(57)【要約】  本発明は、化合物及びそれらの使用に関する。特に、βアレスチンと活性化したＮＫ１Ｒの細胞内Ｃ末端との間の相互作用を阻害する化合物、及び疼痛の治療におけるそれらの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドソームサブスタンスＰ（ＳＰ）又はニューロキニン１受容体（ＮＫ１Ｒ）のシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、βアレスチンと活性化したＮＫ１Ｒの細胞内Ｃ末端との間の相互作用を阻害する化合物を投与することを含む、方法。
【請求項２】
式：Ａ―Ｄ
（前記式中、
Ａは細胞膜を横切ってβアレスチン阻害剤の輸送を促進する膜透過性残基であり、及び
ＤはＮＫ１Ｒの細胞内Ｃ末端上の１以上のリン酸化部位のフラグメントを表す）
又は医薬的に許容されるその塩
のβアレスチン阻害剤。
【請求項３】
以下：
Ａ―ＳＳＳＦＹＳＮＭ―ＯＨ、
Ａ−ＳＮＳＫＴＭＴＥ−ＯＨ、
Ａ−ＬＴＳＮＧＳＳＲ−ＯＨ、及び
Ａ−ＥＭＫＳ＊Ｔ＊ＲＹ＊Ｌ−ＯＨ
（前記式中、
Ａは細胞膜を横切ってβアレスチン阻害剤の輸送を促進する膜透過性残基であり；及び
＊はアミノ酸残基がリン酸化されることを示す）
又は医薬的に許容されるそれらの塩
から選択される、請求項２に記載のβアレスチン阻害剤。
【請求項４】
ＡがＴａｔ膜透過性ペプチド配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲである、請求項２又は３に記載のβアレスチン阻害剤。
【請求項５】
Ａがパルミチン酸である、請求項２又は３に記載のβアレスチン阻害剤。
【請求項６】
エンドソームＳＰ又はＮＫ１Ｒのシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項２〜５のいずれか一項に記載のβアレスチン阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項７】
エンドソームＮＫ１Ｒのシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害が、化学療法誘導性の悪心及び嘔吐（ＣＩＮＶ）、術後悪心及び嘔吐、うつ病及び不安を含む情動障害及び嗜癖障害、炎症性腸疾患及び過敏性腸症候群を含む胃腸障害、関節炎を含む慢性的な炎症性の障害、ＣＯＰＤ及び喘息を含む呼吸器疾患、泌尿生殖器障害、感覚の障害並びに体性痛及び内臓痛を含む疼痛、掻痒、ウイルス及び細菌感染症、並びに増殖性疾患（がん）から選択される、請求項１又は６に記載の方法。
【請求項８】
エンドソームＮＫ１Ｒのシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害が、体性痛又は内臓痛である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
エンドソームＳＰ又はＮＫ１Ｒのシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害が、慢性的な疾患又は障害である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
エンドソームＳＰ又はＮＫ１Ｒのシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害の治療における使用のための、請求項２〜５のいずれか一項に記載のβアレスチン阻害剤。
【請求項１１】
エンドソームＮＫ１Ｒのシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害の治療用の医薬の製造における、請求項２〜５のいずれか一項に記載のβアレスチン阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野
本発明は、化合物及びそれらの使用に関する。具体的には、βアレスチンと活性化したNK1Rの細胞内Ｃ末端との間の相互作用を阻害する化合物、及び疼痛の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Gタンパク質共役受容体(GPCR)は、細胞表面受容体の最大のファミリーであり、殆んどの病態生理学的プロセスに関与し、治療医薬の約30％の標的である (Audet, M. & Bouvier, M. Nat Chem Biol 2008、4、397-403)。細胞表面GPCRは、細胞外リガンドと相互作用し、ヘテロ三量体Gタンパク質に共役し、細胞膜で仕切られたシグナル（第二メッセンジャーの形成、成長因子受容体トランス活性化、イオンチャネル制御）をトリガーする。リガンドの除去及び受容体のβアレスチン（βarr）との結合が、細胞膜シグナルを終結させる。
【０００３】
最近まで、GPCRの活性化、その後の下流シグナル伝達及びシグナルの終結が、専ら細胞膜でだけ起こると、広く考えられていた。細胞膜シグナル伝達は、活性のあるリガンドに結合した受容体の立体構造に選択的であるGPCRキナーゼ (GRK)によって、受容体のリン酸化を介して、活性化の数分以内に終結する。GRKは、GPCRのC末端S／Tリッチドメインをリン酸化する (Sato, P. Y.ら、Physiological reviews 2015、95、377-404)。次いで、リン酸化された受容体は、受容体とGタンパク質との間の共役を構造的に妨げるβarrに結合し、従って、アゴニスト媒介性Gタンパク質活性化を終結する。更に、βarrは、ダイナミン及びクラスリン依存性エンドサイトーシスを介して、細胞表面から早期エンドソームへのリガンド結合受容体の移行を促進する。一旦、エンドサイトーシスされると、リガンド及びリン酸基はGPCRから除去され、受容体は、急速に細胞膜に再分布するか、又は分解のためにリソソームに輸送される。
【０００４】
しかしながら、最近、多様な範囲のGPCRが、常に従来のパラダイムに従う訳ではないことが発見されている。研究によって、リガンド結合及び受容体の活性化に続いて、幾つかの細胞表面GPCRが、ヘテロ三量体のGタンパク質シグナル伝達が長期間持続する早期エンドソームに、内在化し、再分布することが見出されている。従って、リサイクル又は分解経路へのGPCR輸送用の通路（conduit）として単に作用するというよりむしろ、エンドソームは、シグナル伝達の重要な場所であり得る (Murphy, J. E.ら、Proc Natl Acad Sci USA 2009、106、17615-17622)。エンドソームに対して、GPCR及び分裂促進因子活性化プロテインキナーゼを補充することによって、βarrは、エンドソームGPCRシグナル伝達を媒介し得る (Murphy, J. E.ら、Proc Natl Acad Sci USA 2009、106、17615-17622；DeFea, K. A.ら、Proc Natl Acad Sci USA 2000、97、11086-11091；DeFea, K. A.ら、J Cell Biol 2000、148、1267-1281)。
【０００５】
βarrは、細胞膜及びエンドソーム膜で、活性化した受容体に様々なシグナル伝達タンパク質を補充し、シグナル伝達の本質的なメディエーターである。MAPKカスケード[ERK、c-Junアミノ末端キナーゼ (JNK)、p38]は、最も良く特徴付けられたβarr依存性シグナル伝達経路である。βarrがシグナル伝達において活発に関与するという第一の証拠は、βarrの優性抑制変異体が、ERK1/2のβ2AR誘導性の活性化を阻害したという観察であった (Daaka Yら、J Biol Chem 1998、273、685-688)。その後、βarrは、β2ARをc-Srcに連結し、ERK1/2活性化を媒介することが見出された (Lutterall L. M.ら、Science 1999、283、655-661)。同様に、βarrは、ニューロキニン-1受容体 (NK1R)、プロテアーゼ活性化受容体2 (PAR2)、アンギオテンシンII 1A型受容体 (AT1AR)及びバソプレッシンV2受容体 (V2R)を含む他のGPCRによって、ERK1/2シグナル伝達に関与する。これらの発見によって、βarrは活性化したGPCRをMAPKシグナル伝達複合体に連結する足場であるという見解が導き出された。それにより、βarrは、細胞膜で、Gタンパク質依存性シグナル伝達とは異なるGPCRシグナル伝達の第二波を媒介する。
【０００６】
サブスタンスP (SP)ニューロキニン1受容体 (NK1R)は、疼痛及び炎症を媒介する (Steinhoff, M. S.ら、Physiol Rev 2014、94、265-301)。細胞膜NK1Rシグナル伝達のアンタゴニストを用いた臨床前の研究によって、神経学的及び炎症性障害におけるその関与が支持されたが、これらのアンタゴニストは、慢性的な疾患の治療には効果がない。NK1Rは、脊髄 (Marvizon, J. C.ら、J Neurosci 1997、17、8129-8136)における疼痛の伝達部位及び血管系 (Bowden, J. J.ら、Proc Natl Acad Sci USA 1994、91、8964-8968)における炎症の部位で、急速に完全に、エンドソームに再分布し、慢性的な疼痛及び炎症を有する患者において、内在化していると考えられる (Jarcho, J. M.ら、Pain、2013)。
【０００７】
エンドソームNK1Rシグナル伝達が、ニューロンの活性化及び痛覚過敏の根底にある細胞内シグナル（subcellular signal）を生成することが見出されている。受容体バニロイド1の一過性のアゴニストの候補であるカプサイシンを含む、疼痛を伴う、及び炎症促進性の刺激は、後角のラミナI、IIにおける一次感覚性侵害受容器からのSPの放出を刺激し、SPは脊髄ニューロンにおけるNK1Rエンドサイトーシスを刺激する。髄腔内に注射した場合、ダイナミン及びクラスリンの阻害剤は、ラット及びマウスにおけるNK1Rエンドサイトーシスを阻害し、また痛覚を抑制することが見出されている。
【０００８】
従って、活性化したNK1Rの早期エンドソームへのエンドサイトーシスを阻害することによって、疼痛の治療のための新規方法を有利に提供し得る。
【発明の概要】
【０００９】
発明の要約
本発明は、βアレスチンと活性化したNK1Rの細胞内C末端との間の相互作用、及びその後の受容体のエンドサイトーシスを阻害することが、NK1Rによって媒介される疾患及び障害の治療及び予防のための新規方法を提供し得るという発見に基づいて予測される。
【００１０】
従って、一態様においては、本発明は、エンドソームサブスタンスP (SP)又はニューロキニン1受容体 (NK1R)シグナル伝達によって媒介される疾患又は障害の治療のための方法であって、それを必要とする対象に、βアレスチンと活性化したNK1Rの細胞内C末端との間の相互作用を阻害する化合物を、投与することを含む、方法を提供する。
【００１１】
別の態様においては、本発明は、エンドソームサブスタンスP (SP)又はニューロキニン1受容体 (NK1R)のシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害の治療用の医薬の製造における、βアレスチンと活性化したNK1Rの細胞内C末端との間の相互作用を阻害する化合物の使用を提供する。
【００１２】
更なる態様においては、本発明は、エンドソームサブスタンスP (SP)又はニューロキニン1受容体(NK1R)のシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害の治療における使用のための、βアレスチンと活性化したNK1Rの細胞内C末端との間の相互作用を阻害する化合物を提供する。
【００１３】
別の態様においては、本発明は、式：A-D
（前記式中、
Aは細胞膜を横切ってβアレスチン阻害剤の輸送を促進する膜透過性残基であり、及び
DはNK1Rの細胞内C末端上の1以上のリン酸化部位のフラグメントを表す）
又は医薬的に許容されるその塩
のβアレスチン阻害剤を提供する。
【００１４】
更なる態様においては、本発明は、以下：
A-SSSFYSNM-OH、
A-SNSKTMTE-OH、
A-LTSNGSSR-OH、及び
A-EMKS*T*RY*L-OH
（前記式中、
Aは細胞膜を横切ってβアレスチン阻害剤の輸送を促進する膜透過性残基であり；及び
*はアミノ酸がリン酸化されることを示す）
又は医薬的に許容されるそれらの塩
から選択される、βアレスチン阻害剤を提供する。
【００１５】
別の態様においては、本発明は、NK1Rエンドサイトーシスの阻害方法であって、細胞を、本明細書において定義されるβアレスチン阻害剤と接触させることを含む、方法を提供する。
【００１６】
別の態様においては、本発明は、エンドソームサブスタンスP (SP)又はニューロキニン1受容体 (NK1R)のシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書において定義されるβアレスチン阻害剤を投与することを含む、方法を提供する。
【００１７】
別の態様においては、本発明は、エンドソームSP又はNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害の治療用の医薬の製造における、本明細書において定義されるβアレスチン阻害剤の使用を提供する。
【００１８】
更なる態様においては、本発明は、エンドソームSP又はNK1Rシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害の治療における使用のための、本明細書において定義されるβアレスチン阻害剤を提供する。
【００１９】
本発明のこれら及び他の態様は、添付の実施例及び特許請求の範囲に関連して、以下の詳細な説明を読むことで、当業者に、より明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】痛覚に対するβarr siRNAの効果のグラフ表示。髄腔内 (i.t.)βarr siRNAの効果。a．βarr発現。b〜c．マウスにおける痛覚。カプサイシン注射(b)又は注射なし(c)のvon Frey引っ込め反応。対照に対して、*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001。(n)マウス数。
【図２】NK1R／βarr相互作用の破壊のグラフ表示。a．NK1Rδ312トランケーション及びTat結合NK1R及び対照ペプチドを示す、マウスNK1RのC末端。b．細胞表面ELISA：野生型 (WT)NK1R、内在化しないトランケート変異体NK1Rδ312。b〜f．SP誘導性BRET：WT NK1R-RLuc8／若しくはNK1Rδ312-RLuc8／βarr1-YFP、βarr2-YFP、KRas-Venus、又はRab5a-Venus。g．SP誘導性FRET。*P＜0.05。3回反復観察、n＞3回の実験、n＝49〜99細胞。h〜i．SP誘導性NK1R-Rluc8／βarr2-YFP BRET及びNK1Rエンドサイトーシスに対する、対照及び3つのNK1Rペプチドの効果。対照に対して、**P＜0.01、***P＜0.001。
【図３】痛覚に対するNK1Rペプチドの効果のグラフ表示。a〜c．カプサイシン (a)、ホルマリン (b)又は完全フロイントアジュバント (CFA)(c)への侵害刺激反応に対する、髄腔内 (i.t.)NK1Rペプチドの効果。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
活性化時に、エンドソームに盛んに移動する（robustly traffic）プロトタイプのGPCRとして、サブスタンスP (SP)ニューロキニン1受容体 (NK1R)を研究することによって、エンドソームNK1Rが、脊髄ニューロンにおける興奮及び侵害刺激伝達の根底にある持続的なシグナルを運搬することが示されている。エンドソームは、病態生理学的に重要なプロセスの根底にある、区画化されたGPCRシグナル伝達のプラットフォームであるという概念は、受容体シグナル特異性及び治療ターゲティングに対して影響を与える。エンドソーム輸送によって、GPCRは、同じGタンパク質を活性化する異なる受容体とβarrとが、どのようにして反応を特異的に制御し得るかを説明し得る、細胞内区画におけるシグナルを生成することが可能となる。NK1Rエンドサイトーシスを阻害することによって、促進された効能及び選択性を伴って、疾患と関連のあるプロセスの根底にある、シグナルの標的化が可能となり得る。
【００２２】
一態様においては、本発明は、エンドソームサブスタンスP (SP)又はニューロキニン1受容体(NK1R)のシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、βarrと活性化したNK1Rの細胞内C末端との間の相互作用を阻害する化合物を投与することを含む、方法を提供する。
【００２３】
本明細書において使用される場合、用語「βアレスチン阻害剤」は、βアレスチンと活性化したNK1Rの細胞内C末端との間の相互作用を阻害する化合物を指す。
【００２４】
βarrと活性化したNK1Rの細胞内C末端との間の相互作用を阻害する化合物は、活性化したNK1Rの細胞内C末端のリン酸化と、その後のβarrの結合との間の経路において、任意の部位又は複数の部位で作用し得ることを理解する。一実施形態においては、βarrと活性化したNK1Rの細胞内C末端との間の相互作用の阻害は、GPCRキナーゼ-2 (GRK2)リン酸化の代替的な部位を提供することによって、活性化したNK1Rの細胞内C末端におけるリン酸化部位と競合するβアレスチン阻害剤を、対象に投与することによって達成し得、それにより、活性化したNK1Rの細胞内C末端に対するβarrの結合及びその後の受容体のエンドサイトーシスを低減又は改善することが想定される。
【００２５】
別の実施形態においては、βarrと活性化したNK1Rの細胞内C末端との間の相互作用の阻害が、活性のあるNK1Rの細胞内C末端のGPCRキナーゼ-2 (GRK2)リン酸化を阻害するβアレスチン阻害剤を対象に投与することによって、達成され得ることが想定される。一実施形態においては、例えば、受容体のリン酸化に関与するGRK2の中心触媒ドメインで結合することによって、活性化したNK1Rの細胞内C末端のGPCRキナーゼ-2 (GRK2)リン酸化を阻害するβアレスチン阻害剤が、GRK2と直接相互作用することが想定される。別の実施形態においては、例えば、活性化したNK1Rの細胞内C末端上のリン酸化部位の認識を防ぐように、βアレスチン阻害剤が、アロステリックにGRK2に結合し得ることが想定される。更に別の実施形態においては、βアレスチン阻害剤がNK1Rの細胞内C末端内のリン酸化部位又はその近傍で結合し、それによりGRK2による認識及びリン酸化を防ぐことが想定される。また、βarrと活性化したNK1Rの細胞内C末端との間の相互作用を阻害する化合物が、βアレスチンと直接相互作用することによって作用し得、このことが、βアレスチンの、NK1Rの細胞内C末端上のリン酸化部位への結合を阻害することが想定される。
【００２６】
一態様においては、本発明は、エンドソームサブスタンスP (SP)又はニューロキニン1受容体 (NK1R)のシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害の治療用の医薬の製造における、βアレスチンと活性化したNK1Rの細胞内C末端との間の相互作用を阻害する化合物の使用を提供する。
【００２７】
更なる態様においては、本発明は、エンドソームサブスタンスP (SP)又はニューロキニン1受容体(NK1R)のシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害の治療における使用のための、βアレスチンと活性化したNK1Rの細胞内C末端との間の相互作用を阻害する化合物を提供する。
【００２８】
好ましい実施形態においては、βアレスチンとNK1Rの細胞内Ｃ末端との間の相互作用を阻害する化合物は、NK1Rの細胞内C末端上のリン酸化部位と競合する。
【００２９】
一実施形態においては、NK1Rの細胞内C末端上のリン酸化部位と競合するβアレスチン阻害剤は、式：A-D
（前記式中、
Aは細胞膜を横切ってβアレスチン阻害剤の輸送を促進する膜透過性残基であり、及び
DはNK1Rの細胞内C末端上の1以上のリン酸化部位のフラグメントを表す）
の化合物、又は医薬的に許容されるその塩である。
【００３０】
別の実施形態においては、NK1Rの細胞内C末端上のリン酸化部位と競合するβアレスチン阻害剤は、以下：
A-SSSFYSNM-OH、
A-SNSKTMTE-OH、
A-LTSNGSSR-OH、及び
A-EMKS*T*RY*L-OH
（前記式中、
Aは細胞膜を横切ってβアレスチン阻害剤の輸送を促進する膜透過性残基であり；及び
*はアミノ酸残基（reside）がリン酸化されることを示す）
又は医薬的に許容されるそれらの塩から選択される。
【００３１】
一実施形態においては、Aは脂肪酸であるか、又はTat膜透過性ペプチド配列YGRKKRRQRRRである。
【００３２】
好ましい実施形態においては、AはTat膜透過性ペプチド配列YGRKKRRQRRRである。別の好ましい実施形態においては、Aはパルミチン酸である。
【００３３】
上記のように、本発明の化合物は、セリン、チロシン及びスレオニンから選択されるアミノ酸を含むが、それらに限定されない、側鎖官能性を有する1以上のアミノ酸残基を含み得る。幾つかの実施形態においては、アミノ酸の側鎖官能基を誘導体化することが想定される。一実施形態においては、側鎖官能基はリン酸化し得る。他の実施形態においては、アミノ酸の側鎖を、非天然アミノ酸を形成するよう誘導体化することが想定される。非天然アミノ酸は、アミノ及びカルボキシ官能基の両方を有する任意の化合物を含む。非天然アミノ酸は、そのアミノ基及びカルボキシ基を介して結合することによって、ペプチド鎖の部分を形成することが理解される。
【００３４】
一態様においては、本発明は、エンドソームSP又はNK1Rのシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書において定義されるβアレスチン阻害剤を投与することを含む、方法を提供する。
【００３５】
別の態様においては、本発明は、エンドソームSP又はNK1Rのシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害の治療用の医薬の製造における、本明細書において定義されるβアレスチン阻害剤の使用を提供する。
【００３６】
更なる態様においては、本発明は、エンドソームSP又はNK1Rのシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害の治療における使用のための、本明細書において定義されるβアレスチン阻害剤を提供する。
【００３７】
SP媒介性NK1R活性化の調節は、うつ病及び気分障害、不安障害、物質中毒関連の障害、アルコール関連の障害、睡眠障害、摂食障害、自閉症スペクトラム障害、注意欠陥／多動性障害、人格障害、並びにがんを含む、様々な障害の治療及び予防に関連している。NK1Rのモジュレーターはまた、炎症、アレルギー性疾患、神経学的障害、嘔吐、疼痛及びがんの治療及び予防にも有用であり得る。
【００３８】
好ましい実施形態においては、エンドソームNK1Rのシグナル伝達によって媒介される疾患又は障害は、化学療法誘導性の悪心及び嘔吐 (CINV)、術後悪心及び嘔吐、うつ病及び不安を含む情動障害及び嗜癖障害、炎症性腸疾患及び過敏性腸症候群を含む胃腸障害、COPD及び喘息を含む呼吸器疾患、泌尿生殖器障害、感覚の障害並びに体性痛及び内臓痛を含む疼痛、掻痒、ウイルス及び細菌感染症、並びに増殖性疾患（がん）から選択される。
【００３９】
本発明の文脈内において、用語「疼痛」としては、慢性的な炎症性の疼痛（例、関節リウマチ、変形性関節症、リウマチ性脊椎炎、痛風性関節炎及び若年性関節炎と関連する疼痛)；筋骨格の疼痛、下背と首の疼痛、捻挫及び緊張、神経障害性の疼痛、交感神経性の持続する疼痛、筋炎、がん及び線維筋痛と関連する疼痛、片頭痛と関連する疼痛、群発性及び慢性的な日常性頭痛と関連する疼痛、インフルエンザ又は例えば普通の風邪等の他のウイルス感染症と関連する疼痛、リウマチ熱、例えば非潰瘍性消化不良等の機能性腸障害と関連する疼痛、非心臓胸部の疼痛及び過敏性腸症候群、心筋虚血と関連する疼痛、手術後の疼痛、頭痛、歯痛、月経困難症、神経痛、線維筋痛症候群、複合性局所疼痛症候群 (I及びII型のCRPS)、神経因性疼痛症候群(糖尿病性ニューロパチー、化学療法誘発性神経障害性疼痛、坐骨神経痛、非特異的な下背の疼痛、多発性硬化症疼痛、HIV関連のニューロパチー、ヘルペス後神経痛、三叉神経痛を含む)、並びに身体的外傷、切断、がん、毒素又は慢性的な炎症状態から生じる疼痛が挙げられる。好ましい実施形態においては、疼痛は体性痛又は内臓痛である。
【００４０】
公知の固相又は溶液相技術は、例えば直鎖状ペプチドの段階的な合成が続けられる、固相担体（典型的には樹脂）へのN-又はC末端のカップリング等といった、本発明の化合物の合成において使用し得る。側鎖を含むアミノ酸残基の保護のための保護基化学物質は、当該分野において周知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる：Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts、Protecting Groups in Organic Synthesis (第三版、John Wiley & Sons社、1999)において見出し得る。
【００４１】
本発明の化合物は、1以上の立体異性体の形態（例、ジアステレオマー）で存在し得ることが理解される。本発明は、これらの立体異性体の形態の全てを、単離された（例えば、エナンチオマー単離で）か、又は組合された（ラセミ混合物及びジアステレオマー混合物を含む）かのいずれかで、その範囲に含む。本発明は、独立してL体及びD体から選択されるアミノ酸の使用を含む、L体及びD体の両方のアミノ酸の使用を意図し、例えば、該ペプチドは2つのセリン残基を含み、各セリン残基が同じ又は反対の絶対立体化学を有し得る。特に明記しない限り、アミノ酸はL立体配置であると解釈される。
【００４２】
従って、本発明は、アミノ酸残基の不斉中心に関して、例、例えば約95％〜97％のジアステレオマー過剰率（de）、又は99％超のde等の約90％超のdeの、実質的に純粋な立体異性体の形態の化合物、並びにその、ラセミ混合物を含む、混合物にも関連する。そのようなジアステレオマーは、例えば、キラル中間体を使用した不斉合成によって調製し得、又は混合物は、従来の方法、例、クロマトグラフィー又は分割剤の使用によって分割し得る。
【００４３】
本発明の化合物を精製する必要がある場合、例えば高速液体クロマトグラフィー (HPLC)及び逆相HPLC等のクロマトグラフィー技術を使用し得る。ペプチドは、質量分析及び／又は他の適切な方法によって性状を調べ得る。
【００４４】
化合物が、（例えば、生理学的pHで）プロトン化又は脱プロトン化され得る1以上の官能基を含む場合、該化合物は医薬的に許容される塩として調製及び／又は単離し得る。該化合物は所定のpHで双性イオン性であり得ることが理解される。本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される塩」という表現は、所定の化合物の塩を指し、該塩は医薬として投与するために好適である。そのような塩は、例えば、アミン若しくはカルボン酸基と、それぞれ酸若しくは塩を反応させることによって形成し得る。
【００４５】
医薬的に許容される酸付加塩は、無機酸及び有機酸から調製し得る。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等が挙げられる。有機酸の例としては、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸等が挙げられる。
【００４６】
医薬的に許容される塩基付加塩は、無機塩基及び有機塩基から調製し得る。無機塩基に由来する対応する対イオンとしては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩が挙げられる。有機塩基としては、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2-ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、N-アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン及びN-エチルピペリジンを含む、第1級、第2級及び第3級アミン、天然で生じた置換アミンを含む置換アミン並びに環状アミンが挙げられる。
【００４７】
酸／塩基付加塩は、対応する遊離の酸／塩基形態よりも、水性溶媒中において高い溶解性を有する傾向がある。
【００４８】
本発明は、治療有効量の上記において定義した化合物、又は医薬的に許容されるその塩を、少なくとも1の医薬的に許容される担体又は希釈剤と共に含む医薬組成物も提供する。
【００４９】
用語「組成物」は、（他の担体あり又はなしの）有効成分が担体によって囲まれるカプセルを得るための、担体としての封入材料を伴う、有効成分の製剤を含むことを意図する。
【００５０】
上記の化合物、又は医薬的に許容されるその塩が、対象に投与される唯一の有効成分であっても良いが、該化合物と共に他の有効成分(複数可)を投与することは本発明の範囲内である。1以上の実施形態においては、2以上の本発明の化合物の組合せが対象に投与されることが想定される。該化合物（複数可）は、組合せで1以上の追加の治療剤と共に投与され得ることも想定される。該組合せによって、他の有効成分（複数可）と、上記の化合物（複数可）との、別々の、順番の又は同時の投与が可能になり得る。該組合せは、医薬組成物の形態で提供され得る。
【００５１】
用語「組合せ」は、上記で定義した組合せパートナーが、依存的に若しくは独立して、又は顕著な量の組合せのパートナーとの異なる固定された組合せの使用によって、即ち、同時に若しくは異なる時点で、投薬され得る、パーツの組成物又はキットを指す（The term "combination", as used herein refers to a composition or kit of parts where the combination partners as defined above can be dosed dependently or independently or by use of different fixed combinations with distinguished amounts of the combination partners, i.e., simultaneously or at different time points.）。次いで、組合せのパートナーは、例えば、同時に又は時系列的にずらして（即ち、パーツのキットの任意のパーツ（any part of the kit of parts）について、異なる時点で、また等しいか又は異なる時間間隔で）（投与し得る。該組合せで投与される組合せパートナーの総量の比は、例えば、治療される患者亜集団のニーズ又は一人の患者のニーズに対処するために変動し得る（その異なるニーズは、患者の年齢、性別、体重等に起因し得る）。
【００５２】
当業者によって容易に理解されるように、投与経路及び医薬的に許容される担体の性質は、状態の性質及び治療される哺乳動物に依存する。特定の担体又は送達系の選択、及び投与経路は、当業者によって容易に決定され得ると考えられる。活性な化合物を含む任意の製剤の調製においては、その工程において該化合物の活性が失われないこと、及び該化合物が破壊されることなく作用する部位に到達できることを確実にするために、注意を払わなければならない。幾つかの状況においては、例えば、例、マイクロカプセル化等の当該分野において公知な方法によって、該化合物を保護する必要がある場合がある。同様に、該化合物がその作用部位に到達するように、投与経路を選択しなければならない。
【００５３】
当業者は、従来のアプローチを使用して、本発明の化合物のための適切な製剤を容易に決定し得る。好ましいpHの範囲及び好適な賦形剤、例えば抗酸化剤を特定することは、当該技術分野において日常的に行われる。バッファー系は、所望の範囲のpHの値を提供するために日常的に使用され、例えば、酢酸、クエン酸、乳酸、コハク酸のカルボン酸バッファーが挙げられる。そのような製剤のために、例えばBHT又はビタミンE等のフェノール系化合物、例えばメチオニン又は亜硫酸塩等の還元剤、及び例えばEDTA等の金属キレート剤を含む、多様な抗酸化剤が利用できる。
【００５４】
上記の化合物、又は医薬的に許容されるその塩は、静脈内、髄腔内、及び大脳内又は硬膜外送達に好適なものを含む、非経口投与形態で調製しても良い。注射用途に好適な医薬形態としては、無菌の注射用溶液又は分散液、及び無菌の注射用溶液の即時調製のための無菌の粉末が挙げられる。それらは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、還元又は酸化、及び例えば細菌又は真菌等の微生物の汚染に対抗して保存され得る。
【００５５】
注射用溶液又は分散液のための溶媒又は分散媒体は、活性な化合物のための従来の溶媒又は担体系のいずれかを含んでも良く、例えば、水、エタノール、ポリオール (例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等)、それらの好適な混合物、並びに植物油を含んでも良い。適切な流動性は、例えばレシチン等の例えばコーティングの使用によって、分散の場合においては必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持し得る。微生物の作用の抑制は、必要に応じて、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗菌剤及び抗真菌剤の包含によって、もたらされ得る。多くの場合において、浸透圧を調節するための剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを包含することが好ましい。好ましくは、注射用の製剤は、血液と等張である。注射可能な組成物の長期の吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンといった、吸収を遅延させる剤の組成物中での、その使用によってもたらされ得る。注射可能な用途に好適な医薬形態は、静脈内、筋肉内、大脳内、髄腔内、硬膜外の注射又は注入を含む、任意の適切な経路によって送達しても良い。
【００５６】
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、様々な他の成分、例えば上記で列挙したもの等を含む適切な溶媒中に、必要な量で、本発明の化合物を取り込み、続けて濾過滅菌することによって、調製される。一般的に、分散液は、上記で列挙したものから、基本的な分散媒体及び必要な他の成分を含む無菌のビヒクルに、様々な滅菌された有効成分を取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の粉末の場合においては、調製の好ましい方法は、有効成分及び任意の追加的な所望の成分の、前もって濾過滅菌した溶液の吸引乾燥又は凍結乾燥である。
【００５７】
他の医薬形態としては、本発明の経口製剤及び経腸製剤が挙げられ、該活性化合物は、不活性な希釈剤又は同化可能な食用の担体を用いて製剤化しても良く、又はハードシェル若しくはソフトシェルのゼラチンカプセル中に封入しても良く、又は錠剤に圧縮しても良く、又は食事の食物と共に直接取り込んでも良い。経口治療投与のためには、活性な化合物を賦形剤と共に取り込み、摂取可能な錠剤、口腔又は舌下の錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハー剤等の形態で使用しても良い。そのような治療に有用な組成物中の活性な化合物の量は、好適な投薬量が得られる程度である。
【００５８】
錠剤、トローチ剤、丸薬、カプセル剤等はまた、以下に列記した成分：例えばガム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン等の結合剤；例えばリン酸二カルシウム等の賦形剤；例えばコーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸等の崩壊剤；例えばステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；及び例えばスクロース、ラクトース又はサッカリン等の甘味剤を添加しても良く、又は例えばペパーミント、ウィンターグリーン油、若しくはチェリー香料等の香味剤を含んでも良い。投薬単位の形態がカプセルである場合、上記の型の材料に加えて、液体の担体を含んでも良い。様々な他の材料が、コーティングとしてか、又はそうでなければ投薬単位の物理的形態を改変するために、存在しても良い。例えば、錠剤、丸薬又はカプセル剤は、シェラック、糖又はその両方を用いてコートしても良い。シロップ剤又はエリキシル剤は、活性な化合物、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、並びに例えばチェリー又はオレンジの香料等の香味剤を含んでも良い。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、医薬的に純粋であり、使用される量で実質的に無毒でなければならない。更に、本発明の化合物は、腸の特定の領域に対して、活性のあるペプチドの特異的な送達を可能にするものを含む、徐放性調製物及び製剤に取り込んでも良い。
【００５９】
液体製剤はまた、胃又は食道管を介して、経腸的に投与されても良い。経腸製剤は、例えば乳化基剤又は水溶性基剤等の適切な基剤と混合することによって、坐剤の形態で調製しても良い。その必要はないが、本発明の化合物を局所、鼻腔内、膣内、眼内等に投与することもできる。
【００６０】
医薬的に許容されるビヒクル及び／又は希釈剤としては、任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張な吸収遅延剤等が挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒体及び剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体又は剤が有効成分と混合できない場合を除いて、治療組成物におけるそれらの使用が考慮される。補助的な有効成分はまた、組成物に取り込み得る。
【００６１】
容易な投与及び投薬量の均一化のためには、組成物を投薬単位形態に製剤化することは特に利点がある。本明細書で用いられる場合、投薬単位形態は、治療される哺乳動物対象にとって単位用量として適した、物理的に分離した単位を指す；所定量の活性材料を含む各単位は、必要な医薬的に許容されるビヒクルと関連して、所望の治療効果を生成するよう計算される。本発明の新規な投薬単位形態についての明細は、(a)活性材料及び達成される特定の治療効果の独特な特徴、並びに(b)本明細書に詳細に開示されているように、身体の健康が損なわれる疾患状態を有する生きている対象において、疾患の治療のために活性材料を配合する技術に内在する限界によって決定され、それらに直接依存する。
【００６２】
上述したように、簡便で効果的な投与のために、主な有効成分が、投薬単位形態中において、好適な医薬的に許容されるビヒクルと共に、治療有効量、配合され得る。単位投薬形態は、例えば、0.25 μg〜約2000 mgの範囲の量で、主な活性化合物を含み得る。割合で表せば、活性化合物は、約0.25 μg〜約2000 mg／mLの担体中で存在し得る。補助的な有効成分を含む組成物の場合、投薬量は、通常の投薬量及び前記成分の投与様式を参照することによって決定される。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、用語「有効量」は、所望の投薬治療法に従って投与される場合、所望の治療活性を提供する化合物の量を指す。投薬は、1回で行われても良く、或いは数分若しくは数時間の間隔で、又はこれらの期間のいずれか1つに亘って連続して、行われても良い。好適な投薬量は、1投薬につき、体重1 kg当たり約0.1 ng〜体重1 kg当たり1 gの範囲内であっても良い。典型的な投薬量は、1投薬につき、体重1 kg当たり1 μg〜1 gの範囲であり、例えば1投薬につき、体重1 kg当たり1 mg〜体重1 kg当たり1 gの範囲等である。一実施形態においては、投薬量は、1投薬につき、体重1 kg当たり1 mg〜500 mgの範囲であっても良い。別の実施形態においては、投薬量は、1投薬につき、体重1 kg当たり1 mg〜250 mgの範囲であっても良い。また別の実施形態においては、投薬量は、1投薬につき、体重1 kg当たり1 mg〜100 mgの範囲、例えば1投薬につき、体重当たり50 mgまで等であり得る。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、用語「治療」及び「治療する」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける状態又は疾患の任意の治療をカバーし、エンドソームのNK1Rのシグナル伝達によって媒介される、任意の疾患又は障害を治療することを含む。本明細書で用いられる場合、用語「予防」及び「予防する」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける状態又は疾患の予防（prevention）又は予防（prophylaxis）をカバーし、エンドソームのGPCRシグナル伝達によって媒介される、疾患又は障害の予防を含む。
【００６５】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈上別途必要な場合を除き、単語「含む（comprise）」、及び例えば「含む（comprises）」又は「含む（comprising）」等の変形は、記載された整数若しくは一群の整数又はステップを含むが、任意の他の整数又は一群の整数を除外するものではないことを意味するものとして理解する。
【００６６】
本明細書中における、任意の先行文献 (若しくはそれに由来する情報)、又は公知である任意の事項の参照は、その先行文献 (若しくはそれに由来する情報)又は公知の事項が、本明細書が関連する努力の技術傾注分野における共通の一般知識の一部を形成するという同意（acknowledgment）又は承認（admission）、或いは示唆の任意の形態として、捉えられるものでなく、そのように捉えられるべきでない。
【００６７】
これより本発明を以下の非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【００６８】
実験方法：
βarr 阻害剤
マウスNK1Rの細胞内C末端内の推定Gタンパク質受容体キナーゼ-2 (GRK2)リン酸化部位を、Group Based Prediction System（http://gps.biocuckoo.org/wsresult.php?p=1）を使用して予測した。N末端Tat膜透過性配列 (YGRKKRRQRRR)を有する、これらのドメイン (S398SSFYSNM405、S390NSKTMTE397、L382TSNGSSR389)又は対照ペプチド (MSNSYSFS)に対応するペプチドを調製した。リン酸化されたペプチド (E335MKS*T*RY*L342)をまた合成し、Tatに結合した。
【００６９】
cDNA
BRETのプローブである、NK1R-RLuc8、Kras-Venus、Rab5a-Venus、βarr1-YFP、βarr2-YFPは記載されている (Kocan, M.ら、Frontiers in endocrinology 2010、1、12；Lan, T. H.ら、Traffic 2012、13、1450-1456)。CytoEKAR及びNucEKARは、Addgene (それぞれプラスミド18680、18681)由来であった。完全長及びトランケートδ312ラットHA-NK1Rは記載されている (Dery, O.ら、American journal of physiology. Cell physiology 2001、280、C1097-1106)。これらのコンストラクトのRLuc8融合を、PCRによって終止コドンを除去し、pcDNA3.1-RLuc8ベクターにサブクローニングすることによって生成した。
【００７０】
細胞株、トランスフェクション
N末端HA11エピトープを含むラットNK1Rを安定して発現するHEK293細胞は記載されている (Roosterman, D.ら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007、104、11838-11843)。ポリエチレンイミン (Polysciences)又はFuGene (Promega)を使用して、HEK293細胞を一過的にトランスフェクトした。細胞を、5％FBSを補充したDulbecco's改変Eagle's培地 (DMEM)中で増殖させた (37℃、5％CO2)。
【００７１】
BRET
以下のcDNAs：1 μgのNK1R-RLuc8又はNK1Rδ312-RLuc8、及び4 μgのβarr1-YFP、βarr2-YFP、KRas-Venus又はRab5a-Venusを用いて、HEK293細胞をトランスフェクトした。48時間後、細胞を37℃でHank's平衡塩溶液 (HBSS)中で平衡化し、RLuc基質であるセレンテラジンh (5 μM、15分)を用いてインキュベートした。SP (0.1〜10 nM)又はビヒクル (dH2O)を用いたチャレンジ前及び後に、マイクロプレートリーダーLUMIstar Omega (BMG LabTech)を使用して、BRET比を決定した。
【００７２】
区画化されたシグナル伝達のFRETバイオセンサー
1ウェル当たり55 ngのN末端HA.11エピトープタグを含むラットNK1R (HA-NK1R)又はCLR及びRAMP1、並びに1ウェル当たり40 ngのFRETバイオセンサーを用いて、HEK293細胞をトランスフェクトした。血清を制限した後（following serum restriction）(0.5％FBS、終夜)、トランスフェクション後48時間で、FRETを評価した。クラスリン又はダイナミンsiRNAを使用した実験のために、1ウェル当たり55 ngのラットHA-NK1R、1ウェル当たり40 ngのFRETバイオセンサー及び1ウェル当たり25 nMの混合したクラスリン又はダイナミン ON-TARGETplus SMARTpool siRNA (GE Dharmacon)を用いて、細胞をトランスフェクトした。血清を制限した後 (0.5％FBS、終夜)、トランスフェクション後72時間で、FRETを評価した。細胞を、37℃でHBSS中で平衡化し、GE Healthcare INCell 2000 Analyzerを使用してFRETを分析した。GFP/RFP蛍光比分析のために、FITCフィルター (490/20)を使用して細胞を順次励起し、dsRed (605/52)及びFITC (525/36)フィルター、並びにFITC／dsRedフィルター対用に最適化されたポリクロイック（polychroic）（Quad4）を使用して蛍光を測定した。CFP／YFP蛍光比分析のために、CFPフィルター (430/24)を使用して細胞を順次励起し、YFP (535/30)及びCFP (470/24)フィルター、並びにCFP/YFPフィルター対用に多色に最適化されたポリクロイック（Quad3）を使用して蛍光を測定した。細胞を1分毎に画像化し、それにより、1分当たり14ウェルの画像の取得が可能となった。ベースラインとなる蛍光比の画像は、4分間で取得した。EC50濃度のSP (1 nM)、GGRP (1 nM)又はビヒクルを用いて細胞をチャレンジし、20分間画像を取得した。次いで、陽性対照 (ERKについては200 nMホルボール 12,13-ジブチレート；PKCについてはホスファターゼ阻害剤カクテルを含む200 nMホルボール 12,13-ジブチレート；cAMPについては10 μMフォルスコリン、100 μM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、100 nM PGE1)を用いて、細胞を10分間刺激し、最大の増加を生成し、陽性の蛍光比画像を4分間取得した。記載されたようにデータを分析し、各細胞のベースラインと比較した蛍光比 (F／F0)で表した。陽性対照を用いて刺激後、F／F0において＞10％の変化を有する細胞を、分析のために選択した。
【００７３】
細胞表面ELISA
HA-NK1R又はHA-NK1Rδ312を用いて一過的にトランスフェクトしたHEK293細胞を、PFA中で固定した (30分)。総発現の分析のために、固定後に、TBS中の0.5％NP-40を使用して細胞を透過処理した (30分)。細胞を、ブロッキングバッファー (1％スキムミルクパウダー、0.1M NaHCO3)中でインキュベートし（4時間、室温)、次いで、抗HA (1：5,000、Sigma)でインキュベートした（終夜、4℃)。細胞を洗浄し、抗マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗体 (1：2,000)を用いてインキュベートした（2時間、室温)。細胞を洗浄し、SIGMAFAST（登録商標）基質 (SigmaAldrich)を使用して染色した。EnVisionプレートリーダー (PerkinElmer Life Sciences)を使用して、490 nmでの吸収を測定した。pcDNA3を用いてトランスフェクトしたHEK293細胞、又は未処理の細胞に対して、値を標準化した。
【００７４】
マウスにおける機械的痛覚過敏、防御行動
マウスを、実験前の連続した2日間に、1〜2時間、実験装置及び環境に順応させた。段階的なvon Freyフィラメントを用いて、後足の足底表面の刺激に対する足の引っ込めによって、機械的痛覚過敏を評価した。試験の前の日に、各動物についてのベースラインを確立するために、3回反復で、von Freyスコアを測定した。足の浮腫を評価するために、処理の前及び後に、デジタルキャリパーを使用して、後足の厚さを測定した。足底内の注射のために、マウスを鎮静化した (5％イソフルラン)。カプサイシン (5 μg)、完全フロイントアジュバント (CFA；1 ml当たり2 mg)、又はビヒクル (カプサイシン、20％エタノール、10％Tween 80、70％生理食塩水；CFA、生理食塩水)を、左の後足の足底表面に皮下注射した (10 μl)。カプサイシン後30〜240分間、及びCFAの注射後36〜40時間で、von Freyスコア (左及び右足)並びに足の厚さ (左足)を測定した。結果を、注射前の値の％で表している。防御行動の評価のために、マウスを鎮静化し、左の後足の足底表面にホルマリン (4％、10 μl)を皮下注射した。マウスをパースペックス（Perspex）コンテナ内に置き、防御行動 (注射した足を縮める、舐める、噛む)を、60分間記録した。防御イベントの総数を、急性（I、0〜10分）及び強直性（II、10〜60分）段階に細分した。
【００７５】
マウスにおけるペプチドの髄腔内注射
意識があるマウスに髄腔内注射 (5 μl、L3／L4)を行った。細胞を透過するNK1Rペプチド (Tat結合S398SSFYSNM405、S390NSKTMTE397、L382TSNGSSR389、各30 μM)、100 μM対照ペプチド (Tat結合MSNSYSFS)、又はビヒクル (1％DMSO／生理食塩水)を、カプサイシン若しくはホルマリンの足底内注射の30分前、又はCFAの36時間後に、髄腔内に注射した。
【００７６】
マウスにおける髄腔内siRNA
siRNAを送達するために、カチオン性リポソーム及びアジュバントのアニオン性ポリマー (ポリグルタミン酸塩)を使用した。マウスβarr1 (センス5' AGC CUU CUG CGC GGA GAA U dTdT 3'、アンチセンス5' dTdT U CGG AAG ACG CGC CUC UUA 5')及びマウスβarr2 (センス：5' CCU ACA GGG UCA AGG UGA A dT dT 3'、アンチセンス：5' UUC ACC UUG ACC CUG UAG G dT dT 3')、又は対照siRNA (センス：5' AAG GCC AGA CGC GAA UUA U dT dT、3' アンチセンス：5' AUA AUU CGC GUC UGG CCU U dT dT 3')をターゲティングするsiRNA (Dharmacon) (50 ng；ストック1 μl当たり100 ngを、0.5 μl)を、0.5 μlのアジュバントのポリグルタミン酸塩 (ストック1 μl当たり0.1 μg)及び1.5 μlの滅菌0.15 M NaClと混合した。リポソーム溶液、カチオン性脂質2-{3-[bis-(3-アミノ-プロピル)-アミノ]-プロピルアミノ}-N-ジテトラデシルカルバモイルメチル-アセトアミド (DMAPAP)及びL-α-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE) (DMAPAP／DOPE、1／1 M：M) (200 μMを2.5 μl)を、siRNA／アジュバントに添加し、1分間ボルテックスし、インキュベートした (30分、室温)。髄腔内注射 (L1〜L4、5 μl)によって、siRNAリポプレックスをマウスに投与した。行動テスト後 (36時間)、q-PCRによってβarr1及びβarr2発現を分析するために、脊髄 (L1〜L4)を回収した。
【００７７】
q-PCR
マウス腰椎の脊髄 (L1〜L4)を、RNAlater (Qiagen)中に置き、RNeasy RNA単離キット(Qiagen)を使用して、総RNAを単離した。SuperscriptTM III cDNA合成キット (Invitrogen)を使用して、総RNA (500 ng)を逆転写した。Eppendorf RealPlex Real Time PCR Systemを使用して、cDNAを増幅した。20 μlの増幅反応液は、以下の遺伝子 (カタログ番号)：ARRB2 (Mm00520666_g1)、ARRB1 (Mm00617540_m1)、ACTB (Mm02619580_g1)、Gapdh (hs00363153_m1)の1つのためのcDNAテンプレート、TaqMan Universal Master Mix、TaqMan Gene Expression Assaysを含んでいた。試料は3回反復で増幅した。以下の式：2ΔCTを使用したΔCt法によって、各転写物の相対的存在量 (R)を見積もった。Ctは、蛍光の増加が指数関数的である、臨界閾値の平均である。PCR反応の効率が100％であると仮定すると、各PCRのサイクルでの、単位複製配列の量における増加は2倍に相当する。この仮定を用いて、相対的な転写物の存在量を計算するために、2ΔCTを使用した。これらの値は、β-アクチン及びGAPHDに対して標準化した。
【００７８】
実施例1：痛覚に対するβarr siRNAの影響
髄腔内 βarr1+2 siRNAは、カプサイシン誘発性痛覚過敏を、36時間で阻害した (図1a、b)。siRNAは、注射していない足の引っ込め反応には影響しなかった (図1c)。
【００７９】
実施例2：βarr-NK1R相互作用の薬理学的な拮抗作用
疼痛の伝達におけるNK1Rエンドサイトーシスの関与を実証するために、NK1R／βarr相互作用をブロックするための薬理学的アプローチを考案した。Gタンパク質受容体キナーゼ (GRK)は、βarr相互作用を促進する、GPCRのC末端S／Tリッチドメインをリン酸化する。欠失変異体NK1Rδ312はC末端を欠いており、天然で生じたNK1R変異体(Steinhoff, M. S.ら、Physiol Rev 2014、94、265-301)に対応する。NK1Rδ312は、通常、HEK293細胞の細胞膜で発現したが、βarrと結合や内在化をしなかった (図2a〜f)。SPは、HEK-NK1Rδ312において、細胞質ERKを刺激したが、核ERKを刺激せず、エンドサイトーシス依存性核ERKシグナル伝達と整合した (図2g)。マウスNK1RのC末端における推定GRK2リン酸化部位に対応するペプチドを、膜透過性Tat (YGRKKRRQRRR)に結合した (図2a)。これらの化合物は、対照ペプチドと比較して、完全長NK1Rとβarrとの結合を阻害し、エンドサイトーシスを抑制した (図2h、i)。
【００８０】
実施例3：痛覚に対するNK1Rペプチドの影響
髄腔内に注射した場合、本明細書に記載されたβアレスチン阻害剤は、カプサイシン誘発性痛覚過敏を阻害した (図3a)。髄腔内のβアレスチン阻害剤は、ホルマリンの足底内投与に対する防御反応の両方の段階を阻害し、完全フロイントアジュバント (CFA)の足底内投与の37〜40時間後に測定される、持続する機械的痛覚過敏を無効にした (図3b、c)。SP誘発性核ERKシグナル伝達におけるNK1Rエンドサイトーシス及びβarrの役割(DeFea, K. A.ら、Proc Natl Acad Sci USA 2000、97、11086-11091)と一致して、髄腔内MEK阻害剤U0126はカプサイシン誘発性痛覚過敏を阻害した (Ji, R. R.ら、The Journal of neuroscience：the official journal of the Society for Neuroscience 2002、22、478-4850)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
2019509277000001.app
【国際調査報告】
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