(57)【要約】  本発明は、抗ブタＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）  ＭＤＡ陽性仔ブタのＨＥＶ糞便排出の防止における使用のための、ＨＥＶのオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）タンパク質および薬学的に許容される担体を含むワクチンに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＨＥＶ  ＭＤＡ陽性仔ブタのＨＥＶ糞便排出の防止における使用のための、免疫学的有効量の、最小でアミノ酸１２５位からアミノ酸６０７位までの領域および最大でアミノ酸１１２位からアミノ酸６６０位までの領域にわたるＥ型肝炎ウイルスオープンリーディングフレーム２（ＨＥＶ  ＯＲＦ２）のタンパク質断片、ならびに薬学的に許容される担体を含むワクチン。
【請求項２】
少なくとも５マイクログラム／用量の前記タンパク質断片を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのワクチン。
【請求項３】
少なくとも２０マイクログラム／用量の前記タンパク質断片を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのワクチン。
【請求項４】
前記組成物がアジュバントを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のためのワクチン。
【請求項５】
前記アジュバントが水中油型アジュバントであることを特徴とする、請求項４に記載の使用のためのワクチン。
【請求項６】
ブーストワクチンが接種される１５週前を超えずにＨＥＶ排出に対するプライミングワクチンが接種された抗ＨＥＶ  ＭＤＡ陽性仔ブタの防御のためのブースターワクチンとしての使用のための、請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項７】
前記プライミングワクチンが、少なくとも１０マイクログラム／用量の、最小でアミノ酸１２５位からアミノ酸６０７位までの領域および最大でアミノ酸１１２位からアミノ酸６６０位までの領域にわたるＨＥＶ  ＯＲＦ−２タンパク質断片、ならびに薬学的に許容される担体を含むワクチンである、請求項６に記載の使用のためのワクチン。
【請求項８】
前記ワクチンが少なくとも１つの他のブタ病原性微生物もしくはブタ病原性ウイルスおよび／または前記ブタ病原性微生物もしくはブタ病原性ウイルスの少なくとも１つの他の免疫原性成分および／もしくは前記他の免疫原性成分をコードする遺伝材料を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の使用のためのワクチン。
【請求項９】
ブタに対して病原性のウイルスまたは微生物が、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、アフリカ豚コレラウイルス、ニパウイルス、豚サーコウイルス、豚トルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、豚インフルエンザウイルス、豚パルボウイルス、豚呼吸器および生殖症候群ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ、ＰＲＲＳ）、豚伝染性下痢症ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エリシペロ・ルシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびアクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）よりなる群から選択される、請求項８に記載の使用のためのワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＤＡ陽性仔ブタのブタＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）糞便排出の防止における使用のための、ブタＨＥＶのオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）タンパク質および薬学的に許容される担体を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
この１０年間にわたって、ヒトＥ型肝炎感染の激しい増加が世界的に見られる。現在、約２０００万人のＨＥＶ感染が年ベースで報告され、３００万超の急性肝炎症例および５７．０００人のＨＥＶ関連死が見られる。
【０００３】
Ｅ型肝炎ウイルスは、Ｅ型肝炎の病原体であり、ヘペウイルス科の唯一のメンバーであるヘペウイルス属に属する。これは、直径が約２７〜３４ｎｍの非エンベロープウイルスである。そのゲノムは、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムであり、約７．２ｋｂの長さを持つ。このゲノムは、３つの異なるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；非構造タンパク質をコードするＯＲＦ１、ウイルスのカプシドポリペプチドをコードするＯＲＦ２および細胞骨格と会合する小さいリン酸化タンパク質をコードするＯＲＦ３を含む。単独の血清型のみが存在する。それにもかかわらず、様々な分離株間での高レベルのゲノム多様性が与えられ、４つの主要な遺伝子型（遺伝子型１〜４型）への細分がなされる。
【０００４】
ＨＥＶは、ヒトにおける非Ａ型非Ｂ型肝炎の主な原因である。より大きな流行は、特に熱帯および亜熱帯の発展途上国において見出される。工業先進国において、ＨＥＶ感染は、ＨＥＶが特有ではない地域において見られ、患者がＨＥＶ感染個体と関係し得ない場合であっても見られる。ＨＥＶ遺伝子型１型および２型の感染は、１５歳から３５歳の間の人において最もよく見られる。ＨＥＶ遺伝子型３型および４型の感染は、しばしば免疫無防備状態および免疫不全のヒトにおいて、ならびに臓器移植のレシピエントにおいて、より多く見られる。健常人におけるＨＥＶ３型および４型感染の大半は、無症状であるように見える（Ｌｉｎｇ  Ｌｕら、Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、１６：５−３６（２００６））。
【０００５】
ヒトＨＥＶ感染に対するワクチンは、既に何年間も開発中である。大半の場合、かかるワクチンは、例えばバキュロウイルス発現系および細菌発現系において発現させたＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質またはその断片に基づくものである。かかるワクチンは成功が報告されている（Ｋａｍｉｌｉ，Ｓ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６１：９３−１００（２０１１）、Ａｍｉｎｉ−Ｂａｖｉｌ−Ｏｌｙａｅｅ，Ｓ．ら、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｖｉｒｏｌ．、４：１４３−１５４（２００９）、Ｆｅｎｇ−Ｃａｉ  Ｚｈｕら、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、２０１０年８月２３日オンライン公開、ＤＯＩ：１０．１０１６／Ｓ０１４０−６７３６（１０）６１０３０−６）。
【０００６】
現在、（少なくとも）ブタＨＥＶ遺伝子型３型および４型とヒトの疾患との間に人獣共通感染の関係があることは通説である。特に、ブタはＨＥＶ遺伝子型３型および４型の主な保有体である（Ｐａｖｉｏ，Ｎ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．  Ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１０：３４−４１（２０１５）、Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．およびＥｍｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｕ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．  ２０２：８１９−８２１（２０１０）、Ｍｅｎｇ，Ｘ．Ｊ．ら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ９４：９８６０−９８６５（１９９７）、ＷＵ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、６０：１６６−１７１（２０００）、Ｍａｔｓｕｄａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．、１８８，９４４（２００３）、Ｍａｔｓｕｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４８：１３６８−１３７５（２００８）、Ｍｉｓｈｉｒｏ，Ｓ．，Ｕｉｒｕｓｕ、５４：２４３−２４８（２００４）、Ｄａｌｔｏｎ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．、８：６９８−７０９（２００８））。ＨＥＶ遺伝子型３型および４型へのヒトの感染は、大半の場合、汚染された食料（例えば加熱が不十分または生の豚肉）、ブタおよびブタ糞便への直接的な曝露、または環境汚染により引き起こされる。
【０００７】
ＨＥＶの人獣共通感染特性についてのこの明らかな例証を前提とすると、ヒトの感染源としてのブタＨＥＶを回避するために、（ヒトに加えて、またはヒトの代わりにでさえも）ブタにブタＨＥＶに対するワクチンを接種することは有用であるように見える。ブタＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２タンパク質ならびにウイルス検出におけるおよびワクチンとしてのその使用に関するいくつかの特許出願が存在する。ＰＣＴ出願ＷＯ０２／０８９７３３および欧州特許出願ＥＰ１０００１６８は、基本的に、ブタＨＥＶ全ウイルスまたはブタＨＥＶベースのサブユニットワクチンを用いて、ヒトにブタＨＥＶに対するワクチンを接種することを目的とする。ＥＰ１０００１６８は、ヒトのワクチン接種のためにブタＨＥＶを弱毒化生ウイルスとして用いることを提案する。ブタへのワクチン接種は、主に、診断目的のための、なかでも異種移植における使用のためのブタ臓器がＨＥＶを含まないかをチェックするための抗ブタＨＥＶ抗体を得るための手段として提案される。抗ブタＨＥＶ抗体を得る目的のため、その感染に対する抗体を上昇させるために２週齢のＳＰＦ仔ブタをブタＨＥＶに感染させる方法が開示される。かかる仔ブタは、なかでも抗ＨＥＶ母体由来抗体（ｍａｔｅｒｎａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含まない。しかしながら、これらの特許出願は、ワクチン接種を受ける動物の齢に触れることはおろか、ブタへのワクチン接種の例を何ら呈示していない。
【０００８】
一般的に、疾患に対するワクチンを動物に、それらが誕生した後できるだけ早く接種することが魅力的であるように見え得る。しかしながら実際には、特にＨＥＶの場合、当業者はこれを好適なアプローチであるとは考えない。
【０００９】
その理由は以下のとおりである：ブタにおける抗ＨＥＶ抗体保有率はきわめて高い。世界的に、保有率の全体平均は５０％と推定されているが（Ｖａｓｉｃｋｏｖａ，Ｐ，ら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｎｉ  Ｍｅｄｉｃｉｎａ、５２：３６５−３８４（２００７））、これは多くの国において顕著により高いものであり得る。例えば、２０１３年に英国のブタにおける抗ＨＥＶ抗体保有率は９２．８％であることが見出された（Ｇｒｉｅｒｓｏｎ，Ｓ．ら、ＣＤＣ  ＥＩＤ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１、ｎｕｍｂｅｒ  ８、２００５年８月）。したがって、はるかに多くの養豚場がＨＥＶに感染しており、感染圧は非常に高いと結論付けることができる。結果として、はるかに多くのブタがＨＥＶ感染を経験しており、初回の妊娠時に抗ＨＥＶ抗体を発現しているであろう。このことは、今度は、はるかに多くの産まれた仔ブタがＨＥＶに対する母体由来抗体（ＭＤＡ）を持つ、すなわち大半の産まれた仔ブタが抗ＨＥＶ  ＭＤＡ陽性であることを意味する。これらの母体由来抗体は、仔ブタをその生命の最初の数か月間防御する。その後、ＭＤＡは緩徐に消失し、そして、高い感染圧が原因で、ＨＥＶに対する自身の防衛、なかでも抗ＨＥＶ抗体の形態での防衛を確立する前に、ある一定の時期に仔ブタはＨＥＶに易感染性になって、その結果としてＨＥＶ感染を経験し、その結果として環境中へのＨＥＶウイルス放出を開始し得る。結果として、養豚場におけるＨＥＶ感染圧は高いままである。養豚産業において、ブタは誕生後３週から４週の間に離乳される。このことは、それらが３週齢または４週齢において非常に高いＭＤＡ力価を持つことを意味する。その後、ＭＤＡ力価の緩徐な衰退が見られる。平均して、離乳が誕生後３週で行われる場合、通常、早くて約７から１３週間後に、ＨＥＶに感染するようになってこのＨＥＶ感染に対してそれら自身の免疫反応を持つようになる仔ブタの数に増加が見られる。仔ブタ中のＭＤＡが９０％の動物においてＨＥＶ感染を予防しないレベルに減少するまで、しばしば１０から２５週間かかる（実施例セクションの実施例３、およびなかでもＡｎｄｒａｕｄ，Ｍ．ら、ＰＬＯＳ  ｏｎｅ、９：ｅ１０５５２７（２０１４）を参照されたい）。この１０〜２５週の期間の前は、ＭＤＡはある一定のパーセンテージの動物の感染を防ぐが、その理由は、ウイルスが細胞に感染して免疫系を発動させることができる前にＭＤＡがウイルスに結合してこれを除去するためである。
【００１０】
結果として、当業者は１０〜２５週前の仔ブタの群れへのワクチン接種は高いパーセンテージの仔ブタにおいて効果がないと推測するが、これは、群れの中の多くの仔ブタはＨＥＶワクチンの免疫原性成分が免疫系を発動させることができる前にこれを妨げるのに十分に高いＭＤＡ力価をなお持つという単純な理由のためである。ＭＤＡによるワクチン接種の抑制は、ヒトワクチン並びに動物ワクチンの両方について共通の現象である（Ｓｔｅｆａｎ  Ｎｉｅｗｉｅｓｋ  ｉｎ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、総説、２０１４年９月１６日；ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００４４６）。したがって、この期間におけるワクチン接種は、これらの仔ブタにとって有用であるとは考えられない。しかしながら、他方で、既にＭＤＡレベルが減少した群れの中の仔ブタはＨＥＶに易感染性であり、したがってワクチン接種を受けるべきである。
【００１１】
仔ブタの各個体におけるＭＤＡレベルを日毎に決定すること、およびどの仔ブタ個体がワクチン接種を受けなければならないかを日毎に決めることは、実際的／経済的に不可能である。
【００１２】
この長期であるが変動するＨＥＶに対するＭＤＡの寿命は周知の現象であり、ワクチン接種の観点から、これは周知の課題である。この課題はＨＥＶに対するＭＤＡについて存在するだけでなく、一般的に若齢でのワクチン接種の課題である（Ａｎｄｒａｕｄ，Ｍ．（上記参照）、Ｎｉｅｗｉｅｓｋ，Ｓ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５，Ａｒｔｉｃｌｅ  ４４６（２０１４）、Ｐａｓｔｏｒｅｔ，Ｐ．Ｐ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ  １３７，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，Ｐａｇｅｓ  Ｓ２−Ｓ３（２００７））。Ａｎｄｒａｕｄ，Ｍ．（上記参照）は、ＭＤＡの問題点および課題を以下のように記述している：「ワクチン接種がこの問題点（ＭＤＡ漸減の際の感染のリスク）を克服することができても、いくつかの研究がワクチン防御の阻害を介したワクチン誘導性免疫と母体由来抗体との間のアンタゴニスト作用を証明しており、これは感染の動態を潜在的に悪化させることがある」。Ｎｉｅｗｉｅｓｋ，Ｓ．，（上記参照）は、母体由来抗体により阻害される１１個の異なるヒトワクチンおよび１７個の異なる動物ワクチンについて記述さえしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ０２／０８９７３３
【特許文献２】ＥＰ１０００１６８
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｌｉｎｇ  Ｌｕら、Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、１６：５−３６（２００６）
【非特許文献２】Ｋａｍｉｌｉ，Ｓ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６１：９３−１００（２０１１）
【非特許文献３】Ａｍｉｎｉ−Ｂａｖｉｌ−Ｏｌｙａｅｅ，Ｓ．ら、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｖｉｒｏｌ．、４：１４３−１５４（２００９）
【非特許文献４】Ｆｅｎｇ−Ｃａｉ  Ｚｈｕら、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、２０１０年８月２３日オンライン公開、ＤＯＩ：１０．１０１６／Ｓ０１４０−６７３６（１０）６１０３０−６
【非特許文献５】Ｐａｖｉｏ，Ｎ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．  Ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１０：３４−４１（２０１５）
【非特許文献６】Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．およびＥｍｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｕ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．、２０２：８１９−８２１（２０１０）
【非特許文献７】Ｍｅｎｇ，Ｘ．Ｊ．ら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ９４：９８６０−９８６５（１９９７）
【非特許文献８】ＷＵ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、６０：１６６−１７１（２０００）
【非特許文献９】Ｍａｔｓｕｄａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．、１８８，９４４（２００３）
【非特許文献１０】Ｍａｔｓｕｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４８：１３６８−１３７５（２００８）
【非特許文献１１】Ｍｉｓｈｉｒｏ，Ｓ．，Ｕｉｒｕｓｕ、５４：２４３−２４８（２００４）
【非特許文献１２】Ｄａｌｔｏｎ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．、８：６９８−７０９（２００８）
【非特許文献１３】Ｖａｓｉｃｋｏｖａ，Ｐ，ら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｎｉ  Ｍｅｄｉｃｉｎａ、５２：３６５−３８４（２００７）
【非特許文献１４】Ｇｒｉｅｒｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，ＣＤＣ  ＥＩＤ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２１  ｎｕｍｂｅｒ  ８、２００５年８月
【非特許文献１５】Ａｎｄｒａｕｄ，Ｍ．ら、ＰＬＯＳ  ｏｎｅ、９：ｅ１０５５２７（２０１４）
【非特許文献１６】Ｓｔｅｆａｎ  Ｎｉｅｗｉｅｓｋ  ｉｎ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、総説、２０１４年９月１６日；ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００４４６
【非特許文献１７】Ｎｉｅｗｉｅｓｋ，Ｓ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５，Ａｒｔｉｃｌｅ  ４４６（２０１４）
【非特許文献１８】Ｐａｓｔｏｒｅｔ，Ｐ．Ｐ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ  １３７，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，Ｐａｇｅｓ  Ｓ２−Ｓ３（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、仔ブタにＨＥＶに対するワクチンを接種するときのＭＤＡの存在という課題を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
ここに驚くべきことに、免疫学的有効量の、最小でアミノ酸１２５位から６０７位までの領域から、最大でアミノ酸１１２位から６６０位までの領域にわたるＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質断片を含むワクチンが、母体免疫を打破する能力、および、抗ＨＥＶ  ＭＤＡ陽性仔ブタとりわけ１０週齢より前の抗ＨＥＶ  ＭＤＡ陽性仔ブタの免疫系を発動させる能力を持つことが見出された。
【００１７】
図３において、本発明によるＨＥＶ  ＯＲＦ２断片でのワクチン接種後４週時に測定された、３週齢のＭＤＡ陽性仔ブタ（図３Ｃ）における抗ＨＥＶ免疫応答と１０週齢のＭＤＡ陰性仔ブタ（図３Ｄ）における抗ＨＥＶ免疫応答との比較がなされる。図から得られるように、驚くべきことに、ワクチン接種後４週時にＭＤＡ陽性仔ブタにおいて誘導された抗ＨＥＶ力価は、ワクチン接種後４週時のＭＤＡ陰性仔ブタにおける抗ＨＥＶ力価と統計的に同様である。ワクチン接種後９週時でさえ、ＭＤＡ陽性仔ブタにおける抗ＨＥＶ力価は、ＭＤＡ陰性仔ブタにおける抗ＨＥＶ力価よりわずかに低いだけである（図３Ｅ、３Ｆ）。
【００１８】
ＨＥＶ  ＯＲＦ２によりコードされるタンパク質は、７２ｋＤａのＨＥＶカプシドタンパク質である。１１個の異なるＨＥＶ  ＯＲＦ２配列間の比較は、配列同一性は全ての場合において１００％ではないが、異なるＯＲＦ２配列の長さは全ての場合において実際的に同一であることを示す（Ｍｅｎｇ，Ｘ−Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：９８６０−９８６５（１９９７））。
【００１９】
ＨＥＶ  ＯＲＦ２は、５１４７番目のヌクレオチド（ｎｔ）から始まって７１２７番目のｎｔで終わるまでの１，９８０塩基に、及び、細胞内で並びに細胞表面上で発現する６６０アミノ酸の主要構造タンパク質（８８ｋＤａ）をコードする。これは前駆体として合成され、シグナル配列切断を介して、自己会合およびグリコシル化の能力を持つ成熟したタンパク質へとプロセシングされる。バキュロウイルス系を用いたＳｆ９昆虫細胞におけるＯＲＦ２をコードする配列の発現は、推定分子質量が７２ｋＤａおよび５９〜６２ｋＤａの安定なタンパク質生成物を生ずる。昆虫細胞からの完全長タンパク質は不溶性である一方、１１２〜６０７位および１１２〜６６０位の間のアミノ酸を含むトランケートのタンパク質は、アセンブルしてウイルス様粒子になる。ＶＬＰ形成のための最小必要条件は１２５位から６０１位までのアミノ酸の存在であることが知られている（Ｓｕｒｊｉｔ，Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎ．Ｖｉｒｏｌ，、７８：３２０−３２８（２００４）、Ｌｉ，Ｔ−Ｃ．ら、Ｊｏｕｒｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７９，１２９９９−１３００６（２００５））。しかしながら、ＨＥＶ  ＯＲＦ２の最小中和ドメインは、アミノ酸残基４５８〜６０７位にマッピングされている（Ｚｈｏｕ，Ｙ．Ｈ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２２：２５７８−２５８５（２００４）、Ａｈｍａｄ，Ｉ．ら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．、１６１：４７−５８（２０１））。この理由のため、本発明によるワクチンは、少なくとも４５８〜６０７位のＣ末端アミノ酸残基を包含するＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質断片を含むべきである。同時にそのＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質断片は、ＶＬＰの形成を可能にするために、１２５〜４５７位のＮ末端アミノ酸残基を含むべきである。
【００２０】
それゆえ、本発明による使用のためのワクチンにおけるＨＥＶ  ＯＲＦ２断片は、少なくとも１２５〜６０７位のアミノ酸残基を含むべきである。しかしながら、同時にＨＥＶ  ＯＲＦ２断片は、１から１１１位の間の領域のＮ末端のさらなるアミノ酸を含むべきでなく、その理由は、かかるタンパク質断片は特に昆虫細胞発現系において作られたときに溶解性がより低いためである。
【００２１】
したがって、好ましくは、その断片の最小サイズは１１２〜６０７位のアミノ酸残基を含む一方で、同時にその断片の最大サイズは１１２〜６６０位のアミノ酸残基を含む。
【００２２】
ＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質配列のアミノ酸１１２位から６０７位の間の領域の例は、図５中に表される（配列番号１）。
【００２３】
本明細書中で用いられる用語「免疫学的有効量」は、免疫されていない仔ブタにおいて野生型ＨＥＶ感染により引き起こされる影響と比べたときに野生型ＨＥＶ感染により引き起こされる影響を減少させる程度に、仔ブタにおける免疫応答を誘導するのに必要であるＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質断片の量に関する。若い仔ブタのＨＥＶに対するワクチン接種の主な目的は仔ブタの臨床症状の防止ではなく、むしろ感染仔ブタにより排出されるウイルス量の低減であることに留意すべきである。これは、一方でＨＥＶ感染仔ブタにおける臨床徴候は中程度から全く無いものであり、他方で最終ゴールは感染ブタの糞便（なかでも農業従事者）または感染ブタの肉との接触を介してヒトがＨＥＶ感染することを防ぐことであるという事実のためである。それゆえ、仔ブタのワクチン接種の基本的なゴールは、養豚場における感染圧を減少させることである。この理由のため、基本的に、本明細書中で用いられる「免疫学的有効量」が仔ブタにおいて免疫応答を誘導して全身感染を防ぐのに必要であるＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質断片の量に関することは、当業者に明らかである。この全身感染の防止は、今度は、ＨＥＶ感染を経験した後のワクチン接種を受けていない仔ブタによって排出されるウイルスの量と比べたときに、ＨＥＶ感染を経験した後のワクチン接種を受けた仔ブタによって排出されるウイルスの量を減少させる。
【００２４】
例えばワクチン接種を受けた動物およびワクチン接種を受けていない動物の両方に実験的チャレンジ感染を投与し、次に標的動物の血清学的パラメーターを決定することにより、および排出されるウイルスの量を例えば直腸スワブを取ることによって測定することにより、その後に２つのチャレンジ群におけるこれらの知見を比較することにより、処置が免疫学的に有効であるか（すなわち、免疫学的有効量のワクチンが投与されたか）を決定することは十分に当業者の能力の範囲内にある。投与されるＯＲＦ２タンパク質断片の量は、投与経路、アジュバントの存在、ワクチン接種の回数および投与時期に依存する。単なる例として；用いられるアジュバントに依存して、単回の筋肉内ワクチン接種として与えられる約５マイクログラムのＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質／用量という量は、高い抗ＨＥＶ  ＭＤＡ力価を持つ３週齢の仔ブタにおいて防御的免疫応答を誘導する能力を非常に良好に持つ。
【００２５】
好ましくは、本発明による使用のためのワクチンは、少なくとも１０マイクログラム／用量の前記タンパク質断片を含むことを特徴とする。
【００２６】
より好ましくは、本発明による使用のためのワクチンは、少なくとも２０マイクログラム／用量の前記タンパク質断片を含む。
【００２７】
好ましくは、約１５マイクログラムのＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質／用量、より好ましくは、好ましい順にちょうど２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００マイクログラム／用量という量でさえ投与される。１００マイクログラム／用量より多い量は、実行可能ではあるが、防御のレベルに大きな追加を与えるものではなく、コストの観点から魅力的でもない。
【００２８】
本発明の目的のため、単回のワクチン接種は、（プライム−ブーストワクチン接種レジメンと対照的に）１回だけ行われるワクチン接種である。
【００２９】
本発明の目的のため、ＭＤＡ陽性仔ブタは、実施例４において記載されるＥＬＩＳＡ法に従って測定されたときの光学濃度がＯＤ  （４５０ｎｍ）  ０．２５以上であるＭＤＡ抗体力価を持つ仔ブタである。
【００３０】
したがって、本発明の第一の実施形態は、ＭＤＡ陽性仔ブタのＨＥＶ排出の防止における使用のための、免疫学的有効量の、最小でアミノ酸１２５位からアミノ酸６０７位までの領域および最大でアミノ酸１１２位からアミノ酸６６０位までの領域にわたるＥ型肝炎ウイルスオープンリーディングフレーム２（ＨＥＶ  ＯＲＦ２）のタンパク質断片、ならびに薬学的に許容される担体を含むワクチンに関する。
【００３１】
本発明によるワクチンは、２〜４週齢の仔ブタにおいて既に成功裏に用いられているものであることができる。これは、この齢の仔ブタはしばしば他のブタ疾患に対するワクチンを接種されることから、経済的および動物福祉の観点から有利である。したがって、ワクチンは同時期にまたはほぼ同時期に投与することができる。
【００３２】
本発明による使用のためのワクチンにおける使用に適した薬学的に許容される担体の例は、当該技術分野で周知であり、例えば、滅菌水、生理食塩水、ＰＢＳのような水性バッファーなどを含む。加えて、本発明による使用のためのワクチンは、下記のように、他の添加物、例えばアジュバント、安定剤、抗酸化剤及び他のものを含み得る。
【００３３】
図３中には、本発明による組成物での単回ワクチン接種が、仔ブタにおいてＨＥＶの、特に後代ウイルスの排出の良好な防止を既に提供していることが示されるので、原理的にブースターワクチン接種は必要とされない（実施例７、表ＡおよびＢも参照されたい）。
【００３４】
しかしながら、よりいっそう驚くべきことに、ここに、ＭＤＡ陽性仔ブタのワクチン接種群およびＭＤＡ陰性仔ブタのワクチン接種群が１回目のワクチン接種の数週間後に２回目のワクチン接種（ブースターワクチン接種）を受けた場合、両群における力価はいっそう高くなり、両群において実際的に同じ力価で安定化することが見出された。これは、仔ブタが本発明において記載されるＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質の断片でプライムおよびブーストの両方をされたときにいっそう良好にＨＥＶ排出が防がれたことを示す。
【００３５】
そこで、いっそう高くて長期持続する防御レベルを得るため、ブースターを与えることができる。原理的に、かかるブースターワクチンは、１回目のワクチン接種後３週から１５週の間のどこかで、好ましくは３週から１０週のどこかで与えられたときに最も効果的である。より好ましくは、ブースターは、１回目のワクチン接種後５週前後で与えられる。
【００３６】
ブースターワクチンはまた、少なくとも１０マイクログラムのＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質／用量という量を含む。好ましくは、約１５マイクログラムのＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質／用量、より好ましくは、好ましい順にちょうど２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０またはちょうど１００マイクログラム／用量という量が投与される。
【００３７】
したがって、別の実施形態は、ブーストワクチンが接種される１５週前を超えずにＨＥＶ排出に対するプライミングワクチンが接種されたＭＤＡ陽性仔ブタの防御のためのブースターワクチンとしての使用のための、少なくとも１０マイクログラム／用量の、最小でアミノ酸１２５位からアミノ酸６０７位までの領域および最大でアミノ酸１１２位からアミノ酸６６０位までの領域にわたるＥ型肝炎ウイルスオープンリーディングフレーム２（ＨＥＶ  ＯＲＦ２）のタンパク質断片、ならびに薬学的に許容される担体を含むワクチンに関する。
【００３８】
本実施形態のより好ましい形態において、プライミングワクチンは、少なくとも１０マイクログラム／用量の、最小でアミノ酸１２５位からアミノ酸６０７位までの領域および最大でアミノ酸１１２位からアミノ酸６６０位までの領域にわたるＨＥＶ  ＯＲＦ−２タンパク質断片、ならびに薬学的に許容される担体を含むワクチンである。
【００３９】
本発明において記載されるＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質の断片は、これらの断片をコードするＤＮＡ断片の発現により容易に得ることができる。当該技術分野で周知の好適な発現系は、例えば細菌、バキュロウイルスを基にした、酵母を基にしたおよび真核細胞を基にした発現系である。かかる発現系は、当該技術分野において広範に記載され、市販されている。Ｋａｍｉｌｉ（上記参照）は、例えば、バキュロウイルスに基づく発現系および細菌発現系の両方におけるＨＥＶ  ＯＲＦ２発現の例に言及している。
【００４０】
バキュロウイルスに基づく発現系および細菌発現系は、それらの使用の容易さおよびそれらの比較的高い収量の観点で好ましい系である。これら２つのうち、バキュロウイルスに基づく発現系は、わずかにより好ましい。
【００４１】
実施例セクションは、バキュロウイルスに基づく発現系における、最小でアミノ酸１２５位からアミノ酸６０７位までの領域および最大でアミノ酸１１２位からアミノ酸６６０位までの領域にわたるＨＥＶ  ＯＲＦ２タンパク質断片の発現の例を提供する。
【００４２】
本発明による使用のためのワクチンは、好ましくはアジュバントを含む。ブタワクチンにおける使用が当該技術分野で周知である慣用的なアジュバントは、例えば不完全フロイントアジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ  Ａ（登録商標）、ミネラルオイル、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）またはＭａｒｋｏｌ（登録商標）、植物油およびＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）またはＤｉｌｕｖａｃ（登録商標）  Ｆｏｒｔｅである。
【００４３】
好ましくは、本発明による使用のためのワクチンは、油中水型または水中油型のアジュバントを含む。これらのうち、水中油型アジュバントがわずかに好ましい。油中水型および水中油型アジュバント中の油脂成分は、ミネラルオイルであることができる。しかしながら、現在、ミネラルオイルは、例えばスクアラン、スクアレンおよびトコフェロールのような生分解性油脂に置き換えられる傾向がある。
【００４４】
したがって、本発明による使用のためのワクチンは、より好ましくは水中油型アジュバントを含む。
【００４５】
ワクチンはまた、いわゆる「ビークル」を含み得る。ビークルは、ポリペプチドが共有結合することなく付着する化合物である。しばしば用いられるビークル化合物は、例えばアルミニウムの水酸化物、リン酸化物または酸化物、シリカ、カオリンおよびベントナイトである。
【００４６】
養豚の実践において、ブタは、多数の病原性ウイルスまたは微生物に対するワクチンを接種される。それゆえ、実際的な理由および経済的の理由の両方のため、ブタのための本発明によるワクチンを、例えばブタに対して病原性であるウイルスもしくは微生物のさらなる免疫原とまたは前記ウイルスもしくは微生物の免疫原をコードする遺伝材料（ＲＮＡ／ＤＮＡ）と組み合わせることは、大いに魅力的である。
【００４７】
したがって、本実施形態の好ましい形態は、少なくとも１つの他のブタ病原性微生物もしくはブタ病原性ウイルスおよび／または前記ブタ病原性微生物もしくはブタ病原性ウイルスの少なくとも１つの他の免疫原性成分および／もしくは前記他の免疫原性成分をコードする遺伝材料を含む、本発明による使用のためのワクチンに関する。免疫原または免疫原性成分は、動物において免疫応答を誘導する成分である。これは、例えば弱毒化された生のまたは不活化された全ウイルス、細菌もしくは寄生生物、またはそのウイルス、細菌もしくは寄生生物のタンパク質もしくは糖部分であることができる。
【００４８】
ブタに対して病原性を持つ最も一般的な病原性ウイルスおよび微生物は、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、アフリカ豚コレラウイルス、ニパウイルス、豚サーコウイルス、豚トルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、豚インフルエンザウイルス、豚パルボウイルス、豚呼吸器および生殖症候群ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ、ＰＲＲＳ）、豚伝染性下痢症ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エリシペロ・ルシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびアクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。
【００４９】
それゆえ、本実施形態のより好ましい形態は、ブタに対して病原性のウイルスまたは微生物が、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、アフリカ豚コレラウイルス、ニパウイルス、豚サーコウイルス、豚トルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、豚インフルエンザウイルス、豚パルボウイルス、豚呼吸器および生殖症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、豚伝染性下痢症ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、エシェリキア・コリ、エリシペロ・ルシオパシエ、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、サルモネラ・コレラスイス、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・ムルトシダ、ストレプトコッカス・スイス、マイコプラズマ・ハイオニューモニエおよびアクチノバチルス・プルロニューモニアよりなる群から選択される、本発明による使用のためのワクチンに関する。
【００５０】
好ましい投与経路は、筋肉内または皮内経路である。皮内投与のため、無針デバイス、例えばＩＤＡＬ（登録商標）（ＭＳＤ  ＡＨ）などが好ましいデバイスである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】バキュロウイルス感染後の異なる回収時点におけるＳＦ９培養上清およびＳＦ９細胞におけるタンパク質発現ＨＥＶ  １１２−６０７：Ａ）ウエスタンブロットをαＨＩＳ抗体で染色した後の結果。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのブロッティングの後、メンブレンをブロッキングバッファー中で１：５００に希釈したαＨＩＳ−ＭＣＡで１時間染色した。次に、メンブレンを洗浄バッファーで洗浄し、ブロッキングバッファー中で１：１０００に希釈した二次抗体ＧＡＭ／ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）／ＰＯと共に１時間インキュベートした。メンブレンを洗浄バッファーで再度洗浄し、１５ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウムに希釈したＶｅｃｔｏｒ  ＳＧ基質と共にインキュベートした。Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに対するｉｎｓｔａｎｔ  ｂｌｕｅタンパク質染色。ｉｎｓｔａｎｔ  ｂｌｕｅ染色のため、ＳＤＳ  ｐａｇｅゲルを１０ｍｌのＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅタンパク質染色液中で２時間インキュベートした。ｋＤａのタンパク質サイズを有する分子量マーカーは左のレーンにロードされる。  ５０ｋＤａのサイズマーカーが指し示される。予想されるＨＥＶ  １１２−６０７のサイズは５５ｋＤである。  試料のローディングは、以下の番号で指し示される：１．３日目に回収した培地：２．３日目に回収した細胞：３．４日目に回収した細胞：４．４日目に回収した培地：５．５日目に回収した細胞：６．５日目に回収した培地：７．６日目に回収した細胞：８．６日目に回収した培地
【図２】培養上清から回収したタンパク質のＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ精製後のＨＥＶ  １１２−６０７の溶出フラクション１〜１４のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに対するｉｎｓｔａｎｔ  ｂｌｕｅ染色。溶出液は２ｍｌのフラクションに収集した。レーン１５、１６はそれぞれ結合させていないフラクションおよび洗浄フラクションに対応する。ｉｎｓｔａｎｔ  ｂｌｕｅ染色のため、ＳＤＳ  ｐａｇｅゲルを１０ｍｌのＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅタンパク質染色液中で２時間インキュベートした。  ｋＤａのタンパク質サイズを有する分子量マーカーは左端および右端のレーンにロードされる。予想されるＨＥＶ  １１２−６０７のサイズは、５５ｋＤである。溶出物１〜７は精製後にプールした。
【図３】ＥＬＩＳＡにおいて決定された、ワクチン接種調査において様々な時点で測定されたＨＥＶ特異抗体。データはエラーバー（平均値の標準誤差、ＳＥＭ）と共に表される。Ａ：実験開始時の３週齢の仔ブタは、ＨＥＶに対する著しい移行抗体力価を保有していた。Ｂ：実験開始時の１０週齢のブタは、保有するＨＥＶに対する（移行）抗体力価が低減しており、このことはこの齢における母性免疫低減と一致する。Ｃ：１１２−６０７  ＳＵＰおよび１１２−６０７  ＡＫＴＡワクチンの接種は、Ｔ＝ワクチン接種後４週の「３週」齢群においてＨＥＶ  ＯＲＦ２への特異抗体での抗体陽転をもたらした。移行抗体は完全には消失していない。Ｄ：１１２−６０７  ＳＵＰおよび１１２−６０７  ＡＫＴＡワクチンの接種は、Ｔ＝ワクチン接種後４週の「１０週」齢群においてＨＥＶ  ＯＲＦ２への特異抗体での抗体陽転をもたらした。Ｅ：１１２−６０７  ＳＵＰおよび１１２−６０７  ＡＫＴＡワクチンの接種は、Ｔ＝ワクチン接種後９週の「３週」齢群においてＨＥＶ  ＯＲＦ２への特異抗体での抗体陽転をもたらした（Ａでマークした下位群）。最初のワクチン接種後５週でのブースターワクチン接種は、Ｔ＝最初のワクチン接種後９週で、最初のワクチン接種のみと比べて抗体力価の増加をもたらした（Ｂでマークした下位群）。移行抗体は検出レベル未満に低下していた。Ｆ：１１２−６０７  ＳＵＰおよび１１２−６０７  ＡＫＴＡワクチンの接種は、Ｔ＝ワクチン接種後９週の「１０週」齢群においてＨＥＶ  ＯＲＦ２への特異抗体での抗体陽転をもたらした（Ａでマークした下位群）。最初のワクチン接種後５週でのブースターワクチン接種は、Ｔ＝最初のワクチン接種後９週で、最初のワクチン接種のみと比べて抗体力価の増加をもたらした（Ｂでマークした下位群）。
【図４】ＥＬＩＳＡにおいて決定された、ワクチン接種−チャレンジ実験において様々な時点で測定されたＨＥＶ特異抗体。データはエラーバー（平均値の標準誤差、ＳＥＭ）と共に表される。
【図５】この図は、ａ．ａ．配列１１２〜６０７のＯＲＦ２のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図６】この図は、図５のアミノ酸配列をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。
【実施例】
【００５２】
実施例１：ＢＡＣ  ｔｏ  ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏ発現系におけるＨＥＶ  ＯＲＦ２発現
図５中に表されるＨＥＶ遺伝子型３型［ブタＥ型肝炎ウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＪ０６４１７．１を基にする）のＯＲＦ２カプシドタンパク質のドメイン（配列番号１）を、ＢＡＣ  ｔｏ  ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において発現させた。精製のため、Ｃ末端のＨＩＳタグを有するタンパク質を設計した。
【００５３】
発現させたタンパク質断片は、コア構造ドメイン（アミノ酸１１２〜３６７）および予想される中和エピトープ（アミノ酸４５６〜６０７）を含有するが、ＯＲＦ２のＲＮＡ結合ドメインであるＨＥＶ  ＯＲＦ２のＮ末端の１１１アミノ酸を欠いている。
【００５４】
図６中に表されるＨＩＳタグ付加したタンパク質のコーディング配列（配列番号２）を、ｐＦａｓｔｂａｃ１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。コーディング配列は、隣接する５‘  ＢａｍＨＩ制限部位、開始コドン、タンパク質のコドン最適化したヌクレオチド配列、ＨＩＳタグ、停止コドンおよび３’  ＥｃｏＲＩ制限部位を有するように設計した。この情報をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）に送って、そこでヌクレオチド配列を合成し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化したｐＦａｓｔｂａｃ１プラスミドにクローニングした。
【００５５】
続いて、タンパク質を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍの対応するＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎマニュアルに従って、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて発現させた。組換えタンパク質の高レベル発現のためのバキュロウイルスを作製するのに効率的な部位特異的転位システム。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒｓ  １０３５９−０１６、１０３６０−０１４、１０５８４−０２７、１０７１２−０２４．  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  １０３５９、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＭＡＮ００００４１４）。
【００５６】
簡潔には、コンピテントＤＨ１０Ｂａｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、上記のヌクレオチド配列を含有するプラスミドＤＮＡで形質転換した。続いて、インサート配列を、ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中に存在するＢａｃｍｉｄ配列内に転位した。次に、細菌を、抗生物質およびＩＰＴＧを含有するアガープレート上に塗布した。選抜はｗｈｉｔｅ−ｂｌｕｅスクリーニングにより行ったが、これは、白色コロニーは組換えＢａｃｍｉｄを含有するためである。白色コロニーから液体培養をセットアップした。次いで、ミニプレップ分離を実施し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からＢａｃｍｉｄ  ＤＮＡを分離した。ＳＦ９昆虫細胞をこの組換えＢａｃｍｉｄ  ＤＮＡでトランスフェクトし（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、組換えバキュロウイルス粒子の形成をもたらした。これらの粒子を回収し、新たなＳＦ９昆虫細胞単層を感染させるのに用いた。感染は、組換え遺伝子の発現およびＨＩＳタグ付加ＨＥＶ−ＯＲＦ２タンパク質１１２−６０７の生産を誘導する。
【００５７】
最適なタンパク質収量の時点を決定するため、感染後３、４、５および６日の異なる時点でタンパク質を回収した。これらの全ての感染実験において、０．１の最適化されたＭＯＩを用いた。
【００５８】
ＳＦ９細胞培養培地またはＳＦ９細胞中で発現した組換えタンパク質を回収した。タッピングにより細胞を培養フラスコから離し、細胞懸濁液を３．０００×ｇで１０分間遠心分離した。培地を回収し、解析まで−７０℃で保存した。細胞ペレットは、解析まで−２０℃で保存した。上清および細胞回収物の両方をタンパク質発現について解析した。ペレット状の細胞を、タンパク質発現解析の前にＰＢＳ中に再懸濁した。両回収物の試料を、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ａｌｌ  ｂｌｕｅマーカー（Ｂｉｏｒａｄ）と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動し、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｂｌｕｅ染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）およびウエスタンブロット（αＨＩＳ−ＭＣＡ）により解析した。
【００５９】
ｉｎｓｔａｎｔ  ｂｌｕｅ染色のため、ＳＤＳ  ｐａｇｅゲルを１０ｍｌのＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅタンパク質染色液中で２時間インキュベートした。
【００６０】
ウエスタンブロットのため、Ｔｒａｎｓ  Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐａｃｋ（Ｂｉｏｒａｄ）を、対応する説明マニュアルに従って用いた。ブロッティングの後、メンブレンを、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ  ０．０４Ｍ中１％スキムミルク、ポリソルベート２０  ０．０５％）で１時間ブロッキングした。続いて、メンブレンをブロッキングバッファー中、１：５００に希釈したαＨＩＳ−ＭＣＡ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌまたは市販の同等品）で１時間染色した。次に、メンブレンを洗浄バッファー（ＰＢＳ  ０．０４Ｍ、ポリソルベート２０  ０．５％）で洗浄し、ブロッキングバッファー中、１：１０００に希釈した二次抗体ＧＡＭ／ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）／ＰＯ（Ｎｏｒｄｉｃ）と共に１時間インキュベートした。メンブレンを洗浄バッファーで再度洗浄し、１５ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウムに希釈した３滴のＶｅｃｔｏｒ  ＳＧ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に短時間インキュベートした。
【００６１】
組換えタンパク質１１２−６０７は、培養培地中に可溶性タンパク質として分泌されたが、細胞ペレット中にも存在する（図１、Ａ：ウエスタンブロット、Ｂ：タンパク質染色）。最も高いタンパク質収量は培養培地中で感染５日後に達成された。可溶性タンパク質を含有する培養培地を、ガンマ線照射＝１１２−６０７  ＳＵＰによるバキュロウイルスの不活化後にワクチンの調製のために用いた（実施例３、ワクチン調製を参照されたい）。培養培地から、サブユニットタンパク質フラクションも調製した。ＨＩＳタグ付加タンパク質を細胞培養培地からＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔタンパク質精製システム＝１１２−６０７  ＡＫＴＡを用いて精製した（実施例２、精製法  ＡＫＴＡを参照されたい）。
【００６２】
実施例２：精製法  ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔタンパク質精製システム
培養培地中に存在するＨＩＳタグ付加タンパク質１１２−６０７を、ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ）を用いて精製した。
【００６３】
培養上清中のＨＩＳタグ付加タンパク質を、ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ）上で、ＨＩＳｔｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ａｒｔ．１７−５２５５−０１（５ｍｌ）を用いて精製した。精製の前に、フラクションを０．４５μＭフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上でろ過した。
【００６４】
以下のプログラムを用いた：
【表１】
2019516745.tif 000002
洗浄バッファー  ＡＫＴＡ、非変性：３００ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、５ｍＭ  イミダゾール（Ｉｍｍｉｄａｚｏｌｅ）
溶出バッファー、非変性：３００ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、５００ｍＭ  イミダゾール（Ｉｍｍｉｄａｚｏｌｅ）。
【００６５】
溶出液は２ｍｌのフラクションに収集し、これらをＳＤＳ  ｐａｇｅゲル上で泳動し、その後にｉｎｓｔａｎｔ  ｂｌｕｅ染色を行った。ＳＤＳ  ｐａｇｅゲルを１０ｍｌのＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅタンパク質染色液（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）中で２時間インキュベートした（図２）。溶出物１〜７は精製後にプールした。
【００６６】
精製後、精製タンパク質に対して透析を実施した。精製タンパク質をＳｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ３  Ｄｉａｌｙｓｉｓ膜、ＭＷＣＯ  ３．５ｋＤ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）の中に入れ、これを、精製タンパク質の約４００倍の液量の透析バッファー（１５０ｍＭ  ＫＣｌ＋１５０ｍＭ  ＴＲＩＳ）を含む外部チャンバー内に置いた。バッファーを４℃で２日間、絶えず撹拌し、１日後に透析バッファーを交換した。
【００６７】
実施例３：ワクチンの製剤化
Ｘ−ｓｏｌｖｅ製剤は、可溶化Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  Ａｃｅｔａｔｅと組み合わせたミネラルオイルを基材とする水中油型エマルションである。ミネラルオイルベースのエマルションの液滴サイズは約０．５μｍであり、Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  Ａｃｅｔａｔｅの液滴サイズは約１５０ｎｍである。最終ワクチンの粘度は１５ｍＰａ．ｓ未満である。
【００６８】
抗原のタンパク質濃度は以下のように決定した：ワクチン製剤のために用いられる水相を、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ａｌｌ  ｂｌｕｅマーカー（Ｂｉｏｒａｄ）およびタンパク質濃度（２５−５０−１００μｇ／ｍｌ）がわかるＢＳＡ標品と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動し、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｂｌｕｅ染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）により解析した。ｉｎｓｔａｎｔ  ｂｌｕｅ染色のため、ＳＤＳ  ｐａｇｅゲルを１０ｍｌのＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅタンパク質染色液中で２時間インキュベートした。シグナルの濃さをＳｙｎｇｅｎｅからのＧｅｎｅＴｏｏｌｓソフトウェアにより測定した。１１２−６０７  ＡＫＴＡおよび１１２−６０７  ＳＵＰのタンパク質濃度は、ＢＳＡ標品の結果に対する線形回帰に基づいて推定した。
１１２−６０７  ＡＫＴＡ：最終ワクチン製剤中で４０μｇ／ｍｌタンパク質
１１２−６０７  ＳＵＰ：最終ワクチン製剤中で４０μｇ／ｍｌタンパク質。
【００６９】
実施例４：血清中の（移行）抗体レベルの決定
個々のブタの血液試料（Ｖａｃｕｏｌｅｔｔｅ  ８ｍｌ  Ｓｅｐ  Ｃｌｏｔ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｇｒｅｉｎｅｒ−Ｂｉｏ  Ｏｎｅ））を収集した。室温および４℃で一晩の凝固後、血液試料から血清を得た。これに、２，５００×ｇ、４℃で２５分間のチューブの遠心分離を行った。ＥＬＩＳＡのための血清試料を＋５６℃で３０分間加熱して不活化し、最終的に使用するまで−２０℃以下で保存した。ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ、米国からの商業的試験ＨＥＶ  ＥＬＩＳＡ  ４．０キットを用いて、ＨＥＶに対する抗体の存在について血清を試験した。これは、ＨＥＶ  ＥＬＩＳＡ  ４．０キットの対応するプロトコールに従って行った。
【００７０】
ＥＬＩＳＡのカットオフ値は、ＯＤ（４５０ｎｍ）  ０．２＋陰性対照試料の平均（０．０５）である。ＯＤが０．２５０より低い試料はＨＥＶ陰性と考えられる。
【００７１】
実施例５：直腸スワブ、胆汁および血清におけるＨＥＶの検出
個々のブタの血液試料（Ｖａｃｕｏｌｅｔｔｅ  ８ｍｌ  Ｓｅｐ  Ｃｌｏｔ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｇｒｅｉｎｅｒ−Ｂｉｏ  Ｏｎｅ））を収集した。室温および４℃で一晩の凝固後、血液試料から血清を得た。これに、２，５００×ｇ、４℃で２５分間のチューブの遠心分離を行った。ＰＣＲのための血清試料は熱不活化せず、解析まで−２０℃以下で保存した。
【００７２】
胆汁は、剖検時に胆嚢からシリンジを用いて採取し、解析まで−２０℃以下で保存した。
【００７３】
直腸スワブは、実験中の異なる時点で採取した。スワブは１ｍｌ  ＰＢＳおよび抗生物質を含有するチューブ内に置いた。実験室において、チューブをボルテックスし、クライオチューブ中でデカントした。試料は解析まで−２０℃以下で保存した。
【００７４】
直腸スワブ、胆汁および血清試料を、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりＨＥＶ  ＲＮＡの存在について試験した。
【００７５】
ＲＮＡを、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）により、製造業者により記載されたｅｘｔｅｒｎａｌ  ｌｙｓｉｓプロトコールを用いて抽出した。簡潔には、２００μｌの希釈していない試料を２５０μｌのｅｘｔｅｒｎａｌ  ｌｙｓｉｓバッファー（Ｒｏｃｈｅ）と混合し、関連プロトコールに従って核酸を抽出した。
【００７６】
これらの試料におけるＨＥＶ  ＲＮＡの定量的検出のため、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。ｑＰＣＲ反応液は、４．５μｌ  ＲＮａｓｅフリーの水、１２．５μｌ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、４００ｎｍのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、３００ｎｍのプローブ、０．７５μｌ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ｍｉｘ（酵素）ならびに５μｌ  ＲＮＡからなる。
【００７７】
以下のプライマーおよびプローブを用いた：
フォワードプライマー；ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＧＡＣ（配列番号３）
リバースプライマー；ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＴＴＧ  ＧＡＴ  ＧＡＡ（配列番号４）
６ＦＡＭ  ＴＡＭＲＡ標識プローブ；ＴＧＡ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＣＧＣ（配列番号５）
逆転写は５０℃で３０分間行い、その後に９５℃で１５分間の変性を行った。９４℃（１５秒）、５６℃（３０秒）および７６℃（３０秒）のＰＣＲサイクルを４０回使用して、ＤＮＡを直ちに増幅した。反応をＣＦＸ９６リアルタイムシステム（Ｂｉｏｒａｄ）上で行わせ、ＣＦＸマネージャーＶｅｒｓｉｏｎ  ３．１でソフトウェア解析を行った。データは、コピー／ｍｌ試料で表される。定量は、ＣＦＸ９６上での各ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ反応において、１０１〜１０８個のＨＥＶ  ＯＲＦ２コピー／５μｌを含有する標準試料セットの解析に基づいて行った。
【００７８】
実施例６：ワクチン接種実験
ＨＥＶ移行抗体について血清陽性であった合計３０頭の３週齢の仔ブタを本調査において用いた。仔ブタは異なる同腹仔からランダムに選択した。
【００７９】
合計３０頭の１０週齢のブタを本調査において用いた。仔ブタはランダムに選択した。１０週齢時には、ＨＥＶへの移行抗体レベルは２週齢の仔ブタと比べて低減していた（図３Ａ、Ｂ）。
【００８０】
３週齢の仔ブタを各々１０頭の仔ブタの３つの処置群（群１−２−３）に割り当てた。群１の仔ブタは、３週齢時に、Ｘ−Ｓｏｌｖｅ中に製剤化されたＨＥＶ  ＯＲＦ２ワクチン１１２−６０７  ＳＵＰをワクチン接種した（ＩＭワクチン接種、１ｍｌ、首に）。群２の仔ブタは、３週齢時に、Ｘ−Ｓｏｌｖｅ中に製剤化されたＨＥＶ  ＯＲＦ２ワクチン１１２−６０７  ＡＫＴＡをワクチン接種した（ＩＭワクチン接種、１ｍｌ、首に）。群３の仔ブタは、３週齢時にＰＢＳをワクチン接種した（ＩＭワクチン接種、１ｍｌ、首に）。
【００８１】
１０週齢のブタを各々１０頭の仔ブタの３つの処置群（群４−５−６）に割り当てた。群４の仔ブタは、１０週齢時に、Ｘ−Ｓｏｌｖｅ中に製剤化されたＨＥＶ  ＯＲＦ２ワクチン１１２−６０７  ＳＵＰをワクチン接種した（ＩＭワクチン接種、１ｍｌ、首に）。群５の仔ブタは、１０週齢時に、Ｘ−Ｓｏｌｖｅ中に製剤化されたＨＥＶ  ＯＲＦ２ワクチン１１２−６０７  ＡＫＴＡをワクチン接種した（ＩＭワクチン接種、１ｍｌ、首に）。群６の仔ブタは、３週齢時にＰＢＳをワクチン接種した（ＩＭワクチン接種、１ｍｌ、首に）。
【００８２】
１０頭の仔ブタの各群を、最初のワクチン接種の５週後（８／１５週齢）にＡ群およびＢ群に細分した。５頭の仔ブタはブースターワクチン接種を受けず（Ａ下位群）、一方、その他の５頭のブタは最初のワクチン接種と同一のブースターワクチン接種を受けた（Ｂ下位群）。
【００８３】
ワクチン接種の前（３／１０週齢）、７／１４週齢（ワクチン接種の４週後）および１２／１９週齢（ワクチン接種の９週後）に血清を収集した。ＨＥＶへの抗体レベルを実施例４中に記載されるように血清中で決定した。ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ解析により全ての血清試料においてＨＥＶの複製がないことを確認した。
【００８４】
３週齢時に、仔ブタはＨＥＶに対する著しい抗体力価を持っていたが、これは１０週齢のブタにおいて大部分が消失していた（図３Ａ、Ｂ）。１１２−６０７  ＳＵＰワクチン（群１）および１１２−６０７  ＡＫＴＡワクチン（群２）の接種は、ワクチン接種後４週（図３Ｃ、Ｄ）および９週（図３Ｅ、Ｆ；下位群Ａ）で、両方の齢の群においてＨＥＶ  ＯＲＦ２への特異抗体での抗体陽転をもたらした。最初のワクチン接種後５週でのブースターは、最初のワクチン接種後９週で抗体力価の増加をもたらした（図３Ｅ、Ｆ；下位群Ｂ）。
【００８５】
実施例７：仔ブタにおけるワクチン接種−チャレンジ実験
ＨＥＶ移行抗体について血清陽性であった合計１２頭の３週齢の仔ブタを本調査において用いた。仔ブタは異なる同腹仔からランダムに選択し、１つの囲いの中で一緒に飼育した。
【００８６】
仔ブタを各々４頭の仔ブタの３つの処置群（群１−２−３）に割り当てた。群１の仔ブタは、３週齢時に、Ｘ−Ｓｏｌｖｅ中に製剤化されたＨＥＶ  ＯＲＦ２ワクチン１１２−６０７  ＳＵＰをワクチン接種した（ＩＭワクチン接種、１ｍｌ、首に）。ワクチン接種の前（３週齢）、７週齢（ワクチン接種の４週後）および実験的チャレンジの前（１１週齢、ワクチン接種の８週後）に血清を収集した。
【００８７】
ワクチン接種の８週後（１１週齢）、群２の４頭のブタに、オランダの農場からのＨＥＶ陽性動物の肝臓ホモジネートを実験的にチャレンジした。チャレンジ材料は、５０／５０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地／Ｆ−１２  Ｈａｍ培地中の１０％肝臓ホモジネートであった。チャレンジ肝臓ホモジネートを筋肉内（ＩＭ）注射（２×２．５ｍｌ、左右の首）を介して適用し、および１５ｍｌの経口用量をシリンジを用いて適用した。経口注入のため、ホモジネートを３，２００×ｇ、４℃で１時間遠心分離し、上清をチャレンジのために用いた。材料は２．１２×１０６のＨＥＶ  ＲＮＡコピー／ｍｌを含有した。ＩＭ注射のため、この上清を１０，０００×ｇ、４℃で１時間、再度遠心分離し、続いて０．２２μＭフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上でろ過して注射した。この材料は１．２２×１０６のＨＥＶ  ＲＮＡコピー／ｍｌを含有した。用いたＨＥＶ陽性材料は遺伝子型が３ｉ型のＨＥＶを含有しており、これはウイルスヌクレオチド配列のＲＮＡ配列解析に基づいて決定した。ウイルスはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＫＣ６１８４０３．１と最も高い相同性を示した。群３のブタは接触の見張り（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）を務めた。
【００８８】
実験的チャレンジ後の糞便を介したＨＥＶの排出は、直腸スワブのｑ−ＲＴ−ＰＣＲ解析により週に２回モニターした（１２〜１７週齢）。血清中のウイルスの存在は、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ解析により毎週モニターした（１３〜１７週齢）。１７週齢時に剖検を実施した。群２の動物を除いて、剖検時に胆汁および血液を収集した。直腸スワブ、胆汁および血清中においてＨＥＶウイルスの存在を、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ（実施例５）を用いて解析した。
【００８９】
ＨＥＶへの抗体レベルを、実施例４中に記載されるように血清中で決定した。図４はＥＬＩＳＡの結果を示す。３週齢の仔ブタのワクチン接種は、ワクチン接種を受けた動物においてＨＥＶ特異抗体での抗体陽転を誘導し、これは７週齢以降から検出可能であった。群２および３は、１１週齢において、群２の実験的チャレンジの前の移行抗体の消失が原因で、抗体力価の下落を示した。群２の動物のチャレンジは、１３から１４週齢の間にこの群においてＨＥＶ特異抗体の誘導をもたらし、また見張り群３も、実験的チャレンジを受けたブタとの直接的な接触が原因であるＨＥＶ感染の結果として抗体陽転した。見張り群は１５から１６週齢の間に抗体力価を発達させたが、これは実験的チャレンジ群２と比べて約２週間の遅れであり、この期間はウイルスの潜伏期間に相当する。ワクチン接種を受けた群１は、実験的チャレンジを受けたブタ（群２）を介してＨＥＶへの曝露に反応し、１４から１５週の間にＨＥＶ特異抗体の力価が増加した。
【００９０】
群２の実験的チャレンジの成功および群３の見張りブタの感染は、実験動物の胆汁および血清に対してｑ−ＲＴ−ＰＣＲ解析を実施することにより確認された（表Ａ）。実験的チャレンジを受けたブタ４頭のうち３頭、および見張りブタ４頭のうち４頭が、血清または胆汁中に検出可能なレベルのＨＥＶを示した。ワクチン接種を受けたブタのいずれも、血清または胆汁中に検出可能なレベルのＨＥＶを持たなかった。また、直腸スワブをｑ−ＲＴ−ＰＣＲ解析により解析し、これを表Ｂ中に示す。
【００９１】
本実験は、最終フェーズの間にＨＥＶがブタに感染する現場の状況を模倣するようにセットアップした。ワクチン接種は血液および胆汁におけるウイルス血症からブタを保護したが（チャレンジを受けた動物、見張り動物）、これは、ワクチン接種を受けたブタはＨＥＶが全身感染しないことを指し示す。さらに、ＨＥＶワクチン接種を受けたブタは、ウイルスへの曝露に反応して血清抗体レベルが増加する。糞便中のＨＥＶ排出は、同じ囲いの中の見張りブタと比べてワクチン接種を受けたブタにおいて低減する。
【００９２】
より詳細には、表Ｂ中でわかることは、ワクチン接種を受けたブタは、見張りブタに対して、１３、１４および１５週時の糞便排出が実質的に低減されることである（糞便中に存在するＨＥＶ  ＤＮＡ材料が１０〜５０倍少ない量である）。１６週前後で、排出は、低レベルで安定化したように見えるが、これは、ワクチン接種を受けた動物並びに対照動物と本質的に同じである。ワクチン接種を受けた動物はＨＥＶの全身感染を全く示さないことから（表Ａを参照されたい）、これは、ＨＥＶ感染糞便を仔ブタが食べたことが原因で排出されるウイルスであるに違いない。明白に、１５週後に達した排出レベルは感染糞便を食べたことが原因であり、動物が実際に感染したことが原因ではない。要するに、表Ａのデータを表Ｂのデータと合わせると、本ワクチンを使用することで、抗ＨＥＶ  ＭＤＡ陽性仔ブタのＨＥＶ糞便排出を、とりわけ動物自身の感染の結果である糞便排出を防ぐことができることは明らかである。
【００９３】
表Ａ：ワクチン接種−チャレンジ調査における様々な時点での血清および胆汁のｑ−ＲＴ−ＰＣＲ解析（ＲＮＡコピー／ｍｌ）
【表２】
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【００９４】
表Ｂ：ワクチン接種−チャレンジ調査における様々な時点での直腸スワブのｑ−ＲＴ−ＰＣＲ解析（ＲＮＡコピー／ｍｌ）
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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