(57)【要約】本開示は、少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、光化学系ＩＩサブユニットＳ（ＰｓｂＳ）、ゼアキサンチンエポキシダーゼ（ＺＥＰ）、およびビオラキサンチンデエポキシダーゼ（ＶＤＥ）から選択されるポリペプチドをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物を提供する。トランスジェニック植物を作製するための発現ベクター、ならびにＰｓｂＳポリペプチド、ＺＥＰポリペプチド、およびＶＤＥポリペプチドの少なくとも１つの発現が増加した植物においてバイオマス生産および／または炭素固定および／または成長を増加させる方法も提供する。
2019527034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック植物であって、少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、
光化学系ＩＩサブユニットＳ（ＰｓｂＳ）、ゼアキサンチンエポキシダーゼ（ＺＥＰ）、およびビオラキサンチンデエポキシダーゼ（ＶＤＥ）；
ＰｓｂＳおよびＺＥＰ；または
ＺＥＰおよびＶＤＥ
をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック植物。
【請求項２】
前記１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列が双子葉植物に由来する、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
前記１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに由来する、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
前記ＶＤＥ、ＰｓｂＳ、またはＺＥＰのうちのいずれかの転写レベルがコントロール植物と比較して増加する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
ＰｓｂＳが、配列番号１のヌクレオチド配列にコードされ、ＺＥＰが、配列番号２のヌクレオチド配列にコードされ、ＶＤＥが、配列番号３のヌクレオチド配列にコードされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】
ＰｓｂＳが、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ、ＺＥＰが、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ、ＶＤＥが、配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項８】
ＰｓｂＳが、配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ、ＺＥＰが、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ、ＶＤＥが、配列番号３に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項９】
ＰｓｂＳが、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＺＥＰが、配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＶＤＥが、配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
ＰｓｂＳが、配列番号４に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＺＥＰが、配列番号５に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＶＤＥが、配列番号６に少なくとも配列９０％同一であるアミノ酸を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
ＰｓｂＳが、配列番号４に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＺＥＰが、配列番号５に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＶＤＥが、配列番号６に少なくとも配列７０％同一であるアミノ酸を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１２】
ＰｓｂＳが、配列番号７の保存されたドメインを含み、ＺＥＰが、配列番号８の保存されたドメインを含み、ＶＤＥが、配列番号９の保存されたドメインを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３】
前記植物が、作物、モデル植物、単子葉の植物、双子葉の植物、ベンケイソウ型酸代謝（ＣＡＭ）光合成植物、Ｃ３光合成植物、Ｃ４光合成植物、一年生植物、温室植物、園芸種の顕花植物、多年生植物、スイッチグラス植物、メイズ植物、バイオマス植物、またはサトウキビ植物である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
前記植物が、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜作物、飼料作物、工芸作物、木質作物、およびバイオマス作物からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１５】
前記植物がタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１６】
前記植物がトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１７】
前記植物がイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
前記植物がモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１９】
前記植物がダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２０】
前記植物がササゲ（Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２１】
前記植物がポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２２】
前記植物がユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐ．）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２３】
前記植物がキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２４】
前記植物がオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２５】
前記植物がジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２６】
前記植物がサトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２７】
前記植物がアルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２８】
前記植物が、変動光条件下のコントロール植物と比較して、変動光条件下での成長が増大する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２９】
前記植物が、変動光条件下のコントロール植物と比較して、変動光条件下での光合成効率が増大する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３０】
前記植物が、変動光条件下のコントロール植物と比較して、変動光条件下での光防御効率が改善される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３１】
前記植物が、変動光条件下のコントロール植物と比較して、変動光条件下での量子収量およびＣＯ２固定が改善される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３２】
前記植物が優良系統または優良株である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３３】
前記植物が、除草剤抵抗性、昆虫または有害生物に対する抵抗性、病害抵抗性、改変脂肪酸代謝、および／または改変炭水化物代謝を提供する少なくとも１つのさらなるポリペプチドの発現をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３４】
発現ベクターであって、少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、
ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥ；
ＰｓｂＳおよびＺＥＰ；または
ＺＥＰおよびＶＤＥをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの発現制御配列が、Ｒｂｃｓ１Ａ、ＧＡＰＡ−１、およびＦＢＡ２からなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項３４に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
Ｒｂｃｓ１ＡプロモーターがＺＥＰの発現を駆動し、ＧＡＰＡ−１プロモーターがＰｓｂＳの発現を駆動し、ＦＢＡ２プロモーターがＶＤＥの発現を駆動する、請求項３４に記載の発現ベクター。
【請求項３７】
前記発現ベクターがＴ−ＤＮＡである、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
抗生物質抵抗性を提供するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項３９】
発現制御配列ならびにＰｓｂＳポリペプチド、ＺＥＰポリペプチド、およびＶＤＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に隣接する左境界（ＬＢ）ドメインおよび右境界（ＲＢ）ドメインをさらに含む、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項４０】
ＰｓｂＳが配列番号１のヌクレオチド配列にコードされ、ＺＥＰが配列番号２のヌクレオチド配列にコードされ、ＶＤＥが配列番号３のヌクレオチド配列にコードされる、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項４１】
ＰｓｂＳが、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ、ＺＥＰが、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ、ＶＤＥが、配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項４２】
ＰｓｂＳが、配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ、ＺＥＰが、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ、ＶＤＥが、配列番号３に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項４３】
ＰｓｂＳが、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＺＥＰが、配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＶＤＥが、配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項４４】
ＰｓｂＳが、配列番号４に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＺＥＰが、配列番号５に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＶＤＥが、配列番号６に少なくとも配列９０％同一であるアミノ酸を有する、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項４５】
ＰｓｂＳが、配列番号４に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＺＥＰが、配列番号５に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＶＤＥが、配列番号６に少なくとも配列７０％同一であるアミノ酸を有する、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項４６】
ＰｓｂＳが、配列番号７の保存されたドメインを含み、ＺＥＰが、配列番号８の保存されたドメインを含み、ＶＤＥが、配列番号９の保存されたドメインを含む、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項４７】
請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む細菌細胞。
【請求項４８】
請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の発現ベクターを含むアグロバクテリウム細胞。
【請求項４９】
請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の発現ベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項５０】
請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む種子。
【請求項５１】
請求項５０に記載の種子由来の子孫植物。
【請求項５２】
変動光条件下で植物の成長を増大させる方法であって、前記植物中でのＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥからなる群から選択される２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現を増大させる工程であって、それにより、コントロール植物と比較して前記２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む、方法。
【請求項５３】
変動光条件下で植物における光合成効率を増大させる方法であって、前記植物中でのＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥからなる群から選択される２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現を増大させる工程であって、それにより、コントロール植物と比較して前記２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む、方法。
【請求項５４】
変動光条件下で植物における光防御効率を改善する方法であって、前記植物中でのＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥからなる群から選択される２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現を増大させる工程であって、それにより、コントロール植物と比較して前記２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む、方法。
【請求項５５】
変動光条件下で植物における量子収率およびＣＯ２固定を改善する方法であって、前記植物中でのＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥからなる群から選択される２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現を増大させる工程であって、それにより、コントロール植物と比較して前記２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む、方法。
【請求項５６】
植物における非光化学的消光（ＮＰＱ）の緩和速度を増大させる方法であって、植物中での
ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥ；
ＰｓｂＳおよびＺＥＰ；または
ＺＥＰおよびＶＤＥの発現を増大させる工程であって、それにより、コントロール植物と比較して２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む、方法。
【請求項５７】
ＰｓｂＳおよびＶＤＥの発現を増大させる工程を含む、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
ＰｓｂＳおよびＺＥＰの発現を増大させる工程を含む、請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
ＺＥＰおよびＶＤＥの発現を増大させる工程を含む、請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥの発現を増大させる工程を含む、請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの発現を、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列の発現によって増大させる、請求項５２〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの発現を、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥのプロモーターの改変によって増大させる、請求項５２〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
プロモーターをゲノム編集システムによって改変する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ゲノム編集システムがＣＲＩＳＰＲである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
変動光条件下での成長特性を改善するための植物を選択する方法であって、
（ａ）植物集団を提供する工程；
（ｂ）ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかの活性を増大させるように前記植物を改変する工程；
（ｂ）前記植物における変動光条件下での非光化学的消光（ＮＰＱ）レベルを検出する工程；
（ｃ）前記植物における変動光条件下でのＮＰＱレベルを、変動光条件下でのＮＰＱのコントロールレベルと比較する工程；および
（ｄ）前記植物を高光強度から低光強度へ移行した場合にＮＰＱ緩和速度が増大した植物を選択する工程であって；それにより、変動光条件下での成長特性が改善された植物が選択される、選択する工程
を含む、方法。
【請求項６６】
前記ＮＰＱのコントロールレベルが、前記集団におけるＮＰＱの最低レベル、前記集団におけるＮＰＱの中程度のレベル、前記集団におけるＮＰＱの平均レベル、およびコントロール植物におけるＮＰＱレベルからなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記植物を、変異原を用いてＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥにおける１つまたは複数の変異を誘導することによって改変する、請求項６５〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記変異原がエタンメチルスルホナート（ＥＭＳ）である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記植物を、トランスジェニック技術を使用して異種のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥを導入することによって改変する、請求項６５〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記植物を、ゲノム編集システムを使用してＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥのプロモーターを改変することによって改変する、請求項６５〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ゲノム編集システムがＣＲＩＳＰＲである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
変動光条件下での成長特性の改善に関連する多型をスクリーニングする方法であって、
（ａ）植物集団を提供する工程；
（ｂ）前記植物においてＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかを制御および／またはコードするヌクレオチド配列を得る工程；
（ｃ）前記植物においてＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかを制御および／またはコードするヌクレオチド配列内の１つまたは複数の多型を得る工程；
（ｄ）前記植物における高光強度から低光強度への移行の際の非光化学的消光（ＮＰＱ）緩和速度を検出する工程；
（ｅ）前記植物集団における多型のＮＰＱ緩和速度との関連を決定するために統計解析を行う工程；および
（ｆ）前記ＮＰＱ緩和速度と統計的に有意に関連する多型を選択する工程であって；それにより、変動光条件下での成長特性の改善に関連する多型が選択される、選択する工程
を含む、方法。
【請求項７３】
前記多型が一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記多型が、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥのプロモーター内に存在する、請求項７２〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記多型を配列決定によって検出する、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記多型をゲル電気泳動によって検出する、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記多型を、変動光条件下での成長特性が改善されている植物を選択するための植物集団のスクリーニングのためにさらに使用する、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記多型を、変動光条件下での植物の成長特性を改善するためのＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥにおけるゲノム編集のための標的としてさらに使用する、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記成長特性の改善が、成長の改善、光合成効率の改善、光防御効率の改善、量子収量の改善、およびＣＯ２固定の改善からなる群から選択される、請求項６５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
植物におけるＮＰＱを、クロロフィル蛍光の測定によって検出する、請求項６５〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
ＰｓｂＳが、配列番号１のヌクレオチド配列にコードされ、ＺＥＰが、配列番号２のヌクレオチド配列にコードされ、ＶＤＥが、配列番号３のヌクレオチド配列にコードされる、請求項５２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
ＰｓｂＳが、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ、ＺＥＰが、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ、ＶＤＥが、配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる、請求項５２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
ＰｓｂＳが、配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ、ＺＥＰが、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされ、ＶＤＥが、配列番号３に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる、請求項５２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
ＰｓｂＳが、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＺＥＰが、配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＶＤＥが、配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項５２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
ＰｓｂＳが、配列番号４に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＺＥＰが、配列番号５に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＶＤＥが、配列番号６に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項５２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
ＰｓｂＳが、配列番号４に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＺＥＰが、配列番号５に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＶＤＥが、配列番号６に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項５２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
ＰｓｂＳが、配列番号７の保存されたドメインを含み、ＺＥＰが、配列番号８の保存されたドメインを含み、ＶＤＥが、配列番号９の保存されたドメインを含む、請求項５２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記植物が、作物、モデル植物、単子葉の植物、双子葉の植物、ベンケイソウ型酸代謝（ＣＡＭ）光合成植物、Ｃ３光合成植物、Ｃ４光合成植物、一年生植物、温室植物、園芸種の顕花植物、多年生植物、スイッチグラス植物、メイズ植物、バイオマス植物、またはサトウキビ植物である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記植物が、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜作物、飼料作物、工芸作物、木質作物、およびバイオマス作物からなる群から選択される、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記植物がタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記植物がトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記植物がイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項９３】
前記植物がモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記植物がダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記植物がササゲ（Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記植物がポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記植物がユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐ．）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記植物がキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記植物がオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記植物がジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記植物がサトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記植物がアルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）である、請求項５２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
ＶＤＥの転写物レベルがコントロール植物と比較して３倍増大し、ＰｓｂＳの転写物レベルがコントロール植物と比較して３倍増大し、ＺＥＰの転写物レベルがコントロール植物と比較して８倍増大する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０４】
ＶＤＥの転写物レベルがコントロール植物と比較して１０倍増大し、ＰｓｂＳの転写物レベルがコントロール植物と比較して３倍増大し、ＺＥＰの転写物レベルがコントロール植物と比較して６倍増大する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０５】
ＶＤＥの転写物レベルがコントロール植物と比較して４倍増大し、ＰｓｂＳの転写物レベルがコントロール植物と比較して１．２倍増大し、ＺＥＰの転写物レベルがコントロール植物と比較して７倍増大する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０６】
ＶＤＥのタンパク質レベルがコントロール植物と比較して１６倍増大し、ＰｓｂＳのタンパク質レベルがコントロール植物と比較して２倍増大し、ＺＥＰのタンパク質レベルがコントロール植物と比較して８０倍増大する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０７】
ＶＤＥのタンパク質レベルがコントロール植物と比較して３０倍増大し、ＰｓｂＳのタンパク質レベルがコントロール植物と比較して４倍増大し、ＺＥＰのタンパク質レベルがコントロール植物と比較して７４倍増大する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０８】
ＶＤＥのタンパク質レベルがコントロール植物と比較して４７倍増大し、ＰｓｂＳのタンパク質レベルがコントロール植物と比較して３倍増大し、ＺＥＰのタンパク質レベルがコントロール植物と比較して７５倍増大する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０９】
ＶＤＥ、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの間のコントロール植物と比較した転写物レベルの増大が、３：３：８、１０：３：６、および４：１．２：７からなる群から選択される比を有する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１０】
ＶＤＥ、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの間のコントロール植物と比較したタンパク質レベルの増大が、１６：２：８０、３０：４：７４、４７：３：７５からなる群から選択される比を有する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１１】
コントロール植物と比較したＶＤＥの転写物レベルの増大が約３倍から約１０倍であり、コントロール植物と比較したＰｓｂＳの転写物レベルの増大が約１．２倍から約３倍であり、コントロール植物と比較したＺＥＰの転写物レベルの増大が約６倍から約８倍である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１２】
コントロール植物と比較したＶＤＥのタンパク質レベルの増大が約１６倍から約４７倍であり、コントロール植物と比較したＰｓｂＳのタンパク質レベルの増大が約２倍から約４倍であり、コントロール植物と比較したＺＥＰのタンパク質レベルの増大が約７４倍から約８０倍である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１３】
発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＶＤＥの転写物レベルを３倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルを３倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＺＥＰの転写物レベルを８倍増大させることを含む、請求項５２〜６４および８１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＶＤＥの転写物レベルを１０倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルを３倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＺＥＰの転写物レベルを６倍増大させることを含む、請求項５２〜６４および８１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＶＤＥの転写物レベルを４倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルを１．２倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＺＥＰの転写物レベルを７倍増大させることを含む、請求項５２〜６４および８１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＶＤＥのタンパク質レベルを１６倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルを２倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルを８０倍増大させることを含む、請求項５２〜６４および８１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＶＤＥのタンパク質レベルを３０倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルを４倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルを７４倍増大させることを含む、請求項５２〜６４および８１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＶＤＥのタンパク質レベルを４７倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルを３倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルを７５倍増大させることを含む、請求項５２〜６４および８１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＶＤＥ、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの転写物レベルを３：３：８、１０：３：６、および４：１．２：７からなる群から選択される比で増大させることを含む、請求項５２〜６４および８１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＶＤＥ、ＰｓｂＳおよびＺＥＰのタンパク質レベルを１６：２：８０、３０：４：７４、および４７：３：７５からなる群から選択される比で増大させることを含む、請求項５２〜６４および８１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＶＤＥの転写物レベルを約３倍から約１０倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルを約１．２倍から約３倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＺＥＰの転写物レベルを約６倍から約８倍増大させることを含む、請求項５２〜６４および８１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＶＤＥのタンパク質レベルを約１６倍から約４７倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルを約２倍から約４倍増大させることを含み、発現を増大させることが、コントロール植物と比較して前記植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルを約７４倍から約８０倍増大させることを含む、請求項５２〜６４および８１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年５月２７日に出願された米国仮出願第６２／３４２，２４８号の利益を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表の提出
以下のＡＳＣＩＩテキストファイルの提出物の内容は、その全体が本明細書中で参考として組み込まれる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：３３５０３２０００８４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、データ記録日：２０１７年５月２６日、サイズ：２４６ＫＢ）。
【０００３】
発明の分野
本発明は、植物の光合成効率および成長を増大させる方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
植物の樹冠における光強度は非常に動的であり、葉は、慣用的に、照射吸収レベルの急激な変動を受ける。光強度が吸収したエネルギーを利用するための光化学には非常に高いか、光強度の増加が速すぎる場合に、光合成アンテナ複合体を過剰励起から防御するためにいくつかの光防御機構が誘導される。光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナ複合体における過剰な励起エネルギーは、誘導性の防御過程によって熱として無害に散逸される。この防御過程は観察可能であり、しばしば、クロロフィル蛍光の非光化学的消光と呼ばれている（ＮＰＱ；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｖｏｌ  １２５，１５５８−１５６６，２０００）。ＮＰＱの変化は急速であり得るが即効性はなく、したがって、吸収された照射の変動に遅れを取る。ＮＰＱ緩和速度は誘導速度よりかなり遅く、この非対称性は過剰な光条件への長期曝露または反復曝露によって悪化する。消光状態から非消光状態へのＰＳＩＩアンテナの回復速度のこの相対的な遅さは、光合成の量子収量および関連するＣＯ２固定が高光強度から低光強度への変化の際にＮＰＱによって一過性に制限されることを意味し得る。この仮説をモデルシミュレーションで試験し、作物の樹冠にわたって積分した場合、対応するＣＯ２固定の損失は７．５％〜３０％と推定された（Ｚｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．Ｖｏｌ  ５５，１１６７−１１７５，２００４）。これらの計算に基づいて、ＮＰＱの緩和速度の増大は、光合成効率を改善するための可能なストラテジーを示唆しているが、今までのところ実証されていない。
【０００５】
正確なＮＰＱ消光部位および関連する消光機構の性質は依然として解明されていないが、ＮＰＱを生じるにはＰＳＩＩ関連アンテナの高次構造が消光状態に変化する必要があることが明らかであり、この変化を時定数が対照的ないくつかの異なる機構によって誘導することができる。高等植物におけるＮＰＱの優位かつ広く存在している機構は、いわゆるエネルギー依存性消光（ｑＥ）である。ｑＥの誘導には、チラコイドルーメンが低ｐＨであることを必要とし、この誘導は、光化学系ＩＩサブユニットＳ（ＰｓｂＳ）の存在および可逆的なキサントフィル色素サイクルを介したビオラキサンチンのアンテラキサンチンおよびゼアキサンチンへの脱エポキシ化によって非常に促進される。
【０００６】
ＰｓｂＳの過剰発現は、ｑＥ形成の大きさに強く影響を及ぼし、ｑＥの誘導速度および緩和速度を増大させるが、低ストレス条件下で光合成の量子収量と競合し得る。したがって、ＰｓｂＳ過剰発現を介したｑＥの増強は、光の強度が高いか急速に変動する条件下では光防御を増大させることができる一方で、ＣＯ２固定および植物の成長に及ぼすＰｓｂＳ過剰発現のみの正の影響は、優勢な光環境に非常に依存する。ＮＰＱ操作の代替経路は、可逆性キサントフィル色素サイクルを改変することである。リコペンからのカロテノイド（カロテンおよびキサントフィル）の生合成経路の略図を図１７に示す。ゼアキサンチン蓄積は、いくつかのＮＰＱ成分（ｑＥ、ｑＺ、およびｑＩ）に関連する。過剰光におけるビオラキサンチンからゼアキサンチンへの変換は、酵素ビオラキサンチンデエポキシダーゼ（ＶＤＥ）によって触媒される。ゼアキサンチンのビオラキサンチンへの変換は、酵素ゼアキサンチンエポキシダーゼ（ＺＥＰ）によって触媒される。キサントフィル色素プールサイズが増大したシロイヌナズナ変異体は、ＮＰＱの形成速度および緩和速度がより遅いことを示した一方で、ＮＰＱの大きさには影響がなかった。興味深いことに、これらの変異体および野生型コントロール植物におけるＮＰＱの形成速度および緩和速度は、主に、キサントフィル色素プールの脱エポキシ化状態によって制御されるようである。Ｎｉｌｋｅｎｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７９７；４６６−４７５（２０１０）は、特にゼアキサンチンのエポキシ化動態がＮＰＱ緩和速度と強く相関することを示していた。したがって、キサントフィルサイクル平衡の調整速度はまた、ＮＰＱの形成速度および緩和速度を制御し、ビオラキサンチンデエポキシダーゼ（ＶＤＥ）およびゼアキサンチンエポキシダーゼ（ＺＥＰ）による代謝回転速度と比較してキサントフィルのプールサイズの影響を受けるようである。
高光強度での光防御を維持しながら低光強度での光合成の量子収量との一過性の競合を減少させるようにＮＰＱを操作することができるかどうかは依然として明らかにされていない。変動光条件下での量子収量およびＣＯ２固定が改善された植物は、植物の成長および収穫量を改善することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＮＰＱ；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｖｏｌ  １２５，１５５８−１５６６，２０００
【非特許文献２】Ｚｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．Ｖｏｌ  ５５，１１６７−１１７５，２００４）
【非特許文献３】Ｎｉｌｋｅｎｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７９７；４６６−４７５（２０１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本開示の一態様は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよび／またはＶＤＥをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を有するトランスジェニック植物に関する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、双子葉植物に由来する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに由来する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよびＶＤＥをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１のヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２のヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３のヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号７の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号８の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号９の保存されたドメインをさらに含む。上記のいくつかの実施形態では、植物は、作物、モデル植物、単子葉の植物、双子葉の植物、ベンケイソウ型酸代謝（ＣＡＭ）光合成植物、Ｃ３光合成植物、Ｃ４光合成植物、一年生植物、温室植物、園芸種の顕花植物、多年生植物、スイッチグラス���物、メイズ植物、バイオマス植物、またはサトウキビ植物である。上記のいくつかの実施形態では、植物は、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜作物、飼料作物、工芸作物、木質作物、またはバイオマス作物である。いくつかの実施形態では、植物はＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍである。いくつかの実施形態では、植物はＺｅａ  ｍａｙｓである。いくつかの実施形態では、植物はＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒである。いくつかの実施形態では、植物はＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。いくつかの実施形態では、植物はＶｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＰｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＨｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍである。いくつかの実施形態では、植物はＳａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａである。上記のいくつかの実施形態では、植物は、変動光条件下のコントロール植物と比較して、変動光条件下での成長が増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物は、変動光条件下のコントロール植物と比較して、変動光条件下での光合成効率が増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物は、変動光条件下のコントロール植物と比較して、変動光条件下での光防御効率が改善される。上記のいくつかの実施形態では、植物は、変動光条件下のコントロール植物と比較して、変動光条件下での量子収量およびＣＯ２固定が改善される。上記のいくつかの実施形態では、植物は優良系統または優良株である。上記のいくつかの実施形態では、植物は、除草剤抵抗性、昆虫または有害生物に対する抵抗性、病害抵抗性、改変脂肪酸代謝、および／または改変炭水化物代謝を提供する少なくとも１つのさらなるポリペプチドの発現をさらに含む。
【０００９】
本開示の別の態様は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を有する発現ベクターに関する。いくつかの実施形態では、ベクターは、Ｒｂｃｓ１Ａ、ＧＡＰＡ−１、またはＦＢＡ２のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、Ｒｂｃｓ１ＡプロモーターはＺＥＰの発現を駆動し、ＧＡＰＡ−１プロモーターはＰｓｂＳの発現を駆動し、ＦＢＡ２プロモーターはＶＤＥの発現を駆動する。いくつかの実施形態では、ベクターはＴ−ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ベクターは、抗生物質抵抗性を提供するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現制御配列ならびにＰｓｂＳポリペプチド、ＺＥＰポリペプチド、およびＶＤＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に隣接する左境界（ＬＢ）ドメインおよび右境界（ＲＢ）ドメインを有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１のヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２のヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３のヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号７の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号８の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号９の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、細菌細胞内に存在する。上記のいくつかの実施形態では、発現ベクターは、アグロバクテリウム細胞内に存在する。上記のいくつかの実施形態では、発現ベクターを使用してトランスジェニック植物を産生する。上記のいくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、種子を産生する。上記のいくつかの実施形態では、種子は、子孫植物をさらに産生する。
【００１０】
本開示の他の態様は、植物における光合成および成長を増大させる方法であって、本明細書中に記載の２つまたはそれを超えるポリペプチドの植物内での発現を増大させる工程を含む方法に関する。一態様では、本開示は、変動光条件下で植物の成長を増大させる方法であって、植物中でのＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥからの少なくとも２つのポリペプチドの発現を増大させる工程であって、それにより、コントロール植物と比較して２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む、方法に関する。一態様では、本開示は、、およびＶＤＥからの少なくとも２つのポリペプチドの発現を増大させる工程であって、それにより、コントロール植物と比較して２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む、方法に関する。一態様では、本開示は、変動光条件下で植物における光防御効率を増大させる方法であって、植物中でのＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥからの少なくとも２つのポリペプチドの発現を増大させる工程であって、それにより、コントロール植物と比較して２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む、方法に関する。一態様では、本開示は、変動光条件下で植物における量子収率およびＣＯ２を増大させる方法であって、植物中でのＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥからの少なくとも２つのポリペプチドの発現を増大させる工程であって、それにより、コントロール植物と比較して２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む、方法に関する。一態様では、本開示は、植物における非光化学的消光（ＮＰＱ）の緩和速度を増大させる方法であって、植物中でのＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥからの少なくとも２つのポリペプチドの発現を増大させる工程であって、それにより、コントロール植物と比較して２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの発現が増大する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳおよびＶＤＥの発現が増大する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥおよびＺＥＰの発現が増大する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよびＶＤＥの発現が増大する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよび／またはＶＤＥの発現は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよび／またはＶＤＥをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を発現することによって増大する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの発現を、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥのプロモーター領域の改変によって増大させる。いくつかの実施形態では、プロモーターをゲノム編集システムによって改変する。いくつかの実施形態では、ゲノム編集システムはＣＲＩＳＰＲである。
【００１１】
本開示の別の態様は、変動光条件下での成長特性を改善するための植物を選択する方法であって、植物集団を提供する工程、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかの活性を増大させるように植物の集団を改変する工程、植物における変動光条件下での非光化学的消光（ＮＰＱ）レベルを検出する工程、植物における変動光条件下でのＮＰＱレベルを、変動光条件下でのＮＰＱのコントロールレベルと比較する工程、および植物を高光強度下から低光強度へ移行した場合にＮＰＱ緩和速度が増大した植物を選択する工程を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、ＮＰＱのコントロールレベルは、集団におけるＮＰＱの最低レベルである。いくつかの実施形態では、ＮＰＱのコントロールレベルは、集団におけるＮＰＱの中程度のレベルである。いくつかの実施形態では、ＮＰＱのコントロールレベルは、集団におけるＮＰＱの平均レベルである。いくつかの実施形態では、ＮＰＱのコントロールレベルは、コントロール植物におけるＮＰＱレベルである。いくつかの実施形態では、植物を、変異原を用いてＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥにおける１つまたは複数の変異を誘導することによって改変する。いくつかの実施形態では、変異原はエタンメチルスルホナート（ＥＭＳ）である。いくつかの実施形態では、植物を、トランスジェニック技術を使用して異種のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥを導入することによって改変する。いくつかの実施形態では、植物を、ゲノム編集システムを使用してＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのそれぞれのネイティブプロモーターを改変することによって改変する。いくつかの実施形態では、ゲノム編集システムはＣＲＩＳＰＲである。本開示の別の態様は、変動光条件下での成長特性の改善に関連するヌクレオチド配列多型をスクリーニングする方法であって、植物集団を提供する工程、植物の集団においてＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかを制御および／またはコードするヌクレオチド配列を得る工程、植物の集団においてＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかを制御および／またはコードするヌクレオチド配列内の１つまたは複数の多型を得る工程、植物の集団における高光強度から低光強度への移行の際の非光化学的消光（ＮＰＱ）緩和速度を検出する工程、植物集団における多型のＮＰＱ緩和速度との関連を決定するために統計解析を行う工程、およびＮＰＱ緩和速度と統計的に有意に関連する多型を選択する工程を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、多型は一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態では、多型は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥのプロモーター内に存在する。いくつかの実施形態では、多型を配列決定によって検出する。いくつかの実施形態では、多型をゲル電気泳動によって検出する。いくつかの実施形態では、多型を、変動光条件下での成長特性が改善されている植物を選択するための植物集団のスクリーニングのためにさらに使用する。いくつかの実施形態では、多型を、変動光条件下での植物の成長特性を改善するためのＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥにおけるゲノム編集のための標的としてさらに使用する。上記のいくつかの実施形態では、成長特性の改善は、成長の改善、光合成効率の改善、光防御効率の改善、量子収量の改善、および／またはＣＯ２固定の改善である。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＮＰＱを、クロロフィル蛍光の測定によって検出する。
【００１２】
上記のいくつかの実施形態では、成長特性の改善は、成長の改善である。いくつかの実施形態では、成長特性の改善は、光合成効率の改善である。いくつかの実施形態では、成長特性の改善は、光防御効率の改善である。いくつかの実施形態では、成長特性の改善は、量子収量およびＣＯ２固定の改善である。いくつかの実施形態では、成長特性の改善は、非光化学的消光（ＮＰＱ）の緩和速度の増大である。いくつかの実施形態では、ＮＰＱを、クロロフィル蛍光画像化を使用して検出する。
【００１３】
前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１のヌクレオチド配列にコードされる。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２のヌクレオチド配列にコードされる。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３のヌクレオチド配列にコードされる。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５のアミノ酸配列を有する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号７の保存されたドメインをさらに含む。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号８の保存されたドメインをさらに含む。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号９の保存されたドメインをさらに含む。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物は、作物、モデル植物、単子葉の植物、双子葉の植物、ベンケイソウ型酸代謝（ＣＡＭ）光合成植物、Ｃ３光合成植物、Ｃ４光合成植物、一年生植物、温室植物、園芸種の顕花植物、多年生植物、スイッチグラス植物、メイズ植物、バイオマス植物、またはサトウキビ植物である。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物は、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜作物、飼料作物、工芸作物、木質作物、またはバイオマス作物である。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍである。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＺｅａ  ｍａｙｓである。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａである。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＳｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒである。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＶｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａである。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＰｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐである。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐである。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＭａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａである。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＨｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅである。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍである。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＳａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐである。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物はＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａである。
【００１４】
前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物中のＶＤＥの転写物レベルは、コントロール植物と比較して３倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物中のＰｓｂＳの転写物レベルは、コントロール植物と比較して３倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物中のＺＥＰの転写物レベルは、コントロール植物と比較して８倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物中のＶＤＥの転写物レベルは、コントロール植物と比較して１０倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物中のＰｓｂＳの転写物レベルは、コントロール植物と比較して３倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物中のＺＥＰの転写物レベルは、コントロール植物と比較して６倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物中のＶＤＥの転写物レベルは、コントロール植物と比較して４倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物中のＰｓｂＳの転写物レベルは、コントロール植物と比較して１．２倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物中のＺＥＰの転写物レベルは、コントロール植物と比較して７倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物中のＶＤＥのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して１６倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して２倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して８０倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して３０倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して４倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して７４倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して４７倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して３倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して７５倍増大する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの間のコントロール植物と比較した植物における転写物レベルの増大は、３：３：８、１０：３：６、または４：１．２：７の比を有する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの間のコントロール植物と比較した植物におけるタンパク質レベルの増大は、１６：２：８０、３０：４：７４、または４７：３：７５の比を有する。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物におけるＶＤＥの転写物レベルの増大は、３倍から１０倍の範囲である。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルの増大は、約１．２倍から約３倍である。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物におけるＺＥＰの転写物レベルの増大は、約６倍から約８倍である。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物中のＶＤＥのタンパク質レベルの増大は、１６倍から４７倍の範囲である。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物中のＰｓｂＳのタンパク質レベルの増大は、約２倍から約４倍である。前出の実施形態のいずれかと組み合わせられ得るいくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物中のＺＥＰのタンパク質レベルの増大は、約７４倍から約８０倍である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
前述意外の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明を考慮した場合により容易に明確となる。かかる詳細な説明では、以下の図面を参照する。
【００１６】
【図１】（Ａ）１０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＦＤでの１０分間の照射中およびその後の１０分間の暗所での緩和中の野生型および３つの（ＶＤＥ−ＰｓｂＳ−ＺＥＰ）ＶＰＺ過剰発現系統の稚苗における非光化学的消光。２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＦＤで３分間の照射およびその後の２００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＦＤで２分間の照射の反復サイクル中の稚苗における（Ｂ）非光化学的消光および（Ｃ）ＰＳＩＩ効率。エラーバーは±ｓｅ（ｎ＝１８）を示し、アステリスクはＶＰＺ系統と野生型との間の有意差（α＝０．０５）を示す。
【００１７】
【図２】ネイティブ（Ｎｔ）およびトランスジェニック（Ａｔ）のビオラキサンチンデエポキシダーゼ（ＶＤＥ）、光化学系ＩＩサブユニットＳ（ＰｓｂＳ）、およびゼアキサンチンエポキシダーゼ（ＺＥＰ）のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現。（Ａ〜Ｃ）アクチンおよびチューブリンと比較したｍＲＮＡレベル、（Ｄ〜Ｆ）野生型と比較したタンパク質レベル（ウェスタンブロットでのデンシトメトリーから決定）。エラーバーは±ｓｅ（ｎ＝５）を示し、アステリスクは、ＶＰＺ系統と野生型との間の有意差（α＝０．０５）を示す。（Ｇ）ＶＤＥ、ＰｓｂＳ、およびＺＥＰについてのウェスタンブロットの例。
【００１８】
【図３】野生型およびＶＰＺ過剰発現系統の完全に広がった葉における吸収した光強度の関数としてのガス交換中の非光化学的消光。光強度は、各工程での定常状態を待っている間に低ＰＦＤから高ＰＦＤに増加するか（Ａ）、各光強度の変化の前の４分間の２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１を用いて高ＰＦＤから低ＰＦＤに変動した（Ｂ）。エラーバーは±ｓｅ（ｎ＝６）を示し、アステリスクはＶＰＺ系統と野生型との間の有意差（α＝０．０５）を示す。
【００１９】
【図４】（Ａ〜Ｂ）光強度の関数としての線形電子伝達（Ｊ）および純同化率（Ａｎ）ならびに初期勾配についての対応パラメータ（Ｃ〜Ｄ）。光強度は、各光強度の変化の前の４分間の２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＦＤを用いて高ＰＦＤから低ＰＦＤに変動した。エラーバーは±ｓｅ（ｎ＝６）を示し、アステリスクはＶＰＺ系統と野生型との間の有意差（α＝０．０５）を示す。
【００２０】
【図５】ＶＰＺ過剰発現系統および野生型の実生における２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＦＤ（λｍａｘ＝４７０ｎｍ）への（Ａ）１時間または（Ｂ）２時間の曝露後の光防御指数。１未満の指数の値は光阻害の発生を示す。（Ｃ）１時間（上向きの三角−ＶＰＺ、円−ＷＴ）または２時間（下向きの三角−ＶＰＺ、四角−ＷＴ）の２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１への曝露およびその後の１０分間の暗所緩和後の稚苗における残存ＮＰＱに対してプロットしたＰＳＩＩ効率。エラーバーは±ｓｅ（ｎ＝１８）を示し、アステリスクはＶＰＺと野生型との間の有意差（α＝０．０５）を示す。
【００２１】
【図６】温室実験におけるＷＴと比較した最終的な植物のサイズおよび重量。（Ａ）総乾燥重量／植物、（Ｂ）葉領域／植物、（Ｃ）草高、（Ｄ）葉乾燥重量／植物、（Ｅ）幹乾燥重量／植物、（Ｆ）根乾燥重量／植物。エラーバーは、±ｓｅ（実験１および２についてｎ＝２０およびｎ＝１９）を示し、アステリスクはＶＰＺ系統と野生型との間の有意差（α＝０．０５）を示す。
【００２２】
【図７】光強度の関数としての線形電子伝達および純同化率。光強度は、各光強度の変化の前の４分間の２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＦＤを用いて高ＰＦＤから低ＰＦＤに変動した。（Ａ−Ｂ）線形電子伝達（Ｊ）および純同化率（Ａｎ）ならびに初期勾配（Ｃ−Ｄ）、凸状部（Ｅ−Ｆ）、および漸近線（Ｇ−Ｈ）についての対応パラメータ。エラーバーは、±ｓｅ（ｎ＝６）を示す。
【００２３】
【図８】光強度の関数としての線形電子伝達（Ｊ）および純同化率（Ａｎ）に対する凸状部パラメータ（Ａ−Ｂ）および漸近線パラメータ（Ｃ−Ｄ）。光強度は、各光強度の変化の前の４分間の２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＦＤを用いて高ＰＦＤから低ＰＦＤに変動した。エラーバーは、±ｓｅ（ｎ＝６）を示す。
【００２４】
【図９】ＶＤＥ−ＰｓｂＳ−ＺＥＰ構築物のプラスミドマップ。
【００２５】
【図１０】光防御が光強度の変化に応答する速度の意図する増加目標およびこの過程におけるＶＤＥ、ＰｓｂＳ、およびＺＥＰの役割。青線は、橙色線（野生型）と比較したトランスジェニック植物を示す。
【００２６】
【図１１】表現型の高処理スクリーニング。葉片のクロロフィル蛍光（左）および稚苗のクロロフィル蛍光（右）。
【００２７】
【図１２】ＶＰＺ−２３トランスジェニック植物およびＶＰＺ−３４トランスジェニック植物を野生型植物と比較した成長実験。
【００２８】
【図１３】全ての系統で成長が有意に増大したことを示す温室実験。
【００２９】
【図１４】葉への２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＦＤの事前曝露後の種々の光強度での量子収量およびＣＯ２固定の結果。
【００３０】
【図１５】変動光下でのＮＰＱの動態学。
【００３１】
【図１６】第１の誘導／緩和におけるＮＰＱの時定数。
【００３２】
【図１７】ビオラキサンチンのゼアキサンチンへの変換に関連するＮＰＱ成分（ｑＥ、ｑＺ、およびｑＩ）。
【００３３】
【図１８】Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるＮＰＱ関連遺伝子の一過性過剰発現。左上のパネルは、６００μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１での１３分間の照射中（白色バー）およびその後の１０分間の暗所（黒色バー）でのＦＬＡＧでタグ付けしたＰｓｂＳ、ＶＤＥ、ＺＥＰ、およびネガティブコントロールとしてのＧＵＳを過剰発現する葉スポット上のＮＰＱ測定値を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝６）を示す。右上のパネルは、高光曝露から１０分後のＰＳＢＳ、ＶＤＥ、ＺＥＰ、およびＧＵＳを発現する葉のＮＰＱの疑似カラー画像を示す。虹色のバーは、ＮＰＱの相対量を示す。下のパネルは、右上のパネル中の葉から回収し、抗ＦＬＡＧで探索した組織の免疫ブロット分析を示す。
【００３４】
【図１９】Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるＶＤＥおよびＺＥＰの一過性同時過剰発現が、ＮＰＱの誘導および緩和を急速にする。エラーバーは、標準誤差（ｎ＝４）を示す。
【００３５】
【図２０】一過性Ｔ１子孫のＮＰＱ動態学。６００μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１での１０分間の照射中（白色バー）およびその後の１０分間の暗所（黒色バー）において、ＤＵＡＬ  ＰＡＭを用いて以下の３つの異なる系統についてのＴ１成植物の最も若い完全に広がった葉のＮＰＱを測定した：野生型分離個体の系統（Ｎｕｌｌ）、ＺＥＰを過剰発現する系統（ＺＥＰ）、およびＺＥＰおよびＶＤＥを過剰発現する系統（ＺＥＰ−ＶＤＥ）。各曲線は、３つの異なる植物の平均ＮＰＱ測定値に対応し；エラーバーは標準誤差（ｎ＝３）を示す。
【００３６】
【図２１】Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａの安定なトランスジェニックＴ１植物の光化学系ＩＩ量子収量（ＹＩＩ）。
【００３７】
【図２２】温室での成長実験。図中に４組の植物を示す（トランスジェニック系統あたり１組）。各組は３６株の植物を含む。
【００３８】
【図２３】Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるＮｂＰｓｂＳおよびＲｂｃｓ１ａＡｔＺＥＰ＋Ｇａｐａ１ＡｔＰｓｂＳ＋Ｆｂａ２ＡｔＶＤＥ構築物の一過性過剰発現。
【００３９】
【図２４Ａ−１】（Ａ）ＰｓｂＳ、（Ｂ）ＺＥＰ、および（Ｃ）ＶＤＥの代表的な植物種におけるＮＰＱ遺伝子のアミノ酸アラインメント。
【図２４Ａ−２】同上
【図２４Ａ−３】同上
【図２４Ｂ−１】同上
【図２４Ｂ−２】同上
【図２４Ｂ−３】同上
【図２４Ｂ−４】同上
【図２４Ｂ−５】同上
【図２４Ｂ−６】同上
【図２４Ｃ−１】同上
【図２４Ｃ−２】同上
【図２４Ｃ−３】同上
【図２４Ｃ−４】同上
【図２４Ｃ−５】同上
【００４０】
【図２５】温室条件下で成長したトランスジェニックタバコ植物の葉におけるＶＤＥ、ＰｓｂＳ、およびＺＥＰのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベル。（Ａ、Ｃ、およびＥ）アクチンおよびチューブリンと比較したｍＲＮＡレベル。（Ｂ、Ｄ、およびＦ）免疫ブロットのデンシトメトリーから決定した野生型（ＷＴ）に対するタンパク質レベル。エラーバーは、測定値の標準誤差（ＳＥＭ）（ｎ＝５生物学的反復実験）を示し、アステリスクはＶＰＺ系統とＷＴとの間の有意差（α＝０．０５）を示す。（Ｇ）ＶＤＥ、ＰｓｂＳ、およびＺＥＰの代表的免疫ブロット。
【００４１】
【図２６】フィールド条件下で成長したトランスジェニックタバコ植物の葉におけるＶＤＥ、ＰｓｂＳ、およびＺＥＰのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベル。（Ａ、Ｃ、Ｅ）アクチンおよびチューブリンと比較したｍＲＮＡレベル。（Ｂ、Ｄ、Ｆ）免疫ブロットのデンシトメトリーから決定した野生型（ＷＴ）に対するタンパク質レベル。エラーバーは、ＳＥＭ（ｎ＝４）を示し、アステリスクはＶＰＺ系統とＷＴとの間の有意差（α＝０．０５）を示す。
【００４２】
【図２７】トランスジェニックササゲ１６４３Ｂ１におけるＮＰＱ緩和動態学。Ｘ軸は時間（秒）である。Ｙ軸は正規化ＮＰＱである。
【００４３】
【図２８】トランスジェニックササゲ１６４３Ｂ１におけるＮＰＱの誘導および緩和の動態学。Ｘ軸は時間である。Ｙ軸は４で除したＮＰＱである。
【００４４】
【図２９】トランスジェニックササゲ１６４３Ｂ１における変動光下での正規化したＮＰＱの誘導および緩和の動態学。Ｘ軸は時間である。Ｙ軸は４で除したＮＰＱである。データを、各組内で最高のＮＰＱに対して正規化する。
【００４５】
【図３０】トランスジェニックササゲＣＰ４７２ＡにおけるＮＰＱの誘導および緩和の動態学。Ｘ軸は時間である。Ｙ軸は４で除したＮＰＱである。
【００４６】
【図３１】９種のトランスジェニックイネ系統におけるＮＰＱの誘導および緩和の動態学。
【００４７】
【図３２】トランスジェニックイネにおける平均のＮＰＱの誘導および緩和の動態学。
【００４８】
本特許または本出願のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。カラー図面を含む本特許または本特許出願公開の写しは、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、米国特許商標庁により提供される。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
詳細な説明
植物、ベクター、および方法を、ここに、以下の添付の図面を参照してより完全に説明する。図面は、本発明の全てではないがいくつかの実施形態を示す。実際に、本発明を多数の異なる形態で具体化することができ、本発明を、本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈すべきではない；むしろ、これらの実施形態を、本開示が適用可能な法的要求事項を満たすように提供する。
【００５０】
同様に、本発明が属する分野の当業者は、前述の説明および関連する図面に示した教示の利点を有する本明細書中に記載の植物、ベクター、および方法の多数の修正形態および他の実施形態を思いつく。したがって、本発明が開示の特定の実施形態に制限されず、修正形態および他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されると理解すべきである。本明細書中で特定の用語が使用されているが、これらの用語を一般的且つ説明的な意味のみで使用しており、本発明の制限を目的としない。
【００５１】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する分野の当業者が一般的に理解している意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料を本明細書中に記載する。
定義
【００５２】
別段の記載をしていない限り、技術用語を、従来の使用法に従って使用する。分子生物学における共通の用語の定義は、Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ、２００１（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｋｅｎｄｒｅｗら編、１９９９（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ編、１９９５（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ．  Ｉｎｃ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１に見出され得る。
【００５３】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「遺伝子」、および「オリゴヌクレオチド」を、互換的に使用する。これらの用語は、任意の長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのアナログのいずれか）の重合形態をいう。ポリヌクレオチドは、公知または未知にかかわらず、任意の三次元構造を有することができ、任意の機能を果たすことができる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（複数）（遺伝子座（単数））、エクソン、イントロン、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の改変ヌクレオチド（メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなど）を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造を、ポリマーのアセンブリ前または後に改変することができる。ヌクレオチド配列を、非ヌクレオチド成分によって妨害することができる。ポリヌクレオチドを、標識成分との抱合などによって重合後にさらに改変することができる。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントを、この別のＤＮＡセグメントが複製するように挿入することができるレプリコン（プラスミド、ファージ、またはコスミドなど）である。本明細書中に記載のベクターは、発現ベクターであり得る。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「発現ベクター」は、１つまたは複数の発現制御配列を含むベクターである。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「発現制御配列」または「発現カセット」は、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を調節および制御するＤＮＡ配列である。発現制御配列は、異種または非異種のプロモーターを含み得る。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「作動可能に連結された」は、発現制御配列が目的のコード配列の発現を有効に制御するように遺伝子構築物に組み込まれることを意味する。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「形質転換された」および「トランスフェクトされた」は、当該分野で公知のいくつかの技術による細胞内への核酸（例えば、ベクター）の導入を含む。
【００５９】
「プラスミド」を、大文字および／または数字の前および／または後の小文字の「ｐ」によって示す。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「発現レベル」は、所与の核酸またはポリペプチドの測定可能な発現レベルをいう。所与の核酸またはポリペプチドの発現レベルを、当該分野で周知の方法によって決定する。用語「差次的に発現された」または「差次的発現」は、所与の核酸またはポリペプチドの測定可能な発現レベルの増加または減少をいう。「差次的に発現された」または「差次的発現」は、比較のために使用した２つの試料における所与の核酸またはポリペプチドの発現レベルの１倍またはそれを超える（２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍まで（記載の数値を含む）またはそれを超える）相違を意味する。２つの試料のうちの１つが所与の核酸またはポリペプチドの検出可能な発現を含まない場合、所与の核酸またはポリペプチドは、２つの試料中で「差次的に発現された」ともいわれる。
【００６１】
多型は、ゲノム内のヌクレオチド配列の変動をいい、この変動は機能的意義を持っても持たなくても良い。これらのバリアントを遺伝子マーカーとして作出し、遺伝学的調査（遺伝的差異を目的の形質の変動と関連付ける解析が含まれる）の全ての局面で使用することができる。本明細書中で使用される場合、用語「多型」には、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入／欠失（ＩｎＤｅｌ）、単純反復配列（ＳＳＲ）、存在／非存在変動（ＰＡＶ）、およびコピー数多型（ＣＮＶ）が含まれるが、これらに限定されない。多型は、天然に存在し得るか、人為的に誘導することができる。多型の誘導および検出方法は、当該分野で周知である。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列をいう。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントを、しばしば、エンハンサーという。「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、且つ、先天性プロモーターエレメントまたはプロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するように挿入された異種エレメントであり得る。プロモーターは、その完全な形態でネイティブ遺伝子から誘導され得るか、自然界で見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成され得、そして／または合成ＤＮＡセグメントを含み得る。当業者は、異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、異なる発生段階で、または異なる環境条件に応答して遺伝子発現を指示することができると理解している。ほとんどの場合で制御配列の正確な境界は完全に定義されていないので、いくらか変動のあるＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識される。当該分野で周知であるように、プロモーターを、その強さおよび／または活性な条件にしたがって分類することができる（例えば、構成性プロモーター、強力プロモーター、弱いプロモーター、誘導／抑制プロモーター、組織特異的／発生学的に制御されたプロモーター、細胞周期依存性プロモーターなど）。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「ゲノム編集」は、人為的に操作されたヌクレアーゼ（すなわち、「分子鋏」）を使用してＤＮＡをゲノムに挿入するか、置換するか、除去するタイプの遺伝子操作である。ゲノム編集は、配列特異的様式で遺伝子の機能および影響を解明し、ゲノム内を変更して所望の表現型に変化させるための有用なツールである。ゲノム編集システムには、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
用語「植物」は、植物界の種々の光合成真核多細胞生物のうちのいずれかをいい、胚を発生し、クロロプラストを含み、セルロース細胞壁を有し、運動性を欠くことを特徴とする。本明細書中で使用される場合、「植物」には、任意の発生段階の任意の植物または植物の一部（種子、懸濁培養、植物細胞、胚、分裂領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、小胞子、およびその子孫が含まれる）が含まれる。切断物および細胞培養物または組織培養物も含まれる。本開示と併せて使用する場合、植物組織には、例えば、植物全体、植物細胞、植物器官（例えば、葉、茎、根、分裂組織、植物の種子、プロトプラスト、カルス、細胞培養物）、ならびに構造単位および／または機能単位に整理した任意の植物細胞グループが含まれる。
【００６５】
用語「植物」を、その最も広い意味で使用する。植物には、木本、花卉または装飾花、作物または穀類、果実または野菜、および藻類（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の任意の種が含まれるが、これらに限定されない。植物はまた、植物の任意の発生段階で存在する構造に広範に分化する複数の植物細胞をいう。かかる構造には、果実、苗条、茎、葉、花弁などが含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書中で使用される用語「コントロール植物」または「野生型」は、トランスジェニック植物または遺伝子改変植物における表現型の増強または所望の形質の同定を目的としてトランスジェニック植物または遺伝子改変植物と比較するために使用される植物細胞、外植体、種子、植物成分、植物組織、植物器官、または植物全体をいう。「コントロール植物」は、いくつかの場合、空のベクターまたはマーカー遺伝子を含むが、評価されるトランスジェニック植物または遺伝子改変植物内に存在する目的の組み換えポリヌクレオチドを含まないトランスジェニック植物系統であり得る。コントロール植物は、試験されるトランスジェニック植物または遺伝子改変植物と同一の系統または変種の植物であり得るか、別の系統または変種（特異的な表現型、特徴、または公知の遺伝子型を有することが公知の植物など）であり得る。適切なコントロール植物には、本明細書中のトランスジェニック植物を生成するために使用された親系統の遺伝的に不変な植物または非トランスジェニック植物が含まれるであろう。
【００６７】
用語「植物組織」には、植物の分化組織および未分化組織（根、苗条、葉、花序、葯、花粉、子房、種子、および腫瘍内に存在する組織が含まれる）ならびに培養細胞（例えば、単一細胞、プロトプラスト、胚、カルスなど）が含まれる。植物組織は、植物体内、器官培養物内、組織培養物内、または細胞培養物内に存在し得る。
【００６８】
本明細書中で使用される用語「植物の一部」は、植物構造、植物器官、または植物組織をいう。
【００６９】
「天然に存在しない植物」は、人間の介入無しには天然に存在しない植物をいう。天然に存在しない植物には、トランスジェニック植物、遺伝子操作によって作出された植物、および伝統的または市場支援による植物育種などの非トランスジェニック手段によって生成された植物が含まれる。
【００７０】
用語「植物細胞」は、プロトプラストおよび細胞壁を含む植物の構造単位および生理学的単位をいう。植物細胞は、単離された単一細胞もしくは培養細胞の形態またはより高次に集合した単位（例えば、植物組織、植物器官、または植物全体など）の一部としての形態であり得る。用語「植物細胞培養物」は、植物単位の培養物（例えば、液体培地中または固体培地上のプロトプラスト、細胞および細胞集塊、植物の組織および器官、小胞子および花粉、花粉管、葯、胚珠、胚嚢、接合体、ならびに種々の発生段階の胚内の細胞など）をいう。
【００７１】
用語「植物材料」は、葉、茎、根、花序および花もしくは花の一部、果実、花粉、葯、卵細胞、接合体、種子、切断物、細胞培養物もしくは組織培養物、または植物の任意の他の部分もしくは生成物をいう。
【００７２】
「植物器官」は、植物の個別且つ見かけ上構造化および分化した部分（根、茎、葉、花芽、花序、小穂、小花、種子、または胚など）をいう。
【００７３】
用語「作物」は、特に、単子葉類（穀類（コムギ、キビ、モロコシ、ライムギ、ライコムギ、カラスムギ、オオムギ、テフ、スペルトコムギ、ソバ、フォニオ、およびキノア）、イネ、メイズ（トウモロコシ）、および／またはサトウキビなど）；または双子葉類の作物（ビート（サトウダイコンまたは飼料用ビートなど）など）；果実（ナシ状果、核果、またはソフトフルーツ、例えば、リンゴ、セイヨウナシ、セイヨウスモモ、モモ、アーモンド、サクランボ、イチゴ、ラズベリー、またはブラックベリーなど）；マメ科植物（マメ、レンズマメ、エンドウマメ、またはダイズなど）；油料植物（セイヨウアブラナ、カラシ、ポピー、オリーブ、ヒマワリ、ココナツ、トウゴマ、カカオ豆、またはラッカセイなど）；ウリ科植物（マロー、キュウリ、またはメロンなど）；繊維植物（ワタ、アマ、アサ、またはジュートなど）；柑橘類果実（オレンジ、レモン、グレープフルーツ、またはマンダリンなど）；野菜類（ホウレンソウ、レタス、キャベツ、ニンジン、トマト、ジャガイモ、カボチャ類、またはパプリカなど）；クスノキ科（アボカド、シナモン、またはカンフルなど）；タバコ；堅果；コーヒー；茶；ブドウ；ホップ；ドリアン；バナナ；ゴムノキ；および観賞用植物（花、灌木、広葉樹または常緑樹、例えば、針葉樹など）を意味する。このリストは、いかなる制限も示さない。
【００７４】
用語「木質作物」または「木本」は、その構造組織として木を生産する植物を意味する。木質作物には、樹木、灌木、またはつる植物が含まれる。木質作物の例には、アメリカサイカチ、ハイブリッドクリ、クログルミ、イロハモミジ、ユーカリ、モクマオウ、エゾマツ、モミ、マツ（例えば、Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａおよびＰｉｎｕｓ  ｃａｒｉｂａｅａ）、およびアメリカヤマボウシが含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書において、用語「成長の改善」または「成長の増加」をその最も広い意味で使用する。この用語には、植物の成長過程および発生過程の任意の改善または増強が含まれる。成長の改善の例には、光合成効率の増加、バイオマスの増加、収量の増加、種子数の増加、種子重量の増加、茎の高さの増加、葉領域の増加、および植物乾燥重量の増加が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
「量子収量」は、吸収された量子（光子）１モルあたりの固定ＣＯ２のモル数、あるいは、光の固定炭素への変換効率を意味する。光合成の量子収量は、光強度および光合成速度の測定値から導く。そのようなものとして、量子収量は、吸収された光が特定の効果を発揮する効率の尺度である。植物細胞または植物における光合成量を、トランスジェニック植物または植物細胞によるデンプンの産生量の測定によって直接検出することができる。植物細胞培養物または植物における光合成量を、ＣＯ２検出器（例えば、ＣＯ２の減少または消費が光合成レベルの増加を示す）またはＯ２検出器（例えば、Ｏ２レベルの増加が光合成レベルの増加を示す（例えば、Ｓｉｌｖａら，Ａｑｕａｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：１２７−１４１，２００９；およびＢａｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３３：１６７５−１６８１，２０１１に記載の方法を参照のこと））を使用して検出することもできる。光合成を、放射性標識ＣＯ２（例えば、１４ＣＯ２およびＨ１４ＣＯ３−）を使用して測定することもできる（例えば、Ｓｉｌｖａら，Ａｑｕａｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：１２７−１４１，２００９およびこの論文中で引用した参考文献中に記載の方法を参照のこと）。光合成を、クロロフィル蛍光の検出によって測定することもできる（例えば、Ｓｉｌｖａら，Ａｑｕａｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：１２７−１４１，２００９およびこの論文中で引用した参考文献）。植物における光合成のさらなる検出方法は、Ｚｈａｎｇら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３８：４３６９−４３７９，２０１１に記載されている。
【００７７】
物理科学の分野では、用語「緩和」は、摂動系から平衡へ（通常、高エネルギーレベルから低エネルギーレベルへ）戻ることを意味する。本明細書中で使用される場合、用語「非光化学的消光緩和」または「ＮＰＱ緩和」は、高光強度から低光強度への遷移の際にＮＰＱレベルが低下する過程をいう。
【００７８】
本明細書中の値またはパラメータに付する「約」という用語は、本技術分野の当業者が容易に理解する各値についての通常の誤差範囲をいう。本明細書中の値またはパラメータに付する「約」という用語は、この値またはパラメータ自体を指示する態様を含む（そして説明する）。例えば、「約Ｘ」に関する記述には、「Ｘ」の記述を含む。
概要
【００７９】
世界人口が急激に増加する中で、世界を政治的および社会的に安定させるには食糧生産量をさらに増加させることが不可欠である。したがって、２０５０年までにこのような需要を満たすために必要とされる２倍の作物生産が計画されている。それ故、光合成などの重要な作物の特性の根底にある生理学的過程をより深く理解することは、世界の食料安全保障の危機の改善への鍵である。光合成は、光エネルギーを化学エネルギーに変換するために植物および緑藻類によって使用される過程であり、この化学エネルギーをその後に放出して生物の活動を促進することができ、光合成の間に大気二酸化炭素（ＣＯ２）が同化され、酸素が放出される。光子（量子）の吸収量に対するＣＯ２の固定量または同化量の比（量子収量としても公知）を、一般に、植物の光合成効率の尺度として使用する。
【００８０】
光は光合成に必要であるが、葉が高光強度に曝露された場合に損傷が起こり得る。これを回避するために、植物はいくつかの光防御機構を発達させている。非光化学的消光（ＮＰＱ）は光防御機構の１つであり、過剰に吸収した照射を熱として散逸する。しかし、植物が高光強度から低光強度に移行するとき、ＮＰＱがＣＯ２固定を阻害するという事実により、光合成の量子収量は一過性に低下する。さらに、ＮＰＱは、高光強度で急速にオンになる（誘導される）が、再度照射が制限された際によりゆっくりオフになる（緩和される）。結果として、変動光下（天然のフィールド条件下でありふれた状況）での植物の光合成効率および成長が損なわれる。
【００８１】
本開示は、植物の高光強度から低光強度への移行後にＮＰＱの緩和を急速にし、それによりＣＯ２固定の光合成量子収量をより迅速に回収する方法を提供する。この方法は、光化学系ＩＩサブユニットＳ（ＰｓｂＳ）、ゼアキサンチンエポキシダーゼ（ＺＥＰ）、およびビオラキサンチンデエポキシダーゼ（ＶＤＥ）をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列の発現を増加させる工程を含む。ＮＰＱの大きさを減少させることなくこの発現が増加するので、高光強度下での通常の光防御に影響を及ぼさない。植物が高光強度から低光強度への移行を頻繁に受ける変動光条件下では、この方法により、光防御効率が改善され、植物の光合成効率および成長も改善される。
【００８２】
本開示は、光合成および成長を改善するために植物を遺伝子操作する方法をさらに提供する。ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、現在利用可能な方法（プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、微粒子銃が含まれるが、これらに限定されない）によって植物に導入することができる。この方法を使用して、植物種（タバコ、コムギ、メイズ、イネ、ダイズ、モロコシ、キャッサバ、ササゲ、ポプラ、およびユーカリが含まれるが、これらに限定されない）における光合成および成長が改善されたトランスジェニック植物を産生することができる。
【００８３】
ＮＰＱ応答および関連するキサントフィルサイクルの根底にある機序が植物および緑藻類にわたって高度に保存されていることが当該分野で周知である。例えば、Ｎｉｙｏｇｉ  ＫＫ，Ｔｒｕｏｎｇ  ＴＢ（２０１３）．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｎｏｎ−ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｌｉｇｈｔ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ｏｘｙｇｅｎｉｃ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ  １６：３０７−３１４、Ｋｏｚｉｏｌ  ＡＧ，Ｂｏｒｚａ  Ｔ，Ｉｓｈｉｄａ  Ｋ−Ｉ，Ｋｅｅｌｉｎｇ  Ｐ，Ｌｅｅ  ＲＷ，Ｄｕｒｎｆｏｒｄ  ＤＧ（２００７）．Ｔｒａｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｇｈｔ−ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ａｎｔｅｎｎａｅ  ｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ／ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４３：１８０２−１８１６、Ｅｎｇｅｌｋｅｎ  Ｊ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｈ，Ａｄａｍｓｋａ  Ｉ（２０１０）．Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ＬＨＣ（ｌｉｇｈｔ−ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）ａｎｔｅｎｎａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｌ  １０：２３３、Ｂｒｏｏｋｓ  ＭＤ，Ｊａｎｓｓｏｎ  Ｓ，Ｎｉｙｏｇｉ  ＫＫ（２０１４）．ＰｓｂＳ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｏｎ−ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ．Ｉｎ：  Ｎｏｎ−ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｅｒｇｙ  ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ，ａｌｇａｅ  ａｎｄ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｄｅｍｍｉｇ−Ａｄａｍｓ  Ｂ，Ｇａｒａｂ  Ｇ，Ａｄａｍｓ  ＷＷ  ＩＩＩ，Ｇｏｖｉｎｄｊｅｅ  ｅｄｓ．（Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ），ｐｐ．２９７−３１４、Ｋａｓａｊｉｍａ  Ｉ，Ｅｂａｎａ  Ｋ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，Ｔａｋａｈａｒａ  Ｋ，Ｙａｎｏ  Ｍ，Ｋａｗａｉ−Ｙａｍａｄａ  Ｍ，Ｕｃｈｉｍｉｙａ  Ｈ（２０１１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｉｎ  ｒｉｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：１３８３５−１３８４０、Ａｌｂｏｒｅｓｉ  Ａ，Ｇｅｒｏｔｔｏ  Ｃ，Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ  ＧＭ，Ｂａｓｓｉ  Ｒ，Ｍｏｒｏｓｉｎｏｔｔｏ  Ｔ（２０１０）．Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｏｎ  ｈｅａｔ  ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ  ｃｌａｒｉｆｙ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｐｏｎ  ｌａｎｄ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：１１１２８−１１１３３、およびＧｏｓｓ  Ｒ，Ｌｅｐｅｔｉｔ  Ｂ（２０１５）．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＮＰＱ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１７２，１３−３２を参照のこと。したがって、本発明中に開示の方法を、全ての植物およ��緑藻類に適用することができる。
【００８４】
別段の指示がない限り、本開示は、当業者の技能範囲内の植物形質転換、植物育種、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの全ての従来技術を含む。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７；  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  、Ｍ．  Ｄ．  Ｈａｙｗａｒｄら、１９９３；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９５、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．）；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）：  ＰＣＲ  ２：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．  Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓおよび
Ｇ．  Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５を参照のこと。
【００８５】
１つの態様では、発現制御配列に作動可能に連結されたＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物、植物の一部、植物材料、植物種子、または植物細胞を提供する。一実施形態では、、ＰｓｂＳポリペプチドは、配列番号１のヌクレオチド配列にコードされ、ＺＥＰポリペプチドは、配列番号２のヌクレオチド配列にコードされ、ＶＤＥポリペプチドは、配列番号３のヌクレオチド配列にコードされる。別の実施形態では、、トランスジェニック植物は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよびＶＤＥをコードするヌクレオチド配列を含む。Ｔｈｅトランスジェニック植物は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよびＶＤＥのうちの少なくとも２つの任意の組み合わせを含んでもよいし、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよびＶＤＥのうちの１つだけを含んでもよい。Ｔｈｅヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％配列同一であり得る。別の実施形態では、、ＰｓｂＳポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＺＥＰポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＶＤＥポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。Ｔｈｅポリペプチドは、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％アミノ酸配列同一であり得る。シロイヌナズナＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのヌクレオチドおよび前述のヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドのホモログは、ほとんどの植物種および以下に列挙した植物に存在し、このヌクレオチドをシロイヌナズナ遺伝子の代わりに使用することができる。
【００８６】
別の実施形態では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥと類似の活性を有する酵素、または保存されたドメインを有する酵素を代替的に使用することができ、これらに限定されないが、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜、飼料、工芸、木質、およびバイオマス作物におけるホモログが挙げられる。ＰｓｂＳはクロロａ＿ｂ結合ドメイン（配列番号７）が保存されており、ＺＥＰはＮＡＤＢ＿ＲｏｓｓｍａｎおよびＦＨＡスーパーファミリードメイン（配列番号８）を含み、ＶＤＥはリポカリンドメイン（配列番号９）を有する。これらのドメインを有するホモログも使用することができる。
【００８７】
別の実施形態では、トランスジェニック植物、または植物の一部、または植物材料、または植物種子、または植物細胞は、作物、モデル植物、単子葉の植物、双子葉の植物、ベンケイソウ型酸代謝（ＣＡＭ）光合成植物、Ｃ３光合成植物、Ｃ４光合成植物、一年生植物、温室植物、園芸種の顕花植物、多年生植物、スイッチグラス植物、メイズ植物、バイオマス植物、またはサトウキビ植物である。別の実施形態では、植物は、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜、飼料、工芸、木質、およびバイオマス作物から選択される。１つのさらなる実施形態では、トランスジェニック植物はＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍである。別の実施形態では、植物は、変動光条件下での量子収量および／またはＣＯ２固定が改善されており、そして／または成長が改善されている。遺伝子発現レベルのバランスは、植物改善で役割を果たし得る。１つの実施形態では、ＶＤＥポリペプチドおよびＺＥＰポリペプチドは、相対的に類似するレベルで発現する。
【００８８】
別の実施形態では、トランスジェニック植物、植物の一部、植物材料、植物種子、または植物細胞は、さらなる特徴（例えば、除草剤抵抗性、昆虫または有害生物に対する抵抗性、病害抵抗性、改変脂肪酸代謝、および／または改変炭水化物代謝）を有する。
【００８９】
別の態様では、発現ベクターであって、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択される１つまたは複数のポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つの発現制御配列を含む発現ベクターを提供する。１つの実施形態では、ベクターは、植物、植物の一部、植物材料、植物種子、または植物細胞内でＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択される１つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を駆動することができるプロモーターを含む少なくとも１つの発現制御配列を含む。別の実施形態では、プロモーターは、Ｒｂｃｓ１Ａ、ＧＡＰＡ−１、およびＦＢＡ２から選択される。１つのさらなる実施形態では、ベクターは、ＺＥＰの発現を駆動するＲｂｃｓ１Ａプロモーター、ＰｓｂＳの発現を駆動するＧＡＰＡ−１プロモーター、およびＶＤＥの発現を駆動するＦＢＡ２プロモーターを含む。別の実施形態では、ベクターはＴ−ＤＮＡである。別の実施形態では、ベクターは図９に示すベクターを含む。別の実施形態では、ベクターは、作物、モデル植物、単子葉の植物、双子葉の植物、ベンケイソウ型酸代謝（ＣＡＭ）光合成植物、Ｃ３光合成植物、Ｃ４光合成植物、一年生植物、温室植物、園芸種の顕花植物、多年生植物、スイッチグラス植物、メイズ植物、バイオマス植物、またはサトウキビ植物の植物、植物の一部、または植物材料、または植物種子、または植物細胞内でＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現し得る。別の実施形態では、植物は、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜、飼料、工芸、木質、およびバイオマス作物から選択される。
【００９０】
別の態様では、本明細書中に記載の組換えベクターを含むトランスジェニック植物、植物の一部、植物材料、または植物種子を提供する。
【００９１】
別の態様では、植物、植物の一部、植物材料、植物種子、または植物細胞におけるバイオマス生産および／または炭素固定および／または成長を増加させる方法であって、植物、植物組織、植物種子、または植物細胞のゲノム内に、１つまたは複数の発現制御配列に作動可能に連結されたＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を導入する工程を含む方法を提供する。配列番号１、配列番号２、および配列番号３のヌクレオチドにコードされるポリペプチドの組み込みによって変動光条件下での量子収量、ＣＯ２固定が増加し、植物成長が改善されることが見出された。１つの実施形態では、本方法は、本明細書中に記載の組換えベクターを含む。
本開示のトランスジェニック植物
【００９２】
一態様では、本明細書において提供されるのは、１つまたは複数のポリペプチドＰｓｂＳ、ＺＥＰ、またはＶＤＥをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を有するトランスジェニック植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＰｓｂＳをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＺＥＰをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＶＤＥをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＰｓｂＳおよびＺＥＰをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＰｓｂＳおよびＶＤＥをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＺＥＰおよびＶＤＥをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよびＶＤＥをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を有する。
【００９３】
上記のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、双子葉植物に由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、単子葉植物に由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ｚｅａ  ｍａｙｓに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａに由来する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列は、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜作物、飼料作物、工芸作物、木質作物、またはバイオマス作物に由来する。
【００９４】
上記のいくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳまたはＺＥＰのいずれかの転写物レベルは、コントロール植物と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、または少なくとも約３０倍増大する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳまたはＺＥＰのいずれかのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍増大する。
【００９５】
光防御機序は、高等植物間で高度に保存されている。保存の程度（すなわち、相同性）を、目的の遺伝子のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列比較によって解析することができる。本明細書中で使用される「配列同一性」は、解析される配列内の同一の位置で同一である残基の百分率をいう。比較のための配列アラインメント法は、当業者に周知であり、手作業のアラインメントおよびコンピュータ支援の配列アラインメントおよび解析が含まれるが、これらに限定されない。この後者のアプローチは、コンピュータ支援法によって処理量が増加するので、本開示において好ましいアプローチである。任意の２配列間の配列同一率を、数学アルゴリズムを使用して決定することができる。かかる数学アルゴリズムの例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈら，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８（１９８８）の類似性検索法；Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）のアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７（１９９３）などにおいて修正）である。コンピュータによって実行されるこれらの数学アルゴリズムを、配列同一性および／または類似性を決定するための配列比較のために利用することができる。かかる実行には、例えば、以下が含まれる：ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．から利用可能）；ＡｌｉｇｎＸプログラム、バージョン１０．３．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ならびにＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン８内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡから利用可能）。これらのプログラムを使用したアラインメントを、デフォルトパラメータを使用して実施することができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇら、ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５−６５（１９９２）；およびＰｅａｒｓｏｎら，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１（１９９４）によって十分に説明されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０），前出��アルゴリズムに基づいている。
【００９６】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号７の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号８の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号９の保存されたドメインをさらに含む。
【００９７】
上記のいくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、発現ベクターを含み、前述の発現ベクターは、本明細書中に記載の１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、またはＶＤＥのうちのいずれかをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を有する発現ベクターを含む種子を産生する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物に由来する種子は、子孫植物をさらに産生する。
【００９８】
上記のいくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、変動光条件下のコントロール植物と比較して、変動光条件下での成長が増大する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、変動光条件下のコントロール植物と比較して、変動光条件下での光合成効率が増大する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、変動光条件下のコントロール植物と比較して、変動光条件下での光防御効率が改善される。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、変動光条件下のコントロール植物と比較して、変動光条件下での量子収量およびＣＯ２固定が改善される。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は優良系統または優良株である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、除草剤抵抗性、昆虫または有害生物に対する抵抗性、病害抵抗性、改変脂肪酸代謝、および／または改変炭水化物代謝を提供する少なくとも１つのさらなるポリペプチドの発現をさらに含む。
【００９９】
上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥの転写物レベルは、コントロール植物と比較して３倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルは、コントロール植物と比較して３倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰの転写物レベルは、コントロール植物と比較して８倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥの転写物レベルは、コントロール植物と比較して１０倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルは、コントロール植物と比較して３倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰの転写物レベルは、コントロール植物と比較して６倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥの転写物レベルは、コントロール植物と比較して４倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルは、コントロール植物と比較して１．２倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰの転写物レベルは、コントロール植物と比較して７倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して１６倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して２倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して８０倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して３０倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して４倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して７４倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して４７倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して３倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して７５倍増大する。上記のいくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの間のコントロール植物と比較した植物における転写物レベルの増大は、３：３：８、１０：３：６、または４：１．２：７の比を有する。上記のいくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの間のコントロール植物と比較した植物におけるタンパク質レベルの増大は、１６：２：８０、３０：４：７４、または４７：３：７５の比を有する。上記のいくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物におけるＶＤＥの転写物レベルの増大は、３倍から１０倍の範囲である。上記のいくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルの増大は、約１．２倍から約３倍である。上記のいくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物におけるＺＥＰの転写物レベルの増大は、約６倍から約８倍である。上記のいくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物中のＶＤＥのタンパク質レベルの増大は、１６倍から４７倍の範囲である。上記のいくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物中のＰｓｂＳのタンパク質レベルの増大は、約２倍から約４倍である。上記のいくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物中のＺＥＰのタンパク質レベルの増大は、約７４倍から約８０倍である。
本開示の発現ベクター
【０１００】
別の態様では、本開示は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのいずれかをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を有する発現ベクターに関する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＰｓｂＳをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＺＥＰをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＶＤＥをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＰｓｂＳおよびＺＥＰをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＰｓｂＳおよびＶＤＥをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＺＥＰおよびＶＤＥをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよびＶＤＥをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を有する。
【０１０１】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号７の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号８の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号９の保存されたドメインをさらに含む。
【０１０２】
上記のいくつかの実施形態では、ベクターは、植物内でＰｓｂＳ、ＺＥＰ、またはＶＤＥのヌクレオチド配列の発現を駆動することができるプロモーターを有する１つまたは複数の発現制御配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成性プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは弱いプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは種子および／または胚特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは葉特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは時間特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは葯および／または花粉特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは花特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、発現ベクター中でプロモーターの組み合わせを使用する。
【０１０３】
上記のいくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｒｂｃｓ１Ａ、ＧＡＰＡ−１、またはＦＢＡ２である。いくつかの実施形態では、Ｒｂｃｓ１ＡプロモーターはＺＥＰの発現を駆動し、ＧＡＰＡ−１プロモーターはＰｓｂＳの発現を駆動し、ＦＢＡ２プロモーターはＶＤＥの発現を駆動する。いくつかの実施形態では、ベクターはＴ−ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、抗生物質抵抗性を提供するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、発現制御配列ならびにＰｓｂＳポリペプチド、ＺＥＰポリペプチド、およびＶＤＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に隣接する左境界（ＬＢ）ドメインおよび右境界（ＲＢ）ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、細菌細胞内に存在する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、アグロバクテリウム細胞内に存在する。
開示の方法
【０１０４】
一定の他の態様では、本開示は、植物内での１つまたは複数の本明細書中に記載のポリペプチドの発現を増加させる工程を含む、植物における光合成および成長を増加させる方法に関する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかをコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を植物に導入することによって発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかをコードする内因性ヌクレオチド配列の発現を改変することによって発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかをコードする内因性ヌクレオチド配列のプロモーターを改変することによって発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかの転写効率を制御する転写因子を改変することによって発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかのｍＲＮＡの安定性を増加させることによって発現を増加させる。いくつかの実施形態では、標的植物内のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかのコドン使用頻度を最適化することによって発現を増加させる。いくつかの実施形態では、植物におけるエピジェネティクスを変化させることによって発現を増加させる。いくつかの実施形態では、植物におけるＤＮＡメチル化を変化させることによって発現を増加させる。いくつかの実施形態では、植物におけるヒストン修飾を変化させることによって発現を増加させる。いくつかの実施形態では、植物におけるスモールＲＮＡ（ｓＲＮＡ）を変化させることによって発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかの翻訳効率を増加させることによって発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ゲノム編集技術（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲが含まれるが、これらに限定されない）を、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかの発現を制御するヌクレオチド配列を改変するために使用する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥの転写物レベルは、コントロール植物と比較して３倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルは、コントロール植物と比較して３倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰの転写物レベルは、コントロール植物と比較して８倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥの転写物レベルは、コントロール植物と比較して１０倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルは、コントロール植物と比較して３倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰの転写物レベルは、コントロール植物と比較して６倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥの転写物レベルは、コントロール植物と比較して４倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルは、コントロール植物と比較して１．２倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰの転写物レベルは、コントロール植物と比較して７倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して１６倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して２倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して８０倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して３０倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して４倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して７４倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＶＤＥのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して４７倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＰｓｂＳのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して３倍増大する。いくつかの実施形態では、植物におけるＺＥＰのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して７５倍増大する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの間のコントロール植物と比較した植物における転写物レベルの増大は、３：３：８、１０：３：６、または４：１．２：７の比を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの間のコントロール植物と比較した植物におけるタンパク質レベルの増大は、１６：２：８０、３０：４：７４、または４７：３：７５の比を有する。いくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物におけるＶＤＥの転写物レベルの増大は、３倍から１０倍の範囲である。いくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物におけるＰｓｂＳの転写物レベルの増大は、約１．２倍から約３倍である。いくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物におけるＺＥＰの転写物レベルの増大は、約６倍から約８倍である。いくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物中のＶＤＥのタンパク質レベルの増大は、１６倍から４７倍の範囲である。いくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物中のＰｓｂＳのタンパク質レベルの増大は、約２倍から約４倍である。いくつかの実施形態では、コントロール植物と比較した植物中のＺＥＰのタンパク質レベルの増大は、約７４倍から約８０倍である。
変動光条件下で成長を増大させる方法
【０１０７】
１つの態様では、変動光条件下で植物の成長を増大させる方法であって、植物中のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの発現を増大させ、それにより、コントロール植物と比較して１つまたは複数のポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む方法を本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、発現の増大は、転写物レベルの増大の形態である。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳまたはＺＥＰのいずれかの転写物レベルは、コントロール植物と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、または少なくとも約３０倍増大する。いくつかの実施形態では、発現の増大は、タンパク質レベルの増大の形態である。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳまたはＺＥＰのいずれかのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍増大する。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＺＥＰの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳおよびＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＺＥＰおよびＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよびＶＤＥの発現を増大させる。
【０１０８】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。
【０１０９】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号７の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号８の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号９の保存されたドメインをさらに含む。
【０１１０】
上記のいくつかの実施形態では、植物はＺｅａ  ｍａｙｓである。いくつかの実施形態では、植物はＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒである。いくつかの実施形態では、植物はＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。いくつかの実施形態では、植物はＶｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＰｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＨｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍである。いくつかの実施形態では、植物はＳａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物は、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜作物、飼料作物、工芸作物、木質作物、またはバイオマス作物
である。
変動光条件下で光合成効率を増大させる方法
【０１１１】
別の態様では、変動光条件下で植物における光合成効率を増大させる方法であって、植物中のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、またはＶＤＥのいずれかの発現を増大させ、それにより、コントロール植物と比較して１つまたは複数のポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む方法を本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、発現の増大は、転写物レベルの増大の形態である。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳまたはＺＥＰのいずれかの転写物レベルは、コントロール植物と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、または少なくとも約３０倍増大する。いくつかの実施形態では、発現の増大は、タンパク質レベルの増大の形態である。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳまたはＺＥＰのいずれかのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍増大する。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＺＥＰの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳおよびＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＺＥＰおよびＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよびＶＤＥの発現を増大させる。
【０１１２】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。
【０１１３】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号７の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号８の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号９の保存されたドメインをさらに含む。
【０１１４】
上記のいくつかの実施形態では、植物はＺｅａ  ｍａｙｓである。いくつかの実施形態では、植物はＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒである。いくつかの実施形態では、植物はＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。いくつかの実施形態では、植物はＶｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＰｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＨｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍである。いくつかの実施形態では、植物はＳａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物は、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜作物、飼料作物、工芸作物、木質作物、またはバイオマス作物
である。
変動光条件下で光防御効率を増大させる方法
【０１１５】
別の態様では、変動光条件下で植物における光防御効率を増大させる方法であって、植物中のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの発現を増大させ、それにより、コントロール植物と比較して１つまたは複数のポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む方法を本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、発現の増大は、転写物レベルの増大の形態である。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳまたはＺＥＰのいずれかの転写物レベルは、コントロール植物と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、または少なくとも約３０倍増大する。いくつかの実施形態では、発現の増大は、タンパク質レベルの増大の形態である。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳまたはＺＥＰのいずれかのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍増大する。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＺＥＰの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳおよびＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＺＥＰおよびＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよびＶＤＥの発現を増大させる。
【０１１６】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。
【０１１７】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号７の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号８の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号９の保存されたドメインをさらに含む。
【０１１８】
上記のいくつかの実施形態では、植物はＺｅａ  ｍａｙｓである。いくつかの実施形態では、植物はＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒである。いくつかの実施形態では、植物はＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。いくつかの実施形態では、植物はＶｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＰｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＨｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍである。いくつかの実施形態では、植物はＳａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物は、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜作物、飼料作物、工芸作物、木質作物、またはバイオマス作物
である。
変動光条件下で量子効率およびＣＯ２固定を増大させる方法
【０１１９】
別の態様では、変動光条件下で植物における量子効率およびＣＯ２固定を増大させる方法であって、植物中のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの発現を増大させ、それにより、コントロール植物と比較して１つまたは複数のポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む方法を本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、発現の増大は、転写物レベルの増大の形態である。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳまたはＺＥＰのいずれかの転写物レベルは、コントロール植物と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、または少なくとも約３０倍増大する。いくつかの実施形態では、発現の増大は、タンパク質レベルの増大の形態である。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳまたはＺＥＰのいずれかのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍増大する。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＺＥＰの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳおよびＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＺＥＰおよびＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよびＶＤＥの発現を増大させる。
【０１２０】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。
【０１２１】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号７の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号８の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号９の保存されたドメインをさらに含む。
【０１２２】
上記のいくつかの実施形態では、植物はＺｅａ  ｍａｙｓである。いくつかの実施形態では、植物はＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒである。いくつかの実施形態では、植物はＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。いくつかの実施形態では、植物はＶｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＰｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＨｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍである。いくつかの実施形態では、植物はＳａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物は、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜作物、飼料作物、工芸作物、木質作物、またはバイオマス作物
である。
変動光条件下で非光化学的消光（ＮＰＱ）の緩和速度を増大させる方法
【０１２３】
別の態様では、植物における非光化学的消光（ＮＰＱ）の緩和速度を増大させる方法であって、植物中のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの発現を増大させ、それにより、コントロール植物と比較して１つまたは複数のポリペプチドの発現が増大した植物が産生される、発現を増大させる工程を含む方法を本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、発現の増大は、転写物レベルの増大の形態である。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳまたはＺＥＰのいずれかの転写物レベルは、コントロール植物と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、または少なくとも約３０倍増大する。いくつかの実施形態では、発現の増大は、タンパク質レベルの増大の形態である。いくつかの実施形態では、ＶＤＥ、ＰｓｂＳまたはＺＥＰのいずれかのタンパク質レベルは、コントロール植物と比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍増大する。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＺＥＰの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳおよびＺＥＰの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳおよびＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＺＥＰおよびＶＤＥの発現を増大させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＰｓｂＳ、ＺＥＰおよびＶＤＥの発現を増大させる。
【０１２４】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。
【０１２５】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号７の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号８の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号９の保存されたドメインをさらに含む。
【０１２６】
上記のいくつかの実施形態では、植物はＺｅａ  ｍａｙｓである。いくつかの実施形態では、植物はＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒである。いくつかの実施形態では、植物はＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。いくつかの実施形態では、植物はＶｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＰｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＨｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍである。いくつかの実施形態では、植物はＳａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物は、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜作物、飼料作物、工芸作物、木質作物、またはバイオマス作物
である。
変動光条件下での成長特性の改善について植物を選択する方法
【０１２７】
別の態様では、本明細書において提供されるのは、変動光条件下での成長特性を改善するための植物を選択する方法であって、植物集団を提供する工程、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかの活性を増大させるように植物の集団を改変する工程、植物における変動光条件下での非光化学的消光（ＮＰＱ）レベルを検出する工程、植物における変動光条件下でのＮＰＱレベルを、変動光条件下でのＮＰＱのコントロールレベルと比較する工程、および植物を高光強度下から低光強度へ移行した場合にＮＰＱ緩和速度が増大した植物を選択する工程を含む、方法である。いくつかの実施形態では、ＮＰＱのコントロールレベルは、集団におけるＮＰＱの最低レベルである。いくつかの実施形態では、ＮＰＱのコントロールレベルは、集団におけるＮＰＱの中程度のレベルである。いくつかの実施形態では、ＮＰＱのコントロールレベルは、集団におけるＮＰＱの平均レベルである。いくつかの実施形態では、ＮＰＱのコントロールレベルは、コントロール植物におけるＮＰＱレベルである。いくつかの実施形態では、集団には、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの異種配列を発現するか、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの発現が増加するようにゲノムが編集されている植物が含まれる。いくつかの実施形態では、ゲノム編集技術はＺＦＮである。いくつかの実施形態では、ゲノム編集技術はＴＡＬＥＮである。いくつかの実施形態では、ゲノム編集技術はＣＲＩＳＰＲである。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳのプロモーターは改変されている。いくつかの実施形態では、ＺＥＰのプロモーターは改変されている。いくつかの実施形態では、ＶＤＥのプロモーターは改変されている。いくつかの実施形態では、集団には、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの変異を誘導するように処理されている植物が含まれる。いくつかの実施形態では、変異原はＥＭＳである。
【０１２８】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。
【０１２９】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号７の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号８の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号９の保存されたドメインをさらに含む。
【０１３０】
上記のいくつかの実施形態では、植物はＺｅａ  ｍａｙｓである。いくつかの実施形態では、植物はＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒである。いくつかの実施形態では、植物はＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。いくつかの実施形態では、植物はＶｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＰｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＨｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍである。いくつかの実施形態では、植物はＳａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物は、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜作物、飼料作物、工芸作物、木質作物、またはバイオマス作物
である。
変動光条件下での成長特性の改善に関連する多型をスクリーニングする方法
【０１３１】
別の態様では、本明細書において提供されるのは、本開示の別の態様は、変動光条件下での成長特性の改善に関連するヌクレオチド配列多型をスクリーニングする方法であって、植物集団を提供する工程、植物の集団においてＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかを制御および／またはコードするヌクレオチド配列を得る工程、植物の集団においてＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥのうちのいずれかを制御および／またはコードするヌクレオチド配列内の１つまたは複数の多型を得る工程、植物の集団における高光強度から低光強度への移行の際の非光化学的消光（ＮＰＱ）緩和速度を検出する工程、植物集団における多型のＮＰＱ緩和速度との関連を決定するために統計解析を行う工程、およびＮＰＱ緩和速度と統計的に有意に関連する多型を選択する工程を含む、方法である。いくつかの実施形態では、集団は、生殖質群である。いくつかの実施形態では、集団には、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの異種配列を発現するか、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの発現が増加するようにゲノムが編集されている植物が含まれる。いくつかの実施形態では、集団には、変異を誘導するように処理されていない植物が含まれる。いくつかの実施形態では、集団には、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、および／またはＶＤＥの変異を誘導するように処理されている植物が含まれる。いくつかの実施形態では、多型は一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態では、多型は挿入／欠失（ＩｎＤｅｌ）である。いくつかの実施形態では、多型は単純反復配列（ＳＳＲ）である。いくつかの実施形態では、多型は存在／非存在変動（ＰＡＶ）である。いくつかの実施形態では、多型はコピー数多型（ＣＮＶ）である。いくつかの実施形態では、多型はＰｓｂＳのプロモーター内に存在する。いくつかの実施形態では、多型はＺＥＰのプロモーター内に存在する。いくつかの実施形態では、多型はＶＤＥのプロモーター内に存在する。いくつかの実施形態では、多型を、サンガー配列決定によって検出する。いくつかの実施形態では、多型を、次世代配列決定によって検出する。いくつかの実施形態では、多型を、アガロースゲル電気泳動によって検出する。いくつかの実施形態では、多型を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出する。いくつかの実施形態では、多型を、多型が同定されている集団と異なる集団をスクリーニングするためにさらに使用する。いくつかの実施形態では、多型を、植物の成長特性を改善するためのゲノム編集の標的としてさらに使用する。
【０１３２】
上記のいくつかの実施形態では、成長特性の改善は、成長の改善である。いくつかの実施形態では、成長特性の改善は、光合成効率の改善である。いくつかの実施形態では、成長特性の改善は、光防御効率の改善である。いくつかの実施形態では、成長特性の改善は、量子収量およびＣＯ２固定の改善である。いくつかの実施形態では、成長特性の改善は、非光化学的消光（ＮＰＱ）の緩和速度の増大である。いくつかの実施形態では、ＮＰＱを、クロロフィル蛍光画像化を使用して検出する。
【０１３３】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号１に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号２に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号３に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる。
【０１３４】
上記のいくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号４に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号５に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号６に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、または１００％同一なａｎアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰｓｂＳは、配列番号７の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＺＥＰは、配列番号８の保存されたドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＤＥは、配列番号９の保存されたドメインをさらに含む。
【０１３５】
上記のいくつかの実施形態では、植物はＺｅａ  ｍａｙｓである。いくつかの実施形態では、植物はＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒである。いくつかの実施形態では、植物はＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。いくつかの実施形態では、植物はＶｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＰｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａである。いくつかの実施形態では、植物はＨｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅである。いくつかの実施形態では、植物はＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍである。いくつかの実施形態では、植物はＳａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐである。いくつかの実施形態では、植物はＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａである。いくつかの実施形態では、植物は、スイッチグラス、ススキ、ウマゴヤシ、サトウモロコシ、穀実用モロコシ、サトウキビ、エネルギー用サトウキビ、エレファントグラス、メイズ、キャッサバ、ササゲ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、イネ、ダイズ、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、アマ、ワタ、ヒマワリ、カメリナ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、トウジンビエ、アワ、他の穀物、イネ、脂肪種子、野菜作物、飼料作物、工芸作物、木質作物、またはバイオマス作物
である。
本明細書中に記載の実施形態の一般的な実施方法
【０１３６】
目的のヌクレオチド配列での植物の形質転換
【０１３７】
トランスジェニック植物を、植物または植物細胞内に目的の任意のヌクレオチド配列を発現させるための従来の技術を使用して産生することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，ｖｏｌ．２８６，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｐｅｎａ  Ｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＴ）。典型的には、再生可能な外植体を使用して遺伝子移入（すなわち、形質転換）を行って、完全な稔性植物を産生する。一般に、生物に導入すべきＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、形質転換ベクターの一部である。当該分野で公知のかかる多数のかかるベクター系（プラスミドなど）を使用することができる。発現系の成分を、例えば、導入される核酸の発現が増加するように改変することができる。例えば、短縮配列、ヌクレオチド置換、または他の改変を使用することができる。当該分野で公知の発現系を使用して、適切な条件下で実質的に任意の植物細胞を形質転換することができる。目的の遺伝子をコードするＤＮＡ分子を含む導入遺伝子を、安定に形質転換し、宿主細胞のゲノムに組み込むことが好ましい。形質転換した細胞を、完全な植物に再生することが好ましい。形質転換技術の詳細な説明は、当業者の知識の範囲内になる。
【０１３８】
形質転換のための遺伝子構築物
【０１３９】
本明細書中に記載の方法で有用なＤＮＡ構築物には、植物に導入遺伝子を導入することができる形質転換ベクターが含まれる。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック」は、異種ヌクレオチド配列を含む核酸フラグメントが導入されている生物をいう。トランスジェニック生物内の導入遺伝子は、安定且つ遺伝することが好ましい。異種核酸フラグメントを、宿主ゲノム内に組み込んでも組み込まなくてもよい。
【０１４０】
いくつかの植物形質転換ベクターの選択肢を利用可能である（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ，１９９５，Ｐｏｔｒｙｋｕｓら編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ：Ａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１９９６，Ｏｗｅｎら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，１９９５，Ｍａｌｉｇａら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載の植物形質転換ベクターが含まれる）。植物形質転換ベクターは、一般に、５’および３’制御配列（プロモーター、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナル、ならびに選択またはスクリーニング用のマーカー遺伝子が含まれる）の転写調節下で１つまたは複数の目的のコード配列を含む。単一の転写物からの２つまたはそれを超えるポリペプチドの発現のために、さらなるＲＮＡプロセシングシグナルおよびリボザイム配列を、構築物に操作することができる（米国特許第５，５１９，１６４号）。このアプローチは、単一の遺伝子座内に複数の導入遺伝子を配置するという利点を有し、このことはその後の植物育種の試みにおいて有利である。１つの実施形態では、ベクターは、植物、植物の一部、植物材料、植物種子、または植物細胞内でＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択される１つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を駆動することができるプロモーターを含む少なくとも１つの発現制御配列を含む。別の実施形態では、プロモーターは、Ｒｂｃｓ１Ａ、ＧＡＰＡ−１、およびＦＢＡ２から選択される。別の実施形態では、Ｒｂｃｓ１ＡプロモーターはＺＥＰの発現を駆動し、ＧＡＰＡ−１プロモーターはＰｓｂＳの発現を駆動し、ＦＢＡ２プロモーターはＶＤＥの発現を駆動する。別の実施形態では、ベクターはＴ−ＤＮＡである。別の実施形態では、ベクターは図９中に示すとおりである。当業者に公知のように、ある植物型で作用する特定のプロモーターおよびベクターは、別の植物型で作用しなくて良い。本明細書中に記載するように、トランスジェニック植物の作製方法は、当該分野で周知である。
【０１４１】
Ｔ−ＤＮＡ
【０１４２】
アグロバクテリウム媒介形質転換法による植物内への導入遺伝子の導入方法は、一般に、少なくとも１つの導入遺伝子の遺伝因子を取り込み、前述の遺伝因子を植物のゲノム内に移入するＴ−ＤＮＡ（トランスファーＤＮＡ）を含む。導入遺伝子を、典型的には、ＤＮＡプラスミドベクター内で構築し、通常、アグロバクテリウムＴｉプラスミド右境界ＤＮＡ領域（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ領域（ＬＢ）に隣接させる。アグロバクテリウム媒介形質転換過程中、ＤＮＡプラスミドを、エンドヌクレアーゼＶｉｒＤ２によって、右境界領域および左境界領域に切れ目を入れる。Ｔ鎖と呼ばれるニック間由来の一本鎖ＤＮＡを、アグロバクテリウム細胞から植物細胞へ移入する。Ｔ−ＤＮＡ領域に対応する配列を、植物ゲノムに挿入する。
【０１４３】
植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの組み込みは、一般に、ＲＢから開始され、Ｔ−ＤＮＡの末端まで（ＬＢまで）続く。しかし、エンドヌクレアーゼは、時折、両境界に等しく切れ目を入れない。これが起こる場合、植物ゲノムに挿入されたＴ−ＤＮＡは、しばしば、いくつかまたは全てのプラスミドベクターＤＮＡを含む。この現象を、「リードスルー」という。望ましいアプローチは、しばしば、任意の隣接プラスミドベクターＤＮＡ（ベクターバックボーン）を使用せず右境界領域と左境界領域との間に配置された導入遺伝子（Ｔ−ＤＮＡ）のみを植物ゲノムに移入することである。ベクターバックボーンＤＮＡは、種々のプラスミド維持エレメント（例えば、複製起点、細菌選択マーカー遺伝子、および植物内で所望の形質を発現するのに必要のない他のＤＮＡフラグメントが含まれる）を含む。
【０１４４】
操作されたミニ染色体を、植物細胞内で１つまたは複数の遺伝子を発現するために使用することもできる。細胞内に導入されたクローン化テロメア反復は、組み込み部位での新規のテロメアの形成によって染色体の遠位部分を短縮することができる。この方法を使用して、遺伝子移入用ベクターを、天然の植物染色体のアームをトリミングし、巨大インサートのための挿入部位を付加することによって調製することができる（Ｙｕら，２００６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１７３３１−１７３３６；Ｙｕら，２００７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：８９２４−８９２９）。
【０１４５】
植物における代替の染色体操作アプローチは、自律的植物ミニ染色体のｉｎ  ｖｉｖｏアセンブリを含む（Ｃａｒｌｓｏｎら、２００７、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．３：１９６５−７４）。植物細胞を、セントロメア配列で形質転換し、ｄｅ  ｎｏｖｏでアセンブリされた自律染色体を有する植物をスクリーニングすることができる。有用な構築物は、選択マーカー遺伝子と、セントロメアのサテライト配列ならびにレトロエレメント配列および／または他の反復を含むゲノムＤＮＡフラグメントとが組み合わせられている。
【０１４６】
記載の発明に有用な別のアプローチは、操作形質遺伝子座（「ＥＴＬ」）テクノロジーである（米国特許第６，０７７，６９７号；米国特許出願公開第２００６／０１４３７３２号）。この系は、ＤＮＡの標的が末端動原体型染色体の短腕内の植物染色体の異質染色質領域（挟動原体ヘテロクロマチンなど）である。ターゲティング配列には、リボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）またはλファージＤＮＡが含まれ得る。挟動原体ｒＤＮＡ領域は、安定な挿入、低組換え、および高レベルの遺伝子発現を支持する。このテクノロジーはまた、植物における複数の形質のスタッキングに有用である（米国特許出願公開第２００６／０２４６５８６号）。
【０１４７】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９はまた、標的にされた遺伝子を挿入および欠失することができるように植物染色体内の特異的部位で二本鎖ＤＮＡを切断可能であるという点で本発明の実施に有用である（Ｓｈｕｋｌａら，２００９，Ｎａｔｕｒｅ  ４５９：４３７−４４１；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら，２００９，Ｎａｔｕｒｅ  ４５９：４４２−４４５、ＷＯ２０１５０８９４２７Ａ１号）。
【０１４８】
核形質転換のための組織培養ベースの方法
【０１４９】
形質転換プロトコールおよび植物にヌクレオチド配列を導入するためのプロトコールは、形質転換のために標的にされる植物または植物細胞のタイプ（すなわち、単子葉植物または双子葉植物）に応じて変動し得る。
【０１５０】
植物細胞へヌクレオチド配列を導入し、その後に植物ゲノムに配列を挿入するのに適切な方法は、Ｓｏｍｌｅｖａ＆Ａｌｉの米国特許出願公開第２０１０／０２２９２５６Ａｌ号およびＳｏｍｌｅｖａらの米国特許出願公開第２０１２／００６０４１３号に記載されている。
【０１５１】
形質転換された細胞を、従来技術に従って植物内で成長させる。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら，１９８６，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．５：８１−８４を参照のこと。次いで、これらの植物を成長させ、同一の形質転換された変種または異なる変種と受粉することができ、得られたハイブリッドは、同定された所望の表現型の特徴を構成性に発現する。２世代またはまたはそれを超える世代まで成長させて所望の表現型の特徴の構成性発現が安定して維持されて遺伝することを確認し、次いで、種子を採取して所望の表現型の特徴の構成性発現が達成されていることを確認することができる。
【０１５２】
植物内形質転換法
【０１５３】
植物内形質転換のための手順は複雑ではない。組織培養操作およびソマクローナル変動の可能性が回避され、トランスジェニック植物を得るために必要な期間は短い。しかし、かかる接種植物の子孫における形質転換頻度は、比較的低く、且つ変動する。現在、組織培養ベースの再生系の非存在下で日常的に形質転換が可能な種はほとんどない。安定なシロイヌナズナ形質転換体を、いくつかの植物内法（真空浸潤（Ｃｌｏｕｇｈ＆Ｂｅｎｔ，１９９８，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６：７３５−７４３）、発芽種子の形質転換（Ｆｅｌｄｍａｎｎ＆Ｍａｒｋｓ，１９８７，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０８：１−９）、花弁浸漬（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６：７３５−７４３）、および花弁噴霧（Ｃｈｕｎｇら，２０００，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．９：４７１−４７６）が含まれる）によって得ることができる。植物内法によって首尾よく形質転換されている他の植物には、ナタネおよびダイコン（真空浸潤、Ｉａｎ  ａｎｄ  Ｈｏｎｇ，２００１，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．，１０：３６３−３７１；Ｄｅｓｆｅｕｘら，２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３：８９５−９０４）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（真空浸潤，Ｔｒｉｅｕら，２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：５３１−５４１）、カメリナ（花弁浸漬，ＮｇｕｙｅｎらのＷＯ／２００９／１１７５５５号）、およびコムギ（花弁浸漬，Ｚａｌｅら，２００９，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２８：９０３−９１３）が含まれる。植物内法はまた、メイズ（花粉，Ｗａｎｇら、２００１，Ａｃｔａ  Ｂｏｔａｎｉｃａ  Ｓｉｎ．，４３，２７５−２７９；Ｚｈａｎｇら，２００５，Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１４４，１１−２２；雌蘂，Ｃｈｕｍａｋｏｖら、２００６，Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４２，８９３−８９７；Ｍａｍｏｎｔｏｖａら、２０１０，Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４６，５０１−５０４）、およびモロコシ（花粉，Ｗａｎｇら、２００７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４８，７９−８３）における生殖細胞の形質転換のために使用されている。
【０１５４】
レポーター遺伝子および選択マーカー遺伝子
【０１５５】
米国特許出願公開第２０１００２２９２５６号および同第２０１２００６０４１３号（本明細書中で参考として組み込まれる）に記載のように、レポーター遺伝子および／または選択マーカー遺伝子を、発現制御配列（発現カセット）内に含めることができる。目的の異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む発現カセットを使用して、任意の上記方法によって任意の植物を形質転換することができる。異なる作物種範囲のための有用な選択マーカー遺伝子およびトランスジェニック系統の選択方法は、本明細書中の実施例に記載されている。
【０１５６】
植物内でのヌクレオチド配列発現
【０１５７】
異なる植物組織またはオルガネラにおけるヌクレオチド配列の発現を調節するための植物プロモーターを選択することができ、その全ての方法が当業者に公知である（Ｇａｓｓｅｒ＆Ｆｒａｌｅｙ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２９３−１２９９）。
【０１５８】
使用することができるプロモーターの選択は、いくつかの要因（効率、選択性、誘導性、望ましい発現レベル、および／または優先される細胞もしくは組織の発現が含まれるが、これらに限定されない）に依存する。ヌクレオチド配列に対するプロモーターおよび他の調節領域の適切な選択および配置によってヌクレオチド配列の発現を調整するためのこの選択は当業者の日常的作業である。使用することができるプロモーターの例は、当該分野で公知である。使用することができるプロモーターには、植物ゲノム内に存在するプロモーターおよび他の供給源由来のプロモーターが含まれる。いくつかの適切なプロモーターは、一定の細胞型において転写のみを（すなわち、主に転写を）開始する。植物ゲノムＤＮＡ内のプロモーター領域を同定および特徴づける方法には、例えば、Ｊｏｒｄａｎｏら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：８５５−８６６，１９８９；Ｂｕｓｔｏｓら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：８３９−８５４，１９８９；Ｇｒｅｅｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：４０３５−４０４４，１９８８；Ｍｅｉｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：３０９−３１６，１９９１；およびＺｈａｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１０：１０６９−１０７９，１９９６に記載の方法が含まれる。
【０１５９】
使用することができるプロモーターのさらなる例には、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲｂｃＳ）プロモーター（アメリカカラマツ（Ｌａｒｉｘ  ｌａｒｉｃｉｎａ）由来のＲｂｃＳプロモーターなど）、マツｃａｂ６プロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５：７７３−７７８，１９９４）、コムギ由来のＣａｂ−１遺伝子プロモーター（Ｆｅｊｅｓら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：９２１−９３２，１９９０）、ホウレンソウ由来のＣＡＢ−１プロモーター（Ｌｕｂｂｅｒｓｔｅｄｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：９９７−１００６，１９９４）、イネ由来のｃａｂ１Ｒプロモーター（Ｌｕａｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：９７１−９８１，１９９２）、メイズ由来のＧＡＰＡ−１プロモーター、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦＢＡ２プロモーター、メイズ由来のピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター（Ｍａｔｓｕｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：９５８６−９５９０，１９９３）、タバコＬｈｃｂ１＊２プロモーター（Ｃｅｒｄａｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：２４５−２５５，１９９７）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＳＵＣ２スクロース−Ｈ＋シンポータープロモーター（Ｔｒｕｅｒｎｉｔら，Ｐｌａｎｔａ  １９６：５６４−５７０，１９９５）、およびホウレンソウ由来のチラコイド膜タンパク質プロモーター（ｐｓａＤ、ｐｓａＦ、ｐｓａＥ、ＰＣ、ＦＮＲ、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ、ｃａｂ、およびｒｂｃＳ）が含まれる。茎、葉、および緑色組織内での遺伝子転写を駆動するために使用することができるさらなる例示的なプロモーターは、米国特許出願公開第２００７／０００６３４６号（その全体が本明細書中で参考として組み込まれる）に記載されている。植物緑色組織内で優先的に発現するさらなるプロモーターには、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット（Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：８１−９３，１９９２）、アルドラーゼおよびピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１（１）：４２−４８，２０００）などの遺伝子由来のプロモーターが含まれる。
【０１６０】
誘導性プロモーター
【０１６１】
化学的に制御されるプロモーターを使用して、外因性の化学的制御因子の適用による植物におけるヌクレオチド配列の発現を調整することができる。目的に応じて、プロモーターは、化合物の適用によって遺伝子発現が誘導される化学的誘導性プロモーターまたは化合物の適用によって遺伝子発現が抑制される化学的抑制性プロモーターであり得る。化学的誘導性プロモーターは当該分野で公知であり、ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤によって活性化されるメイズｌｎ２−２プロモーター、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子性（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｌｉｃ）化合物によって活性化されるメイズＧＳＴプロモーター、およびサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−１プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。他の化学的に制御されるプロモーターには、ステロイド反応性プロモーター（例えば、糖質コルチコイド誘導性プロモーター（Ｓｃｈｅｎａら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０４２１−１０４２５；ＭｃＮｅｌｌｉｓら，１９９８，Ｐｌａｎｔ  １４：２４７−２５７）を参照のこと）およびテトラサイクリン誘導性プロモーターおよびテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚら，１９９１，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９−２３７；米国特許第５，８１４，６１８号および同第５，７８９，１５６号（その全体が本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと）が含まれる。植物代謝操作に適切な三成分浸透圧誘導性発現系が最近報告されている（Ｆｅｎｇら，２０１１，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６：１−９）。
【０１６２】
構成性プロモーター
【０１６３】
構成性プロモーターには、例えば、ＷＯ９９／４３８３８号および米国特許第６，０７２，０５０号に開示のＲｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーターおよび他の構成性プロモーター、コアＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）、イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら，１９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１）、ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９８９，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）、ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら，１９９１，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）、ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎら，１９８４，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３−２７３０）、およびＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）が含まれる。他の構成性プロモーターは、米国特許第５，６０８，１４９号；同第５，６０８、１４４号；同第５，６０４、１２１号；同第５，５６９，５９７号；同第５，４６６，７８５号；同第５，３９９，６８０号；同第５，２６８，４６３号；および同第５，６０８，１４２に記載されている。
【０１６４】
弱いプロモーター
【０１６５】
低レベルの発現が望ましい場合、弱いプロモーターを使用することができる。一般に、用語「弱いプロモーター」は、低レベルのヌクレオチド配列の発現を駆動するプロモーターを説明することを意図する。プロモーターが許容できない高レベルで発現される場合、プロモーター配列の一部を欠失させるか、発現レベルを減少させるように改変することができる。かかる弱い構成性プロモーターには、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター（ＷＯ９９／４３８３８号および米国特許第６，０７２，０５０号）が含まれる。
【０１６６】
組織特異的プロモーター
【０１６７】
「組織優先型」プロモーターを使用して、特定の組織内での遺伝子発現を標的にすることができる。化学的誘導系と比較して、発生的および空間的に制御された刺激は、植物内への外部因子の透過への依存がより小さい。組織特異的プロモーターとして、Ｖａｎ  Ｅｘら、２００９、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  ２８：１５０９−１５２０；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １２：２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａら、１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３８：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎら、１９９７、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５４：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９９）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ６：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔら、１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １  １２：１３３１−１３４１；Ｖａｎ  Ｃａｍｐら、１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１２：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉら、１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １  １２：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３５：７７３−７７８；Ｌａｍ、１９９４、Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ２０：１８１−１９６、Ｏｒｏｚｃｏら、１９９３、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａら、１９９３、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：９５８６−９５９０、およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａら、１９９３、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ４：４９５−５０５に記載されるものが挙げられる。かかるプロモーターを、必要に応じて、弱く発現させるために改変することができる。
【０１６８】
種子／胚特異的プロモーター
【０１６９】
「種子優先型」プロモーターには、「種子特異的」プロモーター（種子貯蔵タンパク質プロモーターなどの種子発生中に活性なプロモーター）および「種子出芽」プロモーター（種子発芽中に活性なプロモーター）の両方が含まれる。Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  １０：１０８−１１３（本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。かかる種子優先型プロモーターには、Ｃｉｍｌ（サイトカイニン誘導性メッセージ）、ｃＺ１９Ｂｌ（メイズ１９ｋＤａゼイン）、ｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１リン酸シンターゼ）、およびｃｅｌＡ（セルロースシンターゼ）が含まれるが、これらに限定されない。γ−ゼインは、好ましい内胚乳特異的プロモーターである。Ｇｌｏｂ−１は、好ましい胚特異的プロモーターである。双子葉植物について、種子特異的プロモーターには、マメβ−ファセオリン、ナピン、β−コングリシニン、ダイズレクチン、およびクルシフェリンなどが含まれるが、これらに限定されない。単子葉植物について、種子特異的プロモーターには、メイズの１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ｇ−ゼイン、ワキシ、シュランケン１、シュランケン２、およびグロブリン１が含まれるが、これらに限定されない。後期胚発生蓄積タンパク質遺伝子ＬＥＡの段階特異的発生プロモーターは、種子ターミネーターテクノロジーにおける後期胚発生段階の致死遺伝子の切り出し媒介発現のための組換え系を駆動するために首尾よく使用されている（Ｏｌｉｖｅｒらの米国特許第５，７２３，７６５号）。
【０１７０】
葉特異的プロモーター
【０１７１】
葉特異的プロモーターは、当該技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ／２０１１／０４１４９９および米国特許２０１１／０１７９５１１  Ａｌ、Ｔｈｉｌｍｏｎｙら；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １２：２５５−２６５；Ｋｗｏｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０５：３５７−３６７；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３５：７７３−７７８；Ｇｏｔｏｒら、１９９３、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３：５０９−５１８；Ｏｒｏｚｃｏら、１９９３、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３：  １１２９−１１３８、およびＭａｔｓｕｏｋａら、１９９３、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：９５８６−９５９０を参照のこと。
【０１７２】
時間特異的プロモーター
【０１７３】
発生時間枠中に利用することができる（例えば、炭素循環を増強するために植物の葉が成熟した後にオンに切り替わることができる）時間プロモーターも意図する。
【０１７４】
葯／花粉特異的プロモーター
【０１７５】
葯および／または花粉において特異的に発現される多数の遺伝子が同定されており、花粉の発生および稔性におけるその機構が特徴づけられている。これらの遺伝子の特異性は、主にそのプロモーターによって転写レベルで制御されることが見出されている（Ａｒｉｉｚｕｍｉら，２００２，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２１：９０−９６および論文内の参考文献）。異なる植物種由来の多数の葯および／または花粉特異的プロモーターおよびその重要なｄｓエレメントが単離され、機能的に解析されている。
【０１７６】
花特異的プロモーター
【０１７７】
花特異的プロモーターとして、これらに限定されないが、ＣＨＳ（Ｌｉｕら、２０１１、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  ３０：２１８７−２１９４）、ＯｓＭＡＤＳ４５（Ｂａｉら、２００８、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  １７：１０３５−１０４３）、ＰＳＣ（Ｌｉｕら、２００８、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  ２７：９９５−１００４）、ＬＥＡＦＹ、ＡＧＡＭＯＵＳ、およびＡＰＩ（Ｖａｎ  Ｅｘら、２００９、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  ２８：１５０９−１５２０）、ＡＰＩ（Ｖｅｒｗｅｉｒｅら、２００７、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １４５：１２２０−１２３１）、ＰｔＡＧＩＰ（Ｙａｎｇら、２０１１、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐ．  ２９：１６２−１７０）、Ｌｅｍｌ（Ｓｏｍｌｅｖａ  ＆  Ｂｌｅｃｈｌ、２００５、Ｃｅｒｅａｌ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ３３：６６５−６７１；Ｓｋａｄｓｅｎら、２００２、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４５：５４５−５５５）、Ｌｅｍ２（Ａｂｅｂｅら、２００５、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．  ４：３５−４４）、ＡＧＬ６およびＡＧＬ１３（Ｓｃｈａｕｅｒら、２００９、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ５９：  ９８７−１０００）が挙げられる。
【０１７８】
プロモーターの組み合わせ
【０１７９】
一定の実施形態は、１つを超えるプロモーターを保有する多遺伝子発現構築物を有するトランスジェニック植物または植物細胞を使用する。プロモーターは、同一または異なり得る。
【０１８０】
任意の記載のプロモーターを使用して、定義された時空間様式での１つまたは複数の本発明のヌクレオチド配列、そのホモログおよび／またはオルソログならびに任意の他の目的の遺伝子の発現を調節することができる。
【０１８１】
メイズプロモーター
【０１８２】
植物細胞の形質転換のために使用されるトランスジェニックＤＮＡ構築物は、導入されることが望まれる異種ヌクレオチドおよび宿主メイズ細胞内で異種ヌクレオチドを発現するためのプロモーターを含む。当該分野で周知のように、かかる構築物は、必要応じて、制御エレメント、３’非翻訳領域（ポリアデニル化部位など）、輸送ペプチドまたはシグナルペプチド、およびマーカー遺伝子エレメントなどのエレメントをさらに含み得る。１．制御エレメント。植物細胞で活性ないくつかのプロモーターが、文献中に記載されている（構成性プロモーターおよび組織特異的プロモーターならびに誘導性プロモーターの両方）。植物で機能的な広範な種々のプロモーターの説明については、米国特許第６，４３７，２１７号の背景の項を参照のこと。かかるプロモーターには、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎの腫瘍誘導プラスミド上にあるノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーターおよびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター、カリモウイルスプロモーター（カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓプロモーターなど）、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓプロモーター、増強ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ｅ３５Ｓ）、およびリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ、非常に豊富な植物ポリペプチド）由来の光誘導性プロモーターが含まれる。例えば、メイズＲＳ８１プロモーターを開示している米国特許第６，４３７，２１７号、イネアクチンプロモーターを開示している同第５，６４１，８７６号、メイズＲＳ３２４プロモーターを開示している同第６，４２６，４４６号、メイズＰＲ−１プロモーターを開示している同第６，４２９，３６２号、メイズＡ３プロモーターを開示している同第６，２３２，５２６号、および構成性メイズプロモーターを開示している同第６，１７７，６１１号（これらの全てが本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。
【０１８３】
植物発現カセットの構築要件
【０１８４】
トランスジェニック植物での発現を意図するヌクレオチド配列を、発現カセット内の植物で活性な適切なプロモーターの後ろに最初にアセンブリする。発現カセットはまた、導入遺伝子の発現のために必要であるか選択される任意のさらなる配列を含み得る。かかる配列には、転写ターミネーター、イントロンなどの発現を増強するための外来配列、必須配列、ならびに遺伝子産物を特定のオルガネラおよび細胞区画にターゲティングすることを意図する配列が含まれるが、これらに限定されない。次いで、これらの発現カセットを、本明細書中に記載の植物形質転換ベクターに移入することができる。以下は、典型的な発現カセットの種々の成分の説明である。
【０１８５】
転写ターミネーター
【０１８６】
種々の転写ターミネーターは、発現カセット内で使用できる。これらのターミネーターは、導入遺伝子を超えた転写終結および転写物の正確なポリアデニル化を担う。適切な転写ターミネーターは、植物において機能することが公知の転写ターミネーターであり、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、およびエンドウマメｒｂｃＳ  Ｅ９ターミネーターが含まれる。これらを、単子葉の植物および双子葉の植物の両方で使用する。
【０１８７】
発現の増強または制御のための配列
【０１８８】
多数の配列が転写単位内部からの遺伝子発現を増強することが見出されており、これらの配列を、トランスジェニック植物におけるその発現を増加させる遺伝子と併せて使用することができる。例えば、種々のイントロン配列（メイズＡｄｈｌ遺伝子のイントロンなど）は、特に単子葉植物細胞での発現を増強することが示されている。さらに、ウイルス由来のいくつかの非翻訳リーダー配列はまた、発現を増強することが公知であり、これらの配列は特に双子葉植物細胞で有効である。
【０１８９】
コード配列の最適化
【０１９０】
選択された遺伝子のコード配列を、目的の作物種において最適に発現されるようにコード配列を変化させることによって遺伝子操作することができる。特定の作物種における発現を最適するためにコード配列を改変する方法は周知である（Ｐｅｒｌａｋら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３３２４およびＫｏｚｉｅｌら，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１９４−２００）。
【０１９１】
植物形質転換ベクターの構築
【０１９２】
植物形質転換に利用可能な多数のベクターが、植物形質転換分野の当業者に公知である。本開示に関する遺伝子を、任意のかかるベクターと併せて使用することができる。ベクターの選択は、選択される形質転換技術および標的種に依存する。
【０１９３】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用した形質転換のための多数のベクターが利用可能である。これらのベクターは、典型的には、少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ配列を保有し、ｐＢＩＮ１９などのベクターが含まれる。アグロバクテリウム形質転換に適切な典型的ベクターには、バイナリーベクターであるｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１ならびにバイナリーベクターｐＣＩＢ１０およびそのハイグロマイシン選択誘導体が含まれる（例えば、米国特許第５，６３９，９４９号を参照のこと）。
【０１９４】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用しない形質転換は、選択された形質転換ベクター内にＴ−ＤＮＡ配列を必要とせず、結果的に、これらの配列を欠くベクターを、Ｔ−ＤＮＡ配列を含む上記ベクターなどのベクターに加えて使用する。アグロバクテリウムに依存しない形質転換技術のためのベクターの選択は、形質転換される種の好ましい選択に大いに依存する。非アグロバクテリウム形質転換に適切な典型的ベクターには、ｐＣＩＢ３０６４、ｐＳＯＧ１９、およびｐＳＯＧ３５が含まれる（例えば、米国特許第５，６３９，９４９号を参照のこと）。
【０１９５】
培養および植物の形質転換および選択
【０１９６】
１つまたは複数の当業者に周知の上記方法を使用して、植物培養物を形質転換し、選択することができる。
【０１９７】
内因性プロモーターの操作
【０１９８】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９はまた、標的遺伝子の挿入または欠失が可能であるように植物染色体内の特定の部位で二本鎖ＤＮＡが切断されるという点で、本発明の実施に有用である（Ｓｈｕｋｌａら，２００９，Ｎａｔｕｒｅ  ４５９：４３７−４４１；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら，２００９，Ｎａｔｕｒｅ  ４５９：４４２−４４５）。このアプローチは、本発明において、内因性遺伝子のプロモーターを改変し、それにより、目的の植物のゲノム内に存在するＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥと相同な遺伝子の発現を改変するのに特に有用であり得る。この場合、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、非操作植物または野生型植物以上に発現を増加させるか発現のタイミングを変化させるように目的のＴＦの発現を制御する配列を変化させることができる。
【実施例】
【０１９９】
実施例
本開示は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解される。しかし、本開示の範囲を制限すると解釈されるべきではない。本明細書中に記載の実施例および実施形態が例示のみを目的とし、前述の実施例および実施形態を考慮して種々の修正形態または変更形態が当業者に示唆され、本出願の意図および範囲内ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであると理解される。
実施例１．トランスジェニックＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ
【０２００】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ植物を、３つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子を含むＴ−ＤＮＡカセットで形質転換した。シロイヌナズナＺＥＰを、ｑＥ形成の大きさを刺激するためのシロイヌナズナＰｓｂＳ過剰発現およびＲＯＳ除去のためのゼアキサンチンの臨界濃度を維持するためのシロイヌナズナＶＤＥ過剰発現と共に、キサントフィルエポキシ化速度および対応するＮＰＱ緩和を増加させるために過剰発現させた。得られたトランスジェニック植物は、２つの独立した温室実験において、光強度の変動下で光防御の効率を喪失することなくより高い量子収量およびＣＯ２固定が得られ、成長が増加するようにＮＰＱ動態学が改変されたことを示す。これらの結果は、光合成効率が光強度の変動下でＮＰＱによって一過性に制限されることが確認され、ＮＰＱ動態学の変化による光合成効率および作物収量の改善原理を初めて証明している。
実施例２．稚苗におけるＮＰＱおよびＰＳＩＩの操作効率
【０２０１】
一過性ＮＰＱを、１０００μｍｏｌ量子ｍ−２ｓ−１での１０分間の照射中およびその後の１０分間の暗所緩和でのｖｄｅ−ｐｓｂｓ−ｚｅｐ（ＶＰＺ）構築物を用いた２０の独立した形質転換事象のＴ１子孫におけるクロロフィル蛍光画像化から決定した。類似の非光化学的消光能力を維持することが目的であるので、ＷＴに類似する最大レベルのＮＰＱを有する系統を、さらなる調査のために選択した。これにより８種の系統が得られ、そのうちで、単一のＴ−ＤＮＡコピーを保有する２つの系統（ＶＰＺ−３４および５６）および２つのＴ−ＤＮＡが挿入された１つの系統（ＶＰＺ−２３）がこの実験に含まれていた。ホモ接合Ｔ２子孫についての全ての結果を報告する。ＮＰＱ動態学的挙動は、３つのＶＰＺ系統とＷＴとの間で実質的に異なっていた（図１Ａ）。ＶＰＺ系統におけるＮＰＱは急速に増加し、２〜４分間で最大ＮＰＱレベルに到達し、その後のＮＰＱレベルは安定化するか（ＶＰＺ−２３）、さらに僅かに減少した（ＶＰＺ−３４およびＶＰＺ−５６）。対照的に、ＷＴコントロールにおけるＮＰＱは７分間増加し続け、その後、残りの３分間は最大レベルを維持した。これらの対照的な誘導パターンの結果として、ＮＰＱは、５分間の最初の誘導の間は３つ全てのトランスジェニック系統において有意により高かったが、最後の５分間は高くなかった（図１Ａ）。光をオフにした後、ＷＴおよびＶＰＺ系統の両方におけるＮＰＱ緩和は、非常に急速且つ非常に類似していた。
【０２０２】
２０００（３分間）μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１と２００（２分間）μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１との間の光強度の反復サイクルにより、ＶＰＺ系統とＷＴとの間のＮＰＱの相違はさらにより明らかとなった（図１Ｂ）。ＶＰＺ系統におけるＮＰＱは、最初の２サイクルの高光期中に急速に増加し、第２サイクルの第２の時間（分）中に最大レベルに到達した。対照的に、ＮＰＱはＷＴ幼植物においてよりゆっくり増加し、第４サイクルの第３の時間（分）に最大レベルに到達しただけであった。興味深いことに、サイクルの低光期中のＮＰＱは、逆のパターンを示した。第１のサイクルでは、低光期中のＮＰＱレベルは、ＶＰＺ系統より高かったが、第２サイクルのＮＰＱレベルは、ＶＰＺ系統とＷＴとの間で等しく、最後の３サイクルでＶＰＺ系統において有意に低かった。
【０２０３】
ＮＰＱと併せて評価した光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）操作効率は、第１サイクルにおいてＶＰＺ系統とＷＴとの間に差はなかった（図１Ｃ）。しかし、５つのその後のサイクル中、ＶＰＺ系統がサイクルの低光期中により優れたＰＳＩＩ操作効率を示したのに対して、高光期中は相違が認められなかった。このパターンは第２のサイクルで確立され、残りの実験を通して繰り返された。
実施例３．転写およびタンパク質発現
【０２０４】
３つ全てのＶＰＺ系統は、野生型と比較してＶＤＥ（３倍）、ＰｓｂＳ（３倍）、およびＺＥＰ（８倍）のトランスジェニック（Ａｔ）およびネイティブ（Ｎｔ）の転写物レベルの組み合わせが有意に増加した（図２Ａ、Ｂ、およびＣ）。ＰｓｂＳについて、転写物レベルの増加は、ネイティブタンパク質およびトランスジェニックタンパク質を示す約２２ｋＤａ付近の２つのほぼ等しい密度のバンドにおいて例示されるように（図２Ｇ、ＶＰＺレーン）、ＰｓｂＳタンパク質レベルがおよそ２倍と解釈された（図２Ｅ）。しかし、ＶＤＥおよびＺＥＰについて、転写物レベルの増加はタンパク質レベルで増幅され（図２Ｇ、ＺＥＰの約７３ｋＤａおよびＶＤＥの約４５ｋＤａの標識したバンド）、ＷＴと比較してＶＤＥタンパク質（図２Ｄ）およびＺＥＰタンパク質（図２Ｆ）が実質的に増加した（それぞれ１６倍および８０倍）。ネイティブタンパク質の転写レベルおよびタンパク質レベルはＶＰＺ系統およびＷＴで類似していたので、トランスジェニック転写物およびネイティブ転写物とタンパク質レベルとの間の相互作用は無視できると思われた。
実施例４．光強度の反復変化後の稚苗におけるＮＰＱの動態学
【０２０５】
動的ＮＰＱ調整の動態学を比較するために、二重指数モデルの時定数を、２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１と２００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１との間の光強度の反復変化の関数として、稚苗における時系列のＮＰＱにフィティングした（表１）。最初の２０００／２００サイクル中、ＷＴとＶＰＺ過剰発現系統との間に一貫した相違は認められなかった。ＮＰＱ誘導の時定数は、４９．３±１．９（ＶＰＺ−３４）から９１．８±６．２（ＶＰＺ−５６）の間で変動し、２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１から２００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１までの再調整の時定数もＷＴと３つのＶＰＺ系統の間で類似しており、平均してτ１については１０．２秒およびτ２については６６９．９秒であった。第２の２０００／２００サイクル中、ＮＰＱ動態学に及ぼすＶＰＺ発現の影響はより明らかになった。ＷＴにおけるＮＰＱ増加の急速期は、ＶＰＺ系統のおよそ２．３倍速く、ＷＴにおけるτ１が５．５秒であったのに対してＶＰＺ系統における平均τ１は１２．６秒であった（表１）。２００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１へのＮＰＱの第２の調整により、ＮＰＱ減少の遅延成分が明らかに異なっていた。ＶＰＺ系統における推定τ２は、ＷＴの１．９倍であることが認められた（４６４．３秒対８８６．４秒）。したがって、光強度変化の反復により、ＷＴにおいてはＮＰＱがより急速に上昇し、且つより遅く緩和されるが、ＶＰＺ系統における時定数は比較的影響されなかった。この同一の傾向は、２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１での最後の３分間およびその後の１０分間の暗所において継続された。ＷＴ幼植物におけるＮＰＱ増加の急速期は、ＶＰＺ系統よりおよそ２．４倍であったが（τ１が４．３秒対１０．３秒）、１０分間の暗所中のＮＰＱの最終緩和は、ＷＴと比較してＶＰＺ系統において１．４倍（τ１）および３．５倍（τ２）であった。さらに、ＰＳＩＩ操作効率の回復について決定したτ１およびτ２は、ＷＴと比較してＶＰＺ系統において２．１倍および４．１倍であった。
【０２０６】
【表１】
2019527034.tif 000003
【０２０７】
ａ第１のＨＬ期中のデータは２つの時定数を拘束しておらず、したがって、モデルは、単一指数関数に減らし、１つの時定数しかフィッティングしなかった。
【０２０８】
ｂデータ分解能は急速期を正確に拘束するには十分でなく、遅延期のみをフィッティングした。
実施例５．定常状態でのＮＰＱ、線形電子伝達、およびＣＯ２取り込み
【０２０９】
完全に広がった葉における定常状態のガス交換およびクロロフィル蛍光を測定するために、光強度を、各強度でガス交換および蛍光が完全に安定化するように特に配慮しながら、低強度から高強度まで変動させた。ＮＰＱは、特に４００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１未満の光強度にて、ＷＴとＶＰＺ系統との間で非常に類似していた（図３Ａ）。光吸収強度の関数としての線形電子伝達および純同化率の対応応答曲線は、ＷＴとＶＰＺ系統との間で有意差が認められなかった（図７）。さらに、ＣＯ２応答曲線から導いたフィッティングしたパラメータ値Ｖｃｍａｘ、Ｊ、ＴＰＵ、およびＲｄはまた、ＷＴとＶＰＺ系統との間で類似していた（表２）。
【０２１０】
【表２】
2019527034.tif 000004
実施例６．変動光下でのＮＰＱ、電子伝達、およびＣＯ２固定
【０２１１】
光応答曲線の形状に及ぼすＶＰＺ過剰発現の動的影響を評価するために、光強度を、各光移行前の４分間の２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の断続工程を用いた高ＰＦＤから低ＰＦＤへの４分間の工程で変動させた。ＶＰＺ系統のＮＰＱは、高光強度でＷＴと類似していたが、低光強度ではＷＴより有意に低かった（図３Ｂ）。得られた線形電子伝達速度および純同化率の応答曲線は、ＷＴとＶＰＺ系統との間で明らかに異なっていた（図４ＡおよびＢ）。フィッティングした凸状部および漸近線のパラメータは、ＷＴとＶＰＺ系統との間で類似していたが（図８Ａ〜Ｄ）、初期勾配は明らかに異なっていた（図４ＣおよびＤ）。強度変動は、ＷＴ植物においてΦＰＳＩＩｍａｘを０．５４１±０．０１２に低下させたが（図４Ｃ）、ＶＰＺ系統のΦＰＳＩＩｍａｘの低下はより小さかった（０．６１２±０．０２１（ＶＰＺ−２３）、０．５９９±０．０２３（ＶＰＺ−３４）、および０．５９５±０．０２３（ＶＰＺ−５６））。同様に、ΦＣＯ２−ｍａｘは、ＷＴ植物において０．０５８±０．００１に低下したのに対して（図４Ｄ）、ＶＰＺ系統におけるΦＣＯ２−ｍａｘ値の断続的高光強度による影響は遥かに少なく、ＶＰＺ−２３については０．０６９±０．００３、ＶＰＺ−３４については０．０６６±０．００３、およびＶＰＺ−５６については０．０６４±０．００３であった。したがって、これらの変動条件下で、ＶＰＺ系統のΦＰＳＩＩ−ｍａｘおよびΦＣＯ２−ｍａｘの平均は、ＷＴより１１．３％および１４．０％高かった。
実施例７．異なる光処理の関数としてのキサントフィルサイクル脱エポキシ化
【０２１２】
キサントフィルサイクルに及ぼすＶＰＺ過剰発現の影響を評価するために、葉を、４つの異なる光処理に供した（表３）。ビオラキサンチン、アンテラキサンチン、およびゼアキサンチンのプールサイズの組み合わせは、ＷＴとＶＰＺ系統との間で類似していた。キサントフィル色素プールは、暗順応した葉において完全にエポキシ化され、ＷＴとＶＰＺとの間の相違は認められなかった。４００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１のＰＦＤへの曝露により、キサントフィル組成はほとんど変化せず、且つＤＥＳはゼロに近いままであったが、２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１のＰＦＤでの照射により、アンテラキサンチン、主にゼアキサンチンがかなり上昇した。ＶＰＺ系統は、ＷＴと比較してビオラキサンチンを有意により多く保持し、ゼアキサンチンおよびアンテラキサンチンの蓄積が少なく、それにより、ＶＰＺ系統におけるキサントフィルＤＥＳはＷＴのほぼ１／２であった（２５．５％対４６．２％）。変動光処理は、高光曝露と同一の傾向を示し、ＷＴと比較してＶＰＺ系統のキサントフィル脱エポキシ化はさらに低かった（１７．８％対５２．５％）。
【０２１３】
【表３】
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実施例８．非光化学的消光による光防御効率
【０２１４】
ＷＴと比較したＶＰＺ系統における光防御の効率を評価するために、幼植物を、２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の青色光に１時間および２時間曝露した。高光処理後のＦｏ’に及ぼす光阻害およびＮＰＱの対照的な影響を使用して、光防御指数を計算し（図５）、この指数において、値１は光阻害損傷からの完全な防御に等しい。１時間の高光曝露により、光阻害が有意に誘導され、この光阻害はＶＰＺ系統よりもＷＴ幼植物でわずかに高かった（図５Ａ）。２時間後の光防御の効率（図５Ｂ）は、１時間後よりかなり低かったが、ＶＰＺ幼植物はＷＴより光阻害が低いことが再度見出された。１０分間の暗所回復後の残存ＮＰＱは、ＶＰＺ幼植物においてより低い傾向があった（図５Ｃ）。より低い残存ＮＰＱおよびより高い光防御指数の結果として、ＶＰＺ幼植物におけるＰＳＩＩ効率はまた、１０分間の暗所回復後により高くなる傾向があった（図５Ｃ）。
実施例９．温室条件下での植物成長
【０２１５】
前述の光合成効率の相違が成長に影響を及ぼすかどうかを調査するために、２つの温室実験でバイオマス蓄積を評価した。両実験間で温度は類似しており、２１℃と２５℃との間で変動した。ピーク光強度は、第１の実験において２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１を超え、且つ第２の実験で１６００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１を超え、第１の実験および第２の実験における日光積分量は、それぞれ、平均して２１．３ｍｏｌ  ｍ−２ｄ−１および１９．３ｍｏｌ  ｍ−２ｄ−１であった。しかし、第２の実験の最終週において、ピーク光強度および日光積分量は、光強度の季節的減少に起因して、１０３７μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１および８．９ｍｏｌ  ｍ−２ｄ−１まで実質的に減少した。結果として、平均植物乾燥重量は第１の実験において実質的により高く、それぞれ、３５．６ｇ対２２．５ｇであった。両試験にわたり、ＶＰＺ系統由来の植物は、ＷＴと比較して、茎の高さ（図５Ｂ）および葉領域（図５Ｃ）が増加した。さらに、植物あたりの総乾燥重量は、ＶＰＺ系統において１０〜２１％高かった（図５Ａ）。このことは、主に、茎乾燥重量の実質的増加（１４〜２６％、図５Ｄ）ならびに葉（７．５〜１６％、図５Ｅ）および根（１２．５〜３８．３％）の乾燥重量の増加に起因していた。
実施例１０．さらなるデータ
【０２１６】
図１２および１３では、葉、茎、および根のサイズおよび成長は、野生型と比較してトランスジェニック植物系統であるＮ２−２３およびＮ２−３４で増加する。図１４は、トランスジェニック系統であるＶＰＺ−５６、ＶＰＺ−２３、およびＶＰＺ−３４におけるＮＰＱ動態学、量子収量、およびＣＯ２固定の増加を示す。これらの結果は、葉への２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＦＤの事前曝露後の種々の光強度での量子収量およびＣＯ２固定の増加を示す。１、２、および３は、曝露後のこの時間増加の進行を示す。
【０２１７】
図１６は、第１の誘導／緩和におけるＮＰＱの時定数が類似するが、その後の光サイクルにより、トランスジェニック植物においてＮＰＱがより遅く上昇し（大きさと無関係に、これらは時定数である）、且つより速く緩和され、暗所緩和における量子収量の回復がより速くなることを示す。これらの比較結果は、トランスジェニック系統におけるゼアキサンチンの上昇の減少と完全に一致する。高光でのＶＰＺ系統におけるＮＰＱレベルは、ＷＴに類似するかより高い。ｄＡ５３２ｎｍによって評価したＶＰＺ系統におけるｑＥレベルはＷＴより高く、これはＰｓｂＳ過剰発現と関連する可能性が最も高い。反復高光曝露は、ＶＰＺ系統においてＮＰＱ増加のより高い時定数およびＮＰＱ緩和のより低い時定数を示す。ＶＰＺ系統は、より速いＮＰＱ緩和速度に起因してＰＦＤの急速な切り替え中の低ＰＦＤでの量子収量が５〜１０％改善する。
【０２１８】
ＶＤＥ、ＺＥＰ、およびＰｓｂＳの過剰発現の組み合わせにより、幼植物および完全に成長した植物のＮＰＱの上昇および緩和の動態学が改変され、幼植物および完全に成長した植物における変動光条件下での量子収量がより高くなり、完全に成長した植物における定常状態ガス交換に有意差は無く、完全に成長した植物における変動条件下での総同化速度がより高く、温室内での成長がおよそ１０％増加する。
実施例１１．材料と方法
【０２１９】
形質転換
【０２２０】
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．「Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａ」を、Ｃｌｅｍｅｎｔｅ，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄ  Ｗａｎｇ  Ｋ．），ｐｐ．１４３−１５４．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ．に従ってアグロバクテリウム媒介葉片プロトコールを使用して形質転換した。バイナリープラスミドは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来の以下の３つの遺伝子のコード配列を含んでいた：ビオラキサンチンデエポキシダーゼ（ＡｔＶＤＥ）、ＡｔＰｓｂＳおよびゼアキサンチンエポキシダーゼ（ＡｔＺＥＰ）、ならびにビアラホス耐性をコードするｂａｒ遺伝子（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，３６１−３６５，１９８７）。２０種の無関係のＴ０形質転換体を生成し、Ｔ−ＤＮＡコピー数を、Ｇｌｏｗａｃｋａ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｐｃｅ．１２６９３，２０１５にしたがってゲノムＤＮＡのデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）分析を使用して決定した。Ｔ−ＤＮＡの単一コピーを有する２つの系統（ＶＰＺ−３４および５６）および２つのコピーを有する１つの系統（ＶＰＺ−２３）を使用してＴ１子孫を生成し、ホモ接合植物をＧｌｏｗａｃｋａらに従ったｄｄＰＣＲによって同定し、自家受粉させてさらに分析するためのホモ接合Ｔ２子孫を得た。
【０２２１】
植物材料の増殖
【０２２２】
収穫日が同一のＶＰＺ系統のＴ２種子およびＷＴ種子を、１５０μｍｏｌ量子ｍ−２ｓ−１下で１２時間の日中（２３℃）／１２時間の夜（１８℃）サイクルを用いた環境制御されたウォークイン成長室（(Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｃｈａｇｒｉｎ  Ｆａｌｌｓ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）中の成長培地（ＬＣ１サンシャインミックス，Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｇａｗａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）上で出芽させた。発芽から５日後、幼植物を、クロロフィル蛍光画像化のために８×１２ポッティングトレイ（８１２シリーズ、Ｈｕｍｍｅｒｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｅａｒｔｈ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ，ＵＳＡ）または９×４  ポッティングトレイ（３６００シリーズ、Ｈｕｍｍｅｒｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に植え替え、２枚の本葉が出現するまで成長させた。最初の植え替え後、ガス交換およびバイオマス分析で使用される幼植物を温室に移した。
【０２２３】
転写およびタンパク質発現
【０２２４】
５つの葉片（合計２．９ｃｍ２）を、系統あたり５株の植物由来の最も若い完全に広がった葉の、ガス交換も行われている葉の位置から試料採取した。タンパク質およびｍＲＮＡを、同一の葉試料から抽出した（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎキット、ＲＥＦ７４０９３３，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）。抽出したｍＲＮＡを、ＤＮアーゼによって処理し（Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡフリーキット；ＡＭ１９０７，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（１８０８０−０５１；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡに転写した。ＲＴ−ｑＰＣＲを使用して、ＮｔＡｃｔｉｎおよびＮｔＴｕｂｕｌｉｎ（補足材料として提供されたプライマー配列）と比較して導入遺伝子であるＡｔＺＥＰ、ＡｔＰｓｂＳ、およびＡｔＶＤＥ、ならびにネイティブ遺伝子であるＮｔＺＥＰ、ＮｔＰｓｂＳ、およびＮｔＶＤＥの発現レベルを定量した。
【０２２５】
総タンパク質濃度（タンパク質定量アッセイｒｅｆ７４０９６７．５０、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）の定量後、４μｇのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離し、セミドライブロッティング（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，ＩＰＶＨ０００１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）にブロッティングし、ＡｔＰｓｂＳ（ＡＳ０９５３３，Ａｇｒｉｓｅｒａ，Ｖａｎｎａｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＡｔＺＥＰ（ＡＳ０８２８９，Ａｇｒｉｓｅｒａ）、およびＡｔＶＤＥ（ＡＳ１５３０９１，Ａｇｒｉｓｅｒａ）に対して惹起する一次抗体で免疫標識し、その後に二次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗ４０１Ｂ）とインキュベートした。化学発光を、スキャナ（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ−４０１０、Ｆｕｊｉ）を使用して検出し、デンシトメトリーを、ＩｍａｇｅＪ（バージョン１．４７ｖ、国立衛生研究所、米国）を使用して行ってタンパク質濃度を評価し、野生型タンパク質濃度を正規化のために使用した。
【０２２６】
稚苗におけるＮＰＱおよびＰＳＩＩ操作効率
【０２２７】
非光化学的消光（ＮＰＱ）を、クロロフィル蛍光撮像装置（ＣＦ  Ｉｍａｇｅｒ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａ，Ｃｏｌｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を使用して、１８株の幼植物において同時に決定した。幼植物を、最初に２０分間暗順応させ、その後に暗順応させた最小蛍光（Ｆｏ）および最大蛍光蛍光（Ｆｍ）を、８００ｍｓパルスの飽和光強度（６０００μｍｏｌ量子ｍ−２ｓ−１、λｍａｘ＝４７０ｎｍ）を使用して画像化した。その後に、幼植物を、１０分間の１０００μｍｏｌ量子ｍ−２ｓ−１およびその後の１０分間の暗所または６サイクルの３分間の２０００μｍｏｌ量子ｍ−２ｓ−１およびその後の２分間の２００μｍｏｌ量子ｍ−２ｓ−１のいずれかに供した。飽和閃光を等間隔で照射して照射条件下での変動蛍光（Ｆ’）および最大蛍光（Ｆｍ’）を画像化した。次いで、幼植物あたりの平均ＮＰＱを、シュルテン・フォルマー消光モデルを想定した以下の式１に従って、これらの測定値から計算した：
【０２２８】
ＮＰＱ＝Ｆｍ／Ｆｍ’−１        式１
【０２２９】
最大ＰＳＩＩ効率または操作ＰＳＩＩ効率を、Ｇｅｎｔｙら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ９９０，８７−９２１９８９，１９８９に従った式２および３に従って蛍光測定値から評価した。
【０２３０】
最大ＰＳＩＩ効率＝（Ｆｍ−Ｆｏ）／Ｆｍ        式２
【０２３１】
ＰＳＩＩ操作効率＝（Ｆｍ’−Ｆ’）／Ｆｍ’      式３
【０２３２】
光強度の変化に対するＮＰＱ調整の時定数
【０２３３】
幼植物を暗順応させ、クロロフィル蛍光を、上記のようにクロロフィル蛍光撮像装置を使用して決定した。最大蛍光を、光強度を３分毎に２０００から２００、２０００、２００、２０００、最後に０μｍｏｌ量子ｍ−２ｓ−１まで変化させながら、３０秒毎に測定した。暗所での最終緩和を、１０分間持続させた。従って、３つのＶＰＺ形質転換系統および野生型の１８株の幼植物からなる６組を測定し、それにより、蛍光測定の間に５秒間のフレームシフトを作製し、各組間で光強度を変化させた。ＮＰＱを式１に従って計算し、各組内の最高値に対して正規化し、その後に６組全てを時間の関数としてコンパイルして、５秒を最小単位とした正規化ＮＰＱの時系列を生成した。ＮＰＱの誘導または緩和についての二重指数関数における時定数を、光強度のそれぞれの変化後にコンパイルした時系列に対してフィッティングした。暗所での最終回収について、時定数を（式３を使用して評価した）ＰＳＩＩ操作効率についてフィッティングした。
【０２３４】
光防御効率
【０２３５】
幼植物を２０分間暗順応させ、その後に暗順応させた最大ＰＳＩＩ効率（Ｆｖ／Ｆｍ）を、上記のようにクロロフィル蛍光撮像装置を使用して決定した。その後に、幼植物を、２０００μｍｏｌ量子ｍ−２ｓ−１に６０分間または１２０分間曝露した。曝露後、幼植物を暗所で１０分間回復させてｑＥを緩和し、その後に完全な暗順応を用いずに最小蛍光（Ｆｏ’）および最大蛍光（Ｆｍ’）を測定した。Ｆｏ’の測定値を誘導値と比較し、Ｆｏ’に及ぼすＮＰＱの影響を排他的に考慮する（Ｏｘｂｏｒｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：１３５−１４２，１９９７）。次いで、Ｆｏ’の測定値またはＦｏ’の誘導値のいずれかを使用したＰＳＩＩ効率間の相違を使用して、光防御効率を決定した。
【０２３６】
完全に広がった葉におけるガス交換および線形電子伝達
【０２３７】
ガス交換分析のために、幼植物を、トレイから成長培地（ＬＣ１  Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  ｍｉｘ、ポットあたり１０ｇの粒状肥料（Ｏｓｍｏｃｏｔｅ  Ｐｌｕｓ  １５／９／１２，Ｔｈｅ  Ｓｃｏｔｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ＬＬＣ，Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）を補足）で満たした３．８Ｌのポット（４００Ｃ，Ｈｕｍｍｅｒｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に植え替えた。ポットを無作為化し、温室テーブル上に３０ｃｍ間隔で配置した。植物に水を与え、５番目の葉が展開完了するまで植物の位置を２日毎に無作為に変えた。２ｃｍ２の葉室蛍光光度計を備えた開放型ガス交換システム（ＬＩ６４００ＸＴ，ＬＩ−ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ，ＵＳＡ）を使用して、ガス交換を測定した。全てのガス交換の測定値を、Ｇｏｎｇら、Ｐｌａｎｔ，Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ３８，２４１７−２４３２２０１５に従って種々のＣＯ２濃度での暗所の測定値を使用して、キュベットと周囲大気との間の拡散による漏れを補正した。
【０２３８】
完全に広がった葉における純同化率および線形電子伝達の光用量反応曲線を決定するために、ガス交換およびパルス大きさ変調クロロフィル蛍光を、光強度範囲で測定した。全てのクロロフィル蛍光を、マルチフェーズフラッシュの一般的手順を使用して測定した（Ｌｏｒｉａｕｘら、２０１３）。最も若い完全に広がった葉（ｎ＝６）を、ブロック温度を２５℃に設定し、且つ気流中のＣＯ２濃度１５００ｐｐｍに制御したキュベット中に固定した。３０分間の暗順応後、最小蛍光（Ｆｏ）および最大蛍光（Ｆｍ）を決定した。その後に、２つの異なる方法で光強度を変動させた。第１の実験では、各光強度でのＮＰＱの誘導を絶対最小値に維持するように試みながら光強度を０から５０、８０、１１０、１４０、１７０、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１５００、および２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１までゆっくり増加させた。定常状態に到達したとき、ガス交換パラメータを記録し、ベースライン蛍光（Ｆ’）および明順応最大蛍光（Ｆｍ’）を測定して、ＮＰＱ（式１）およびＰＳＩＩ操作効率（式３）を評価した。第２の実験では、葉を２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１で定常状態ガス交換に到達させた。その後に、光強度を、２０００から１５００、１０００、８００、６００、４００、２００、１７０、１４０、１１０、８０、および５０に変化させ、各工程は４分間持続し、４分間の２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１を先に実施した。各光強度で、Ｆ’およびＦｍ’ならびにガス交換のパラメータを、６０秒後、１４０秒後、および２２０秒後に決定した。これらの３つの測定値の平均値を、断続性の高ＰＦＤを使用した光応答曲線を再構築するためのその後の分析のために使用した。
【０２３９】
分光計（ＵＳＢ−２０００，Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｉｎｃ，Ｄｕｎｅｄｉｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ＵＳＡ）に接続した積分球（ＬＩ１８００、ＬＩ−ＣＯＲ、ＵＳＡ）を使用して、ガス交換分析のために使用した同一のスポット上の入射照射の葉吸収を測定した。両実験についての線形電子伝達速度（Ｊ）を、以下の式に従って決定した：
【０２４０】
Ｊ＝葉吸収＊ＰＳＩＩ操作効率＊ＰＦＤ＊０．５        式４
【０２４１】
両実験に由来する線形電子伝達およびガス交換についての光強度用量反応曲線を、Ｓｈａｒｋｅｙら（２００７）の式に従って葉の一定温度に調整し、記述的非直角双曲線モデル（Ｖｏｎ  Ｃａｅｍｍｅｒｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｌｅａｆ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ：ＣＳＩＲＯ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ２０００）に対してフィッティングして、初期勾配、凸状部、および漸近線を評価した。
【０２４２】
純同化率のＣＯ２用量反応曲線を分析するために、葉を、ブロック温度を２５℃に制御し、光強度を２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１に設定したキュベット中に固定した。気流中のＣＯ２濃度を、４００、３００、２００、１００、７５、４００、４００、５００、６００、７００、８００、１２００、および１６００ｐｐｍに調節し、定常状態に到達したときにガス交換パラメータを記録した。Ｆａｒｑｕｈａｒら、Ｐｌａｎｔａ  １４９，７８−９０．１９８０によって無限葉肉コンダクタンスを想定し、Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．３０，１０３５−１０４０，２００７に従って温度補正した葉光合成モデルをフィッティングして、最大カルボキシル化速度（Ｖｃｍａｘ）、２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１での電子伝達速度（Ｊ）、トリオースリン酸利用率（ＴＰＵ）、および光呼吸と無関係のミトコンドリア呼吸速度（Ｒｄ）を導いた。
【０２４３】
キサントフィルサイクル色素濃度
【０２４４】
葉を、上記のように開放型ガス交換システムのリーフキュベット中に固定し、暗順応させた。その後に、ＣＯ２およびＨ２Ｏの交換を、０、４００、および２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１で定常状態に到達させるか、一連の光強度の変化（３分間の２０００／３分間の２００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１を３サイクル）に供し、その直後に、葉片（０．５８ｃｍ２）を展開した葉スポットから試料採取し、液体窒素中で瞬間凍結し、抽出するまで−８０℃で保存した。ホーンポイント研究所（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）で色素分析を行った。凍結サンプルを、超音波プローブを使用して９０％アセトン中で浸軟し、粗抽出物を濾過した（０．４５μｍ）。色素を、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８カラム（９６３９６７−９０６，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＨＰＬＣによって分離し、Ｖａｎ  Ｈｅｕｋｅｌｅｍ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ（２００１）のプロトコールに従って定量した。
【０２４５】
成長および最終バイオマス蓄積
【０２４６】
成長に及ぼすＶＰＺ過剰発現の影響を評価するために、２つの独立した温室実験を、２０１５年５月２５日から６月２９日まで（ＷＴ、ＶＰＺ−２３、およびＶＰＺ−３４を使用）および２０１５年１０月９日〜１１月１３日まで（ＷＴ、ＶＰＺ−２３、ＶＰＺ−３４、およびＶＰＺ−５６を使用）行った。幼植物を、上記で特定するように繁殖させ（植物繁殖の段落）、トレイからポットあたり３０ｇの遅滞放出粒状肥料（Ｏｓｍｏｃｏｔｅ  Ｐｌｕｓ  １５／９／１２、Ｔｈｅ  Ｓｃｏｔｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ＬＬＣ）を補足した成長培地（ＬＣ１  Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  ｍｉｘ、Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ）で満たした１４．５Ｌのポット（２０００Ｃ、Ｈｕｍｍｅｒｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に植え替えた。ポットを無作為化し、温室テーブル上に３０ｃｍ間隔で配置した。植物に水を与え、植物の位置を２日毎に無作為に変えた。三脚上に取り付けられ、且つ最も若い葉の１０ｃｍ上部の位置を維持するように毎日調整した量子センサ（ＬＩ−１９０Ｒ、ＬＩ−ＣＯＲ、ＵＳＡ）を用いて温室テーブルの中央の葉レベルの光強度を記録した。温湿度センサ（ＨＭＰ６０−Ｌ，Ｖａｉｓａｌａ  Ｏｙｊ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）と赤外線ガス分析計（ＳＢＡ−５，ＰＰｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｍｅｓｂｕｒｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）との組み合わせを使用して樹冠のおよそ１ｍ上部の気温、相対湿度、およびＣＯ２濃度を測定した。全ての気候データを、データロガー（ＣＲ１０００，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）を使用して３０分毎に記録した。温室内の温度を、一般に、換気、蒸発冷却、およびガスヒーターの組み合わせを使用して、２８℃（日中）と１８℃（夜）との間に維持した。光強度は入射量によって変動し、日中ピークは、第１の実験ではおよそ１８００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１に到達し、第２の実験では１０００〜１５００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１に到達した。ＣＯ２濃度は制御せず、３６０ｐｐｍ（日中）と４３０ｐｐｍ（夜）の間で変動した。最初の花が開花した後、茎の長さおよび植物あたりの葉数を決定し、植物あたりの総葉領域を、コンベヤベルトスキャナ（ＬＩ−３１００Ｃ  Ａｒｅａ  Ｍｅｔｅｒ，ＬＩ−ＣＯＲ，ＵＳＡ）を用いて測定した。その後に植物を葉、茎、および根の画分に分離し、７０℃で恒量まで乾燥させた。
【０２４７】
統計解析
【０２４８】
全ての統計解析を、ＳＡＳ（バージョン９．３、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して行った。データを、ブラウン・フォーサイス検定を使用して分散の一様性について検定し、シャピロ・ウイルク検定を使用して正規性について試験した。一元配置分散分析を、フィッティングしたガス交換パラメータ、転写レベル、およびタンパク質発現に適用した。稚苗におけるＮＰＱのクロロフィル蛍光画像化データセットを二元配置分散分析（光防御）、または反復測定一元配置分散分析（１０分のオン／オフ）もしくは二元配置分散分析（高光／低光）によって解析した。２つの反復温室試験を、２つの完全ランダム化ブロックを使用した混合モデルを使用して分析した。全ての場合において、ＡＮＯＶＡにおいて有意な効果を得た後に、ＷＴコントロールに対する系統平均のダネット多重比較検定を行った（α＝０．０５）。ＮＰＱの誘導および緩和のフィッティングした時定数を、９５％信頼区間に基づいて比較した。
実施例１２．トランスジェニックメイズ（仮想例）
【０２４９】
本発明はまた、メイズ系統の親の表現型と比較して光合成および成長が改善されたメイズ系統を提供することができる。メイズ系統を、本明細書中に記載のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物集団を生成することによって作出することができる。各トランスジェニック事象は、本明細書中に記載の異種ヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つのヌクレオチド構築物を親植物のゲノムに移入する工程を含む。ヌクレオチド構築物を、前述の表現型が増強されたトランスジェニックメイズ植物内で培養することができるトランスジェニック細胞を産生するのに十分な量で親ゲノムに移入する。トランスジェニック細胞をトランスジェニック植物内で培養して、子孫トランスジェニック種子を産生する。トランスジェニック植物集団を、観察可能な表現型についてスクリーニングする。種子を、予想外に増強された表現型を有することによって選択されるトランスジェニック植物から回収する。任意選択的に、この方法は、トランスジェニック種子を出芽させ、前述のトランスジェニック種子から次世代の植物を成長させ、前述の次世代の植物の表現型を観察し、表現型が増強された次世代の植物から種子を回収するというサイクルを繰り返す工程を含む。この方法の別の態様では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を使用することによって大集団をスクリーニングする。この方法の他の好ましい態様は、異種ＤＮＡが選択されたプロモーター（例えば、プロモーター領域の５’末端）が作動可能に連結されているヌクレオチド構築物を使用する。ＤＮＡ構築物を、ゲノム内の無作為な位置またはゲノム内の予め選択された部位に導入することができる。
【０２５０】
メイズ形質転換プロトコールの例を、本明細書中に記載する。
【０２５１】
アグロバクテリウム培養の開始
【０２５２】
１．−８０℃のストック由来の単純バイナリーベクター（例えば、ｐＺＹ１０２）を保有するＡＧＬ１を、適切な抗生物質（本明細書中に例示したベクターおよび株については、１００ｍｇ／リットルのスペクチノマイシンおよび３０ｍｇ／リットルのリファンピン）を有するＡＢＣ寒天プレート上に画線し、単一コロニーを得るための希釈系列を調製する。プレートを暗所にて２８℃で３日間インキュベートする。
【０２５３】
２．単一コロニーを選択し、このコロニーを、適切な抗生物質（本明細書中に例示したベクターおよび株については、１００ｍｇ／リットルのスペクチノマイシンおよび３０ｍｇ／リットルのリファンピン）を含むＹＥＰ寒天プレート上に画線する。プレートを暗所にて２０℃で３日間インキュベートする。
【０２５４】
３．５ｍｌの滅菌ＰＨＩ−Ａ（植菌培地）を１５ｍｌの円錐遠心管に添加する。
【０２５５】
４．２フルループのＹＥＰプレート由来のＡＧＬ１を工程３で調製した管に移す。２〜３分後、管を振盪して細菌細胞を完全に懸濁する。
【０２５６】
５．１ｍｌのこの懸濁液を取り出し、これを分光光度計キュベットに入れて５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ５５０）をチェックする。さらなるアグロバクテリウム細胞を添加することか、さらなるＰＨＩ−Ａで培養物を希釈することのいずれかによって細胞懸濁液を室温（例えば、２４℃）で０．３５のＯＤ５５０（０．５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）に調整する。
【０２５７】
６．培養物を振盪器内において室温（例えば、２４℃）にて１００ｒｐｍで４〜５時間振盪する。
【０２５８】
７．１ｍｌの懸濁液を２ｍｌ滅菌微量遠心管に等分する。
【０２５９】
胚の単離、植菌、および共培養
【０２６０】
８．受粉１０〜１３日後に採取した穂から外皮およびシルクを除去する（胚サイズは１．５ｍｍ；サポートプロトコールを参照のこと）。鉗子を穂の一端に挿入する。
【０２６１】
９．新鮮なＨｉ−ＩＩ穂を、（無菌の１リットルの広口瓶中の）数滴のＴｗｅｅｎ  ２０を加えた０．５リットルの３０％市販漂白剤を含む溶液に完全に２０分間浸漬する。
【０２６２】
１０．穂を滅菌水で３回洗浄し（各回において、穂が水中に完全に浸漬していることを確認する）、穂を１５０×１５ｍｍの滅菌ペトリ皿上に直立させる。
【０２６３】
１１．１１番の滅菌した剃刀の刃を用いて各穂から穀粒の上半分を除去する。
【０２６４】
１２．滅菌マイクロスパチュラを用いて滅菌穂から１．５ｍｍの未成熟胚を単離し、１．７ｍｌ〜２．０ｍｌの微量遠心管あたり５０〜１００の胚を移す。胚を１ｍｌのＰＨＩ−Ａ溶液で３回洗浄して、デブリおよびデンプンを除去する。
【０２６５】
１３．直後に、１ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液を、未成熟胚を含む管に添加し、管を滅菌フード内で５分間静置し、次いで、全ての胚を含む全内容物をＰＨＩ−Ｂ（共培養培地）寒天プレート上に注ぐ。
【０２６６】
１４．微細なチップを備えたピペットを用いてアグロバクテリウム懸濁液を吸い出し、次いで、胚をプレート全体に均等に広げ、胚を、胚盤を表向きにし、且つ平坦面を培地上に下向きにして配置する。
【０２６７】
１５．プレートをパラフィンでシールし、暗所にて２０℃で３日間インキュベートする。
【０２６８】
静置
【０２６９】
１６．スパチュラを用いて胚をＰＨＩ−Ｃ（静置培地）のプレートに移す。胚の損傷を回避する。
【０２７０】
１７．プレートをパラフィンでシールし、暗所にて２８℃で７日間インキュベートする。
【０２７１】
選択
【０２７２】
１８．スパチュラまたは鉗子を用いて胚をＰＨＩ−Ｄ１（選択培地Ｉ）のプレートに移す。プレートあたり２５の胚を配置し、プレートをシールする。最初の２週間の選択のために、胚を暗所にて２８℃でインキュベートする。
【０２７３】
１９．鉗子を用いてカルスをＰＨＩ−Ｄ１プレートからＰＨＩ−Ｄ２（選択培地ＩＩ）のプレートに移す。工程１８に記載のインキューベーション条件を使用して、カルスを２週間毎に合計で２ヶ月にわたって新鮮なＰＨＩ−Ｄ２培地上で継代する。
【０２７４】
２０．工程１８および１９と同一の条件下でカルスの直径が約１．０ｃｍになるまで新鮮なＰＨＩ−Ｄ２培地上でさらに２週間成長させることによって除草剤耐性カルスを増大させる。
【０２７５】
成熟および再生
【０２７６】
２１．鉗子を使用して、不透明な胚を含む各カルス塊全体を２０×１００ｍｍのペトリプレート（３Ｍ多孔質テープで包まれている）中のＰＨＩ−Ｅ（成熟培地）上に移し、培養プレートを暗所に２８℃で２〜３週間置いて体細胞胚を成熟させる。
【０２７７】
２２．乳白色のカルスをＰＨＩ−Ｆ（再生培地）上に移し、苗条および根が発生するまで１６時間の明期下にて２５℃でインキュベートする。
【０２７８】
２３．各小植物を、ＰＨＩ−Ｆ（再生培地）を含む２５×１５０ｍｍの管に移し、１６時間の明期下にて２５℃で２〜３週間成長させる。
【０２７９】
２４．１８時間／明期、６時間／暗期サイクルを用いた２４℃の照明付きのインキュベーターまたは培養室内で、植物を、土壌混合物（例えば、Ｐｒｏｍｉｘ  ＢＸ土）を含むプラスチック製の小ポットに移す。
実施例１３．トランスジェニックモロコシ（仮想例）
【０２８０】
本発明はまた、モロコシ系統の親の表現型と比較して光合成および成長が改善されたモロコシ系統を提供することができる。モロコシ系統を、本明細書中に記載のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物集団を生成することによって作出することができる。各トランスジェニック事象は、本明細書中に記載の異種ヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つのヌクレオチド構築物を親植物のゲノムに移入する工程を含む。ヌクレオチド構築物を、前述の表現型が増強されたトランスジェニックモロコシ植物内で培養することができるトランスジェニック細胞を産生するのに十分な量で親ゲノムに移入する。トランスジェニック細胞をトランスジェニック植物内で培養して、子孫トランスジェニック種子を産生する。トランスジェニック植物集団を、観察可能な表現型についてスクリーニングする。種子を、予想外に増強された表現型を有することによって選択されるトランスジェニック植物から回収する。任意選択的に、この方法は、トランスジェニック種子を出芽させ、前述のトランスジェニック種子から次世代の植物を成長させ、前述の次世代の植物の表現型を観察し、表現型が増強された次世代の植物から種子を回収するというサイクルを繰り返す工程を含む。この方法の別の態様では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を使用することによって大集団をスクリーニングする。この方法の他の好ましい態様は、異種ＤＮＡが選択されたプロモーター（例えば、プロモーター領域の５’末端）が作動可能に連結されているヌクレオチド構築物を使用する。ＤＮＡ構築物を、ゲノム内の無作為な位置またはゲノム内の予め選択された部位に導入することができる。
【０２８１】
モロコシ形質転換プロトコールの例は、Ｇｕｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １２２３，１８１−１８８，  ２０１５ならびにＨｏｗｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２５（８）：  ７８４−７９１，  ２００６に記載される。
実施例１４．トランスジェニックダイズ（仮想例）
【０２８２】
本発明はまた、ダイズ系統の親の表現型と比較して光合成および成長が改善されたダイズ系統を提供することができる。ダイズ系統を、本明細書中に記載のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物集団を生成することによって作出することができる。各トランスジェニック事象は、本明細書中に記載の異種ヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つのヌクレオチド構築物を親植物のゲノムに移入する工程を含む。ヌクレオチド構築物を、前述の表現型が増強されたトランスジェニックダイズ植物内で培養することができるトランスジェニック細胞を産生するのに十分な量で親ゲノムに移入する。トランスジェニック細胞をトランスジェニック植物内で培養して、子孫トランスジェニック種子を産生する。トランスジェニック植物集団を、観察可能な表現型についてスクリーニングする。種子を、予想外に増強された表現型を有することによって選択されるトランスジェニック植物から回収する。任意選択的に、この方法は、トランスジェニック種子を出芽させ、前述のトランスジェニック種子から次世代の植物を成長させ、前述の次世代の植物の表現型を観察し、表現型が増強された次世代の植物から種子を回収するというサイクルを繰り返す工程を含む。この方法の別の態様では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を使用することによって大集団をスクリーニングする。この方法の他の好ましい態様は、異種ＤＮＡが選択されたプロモーター（例えば、プロモーター領域の５’末端）が作動可能に連結されているヌクレオチド構築物を使用する。ＤＮＡ構築物を、ゲノム内の無作為な位置またはゲノム内の予め選択された部位に導入することができる。
【０２８３】
ダイズ形質転換プロトコールの例を、本明細書中に記載する。
【０２８４】
子葉外植体を、５日齢のダイズ幼植物から、子葉からおよそ３〜５ｍｍ下の胚軸領域を水平方向にスライスすることによって調製する。その後に垂直方向のスライスを子葉の間で作製し、胚子軸を除去する。この操作によって、２つの子葉節外植体が得られる。およそ７〜１２の垂直スライスを、子葉／胚軸接合部から３ｍｍ上部および子葉／胚軸接合部から１ｍｍ下部を含む領域に関して、外植体の向軸面上で作製する。１５番の外科用メスを使用して外植体を操作する。
【０２８５】
外植体をアグロバクテリウム接種菌液中に３０分間浸漬し、次いで、０．５％精製寒天（ＢＢＬカタログ番号１１８５３）で固化したアグロバクテリウム懸濁培地を含む１００×１５ｍｍのペトリプレート上で共培養する。共培養プレートを、Ｗｈａｔｍａｎ＃１濾紙片で覆った（Ｍｕｌｌｉｎｓら，１９９０；Ｊａｎｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｇａｒｄｎｅｒ，１９９３；Ｚｈａｎｇら，１９９７）。外植体（プレートあたり５株）を、８０μｍｏｌ  ｓ−１ｍ−２の近似光強度（Ｆ１７Ｔ８／７５０白色電球、Ｌｉｔｅｔｒｏｎｉｃｓ）を用いて１８／６時間明期レジメ下にて２４℃で３日間、濾紙で覆った共培養プレート上で向軸面を下にして培養する。共培養プレートを、パラフィンで包む。
【０２８６】
共培養期間後、外植体を、１．６７ｍｇｌ−１のＢＡＰ、３％スクロース、５００ｍｇｌ−１のチカルシリンおよび１００ｍｇｌ−１セフォタキシムを補足したＢ５培地中で短時間洗浄する。培地を、３ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．６）で緩衝化する。オートクレーブ処理後に成長調節物質、ビタミン、および抗生物質を濾過滅菌する。洗浄工程後、外植体を、１００×２０ｍｍのペトリプレート中で、向軸面を上にして培養し（プレートあたり５株）、３．３または５．０ｍｇｌ−１のグルホシナート（ＡｇｒＥｖｏ  ＵＳＡ）のいずれかで修正した０．８％精製寒天（ＢＢＬカタログ番号１１８５３）を用いて固化した洗浄培地を含む培地中に胚軸を浸漬する。この培地を苗条開始培地（ＳＩ）という。プレートを３Ｍ粘着テープ（ＳｃｏｔｃｈＴＭ、３Ｍ、ＵＳＡ）で包み、種子発芽工程で使用した環境条件下で培養する。
【０２８７】
培養２週間後、胚軸領域を各外植体から切り出し、残存する外植体（分化節を有する子葉）を、新鮮なＳＩ培地上で継代する。ＳＩ培地上でのさらに２週間の培養後、分化節から子葉を除去する。分化節を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）（１９６２）基本塩、ビタミンＢ５、１ｍｇｌ−１のゼアチン−リボシド、０．５ｍｇｌ−１のＧＡ３および０．１ｍｇｌ−１のＩＡＡ、５０ｍｇｌ−１グルタミン、５０ｍｇｌ−１アスパラギン、３％スクロース、および３ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．６）から構成される苗条伸長培地（ＳＥ）に継代する。ＳＥ培地を、１．７または２．０ｍｇｌ−１のグルホシナートのいずれかで修正する。外植体を、苗条が３ｃｍを超える長さに到達するまで新鮮なＳＩ培地に隔週で継代する。伸長した苗条を、マジェンタボックス中またはサンデーカップ中（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｏａｐ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）のいずれかでさらに選択することなくビタミンＢ５、１％スクロース、０．５ｍｇｌ−１  ＮＡＡを補足したＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ塩上に植え付ける。
実施例１５．トランスジェニックイネ（仮想例）
【０２８８】
本発明はまた、イネ系統の親の表現型と比較して光合成および成長が改善されたイネ系統を提供することができる。イネ系統を、本明細書中に記載のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物集団を生成することによって作出することができる。各トランスジェニック事象は、本明細書中に記載の異種ヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つのヌクレオチド構築物を親植物のゲノムに移入する工程を含む。ヌクレオチド構築物を、前述の表現型が増強されたトランスジェニックイネ植物内で培養することができるトランスジェニック細胞を産生するのに十分な量で親ゲノムに移入する。トランスジェニック細胞をトランスジェニック植物内で培養して、子孫トランスジェニック種子を産生する。トランスジェニック植物集団を、観察可能な表現型についてスクリーニングする。種子を、予想外に増強された表現型を有することによって選択されるトランスジェニック植物から回収する。任意選択的に、この方法は、トランスジェニック種子を出芽させ、前述のトランスジェニック種子から次世代の植物を成長させ、前述の次世代の植物の表現型を観察し、表現型が増強された次世代の植物から種子を回収するというサイクルを繰り返す工程を含む。この方法の別の態様では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を使用することによって大集団をスクリーニングする。この方法の他の好ましい態様は、異種ＤＮＡが選択されたプロモーター（例えば、プロモーター領域の５’末端）が作動可能に連結されているヌクレオチド構築物を使用する。ＤＮＡ構築物を、ゲノム内の無作為な位置またはゲノム内の予め選択された部位に導入することができる。
【０２８９】
イネ形質転換プロトコールの例を、本明細書中に記載する。
【０２９０】
感染および共培養
【０２９１】
カルスを滅菌茶漉し器に移し、茶漉し器を非常に穏やか且つ断続的に１５分間振盪することによってアグロバクテリウム懸濁液中で茶漉し器をインキュベートし、次いで、滅菌ペトリ皿中の重ねたＷｈａｔｍａｎｎ１滅菌濾紙の上で茶漉し器を吸い取って乾燥させて過剰な細菌を除去する。ＭＳＧ４Ｋ培地上に配置した滅菌濾紙上にカルスを移し、暗所にて２５℃で４８時間培養する。
【０２９２】
静置およびビオラホス（バスタ）選択
【０２９３】
共培養したカルスを滅菌５０ｍｌ管に移し、滅菌水で５回およびチメンチン２００ｍｇ／ｌを含む液体共培養培地で１回洗浄する。カルスを滅菌Ｗｈａｔｍａｎ濾紙で吸い取って乾燥させ、ＭＳＧ２Ｋ「静置」培地含有プレートに移す。カルスプレートを暗所にて２５℃で７日間培養する。カルスをＭＳＧ２Ｋビオラホス選択培地に移す。プレートを暗所にて２５℃で３週間培養する。この過程をさらに５週間繰り返し、３週間毎に新鮮な培地に継代する。
【０２９４】
カルスの乾燥、苗条再生、および発根
【０２９５】
選択培地中での８週間の３〜４ラウンドの選択後、カルスを滅菌フード中の２層の滅菌Ｗｈａｔｍａｎ＃１濾紙を重ねた滅菌ペトリ皿に移す。これを３Ｍサージカルテープで包み、フード中で放置し、それにより、暗所で２４時間静置した。プレートは、カルスを確実に暗所に置くためにアルミニウム箔で覆う必要がある。カルス工程のこの部分的乾燥は、苗条再生培地中で苗条を誘導するのに絶対に必要である。４８時間後、カルスをＭＳＧ７５Ｋ苗条再生培地に移し、暗所で３週間インキュベートする。体細胞胚を有する増殖カルスを同一の培地に移し、１２時間／８時間暗周期を用いた低光下（およそ２０〜３０μＥ  ｍ−２ｓ−１）でインキュベートする。苗条は、１０日後に明所で出現し始め、ほとんどのカルスは緑色になる。十分な量の苗条が得られるまで同一の光レジメン下でＭＳＧ７５Ｋ苗条再生培地中にて胚に沿って緑色カルスを培養し続ける。一方、苗条の長さが５ｃｍを超えたとき、底部で切断し、ＭＳＧ１００Ｋ発根培地を含むＧｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ植物培養容器（番号９６８１６１−８２０５１−５０８−蓋付き容器、３３０ｍｌ、滅菌、直径６８ｍｍ×高さ１１０ｍｍ）に移す。
実施例１６．トランスジェニックコムギ（仮想例）
【０２９６】
本発明はまた、コムギ系統の親の表現型と比較して光合成および成長が改善されたコムギ系統を提供することができる。コムギ系統を、本明細書中に記載のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物集団を生成することによって作出することができる。各トランスジェニック事象は、本明細書中に記載の異種ヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つのヌクレオチド構築物を親植物のゲノムに移入する工程を含む。ヌクレオチド構築物を、前述の表現型が増強されたトランスジェニックコムギ植物内で培養することができるトランスジェニック細胞を産生するのに十分な量で親ゲノムに移入する。トランスジェニック細胞をトランスジェニック植物内で培養して、子孫トランスジェニック種子を産生する。トランスジェニック植物集団を、観察可能な表現型についてスクリーニングする。種子を、予想外に増強された表現型を有することによって選択されるトランスジェニック植物から回収する。任意選択的に、この方法は、トランスジェニック種子を出芽させ、前述のトランスジェニック種子から次世代の植物を成長させ、前述の次世代の植物の表現型を観察し、表現型が増強された次世代の植物から種子を回収するというサイクルを繰り返す工程を含む。この方法の別の態様では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を使用することによって大集団をスクリーニングする。この方法の他の好ましい態様は、異種ＤＮＡが選択されたプロモーター（例えば、プロモーター領域の５’末端）が作動可能に連結されているヌクレオチド構築物を使用する。ＤＮＡ構築物を、ゲノム内の無作為な位置またはゲノム内の予め選択された部位に導入することができる。
【０２９７】
コムギ形質転換プロトコールの例は、Ｍｅｄｖｅｃｋａ  Ｅ，  Ｈａｒｗｏｏｄ  ＷＡ．  Ｗｈｅａｔ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｔｕｒｅ  Ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｖｏｌｕｍｅ  １．  ２０１５：１９９−２０９に記載される。
実施例１７．トランスジェニックササゲ
【０２９８】
Ｈｉｇｇｉｎｓら，Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｗｐｅａ  ｖａｌｕｅ  ｃｈａｉｎ．Ｉｂａｄａｎ，Ｎｉｇｅｒｉａ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．１３３−１３９，２０１３に記載の形質転換プロトコールに従って、ササゲ植物を、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥをコードするヌクレオチド配列を含むＴ−ＤＮＡ構築物で形質転換した。動的ＮＰＱ調整の動態学を比較するために、二重指数モデルを、変動光への曝露後にＴ０トランスジェニックササゲにおけるＮＰＱの暗所緩和にフィッティングした。表４に示すように、ｑＥ緩和（τ１）は、コントロールと比較して形質転換体系統１６４３８１Ａにおいて顕著に急速であり、測定値は２０．５秒および１９．７秒対３５．９秒および２９．７秒であった。ＮＰＱ緩和のｑＺ期（τ２）は、コントロールと比較して形質転換体系統１６４３Ｂ１で遅く、これは、おそらくＴ０トランスジェニック植物において測定したという制限に原因していた。当該分野で公知のように、Ｔ１世代またはＴ２世代由来のトランスジェニック植物は、通常は表現型の測定値がＴ０を超えることが好ましい。１つの理由としては、Ｔ０トランスジェニック植物において、形質転換過程および組織培養過程に由来するストレスが通常の植物生理学を妨害し、表現型測定値に影響を及ぼし得ることである。別の理由は、導入遺伝子の分子特徴づけがＴ１世代またはＴ２世代まで完了できないこと、およびコピー数およびゲノム内の挿入位置などのトランスジェニックの特徴が導入遺伝子発現に有意に影響を及ぼし得ることである。図２７、図２８、および図２９に示すように、ＮＰＱは、コントロール植物よりも形質転換体系統１６４３Ｂ１で急速に緩和した。図３０に示すように、ＮＰＱの緩和はコントロール植物（青色ドット）よりも形質転換体系統ＣＰ４７２Ａ（橙色ドット）でより遅く、これは、おそらく、上記で考察するように、Ｔ０トランスジェニック植物において測定したという制限に原因する。
【０２９９】
【表４】
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実施例１８．トランスジェニックキャッサバ（仮想例）
【０３００】
本発明はまた、キャッサバ系統の親の表現型と比較して光合成および成長が改善されたキャッサバ系統を提供することができる。キャッサバ系統を、本明細書中に記載のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物集団を生成することによって作出することができる。各トランスジェニック事象は、本明細書中に記載の異種ヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つのヌクレオチド構築物を親植物のゲノムに移入する工程を含む。ヌクレオチド構築物を、前述の表現型が増強されたトランスジェニックキャッサバ植物内で培養することができるトランスジェニック細胞を産生するのに十分な量で親ゲノムに移入する。トランスジェニック細胞をトランスジェニック植物内で培養して、子孫トランスジェニック種子を産生する。トランスジェニック植物集団を、観察可能な表現型についてスクリーニングする。種子を、予想外に増強された表現型を有することによって選択されるトランスジェニック植物から回収する。任意選択的に、この方法は、トランスジェニック種子を出芽させ、前述のトランスジェニック種子から次世代の植物を成長させ、前述の次世代の植物の表現型を観察し、表現型が増強された次世代の植物から種子を回収するというサイクルを繰り返す工程を含む。この方法の別の態様では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を使用することによって大集団をスクリーニングする。この方法の他の好ましい態様は、異種ＤＮＡが選択されたプロモーター（例えば、プロモーター領域の５’末端）が作動可能に連結されているヌクレオチド構築物を使用する。ＤＮＡ構築物を、ゲノム内の無作為な位置またはゲノム内の予め選択された部位に導入することができる。
【０３０１】
キャッサバ形質転換プロトコールの例は、Ｃｈｅｔｔｙら、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０．２：  １３６−１４３，  ２０１３に記載される。
実施例１９．トランスジェニックポプラ（仮想例）
【０３０２】
本発明はまた、ポプラ系統の親の表現型と比較して光合成および成長が改善されたポプラ系統を提供することができる。ポプラ系統を、本明細書中に記載のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物集団を生成することによって作出することができる。各トランスジェニック事象は、本明細書中に記載の異種ヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つのヌクレオチド構築物を親植物のゲノムに移入する工程を含む。ヌクレオチド構築物を、前述の表現型が増強されたトランスジェニックポプラ植物内で培養することができるトランスジェニック細胞を産生するのに十分な量で親ゲノムに移入する。トランスジェニック細胞をトランスジェニック植物内で培養して、子孫トランスジェニック種子を産生する。トランスジェニック植物集団を、観察可能な表現型についてスクリーニングする。種子を、予想外に増強された表現型を有することによって選択されるトランスジェニック植物から回収する。任意選択的に、この方法は、トランスジェニック種子を出芽させ、前述のトランスジェニック種子から次世代の植物を成長させ、前述の次世代の植物の表現型を観察し、表現型が増強された次世代の植物から種子を回収するというサイクルを繰り返す工程を含む。この方法の別の態様では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を使用することによって大集団をスクリーニングする。この方法の他の好ましい態様は、異種ＤＮＡが選択されたプロモーター（例えば、プロモーター領域の５’末端）が作動可能に連結されているヌクレオチド構築物を使用する。ＤＮＡ構築物を、ゲノム内の無作為な位置またはゲノム内の予め選択された部位に導入することができる。
【０３０３】
ポプラ形質転換プロトコールの例は、Ｍｏｖａｈｅｄｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５．６：  １０７８０−１０７９３，  ２０１４に記載される。
実施例２０．トランスジェニックユーカリ（仮想例）
【０３０４】
本発明はまた、ユーカリ系統の親の表現型と比較して光合成および成長が改善されたユーカリ系統を提供することができる。ユーカリ系統を、本明細書中に記載のＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物集団を生成することによって作出することができる。各トランスジェニック事象は、本明細書中に記載の異種ヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つのヌクレオチド構築物を親植物のゲノムに移入する工程を含む。ヌクレオチド構築物を、前述の表現型が増強されたトランスジェニックユーカリ植物内で培養することができるトランスジェニック細胞を産生するのに十分な量で親ゲノムに移入する。トランスジェニック細胞をトランスジェニック植物内で培養して、子孫トランスジェニック種子を産生する。トランスジェニック植物集団を、観察可能な表現型についてスクリーニングする。種子を、予想外に増強された表現型を有することによって選択されるトランスジェニック植物から回収する。任意選択的に、この方法は、トランスジェニック種子を出芽させ、前述のトランスジェニック種子から次世代の植物を成長させ、前述の次世代の植物の表現型を観察し、表現型が増強された次世代の植物から種子を回収するというサイクルを繰り返す工程を含む。この方法の別の態様では、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥから選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を使用することによって大集団をスクリーニングする。この方法の他の好ましい態様は、異種ＤＮＡが選択されたプロモーター（例えば、プロモーター領域の５’末端）が作動可能に連結されているヌクレオチド構築物を使用する。ＤＮＡ構築物を、ゲノム内の無作為な位置またはゲノム内の予め選択された部位に導入することができる。
【０３０５】
ユーカリ形質転換プロトコールの例は、Ｄｉｗａｋａｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，  Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｐ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，  ２１９−２４４，  ２０１６に記載される。
実施例２１．ＮＰＱ遺伝子の配列同一性分析
【０３０６】
シロイヌナズナＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥと相同なアミノ酸配列を同定するために、ＢＬＡＳＴＸプログラムを使用してＢＬＡＳＴタンパク質検索を行った。ＢＬＡＳＴによる配列類似率を、ＰｓｂＳについては表４、ＺＥＰについては表５、およびＶＤＥについては表６に示し、ここで、シロイヌナズナホモログに対する配列同一率を降順に並べた配列の上位１００ヒットを列挙している。
【０３０７】
シロイヌナズナＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥに相同なアミノ酸配列の配列同一性および／または類似性を比較するために、ＣＬＵＳＴＡＬ  ＯＭＥＧＡプログラムを使用して、配列アラインメントを行った。図２４は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｏによるそれぞれ（Ａ）ＰｓｂＳ、（Ｂ）ＺＥＰ、および（Ｃ）ＶＤＥについてのアミノ酸配列類似性を例示している。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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実施例２２．温室ＮＰＱ発現実験
【０３０８】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍを、葉の発現についての異なるプロモーターの調節下においてシロイヌナズナＶＤＥ、ＺＥＰ、およびＰｓｂＳのコード配列で形質転換した。単一トランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）組み込みを有する２つの形質転換体（ＶＰＺ−３４およびＶＰＺ−５６）ならびに２つのＴ−ＤＮＡ挿入を有する１つの形質転換体（ＶＰＺ−２３）を、幼植物ＮＰＱスクリーニングに基づいて選択し、自家受粉してさらなる調査用のホモ接合Ｔ２子孫を得た。次いで、これらの植物を、温室内で成長させた。ＶＤＥ、ＰｓｂＳ、およびＺＥＰのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを測定した（図２５）。
【０３０９】
３つ全てのＶＰＺ系統は、ＷＴと比較して総（トランスジェニック＋ネイティブ）転写物レベルがＶＤＥ（１０倍）、ＰｓｂＳ（３倍）、およびＺＥＰ（６倍）で増加した（Ａ、Ｃ、およびＥ）。ＰｓｂＳについては、転写物レベルの増加は、２１ｋＤａ（ＡｔＰｓｂＳ）および２４ｋＤａ（ＮｔＰｓｂＳ）でのバンド（Ｇ）に例示されるように、ＰｓｂＳタンパク質レベル（Ｄ）がおよそ４倍と解釈された。ＶＤＥおよびＺＥＰについては、転写物レベルの増加は、ＷＴタンパク質レベルの、ＶＤＥについては３０倍（４５ｋＤａ）（ＢおよびＧ）およびＺＥＰについては７４倍（７３ｋＤａ）（ＦおよびＧ）に相当していた。
実施例２３．野外ＮＰＱ発現実験
【０３１０】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍを、葉の発現についての異なるプロモーターの調節下においてシロイヌナズナＶＤＥ、ＺＥＰ、およびＰｓｂＳのコード配列で形質転換した。単一トランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）組み込みを有する２つの形質転換体（ＶＰＺ−３４およびＶＰＺ−５６）ならびに２つのＴ−ＤＮＡ挿入を有する１つの形質転換体（ＶＰＺ−２３）を、幼植物ＮＰＱスクリーニングに基づいて選択し、自家受粉してさらなる調査用のホモ接合Ｔ２子孫を得た。次いで、これらの植物を、実地で成長させた。ＶＤＥ、ＰｓｂＳ、およびＺＥＰのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを測定した（図２６）。
【０３１１】
３つ全てのＶＰＺ系統は、ＷＴと比較して総（トランスジェニック＋ネイティブ）転写物レベルがＶＤＥ（４倍）、ＰｓｂＳ（１．２倍）、およびＺＥＰ（７倍）で増加した。３つ全てのＶＰＺ系統はまた、ＷＴと比較して総（トランスジェニック＋ネイティブ）タンパク質レベルがＶＤＥ（４７倍）、ＰｓｂＳ（３倍）、およびＺＥＰ（７５倍）で増加した。
実施例２４．トランスジェニックイネ実験
【０３１２】
イネ植物を、実施例１５に記載の形質転換プロトコールに従って、ＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥをコードするヌクレオチド配列を含むＴ−ＤＮＡ構築物で形質転換した。トランスジェニックタバコ実験で使用した同一の発現構築物を、この実験で使用した。９つの独立したＴ０形質転換体および２つのＧＵＳコントロールの葉を暗順応させた。その後に、１０分間の１０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の照射およびその後の３分間の暗所中にＮＰＱを測定した。図３１は、一連の１０分間の１０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の照射およびその後の３分間の暗所にわたる９つのイネ形質転換体（点）およびコントロール（線）のＮＰＱを示す。図３２は、一連の１０分間の１０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の照射およびその後の３分間の暗所にわたる９つのイネ形質転換体（青色の点）およびコントロール（橙色ドット）のＮＰＱの平均を示す。
【０３１３】
図３１および図３２に示すように、１０分間の１０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１照射中のこれら９つの形質転換体のＮＰＱ大きさはコントロールより低かった。この結果は、これらの形質転換体におけるＺＥＰの発現の増加と一致し、この発現の増加により、ゼアキサンチン形成が防止され、それにより、ＮＰＱ大きさが減少する。別の説明としては、ＰｓｂＳ過剰発現がネイティブＰｓｂＳの発現を妨害し、それにより、ＮＰＱ大きさが減少するということである。結果は、暗所で３分間の緩和では形質転換体とコントロールとの間にＮＰＱの有意差は認められず、これはこの実験においてゼアキサンチンの上昇を欠く可能性があることに起因することも示す。
【０３１４】
これらのトランスジェニックイネ植物におけるＮＰＱ動態学の変化の欠如は、実験デザインの制限に起因する可能性が最も高い：この実験では、イネ植物を、双子葉植物における最適な遺伝子発現のためにデザインされたプロモーターを含むタバコ形質転換のために構築された発現カセットで形質転換した。双子葉植物プロモーターは単子葉植物で十分に機能しないことが当該分野で公知である。したがって、これらのトランスジェニックイネ植物内でのＰｓｂＳ、ＺＥＰ、およびＶＤＥの発現は、ＮＰＱ緩和速度の増加に役立つレベルまで最適に増加しなかった可能性がある。
実施例２５．さらなる実験
【０３１５】
ＮＰＱ関連遺伝子の一過性過剰発現をＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて行った。ネガティブコントロールとしてＦＬＡＧタグ化したＰｓｂＳ、ＶＤＥ、ＺＥＰ、およびＧＵＳを過剰発現する葉スポットの、６００μｍｏｌ  光子  ｍ−２ｓ−１で１３分間の照射およびその後の１０分間の暗所中のＮＰＱを測定した。図１８に示すように、結果は、ＰｓｂＳの過剰発現がＧＵＳコントロールと比較してＮＰＱ能力を増加させたことを示した。ＶＤＥの過剰発現は、ＮＰＱ誘導を急速にした。ＺＥＰの過剰発現は、ＮＰＱ緩和を急速にしたが、ＮＰＱの誘導および能力に負の影響を及ぼした。
【０３１６】
ＶＤＥおよびＺＥＰの一過性同時過剰発現をＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて行った。図１９に示すように、結果は、ＮＰＱの誘導速度および緩和速度の増加を示した。ＶＤＥの同時過剰発現は、ＺＥＰの過剰発現のバランスを取り、且つ、ＮＰＱの誘導および能力に及ぼすＺＥＰ過剰発現の負の影響を防止するために必要であることが示された。
【０３１７】
図２０は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａの安定なトランスジェニックＴ１植物のＮＰＱ動態学を示す。６００μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１での１０分間の照射およびその後の１０分間の暗所中の以下の３つの異なる系統についてのＴ１成植物の最も若い完全に広がった葉のＮＰＱを、ＤＵＡＬ  ＰＡＭを使用して測定した：１つの野生型分離個体系統（Ｎｕｌｌ）、１つのＺＥＰを過剰発現する系統（ＺＥＰ）、ならびに１つのＺＥＰおよびＶＤＥを過剰発現する系統（ＺＥＰ−ＶＤＥ）。結果は、ＺＥＰ−ＶＤＥ系統のＮＰＱの誘導および緩和がより急速であることを示した。
【０３１８】
図２１は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａの安定なトランスジェニックＴ１植物の光化学系ＩＩ量子収量（ＹＩＩ）を示す。同一の植物および同一の条件下で、図２０に記載のＮＰＱ測定と同時にＹＩＩを測定した。暗所回復期間中、ＹＩＩは、ＺＥＰまたはＮｕｌｌを過剰発現する系統と比較して、ＺＥＰ−ＶＤＥを過剰発現する系統でより高かった。
【０３１９】
図２２は、温室での成長実験を示す。結果は、ＺＥＰおよびＶＤＥを過剰発現するＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａの安定なトランスジェニックＴ１植物（ＺＥＰ−ＶＤＥ）が野生型（Ｎｕｌｌ）と比較して、サイズおよびバイオマスが増加することことを証明した。ＰｓｂＳ（ＰｓｂＳ）またはＺＥＰおよびＰＳＢＳ（ＺＥＰ−ＰｓｂＳ）を過剰発現する系統は、野生型と類似のバイオマスを示した。４組（トランスジェニック系統あたり１組）の植物を図中に示す。各組は３６株の植物を含む。各組についての地上バイオマスを、成長１９日後に３６株の植物の収穫物の総湿重量および総乾燥重量によって決定した。データは、単一の実験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ−１】
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【図２４Ａ−２】
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【図２４Ａ−３】
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【図２４Ｂ−１】
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【図２４Ｂ−２】
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【図２４Ｂ−３】
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【図２４Ｂ−４】
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【図２４Ｂ−５】
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【図２４Ｂ−６】
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【図２４Ｃ−１】
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【図２４Ｃ−２】
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【図２４Ｃ−３】
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【図２４Ｃ−４】
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【図２４Ｃ−５】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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