、任意の公知の遺伝子変異方法を介して編集される。他の実施形態では、本開示のプロモーターは、所望の配列を有する新しいプロモーターバリアントを合成することによって編集される。
【０１２１】
２０１５年１２月７日に出願された米国特許出願第６２／２６４，２３２号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１００３７６号の開示全体はそれぞれ、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１２２】
本開示のプロモーターの非網羅的なリストを以下の表２に提供する。
【表２】
2019519243.tif 000004
【０１２３】
一部の実施形態では、本発明のプロモーターは、表２のプロモーター配列と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、または７５％の配列同一性を呈する。
ＲＮＡ分解遺伝子発現の撹乱
【０１２４】
一部の実施形態では、本開示は、ＲＮＡデグラドソーム遺伝子を本発明のプロモーターに作動可能に連結することにより１種または複数種のＲＮＡデグラドソーム遺伝子の発現を最適化することを教示する。よって、プロモーターＰ１〜Ｐ８（一連の発現強度を呈するように同定および／または生成された８つのプロモーターを表す）を有し、プロモーターラダーを微生物中の単一のＲＮＡ分解遺伝子と関連させる（すなわち、ＲＮＡ分解遺伝子の天然または外因性のコード領域に作動可能に連結した所与のプロモーターで微生物を遺伝的に操作する）場合、８つのプロモーターのそれぞれの効果を、操作された微生物が標的遺伝子と関連した特定のプロモーターを除いてその他は同一の遺伝的バックグラウンドを有することを考慮して、８つの操作された株のそれぞれを特徴付けることによって確認することができる。
【０１２５】
生物内の遺伝子の定常状態レベルをモジュレートすることは、生物挙動を生じさせるための重要な制御点である。細胞は、数千の異なるタイプのタンパク質を発現し、これらのタンパク質は、多数の複雑なやり方で相互作用して機能を作製する。選択されたＲＮＡデグラドソーム遺伝子の定常状態レベルを変更することにより、本発明は、宿主性能の改善を達成する。ＲＮＡデグラドソームに対する一部の変更は、性能を増大させることができ、したがって、性能を評定するための機構と連関して、この技法は、機能が改善された生物の生成を可能にする。
【０１２６】
よって、特定の実施形態では、ＲＮＡ分解遺伝子撹乱は、ｉ）プロモーターラダーから（例えば、本開示の表２に列挙されたプロモーターまたはこれらのバリアントから）プロモーターを選択するステップと、ｉｉ）標的とするＲＮＡデグラドソーム遺伝子を（例えば、本開示の表１に列挙された遺伝子またはこれらのバリアントから）選択するステップと、ｉｉｉ）選択された宿主生物のゲノム内の選択された遺伝子に選択されたプロモーターを作動可能に連結するステップとを含む、多段階ステップのプロセスである。一部の実施形態では、選択されたプロモーターを選択された遺伝子に作動可能に連結するステップは、次のように行われる。選択されたＲＮＡデグラドソーム遺伝子の前に天然プロモーターが存在し、その配列が公知の場合、天然プロモーターを選択されたプロモーターで置き換える。天然プロモーターが存在せず、またはその配列が未知であるとき、選択されたプロモーターをＲＮＡデグラドソーム遺伝子の前に挿入する。
【０１２７】
一部の実施形態では、本開示は、作動可能に連結したプロモーターの、選択されたＲＮＡ分解遺伝子との特定の組合せを、プロモーターおよび遺伝子の配列または名称を「：：」で分けて記述することによって参照する。よって、本開示で使用される記号「：：」は、「作動可能に連結した」の代わりに使用されている。よって、配列番号１：：配列番号２２の記述は、配列番号２２のＲＮＡ分解遺伝子に作動可能に連結した配列番号１からのプロモーターを指す。同様に、Ｐ１：：Ｇ１０は、表１に開示されるｍｕｔＭ２  ＲＮＡ分解配列に作動可能に連結した、表２のプロモーター１を指す。本明細書の一部分では、記号「−」が「：：」と互換的に使用されている。
【０１２８】
一部の実施形態では、本開示は、作動可能に連結したプロモーターおよびＲＮＡ分解遺伝子を含む遺伝子操作された宿主生物を検証する方法であって、最適化されている性能を示す１つまたは複数の測定基準に対して、操作された宿主を、作動可能に連結したプロモーターを欠く遺伝的に同一の宿主と比較することによる、方法も教示する。
【０１２９】
一部の実施形態では、本開示は、選択されたＲＮＡデグラドソーム遺伝子に作動可能に連結した選択されたプロモーターの特定の組合せを教示する。本開示が企図するプロモーター：：遺伝子の組合せの非網羅的なリストを、以下の表３に要約する。スペースが限られていることを考慮して、これらの組合せは、本明細書の前出部分において定義したプロモーターおよび遺伝子の省略名によって表されている。
【表３】
2019519243.tif 000005
開始コドンの最適化
【０１３０】
一部の実施形態では、本開示は、開始および停止コドンバリアントをスワップする方法を教示する。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物の典型的な停止コドンは、それぞれＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物の典型的な停止コドンは、ＵＧＡであり、一方、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは一般に、停止コドンとしてＵＡＡを使用する（Dalphinら（１９９６年）、Nucl. Acids Res.、２４巻：２１６〜２１８頁）。
【０１３１】
他の実施形態では、本発明は、ＡＴＧ開始コドンをＴＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＡＴＧ開始コドンをＧＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＧＴＧ開始コドンをＡＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＧＴＧ開始コドンをＴＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＴＴＧ開始コドンをＡＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本発明は、ＴＴＧ開始コドンをＧＴＧで置き換えることを教示する。
遺伝子設計に受け入れられる生物
【０１３２】
開示されるゲノム操作法は、工業用微生物細胞培養で例示されるが、任意の生物に適用可能である。
【０１３３】
よって、本明細書で使用される場合、用語「微生物」は、広く解釈されるべきである。これは、これらに限定されないが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌および原生生物を含む。しかし、ある特定の態様では、「高等」真核生物、例えば、昆虫、植物、および動物を本明細書に教示の方法において利用することができる。
【０１３４】
適当な宿主細胞としては、これらに限定されないが、細菌細胞、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。一例示的な実施形態では、適当な宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  ｉｎ  Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．から入手可能なＳＨｕｆｆｌｅ（商標）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ）が含まれる。
【０１３５】
一例示的な実施形態では、適当な宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉが含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ種の適当な宿主株は、腸内毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管組織侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）、ベロ毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１０４：Ｈ４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１０４：Ｈ２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＣ１０１を含む。一部の実施形態では、本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｃのゲノム操作を教示する。
【０１３６】
一部の実施形態では、本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉ株、ＮＣＴＣ  １２７５７、ＮＣＴＣ  １２７７９、ＮＣＴＣ  １２７９０、ＮＣＴＣ  １２７９６、ＮＣＴＣ  １２８１１、ＡＴＣＣ  １１２２９、ＡＴＣＣ  ２５９２２、ＡＴＣＣ  ８７３９、ＤＳＭ  ３００８３、ＢＣ  ５８４９、ＢＣ  ８２６５、ＢＣ  ８２６７、ＢＣ  ８２６８、ＢＣ  ８２７０、ＢＣ  ８２７１、ＢＣ  ８２７２、ＢＣ  ８２７３、ＢＣ  ８２７６、ＢＣ  ８２７７、ＢＣ  ８２７８、ＢＣ  ８２７９、ＢＣ  ８３１２、ＢＣ  ８３１７、ＢＣ  ８３１９、ＢＣ  ８３２０、ＢＣ  ８３２１、ＢＣ  ８３２２、ＢＣ  ８３２６、ＢＣ  ８３２７、ＢＣ  ８３３１、ＢＣ  ８３３５、ＢＣ  ８３３８、ＢＣ  ８３４１、ＢＣ  ８３４４、ＢＣ  ８３４５、ＢＣ  ８３４６、ＢＣ  ８３４７、ＢＣ  ８３４８、ＢＣ  ８８６３、およびＢＣ  ８８６４のゲノム操作を教示する。
【０１３７】
一部の実施形態では、本開示は、ベロ細胞毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＶＴＥＣ）、例えば、ＢＣ４７３４（Ｏ２６：Ｈ１１）、ＢＣ４７３５（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ４７３６、ＢＣ４７３７（ｎ．ｄ．）、ＢＣ  ４７３８（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ４９４５（Ｏ２６：Ｈ−）、ＢＣ  ４９４６（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ４９４７（Ｏ１１１：Ｈ−）、ＢＣ  ４９４８（Ｏ１５７：Ｈ）、ＢＣ  ４９４９（Ｏ５）、ＢＣ  ５５７９（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ５５８０（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ５５８２（Ｏ３：Ｈ）、ＢＣ  ５６４３（Ｏ２：Ｈ５）、ＢＣ  ５６４４（Ｏ１２８）、ＢＣ  ５６４５（Ｏ５５：Ｈ−）、ＢＣ  ５６４６（Ｏ６９：Ｈ−）、ＢＣ  ５６４７（Ｏ１０１：Ｈ９）、ＢＣ  ５６４８（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ５８５０（Ｏ２２：Ｈ８）、ＢＣ  ５８５１（Ｏ５５：Ｈ−）、ＢＣ  ５８５２（Ｏ４８：Ｈ２１）、ＢＣ  ５８５３（Ｏ２６：Ｈ１１）、ＢＣ  ５８５４（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ５８５５（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ５８５６（Ｏ２６：Ｈ−）、ＢＣ  ５８５７（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ５８５８（Ｏ２６：Ｈ１１）、ＢＣ７８３２、ＢＣ７８３３（Ｏ原型：Ｈ−）、ＢＣ７８３４（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ７８３５（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ７８３６（Ｏ５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８３７（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８３８、ＢＣ  ７８３９（Ｏ１２８：Ｈ２）、ＢＣ  ７８４０（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４１（Ｏ２３：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４２（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４３、ＢＣ  ７８４４（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４５（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ７８４６（Ｏ２６：Ｈ１１）、ＢＣ  ７８４７（Ｏ１４５：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４８（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４９（Ｏ１５６：Ｈ４７）、ＢＣ  ７８５０、ＢＣ  ７８５１（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８５２（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８５３（Ｏ５：Ｈ−）、ＢＣ  ７８５４（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ７８５５（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ７８５６（Ｏ２６：Ｈ−）、ＢＣ  ７８５７、ＢＣ  ７８５８、ＢＣ  ７８５９（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８６０（Ｏ１２９：Ｈ−）、ＢＣ  ７８６１、ＢＣ  ７８６２（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ７８６３、ＢＣ７８６４（Ｏ原型：Ｈ−）、ＢＣ７８６５、ＢＣ７８６６（Ｏ２６：Ｈ−）、ＢＣ７８６７（Ｏ原型：Ｈ−）、ＢＣ７８６８、ＢＣ７８６９（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ７８７０（Ｏ１１３：Ｈ−）、ＢＣ７８７１（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ７８７２（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ７８７３、ＢＣ７８７４（Ｏ原型：Ｈ−）、ＢＣ７８７５（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ７８７６（Ｏ１１１：Ｈ−）、ＢＣ７８７７（Ｏ１４６：Ｈ２１）、ＢＣ７８７８（Ｏ１４５：Ｈ−）、ＢＣ７８７９（Ｏ２２：Ｈ８）、ＢＣ７８８０（Ｏ原型：Ｈ−）、ＢＣ７８８１（Ｏ１４５：Ｈ−）、ＢＣ８２７５（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ８３１８（Ｏ５５：Ｋ−：Ｈ−）、ＢＣ８３２５（Ｏ１５７：Ｈ７）、およびＢＣ８３３２（ＯＮＴ）、ＢＣ８３３３の各株を教示する。
【０１３８】
一部の実施形態では、本開示は、腸管組織侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、例えば、ＢＣ８２４６（Ｏ１５２：Ｋ−：Ｈ−）、ＢＣ８２４７（Ｏ１２４：Ｋ（７２）：Ｈ３）、ＢＣ８２４８（Ｏ１２４）、ＢＣ８２４９（Ｏ１１２）、ＢＣ８２５０（Ｏ１３６：Ｋ（７８）：Ｈ−）、ＢＣ８２５１（Ｏ１２４：Ｈ−）、ＢＣ８２５２（Ｏ１４４：Ｋ−：Ｈ−）、ＢＣ８２５３（Ｏ１４３：Ｋ：Ｈ−）、ＢＣ８２５４（Ｏ１４３）、ＢＣ８２５５（Ｏ１１２）、ＢＣ８２５６（Ｏ２８ａ．ｅ）、ＢＣ８２５７（Ｏ１２４：Ｈ−）、ＢＣ８２５８（Ｏ１４３）、ＢＣ８２５９（Ｏ１６７：Ｋ−：Ｈ５）、ＢＣ８２６０（Ｏ１２８ａ．ｃ．：Ｈ３５）、ＢＣ８２６１（Ｏ１６４）、ＢＣ８２６２（Ｏ１６４：Ｋ−：Ｈ−）、ＢＣ８２６３（Ｏ１６４）、およびＢＣ８２６４（Ｏ１２４）の各株を教示する。
【０１３９】
一部の実施形態では、本開示は、腸内毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、例えば、ＢＣ  ５５８１（Ｏ７８：Ｈ１１）、ＢＣ  ５５８３（Ｏ２：Ｋ１）、ＢＣ  ８２２１（Ｏ１１８）、ＢＣ  ８２２２（Ｏ１４８：Ｈ−）、ＢＣ  ８２２３（Ｏ１１１）、ＢＣ  ８２２４（Ｏ１１０：Ｈ−）、ＢＣ  ８２２５（Ｏ１４８）、ＢＣ  ８２２６（Ｏ１１８）、ＢＣ  ８２２７（Ｏ２５：Ｈ４２）、ＢＣ  ８２２９（Ｏ６）、ＢＣ  ８２３１（Ｏ１５３：Ｈ４５）、ＢＣ  ８２３２（Ｏ９）、ＢＣ  ８２３３（Ｏ１４８）、ＢＣ  ８２３４（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８２３５（Ｏ１１８）、ＢＣ  ８２３７（Ｏ１１１）、ＢＣ  ８２３８（Ｏ１１０：Ｈ１７）、ＢＣ  ８２４０（Ｏ１４８）、ＢＣ  ８２４１（Ｏ６Ｈ１６）、ＢＣ  ８２４３（Ｏ１５３）、ＢＣ  ８２４４（Ｏ１５：Ｈ−）、ＢＣ  ８２４５（Ｏ２０）、ＢＣ  ８２６９（Ｏ１２５ａ．ｃ：Ｈ−）、ＢＣ  ８３１３（Ｏ６：Ｈ６）、ＢＣ  ８３１５（Ｏ１５３：Ｈ−）、ＢＣ  ８３２９、ＢＣ  ８３３４（Ｏ１１８：Ｈ１２）、およびＢＣ  ８３３９の各株を教示する。
【０１４０】
一部の実施形態では、本開示は、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、例えば、ＢＣ  ７５６７（Ｏ８６）、ＢＣ  ７５６８（Ｏ１２８）、ＢＣ  ７５７１（Ｏ１１４）、ＢＣ  ７５７２（Ｏ１１９）、ＢＣ  ７５７３（Ｏ１２５）、ＢＣ  ７５７４（Ｏ１２４）、ＢＣ  ７５７６（Ｏ１２７ａ）、ＢＣ  ７５７７（Ｏ１２６）、ＢＣ  ７５７８（Ｏ１４２）、ＢＣ  ７５７９（Ｏ２６）、ＢＣ  ７５８０（ＯＫ２６）、ＢＣ  ７５８１（Ｏ１４２）、ＢＣ  ７５８２（Ｏ５５）、ＢＣ  ７５８３（Ｏ１５８）、ＢＣ  ７５８４（Ｏ−）、ＢＣ  ７５８５（Ｏ−）、ＢＣ  ７５８６（Ｏ−）、ＢＣ  ８３３０、ＢＣ  ８５５０（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５５１（Ｏ５５）、ＢＣ  ８５５２（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５５３（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５５４（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５５５（Ｏ８６）、ＢＣ  ８５５６（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５５７（ＯＫ２６）、ＢＣ  ８５５８（Ｏ５５）、ＢＣ  ８５６０（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６１（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６２（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５６３（Ｏ８６）、ＢＣ  ８５６４（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５６５（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６７（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６８（Ｏ１１１）、ＢＣ  ８５６９（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５７０（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５７１（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５７２（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５７３（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７４（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７５（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７７（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７８（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５８１（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５８３（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５８４（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５８５（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５８６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５８８（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５８９（Ｏ８６）、ＢＣ  ８５９０（Ｏ１２７）、ＢＣ  ８５９１（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５９２（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５９３（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５９４（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５９５（Ｏ１２５）、ＢＣ  ８５９６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５９７（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５９８（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５９９（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６０５（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６０６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６０７（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６０８（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８６０９（Ｏ５５）、ＢＣ  ８６１０（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８６１５（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６１６（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８６１７（Ｏ２６）、ＢＣ  ８６１８（Ｏ８６）、ＢＣ  ８６１９、ＢＣ  ８６２０、ＢＣ  ８６２１、ＢＣ  ８６２２、ＢＣ  ８６２３、ＢＣ  ８６２４（Ｏ１５８）、およびＢＣ  ８６２５（Ｏ１５８）の各株を教示する。
【０１４１】
本開示の他の適当な宿主生物としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物が挙げられる。一部の実施形態では、好適なＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株／種としては、寄託基準株がＤＳＭ４４５４９であるＣ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、寄託基準株がＡＴＣＣ１３０３２であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、および寄託基準株がＡＴＣＣ６８７１であるＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓが挙げられる。一部の実施形態では、本開示の好適な宿主は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【０１４２】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の、特に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種の適当な宿主株は、特に、公知の野生型株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ  ＡＴＣＣ１４０２０；ならびにこれらから調製されるＬ−アミノ酸産生変異体または株、例えば、Ｌ−リシン産生株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７１２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６３、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＭ５８−１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＧ５２−５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ５７１４、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ１２８６６などである。
【０１４３】
用語「Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ」も、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍについて使用されている。Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ種のいくつかの代表は、例えば、株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９など、先行技術においてＣ．ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓとも呼ばれている。
【０１４４】
他の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。適当な原核細胞としては、グラム陽性、グラム陰性、およびグラム可変性細菌細胞が挙げられる。宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓの種であり得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。一部の実施形態では、細菌宿主株は、工業用株である。多数の細菌工業用株が公知であり、本明細書に記載の方法および組成物において適している。
【０１４５】
一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｒｕｂｉ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｒｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のものである。特定の実施形態では、宿主細胞は、これらに限定されないが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含めた工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｅ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。一���の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｚ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などである。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、真核細胞である。適当な真核宿主細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、動物細胞、および植物細胞が挙げられる。適当な真菌宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられる。ある特定の好適な真菌宿主細胞には、酵母細胞および糸状菌細胞が含まれる。適当な糸状菌宿主細胞としては、例えば、ＥｕｍｙｃｏｔｉｎａおよびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門の任意のフィラメント形が挙げられる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Hawksworthら、In Ainsworth and Bisby'sDictionary of The Fungi、８版、１９９５年、CAB International、University Press、Cambridge、UKを参照）。糸状菌は、キチン、セルロース、および他の複合多糖から構成される細胞壁を有する栄養菌糸体によって特徴付けられる。糸状菌宿主細胞は、酵母と形態学的に別個のものである。
【０１４６】
ある特定の例示的であるが限定されない実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフおよび同義語もしくは分類学的均等物の種の細胞であり得る。
【０１４７】
適当な酵母宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａが挙げられる。一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、藻類細胞、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．Ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）である。
【０１４９】
一部の実施形態では、本開示の方法は、多細胞生物にも適用可能である。例えば、プラットフォームは、作物の性能を改善するのに使用することができる。生物体は、複数の植物、例えば、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ、Ｆｅｔｕｃｏｉｄｅａｅ、Ｐｏａｃｏｉｄｅａｅ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｓｏｒｇｕｍ、Ｓｅｔａｒｉａ、Ｚｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ａｖｅｎａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｐｏａ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｃｏｉｘ、Ｏｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｅａｅ、Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ、またはＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅを含み得る。例えば、植物は、トウモロコシ、イネ、ダイズ、綿、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、エンドウマメ、マメ、レンズマメ、ピーナッツ、ヤムビーン、ササゲ、ハッショウマメ、クローバー、アルファルファ、ルピナス、カラスノエンドウ、ハス、スイートクローバー、フジ、スイートピー、モロコシ、キビ、ヒマワリ、キャノーラなどであり得る。同様に、生物体は、複数の動物、例えば、非ヒト哺乳動物、魚、昆虫などを含み得る。
【０１５０】
本開示は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト（２９３、ＷＩ３８、ＰＥＲ．Ｃ６、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞を含む）、マウス（３Ｔ３、ＮＳ０、ＮＳ１、Ｓｐ２／０を含む）、ハムスター（ＣＨＯ、ＢＨＫ）、サル（ＣＯＳ、ＦＲｈＬ、Ｖｅｒｏ）、およびハイブリドーマ細胞株を含めて、様々な動物細胞型での使用にも適している。
【０１５１】
様々な実施形態では、本開示の実践において使用され得る株は、いくつかの培養細胞保存機関（culture collection）、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）から一般人に容易にアクセス可能である。
特注プラスミドのアセンブリング／クローニング
【０１５２】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物のゲノム内に所望の標的ＤＮＡ切片（例えば、特定のプロモーター、またはプロモーター：：遺伝子の組合せを含有する）を挿入することができるベクターを構築するための方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ、ホモロジーアーム、および少なくとも１つの選択マーカーを含むベクターをクローニングする方法を教示する（図１を参照）。
【０１５３】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物内への形質転換に適した任意のベクターに適合する。一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞に適合するシャトルベクターの使用を教示する。一実施形態では、本明細書に提供される方法において使用するためのシャトルベクターは、少なくとも２つの異なる種で増殖可能な（例えば、初期クローニング／増幅のためのＥ．ｃｏｌｉおよび組込みのためのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍに適合する）シャトルベクターである。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法において使用するためのベクターは、本明細書に記載の選択および／または対抗選択のためのマーカーを含み得る。マーカーは、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意のマーカーであり得る。シャトルベクターは、任意の調節配列（複数可）および／または当技術分野で公知の前記シャトルベクターのアセンブリーにおいて有用な配列をさらに含み得る。シャトルベクターは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなど本明細書に提供される宿主細胞内での増殖に必要とされ得る任意の複製起点をさらに含むことができる。一部の実施形態では、本開示のベクターは、少なくとも１つの調節配列を含む。一部の実施形態では、調節配列は、当技術分野で公知の、または本明細書に提供される任意の調節配列、例えば、宿主細胞の遺伝機構によって使用される、プロモーター配列、開始配列、停止配列、シグナル配列、分泌配列、および／または終結配列などであり得る。ある特定の事例では、標的ＤＮＡは、任意のリポジトリまたはカタログ製品から入手可能なベクター、コンストラクト、またはプラスミド、例えば、市販のベクター（例えば、ＤＮＡ２．０特注またはＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクターを参照）内に挿入することができる。
【０１５４】
一部の実施形態では、本開示のアセンブリー／クローニング方法は、以下のアセンブリーストラテジー：ｉ）ＩＩ型従来クローニング、ｉｉ）ＩＩ  Ｓ型媒介または「ゴールデンゲート」クローニング（例えば、Engler, C.、R. Kandzia、およびS. Marillonnet、２００８年、「A one pot, one step,precision cloning method with high-throughput capability」、PLos One、３巻：ｅ３６４７頁；Kotera, I.およびT. Nagai、２００８年、「A high-throughput andsingle-tube recombination of crude PCR products using a DNA polymeraseinhibitor and type IIS restriction enzyme」、J Biotechnol、１３７巻：１〜７頁；Weber, E.、R. Gruetzner、S. Werner、C. Engler、およびS. Marillonnet、２０１１年、Assembly of DesignerTAL Effectors by Golden Gate Cloning、PloS One、６巻：ｅ１９７２２頁を参照）、ｉｉｉ）ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え、ｉｖ）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング、エキソヌクレアーゼ媒介アセンブリー（Aslanidisおよびde Jong、１９９０年、「Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR)」、Nucleic Acids Research、１８巻、２０号、６０６９頁）、ｖ）相同組換え、ｖｉ）非相同末端接合、またはこれらの組合せの少なくとも１つを使用することができる。モジュラーＩＩＳ型ベースアセンブリーストラテジーは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１５４１４７に開示されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５５】
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの選択マーカーを有するベクターをクローニングすることを教示する。選択圧下で原核細胞（例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（chloramphenycol）、ゼオシン、スペクチノマイシン／ストレプトマイシンに対する）、または真核細胞（例えば、ジェネテシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン）における選択のための抗生物質耐性機能をコードすることが多い様々な選択マーカー遺伝子が当技術分野で公知である。他のマーカーシステム、例えば、成功裡に形質導入された宿主細胞内で発現されるＸ−ｇａｌまたは緑色もしくは赤色蛍光タンパク質などの蛍光レポーターの存在下で陽性クローンを選択するのに細菌において使用される周知のブルー／ホワイトスクリーニングシステムは、望まれるまたは望まれない細胞のスクリーニングおよび同定を可能にする。そのほとんどが原核生物系内でのみ機能的である選択マーカーの別のクラスは、産生細胞を殺滅する毒性遺伝子産物を発現する、「デス遺伝子（death gene）」とも呼ばれることが多い対抗選択可能マーカー遺伝子に関する。このような遺伝子の例としては、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｇａｔａ−１、またはｃｃｄＢが挙げられ、その機能は、（Reyratら、１９９８年、「Counterselectable Markers:Untapped Tools for Bacterial Genetics and Pathogenesis」、Infect Immun.、６６巻（９号）：４０１１〜４０１７頁）に記載されている。
宿主細胞の形質転換
【０１５６】
一部の実施形態では、本開示のベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはＴｉ媒介遺伝子移入を含めた様々な技法のいずれかを使用して宿主細胞内に導入することができる。特定の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔が挙げられる（Davis, L.、Dibner, M.、Battey, I.、１９８６年、「Basic Methods in MolecularBiology」）。形質転換の他の方法としては、例えば、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔が挙げられる。例えば、Gietzら、Nucleic Acids Res.、２７巻：６９〜７４頁（１９９２年）；Itoら、J. Bacterol.、１５３巻：１６３〜１６８頁（１９８３年）；ならびにBeckerおよびGuarente、Methodsin Enzymology、１９４巻：１８２〜１８７頁（１９９１年）を参照。一部の実施形態では、形質転換宿主細胞は、組換え宿主株と呼ばれる。
【０１５７】
一部の実施形態では、本開示の挿入ＤＮＡは、シングルクロスオーバー組換えまたはダブルクロスオーバー組換えによって標的ゲノムＤＮＡ領域内に組み込まれる（Nakashimaら、２０１４年、「Bacterial CellularEngineering by Genome Editing and Gene Silencing」、Int.J. Mol Sci.、１５巻（２号）、２７７３〜２７９３頁を参照）。
【０１５８】
一部の実施形態では、本開示は、上記した１種または複数種の選択マーカーを有する形質転換細胞をスクリーニングすることを教示する。このような一実施形態では、カナマイシン耐性マーカー（ＫａｎＲ）を含むベクターで形質転換された細胞を、有効量のカナマイシン抗生物質を含有する培地上に蒔く。カナマイシンが入った培地上で目に見えるコロニー形成単位は、ベクターカセットをこれらのゲノム内に組み込んだと推定される。所望の配列の挿入は、ＰＣＲ、制限酵素分析、および／または関連した挿入部位のシーケンシングを介して確認することができる。
選択された配列のループアウト
【０１５９】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物からＤＮＡの選択された領域をループアウトする方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、陽性形質転換体から選択マーカーをループアウトすることを教示する。ループアウト欠失技法は、当技術分野で公知であり、（Tearら、２０１４年、「Excision of Unstable ArtificialGene-Specific inverted Repeats Mediates Scar-Free Gene Deletions in Escheriacoli.」、Appl. Biochem. Biotech.、１７５巻：１８５８〜１８６７頁）に記載されている。
【０１６０】
本明細書に提供される方法で使用されるループアウト法は、シングルクロスオーバー相同組換えまたはダブルクロスオーバー相同組換えを使用して実施することができる。一実施形態では、本明細書に記載の選択された領域のループアウトは、シングルクロスオーバー相同組換えを使用して行われる。
【０１６１】
第１に、ループアウトベクター（loop out vector）が、宿主生物のゲノム内の選択された標的領域内に挿入される（例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ、または他の遺伝子編集技法を介して）。挿入されるベクターは、既存のまたは導入される近傍の宿主配列のダイレクトリピート（a direct）である配列を用いて設計され、その結果、ダイレクトリピート（thedirect repeat）がルーピングおよび欠失を予定しているＤＮＡの領域に隣接する。挿入されると、ループアウトベクターを含有する細胞を、選択領域の欠失（例えば、選択遺伝子に対する耐性の欠如）について対抗選択することができる。このような一実施形態では、選択マーカーにダイレクトリピート配列が隣接しているループアウトベクターにＳＮＰが挿入される。ベクターの挿入は、その選択マーカーによって確認される。確認されたら、次いで、欠失を予定しているＤＮＡのループアウトについて選択することによって選択マーカーが除去される（図２参照）。
細胞培養および発酵
【０１６２】
本開示の細胞は、任意の所望の生合成反応または選択に適切に改変された慣例的な栄養培地中で培養することができる。一部の実施形態では、本開示は、プロモーターを活性化するための誘導培地中での培養を教示する。一部の実施形態では、本開示は、形質転換体（例えば、抗生物質）の選択剤、または阻害条件（例えば、高エタノール条件）下で増殖させるのに適した生物体の選択を含めた選択剤を含む培地を教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞増殖のために最適化された培地中の増殖細胞培養を教示する。他の実施形態では、本開示は、産物収率のために最適化された培地中の増殖細胞培養を教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞増殖を誘導することができ、最終産物産生に必要な前駆体（例えば、エタノール産生のための高レベルの糖）も含有する培地中の増殖培養を教示する。
【０１６３】
例えば、温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに使用するのに適したものであり、当業者に明らかである。述べたように、多くの参考文献が、細菌、植物、動物（哺乳動物を含む）、および古細菌起源の細胞を含めた多くの細胞の培養および産生に利用可能である。例えば、Sambrook、Ausubel（すべて上記）、ならびにBerger、Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques、Methods  in  Enzymology、１５２巻、Academic  Press,  Inc.、San  Diego、CA；ならびにFreshney（１９９４年）、Culture  of  Animal  Cells、a  Manual  of  Basic  Technique、３版、Wiley-Liss、New  York、およびそれに引用された参考文献；DoyleおよびGriffiths（１９９７年）、Mammalian  Cell  Culture:Essential  Techniques、John  Wiley  and  Sons、NY；Humason（１９７９年）、Animal  Tissue  Techniques、４版、W.H.  Freeman  and  Company；ならびにRicciardelleら、（１９８９年）、In  Vitro  Cell  Dev.  Biol.、２５巻：１０１６〜１０２４頁を参照。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。植物細胞培養および再生について、Payneら（１９９２年）、Plant  Cell  and  Tissue  Culture  in  Liquid  Systems、John  Wiley  &  Sons,  Inc.、New  York、N.Y.；GamborgおよびPhillips（編）（１９９５年）、Plant  Cell,  Tissue  and  Organ  Culture;  Fundamental  Methods  Springer  Lab  Manual、Springer-Verlag（Berlin  Heidelberg  N.Y.）；Jones編（１９８４年）、Plant  Gene  Transfer  and  Expression  Protocols、Humana  Press、Totowa、N.J．、ならびにPlant  Molecular  Biology（１９９３年）、R.  R.  D.  Croy編、Bios  Scientific  Publishers、Oxford、U.K.  ISBN  0  12  198370  6。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。一般に細胞培養培地は、AtlasおよびParks（編）、The  Handbook  of  Microbiological  Media（１９９３年）、CRC  Press、Boca  Raton、Fla.に示されており、これは、参照により本明細書に組み込まれている。細胞培養の追加の情報は、Sigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのLife  Science  Research  Cell  Culture  Catalogue（「Sigma-LSRCCC」）、および例えば、やはりSigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのThe  Plant  Culture  Catalogue  and  supplement（「Sigma-PCCS」）などの入手可能な市販の文献に見出され、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１６４】
使用される培養培地は、適当な様式で、それぞれの株の要求を満たさなければならない。様々な微生物の培養培地の記載は、American  Society  for  Bacteriologyの「Manual  of  Methods  for  General  Bacteriology」（Washington  D.C.、USA、１９８１年）に存在する。
【０１６５】
本開示は、目的の産物を発酵調製するためのプロセスであって、ａ）適当な培地中で本開示による微生物を培養し、発酵ブロスをもたらすステップと；ｂ）ａ）の発酵ブロス中、かつ／または微生物の細胞内で目的の産物を濃縮するステップとを含む、プロセスをさらに提供する。
【０１６６】
一部の実施形態では、本開示は、生成される微生物を、所望の有機−化学化合物を産生させる目的で、例えば、ＷＯ０５／０２１７７２に記載されているように連続的に、あるいはバッチプロセス（バッチ培養）またはフェドバッチもしくは繰り返しフェドバッチプロセスで不連続に培養することができることを教示する。公知の培養方法についての全般的な特質の概要は、Chmiel（Bioprozesstechnik.  1:  Einfuehrung  in  die  Bioverfahrenstechnik（Gustav  Fischer  Verlag、Stuttgart、１９９１年））による教科書、またはStorhas（Bioreaktoren  and  periphere  Einrichtungen（Vieweg  Verlag、Braunschweig/Wiesbaden、１９９４年））による教科書において入手可能である。
【０１６７】
一部の実施形態では、本開示の細胞は、バッチまたは連続発酵条件下で増殖される。
【０１６８】
古典的なバッチ発酵は、クローズドシステムであり、培地の組成は、発酵の開始時に設定され、発酵中に人為的な変更に供されない。バッチシステムの変形は、フェドバッチ発酵であり、これは、本開示においても使用を見出す。この変形では、基質は、発酵が進行するにつれて徐々に添加される。フェドバッチシステムは、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性がある、および培地中の基質の量が限定されていることが望ましい場合、有用である。バッチ発酵およびフェドバッチ発酵は、一般的であり、当技術分野で周知である。
【０１６９】
連続発酵は、所望のタンパク質を処理および回収するために、規定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、等量の馴化培地が同時に除去されるシステムである。一部の実施形態では、連続発酵は一般に、一定の高密度で培養物を維持し、この場合、細胞は、主に、対数期増殖にある。一部の実施形態では、連続発酵は一般に、静止または後期対数／静止期増殖で培養物を維持する。連続発酵システムは、定常状態増殖条件を維持しようと努める。
【０１７０】
連続発酵プロセスのための栄養分および成長因子をモジュレートするための方法、ならびに産物形成の速度を最大化するための技法は、工業微生物学の技術分野で周知である。
【０１７１】
例えば、本開示の培養のための炭素源の限定されないリストとしては、糖および炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、サトウダイコンまたはサトウキビ加工からのスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物、およびセルロースなど；油脂、例えば、ダイズ油、ヒマワリ油、落花生油、およびココナツ脂肪など；脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸など；アルコール、例えば、グリセロール、メタノール、およびエタノールなど；ならびに有機酸、例えば、酢酸または乳酸などが挙げられる。
【０１７２】
本開示の培養のための窒素源の限定されないリストとしては、有機窒素含有化合物、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、トウモロコシ浸出液、ダイズ粉、および尿素；または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、アンモニウムクロリド、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源は、個々に、または混合物として使用され得る。
【０１７３】
本開示の培養のための可能なリン源の限定されないリストとしては、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩が挙げられる。
【０１７４】
培養培地は、例えば、金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、および鉄などの塩化物または硫酸塩、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの形態で塩をさらに含み得、これらは、増殖に必要である。
【０１７５】
最後に、アミノ酸などの必須の成長因子、例えば、ホモセリンおよびビタミン、例えば、チアミン、ビオチン、またはパントテン酸を、上述した物質に加えて使用することができる。
【０１７６】
一部の実施形態では、培養物のｐＨは、これらに限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水を含めた任意の酸もしくは塩基または緩衝塩；あるいは適当な様式でのリン酸または硫酸などの酸性化合物によって制御することができる。一部の実施形態では、ｐＨは一般に、６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８の値に調整される。
【０１７７】
一部の実施形態では、本開示の培養物は、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を含み得る。一部の実施形態では、本開示の培養物は、例えば、抗生物質などの適当な選択物質を添加することによって、培養物のプラスミドを安定化するように改変される。
【０１７８】
一部の実施形態では、培養は、好気性条件下で実行される。これらの条件を維持するために、酸素または酸素含有気体混合物、例えば、空気などが、培養物に導入される。過酸化水素を富化させた液体を使用することが同様に可能である。発酵は、適切な場合、高圧で、例えば、０．０３〜０．２ＭＰａの高圧で実行される。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、特に好ましくは３０℃〜３７℃である。バッチプロセスまたはフェドバッチプロセスでは、培養は、好ましくは、回収されるのに十分な目的の所望の産物（例えば、有機−化学化合物）の量が形成されるまで継続される。この目的は通常、１０時間〜１６０時間以内に達成することができる。連続プロセスでは、より長い培養時間が可能である。微生物の活動により、発酵培地中で、かつ／または前記微生物の細胞内で目的の産物が濃縮（蓄積）される。
【０１７９】
一部の実施形態では、培養は、嫌気性条件下で実行される。
遺伝子操作された株の検証
【０１８０】
一部の実施形態では、本開示は、選択されたＲＮＡ分解遺伝子に作動可能に連結した選択されたプロモーターを含む遺伝子操作された株を検証する方法を教示する。一部の実施形態では、検証は、遺伝子操作された株を対照株と比較することを含む。一部の実施形態では、対照株は、遺伝子操作された株のプロモーター：：ＲＮＡ分解遺伝子の改変を欠く遺伝的に同一の株である。よって、一部の実施形態では、本開示は、遺伝子操作された株の宿主性能を対照株の宿主性能と比較する方法を教示する。一部の実施形態では、増強された宿主性能は、下に記載するように、特定の選択目標に対して測定される。
選択判定基準および目標
【０１８１】
本開示の方法に適用される試験判定基準は、株改善プログラムの具体的な目標によって変動する。本開示は、任意のプログラム目標を満たすように適応させることができる。例えば、一部の実施形態では、プログラム目標は、差し迫った期限なしで反応物の単一バッチ収量を最大化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、生合成収量をリバランスして、特異的な産物を産生させ、または特定の比の産物を産生させることであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、産物の化学構造を改変すること、例えば、ポリマーの炭素鎖を延長することであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、性能特性、例えば、収率、力価、生産性、副生成物排除、プロセスエクスカーションに対する寛容性、最適な成長温度、および成長速度を改善することであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、宿主細胞によって産生される目的の産物の体積生産性、比生産性、収率、または力価によって測定した宿主性能の改善である。
【０１８２】
他の実施形態では、プログラム目標は、投入量当たりの最終産物収率（例えば、スクロース１ポンド当たりに産生されるエタノールの合計量）の観点から市販の株の合成効率を最適化することであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、パーセント収率を最適化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、例えば、バッチ完了率、または連続培養システムにおける歩留まり率の観点から測定した、合成速度を最適化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、特定のファージに対する株の耐性を増大させること、またはさもなければ培養条件下で株の活力／ロバスト性を増大させることであり得る。さらに他の実施形態では、プログラム目標は、株成長速度（例えば、飽和バイオマス）を改善することであり得る。
【０１８３】
一部の実施形態では、株改善プロジェクトは、１つを超える目標を課される場合がある。一部の実施形態では、株プロジェクトの目標は、品質、信頼性、または全体的な収益性で定まり得る。一部の実施形態では、本開示は、上記した株性質の１つまたは複数を有する関連した選択された変異または変異の群の方法を教示する。
【０１８４】
当業者は、特定のプロジェクト目標を満たすように株試験判定基準をどのように適合させる（tailor）かを認識する。例えば、反応が飽和しているときの株の単一バッチ最大収量の選択は、単一バッチ収量が高い株を同定するのに適切であり得る。一連の温度および条件にわたる収率の一貫性に基づく選択は、ロバスト性および信頼性が増大した株を同定するのに適切であり得る。
【０１８５】
一部の実施形態では、初期の小バッチフェーズおよびタンクベースの検証のための選択判定基準は、同一である。他の実施形態では、タンクベースの選択は、追加のおよび／または異なる選択判定基準下で動作し得る。例えば、一部の実施形態では、ハイスループット株選択は、単一バッチ反応完了収率に基づき得る一方、タンクベースの選択は、反応速度に対する収率に基づく選択を含むように拡張することができる。
【０１８６】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された宿主細胞は、対照細胞と比べて中等度の性能増大を呈する。一部の実施形態では、選択されたＲＮＡ分解遺伝子に作動可能に連結した、選択された異種プロモーターポリヌクレオチドを含む、本開示の遺伝子操作された宿主細胞は、異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞と比較したとき、少なくとも１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６％、６．１％、６．２％、６．３％、６．４％、６．５％、６．６％、６．７％、６．８％、６．９％、７％、７．１％、７．２％、７．３％、７．４％、７．５％、７．６％、７．７％、７．８％、７．９％、８％、８．１％、８．２％、８．３％、８．４％、８．５％、８．６％、８．７％、８．８％、８．９％、９％、９．１％、９．２％、９．３％、９．４％、９．５％、９．６％、９．７％、９．８％、９．９％、または１０．０％の性能増大を呈する。一部の実施形態では、本開示は、微生物の収率、パーセント収率、生産性、または飽和バイオマスを含むがこれらに限定されない、性能を測定する様々なやり方を教示する。よって当業者は、本開示の微生物性能のパーセンテージまたは倍率増加が、本明細書に開示される任意の性能増大を指し得ることを理解するはずである。一部の実施形態では、性能パーセンテージ増加は、異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞と比較した収率の増加に直接言及する。
【０１８７】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された宿主細胞は、対照細胞と比べて良好な性能増大を呈する。一部の実施形態では、選択されたＲＮＡ分解遺伝子に作動可能に連結した、選択された異種プロモーターポリヌクレオチドを含む、本開示の遺伝子操作された宿主細胞は、異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞と比較したとき、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、または２００％の性能増大を呈する。
【０１８８】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された宿主細胞は、対照細胞と比べて優秀な性能増大を呈する。一部の実施形態では、選択されたＲＮＡ分解遺伝子に作動可能に連結した、選択された異種プロモーターポリヌクレオチドを含む、本開示の遺伝子操作された宿主細胞は、異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞と比較したとき、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、もしくは２０倍、またはそれを上回る性能増大を呈する。一部の実施形態では、性能増大は、体積生産性、比生産性、収率、力価、および総力価からなる群から選択される生産性の尺度によって評定される。一部の実施形態では、性能増大は、所望の産物の宿主細胞収率である。一部の実施形態では、性能は、飽和バイオマスによって決定される。一部の実施形態では、本開示は、１種または複数種のＲＮＡ分解遺伝子の他の撹乱を有する遺伝子操作された宿主細胞も、上記した中等度、良好、および優秀な性能改善を呈し得ることを教示する。例えば、一部の実施形態では、変異したＲＮＡ分解遺伝子（例えば、変異した開始コドン）を有する宿主細胞は、対照細胞と比べて中等度（１〜１０％）、良好（１〜２００％）、または優秀な（２〜２０倍）の性能増大を呈することができる。
産物回収および定量
【０１８９】
目的の産物の産生について分析するための方法は、当業者に公知であり、本明細書全体にわたって論じられている。このような方法は、本開示の株をスクリーニングするとき使用することができる。
【０１９０】
一部の実施形態では、本開示は、非分泌型細胞内産物を産生するように設計された株を改善する方法を教示する。例えば、本開示は、細胞内酵素、油、医薬品、または他の貴重な低分子もしくはペプチドを産生する細胞培養物のロバスト性、収率、効率、または全体的な望ましさを改善する方法を教示する。非分泌型細胞内産物の回収または単離は、本明細書に記載のものを含めて当技術分野で周知である溶解技法および回収技法によって達成することができる。
【０１９１】
例えば、一部の実施形態では、本開示の細胞は、遠心分離、濾過、沈殿、または他の方法によって回収することができる。次いで回収された細胞は、当業者に周知である凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または他の方法を含めた任意の好都合な方法によって破壊される。
【０１９２】
結果として生じる目的の産物、例えば、ポリペプチドは、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって回収／単離および任意選択で精製することができる。例えば、産物ポリペプチドは、これらに限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、または沈降を含めた慣例的な手順によって栄養培地から単離することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製ステップで使用することができる。（例えば、ともに参照により本明細書に組み込まれている、Parryら、２００１年、Biochem.  J.、３５３巻：１１７頁、およびHongら、２００７年、Appl.  Microbiol.  Biotechnol．、７３巻：１３３１頁に記載の細胞内タンパク質の精製を参照）。
【０１９３】
上述した参考文献に加えて、様々な精製方法は、例えば、Sandana（１９９７年）、Bioseparation  of  Proteins、Academic  Press,  Inc.；Bollagら（１９９６年）、Protein  Methods、２版、Wiley-Liss、NY；Walker（１９９６年）、The  Protein  Protocols  Handbook、Humana  Press、NJ；HarrisおよびAngal（１９９０年）、Protein  Purification  Applications:  A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；HarrisおよびAngal  Protein  Purification  Methods:A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；Scopes（１９９３年）、Protein  Purification:  Principles  and  Practice、３版、Springer  Verlag、NY；JansonおよびRyden（１９９８年）、Protein  Purification:  Principles,  High  Resolution  Methods  and  Applications、２版、Wiley-VCH、NY；ならびにWalker（１９９８年）、Protein  Protocols  on  CD-ROM、Humana  Press、NJに示されたものを含めて、当技術分野で周知である。これらの文献のすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１９４】
一部の実施形態では、本開示は、分泌産物を産生させるように設計された株を改良する方法を教示する。例えば、本開示は、貴重な低分子またはペプチドを産生する細胞培養物のロバスト性、収率、効率、または全体的な望ましさを改善する方法を教示する。
【０１９５】
一部の実施形態では、免疫学的方法は、本開示の細胞によって産生される分泌型または非分泌型産物を検出および／または精製するのに使用することができる。一例示的手法では、従来の方法を使用して産物分子に対して（例えば、インスリンポリペプチドまたはその免疫原性断片に対して）産生される抗体は、ビーズ上に固定化され、エンドグルカナーゼが結合している条件下で細胞培養培地と混合され、沈降される。一部の実施形態では、本開示は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の使用を教示する。
【０１９６】
他の関連した実施形態では、米国特許第５，５９１，６４５号、米国特許第４，８５５，２４０号、米国特許第４，４３５，５０４号、米国特許第４，９８０，２９８号、およびSe-Hwan  Paekら、「Development  of  rapid  One-Step  Immunochromatographic  assay,  Methods」、２２巻、５３〜６０頁、２０００年）に開示された免疫クロマトグラフィーが使用される。これらの文献のそれぞれは、本明細書に参照により組み込まれている。一般的な免疫クロマトグラフィーは、２つの抗体を使用することによって検体を検出する。第１の抗体は、試験溶液中に、または試験溶液が滴下される、多孔質膜から作製されたおよそ矩形状をした試験片の末端の部分に存在する。この抗体は、ラテックス粒子または金コロイド粒子で標識される（この抗体は、以下で標識抗体と呼ばれる）。滴下された試験溶液が検出されるべき検体を含むとき、標識抗体は、検体を認識して検体と結合する。検体と標識抗体との複合体は、アブソーバーに向けて毛管現象によって流れ、このアブソーバーは、濾紙から作製され、標識抗体を含んだ末端と反対の末端に結合している。流れている間に、検体と標識抗体との複合体は、多孔質膜の中間に存在している第２の抗体（これは、以下でタッピング抗体（tapping  antibody）と呼ばれる）によって認識および捕捉され、この結果として、複合体は、可視シグナルとして多孔質膜上の検出部分に現れ、検出される。
一部の実施形態では、本開示のスクリーニング方法は、測光検出技法（吸収、蛍光）に基づく。例えば、一部の実施形態では、検出は、抗体に結合したＧＦＰなどのフルオロフォア検出剤の存在に基づき得る。他の実施形態では、測光検出は、細胞培養からの所望の産物の蓄積に基づき得る。一部の実施形態では、産物は、培養物または前記培養物からの抽出物のＵＶを介して検出可能であり得る。
【実施例】
【０１９７】
（実施例１）
候補プロモーターの活性評価。
候補プロモーターの活性を評価するため、プラスミドベースの蛍光レポーターコンストラクトのセットを設計した。手短に述べると、シャトルベクターｐＫ１８ｒｅｐの黄色蛍光タンパク質をコードする遺伝子であるｅｙｆｐの前に各プロモーターをクローニングした。これらのプラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４に形質転換し、ＹＦＰタンパク質の蓄積を分光法により測定することによってプロモーター活性を評定した。
【０１９８】
ｐＫ１８ｍｏｂＳａｃＢ（ＡＴＣＣ  ８７０８７）中のｓａｃＢ遺伝子をｐＢＬ１複製起点（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０９２０３７．１）で置き換えることによりシャトルベクターｐＫ１８ｒｅｐを構築し、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの両方において増殖可能なベクターをもたらした。
【０１９９】
配列番号１〜８から選択されたプロモーターのそれぞれを含むｅｙｆｐ  ｐＫ１８ｒｅｐプラスミドで形質転換したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えたＢＨＩ寒天上で選択した。各形質転換においては、複数の単一コロニーを選び、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えた３００μＬのＢＨＩ培地を含有する９６ミッドウェルブロックの個々のウェルに播種した。細胞を１，０００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で４８時間インキュベーションすることにより、飽和するまで成長させた。
【０２００】
インキュベーション後、培養物を３，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培地を吸引により除去した。細胞を３００μＬのＰＢＳに再懸濁して１回洗浄し、３，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を吸引し、３００  ５μＬのＰＢＳ中で最後の再懸濁を行った。この混合物の２０μＬの一定分量を、１８０μＬのＰＢＳを含有する９６ウェルの全領域が黒の透明底アッセイプレートに移した。６００ｎｍにおける細胞の光学密度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーで測定し、ＴＥＣＡＮ  Ｍ１０００マイクロプレートリーダーを用いて５１４ｎｍで励起し、５２７ｎｍにおける放射を測定することによって蛍光を測定した。各ウェルについて、蛍光を光学密度で除すことにより、正規化された蛍光活性を計算した。
【０２０１】
親プラスミドｐＫ１８ｒｅｐで形質転換した宿主細胞を陰性対照とした。正規化された蛍光活性を、レポーターコンストラクト間および生物学的複製物間で比較した。プロモーター活性の数値的概要を以下の表４に提供する。
【表４】
2019519243.tif 000006
【０２０２】
２０１５年１２月７日に出願された米国特許出願第６２／２６４，２３２号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１００３７６号の開示全体はそれぞれ、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
（実施例２）
飽和バイオマスに対するプロモーター撹乱の影響
【０２０３】
本開示のプロモーター：：遺伝子の組合せを経験的に試験して、培養飽和バイオマスに対するそれらの影響を決定した。
【０２０４】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＲＮＡデグラドソーム撹乱のための標的を、本開示の表１に開示したＫＥＧＧデータベース（http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html）におけるそれらのアノテーションに基づいて選択した。標的の遺伝子のそれぞれに関する天然プロモーターを、文献検索に基づいて決定した。同定された天然プロモーターのリストを以下の表５に提供する。
【表５−１】
2019519243.tif 000007
【表５−２】
2019519243.tif 000008
【０２０５】
利用可能な場合、上記表５に概説した本開示のプロモーターのそれぞれで天然プロモーター配列の全体を置き換えた。天然プロモーターが同定できなかった場合、プロモーターラダーにおける８種のプロモーターのそれぞれを標的の開始コドンの５’側に直接挿入した。
【０２０６】
酵母相同組換えを使用し、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノム内でこれらの変化を行うためのプラスミドを生成し、次いでＥ．ｃｏｌｉ内で増殖させた。各プラスミドは、ゲノム編集の場所に隣接する約２ｋｂの相同領域を挿入した共通の骨格から形成した。これらの相同領域は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。これらの２ｋｂ相同領域の間で、相同領域のＰＣＲを行うために使用したプライマーの５’末端に新しいプロモーターまたは開始コドンがコードされた。
【０２０７】
プラスミドの配列を確認し、次いで電気穿孔によりＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに導入した。ゲノム組込みのための選択の後、本開示のループアウト対抗選択法を使用してプラスミド骨格ＤＮＡを除去した。正確に形成されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を、ＰＣＲおよびシーケンシングにより確認した。
【０２０８】
正確に形成された遺伝子操作Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を統合し、次いで、飽和バイオマス性能を評定するよう設計された小規模の培養において増殖させた。小規模の培養は、工業規模の培養からの培地を反映する培地を使用して実施した。９６時間時の培養物のＯＤ６００を決定することにより飽和バイオマスを測定した。この小規模試験によるデータは、以下の表６に含まれている。バイオマスにおける最良の改善を呈するプロモーター：：遺伝子の組合せが強調されている。この実験の結果の視覚的表現を図３Ａおよび図３Ｂに提供する。
【０２０９】
図３Ａおよび図３Ｂに概説した結果は、プロモーターＰｃｇ１８６０（Ｐ３、配列番号３）が飽和バイオマス増加において、ｃｓｈＡ（Ｇ３、配列番号１１）およびｇｐｓＩ（Ｇ６、配列番号６）に作動可能に連結したときに特に効果的であることを実証した。
【０２１０】
これらの結果はさらに、プロモーターＰｃｇ３１２１（Ｐ８、配列番号８）が飽和バイオマス増加において、ｇｐｓＩ（Ｇ６、配列番号６）およびｒｎｅ（Ｇ１３、配列番号２１）に作動可能に連結したときに特に効果的であることを実証した。
【表６−１】
2019519243.tif 000009
【表６−２】
2019519243.tif 000010
【表６−３】
2019519243.tif 000011
【表６−４】
2019519243.tif 000012
（実施例３）
産物力価（収率）に対するプロモーター撹乱の影響
【０２１１】
実施例２の様々なプロモーター：：遺伝子の組合せを有する遺伝子操作された培養物を、産物力価性能を評定するよう設計された小規模の培養において増殖させた。小規模の培養は、工業規模の培養からの培地を反映する培地を使用して実施した。標準的な比色分析アッセイを用いて、炭素消耗時の産物力価（すなわち、収率）を光学的に測定した。培養物は、産物培養物のさらなる変化が測定できなくなるまで成長させた。この小規模試験によるデータを、以下の表７に要約する。収率における最良の改善を呈するプロモーター：：遺伝子の組合せが強調されている。この実験の結果の視覚的表現を図３Ａおよび図３Ｂに提供する。
【０２１２】
開始コードスワッピングおよびプロモータースワッピングは、複数の表現型に影響を及ぼし得る：ｃｓｈＡ（Ｇ３、配列番号１１）に連結したＰｃｇ３３８１（Ｐ６、配列番号６）は産物収率を改善し、一方、ｅｎｏ（Ｇ５、配列番号１３）に連結したＰｃｇ３３８１（Ｐ６、配列番号６）は飽和バイオマスを改善する。
【０２１３】
これらの結果は、同じＲＮＡ分解遺伝子標的が、それがどのように標的化されるかにより、異なる表現型に正の影響を及ぼす場合があり、ｃｓｈＡ（Ｇ３、配列番号１１）に連結したＰｃｇ１８６０（Ｐ３、配列番号３）は飽和バイオマスを改善し、一方、ｃｓｈＡ（Ｇ３、配列番号１１）に連結したＰｃｇ３３８１（Ｐ６、配列番号６）は産物収率を改善することも示す。
【表７−１】
2019519243.tif 000013
【表７−２】
2019519243.tif 000014
【表７−３】
2019519243.tif 000015
（実施例４）
飽和バイオマスおよび産物力価（収率）に対する変異の影響
【０２１４】
本開示の選択されたＲＮＡ分解遺伝子における開始コドンの置き換えによる産物力価および飽和バイオマスへの影響を試験した。酵母相同組換えを使用し、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムを遺伝子操作するために使用したプラスミドを生成し、次いでＥ．ｃｏｌｉ内で増殖させた。各プラスミドは、ゲノム編集の場所に隣接する約２ｋｂの相同領域を挿入した共通の骨格から形成した。これらの相同領域は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。これらの２ｋｂ相同領域の間で、相同領域のＰＣＲを行うために使用したプライマーの５’末端に新しい開始コドンがコードされた。
【０２１５】
プラスミドをシーケンシングしてクローニングの成功を確認し、次いで電気穿孔によりＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに導入した。ゲノム組込みのための選択の後、本開示のループアウト対抗選択法を使用してプラスミド骨格ＤＮＡを除去した。正確に操作されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を、ＰＣＲおよびシーケンシングにより確認した。この場合はすべての開始コドンがＴＴＧに変化したが、ＡＴＧ、ＧＴＧ、およびＴＴＧからなる群から選択される任意の開始コドンへの他の変化も本発明の範囲内である。
【０２１６】
様々な開始コドンの置き換えを有する遺伝子操作された培養物を、培養物の産物性能およびバイオマスを評定するよう設計された小規模の培養において増殖させた。培養条件ならびにバイオマスおよび力価測定は、実施例２および３に記載のように実施した。したがって、炭素消耗時の産物力価の測定値は、宿主細胞培養物の産物収率値を表したものである。培養物は、産物培養物のさらなる変化が測定できなくなるまで成長させた。バイオマス培養物は９６時間にわたって成長させた。この小規模試験によるデータは、以下の表８および９に含まれている。産物収率および飽和バイオマスにおける最良の改善を呈する開始コドンの置き換えが強調されている。この実験の結果の視覚的表現も図４に提供する。
【０２１７】
興味深いことに、ｇｐｓＩ遺伝子のプロモーターを置き換えると、遺伝子操作された培養物の飽和バイオマスが増加するが、開始コドンをあまり発現しないコドンに切り替えると、これが減少する。
【０２１８】
これらの結果はさらに、ｒｈｌＥ（Ｇ１１、配列番号１９）におけるＧＴＧ＞ＴＴＧのコドン変化は産物収率を改善するが、ｒｎｅ（Ｇ１３、配列番号２１）におけるＧＴＧ＞ＴＴＧは飽和バイオマスを改善することを示唆する。
【０２１９】
一部の実施形態では、単一の標的の撹乱が、ｒｎｅ（Ｇ１３、配列番号２１）におけるＧＴＧ＞ＴＴＧの場合と同様に、産物収率および飽和バイオマスの両方を改善し得る。
【表８】
2019519243.tif 000016
【表９】
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（実施例５）
産物力価を改善するさらなるプロモーター：：遺伝子の組合せの検証
【０２２０】
本開示のプロモーター：：遺伝子の組合せを経験的に試験して、目的の産物の力価に対するそれらの影響を決定した。
【０２２１】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＲＮＡデグラドソーム撹乱のための標的は、実施例２に従って選択した。利用可能な場合、上記表５に概説した本開示のプロモーターのそれぞれで天然プロモーター配列の全体を置き換えた。天然プロモーターが同定できなかった場合、プロモーターラダーにおける８種のプロモーターのそれぞれを標的の開始コドンの５’側に直接挿入した。
【０２２２】
酵母相同組換えを使用し、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノム内でこれらの変化を行うためのプラスミドを生成し、次いでＥ．ｃｏｌｉ内で増殖させた。各プラスミドは、ゲノム編集の場所に隣接する約２ｋｂの相同領域を挿入した共通の骨格から形成した。これらの相同領域は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。これらの２ｋｂ相同領域の間で、相同領域のＰＣＲを行うために使用したプライマーの５’末端に新しいプロモーターまたは開始コドンがコードされた。
【０２２３】
プラスミドの配列を確認し、次いで電気穿孔によりＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに導入した。ゲノム組込みのための選択の後、本開示のループアウト対抗選択法を使用してプラスミド骨格ＤＮＡを除去した。正確に形成されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を、ＰＣＲおよびシーケンシングにより確認した。
【０２２４】
正確に形成された遺伝子操作Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を統合し、次いで、産物力価を評定するよう設計された小規模の培養において増殖させた。目的の産物は、発酵培地中に含まれる基質のメチル化によって生成される。このメチル化反応は、複製プラスミドから発現される異種Ｓ−アデノシルメチオニン依存性ｏ−メチルトランスフェラーゼによって触媒される。
【０２２５】
９６ウェルマイクロウェルプレートにおける別個のバイオマス増殖ステップの後に、細胞塊を、９６ウェルマイクロウェルプレート中の基質を含有する発酵培地に添加し、生物変換を２４時間進行させた。各株について、期待される収率を測定するために、２４時間時に採取した試料から、産物の力価を、高速液体クロマトグラフィーを使用して決定した。培養物は、産物培養物のさらなる変化が測定できなくなるまで成長させた。この試験によるデータは、以下の表１０に含まれている。産物収率における最良の改善を呈するプロモーター：：遺伝子の組合せが強調されている。この実験の結果の視覚的表現を図５に提供する。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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（実施例６）
大規模培養におけるハイスループット結果の検証。
【０２２６】
実施例５のハイスループット分析により同定された有益なプロモーター：：遺伝子の組合せを、より体積が大きい振とうフラスコ系において評価した。２５０ｍＬのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中で培養することにより細胞塊を生成し、発酵培地および基質を含有するフラスコに移した。上記の通り、基質から産物への生物変換を２４時間進行させ、高速液体クロマトグラフィーによって産物力価を評価した。この（Ｐ１：：Ｇ１２）を含む宿主細胞株の検証によるデータを、表１１に要約する。
【表１１】
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【０２２７】
Ｇ１２  ＲＮＡ分解遺伝子に作動可能に連結したＰ１プロモーターを含む宿主細胞培養物は、ｒｈｏＩ（Ｇ１２）プロモーター改変を欠く対照の親宿主細胞培養物よりも２０％高い炭素消耗時の力価を呈し、有意に高い収率を実証した。
（実施例７）
他の種におけるＲＮＡ分解遺伝子相同体の同定
【０２２８】
表１に開示したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ由来のＲＮＡ分解遺伝子配列を使用して、同じ属の生物に由来する相同遺伝子バリアント、ならびに他の真核生物および原核生物に由来するオルソロガスな遺伝子を同定した。
【０２２９】
手短に述べると、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＰ（登録商標）データベースにおいて、表１に開示したＲＮＡ分解遺伝子のアミノ酸配列を検索文字列として使用して、検索遺伝子と高い相同性を有する関連配列を同定した。初期の検索は、各検索された遺伝子について関連性の高い細菌相同体を同定するため、デフォルトの検索パラメータを用いて実施した。選択された属／種においてオルソロガスな配列を同定するため、特定のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに限定された二次検索も実施した。
【０２３０】
以下の表１２は、この検索中に同定された遺伝子のポリペプチド配列のＮＣＢＩ参照配列名を提供する。本開示のＲＮＡ分解遺伝子配列に基づくさらなる配列検索により、さらなる相同体およびオルソログが同定可能である。
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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本発明のさらなる実施形態
【０２３１】
本開示が企図する他の主題を、以下の番号を付けた実施形態において示す。
１．  ａ．異種プロモーターポリヌクレオチドと、
ｂ．ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドと
を含む、増強された工業的性能を有する遺伝子操作された宿主細胞であって、
該異種プロモーターポリヌクレオチドが、該ＲＮＡ分解遺伝子をコードする該ポリヌクレオチドに作動可能に連結している、遺伝子操作された宿主細胞。
２．  前記ＲＮＡ分解遺伝子が内在性遺伝子である、実施形態１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
３．  前記異種プロモーターが、配列番号２、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターである、実施形態１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
４．  前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である、実施形態３に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
４．１  ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドが、配列番号４２、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号３４、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、実施形態３に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
５．  前記異種プロモーターが、配列番号２、配列番号１、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、実施形態１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
５．１  異種プロモーターが、配列番号２、配列番号１、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドが配列番号４５をコードする、実施形態１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
６．  前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１０）、ｂ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｃ−（配列番号１：：配列番号１８）、ｄ−（配列番号１：：配列番号２０）、ｅ−（配列番号２：：配列番号１１）、ｆ−（配列番号２：：配列番号１８）、ｇ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｈ−（配列番号２：：配列番号１８）、ｉ−（配列番号２：：配列番号１７）、ｊ−（配列番号２：：配列番号１９）、ｋ−（配列番号３：：配列番号１１）、ｌ−（配列番号３：：配列番号１４）、ｍ−（配列番号３：：配列番号１２）、ｎ−（配列番号３：：配列番号１５）、ｏ−（配列番号３：：配列番号１７）、ｐ−（配列番号３：：配列番号１９）、ｑ−（配列番号５：：配列番号１４）、ｒ−（配列番号５：：配列番号１１）（配列番号６：：配列番号１３）、ｓ−（配列番号６：：配列番号１９）、ｔ−（配列番号８：：配列番号２１）、ｕ−（配列番号８：：配列番号１４）、ｖ−（配列番号６：：配列番号２０）、ｗ−（配列番号６：：配列番号１１）、ｘ−（配列番号８：：配列番号９）、およびｙ−（配列番号８：：配列番号１８）からなる群から選択される、実施形態１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
６．１  遺伝子操作された宿主細胞が、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターの組合せを含み、前記組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号３５をコードするポリヌクレオチド）、ｂ−（配列番号１：：配列番号３９をコードするポリヌクレオチド）、ｃ−（配列番号１：：配列番号４３をコードするポリヌクレオチド）、ｄ−（配列番号１：：配列番号４５をコードするポリヌクレオチド）、ｅ−（配列番号２：：配列番号３６をコードするポリヌクレオチド）、ｆ−（配列番号２：：配列番号４３をコードするポリヌクレオチド）、ｇ−（配列番号２：：配列番号３８をコードするポリヌクレオチド）、ｈ−（配列番号２：：配列番号４３をコードするポリヌクレオチド）、ｉ−（配列番号２：：配列番号４２をコードするポリヌクレオチド）、ｊ−（配列番号２：：配列番号４４をコードするポリヌクレオチド）、ｋ−（配列番号３：：配列番号３６をコードするポリヌクレオチド）、ｌ−（配列番号３：：配列番号３９をコードするポリヌクレオチド）、ｍ−（配列番号３：：配列番号３７をコードするポリヌクレオチド）、ｎ−（配列番号３：：配列番号４０をコードするポリヌクレオチド）、ｏ−（配列番号３：：配列番号４２をコードするポリヌクレオチド）、ｐ−（配列番号３：：配列番号４４をコードするポリヌクレオチド）、ｑ−（配列番号５：：配列番号３９をコードするポリヌクレオチド）、ｒ−（配列番号５：：配列番号３６をコードするポリヌクレオチド）（配列番号６：：配列番号３８をコードするポリヌクレオチド）、ｓ−（配列番号６：：配列番号４４をコードするポリヌクレオチド）、ｔ−（配列番号８：：配列番号４６をコードするポリヌクレオチド）、ｕ−（配列番号８：：配列番号３９をコードするポリヌクレオチド）、ｖ−（配列番号６：：配列番号４５をコードするポリヌクレオチド）、ｗ−（配列番号６：：配列番号３６をコードするポリヌクレオチド）、ｘ−（配列番号８：：配列番号３４をコードするポリヌクレオチド）、およびｙ−（配列番号８：：配列番号４３をコードするポリヌクレオチド）からなる群から選択される、実施形態１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
７．  前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｂ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｃ−（配列番号３：：配列番号１１）、ｄ−（配列番号３：：配列番号１４）、ｅ−（配列番号６：：配列番号１１）、およびｆ−（配列番号８：：配列番号９）からなる群から選択される、実施形態１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
７．１  遺伝子操作された宿主細胞が、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターの組合せを含み、前記組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号３９をコードするポリヌクレオチド）、ｂ−（配列番号２：：配列番号３８をコードするポリヌクレオチド）、ｃ−（配列番号３：：配列番号３６をコードするポリヌクレオチド）、ｄ−（配列番号３：：配列番号３９をコードするポリヌクレオチド）、ｅ−（配列番号６：：配列番号３６をコードするポリヌクレオチド）、およびｆ−（配列番号８：：配列番号３４をコードするポリヌクレオチド）からなる群から選択される、実施形態１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
８．  前記異種プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、実施形態１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
９．  前記異種プロモーターが、配列番号６のヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、実施形態１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
９．１  異種プロモーターが、配列番号６のヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドが配列番号４５をコードする、実施形態１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
１０．  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、実施形態１から９．１のいずれか１つに記載の遺伝子操作された宿主細胞。
１１．  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の遺伝子操作された宿主細胞。
１２．  前記増強された工業的性能が飽和バイオマスであり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約５％高い飽和バイオマスを呈する、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の遺伝子操作された宿主細胞。
１３．  前記増強された工業的性能が飽和バイオマスであり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約１０％高い飽和バイオマスを呈する、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の遺伝子操作された宿主細胞。
１４．  前記増強された工業的性能が飽和バイオマスであり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約２０％高い飽和バイオマスを呈する、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の遺伝子操作された宿主細胞。
１５．  アミノ酸、有機酸、およびアルコールからなる群から選択される生体分子を産生する、実施形態１から１４のいずれか１つに記載の遺伝子操作された宿主細胞。
１６．  前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンである、実施形態１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
１７．  前記有機酸が、スクシネート、ラクテート、またはピルベートである、実施形態１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
１８．  前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、実施形態１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
１９．  前記増強された工業的性能が産物収率であり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約２％高い収率の前記生体分子を産生する、実施形態１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
２０．  前記増強された工業的性能が産物収率であり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約３％高い収率の前記生体分子を産生する、実施形態１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
２１．  前記増強された工業的性能が産物収率であり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約６％高い収率の前記生体分子を産生する、実施形態１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
２２．  生体分子を産生する方法であって、該生体分子を産生するのに適した条件下で実施形態１から２１のいずれか１つに記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
２３．  生体分子収率を増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、
ａ．該宿主細胞のゲノムに異種プロモーターポリヌクレオチドを導入することによって、遺伝子操作された宿主細胞を作製するステップであって、前記異種プロモーターポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、ステップ
を含み、該遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養された対照宿主細胞の生体分子収率と比較してより高い該生体分子収率をもたらし、該対照宿主細胞は、該異種プロモーターポリヌクレオチドを含まない、方法。
２４．  飽和バイオマスを増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、
ａ．該宿主細胞のゲノムに異種プロモーターポリヌクレオチドを導入することによって、遺伝子操作された宿主細胞を作製するステップであって、該異種プロモーターポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、ステップ
を含み、該遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養された対照宿主細胞の飽和バイオマスと比較して増加した該飽和バイオマスを呈し、該対照宿主細胞は、該異種プロモーターポリヌクレオチドを含まない、方法。
２５．  前記ＲＮＡ分解遺伝子が内在性遺伝子である、実施形態２３から２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．  前記異種プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、実施形態２３から２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．  前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される、実施形態２３から２６のいずれか１つにに記載の方法。
２７．１  ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドが、配列番号４２、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号３４、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、実施形態２３から２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．  前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、実施形態２３から２６のいずれか１つにに記載の方法。
２８．１  ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドが配列番号４５をコードする、実施形態２３から２６のいずれか１つに記載の方法。
２９．  前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号２：：配列番号１７）、ｂ−（配列番号３：：配列番号１７）、ｃ−（配列番号６：：配列番号２０）、ｄ−（配列番号６：：配列番号１１）、およびｆ−（配列番号８：：配列番号９）からなる群から選択される、実施形態２３または２５から２６のいずれか１つに記載の方法。
２９．１  遺伝子操作された宿主細胞が、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、前記組合せが、ａ−（配列番号２：：配列番号４２をコードするポリヌクレオチド）、ｂ−（配列番号３：：配列番号４２をコードするポリヌクレオチド）、ｃ−（配列番号６：：配列番号４５をコードするポリヌクレオチド）、ｄ−（配列番号６：：配列番号３６をコードするポリヌクレオチド）、およびｆ−（配列番号８：：配列番号３４をコードするポリヌクレオチド）からなる群から選択される、実施形態２３または２５から２６のいずれか１つに記載の方法。
３０．  遺伝子操作された宿主細胞が、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、前記組合せが、ａ−（配列番号６：：配列番号１１）、およびｆ−（配列番号８：：配列番号９）からなる群から選択される、実施形態２３または２５から２６のいずれか１つに記載の方法。
３０．１  遺伝子操作された宿主細胞が、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、前記組合せが、ａ−（配列番号６：：配列番号３６をコードするポリヌクレオチド）、およびｆ−（配列番号８：：配列番号３４をコードするポリヌクレオチド）からなる群から選択される、実施形態２３または２５から２６のいずれか１つに記載の方法。
３１．  異種プロモーターポリヌクレオチドが配列番号６であり、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドが配列番号２０である、実施形態２３または２５から２６のいずれか１つに記載の方法。
３１．１  異種プロモーターポリヌクレオチドが配列番号６であり、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドが配列番号４５をコードする、実施形態２３または２５から２６のいずれか１つに記載の方法。
３２．  前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１０）、ｂ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｃ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｄ−（配列番号２：：配列番号１８）、ｅ−（配列番号２：：配列番号１７）、ｆ−（配列番号２：：配列番号１９）、ｇ−（配列番号３：：配列番号１１）、ｈ−（配列番号３：：配列番号１４）、ｉ−（配列番号３：：配列番号１９）、ｊ−（配列番号５：：配列番号１４）、ｋ−（配列番号６：：配列番号１３）、ｌ−（配列番号６：：配列番号１９）、ｍ−（配列番号８：：配列番号２１）、およびｎ−（配列番号８：：配列番号１４）からなる群から選択される、実施形態２４から２６のいずれか１つにに記載の方法。
３２．１  遺伝子操作された宿主細胞が、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、前記組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号３５をコードするポリヌクレオチド）、ｂ−（配列番号１：：配列番号３９をコードするポリヌクレオチド）、ｃ−（配列番号２：：配列番号３８をコードするポリヌクレオチド）、ｄ−（配列番号２：：配列番号４３をコードするポリヌクレオチド）、ｅ−（配列番号２：：配列番号４２をコードするポリヌクレオチド）、ｆ−（配列番号２：：配列番号４４をコードするポリヌクレオチド）、ｇ−（配列番号３：：配列番号３６をコードするポリヌクレオチド）、ｈ−（配列番号３：：配列番号３９をコードするポリヌクレオチド）、ｉ−（配列番号３：：配列番号４４をコードするポリヌクレオチド）、ｊ−（配列番号５：：配列番号３９をコードするポリヌクレオチド）、ｋ−（配列番号６：：配列番号３８をコードするポリヌクレオチド）、ｌ−（配列番号６：：配列番号４４をコードするポリヌクレオチド）、ｍ−（配列番号８：：配列番号４６をコードするポリヌクレオチド）、およびｎ−（配列番号８：：配列番号３９をコードするポリヌクレオチド）からなる群から選択される、実施形態２４から２６のいずれか１つに記載の方法。
３３．  前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｂ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｃ−（配列番号３：：配列番号１１）、およびｄ−（配列番号３：：配列番号１４）からなる群から選択される、実施形態２４から２６のいずれか１つにに記載の方法。
３３．１  遺伝子操作された宿主細胞が、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、前記組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号３９をコードするポリヌクレオチド）、ｂ−（配列番号２：：配列番号３８をコードするポリヌクレオチド）、ｃ−（配列番号３：：配列番号３６をコードするポリヌクレオチド）、およびｄ−（配列番号３：：配列番号３９をコードするポリヌクレオチド）からなる群から選択される、実施形態２４から２６のいずれか１つに記載の方法。
３４．  前記異種プロモーターポリヌクレオチドが配列番号１であり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、実施形態２４から２６のいずれか１つにに記載の方法。
３４．１  異種プロモーターポリヌクレオチドが配列番号１であり、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドが配列番号４５をコードする、実施形態２４から２６のいずれか１つに記載の方法。
３５．  前記遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、実施形態２３から３４．１のいずれか１つに記載の方法。
３６．  前記遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、実施形態２３から３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．  前記生体分子が、アミノ酸、有機酸、およびアルコールからなる群から選択される、実施形態２３および２５から３１のいずれか１つに記載の方法。
３８．  前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンである、実施形態３７に記載の方法。
３９．  前記有機酸が、スクシネート、ラクテート、またはピルベートである、実施形態３７に記載の方法。
４０．  前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、実施形態３７に記載の方法。
４１．  ａ．ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、
ｂ．（ａ）の該ポリヌクレオチドの開始コドンにおける変異と
を含む、増強された工業的性能を有する遺伝子操作された宿主細胞であって、
該変異が、異なる開始コドンでの該ポリヌクレオチドの内在性開始コドンの置き換えをもたらす、宿主細胞。
４２．  前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される、実施形態４１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
４２．１  ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、実施形態４１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
４３．  ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドが配列番号１９である、実施形態４１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
４３．１  ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドが配列番号４４をコードする、実施形態４１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
４４．  内在性ＲＮＡ分解遺伝子の開始コドンが、「ＡＴＧ」または「ＧＴＧ」から「ＴＴＧ」に変化している、実施形態４１から４３．１のいずれか１つに記載の遺伝子操作された宿主細胞。
４５．  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、実施形態４１から４４のいずれか１つに記載の遺伝子操作された宿主細胞。
４６．  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、実施形態４１から４５のいずれか１つに記載の遺伝子操作された宿主細胞。
４７．  アミノ酸、有機酸、およびアルコールからなる群から選択される生体分子を産生する、実施形態４１から４６のいずれか１つにに記載の遺伝子操作された宿主細胞。
４８．  前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンである、実施形態４７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
４９．  前記有機酸が、スクシネート、ラクテート、またはピルベートである、実施形態４７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
５０．  前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、実施形態４７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
５１．  同一培養条件下で、異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも２％高い収率の前記生体分子を産生する、実施形態４７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
５２．  生体分子収率を増加させることまたは飽和バイオマスを増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、
ａ．該宿主細胞を遺伝的に改変するステップであって、該改変するステップは、内在性ＲＮＡ分解遺伝子の開始コドンを変異させることを含み、該改変により、遺伝子操作された宿主細胞が生成される、ステップ
を含み、該遺伝子操作された宿主細胞は、対照宿主細胞の生体分子収率と比較して増加した該生体分子収率を有するか、または該遺伝子操作された宿主細胞は、該対照宿主細胞の飽和バイオマスと比較してより高い該飽和バイオマスを達成し、該対照宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞の開始コドン変異を含まず、該遺伝子操作された宿主細胞および該対照宿主細胞は、同一条件下で培養される、方法。
５３．  前記内在性ＲＮＡ分解遺伝子が、配列番号１７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である、実施形態５２に記載の方法。
５３．１  内在性ＲＮＡ分解遺伝子が、配列番号４２、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号３４、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、実施形態５２に記載の方法。
５４．  前記ＲＮＡ分解遺伝子が、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む遺伝子である、実施形態５２に記載の方法。
５４．１  ＲＮＡ分解遺伝子が配列番号４４をコードする、実施形態５２に記載の方法。
５５．  前記内在性ＲＮＡ分解遺伝子の開始コドンが、「ＡＴＧ」または「ＧＴＧ」から「ＴＴＧ」に変化している、実施形態５２から５４．１のいずれか１つに記載の方法。
５６．  前記遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、実施形態５２から５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．  前記遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、実施形態５２から５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．  前記生体分子が、アミノ酸、有機酸、およびアルコールからなる群から選択される、実施形態５２から５５のいずれか１つに記載の方法。
５９．  前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンである、実施形態５８に記載の方法。
６０．  前記有機酸が、スクシネート、ラクテート、またはピルベートである、実施形態５８に記載の方法。
６１．  前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、実施形態５８に記載の方法。
６２．  前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも２％高い収率の前記生体分子を産生する、実施形態５８に記載の方法。
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参照による組込み
【０２３２】
本明細書に引用したすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている。
【０２３３】
しかし、本明細書に引用した任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、これらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれかの国における共通の一般的知識の一部を形成するという承認または何らかの形式の示唆として解釈されず、かつそのように解釈されるべきでない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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