(57)【要約】  本発明は、種々の異なる所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞のパネル（即ち細胞ライブラリー）であって、一細胞当たり前記突然変異体の一つのみが単一の遺伝子コピーから発現される、細胞のパネルを作製する方法に関する。また、本発明は、野生型の所期のタンパク質と比較して異なるまたは改変された生物活性を有する、所期のタンパク質の複数の突然変異体を同定するための方法又は細胞ライブラリーにも関する。本発明によれば、同定された所期のタンパク質の複数の突然変異体は、例えばホワイト・バイオテクノロジーに応用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞のパネルを作製する方法であって、各細胞当たり単一の遺伝子コピーから前記所期のタンパク質の複数の突然変異体のうち一つが発現され、前記方法が、
ａ）細胞のゲノムに対して、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内の突然変異誘発標的部位又はその近傍に、二本鎖切断（double-strand break：ＤＳＢ）又は一本鎖ニックを誘導し、ここで前記細胞のゲノムには、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子が、単一のコピーとして含まれており、ここで前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の前記単一のコピーは、前記突然変異誘発標的部位又はその近傍に、不活性化突然変異を含み、
ｂ）好ましくは、工程ａ）の細胞に対して、前記誘導されたＤＳＢ又は一本鎖ニックの相同組換えによる修復のための、複数の異なるドナー核酸テンプレートのライブラリーを提供し、ここで前記ライブラリーの前記複数の異なるドナー核酸テンプレートは、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置に、異なる突然変異を含むと共に、相同標的化修復（homology-directed repair：ＨＤＲ）により、前記不活性化突然変異を除去し、
ｃ）前記不活性化突然変異が除去された細胞を選択及び／又は濃縮し、
ｄ）工程ｃ）で選択された細胞のパネルを、前記所期のタンパク質の複数の異なる突然変異体を発現する細胞のパネルとして提供し、ここで各細胞毎に、前記所期のタンパク質の前記異なる突然変異体のうちの一つが、単一の遺伝子コピーから発現されている
ことを含む方法。
【請求項２】
前記不活性化突然変異が前記所期のタンパク質の発現を妨げる、請求項１の方法。
【請求項３】
前記所期のタンパク質をコードする遺伝子が、前記細胞のゲノム内に、融合遺伝子として含まれており、ここで前記融合遺伝子が、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の下流にマーカー遺伝子を含み、ここで前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内の前記不活性化突然変異が、前記マーカー遺伝子の発現を妨げる、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
前記マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質が蛍光タンパク質である、請求項１〜３の何れか一項の方法。
【請求項５】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、転写アクティベーター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びｍｅｇａＴＡＬエンドヌクレアーゼからなる群より選択され、或いは前記部位特異的ニッカーゼがＣａｓ９ニッカーゼである、請求項１〜４の何れか一項の方法。
【請求項６】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１〜５の何れか一項の方法。
【請求項７】
前記方法が更に、工程ｃ）で選択及び／又は濃縮され、或いはｄ）で提供された細胞に含まれる、前記所期のタンパク質の前記複数の異なる突然変異体をコードする遺伝子の１又は２以上の核酸配列を決定すること、或いは、工程ｃ）で選択及び／又は濃縮され、或いはｄ）で提供された細胞に含まれる、前記所期のタンパク質の前記複数の異なる突然変異体の１又は２以上のアミノ酸配列を決定することを含む、請求項１〜６の何れか一項の方法。
【請求項８】
前記所期のタンパク質が蛍光タンパク質、抗体、酵素、成長因子、サイトカイン、ペプチドホルモン、転写因子、ＲＮＡ結合タンパク質、細胞骨格タンパク質、イオンチャンネル、Ｇタンパク質結合受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、シャペロン、トランスポーター、又は膜貫通タンパク質である、請求項１〜７の何れか一項の方法。
【請求項９】
（ｉ）前記所期のタンパク質が抗体であり、ここで前記突然変異誘発標的部位が、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸配列のＣＤＲコーディング領域内に存在する、或いは、
（ii）前記所期のタンパク質が酵素であり、ここで前記突然変異誘発標的部位が、前記酵素又は前記酵素の制御性サブユニットの活性中心をコードする核酸領域内に存在する、請求項１〜８の何れか一項の方法。
【請求項１０】
前記所期のタンパク質の前記複数の突然変異体前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなり、ここで前記方法が更に、
ｅ）前記の細胞のパネルから、前記第一の活性が改善されてなり、及び／又は、前記新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する第二の細胞のパネルを選択及び／又は濃縮する
ことを含む、請求項１〜９の何れか一項の方法。
【請求項１１】
前記所期のタンパク質の複数の突然変異体前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなり、ここで工程ｃ）が、前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体を選択及び／又は濃縮することを含む、請求項１〜９の何れか一項の方法。
【請求項１２】
野生型の所期のタンパク質と比較して異なる又は改変された活性を有する、前記所期のタンパク質の複数の突然変異体を同定する方法であって、前記方法は、
ａ）請求項１〜９の何れかの結果得られる前記の細胞のパネルから、前記第一の活性が改善されてなり、及び／又は、前記新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する第二の細胞のパネルを選択及び／又は濃縮し、
ｂ）前記第二のパネルにより発現される前記所期のタンパク質の突然変異体のアミノ酸配列を決定し、及び／又は、前記第二のパネルにより発現される前記所期のタンパク質の突然変異体をコードする遺伝子の核酸配列を決定する
ことを含む方法。
【請求項１３】
野生型の所期のタンパク質と比較して異なる又は改変された活性を有する、前記所期のタンパク質の複数の突然変異体を同定する方法であって、
前記方法は、ａ）請求項１〜９の何れかの所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞のパネルを作製する方法を含み、ここで工程ｃ）が、前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体を選択及び／又は濃縮することを含み、且つ、
前記方法は更に、ｂ）前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体の少なくとも１つのアミノ酸配列を決定し、及び／又は、前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体をコードする遺伝子の少なくとも１つの核酸配列を決定することを含む方法。
【請求項１４】
（ｉ）前記所期のタンパク質が抗体であると共に、前記第一の活性及び／又は前記新たな活性が抗原結合性であり、又は、
（ii）前記所期のタンパク質が酵素であると共に、前記第一の活性及び／又は前記新たな活性が前記酵素の酵素活性である、請求項１０〜１３の何れかの方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１４の何れかの方法により得られる細胞ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の異なる所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞のパネル（即ち細胞ライブラリー）であって、各細胞が前記複数の突然変異体のうち１つのみを単一の遺伝子コピーから発現する、細胞のパネルを作製するための方法に関する。また、本発明は、対応する野生型の所期のタンパク質と比較して異なる又は改変された生物活性を有する、所期のタンパク質の複数の突然変異体を同定するための方法又は細胞ライブラリーにも関する。本発明によれば、同定された所期のタンパク質の複数の突然変異体は、例えばホワイト・バイオテクノロジーに応用可能である。
【背景技術】
【０００２】
ホワイト・バイオテクノロジー（即ち工業生産に適用されるバイオテクノロジー）は、持続可能な開発のために極めて有望である。ホワイト・バイオテクノロジーでは、生存細胞及び酵素を用いて、分解されやすく、従来品と比較して製造時に必要なエネルギーがより少なく、発生する廃棄物がより少ない製品を合成する。例えば、幾つかの酵素は食品製造において、また、人工界面活性剤の量を減らすために粉末洗剤の活性成分として、広く使用されている。また、洗浄剤での使用のために、脂肪を分解する酵素が設計されている。更に、抗体やヒトインシュリン等の医薬品を大規模発酵槽で製造するためにトランスジェニック微生物が使用されている。ホワイト・バイオテクノロジーの利点は多数存在する。即ち、化石資源に依存せず、従来のプロセスやその基質と比較してエネルギー効率に優れ、製品や廃棄物が生物学的に分解可能である等。これらの利点は何れも、その環境影響を低下するのに利する。代替の基質及びエネルギー源を用いることで、ホワイト・バイオテクノロジーは化学、繊維、食品、包装、及びヘルスケア業界に多数の革新をもたらし得る。
【０００３】
ホワイト・バイオテクノロジーにおいて、例えば工業プロセスや医薬において、タンパク質は重要なツールとなっているが、天然型のままで使用されることはめったにない。所与の酵素、抗体、又は他の所期のタンパク質から、有用性に優れた突然変異体を産生するには、多数回の逐次改善が必要となる場合が多い。構造と機能との関係に関する詳細な知識がない状況では、突然変異誘発及びスクリーニングによるタンパク質の多様化が、有用な特性を有するタンパク質を進化させるための最適な選択となっている。
【０００４】
部位特異的及びランダム突然変異誘発法の双方を実施し、ある段階ではしばしば両者を組み合わせて実施するために、広範な技術が用いられている。部位特異的突然変異誘発は、改変ＰＣＲ技術により達成可能であり（QuickChange Kit, Stratagene; Kunkel, 1985, Proc Natl Acad Sci U S A. 82(2): 488-492; Vandeyar, Gene 65(1): 129-133）、所与のタンパク質の機能に関する知識が既に存在する場合には有用である。本手法を用いれば、試験対象の変異体の数を比較的少なく抑えながら、個々のアミノ酸を他の広範なアミノ酸に置換することができる。更に、突然変異誘発のために個々のアミノ酸を選択するには、所期のタンパク質における種々のアミノ酸残基の機能的重要性に関する、極めて正確な知識が必要である。
【０００５】
ランダム突然変異誘発は、機能的部位の候補についての予備知識を要することなく、タンパク質内の配列スペースを探索することを目的とする。斯かる技術は、例えば化学的又は物理的突然変異誘発や、エラー許容性（error-prone）ＰＣＲ法など多数存在する。化学的又は物理的突然変異誘発では、ＤＮＡ修飾性物質又はＵＶ光を用いて（Bridges, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4193-4197）ＤＮＡに損傷を与える。斯かるエラーが修復される際に、異なるヌクレオチドが導入される結果、コードされるタンパク質にアミノ酸置換が生じることになる。この目的に使用される物質としては、メタンスルホン酸エチル等のアルキル化化合物（Lai, 2004, Biotechnol. Bioeng. 86: 622-627）、亜硝酸等の脱アミノ化物質（Myers, 1985, Science 229: 242-247）、２−アミノプリン等の塩基類似体（Freese, 1959, J. Mol. Biol. 1: 87-105）等が挙げられる。これらの化学的又は物理的突然変異誘発技術の欠点は、所期の遺伝子のみならず、細胞全体及びゲノム内の全ての遺伝子に影響を与えてしまう点である。従って、毒性及び改変された細胞の恒常性は、スクリーニング結果に深刻な影響を与える。更に、これらの技術は突然変異時のバイアス性が強く、特定のヌクレオチドに対して突然変異を生じやすい強い選好性がある（Myers, 1985, 1985, Science 229: 242-247; Lai, 2004, Biotechnol. Bioeng. 86: 622-627）。従って、これらの技術は主に、遺伝子の不活性化による研究に使用される。
【０００６】
現在好ましい遺伝子多様化のための方法は、エラー許容性（error-prone）ＰＣＲの変法である（Leung, 1989, Technique 1: 11-15）。この方法では、所期の遺伝子がポリメラーゼによりインビトロ（in vitro）で複製され、その際に種々の手段で誤りが導入される。ＰＣＲの各周回毎に誤りが蓄積される。この技術は所期の遺伝子の配列スペースをサンプリングするのに有用である。しかし、この突然変異誘発は、可能な全てのアミノ酸をコードするようにコドンを多様化させることができず、この方法では突然変異にバイアスが生じてしまう。その理由は、多くのアミノ酸の変換には、各コドン当たり最大３つのヌクレオチド置換が必要なのに対し、エラーＰＣＲでは多くの場合、１コドン当たりせいぜい１つのヌクレオチドしか変換されないからである。結果として、最初のコドンによっては、アミノ酸は通常３〜７種の他のアミノ酸にしか変換されず、所与の位置における可能なアミノ酸の殆どの機能は探索されないまま終わってしまう（Wong, 2006, Journal of Molecular Biology, 355(4): 858-871）。更に、ある遺伝子内の隣接する複数のアミノ酸残基や、ある短い領域の残基群を突然変異させるのは困難である。従って、隣接する（close-by）複数の突然変異間の相乗効果やエピスタシス相互作用をサンプルすることはできない。この方法の他の欠点は、操作がインビトロ（in vitro）で行われるため、所望の表現型をスクリーニングするには、多様化されたライブラリーを所期の細胞又は生物に導入しなければならないという点である。ライブラリーの増殖及びスクリーニングのための大腸菌（Escherichia coli）への形質転換は効率的に実施可能であるが、このアプローチを哺乳類細胞に用いるには多くの課題がある。その主たる課題は、１のライブラリーの単一種の複数の変異体（即ち単一種の複数の突然変異体）を、１つの所与の細胞内で発現させて、その機能を明確に評価する必要がある点に存する。残念ながら、哺乳類細胞のための主なトランスフェクション法である、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションやリポソーム媒介性トランスフェクションを用いると、大量のＤＮＡコンストラクトが単一の細胞へと共トランスフェクションされることになる。この側面は研究用途では利点となる場合が多いが、ライブラリーの個々の突然変異体をスクリーニングし、機能的に評価する際には、重大な課題を生じることになる。ウイルストランスフェクションは、１の変異体の多重感染を超えないようにウイルス粒子を調節することが可能であり、斯かる共トランスフェクションの課題を克服するのに原則として有用である。しかし、多様化された遺伝子ライブラリーをレンチウイルス産生用プラスミド等の大型ウイルスシャトルプラスミドにクローニングするのは非常に時間がかかる上に、極めて非効率であることが知られている。斯かる非効率性ゆえに、産生されたライブラリーの豊富度は大きく損なわれてしまう。更に、感染した細胞による外来遺伝子の発現レベルには大きなばらつきがあるため、突然変異されたタンパク質の機能活性が埋もれてしまうことになる。
【０００７】
従って、現在のところ、標的化されたタンパク質の多様化は非効率である。特に、所定の位置に異なるアミノ酸残基を有する所期のタンパク質の複数の異なる変異体を産生する細胞ライブラリーの作製には、時間が斯かる上に労力も必要である。特に、ここで所期のタンパク質の変異体が一細胞当たり１種のみ発現される細胞ライブラリーを得る場合には、必要な労力及び資源は更に増加することになる。しかし、斯かるライブラリーは、有益な特性を有するタンパク質変異体の迅速かつ網羅的なスクリーニングを可能とすることから、非常に大きな利点を有する。
【０００８】
従って、本発明の基となる技術的課題は、タンパク質の多様化のための改善された方法を提供することである。特に、本発明の目的は、タンパク質の複数の異なる変異体を産生する細胞のパネル（即ち細胞のライブラリー）であって、タンパク質の変異体が一細胞当たり１種のみ発現された細胞のパネルを、効率的に作製する手段及び方法を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記の技術的課題は、本開示にて提供され、添付の特許請求の範囲にて特定されるような態様の提供により解決される。
【００１０】
従って、本発明は、タンパク質ライブラリーを作製する方法、特に、所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞のパネルを作製する方法であって、各細胞当たり単一の遺伝子コピーから前記所期のタンパク質の複数の突然変異体のうち一つが発現されると共に、以下の工程を含む方法に関する。
ａ）細胞のゲノムに対して、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内の突然変異誘発標的部位又はその近傍に、二本鎖切断（double-strand break：ＤＳＢ）又は一本鎖ニックを誘導する。ここで前記細胞のゲノムには、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子が、単一のコピーとして含まれており、ここで前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の前記単一のコピーは、前記突然変異誘発標的部位又はその近傍に、不活性化突然変異を含む。
ｂ）好ましくは、（工程ａ）の）細胞に対して、前記誘導されたＤＳＢ又は一本鎖ニックの相同組換えによる修復のための、複数の異なるドナー核酸テンプレートのライブラリーを提供する。ここで前記ライブラリーの前記複数の異なるドナー核酸テンプレートは、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置に、異なる突然変異を含み、相同標的化修復（homology directed repair：ＨＤＲ）、特に相同組換えにより、前記不活性化突然変異を除去する。
ｃ）前記不活性化突然変異が除去された細胞を選択及び／又は濃縮する。
ｄ）工程ｃ）で選択された細胞のパネルを、前記所期のタンパク質の複数の異なる突然変異体を発現する細胞のパネルとして提供する。ここで各細胞毎に、前記所期のタンパク質の前記異なる突然変異体のうちの一つが、単一の遺伝子コピーから発現される。
【００１１】
ゲノムＤＮＡ内にＤＳＢ又は一本鎖ニックが存在することで、非相同末端連結（non-homologous end joining：ＮＨＥＪ）等の細胞内修復機構が引き起こされる。従って、工程ｂ）の他でも、本発明の方法によって、所望のタンパク質の複数の異なる変異体が得られ得る。実際に、ＮＨＥＪによる修復では、多種のランダムな欠失や挿入が導入され、ひいては所期のタンパク質の多様化が達成される。従って、本発明の一側面は、所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞のパネルを作製する方法であって、各細胞当たり単一の遺伝子コピーから前記所期のタンパク質の複数の突然変異体のうち一つが発現されると共に、以下の工程を含む方法に関する。
ｉ）細胞のゲノムに対して、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内の突然変異誘発標的部位又はその近傍に、二本鎖切断（double-strand break：ＤＳＢ）又は一本鎖ニックを誘導する。ここで前記細胞のゲノムには、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子が、単一のコピーとして含まれており、ここで前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の前記単一のコピーは、前記突然変異誘発標的部位又はその近傍に、不活性化突然変異を含む。
（ii）前記不活性化突然変異が除去された細胞を、細胞ＤＮＡ修復プロセスにより選択及び／又は濃縮する。
iii）工程ｃ）で選択された細胞のパネルを、前記所期のタンパク質の複数の異なる突然変異体を発現する細胞のパネルとして提供する。ここで各細胞毎に、前記所期のタンパク質の前記異なる突然変異体のうちの一つが、単一の遺伝子コピーから発現される。
【００１２】
本発明の方法の工程ａ）に関して以下に提供される全ての記載及び定義が、上記の工程ｉ）にも準用される。更に、本発明の方法の工程ｃ）に関して以下に提供される全ての記載及び定義が、上記の工程ii）にも準用される。これに伴い、本発明の方法の工程ｄ）に関して以下に提供される全ての記載及び定義が、上記の工程iii）にも準用される。
【００１３】
しかし、以下においてより詳細に説明するように、ＤＳＢ又は一本鎖ニックが相同標的化修復（ＨＤＲ）によって修復されれば、所望のタンパク質の多様化の程度を顕著に同化させることができる。従って、本発明の方法は、好ましくは工程ｂ）を含むと共に、ここでＨＤＲ修復がドナー核酸テンプレートによって誘導される。
【００１４】
従って、本発明は、製造方法（即ち、所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞のパネルを作製する方法）に関する。この方法では、突然変異誘発標的部位の近傍にＤＳＢ又は一本鎖ニック（好ましくはＤＳＢ）が誘導される（即ち導入される）。このＤＳＢ又は一本鎖ニックは、好ましくは相同標的化修復（ＨＤＲ）、特に相同組換えにより修復される。工程（ｂ）において複数の異なる核酸テンプレートを使用することで、前記所期のタンパク質の幾つかの異なる突然変異体を、一の工程で生成することが可能となり有利である。更に、所期のタンパク質が首尾よく改変された（特に突然変異された）細胞を容易に選択することができる。なぜなら、所望の突然変異の（好ましくはＨＤＲによる）導入の際に、所期のタンパク質内の不活性化突然変異（例えばフレームシフト突然変異）が除去されるからである。従って、所期のタンパク質の突然変異が首尾よく生じた細胞のみが、活性な所期のタンパク質を発現することになり、惹いては容易に選択する（又は濃縮する）ことが可能となる。このタンパク質ライブラリー生成方法を用いることで、複数の異なる細胞、例えば哺乳類細胞内で発現される、所期のタンパク質の幾つかの変異体を調製することが可能となる。従って、本開示にて提供される方法によれば、各々異なる所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞を含む細胞のパネル（即ち細胞ライブラリー）が調製される。特に、本開示にて提供される生成方法によれば、一細胞当たり単一の所期のタンパク質の突然変異体が発現される、細胞（例えば哺乳類細胞）のパネルが提供される。斯かる細胞のパネルは、特性が改善された所期のタンパク質の複数の突然変異体を選択及び／又は同定する有用なツールである。例えば、得られた細胞のパネルは、所期のタンパク質を単一のコピーから、及び任意により同一のプロモーターから発現する細胞との比較により、表現型分析等の下流分析のために使用される。従って、本発明は、タンパク質の多様化のための効率的且つ費用効率に優れた方法を提供する。このアプローチの容易さ、効率性、細胞コンテクスト性、及び突然変異の偏好性の不在は、タンパク質工学を促進する点で有利である。
【００１５】
更に、本発明の製造方法では、標的化された一本鎖ニック又はＤＳＢと、対応するその（好ましくはＨＤＲによる）修復との組合せによって、所期のタンパク質の多様性が、所望の程度のバイアスを以て導入される。これによって、生存細胞のコンテクストで所与のタンパク質内における一連のアミノ酸群の影響を連続的にスキャンするという、従来にない機会が提供されることになる。従って、本開示にて提供される手段及び方法によれば、特性が改善された新たなタンパク質変異体の同定が促進され、これによってホワイト・バイオテクノロジーによるアプローチの適用可能性が顕著に拡大される可能性がある。例えば、本開示にて提供される手段及び方法は、工業生産に使用できる新たな酵素変異体や、疾患の治療及び／又は予防に使用できる新たな抗体変異体の同定に繋がるかも知れない。以下に記載するように、本開示にて提供される手段及び方法によれば、成長因子の新規な変異体も得られる可能性がある。
【００１６】
本発明の製造方法の使用により、既存の技術を超える多数の利点が提供される。例えば、本発明の製造方法を用いることにより、単回のトランスフェクションにて、所期のタンパク質を迅速に多様化させることが可能となる。更に、得られた細胞のパネル内では、各細胞が単一のタンパク質変異体を含むので、選択されたタンパク質変異体の更なる分析及び処理が容易である。更に、トランスフェクトされた（例えばＣＲＩＳＰＲ）プラスミドが希釈により除外されると、得られた細胞はタンパク質変異体を安定に発現する。更に、突然変異誘発時に除去される不活性化突然変異を使用することにより、多様化を受けたタンパク質を発現する細胞を容易に同定して、親（即ち野生型）タンパク質を発現する細胞から分離することができる。また、本発明の製造方法は、導入される突然変異の性質の点でも、極めて大きな柔軟性を有する。例えば、少なくとも最大１２個のクラスター化されたアミノ酸残基の列に対して、並行に飽和突然変異誘発を行うことが可能である。更に、本開示にて提供される製造方法は、実質的に突然変異のバイアスがなく、全ての可能な変異体を生成することができる。しかし、所望の場合には、ドナー核酸テンプレートの相同性の設計により、潜在的なバイアスを導入することも可能である。しかし、本開示にて提供される製造方法は、前記細胞のゲノム内に不所望の突然変異が生成されることがなく、極めて特異性が高い。例えば、所期のタンパク質内の重要な残基は変化せず維持される一方で、その周辺の残基は改変されるように、ドナー核酸テンプレートを容易に設計することが可能である。更に、本開示にて提供される製造方法を用いることで、生存細胞内で首尾よく発現される突然変異体を、直接選択（及び／又は濃縮）することが可能である。更に、本開示にて提供される製造方法に使用される試薬は、何れも費用効率に優れている。
【００１７】
本開示にて提供される製造方法の更なる利点としては、これにより得られる細胞のパネルに含まれる細胞が各々、所期のタンパク質の変異体をコードする遺伝子の単一のコピー（即ち一のアレル）のみを担持するという点が挙げられる。（従来技術の方法の場合のように）第二のコピーが存在すると、得られる細胞は、所期のタンパク質の２種以上の突然変異体を発現することになる。これは下流分析に顕著な影響を及ぼす。従って、単一の遺伝子コピーを用いることで、得られる細胞のパネルには確実に、所期のタンパク質の単一の突然変異体のみを発現する細胞のみが含まれることになり、有利である。
【００１８】
従って、本発明によれば、有利なことに、哺乳類細胞を用いた場合でも、一細胞当たり単一の変異体が発現された、極めて豊富に多様化されたタンパク質ライブラリーを、簡便且つ迅速に生成することが可能である。斯かる多様化は、好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系及びＨＤＲ（特に相同組換え）を用いて達成される。本発明の製造方法は、例えば以下のように実現される。リーディングフレームシフト等の不活性化突然変異を、所期のタンパク質内の突然変異誘発の標的部位に、或いはその近傍に導入すればよい。この目的のためには、所期のタンパク質を単一のコピー数で、細胞内に、例えば哺乳類細胞内に、安定に形質転換すればよい。その後、例えばＤＳＢ又は一本鎖ニック（好ましくはＤＳＢ）を、突然変異誘発標的部位の近傍に、例えばＣＲＩＳＰＲ系を用いて導入すればよい。前記の一本鎖ニック又はＤＳＢは、細胞修復機構により、好ましくは細胞ＨＤＲ系を用いることにより修復すればよい。ＨＤＲを誘発するために特別に設計された、修復テンプレートとして機能するオリゴヌクレオチド（即ちドナー核酸テンプレート）は、２つの相同性アーム及び所望の多様化配列を含む。ＨＤＲによれば、有利なことに、所望の多様化が挿入されると共に、不活性化突然変異が除去され、例えばリーディングフレームが再生される。
【００１９】
例えば、本開示にて提供される製造方法によれば、前記所期のタンパク質の突然変異体として、直接的に選択可能な（即ち陽性選択可能な）突然変異体を調製することができる。直接選択可能なタンパク質の例としては、蛍光タンパク質が挙げられる。所期のタンパク質を直接選択することができれば、例えば蛍光が増加した突然変異体を選択（及び／又は濃縮）することにより、特性が改善された突然変異体を容易に選択（及び／又は濃縮）することができる。直接選択できないタンパク質（例えば非蛍光タンパク質）を加工する場合には、所期のタンパク質の下流側（即ちＣ末端側）にインフレームで、蛍光タンパク質をタグ化すればよい。この場合、ＨＤＲ又はＮＨＥＪ（好ましくはＨＤＲ）により前記不活性化突然変異（例えばフレームシフト突然変異）を除去することによっても、蛍光タンパク質の発現を再生することができ、惹いては多様化されたタンパク質変異体の全てを蛍光選別法により収穫（即ち選択及び／又は濃縮）することが可能となる。
【００２０】
上述したように、本発明の製造方法によれば、所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞のパネルを生成することが可能となる。具体的に、各細胞が単一の遺伝子コピーから個別の突然変異体を発現する、細胞のパネルを生成することが可能となる。即ち、前記細胞のパネルに含まれる細胞は各々、異なる所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する。
【００２１】
本発明の一側面によれば、本開示にて提供される製造方法は更に、工程ａ）に使用される細胞を生成する工程を含む。本開示にて提供される製造方法では、所期のタンパク質をコードする遺伝子（即ち所期の遺伝子）の単一のコピーは、内因性遺伝子のコピーであってもよい。しかし、本開示にて提供される製造方法では、所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーは、外因性遺伝子のコピーである（即ち、使用される細胞内に天然では存在しない）ことが好ましい。もし、本開示にて提供される製造方法において、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーが外因性である場合、工程ａ）の細胞の生成は、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーを、細胞のゲノム内に導入することを含む。所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一の外因性のコピーをゲノム内に導入する方法は、本技術分野で周知であり、例えば部位特異的相同組換え系が挙げられる。例えば、所期の遺伝子の単一のコピーの細胞への組み込みは、標準的な抗生物質による選択、Ｆｌｐ−Ｉｎ又はＪｕｍｐ−ｉｎ組換え、レンチウイルスによるトランスフェクション及び選択、或いは、Ｃａｓ９標的化切断と、例えばＡＡＶＳ１遺伝子座等の相同性ドメインを用いた組換えとにより達成することができる。
【００２２】
本発明の一側面によれば、工程ａ）に使用される細胞の生成は、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピー内に、前記の不活性化突然変異を導入することを含む。前記の不活性化突然変異は、例えばフレームシフト突然変異であってもよい。斯かるフレームシフト突然変異は、例えば、前記所期の遺伝子のコーディングリーディングフレーム内で、１、２、３又は４塩基の付加又は除去を行うことにより導入できる。即ち、斯かるフレームシフトは、フレームシフトを生じさせるのに必要な欠失よりも大きな欠失により、例えば幾つかのアミノ酸をコードするヌクレオチドの欠失により生じさせてもよい。このように、より大きな領域を欠失させると、修復テンプレートに対する相同性が増加し、惹いては組換え効率が向上しうるため、有利な場合がある。例えば、より大きな欠失（例えば標的化された全アミノ酸をコードするヌクレオチドプラス１〜２塩基の除去）によりフレームシフトを生じさせて所期の遺伝子を不活性化すると、ＤＳＢの誘導直後に、染色体の自由端にドナー核酸テンプレートとの直接の相同部位を共有させることができる。相同組換え反応を損ないうる中間的な原ＤＮＡも生じない。しかし、選択（又は導入）されたＰＡＭ部位の下流の４塩基を除去してフレームシフトを作成することにより、１アミノ酸を除去してフレームシフトを生じさせることもできる。前記所期のタンパク質をコードする単一の遺伝子が外因性である場合、前記不活性化突然変異の導入は、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一コピーの細胞ゲノムへの導入前に行ってもよく、当該導入後に行ってもよい。原則として、本技術分野で公知の任意の突然変異誘発方法を用いて、前記所期の遺伝子を細胞内に組み込む前に、当該遺伝子内に不活性化突然変異を導入することができる。斯かる突然変異誘発方法の非限定的な例としては、標的化された制限酵素消化及び連結や、ＰＣＲを用いた部位特異的突然変異誘発方法が挙げられる（Quick Change Kit, Stratagene; Kunkel, 1985, Proc Natl Acad Sci U S A. 82(2): 488-492）。本発明では、（不活性化突然変異を有さない）所期の遺伝子のコピーを細胞ゲノム内に導入した後で、不活性化突然変異を導入してもよい。これは本技術分野で公知の遺伝子工学的手法により達成することができる。斯かる遺伝子工学的手法としては、例えばフレームシフトを含む適切なドナー核酸テンプレートを用いた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子編集が挙げられる。斯かる方法は本技術分野で周知であり、例えばRan, 2013, Nature Protocols 8 (11): 2281-2308等に記載されている。
【００２３】
前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーが内因性である場合、工程ａ）に使用される細胞の生成は、例えば前記細胞のゲノム内の所期のタンパク質をコードする遺伝子内に、部位特異的相同組換え系を用いて、不活性化突然変異を導入することを含んでいてもよい。部位特異的相同組換え系、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、本技術分野で周知であり、例えばRan, 2013, Nature Protocols 8 (11): 2281-2308等に記載されている。
【００２４】
本開示にて提供される製造方法によれば、所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞のパネルであって、各細胞当たり単一の遺伝子コピーから、所期のタンパク質の複数の突然変異体のうち一つが発現される、細胞のパネルが製造される。即ち、本開示にて提供される製造方法の工程ａ）では、所期のタンパク質をコードする遺伝子が、細胞内に単一のコピーとして存在する。従って、工程ａ）の細胞の生成は、所期のタンパク質をコードする遺伝子が一細胞当たり単一コピーのみとなるよう、所期のタンパク質をコードする遺伝子の他のコピーの不活性化（好ましくは欠失）を含んでいてもよい。多くの細胞培養系及び植物では、３つ以上のアレルが存在する。従って、工程ａ）に使用される細胞を生成するには、最終的に単一のコピーとするために、（１つを除く）他の全てのアレルを不活性化（好ましくは欠失）させなければならない。従って、もし所期のタンパク質をコードする遺伝子が、ゲノム内に２コピー以上存在する内因性遺伝子である場合は、工程ａ）の細胞の生成は、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子を一細胞当たり単一コピーとするために、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の内因性コピーの不活性化（好ましくは欠失）を含んでいてもよい。特定の遺伝子のコピー（即ち特定のアレル）の不活性化又は欠失の方法は、本技術分野では周知である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いた遺伝子の一コピーの欠失は、Ran, 2013, Nature Protocols 8 (11): 2281-2308に記載されている。或いは、所期の遺伝子を単一のコピーのみ含む細胞は、例えば国際公開第２０１３／０７９６７０Ａ１号に記載された単数体細胞培養等を用いて得ることができる。
【００２５】
本開示にて提供される方法の工程ａ）は、ＤＳＢ又は一本鎖ニック（好ましくはＤＳＢ）を、細胞のゲノム内に導入することを含む。前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックはそれぞれ、部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼを用いて実施することが好ましい。従って、工程ａ）の細胞の生成は、部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼをコードする核酸配列を細胞内に導入することを含んでいてもよい。更に、工程ａ）の細胞の生成は更に、部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼのための対応する認識部位を、所期の遺伝子の単一のコピー内に含んでいてもよい。
【００２６】
例えば、部位特異的ヌクレアーゼがＣａｓ９又はＣｐｆ１である場合、或いは部位特異的ニッカーゼがＣａｓ９である場合、前記認識配列は開裂部位の直ぐ下流にプロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer-adjacent motif：ＰＡＭ）を含むことが好ましい。種々のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びその変異体のＰＡＭ標的配列（例えばＳｐＣａｓ９の場合は５’−ＮＧＧ、ＳａＣａｓ９の場合は５’−ＮＮＧＲＲＴ、Ｃｐｆ１の場合は５’−ＴＴＮ）は、哺乳類ゲノム内に豊富に存在する。従って、本開示にて提供される方法を用いれば、ＰＡＭ配列を導入しなくとも、殆どの遺伝子を標的化することができる。しかし、所望の開裂部位の直ぐ下流にＰＡＭ配列が存在しない場合には、ＰＡＭ配列（例えばＳｐＣａｓ９の場合は５’−ＮＧＧ、ＳａＣａｓ９の場合は５’−ＮＮＧＲＲＴ、Ｃｐｆ１の場合は５’−ＴＴＮ）を所期のタンパク質内に、所望の開裂部位の下流に導入してもよい。従って、使用される部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼに応じて、もし所期の遺伝子の所望の位置に存在しない場合には、前記部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼによる開裂のための認識部位（例えばＣａｓ９又はＣｐｆ１を使用する場合にはＰＡＭ配列、或いはジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ又はｍｅｇａＴＡＬエンドヌクレアーゼの特異的認識部位）を、所期の遺伝子内に、フレームシフトと共に形成してもよい。
【００２７】
工程ａ）の細胞の生成は更に、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼを、前記認識部位に対して標的化する手段を、細胞内に導入することを含んでいてもよい。例えばガイドＲＮＡ、又は前記ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを、工程ａ）の細胞に導入してもよい。ガイドＲＮＡは、小型合成キメラｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」（single-guide RNA）又はｓｇＲＮＡ）であってもよい。或いは、ガイドＲＮＡは、２つの小型合成ｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡ（「二重ガイドＲＮＡ」（dual guide RNA）又はｄｇＲＮＡ）であってもよい。一部の部位特異的ヌクレアーゼ（例えばＣｐｆ１）の場合、小型合成ｃｒＲＮＡがガイドＲＮＡとして機能しうる。本開示にて提供される方法の一側面によれば、Ｃａｓ９は認識部位に対して、ｓｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡを介して標的化される。Ｃｐｆ１は認識部位に対してｃｒＲＮＡを介して標的化することができる。
【００２８】
従って、工程ａ）の細胞の生成は、細胞に対して外部から、所期のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、単一のコピーとして導入することを含んでいてもよい。例えば、所期のタンパク質をコードするヌクレオチド配列により、細胞を形質転換、トランスフェクト、又は形質導入すればよく、その結果として所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーが発現されることになる。細胞のトランスフェクション、形質転換、又は形質導入のための手段及び方法は、本技術分野では周知であるが、例としてはリポソーム媒介トランスフェクション、Ｃａ２＋−リン酸媒介トランスフェクション、ウイルスベクター媒介送達（例えばGreen, Sambrook, 2012, Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照）。得られた細胞は、所期のタンパク質を安定に発現することが好ましい。上述したように、工程ａ）の細胞の生成は更に、部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼ、或いは、部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードするポリヌクレオチドを、例えばトランスフェクション、形質転換又は形質導入により、細胞内に導入することを含んでいてもよい。更に、工程ａ）の細胞の生成は更に、ガイドＲＮＡ、或いはガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを、例えばトランスフェクション、形質転換又は形質導入により、細胞内に導入することを含んでいてもよい。最後に、工程ａ）の細胞の生成は、認識部位（例えばＰＡＭ配列）を、部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼの所望の開裂部位の下流に導入することを含んでいてもよい。
【００２９】
或いは、工程ａ）では、既に所期のタンパク質を（対応する遺伝子の単一のコピーから）発現する細胞を用いてもよい。斯かる所期のタンパク質は、既に不活性化（例えばフレームシフト）突然変異及び／又は認識部位（例えばＰＡＭ配列）を、所望の開裂部位の下流に含んでいてもよい。前記の細胞は、既に部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼ、或いは前記部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。また、前記の細胞は、既にガイドＲＮＡ、或いは前記ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００３０】
「所期のタンパク質をコードする遺伝子内の突然変異誘発標的部位」（target site for mutagenesis in the gene encoding for the protein of interest）とは、ａ）の細胞内の所期のタンパク質をコードする遺伝子（即ち所期の遺伝子）の単一コピーの核酸配列内における位置であって、前記所期のタンパク質の突然変異体を生成するための多様化／突然変異誘発の対象として想定された位置に対応する位置である。従って、突然変異誘発標的部位は、原則として、突然変異を導入すべき所期の遺伝子のコーディング配列内における、任意の特定の位置とすることができる。例えば、所期のタンパク質内の特定のアミノ酸を突然変異させる場合には、突然変異誘発標的部位は、突然変異させるべきアミノ酸をコードする３つのヌクレオチドからなるトリプレットとすればよい。幾つかのアミノ酸を突然変異させる場合には、突然変異誘発の標的部位は、斯かる複数のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列とすればよい。
【００３１】
誘導されたＤＳＢ又は一本鎖ニックの位置は、所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピー内の所定の突然変異誘発標的部位に（直接）存在するか、又はその近傍に存在する。本開示において「突然変異誘発標的部位の近傍」（close proximity to the target site for mutagenesis）とは、以下の様に定義される。例えば、フレームシフトがアミノ酸の欠失及び／又は導入（例えば欠失）によって導入された場合、ＤＳＢ又は一本鎖ニックは、例えば前記欠失及び／又は導入の上流又は下流１〜１００ｂｐの位置に存在する。
【００３２】
本発明の方法の工程ａ）は、ＤＳＢ又は一本鎖ニック（single-strand nick）（別称一本鎖切断（single-strand break））の誘導（即ち導入）を含み、或いは斯かる誘導からなる。前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックは、「細胞のゲノム内に」導入される。即ち、ＤＳＢ又は一本鎖ニックは、細胞ゲノムＤＮＡ内に誘導される。前記のゲノムＤＮＡは、例えば内因性ゲノムＤＮＡであってもよい。しかし、前記ゲノムＤＮＡは、例えば安定なトランスフェクション、形質転換、又は形質導入により、ゲノムＤＮＡに対して挿入されたプラスミドに由来するものであってもよい。
【００３３】
本技術分野で公知のように、ＤＳＢは、ＤＮＡ二重螺旋の両ＤＮＡ鎖の中断である。ＤＳＢは、平滑断端（即ち両鎖が同一の位置で切断された端）であってもよく、粘着末端（即ち両鎖が異なる位置で切断され、短い一本鎖の相補性配列がＤＳＢの両端に形成された端）であってもよい。本技術分野では一本鎖ニック（single-strand nick）（又は一本鎖切断（single-strand break））としても知られているのは、ＤＮＡ二重螺旋の一方のＤＮＡ鎖のみの中断である。「中断」（interruption）とは、ＤＳＢに関しては、両鎖の２つのヌクレオチド間のホスホジエステル結合の切断を意味し、一本鎖ニックに関しては、二重螺旋の２つの鎖のうち一方のみのホスホジエステル結合の切断を意味する。好ましくは、ＤＳＢは、工程ａ）の細胞のゲノムに誘導（即ち導入）される。
【００３４】
本発明との関連において、前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックは、前記突然変異誘発標的部位から、例えば１２０塩基対未満、好ましくは３０塩基対未満、又は最も好ましくは１０塩基対未満の距離に誘導することができる。同様に、前記不活性化突然変異は、前記突然変異誘発標的部位から１２０塩基対未満、好ましくは３０塩基対未満、又は最も好ましくは１０塩基対未満の距離とすることができる。従って、前記不活性化突然変異（例えばフレームシフト）と前記のＤＳＢ又は一本鎖切断との距離は、例えば０〜１２０塩基対（これは０〜４０アミノ酸に相当する）とすることができる。
【００３５】
前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックは、原則として、部位特異的ＤＳＢ又は部位特異的一本鎖ニックを生成するための本技術分野で公知の任意の方法により達成することができる。ＤＳＢは、部位特異的ヌクレアーゼ（別名「配列特異的ヌクレアーゼ」）により誘導（即ち導入）されることが好ましく、工程ａ）の所期のタンパク質をコードする遺伝子の不活性化された単一のコピーは、前記部位特異的ヌクレアーゼのための対応する認識部位を含むことが好ましい。同様に、一本鎖ニックは、部位特異的ニッカーゼ（別名「配列特異的ニッカーゼ」）により導入されることが好ましく、工程ａ）の所期のタンパク質をコードする遺伝子の不活性化された単一のコピーは、前記部位特異的ニッカーゼのための対応する認識部位を含むことが好ましい。従って、本発明の工程ａ）に使用される細胞は、部位特異的ヌクレアーゼ若しくは部位特異的ニッカーゼ、又は、部位特異的ヌクレアーゼ若しくは部位特異的ニッカーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。本発明の一側面によれば、工程ａ）の細胞のゲノムは、使用される部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼのための更なる認識部位を含んでいなくともよい。これにより、細胞のゲノムＤＮＡに対する更なる修飾を回避できるという利点が得られる。前記の部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼをコードするポリヌクレオチドは、工程ａ）の細胞に含まれるベクター（例えばプラスミドベクター）にコードされていてもよく、或いは、前記細胞のゲノムに安定に組み込まれていてもよい。細胞を（プラスミド）ベクターで一過的に形質転換若しくはトランスフェクトし、又は、ポリヌクレオチドを細胞のゲノム内に安定に組み込む手段及び方法は、本技術分野で公知である。プラスミドの一過性トランスフェクションは、ＤＮＡのリン酸カルシウム沈殿又はリポソーム媒介性トランスフェクションを用いて簡便に達成することができる。斯かる技術を実施するための指針は、Green, Sambrook, 2012, Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Pressにより提供される。リン酸カルシウムトランスフェクションは、例えばKingston, 2003, Curr Protoc Cell Biol. Chapter 20: Unit 20.3に記載されている。ＤＥＡＥ−デキストランを用いたトランスフェクションは、例えばGulick, 2003, Curr Protoc Cell Biol. Chapter 20: Unit 20.4Tに記載されている。電気穿孔法によるトランスフェクションは、例えばPotter, 2011, Curr Protoc Cell Biol. Chapter 20: Unit 20.5に記載されている。陽イオン性脂質試薬を用いた培養真核細胞のトランスフェクションは、例えばHawley-Nelson, 2003, Curr Protoc Cell Biol. Chapter 20: Unit 20.6に記載されている。前記の部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼをコードするポリヌクレオチドは、とりわけ、使用される細胞内で活性な恒常的（即ち恒常的に活性な）プロモーターに作動式に融合されていてもよい。即ち、部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼは、恒常的（即ち恒常的に活性な）プロモーターの制御下で発現されてもよい。本技術分野で公知の恒常的プロモーター系の非限定的な例としては、ＣＭＶ、ユビキチンプロモーター、及びＣＡＧプロモーターが挙げられる。例えば、一側面によれば、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼは、ＣＭＶプ��モーターの制御下で発現される。或いは、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼは、誘導性プロモーターの制御下で発現されてもよい。即ち、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードするポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターに作動式に融合されてもよい。誘導性プロモーター系の非限定的な例は本技術分野で公知であり、例えばＴｅｔオン／オフ系、ヒートショックプロモーター、及び光誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーター系を使用すると、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼの発現が、惹いては、ＤＳＢ又は一本鎖ニックの誘導が、適時に制御できるという利点が得られる。例えば、斯かる誘導可能な系によれば、ＤＳＢ又は一本鎖ニックが導入されるのに十分な時間の経過後に、発現を停止することが可能となる。即ち、発現は、例えば２４〜４８時間経過後に停止されてもよい。誘導性発現系によれば、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼの発現を、所定の時点で開始することも可能となる。これは、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、使用される細胞内で安定に発現される場合に有利である。
【００３６】
好ましくは、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼは、工程ａ）の細胞に含まれるプラスミドから発現される。このプラスミドは、細胞から除去されてもよい。プラスミドの除去は、例えば、プラスミドを希釈除去（diluting out）することにより達成できる。希釈除去（diluting out）とは、トランスフェクトされたヌクレアーゼ／ニッカーゼをコードするプラスミドがエピソーム性であり、哺乳類細胞において増幅されないことにより、その後の細胞分裂周期において、新たに生成された細胞がこれらのプラスミドの全てを徐々に消失することを意味する。しかし、上述したように、工程ａ）の細胞は、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼを安定に発現してもよい。
【００３７】
本発明の方法に使用される部位特異的ヌクレアーゼは、公知の何れの部位特異的ヌクレアーゼであってもよい。具体的に、「部位特異的ヌクレアーゼ」（site-specific nuclease）（又は「配列特異的ヌクレアーゼ」（sequence-specific nuclease））という語は、ＤＮＡ二本鎖にＤＳＢを導入するべく、ＤＮＡ二本鎖の両鎖を所定の標的部位で切断可能な任意の酵素を意味する。同様に、本発明の方法に使用される部位特異的ニッカーゼは、公知の何れの部位特異的ニッカーゼであってもよい。具体的に、「部位特異的ニッカーゼ」（site-specific nickase）（又は「配列特異的ニッカーゼ」（sequence-specific nickase））という語は、ＤＮＡ二本鎖に一本鎖ニックを導入するべく、ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖を所定の標的部位で切断可能な酵素を意味する。
【００３８】
本発明では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（zinc finger nucleases：ＺＦＮ）又は転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（transcription activator-like effector nucleases：ＴＡＬＥＮ）を、それぞれ部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼとして使用してもよい。なぜなら、これらの分子は、従来からＨＤＲ媒介性ゲノム編集に使用されているからである（Li, 2011, Nature 475: 217-221; Bedell, 2012, Nature 491: 114-118; Genovese, 2014, Nature 510: 235-240）。本発明において有用な他の部位特異的ヌクレアーゼとしてはｍｅｇａＴＡＬエンドヌクレアーゼが挙げられる。これは高い標的特異性を有し、オフ−標的開裂を最小化できることから、遺伝子編集に特に適している。例えばBoissel, 2014, Nucleic Acids Res. 42(4): 2591-2601を参照。しかし、クラスター化規則的間隔形成短小回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeat：ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エフェクタータンパク質、例えばＣａｓ９やＣｐｆ１によれば、遥かに簡単で汎用性の高いゲノム編集法が提供される。従って、本発明では、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼがＣａｓ９であるか、部位特異的ヌクレアーゼがＣｐｆ１であることが好ましい。最も好ましくは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（別名「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」）を、本発明の製造方法における部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼとして使用することである。
【００３９】
ＺＦＮはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む。これは各標的遺伝子及びＦｏｋＩヌクレアーゼに合わせて設計すべきである。同様に、ＴＡＬＥＮはＤＮＡ結合ドメインを含む。これは各標的遺伝子及びＦｏｋＩヌクレアーゼに合わせて設計すべきである。ＦｏｋＩヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン又はＤＮＡ結合ドメインと結合すると、所定の標的部位においてＤＮＡに一本鎖ニック又は二本鎖切断を導入する活性を有する。実際に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、所定の標的側のＤＮＡに一本鎖ニックを導入できることから、それぞれジンクフィンガーニッカーゼ（ＺＦニッカーゼ）及び転写アクティベーター様エフェクターニッカーゼ（ＴＡＬＥニッカーゼ）と呼ばれる場合が多い。従って、本発明では上記のように、ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮを部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼとして使用してもよい。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは主にＤＳＢを誘導する。しかし、タンパク質のヌクレアーゼ機能をニック形成機能へと変更した改変Ｃａｓ９ヌクレアーゼも報告されている。換言すれば、二本鎖標的ＤＮＡの両鎖を切断する天然Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、二本鎖の一方のみを切断する（即ちニック形成する）ニッカーゼへと改変することができる。幾つかのＣａｓ９ニッカーゼは本技術分野で公知であり、例えばTsai, 2016, Nature Reviews Genetics 17.5: 300-312に記載されている。部位特異的ニッカーゼを得るためにＣａｓ９タンパク質を修飾する手段及び方法は、本技術分野で周知であるが、例えばヌクレアーゼドメインの一つを不活性にするアミノ酸置換をＣａｓ９に導入することを含む。より具体的には、Cong, 2013, Science, 339: 819-823に示すように、例えば化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９の位置１０のアスパラギン酸をアラニンに置換することができる。
【００４０】
ニック形成機能を有する改変Ｃａｓ９タンパク質を用いることで、ゲノム内に導入されたＤＮＡ損傷が非相同末端連結ではなく、相同組換えにより修復される可能性が高まるという利点がある。従って、本発明の方法では、部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼとしてＣａｓ９を使用してもよい。本開示にて提供される方法では、部位特異的ヌクレアーゼとしてＣｐｆ１を使用してもよい。
【００４１】
Ｆｏｋｌヌクレアーゼのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、本技術分野では周知である。Ｆｏｋｌヌクレアーゼのアミノ酸配列は、本開示では配列番号１９として示される。好ましくは、本開示で使用される部位特異的ヌクレアーゼとして使用されるＦｏｋｌヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼ活性を有すると共に、配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％、更に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性 を有するアミノ酸配列を含む。
【００４２】
部位特異的ヌクレアーゼ活性は、標的化された遺伝子配列を含むプラスミド又は直鎖ｄｓＤＮＡを用いて、インビトロ（in vitro）で試験することができる。標的化されたＤＮＡを部位特異的ヌクレアーゼと混合し、１時間消化させ、開裂の成否をゲル電気泳動で可視化する。
【００４３】
本開示にて提供される方法において、Ｆｏｋｌヌクレアーゼを部位特異的ニッカーゼとして用いる場合には、斯かるＦｏｋｌヌクレアーゼは部位特異的ニッカーゼ活性を有すると共に、配列番号１９に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％、更に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をふくむことが好ましい。
【００４４】
部位特異的ニッカーゼ活性を試験するための方法は、本技術分野では周知であり、例えばMcConnell, 2009, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106(13): 5099-5104に記載されている。要すれば、ニック形成部位の上流及び下流を２００ｂｐで挟んだニッカーゼアッセイ標的断片をＰＣＲで生成する。５０ｍＭ トリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び１ｍＭ ＤＴＴを含む１０μＬの反応液内で、ニック形成反応を３７℃で１時間進行させる。消化後、２μＬの５×停止溶液［０．１Ｍ トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、５％ ＳＤＳ］を加え、脱イオン化ホルムアミド、０．１％キシレンシアノール、及び０．１％ブロモフェノールブルーと共に、試料を９５℃で５分間変性させ、急速冷却した後、６％ポリアクリルアミド変性ゲルを用いた電気泳動で分離する。ゲルを乾燥し、リン酸画像化法（phosphorimaging）により分析する。
【００４５】
メガヌクレアーゼとＴＡＬエフェクターとの融合体であるｍｅｇａＴＡＬエンドヌクレアーゼは、高い活性及び特異性を有する新たなクラスのＤＮＡ標的化エンドヌクレアーゼである。ＭｅｇａＴＡＬエンドヌクレアーゼ のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、本技術分野では周知であり、例えばBoissel, 2014, Nucleic Acids Res. 42(4): 2591-2601に示されている。本開示において部位特異的ヌクレアーゼとして使用されるｍｅｇａＴＡＬエンドヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼ活性を有すると共に、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％、更に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。部位特異的ヌクレアーゼ活性は、上記の手順によりインビトロ（in vitro）で試験することができる。
【００４６】
Ｃｆｐ１ヌクレアーゼのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、本技術分野で周知であり、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/U2UMQ6.1又はhttp://www.addgene.org/browse/sequence/124373/に示されている。ＡｓＣｐｆ１及びＬｂＣｐｆ１のアミノ酸配列を、それぞれ本開示の配列番号２１及び２２に示す。本発明において使用されるＣｐｆ１ヌクレアーゼは、例えば、部位特異的ヌクレアーゼ活性を有すると共に、配列番号２１又は２２のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％、更に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。部位特異的ヌクレアーゼ活性は、上記の手順によりインビトロ（in vitro）で試験することができる。
【００４７】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ファミリーの酵素である。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの非限定的な例は、本技術分野では公知である。本発明では、ＤＳＢを誘導するのに、任意の（ＤＳＢ誘導性）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用することができる。同様に、一本鎖ニックを誘導するのに、任意の（一本鎖切断誘導性）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用することができる。本開示で使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、細菌種に由来することが好ましい。本開示で使用できるＣａｓ９ヌクレアーゼの非限定的な例としては、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼ、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）由来のＳｔ１Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及び、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のＳａＣａｓ９ヌクレアーゼが挙げられる。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、本技術分野で公知であり、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/500000239?report=genbank&log$=protalign&blast_rank=1&RID=T6UUUEV901R又はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/J7RUA5.1に示されている。ＳｐＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、及びＳａＣａｓ９のアミノ酸配列は、それぞれ本開示の配列番号２３、２４、及び２５として提供される。本開示で使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼ活性を有すると共に、任意の既知のＣａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列、例えばそれぞれ配列番号２３、２４、又は２５に示される、ＳｐＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、又はＳａＣａｓ９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。部位特異的ヌクレアーゼ活性は、上記の手順によりインビトロ（in vitro）で試験することができる。本開示にて提供される方法において、部位特異的ニッカーゼとしてＣａｓ９ヌクレアーゼを使用する場合、斯かるＣａｓ９ヌクレアーゼは、部位特異的ニッカーゼ活性を有すると共に、任意の既知のＣａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列、例えばＳｐＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、又はＳａＣａｓ９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。部位特異的ニッカーゼ活性は、上記の手順によりインビトロ（in vitro）で試験することができる。
【００４８】
従って、本発明において、部位特異的ヌクレアーゼは、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びｍｅｇａＴＡＬエンドヌクレアーゼからなる群より選択される。Ｃａｓ９をヌクレアーゼ又はニッカーゼとして使用することで、標的特異性を規定する単一の短い合成キメラｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」（single-guide RNA）、ｓｇＲＮＡ）又は二つの短い合成ｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡ（「二重ガイドＲＮＡ」（dual-guide RNA）、ｄｇＲＮＡ）との組合せで、Ｃａｓ９タンパク質を発現させればよいという利点が得られる。同様に、ヌクレアーゼとしてＣｐｆ１として使用することで、標的特異性を規定する単一の短い合成ｃｒＲＮＡとの組合せで、Ｃｐｆ１タンパク質を発現させればよいという利点が得られる。従って、部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼとしてＣａｓ９又はＣｐｆ１を使用することにより、標的特異的な一本鎖若しくは二本鎖切断（Ｃａｓ９）又は二本鎖切断（Ｃｐｆ１）を生成するための構成を、大幅に簡素化することが可能となる。従って、本発明においては、部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼがＣａｓ９又はＣｐｆ１であることが好ましく、或いは、部位特異的ニッカーゼがＣａｓ９であることが好ましい。最も好ましくは、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼがＣａｓ９（即ちＣａｓ９ヌクレアーゼ）であることである。
【００４９】
ＳｐＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、及びＳａＣａｓ９の他にも、幾つかのＣａｓ９オルソログが知られており、本発明ではそれらを使用してもよい。斯かるＣａｓ９オルソログとしては、髄膜炎菌（Neisseria meningitides）及びフランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）に由来するものが挙げられる。本発明の方法に適用可能な幾つかの既知のＣａｓ９ヌクレアーゼの配列は、本技術分野で公知であり、例えば国際公開第２０１４／１３１８３３号に記載されている。本開示において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９変異体、例えばｅＳｐＣａｓ９（Ian, 2016, Science, 351: 84-88）又はＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（Kleinstiver, 2016, Nature, 529: 490-495）であってもよい。これらは、元のＳｐＣａｓ９よりもより特異的に開裂を誘導することができる。更に、複数の異なるＰＡＭを認識するＳｐＣａｓ９変異体や（Kleinstiver, 2015, Nature 523(7561): 481-485）、ＰＡＭ特異性が改変された変異体（例えばKleinstiver, 2015, Nature 523(7561): 481-485に記載のＶＱＲ及びＥＱＲ変異体）も存在し、それらを本開示にて提供される方法に使用してもよい。また、他の既知のＣａｓ９変異体、例えばスプリット（split）Ｃａｓ９、インテイン（intein）Ｃａｓ９、遺伝子操作（engineered）Ｃａｓ９、又は二量体ＲＮＡガイドＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９ヌクレアーゼ（RNA-guided FokI-dCas9 nuclease：ＲＦＮ）等を、本開示にて提供される方法に使用してもよい。これらのＣａｓ９変異体は、例えばZetsche, 2015,  Nat Biotechnol. 33(2):139-142; Truong, 2015, Nucleic Acids Res. 43(13): 6450-6458; Tsai, 2014, Nat Biotechnol. 32(6): 569-576等に記載されている。これらのＣａｓ９変異体の何れかを本開示にて提供される方法に使用する場合、本技術分野で周知のように実験を適合させなければならない。特にスプリットＣａｓ９及びＲＦＮには、それぞれ複数のプラスミド及びテンプレートが必要となり、インテインＣａｓ９には、４−ヒドロキシタモキシフェンの添加が必要となる。しかし、これらは当業者には周知の微細な変更に過ぎない。
【００５０】
本開示にて提供される方法は、従来に匹敵するオン−標的開裂活性を維持しつつ、オフ−標的作用が最小化されたＣａｓ９変異体、又はオフ−標的作用を有さないＣａｓ９変異体を用いることで、その特異性を更に強化することもできる（Kleinstiver, 2016, Nature, 529: 490-495; Slaymaker, 2016, Science 351, 84-88）。しかし、本発明においては、Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＳｐＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９又はＳａＣａｓ９であることが好ましい。最も好ましいＣａｓ９ヌクレアーゼはＳｐＣａｓ９である。
【００５１】
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮによれば、タンパク質ドメインを介した特異的なＤＮＡ結合が達成されることから、各ヌクレアーゼ毎に個別の標的部位を挿入しなければならない。或いは、所与の配列に合わせて特異的なヌクレアーゼをカスタマイズする必要がある（Heidenreich, 2016, Nature Reviews Neurosciences, 17: 36-44）。これに対して、Ｃａｓ９は特異性決定ガイドＲＮＡ配列（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ））によってガイドされる。斯かるｃｒＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と関連し、相補的ＤＮＡ標的配列とワトソン・クリック（Watson-Crick）塩基対を形成することにより、部位特異的二本鎖切断を生じさせる（Heidenreich, 2016, Nature Reviews Neurosciences, 17: 36-44）。（Ｃａｓ９と、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ二本鎖の「単一ガイドＲＮＡ」（single-guide RNA：ｓｇＲＮＡ）に対する複合体とからなる）シンプルな二成分系、或いは、（Ｃａｓ９と、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子と、ｃｒＲＮＡ分子とからなり、ここで２つのＲＮＡ分子は「二重ガイドＲＮＡ」（dual-guided RNA）、即ちｄｇＲＮＡを形成する）シンプルな三成分系を用いることにより、任意の所期のゲノム遺伝子座でＤＮＡ開裂を達成することができる。Ｃｐｆ１、単一のＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ｃｒＲＮＡのみを使用し、ｔｒａｃｒＲＮＡを使用しない）も、部位特異的ＤＳＢの誘導に使用できる。それゆえ、ガイドＲＮＡの短い特異性決定部分を変えるだけで、異なるＣａｓタンパク質を特定のＤＮＡ配列に標的化することができる。斯かる特異性決定部分の変更は、一回のクローニング工程で容易に達成することができる。
【００５２】
従って、本開示にて提供される方法が、部位特異的ヌクレアーゼとしてＣａｓ９を使用する場合には、工程ａ）の細胞は更に、
（ｉ）少なくとも１つの標的配列特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子と、少なくとも１つのトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子（「二重ガイドＲＮＡ」、ｄｇＲＮＡ）とからなる、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、
（ii）前記（ｉ）のＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド、
（iii）少なくとも１つの標的配列特異的ｃｒＲＮＡと、少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」、ｓｇＲＮＡ）とを含むキメラＲＮＡ分子である、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、及び／又は、
（iv）前記（iii）のキメラＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
を含んでいてもよい。
【００５３】
前記のガイドＲＮＡは、前記の部位特異的ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９又はＣｐｆ１）又は部位特異的ニッカーゼ（例えばＣａｓ９）を、所望のＤＳＢ又は一本鎖ニックの部位に標的化する。例えば、アミノ酸の欠失及び／又は導入（例えば欠失）によりフレームシフトが誘導される場合、前記ガイドＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）は、例えば前記の部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼを、それぞれ前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックの所望の位置に標的化する。斯かる標的化位置は、例えば、前記欠失及び／又は導入の上流又は下流側の１〜１００ｂｐの位置（１〜３３アミノ酸に相当）である。部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９又はＣｐｆ１）及びガイドＲＮＡを用いたゲノム編集は、本技術分野では周知であり、例えば"CRISPR-Cas: A Laboratory Manual", 2016, edited by Jennifer Doudna, ISBN  978-1-621821-31-1に記載されている。
【００５４】
本開示にて提供される方法の好ましい側面によれば、工程ａ）の細胞は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド（例えばプラスミドベクター）を含む。このポリヌクレオチドは、標的配列に対して相補的な（或いは標的配列の一部に対して相補的な）長さ約２０ヌクレオチドの配列と、それに続く長さ約７６ヌクレオチドのガイドＲＮＡスキャフォールド配列とをコードする配列を含んでいてもよい。このスキャフォールド配列は、ダイレクトリピート（direct repeat：ＤＲ）配列と、ｔｒａｃｒＲＮＡとをコードする。
【００５５】
上述のように、本発明の一態様によれば、前記部位特異的ヌクレアーゼはＣｐｆ１である。この態様では、ゲノム編集機構は更に、
（ｉ）標的配列特異的ｃｒＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ、又は、
（ii）（ｉ）のＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド
を含んでいてもよい。
【００５６】
本発明において、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとは、単一の核酸配列に、例えば単一のプラスミドベクターに含まれていてもよい。或いは、各々Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡをコードする複数の個別の核酸配列、例えば複数の個別のプラスミドベクターが、工程ａ）の細胞内に存在し（或いは工程ａ）の細胞内に送達され）てもよい。しかし、予め構築されたＣａｓ９タンパク質−ガイドＲＮＡリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）が、本開示にて提供される製造方法の工程ａ）の細胞内に存在し（或いは工程ａ）の細胞内に送達され）てもよい。
【００５７】
記述のように、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的配列特異的ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含むガイドＲＮＡと組み合わされると、一本鎖又は二本鎖切断、好ましくは二本鎖切断を、所定の標的部位のＤＮＡに導入する活性を有する。本発明の好ましい側面によれば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えばＳｐＣａｓ９）及びｓｇＲＮＡをコードするプラスミドベクターが、工程ａ）の細胞内に存在する（或いは工程ａ）の細胞内に送達される）。本発明の他の好ましい側面によれば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは細胞内で安定に発現される一方、ｓｇＲＮＡは細胞に対して、例えばｓｇＲＮＡをコードするプラスミドベクターを介して送達される。
【００５８】
本記載の前又は後に示すように、本開示にて提供される製造方法の工程ａ）の細胞は、使用された部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼのための認識部位を、前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックの標的部位又はその近傍に含むことが好ましい。Ｃａｓ９を部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼとして使用する場合、又は、Ｃｐｆ１を部位特異的ヌクレアーゼとして使用する場合、所定の認識部位（即ちプロトスペーサー隣接モチーフ、ＰＡＭ）は、前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックの標的部位の直ぐ下流にあることが好ましい。本開示において、「前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックのための標的部位」（target site for the DSB or single-strand nick）とは、前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックが導入されるポリヌクレオチド内の位置のことである。種々のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びその変異体のＰＡＭ配列は、本技術分野では周知であり（例えばＳｐＣａｓ９の場合は５’−ＮＧＧ、ＳａＣａｓ９の場合は５’−ＮＮＧＲＲＴ（配列番号５０）又は５’−ＮＮＧＲＲ（Ｎ）（配列番号５１）、Ｓｔ１Ｃａｓ９の場合は５’−ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号５２）、Ｃｐｆ１の場合は５’−ＴＴＮ）、哺乳類のゲノムには豊富に存在する。従って、前記のＣａｓ９ヌクレアーゼ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼを用いれば、ＰＡＭ配列を人工的に導入することなく、殆どの遺伝子を標的化することができる。しかし、所期の野生型遺伝子内で、適用される部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼのためのＰＡＭ配列が、前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックのための所望の標的部位の直ぐ下流に存在しない場合には、ＰＡＭ配列を外部から導入してもよい。前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックの標的部位の直ぐ下流に、所望のＰＡＭ配列の一部が既に存在している場合には、ＰＡＭ配列の欠落しているヌクレオチドを外部から導入することにより（即ち、天然では所期の遺伝子内の所望の位置に存在しないＰＡＭ配列のヌクレオチドを外部から導入することにより）、完全ＰＡＭ配列を生成することができる。
【００５９】
ｃ）で選択され、及び／又は、ｄ）で提供される細胞に含まれる、所期のタンパク質をコードする遺伝子の突然変異体には、認識部位（例えばＰＡＭ配列が存在していてもいなくてもよい。例えば、前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックの導入及び細胞修復、例えば ＨＤＲ又はＮＨＥＪの際に、前記認識部位が除去されてもよい。特に、工程ｂ）で提供されるドナー核酸テンプレートを、前記所期の遺伝子から前記認識部位を除去するように設計してもよい。例えば、前記のドナー核酸テンプレートは、前記所期の遺伝子内の前記認識部位に対応する位置の認識部位に対応する配列を、含んでいなくてもよい。従って、本発明の一側面によれば、前記認識部位は、工程ｃ）で選択及び／又は濃縮される細胞に含まれる、所期のタンパク質をコードする遺伝子の突然変異体内に存在していなくてもよい。これにより、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１による繰り返しの切断を防止することができる。
【００６０】
認識部位又はその部分の外部からの導入は、所期の遺伝子を前記細胞のゲノム内に導入する前に、前記認識部位又はその部分をその所期の遺伝子に導入することにより、達成することができる。所期の遺伝子が内因性タンパク質である場合には、本技術分野で公知の遺伝子工学的手法、特に相同組換えにより、外因性認識部位又はその部分を組み込んでもよい。
【００６１】
本発明の好ましい側面によれば、工程ａ）の細胞は所期の遺伝子を含み、ここで、適用される部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼのための認識部位（例えばＰＡＭ配列）は、それぞれ前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックのための標的部位の直ぐ下流又は上流に存在する。上述したように、本開示にて提供される方法では、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼが、Ｃａｓ９であることが好ましい。更に、本開示にて提供される方法では、工程ａ）の細胞が、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼを前記認識部位（例えば前記ＰＡＭ配列）に対して標的化するｓｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡを発現することがより好ましい。例えば、ＰＡＭ部位は、所望の切断部位（例えば前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックのための所望の部位）の１〜１００ｂｐ下流又は上流とすることができる。
【００６２】
上に示すように、ＺＲＮ、ＴＡＬＥＮ、又はｍｅｇａＴＡＬエンドヌクレアーゼを部位特異的ヌクレアーゼ／ニッカーゼとして使用する場合には、所与の配列に応じて特異的なヌクレアーゼをカスタマイズする必要がある。ＴＡＬＥＮは、所定の程度の特異性を達成するために、標的特異的なＤＮＡ配列、例えば１２塩基の配列に合わせて、カスタム設計することが可能である。ＴＡＬＥＮは、各々特定の塩基を認識する複数のタンパク質モジュールから構成される。例えば、１２塩基のＤＮＡ配列を認識するには、各々が正確に塩基を認識する１２のタンパク質モジュールを融合しなければならない。配列に応じた正しいＴＡＬＥＮの設計は、従来技術により定型的に実施することができ、例えばオンラインツールを使用して実施可能である。更に、ＴＡＬＥＮによる設計及び標的化のための指針は、インターネット上で、例えばＴＡＬＥＮターゲッターチュートリアル （TALEN targeter tutorial: https://tale-nt.cac.cornell.edu/tutorials/talentargeterupdated及びhttp://www.e-talen.org/E-TALEN/designtalens.html）等に掲載されている。更に、ＤＮＡ標的化用のＴＡＬＥＮや他のＴＡＬエフェクター系コンストラクトのカスタム設計及び組立は、科学文献、例えばCermak, 2011, Nucleic Acids Res. 39(12): e82等に掲載されている。
【００６３】
本開示にて提供される生成方法の工程ａ）におけるＤＳＢは、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の二本鎖の各々に、２つの一本鎖ニックにより誘導（即ち導入）されてもよい。前記の２つの一本鎖ニックは、同一のニッカーゼにより導入されてもよく、２つの異なるニッカーゼにより導入されてもよい。従って、工程ａ）の細胞における前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーは、２つの認識部位（例えばＰＡＭ配列）を含んでいてもよい。両方の一本鎖ニックに同一のニッカーゼを使用する場合には、両者の認識部位は同一であってもよい。両方の一本鎖ニックに２つの異なるニッカーゼを用いる場合には、両者の認識部位は互いに異なっていてもよい。前記第一及び／又は第二のニッカーゼとしては、例えば部位特異的ニック形成活性を有するＣａｓ９ヌクレアーゼであってもよい。例えばＣａｓ９ヌクレアーゼを用いることで、単一の酵素を用いて２つのニックを導入することが可能となる。これは、酵素をそれぞれの認識部位へと標的化するよう媒介する２つの異なるガイドＲＮＡ（例えば２つの異なるｓｇＲＮＡ）を提供することで達成できる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの場合、２つの異なるｓｇＲＮＡにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを２つの異なる標的部位に標的化することができる。ここで、所望のＤＳＢを導入するのに、少なくとも１つのＰＡＭ配列を用いてもよい（例えばTsai, Shengdar Q., and J. Keith Joung. "Defining and improving the genome-wide specificities of CRISPR-Cas9 nucleases." Nature Reviews Genetics 17.5 (2016): 300-312参照）。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び／又は２つのガイドＲＮＡ（例えば２つの異なるｓｇＲＮＡ）は、それぞれ個別のプラスミドから発現されてもよいが、同一のプラスミドから発現されることが好ましい。ニック形成活性を有するＣａｓ９ヌクレアーゼのための認識部位として機能するＰＡＭ配列は、本技術分野では公知である。例えば、Ｃａｓ９ｎ（Ｃａｓ９のＤ１０Ａ変異体）のＰＡＭ配列は５’−ＮＧＧである。
【００６４】
ゲノムＤＮＡ内にＤＳＢ又は一本鎖ニックが存在することで、細胞内修復機構が作動する。典型的には、一本鎖ニックが存在し、修復テンプレートが利用可能であれば、斯かる切断部は相同標的化修復（ＨＤＲ）により、特に相同組換えにより修復される。一方、二本鎖切断は通常は非相同末端連結（ＮＨＥＪ）又はＨＤＲにより修復される。なお、一本鎖ニックの場合にもＮＨＥＪによる修復は生じうるが、その頻度はＨＤＲによるものよりも遙かに低い。一般的に、一本鎖又は二本鎖切断の導入後、ドナー核酸テンプレートが存在すればＨＤＲが誘導される。例えばHeidenreich, 2016, Nature Reviews Neurosciences, 17: 36-44; Cong, 2013, Science, 339: 819-23; Doudna, 2014, Science, 346: 1258096; Hsu, 2014,Cell 157: 1262-78参照。ＨＤＲにより、突然変異誘発標的部位における所望の配列の正確な挿入、欠失又は置換を含む、精密なゲノム編集が可能となる。これに対して、ＮＨＥＪによる修復によれば、任意の種類のランダムな欠失又は挿入が導入されることから、「ＩＮＤＥＬ突然変異」とも呼ばれる。斯かるＩＮＤＥＬ突然変異により挿入されるヌクレオチドの数や種類は制御困難である。なお、ＩＮＤＥＬ突然変異は１又は２以上のヌクレオチド挿入の及び／又は欠失二限定されるため、所期のタンパク質に対してＨＤＲと同程度の多様化を達成することはできない。従って、本発明の優先される側面によれば、前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックは、少なくとも優先的にＨＤＲにより修復されることが想定される。これは、ドナー核酸テンプレートのライブラリーを細胞に供することで達成される。従って、本発明の方法では、ＮＨＥＪによるＨＤＲの導入を抑制（即ち防止）する必要はない。実際に、前記所期のタンパク質の突然変異体を更に多様化するには、所定の割合のＮＨＥＪが存在することが望ましい。
【００６５】
本発明の方法が工程ｂ）を有するか否かとは独立に、ＮＨＥＪは所期のタンパク質の多様化に寄与する場合がある。工程ａ）において所期の遺伝子の単一のコピーに含まれる不活性化突然変異がＮＨＥＪにより除去される場合、工程ｃ）において斯かる前記所期のタンパク質の突然変異体を発現する細胞を選択してもよく、惹いては斯かる細胞が工程ｄ）により提供される細胞のパネルの一部を構成してもよい。従って、本発明の一側面によれば、工程ｄ）により提供される細胞のパネルは更に、ＮＨＥＪにより前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックの修復が生じた細胞を含んでいてもよい。ＮＨＥＪにより前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックの修復が生じた細胞は、不活性化突然変異を除去した少なくとも１つのランダムな突然変異を含んでいてもよい。ここで前記ランダムな突然変異は、工程ａ）で前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックが導入された位置に直接隣接する位置に、１又は２以上のヌクレオチドの挿入及び／又は欠失を含むことが好ましい。上述したように、斯かるランダムな突然変異は、ＩＮＤＥＬ突然変異とも呼ばれる。
【００６６】
所望の場合には、工程ａ）及びｂ）において、ＮＨＥＪに対する相同組換えの比率が上昇するような条件下で細胞を培養してもよい。前記条件としては、例えば、ＮＨＥＪに関与する酵素の阻害又は不活性化、ＮＨＥＪを阻害するタンパク質の発現、ＮＨＥＪを阻害する物質の添加、複製フォーク信仰の遅延化、及び／又は、細胞周期のＧ２／Ｍ期での停止誘発等が挙げられる（例えばWu, 2005, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102.7: 2508-2513参照）。ＮＨＥＪに関与すると考えられ、抑制対象となる酵素としては、ＫＵ７０及び／又はＤＮＡリガーゼIVが挙げられる。ＮＨＥＪを抑制するタンパク質としては、例えばＥ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６からなるタンパク質複合体、又はこれらを含むタンパク質複合体が挙げられる。ＮＨＥＪを阻害する物質としては、例えばＳｃｒ７−ピラジン、ＥＳＣＲ７、Ｌ７５５５０７、ブレフェルジンＡ及びＬ１８９（ＣＡＳ６４２３２−８３−３）からなる群より選択される物質が挙げられる（例えばYu, 2015, Cell stem cell 16.2: 142-147又はhttp://www.tocris.com/pdfs/5342.pdf参照）。斯かる培養条件ゆえに、ＮＨＥＪに対する相同組換えの比率は、例えば少なくとも１倍、好ましくは少なくとも３倍、最も好ましくは少なくとも１５倍に増加する。ＮＨＥＪを媒介する酵素、例えばＤＮＡリガーゼIVやＫＵ７０等は、適切な細胞系列内で完全にノックアウトされ、或いは対応するタンパク質の変異体で置換されうる。不安定化アミノ酸配列がＮ−又はＣ−末端に融合された、安定化薬物によって斯かる酵素を機能的に維持する一方、斯かる薬物を除去すれば、タンパク質は迅速に分解される。例えば Egeler, 2011, Journal of Biol Chemistry 286: 31328-31336を参照。続いて、ＮＨＥＪの酵素が分解により一過的に除去されるような条件下で、本願のタンパク質多様化プロトコールを用いればよい。タンパク質の多様化の後、再度リガンドを加えることで、新たに発現されるＮＨＥＪを媒介する酵素を安定化してもよい。
【００６７】
本開示にて提供される製造方法の工程ｂ）では、ドナー核酸テンプレートのライブラリーを細胞に供する。前記のドナー核酸テンプレートが、所期のタンパク質をコードする遺伝子内の不活性化突然変異を除去する。従って、前記核酸テンプレートは不活性化突然変異を除去するように設計される。換言すれば、前記ドナー核酸テンプレートの核酸配列は、供給されたドナー核酸テンプレートを用いた前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックのＨＤＲ（特に相同組換え）により、所期のタンパク質をコードする遺伝子内の不活性化突然変異が除去されるように設計される。
【００６８】
前記の複数の異なるドナー核酸テンプレートは、二本鎖ＤＮＡ分子を含んでいてもよく、二本鎖ＤＮＡ分子であってもよい。例えば、前記複数の異なるドナー核酸テンプレートは、ベクター、例えばプラスミドベクター内に含まれていてもよい。この場合、前記複数の異なるドナー核酸テンプレートは、各々個別のベクターに含まれていてもよい。或いは、前記複数の異なるドナー核酸テンプレートは、一本鎖オリゴヌクレオチドを含んでいてもよく、一本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）及び／又はホスホロチオエート修飾を含んでいてもよい。
【００６９】
「ロックド核酸」（locked nucleic acid）又は「ＬＮＡ」という語は、本技術分野では周知である。ＬＮＡは、リボース部分が２'酸素と４'炭素とを連結する余剰の架橋により修飾されたヌクレオチドである。Ａ型二重鎖にしばしば見られるように、この架橋がリボースを３'-エンド（North）立体構造で「ロック」しているのである。ロックされた立体構造により、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性、標的特異性、及びヌクレアーゼに対する抵抗性が向上する。
【００７０】
「ホスホロチオエート修飾」（phosphorothioate modification）という語は、当業者には周知であるが、ホスホロチオエート結合によって、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格中の非架橋酸素が硫黄原子で置換された構造を意味する。この修飾により、ヌクレオチド間の結合がヌクレアーゼ分解に対して抵抗性を有することになる。
【００７１】
前記複数の異なるドナー核酸テンプレートは各々、突然変異誘発標的部位の両側に存在する領域に対して相同な相同核酸配列を含む。これらの相同核酸配列は、前記の所望の突然変異をコードする領域を挟み込んでいる。例えば、ドナー核酸テンプレートがプラスミドに含まれる場合には、相同配列の長さは例えば少なくとも８００ヌクレオチド（即ち、所望の突然変異の両側に各々少なくとも４００ヌクレオチド）、好ましくは少なくとも１６００（即ち、所望の突然変異の両側に各々少なくとも８００ヌクレオチド）、最も好ましくは少なくとも２０００ヌクレオチド（即ち、所望の突然変異の両側に各々少なくとも１０００ヌクレオチド）である。ドナー核酸テンプレートがｓｓＯＤＮの場合、相同配列の長さは例えば約４０ヌクレオチド（即ち、所望の突然変異の両側に各々２０ヌクレオチド）〜約２００ヌクレオチド（即ち、所望の突然変異の両側に各々１００）、好ましくは約６０ヌクレオチド（即ち、所望の突然変異の両側に各々３０ヌクレオチド）〜約１２０ヌクレオチド（即ち、所望の突然変異の両側に各々６０ヌクレオチド）、最も好ましくは約８０ヌクレオチド（即ち、所望の突然変異の両側に各々４０ヌクレオチド）〜約１００ヌクレオチド（即ち、所望の突然変異の両側に各々５０ヌクレオチド）である。従って、前記複数の異なるドナー核酸テンプレートは各々、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置の上流に、長さ少なくとも２０ヌクレオチド、例えば２０〜５００ヌクレオチド、２０〜３００ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド、又は４０〜５０ヌクレオチドの第一の相同核酸配列を含んでいてもよい。或いは更に、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置の下流に、長さ少なくとも２０ヌクレオチド、例えば２０〜５００ヌクレオチド、２０〜３００ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド、又は４０〜５０ヌクレオチドの第二の相同核酸配列を含んでいてもよい。
【００７２】
前記第一の相同核酸配列は、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置のすぐ上流に存在してもよく、又は、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置のすぐ上流から１０核酸以内に存在してもよい。同様に、前記第二の相同核酸配列は、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置のすぐ下流に存在してもよく、又は、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置のすぐ下流から１０核酸以内に存在してもよい。
【００７３】
ドナー核酸テンプレート内の相同配列は、突然変異誘発標的部位を挟み込む領域に対して、例えば少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有していてもよい。
【００７４】
上述したように、本発明によれば、前記のドナー核酸テンプレートは、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置に、複数の異なる突然変異を含んでいてもよい。特に、各ドナー核酸テンプレートは、所期のタンパク質内（の前記突然変異誘発標的部位）に生成するべき所望の突然変異を含んでいてもよい。前記突然変異誘発標的部位に対応する位置における、前記の複数の異なる突然変異は、１又は２以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入である。即ち、野生型（即ち非改変）の所期のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と比較して、１又は２以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入である。例えば、所期のタンパク質に対して内因性のヌクレオチドと、変異されたヌクレオチドとの組み合わせにより、前記の突然変異誘発標的部位結果に異なるアミノ酸配列が形成されうる。或いは、前記の突然変異誘発標的部位に新たに挿入されたヌクレオチドが、野生型（即ち非改変）の所期のタンパク質の対応する位置に存在するアミノ酸残基と比較して、異なる１又は２以上のアミノ酸残基をコードしてもよい。
【００７５】
本発明において、前記ドナー核酸テンプレートは、ＨＤＲ、特に相同組換えにより、（所期のタンパク質をコードする遺伝子の）不活性化突然変異を除去する。斯かるドナー核酸テンプレート内で、前記不活性化突然変異を除去する核酸配列は、例えば所期のタンパク質をコードする遺伝子に対応する野生型配列であってもよく、及び／又は、所期のタンパク質をコードする遺伝子内のフレームシフト突然変異を除去する配列であってもよい。
【００７６】
典型的には、本開示にて提供される方法では、相同性アームによって挟まれ、プログラムされた多様性を含む、ドナー核酸テンプレートの１バッチが使用される。通常は、全てのドナー核酸テンプレートが１バッチで合成され、これらは同一の相同性アームを共有するが、数百万の異なるドナー分子を構成する。特に、「ドナー核酸配列」（donor nucleic acid sequences）が異なるゆえに、斯かるドナー核酸テンプレートのライブラリーは、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも１００、少なくとも１０００、少なくとも１００００、又は少なくとも１００００００の異なるドナー核酸テンプレートを含む。従って、本発明の一側面は、本開示にて提供される方法であって、複数の異なるドナー核酸テンプレートのライブラリーが、少なくとも２つの異なるドナー核酸テンプレート、好ましくは少なくとも５の異なるドナー核酸テンプレート、より好ましくは少なくとも１０の異なるドナー核酸テンプレート、更に好ましくは少なくとも１５の異なるドナー核酸テンプレート、更に好ましくは少なくとも２０の異なるドナー核酸テンプレート、更に好ましくは少なくとも１００の異なるドナー核酸テンプレート、更に好ましくは少なくとも１０００の異なるドナー核酸テンプレート、更に好ましくは少なくとも１００００の異なるドナー核酸テンプレート、又は更に好ましくは少なくとも１００００００の異なるドナー核酸テンプレートを含む方法に関する。上述したように、斯かるドナー核酸テンプレートは、複数の異なる突然変異を含む。１つのドナー核酸分子当たり１つの突然変異を含むことが好ましい。各ドナー核酸テンプレート内の「突然変異」（mutation）は、所期の遺伝子内の対応する配列と比較して異なるヌクレオチド又はヌクレオチド配列である。各ドナー核酸テンプレート内の「突然変異」は、別名「多様化配列」とも呼ばれる。前記の「突然変異」又は「多様化配列」により、所期のタンパク質内に、１又は２以上のアミノ酸置換、置き換え、及び／又は挿入が生じることが好ましい。前記の多様化配列は、１又は２以上の具体的なアミノ酸をコードしていてもよく、及び／又は、縮重コドンを含んでいてもよい。多様化配列の縮重コードとしては、例えばＮＮＮ、ＮＮＫ／ＮＮＳ、ＮＮＢ、及び／又は、ＭＡＸ系が挙げられる。本技術分野で公知のように、Ｎは、ＤＮＡの何れかのヌクレオチド、即ちアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、又はチミン（Ｔ）を表す。Ｂは、アデニン以外の何れかのヌクレオチドを表す。従って、縮重コードＮＮＢは、停止コドン（即ちＴＡＡ、ＴＧＡ）を導入する可能性を低下させる。本技術分野で公知のように、縮重コードにおいて、Kは、アデニン（A）又はシトシン（C）以外、即ち、グアニン（G）又はチミン（T）を表す。Sは、アデニン（A）又はチミン（T）以外、即ち、シトシン（C）又はグアニン（G）を表す。ＭＡＸ系も本技術分野では公知であり、例えばHughes, 2003, J. Mol. Biol. 331: 973-979に記載されている。この系では、標的化された各部位で、最大２０のプライマーが（１アミノ酸アミノ酸当たり１つずつ）生成される。これらは十分にランダム化されたテンプレート（標的化された残基のＮＮＮ）にア���ールされ、連結されてバイアスのないライブラリーが形成される。
【００７７】
前記のドナー核酸テンプレートは、特定の（１又は２以上の）アミノ酸を、変化させないまま維持すると共に、隣接するアミノ酸（即ち変化しないアミノ酸の両側にあるアミノ酸）が改変されるように設計されてもよい。従って、ドナー核酸テンプレート内の縮重コドンが、所期のタンパク質の元のアミノ酸配列由来の（１又は２以上の）アミノ酸で中断されていてもよい。例えば、突然変異誘発標的部位内の一部のアミノ酸のみが重要と考えられる場合には、これらは多様化すべきではない。
【００７８】
前記の複数の異なるドナー核酸テンプレートのライブラリーは、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置に含まれる突然変異が異なる複数のドナー核酸テンプレートを含む。例えば、斯かる複数の異なるドナー核酸テンプレートは、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置でコードされるアミノ酸が異なっていてもよい。或いは、斯かる複数の異なるドナー核酸テンプレートは、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置でコードされる複数の異なるアミノ酸の量が異なっていてもよい。例えば、複数の異なるドナー核酸テンプレートのライブラリー内において、一部のドナー核酸テンプレートが前記突然変異誘発標的部位に対応する位置で１アミノ酸をコードし、他のテンプレートが前記突然変異誘発標的部位に対応する位置で少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、及び／又は、少なくとも１２のアミノ酸（例えば３〜５のアミノ酸）をコードしてもよい。
【００７９】
例えば、不活性化された所期の遺伝子（即ち、不活性化突然変異を含む所期の遺伝子）内において、少なくとも１つのアミノ酸のコドンが欠失していてもよい。この場合、ドナー核酸テンプレートは、欠失されるアミノ酸を置換し、フレームシフトを除去し、置換されたアミノ酸に隣接する少なくとも１つのアミノ酸（例えば１又は２アミノ酸）をランダム化するように設計される。
【００８０】
本開示にて提供される製造方法では、工程ｂ）は工程ａ）の前に実施してもよいが、工程ａ）と同時に実施することが好ましい。工程ａ）とｂ）を同時に実施する場合、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、同時にドナー核酸テンプレートの一部を切断してしまってもよい。これにより、本発明の方法が顕著に妨害されることはない。しかし、所望の場合には、斯かるドナー核酸テンプレートの切断を、当業者に周知の幾つかの方法により防止することができる。例えば前記ドナー核酸テンプレートが、例えばプラスミドに含まれた、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である場合、サイレント突然変異又は少なくとも中立突然変異を、前記ドナー核酸テンプレートのＰＡＭ配列内に導入すればよい。前記ドナー核酸テンプレートがｓｓＯＤＮである場合、例えばｓｇＲＮＡ配列と対応するｓｓＯＤＮ配列とを同一の鎖に配置することで、ｓｓＯＤＮの切断を防止することができる。
【００８１】
本発明の工程ａ）の製造方法において、ＤＳＢ又は一本鎖ニックは、所期のタンパク質をコードする遺伝子（即ち所期の遺伝子）内の突然変異誘発標的部位又はその近傍に導入される。この場合、細胞はそのゲノム内に、所期の遺伝子の不活性化されたコピーを一つのみ（即ち、所期の遺伝子の不活性化されたアレルを一つのみ）含む。具体的に、前記所期の遺伝子の単一のコピーは、アミノ酸配列を多様化すべき（特に突然変異を誘発すべき）突然変異誘発標的部位又はその近傍に、少なくとも１つの不活性化突然変異を含むことにより不活性化されてなる。
【００８２】
従って、所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーは、前記突然変異誘発標的部位又はその近傍に、不活性化突然変異を含む。前記の不活性化突然変異は、前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックが導入される位置又はその近傍に存在していてもよい。例えば、選択（又は導入）されたＰＡＭ部位の１〜２１ヌクレオチド（１〜７アミノ酸に相当する）下流の４塩基対を除去することで、１アミノ酸を除去すると共にフレームシフトを生じさせてもよい。
【００８３】
不活性化突然変異を含む遺伝子は、不活性化された遺伝子、又は、突然変異により不活性化された遺伝子とも呼ばれる。従って、所期の遺伝子に含まれる不活性化突然変異は、対応するタンパク質の発現を少なくとも抑制し、又はより好ましくは防止する遺伝子の核酸配列内の、何らかの改変／修飾であることが好ましい。換言すれば、前記不活性化突然変異は、不活性化突然変異を有さない対応する野生型遺伝子によりコードされるタンパク質と比較して、所期のタンパク質の発現を少なくとも抑制し、又はより好ましくは防止するものであってもよい。前記不活性化突然変異は、対応する野生型タンパク質と比較して、より活性の低いタンパク質を発現させるものであってもよい。換言すれば、不活性化された所期の遺伝子（即ち、不活性化突然変異を有する所期の遺伝子によりコードされる所期のタンパク質）から発現されるタンパク質は、前記野生型の所期のタンパク質（即ち、不活性化突然変異のない所期の遺伝子によりコードされるタンパク質）と比較して、より活性が低いものであってもよい。例えば、斯かるより低活性のタンパク質の活性は、対応する野生型の所期のタンパク質の活性と比較して、７０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、更に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％である。斯かるより低活性のタンパク質は、対応する野生型タンパク質と比較して、例えば酵素活性（所期のタンパク質が酵素の場合）がより低く、又は、特定のエピトープに対する結合活性（所期のタンパク質が抗体の場合）がより低い。所期のタンパク質が蛍光タンパク質である場合、斯かるより低活性のタンパク質は、例えば蛍光がより低い（或いは、好ましくは蛍光を有さない）。しかし、所期のタンパク質は、酵素、抗体、及び蛍光タンパク質に限定されるものではない。従って、所期のタンパク質によっては、斯かるより低活性のタンパク質は、例えば、親和性物質又は分子構造（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、又はペプチド）に対する結合親和性がより低く、インビボで観察される化学反応（例えば呈色反応）の誘導活性がより低く、或いは、薬物及び／又は抗生物質への抵抗性がより低い。
【００８４】
本発明において、前記不活性化突然変異により生じる所期のタンパク質の活性低下を、工程ｃ）において、相同組換えにより前記不活性化突然変異が除去された細胞の選択及び／又は濃縮に使用することもできる。斯かる例では、前記不活性化突然変異が蛍光活性の低下を生じる場合、蛍光を発する細胞（及び／又は、強い蛍光を発する細胞）を、工程ｃ）で選択及び／又は濃縮すればよい。即ち、蛍光活性化細胞分別（fluorescence-activated cell sorting：ＦＡＣＳ）技術を用いることができる。斯かるＦＡＣＳ技術を実施するための非限定的な例は、後述の実施例に記載されている。
【００８５】
不活性化突然変異の例は、所期のタンパク質をコードする遺伝子内にフレームシフトを生じさせる突然変異（即ち、所期の遺伝子のリーディングフレームの改変を生じさせる突然変異）、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内に未成熟停止コドンを導入し、又は、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内に突然変異を導入し、これにより不活性化アミノ酸置換を生じさせる突然変異を含む。前記の不活性化アミノ酸置換は、対応するタンパク質の活性（例えば酵素活性又は結合活性）を抑制又は防止するものであってもよく、或いは対応するタンパク質の発現を好ましくは抑制し、又はより好ましくは防止するものであってもよい。最も好ましい前記不活性化突然変異は、所期のタンパク質をコードする遺伝子（即ちヌクレオチド配列）内のフレームシフト突然変異である。
【００８６】
分子的観点からは、不活性化突然変異は、例えば塩基対の置換、１又は２以上のヌクレオチドの挿入、或いは、１又は２以上のヌクレオチドの欠失であってもよい。例えば、前記不活性化突然変異は、塩基対置換、塩基対挿入、塩基対欠失、停止コドン、又は不活性化アミノ酸置換であってもよく、これらを含んでいてもよい。前記の不活性化アミノ酸置換は、例えば正しく折り畳まれないタンパク質及び／又は触媒的に不活性なタンパク質を生じさせるものであってもよい。当業者であれば、上記の何れかの種類の不活性化突然変異を達成するのに、どのような突然変異が必要であるかを理解するであろう。
【００８７】
上述したように、所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピー内の前記不活性化突然変異は、前記突然変異誘発標的部位又はその近傍に存在する。本明細書で使用する場合、「突然変異誘発標的部位の近傍」（close proximity to the target site for mutanogenesis）という語は、前記突然変異誘発標的部位に所望の突然変異を導入し、不活性化突然変異を除去するようなドナー核酸テンプレートの設計を可能とする、突然変異誘発標的部位に対する距離を意味する。従って、「突然変異誘発標的部位近傍」という語は、例えば１００ヌクレオチド以下、好ましくは８０ヌクレオチド以下、より好ましくは６０ヌクレオチド以下、更に好ましくは４０ヌクレオチド以下、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下、最も好ましくは１０ヌクレオチド以下の距離を意味する。なお、前記不活性化突然変異は、ちょうど前記突然変異誘発標的部位に存在していてもよい。
【００８８】
本発明において、前記不活性化突然変異は、所期のタンパク質の選択可能な活性（例えば蛍光活性）を防止するものであってもよい。この場合、本開示にて提供される製造方法の工程ｃ）は、前記選択可能な活性（例えば蛍光活性）を有する細胞の選択及び／又は濃縮であってもよく、又はこれらを含んでいてもよい。中でも、前記不活性化突然変異は、所期のタンパク質の発現を防止するものであることが好ましい。この場合、所期のタンパク質の発現は、不活性化突然変異の首尾よき除去を示すものであり、惹いては有利なことには、所期のタンパク質の首尾よき突然変異誘発を示すものである。この場合、本開示にて提供される製造方法の工程ｃ）は、前記所期のタンパク質を発現する細胞の選択及び／又は濃縮であってもよく、これらを含んでいてもよい。前記所期のタンパク質が直接選択可能でない（即ち、例えば蛍光等の固有の特性により選択可能でない）場合、所期のタンパク質を発現する細胞は、前記所期のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いることにより、選択及び／又は濃縮されてもよい。
【００８９】
例えばＦＡＣＳと、所期のタンパク質に特異的に結合する抗体とを用いて、所期のタンパク質を発現する細胞を選択及び／又は濃縮してもよい。斯かる方法は、所期のタンパク質が細胞表面に提示される場合には、とりわけ有用である。これは、市販のベクター、例えばpDisplay等を用いることにより、達成することが可能である。特に、細胞ゲノム内への単一のコピー数の挿入前に、前記所期のタンパク質の突然変異体を細胞表面に送達する標的化配列を、所期のタンパク質をコードする遺伝子カセットにそのまま加えることができる。斯かる技術は非常に強力な手法であり、細胞、例えば哺乳類細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞の表面における、タンパク質（例えばＦａｂ断片、単一鎖抗体、又は全ＩｇＧ）の機能的提示を、効率的に達成することを可能とする。効率的な提示及びスクリーニングのためのプロトコールは、本技術分野では既に標準的となっており、例えばHo, 2008, Methods in Molecular Biology, 525: pp 337-352; and Zhou, 2012, Methods in Molecular Biology, 907: 293-302によって提供される。
【００９０】
或いは、所期のタンパク質が抗体等の結合分子である場合、前記所期のタンパク質を発現する細胞の突然変異体を、例えばパニングアプローチにより同定することができる。この目的のためには、特異的な表面に所望の抗原を結合させればよい。抗体ライブラリーを細胞表面に発現する細胞を、この表面上でインキュベートする。有効な抗体を発現する細胞が、この表面に結合する。非結合細胞を洗い流した後、加える可溶性抗原の量を増加させると共に、更なる洗浄によりストリンジェンシーを上昇させてもよい。何ラウンドかの洗浄の後、表面に結合して残存する細胞を、何らかの適切な方法、例えばトリプシン処理等で収穫して回収すればよい。
【００９１】
或いは、斯かるパニングアプローチを逆転させ、抗体を表面に吸着させて、所期のタンパク質を細胞の表面に提示させてもよい。このパニングは、細胞の濃縮に使用することができる。
【００９２】
また、免疫タグ、例えばｍｙｃエピトープ又はＨＡタグ等を、（蛍光タンパク質又は薬物抵抗性タンパク質の代わりに、或いはこれらに加えて）選択可能マーカーとして用い、所期のタンパク質と融合させた融合タンパク質を形成してもよい。
【００９３】
（例えば、所期のタンパク質が蛍光タンパク質である場合には）所期のタンパク質は単量体であることが望ましい。惹いては、発現される所期のタンパク質の二量体又は多量体形成を防止するように、所期の遺伝子を改変してもよい。
【００９４】
或いは、所期のタンパク質をコードする遺伝子が、前記細胞のゲノム内に融合遺伝子として存在していてもよく、ここで前記融合遺伝子が、所期のタンパク質をコードする遺伝子の下流に、マーカー遺伝子を含んでいてもよい。マーカー遺伝子（別名「選択可能マーカー遺伝子」（selectable marker gene））とは、人工的な選択に適した特性を付与する遺伝子である。斯かるマーカー遺伝子は、マーカー（別名「マーカータンパク質」（marker protein））をコードする。「陽性マーカー」とは、宿主生物に対して選択的な利点を付与する選択可能マーカー、或いは、その固有の特性（例えば蛍光等）に基づき選択可能な選択可能マーカーである。「陰性マーカー」（negative marker）（別名「反選択可能マーカー」（counter-selectable marker））とは、選択対象ではない宿主生物の成長を阻害又は抑制する選択可能マーカーである。
【００９５】
上述の融合遺伝子において、マーカー遺伝子と所期のタンパク質をコードする遺伝子とはインフレームで存在する。特に、融合遺伝子においては、所期のタンパク質及びマーカー遺伝子のコーディング配列は、互いに作動式に融合され、単一のｍＲＮＡ分子として発現されて、対応する融合タンパク質の発現を可能とするように構成される。前記の融合タンパク質は、互いに作動式に連結／融合された所期のタンパク質及びマーカータンパク質を含む。特に、前記融合タンパク質は、所期のタンパク質を含むと共に、そのＣ末端にマーカータンパク質を含む。
【００９６】
本発明では、前記融合遺伝子に含まれる所期のタンパク質内の前記不活性化突然変異は、マーカー遺伝子の発現をも防止することが好ましい。この場合、前記不活性化突然変異が除去され、それにより所期のタンパク質の多様化が生じた細胞は、マーカー遺伝子を発現する細胞を選択及び／又は濃縮することによって、容易に選択することができる。従って、本開示にて提供される製造方法の一側面によれば、工程ｃ）が、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質を発現する細胞の選択及び／又は濃縮であるか、或いはこれらを含む。好ましくは、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質の発現は、直接選択である（即ち、その固有の特性、例えばその蛍光に基づき選択可能である）。例えば、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質は、蛍光タンパク質であってもよい。この場合、工程ｃ）の選択及び／又は濃縮は、斯かる蛍光タンパク質を発現する細胞の単離を含むことが好ましい。細胞の集団を選択的に単離するための方法としては、幾つかの方法が本技術分野で公知である。例えば、細胞の単離は、ＦＡＣＳ又はマイクロ流体細胞選別で達成することができるところ、これらを使用してもよい。所望の（例えばマーカー遺伝子が蛍光タンパク質をコードする場合）、マーカータンパク質（例えばマーカー遺伝子によりコードされるタンパク質）は単量体であることが望ましい。従って、上述したように、発現されるマーカータンパク質の二量体又は多量体形成を防止するように、マーカー遺伝子を改変してもよい。
【００９７】
上述の融合遺伝子（即ち、所期のタンパク質をコードする遺伝子とマーカー遺伝子とを含む融合遺伝子）を発現する細胞の選択及び／又は濃縮は、蛍光による選別以外の機構によっても達成される。例えば、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質の発現は、薬物抵抗性を付与するものであってもよく、抗生物質抵抗性を付与するものであってもよく、栄養要求性を補完するものであってもよく、検出可能な酵素活性を付与するものであってもよく、又は免疫エピトープであってもよい。工程ｃ）において、前記不活性化突然変異が除去された細胞を選択及び／又は濃縮するのに、マーカータンパク質のこれらの特性を用いてもよい。
【００９８】
例えば、マーカー遺伝子によりコードされ、酵素活性を付与するタンパク質としては、例えばβ−ラクタマーゼ、又はプロテアーゼ、例えばエンテロキナーゼ、又はＴＥＶ等が挙げられる。薬物（例えば抗生物質）や、斯かる薬物に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝子は、種々知られている。例えば、ピューロマイシンは、翻訳時にペプチドのリボソームへの移送を妨害し、未成熟鎖終了を生じさせることにより、タンパク質合成を阻害する。ピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼをコードするｐａｃ遺伝子は、ピューロマイシン抵抗性遺伝子である。ハイグロマイシンＢはアミノグリコシド抗生物質であって、転座を妨害し、８０Ｓリボソームの誤訳を促進することにより、タンパク質合成を阻害する。アミノシクリトールホスホトランスフェラーゼをコードするｈｙｇ遺伝子は、ハイグロマイシンＢに対する抵抗性を付与する。ゼオシンは、ＤＮＡ内に侵入して切断することにより、細胞死を生じさせる。Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子産物はゼオシンに結合し、ゼオシンのＤＮＡへの結合を防止することで、抵抗性を付与する。ブラストサイジンは原核細胞及び真核細胞の何れにおいても翻訳阻害剤である。ブラストサイジンに対する抵抗性は、ｂｓｄ遺伝子産物により付与される。Ｇ−４１８は、８０Ｓリボソームの機能に干渉し、真核細胞でのタンパク質合成を阻害する。ｎｅｏｒ遺伝子はＧ−４１８に対する抵抗性を付与する。マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質が、薬物抵抗性若しくは抗生物質抵抗性を付与し、又は栄養要求性を補完する場合、工程ｃ）の選択及び／又は濃縮は、細胞を選択的な条件下で培養することを含むことが好ましい。
【００９９】
本発明では、所期のタンパク質の発現は、陰性選択可能であってもよい。換言すれば、非マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が、所期のタンパク質の発現を示すものであってもよい。即ち、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質が、前記不活性化突然変異の存在下で発現されてもよく、前記不活性化突然変異が除去された細胞では、マーカー遺伝子が発現されなくてもよい。本開示において「発現されない」（not expressed）とは、タンパク質がインフレームで発現されないことを含む概念である。従って、本開示では、マーカー遺伝子のリーディングフレームとは異なるリーディングフレームが転写される場合には、マーカー遺伝子は発現されないものと見做される。従って、本発明の一側面は、本開示にて提供される製造方法において、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内に前記不活性化突然変異が存在すると、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質が発現されると共に、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内の前記不活性化突然変異が除去された細胞では、前記マーカー遺伝子が発現されない、又はインフレームでは発現されないことを含む方法に関する。この場合、本開示にて提供される製造方法の工程ｃ）は、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質を発現しない細胞の選択及び／又は濃縮であるか、これを含むことが好ましい。マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質が発現されない場合に所期のタンパク質の発現を達成するための系として、本技術分野で公知のものは少数であるが存在する。例えば、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質は、チミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）であってもよい。このタンパク質は、哺乳類細胞では条件付き致死マーカーとして機能する。ガンシクロビル等の特定のヌクレオシド類似物をリン酸化して、毒性ＤＮＡ複製阻害剤に転換するからである。
【０１００】
上述の融合遺伝子（即ち、所期のタンパク質をコードする遺伝子とマーカー遺伝子とを含む融合遺伝子）は、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子と前記マーカー遺伝子との間に、リンカー核酸配列を含んでいてもよい。前記のリンカー核酸配列は、自己開裂ペプチドをコードする核酸配列であってもよく、当該配列を含んでいてもよい。自己開裂ペプチドとしては幾つかのものが本技術分野で周知である。例えば、自己開裂ペプチドは、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、及びＦ２Ａペプチドからなる群より選択されるものであってもよい。２Ａペプチドのアミノ酸配列、特にＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａのアミノ酸配列を本開示において配列番号１〜４として示す。
【０１０１】
また、リンカー核酸配列は、部位特異的プロテアーゼの標的部位をコードする核酸配列であってもよく、当該配列を含んでいてもよい。例えば、前記部位特異的プロテアーゼの標的部位は、例えば配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＴＥＶプロテアーゼの標的部位、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するジェネナーゼＩ（Genenase I）の標的部位、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するエンテロキナーゼの標的部位、及び、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するヒトライノウイルス（ＨＲＶ）３Ｃプロテアーゼの標的部位からなる群より選択されてもよい。好ましさの面では劣るが、部位特異的プロテアーゼの標的部位は、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する因子Ｘａの標的部位、又は、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するトロンビンの標的部位であってもよい。前記リンカー核酸配列が、部位特異的プロテアーゼの標的部位をコードする核酸配列であるか、当該配列を含む場合、前記細胞（即ち、本開示にて提供される製造方法の工程ａ）〜ｄ）何れかの細胞）は更に、前記標的部位を切断するための、対応する部位特異的プロテアーゼを発現してもよい。前記の部位特異的プロテアーゼは、例えばＴＥＶプロテアーゼ、ジェネナーゼＩ（Genenase I）、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）３Ｃプロテアーゼ、因子Ｘａ、及びトロンビンからなる群より選択されてもよい。
【０１０２】
好ましくは、本開示にて提供される製造方法の工程ａ）及びｂ）の後に、多様化を受けた細胞が、所期のタンパク質に融合されたマーカータンパク質を産生してもよい。マーカー遺伝子は所期の遺伝子と同一のレベルで発現され、マーカータンパク質として蛍光タンパク質を用いた場合には、斯かる蛍光タンパク質はタンパク質濃度の指標として使用できる。従って、所期のタンパク質を利用した結合アッセイの場合、発現レベルに対して結合を校正すればよい。更に、蛍光マーカー遺伝子を発現する細胞は、ＦＡＣＳ又はマイクロ流体選別を用いて収集することができ、抗生物質選択よりも迅速なプロセスで回収できる。
【０１０３】
マーカー遺伝子が陽性又は陰性の選択可能マーカータンパク質をコードする場合、適切に多様化された変異体からなる細胞集団を得るためには、幾つかの可能性が存在する。複数の開裂可能なペプチドリンカー、例えばＴ２Ａ又はＦ２Ａと共に、陽性及び陰性の両マーカーを用いることにより、例えば単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ等の遺伝子により、陰性選択で非フレームシフト変異体を除去して、ガンシクロビルに対して選択することができる。細胞が同質となり、本発明の製造方法による多様化に供される際には、残存する不所望のフレームシフト変異体を、陽性選択遺伝子、例えばハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ及びハイグロマイシンＢ等で除去することができる。しかし、本開示にて上述したように、他の選択マーカーも使用可能である。
【０１０４】
本発明の方法の工程ｃ）において、前記不活性化突然変異が除去された細胞が、選択及び／又は濃縮（例えば濃縮）される。前記不活性化突然変異が除去された細胞の選択及び／又は濃縮は、選択を更に少なくとも１回（例えば１〜１０回、例えば３回）実施することで、更に改善することができる。例えば、工程ｃ）で選択／濃縮された細胞を培養し、所望のフラクション（例えば最も高いタンパク質発現を示す１〜３０％の細胞、例えば５％の細胞）を選択して更に培養してもよい。斯かる手順を１〜１０回、例えば３回繰り返すことができる。所期のタンパク質が蛍光タンパク質である場合、又は蛍光タンパク質を含む融合タンパク質の場合、最も高いタンパク質発現を示す１〜３０％の細胞の選択は、例えば、最も高い蛍光を示す１〜３０％の細胞を、例えばＦＡＣＳ等により選択することで実施できる。
【０１０５】
工程ｃ）により選択される細胞は、工程ａ）で誘導されたＤＳＢ又は一本鎖ニックの修復により、所期のタンパク質をコードする遺伝子内の前記不活性化突然変異が除去された細胞を含み、或いはこうした細胞からなる。ここで前記不活性化突然変異の除去とは、好ましくは、所期のタンパク質の突然変異体が発現されるように、所期のタンパク質をコードする不活性化された単一のコピーの配列が改変されることを意味する。以下に詳述するように、前記突然変異体は所期のタンパク質に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有する。従って、完全に異なるタンパク質（例えば所期のタンパク質をコードする遺伝子のリーディングフレームとは異なるリーディングフレームの転写により生じたタンパク質）は、所期のタンパク質の突然変異体とは見做されない。上述したように、前記不活性化突然変異により、活性が低下しているか、或いは活性を全く有さない、所期のタンパク質の変異体が発現されてもよい。この場合、前記不活性化突然変異を除去することで、前記所期のタンパク質の突然変異体の少なくとも一部において、所期のタンパク質の活性が回復する。しかし、本開示にて提供される方法では、前記所期のタンパク質の幾つかの異なる突然変異体が産生されるところ、これらの突然変異体の多くは通常、改善対象となるタンパク質活性の面では非機能的である。例えば、前記不活性化突然変異の除去により、対応する所期のタンパク質の活性の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％、更に好ましくは少なくとも９９％、更に好ましくは少なくとも１００％の活性を有する、所期のタンパク質の突然変異体が発現される。最も好ましくは、突然変異体が所期のタンパク質の活性の１００％超（例えば少なくとも１０１％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、又は少なくとも１５０％）の活性を有することである。
【０１０６】
本開示にて提供される製造方法の工程ｄ）においては、前記所期のタンパク質の複数の異なる突然変異体を発現する細胞のパネルが提供される。所期のタンパク質のアミノ酸配列は、不活性化突然変異を有さない所期の遺伝子によりコードされる。換言すれば、所期のタンパク質（本開示では「野生型の所期のタンパク質」とも称する）とは、工程ａ）の細胞における所期のタンパク質をコードする遺伝子が不活性化突然変異を含まなければコードしていたであろうタンパク質である。所期のタンパク質の別名は「野生型の所期のタンパク質」であるものの、原則としては特定のタンパク質の既知の突然変異体であってもよい。例えば、特性の改善されたタンパク質の突然変異体が本技術分野で公知であってもよく、その場合には、斯かる既知の突然変異体に対して更なる突然変異を加えることで、より優れた性能のタンパク質が生じるか否かを検証することが望ましい。
【０１０７】
従って、所期のタンパク質は、本開示にて提供される手段及び方法において変異対象となる任意のタンパク質であり得る。所期のタンパク質としては、例えば蛍光タンパク質、抗体、酵素、成長因子、サイトカイン、ペプチドホルモン、転写因子、ＲＮＡ結合タンパク質、細胞骨格タンパク質、イオンチャンネル、Ｇタンパク質結合受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、シャペロン、トランスポーター、又は膜貫通タンパク質等が挙げられる。所期のタンパク質は、酵素、抗体、又は蛍光タンパク質であることが好ましい。前記所期のタンパク質が蛍光タンパク質である場合、mNeonGreen、mRuby2／３、dTomato、TagRFP、Citrine、Venus、YPet、mTFP１、EGFP、Kusabira Orange、mOrange、mApple、mCerulean３、mTurquoise２、mCardinal、EosFP、Dronpa、Dreiklang、及び赤外iRFPからなる群より選択される蛍光タンパク質であってもよい。所期のタンパク質が蛍光タンパク質である場合、mNeonGreen2であることが好ましい。所期のタンパク質が抗体である場合、前記突然変異誘発標的部位は、斯かる抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸配列のＣＤＲコーディング領域内に存在することが好ましい。所期のタンパク質が酵素である場合、前記突然変異誘発標的部位は、前記酵素又は前記酵素の制御性サブユニットの活性中心をコードする核酸領域内に存在することが好ましい。
【０１０８】
所期のタンパク質の突然変異体とは、所期のタンパク質のアミノ酸配列と同一ではないが、関連するアミノ酸配列を有するタンパク質である。特に、所期の突然変異体のアミノ酸配列は、所期のタンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有していてもよい。本発明の製造方法の一側面によれば、工程ｄ）により提供される細胞のパネルに含まれる細胞が発現する、前記所期のタンパク質の複数の異なる突然変異体は、所期のタンパク質と比較して、１又は２以上のアミノ酸の交換、１又は２以上のアミノ酸の挿入、及び／又は １又は２以上のアミノ酸の欠失を含む。前記１又は２以上のアミノ酸の交換は、例えば少なくとも１、例えば少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも５のアミノ酸の交換とすることができる。同様に、前記１又は２以上のアミノ酸の挿入は、例えば少なくとも１、例えば少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも５アミノ酸の挿入とすることができる。同様に、前記１又は２以上のアミノ酸の欠失は、例えば少なくとも１、例えば少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも５アミノ酸の欠失とすることができる。
【０１０９】
好ましくは、前記所期のタンパク質の突然変異体のアミノ酸配列は、所期のタンパク質と比較して、１又は２以上のアミノ酸置換（即ち交換）、１又は２以上のアミノ酸の挿入、及び／又は、１又は２以上のアミノ酸の欠失を有する他は、所期のタンパク質のアミノ酸配列と同一である。これら１又は２以上のアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失は、突然変異誘発標的部位に生じる。置換、挿入、及び／又は欠失されるアミノ酸の数は、例えば１〜２５アミノ酸、好ましくは１〜２０アミノ酸、より好ましくは１〜１５アミノ酸、更に好ましくは１〜１２アミノ酸、更に好ましくは１〜５アミノ酸、最も好ましくは３〜５アミノ酸とすることができる。
【０１１０】
本開示にて提供される製造方法の工程ｄ）により提供される細胞のパネルは、複数の異なるドナー核酸テンプレート内の、所期のタンパク質をコードする遺伝子内の前記突然変異誘発標的部位に対応する位置に含まれる複数の異なる突然変異を、突然変異誘発標的部位に含む細胞を濃縮することが好ましい。突然変異誘発標的部位に対応する位置は、例えば、本開示の別の場所で言及され、及び／又は、本技術分野で公知である、配列アラインメント法により決定することができる。好ましくは、細胞のパネル内で濃縮される細胞は、工程ｂ）で提供される複数の異なるドナー核酸テンプレートのライブラリーのドナー核酸テンプレートとの相同組換えにより、前記ＤＳＢ又は一本鎖ニック（好ましくはＤＳＢ）のＨＤＲが生じた細胞であることが好ましい。換言すれば、本発明の方法の工程ｄ）により提供される細胞のパネルは、所期の遺伝子に変異を形成した変異体によりコードされる前記所期のタンパク質の複数の異なる突然変異体を発現する細胞を濃縮することが好ましい。特に、上述したように、本開示にて提供される製造方法の工程ａ）では、所期の遺伝子が不活性化突然変異を含む。即ち、所期のタンパク質の活性が低下し、及び／又は、発現が低下する。所期のタンパク質が全く発現されないことが好ましい。本開示にて提供される製造方法の工程ｂ）では、ドナー核酸テンプレートを提供することでＨＤＲが生じ、これにより不活性化突然変異が除去される。結果として、所期のタンパク質の活性及び／又は発現が回復される。更に、ドナー核酸テンプレートに含まれる突然変異が、ＨＤＲにより所期のタンパク質に導入される。所期の遺伝子の突然変異誘発標的部位に突然変異が導入される。従って、ｄ）で提供される細胞のパネルは、提供された複数の異なるドナー核酸テンプレートのライブラリーのドナー核酸テンプレートを用いて、誘導されたＤＳＢ又は一本鎖ニックのＨＤＲが生じた細胞を含み、或いは斯かる細胞が濃縮されテイルことが好ましい。工程ｄ）により提供される細胞のパネルは、少なくとも４％、好ましくは少なくとも６％、より好ましくは少なくとも８％、更に好ましくは少なくとも１２％、更に好ましくは少なくとも１５％、更に好ましくは少なくとも２０％、更に好ましくは少なくとも３０％、更に好ましくは少なくとも４０％、更に好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％の細胞が、複数の異なるドナー核酸テンプレートに含まれる突然変異のうちの一つを、突然変異誘発標的部位に含むことが好ましい。
【０１１１】
本開示にて提供される方法において、複数の異なるドナー核酸テンプレートのライブラリーを使用することにより、得られる細胞のパネルは、前記所期のタンパク質の複数の異なる突然変異体を含む。従って、本開示にて提供される製造方法では、工程ｄ）において提供される前記細胞のパネルが、前記所期のタンパク質の複数の異なる突然変異体を発現する細胞のプールを含み（或いは、好ましくは斯かる細胞のプールであり）、ここで各細胞において、前記複数の異なる突然変異体のうちの一つが、単一の遺伝子コピーから発現される。従って、前記作製された細胞のパネルが、所期のタンパク質の異なる突然変異体を発現する異なる複数の細胞を含む。前記の異なる複数の細胞を一つのプールとして培養してもよい。或いは、前記異なる複数の細胞を個別に培養してもよい。これらの細胞を個別に培養することで、所期のタンパク質の個別の突然変異体の精製及び／又は分析が容易となる。従って、本開示にて提供される製造方法の一側面によれば、工程ｄ）において提供される前記細胞のパネルは、それぞれ異なる突然変異体を発現する細胞が個別に培養された細胞のライブラリーである。本発明のこの側面によれば、本開示にて提供される製造方法は更に、工程ｃ）とｄ）との間に、工程ｃ）で選択及び／又は濃縮された細胞から、それぞれ異なる突然変異体を発現する細胞を分離する工程を含んでいてもよい。
【０１１２】
本発明によれば、（作製された細胞のパネルに含まれる）前記所期のタンパク質の１又は２以上の突然変異体の核酸及び／又はアミノ酸配列を決定してもよい。所期のタンパク質の突然変異体のヌクレオチド又はアミノ酸配列の分析は、生成された突然変異を決定し、及び／又は、所望の突然変異体をクローニングするのに有用である。従って、本発明の一側面によれば 本開示にて提供される製造方法 更に、工程ｃ）で選択及び／又は濃縮され、或いはｄ）で提供された細胞に含まれる、前記所期のタンパク質の前記複数の異なる突然変異体をコードする遺伝子の１又は２以上の核酸配列を決定すること、或いは、工程ｃ）で選択及び／又は濃縮され、或いはｄ）で提供された細胞に含まれる、前記所期のタンパク質の前記複数の異なる突然変異体の１又は２以上のアミノ酸配列を決定することを含む。
【０１１３】
前記細胞のパネル（別名「細胞ライブラリー」又は「細胞集団」）は、１００，０００から数十億の細胞を含むことが好ましい。例えば、ＦＡＣＳの場合、通常は２〜３億個の細胞（例えば１００，０００，０００〜３００，０００，０００個の細胞）が使用される。パニングの場合、例えば１ｍＬ当たり約５００,０００個の細胞を含むリットル単位の懸濁細胞培養が使用されうる。従って、パニングの場合、数十億の細胞が適用されうる。本発明の方法で使用される細胞は、細胞修復、例えばＨＤＲ（特に相同組換え）が生じうる限り、原則としてどのような細胞であってもよい。斯かる細胞は本技術分野で周知である。全ての２倍体生物（複製細菌や複製単数体酵母のように、たとえ２倍体性が一過的なものであったとしても）において、原則としてＨＤＲを誘導することができる。例えば、本開示にて提供される手段及び方法によれば、細胞は（例えばＨＤＲ、特に相同組換えが生じうる）如何なる原核細胞又は（例えばＨＤＲ、特に相同組換えが生じうる）如何なる真核細胞であってもよい。例えば、本発明で使用される細胞は、例えば酵母細胞、（例えばＨＤＲ、特に相同組換えが生じうる）非哺乳類脊椎動物細胞、（例えばＨＤＲ、特に相同組換えが生じうる）植物細胞、（例えばＨＤＲ、特に相同組換えが生じうる）昆虫細胞、又は（例えばＨＤＲ、特に相同組換えが生じうる）哺乳類細胞からなる群より選択される。好ましくは、哺乳類細胞又は非哺乳類脊椎動物細胞が使用される。最も好ましくは、哺乳類細胞が使用される。特に好ましい非哺乳類脊椎動物細胞は、ＤＴ−４０細胞である。これは、トリ白血病ウイルスによりホワイトレグホーン（white leghorn）種の鶏に誘導された滑液嚢リンパ腫由来のＢ細胞系列の細胞である。本発明での使用に特に好ましい哺乳類細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞（別名として、ヒト胚性腎２９３細胞、ＨＥＫ−２９３、２９３細胞、２９３Ｔ細胞又はＨＥＫ細胞と呼ばれる場合もある）、リンパ腫細胞系（例えばＮＳ０、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４）、白血病細胞系、ジャーカット（Jurkat）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary：ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＣ１２細胞、抗体産生ハイブリドーマ細胞系、不死化ヒトＢ細胞系、又は本技術分野で公知の他の不死化ヒト細胞系等が挙げられる。
【０１１４】
本開示にて提供される製造方法では、培養期間は、使用される個々の細胞型に応じて調整すればよい。ＨＤＲの誘導後の培養期間（即ち工程ａ）及びｂ）の後の培養期間）の間に、前記所期のタンパク質の突然変異体の発現が生じる。その後、本開示にて提供される製造方法の工程ｃ）において、所期のタンパク質を（例えば所期のタンパク質及びマーカータンパク質を含む融合タンパク質の形で）含む細胞を選択及び／又は濃縮することができる。例えば、細胞が哺乳類細胞である場合、工程ａ）及びｂ）の後に、斯かる細胞を少なくとも４８時間、好ましくは少なくとも７２時間最も好ましくは少なくとも９６時間に亘って培養すればよい。本開示において記載するように、工程ａ）及びｂ）は同時に実施することが好ましい。従って、工程ａ）及びｂ）を同時に実施した後に、上述の培養期間を設けることが好ましい。
【０１１５】
本開示にて提供される製造方法で製造される細胞のパネルは、前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善された、及び／又は、新たな活性を有する、（所期のタンパク質の）突然変異体を発現する細胞を含んでいてもよい。従って、本開示にて提供される方法の工程ｄ）において細胞のパネルを提供した後、第一の活性が改善された、及び／又は、新たな活性を有する突然変異体を特異的に濃縮するための更なる工程ｅ）を実施してもよい。従って、本発明の一側面は、本開示にて提供される製造方法であって、前記所期のタンパク質の前記複数の突然変異体前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなり、ここで前記方法が更に、ｅ）前記の細胞のパネルから、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体を発現する第二の細胞のパネルを選択及び／又は濃縮することを含む方法に関する。
【０１１６】
或いは、本開示にて提供される製造方法の工程ｃ）において、改善された第一の活性及び／又は新たな活性を直接、特に前記改善された第一の活性及び／又は新たな活性を有する突然変異体を発現する細胞の選択及び／又は濃縮に用いてもよい。例えば、所期のタンパク質が蛍光タンパク質である場合、本開示にて提供される方法の工程ｃ）において、改善された蛍光（例えば改善された第一の活性）を有する前記所期のタンパク質の突然変異体を発現する細胞を、選択的に濃縮してもよい。
【０１１７】
従って、本発明の更なる側面は、本開示にて提供される製造方法であって、前記所期のタンパク質の複数の突然変異体前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなり、ここで工程ｃ）が、前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体を選択及び／又は濃縮することを含む方法に関する。
【０１１８】
本開示にて提供される製造方法は、所期のタンパク質と比較して異なる活性又は改変された活性を有する（所期のタンパク質の）突然変異体のスクリーニングを可能とする点で有利である。従って、本発明は、前記野生型の所期のタンパク質と比較して異なる又は改変された（例えば生物学的）活性を有する所期のタンパク質の複数の突然変異体をスクリーニングするための方法、即ち、同定するための方法であって、
ａ）本発明の製造方法により得られた前記の細胞のパネルから、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体を発現する、第二の細胞のパネルを選択及び／又は濃縮し、
ｂ）前記第二のパネルにより発現される前記所期のタンパク質の突然変異体のアミノ酸配列を決定し及び／又は前記第二のパネルにより発現される前記所期のタンパク質の突然変異体をコードする遺伝子の核酸配列を決定する
ことを含む方法を提供する。
【０１１９】
上述のように、本開示にて提供される製造方法の工程ｃ）において、改善された第一の活性及び／又は新たな活性を直接、改善された第一の活性及び／又は新たな活性を有する突然変異体を発現する細胞の選択及び／又は濃縮に使用してもよい。従って、本発明は、前記野生型の所期のタンパク質と比較して異なる又は改変された（例えば生物学的）活性を有する、所期のタンパク質の複数の突然変異体をスクリーニングするための、即ち、同定するための更なる方法であって、
ａ）本開示にて提供される製造方法において、工程ｃ）が、前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体を選択及び／又は濃縮することを含み、更に、
ｂ）前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体の少なくとも１つのアミノ酸配列を決定し；及び／又は前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体をコードする遺伝子の少なくとも１つの核酸配列を決定する
ことを含む方法を提供する。
【０１２０】
本開示にて提供される製造方法又は本開示にて提供されるスクリーニング方法は更に、前記野生型の所期のタンパク質と比較して異なる又は改変された生物活性を有する、前記所期のタンパク質を発現させること、及び、任意により斯かる細胞を採取することを含んでいてもよい。前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善された、及び／又は、新たな活性を有する突然変異体を発現する細胞を選択及び／又は濃縮するために使用できる方法として、本技術分野では幾つかの方法が公知である。例えば、前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体の選択及び／又は濃縮は、例えばＦＡＣＳ、磁気活性化細胞選別法、マイクロ流体細胞選別法、及び／又は、ビーズを用いた細胞単離法等を用いて実施することができる。
【０１２１】
上述のように、「所期のタンパク質」（protein of interest）及び「野生型の所期のタンパク質」（wild-type protein of interest）という語は、本開示では相互交換可能に使用され、本開示にて提供される方法において突然変異型性の対象となるタンパク質を指す。従って、斯かる既知の変異体を更に修飾することが所望される場合には、「野生型の所期のタンパク質」という語は、特定のタンパク質の既知の変異体を指す場合もある。本開示において「第一の活性」（first activity）とは、新たに同定される又は本技術分野で公知の所期のタンパク質の活性を指す。本開示において「新たな活性」（new activity）という語は、前記「第一の活性」とは異なる更なる活性を意味する。従って、「新たな活性」とは、「第一の活性」とは異なる活性であれば、新たに同定される活性であってもよく、本技術分野で公知であってもよい。異なる活性又は改変された活性は、増加した活性であることが好ましい。例えば、増加した活性を有する所期のタンパク質の複数の突然変異体は、野生型の所期のタンパク質の当該活性と比較して、例えば少なくとも１０１％、好ましくは少なくとも１１０％、より好ましくは少なくとも１２０％、又は最も好ましくは少なくとも１５０％の活性を有していてもよい。
【０１２２】
例えば、本開示にて提供される製造方法又はスクリーニング方法の一側面によれば、前記所期のタンパク質が蛍光タンパク質であると共に、前記第一の活性及び／又は前記新たな活性（例えば前記第一の活性）は、蛍光である。細胞を蛍光に基づいて選別する方法は、本技術分野では周知であり、例えばＦＡＣＳ等が挙げられる。本開示にて提供される製造方法又はスクリーニング方法の他の側面によれば、所期のタンパク質が抗体であると共に、前記第一の活性及び／又は前記新たな活性（例えば前記第一の活性）が抗原結合性である。前記抗体の潜在的な「新たな活性」としては、例えば他の生物内の対応する抗原に対する交差反応性などが挙げられる。ヒト抗原に対する抗体であって、非ヒト動物の対応する抗原に対する交差反応性を有する抗体は、前臨床動物実験を実施する際に望ましい。本開示にて提供される製造方法又はスクリーニング方法の他の側面によれば、前記所期のタンパク質が酵素であると共に、前記第一の活性及び／又は前記新たな活性 （例えば前記第一の活性）が前記酵素の酵素活性である。タンパク質のプールから所望の活性を有する細胞を同定するための方法は、本技術分野で周知であり、例えばWojcik, 2015, Int. J. Mol. Sci. 16: 24918-24945; and Xiao, 2015, Ind. Eng. Chem. Res. 54: 4011-4020等に記載されている。
【０１２３】
上述のように、本開示にて提供される手段及び方法によれば、所期のタンパク質は、例えば抗体であってもよい。例えば、天然変異体と比較して新たな特異性又はより高い親和性を有するＦａｂ断片、単一鎖抗体、又は全長ＩｇＧ等の遺伝子操作及び選択において、本発明は多数の利点を提供する。
【０１２４】
この目的のために、Ｆａｂ断片、単一鎖抗体、又は軽鎖及び重鎖ＩｇＧをコードする遺伝子を、細胞内に単一コピーとして挿入してもよい。本開示にて上述及び後述するように、フレームシフト又は他の不活性化突然変異を、前記突然変異誘発標的部位の近傍に挿入してもよい。この例では、前記突然変異誘発標的部位は、ＣＤＲ（complementarity determining regions：相補性決定領域）をコードする領域内、即ち、抗原結合ドメインの領域内に位置することが好ましい。しかし、前記突然変異誘発標的部位は、抗体機能に影響を及ぼす他の部位に存在してもよい。必要であれば（例えば、ヒト細胞系においてヒト化抗体遺伝子を多様化するなどの場合には）、外因性遺伝子のみが多様化されるように、内因性抗体遺伝子配列とはコドンを区別してもよい。
【０１２５】
まずはライブラリーから、リーディングフレームが有効に回復した細胞、及び／又は、融合されたマーカー遺伝子（例えば蛍光タンパク質又は抵抗性マーカー）が生成した細胞をスクリーニングする。抗体ライブラリーによる効率的な提示及びその後のスクリーニングのために、表面ディスプレイ技術を用いて、抗体変異体が細胞表面に発現させてもよい。所期のタンパク質をコードする遺伝子カセットの単一コピーを細胞ゲノム内に挿入する前に、抗体変異体を細胞表面に移送するための標的化配列を、斯かる遺伝子カセットに付加してもよい。斯かる技術は非常に強力なツールとなっており、例えばＦａｂ断片、単一鎖抗体、又は全長ＩｇＧを、細胞、例えば哺乳類細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞の表面に機能的に提示させる上で有効である。有効なディスプレイ及びスクリーニングのためのプロトコールは、本技術分野では標準的であり、例えばHo, 2008, Methods in Molecular Biology, 525: pp 337-352; and Zhou, 2012, Methods in Molecular Biology, 907: 293-302により提供されている。斯かる表面ディスプレイ抗体ライブラリーのスクリーニングは、例えばＦＡＣＳ選別により行うことができる。
【０１２６】
この目的のために、フルオロフォア結合抗原を用いて、斯かる特定の抗原に親和性を有する抗体を提示する細胞のみを標識することができる。ＦＡＣＳ選別を行うことで、これらの細胞を収穫することができる。スクリーニングを繰り返し実施することで、ストリンジェンシーを上昇させることができる。ここで非標識抗原の量を増やして細胞を洗浄し、更にＦＡＣＳによる選別を行ってもよい。これにより、所与の抗原に対して高い親和性を有する変異体を同定することが可能となる。
【０１２７】
或いは、パニングアプローチにより、所望の抗体を同定することも可能である。この目的のためには、例えば、特定の表面に所望の抗原を結合させればよい。この表面上で、抗体ライブラリーを細胞表面に発現する細胞をインキュベートする。有効な抗体を発現する細胞は当該表面に結合する。非結合細胞を洗い落とし、加える可溶性抗原を増やして更に洗浄を繰り返すことで、ストリンジェンシーを上昇させることができる。数回の洗浄の後、表面に結合して残った細胞を、トリプシン処理等の適切な方法で採集し、回収すればよい。
【０１２８】
選択された抗体変異体をコードする遺伝子を単離するには、これらの細胞からポリＡ−ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲを実施してこれらの遺伝子をｃＤＮＡへと転写すればよい。その後、それらを適切なベクターにサブクローニングして、更なる分析に供すればよい。
【０１２９】
上述のように、本開示にて提供される製造方法によれば、非所望の突然変異のバイアスを受けることなく、細胞ライブラリー（即ち細胞のパネル）を効率的に産生できる点で有利である。従って、作製された細胞ライブラリー内では、複数のアミノ酸がそれらのコドン占有率に応じた割合で、ランダムに挿入、欠失、及び／又は置換されている。しかし、所望の突然変異のバイアスを誘導するよう特別に設計されたドナー核酸テンプレートを用いることにより、所望の突然変異のバイアスをプログラムすることも可能である。従って、本開示にて提供される細胞ライブラリーは、突然変異のバイアスを有さない、特定の部位がランダムに改変された突然変異体、又は、特定のドナー核酸テンプレートを有することにより生成された所望の突然変異のバイアスを有する、特定の部位がランダムに改変された突然変異体を含む。結果として、本開示にて提供される細胞ライブラリーは、広範なバリエーションを有する。
【０１３０】
例えば、本開示にて提供される製造方法を用いれば、例えば僅か８アミノ酸という小さな領域を標的化した場合でも、結果として２５０億を超える変異体のライブラリーを得ることができる。斯かる大規模なプールからライブラリーを作製するので、重複は殆ど生じない。
【０１３１】
これに対して、従来技術の突然変異誘発方法、例えばエラープローン（Error Prone）ＰＣＲ等では、バイアスを排したコドンの使用は不可能である上に、より重要な点として、ＰＣＲ複製プロセスゆえに冗長性が極めて高くなってしまう（即ち、ライブラリーの大部分を同一変異体の多数のコピーが占めることとなる）。これにより、スクリーニングの手間の大部分が無駄になってしまう。エラープローン（Error Prone）ＰＣＲは、例えばFirth, 2005, Bioinformatics 21(15): 3314-3315に記載されている。本文献の実験によれば、１億個の変異体のライブラリーの中で、６以上の突然変異を有する変異体は僅か約１００，０００にすぎず、５５０万もの複製が生じていることになる。
【０１３２】
本開示にて提供される製造方法により作製される細胞ライブラリーは、従来技術の細胞ライブラリー、例えば欧州特許公開第２３１９９１８Ａ１号等に開示の細胞ライブラリーとは顕著に異なる。本文献では、多様化された配列をレンチウイルスプラスミドにクローン化してレンチウイルスを生成し、これを細胞に感染させて安定に組み込ませる。欧州特許公開第２３１９９１８Ａ１号では、レンチウイルスがゲノム内の異なる部位に組み込まれているため、異なる複数の細胞内で発現されたレンチウイルスによりコードされるタンパク質は、（隣接する制御性配列が異なるために）強い変動要因に晒されることになる。これに対して、本開示にて提供される方法により作製される細胞ライブラリーでは、多様化された（即ち説く禅変異を生じさせた）所期のタンパク質は、同一のゲノム遺伝子座から発現されるために、異なる複数の細胞内で発現されたタンパク質であっても、高い再現性及び比較可能性を有することになる。更に、（欧州特許公開第２３１９９１８Ａ１号に記載のように）ＤＮＡライブラリーを大型のレンチウイルスプラスミドにクローニングするのは、極めて効率が悪く、惹いては、作製される所期のタンパク質の変異体（即ち突然変異体）の多様性も大幅に損なわれることになる。従って、本発明の方法により提供される細胞ライブラリーの方が、所期のタンパク質の異なる変異体をより多く含むことになる。更に、欧州特許公開第２３１９９１８Ａ１号に記載のレンチウイルスを用いた方法では、小型のタンパク質しか多様化できない。
【０１３３】
本開示にて提供される製造方法を用いると、例えば６つのアミノ酸位置をランダム化する場合、以下の式で計算されるように、１０００万個の変異体のライブラリーを得ることができる。
【数１】
2019523005.tif 000002
ここで
ｐは被覆率（Coverage）
ｓは試料の数、
ｎは変異体の数である。
【数２】
2019523005.tif 000003
ｐ＝１４．４７％、即ち９．２６百万（ｐ×ｎ）個の異なる変異体が、１千万のプールから得られることになる。
【０１３４】
従って、本開示にて提供される細胞ライブラリーでは、一細胞集団当たりの異なる突然変異体の数は、従来技術の細胞ライブラリーと比較して多くなる。従って、提供される細胞ライブラリーは、本技術分野で公知の細胞ライブラリーと比較して、特性の改善された所期のタンパク質の複数の突然変異体をより効率的にスクリーニングするツールとなる点で有利である。従って、本発明の更なる側面は、本開示にて提供される方法により得られる細胞ライブラリーに関する。
【０１３５】
本発明によれば、本開示にて提供される細胞ライブラリーを、前記野生型の所期のタンパク質と比較して異なる又は改変された生物活性を有する、所期のタンパク質の複数の突然変異体の同定に使用してもよい。同定された所期のタンパク質の突然変異体は、ホワイト・バイオテクノロジーに適用することができる。例えば、同定される突然変異体は、疾患の処置、即ち治療及び／又は予防に使用される抗体であってもよい。また、同定される突然変異体は、例えば生分解性プラスチック等の工業生産等に使用される酵素であってもよい。改変された酵素（例えばセルラーゼ）の変異体を、繊維や紙の産生に使用してもよい。或いは、同定された酵素の突然変異体を、バイオ燃料の製造に使用してもよい。例えば、バイオテクノロジーによって製造されたエタノールを、ガソリンの代替燃料として使用することができる。また、所期のタンパク質は、疾患の処置に有用となるように改変したサイトカイン又は成長因子であってもよい。
【０１３６】
本開示にて提供される方法を実現する手段は、キットの一部であってもよく、これを用いて本開示にて提供される細胞のパネル（即ち細胞のライブラリー）を作製してもよい。従って、本発明は、
（ｉ）所期の遺伝子を１コピーのみ含む細胞、
（ii）本開示にて定義した複数の異なるドナー核酸テンプレートのライブラリー、及び／又は
（iii）部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼ、或いは、部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードするポリヌクレオチド
を含むキットに関する。
【０１３７】
本発明のキットにおいて、所期の遺伝子は、本開示において記載する不活性化突然変異を含んでいてもよい。本発明のキットは更に、（１又は２以上の）反応緩衝剤、保存溶液、洗浄溶液、及び／又は、本開示に記載される方法の実施に必要なその他の試薬若しくは材料を含む。更に、本発明のキットの要素を、個別のバイアル又はボトルに梱包してもよく、或いは、容器又はマルチコンテナーユニットに纏めて梱包してもよい。斯かるキットは更に、使用指示書を含んでいてもよい。本発明のキットは、標準的な手順により製造することが好ましい。斯かる手順は当業者には既知である。上述したように、本開示にて提供されるキットは、本開示にて提供される方法を実施するのに、特に本発明の細胞ライブラリーを製造する方法の実施に有用である。
【０１３８】
本発明では、「同一性」（identity）又は「％同一性」（percent identity）という語は、アミノ酸又はヌクレオチド配列が、本開示に示す配列に対して、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％、更に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有することを意味する。ここで、同一性の値が高い配列ほど、同一性の値が低い配列と比較して好ましい。本発明によれば、２以上の核酸又はアミノ酸配列に関して「同一性」又は「％同一性」とは、比較ウィンドウ内で最大限対応するよう比較及びアラインした場合に、或いは本技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを用いて指定領域内を測定した場合に、或いは手動でアラインメントし、目視で検証した場合に、２以上の配列が同一であるか、指定された百分率のアミノ酸残基又はヌクレオチドが同一である（例えば、例えば配列番号１９〜２５の何れかのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である）ことを意味する。前記指定の同一性は、全長のアミノ酸又はヌクレオチド全体に亘って存在することが好ましい。
【０１３９】
本技術分野では公知のように、当業者であれば、種々のアルゴリズム、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷコンピューター プログラム（Thompson, 1994, Nucl Acids Res, 2: 4673-4680）又はＦＡＳＴＤＢ（Brutlag, 1990, Comp App Biosci, 6: 237-245）等を用いて、複数の配列間の％同一性を決定する手法を理解しうる。また、当業者であれば、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０ アルゴリズムも利用可能である（Altschul, 1997, Nucl Acids Res 25: 3389-3402; Altschul, 1993, J Mol Evol, 36: 290-300; Altschul, 1990, J Mol Biol 215: 403-410）。例えば、ＢＬＡＳＴ ２．０（ＢＬＡＳＴはBasic L℃al Alignment Search Toolの略称：Altschul, 1997, loc. cit.; Altschul, 1993, loc. cit.; Altschul, 1990, loc. cit.）を用いて、局所的な配列アラインメントを行うことができる。上述のＢＬＡＳＴによれば、両ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のアラインメントを行って配列の類似性を決定することができる。ＢＬＡＳＴはアラインメントの局所性ゆえに、同様の配列の正確なマッチ及び同定に特に有用である。ＢＬＡＳＴを用いた類似のコンピューター技術（Altschul, 1997, loc. cit.; Altschul, 1993, loc. cit.; Altschul, 1990, loc. cit.）を用いて、例えばGenBankやEMBL等のヌクレオチドデータベースにおける同一または関連する分子の検索を行うことも可能である。
【０１４０】
本明細書で使用される「標的配列特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」（target sequence specific CRISPR RNA）又は「ｃｒＲＮＡ」という語は、本技術分野では一般に知られている語であり、例えばRan, 2013, Nature Protocols 8 (11): 2281-2308等に記載されている。ｃｒＲＮＡは通常、長さ１０〜３０、好ましくは１５〜２５（例えば約２０）ヌクレオチドの標的配列に対して相補的な（或いは標的配列の一部に対して相補的な）配列を、長さ２１〜４６ヌクレオチドの２つのダイレクトリピート（direct repeats：ＤＲ）に挟まれた状態で含む。ｃｒＲＮＡの３'に配置されたＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的で且つそれにハイブリダイズする。そのｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質にハイブリダイズする。ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９ヌクレアーゼとの使用に好ましいＤＲ配列は、配列番号１１（即ちＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡ）に示す配列である。他の細菌種のＣａｓ９ヌクレアーゼと共に機能するＤＲ配列は、Deltcheva, 2011, Nature, 471: 602-607に示すように、それぞれのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓオペロンに生じる配列リピートのバイオインフォマティクス分析、及び、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びｔｒａｃｒＲＮＡと仮想的ＤＲ配列で挟まれた標的配列との実験的結合試験で同定される。
【０１４１】
本明細書で使用する場合、「トランス活性化ｃｒＲＮＡ」（trans-activating crRNA）又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ）」という語は、本技術分野で周知であり、例えばHsu, 2014, Cell 157: 1262-78, Yang, 2014, Nature Protocols, 9:1956-1968 and Heidenreich, 2016, Nature Reviews Neurosciences, 17: 36-44に記載されている。「ｔｒａｃｒＲＮＡ」とは、ｃｒＲＮＡと相補的且つ塩基対をなす小型ＲＮＡであり、これによりｃｒＲＮＡｒとＲＮＡ二本鎖を形成する。また、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡと相補的且つ塩基対をなす小型ＲＮＡであってもよい。ここで、このｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼによって切断され、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを形成する。特に、この「ｔｒａｃｒＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡ又はｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのパリンドロミック・リピートに相補的な配列を含む。これにより、ダイレクトリピートを有するｃｒＲＮＡ又はｐｒｅ−ｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることができる。このｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｅｒＲＮＡハイブリッドは通称「ガイドＲＮＡ」といい、侵入した核酸をＣａｓ９ヌクレアーゼが切断するのを補助する。ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９ヌクレアーゼと使用するのに好ましいｔｒａｃｒＲＮＡ配列を、本開示では配列番号１２に示す（即ちＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＴＴＴである）。
【０１４２】
所望の標的配列 （例えばa 所望の突然変異誘発標的部位）を標的とする少なくとも１つの標的配列特異的ｃｒＲＮＡ及び少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡ（即ち単一ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）を含むキメラＲＮＡ分子は、常用の技術を用いて容易に設計することができる。例えば、ｓｇＲＮＡは、ＰＡＭ部位に隣接する配列（例えばＳｐＣａｓ９の場合はＮＧＧ）に対して相補的な、長さ少なくとも１７ヌクレオチド（例えば約１９塩基対）の配列を含んでいてもよい。加えて、ｓｇＲＮＡは、前記細胞のゲノム内の配列とは（所期の遺伝子を除いて）実質的に相動性を有しないことが好ましい。例えば、斯かるキメラＲＮＡは、例えばJinek, Science, 337: 816-821に示すものであってもよい。単一ガイドＲＮＡを得るための更なる方法は、Ran, 2013, Nat Protoc 8 2281-2308に記載されている。特に、単一ガイドＲＮＡをバイアスのないゲノムワイド分析により設計し、Ｃａｓ９によるオフ標的開裂の可能性を最小化してもよい（Ran, 2013, Nat Protoc 8 2281-2308）。このためにオンラインツール（例えばＣＲＩＳＰＲ設計ツール、http://crispr.mit.edu/）を用いてもよい。
【０１４３】
当業者であれば、所望の標的配列（例えば所望の突然変異誘発標的部位）を標的とする二重ガイドＲＮＡ（即ち、少なくとも１つの標的配列特異的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子及び少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含むガイドＲＮＡ）を設計する方法を、容易に知ることができる。例えば、斯かる二重ガイドＲＮＡの設計は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを個別に設計することにより行うことができる。ｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的な配列と、ＤＲ配列の部分または全体配列とを用いて設計することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡの合成は、Jinek, Science, 337: 816-821に示す方法で行うことができる。
【０１４４】
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼのためのガイドＲＮＡの生成は、本技術分野で周知である。例えば、斯かるガイドＲＮＡは、Zetsche, 2015, Cell, 163: 759-71に記載の方法で設計できる。斯かるｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的な（或いは標的配列の一部に対して相補的な）長さ１０〜３０、好ましくは１５〜２５ヌクレオチドの配列を含むと想定される。斯かるＣｐｆ１のためのｃｒＲＮＡは、標的配列に対して相補的な（或いは標的配列の一部に対して相補的な）、長さ約２０ヌクレオチドの配列と、それに続く長さ約１９ヌクレオチドのヌクレオチド配列とを含むことが好ましい。この１９ヌクレオチド配列は、ダイレクトリピート内の短いステムループ構造である。Ｃｐｆ１は更なるｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。
【０１４５】
本開示において「相同標的化修復」又は「ＨＤＲ」とは、通常は相同組換えにより実施される、細胞内でＤＳＢ又は一本鎖ニックを修復する機構を指す。例えばCong, 2013, Science 339 819-23; Pardo, 2009, Cellular and Molecular Life Sciences 66 (6): 1039-1056; Bolderson, 2009, Clinical Cancer Research, 15: 6314-6320を参照。即ち、「相同標的化修復」又は「ＨＤＲ」という語は、好ましくは相同組換えを指す。ＨＤＲ修復機構は、核内にＤＮＡの騒動断片（即ちドナー核酸テンプレート）が存在する場合にのみ、細胞が使用することができる。相同ＤＮＡ断片が不在だと、代わりに非相同末端連結（non-homologous end joining：ＮＨＥＪ）と呼ばれる他のプロセスが生じうる。斯かる極めてエラー許容性（error-prone）の高いＮＨＥＪ経路は、種々の長さの挿入及び欠失（insertions and deletions：ＩＮＤＥＬS）を誘導することにより、フレームシフト突然変異を生じさせ、結果として遺伝子をノックアウトする。これに対して、ＨＤＲ経路は、相同ＤＮＡドナーテンプレート（即ち、ドナー核酸テンプレート）と損傷を受けたＤＮＡ部位との間に精密な組換え事象を生じさせ、結果として一本鎖又は二本鎖切断が正確に修正される。従って、ＨＤＲは、突然変異又はトランス遺伝子をゲノム内に特異的に導入するのに使用される。斯かるドナー核酸テンプレート（通常はｓｓＯＤＮ）は、修復されるべき領域と相同な配列の領域を含む必要がある。相同組換えがＨＤＲの優先的な手法と考えられているが、単鎖化したオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を修復テンプレートとしてライブラリーに挿入する場合には、別の第二の機構がＨＤＲに関与していることを示す証拠がある。Aarts and te Riel (2010, J. Cell. Mol. Med. 14(6B): 1657-1667)の教示は、オリゴ媒介性ＨＤＲが、複製フォークのコンテクストにおいて、ゲノム内の標的領域に対するオリゴヌクレオチドの相同性領域のアニーリングを伴うことを示している。本研究は、岡崎断片様のプライミングの関与を示唆している。即ち、複製フォークの進行の際に斯かるオリゴヌクレオチドが遺伝子標的部位物理的に組み込まれるものと考えられる。
【０１４６】
「相同組換え」（homologous recombination）という語は、同様のヌクレオチド配列を含む二本のＤＮＡ鎖が遺伝材料を交換する遺伝子組換え機構を指す。細胞は相同組換えを、損傷を受けたＤＮＡの修復、特に一本鎖又は二本鎖切断の修復のために使用する。相同組換えの機構は当業者には周知であり、例えばPaques, 1999, Microbiol Mol Biol Rev, 63: 349404に記載されている。
【０１４７】
本発明の方法によれば、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼ（例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ）が、工程ａ）の細胞内に存在し、或いは斯かる細胞内に導入されてもよい。例えば、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼは、タンパク質として存在し、或いは導入されてもよい。或いは、前記の部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼ（例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ）は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの形態で導入されてもよい。当然ながら、斯かるポリヌクレオチドは、前記部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼ（例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ）、及び／又は、前記ガイドＲＮＡを、発現可能な形態でコードし、これが工程ａ）の細胞内で発現することにより、機能的な部位特異的ヌクレアーゼ又はニッカーゼと機能的なガイドＲＮＡとが生じることになる。機能的なポリペプチド又はＲＮＡの発現を実現する手段及び方法は、本技術分野で周知である。例えば、斯かるコーディング配列がベクター内、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、又は遺伝子工学等で従来使用されている他のベクター内に存在していてもよい。斯かるベクターは、プラスミドベクターであることが好ましい。ベクター内に挿入されるコーディング配列は、例えば標準的な方法により合成することができ、或いは天然材料から単離することができる。斯かるコーディング配列は更に、転写制御要素、及び／又は、他のアミノ酸コーディング配列と連結されていてもよい。斯かる制御性配列は当業者には周知であり、例としては、限定されるものではないが、転写の開始を誘導する制御性配列、内部リボソーム侵入部位（internal ribosomal entry sites：ＩＲＥＳ）（Owens, 2001, Proc Natl Acad Sei, USA, 98: 1471-1476）、及び任意により、転写の終了及び転写産物の安定化を誘導する制御要素が挙げられる。転写の開始を誘導する制御要素の非限定的な例としては、翻訳開始コドン、転写エンハンサー、例えばＳＶ４０エンハンサー、インシュレーター、及び／又はプロモーター、例えばサイトメガロウイルス（cytomegalovirus：ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶ（Rous sarcome virus）プロモーター、ｌａｃＺプロモーター、鶏βアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（鶏βアクチンプロモーターとサイトメガロウイルス前初期エンハンサーとの組み合わせ）、ｇａｉ１０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーターＣａＭキナーゼプロモーター、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、又はカリフォルニアガマキンウワバ多核ポリヘドロシスウイルス（autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus：ＡｃＭＮＰＶ）多面性（polyhedral）プロモーター等が挙げられる。転写終了を誘導する制御要素の非限定的な例としては、Ｖ４０ポリＡ部位、ｔｋ−ポリＡ部位、又はＳＶ４０、ｌａｃＺ若しくはＡｃＭＮＰＶ多面性（polyhedral）ポリアデニル化シグナル等が挙げられる。更なる制御要素としては、翻訳エンハンサー、コザック（Kozak）配列、及びＲＮＡスプライシングのドナー及びアクセプター部位に挟まれた介在配列等が挙げられる。更に、例えば複製起点、薬物抵抗遺伝子又はレギュレーター（誘導性プロモーター���一部として）等の要素が含まれていてもよい。
【０１４８】
本開示において「ポリヌクレオチド」（polynucleotide）、「核酸」（nucleic acid）、「核酸配列」（nucleic acid sequence）、又は「ヌクレオチド配列」（nucleotide sequence）という語は、本開示では相互交換可能に使用され、ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ、及びＲＮＡを指す。本発明で使用されるポリヌクレオチドは、天然でもよく、（半）合成由来のものでもよい。従って、斯かるポリヌクレオチドは、例えば従来の有機化学のプロトコールに従って合成された核酸分子であってもよい。当業者であれば、ポリヌクレオチドの調製及び使用には精通しているであろう（例えばSambrook and Russel “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)等を参照）。本発明で使用されるポリヌクレオチドは、本技術分野で公知の核酸模倣分子を含んでいてもよく、斯かる核酸模倣分子からなるものであってもよい。当業者であれば容易に理解するように、これらは更なる非天然又は誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。本発明に係る核酸模倣分子又は核酸誘導体としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート核酸、ホスホロアミド核酸、モルフォリノ核酸、ヘキシトール核酸（hexitol nucleic acid：ＨＮＡ）、ペプチド核酸（peptide nucleic acid：ＰＮＡ）、及びロックド核酸（locked nucleic acid：ＬＮＡ）が挙げられる。
【０１４９】
本開示において「遺伝子」（gene）という語は、ヌクレオチドからなるＤＮＡの座（又は領域）を指す。遺伝子は、生物のゲノム内における遺伝の分子単位である。しかし、本開示において「遺伝子」という語は、生物のゲノム内に存在するヌクレオチド配列には限定されない。本開示において「遺伝子」という語は、タンパク質をコードする各ヌクレオチド配列を対象とする。従って、本開示において「遺伝子」という語は、人工的に作成されたヌクレオチド配列、例えばイントロンのないヌクレオチド配列も含む。従って、本開示において「遺伝子」という語は、ｃＤＮＡ配列も含む。従って、本開示において「所期の遺伝子」（gene of interest）又は「所期のタンパク質をコードする遺伝子」（gene encoding (for) the protein of interest）という語は、相互交換可能に使用され、所期のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。前記のヌクレオチド配列は、所期のタンパク質をコードするｃＤＮＡであることが好ましい。「コードする」を意味する“encode”又は“encoding”という語は、それぞれ“encode for”又は“encoding for”という語と相互交換可能に使用される。更に、本開示において「遺伝子コピー」（gene copy）という語は、ヌクレオチド配列のコピーを指す。従って、「単一の遺伝子コピー」（a single gene copy）という語は、特定のヌクレオチド配列の単一のコピーを指すと共に、前記ヌクレオチド配列が特定の細胞のゲノム内で一つしか存在しないことを意味する。
【０１５０】
本開示において「ドナー核酸テンプレート」（donor nucleic acid template）（別名「ＤＮＡドナーテンプレート」（DNA donor template）、例えばHeidenreich, 2016, Nature Reviews Neurosciences, 17: 36-44参照）という語は、ＨＤＲのプロセス、好ましくは相同組換えのプロセスにおいてテンプレートとして機能する、標的配列に導入されるべき修飾を含む核酸配列を意味する。このドナー核酸テンプレートをテンプレートとして使用することで、斯かる修飾を含む遺伝子情報が、所期の遺伝子内にコピーされる。例えば、ドナー核酸テンプレートは、１〜３６ヌクレオチドが異なる点を除いては、所期の遺伝子の一部と同一であってもよい。これにより、相同組換えで１〜１２アミノ酸が導入又は置換される。斯かるドナー核酸テンプレートは、相同組換えによって一部アミノ酸、例えば１〜１２のアミノ酸が欠失するように設計してもよい。本開示において、ドナー核酸テンプレートは、一本鎖核酸分子（即ちｓｓＯＤＮ）であることが好ましい。しかし、プラスミドベクターをドナー核酸テンプレートとして用いてもよい。即ち、（プラスミドに基づく）二本鎖ＤＮＡをドナー核酸テンプレートとして用いてもよい。
【０１５１】
ドナー核酸テンプレートは、挿入されるべき突然変異（即ち、所期の遺伝子に対する修飾）を有する「ドナー核酸配列」（donor nucleic acid sequence）を含む。ドナー核酸テンプレートは更に、ドナー核酸テンプレートの標的配列に対して相同な領域を含む。ここで「ドナー核酸テンプレートの標的配列」（target sequence of the donor nucleic acid template）とは、所期の遺伝子内の突然変異誘発標的部位を取り囲む配列領域である。本開示において「ドナー核酸テンプレートの標的配列に対して相同な領域」（regions homologous to the target sequence of the donor nucleic acid template）とは、いわゆる「相同性アーム」（homology arms）を意味する。相同性アームとは、ドナー核酸テンプレートの標的配列に対して特異的な結合を達成するのに十分な配列同一性を有する領域である。ドナー核酸テンプレートの標的配列に対して相同な領域（相同性アーム）は、所期の遺伝子に挿入されるべき突然変異（即ち修飾）を含む「ドナー核酸配列」の両側に隣接して存在する。換言すれば、相同性アームはドナー核酸配列の５’及び３’末端に存在する。従って、本開示にて提供される方法で使用されるドナー核酸テンプレートは、第一の相同性アームと、それに続くドナー核酸配列と、更にそれに続く第二の相同性アームとを含む。相同性アームは、ドナー核酸配列（即ち突然変異を有する配列）の両側の、好ましくは＞３０ヌクレオチド、より好ましくは３０〜１５０ヌクレオチド、更に好ましくは３０〜８０（例えば４０〜５５）ヌクレオチドの範囲に隣接して存在する。
【０１５２】
「ドナー核酸テンプレートの標的配列に対して相同な領域」（regions homologous to the target sequence of the donor nucleic acid template）は、対応するドナー核酸テンプレートの標的配列と、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、更に好ましくは少なくとも９９％、更に好ましくは少なくとも９９．９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。前記所定の配列同一性は、相同性アームの結合部位として機能する「ドナー核酸テンプレートの標的配列」との関係においてのみ定められる。従って、所期の遺伝子の突然変異誘発標的部位（即ちドナー核酸配列）に挿入されるべき部分がドナー核酸テンプレート内に存在する場合には、全ドナー核酸テンプレートと「ドナー核酸テンプレートの標的配列」との全体の配列同一性は、前記所定の配列同一性とは異なる場合もあり得る。
【０１５３】
所望の突然変異誘発標的部位にＨＤＲ（特に相同組換え）を誘導するドナー核酸テンプレートは、常用の技術、例えばRan, 2013, Nat Protoc 8 2281-2308に記載の技術等を用いて、容易に設計することができる。
【０１５４】
記述のように、本発明において、ドナー核酸テンプレートは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であってもよい。「オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）」という語は、本技術分野では周知であり、デソキシヌクレオチド残基の配列からなる核酸ポリマーである。ＯＤＮは、第二の異なる（即ち、相補的又は部分的に相補的な）オリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズしない場合には、一本鎖ＯＤＮ（ｓｓＯＤＮ）である。但し当然ながら、ｓｓＯＤＮが自身に対して折り畳まれることにより、１本のオリゴデオキシヌクレオチド鎖からなる部分的又は完全な二本鎖分子を形成する場合もある。しかし、ｓｓＯＤＮは、自身に対して折り畳まれて部分的又は完全な二本鎖分子を形成するのではなく、その全長に亘って一本鎖であることが好ましい。本発明において、ＯＤＮとは、オリゴデオキシヌクレオチド及びポリデソキシヌクレオチドの双方を指し、その長さは３０〜６００ヌクレオチド、好ましくは５０〜５００ヌクレオチド、更に好ましくは７０〜３５０ヌクレオチド、最も好ましくは９０〜１５０ヌクレオチドである。例えば、短い配列（例えば長さ１〜３６ヌクレオチドのヌクレオチド配列）を挿入揺する場合、約９０〜１５０ヌクレオチド長のｓｓＯＤＮを使用することができる。ここで、ｓｓＯＤＮは、ドナー核酸配列（即ち突然変異を含む配列）の両側に隣接して、長さ＞３０ヌクレオチド、より好ましくは３０〜１５０ヌクレオチド、更に好ましくは４０〜５５ヌクレオチド（例えば約５０ヌクレオチド）の相同性アームを含むことが好ましい。
【０１５５】
本開示にて上述及び後述するように、本開示にて提供される手段及び方法を用いることにより、インビボにおいて、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系及び相同組換え修復を用いて、外因性組換遺伝子を哺乳類細胞系に対して、１コピーのみ安定に導入し、多様化することが可能となる。例として、蛍光タンパク質mNeonGreenを用いることにより、添付の実施例に示すように、ＣＲＩＳＰＲにより所期の部位を標的化して、長さの異なる多様化されたアミノ酸配列の大きなライブラリーを、相同修復により挿入することが可能となる。この目的のために、リーディングフレームシフトを標的化部位の近傍に選択的に導入し、非蛍光タンパク質としてもよい。添付の実施例において実証するように、切断及び修復によって、所望の多様化が挿入され、リーディングフレームが復元される。変異体を（例えばＦＡＣＳで）分析することにより、大量の変異体及び配列スペースをスクリーニングすることが可能となる。添付の実施例において実証するように、本開示にて提供される方法により、mNeonGreen2というより高い明度（brightness）を有する緑色蛍光変異体の作出に成功している。また、添付の実施例に示すように、このアプローチを非蛍光タンパク質標的に拡大し、多様化されたタンパク質を採集して更なる機能分析に供するために、蛍光タンパク質又は選択マーカーの融合を用いることも可能である。
【０１５６】
上述のように、本発明では、タンパク質mNeonGreen2を改変した。このタンパク質は、mNeonGreenと比較してより高い明度を有する点で有利である。従って、本発明はmNeonGreen2にも関する。従って、本発明の一側面は、
（ａ）配列番号９１に示す核酸配列を有する核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号９２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号９２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子によりコードされるポリペプチド、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の何れかのポリペプチドに対して、少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９８％、更に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドであって、配列番号２８に示すmNeonGreenの位置１４７〜１５０に対応する位置に、アミノ酸「ＤＡＣＷ」を含むポリペプチド、及び、
（ｅ）（ａ）又は（ｃ）に示す核酸分子のヌクレオチド配列に対する遺伝子コードの結果として縮重した核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドに関する。
【０１５７】
本開示にて提供されるmNeonGreen2は蛍光活性を有する。実際に、量子収量と消散係数（extinction coefficient）との積により決定されるmNeonGreen2の全体明度（overall brightness）は、（例えば配列番号２８に示される）mNeonGreenよりも高い。例えば、本開示にて提供されるmNeonGreen2の全体明度は、（例えば配列番号２８に示される）mNeonGreenよりも、少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも４％、更に好ましくは少なくとも６％、最も好ましくは少なくとも８％、又は少なくとも１０％は明るい。
【０１５８】
本発明の一側面は、以下の項に関する。
【０１５９】
１．所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞のパネルを作製する方法であって、各細胞当たり単一の遺伝子コピーから前記所期のタンパク質の複数の突然変異体のうち一つが発現され、前記方法が、
ａ）細胞のゲノムに対して、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内の突然変異誘発標的部位又はその近傍に、二本鎖切断（double-strand break：ＤＳＢ）又は一本鎖ニックを誘導し、ここで前記細胞のゲノムには、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子が、単一のコピーとして含まれており、ここで前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の前記単一のコピーは、前記突然変異誘発標的部位又はその近傍に、不活性化突然変異を含み、
ｂ）工程ａ）の細胞に対して、前記誘導されたＤＳＢ又は一本鎖ニックの相同組換えによる修復のための、複数の異なるドナー核酸テンプレートのライブラリーを提供し、ここで前記ライブラリーの前記複数の異なるドナー核酸テンプレートは、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置に異なる突然変異を含むと共に、相同標的化修復（ＨＤＲ）、特に相同組換えにより、前記不活性化突然変異を除去し、
ｃ）前記不活性化突然変異が除去された細胞を選択及び／又は濃縮し、
ｄ）工程ｃ）で選択された細胞のパネルを、前記所期のタンパク質の複数の異なる突然変異体を発現する細胞のパネルとして提供し、ここで各細胞毎に、前記所期のタンパク質の前記異なる突然変異体のうちの一つが、単一の遺伝子コピーから発現されている
ことを含む方法。
【０１６０】
２．前記ｄ）で提供される前記細胞のパネルにおいて、前記複数の異なるドナー核酸テンプレート内の、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置に含まれていた複数の異なる突然変異を、前記突然変異誘発標的部位に含む細胞が濃縮される、１項の方法。
【０１６１】
３．前記細胞のパネルにおいて濃縮される細胞が、前記複数の異なるドナー核酸テンプレートのライブラリーのドナー核酸テンプレートとの相同組換えにより、前記ＤＳＢ又は一本鎖ニックの修復が生じた細胞を含む、２項の方法。
【０１６２】
４．前記ｄ）で提供される前記細胞のパネルにおける、少なくとも４％、好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも６０％の細胞が、前記複数の異なるドナー核酸テンプレートに含まれる突然変異の一つを含む、１〜３項の何れか一項の方法。
【０１６３】
５．前記ｄ）で提供される前記細胞のパネルが更に、前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックの修復が非相同末端連結（ＮＨＥＪ）により生じた細胞を含む、１〜４項の何れか一項の方法。
【０１６４】
６．前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックの修復がＮＨＥＪにより生じた細胞が、前記不活性化突然変異を除去した少なくとも１つのランダムな突然変異を含み、ここで好ましくは、前記ランダムな突然変異が、工程ａ）で前記のＤＳＢ又は一本鎖ニックが導入された位置に直接隣接する位置に、１又は２以上のヌクレオチドの挿入及び／又は欠失を含む、５項の方法。
【０１６５】
７．前記不活性化突然変異が、所期のタンパク質をコードする遺伝子の前記単一のコピー内に導入されてなる、１〜６項の何れか一項の方法。
【０１６６】
８．前記不活性化突然変異が、前記所期のタンパク質の発現を妨げる、１〜７項の何れか一項の方法。
【０１６７】
９．前記不活性化突然変異が、塩基対置換、塩基対挿入、塩基対欠失、停止コドン、又は不活性化アミノ酸置換であるか、或いはこれらの何れかを含む、１〜８項の何れか一項の方法。
【０１６８】
１０．前記不活性化突然変異が、所期のタンパク質の選択可能な活性を阻害する、１〜９項の何れか一項の方法。
【０１６９】
１１．工程ｃ）が、前記選択可能な活性を有する細胞の選択及び／又は濃縮を含むか、或いは斯かる選択及び／又は濃縮である、１０項の方法。
【０１７０】
１２．前記不活性化突然変異が、 前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内にフレームシフトを導入するか、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内に未成熟停止コドンを導入するか、或いは前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内に突然変異を導入し、結果として不活性化アミノ酸置換を生じさせる、１〜１１項の何れか一項の方法。
【０１７１】
１３．工程ｃ）が、前記所期のタンパク質を発現する細胞の選択を含むか、或いは斯かる選択である、１〜１２項の何れか一項の方法。
【０１７２】
１４．前記所期のタンパク質をコードする遺伝子が、前記細胞のゲノム内に融合遺伝子として含まれており、ここで前記融合遺伝子が、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の下流にマーカー遺伝子を含む、１２又は１３項の方法。
【０１７３】
１５．前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内の前記不活性化突然変異が、前記マーカー遺伝子の発現を妨げる、１４項の方法。
【０１７４】
１６．前記マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が、直接選択可能である、１４又は１５項の方法。
【０１７５】
１７．工程ｃ）が、前記マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質を発現する細胞の選択を含むか、或いは斯かる選択である、１４〜１６項の何れか一項の方法。
【０１７６】
１８．前記マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質が、蛍光タンパク質である、１４〜１７項の何れか一項の方法。
【０１７７】
１９．前記工程ｃ）の選択及び／又は濃縮が、斯かる蛍光タンパク質を発現する細胞の単離を含む、１８項の方法。
【０１７８】
２０．前記細胞の単離が、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）又はマイクロ流体細胞選別であるか、或いはこれらの手法を含む、１９項の方法。
【０１７９】
２１．前記マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が、抗生物質抵抗性を付与するか、薬物抵抗性を付与するか、栄養要求性を補完するか、或いは検出可能な酵素活性を付与する、１４〜１７項の何れか一項の方法。
【０１８０】
２２．前記工程ｃ）の選択及び／又は濃縮が、選択的な条件下で細胞を培養することを含む、２１項の方法。
【０１８１】
２３．前記マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質が、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内に前記不活性化突然変異が存在する場合には発現され、ここで前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内の前記不活性化突然変異が除去された細胞では、前記マーカー遺伝子が発現されないか、或いはインフレームでは発現されない、１４項の方法。
【０１８２】
２４．前記所期のタンパク質の発現が、陰性選択可能である、１４又は２３項の方法。
【０１８３】
２５．工程ｃ）が、前記マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質を発現しない細胞の選択及び／又は濃縮を含むか、或いは斯かる選択及び／又は濃縮である、１４、２３又は２４項の方法。
【０１８４】
２６．前記マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質が、チミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）である、１４及び２３〜２５項の何れかの方法。
【０１８５】
２７．前記融合遺伝子が更に、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子と前記マーカー遺伝子との間に、リンカー核酸配列を含む、１４〜２６項の何れか一項の方法。
【０１８６】
２８．前記リンカー核酸配列が、自己開裂ペプチドをコードする核酸配列を含むか、或いは斯かる配列からなる、２７項の方法。
【０１８７】
２９．前記自己開裂ペプチドが、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、及びＦ２Ａペプチドからなる群より選択される。２８項の方法。
【０１８８】
３０．前記リンカー核酸配列が、部位特異的プロテアーゼの標的部位をコードする核酸配列を含むか、或いは斯かる配列からなる、２７項の方法。
【０１８９】
３１．前記部位特異的プロテアーゼの標的部位が、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＴＥＶプロテアーゼの標的部位、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するジェネナーゼＩ（Genenase I）の標的部位、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するエンテロキナーゼの標的部位、及び配列番号８に示すアミノ酸配列を有するヒトライノウイルス （ＨＲＶ）３Ｃプロテアーゼの標的部位からなる群より選択される、３０項の方法。
【０１９０】
３２．前記細胞が更に、前記標的部位を切断する対応の部位特異的プロテアーゼを含む、３０又は３１項の方法。
【０１９１】
３３．前記部位特異的プロテアーゼが、ＴＥＶプロテアーゼ、ジェネナーゼＩ（Genenase I）エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）３Ｃプロテアーゼ、因子Ｘａ、及びトロンビンからなる群より選択される、３０又は３２項の方法。
【０１９２】
３４．所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーが、外因性遺伝子のコピーである、１〜３３項の何れか一項の方法。
【０１９３】
３５．所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーが、内因性遺伝子のコピーである、１〜３４項の何れか一項の方法。
【０１９４】
３６．前記方法が更に、ａ）で使用される細胞を生成する工程を含む、１〜３５項の何れか一項の方法。
【０１９５】
３７．前記生成する工程が、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピー内に、前記不活性化突然変異を導入することを含む、３６項の方法。
【０１９６】
３８．前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーが外因性であると共に、前記生成する工程が、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーを、細胞のゲノム内に導入することを含む、３６又は３７項の方法。
【０１９７】
３９．前記の所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一の外因性のコピーをゲノム内に導入する工程が、部位特異的相同組換え系を含む、３８項の方法。
【０１９８】
４０．前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーを前記細胞のゲノム内に導入する工程の前又は後に、前記不活性化突然変異が導入される、３８又は３９項の方法。
【０１９９】
４１．前記生成する工程が、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーを前記細胞のゲノム内に導入する工程の前又は後に、前記所期の遺伝子内に前記不活性化突然変異を導入することを含む、３８又は３９項の方法。
【０２００】
４２．前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーが内因性であると共に、前記生成する工程が、部位特異的相同組換えを用いて、系前記細胞のゲノム内の所期のタンパク質をコードする遺伝子内に、前記不活性化突然変異を導入することを含む、３６又は３７項の方法。
【０２０１】
４３．前記所期のタンパク質をコードする遺伝子が、ゲノム内に２コピー以上存在する内因性遺伝子であると共に、前記生成が、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の一部の内因性コピーを不活性化して、一細胞当たり前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一コピーを得ることを含む、３６、３７、又は４２項の方法。
【０２０２】
４４．前記生成する工程が、部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ニッカーゼをコードする核酸配列を、細胞内に導入することを含む、３６〜４３項の何れか一項の方法。
【０２０３】
４５．前記生成する工程が更に、前記所期の遺伝子の単一のコピー内における、前記部位特異的ヌクレアーゼ又は前記部位特異的ニッカーゼに対応する認識配列を、細胞内に導入することを含む、４４項の方法。
【０２０４】
４６．前記生成する工程が更に、前記部位特異的ヌクレアーゼ又は前記部位特異的ニッカーゼを前記認識部位に標的化する手段を、細胞内に導入することを含む、４４又は４５項の方法。
【０２０５】
４７．前記ＤＳＢが誘導される、１〜４６項の何れか一項の方法。
【０２０６】
４８．前記ＤＳＢが部位特異的ヌクレアーゼにより誘導されると共に、工程ａ）の細胞における前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーが、前記部位特異的ヌクレアーゼに対応する認識部位を含む、１〜４７項の何れか一項の方法。
【０２０７】
４９．前記部位特異的ヌクレアーゼが、恒常性又は誘導性プロモーターの制御下で発現される、４８項の方法。
【０２０８】
５０．前記部位特異的ヌクレアーゼがプラスミドにコードされる、４８又は４９項の方法。
【０２０９】
５１．前記方法が更に、工程ｃ）とｄ）との間、又は工程ｄ）の後に、前記部位特異的ヌクレアーゼをコードするプラスミドを、選択及び／又は提供された細胞から除去することを含む、５０項の方法。
【０２１０】
５２．前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内の、前記部位特異的ヌクレアーゼの認識部位が、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピー内に内因的に存在するか、或いは完全又は部分的に外から導入されたものである、３３〜３６項の何れか一項の方法。
【０２１１】
５３．前記部位特異的ヌクレアーゼの認識部位が、完全又は部分的に外から導入されると共に、前記外から導入された配列が、ｃ）で選択される細胞又はｄ）で提供される細胞に含まれる、所期のタンパク質をコードする遺伝子の突然変異体内には存在しない、４８〜５２項の何れか一項の方法。
【０２１２】
５４．前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、転写アクティベーター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びｍｅｇａＴＡＬエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、４８〜５３項の何れか一項の方法。
【０２１３】
５５．前記部位特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、４８〜５３項の何れか一項の方法。
【０２１４】
５６．前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のＳｐＣａｓ９、ストレプトコッカス サーモフィルス（Streptococcus thermophiles）由来のＳｔ１Ｃａｓ９、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のＳａＣａｓ９、Ｃａｓ９ ＶＱＲ変異体、Ｃａｓ９ ＥＱＲ変異体、スプリット（Split）Ｃａｓ９、インテリン（Intein）Ｃａｓ９、遺伝子改変Ｃａｓ９、及び、二量体ＲＮＡガイドＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９ヌクレアーゼ（ＲＦＮ）からなる群より選択される、５４又は５５項の方法。
【０２１５】
５７．工程ａ）の細胞が、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼを前記認識部位に対して標的化するｓｇＲＮＡを含む、５４〜５６項の何れか一項の方法。
【０２１６】
５８．前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの対応する認識部位が、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭ部位を含む、５４〜５７項の何れか一項の方法。
【０２１７】
５９．前記二本鎖切断が、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内の異なる鎖における２つの一本鎖ニックによって認識される、１〜４７項の何れか一項の方法。
【０２１８】
６０．前記２つの単鎖ニックが、１又は２以上のニッカーゼによって導入されると共に、工程ａ）の細胞における前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーが、第一の部位特異的ニッカーゼのための第一の認識部位と、第二の部位特異的ニッカーゼのための第二の認識部位とを含む、５９項の方法。
【０２１９】
６１．前記第一の部位特異的ニッカーゼと前記第二の部位特異的ニッカーゼとが同一である、５９項の方法。
【０２２０】
６２．前記第一のニッカーゼ及び／又は前記第二のニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼである、６０〜６１項の何れか一項の方法。
【０２２１】
６３．工程ａ）の細胞が、前記第一の部位特異的ニッカーゼを前記第一の認識部位に、前記第二の部位特異的ニッカーゼを前記第二の認識部位にそれぞれ標的化する、第一のｓｇＲＮＡを含む、６２項の方法。
【０２２２】
６４．前記第一の認識配列及び／又は前記第二の認識配列が、ＰＡＭ配列を含む、６３項の方法。
【０２２３】
６５．前記一本鎖ニックが、部位特異的ニッカーゼによって認識されると共に、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーが、前記部位特異的ニッカーゼのための対応する認識部位を含む、１〜４６項の何れか一項の方法。
【０２２４】
６６．前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内の、前記部位特異的ニッカーゼのための前記認識部位が、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子内に内因的に存在するか、或いは完全又は部分的に外から導入される、６５項の方法。
【０２２５】
６７．前記部位特異的ニッカーゼのための前記認識部位が、完全又は部分的に外から導入されると共に、前記の外から導入される配列が、ｃ）で選択される細胞又はｄ）で提供される細胞に含まれる所期のタンパク質をコードする遺伝子の突然変異体内には存在しない、６５又は６６項の方法。
【０２２６】
６８．前記部位特異的ニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼである、６５〜６７項の何れか一項の方法。
【０２２７】
６９．前記Ｃａｓ９ニッカーゼのための対応する認識配列が、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ニッカーゼによって認識されるＰＡＭ配列である、６８項の方法。
【０２２８】
７０．前記細胞が、原核細胞又は真核細胞である、１〜６９項の何れか一項の方法。
【０２２９】
７１．前記細胞が、酵母細胞、非哺乳類脊椎動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞である、１〜６９項の何れか一項の方法。
【０２３０】
７２．前記細胞が哺乳類細胞である、１〜６９項の何れか一項の方法。
【０２３１】
７３．前記哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、リンパ腫 細胞系 （例えばＮＳ０又はＳｐ２／０−Ａｇ１４）,白血病 細胞系、ジャーカット（Jurkat）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＣ１２細胞、抗体産生ハイブリドーマ細胞系、不死化ヒトＢ細胞系、及び不死化ヒト細胞系からなる群より選択される、７１又は７２項の方法。
【０２３２】
７４．前記非哺乳類脊椎動物細胞が、ＤＴ４０鶏細胞である、７１項の方法。
【０２３３】
７５．前記ＤＳＢ又は前記一本鎖ニックが、前記突然変異誘発標的部位に対して１００塩基対未満、好ましくは３０塩基対未満、又は最も好ましくは１０塩基対未満の距離に誘導される、１〜７４項の何れか一項の方法。
【０２３４】
７６．前記不活性化突然変異が、前記突然変異誘発標的部位に対して１００塩基対未満、好ましくは３０塩基対未満、又は最も好ましくは１０塩基対未満の距離に誘導される、１〜７５項の何れか一項の方法。
【０２３５】
７７．前記複数の異なるドナー核酸テンプレートが、二本鎖ＤＮＡ分子を含むか、或いは二本鎖ＤＮＡ分子である、１〜７６項の何れか一項の方法。
【０２３６】
７８．前記複数の異なるドナー核酸テンプレートが各々、個別のベクターに含まれる、７７項の方法。
【０２３７】
７９．前記複数の異なるドナー核酸テンプレートが、一本鎖オリゴヌクレオチドを含むか、或いは一本鎖オリゴヌクレオチドである、１〜７８項の何れか一項の方法。
【０２３８】
８０．前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、ロックド核酸及び／又はホスホロチオエート修飾を含む、７９項の方法。
【０２３９】
８１．前記複数の異なるドナー核酸テンプレートの各々が、前記所期のタンパク質をコードする遺伝子と相同な相同核酸配列を含む、１〜８０項の何れか一項の方法。
【０２４０】
８２．前記相同核酸配列が、２０〜１００ヌクレオチド、好ましくは３０〜６０ヌクレオチド、最も好ましくは４０〜５０ヌクレオチドを含む、８１項の方法。
【０２４１】
８３．前記複数の異なるドナー核酸テンプレートの各々が、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置の上流に、長さ少なくとも２０ヌクレオチド、例えば ２０〜５００ヌクレオチド、２０〜３００ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド、又は４０〜５０ヌクレオチドの第一の相同核酸配列を含むと共に、更に、前記突然変異誘発標的部位に対応する位置の下流に、長さ少なくとも２０ヌクレオチド、例えば２０〜５００ヌクレオチド、２０〜３００ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド、又は４０〜５０ヌクレオチドの第二の相同核酸配列を含む、１〜８２項の何れか一項の方法。
【０２４２】
８４．相同が、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を意味する、８１〜８３項の何れか一項の方法。
【０２４３】
８５．前記突然変異誘発標的部位に対応する位置における、前記複数の異なる突然変異が、１又は２以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入である、１〜８４項の何れか一項の方法。
【０２４４】
８６．ｄ）で提供される細胞のパネルの細胞内で発現される、前記所期のタンパク質の前記複数の異なる突然変異体が、前記所期のタンパク質と比較して、１又は２以上のアミノ酸の置換、１又は２以上のアミノ酸の挿入、及び／又は、１又は２以上のアミノ酸の欠失を含む、１〜８５項の何れか一項の方法。
【０２４５】
８７．前記１又は２以上のアミノ酸の置換が、少なくとも１、例えば少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも５のアミノ酸の置換である、８６項の方法。
【０２４６】
８８．前記１又は２以上のアミノ酸の挿入が、少なくとも１、例えば少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも５アミノ酸の挿入である、８６項の方法。
【０２４７】
８９．前記１又は２以上のアミノ酸の欠失が、少なくとも１、例えば少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも５アミノ酸の欠失である、８６項の方法。
【０２４８】
９０．前記不活性化突然変異を除去する核酸配列が、所期のタンパク質をコードする遺伝子に対応する野生型配列であるか、及び／又は、前記所期のタンパク質の遺伝子内のフレームシフト突然変異を除去する、１〜８９項の何れか一項の方法。
【０２４９】
９１．工程ｂ）が工程ａ）の前に、或いは好ましくは工程ａ）と同時に実施される、１〜９０項の何れか一項の方法。
【０２５０】
９２．工程ａ）及びｂ）において細胞が、ＮＨＥＪに対する相同組換えの比率を増加させる条件下で培養される、１〜９１項の何れか一項の方法。
【０２５１】
９３．前記条件が、ＮＨＥＪに関与する酵素の阻害又は不活性化、ＮＨＥＪを制御するタンパク質の発現、ＮＨＥＪを抑制する物質の添加、複製フォークの進行の遅延化、又は細胞周期のＧ２／Ｍ期での停止の誘発である、９２項の方法。
【０２５２】
９４．ＮＨＥＪに関与する酵素が、ＫＵ７０又はＤＮＡリガーゼIVであると共に、ＮＨＥＪに関与する酵素が抑制される、９３項の方法。
【０２５３】
９５．ＮＨＥＪを制御するタンパク質が、Ｅ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６を含む、又はこれらからなるタンパク質複合体、９３項の方法。
【０２５４】
９６．前記ＮＨＥＪを抑制する物質が、Ｓｃｒ７−ピラジン、ＥＳＣＲ７、Ｌ７５５５０７、ブレフェルジンＡ、及びＬ１８９（ＣＡＳ ６４２３２−８３−３）からなる群より選択される、９３項の方法。
【０２５５】
９７．ＮＨＥＪに対する相同組換えの比率が、少なくとも１倍、好ましくは少なくとも３倍、最も好ましくは少なくとも１５倍に増加される、９２〜９６項の何れか一項の方法。
【０２５６】
９８．前記細胞が哺乳類細胞であると共に、工程ａ）及び／又はｂ）と工程ｃ）との間に、少なくとも４８時間、好ましくは少なくとも７２時間、最も好ましくは少なくとも９６時間に亘って培養される、１〜９７項の何れか一項の方法。
【０２５７】
９９．ｄ）で提供される前記細胞のパネルが、前記所期のタンパク質の複数の異なる突然変異体を発現する細胞のプールであると共に、各細胞毎に前記複数の異なる突然変異体のうちの一つが単一の遺伝子コピーから発現される、１〜９８項の何れか一項の方法。
【０２５８】
１００．ｄ）で提供される前記細胞のパネルが、それぞれ異なる突然変異体を発現する細胞が個別に培養された細胞のライブラリーである、１〜９８項の何れか一項の方法。
【０２５９】
１０１．前記方法が更に、工程ｃ）と工程ｄ）との間に、工程ｃ）により選択される細胞から、それぞれ異なる突然変異体を発現する細胞を分離する工程を含む、１００項の方法。
【０２６０】
１０２．前記方法が更に、工程ｃ）で選択及び／又は濃縮され、或いはｄ）で提供された細胞に含まれる、前記所期のタンパク質の前記複数の異なる突然変異体をコードする遺伝子の１又は２以上の核酸配列を決定すること、或いは、工程ｃ）で選択及び／又は濃縮され、或いはｄ）で提供された細胞に含まれる、前記所期のタンパク質の前記複数の異なる突然変異体の１又は２以上のアミノ酸配列を決定することを含む、１〜１０１項の何れか一項の方法。
【０２６１】
１０３．前記所期のタンパク質が、蛍光タンパク質、抗体、酵素、成長因子、サイトカイン、ペプチドホルモン、転写因子、ＲＮＡ結合タンパク質、細胞骨格タンパク質、イオンチャンネル、Ｇタンパク質結合受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、シャペロン、トランスポーター、又は膜貫通タンパク質である、１〜１０２項の何れか一項の方法。
【０２６２】
１０４．前記所期のタンパク質が、mNeonGreen、mRuby2／３、dTomato、TagRFP、Citrine、Venus、YPet、mTFP１、EGFP； Kusabira Orange、mOrange、mApple、mCerulean３、mTurquoise２、mCardinal、EosFP、Dronpa、Dreiklang、及び赤外iRFPからなる群より選択される蛍光タンパク質である、１〜１０２項の何れか一項の方法。
【０２６３】
１０５．前記所期のタンパク質が抗体であり、ここで 前記突然変異誘発標的部位が、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸配列のＣＤＲコーディング領域内に存在する、１〜１０２項の何れか一項の方法。
【０２６４】
１０６．前記所期のタンパク質が酵素であり、ここで前記突然変異誘発標的部位が、前記酵素又は前記酵素の制御性サブユニットの活性中心をコードする核酸領域内に存在する、１〜１０２項の何れか一項の方法。
【０２６５】
１０７．前記所期のタンパク質の前記複数の突然変異体前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなり、ここで前記方法が更に、
e）前記の細胞のパネルから、前記第一の活性が改善されてなり、及び／又は、前記新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する第二の細胞のパネルを選択及び／又は濃縮する
ことを含む、１〜１０６項の何れか一項の方法。
【０２６６】
１０８．前記所期のタンパク質の複数の突然変異体前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなり、ここで工程ｃ）が、前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体を選択及び／又は濃縮することを含む、１〜１０６項の何れか一項の方法。
【０２６７】
１０９．野生型の所期のタンパク質と比較して異なる又は改変された活性を有する、所期のタンパク質の複数の突然変異体を同定する方法であって、前記方法が、
a）１〜１０６項の何れか一項から得られる前記の細胞のパネルから、前記第一の活性が改善されてなり、及び／又は、前記新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する第二の細胞のパネルを選択及び／又は濃縮し、
ｂ）前記第二のパネルにより発現される前記所期のタンパク質の突然変異体のアミノ酸配列を決定し及び／又は前記第二のパネルにより発現される前記所期のタンパク質の突然変異体をコードする遺伝子の核酸配列を決定する
ことを含む方法。
【０２６８】
１１０．前記野生型の所期のタンパク質と比較して異なる又は改変された活性を有する、所期のタンパク質の複数の突然変異体を同定する方法であって、前記方法が、
a）１〜１０６項の何れか一項の所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞のパネルを作製する方法を含み、ここで工程ｃ）が、前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体を選択及び／又は濃縮することを含み、
b）前記方法が更に、前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体の少なくとも１つのアミノ酸配列を決定し；及び／又は前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、前記所期のタンパク質の突然変異体をコードする遺伝子の少なくとも１つの核酸配列を決定することを含む、方法。
【０２６９】
１１１．前記方法が更に、野生型の所期のタンパク質と比較して異なる又は改変された生物活性を有する所期のタンパク質の発現及び任意により収集を含む、１０９又は１１０項の方法。
【０２７０】
１１２．前記前記野生型の所期のタンパク質と比較して、第一の活性が改善されてなり、及び／又は、新たな活性を有してなる、所期のタンパク質の突然変異体の選択及び／又は濃縮が、ＦＡＣＳ細胞選別、磁気活性化細胞選別、マイクロ流体細胞選別、及び／又はビーズを用いた細胞単離を含む、１０７〜１１１項の何れか一項の方法。
【０２７１】
１１３．前記所期のタンパク質が蛍光タンパク質であると共に、前記第一の活性及び／又は前記新たな活性が蛍光である、１０７〜１１２項の何れか一項の方法。
【０２７２】
１１４．前記所期のタンパク質が抗体であると共に、前記第一の活性及び／又は前記新たな活性が抗原結合性である、１０７〜１１２項の何れか一項の方法。
【０２７３】
１１５．前記所期のタンパク質が酵素であると共に、前記第一の活性及び／又は前記新たな活性が前記酵素の酵素活性である。１０７〜１１２項の何れか一項の方法。
【０２７４】
１１６．１〜１１５項の何れか一項の方法により得られる細胞ライブラリー。
【０２７５】
１１７．前記野生型の所期のタンパク質と比較して異なる又は改変された生物活性を有する、所期のタンパク質の複数の突然変異体の同定のための、１１６項の細胞ライブラリーの使用。
【０２７６】
１１８．同定された所期のタンパク質の突然変異体が、ホワイト・バイオテクノロジーに適用される、１１７項の使用。
【０２７７】
１１９．前記所期のタンパク質が、成長因子、サイトカイン、ペプチドホルモン、転写因子、ＲＮＡ結合タンパク質、細胞骨格タンパク質、イオンチャンネル、Ｇタンパク質結合受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、シャペロン、トランスポーター、及び膜貫通タンパク質から選択される何れかのタンパク質である、１〜１１５項の何れか一項の方法、１１６項の細胞ライブラリー、又は１１７又は１１８項の使用。
【０２７８】
本開示では、特許公報及び学術文献を含む多数の文献を引用する。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連するわけではないが、それらの全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２７９】
【図１】図１：本発明のタンパク質ライブラリー生成ための方法の例示的且つ非限定的な態様のスキームである。所期の遺伝子、この場合は蛍光タンパク質mNeonGreenをコードする遺伝子の発現カセットが、適切な細胞系列のゲノム内に一コピーのみ安定に形質転換される。改変された細胞系のゲノム内の単独のＦＲＴ部位内に挿入するのが適切な手法である。mNeonGreen内の突然変異誘発の標的化対象部位近傍にフレームシフトが導入される。斯かるフレームシフトにより、mNeonGreenの発現と、mNeonGreenの３’末端に融合された他の選択可能マーカータンパク質、この場合は蛍光タンパク質mKate2の発現とが阻害される。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡのトランスフェクションによって、まず、フレームシフトに隣接してゲノムに組み込まれた標的遺伝子mNeonGreen内に、標的化された開裂が生成される。共形質転換されたｓｓＤＮＡライブラリー（オリゴライブラリー）は、mNeonGreenの切断部位に隣接する相同領域を含むことで、相同標的化修復が可能となっている。mNeonGreen遺伝子内への組み込みにより、フレームシフトが修復されて、所望のランダムさで多様化されたライブラリーが標的部位に挿入される。
【０２８０】
【図２】図２：プラスミド及びクローニングスキーム。mNeonGreenの遺伝子が細菌発現プラスミドpSLICE3（ｐＲＳＥＴＢ由来）内に挿入され、フレームシフトが、ＰＣＲ技術を用いて、mNeonGreen内の標的部位に隣接するように導入される。フレームシフトされたmNeonGreenの下流にmKate2が第二のマーカー遺伝子として融合され、斯かるカセットが哺乳類発現プラスミドｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ内に挿入される。ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ−mNeonフレームシフト−mKate2が、ゲノム内に単一のＦＲＴ部位を有する適切な細胞系（例えばＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされる。mNeonフレームシフト−mKate2の発現カセットが単独のＦＲＴ部位内に一コピーのみ組み込まれる。斯かるカセットを安定に発現する細胞が選択される。Ｃａｓ９及び適切なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする発現プラスミドが細胞内にトランスフェクトされる。Ｃａｓ９による切断で、対応する相同性アームを有する共トランスフェクトオリゴヌクレオチドライブラリーによる相同標的化修復が可能となり、これによってmNeonGreen内のフレームシフトが修復されて、所望のランダム化された一連の多様化された配列が、遺伝子内の選択された標的部位に挿入される。
【０２８１】
【図３】図３：ａ）３残基（mNeonGreenの残基１４８〜１５０）ライブラリー及びｂ）５残基（mNeonGreenの残基１４５〜１４９）ライブラリーについて４ラウンドのスクリーニングの間に得られた生細胞の明度のヒストグラム。最初の選別（短い点線で塗りつぶし）では、蛍光の中央値は極めて低い。続くＦＡＣＳ選別のラウンド（中抜き灰色丸〜黒丸）では、明度が大幅に上昇し、低蛍光mNeonGreen変異体は集団から排除されている（ＦＩＴＣ−Ａ：緑色蛍光チャンネル）。
【０２８２】
【図４】図４：前記３残基及び５残基ライブラリーのＦＡＣＳ選別の最終ラウンド後の生細胞の明度のヒストグラム。比較のために、親mNeonGreen発現細胞の集団も示す。
【０２８３】
【図５】図５：安定に形質転換されたmNeonGreen発現ＨＥＫ２９３細胞（ａ）、３残基ライブラリーの成員（ｂ）、及び５残基ライブラリーの成員（ｃ）の蛍光顕微鏡画像。発光は５３０／２０ｎｍ。細胞のサイトゾル及び核の全体に亘って、蛍光は等しく分布しており、凝集の兆候は見られなかった。
【０２８４】
【図６】図６：ＦＡＣＳ選別の初回ラウンド後の多様化されたmNeonGreen変異体のアミノ酸配列。本技術を用いて３アミノ酸（残基１４７〜１４９）の配列が多様化された。この図は、選択された１０の変異体のＤＮＡ配列（左）及び翻訳されたタンパク質配列（右）を示す。多様化されたアミノ酸配列をハイフンで挟んで示す。mNeonGreen内の標的部位の親アミノ配列はＤＷＣであった。
【０２８５】
【図７】図７：mNeonGreen2の特性決定。グラフは、大腸菌（E. coli）から精製された組換mNeonGreen2の励起及び発光スペクトルを示す。変異体の量子収量は０．８と決定された。消散係数は１２４．０００Ｍ−１・ｃｍ−１と、親mNeonGreenの消散係数（１１６．０００）よりも高かった。従って、量子収量と消散係数との積により決定される全体明度によれば、mNeonGreen2は親mNeonGreenよりも最大１０％明るかった。
【０２８６】
【図８】図８：mNeonGreen内の標的選択。mNeonGreenの構造（上図）及び一次アミノ酸配列（下図）を示す。多様化の対象として選択した５つの領域を、構造中では黒色で、アミノ酸配列中では番号及び下線を付して示す。二量体及び三量体形成を阻止する残基をアミノ酸配列中に網掛けで示す。これらの残基は改変せずに残し、その周囲の残基を多様化した。各部位について、Ｃａｓ９標的化のために近隣のＮＧＧ ＰＡＭ部位を同定し、プラスミドｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏと共同することで適切なｓｇＲＮＡを生成するようにプライマーを設計した。
【０２８７】
【図９】図９：図７に示すmNeonGreen内の部位を標的化するためのｓｇＲＮＡを生成するのに用いたプライマーのリスト。
【０２８８】
【図１０】図１０：本発明を実施するための一般化したスキーム。
【０２８９】
【図１１】図１１：突然変異及びスクリーニング手順のための他のコンストラクトの設計。マーカータンパク質であるＮ−アセチルトランスフェラーゼピューロマイシン抵抗性タンパク質を、Ｐ２Ａペプチドを介して蛍光タンパク質mRuby2のＣ末端に融合する。mRuby2内の標的部位の近傍に導入されたフレームシフトが修復され、ピューロマイシン抵抗性が生成されることで、多様化されたmRuby2ライブラリーの収穫及び濃縮が、薬物選択を用いて可能になる。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を、２日間連続でピューロマイシンで処理することにより、標的蛍光タンパク質ライブラリーを適切に発現しない細胞を除去する。
【０２９０】
【図１２】図１２：ピューロマイシンを用いた２日間の選択後における、mRuby2の発色団領域内に挿入された（mRuby2のアミノ酸残基６７〜６９が多様化された）３残基アミノ酸ライブラリーの次世代シークエンシング結果。Ｘ軸は、観察された突然変異型の百分率（０〜１００％）を示す。総ライブラリーサイズは７２９２配列であった。「インフレーム」は、野生型mRuby2遺伝子に対してインフレームであった観察された変異体配列の数を示す（６６３９配列）。「インフレーム、停止なし」は、インフレームであり且つ早い段階で停止コドンを有しない配列の数を示す（６５３７配列）。「インフレーム、停止なし、正しい長さ」は、インフレームであり、早期に停止コドンを含まず、且つ野生型mRuby2遺伝子と同じ長さの配列の数を示す（３０７７配列）。「ライブラリーの要請を充足」は、インフレームで挿入された正しいライブラリーを提示する配列の数を示す（２５５０配列）。「インフレームでない」は、野生型mRuby2遺伝子と比較してインフレームでない配列を示す（６５３配列）。「インフレーム、停止あり」は、野生型mRuby2遺伝子と比較して早い段階で停止コドンを有する変異体配列の数を示す（１０２配列）。ピューロマイシン処理による効果は、ライブラリーにおいて「インフレームでない」配列及び「インフレーム、停止あり」配列の存在割合が低いことに表れている。
【０２９１】
【図１３】図１３：次世代シークエンシングにより検証された、翻訳後の多様化ライブラリータンパク質の長さ分布。単独の配列のみを考慮した。軸は、観察された多様化後のmRuby2タンパク質の長さ分布及びそれぞれの存在割合を示す。親mRuby2タンパク質の長さは２３６アミノ酸である。ＩＮＤＥＬ（挿入・欠失）事象があったことが見て取れるが、これはおそらくは非相同末端連結による。これによって、突然変異誘発により多様化されたアミノ酸配列の長さが異なる種々のタンパク質変異体が生じ、結果としてライブラリーの多様性が更に上昇している。
【０２９２】
【図１４】図１４：mRuby2の発色団領域内の多様化された３-アミノ酸残基配列（アミノ酸６７〜６９）の各位置におけるヌクレオチド頻度の次世代シークエンシング分析。ドナー単鎖オリゴヌクレオチドに、予め設計した合成型ＮＮＢ（ここでＮは任意のヌクレオチドであり、ＢはＡ（アデニン）以外の任意のヌクレオチドである）という３コドンを有するライブラリーを組み込んだ。斯かる設計により、ＴＡＡ及びＴＧＡ停止コドンの生成が防止される。このように停止コドンを忌避するバイアスを予めプログラムした他は、ヌクレオチドは突然変異誘発位置に対して概ね均等に、即ちランダムに配分された。即ち、ここで提案する方法によれば、既定のバイアスを有する極めて不均一且つ複雑なライブラリーが生成される。
【０２９３】
【図１５】図１５： mRuby2のアミノ酸残基４３〜４７における標的化された突然変異誘発。ａ）mRuby2の構造。ベータシートの黒色の配列は、Ｃａｓ９を用いて多様化される領域を示す。これは残基４３〜４７に対応する５アミノ酸領域である。親mRuby2におけるこの改変領域の元の一次配列は、Ｑ４３、Ｔ４４、Ｍ４５、Ｒ４６、及びＩ４７である。ｂ）mRuby2の突然変異誘発に用いられた発現カセットの基本構造。この一連の実験のために、選択マーカーであるピューロマイシンＲに加えて、蛍光タンパク質ＴａｇＢＦＰ２をmRuby2に融合した。第二のフルオロフォアを使用することで、追加の波長によるＦＡＣＳ選別を可能とした。
【０２９４】
【図１６】図１６：Ｃａｓ９編集及びそれに続く一連のＦＡＣＳ選別のラウンド後のmRuby2明度の進化を示す蛍光ヒストグラム。mRuby2をアミノ酸４３〜４７の領域で多様化した。縦の点線は、ＦＡＣＳラウンドのカットオフゲートを示す。ａ）対照は、編集前のフレームシフトを有するmRuby2ベクターを発現する細胞を示す。ｂ）Ｃａｓ９編集開始から７２時間後の細胞集団の蛍光ヒストグラム。１億個の細胞の集団を用いて選択を開始した。所定のカットオフラインを超える赤色を示す細胞を選別し、繁殖させ、増幅し、ＦＡＣＳ選別の新たなラウンドに使用した。ｃ）第２ラウンドのＦＡＣＳ選別。１％のカットオフを用いて発光細胞を選択した。ｄ）第３ラウンドの選別。mRuby2対照集団よりも明るい細胞集団を選択した。ｅ）第３ラウンドの選択及び増幅後の細胞集団のヒストグラム。f）親mRuby2を発現する対照集団のヒストグラム。
【０２９５】
【図１７】図１７：Ｃａｓ９編集及び３ラウンドのＦＡＣＳ選別後における、融合マーカータンパク質「ｍＴａｇＢＦＰ２」を基準とした、mRuby2の蛍光強度の進化を示す蛍光ドットプロット表示。ａ〜ｆ）図１６と同様。
【０２９６】
【図１８】図１８：第１ラウンドのＦＡＣＳ選別後の７つの蛍光組換タンパク質の蛍光発光グラフ。各タンパク質の多様化領域のアミノ酸配列を右側に示す。蛍光に基づく選別後、ｍＲＮＡを細胞から単離し、逆転写し、そのｃＤＮＡを細菌発現ベクターｐＲＳＥＴＢにクローニングした。細菌で発現させた後、本分野で標準的な手順を用いて蛍光タンパク質を抽出し、蛍光分光計を用いて組換タンパク質を分析した。融合タグＢＦＰ２を標準として用いてタンパク質レベルを正規化した。斯かるデータは、これらの細胞系からタンパク質変異体を簡便に抽出し、他の分析系へと移送できることを示している。線上の数値は発光ピーク波長（単位：ｎｍ）を示す。右上の配列ＱＴＭＲＩは親mRuby2配列を示す。
【０２９７】
【図１９】図１９：図１８に示す７つの異なるmRuby2変異体のＤＮＡ及びタンパク質配列。変異体の多様化領域のＤＮＡ配列を濃網掛けで強調して示す。薄網掛けは、ｓｇＲＮＡと複数の再切断部位との再結合を除去するために、修復テンプレートによって導入されたサイレント突然変異により改変されたコドンを強調して示す。ＡＡＡは変更されていない親配列を示す。ここから分かるように、この場合における多様化は非相同末端連結（ＮＨＥＪ）の結果であるのに対し、ＡＡＧは相同テンプレートに基づく修復により導入される。従って、ＮＨＥＪはタンパク質の多様化に極めて有効である。最右側のパネルは、変異体の多様化領域における対応するアミノ酸配列を示す。mRuby2は親配列を示す。mRuby2のＤＮＡ配列内の２つの下付の「ａａ」は、親mRuby2タンパク質の不活性化のためにフレームシフトを導入するべく欠失された２つのヌクレオチドを示す。その後、Ｃａｓ９編集により変異体内のフレームシフトが修復されて、リーディングフレームが再建される。これは相同標的化修復によるが、ＮＨＥＪを通じて行われる場合もある。
【０２９８】
【図２０】図２０：図に結果を示す実験の手順を模式的に示すスキーム。その目的は、相同標的化修復の総比率を決定すると共に、何らかの薬物処理がこの比率に影響を及ぼすか否かを調べることである。ａ）mRuby2のＤＮＡの標的化Ｃａｓ９編集のためのスキーム。この特定の例では、親mRuby2に修復テンプレートと共にフレームシフトが導入された。ガイドＲＮＡ及び修復テンプレート（ＳＳＯＤＮ ＨＤＲテンプレート）を共送達し、フレームシフトを含むmRuby2を生成した。ＨＡ−Ｌ：左側相同性アーム；ＨＡ−Ｒ：右側相同性アーム、ｓｓＯＤＮ：一本鎖オリゴヌクレオチド。黒点部分はフレームシフト導入領域を示す。ｂ）ＨＤＲ誘導ストラテジーの次世代シークエンシング分析の概略。４つの連続する工程として設計した。mRuby2が不活性化された約２百万の細胞から非発光細胞を選別した（１）。この集団からｍＲＮＡを単離し、逆転写し、次世代シークエンシングに供した（２）。フレームシフト部位周囲の２百万の配列をディープシークエンシングで得た（３）。最後に、配列をアラインし、重複を除去し、残る６００．０００の結果を分析した。ＵＭＩ：独自分子識別子（Unique Molecular Identifier）、１５のランダムなヌクレオチドの配列。ＧＳＰ：遺伝子特異的プライマー。縞模様はＵＭＩ変異体を示す。配列決定した領域は２５０ｂｐであった。
【０２９９】
【図２１】図２１：次世代シークエンシングにより分析したmRuby2の相同標的化修復（ＨＤＲ）率に対し、８種の異なる薬物介入が与える影響。実験の詳細を図２０に示す。相同標的化修復率をＸ軸に示す。Ｃａｓ９編集のための７２時間の期間内に、細胞を医薬化合物で処理した。全ての場合において、同一のｓｇＲＮＡ及び同一の修復テンプレートを適用した（ＳＧのみの場合を除く）。ＮＵ７４４１：ＮＵ７４４１による処理；ＳＣＲ７：ＳＣＲ７による処理；ＳＧ＋ＳＳ：対照実験、更なる薬物処理を行わず、ｓｇＲＮＡ及びＨＤＲテンプレートのみを適用した；ＢＦＡ：ブレフェルジンＡによる処理；ＮＯＣＯＤ：ノコダゾールによる処理；ＲＳ−１：ＲＳ−１による処理；ＮＯＣＯＤ＋ＲＡＤ５１：ノコダゾール及びＲＡＤ５１ｍＲＮＡによる同時処理；ＲＡＤ５１：ＲＡＤ５１ｍＲＮＡによる処理。ＳＧのみ：ガイドｓｇＲＮＡのみ、相同テンプレートは使用しなかった。
【実施例】
【０３００】
以下、非限定的な実施例を参照しながら、本発明を更に説明及び／又は例示する。
【０３０１】
実施例１：mNeonGreenのタンパク質多様化及び標的化突然変異誘発
【０３０２】
タンパク質ライブラリー生成の模式的な概略
実施した実験の基本的な構成を図１及び２に模式的に示す。具体的に、第一の工程では、mNeonGreen遺伝子の単一のコピーをＣＭＶプロモーターの制御下に含むベクター（ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＮＧＦＳと呼ぶ）を生成した。このベクターにクローニングで導入された単一のmNeonGreen遺伝子コピーは、mNeonGreen遺伝子内に不活性化フレームシフト突然変異を含み、これにより前記ベクターからのmNeonGreenタンパク質の発現が防止される。遺伝子をベクターにクローニングする前に、部位特異的突然変異誘発によりフレームシフト突然変異を遺伝子に導入した。具体的に、予め定めた位置の４塩基対を欠失させることにより、特定の標的部位にフレームシフト突然変異を導入し、配列番号２６に示すmNeonGreenヌクレオチド配列のフレームシフト版を作製した。ここでいう予め定めた位置とは、以下に説明する更なる工程において複数の異なる突然変異を導入する標的部位として選択された部位である。
【０３０３】
次工程では、ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＮＧＦＳベクターの単一のコピーが前記細胞のゲノムに導入された安定な細胞系列を生成した。具体的に、これはＦｌｐ−Ｉｎ−２９３細胞系列（Thermofisher）にＦｌｐ−Ｉｎ組換えを導入することにより達成した。従って、不活性化mNeonGreen変異体（ＮＧＦＳと呼ぶ）の単一のコピーを、ＣＭＶプロモーターの制御下に含む安定な細胞系列を生成した。
【０３０４】
その後、生成された細胞系列を用いて、mNeonGreenの複数の異なる突然変異体を発現する細胞のパネル（換言すれば細胞のライブラリー）を生成した。突然変異体の産生は、組換え系アプローチにより、まず二本鎖切断（double-strand break：ＤＳＢ）を、前記細胞のゲノム内のＮＧＦＳ遺伝子の単一のコピー内における、不活性化フレームシフト突然変異の近傍の位置に導入する。特にここでは、欠失部位の１ｂｐ上流に切断を導入した。この例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いて部位特異的ＤＳＢを導入した。このために、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（即ち ＳｐＣａｓ９）をコードするベクターを用いて、安定な細胞系列を形質転換した。この同一のベクターには、ＤＳＢが導入された部位にＣａｓ９ヌクレアーゼを標的化するｓｇＲＮＡもコードされていた。斯かるＣａｓ９ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡをコードするベクターに加えて、オリゴヌクレオチドのライブラリーも細胞系列に共形質転換した。このライブラリーのオリゴヌクレオチドは、導入されたＤＳＢの相同組換えによる修復のためのドナー核酸テンプレートとして機能するための配列も有していた。相同組換えのためのドナー核酸テンプレートとして機能するために、これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＳＢに隣接する領域に対して相同な配列を含んでいた。更に、これらのオリゴヌクレオチドは、３又は５アミノ酸に対応する、突然変異を有するコドンを有していた。斯かるオリゴヌクレオチドのライブラリーは、それぞれ３アミノ酸（mNeonGreenの残基１４７〜１４９）又は５アミノ酸（mNeonGreenの残基１４６〜１５０）の標的部位に、複数の異なる突然変異を有する複数の異なるオリゴヌクレオチドを有しており、これにより基本的に全ての可能なコドンをカバーすることが可能であった。同様に、これらのオリゴヌクレオチドは、フレームシフトを導入した前述の不活性化突然変異を有していなかった。こうして、これらのオリゴヌクレオチドを用いた相同組換えにより、フレームシフト突然変異が除去されるように設計した。
【０３０５】
結果及び考察
ここで使用された、所期のタンパク質の複数の突然変異体を発現する細胞を生成するための方法（即ち、あるタンパク質の複数の異なる突然変異体を発現する細胞のライブラリーを生成するための方法）の基本的な考え方を図１及び２に示す。具体的に、Ｆｌｐ−リコンビナーゼ系を用いて、タンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーを哺乳類細胞系列に挿入した。本実施例では、蛍光タンパク質mNeonGreen（Shaner, 2013, Nature methods 10.5: 407-409）を改変した。前記ライブラリーの成員を親mNeonGreenから識別するために、不活性化突然変異をフレームシフトの形でmNeonGreenのリーディングフレーム内に挿入し、標的タンパク質の正しい発現、惹いてはそれによるＣ末端融合タンパク質の正しい発現を防止した。フレームシフト部位の近傍を特異的に切断するようにＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ系を設計した。具体的には、欠失部位の１ｂｐ上流に切断を導入した。二本鎖切断を修復するために、適切な相同性アームを両端に有するオリゴヌクレオチド（即ち、ドナー核酸テンプレート）を細胞に共トランスフェクトし、修復テンプレートとして機能させた。これらの修復テンプレートは、相同配列に加えて、mNeonGreen内の標的部位（即ち突然変異誘発標的部位）にインフレームで融合されるべき、多様化されたＤＮＡ配列を含んでいた。修復テンプレートを合成する前に予め、ＤＮＡ及びタンパク質の多様化配列の多様化の程度及び長さを設計した。その後、二本鎖切断部位における修復テンプレートの組換えにより、所望の多様化が挿入されると共に、mNeonGreen内のフレームシフトが修復され、発現が復旧される。これにより、得られる蛍光細胞は、適切に折り畳まれると共に機能性を維持している、多様化された遺伝子の変異体を有することとなった。
【０３０６】
詳細には、mNeonGreenのフレームシフト／欠失を含むＨＥＫ２９３細胞を、標的化されたＣａｓ９／ｓｇＲＮＡベクターを用いて形質転換した。ここで、３つの多様化されたアミノ酸を有する修復テンプレートのライブラリー、又は、５つの多様化されたアミノ酸を有する修復テンプレートのライブラリーを、形質転換に一緒に用いた。これらの修復テンプレートにより、３つ又は５つの多様化されたアミノ酸が、mNeonGreen遺伝子内の選択された部位に導入された。このライブラリーはヌクレオチドＮＮＢによってコードされていた（ここでＮは４種のヌクレオチドの何れかを表し、ＢはＡ以外の任意のヌクレオチドを表す）。これにより、停止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ）が導入される可能性を低減した。しかし、原則としては、任意のヌクレオチドについての選好性やバイアスを組み込むことが可能である。３アミノ酸ライブラリーのための標的として、当初はmNeonGreen内のアミノ配列ＮＳＬＴＡＡＤ＊ＷＣＲＳＫ（配列番号３０）を選択した。ここでアスタリスク（「＊」）は、アスパラギン酸１４７をコードするコドンの直後の二本鎖切断部位を指す。下線を付したアミノ酸は、３残基ライブラリーによって置換された残基を指す。これらのオリゴヌクレオチド修復テンプレートは、多様化されたライブラリーを挟み込むと共に、mNeonGreenのＣａｓ９切断部位の両側の配列に対して、それぞれ４８又は４５塩基対の相同性を有していた。最後に、この修復テンプレート内の可変ドメインは、欠失された塩基対を含むことにより、正しいリーディングフレームを復元できると共に、残りのＣ末端ドメインを正確に発現するように構成されていた。トランスフェクションの後、蛍光顕微鏡で毎日観察したところ、トランスフェクションから４８時間後に細胞内に緑色蛍光が生じ始め、その後に蛍光mNeonGreen変異体を発現する細胞の明度及び数は増加し続け、トランスフェクションから９６時間後には最大となった。斯かる遅れは、第一のＣａｓ９、その後のゲノムＤＮＡの特異的な開裂、それに続く相同性修復、その後のＣＭＶプロモーター誘導性のmNeonGreen変異体の発現が、連続的に進行するのに時間を要したためと考えられる。対して、フレームシフトを親mNeonGreenの状態に修復するだけのテンプレートを用いた対照反応によれば、効率は５％に過ぎなかった。なお、蛍光細胞の百分率はサイトメトリーにより検出した。
【０３０７】
この段階で、細胞を明度に基づくＦＡＣＳに供した。mNeonGreenウェルのスペクトルプロファイルに合わせたＦＩＴＣチャンネルを、FACSAria IIIソーター（BD）と組み合わせて用いた。その後のシークエンシングに向けてライブラリーサイズを最大化するために、このシグナルを示す細胞を、ベースラインを超えるものも含めて全て採取した。選別した細胞を更に３ラウンドのスクリーニングに供し、各ラウンドで上位５％の細胞を取得して培養した。図３に示すように、多様化された変異体からの初回の細胞の選択では、蛍光強度の分布は広く、平均強度は極めて低かった。斯かる低レベルの平均蛍光は、蛍光タンパク質の構造に悪影響を及ぼす変異体が多数存在していたことによる。
【０３０８】
多様化された残基が所望の部位に正しく挿入されたことを確認するために、第１ラウンドのＦＡＣＳ選別後に細胞を採取し、ゲノムＤＮＡを抽出した。多様化されたmNeonGreen遺伝子をＰＣＲで抽出し、大腸菌（E. coli）発現ベクターにクローン化した。形質転換の後、細菌コロニーのランダム選択を選び出し、変異体の配列を決定した。複数のクローンのシークエンシング結果を図６に示す。変異体は所期の所望の部位で多様化されていた。更に、多様性を有する配列を検証したところ、何れのコドンのバイアスも観察されなかった。
【０３０９】
更なるラウンドの選別を行う毎に、暗い変異体（即ち、蛍光強度が低レベルの変異体）が除去され、ライブラリー集団の平均蛍光は上昇した。図４に、最後の第３ラウンドの選別の後の結果を、親mNeonGreenと比較して示す。両ライブラリー集団の平均明度から分かるように、親mNeonGreenと比較して、本発明者らが選別した多様化変異体の蛍光の方が高かった。
【０３１０】
最終ラウンドのＦＡＣＳ選別で得られた細胞の画像を図５に示す。細胞は均一な蛍光を示し、細胞小器官内に隔離された凝集体は見られなかった。ＦＡＣｓ選別の最終ラウンドの後、mNeonGreenのより明るい変異体をコードする遺伝子をＲＴ−ＰＣＲで抽出し、ｃＤＮＡへと転写し、細菌発現ベクターにクローン化した。斯かるmNeonGreen変異体の一つを、暫定的にmNeonGreen2（配列番号９１及び９２）と命名し、精製してその特性をより詳細に決定した（図７）。
【０３１１】
このアプローチを用いて多様化されるmNeonGreen内の更なる標的部位の概要を図８に示す。It is expected that これらの標的部位を多様化することで、より強い白光を有するmNeonGreenの変異体が得られることが期待される。最後に、本願内で提示したプロトコールを用いて、これらの多様化された部位を全て組み合わせれば、超高発光のmNeonGreenの変異体が得られるかも知れない。
【０３１２】
図８に示したmNeonGreen内の他の部位に対してＣａｓ９を標的化するのに使用できるｓｇＲＮＡの配列を図９に示す。
【０３１３】
材料及び方法
【０３１４】
不活性化突然変異を有するmNeonGreenを含むmNeonGreen基質プラスミドの構築
プラスミドｐＳＬｉＣＥ３−NeonGreen（Shaner, 2013, Nature methods 10.5: 407-409）mNeonGreenのコーディング領域（Allele Biotechnology；核酸配列については配列番号２７参照；アミノ酸配列については配列番号２８参照）を、プライマー５’−ＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＧＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＴＡＣＣ−３’−フォワード（配列番号１３）及び５’−ＧＴＣＣＧＣＡＧＣＧＧＴＣＡＧＣＧＡＧＴＴＧＧＴＣ−３’−リバース（配列番号１４）を用いた部位特異的突然変異誘発に供し、４塩基対を削除した。特に、mNeonGreenのヌクレオチド配列の位置４４２〜４４５が欠失された。欠失位置は、切断部位の１ｂｐ下流、選択されたＰＡＭ部位の３ｂｐ上流であった。選択されたＰＡＭ部位は、mNeonGreenのヌクレオチド配列の位置４４８〜４５０であった。換言すれば、塩基対４４２、４４３、４４４及び４４５が欠失され、位置４４６及び４４７（２ｂｐ）が維持された。選択されたＰＡＭ部位は位置４４８、４４９及び４５０であった。これにより、一アミノ酸が除去され、フレームシフトが導入されて、非蛍光タンパク質が生じた。この非蛍光タンパク質をＮＧＦＳと命名した。mNeonGreenの突然変異を形成したコーディング領域の核酸配列を配列番号２９に示す。
【０３１５】
突然変異誘発ＰＣＲの後、ＮＧＦＳのコーディングドメインを、以下のプライマーを用いて増幅した。
５’−ＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＧＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＴＡＣＣ−３’（フォワードプライマー、配列番号１５）；及び
５’−ＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’（リバースプライマー、配列番号１６）。
【０３１６】
上記のプライマーは、ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ ベクター（Thermofisher）との重複配列を含んでおり、ＰＣＲで生成したコーディングドメイン断片を、ＳＬｉＣＥクローニング（Methods Mol Biol. 2014; 1116: 235-244）を用いて、ＡｆlII−Ｎｏｔ１で切断したｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ（Thermofisher）ベクターに組み込むことにより、結果としてコンストラクトｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＮＧＦＳを生成した。このコンストラクトの配列をＤＮＡシークエンシングにより検証した。
【０３１７】
ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９プラスミドの構築
プラスミドｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ（Ran, 2013, Nat Protoc. 8(11): 2281-2308）を制限酵素ＢｂｓＩ（NEB）で二重に切断し、ゲル精製し（NucleoSpinゲル及びＰＣＲ Clean-up、Macherey-Nagel）、予めアニールしたプライマー５’−ＣＡＣＣＧＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＧＣ−３’（フォワード、配列番号１７）及び５’−ＡＡＡＣＧＣＧＴＣＣＧＣＡＧＣＧＧＴＣＡＧＣＧＣ−３’（リバース、配列番号１８）に連結して、４塩基対欠失の上流のＮＧＦＳ配列を標的化するｓｇＲＮＡ配列をコードする核酸配列を生成した。特に、４ｂｐ欠失は２０ｂｐのＮＧＦＳの認識配列内に存在した。ｓｇＲＮＡをコードする配列をプラスミドｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ内に、Ｕ６プロモーターから発現されるように導入した。最終コンストラクト（ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ−ＮＧＦＳと命名した）をシークエンシングで確認した。このｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ−ＮＧＦＳを用いることで、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び対応するｓｇＲＮＡを発現させ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、ＮＧＦＳ遺伝子配列の４塩基対欠失の上流の所定の部位に標的化することができる。
【０３１８】
ドナー核酸テンプレートライブラリーの構築／設計
合成されたｓｓＤＮＡの１０５塩基対の修復テンプレート（即ちドナー核酸テンプレート）、名称NSFS-R（配列番号３０参照）は、ＮＧＦＳ欠失の両側にそれぞれ５０ｂｐの相同配列を含むと共に、ＮＧＦＳ配列内の４bpが欠失された配列である。本テンプレートを用いて、Ｃａｓ９系の効率を試験した。また、欠失されたアミノ酸及びフレームシフトを置換し、欠失に隣接する１又は２アミノ酸をランダム化するために、やはり５０ｂｐの相同性フランキング配列と、縮重ＮＮＢコドンとを含む２つのドナー核酸テンプレートのライブラリーも生成した。これらのライブラリーは、それぞれランダム化されたアミノ酸の数に因んで、ＮＧＦＳ−３Ｍ及びＮＧＦＳ−５Ｍと命名した。
【０３１９】
全てのクローニング工程は、大腸菌（E. coli）ＸＬ１−ブルー（Agilent）内で、アンピシリンを補充したＬＢプレート及びＬＢ培地を用いて、３７℃で培養することにより行った。
【０３２０】
安定な細胞系列の生成
Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３細胞系列（Thermofisher）の培養は、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び２．５ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭを用いて行い、ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＮＧＦＳと、Ｆｌｐ−リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むｐＯＧＧ４４プラスミド（Thermofisher）とを用いて共形質転換を行った。形質転換にはリポフェクタミン３０００を用い、標準的なプロトコールに従って行った。細胞を１００μＭのハイグロマイシン選択に供し、同質なコロニーが生成されたら、斯かるコロニーをプールし、標準プロトコールに従って維持した。結果として、ＮＧＦＳ遺伝子の単一のコピーを含む安定な細胞系列が得られた。注目すべきは、使用されたＦｌｐ−Ｉｎストラテジーによって、単一のｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＮＧＦＳベクターがＦｌｐ−Ｉｎ−２９３細胞系列内の所定の標的部位に（Ｆｌｐ媒介組換えにより）導入され、ＮＧＦＳ遺伝子の単一のコピーがゲノムに組み込まれることになる。Ｆｌｐ−Ｉｎ組換えの基本原理は、本技術分野で公知であり、例えばhttps://www.thermofisher.com/de/de/home/references/protocols/proteins-expression-isolation-and-analysis/protein-expression-protocol/flp-in-system-for-generating-constitutive-expression-cell-lines.htmlに記載されている。
【０３２１】
ＨＥＫ２９３ Ｃａｓ９発現、ドナー修復テンプレートライブラリーの提供、及びＦＡＣＳ選別
細胞を１０ｃｍのプレートで８０％の集密度となるまで培養した後、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ−ＮＧＦＳと、ドナー核酸テンプレートのライブラリーＮＧＳＦ−３Ｍ、ＮＧＦＳ−５Ｍ、及びＮＧＦＳ−Ｒの何れかとの共形質転換に供した。細胞を蛍光顕微鏡（Axiovert 135TV, Zeiss）で観察したところ、９６時間後に最大の蛍光が観察された。細胞をＦＡＣＳ細胞選別（FACSAria III, BD Biosciences）用に調製した。ＦＩＴＣ チャンネルで蛍光を発する全ての細胞を選別し、増幅した。
【０３２２】
第１ラウンドでは、ＮＳＦＳ−３Ｍ及びＮＧＦＳ−５Ｍ選別細胞を、１０ｃｍのプレート上で密集するまで培養し、その時点で５百万の細胞を採取し、DNeasy Blood & Tissueキット（Qiagen）を用いたゲノムＤＮＡ抽出に供した。残る細胞を培養し、その後のラウンドのＦＡＣＳに供し、各ラウンド毎に上位５％の明度を有する細胞を選択して増幅した。最終ラウンドの後、最もパフォーマンスの良い変異体、即ち最も蛍光の強い変異体からゲノムＤＮＡを抽出した。
【０３２３】
ＤＮＡ分析及び標的遺伝子の突然変異の検証、並びにタンパク質の発現及び分析
上記の手順で単離されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、プライマー５’−ＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴ−３’フォワード（配列番号３８）及び５’−ＴＡＴＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣ−３’ リバース（配列番号３９）を用いて、修復されたmNeonGreenのコーディングドメインを抽出した。これらのプライマーは、ＥｃｏＲＶ切断ベクターｐＳＬｉＣＥ３との重複領域を有する。ＳＬｉＣＥクローニング及びその後の大腸菌（E. coli）ＸＬ１−ブルーの熱ショック形質転換により、蛍光コロニーを生成した。初回ラウンドのＮＧＦＳ−３Ｍ及びＮＧＦＳ−５Ｍ選別では、蛍光強度には大きなばらつきが見られた。シークエンシング及びその後の大腸菌（E. coli）株ＢＬ−２１（NEB）内での発現のために、コロニーを選択してプラスミド調製（NucleoSpin Plasmid, Macherey-Nagel）に供した。
【０３２４】
要すれば、ＬＢ＋アンピシリン中、３７℃、振盪下で培養した形質転換ＢＬ２１の初回培養物４ｍＬを、２００ｍＬの自己誘導性Studier培地に接種し、ＲＴ、震盪下で４８ｈ培養した。細胞を採取し、リゾチームで溶解し、凍結融解サイクルに供し、１０ｍの超音波処理に供した後、超遠心分離を行った。１０−Ｈｉｓタグ化タンパク質を、ＮＩ−ＮＴＡ樹脂（Jena Bioscience）で精製し、２５ｍＭのイミジゾール（Imidizole）で洗浄し、２５０ｍＭのイミジゾール（Imidizole）で溶出した。３ＭグアナジンＨＣｌ中９５℃で５mの熱変性後、蛍光タンパク質の濃度をBradfordアッセイで決定した。４８０ｎｍの励起を用い、０．０１〜０．１吸光度単位の希釈スペクトルの統合蛍光スペクトルにより量子収量を決定し、０．１ＮのＮａＣｌ中フルオレセインの発光で較正した（ＱＥ０．９５）。
【０３２５】
実施例２：多様化及び標的化された突然変異誘発の方法の考えられる変形例
【０３２６】
本発明の手段及び方法によれば、標的タンパク質内のペプチド配列に対し、複合飽和突然変異誘発（complex saturated mutanogenesis）が可能となる。一般的な手順の流れを図１０に示す。
【０３２７】
本プロセスはまず、培養された細胞系列に対する初期の遺伝子（gene-of-interest：ＧＯＩ）の安定且つ単一コピーのみの組み込みを達成する。斯かる単一コピーの組み込みプロセスは、種々の手段により達成できる。例としては、標準的な抗生物質による選択、Ｆｌｐ−Ｉｎ及びＪｕｍｐ−Ｉｎ組換え、レンチウイルストランスフェクション及び選択、又は、例えばＡＡＶＳ１遺伝子座内等における、相同性ドメインを用いたＣａｓ９標的化切断及び組換え等が挙げられる。以下の記載では安定な単一コピーの細胞系を生成するためのＦｌｐ−Ｉｎ系に絞って説明するが、これに限定されるものではない。
【０３２８】
ＧＯＩはフレームシフト突然変異を受容するが、これは多様化の標的部位に位置する。また、斯かる部位は、部位特異的ヌクレアーゼによる開裂の標的としても好適である。当該ＧＯＩは、蛍光タンパク質でも非蛍光タンパク質でもよい。所望の場合には、斯かるＧＯＩによりコードされるタンパク質産物は、種々のマーカー遺伝子、例えば更なる蛍光レポーター又は薬物抵抗遺伝子等と融合されたものであってもよい。その場合、これらのマーカーは直接融合していてもよく、開裂可能な又は自己開裂ペプチドリンカーにより融合していてもよい。ＧＯＩ内のフレームシフトゆえ、斯かるマーカーは当初は正しく発現されない。斯かるフレームシフトは、ＧＯＩのクローニングの際に、部位特異的突然変異誘発によって生じるものであってもよく、或いはＧＯＩ・マーカー融合体を含む細胞系内で直接的、以下に記載するようなヌクレアーゼプロセスによって生じるものでもよい。
【０３２９】
所期の遺伝子内に標的化二本鎖切断を導入するには、ヌクレアーゼとしてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いることが好ましい。効率的であり、且つ、遺伝子内の多くの部位を標的とするようプログラム可能だからである。しかし、一本鎖ニック、又は好ましくは二本鎖切断を導入する他の酵素及び手段、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）又は転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）も適用可能である。所期の遺伝子内の正しい位置に存在しない場合、ＣＲＩＳＰＲ （ＰＡＭ部位）による開裂の標的部位や、ＴＡＬＥＮ又はジンクフィンガーヌクレアーゼの標的部位を、所期の遺伝子内にフレームシフトと共に組換え導入することができる。切断及び修復により、斯かる部位は多様化された遺伝子から除去することができる。
【０３３０】
切断／修復プロトコールの効率を向上させることが可能な手段は幾つか存在する。トランスフェクションプロトコールや、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９又は他のヌクレアーゼを細胞内に送達する方法は、最適化することができる。更に、例えばＥ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６を共発現する方法や、阻害剤Ｓｃｒ７を用いてＫＵ７０及びＤＮＡリガーゼIVを抑制する方法を介して、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）を抑制することにより、相同組換え修復の効率を改善することができる。
【０３３１】
ＧＯＩ内のゲノムＤＮＡの開裂を標的化するには、単鎖ＤＮＡを相同組換え修復のテンプレート（即ちドナー核酸テンプレート）として使用する。斯かるオリゴヌクレオチドは、多様化に必要な縮重コドンと、フレームシフトを修正する塩基対とを含む。多様化配列の両側には、開裂部位に隣接する領域に対して相同な、長さ３０〜８０塩基対の領域が配置される。斯かる多様化配列は、あらゆるアミノ酸の発現を可能とするべく、特定のアミノ酸や縮重コドン、例えばＮＮＮ、ＮＮＫ／ＮＮＳ、ＮＮＢ、又はＭＡＸ系を含んでいてもよい。縮退コドンの間には、重要であり、多様化すべきでない、元のペプチド配列由来のアミノ酸が介在していてもよい。縮重の数や具体的なコドンの数は種々変更してもよく、それによって最終タンパク質の長さが延長又は短縮されてもよい。
【０３３２】
多様化の後、正しい処理を受けた細胞は、融合されたマーカー遺伝子を発現する。この遺伝子はＧＯＩと同一のレベルで発現される。蛍光タンパク質を使用する場合、この遺伝子はタンパク質濃度の推定根拠ともなる。従って、ＧＯＩを利用した結合アッセイのためには、発現レベルに基づき結合を較正することができる。蛍光マーカー遺伝子を発現する細胞は、抗生物質選択よりも迅速なプロセスである、ＦＡＣＳ又はマイクロ流体選別により迅速に採取可能である。
【０３３３】
融合マーカーが陽性又は陰性の抵抗性遺伝子である場合、多様化された変異体のみからなる細胞集団を得るには、幾つかの可能性が存在する。複数の開裂可能なペプチドリンカー、例えばＴ２Ａ又はＦ２Ａと共に、陽性マーカーと陰性マーカーの両方を使用する場合は、元のＧＯＩを上記のプロセスでフレームシフト変異体に変換し、陰性選択を用いて非フレームシフト変異体を除去すればよい。このためには、例えば単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ等の遺伝子を用い、ガンシクロビル等で選択を行えばよい。こうして同質な細胞が得られたら、上記のプロセスによる多様化を行った後、残存する不所望のフレームシフト変異体を、陽性選択遺伝子、例えばハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ等と、ハイグロマイシンＢ等を用いて除去すればよい。但し、他の選択マーカーを使用することも可能である。
【０３３４】
本開示にて提供される製造方法の用途の例として、既知の最も明るい単量体蛍光タンパク質である、mNeonGreenをコードする遺伝子の多様化を挙げて説明する。本開示にて提供される方法を用いることで、種々のタンパク質、例えばmNeonGreen等を多様化し、明度が増した変異体をＦＡＣＳにより選別することができる。単量体mNeonGreenは、三量体蛍光タンパク質LanYFPから改変されたものである。赤色蛍光マーカー遺伝子mKate2を、mNeonGreenのＣ末端に融合してもよい。フレームシフト修正の後も蛍光は維持されるが、多様化されたmNeonGreenの変異体は、明度が低下した場合や非蛍光の場合でも採取することが可能である。選別の際にはmKate2を利用して、タンパク質発現レベルを修正してもよい。実験プロセスの例を図１０に示す。
【０３３５】
予測される結晶構造、及び、mNeonGreenの開発に際し公開された研究結果によれば、複合飽和突然変異誘発のために標的化可能な領域は５つ存在する。mNeonGreen内の標的選択の例を図８に示す。mNeonGreen内の部位を標的とするｓｇＲＮＡの生成に使用可能なプライマーのリストを図９に示す。本開示にて提供される方法を用いることにより、例えば各遺伝子座において、５つのアミノ酸に飽和突然変異誘発を生じさせることで、一遺伝子座当たり３百２十万の組合せ変異体を生じさせることが可能となる。更に、多様化対象の配列内において、一部の部位で特定の残基が改変されないように、本開示にて提供される方法を実施することも可能である。例えば、二量体及び三量体形成を防止し、単量体mNeonGreenを生成する目的で従前導入された残基を、改変されないようにブロックしてもよい。これらの残基の改変を防ぐことで、二量体による干渉の形成を防止することが可能となる。斯かる本開示にて提供される方法の例は、本発明が可能とする突然変異誘発が、極めて高いフレキシビリティーを有することを示している。
【０３３６】
初回の選別で、組換えが首尾よく行われたことを示す赤色蛍光変異体の全てを選別した後、mNeoGenシークエンシングを用いて多様化領域の配列を決定し、多様化の範囲を正確に確認してもよい。斯かるシークエンシングには、例えばIllumina MiSeq NextGen シークエンシングプラットフォームを使用できる。
【０３３７】
変異体の各セットを複数ラウンドのスクリーニングに供し、最も優れた特性を有する蛍光タンパク質変異体を選択してもよい。最終的な変異体を、任意により特性決定後、ＤＮＡシャッフリングに供することにより、野生型の所期のタンパク質、この場合には前駆体であるmNeonGreenと比較すべき、最終セットとなる変異体の組み合わせを生成してもよい。
【０３３８】
材料及び方法
【０３３９】
融合遺伝子（例えばmNeonGreen及びmKate2）を多様化するための材料及び方法を以下に示す。
【０３４０】
オリゴアニーリング及び骨格ベクターへのクローニング：
【０３４１】
１．１μｇのｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏを、ＢｂｓＩにより３７℃で３０分間消化：
１μｇ プラスミド （ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ）
１μＬ ＢｂｓＩ
１μＬ アルカリホスファターゼ
２μＬ １０×緩衝剤
ＸμＬ ｄｄＨ２Ｏ
２０μＬ 総量
２．消化されたプラスミドをゲルで精製
３．オリゴの各対をリン酸化及びアニール：
１μＬ オリゴ１（１００ｍＭ）
１μＬ オリゴ２（１００ｍＭ）
１μＬ １０× Ｔ４ライゲーション緩衝剤（NEB）
６．５μＬ ｄｄＨ２Ｏ
０．５μＬ Ｔ４ ＰＮＫ（NEB）
１０μＬ 総量
アニールはサーモサイクラーで、以下のパラメーターを用いて実施：
３７℃  ３０分、
９５℃    ５分、その後
２５℃まで５℃／分ずつ降温。
４．ライゲーション反応を設定し、室温で１０分間：
ＸμＬ 工程２のＢｂｓＩ消化プラスミド（５０ｎｇ）
１μＬ 工程３のリン酸化及びアニールされたオリゴ二本鎖（１：２００希釈）
５μＬ ２× Quickライゲーション緩衝剤（NEB）
ＸμＬ ｄｄＨ２Ｏ            
１０μＬ 部分総量
１μＬ Quickリガーゼ（NEB）
１１μＬ 総量
５．プラスミドをＸＬ１−ブルーに形質転換。
６．シークエンシングによりクローンを確認、Midiprepでベクターを増幅。
【０３４２】
ＰＣＲ突然変異誘発のためのフレームシフト用プライマー 
【表１】
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【０３４３】
ＰＣＲ突然変異誘発
【０３４４】
１．ＰＣＲ ｐＳＬｉＣＥ３−NeonGreen
１μＬ プラスミド
１μＬ プライマーＦ  １０×希釈
１μＬ プライマーＲ  １０×希釈
１μＬ ｄＮＴＰ
１μＬ Herculase II
１０μＬ ５×Herculase緩衝剤
３５μＬ ｄｄＨ２Ｏ
５０μＬ 総量
９５℃／３０ｓ変性、６０℃／３０ｓアニーリング、７２℃／３ｍ伸長：
２．Ｄｐｎ１消化
５０μＬのＰＣＲ反応混合物中２．５μＬ
３７℃で６０分：
３．分析ゲル ＋ ＰＣＲクリーンアップ。
【０３４５】
ＦＲＴ ベクター 生成
１．ＰＣＲ NeonGreen-フレームシフト
１μＬ ｐＳＬｉＣＥ３−NeonGreenフレームシフト
１μＬ プライマーＦ  １０×希釈
１μＬ プライマーＲ  １０×希釈
１μＬ ｄＮＴＰ
１μＬ Herculase II
１０μＬ ５×Herculase緩衝剤
３５μＬ ｄｄＨ２Ｏ
５０μＬ 総量
９５℃／３０ｓ変性、６０℃／３０ｓアニーリング、７２℃／３０ｓ伸長：
２．ＰＣＲ mKate2
１μＬ pSlice３−mKate2
１μＬ プライマーＦ  １０×希釈
１μＬ プライマーＲ  １０×希釈
１μＬ ｄＮＴＰ
１μＬ Herculase II
１０μＬ ５×Herculase緩衝剤
３５μＬ ｄｄＨ２Ｏ
５０μＬ 総量
９５℃／３０ｓ変性、６０℃／３０ｓアニーリング、７２℃／３０ｓ伸長：
３．１μｇのｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ−ＡＰＭＡ−ａｐ−ＩＲＥＳ−Ｈ２ＢＧＦＰをＡｆlII及びＮｏｔＩにより３７℃で３時間消化：
１μｇ プラスミド
１μＬ ＡｆlII
１μＬ ＮｏｔＩ
２μＬ １０×緩衝剤
ＸμＬ ｄｄＨ２Ｏ
２０μＬ 総量：
４．消化されたＤＮＡのゲル精製：
５．ＤＮＡ断片を３７℃で３０分間、ＳＬｉＣＥでライゲート：
１μＬ 工程３の切断プラスミド
３μＬ 工程１の断片
３μＬ 工程２断片の
１μＬ Ｔ４ライゲーション緩衝剤
１μＬ ＳＬｉＣＥ 試薬
１μＬ ｄｄＨ２Ｏ
１０μＬ 総量：
６．形質転換：
７．シークエンシングによるクローンの確認。
【０３４６】
安定な細胞系列の生成
１．３×３０ｍｍプレートでＦｌｐ−Ｉｎ−２９３細胞を８０％の集密度となるまで培養。
２．形質転換する with １０：１のｐＯＧ４４プラスミド及びｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＮＧＦＳプラスミドをリポフェクタミン３０００で形質転換。
３．抗生物質の不在下、３０℃で一晩培養。
４．コロニーが形成されるまで３０、６０、及び１２０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンで選択。
【０３４７】
ライブラリー生成
１．４×１０ｃｍプレートで各mNeonGreen−mKate2変異体を８０％の集密度となるまで培養。
２．ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ−ＮＧＦＳ１−５プラスミドをリポフェクタミン３０００により形質転換。１００ｐＭ／ｕｌテンプレートを１０００×に希釈し、培地の最終体積とする（１００ｎＭ）。
３．ＦＡＣＳ前に９６時間培養。
【０３４８】
ＦＡＣＳ 第１ラウンド
１．細胞をトリプシンで処理。
２．２百万細胞／ｍＬとなるよう再懸濁。
３．NeonGreen−mKate2 対照系を含め、各細胞系列につき１百万事象を記録。
４．mNeonGreen−mKate2対照系により決定される、mKate2蛍光を示す全細胞を選別。
mKate2にはＰＥ−ＴｅｘａｓＲｅｄ又はＰＥ−Ｃｙ５を用い、最も優れたシグナルのものを使用。
１５ｍＬファルコンチューブに２ｍＬの培地を入れ、各コンストラクト当たり４本を作製。
４００ｋ細胞毎に採取チューブを交換。
５．コンストラクト当たり約１．６百万細胞を予想（５％効率）。
６．２×１０ｃｍプレートで密集するまで培養。
７．各ライブラリー変異体につき、細胞をトリプシン処理し、プールし、洗浄し、５百万細胞を採取して、DNeasy Kitを用いてゲノムＤＮＡ抽出。ＤＮＡを−８０℃で保存。
８．残る細胞をＦＡＣＳ用に２×１０ｃｍプレートに播種。
【０３４９】
ＦＡＣＳ 第２ラウンド以降
１．細胞をトリプシンで処理。
２．２百万細胞／ｍＬとなるよう再懸濁。
３．NeonGreen−mKate2 対照系を含め、各細胞系列につき１百万事象を記録。
４．ＦＩＴＣチャンネルの全ての細胞を選別。
Forward ScatteringによりＦＩＴＣをプロット。
明度が上位１０％の細胞を取得、但しサイズにより較正。
１５ｍＬファルコンチューブに２ｍＬの培地を入れ、各細胞系当たり４本を作製。
４００ｋ細胞毎に採取チューブを交換。
５．コンストラクト当たり約１．６百万細胞を予想。
６．２×１０ｃｍプレートで密集するまで培養。
【０３５０】
実施例３：蛍光タンパク質mRuby2の原位置標的化突然変異誘発及びその後の変異体のディープシークエンシング分析
【０３５１】
この実施例３では、Ｆｌｐ−リコンビナーゼ系を用いて、タンパク質をコードする遺伝子の単一のコピーを哺乳類細胞系列に挿入する。本実施例においては、蛍光タンパク質mRuby2（Lam, 2012, Nature methods 9.10: 1005-1012）（配列番号３１）を、ピューロマイシン抵抗性遺伝子（ピューロマイシンＲ）（配列番号３２）に対し、Ｐ２Ａペプチド（配列番号２）を介してＣ末端で連結したものを作製した。前記ライブラリーの成員を親mRuby2から識別するために、不活性化突然変異をフレームシフトの形態で、mRuby2のリーディングフレーム内に挿入し、標的タンパク質の正しい発現、惹いてはＣ末端に融合されたタンパク質ピューロマイシンＲの正しい発現を阻害した。変異体ライブラリー生成手順は、２つの連続する工程を含む。要すれば、第一の工程では、Ｃａｓ９／mRuby2−Ｐ２Ａ−ｐｕｒｏＲ二重安定細胞を、まずインビトロ（in vitro）転写フレームシフト用ｓｓＯＤＮトでランスフェクトすることにより、発色団領域内の２つのヌクレオチドを欠失させて特異的なフレームシフトを生じさせる。その後、フレームシフトにより非発光性となった細胞をＦＡＣＳで選択する。その後の第二の工程では、フレームシフトされたmRuby2−Ｐ２Ａ−ｐｕｒｏＲカセットを発現する非発光細胞を、フレームシフトされたmRuby2に結合する他のインビトロ（in vitro）転写ｓｇＲＮＡ及びｓｓＯＤＮにより、ランダム化しながらトランスフェクトすることにより、mRuby2変異体ライブラリーを生成する。Ｃ末端に融合されたピューロマイシン抵抗性遺伝子により、mRuby2ライブラリーを適切に発現する細胞を陽性選択して濃縮すると共に、フレームシフトを含む親細胞を取り除くことが可能となる。第二の工程の最後に、ピューロマイシンによる抗生物質処置を行う。実験の詳細は方法の欄で説明する。
【０３５２】
多様化対象の蛍光タンパク質のコンストラクト設計を、図１１に模式的に示す。
【０３５３】
第二のmRuby2コンストラクトには、青色蛍光タンパク質ＴａｇＢＦＰ２に加えて、ピューロマイシン抵抗性遺伝子がＣ末端マーカーとして組み込まれている（配列番号９４）。これにより、青色レーザーラインによる更なるＦＡＣＳ選別が可能となる。斯かるコンストラクトを図１５に模式的に示す。
【０３５４】
結果及び考察
【０３５５】
詳細には、まず、マーカータンパク質であるＮ−アセチルトランスフェラーゼピューロマイシン抵抗性タンパク質の単一のコピーを含むプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−mRuby2−Ｐ２Ａ−ピューロマイシンＲ）を生成する。マーカータンパク質は、Ｐ２Ａペプチドを介して蛍光タンパク質mRuby2のＣ末端に連結され、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現される。並行して、ネオマイシン抵抗性遺伝子に融合されたＣａｓ９遺伝子を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞系列を生成した。
【０３５６】
次工程では、ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−mRuby2−Ｐ２Ａ−ピューロマイシンＲプラスミドベクターの単一のコピーがゲノムに組み込まれたＣａｓ９安定化細胞を用いて、二重安定細胞系列を生成した。具体的には、これはＦｌｐ−Ｉｎ−２９３細胞系列（Thermofisher）へのＦｌｐ−Ｉｎ組換えを用いて達成した。最後に、mRuby2−Ｐ２Ａ−ピューロマイシン遺伝子カセットの単一のコピーを含み、Ｃａｓ９−ネオマイシンＲ遺伝子を発現する二重安定細胞系列が生成された。
【０３５７】
生成された二重安定細胞系列を、２つの工程からなる突然変異誘発プロトコールに利用した。これにより最終的に、mRuby2の複数の異なる突然変異体を発現する細胞のパネルが生成された。斯かるライブラリー生成手順は、連続する２つの工程を含む。第一の工程では、mRuby2＋／Ｃａｓ９＋二重陽性細胞を、まずmRuby2の発色団領域内の２つのヌクレオチドの欠失により特異的にフレームシフトを導入するｓｓＯＤＮでトランスフェクトする。その後、mRuby2にフレームシフトを生じることで暗くなった細胞を、ＦＡＣＳにより選択した。それに続く第二の工程では、フレームシフトを含むmRuby2−Ｐ２Ａ−ピューロマイシンＲタンパク質を発現する非発光細胞を、フレームシフトを修復することにより変異体細胞ライブラリーを生成するｓｓＯＤＮにより、ランダム化しながらトランスフェクトした。第一及び第二の工程の何れにおいても、変異体は組換え系アプローチにより、本実施例の場合は部位特異的二本鎖切断（double-strand break：ＤＳＢ）を導入するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系により生成した。
【０３５８】
第一の工程では、前記細胞のゲノムにおける、Ｍｅｔ−６７のコドンの最後のヌクレオチドに対応する位置に、ＤＳＢが導入された。これは、mRuby2の発色団領域の一部に当たる。この第一のＤＳＢによって、mRuby2−Ｐ２Ａ−ピューロマイシンＲカセットの単一のコピー内にフレームシフト突然変異が生じる。斯かる目的の下、mRuby2タンパク質を不活性するために、特異的にインビトロ（in vitro）で転写されたｓｇＲＮＡで、mRuby2／Ｃａｓ９二重安定細胞系列をトランスフェクトすると共に、フレームシフトを生じさせるｓｓＯＤＮドナーテンプレートを細胞系列に共トランスフェクトした。斯かるオリゴヌクレオチドは、相同標的化修復により、導入されたＤＳＢを修復するためのドナー核酸テンプレートとして機能させるための配列を有する。相同標的化修復のためのドナー核酸テンプレートとして機能するために、斯かるオリゴヌクレオチドは、ＤＳＢに隣接する領域に相同な配列を含む。更に、斯かるオリゴヌクレオチドは、mRuby2の発色団領域のすぐ上流側に、２つのヌクレオチドを欠失させ、フレームシフトを生じさせる配列を含む。
【０３５９】
Tフレームシフトを生じさせるｓｓＯＤＮトランスフェクションの２日後、mRuby2のフレームシフト変異体を発現する細胞を採取するべく、細胞をＦＡＣＳに供した。TexasRedチャンネルを、mRuby2のスペクトルプロファイルに適合させたFACSAria IIIソーター（BD）で用いた。mRuby2を発現しないＨＥＫ２９３細胞系列の基底シグナルに基づきオフセットされた上で、ゼロ値シグナルを示す全ての細胞を、フレームシフトを生じた非発光細胞として採取した。ＦＡＣＳ選別データによれば、全集団に対する非発光細胞の百分率は、即ち突然変異効率は４０％であった。選別した細胞を更に４日間培養した上で、突然変異誘発プロトコールの第二の工程に供した。非発光細胞の選別後の４日目に、細胞の半分を保存用に凍結し、残る半分を第二の工程で用いた。
【０３６０】
第二の工程では、前記細胞のゲノム内における、mRuby2遺伝子の発色団領域のすぐ上流側に相当する位置に、ＤＳＢを導入した。この第二のＤＳＢ、及び、それに続く共送達されたｓｓＯＤＮライブラリーを通じた相同標的化修復によって、フレームシフトを修正すると共に、変異体mRuby2細胞ライブラリーを生成した。相同標的化修復のドナー核酸テンプレートとして機能するために、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮs）は、ＤＳＢに隣接する領域に相同な配列を含む。更に、斯かるオリゴヌクレオチドは、mRuby2の発色団領域タンパク質を含む、アミノ酸Ｍｅｔ６７−Ｔｒｙ６８−Ｇｌｙ６９を置換する多様化されたコドンを含む。斯かるオリゴにおけるコドンの多様化のために、合成スキームＮＮＢを使用した。ここで、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、ＢはＡ（アデニン）以外の任意のヌクレオチドを表す。オリゴヌクレオチドはリバース鎖に結合するため、多様化されるコドンは配列ＶＮＮでコードされる。ここで、ＶはＴ（チミジン）以外の任意のヌクレオチドを表す（配列番号３３参照）。従って、逆鎖から読んだ場合、生成される配列はＮＮＢとなる。
【０３６１】
ｓｓＯＤＮは全長１０９ヌクレオチドであった。ｓｓＯＤＮの５’及び３’の両部位には５０塩基の相同性領域が存在し、それらの間には９つのランダム化されたヌクレオチドが存在する（配列番号３４）。ＮＮＢコドンは、第一及び第二のヌクレオチド位置（ＮＮ）における４種のヌクレオチドの何れかと、第３の位置（Ｂ）におけるＡ以外のヌクレオチドとからなる。実験の詳細は方法の部に示す。また、斯かるオリゴヌクレオチドは、mRuby2内のフレームシフト突然変異を、相同標的化修復によって除去するように構成される。適切なｓｇＲＮＡ及び修復オリゴヌクレオチドとのトランスフェクションから２４時間後、培地を交換し、培地に新鮮なピューロマイシンを補充しながら、３日間連続で２μｇ／μＬのピューロマイシンを細胞に適用した。最初の２日間の適用後には、相当数の細胞死が観察されるが、３日目には、それほどの細胞死は見られなくなったので、ピューロマイシン処理を終了した。ピューロマイシン処理により、インフレーム変異体が陽性選択され、親フレームシフト細胞が、不所望の早期の停止コドンを有する細胞と共に除去された。最終的に、この抗生物質処置により、所望のライブラリーを含む細胞が濃縮された。
【０３６２】
最後に、全ライブラリーを、MiSeq次世代シークエンシング系（Illumina）によるディープシークエンシングに直接用いた。全変異体遺伝子ライブラリーを採取するために、RNeasyミニキット（Qiagen）を用いて総ＲＮＡ単離を実施した。総ＲＮＡの採取後、遺伝子特異的プライマー（配列番号３５）を用いて、mRuby2配列をｃＤＮＡライブラリーに逆転写し、続いてMachery Nagelゲル＆ＰＣＲクリーンアップキットで精製した。次に、これらのｃＤＮＡライブラリーを１０サイクルのＰＣＲで増幅し、ディープシークエンシングに供した。mRuby2配列の所期の小さな領域のみをＰＣＲ増幅した。増幅された配列は、野生型mRuby2のＤＮＡ配列内のヌクレオチド位置８６〜３１３内の領域に対応する。１０サイクルのＰＣＲにはフォワード及びリバースプライマーを用いた。これらは何れも、ライブラリーアンプリコンがIllumina MiSeqプラットフォームのフローに結合するのを可能とする、アダプターフランキング配列を有する（配列番号３６及び配列番号３７）。
【０３６３】
図１２に示すように、配列の９１％はインフレームであった。これは、ピューロマイシン選択が効率的に行われ、フレームシフトmRuby2−Ｐ２Ａ−ピューロマイシンＲカセット及び／又は早期の停止コドンを含む細胞の殆どが除去されたことを示している。他方、ライブラリーの要請を完全には満たさない配列が存在することも分かる。これらは、おそらくは相同標的化修復により、ヌクレオチド及びコドンの更なる挿入又は欠失が導入されたものと考えられる。しかし、本発明者らは、このように多様化された標的配列の長さに更なるばらつきが生じたことは、プロトコールの好ましい副作用であり、興味ある表現型の検出に有用かもしれないと考えた。オリゴヌクレオチドによって導入されたライブラリーの長さを完全に反映した配列の百分率は３５％であった。
【０３６４】
図１３に示すディープシークエンシングデータは、突然変異を形成したタンパク質の長さには、２１８〜２４３アミノ酸の間のばらつきがあることがあることを示している。それにもかかわらず、観察された主なタンパク質の長さは２３６であった。これは、野生型mRuby2タンパク質の長さである。これらのデータは、提案した突然変異誘発系によって、タンパク質の長さの点では、極めて高い正確さで、タンパク質ライブラリーを生成することができたことを示している。
【０３６５】
３コドン、９ヌクレオチドからなるmRuby2の発色団領域に対して、５’側及び３’側にそれぞれ５０塩基の相同性アームを有し、これらの相同性アームの間に３つの連続するＮＮＢコドン（ここでＮは任意のヌクレオチドを示し、ＢはＡ（アデニン）以外の任意のヌクレオチドを示す）を有する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、突然変異形成を誘導した。斯かる設計によって、ＴＡＡ及びＴＧＡ停止コドンの生成が除かれる。図１４は、何れのコドンでも３番目の位置にはＡヌクレオチドが観察されないことを示している。更に、突然変異形成位置全体に亘って、ヌクレオチドは概ね均等に、即ちランダムに分布している。これは、提案した方法により、意図的にプログラムされたバイアスを以て、極めて不均一且つ複雑なライブラリーが生成されたことを示している。
【０３６６】
第二の親コンストラクトでは、mRuby2が青色蛍光タンパク質ＴａｇＢＦＰ２及びピューロマイシン抵抗性遺伝子に融合された（図１５）。このコンストラクトを用いて、アミノ酸４３〜４７を多様化した。結晶構造の情報によれば、残基Ｑ４３、Ｔ４４、Ｍ４５、Ｒ４６、及びＩ４７は発色団と相互作用する領域の一部であることから、多様化の標的として期待される。まずは図１５に示す、mRuby2−ＴａｇＢＦＰ２−ピューロマイシンをコードする発現カセットを、ＨＥＫ２９３細胞のゲノム内に単一コピーのみ挿入した。これは、上述のようにＦｌｐ−Ｉｎ−２９３細胞系列に対するＦｌｐ−Ｉｎ組換えにより実施した。導入されたmRuby2−ＴａｇＢＦＰ２−ピューロマイシン遺伝子の単一のコピーは、不活性化されたフレームシフト突然変異をmRuby2遺伝子内に含んでおり、これによりカセットからのmRuby2タンパク質の発現が防止される。斯かる遺伝子のベクター内へのクローニングに先立ち、当該遺伝子に部位特異的突然変異誘発によりフレームシフト突然変異を導入した。具体的に、フレームシフト突然変異の特定の標的部位への導入は、所定の位置における２つの塩基対を欠失させ、mRuby2のフレームシフト型ヌクレオチド配列を生成することにより行った。その後、生成された細胞系列を用いて、mRuby2の異なる突然変異体を発現する細胞のライブラリーを生成した。具体的に、ここでは欠失部位の６ｂｐ下流に切断を導入した。
【０３６７】
変異体ライブラリーの生成及びmRuby2タンパク質の指向進化の手順は、２つの連続する工程を含む。要すれば、第一の工程では、Ｃａｓ９／mRuby2−Ｐ２Ａ−ｐｕｒｏＲ二重安定細胞を、改変されるべきＤＮＡ領域の近傍に結合するインビトロ（in vitro）転写ｓｇＲＮＡ、及び、所期領域の多様化を生じさせるｓｓＯＤＮで共トランスフェクトした。このｓｓＯＤＮの長さは１１５塩基であった。５’側５０塩基と３’側５０塩基は相同性アームであり、中間の１５塩基はＮＮＢの５つのコドンを有するライブラリーに組み込まれる。斯かる相同テンプレートは、所期領域の多様化を生じさせると共に、その相同性アームによって、事前に導入されたフレームシフトを除去し、再度フレーム化する。トランスフェクションの７２時間後、細胞をFACSAria IIIソーター（BD）で選別することにより、第二の工程が開始される（図１６、１７）。
【０３６８】
第二の工程、即ち新たな蛍光変異体の選択及び濃縮は、４つの連続するインフレーム選別プロセスを含み、ＦＡＣＳにより蛍光細胞が選択された。図１６に示すように、３回の逐次ラウンドのＦＡＣＳを適用することにより、より明るい変異体を徐々に選択及び濃縮した。第１ラウンドのＦＡＣＳでは、約１００百万個の細胞を処理し、その結果として、第１回目のラウンドの終わりに約２５０ｋ個の蛍光細胞を採取した。ラウンド１の後、採取された細胞からｍＲＮＡを採取し、ＤＮＡへと逆転写し、細菌発現ベクターｐＲＳＥＴＢにクローン化し、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１に形質転換した。Ｎｉ２＋親和性カラムを用いて、大腸菌（E. coli）から７つの異なるmRuby2タンパク質変異体を精製し、蛍光分光計により発光スペクトルを取得した（図１８）。多様化された変異体の配列を図１９に示す。何れの変異体も、意図したとおりに残基４３〜４７が多様化されていた。ｓｇＲＮＡ結合領域内におけるサイレント突然変異の導入又は欠落から判断するに、７つの変異体のうち５つがＨＤＲにより多様化されており、他はＮＨＥＪによるものであった（図１９）。
【０３６９】
ＦＡＣＳ選別のラウンド１後の細胞集団（図１６、１７）を、続いて更に２回のＦＡＣＳラウンドにより処理し、より高い蛍光強度を有する細胞の割合を増加させた。各ＦＡＣＳラウンドの間に、採取された細胞を１０ｃｍプレートで、プレート内で完全に密集するまで培養した。プレート内で完全に密集したところで、濃縮された細胞を更なるＦＡＣＳラウンドにより処理した。
【０３７０】
本発明者等の興味は、所期のタンパク質の修復及び多様化における、ＮＨＥＪ等の他の機構に対するＨＤＲの比率が、薬物処理又は他の条件によって変化するか否かを決定する点にもあった（図２０、２１）。種々のストラテジーによるＨＤＲ経路の誘導活性を試験するために、本発明者等は複数の異なる処理アプローチを検証した。ＨＤＲ活性の分析にはディープシークエンシング技術を用いた。実験の概要を図２０に示す。この実験では、前述したように、ＨＥＫ２９３細胞に単一コピーとして挿入された、mRuby2の無傷の単純コーディング配列を発現する細胞に、フレームシフトを生じさせるｓｓＯＤＮテンプレートを導入した。ｓｓＯＤＮを、フレームシフトを導入した領域の近傍に結合するｓｇＲＮＡと共に送達した。ＰＡＭ部位の直ぐ上流の２つのヌクレオチドを欠失させることによりフレームシフトを生じさせた。ｓｓＯＤＮの長さは１００塩基対であった。これは所定の２つのヌクレオチドの欠失の５’及び３’末端に相補的であった。
【０３７１】
８種の異なるストラテジーを検証し、１つの対照と比較した。対照としては、ＨＤＲｓｓＯＤＮテンプレートを用いず、ｓｇＲＮＡのみで細胞をトランスフェクトした。全ての例で同じｓｇＲＮＡを用いると共に、対照を除く全ての例で同じｓｓＯＤＮ ＨＤＲテンプレートを用いた。ノコダゾールを用いた例を除く全ての例において、処理薬物、ｓｇＲＮＡ、及びＨＤＲテンプレートを一緒に送達した。共送達から２４時間後、細胞培地を前記薬物を含まないものに交換した。ノコダゾールを用いた例では、細胞を予めノコダゾールで１８時間処理してから、ｓｇＲＮＡ、ｓｓＯＤＮ、及び処置試薬の共送達に供した。１８時間が経過した時点で、細胞を同期させ、トランスフェクションを実施した。トランスフェクションから７２時間後、細胞をＦＡＣＳソーターに供した。mRuby2チャンネルでゼロ値シグナルを示す全ての細胞と、青色チャンネルにおいて０から最大の間の任意のレベルのシグナルを示す細胞を、編集された細胞として採取した。この採取された全集団は、ＨＤＲテンプレートにより導入されたフレームシフトと、ＮＨＥＪにより生じたバラツキを含む、可能性のある何れかの編集を示している。合計２百万個の細胞を選別した後、全ライブラリーをMiSeq次世代シークエンシング系（Illumina）によるディープシークエンシングに直接使用した。全変異体遺伝子ライブラリーを採取するために、RNeasyミニキット（Qiagen）を用いて総ＲＮＡ単離を実施した。総ＲＮＡの採取後、遺伝子特異的プライマーを用いて、mRuby2配列をｃＤＮＡライブラリーに逆転写し、続いてMachery Nagelゲル＆ＰＣＲクリーンアップキットで精製した。その後、これらのｃＤＮＡライブラリーを１０サイクルのＰＣＲで増幅し、ディープシークエンシングに供した。mRuby2配列の所期の小さな領域のみをＰＣＲ増幅した（配列番号９５）。増幅された配列は、親mRuby2の元のＤＮＡ配列内における、ヌクレオチド位置７５〜３２４の間の領域に対応する。フォワード及びリバースプライマーを用いて、１０サイクルのＰＣＲを実施した。これらのプライマーは何れも、Illumina MiSeqプラットフォームのフローへのライブラリーアンプリコンの結合を可能とする、アダプターフランキング配列を有していた。異なる処理がＨＤＲに及ぼす影響の結果を図２１に示す。
【０３７２】
材料及び方法
ＦＲＴ ベクター 生成
１．ＰＣＲ mRuby2
１μＬ ｐＳＬｉＣＥ３−mRuby2
１μＬ プライマーＦ  １０×希釈
１μＬ プライマーＲ  １０×希釈
１μＬ ｄＮＴＰ
１μＬ Herculase II
１０μＬ ５×Herculase緩衝剤
３５μＬ ｄｄＨ２Ｏ
５０μＬ 総量
９５℃／３０ｓの変性、６０℃／３０ｓのアニーリング、７２℃／３０ｓの伸長。
２．ＰＣＲ Ｐ２Ａ−ピューロマイシン抵抗性遺伝子
１μＬ ｐＳＬｉＣＥ３−Ｐ２Ａ−ピューロマイシン抵抗性遺伝子
１μＬ プライマーＦ  １０×希釈
１μＬ プライマーＲ  １０×希釈
１μＬ ｄＮＴＰ
１μＬ Herculase II
１０μＬ ５×Herculase緩衝剤
３５μＬ ｄｄＨ２Ｏ
５０μＬ 総量
９５℃／３０ｓの変性、６０℃／３０ｓのアニーリング、７２℃／３０ｓの伸長。
３．１μｇのｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ−ＡＰＭＡ−ａｐ−ＩＲＥＳ−Ｈ２ＢＧＦＰを、ＡｆlII及びＮｏｔＩにより、３７℃で３ｈ消化：
１μｇ プラスミド
１μＬ ＡｆlII
１μＬ ＮｏｔＩ
２μＬ １０×緩衝剤
ＸμＬ ｄｄＨ２Ｏ
２０μＬ 総量。
４．消化されたＤＮＡをゲルで精製。
５．ＤＮＡ断片を３７℃で３０分間ＳＬｉＣＥライゲート：
１μＬ 工程３の切断プラスミド
３μＬ 工程１の断片
３μＬ 工程２の断片
１μＬ Ｔ４ライゲーション緩衝剤
１μＬ ＳＬｉＣＥ試薬
１μＬ ｄｄＨ２Ｏ
１０μＬ 総量。
６．形質転換。
７．シークエンシングによるクローンの確認。
【０３７３】
安定な細胞系列の生成
安定なＦＲＴ−mRuby2−Ｐ２Ａ−ピューロマイシンＲ発現細胞系列の生成：
１．Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３細胞を３×３０ｍｍのプレートで８０％の集密度となるまで培養。
２．１０：１のｐＯＧ４４-ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−mRuby2−Ｐ２Ａ−ピューロマイシンＲプラスミド及びリポフェクタミン３０００でトランスフェクト。
３．抗生物質の不在下、３０℃で一晩培養。
４．３０、６０及び１２０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンで、コロニーが形成されるまで選択。
安定なＣａｓ９発現ＦＲＴ−mRuby2−Ｐ２Ａ−ピューロマイシンＲ陽性細胞系列の生成：
１．ＦＲＴ−mRuby2−Ｐ２Ａ−ピューロマイシンＲ発現細胞系列を３×３０ｍｍのプレートで８０％の集密度となるまで培養。
２．１０：１の、ネオマイシン抵抗性遺伝子に融合された化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼを含むｐＳｐＣａｓ９プラスミドベクターと、リポフェクタミン３０００とでトランスフェクト。
３．抗生物質の不在下、３０℃で一晩培養。
４．６００μｇ／ｍＬのG４１８ 抗生物質で、コロニーが形成されるまで選択。
【０３７４】
ライブラリー生成ｘｃ
ライブラリー生成プロトコールは、２つの連続工程を含む。第一の工程では、細胞をまず、発色団領域内の２つのヌクレオチドの欠失によって特異的にフレームシフトを生じさせるｓｓＯＤＮによりトランスフェクトする。それに続く第二の工程では、フレームシフトが形成されたタンパク質を発現する細胞を、ライブラリーの生成を誘導するｓｓＯＤＮにより、ランダム化しながらトランスフェクトする。
【０３７５】
プロトコールは以下の通り：
第一の工程：
１．細胞をトリプシン処理した後、１０ｃｍの細胞培養プレートに、７０〜８０％の集密度となるように播種する。
２．播種の翌日、１０μｇのｓｇＲＮＡ＋１０μｇのフレームシフト形成用ｓｓＯＤＮ（mixed in ２００μＬのOptimemと混合）、及び、（別の２００μＬのOptimemチューブに入れた）７．５μＬのリポフェクタミンMessengerMax試薬を混合する。その後、これら２つの２００μＬの溶液を混合して一つとし、ＲＴで１５分間インキュベートする。総溶液を１０ｃｍのプレートに播種する。
３．翌日、培地を交換し、さらに一日インキュベートする。トランスフェクションから２日後、フレームシフトを含む非発光細胞をＦＡＣＳで選別し、１０ｃｍプレートで増幅する。６０〜７０％の集密度となるまで４日間かかる。
４．７０％の集密度に達した後、プレートを２つの１０ｃｍプレートに分割する。これらのプレートの一方を保存用に冷凍し、他のプレートを一晩培養して、ランダム化及びライブラリー生成プロセスに供する。
第二の工程：
５．翌日、フレームシフト形成mRuby2発現細胞内の所期の領域を、ＮＮＢ含有ランダム化ｓｓＯＤＮにより、上述したのと同一のトランスフェクションパラメーターを用いて、リポフェクタミンMessengerMaxでトランスフェクトする。トランスフェクションから２４時間後、培地を交換する。その後、細胞を１５ｃｍのプレートに移す。再播種から２４時間後、培地に新鮮なピューロマイシンを補充することにより、２μｇ／μＬのピューロマイシンを３日間連続で細胞に適用する。最初の２日間の適用の間は、顕著な数の細胞死が観察されたが、３日目には細胞死はほとんど見られなくなった。この時点でピューロマイシン処理を終了する。ピューロマイシン処理によって、インフレーム変異体と共に、早期の停止コドンを含まない細胞が陽性選択される。これにより、所望のライブラリーが組み込まれた細胞が濃縮される。
【０３７６】
ｃＤＮＡライブラリー生成及び次世代シークエンシングの調製
１．RNeasyミニキット（Qiagen）のデータシートに従って総ＲＮＡ単離を実施する。
２．RevertAid H Minus First Strand ｃＤＮＡ合成キット（Thermo Fisher）に従って、配列番号４のmRuby2特異的リバースプライマーにより、４２℃で５０分間ｃＤＮＡ変換を実施する。
３．配列番号５及び配列番号６のプライマー対を用い、２４の個別のＰＣＲチューブにより、全ｃＤＮＡライブラリーに対して１０サイクルの次世代シークエンシングＰＣＲを実施する。各ＰＣＲ反応チューブの反応条件は以下の通り：
２μＬ ｃＤＮＡ
１μＬ プライマーＦ  １０×希釈
１μＬ プライマーＲ  １０×希釈
１μＬ ｄＮＴＰ
１μＬ Herculase II
１０μＬ ５×Herculase緩衝剤
３４μＬ ｄｄＨ２Ｏ
５０μＬ 総量
９５℃／１０ｓの変性、６０℃／１０ｓのアニーリング、７２℃／１０ｓの伸長。
４．ＰＣＲ精製
５．MiSeq（Illumina）によるディープシークエンシング。
【０３７７】
実施例４：多様化及び標的化突然変異誘発のための方法を用いた抗体の改変
【０３７８】
上述のように、本開示にて提供される手段及び方法によれば、所期のタンパク質は抗体であってもよい。例えば、本発明は、天然変異体と比較して新たな特異性又は親和性を有するＦａｂ断片、単一鎖抗体、又は全長ＩｇＧの遺伝子操作及び選択において、数々の利点を提供する。
【０３７９】
この目的のために、Ｆａｂ断片、単一鎖抗体、又は軽鎖及び重鎖ＩｇＧをコードする遺伝子を、細胞に単一コピー挿入してもよい。フレームシフト又は他の不活性化突然変異が、前記突然変異誘発標的部位の近傍に挿入される。この例では、突然変異誘発標的部位は、ＣＤＲ（相補性決定領域）をコードする領域内に、即ち抗原結合ドメインの領域内に存在することが好ましい。しかし、突然変異誘発標的部位は、抗体機能に影響を与える他の部位内に存在していてもよい。
【０３８０】
必要であれば（例えばヒト細胞系においてヒト化抗体遺伝子を多様化する場合）、内因性抗体遺伝子配列と異なるコドンを用いることで、外因性遺伝子のみが多様化されるように構成してもよい。
【０３８１】
まずはライブラリーを、リーディングフレームの有効な回復、及び／又は、生成 of a 融合されたマーカー遺伝子（例えば蛍光タンパク質又は抵抗性マーカー）の生成に基づいてスクリーニングしてもよい。抗体ライブラリーの効率的な提示及びその後のスクリーニングのために、表面ディスプレイ技術を用いて、抗体変異体を細胞表面に局在化させてもよい。所期のタンパク質をコードする遺伝子カセットを細胞ゲノム内に単一コピー挿入する前に、抗体変異体を細胞表面に送達するための標的化配列を、斯かる遺伝子カセットに付加してもよい。斯かる技術は現在では非常に有効となっており、例えばＦａｂ断片、単一鎖抗体、又は全長ＩｇＧを、細胞、例えば哺乳類細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞等の表面に機能的に提示させる上で、極めて有効である。効率的ディスプレイ及びスクリーニングのためのプロトコールは、本技術分野では標準的となっており、例えばHo, 2008, Methods in Molecular Biology, 525: pp 337-352; and Zhou, 2012, Methods in Molecular Biology, 907: 293-302によって提供されている。
【０３８２】
斯かる表面に提示された抗体ライブラリーのスクリーニングは、ＦＡＣＳ選別によって行うことができる。この目的のために、フルオロフォアに連結した抗原を用いて、この特異的な抗原に親和性を示す抗体を提示する細胞を標識してもよい。ＦＡＣＳ選別によって、これらの細胞を収穫することができる。更なるスクリーニングのラウンドにおいて、未標識抗原の量を増加させながら細胞を洗浄することで、ストリンジェンシーを上昇させてから、更なるＦＡＣ選別に供してもよい。これにより、所与の抗原に対してより高い親和性を示す変異体を同定することが可能である。
【０３８３】
或いは、所望の抗体をパニングアプローチにより同定することもできる。この目的のためには、特異的な表面に所望の抗原を連結させればよい。抗体ライブラリーを細胞表面に発現する細胞を、この表面上でインキュベートする。有効な抗体を発現する細胞は、斯かる表面に結合する。非結合細胞を洗い流した後、加える可溶性抗原の量を増加させることにより、ストリンジェンシーを増加させることができる。数回の洗浄ラウンドの後、表面に結合して残存する細胞を、適切な方法、例えばトリプシン処理により収穫して回収することができる。
【０３８４】
選択された抗体変異体をコードする遺伝子を単離するには、これらの細胞に由来するポリＡ−ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲを実施してこれらの遺伝子をｃＤＮＡへと転写し、これらを適切なベクターにサブクローニングして更なる分析に供すればよい。
【配列表フリーテキスト】
【０３８５】
本発明では以下のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を参照する。
・配列番号１：２ＡペプチドＴ２Ａのアミノ酸配列：
ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
・配列番号２：２ＡペプチドＰ２Ａのアミノ酸配列：
ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
・配列番号３：２ＡペプチドＥ２Ａのアミノ酸配列：
ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
・配列番号４：２ＡペプチドＦ２Ａのアミノ酸配列：
ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
・配列番号５：ＴＥＶプロテアーゼの標的部位：Ｘは任意のアミノ酸でよい。
Ｇｌｕ、Ｘ、Ｘ、Ｔｙｒ、Ｘ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ／Ｓｅｒ
・配列番号６：ジェネナーゼＩ（Genenase I）の標的部位：
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ
・配列番号７：エンテロキナーゼの標的部位：
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
・配列番号８：ヒトライノウイルス （ＨＲＶ）３Ｃプロテアーゼの標的部位：
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
・配列番号９：因子Ｘａの標的部位：
Ｉｌｅ−（Ｇｌｕ又はＡｓｐ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
・配列番号１０：トロンビンの標的部位：
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
・配列番号１１：ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９ヌクレアーゼと使用される好ましいダイレクトリピート（ＤＲ）配列：
ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡ
・配列番号１２：ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９ヌクレアーゼと使用される好ましいｔｒａｃｒＲＮＡ配列：
ＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＴＴＴ
・配列番号１３：部位特異的突然変異誘発のフォワードプライマー：
５’−ＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＧＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＴＡＣＣ−３’−フォワード
・配列番号１４：部位特異的突然変異誘発のリバースプライマー：
５’−ＧＴＣＣＧＣＡＧＣＧＧＴＣＡＧＣＧＡＧＴＴＧＧＴＣ−３’−リバース
・配列番号１５：フォワード増幅プライマー：
５’−ＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＧＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＴＡＣＣ−３’
・配列番号１６：リバース増幅プライマー：
５’−ＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’
・配列番号１７：予めアニールされるフォワードプライマー：
５’−ＣＡＣＣＧＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＧＣ−３’
・配列番号１８：予めアニールされるリバースプライマー：
５’−ＡＡＡＣＧＣＧＴＣＣＧＣＡＧＣＧＧＴＣＡＧＣＧＣ−３’
・配列番号１９：ＦｏｋＩヌクレアーゼのアミノ酸配列：
【表２】
2019523005.tif 000005
・配列番号２０：ｍｅｇａＴＡＬエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列：
【表３】
2019523005.tif 000006
・配列番号２１：ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸配列：
【表４−１】
2019523005.tif 000007
【表４−２】
2019523005.tif 000008
・配列番号２２：ＬｂＣｐｆ１のアミノ酸配列：
【表５】
2019523005.tif 000009
・配列番号２３：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列：
【表６−１】
2019523005.tif 000010
【表６−２】
2019523005.tif 000011
・配列番号２４：Ｓｔ１Ｃａｓ９のアミノ酸配列：
【表７】
2019523005.tif 000012
・配列番号２５：ＳａＣａｓ９のアミノ酸配列：
【表８−１】
2019523005.tif 000013
【表８−２】
2019523005.tif 000014
・配列番号２６：フレームシフト型mNeonGreenのヌクレオチド配列：
【表９】
2019523005.tif 000015
・配列番号２７： mNeonGreenのコーディング領域のヌクレオチド配列：
【表１０】
2019523005.tif 000016
・配列番号２８：mNeonGreenのアミノ酸配列：
【表１１】
2019523005.tif 000017
・配列番号２９：mNeonGreenの突然変異形成コーディング領域のヌクレオチド配列：
【表１２−１】
2019523005.tif 000018
【表１２−２】
2019523005.tif 000019
・配列番号３０：１０５塩基対のドナー核酸テンプレート、通称ＮＳＦＳ−Ｒ：
【表１３】
2019523005.tif 000020
・配列番号３１：mRuby2のアミノ酸配列：
【表１４】
2019523005.tif 000021
・配列番号３２：ピューロマイシン抵抗性遺伝子のアミノ酸配列：
【表１５】
2019523005.tif 000022
・配列番号３３：mRuby2発色団領域のコドン多様化のためのオリゴヌクレオチド（リバース鎖に結合）：
５’ ＴＧＴ ＴＴＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＴＧ ＣＣＴ ＴＴＣ ＧＧＧ ＴＡＣ ＴＴＧ ＡＴＡ ＡＡＡ ＧＴＡ ＣＧＧ ＣＴ ＶＮＮＶＮＮＶＮＮ ＧＡＡＣＧＡＣ ＧＴＧ ＧＣＡ ＡＧＡ ＡＴＧ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＧＧ ＧＧＴ ＣＣＴ ＣＣＣ ＴＣＧ Ａ ３’
・配列番号３４：mRuby2の発色団領域近傍にフレームシフト（２ヌクレオチドの欠失）を誘導するのに使用されるオリゴ：
５’ ＡＧＴＣＡＴＣＧＡＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＴＧＣＣＡＣＧＴＣＧＴＴＣＧＴＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＴＡＣＴＴＴＴＡＴＣＡＡＧＴＡＣＣＣＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＣＡＧＴＣＣＴ ３’
・配列番号３５：ＲＴ ＰＣＲのための遺伝子特異的プライマー：
５’ ＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＣＣＣ ３’
・配列番号３６：ディープシークエンシングプライマー１：
５’ ＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧ ３’
・配列番号３７：ディープシークエンシングプライマー２：
５’ ＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＧＴＡＴＣＴＣＧ ３’
・配列番号３８：修復されたmNeonGreenのコーディングドメインを抽出するためのフォワードプライマー：
５’−ＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴ−３’ フォワード
・配列番号３９：修復されたmNeonGreenのコーディングドメインを抽出するためのリバースプライマー：
５’−ＴＡＴＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣ−３’ リバース
・配列番号４０：ＰＣＲ突然変異誘発のためのフレームシフト導入用プライマー、１．Ｆ：
ＣＴＴＴＡＡＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＣＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＡＧＣ
・配列番号４１：ＰＣＲ突然変異誘発のためのフレームシフト導入用プライマー、１．Ｒ：
ＣＣＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＴＡＡＡＧＧＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＧ
・配列番号４２：ＰＣＲ突然変異誘発のためのフレームシフト導入用プライマー、２．Ｆ：
ＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＴＴＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＣＡＡＡＡＣ
・配列番号４３：ＰＣＲ突然変異誘発のためのフレームシフト導入用プライマー、２．Ｒ：
ＴＡＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＣＣＧＣＡＧＣ
・配列番号４４：ＰＣＲ突然変異誘発のためのフレームシフト導入用プライマー、３．Ｆ：
ＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴＣ
・配列番号４５：ＰＣＲ突然変異誘発のためのフレームシフト導入用プライマー、３．Ｒ：
ＡＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＴＣＴＣＣ
・配列番号４６：ＰＣＲ突然変異誘発のためのフレームシフト導入用プライマー、４．Ｆ：
ＴＣＧＧＧＴＡＴＧＧＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＧＣＣＣＴＡＣＣＣＴＧＡＣ
・配列番号４７：ＰＣＲ突然変異誘発のためのフレームシフト導入用プライマー、４．Ｒ：
ＧＧＴＡＣＴＧＡＴＧＣＣＡＴＡＣＣＣＧＡＴＡＴＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧ
・配列番号４８：ＰＣＲ突然変異誘発のためのフレームシフト導入用プライマー、５．Ｆ：
ＧＴＣＣＧＣＡＧＣＧＧＴＣＡＧＣＧＡＧＴＴＧＧＴＣ
・配列番号４９：ＰＣＲ突然変異誘発のためのフレームシフト導入用プライマー、５．Ｒ：
ＧＣＡＡＣＣＧＴＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＴＡＣＡＡＡＧＧ
・配列番号５０：ＳａＣａｓ９の場合のＰＡＭ配列：
５’−ＮＮＧＲＲＴ
・配列番号５１：ＳａＣａｓ９の場合のＰＡＭ配列：
５’−ＮＮＧＲＲ（Ｎ）
・配列番号５２：Ｓｔ１Ｃａｓ９の場合のＰＡＭ配列：
５’−ＮＮＡＧＡＡＷ
・配列番号５３〜９０：添付の図に示す。
・配列番号９１：mNeonGreen2のヌクレオチド配列（多様化配列を斜体下線太字で示す）：
【表１６】
2019523005.tif 000023
・配列番号９２：mNeonGreen2のアミノ酸配列（多様化配列を斜体下線太字で示す）：
【表１７】
2019523005.tif 000024
・配列番号９３：mNeonGreen2内のアミノ酸配列：
Ａｓｐ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｔｒｐ
・配列番号９４：mRuby2−ＴａｇＢＦＰ２−ピューロマイシンのアミノ酸配列：
【表１８】
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・配列番号９５：元の親mRuby2配列内の配列決定領域のヌクレオチド配列：
【表１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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