(57)【要約】  本発明は、難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤のインビトロ放出試験方法、難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の評価方法、及び難水溶性薬物を含む高分子ミセル組成物に関する。
2019527351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤のインビトロ放出試験方法であって、
１）順次希釈された前記難水溶性薬物の有機溶液をアルブミン含有水性媒体に加え、そこから沈殿した難水溶性薬物とアルブミンを除去して、標準溶液を製造する工程；
２）前記難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の水溶液をアルブミン含有水性媒体に加えて放出溶液を製造し、そこから沈殿した難水溶性薬物とアルブミンを除去して、検液を製造する工程；
３）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、前記工程１）の標準溶液と前記工程２）の検液をそれぞれ分析する工程；及び、
４）下式（１）により難水溶性薬物の放出率（％）を求める工程；
を含み、
前記高分子ミセル製剤は、難水溶性薬物が親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）とを含む両親媒性ブロック共重合体から形成された高分子ミセル中に封入されているインビトロ放出試験方法：
難水溶性薬物の放出率（％）＝難水溶性薬物の沈殿率（％）＝（初期検液中の難水溶性薬物の濃度−時間ｔにおける検液中の難水溶性薬物の濃度）／初期検液中の難水溶性薬物の濃度×１００＝（Ａ0−Ａt）／Ａ0×１００      （１）
Ａ0＝初期検液の難水溶性薬物のピーク面積／標準溶液の難水溶性薬物のピーク面積×標準溶液中の難水溶性薬物の濃度×希釈倍数×放出溶液の体積、
Ａt＝時間ｔにおける検液中の難水溶性薬物のピーク面積／標準溶液の難水溶性薬物のピーク面積×標準溶液中の難水溶性薬物の濃度×希釈倍数×放出溶液の体積。
【請求項２】
前記工程１）及び前記工程２）のアルブミン含有水性媒体が、アルブミンを０％超２０％以下の濃度で含有する脱イオン水又は緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程１）及び前記工程２）において、沈殿した前記難水溶性薬物をろ過により除去する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ろ過が、気孔径０．８μｍ以下のフィルターを用いて行われる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程１）及び前記工程２）において、前記アルブミンを有機溶媒の添加により沈殿させ、次いで遠心分離により除去する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程２）の放出溶液中の前記難水溶性薬物の初期濃度が、０．５ｍｇ／ｍＬ以上である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記工程３）において、高速液体クロマトグラフィーが、下記（ａ）及び（ｂ）の条件を利用する請求項１に記載の方法：
（ａ）粒径４μｍ以下のペンタフルオロフェニル多孔性粒子固定相；及び
（ｂ）内径５ｍｍ以下及び長さ５０ｍｍ以上のカラム。
【請求項８】
前記工程２）の前記難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の水溶液が、凍結乾燥製剤を水溶液で再構成することにより製造される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記親水性ブロック（Ａ）が、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール及びポリアクリルアミドよりなる群から選ばれ、
前記疎水性ブロック（Ｂ）が、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリジオキサン−２−オン、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコリド、ポリ乳酸−ｃｏ−カプロラクトン、ポリ乳酸−ｃｏ−ジオキサン−２−オン及びポリグリコール酸−ｃｏ−カプロラクトン、及びそのカルボン酸末端が脂肪酸基で置換されたこれらの誘導体よりなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記難水溶性薬物が、抗癌剤である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗癌剤が、タキサン抗癌剤である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の評価方法であって、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法に従って前記難水溶性薬物の放出パターンを調査する段階；及び
得られた放出パターンから前記高分子ミセル製剤の品質又は効能を評価する段階；
を含み、
前記難水溶性薬物が、親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）を含む両親媒性ブロック共重合体から形成された高分子ミセル中に封入されている評価方法。
【請求項１３】
難水溶性薬物を含む高分子ミセル組成物であって、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法に従って試験したとき、前記難水溶性薬物の前記放出率が３時間後に９０％以上であることを特徴とし、
前記難水溶性薬物が、親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）を含む両親媒性ブロック共重合体から形成された高分子ミセル中に封入されている高分子ミセル組成物。
【請求項１４】
前記難水溶性薬物の前記放出率が、１時間後に１０％以上であり、３時間後に９０％以上であることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記難水溶性薬物の前記放出率が、１時間後に１０％以上３０％以下であり、３時間後に９０％以上であることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記難水溶性薬物の前記放出率が、１時間後に１０％以上３０％以下であり、１．２５時間後に３０％超７０％以下であり、３時間後に９０％以上であることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤のインビトロ放出試験方法、難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の評価方法、及び難水溶性薬物を含む高分子ミセル組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
難水溶性薬物の放出試験方法は、生体関連性（ｂｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ）があり、投薬形態からのインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）薬物放出と同じメカニズムによるインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）薬物放出を測定できなければならない。この方法はまた、「良い」バッチと「悪い」バッチとを区別する必要がある。即ち、インビトロ放出試験方法は、薬物放出に影響を及ぼし得る製品の変化を検出できなければならない。
【０００３】
ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）からのインビトロ放出の測定に適した装置の開発が注目されている。しかし、放出媒体の選択及び撹拌などの見逃せないさらなる要因が存在する。胃腸管のｐＨとほぼ同じ経口投与形態の放出媒体とは対照的に、ミセル投与形態のための放出媒体の選択は、投与部位ならびに作用部位に応じて変わるので、インビボ条件のシミュレーションは容易ではない。一般に、放出媒体は、薬物の溶解度及び安定性、分析の敏感度及び使用される方法に応じて選ばれる。シンク条件（ｓｉｎｋ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を維持するこが好ましいにも関わらず、非シンク条件が採用されてきた。また、撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）は、インビトロ放出試験中に分散相の凝集を防ぐために頻繁に行われる重要な工程条件である。しかし、撹拌により生じる動力学的条件は使用する装置に依存する。さらに、サンプリング及び緩衝液の（全体又は部分的な）交換技術は、使用するインビトロ法の種類に応じて選択されている。
【０００４】
従って、インビボ条件を再現することができ、薬物放出に影響を及ぼし得る製品品質の差を検出することができる、ミセル製剤からの難水溶性薬物のインビトロ放出試験及び品質評価の新規な方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的はインビボ放出メカニズムを反映し、薬物製品の品質を評価できる、難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤のインビトロ放出試験の方法を提供することである。
【０００６】
しかし、本発明が解決しようとする課題は、前述したものに限定されない。本明細書で述べられる他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１態様は、難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤のインビトロ放出試験方法であって、１）順次希釈された難水溶性薬物の有機溶液をアルブミン含有水性媒体に加え、そこから沈殿した難水溶性薬物とアルブミンを除去して標準溶液を製造する工程；２）難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の水溶液をアルブミン含有水性媒体に加えて放出溶液を製造し、そこから沈殿した難水溶性薬物とアルブミンを除去して検液を製造する工程；３）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、工程１）の標準溶液と工程２）の検液をそれぞれ分析する工程；及び、４）下式（１）により難水溶性薬物の放出率（％）を求める工程；を含み、前記高分子ミセル製剤は、難水溶性薬物が親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）とを含む両親媒性ブロック共重合体から形成された高分子ミセル中に封入されているインビトロ放出試験方法を提供することができる：
【０００８】
難水溶性薬物の放出率（％）＝難水溶性薬物の沈殿率（％）＝（初期検液中の難水溶性薬物の濃度−時間ｔにおける検液中の難水溶性薬物の濃度）／初期検液中の難水溶性薬物の濃度×１００＝（Ａ0−Ａt）／Ａ0×１００      （１）
Ａ0＝初期検液の難水溶性薬物のピーク面積／標準溶液の難水溶性薬物のピーク面積×標準溶液中の難水溶性薬物の濃度×希釈倍数×放出溶液の体積、
Ａt＝時間ｔにおける検液の難水溶性薬物のピーク面積／標準溶液の難水溶性薬物のピーク面積×標準溶液中の難水溶性薬物の濃度×希釈倍数×放出溶液の体積。
【０００９】
本発明の第２態様は、難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の評価方法であって、本発明の第１態様による方法に従って難水溶性薬物の放出パターンを調査する段階；得られた放出パターンから高分子ミセル製剤の品質又は効能を評価する段階；を含み、難水溶性薬物が親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）を含む両親媒性ブロック共重合体から形成された高分子ミセル中に封入されている評価方法を提供することができる。
【００１０】
本発明の第３態様は、難水溶性薬物を含む高分子ミセル組成物であって、本発明の第１態様に従って試験したとき、難水溶性薬物の放出率が３時間後に９０％以上であることを特徴とし、水溶性薬物が、親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）を含む両親媒性ブロック共重合体から形成された高分子ミセル中に封入されている高分子ミセル組成物を提供することができる。
【００１１】
上記課題を解決するための上記技術的手段は例示に過ぎず、本発明を制限するものと解釈してはならない。前述の例示的な実施形態に加えて、下記図面及び発明の詳細な説明に記載されたさらなる実施形態及び実施例があり得る。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の放出試験法を提供することができる。本発明の方法は、難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の品質及び性能の指標として使用することができ、また、インビボ条件を再現し、放出メカニズム及びインビトロ−インビボ相関関係（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ，  ＩＶＩＶＣ）を確立するためにも使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】各濃度のｍＰＥＧ−ＰＬＡ高分子溶液中の震とう時間に対するパクリタキセルの濃度を示したグラフである。
【図２】２５℃及び３７℃のｍＰＥＧ−ＰＬＡ高分子溶液中の震とう時間に対するパクリタキセルの濃度を示したグラフである。
【図３ａ】脱イオン水及び４％アルブミンリン酸緩衝液中の共重合体の濃度に対するパクリタキセルの過飽和溶解度を示したグラフである。
【図３ｂ】脱イオン水及び４％アルブミンリン酸緩衝液中の共重合体の濃度に対するパクリタキセルの固有溶解度を示したグラフである。
【図４】パクリタキセルが過飽和である高分子ミセルの動力学的安定度を示したグラフである。
【図５】３７℃、４％アルブミンリン酸緩衝液中のＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭのパクリタキセル沈殿を示したグラフである。
【図６】パクリタキセル標準溶液の検量線を示したグラフである。
【図７】沈殿法を用いて、各パクリタキセルの濃度において、３７℃、４％アルブミンリン酸緩衝液中のＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭのパクリタキセル放出挙動を示したグラフである。
【図８】Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭ放出試験の再現性確認試験のための３７℃、４％アルブミンリン酸緩衝液中のパクリタキセル放出挙動を示したグラフである。
【図９】各ロット番号において、３７℃、４％アルブミンリン酸緩衝液中のＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭのパクリタキセル放出挙動を示したグラフである。
【図１０】Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭ不良バッチ（５０：５００）と正常バッチ（１００：５００、ＧＰ１１５１１）の３７℃、４％アルブミンリン酸緩衝液中のパクリタキセル放出挙動を示したグラフである。
【図１１】Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭのインビボパクリタキセル放出メカニズムを示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤のインビトロ放出試験方法、難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の評価方法、及び難水溶性薬物を含む高分子ミセル組成物に対し具現例及び実施例と図面を参照して具体的に説明する。しかし、本発明がこのような具現例及び実施例と図面に制限されるのではない。
【００１５】
本発明の第１態様は、難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤のインビトロ放出試験方法であって、１）順次希釈された難水溶性薬物の有機溶液をアルブミン含有水性媒体に加え、そこから沈殿した難水溶性薬物とアルブミンを除去して標準溶液を製造する工程；２）難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の水溶液をアルブミン含有水性媒体に加えて放出溶液を製造し、そこから沈殿した難水溶性薬物とアルブミンを除去して検液を製造する工程；３）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、工程１）の標準溶液と工程２）の検液をそれぞれ分析する工程；及び、４）下式（１）により難水溶性薬物の放出率（％）を求める工程；を含み、前記高分子ミセル製剤は、難水溶性薬物が親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）とを含む両親媒性ブロック共重合体から形成された高分子ミセル中に封入されているインビトロ放出試験方法を提供することができる：
【００１６】
難水溶性薬物の放出率（％）＝難水溶性薬物の沈殿率（％）＝（初期検液中の難水溶性薬物の濃度−時間ｔにおける検液中の難水溶性薬物の濃度）／初期検液中の難水溶性薬物の濃度×１００＝（Ａ0−Ａt）／Ａ0×１００      （１）
Ａ0＝初期検液の難水溶性薬物のピーク面積／標準溶液の難水溶性薬物のピーク面積×標準溶液中の難水溶性薬物の濃度×希釈倍数×放出溶液の体積、
Ａt＝時間ｔにおける検液の難水溶性薬物のピーク面積／標準溶液の難水溶性薬物のピーク面積×標準溶液中の難水溶性薬物の濃度×希釈倍数×放出溶液の体積。
【００１７】
例えば、前記両親媒性ブロック共重合体の親水性ブロックの含量は、共重合体全重量に対して、約２０〜９５重量％、又は約４０〜９５重量％であってもよいが、それに限定されない。また、両親媒性ブロック共重合体の疎水性ブロックの含量は、共重合体全重量に対して、約５〜８０重量％、又は約５〜６０重量％であってもよいが、それに限定されない。
【００１８】
例えば、前記両親媒性ブロック共重合体の数平均分子量は、１，０００〜５０，０００ダルトンであってもよく、より具体的には、１，５００〜２０，０００ダルトンであってもよいが、それに限定されない。前記高分子ミセルは、本発明が属する技術分野において通常用いられる方法により形成され得る。
【００１９】
例えば、前記有機溶液は、水混和性有機溶媒、例えば、アルコール、アセトン、テトラヒドロフラン、酢酸、アセトニトリル及びジオキサン及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる有機溶媒を含んでもよいが、それに限定されない。また、前記水溶液は通常の水、脱イオン水、注射用蒸溜水、生理食塩水、グルコース溶液（例えば、５％グルコース溶液）、緩衝液及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれるいずれかを含んでもよいが、それに限定されない。
【００２０】
前記難水溶性薬物は、水への溶解度（２５℃）が、１００ｍｇ／ｍＬ以下の薬物から選ぶことができ、例えば、抗癌剤（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、抗真菌剤（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｇｅｎｔｓ）、免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔｓ）、麻酔剤（ａｎａｌｇｅｓｉｃｓ）、消炎鎮痛剤（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ）、抗ウイルス剤（ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔｓ）、鎮静剤（ａｎｘｉｏｌｙｔｉｃ  ｓｅｄａｔｉｖｅｓ）、造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、コルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、診断薬（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、診断造影剤（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、利尿剤（ｄｉｕｒｅｔｉｃｓ）、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ）、放射性医薬品（ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）を含む性ホルモン剤（ｓｅｘ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ）とそれらの組み合わせより選ばれてもよいが、それに限定されない。
【００２１】
本発明の一実施形態によれば、工程１）及び工程２）のアルブミン含有水性媒体が、アルブミンを約０％超２０％以下の濃度で含有する脱イオン水又は緩衝液であってもよいが、それに限定されない。例えば、前記アルブミン含有水性媒体が、アルブミンを約１〜１０％（ｗ／ｖ）、約１〜５％（ｗ／ｖ）又は約４％（ｗ／ｖ）含有してもよいが、それに限定されない。
【００２２】
本発明の一実施形態によれば、工程１）及び工程２）において、沈殿した難水溶性薬物をろ過により除去してもよいが、それに限定されない。
【００２３】
本発明の一実施形態によれば、ろ過を気孔径約０．８μｍ以下のフィルターを使用して行ってもよいが、それに限定されない。例えば、ろ過は、気孔径約０．１μｍ以上０．８μｍ未満、約０．２μｍ以上０．８μｍ未満、又は約０．２μｍ以上０．５μｍ未満のフィルターを用いて行ってもよいが、それに限定されない。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、工程１）及び工程２）において、アルブミンを有機溶媒の添加により沈殿させ、遠心分離により除去してもよいが、それに限定されない。
【００２５】
本発明の一実施形態によれば、工程２）における放出溶液における難水溶性薬物の初期濃度が、約０．５ｍｇ／ｍＬ以上、例えば、０．５ｍｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよいが、それに限定されない。
【００２６】
本発明の一実施形態によれば、工程３）の高速液体クロマトグラフィーは、好ましくは、下記（ａ）及び（ｂ）の条件を利用することができる。（ａ）粒径４μｍ以下のペンタフルオロフェニル多孔性粒子固定相；及び（ｂ）内径５ｍｍ以下及び長さ５０ｍｍ以上のカラム。本発明において、工程３）の分析は、韓国公開特許第２０１７−００１４０５７号の開示に従って実施することができる。この場合、韓国公開特許第２０１７−００１４０５７号は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、工程２）の難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の水溶液は、凍結乾燥製剤を水溶液で再構成することにより製造されてもよいが、それに限定されない。
【００２８】
本発明の一実施形態によれば、親水性ブロック（Ａ）が、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール及びポリアクリルアミドよりなる群から選ばれ、疎水性ブロック（Ｂ）がポリラクチド、ポリグリコリド、ポリジオキサン−２−オン、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコリド、ポリ乳酸−ｃｏ−カプロラクトン、ポリ乳酸−ｃｏ−ジオキサン−２−オン及びポリグリコール酸−ｃｏ−カプロラクトン及びそのカルボン酸末端が脂肪酸基で置換されたそれらの誘導体よりなる群から選ばれてもよいが、それに限定されない。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、難水溶性薬物が抗癌剤であってもよいが、それに限定されない。
【００３０】
本発明の一実施形態によれば、抗癌剤が、タキサン抗癌剤であってもよいが、それに限定されない。例えば、前記タキサン抗癌剤としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、７−エピパクリタキセル（７−ｅｐｉｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ｔ−アセチルパクリタキセル（ｔ−ａｃｅｔｙｌｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、１０−デスアセチルパクリタキセル（１０−ｄｅｓａｃｅｔｙｌｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、１０−デスアセチル−７−エピパクリタキセル（１０−ｄｅｓａｃｅｔｙｌ−７−ｅｐｉｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、７−キシロシルパクリタキセル（７−ｘｙｌｏｓｙｌｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、１０−デスアセチル−７−グルタリルパクリタキセル（１０−ｄｅｓａｃｅｔｙｌ−７−ｇｌｕｔａｒｙｌｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、７−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシルパクリタキセル（７−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｙｌｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、７−Ｌ−アラニルパクリタキセル（７−Ｌ−ａｌａｎｙｌｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）及びカバジタキセルよりなる群から選ばれる１種以上であってもよく、より具体的には、パクリタキセルであってもよいが、それに限定されない。
【００３１】
本発明の第２態様は、難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の評価方法であって、本発明の第１態様による方法に従って難水溶性薬物の放出パターンを調査する段階；得られた放出パターンから高分子ミセル製剤の品質又は効能を評価する段階；を含み、難水溶性薬物が、親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）を含む両親媒性ブロック共重合体から形成された高分子ミセル中に封入されている評価方法を提供することができる。
【００３２】
例えば、前記難水溶性薬物を含む高分子ミセル製剤の評価方法によれば、難水溶性薬物の放出率が、１時間後に１０％以上であり、３時間後に９０％以上である場合に、好ましい品質を有すると評価することができるが、それに限定されない。例えば、難水溶性薬物の放出率が１時間後に１０％以上３０％以下であり、３時間後に９０％以上である場合に、難水溶性薬物高分子ミセル製剤が好ましい品質を有すると評価することができ、又は難水溶性薬物の放出率が、１時間後に１０％以上３０％以下であり、１．２５時間後に３０％超７０％以下であり、３時間後に９０％以上である場合に、難水溶性薬物高分子ミセル製剤が好ましい品質を有すると評価することができるが、それに限定されない。
【００３３】
本発明の第３態様は、難水溶性薬物を含む高分子ミセル組成物であって、本発明の第１態様による方法に従って試験するとき、難水溶性薬物の放出率が３時間後に９０％以上であることを特徴とし、難水溶性薬物が、親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）を含む両親媒性ブロック共重合体から形成された高分子ミセル中に封入されている高分子ミセル組成物を提供することができる。
【００３４】
本発明の一実施形態によれば、前記組成物は、難水溶性薬物の放出率が、１時間後に１０％以上であり、３時間後に９０％以上であり、例えば、９０％以上９９．５％以下であってもよいが、それに限定されない。
【００３５】
本発明の一実施形態によれば、前記組成物は、難水溶性薬物の放出率が、１時間後に１０％以上３０％以下であり、３時間後に９０％以上、例えば、９０％以上９９．５％以下であってもよいが、それに限定されない。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、前記組成物は、難水溶性薬物の放出率が、１時間後に１０％以上３０％以下であり、１．２５時間後に３０％超７０％以下であり、３時間後に９０％以上であり、例えば、９０％以上９９．５％以下であってもよいが、それに限定されない。
【００３７】
本発明は、以下の実施例によってより詳細に説明される。しかし、これらの実施例は本発明を例示することのみを目的としており、本発明の範囲はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
薬物製品
【００３９】
注射投与のためのＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭは、パクリタキセル（ＰＴＸ）を溶解する高分子ミセルを形成するための低分子量で両親媒性のジブロック共重合体を利用する剤形である。注射投与のための１００ｍｇ  Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭの各バイアルは、下記表１に示す成分を含む。
【００４０】
【表１】
2019527351.tif 000003
【００４１】
インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）放出実験方法
１．試薬及び材料
パクリタキセル標準品：ＬｏｔＧ４７９（Ｓａｍｙａｎｇ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ社製）
−ｍＰＥＧ−ＰＤＬＬＡ：ｌｏｔ  ＰＭ１４０３（Ｓａｍｙａｎｇ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ社製）
−Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭ：ロット番号（Ｌｏｔ）ＧＰ１１５１１、ＧＰ１１４Ａ１、ＧＰ１１４Ｂ１、ＧＰ１１４Ｃ１（Ｓａｍｙａｎｇ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ社製）
−２０％ヒト血清アルブミン１００ｍＬ：Ｌｏｔ  １６１Ｄ１４２４０（Ｇｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓ社製）
−０．９％生理食塩水（ＣＪ  Ｃｈｅｉｌ  Ｊｅｄａｎｇ社製）
−アセトニトリル（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ社製、ＡＣＳ／ＨＰＬＣ  Ｇｒａｄｅ）
【００４２】
２．機器及び装備
−震とう恒温水槽：Ｍａｘｔｕｒｄｙ  ３０、ＤＡＩＨＡＮ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
−振盪培養器：Ｖｉｓｉｏｎ  Ｓｃｉ．  Ｃｏ．製
−高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：ＨＰ１２００シリーズ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製
−遠心分離機：Ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｐｌｕｓ，  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製
【００４３】
３．共重合体溶液中のパクリタキセルの溶解度の測定
１）ｍＰＥＧ−ＰＤＬＬＡ共重合体を含有する脱イオン水溶液中のパクリタキセルの溶解度
−機器：振盪培養器（Ｖｉｓｉｏｎ  Ｓｃｉ．Ｃｏ製）
−媒体：脱イオン水
【００４４】
−共重合体溶液の製造
５ｇのｍＰＥＧ−ＰＤＬＬＡ共重合体を５０ｍＬの脱イオン水（１００．０ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。この共重合体水溶液を脱イオン水で順次希釈して、２．５、５、１０、２５、５０、１００ｍｇ／ｍＬ溶液を製造した。
【００４５】
−共重合体溶液へのパクリタキセルの添加
１００ｍｇの非結晶パクリタキセルを２０ｍＬのｍＰＥＧ−ＰＤＬＬＡ共重合体水溶液に添加した。パクリタキセルと高分子の懸濁液を震とう恒温水浴に入れ、２５℃又は３７℃で、２００ｒｐｍで震とうした。
【００４６】
−サンプリング
各サンプリング時間（０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４時間）ごとに１ｍＬの懸濁液を採取し、０．４５μｍメンブランフィルターでろ過した。ろ液０．６ｍＬとアセトニトリル０．６ｍＬとを混合した。この混合溶液をＨＰＬＣで分析した。
【００４７】
−分析
パクリタキセルの濃度は、ＨＰＬＣを用いて分析し、下式（２）により算出した。
ａ＝（パクリタキセルピーク面積−ｙ切片）／勾配×１００（ｍｇ）    （２）
勾配は、標準溶液の検量線から計算した（２．５、５、２５、５０、２５０、５００μｇ／ｍＬ）
【００４８】
［ＨＰＬＣ］
−カラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＰＦＰ  カラム（２．７μｍ、４．６×１５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製、米国）
−検出器：ＵＶ（λ＝２２７ｎｍ）
−流速：０．６ｍＬ／分
−注入量：１０μＬ
−カラム温度：２５℃
−移動相：
０〜２５分：水／アセトニトリル＝６５／３５（ｖ／ｖ）→４５／５５（ｖ／ｖ）
２５〜２８分：水／アセトニトリル＝４５／５５（ｖ／ｖ）
２５〜３０分：水／アセトニトリル＝４５／５５（ｖ／ｖ）→６５／３５（ｖ／ｖ）
３０〜３５分：水／アセトニトリル＝６５／３５（ｖ／ｖ）
【００４９】
２）ｍＰＥＧ−ＰＤＬＬＡ共重合体を含有する４％アルブミンリン酸緩衝液中のパクリタキセルの溶解度
−機器：振盪培養器：Ｖｉｓｉｏｎ  Ｓｃｉ．  Ｃｏ．製
−媒体：４％アルブミンリン酸緩衝液
【００５０】
−共重合体溶液の製造
５ｇのｍＰＥＧ−ＰＤＬＬＡ共重合体を５０ｍＬの４％アルブミン緩衝液（１００．０ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。共重合体溶液を４％アルブミンリン酸緩衝液で順次希釈して、２．５、５、１０、２５、５０、１００ｍｇ／ｍＬ溶液を製造した。
【００５１】
−共重合体溶液へのパクリタキセルの添加
１００ｍｇの非結晶パクリタキセルを２０ｍＬのｍＰＥＧ−ＰＤＬＬＡ共重合体溶液に添加した。パクリタキセルと高分子懸濁液を震とう恒温水槽に入れ、２５℃又は３７℃で、２００ｒｐｍで震とうした。
【００５２】
−サンプリング
各サンプリング時間（０、1,２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４時間）ごとに１ｍＬの懸濁液を採取し、０．４５μｍメンブランフィルターでろ過した。ろ液０．２ｍＬとアセトニトリル０．８ｍＬとを混合し、アルブミンを沈殿させた。この混合溶液を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．５ｍＬの上清を採取して０．５ｍＬの８０％アセトニトリル水溶液と混合した。この容器を検液とした。
【００５３】
−標準溶液の製造
１２．５ｍｇのパクリタキセルを正確に秤量し、１００ｍＬのメスフラスコに入れ、アセトニトリルを添加することによってパクリタキセルを溶解した（１２５μｇ／ｍＬ）。この溶液をアセトニトリルで順次希釈して、標準原液（６２．５、１２．５、６．２５、１．２５、０．６２５μｇ／ｍＬ）を製造した。各標準原液０．８ｍＬを４％アルブミンリン酸緩衝液０．２ｍＬと混合して、アルブミンを沈殿させた。この混合溶液を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した、０．５ｍＬの上清を採取して０．５ｍＬの８０％アセトニトリル水溶液と混合した。この溶液を標準溶液として使用した（１００、５０、１０、５、１、０．５μｇ／ｍＬ）。
【００５４】
【表２】
2019527351.tif 000004
【００５５】
−分析
パクリタキセルの濃度を、ＨＰＬＣを用いて分析し、下式（２）により算出した。
ａ＝（パクリタキセルピーク面積−ｙ切片）／勾配×１００（ｍｇ）    （２）
勾配は、標準溶液の検量線から計算した（２．５、５、２５、５０、２５０、５００μｇ／ｍＬ）
【００５６】
４．アルブミン溶液中のＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭからのパクリタキセル放出試験
−機器：震とう恒温水槽：Ｍａｘｔｕｒｄｙ  ３０，  ＤＡＩＨＡＮ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
−媒体：４％アルブミンリン酸緩衝液
−薬物の濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ
【００５７】
−４％アルブミンリン酸緩衝液中のパクリタキセルの放出
Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭ  １００ｍｇバイアルを２０ｍＬの生理食塩水で再構成して、５．０ｍｇ／ｍＬの溶液を製造した。４ｍＬの溶液を取り、３７℃、１６ｍＬの４％アルブミンリン酸緩衝液に添加した。この溶液を３７℃、２００ｒｐｍで震とうした。
【００５８】
−サンプリング
前記溶液１ｍＬを各サンプリング時間（０、０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．５、３、３．５、４、５、２４時間）ごとに採取し、０．４５μｍのＰＶＤＦ注射器フィルターでろ過した。次に、ろ液０．２ｍＬを採取し、アセトニトリル０．８ｍＬと混合した。この混合溶液を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．５ｍＬの上清を採取して０．５ｍＬの８０％アセトニトリル水溶液と混合した。この溶液をＨＰＬＣ分析のための検液とした。
【００５９】
−標準溶液の調剤
３．２）の方法と同様に製造した。
【００６０】
−分析
３．１）の方法と同様に、ＨＰＬＣを利用してパクリタキセルの濃度を分析した。
【００６１】
５．Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭの放出実験
−放出溶液の製造
Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭ  １００ｍｇバイアルを生理食塩水２０ｍＬで再構成して、５．０ｍｇ／ｍＬの溶液を製造した。この溶液４ｍＬを採取し、３７℃、４％アルブミンリン酸緩衝液１６ｍＬに添加した。得られた溶液を３７℃、２００ｒｐｍで震とうし、放出溶液とした。
【００６２】
−放出
放出溶液を震とう恒温水槽中、３７℃、２００ｒｐｍで震とうした。
【００６３】
−サンプリング
前記溶液１ｍＬを各サンプリング時間（０、０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．５、３、３．５、４、５、２４時間）ごとに採取し、０．４５μｍのＰＶＤＦ注射器フィルターでろ過した。次に、ろ液０．２ｍＬを採取し、アセトニトリル０．８ｍＬと混合した。この混合溶液を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．５ｍＬの上清を採取して０．５ｍＬの８０％アセトニトリル水溶液と混合した。この溶液をＨＰＬＣ分析のための検液とした。
【００６４】
−ＨＰＬＣ
１）標準溶液の製造
パクリタキセル１２．５ｍｇを正確に秤量して１００ｍＬのメスフラスコに入れ、アセトニトリルを添加することによって溶解した（１２５μｇ／ｍＬ）。この溶液をアセトニトリルで順次希釈して標準原液（６２．５、１２．５、６．２５、１．２５、０．６２５μｇ／ｍＬ）を製造した。０．８ｍＬの各標準原液を４％アルブミンリン酸緩衝液０．２ｍＬと混合して、アルブミンを沈殿させた。この混合溶液を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．５ｍＬの上清を採取して８０％アセトニトリル水溶液０．５ｍＬを混合した。この溶液を標準溶液とした（１００、５０、１０、５、１、０．５μｇ／ｍＬ）。
【００６５】
２）初期検液の製造
Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭ  １００ｍｇバイアルを２０ｍＬの生理食塩水で再構成した。生成溶液４ｍＬを採取し、３７℃、４％アルブミンリン酸緩衝液１６ｍＬに添加した。１ｍＬの溶液を０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターでろ過した。ろ液０．２ｍＬに０．８ｍＬのアセトニトリルを添加して、アルブミンを沈殿させた。この溶液を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．５ｍＬの上清を採取して８０％アセトニトリル水溶液０．５ｍＬと混合した。この溶液を初期検液として使用した。
【００６６】
下記条件のＨＰＬＣに標準溶液と検液を注入した。パクリタキセル放出量は、検液と標準溶液の各パクリタキセルのピーク面積に基づいて計算した。
[ＨＰＬＣ]
−カラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＰＦＰ  カラム（２．７μｍ、４．６×１５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製、米国)
−検出器：ＵＶ（λ＝２２７ｎｍ）
−流速：０．６ｍＬ／分
−注入量：１０μＬ
−カラム温度：２５℃
−移動相
０〜２５分：水／アセトニトリル＝６５／３５（ｖ／ｖ）→４５／５５（ｖ／ｖ）
２５〜２８分：水／アセトニトリル＝４５／５５（ｖ／ｖ）
２５〜３０分：水／アセトニトリル＝４５／５５（ｖ／ｖ）→６５／３５（ｖ／ｖ）
３０〜３５分：水／アセトニトリル＝６５／３５（ｖ／ｖ）
【００６７】
−計算
パクリタキセル放出（％）＝沈殿したパクリタキセル（％）＝（初期検液中のパクリタキセルの濃度−各サンプリング時間（ｔ）における検液中のパクリタキセルの濃度）／初期検液中のパクリタキセルの濃度×１００＝（Ａ0−Ａt）／Ａ0×１００      （１）
−Ａ0＝初期検液のパクリタキセルのピーク面積／標準溶液のパクリタキセルのピーク面積×標準溶液中のパクリタキセルの濃度×１０×２０
−Ａt＝時間ｔにおける検液のパクリタキセルのピーク面積／標準溶液のパクリタキセルのピーク面積×標準溶液中のパクリタキセルの濃度×１０×２０
検液（Ａt）中のパクリタキセルの濃度は、４％アルブミンリン酸緩衝液中の固有溶解度とミセルから放出されないパクリタキセルの量の合計に等しい。
【００６８】
結果及び考察
１．高分子溶液中のパクリタキセルの溶解度
１）各濃度の高分子溶液中のパクリタキセルの濃度の経時変化
パクリタキセルの溶解度は、脱イオン水と４％アルブミンリン酸緩衝液を用いて評価した。過量の非結晶パクリタキセルを様々な濃度の高分子溶液に加えると、非結晶パクリタキセルは、高分子ミセルに自然に溶解し、一定時間で高分子溶液に過飽和となる。図１及び表３に、様々な濃度のｍＰＥＧ−ＰＬＡ高分子溶液中のパクリタキセルの濃度の経時変化を示す。図１及び表３に示すように、パクリタキセルの濃度は、ある期間過飽和状態を維持した後、過飽和濃度から固有溶解度まで減少した。パクリタキセルの濃度が過飽和濃度から固有溶解度まで減少する理由は、一時的に高分子ミセルに捕捉されていた非結晶パクリタキセルが溶解度の低い二水和物の形態になるからである。
【００６９】
【表３】
2019527351.tif 000005
【００７０】
温度によってパクリタキセルの濃度の経時変化は異なった。図２及び表４に、２５℃と３７℃におけるｍＰＥＧ−ＰＬＡ高分子容液中のパクリタキセルの濃度の経時変化を示す。図２及び表４から分かるように、パクリタキセルの過飽和溶解度は、２５℃よりも３７℃において高かった一方、固有溶解度は２５℃よりも３７℃において低かった。
【００７１】
また、過飽和持続時間は、２５℃より３７℃で短かった。これは、非結晶パクリタキセルは温度が高いほど高分子ミセルに迅速に溶解する一方で、二水和物形態に容易に結晶化するためである。
【００７２】
【表４】
2019527351.tif 000006
【００７３】
２）高分子濃度に応じたパクリタキセルの溶解度
図３Ａ、図３Ｂ及び表５は、脱イオン水と４％アルブミンリン酸緩衝液中の高分子濃度に対するパクリタキセルの過飽和溶解度と固有溶解度（ｍＰＥＧ−ＰＬＡ２５ｍｇ／ｍＬ、３７℃）を示している。パクリタキセルの過飽和溶解度及び固有溶解度は、高分子の濃度が増加するにつれて線形的に増加した。２５ｍｇ／ｍＬ以上のｍＰＥＧ−ＰＬＡ高分子濃度では、脱イオン水と４％アルブミンリン酸緩衝液との間で、パクリタキセルの過飽和溶解度又は固有溶解度の有意差は観察できなかった。しかし、２５ｍｇ／ｍＬ以下の濃度のｍＰＥＧ−ＰＬＡ高分子では、パクリタキセルの過飽和溶解度及び固有溶解度は４％アルブミンリン酸緩衝液中においてより高かった（図３Ａ及び図３Ｂ）。
【００７４】
【表５】
2019527351.tif 000007
【００７５】
２．Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭ水溶液中のパクリタキセルの沈殿
ｍＰＥＧ−ＰＬＡ高分子ミセルは、低分子量界面活性剤ミセルよりも動力学的により安定であるため、疎水性薬物を過量含有することができる。低分子量界面活性剤ミセルの場合、過量の薬物は、水と接触すると簡単に沈殿するので、長時間過量の薬物を含まなければならない注射剤には適さない。
【００７６】
図４は、パクリタキセルが過飽和した高分子ミセルの動力学的安定度を示すグラフである。Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭは、高分子ミセル中に過量のパクリタキセルを有する。ミセル溶液は室温で長時間安定であるため、臨床において有用である。しかし、体温のような高温では動力学的に不安定になる。これは、パクリタキセルが高温で高分子ミセルから容易に放出され得ることを意味する。Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭ中のパクリタキセルは、一定量の水溶液にミセルから放出され結晶性パクリタキセル二水和物として沈殿する。これに関連して、図５及び表６は、３７℃、４％アルブミンリン酸緩衝液中のＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭからのパクリタキセル沈殿物を示す。このようなＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭの特性を考慮した結果、インビトロ放出試験法である沈殿法を開発することができた。体温では、脱イオン水と４％アルブミンリン酸緩衝液中のパクリタキセルの固有溶解度はゼロに近くなる（表６）。従って、沈殿法における沈殿量は、Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭから放出されるパクリタキセルの量とみなすことができる。実際に、Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭを含む４％アルブミンリン酸緩衝液中のパクリタキセル濃度は、２時間後に０．９ｍｇ／ｍＬから０．０８ｍｇ／ｍＬに減少した。パクリタキセルの９０及び９７％以上が、それぞれ２時間後及び６時間後に放出され、沈殿した。
【００７７】
【表６】
2019527351.tif 000008
【００７８】
３．Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭのインビトロ放出試験法の設定
１）生体関連媒体
Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭは、血液、血漿及び血清などの生物学的媒体中で利用されるが、そのような生物学的媒体は、インビトロ放出試験を行うのに十分な量を容易に入手できない。さらに、そのような種類の媒体で薬物を分析することは困難である。そのため、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）が生体関連媒体として使用されてきた。本実施例では、アルブミン含有リン酸緩衝液を、Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭのインビトロ放出試験法のための生体関連媒体として選択した。
【００７９】
２）生体関連媒体からのパクリタキセル沈殿物の分離
生体関連媒体からパクリタキセル沈殿物を分離するには２つの方法がある。一つは遠心分離法、もう一つはろ過法である。
【００８０】
遠心分離法では、適切な遠心分離力及び時間を選択することが容易ではない。表７は、遠心分離時間に対する２４時間後に３７℃、４％アルブミンリン酸緩衝液中のＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭから放出されたパクリタキセルの量を示す。表７から分かるように、遠心分離時間が長くなるにつれて、放出されたパクリタキセルの量が増加した。遠心分離中（５分以上）、パクリタキセルは連続的に沈殿したため、放出されたパクリタキセルの量は過大評価されているおそれがある。
【００８１】
一方でろ過法を使用すると、ろ過時間は１分未満である。従って、ろ過時間は実験の結果に影響を与えない。ろ過法では、Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭを含有する放出媒体のアリコートを各サンプリング時間ごとに採取し、ＰＶＤＦ注射器フィルターでろ過した。フィルターにより、沈殿したパクリタキセル（結晶化パクリタキセル）は除去され、ミセル中のパクリタキセルと、アルブミンが結合したパクリタキセルは、ろ液中に残される。ろ液は、純水に溶解したパクリタキセルを含んでいてもよいが、その量は微量であり無視できる。従って、ろ過法は、遠心分離法よりも信頼性が高い。
【００８２】
様々な気孔を有するフィルターを使用することができるので、フィルター気孔径に対する、３７℃、４％アルブミンリン酸緩衝液中の２４時間後にＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭから放出されたパクリタキセルの量を評価した（表８）。０．２２μｍのフィルターを使用したとき、ろ液中（未放出パクリタキセル及び無視できるアルブミン結合パクリタキセル）のパクリタキセル量は、０．４５μｍのフィルターが使用したときよりも少なかった。しかし、その差は、表８に示すようにごくわずかであった。
【００８３】
一方で、０．８μｍのフィルターを使用すると、比較的大きなサイズの沈殿したパクリタキセルがフィルター気孔を透過したため、パクリタキセルの量が、０．４５又は０．２２μｍのフィルターを使用したときよりも有意に多かった。従って、Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭのインビトロ放出試験法には、０．４５μｍのフィルターを使用した。
【００８４】
【表７】
2019527351.tif 000009
【００８５】
【表８】
2019527351.tif 000010
【００８６】
３）生体関連媒体中のパクリタキセルの分析
実証済みＨＰＬＣ分析法を使用して、生体関連媒体中のパクリタキセルの放出を定量した。ＨＰＬＣ分析の前に、Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭの放出媒体からアルブミンを除去するための前処理が必要であった。アルブミンを除去しないと、ＨＰＬＣ分析中にＨＰＬＣカラムが損傷するので、アルブミン除去は必須の前処理工程である。アセトニトリル及びメタノールなどの有機溶媒を添加することでタンパク質が変性（沈殿）することが報告されている。沈殿したアルブミンは、遠心分離又はろ過により除去することができる。本実施例では遠心分離を使用した。パクリタキセルとｍＰＥＧ−ＰＬＡ高分子の両方が、８０％アセトニトリル溶液に溶解するので、その中にミセルは存在しない。従って、アルブミンが除去された８０％アセトニトリル溶液は、パクリタキセル及び高分子のみを含む。
【００８７】
実証済みＨＰＬＣ分析法
[ＨＰＬＣ]
−カラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＰＦＰカラム（２．７μｍ、４．６×１５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製、米国）
−検出器：ＵＶ（λ＝２２７ｎｍ）
−流速：０．６ｍＬ／分
−注入量：１０μＬ
−カラム温度：２５℃
−移動相：
０〜２５分：水／アセトニトリル＝６５／３５（ｖ／ｖ）→４５／５５（ｖ／ｖ）
２５〜２８分：水／アセトニトリル＝４５／５５（ｖ／ｖ）
２５〜３０分：水／アセトニトリル＝４５／５５（ｖ／ｖ）→６５／３５（ｖ／ｖ）
３０〜３５分：水／アセトニトリル＝６５／３５（ｖ／ｖ）
【００８８】
パクリタキセル標準溶液の検量線と結果を図６及び表９に示す。
【００８９】
【表９】
2019527351.tif 000011
【００９０】
４）放出媒体中のパクリタキセルの初期濃度
放出媒体中の初期パクリタキセルの濃度を測定するために、放出媒体中のパクリタキセルの濃度がＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭの放出挙動に及ぼす影響を沈殿法で評価した。図７は、３７℃、４％アルブミンリン酸緩衝液中のＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭのパクリタキセル放出挙動を示すグラフである。図７に示すように、パクリタキセルの濃度が低いほど放出速度が速い。これは、高分子の濃度が低いほど臨界ミセル濃度に早く到達するためでる。この結果は、Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭが血中で容易に解離し、パクリタキセルが血中で容易に放出される可能性があることを意味する。従って、Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭは、体内への注射直後に放出されると予想される。
【００９１】
初期の低いパクリタキセルの濃度は、遅い速度の静脈内注射状況を表している。この沈殿法では、放出されたパクリタキセルはアルブミンに結合しなかった沈殿パクリタキセルを含み、表５に示すように、その濃度は無視できるほど低かった（３７℃、４％アルブミン溶液中で約８μｇ／ｍＬ）。しかし、Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭの濃度を低くすると（１．０ｍｇ／ｍＬ→０．１ｍｇ／ｍＬ）、アルブミン結合パクリタキセルの割合は無視できるほどになる。従って、１．０ｇ／ｍＬの初期パクリタキセル濃度が選択された。
【００９２】
３．４．生体関連媒体中のＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭのパクリタキセル放出
１）放出試験の再現性
沈殿法の再現性を評価するために、同じロット番号のＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭ（Ｌｏｔ  ＧＰ１１５１１）を使用して試験を３回繰返した。その結果を図８及び表１０に示す。試験方法は非常に再現性があることがわかった。
【００９３】
【表１０】
2019527351.tif 000012
【００９４】
２）様々なロット番号によるＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭの放出
沈殿法を利用し、異なるロット番号を有する４種類のＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭの放出挙動を評価した。結果を図９及び表１１に示す。
【００９５】
【表１１】
2019527351.tif 000013
【００９６】
３）不良製品の評価
インビトロ放出法は、不良製品を識別できなければならない。沈殿法を用いて不良製品の放出挙動を評価するために、２つの不良製品を意図的に製造した。不良製品の構成を表１２に示す。パクリタキセルとｍＰＥＧ−ＰＬＡの割合が１００：３００の不良製品は、生理食塩水で再構成したとき、半透明の溶液を形成したため、放出試験を行うことができなかった。５０：５００と１００：５００（ＧＰ１１５１１）の放出挙動を図１０及び表１３に示す。
【００９７】
【表１２】
2019527351.tif 000014
【００９８】
【表１３】
2019527351.tif 000015
【００９９】
４．放出試験方法と基準
４．１．放出試験法
１）標準溶液の製造
パクリタキセル１２．５ｍｇを正確に称量して１００ｍＬのメスフラスコに入れ、アセトニトリルを添加して溶解（１２５μｇ／ｍＬ）した。この溶液を順次アセトニトリルで希釈し、６２．５、１２．５、６．２５、１．２５、０．６２５μｇ／ｍＬの標準原液を製造した。０．８ｍＬの各標準原液を０．２ｍＬの４％アルブミンリン酸緩衝液と混合して、アルブミンを沈殿させた。この混合溶液を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．５ｍＬの上清を採取して８０％アセトニトリル水溶液０．５ｍＬと混合した。この溶液を標準溶液とした（１００、５０、１０、５、１、０．５μｇ／ｍＬ）。
【０１００】
２）試料溶液の製造
２０ｍＬの生理食塩水をＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭ  １００ｍｇバイアルに添加して、完全に溶解させた（５．０ｍｇ／ｍＬ）。この溶液４ｍＬを採取し、３７℃、４％アルブミンリン酸緩衝液１６ｍＬに添加し、放出溶液として使用した。この放出溶液１ｍＬを採取し、０．４５μｍのＰＶＤＦ注射器フィルターを使用することによりろ過した。このろ液０．２ｍＬを取り、アセトニトリル０．８ｍＬと混合して、アルブミンを沈殿させた。この溶液を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．５ｍＬの上清を採取して８０％アセトニトリル０．５ｍＬと混合した。この溶液を初期放出溶液として使用した。その後、放出条件に応じて一定時間、３７℃、２００ｒｐｍで放出溶液を撹拌（沈殿）させた。この溶液１ｍＬを採取し、０．４５μｍの注射器フィルターを使用することによりろ過した。このろ液０．２ｍＬを採取し、アセトニトリル０．８ｍＬと混合して、アルブミンを沈殿させた。この溶液を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．５ｍＬの上清を採取して８０％アセトニトリル０．５ｍＬと混合した。この溶液を時間ｔにおける放出溶液として使用した。
【０１０１】
３）放出と分析
放出溶液を３７℃、２００ｒｐｍで震とうするために震とう水浴を使用した。
【０１０２】
[放出条件]
−放出方法：沈殿法
−放出媒体：４％ヒトアルブミンリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
−容量：２０ｍＬ
−撹拌速度：２００ｒｐｍ
−放出温度：３７．０±０．５℃
標準溶液と試料溶液をＨＰＬＣに注入し、以下の条件でパクリタキセルのピーク面積を用いて、放出されたパクリタキセルを計算した。
【０１０３】
[ＨＰＬＣ]
−カラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＰＦカラム（２．７μｍ、４．６×１５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製、米国）
−検出器：ＵＶ（λ＝２２７ｎｍ）
−流速：０．６ｍＬ／分
−注入量：１０μＬ
−カラム温度：２５℃
【０１０４】
−移動相
０〜２５分：水／アセトニトリル＝６５／３５（ｖ／ｖ）→４５／５５（ｖ／ｖ）
２５〜２８分：水／アセトニトリル＝４５／５５（ｖ／ｖ）
２５〜３０分：水／アセトニトリル＝４５／５５（ｖ／ｖ）→６５／３５（ｖ／ｖ）
３０〜３５分：水／アセトニトリル＝６５／３５（ｖ／ｖ）
【０１０５】
−計算
パクリタキセル放出（％）＝沈殿したパクリタキセル（％）＝（初期検液中のパクリタキセルの濃度−各サンプリング時間（ｔ）における検液中のパクリタキセルの濃度）／初期検液中のパクリタキセルの濃度×１００＝（Ａ0−Ａt）／Ａ0×１００    （１）
−Ａ0＝初期検液のパクリタキセルピーク面積／標準溶液のパクリタキセルピーク面積×標準溶液中のパクリタキセル濃度×１０×２０
−Ａt＝時間ｔにおける検液のパクリタキセルのピーク面積／標準溶液のパクリタキセルのピーク面積×標準溶液中のパクリタキセルの濃度×１０×２０
【０１０６】
５．インビボでのパクリタキセル放出の可能なメカニズム
Ｇｅｎｅｘｏｌ−ＰＭは、体内に注入されると非常に早く希釈されるので、結晶化して沈殿する可能性はなく、他のタンパク質とすみやかに結合し、血液と同様に全身に運ばれる。しかし、沈殿法は無限に希釈されるインビボ条件を容易に再現することはできない。そのため、インビトロでのパクリタキセルの沈殿は、インビボでのタンパク質結合と見なした。即ち、インビトロでの高分子ミセル中のパクリタキセルの結晶化は、多くのタンパク質と血液成分が存在して高速希釈されるインビボでのパクリタキセルとタンパク質の結合と見なすことができる。図１１は、沈殿法を利用したインビトロ放出試験結果からＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭからのパクリタキセル放出の可能な放出メカニズムを示す図である。
【０１０７】
第１段階：
高分子ミセル中の過飽和パクリタキセルは、高分子ミセルから急速に放出され、直ちに血漿タンパク質に結合する。この段階は全体放出の９５％以上を占める。
【０１０８】
第２段階：
高分子ミセル中の残存パクリタキセルは、高分子ミセルがＣＭＣ下で解離されるか、又は血液内酵素によって分解され、ゆっくり放出される。この段階は全体放出の５％未満を占める。
【０１０９】
６．従来の高分子及び精製高分子含有高分子ミセル製剤の放出試験
モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ、数平均分子量＝２，０００）１５０ｇを撹拌機付き５００ｍＬ丸底フラスコに加えた後、１２０℃で２時間、真空条件で撹拌して、水分を除去した。反応フラスコにトルエン２００μＬに溶解したオクタン酸スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）０．１５ｇを添加し、真空条件で再び１時間撹拌しながらトルエンを蒸留除去した。次いで、Ｄ，Ｌ−ラクチド１５０ｇを添加し、撹拌しながら窒素雰囲気下で溶解した。Ｄ，Ｌ−ラクチドが完全に溶解した後、反応器を密封し、１２０℃で１０時間重合を行った。
【０１１０】
得られたｍＰＥＧ−ＰＤＬＬＡ  ３０ｇを１口フラスコに添加し、１２０℃で溶融した。溶融したｍＰＥＧ−ＰＤＬＬＡを磁石バーで撹拌しながら、真空ポンプと連結し、ラクチドを１ｔｏｒｒ以下で昇華法により７時間除去した（従来の高分子）。
【０１１１】
一方で、得られたｍＰＥＧ−ＰＤＬＬＡ  ２０ｇを１口フラスコに添加し、エタノール１２０ｍＬを添加し、５０℃で２時間撹拌溶解した。高分子溶液を分液ロートに移し、２５℃で２時間層分離させた。層分離が完了した後、下層の高分子溶液を１口フラスコに添加した。真空蒸留器を利用して高分子溶液中の残留エタノールを真空蒸留して除去した（精製高分子）。
【０１１２】
前述のようにして得られた従来の高分子と精製高分子を利用してパクリタキセル高分子ミセル製剤を製造し、本発明に従って放出試験を行った。その結果を表１４に示す。
【０１１３】
【表１４】
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【０１１４】
前述した本発明の説明は、例示のみを目的としており、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく各種実施形態及び詳細における様々な変更が容易に成され得ることが当業者にとって理解されるであろう。全ての実施形態は、説明的な意味でのみ考慮されるべきであり、限定する目的はない。例えば、単一の種類として記載されている各構成要素は分割されてもよく、同様に、分割して記載された構成要素は組み合わされてもよい。
【０１１５】
本発明の範囲は、前記詳細な説明ではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び当該範囲内での全ての変更が含まれることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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