(57)【要約】例えばがん患者を含む、免疫応答および／または活性を増加させることを必要とする患者における免疫応答および／または活性を増加させるためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび方法が本明細書に開示されている。一部の実施形態では、本開示は、患者におけるがんおよび／または腫瘍を処置するための方法であって、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストの投与を含む方法に関する。本開示の一目的は、免疫応答を増加させることを必要とする患者における免疫応答を増加させると共に、がんおよび感染性疾患を処置するための方法を提供することである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんまたは腫瘍を処置する方法であって、
ａ．ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体（ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体）、および
ｂ．ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニスト
を、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者に投与する工程を含み、
前記ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体およびＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストが有効量で投与される、方法。
【請求項２】
前記ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストが、ＰＤ１抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＤ１抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブおよびＢＧＢ−Ａ３１７からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストが、ＰＤＬ１抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＤＬ１抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記がんまたは腫瘍が、増加したＰＤＬ１発現に関連する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記がんまたは腫瘍が、≧１％のＰＤＬ１腫瘍比率スコア（ＴＰＳ）を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記がんまたは腫瘍が、≧５０％のＰＤＬ１腫瘍比率スコア（ＴＰＳ）を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
がんまたは腫瘍を処置する方法であって、
ａ．ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ、ならびに
ｂ．前記がんまたは腫瘍を処置するための追加的な活性剤または支持療法
を、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者に投与する工程を含み、
前記ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せならびに追加的な活性剤が有効量で投与される、方法。
【請求項１０】
がんまたは腫瘍を処置する方法であって、
ａ．ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および
ｂ．前記がんまたは腫瘍を処置するための追加的な活性剤または支持療法
を、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者に投与する工程を含み、
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび追加的な活性剤が有効量で投与される、方法。
【請求項１１】
前記追加的な活性剤が、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニスト（例えば、ＰＤ１またはＰＤＬ１抗体）、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ４抗体）、ＣＤ２０抗体、ＣＤ５２抗体、インターフェロン（ＩＦＮ−ガンマ）、インターロイキン（ＩＬ−２）、ＣＤ４７アンタゴニスト（例えば、ＣＤ４７抗体）およびＧＤ２抗体からなる群から選択される免疫療法剤である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫療法剤が、イピリムマブ、リツキシマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、オカラツズマブ（ocaratuzumab）、オクレリズマブ、ＴＲＵ−０１５、ベルツズマブ、オファツムマブ、アレムツズマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＢＧＢ−Ａ３１７、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者におけるがんまたは腫瘍細胞負荷を減少させる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
がんまたは腫瘍転移を阻害する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記がんまたは腫瘍が、前記患者における免疫抑制を促進する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
患者生存を増加させる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者が、化学療法剤で処置されている、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者が、前記化学療法剤による処置の１２ヶ月以内に疾患進行を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化学療法剤が、白金に基づく化学療法剤である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者が、白金を含有する化学療法によるネオアジュバントまたはアジュバントで処置されている、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、ＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ、またはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの量が、単独では前記がんまたは腫瘍の処置において無効である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストまたは免疫療法剤の量が、単独では前記がんまたは腫瘍の処置において無効である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者が、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌等の転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者が、自己免疫疾患に罹っていない、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者が、臓器もしくは組織移植を経ていない、または臓器もしくは組織移植を受けている、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記患者が、移植片対宿主病に罹っていない、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
患者における免疫応答を誘導または増強する方法であって、
ａ．ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および
ｂ．免疫療法剤
を、免疫応答を誘導または増強することを必要とする患者に投与する工程を含み、
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび前記免疫療法剤が有効量で投与される、方法。
【請求項２８】
患者における免疫疲弊を処置または予防する方法であって、
ａ．ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および
ｂ．免疫療法剤
を、免疫疲弊を処置または予防することを必要とする患者に投与する工程を含み、
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび前記免疫療法剤が有効量で投与される、方法。
【請求項２９】
患者における抗原に対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、ｉ）ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ｉｉ）免疫療法剤およびｉｉｉ）前記抗原を、抗原に対する免疫応答を誘導または増強することを必要とする患者に投与する工程を含み、前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、前記免疫療法剤および前記抗原が有効量で投与される、方法。
【請求項３０】
病原体またはがんに対して患者にワクチン接種する方法であって、ｉ）ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ｉｉ）免疫療法剤およびｉｉｉ）病原体またはがん抗原を、ワクチン接種することを必要とする患者に投与する工程を含み、前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、前記免疫療法剤および前記抗原が、前記患者のワクチン接種に有効な量で投与される、方法。
【請求項３１】
患者におけるワクチンによって誘導される免疫応答を増強する方法であって、前記患者における前記ワクチンによって誘導される免疫応答の増強に有効な量で、ｉ）ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびｉｉ）免疫療法剤を患者に投与する工程を含む方法。
【請求項３２】
前記免疫療法剤が、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニスト（例えば、ＰＤ１抗体またはＰＤＬ１抗体）、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ４抗体）、ＣＤ２０抗体、ＣＤ５２抗体、インターフェロン（ＩＦＮ−ガンマ）、インターロイキン（ＩＬ−２）、ＣＤ４７アンタゴニスト（例えば、ＣＤ４７抗体）およびＧＤ２抗体からなる群から選択される、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫療法剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＢＧＢ−Ａ３１７、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、リツキシマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、ＴＲＵ−０１５、ベルツズマブ、オファツムマブ、アレムツズマブおよびトレメリムマブからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
患者における免疫応答を誘導または増強する方法であって、有効量のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、免疫応答を誘導または増強することを必要とする患者に投与する工程を含む方法。
【請求項３５】
患者における免疫疲弊を処置または予防する方法であって、有効量のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、免疫疲弊を処置または予防することを必要とする患者に投与する工程を含む方法。
【請求項３６】
患者における抗原に対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、ｉ）ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびｉｉ）前記抗原を、抗原に対する免疫応答を誘導または増強することを必要とする患者に投与する工程を含み、前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび前記抗原が有効量で投与される、方法。
【請求項３７】
病原体またはがんに対して患者にワクチン接種する方法であって、ｉ）ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびｉｉ）病原体またはがん抗原を、ワクチン接種することを必要とする患者に投与する工程を含み、前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび前記抗原が、前記患者のワクチン接種に有効な量で投与される、方法。
【請求項３８】
患者におけるワクチンによって誘導される免疫応答を増強する方法であって、有効量のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、免疫応答を増強することを必要とする患者に投与して、前記患者における前記ワクチンによって誘導される免疫応答を増強する工程を含む方法。
【請求項３９】
前記患者が、がんまたは腫瘍を有する、請求項２７から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
惹起または増強される免疫応答が、がんまたは腫瘍に対するものである、請求項２７から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記惹起または増強される免疫応答が、前記患者におけるがんまたは腫瘍細胞の成長を阻害する、請求項２７から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記惹起または増強される免疫応答が、前記患者におけるがんまたは腫瘍細胞負荷を減少させる、請求項２７から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記惹起または増強される免疫応答が、がんまたは腫瘍転移を処置または予防する、請求項２７から４２の一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記がんまたは腫瘍が、前記患者における免疫抑制を促進する、請求項２７から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記患者が、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する、請求項２７から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記惹起または増強される免疫応答が、病原体に対するものである、請求項２７から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記病原体が、前記患者における免疫抑制を促進する、請求項２７から３８および４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記病原体が、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫病原体からなる群から選択される、請求項２７から３８、４６および４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが、
ａ．ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、ならびに
ｂ．ＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ
からなる群から選択される、請求項１０から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０、配列番号５０、配列番号５４および配列番号５７のうちいずれか１種のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドである、請求項１０から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９；配列番号１のアミノ酸２５〜１３１；配列番号２；配列番号３；配列番号５；配列番号６；配列番号６５；配列番号６８；配列番号６９；配列番号１３２；配列番号５８；配列番号６０；配列番号６３；配列番号６４；配列番号６６；配列番号７０；配列番号１２３；配列番号１２８；配列番号１３１；および配列番号１３２のうちいずれか１種のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである、請求項１０から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリペプチドが、配列番号１に関する７９位に酸性アミノ酸を含まない、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体である、請求項１０から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、配列番号１４のアミノ酸３４〜１０１；配列番号１４のアミノ酸２４〜１２６；配列番号１５；配列番号１９；配列番号３４；配列番号３８；配列番号７４；配列番号７６；配列番号７９；および配列番号８０のうちいずれか１種のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９；配列番号１のアミノ酸２５〜１３１；配列番号２；配列番号３；配列番号５；配列番号６；配列番号３５；配列番号３９；配列番号７１；配列番号７３；配列番号７７；および配列番号７８のうちいずれか１種のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸を含まない、請求項５３から５５のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項５７】
前記ヘテロ多量体が、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である、請求項５１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが、抗体または抗体の組合せである、請求項１０から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体または抗体の組合せが、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ９、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢおよびＡＬＫ４のうち１種または複数に結合する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが、小分子または小分子の組合せである、請求項１０から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記小分子または小分子の組合せが、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ９、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢおよびＡＬＫ４のうち１種または複数を阻害する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せである、請求項１０から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ９、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢおよびＡＬＫ４のうち１種または複数を阻害する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記がんまたは腫瘍または病原体を処置するための１種または複数の追加的な活性剤または支持療法を投与する工程をさらに含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
患者におけるがんまたは腫瘍の処置における使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび免疫療法剤であって、前記処置が、有効量で前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび前記免疫療法剤を投与する工程を含む、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび免疫療法剤。
【請求項６６】
患者におけるがんまたは腫瘍を処置するための医薬の製造のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの使用であって、前記がんまたは腫瘍の前記処置が、有効量で前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび免疫療法剤を投与する工程を含む、使用。
【請求項６７】
患者におけるがんまたは腫瘍を処置するための医薬の製造のための免疫療法剤の使用であって、前記がんまたは腫瘍の前記処置が、有効量で前記免疫療法剤およびＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを投与する工程を含む、使用。
【請求項６８】
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せである、請求項６５に記載のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび免疫療法剤、または請求項６６および６７に記載の使用。
【請求項６９】
前記免疫療法剤が、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニスト（例えば、ＰＤ１抗体またはＰＤＬ１抗体）、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ４抗体）、ＣＤ２０抗体、ＣＤ５２抗体、インターフェロン（ＩＦＮ−ガンマ）、インターロイキン（ＩＬ−２）、ＣＤ４７アンタゴニスト（例えば、ＣＤ４７抗体）およびＧＤ２抗体からなる群から選択される、請求項６５に記載のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび免疫療法剤、または請求項６６および６７に記載の使用。
【請求項７０】
前記免疫療法剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＢＧＢ−Ａ３１７、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、リツキシマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、ＴＲＵ−０１５、ベルツズマブ、オファツムマブ、アレムツズマブおよびトレメリムマブからなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年２月２２日に出願された米国仮出願第６２／２９８，３６６号の優先権の利益を主張する。上記出願の明細書全体が、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
がん処置において、化学療法は、高い毒性を伴い、抵抗性がん細胞改変体の出現をもたらし得ると長年認識されてきた。腫瘍生存および成長に重要な過剰発現または活性化された腫瘍性タンパク質に対する標的化療法を用いた場合であっても、がん細胞は、高頻度で変異し、冗長な経路を利用することなどにより、標的化された経路への依存を低減させるように適応する。がん免疫療法は、がん細胞を標的化する代わりに、免疫系の活性化に焦点を合わせる、がん処置における新たなパラダイムである。その原理は、宿主の免疫応答、特に、養子Ｔ細胞応答を再武装化し、がん細胞を同定および死滅させ、長く続く防御免疫を達成するためのものである。このような治療法は、免疫系の活性の増加に向けられるため、がん免疫療法剤は、他の障害、特に、病原体が免疫回避性および／または宿主免疫系を損なう感染性疾患における免疫応答を改善する能力についても調査されている。
【０００３】
２０１１年におけるメラノーマの処置のための抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブのＦＤＡ承認は、がん免疫療法の新時代を導いた。抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１療法が、臨床治験でメラノーマ、腎臓および肺がんにおける耐久性のある応答を誘導したと実証したことは、広範囲のがんの処置における免疫療法の潜在的用途をさらに知らしめる（Pardoll,  D.  M.、Nat  Immunol.２０１２年；１３巻：１１２９〜３２頁）。しかし、利用できるまたは臨床治験中のがん免疫治療法の多くには限界がある。例えば、おそらく、抗ＣＴＬＡ−４処置は、主要Ｔ細胞阻害チェックポイントに干渉することにより、新たな自己反応性Ｔ細胞の生成をもたらし得るため、イピリムマブ療法は、高い毒性プロファイルを有する。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用の阻害は、大部分は抗ウイルスまたは抗がんの性質である疲弊したＴ細胞における現存している慢性免疫応答の脱阻害をもたらすが（Wherry,  E.  J.、Nat  Immunol.２０１１年；１２巻：４９２〜９頁）、にもかかわらず抗ＰＤ−１療法は時に、潜在的に致死的な肺関連の自己免疫性有害事象をもたらす場合がある。加えて、免疫チェックポイント阻害剤は、一部の患者における強力な抗がん療法薬となり得るが、これは一般に、多くの患者において有効性が低い〜有効性が全くない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Pardoll,  D.  M.、Nat  Immunol.２０１２年；１３巻：１１２９〜３２頁
【非特許文献２】Wherry,  E.  J.、Nat  Immunol.２０１１年；１２巻：４９２〜９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
よって、患者、特に、がんまたは感染性疾患を有する患者における免疫応答を増加させるための有効な治療法の必要は、依然として大いに満たされていない。さらに、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなど、現存している治療法の抗がん効果を増加し得る連携治療剤を開発する必要がある。したがって、本開示の一目的は、免疫応答を増加させることを必要とする患者における免疫応答を増加させると共に、がんおよび感染性疾患を処置するための方法を提供することである。
一部には、本明細書に提示されているデータは、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）を使用して、がんを処置することができることを実証する。特に、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢ（ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体）、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体に別々に結合する抗体のいずれかによる処置が、例えば、腫瘍負荷の減少および生存時間の増加を含む、がんモデルにおける様々なプラス効果を有することが示された。さらに、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、いずれかの薬剤単独により観察される効果と比較して、抗がん活性を相乗的に増加することができることが示された。したがって、本開示は、一部には、単独で、または１つまたは複数の支持療法および／または追加的な活性剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤など、免疫療法剤）と組み合わせてＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、がんまたは腫瘍を処置する、特に、がんまたは腫瘍の１つまたは複数の合併症の重症度または進行を予防または低減する（例えば、がんまたは腫瘍負荷を低減する）方法を提供する。加えて、データは、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト療法の有効性が、免疫系に依存することを指し示す。したがって、一部には、本開示は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、単独で、または１つまたは複数の支持療法および／または追加的な活性剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤など、免疫療法剤）と組み合わせて、免疫療法薬として使用して、特に、多種多様ながんおよび腫瘍（例えば、免疫抑制および／または免疫疲弊に関連するがんおよび腫瘍）を処置することができるという発見に関する。他の公知の免疫腫瘍学的薬剤と同様に、患者における免疫応答を増強する、単独での、または１つまたは複数の支持療法および／または追加的な活性剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤など、免疫療法剤）と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの能力は、がん分野外のより幅広い治療上の意義を有することができる。例えば、免疫増強剤が、多種多様な感染性疾患、特に、免疫抑制および／または免疫疲弊を促進する病原体の処置において有用となり得ることが提案された。また、このような免疫増強剤は、ワクチン（例えば、感染性疾患およびがんワクチン）の免疫化有効性のブーストにおいて有用となり得る。したがって、本開示は、単独で、または１つまたは複数の支持療法および／または追加的な活性剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤など、免疫療法剤）と組み合わせて使用して、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させる、がんもしくは腫瘍を処置する、病原体（感染性疾患）を処置する、および／または免疫化有効性を増加させることができる様々なＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを提供する。
【０００６】
例に記載されているＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩ経路の阻害以外の機構により免疫系および／またはがんに影響を与えることができるが［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢおよびアクチビンＡＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ２のうち１つまたは複数の阻害は、おそらく、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーの他のメンバーを含む追加的な薬剤のスペクトルの活性を阻害する薬剤の傾向の指標となることができ、このような集団的阻害は、例えば、がんにおける所望の効果をもたらすことができる］、例えば、ＡｃｔＲＩＩ関連リガンド阻害剤；Ｉ型、ＩＩ型および／または共受容体阻害剤（例えば、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢのうち１つまたは複数の阻害剤）；および／または下流シグナル伝達阻害剤（例えば、Ｓｍａｄ２および３など、Ｓｍａｄタンパク質の１つまたは複数の阻害剤）］を含む他の種類のＡｃｔＲＩＩシグナル伝達阻害剤が、本開示の方法および使用に従って有用であると予測される。このようなＡｃｔＲＩＩシグナル伝達阻害剤は、例えば、抗体アンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）、核酸アンタゴニスト、小分子アンタゴニストおよびリガンドトラップ（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体、フォリスタチンポリペプチドおよびＦＬＲＧポリペプチド）を含む。本明細書で使用する場合、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）活性を阻害する薬剤は、「ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト」または「ＡｃｔＲＩＩ阻害剤」とまとめて称される。
【０００７】
一般に、がん免疫療法は、がんを処置するための免疫系の使用である。免疫療法は、能動的、受動的またはハイブリッドとしてカテゴリー化することができる。これらのアプローチは、がん細胞が、免疫によって検出され得るその表面に発現された分子を有することが多いという事実を活用する。このようながん特異的分子は、典型的にはタンパク質または他の高分子（例えば、炭水化物）である、腫瘍関連抗原と称されることが多い。能動的免疫療法は、腫瘍関連抗原を標的とすることにより腫瘍細胞を攻撃するように免疫系を方向づける。受動的免疫療法は、現存している抗腫瘍応答を増強し、抗体、リンパ球およびサイトカインの使用を含む。一部の実施形態では、本開示は、免疫チェックポイント阻害剤の使用に関する。一般に、免疫チェックポイントは、免疫系活性に影響を与え、刺激型または阻害型となり得る。一部の腫瘍は、免疫系攻撃から自分を保護するためにこのようなチェックポイントを使用する。チェックポイント治療薬は、免疫系機能を回復しつつ阻害チェックポイントを遮断し、これによって、免疫媒介性抗がん応答を促進することができる。例えば、プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ１）および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）の阻害剤を含む、いくつかのチェックポイント阻害剤が、がんおよび腫瘍の処置のために承認された、または臨床治験にて評価中である。一部の実施形態では、本開示は、特に、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）と組み合わせたＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストの使用に関する。本明細書で記載されている通り、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストは、ＰＤ１−ＰＤＬ１相互作用、下流シグナル伝達ＰＤ１−ＰＤＬ１相互作用、ならびに／またはＰＤ１および／もしくはＰＤＬ１の発現を阻害することができる種々の異なる薬剤（例えば、抗体、小分子およびポリヌクレオチド）を含む。
【０００８】
ある特定の態様では、本開示は、がんまたは腫瘍を処置する方法であって、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体（ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体）（またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）およびＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストを、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者におけるがんまたは腫瘍を処置するための、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストと組み合わせた使用のためのＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体（またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）に関する。一部の態様では、本開示は、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者におけるがんまたは腫瘍を処置するための、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体（またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）と組み合わせた使用のための、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストに関する。一部の態様では、本開示は、がんまたは腫瘍を処置するための、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストと組み合わせたＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体（またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）の使用に関する。一部の実施形態では、本方法は、がんまたは腫瘍の１つまたは複数の合併症の重症度または進行を予防または低減する。例えば、本方法は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞負荷を減少させることができる。一部の実施形態では、本方法は、がんまたは腫瘍転移を阻害することができる。一部の実施形態では、患者は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する。ある特定の好ましい実施形態では、本方法は、患者の生存時間を増加させる（例えば、６、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６ヶ月間またはそれよりも長い月数を超えて生存時間を増加させる）。一部の実施形態では、本方法は、患者の無再発生存時間を増加させる（例えば、６、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６ヶ月間またはそれよりも長い月数を超えて無再発生存時間を増加させる）。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、患者における免疫抑制を促進する。本開示に従った使用のためのＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストは、例えば、抗体、小分子およびポリヌクレオチドを含む様々な分子を含む。一部の実施形態では、本開示に従って使用されるべきＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストは、ＰＤ１抗体である。一部の実施形態では、本開示の方法に従って使用されるべきＰＤ１抗体は、ニボルマブである。一部の実施形態では、本開示の方法に従って使用されるべきＰＤ１抗体は、ペンブロリズマブである。一部の実施形態では、本開示の方法に従って使用されるべきＰＤ１抗体は、ピディリズマブである。一部の実施形態では、本開示の方法に従って使用されるべきＰＤ１抗体は、ＢＧＢ−Ａ３１７である。他の実施形態では、本開示に従って使用されるべきＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストは、ＰＤＬ１抗体である。一部の実施形態では、本開示の方法に従って使用されるべきＰＤＬ１抗体は、アテゾリズマブである。一部の実施形態では、本開示の方法に従って使用されるべきＰＤＬ１抗体は、アベルマブである。一部の実施形態では、本開示の方法に従って使用されるべきＰＤＬ１抗体は、デュルバルマブである。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、増加したＰＤＬ１発現に関連する。例えば、本開示の方法を使用して、≧１％（≧１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％またはそれを超える％のＰＤＬ１陽性腫瘍細胞）のＰＤＬ１腫瘍比率スコア（ＴＰＳ）を有するがんまたは腫瘍を処置することができる。一部の実施形態では、本開示の方法を使用して、≧５０％のＰＤＬ１腫瘍比率スコア（ＴＰＳ）を有するがんまたは腫瘍を処置することができる。がんまたは腫瘍におけるＰＤＬ１発現レベルを決定する種々の方法は、当該分野で公知であり、本開示に従って容易に使用することができる。例えば、ＦＤＡ承認されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断用ＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣ  ２２Ｃ３  ｐｈａｒｍＤｘ（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）を使用して、種々の異なる組織型由来のＰＤＬ１タンパク質が陽性に染色する生存がんまたは腫瘍細胞の百分率を決定することができる。一部の実施形態では、患者は、化学療法剤で処置されている。一部の実施形態では、患者は、化学療法剤による処置の１２ヶ月以内に（例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２ヶ月以内に）疾患進行を有する。一部の実施形態では、化学療法剤は、白金に基づく化学療法剤である。一部の実施形態では、患者は、白金を含有する化学療法によるネオアジュバントまたはアジュバントで処置されている。例に示す通り、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体およびＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストを使用して、がんを相乗的に処置することができる。よって、併用療法は、いずれかの薬剤単独をより多い量および／または増加した投薬頻度で処置した場合に観察されるがんの処置における同様のプラス効果を達成するために、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体およびＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストのより少ない量を可能にすることができる、および／またはそれによる投薬の頻度を低減することができる。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体およびＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニスト併用療法は、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体またはＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニスト単独による処置において起こり得る所望されないオフターゲット効果のリスクを低減することができる。一部の実施形態では、本開示は、がんまたは腫瘍を処置する方法であって、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体（またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）およびＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストを、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者に投与する工程を含み、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体（またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）の量が、単独ではがんまたは腫瘍の処置において無効である、方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、がんまたは腫瘍を処置する方法であって、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体（またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）およびＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストを、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者に投与する工程を含み、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストの量が、単独ではがんまたは腫瘍の処置において無効である、方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、がんまたは腫瘍を処置する方法であって、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体（またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）およびＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストを、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者に投与する工程を含み、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体（またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）の量が、単独ではがんまたは腫瘍の処置において無効であり、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストの量が、単独ではがんまたは腫瘍の処置において無効である、方法に関する。好ましくは、本開示に従って処置されるべき患者は、自己免疫疾患に罹っていない、臓器もしくは組織移植を経ているもしくはこれを受けている、または移植片対宿主病に罹っていない。ある特定の態様では、本開示は、がんまたは腫瘍を処置する方法であって、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）および免疫療法剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなど、免疫チェックポイント阻害剤）を、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、がんを処置または予防することを必要とする患者におけるがんを処置または予防するための、免疫療法剤と組み合わせた使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の態様では、本開示は、がんを処置または予防することを必要とする患者におけるがんを処置または予防するための、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせた使用のための免疫療法剤に関する。一部の実施形態では、本方法は、がんまたは腫瘍の１つまたは複数の合併症の重症度または進行を予防または低減する。例えば、本方法は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞負荷を減少させることができる。一部の実施形態では、本方法は、がんまたは腫瘍転移を阻害することができる。一部の実施形態では、患者は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する。ある特定の好ましい実施形態では、本方法は、患者の生存時間を増加させる（例えば、６、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６ヶ月間またはそれよりも長い月数を超えて生存時間を増加させる）。一部の実施形態では、本方法は、患者の無再発生存時間を増加させる（例えば、６、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６ヶ月間またはそれよりも長い月数を超えて無再発生存時間を増加させる）。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、患者における免疫抑制を促進する。本開示に従った使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、例えば、本明細書に記載されているものなど、抗体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９のうち１つまたは複数に結合する抗体）、リガンドトラップ（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、フォリスタチンポリペプチドおよびＦＬＲＧポリペプチド）、小分子（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ならびにＳｍａｄ２および３などの１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質のうち１つまたは複数の小分子阻害剤）およびポリヌクレオチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ならびにＳｍａｄ２および３などの１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質のうち１つまたは複数のポリヌクレオチド阻害剤）を含む様々な分子を含む。同様に、本開示に従った使用のための免疫療法剤は、例えば、抗体、小分子およびポリヌクレオチドを含む様々な分子を含む。一部の実施形態では、免疫療法剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態では、免疫療法
剤は、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニスト（例えば、ＰＤ１またはＰＤＬ１抗体）、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ４抗体）、ＣＤ２０抗体、ＣＤ５２抗体、インターフェロン（ＩＦＮ−ガンマ）、インターロイキン（ＩＬ−２）、ＣＤ４７アンタゴニスト（例えば、ＣＤ４７抗体）およびＧＤ２抗体のうち１つまたは複数である。一部の実施形態では、免疫療法剤は、イピリムマブ、リツキシマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、ＴＲＵ−０１５、ベルツズマブ、オファツムマブ、アレムツズマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＢＧＢ−Ａ３１７、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブのうち１つまたは複数である。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、増加したＰＤＬ１発現に関連する。例えば、本開示の方法を使用して、≧１％（≧１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％またはそれを超える％のＰＤＬ１陽性腫瘍細胞）のＰＤＬ１腫瘍比率スコア（ＴＰＳ）を有するがんまたは腫瘍を処置することができる。一部の実施形態では、本開示の方法を使用して、≧５０％のＰＤＬ１腫瘍比率スコア（ＴＰＳ）を有するがんまたは腫瘍を処置することができる。一部の実施形態では、患者は、化学療法剤で処置されている。一部の実施形態では、患者は、化学療法剤による処置の１２ヶ月以内に（例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２ヶ月以内に）疾患進行を有する。一部の実施形態では、化学療法剤は、白金に基づく化学療法剤である。一部の実施形態では、患者は、白金を含有する化学療法によるネオアジュバントまたはアジュバントで処置されている。例に示す通り、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体およびＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストを使用して、がんを相乗的に処置することができる。一部の実施形態では、本開示は、がんまたは腫瘍を処置する方法であって、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび免疫療法剤を、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者に投与する工程を含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの量が、単独ではがんまたは腫瘍の処置において無効である、方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、がんまたは腫瘍を処置する方法であって、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび免疫療法剤アンタゴニストを、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者に投与する工程を含み、免疫療法剤アンタゴニストの量が、単独ではがんまたは腫瘍の処置において無効である、方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、がんまたは腫瘍を処置する方法であって、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび免疫療法剤を、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者に投与する工程を含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの量が、単独ではがんまたは腫瘍の処置において無効であり、免疫療法剤の量が、単独ではがんまたは腫瘍の処置において無効である、方法に関する。好ましくは、本開示に従って処置されるべき患者は、自己免疫疾患に罹っていない、臓器もしくは組織移植を経ているまたはこれを受けている、または移植片対宿主病に罹っていない。
【０００９】
ある特定の態様では、本開示は、患者における免疫応答を誘導または増強する方法であって、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）および免疫療法剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなど、免疫チェックポイント阻害剤）を、免疫応答を誘導または増強することを必要とする患者に投与する工程を含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび免疫療法剤が有効量で投与される、方法に関する。一部の態様では、本開示は、免疫応答を誘導または増強することを必要とする患者における免疫応答を誘導または増強するための免疫療法剤と組み合わせた使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の態様では、本開示は、免疫応答を誘導または増強することを必要とする患者における免疫応答を誘導または増強するためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせた使用のための免疫療法剤に関する。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を有する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、がんまたは腫瘍に対するものである。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、がんまたは腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、がんまたは腫瘍転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連する疾患または障害を有する。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、内在性免疫応答である。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、Ｔ細胞免疫応答を含む。一部の実施形態では、患者は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、病原体に対するものである。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、患者における病原体による感染を処置する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、患者における病原体による感染を予防する。一部の実施形態では、病原体は、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、病原体は、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫病原体からなる群から選択される。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を処置するために１つまたは複数の追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、病原体を処置するために１つまたは複数の追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、１つまたは複数の追加的な免疫腫瘍学的薬剤をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患に罹っていない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経ていない、または組織もしくは臓器移植を受けたことがない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主病に罹っていない。
【００１０】
ある特定の態様では、本開示は、患者における免疫応答を誘導または増強する方法であって、有効量の少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）を、免疫応答を誘導または増強することを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、免疫応答の誘導または増強を必要とする患者における免疫応答の誘導または増強における使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を有する。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞の成長を阻害する。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、患者における転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連する疾患または障害を有する。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、内在性免疫応答である。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、Ｔ細胞免疫応答を含む。一部の実施形態では、患者は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんを有する。一部の実施形態では、患者は、感染性疾患を有する。一部の実施形態では、患者は、抗原をさらに投与される。一部の実施形態では、抗原は、非内在性抗原である。一部の実施形態では、抗原は、がん抗原である。一部の実施形態では、抗原は、感染性疾患抗原である。一部の実施形態では、本方法は、抗原に対する患者の免疫化をもたらす。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を処置するために、少なくとも１つの追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、感染性疾患を処置するために、少なくとも１つの追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、抗原は、ワクチン接種プロトコルに従って投与される。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患に罹っていない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経ていない、または組織もしくは臓器移植を受けたことがない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主病に罹っていない。
【００１１】
ある特定の態様では、本開示は、患者における免疫疲弊を処置または予防する方法であって、有効量のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）および免疫療法剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなど、免疫チェックポイント阻害剤）を、免疫疲弊を処置または予防することを必要とする患者に投与する工程を含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび免疫療法剤が有効量で投与される、方法に関する。一部の態様では、本開示は、免疫疲弊を処置または予防することを必要とする患者における免疫疲弊を処置または予防するための、免疫療法剤と組み合わせた使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の態様では、本開示は、免疫疲弊を処置または予防することを必要とする患者における免疫疲弊を処置または予防するための、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせた使用のための免疫療法剤に関する。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を有する。一部の実施形態では、本方法の応答は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞の成長を阻害する。一部の実施形態では、本方法は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、本方法は、患者における転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連する疾患または障害を有する。一部の実施形態では、本方法は、内在性免疫応答を増加させる。一部の実施形態では、本方法は、Ｔ細胞免疫応答を増加させる。一部の実施形態では、患者は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんを有する。一部の実施形態では、患者は、感染性疾患を有する。一部の実施形態では、患者は、抗原をさらに投与される。一部の実施形態では、抗原は、非内在性抗原である。一部の実施形態では、抗原は、がん抗原である。一部の実施形態では、抗原は、感染性疾患抗原である。一部の実施形態では、本方法は、抗原に対する患者の免疫化をもたらす。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を処置するために、少なくとも１つの追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、感染性疾患を処置するために、少なくとも１つの追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、抗原は、ワクチン接種プロトコルに従って投与される。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患に罹っていない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経ていない、または組織もしくは臓器移植を受けたことがない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主病に罹っていない。
【００１２】
ある特定の態様では、本開示は、患者における免疫疲弊を処置または予防する方法であって、有効量のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）を、免疫疲弊を処置または予防することを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、免疫疲弊の処置または予防を必要とする患者における免疫疲弊の処置または予防における使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を有する。一部の実施形態では、本方法の応答は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞の成長を阻害する。一部の実施形態では、本方法は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、本方法は、患者における転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連する疾患または障害を有する。一部の実施形態では、本方法は、内在性免疫応答を増加させる。一部の実施形態では、本方法は、Ｔ細胞免疫応答を増加させる。一部の実施形態では、患者は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんを有する。一部の実施形態では、患者は、感染性疾患を有する。一部の実施形態では、患者は、抗原をさらに投与される。一部の実施形態では、抗原は、非内在性抗原である。一部の実施形態では、抗原は、がん抗原である。一部の実施形態では、抗原は、感染性疾患抗原である。一部の実施形態では、本方法は、抗原に対する患者の免疫化をもたらす。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を処置するために、少なくとも１つの追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、感染性疾患を処置するために、少なくとも１つの追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、抗原は、ワクチン接種プロトコルに従って投与される。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患に罹っていない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経ていない、または組織もしくは臓器移植を受けたことがない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主病に罹っていない。
【００１３】
ある特定の態様では、本開示は、患者におけるがんまたは腫瘍に対する免疫応答を増強する方法であって、有効量のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）を、がんまたは腫瘍に対する免疫応答を増強することを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、がんまたは腫瘍に対する免疫応答を惹起または増強することを必要とする患者におけるがんまたは腫瘍に対する免疫応答を惹起または増強するためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞の成長を阻害する。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、患者における転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連する疾患または障害を有する。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、内在性免疫応答である。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、Ｔ細胞免疫応答を含む。一部の実施形態では、患者は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんを有する。一部の実施形態では、患者は、抗原をさらに投与される。一部の実施形態では、抗原は、非内在性抗原である。一部の実施形態では、抗原は、がん抗原である。一部の実施形態では、本方法は、抗原に対する患者の免疫化をもたらす。一部の実施形態では、抗原は、ワクチン接種プロトコルに従って投与される。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を処置するための少なくとも１つの追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患に罹っていない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経ていない、または組織もしくは臓器移植を受けたことがない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主病に罹っていない。
【００１４】
ある特定の態様では、本開示は、患者における抗原に対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、有効量の：ｉ）ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）、ｉｉ）免疫療法剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなど、免疫チェックポイント阻害剤）およびｉｉｉ）抗原を、抗原に対する免疫応答を誘導または増強することを必要とする患者に投与する工程を含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、免疫療法剤および抗原が有効量で投与される、方法に関する。一部の態様では、本開示は、抗原に対する免疫応答を増強するための、免疫療法剤と組み合わせた使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の態様では、本開示は、抗原に対する免疫応答を増強するための、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（antagoinst）と組み合わせた使用のための免疫療法剤に関する。一部の実施形態では、抗原は、非内在性抗原である。一部の実施形態では、抗原は、がん抗原である。一部の実施形態では、抗原は、感染性疾患抗原である。一部の実施形態では、本方法は、抗原に対する患者の免疫化をもたらす。
【００１５】
ある特定の態様では、本開示は、患者における抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、有効量の：ｉ）ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）およびｉｉ）抗原を、抗原に対する免疫応答を増強することを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、抗原に対する免疫応答の増強における使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の実施形態では、抗原は、非内在性抗原である。一部の実施形態では、抗原は、非内在性抗原である。一部の実施形態では、抗原は、がん抗原である。一部の実施形態では、抗原は、感染性疾患抗原である。一部の実施形態では、本方法は、抗原に対する患者の免疫化をもたらす。
【００１６】
ある特定の態様では、本開示は、がんを処置する方法であって、有効量のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）を、がんを処置することを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、がんの処置を必要とする患者におけるがんの処置における使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の実施形態では、本方法は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞の成長を阻害する。一部の実施形態では、本方法は、患者におけるがんまたは腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、本方法は、患者における転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、患者は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんを有する。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を処置するために、少なくとも１つの追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患に罹っていない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経ていない、または組織もしくは臓器移植を受けたことがない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主病に罹っていない。
【００１７】
ある特定の態様では、本開示は、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種する方法であって、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）、免疫療法剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなど、免疫チェックポイント阻害剤）、およびがんまたは病原体抗原を、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種することを必要とする患者に投与する工程を含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、免疫療法剤および抗原が、患者のワクチン接種に有効な量で投与される、方法に関する。一部の態様では、本開示は、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種するための、免疫療法剤と組み合わせた使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の態様では、本開示は、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種するための、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせた使用のための免疫療法剤に関する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍抗原は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんまたは腫瘍に関連する。一部の実施形態では、病原体抗原は、細菌病原体、ウイルス病原体、真菌病原体または寄生虫病原体からなる群から選択される病原体に関連する。一部の実施形態では、がん抗原は、ワクチン接種プロトコルに従って投与される。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ワクチン接種プロトコルに従って投与される。一部の実施形態では、病原体抗原は、ワクチン接種プロトコルに従って投与される。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を処置するために、１つまたは複数の追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、病原体を処置するために、１つまたは複数の追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、１つまたは複数の追加的な免疫腫瘍学的薬剤をさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加的な免疫腫瘍学薬剤は、アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ（ofatmumab）、リツキシマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ（atexolizumab）、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ−Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解性結合剤（例えば、ＣＤ−２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ−４抗体）およびプログラム死受容体−１（ＰＤ−１）結合剤（例えば、ＰＤ−１抗体）からなる群から選択される。一部の実施形態では、がんは、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、病原体は、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連する疾患または状態を有する。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患に罹っていない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経ていない、または組織もしくは臓器移植を受けたことがない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主病に罹っていない。
【００１８】
ある特定の態様では、本開示は、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種する方法であって、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）およびがんまたは病原体抗原を、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種することを必要とする患者に投与する工程を含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび抗原が、患者のワクチン接種に有効な量で投与される、方法に関する。一部の態様では、本開示は、がんまたは病原体に対する患者のワクチン接種における使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍抗原は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんまたは腫瘍に関連する。一部の実施形態では、病原体抗原は、細菌病原体、ウイルス病原体、真菌病原体または寄生虫病原体からなる群から選択される病原体に関連する。一部の実施形態では、がん抗原は、ワクチン接種プロトコルに従って投与される。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ワクチン接種プロトコルに従って投与される。一部の実施形態では、病原体抗原は、ワクチン接種プロトコルに従って投与される。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を処置するために、１つまたは複数の追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、病原体を処置するために、１つまたは複数の追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、１つまたは複数の追加的な免疫腫瘍学的薬剤をさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加的な免疫腫瘍学薬剤は、アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ−Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解性結合剤（例えば、ＣＤ−２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ−４抗体）およびプログラム死受容体−１（ＰＤ−１）結合剤（例えば、ＰＤ−１抗体）からなる群から選択される。一部の実施形態では、がんは、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、病原体は、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連する疾患または状態を有する。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患に罹っていない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経ていない、または組織もしくは臓器移植を受けたことがない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主病に罹っていない。
【００１９】
ある特定の態様では、本開示は、患者におけるワクチンによって誘導される免疫応答を増強する方法であって、患者におけるワクチンによって誘導される免疫応答の増強に有効な量で、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）および免疫療法剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなど、免疫チェックポイント阻害剤）を患者に投与する工程を含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、患者におけるワクチンによって誘導される免疫応答を増強するための、免疫療法剤と組み合わせた使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の態様では、本開示は、患者におけるワクチンによって誘導される免疫応答を増強するための、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせた使用のための免疫療法剤に関する。一部の実施形態では、ワクチンは、がんワクチンである。一部の実施形態では、ワクチンは、腫瘍ワクチンである。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、がんの成長を阻害する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、患者におけるがん細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、患者における腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、がん転移を処置または予防する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、腫瘍転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんは、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、患者は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する。一部の実施形態では、ワクチンは、病原体ワクチンである。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、患者における病原体による感染を処置する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、患者における病原体による感染を予防する。一部の実施形態では、病原体は、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、病原体は、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫病原体からなる群から選択される。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連する疾患または状態を有する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、Ｔ細胞免疫応答を含む。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を処置するために、１つまたは複数の追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、病原体を処置するために、１つまたは複数の追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、１つまたは複数の追加的な免疫腫瘍学的薬剤をさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加的な免疫腫瘍学薬剤は、アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ−Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解性結合剤（例えば、ＣＤ−２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ−４抗体）およびプログラム死受容体−１（ＰＤ−１）結合剤（例えば、ＰＤ−１抗体）からなる群から選択される。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患に罹っていない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経ていない、または組織もしくは臓器移植を受けたことがない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主病に罹っていない。
【００２０】
ある特定の態様では、本開示は、患者における免疫応答を誘導または増強する方法であって、有効量のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）を、免疫応答を誘導または増強することを必要とする患者に投与する工程を含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、免疫応答の誘導または増強を必要とする患者における免疫応答の誘導または増強における使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関する。一部の実施形態では、患者は、がんを有する。一部の実施形態では、患者は、腫瘍を有する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、がんに対するものである。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、腫瘍に対するものである。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、がんの成長を阻害する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、患者におけるがん細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、患者における腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、がん転移を処置または予防する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、腫瘍転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんは、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、患者は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、病原体に対するものである。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、患者における病原体による感染を処置する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、患者における病原体による感染を予防する。一部の実施形態では、病原体は、患者における免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者における免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に対し応答性である。一部の実施形態では、病原体は、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫病原体からなる群から選択される。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連する疾患または状態を有する。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、Ｔ細胞免疫応答を含む。一部の実施形態では、惹起または増強された免疫応答は、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、患者は、がんまたは腫瘍を処置するために、１つまたは複数の追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、病原体を処置するために、１つまたは複数の追加的な活性剤および／または支持療法をさらに投与される。一部の実施形態では、患者は、１つまたは複数の追加的な免疫腫瘍学的薬剤をさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加的な免疫腫瘍学薬剤は、アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ−Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解性結合剤（例えば、ＣＤ−２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ−４抗体）およびプログラム死受容体−１（ＰＤ−１）結合剤（例えば、ＰＤ−１抗体）からなる群から選択される。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患に罹っていない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経ていない、または組織もしくは臓器移植を受けたことがない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主病に罹っていない。
【００２１】
一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）および／またはＡＬＫ４受容体を阻害、特に、下流シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ１、２、３、５および／または８）を阻害することができる薬剤である。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩおよび／ＡＬＫ４関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］を阻害することができる薬剤である。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４シグナル伝達経路（例えば、Ｓｍａｄ１、２、３、５および／または８）の１つまたは複数の細胞内メディエーターを阻害することができる薬剤である。このようなＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト薬剤は、例えば、リガンドトラップ［例えば、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢ）ポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの組合せと共にその改変体（例えば、ＧＤＦトラップポリペプチド）；ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体；フォリスタチンポリペプチド；ＦＬＲＧポリペプチド）；１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド、ＡＬＫ４受容体および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体を阻害する抗体または抗体の組合せ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体）；１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩ受容体、および／またはＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４下流シグナル伝達構成成分（例えば、Ｓｍａｄ）を阻害するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せ；１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩ受容体および／または、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４下流シグナル伝達構成成分（例えば、Ｓｍａｄ）を阻害する小分子または小分子の組合せ、ならびにこれらの組合せを含む。
【００２２】
ある特定の態様では、本明細書で記載されている方法および使用に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する薬剤である。ＧＤＦ１１阻害における効果は、例えば、本明細書で記載されているアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ１１アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ１１に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書で記載されているアッセイを含む、結合アフィニティアッセイを例えば使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＧＤＦ１１に結合する。
【００２３】
ある特定の態様では、本明細書で記載されている方法および使用に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ８を阻害する薬剤である。ＧＤＦ８阻害における効果は、例えば、本明細書で記載されているアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ８アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ８に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書で記載されているアッセイを含む、結合アフィニティアッセイを例えば使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＧＤＦ８に結合する。
【００２４】
ある特定の態様では、本明細書で記載されている方法および使用に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢおよびアクチビンＡＥ）を阻害する薬剤である。アクチビン阻害における効果は、例えば、本明細書で記載されているアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のアクチビンアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビンに結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書で記載されているアッセイを含む、結合アフィニティアッセイを例えば使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともアクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣおよび／またはアクチビンＥに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、実質的に、アクチビンＡに結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも高いＫＤで、または相対的に弱い結合、例えば、約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９ＭでアクチビンＡに結合する）、および／またはアクチビンＡ活性を阻害しない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビンＢに結合する（例えば、少なくとも１×１０−７Ｍ、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２ＭのＫＤで結合する）が、実質的に、アクチビンＡに結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも高いＫＤで、または相対的に弱い結合、例えば、約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９ＭでアクチビンＡに結合する）、および／またはアクチビンＡ活性を阻害しない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、実質的に、アクチビンＢに結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも高いＫＤで、アクチビンＢに結合する、または相対的に弱い結合、例えば、約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）、および／またはアクチビンＢ活性を阻害しない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビンＡに結合する（例えば、少なくとも１×１０−７Ｍ、少なくとも１×１０−８Ｍ、少な��とも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２ＭのＫＤで結合する）が、実質的に、アクチビンＢに結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも高いＫＤで、または相対的に弱い結合、例えば、約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９ＭでアクチビンＡに結合する）、および／またはアクチビンＢ活性を阻害しない。
【００２５】
ある特定の態様では、本明細書で記載されている方法および使用に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ６を阻害する薬剤である。ＢＭＰ６阻害における効果は、例えば、本明細書で記載されているアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ６アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ６に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書で記載されているアッセイを含む、結合アフィニティアッセイを例えば使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＢＭＰ６に結合する。
【００２６】
ある特定の態様では、本明細書で記載されている方法および使用に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ３を阻害する薬剤である。ＧＤＦ３阻害における効果は、例えば、本明細書で記載されているアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ３アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ３に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書で記載されているアッセイを含む、結合アフィニティアッセイを例えば使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＧＤＦ３に結合する。
【００２７】
ある特定の態様では、本明細書で記載されている方法および使用に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ９を阻害する薬剤である。ＢＭＰ９阻害における効果は、例えば、本明細書で記載されているアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ９アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ９に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書で記載されているアッセイを含む、結合アフィニティアッセイを例えば使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＢＭＰ９に結合する。
【００２８】
ある特定の態様では、本明細書で記載されている方法および使用に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する薬剤である。ＢＭＰ１０阻害における効果は、例えば、本明細書で記載されているアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ１０に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書で記載されているアッセイを含む、結合アフィニティアッセイを例えば使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＢＭＰ１０に結合する。
【００２９】
ある特定の態様では、本明細書で記載されている方法および使用に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡを阻害する薬剤である。ＡｃｔＲＩＩＡ阻害における効果は、例えば、本明細書で記載されているアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡに結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書で記載されているアッセイを含む、結合アフィニティアッセイを例えば使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＡｃｔＲＩＩＡに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡに結合するおよび／またはこれを阻害するＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＢにさらに結合するおよび／またはこれを阻害することができる（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体）。
【００３０】
ある特定の態様では、本明細書で記載されている方法および使用に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害する薬剤である。ＡｃｔＲＩＩＢ阻害における効果は、例えば、本明細書で記載されているアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書で記載されているアッセイを含む、結合アフィニティアッセイを例えば使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するおよび／またはこれを阻害するＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡにさらに結合するおよび／またはこれを阻害することができる（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体）。
【００３１】
ある特定の態様では、本明細書で記載されている方法および使用に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ４を阻害する薬剤である。ＡＬＫ４阻害における効果は、例えば、本明細書で記載されているアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ４に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書で記載されているアッセイを含む、結合アフィニティアッセイを例えば使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともＡＬＫ４に結合する。
【００３２】
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびその使用を含む組成物に関する。「ＡｃｔＲＩＩポリペプチド」という用語は、本明細書で記載されているもの（例えば、ＧＤＦトラップポリペプチド）など、自然発生のＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにこれらの切断型および改変体をまとめて指す。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのリガンド結合性ドメインまたはその修飾（改変体）形態を含む、から本質的になる、またはからなる。例えば、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドのＡｃｔＲＩＩＡリガンド結合性ドメイン、例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインの部分を含む、から本質的になる、またはからなる。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合性ドメイン、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの部分を含む、から本質的になる、またはからなることができる。好ましくは、本明細書で記載されている方法に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、可溶性ポリペプチドである。
【００３３】
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、これを含む組成物、およびそれらの使用に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。なお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。
【００３４】
他の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む組成物およびその使用に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸［自然発生の（ＥもしくはＤ）または人工の酸性アミノ酸］を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。なお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。他では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。他では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。他では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。他では、ＡｃｔＲＩＩ
Ｂポリペプチドは、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。他では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。他では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらになお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で記載されている方法および使用に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸を含まない。
【００３５】
他の態様では、本開示は、ＧＤＦトラップポリペプチドを含む組成物およびその使用に関する。一部の実施形態では、変更されたＡｃｔＲＩＩリガンド結合性ドメインを含む、から本質的になる、またはからなるＧＤＦトラップは、野生型リガンド結合性ドメインに対する比と比べて少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００またはさらには１０００倍大きい、アクチビンＡ結合に関するＫｄの、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合に関するＫｄに対する比を有する。任意選択で、変更されたリガンド結合性ドメインを含むＧＤＦトラップは、野生型ＡｃｔＲＩＩリガンド結合性ドメインと比べて少なくとも２、５、１０、２０、２５、５０、１００またはさらには１０００倍大きい、アクチビンＡ阻害に関するＩＣ５０の、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８阻害に関するＩＣ５０に対する比を有する。任意選択で、変更されたリガンド結合性ドメインを含むＧＤＦトラップは、アクチビンＡ阻害に関するＩＣ５０よりも少なくとも２、５、１０、２０、５０またはさらには１００倍少ないＩＣ５０で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８を阻害する。このようなＧＤＦトラップは、免疫グロブリンＦｃドメイン（野生型または変異体のいずれか）を含む融合タンパク質となることができる。ある特定の事例では、対象可溶性ＧＤＦトラップは、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１媒介性細胞内シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達）のアンタゴニスト（阻害剤）である。
【００３６】
一部の実施形態では、本開示は、変更されたリガンド結合性（例えば、ＧＤＦ１１結合性）ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであるＧＤＦトラップを提供する。変更されたリガンド結合性ドメインを有するＧＤＦトラップは、例えば、ヒトＡｃｔＲＩＩＢのＥ３７、Ｅ３９、Ｒ４０、Ｋ５５、Ｒ５６、Ｙ６０、Ａ６４、Ｋ７４、Ｗ７８、Ｌ７９、Ｄ８０、Ｆ８２およびＦ１０１（ナンバリングは、配列番号１と比べてである）などのアミノ酸残基に１つまたは複数の変異を含むことができる。任意選択で、変更されたリガンド結合性ドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の野生型リガンド結合性ドメインと比べて、ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１などのリガンドに対し増加した選択性を有することができる。説明するために、これらの変異は、アクチビンよりも、ＧＤＦ１１（およびしたがって、おそらくＧＤＦ８）に対する変更されたリガンド結合性ドメインの選択性を増加することが本明細書で実証される：Ｋ７４Ｙ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９ＥおよびＤ８０Ｉ。次の変異は、逆効果を有し、ＧＤＦ１１よりもアクチビン結合の比を増加させる：Ｄ５４Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｌ７９ＡおよびＦ８２Ａ。全体的な（ＧＤＦ１１およびアクチビン）結合活性は、「テール」領域またはおそらく、不定形リンカー領域の包含によって、また、Ｋ７４Ａ変異の使用によって増加され得る。リガンド結合アフィニティの全体的な減少を引き起こした他の変異は、Ｒ４０Ａ、Ｅ３７Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｒ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０ＭおよびＤ８０Ｎを含む。変異を組み合わせて、所望の効果を達成することができる。例えば、ＧＤＦ１１：アクチビン結合の比に影響を与える変異の多くは、リガンド結合に全体的なマイナス効果を有し、したがって、これらは、リガンド結合を一般に増加させる変異と組み合わせて、リガンド選択性を有する改善された結合タンパク質を産生することができる。例示的な実施形態では、ＧＤＦトラップは、追加的なアミノ酸置換、付加または欠失と任意選択で組み合わせた、Ｌ７９ＤまたはＬ７９Ｅ変異を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである。
【００３７】
本明細書で記載されている通り、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびその改変体（ＧＤＦトラップ）は、ホモ多量体、例えば、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体、ホモ五量体およびより高次のホモ多量体複合体となることができる。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびその改変体は、ホモ二量体である。ある特定の実施形態では、本明細書で記載されているＡｃｔＲＩＩポリペプチド二量体は、第２のＡｃｔＲＩＩポリペプチドと共有結合または非共有結合により会合した、第１のＡｃｔＲＩＩポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩドメインおよび相互作用ペアの第１のメンバー（または第２のメンバー）（例えば、免疫グロブリンの定常ドメイン）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび相互作用ペアの第２のメンバー（または第１のメンバー）のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
ある特定の態様では、その改変体を含むＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＧＤＦトラップ）は、融合タンパク質となることができる。例えば、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非ＡｃｔＲＩＩ）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質となることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、１つのドメインとして、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに由来するアミノ酸配列（例えば、ＡｃｔＲＩＩ受容体のリガンド結合性ドメインまたはその改変体）、および改善された薬物動態、より容易な精製、特定の組織への標的化などの所望される特性をもたらす１つまたは複数の異種ドメインを有する融合タンパク質となることができる。例えば、融合タンパク質のドメインは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、取り込み／投与、組織局在もしくは分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および／または精製のうち１つまたは複数を増強することができる。任意選択で、融合タンパク質のＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインは、１つまたは複数の異種ポリペプチドドメインに直接的に接続される（融合される）、またはリンカーなどの介在配列が、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのアミノ酸配列および１つまたは複数の異種ドメインのアミノ酸配列の間に位置することができる。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質は、異種ドメインおよびＡｃｔＲＩＩドメインの間に位置する相対的に不定形なリンカーを含む。この不定形リンカーは、ＡｃｔＲＩＩＡもしくはＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（「テール」）のＣ末端側におけるおよそ４〜１５アミノ酸不定形領域に対応することができる、または相対的に二次構造がない３〜１５、２０、３０、５０またはそれよりも多いアミノ酸の間の人工配列となることができる。リンカーは、グリシンおよびプロリン残基リッチとなることができ、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列を含有することができる。リンカーの例として、ＴＧＧＧ（配列番号３１）、ＳＧＧＧ（配列番号３２）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＳＧＧＧＧ（配列番号３０）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧＧ（配列番号２８）およびＧＧＧ（配列番号２７）の配列が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質は、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの定常ドメインを含むことができる。例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥまたはＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列。例えば、免疫グロブリンドメインのＦｃ部分は、配列番号２２〜２６のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。このような免疫グロブリンドメインは、変更されたＦｃ活性、例えば、１つまたは複数のＦｃエフェクター機能の減少を付与する、１つまたは複数のアミノ酸修飾（例え��、欠失、付加および／または置換）を含むことができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃに表記されるアミノ酸配列を含む。例えば、Ｂ部分は、本明細書で記載されている通り、ＮおよびＣ末端で切断されたＡｃｔＲＩＩポリペプチドである。ＡおよびＣ部分は、独立して、０、１つまたは２つ以上のアミノ酸となることができ、ＡおよびＣ部分の両方は、Ｂにとって異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に接合することができる。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質は、リーダー配列を含む。リーダー配列は、ネイティブＡｃｔＲＩＩリーダー配列（例えば、ネイティブＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢリーダー配列）または異種リーダー配列となることができる。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー配列である。
【００３９】
本明細書で記載されている通り、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体タンパク質複合体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢおよびＡＬＫ４ホモ二量体と比較して、異なるリガンド結合プロファイル／選択性を有することが発見された。特に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較して、アクチビンＢへの増強された結合を呈し、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体により観察される通りアクチビンＡ、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１への強い結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０およびＧＤＦ３への実質的に低減した結合を示す。特に、ＢＭＰ９は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体に対し弱く観察可能から観察不能なアフィニティを呈する一方、このリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体に強く結合する。ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と同様に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＢＭＰ６への中間レベル結合を保持する。図１９を参照されたい。したがって、これらの結果は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニスト（阻害剤）であることを実証する。したがって、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、このような選択的アンタゴニズムが有利となるある特定の適用において、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体よりも有用になるであろう。その例として、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１のうち１つまたは複数のアンタゴニズムを保持するが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０およびＧＤＦ３のうち１つまたは複数のアンタゴニズムを最小化することが所望される治療適用が挙げられる。さらに、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、患者におけるがんを処置することが示された。したがって、本開示は、一部には、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体およびその使用に関する。特定の作用機構に束縛されることは望まないが、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢおよびアクチビンＡＣ）、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１のうち少なくとも１つまたは複数に結合するＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と共にその改変体が、がん患者における有益な効果の促進に有用な薬剤となるであろうことが予測される。
【００４０】
したがって、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドおよび少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）を含むヘテロ多量体複合体（ヘテロ多量体）、ならびにその使用を提供する。好ましくは、ＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡＬＫ４受容体のリガンド結合性ドメイン、例えば、ＡＬＫ４細胞外ドメインの部分を含む。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは一般に、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド結合性ドメイン、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの部分を含む。好ましくは、このようなＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにそれらの結果としてのヘテロ多量体は、可溶性である。
【００４１】
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４のアミノ酸２４〜３４のいずれか１つから始まり、配列番号１４のアミノ酸１０１〜１２６のいずれか１つで終結するポリペプチドと少なくとも７０％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４のアミノ酸３４〜１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらに他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらに他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらに他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらに他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらに他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号８０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらに他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらに他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。
【００４２】
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２０〜２９のいずれか１つから始まり、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１のいずれか１つで終結するポリペプチドと少なくとも７０％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはから本質的になる、またはからなることができる。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらに他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。なお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号５８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号６０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号６３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号６６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１３９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。さらになお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。ある特定の好ましい実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸（例えば、ＥまたはＤ）を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含まない。
【００４３】
本明細書で記載されているＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの様々な組合せも、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関して想定される。例えば、ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号１４のアミノ酸３４〜１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号１のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むまたはから本質的になる、またはからなるポリペプチドを含むことができる。さらなる態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号１４のアミノ酸３４〜１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号１のアミノ酸２５〜１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むまたはから本質的になる、またはからなるポリペプチドを含むことができる。ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号１４のアミノ酸３４〜１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号１のアミノ酸２０〜１３４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むまたはから本質的になる、またはからなるポリペプチドを含むことができる。他の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号１５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むまたはから本質的になる、またはからなるポリペプチドを含むことができる。なお他の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号１５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むまたはから本質的になる、またはからなるポリペプチドを含むことができる。さらに他の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号１５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むまたはから本質的になる、またはからなるポリペプチドを含むことができる。さらになお他の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号１５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むまたはから本質的になる、またはからなるポリペプチドを含むことができる。
【００４４】
本明細書で記載されている通り、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体構造は、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、ヘテロ五量体およびより高次のヘテロ多量体複合体を含む。例えば、図２１〜２３を参照されたい。ある特定の好ましい実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。ある特定の態様では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、融合タンパク質となることができる。
【００４５】
ある特定の態様では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは融合タンパク質であり得る。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡＬＫ４ポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非ＡＬＫ４）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であり得る。同様に、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非ＡｃｔＲＩＩＢ）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であり得る。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で記載されているＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと共有結合または非共有結合により会合したＡＬＫ４ポリペプチドを含み、ＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡＬＫ４ドメインおよび相互作用ペアの第１のメンバー（または第２のメンバー）のアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび相互作用ペアの第２のメンバー（または第１のメンバー）のアミノ酸配列を含む。任意選択で、このようなＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（または第２のメンバー）に直接的に接続される（融合される）、またはリンカーなどの介在配列が、ＡＬＫ４ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第１のメンバー（または第２のメンバー）のアミノ酸配列の間に位置することができる。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（または第１のメンバー）に直接的に接続（融合）することができる、またはリンカーなどの介在配列が、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第２のメンバー（または第１のメンバー）のアミノ酸配列の間に位置することができる。リンカーの例として、ＴＧＧＧ（配列番号３１）、ＳＧＧＧ（配列番号３２）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＳＧＧＧＧ（配列番号３０）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧＧ（配列番号２８）およびＧＧＧ（配列番号２７）の配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書で記載される相互作用ペアは、二量体化を促進するか、または高次の多量体を形成するように設計されている。例えば、図２１〜２３を参照。一部の実施形態では、相互作用ペアは、相互作用して複合体、特に、ヘテロ二量体の複合体を形成する任意の２つのポリペプチド配列の場合もあるが、実効性のある実施形態は、ホモ二量体の配列を形成する相互作用ペアを用いることもできる。相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、非対称ペアとなることができ、これは、ペアのメンバーが、自己会合する（すなわち、誘導型相互作用ペア）よりもむしろ、互いと優先的に会合することを意味する。したがって、非対称相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、会合して、ヘテロ二量体の複合体を形成することができる。代替的に、相互作用ペアは、非誘導型であってもよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先度なしで、互いと会合しても自己会合してもよく、よって、同じまたは異なるアミノ酸配列を有することができることを意味する。したがって、非誘導型相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、会合して、ホモ二量体の複合体またはヘテロ二量体の複合体を形成することができる。任意選択で、相互作用的作用ペア（例えば、非対称ペアまたは非誘導型相互作用ペア）の第１のメンバーは、相互作用ペアの第２のメンバーと共有結合により会合する。任意選択で、相互作用的作用ペア（例えば、非対称ペアまたは非誘導型相互作用ペア）の第１のメンバーは、相互作用ペアの第２のメンバーと非共有結合により会合する。任意選択で、相互作用作用ペア（例えば、非対称ペアまたは非誘導相互作用ペア）の第１のメンバーは、と共有結合的および非共有結合的両方の機を介して相互作用ペアの第２のメンバーに会合する。
【００４７】
伝統的なＦｃ融合タンパク質および抗体は、非誘導型相互作用ペアの例である一方で、種々の操作されたＦｃドメインが、非対称相互作用ペアとして設計された［Ｓｐｉｅｓｓら（２０１５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２Ａ）：９５−１０６］。したがって、本明細書で記載される相互作用ペアの第１のメンバーおよび／または第２のメンバーは、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの定常ドメインを含み得る。例えば、相互作用ペアの第１のメンバーは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥまたはＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含み得る。そのような免疫グロブリンドメインは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、欠失、付加および／または置換）を含み得る。例えば、相互作用ペアの第１のメンバーは、配列番号２２〜２６のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。同様に、相互作用ペアの第２のメンバーは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含み得る。そのような免疫グロブリンドメインは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含み得る。例えば、相互作用ペアの第２のメンバーは、配列番号２２〜２６のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。一部の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーおよび第２のメンバーは、免疫グロブリンクラスおよびサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。別の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーおよび第２のメンバーは、異なる免疫グロブリンクラスまたはサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ｉ）配列番号７６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるＡＬＫ４ポリペプチド、およびｉｉ）配列番号７３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ｉ）配列番号８０と少なくとも７��％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるＡＬＫ４ポリペプチド、およびｉｉ）配列番号７８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ｉ）配列番号１３９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるＡＬＫ４ポリペプチド、およびｉｉ）配列番号１４３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ｉ）配列番号１４１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるＡＬＫ４ポリペプチド、およびｉｉ）配列番号１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。
【００４８】
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。本明細書に記載のＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの種々の組み合わせが、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に関して企図される。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号７６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号７３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ａ）配列番号８０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド；およびｂ）配列番号７８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを含み得る。
【００４９】
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体（heteromulitmer）のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つのドメインとして、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢに由来するアミノ酸配列（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢもしくはＡＬＫ４またはその改変体のリガンド結合性ドメイン）、および改善された薬物動態、より容易な精製、特定の組織への標的化などの所望される特性をもたらす１つまたは複数の追加的なドメインを有する融合タンパク質となることができる。例えば、融合タンパク質のドメインは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、取り込み／投与、組織局在もしくは分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および／または精製のうち１つまたは複数を増強することができる。
【００５０】
その改変体（例えば、ＧＤＦトラップ）を含むＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／またはその改変体を含むＡＬＫ４ポリペプチドは、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列およびＧＳＴ融合体など、精製部分配列を含むことができる。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、グリコシル化されたアミノ酸、ペグ化されたアミノ酸、ファルネシル化されたアミノ酸、アセチル化されたアミノ酸、ビオチン化されたアミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、および有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択される、１つまたは複数の修飾されたアミノ酸残基を含む。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、少なくとも１つのＮ結合型糖を含むことができ、２つ、３つまたはそれよりも多いＮ結合型糖を含むことができる。このようなポリペプチドは、Ｏ結合型糖を含むこともできる。一般に、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリペプチドおよび／またはＡＬＫ４アンタゴニストポリペプチドが、患者における好ましくない免疫応答の見込みを縮小することができるように、ポリペプチドの天然グリコシル化を適切に媒介する哺乳動物細胞系において発現されることが好ましい。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＡＬＫポリペプチドは、操作された昆虫または酵母細胞、ならびにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞およびＮＳＯ細胞などの哺乳動物細胞を含む、患者使用に適した形でタンパク質をグリコシル化する種々の細胞系において産生させることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、グリコシル化され、チャイニーズハムスター卵巣細胞系から得ることができるグリコシル化パターンを有する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において少なくとも４、６、１２、２４、３６、４８または７２時間の血清半減期を示す。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において少なくとも６、８、１０、１２、１４、２０、２５または３０日間の血清半減期を示すことができる。
【００５１】
ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数の本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む医薬調製物を提供する。医薬調製物は、本明細書で記載されている通りの障害または状態［例えば、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマまたは皮膚性メラノーマ）、肺がん（例えば、転移性および非転移性小細胞肺がん、ならびに扁平上皮癌、大細胞癌または腺癌などの転移性および非転移性非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、進行型または転移性尿路上皮癌）、リンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、多形神経膠芽腫、前立腺がん、膵がんおよび肉腫（例えば、転移性肉腫）］の処置または予防に使用される化合物など、１つまたは複数の追加的な活性剤を含むこともできる。
【００５２】
本明細書で記載されているＡｃｔＲＩＩアンタゴニストのいずれかを医薬調製物（組成物）として製剤化することができる。一部の実施形態では、医薬調製物は、薬学的に許容される担体を含む。医薬調製物は、好ましくは、発熱物質非含有（治療的使用のための製品の品質を統制する法規により要請される程度に発熱物質非含有であることを意味する）であることが好ましいであろう。医薬調製物は、本明細書で記載されている障害／状態の処置に使用される化合物など、１つまたは複数の追加的な化合物を含むこともできる。一般に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を実質的に含まない。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満のＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む。
【００５３】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩリガンド、ＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）およびＡＬＫ４のうち１つまたは複数を阻害する抗体または抗体の組合せである。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体または抗体の組合せである。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ１１に結合する抗体または抗体の組合せであり、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうち１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ８に結合する抗体または抗体の組合せであり、任意選択で、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうち１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣおよび／またはアクチビンＥ）に結合する抗体または抗体の組合せであり、任意選択で、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうち１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともアクチビンＡおよびアクチビンＢに結合する抗体または抗体の組合せであり、任意選択で、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうち１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ６に結合する抗体または抗体の組合せであり、任意選択で、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＥ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうち１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ３に結合する抗体または抗体の組合せであり、任意選択で、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＥ）、ＢＭＰ６、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうち１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ９に結合する抗体または抗体の組合せであり、任意選択で、ＧＤＦ１１、ＡＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３およびＢＭＰ１０のうち１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ１０に結合する抗体または抗体の組合せであり、任意選択で、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３およびＢＭＰ９のうち１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡＬＫ４に結合する抗体または抗体の組合せであり、任意選択で、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうち１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する抗体または抗体の組合せであり、任意選択で、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のうち１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示の抗体は、多特異性抗体である。一部の実施形態では、本開示の抗体は、二特異性抗体である。
【００５４】
ある特定の実例では、本明細書で記載されている障害または状態に対し本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せを投与する場合、赤血球細胞における望まれない効果を低減するために、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの投与の際に赤血球細胞における効果をモニタリングすること、またはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの投薬を決定または調整することが所望され得る。例えば、赤血球細胞レベル、ヘモグロビンレベルまたはヘマトクリットレベルの増加は、血圧の所望されない増加を引き起こすであろう。
【００５５】
特許または特許出願は、色付きで実行された少なくとも１つの図面を含む。色付きの図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な手数料の支払い時に特許商標庁によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインと、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡ結晶構造の複合分析に基づいて、囲みで示されるリガンドと直接接触すると本明細書で推定される残基とのアラインメントを示す。
【００５７】
【図２】図２は、様々な脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質（配列番号１００〜１０５）およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号１２２）の複数の配列アラインメントならびにアラインメントに由来するコンセンサスＡｃｔＲＩＩ配列（配列番号１０６）を示す。
【００５８】
【図３】図３は、様々な脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＡタンパク質およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号１０７〜１１４）の複数の配列アラインメントを示す。
【００５９】
【図４】図４は、様々な脊椎動物ＡＬＫ４タンパク質およびヒトＡＬＫ４（配列番号１１５〜１２１）の複数の配列アラインメントを示す。
【００６０】
【図５】図５は、ＣＨＯ細胞中で発現されるＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの精製を示す。タンパク質は、サイズカラム（上パネル）およびクマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（下パネル）（左レーン：分子量標準；右レーン：ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃ）により可視化されるように、単一の、明確なピークとして精製される。
【００６１】
【図６】図６は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイにより測定される、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの、アクチビン（上パネル）およびＧＤＦ−１１（下パネル）への結合を示す。
【００６２】
【図７】図７は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃの完全な、プロセシングされていないアミノ酸配列（配列番号１２３）を示す。ＴＰＡリーダー（残基１〜２２）および二重切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（残基２４〜１３１、配列番号１中のネイティブ配列に基づく番号付けを使用する）に、それぞれ下線を付す。強調は、配列番号１に対して２５位にある、成熟融合タンパク質のＮ末端アミノ酸であると配列決定することによって示されるグルタミン酸である。
【００６３】
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す（コード鎖は上の配列番号１２４に示され、相補鎖は下の３’−５’で配列番号１２５に示される）。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列に下線を付す。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）の対応するアミノ酸配列も示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す（コード鎖は上の配列番号１２４に示され、相補鎖は下の３’−５’で配列番号１２５に示される）。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列に下線を付す。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）の対応するアミノ酸配列も示す。
【００６４】
【図９Ａ】図９Ａおよび図９Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃをコードする代替的なヌクレオチド配列を示す（コード鎖は上の配列番号１２６に示され、相補鎖は下の３’−５’で配列番号１２７に示される）。この配列は、初期の形質転換体においてより高いレベルのタンパク質発現を提供し、細胞系開発をより迅速なプロセスにする。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列に下線を付し、ＥＣＤの野生型ヌクレオチド配列中の置換（図８を参照されたい）を強調する。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）の対応するアミノ酸配列も示す。
【図９Ｂ】図９Ａおよび図９Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃをコードする代替的なヌクレオチド配列を示す（コード鎖は上の配列番号１２６に示され、相補鎖は下の３’−５’で配列番号１２７に示される）。この配列は、初期の形質転換体においてより高いレベルのタンパク質発現を提供し、細胞系開発をより迅速なプロセスにする。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列に下線を付し、ＥＣＤの野生型ヌクレオチド配列中の置換（図８を参照されたい）を強調する。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）の対応するアミノ酸配列も示す。
【００６５】
【図１０】図１０は、ＴＰＡリーダー配列（二重下線）、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２０〜１３４；一重下線）、およびｈＦｃドメインを含む、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０−１３４）−ｈＦｃ（配列番号１２８）の完全なアミノ酸配列を示す。成熟融合タンパク質中のＮ末端残基であると配列決定することによって示されるグリシンのように、ネイティブ配列中の７９位で置換されたアスパラギン酸に二重下線を付し、強調する。
【００６６】
【図１１Ａ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０−１３４）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号１２９はセンス鎖に対応し、配列番号１３０はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付し、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜４２０）に一重下線を付す。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０−１３４）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号１２９はセンス鎖に対応し、配列番号１３０はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付し、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜４２０）に一重下線を付す。
【００６７】
【図１２】図１２は、ＴＰＡリーダー（二重下線）、切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５〜１３１；一重下線）、およびｈＦｃドメインを含む、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃの完全なアミノ酸配列（配列番号１３１）を示す。成熟融合タンパク質中のＮ末端残基であると配列決定することによって示されるグルタミン酸のように、ネイティブ配列中の７９位で置換されたアスパラギン酸に二重下線を付し、強調する。
【００６８】
【図１３】図１３は、リーダーを含まない切断されたＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃのアミノ酸配列（配列番号１３２）を示す。切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５〜１３１）に下線を付す。成熟融合タンパク質中のＮ末端残基であると配列決定することによって示されるグルタミン酸のように、ネイティブ配列中の７９位で置換されたアスパラギン酸に二重下線を付し、強調する。
【００６９】
【図１４】図１４は、リーダー、ｈＦｃドメイン、およびリンカーを含まない、切断されたＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）のアミノ酸配列（配列番号１３３）を示す。成熟融合タンパク質中のＮ末端残基であると配列決定することによって示されるグルタミン酸のように、ネイティブ配列中の７９位で置換されたアスパラギン酸に下線を付し、強調する。
【００７０】
【図１５Ａ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号１３４はセンス鎖に対応し、配列番号１３５はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付し、切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）に一重下線を付す。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１の残基２５〜１３１）も示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号１３４はセンス鎖に対応し、配列番号１３５はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付し、切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）に一重下線を付す。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１の残基２５〜１３１）も示す。
【００７１】
【図１６Ａ】図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃをコードする代替的なヌクレオチド配列を示す。配列番号１３６はセンス鎖に対応し、配列番号１３７はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付し、切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）に下線を付し、細胞外ドメインの野生型ヌクレオチド配列中の置換に二重下線を付し、強調する（配列番号１３４、図１５と比較されたい）。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１の残基２５〜１３１）も示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃをコードする代替的なヌクレオチド配列を示す。配列番号１３６はセンス鎖に対応し、配列番号１３７はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付し、切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）に下線を付し、細胞外ドメインの野生型ヌクレオチド配列中の置換に二重下線を付し、強調する（配列番号１３４、図１５と比較されたい）。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１の残基２５〜１３１）も示す。
【００７２】
【図１７】図１７は、図１６に示された代替的なヌクレオチド配列（配列番号１３６）のヌクレオチド７６〜３９６（配列番号１３８）を示す。図１６に示された同じヌクレオチド置換にはまた、ここで下線を付し、強調する。配列番号１３８は、Ｌ７９Ｄ置換を有する切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインのみ（配列番号１の残基２５〜１３１に対応する）、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）をコードする。
【００７３】
【図１８】図１８は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ２．１を使用したヒトＩｇＧアイソタイプに由来するＦｃドメインの多重配列アラインメントを示す。ヒンジ領域は、点線の下線付きで示される。二重下線は、非対称鎖ペア形成を促進するためにＩｇＧ１  Ｆｃ中で操作された位置の例ならびに他のアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に関する対応する位置を示す。
【００７４】
【図１９】図１９は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体と比較した、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体に関する比較リガンド結合データを示す。それぞれのタンパク質複合体について、リガンドは、リガンドシグナル伝達阻害と良好に相関する速度定数ｋｏｆｆによって順位付けられ、結合アフィニティの降順に列挙される（最も緊密なリガンド結合は上に列挙される）。左側の黄色、赤色、緑色、および青色の線は、オフ速度定数の規模を示す。黒色の実線は、ヘテロ二量体への結合がホモ二量体と比較して増強されるか、または変化しないリガンドを示すが、赤色の破線は、ホモ二量体と比較して実質的に低下した結合を示す。示されるように、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較して、アクチビンＢへの結合の増強を示し、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体について観察されるアクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１への強力な結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３への実質的に低下した結合を示す。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体のように、ヘテロ二量体は、ＢＭＰ６への中間レベルの結合を保持する。
【００７５】
【図２０】図２０は、本明細書に記載のＡ−２０４レポーター遺伝子アッセイによって決定された場合の比較ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体／ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体のＩＣ５０データを示す。ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と同様、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害する。しかしながら、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０のシグナル伝達経路のＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体阻害は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較して有意に低下している。これらのデータは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢ：ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを示している。
【００７６】
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体ポリペプチドを含む異種タンパク質複合体の２つの概略例を示す。図２１Ａは、１つのＩ型受容体融合ポリペプチドおよび１つのＩＩ型受容体融合ポリペプチドを含むヘテロ二量体のタンパク質複合体を示し、これは、各ポリペプチド鎖内に含まれる多量体化ドメインを介して共有結合的または非共有結合的にアセンブリすることができる。２つのアセンブリされた多量体化ドメインが相互作用ペアを構成し、これは誘導型であっても非誘導型であってもよい。図２１Ｂは、図２１Ａで描示した通りの２つのヘテロ二量体複合体を含むヘテロ四量体タンパク質複合体について描示する。より高次の複合体も、想定することができる。
【００７７】
【図２２】図２２は、Ｉ型受容体ポリペプチド（「Ｉ」と示す）（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）およびＩＩ型受容体ポリペプチド（「ＩＩ」と表示される）（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）を含む異種タンパク質複合体の概略例を示す。例示された実施形態では、Ｉ型受容体ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの部分であり、ＩＩ型受容体ポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの部分である。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、Ｉ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドと、相互作用ペアの対応するメンバーとの間に位置付けられ得る。相互作用ペアの第１および第２のメンバーは誘導型（非対称）であってよく、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりむしろ、優先的に互いと会合することを意味し、あるいは相互作用ペアは非誘導型であってよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先性なしで互いと会合する、または自己会合することができ、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味する。伝統的なＦｃ融合タンパク質および抗体は非誘導型相互作用ペアの例であり、他方、操作されたＦｃドメインの種類は誘導型（非対称）相互作用ペアとしてデザインされている［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２Ａ）：  ９５−１０６］。
【００７８】
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）と、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）とを含むンパク質複合体の概略例を示す。例示された実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの部分であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの部分である。適当な相互作用ペアは、例えば、本明細書に記載されるものなどの重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用ペア、その短縮体および改変体を含んだ［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２Ａ）：  ９５−１０６］。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用ペアの対応するメンバーとの間に位置付けられ得る。相互作用ペアの第１および第２のメンバーは非誘導型であり得、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先性なしで互いと会合する、または自己会合することができることを意味し、これらは、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得る。図２３Ａを参照のこと。代替的に、相互作用ペアは誘導型（非対称）ペアであり得、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりむしろ、優先的に互いと会合することを意味する。図２３Ｂを参照のこと。より高次の複合体が構想され得る。図２３Ｃおよび２３Ｄを参照のこと。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）と、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）とを含むンパク質複合体の概略例を示す。例示された実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの部分であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの部分である。適当な相互作用ペアは、例えば、本明細書に記載されるものなどの重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用ペア、その短縮体および改変体を含んだ［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２Ａ）：  ９５−１０６］。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用ペアの対応するメンバーとの間に位置付けられ得る。相互作用ペアの第１および第２のメンバーは非誘導型であり得、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先性なしで互いと会合する、または自己会合することができることを意味し、これらは、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得る。図２３Ａを参照のこと。代替的に、相互作用ペアは誘導型（非対称）ペアであり得、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりむしろ、優先的に互いと会合することを意味する。図２３Ｂを参照のこと。より高次の複合体が構想され得る。図２３Ｃおよび２３Ｄを参照のこと。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）と、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）とを含むンパク質複合体の概略例を示す。例示された実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの部分であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの部分である。適当な相互作用ペアは、例えば、本明細書に記載されるものなどの重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用ペア、その短縮体および改変体を含んだ［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２Ａ）：  ９５−１０６］。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用ペアの対応するメンバーとの間に位置付けられ得る。相互作用ペアの第１および第２のメンバーは非誘導型であり得、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先性なしで互いと会合する、または自己会合することができることを意味し、これらは、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得る。図２３Ａを参照のこと。代替的に、相互作用ペアは誘導型（非対称）ペアであり得、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりむしろ、優先的に互いと会合することを意味する。図２３Ｂを参照のこと。より高次の複合体が構想され得る。図２３Ｃおよび２３Ｄを参照のこと。
【図２３Ｄ】図２３Ａ〜２３Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）と、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載されるような他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるペプチド）とを含むンパク質複合体の概略例を示す。例示された実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの部分であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの部分である。適当な相互作用ペアは、例えば、本明細書に記載されるものなどの重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用ペア、その短縮体および改変体を含んだ［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら、（２０１５）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２Ａ）：  ９５−１０６］。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用ペアの対応するメンバーとの間に位置付けられ得る。相互作用ペアの第１および第２のメンバーは非誘導型であり得、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先性なしで互いと会合する、または自己会合することができることを意味し、これらは、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得る。図２３Ａを参照のこと。代替的に、相互作用ペアは誘導型（非対称）ペアであり得、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりむしろ、優先的に互いと会合することを意味する。図２３Ｂを参照のこと。より高次の複合体が構想され得る。図２３Ｃおよび２３Ｄを参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
１．概観
ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、ＴＧＦ−β、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、骨形成遺伝子タンパク質（ＢＭＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、および抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を含む、３０を超える分泌因子から構成される［Ｗｅｉｓｓら（２０１３年）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（１号）：４７〜６３頁］。スーパーファミリーのメンバーであって、脊椎動物および非脊椎動物のいずれにおいても見出されるメンバーは、多様な組織内で遍在的に発現し、動物の寿命を通して発生の最早期に機能する。実際、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、幹細胞の自己再生、原腸形成、分化、器官の形態形成、および成体組織のホメオスタシスの鍵となるメディエーターである。ＴＧＦ−βスーパーファミリーによるシグナル伝達の異常が広範にわたるヒト病態と関連することは、この活性の遍在性と符合する。
【００８０】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンドは、１つの単量体の中央３−１／２ターンヘリックスが、他の単量体のベータ−ストランドにより形成される凹部表面に対してパッキングされる、同じ二量体構造を共有する。ＴＧＦ−βファミリーメンバーの大半は、分子間ジスルフィド結合によりさらに安定化される。このジスルフィド結合は、「システインノット」モチーフと称されるモチーフを生成する他の２つのジスルフィド結合により形成されるリングを横切る［Ｌｉｎら（２００６年）、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、１３２巻：１７９〜１９０頁；およびＨｉｎｃｋら（２０１２年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。
【００８１】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのシグナル伝達は、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼ受容体の異種複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ）によって媒介され、これらは、リガンド刺激の際に、下流のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤタンパク質１、２、３、５、および８）をリン酸化および活性化する［Ｍａｓｓａｇｕｅ、２０００年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１巻：１６９〜１７８頁］。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、システインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および、予測セリン／スレオニンキナーゼ特異性を持つ細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。概して、Ｉ型受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介する一方、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドの結合に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型の受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。
【００８２】
ＴＧＦ−βファミリーは、結合するＩ型受容体と、活性化させるＳｍａｄタンパク質とに基づき、系統発生上の２つの分枝に分けることができる。１つは、近年進化した分枝であり、例えば、ＴＧＦ−β、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ３およびＮｏｄａｌを含み、これは、Ｓｍａｄ２および３を活性化するＩ型受容体を介してシグナル伝達する［Ｈｉｎｃｋ  （２０１２）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８６：１８６０−１８７０］。他の分枝は、スーパーファミリーのより遠い関連タンパク質を含み、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７を含み、これは、Ｓｍａｄ１、５、および８を介してシグナル伝達する。
【００８３】
ＴＧＦβアイソフォームは、ＴＧＦβスーパーファミリーの創立メンバーであり、そのうち、哺乳動物では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３と表示される、３つのアイソフォームが公知である。生物活性の成熟ＴＧＦβリガンドは、ホモ二量体として機能し、主に、Ｉ型受容体であるＡＬＫ５を介してシグナル伝達するが、加えてまた、内皮細胞内のＡＬＫ１を介してもシグナル伝達することが見出されている［Goumansら（２００３年）Mol  Cell  １２巻（４号）：８１７〜８２８頁］。ＴＧＦβ１は、最も夥多であり、かつ遍在的に発現するアイソフォームである。ＴＧＦβ１は、創傷治癒において重要な役割を果たすことが公知であり、構成的に活性のＴＧＦβ１トランス遺伝子を発現させるマウスは、線維症を発症する［Clouthierら（１９９７年）J  Clin.  Invest.１００巻（１１号）：２６９７〜２７１３頁］。ＴＧＦβ１の発現は、ヒト神経膠芽腫細胞において最初に記載されたが、胚性神経系のニューロン内および星状膠細胞細胞内で生じる。ＴＧＦβ３は当初、ヒト横紋筋肉腫細胞系から単離され、以来、肺腺癌および腎癌細胞系において見出されている。ＴＧＦβ３は、口蓋および肺の形態形成に重要であることが公知である［Kubiczkovaら（２０１２年）Journal  of  Translational  Medicine  １０巻：１８３頁］。
【００８４】
アクチビンは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであり、当初、濾胞刺激ホルモンの分泌の調節因子として発見されたが、その後、多様な生殖的および非生殖的役割が特徴付けられている。２つの近縁のβサブユニットのホモ／ヘテロ二量体（それぞれ、βＡβＡ、βＢβＢ、およびβＡβＢ）である、３つの主要なアクチビン形態（Ａ、Ｂ、およびＡＢ）が存在する。ヒトゲノムはまた、主に肝臓内で発現する、アクチビンＣおよびアクチビンＥもコードし、βＣまたはβＥを含有するヘテロ二量体形態もまた公知である。ＴＧＦ−βスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤の細胞におけるホルモン生成を刺激し得、神経細胞の生存を支援し得、細胞周期の進行に対して細胞型に依存して正もしくは負に影響を及ぼし得、そして、少なくとも両生類の胚において中胚葉分化を誘導し得る、独特かつ多機能の作用因子である［ＤｅＰａｏｌｏら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１９８巻：５００〜５１２頁；Ｄｙｓｏｎら（１９９７年）、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．７巻：８１〜８４頁；およびＷｏｏｄｒｕｆｆ（１９９８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５巻：９５３〜９６３頁］。いくつかの組織では、アクチビンのシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体であるインヒビンによってアンタゴナイズされる。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌の制御において、アクチビンは、ＦＳＨの合成および分泌を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨの合成および分泌を低減する。アクチビンの生活性を調節し得、そして／または、アクチビンに結合し得る他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ、ＦＬＲＧまたはＦＳＴＬ３としても公知）およびα２−マクログロブリンが挙げられる。
【００８５】
本明細書で記載される通り、「アクチビンＡ」に結合する作用因子は、単離βＡサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてであれ、βＡサブユニットに特異的に結合する作用因子である。ヘテロ二量体の複合体（例えば、βＡβＢヘテロ二量体）の場合、「アクチビンＡ」に結合する作用因子は、βＡサブユニット内に存在するエピトープには特異的であるが、複合体のβＡ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンＡ」にアンタゴナイズする（これを阻害する）本明細書で開示される作用因子は、単離βＡサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてあれ、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性を阻害する作用因子である。βＡβＢヘテロ二量体の場合、「アクチビンＡ」を阻害する作用因子は、βＡサブユニットの１つまたは複数の活性を特異的に阻害するが、複合体のβＡ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）の活性は阻害しない作用因子である。この原則はまた、「アクチビンＢ」、「アクチビンＣ」、および「アクチビンＥ」に結合し、かつ／またはこれらを阻害する作用因子にも当てはまる。「アクチビンＡＢ」にアンタゴナイズする本明細書で開示される作用因子は、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性と、βＢサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性とを阻害する作用因子である。
【００８６】
ＢＭＰおよびＧＤＦは、併せて、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの特徴的折り畳みを共有するシステインノットサイトカインのファミリーを形成する［Ｒｉｄｅｒら（２０１０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、４２９巻（１号）：１〜１２頁］。このファミリーは、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２ａ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ１０としても公知）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２としても公知）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１としても公知）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７としても公知）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６）、ＢＭＰ１４（ＧＤＦ５としても公知）、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３（ＶＧＲ２としても公知）、ＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１５およびｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃを含む。骨形成を誘導する能力であって、ＢＭＰにそれらの名称を与えた能力のほか、ＢＭＰ／ＧＤＦは、広範にわたる組織の発達における形態形成活性も提示する。ＢＭＰ／ＧＤＦホモおよびヘテロ二量体は、Ｉ型およびＩＩ型受容体の二量体の組合せと相互作用して、複数の可能なシグナル伝達複合体をもたらし、ＳＭＡＤ転写因子の２つの競合するセットのうちの１つを活性化させる。ＢＭＰ／ＧＤＦは、高度に特異的で、局在化された機能を有する。これらは、ＢＭＰ／ＧＤＦ発現の発達上の制限を含む多数の形で調節されており、高アフィニティでサイトカインに結合するいくつかの特異的ＢＭＰアンタゴニストタンパク質の分泌を介して調節されている。興味深いことに、これらの多数のアンタゴニストは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンドに相似している。
【００８７】
増殖および分化因子８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知であり、骨格筋量の負の調節因子である。ＧＤＦ８は、発生中および成体中の骨格筋において高度に発現する。遺伝子導入マウスにおけるＧＤＦ８欠失変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成を特徴とする［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７年）、３８７巻：８３〜９０頁］。骨格筋量の同様の増加は、ウシおよび、驚くべきことに、ヒト［Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４年）、Ｇｒｏｗｔｈ、３８巻：５０１〜５０７頁；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ、Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．、（１９９４年）３８巻：７５２〜７５７頁；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、（１９９７年）９４巻：１２４５７〜１２４６１頁；Ｋａｍｂａｄｕｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、（１９９７年）７巻：９１０〜９１５頁；およびＳｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２〜８頁］におけるＧＤＦ８の天然に存在する変異において明らかである。研究は、ヒトにおけるＨＩＶ感染に関連する筋肉疲弊には、ＧＤＦ８タンパク質の発現の増加が随伴することも示している［Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、ＰＮＡＳ、（１９９８年）９５巻：１４９３８〜４３頁］。加えて、ＧＤＦ８は、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成を調節することが可能であり、筋芽細胞の増殖を調節し得る［国際特許出願公開第ＷＯ００／４３７８１号］。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合的に結合し、その生物活性を不活性化することができる［Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：６４０７〜６４１５頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：７６４６〜７６５４頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９０年）、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻：３５〜４３頁］。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、それらの生物活性を阻害する他のタンパク質として、フォリスタチン、および、潜在的に、フォリスタチン関連タンパク質が挙げられる［Ｇａｍｅｒら（１９９９年）、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜２３２頁］。
【００８８】
ＢＭＰ１１としても公知のＧＤＦ１１は、マウス発生時に尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓、ならびに後根神経節において発現する分泌タンパク質である［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９９年）、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．、２２巻：２６０〜２６４頁；およびＮａｋａｓｈｉｍａら（１９９９年）、Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．、８０巻：１８５〜１８９頁］。ＧＤＦ１１は、中胚葉組織および神経組織の両方のパターン形成において、固有の役割を果たす［Ｇａｍｅｒら（１９９９年）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜３２頁］。ＧＤＦ１１は、発生中のニワトリの肢における軟骨形成および筋発生の負の調節因子であることが示された［Ｇａｍｅｒら（２００１年）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２２９巻：４０７〜２０頁］。筋内のＧＤＦ１１の発現はまた、ＧＤＦ８と同様の方式での筋肉の増殖の調節におけるその役割も示唆する。加えて、脳内のＧＤＦ１１の発現は、ＧＤＦ１１はまた、神経系の機能に関連する活性を有し得ることを示唆する。興味深いことに、ＧＤＦ１１は、嗅上皮における神経発生を阻害することも見出された［Ｗｕら（２００３年）、Ｎｅｕｒｏｎ、３７巻：１９７〜２０７頁を参照］。よって、ＧＤＦ１１は、筋疾患および神経変性疾患（例えば、筋委縮性側索硬化症）などの疾患を処置するのに、インビトロおよびインビボにおいて適用することができる。
【００８９】
一部には、本明細書に提示されているデータは、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）を使用して、がんを処置することができることを実証する。特に、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体のいずれか別々による処置が、がんモデルにおける腫瘍負荷を減少し、生存時間を増加したことが示された。さらに、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストと組み合わせたＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体を使用して、いずれかの薬剤単独で観察される効果と比較して、抗腫瘍活性を相乗的に増加させ得ることが示された。いずれか特定の機構に束縛されることを望まないが、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の効果が、主としてＡｃｔＲＩＩシグナル伝達アンタゴニスト効果に起因することが予測される。機構に関係なく、本明細書に提示されているデータから、ＡｃｔＲＩＩシグナル伝達アンタゴニストが、がん患者における腫瘍負荷の重症度を低減し、生存を延長することが明らかである。
【００９０】
本明細書で記載されている研究において使用されたがんのための動物モデルは、ヒトにおける有効性を予測するものと考慮され、したがって、本開示は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、単独で、または１つまたは複数の支持療法および／または追加的な活性剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなど、免疫チェックポイント阻害剤）と組み合わせて使用して、がんを処置し、特に、がんの１つまたは複数の合併症の重症度および／または進行を予防または低減する（例えば、腫瘍負荷を低減し、生存時間を増加させる）ための方法を提供する。加えて、データは、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト療法の有効性が、免疫系に依存することを指し示す。したがって、一部には、本開示は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを免疫療法薬として使用して、特に、多種多様ながん（例えば、免疫抑制および／または免疫疲弊に関連するがん）を処置することができるという発見に関する。他の公知の免疫腫瘍学的薬剤と同様に、患者における免疫応答を増強するＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの能力は、がん分野外のより幅広い治療上の意義を有することができる。例えば、免疫増強剤が、免疫抑制および／または免疫疲弊を促進する多種多様な感染性疾患、特に、病原因子の処置において有用となり得ることが提案された。また、このような免疫増強剤は、ワクチン（例えば、感染性疾患およびがんワクチン）の免疫化有効性のブーストにおいて有用となり得る。したがって、本開示は、単独でまたは組み合わせて使用して、任意選択で、１つまたは複数の支持療法および／または追加的な活性剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなど、免疫チェックポイント阻害剤）と組み合わせて、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させる、がんを処置する、感染性疾患（病原体）を処置する、および／または免疫化有効性を増加させることができる様々なＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを提供する。
【００９１】
本明細書で開示される通り、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストという用語は、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡおよびアクチビンＢ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９］を阻害するアンタゴニスト；１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連Ｉ型、ＩＩ型または共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢおよびＡＬＫ４）を阻害するアンタゴニスト；および１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連下流シグナル伝達構成成分（例えば、Ｓｍａｄ２および３など、Ｓｍａｄタンパク質）を阻害するアンタゴニストを含む、ＡｃｔＲＩＩシグナル伝達のアンタゴナイズに使用することができる種々の薬剤を指す。本開示の方法および使用に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、種々の形態、例えば、リガンドトラップ（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体）、抗体アンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびＡｃｔＲＩＩＢ抗体の組合せ）、小分子アンタゴニスト［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡおよびアクチビンＢ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢおよび１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうち１つまたは複数を阻害する小分子］およびヌクレオチドアンタゴニスト［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡおよびアクチビンＢ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢおよび１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうち１つまたは複数を阻害するヌクレオチド配列］を含む。
【００９２】
本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の組成物および方法、ならびに、これらの作製方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲および意味は、それが使用される特定の文脈から明らかである。
【００９３】
「ヘテロマー」または「ヘテロ多量体」という用語は、本明細書で使用する場合、少なくとも第１のポリペプチド鎖と、第２のポリペプチド鎖とを含む複合体であって、第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、第１のポリペプチド鎖と、少なくとも１つのアミノ酸残基だけ異なる複合体を指す。ヘテロマーは、第１および第２のポリペプチド鎖により形成される「ヘテロ二量体」を含む場合もあり、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖に加えて、１つまたは複数のポリペプチド鎖が存在する高次構造を形成する場合もある。ヘテロ多量体の例示的な構造は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびさらなるオリゴマー構造を含む。本明細書では、ヘテロ二量体を、Ｘ：Ｙまたは、これと同義に、Ｘ−Ｙと表示する［表示中、Ｘは、第１のポリペプチド鎖を表示し、Ｙは、第２のポリペプチド鎖を表示する］。本明細書では、高次ヘテロマー構造および高次オリゴマー構造も、対応する形で表示する。
【００９４】
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて「共通する進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、同じ生物種のスーパーファミリーからのタンパク質ならびに異なる生物種からの相同タンパク質を含む。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。しかし、一般的な用法およびこの出願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連していてもしていなくてもよい。
【００９５】
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共有している場合も共有していない場合もある、核酸もしくはアミノ酸配列間の同一性もしくは対応性の程度をいう。
【００９６】
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に照らした「配列同一性パーセント（％）」とは、配列を決定し、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後における、保存的置換は配列同一性の一部と考えない場合の、候補配列内のアミノ酸残基（または核酸）の百分率であって、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列内のアミノ酸残基（または核酸）と同一であるアミノ酸残基（または核酸）の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的とするアラインメントは、当該分野の技術の範囲内にある種々の方式で、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア、ＢＬＡＳＴ−２ソフトウェア、ＡＬＩＧＮソフトウェア、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、配列を決定するのに適切なパラメータであって、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含むパラメータを決定することができる。しかし、本明細書の目的では、アミノ酸（核酸）配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムである、ＡＬＩＧＮ−２を使用して生成する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードは、使用説明書と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここで、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から一般に利用可能であるが、ソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上の使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変化しない。
【００９７】
その全ての文法的形態において、「アゴナイズ」とは、タンパク質および／もしくは遺伝子を活性化させる（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を活性化させるか、もしくは増幅することにより、または不活性タンパク質を活性状態に入るように誘導することにより）か、またはタンパク質および／もしくは遺伝子の活性を増大させる過程を指す。
【００９８】
その全ての文法的形態において、「アンタゴナイズ」とは、タンパク質および／もしくは遺伝子を阻害する（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を阻害するか、もしくは減少させることにより、または活性タンパク質を不活性状態に入るように誘導することにより）か、または
タンパク質および／もしくは遺伝子の活性を減少させる過程を指す。
【００９９】
本明細書で使用する場合、他に記されていなければ、「Ｘに実質的に結合しない」は、薬剤が、「Ｘ」に対し約１０−７、１０−６、１０−５、１０−４超もしくはそれを超える（例えば、ＫＤの決定に使用されるアッセイによって検出可能な結合なし）ＫＤを有する、または「Ｘ」に対し相対的に弱い結合、例えば、約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有することを意味すると意図される。
【０１００】
本明細書および特許請求の範囲を通して数値と関連して使用される場合の「約」および「およそ」という用語は、当業者にとって馴染みがあり、許容可能な、正確さの区間を表す。一般に、このような正確さの区間は、±１０％である。代替的に、特に、生物学的系では、「約」および「およそ」という用語は、ある大きさの程度内、好ましくは、所与の値の≦５倍であり、より好ましくは、≦２倍以内である値を意味し得る。
【０１０１】
本明細書で開示される数値範囲は、範囲を規定する数について包含的である。
【０１０２】
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、その用語が使用される文脈によりそうでないことが明らかに指示されるのでない限り、複数の言及を含む。本明細書では、「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）という用語、ならびに「１つまたは複数の」および「少なくとも１つの」という用語を、互換的に使用することができる。さらに、本明細書で使用される場合の「および／または」とは、２つまたはこれを超える指定された特色または構成要素であって、他の特色または構成要素を伴うかまたは伴わない特色または構成要素の各々を具体的に開示するものとして理解されるものとする。したがって、本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、以下の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）の各々を包摂することを意図する。
【０１０３】
本明細書を通して、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、言明された整数または整数の群の包含を含意するものであり、他のいずれの整数または整数の群の除外も含意するものではないと理解される。
【０１０４】
２．ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびその使用（例えば、免疫応答の増加を必要とする対象における免疫応答の増加およびがんまたは病原体の処置）に関する。本明細書で使用する場合、「ＡｃｔＲＩＩ」という用語は、ＩＩ型アクチビン受容体のファミリーを指す。このファミリーは、アクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）およびアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）を含む。一部の態様では、本開示は、本明細書において概して、「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体」または「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体」と称される、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびその使用（例えば、免疫応答の増加を必要とする対象における免疫応答の増加およびがんまたは病原体の処置）に関する。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡｃｔＲＩＩＢタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＢに対する言及は、現在同定されている形態のうちの任意の１つに対する言及であるものと理解される。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび予測セリン／スレオニンキナーゼ活性を持つ細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。
【０１０６】
用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合体およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを包含する。このような改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例は、本開示を通して提供されるほか、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０１２６２７号、同第ＷＯ２００８／０９７５４１号および同第ＷＯ２０１０／１５１４２６号においても提供されている。本明細書で記載される、全てのＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記で提供される、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のタンパク質配列（配列番号１）の番号付けに基づく。
【０１０７】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のタンパク質配列は、以下の通りである。
【化１】
2019510001.tif 000002
【化２】
2019510001.tif 000003
【０１０８】
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し、潜在的な、内因性Ｎ−連結グリコシル化部位は、二重下線で指し示す。
【０１０９】
プロセシング後の細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである。
【化３】
2019510001.tif 000004
【０１１０】
一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端における「ＳＧＲ・・・」配列により生成することができる。細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。
【化４】
2019510001.tif 000005
【０１１１】
配列番号１の６４位においてアラニン（Ａ６４）を有するＡｃｔＲＩＩＢの形態についてはまた、文献、例えば、Ｈｉｌｄｅｎら（１９９４年）、Ｂｌｏｏｄ、８３巻（８号）：２１６３〜２１７０頁を参照されたい、においても報告されている。Ａ６４置換を有するＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティが比較的低いことが確認された。これに対し、６４位においてアルギニン（Ｒ６４）を有する、同じＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティが、低ｎＭ〜高ｐＭの範囲である。したがって、Ｒ６４を有する配列を、本開示におけるヒトＡｃｔＲＩＩＢのための「野生型」参照配列として使用する。
６４位においてアラニンを有するＡｃｔＲＩＩＢの形態は、以下の通りである。
【化５】
2019510001.tif 000006
【化６】
2019510001.tif 000007
【０１１２】
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
【０１１３】
代替的なＡ６４形態の、プロセシング後の細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである。
【化７】
2019510001.tif 000008
【０１１４】
一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端における「ＳＧＲ・・・」配列により生成することができる。細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。
【化８】
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【０１１５】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列であって、ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のアミノ酸１〜５１３をコードする、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０６．３のヌクレオチド２５〜１５６０を表す核酸配列を、下記（配列番号７）に示す。示される配列は、６４位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。シグナル配列に下線を付す。
【化９】
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【化１０】
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【０１１６】
プロセシング後のヒト細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸配列は、以下（配列番号８）の通りである。示される配列は、６４位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。
【化１１】
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【０１１７】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを、図１に例示する。このアラインメントは、両方の受容体内のアミノ酸残基であって、ＡｃｔＲＩＩリガンドに直接接触すると考えられるアミノ酸残基を指し示す。例えば、複合ＡｃｔＲＩＩ構造は、ＡｃｔＲＩＩＢ−リガンドの結合ポケットが、部分的に、残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８〜Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３〜Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８〜Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４〜Ｆ１０１により規定されることを指し示した。これらの位置では、保存的変異が許容されることが予測される。
【０１１８】
加えて、ＡｃｔＲＩＩＢは、完全に保存された細胞外ドメインの大きな連なりを伴って、脊椎動物間で良好に保存されている。例えば、図２は、多様なＡｃｔＲＩＩＢオーソログと比較してヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの多重配列アラインメントを描示する。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くもまた、高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントから、リガンド結合ドメイン内の鍵となるアミノ酸位置であって、正常なＡｃｔＲＩＩＢ−リガンド結合活性に重要なアミノ酸位置を予測するほか、正常なＡｃｔＲＩＩＢ−リガンド結合活性を著明に変更せずに、置換を許容する可能性が高いアミノ酸位置も予測することが可能である。したがって、本開示の方法に従い有用な活性ヒトＡｃｔＲＩＩＢ改変体ポリペプチドは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢの配列に由来する、対応する位置における１つまたは複数のアミノ酸を含んでもよいし、ヒトまたは他の脊椎動物配列内の残基と類似する残基を含んでもよい。以下の例は、限定的であると意図せずに、活性ＡｃｔＲＩＩＢ改変体を規定するこの手法を例示する。ヒト細胞外ドメイン（配列番号１０３）内のＬ４６は、ＸｅｎｏｐｕｓのＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号１０５）ではバリンであるので、この位置は変更することができ、任意選択で、Ｖ、Ｉ、もしくはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基に変更することができる。ヒト細胞外ドメイン内のＥ５２はＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、この部位がＥ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、ＹおよびおそらくＡなどの極性残基を含む、広範な変化を許容し得ることを示す。．ヒト細胞外ドメイン内のＴ９３はＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、広範な構造バリエーションがこの位置で許容され、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの極性残基が好まれることを示す。ヒト細胞外ドメイン内のＦ１０８はＸｅｎｏｐｕｓではＹであり、したがってＹまたは他の疎水性基、例えばＩ、ＶまたはＬが許容されるはずである。ヒト細胞外ドメイン内のＥ１１１はＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨ，ならびにＱおよびＮを含む荷電残基がこの位置で許容されることを示す。ヒト細胞外ドメイン内のＲ１１２はＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、ＲおよびＨを含む塩基性残基がこの位置で許容されることを示す。ヒト細胞外ドメイン内の１１９位のＡは、比較的保存が不良であり、齧歯動物ではＰとして現れ、ＸｅｎｏｐｕｓではＶとして現れるので、この位置では、本質的に任意のアミノ酸が許容されるはずである。
【０１１９】
さらに、当該分野では、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、特にリガンド結合に関する、構造機能的特徴との関係で特徴付けられている［Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、６８巻（１号）：９７〜１０８頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻（１号）：１８〜２２頁；Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら（２００６年）、ＰＮＡＳ、１０３巻（２０号）：７６４３〜７６４８頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００３年）、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２２巻（７号）：１５５５〜１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号、および同第７，８４２，６６３号］。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献も、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＢ改変体をどのようにして生成するのかについての指針を十分に提供している。
【０１２０】
例えば、３フィンガーの毒素フォールドとして公知の構造モチーフを規定することは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体の受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に配置された保存されたシステイン残基により形成される［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ、６巻：１８〜２２頁；およびＨｉｎｃｋ（２０１２年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。したがって、これらの保存されたシステインの最外殻により画されるようなヒトＡｃｔＲＩＩＢのコアとなるリガンド結合性ドメインは、配列番号１（ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体）の２９〜１０９位に対応する。これらのシステインによって画されるコア配列に隣接する構造的に秩序のより乏しいアミノ酸は、必ずしもリガンド結合性を変更することなく、Ｎ末端で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８残基だけ、かつ／またはＣ末端で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５残基だけ短縮することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端短縮型についての例示的なＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインとして、配列番号２、３、５、および６が挙げられる。
【０１２１】
Ａｔｔｉｓａｎｏらは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失が、受容体のアクチビンに対するアフィニティを低減することを示した。本明細書の配列番号１のアミノ酸２０〜１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質である「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１１９）−Ｆｃ」は、ＧＤＦ１１およびアクチビンへの結合が、プロリンノット領域と、完全膜近傍ドメインとを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−Ｆｃと比べて低減されている（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１２９）−Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されていてもなお、野生型と比べてある程度低減されているが、同様の活性を保持する。
【０１２２】
よって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０および１２９（配列番号１に関する）で終止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て、活性であることが予測されるが、１３４または１３３で終止する構築物は、最も活性であり得る。同様に、残基１２９〜１３４（配列番号１に関する）のいずれかにおける変異も、リガンド結合アフィニティを、大幅に変更することはないと予測される。この裏付けとして、当該分野では、Ｐ１２９およびＰ１３０（配列番号１に関する）の変異は、リガンド結合を、実質的に減少しないことが公知である。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アミノ酸１０９（最終システイン）という前方の位置で終結し得るが、１０９および１１９において、または１０９〜１１９の間（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８または１１９）で終結する形態は、リガンド結合が低減されることが予測される。アミノ酸１１９（配列番号１に関する）は、保存が良好でないので、たやすく変更または切断される。１２８（配列番号１に関する）またはこの後方の位置で終結するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢに基づくＧＤＦトラップは、リガンド結合活性を保持するはずである。配列番号１に関して、１１９および１２７でまたは１１９〜１２７の間（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６または１２７）で終結するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢに基づくＧＤＦトラップは、中程度の結合能を有するであろう。これらの形態のいずれも、臨床状況または実験状況に応じて、使用が所望され得る。
【０１２３】
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端では、アミノ酸２９またはこの前方の位置（配列番号１に関する）で始まるタンパク質は、リガンド結合活性を保持することが予測される。アミノ酸２９は、最初のシステインを表示する。２４位（配列番号１に関する）における、アラニンからアスパラギンへの変異は、リガンド結合に実質的に影響を及ぼさずに、Ｎ結合型グリコシル化配列を導入する［米国特許第７，８４２，６６３号］。これは、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域との間の領域であって、アミノ酸２０〜２９に対応する領域内の変異が、良好に許容されることを確認する。特に、２０、２１、２２、２３および２４位（配列番号１に関する）に始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢに基づくＧＤＦトラップは、一般的なリガンド結合（biding）活性を保持するはずであり、２５、２６、２７、２８および２９位（配列番号１に関する）に始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢに基づくＧＤＦトラップもまた、リガンド結合活性を保持すると予測される。例えば、米国特許第７，８４２，６６３号では、驚くべきことに、２２、２３、２４または２５で始まるＡｃｔＲＩＩＢ構築物は、最も大きな活性を有することが実証されている。
【０１２４】
まとめると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分（例えば、リガンド結合部分）の一般式は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９を含む。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸２０〜２９のいずれか１つ（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のいずれか１つで始まる）に対応する残基で始まり、配列番号１のいずれか１つのアミノ酸１０９〜１３４（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終わる）に対応する位置で終わるＡｃｔＲＩＩＢの部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなり得る。他の例として、配列番号１の２０〜２９（例えば、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、または２９位のいずれか１つ）または２１〜２９（例えば、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、または２９位のいずれか１つ）の位置で始まり、配列番号１の１１９〜１３４（例えば、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、または１３４位のいずれか１つ）、１１９〜１３３（例えば、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、または１３３位のいずれか１つ）、１２９〜１３４（例えば、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、または１３４位のいずれか１つ）、または１２９〜１３３（例えば、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、または１３３位のいずれか１つ）の位置で終わるポリペプチドが挙げられる。他の例として、配列番号１の２０〜２４（例えば、２０位、２１位、２２位、２３位、または２４位のいずれか１つ）、２１〜２４（例えば、２１位、２２位、２３位、または２４位のいずれか１つ）、または２２〜２５（例えば、２２位、２２位、２３位、または２５位のいずれか１つ）の位置で始まり、配列番号１の１０９〜１３４（例えば、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、または１３４位のいずれか１つ）、１１９〜１３４（例えば、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、または１３４位のいずれか１つ）または１２９〜１３４（例えば、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、または１３４位のいずれか１つ）の位置で終わる構築物が挙げられる。上述の範囲内の改変体、特に、配列番号１の対応する部分に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなる改変体も想定される。
【０１２５】
本明細書で記載されている改変は、多様な形で組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ改変体は、リガンド結合ポケット内の、１、２、５、６、７、８、９、１０または１５個を超えない保存的アミノ酸変化と、任意選択で、リガンド結合ポケットの４０、５３、５５、７４、７９および／または８２位における、０、１つまたはこれを超える非保存的変更とを含む。ばらつきが特に良好に許容され得る、結合ポケットの外側の部位は、細胞外ドメイン（上記で言及した）のアミノ末端およびカルボキシ末端と、４２〜４６および６５〜７３位（配列番号１に関する）とを含む。６５位におけるアスパラギンからアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、Ｒ６４バックグラウンドにおけるリガンド結合を減少させるとは思われない［米国特許第７，８４２，６６３号］。この変化はおそらく、バックグラウンドをＡ６４とするときの、Ｎ６５におけるグリコシル化を消失させることからこの領域内の著名な変化は、許容される可能性が高いことが実証される。Ｒ６４Ａ変化は、許容が不良であるが、Ｒ６４Ｋは、許容が良好であるので、６４位には、Ｈなど、別の塩基性残基も、許容され得る［米国特許第７，８４２，６６３号］。その上、当該分野で記載されている変異誘発プログラムの結果は、保存することが有益であることが多いアミノ酸位置がＡｃｔＲＩＩＢに存在することを指し示す。配列番号１に関して、このような位置は、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、特に、トリプトファン）、３７位（酸性、特に、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特に、フェニルアラニンまたはチロシン）を含む。よって、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおいて保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存することが所望され得る他の位置を次に挙げる：全て配列番号１に関する、５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８（極性または荷電、特に、Ｅ、Ｄ、ＲまたはＫ）。
【０１２６】
ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインへのさらなるＮ結合型グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）の付加の許容が良好であることがすでに実証されている（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照）。したがって、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は一般に、例えば、図１に定義されている、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおけるリガンド結合ポケットの外側の位置に導入することができる。非内在性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列の導入に特に適した部位は、アミノ酸２０〜２９、２０〜２４、２２〜２５、１０９〜１３４、１２０〜１３４または１２９〜１３４（配列番号１に関する）を含む。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は、ＡｃｔＲＩＩＢ配列およびＦｃドメインまたは他の融合構成成分の間のリンカーに、ならびに任意選択で、融合構成成分それ自体に導入することもできる。このような部位は、最小の労力で、既存のＳもしくはＴに関して正確な位置にＮを導入することにより、または既存のＮに対応する位置にＳもしくはＴを導入することにより、導入することができる。よって、Ｎ結合型グリコシル化部位を作製するであろう所望される変更を次に示す：Ａ２４Ｎ、Ｒ６４Ｎ、Ｓ６７Ｎ（おそらく、Ｎ６５Ａ変更と組み合わせた）、Ｅ１０５Ｎ、Ｒ１１２Ｎ、Ｇ１２０Ｎ、Ｅ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｎ、Ａ１３２Ｎ、Ｒ１１２ＳおよびＲ１１２Ｔ（配列番号１に関する）。グリコシル化されると予測される任意のＳは、グリコシル化によって提供される保護により、免疫原性部位を作製することなくＴに変更され得る。同様に、グリコシル化されると予測される任意のＴは、Ｓに変更され得る。よって、Ｓ６７ＴおよびＳ４４Ｔ（配列番号１に関する）の変更が想定される。同様に、Ａ２４Ｎ改変体において、Ｓ２６Ｔ変更を使用することができる。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、上述の通り１つまたは複数の追加的な非内在性Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列を有する改変体となることができる。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本開示は、そのフラグメント、機能的な改変体および修飾形態、ならびにその使用（例えば、免疫応答の増加を必要とする患者における免疫応答の増加、およびがんの処置）を含む、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）に関する。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、可溶性である（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］の活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）をアンタゴナイズする。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２０〜２９に対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９のいずれか１つから始まる）、配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４に対応する位置で終結する（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４のいずれか１つで終結する）ＡｃｔＲＩＩＢの部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸（自然発生の酸性アミノ酸ＤおよびＥまたは人工の酸性アミノ酸）である。ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、��２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる。ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸である。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７３、７７、７８、１２８、１３１、１３２および１３３のうちいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７３、７７、７８、１２８、１３１、１３２および１３３のうちいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸である。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む、からなる、またはから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸ではない（すなわち、自然発生の酸性（acid）アミノ酸ＤもしくはＥまたは人工の酸性アミノ酸残基ではない）。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに関する。本明細書で使用する場合、「ＡｃｔＲＩＩＡ」という用語は、任意の種由来のアクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）タンパク質のファミリー、および変異誘発または他の修飾によるこのようなＡｃｔＲＩＩＡタンパク質に由来する改変体を指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＡの参照は、現在同定された形態のいずれか１つの参照であると理解される。ＡｃｔＲＩＩＡファミリーのメンバーは一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成された膜貫通タンパク質である。
【０１２９】
「ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド」という用語は、ＡｃｔＲＩＩＡファミリーメンバーの任意の自然発生のポリペプチド、および有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合体およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。このような改変体ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの例は、本開示を通して、ならびにこれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０１２６２７およびＷＯ２００７／０６２１８８において提供される。本明細書で記載されている全ＡｃｔＲＩＩＡ関連ポリペプチドのアミノ酸のナンバリングは、他に特に表示がなければ、下に示すヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列（配列番号９）のナンバリングに基づく。
【０１３０】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列を次に示す：
【化１２】
2019510001.tif 000013
【化１３】
2019510001.tif 000014
【０１３１】
シグナルペプチドは、一重下線によって指し示され；細胞外ドメインは、太字フォントで指し示され；潜在的内在性Ｎ結合型グリコシル化部位は、二重下線によって指し示される。
【０１３２】
プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド配列を次に示す：
【化１４】
2019510001.tif 000015
【０１３３】
細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線によって指し示される。「テール」が欠失した配列（Δ１５配列）を次に示す：
【化１５】
2019510001.tif 000016
【０１３４】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質をコードする核酸配列を、次のように下に示す（配列番号１２）；Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１６１６．４のヌクレオチド１５９〜１７００。シグナル配列に下線を引く。
【化１６】
2019510001.tif 000017
【化１７】
2019510001.tif 000018
【０１３５】
プロセシングされたヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドをコードする核酸配列を次に示す：
【化１８】
2019510001.tif 000019
【０１３６】
ＡｃｔＲＩＩＡは、脊椎動物の間で十分に保存されており、細胞外ドメインの大きいストレッチが完全に保存されている。例えば、図３は、様々なＡｃｔＲＩＩＡオルソログと比較して、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインの多重配列アライメントを描写する。ＡｃｔＲＩＩＡに結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、これらのアライメントから、正常なＡｃｔＲＩＩＡ−リガンド結合活性に重要なリガンド結合性ドメイン内の鍵となるアミノ酸位置を予測すると共に、正常なＡｃｔＲＩＩＡ−リガンド結合活性を有意に変更することなく、置換に許容がある可能性があるアミノ酸位置を予測することが可能である。したがって、本明細書で開示されている方法に従って有用な活性ヒトＡｃｔＲＩＩＡ改変体ポリペプチドは、対応する位置に、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＡの配列由来の１つまたは複数のアミノ酸を含むことができる、またはヒトもしくは他の脊椎動物配列における残基と同様の残基を含むことができる。
【０１３７】
限定を意味するものではないが、次の例は、活性ＡｃｔＲＩＩＡ改変体を定義する本手法を説明する。図３に説明される通り、ヒト細胞外ドメイン内のＦ１３は、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ（配列番号１０８）、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（配列番号１１１）、Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ（配列番号１１２）、Ｔｙｔｏ  ａｌｂａ（配列番号１１３）およびＭｙｏｔｉｓ  ｄａｖｉｄｉｉ（配列番号１１４）ＡｃｔＲＩＩＡではＹであり、Ｆ、ＷおよびＹを含む芳香族残基がこの位置で許容されることが指し示される。ヒト細胞外ドメイン内のＱ２４は、Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ  ＡｃｔＲＩＩＡではＲであり、Ｄ、Ｒ、Ｋ、ＨおよびＥを含む荷電残基がこの位置で許容されることが指し示される。ヒト細胞外ドメイン内のＳ９５は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓおよびＴｙｔｏ  ａｌｂａ  ＡｃｔＲＩＩＡではＦであり、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙなどの極性残基、およびおそらくＬ、ＩまたはＦなどの疎水性残基を含む多種多様な変化がこの部位で許容されることが指し示される。ヒト細胞外ドメイン内のＥ５２は、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ  ＡｃｔＲＩＩＡではＤであり、ＤおよびＥを含む酸性残基がこの位置で許容されることが指し示される。ヒト細胞外ドメイン内のＰ２９は、比較的保存が不良であり、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ  ＡｃｔＲＩＩＡではＳ、Ｍｙｏｔｉｓ  ｄａｖｉｄｉｉ  ＡｃｔＲＩＩＡではＬとして現れるので、この位置では、本質的に任意のアミノ酸が許容されるはずである。
【０１３８】
さらに、上記で論じた、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、構造／機能的特徴の観点から、特に、リガンド結合に関して、当該分野において特徴付けられた［Attisanoら（１９９２年）Cell  ６８巻（１号）：９７〜１０８頁；Greenwaldら（１９９９年）Nature  Structural  Biology  ６巻（１号）：１８〜２２頁；Allendorphら（２００６年）PNAS  １０３巻（２０号）：７６４３〜７６４８頁；Thompsonら（２００３年）The  EMBO  Journal  ２２巻（７号）：１５５５〜１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号および同第７，８４２，６６３号］。本明細書の教示加えて、これらの参考文献は、１つまたは複数の所望の活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＡ改変体を、どのようにして生成するのかについての指針を、十分に提供している。
【０１３９】
例えば、３フィンガーの毒素フォールドとして公知の構造モチーフを規定することは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、単量体の各受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に配置された、保存的システイン残基により形成される［Greenwaldら（１９９９年）Nat  Struct  Biol  ６巻：１８〜２２頁；およびHinck（２０１２年）FEBS  Lett  ５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。したがって、これらの保存的システインの最外殻により画される、ヒトＡｃｔＲＩＩＡの、コアとなるリガンド結合性ドメインは、配列番号９（ＡｃｔＲＩＩＡ前駆体）の３０〜１１０位に対応する。したがって、このようなシステインが画すコア配列に隣接する構造的に規則正しくないアミノ酸は、必ずしもリガンド結合を変更することなく、Ｎ末端において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９残基、Ｃ末端において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５残基で切断することができる。例示的なＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインの切断型は、配列番号１０および１１を含む。
【０１４０】
したがって、ＡｃｔＲＩＩＡの活性部分（例えば、リガンド結合）の一般式は、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチドである。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、例えば、配列番号９のアミノ酸２１〜３０のいずれか１つに対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つから始まる）、配列番号９のアミノ酸１１０〜１３５のいずれか１つに対応する位置で終結する（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３５のいずれか１つで終結する）ＡｃｔＲＩＩＡの部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなることができる。他の例として、配列番号９の２１〜３０（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つから始まる）、２２〜３０（例えば、アミノ酸２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つから始まる）、２３〜３０（例えば、アミノ酸２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つから始まる）、２４〜３０（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つから始まる）から選択される位置から始まり、配列番号９の１１１〜１３５（例えば、アミノ酸１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終結する）、１１２〜１３５（例えば、アミノ酸１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終結する）、１１３〜１３５（例えば、アミノ酸１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終結する）、１２０〜１３５（例えば、アミノ酸１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終結する）、１３０〜１３５（例えば、アミノ酸１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終結する）、１１１〜１３４（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４のいずれか１つで終結する）、１１１〜１３３（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２または１３３のいずれか１つで終結する）、１１１〜１３２（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１または１３２のいずれか１つで終結する）または１１１〜１３１（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０または１３１のいずれか１つで終結する）から選択される位置で終結する構築物が挙げられる。上述の範囲内の改変体、特に、配列番号９の対応する部分に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなる改変体も想定される。よって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドを含む、から本質的になる、またはからなることができる。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、リガンド結合ポケットに１、２、５、１０または１５個を超えない保存的アミノ酸変化を含む、ポリペプチドを含む。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、本開示は、そのフラグメント、機能的な改変体および修飾形態、ならびにその使用（例えば、免疫応答の増加を必要とする患者における免疫応答の増加、およびがんの処置）を含む少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）に関する。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、可溶性である（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］の（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸２１〜３０に対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つから始まる）、配列番号９のアミノ酸１１０〜１３５のいずれか１つに対応する位置で終結する（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３５のいずれか１つで終結する）ＡｃｔＲＩＩＡの部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸２１〜１３５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、５０、５４および５７のうちいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、からなる、ま��はから本質的になる。
【０１４２】
ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦトラップポリペプチド（「ＧＤＦトラップ」とも称される）に関する。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドよりも１つまたは複数の変更されたリガンド結合活性を有するような、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、「野生型」または無修飾ＡｃｔＲＩＩポリペプチド）の細胞外ドメイン（リガンド結合性ドメインとも称される）に１つまたは複数の変異（例えば、アミノ酸付加、欠失、置換、およびこれらの組合せ）を含む改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）である。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと同様の少なくとも１つの活性を保持する。例えば、好ましいＧＤＦトラップは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合し、その機能を阻害する（例えば、アンタゴナイズする）。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、ＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドの１つまたは複数にさらに結合し、これを阻害する。したがって、本開示は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンドに対する結合特異性が変更したＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。
【０１４３】
説明するために、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣおよび／またはアクチビンＥ）、特に、アクチビンＡなど、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ結合リガンドよりも、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に対する変更されたリガンド結合性ドメインの選択性を増加させる１つまたは複数の変異を選択することができる。任意選択で、変更されたリガンド結合性ドメインは、野生型リガンド結合性ドメインに対する比と比べて少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００またはさらには１０００倍大きい、アクチビン結合に関するＫｄの、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合に関するＫｄに対する比を有する。任意選択で、変更されたリガンド結合性ドメインは、野生型リガンド結合性ドメインと比べて少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００またはさらには１０００倍大きい、アクチビンの阻害に関するＩＣ５０の、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８の阻害に関するＩＣ５０に対する比を有する。任意選択で、変更されたリガンド結合性ドメインは、アクチビンの阻害に関するＩＣ５０よりも少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００またはさらには１０００倍低いＩＣ５０で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８を阻害する。
【０１４４】
ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）に優先的に結合するように設計される。任意選択で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、アクチビンＢにさらに結合することができる。任意選択で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、ＢＭＰ６にさらに結合することができる。任意選択で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、ＢＭＰ１０にさらに結合することができる。任意選択で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、アクチビンＢおよびＢＭＰ６にさらに結合することができる。ある特定の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、例えば、野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと比較して、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡ／Ｂ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）に対し縮小された結合アフィニティを有する。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、アクチビンＡに対し縮小された結合アフィニティを有する。
【０１４５】
ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質のアミノ酸残基（例えば、配列番号１に関してＥ３９、Ｋ５５、Ｙ６０、Ｋ７４、Ｗ７８、Ｌ７９、Ｄ８０およびＦ１０１）は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合ポケットに存在し、例えば、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８を含むそのリガンドへの媒介性結合に役立つ。よって、本開示は、これらのアミノ酸残基に１つまたは複数の変異を含む、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の変更されたリガンド結合性ドメイン（例えば、ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１結合性ドメイン）を含むＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。
【０１４６】
具体例として、ＡｃｔＲＩＩＢのリガンド結合性ドメインの正に荷電したアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ８０）を異なるアミノ酸残基へと変異させて、ＧＤＦ８に優先的に結合するが、アクチビンに結合しないＧＤＦトラップポリペプチドを産生することができる。好ましくは、配列番号１に関するＤ８０残基は、無電荷アミノ酸残基、負のアミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基へと変化させられる。さらに別の具体例として、配列番号１の疎水性残基Ｌ７９を変更させて、変更されたアクチビン−ＧＤＦ１１／ＧＤＦ８結合特性を付与することができる。例えば、Ｌ７９Ｐ置換は、アクチビン結合よりも大きな程度までＧＤＦ１１結合を低減する。対照的に、酸性アミノ酸［アスパラギン酸またはグルタミン酸；Ｌ７９ＤまたはＬ７９Ｅ置換］によるＬ７９の置き換えは、ＧＤＦ１１結合アフィニティを保持しつつ、アクチビンＡ結合アフィニティを大幅に低減する。例示的な実施形態では、本明細書で記載されている方法は、任意選択で１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換、付加または欠失と組み合わせた、配列番号１の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸（例えば、ＤまたはＥ）を含む改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであるＧＤＦトラップポリペプチドを利用する。
【０１４７】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびその使用（例えば、免疫応答の増加を必要とする患者における免疫応答の増加、およびがんまたは病原体の処置）に関する。本明細書で使用する場合、「ＡＬＫ４」という用語は、任意の種由来のアクチビン受容体様キナーゼ−４タンパク質のファミリー、および変異誘発または他の修飾によるこのようなＡＬＫ４タンパク質に由来する改変体を指す。本明細書におけるＡＬＫ４の参照は、現在同定された形態のいずれか１つの参照であると理解される。ＡＬＫ４ファミリーのメンバーは一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成された膜貫通タンパク質である。
【０１４８】
用語「ＡＬＫ４ポリペプチド」は、ＡＬＫ４ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合体、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載される、全てのＡＬＫ４関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記のヒトＡＬＫ４前駆体のタンパク質配列（配列番号１４）の番号付けに基づく。
【０１４９】
ヒトＡＬＫ４前駆体のタンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４２９３）は、以下の通りである。
【化１９】
2019510001.tif 000020
【０１５０】
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
【０１５１】
プロセシング後の細胞外ヒトＡＬＫ４ポリペプチド配列は、以下の通りである。
【化２０】
2019510001.tif 000021
【０１５２】
ＡＬＫ４前駆体タンパク質をコードする核酸配列を、下記（配列番号１６）に示し、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４３０２．４のヌクレオチド７８〜１５９２に対応する。シグナル配列に下線を付し、細胞外ドメインを太字のフォントで指し示す。
【化２１】
2019510001.tif 000022
【化２２】
2019510001.tif 000023
【０１５３】
細胞外ＡＬＫ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の通りである。
【化２３】
2019510001.tif 000024
【０１５４】
ヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームであるアイソフォームＢ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６４７３２．３）を次に示す：
【化２４】
2019510001.tif 000025
細胞外ドメインは、太字フォントで指し示されている。
【０１５５】
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド配列を次に示す：
【化２５】
2019510001.tif 000026
【０１５６】
ＡＬＫ４前駆体タンパク質（アイソフォームＢ）をコードする核酸配列を下に示し（配列番号２０）、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿０２０３２７．３のヌクレオチド１８６〜１５４７に対応する。細胞外ドメインをコードするヌクレオチドは、太字フォントで指し示されている。
【化２６】
2019510001.tif 000027
【化２７】
2019510001.tif 000028
【０１５７】
細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド（アイソフォームＢ）をコードする核酸配列を次に示す：
【化２８】
2019510001.tif 000029
【０１５８】
ＡＬＫ４は、脊椎動物間で、完全に保存された細胞外ドメインの大きな連なりを伴って、良好に保存されている。例えば、図４は、多様なＡＬＫ４オーソログと比較してヒトＡＬＫ４細胞外ドメインの多重配列アラインメントを描示する。ＡＬＫ４に結合するリガンドの多くもまた、高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントからは、リガンド結合性ドメイン内の鍵となるアミノ酸位置であって、通常のＡＬＫ４−リガンドの結合活性に重要なアミノ酸位置を予測することが可能であるほか、通常のＡＬＫ４−リガンドの結合活性を顕著に変更させずに、置換に対して許容性を有する可能性が高いアミノ酸位置を予測することも可能である。したがって、本開示の方法に従い有用な活性ヒトＡＬＫ４改変体ポリペプチドは、別の脊椎動物ＡＬＫ４の配列に由来する、対応する位置における１つまたは複数のアミノ酸を含んでもよいし、ヒトまたは他の脊椎動物配列内の残基と類似する残基を含んでもよい。
【０１５９】
限定を意味するものではないが、次の例は、活性ＡＬＫ４改変体を定義するこの手法を説明する。図４において説明される通り、ヒトＡＬＫ４細胞外ドメイン（配列番号１１５）内のＶ６は、Ｍｕｓ  ｍｕｃｕｌｕｓ  ＡＬＫ４（配列番号１１９）ではイソロイシンであることから、この位置を変更することができ、任意選択で、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＡＬＫ４（配列番号１１８）に観察される通り、Ｌ、ＩもしくはＦなどの別の疎水性残基またはＡなどの非極性残基へと変更することができる。ヒト細胞外ドメイン内のＥ４０は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＡＬＫ４ではＫであり、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙなどの極性残基およびおそらくＡなどの非極性残基を含む多種多様な変化がこの部位で許容されることが指し示される。ヒト細胞外ドメイン内のＳ１５は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＡＬＫ４ではＤであり、幅広い構造改変が、この位置で許容されることが指し示され、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなど、極性残基が好ましい。ヒト細胞外ドメイン内のＥ４０は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＡＬＫ４ではＫであり、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｈを含む荷電残基ならびにＱおよびＮが、この位置で許容されることが指し示される。ヒト細胞外ドメイン内のＲ８０は、Ｃｏｎｄｙｌｕｒａ  ｃｒｉｓｔａｔａ  ＡＬＫ４（配列番号１１６）ではＫであり、Ｒ、ＫおよびＨを含む塩基性残基が、この位置で許容されることが指し示される。ヒト細胞外ドメイン内のＹ７７は、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ＡＬＫ４（配列番号１２０）ではＦであり、Ｆ、ＷおよびＹを含む芳香族残基が、この位置で許容されることが指し示される。ヒト細胞外ドメイン内のＰ９３は、比較的保存が不良であり、Ｅｒｉｎａｃｅｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  ＡＬＫ４（配列番号１１７）ではＳとして、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＡＬＫ４ではＮとして現れるので、この位置では、本質的に任意のアミノ酸が許容されるはずである。
【０１６０】
さらに、当該分野では、ＡＬＫ４タンパク質は、特にリガンド結合に関する、構造機能的特徴との関係で特徴付けられている［例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎら（２００３年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７８巻（２３号）：２１１２９〜２１１３５頁；Ｒｏｍａｎｏら（２０１２年）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｏｄｅｌ、１８巻（８号）：３６１７〜３６２５頁；およびＣａｌｖａｎｅｓｅら（２００９年）、１５巻（３号）：１７５〜１８３頁］。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献も、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡＬＫ４改変体をどのようにして生成するのかについての指針を十分に提供している。
【０１６１】
例えば、３フィンガーの毒素フォールドとして公知の構造モチーフを規定することは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、単量体の各受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に配置された、保存的システイン残基によって形成される［Greenwaldら（１９９９年）Nat  Struct  Biol  ６巻：１８〜２２頁；およびHinck（２０１２年）FEBS  Lett  ５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。したがって、これらの保存的システインの最外殻により画される、ヒトＡＬＫ４の、コアとなるリガンド結合性ドメインは、配列番号１４（ＡＬＫ４前駆体）の３４〜１０１位に対応する。このようなシステインが画すコア配列に隣接する構造的に規則正しくないアミノ酸は、必ずしもリガンド結合を変更することなく、Ｎ末端において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３残基、および／またはＣ末端において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５残基で切断することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端切断のための例示的なＡＬＫ４細胞外ドメインは、配列番号１５および１９を含む。
【０１６２】
したがって、ＡＬＫ４の活性部分（例えば、リガンド結合部分）の一般式は、配列番号１４に関するアミノ酸３４〜１０１を含む。したがって、ＡＬＫ４ポリペプチドは、例えば、配列番号１４のアミノ酸２４〜３４のいずれか１つ（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれか１つで始まる）に対応する残基で始まり、配列番号１４の任意の１つのアミノ酸１０１〜１２６（例えば、アミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６のいずれか１つで終わる）に対応する位置で終わるＡＬＫ４の部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、から本質的になってもよいし、からなってもよい。他の例として、配列番号１４の２４〜３４（例えば、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、または３４位のいずれか１つ）、２５〜３４（例えば、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、または３４位のいずれか１つ）、または２６〜３４（例えば、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、または３４位のいずれか１つ）の位置で始まり、配列番号１４の１０１〜１２６（例えば、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、または１２６位のいずれか１つ）、１０２〜１２６（例えば、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、または１２６位のいずれか１つ）、１０１〜１２５（例えば、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、または１２５位のいずれか１つ）、１０１〜１２４（例えば、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、または１２４位のいずれか１つ）、１０１〜１２１（例えば、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、または１２１位のいずれか１つ）、１１１〜１２６（例えば、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、または１２６位のいずれか１つ）、１１１〜１２５（例えば、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、または１２５位のいずれか１つ）、１１１〜１２４（例えば、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、または１２４位のいずれか１つ）、１２１〜１２６（例えば、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、または１２６位のいずれか１つ）、１２１〜１２５（例えば、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、または１２５位のいずれか１つ）、１２１〜１２４（例えば、１２１位、１２２位、１２３位、または１２４位のいずれか１つ）、または１２４〜１２６（例えば、１２４位、１２５位、または１２６位のいずれか１つ）の位置で終わる構築物が挙げられる。これらの範囲内の改変体、特に配列番号１４の対応する部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するもの、もまた企図される。
【０１６３】
本明細書に記載のバリエーションは、様々な形で組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４改変体は、１、２、５、６、７、８、９、１０または１５以下の保存的アミノ酸変化をリガンド結合ポケットに含む。結合ポケット外の部位（変動が特によく許容され得る）は細胞外ドメインのアミノおよびカルボキシ末端を含む（上記）。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本開示は、そのフラグメント、機能的な改変体および修飾形態、ならびにその使用（例えば、免疫応答の増加を必要とする患者における免疫応答の増加、およびがんの処置）を含む、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体であるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）に関する。好ましくは、ＡＬＫ４ポリペプチドは、可溶性である（例えば、ＡＬＫ４の細胞外ドメイン）。一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］の（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、配列番号１４に関するアミノ酸３４〜１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、配列番号１４、１５、１８、１９、７３、７４、７６、７７、７９および８０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、配列番号１４、１５、１８、１９、７４、７６、７９、８０、１４３および１４５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドからなるまたはから本質的になる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。
【０１６５】
ある特定の態様では、本開示は、その使用（例えば、免疫応答の増加を必要とする患者における免疫応答の増加、およびがんの処置）を含む、本明細書において概して「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体」または「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体」と称される、１つまたは複数のＡＬＫ４受容体ポリペプチド（例えば、配列番号１４、１５、１８、１９、７４、７６、７９、８０、１４３および１４５ならびにこれらの改変体）および１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢ受容体ポリペプチド（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７１、７３、７７、７８、１３１、１３２、１３３、１３９、１４１およびこれらの改変体）を含むヘテロ多量体複合体に関する。好ましくは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、可溶性である［例えば、ヘテロ多量体複合体は、ＡＬＫ４受容体の可溶性部分（ドメイン）およびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の可溶性部分（ドメイン）を含む］。一般に、ＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインは、このような受容体の可溶性部分に対応する。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＡＬＫ４受容体の細胞外ドメインおよびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］の（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４、１５、１８、１９、７４、７６、７７、７９、８０、１４３および１４５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、またはからなる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体は、配列番号１４のアミノ酸２４〜３４、２５〜３４または２６〜３４のいずれか１つに対応する残基から始まり、配列番号１４の１０１〜１２６、１０２〜１２６、１０１〜１２５、１０１〜１２４、１０１〜１２１、１１１〜１２６、１１１〜１２５、１１１〜１２４、１２１〜１２６、１２１〜１２５、１２１〜１２４または１２４〜１２６由来の位置で終結するＡＬＫ４の部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％��一である配列を含む、から本質的になる、からなる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４に関するアミノ酸３４〜１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、からなる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１、２、３、４、５、６、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７１、７３、７７、７８、１３１、１３２、１３３、１３９、１４１のうちいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、からなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体は、配列番号１のアミノ酸２０〜２９、２０〜２４、２１〜２４、２２〜２５または２１〜２９のいずれか１つに対応する残基から始まり、１０９〜１３４、１１９〜１３４、１１９〜１３３、１２９〜１３４または１２９〜１３３由来の位置で終結するＡｃｔＲＩＩＢの部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、からなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、からなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、からなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体は、配列番号１のＬ７９に対応する位置が酸性アミノ酸ではない（すなわち、自然発生のＤもしくはＥアミノ酸残基または人工の酸性アミノ酸残基ではない）少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびさらにより高次のオリゴマー構造を含む。例えば、図２１〜図２３を参照されたい。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、��ＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である。
【０１６６】
一部の実施形態では、本開示は、治療効率または安定性（例えば、保管寿命およびｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質分解に対する抵抗性）を増強することなどを目的として、ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの構造を修飾することにより、機能的な改変体の作製することを想定する。改変体は、アミノ酸置換、欠失、付加またはこれらの組合せによって産生することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンによる、アスパラギン酸のグルタミン酸による、スレオニンのセリンによる単離された置き換え、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸による同様の置き換え（例えば、保存的変異）に、その結果得られる分子の生物活性に主要な効果がないことを予測するのは妥当である。保存的置き換えは、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置き換えである。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化が、機能的なホモログをもたらすか否かは、野生型ポリペプチドと同様の様式で、細胞における応答を産生する、または例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙを含む１つもしくは複数のリガンドに結合する、改変体ポリペプチドの能力を評価することにより容易に決定することができる。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更することができるような、ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの特異的な変異を想定する。このような変異は、Ｏ結合型またはＮ結合型グリコシル化部位など、１つまたは複数のグリコシル化部位を導入するまたは消失させることができるように選択することができる。アスパラギン結合型グリコシル化認識部位は一般に、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列である、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（式中、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含む。変更は、ポリペプチドの配列への１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加またはこれによる置換（Ｏ結合型グリコシル化部位のため）によって為すこともできる。グリコシル化認識部位の１番目または３番目のアミノ酸位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換または欠失（および／または２番目の位置におけるアミノ酸欠失）は、修飾されたトリペプチド配列における非グリコシル化をもたらす。ポリペプチドにおける炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素によるカップリングによる。使用されるカップリング機序に応じて、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）システインの遊離スルフヒドリル基など、遊離スルフヒドリル基；（ｄ）セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基など、遊離ヒドロキシル基；（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンの芳香族残基など、芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に、糖（複数可）を接合することができる。ポリペプチドに存在する１つまたは複数の炭水化物部分の除去は、化学的におよび／または酵素により達せられることができる。化学的脱グリコシルは、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または均等な化合物へのポリペプチドの曝露が関与し得る。この処置は、アミノ酸配列をインタクトに保ちながら、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除いた大部分または全ての糖の切断をもたらす。ポリペプチドにおける炭水化物部分の酵素による切断は、Thotakuraら［Meth.  Enzymol.（１９８７年）１３８巻：３５０頁］によって記載されている通り、種々のエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。哺乳動物、酵母、昆虫および植物細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るため、ポリペプチドの配列は、使用される発現系の種類に応じて適宜調整することができる。一般に、ヒトにおける使用のための本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびヘテロ多量体は、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞系など、適したグリコシル化をもたらす哺乳動物細胞系において発現させることができるが、他の哺乳動物発現細胞系も同様に、有用であることが予測される。
【０１６８】
本開示は、変異体、特に、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドならびに切断型変異体のコンビナトリアル変異体のセットを生成する方法をさらに想定する。コンビナトリアル変異体のプールは、機能的に活性である（例えば、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合）ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩ配列の同定に特に有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、変更された薬物動態または変更されたリガンド結合など、変更された特性を有するポリペプチド改変体を生成することとなり得る。種々のスクリーニングアッセイを下に示し、このようなアッセイを使用して、改変体を評価することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体改変体は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）に結合する、ＴＧＦβスーパーファミリー受容体へのＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの結合を予防する、および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに起因するシグナル伝達に干渉する能力に関してスクリーニングすることができる。
【０１６９】
ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の活性は、細胞に基づくアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏで試験することもできる。例えば、がん細胞におけるがん成長に関与する遺伝子の発現におけるＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の効果を評価することができる。これは、必要に応じて、１つまたは複数の組換えＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドタンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）の存在下で行うことができ、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体（heteromultimes）および任意選択でＴＧＦβスーパーファミリーリガンドを産生することができるように、細胞をトランスフェクトすることができる。同様に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体ヘテロ多量体をマウスまたは他の動物に投与することができ、当該分野で認識されている方法を使用して、筋肉形成および強度など、１つまたは複数の測定値を評価することができる。同様に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドもしくはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体またはその改変体の活性は、例えば、本明細書で記載されているアッセイおよび当該分野の共通知識のアッセイによって、がん細胞において、このような細胞の成長におけるいずれかの効果に関して試験することができる。ＳＭＡＤ応答性レポーター遺伝子は、このような細胞系において使用して、下流シグナル伝達における効果をモニタリングすることができる。
【０１７０】
参照ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と比べて増加した選択性または全般的に増加した効力を有するコンビナトリアル由来改変体を生成することができる。このような改変体は、組換えＤＮＡ構築物から発現される場合、遺伝子療法プロトコルにおいて使用することができる。同様に、変異誘発は、対応する無修飾ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体とは劇的に異なる細胞内半減期を有する改変体を生じることができる。例えば、変更されたタンパク質は、無修飾ポリペプチドのタンパク質分解または破壊もしくはそうでなければ不活性化をもたらす他の細胞過程に対する安定性をより高く、または安定性をより低くすることができる。このような改変体およびこれをコードする遺伝子を利用して、ポリペプチドの半減期をモジュレートすることにより、ポリペプチド複合体レベルを変更することができる。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的効果を生じることができ、誘導性発現系の一部の場合、細胞内における組換えポリペプチド複合体レベルのより厳密な制御を可能にすることができる。Ｆｃ融合タンパク質において、変異を、リンカー（あるとすれば）および／またはＦｃ部分に為して、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の半減期を変更することができる。
【０１７１】
コンビナトリアルライブラリーは、潜在的ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩ配列の少なくとも部分をそれぞれ含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーとして産生することができる。例えば、潜在的ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩコードヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、より大きい融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイのための）のセットとして発現できるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、遺伝子配列へと酵素によりライゲーションすることができる。
【０１７２】
潜在的な相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成し得る、多くの方式が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動式ＤＮＡ合成器で実行することができ、次いで、合成遺伝子は、発現に適切なベクターにライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である［Ｎａｒａｎｇ，  ＳＡ（１９８３年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９巻：３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１年）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ．  ３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２７３〜２８９頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３巻：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８巻：１０５６頁；Ｉｋｅら（１９８３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１１巻：４７７頁］。このような技法は、他のタンパク質の指向進化で利用されている［Ｓｃｏｔｔら、（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：３８６〜３９０頁；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９巻：２４２９〜２４３３頁；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：４０４〜４０６頁；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８７巻：６３７８〜６３８２頁のほか、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、および同第５，０９６，８１５号］。
【０１７３】
あるいは、他の形態の変異誘発を利用して、コンビナトリアルライブラリーを生成することができる。例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発［Rufら（１９９４年）Biochemistry  ３３巻：１５６５〜１５７２頁；Wangら（１９９４年）J.  Biol.  Chem.２６９巻：３０９５〜３０９９頁；Balintら（１９９３年）Gene  １３７巻：１０９〜１１８頁；Grodbergら（１９９３年）Eur.  J.  Biochem.２１８巻：５９７〜６０１頁；Nagashimaら（１９９３年）J.  Biol.  Chem.２６８巻：２８８８〜２８９２頁；Lowmanら（１９９１年）Biochemistry  ３０巻：１０８３２〜１０８３８頁；およびCunninghamら（１９８９年）Science  ２４４巻：１０８１〜１０８５頁］を使用したスクリーニングによって、リンカースキャニング変異誘発［Gustinら（１９９３年）Virology  １９３巻：６５３〜６６０頁；およびBrownら（１９９２年）Mol.  Cell  Biol.１２巻：２６４４〜２６５２頁；McKnightら（１９８２年）Science  ２３２巻：３１６頁］によって、飽和変異誘発［Meyersら（１９８６年）Science  ２３２巻：６１３頁］によって；ＰＣＲ変異誘発［Leungら（１９８９年）Method  Cell  Mol  Biol  １巻：１１〜１９頁］によって；または化学的変異誘発［Millerら（１９９２年）A  Short  Course  in  Bacterial  Genetics、CSHL  Press、Cold  Spring  Harbor、NY；およびGreenerら（１９９４年）Strategies  in  Mol  Biol  ７巻：３２〜３４頁］を含むランダム変異誘発によってライブラリーから生成および単離することができる。特にコンビナトリアル状況におけるリンカースキャニング変異誘発は、トランケート（生物活性）形態のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドを同定するための魅力的な方法である。
【０１７４】
点変異および切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、また、そのことについては、ある特定の特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範囲の技法が当該分野で公知である。このような技法は一般に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体のコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応可能となるであろう。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用されている技法は典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングする工程と、その結果得られるベクターライブラリーにより適切な細胞を形質転換する工程と、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの相対的に容易な単離を促通する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させる工程とを含む。好ましいアッセイは、ＴＧＦ−ベータリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）結合アッセイおよび／またはＴＧＦ−ベータリガンド媒介性細胞シグナル伝達アッセイを含む。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドに自然に存在するいずれかに加えて、翻訳後修飾をさらに含むことができる。このような修飾として、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ポリエチレングリコール、脂質、多糖または単糖およびリン酸塩など、非アミノ酸エレメントを含むことができる。ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の機能性におけるこのような非アミノ酸エレメントの効果は、他のヘテロ多量体複合体改変体に関して本明細書で記載されている通り試験することができる。本開示のポリペプチドが、細胞において新生形態のポリペプチドを切断することにより産生される場合、翻訳後プロセシングがタンパク質の正確なフォールディングおよび／または機能に重要となることもできる。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）は、このような翻訳後活性に特異的な細胞の仕組みおよび特徴的機構を有し、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを確実にするように選択することができる。
【０１７６】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）またはＡＬＫ４ポリペプチドの少なくとも部分（ドメイン）および１つまたは複数の異種部分（ドメイン）を含む融合タンパク質である。このような融合ドメインの周知の例として、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望の特性を付与することができるように選択することができる。例えば、一部の融合ドメインは、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製の目的のため、グルタチオン、アミラーゼおよびニッケルまたはコバルトコンジュゲート樹脂など、アフィニティクロマトグラフィーのための関連するマトリックスが使用される。このようなマトリックスの多くは、（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用なＰｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）など、「キット」形態で利用できる。別の例として、融合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの検出を促通することができるように選択することができる。このような検出ドメインの例として、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）と共に、通常、特異的抗体を利用できる短いペプチド配列である、「エピトープタグ」が挙げられる。特異的モノクローナル抗体を容易に利用できる周知のエピトープタグは、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグを含む。一部の事例では、融合ドメインは、関連するプロテアーゼが、融合タンパク質を部分的に消化し、これにより、そこから組換えタンパク質を遊離させることを可能にする、第Ｘａ因子またはトロンビンに対応する部位など、プロテアーゼ切断部位を有する。続いて、その後のクロマトグラフィー分離によって、融合ドメインから遊離されたタンパク質を単離することができる。選択することができる他の種類の融合ドメインは、例えば、免疫グロブリン由来の定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）を含む、多量体化（例えば、二量体形成、四量体形成）ドメインおよび機能ドメイン（追加的な生物学的機能を付与する）を含む。本明細書で記載されている通り、一部の実施形態では、好ましい多量体化ドメインは、非対称的ペア形成を促進して、ヘテロ多量体構造（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）を形成する、修飾されたＦｃドメインである。
【０１７７】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、ポリペプチドを「安定化」することができる１つまたは複数の修飾を含有する。「安定化」とは、破壊減少、腎臓によるクリアランス減少または薬剤の他の薬物動態効果によるものか否かに関係なく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期、血清半減期を増加させることを意味する。例えば、このような修飾は、ポリペプチドの保管寿命を増強する、ポリペプチドの循環半減期を増強する、および／またはポリペプチドのタンパク質分解を低減する。このような安定化修飾として、融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＡＬＫ４ポリペプチドドメインおよびスタビライザードメインを含む融合タンパク質を含む）、グリコシル化部位の修飾（例えば、本開示のポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む）および炭水化物部分の修飾（例えば、本開示のポリペプチドからの炭水化物部分の除去を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で使用する場合、「スタビライザードメイン」という用語は、融合タンパク質の場合のような融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を指すだけではなく、ポリエチレングリコールなど、炭水化物部分または非タンパク質性部分など、非タンパク質性修飾も含む。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、ポリペプチドを安定化する異種ドメイン（「スタビライザー」ドメイン）、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドの安定性を増加させる異種ドメインと融合される。免疫グロブリンの定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）との融合体は、広範囲のタンパク質に所望される薬物動態特性を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合体は、所望される安定化特性を付与することができる。
【０１７８】
一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、Ｆｃ融合タンパク質である。ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）に使用することができるネイティブアミノ酸配列の例を下に示す（配列番号２２）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、自然発生の改変体を有する位置を指し示す。一部には、本開示は、配列番号２２に対し７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおける自然発生の改変体は、配列番号２２（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７を参照）で使用されるナンバリング方式に従ったＥ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌを含むであろう。
【化２９】
2019510001.tif 000030
【０１７９】
任意選択で、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２およびＡｓｎ−４３４などの残基に１つまたは複数の変異を有する。ある特定の事例では、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を有する変異体ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比べて、Ｆｃγ受容体への結合能が低減される。他の事例では、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比べて、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）への結合能が増加する。
【０１８０】
ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）に使用することができるネイティブアミノ酸配列の例を下に示す（配列番号２３）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、二重下線は、配列にデータベース矛盾が存在する位置を指し示す（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従う）。一部には、本開示は、配列番号２３に対し７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなるポリペプチドを提供する。
【化３０】
2019510001.tif 000031
【化３１】
2019510001.tif 000032
【０１８１】
ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）に使用することができるアミノ酸配列の２つの例を下に示す。Ｇ３Ｆｃにおけるヒンジ領域は、他のＦｃ鎖におけるものの最大４倍の長さとなることができ、同様の１７残基セグメントに先行される３つの同一１５残基セグメントを含有する。下に示す第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号２４）は、単一の１５残基セグメントからなる短いヒンジ領域を含有する一方、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号２５）は、全長ヒンジ領域を含有する。各事例では、点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従った自然発生の改変体を有する位置を指し示す。一部には、本開示は、配列番号２４または２５に対し７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなるポリペプチドを提供する。
【化３２】
2019510001.tif 000033
【０１８２】
Ｇ３Ｆｃ（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８６０を参照）における自然発生の改変体は、配列番号２４で使用されるナンバリング方式へと変換された場合のＥ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本開示は、これらの改変の１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。加えて、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジの長さによって特徴付けられる構造多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５９を参照］。特に、改変体ＷＩＳは、Ｖ領域の大部分およびＣＨ１領域の全体を欠いている。これは、ヒンジ領域に正常に存在する１１個に加えて、７位に余分な鎖間ジスルフィド結合を有する。改変体ＺＵＣは、Ｖ領域の大部分、ＣＨ１領域の全体およびヒンジの一部を欠く。改変体ＯＭＭは、アレル型または別のガンマ鎖サブクラスを表すことができる。本開示は、これらの改変体の１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む追加的な融合タンパク質を提供する。
【０１８３】
ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）に使用することができるネイティブアミノ酸配列の例を下に示す（配列番号２６）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示す。一部には、本開示は、配列番号２６に対し７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、から本質的になるまたはからなるポリペプチドを提供する。
【化３３】
2019510001.tif 000034
【０１８４】
Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号２２）に関してＦｃドメインにおける種々の操作された変異が本明細書に提示されており、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃにおける類似の変異は、図１８におけるＧ１Ｆｃとそれらとのアライメントに由来し得る。不等なヒンジの長さにより、アイソタイプアライメント（図１８）に基づく類似のＦｃ位置は、配列番号２２、２３、２４、２５および２６において異なるアミノ酸番号を保有する。ナンバリングが、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに見られるＩｇＧ１重鎖定常ドメイン全体（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）を包摂する場合、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる免疫グロブリン配列（例えば、配列番号２２、２３、２４、２５および２６）における所与のアミノ酸位置が、同じ位置とは異なる番号によって同定されるであろうと察知することもできる。例えば、ヒトＧ１Ｆｃ配列（配列番号２２）、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７）およびヒトＩｇＧ１重鎖における選択されたＣＨ３位置の間の対応を次に示す。
【表１−１】
2019510001.tif 000035
【表１−２】
2019510001.tif 000036
【０１８５】
ある特定の態様では、本明細書に開示されているポリペプチドは、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと共有結合または非共有結合により会合した少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む、タンパク質複合体を形成することができる。好ましくは、本明細書に開示されているポリペプチドは、ヘテロ二量体複合体を形成するが、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびさらなるオリゴマー構造などが挙げられるがこれらに限定されない、より高次のヘテロ多量体複合体（ヘテロ多量体）も含まれる（例えば、図２１〜図２３を参照）。一部の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つの多量体化ドメインを含む。本明細書で開示される通り、「多量体化ドメイン」という用語は、少なくとも第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドの間の共有結合または非共有結合相互作用を促進する、あるアミノ酸または一連のアミノ酸を指す。本明細書に開示されているポリペプチドは、共有結合または非共有結合により、多量体化ドメインに連接することができる。好ましくは、多量体化ドメインは、第１のポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチド）および第２のポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の間の相互作用を促進して、ヘテロ多量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進し、任意選択で、ホモ多量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を邪魔するか、またはそうでなければ忌避し、これにより、所望のヘテロ多量体（例えば、図２２を参照）の収量を増加させる。
【０１８６】
当該分野で公知の多くの方法を使用して、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を生成することができる。例えば、天然には生じないジスルフィド結合は、フリーのチオールが第２のポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）上の別のフリーのチオール含有残基と相互作用して、ジスルフィド結合が第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドとの間で形成されるように、第１のポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチド）上で、天然に生じるアミノ酸をシステインなどのフリーのチオール含有残基で置きかえることにより構築することができる。ヘテロ多量体の形成を促進する相互作用の追加の例は、Ｋｊａｅｒｇａａｒｄら、ＷＯ２００７１４７９０１などに記載されているイオン性相互作用；Ｋａｎｎａｎら、Ｕ．Ｓ．８，５９２，５６２などに記載されている静電ステアリング効果；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｕ．Ｓ．２０１２０３０２７３７などに記載されているコイルドコイル相互作用；ＰａｃｋおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、（１９９２年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻：１５７９〜１５８４頁などに記載されているロイシンジッパー；およびＰａｃｋら、（１９９３年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１巻：１２７１〜１２７７頁などに記載されているヘリックスターンヘリックスモチーフを含むが、これらに限定されない。多様なセグメントの連結は、例えば、化学的架橋、ペプチドリンカー、ジスルフィド架橋などによる共有結合、またはアビジン−ビオチンなどによるアフィニティ相互作用、またはロイシンジッパー技術を介して得ることができる。
【０１８７】
ある特定の態様では、多量体化ドメインは、相互作用ペアの１つの構成成分を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示のポリペプチドは、第２のポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に会合した第１のポリペプチドを含むタンパク質複合体を形成することができ、ここで、第１のポリペプチドは、ＡＬＫ４ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第２のメンバーのアミノ酸配列を含む。相互作用ペアは、相互作用して、複合体、特にヘテロ二量体の複合体を形成する任意の２つのポリペプチド配列であり得るが、実効的な実施形態はホモ二量体の複合体を形成することができる相互作用ペアもまた利用し得る。相互作用ペアの１つのメンバーは、例えば、配列番号２、３、５、６、１５、および１９のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド配列を含む本明細書に記載されるようなＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに融合されてもよい。血清半減期の延長などの特性／活性の改善を付与するように相互作用ペアを選択することもでき、特性／活性の改善をもたらすように別の部分をその上に結合させるアダプターとして作用するように相互作用ペアを選択することもできる。例えば、ポリエチレングリコール部分を、相互作用ペアの構成要素の一方または両方へと結合させて、血清半減期の改善などの特性／活性の改善をもたらすことができる。
【０１８８】
相互作用ペアの第１および第２のメンバーは非対称ペアであってもよく、これは、ペアのメンバーが、自己会合よりも優先的に互いに会合することを意味する。したがって、非対称相互作用ペアの第１および第２のメンバーは会合して、ヘテロ二量体の複合体を形成することができる（例えば、図２２を参照）。代替的に、相互作用ペア非誘導型であってもよく、これは、アのメンバーが、実質的な優先性なく互いに会合することも自己会合することもでき、そのため、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味する。したがって、非誘導相互作用ペアの第１および第２のメンバーは会合して、ホモ二量体複合体またはヘテロ二量体の複合体を形成してもよい。任意選択で、相互作用ペアの第１のメンバー（例えば、非対称ペアまたは非誘導相互作用ペア）は、共有結合的に相互作用ペアの第２のメンバーに会合する。任意選択で、相互作用ペアの第１のメンバー（例えば、非対称ペアまたは非誘導相互作用ペア）は、非有結合的に相互作用ペアの第２のメンバーに会合する。
【０１８９】
具体例として、本開示は、ヘテロ多量体形成を促進するように修飾された、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４に由来するＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインなど、免疫グロブリンの定常ドメインを含むポリペプチドに融合されたＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢを含む融合タンパク質を提供する。単一の細胞系からの非対称免疫グロブリンに基づくタンパク質の大規模産生において生じる問題は、「鎖会合課題」として公知である。二特異性抗体の産生において顕著に直面する通り、鎖会合課題は、単一の細胞系において異なる重鎖および／または軽鎖が産生される場合に、固有に生じる複数の組合せの間から所望の多重鎖タンパク質を効率的に産生するという難題に関係する［Kleinら（２０１２年）mAbs  ４巻：６５３〜６６３頁］。同じ細胞において２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖が産生される場合、この問題は最も急を要し、この事例では、典型的には１通りのみが望まれる場合に、総計１６通りの可能な鎖の組合せ（これらのうちいくつかは同一であるが）が存在する。にもかかわらず、同じ原理は、２つの異なる（非対称）重鎖のみを組み込む所望の多重鎖融合タンパク質の収量縮小を説明する。
【０１９０】
単一細胞株においてＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望のペア形成を増加させて、許容される収量で好ましい非対称融合タンパク質を産生する様々な方法が、当該分野で公知である［Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ  ４巻：６５３〜６６３頁；およびＳｐｉｅｓｓら（２０１５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２Ａ）：９５−１０６］。Ｆｃ含有鎖の所望のペア形成を得るための方法として、電荷に基づくペア形成（静電ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ））、「ノブ・ホール型（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」立体ペア形成およびＳＥＥＤｂｏｄｙペア形成およびロイシンジッパーベースのペア形成が挙げられるがこれらに限定されない［Ｒｉｄｇｗａｙら（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９巻：６１７〜６２１頁；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（１９９８年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６巻：６７７〜６８１頁；Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２３巻：１９５〜２０２頁；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら（２０１０）；２８５：１９６３７−１９６４６；Ｗｒａｎｉｋら（２０１２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７：４３３３１−４３３３９；ＵＳ５９３２４４８；ＷＯ１９９３／０１１１６２；ＷＯ２００９／０８９００４およびＷＯ２０１１／０３４６０５］。本明細書において記載されるように、これらの方法を使用して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体複合体を生成することができる。例えば、図２３を参照のこと。
【０１９１】
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびこのようなヘテロ多量体を作製する方法は、以前に開示されている。例えば、その教示全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／１６４４９７を参照されたい。
【０１９２】
融合タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質）の異なるエレメントを、所望の機能性と一貫した任意の様式で配列することができることが理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインまたはＡＬＫ４ポリペプチドドメインは、異種ドメインに対しＣ末端に設置することができる、あるいは、異種ドメインは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインまたはＡＬＫ４ポリペプチドドメインに対しＣ末端に設置することができる。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインまたはＡＬＫ４ポリペプチドドメインおよび異種ドメインは、融合タンパク質において隣接している必要はなく、追加的なドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインに対しＣもしくはＮ末端にまたはドメイン間に含まれていてよい。
【０１９３】
例えば、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）受容体融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃに表記されているアミノ酸配列を含むことができる。Ｂ部分は、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）ポリペプチドドメインに対応する。ＡおよびＣ部分は独立して０、１つまたは２つ以上のアミノ酸となることができ、ＡおよびＣ部分の両方は、存在する場合、Ｂにとって異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に接合することができる。リンカーは、グリシン（例えば、２〜１０、２〜５、２〜４、２〜３個のグリシン残基）またはグリシンおよびプロリン残基リッチとなることができ、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの単一の配列、またはスレオニン／セリンおよび／またはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号２７）、ＧＧＧＧ（配列番号２８）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＳＧＧＧＧ（配列番号３０）、ＴＧＧＧ（配列番号３１）、ＳＧＧＧ（配列番号３２）またはＧＧＧＧＳ（配列番号３３）シングレットまたは反復を含有することができる。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃ（式中、Ａは、リーダー（シグナル）配列であり、Ｂは、ＡｃｔＲＩＩ（ＡＬＫ４）ポリペプチドドメインからなり、Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、取り込み／投与、組織局在もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製のうち１つまたは複数を増強するポリペプチド部分である）に表記されているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ（ＡＬＫ４）融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃ（式中、Ａは、ＴＰＡリーダー配列であり、Ｂは、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）受容体ポリペプチドドメインからなり、Ｃは、免疫グロブリンＦｃドメインである）に表記されているアミノ酸配列を含む。好ましい融合タンパク質は、配列番号５０、５４、５７、５８、６０、６３、６４、６６、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８０、１２３、１２８、１３１、１３２、１３９、１４１、１４３および１４５のいずれか１つに表記されているアミノ酸配列を含む。
【０１９４】
あるいは、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、本明細書で記載されている通り１つまたは複数の単鎖リガンドトラップを含むことができ、このトラップは任意選択で、１つまたは複数のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび追加的なＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖リガンドトラップと共有結合または非共有結合により会合していてよい［ＵＳ２０１１／０２３６３０９およびＵＳ２００９／００１０８７９］。図２７を参照されたい。本明細書で記載されている通り、単鎖リガンドトラップは、多価となるのにコイルドコイルＦｃドメインなどの任意の多量体化ドメインへの融合を要求しない。一般に、本開示の単鎖リガンドトラップは、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドドメインおよび１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインを含む。本明細書において概して、結合性ドメイン（ＢＤ）と称されるＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインは任意選択で、リンカー領域によって連接されていてよい。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖リガンドトラップは、以前に記載された。例えば、それぞれの教示全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／１６４４９７を参照されたい。
【０１９５】
ある特定の好ましい実施形態では、本明細書で記載されている方法に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、単離された複合体である。本明細書で使用する場合、単離されたタンパク質（またはタンパク質複合体）またはポリペプチド（またはポリペプチド複合体）は、その天然環境の構成成分から分離されたものである。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドまたはヘテロ多量体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定された場合、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法は、当該分野で周知である［Flatmanら、（２００７年）J.  Chromatogr.  B  ８４８巻：７９〜８７頁］。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、種々の当該分野で公知の技法によって産生することができる。例えば、本開示のポリペプチドは、Bodansky,  M.、Principles  of  Peptide  Synthesis、Springer  Verlag、Berlin（１９９３年）およびGrant  G.  A.（編）Synthetic  Peptides:  A  User's  Guide、W.  H.  Freeman  and  Company、New  York（１９９２年）に記載されている技法など、標準タンパク質化学技法を使用して合成することができる。加えて、自動ペプチド合成機が市販されている（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）。あるいは、そのフラグメントまたは改変体を含む本開示のポリペプチドおよび複合体は、当該分野で周知の通り、様々な発現系［Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス］を使用して、組換えにより産生することができる。さらなる実施形態では、本開示の修飾または無修飾ポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシンまたは対形成塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）を使用することにより、組換えにより産生された全長ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの消化によって産生することができる。コンピュータ解析（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用）を使用して、タンパク質分解性切断部位を同定することができる。
【０１９７】
３．ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドをコードする核酸
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチド（そのフラグメント、機能的な改変体および融合タンパク質を含む）をコードする、単離されたおよび／または組換えの核酸を提供する。例えば、配列番号１６は、自然発生のヒトＡＬＫ４前駆体ポリペプチドをコードし、配列番号１７は、ＡＬＫ４のプロセシングされた細胞外ドメインをコードする。対象核酸は、一本鎖または二本鎖となることができる。このような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子となることができる。これらの核酸は、例えば、本明細書で記載されている通りのＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を作製するための方法において使用することができる。
【０１９８】
本明細書で使用する場合、単離核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、その核酸分子を通常含有するが、その核酸分子が染色体外またはその天然の染色体位置と異なる染色体位置に存在する細胞内に含有される核酸分子を含む。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする核酸は、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４および１４６ならびにその改変体のいずれか１つを含むと理解される。改変体ヌクレオチド配列は、アレル改変体を含む、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失によって異なる配列を含み、したがって、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４および１４６のいずれか１つに表示されているヌクレオチド配列とは異なるコード配列を含むであろう。
【０２００】
ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４および１４６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、またはからなる単離されたまたは組換えの核酸配列によってコードされる。当業者は、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４および１４６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列と相補的な配列を含む、から本質的になる、またはからなる核酸配列も、本開示の範囲内にあることを察知するであろう。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離されていても、組換えであっても、および／または異種ヌクレオチド配列と融合されていてよい、またはＤＮＡライブラリー中に存在してもよい。
【０２０１】
他の実施形態では、本開示の核酸は、ストリンジェントな条件下で、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４および１４６に表示されているヌクレオチド配列、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４および１４６の相補体配列、またはそのフラグメントにハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変動し得ることを容易に理解するであろう。例えば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約４５℃でハイブリダイゼーションを行い、続いて２．０×ＳＳＣ、５０℃の洗浄を行うことができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、約２．０×ＳＳＣ、５０℃の低ストリンジェンシーから、約０．２×ＳＳＣ、５０℃の高ストリンジェンシーまで選択することができる。加えて、洗浄工程における温度は、室温、約２２℃の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件へと増加させることができる。温度および塩の両方を変動させることができる、または他の変数を変化させつつ、温度もしくは塩濃度を一定に保つことができる。一実施形態では、本開示は、２×ＳＳＣ、室温の洗浄が続いて行われる６×ＳＳＣ、室温の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【０２０２】
遺伝暗号の縮重のため、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４および１４６に表記されている核酸とは異なる単離された核酸も、本開示の範囲内にある。例えば、多数のアミノ酸が、２つ以上のトリプレットによって表示される。同じアミノ酸を指定するコドンまたは同義（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンの同義である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」変異をもたらすことができる。しかし、対象タンパク質のアミノ酸配列に変化を生じるＤＮＡ配列多型が、哺乳動物細胞の間に存在するであろうと予測される。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの最大約３〜５％）におけるこのような改変が、天然のアレル改変により、所与の種の個体間に存在し得ることを察知するであろう。ありとあらゆるこのようなヌクレオチド改変およびその結果得られるアミノ酸多型は、本開示の範囲内にある。
【０２０３】
特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物において１または複数の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に対して適切なものである。種々の宿主細胞について、多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知である。代表的には、上記１または複数の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列もしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくはアクチベーター配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性のプロモーターが、本開示によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または、１つより多くのプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在し得るか、または、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用される宿主細胞により変化する。
【０２０４】
本開示の特定の態様では、本主題の核酸は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードし、そして、少なくとも１つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語、調節性配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣもしくはＴＲＣシステム、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が誘導されるＴ７プロモーター、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子（ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに、原核生物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた考慮されるべきである。
【０２０５】
本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか一方または両方における発現に適したベクターにライゲーションすることにより産生することができる。組換えＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドの産生のための発現ビヒクルは、プラスミドおよび他のベクターを含む。例えば、適したベクターは、次の型のプラスミドを含む：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。
【０２０６】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞において発現される１または複数の真核生物の転写単位との両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列を用いて改変される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体が、真核生物細胞におけるタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一般的な組換え手順、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年］。いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系を用いて組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷｌ）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β−ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）が挙げられる。
【０２０７】
好ましい実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞における本主題のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの生成のために設計される（例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ））。明らかであるように、本主題の遺伝子構築物は、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を生成するため、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本主題のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
【０２０８】
本開示はまた、１または複数の本主題のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩトラップポリペプチドのコード配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩトラップポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株］において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０２０９】
したがって、本開示はさらに、本主題のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドを生成する方法に関する。例えば、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を起こすことが可能な適切な条件下で培養され得る。ポリペプチドは、ポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、細胞質または膜画分から単離されてもよいし、回収し、溶解された細胞から得られてもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本主題のポリペプチドは、タンパク質を精製するための当該分野で公知の技法であって、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫アフィニティ精製、およびＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドに融合させたドメインに結合する作用因子によるアフィニティ精製（例えば、プロテインＡカラムを使用して、ＡＬＫ４−Ｆｃおよび／またはＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を精製することができる）を含む技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはこれらの両方から単離することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、その精製を容易とするドメインを含有する融合タンパク質である。
【０２１０】
一部の実施形態では、例えば、任意の順序で、以下のもの：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれよりも多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって、精製は達成される。ウイルス濾過および緩衝液交換によって精製を完了することができる。ＡＬＫ４−Ｆｃおよび／またはＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質ならびにそれらのヘテロマー複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合に、９０％、９５％、９６％、９８％または９９％を超える純度およびＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定される場合に、９０％、９５％、９６％、９８％または９９％を超える純度まで精製することができる。純度の標的レベルは、哺乳動物系、特に、非ヒト霊長類、齧歯類（マウス）およびヒトにおける所望される結果の達成に十分なレベルとなるべきである。
【０２１１】
別の実施形態では、組換えＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの所望の部分のＮ末端におけるポリ（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列など、精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用したアフィニティクロマトグラフィーによる発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。続いて、エンテロキナーゼによる処置により、精製リーダー配列をその後に除去して、精製されたＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドならびにそれらのヘテロマー複合体をもたらすことができる［Hochuliら（１９８７年）J.  Chromatography  ４１１巻：１７７頁；およびJanknechtら（１９９１年）PNAS  USA  ８８巻：８９７２頁］。
【０２１２】
融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もしくは突出（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端のフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、所望されない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用いる従来の技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照のこと。
【０２１３】
４．抗体ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト
ある特定の態様では、本開示は、抗体、または抗体の組合せであるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）に関する。ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合し得る。特に、本開示は、望ましい効果を達成することを必要とする対象において望ましい効果を達成する（例えば、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させ、がんまたは病原体を処置する）ために、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、もしくはＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体の組合せを、単独で、または１つもしくは複数のさらなる支持療法および／もしくは活性薬剤と組み合わせて使用する方法を提供する。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体を、免疫療法剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）と組み合わせて使用することができる。
【０２１４】
ある特定の好ましい態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢ（ＡｃｔＲＩＩ  Ａ／Ｂ抗体）に結合する。一部の代替的な実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡに結合するが、ＡｃｔＲＩＩＢには結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍより大きいＫＤでＡｃｔＲＩＩＢに結合するか、または比較的低い結合、例えば、約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。他の代替的な実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、ＡｃｔＲＩＩＡには結合しない、または実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍより大きいＫＤでＡｃｔＲＩＩＡに結合するか、または比較的低い結合、例えば、約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。本明細書で使用される場合、ＡｃｔＲＩＩ抗体（抗ＡｃｔＲＩＩ抗体）は、一般的に、抗体がＡｃｔＲＩＩを標的とする際に診断剤および／または治療剤として有用であるような十分なアフィニティでＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体の、関連しない非ＡｃｔＲＩＩタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定された場合、抗体のＡｃｔＲＩＩへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、異なる種に由来するＡｃｔＲＩＩ間で保存されたＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ヒトＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］が、ＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合するのを阻害し得る。ＡｃｔＲＩＩＡは、ＡｃｔＲＩＩＢに対する配列相同性を有し、したがって、ＡｃｔＲＩＩＡに結合する抗体は、いくつかの場合、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する、および／またはそれを阻害することができ、その逆も当てはまることに留意すべきである。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）と、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、ア���チビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］とに結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡとＡｃｔＲＩＩＢとに結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せが、少なくとも抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体と、少なくとも抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体とを含む、抗体の組合せ、ならびにその使用（例えば、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させ、がんを処置すること）に関する。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せが、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体と、例えば、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に結合する１つまたは複数のさらなる抗体とを含む、抗体の組合せ、ならびにその使用（例えば、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させ、がんまたは病原体を処置すること）に関する。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せが、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体と、例えば、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］および／またはＡＬＫ４に結合する１つまたは複数のさらなる抗体とを含む、抗体の組合せ、ならびにその使用（例えば、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させ、がんを処置すること）に関する。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せが、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体と、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体と、例えば、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］および／またはＡＬＫ４に結合する少なくとも１つまたは複数のさらなる抗体とを含む、抗体の組合せ、ならびにその使用（例えば、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させ、がんを処置すること）に関する。
【０２１５】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ１１に結合する。本明細書で使用される場合、ＧＤＦ１１抗体（抗ＧＤＦ１１抗体）は、一般的に、抗体がＧＤＦ１１を標的とする際に診断剤および／または治療剤として有用であるような十分なアフィニティでＧＤＦ１１に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体の、関連しない非ＧＤＦ１１タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定された場合、抗体のＧＤＦ１１への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ１１間で保存されたＧＤＦ１１のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、ヒトＧＤＦ１１に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、ＧＤＦ１１が同族Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、かくして、これらの受容体を介するＧＤＦ１１媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。ＧＤＦ１１は、ＧＤＦ８に対する高い配列相同性を有し、したがって、ＧＤＦ１１に結合する抗体はまた、いくつかの場合、ＧＤＦ８に結合する、および／またはそれを阻害することができることに留意すべきである。一部の実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、１つもしくは複数のさらなるリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せが、抗ＧＤＦ１１抗体と、例えば、異なるリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数のさらなる抗体とを含む、抗体の組合せ、ならびにその使用に関する。
【０２１６】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ８を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ８に結合する。本明細書で使用される場合、ＧＤＦ８抗体（抗ＧＤＦ８抗体）は、一般的に、抗体がＧＤＦ８を標的とする際に診断剤および／または治療剤として有用であるような十分なアフィニティでＧＤＦ８に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体の、関連しない非ＧＤＦ８タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定された場合、抗体のＧＤＦ８への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ８間で保存されたＧＤＦ８のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、ヒトＧＤＦ８に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、ＧＤＦ８が同族Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、かくして、これらの受容体を介するＧＤＦ８媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。ＧＤＦ８は、ＧＤＦ１１に対する高い配列相同性を有し、したがって、ＧＤＦ８に結合する抗体はまた、いくつかの場合、ＧＤＦ１１に結合する、および／またはそれを阻害することができることに留意すべきである。一部の実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、１つもしくは複数のさらなるリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せが、抗ＧＤＦ８抗体と、例えば、異なるリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数のさらなる抗体とを含む、抗体の組合せ、ならびにその使用に関する。
【０２１７】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともアクチビンに結合する。本明細書で使用される場合、アクチビン抗体（抗アクチビン抗体）とは、一般的に、抗体がアクチビンを標的とする際に診断剤および／または治療剤として有用であるような十分なアフィニティでアクチビンに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗アクチビン抗体の、関連しない非アクチビンタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定された場合、抗体のアクチビンへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗アクチビン抗体は、異なる種に由来するアクチビン間で保存されたアクチビンのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗アクチビン抗体は、ヒトアクチビンに結合する。他の好ましい実施形態では、抗アクチビン抗体は、アクチビンが同族Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、かくして、これらの受容体を介するアクチビン媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。アクチビンは、配列相同性を共有し、したがって、１つのアクチビン（例えば、アクチビンＡ）に結合する抗体は１つまたは複数のさらなるアクチビン（例えば、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＣ）に結合することができることに留意すべきである。一部の実施形態では、抗アクチビン抗体は、少なくともアクチビンＡおよびアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、抗アクチビン抗体は、１つもしくは複数のさらなるリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せが、抗アクチビン抗体と、例えば、異なるリガンド［例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数のさらなる抗体とを含む、抗体の組合せ、ならびにその使用に関する。
【０２１８】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ３を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ３に結合する。本明細書で使用される場合、ＧＤＦ３抗体（抗ＧＤＦ３抗体）とは、一般的に、抗体がＧＤＦ３を標的とする際に診断剤および／または治療剤として有用であるような十分なアフィニティでＧＤＦ３に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体の、関連しない非ＧＤＦ３タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定された場合、抗体のＧＤＦ３への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ３間で保存されたＧＤＦ３のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体は、ヒトＧＤＦ３に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体は、ＧＤＦ３が同族Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、かくして、これらの受容体を介するＧＤＦ３媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体は、１つもしくは複数のさらなるＴＧＦ−βリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せが、抗ＧＤＦ３抗体と、例えば、異なるＴＧＦ−βリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数のさらなる抗体とを含む、抗体の組合せ、ならびにその使用（例えば、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させ、がんまたは病原体を処置すること）に関する。
【０２１９】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ６を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ６に結合する。本明細書で使用される場合、ＢＭＰ６抗体（抗ＢＭＰ６抗体）とは、一般的に抗体がＢＭＰ６を標的とする際に診断剤および／または治療剤として有用であるような十分なアフィニティでＢＭＰ６に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体の、関連しない非ＢＭＰ６タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定された場合、抗体のＢＭＰ６への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、異なる種に由来するＢＭＰ６間で保存されたＢＭＰ６のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、ヒトＢＭＰ６に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、ＢＭＰ６が同族Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、かくして、これらの受容体を介するＢＭＰ６媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、１つもしくは複数のさらなるＴＧＦ−βリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せが、抗ＢＭＰ６抗体と、例えば、異なるＴＧＦ−βリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数のさらなる抗体とを含む、抗体の組合せ、ならびにその使用（例えば、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させ、がんまたは病原体を処置すること）に関する。
【０２２０】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ９を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ９に結合する。本明細書で使用される場合、ＢＭＰ９抗体（抗ＢＭＰ９抗体）とは、一般的に抗体がＢＭＰ９を標的とする際に診断剤および／または治療剤として有用であるような十分なアフィニティでＢＭＰ９に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体の、関連しない非ＢＭＰ９タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定された場合、抗体のＢＭＰ９への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、異なる種に由来するＢＭＰ９間で保存されたＢＭＰ９のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、ヒトＢＭＰ９に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、ＢＭＰ９が同族Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、かくして、これらの受容体を介するＢＭＰ９媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、１つもしくは複数のさらなるＴＧＦ−βリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ６］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せが、抗ＢＭＰ９抗体と、例えば、異なるＴＧＦ−βリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ６］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数のさらなる抗体とを含む、抗体の組合せ、ならびにその使用（例えば、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させ、がんまたは病原体を処置すること）に関する。
【０２２１】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ１０に結合する。本明細書で使用される場合、ＢＭＰ１０抗体（抗ＢＭＰ１０抗体）とは、一般的に抗体がＢＭＰ１０を標的とする際に診断剤および／または治療剤として有用であるような十分なアフィニティでＢＭＰ１０に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体の、関連しない非ＢＭＰ１０タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定された場合、抗体のＢＭＰ１０への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、異なる種に由来するＢＭＰ１０間で保存されたＢＭＰ１０のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、ヒトＢＭＰ１０に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ１０が同族Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、かくして、これらの受容体を介するＢＭＰ１０媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、１つもしくは複数のさらなるＴＧＦ−βリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ９］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せが、抗ＢＭＰ１０抗体と、例えば、異なるＴＧＦ−βリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ９］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数のさらなる抗体とを含む、抗体の組合せ、ならびにその使用（例えば、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させ、がんまたは病原体を処置すること）に関する。
【０２２２】
他の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ４を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ４に結合する。本明細書で使用される場合、ＡＬＫ４抗体（抗ＡＬＫ４抗体）とは、一般的に抗体がＡＬＫ４を標的とする際に診断剤および／または治療剤として有用であるような十分なアフィニティでＡＬＫ４に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体の、関連しない非ＡＬＫ４タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティアッセイによって測定された場合、抗体のＡＬＫ４への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、異なる種に由来するＡＬＫ４間で保存されたＡＬＫ４のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、ヒトＡＬＫ４に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、１つまたは複数のＴＧＦ−βリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］がＡＬＫ４に結合するのを阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、ＡＬＫ４と、１つまたは複数のＴＧＦ−βリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］ならびに／またはＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ）とに結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せが、抗ＡＬＫ４抗体と、例えば、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］ならびに／またはＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する１つまたは複数のさらなる抗体とを含む、抗体の組合せ、ならびにその使用に関する。
【０２２３】
用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、およびそれらが所望の抗原結合活性を示す限り、抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。抗体フラグメントとは、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディー；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を含むがこれらに限定されない。例えば、Hudsonら（２００３年）Nat.  Med.  ９巻：１２９〜１３４頁；Pluckthun、The  Pharmacology  of  Monoclonal  Antibodies、１１３巻、RosenburgおよびMoore編、（Springer-Verlag、New  York）、２６９〜３１５頁（１９９４年）；ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号、第５，５８７，４５８号、および第５，８６９，０４６号を参照されたい。本明細書に開示される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、それに結合し、検出することができる標識を含む（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素コファクターであってもよい）。好ましい実施形態では、本開示の抗体は、単離された抗体である。
【０２２４】
ダイアボディーは、二価または二特異性であり得る、２つの抗原結合性部位を有する抗体フラグメントである。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、９巻：１２９〜１３４頁；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁を参照されたい。トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｙ）およびテトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）もまた、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、９巻：１２９〜１３４頁において記載されている。
【０２２５】
単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である。例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい。
【０２２６】
抗体フラグメントを、本明細書に記載されるような、インタクト抗体のタンパク質分解的消化ならびに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができる。
【０２２７】
本明細書の抗体は、任意のクラスの抗体であり得る。抗体のクラスとは、その重鎖により保有される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。
【０２２８】
一般に、本明細書に開示される方法における使用のための抗体は、好ましくは、高い結合アフィニティでその標的抗原に特異的に結合する。アフィニティは、Ｋｄ値として表され得、固有の結合アフィニティを反映する（例えば、最小化されたアビディティ効果を有する）。典型的には、結合アフィニティは、無細胞設定であっても、または細胞関連設定であっても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される。例えば、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ）、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）、およびＥＬＩＳＡを含む、本明細書に開示されるものを含む、当該分野で公知のいくつかのアッセイのいずれかを使用して、結合アフィニティ測定値を得ることができる。一部の実施形態では、本開示の抗体は、その標的抗原［例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に、少なくとも１×１０−７もしくはそれよりも強い、１×１０−８もしくはそれよりも強い、１×１０−９もしくはそれよりも強い、１×１０−１０もしくはそれよりも強い、１×１０−１１もしくはそれよりも強い、１×１０−１２もしくはそれよりも強い、１×１０−１３もしくはそれよりも強い、または１×１０−１４もしくはそれよりも強いＫＤで結合する。
【０２２９】
ある特定の実施形態では、ＫＤは、以下のアッセイにより記載されるように、関心のある抗体のＦａｂバージョンおよびその標的抗原で実施されるＲＩＡにより測定される。Ｆａｂの抗原に対する溶液結合アフィニティは、Ｆａｂを、滴定系列の非標識抗原の存在下において、最低濃度の放射性標識された抗原（例えば、１２５Ｉで標識された）と平衡化し、次いで、結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートで捕捉することにより測定する［例えば、Ｃｈｅｎら（１９９９年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９３巻：８６５〜８８１頁を参照されたい］。アッセイ条件を確立するために、マルチウェルプレート（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標））を、捕捉用抗Ｆａｂ抗体（例えば、Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ製）でコーティングし（例えば、一晩にわたり）、その後、好ましくは、室温（例えば、およそ２３℃）において、ウシ血清アルブミンでブロッキングする。非吸着型プレートでは、放射性標識された抗原を、関心のあるＦａｂの系列希釈液と混合する［例えば、Ｐｒｅｓｔａら、（１９９７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７巻：４５９３〜４５９９頁における抗ＶＥＧＦ抗体である、Ｆａｂ−１２の評価と符合する］。次いで、関心のあるＦａｂを、好ましくは、一晩にわたりインキュベートするが、平衡に到達することを確保するように、インキュベーションは、長時間（例えば、約６５時間）にわたり継続することもできる。その後、混合物を、好ましくは、室温で約１時間にわたるインキュベーションのために、捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、好ましくは、ポリソルベート２０とＰＢＳとの混合物で、複数回洗浄する。プレートを乾燥させたら、シンチレーション剤（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ製のＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（登録商標））を添加し、ガンマカウンター（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ製のＴＯＰＣＯＵＮＴ（登録商標））上で、プレートをカウントする。
【０２３０】
別の実施形態によれば、ＫＤは、例えば、抗原ＣＭ５チップを約１０応答単位（ＲＵ）で固定化させた、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定する。略述すると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。例えば、抗原は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）まで希釈してから、５μｌ／分の流量で注入して、およそ１０応答単位（ＲＵ）のタンパク質のカップリングを達成することができる。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。反応速度の測定のため、Ｆａｂの２倍系列希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に、およそ２５μｌ／分の流量で注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、例えば、単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサーグラムおよび解離センサーグラムのフィッティングを同時に行うことにより計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算する［例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９９年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２９３巻：８６５〜８８１頁を参照されたい］。オン速度が、例えば、上記の表面プラズモン共鳴アッセイで１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オン速度は、徐々に増大する濃度の抗原の存在下におけるＰＢＳ中、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度（例えば、励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）であって、攪拌型キュベットを有するストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（登録商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計により測定した場合の、蛍光発光強度の増加または減少を測定する蛍光消光法を使用することにより決定することができる。
【０２３１】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９の核酸およびアミノ酸配列は、当該分野で周知であり、かくして、本開示に従う使用のための抗体アンタゴニストは、当該分野における知識および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者によって慣例的に作製され得る。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来する一方、重鎖および／または軽鎖の残余は異なる供給源または種に由来する抗体を指す。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁に記載されている。一部の実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長動物に由来する可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。一部の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスを、親抗体のクラスまたはサブクラスから変化させた「クラススイッチ」抗体である。一般に、キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
【０２３３】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）に由来するアミノ酸残基と、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つの可変ドメインであり、典型的には２つの可変ドメインであって、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）に対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を経た抗体を指す。
【０２３４】
ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）、Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．、１３巻：１６１９〜１６３３頁において総説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２９頁；Ｑｕｅｅｎら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻：１００２９〜１００３３頁；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、および同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：２５〜３４頁［ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングについて記載する］；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９１年）、２８巻：４８９〜４９８頁（「リサーフェシング」について記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：４３〜６０頁（「ＦＲシャフリング」について記載する）；Ｏｓｂｏｕｒｎら（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：６１〜６８頁；ならびにＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ（２０００年）、８３巻：２５２〜２６０頁（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチについて記載する）においてさらに記載されている。
【０２３５】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域は、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域［例えば、Ｓｉｍｓら（１９９３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁を参照されたい］；軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定の亜集団による、ヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域［例えば、Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁；およびＰｒｅｓｔａら（１９９３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁を参照されたい］；ヒト成熟（体細胞変異させた）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域［例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）、Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．、１３巻：１６１９〜１６３３頁を参照されたい］；およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域［例えば、Ｂａｃａら、（１９９７年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７２巻：１０６７８〜１０６８４頁；およびＲｏｓｏｋら、（１９９６年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７１巻：２２６１１〜２２６１８頁を参照されたい］を含むがこれらに限定されない。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体を、当該分野で公知の様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は、van  Dijkおよびvan  de  Winkel（２００１年）Curr.  Opin.  Pharmacol.  ５巻：３６８〜７４頁およびLonberg（２００８年）Curr.  Opin.  Immunol.  ２０巻：４５０〜４５９頁に一般的に記載されている。
【０２３７】
免疫原［例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］を、抗原性チャレンジに応答してインタクトヒト抗体またはヒト可変領域を含むインタクト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に投与することによって、ヒト抗体を調製することができる。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えた、または染色体外に存在する、もしくは動物の染色体中に無作為に組み込まれた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。そのようなトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を取得するための方法の概説については、例えば、Lonberg（２００５年）Nat.  Biotechnol.  ２３巻：１１１７〜１１２５頁；米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する）；米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載する）；米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する）；ならびに米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載する）を参照されたい。そのような動物によって生成されるインタクト抗体に由来するヒト可変領域を、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに改変することができる。
【０２３８】
本明細書で提供されるヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は記載されている［例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９８４年）、１３３巻：３００１頁；Ｂｒｏｄｅｕｒら（１９８７年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＢｏｅｒｎｅｒら（１９９１年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６頁を参照されたい］。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉら、（２００６年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０３巻：３５５７〜３５６２頁において記載されている。追加の方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の生成について記載）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ（２００６年）、２６巻（４号）：２６５〜２６８頁（２００６年）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて記載）において記載されている方法を含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ（２００５年）、Ｈｉｓｔｏｌ．  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、２０巻（３号）：９２７〜９３７頁；ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２７巻（３号）：１８５〜９１頁において記載されている。  
【０２３９】
本明細書で提供されるヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーより選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成することができる。次いで、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。ヒト抗体を抗体ライブラリーより選択するための技法は、本明細書で記載される。
【０２４０】
例えば、本開示の抗体は、１つまたは複数の所望の活性を有する抗体のためのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。当該分野では、ファージディスプレイライブラリーを生成し、このようなライブラリーを、所望の結合特徴を保有する抗体についてスクリーニングするための、様々な方法が公知である。このような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７８巻：１〜３７頁、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．において総説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁；Ｍａｒｋｓら（１９９２年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁；ＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ（２００３年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻：１６１〜１７５頁、Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．；Ｓｉｄｈｕら（２００４年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３３８巻（２号）：２９９〜３１０頁；Ｌｅｅら（２００４年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３４０巻（５号）：１０７３〜１０９３頁；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ（２００４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０１巻（３４号）：１２４６７〜１２４７２頁；ならびにＬｅｅら（２００４年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８４巻（１〜２号）：１１９〜１３２頁においてさらに記載されている。
【０２４１】
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングされ、ファージライブラリー中で無作為に組み換えられ、次いで、Winterら（１９９４年）Ann.  Rev.  Immunol.、１２巻：４３３〜４５５頁に記載されたように抗原結合性ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントとして、またはＦａｂフラグメントとして、抗体フラグメントを展示する。免疫化された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマの構築を要求することなく、免疫原［例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に対する高アフィニティ抗体を提供する。あるいは、ナイーブなレパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）、Griffithsら（１９９３年）EMBO  J、１２巻：７２５〜７３４頁によって記載された免疫化なしに様々な非自己およびまた、自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供することができる。最後に、HoogenboomおよびWinter（１９９２年）J.  Mol.  Biol.、２２７巻：３８１〜３８８頁によって記載されたように、幹細胞に由来する非再配置Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再配置を達成するための無作為配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することによって、ナイーブなライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許刊行物としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号、および第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０２４２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多特異性抗体、例えば、二特異性抗体である。多特異性抗体（典型的に、モノクローナル抗体）は、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれを超える）抗原上の、少なくとも２つの（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれを超える）異なるエピトープに対する結合特異性を有する。
【０２４３】
「オクトパス抗体」を含む、３個またはそれよりも多くの機能的抗原結合性部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能な改変体抗体、例えば、天然に存在する変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の生成時に発生する改変体抗体（このような改変体は、一般に少量で存在する）を除き同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。典型的に、異なるエピトープを指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープを指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の性質を指し示し、任意の特定の方法により抗体の生成を必要とするとはみなさないものとする。例えば、本方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を活用する方法、本明細書で記載されるモノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法を含むがこれらに限定されない様々な技法により作製することができる。
【０２４５】
例えば、標準的なプロトコルを介して、ＧＤＦ１１に由来する免疫原を使用することにより、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清または抗タンパク質／抗ペプチドモノクローナル抗体を作製することができる［例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい］。マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳動物は、ＧＤＦ１１ポリペプチドの免疫原性形態、抗体応答を誘発することが可能である抗原性フラグメント、または融合タンパク質で免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法は、キャリアへのコンジュゲーションまたは当該分野で周知の他の技法を含む。ＧＤＦ１１ポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血漿中または血清中の抗体力価の検出によりモニタリングすることができる。免疫原を抗原とする標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを使用して、抗体生成レベルおよび／または結合アフィニティレベルを評価することができる。
【０２４６】
ＧＤＦ１１の抗原性調製物で動物を免疫化した後、抗血清を得ることができ、所望の場合、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を生成するために、抗体生成細胞（リンパ球）を、免疫化動物から採取し、標準的な体細胞融合手順により、骨髄腫細胞など、不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞をもたらすことができる。このような技法は、当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技法［例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁を参照されたい］、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法［例えば、Ｋｏｚｂａｒら（１９８３年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁を参照されたい］、およびヒトモノクローナル抗体を生成するＥＢＶハイブリドーマ技法［Ｃｏｌｅら（１９８５年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、７７〜９６頁］が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、ＧＤＦ１１ポリペプチドと特異的に反応性である抗体、およびこのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離されたモノクローナル抗体の生成について、免疫化学的にスクリーニングすることができる。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、これにより、Ｆｃ領域改変体を生成することができる。Ｆｃ領域改変体は、１つまたは複数のアミノ酸位置において、アミノ酸改変（例えば、置換、欠失、および／または付加）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、またはヒトＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
【０２４８】
例えば、本開示は、全てではないが、いくつかのエフェクター機能を有する抗体改変体であって、それを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の半減期が、不要であるか、または有害である、ある特定のエフェクター機能［例えば、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）］にとって依然として重要である用途のための望ましい候補にする抗体改変体を企図する。インビトロおよび／またはインビボにおける細胞傷害作用アッセイを実行して、ＣＤＣ活性および／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体が、ＦｃγＲ結合を欠く（よって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎへの結合能は保持することを確保することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、例えば、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ（１９９１年）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻：４５７〜４９２頁にまとめられている。関心のある分子のＡＤＣＣ活性を評価するインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｉ．ら（１９８６年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８３巻：７０５９〜７０６３頁、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｉら（１９８５年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻：１４９９〜１５０２頁；米国特許第５，８２１，３３７号；およびＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ，  Ｍ．ら（１９８７年）、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１６６巻：１３５１〜１３６１頁において記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法を利用することができる（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害作用アッセイ；ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害作用アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に、または加えて、関心のある分子のＡＤＣＣ活性は、インビボにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら（１９９８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９５巻：６５２〜６５６頁において開示されている動物モデルなどの動物モデルにおいて評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合できず、よって、ＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる［例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２における、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい］。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる［例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９６年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２巻：１６３頁；Ｃｒａｇｇ，  Ｍ．  Ｓ．ら（２００３年）、Ｂｌｏｏｄ、１０１巻：１０４���〜１０５２頁；ならびにＣｒａｇｇ，  Ｍ．  Ｓ．およびＭ．  Ｊ．  Ｇｌｅｎｎｉｅ（２００４年）、Ｂｌｏｏｄ、１０３巻：２７３８〜２７４３頁を参照されたい］。当該分野で公知の方法を使用して、ＦｃＲｎへの結合およびインビボにおけるクリアランス／半減期の決定もまた、実施することができる［例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，  Ｓ．  Ｂ．ら（２００６年）、Ｉｎｔｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８巻（１２号）：１７５９〜１７６９頁を参照されたい］。
【０２４９】
エフェクター機能を低減した本開示の抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つまたは複数を置換した抗体を含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体は、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、および３２７位のうちの２つまたはこれより多くにおいて置換を有するＦｃ変異体であって、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含むＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２５０】
ある特定の実施形態では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１つまたは複数の残基をシステイン残基で置換した「チオＭＡｂ」を創出することが望ましいと考えられる。特定の実施形態では、残基の置換を、抗体の接近可能な部位に施す。システインでこれらの残基を置換することにより、反応性のチオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、抗体を、薬物部分またはリンカー−薬物部分など、他の部分にコンジュゲートして、本明細書でさらに記載されるような、免疫コンジュゲートを創出するのに使用することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちの任意の１つまたは複数を、システインで置換することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号において記載されているように生成することができる。
【０２５１】
加えて、望ましい抗体を同定するための抗体をスクリーニングするのに使用される技法は、得られる抗体の特性に影響を及ぼし得る。例えば、抗体を、溶液中の抗原の結合に使用する場合、溶液中での結合について試験することが望ましいと考えられる。抗体と抗原との相互作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために、様々な異なる技法が利用可能である。このような技法として、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織化学が挙げられる。
【０２５２】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列改変体が企図される。例えば、抗体および／または結合ポリペプチドの結合アフィニティおよび／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体および／もしくは結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に適切な改変を導入するか、またはペプチド合成により、抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列改変体を調製することができる。そのような改変としては、例えば、抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列からの欠失、および／またはその中への挿入、および／またはその中の残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特徴、例えば、標的結合（ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９結合）を有するという条件で、欠失、挿入、および置換の任意の組合せを作製して、最終構築物に到達することができる。
【０２５３】
変更（例えば、置換）をＨＶＲ内に施して、例えば、抗体のアフィニティを改善することができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスにおいて高頻度で変異を経るコドンによりコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ（２００８年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２０７巻：１７９〜１９６頁（２００８年）を参照されたい）、および／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）に施すことができ、結果として得られる改変体ＶＨまたは改変体ＶＬを結合アフィニティについて調べる。当該分野では、二次ライブラリーを構築し、ここから再選択することによるアフィニティ成熟が記載されている［例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７８巻：１〜３７頁、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（２００１年）を参照されたい］。アフィニティ成熟の一部の実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指向変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを創出する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望のアフィニティを有する任意の抗体改変体を同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）をランダム化する、ＨＶＲ指向アプローチを伴う。抗原の結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニン走査変異誘発またはモデル化を使用して、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３は、しばしば標的化される。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、このような変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限りにおいて、１つまたは複数のＨＶＲ内に置換、挿入、または欠失を施すことができる。例えば、結合アフィニティを実質的に低減しない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）を、ＨＶＲ内に施すことができる。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外部であり得る。上記で提供した改変体ＶＨ配列およびＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、不変であるか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
【０２５５】
変異誘発のために標的化され得る抗体および／または結合ポリペプチドの残基または領域の同定のための有用な方法は、CunninghamおよびWells（１９８９年）Science、２４４巻：１０８１〜１０８５頁によって記載されたように、「アラニン走査変異誘発」と呼ばれる。この方法では、抗体または結合ポリペプチドの抗原との相互作用が影響されるかどうかを決定するために、残基または標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、中性の、または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンもしくはポリアラニン）によって置き換える。さらなる置換を、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入することができる。あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との接触点を同定することができる。そのような接触残基および近隣の残基を、置換のための候補として標的化または排除することができる。改変体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定することができる。
【０２５６】
アミノ酸配列の挿入は、１残基〜１００またはこれより多くの残基を含有するポリペプチドの範囲の長さのアミノ末端融合体および／またはカルボキシル末端融合体のほか、単一または複数のアミノ酸残基の内部配列挿入も含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入改変体として、抗体のＮ末端もしくはＣ末端の、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）、または抗体の血清中半減期を延長するポリペプチドへの融合体が挙げられる。
【０２５７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合性ポリペプチドを、当該分野で公知であり、たやすく利用可能である、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾することができる。抗体および／または結合性ポリペプチドの誘導体化に適する部分は、水溶性ポリマーを含むがこれらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、およびデキストラン、またはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中のその安定性のために、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であることが可能であり、分枝状でもよく、非分枝状でもよい。抗体および／または結合ポリペプチドに付加させるポリマーの数は、変化させることができ、１つより多くのポリマーを付加させる場合、それらは、同じ分子でもよく、異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、抗体の誘導体および／または結合ポリペプチドの誘導体が規定の条件下での治療に使用されようと、改善する抗体および／または結合ポリペプチドの特定の特性または機能を含むがこれらに限定されない検討事項に基づき決定することができる。
【０２５８】
本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体のいずれかを、１つまたは複数のさらなるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせて、所望の効果を達成することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体を、ｉ）１つもしくは複数のさらなるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、ｉｉ）１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、および／もしくはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体；ｉｉｉ）１つもしくは複数の小分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト；ｉｖ）１つもしくは複数のポリヌクレオチドＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト；ｖ）１つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド；ならびに／またはｖｉ）１つもしくは複数のＦＬＲＧポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
【０２５９】
５．小分子アンタゴニスト
他の態様では、本開示は、小分子、または小分子の組合せであるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）に関する。ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト小分子は、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）、または１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩ下流シグナル伝達構成成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）を阻害し得る。特に、本開示は、所望の効果を達成することを必要とする対象における所望の効果を達成する（例えば、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させ、がんまたは病原体を処置する）ために、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト小分子、またはＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト小分子の組合せを、単独で、または１つもしくは複数のさらなる支持療法および／もしくは活性薬剤と組み合わせて使用する方法を提供する。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト小分子を、免疫療法剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）と組み合わせて使用することができる。
【０２６０】
一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢを阻害する、小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢを阻害する、小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡを阻害する、小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡを阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢを阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する、小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ８を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＧＤＦ８を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＥ）を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、アクチビンを阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ３を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＧＤＦ３を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ６を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ６を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ９を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ９を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡＬＫ４を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４を阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、および／もしくはＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢをさらに阻害する。
【０２６１】
小分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、直接的または間接的阻害剤であってもよい。例えば、間接的な小分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、少なくとも１つもしくは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）または１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩ下流シグナル伝達構成成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは２）の発現（例えば、転写、翻訳、細胞分泌、またはその組合せ）を阻害し得る。あるいは、直接的な小分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せは、例えば、１つもしくは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）または１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩ下流シグナル伝達構成成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）のうちの１つまたは複数に直接的に結合し得る。１つまたは複数の間接的小分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと、１つまたは複数の直接的小分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストとの組合せを、本明細書に開示される方法に従って使用することができる。
【０２６２】
本開示の有機小分子アンタゴニストの結合を、公知の方法（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５を参照されたい）を使用して同定し、化学的に合成することができる。一般に、本開示の小分子アンタゴニストは、通常、約２０００ダルトン未満のサイズ、あるいは、約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満のサイズであり、そのような有機小分子は、本明細書に記載のポリペプチド［例えば、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］に、好ましくは特異的に結合することができる。そのような小分子アンタゴニストを、周知の技術を使用して過度の実験を行うことなく同定することができる。これに関して、ポリペプチド標的に結合することができる分子について有機小分子ライブラリーをスクリーニングするための技術は当該分野で周知であることに留意されたい（例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５を参照されたい）。
【０２６３】
本開示の結合有機低分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニル塩化物、ジアゾ化合物、および酸塩化物であり得る。
【０２６４】
本明細書に開示される小分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストはいずれも、１つまたは複数のさらなるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせて、所望の、任意選択で、免疫療法剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）とさらに組み合わせて達成することができる。例えば、小分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、ｉ）１つもしくは複数のさらなるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト小分子、ｉｉ）１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、および／もしくはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体；ｉｉｉ）１つもしくは複数の抗体ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト；ｉｖ）１つもしくは複数のポリヌクレオチドＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト；ｖ）１つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド；ならびに／またはｖｉ）１つもしくは複数のＦＬＲＧポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
【０２６５】
６．ヌクレオチドＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト
他の態様では、本開示は、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの組合せであるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）に関する。ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリヌクレオチドは、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）、または１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩ下流シグナル伝達構成成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）を阻害し得る。特に、本開示は、所望の効果を達成することを必要とする対象における所望の効果を達成する（例えば、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させ、がんまたは病原体を処置する）ために、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリヌクレオチド、またはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリヌクレオチドの組合せを、単独で、または１つもしくは複数のさらなる支持療法および／もしくは活性薬剤と組み合わせて使用する方法を提供する。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリヌクレオチドを、免疫療法剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）と組み合わせて使用することができる。
【０２６６】
一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢを阻害する、ポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢを阻害する、ポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡを阻害する、ポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する、ポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ８を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＧＤＦ８を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＥ）を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、アクチビンを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリヌクレオチドは、少なくともＧＤＦ３を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＧＤＦ３を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ６を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ６を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ１０を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ９を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ９を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＡＬＫ４をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡＬＫ４を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ関連リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、および／もしくはＢＭＰ９］、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢをさらに阻害する。
【０２６７】
本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子［例えば、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）］、アプタマーおよび／またはリボザイムであり得る。ヒトＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９の核酸およびアミノ酸配列は、当該分野で公知であり、かくして、本開示の方法に従う使用のためのポリヌクレオチドアンタゴニストは、当該分野における知識および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者によって慣例的に作製され得る。
【０２６８】
例えば、アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡ、または三重螺旋形成を介して、遺伝子発現を制御するのに使用することができる。アンチセンス法は、例えば、Ｏｋａｎｏ（１９９１年）、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６巻：５６０頁；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８８年）において論じられている。三重螺旋形成は、例えば、Ｃｏｏｎｅｙら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：４５６頁；およびＤｅｒｖａｎら、（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻：１３００頁において論じられている。方法は、ポリヌクレオチドの、相補性ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。一部の実施形態では、アンチセンス核酸は、所望の遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な一本鎖ＲＮＡ配列または一本鎖ＤＮＡ配列を含む。しかし、絶対的な相補性は、好ましいが、必要ではない。
【０２６９】
本明細書で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズし、安定的な二重鎖を形成することが可能であるのに十分な相補性を有する配列を意味し、したがって、本明細書で開示される遺伝子の二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験してもよく、三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズさせる核酸が大型であるほど、それが含有し得るＲＮＡとの塩基のミスマッチも多くなるが、なおも安定的な二重鎖（または、場合に応じて、三重鎖）を形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な手順の使用により、ミスマッチの許容可能な程度を確認することができる。
【０２７０】
メッセンジャーの５’末端と相補的であるポリヌクレオチド、例えば、ＡＵＧ開始コドンを含むそれまでの５’非翻訳配列は、翻訳の阻害において最も効率的に機能するはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列と相補的な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳の阻害において有効であることが示されている［例えば、Wagner,  R.（１９９４年）Nature  ３７２巻：３３３〜３３５頁を参照されたい］。かくして、本開示の遺伝子の５’または３’非翻訳非コード領域と相補的なオリゴヌクレオチドを、アンチセンス法において使用して、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域と相補的なポリヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域と相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳の阻害剤としてあまり有効ではないが、本開示の方法に従って使用することができる。本開示のｍＲＮＡの５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、またはコード領域にハイブリダイズするように設計されたかに応じて、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、好ましくは、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２７１】
一実施形態では、本開示のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写により、細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部は、転写され、本開示の遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成する。このようなベクターは、所望のアンチセンス核酸をコードする配列を含有する。このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを生成するように転写され得る限りにおいて、エピソームにとどまってもよく、染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ法により構築することができる。ベクターは、プラスミドベクターでもよく、ウイルスベクターでもよく、または当該分野で公知の他のベクターであって、脊椎動物細胞内の複製および発現のために使用されるベクターでもよい。本開示の所望の遺伝子またはこれらのフラグメントをコードする配列の発現は、脊椎動物細胞内、好ましくは、ヒト細胞内で作用することが当該分野で公知の任意のプロモーターによるものであり得る。このようなプロモーターは、誘導性であっても、恒常的であってもよい。このようなプロモーターとして、ＳＶ４０初期プロモーター領域［例えば、ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ（１９８１年）、Ｎａｔｕｒｅ、２９巻：３０４〜３１０頁を参照されたい］、ラウス肉腫ウイルスの３’側長末端リピート内に含有されるプロモーター［例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８０年）、Ｃｅｌｌ、２２巻：７８７〜７９７頁を参照されたい］、ヘルペスチミジンプロモーター［例えば、Ｗａｇｎｅｒら（１９８１年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８巻：１４４１〜１４４５頁を参照されたい］、およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列［例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２年）、Ｎａｔｕｒｅ、２９６巻：３９〜４２頁を参照されたい］が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２７２】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアンタゴニストは、１つまたは複数の遺伝子の発現を標的とする干渉ＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子である。ＲＮＡｉとは、標的ｍＲＮＡの発現を妨げるＲＮＡの発現を指す。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（小分子干渉ＲＮＡ）を介して特定のｍＲＮＡと相互作用することによって標的遺伝子をサイレンシングする。次いで、ｄｓ  ＲＮＡ複合体が、細胞による分解のために標的化される。ｓｉＲＮＡ分子は、十分に相補的である標的遺伝子（例えば、遺伝子と少なくとも８０％同一である）の発現を妨げる、１０〜５０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ二重鎖である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０２７３】
さらなるＲＮＡｉ分子は、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；また、短干渉ヘアピンおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。ｓｈＲＮＡ分子は、ループによって接続された標的遺伝子に由来するセンスおよびアンチセンス配列を含有する。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、ｍＲＮＡと共に分解される。Ｐｏｌ  ＩＩＩまたはＵ６プロモーターを使用して、ＲＮＡｉのためのＲＮＡを発現させることができる。Paddisonら［Genes  &  Dev.（２００２年）１６巻：９４８〜９５８頁、２００２年］は、ＲＮＡｉを行うための手段として、ヘアピンに折り畳まれた小分子ＲＮＡを使用した。したがって、そのような短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子もまた、本明細書に記載される方法において有利に使用される。機能的なｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは変化する；ステム長は、約２５〜約３０ｎｔあたりの範囲であってよく、ループサイズはサイレンシング活性に影響しない４〜約２５ｎｔの範囲であってよい。いかなる特定の理論によっても束縛されることを望むものではないが、これらのｓｈＲＮＡはＤＩＣＥＲ  ＲＮａｓｅの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物と似ており、いずれにしても、特定の遺伝子の発現を阻害することについて同じ能力を有すると考えられる。ｓｈＲＮＡを、レンチウイルスベクターから発現させることができる。ｍｉＲＮＡは、「ステム−ループ」構造を特徴とするプレ−ｍｉＲＮＡとして最初に転写された後、ＲＩＳＣによるさらなるプロセシングの後に成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる、約１０〜７０ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡである。
【０２７４】
ｓｉＲＮＡを含むがこれに限定せず、ＲＮＡｉを媒介する分子は、インビトロで、化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、５２１巻：１９５〜１９９頁、２００２年）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９巻：９９４２〜９９４７頁、２００２年）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３０巻：ｅ４６頁、２００２年；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９巻：６０４７〜６０５２頁、２００２年）、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩなどのヌクレアーゼを使用する二本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９巻：９９４２〜９９４７頁、２００２年）によって生成することができる。
【０２７５】
別の態様に従うと、本開示は、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、封入型ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、封入型ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉をもたらすことが可能な分子、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドアンタゴニストを提供する。
【０２７６】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９ポリペプチドなどの、標的分子に特異的に結合する三次構造に結合し、それを形成する、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ分子を含む核酸分子である。アプタマーの生成および治療的使用は、当該分野で確立されている。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。アプタマーに関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号に見出すことができる。核酸アプタマーは、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、指数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）プロセスによって選択される。ＳＥＬＥＸは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，５８０，７３７号、同第５，５６７，５８８号、同第５，７０７，７９６号、同第５，７６３，１７７号、同第６，０１１，５７７号、および同第６，６９９，８４３号に記載のような、標的分子に非常に特異的に結合する核酸分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化のための方法である。アプタマーを同定するための別のスクリーニング方法は、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている。ＳＥＬＥＸプロセスは、様々な２次元および３次元構造を形成する核酸の能力、ならびに単量体であっても、多量体であっても、他の核酸分子およびポリペプチドを含む、実質的に任意の化合物とのリガンドとして作用する（特異的結合ペアを形成する）ヌクレオチド単量体内で利用可能な化学的多用途性に基づくものである。任意のサイズおよび組成の分子が、標的として働き得る。ＳＥＬＥＸ法は、所望の結合アフィニティおよび選択性を達成するために、同じ一般的選択スキームを使用する、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択ならびに結合、分離および増幅の段階的反復を含む。無作為化配列のセグメントを含んでもよい核酸の混合物から出発して、ＳＥＬＥＸ法は、結合にとって好ましい条件下で混合物と標的とを接触させる工程；標的分子に特異的に結合した核酸から未結合の核酸を分離する工程；核酸−標的複合体を解離させる工程；核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド濃縮された混合物を得る工程を含む。結合、分離、解離および増幅の工程は、標的分子に対する高度に特異的な高アフィニティ核酸リガンドを得るために、必要に応じて多くのサイクルにわたって繰り返される。
【０２７７】
典型的に、このような結合分子は、動物に別個に投与される［例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ（１９９１年）、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６巻：５６０頁を参照されたい］が、このような結合分子はまた、宿主細胞により取り込まれたポリヌクレオチドからインビボで発現させることもでき、インビボで発現させることができる［例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８８年）を参照されたい］。
【０２７８】
本明細書に開示される任意のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリヌクレオチドを、１つまたは複数のさらなるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせて、所望のものを達成することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリヌクレオチドを、ｉ）１つもしくは複数のさらなるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリヌクレオチド、ｉｉ）１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、および／もしくはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体、ｉｉｉ）１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ｉｖ）１つもしくは複数の小分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ｖ）１つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド、ならびに／またはｖｉ）１つもしくは複数のＦＬＲＧポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
【０２７９】
７．フォリスタチンおよびＦＬＲＧアンタゴニスト
他の態様では、本明細書に開示される方法に従う使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）は、所望の効果を達成する（例えば、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させ、病原体のがんを処置する）ために、単独で、または１つもしくは複数の追加的な支持療法および／もしくは本明細書に開示される活性薬剤と組み合わせて使用することができる、フォリスタチンまたはＦＬＲＧポリペプチドである。ある特定の好ましい実施形態では、フォリスタチンまたはＦＬＲＧポリペプチドを、免疫療法剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）と組み合わせて使用することができる。
【０２８０】
用語「フォリスタチンポリペプチド」は、フォリスタチンの任意の天然起源のポリペプチドならびに有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含み、フォリスタチンの任意の機能的単量体または多量体をさらに含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のフォリスタチンポリペプチドは、アクチビン、特に、アクチビンＡに結合する、および／またはその活性を阻害する。アクチビン結合特性を保持するフォリスタチンポリペプチドの改変体を、フォリスタチンとアクチビンの相互作用を含む以前の研究に基づいて同定することができる。例えば、ＷＯ２００８／０３０３６７は、アクチビン結合にとって重要であることが示されている特異的フォリスタチンドメイン（「ＦＳＤ」）を開示する。以下の配列番号４６〜４８に示されるように、フォリスタチンのＮ末端ドメイン（「ＦＳＮＤ」、配列番号４６）、ＦＳＤ２（配列番号４８）、および比較的程度は低いが、ＦＳＤ１（配列番号４７）は、アクチビン結合にとって重要であるフォリスタチン内にある例示的ドメインである。さらに、ポリペプチドのライブラリーを作製し、試験するための方法は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの文脈で上に記載されており、そのような方法もまた、フォリスタチンの改変体を作製し、試験することに関する。フォリスタチンポリペプチドは、フォリスタチンポリペプチドの配列と少なくとも約８０％同一であり、任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有する配列を有する任意の公知のフォリスタチンの配列に由来するポリペプチドを含む。フォリスタチンポリペプチドの例は、例えば、ＷＯ２００５／０２５６０１に記載されたような、成熟フォリスタチンポリペプチドまたはヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのより短いアイソフォームもしくは他の改変体（配列番号４４）を含む。
【０２８１】
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのアイソフォームであるＦＳＴ３４４は、以下の通りである。
【化３４】
2019510001.tif 000037
【化３５】
2019510001.tif 000038
【０２８２】
シグナルペプチドに下線を付す；上記ではまた、このフォリスタチンアイソフォームを、下記に示される短いフォリスタチンアイソフォームであるＦＳＴ３１７から弁別する、Ｃ末端伸長部分を表す最後の２７残基にも下線を付している。
【０２８３】
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのアイソフォームであるＦＳＴ３１７は、以下の通りである。
【化３６】
2019510001.tif 000039
【０２８４】
シグナルペプチドに下線を付す。
フォリスタチンのＮ末端ドメイン（ＦＳＮＤ）配列は、以下の通りである。
【化３７】
2019510001.tif 000040
ＦＳＤ１およびＦＳＤ２の配列は以下の通りである：
【化３８】
2019510001.tif 000041
【０２８５】
他の態様では、本明細書に開示される方法に従う使用のためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、フォリスタチン関連タンパク質３（ＦＳＴＬ３）としても公知の、フォリスタチン様関連遺伝子（ＦＬＲＧ）である。用語「ＦＬＲＧポリペプチド」は、ＦＬＲＧの任意の天然起源のポリペプチド、ならびに有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）を含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＦＬＲＧポリペプチドは、アクチビン、特に、アクチビンＡに結合する、および／またはその活性を阻害する。アクチビン結合特性を保持するＦＬＲＧポリペプチドの改変体を、ＦＬＲＧとアクチビンの相互作用をアッセイするための日常的な方法（例えば、米国特許第６，５３７，９６６号を参照されたい）を使用して同定することができる。さらに、ポリペプチドのライブラリーを作製し、試験するための方法は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの文脈で上に記載されており、そのような方法もまた、ＦＬＲＧの改変体を作製し、試験することに関する。ＦＬＲＧポリペプチドは、ＦＬＲＧポリペプチドの配列と少なくとも約８０％同一であり、任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれよりも高い同一性を有する配列を有する任意の公知のＦＬＲＧの配列に由来するポリペプチドを含む。
【０２８６】
ヒトＦＬＲＧ前駆体（フォリスタチン関連タンパク質３前駆体）ポリペプチドは、以下の通りである。
【化３９】
2019510001.tif 000042
シグナルペプチドに下線を付す。
【０２８７】
ある特定の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドおよびＦＬＲＧポリペプチドの機能的な改変体または改変形態は、フォリスタチンポリペプチドまたはＦＬＲＧポリペプチドの少なくとも一部を有する融合タンパク質と、例えば、ポリペプチドの単離、検出、安定化、または多量体化を容易とするドメインなど、１つまたは複数の融合ドメインとを含む。適切な融合ドメインについては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに関して、上記で詳細に論じられている。一部の実施形態では、本開示のアンタゴニスト作用因子は、Ｆｃドメインに融合させたフォリスタチンポリペプチドのアクチビン結合性部分を含む融合タンパク質である。別の実施形態では、本開示のアンタゴニスト作用因子は、Ｆｃドメインに融合させたＦＬＲＧポリペプチドのアクチビン結合性部分を含む融合タンパク質である。
【０２８８】
本明細書に開示される任意のフォリスタチンポリペプチドを、本開示の１つまたは複数のさらなるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト剤と組み合わせて、所望の効果を達成することができる。例えば、フォリスタチンポリペプチドを、ｉ）１つもしくは複数のさらなるフォリスタチンポリペプチド、ｉｉ）１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／もしくはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ｉｉｉ）１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、ｉｖ）１つもしくは複数の小分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ｖ）１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリヌクレオチド、ならびに／またはｖｉ）１つもしくは複数のＦＬＲＧポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
【０２８９】
同様に、本明細書に開示される任意のＦＬＲＧポリペプチドを、本開示の１つまたは複数のさらなるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト剤と組み合わせて、任意選択で、免疫療法剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）とさらに組み合わせて、所望の効果を達成することができる。例えば、ＦＬＲＧポリペプチドを、ｉ）１つもしくは複数のさらなるＦＬＲＧポリペプチド、ｉｉ）１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび／もしくはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ｉｉｉ）１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、ｉｖ）１つもしくは複数の小分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ｖ）１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリヌクレオチド、ならびに／またはｖｉ）１つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
【０２９０】
８．スクリーニングアッセイ
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストである化合物（薬剤）を同定するための、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の使用に関する。このスクリーニングにより同定される化合物を試験して、がんおよび／または腫瘍増殖を調節するその能力を評価する、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでがんおよび／または腫瘍増殖を調節するその能力を評価することができる。これらの化合物を、例えば、動物モデルにおいて試験することができる。
【０２９１】
ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドシグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤシグナル伝達）を標的化することにより組織増殖を調節するための治療剤をスクリーニングするためのいくつかの手法が存在する。ある特定の実施形態では、化合物の高効率スクリーニングを実行して、選択された細胞系に対するＴＧＦβスーパーファミリー受容体により媒介される効果を混乱させる薬剤を同定することができる。ある特定の実施形態では、アッセイは、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）などの、結合パートナーへの、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の結合を特異的に阻害するか、または低下させる化合物をスクリーニングし、同定するために実行される。あるいは、このアッセイを使用して、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドなどの結合パートナーへの、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の結合を増強する化合物を同定することができる。さらなる実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と相互作用するその能力によって、化合物を同定することができる。
【０２９２】
種々のアッセイ形式が十分であり、そして、本開示を考慮すれば、本明細書中に明示的に記載されない形式は、本明細書中に記載されていないにもかかわらず、当業者によって理解される。本明細書中に記載されるように、本発明の試験化合物（作用因子）は、任意の組み合わせ化学の方法によって作製され得る。あるいは、本主題の化合物は、インビボまたはインビトロで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織増殖の調節因子として作用するその能力について試験される化合物（作用因子）は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物によって生成されても（例えば、天然の生成物）、化学的に生成されても（例えば、ペプチド模倣物を含む低分子）、組換えにより生成されてもよい。本発明によって企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子が挙げられる。ある特定の実施形態では、試験作用因子は、約２０００ダルトン未満の分子量を持つ小さな有機分子である。
【０２９３】
本開示の試験化合物は、単一の別個の実体として提供され得るか、または、組み合わせ化学によって作製されたような、より複雑度の高いライブラリーにおいて提供され得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび有機化合物の他の分類を含み得る。試験システムに対する試験化合物の提示は、特に、最初のスクリーニング段階において、単離された形態または化合物の混合物としてのいずれかであり得る。任意選択で、化合物は、任意選択で他の化合物で誘導体化され得、そして、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有し得る。誘導体化基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化クロスリンカー、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０２９４】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間に調査される化合物の数を最大化するために高効率アッセイが望ましい。精製または半精製タンパク質を用いて誘導され得るものなどの無細胞系で実施されるアッセイは、試験化合物によって媒介される分子標的における変化の迅速な発達および比較的容易な検出を可能にするためにそれらを生成することができる点で、「一次」スクリーンとして好ましいことが多い。さらに、試験化合物の細胞傷害性またはバイオアベイラビリティの効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系では一般に無視することができ、アッセイはその代わりに、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体ならびにその結合パートナー（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）の間の結合アフィニティの変化において明らかであり得るような分子標的に対する薬物の効果に主に焦点を当てたものである。
【０２９５】
単なる例示として、本開示の例示的なスクリーニングアッセイでは、関心のある化合物は、アッセイの意図に応じて適宜、通常ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドに結合し得る単離および精製されたＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と接触させられる。その後、化合物とＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体との混合物は、適当なＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）を含む組成物に加えられる。ヘテロ多量体−スーパーファミリーリガンド複合体の検出および定量は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体とその結合タンパク質との間の複合体の形成の阻害（または助長）における化合物の効力を決定するための手段を提供する。化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量応答曲線を生成することによって評価され得る。さらに、比較のためのベースラインを提供するためのコントロールアッセイもまた行われ得る。例えば、コントロールアッセイでは、単離および精製されたＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を含む組成物に加えられ、そして、ヘテロ多量体リガンド複合体の形成は、試験化合物の非存在下で定量される。一般に、反応物が混合され得る順序は変化し得、そして、同時に混合され得ることが理解される。さらに、適切な無細胞アッセイ系を与えるように、精製したタンパク質の代わりに、細胞の抽出物および溶解物が使用され得る。
【０２９６】
ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の、別のタンパク質への結合を、様々な技術によって検出することができる。例えば、複合体の形成の調節を、例えば、イムノアッセイ、またはクロマトグラフィー検出により、放射標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃもしくは３Ｈ）された、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ）された、もしくは酵素標識されたＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／もしくはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体などの検出可能に標識されたタンパク質ならびに／または結合タンパク質を使用して定量することができる。
【０２９７】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と、結合タンパク質との相互作用の程度を、直接的または間接的に測定する際の、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、光導波路（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサー、および表面力センサーに基づくものなどの、他の検出様式は、本開示の多くの実施形態と適合する。
【０２９８】
さらに、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と、結合パートナーとの相互作用を破壊する、または強化する薬剤を同定するための、「２ハイブリッドアッセイ」としても公知の相互作用捕捉アッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Zervosら（１９９３年）Cell  ７２巻：２２３〜２３２頁；Maduraら（１９９３年）J  Biol  Chem  ２６８巻：１２０４６〜１２０５４頁；Bartelら（１９９３年）Biotechniques  １４巻：９２０〜９２４頁；およびIwabuchiら（１９９３年）Oncogene  ８巻：１６９３〜１６９６頁を参照されたい。特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と、結合タンパク質との相互作用を解離させる化合物（例えば、小分子またはペプチド）を同定するための逆２ハイブリッド系の使用を企図する［VidalおよびLegrain（１９９９年）Nucleic  Acids  Res  ２７巻：９１９〜２９頁；VidalおよびLegrain（１９９９年）Trends  Biotechnol  １７巻：３７４〜８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号］。
【０２９９】
ある特定の実施形態では、対象化合物は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と相互作用するその能力によって同定される。化合物と、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体との相互作用は、共有結合性または非共有結合性であってもよい。例えば、そのような相互作用を、光架橋、放射標識リガンド結合、およびアフィニティクロマトグラフィーを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生化学的方法を使用して、タンパク質レベルで同定することができる［Jakoby  WBら（１９７４年）Methods  in  Enzymology  ４６巻：１頁］。ある特定の場合、化合物は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体に結合する化合物を検出するためのアッセイなどの、機構に基づくアッセイにおいてスクリーニングされ得る。これは、固相または液相結合事象を含んでもよい。あるいは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体をコードする遺伝子を、レポーター系（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質）と共に細胞中にトランスフェクトし、好ましくは、高効率スクリーニングにより、またはライブラリーの個々のメンバーを用いて、ライブラリーに対してスクリーニングすることができる。他の機構に基づく結合アッセイ；例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイを使用してもよい。結合アッセイを、ウェル、ビーズもしくはチップに固定された、または固定された抗体により捕捉された、またはキャピラリー電気泳動により分解された標的を用いて実施することができる。結合した化合物を、通常は比色終点または蛍光もしくは表面プラズモン共鳴を使用して検出することができる。
【０３００】
９．例示的な治療的使用
本明細書に記載されるように、出願人は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）が、単独で、または免疫療法剤と組み合わせて、例えば、がん患者における全身腫瘍組織量の減少および生存時間の増大を含む、がんの処置における驚くべき正の効果を有することを発見した。したがって、本開示は、部分的には、がんを処置するため、特に、がんの１つまたは複数の合併症を処置または防止するため（例えば、全身腫瘍組織量を減少させるため）に、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤（例えば、免疫療法剤）と組み合わせて、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用する方法を提供する。さらに、データは、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト療法の効能が、免疫系に依存することを示す。したがって、部分的には、本開示は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、単独で、または１つまたは複数の追加的な活性薬剤と組み合わせて、免疫療法剤として使用して、特に、様々ながん（例えば、免疫抑制および／または免疫疲弊と関連するがん）を処置することができるという発見に関する。他の公知の免疫腫瘍剤と同様、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが患者における免疫応答を強化する能力は、がんの分野の外ではるかに幅広い治療との関連を有し得る。例えば、免疫強化剤は、様々な感染性疾患、特に、免疫抑制および／または免疫疲弊を促進する病原因子を処置する際に有用であり得ることが提唱されている。また、そのような免疫強化剤は、ワクチン（例えば、感染性疾患およびがんワクチン）の免疫化効能を強化する際に有用であり得る。したがって、本開示は、単独で、または組み合わせて、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と共に使用して、免疫応答を増加させることを必要とする対象における免疫応答を増加させる、がんを処置する、感染性疾患を処置する、および／またはワクチン接種／免疫化効能を増加させることができる様々なＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを提供する。
【０３０１】
本明細書に記載され、特許請求される方法およびＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、悪性または前悪性状態を処置する、および本明細書に記載の障害を含むがこれらに限定されない、新生物または悪性状態への進行を防止することができる。そのような使用は、特に、過形成、化生、または最も特には、異形成からなる非新生物性細胞増殖が起こった場合に、新生物またはがんへの進行に先行することが知られる、または疑われる状態で示される。
【０３０２】
ある特定の態様では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体）を使用して、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者におけるがんまたは腫瘍を処置することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、がんまたは腫瘍細胞の増殖を阻害することを必要とする患者におけるがんまたは腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、がんまたは腫瘍の進行を阻害することを必要とする患者におけるがんまたは腫瘍の進行を阻害することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、がんまたは腫瘍の転移を阻害または防止することを必要とする患者におけるがんまたは腫瘍の転移を阻害または防止することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、がんまたは腫瘍細胞の組織量を減少させることを必要とする患者におけるがんまたは腫瘍細胞の組織量を減少させることができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、がんまたは腫瘍細胞に対する免疫応答を増強することを必要とする患者におけるがんまたは腫瘍細胞に対する免疫応答を増強することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者における抗がん／腫瘍免疫応答を回避する免疫抑制と関連する、またはそれを用いるがんまたは腫瘍を処置することができる。
【０３０３】
一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体）を使用して、がんまたは腫瘍を処置することを必要とする患者における抗がん／腫瘍Ｔ細胞活性を回避するＴ細胞疲弊と関連する、またはそれを用いるがんまたは腫瘍を処置することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、抗がん／腫瘍免疫応答を増加させることを必要とする患者における抗がん／腫瘍免疫応答を増加させることができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、Ｔ細胞活性を増加させることを必要とする患者におけるＴ細胞活性を増加させることができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、免疫抑制と関連する疾患または状態のリスクがある対象を処置することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、免疫抑制と関連する疾患または状態のリスクがある対象を処置することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、免疫抑制を処置または防止することを必要とする患者における免疫抑制を処置または防止することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、Ｔ細胞疲弊と関連する疾患もしくは状態のリスクがある、またはＴ細胞疲弊を生じるリスクがある対象を処置することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、Ｔ細胞疲弊を処置または防止することを必要とする対象におけるＴ細胞疲弊を処置または防止することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、がんまたは細胞増殖疾患もしくは障害の症状を防止する、処置する、または軽減することを必要とする対象における、がんまたは細胞増殖疾患もしくは障害の症状を防止する、処置する、または軽減することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、免疫療法に応答するがんまたは腫瘍を阻害する、処置する、または防止することができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、免疫監視を増加させることを必要とする対象における免疫監視を増加させることができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび／または活性薬剤を使用して、がんまたは腫瘍細胞に対する免疫を増加させることを必要とする対象におけるがんまたは腫瘍細胞に対する免疫を増加させることができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび／または活性薬剤を使用して、感染性疾患に対する免疫を増加させることを必要とする対象における感染性疾患に対する免疫を増加させることができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、受動免疫を能動免疫に変換させることを必要とする対象における標的（例えば、がん細胞または感染性因子）に対する受動免疫を能動免疫に変換させることができる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、内因性免疫応答を強化することを必要とする対象（例えば、がん患者または感染性疾患を有する患者）における内因性免疫応答を強化することができる。ある特定の実施形態では、処置のための好ましい対象は、免疫応答の増加を必要とする患者である。
【０３０４】
本明細書中で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計的試料において、無処置の対照試料に対して、処置試料における障害もしくは状態の出現を低下させるか、あるいは、無処置の対照試料に対して、障害もしくは状態の１または複数の症状の発症を遅延させるか、または、重篤度を低下させるような化合物を指す。
【０３０５】
用語「処置する」は、本明細書中で使用される場合、一度確立された状態の改善もしくは除去を含む。いずれの場合にも、予防または処置は、医師または他の医療提供者によって提供される診断、および、治療剤の投与の意図される結果において認識され得る。
【０３０６】
一般に、本開示に記載される疾患または状態の処置または防止は、任意選択で、１つまたは複数の追加的な活性薬剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）と組み合わせた、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、有効量で投与することによって達成される。薬剤の有効量とは、所望の治療または予防結果を達成するのに必要な用量で、および期間にわたって有効な量を指す。本開示の薬剤の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を惹起する薬剤の能力などの因子に応じて変化し得る。予防有効量とは、所望の予防結果を達成するのに必要な用量で、および期間にわたって有効な量を指す。
【０３０７】
一般に、腫瘍とは、良性および悪性のがん、ならびに休止状態の腫瘍を指す。一般に、がんとは、一次悪性細胞または腫瘍（例えば、細胞が元の悪性腫瘍または腫瘍の部位以外の対象の体内の部位に移動していないもの）および二次悪性細胞または腫瘍（例えば、元の腫瘍の部位とは異なる二次的な部位への悪性細胞または腫瘍細胞の移動である転移から生じるもの）を指す。転移は、局所性または遠隔性であり得る。転移は、特定の症状のモニタリングに加えて、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）走査、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）走査、血液および血小板計数、肝機能検査、胸部Ｘ線、骨走査の単独使用または組み合わせた使用、ならびにその組合せにより検出されることが最も多い。
【０３０８】
一般に、免疫応答とは、刺激原に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞（ＣＤ４もしくはＣＤ８）、調節性Ｔ細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、好塩基球、好酸球、または好中球などの免疫系の細胞による応答を指す。一部の実施形態では、応答は、特定の抗原に特異的であり（「抗原特異的応答」）、その抗原特異的受容体を介する、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、またはＢ細胞による応答を指す。一部の実施形態では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答である。これらの細胞によるそのような応答は、例えば、細胞傷害、増殖、サイトカインもしくはケモカイン産生、輸送、または食作用を含んでもよく、応答を受けている免疫細胞の性質に依存し得る。免疫応答は、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん性もしくは他の異常な細胞、または自己免疫もしくは病理的炎症の場合、正常細胞もしくは組織の選択的標的化、それへの結合、それに対する損傷、その破壊、および／またはその体内からの排除をもたらし得る。
【０３０９】
宿主免疫応答の免疫抑制は、持続感染および腫瘍免疫抑制におけるものなどの、様々な慢性免疫状態において役割を果たしている。免疫系に関して、本明細書で使用される場合、「非応答性」または「機能的疲弊」は一般に、活性化受容体またはサイトカインによる刺激などの刺激に対する免疫細胞の不応性（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｉｔｙ）を指す。非応答性は、例えば、免疫抑制剤への曝露、高用量もしくは一定用量の抗原への曝露のため、またはＰＤ−１もしくはＴＩＭ−３などの阻害剤受容体の活性によって生じ得る。本明細書で使用される場合、用語「非応答性」は、活性化刺激に対する不応性を含む。そのような不応性は、一般に、抗原特異的であり、抗原への曝露が停止した後にも持続する。非応答性免疫細胞は、同じ型の対応する対照免疫細胞と比較して、細胞傷害活性、サイトカイン産生、増殖、輸送、食作用活性、またはそれらの任意の組合せの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには１００％の減少を有し得る。
【０３１０】
一般に、免疫療法とは、免疫応答を誘導すること、増強すること、抑制すること、またはそうでなければ改変することを含む方法による、疾患に罹患した、または疾患の再発に罹る、もしくは罹患するリスクがある対象の処置を指す。
【０３１１】
一般に、免疫応答の強化とは、対象における現存の免疫応答の有効性または効力の活性化または増大を指す。有効性および効力のこの活性化または増大は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機構に打ち勝つことにより、または内因性宿主免疫応答を活性化／増強する機構を刺激することにより達成され得る。
【０３１２】
任意選択で、本開示の１つまたは複数の追加的な活性薬剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、子宮頸部、膵臓、直腸、前立腺、胃、表皮のがん；リンパ球または骨髄系列の造血腫瘍；線維肉腫または横紋筋肉腫などの間葉起源の腫瘍；メラノーマ、奇形癌、神経芽腫、神経膠腫、腺癌および非小細胞肺癌などの他の腫瘍型を含むがこれらに限定されない、様々な形態のがんの処置において使用することができる。がんの例は、癌腫、リンパ腫、グリア芽腫、メラノーマ、肉腫、および白血病、骨髄腫、またはリンパ性悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない。そのようながんのより特定の例は、以下に記載され、扁平上皮がん（例えば、扁平上皮細胞がん）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌および肺の扁平上皮が癌を含む肺がん、腹膜のがん、肝細胞がん、胃腸がんを含む胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ、ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵がん、多形成グリア芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、肝癌、肝細胞癌、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様がん、分化甲状腺癌、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮癌、唾液腺癌、腎臓がんまたは腎がん、前立腺がん、外陰がん、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部がんを含む。
【０３１３】
がんまたは悪性腫瘍の他の例は、急性リンパ芽球性小児白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞がん、成人（原発性）肝臓がん、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓がん、成人軟部組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門がん、星状細胞腫、胆管がん、骨肉腫、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳がん、腎盂および尿管のがん、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸がん、小児（原発性）肝細胞がん、小児（原発性）肝臓がん、急性リンパ芽球性小児白血病、急性骨髄性小児白血病、小児脳幹グリオーマ、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視経路神経膠腫、リンパ芽球性小児白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児原発性肝臓がん、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視経路および視床下部神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膵内分泌腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、上皮がん、食道がん、ユーイング肉腫および関連腫瘍、膵外分泌腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、女性乳がん、ゴーシェ病、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭がん、大腸がん、眼内メラノーマ、膵島細胞癌、膵島細胞がん、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、肝臓がん、肺がん、リンパ増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳がん、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、メラノーマ、中皮腫、転移性原発不明扁平上皮頸部がん、転移性原発性扁平上皮頸部がん、転移性扁平上皮頸部がん、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非メラノーマ皮膚がん、非小細胞肺がん、原発不明転移性扁平上皮頸部がん、口腔咽頭がん、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵がん、異常タンパク血症、副甲状腺がん、陰茎がん、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓がん、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂および尿管がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮頸部がん、胃がん、テント上原始神経外胚葉および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、胸腺腫、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、移行腎盂および尿管がん、絨毛性腫瘍、尿管および腎盂細胞がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、視経路および視床下部神経膠腫、外陰がん、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに上に列挙された臓器系に位置する、新生物を除く任意の他の過増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。
【０３１４】
異形成は、頻繁には、がんの前兆であり、主に上皮に見出される。それは、個々の細胞均一性および細胞の構造的な向きの喪失を含む、最も無秩序な形態の非新生物性細胞増殖である。異形成は、特徴的には、慢性的な刺激または炎症が存在する場所で生じる。一部の実施形態では、任意選択で、１つまたは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、異形成障害を処置することができる。異形成障害は、無汗性外胚葉性形成異常、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成（ａｔｒｉｏｄｉｇｉｔａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、気管支肺異形成、脳異形成、子宮頸部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、半肢骨端異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ  ｈｅｍｉｍｅｌｉａ）、多発性骨端異形成、点状骨端異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ  ｐｕｎｃｔａｔａ）、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、下顎の家族性線維性異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、線維性骨異形成、開花性骨異形成、遺伝性腎−網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、発汗減少症性外胚葉異形成、リンパ球減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成（ｍｅｔａｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、モンディーニ型内耳異形成、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯原性異形成、眼下顎四肢異形成、根尖性セメント質異形成、多発性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成、および心室橈骨異形成を含むが、これらに限定されない。
【０３１５】
任意選択で、１つまたは複数の追加的な活性薬剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置され得るさらなる前新生物障害は、良性増殖異常障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大、腸ポリープまたはアデノーマ、および食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、および日光性角化症を含むがこれらに限定されない。
【０３１６】
任意選択で、１つまたは複数の追加的な活性薬剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置され得るさらなる過増殖性疾患、障害、および／または状態は、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、ならびに線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫などの肉腫および癌腫、結腸癌、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫（emangioblastoma）、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、および網膜芽細胞腫などの肉腫および癌腫を含むがこれらに限定されない固形腫瘍などの悪性腫瘍および関連障害の進行および／または転移を含むがこれらに限定されない。
【０３１７】
ある特定の態様では、細胞傷害剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、免疫調節剤、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素または他の活性薬剤などのがん治療剤を、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせて使用することができる。有用な薬物は、例えば、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、アルカロイド剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、およびその組合せから選択される薬学的特性を有し得る。
【０３１８】
本明細書で使用される場合、「と組み合わせた」、「共同投与」、「共同的に」とは、さらなる療法（例えば、第２、第３、第４など）が体内で依然として有効である（例えば、複数の化合物が患者において同時に有効であり、これらの化合物の相乗効果を含んでもよい）ような任意の形態の投与を指す。有効性は、血液、血清、または血漿中での薬剤の測定可能な濃度と相関しなくてもよい。例えば、異なる治療化合物を、同時に、または連続的に、異なるスケジュールで、同じ製剤中で、または別々の製剤中で投与することができる。かくして、そのような処置を受ける個体は、異なる療法の組み合わせた効果から利益を得ることができる。本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、１つまたは複数の他のさらなる薬剤および／または支持療法（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫チェックポイント阻害剤）と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、それぞれの治療剤は、その特定の薬剤について決定された用量および／または時間スケジュールで投与されるであろう。レジメンにおいて使用するための特定の組合せは、本開示のアンタゴニストと、療法および／または所望のものとの適合性を考慮に入れる。
【０３１９】
有用な薬物の例は、フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、アミノグルテチミド、アムサクリン、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ビカルタミド、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カペシタビン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シプロテロン、クロドロナート、ダカルバジン、ダサチニブ、ジエネストロール、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フィンゴリモッド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、フルオキシメステロン、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルドロコルチゾン、フルダラビン、フルタミド、ゴセレリン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イブルチニブ、イダルビシン、レバミソール、イデラリシブ、イフォスファミド、イマチニブ、レトロゾール、アスパラギナーゼ、ロイプロリド、ラパチニブ、レノリダミド、ロイコボリン、イリノテカン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メゲストロール、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニルタミド、ミトラマイシン、マイトマイシン、ノコダゾール、オクトレオチド、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソウレア、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、オキサリプラチン、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、プリカマイシン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、ポルフィマー、テモゾロミド、メスナ、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランス白金、サリドマイド、チオグアニン、ラルチトレキセド、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、リツキシマブ、パミドロナート、ビンクリスチン、ビンカアルカロイドおよびＺＤ１８３９を含むがこれらに限定されない。
【０３２０】
有用な毒素は、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えば、オンコナーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エントロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス菌外毒素、およびシュードモナス菌内毒素を含んでもよい。
【０３２１】
有用なケモカインは、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−アルファ、ＭＩＰ１−ベータおよびＩＰ−１０を含んでもよい。
【０３２２】
ある特定の実施形態では、アンギオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰｌＧＦペプチドおよび抗体、抗血管増殖因子抗体、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体およびペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ移動阻害因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン−１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−ベータ、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ポリ硫酸ペントサン、アンギオポエチン−２、インターフェロン−アルファ、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノミド（ロキニメックス）、サリドマイド、ペントキシフェリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アックチン、アンギオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４、ＡＬＫ１ポリペプチド（例えば、ダランテルセプト）またはミノサイクリンなどの抗血管新生剤が、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせて有用であり得る。
【０３２３】
有用な免疫調節剤は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチンおよびその組合せから選択され得る。特に有用なものは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロン−アルファ、−ベータ、または−ラムダなどのインターフェロン、ならびに「Ｓ１因子」と命名されたものなどの幹細胞増殖因子である。サイトカインに含まれるものは、ヒト増殖ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト増殖ホルモン、およびウシ増殖ホルモンなどの増殖ホルモン；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；ミュラー管阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦβなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−アルファ、−ベータ、および−ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５などのインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、ｋｉｔリガンドまたはＦＬＴ−３、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子およびＬＴである。
【０３２４】
有用な放射性核種は、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ｐｂ、および２２７Ｔｈを含むがこれらに限定されない。治療的放射性核種は、好ましくは、オージェ放射体については２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくは、６０〜２００ｋｅＶの範囲、ベータ放射体については１００〜２，５００ｋｅＶ、およびアルファ放射体については４，０００〜６，０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有する。有用なベータ粒子を放出する核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。また、オージェ放出粒子と共に実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍおよびＩｒ−１９２である。有用なベータ粒子を放出する核種の崩壊エネルギーは、好ましくは１，０００ｋｅＶ未満、より好ましくは１００ｋｅＶ未満、最も好ましくは７０ｋｅＶ未満である。また、アルファ粒子の生成と共に実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。そのような放射性核種は、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｔｈ−２２７およびＦｍ−２５５を含むがこれらに限定されない。有用なアルファ粒子を放出する放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。有用なさらなる潜在的な放射性同位体は、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、および１６９Ｙｂを含む。
【０３２５】
一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくとも１つのアルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、コルチコステロイドホルモン、性ホルモン、および／または標的抗腫瘍化合物と組み合わせた使用のためのものである。
【０３２６】
標的抗腫瘍化合物は、標準的な化学療法薬ができるよりも特異的にがん細胞を攻撃するように設計された薬物である。これらの化合物の多くは、ある特定の遺伝子の変異を担持する細胞、またはこれらの遺伝子のコピーを過剰発現する細胞を攻撃する。一実施形態では、抗腫瘍化合物は、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、またはベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）であってもよい。
【０３２７】
アルキル化剤は、ＤＮＡに直接作用して、がん細胞が増殖するのを防止する。これらの薬剤は、細胞周期の任意の特定の期に特異的なものではない。一実施形態では、アルキル化剤を、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イフォスファミド、デカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（窒素マスタード）、メルファラン、およびテモゾロミドから選択することができる。
【０３２８】
代謝拮抗剤は、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成を阻害する薬物のクラスを構成する。これらの薬剤は、細胞周期のＳ期の間に作用し、白血病、乳房、卵巣、および消化管の腫瘍、ならびに他のがんを処置するために一般的に使用される。一実施形態では、代謝拮抗剤は、５−フルオロウラシル、カペシタビン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、フルダラビン、またはペメトレキセドであり得る。
【０３２９】
トポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ複製において重要であるトポイソメラーゼ酵素を阻害する薬物である。トポイソメラーゼＩ阻害剤の一部の例としては、トポテカンおよびイリノテカンが挙げられるが、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の一部の代表例としては、エトポシド（ＶＰ−１６）およびテニポシドが挙げられる。
【０３３０】
アントラサイクリンも、ＤＮＡ複製に関与する酵素を阻害する化学療法薬である。これらの薬剤は、細胞周期の全ての期において作用し、かくして、様々ながんの処置として広く使用されている。一実施形態では、本発明に関して使用されるアントラサイクリンは、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、またはミトキサントロンであり得る。
【０３３１】
腫瘍は、特に、腫瘍抗原に特異的であるＴ細胞中で、ある特定の免疫チェックポイント経路を同時選択することによって免疫監視を回避する（Pardoll、２０１２年、Nature  Reviews  Cancer  １２巻：２５２〜２６４頁）。がん療法のためのチェックポイント阻害剤抗体に関する研究は、がん処置に対して耐性であると以前は考えられていたがんを処置するのに成功している（例えば、OttおよびBhardwaj、２０１３年、Frontiers  in  Immunology  ４巻：３４６頁；MenziesおよびLong、２０１３年、Ther  Adv  Med  Oncol  ５巻：２７８〜８５頁；Pardoll、２０１２年、Nature  Reviews  Cancer  １２巻：２５２〜６４頁；MavilioおよびLugliを参照されたい）。大部分の抗がん剤とは対照的に、チェックポイント阻害剤は腫瘍細胞を直接標的化するのではなく、リンパ球受容体またはそのリガンドを標的化して、免疫系の内因性抗腫瘍活性を増強する（Pardoll、２０１２年、Nature  Reviews  Cancer  １２巻：２５２〜２６４頁）。そのような阻害剤は主として、疾患を有する細胞、組織または病原体に対する免疫応答を調節することによって作用するため、それらを、そのような薬剤の抗腫瘍効果を増強するための対象となるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡＤＣおよび／またはインターフェロンなどの他の治療モダリティーと組み合わせて使用することができる。
【０３３２】
抗ＰＤ１抗体は、メラノーマ、非小細胞肺がん、膀胱がん、前立腺がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、トリプルネガティブ乳がん、白血病、リンパ腫および腎細胞がんの処置のために使用されてきた（Topalianら、２０１２年、N  Engl  J  Med  ３６６巻：２４４３〜５４頁；Lipsonら、２０１３年、Clin  Cancer  Res  １９巻：４６２〜８頁；Bergerら、２００８年、Clin  Cancer  Res  １４巻：３０４４〜５１頁；Gildener-Leapmanら、２０１３年、Oral  Oncol  ４９巻：１０８９〜９６頁；MenziesおよびLong、２０１３年、Ther  Adv  Med  Oncol  ５巻：２７８〜８５頁）。例示的な抗ＰＤ１抗体としては、ランブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、ＭＥＲＣＫ）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＡＭＰ−２２４（Ｍｅｒｃｋ）、およびピディリズマブ（ＣＴ−０１１、Ｃｕｒｅｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（ＡＢ１３７１３２）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１−１４）およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から市販されている。
【０３３３】
抗ＣＴＬ４Ａ抗体は、メラノーマ、前立腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がんの処置のための臨床試験において使用されている（RobertおよびGhiringhelli、２００９年、Oncologist  １４巻：８４８〜６１頁；Ottら、２０１３年、Clin  Cancer  Res  １９巻：５３００頁；Weber、２００７年、Oncologist  １２巻：８６４〜７２頁；Wadaら、２０１３年、J  Transl  Med  １１巻：８９頁）。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体としては、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）およびトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（ＡＢ１３４０９０）、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．（１１１５９−Ｈ０３Ｈ、１１１５９−Ｈ０８Ｈ）、およびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ（ＰＡ５−２９５７２、ＰＡ５−２３９６７、ＰＡ５−２６４６５、ＭＡ１−１２２０５、ＭＡ１−３５９１４）から市販されている。イピリムマブは、転移性メラノーマの処置について最近ＦＤＡ認可を受けた（Wadaら、２０１３年、J  Transl  Med  １１巻：８９頁）。
【０３３４】
ＣＴＬＡ４、ＰＤ１およびＰＤ−Ｌ１に対するチェックポイント阻害剤が最も臨床的に進んでいるが、他の潜在的なチェックポイント抗原が公知であり、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４およびＴＩＭ３などの、対象となるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせた治療的阻害剤の標的として使用することができる（Pardoll、２０１２年、Nature  Reviews  Cancer  １２巻：２５２〜２６４頁）。腫瘍および／または病原体に対する免疫応答を刺激するこれらの薬剤および他の公知の薬剤を、ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストと組み合わせて、単独で、またはがん療法の改善のために、インターフェロン−アルファなどのインターフェロン、および／または抗体−薬物コンジュゲートとさらに組み合わせて使用することができる。組み合わせて使用することができる他の公知の共刺激経路モジュレーターは、アガトリモッド、ベラタセプト、ブリナツモマブ、ＣＤ４０リガンド、抗Ｂ７−１抗体、抗Ｂ７−２抗体、抗Ｂ７−Ｈ４抗体、ＡＧ４２６３、エリトラン、抗ＯＸ４０抗体、ＩＳＦ−１５４、およびＳＧＮ−７０；Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ４８、ＬＦＡ−３、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、熱安定抗原、Ｂ７ｈ、ＯＸ４０リガンド、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ７０およびＣＤ２４を含むがこれらに限定されない。
【０３３５】
治療剤は、光活性剤または色素を含んでもよい。蛍光色素、および他の色原体などの蛍光組成物、または可視光線に対して感受性のポルフィリンなどの色素が、病変に好適な光を向けることによって病変を検出し、処置するために使用されている。療法において、これは、光線照射、光線療法、または光線力学的療法と呼ばれている。Joniら（編）、PHOTODYNAMIC  THERAPY  OF  TUMORS  AND  OTHER  DISEASES（Libreria  Progetto  １９８５年）；van  den  Bergh、Chem.  Britain（１９８６年）、２２巻：４３０頁を参照されたい。さらに、モノクローナル抗体を、光線療法を達成するために、光活性化色素と結合させた。Mewら、J.  Immunol.（１９８３年）、１３０巻：１４７３頁；同著者、Cancer  Res.（１９８５年）、４５巻：４３８０頁；Oseroffら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA（１９８６年）、８３巻：８７４４頁；同著者、Photochem.  Photobiol.（１９８７頁）、４６巻：８３頁；Hasanら、Prog.  Clin.  Biol.  Res.（１９８９年）、２８８巻：４７１頁；Tatsutaら、Lasers  Surg.  Med.（１９８９年）、９巻：４２２頁；Pelegrinら、Cancer（１９９１年）、６７巻：２５２９頁を参照されたい。
【０３３６】
他の有用な治療剤は、好ましくは、ｂｃｌ−２またはｐ５３などの、がん遺伝子およびがん遺伝子産物に対するオリゴヌクレオチド、特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。好ましい形態の治療的オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡである。当業者であれば、任意のｓｉＲＮＡまたは干渉ＲＮＡ種を、標的組織への送達のために抗体またはそのフラグメントに結合させることができることを認識できる。様々な標的に対する多くのｓｉＲＮＡ種が当該分野で公知であり、任意のそのような公知のｓｉＲＮＡを、特許請求された方法および組成物において使用することができる。
【０３３７】
潜在的に有用な公知のｓｉＲＮＡ種としては、ＩＫＫ−ガンマ（米国特許第７，０２２，８２８号）；ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１およびＦｌｋ−１／ＫＤＲ（米国特許第７，１４８，３４２号）；Ｂｃｌ２およびＥＧＦＲ（米国特許第７，５４１，４５３号）；ＣＤＣ２０（米国特許第７，５５０，５７２号）；トランスダクチン（ベータ）様３（米国特許第７，５７６，１９６号）；ＫＲＡＳ（米国特許第７，５７６，１９７号）；炭酸脱水酵素ＩＩ型（米国特許第７，５７９，４５７号）；補体成分３（米国特許第７，５８２，７４６号）；インターロイキン−１受容体関連キナーゼ４（ＩＲＡＫ４）（米国特許第７，５９２，４４３号）；スルビビン（米国特許第７，６０８，７０７０号）；スーパーオキシドジスムターゼ１（米国特許第７，６３２，９３８号）；ＭＥＴプロトオンコジーン（米国特許第７，６３２，９３９号）；アミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）（米国特許第７，６３５，７７１号）；ＩＧＦ−１Ｒ（米国特許第７，６３８，６２１号）；ＩＣＡＭ１（米国特許第７，６４２，３４９号）；補体因子Ｂ（米国特許第７，６９６，３４４号）；ｐ５３（米国特許第７，７８１，５７５号）、およびアポリポタンパク質Ｂ（米国特許第７，７９５，４２１号）に特異的なものが挙げられ、それぞれの参照された特許の実施例のセクションは参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３８】
さらなるｓｉＲＮＡ種は、特に、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆ．）、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）およびＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）などの公知の商業的供給源から入手可能である。ｓｉＲＮＡ種の他の公共的に入手可能な供給源としては、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＣｅｎｔｒｅのｓｉＲＮＡｄｂデータベース、ＭＩＴ／ＩＣＢＰ  ｓｉＲＮＡデータベース、Ｂｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＲＮＡｉ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｓｈＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ、およびＮＣＢＩのＰｒｏｂｅデータベースが挙げられる。例えば、ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｂｅデータベース中に３０，８５２のｓｉＲＮＡ種がある。当業者であれば、任意の目的の遺伝子について、ｓｉＲＮＡ種が既に設計されているか、または公共的に利用可能なソフトウェアツールを使用して容易に設計することができることを認識できる。任意のそのようなｓｉＲＮＡ種を、対象となるＤＮＬ．ＴＭ．複合体を使用して送達することができる。
【０３３９】
ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト免疫療法は、ワクチン接種プロトコルと組み合わせた場合に、より有効であり得る。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験戦略が考案されている（Rosenberg,  S.、２０００年、Development  of  Cancer  Vaccines、ASCO  Educational  Book  Spring：６０〜６２頁；Logothetis,  C.、２０００年、ASCO  Educational  Book  Spring：３００〜３０２頁；Khayat,  D.２０００年、ASCO  Educational  Book  Spring：４１４〜４２８頁；Foon,  K.  ２０００年、ASCO  Educational  Book  Spring：７３０〜７３８頁を参照されたい；また、DeVita,  V.ら（編）、１９９７年、Cancer:  Principles  and  Practice  of  Oncology、第５版中のRestifo,  N.およびSznol,  M.、Cancer  Vaccines、第６１章、３０２３〜３０４３頁も参照されたい）。これらの戦略の１つでは、ワクチンは、自己または同種異系腫瘍細胞を使用して調製される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入された場合、有効性が増加することが示されている（Dranoffら（１９９３年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  ９０巻：３５３９〜４３頁）。したがって、一部の実施形態では、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、がん性細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子を含む）、細胞、および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞などの、免疫原性薬剤と組み合わせることができる（Heら（２００４年）J.  Immunol.１７３巻：４９１９〜２８頁）。使用することができる腫瘍ワクチンの非限定例としては、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／もしくはチロシナーゼのペプチドなどのメラノーマ抗原のペプチド、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる。
【０３４０】
様々な腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義をもたらした（Rosenberg,  S  A（１９９９年）Immunity  １０巻：２８１〜７頁）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍中で、および腫瘍が生じた細胞中で発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、およびＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主に見出される腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であると示すことができる。ＰＤＬ１遮断剤を、腫瘍中で発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの収集物と一緒に使用して、これらのタンパク質に対する免疫応答を生成させることができる。これらのタンパク質は通常、自己抗原として免疫系によって見られ、したがって、それらに対して寛容である。腫瘍抗原はまた、染色体のテロメアの合成にとって必要であり、８５％を超えるヒトがんにおいて、および限られた数の体細胞組織においてのみ発現される、タンパク質テロメラーゼを含んでもよい（Kim,  Nら（１９９４年）Science  ２６６巻：２０１１〜２０１３頁）。これらの体細胞組織を、様々な手段によって免疫攻撃から保護することができる。タンパク質配列を変化させる、もしくは２つの非関連配列間の融合タンパク質（例えば、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ染色体中のｂｅｒ−ａｂｌ）を作出する体細胞変異、またはＢ細胞腫瘍に由来するイディオタイプのため、腫瘍抗原はまた、がん細胞中で発現される「新抗原」であってもよい。
【０３４１】
他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）ならびにカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＨＳＶ）などのヒトがんに関与するウイルスに由来するタンパク質を含んでもよい。ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト療法と一緒に使用することができる別の形態の腫瘍特異的抗原は、腫瘍組織自体から単離される精製熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞に由来するタンパク質のフラグメントを含有し、これらのＨＳＰは腫瘍免疫を惹起するための抗原提示細胞への送達において非常に有効である（Suot,  RおよびSrivastava,  P（１９９５年）Science  ２６９巻：１５８５〜１５８８頁；Tamura,  Y.ら（１９９７年）Science  ２７８巻：１１７〜１２０頁）。
【０３４２】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答をプライミングするために使用することができる強力な抗原提示細胞である。ＤＣをエクスビボで産生させ、それに、様々なタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物をロードすることができる（Nestle,  F.ら（１９９８年）Nature  Medicine  ４巻：３２８〜３３２頁）。同様に遺伝的手段によってＤＣを形質導入して、これらの腫瘍抗原を発現させることもできる。また、免疫化のために、ＤＣを腫瘍細胞に直接的に融合させた（Kugler,  A.ら（２０００年）Nature  Medicine  ６巻：３３２〜３３６頁）。ワクチン接種の方法として、ＤＣの免疫化を、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと有効に組み合わせて、より強力な抗腫瘍応答を活性化することができる。
【０３４３】
本開示の他の方法は、特定の毒素または病原体に曝露された患者を処置するために使用される。したがって、本開示の別の態様は、対象における感染性疾患（例えば、ウイルス、細菌または寄生虫感染）を処置または防止するための方法であって、感染性疾患を処置または防止することを必要とする対象に、治療有効量の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを投与することを含み、任意選択で、感染性疾患を処置するための１つもしくは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤を投与することをさらに含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、例えば、感染性疾患に罹患した対象における内因性免疫応答を強化することによって、対象における感染性疾患を処置するための方法であって、対象に、治療有効量の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを投与することを含み、任意選択で、感染性疾患を処置するための１つもしくは複数の追加的な支持療法および／または活性薬剤を投与することをさらに含む、方法を提供する。
【０３４４】
感染性ウイルスの例は、レトロウイルス科；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（胃腸炎を引き起こす株など）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（例えば、ハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アリーナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（多くのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１およびＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（アフリカ豚コレラウイルスなど）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ型非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部伝染；クラス２＝非経口伝染（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび方法は、これらのウイルス因子による感染の処置における使用について企図される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、例えば、ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連合併症、水痘、風邪、ウイルス性気管支炎、サイトメガロウイルス感染、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、流行性耳下腺炎、「手足口」病、肝炎、単純ヘルペス、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ（インフル）、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、感染性単核球症、おたふく風邪、ポリオウイルス感染症、進行性多巣性白質脳症、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、天然痘、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、西ナイル熱、および黄熱病を含むウイルス感染を処置または防止するために、任意選択で、１つもしくは複数の支持療法および／または活性薬剤と組み合わせて、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用する方法を提供する。
【０３４５】
感染性細菌の例は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐ（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅなど）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ビリダンス群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉａ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉを含むがこれらに限定されない。本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩ組成物および方法は、これらの細菌性因子による感染の処置における使用について企図される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、例えば、炭疽、細菌性成人呼吸窮迫症候群、細菌性髄膜炎、ブルセラ症、カンピロバクター感染症、猫ひっかき病、気管支炎、コレラ、ジフテリア、発疹チフス、淋病、レジオネラ症、らい病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、類鼻疽、ＭＲＳＡ感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、ノカルジア症、腎炎、糸球体腎炎、歯周病、ペルツシス（百日咳）、ペスト、肺炎球菌性肺炎、オウム病、Ｑ熱、ロッキー山発疹熱（ＲＭＳＦ）、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、敗血性ショック、出血性ショック、敗血症候群、破傷風、トラコーマ、結核、ツラレミア、腸チフスを含む細菌感染を処置または防止するために、任意選択で、１つもしくは複数の支持療法および／または活性薬剤と組み合わせて、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用する方法を提供する。
【０３４６】
感染性真菌の例は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを含むがこれらに限定されない。本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび方法は、これらの真菌因子による感染の処置における使用について企図される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、例えば、アスペルギルス症；鵝口瘡、クリプトコッカス症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症、およびヒストプラスマ症を含む真菌感染を処置または防止するために、任意選択で、１つもしくは複数の支持療法および／または活性薬剤と組み合わせて、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用する方法を提供する。
【０３４７】
感染性寄生虫の例は、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｓｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓを含むがこれらに限定されない。本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび方法は、これらの因子による感染の処置における使用について企図される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、例えば、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ症、回虫症、バベシア症、シャーガス病、肝吸虫症、クリプトスポリジウム症、神経嚢虫症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、自由生息アメーバ感染、ランブル鞭毛虫症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、カラアザール、レーシュマニア症、マラリア、メタゴニムス症、ハエウジ症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、蟯虫感染、疥癬、住血吸虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫病（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌｏｓｉｓ）、旋毛虫病（Ｔｒｉｃｈｉｎｏｓｉｓ）、鞭虫症、およびトリパノソーマ症を含む真菌感染を処置または防止するために、任意選択で、１つもしくは複数の支持療法および／または活性薬剤と組み合わせて、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用する方法を提供する。
【０３４８】
一部の実施形態では、本開示は、感染性疾患を処置することを必要とする患者に、有効量のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、単独で、または感染性疾患（病原体）を処置するための第２の治療剤、例えば、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、または抗寄生虫薬と組み合わせて投与することによって、感染性疾患を処置する方法を提供する。
【０３４９】
一般に、抗生物質とは、細菌の増殖を阻害する、または細菌を殺傷する任意の化合物を指す。抗生物質の有用な非限定例としては、リンコサミド（クリンドマイシン）；クロラムフェニコール；テトラサイクリン（テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンなど）；アミノグリコシド（ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、アミカシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシンなど）；ベータラクタム（ペニシリン、セファロスポリン、イミペネム、アズトレオナムなど）；バンコマイシン；バシトラシン；マクロライド（エリスロマイシン）、アンホテリシン；スルホンアミド（スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフィソキサゾール、スルファシチン、スルファドキシン、マフェニド、ｐ−アミノ安息香酸、トリメトプリム−スルファメトキサゾールなど）；メテナミン；ニトロフラントイン；フェナゾピリジン；トリメトプリム；リファンピシン；メトロニダゾール；セファゾリン；リンコマイシン；スペクチノマイシン；ムピロシン；キノロン（ナリジクス酸、シノキサシン、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、ペルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、レボフロキサシンなど）；ノボビオシン；ポリミキシン；グラミシジン；および抗緑膿菌剤（カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリンなど）またはその任意の塩もしくは改変体が挙げられる。Physician's  Desk  Reference、第５９版（２００５年）、Thomson  P  D  R、Montvale  N.J.；Gennaroら編、Remington's  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、第２０版（２０００年）、Lippincott  Williams  and  Wilkins、Baltimore  Md.；Braunwaldら編、Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、第１５版（２００１年）、McGraw  Hill、NY；Berkowら編、The  Merck  Manual  of  Diagnosis  and  Therapy（１９９２年）、Merck  Research  Laboratories、Rahway  N.J.も参照されたい。使用される抗生物質は、細菌感染の型に依存するであろう。
【０３５０】
一般に、抗真菌剤とは、真菌の増殖を阻害する、または真菌を殺傷する任意の化合物を指す。非限定例としては、イミダゾール（グリセオフルビン、ミコナゾール、テルビナフィン、フルコナゾール、ケトコナゾール、ボリコナゾール、およびイトラコニゾールなど）；ポリエン（アンホテリシンＢおよびナイスタチンなど）；フルシトシン；およびカンジシジンまたはその任意の塩もしくは改変体が挙げられる。Physician's  Desk  Reference、第５９版（２００５年）、Thomson  P  D  R、Montvale  N.J.；Gennaroら編、Remington's  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、第２０版（２０００年）、Lippincott  Williams  and  Wilkins、Baltimore  Md.；Braunwaldら編、Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、第１５版（２００１年）、McGraw  Hill、NY；Berkowら編、The  Merck  Manual  of  Diagnosis  and  Therapy（１９９２年）、Merck  Research  Laboratories、Rahway  N.J.も参照されたい。使用される抗真菌剤は、真菌感染の型に依存するであろう。
【０３５１】
抗ウイルス薬とは、ウイルスの作用を阻害する任意の化合物を指す。非限定例としては、インターフェロンアルファ、ベータもしくはガンマ、ジダノシン、ラミブジン、ザナマビル、ロパニビル、ネルフィナビル、エファビレンズ、インジナビル、バラシクロビル、ジドブジン、アマンタジン、リマンチジン、リバビリン、ガンシクロビル、ホスカルネット、およびアシクロビルまたはその任意の塩もしくは改変体が挙げられる。Physician's  Desk  Reference、第５９版（２００５年）、Thomson  P  D  R、Montvale  N.J.；Gennaroら編、Remington's  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、第２０版（２０００年）、Lippincott  Williams  and  Wilkins、Baltimore  Md.；Braunwaldら編、Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、第１５版（２００１年）、McGraw  Hill、NY；Berkowら編、The  Merck  Manual  of  Diagnosis  and  Therapy（１９９２年）、Merck  Research  Laboratories、Rahway  N.J.も参照されたい。使用される抗ウイルス薬は、ウイルス感染の型に依存するであろう。
【０３５２】
抗寄生虫剤とは、寄生虫の増殖を阻害する、または寄生虫を殺傷する任意の化合物を指す。抗寄生虫剤の有用な非限定例としては、クロロキン、メフロキン、キニン、プリマキン、アトバクオン、スルファソキシン、およびピリメタミンまたはその任意の塩もしくは改変体が挙げられる。Physician's  Desk  Reference、第５９版（２００５年）、Thomson  P  D  R、Montvale  N.J.；Gennaroら編、Remington's  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、第２０版（２０００年）、Lippincott  Williams  and  Wilkins、Baltimore  Md.；Braunwaldら編、Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、第１５版（２００１年）、McGraw  Hill、NY；Berkowら編、The  Merck  Manual  of  Diagnosis  and  Therapy（１９９２年）、Merck  Research  Laboratories、Rahway  N.J.も参照されたい。使用される抗寄生虫剤は、寄生虫感染の型に依存するであろう。
【０３５３】
上記で論じられた腫瘍へのその適用と同様、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、単独で、またはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて使用して、病原体、毒素、および自己抗原に対する免疫応答を刺激することができる。これらの手法を、サイトカイン処置（例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＩＬ−２の投与）などの他の形態の免疫療法と組み合わせることができる。この治療手法が特に有用であり得る病原体の例としては、現在有効なワクチンがない病原体、または従来のワクチンが完全に有効ではない病原体が挙げられる。これらのものは、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、およびＣ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、レーシュマニア、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むがこれらに限定されない。
【０３５４】
一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、乳がんを有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、多発性骨髄腫を有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、乳がんを有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、骨髄異形成症候群を有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＦＳＨ分泌性下垂体部腫瘍を有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、前立腺がんを有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、正常で健康な患者と比較して、免疫活性が望ましくなく上昇した（例えば、Ｔ細胞活性が増加した）患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、自己免疫障害、または自己免疫関連障害を有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、Ｔ細胞活性の望ましくない上昇によって媒介される自己免疫障害、または自己免疫関連障害を有する患者には投与されない。例えば、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、急性播種性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血漿、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性脂質異常症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索およびニューロン神経障害、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、カッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、慢性再発性多巣性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管性肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化症、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病（慢性）、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、視神経脊髄炎（デビック病）、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌と関連する小児自己免疫性神経精神疾患）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、天疱瘡、静脈周囲脳炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛、多発筋炎、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン初稿群、精子および精巣の自己免疫、全身硬直症候群、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、トローザ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、小水疱水疱性皮膚病、ウェゲナー肉芽腫症のうちの１つまたは複数を有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、組織または臓器移植を受けている患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、組織または臓器移植を受けた患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、移植片対宿主疾患を有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、１つまたは複数の免疫抑制剤および／または療法で処置される患者には投与されない。
【０３５５】
一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、単独で、またはがんを処置するための支持療法もしくは追加的な活性薬剤（例えば、ＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの免疫療法剤）と組み合わせて使用して、がん患者の生存を改善する（死亡のリスクを低減する）ことができる。本明細書で使用される場合、がん患者の生存の改善とは、一定期間に、または一定期間を超えて、対象集団によって経験される致死的ながん関連事象の数を維持すること、または減少させることを指す。第１の群（処置群）が本発明の方法によって処置され、第２の群（プラセボ群）が、本発明の方法による処置の代替として、またはその代わりに、プラセボ（すなわち、偽薬）を使用することによって処置される、２群の対象の間で、一定期間を超える、またはその間の致死的ながん関連事象の発生率を比較することによって、がん患者の生存の改善を評価または測定することができる。処置群の致死的がん関連事象の数が、プラセボ群の致死的がん関連事象の数よりも少ない場合、がん患者の生存の改善があった、またはかつてあったとの決定が為される。あるいは、第１の期間に関する致死的がん関連事象のベースライン数を決定した後、第２の、より後の期間での対象集団に関する致死的がん関連事象の数を測定することにより、致死的心血管事象の発生率の減少を評価または決定することができる。第２の、より後の期間での対象集団に関する致死的がん関連事象の数が、第１の期間での対象集団に関する致死的がん関連事象の数と同じであるか、またはそれよりも少ない場合、前記対象集団に関するがん患者の生存の改善があったとの決定が為される。
【０３５６】
ある特定の実施形態では、本開示は、患者における１つまたは複数の血液パラメータを測定することによって、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置された、または処置される候補である患者を管理するための方法を提供する。血液パラメータを使用して、本開示のアンタゴニストで処置される候補である患者のための適切な用量を評価する、処置中の血液パラメータをモニタリングする、本開示の１つもしくは複数のアンタゴニストによる処置中に用量を調整すべきかどうかを評価する、および／または本開示の１つもしくは複数のアンタゴニストの適切な維持用量を評価することができる。１つまたは複数の血液パラメータが正常レベルから外れている場合、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの投与を減少させる、遅延させる、または終結させることができる。
【０３５７】
本明細書に提供される方法に従って測定され得る血液パラメータとしては、当該分野で認識される方法を使用した、例えば、赤血球レベル、血圧、鉄貯蔵、および赤血球レベルの増加と相関する体液中に認められる他の因子が挙げられる。そのようなパラメータを、患者由来血液試料を使用して決定することができる。赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルの増加は、血圧の増加を引き起こし得る。
【０３５８】
一実施形態では、１つまたは複数の血液パラメータが、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置される候補である患者における正常範囲から外れているか、または正常高値にある場合、１つまたは複数のアンタゴニストの投与の開始を、血液パラメータが、自然に、または治療的介入によって、正常レベルまたは許容し得るレベルに戻るまで遅らせることができる。例えば、候補患者が高血圧または前高血圧である場合、その患者を、患者の血圧を低下させるための血圧低下剤で処置することができる。例えば、利尿剤、アドレナリン阻害剤（アルファ遮断剤およびベータ遮断剤を含む）、血管拡張剤、カルシウムチャネル遮断剤、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、またはアンギオテンシンＩＩ受容体遮断剤を含む、個々の患者の状態にとって適切な任意の血圧低下剤を使用することができる。あるいは、食事および運動のレジメンを使用して、血圧を処置することができる。同様に、候補患者が正常より低い、または正常の低い側にある鉄貯蔵を有する場合、患者の鉄貯蔵が正常レベルまたは許容し得るレベルに戻るまで、患者を、食事および／または鉄補給剤の適切なレジメンで処置することができる。正常な赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルよりも高い患者については、そのレベルが正常レベルまたは許容し得るレベルに戻るまで、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与を遅らせることができる。
【０３５９】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の血液パラメータが、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト剤で処置される候補である患者における正常範囲から外れているか、または正常高値にある場合、投与の開始を遅らせなくてもよい。しかしながら、１つまたは複数のアンタゴニストの用量または投与頻度を、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与時に生じる血液パラメータの許容できない増加のリスクを低減させる量に設定することができる。あるいは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと、望ましくないレベルの血液パラメータに対処する治療剤とを組み合わせる治療レジメンを患者のために開発することができる。例えば、患者の血圧が上昇している場合、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと、血圧低下剤との投与を含む治療レジメンを設計することができる。所望の鉄貯蔵より低い患者については、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと、鉄補給剤とを含む治療レジメンを開発することができる。
【０３６０】
一実施形態では、１つまたは複数の血液パラメータのベースラインパラメータを、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置される候補である患者について確立し、ベースライン値に基づいて、その患者に関する適切な投薬レジメンを確立することができる。あるいは、患者の病歴に基づく確立されたベースラインパラメータを使用して、患者に関する適切なアンタゴニスト投薬レジメンについて情報提供することができる。例えば、健康な患者が規定の正常範囲より上である確立された血圧読取り値を有する場合、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いる処置の前に、患者の血圧を、一般的な集団に関する正常と考えられる範囲に持って行く必要はない。１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを用いる処置の前の１つまたは複数の血液パラメータに関する患者のベースライン値を、本明細書に記載の１つまたは複数のアンタゴニストを用いる処置中の血液パラメータに対する任意の変化をモニタリングするために関連する比較値として使用することもできる。
【０３６１】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の血液パラメータは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置される患者において測定される。血液パラメータを使用して、処置中に患者をモニタリングし、本開示の１つもしくは複数のアンタゴニストの投薬または別の治療剤のさらなる投薬の調整または終結を可能にすることができる。例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの投与が血圧、赤血球レベル、もしくはヘモグロビンレベルの増加、または鉄貯蔵の減少をもたらす場合、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの用量を、量または頻度において減少させて、１つまたは複数の血液パラメータに対する本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの効果を低下させることができる。１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの投与が、患者にとって有害である１つまたは複数の血液パラメータの変化をもたらす場合、本明細書に記載の１つまたは複数のアンタゴニストの投薬を、一時的に、血液パラメータが許容し得るレベルに戻るまで、または永続的に終結させることができる。同様に、１つまたは複数の血液パラメータが、本明細書に記載の１つまたは複数のアンタゴニストの用量または投与頻度を減少させた後に許容し得る範囲内にならない場合、投薬を終結させることができる。本明細書に記載の１つまたは複数のアンタゴニストの投薬を減少させるか、または終結させる代わりに、またはそれに加えて、例えば、血圧低下剤または鉄補給剤などの、血液パラメータの望ましくないレベルに対処するさらなる治療剤を患者に投与することができる。例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置される患者の血圧が上昇している場合、本開示の１つもしくは複数のアンタゴニストの投薬を、同じレベルで継続し、血圧低下剤を処置レジメンに加え、１つもしくは複数のアンタゴニスト（例えば、量および／もしくは頻度）および血圧低下剤の投与を処置レジメンに加えるか、または１つもしくは複数のアンタゴニストの投薬を終結し、患者を血圧低下剤で処置することができる。
【０３６２】
１０．医薬組成物
ある特定の態様では、本開示の、任意選択でＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの１つまたは複数の追加的な活性薬剤と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、単独で、または医薬製剤の成分（治療組成物もしくは医薬組成物とも称される）として投与することができる。医薬製剤とは、その中に含有される活性成分（例えば、本開示の薬剤）の生物活性が有効であることを可能にするような形態にあり、製剤が投与される対象にとって許容されないほどに毒性的であるさらなる成分を含有しない調製物を指す。対象化合物を、ヒト医学または獣医学における使用のための任意の都合の良い方法での投与のために製剤化することができる。例えば、本開示の１つまたは複数の薬剤を、薬学的に許容される担体と共に製剤化することができる。薬学的に許容される担体とは、一般に、対象にとって非毒性的である、活性成分以外の、医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤、および／または保存剤を含むがこれらに限定されない。一般に、本開示における使用のための医薬製剤は、発熱源を含まず、対象に投与される場合に生理的に許容される形態にある。任意選択で、上記の製剤中に含有されてもよい、本明細書に記載のもの以外の治療的に有用な薬剤を、本開示の方法において対象薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０３６３】
ある特定の実施形態では、組成物は、非経口投与される［例えば、静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射、動脈内注射、骨内注射、筋内注射、髄腔内注射、皮下注射、または皮内注射により］。非経口投与に適する薬学的組成物は、本開示の１つまたは複数の作用因子を、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌かつ等張の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液、もしくはエマルジョン、または使用直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散液へと再構成され得る無菌粉末と組み合わせて含み得る。注射可能な溶液または分散液は、抗酸化物質、緩衝剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、または製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。本開示の医薬製剤において利用され得る、適切な水性および非水性のキャリアの例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、植物油（例えば、オリーブ油）、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、およびこれらの適切な混合物を含む。適正な流動性は、例えば、コーティング材料（例えば、レシチン）の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒子径の維持によって、および、界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０３６４】
一部の実施形態では、例えば、局所投与、眼内（例えば、硝子体内）注射によるか、またはインプラントもしくはデバイスにより、化合物を眼に投与する。硝子体内注射を、例えば、扁平部を介して、縁に対して３ｍｍ〜４ｍｍ後部に注射することができる。眼への投与のための医薬組成物を、例えば、点眼剤、点眼液、点眼懸濁剤、点眼エマルジョン、硝子体内注射剤、テノン嚢下注射剤、眼科用生分解性インプラント、および非生分解性眼科用挿入物またはデポーを含む、様々な方法で製剤化することができる。
【０３６５】
一部の実施形態では、本開示の治療法は、インプラントもしくはデバイスから薬学的組成物を全身投与または局所投与する工程を包含する。さらに、薬学的組成物は、カプセル化され得、または、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）へと送達するための形態で注射され得る。特定の実施形態では、本開示の組成物は、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）に本開示の１つまたは複数の作用因子を送達し得、成長中の組織のための構造を提供し得、そして、最適には身体内へと再吸収され得るマトリクスを含み得る。例えば、マトリクスは、本開示の１つまたは複数の作用因子の遅速放出を提供し得る。このようなマトリクスは、他の移植医療用途に現在使用される材料から形成され得る。
【０３６６】
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、見かけ上の様相および界面の特性のうちの１つまたは複数に基づいてもよい。本主題の組成物の特定の用途が、適切な製剤を画定する。組成物のための可能性のあるマトリクスは、生分解性でかつ化学的に画定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の可能性のある材料は、生分解性でかつ生物学的に十分に画定されたもの（例えば、骨または皮膚のコラーゲンが挙げられる）である。さらなるマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリクスの成分から構成される。他の可能性のあるマトリクスは、非生分解性でかつ化学的に規定されたもの（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩、または他のセラミクスが挙げられる）である。マトリクスは、上述のタイプの材料のいずれかの組み合わせ（例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、または、コラーゲンおよびリン酸三カルシウム）を含み得る。バイオセラミクスは、組成物（例えば、カルシウム−アルミン酸−リン酸）中で変化され得、孔径、粒子径、粒子の形状および生分解性のうちの１つまたは複数を変更するように加工され得る。
【０３６７】
ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物を、局所的に投与することができる。「局所適用」または「局所的」とは、医薬組成物と、例えば、皮膚、創傷部位、および粘膜を含む、体表面との接触を意味する。局所医薬組成物は、様々な適用形態を有してもよく、典型的には、組成物を局所的に投与する際に、組織の近くに、または組織と直接接触して配置されるように適合される、薬物含有層を含む。局所投与にとって好適な医薬組成物は、任意選択で、液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、気泡、ペースト、パテ、半固体、または固体として同時に製剤化される、本開示のＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストなどの１つまたは複数の追加的な活性薬剤と組み合わせた、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを含んでもよい。液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、気泡、ペースト、またはパテ形態の組成物を、標的組織に組成物を拡散させる、噴霧する、塗布する、軽く叩く、またはローラーで延ばすことによって適用することができる。また、組成物を、滅菌包帯、経皮パッチ、膏薬、および包帯に含浸させることもできる。パテ、半固体または固体形態の組成物は、変形可能であってもよい。それらは弾性または非弾性（例えば、可撓性もしくは剛性）であってもよい。ある特定の態様では、組成物は、複合物の一部を形成し、同じか、または異なる組成を有する繊維、粒子、または多層を含んでもよい。
【０３６８】
液体形態の局所用組成物は、薬学的に許容される溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、および懸濁液を含み得る。有効成分に加えて、液体剤形は、当該分野において一般に使用される不活性の希釈剤であって、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および／もしくは乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、または１，３−ブチレングリコール、油（例えば、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含む希釈剤を含有し得る。
【０３６９】
局所用のゲル、クリーム、ローション、軟膏、半固形または固形組成物は、多糖、合成ポリマーまたはタンパク質ベースのポリマーなどの１つまたは複数の増粘剤を含み得る。本発明の一実施形態では、本明細書のゲル化剤は、適切に非毒性であり、所望の粘性をもたらすゲル化剤である。増粘剤として、ビニルピロリドン、メタクリルアミド、アクリルアミドＮ−ビニルイミダゾール、カルボキシビニル、ビニルエステル、ビニルエーテル、シリコーン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ビニルアルコール、アクリル酸ナトリウム、アクリレート、マレイン酸、ＮＮ−ジメチルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、アクリルアミド、アクリロイルモルホリン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、コラーゲン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニレン、ポリビニルシリケート、糖（例えば、スクロース、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、トレハロース、マンノース、またはラクトース）で置換されたポリアクリレート、アシルアミドプロパンスルホン酸、テトラメトキシオルトシリケート、メチルトリメトキシオルトシリケート、テトラアルコキシオルトシリケート、トリアルコキシオルトシリケート、グリコール、プロピレングリコール、グリセリン、多糖、アルギネート、デキストラン、シクロデキストリン、セルロース、修飾セルロース、酸化セルロース、キトサン、キチン、グアーガム、カラギーナン、ヒアルロン酸、イヌリン、デンプン、修飾デンプン、アガロース、メチルセルロース、植物ガム、ヒアルロナン（ｈｙｌａｒｏｎａｎｓ）、ハイドロゲル、ゼラチン、グリコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ペクチン、低メトキシペクチン、架橋デキストラン、デンプン−アクリロニトリルグラフトコポリマー、ポリアクリル酸ナトリウムデンプン、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニレン、ポリエチルビニルエーテル、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリアルカノエート、ポリ乳酸、ポリラクテート、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、スルホン化ハイドロゲル、ＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、ＳＥＭ（スルホエチルメタクリレート）、ＳＰＭ（スルホプロピルメタクリレート）、ＳＰＡ（スルホプロピルアクリレート）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−メタクリロキシエチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタイン、メタクリル酸アミドプロピル−ジメチルアンモニウムスルホベタイン、ＳＰＩ（イタコン酸−ビス（１−プロピルスルホン酸（ｓｕｌｆｏｎｉｚａｃｉｄ）−３）エステル二カリウム塩）、イタコン酸、ＡＭＢＣ（３−アクリルアミド−３−メチルブタン酸）、ベータ−カルボキシエチルアクリレート（アクリル酸二量体）、およびマレイン酸無水物−メチルビニルエーテルポリマー、これらの誘導体、これらの塩、これらの酸、ならびにこれらの組合せによる、ポリマー、コポリマー、および単量体が挙げられ得る。ある特定の実施形態では、本開示の薬学的組成物は、例えば、カプセル、カシェ、丸剤、錠剤、ロゼンジ（スクロースおよびアカシアまたはトラガントなどの矯味矯臭基材を使用する）、散剤、顆粒剤、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油もしくは油中水の液体エマルジョン、またはエリキシルもしくはシロップ、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基材を使用する）、かつ／またはマウスウォッシュの形態で経口投与することもでき、各々が、所定量の、本開示の化合物と、任意選択で、１つまたは複数の他の活性成分とを含有する。本開示の化合物と、任意選択で、１つまたは複数の他の活性成分とはまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとしても投与することができる。
【０３７０】
経口投与のための固体投薬形態（例えば、カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤および顆粒剤）において、本開示の１または複数の化合物は、１または複数の薬学的に受容可能なキャリア（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア）、湿潤剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、アガー−アガー、炭酸カルシウム、ポテトもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶液抑制因子（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、パラフィン）、吸収加速剤（例えば、四級アンモニウム化合物）、加湿剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ）、潤滑剤（例えば、滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤およびこれらの混合物を含む）と共に混合され得る。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、医薬製剤（組成物）はまた、緩衝剤も含み得る。また、同様の種類の固形組成物も、例えば、ラクトースまたは乳糖のほか、高分子量ポリエチレングリコールを含む、１つまたは複数の賦形剤を使用して、軟充填ゼラチンカプセル中および硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として利用することができる。
【０３７１】
薬学的組成物の経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分に加え、液体投薬形態は、当該分野で一般に用いられる不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒が挙げられる）、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（例えば、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含み得る。不活性な希釈剤に加え、経口用組成物はまた、例えば、加湿剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤、保存剤およびこれらの組み合わせを含む佐剤を含み得る。
【０３７２】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー−アガー、トラガント、およびこれらの組み合わせを含む懸濁剤を含有し得る。
【０３７３】
微生物の作用および／または増殖の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびソルビン酸フェノールを含む、種々の抗細菌剤および抗真菌剤を組み入れることにより確保することができる。
【０３７４】
ある特定の実施形態では、例えば、糖、または塩化ナトリウムを含む等張化剤を組成物中に組み入れることも望ましいと考えられる。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の遅延も、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含む、吸収を遅延させる作用因子を組み入れることにより、もたらすことができる。
【０３７５】
投薬レジメンは、本開示の１つまたは複数の作用因子の作用を修飾する種々の要因を考慮して主治医によって決定されることが理解される。赤血球の形成を促進するＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの場合では、種々の要因として、患者の赤血球数、ヘモグロビンレベル、所望の標的赤血球数、患者の年齢、患者の性別、および患者の食餌、赤血球レベルの低下に寄与し得る任意の疾患の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的要因が挙げられ得るがこれらに限定されない。他の公知の活性の作用因子の、最終組成物への添加もまた、投与量に影響を及ぼし得る。進行は、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、網状赤血球レベル、および造血プロセスの他の指標のうちの１つまたは複数の定期的な評価によりモニタリングすることができる。
【０３７６】
特定の実施形態では、本開示はまた、本開示の１つまたは複数の作用因子のインビボ産生のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、上に列挙したような障害のうち１つまたは複数を有する細胞または組織中に作用因子配列を導入することによってその治療作用を達成する。作用因子配列の送達は、例えば、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いることによって達成され得る。本開示の１つまたは複数の作用因子配列の好ましい治療的送達は、標的化されたリポソームの使用である。
【０３７７】
本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、ＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）が挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスもしくはトリのレトロウイルスの誘導体であり得る。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多数のさらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択マーカーについての遺伝子を移送または組み込み得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって、標的特異的とされ得る。好ましい標的化は、抗体を用いて達成される。当業者は、本開示の１つまたは複数の作用因子を含むレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノム中に挿入され得るか、または、ウイルスエンベロープに付着され得ることを認識する。
【０３７８】
あるいは、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、レトロウイルスの構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をコードするプラスミドを用いて直接トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、次いで、関心のある遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【０３７９】
本開示の１つまたは複数の作用因子のための別の標的化送達システムは、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む）が挙げられる。特定の実施形態において、本開示の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして有用な人工の膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンが、水性の内部に封入され得、そして、生物学的に活性な形態で細胞へと送達され得る［Ｆｒａｌｅｙら（１９８１年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．、６巻：７７頁］。リポソームビヒクルを用いた効率的な遺伝子移入のための方法は当該分野で公知である［Ｍａｎｎｉｎｏら（１９８８年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８］。
【０３８０】
リポソームの組成は通常、リン脂質の組み合わせであり、ステロイド（例えば、コレステロール）を含み得る。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。また、他のリン脂質または他の脂質であって、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシド）、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含むリン脂質または脂質も使用することができる。例えば、器官特異性、細胞特異性および細胞小器官特異性に基づいたリポソームの標的化もまた可能であり、当該分野で公知である。
【実施例】
【０３８１】
本発明は、ここで、一般的に記載されるが、単に特定の実施形態および本発明の実施形態を例示する目的のために含められ、本発明を限定することは意図されない以下の実施例を参照するとより容易に理解される。
【０３８２】
（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質
出願人は、間にリンカーを有する、ヒトまたはマウスＦｃドメインに融合されたヒトＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメインを有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質を構築した。この構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃと称される。
【０３８３】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、ＣＨＯ細胞系から精製されたものとして以下に示される（配列番号５０）：
【化４０】
2019510001.tif 000043
【０３８４】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞系中で発現させた。３つの異なるリーダー配列を考慮した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号５１）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号５２）
（ｉｉｉ）ネイティブ：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号５３）。
【０３８５】
選択された形態は、ＴＰＡリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する。
【化４１】
2019510001.tif 000044
【０３８６】
このポリペプチドは、以下の核酸配列によってコードされる。
【化４２】
2019510001.tif 000045
【化４３】
2019510001.tif 000046
【０３８７】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃとＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃは両方とも、組換え発現に顕著に適していた。図５に示されるように、タンパク質は、単一の、明確に規定されたピークのタンパク質として精製された。Ｎ末端配列決定により、−ＩＬＧＲＳＥＴＱＥ（配列番号５６）の単一配列が示された。例えば、任意の順序で、以下のもの：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれよりも多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって、精製を達成することができた。ウイルス濾過および緩衝液交換によって精製を完了することができた。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定された場合、９８％を超える純度およびＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定された場合、９５％を超える純度まで精製された。
【０３８８】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃは、リガンドに対する高いアフィニティを示した。ＧＤＦ−１１またはアクチビンＡを、標準的なアミンカップリング手順を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップ上に固定した。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃタンパク質をシステム上にロードし、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、５×１０−１２の解離定数（ＫＤ）でアクチビンに結合し、９．９６×１０−９のＫＤでＧＤＦ１１に結合した。図６を参照されたい。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃも同様の挙動であった。
【０３８９】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、薬物動態試験において非常に安定であった。ラットに、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質を投与し、タンパク質の血漿レベルを、２４、４８、７２、１４４および１６８時間で測定した。別の試験において、ラットに、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇで投与した。ラットでは、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、１１〜１４日の血清半減期を有し、薬物の循環レベルは２週間後でも非常に高かった（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの初期投与について、それぞれ、１１μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌ、または３０４μｇ／ｍｌ）。カニクイザルでは、血漿半減期は１４日よりも実質的に大きく、薬物の循環レベルは、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの初期投与について、それぞれ、２５μｇ／ｍｌ、３０４μｇ／ｍｌ、または１４４０μｇ／ｍｌであった。
【０３９０】
（実施例２）
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質の特徴付け
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃ融合タンパク質を、配列番号５２の組織プラスミノーゲンリーダー配列を使用して、ｐＡＩＤ４ベクター（ＳＶ４０  ｏｒｉ／エンハンサー、ＣＭＶプロモーター）に由来する安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞中で発現させた。実施例１に上記したように精製されたタンパク質は、配列番号５０の配列を有していた。Ｆｃ部分は、配列番号５０に示されるような、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列である。タンパク質分析により、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃ融合タンパク質がジスルフィド結合を含むホモ二量体として形成されることが示された。
【０３９１】
ＣＨＯ細胞により発現される材料は、ヒト２９３細胞中で発現されるＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃ融合タンパク質について報告されたものよりも、アクチビンＢリガンドに対する高いアフィニティを有する［del  Reら（２００４年）J  Biol  Chem.  ２７９巻（５１号）：５３１２６〜５３１３５頁を参照されたい］。さらに、ＴＰＡリーダー配列の使用は、他のリーダー配列よりも多い産生を提供し、ネイティブリーダーを用いて発現されたＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃと違って、非常に純粋なＮ末端配列を提供した。ネイティブリーダー配列の使用は、それぞれ、異なるＮ末端配列を有する、２つの主要な種のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃをもたらした。
【０３９２】
（実施例３）
代替的なＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃタンパク質
本明細書に記載の方法に従って使用され得る様々なＡｃｔＲＩＩＡ改変体が、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００６／０１２６２７（例えば、５５〜５８頁を参照されたい）として公開された国際特許出願に記載されている。代替的な構築物は、Ｃ末端テール（ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインの最後の１５アミノ酸）の欠失を有し得る。そのような構築物の配列を以下に提示する（Ｆｃ部分に下線を付す）（配列番号５７）。
【化４４】
2019510001.tif 000047
【０３９３】
（実施例４）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の生成
出願人は、間にリンカー（３個のグリシンアミノ酸）を有する、ヒトまたはマウスＦｃドメインに融合されたヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質を構築した。この構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃと称される。
【０３９４】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃは、ＣＨＯ細胞系から精製されたものとして以下に示される（配列番号５８）。
【化４５】
2019510001.tif 000048
【０３９５】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞系中で発現させた。３つの異なるリーダー配列：（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）、ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、および（ｉｉｉ）ネイティブ：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号５９）を考慮した。
【０３９６】
選択された形態は、ＴＰＡリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列（配列番号６０）を有する。
【化４６】
2019510001.tif 000049
【０３９７】
このポリペプチドは、以下の核酸配列によってコードされる（配列番号６１）。
【化４７】
2019510001.tif 000050
【化４８】
2019510001.tif 000051
【０３９８】
ＣＨＯ細胞により産生される材料のＮ末端配列決定により、−ＧＲＧＥＡＥ（配列番号６２）の主要な配列が示された。注目すべきことに、文献で報告された他の構築物は、−ＳＧＲ．．．配列から始まる。
【０３９９】
例えば、任意の順序で、以下のもの：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれよりも多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって、精製を達成することができた。ウイルス濾過および緩衝液交換によって精製を完了することができた。
【０４００】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＯＳ細胞中でも発現させた。全ての細胞系に由来する材料および合理的な培養条件は、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋肉増強活性を有するタンパク質を提供したが、おそらく、細胞系の選択および／または培養条件に関して効力の変動が観察された。
【０４０１】
出願人は、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン中で一連の変異を生成し、細胞外ＡｃｔＲＩＩＢと、Ｆｃドメインとの可溶性融合タンパク質としてこれらの変異体タンパク質を産生した。バックグラウンドＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合体は、配列番号５８の配列を有する。
【０４０２】
ＮおよびＣ末端切断を含む、様々な変異を、バックグラウンドＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質中に導入した。本明細書に提示されるデータに基づいて、これらの構築物は、ＴＰＡリーダーと共に発現された場合、Ｎ末端セリンを欠くと予想される。ＰＣＲ変異誘発により、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン中で変異を生成した。ＰＣＲ後、フラグメントを、Ｑｉａｇｅｎカラムを通して精製し、ＳｆｏＩおよびＡｇｅＩで消化し、ゲル精製した。これらのフラグメントを、ライゲーション時に、ヒトＩｇＧ１との融合キメラを作出するように、発現ベクターｐＡＩＤ４（ＷＯ２００６／０１２６２７を参照されたい）中にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５アルファ中への形質転換時に、コロニーを拾い、ＤＮＡを単離した。マウス構築物（ｍＦｃ）については、マウスＩｇＧ２ａを、ヒトＩｇＧ１に置換した。全ての変異体の配列を検証した。
【０４０３】
全ての変異体を、一過的トランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で産生させた。まとめると、５００ｍｌのスピナー中で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２５０ｍｌ容量でＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中、６×１０５細胞／ｍｌに設定し、一晩増殖させた。次の日、これらの細胞を、０．５μｇ／ｍｌの最終ＤＮＡ濃度で、ＤＮＡ：ＰＥＩ（１：１）複合体で処理した。４ｈ後、２５０ｍｌの培地を添加し、細胞を７日間増殖させた。細胞をスピンダウンすることによって馴化培地を集め、濃縮した。
【０４０４】
例えば、プロテインＡカラムを含む様々な技術を使用して変異体を精製し、低ｐＨ（３．０）のグリシン緩衝液を用いて溶出させた。中和後、これらのものをＰＢＳに対して透析した。
【０４０５】
また、変異体を、同様の方法によってＣＨＯ細胞中でも産生させた。変異体を、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０９７５４１およびＷＯ２００６／０１２６２７に記載の結合アッセイおよび／またはバイオアッセイにおいて試験した。一部の例では、精製タンパク質よりもむしろ馴化培地を用いてアッセイを実施した。ＡｃｔＲＩＩＢのさらなる変化は、米国特許第７，８４２，６６３号に記載されている。
【０４０６】
出願人は、ネイティブＡｃｔＲＩＩＢリーダーに置換されたＴＰＡリーダー配列とＮ末端で融合され、最小リンカー（３個のグリシン残基）を介してヒトＦｃドメインとＣ末端で融合された、Ｎ末端およびＣ末端切断（配列番号１のネイティブタンパク質の残基２５〜１３１）を有するヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを含む、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃ融合タンパク質を生成した（図７；配列番号１２３）。この融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、図８に示す（配列番号１２４はコード鎖であり、配列番号１２５は相補鎖である）。コドンを改変したところ、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃタンパク質をコードする核酸改変体は、初期の形質転換体の発現レベルの実質的な改善を提供することがわかった（図９；配列番号１２６はコード鎖であり、配列番号１２７は相補鎖である）。
【０４０７】
成熟タンパク質は、以下のようなアミノ酸配列を有する（Ｎ末端配列決定により確認されたＮ末端）（配列番号６３）。
【化４９】
2019510001.tif 000052
【化５０】
2019510001.tif 000053
アミノ酸１〜１０７は、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する。
【０４０８】
例えば、任意の順序で、以下のもの：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれよりも多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程を使用して、発現された分子を精製した。ウイルス濾過および緩衝液交換によって精製を完了することができた。
【０４０９】
ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃおよびその完全長対応物ＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１３４）−ｈＦｃに対するいくつかのリガンドのアフィニティを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）機器を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価し、その結果を以下の表にまとめる。ｋｏｎおよびｋｏｆｆの正確な決定を妨げる、複合体の非常に急速な会合および解離のため、安定状態のアフィニティ適合により、Ｋｄ値を得た。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃは、高いアフィニティでアクチビンＡ、アクチビンＢ、およびＧＤＦ１１に結合した。
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ形態のリガンドアフィニティ：
【表２】
2019510001.tif 000054
【０４１０】
（実施例５）
ＧＤＦトラップの生成
出願人は、以下のようにＧＤＦトラップを構築した。ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンと比較してアクチビンＡ結合が大きく低下した（配列番号１の７９位でのロイシンからアスパラギン酸への置換の結果として）、ＡｃｔＲＩＩＢの改変された細胞外ドメイン（Ｌ７９Ｄ置換を有する配列番号１のアミノ酸２０〜１３４）を有するポリペプチドを、間の最小リンカー（３個のグリシンアミノ酸）を用いてヒトまたはマウスＦｃドメインに融合した。この構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０−１３４）−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０−１３４）−ｍＦｃと称される。７９位にアスパラギン酸よりもむしろグルタミン酸を有する代替的な形態も、同様に実施した（Ｌ７９Ｅ）。以下の、配列番号６４に関して２２６位にバリンよりもむしろアラニンを有する代替的な形態も生成し、試験した全ての点において同等に実施した。７９位のアスパラギン酸（配列番号１と比較、または配列番号６４と比較した６０位）を、以下に二重下線で示す。配列番号６４と比較した２２６位のバリンも、以下に二重下線で示す。
【０４１１】
ＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０−１３４）−ｈＦｃを、ＣＨＯ細胞系から精製されたものとして以下に示す（配列番号６４）。
【化５１】
2019510001.tif 000055
【０４１２】
ＧＤＦトラップのＡｃｔＲＩＩＢ由来部分は、以下に記載のアミノ酸配列（配列番号６５）を有し、その部分を、単量体として、または単量体、二量体、もしくはより高次の複合体としての非Ｆｃ融合タンパク質として使用することができた。
【化５２】
2019510001.tif 000056
【０４１３】
ＧＤＦトラップタンパク質を、ＣＨＯ細胞系中で発現させた。３つの異なるリーダー配列を考慮した：（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）、（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、および（ｉｉｉ）ネイティブ。
【０４１４】
選択された形態は、ＴＰＡリーダー配列を使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する。
【化５３】
2019510001.tif 000057
【化５４】
2019510001.tif 000058
【０４１５】
このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号６７）によってコードされる。
【化５５】
2019510001.tif 000059
【０４１６】
例えば、任意の順序で、以下のもの：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれよりも多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程により、精製を達成することができた。ウイルス濾過および緩衝液交換によって精製を完了することができた。精製スキームの一例では、細胞培養培地を、プロテインＡカラム上を通過させ、１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中で洗浄した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出させる。低ｐＨの溶出液を、ウイルスクリアランス工程として、室温で３０分間保持する。次いで、溶出液を中和し、Ｑ−セファロースイオン交換カラム上を通過させ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中、１５０ｍＭ〜３００ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出させる。次いで、溶出液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１．１Ｍ硫酸アンモニウムに変更し、フェニルセファロースカラム上に通過させ、洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中、１５０〜３００ｍＭの硫酸アンモニウムで溶出させる。溶出液を透析し、使用のために濾過する。
【０４１７】
さらなるＧＤＦトラップ（ミオスタチンまたはＧＤＦ１１結合に対するアクチビンＡ結合の比が低減されるように改変されたＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質）は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０９７５４１およびＷＯ２００６／０１２６２７に記載されている。
【０４１８】
（実施例６）
ＧＤＦ−１１およびアクチビンにより媒介されるシグナル伝達のためのバイオアッセイ
Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイを使用して、ＧＤＦ−１１およびアクチビンＡによるシグナル伝達に対するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの効果を評価した。細胞系：ヒト横紋筋肉腫（筋肉に由来する）。レポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Dennlerら、１９９８年、EMBO  １７巻：３０９１〜３１００頁に記載されている）。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦ−ベータＴＧＦβ応答遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１遺伝子）中に存在するため、このベクターは、ＳＭＡＤ２および３を介する因子のシグナル伝達にとって一般的に有用である。
１日目：Ａ−２０４細胞を４８ウェルプレートに分割する。
２日目：Ａ−２０４細胞に、１０μｇのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２またはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０μｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）およびＦｕｇｅｎｅをトランスフェクトする。
３日目：因子（培地＋０．１％ＢＳＡ中に希釈したもの）を添加する。細胞に添加する前に１ｈ、阻害剤を因子と共に予備インキュベートする必要がある。６時間後、細胞をＰＢＳですすぎ、溶解した。
【０４１９】
この後、ルシフェラーゼアッセイを行う。任意の阻害剤の非存在下では、アクチビンＡは、レポーター遺伝子発現の１０倍の刺激を示し、ＥＤ５０は約２ｎｇ／ｍｌであった。ＧＤＦ−１１：１６倍刺激、ＥＤ５０：約１．５ｎｇ／ｍｌ。
【０４２０】
ＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１３４）は、このアッセイにおいて、アクチビンＡ、ＧＤＦ−８、およびＧＤＦ−１１活性の強力な阻害剤である。下記に記載されている通り、ＡｃｔＲＩＩＢ改変体もこのアッセイで試験した。
【０４２１】
（実施例７）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ改変体、細胞に基づく活性
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの活性を、上記のような細胞に基づくアッセイにおいて試験した。結果を、以下の表にまとめる。いくつかの改変体を、異なるＣ末端切断型構築物中で試験した。上で論じられたように、５個または１５個のアミノ酸の切断は、活性の低下を引き起こした。ＧＤＦトラップ（Ｌ７９ＤおよびＬ７９Ｅ改変体）は、ＧＤＦ−１１のほぼ野生型の阻害を保持しながら、アクチビンＡ阻害の実質的な喪失を示した。
ＧＤＦ１１およびアクチビンＡへの可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの結合：
【表３−１】
2019510001.tif 000060
【表３−２】
2019510001.tif 000061
+      弱い活性(およそ1x10-6  KI)
++    中程度の活性(およそ1x10-7  KI)
+++  良好な(野生型)活性(およそ1x10-8  KI)
++++  野生型より高い活性
【０４２２】
（実施例８）
ＧＤＦ−１１およびアクチビンＡの結合
ある特定のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの、リガンドへの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイにおいて試験した。
【０４２３】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ改変体または野生型タンパク質を、抗ｈＦｃ抗体を使用してシステム上に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流した。結果を、以下の表にまとめる。
ＩＩＢ改変体のリガンド結合特異性：
【表４−１】
2019510001.tif 000062
【表４−２】
2019510001.tif 000063
【表４−３】
2019510001.tif 000064
【０４２４】
無細胞アッセイで得られたこれらのデータは、細胞に基づくアッセイデータを確認するものであり、Ａ２４Ｎ改変体がＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１３４）−ｈＦｃ分子のものと同様のリガンド結合活性を保持すること、およびＬ７９ＤまたはＬ７９Ｅ分子がミオスタチンおよびＧＤＦ１１結合を保持するが、アクチビンＡへの結合の顕著な低下（定量不可）を示すことを示している。
【０４２５】
他の改変体は、ＷＯ２００６／０１２６２７（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に報告されたように生成および試験された。例えば、デバイスにカップリングされたリガンドを使用し、カップリングされたリガンドに対して受容体を流す、５９〜６０頁を参照されたい。注目すべきことに、Ｋ７４Ｙ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ（およびおそらく、Ｋ７４Ｌなどの、Ｋ７４での他の疎水性置換）、およびＤ８０Ｉは、野生型Ｋ７４分子と比較した、アクチビンＡ（ＡｃｔＡ）結合のＧＤＦ１１結合に対する比の低下を引き起こす。これらの改変体に関するデータの表を、以下に再現する。
ＧＤＦ１１およびアクチビンＡへの可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ改変体の結合（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ）
【表５−１】
2019510001.tif 000065
【表５−２】
2019510001.tif 000066
*    観察された結合なし
--    WTの1/5未満の結合
-    WTの約1/2の結合
+    WT
++    2倍未満増加した結合
+++    約5倍増加した結合
++++  約10倍増加した結合
+++++  約40倍増加した結合
【０４２６】
（実施例９）
ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインが切断されたＧＤＦトラップの生成
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０−１３４）−ｈＦｃと称されるＧＤＦトラップを、ロイシンからアスパラギン酸への置換（配列番号１中の残基７９での）を含有するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１中の残基２０〜１３４）へのＴＰＡリーダーのＮ末端融合およびヒトＦｃドメインと、最小リンカー（３個のグリシン残基）とのＣ末端融合によって生成した（図１０；配列番号１２８）。この融合タンパク質に対応するヌクレオチド配列は、図１１に示される（配列番号１２９、センス鎖；および配列番号１３０、アンチセンス鎖）。
【０４２７】
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃと称される、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインが切断されたＧＤＦトラップを、ロイシンからアスパラギン酸への置換（配列番号１中の残基７９での）を含有する切断された細胞外ドメイン（配列番号１中の残基２５〜１３１）へのＴＰＡリーダーのＮ末端融合およびヒトＦｃドメインと、リンカー（３個のグリシン残基）とのＣ末端融合によって生成した（図１２；配列番号１３１）。細胞精製型のＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃの配列は、図１３（配列番号１３２）中に提示され、リーダー、リンカーまたはＦｃドメインを含まない成熟細胞外ドメインは、図１４（配列番号１３３）に提示される。この融合タンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列を、その相補配列（配列番号１３５）と共に図１５（配列番号１３４）に示し、全く同じ融合タンパク質をコードする代替的なヌクレオチド配列を、その相補配列（配列番号１３７）と共に図１６（配列番号１３６）に示す。
【０４２８】
（実施例１０）
ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインが二重切断されたＧＤＦトラップによる選択的リガンド結合
いくつかのリガンドに対するＧＤＦトラップおよび他のＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃタンパク質のアフィニティを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）機器を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。結果を、以下の表にまとめる。ｋｏｎおよびｋｏｆｆの正確な決定を妨げる、複合体の非常に急速な会合および解離のため、安定状態アフィニティ適合により、Ｋｄ値を得た。
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ改変体のリガンド選択性：
【表６】
2019510001.tif 000067
【０４２９】
細胞外ドメインが切断されたＧＤＦトラップ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃは、より長い改変体、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０−１３４）−ｈＦｃによって示されるリガンド選択性と同等であるか、またはそれを上回るものであり、Ｌ７９Ｄ置換を欠くＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ対応物と比較して、アクチビンＡ結合の顕著な喪失、アクチビンＢ結合の部分的欠失、およびＧＤＦ１１結合のほぼ完全な保持を示した。切断型単独（Ｌ７９Ｄ置換を含まない）では、ここに示されたリガンド間で選択性を変化させなかった［ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９  ２５−１３１）−ｈＦｃとＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９  ２０−１３４）−ｈＦｃとを比較］ことに留意されたい。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃはまた、Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達リガンドＧＤＦ８ならびにＳｍａｄ１／５／８リガンドＢＭＰ６およびＢＭＰ１０への強いものから中間の結合を保持する。
【０４３０】
（実施例１１）
ＡｃｔＲＩＩＢ５に由来するＧＤＦトラップ
他者は、ＡｃｔＲＩＩＢ膜貫通ドメインを含むエクソン４が異なるＣ末端配列によって置き換えられた、別の可溶性形態のＡｃｔＲＩＩＢ（ＡｃｔＲＩＩＢ５と命名されている）を報告した（例えば、ＷＯ２００７／０５３７７５を参照されたい）。
【０４３１】
そのリーダーを含まないネイティブなヒトＡｃｔＲＩＩＢ５の配列は、以下の通りである。
【化５６】
2019510001.tif 000068
【化５７】
2019510001.tif 000069
【０４３２】
ロイシンからアスパラギン酸への置換、または他の酸性の置換を、記載のようにネイティブな７９位（下線）で実施して、以下の配列を有する改変体ＡｃｔＲＩＩＢ５（Ｌ７９Ｄ）を構築することができる。
【化５８】
2019510001.tif 000070
【０４３３】
この改変体を、ＴＧＧＧリンカー（一重下線）を用いてヒトＦｃ（二重下線）に接続して、以下の配列を有するヒトＡｃｔＲＩＩＢ５（Ｌ７９Ｄ）−ｈＦｃ融合タンパク質を生成することができる。
【化５９】
2019510001.tif 000071
【０４３４】
この構築物を、ＣＨＯ細胞中で発現させることができる。
【０４３５】
（実施例１２）
マウスにおけるＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの抗腫瘍活性
出願人は、同系マウス白血病モデルにおいてホモ二量体ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ（配列番号５０のホモ二量体）およびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（配列番号５８のホモ二量体）融合タンパク質の潜在的な抗腫瘍活性を調査した。７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、処置に無作為に割り当て（ｎ＝１０匹／群）、腫瘍埋込みの２日前に開始して、週２回、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ）で腹腔内処置した。０日目に、それぞれのマウスに、ＰＢＳ（１００μＬ）中に懸濁した１×１０６個のＲＬ♂１（ＲＬ雄１）細胞を皮下接種した。ＲＬ雄１は、ＢＡＬＢ／ｃ起源のｘ線誘導性白血病であり（Sato  Hら、１９７３年、J  Exp  Med  １３８巻：５９３〜６０６頁）、細胞は、ＭＥＸＴ、日本のナショナルバイオリソースプロジェクトを介してＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ（バイオリソースセンター）細胞バンクから得られたものであり、これらの試験における使用のためにサブクローニングされたものであった。マウスへの接種後、体重および腫瘍体積を週に２回測定した。カリパスを用いて得られた２次元測定値から、腫瘍体積を算出した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ＬｘＷｘＷ）／２（式中、ＬおよびＷは、それぞれ、腫瘍の長さおよび幅（ｍｍ）である）。完全な腫瘍退縮および無腫瘍生存を両方とも、Teicher  BA（編）Anticancer  Drug  Development  Guide:  Preclinical  Screening,  Clinical  Trials,  and  Approval；Humana  Press、１９９７年に従って定義した。地方のＩＡＣＵＣ規則により、生存分析のために使用された終点は、２０００ｍｍ３より大きい腫瘍体積、２０％を超える体重減少、または後肢麻痺であった。異なる群の生存曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用して、中央生存により、ならびにログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定により比較した。
【０４３６】
以下の表に示されるように、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃは両方とも、抗腫瘍活性を示した。
【表７】
2019510001.tif 000072
【０４３７】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃまたはＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃを用いる処置は、ビヒクル処置されたマウスのうちの０匹と比較して、１０匹のマウスのうちの２匹（２０％）において５６日目に無腫瘍状態をもたらした。ログランク検定における中央生存の増加および高い有意性（表を参照されたい）もまた、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃがそれぞれ、腫瘍担持マウスの生存を促進したことを示す。ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ処置されたマウスの５０％が、ビヒクル処置群における０％と比較して、３４日目までに完全な腫瘍退縮を示したため、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃに対する初期応答は特にロバストであった。これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃが、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有することを示す。さらに、これらのデータは、他のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが患者におけるがんおよび腫瘍の処置において有用であり得ることを示す。
【０４３８】
（実施例１３）
マウスにおけるＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの抗腫瘍活性は、Ｔ細胞を必要とする
出願人は次に、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃがＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃのものと同様の抗腫瘍活性を有するかどうか、および抗腫瘍活性がＴ細胞媒介性免疫に依存するかどうかを、同じマウス白血病モデルにおいて調査した。７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、処置に無作為に割り当て（ｎ＝１０匹／群）、腫瘍埋込みの２日前に開始して、週２回、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ）で腹腔内処置した。さらに、Ｔ細胞免疫欠損を有する７週齢のＮＣｒヌードマウスを、処置に無作為に割り当て（ｎ＝１０匹／群）、腫瘍埋込みの２日前に開始して、週２回、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ）で腹腔内処置した。最後に、以前の実験中に約７週間にわたって無腫瘍を保持した４匹のマウス（実施例１２；ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃで処置された２匹のマウスおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃで処置された２匹のマウス）に、本実験においてＲＬ雄１細胞を再チャレンジして、抗腫瘍免疫記憶について試験した。０日目に、それぞれのマウスに、ＰＢＳ（１００μＬ）中に懸濁した１×１０６個のＲＬ♂１（ＲＬ雄１）細胞を皮下接種した。マウスへの接種後、体重および腫瘍体積を週に２回測定した。地方のＩＡＣＵＣ規則により、生存分析のために使用された終点は、２０００ｍｍ３より大きい腫瘍体積、２０％を超える体重減少、または後肢麻痺であった。
【０４３９】
以下の表に示されるように、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃの抗腫瘍効果は、マウス株に依存していた。
【表８】
2019510001.tif 000073
【０４４０】
以前の実験において観察されたように、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃとＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃは両方とも、免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて抗腫瘍活性を示した。ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃまたはＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃを用いる処置は、ビヒクル処置されたマウスの０％と比較して、５６日目にそれぞれ１０％または３０％のマウスの無腫瘍状態をもたらした。ログランク検定における中央生存の増加および高い有意性（表を参照されたい）はまた、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃがそれぞれ、腫瘍担持マウスの生存を促進したことを示す。重要なことに、ＮＣｒヌードマウスにおけるＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃの抗腫瘍効果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、存在しないか、または顕著に鈍った（表を参照されたい）が、それによって、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドのこれらの阻害剤に関する作用機構においてＴ細胞免疫を関与させる。さらに、以前の実験から持ち越された４匹全部の無腫瘍マウスが、ＲＬ雄１腫瘍細胞の反復接種にも拘わらず、本実験を通して検出可能な腫瘍増殖を示さなかった。これらの結果は、免疫細胞が、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド上でのＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃまたはＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃを用いる処置によって引き起こされるＲＬ雄１腫瘍の退縮を媒介すること、および有効な抗腫瘍免疫応答が腫瘍抗原に対する免疫記憶を生成したことのさらなる証拠を提供する。まとめると、これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃの抗腫瘍活性を確認し、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに関してこの活性にＴ細胞免疫を強く関与させる。したがって、このデータは、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、特に、がんを処置するための免疫腫瘍剤として、免疫活性を促進することができる。
【０４４１】
（実施例１４）
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の生成
出願人は、それぞれ、リンカーが細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に位置付けられたＦｃドメインに融合されたヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡＬＫ４の細胞外ドメインを含む可溶性ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ異種複合体を構築した。個々の構築物を、それぞれＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドと称し、各々の配列は以下に提供される。
【０４４２】
ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ異種複合体の形成を促進するための方法は、ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体の複合体とは反対に非対称異種複合体の形成を誘導するためにＦｃドメインのアミノ酸配列に変更を導入する。Ｆｃドメインを使用して非対称相互作用ペアを作製するための多くの異なるアプローチが、本開示において記載される。
【０４４３】
１つのアプローチでは、それぞれ配列番号７１および７３および配列番号７４および７６のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃポリペプチド配列において、１つのＦｃドメインは、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更され、他方、他のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されていることが示されている。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、それぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダーを利用する。
【０４４４】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号７１）は以下に示される：
【化６０】
2019510001.tif 000074
【０４４５】
リーダー（シグナル）配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリジンで置き換える）が、上の二重下線で示されるようにＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のＦｃドメインに導入され得る。配列番号７１のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
【０４４６】
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は以下の核酸配列（配列番号７２）にコードされる：
【化６１】
2019510001.tif 000075
【０４４７】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号７３）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
【化６２】
2019510001.tif 000076
【０４４８】
ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号７４）の相補的形態は、以下の通りである：
【化６３】
2019510001.tif 000077
【０４４９】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。上記配列番号７１および７３のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドでヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（リジンをアスパラギン酸で置き換える）が、上の二重下線で示されるようにＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号７４のアミノ酸配列は、任意選択で、リジン（Ｋ）がＣ末端に付加されて提供されてもよい。
【０４５０】
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質は以下の核酸（配列番号７５）にコードされる：
【化６４】
2019510001.tif 000078
【０４５１】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号７６）は、以下の通りであり、任意選択で、リジン（Ｋ）がＣ末端に付加されて提供されてもよい。
【化６５】
2019510001.tif 000079
【０４５２】
それぞれ、配列番号７３および配列番号７６のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞系、から共発現させ、精製して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを含む異種複合体が得られ得る。
【０４５３】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進する別のアプローチでは、Ｆｃドメインは、それぞれ、配列番号７７および７８および配列番号７９および８０のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃポリペプチド配列に示されるように相補的な疎水性相互作用および追加の分子内ジスルフィド結合を導入するように変更されている。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、それぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダーを利用する。
【０４５４】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号７７）は以下に示される：
【化６６】
2019510001.tif 000080
【０４５５】
リーダー（シグナル）配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体の複合体のいずれかよりむしろＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで置き換え、スレオニンをトリプトファンで置き換える）が、上の二重下線で示されるように融合タンパク質のＦｃドメインに導入され得る。配列番号７７のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
【０４５６】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の通りである：
【化６７】
2019510001.tif 000081
【０４５７】
ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号７９）の相補的形態は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
【化６８】
2019510001.tif 000082
【０４５８】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。上記配列番号７７および７８のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドでヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換が、上の二重下線で示されるようにＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入され得る。配列番号７９のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
【０４５９】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質配列は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリジン（Ｋ）が除去されて提供されてもよい。
【化６９】
2019510001.tif 000083
【０４６０】
それぞれ、配列番号７８および配列番号８０のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞系から同時発現させ、精製して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを含む異種複合体を生じさせることができる。
【０４６１】
様々なＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序で、以下のもの：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれよりも多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成することができた。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換によって完了することができた。
【０４６２】
非対称性Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを変化させて、それぞれ、配列番号１３９〜１４２および配列番号１４３〜１４６のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃポリペプチド配列中に示されるように、正味の分子電荷に基づく精製を容易にするために、２つのＦｃドメイン間に相補的疎水性相互作用、さらなる分子間ジスルフィド結合、および静電気的差異を導入する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダーを使用する。
【０４６３】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１３９）を以下に示す。
【化７０】
2019510001.tif 000084
【０４６４】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。可能なホモ二量体複合体のいずれかよりもＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２個のアミノ酸置換（セリンをシステインで、およびスレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上で二重下線によって示されるように融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、２個のアミノ酸置換（リジンを酸性アミノ酸で置き換える）も、上で二重下線によって示されるように融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１３９のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端にリジンを付加して提供され得る。
【０４６５】
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号１４０）によってコードされる。
【化７１】
2019510001.tif 000085
【化７２】
2019510001.tif 000086
【０４６６】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の通りであり（配列番号１４１）、任意選択で、Ｃ末端にリジンを付加して提供され得る。
【化７３】
2019510001.tif 000087
【０４６７】
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１４２）によってコードされる。
【化７４】
2019510001.tif 000088
【化７５】
2019510001.tif 000089
【０４６８】
相補形態のＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１４３）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリジンを除去して提供され得る。
【化７６】
2019510001.tif 000090
【０４６９】
リーダー配列およびリンカーに下線を付す。上の配列番号１３９および配列番号１４１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を導くために、４個のアミノ酸置換（チロシンをシステインで、スレオニンをセリンで、ロイシンをアラニンで、およびチロシンをバリンで置き換える）を、上に二重下線によって示されたようにＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、２個のアミノ酸置換（アスパラギンをアルギニンで、およびアスパラギン酸をアルギニンで置き換える）を、上に二重下線で示されたようにＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することもできる。配列番号１４３のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリジンを除去して提供され得る。
【０４７０】
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１４４）によってコードされる。
【化７７】
2019510001.tif 000091
【化７８】
2019510001.tif 000092
【０４７１】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は以下の通りであり（配列番号１４５）、任意選択で、Ｃ末端からリジンを除去して提供され得る。
【化７９】
2019510001.tif 000093
【０４７２】
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１４６）によってコードされる。
【化８０】
2019510001.tif 000094
【化８１】
2019510001.tif 000095
【０４７３】
それぞれ、配列番号１４１および配列番号１４５のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞系から同時発現させ、精製して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを含む異種複合体を生じさせることができる。
【０４７４】
様々なＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序で、以下のもの：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、エピトープに基づくアフィニティクロマトグラフィー（例えば、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ上のエピトープに対する抗体または機能的に等価なリガンドを用いる）、および多様なクロマトグラフィー（例えば、静電気的リガンドと疎水性リガンドの両方を含有する樹脂を用いる）のうちの３つまたはそれよりも多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成することができた。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換によって完了することができた。
【０４７５】
実施例１５．ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体と比較したＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ベースの結合アッセイを使用して、上記で記載したＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体複合体およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用するシステムに独立に捕捉させた。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上を流動させた。結果を、下記の表にまとめ、この表では、有効なリガンドトラップを最もよく示すリガンドのオフ速度（ｋｄ）を、グレーの影で表示する。
【表９】
2019510001.tif 000096
【０４７６】
これらの比較結合データは、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体またはＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体と比べて結合プロファイル／結合選択性の変更を有することを実証する。、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体は、ホモ二量体と比較してアクチビンＢへの結合の増強を提示し、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体について観察されるようなアクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１への強い結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３への結合の実質的な低減を呈示する。特に、ＢＭＰ９は、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体に対して低度のアフィニティを提示するか、または観察可能なアフィニティを提示しないが、このリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体には強く結合する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と同様に、ヘテロ二量体は、ＢＭＰ６への中レベルの結合を保持する。図１９を参照。
【０４７７】
加えて、Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイを使用して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体の、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９によるシグナル伝達に対する効果を評価した。細胞系：ヒト横紋筋肉腫（筋肉に由来する）である。レポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２である（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８年、ＥＭＢＯ、１７巻：３０９１〜３１００頁において記載されている通り）。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦ−β応答性遺伝子（ＰＡＩ−１遺伝子）内に存在するので、このベクターは、Ｓｍａｄ２および３を介してシグナル伝達する因子のために一般に使用される。例示的なＡ−２０４レポーター遺伝子アッセイを、下記に概括する。
１日目：Ａ−２０４細胞を、４８ウェルプレートに分注する。
２日目：Ａ−２０４細胞に、１０ｕｇのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２またはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０ｕｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１ｕｇ）およびＦｕｇｅｎｅをトランスフェクトする。
３日目：因子（培地＋０．１％のＢＳＡに希釈した）を添加する。阻害剤は、細胞に添加する前に約１時間にわたり因子と共にプレインキュベートする必要がある。約６時間後、細胞をＰＢＳですすぎ、次いで、溶解させる。
【０４７８】
上記の工程の後、出願人は、ルシフェラーゼアッセイを実施した。
【０４７９】
このアッセイでは、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体のいずれも、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８の強力な阻害剤であることが決定された。特に、図１９に例示される比較ホモ二量体／ヘテロ二量体ＩＣ５０データにおいて見ることができるように、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と同様にアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害する。しかし、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０シグナル伝達経路のＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体による阻害は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較して著明に低減した。このデータは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対しては、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体のいずれもが、強い結合を提示するが、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較してＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体に対して著明に低減されたアフィニティを有することを観察した上記で論じた結合データと符合する。
【０４８０】
したがって、まとめると、これらのデータは、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較してアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを実証する。したがって、このような選択的アンタゴニズムが有利なある特定の適用では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体より有用である。例として、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＣ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のうちの１つまたは複数に対するアンタゴニズムは保持するが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ６のうちの１つまたは複数に対するアンタゴニズムは最小化することが所望される治療適用が挙げられる。
【０４８１】
（実施例１６）
マウスにおけるＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の抗腫瘍活性
出願人は、ホモ二量体ＡＬＫ４−ＦｃまたはＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（上記参照）と比較して、リガンド結合プロファイルの変化を示す、ヘテロ二量体融合タンパク質ＡＬＫ４−ｈＦｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃの潜在的な抗腫瘍活性を調査した。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、処置に無作為に割り当て（ｎ＝１０匹／群）、腫瘍埋込みの２日前に開始して、週に２回、ＡＬＫ４−ｈＦｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ（５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ）で腹腔内処置した。０日目に、それぞれのマウスに、ＰＢＳ（１００μＬ）中に懸濁した１×１０６個のＲＬ♂１（ＲＬ雄１）細胞を皮下接種した。マウスへの接種後、体重および腫瘍体積を週に２回測定した。ＩＡＣＵＣ規則により、生存分析のために使用された終点は、２０００ｍｍ３より大きい腫瘍体積、２０％を超える体重減少、または後肢麻痺であった。
【０４８２】
試験の結果を、以下の表に示す。
【表１０】
2019510001.tif 000097
【０４８３】
ＡＬＫ４−ｈＦｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃヘテロ二量体を用いる処置は、ビヒクル処置されたマウスの０匹と比較して、４１日目に１０匹のマウスのうちの４匹（４０％）において、無腫瘍状態をもたらした。ログランク検定における中央生存の増加および高い有意性（表を参照されたい）はまた、ＡＬＫ４−ｈＦｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃが、腫瘍担持マウスの生存を促進したことを示す。これらの結果は、ヘテロ二量体ＡＬＫ４−ｈＦｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ融合タンパク質複合体がｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有することを示している。
【０４８４】
まとめると、前記結果は、ホモ二量体ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ、ホモ二量体ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ、および異種ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質複合体は、がんのげっ歯類モデルにおいて抗腫瘍活性を有することを示す。そのような活性は、少なくとも部分的には、Ｔ細胞免疫の変化によって媒介されると考えられる。かくして、このデータは、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが、特に、がんを処置するための免疫腫瘍剤として、免疫活性を増加させることを必要とする患者における免疫活性を増加させるのに有用であり得ることを示す。
【０４８５】
（実施例１７）
マウス腫瘍モデルにおける、単独での、およびＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストと組み合わせたＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体の抗腫瘍活性
出願人は、同系マウス白血病モデルにおけるＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂモノクローナル抗体の潜在的な抗腫瘍活性を調査した。７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを処置群に割り当て（ｎ＝１０匹／群）、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＰＤ１抗体（３ｍｇ／ｋｇ）、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体と抗ＰＤ１抗体との組合せ（それぞれ、１０ｍｇ／ｋｇと３ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクルのみ（ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ；対照マウス）で腹腔内処置した。腫瘍埋込みの２日前に開始して、マウスをＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体で処置し、その後、週に２回のベースで処置した。マウスを、腫瘍埋込み後、３、６、および９日目に抗ＰＤ１抗体で処置した。０日目に、それぞれのマウスに、ＰＢＳ（１００μＬ）中に懸濁した１×１０６個のＲＬ♂１（ＲＬ♂１）細胞を皮下接種した。ＲＬ♂１は、ＢＡＬＢ／ｃ起源のｘ線誘導性白血病であり（Sato  Hら、１９７３年、J  Exp  Med  １３８巻：５９３〜６０６頁）、細胞は、ＭＥＸＴ、日本のナショナルバイオリソースプロジェクトを介してＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ（バイオリソースセンター）細胞バンクから得られたものであり、これらの試験における使用のためにサブクローニングされたものであった。マウスへの接種後、体重および腫瘍体積を週に２回測定した。カリパスを用いて得られた２次元測定値から、腫瘍体積を算出した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ＬｘＷｘＷ）／２（式中、ＬおよびＷは、それぞれ、腫瘍の長さおよび幅（ｍｍ）である）。地方のＩＡＣＵＣ規則により、生存分析のために使用された終点は、２０００ｍｍ３より大きい腫瘍体積、２０％を超える体重減少、または後肢麻痺であった。
【０４８６】
以下の表に示されるように、組合せ療法は、いずれかの単剤療法よりも、がんの処置に対する驚くべき高い効果を有していた。
【表１１】
2019510001.tif 000098
【０４８７】
それぞれの単剤療法は、がん処置に対する中程度の効果を示し、マウスの２０％が３４日目に無腫瘍であった（それに対して、ビヒクル群の全マウスが２０日目までに最大腫瘍サイズに達した）。対照的に、ＡｃｔＲＩＩＢ／Ａ  ｍＡｂとＰＤ−１  ｍＡｂとの組合せによる処置は、抗腫瘍活性の驚くべき有意な増加をもたらした。特に、組合せ療法は、３４日目に６０％のマウスに無腫瘍をもたらしたが、これは、その別々の効果の合計よりも高い。この型の相乗作用は一般に、個々の薬剤が異なる細胞機構を介して作用していることの証拠であると考えられる。腫瘍負荷に対する効果の増大はまた、組合せ療法を受けているマウスにおける生存時間の増大とも相関していた。３４日目までに、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ  ｍＡｂまたはＰＤ１  ｍＡｂのいずれかを受けているマウスのわずか２０％が生存していた。対照的に、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ  ｍＡｂとＰＤ１  ｍＡｂとの組合せ療法を受けているマウスの６０％が、試験の３４日目に依然として生存していた。
【０４８８】
したがって、このデータは、ＡｃｔＲＩＩまたはＰＤ１−ＰＤＬ１シグナル伝達経路のいずれかの阻害が、がんの処置において有用であり得るが、両方の経路の阻害を使用して、抗腫瘍活性の増加が望ましいそのような実験または臨床状況において抗腫瘍活性を相乗的に増大させることができることを示している。例えば、補完的であるが、明確ではない機構により作用して、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストとの同時処置により、より低用量のＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストについて抗腫瘍効果を得ることができ、それによって、より高レベルのＰＤ１−ＰＤＬ１アンタゴニストと関連する潜在的な有害副作用または他の問題を回避することができる。かくして、このデータは、がんおよび腫瘍を処置するために、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを単独で使用することができるだけでなく、特に、他の免疫療法剤と組み合わせて使用することができることを示している。
【０４８９】
参照による組込み
本明細書に記載の全ての刊行物および特許は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許が具体的かつ個別的に参照により組み込まれると示されたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
主題の特定の実施形態が論じられてきたが、上記明細書は例示的なものであり、限定的なものではない。多くの変更が、本明細書および以下の特許請求の範囲を見れば、当業者には明らかとなるであろう。本発明の完全な範囲は、その等価物の完全な範囲と共に、特許請求の範囲を、また、そのような変更と共に、本明細書を参照することによって決定されるべきである。
【図１】
2019510001.tif 000099
【図２】
2019510001.tif 000100
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
2019510001.tif 000106
【図８Ｂ】
2019510001.tif 000107
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2019510001.tif 000109
【図１０】
2019510001.tif 000110
【図１１Ａ】
2019510001.tif 000111
【図１１Ｂ】
2019510001.tif 000112
【図１２】
2019510001.tif 000113
【図１３】
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【図１４】
2019510001.tif 000115
【図１５Ａ】
2019510001.tif 000116
【図１５Ｂ】
2019510001.tif 000117
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
2019510001.tif 000121
【図１９】
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【図２０】
2019510001.tif 000123
【図２１】
2019510001.tif 000124
【図２２】
2019510001.tif 000125
【図２３Ａ】
2019510001.tif 000126
【図２３Ｂ】
2019510001.tif 000127
【図２３Ｃ】
2019510001.tif 000128
【図２３Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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