(57)【要約】  本発明は、２００μｌ未満を含む血液サンプル中のヘモグロビンの濃度に対するＨｂＡ１ｃの量を決定するための方法及びパーツキットに関し、この方法は、サンプルにフルオロフォアを添加して、経時的な蛍光の変化が＞０である時間間隔内の１又は複数の時点で蛍光を測定する工程と、次いで、ヘモグロビン結合剤を添加することによってヘモグロビンを測定する工程と、約５７０ｎｍでの透過率の変化を測定する工程と、得られた結果を内部標準と比較する工程と、を含む。
2019502123.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ＨｂＡ１ｃを結合することができるリガンドを含むフルオロフォアを準備する工程と、
ｂ．緩衝液を準備する工程と、
ｃ．約５７０ｎｍの波長で時間Ｔ０での前記緩衝液の透過率（ＴＲＴ０）を測定し、任意選択的に、励起時にフルオロフォアが蛍光を発する波長（Ｘ）での前記緩衝液の蛍光（ＦＬＴ０）を測定する工程と、
ｄ．前記フルオロフォアを前記緩衝液に添加して緩衝反応液を生成し、任意選択的に、波長Ｘで時間Ｔ１での前記緩衝反応液の蛍光（ＦＬＴ１）を測定する工程と、
ｅ．時間Ｔ２で前記サンプルを前記緩衝反応液に添加することにより、前記フルオロフォアとＨｂＡ１ｃとを含む蛍光複合体を含む第１検出液が形成され、サンプル中の全てよりも少ないＨｂＡ１ｃが検出液中の蛍光複合体の一部であることを反映して、経時的な蛍光の変化が＞０である時間間隔Ｔ３〜Ｔ４内の１又は複数の時点での前記第１検出液の波長Ｘでの蛍光（ＦＬＴ３，４）を測定する工程と、
ｆ．時間Ｔ５で前記第１の検出液にヘモグロビン結合剤を添加することにより、ヘモグロビン結合剤とヘモグロビンとを含む複合体を含む第２の検出液を生成し、時間Ｔ６で約５７０ｎｍでの前記第２の検出液の透過率（ＴＲＴ６）を測定する工程と、
ｇ．透過シグナル（ＴＲＴ６）を透過シグナル（ＴＲＴ０）で除算することによってサンプルの吸光度を決定する工程と、
ｈ．蛍光シグナル（ＦＬＴ３，４）を工程ｇ）で決定された吸光度で除算することによってＨｂＡ１ｃの相対量を決定し、得られた結果を内部標準と比較する工程と、
を含む、２００μｌ未満を含む血液サンプル中のヘモグロビンの濃度に対するＨｂＡ１ｃの量を決定する方法。
【請求項２】
工程ｄ）における液体に添加されるフルオロフォアの量が、工程ｄ）における液体の蛍光（ＦＬＴ１）を測定することによって決定され、蛍光シグナル（ＦＬＴ３，４）が、添加されるフルオロフォアの量に関して補正される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
時間間隔Ｔ３〜Ｔ４は、時間Ｔ２でサンプルを緩衝反応液に添加した後の０〜３０秒、例えば０〜２０秒の時間間隔である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光（ＦＬＴ３，４）の測定が、時間間隔Ｔ３〜Ｔ４内の少なくとも２つの時点の測定を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
蛍光（ＦＬＴ３，４）の測定が、時間間隔Ｔ３〜Ｔ４内の少なくとも３つの時点の測定を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヘモグロビン結合剤がラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドがボレート又はボロン酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記フルオロフォアがエオシンを含み、前記蛍光Ｘが約５７０ｎｍで測定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
血液サンプルが５μｌ未満を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＨｂＡ１ｃを結合することができるリガンドを含むフルオロフォアと、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を実施するための指示書と、前記方法の工程ｈ）で使用するための既知の量のＨｂＡ１ｃ及びヘモグロビンを有する内部標準について前記方法を用いて得られる１又は複数の所定の値と、を含む、サンプル中のＨｂＡ１ｃの量を決定するためのパーツキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００μｌ未満を含む血液サンプル中のＨｂＡ１ｃの量を決定するための方法に関する。更に、本発明は、サンプル中のＨｂＡ１ｃの量を決定するためのパーツキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ、又はヘモグロビンＡ１ｃ、ＨｂＡ１ｃ、Ａ１Ｃ若しくはＨｂ１ｃ）は、ヘモグロビンの天然形態であり、主にヒトにおける長期間にわたる平均血漿グルコース濃度を同定するために測定される。ＨｂＡ１ｃは、血漿グルコースへのヘモグロビンの曝露によって非酵素的な糖化経路で形成される。血漿グルコースの平均量が増加するにつれ、糖化ヘモグロビンの割合は予測可能な形で増加する。従って、ＨｂＡ１ｃの血中レベルは、測定前の数ヶ月における患者の血液中の平均グルコース濃度のマーカーとしての役割を果たし、運動、休息、食事、及びグルコースレベルに対する他の行動的影響等に起因するグルコースレベルの自然日変動に対して比較的鈍感である。従って、ＨｂＡ１ｃは、個々の患者の一般的な健康状態のマーカーとして示唆されている。
【０００３】
患者から採取した血液サンプル中のＨｂＡ１ｃの量を正確に評価することは、医師に普遍的な課題を提起する。多量の糖化ヘモグロビンは、血糖値があまり制御されていないことを示し、これは心血管疾患、腎症、及び網膜症に関連している。特に、１型及び２型糖尿病患者では、ＨｂＡ１ｃのモニタリングが診断及び治療を改善する可能性がある。
【０００４】
血液サンプル中のＨｂＡ１ｃを測定する従来の方法には、カラムベースのボレート親和性、ＨＰＬＣ親和性、免疫アッセイ、及びボレート蛍光消光法が含まれ、これらの方法では、フルオロフォアへのＨｂＡ１ｃの選択的結合によって、フルオロフォアを含む液体中の蛍光の変化が誘発される。ＨｂＡ１ｃ含有サンプルへの曝露後の蛍光測定値の変化を評価し、ヘモグロビンの相対的存在と相関させる。
【０００５】
特許文献１及び特許文献２はそのような方法を開示し、糖化タンパク質（ＨｂＡ１ｃ等）と選択的に反応するボロン酸基を含む、光ルミネセンス又は化学発光性マーカー化合物の使用を記載している。
【０００６】
全ヘモグロビンの濃度を決定する方法は、例えば特許文献３に開示されるように、４０５ｎｍ又は４１５ｎｍでの吸光度の従来型測光測定を使用することである。別の方法は、等吸収点（ｎｍ）で全ヘモグロビンを測定することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０１７６３０９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８７７，０２５号明細書
【特許文献３】欧州特許第０７７２７７９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の方法は、特に小容量サンプルとの関連で使用される場合、正確度及び再現性の点で不満足な結果をもたらす。再現性は、ＨｂＡ１ｃ検体を糖尿病患者のモニタリングツールとして使用する場合に特に重要である。４％未満、例えば３．５％未満（ＮＧＳＰ標準）の％ＣＶ値を有することが好ましい。
【０００９】
このように、ＨｂＡ１ｃを決定するための代替的な方法、特に高い正確度を提供すると共に高い再現性を付与する方法が、当技術分野において絶えず必要とされている。本発明の目的は、このような方法を提供することである。
【００１０】
患者及び使用者に優しい装置による血液サンプル中の検体の測定は、従来、２００μｌ未満の血液からなる血液サンプルの分析を目的とする。このような量は、重大な健康リスクに関連することなく、個々の患者によって容易に得られる。
【００１１】
従って、２００μｌ未満の血液を含む血液サンプル中のＨｂＡ１ｃ量を分析することができる方法及び装置が当技術分野において必要とされている。更により具体的には、１８０μｌ未満の血液、例えば１５０μｌ未満、例えば１００μｌ未満、例えば５０μｌ未満、例えば２０μｌ未満、例えば１０μｌ未満、例えば９μｌ未満、例えば８μｌ未満、例えば７μｌ未満、例えば６μｌ未満、例えば５μｌ未満、例えば４μｌ未満、例えば３μｌ未満、例えば２μｌ以下の血液を含む血液サンプル中のＨｂＡ１ｃ量を分析することができる方法及び装置が当技術分野で必要とされている。本発明の目的は、このような方法を提供することである。
【００１２】
別の課題は、各分析の容易さを、好ましくは血液中のＨｂＡ１ｃの測定を医師の助けなしに患者が行うことができるレベルまで高めることである。更に、各測定値が消費者によって手頃な価格になるようにすることも課題である。
【００１３】
従って、個々の患者が血液サンプル中のＨｂＡ１ｃレベルを正確且つ容易に測定することを可能にする方法及び患者に優しいパーツキットが当技術分野において必要とされている。更に、サンプル及び血液分析の簡単で容易な取り扱いを可能にする方法及びパーツキットが当技術分野において必要とされている。本発明の目的は、このような方法及びパーツキットを提供することである。
【００１４】
上記のように、血液サンプル中のＨｂＡ１ｃレベルの正確で感受性の高い再現性のある測定を提供する方法及び患者に優しいパーツキットに対する遍在的必要性が当技術分野において存在する。本発明の目的は、このようなパーツキット及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
血液サンプル中のＨｂＡ１ｃレベルの測定は、２つの測定、即ち、ＨｂＡ１ｃの量の測定及びサンプル中のヘモグロビンの総量の測定を必要とする。
【００１６】
驚くべきことに、蛍光色素結合法でサンプル中のＨｂＡ１ｃの量を測定することによって、少量のサンプルを用いた正確度及び精度がより高い改良方法を得ることができ、この方法では、サンプル中のＨｂＡ１ｃの全てがフルオロフォアと会合しているわけではないことを反映して、蛍光が時間と共に減少している、サンプルとフルオロフォアとの接触後の特定時間（Ｔ３，４）に蛍光測定を行うことが見出された。前記時間（Ｔ３，４）は、結合段階とも呼ばれる。
【００１７】
更に驚くべきことに、サンプルをヘモグロビン結合剤と接触させた後に約５７０ｎｍでの吸光度を測定することによって全ヘモグロビン濃度を測定することによって、正確度及び精度がより高い改良方法が得られ、前記測定は、ＨｂＡ１ｃの量を測定した後にサンプル中で行われることが見出された。
【００１８】
従って、本発明により上記の問題が解決された。本発明は、２００μｌ未満を含む血液サンプル中のヘモグロビンの濃度に対するＨｂＡ１ｃの量を決定する方法であって、
ａ．ＨｂＡ１ｃを結合することができるリガンドを含むフルオロフォアを準備する工程と、
ｂ．緩衝液を準備する工程と、
ｃ．約５７０ｎｍの波長で時間Ｔ０での緩衝液の透過率（ＴＲＴ０）を測定し、任意選択的に、励起時にフルオロフォアが蛍光を発する波長（Ｘ）での緩衝液の蛍光（ＦＬＴ０）を測定する工程と、
ｄ．フルオロフォアを緩衝液に添加して緩衝反応液を生成し、任意選択的に、波長Ｘで時間Ｔ１での緩衝反応液の蛍光（ＦＬＴ１）を測定する工程と、
ｅ．時間Ｔ２でサンプルを緩衝反応液に添加することにより、フルオロフォアとＨｂＡ１ｃとを含む蛍光複合体を含む第１検出液が形成され、サンプル中の全てよりも少ないＨｂＡ１ｃが検出液中の蛍光複合体の一部であることを反映して、経時的な蛍光の変化が＞０である時間間隔Ｔ３〜Ｔ４内の１又は複数の時点での第１検出液の波長Ｘでの蛍光（ＦＬＴ３，４）を測定する工程と、
ｆ．時間Ｔ５で第１の検出液にヘモグロビン結合剤を添加することにより、ヘモグロビン結合剤とヘモグロビンとを含む複合体を含む第２の検出液を生成し、時間Ｔ６で約５７０ｎｍでの第２の検出液の透過率（ＴＲＴ６）を測定する工程と、
ｇ．透過シグナル（ＴＲＴ６）を透過シグナル（ＴＲＴ０）で除算することによってサンプルの吸光度を決定する工程と、
ｈ．蛍光信号（ＦＬＴ３，４）を工程ｇ）で決定された吸光度で除算することによってＨｂＡ１ｃの相対量を決定し、得られた結果を内部標準と比較する工程と、
を含む方法を提供する。
【００１９】
相対的ＨｂＡ１ｃ濃度対全ヘモグロビン濃度は、得られた測定値と、既知の濃度のＨｂＡ１ｃ及びヘモグロビンを有する内部標準サンプルを適用する同一の方法を用いて得られた結果とを比較することによって決定することができる。そのような内部標準サンプルは、商業的供給源から得ることができる。
【００２０】
本発明の実施形態は、添付図面に関して以下により詳細に説明される。図面は、本発明を実施する１つの方法を示し、添付の請求項の範囲内に入る他の可能な実施形態に限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】使用される測定装置内の光学系を示しており、以下「ＴＲＡＣＥ」と呼ぶ。光学系は、２つの光路からなる。光路１において、光源はＬＥＤ５７０ｎｍを、検出器はフォトダイオード１を使用して透過率を５７０ｎｍで測定する。光路２において、光源はＬＥＤ５１０であり、フォトダイオード１は蛍光シグナルを測定するための検出器である。更に、光路２は、フォトダイオード２上の５１０ｎｍシグナルを測定する伝送チャネルも有する。
【図２】実施例１で説明するようなＴＲＡＣＥ上の６つのＨｂＡ１ｃ標準（ＢＩＯ−ＲＡＤ）測定値を示す。蛍光はｔ＝２１（血液サンプルを反応液に加えたとき）からｔ＝１９８秒まで毎秒連続して測定した。図２に見られるように、蛍光は減少し続け、約８０〜１００秒で漸近線に僅かに近づく。
【図３】参照としてＴｉｎａ−ｑｕａｎｔ  ＨｂＡ１ｃアッセイを使用した、ＴＲＡＣＥ未処理シグナル（ｘ軸）からＩＦＣＣ単位（ｙ軸）への変換を示す。
【図４】参照としてＴｉｎａ−ｑｕａｎｔ  ＨｂＡ１ｃアッセイを用いた、ＴＲＡＣＥ未処理シグナル（ｘ軸）からＮＧＳＰ単位（ｙ軸）への変換を示す。
【図５】図４に示す較正曲線に従ってＴＲＡＣＥ  ＨｂＡ１ｃ未処理シグナル（ｘ軸）から最終ＮＧＳＰ単位（ｙ軸）に変換された４０個の患者サンプルを示す。
【図６】表４の内容をグラフで示しているが、４０人の患者から得られたＴＲＡＣＥ  ＨｂＡ１ｃ  ＮＧＳＰ結果は、Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｂａｓ  ｃシステム（Ｔｉｎａ−ｑｕａｎｔ  ＨｂＡ１ｃアッセイ方式）からの最終ＴＲＡＣＥ  ＮＧＳＰシグナル（ｙ軸）の関数として示されている（ｘ軸）。
【図７】表７の内容をグラフで示しており、ここでは、６つの較正物質から得られたＴＲＡＣＥ  ＨｂＡ１ｃ  ＩＦＣＣ結果は、工程１ｄで添加されたフルオロフォアの３つの異なる濃度での最終ＴＲＡＣＥシグナル（ｙ軸）の関数として示されている（ｘ軸）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
【００２３】
「フルオロフォア」
【００２４】
本発明によれば、フルオロフォアとは、反応及び検出液体中に存在することにより、光ルミネセンスマーカー化合物等の検出可能な電磁放射線（光）の放出を引き起こす（励起された後）薬剤又は手段を意味する。好ましい実施形態では、フルオロフォアは、光に接触又は照射されると検出可能な光を発する薬剤である。
【００２５】
「血液サンプル」
【００２６】
本発明によれば、血液サンプルとは、患者からの全血サンプル、又は患者からの赤血球に由来するか、又は患者からの赤血球を含む材料を意味する。
【００２７】
「リガンド」
【００２８】
本発明によれば、リガンドは、（例えば、フルオロフォア上に又はフルオロフォアと会合して）存在することによりＨｂＡ１ｃとフルオロフォアとの結合又は会合を生じさせる薬剤又は手段を意味する。好ましい実施形態では、リガンドは、フルオロフォアに（共有結合的に）付着し、ＨｂＡ１ｃに結合することができる薬剤である。ボレート（ｂｏｒａｔｅ）はＨｂＡ１ｃに選択的に結合し、いくつかのフルオロフォアに付着することができる。従って、ボレート又はボロン酸は、本発明による適切なリガンドである。従って、本発明によれば、「リガンドを含むフルオロフォア」は、フルオロフォア基及びリガンド基を含む分子複合体を意味する。米国特許第５，８７７，０２５号は、ＨｂＡ１ｃ等の糖化タンパク質と選択的に反応するボロン酸基を含む光ルミネセンス又は化学発光性マーカー化合物である例示的なフルオロフォア／リガンド複合体を記載している。
【００２９】
「結合段階」
【００３０】
本発明によれば、結合段階は、ＨｂＡ１ｃとフルオロフォアとの結合又は会合は生じているが、結合がまだ完了していない段階を意味する。
【００３１】
「精度」及び「正確度」
【００３２】
本発明によれば、精度とは、互いに大きく異ならない（例えば、同じサンプルに関する複数回からの）ＨｂＡ１ｃ濃度に関する試験結果を生成する方法の能力を意味する。本発明によれば、正確度とは、平均値が真のＨｂＡ１ｃ濃度と大きく異ならないＨｂＡ１ｃ濃度に関する試験結果を生成する方法の能力を意味する。方法の正確度が低く、精度が高い場合があり、これは、試験が一貫して真の結果と異なる同様の結果を示すことを意味する。
【００３３】
真の結果は、ＮＧＳＰ標準に従って定義される。また、方法の正確度が高く、精度が低い場合もあり、これは、試験が一貫して異なる結果を示すが、平均結果は真の結果と同様であることを意味する。正確度と精度の両方が高い方法を得て使用することが非常に好ましい。
【００３４】
驚くべきことに、フルオロフォア結合法によってサンプル中のＨｂＡ１ｃの量を測定することにより、正確度及び精度がより高い改良方法が得られることが見出された。この方法では、サンプル中の全てのＨｂＡ１ｃがフルオロフォアと会合しているわけではないことを反映して、時間と共に蛍光が減少している、サンプルとフルオロフォアとの接触後の時間（Ｔ３，４）に蛍光測定を行うものである。前記時間（Ｔ３，４）は、フルオロフォアがリガンドを介してＨｂＡ１ｃに結合する結合段階とも呼ばれる。
【００３５】
更に驚くべきことに、全ヘモグロビンを結合することができる薬剤とサンプルを接触させた後に、約５７０ｎｍでの吸光度の減少を測定することによって、全ヘモグロビン濃度を測定することにより、正確度及び精度がより高い改良方法が得られることが見出された。前記測定は、ＨｂＡ１ｃの量が測定された後にサンプル中で行われるものである。
【００３６】
従って、本発明に至る研究の間に、驚くべきことに、全ヘモグロビン含有量を、全ヘモグロビンが適切なヘモグロビン結合剤に結合して５７０ｎｍでの透過率の検出可能な減少をもたらす方法を用いて測定した後、ＨｂＡ１ｃのフルオロフォアへの結合段階を付与する反応条件下で、フルオロフォアから放出された蛍光に対するＨｂＡ１ｃの影響を測定することによって、改善された精度及び正確度ならびに改善された容易さで血液サンプルからのＨｂＡ１ｃの測定値を得ることが可能であることが観察された。
【００３７】
従って、本発明は、２００μｌ未満を含む血液サンプル中のヘモグロビンの濃度に対するＨｂＡ１ｃの量を決定する方法であって、
ａ．ＨｂＡ１ｃを結合することができるリガンドを含むフルオロフォアを準備する工程と、
ｂ．緩衝液を準備する工程と、
ｃ．約５７０ｎｍの波長で時間Ｔ０での緩衝液の透過率（ＴＲＴ０）を測定し、任意選択的に、励起時にフルオロフォアが蛍光を発する波長（Ｘ）での緩衝液の蛍光（ＦＬＴ０）を測定する工程と、
ｄ．フルオロフォアを緩衝液に添加して緩衝反応液を生成し、任意選択的に、波長Ｘで時間Ｔ１での緩衝反応液の蛍光（ＦＬＴ１）を測定する工程と、
ｅ．時間Ｔ２でサンプルを緩衝反応液に添加することにより、フルオロフォアとＨｂＡ１ｃとを含む蛍光複合体を含む第１検出液が形成され、サンプル中の全てよりも少ないＨｂＡ１ｃが検出液中の蛍光複合体の一部であることを反映して、経時的な蛍光の変化が＞０である時間間隔Ｔ３〜Ｔ４内の１又は複数の時点での第１検出液の波長Ｘでの蛍光（ＦＬＴ３，４）を測定する工程と、
ｆ．第１の検出液にヘモグロビン結合剤を時間Ｔ５で添加することにより、ヘモグロビン結合剤とヘモグロビンとを含む複合体を含む第２の検出液を生成し、時間Ｔ６で約５７０ｎｍでの第２の検出液の透過率（ＴＲＴ６）を測定する工程と、
ｇ．透過シグナル（ＴＲＴ６）を透過シグナル（ＴＲＴ０）で除算することによってサンプルの吸光度を決定する工程と、
ｈ．蛍光信号（ＦＬＴ３，４）を工程ｇ）で決定された吸光度で除算することによってＨｂＡ１ｃの相対量を決定し、得られた結果を内部標準と比較する工程と、
を含む方法に関する。
【００３８】
工程ｈ）で使用される内部標準からの結果は、サンプル結果を生成するときに使用された方法と全く同じ方法を用いて得られた結果でなければならない。内部サンプル結果は、この方法が実施されるたびに実行される必要はないが、好ましくは以前に得られ、後続のサンプルとの比較のために提供され、保存される。しかし、驚くべきことに、サンプルに添加されたフルオロフォアの量は、工程ｈ）の内部標準との比較に関する方法の性能に重大な影響を有することが観察された。
【００３９】
小容量のサンプルに明確な容量のフルオロフォアを添加することは困難な作業であり、実際には、フルオロフォアの量が正確であり且つアッセイ間で均一であることが保証されるパーツキット又はすぐに使用できるアッセイを提供することは不可能である。
【００４０】
しかしながら、驚くべきことに、本発明の方法における結合段階（ＦＬＴ３，４）で行われた蛍光測定は、予め決定された因子によって補正することができることが見出された。前記因子は、サンプル中に存在するフルオロフォアの実際の量に依存する。従って、実際に得られた蛍光シグナルを、使用されるフルオロフォアの量について補正する増倍因子を組み込むことにより、個々のサンプルの各ランを、はるかに高い正確度及び精度で、添加されたフルオロフォアの変動に関係なく内部標準と比較することができる。
【００４１】
従って、好ましい態様では、本発明は、工程ｄ）における液体に添加されるフルオロフォアの量が、工程ｄ）における液体の蛍光（ＦＬＴ１）を測定することによって決定され、蛍光シグナル（ＦＬＴ３，４）が、フルオロフォアの添加量について補正される方法に関する。それぞれの場合に適用される補正因子は、本発明の個々の実施形態（使用される温度、緩衝液、フルオロフォア等の特異的アッセイ条件）によって変化するが、それぞれの特異的アッセイ用に容易に決定され得る。このような補正因子は、フルオロフォアの（実際の）添加量が未知の量である後のアッセイにすぐに適用できるように、特定のアッセイごとに予め決定することができる。
【００４２】
更に、本発明によれば、フルオロフォア−ＨｂＡ１ｃ複合体の形成直後に蛍光減少（ＦＬＴ３，４）が確認された場合、方法の精度及び正確度がより高くなることが観察された。
【００４３】
従って、本発明の好ましい実施形態では、時間Ｔ３〜Ｔ４での検出液の蛍光減少（ＦＬＴ３，４）の測定は、結合段階において、１％超〜８５％未満のＨｂＡ１ｃが、フルオロフォアを含む複合体おいて結合されるときに行われる。
【００４４】
時間Ｔ３〜Ｔ４での検出液の蛍光減少（ＦＬＴ３，４）の測定は、結合段階において、１％超〜７５％未満のＨｂＡ１ｃがフルオロフォアを含む複合体において結合されるときに行われるのがさらにより好ましい。
【００４５】
時間Ｔ３〜Ｔ４での検出液の蛍光減少（ＦＬＴ３，４）の測定は、結合段階において、１％超〜６０％未満のＨｂＡ１ｃがフルオロフォアを含む複合体において結合されるときに行われるのが更により好ましい。
【００４６】
時間Ｔ３〜Ｔ４での検出液の蛍光減少（ＦＬＴ３，４）の測定は、結合段階において、１％超〜５０％未満のＨｂＡ１ｃがフルオロフォアを含む複合体において結合されるときに行われるのが更に好ましい。
【００４７】
好ましい実施形態では、時間Ｔ３〜Ｔ４での検出液の蛍光減少（ＦＬＴ３，４）の少なくとも１つの測定は、結合段階において、１％超〜１０％未満のＨｂＡ１ｃがフルオロフォアを含む複合体において結合される、即ち、少なくとも１つの測定はフルオロフォアの添加直後に行われる。
【００４８】
従って、本発明は、時間間隔Ｔ３〜Ｔ４が、時間Ｔ２で緩衝反応液にサンプルを添加した後の０〜３０秒、例えば０〜２０秒の時間間隔である方法に関する。更により好ましくは、時間間隔Ｔ３〜Ｔ４は、時間Ｔ２でサンプルを緩衝反応液に添加した後、０〜１５秒の時間間隔である。更により好ましくは、時間間隔Ｔ３〜Ｔ４は、時間Ｔ２でサンプルを緩衝反応液に添加した後、０〜１５秒の時間間隔である。
【００４９】
蛍光（ＦＬＴ３，４）の測定は、所与の期間にわたる減少が確認できるように、時間間隔Ｔ３〜Ｔ４内の少なくとも２つの時点での測定を含む。より好ましくは、蛍光（ＦＬＴ３，４）の測定は、時間間隔Ｔ３〜Ｔ４内の少なくとも３つの時点での測定を含み、それによって測定された減少の正確度を改善する。更により好ましくは、蛍光（ＦＬＴ３，４）の測定は、時間間隔Ｔ３〜Ｔ４内の少なくとも４つの時点での測定を含み、それによって測定された減少の正確度を改善する。
【００５０】
相対的ＨｂＡ１ｃ濃度対全ヘモグロビン濃度は、全ヘモグロビン濃度を測定し、相対濃度を計算することによって決定することができる。
【００５１】
約５７０ｎｍでの透過率の測定
【００５２】
ヘモグロビン結合剤とサンプルを接触させる方法を用いてサンプル中のヘモグロビンの量を測定し、約５７０ｎｍでのサンプルの透過率の変化を測定することにより、改善された正確度及び精度が得られることが見出された。本発明による蛍光の測定とは対照的に、（ヘモグロビン結合剤の添加後に）サンプルの透過率の測定が行われる時間は、この方法の性能にとってほとんど重要ではないことが分かった。
【００５３】
実際には、透過率の測定は、約５７０ｎｍで光を放出（及びフィルタリング）する光源（及び好ましくはフィルタ）を用いて液体を照射し、ほぼ同じ波長で透過される光の量を検出することによって行われる。
【００５４】
本発明による方法は、少なくとも２つの透過率測定、砂和ｔ、サンプルのベースライン測定の役割を果たす第１の測定（Ｔ１）と、ベースライン測定値と比較した後、ヘモグロビンを結合する薬剤をサンプルに添加することによって引き起こされる透過率の変化を測定する、全ヘモグロビンを結合する薬剤を添加した後の後続の測定（Ｔ２）とを必要とする。その後、透過率の変化を用いてサンプルの吸光度を決定することができ、これはサンプル中のヘモグロビン濃度の直接測定である。
【００５５】
好ましくは約５７０ｎｍでの蛍光の測定
【００５６】
ＨｂＡ１ｃ結合フルオロフォアとサンプルとを接触させる方法を用いてサンプル中のＨｂＡ１ｃの量を測定し、フルオロフォアのおよそ発光波長でのサンプルの蛍光変化を測定することにより、改善された正確度及び精度が得られることが見出された。
【００５７】
実際には、蛍光測定は、それぞれのフルオロフォアの励起波長付近で光を放出（及びフィルタリング）する光源（及び好ましくはフィルタ）を用いて液体を照射し、フルオロフォアのおよそ発光波長でのサンプルの蛍光を検出することによって行われる。
【００５８】
エオシンを含むフルオロフォアを使用する場合、エオシンは約５４３ｎｍ付近で発光するが、（アッセイの正確度及び精度に影響を及ぼすことなく）透過波長と同じ波長での蛍光を測定し、これにより、はるかに簡単なアッセイを提供することができることが見出された。従って、本発明の非常に好ましい実施形態では、フルオロフォアはエオシンを含み、蛍光測定（Ｘ）は５７０ｎｍで行われる。
【００５９】
フルオロフォア
【００６０】
本発明によれば、用語「フルオロフォア」は、燐光性化合物及び蛍光性化合物の両方を含む。フルオロフォアは、４５０〜８００ｎｍの主励起波長（即ち、タンパク質の主励起波長から幾分離れている）を有することが好ましい。主蛍光波長は４５０〜６００ｎｍであることが更に好ましい。フルオロフォアが、フルオレセイン又はフルオレセイン誘導体のような蛍光化合物の残基、例えばカルボキシフルオレセイン又はクロロフルオレセインを含有することが特に好ましい。この場合、励起波長は好ましくは約４８０ｎｍであり、蛍光は好ましくは約５２０ｎｍで検出される。蛍光ではなく化学発光又は燐光である他の複雑な有機分子もまた、本発明の方法において発光マーカーとして使用することができ、ＨｂＡ１ｃへの共有結合によってそれらの化学発光又は燐光を選択的に消光させることができる。
【００６１】
適切なフルオロフォアには、ナフトフルオレセイン（６００／６７２ｎｍ）エオシン（５２２／５４３ｎｍ）、エリスロシン（５２８／５５３ｎｍ）、クマリン及びウンベリフェロン（３６０／４６０ｎｍ）、誘導体ローダミン誘導体、例えば、ローダミンＢ（５５０／５８５ｎｍ）、テトラメチルローダミン（５４０／５７０ｎｍ）、テキサスレッド誘導体（５８９／６１５ｎｍ）、ルシファーイエロー誘導体（４２０／５３５ｎｍ）、並びに種々のＢＯＤＩＰＹ（４，１  ４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，１  ４ａ  ジアザ−ｓ−インダシン）誘導体、ＮＢＤ−ハロゲン化物（４−ハロゲノ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，１  ３−ジアゾール）誘導体、ランタニドキレート誘導体、遷移金属キレート誘導体、例えばＲｕトリスフェナントロリン又はＲｕトリスビピリジル誘導体及びフィコビリプロテイン誘導体が含まれる（括弧内の数字は主励起及び蛍光波長である）。
【００６２】
励起光源及び放出測定ダイオード（又はそれぞれのフィルタ）は、好ましくは、関連する波長付近の光を放出／測定するが、これらの最適な波長と正確に一致させる必要はない。本発明の好ましい実施形態によれば、フルオロフォアはエオシン（５２２／５４３ｎｍ）を含み、放出蛍光Ｘは約５７０ｎｍで測定され、より簡単なアッセイを提供する。
【００６３】
ＨｂＡ１ｃを結合することができるリガンド
【００６４】
本発明によれば、リガンドは、ＨｂＡ１ｃとフルオロフォアとを選択的に接合又は結合することができる任意の薬剤である。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態において、リガンドはボレート又はボロン酸である。
【００６６】
ヘモグロビン結合剤
【００６７】
本発明によれば、ヘモグロビン結合剤は、あらゆるタイプのヘモグロビンを結合することができる任意の薬剤である。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態では、ヘモグロビン結合剤はラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。
【００６９】
パーツキット
【００７０】
別の実施形態では、本発明は、ＨｂＡ１ｃを結合することができるリガンドを含むフルオロフォアと、本発明による方法を実施するための指示書と、前記方法の工程ｈ）で使用するための既知の量のＨｂＡ１ｃ及びヘモグロビンを有する内部標準について前記方法を用いて得られる１又は複数の所定の値と、を含む、サンプル中のＨｂＡ１ｃの量を決定するためのパーツキットを提供する。
【００７１】
好ましい実施形態では、リガンドは、本発明のパーツキットにおけるボレート又はボロン酸である。
【００７２】
好ましい実施形態では、本発明によるパーツキットにおいて、フルオロフォアはエオシンを含む。
【００７３】
好ましい実施形態では、パーツキットは、前記方法の工程ｄ）においてサンプルに添加されるフルオロフォアの実際の量について補正するために使用される一組の所定の補正因子をさらに含む。
【実施例】
【００７４】
実施例１．ＨｂＡ１ｃアッセイ及び較正手順
【００７５】
サンプル
【００７６】
ヒト血液中の異なるレベルのＨｂＡ１ｃ濃度を表す６つの較正物質サンプルを、Ｌｙｐｈｏｃｈｅｋ  Ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ａ１ｃ直線性セット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）から購入した。このＢＩＯ−ＲＡＤキットからの６つのサンプルを、製造者の指示に従って溶解させた。
【００７７】
ＴＲＡＣＥで測定された６つの直線性サンプル及び未処理シグナル値を、以下の表１に報告する。
【００７８】
【表１】
2019502123.tif 000003
【００７９】
表１は、６つの較正物質（ＢＩＯ−ＲＡＤ）のＴＲＡＣＥ測定値を示す。列２には、ＴＲＡＣＥ蛍光シグナルが示されている。列３には、全ヘモグロビンシグナルが示され、列４には、最終的なＴＲＡＣＥ  ＨｂＡ１ｃ未処理シグナルが示されている。列１は、６つの異なるレベルのＨｂＡ１ｃを示しており、各レベルは特定のＨｂＡ１ｃ濃度を表している。列２は、血液サンプルを添加した後に蛍光減少を２０秒測定した後に５１０ｎｍ蛍光チャネルで報告されたＨｂＡ１ｃの未処理シグナルを示している。列３は、蛍光シグナルを測定し、ＳＬＳ溶液をＴＲＡＣＥキュベットに混合した後の５７０ｎｍ吸光度チャネルで報告されたヘモグロビン吸光度シグナルを示している。５７０ｎｍシグナルを２０秒で測定した。列４は、列２からの蛍光シグナルを列３からの吸光度シグナルで除算した最終的なＨｂＡ１ｃの結果を示している。列４のシグナルは、ＴＲＡＣＥによって報告された最終的なＨｂＡ１ｃ未処理シグナルを表している。
【００８０】
アッセイ手順
【００８１】
ｔ＝０からｔ＝１０秒までの間に、ＨｂＡ１ｃ緩衝液（塩化アンモニウム、デオキシコール酸ナトリウム、アジ化ナトリウム（ＰＨ８，６））からのシグナルを、図１に示すように、ＴＲＡＣＥキュベットの、フォトダイオード１で測定された５１０ｎｍの蛍光チャネル（光路１）及びフォトダイオード２を用いた５７０ｎｍの吸光度チャネル（光路２）に記録した。
【００８２】
時間ｔ＝１１で、エオシン−ボレート（ＨｂＡ１ｃリガンドを含む蛍光マーカー化合物）を反応キュベットに導入した。キュベット内の反応液を５１０ｎｍのＬＥＤ（通過波長５０４〜５２１ｎｍ）で励起し、蛍光シグナルを光路１（フォトダイオード１）及び光路２（フォトダイオード２）の両方にｔ＝１１からｔ＝２０秒までの間記録した。
【００８３】
ｔ＝２１秒で、全血（各サンプルで２．０μｌ）由来のサンプル（レベル１〜６）をキュベットに添加し、ＨｂＡ１ｃ緩衝液及びエオシン−ボロネート（Ｂｏｒｏｎａｔｅ）成分を含む反応液と混合した。
【００８４】
蛍光は、ｔ＝２１（血液サンプルを反応液に加えたとき）からｔ＝１９８秒まで１秒ごとに連続的に測定した。図２に見られるように、蛍光は減少し続け、約８０〜１００秒で漸近線に僅かに近づく。
【００８５】
このアッセイにおいて、ｔ＝２２秒の時点からｔ＝４２秒の時点（即ち、サンプルの添加後２０秒）での測定値、蛍光チャネル（光路１、フォトダイオード１）に記録された蛍光シグナルは、ＨｂＡ１ｃ−フルオロフォア複合体の約５０％が形成されたことを示すことが観察された。この時点（２０秒）前のサンプルの測定値は、この時点後の測定値よりも内部標準とよく相関することが判明した。
【００８６】
ｔ＝４５の時点で、ドデシル硫酸ナトリウムを主キュベットに導入し（３ｍｇ／ｍＬ  ＨｂＡ１ｃ緩衝液）、時間ｔ＝５５〜ｔ＝６５の間に、ラウリル硫酸ナトリウム−全ヘモグロビン複合体を吸光度チャネル（光路２、フォトダイオード２）において測定した。ヘモグロビン濃度を表す最終値は、５７０ｎｍ吸光度チャネル（光路２、フォトダイオード２）におけるｔ＝５５〜ｔ＝６５秒での１０秒測定の中間値で計算した。全ヘモグロビン濃度は、未処理の５７０ｎｍシグナルを、ｔ＝０〜ｔ＝１０秒の間に生成された緩衝シグナルを用いて吸光度シグナルに変換することによって計算された（Ａｂｓ＝２−ｌｏｇ（Ｔ％））、％Ｔ＝（ｔ＝５５〜ｔ＝６５での５７０ｎｍシグナル／ｔ＝０〜ｔ＝１０での５７０ｎｍシグナル））×１００。
【００８７】
最終ＨｂＡ１ｃシグナルは、ＨｂＡ１ｃ＝ＨｂＡ１ｃ（ｔ＝２２〜ｔ＝４２秒での蛍光シグナル／ｔ＝５５〜ｔ＝６５秒での吸光度シグナル）として記録した。
【００８８】
ｔ＝１１〜ｔ＝２０の間に測定された蛍光シグナル、即ち、導入されたフルオロフォア分子の量は、最終ＨｂＡ１ｃシグナルに影響を及ぼし得るが、これは、ＴＲＡＣＥで得られた結果を内部標準と比較する際にこの観察値を相関させる相関因子を導入し得ることを意味していることに留意すべきである。しかしながら、そのような相関因子は容易に決定され、結果を比較するときに容易に使用することができる。
【００８９】
ＴＲＡＣＥ未処理シグナルから最終ＩＦＣＣ又はＮＧＳＰ標準ＨｂＡ１ｃ結果まで
【００９０】
ＨｂＡ１ｃ値をｍｍｏｌ／ｍｏｌ値として報告することはＩＦＣＣ（国際臨床化学連合）単位として知られているが、％値としてＨｂＡ１ｃ値を報告することはＮＧＳＰ（全米グリコヘモグロビン標準化プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ））単位として知られている。
【００９１】
表２に示すように、最終的なＴＲＡＣＥ未処理シグナルは、当技術分野における既知の標準機器に対して較正される。表２には、Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｂａｓ  ｃシステム（Ｔｉｎａ−ｑｕａｎｔ  ＨｂＡ１ｃアッセイ）で測定した６つの較正物質のＩＦＣＣ及びＮＧＳＰ値による既知の値が示されている。
【００９２】
【表２】
2019502123.tif 000004
【００９３】
表２は、ＩＦＣＣ及びＮＧＳＰ標準の両方についての参照方法（Ｒｏｃｈｅ  Ｔｉｎａ−ｑｕａｎｔアッセイ）と比較した６つの較正物質（ＢＩＯ−ＲＡＤ）のＴＲＡＣＥ測定値を示す。図３及び図４では、Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｂａｓ  ｃシステム（Ｔｉｎａ−ｑｕａｎｔ  ＨｂＡ１ｃアッセイ）に対するアッセイの最終ＨｂＡ１ｃ値の較正が示され、図３はＩＦＦＣ較正を示し、図４はＮＧＳＰ較正を示す。
【００９４】
実施例２．ＨｂＡ１ｃ正確度手順
【００９５】
Ｈｅｒｌｅｖ病院から得られた４０人の患者のサンプルを、実施例１に従ってＴＲＡＣＥで測定した。各サンプルについて、ＮＧＳＰ方式で報告されたＲｏｃｈｅ  ｃｏｂａｓ  ｃシステム（Ｔｉｎａ−ｑｕａｎｔ  ＨｂＡ１ｃアッセイ）から既知の値を得た。
【００９６】
表３において、４０人の患者のサンプルについてのＴＲＡＣＥ未処理シグナルは、図４に示される較正アルゴリズムを用いて４０個のＮＧＳＰ値に変換された。
【００９７】
【表３】
2019502123.tif 000005
【００９８】
図５は、表３の内容をグラフで示しているが、４０人の患者からのＴＲＡＣＥ  ＨｂＡ１ｃ未処理シグナルは、最終ＴＲＡＣＥ  ＮＧＳＰシグナル（ｙ軸）の関数として示されている（ｘ軸）。
【００９９】
表４において、ＴＲＡＣＥ上での４０人の患者のランを、Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｂａｓ  ｃシステム（Ｔｉｎａ−ｑｕａｎｔ  ＨｂＡ１ｃアッセイ形式）上での同一の４０人の患者のサンプルのランと比較する。
【０１００】
【表４】
2019502123.tif 000006
【０１０１】
図６は、表４の内容をグラフで示しているが、４０人の患者からのＴＲＡＣＥ  ＨｂＡ１ｃ  ＮＧＳＰ結果は、Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｂａｓ  ｃシステム（Ｔｉｎａ−ｑｕａｎｔ  ＨｂＡ１ｃアッセイ方式）からの最終ＴＲＡＣＥ  ＮＧＳＰシグナル（ｙ軸）の関数として示されている（ｘ軸）。
【０１０２】
図６から、ＴＲＡＣＥ  ＨｂＡ１ｃアッセイ方式対Ｔｉｎａ−ｑｕａｎｔ  ＨｂＡ１ｃアッセイ方式の２つのアッセイ方式の間に良好な相関が存在することが観察され得る。
【０１０３】
表５において、ＴＲＡＣＥとＴｉｎａ−ｑｕａｎｔ  ＨｂＡ１ｃアッセイ方式との間の偏りは、実数値（列４）及び％値（列５）の両方で計算される。
【０１０４】
【表５】
2019502123.tif 000007
【０１０５】
ＮＧＳＰの認証手続きによれば、４０個のうち３７個のサンプルは、既知の標準アッセイから＋／−６％でなければならない。表５に示すように、ＴＲＡＣＥはＮＧＳＰ認証のこの基準を満たす（偏り＝＋／−６％以内）。
【０１０６】
実施例３．ＨｂＡ１ｃ精度手順
【０１０７】
Ｌｉｑｕｉｃｈｅｋ糖尿病コントロールレベル１、２、及び３（ＢＩＯ−ＲＡＤ標準）をＴＲＡＣＥで５日間測定した。各コントロールを１日当たり４回測定した。合計３×４×５＝６０回の測定を実施例１及び２に従って行った。
【０１０８】
較正をＴｉｎａ−ｑｕａｎｔ  ＨｂＡ１ｃアッセイ方式に対して実施し、値をＮＧＳＰ単位で報告した。
【０１０９】
表６は、平均値並びにイントラバッチ及びインターバッチ％ＣＶ表示を示している。
【０１１０】
【表６】
2019502123.tif 000008
【０１１１】
ＮＧＳＰプログラムによると、ＨｂＡ１ｃアッセイの精度の推奨は３．５％未満であるべきである。表６に示すように、本発明による方法は、精度基準に対するＮＧＳＰ推奨のこの基準を満たす。
【０１１２】
実施例４．サンプル中のフルオロフォアの濃度のＨｂＡ１ｃ最終シグナル依存性
【０１１３】
サンプル
【０１１４】
ヒト血液中の異なるレベルのＨｂＡ１ｃ濃度を表す６つの較正物質サンプルを、Ｌｙｐｈｏｃｈｅｋ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ａ１ｃ直線性セット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）から購入した。このＢＩＯ−ＲＡＤキットからの６つのサンプルを、製造者の指示に従って溶解させた。
【０１１５】
６つの直線性サンプルを、本発明による方法の工程１ｄで添加した３つの異なる濃度のフルオロフォア（ＦＬＴ１）で、ＴＲＡＣＥで測定した。最終シグナル値を表７に報告する。
【０１１６】
【表７】
2019502123.tif 000009
【０１１７】
表７は、工程１ｄ（ＦＬＴ１）で添加した３つの異なる濃度のフルオロフォアで、ＴＲＡＣＥで測定した６つの直線性サンプルを示している。
【０１１８】
表７及び図７から、添加したフルオロフォアの初期濃度が最終ＨｂＡ１ｃシグナルに影響を及ぼすことが観察され得る。特に、フルオロフォア濃度４μｇで開始する６つの較正物質と比較して、フルオロフォア濃度３μｇで開始する６つの較正物質の間には大きな違いが存在することが観察される。
【図１】
2019502123.tif 000010
【図２】
2019502123.tif 000011
【図３】
2019502123.tif 000012
【図４】
2019502123.tif 000013
【図５】
2019502123.tif 000014
【図６】
2019502123.tif 000015
【図７】
2019502123.tif 000016
【国際調査報告】
2019502123.tif 000017
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