(57)【要約】  本発明は、生細胞コンストラクト又は支持体を作る方法を対象とし：（ａ）頂部表面、底部表面、及びその間の中間部分を有する非細胞性有機ポリマー支持体を提供することと、（ｂ）前記中間部分において前記ポリマーの架橋の勾配を作出するために十分な時間に渡って、前記支持体の１つの表面に架橋剤を接触させることとを含む。生細胞コンストラクト、支持体、並びに支持体及び生細胞コンストラクトの使用の方法もまた提供される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞コンストラクト又は支持体を作る方法であって：
（ａ）頂部表面、底部表面、及びその間の中間部分を有する非細胞性有機ポリマー支持体を提供することと、
（ｂ）前記中間部分において前記ポリマーの架橋の勾配を作出するために十分な時間に渡って、前記支持体の１つの面に（例えば、水系条件下において）架橋剤を接触させることと；
（ｃ）任意に、前記中間部分の架橋の前記勾配が、前記中間部分において自由なアミノ及び／又はカルボキシ基の対応する勾配を生じ、所期の化合物を前記自由なアミノ及び／又はカルボキシ基にカップリングして、前記中間部分において所期の前記化合物の勾配を生ずることと；
（ｄ）任意に、未分化の上皮生細胞を前記非細胞性支持体に接触させることと、
（ｅ）任意に、未分化の及び／又は分化した上皮細胞単層を前記頂部表面において増やすことと、
を含む、生細胞コンストラクト又は支持体を作る方法。
【請求項２】
単層中の細胞が：
（ｉ）未分化の細胞（例えば、幹又は前駆細胞）と；
（ｉｉ）任意に、未分化の細胞との組み合わせとしての分化した細胞と、
を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
未分化の上皮生細胞が、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、及び昆虫細胞からなる群から選択される、
請求項１又は２の何れか１項に記載の方法。
【請求項４】
未分化の上皮生細胞が、胃腸管上皮細胞、泌尿器上皮細胞、呼吸器上皮細胞、生殖器上皮細胞、内分泌及び内分泌腺上皮細胞、リンパ管上皮細胞、血管上皮細胞、又は脳室上衣上皮細胞である、
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
未分化の上皮生細胞がヒト細胞である、
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
未分化の上皮生細胞が癌又は腫瘍細胞ではない、
請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
未分化の上皮生細胞が、結腸、小腸、胃、食道、舌、鼻咽頭、口咽頭、咽頭喉頭部（laryngeopharynx）、膵臓、腎臓、膀胱、気管、肺、精巣、卵巣、生殖器の導管、子宮内膜、甲状腺、副腎、副甲状腺、脳室上衣、及び／又は脳からである、
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
さらに：
（ｄ）培養培地を生細胞の前記単層に接触させ（例えば、この培養培地は前記支持体中又は上にある）、この培養培地が生細胞の前記単層を持続させること、
を含む、
請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地が短鎖脂肪酸を含む、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）前記培養培地が１０ミリモーラー以下の単糖プラス二糖を含有し；
（ｉｉ）前記培養培地が少なくとも２ミリモーラーの前記短鎖脂肪酸（例えば最大２０、５０、又は１００ミリモーラーまでの前記短鎖脂肪酸）を含有する、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体が多孔質支持体である、
請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記支持体が、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸（heparin sulfate）、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸（keratin sulfate）、ヒアルロン酸、エンゲルブレット−ホルム−スワームマウス肉腫細胞によって分泌される膠様蛋白質混合物（例えば、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、ＭａｘＧｅｌ（商標）等）、及びその組み合わせを含み；並びに／又は前記支持体が、天然又は合成ポリマー（例えば、キトサン、アガロース、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、ポリエチレングリコール、合成ペプチド等。任意に、上に記載されている化合物によって表面修飾される）から形成されるハイドロゲルを含む、
請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記支持体底部表面が、多孔質担体（例えば、多孔質膜（これはポリテトラフルオロエチレン［ＰＴＦＥ］、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロース等から形成され得る）、メッシュ（これはナイロン、生分解性ポリマー、金属等から形成され得る）、無機グリッド、ハイドロゲル、又はその組み合わせの上にある、
請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記頂部表面が、その中に形成された複数のウェルを有し；前記ウェルのそれぞれが頂部開口部、側壁、及び床部を有し；前記上皮細胞単層が前記ウェル側壁及び床部上に広がり、ウェル頂部開口部は開いたままであって、細胞によって内張りされた開いた内腔（又は「陰窩」）を前記ウェル中に形成する、
請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
生細胞コンストラクト、又は生細胞コンストラクトを生ずることにとって有用な支持体であって：
（ａ）頂部表面、底部表面、及びその間の中間部分を有する非細胞性有機ポリマー支持体と（前記中間部分は、その中に形成された前記ポリマーの架橋の勾配を有する）；
（ｂ）任意に、前記頂部表面に形成された未分化の及び／又は分化した上皮生細胞の単層と；
（ｃ）任意に、（ｉ）前記中間部分における自由な反応性アミノ酸及び／若しくはカルボン酸基の勾配、又は（ｉｉ）前記中間部分におけるアミノ酸及び／若しくはカルボン酸基に共有結合的にカップリングされた所期の化合物の勾配と、
を含む、
生細胞コンストラクト、又は生細胞コンストラクトを生ずることにとって有用な支持体。
【請求項１６】
前記単層中の前記生細胞が：
（ｉ）未分化の細胞（例えば、幹又は前駆細胞）と；
（ｉｉ）任意に、前記未分化の細胞との組み合わせとしての分化した細胞と、
を含む、
請求項１４に記載のコンストラクト。
【請求項１７】
上皮細胞が、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、及び昆虫細胞からなる群から選択される、
請求項１５又は請求項１６に記載のコンストラクト。
【請求項１８】
上皮細胞が、胃腸管上皮細胞、泌尿器上皮細胞、呼吸器上皮細胞、生殖器上皮細胞、内分泌及び内分泌腺上皮細胞、リンパ管上皮細胞、血管上皮細胞、又は脳室上衣上皮細胞である、
請求項１５〜１７の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項１９】
未分化の上皮生細胞がヒト細胞である、
請求項１５〜１８の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２０】
上皮細胞が悪性（癌又は腫瘍）細胞ではない、
請求項１５〜１９の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２１】
上皮細胞が、結腸、小腸、胃、食道、舌、鼻咽頭、口咽頭、咽頭喉頭部（laryngeopharynx）、膵臓、腎臓、膀胱、気管、肺、精巣、卵巣、生殖器の導管、子宮内膜、甲状腺、副腎、副甲状腺、脳室上衣、及び／又は脳からである、
請求項１５〜２０の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２２】
さらに：
（ｃ）培養培地が生細胞の前記単層に接触し（例えば、この培養培地は前記支持体中又は上にある）、この培養培地が生細胞の前記単層を持続させること、
を含む、
請求項１５〜２１の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２３】
前記培養培地が短鎖脂肪酸（例えば、酪酸、酢酸、プロピオン酸、バルプロ酸等）を含む、
請求項２２に記載のコンストラクト。
【請求項２４】
（ｉ）前記培養培地が１０ミリモーラー以下の単糖プラス二糖を含有し；
（ｉｉ）前記培養培地が少なくとも２ミリモーラーの前記短鎖脂肪酸（例えば最大２０、５０、又は１００ミリモーラーまでの前記短鎖脂肪酸）を含有する、
請求項２３に記載のコンストラクト。
【請求項２５】
前記支持体が、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、エンゲルブレット−ホルム−スワームマウス肉腫細胞によって分泌される膠様蛋白質混合物（例えば、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、ＭａｘＧｅｌ（商標）等）、及びその組み合わせを含み；並びに／又は前記支持体が、天然又は合成ポリマー（例えば、キトサン、アガロース、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、ポリエチレングリコール、合成ペプチド等。任意に、上に記載されている化合物によって表面修飾される）から形成されるハイドロゲルを含む、
請求項１５〜２４の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２６】
前記支持体が多孔質である、
請求項１５〜２５の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２７】
前記支持体底部表面が、多孔質担体（例えば、多孔質膜（これはポリテトラフルオロエチレン［ＰＴＦＥ］、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロース等から形成され得る）、メッシュ（これはナイロン、生分解性ポリマー、金属等から形成され得る）、無機グリッド、ハイドロゲル、又はその組み合わせの上にある、
請求項１５〜２６の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２８】
前記頂部表面が、その中に形成された複数のウェルを有し、前記ウェルのそれぞれが頂部開口部、側壁、及び床部を有し；
前記上皮細胞単層が前記ウェル側壁及び床部上に広がり、前記ウェル頂部開口部は被覆されないままであって、開いた細胞内腔（又は「陰窩」）を前記ウェル中に形成する、
請求項１５〜２７の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項２９】
前記ウェルが、１００、２００、若しくは３００ミクロンの深さから、最大８００若しくは１０００ミクロンの深さ若しくはそれ以上までであり、及び／又は前記ウェルが、１０若しくは５０ミクロンの幅から、最大１００若しくは２００ミクロンの幅若しくはそれ以上までであり、及び／又は前記ウェルの少なくとも１０、５０、若しくは１００個が前記頂部表面に形成される、
請求項２８に記載のコンストラクト。
【請求項３０】
前記単層中の前記生細胞が、分化した細胞及び未分化の細胞（例えば、幹又は前駆細胞）両方を組み合わせとして含み；
前記分化した細胞及び前記未分化の細胞が前記単層中において勾配として位置し（例えば、より高い濃度の分化した細胞を勾配の一端に；より高い濃度の未分化の細胞を前記勾配の他端に有する）；
前記勾配が前記ウェル側壁に対して又はそれに沿って定位する、
請求項２８又は請求項２９に記載のコンストラクト。
【請求項３１】
生細胞コンストラクトを持続させる方法であって：
（ａ）請求項１５〜３０の何れか１項に記載のコンストラクトを提供することと；
（ｂ）第１の培養培地を前記頂部表面に接触させることと；
（ｃ）第２の培養培地を前記底部表面に接触させることと、
を含み、
前記培養培地の１つが増えている幹及び前駆細胞の分化を誘導し、前記培養培地の他方が未分化の細胞の増えることを誘導する、
生細胞コンストラクトを持続させる方法。
【請求項３２】
試験化合物又は微生物を毒物学的、生理学的、又は発癌性効果についてスクリーニングする方法であって：
（ａ）請求項１５〜３０の何れか１項に記載のコンストラクト又は請求項３１に記載の方法に従って持続させられるコンストラクトを提供することと、
（ｂ）試験化合物又は微生物を前記コンストラクトに接触させることと；それから
（ｃ）前記コンストラクトの細胞に及ぼす前記試験化合物又は微生物の毒物学的、生理学的、又は発癌性効果を検出することと（例えば、前記接触後のコンストラクトを、前記試験化合物若しくは微生物が接触させられていない同様のコンストラクトと比較することによってであり、及び／又は前記接触ステップ後のコンストラクトを前記接触ステップ前の前記コンストラクトと比較することによる）、
を含む、
試験化合物又は微生物を毒物学的、生理学的、又は発癌性効果についてスクリーニングする方法。
【請求項３３】
前記試験化合物が、芳香族有機化合物、脂肪族有機化合物、並びに混合された芳香族及び脂肪族有機化合物からなる群から選択される、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試験微生物が、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、酵母、及び糸状菌からなる群から選択される、
請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本願は２０１６年７月２７日出願のＵ．Ｓ．仮出願Ｎｏ．６２／３６７，３３９の米国特許法第１１９条（ｅ）の下における利益を請求し、その内容全体は参照によって本願に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援
本発明は国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＤＫ１０９５５９の下における政府の支援によってなされた。米国政府は本発明にある種の権利を有する。
【０００３】
本発明は、生細胞コンストラクト及び支持体に関する。
【背景技術】
【０００４】
小腸及び結腸は、腸陰窩の基部に在る幹細胞によって燃料供給される速い自己複製速度（マウスでは約５日（非特許文献１）１）を持つ上皮細胞の単層によって内張りされている（非特許文献２）２。幹細胞は幹細胞ニッチと言われるインビボの微小環境内に維持され、これは、基底−内腔軸に沿って変動する可溶性因子（例えば、Ｗｎｔ−３Ａ、ＢＭＰ、及びＮｏｔｃｈ）と基底膜との生物物理学的相互作用とを包含する生化学的及び生物物理学的特性両方を要求する（非特許文献３から５）３−５。初代腸上皮細胞のインビトロ培養が１９７０年代から試みられてきたが、試みの何れも真に長期増殖性の自己複製する細胞を作出しなかった。例えば、ディッシュによる腸細胞の標準的な２Ｄ培養は短期培養物のみを作出し、次に細胞のアポトーシスの開始をした（非特許文献６から８）１３−１５。この状況はハンス・クレバース（Hans Clevers）及び彼の同僚が３Ｄオルガノイド培養系を報告した２００９年に改められた。これは生化学的（Ｗｎｔ−３Ａ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、及び上皮成長因子［ＥＧＦ］）及び生物物理学的（マトリゲル封入）刺激両方を腸上皮幹細胞に提供して、腸上皮細胞の長期増殖性培養物を生じた（非特許文献９から１２）１６−２１。それらの条件下において成長した細胞はオルガノイドと言われる３Ｄ構造を生ずる。オルガノイドは、自己複製する幹細胞、並びに種々の分化した腸系統；杯細胞（粘液を分泌する）、吸収性のエンテロサイト（水及び電解質を吸収する）、腸内分泌細胞（ホルモンを分泌する）、及びパネート細胞（小腸）を含有する（非特許文献１１）１８。この３Ｄ器官型培養物は全ての細胞型を有するオルガノイドの長期増殖性の成長を支持する点で有効であるが、一方で、系は深刻な制約を被る。重大な制約は、オルガノイドのスフェロイド様アーキテクチャーが、上皮細胞を横断する分子輸送の研究における障害であるということである。なぜなら、内腔ではなくむしろ基底上皮表面が外因的に追加される化合物に暴露されるからである。代謝物質感知性ＧＰＣＲ及び他の受容体は内腔表面に並んでおり、分子輸送系は吸収細胞内において指向的に編成されているので、この反転は危機的であり得る２３。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎ．バーカー（Barker）、Ｍ．ファン・デ・ウェテリンク（van de Wetering）、及びＨ．クレバース（Clevers）著，ジーンズ・アンド・デベロップメント（Genes & Development），２００８年，２２巻，ｐ．１８５６−１８６４．
【非特許文献２】Ｅ．フックス（Fuchs）及びＴ．チェン（Chen）著，エンボ・リポーツ（Embo Reports），２０１３年，１４巻，ｐ．３９−４８．
【非特許文献３】Ｍ．ブリタン（Brittan）及びＮ．Ａ．ライト（Wright）著，ガット（Gut），２００４年，５３巻，ｐ．８９９−９１０．
【非特許文献４】Ｃ．コシンスキー（Kosinski）、Ｖ．Ｓ．Ｗ．リ（Li）、Ａ．Ｓ．Ｙ．チャン（Chan）、Ｊ．ジャン（Zhang）、Ｃ．ホー（Ho）、Ｗ．Ｙ．ツイ（Tsui）、Ｔ．Ｌ．チャン（Chan）、Ｒ．Ｃ．ミフリン（Mifflin）、Ｄ．Ｗ．パウエル（Powell）、Ｓ．Ｔ．ユエン（Yuen）、Ｓ．Ｙ．リョン（Leung）、及びＸ．チェン（Chen）著，米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），２００７年，１０４巻，ｐ．１５４１８−１５４２３．
【非特許文献５】Ｔ．Ｈ．イェン（Yen）及びＮ．Ａ．ライト（Wright）著，ステム・セル・レビューズ・アンド・リポーツ（Stem Cell Reviews and Reports），２００６年，２巻，ｐ．２０３−２１２．
【非特許文献６】Ｈ．Ｇ．スンダララガワン（Sundararaghavan）、Ｇ．Ａ．モンテイロ（Monteiro）、Ｎ．Ａ．ラパン（Lapin）、Ｙ．Ｊ．シャバル（Chabal）、Ｊ．Ｒ．ミクサン（Miksan）、及びＤ．Ｉ．シュライバー（Shreiber）著，ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアルズ・リサーチ・パートＡ（Journal of Biomedical Materials Research Part A），２００８年，８７巻Ａ，ｐ．３０８−３２０．
【非特許文献７】Ｅ．ソン（Song）、Ｓ．Ｙ．キム（Kim）、Ｔ．チュン（Chun）、Ｈ．Ｊ．ビュン（Byun）、及びＹ．Ｍ．リー（Lee）著，バイオマテリアルズ（Biomaterials），２００６年，２７巻，ｐ．２９５１−２９６１．
【非特許文献８】Ｐ．シュパーク（Szpak）著，ジャーナル・オブ・アーケオロジカル・サイエンス（Journal of Archaeological Science），２０１１年，３８巻，ｐ．３３５８−３３７２．
【非特許文献９】Ｙ．Ｗ．リュー（Liu）、Ｌ．Ｈ．ガン（Gan）、Ｄ．Ｊ．カールソン（Carlsson）、Ｐ．ファーゲルホルム（Fagerholm）、Ｎ．ラガリ（Lagali）、Ｍ．Ａ．ワトスキー（Watsky）、Ｒ．マンガー（Munger）、Ｗ．Ｇ．ホッジ（Hodge）、Ｄ．プリースト（Priest）、及びＭ．グリフィス（Griffith）著，インベスティガティブ・オフサルモロジー・アンド・ビジュアル・サイエンス（Investigative Ophthalmology & Visual Science），２００６年，４７巻，ｐ．１８６９−１８７５．
【非特許文献１０】Ｐ．Ｂ．ファン・ワヘム（van Wachem）、Ｊ．Ａ．プランティンガ（Plantinga）、Ｍ．Ｊ．Ｂ．ウィシンク（Wissink）、Ｒ．ベールニンク（Beernink）、Ａ．Ａ．プート（Poot）、Ｇ．Ｈ．Ｍ．エンバース（Engbers）、Ｔ．ブーヘリン（Beugeling）、Ｗ．Ｇ．ファン・ エイケン（van Aken）、Ｊ．フェイジェン（Feijen）、及びＭ．Ｊ．Ａ．ファン・ルイン（van Luyn）著，ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアルズ・リサーチ（Journal of Biomedical Materials Research），２００１年，５５巻，ｐ．３６８−３７８．
【非特許文献１１】Ｃ．Ｒ．ヤン（Yang）著，ブレティン・オブ・マテリアルズ・サイエンス（Bulletin of Materials Science），２０１２年，３５巻，ｐ．９１３−９１８．
【非特許文献１２】Ｈ．Ｈ．ヨー（Yoo）、Ｍ．リー（Lee）、Ｍ．Ｗ．リー（Lee）、Ｓ．Ｙ．リム（Lim）、Ｊ．シン（Shin）、及びＤ．Ｈ．キム（Kim）著，プランタ・メディカ（Planta Medica），２００７年，７３巻，ｐ．４４４−４５０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、それらを一緒にして混合する代わりに、足場の１つの側からの架橋剤／強化試薬の拡散によって足場を強化するための方法を提供する。利益は、底部表面においては足場を有効に架橋又は強化しながら、頂部表面においては足場の固有の特性を保つことである。
【０００７】
足場は、コラーゲン、具体的にはコラーゲンハイドロゲルであり得る。ハイドロゲル足場は天然及び合成ポリマーを包含する他の材料から作られ得る。かかる材料の例は、ゼラチン、ラミニン、アガロース、キトサン、アルギン酸、エンゲルブレット−ホルム−スワーム（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞によって分泌される膠様蛋白質混合物（例えばマトリゲル（登録商標））、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド等を包含するが、これに限定されない。
【０００８】
足場は、共有結合的及び非共有結合的架橋剤を包含する架橋剤又は強化試薬によって架橋され得る（例えば、イオン結合性のアルギン酸はカルシウムイオンによってゲル化され得る）。架橋剤の例は、グルタルアルデヒド、イオン（カルシウム）、フリーラジカル、紫外線、エポキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等を包含するが、これに限定されない。
【０００９】
本発明は、コラーゲンハイドロゲル等の足場内に架橋勾配を作る方法；足場内に剛性勾配を作る方法；足場内に所期の蛋白質の勾配を作る方法；足場内に多孔度（又はメッシュワーク目開き）の勾配を作る方法；並びに下でさらに論じられる他の目的及び態様を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明のある態様は、生細胞コンストラクト又は支持体を作る方法であり：（ａ）頂部表面、底部表面、及びその間の中間部分を有する非細胞性有機ポリマー支持体を提供することと、（ｂ）中間部分においてポリマーの架橋の勾配を作出するために十分な時間に渡って、支持体の１つの面に（例えば、水系条件下において）架橋剤を接触させることと；（ｃ）任意に、中間部分における架橋の勾配が、中間部分において自由なアミノ及び／又はカルボキシ基の対応する勾配を生じ、所期の化合物を自由なアミノ及び／又はカルボキシ基にカップリングして、中間部分において所期の化合物の勾配を生ずることと；（ｄ）任意に、未分化の生細胞を非細胞性支持体に接触させることと、それから（ｅ）任意に、未分化の及び／又は分化した細胞単層（例えば、胃腸管上皮細胞単層（例えば、結腸、小腸、胃、食道、舌、鼻咽頭（nasopharnyx）、口咽頭、咽頭喉頭部（laryngeopharynx）、及び／又は膵臓（pancreatic））、泌尿器上皮細胞単層（例えば、腎臓、膀胱）、呼吸器上皮細胞単層（例えば、気管、肺）、生殖器上皮細胞単層（例えば、精巣、卵巣、導管、子宮内膜）、内分泌及び内分泌腺上皮細胞単層（例えば、甲状腺、副腎、副甲状腺、膵臓）、リンパ管上皮細胞単層、血管上皮細胞単層、脳室上衣上皮細胞単層（例えば、脳。ニューロン又はアストロサイトではない））を頂部表面において増やすこととを含む。
【００１１】
幾つかの態様において、本発明は、さらに、生細胞コンストラクト、又は生細胞コンストラクトを生ずることにとって有用な支持体を提供し：（ａ）頂部表面、底部表面、及びその間の中間部分を有する非細胞性有機ポリマー支持体と（中間部分は、その中に形成されたポリマーの架橋の勾配を有する）；（ｂ）任意に、頂部表面に形成された未分化の及び／又は分化した生細胞の単層（例えば、胃腸管上皮細胞単層（例えば、結腸、小腸、胃、食道、舌、鼻咽頭（nasopharnyx）、口咽頭、咽頭喉頭部（laryngeopharynx）、及び／又は膵臓（pancreatic））、泌尿器上皮細胞単層（例えば、腎臓、膀胱）、呼吸器上皮細胞単層（例えば、気管、肺）、生殖器上皮細胞単層（例えば、精巣、卵巣、導管、子宮内膜）、内分泌及び内分泌腺上皮細胞単層（例えば、甲状腺、副腎、副甲状腺、膵臓）、リンパ管上皮細胞単層、血管上皮細胞単層、脳室上衣上皮細胞単層（例えば、脳。ニューロン又はアストロサイトではない））と；（ｃ）任意に、（ｉ）中間部分における自由な反応性アミノ酸及び／若しくはカルボン酸基の勾配又は（ｉｉ）中間部分におけるアミノ酸及び／若しくはカルボン酸基に共有結合的にカップリングされた所期の化合物の勾配とを含む。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、生細胞コンストラクトを持続させる方法を提供し：（ａ）上又は下に記載されているコンストラクトを提供することと；（ｂ）第１の培養培地を頂部表面に接触させることと；（ｃ）第２の培養培地を底部表面に接触させることとを含み、培養培地の１つは増えている幹及び前駆細胞の分化を誘導し、培養培地の他方は、未分化の細胞の増えることを誘導する。
【００１３】
幾つかの態様において、本発明は、試験化合物又は微生物を毒物学的、生理学的、又は発癌性効果についてスクリーニングする方法を提供し：（ａ）上又は下に記載されているコンストラクトを提供することと；（ｂ）試験化合物又は微生物をコンストラクトに接触させることと；それから（ｃ）コンストラクトの細胞に及ぼす微生物の毒物学的、生理学的、又は発癌性効果を検出することと（例えば、接触後のコンストラクトを、化合物若しくは微生物が接触させられていない同様のコンストラクトと比較することによってであり、及び／又は接触ステップ後のコンストラクトを接触ステップ前のコンストラクトと比較することによる）を含む。
【００１４】
幾つかの態様において、本発明は、試験化合物又は微生物を毒物学的、生理学的、又は発癌性効果についてスクリーニングする方法を提供し：（ａ）試験化合物又は微生物を本発明の生細胞コンストラクトに接触させることと；それから（ｂ）コンストラクトの細胞に及ぼす微生物の毒物学的、生理学的、又は発癌性効果を検出することと（例えば、接触後のコンストラクトを、化合物若しくは微生物が接触させられていない同様のコンストラクトと比較することによってであり、及び／又は接触ステップ後のコンストラクトを接触ステップ前のコンストラクトと比較することによる）を含む。
【００１５】
前述の幾つかの実施形態において、支持体はハイドロゲルを含む。
【００１６】
前述の幾つかの実施形態において、細胞単層は少なくとも０．０１又は０．１平方センチメートル（例えば、最大１又は１０平方センチメートル、又はそれ以上まで）の表面積（例えば、分断されていない連続的な表面積）を有し、細胞単層は平方センチメートルあたり少なくとも１００、１５０、又は２００オームの抵抗を有する（Ｐ．シャー（Shah）、Ｖ．ジョガニ（Jogani）、Ｔ．バクシ（Bagchi）、及びＡ．ミスラ（Misra）著，「腸の薬物吸収の予測に果たすＣａｃｏ−２細胞単層の役割（Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption）」，バイオテクノロジー・プログレス（Biotechnology Progress），２２巻：ｐ．１８６−１９８（２００６年）を見よ）。
【００１７】
前述の幾つかの実施形態において、足場には、架橋の勾配に対応する多孔度の勾配がある（例えば、架橋プロセスによって形成された多孔度勾配であって、より高い多孔度（より大きい細孔及び／又はより多くの細孔）がより少ない架橋の領域において見出され、より少ない多孔度（より小さい細孔及び／又はより少ない細孔）がより高い架橋の領域において見出される。
【００１８】
本発明は、本願の図面及び下に提示されている明細書によってより詳細に説明される。ウェル、陰窩、又は内腔を有する実施形態の実質的な議論が提供されるが、本発明の他の実施形態はかかるウェル、陰窩、又は内腔を要求しないということに注意されたい。本発明は上皮細胞が支持体に取り付けられる実施形態によって実質的に詳細に説明されるが、上皮細胞は他の使用又は目的（例えば治療薬、移植、薬物スクリーニング、継代／拡大培養、凍結保存等）のためのその細胞懸濁液を提供するために支持体から分離され得るということにもまた注意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】乃至
【図１Ｄ】コラーゲンハイドロゲルは初代マウス結腸上皮細胞の増殖を維持したが、細胞によって誘導される収縮が原因で、その低い強度は連続的な細胞単層を作出することにとっては不適であった。（図１Ａ）ポリスチレン（上パネル）又はコラーゲンハイドロゲル（下パネル）上で培養した陰窩のタイムラプス画像。重ね合わせた明視野及びＤｓＲｅｄ蛍光画像を示している。陰窩はニワトリアクチンプロモーター下で全ての細胞にＤｓＲｅｄを発現するマウスに由来した。（図１Ｂ）ＥＤＵ染色（ここでは明灰色／白色として示す）及びヘキスト３３３４２（暗灰色）を示す第５日の細胞の蛍光画像。図１Ａ及び１Ｂのスケールバー＝１００μｍ。（図１Ｃ）ポリスチレン及びコラーゲンハイドロゲル上の細胞のＥＤＵ／核の比。（図１Ｄ）コラーゲンハイドロゲルの細胞によって誘導される収縮（矢印）を示す、低倍率の明視野（左）及び蛍光（右）画像。初代マウス結腸上皮細胞をファルコン細胞培養インサート内側のコラーゲンハイドロゲル（１ｍｍ高さ）上にプレーティングした。コラーゲンハイドロゲルは第２日までに収縮し出した。
【図２Ａ】乃至
【図２Ｃ】架橋密度の勾配を持つコラーゲンハイドロゲル足場。（図２Ａ）ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングケミストリーによるコラーゲン鎖の架橋。（図２Ｂ）底部から架橋剤（ＥＤＣ及びＮＨＳ）を拡散させることによってコラーゲンを架橋する。（ｉ）コラーゲン溶液を、その底部に多孔質膜を有する細胞培養インサートに追加した。（ｉｉ）架橋剤を膜の下のリザーバー中に追加した。（ｉｉｉ）架橋剤の拡散はコラーゲンに作用して、架橋の密度の勾配を作出した。（図２Ｃ）架橋密度の度合いをハイドロゲルの断面切片中の蛍光の強さによって可視化した。これは、ハイドロゲルの残存アミン基をアミン反応性蛍光色素５−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルと反応させることによって達成した。（ｉ）ハイドロゲルの断面の蛍光画像（厚さ＝１．８ｍｍ）。（ｉｉ）蛍光の強さのプロファイル。
【図３Ａ】乃至
【図３Ｄ】初代ヒト小腸上皮細胞の連続的な単層を、架橋されたコラーゲンハイドロゲル足場上に作出した。（図３Ａ）コラーゲンハイドロゲルがコンフルエントな細胞層を持ち、足場収縮の証拠はなかったということを示す、広視野蛍光画像。（図３Ｂ）ＥＤＵ染色（白色／明灰色）及びヘキスト３３３４２（暗灰色）を示す、細胞の蛍光画像。細胞培養時間はＡ及びＢでは１０日間であった。（図３Ｃ）ＴＥＥＲ対時間（ｎ＝３つの足場）。（図３Ｄ）細胞培養の第９日におけるローダミン１２３の基底から頂端への輸送及びルシファーイエローの頂端から基底への拡散（ｎ＝３つの足場）。
【図４Ａ】乃至
【図４Ｅ】ＥＤＣ／ＮＨＳの拡散によってコラーゲンメッシュワークを架橋すること、及び初代マウス結腸上皮細胞を培養するための架橋されたコラーゲンハイドロゲルの使用。（図４Ａ）架橋戦略。（ｉ）コラーゲンメッシュワークを細胞培養インサート内側に調製した。（ｉｉ）架橋剤（ＥＤＣ及びＮＨＳ）をインサートの膜の他方の側のリザーバーに追加した。（ｉｉｉ）架橋剤の拡散はコラーゲン原繊維を架橋し、架橋密度の勾配を作出した。（図４Ｂ）コラーゲンハイドロゲルが足場収縮なしに細胞によって不足なく被覆されたということを示す、広視野蛍光画像。（図４Ｃ）ＴＥＥＲ対時間（ｎ＝３つの足場）。（図４Ｄ）細胞培養の第５日におけるローダミン１２３の基底から頂端（Ｂ−Ａ）及び頂端から基底（Ａ−Ｂ）への輸送（ｎ＝３つの足場）。（図４Ｅ）経時的な連続的なマウス２Ｄ単層中の異なる細胞系統。ここで示されている同じ単層のＴＥＥＲ＝２１Ωｃｍ２（第２日）、１１７Ωｃｍ２（第３日）、及び８８０Ωｃｍ２（第４日）。
【図５Ａ】乃至
【図５Ｅ】トランスウェルインサート／ハイドロゲル足場に対して下重ねになるリザーバーから架橋剤を拡散させることによって作出された、３Ｄコラーゲン足場。（図５Ａ）作製プロセスの模式図。（ｉ）ＰＴＦＥ多孔質膜を有するトランスウェルインサート。（ｉｉ）２００μＬコラーゲン溶液をインサートに追加し、次にＰＤＭＳ押し型を置いた。（ｉｉｉ）下部リザーバーからのＥＤＣ／ＮＨＳの拡散はコラーゲンを架橋した。（ｉｖ）ＰＤＭＳ押し型の離型は、マイクロウェル（直径＝７５μｍ、高さ＝２５０μｍ、ウェル間の中心間距離＝１２５μｍ）のアレイを持つ３Ｄコラーゲン足場を作出した。（図５Ｂ）３Ｄ足場の上視図。（図５Ｃ）３Ｄ足場の側視図。（図５Ｄ）３Ｄ足場が細胞成長をガイドしてインビトロの陰窩を形成するということを示す、模式図。（図５Ｅ）初代マウス結腸上皮細胞から３Ｄ足場上に形成されたインビトロ陰窩様構造を示す明視野画像。スケールバー＝１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ここで、本発明は、付随する図面の参照によって以下でより不足なく記載され、その中では本発明の実施形態が示される。しかしながら、本発明は多くの異なる形態で実施され得、本願に提示されている実施形態に限定されると受け取られるべきではない；むしろ、それらの実施形態は、本開示が徹底的且つ完全であり、本発明の範囲を不足なく当業者に伝えるように提供される。例えば、１つの実施形態について例解される特徴が他の実施形態に組み込まれ得、ある具体的な実施形態について例解される特徴がその実施形態から削除され得る。それ故に、本発明は、本発明の幾つかの実施形態においては、本願に提示されている何れかの特徴又は特徴の組み合わせが排除又は省略され得るということを企図する。加えて、本発明から外れない本願において提案される種々の実施形態の数々の変形及び追加は、本開示に鑑みて当業者には明らかであろう。ゆえに、次の記載は本発明の幾つかの具体的な実施形態を例解することを意図されており、その全ての順列、組み合わせ、及び変形を漏れなく指定することを意図されてはいない。
【００２１】
本願に引用される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照は、参照が呈示されている文及び／又は段落に該当する教示について、それらの全体が参照によって組み込まれる。
【００２２】
同様の番号は、一貫して同様の要素を言う。図中において、ある種の線、層、コンポーネント、要素、又は特徴の厚さは明瞭性のために誇張され得る。用いられているところでは、破線は別様に指定されない限り任意の特徴又は操作を図解している。
【００２３】
本願において用いられる術語は、具体的な実施形態を記載する目的のためのみであり、本発明の限定を意図されていない。本願において用いられる単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明瞭に別様に示さない限り複数形をも包含することを意図されている。さらに、用語「含む（comprises）」又は「含む（comprising）」は、本明細書において用いられるときには、述べられている特徴、物、ステップ、操作、要素、コンポーネント、及び／若しくは群、又はその組み合わせの存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、物、ステップ、操作、要素、コンポーネント、及び／若しくは群、又はその組み合わせの存在又は追加を妨げないということは理解されるであろう。
【００２４】
本願において用いられる用語「及び／又は」は、関連する挙げられている項目の何れか及び全ての可能な組み合わせ又は１つ以上と、選択肢（「又は」）として解釈されるときには組み合わせの欠如とを包含する。
【００２５】
本願において用いられる用語「約」は、量又は濃度及び同類等の測定可能な値に言及しているときには、指定の値の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又はさらには±０．１％の変動と、指定の値とを包摂することを意味されている。例えば、Ｘが測定可能な値であるところでは、「約Ｘ」は、Ｘと、Ｘの±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又はさらには±０．１％の変動とを包含することを意味されている。測定可能な値について本願において提供される範囲は、その中の何れかの他の範囲及び／又は個々の値を包含し得る。
【００２６】
別様に定められない限り、本願において用いられる全ての用語（技術及び科学用語を包含する）は、本発明が属する分野の業者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。さらに、普通に用いられる辞書に定められているもの等の用語は、明細書及び請求項の文脈中におけるそれらの意味と整合する意味を有すると解釈されるべきであり、本願において明白にそう定められない限り理想化された又は極端に形式的な意味で解釈されるべきではないということは理解されるであろう。周知の機能又は構築物は、簡潔性及び／又は明瞭性のために詳細には記載されずにあり得る。
【００２７】
ある要素が別の要素「の上にある」、「に取り付けられる」、「に接続される」、「とカップリングされる」、「に接触する」等と言われるときには、これは他方の要素の直接的に上にあり得、それに取り付けられ得、それに接続され得、それとカップリングされ得、及び／若しくはそれに接触し得、又は介在する要素もまた存在し得るということは理解されるであろう。対照的に、ある要素が例えば別の要素「の直接的に上にある」、「に直接的に取り付けられる」、「に直接的に接続される」、「と直接的にカップリングされる」、又は「に直接的に接触する」と言われるときには、介在する要素は存在しない。別の特徴に「隣接して」配されているある構造又は特徴への言及は、隣接する特徴に対して上重ねになる又は下重ねになる部分を有し得るということもまた当業者には分かるであろう。
【００２８】
空間的に相対的な用語、例えば「頂部（top）」、「底部（bottom）」、「の下に（under）」、「の下に（below）」、「下部（lower）」、「の上に（over）」、「上側（upper）」、及び同類は、本願においては、図中に図解されている別の要素（単数若しくは複数）又は特徴（単数若しくは複数）に対するある要素の又は特徴の関係性を記載するための記載の便のために用いられ得る。空間的に相対的な用語は、図中に図示されている定位に加えて、使用又は操作中のデバイスの異なる定位を包摂することを意図されているということは理解されるであろう。例えば、図中のデバイスが反転させられる場合には、他の要素又は特徴「の下（under）」又は「の下側（beneath）」と記載される要素は他の要素又は特徴「の上に（over）」定位するであろう。それ故に、例示的な用語「下（under）」は上及び下両方の定位を包摂し得る。デバイスは別様に（９０度回転されて、又は他の定位で）定位し得、本願において用いられる空間的に相対的な記述語は然るべく解釈される。
【００２９】
用語第１、第２等が本願において種々の要素、コンポーネント、領域、層、及び／又は部分を記載するために用いられ得るが、それらの要素、コンポーネント、領域、層、及び／又は部分はこれらの用語によって限定されるべきではないということは理解されるであろう。むしろ、これらの用語は、１つの要素、コンポーネント、領域、層、及び／又は部分を別の要素、コンポーネント、領域、層、及び／又は部分から区別するためにのみ用いられる。それ故に、本願において論じられる第１の要素、コンポーネント、領域、層、又は部分は、本発明の教示から外れることなしに第２の要素、コンポーネント、領域、層、又は部分と称され得る。操作（又はステップ）の順序は、具体的に別様に示されない限り、請求項又は図に呈示されている順に限定されない。
【００３０】
本願において用いられる「Ｘ及びＹの間」並びに「約Ｘ及びＹの間」等の句は、Ｘ及びＹを包含すると解釈されるべきである。本願において用いられる「約Ｘ及びＹの間」等の句は「約Ｘ及び約Ｙの間」を意味し、「約ＸからＹまで」等の句は「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。
【００３１】
本願において用いられる用語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含む（comprising）」は、述べられている特徴、物、ステップ、操作、要素、及び／又はコンポーネントの存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、物、ステップ、操作、要素、コンポーネント、及び／又はその群の存在又は追加を妨げない。
【００３２】
本願において用いられる移行句「から本質的になる」は、ある請求項の範囲が、請求項に記載されている指定の材料又はステップと、請求される発明の不可欠の新規の特徴（単数又は複数）に著しく影響を及ぼさないものとを包摂していると解釈されるべきであるということを意味する。それ故に、用語「から本質的になる」は、本発明の請求項に用いられるときには、「含む」と同等であると解釈されることを意図されていない。
【００３３】
用語「接触」又は「接触する」（或いはその文法的変形）は、細胞を本発明の足場に接触させること又は試験化合物若しくは微生物を本発明の生細胞コンストラクトと接触させることへの言及において用いられるときには、細胞を本発明の足場に、又は試験化合物若しくは試験微生物を本発明の生細胞コンストラクトに送達するための何れかの手段を言う。
【００３４】
１．上皮細胞．
本発明に有用な未分化の細胞及び／又は上皮細胞等の細胞は、何れかの起源の種であり得、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、及び昆虫を包含するが、これに限定されない。幾つかの実施形態において、細胞は哺乳類細胞であり得、その例は、ヒト、サル、類人猿、ヤギ、羊、犬、猫、馬、牛、及びブタからの上皮細胞を包含するが、これに限定されない。幾つかの実施形態において、細胞は初代組織に由来し得、幾つかの実施形態においては、細胞は癌又は腫瘍細胞ではない。上皮細胞を含む何れかの器官からの上皮細胞の何れかの型が用いられ得、胃腸管上皮細胞、泌尿器上皮細胞、呼吸器上皮細胞、生殖器上皮細胞、内分泌及び内分泌腺上皮細胞、リンパ管上皮細胞、血管上皮細胞、脳室上衣上皮細胞を包含するが、これに限定されない。
【００３５】
幾つかの実施形態においては、胃腸管上皮細胞が、例えば結腸、小腸、胃、食道、舌、鼻咽頭（nasopharnyx）、口咽頭、咽頭喉頭部（laryngeopharynx）、及び／又は膵臓から得られ得る。幾つかの実施形態においては、泌尿器上皮細胞が例えば腎臓又は膀胱から得られ得る。幾つかの実施形態においては、呼吸器上皮細胞が例えば気管又は肺から得られ得る。幾つかの実施形態においては、生殖器上皮細胞が例えば精巣、卵巣、導管、子宮内膜から得られ得る。幾つかの実施形態においては、内分泌及び内分泌腺上皮細胞が例えば甲状腺、副腎、副甲状腺、又は膵臓から得られ得る。幾つかの実施形態においては、脳室上衣上皮細胞が脳から得られ得るが、ニューロン又はアストロサイトを包含しない。
【００３６】
上皮細胞は、未分化の細胞（例えば、幹又は前駆細胞）、分化した細胞（例えば、エンテロサイト、パネート細胞、腸内分泌細胞、タフト細胞、マイクロセル、上皮内リンパ球、及び／又は杯細胞）、又はその組み合わせであり得、本発明が行われようとする具体的なステージ又は時間に依存する。
【００３７】
未分化の上皮細胞（例えば、胃腸管上皮細胞、泌尿器上皮細胞、呼吸器上皮細胞、生殖器上皮細胞、内分泌及び内分泌腺上皮細胞、リンパ管上皮細胞、血管上皮細胞、脳室上衣上皮細胞）を包含する上皮細胞は公知であり、公知技術、又は当業者には明らかであろうその変形に従って収穫又は提供され得る。例えば、Ｔ．イェン（Yen）及びＮ．ライト（Wright）著，「胃腸菅幹細胞ニッチ（The gastrointestinal tract stem cell niche）」，ステム・セル・レビューズ・アンド・リポーツ（Stem Cell Reviews and Reports），２巻（３号），ｐ．２０３−２１２（２００６年）；Ｓ．ウマル（Umar）著，「腸幹細胞（Intestinal Stem Cells）」，カレント・ガストロエンテロロジー・リポーツ（Current Gastroenterology Reports），１２巻（５号），ｐ．３４０−３４８（２０１０年１０月）；Ｐ．ジュン（Jung）等著，「ヒト結腸幹細胞の単離及びインビトロ拡大培養（Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells）」，ネイチャー・メディシン（Nature Medicine），１７巻，ｐ．１２２５−１２２７（２０１１年）；Ｊ．ミルズ（Mills）及びＲ．シブダサニ（Shivdasani）著，「胃上皮幹細胞（Gastric epitherial stem cells）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），１４０巻（２号），ｐ．４１２−４２４（２０１１年２月）；Ａ．デウォード（DeWard）、Ｊ．クレイマー（Cramer）、及びＥ．ラガス（Lagasse）著，「マウス食道の細胞不均質性は非静止期上皮幹細胞集団の存在を示唆する（Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population）」，セル・リポーツ（Cell Reports），９巻（２号），ｐ．７０１−７１１（２０１４年１０月２３日）；Ａ．グラッツ（Gracz）等著，「ＣＤ２４及びＣＤ４４は活性及び条件的幹細胞の特徴を有するヒト腸上皮細胞集団のマーカーである（CD24 and CD44 Mark Human Intestinal Epithelial Cell Populations with Characteristics of Active and Facultative Stem Cells）」，ステムセルズ（Stem Cells），３１巻（９号），ｐ．２０２４−３０（２０１３年）；Ｆ．ワン（Wang）等著，「表面マーカー組み合わせ及びコロニー形成アッセイに基づく腸幹細胞の単離及びキャラクタリゼーション（Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），１４５巻（２号），ｐ．３８３−９５（２０１３年）を見よ。
【００３８】
２．支持体、生細胞コンストラクト、及び作る方法．
上に書かれているように、本発明は生細胞コンストラクト及び支持体、並びにそれを作る方法を提供する。一般的に、方法は：
（ａ）頂部表面及び底部表面を有する非細胞性支持体を提供することと、
（ｂ）未分化の生細胞（例えば、幹及び／又は前駆細胞）を非細胞性支持体に（典型的にはその頂部表面において）接触させることと、それから
（ｃ）上皮細胞単層を支持体上で（典型的にはその頂部表面において）増やすことと、
によって行われる。
【００３９】
未分化の細胞は何れかの好適な型であり得、間葉系幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、限定なしに、胃腸管上皮、泌尿器上皮、呼吸器上皮、生殖器上皮、内分泌及び内分泌腺上皮、リンパ管上皮、血管上皮、及び／又は脳室上衣上皮から得られるか又はそれに由来する幹細胞を包含するが、これに限定されない。
【００４０】
単層中の生細胞は、分化した細胞（例えば、エンテロサイト、パネート細胞、腸内分泌細胞、タフト細胞、マイクロセル、上皮内リンパ球、及び／又は杯細胞）及び未分化の細胞（例えば、幹又は前駆細胞）両方を組み合わせとして（例えば、１：１０，０００、２：１０，０００、又は１０：１０，０００から、最大１０，０００：１、１０：０００：２、又は１０，０００：１０までの比で）含み得る。幾つかの実施形態において、方法は、さらに：
（ｄ）培養培地を生細胞の単層に接触させるステップを包含し得（例えば、この培養培地は支持体中又は上にある）、この培養培地が生細胞の単層を持続させる。幾つかの実施形態において、培養培地は、短鎖脂肪酸（例えば、酪酸、酢酸、プロピオン酸、バルプロ酸等）を生理的濃度で（例えば、結腸については０．１〜５ｍＭの範囲で）包含し得る。培養培地は、下でさらに論じられるように典型的な栄養素、成長因子、及びシグナル因子、並びに同類をもまた包含し得る。
【００４１】
幾つかの実施形態においては：（ｉ）培養培地は１０ミリモーラー以下の単糖プラス二糖を含有し（組み合わせの合計）；同時に（ｉｉ）培養培地は少なくとも２ミリモーラーの前記短鎖脂肪酸を含有し得る（例えば、組み合わせの合計で最大２０、５０、又は１００ミリモーラーまでの短鎖脂肪酸）。
【００４２】
有利には、単層は長時間持続させられ得、増やされ得る。時間の長さの上限は観察されなかった。例えば、単層は、少なくとも２、３、４、５、６、若しくは７日、２、３、若しくは４週間、又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月、２年、３年、又はそれ以上の時間に渡って持続させられ得、増やされ得る。それ故に、幾つかの実施形態において、単層は、約１日から約２年、約１週間から約２年、約１ヶ月から約２年、約６ヶ月から約２年、約１週間から約２ヶ月、約１週間から約４ヶ月、約１週間から約６ヶ月、約１ヶ月から約４ヶ月、約１ヶ月から約６ヶ月、約１ヶ月から約９ヶ月、約１ヶ月から約１年、約１ヶ月から約１８ヶ月、約１ヶ月から約２年まで、及びその中の何れかの範囲又は値、持続させられ得、増やされ得る。
【００４３】
本発明に用いられる支持体（場合によっては細胞外マトリックス又は「ＥＣＭ」と言われる）は下の例及び下の議論に記載されている。支持体は有機、無機、又はその複合物であり得る。幾つかの実施形態において、支持体は、コラーゲン等の有機ポリマーを、典型的には下で論じられる他の成分との組み合わせとして含む。多くの実施形態において、支持体は多孔質である。支持体は、また下で論じられるように、それに構造的な支持を授けるために多孔質担体（例えば、多孔質膜、メッシュ、無機グリッド、ハイドロゲル、又はその組み合わせ）上に提供又はマウントされ得る。支持体は何れかの好適な形状又は構成であり得、平ら、管状、湾曲、球形、楕円体等を包含し、そこの複合物を包含する（例えば、マクロ解剖学的構造を真似るため）。
【００４４】
有機ポリマー支持体の架橋．上に書かれているように、本発明の幾つかの実施形態において、支持体は架橋され得る有機ポリマーを含む。
【００４５】
何れかの好適な架橋剤が、本発明を行うために単独で又は互いとの組み合わせとして用いられ得る。かかる架橋反応を行うための数々の例及び条件が公知である。例えばＵＳ特許Ｎｏ．９，２８３，３０１；９，２７２，００４；９，２００，６７６；９，２１１，３６２；９，２０５，１７２；９，１３２，２０８；９，０４０，６６５；及び８，９４６，３０５を見よ。
【００４６】
架橋剤は共有結合的又は非共有結合的（例えばイオン性）架橋結合を作り出し得る。非共有結合的な架橋剤の例はカルシウムイオン等のイオンを包含する。架橋剤の具体的な例は、カルボジイミド（ＣＢＤ；例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド若しくは「ＥＤＣ」；ジシクロヘキシル−カルボジイミド若しくは「ＤＣＣ」等）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ−エステル）、イソチオシアネート、イソシアネート、アジ化アシル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、酸無水物、及び／又はフルオロフェニルエステル架橋剤、並びにその何れかの組み合わせを包含するが、これに限定されない。
【００４７】
光増感剤架橋剤．幾つかの実施形態において、架橋剤は光増感剤であり得、これは光線（例えば紫外光）を吸収し、今度は足場の架橋に至る。例えば、紫外光は、リボフラビンが架橋剤／光増感剤として用いられるときにコラーゲン支持体を架橋し得る（例えば、Ｇ．ウォレンサック（Wollensak）等著，「円錐角膜の処置のためのリボフラビン／紫外ａによって誘導されるコラーゲン架橋（Riboflavin/ultraviolet-a-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus）」，アメリカン・ジャーナル・オブ・オフサルモロジー（American Journal of Ophthalmology），２００３年５月；１３５巻（５号）：ｐ．６２０−７を見よ）。幾つかの実施形態においては、リボフラビンがＵＶ線を吸収し、活性酸素種及びフリーラジカルを作出し、これはコラーゲン（例えばコラーゲンハイドロゲル）の架橋を引き起こす。例えば、コラーゲンハイドロゲルの底部にリボフラビンを置くことによって、架橋密度の勾配が作り出され得る。リボフラビンはハイドロゲル中に拡散し、リボフラビンの勾配がハイドロゲルのｚ軸に沿って確立される。ハイドロゲルが頂部側においてＵＶ線に暴露されるときには、架橋密度の勾配が作り出される。リボフラビンに加えて、好適な光増感剤架橋剤の例は、フィボフラビン、フォトフリン、６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸スルホスクシンイミジル、4−アクリロイルオキシベンゾフェノン、フェニル−（１−アクリロイルオキシ）−シクロヘキシルケトン、及び／又は１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン（ＩＲＧＡＣＵＲＥ１８４）を包含するが、これに限定されない。
【００４８】
内腔又は陰窩の形成を促進するためのウェルを有する支持体．幾つかの実施形態において、支持体頂部表面はその中に形成された複数のウェルを有し、ウェルのそれぞれは頂部開口部、側壁、及び床部を有する（典型的には、支持体全体にまたがって伸びてはいない）。上皮細胞単層はウェル中に−即ちウェル側壁及び（一般的に）床部上に広がり得、ウェル頂部開口部は開いたままであって、細胞によって内張りされた開いた内腔（又は「陰窩」）をウェル中に形成する。
【００４９】
幾つかの実施形態において、ウェルは約１００から約１０００ミクロンの深さ又はそれ以上であり得（例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００ミクロンの深さ又はそれ以上、及びその中の何れかの範囲又は値）、及び／又はウェルは約１０から約２００ミクロンの幅であり得る（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ミクロンの幅又はそれ以上、及びその中の何れかの範囲又は値）。幾つかの実施形態においては、ウェルの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個が頂部表面に形成される。ウェルの何れかの好適な数が頂部表面に形成され得るが、幾つかの実施形態においては、少なくとも約１０から約１００ウェルが形成され得（例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００ウェル、及びその中の何れかの範囲又は値））、最大約１，０００から約１０，０００又はそれ以上までのウェルが形成され得（例えば、約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００又はそれ以上のウェル）、コンストラクトの具体的な使用に依存する。それ故に、幾つかの実施形態において、ウェルは１００、２００、若しくは３００ミクロンの深さから最大８００若しくは１０００ミクロンの深さ若しくはそれ以上までであり得、及び／又は前記ウェルは１０若しくは５０ミクロンの幅から最大１００若しくは２００ミクロンの幅若しくはそれ以上までである；及び／又は前記ウェルの少なくとも１０、５０、若しくは１００個が前記頂部表面に形成される。
【００５０】
ウェルは、正方形、長方形、円形、若しくは楕円形プロファイル、又はその他の複合物を包含する何れかの好適な幾何形状を有し得る；垂直な若しくは傾斜した側壁、又はその組み合わせを有し得る；平らな若しくは丸まった床部、又はその組み合わせを有し得る；等である。
【００５１】
上に記載されているもの等のコンストラクトでは、幹細胞（及び／又は分化した細胞、若しくは分化した幹細胞の型）の勾配が単層中に形成され得る。これは：（ａ）上に記載されているコンストラクトを提供することと；（ｂ）第１の培養培地をコンストラクト頂部表面に接触させることと；（ｃ）第２の培養培地（第１の培養培地とは異なる）をコンストラクト底部表面に接触させることとによって達成され得る。幾つかの実施形態において、培養培地の１つは増えている幹及び前駆細胞の分化を誘導し、培養培地の他方は未分化の細胞の増えることを誘導する（例えば、下でさらに論じられるように、適切なシグナル因子の包含による）。幾つかの実施形態（embodments）においては、下でさらに論じられるように、勾配はウェル壁に対して定位又は整列し得る（例えば、幹細胞対分化した細胞の比が頂部よりもウェルの底部において高いか、又は逆）。
【００５２】
他の支持体材料．コラーゲンのほかに、ＥＣＭの他の型が本発明のバイオミメティック足場を構築するために用いられ得る。それらは、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸（heparin sulfate）、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸（keratin sulfate）、ヒアルロン酸、エンゲルブレット−ホルム−スワームマウス肉腫細胞によって分泌される膠様蛋白質混合物（例えばマトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、ＭａｘＧｅｌ（商標）等）、及び上のＥＣＭの混合物（例えば、コラーゲン／マトリゲル混合物）を包含するが、これに限定されない。天然ポリマー及び合成ポリマーからのハイドロゲルもまたこの足場を構築するために用いられ得、次に足場をＥＣＭ分子によって表面加工する。天然ポリマー及び合成ポリマーの例は、キトサン、アガロース、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、ポリエチレングリコール、合成ペプチド等を包含する。
【００５３】
上に書かれているように、支持体は、無機、又は有機及び無機材料の複合物でもまたあり得る。支持体にとって好適な無機材料の例は、ガラス、ヒドロキシアパタイト、４５Ｓ５バイオガラス等のバイオガラス、リン酸カルシウム、ケイ素、酸化ケイ素、酸化チタン、金、酸化アルミニウム等を包含するが、これに限定されない。本来的に多孔質ではないところでは、これらの材料は種々の方法によって多孔質にされ得、焼結、エッチング、リーチング、リソグラフィー等を包含するがこれに限定されない。例えば、ケイ素及び金の多孔質メッシュはリソグラフィー／エッチングによって作製され得る。
【００５４】
本発明の支持体又は足場は、透過性、剛性、及びＥＣＭコンポーネントの存在の点で生物物理学的微小環境（粘膜固有層）を模倣又は実質的に模倣し得る。幾つかの実施形態において、足場は、約５１〜１００ｗｔ％の水（例えば、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ｗｔ％、及び同類、並びにその中の何れかの範囲又は値）と約０〜４９ｗｔ％のポリマー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９ｗｔ％、及び同類、並びにその中の何れかの範囲又は値）とを含むポリマーハイドロゲルから作製され得る。それ故に、幾つかの実施形態において、ポリマーハイドロゲルは、約６０ｗｔ％の水及び約４０ｗｔ％のポリマー、約６５ｗｔ％の水及び約３５ｗｔ％のポリマー、約７０ｗｔ％の水及び約３０ｗｔ％のポリマー、約７５ｗｔ％の水及び約２５ｗｔ％のポリマー、約８０ｗｔ％の水及び約２０ｗｔ％のポリマー、約８５ｗｔ％の水及び約１５ｗｔ％のポリマー、約９０ｗｔ％の水及び約１０ｗｔ％のポリマー、約９１ｗｔ％の水及び約９ｗｔ％のポリマー、約９２ｗｔ％の水及び約８ｗｔ％のポリマー、約９３ｗｔ％の水及び約７ｗｔ％のポリマー、約９４ｗｔ％の水及び約６ｗｔ％のポリマー、約９５ｔ％の水及び約５ｗｔ％のポリマー、約９６ｗｔ％の水及び約４ｗｔ％のポリマー、約９７ｗｔ％の水及び約３ｗｔ％のポリマー、約９８ｗｔ％の水及び約２ｗｔ％のポリマー、約９９ｗｔ％の水及び約１ｗｔ％のポリマー、約９９．５ｗｔ％の水及び約０．５ｗｔ％のポリマー、約９９．９ｗｔ％の水及び約０．１ｗｔ％のポリマー、約９９．９ｗｔ％の水及び約０．０１ｗｔ％のポリマー、並びにその中の何れかの範囲又は値を含み得る。幾つかの実施形態において、ポリマーハイドロゲルは、約０．０１〜１０ｗｔ％の範囲のポリマーと約９０〜９９．９９ｗｔ％の範囲の水とを含む。幾つかの実施形態において、ハイドロゲルはコラーゲンハイドロゲルであり得、ポリマーは約０．０１〜１０ｗｔ％の範囲であり得、水は約９０〜９９．９９ｗｔ％の範囲であり得る。
【００５５】
ポリマーは天然ポリマー（例えばコラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、ラミニン、キトサン、アガロース等）及び／又は合成ポリマー（ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等）を包含し得る。足場は、それらの表面にＥＣＭ蛋白質の層を有するように誂えられている非ハイドロゲル材料から作製され得る。足場は、栄養素、因子、代謝物質、及び他の分子の通過を許すように多孔質又は透過性であり得る。この透過性のおかげで、かかる足場上で成長した組織は組織の面に直交する勾配に晒され得る。勾配は組織の表面に平行して、即ち組織表面上にもまた形成され得る。３Ｄ足場上の垂直の勾配は、足場上の成長因子の勾配の適用によって、同じ足場上において幹細胞及び分化した細胞両方を維持する。足場は再生医療用途のための移植を許すように生分解性であり得る。足場は固体表面に取り付けられ得、又は自立し得る。足場は細胞性材料（細胞、組織、血液、微生物叢）又は非細胞性材料（薬物、ポリマービーズ、磁性粒子等）と混合され得る。幾つかの実施形態において、培地への酪酸ナトリウムの追加は足場上における結腸上皮細胞の培養を向上させ得る。幹細胞が自己複製のためのソースを提供するので、組織は長命であり得る。３Ｄ足場は微小構造（例えば、マイクロウェル、マイクロポスト、チャネル、ストライプ、及び他の微小構造）を含有し得る。方法は、結腸上皮から他の健康な胃腸管（ＧＩ）上皮組織（小腸、胃、食道、舌、膵臓等を包含する）、及び幹細胞を持つ非ＧＩ組織（肝臓、脳、毛包、腎臓、網膜上皮等）、並びに有疾患組織にまで広げられ得る。
【００５６】
インビトロの陰窩を形成若しくはそれに影響するか、又はそれらの機能を変えるために用いられ得る他の因子、化学薬品、及び薬物．因子（Ｗｎｔ、ＢＭＰ［骨形成蛋白質］、及びＮｏｔｃｈ）のシグナルの勾配は、細胞位置及び増殖を制御することによって陰窩極性に関与すると考えられている。上に記載されているＷｎｔ−３Ａ蛋白質の勾配のほかに、他の因子、低分子、及び薬物が、組織の極性化を誘導するための細胞シグナル経路を制御するために用いられ得る。因子、低分子、及び薬物は、Ｗｎｔ、ＢＭＰ、ＧＲＥＭ１，２、Ｎｏｔｃｈシグナル経路の活性化剤及び阻害剤を包含し得るが、これに限定されない。例は、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗｎｔ活性化剤）、ＩＷＰ（Ｗｎｔ阻害剤）、Ｙ−２７６３２（Ｎｏｔｃｈ阻害剤）、Ｎｏｇｇｉｎ（ＢＭＰ阻害剤）、Ｊａｇｇｅｄ１（Ｎｏｔｃｈ活性化剤）、Ｇｒｅｍｌｉｎ（ＢＭＰアンタゴニスト）、サイトカイン、食物化合物（繊維、酪酸、他の脂肪酸、代謝物質）等である。他の脂肪酸はプロピオン酸及び／又は酢酸を包含し、これらは繊維の細菌発酵によって生ずる短鎖脂肪酸である。追加の代謝物質は、分枝鎖脂肪酸、胆汁酸及び微生物由来の二次胆汁酸、尿素、アミン、アンモニア、乳酸、フェノール、インドール、硫黄、二酸化炭素、水素、硫化水素、並びに／又はメタンを包含するが、これに限定されない。代謝物質は、複合炭水化物（可溶性繊維）、豆類、及び難消化性澱粉からのものを包含し得（amy）、微生物叢から生じ得る。本発明に有用な他の化学薬品は、抗利尿ホルモン、瀉下薬、細菌性エンドトキシン、ホルモン（例えばＶＩＰ）、及び内因性の物質（例えば胆汁酸）、アルドステロン、ソマトスタチン、アルファ２−アドレナリン作動薬（例えばクロニジン）、アセチルコリン、一酸化窒素、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等を包含する。
【００５７】
他の膜がバイオミメティック足場の下側に用いられ得る。バイオミメティック足場は上で記載されているように支持体上に作製され得る。支持体は、多孔質膜（ポリテトラフルオロエチレン［ＰＴＦＥ］、ポリエステル、ポリカーボネート、及び／又はセルロース）、メッシュ（ナイロン、生分解性ポリマー、金属）、無機グリッド（grit）材料、及び／又はハイドロゲル、並びに他のものを包含するが、これに限定されない。
【００５８】
他の足場が、２Ｄ単層中の腸上皮細胞の長期増殖活性及び生存能を支持するために用いられ得る．足場は、透過性、剛性、及びＥＣＭコンポーネントの存在の点で生物物理学的微小環境（粘膜固有層）を模倣し得る。足場は、約５１〜１００ｗｔ％の水と約０〜４９ｗｔ％のポリマーとを含み得るポリマーハイドロゲルから作製され得る。ポリマーは天然ポリマー（例えば、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、ラミニン、キトサン、アガロース等）及び／又は合成ポリマー（ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等）を包含し得る。足場は、それらの表面にＥＣＭ蛋白質の層を有するように誂えられている非ハイドロゲル材料から作製され得る。幾つかの実施形態において、足場は、栄養素、因子、代謝物質、及び他の分子の通過を許すように多孔質又は透過性であり得る。足場は、体への移植を許すように生分解性であり得る。足場は固体表面に取り付けられ得、又は自立し得る。足場は細胞性材料（免疫細胞若しくは他の細胞型、組織、血液）又は非細胞性材料（薬物、ポリマービーズ、磁性粒子等）と混合され得る。培地への酪酸ナトリウム等の短鎖（例えば、Ｃ１からＣ４又はＣ６）脂肪酸の追加は、足場上における結腸上皮細胞の培養を向上させ得る。幾つかの実施形態において、３Ｄ足場は、足場上の成長因子の勾配を適用することによって、同じ足場上において幹細胞及び分化した細胞両方を維持し得る。幹細胞が自己複製のためのソースを提供するので、組織は長命であり得る。３Ｄ足場は微小構造（例えばマイクロウェル、マイクロポスト、チャネル、ストライプ、及び他の微小構造）を含有し得る。本発明の方法は、結腸上皮から他の健康な胃腸管（ＧＩ）上皮組織（小腸、胃、食道、舌等を包含する）、及び幹細胞を持つ非ＧＩ組織（肝臓、脳、毛包、腎臓、網膜上皮等）、並びに有疾患組織にまで広げられ得る。
【００５９】
固体支持体へのカップリングのための所期の化合物．上に書かれているように、固体支持体中の架橋の勾配は、ポリマー上の未架橋の、ゆえに自由なアミノ及び／又はカルボキシ基の対応する勾配をもまた作り出し得る。かかるアミノ及び／又はカルボキシ基は、所期の化合物を固体支持体にカップリングするために利用され得、所期の化合物が、対応する勾配様式又は構成で支持体にカップリングされる。好適なカップリング反応は当分野において公知である。
【００６０】
所期の何れかの好適な化合物が、自由なアミノ又はカルボキシ基に取り付けられ得る。例は：（１）成長因子、例えば上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、Ｗｎｔ蛋白質、Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ蛋白質、Ｎｏｇｇｉｎ等；分化因子、例えば骨形成蛋白質、トランスフォーミング成長因子ベータ蛋白質、成長分化因子蛋白質等；及び細胞外マトリックス蛋白質及び細胞接着分子、例えばプロテオグリカン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ＲＧＤペプチド、ビトロネクチン、ｌｅｕｋａｄｈｅｒｉｎ１等；及び同類を包含する蛋白質、（２）細胞調節ペプチド、例えば細胞接着ペプチド（例えばＲＧＤ配列）、免疫調節ペプチド、例えばベータ−カゼイン（５４〜５９）、アルファラクトアルブミン（５１〜５３）、ＡＣＥ阻害剤、ブラジキニン等；無機物結合ペプチド、例えばＳｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ等；抗微生物ペプチド、例えばラクトフェリン断片、ディフェンシン等；抗酸化ペプチド；血管作動性腸管ペプチド、例えばＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド）、ＰＡＣＡＰ下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、ペプチドヒスチジンイソロイシン２７、成長ホルモン放出ホルモン、グルカゴン、セクレチン等、及び同類を包含するペプチド；並びに（３）脂肪酸、例えば酪酸、酢酸、カプロン酸、コハク酸等；胆汁酸、例えばデオキシコール酸；フラボノイド、例えばルテオリン、ケルセチン（quercitin）等；フィトエストロゲン、例えばダイジン、ゲニスチン等；フェノール、例えばタンニン酸、没食子酸等；スチルベン、例えばレスベラトロール、アグリコン（aglcone）等；クルクミノイド、例えばデメトキシクルクミン等；カルコノイド、例えばカルコン等；テルペノイド、例えばイソプレン、ユーカリプトール等；カロテノイド、例えばベータ−カロテン等；フィトステロール、例えばベータ−シトステロール等；及び同類を包含する代謝物質（一般的に、小さい単量体有機化合物）を包含するが、これに限定されない。
【００６１】
３．実用性．
殆どの上皮組織の現行のインビトロモデルは、腫瘍に由来する不死化細胞株の使用に尚頼っている。例えば、結腸癌腫に由来するＣａｃｏ−２細胞は腸上皮を模倣することに広く用いられている２６−２８。それらの腫瘍細胞株は連続した単層を形成し得るが、それらの癌表現型はインビボで見出される正常な組織生理又は微小アーキテクチャーを不良に反映する。この件はインビトロ組織モデルの重大な課題の１つを指摘しており、それは、インビボの器官系をより代表する系を形成するための、正常組織に由来する初代細胞の使用である２９。３Ｄオルガノイド培養系は、初代細胞に由来する細胞の連続培養のこの必要性を克服したが、スフェロイド様オルガノイドの閉鎖的アーキテクチャーによって限定されたままであり、従来の組織培養系に典型的な標準的な開いた表面とは反対に膠様層内で培養される必要がある（例えば、これは、平らな表面上に成長した、極性化した上皮と露出した内腔表面とを有する全ての層（即ち上皮及び間葉）から成るカルバン・クオ（Calvin Kuo）の気液界面培養物と対比され得る。違いは、再び、それらが長命ではなく、成長及び分化がある種の程度までランダムでありコントロールされていないということである）。この表面は平面的又は複雑であり得るが、閉じた構造であるオルガノイドとは違って開いたアーキテクチャーを有することを特徴とする。開いたアーキテクチャーを特徴とする培養系を発明することによって、本発明は、オルガノイド系の制約を克服し、従来の組織培養方法、及び自動化されたハイスループットな培養及び分析プラットフォームに用いられる現行のロボティクスと適合する初代細胞から構成される上皮組織の培養物を作った。開いたアーキテクチャー及び透過性の基材は、上皮表面に平行及び直交の両方である可溶性因子の勾配下における細胞の培養を可能にする。開いたアーキテクチャーは、閉鎖系では可能でない上皮バリア機能、吸収、及び分泌のアッセイを可能にし得る。ここでは、上重ねになる細菌及びマイクロバイオームの他のコンポーネントとの初代上皮の相互作用もまた可能である。それらのエクスビボ組織は、とりわけマウス、ブタ、及びヒトを包含する種々の種から作り出され得る。トランスジェニック動物から発展したモデル系、遺伝子改変されたヒト幹細胞（例えばＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ）、人工多能性幹細胞、並びに具体的な疾患を有する動物及びヒト生物に由来する幹細胞は、それらの組織を作り出すために用いられ得る材料の他の限定しない例である。健康及び有疾患のソースから、及び異なる遺伝学的バックグラウンドの細胞からそれらの組織を作り出す能力は、薬物をスクリーニングすること、疾患メカニズムの研究、及び基礎生物学の研究にとって重要であろう。バイオミメティック足場上又は内において共培養される種々の他の細胞型（例えば、インビボの具体的な上皮組織と共存して見出される免疫細胞、線維芽細胞、及び他のもの）の追加は、細胞−細胞相互作用と組織に及ぼす薬物及び代謝物質の効果とを理解することにとって有益であろう。我々は、初代組織を用いてバイオミメティック足場上に作出される上皮組織が、上皮組織の研究のための現行の細胞モデルよりも優れていると断定する。��は幾つかの例であるが、このリストは包括的ではない。
【００６２】
１）生理的研究のためのインビトロモデル（腸上皮細胞を横断する分子輸送、誘導される酵素機能、細菌との相互作用）；
２）薬物、バイオロジクス、毒素、変異原、食物化合物、病原体、ウイルス、微生物叢等のスクリーニング研究；
３）コントロールされた条件（酸素分圧、薬物暴露、食物化合物、代謝物質等）下における微生物叢のスクリーニング研究；
４）トランスレーショナル動物モデル又はヒトに由来する幹及び初代細胞を用いることによる疾患モデル；
５）薬物、食物化合物等の網羅的な用量反応プロファイルを包含する、スクリーニングのための薬理学的及び薬物動態学的モデル；
６）代謝を研究するためのインビトロモデル；
７）バリア機能を維持するための上皮組織の創傷治癒のインビトロモデル；
８）細菌−上皮相互作用を研究するためのインビトロモデル；
９）有損傷上皮を修復するための移植のための組織工学；
１０）具体的な遺伝学的バックグラウンド及び個々の患者に対して実行される研究による個別化医療；
１１）アッセイの実行：例えば、水及び電解質（ナトリウム、塩化物、プロトン、重炭酸、カリウム）の吸収、並びに未吸収の栄養素の回収；
１２）粘液の流れ、移動、及び産生、並びに嚢胞性線維症等におけるこれから発生する疾患の影響；
１３）止痢剤のアッセイ；
１４）オピエート、及び便秘の処置、例えば下剤のアッセイ；
１５）シン、プレ、及びプロバイオティクス薬剤のアッセイ；
１６）放射線不透過性及びシンチグラフィーマーカー、並びに上皮に及ぼすそれらの影響のアッセイ；
１７）上皮に及ぼす免疫細胞及びそれらの産物（抗体及びサイトカイン）の影響；
１８）可溶性及び不溶性繊維と上皮に及ぼすその影響とのアッセイ；
１９）何れかの型の傷害に応答した上皮の応答及び修復を理解すること；
２０）偽膜形成に至る細菌、例えばクロストリジウム・ディフィシルの調査；
２１）発癌性化合物のスクリーニング；
２２）生物戦化合物のスクリーニング；
２３）ＮＳＡＩＤ処置の副作用としてのＧＩ出血を防ぐための研究；
２４）上皮インテグリティー及び疾患（例えば、炎症性腸疾患、腸症、癌等）における免疫系の役割の研究；
２５）放射線及び化学治療薬、並びにオフターゲット効果を改善する薬剤のアッセイ；
２６）エクスビボの組織拡大培養。
【００６３】
上の用途は平面的なインビトロ組織コンストラクトによって可能になる研究に主に関するが、コンストラクトは体の有損傷又は有疾患組織の修復のために新たな組織を作り出すための手段として見込まれ得る。例えば、２Ｄ単層は次の通り再生医療に用いられ得る：幹細胞が、（例えば炎症性腸疾患からの）消化器上皮損傷を有する患者の生検から得られ得る。幹細胞は、多数の増殖性細胞を作出するために足場上で拡大培養され得る。細胞は培養ベッセルから分離され、有損傷上皮組織を修復するために同じ患者に戻され得る。
【００６４】
４．スクリーニング方法．
それ故に、上に書かれているように、幾つかの実施形態において、本発明は、試験化合物又は微生物を毒物学的、生理学的、又は発癌性効果についてスクリーニングする方法を提供し：（ａ）試験化合物又は微生物を本発明のコンストラクトに接触させることと；（ｂ）前記コンストラクトの細胞に及ぼす前記試験化合物又は微生物の毒物学的、生理学的、又は発癌性効果を検出することと（例えば、前記接触後のコンストラクトを、前記試験化合物若しくは微生物が接触させられていない同様のコンストラクトと比較することによってであり、及び／又は前記接触ステップ後のコンストラクトを前記接触ステップ前の前記コンストラクトと比較することによる）を含む。幾つかの実施形態において、本発明は、試験化合物又は微生物を毒物学的、生理学的、又は発癌性効果についてスクリーニングする方法を提供し：（ａ）上に記載されているコンストラクトを提供することと；（ｂ）試験化合物又は微生物を前記コンストラクトに接触させることと；それから（ｃ）前記コンストラクトの細胞に及ぼす前記試験化合物又は微生物の毒物学的、生理学的、又は発癌性効果を検出することと（例えば、前記接触後のコンストラクトを、前記試験化合物又は微生物が接触させられていない同様のコンストラクトと比較することによってであり、及び／又は前記接触ステップ後のコンストラクトを前記接触ステップ前の前記コンストラクトに接触させることによる）を含む。
【００６５】
幾つかの実施形態において、試験化合物は芳香族有機化合物、脂肪族有機化合物、混合された芳香族及び脂肪族有機化合物であり得る。例えば、幾つかの実施形態において、スクリーニングのための化合物は、天然産物である化合物、プレバイオティクス、プロバイオティクス、食材、発癌物質、薬物、薬物代謝物質、細菌性の代謝物質及び／又は毒素、刺激物質、土壌化合物、摂取の可能性がある毒素、並びに同類であり得る。
【００６６】
幾つかの実施形態において、試験微生物はグラム陰性細菌、グラム陽性細菌、酵母、及び糸状菌からなる群から選択され得る。例えば、幾つかの実施形態において、微生物は哺乳動物の通常の又は健康な腸内フローラ（又は「マイクロバイオーム」）に見出される型の細菌であり得る。幾つかの実施形態において、哺乳動物はヒトであり得る。例えばＵＳ特許出願公開Ｎｏ．ＵＳ２０１４００９３４７８を見よ。幾つかの実施形態において、微生物は感染性生物であり得、クロストリジウム、コレラ、サルモネラ、赤痢菌、寄生虫（条虫、蟯虫、鉤虫等）、アメーバ（ジアルジア等）、及び同類を包含するが、これに限定されない。それ故に、幾つかの実施形態において、微生物は腸内細菌又は病原体であり得、良性及び感染性腸内細菌及び病原体両方を包含する。
【００６７】
好適な検出方法は、免疫組織化学、ＤＮＡのＰＣＲ、ｍＲＮＡ発現、ＲＮＡシーケンシング、経上皮電気抵抗、輸送アッセイ（イオン、化合物、蛋白質等）、分泌アッセイ、電子顕微鏡法、フローサイトメトリー、上清又はリザーバーの質量分析、それのＥＬＩＳＡ及び放射化学アッセイ、それの蛍光に基づくセンサー、並びに上皮細胞への微生物接着を包含するが、これに限定されない。
【００６８】
本発明は次の限定しない例においてより詳細に説明される。結腸単層の具体的な例が与えられているが、本願に記載されるように上皮細胞を含む何れかの器官からの上皮細胞の他の型からの単層もまた形成され得るということは分かるであろう。幾つかの実施形態においては、結腸、小腸、腸、胃、食道、舌、鼻咽頭、口咽頭、咽頭喉頭部（laryngeopharynx）、膵臓、腎臓、膀胱、気管、肺、精巣、卵巣、生殖器の導管、子宮内膜、甲状腺、副腎、副甲状腺、脳室上衣、及び／又は脳からの上皮細胞が、下に記載されているものと同様の様式で、又は当業者には明らかであろうかかる技術の変形によって用いられ得る。
【００６９】
コラーゲン又はゼラチン等の他の蛋白質から構成されるハイドロゲル６は、種々の確立された架橋アプローチによって強化され得７、例えばグルタルアルデヒド８、ポリ（エチレングリコール）エーテルテトラスクシンイミジルグルタレート９、トランスグルタミナーゼ１０、Ｎ−エチル−Ｎ’−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）１１、ポリエポキシド１２、及びゲニピン等の天然産物１３という架橋剤を用いることによる。本発明においては、ＥＤＣ／ＮＨＳがコラーゲンハイドロゲルを架橋するために例として用いられる。ここで概説されている方法は、種々の他の架橋アプローチの何れか及び他のハイドロゲルに適用され得る。ＥＤＣ／ＮＨＳに基づくカルボジイミドカップリングは、ユニークな利点をそのゼロ長架橋に有する。即ち、ＥＤＣ／ＮＨＳはカルボン酸基を活性化し、アミン残基とのそれらの反応を促進し、アミド結合の形成をもたらす。ＥＤＣ／ＮＨＳ分子はコラーゲンハイドロゲル中には組み込まれず、それらは架橋反応後に足場からリーチング又は除去される。結果として、ＥＤＣ／ＮＨＳ修飾されたコラーゲン足場は事実上細胞毒性を不含である１４。
【００７０】
我々は、以前の公開されたプロトコールによって、４ｈの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ５、０．１Ｍ）中の６００ｍＭのＥＤＣ及び１５０ｍＭのＮＨＳ中におけるインキュベーションによってコラーゲンハイドロゲルを架橋することを試みた。この実験では、架橋溶液をマトリックスの上のリザーバーに追加した。しかしながら、この様式で架橋されたコラーゲン足場は、それらの細胞を足場の表面に追加したときに初代マウス結腸上皮細胞の増殖を支持し得なかった（データは示さない。＞１０試行）。不良な細胞成長特性の理由は、ＥＤＣ／ＮＨＳ架橋が剛性を増大させ（架橋前：１１８±１３６Ｐａ［ｎ＝６９回の測定］；架橋後：２，３０２±１，４１１Ｐａ［ｎ＝５３］）、且つＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）と細胞接着を媒介するインテグリンの他の認識配列とを修飾し（例えばＬ−アスパラギン酸［Ａｓｐ］はカルボン酸側鎖基を有し、これはＥＤＣ／ＮＨＳによって修飾され得る）、それ故に、修飾されたハイドロゲルを初代腸上皮細胞を培養することにとって不適にしたことであると推測された。
【００７１】
本発明において、我々は、コラーゲンハイドロゲル層の１つの側からＥＤＣ／ＮＨＳ等の架橋剤を拡散させることによってコラーゲンハイドロゲルを強化し、それ故にその厚さに沿って架橋密度の勾配を持つ架橋されたコラーゲンハイドロゲルを作出するための、新規方法を提唱する（図２）。ハイドロゲルの残存アミン基をアミン反応性蛍光色素と反応させた後に、ハイドロゲルの断面の蛍光の強さを可視化することによって、架橋密度の勾配を実証した（図２Ｃ）。架橋されたコラーゲンハイドロゲルは、細胞が接着した表面における比較的低い架橋密度、それ故に所望の剛性及び分子組成（即ち、ＲＧＤ細胞接着モチーフ）を保つことの結果として、初代腸上皮細胞を培養することにとって好適であることが見出された。同時に、架橋溶液との直接的接触をするコラーゲンの表面は比較的高い架橋密度を持っていたので、バルクのハイドロゲルの細胞によって誘導される収縮は有効に防がれた。この新規方法は、その細胞培養表面の剛性及び分子組成を有意に変化させることなしに、収縮に対する向上した抵抗を有するコラーゲンハイドロゲルを作出する。ここでは、この拡散架橋方法を用いてコラーゲンを架橋する３つの例を与える：（１）コラーゲン鎖を架橋して平面的な２Ｄハイドロゲル足場を作出する；（２）中性化したコラーゲンメッシュワークを架橋して平面的な２Ｄ足場を作出する；（３）コラーゲンを架橋して３Ｄ足場を作出する。
【００７２】
例１
コラーゲン分子鎖を架橋して、架橋密度の勾配を持つ平面的な２Ｄハイドロゲル足場を作出する
カルボン酸及び第一級アミン基両方はコラーゲン中に豊富である。例えば、哺乳類皮膚コラーゲンでは１，０００アミノ酸残基あたり１２１個のカルボン酸基（グルタミン酸：７４残基／１０００、アスパラギン酸：４７残基／１０００）及び２９個の第一級アミン基（リジン：２９残基／１０００）がある１５。ＥＤＣ及びＮＨＳの存在下において、コラーゲンの１つの鎖のカルボン酸基は反応性ＮＨＳエステルに変換され、これは、爾後にコラーゲンの他方の鎖の第一級アミン基と反応して安定なアミド結合を形成し、コラーゲンを共有結合的に架橋する（図２Ａ）。反応の間に、ＥＤＣ／ＮＨＳは架橋を触媒するように作用し、コラーゲン中には組み込まれない。それ故に、ＥＤＣ／ＮＨＳは反応後のコラーゲンゲルからリーチングされ得る。架橋戦略は、角膜移植のための組織代替物として生体適合性コラーゲンハイドロゲルを調製するために用いられた１６。
【００７３】
図２Ｂは、架橋密度の勾配を持つコラーゲンハイドロゲルを作出するための我々の戦略を示している。凍結乾燥コラーゲン（Ｉ型、ラット尾部）をＭＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５）中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。コラーゲン溶液（１００〜２００μＬ）を細胞培養インサート（ＢＤファルコン＃３５３１８０、１２ウェルプレート用、透明ＰＥＴ膜、１．６×１０６細孔／ｃｍ２、図２Ｂ−ｉ）に追加した。インサートを１２ウェルプレート上に置き、ＭＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５）中の３５．３ｍＭのＥＤＣ及び８．８ｍＭのＮＨＳの１ｍＬ溶液をウェルに１ｈ追加した（図２Ｂ−ｉｉ模式図の黒色溶液）。架橋剤（ＥＤＣ及びＮＨＳ）はウェルから細胞培養インサートへと多孔質膜を通り抜けて、コラーゲン溶液に接触した。ＥＤＣ及びＮＨＳは、それらがコラーゲン溶液中に拡散するにつれて架橋反応を開始した。１ｈ後に、インサート内側のコラーゲン溶液はハイドロゲルになった。ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液の最も近くにより高い架橋密度と、ハイドロゲル層の上側表面により低い密度とを有する架橋密度の勾配（図２Ｂ−ｉｉｉ）。
【００７４】
図２Ａに示されているように、ＥＤＣ／ＮＨＳ架橋反応は第一級アミノ基を消費する。例えば、ウシアキレス腱に由来する未架橋のコラーゲンは１，０００アミノ酸残基あたり２６．７個の第一級アミノ基を含有する１７。ＭＥＳ緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ５．４）中の９．０３ｍＭのＥＤＣ及び３．６１ｍＭのＮＨＳとの反応は、第一級アミノ基を２１．５個（１５ｍｉｎ反応時間）、１８．１個（３０ｍｉｎ）、及び１３．６個（２４０ｍｉｎ）まで減少させる１７。よって、残存（residueal）第一級アミノ基は架橋密度を明らかにするために用いられ得る。即ち、残存アミノ基がより少ないほど、架橋密度はより高いであろう。そうするために、架橋されたコラーゲンハイドロゲルを、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍＬの５−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（５−ＦＡＭ−ＳＥ）中において１６ｈインキュベーションした。５−ＦＡＭ−ＳＥはアミン反応性蛍光色素であり、これは残存第一級アミノ基と反応し、コラーゲン分子に共有結合的に取り付く。未反応の５−ＦＡＭ−ＳＥのリーチング後に、コラーゲンハイドロゲルの薄切片をカミソリ刃によって切り出し、その断面を蛍光顕微鏡を用いて点検した。蛍光の強さの勾配がコラーゲンハイドロゲルの断面に沿って観察された。強さはＥＤＣ／ＮＨＳ溶液から距離がある表面においてより高く、減少した蛍光を見せた触媒に隣接する表面と比較したときに、より低い架橋を示した（図２Ｃ）。これらのデータは、図２Ｂに模式的に示されている架橋密度の勾配の予想を確認している。
【００７５】
細胞が培養されるコラーゲン表面は比較的低い架橋密度を有するので、我々は、固有の剛性及び分子組成（即ちＲＧＤモチーフ）が未修飾のコラーゲンハイドロゲルに類似であり、それ故に初代腸上皮細胞の付着及び成長を支持するであろうと推測した。この仮説を試験するために、ヒト小腸上皮細胞をこの様式で調製されたハイドロゲル足場上にプレーティングし、細胞成長及びＴＥＥＲを最大１４日間までモニターした（図３Ｃ）。細胞は足場上で増殖し、足場の収縮は観察されなかった（ｎ＝３つの足場）。ＴＥＥＲは線形の様式で１４日間増殖し（図３Ｃ）、第１４日には５５５±６２Ω．ｃｍ２に達した（ｎ＝３）。第１０日に、細胞を、増殖細胞を算定するためのＥＤＵ（３ｈパルス）と、足場の細胞被覆率の算定を可能にするためのヘキスト（Hoecsht）核染色剤とによって染色した（図３Ａ及び３Ｂ）。足場の収縮はなく、１００％の細胞被覆率が存在した。増殖性細胞（ＥＤＵ＋）が単層（monoalyer）上に分布しており、足場が細胞増殖を支持するということを示した。勾配架橋された足場の機能的実用性を実証するために、ｐ糖蛋白質基質（ローダミン１２３）の基底から頂端への輸送と透過性マーカー（ルシファーイエロー）を用いる透過性とを第９日の足場上の細胞層について決定し、この時にＴＥＥＲは３８３±２０Ω．ｃｍ２（ｎ＝３）であった（図３Ｄ）。ローダミン１２３の透過性（３７．４±１．３×１０−８ｃｍ．ｓ−１、ｎ＝３）はルシファーイエロー（２．４±０．７×１０−８ｃｍ．ｓ−１、ｎ＝３）よりも１５倍高く、ｐ糖蛋白質によって促進されるローダミン１２３の能動輸送を実証した。
【００７６】
例２
片側からの架橋剤拡散によってコラーゲンメッシュワークを架橋する
例１では、我々は、コラーゲンペプチド鎖（ＭＥＳ緩衝液中のｐＨ５の溶液）がＥＤＣ／ＮＨＳの拡散によって架橋されて架橋密度の勾配を作出し得るということを示した。ここで、我々は、中性化したコラーゲンメッシュワークを用いることによる別の例を与える。コラーゲンは酸性ｐＨ（ｐＨ≦５）においては水に可溶性である。ひとたびそのｐＨが中性（例えばｐＨ＞７）に調整されると、コラーゲンペプチド鎖はアミン基の脱プロトン化が原因で不溶性になり始め、沈殿し、自己組織化した原繊維を形成する。３７℃でのインキュベーションは原繊維の沈殿（precipiation）及び形成を促進し（faciliate）、コラーゲン原繊維のメッシュワークであるコラーゲンハイドロゲルを作出（genertaing）する。図１に示されているように、この中性化したコラーゲンハイドロゲルは初代腸上皮細胞の増殖を支持し得るが、それ（its）は低い機械的強度を有する。なぜなら、コラーゲン原繊維は架橋されていないからである。上で論じられているように、ＥＤＣ／ＮＨＳはアミド結合による隣接コラーゲン原繊維又は原繊維束の架橋を触媒し得、未架橋のコラーゲンハイドロゲルと比較して膨潤比の減少と熱処理及び酵素的分解に対する抵抗の増大とをもたらす１８。
【００７７】
我々は、図４Ａに概説されている戦略を用いて、１つの側のみからＥＤＣ／ＮＨＳを拡散させることによってコラーゲンメッシュワークを架橋した。第１に、コラーゲン（０．０２Ｎ酢酸中の３．３９ｍｇ／ｍＬの２９５μＬ）、水酸化ナトリウム（７μＬ、１Ｎ）、ＨＥＰＥＳ（２０μＬ、１Ｎ、ｐＨ７．４）、重炭酸ナトリウム（６０μＬ、７．５ｗｔ％、ｐＨ８）、ＤＩ水（５１８μＬ）、及び１０×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１００μＬ）を混合することによって、中性化したコラーゲン溶液（１ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ）を氷上で調製した。溶液をゆっくりとした反復的なピペッティングによって混合した。混合物（２００μＬ）を細胞培養インサート（ＢＤファルコン＃３５３１８０、１２ウェルプレート用、透明ＰＥＴ膜、１．６×１０６細孔／ｃｍ２）に追加した。インサートを３７℃で１ｈインキュベーションして、図４Ａ−ｉに黒色のグリッドとして模式的に（schemaicaly）図解されているコラーゲンメッシュワークを作出した。コラーゲンメッシュワークを架橋するために、インサートを１２ウェルプレート上に置き、ＰＢＳ緩衝液中の３５３ｍＭのＥＤＣ及び８８ｍＭのＮＨＳの１ｍＬ溶液をウェルに追加し（図４Ａ−ｉｉの濃い灰色領域）、ＰＢＳ緩衝液の０．５ｍＬをインサートに追加した（図４Ａ−ｉｉの灰色領域）。多孔質膜を通したウェルから細胞培養インサートへの架橋剤（ＥＤＣ及びＮＨＳ）の拡散。ＥＤＣ及びＮＨＳはそれらがコラーゲンメッシュワーク中に拡散するにつれて架橋反応を開始し、橋渡しのアミド結合を作出した（図４Ａ−ｉｉｉでは灰色のドットとして表されている）。４０ｍｉｎ反応後には、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液に最も近い（nerest）側により高い架橋密度と、溶液からより遠くにより低い密度とを有する架橋密度の勾配が予想された（図４Ａ−ｉｉｉ）。
【００７８】
架橋密度の勾配の存在（existance）を確認するために、我々は原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いてコラーゲンメッシュワークの剛性を測定した。剛性は架橋密度に反比例するであろう。架橋前の中性化したコラーゲンメッシュワークは１１８±１３６Ｐａの剛性を有した（ｎ＝６９回の測定）。ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液に隣接する表面において、剛性は２，３０２±１，４１１Ｐａまで増大した（ｎ＝５３回の測定）。反対側の表面の剛性は１，１５９±５７２Ｐａまで増大し（ｎ＝５１回の測定）、未架橋のコラーゲン（１１８Ｐａ）と架橋溶液に隣接するハイドロゲル（２３０２Ｐａ）との間に位置取る値であった。この結果は、先の蛍光の強さのデータと併せて、コラーゲンメッシュワークの高さ層に沿った剛性及び架橋密度の勾配の存在を支持している。
【００７９】
拡散的に作出された中性化したコラーゲンメッシュワークハイドロゲルによって生じた足場が、細胞培養の間の収縮に対して抵抗性であるかどうかを試験するために、初代マウス結腸上皮細胞を、図４Ａに示されている戦略によって架橋されたコラーゲンメッシュワーク上にプレーティングした。コラーゲン足場はそれらの細胞の増殖を支持した。細胞被覆率が１００％に達したときに、足場の何れも収縮の証拠を有さなかった（ｎ＝１０個の足場、図４Ｂ）。ＴＥＥＲは経時的に増大し、第５日においては２，６８２±２０８Ω．ｃｍ２（ｎ＝３）に達した（図４Ｃ）。これらの２Ｄ単層中の細胞増殖及び分化を同定するために、時系列染色実験を実行した。図４Ｅに示されているように、単層中の増殖性細胞（ＥＤＵ＋）は第３〜４日までに主としてエンテロサイト（ＡＬＰ＋）に分化した。また、単層中に見られ得る杯細胞（Ｍｕｃ２＋）の数個のパッチもまたあった（図４Ｅ）。図４ＣにおけるＴＥＥＲの爾後の減少は、蓋然的には、分化した細胞のアポトーシスが原因の細胞損失の結果であった。これらのコラーゲンメッシュワークハイドロゲル足場の実用性を実証するために、ｐ糖蛋白質基質（ローダミン１２３）の基底から頂端（Ｂ−Ａ）及び頂端から基底（Ａ−Ｂ）への輸送を第５日に研究し、このときＴＥＥＲは＞２，０００Ω．ｃｍ２であった（図４Ｄ）。基底から頂端へのローダミン１２３の透過性は頂端から基底よりも〜７倍高く、ｐ糖蛋白質によって促進されるローダミン１２３の能動的で指向的な輸送を示した１９。
【００８０】
例３
架橋剤の片側からの拡散によって作出される３Ｄコラーゲン足場
例１及び２は、平面的な２Ｄコラーゲン足場が、コラーゲン層の１つの側からＥＤＣ／ＮＨＳを拡散させることによって架橋され得るということを示した。ここでは、我々は３Ｄマイクロフィーチャーを持つコラーゲン足場が類似の様式でＥＤＣ／ＮＨＳを拡散させることによって架橋され得るということを示す。３Ｄ足場は、細胞増殖をガイドしてインビボの腸陰窩に類似のインビトロ組織を形成することに有用である。
【００８１】
上で論じられているように、培養系の重大な制約は、オルガノイドのスフェロイド様アーキテクチャーが、上皮細胞を横断する分子輸送の研究における障害となるということであった。これは、内腔ではなくむしろ基底上皮表面が外因的に追加される化合物に暴露されるからである。
【００８２】
この制約を克服するために、我々は広範囲の剛性（１０１〜１０９Ｐａ）を有する種々の足場をスクリーニングし、中性化したコラーゲンハイドロゲル（１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｍ高さ）が、ＵＮＣ特許出願ＰＣＴＵＳ２０１６０１５６３１に記載されているように、アクセス可能な内腔表面を有する２Ｄ単層中において、腸上皮細胞の長期増殖性培養物を維持し得るということを同定した。この２Ｄ単層培養系は、細胞増殖、分化、表現型、及び機能の点で３Ｄオルガノイド系を再現する。コラーゲンハイドロゲル足場の重要性を例証するために、結腸陰窩を、全ての必要とされる成長因子（Ｗｎｔ−３Ａ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、及びＥＧＦ等）を含有する培地中において、それぞれポリスチレン表面及びコラーゲンハイドロゲル表面に１００個の陰窩／ｃｍ２の密度でプレーティングした。細胞成長を最大５日間までモニターした（図１Ａ）。第５日に、細胞を５−エチニル−２−デオキシウリジン（ＥｄＵ、増殖性細胞用）及びヘキスト３３３４２（全ての細胞の核用）によって染色し、細胞増殖をＥＤＵ／核の蛍光の強さの比によって定量した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。ポリスチレン表面においては、陰窩の何れも拡大培養される単層を形成せず（図１Ａ）、増殖性細胞（ＥＤＵ＋）は稀であった（図１Ｂ及び１Ｃ）。対照的に、細胞はコラーゲンハイドロゲル上においては拡大培養される単層を形成し、豊富な増殖性細胞（ＥＤＵ＋）が存在した（図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃ）。コラーゲンハイドロゲル上の単層の細胞をコラゲナーゼによってコラーゲン表面から容易に取り外し、脱凝集させ、継代培養した。細胞は生存能及び増殖能の損失なしに長期（現在までに試験した最も長い時間、最大１０ヶ月まで）維持され得た。これらのデータは、初代マウス結腸上皮細胞が足場の生物物理学的特性に非常に敏感であり、コラーゲンハイドロゲルが、剛性（１００〜１，０００Ｐａ）、多孔度、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蛋白質の存在の点で、腸上皮に対して下重ねになる基底膜をより良好に模倣することによって、幹細胞に生物物理学的キューを提供するということを実証した。中性化したコラーゲンハイドロゲルは初代腸上皮細胞の増殖を維持したが、その機械的強度の不足は、連続した細胞単層を作出することへのその使用にとって重大な弱点であると判明した。細胞被覆率がハイドロゲル足場の表面の＞７０％であるときに、コラーゲンハイドロゲルは収縮することが見られ、その結果、足場は湾曲し、培養デバイスの側壁から分離した（１００±０％、ｎ＝１０回の試験、図１Ｄ）。結果として、多孔質膜の表面全体を被覆する連続的な細胞単層を作り出し得なかった。これは、細胞層周囲に多孔質膜からの漏れを生じ、輸送及び透過性研究に必要とされる経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）＞５００Ω．ｃｍ２を提供することができる連続した単層を作り出すことを防いだ（Ｎ＝＞５０試行）。
【００８３】
第１に、ＰＤＭＳ押し型を標準的なフォトリソグラフィ、次にレプリカ成形によって作製した。ＰＤＭＳ押し型は、２５０μｍの高さ、７５μｍの直径、及び１２５μｍの中心間距離を有する円筒状ポストのアレイを持った。ＰＤＭＳ押し型を２ｍｉｎプラズマ処理し、次にｍＰＥＧ−シラン（エタノール：水混合物［９５：５ｖｏｌ：ｖｏｌ］中に１％。ｍＰＥＧ−シランのＭＷは２０，０００である）による１６ｈのコーティングをした。ＰＤＭＳ押し型をエタノールによって５回リンスし、風乾した。コラーゲン溶液（２００μＬ、ＭＥＳ緩衝液［ｐＨ５、０．１Ｍ］中の５ｍｇ／ｍＬ）をＰＴＦＥ多孔質膜を有する細胞培養トランスウェルインサート（コーニング＃３４６０、１２ウェルプレート用）に追加し、ＰＤＭＳ押し型をコラーゲン上に置いた（図５Ａ−ｉｉ）。インサートを１２ウェルプレート上に置き、プレートを加圧したポット内に２５ｐｓｉの窒素で５ｍｉｎ置いて、ＰＤＭＳポスト間にトラップされた気泡を除去した。窒素を圧力ポットから約１ｈかけてゆっくり放出した。プレートを圧力ポットから取り出し、ＭＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５）中の３５．３ｍＭのＥＤＣ及び８．８ｍＭのＮＨＳの溶液の１ｍＬをウェルに１ｈ追加した（図５Ａ−ｉｉの明灰色領域）。多孔質膜を通したＥＤＣ及びＮＨＳの拡散は架橋剤をウェルから細胞培養インサートに移動させ、ＥＤＣ及びＮＨＳがコラーゲン溶液に接触して架橋反応を開始することを許した。１ｈ架橋後に、ＰＤＭＳ押し型をコラーゲン層から除去し、３Ｄコラーゲン足場を作出した（図５Ａ−ｉｖ）。足場は、ＰＤＭＳポストと同じ寸法を有するマイクロウェルのアレイを持った（図５Ｂ及び５Ｃ）：マイクロウェルの高さは２５０μｍであり、直径は７５μｍであった。３Ｄ足場が腸上皮細胞をガイドしてインビトロ腸陰窩様構造を形成するために用いられ得るということを実証するために、初代マウス結腸上皮細胞を足場上にプレーティングし、培養した。第４日までに、細胞は、組織幾何形状（gemoetry）が結腸陰窩に類似である３Ｄコンストラクトのアレイを形成した（図５Ｄ及び５Ｅ）。コラーゲン足場はインテグリティーを維持し、マイクロウェルの形崩れの収縮は観察されなかった。
【００８４】
参照
１．  Ｎ．バーカー（Barker）、Ｍ．ファン・デ・ウェテリンク（van de Wetering）、及びＨ．クレバース（Clevers）著，ジーンズ・アンド・デベロップメント（Genes & Development），２００８年，２２巻，ｐ．１８５６−１８６４．
２．  Ｅ．フックス（Fuchs）及びＴ．チェン（Chen）著，エンボ・リポーツ（Embo Reports），２０１３年，１４巻，ｐ．３９−４８．
３．  Ｍ．ブリタン（Brittan）及びＮ．Ａ．ライト（Wright）著，ガット（Gut），２００４年，５３巻，ｐ．８９９−９１０．
４．  Ｃ．コシンスキー（Kosinski）、Ｖ．Ｓ．Ｗ．リ（Li）、Ａ．Ｓ．Ｙ．チャン（Chan）、Ｊ．ジャン（Zhang）、Ｃ．ホー（Ho）、Ｗ．Ｙ．ツイ（Tsui）、Ｔ．Ｌ．チャン（Chan）、Ｒ．Ｃ．ミフリン（Mifflin）、Ｄ．Ｗ．パウエル（Powell）、Ｓ．Ｔ．ユエン（Yuen）、Ｓ．Ｙ．リョン（Leung）、及びＸ．チェン（Chen）著，米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），２００７年，１０４巻，ｐ．１５４１８−１５４２３．
５．  Ｔ．Ｈ．イェン（Yen）及びＮ．Ａ．ライト（Wright）著，ステム・セル・レビューズ・アンド・リポーツ（Stem Cell Reviews and Reports），２００６年，２巻，ｐ．２０３-２１２．
６．  Ａ．Ｌ．パギリガン（Paguirigan）及びＤ．Ｊ．ビービ（Beebe）著，ネイチャー・プロトコールズ（Nature Protocols），２００７年，２巻，ｐ．１７８２−１７８８．
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８．  Ｌ．ダミンク（Damink）、Ｐ．Ｊ．ダイクストラ（Dijkstra）、Ｍ．Ｊ．Ａ．ファンライン（Vanluyn）、Ｐ．Ｂ．ファンワヘム（Vanwachem）、Ｐ．ニーウェンハイス（Nieuwenhuis）、及びＪ．フェイエン（Feijen）著，ジャーナル・オブ・マテリアルズ・サイエンス−マテリアルズ・イン・メディシン（Journal of Materials Science-Materials in Medicine），１９９５年，６巻，ｐ．４６０−４７２．
９．  Ｎ．セイエドハッサンテヘラニ（Seyedhassantehrani）、Ｙ．リ（Li）、及びＬ．ヤオ（Yao）著，インテグラティブ・バイオロジー（Integrative Biology），２０１６年．
１０．  Ｊ．Ｍ．オルバン（Orban）、Ｌ．Ｂ．ウィルソン（Wilson）、Ｊ．Ａ．コフロス（Kofroth）、Ｍ．Ｓ．エルクルディ（El-Kurdi）、Ｔ．Ｍ．マウル（Maul）、及びＤ．Ａ．ヴォープ（Vorp）著，ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアルズ・リサーチ・パートＡ（Journal of Biomedical Materials Research Part A），２００４年，６８巻Ａ，ｐ．７５６−７６２．
１１．  Ｎ．Ｅ．ヴラナ（Vrana）、Ｎ．ビュイユ（Builles）、Ｈ．コカク（Kocak）、Ｐ．グレイ（Gulay）、Ｖ．ジャスティン（Justin）、Ａ．マルブイレ（Malbouyres）、Ｆ．ルギエロ（Ruggiero）、Ｏ．ダムール（Damour）、及びＶ．ハシルシ（Hasirci）著，ジャーナル・オブ・マテリアルズ・サイエンス−ポリマー・エディション（Journal of Biomaterials Science-Polymer Edition），２００７年，１８巻，ｐ．１５２７−１５４５．
１２．  Ｙ．ディー（Di）及びＲ．Ｊ．ヒース（Heath）著，ポリマー・デグラデーション・アンド・スタビリティー（Polymer Degradation and Stability），２００９年，９４巻，ｐ．１６８４−１６９２．
１３．  Ｈ．Ｇ．スンダララガワン（Sundararaghavan）、Ｇ．Ａ．モンテイロ（Monteiro）、Ｎ．Ａ．ラパン（Lapin）、Ｙ．Ｊ．シャバル（Chabal）、Ｊ．Ｒ．ミクサン（Miksan）、及びＤ．Ｉ．シュライバー（Shreiber）著，ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアルズ・リサーチ・パートＡ（Journal of Biomedical Materials Research Part A），２００８年，８７巻Ａ，ｐ．３０８−３２０．
１４．  Ｅ．ソン（Song）、Ｓ．Ｙ．キム（Kim）、Ｔ．チュン（Chun）、Ｈ．Ｊ.ビュン（Byun）、及びＹ．Ｍ．リー（Lee）著，バイオマテリアルズ（Biomaterials），２００６年，２７巻，ｐ．２９５１−２９６１．
１５．  Ｐ．シュパーク（Szpak）著，ジャーナル・オブ・アーケオロジカル・サイエンス（Journal of Archaeological Science），２０１１年，３８巻，ｐ．３３５８−３３７２．
１６．  Ｙ．Ｗ．リュー（Liu）、Ｌ．Ｈ．ガン（Gan）、Ｄ．Ｊ．カールソン（Carlsson）、Ｐ．ファーゲルホルム（Fagerholm）、Ｎ．ラガリ（Lagali）、Ｍ．Ａ．ワトスキー（Watsky）、Ｒ．マンガー（Munger）、Ｗ．Ｇ．ホッジ（Hodge）、Ｄ．プリースト（Priest）、及びＭ．グリフィス（Griffith）著，インベスティガティブ・オフサルモロジー・アンド・ビジュアル・サイエンス（Investigative Ophthalmology & Visual Science），２００６年，４７巻，ｐ．１８６９−１８７５．
１７．  Ｐ．Ｂ．ファン・ワヘム（van Wachem）、Ｊ．Ａ．プランティンガ（Plantinga）、Ｍ．Ｊ．Ｂ．ウィシンク（Wissink）、Ｒ．ベールニンク（Beernink）、Ａ．Ａ．プート（Poot）、Ｇ．Ｈ．Ｍ．エンバース（Engbers）、Ｔ．ブーヘリン（Beugeling）、Ｗ．Ｇ．ファン・ エイケン（van Aken）、Ｊ．フェイジェン（Feijen）、及びＭ．Ｊ．Ａ．ファン・ルイン（van Luyn）著，ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアルズ・リサーチ（Journal of Biomedical Materials Research），２００１年，５５巻，ｐ．３６８−３７８．
１８．  Ｃ．Ｒ．ヤン（Yang）著，ブレティン・オブ・マテリアルズ・サイエンス（Bulletin of Materials Science），２０１２年，３５巻，ｐ．９１３−９１８．
１９．  Ｈ．Ｈ．ヨー（Yoo）、Ｍ．リー（Lee）、Ｍ．Ｗ．リー（Lee）、Ｓ．Ｙ．リム（Lim）、Ｊ．シン（Shin）、及びＤ．Ｈ．キム（Kim）著，プランタ・メディカ（Planta Medica），２００７年，７３巻，ｐ．４４４−４５０．
【００８５】
前述は本発明の例解であり、その限定として受け取られるべきではない。本発明は次の請求項によって定められ、請求項の均等物はその中に包含される。
【図１Ａ】
2019523003.tif 000003
【図１Ｂ】
2019523003.tif 000004
【図１Ｃ】
2019523003.tif 000005
【図１Ｄ】
2019523003.tif 000006
【図２Ａ】
2019523003.tif 000007
【図２Ｂ】
2019523003.tif 000008
【図２Ｃ】
2019523003.tif 000009
【図３Ａ】
2019523003.tif 000010
【図３Ｂ】
2019523003.tif 000011
【図３Ｃ】
2019523003.tif 000012
【図３Ｄ】
2019523003.tif 000013
【図４Ａ】
2019523003.tif 000014
【図４Ｂ】
2019523003.tif 000015
【図４Ｃ】
2019523003.tif 000016
【図４Ｄ】
2019523003.tif 000017
【図４Ｅ】
2019523003.tif 000018
【図５Ａ】
2019523003.tif 000019
【図５Ｂ】
2019523003.tif 000020
【図５Ｃ】
2019523003.tif 000021
【図５Ｄ】
2019523003.tif 000022
【図５Ｅ】
2019523003.tif 000023
【国際調査報告】
2019523003.tif 000024
2019523003.tif 000025
2019523003.tif 000026