(57)【要約】  本開示は、野生型ランチビオティックに比べて抗微生物特性が向上したランチビオティックの構造的なバリアント、およびその使用に関する。実施形態は、非天然由来のランチビオティックを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列を含み、
ａ．  １３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）；
ｂ．  １７位のフェニルアラニンのロイシン（Ｆ１７Ｌ）またはチロシン（Ｆ１７Ｙ）への変更；
ｃ．  １８位のアスパラギンのアラニンへの変更（Ｎ１８Ａ）；
ｄ．  ２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更（Ｙ２０Ｆ）；または
ｅ．  それらの組合せ、を含む変異をさらに含む、非天然由来のランチビオティック。
【請求項２】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列を含み、二つの変異をさらに含み、一つの変異が：
ａ．  １３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）；
ｂ．  １７位のフェニルアラニンのロイシン（Ｆ１７Ｌ）またはチロシン（Ｆ１７Ｙ）への変更；
ｃ．  １８位のアスパラギンのアラニンへの変更（Ｎ１８Ａ）；
ｄ．  ２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更（Ｙ２０Ｆ）；または
ｅ．  それらの組合せ、を含む、非天然由来のランチビオティック。
【請求項３】
一つの変異が、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）である、請求項２に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項４】
一つの変異が、１位のフェニルアラニンのバリンへの変更（ＦＩＶ）である、請求項２または３に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項５】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列を含み、二つの変異をさらに含み、一つの変異が、
ａ．１位のフェニルアラニンのバリンへの変更（Ｆ１Ｖ）；
ｂ．１位のフェニルアラニンのアラニンへの変更（Ｆ１Ａ）；
ｃ．１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更（Ｆ１Ｉ）；
ｄ．１位のフェニルアラニンのロイシンへの変更（Ｆ１Ｌ）；
ｅ．１位のフェニルアラニンのスレオニンへの変更（Ｆ１Ｔ）；または
ｆ．１位のフェニルアラニンのチロシンへの変更（Ｆ１Ｙ）、を含む、非天然由来のランチビオティック。
【請求項６】
一つの変異が、１位のフェニルアラニンのバリンへの変更（ＦＩＶ）である、請求項５に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項７】
一つの変異が、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）である、請求項５または６に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項８】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列を含み、
ａ．  １位のフェニルアラニンのアラニンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  バリン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ｖ）、
ｉｉｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ｎ）、もしくは
ｉｖ．  セリン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ｓ）への変更との組合せ；
ｂ．  １位のフェニルアラニンのグリシンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  グリシン（Ｆ１Ｇ  Ｒ１３Ｇ）への変更との組合せ；
ｃ．  １位のフェニルアラニンのヒスチジンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ｈ  Ｒ１３Ｎ）への変更との組合せ；
ｄ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  グリシン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｇ）、
ｉｉｉ．  イソロイシン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｉ）、
ｉｖ．  アスパラギン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｎ）、
ｖ．  プロリン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｐ）、
ｖｉ．  グルタミン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｑ）、
ｖｉｉ．  グルタミン酸（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｓ）、
ｖｉｉｉ．  セリン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｖ）、もしくは
ｉｘ．  バリン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｅ）への変更との組合せ；
ｅ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  アスパラギン酸（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｄ）、
ｉｉｉ．  グリシン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｇ）、
ｉｖ．  アスパラギン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｎ）、
ｖ．  プロリン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｐ）、もしくは
ｖｉ．  グルタミン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｑ）への変更との組合せ；
ｆ．  １位のフェニルアラニンのスレオニンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ｎ）、もしくは
ｉｉｉ．  バリン（Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ｖ）への変更との組合せ；
ｇ．  １位のフェニルアラニンのバリンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｎ）、
ｉｉｉ．  グルタミン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｑ）、
ｉｖ．  アスパラギン酸（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｄ）、
ｖ．  バリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｖ）、もしくは
ｖｉ．  プロリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｐ）への変更との組合せ；または
ｈ．  １位のフェニルアラニンのチロシンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アスパラギン酸（Ｆ１Ｙ  Ｒ１３Ｄ）、もしくは
ｉｉ．  グリシン（Ｆ１Ｙ  Ｒ１３Ｇ）、への変更との組合せ、を含む二つの変異をさらに含む、非天然由来のランチビオティック。
【請求項９】
１位のフェニルアラニンのバリンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｎ）、
ｉｉｉ．  グルタミン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｑ）、
ｉｖ．  アスパラギン酸（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｄ）、
ｖ．  バリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｖ）、または
ｖｉ．  プロリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｐ）、への変更との組合せを含む二つの変異を含む、請求項８に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項１０】
前記二つの変異が、１位のフェニルアラニンのバリンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ（ＦＩＶ  Ｒ１３Ｎ）とからなる、請求項９に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項１１】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列を含み、
ａ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、１５位のグリシンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ａ  Ｇ１５Ａ）；
ｂ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ、１５位のグリシンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｄ  Ｇ１５Ａ）；
ｃ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、４位のトリプトファンのイソロイシンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｗ４Ｉ  Ｒ１３Ａ）；
ｄ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、４位のトリプトファンのメチオニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｗ４Ｍ  Ｒ１３Ｄ）；
ｅ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、４位のトリプトファンのメチオニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｗ４Ｍ  Ｒ１３Ｎ）；
ｆ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｒ１３Ａ）；
ｇ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、６位のロイシンのバリンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｌ６Ｖ  Ｒ１３Ａ）；
ｈ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ａ  Ｙ２０Ｆ）；
ｉ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｄ  Ｙ２０Ｆ）；
ｊ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｎ  Ｙ２０Ｆ）；
ｋ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｎ  Ｙ２０Ｆ）；
ｌ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ａ  Ｙ２０Ｆ）；または
ｍ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｄ  Ｙ２０Ｆ）を含む三つの変異をさらに含む、非天然由来のランチビオティック。
【請求項１２】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列を含み、
ａ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、４位のトリプトファンのリジンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｗ４Ｋ  Ｒ１３Ａ）；または
ｂ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、４位のトリプトファンのリジンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｗ４Ｋ  Ｒ１３Ｄ）の変異をさらに含む、非天然由来のランチビオティック。
【請求項１３】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列を含み、１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、４位のトリプトファンのメチオニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｗ４Ｋ  Ｒ１３Ａ  Ｙ２０Ｆ）の変異をさらに含む、非天然由来のランチビオティック。
【請求項１４】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（配列番号１１５６）を含み、
ａ．  １３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）；
ｂ．  １７位のフェニルアラニンのロイシン（Ｆ１７Ｌ）またはチロシン（Ｆ１７Ｙ）への変更；
ｃ．  １８位のアスパラギンのアラニンへの変更（Ｎ１８Ａ）；
ｄ．  ２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更（Ｙ２０Ｆ）；または
ｅ．  それらの組合せ  を含む変異をさらに含む、非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項１５】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（配列番号１１５６）を含み、二つの変異をさらに含み、一つの変異は：
ａ．  １３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）；
ｂ．  １７位のフェニルアラニンのロイシン（Ｆ１７Ｌ）またはチロシン（Ｆ１７Ｙ）への変更；
ｃ．  １８位のアスパラギンのアラニンへの変更（Ｎ１８Ａ）；
ｄ．  ２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更（Ｙ２０Ｆ）；または
ｅ．  それらの組合せ  を含む、非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項１６】
一つの変異が、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）である、請求項１５に記載の非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項１７】
一つの変異が、１位のフェニルアラニンのバリンへの変更（ＦＩＶ）である、請求項１５または１６に記載の非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項１８】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（配列番号１１５６）を含み、二つの変異をさらに含み、一つの変異は：
ａ．  １位のフェニルアラニンのバリンへの変更（Ｆ１Ｖ）；
ｂ．  １位のフェニルアラニンのアラニンへの変更（Ｆ１Ａ）；
ｃ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更（Ｆ１Ｉ）；
ｄ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更（Ｆ１Ｌ）；
ｅ．  １位のフェニルアラニンのスレオニンへの変更（Ｆ１Ｔ）；または
ｆ．  １位フェニルアラニンのチロシンへの変更（Ｆ１Ｙ）を含む、非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項１９】
一つの変異が、１位のフェニルアラニンのバリンへの変更（ＦＩＶ）である、請求項１８に記載の非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項２０】
一つの変異が、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）である、請求項１８または１９に記載の非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項２１】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（配列番号１１５６）を含み、
ａ．  １位のフェニルアラニンのアラニンへの変更と１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  バリン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ｖ）、
ｉｉｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ｎ）、もしくは
ｉｖ．  セリン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ｓ）への変更との組合せ；
ｂ．  １位のフェニルアラニンのグリシンへの変更と１３位のアルギニンの：
ｉ．  グリシン（Ｆ１Ｇ  Ｒ１３Ｇ）への変更との組合せ；
ｃ．  １位のフェニルアラニンのヒスチジンへの変更と１３位のアルギニンの：
ｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ｈ  Ｒ１３Ｎ）への変更との組合せ；
ｄ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  グリシン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｇ）、
ｉｉｉ．  イソロイシン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｉ）、
ｉｖ．  アスパラギン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｎ）、
ｖ．  プロリン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｐ）、
ｖｉ．  グルタミン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｑ）、
ｖｉｉ．  グルタミン酸（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｓ）、
ｖｉｉｉ．  セリン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｖ）、もしくは
ｉｘ．  バリン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｅ）への変更との組合せ；
ｅ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  アスパラギン酸（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｄ）、
ｉｉｉ．  グリシン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｇ）、
ｉｖ．  アスパラギン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｎ）、
ｖ．  プロリン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｐ）、もしくは
ｖｉ．  グルタミン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｑ）への変更との組合せ；
ｆ．  １位のフェニルアラニンのスレオニンへの変更と１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ｎ）、もしくは
ｉｉｉ．  バリン（Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ｖ）への変更との組合せ；
ｇ．  １位のフェニルアラニンのバリンへの変更と１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｎ）、
ｉｉｉ．  グルタミン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｑ）、
ｉｖ．  アスパラギン酸（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｄ）、
ｖ．  バリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｖ）、もしくは
ｖｉ．  プロリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｐ）への変更との組合せ；または
ｈ．  １位フェニルアラニンのチロシンへの変更と１３位のアルギニンの：
ｉ．  アスパラギン酸（Ｆ１Ｙ  Ｒ１３Ｄ）、もしくは
ｉｉ．  グリシン（Ｆ１Ｙ  Ｒ１３Ｇ）への変更との組合せ、を含む二つの変異をさらに含む、非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項２２】
１位のフェニルアラニンのバリンへの変更と１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｎ）、
ｉｉｉ．  グルタミン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｑ）、
ｉｖ．  アスパラギン酸（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｄ）、
ｖ．  バリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｖ）、または
ｖｉ．  プロリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｐ）、への変更との組合せを含む二つの変異を含む、請求項２１に記載の非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項２３】
前記二つの変異が、１位のフェニルアラニンのバリンへの変更と１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（ＦＩＶ  Ｒ１３Ｎ）（配列番号５５０）とからなる、請求項２２に記載の非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項２４】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（配列番号１１５６）を含み、
ａ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、１５位のグリシンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ａ  Ｇ１５Ａ）；
ｂ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ、１５位のグリシンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｄ  Ｇ１５Ａ）；
ｃ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、４位のトリプトファンのイソロイシンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｗ４Ｉ  Ｒ１３Ａ）；
ｄ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、４位のトリプトファンのメチオニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｗ４Ｍ  Ｒ１３Ｄ）；
ｅ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、４位のトリプトファンのメチオニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｗ４Ｍ  Ｒ１３Ｎ）；
ｆ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｒ１３Ａ）；
ｇ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、６位のロイシンのバリンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｌ６Ｖ  Ｒ１３Ａ）；
ｈ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ａ  Ｙ２０Ｆ）；
ｉ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｄ  Ｙ２０Ｆ）；
ｊ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｎ  Ｙ２０Ｆ）；
ｋ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｎ  Ｙ２０Ｆ）；
ｌ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ａ  Ｙ２０Ｆ）；または
ｍ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｄ  Ｙ２０Ｆ）を含む三つの変異をさらに含む、非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項２５】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（配列番号１１５６）を含み、
ａ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、４位のトリプトファンのリジンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｗ４Ｋ  Ｒ１３Ａ）；または
ｂ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、４位のトリプトファンのリジンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｗ４Ｋ  Ｒ１３Ｄ）の変異をさらに含む、非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項２６】
ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（配列番号１１５６）を含み、１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、４位のトリプトファンのメチオニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｗ４Ｋ  Ｒ１３Ａ  Ｙ２０Ｆ）の変異をさらに含む、非天然由来の翻訳後修飾されたランチビオティック。
【請求項２７】
ＭＵ１１４０の単アミノ酸変異を含み、配列番号２から４３１のいずれか一つによってコードされるアミノ酸配列を有する、非天然由来のランチビオティック。
【請求項２８】
ＭＵ１１４０の複数箇所のアミノ酸変異を含み、図７に記載されるようなバリアントである、非天然由来のランチビオティック。
【請求項２９】
図８：第１群、第２群、または第３群に記載されるようないずれかのバリアントを含む、非天然由来のランチビオティック。
【請求項３０】
図８：第１群に記載されるようないずれかのバリアントを含む、非天然由来のランチビオティック。
【請求項３１】
図６に記載されるようなＭＵ１１４０の単アミノ酸変異を含む、非天然由来のランチビオティック。
【請求項３２】
配列番号５５０のアミノ酸配列を含む、非天然由来のランチビオティック。
【請求項３３】
翻訳後修飾される、請求項２７から３２のいずれか１項に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項３４】
前記翻訳後修飾が、５位にＤｈａを含む、請求項３３に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項３５】
前記翻訳後修飾が、８位にＡｂｕを含む、請求項３３または請求項３４に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項３６】
前記翻訳後修飾が、１４位にＤｈｂを含む、請求項３３から請求項３５のいずれか１項に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項３７】
前記翻訳後修飾が、５位にＤｈａを、８位にＡｂｕを、１４位にＤｈｂを含む、請求項３３から請求項３６のいずれか１項に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項３８】
前記翻訳後修飾が、図１に記載されるように（Ａｌａ3−Ｓ−Ａｌａ7）間のランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）残基によって形成される環（環Ａ）を含む、請求項３３から請求項３７のいずれか１項に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項３９】
前記翻訳後修飾が、図１に記載されるように、８位のアルファ−アミノ酪酸残基と１１位のＡｌａとを含む環である環Ｂ（Ａｂｕ8−Ｓ−Ａｌａ11）を形成するメチル−ランチオニン残基（Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ）を含む、請求項３３から請求項３８のいずれか１項に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項４０】
前記翻訳後修飾が、図１に記載されるように（Ａｌａ16−Ｓ−Ａｌａ21）間のランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）残基によって形成される環（環Ｃ）を含む、請求項３３から請求項３９のいずれか１項に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項４１】
前記翻訳後修飾が、図１に記載されるようにチオエーテル連結によってアミノビニル基に連結された１９位のＡｌａ（Ａｌａ19−Ｓ−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−）である環Ｄを含む、請求項３３から請求項４０のいずれか１項に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項４２】
前記翻訳後修飾が、環Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤを含む、請求項３３から請求項４１のいずれか１項に記載の非天然由来のランチビオティック。
【請求項４３】
前記翻訳後修飾されたＭＵ１１４０バリアントが、環Ａ、環Ｂ、環Ｃ、および環Ｄを含み、
ａ．  これらの環のうち二つが、環Ａ中の一つ（Ａｌａ3−Ｓ−Ａｌａ7）と環Ｃ中の一つ（Ａｌａ16−Ｓ−Ａｌａ21）とを含むランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）残基によって形成され；
ｂ．  メチル−ランチオニン残基（Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ）が、８位のアルファ−アミノ酪酸残基と１１位のＡｌａとを含む環Ｂ（Ａｂｕ8−Ｓ−Ａｌａ11）を形成し；
ｃ．  第４の環であるＤが、チオエーテル連結によってアミノビニル基に連結された１９位のＡｌａ（Ａｌａ19−Ｓ−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−）から構成され、
ならびに、５位のアミノ酸が、Ｄｈａに修飾され、８位のアミノ酸が、Ａｂｕに修飾され、１４位のアミノ酸が、Ｄｈｂに修飾されている、請求項３３から４２のいずれか１項に記載の非天然由来のランチオビオティック。
【請求項４４】
図５または図７のランチビオティックバリアントをコードするポリヌクレオチドからポリペプチドを発現することによって宿主細胞中に生産され、前記発現されたポリペプチドは、前記宿主細胞中で翻訳後修飾される、単離されたランチビオティックバリアント。
【請求項４５】
前記宿主細胞が、Ｓ．ミュータンスである、請求項４４に記載の単離されたランチビオティックバリアント。
【請求項４６】
配列番号１１５７のアミノ酸配列を含む、翻訳後修飾された非天然由来のランチビオティック。
【請求項４７】
請求項１から２６または３３から４６のいずれか１項に記載の非天然由来のランチビオティックと、医薬的に許容可能な担体、医薬的に許容可能な希釈剤、他の希釈剤または賦形剤とを含む、抗微生物組成物。
【請求項４８】
抗真菌剤、追加の抗微生物剤、膜破壊剤、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項４７に記載の抗微生物組成物。
【請求項４９】
前記追加の抗微生物剤が、グラム陰性の静菌または殺細菌の活性を有し、前記膜破壊剤が、グラム陰性細菌を前記バリアントランチビオティックに対し感受性にする、請求項４８に記載の抗微生物組成物。
【請求項５０】
非天然由来のランチビオティックが、組成物中に約０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／Ｌで存在する、請求項４７から４９のいずれか１項に記載の抗微生物組成物。
【請求項５１】
治療有効量の請求項４７から５０のいずれか１項に記載の抗微生物組成物を対象に投与することを含む、対象の中または上に存在する、細菌の繁殖を低減するかまたは細菌数を低減する方法。
【請求項５２】
前記対象がヒトである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記組成物が、経口的に、局所的に、経鼻的に、バッカルで、舌下に、経粘膜的に、直腸性に、経皮的に、吸入によって、注射によって、または髄腔内に投与される、請求項４７または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記注射が、筋肉内、静脈内、肺内、筋肉内、皮内、腹腔内、くも膜下腔内、または皮下の注射である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
３と８の間のｐＨの生理的溶液中に請求項１から２６または３３から４６のいずれか１項に記載の有効量の非天然由来のランチビオティックを含む保存剤。
【請求項５６】
組成物中の細菌の繁殖または細菌数を低減するのに充分な、ある量の請求項１から２６または３３から４６のいずれか１項に記載の非天然由来のランチビオティックを含む、食品、飲料、ガム、または歯磨き剤の組成物。
【請求項５７】
組成物もしくは物体の中もしくは上の細菌の繁殖を低減するかまたは細菌数を低減するのに有効な期間、請求項１から２６または３３から４６のいずれか１項に記載の抗微生物組成物を、前記組成物または物体に接触させることを含む、組成物もしくは物体の中もしくは上に存在する細菌の繁殖を低減するかまたは細菌数を低減する方法。
【請求項５８】
前記組成物が、食品、飲料、ガム、または歯磨き剤である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
固体表面または布地を、請求項請求項１から２６または３３から４６に記載のランチビオティック組成物、または前記固体表面もしくは布地に被覆、固相化、連結、もしくは結合されている前記組成物とともに含む、組成物。
【請求項６０】
バイオフィルムもしくは生物付着の状態の中もしくは上で細菌の繁殖を低減するかまたは細菌数を低減するのに有効な期間、請求項４７から５０のいずれか１項に記載の抗微生物組成物を、前記バイオフィルムまたは生物付着の状態に接触させることを含む、バイオフィルムまたは生物付着の状態を低減する方法。
【請求項６１】
請求項１から２６または３３から４６のいずれか１項に記載のランチビオティックと、一つまたは複数のアプリケーターとを含むキット。
【請求項６２】
請求項１から２６または３３から４６のいずれか１項に記載の非天然由来のランチビオティックを投与することを含む、細菌感染と診断された対象を予防または治療する方法。
【請求項６３】
前記対象がヒトである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象が、グラム陽性細菌に感染している、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、バンコマイシン耐性のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、バンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、アクチノマイセス・イスラエリー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノマイセス・ネスランディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、アクチノマイセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、バチルス・アンシラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のうち一つまたは複数である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記グラム陽性細菌が、クロストリジウム・ディフィシルである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象が、グラム陰性細菌に感染している、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記グラム陰性細菌が、アシネトバクター・バウマニ、ボルデテラ・パーツシス、ボレリア・ブルグドルフェリ、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・カニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、コクシエラ・バーネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  インフルエンザ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ），シゲラ・ソンネ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ），トレポネーマ・パリズム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、またはエルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）のうち一つまたは複数である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記非天然由来のランチビオティックが、一つまたは複数の追加の抗微生物剤、膜破壊剤、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項６２から６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
請求項４６に記載の非天然由来のランチビオティックと、医薬的に許容可能な担体、医薬的に許容可能な希釈剤、他の希釈剤、賦形剤、またはそれらの組合せとを含む、抗微生物組成物。
【請求項７１】
抗真菌剤、追加の抗微生物剤、膜破壊剤またはそれらの組合せをさらに含む、請求項４７に記載の抗微生物組成物。
【請求項７２】
前記追加の抗微生物剤が、グラム陰性の静菌または殺細菌の活性を有し、前記膜破壊剤が、グラム陰性細菌を前記バリアントランチビオティックに対し感受性にする、請求項４８に記載の抗微生物組成物。
【請求項７３】
前記非天然由来のランチビオティックが、約０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／Ｌで前記組成物中に存在する、請求項７０から７２のいずれか１項に記載の抗微生物組成物。
【請求項７４】
請求項７０から７３のいずれか１項に記載の治療有効量の抗微生物組成物を対象に投与することを含む、対象の中または上に存在する細菌の繁殖を低減するかまたは細菌数を低減する方法。
【請求項７５】
前記対象がヒトである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記組成物が、経口的に、局所的に、経鼻的に、バッカルで、舌下に、経粘膜的に、直腸性に、経皮的に、吸入によって、注射によって、または髄腔内に投与される、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記注射が、筋肉内、静脈内、肺内、筋肉内、皮内、腹腔内、くも膜下腔内、または皮下の注射である、請求項７５の方法。
【請求項７８】
３と８の間のｐＨの生理的溶液中に、有効量の請求項４６に記載の非天然由来のランチビオティックを含む保存剤。
【請求項７９】
組成物中の細菌の繁殖または細菌数を低減するのに充分なある量の請求項４６に記載の非天然由来のランチビオティックを含む、食品、飲料、ガム、または歯磨き剤の組成物。
【請求項８０】
組成物もしくは物体の中もしくは上の細菌の繁殖を低減するかまたは細菌数を低減するのに有効な期間、請求項４６に記載の非天然由来のランチビオティックを、前記組成物または物体に接触させることを含む、組成物もしくは物体の中もしくは上に存在する細菌の繁殖を低減するかまたは細菌数を低減する方法。
【請求項８１】
前記組成物が、食品、飲料、ガム、または歯磨き剤である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
固体表面または布地を、請求項４６に記載の非天然由来のランチビオティック、または前記固体表面もしくは布地に被覆、固相化、連結、もしくは結合されている前記ランチビオティックとともに含む、組成物。
【請求項８３】
バイオフィルムもしくは生物付着の状態の中もしくは上で細菌の繁殖を低減するかまたは細菌数を低減するのに有効な期間、請求項４６に記載の非天然由来のランチビオティックを、前記バイオフィルムまたは生物付着の状態に接触させることを含む、バイオフィルムまたは生物付着の状態を低減する方法。
【請求項８４】
請求項４６に記載のランチビオティックおよび一つまたは複数のアプリケーターを含むキット。
【請求項８５】
請求項４６に記載の非天然由来のランチビオティックを投与することを含む、細菌感染と診断された対象を予防または治療する方法。
【請求項８６】
前記対象がヒトである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記対象が、グラム陽性細菌に感染している、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス・エピデルミディス、バンコマイシン耐性のエンテロコッカス、バンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、プロピオニバクテリウム・アクネス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ラクトバチルス・サリバリウス、リステリア・モノサイトゲネス、アクチノマイセス・イスラエリー、アクチノマイセス・ネスランディ、アクチノマイセス・ビスコーサス、バチルス・アンシラシス、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・インターメディウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、コリネバクテリウム・ジフテリア、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・パーフリンゲンス、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・ディフィシルのうち一つまたは複数である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記グラム陽性細菌が、クロストリジウム・ディフィシルである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記対象が、グラム陰性細菌に感染している、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項９１】
前記グラム陰性細菌が、アシネトバクター・バウマニ、ボルデテラ・パーツシス、ボレリア・ブルグドルフェリ、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・カニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス、カンピロバクター・ジェジュニ、コクシエラ・バーネッティ、エシェリキア・コリ、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ・インターロガンス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、シュードモナス・エルギノーザ、リケッチア・リケッチイ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、シゲラ・ソンネ、トレポネーマ・パリズム、ビブリオ・コレラ、エルシニア・エンテロコリチカ、またはエルシニア・ペスティスのうち一つまたは複数である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記非天然由来のランチビオティックが、一つまたは複数の追加の抗微生物剤、膜破壊剤、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項８５から９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
配列番号２〜４３１のいずれか一つを含むか、または図７に記載されるようなバリアントをコードする、精製ポリヌクレオチドまたはそれらの組合せ。
【請求項９４】
配列番号７５６、７５７、７５８、７５９、または７６０のいずれか一つを含む、精製ポリヌクレオチド。
【請求項９５】
配列番号７０９、７１４、７１６、７３５、７４７、７５１、７５４、または７５８のいずれか一つを含む、精製ポリヌクレオチド。
【請求項９６】
配列番号７５８を含む、精製ポリヌクレオチド。
【請求項９７】
配列番号１１６３を含む、精製ポリヌクレオチド。
【請求項９８】
配列番号７５８のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項９９】
配列番号１１６３のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１００】
配列番号７５８のポリヌクレオチドを含む、単離された組換えストレプトコッカス・ミュータンス株。
【請求項１０１】
配列番号１１６３のポリヌクレオチドを含む、単離された組換えストレプトコッカス・ミュータンス株。
【請求項１０２】
配列番号１１６１のアミノ酸配列を含む非天然由来のポリペプチド。
【請求項１０３】
（ａ）乳酸の発現が野生型Ｓ．ミュータンス株に比べて約８０％以上減るような、乳酸合成に関与するポリヌクレオチド中の変異；（ｂ）組換えアルコールデヒドロゲナーゼのポリヌクレオチド；および（ｃ）請求項１から２６または３３から４６のいずれか１項に記載の非天然由来のランチビオティックをコードする組換えポリヌクレオチド、を含む、単離された組換えストレプトコッカス・ミュータンス株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１６年７月１５日出願の米国仮特許出願第６２／３６２，７８８号、２０１６年７月１５日出願の第６２／３６２，８０９号、および２０１６年１１月１０日出願の第６２／４２０，３２８号の利益を請求し、これらはそれぞれ、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表への参照
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子出願された配列表を含み、ここに参照によりその全体を組み込まれる。２０１７年７月１２日に作製された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０１００−００１７ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、４２１，４６５バイトのサイズである。
【０００３】
本願発明は、概して、分子生物学、感染疾患、およびポリペプチドベースの抗生物剤の分野に関する。さらに具体的には、本発明のある特定の態様は、新規のランチビオティック（ポリペプチド）バリアント、および一つまたは複数のランチビオティック（ポリペプチド）バリアントをコードする核酸配列に関する。本発明のある特定の他の態様は、一つまたは複数のランチビオティックバリアントをコードする一つまたは複数の核酸配列を含む組換えベクター、前記ベクターを用いて形質転換された宿主細胞、ランチビオティックバリアントを生産するための方法、およびそれらの使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
疾患を引き起こす細菌の数多くの株が、現在利用可能な抗生物剤に対し次第に耐性となりつつある。多剤耐性の病原体に起因する医療関連の感染は、特に難題である。世界中で何万人もが、抗生物剤耐性の感染に苦しみ、この感染により、医療システムに莫大なコストが生じている。新しい抗生物剤の必要性は、医学界で極めて重要なアンメットニーズとなりつつある。
【０００５】
臨床的意義を持つ可能性のある抗生物剤のクラスであるランチビオティック（Ｓｍｉｔｈ＆Ｈｉｌｌｍａｎ，（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．１１：４０１−４０８に概説されている）は、存在する特徴的なランチオニン環ゆえにその名称を得た。ランチビオティックはまた、２，３−ジデヒドロアラニン（Ｄｈａ）、２，３−ジデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）、Ｓ−アミノビニ−Ｄ−システイン（ＡｖｉＣｙｓ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、２−オキソプロピオニル、２−オキソブチリルやヒドロキシプロピオニルなど、様々な通常にないアミノ酸を有することが知られている（Ｈａｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１６３６−１６３７．）。ミュータシン１１４０（「ＭＵ１１４０」）は、口腔微生物ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）の特定の株が生産することのできるランチビオティックの１タイプである（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６８１０−６８１６．）。
【発明の概要】
【０００６】
本願開示は、ＭＵ１１４０の単アミノ酸変異を含む非天然由来のランチビオティックを提供し、このランチビオティックは、配列番号２から４３１のうちのいずれか一つをコードするアミノ酸配列を有する。
【０００７】
本願開示はまた、ＭＵ１１４０の複数部位のアミノ酸変異を含み、図７に記載されるようなバリアントである、非天然由来のランチビオティックを提供する。
【０００８】
本願開示はまた、図８：第１群、第２群、または第３群に記載されるようないずれかのバリアントを含む、非天然由来のランチビオティックを提供する。実施形態によっては、非天然由来のランチビオティックは、図８：第１群に記載されるようないずれかのバリアントを含む。
【０００９】
本願開示はまた、図６に記載されるようなＭＵ１１４０の単アミノ酸変異を含む、非天然由来のランチビオティックを提供する。
【００１０】
本願開示はまた、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含み、（ａ）１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）；（ｂ）１７位のフェニルアラニンのロイシン（Ｆ１７Ｌ）またはチロシン（Ｆ１７Ｙ）への変更；（ｃ）１８位のアスパラギンのアラニンへの変更（Ｎ１８Ａ）；（ｄ）２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更（Ｙ２０Ｆ）；または（ｅ）それらの組合せである変異をさらに含む、非天然由来のランチビオティックを提供する。実施形態によっては、非天然由来のランチビオティックは、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含み、二つの変異をさらに含み、一つの変異が：（ａ）１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）；（ｂ）１７位のフェニルアラニンのロイシン（Ｆ１７Ｌ）またはチロシン（Ｆ１７Ｙ）への変更；（ｃ）１８位のアスパラギンのアラニンへの変更（Ｎ１８Ａ）；（ｄ）２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更（Ｙ２０Ｆ）；または（ｅ）それらの組合せである。実施形態によっては、非天然由来のランチビオティックは、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含み、二つの変異をさらに含み、一つの変異が、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）である。
【００１１】
実施形態によっては、本開示は、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含む非天然由来のランチビオティックを提供し、二つの変異をさらに含み、一つの変異が：（ａ）１位のフェニルアラニンのバリンへの変更（Ｆ１Ｖ）；（ｂ）１位のフェニルアラニンのアラニンへの変更（Ｆ１Ａ）；（ｃ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更（Ｆ１Ｉ）；（ｄ）１位のフェニルアラニンのロイシンへの変更（Ｆ１Ｌ）；（ｅ）１位のフェニルアラニンのスレオニンへの変更（Ｆ１Ｔ）；または（ｆ）１位のフェニルアラニンのチロシンへの変更（Ｆ１Ｙ）である。実施形態によっては、本開示は、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含む非天然由来のランチビオティックを提供し、二つの変異をさらに含み、一つの変異が、１位のフェニルアラニンのバリンへの変更（ＦＩＶ）である。本願開示はまた、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含み：（ａ）１位のフェニルアラニンのアラニンへの変更と、１３位のアルギニンの：（ｉ）アラニン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ａ）、（ｉｉ）バリン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ｖ）、（ｉｉｉ）アスパラギン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ｎ）、もしくは（ｉｖ）セリン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ｓ）への変更との組合せ；（ｂ）１位のフェニルアラニンのグリシンへの変更と、１３位のアルギニンの：（ｉ）グリシン（Ｆ１Ｇ  Ｒ１３Ｇ）への変更との組合せ；（ｃ）１位のフェニルアラニンのヒスチジンへの変更と、１３位のアルギニンの：（ｉ）アスパラギン（Ｆ１Ｈ  Ｒ１３Ｎ）への変更との組合せ；（ｄ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンの：（ｉ）アラニン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ａ）、（ｉｉ）グリシン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｇ）、（ｉｉｉ）イソロイシン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｉ）、（ｉｖ）アスパラギン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｎ）、（ｖ）プロリン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｐ）、（ｖｉ）グルタミン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｑ）、（ｖｉ）グルタミン酸（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｓ）、（ｖｉｉ）セリン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｖ）、もしくは（ｖｉｉｉ）バリン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｅ）への変更との組合せ；（ｅ）１位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンの：（ｉ）アラニン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ａ）、（ｉｉ）アスパラギン酸（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｄ）、（ｉｉｉ）グリシン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｇ）、（ｉｖ）アスパラギン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｎ）、（ｖ）プロリン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｐ）、もしくは（ｖｉ）グルタミン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｑ）への変更との組合せ；（ｆ）１位のフェニルアラニンのスレオニンへの変更と、１３位のアルギニンの：（ｉ）アラニン（Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ａ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ｎ）、もしくは（ｉｉｉ）バリン（Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ｖ）への変更との組合せ；（ｇ）１位のフェニルアラニンのバリンへの変更と、１３位のアルギニンの：（ｉ）アラニン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ａ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｎ）、（ｉｉｉ）グルタミン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｑ）、（ｉｖ）アスパラギン酸（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｄ）、（ｖ）バリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｖ）、もしくは（ｖｉ）プロリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｐ）への変更との組合せ；または（ｈ）１位のフェニルアラニンのチロシンへの変更と、１３位のアルギニンの：（ｉ）アスパラギン酸（Ｆ１Ｙ  Ｒ１３Ｄ）もしくは（ｉｉ）グリシン（Ｆ１Ｙ  Ｒ１３Ｇ）への変更との組合せを含む二つの変異をさらに含む、非天然由来のランチビオティックを提供する。実施形態によっては、本開示は、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含み、１位のフェニルアラニンのバリンへの変更と、１３位のアルギニンの：（ｉ）アラニン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ａ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｎ）、（ｉｉｉ）グルタミン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｑ）、（ｉｖ）アスパラギン酸（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｄ）、（ｖ）バリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｖ）、または（ｖｉ）プロリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｐ）への変更との組合せを含む二つの変異をさらに含む、非天然由来のランチビオティックを提供する。実施形態によっては、本開示は、二つの変異を有するＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含み、上記二つの変異が、１位のフェニルアラニンのバリンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ（ＦＩＶ  Ｒ１３Ｎ）（例えば、配列番号１１５７）からなる、非天然由来のランチビオティックを提供する。
【００１２】
本願開示はまた、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含み：（ａ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、１５位のグリシンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ａ  Ｇ１５Ａ）；（ｂ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ、１５位のグリシンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｄ  Ｇ１５Ａ）；（ｃ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、４位のトリプトファンのイソロイシンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｗ４Ｉ  Ｒ１３Ａ）；（ｄ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、４位のトリプトファンのメチオニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｗ４Ｍ  Ｒ１３Ｄ）；（ｅ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、４位のトリプトファンのメチオニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｗ４Ｍ  Ｒ１３Ｎ）；（ｆ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｒ１３Ａ）；（ｇ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、６位のロイシンのバリンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｌ６Ｖ  Ｒ１３Ａ）；（ｈ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ａ  Ｙ２０Ｆ）；（ｉ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｄ  Ｙ２０Ｆ）；（ｊ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｎ  Ｙ２０Ｆ）；（ｋ）１位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｎ  Ｙ２０Ｆ）；（ｌ）１位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ａ  Ｙ２０Ｆ）；または（ｍ）１位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｄ  Ｙ２０Ｆ）を含む三つの変異をさらに含む、非天然由来のランチビオティックを提供する。
【００１３】
本願開示はまた、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含み：（ａ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、４位のトリプトファンのリジンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｗ４Ｋ  Ｒ１３Ａ）；および（ｂ）１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、４位のトリプトファンのリジンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｗ４Ｋ  Ｒ１３Ｄ）を含む変異をさらに含む、非天然由来のランチビオティックを提供する。
【００１４】
本願開示はまた、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含み、１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、４位のトリプトファンのメチオニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｗ４Ｋ  Ｒ１３Ａ  Ｙ２０Ｆ）を含む変異をさらに含む、非天然由来のランチビオティックを提供する。
【００１５】
実施形態によっては、本開示は、本明細書に記載されるような非天然由来のランチビオティックと、医薬的に許容可能な担体、医薬的に許容可能な希釈剤、他の希釈剤または賦形剤とを含む、抗微生物組成物に向けられる。実施形態によっては、本組成物は、抗真菌剤、追加の抗微生物剤、膜破壊剤、またはそれらの組合せをさらに含む。実施形態によっては、上記追加の抗微生物剤は、グラム陰性の静菌または殺細菌の活性を有し、上記膜破壊剤は、グラム陰性細菌をバリアントランチビオティックに対し感受性にする。
【００１６】
実施形態によっては、一つまたは複数の単離されたランチビオティックは、組成物中に約０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／Ｌで存在する、
【００１７】
実施形態によっては、本開示は、治療有効量の本明細書に記載されるような抗微生物組成物を対象に投与することを含む、対象の中または上に存在する、細菌の繁殖を低減するかまたは細菌数を低減する方法に向けられる。実施形態によっては、対象はヒトである。
【００１８】
実施形態によっては、本組成物は、経口的に、局所的に、経鼻的に、バッカルで、舌下に、経粘膜的に、直腸に、経皮的に、吸入によって、注射によって、または髄腔内に投与される。実施形態によっては、注射は、筋肉内、静脈内、肺内、筋肉内、皮内、腹腔内、くも膜下腔内、または皮下の注射である、
【００１９】
実施形態によっては、本開示は、３と８の間のｐＨで生理的溶液中に、有効量の本明細書に記載されるような非天然由来のランチビオティックを含む保存剤に向けられる。
【００２０】
実施形態によっては、本開示は、組成物中の細菌の繁殖または細菌数を低減するのに充分な、ある量の本明細書に記載されるような非天然由来のランチビオティックを含む、食品、飲料、ガム、または歯磨き剤の組成物に向けられる。
【００２１】
実施形態によっては、本開示は、組成物もしくは物体の中もしくは上の細菌の繁殖を低減するかまたは細菌数を低減するのに有効な期間、本明細書に記載されるような抗微生物組成物を、組成物または物体に接触させることを含む、組成物もしくは物体の中もしくは上に存在する細菌の繁殖を低減するかまたは細菌数を低減する方法に向けられる。実施形態によっては、組成物は、食品、飲料、ガム、または歯磨き剤である。
【００２２】
実施形態によっては、本開示は、配列番号２〜４３１のいずれか一つを含むかもしくは図７に記載されたバリアントをコードする精製ポリヌクレオチド、またはそれらの組合せに向けられる。実施形態によっては、本開示は、配列番号７５６、７５７、７５８、５５９、７６０、または７６１のいずれか一つを含む、精製ポリヌクレオチドを提供する。実施形態によっては、本開示は、配列番号７０９、７１４、７１６、７３５、７４７、７５１、７５４、または７５８のいずれか一つを含む、精製ポリヌクレオチドを提供する。実施形態によっては、本開示は、配列番号７５８を含む、精製ポリヌクレオチドに向けられる。
【００２３】
実施形態によっては、本開示は、固体表面または布地を本明細書に記載されるようなランチビオティック組成物と共に含むか、または固体表面もしくは布地に被覆、固相化、連結、もしくは結合されている、組成物に向けられる。
【００２４】
実施形態によっては、本開示は、バイオフィルムもしくは生物付着の状態の中もしくは上で細菌の繁殖を低減するかまたは細菌数を低減するのに有効な期間、本明細書に記載されるような抗微生物組成物を、バイオフィルムまたは生物付着の状態に接触させることを含む、バイオフィルムまたは生物付着の状態を低減する方法に向けられる。
【００２５】
実施形態によっては、本開示は、本明細書に記載されるようなランチビオティックと、一つまたは複数のアプリケーターとを含むキットに向けられる。
【００２６】
実施形態によっては、本開示は、本明細書に記載されるような非天然由来のランチビオティックを投与することを含む、細菌感染と診断された対象を予防または治療する方法に向けられる。実施形態によっては、対象はヒトである。実施形態によっては、対象は、グラム陽性細菌に感染している。実施形態によっては、グラム陽性細菌は、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、バンコマイシン耐性のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、バンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、アクチノマイセス・イスラエリー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノマイセス・ネスランディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、アクチノマイセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、バチルス・アンシラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、およびクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のうち一つまたは複数である。実施形態によっては、グラム陽性細菌は、クロストリジウム・ディフィシルである。
【００２７】
実施形態によっては、対象は、グラム陰性細菌に感染している。実施形態によっては、グラム陰性細菌は、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ）、ボルデテラ・パーツシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｔｉｅｒｉ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、コクシエラ・バーネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ・ソンネ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、トレポネーマ・パリズム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、およびエルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）のうち一つまたは複数である。実施形態によっては、非天然由来のランチビオティックは、一つまたは複数の追加の抗微生物剤、膜破壊剤、またはそれらの組合せをさらに含む。
【００２８】
実施形態によっては、本開示は、（ａ）野生型Ｓ．ミュータンス株に比べて乳酸の発現が約８０％以上消失するような、乳酸合成に関与するポリヌクレオチド中の変異；（ｂ）組換えアルコールデヒドロゲナーゼポリヌクレオチド；および（ｃ）図５または図７に記載されるような非天然由来のランチビオティックをコードする組換えポリヌクレオチドを含む、単離された組換えストレプトコッカス・ミュータンス株に向けられる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】野生型（生来の）成熟ＭＵ１１４０ランチビオティックポリペプチド（配列番号１１５６）の一次アミノ酸配列、二次構造、および大環状環（図１Ａおよび図１Ｂ）、ならびに成熟ＭＵ１１４０ランチビオティックポリペプチド（配列番号１１５７）の複数部位バリアントＦ１Ｖ  Ｒ１３Ｎの一次アミノ酸配列、二次構造、および大環状環（図１Ｃおよび図１Ｄ）を示す図である。アミノ酸の略称は以下を含む。Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａはランチオニンであり；Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａは３−メチルランチオニンであり；Ｄｈａはα，β−ジデヒドロアラニンであり；Ｄｈｂはα，β−ジデヒドロブチリン（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２（３５）：１０３７２−８４（２００３））である。
【００３０】
【図２】ｐＬＡＮ０４２のプラスミドベクター地図を示す図である。
【００３１】
【図３】ｐＬＡＮ１２６のプラスミド地図を示す図である。
【００３２】
【図４】ＭＵ１１４０の単アミノ酸バリアントの一覧であり、配列番号１（ＭＵ１１４０）と、バリアントをコードし得る配列番号２〜４３１（ＭＵ１１４０のバリアント）とのポリヌクレオチドを含む。
【００３３】
【図５】配列番号４３２（ＭＵ１１４０）およびＭＵ１１４０の単アミノ酸バリアントの一覧である。
【００３４】
【図６】Ｓ．ミュータンス内に染色体組込みされたＭＵ１１４０の単アミノ酸バリアントの一覧である。
【００３５】
【図７】ＭＵ１１４０の単数または複数のアミノ酸バリアントの特徴を示す配列番号４３２（ＭＵ１１４０）の一覧である。
【００３６】
【図８】様々な変異体の透明域化の結果の概要を示す図である。透明域化能は、６群に分けられる。第１群：活性＞ＳＭ２５３対照株（透明域＞０．３１９ｃｍ２）；第２群：２回の反復実験で活性＞ＳＭ２５３（１回の反復実験；第３群：１回の反復で活性＞ＳＭ２５３であり、１回の反復実験で活性≦ＳＭ２５３；第４群：活性＞ＳＭ２５３対照株（透明域＞０．１６７ｃｍ２であるが透明域＜０．３１９ｃｍ２）；第５群活性≦ＳＭ２５３対照（透明域≦０．１６７ｃｍ２）；および第６群：決定せず。
【００３７】
【図９】二次構造、例えば環を持たない、翻訳後修飾されたランチビオティックの野生型（配列番号１１５９）およびランチビオティックバリアントのＦ１Ｖ  Ｒ１３Ｎ（配列番号１１５８）の配列の例を標示する図である。
【００３８】
【図１０】図１０ＡはＭＵ１１４０の全長６３アミノ酸の前駆タンパク質の配列（配列番号１１６０であり、生物活性を持つ成熟したランチビオティックの一部となり得る「コアペプチド」残基と、翻訳後修飾中に切断される「切断ペプチド」残基とを示す図である。図１０Ｂは  Ｆ１ＶＲ１３Ｎの全長６３アミノ酸前駆タンパク質の配列（配列番号１１６１）であり、また「コアペプチド」残基および「切断ペプチド」残基を示す図である。
【００３９】
【図１１】図１１ＡはＭＵ１１４０の全長６３アミノ酸の前駆タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１１６２）を示す図である。図１１Ｂ：バリアントＦ１Ｖ  Ｒ１３Ｎの全長６３アミノ酸前駆タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１１６３）を示す図である。図１１Ｃは切断されたタンパク質、すなわち、全長６３アミノ酸の前駆タンパク質からコアペプチドを差し引いたアミノ酸配列を示す図である。図１１Ｄは切断されたタンパク質のヌクレオチド配列を示す図である。
【００４０】
ランチビオティックＭＵ１１４０のバリアント
野生型ＭＵ１１４０は、図１Ａおよび図１Ｂに示されている。用語「ＭＵ１１４０」とは、（１）翻訳された全長６３アミノ酸のＭＵ１１４０の前駆タンパク質（配列番号１１６０）、（２）翻訳および切断された２２アミノ酸のＭＵ１１４０のポリペプチド（配列番号４３２）、ならびに（３）翻訳後修飾された生物活性のＭＵ１１４０の、二次構造環の標示のあるもの（配列番号１１５６）、または二次構造環の標示のないもの（配列番号１１５９）を指す。配列番号１１６０は、ランチビオティックの前駆タンパク質形態であり、この形態は、タンパク質分解による切断と、宿主細胞中に存在する他の要因によるプロセッシングの後に、結果としてＭＵ１１４０（配列番号１１５６または配列番号１１５９）の合成を生じる。配列番号４３２は、翻訳後修飾、例えば、位置的な変異および環の形成が指定されていない、切断された２２アミノ酸のタンパク質（「コアペプチド」）である。明確にするために、「ＭＵ１１４０のアミノ酸配列を含むランチビオティック」相とは、（１）全長６３アミノ酸のＭＵ１１４０の前駆タンパク質、（２）翻訳後修飾および切断された２２アミノ酸のＭＵ１１４０のポリペプチド、ならびに（３）翻訳後修飾された生物活性のＭＵ１１４０を含めた、様々な形態のポリペプチドを指す。ＭＵ１１４０としては、「ランチビオティック」活性を持つこともあれば持たないこともある、上に記載されたようなポリペプチドの形態を挙げることができる。そのため、ランチビオティック活性を失っていることがある全長６３アミノ酸のＭＵ１１４０の前駆タンパク質は、やはり「ＭＵ１１４０のアミノ酸配列を含むランチビオティック」であるものと考えられ、それはなぜなら、そのような前駆タンパク質は、翻訳後修飾されてランチビオティック活性を獲得できるためである。
【００４１】
用語「翻訳後の切断されたポリペプチド」とは、翻訳後修飾の間に切断除去された、ランチビオティックの一部ではないポリペプチド（配列番号１１６４）を指す。配列番号１１５６は、切断および翻訳後修飾された生物活性のＭＵ１１４０を指す。翻訳後修飾された生物活性のＭＵ１１４０は、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤと標識された四つの環を有する。これらの環のうち二つは、環Ａ中の一つ（Ａｌａ3−Ｓ−Ａｌａ7）と環Ｃ中の一つ（Ａｌａ16−Ｓ−Ａｌａ21）とを含むランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）残基によって形成され；アルファ−アミノ酪酸残基を８位に、Ａｌａを１１位に含む環Ｂ（Ａｂｕ8−Ｓ−Ａｌａ11）を形成するメチル−ランチオニン残基（Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ）があり；第４の環であるＤは、チオエーテル連結によってアミノビニル基に連結された１９位のＡｌａ（Ａｌａ19−Ｓ−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−）から構成される。用語「環」または「複数の環」は、「架橋（複数可）」または「連結（複数可）」と共に互換的に使用されることがある。用語「生物活性の」または「生物学的に機能的な」とは、グラム陽性またはグラム陰性の細菌を死滅させるかまたはその成長を阻害することができる、すなわち抗微生物活性を有する、ポリペプチドを指す。
【００４２】
本明細書に記載されるＭＵ１１４０のバリアントは、全長６３アミノ酸の前駆タンパク質（配列番号１１６０）、翻訳後の切断された２２アミノ酸のポリペプチド（配列番号４３２）、および／または翻訳後修飾された生物活性のＭＵ１１４０（配列番号１１５６）に適用される。ＭＵ１１４０のバリアントは、（１）変更されている本来のアミノ酸の同一性（１文字指定）、（２）変更されているアミノ酸の場所、および（３）バリアント中のアミノ酸の同一性を特定することによって、本明細書に指定されている。明確にするために、本明細書に使用される位置的な命名法は、２２アミノ酸タンパク質の相対的な位置を指す。そのため、全長６３アミノ酸の前駆タンパク質を指す場合であっても、「１位」とは、２２アミノ酸の翻訳後の切断されたタンパク質中に見出されるであろう最初のアミノ酸を指す。図１０Ａは、例えば、１から２２まで指定されたＭＵ１１４０中のアミノ酸の位置的な命名を図示する。例えば、「Ｒ１３Ｔ」と指定されたバリアントは、２２アミノ酸のポリペプチドの１３番目のアミノ酸（本来はアルギニン「Ｒ」）がスレオニン「Ｔ」に置換されている）、ＭＵ１１４０ポリペプチドを指す。同じく、野生型ＭＵ１１４０の複数のアミノ酸が置換されている場合、置換されているアミノ酸のそれぞれは、同様の方法で指定される。例えば、「Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ｔ」と指定されたバリアントは、２２アミノ酸のポリペプチドの１番目のアミノ酸がフェニルアラニン「Ｆ」からスレオニン「Ｔ」に変更され、２２アミノ酸ポリペプチドの１３番目のアミノ酸が、アルギニン「Ｒ」からスレオニン「Ｔ」に変更されている、ＭＵ１１４０ポリペプチドを指す。同様の名付けの決まりが、野生型ＭＵ１１４０とは異なる、３個、４個、５個、またはそれを超えるアミノ酸を有するバリアントに適用される。
【００４３】
実施形態では、本開示は、ランチビオティックＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）の以下の変異：
ａ．  １３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）；
ｂ．  １７位のフェニルアラニンのロイシン（Ｆ１７Ｌ）またはチロシン（Ｆ１７Ｙ）への変更；
ｃ．  １８位のアスパラギンのアラニンへの変更（Ｎ１８Ａ）；
ｄ．  ２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更（Ｙ２０Ｆ）；および
ｅ．  それらの組合せ、を含む、ランチビオティックを提供する。
【００４４】
実施形態によっては、本非天然由来のランチビオティックは、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含み、二つの変異をさらに含み、ここで、一つの変異は：
ａ．  １３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）；
ｂ．  １７位のフェニルアラニンのロイシン（Ｆ１７Ｌ）またはチロシン（Ｆ１７Ｙ）への変更；
ｃ．  １８位のアスパラギンのアラニンへの変更（Ｎ１８Ａ）；
ｄ．  ２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更（Ｙ２０Ｆ）；または
ｅ．  それらの組合せ、である。
【００４５】
実施形態によっては、非天然由来のランチビオティックは、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含み、二つの変異をさらに含み、ここで、一つの変異は、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更（Ｒ１３Ｎ）である。
【００４６】
実施形態によっては、本開示は、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含む非天然由来のランチビオティックを提供し、二つの変異をさらに含み、ここで、一つの変異は：
ａ．  １位のフェニルアラニンのバリンへの変更（Ｆ１Ｖ）；
ｂ．  １位のフェニルアラニンのアラニンへの変更（Ｆ１Ａ）；
ｃ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更（Ｆ１Ｉ）；
ｄ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更（Ｆ１Ｌ）；
ｅ．  １位のフェニルアラニンのスレオニンへの変更（Ｆ１Ｔ）；または
ｆ．  １位のフェニルアラニンのチロシンへの変更（Ｆ１Ｙ）である。
【００４７】
実施形態によっては、本開示は、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含む非天然由来のランチビオティックを提供し、二つの変異をさらに含み、ここで、一つの変異は、１位のフェニルアラニンのバリンへの変更（ＦＩＶ）である。
【００４８】
実施形態によっては、本開示は、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含む非天然由来のランチビオティックを提供し、二つの変異をさらに含み、ここで、一つの変異は１位にあり、一つの変異は１３位にある。実施形態によっては、本開示は、ＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含む非天然由来のランチビオティックを提供し、二つの変異をさらに含み、ここで、１位のフェニルアラニンは、バリンに変更され、１３位のアルギニンは、アスパラギンに変更されている（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｎ）。例えば、配列番号５５０を参照されたい。
【００４９】
実施形態では、本開示は、二つ以上の上記の変異を有するＭＵ１１４０（例えば配列番号１１５６）のバリアントを提供する。
【００５０】
実施形態では、本開示は、ランチビオティックＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）の以下の二つの変異：
ａ．  １位のフェニルアラニンのアラニンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ａ）、
ｉｉ．  バリン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ｖ）、
ｉｉｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ｎ）、または
ｉｖ．  セリン（Ｆ１Ａ  Ｒ１３Ｓ）への変更との組合せ、
ｂ．  １位のフェニルアラニンのグリシンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  グリシン（Ｆ１Ｇ  Ｒ１３Ｇ）への変更との組合せ；
ｃ．  １位のフェニルアラニンのヒスチジンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ｈ  Ｒ１３Ｎ）への変更との組合せ；
ｄ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ａ）；
ｉｉ．  グリシン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｇ）；
ｉｉｉ．  イソロイシン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｉ）；
ｉｖ．  アスパラギン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｎ）；
ｖ．  プロリン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｐ）；
ｖｉ．  グルタミン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｑ）；
ｖｉｉ．  グルタミン酸（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｓ）；
ｖｉｉｉ．  セリン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｖ）；または
ｉｘ．  バリン（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｅ）への変更との組合せ；
ｅ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ａ）；
ｉｉ．  アスパラギン酸（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｄ）；
ｉｉｉ．  グリシン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｇ）；
ｉｖ．  アスパラギン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｎ）；
ｖ．  プロリン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｐ）；または
ｖｉ．  グルタミン（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｑ）への変更との組合せ；
ｆ．  １位のフェニルアラニンのスレオニンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ａ）；
ｉｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ｎ）；または
ｉｉｉ．  バリン（Ｆ１Ｔ  Ｒ１３Ｖ）への変更との組合せ；
ｇ．  １位のフェニルアラニンのバリンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ａ）；
ｉｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｎ）；
ｉｉｉ．  グルタミン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｑ）；
ｉｖ．  アスパラギン酸（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｄ）；
ｖ．  バリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｖ）；または
ｖｉ．  プロリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｐ）への変更との組合せ；
ｈ．  １位のフェニルアラニンのチロシンへの変更と、１３位のアルギニンの：
ｉ．  アスパラギン酸（Ｆ１Ｙ  Ｒ１３Ｄ）；または
ｉｉ．  グリシン（Ｆ１Ｙ  Ｒ１３Ｇ）への変更との組合せ、を含む、非天然由来のランチビオティックを提供する
【００５１】
実施形態によっては、本開示は、ランチビオティックＭＵ１１４０のアミノ酸配列（例えば配列番号１１５６）を含む非天然由来のランチビオティックを提供し、ここで、１位のフェニルアラニンはバリンに変更され、１３位のアルギニンは：
ｉ．  アラニン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ａ）；
ｉｉ．  アスパラギン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｎ）；
ｉｉｉ．  グルタミン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｑ）；
ｉｖ．  アスパラギン酸（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｄ）；
ｖ．  バリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｖ）；または
ｖｉ．  プロリン（Ｆ１Ｖ  Ｒ１３Ｐ）に変更されている。
【００５２】
実施形態では、本開示は、ＭＵ１１４０（例えば配列番号１１５６）の以下の三つの変異の組合せ：
ａ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、１５位のグリシンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ａ  Ｇ１５Ａ）；
ｂ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ、１５位のグリシンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｄ  Ｇ１５Ａ）；
ｃ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、４位のトリプトファンのイソロイシンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｗ４Ｉ  Ｒ１３Ａ）；
ｄ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、４位のトリプトファンのメチオニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｗ４Ｍ  Ｒ１３Ｄ）；
ｅ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、４位のトリプトファンのメチオニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｗ４Ｍ  Ｒ１３Ｎ）；
ｆ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｒ１３Ａ）；
ｇ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、６位のロイシンのバリンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｌ６Ｖ  Ｒ１３Ａ）；
ｈ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ａ  Ｙ２０Ｆ）；
ｉ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｄ  Ｙ２０Ｆ）；
ｊ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｒ１３Ｎ  Ｙ２０Ｆ）；
ｋ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｎ  Ｙ２０Ｆ）；
ｌ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ａ  Ｙ２０Ｆ）；または
ｍ．  １位のフェニルアラニンのロイシンへの変更と、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｌ  Ｒ１３Ｄ  Ｙ２０Ｆ）  を有する、非天然由来のランチビオティックを提供する。
【００５３】
実施形態では、本開示は、以下の変異の組合せ：
ａ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、４位のトリプトファンのリジンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｗ４Ｋ  Ｒ１３Ａ）；および
ｂ．  １位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、４位のトリプトファンのリジンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアスパラギン酸への変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｗ４Ｋ  Ｒ１３Ｄ）を有する、ＭＵ１１４０（例えば配列番号１１５６）のバリアントを提供する。
【００５４】
実施形態では、本開示は、以下の変異の組合せを有するＭＵ１１４０（例えば配列番号１１５６）のバリアントを提供し、そのようなものとしては、１位のフェニルアラニンのイソロイシンへの変更と、２位のリジンのアラニンへの変更との組合せ、４位のトリプトファンのメチオニンへの変更との組合せ、１３位のアルギニンのアラニンへの変更との組合せ、２０位のチロシンのフェニルアラニンへの変更との組合せ（Ｆ１Ｉ  Ｋ２Ａ  Ｗ４Ｋ  Ｒ１３Ａ  Ｙ２０Ｆ）が挙げられる。
【００５５】
実施形態では、本開示は、ＭＵ１１４０の単アミノ酸変異を含む、非天然由来のランチビオティックを提供し、ここで、ランチビオティックは、配列番号２から４３１のいずれか一つを含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有する。本開示はまた、配列番号２から４３１または７０８から７６３のいずれか一つによってコードされるアミノ酸配列を含む全長６３アミノ酸の前駆タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。例えば、配列番号７６４の前駆タンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１６５および配列番号２を含み得る。実施形態では、本開示は、ＭＵ１１４０の一つまたは複数のアミノ酸変異を含む、非天然由来のランチビオティックを提供し、ここでは、ランチビオティックは、配列番号４３３〜７０７のいずれか一つを含むアミノ酸配列を有する。実施形態では、本開示は、図８：第１群、第２群、または第３群にあるいずれかのバリアントを含む、非天然由来のランチビオティックを提供する。実施形態では、本開示は、図８：第１群にあるいずれかのバリアントを含む、非天然由来のランチビオティックを提供する。本開示はまた、図８の第１群、第２群、または第３群にあるいずれかのバリアントを含む、非天然由来の全長６３アミノ酸の前駆タンパク質を提供する。本開示はまた、図８の第１群にあるいずれかのバリアントを含む、非天然由来の全長６３アミノ酸の前駆タンパク質を提供する。
【００５６】
図５のランチビオティックバリアントは、単アミノ酸バリアントを含む。実施形態によっては、本開示は、図５に見出されるようなＭＵ１１４０の単アミノ酸変異を含む、非天然由来のランチビオティックに向けられる。本開示はまた、図５に記載されるような、非天然由来の全長６３アミノ酸前駆タンパク質形態のランチビオティックバリアントを提供する。例えば、配列番号７６６の前駆タンパク質形態は、配列番号１１６４および配列番号７６６を含むことがあり、配列番号７６７の前駆タンパク質形態は、配列番号１１６４および配列番号７６７などを含み得る。
【００５７】
実施形態によっては、本開示は、図７に見出されるようなランチビオティックバリアントを提供する。図７のランチビオティックバリアントは、「コアペプチド」を含む。本開示はまた、図７に記載されるような、非天然由来の全長６３アミノ酸の前駆タンパク質形態の「コアペプチド」バリアントを提供する。例えば、配列番号７０３の前駆タンパク質形態は、配列番号１１６４および配列番号７０３を含み得る。
【００５８】
本開示のランチビオティックは、ランチビオティックバリアントを含み、このバリアントは、非天然由来のランチビオティックバリアントとすることができる。用語「ランチビオティックバリアント」、「ＭＵ１１４０バリアント」、「非天然由来のランチビオティック」、または「バリアント」は、互換的であり、一つまたは複数の（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれを超えるアミノ酸の置換（修飾アミノ酸置換を含む）、欠失、または挿入を有するＭＵ１１４０（すなわち野生型ランチビオティック）ポリペプチド（配列番号４３２）を指す。用語「修飾アミノ酸置換」は、修飾アミノ酸へのアミノ酸の置換を含む。実施形態によっては、用語「ランチビオティックバリアント」、「ＭＵ１１４０バリアント」、「非天然由来のランチビオティック」、または「バリアント」とは、一つまたは複数の（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれを超えるアミノ酸の置換（修飾アミノ酸置換を含む）、欠失、または挿入を有する、翻訳された全長６３アミノ酸のＭＵ１１４０の前駆タンパク質（配列番号１１６０）を指す。実施形態によっては、用語「ランチビオティックバリアント」、「ＭＵ１１４０バリアント」、「非天然由来のランチビオティック」、または「バリアント」とは、一つまたは複数の（（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれを超えるアミノ酸の置換（修飾アミノ酸置換を含む）、欠失、または挿入を有する、翻訳後修飾されている成熟した生物活性のＭＵ１１４０（すなわち野生型ランチビオティック）ポリペプチド（配列番号１１５６）を指す。修飾アミノ酸としては、例えば、２，３−ジデヒドロアラニン（Ｄｈａ）、２，３−ジデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）、Ｓ−アミノビニ−Ｄ−システイン（ＡｖｉＣｙｓ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、２−オキソプロピニル、２−オキソブチリル、およびヒドロキシプロピオニルが挙げられる。本明細書に使用される際に、「単一部位バリアント（複数可）」とは、１アミノ酸の置換（修飾アミノ酸置換を含む）、欠失、または挿入を有するＭＵ１１４０（すなわち野生型ランチビオティック）ポリペプチド（例えば、配列番号４３２または１１５６）を指し、「複数部位バリアント（複数可）」とは、２個以上の（例えば、２個、３個、４個、５個、またはそれを越えるアミノ酸の置換（修飾アミノ酸置換を含む）、欠失、または挿入を有するＭＵ１１４０（すなわち野生型ランチビオティック）ポリペプチド（例えば、配列番号４３２または１１５６）を指す。実施形態によっては、「野生型」ランチビオティックＭＵ１１４０（すなわち野生型ランチビオティック）ポリペプチド（配列番号４３２）または本明細書に記載されるいずれかのバリアントを、翻訳後修飾することができる（例えば、配列番号１１５６）。翻訳後修飾は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれている米国特許第６，９６４，７６０号に記載されている。様々な翻訳後修飾としては、例えば、無水残基およびランチオニン環の存在を挙げることができる。実施形態によっては、修飾残基の２，３−ジデヒドロアラニン（Ｄｈａ）および２，３−ジデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）は、それぞれセリンおよびスレオニンの脱水から形成することができる。実施形態によっては、翻訳後修飾としては、スレオニンから形成される修飾残基Ｓ−２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）を挙げることができる。実施形態によっては、翻訳後修飾としては、ランチオニンまたはメチルランチオニン環をそれぞれ形成するようなシステインとＤｈａまたはＤｈｂのどちらかとの間の環化を挙げることができる。実施形態によっては、３位、５位、１６位、および／または１９位のセリンは、Ｄｈａ残基に修飾され、８位は、Ａｂｕに修飾され、１４位は、Ｄｈｂに修飾されている。実施形態によっては、翻訳後修飾は、本明細書に記載されるいずれかの宿主細胞中で起こり、例えば、実施形態によっては、本明細書に示されるようなランチビオティックバリアントは、ストレプトコッカス・ミュータンスによって修飾され得る。
【００５９】
実施形態によっては、翻訳後修飾は、５位にＤｈａを含む。実施形態によっては、翻訳後修飾は、８位にＡｂｕを含む。実施形態によっては、翻訳後修飾は、１４位にＤｈｂを含む。実施形態によっては、翻訳後修飾は、５位にＤｈａを、８位にＡｂｕを、１４位にＤｈｂを含む。実施形態によっては、翻訳後修飾は、図１に記載されるように（Ａｌａ3−Ｓ−Ａｌａ7）間のランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）残基によって形成される環（環Ａ）を含む。実施形態によっては、翻訳後修飾は、図１に記載されるように、８位のアルファ−アミノ酪酸残基と１１位のＡｌａとを含む環である環Ｂ（Ａｂｕ8−Ｓ−Ａｌａ11）を形成するメチル−ランチオニン残基（Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ）を含む。実施形態によっては、翻訳後修飾は、図１に記載されるように（Ａｌａ16−Ｓ−Ａｌａ21）間のランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）残基によって形成される環（環Ｃ）を含む。実施形態によっては、翻訳後修飾は、図１に記載されるようにチオエーテル連結によってアミノビニル基に連結された１９位のＡｌａ（Ａｌａ19−Ｓ−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−）である環Ｄを含む。実施形態によっては、翻訳後修飾は、環Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤを含む。実施形態によっては、翻訳後修飾されたＭＵ１１４０バリアントは、環Ａ、環Ｂ、環Ｃ、および環Ｄを含み、ここでは、（ａ）これらの環のうち二つが、環Ａ中の一つ（Ａｌａ3−Ｓ−Ａｌａ7）と環Ｃ中の一つ（Ａｌａ16−Ｓ−Ａｌａ21）とを含むランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）残基によって形成され；（ｂ）メチル−ランチオニン残基（Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ）が、８位のアルファ−アミノ酪酸残基と１１位のＡｌａとを含む環Ｂ（Ａｂｕ8−Ｓ−Ａｌａ11）を形成し；（ｃ）第４の環であるＤが、チオエーテル連結によってアミノビニル基に連結された１９位のＡｌａ（Ａｌａ19−Ｓ−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−）から構成され、ならびに、５位のアミノ酸が、Ｄｈａに修飾され、８位のアミノ酸が、Ａｂｕに修飾され、１４位のアミノ酸が、Ｄｈｂに修飾されている。実施形態によっては、単離されたランチビオティックバリアントが、図５または図７のランチビオティックバリアントをコードするポリヌクレオチドからポリペプチドを発現することによって宿主細胞中に生産され、発現されたポリペプチドは、宿主細胞中で翻訳後修飾される。実施形態によっては、宿主細胞はＳ．ミュータンスである。実施形態によっては、翻訳後修飾されランチビオティックバリアントは、配列番号１１５７のアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、翻訳後修飾されランチビオティックバリアントは、配列番号１１５８（二次構造、例えば環を指定しない）のアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、翻訳後修飾されたランチビオティックバリアントは、配列番号１１６１のアミノ酸配列を含む。
【００６０】
例えば、実施形態によっては、ランチビオティックバリアントとしては、図１の配列番号１１５７のポリペプチドを挙げることができる。実施形態によっては、ランチビオティックバリアントとしては、図９の配列番号１１５８のポリペプチドを挙げることができる。実施形態によっては、ランチビオティックバリアントとしては、配列番号１１６１のポリペプチドを挙げることができる。
【００６１】
実施形態によっては、本開示は、単離されたランチビオティックバリアントに備えるものであり、ここでは、単離されたランチビオティックバリアントは、図５または図７のランチビオティックバリアントをコードするポリヌクレオチドからポリペプチドを発現することによって宿主細胞中に生産され、発現されたポリペプチドは、宿主細胞中で翻訳後修飾される。このように、明確にするために、本開示は、本明細書に記載されるランチビオティックバリアント、ならびに翻訳後修飾を有するランチビオティックバリアントに備えるものである。実施形態によっては、宿主細胞は、Ｓ．ミュータンスである。実施形態によっては、本開示は、配列番号１１５７のアミノ酸配列を含む、翻訳後修飾された非天然由来のランチビオティックを提供する。
【００６２】
実施形態では、本開示のランチビオティックバリアントの生物活性の等価体はまた、一つもしくは複数の保存されたアミノ酸のバリエーションまたは他の軽微な修飾を有し、上記に開示されたアミノ酸変更に加えて、生物活性を保持している。生物活性の等価体は、対応のランチビオティックと比べて、実質的に等しい機能を有する。実施形態では、本開示のランチビオティックバリアントは、約１個、２個、３個、４個、または５個の保存されたアミノ酸置換を有する。保存された置換とは、あるアミノ酸が同様の特性を持つ別のアミノ酸に置換され、その結果、そのポリペプチドの二次構造および全般的な性質が実質的に不変であるものとペプチド化学分野の当業者が予想することになるものである。保存された置換の例は、例えば、Ｙａｍｐｏｌｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７０（４）：１４５９−１４７２（２００５）に見出すことができる。実施形態によっては、保存された置換は、それらのクラス、例えば、
クラス アミノ酸の名称
脂肪族                    グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
ヒドロキシルまたは硫黄/セレン含有セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン
環状                      プロリン
芳香族                    フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
塩基性                    ヒスチジン、リジン、アルギニン
酸性およびそれらのアミド  アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン によって特徴付けることができる。
【００６３】
実施形態によっては、保存された置換は、以下の群内で作製することができる。
第１群：正電荷性（Ｒ−Ａｒｇ、Ｈ−Ｈｉｓ、およびＫ−Ｌｙｓ）
第２群：負電荷性（Ｄ−ＡｓｐおよびＥ−Ｇｌｕ）
第３群：極性非電荷性（Ｓ−Ｓｅｒ、Ｔ−Ｔｈｒ、Ｎ−Ａｓｎ、Ｑ−Ｇｌｎ）
第４群：疎水性（Ａ−Ａｌａ、Ｖ−Ｖａｌ、Ｉ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｍ−Ｍｅｔ、Ｆ−Ｐｈｅ、Ｙ−Ｔｙｒ、Ｗ−Ｔｒｐ）
第５群：「その他」（Ｃ−Ｃｙｓ、Ｇ−Ｇｌｙ、Ｐ−Ｐｒｏ）
例えば、ＨとＲの両方が第１群にあることから、保存された置換を、ＨのＲへの置換とすることができる。例として、実施形態によっては、本開示は、１位のフェニルアラニンが脂肪族クラスの残基、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンに置換された、ランチビオティックのバリアントを提供する。本開示はまた、１３位のアルギニンが酸性およびそれらのアミドのクラスの残基、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンに置換された、ランチビオティックのバリアントを提供する。
【００６４】
実施形態では、本開示のランチビオティックは、翻訳後修飾、すなわち、ポリペプチドが翻訳された後の化学的または生化学的な修飾を含む、ポリペプチドである。
【００６５】
精製ランチビオティックとは、細胞物質、他のタイプのポリペプチド、化学前駆体、ポリペプチドの合成に使用された化学物質、またはそれらの組合せを実質的に含まない、ランチビオティック調製物である。細胞物質、培養培地、化学前駆体、ポリペプチドの合成に使用された化学物質などを実質的に含まない精製ランチビオティック調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％、１％未満の他のポリペプチド、培養培地、化学前駆体、および／または合成に使用された他の化学物質を有する。そのため、精製ランチビオティックは、約７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれを超えて純粋である。精製ランチビオティックは、７０％未満の純度の未精製または準精製の細胞抽出物またはポリペプチドの混合物を含まない。
【００６６】
本開示のランチビオティックは、本ランチビオティックが天然では通常関連のないアミノ酸配列、すなわち異種のアミノ酸配列に、共有結合的にまたは非共有結合的に連結させることができる。例えば、異種のアミノ酸配列は、ランチビオティックを天然に生産しない生物、合成配列、または天然由来のランチビオティックのカルボキシ末端またはアミノ末端に普段は位置しない配列に由来する。さらに、本開示のランチビオティックは、標示試薬などのアミノ酸以外の化合物または分子に、共有結合的にまたは非共有結合的に連結させることができる。本開示のランチビオティックは、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、トランスファー−メッセンジャーＲＮＡ（ＴＭＲ）移送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンド、またはそれらの組合せと共有結合的にまたは非共有結合的に連結させることができる。ポリペプチドはまた、精製を容易にする部分（すなわち、ポリペプチドまたは他の化合物とし得る官能基）［例えば、６ヒスチジンタグ（配列番号１１６６）、ｔｒｐＥ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、スタフィロコッカスのプロテインＡなどのアフィニティータグ］、またはポリペプチドの安定性を促進する部分（例えば、ポリエチレングリコール；アセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルやｔ−ブチルオキシカルボニルなどのアミノ末端保護基；アミド、メチルアミドやエチルアミドなどのカルボキシル末端保護基）に、連結させることができる。本開示の一実施形態では、タンパク質精製リガンドを、例えば、本開示のポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端の一つまたは複数のアミノ酸残基とすることができる。アミノ酸スペーサーは、天然では本開示のポリペプチドに関連のないアミノ酸の配列である。アミノ酸スペーサーは、約１、５、１０、２０、１００、または１，０００アミノ酸を含み得る。
【００６７】
実施形態では、本開示のランチビオティックは、異種のアミノ酸配列を含有し得る融合タンパク質の一部である。異種のアミノ酸配列は、本開示のランチビオティックのＣ末端またはＮ末端に存在して、融合タンパク質を形成することができる。実施形態では、本開示の二つ以上のランチビオティックは、融合タンパク質中に存在する。本開示のランチビオティックの断片は、本開示の融合タンパク質中に存在し得る。本開示の融合タンパク質は、本開示の一つまたは複数のランチビオティック、それらの断片、またはそれらの組合せを含み得る。
【００６８】
医薬的に許容可能な塩、エステル、アミド、およびプロドラッグは、本ランチビオティックのカルボン酸塩、アミノ酸付加塩、エステル、アミド、およびプロドラッグであり、本願開示の一部である。これらの化合物は、対象を伴う使用に適しており、過度の毒性、刺激、またはアレルギー反応を引き起こさず、理に適ったベネフィット／リスク比に見合うものであり、それらの目的とする使用に有効である。塩は、本開示のランチビオティックの実質的に非毒性の無機酸または有機酸の付加塩である。塩としては、例えば、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫化水素塩、硝酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ギ酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシレート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。これらは、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ金属およびアルカリ土類金属に基づくカチオン；ならびに以下に限定されないがアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む非毒性のアンモニウム、４級のアンモニウムおよびアミンのカチオンを含むことがある。
【００６９】
本開示のランチビオティックの医薬的に許容可能な非毒性のエステルとしては、例えば、アルキル基が直鎖または分枝鎖であるＣ１−Ｃ６アルキルエステルが挙げられる。他のエステルとしては、Ｃ５−Ｃ７環状アルキルエステル、ならびに以下に限定されないがベンジルＣ１−Ｃ４アルキルエステルなどのアリールアルキルエステルが挙げられる。
【００７０】
本開示のランチビオティックの医薬的に許容可能な非毒性アミドとしては、アンモニア、１級Ｃ１−Ｃ６アルキルアミン、および２級Ｃ１−Ｃ６ジアルキルアミンに由来するアミドが挙げられ、ここでは、アルキル基が直鎖または分枝鎖である。２級アミンの場合、アミンは、１個の窒素原子を含有する５員または６員の複素環の形態であることがある。また挙げられるのは、アンモニア、Ｃ１−Ｃ３アルキル１級アミン、およびＣ１−Ｃ２ジアルキル２級アミンに由来するアミドである。
【００７１】
ランチビオティックを生産するための系
実施形態によっては、本開示のランチビオティックポリペプチドは、ＤＰＯＬＴの方法論を使用して合成することができる。例えば、それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれている米国特許第７，５２１，５２９号；米国特許公開公報第２００９／０２１５９８５号を参照されたい。本開示のランチビオティックは、組換えで生産することができる。実施形態では、本開示のランチビオティックをコードするポリヌクレオチドは、組換え発現ベクター内に導入され、このベクターは、当技術分野に周知の手法を用いて、適した発現宿主細胞系で発現される。種々の細菌、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫の発現系が、当技術分野で利用可能であり、任意のそのような発現系を使用することができる。本開示のランチビオティックはまた、Ｓ．ミュータンスの細胞培養物から精製することもできる。
【００７２】
上記に言及したように、本開示は、当技術分野に周知の手法を用いて、適した発現宿主細胞系で発現することによって組換えで生産される、ランチビオティックを提供する。実施形態では、生来のランチビオティック生産細菌が、本開示のランチビオティックを生産するために使用される。そのような細菌としては、以下に限定されないが、ストレプトコッカス・ミュータンス、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ガリナリウム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、ミクロコッカス・バリアンス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＯＨ−４１５６、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ブチリビブリオ・フィブリオソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｏｓｏｌｖｅｎｓ）、ストレプトマイセス・シナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトバーティシリウム・ハチジョエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｈａｃｈｉｊｏｅｎｓｅ）、ストレプトバーティシリウム、ストレプトマイセス・グリセオルテウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｌｕｔｅｕｓ）、バチルス種のＨＩＬ  Ｙ−８５株、アクチノプラネス・リングリエ（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｌｉｎｇｕｒｉａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス、ルミノコッカス・グナブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ）、カルノバクテリウム・ピスシコラ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｉｓｃｉｃｏｌａ）、ストレプトコッカス・マセドニクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、スタフィロコッカス・ワーネリー（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、およびストレプトマイセス種が挙げられる。実施形態によっては、本明細書に記載されるランチビオティックバリアントは、上記に挙げられたいずれかの細菌によって翻訳後修飾され得る。
【００７３】
また、本開示のランチビオティックを生産するための系としては、遺伝子的に扱い易い宿主でありかつ異種によるランチビオティックの生産が可能な公知の細菌または酵母、すなわち、生来はランチビオティックを生産しない酵母または細菌が挙げられる。そのような生物としては、以下に限定されないが、大腸菌およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の細菌、グラム陰性細菌、およびサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母が挙げられる。実施形態では、Ｐ．フルオレッセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）が、本開示のランチビオティックを生産するために使用される。
【００７４】
実施形態では、本開示は、本開示のランチビオティックを生産する組換え細菌株を提供する。例えば、本開示は、機能的なバリアントのＭＵ１１４０を発現するポリヌクレオチドを含む、上記に挙げられたようなランチビオティックを生産する組換え細菌株を提供する。ＭＵ１１４０のランチビオティックバリアントの生物活性は、当技術分野に公知の方法、例えば阻害域アッセイを用いてアッセイすることができる。
【００７５】
実施形態によっては、本開示は、（ａ）乳酸の発現が野生型Ｓ．ミュータンス株に比べて約８０％以上減るような、乳酸合成に関与するポリヌクレオチド中の変異；（ｂ）組換えアルコールデヒドロゲナーゼのポリヌクレオチド；および（ｃ）本明細書に記載されるような非天然由来のランチビオティック、例えば図５および図７のランチビオティックをコードする組換えポリヌクレオチドを含む、単離された組換えストレプトコッカス・ミュータンス株に向けられる。
【００７６】
ポリヌクレオチド
本開示のポリヌクレオチドは、全微生物ゲノムよりも少ないものを含有し、１本鎖または二重鎖の核酸とすることができる。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成されたＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの組合せとすることができる。ポリヌクレオチドは、タンパク質、脂質や他のポリヌクレオチドなどの他の構成成分を含まないように精製することができる。例えば、ポリヌクレオチドを、５０％、７５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％精製することができる。例えばｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー内の何百から何万もの他の核酸分子の中に存在する核酸分子、またはゲノムＤＮＡの制限酵素消化物を含有するゲル切片は、単離されたポリヌクレオチドとみなされることはない。本開示のポリヌクレオチドは、上に記載されるポリペプチドをコードする。配列番号１１６２は、６３アミノ酸のＭＵ１１４０の前駆タンパク質をコードする。配列番号１は、野生型ＭＵ１１４０のコアタンパク質をコードする。配列番号１１６５は、本明細書に記載されるような切断ペプチドをコードする。実施形態では、本開示は、配列番号２〜４３１に示される精製ポリヌクレオチドを提供する。実施形態では、本開示は、配列番号７０８〜７６３に示される精製ポリヌクレオチドを提供する。実施形態によっては、本開示は、配列番号７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、または７６１のいずれか一つを含む精製ポリヌクレオチドを提供する。実施形態によっては、本開示は、配列番号７０９、７１４、７１６、７３５、７４７、７５１、７５４、または７５８のいずれか一つを含む精製ポリヌクレオチドを提供する。実施形態によっては、本開示は、配列番号７５８（ＦＩＶ  Ｒ１３Ｎ）を含む精製ポリヌクレオチドを提供する。実施形態によっては、本開示は、配列番号１１６３（ＦＩＶ  Ｒ１３Ｎ）を含む精製ポリヌクレオチドを提供する。
【００７７】
本明細書の開示は、６３アミノ酸のＭＵ１１４０の前駆タンパク質のバリアントをコードするポリヌクレオチドを提供する。そのため、本開示は、切断ペプチド（配列番号１１６５）をコードする、本明細書に記載されるいずれかのヌクレオチドを提供する。
【００７８】
本開示のポリヌクレオチドは、約６６、６０、５０、４５、３０、１５未満の（または約６６と１５との間の任意の範囲）の連続したヌクレオチドからなり得る。精製ポリヌクレオチドは、追加の異種ポリヌクレオチドを含むことができる。本開示のポリヌクレオチドは、リンカー、シグナル配列、ＴＭＲ停止移送配列、膜貫通ドメイン、またはタンパク質精製に有用なリガンド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグやスタフィロコッカスのプロテインＡなどをコードする配列など、他のヌクレオチド配列を含むことができる。本開示の一実施形態は、少なくとも約６個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、４５個、５０個、６０個、６６個、またはそれを超える配列番号２〜４３１の連続したヌクレオチドを含む、精製ポリヌクレオチドを提供する。本開示の一実施形態は、少なくとも約６個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、４５個、５０個、６０個、６６個、またはそれを超える配列番号１１６３の連続したヌクレオチドを含む、精製ポリヌクレオチドを提供する。
【００７９】
本開示のポリヌクレオチドは単離され得る。単離されたポリヌクレオチドは、天然に関連する５´および３´のフランキングゲノム配列の一方または両方に直に隣接していない、天然由来のポリヌクレオチドである。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、任意の長さの組換えＤＮＡ分子とすることができる。単離されたポリヌクレオチドはまた、非天然由来の核酸分子を含むことができる。本開示のポリヌクレオチドは、全長ポリペプチド、ポリペプチド断片、およびバリアントまたは融合ポリペプチドをコードすることができる。
【００８０】
本開示のポリヌクレオチド配列とその相補体に少なくとも約８０％、または約：９０、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性がある本開示のポリペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列、ならびに相同なヌクレオチド配列もまた、本開示のポリヌクレオチドである。縮重ヌクレオチド配列とは、本開示のポリペプチドおよびその断片をコードするが、遺伝コードの縮重性があるために所与のポリヌクレオチド配列とは核酸配列が異なるポリヌクレオチドである。パーセント配列同一性は、当技術分野で認識されている意味を有し、二つのポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の間の同一性を測定するための多数の方法がある。例えば、Ｌｅｓｋ，Ｅｄ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）；Ｓｍｉｔｈ，Ｅｄ．，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９３）；Ｇｒｉｆｆｉｎ＆Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｅｄｓ．  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，（１９９４）；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８７）；ａｎｄ  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ＆Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｅｄｓ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９１）を参照されたい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを整列化する方法は、コンピュータプログラムに成文化されており、そのようなプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ［Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：３８７］、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ［Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３］、ならびにＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  の局所相同性アルゴリズム［（１９８１）  Ａｄｖ．  Ａｐｐ．  Ｍａｔｈ．，２：４８２−４８９］を使用するＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ユニバーシティリサーチパーク、サイエンスドライブ５７５、マディソン、ウィスコンシン州５３７１１）が挙げられる。例えば、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを採用するコンピュータプログラムＡＬＩＧＮを使用することができ、このプログラムでは、ギャップ開始ペナルティ−１２とギャップ伸張ペナルティ−２とによるアフィンギャップサーチを用いる。
【００８１】
いずれかの配列整列化プログラムを使用して、ある特定の配列が例えば参照配列と約９５％の同一性を持つか否かを決定する際には、同一性のパーセンテージが参照ポリヌクレオチドの全長にわたって計算され、かつ同一性のギャップを参照ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの総数の最大５％とすることが可能になるように、パラメーターが設定される。
【００８２】
本開示のポリヌクレオチドは、例えば細菌試料に存在する核酸配列から単離することができる。ポリヌクレオチドは、実験室でも、例えば自動合成機を使用して合成することができる。ＰＣＲなどの増幅方法は、ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのどちらかからポリヌクレオチドを増幅するために、使用することができる。
【００８３】
本開示のポリヌクレオチドは、天然由来のポリペプチドのためのコード配列を含み得るか、または天然では発生しない変更された配列をコードし得る。所望に応じて、ポリヌクレオチドは、発現制御エレメントを含む発現ベクター内にクローニングすることができ、そのようなエレメントとしては、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、または宿主細胞における本開示のポリヌクレオチドの発現を駆動する他の調節エレメントが挙げられる。発現ベクターは、例えばプラスミドとすることができる。ＭＣやＭＣ１などのミニ染色体、バクテリオファージ、ファージミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、コスミド（ラムダファージのｃｏｓ部位が内部に挿入されているプラスミド）、およびレプリコン（細胞中でそれ自体の制御下で複製することが可能な遺伝子エレメント）を使用することができる。
【００８４】
発現制御配列に動作可能に連結されたポリヌクレオチドを調製し、それらを宿主細胞中で発現するための方法は、当技術分野に周知である。例えば、米国特許第４，３６６，２４６号を参照されたい。本開示のポリヌクレオチドは、一つまたは複数の発現制御エレメントに隣接または近接して位置する際に、動作可能に連結され、このエレメントは、ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳に向けられているものである。
【００８５】
組成物
実施形態では、本開示の一つまたは複数のランチビオティック（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上）が、抗微生物剤、消毒剤、抗生物剤、防腐剤、保存剤、抗ウイルス剤、または除染剤である組成物中に存在する。抗微生物組成物は、細菌などの微生物を死滅させるか、または微生物の繁殖を遅らせる。消毒剤組成物は、細菌などの微生物を死滅させるか、または微生物の繁殖を遅らせるために、非生物の物体に適用される。抗生物剤は、対象の体内または細胞もしくは組織中で、細菌などの微生物を死滅させるか、または微生物の繁殖を遅らせる。防腐剤は、皮膚、組織、または器官上で、細菌などの微生物を死滅させるか、または微生物の繁殖を遅らせる。保存剤組成物は、塗料、木材、食品、飲料、生体試料、細胞もしくは組織の培養物、または医薬組成物などの製品で、微生物を死滅させるかまたは微生物の繁殖を遅らせて、細菌などの微生物による分解を防止する。除染剤は、生きた生物、細胞、組織、または物体の中または上で、細菌などの微生物を死滅させるかまたは微生物の繁殖を低減するために使用することができる洗浄剤である。
【００８６】
実施形態では、本開示は、細菌を死滅させる本開示の一つまたは複数のランチビオティックを含む組成物を提供する。実施形態では、バリアントＭＵ１１４０ランチビオティック（すなわち本開示のランチビオティック）を含む組成物は、それらが接触する約：５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％（または約５％と１００％の間の任意の範囲）の細菌を死滅させる。ランチビオティックが静菌剤と殺細菌剤のどちらとして作用するのかの違いは、処置される対象、組成物、または物体に送達されるランチビオティックの量または濃度とすることができる。実施形態では、本開示のランチビオティックは、処置される組成物、対象、細胞、または組織に存在する細菌数を低減する。本開示の一実施形態では、本開示のランチビオティックを含む組成物は、細菌数を約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％（または約５％と１００％の間の任意の範囲）低減する。
【００８７】
実施形態では、本開示のバリアントランチビオティックは、本開示の一つまたは複数の単離されたランチビオティックと、一つまたは複数の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤（固体または液体）とを含む抗微生物組成物中に存在する。本開示の一実施形態では、本バリアントランチビオティックは、少なくとも１タイプのグラム陽性細菌の細菌繁殖を約：５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％（または約５％と１００％の間の任意の範囲で）実質的に低減するのに有効な量で、組成物中に存在する。本開示の実施形態では、バリアントＭＵ１１４０ランチビオティックは、少なくとも１タイプのグラム陽性細菌の数を約：５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％（または約５％と１００％の間の任意の範囲で）実質的に低減するのに有効な量で、組成物中に存在する。実施形態では、グラム陽性細菌のうち少なくとも１タイプは、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス、メチシリン耐性のスタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ））ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス、バンコマイシン耐性のエンテロコッカス、バンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、プロピオニバクテリウム・アクネス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ラクトバチルス・サリバリウス、リステリア・モノサイトゲネス、アクチノマイセス・イスラエリー、アクチノマイセス・ネスランディ、アクチノマイセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、バチルス・アンシラシス、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・インターメディウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、コリネバクテリウム・ジフテリア、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・パーフリンゲンス、クロストリジウム・テタニ、およびクロストリジウム・ディフィシルである。全てのグラム陽性種類は、本開示のランチビオティックバリアントに対し感受性である。
【００８８】
さらに、グラム陰性細菌を、本開示のランチビオティックバリアントに感受性とすることができる。任意選択で、グラム陰性細菌の外膜を、例えばＴｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡやＥＤＴＡなどのキレート剤を用いて破壊することができる。任意の膜破壊化合物を、本開示のランチビオティックバリアントに対するグラム陰性細菌の感受性を増加させるために本開示の組成物に添加することができ、そのようなものとしては、例えば、ポリミキシン、膜破壊抗生物剤、セクロピン（例えば、イエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）のセクロピン、ヤロフォラ蛾（ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ）のセクロピン、セクロピンＢ、セクロピンＰ１）、Ｇ１  ＯＫＨｃ［Ｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５０：１４８０を参照］；アルファディフェンシンおよびベータディフェンシン、ヒツジ由来のカテリシジン［Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：６７３を参照］、スクアラミン誘導体［例えばＳＭ−７、Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１：１４３３を参照］、ヘキサメタリン酸ナトリウム、顆粒球の細胞性酵素［ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｋ，（１９８９）Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１１：２１３］、ＥＭ４９［Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５：５７８３］、およびラウリルサルコシンナトリウムがある。本開示のランチビオティックバリアントと膜破壊剤および／または他の抗生物剤もしくはグラム陰性種を標的とする薬剤との組合せは、グラム陽性種とグラム陰性種の両方に対して有効な組成物を提供することができる。そのため、本開示は、本開示の一つまたは複数のランチビオティックと、一つまたは複数の追加の抗微生物剤または膜破壊剤とを含む組成物を含む。上記一つまたは複数の追加の抗微生物剤は、グラム陰性静菌または殺細菌の活性を有し得る。上記膜破壊剤は、グラム陰性細菌を、本開示のランチビオティックに対し感受性とすることができる（すなわち、膜破壊剤と一つまたは複数の本開示のランチビオティックバリアントとの組合せは、グラム陰性細菌に対し静菌性または殺細菌である）。グラム陰性細菌としては、例えば、アシネトバクター・バウマニ、ボルデテラ・パーツシス、ボレリア・ブルグドルフェリ、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・カニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス、カンピロバクター・ジェジュニ、コクシエラ・バーネッティ、エシェリキア・コリ、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ・インターロガンス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、シュードモナス・エルギノーザ、リケッチア・リケッチイ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、シゲラ・ソンネ、トレポネーマ・パリズム、ビブリオ・コレラ、エルシニア・エンテロコリチカ、およ���エルシニア・ペスティスが挙げられる。
【００８９】
グラム可変性およびグラム不定性の細菌もまた、本開示のランチビオティックバリアントに対し感受性とすることができる。任意選択で、これらの生物の外膜を破壊するために、ＥＤＴＡなどのキレート剤を本開示の組成物に添加することができる。グラム可変性およびグラム不定性の細菌としては、例えば、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トリコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、およびマイコバクテリウム・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が挙げられる。
【００９０】
本開示のランチビオティックは、動物、組成物、または物体への適用に適した一つまたは複数の医薬的に許容可能な担体、他の担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または被包基質とともに、製剤中に組み合わせることができる。例示的な医薬的に許容可能な担体、他の担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはそれらの被包基質としては、糖、例えばラクトース、グルコース、デキストロ―スやスクロースなど；デンプン、例えばトウモロコシデンプンやジャガイモデンプンなど；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロースやメチルセルロースなど；多糖、例えばラテックス機能化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）やアガロースなど；粉末トラガカント；グリセロール；麦芽；ゼラチン；タルク；固体滑沢剤、例えばステアリン酸やステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；植物油、例えばピーナツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油；ポリオール、例えばプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、プロピレングリコールやポリエチレングリコール；タンパク質、例えば血清アルブミン、スカシ貝ヘモシアニン、イムノグロブリン分子、サイログロブリン、オバルブミン、破傷風トキソイド；アルギン酸；乳化剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリソルベート）；ポリ乳酸；ポリグリコール酸；ポリマーアミノ酸、例えばポリグルタミン酸やポリリジンなど；アミノ酸コポリマー；ペプトイド；リピトイド；不活性かつ非病原性のウイルス粒子または細菌細胞；リポソーム；ハイドロゲル；シクロデキストリン；生分解性のナノカプセル；生体接着材；湿潤剤、そのようなラウリル硫酸ナトリウム；着色剤；着香剤；錠剤化剤；安定化剤；抗酸化剤；保存剤；パイロジェン不含水；等張生理食塩水；エタノール；オレイン酸エチル；ピロリドン；リンゲル溶液、デキストロ―ス溶液、ハンクス溶液；アルギン酸ナトリウム；ポリビニルピロリドン；トラガカントゴム；アカシアゴム；ならびに滅菌水および水性緩衝液および生理的リン酸緩衝食塩水などの溶液が挙げられる。治療用途のための担体、例えば医薬的に許容可能な担体や希釈剤などは、当技術分野に周知であり、例えば，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．［Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．（１９８５）］に記載されている。医薬的に許容可能な塩もまた、本開示の組成物に使用することができ、そのようなものとしては例えば、鉱塩、例えば塩酸塩、リン酸塩や硫酸塩など、ならびに有機酸塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩や安息香酸塩がある。
【００９１】
様々な剤形が、本明細書に記載されるようなランチビオティック組成物を含むことができる。実施形態によっては、剤形は、経口、直腸、膣、尿道、局所（経粘膜および経皮を含む）、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、または腹腔内へのランチビオティックの送達に適合させることができる。
【００９２】
バリアントランチビオティック組成物は、製剤中に、経口送達に適した形態、例えば錠剤、トローチ、菱形剤、口腔洗浄剤、歯磨き剤、バッカル錠剤、溶液、水性もしくは油性の懸濁液、分散性の粉末もしくは顆粒、エマルジョン、硬カプセルもしくは軟カプセル、またはシロップもしくはエリキシルなどとすることができる。そのような組成物は、一つまたは複数の剤、例えば乳化剤、湿潤剤、ｐＨ緩衝剤、甘味剤、着香剤、着色剤や保存剤などを含有し得る。本ランチビオティック組成物は、使用前に水または他の適した液体を用いて再構成するための、乾燥製品とすることができる。
【００９３】
本開示のランチビオティックはまた、直腸、膣、または尿道への薬剤の投与のために、坐剤の形態で投与することができる。これらの組成物は、通常の温度では固体であるが体温では液体であるがゆえに直腸内では融解して薬剤を放出することになる適した非刺激性の担体に、バリアントランチビオティックを混合することによって、調製することができる。そのような素材は、ココアバターおよびポリエチレングリコールである。
【００９４】
本開示のランチビオティックはまた、例えば、ローション、ゲル、または小単層ベシクル、大単層ベシクルや多層ベシクルなどのリポソーム送達系の形態で、局所的に投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンやホスファチジルコリンなどの種々のリン脂質から形成することができる。他の剤形としては、例えば、注射可能な、舌下の、浣腸の、および経鼻の剤形が挙げられる。吸入に用いる組成物は、典型的には、乾燥粉末として投与することができる溶液、懸濁液、もしくはエマルジョンの形態で、または従来の噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタンもしくはトリクロロフルオロメタン）を用いたエアロゾルの形態で、提供することができる。
【００９５】
製剤は、約０．０００１％と約９９．９９９９％との間の重量の本開示の一つまたは複数のランチビオティック（複数可）、通常は少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％（重量％）の本願開示の一つまたは複数のランチビオティックバリアントを、含有することができる。いくつかの実施形態は、約２５％から約５０％まで、または５％から７５％までの開示のランチビオティックを含有する。
【００９６】
本開示の一つまたは複数のランチビオティックは、一つまたは複数の抗微生物、抗生物剤、バクテリオシン、抗ウイルス性の化合物もしくは分子、殺ウイルス性の化合物もしくは分子、または抗真菌性の化合物もしくは分子と組み合わせて、本開示の方法で有用な組成物を形成することができる。
【００９７】
抗生物剤としては、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、ポリミキシン、キノロン、スルホンアミド、アミノグリコシド、マクロライド、テトラサイクリン、環状リポペプチド（例えばダプトマイシン）、グリシルサイクリン（例えばチゲサイクリン）、およびオキサゾリジノン（例えばリネゾイド（ｌｉｎｅｚｏｉｄ））が挙げられる。
【００９８】
バクテリオシンとしては、例えば、アシドシン、アクタガルジン、アグロシン、アルベイシン（ａｌｖｅｉｃｉｎ）、オーレオシン（ａｕｒｅｏｃｉｎ）、カルノシン、コリシン、クルバチシン（ｃｕｒｖａｔｉｃｉｎ）、ダイバーシン（ｄｉｖｅｒｃｉｎ）、デュラマイシン、エンテロシン、エンテロリシン、エピデルミン、エルウィニオシン、ガリデルミン、グリシネシン（ｇｌｙｃｉｎｅｃｉｎ）、ハロシン、ハロデュラシン（ｈａｌｏｄｕｒａｃｉｎ）、ラクトコシン（ｌａｃｔｏｃｏｃｉｎ）、ラクチシン、ロイコシン、マセドシン（ｍａｃｅｄｏｃｉｎ）、メルサシジン（ｍｅｒｓａｃｉｄｉｎ）、メセンテリシン（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｉｎ）、ミクロビスポリシン、ミュータシン、ナイシン、パエニバシリン（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｎ）、プラノスポリシン（ｐｌａｎｏｓｐｏｒｉｃｉｎ）、ペディオシン、ペントシン（ｐｅｎｔｏｃｉｎ）、プランタリシン、ロイテリシン（ｒｅｕｔｅｒｉｃｉｎ）、サカシン（ｓａｋａｃｉｎ）、サリバリシン、サブチリン、スルホロビシン（ｓｕｌｆｏｌｏｂｉｃｉｎ）、スリシン１７、トリホリトキシン（ｔｒｉｆｏｌｉｔｏｘｉｎ）、バリアシン、ビブリオシン、ワルネリシン（ｗａｒｎｅｒｉｃｉｎ）、およびワーネリン（ｗａｒｎｅｒｉｎ）が挙げられる。
【００９９】
抗真菌としては、例えば、ポリエン抗真菌剤（例えば、アンホテリシンＢ、ナタマイシン、リモシジン、フィリピン、ナイスタチン、カンディシン（ｃａｎｄｉｃｉｎ）、ハマイシン）、アゾール抗真菌剤（例えば、イミダゾール、トリアゾール、チアゾール）、イミダゾール（例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、オモコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール）、トリアゾール（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾール、アルバコナゾール）、チアゾール（例えば、アバガンジン（ａｂａｇｕｎｇｉｎ））、アリルアミン（例えば、テルビナフィン、ナフチフィン、ブテナフィン）、エキノキャンディン（例えば、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン）、ポリゴジアール、安息香酸、シクロピロクスオラミン、トルナフテート、ウンデシレン酸、フルシトシン、およびグリセオフルビンが挙げられる。
【０１００】
抗ウイルス剤および殺ウイルス剤としては、例えば、アバカビル、アシクロビル（ａｃｉｃｌｏｖｉｒｅ）、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリジェン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビル、シドフォビル、コンビビル、デラビルジン、ディダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、侵入阻害剤、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、インターフェロンｉ、ｉｉもしくはｉｉｉ型、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル（ｎｅｘａｖｉｒ）、ヌクレオシド類似体、オセルタミビル、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害剤、ラルテグラビル、逆転写酵素阻害剤、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン、サクイナビル、スタブジン、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、およびジドブジンが挙げられる。
【０１０１】
組換えＳ．ミュータンスを含む組成物
本開示の組成物は、本明細書に記載されるような一つまたは複数の株の組換えＳ．ミュータンス株、および医薬的に許容可能なまたは栄養的に許容可能な担体によって、発現させることができる。例えば、組換えＳ．ミュータンス株は、１）乳酸欠乏性、および２）組換えＡＤＨの生産、３）バリアントＭＵ１１４０の生産、４）任意選択で、特異的な有機物質（例えば、Ｄ−アラニンなどのＤアミノ酸）に対する栄養要求性、５）任意選択で、ＣｏｍＥ発現の欠乏性、またはそれらの組合せによって、特徴付けることができる。
【０１０２】
担体は、投与される対象の範囲に生理的に適合性がある。担体は、錠剤、カプセル、菱形剤、または粉末形態に製剤化するために、固体ベースの乾燥素材から構成され得る。担体はまた、液体またはゲルベースの素材から構成され得る。
【０１０３】
ランチビオティックの使用
実施形態によっては、本開示のランチビオティックは、細菌の成長を低減するために、細菌の成長を防止するために、細菌の繁殖を防止するために、細菌の繁殖を低減するために、または物体、組成物、もしくは対象の中もしくは上に存在する細菌数を低減もしくは排除するために、使用される。本開示の一実施形態では、細菌は、少なくとも１タイプのグラム陽性細菌、少なくとも１タイプのグラム陰性細菌、少なくとも１タイプのグラム可変もしくはグラム不定の細菌、または少なくとも１タイプのグラム陽性もしくは少なくとも１タイプのグラム陰性の細菌または少なくとも１タイプのグラム可変もしくはグラム不定の細菌の組合せである。実施形態では、本開示のランチビオティックは、組成物に、または治療を必要とする対象に、添加するかまたは接触させるために投与される。
【０１０４】
本開示の実施形態では、本開示のランチビオティックの静菌作用によって、細菌の繁殖が約：５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％（または約５％と１００％の間の任意の範囲で）低減される。実施形態では、本開示のランチビオティックは、細菌を死滅させる。本開示の実施形態では、バリアントＭＵ１１４０ランチビオティックは、それらが接触する約：５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％（または約５％と１００％の間の任意の範囲）の細菌を死滅させる。ランチビオティックが静菌剤と殺細菌剤のどちらとして作用するのかの違いは、処置される対象、組成物、または物体に送達されるランチビオティックの量または濃度とすることができる。本開示のランチビオティックは、処置される組成物、対象、細胞、または組織に存在する細菌数を低減することができる。本開示の一実施形態では、バリアントＭＵ１１４０ランチビオティックは、細菌数を約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％（または約５％と１００％の間の任意の範囲に）低減する。
【０１０５】
そのため、本開示は、疾患、感染、またはコロニー形成を治療、寛解、または予防する方法を提供する。疾患とは、感染の結果生じ、かつ特定可能な一群の徴候および症状によって特徴付けられる、生物の一部、器官、または系の病的な状態である。感染とは、身体の一部または組織中での細菌などの病原性微生物による侵入および増殖であり、それは続いて、組織の傷害を生じ、種々の細胞機構または毒性機構を通じて顕在的な疾患を進行させることがある。コロニー形成とは、宿主または物体の上または内部でそれ自体を確立する細菌などの微生物の作用または過程である。コロニー形成は、下に記載されるように、引き続きバイオフィルムまたは生物付着の状態を生じることがある。実施形態では、本開示のランチビオティックは、疾患、感染、もしくはコロニー形成を防止するために、または疾患もしくは感染の広がりを防止するために、予防的に使用される。本開示の組成物および方法が治療または予防することのできる疾患、感染、およびコロニー形成の例としては、例えば、敗血症、細菌性髄膜炎、嚢胞性線維症、ウシ乳房炎、膿痂疹、細菌性膣症、細菌性肺炎、尿路感染、細菌性胃腸炎、丹毒、蜂巣炎、炭疽、百日咳、ブルセラ症、腸炎、日和見感染、市中感染の呼吸器感染、上気道および下気道感染、ジフテリア、院内感染、下痢、潰瘍、気管支炎、リステリア症、結核、淋病、シュードモナス感染、サルモネラ症、赤痢菌感染症、大腸菌感染、スタフィロコッカス感染、ストレプトコッカス感染、再発性または原発性のＣ．ディフィシル関連感染、および壊死性筋膜炎が挙げられる。
【０１０６】
実施形態では、本開示は、本開示のランチビオティックを投与することによって細菌感染を有する対象を治療する方法を提供する。実施形態では、本開示は、本開示のランチビオティックを投与することによって、医師、看護師や医師助手などの医療提供者により細菌感染と診断されている対象を治療する方法を提供する。実施形態では、治療することは、対象の中または上の細菌数を低減または排除することを含む。実施形態では、本開示は、本開示のランチビオティックを投与することによって、細菌感染を予防する方法をさらに提供する。実施形態では、対象は、グラム陽性細菌に感染している。実施形態では、グラム陽性細菌は、スタフィロコッカス・アウレウス、メチシリン耐性のスタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、バンコマイシン耐性のエンテロコッカス、バンコマイシン耐性のエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、プロピオニバクテリウム・アクネス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サンギス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ラクトバチルス・サリバリウス、リステリア・モノサイトゲネス、アクチノマイセス・イスラエリー、アクチノマイセス・ネスランディ、アクチノマイセス・ビスコーサス、バチルス・アンシラシス、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・インターメディウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、コリネバクテリウム・ジフテリア、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・パーフリンゲンス、クロストリジウム・テタニおよびクロストリジウム・ディフィシルである。実施形態では、本開示は、本開示のランチビオティックを対象に投与することによって、Ｃ．ディフィシル感染を有する対象を治療する方法、例えば、対象中のＣ．ディフィシルの細菌数を低減する方法を提供する。実施形態では、本開示は、対象に本開示のランチビオティックを投与することによって、対象でＣ．ディフィシル感染を予防する方法を提供する。実施形態では、対象はヒトである。対象が細菌感染を有するか否かを決定する方法は、当技術分野で周知である。
【０１０７】
実施形態では、対象は、哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、モルモット、マカクザル、ヒヒ、チンパンジー、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなど、または非哺乳動物、例えばニワトリ、アヒルや魚などにである。本開示のランチビオティックはまた、植物、種類子、または土壌などの植物培地に投与することができる。
【０１０８】
本開示のランチビオティックの投与は、従来の非毒性の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、および媒体を含有する投薬単位製剤で、注射（例えば、筋肉内、静脈内、肺内、筋肉内、皮内、腹腔内、くも膜下腔内、もしくは皮下の注射）、エアロゾル、鼻腔内、輸液ポンプ、坐剤（直腸、膣、尿道）、経粘膜的に、局所的に、バッカルで、経口的に、非経口的に、輸液法、浣腸により、吸入により、浣腸、または噴霧、舌下に、経皮的に、眼科用溶液として、脊髄内適用、または他の手段を含めた、当技術分野に公知の任意の手段によるものとすることができる。投与方法の組合せもまた、使用することができる。
【０１０９】
治療用途では、本開示のランチビオティック組成物は、細菌の繁殖を低減するか、または細菌数を低減するか、またはその両方のために、対象に投与される。組成物中のランチビオティックの具体的な投薬量は、数多くの要因に依存するものとなり、そのような要因としては、以下に限定されないが、組成物が投与される対象の種類、年齢、性別、感染の重症度、併用の薬物療法、全身状態、および組成物の投与モードが挙げられる。本開示の組成物の有効量は、定型の実験作業のみを使用して、容易に決定することができる。治療有効量とは、細菌感染またはコロニー形成の治療、寛解、または予防に有効な単位用量でまたは一連の一部としてのどちらかで、その量を対象へ投与することを意味する。治療有効量とはまた、感染の症状を寛解もしくは低減する際に、または対象の中もしくは上で細菌の繁殖を低減するかまたは対象の中もしくは上で細菌の量を低減する際に、有効な量である。
【０１１０】
組成物中のランチビオティックの濃度は、様々とすることができ、主に、選択された具体的な投与方法および対象の要求に従って、上に記載されるようなランチビオティックの活性、対象の体重、対象の全体的な健康状態などに基づき選択されるものとなる。しかし、濃度は、典型的には、約：０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０ｍｇ／ｋｇ／日（または約０．００１と１５０ｍｇ／ｋｇ／日との間の任意の範囲）からに及ぶ、および時にはそれよりも高い、投薬量を提供するよう選択されるものとなる。典型的な投薬量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約５ｍｇ／ｋｇ／日まで、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約１５ｍｇ／ｋｇ／日まで、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約２０ｍｇ／ｋｇ／日まで、および約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日までに及ぶ。
【０１１１】
本開示のランチビオティックは、疾患、感染、コロニー形成、バイオフィルム、または生物付着の状態を予防または低減するために、時間をかけて期日（例えば、１日、３日、１週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、もしくはそれを超える）当たり数回投与するか、または長期間にわたって維持用量で投与することができる。
【０１１２】
本開示のランチビオティックは、細菌による感染がないかもしくはコロニー形成がない動物に投与することができるか、または、細菌感染もしくはコロニー形成のある動物に投与することができる。
【０１１３】
本開示の一実施形態は、無生物の物体の上または中で除染または細菌成長を低減するための方法を提供し、この方法は、少なくとも１タイプの細菌の細菌成長を実質的に阻害するのに有効な期間、本開示のランチビオティックに物体を接触することを含む。接触は、１分間、１５分間、３０分間、もしくは６０分間、または２時間、３時間、１０時間、１２時間、２４時間、３６時間もしくは４８時間（または約１分間と４８時間の間の任意の範囲）とすることができる。物体は、例えば、食品調理の表面、食品調理の器具、工業器具、管、または医療デバイス、例えばカテーテル、メス、ナイフ、ハサミ、スパチュラ、エキスパンダ、クリップ、ピンセット、スペキュラ、開創器、縫合糸、外科用メッシュ、チゼル、ドリル、水準器、やすり、のこぎり、スプリント、ノギス、クランプ、鉗子、フック、ランセット、針、カニューレ、キュレット、圧低器、拡張器、起子、咬合器、抽出器、探針、ステープル、人工関節、創傷被覆材、カテーテル、ステント、チューブ、ボウル、トレイ、スポンジ、シュリンゲ、スプーン、シリンジ、ペースメーカー、ねじ、プレート、ピン、ワイヤ、ガイドワイヤ、ペースメーカーリード、インプラント、センサー、グルコースセンサー、血管バイパスチューブ、静注バッグ、心室補助装置部材、眼科用レンズ、およびバルーンとすることができる。
【０１１４】
除染可能な他の物体としては、布地、例えば織布材（天然もしくは非天然の素材または天然素材と合成素材との混紡から織られた）または不織布材（例えば、弾性もしくは非弾性の熱可塑性ポリマー）が挙げられる。布地は、例えば、患者、医療従事者、または潜在的な感染性因子もしくは微生物に接触する可能性のある他の人間が着用する保護用品、例えばガウン、ローブ、フェイスマスク、頭部カバー、靴カバー、または手袋に使用することができる。他の保護布としては、外科用覆布、外科用カバー、覆布、シート、寝具またはリネン類、パッド、ガーゼ包帯、ワイプ、スポンジ、ならびに家庭、施設、医療、および工業用途のための他の抗微生物用品を挙げることができる。
【０１１５】
本開示の実施形態では、ランチビオティックは、食品調理の表面、食品調理の器具、工業器具、管、または医療デバイス、例えばカテーテル、メス、ナイフ、ハサミ、スパチュラ、エキスパンダ、クリップ、クリップ、ピンセット、スペキュラ、開創器、縫合糸、外科用メッシュ、チゼル、ドリル、水準器、やすり、のこぎり、スプリント、ノギス、クランプ、鉗子、フック、ランセット、針、カニューレ、キュレット、圧低器、拡張器、起子、咬合器、抽出器、探針、ステープル、人工関節、創傷被覆材、カテーテル、ステント、チューブ、ボウル、トレイ、スポンジ、シュリンゲ、スプーン、シリンジ、ペースメーカー、ねじ、プレート、ピン、ワイヤ、ガイドワイヤ、ペースメーカーリード、インプラント、センサー、グルコースセンサー、血管バイパスチューブ、静注バッグ、心室補助装置部材、眼科用レンズ、およびバルーン、ならびに上に記載された布地などの固体表面の上に被覆されるか、固相化されるか、連結されるか、または結合される。
【０１１６】
本開示の別の実施形態では、本開示のランチビオティック組成物は、経皮製剤中に存在する。ランチビオティック組成物が投与部位で局所的に、または動物もしくはヒトの血液循環に入ることによって全身的に作用するように、経皮製剤を設計することができる。そのため、送達は、ランチビオティック組成物を軟膏またはローションの形態で直接的に局所適用することによって、またはランチビオティック組成物を、もしくはランチビオティック組成物を保持し一斉にもしくは時間制御方式で皮膚に放出するリザーバーを、埋め込んだパッチを貼付することによって起こる。
【０１１７】
任意選択で、ランチビオティック組成物を、経皮送達または局所送達のための微粒子、ミクロスフェア、リポソーム、脂質ベシクルやトランスファーソームなどのベシクル内に含有させることができる。衝撃波を生成して孔を広げるための超音波デバイス、皮膚を横切って物質を射出するための電流の使用、皮膚を穿孔してランチビオティック組成物を血流中に送達するためのマイクロニードルの使用もまた、経皮投与または局所投与と共に使用することができる。本開示のランチビオティックなどのペプチドを表面上に被覆、結合、または固相化する方法は、当技術分野に周知である。例えば、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｈ．Ｓｃｏｕｔｅｎ，ｆｉｒｓｔ  Ｅｄ．（２００１）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ），Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆ．  Ｔａｙｌｏｒ（１９９１）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【０１１８】
本開示の方法はまた、生物付着またはバイオフィルムを寛解、低減、除去、または防止するために使用することができる。生物付着とは、溶媒に曝露された構造の上の細菌などの微生物の望ましくない蓄積である。生物付着は、例えば、船の船体の上に、膜バイオリアクターや逆浸透渦巻き型膜などの膜システム、大型工業用器具の水冷却システムおよび発電所、ならびに例えば使用済み油、切削油、可溶化油や油圧油などを運ぶ油送管の中に、起こり得る。
【０１１９】
バイオフィルムは、生物付着を引き起こすことがあり、生物の凝集体であり、そこでは、生物が互いに、表面に、またはその組合せで接着している。バイオフィルムは、細菌、真菌、糸状菌、酵母、藻類、ラン藻、ウイルス、および原虫ならびにそれらの組合せのうち一つまたは複数の種を含むことができる。バイオフィルム中に存在する微生物は、細胞外ポリマー性基質の自己産生マトリックス内に埋め込むことができる。微生物がバイオフィルムの成長モードに切り替わると、行動の表現型シフトを経ることがあり、その際に、数多くの一揃いの遺伝子が差時的に調節される。微生物のほぼどの種類も、バイオフィルムを形成することができる。バイオフィルムは、生きている生物の上もしくは中に、または非生物の構造の中または上に、見出すことができる。バイオフィルムは、天然由来の水場または人造の水場の中に含まれている構造の上、水の表面、湿気に曝露された表面、パイプの内部、冷却水システム、海洋システム、艇体、歯の上、植物表面、植物の内部、ヒトおよび動物の体表、ヒトおよび動物の内部、コンタクトレンズ上、カテーテル、人工心臓弁、他の装具、子宮内デバイス、ならびに他の構造／デバイス上に、存在し得る。
【０１２０】
バイオフィルムは、金属表面の腐食を引き起こし、船舶の速度を阻害し、植物病を引き起こし、ヒトおよび動物の疾患を引き起こし得る。バイオフィルムは、ヒトおよび動物の感染に関与し、そのようなものとしては、例えば、尿路感染、カテーテル感染、中耳感染、歯のプラーク、歯肉炎、歯のう蝕、歯周疾患、心内膜炎、嚢胞性線維症での感染、慢性副鼻腔炎、および人工関節や心臓弁などの永久留置デバイスの感染が挙げられる。バイオフィルムはまた、感染している皮膚の創傷を治癒させるかまたは治療する際に、皮膚の創傷の治癒を弱め、局所的な抗細菌効率を低減し得る。
【０１２１】
バイオフィルムを形成し得る、生物付着を引き起こし得る、ならびに／またはヒトおよび動物で疾患を引き起こし得る、いくつかの微生物としては、例えば、上に記載されたような細菌、真菌、酵母、藻類、原虫、およびウイルスが挙げられる。バイオフィルムは、上に記載されるように生きた生物中で処理することができる。非生物の表面のバイオフィルムおよび生物付着の状態は、非生物の表面に、またはその表面の周囲の範囲に、本開示のランチビオティックを適用することによって、処置することができる。本開示のランチビオティックはまた、水、油、または非生物の表面を囲んでいるかもしくは接触している他の流体に、添加することができる。
【０１２２】
本開示は、細菌などの一つまたは複数の微生物によって引き起こされる生物付着の状態またはバイオフィルムの状態を寛解または予防する方法を提供する。この方法は、バリアントランチビオティックのうち一つまたは複数を、生物付着の状態またはバイオフィルムの状態に投与することを含み、その際に、生物付着の状態またはバイオフィルムの状態は寛解される。
【０１２３】
一つまたは複数のランチビオティックは、バイオフィルムもしくは生物付着の状態を有する表面に投与することができるか、または予防的処置として表面に投与することができる。本ランチビオティックは、乾燥形態（例えば、凍結乾燥もしくは錠剤の形態）または液体溶液もしくは懸濁液の形態とすることができる。乾燥または液体の形態は、表面（例えば、管もしくは膜）じゅうを拭くか、注ぐか、噴霧するか、洗い流すか、またはその他表面に適用することができる。本開示のランチビオティックは、組成物中に担体または希釈剤と共に、約０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０ｍｇ／ｍ2（または約０．００１と約３０  １５０ｍｇ／ｍ2の間の任意の範囲）から、および時にはそれよりも高い量で、存在することができる。
【０１２４】
バイオフィルムがヒトもしくは動物（例えば、カテーテルまたは医療デバイス）内の人工表面に存在するかまたは存在する可能性がある際に、その人工表面を、ヒトまたは動物中に挿入する前に、一つまたは複数のランチビオティックに接触させることができる。任意選択で、人工表面がヒトまたは動物中に挿入された後に、本ランチビオティックをその表面に送達することができる。
【０１２５】
本開示の一実施形態では、バリアントランチビオティックは、生体組織または細胞培養において除染するかまたは細菌繁殖もしくは細菌数を低減するために、使用することができる。本ランチビオティックは、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤中に、上に記載された医薬組成物に関する投薬比率で存在することができる。本ランチビオティックまたはランチビオティック組成物は、少なくとも１タイプの細菌の細菌成長を実質的に阻害するのに有効な期間、組織または細胞培養物に接触させることができる。ランチビオティックは、生体組織または細胞の生理的な特徴を維持するのに有効な量で、および／または生体組織または細胞の生存性を実質的に維持するのに有効な量で、提供することができる。
【０１２６】
本開示の一実施形態は、同種移植の器官、組織、もしくは細胞、自家移植の組織もしくは細胞、同種異系移植の器官、組織もしくは細胞、異種移植の器官、組織、もしくは細胞、または移植に用いる他の細胞もしくは組織を調製するための方法を提供する。この方法は、少なくとも１タイプのグラム陽性細菌の細菌成長または細菌数を阻害または低減するのに有効な期間、器官、細胞、または組織を本開示のランチビオティック組成物に接触させることを含む。細胞、器官、または組織は、例えば、心臓弁、血管、心膜または筋骨格系組織、前十字靱帯などの靱帯、膝関節、股関節、足首関節、半月板組織、皮膚、角膜、心臓、肺、小腸、腸、肝臓、腎臓、骨髄、骨、および腱とすることができる。
【０１２７】
接触ステップは、約２℃から約４２℃の温度で約：０．５、１、２、３、５、１０、２４、３６、または４８時間、実施することができる。本ランチビオティック組成物は、例えばバンコマイシン、イミペネム、アミカシンやアムホテリシンＢなどの一つまたは複数の広範なスペクトラムの抗微生物剤および／または一つまたは複数の抗真菌剤をさらに含む、生理的溶液をさらに含むことができる。
【０１２８】
本開示のランチビオティック組成物はまた、同種異系移植および異種移植の過程の溶液、ならびに細胞培養および組織の溶液に用いる保存剤として、使用することができる。この溶液は、有効量の一つまたは複数のランチビオティックを、生理的溶液中に３と８との間のｐＨで含むことができる。
【０１２９】
一つまたは複数の本開示のランチビオティックは、保存剤として、食品または飲料に添加することができる。食品の例としては、プロセスチーズ製品、低温殺菌された乳製品、野菜の缶詰、高水分の高温焼成された小麦粉製品、低温殺菌された液体卵、およびナチュラルチーズ製品が挙げられる。本開示のランチビオティックはまた、食品中のリステリアを制御して、例えば、ビール、ワイン、アルコールの生産、およびサラダドレッシングなどの低ｐＨの食品における乳酸細菌による損傷を制御するために、使用することができる。本開示のランチビオティックは、高圧滅菌やエレクトロポレーションなどの食品加工技術での添加物としても使用することができる。ランチビオティックは、食品または飲料中に、約：０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００またはそれを超えるｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／Ｌ（または約０．００１と約１，０００ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／Ｌと何倍かの高さとの間の任意の範囲からの量で存在することができる。
【０１３０】
本開示のランチビオティックはまた、分子ワイヤ、分子スイッチ、または分子ベースのメモリシステムとして使用することもできる。そのため、バリアントランチビオティックおよび野生型ランチビオティックは、ナノ回路の構築、ならびに他のナノベースの適用のために使用される可能性を有する。分子ワイヤ（分子ナノワイヤとしても知られる）は、電流を伝える分子スケールの基質であり、分子電子デバイスに用いるための基本的なビルディングブロックである。分子ワイヤの典型的な径は、３ナノメートル未満であり、一方、長さは、センチメートル以上に伸長することができる、分子ワイヤによって、ワイヤの一端からワイヤの他端まで電子を流すことが可能になる。分子ワイヤは、ナノ電子デバイスの追加の構成部材と接触するための少なくとも二つの末端を含むことができる。
【０１３１】
分子スイッチ（制御可能ワイヤとしても知られる）は、要求に応じて電子の流れをオンとオフとに切り替えることができる分子構造である。分子ベースのメモリシステムは、電子の貯蔵によってその導電性を変える能力を有する一つまたは複数の分子ワイヤまたはスイッチである。分子ワイヤ、スイッチ、または分子ベースのメモリシステムは、シリコンウエハ、合成ポリマー支持体、ガラス、アガロース、ニトロセルロース、ナイロン、Ａｕ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ａｌ、Ａｌ2Ｏ3、ニッケルグリッドまたはディスク、カーボン支持体、アミノシラン処理シリカ、ポリリジン被覆ガラス、雲母や半導体などの基質に、存在するかまたは係留することができる。
【０１３２】
実施形態では、本開示は、一つまたは複数の本開示のランチビオティックバリアントを生産する組換えＳ．ミュータンス株を提供する。そのような株の例としては、ＪＨ１０００またはＪＨ１１４０が挙げられる。組換えＳ．ミュータンス株は、ｍｕｔＡ’−ｍｕｔＢ遺伝子間領域にエリスロマイシン遺伝子をさらに含有し得る。そのような株の例としては、ＳＭ１５２が挙げられる。組換えＳ．ミュータンス株はまた、例えば、野生型組換えＳ．ミュータンス株よりも２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１００×、１０００×多くランチビオティックを生産する株とすることができる。
【０１３３】
実施形態では、本開示は、野生型のう蝕性のＳ．ミュータンスを競り負かして宿主の口腔から実質的に排除する［例えば、野生型Ｓ．ミュータンスの数を約：５、１０、２５、５０、７５、９０、９５、９９、または１００％（または約５％と約１００％の間の任意の範囲で）低減する］、一つまたは複数の本開示のランチビオティックバリアントを生産する組換えＳ．ミュータンス株を提供する。野生型ＭＵ１１４０ランチビオティックに比べて生物活性が増強された本発明のランチビオティックバリアントの生産は、それゆえ、宿主の口腔中に存在するＭＵ１１４０生産性の、非ＭＵ１１４０ランチビオティック生産性の、または非ランチビオティック生産性のＳ．ミュータンス株を超える選択的な利点を有するＳ．ミュータンスを、提供することができる。本開示のランチビオティックバリアントは、本開示の組換えＳ．ミュータンス株によって発現される際に、ランチビオティック感受性の常在のＳ．ミュータンス株を排除し、それゆえランチビオティック感受性株のコロニー形成に干渉し、口腔の組換えＳ．ミュータンスのコロニー形成を促進する。野生型の本来のＳ．ミュータンスが口腔から追い出されることから、歯のう蝕の発生率および／または重症度は低減する、
【０１３４】
本開示の一実施形態では、組換え株は、ｌａｎＢ、ｌａｎＣ、ｌａｎＤ、ｌａｎＥ、ｌａｎＦ、ｌａｎＧ、ｌａｎＫ、ｌａｎＭ、ｌａｎＰ、ｌａｎＲ、ｌａｎＴ、ｌａｎＩ、ｍｕｔＲ、ｍｕｔＡＡ’、ｍｕｔＢＣＤＰＴ、ｍｕｔＦＥＧまたはこれらのＳ．ミュータンスポリペプチドのうち二つ以上の組合せを追加的に発現することができる。
【０１３５】
実施形態では、本開示の組換えＳ．ミュータンス株は、乳酸欠損性であり、このことは、組換えＳ．ミュータンス株が、野生型Ｓ．ミュータンスに比べて実質的に減少した量の乳酸を生産することを意味する。実質的に減少した量の乳酸とは、野生型Ｓ．ミュータンス株［例えばＳ．ミュータンス株ＵＡ１５９（ＡＴＣＣ  ７００６１０）］またはストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）［例えばＳ．ソブリヌスＳＬ１株（ＡＴＣＣ  ３３４７８）］、ストレプトコッカス・ラタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｔｔｕｓ）［例えばＳ．ラタスＦＡ１株（ＡＴＣＣ  １９６４５）］、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｕｓ）［Ｓ．クリセタスＨＳ６株（ＡＴＣＣ  １９６４２）］、およびストレプトコッカス・フェラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｕｓ）［Ｓ．フェラス８Ｓ１株））を含めたストレプトコッカス属に属する他の種類によって生産されるよりも、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００％（または約４０％と約１００％の間の任意の範囲）少ない乳酸である。本開示の一実施形態では、乳酸欠損Ｓ．ミュータンスエフェクター株は、検出可能な乳酸を生産しない。乳酸の発現は、例えば、Ｈｉｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：６０（１９９４）；Ｈｉｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：４３１９（１９９６）；Ｈｉｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８：１２９０−１２９５に記載されるように検出することができる。
【０１３６】
本開示の組換えＳ．ミュータンス株は、そのそれぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２７３４０または米国特許第５，６０７，６７２号に開示されるように、非機能的な、不活性化された、部分的に機能的な、または部分的に不活性化された乳酸合成の調節領域、翻訳シグナル、転写シグナル、または構造配列の結果として、乳酸欠損とすることができる。
【０１３７】
乳酸合成の欠乏は、Ｓ．ミュータンスにとって致死的であることから、組換えの乳酸欠損Ｓ．ミュータンス株におけるこの欠乏は、組換えアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の生産によって補完される必要がある。例えば、Ｈｉｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：４３１９（１９９６）を参照されたい。組換えＡＤＨの生産によって、その他乳酸欠損Ｓ．ミュータンスの死を引き起こす代謝物、例えばピルべートの蓄積が防止される。
【０１３８】
Ｓ．ミュータンス株は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２７３４０に開示されるように、組換えアルコールデヒドロゲナーゼを発現するように遺伝子工学的に作製することができる。本開示の組換えＳ．ミュータンス株は、通常は口腔または宿主の食事の中には存在しない有機物質に対する栄養要求性を持つように、任意選択で遺伝子工学的に作製することができ、その結果、その組換えＳ．ミュータンス株による口腔内のコロニー形成を制御することができる。すなわち、組換えＳ．ミュータンス株は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２７３４０に開示されるように、成長に必要な特定の有機化合物を合成できないように、任意選択で遺伝子工学的に作製することができる。
【０１３９】
任意選択で、本開示の組換えＳ．ミュータンス株は、不活性化されているかまたは非機能的なｃｏｍＥ遺伝子を含むことができる。「ＣｏｍＥ欠損である」または「ＣｏｍＥ生産の欠損」とは、野生型Ｓ．ミュータンスに比べて実質的に減少した量のＣｏｍＥタンパク質を組換えＳ．ミュータンス株が生産することを意味する。実質的に低減した量のＣｏｍＥとは、野生型Ｓ．ミュータンス株によって生産されるよりも、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００％（または約４０％と約１００％との間の任意の範囲）少ないＣｏｍＥタンパク質である。本開示の一実施形態では、ＣｏｍＥ欠損組換えＳ．ミュータンス株は、検出可能なＣｏｍＥタンパク質を生産しない。ＣｏｍＥ発現は、例えば、Ｃｈｅｎ＆Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：３１６０（２００１）に記載されるようにアッセイすることができる。本開示の組換えＳ．ミュータンス株は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２７３４０に開示されるように、非機能的な、不活性化された、部分的に機能的な、または部分的に不活性化されたＣｏｍＥ合成の調節領域、翻訳シグナル、転写シグナル、または構造配列の結果として、ＣｏｍＥ欠損とすることができる。
【０１４０】
実施形態では、本開示の組換えＳ．ミュータンスは、本開示の組成物中に治療有効量で存在する。治療的に有効とは、数または発生率を予防または低減する（例えば、組成物を受けなかった対照よりもう蝕が５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％少ない）、および／またはう蝕の重症度を低減する（例えば、組成物を受けなかった対照よりもう蝕の重症度が５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％低い）のに有効であることを意味する。
【０１４１】
治療的に有効な量または投薬量とは、健全な医療／歯科的な判断の範囲内で、う蝕を予防する、ならびに／またはう蝕の数および／もしくはう蝕の重症度を低減するのに充分に高いレベルであるが重篤な副作用を（理に適ったベネフィット／リスク比で）回避するのに充分に低い、本開示の組成物の量または投薬量である。本開示の組成物は、当技術分野に公知の方法を用いて、う蝕の治療および／または予防のために、治療有効量で宿主の口腔に適用することができる。
【０１４２】
本開示の一実施形態では、組成物は、当技術分野に公知の方法を用いて、一つまたは複数の単離されたストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）株、一つまたは複数の単離されたＳ．ラタス株、および／または一つまたは複数の単離されたストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）株と併せて、本開示の一つまたは複数の単離された組換え株を含むことができる。
【０１４３】
本開示の一実施形態は、歯のう蝕を治療する方法を提供し、この方法は、当技術分野に公知の方法を用いて、本開示の一つまたは複数の組換えＳ．ミュータンス株を含む組成物を、それを必要とする対象の口腔に投与することを含む。
【０１４４】
本開示はまた、対象で歯のう蝕を引き起こし得る細菌の量を低減する方法を提供する。本開示の別の実施形態は、対象で歯のう蝕を予防する方法を提供し、例えば、本開示の組換えＳ．ミュータンス株を含む組成物は、当技術分野に公知の方法を用いて、動物などの宿主または対象の口腔に投与され、そのような動物としては、哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、またはウサギが挙げられる。本開示の組成物は、当技術分野に公知の方法を用いて、経口的に投与することができる。
【０１４５】
キット
本開示の組成物は、一つまたは複数の本開示のランチビオティックの容器を含むキット中に存在し得る。本ランチビオティックは、凍結して、凍結粉末もしくは錠剤の形態とするか、または溶液もしくは懸濁液として、任意選択で緩衝剤、賦形剤、希釈剤、アジュバント、もしくは医薬的に許容可能な担体を共存させることができる。キットはまた、身体の一部または組織または表面へ一つまたは複数のランチビオティックを用いるための一つまたは複数のアプリケーターを含むことができる。アプリケーターは、例えば、スワブ、シリンジ（針を持つか持たない）、点滴器、噴霧器、外科用被覆材、創傷包装材、または包帯とすることができる。任意選択で、キットは、一つまたは複数のバリアントＭＵ１１４０ランチビオティックを再構成、希釈、または調製するために、一つまたは複数の緩衝剤、希釈剤、アジュバント、治療的に許容可能な担体、または医薬的に許容可能な担体を含むことができる。
【０１４６】
本開示のキットは、単回用量の、１週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、または１２か月の供給の本開示の組成物を含有することができる。本開示の組成物は、梱包することができ、複数の包装された組成物は、順次、貯蔵容器または外装またはカートンで提供することができる。一つまたは複数のＳ．ミュータンスの株が栄養要求性である際には、キットは、細菌の栄養要求性を維持する量の有機物質、例えば、Ｄ−アラニンなどのＤ−アミノ酸を含む組成物を含むことができる。
【０１４７】
本明細書のどこかで言及されている全ての特許、特許出願、および他の科学文書または技術文書は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。本明細書に説明的に記載されている本開示は、本明細書に具体的に開示されていないいかなる一つまたは複数の構成要素、一つまたは複数の限定の不在下でも、適切に実践することができる。それゆえ、例えば、本明細書中の各場合で、「含む」、「から本質的になる」および「からなる」のいずれの用語も、それらの本来の意味を保持しつつ、他の二つの用語のどちらかと置き換えられることがある。採用されている用語および表現は、限定の用語ではなく記載の用語として使用され、そのような用語および表現の使用に際して、呈示および記載される特長のいかなる等価物またはその一部も排除することを意図するものではないが、特許請求の範囲にある本開示の範囲内で様々な改変が可能であることが認識される。それゆえ、本願開示が実施形態によって具体的に開示されているとはいえ、本明細書に開示される概念の任意選択的な特長、改変、およびバリエーションが、当業者によって行われることがあること、ならびにそのような改変およびバリエーションは、本記載および添付の特許請求の範囲によって規定されるこの開示の範囲内にあるものとみなされることが、認識されるべきである。
【０１４８】
以下は、例証の目的のみで示され、上記の幅広い用語に記載される本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１４９】
本願開示は、以下の実施例にてさらに規定される。本明細書に明記される実施例は、本開示のある特定の特長、構成要素、および実施形態を表し、本開示の範囲を限定すると意図するものではなく解釈されるべきものでもない。
【０１５０】
（成熟した）２２アミノ酸の生来の（野生型）ＭＵ１１４０ポリペプチド配列（配列番号１１５６、図１）内の選ばれた単一および複数のアミノ酸の組合せを変異させることによって、抗微生物／抗生物活性および／または安定性が向上したＭＵ１１４０バリアント（すなわち、非天然由来のバリアントを含むＭＵ１１４０ポリペプチドバリアント）を生じた。ｐＬＡＮ０４２を用いてｍｕｔＡバリアントを構築した。ｐＬＡＮ０４２由来の線状のアンプリコンを使用して、コドン置換を含有するｍｕｔＡ配列に生来のｍｕｔＡ配列を置換した。ＳＭ１５２（ＪＨ１１４０ｌａｎＡ’Ｂ：：ｅｒｍ）内のｍｕｔＡバリアントライブラリーの形質転換を行い、ｍｕｔＡ中のコドン置換を確認した後、Ｓ．ミュータンスバリアントのクローンを拾って発現し、抗微生物活性（下記の表１および表２を参照）および安定性を分析した。ｍｕｔＡ不変の対照のＳＭ１５２および野生型の親株ＪＨ１１４０を用いた各ランチビオティックバリアント生産株について透明域のサイズを定性的に比較することによって、データを解釈した。
【０１５１】
実施例１
ＭＵ１１４０の単一部位および複数部位でのバリアント
ｍｕｔＡバリアント株の構築
ＭＵ１１４０バリアントの構築用のプラスミドは、Ｓ．ミュータンス中のＭＵ１１４０プロペプチドをコードする主要な構造遺伝子であるｍｕｔＡを用いて構築した。エピソームプラスミドは、ＣｏｌＥ１複製起点、大腸菌でのアンピシリン耐性、およびＳ．ミュータンスでのクロラムフェニコール耐性を有するプラスミドであるプラスミドｐＭＫ４（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ５４９７７８．１）を用いて構築した。ｍｕｔＡＡ’遺伝子座を含有するＳ．ミュータンスＪＨ１１４０（ＡＴＣＣ寄託：５５６７６）のＤＮＡ断片を、ｐＭＫ４内にライゲーションし、ｐＬＡＮ０４２（図２）と命名した。表１Ａに一覧にしたコドン置換を用いて、プラスミドｐＬＡＮ０４２を鋳型として使用し、ＰＣＲ変異生成法を用いてｍｕｔＡバリアントを造成した（Ｒａｍａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１，２０１４）。
【０１５２】
相同組換えを用いた染色体組込みストラテジーを採用して、生来の染色体ｍｕｔＡ遺伝子を、コドン置換をコードするｍｕｔＡバリアントに置き換えることによって、Ｓ．ミュータンスＪＨ１１４０でＭＵ１１４０バリアントを生産した。ｍｕｔＡＡ’の上流の組込みアーム、ｍｕｔＡＡ’の下流の組込みアーム、およびエリスロマイシン耐性遺伝子を、ＰＣＲによって増幅し、スプライシングオーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＳＯＥ  ＰＣＲ）を用いてアセンブリした。ＳＯＥ産物を、ｐＭＫ４にライゲーションし、大腸菌中に形質転換し、ＤＮＡシークエンシングによって確認して、ｐＬＡＮ１２６（図３）と命名した。
【０１５３】
ＭｕｔＡバリアントライブラリーは、上流および下流の組換えアームをｐＬＡＮ１２６鋳型からＰＣＲ増幅し、続いて、ｐＬＡＮ０４２  ｍｕｔＡバリアントライブラリーからＰＣＲ増幅したｍｕｔＡバリアント（表１Ａ）またはｍｕｔＡコドンバリアントをコードするオリゴヌクレオチドライブラリー（表１Ｂ）に、ＳＯＥ  ＰＣＲを用いてアセンブリすることによって、構築した。最後のＰＣＲ反応を使用して、７５０ｂｐの組換えアームを含有する単一のＳＯＥ産物を増幅した。
【０１５４】
ＤＮＡベクターを、標準的な手法［Ｂｉｓｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４２．４：４８７（２００７）］を用いてＳ．ミュータンスＪＨ１１４０中に形質転換した。形質転換体を、３μｇ／ｍＬエリスロマイシンを含有するＴＳＹＥＸ寒天（Ｇｈｏｂｒｉａｌ  ２００８，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ＭＵ１１４０．Ｐｈ．Ｄ．論文、フロリダ大学）上に播き、キャンドルジャー中、３７℃で３日間インキュベーションした。ＰＣＲおよびサンガーＤＮＡシークエンシングを利用して、ｍｕｔＡの染色体性コピーが、組込みベクター上にコードされたｍｕｔＡバリアントに置き換わったことを確定した。
【表１】
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【表２】
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【０１５５】
このようにして、ｐＬＡＮ０４２を基本ベクターとして用いて、４１８種類のｍｕｔＡバリアントのプラスミドライブラリーをそれゆえ構築した。指定のアミノ酸変化をもたらすような単一のコドン変異を４１８種類のベクターそれぞれのデザインに含有させて、ｍｕｔＡバリアントライブラリーを、アドレス指定可能な方式で構築した。４１８種類のバリアントそれぞれのコドン変化の確認は、ＤＮＡシークエンシングによって確かめた。
【０１５６】
ＭＵ１１４０バリアントの生産のレベルと一致性とを向上させるため、同様のゲノム組込みストラテジーを用いて、複数部位ｍｕｔＡバリアントも構築した。
【０１５７】
実施例２
ＭＵ１１４０単一および複数部位バリアントの非正規化試験
工学的に作製されたＳ．ミュータンスｍｕｔＡバリアント株が抗微生物活性のＭＵ１１４０バリアントを生産するか否かを決定するために、まず、ＭＵ１１４０感受性抗生物標示株であるミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）２７２に対し透明域を形成を誘導する能力について、ｍｕｔＡバリアント株の培養上清を試験した。
【０１５８】
ハイスループット（ＨＴＰ）成長
１ｍＬのＴＳＹＥＸ（３％トリプシン消化大豆ブロスおよび０．３％酵母抽出物）および３μｇ／ｍＬエリスロマイシンを含有する２．２ｍＬの９６ウェル深底プレート内に、Ｓ．ミュータンスのコロニーを拾った。プレートを撹拌せずに、微好気的に３７℃で一晩成長させた。９００μＬのＧｈｏｂｒｉａｌ発現培地（５％酵母抽出物、４％グルコース、０．１％ＣａＣｌ２、１００ｍＭビス−トリス緩衝液ｐＨ６．７；Ｇｈｏｂｒｉａｌ、２００８）を含有する２．２ｍＬの９６ウェル深底プレートに、１００（１００）μＬの一晩培養物を移し入れた。発現プレートを多孔性シールで密封し、３７℃、９００ｒｐｍで２０時間撹拌した。細胞培養物を３２２０×ｇで１０分間遠心分離し、ミクロコッカス・ルテウスバイオアッセイでの試験用に上清を除去した。Ｓ．ミュータンス株の一晩ＴＳＹＥＸ培養物を２５％グリセロール（終体積）で希釈して−８０℃でインキュベーションすることによって、冷凍庫ストックを構築した。
【０１５９】
ミクロコッカス・ルテウスＨＴＰバイオアッセイ
Ｍ．ルテウス（ＡＴＣＣ寄託番号：２７２）をＬＢ寒天プレート上に筋状に付け、３０℃で４８時間成長させ、次いで、５ｍＬのＬＢブロスを１４ｍＬ培養チューブに移した。Ｍ．ルテウス細胞を、プレート培養物から接種し、振盪器中２５０ｒｐｍ、３０℃で一晩成長させた。細胞を、２５０ｍＬ三角フラスコ中、５０ｍＬ体積のＬＢブロスを用いて１：１００に希釈し、３０℃で２時間成長させた。続いて、Ｍ．ルテウス細胞を３２２０×ｇで５分間遠心分離し、５ｍＬの新鮮ＬＢに再懸濁し、４５℃溶融の１２５ｍＬの軟栄養寒天（５ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ寒天、８ｇ／Ｌ  Ｄｉｆｃｏ栄養ブロス）中にＯＤ６００  ０．１で接種類して、ＱＴｒａｙ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）中に注ぎ入れた。クリーンベンチ（ｌａｍｉｎａｒ  ｆｌｏｗ  ｈｏｏｄ）内で蓋を取り、ＱＴｒａｙを３０分間乾燥した。９６本の金属ピンヘッドを取り付けたＱＰＩＸ（商標）４５０格子ロボットを使用し、１５０μＬの培地を含有する９６ウェルソースプレート（ＧｒｅｉｎｅｒのＵ字浅底）からＱＴｒａｙへ、各バリアントのスポットを１０回反復した。ＱＴｒａｙｓを３０℃で一晩インキュベーションし、ＥＰＳＯＮ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  １０，０００  ＸＬ光学スキャナーを用いて画像化した。透明域を、ＳＭ１５２（「１」と標示）以下の活性およびＳＭ１５２を超える活性（「２」と標示）としてスコア化した。
【０１６０】
ＭＵ１１４０単一部位バリアント（エピソームプラスミド上で発現）の結果
Ｓ．ミュータンス株の一晩成長物から得られた非正規化培養上清を使用したＭ．ルテウス透明域アッセイを用いて、ＭＵ１１４０バリアント生産株を抗微生物活性の向上について評価した（表２）。Ｓ．ミュータンス株ＪＨ１１４０とＳＭ１５２の両方では、均一な（ウェル間およびプレート間）透明域が、観察された。Ｓ．ミュータンスＳＭ１５２株（ｍｕｔＡ不変）およびバリアント生産ｍｕｔＡバリアント株は、ｐＬＡＮ１２６ベースの組込みベクター由来のｍｕｔＡ’ｍｕｔＢ遺伝子間領域にエリスロマイシン耐性遺伝子を含有する（図３）。ＳＭ１５２  ｍｕｔＡ不変株の妥当性確認の間、エリスロマイシン耐性カセットの挿入によって、観察された活性域のサイズに、親株ＪＨ１１４０で観察された活性域のサイズと比べて均一な機能獲得の向上が引き起こされたことが見出された（表２）。観察された抗微生物活性の増加は、上流のｍｕｔＡＡ’または下流のｍｕｔＢＣＤＰＴのオペロンの高レベルの発現をもたらす調節領域の調節解除に起因する可能性がある。このアッセイにおける透明域のサイズの変化は、特異的な抗微生物活性、安定性、力価、および／もしくは拡散性、またはそのような要因の組合せの増加に起因した可能性があった。
【０１６１】
続いて、１箇所以上のアミノ酸位置の変異がＭ．ルテウス透明域アッセイにおける性能の向上をもたらすか否かを決定するために、複数部位ＭＵ１１４０バリアント生産株を試験した（表３）。供試した複数部位バリアントは、ＳＭ１５２ならびに単アミノ酸バリアント株Ｆ１ＩおよびＦ１Ｌよりも大きな透明域を示し、このことは、特異的な抗微生物活性、安定性、力価、および／もしくは拡散性、またはそのような要因の組合せの増加があった可能性を標示している。
【表３】
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【表４】
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【０１６２】
アドレス指定可能な４１８種類のｍｕｔＡバリアントライブラリーを形質転換した後、ｍｕｔＡバリアント当たり二つのＳ．ミュータンスＳＭ１２６  ΔｍｕｔＡＡ’  ｐＬＡＮ０４２バリアントクローンを拾い、発現し、抗微生物活性を分析した（下記の表４のプレート１〜６を参照）。陽性対照のＳＭ１２６  ΔｍｕｔＡＡ’  ｐＬＡＮ０４２および陰性対照のＳＭ１２６  ΔｍｕｔＡＡ’  ｐＭＫ４（空ベクター）を用いた各バリアント生産株について透明域のサイズを定性的に比較することによって、データを解釈した。４１（４１）種類のバリアントが、２クローンのうち少なくとも一つについて、陽性対照よりも大きな抗微生物活性を示した（表４）。７３（７３）種類のバリアントが、２クローンのうち少なくとも一つについて、対照と等しい抗微生物活性を示した。８３（８３）種類のバリアントが、陽性対照よりも少ない活性を示したが、検出可能な透明域を依然として生成した。２２１（２２１）種類のバリアントが、供試されたどちらのクローンでも、検出可能な透明域を生成しなかった。
【０１６３】
このプラスミド媒介性相補系を用いて、クローン間および実験間でバリエーションが観察され、それは、各９６ウェルプレート実験に含まれた対照が、検出可能な抗微生物活性がないものから対照よりも大きな抗微生物活性があるものまで大幅なバリエーションを示した通りであった（表５）。実験的なエラー源としてのｐＬＡＮ０４２プラスミドのＤＮＡ変異を除外するために、個々のクローンをスポットシークエンシングした。
【表５】
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【０１６４】
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【０１６５】
４１８種類のｍｕｔＡバリアントを含有する飽和スキャニング変異ライブラリーを構築および試験することによって、感受性標示微生物（すなわちＭ．ルテウス）に対する抗微生物活性の向上をもたらすバリアントをスクリーニングするために、ＭＵ１１４０アミノ酸配列を偏りなくサンプリングすることが可能になる。この研究に使用されるｍｕｔＡバリアントプラスミド発現系は、抗微生物活性の差次的な変化を決定するには充分な堅牢性がないことがあり、それは、このプラスミドベースの系を用いて実験的なバリエーションが観察された通りである。プラスミドベースのｍｕｔＡ発現に由来する抗微生物活性のレベルは低く、一致性がなく、タンパク質生産のレベルに対して正規化されていなかった（例えば表５を参照）。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、表１に明示されるある種類のＭＵ１１４０バリアントは、これらのバリアントがＳ．ミュータンスＳＭ１２６宿主細胞を著しく阻害するかまたは死滅させ得るほどに高いレベルの抗生物／抗微生物活性を有する可能性があるものと、出願人は想定している。
【０１６６】
合計で４１種類のｍｕｔＡバリアントが、供試された２クローンのうち少なくとも一つについて、陽性対照株（すなわちＳＭ１２６  ΔｍｕｔＡＡ’）よりも大きな透明域を生成し、このことは、ＭＵ１１４０ポリペプチドの２２箇所のあり得るアミノ酸位置のうち１２箇所を表す。下記の実施例２に明示されているように、ｍｕｔＡバリアントのゲノム組込みを、ＭＵ１１４０バリアント生産のレベルおよび一致性を向上させるための代替の発現ストラテジーとして選択した。
【０１６７】
ＭＵ１１４０単一部位バリアント（染色体内に安定的に組み込まれている）の結果
４１８種類のＭＵ１１４０バリアントの第１世代ライブラリーを構築し、Ｓ．ミュータンス中で試験し（実施例１を参照）、その結果、Ｍ．ルテウスに対するすなわち生来の（野生型）ＭＵ１１４０に比べて］等しいかまたは向上した抗微生物活性を示す、１１４種類のバリアントが検出された。１１４種類のＭＵ１１４０バリアント生産株のうち５８メンバーのサブセットを、Ｓ．ミュータンス染色体上のｍｕｔＡ遺伝子座に部位特異的に組み込むように設計したベクターを用いて再構築し、生来のｍｕｔＡのコピーを置き換えた。Ｍ．ルテウスに対する抗微生物活性の向上に基づき、５８種類のＭＵ１１４０バリアントを選択した。図６を参照されたい。
【０１６８】
５８種類のＭＵ１１４０バリアント生産株を、抗微生物活性の向上について、Ｓ．ミュータンス株の一晩成長物から得られた非正規化培養上清を使用したＭ．ルテウス透明域アッセイを用いて評価した。Ｓ．ミュータンス株のＪＨ１１４０およびＳＭ１５２の両方について、一致性のある（ウェル間およびプレート間）透明域が観察された。陽性対照（ＳＭ１５２株）よりも大きな透明域を生成した２６（２６）種類の異なるバリアントを発現する株を、さらに進んだ分析のために特定した。追加の１５種類のバリアントを発現する株（対照株ＳＭ１５２と同様のまたはそれよりも小さな透明域を有する）を特定したが、このことは、新規のおよび／または充分に表されていないアミノ酸位置があることを表す。合計で４１バリアントを、さらに進んだ分析のために、抗微生物活性と位置多様性の基準に基づき特定した（表６）。
【表１２】
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【０１６９】
実施例３
生来のＭＵ１１４０およびＭＵ１１４０バリアントの質量スペクトル
質量分析を使用し、Ｓ．ミュータンスＪＨ１１４０中でｍｕｔＡ遺伝子のコドン置換を用いて生産されたＭＵ１１４０バリアントの同一性を確かめた。ＭＵ１１４０の公表されている２，２６６ダルトン（Ｄａ）の分子量（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７９（１３），４０１５−２３，２０１３）に基づき、特異的なアミノ酸残基の分子量を差し引いて、置き換えたアミノ酸残基の分子量を加え、適切であれば環加水分解（１８Ｄａ）または２，３−ジデヒドロアラニン（ＤＨＡ）置換（２Ｄａ）につき調整することによって、各バリアントの理論分子量を算出した。
【０１７０】
結果
標準的な方法を用いてＬＣ−ＭＳによって、複数部位コドンＭＵ１１４０バリアントを個別に解析した。単一部位バリアントおよび複数部位バリアントについての結果を、表７および表８にそれぞれ示す。
【表１３】
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【表１４】
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【０１７１】
バリアントの分子量は、分子量の計算値に２．０ダルトン以内で一致することが見出された。分子量の実験値と計算値との間の一致は、Ｓ．ミュータンスで工学的に作製されたようなバリアントの生産を確定するものである。
【０１７２】
実施例４
ＭＵ１１４０バリアントの治療特性
スケールアップおよび精製
Ｓ．ミュータンス株を、１Ｌ攪拌フラスコまたは１Ｌ発酵槽中で成長させた。清澄にした培養上清を、クロロホルム抽出を用いて回収し［Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７９（１３），４０１５−２３，２０１３］、フラッシュクロマトグラフィーを用い、標準的な手法を用いて２８０ｎｍでの吸光度に基づき９０％超の純度に精製した。バリアントを凍結乾燥して乾燥状態とし、乾燥重量およびＵＰＬＣによって定量し、次いで、Ｃ．ディフィシルＭＩＣおよび擬似腸液安定性アッセイを用いて活性をアッセイした。
【０１７３】
動物モデルにおけるＭＵ１１４０バリアントの性能の追跡試験では、処置当たり２００ｍｇ超の純粋なバリアントが必要であった。選ばれたバリアントを、５Ｌ発酵槽にスケールアップし、２段階のクロマトグラフィー精製を用いて、２８０ｎｍでの吸光度に基づき９０％超の純度に精製した。
【０１７４】
Ｃ．ディフィシルＭＩＣアッセイ
最小阻害濃度（ＭＩＣ）評価は、嫌気性のヒト胃腸病原体クロストリジウム・ディフィシルを用いて実施した。バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）感受性試験用のＣＬＳＩ  Ｍ１１−Ａ８  ブロス希釈法の改変を、Ｃ．ディフィシルに使用した。［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｔｈａｔ  Ｇｒｏｗ  Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ−ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  ＣＬＳＩ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｍ０７−Ａ８（ＩＳＢＮ  １−５６２３８−６８９−１）．Ｖｏｌ．２９  Ｎｏ．２．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＵＳＡ，２００９］。試験では、バンコマイシンおよびＭＵ１１４０バリアントのＭＩＣを決定し、このＭＩＣは、ブロス培地中、目に見える細菌の成長を完全に防止する抗微生物剤の最低濃度として規定した。Ｃ．ディフィシルを、血液寒天プレート上に筋状に付けて、嫌気性条件下でインキュベーションした。バンコマイシンおよびＭＵ１１４０バリアントを、溶解して、１００％ＤＭＳＯにより２倍希釈物に希釈した。Ｃ．ディフィシル株を（選択した単一および／または複数部位バリアントについてはＡＴＣＣ  ９６８９、ＢＡＡ−１８０５、ＡＴＣＣ  ７００５７、ＡＴＣＣ  ４３５９６、ＡＴＣＣ  ４３２５５、ＢＩ１、およびＢＡＡ−１８７５を、選択した複数部位バリアントについてはＵＮＴ１０３−１、ＵＮＴ１０７−１、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ  １８７４、ＡＴＣＣ  ４３５９７、およびＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１８０８を）、６４から０．０６２５μｇ／ｍＬまでの２倍順次希釈による１１通りのバノマイシンまたはＭＵ１１４０バリアントの濃度で、それぞれ試験した。各希釈物の４μＬのアリコートを、９６ウェルプレートのウェル中、被験株を含む１９６μＬの強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ）に添加した。終体積を各ウェル２００μＬとした。アッセイプレートをビニール袋で緩く覆い、Ｃ．ディフィシルを嫌気性条件下、３６℃で４６〜４８時間インキュベーションし、次いで可視的に調べて、成長もしくは濁りの阻害には陽性（＋）を、または成長もしくは濁りに効果のないものには陰性（−）を、スコア付けした。
【０１７５】
他のグラム陽性および抗酸性の微生物に対するＭＩＣアッセイ
複数の他のグラム陽性微生物およびマイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）（抗酸性生物）に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）の評価を、ＣＬＳＩ（ＣＬＳＩ文書Ｍ０７−Ａ８）に記載されているブロス希釈アッセイにより行った。単一部位バリアントを、３種類のバンコマイシン耐性のエンテロコッカス［ＶＲＥ；２種類のエンテロコッカス・フェカリス株（ＡＴＣＣ  ５１５７５およびＡＴＣＣ  ５１２９９）、１種類のエンテロコッカス・フェシウム株（ＡＴＣＣ  ７００２２１）］、５種類のスタフィロコッカス・アウレウス株（ＡＴＣＣ  ２９２１３、１９６３６、３３５９１、７００６９９、およびＢＡＡ−１７１７）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（ＡＴＣＣ  ７００６７５）、ならびに  マイコバクテリウム・フレイ（ＡＴＣＣ  １１７５８）に対して供試した。複数部位バリアントを、３種類のＶＲＥ株［２種類のエンテロコッカス・フェカリス株（ＣＣＵＧ  ４７７７５およびＡＴＣＣ  ７００２２１）、１種類のエンテロコッカス・フェシウム株（ＡＴＣＣ  ７００２２１）］、クロストリジウム・シンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ３５７０４）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）（ＡＴＣＣ  １５７００）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（ＣＣＵＧ  ４３５６）、ペプトストレプトコッカス・アナエロビウス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ）（ＡＴＣＣ  ２７３３７）、ならびにエガセラ・レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ）（ＡＴＣＣ  ２７３３７）に対して供試した。各株に対する試料および標準参照剤（適用可能である場合にはリネゾリド、アンピシリン、ゲンタマイシン、バンコマイシン）を、１００％ＤＭＳＯに溶解して希釈し、４μＬを、被験生物を播種した１９６μＬのブロスと共に、９６ウェルプレートにウェル当たりに添加した。試料を６４から０．０６２５μｇ／ｍＬまでの１１通りの濃度で供試した。アッセイプレートをビニール袋で緩く覆い、エンテロコッカス属、Ｓ．アウレウス、Ｍ．フレイ、およびＰ．エルギノーザを好気性条件下で、Ｓ．ニューモニエ、Ｃ．シンデンス、Ｂ．ブレーベ、Ｌ．アシドフィルス、Ｐ．アナエロビウス、およびＥ．レンタを５％  ＣＯ２下で、３６℃で２０〜２４時間インキュベーションし、次いで可視的に調べて、成長もしくは濁りの阻害には陽性（＋）を、または成長もしくは濁りに効果のないものには陰性（−）を、スコア付けした。
【０１７６】
グラム陰性（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉを含む）に対するＭＩＣ
シュードモナス・エルギノーザ（グラム陰性細菌）に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）の評価を、単一部位バリアントについて、ＣＬＳＩ（ＣＬＳＩ文書Ｍ０７−Ａ８）に記載されているブロス希釈アッセイにより行った。試料およびオフロキサシン対照を、１００％  ＤＭＳＯに溶解して順次希釈し、４μＬを、Ｐ．エルギノーザの播種された１９６μＬのカチオン調整ミューラーヒントンＩＩブロスと共に、９６ウェルプレートにウェル当たり添加した。化合物を６４から０．０６２５μｇ／ｍＬまでの１１通りの濃度で供試した。アッセイプレートをビニール袋で緩く覆い、３６℃（好気性条件）で２０〜２４時間インキュベーションし、次いで可視的に調べて、成長もしくは濁りの阻害には陽性（＋）を、または成長もしくは濁りに効果のないものには陰性（−）を、スコア付けした。
ヘリコバクター・ピロリ（グラム陰性）に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）の評価を、複数部位バリアントについて、ＣＬＳＩ（ＣＬＳＩ文書Ｍ０７−Ａ８）に記載されているブロス希釈アッセイにて、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、細胞膜増感剤）の添加の存在および不在下で行った。試料およびテトラサイクリン対照を、１００％  ＤＭＳＯに溶解して順次希釈し、４μＬを、Ｈ．ピロリ±０．０５Ｍ  ＥＤＴＡの播種された１９６μＬのブルセラブロス−７％  ＦＢＳと共に、９６ウェルプレートにウェル当たり添加した。化合物を６４から０．０６２５μｇ／ｍＬまでの１１通りの濃度で供試した。アッセイプレートをビニール袋で緩く覆い、３６℃、５％ＣＯ2（嫌気性条件）下で２０〜２４時間インキュベーションし、次いで可視的に調べて、成長もしくは濁りの阻害には陽性（＋）を、または成長もしくは濁りに効果のないものには陰性（−）を、スコア付けした。
【０１７７】
擬似腸液アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ擬似腸液安定性アッセイを、擬似腸液およびプロテアーゼの存在下、胃腸管中でのＭＵ１１４０バリアントの安定性を模擬実験するために実施した。アッセイのインキュベーション条件は、９６ウェルフォーマットで、１％ブタパンクレアチン、３μｇ／ｍＬウシトリプシン、および３μｇ／ｍＬウシキモトリプシンを含有する４７５μＬの擬似腸液［ＦａＳＳＩＦ−ｖ２（Ｅｋａｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ  ２００８）を、２５μＬの１ｍｇ／ｍＬバリアントと混合して終濃度５０μｇ／ｍＬバリアントとして含んでいた。試料を３７℃でインキュベーションし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて基質の損失について分析した。残存する消失速度定数（Ｋｅ）のパーセントおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏのタンパク質の半減期を算出した。
【０１７８】
擬似胃液アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ擬似胃液安定性アッセイを、擬似胃液およびプロテアーゼの存在下、胃袋中での９種類のＭＵ１１４０バリアントの安定性を模擬実験するために実施した。アッセイのインキュベーション条件は、マイクロチューブ中、１．７５ｍｇ／ｍＬペプシン（３２００〜４５００Ｕ／ｍｇ）を含有する２４２．５μＬの擬似胃液（ＳＧＦ、ＵＳＰ３９試験溶液；２ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、７ｍＬ／Ｌ氷ＨＣｌ、ｐＨ１．４）を、７．５μＬの１０ｍｇ／ｍＬバリアント（または陽性対照、ＮＨ2−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯＨ、ＭＲＦＡ、ＣＡＳ＃６７３６８−２９−０）と混合して終濃度３００μｇ／ｍＬバリアントとして含んでいた。試料を３７℃でインキュベーションし、ＨＰＬＣまたはＬＣ−ＭＳを用いて基質の損失について分析した。残存する消失速度定数（Ｋｅ）のパーセントおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏのタンパク質の半減期を算出した。酵素を含まないＳＧＦの対照も各バリアントについて実施し、同じ方式で分析した。
【０１７９】
動物試験
カニューレ挿入されたシリアンハムスターのＣ．ディフィシルモデルを使用して、Ｃ．ディフィシル感染の処置におけるＭＵ１１４０バリアントの効能を評価した。回腸のカニューレ挿入手術と回復の後、雄のゴールデンシリアンハムスターに、クロストリジウム・ディフィシルＵＮＴ１０３−１［ＶＡ１１、非流行性（ｃｄｔＢ−、ＲＥＡグループＪ）Ｃｕｒｔｉｓ  Ｄｏｎｓｋｅｙ、クリーブランドＶＡ病院、クリーブランド、オハイオ州］を接種した。１日目、感染の２４時間後に、全ての動物は、クリンダマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）の単回皮下注射を受けた。被験物質製剤を１日３回（ＴＩＤ）、２日目にクリンダマイシン注射の１８時間後に開始して５連続日の間（２日目から６日目）、投与した。バンコマイシン（陽性対照）を、２日目から６日目に１日１回、２０ｍｇ／ｋｇで投与し、その後２２日目まで再発を評価した。試験で死亡したかまたは終了時（２１日目）に安楽死させた全てのハムスターの盲腸の内容物を、Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂ（ｔｇｃ  ＢＩＯＭＩＣＳ  ＥＬＩＳＡキット、カタログ番号ＴＧＣ−Ｅ００２−１）について、およびＣ．ディフィシルの胞子数について、試験した。盲腸の内容物を５０％終濃度のエタノール中、室温で６０分間インキュベーションし、遠心分離し、ペレットをナノピュア水に再懸濁することによって、胞子力価を決定した。再懸濁物を６５℃で１５分間インキュベーションし、再度遠心分離して、ペレットを再度ナノピュア水に再懸濁した。試料を希釈して、７％ウマ溶血血液、０．５ｍｇ／ｍＬシクロセリン、１５μｇ／ｍＬセフォキシチン、および１ｍｇ／ｍＬタウロコール酸を含むコロンビア寒天プレート上に斑点状に付けた。嫌気性インキュベーションの４８時間後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）として胞子数を決定した。
【０１８０】
追跡試験のカニューレ挿入のないシリアンハムスターのＣ．ディフィシル感染モデルを使用して、経口胃管栄養レジメン後のＣ．ディフィシル感染の処置における７種類のＭＵ１１４０バリアントの効能を評価した。回復期の後、雄のゴールデンシリアンハムスターに、クロストリジウム・ディフィシルＵＮＴ１０３−１［ＶＡ１１、非流行性（ｃｄｔＢ−、ＲＥＡグループＪ）  Ｃｕｒｔｉｓ  Ｄｏｎｓｋｅｙ、クリーブランドＶＡ病院、クリーブランド、オハイオ州］を接種した。１日目、感染の２４時間後に、全ての動物は、クリンダマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）の単回皮下注射を受けた。被験物質製剤を１日３回（ＴＩＤ）、２日目にクリンダマイシン注射の１８時間後に開始して５連続日の間（２日目から６日目）投与し、その後２２日目まで再発を評価した。バンコマイシン（陽性対照）を、２日目から６日目に１日１回、２０ｍｇ／ｋｇで投与した。盲腸の胞子数ならびに毒素ＡおよびＢを、上に記載されたように決定した。
【０１８１】
第２のカニューレ挿入のないシリアンハムスターＣ．ディフィシル感染モデルを使用して、経口胃管栄養レジメン後のＣ．ディフィシル感染の処置における２種類のＭＵ１１４０バリアントの最適な治療レジメンをさらに突き詰めて規定した。回復期の後、雄のゴールデンシリアンハムスターに、クロストリジウム・ディフィシルＵＮＴ１０３−１［ＶＡ１１、非流行性（ｃｄｔＢ−、ＲＥＡグループＪ）Ｃｕｒｔｉｓ  Ｄｏｎｓｋｅｙ、クリーブランドＶＡ病院、クリーブランド、オハイオ州］を接種した。１日目、感染の２４時間後に、全ての動物は、クリンダマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）の単回皮下注射を受けた。３通りから５通りの異なる用量の被験物質製剤を、１日３回（ＴＩＤ）、２日目にクリンダマイシン注射の１８時間後に開始して５連続日の間（２日目から６日目）投与し、その後２２日目まで再発を評価した。バンコマイシン（陽性対照）を、２日目から６日目に１日１回、２０ｍｇ／ｋｇで投与した。盲腸の胞子数ならびに毒素ＡおよびＢを、上に記載されたように決定した。
【０１８２】
結果
バリアントを、嫌気性グラム陽性病原体であるＣ．ディフィシルに対する特異的な抗微生物活性について、重量／体積に基づき試験した（表９）。３種類の個々のＣ．ディフィシル株を検討し、Ｃ．ディフィシルに対するＭＵ１１４０バリアントの活性のスペクトルを評価した。Ｍ．ルテウスに対する非正規化培養上清中に抗微生物活性の向上が観察されたものの、正規化されたアッセイでは、バリアントは、ＭＵ１１４０に比べて、Ｃ．ディフィシルに対する抗微生物活性の向上を示さなかった。しかし、供試したバリアントは、Ｃ．ディフィシル感染に対するケアの現在の標準であるバンコマイシンよりも優れた、特異的な抗微生物活性を示した。
【０１８３】
続いて、複数部位バリアントを、Ｃ．ディフィシルＭＩＣアッセイにおいて、特異的な抗微生物活性について試験した（表１０）［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ−ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＣＬＳＩ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｍ１１−Ａ８（ＩＳＢＮ  １−５６２３８−７９０−１）．Ｖｏｌ．３２  Ｎｏ．５．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＵＳＡ，２０１２］。
【表１５】
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【表１６】
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【０１８４】
単一部位バリアントを、グラム陽性の宿主および抗酸性微生物に対する特異的な抗微生物活性について（表１１）、重量／体積に基づき試験した。３種類の個々のエンテロコッカス株を検討し、ＶＲＥ、５種類の、Ｓ．アウレウスの株、Ｓ．ニューモニエ、および抗酸性株Ｍ．フレイに対するＭＵ１１４０バリアントの活性のスペクトルを評価した。供試したバリアントがＭＵ１１４０とは大幅な差を示さなかった一方で、多くが対照よりも感受性が低かったとはいえ、全てが、供試した範囲（≦６４μｇ／ｍＬ）で、供試した全ての生物に対し特異的な抗微生物活性を示した。
【０１８５】
複数部位バリアントを、グラム陽性微生物の宿主に対する特異的な抗微生物活性について、重量／体積に基づき試験した（表１２）。個々のエンテロコッカス株を検討して、ＶＲＥに対するＭＵ１１４０バリアントの活性のスペクトルを評価し、Ｃ．シンデンス、Ｂ．ブレーベ、Ｌ．アシドフィルス、Ｐ．アナエロビウス、Ｅ．レンタの株も評価した。複数部位バリアントは、その多くが対照よりも感受性が低かったとはいえ、供試した生物の殆どに対してＭＩＣを示した。少数の複数部位バリアントが、供試したいくつかのＶＲＥ株に対し何の活性も示さなかった。
【表１７】
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【表１８】
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【０１８６】
単一部位バリアントを、Ｐ．エルギノーザ（グラム陰性微生物）に対する特異的な抗微生物活性について、重量／体積に基づき試験した（表１３）。全ての単一部位バリアントは、供試した全ての希釈物で成長の阻害を示さず（ＭＩＣ＞６４μｇ／ｍＬ）、グラム陽性生物に対する活性についてのＭＵ１１４０の特異性と一致した。
【０１８７】
複数部位バリアントを、Ｈ．ピロリ（グラム陰性微生物）に対する特異的な抗微生物活性について、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ（膜増感剤）の存在または不在下、重量／体積に基づき試験した（表１４）。成長の阻害が、いくつかのバリアントについて観察されたが、テトラサイクリン対照よりも大幅に高いレベルにおいてであった。０．０５Ｍ  ＥＤＴＡの添加は、全てではないがいくつかのバリアントのＭＩＣ値に、顕著な正の効果を及ぼした。
【表１９】
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【表２０】
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【０１８８】
ＭＵ１１４０バリアントを擬似腸液アッセイにて試験し、パンクレアチン、トリプシン、およびキモトリプシンの存在下でのバリアントの安定性を決定した（表１５）。５３．２分から７２．４分の半減期がＭＵ１１４０に観察された一方で、１位の置換（推定ペプシン切断部位）によって、バリアントＦ１ＩおよびＦ１Ｌの半減期がそれぞれ９５分および７７．３分に延長された。推定トリプシン切断部位である１３位の変異によって、バリアントＲ１３Ｎの半減期が＞２４０分に延長された。推定キモトリプシン部位である２０位の変異によって、バリアントＹ２０Ｆの半減期が１４８分に延長された。しかし、１８位のＮ１８Ａへの変異によって、分子がタンパク質消化性分解に対し感受性となり、半減期が２４分に短縮された。
【表２１】
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【０１８９】
次に、独立した変異が、相加的な様式でバリアントの安定性を増加させるという仮説を試験した。パンクレアチン、トリプシン、およびキモトリプシンを含有する擬似腸液中で、複数部位バリアントを試験し、複数部位バリアントの半減期が残存性の向上を示すか否かを決定した（表１６）。供試した１５種類の複数部位バリアントのうち１０種類が、７２０分を超える半減期を示したのに対し、複数部位バリアントと同じ条件を用いて精製されたＳＭ２５３参照標準および陽性対照Ｆ１Ｉでは、４８分および５８分の半減期が観察された。単一部位バリアントＳＭ２５３に比べて複数部位バリアントの安定性が向上したことは、ランチビオティックが広範囲の翻訳後修飾を持つにも関わらず、生来のＭＵ１１４０の推定プロテアーゼ切断部位が、生理条件下でプロテアーゼ媒介性切断に感受性であることを示す。
【表２２】
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【０１９０】
次に、ランチビオティックは（ｃ末端アミノ酸を欠くために）ペプシンを含む胃液中で分解されず、鍵となる独立した変異はこの安定性に影響を及ぼさなかった、という仮説を試験した。ＦａＳＳＩＦ中で安定性の向上を示し、かつＦＩ１（ＳＭ２５３）以上のＭＩＣを有していた複数部位バリアントを、ペプシンを含有する擬似胃液（ｐＨ１．５）中で試験し、複数部位バリアントの半減期が分解において差を示すか否かを決定した（表１７）。供試した８種類のバリアント全てが、Ｆ１Ｉに匹敵する１４４０分（２４時間）を超える半減期を示した。複数部位バリアントの安定性が延長したということは、性能の向上をもたらすペプチド内の変異が、胃上部での移行中の安定性の低減に繋がらないことを示す。
【表２３】
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【０１９１】
Ｃ．ディフィシルのカニューレ挿入されたシリアンハムスターモデルを用いて、６種類のバリアントをｉｎ  ｖｉｖｏで検討し、ケアの現在の臨床標準であるバンコマイシン（Ｓｕｒａｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１０８（４）：４７８−９８，２０１３）に比べて、Ｃ．ディフィシルの処置における効能の向上を観察することができるか否かを決定した。Ｃ．ディフィシルを感染させて媒体、バンコマイシン、またはＭＵ１１４０バリアントで処置したハムスターについての生存結果を、表１８に提示する。２１日目の試験の終了まで、バリアントＦ１Ｉ、Ｒ１３Ｎ、およびＹ２０Ｆは、バンコマイシンを超える優位性を示し、それは、バンコマイシン対照に３３％の生存率が観察されたのに対して、バリアントを処置したハムスターに最大１００％の生存率が観察された通りであった。試験終了時の動物中の胞子数および毒素レベルは、臨床生存像に一致した。
【表２４】
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【０１９２】
Ｃ．ディフィシルのシリアンハムスターモデルを用いて、８種類のバリアントをｉｎ  ｖｉｖｏで検討し、このモデルでは、上記ペプチドを経口胃管栄養により送達し、ケアの現在の臨床標準であるバンコマイシンに比べて、Ｃ．ディフィシルの処置における効能の向上を観察することができるか否かを決定した。Ｃ．ディフィシルを感染させて媒体、バンコマイシン、またはＭＵ１１４０バリアントで処置したハムスターについての生存結果を、表１９に提示する。２１日目の試験の終了まで、バリアントＦ１Ｖ  Ｒ１３ＮおよびＦ１Ｉ  Ｒ１３Ｎ  Ｙ２０Ｆは、バンコマイシン処置された動物に比べて、等価または優位な効能を示した。試験終了時の動物中の胞子数および毒素レベルは、臨床生存像に一致した。
【表２５】
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【０１９３】
Ｃ．ディフィシルのシリアンハムスターモデルを用いて、２種類の選択したバリアントをｉｎ  ｖｉｖｏで検討し、このモデルでは、上記ペプチドを経口胃管栄養により送達し、上述の用量レジメンに従って、ケアの現在の臨床標準であるバンコマイシンに比べてＣ．ディフィシルの処置における効能の向上を観察することができるか否かを決定した。Ｃ．ディフィシルを感染させて媒体、バンコマイシン、またはＭＵ１１４０バリアントで処置したハムスターについての生存結果を、表２０に提示する。２１日目の試験の終了まで、バリアントＦ１Ｖ  Ｒ１３Ｎは、同じ用量でバンコマイシン処置された動物に比べて優位な効能を示し、用量依存的な応答を辿った。試験終了時の動物中の胞子数および毒素レベルは、臨床生存像に一致した。
【表２６】
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【０１９４】
実施例５
複数アミノ酸置換
単アミノ酸置換を含むバリアントの生産の追跡試験として、３０５種類のバリアントを設計し、２２アミノ酸の成熟ペプチド配列のうち１位、２位、４位、５位、６位、７位、１２位、１３位、１５位、および２０位で、バリアント当たり最大８個のアミノ酸置換を組み合わせた。ｍｕｔＡ遺伝子座のコロニーＰＣＲおよびＤＮＡ配列確定により確認したところ、２７０種類のバリアント株を造成することに成功した。ベクター構築および形質転換でのいくつかの試みが実行されたにも関わらず、我々は、株の構築が技術的な理由によりできなかったのか、または生物学的な理由（そのバリアントが宿主にとって毒性であった）によりできなかったのかを決定できていない。
【０１９５】
バリアント生産株を、抗微生物活性の向上について、Ｓ．ミュータンス株の一晩成長物から得られた非正規化培養上清を使用したＭ．ルテウス透明域アッセイを用いて評価した。より大きな透明域が、より高い特異性の抗微生物活性を持つバリアントの生産に起因するのか、または、より高い力価が、より大きな透明域に関与するのかは、知られていない。透明域に一致した生産が、ＪＨ１１４０およびＳＭ２５３の両方のＳ．ミュータンス株に、ウェル間およびプレート間で観察された。Ｆ１Ｎ、Ｆ１Ｐ、Ｆ１Ｅ、Ｓ５Ｆ、Ｌ６Ｉ、およびＡ１２Ｔ変異をコードする株は、結果として、低レベルの抗微生物活性かまたは検出レベルを下回る活性かのどちらかを生じる。バリアントライブラリーの大多数が、現在のリード候補物および対照株Ｆ１Ｉ以上の抗微生物活性を示した。
【０１９６】
バリアントの安定性は、胃腸管適用のための好結果をもたらす治療剤としてＭＵ１１４０の開発を成功させるのに不可欠な医薬特性である。生来のＭＵ１１４０は、トリプシン切断部位をＲ１３位に含有するが、尤も、この部位は、効率の良いプロテアーゼ切断から保護されていることがある（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７９（１３），４０１５−２３，２０１３）。Ｆ１およびＲ１３へのアミノ酸置換はそれぞれ、結果として、擬似腸液中で精製ＭＵ１１４０バリアントの半減期の延長をもたらす。
【０１９７】
Ｆ１残基およびＫ２残基の変異は、プロテアーゼｍｕｔＰによるＭＵ１１４０プロペプチドの成熟、ならびにペプシンおよびキモトリプシンによる切断に影響を与えることがある。Ｆ１Ｅ置換およびＦ１Ｐ置換を含有する株は、それぞれＳＭ２５３対照株（Ｆ１Ｉ）を下回る性能を示す。しかし、Ｆ１Ａ置換、Ｆ１Ｇ置換、Ｆ１Ｉ置換、およびＦ１Ｖ置換は、概して、ＳＭ２５３よりも高い活性を産生する。
【０１９８】
１３種類の異なるアミノ酸置換を１３位に作製した。全てが機能的であり、少なくとも一つのバリアントで≧ＳＭ２５３の性能を示した。Ｒ１３Ａ変異は、透明域＞０．３１９ｃｍ2を生成した高性能のバリアント群では大きな比率を占める。
【０１９９】
アミノ酸置換の概要は、図８に見られ、６つの異なる群に分けられる。
第１群：活性＞ＳＭ２５３対照株（透明域＞０．３１９ｃｍ2）
第２群：２回の反復実験で活性＞ＳＭ２５３（１回の反復実験
第３群：１回の反復で活性＞ＳＭ２５３であり、１回の反復実験で活性≦ＳＭ２５３
第４群：活性＞ＳＭ２５３対照株（透明域＞０．１６７ｃｍ2であるが透明域＜０．３１９ｃｍ2）
第５群：活性≦ＳＭ２５３対照（透明域≦０．１６７ｃｍ2）
第６群：決定せず
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図４−１３】
2019529344.tif 000055
【図４−１４】
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【図４−１５】
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【図４−１６】
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【図４−１７】
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【図４−１８】
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【図４−１９】
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【図４−２０】
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【図４−２１】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図５−１４】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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