(57)【要約】本開示は、ベルベリンナノ粒子の投与によって、免疫学的状態、例えばアレルギーを治療する方法を提供する。
2019531352.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において免疫疾患を治療する方法であって、ナノ粒子中に被包されたベルベリンまたはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはその塩を含むナノ粒子を含む、有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
ベルベリンまたはその塩が、前記ナノ粒子中に被包されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ナノ粒子がアニオン性ポリマーを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アニオン性ポリマーがアニオン性多糖である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アニオン性ポリマーが硫酸化多糖である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アニオン性ポリマーがアニオン性アミノグリカンポリマーである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記アニオン性ポリマーが硫酸化アミノグリカンポリマーである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、ベルベリン、またはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはそれらの塩と前記アニオン性ポリマーとを、約１：５〜約５：５、例えば、約１：５；約２：５；約３：５；約４：５または約５：５の範囲の重量比で含む、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ナノ粒子がヘパリンを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ナノ粒子が、ベルベリン、またはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはそれらの塩とヘパリンとを、約１：５〜約５：５、例えば、約１：５；約２：５；約３：５；約４：５または約５：５の範囲の重量比で含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が多糖を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノ粒子がリポ多糖を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ナノ粒子がアミノグリコシドポリマーを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ナノ粒子がキトサンを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ナノ粒子がベルベリン、ヘパリンおよびキトサンを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が、ヘパリンとキトサンとを、約５：１〜５：５の重量比、例えば約５：１〜約５：２．５、例えば約５：１、約５：１．５、約５：２または約５：２．５の重量比で含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ナノ粒子が、ベルベリン、ヘパリンおよびキトサンを、約２：５：１．５、約３：５：１．５、または約４：５：１．５の重量比で含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ナノ粒子が、約−１０〜約−５０ｍＶ、例えば、約−１０ｍＶ、約−１５ｍＶ、約−２０ｍＶ、約−２５ｍＶ、約−３０ｍＶ、約−３５ｍＶ、約−４０ｍＶ、約−４５ｍＶ、または約−５０ｍＶの範囲のゼータ（ζ）電位を有する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ナノ粒子が、約５ｎｍ〜約１０００ｎｍ、例えば、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約１０００ｎｍ；例えば、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、または約１０００ｎｍの範囲の平均粒径を有する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が経口投与される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が反復投与される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が１日に約１回の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物がほぼ１日おきの頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が週に約２回の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が週に約１回の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が２週間に約１回の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が月に約２回の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が月に約１回の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が２カ月に約１回の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物が３カ月に約１回の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が４カ月に約１回の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物が５カ月に約１回の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物が６カ月に約１回の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が年に約２回（半年ごと）の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が年に約１回（年ごと）の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が２年に約１回（隔年）の頻度で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
単回投与が、少なくとも約１週間、少なくとも約１カ月間、少なくとも約６カ月間、少なくとも約１年間、または少なくとも約２年間の期間にわたって免疫疾患を治療するのに有効である、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記免疫疾患がＩｇＥ媒介性免疫疾患である、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記免疫疾患がＢ細胞媒介性免疫疾患である、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
免疫障害が、アレルギー、喘息、アレルギー性鼻炎、関節リウマチ、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、乾癬、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、ギランバレー症候群、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主病および移植拒絶反応から選択される、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記免疫障害がアレルギーである、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記アレルギーが食物アレルギーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アレルギーが、ピーナッツ、木の実（例えば、アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、マカダミアナッツ、またはクルミ）、大豆製品、乳製品、卵製品、魚製品、甲殻類製品、グルテンまたは小麦製品に対する食物アレルギーである、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年１０月１４日に出願された米国特許仮出願第６２／４０８，５４１号の利益を主張する。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＡＴ００２６４７およびＡＴ００１４９５の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本開示は、アレルギーなどの免疫学的状態の治療に関し、より具体的にはアレルギーなどの免疫学的状態の治療に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
ＩｇＥ媒介性アナフィラキシー反応は、多くの場合、食物アレルギーを患っている人々にとって深刻であり時には致命的な健康への影響をもたらす。劇的にＩｇＥを低減することができる治療法は見当たらない。
【０００５】
ＩｇＥは、食物アレルギー、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、および他の多くのものなどのアレルギー性疾患の病理学において中心的な役割を果たす。生涯にわたる食物アレルギーおよびアレルギー性喘息などの持続的なアレルギー状態は、アレルゲン特異的ＩｇＥの慢性的な存在を意味し、ＩｇＥを低減させるための特異的な治療法は極めて限られている。喘息および他のアレルギー状態に対する標準的な治療は、多くの患者にとって準最適に有効であり、ＦＤＡが承認したＩｇＥ媒介性食物アレルギーに対する薬は存在しない。
【０００６】
慢性ステロイドの有害な副作用を考慮すると、アレルギー状態の非ステロイド治療の開発に関する研究は重要である。抗ＩｇＥ抗体投与は、ＩｇＥ分子を標的とすることによってアレルギー状態を治療するためのさらなる選択肢を提供し、制御が不十分な喘息の治療に組み込まれている。しかしながら、この治療は分泌されたＩｇＥを中和するが、それはＢ細胞によるＩｇＥ産生を停止しないため、効果を維持するために継続的な毎月の注射が必要である。ＩｇＥ−Ｂ細胞を意図的に枯渇させる、抗体を標的とするｍＩｇＥ（膜結合型ＩｇＥ）の使用に関する研究は進行中であるが、しかしながら、臨床試験において研究されたこの種の生物製剤の最初のものであるキリズマブを用いた初期のヒト研究は、有意な臨床的利益なしに、中程度のＩｇＥ低減のみを示した。Hendeles et al., Anti-immunoglobulin E therapy with omalizumab for asthma. Ann. Pharmacother., 2007, 41, 1397-410; Luger et al., Allergy for a lifetime? Allergol. Int., 2010, 59, 1-8; Gauvreau, et al., Targeting membrane-expressed IgE B cell receptor with an antibody to the M1 prime epitope reduces IgE production. Sci. Transl. Med., 2014, 6, 243ra85; Harris et al., A randomized trial of quilizumab in adults with refractory chronic spontaneous urticaria. J. Allergy Clin. Immunol., 2016, 138(6), 1730-1732; Harris et al., A randomized trial of the efficacy and safety of quilizumab in adults with inadequately controlled allergic asthma. Respir. Res., 2016, 17, 29.
【０００７】
Ｂ細胞によるＩｇＥ産生、特に記憶ＩｇＥ応答を阻害する方法は、重要な新規の抗ＩｇＥ治療法である。過去数年間において、伝統的な漢方（ＴＣＭ）処方ＦＡＨＦ−２とＡＳＨＭＩは、抗原特異的ＩｇＥおよびアレルギー性炎症の低減を含む包括的な抗アレルギー免疫効果を提供する、食物アレルギーおよび喘息のための効果的な代替療法であることが示された。Srivastava et al. The Chinese herbal medicine formula FAHF-2 completely blocks anaphylactic reactions in a murine model of peanut allergy. J. Allergy Clin. Immunol. 2005, 115, 171-8; Srivastava et al., Anti-Asthma Simplified Herbal Medicine Intervention-induced long-lasting tolerance to allergen exposure in an asthma model is interferon-gamma, but not transforming growth factor-beta dependent. Clin. Exp. Allergy 2010, 40, 1678-88. しかしながら、製品の使いやすさおよび効力を増大するためには継続的な研究が必要である。
【０００８】
ＦＡＨＦ−２の薬草構成物であるキハダ（Phellodendron amurens）から単離されたイソキノリンアルカロイド化合物であるベルベリン（ＢＢＲ）、およびブタノール精製されたＦＡＨＦ−２（Ｂ−ＦＡＨＦ−２）は、食物アレルギーを有する患者由来のヒトＢ細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＩｇＥ産生を有意に低減させた。Yang et al., Berberine and limonin suppress IgE production by human B cells and peripheral blood mononuclear cells from food-allergic patients. Ann. Allergy Asthma Immunol., 2014, 113, 556-64.e4. そのＩＣ５０値は０．１９６２μｇ／ｍＬと非常に低い。ＰＢＭＣにおける阻害は、非細胞毒性様式であり、これは、イプシロン生殖細胞系転写産物（εＧＬＴ）発現、ＩｇＥアイソタイプスイッチングを促進する重要なメカニズムの抑制と関連している。Yang et al., Berberine and limonin suppress IgE production by human B cells and peripheral blood mononuclear cells from food-allergic patients. Ann. Allergy Asthma Immunol., 2014, 113, 556-64.e4. この所見は、ベルベリンが抗ＩｇＥ治療法として開発される可能性があり得ることを示唆した。
【０００９】
ベルベリンは、東アジアで最も頻繁に使用されている漢方薬の１つであり、抗炎症作用を含む様々な薬理学的活性を有するが、その臨床応用はその乏しいバイオアベイラビリティーによって制限される。Singh et al., Berberine and its derivatives: a patent review (2009 - 2012). Expert. Opin. Ther. Pat., 2013, 23, 215-31. ベルベリンのバイオアベイラビリティーは、通常、１％未満である。Godugu et al., Approaches to improve the oral bioavailability and effects of novel anticancer drugs berberine and betulinic acid. PLoS One, 2014, 9, e89919. これは、ベルベリンは腸内での溶解度および吸収が乏しく、それがＰ−糖タンパク質により媒介される腸上皮細胞からの高い流出速度（最大９５％）を有するという事実による。Wei et al., Intestinal absorption of berberine and 8-hydroxy dihydroberberine and their effects on sugar absorption in rat small intestine. J. Huazhong Univ. Sci. Technolog. Med. Sci., 2014, 34, 186-9; Zhang et al. Intestinal absorption mechanisms of berberine, palmatine, jateorhizine, and coptisine: involvement of P-glycoprotein. Xenobiotica, 2011, 41, 290-6. それはまた、肝臓を最初に通過する間に大部分代謝される。Guo et al., CYP2D plays a major role in berberine metabolism in liver of mice and humans. Xenobiotica, 2011, 41, 996-1005. Ｂ−ＦＡＨＦ−２の成分として与えられた場合、ベルベリンの用量（Ｃｍａｘ）および曲線下面積（ＡＵＣ）で得られた最大ベルベリンレベルは、単独で与えられたＢ−ＦＡＨＦ−２のベルベリンのＣｍａｘおよびＡＵＣの２倍量よりも何倍も高いことが見出された。したがって、Ｂ−ＦＡＨＦ−２中のいくつかの成分は、バイオアベイラビリティーを増加させ、および／またはベルベリンのクリアランスを減少させる。
【００１０】
ナノ医療技術は、ベルベリンのバイオアベイラビリティーを増大するための潜在的な改善された送達方法として研究されてきた。Godugu et al., Approaches to improve the oral bioavailability and effects of novel anticancer drugs berberine and betulinic acid. PLoS One, 2014, 9, e89919; Gui et al., Preparation and evaluation of a microemulsion for oral delivery of berberine. Pharmazie, 2008, 63, 516-9.
【００１１】
したがって、ベルベリンは、細胞培養におけるＩｇＥ産生を直接阻害することができるが、ＩｇＥに対するベルベリンの医学的適用は乏しいバイオアベイラビリティーのために問題があることが見出されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
要旨
本開示は、ナノ粒子ベルベリン、例えば、ヘパリン／キトサンナノ粒子中に被包されたベルベリンの経口投与が、例えば、ピーナッツアレルギーのマウスモデルにおいて、ＩｇＥ応答の実質的および持続的な低減をもたらすことを記載する。この概念は、ヘパリン／キトサンナノ粒子内に送達されたベルベリンのインビボでのＩｇＥ低減能力を決定することによって試験された。
【００１３】
簡単には、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子（ＢＢＲ−ナノ）を単純なイオン化ゲル化によって調製した。この方法により、平均直径（average diameter）が３２６μｍであり、ゼータ電位がおよそ−１９．７９ｍＶであるナノ粒子が得られた。１経口用量のベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子を投与されたマウスは、ベルベリン単独を投与されたマウスと比較して、血中のベルベリンレベルがより有意に高かった。インビボ試験について、マウスは、アジュバントとしてミョウバンを使用して、ピーナッツに対して全身感作され、その後、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子、ベルベリン単独またはヘパリン／キトサンナノ粒子の２つの経口経路で処置された。ベルベリン単独ではなく、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子による治療は、ピーナッツ特異的ＩｇＥの大幅であり、持続的な低減をもたらすことが見出された。ＩｇＥ低減は、処置の１週間後に観察され、処置を停止した後、少なくとも２０週間は持続した。総ＩｇＥについても低減が観察されたが、総ＩｇＡおよびピーナッツ特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａについては観察されなかった。さらに、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子で処置されたマウスは、治療後の経口ピーナッツチャレンジに対するアナフィラキシー症状から完全に保護され、アナフィラキシー関連低体温を示さなかった。最後に、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子で処置されたマウスは、再刺激された脾細胞においてより低いＩＬ−４産生および高いＩＦＮ−γ産生、ならびに増加した割合のＩＦＮ−γ産生ＣＤ  Ｔ細胞を示した。マウスＦｏｘＰ３プロモーター中のＣｐＧ残基の有意により低い累積的メチル化もまた観察され、これは抗アレルギー性および調節性免疫環境の促進を示している。ナノ粒子ベルベリン、特にベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子による治療は、ＩｇＥ応答を長期的に消失させるその能力のために、この障害に対する治癒に近づく可能性を有するＩｇＥ媒介性食物アレルギーの新規な処置を表す。
【００１４】
したがって、本開示は、それを必要とする対象における免疫疾患を治療するための方法であって、ナノ粒子中に被包された、ベルベリンまたはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはその塩を含む、有効量のナノ粒子を含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ベルベリンまたはその塩は、ナノ粒子中に被包されている。
【００１５】
一部の実施形態では、ナノ粒子はアニオン性ポリマーを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、アニオン性ポリマーはアニオン性多糖である。
【００１７】
一部の実施形態では、アニオン性ポリマーは硫酸化多糖である。
【００１８】
一部の実施形態では、アニオン性ポリマーはアニオン性アミノグリカンポリマーである。
【００１９】
一部の実施形態では、アニオン性ポリマーは硫酸化アミノグリカンポリマーである。
【００２０】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約１：５〜約５：５、例えば、約１：５；約２：５；約３：５；約４：５または約５：５の範囲の重量比でベルベリンまたはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはその塩、およびアニオン性ポリマーを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、ナノ粒子はヘパリンを含む。
【００２２】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約１：５〜約５：５、例えば、約１：５；約２：５；約３：５；約４：５または約５：５の範囲の重量比でベルベリンまたはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはその塩、およびヘパリンを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、ナノ粒子は多糖を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、ナノ粒子はリポ多糖を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、ナノ粒子はアミノグリコシドポリマーを含む。
【００２６】
一部の実施形態では、ナノ粒子はキトサンを含む。
【００２７】
一部の実施形態では、ナノ粒子はベルベリン、ヘパリンおよびキトサンを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約５：１〜５：５、例えば約５：１〜約５：２．５、例えば約５：１、約５：１．５、約５：２または約５：２．５の重量比でヘパリンおよびキトサンを含む。
【００２９】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約２：５：１．５、約３：５：１．５または約４：５：１．５の重量比でベルベリン、ヘパリンおよびキトサンを含む。
【００３０】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約−１０〜約−５０ｍＶ、例えば、約−１０ｍＶ、約−１５ｍＶ、約−２０ｍＶ、約−２５ｍＶ、約−３０ｍＶ、約−３５ｍＶ、約−４０ｍＶ、約−４５ｍＶ、または約−５０ｍＶの範囲のゼータ（ζ）電位を有する。
【００３１】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約５ｎｍ〜約１０００ｎｍ、例えば、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約１０００ｎｍ；例えば、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、または約１０００ｎｍの範囲の平均粒径（mean particle size）を有する。
【００３２】
一部の実施形態では、組成物は経口投与される。組成物はまた、例えば、注射によりまたは吸入により投与することができる。
【００３３】
一部の実施形態では、組成物は反復投与される。
【００３４】
一部の実施形態では、組成物は１日に約１回の頻度で投与される。
【００３５】
一部の実施形態では、組成物はほぼ１日おき（about every other day）の頻度で投与される。
【００３６】
一部の実施形態では、組成物は週に約２回の頻度で投与される。
【００３７】
一部の実施形態では、組成物は週に約１回の頻度で投与される。
【００３８】
一部の実施形態では、組成物は２週間に約１回の頻度で投与される。
【００３９】
一部の実施形態では、組成物は月に約２回の頻度で投与される。
【００４０】
一部の実施形態では、組成物は月に約１回の頻度で投与される。
【００４１】
一部の実施形態では、組成物は２カ月に約１回の頻度で投与される。
【００４２】
一部の実施形態では、組成物は３カ月に約１回の頻度で投与される。
【００４３】
一部の実施形態では、組成物は４カ月に約１回の頻度で投与される。
【００４４】
一部の実施形態では、組成物は５カ月に約１回の頻度で投与される。
【００４５】
一部の実施形態では、組成物は６カ月に約１回の頻度で投与される。
【００４６】
一部の実施形態では、組成物は年に約２回（半年ごと）の頻度で投与される。
【００４７】
一部の実施形態では、組成物は年に約１回（年ごと）の頻度で投与される。
【００４８】
一部の実施形態では、組成物は２年に約１回（隔年（biannually））の頻度で投与される。
【００４９】
一部の実施形態では、単回投与は、少なくとも約１週間、少なくとも約１カ月間、少なくとも約６カ月間、少なくとも約１年間、または少なくとも約２年間の期間にわたって免疫疾患を治療するのに有効である。
【００５０】
一部の実施形態では、免疫疾患は、ＩｇＥ媒介性免疫疾患である。
【００５１】
一部の実施形態では、免疫疾患は、Ｂ細胞媒介性免疫疾患である。
【００５２】
一部の実施形態では、免疫障害は、アレルギー、喘息、アレルギー性鼻炎、関節リウマチ、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病（coeliac disease）、乾癬、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、ギランバレー症候群、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主病および移植拒絶反応から選択される。
【００５３】
一部の実施形態では、免疫疾患は、アレルギーである。
【００５４】
一部の実施形態では、免疫疾患は、食物アレルギーである。
【００５５】
一部の実施形態では、免疫疾患は、ピーナッツ、木の実（tree nuts）（例えば、アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、マカダミアナッツ、またはクルミ）、大豆製品、乳製品、卵製品、魚製品、甲殻類製品、グルテンまたは小麦製品に対する食物アレルギーである。
【００５６】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、ベルベリン単独（ＢＢＲ）またはベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子（ＢＢＲ−ナノ）の経口投与後の血漿ベルベリンレベルのプロット図である。マウスを一晩絶食させた。経口投与の１時間後、血液を採取し、血漿中のＢＢＲレベルをＨＰＬＣにより測定した。バーは群平均を示す。Ｎ＝５匹のマウス／群。＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＢＢＲ。
【図２−１】図２Ａは、指示された時間に１０匹のマウスから採取された血液からの血清中のピーナッツ特異的ＩｇＥレベルをＥＬＩＳＡによって測定したことを示すプロット図である。データは、群平均±ＳＥＭとして示される。Ｎ＝８〜１０匹のマウス／群。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１対シャム。
【図２−２】図２Ｂは、治療後２０週間でモニターし続けたマウスについてのピーナッツ特異的ＩｇＥレベルを測定したことを示すプロット図である。図２Ｂ中の記号は、個々のマウスを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１対シャム。
【図２−３】図２Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定された血清中の卵白特異的ＩｇＥを示すプロット図である。データは、群平均±ＳＥＭとして示される。Ｎ＝２〜３匹のマウス／群。
【図３−１】図３Ａ〜Ｃは、全身または経口のピーナッツチャレンジに対するアナフィラキシー反応の結果を示すプロット図である。図３Ａは、治療の２、９、１４および２０週間後にチャレンジの３０分後に記録された症状スコアをプロットする。２週目および１４週目のチャレンジは全身であり、９週目および２０週目のチャレンジは経口であった。症状スコアはスコアリングキーを用いて割り当てられた。０−兆候なし；１−鼻および頭部の周囲のひっかきおよびこすり、他の全身症状を示さない下痢；２−目および鼻の周囲の腫れ、鼻の周囲の発赤、毛の逆立ち（pilar erecti）、活動低減、および／または呼吸数の増加に伴う活動減少；３−努力性呼吸、体温低下を伴う下痢、ならびに体温低下および随意運動の持続的欠如を伴う努力性呼吸、ただし、突き刺激後の活動；４−努力性呼吸、体温低下、口腔周囲のチアノーゼ、およびケージの床に腹部を載せた状態での四肢の尾部の広がり、突き刺激後の活動が最小または全くない、振戦およびけいれん；５−死亡。バーは、群メジアンである。図３Ｂは、症状スコアの割り当て直後に直腸プローブを用いて記録された体温をプロットする。ボックスプロットは、群の平均および範囲を示す。図３Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定された症状スコアが記録された後に採取された血液サンプル中の血漿ヒスタミンレベルをプロットする。バーは、群平均である。Ｎ＝８〜１０匹のマウス／群。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３−２】図３Ａ〜Ｃは、全身または経口のピーナッツチャレンジに対するアナフィラキシー反応の結果を示すプロット図である。図３Ａは、治療の２、９、１４および２０週間後にチャレンジの３０分後に記録された症状スコアをプロットする。２週目および１４週目のチャレンジは全身であり、９週目および２０週目のチャレンジは経口であった。症状スコアはスコアリングキーを用いて割り当てられた。０−兆候なし；１−鼻および頭部の周囲のひっかきおよびこすり、他の全身症状を示さない下痢；２−目および鼻の周囲の腫れ、鼻の周囲の発赤、毛の逆立ち、活動低減、および／または呼吸数の増加に伴う活動減少；３−努力性呼吸、体温低下を伴う下痢、ならびに体温低下および随意運動の持続的欠如を伴う努力性呼吸、ただし、突き刺激後の活動；４−努力性呼吸、体温低下、口腔周囲のチアノーゼ、およびケージの床に腹部を載せた状態での四肢の尾部の広がり、突き刺激後の活動が最小または全くない、振戦およびけいれん；５−死亡。バーは、群メジアンである。図３Ｂは、症状スコアの割り当て直後に直腸プローブを用いて記録された体温をプロットする。ボックスプロットは、群の平均および範囲を示す。図３Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定された症状スコアが記録された後に採取された血液サンプル中の血漿ヒスタミンレベルをプロットする。バーは、群平均である。Ｎ＝８〜１０匹のマウス／群。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３−３】図３Ａ〜Ｃは、全身または経口のピーナッツチャレンジに対するアナフィラキシー反応の結果を示すプロット図である。図３Ａは、治療の２、９、１４および２０週間後にチャレンジの３０分後に記録された症状スコアをプロットする。２週目および１４週目のチャレンジは全身であり、９週目および２０週目のチャレンジは経口であった。症状スコアはスコアリングキーを用いて割り当てられた。０−兆候なし；１−鼻および頭部の周囲のひっかきおよびこすり、他の全身症状を示さない下痢；２−目および鼻の周囲の腫れ、鼻の周囲の発赤、毛の逆立ち、活動低減、および／または呼吸数の増加に伴う活動減少；３−努力性呼吸、体温低下を伴う下痢、ならびに体温低下および随意運動の持続的欠如を伴う努力性呼吸、ただし、突き刺激後の活動；４−努力性呼吸、体温低下、口腔周囲のチアノーゼ、およびケージの床に腹部を載せた状態での四肢の尾部の広がり、突き刺激後の活動が最小または全くない、振戦およびけいれん；５−死亡。バーは、群メジアンである。図３Ｂは、症状スコアの割り当て直後に直腸プローブを用いて記録された体温をプロットする。ボックスプロットは、群の平均および範囲を示す。図３Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定された症状スコアが記録された後に採取された血液サンプル中の血漿ヒスタミンレベルをプロットする。バーは、群平均である。Ｎ＝８〜１０匹のマウス／群。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡによって測定された総ＩｇＥの治療前後のレベルのプロット図である。バーは、群平均±ＳＥＭを表す。Ｎ＝８〜１０匹のマウス／群。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡによって測定された治療前および治療後のＡ−総ＩｇＡ、Ｂ−ピーナッツ特異的ＩｇＧ１およびＣ−ピーナッツ特異的ＩｇＧ２ａのレベルのプロット図である。バーは、群平均±ＳＥＭを表す。Ｎ＝８〜１０匹のマウス／群。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定された、ピーナッツ再刺激された脾細胞培養物中のサイトカインレベルを示すプロット図である。図６Ａ：ＩＬ−４、図６Ｂ：ＩＦＮγおよび図６Ｃ：ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４比。データは、群平均±ＳＥＭとして示す。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１対シャム（Ｎ＝４〜５匹のマウス／群）。
【図７−１】図７ＡおよびＢは、ＣＤ８  Ｔ細胞の集団がベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子処置されたマウスにおいて増加したことを示す、ピーナッツ再刺激された脾細胞の分析のプロット図である。図７Ａは、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８  Ｔ細胞の割合を示すフローサイトメトリー分析の代表的なデータの記述である。図７Ｂは、群データの数値分析のプロット図である。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１対シャム。
【図７−２】図７ＡおよびＢは、ＣＤ８  Ｔ細胞の集団がベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子処置されたマウスにおいて増加したことを示す、ピーナッツ再刺激された脾細胞の分析のプロット図である。図７Ａは、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８  Ｔ細胞の割合を示すフローサイトメトリー分析の代表的なデータの記述である。図７Ｂは、群データの数値分析のプロット図である。データは、平均±ＳＥＭとして示される。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１対シャム。
【図８】図８は、指示された時間に採取された血液からの、ＥＬＩＳＡによって測定された血清中のピーナッツ特異的ＩｇＥレベルのプロット図である。データは、群平均±ＳＥＭとして示される。Ｎ＝３〜５匹のマウス／群。＊８Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１対シャム。
【図９−１】図９Ａ〜Ｅは、マウスＦｏｘＰ３プロモーターにおけるＣｐＧ残基の治療後のメチル化の割合のプロット図である。図９Ａ〜図９Ｄは、血液から得られた重亜硫酸塩変換ゲノムＤＮＡのパイロシークエンシングによってアセスメントされたＦｏｘＰ３プロモーターＣｐＧを示すプロット図である。図９Ｅは、各実験群について、すべてのＦｏｘＰ３プロモーターＣｐＧについての累積メチル化を示すプロット図である。バーは、群平均±ＳＥＭを示す。Ｎ＝４〜５匹のマウス／群。＊Ｐ＜０．０５対シャム。
【図９−２】図９Ａ〜Ｅは、マウスＦｏｘＰ３プロモーターにおけるＣｐＧ残基の治療後のメチル化の割合のプロット図である。図９Ａ〜図９Ｄは、血液から得られた重亜硫酸塩変換ゲノムＤＮＡのパイロシークエンシングによってアセスメントされたＦｏｘＰ３プロモーターＣｐＧを示すプロット図である。図９Ｅは、各実験群について、すべてのＦｏｘＰ３プロモーターＣｐＧについての累積メチル化を示すプロット図である。バーは、群平均±ＳＥＭを示す。Ｎ＝４〜５匹のマウス／群。＊Ｐ＜０．０５対シャム。
【図１０】全身性ピーナッツチャレンジに対するアナフィラキシー反応を示す一対のプロットである。左パネルは、チャレンジの３０分後に記録された症状スコアのプロット図である。症状スコアは、本明細書に記載されるスコアリングキーを用いて割り当てられた；バーは、群メジアンを示す。左パネルは、症状スコアの割り当て直後に、直腸プローブを使用して測定された体温のプロットである；バーは、群平均を示す。Ｎ＝３〜５匹のマウス／群。＊＝ｐ＜００５；＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図１１】図１１は、経口ピーナッツチャレンジに対するアナフィラキシー反応を示す一対のプロット図である。左パネルは、チャレンジの３０分後に記録された症状スコアのプロット図である。症状スコアは、本明細書に記載されるスコアリングキーを用いて割り当てられた；バーは、群メジアンを示す。左パネルは、症状スコアの割り当て直後に、直腸プローブを使用して測定された体温のプロットである；バーは、群平均を示す。Ｎ＝３〜５匹のマウス／群。＊＝ｐ＜００５；＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００５９】
用語「例えば」および「など」ならびにそれらの文法的同等物について、他に明示的に記述されていない限り、語句「および限定されない」という句が続くことが理解される。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、用語「約（about）」は、「およそ（approximately）」（例えば、指示された値のプラスまたはマイナスおよそ１０％）を意味する。
【００６２】
ベルベリンは、ベンジルイソキノリンアルカロイドのプロトベルベリン群からの第四級アンモニウム塩であり、以下の化学構造：
【００６３】
【化１】
2019531352.tif 000003
を有する。
【００６４】
ベルベリンは、医薬的に許容されるアニオンとの塩として用いることができる。本発明はまた、ベルベリンの代わりにベルベリン類似体を使用することによって実行することができる。ベルベリンの類似体には、ベルベリンの置換誘導体もしくは同族体、または他のプロトベルベリンもしくはベンジルイソキノリンアルカロイドが含まれる。
【００６５】
本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、約１ｎｍから約１０００ｎｍまでのサイズを有する粒子を指す。用語「ナノ粒子」はまた、約１０００ｎｍから約１ｍｍの範囲のサイズを有する「微粒子（マイクロ粒子（microparticle））」を指す場合がある。
【００６６】
本明細書で使用される「ナノ粒子サイズ」という用語は、ナノ粒子の分布におけるメジアンサイズを指す。メジアンサイズは、個々のナノ粒子の平均長さ寸法、例えば球状ナノ粒子の径から決定される。サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）技術を含む、当該技術分野における任意の数の方法によって決定され得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約５から約１０００ｎｍ、２００から約５００ｎｍ、および／または約２００から約４００ｎｍのサイズを有する。
【００６７】
用語「塩」には、任意のイオン形態のポリマーおよび１つまたは複数の対イオン種（カチオンおよび／またはアニオン）が含まれる。塩はまた、両性イオン性ポリマー（すなわち、もう１つのカチオン種およびアニオン種を含有する分子、例えば両性イオン性アミノ酸）を含む。塩中に存在する対イオンは、任意のカチオン種、アニオン種、または両性イオン種を含み得る。例示的なアニオンとしては、限定されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、過塩素酸塩、塩素酸塩、亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、過ヨウ素酸塩、ヨウ素酸塩、亜ヨウ素酸塩、次亜ヨウ素酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、二酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、サッカラート（saccharate）、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ｐ−トリフルオロメチルベンゼンスルホン酸塩、水酸化物、アルミン酸塩およびホウ酸塩が挙げられる。例示的なカチオンとしては、限定されないが、一価アルカリ金属カチオン、例えばリチウム、ナトリウム、カリウムおよびセシウム、ならびに二価アルカリ土類金属、例えばベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウムおよびバリウムが挙げられる。また、遷移金属カチオン、例えば金、銀、銅および亜鉛、ならびに非金属カチオン、例えばアンモニウム塩も含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる。
【００６８】
本明細書に記載および開示されているポリマーへの言及は、遊離酸、遊離塩基、ならびにポリマーのすべての付加塩および複合体を含むと考えられる。遊離カルボキシ基および塩基性アミノ基が同時に存在する場合、ポリマーはまた、内部塩または両性イオンを形成し得る。用語「医薬的に許容される塩」とは、医薬的用途に有用性をもたらす範囲内の毒性プロファイルを有する塩を指す。適切な塩形態の調製および選択は、Stahl et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-VCH 2002に記載されている。
【００６９】
語句「医薬的に許容される」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、適切なベネフィット／リスク比で、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適しているポリマー、材料、組成物および／または剤形を指すために本明細書において用いられる。
【００７０】
明確にするために、別々の実施形態の文脈で記載されている本発明のある特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明されている本発明の様々な特徴はまた、別々にまたは任意の適切なサブコンビネーションで提供され得る。
【００７１】
略語
以下の略語を本明細書において使用し得る：ＡｃＯＨ（酢酸）；ａｑ（水性）；ａｔｍ（雰囲気）；Ｄａ（ダルトン）；ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；Ｅｔ（エチル）；Ｅｔ３ＮまたはＴＥＡ（トリエチルアミン）；ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＦＢＳ（ウシ胎児血清）；ｈ（時間）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；Ｍ（モル）；Ｍｅ（メチル）；ＭｅＣＮ（アセトニトリル）；ＭｅＯＨ（メタノール）；ｍｇ（ミリグラム）；ｍｉｎ．（分）；ｍＬ（ミリリットル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；ｍＶ（ミリボルト）；ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）；ＭｎまたはＭＷ（分子量）；Ｎ（正常）；ｎｍ（ナノメートル）；ｎＭ（ナノモル）；ＮＰ（ナノ粒子）；ＮＰ（ナノ粒子）；ｎＰｎ（ｎ−ペンチル）；ｎＰｒ（ｎ−プロピル）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｓ（秒）；ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）；ＴＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）；μｇ（マイクログラム）；μＬ（マイクロリットル）；μｍ（マイクロモル）；ｗｔ（重量）；ｗｔ％（重量パーセント）。
【００７２】
治療方法
本明細書に記載される研究において、驚くべきことに、ベルベリン、またはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはベルベリンの塩、その類似体もしくは誘導体のナノ粒子製剤は、アレルギー、例えば食物アレルギーなどの免疫疾患の治療に驚くほどに効果的であることが見出された。特に、驚くべきことに、アレルギーなど、例えば食物アレルギーの免疫疾患をベルベリンのナノ粒子製剤で治療することが長期にわたる治療的および保護的効果をもたらし得ることが見出された。
【００７３】
したがって、本開示は、それを必要とする対象において免疫疾患を治療するための方法であって、ベルベリンまたはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはベルベリンの塩、その類似体もしくは誘導体を含む、有効量のナノ粒子を含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００７４】
一部の実施形態では、免疫障害は、アレルギー、喘息、アレルギー性鼻炎、関節リウマチ、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、乾癬、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、ギランバレー症候群、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主病および移植拒絶反応から選択される。
【００７５】
一部の実施形態では、免疫疾患は、ＩｇＥ媒介性免疫疾患、例えばアレルギーである。
【００７６】
一部の実施形態では、免疫疾患は、Ｂ細胞媒介性免疫疾患である。
【００７７】
一部の実施形態では、免疫疾患は、アレルギーである。一部の実施形態では、  またはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはベルベリンの塩、その類似体もしくは誘導体を含むナノ粒子を含む提供される組成物は、アレルギー反応の発症を予防および／または遅延させるために投与され得る。一般的に、本明細書に記載されるナノ粒子組成物は、任意のタイプのアレルギーの治療および／または予防に使用され得る。一部の実施形態では、提供されるナノ粒子組成物は、１つもしくは複数のタンパク質アレルゲンに関連するアレルギーの治療および／または予防のために使用され得る。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、花粉アレルゲン、ダニアレルゲン、動物のふけ（例えば、イヌ、ネコ）または排泄物（例えば、唾液、尿）中のアレルゲン、および真菌アレルゲンに対するアレルギーなどのアレルギーの治療に使用され得る。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、限定されないが、ナッツアレルゲン（例えば、ピーナッツ、クルミ、アーモンド、ピーカン、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、パインナッツ、ブラジルナッツ由来）、乳製品アレルゲン（例えば、卵、牛乳由来）、種子アレルゲン（例えば、ゴマ、ケシ、マスタード由来）、大豆、小麦、魚アレルゲン（例えば、エビ、カニ、ロブスター、ハマグリ、ムール貝、カキ、ホタテ、ザリガニ由来）を含む食品アレルゲン、限定されないが、ハチ刺され、狩バチ刺されを含む昆虫アレルゲン、およびゴムアレルゲン（例えばラテックス由来）などのアナフィラキシーアレルゲンに関連するアレルギーの治療に使用され得る。
【００７８】
一部の実施形態では、免疫疾患は、食物アレルギーである。一部の実施形態では、免疫疾患は、ピーナッツ、木の実（例えば、アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、マカダミアナッツ、またはクルミ）、大豆製品、乳製品、卵製品、魚製品、甲殻類製品、グルテンまたは小麦製品に対する食物アレルギーである。
【００７９】
食物アレルギーは、食物中に含有される特定のタンパク質に対するＩｇＥの相互作用によって媒介される。一般的な食物アレルゲンの例には、ナッツ（例えば、ピーナッツ、クルミ、アーモンド、ピーカン、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、パインナッツ、ブラジルナッツ由来）、乳製品（例えば、卵、ミルク由来）、種子（例えば、ゴマ、ケシ、マスタード）、大豆、小麦、および魚（例えば、エビ、カニ、ロブスター、アサリ、ムール貝、カキ、ホタテ、ザリガニ）由来のタンパク質が含まれる。一般的な昆虫アレルゲンの例には、限定されないが、ノミ、ダニ、アリ、ゴキブリ、およびハチなどの昆虫由来のタンパク質が含まれる。
【００８０】
ベルベリン、またはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはベルベリンの塩、その類似体もしくは誘導体のナノ粒子製剤は、治療を必要とする対象に、ベルベリンまたはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはベルベリンの塩、その類似体もしくは誘導体を含む、有効量のナノ粒子を含む組成物を投与することによって治療されるアレルギー／アレルゲンに特異的なＩｇＥのレベルを低減させるための治療の方法において使用することができる。
【００８１】
ベルベリンナノ粒子
本明細書に記載される方法において有用なベルベリンナノ粒子は、そこに被包されたベルベリンまたはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはベルベリンの塩、その類似体もしくは誘導体を含み得る。
【００８２】
ベルベリンの類似体には、例えば、Grycova et al., Quaternary Protoberberine Alkaloids, Phytochemistry, 2007, 68, 150-175に開示されるようなベルベリンの置換誘導体もしくは同族体、または他のプロトベルベリンもしくはベンジルイソキノリンアルカロイドが含まれる。塩には、アニオン、例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、過塩素酸塩、塩素酸塩、亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、過ヨウ素酸塩、ヨウ素酸塩、亜ヨウ素酸塩、次亜ヨウ素酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、二酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、サッカラート（saccharate）、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ｐ−トリフルオロメチルベンゼンスルホン酸塩、水酸化物、アルミン酸塩およびホウ酸塩との塩が含まれ得る。
【００８３】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、アニオン性ポリマー、リン脂質などの界面活性剤を含む。
【００８４】
一部の実施形態では、ナノ粒子はアニオン性ポリマーを含む。
【００８５】
一部の実施形態では、アニオン性ポリマーはアニオン性多糖である。
【００８６】
一部の実施形態では、アニオン性ポリマーは硫酸化多糖である。
【００８７】
一部の実施形態では、アニオン性ポリマーはアニオン性アミノグリカンポリマーである。
【００８８】
一部の実施形態では、アニオン性ポリマーは硫酸化アミノグリカンポリマーである。
【００８９】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約１：５〜約５：５、例えば、約１：５；約２：５；約３：５；約４：５または約５：５の範囲の重量比でベルベリンおよびアニオン性ポリマーを含む。
【００９０】
適切なアニオン性ポリマーの例には、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、フコイダン、ヒアルロン酸が含まれる。
【００９１】
一部の実施形態では、ナノ粒子はヘパリンを含む。
【００９２】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約１：５〜約５：５、例えば、約１：５；約２：５；約３：５；約４：５または約５：５の範囲の重量比でベルベリンおよびヘパリンを含む。
【００９３】
一部の実施形態では、ナノ粒子は多糖を含む。
【００９４】
一部の実施形態では、ナノ粒子はリポ多糖を含む。
【００９５】
一部の実施形態では、ナノ粒子はアミノグリコシドポリマーを含む。
【００９６】
一部の実施形態では、ナノ粒子はキトサンを含む。
【００９７】
一部の実施形態では、ナノ粒子はベルベリン、ヘパリンおよびキトサンを含む。
【００９８】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約５：１〜５：５、例えば約５：１〜約５：２．５、例えば約５：１、約５：１．５、約５：２または約５：２．５の重量比でヘパリンおよびキトサンを含む。
【００９９】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約２：５：１．５、約３：５：１．５または約４：５：１．５の重量比でベルベリン、ヘパリンおよびキトサンを含む。
【０１００】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、例えば、Wu et al., Delivery of Berberine Using Chitosan/Fucoidan-Taurine Conjugate Nanoparticles for Treatment of Defective Intestinal Epithelial Tight Junction Barrier, Mar. Drugs, 2014, 12, 5677-5697に記載されるようなキトサンおよびフコイダン−タウリンコンジュゲートを用いるベルベリンナノ粒子であり得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、例えば、Khemani, et al., Encapsulation of Berberine in Nano-Sized PLGA Synthesized by Emulsification Method, ISRN Nanotechnology, 2012, Article ID 187354に記載されているようなナノサイズのＰＬＧＡ中のベルベリンナノ粒子であり得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、リン脂質、例えば、レシチン、コレステロールおよびリン酸ジヘキサデシルを用いて調製された脂質を用いて調製されたナノリポソームであり得る。リポソームは、例えばキトサンでコーティングすることができる。Nguyen et al., Chitosan-coated nano-liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride. J. Mater. Chem. B, 2014, 2, 7149-7159.
【０１０１】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約−１０〜約−５０ｍＶ、例えば、約−１０ｍＶ、約−１５ｍＶ、約−２０ｍＶ、約−２５ｍＶ、約−３０ｍＶ、約−３５ｍＶ、約−４０ｍＶ、約−４５ｍＶ、または約−５０ｍＶの範囲のゼータ（ζ）電位を有する。
【０１０２】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約５ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の平均粒径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約５ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均粒径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の平均粒径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の平均粒径を有する。
【０１０３】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、約５ｎｍ〜約１０００ｎｍ、例えば、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約１０００ｎｍ；例えば、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、または約１０００ｎｍの範囲の平均粒径を有する。
【０１０４】
本明細書に記載されるナノ粒子の平均サイズは、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、サイズは、約５ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約５ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５ｎｍ〜約４００ｎｍ、約５ｎｍ〜約３００ｎｍ、約５ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、および／または約７５ｎｍ〜約１５０ｎｍの範囲である。
【０１０５】
一部の実施形態では、集団内に、例えば組成物中に、存在するナノ粒子は、実質的に同じ形状および／またはサイズを有することができる（すなわち、それらは「単分散」である）。例えば、粒子は、ナノ粒子の約５％以下または約１０％以下が、粒子の平均径よりも約１０％より大きい径を有するような分布を有することができ、一部の場合においては、約８％以下、約５％以下、約３％以下、約１％以下、約０．３％以下、約０．１％以下、約０．０３％以下、または約０．０１％以下が、ナノ粒子の平均径よりも約１０％より大きい径を有するような分布を有することができる。
【０１０６】
一部の実施形態では、２５％以下のナノ粒子の径は、平均ナノ粒子径から、平均ナノ粒子径の１５０％、１００％、７５％、５０％、２５％、２０％、１０％、または５％超で変化する。大部分のナノ粒子が類似した特性を有するように、サイズ、形状、および／または組成に関して比較的均一であるナノ粒子の集団を製造することがしばしば望ましい。例えば、本明細書に記載される方法を用いて製造されたナノ粒子の少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、平均径の５％、１０％もしくは２０％以内または最大寸法以内に入る径または最大寸法を有することができる。一部の実施形態では、ナノ粒子の集団は、サイズ、形状、および／または組成に関して不均質であり得る。これに関して、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／１５００３０号パンフレットを参照されたい。
【０１０７】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、形状が球形または実質的に球形である。
【０１０８】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、ヘパリンなどのアニオン性多糖およびキトサンなどのリポ多糖とともに、ベルベリン、その類似体もしくは誘導体、またはベルベリンの塩、その類似体もしくは誘導体を含む。副作用なしにベルベリンの治療効果を増大するために、そのバイオアベイラビリティーを増大するためにいくつかの研究が考案された。これらの研究の１つは、薬物輸送のための充填可能なナノ粒子の創製である。ヘパリンは、抗凝固薬として有用な高硫酸化グリコサミノグリカンである。その抗凝固作用に加えて、ヘパリンは、抗炎症作用および免疫調節作用を有する。Mousavi et al., Anti-Inflammatory Effects of Heparin and Its Derivatives: A Systematic Review. Adv. Pharmacol. Sci., 2015, 2015, 507151. いくつかの研究は、ヘパリンの抗喘息作用を証明している。Avadi et al. Preparation and characterization of insulin nanoparticles using chitosan and Arabic gum with ionic gelation method. Nanomedicine, 2010, 6, 58-63. ヘパリンは陰イオン（negative icons）を有し、これは、陽性のベルベリンと相互作用してナノ粒子を形成し得る。しかし、これらのナノ粒子は、楕円形のドーナツ形をした不均質なサイズ分布をしているようである。ベルベリン−ヘパリンナノ粒子をより適切にするために、キトサンを組み込んで、比較的均質なサイズ分布を有する、形状が球形であるベルベリン  ヘパリン  キトサンハイブリッド化ナノ粒子を形成した。Avadi et al. Ex vivo evaluation of insulin nanoparticles using chitosan and arabic gum. ISRN Pharm, 2011; 2011, 860109. キトサンは、甲殻類の殻をアルカリ性水酸化ナトリウムで処理することによって生成され、併用薬物の送達に有用であることが示されており、上皮細胞間のタイトジャンクションに付着して開くことが証明されており、したがって、被包された薬物のバイオアベイラビリティーを潜在的に増加し得る。Chen et al. Recent advances in chitosan-based nanoparticles for oral delivery of macromolecules. Adv. Drug Deliv. Rev., 2013, 65, 865-79; Bowman et al. Differential biological and adjuvant activities of cholera toxin and Escherichia coli heat-labile enterotoxin hybrids. Infect. Immun., 2001, 69, 1528-35.
【０１０９】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、従来の方法によって調製することができる。ナノ粒子製剤のための方法の例には、例えば、遠心分離、高速混合、もしくは超音波処理による、またはナノ沈殿技術による乳化が含まれる。例えば、ベルベリン、ヘパリンおよびキトサンを含有するナノ粒子は、ベルベリン、ヘパリンおよびキトサンを含有する水溶液の乳化によって調製することができる。
【０１１０】
追加の製剤成分
本明細書に記載される粒子を含む成分に加えて、組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって確実にすることができる。糖などの等張化剤を組成物に含めることもまた望ましい場合がある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることによって、注射用医薬形態の長期吸収をもたらし得る。
【０１１１】
本明細書に記載されるナノ粒子を含有する組成物は、治療される疾患または障害、ならびに対象の年齢、状態、および体重に応じて様々な形態で投与することができる。例えば、組成物が経口投与される場合、それらは、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤またはシロップ剤として製剤化され得る；または非経口投与用には、それらは、注射（静脈内、筋肉内、または皮下）、点滴注入調製物、または坐剤として製剤化され得る。眼の粘膜経路による適用には、それらは、点眼剤または眼軟膏剤として製剤化され得る。これらの製剤は、本明細書に記載される方法と併せて従来の手段によって調製することができ、必要に応じて、活性成分は、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、可溶化剤、懸濁助剤、乳化剤、またはコーティング剤などの任意の従来の添加剤または賦形剤と混合され得る。
【０１１２】
錠剤は、任意選択的に１種または複数の補助的な成分とともに圧縮または成形することにより製造され得る。圧縮錠剤はまた、不活性な希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を使用して調製され得る。成形錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適切な機械で成形することによって製造され得る。
【０１１３】
経口投与用の液体剤形には、医薬的に許容される乳剤、マイクロ乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。ナノ粒子に加えて、液体剤形は、不活性な希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含み得る。
【０１１４】
懸濁液は、ナノ粒子に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物のような懸濁剤を含有し得る。
【０１１５】
組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【０１１６】
投薬量（dosage）および投与
本明細書において提供される組成物中のベルベリンの実際の投薬量レベルは、特定の対象、組成、および投与様式について、対象に毒性なく、所望の治療応答を達成するのに有効である量のベルベリン、またはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはそれらの塩を得るように変化させ得る。ベルベリンの含有量は、全体として組成物の０．１〜９０ｗｔ％（wt.-%）、好ましくは０．１〜５０ｗｔ％（wt.-%）の範囲、すなわち、以下に特定される投薬量の範囲を達成するのに十分な量であるべきである。
【０１１７】
記載されているベルベリンを含有する剤形または組成物は、一般的に、成人ヒト対象に推奨される化合物の一日投薬量０．０１〜２０００ｍｇを含有し得、これは単回用量または分割用量で投与され得る。単一剤形（single dosage form）を製造するために担体材料と組み合わせることができるベルベリン、またはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはその塩の量は、一般的に、治療効果を生み出すベルベリン、またはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはその塩の量である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるナノ粒子組成物は、約０．０１ｍｇ〜約５０００ｍｇのベルベリン、またはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはその塩を含有することができる。当業者は、これが、約０．０１ｍｇ〜０．１ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約５ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１０ｍｇ〜１５ｍｇ、約１５ｍｇ〜約２０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２５ｍｇ、約２５ｍｇ〜約３０ｍｇ、約３０ｍｇ〜約３５ｍｇ、約３５ｍｇ〜約４０ｍｇ、約４０ｍｇ〜約４５ｍｇ、または約４５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約３００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約４００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１０００ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約２０００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約３０００ｍｇ〜約４０００ｍｇまたは約４０００ｍｇ〜約５０００ｍｇのベルベリン、またはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはその塩を含有する組成物を包含することを理解する。
【０１１８】
組成物は、一度に投与することができ、または時間間隔で投与するために多数のより少ない用量に分割することができる。正確な投薬量および治療期間は、治療される疾患の関数（function）であり、公知の試験プロトコールを使用して経験的に、またはインビボもしくはインビトロの試験データからの外挿によって決定され得ることが理解される。濃度および投薬量の値はまた、軽減されるべき状態の重症度により変わり得ることに留意すべきである。さらに、任意の特定の対象について、特定の投薬量レジメンは、個々の必要性、および組成物の投与を管理または監督する人の専門的な判断に従って経時的に調整されるべきであり、本明細書に記載される濃度範囲は例示のみであり、特許請求される組成物の範囲または実施を制限することを意図しないことを理解するべきである。
【０１１９】
所与の対象における治療の有効性に関して最も効果的な結果をもたらす正確な投与の時間および／または組成物の量は、特定の薬物分子の活性、薬物動態学およびバイオアベイラビリティー、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類および段階、一般的な身体状態、与えられた投薬量に対する反応性、および適用薬物（medication）の種類を含む）、投与経路などに依存する。しかしながら、上記のガイドラインは、処置を微調整するための基礎として、例えば、投与の最適な時間および／または量を決定するために使用することができ、これは、対象を監視すること、ならびに投薬量および／またはタイミングを調整することからなる日常的な実験を超える必要はない。
【０１２０】
組成物は、投与のための説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサーに入れることができる。
【０１２１】
一部の実施形態では、組成物は経口投与される。組成物はまた、例えば、非経口的に、注射によりまたは吸入により投与することができる。
【０１２２】
一部の実施形態では、組成物は反復投与される。
【０１２３】
一部の実施形態では、組成物は１日に約４回の頻度で投与される。
【０１２４】
一部の実施形態では、組成物は１日に約３回の頻度で投与される。
【０１２５】
一部の実施形態では、組成物は１日に約２回の頻度で投与される。
【０１２６】
一部の実施形態では、組成物は１日に約１回の頻度で投与される。
【０１２７】
本明細書に記載されるベルベリンまたはベルベリンの類似体もしくは誘導体、またはベルベリンの塩、その類似体もしくは誘導体を含むナノ粒子を使用することの特別な利点は、ナノ粒子製剤を使用することによって得られる長期にわたる治療効果である。これにより、１日１回またはそれ未満の頻度で組成物を投与することによって治療の方法を実行することが可能になり得る。
【０１２８】
一部の実施形態では、組成物はほぼ１日おきの頻度で投与される。
【０１２９】
一部の実施形態では、組成物は週に約２回の頻度で投与される。
【０１３０】
一部の実施形態では、組成物は週に約１回の頻度で投与される。
【０１３１】
一部の実施形態では、組成物は２週間に約１回の頻度で投与される。
【０１３２】
一部の実施形態では、組成物は月に約２回の頻度で投与される。
【０１３３】
一部の実施形態では、組成物は月に約１回の頻度で投与される。
【０１３４】
一部の実施形態では、組成物は２カ月に約１回の頻度で投与される。
【０１３５】
一部の実施形態では、組成物は３カ月に約１回の頻度で投与される。
【０１３６】
一部の実施形態では、組成物は４カ月に約１回の頻度で投与される。
【０１３７】
一部の実施形態では、組成物は５カ月に約１回の頻度で投与される。
【０１３８】
一部の実施形態では、組成物は６カ月に約１回の頻度で投与される。
【０１３９】
一部の実施形態では、組成物は年に約２回（半年ごと）の頻度で投与される。
【０１４０】
一部の実施形態では、組成物は年に約１回（年ごと）の頻度で投与される。
【０１４１】
一部の実施形態では、組成物は２年に約１回（隔年）の頻度で投与される。
【０１４２】
一部の実施形態では、単回投与は、少なくとも約１週間、少なくとも約１カ月間、少なくとも約６カ月間、少なくとも約１年間、または少なくとも約２年間の期間にわたって免疫疾患を治療するのに有効である。
【０１４３】
本発明は、特定の実施例によってさらに詳細に説明される。以下の実施例は例証目的のために提供され、いかなる様式においても本発明を限定することを意図しない。当業者は、本質的に同じ結果を得るために変更または改変することができる様々な重要ではないパラメータを容易に認識する。
【実施例】
【０１４４】
材料および方法
ナノ粒子の調製
塩化ベルベリン、ヘパリン（１７，０００ｋＤａ〜１９，０００ｋＤａの範囲）およびキトサン（低分子量、７５〜８５％脱アセチル化）をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）から購入し、（氷）酢酸およびＮａＯＨ（１Ｎ）をＦｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ、ＰＡ、ＵＳＡ）から購入した。他のすべての化学薬品および試薬は、分析グレードのものであった。ナノ粒子の２つの組成物（ベルベリン／ヘパリン／キトサン）は、室温で磁気撹拌しながら簡単なイオン化ゲル化法によって調製された。表１は、各試験サンプルについて、ナノ粒子の調製条件、ならびに測定された粒度分布およびゼータ電位値を列挙する。最初に、ベルベリン／ヘパリンナノ粒子（表１）は、様々な重量比（重量でベルベリン／ヘパリン２：５、３：５、４：５）でピペットチップを用いてフラッシュ混合することによってベルベリン水溶液（２ｍｇ／ｍｌ）をヘパリン水溶液と合わせることによって調製された。次に、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子は、キトサン水溶液（０．５ｍｌ、ｐＨ６．０）にベルベリン／ヘパリン水溶液（０．５ｍｌ）を加えることにより、異なる重量比（重量でベルベリン／ヘパリン／キトサン２：５：１、３：５：１、４：５：１、２：５：１．５、３：５：１．５、４：５：１．５、２：５：２、３：５：２および４：５：２）で調製された。
【０１４５】
ベルベリンを充填したナノ粒子の特徴付け
ＤＩ水で調製されたナノ粒子の粒度分布およびゼータ電位値を動的光散乱分析器（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳ９０、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ））を用いて測定した。調製されたナノ粒子のＦＴＩＲスペクトルは、フーリエ変換赤外分光計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）を用いて記録された。ＴＥＭを用いて、異なる組成のナノ粒子（ベルベリン／ヘパリン粒子またはベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子）の形態を調べた。ナノ粒子懸濁液を、炭素被覆した４００メッシュの銅グリッド上に置いた。堆積から約２分後、グリッドを濾紙で軽くたたいて、表面の水を除去し、リンタングステン酸溶液でネガティブに染色した。
【０１４６】
ベルベリンの薬物充填効率の決定
調製されたナノ粒子のベルベリン充填効率を測定するために、ベルベリン充填されたナノ粒子を含有する得られた溶液を１６，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１時間、４℃にて遠心分離した。上清中の遊離ベルベリンの量は、ＵＶ検出器（Ｊｕｓｃｏ  Ｃｏ．８７５−ＵＶ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）および逆相Ｃ１８カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析され、アセトニトリル−０．０４Ｍ  Ｈ３ＰＯ４（４２：５８体積％）を用いて、１．０ｍＬ／分の流速で溶出された。ナノ粒子のベルベリン充填効率（ＬＥ％）は、式：１Ｅ（％）＝（総ベルベリン−遊離ベルベリン）／総ベルベリン×１００％を用いて計算された。
【０１４７】
マウスの感作、治療およびチャレンジプロトコール
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した６週齢の雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、動物のケアおよび使用のための標準的なガイドラインに従って、ピーナッツを含まない固形飼料に、シナイ山生態動物園の無病原体施設内で維持された。Institute of Laboratory Animal Resources Commission of Life Sciences NRC. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: National Academic Press, 1996. 図１に示すように、２ｍｇのミョウバンと混合した０．５ｍｇの粗ピーナッツ抽出物（ＣＰＥ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ＮＪ）で３週間にわたって週１回、マウスを全身感作した。一部のマウスは、同様のプロトコールを用いて卵白（ＥＷ）に感作された。その後、ＢＢＲナノ粒子による毎日の経口治療は、２週間の間隔をおいて４週間および２週間の時期で指示された時間に投与された。指示されているように、マウスをおよそ６週間の間隔で全身的チャレンジおよび経口的チャレンジで定期的にチャレンジされた。一部の実験では、マウスは、処置期間の１日前に、次に、処置期間の間、週に２回、抗ＣＤ８または抗ＩＦＮγ抗体の１００μｇを腹腔内注射された。
【０１４８】
過敏反応のアセスメント
アナフィラキシー症状が３０分間にわたって観察され、グレード０〜５を使用して反応を採点した。０−兆候なし；１−鼻および頭部の周囲のひっかきおよびこすり、他の全身症状を示さない下痢；２−目および鼻の周囲の腫れ、鼻の周囲の発赤、毛の逆立ち、活動低減、および／または呼吸数の増加に伴う活動減少；３−努力性呼吸、体温低下を伴う下痢、ならびに体温低下および随意運動の持続的欠如を伴う努力性呼吸、ただし、突き刺激後の活動；４−努力性呼吸、体温低下、口腔周囲のチアノーゼ、およびケージの床に腹部を載せた状態での四肢の尾部の広がり、突き刺激後の活動が最小または全くない、振戦およびけいれん；５−死亡。スコア１の反応は軽度と定義された；スコア２は中等度から重度と定義された；スコア３〜４は重度と定義された；スコア５は非常に重度と定義された。
【０１４９】
ピーナッツおよび卵白特異的な免疫グロブリンの測定
マイクロタイタープレートは、ピーナッツまたは卵白（サンプルウェル）の脱脂タンパク質抽出物、およびラット抗マウスＩｇＥ（参照ウェル）で被覆され、一晩、４℃で保持された。３回洗浄した後、プレートを２％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて２時間、室温にてブロッキングした。３回洗浄した後、プレートを希釈した血清サンプルとともに一晩、４℃でインキュベートした。ビオチン化された抗ＩｇＥをプレートに添加し、続いてアビジン−ペルオキシダーゼおよびＡＢＴＳ基質を添加した。抗原捕捉法を用いて、ＷＮ特異的ＩｇＥを検出した。簡単には、マイクロタイタープレートを抗ＩｇＥ抗体で被覆し、一晩、４℃で保持した。３回洗浄した後、プレートを上記のようにブロッキングした。次に、プレートを洗浄し、希釈した血清またはマウスＩｇＥを添加し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ビオチン化されたＷＮ抽出物をサンプルウェルに添加し、ビオチン化された抗ＩｇＥを参照ウェルに添加した。最後に、すべてのウェルをアビジン−ＨＲＰ、続いてＡＢＴＳ基質の添加によって発色させた。総ＩｇＡ、ピーナッツ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルを以前の刊行物に記載されているように測定した。Srivastava et al. Efficacy, safety and immunological actions of butanol-extracted Food Allergy Herbal Formula-2 on peanut anaphylaxis. Clin. Exp. Allergy, 2011, 41, 582-91; Lee et al., Oral administration of IL-12 suppresses anaphylactic reactions in a murine model of peanut hypersensitivity. Clin. Immunol., 2001, 101, 220-8.
【０１５０】
脾細胞培養およびサイトカイン測定
実験終了時にマウスを安楽死させ、脾細胞の単細胞懸濁液は、組織培養条件下で７２時間、２００μｇ／ｍＬのＣＰＥとともにまたは培地単独で培養された。上清を採取し、使用するまで−８０℃で保存した。製造業者の説明書に従って、市販のＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってＩＬ−４およびＩＦＮγを測定した。
【０１５１】
フローサイトメトリー
培養脾細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析のために処理した。細胞をＦｃブロックの存在下で細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４）について蛍光染色した。洗浄後、細胞を固定して透過処理し、ＩＦＮγについての細胞内染色を実施した。データは、ＦＡＣＳＤｉｖａを使用してＬＳＲＩＩフローサイトメーターで取得され、ＦｌｏｗＪｏによって分析された。
【０１５２】
ＣｐＧメチル化分析
Ａｌｌ  ｐｒｏｔｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）に保存されている腸組織由来のゲノムＤＮＡをＡｌｌＰｒｅｐ  ｍｉｎｉ  ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）を用いて単離した。次に、製造者の指示に従って、Ｅｐｉｔｅｃｔ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）を用いて、単離したＤＮＡを亜硫酸水素塩変換した。亜硫酸水素塩変換されたＤＮＡを用いて、ＰＣＲによりプロモーター領域ＦｏｘＰ３遺伝子を増幅し、続いてＰｙｒｏｍａｒｋ  Ｑ２４  ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇシステムおよびＰｙｒｏｍａｒｋソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）を用いてパイロシーケンシングを行い、転写開始部位に対して、−７１、−６２、−５３、−５０、−３５でのＣｐＧ残基のメチル化の割合を決定した。以下の前述のＰＣＲおよび配列決定プライマーを使用した。ＦｏｘＰ３  Ｆｗｄ：５’−ＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＡＡＡＧＧＧＴＡＡＡ（配列番号１）、ＦｏｘＰ３  Ｒｅｖ：５’−ビオチン−ＴＣＡＣＣＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＡＣＴＡ（配列番号２）、配列決定プライマー：５’−ＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＡＴＴＡＴＴＡＧＡＡ（配列番号３）。Song et al., Maternal allergy increases susceptibility to offspring allergy in association with TH2-biased epigenetic alterations in a mouse model of peanut allergy. J. Allergy Clin. Immunol., 2014, 134, 1339-45.e7; Liu et al., The ligase PIAS1 restricts natural regulatory T cell differentiation by epigenetic repression. Science, 2010, 330, 521-5; Liu et al., Combined inhaled diesel exhaust particles and allergen exposure alter methylation of T helper genes and IgE production in vivo. Toxicol. Sci., 2008, 102, 76-81.
【０１５３】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してデータを分析した。一元配置分散分析を適用して、処置群間の有意差を決定した。スチューデントのｔ検定を使用して、選択された群間の差を分析した。正規分布ではないデータについて、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定をＤｕｎｎの事後検定とともに使用した。回帰分析にはピアソン相関を用いた。Ｐ≦０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
【０１５４】
結果
実施例１  ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子製剤はインビボでのＢＢＲ取り込みを顕著に増強した。
ベルベリンの不十分な取り込みおよびバイオアベイラビリティーに対処するために、ナノ粒子送達アプローチを開発した。２：４：１．５の比でヘパリン／キトサンの水性混合物中にベルベリンを可溶化することによって、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子を調製した（表１）。これらのナノ粒子中のベルベリンの薬物充填は７０％に近づき、粒子の物理的特性は、胃腸の取り込みに理想的なパラメータ内にあることが見出された。単回用量のベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子を与えられたマウスにおける血清ベルベリンレベルは、ベルベリンを単独で与えられたマウスと比較して有意に増加した（図１）。
【０１５５】
実施例２  ピーナッツアレルギーマウスをベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子で処置することにより、ピーナッツ特異的ＩｇＥレベルを大幅に、かつ持続的に低減した。
全身的にピーナッツに感作したマウスは、２コースの経口ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子療法を受け、ＩｇＥレベルを定期的に測定した。ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子処置は、ピーナッツ特異的ＩｇＥを無視し得るレベルまたはほぼ無視できるレベルにまで低減させ、これは治療後の最大９週間まで減少し続け、ゼロに近づいた（図２Ａ）。この効果は、治療後の最大２０週間まで延長された（図２Ｂ）。本発明者らはまた、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子療法によるＩｇＥ低減がピーナッツアレルギーに特異的ではないことを見出した。卵白アレルギーマウスのベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子処置は、ＩｇＥの有意な低減をもたらした（図２Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子の使用が複数のアレルゲンに適用可能な有効なＩｇＥ低減治療であることを示唆している。
【０１５６】
実施例３  ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子は、全身および経口ピーナッツチャレンジ誘発アナフィラキシーに対する保護を提供した。
ピーナッツに全身感作されたマウスをベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子で処置し、治療後の２および１４週目に全身的にチャレンジし、治療後の９および２０週目に経口的にチャレンジした（図３−Ｃ）。症状スコア（図３Ａ）、体温（図３Ｂ）および血漿ヒスタミン（図３Ｃ）を各チャレンジで評価した。ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子処置群のマウスは、経口ピーナッツチャレンジ後に有意に保護され、治療後の２週目でアナフィラキシーまたは関連低体温の視覚的徴候を有する１匹のマウスのみが示された。アナフィラキシーの徴候は、その後のチャレンジでこの群において観察されなかった（Ｐ＜０．０１〜０．００１対シャム）。一貫して、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子で処置されたマウスは、アナフィラキシー関連低体温から有意に保護され（Ｐ＜０．００１対シャム）、この群における血漿ヒスタミンレベルは、すべてのチャレンジにおいてシャムマウスより有意に低かった（Ｐ＜０．００１対シャム）。
【０１５７】
実施例４  ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子療法は総ＩｇＥレベルを低減させたが、総ＩｇＡまたは特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａレベルには影響を及ぼさなかった。
ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子療法が特異的ＩｇＥ以外の免疫グロブリンに影響を及ぼしたかどうかを決定するために、血清総ＩｇＥおよびＩｇＡを評価した。ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子処置されたピーナッツアレルギーマウスは、総ＩｇＥの減少を示したが（図４）、総ＩｇＡの減少は示さなかった（図５Ａ）。さらに、ピーナッツ特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａレベルに対して処置効果は観察されなかった（図５Ｂ、Ｃ）。これらのデータは、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子療法が選択的にＩｇＥを標的とすることを示している。
【０１５８】
実施例５  ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子処理は有益なサイトカインプロファイルを付与する。
ＩＬ−４は、ＩｇＥ産生に主要な役割を果たす重要なＴｈ２サイトカインである。Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γは、アレルギーの発生に関連付けられる。本発明者らは、ピーナッツ再刺激された脾細胞培養におけるサイトカインを評価した。ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子で処置されたマウスでは、ＩＬ−４は有意に低減し（図６Ａ、Ｐ＜０．０１対シャム）、一方、ＩＦＮ−γについて、有意な増加が観察された（図６Ｂ、Ｐ＜０．０１対シャム）。ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４の比はまた、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子で処置された群において有意に増加した（図６Ｃ、Ｐ＜０．０１対シャム）。
【０１５９】
実施例６  ＣＤ８  Ｔ細胞はベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子で処置されたマウスにおける上昇したＩＦＮ−γの主な供給源であり、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子によって誘発されるＩｇＥの低減に機能的に重要である。
インビボで処置されたマウス由来のピーナッツ再刺激された脾細胞培養物中のＩＦＮ−γの増加を観察したため、細胞供給源を調べた。ピーナッツ再刺激された脾細胞におけるＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン染色の分析は、ＣＤ８  Ｔ細胞の集団がベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子で処置されたマウスにおいて増加したことを示した（図７Ａおよび７Ｂ；Ｐ＜０．０１対シャム；Ｐ＜０．０５対ベルベリン単独）。ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子の治療効果に対するＣＤ８Ｔ細胞およびＩＦＮ−γの機能的寄与もまたアセスメントされた。治療前および治療中に投与される枯渇抗体を使用することにより、ＣＤ８  Ｔ細胞枯渇抗体を投与されたマウスでは、ＩｇＥのベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子低減が著しく損なわれ、ＩＦＮ−γ枯渇抗体ではより低い程度であることが見出された（図８）。アイソタイプ対照抗体は、効果がなかった。
【０１６０】
実施例７  ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子で処置されたアレルギーマウスはＦｏｘＰ３プロモーター中のＣｐＧ残基の脱メチル化を示す。
増強されたＴｒｅｇプロファイルは、抗アレルギー療法の有益であり、持続的な結果に関連付けられる。アレルギーマウスのベルベリン処理が陽性Ｔｒｅｇプロファイルを確立するかどうかを決定するために、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子処理の完了から２週間後に採取された末梢血から単離されたゲノムＤＮＡを用いて、ＦｏｘＰ３プロモーター中のＣｐＧ残基のメチル化を調べた。本発明者らは、シャムマウスまたはベルベリン単独を与えられたマウスと比較した場合、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子で処置されたマウスからのサンプル中のいくつかのＦｏｘＰ３プロモーターＣｐＧ残基のメチル化パーセントの減少、およびＦｏｘＰ３プロモーターにおける他のＣｐＧでのメチル化減少の傾向を見出した（図９Ａ〜Ｄ）。累積的に評価した場合、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子で処置されたマウスにおけるメチル化レベルは、シャムマウスにおけるよりも有意に低く（図９Ｅ）、これは、ＦｏｘＰ３発現の治療誘発性の上昇、したがって調節性Ｔ細胞プロファイルの有益な変更を示唆している。
【０１６１】
討論
本発明者らの現在の研究は、ヘパリン／キトサンナノ粒子に送達されたベルベリンを使用するＩｇＥ低減への新規なアプローチを報告する。５％未満のベルベリンが胃腸管によって取り込まれるため、ベルベリンのＧＩ保持を増大させるための戦略が望ましい。キトサンおよびヘパリンなどの粘膜付着性成分を使用するベルベリンナノ粒子は、以前に記載されている。薬物担体としてのナノ粒子は、薬物の経口摂取を増強し、それらの半減期を延長し、薬物をリンパ器官に標的化することが示されている。キトサンは天然に存在する多糖であり、安全であり、生体適合性および生分解性の粘膜付着性ポリマーである。ヘパリンはまた、その抗凝固特性についてより知られているが、高い負電荷のために、薬物担体開発に理想的なバイオポリマーとして現在認められているポリマー多糖である。さらに、ヘパリンは抗喘息作用を有することが報告されており、キトサンは抗アレルギー治療として研究されている。ヘパリン／キトサンナノ粒子を介するベルベリン送達を用いて、ベルナリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子は、マウスピーナッツアレルギーモデルにおいて、一部のマウスにおけるピーナッツ（ＰＮ）特異的ＩｇＥ産生の完全な低減の程度まで、劇的にＩｇＥ産生を阻害することが実証された。血清ピーナッツ特異的ＩｇＥの仮想排除は、以前のいかなる介入によっても確立されていない。治療後に低減が続くということは固有であり、印象的である。さらに、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子療法によるＩｇＥ低減は、卵白アレルギーマウスにおいても利点が観察されたため、ピーナッツアレルギーに限定されないことが見出された。これらの現在のデータは、培養されたＵ２６６細胞（不死化ヒトＩｇＥ＋ＰＣ細胞株）およびヒトＰＢＭＣのベルベリン処置がＩｇＥの有意な低減を引き起こすことが実証されている、以前に公開された研究に基づいている。Yang et al., Berberine and limonin suppress IgE production by human B cells and peripheral blood mononuclear cells from food-allergic patients. Ann. Allergy Asthma. Immunol., 2014, 113, 556-64.e4. ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子はまた、ナイーブなマウスにおけるものと同様に総ＩｇＥレベルを低減させ、重要なことには、ＩｇＡおよびＩｇＧレベルに影響を及ぼさないことがさらに見出された。これらのデータは、ＩｇＥ産生がベルベリンによる調節に特に感受性であり得ることを示唆する。
【０１６２】
ＩｇＥのベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子療法が低減する機構の理解を提供するために、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子処置されたマウスにおけるＩＦＮ−γの上昇を主に関与したＩＦＮγ産生ＣＤ８  Ｔ細胞の機能的寄与を調べた。抗体枯渇を使用して、ＣＤ８  Ｔ細胞の枯渇は、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子のＩｇＥ低減を逆転させたが、一方、ＩＦＮ−γに対する抗体はわずかな効果しか有さなかったことが見出された。ＣＤ８  Ｔ細胞がどのようにＩｇＥ産生を調節するのかを明らかにするためには、さらなる研究が必要である。
【０１６３】
以前の報告は、マウスおよびヒトにおける持続的なＩｇＥレベルが、長寿命のＩｇＥ＋ＰＣの直接発生によって、および／またはその後に短寿命のＩｇＥ＋形質細胞になるように進行するＩｇＥ＋Ｂ細胞へのＩｇＧ１＋Ｂ細胞の順次のスイッチングによるＩｇＥ＋ＰＣプールの補充によって維持され得ることを提示した。He et al., Biology of IgE production: IgE cell differentiation and the memory of IgE responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2015, 388, 1-19; Erazo et al., Unique maturation program of the IgE response in vivo. Immunity, 2007, 26, 191-203; He et al., The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. J. Exp. Med., 2013, 210, 2755-71. それらの開発への道筋にかかわらず、ＩｇＥ＋ＰＣはＩｇＥの高出力を示し、主にＩｇＥレベルの維持に関与している。Jackson et al., Factors regulating immunoglobulin production by normal and disease-associated plasma cells. Biomolecules, 2015, 5, 20-40; Wu et al., Targeting IgE production in mice and humans. Curr. Opin. Immunol., 2014, 31, 8-15. したがって、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子を用いたインビボ治療は、関与するＩｇＥ＋ＰＣの生成または生存を妨げることによって、ＩｇＥ＋ＰＣの数および／または活性を低減させることにより、おそらくＩｇＥレベルを負に調節し得る。あるいは、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子は、アネルギー状態を誘導することによって、ＩｇＥ＋ＰＣにおけるＩｇＥ合成をブロッキングするように機能することが可能である。Ｕ２６６細胞におけるベルベリンによるＩｇＥ低減に関する本発明者らのデータは、ベルベリンがＩｇＥ−形質細胞機能に直接影響を与えることを示唆する。本発明者らは、この影響の根底にある決定的なシグナル伝達機構を積極的に調査している。興味深いことに、インビボベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子療法は、マウスＦｏｘＰ３プロモーターのＣｐＧ残基の低メチル化をもたらすことが見出され、ベルベリンが増強されたＴｒｅｇ応答を促進し得ることを示唆した。Ｔｒｅｇは、直接接触を介してＰＣ数を負に調節し、ＦｃγＲＩＩｂ／免疫複合体媒介死に対するＰＣの感受性に影響を及ぼすことが最近示されている。Jang et al. Foxp3+ regulatory T cells control humoral autoimmunity by suppressing the development of long-lived plasma cells. J. Immunol., 2011, 186, 1546-53. 重要なことに、ヒトＢ細胞／Ｔｒｅｇ共培養はＩｇＥの低減をもたらすが、ＩｇＧ４レベルの上昇をもたらすことを示した研究において実証されたように、ＩｇＥ＋ＰＣはＴｒｅｇ抑制に対してより感受性であると考えられる。Meiler et al. Distinct regulation of IgE, IgG4 and IgA by T regulatory cells and toll-like receptors. Allergy, 2008, 63, 1455-63. したがって、ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子療法は、さらなる調査を必要とするＩｇＥ産生形質細胞に対する直接的および間接的な作用機序を有し得る。
【０１６４】
結論として、本発明者らは、初めて、全身チャレンジと経口チャレンジの後に、大幅に、かつ持続的なＩｇＥ応答の低減、およびピーナッツアナフィラキシーの予防をもたらした。それはまた総ＩｇＥを正常範囲に低減させた。重要なことに、ＩｇＡおよびＩｇＧレベルは影響を受けない。それはまたＦｏｘｐ３遺伝子プロモーターの脱メチル化を誘導し、このモデルにおける好ましいエピジェネティックな修飾を示す。ベルベリン／ヘパリン／キトサンナノ粒子療法戦略は、アレルギー治療の全体像を実質的に変える可能性を有し得る。
【０１６５】
【表１】
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【０１６６】
【表２】
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【０１６７】
本発明の多数の実施形態を記載した。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変をなし得ることが理解される。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。本出願において引用されているすべての特許、特許出願、および刊行物を含む各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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