(57)【要約】本発明は、少なくとも２つの透過処理試薬を使用することにより、細胞の試料内の検体の細胞内局在を判定及び定量化する方法を提供する。この方法は、細胞の第１のアリコートを、細胞質膜を透過処理するが核膜を透過処理しない、第１の透過処理試薬で処理することと、細胞の第２のアリコートを、細胞質膜と核膜との両方を透過処理する第２の透過処理試薬で処理することと、第１及び第２のアリコートを、ＢＳＡ若しくはＦＢＳを有する又は有しないＰＢＳなどの洗浄緩衝液で洗浄することと、第１のアリコート及び第２のアリコートを、検体に特異的に結合可能な標識化試薬で染色することと、第１のアリコートの細胞における標識化試薬からの第１のシグナルと、第２のアリコートの細胞における標識化試薬からの第２のシグナルと、を測定することと、第１のシグナルを第２のシグナルと比較して検体の分布を判定することと、を含む。
2019510224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の試料内の検体を定量化する方法であって、
細胞質膜を透過処理するが、核膜を透過処理しない第１の透過処理試薬を用いて、前記細胞の第１のアリコートを処理することと、
前記細胞質膜及び前記核膜の両方を透過処理する第２の透過処理試薬を用いて、前記細胞の第２のアリコートを処理することと、
前記第１のアリコート及び前記第２のアリコートを洗浄することと、
前記検体に特異的に結合できる標識化試薬を用いて、前記第１のアリコート及び前記第２のアリコートを染色することと、
前記第１のアリコートの細胞における前記標識化試薬からの第１のシグナルと、前記第２のアリコートの細胞における前記標識化試薬からの第２のシグナルと、を測定することと、
前記第１のシグナルを前記第２のシグナルと比較して前記検体の分布を判定することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記測定する工程が、前記第１のアリコートの複数の細胞からの前記第１のシグナルと、前記第２のアリコートの複数の細胞からの前記第２のシグナルと、を、細胞ごとに測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞ごとに測定する工程が、サイトメーターで測定することを含む、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞質膜及び小器官膜を透過処理する第３の透過処理試薬を用いて、前記細胞の第３のアリコートを処理することを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の試薬が、０．００１〜０．２５％のジギトニンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の透過処理試薬が、約０．０１〜０．１５％のジギトニンを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の透過処理試薬が、ｐＨ４．５〜６．５の約１〜１００ｍＭのＭＥＳと、０〜２７４ｍＭのＮａＣｌと、０〜５．２ｍＭのＫＣｌと、を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の透過処理試薬が、約１３７ｍＭのＮａＣｌと、約２．７ｍＭのＫＣｌと、を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の透過処理試薬が、＞０．０１％のジギトニン又は＞０．０１２５％のＴＸ−１００のうちの１つを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の透過処理試薬が、約０．０２５〜０．５％のジギトニン又は約０．０１２５〜０．２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のうちの１つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の透過処理試薬が、ｐＨ４．５〜６．５の約１〜１００ｍＭのＭＥＳと、０〜２７４ｍＭのＮａＣｌと、０〜５．２ｍＭのＫＣｌと、を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞の前記第１のアリコートを処理する前記工程が、固定剤を用いて前記細胞を固定することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記固定剤が、約１〜１０％のパラホルムアルデヒドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、単核球を含む、請求項１〜１３のいずれかの一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記検体が、活性化可能なタンパク質、いずれかのコンパートメントに恒常的に存在するタンパク質、疾患試料若しくは異常な試料において差次的に発現若しくは活性化するタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、又は糖類である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性化可能なタンパク質が、転写因子、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ結合若しくは修飾タンパク質、核内若しくは核外輸送受容体、アポトーシス若しくは細胞生存の調節因子、ユビキチン若しくはユビキチン様タンパク質、又はユビキチン若しくはユビキチン様修飾酵素である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
いずれかのコンパートメント内に恒常的に存在する前記タンパク質が、構造タンパク質、小器官特異的マーカー、プロテアソーム、膜貫通タンパク質、表面受容体、核膜孔タンパク質、タンパク質／ペプチド転位酵素、タンパク質フォールディングシャペロン、シグナル伝達スカフォールド、又はイオンチャネルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記検体がまた、前記ＤＮＡ、染色体、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、イオン、モノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、リポタンパク質、糖タンパク質、糖脂質又はそれらのフラグメントであり得る、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、顆粒球を含み、前記第１の透過処理試薬が、約０．０１〜０．１５％のジギトニン及び約０．０１２５〜０．２５％のＴＸ−１００の混合物のうちの１つを含み、前記第２の試薬が、約０．０１〜０．１５％のジギトニン及び＞０．０１２５％のＴｗｅｅｎ  ２０の混合物又は＞０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のアリコート及び前記第２のアリコートを染色する前記工程が、前記第１のアリコート及び前記第２のアリコートを、前記細胞の表面マーカーに特異的に結合可能な標識化試薬で染色することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞の試料内の検体を定量化するためのキットであって、
前記細胞の前記細胞質膜を透過処理するが前記細胞の前記核膜を透過処理しない第１の透過処理試薬と、
前記細胞の前記細胞質膜と前記核膜との両方を透過処理する第２の透過処理試薬と、を含む、キット。
【請求項２２】
前記第１の透過処理試薬が、約０．０１〜０．１５％のジギトニン、又は約０．０１〜０．１５％のジギトニンと約０．０１２５〜０．２５％のＴＸ−１００との混合物のうちの１つを含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記第２の透過処理試薬が、約０．０２５〜０．５％のジギトニン、０．０１２５〜０．２５％のＴＸ−１００、０．０１〜０．１５％のジギトニン及び＞０．０１２５％のＴｗｅｅｎ２０、又は＞０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０のうちの１つを含む、請求項２１又は２２に記載のキット。
【請求項２４】
固定剤を更に含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月１８日に出願された、米国仮特許出願第６２／３１０，５９５号に対する優先権を主張し、その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、細胞試料中の標的検体の細胞内検出及び分析のための方法、物品並びに組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
フローサイトメトリーによる細胞内のマーカーの分析は、それぞれの細胞内に存在するそれぞれの染料又は蛍光マーカーにより放出される絶対シグナルの測定に依存する。これらのデータは、かかるシグナルの細胞内局在を付与するものではなく、可能な場合は、染料又は標的分子の既存の知識によって局在を推定することが利用者に託される。例えば、転写因子などの活性化可能なタンパク質の活性化を分析する場合、従来のフローサイトメトリーによる唯一の既存の方法は、それらのリン酸化又は他の修飾のレベルを分析し、この情報が最終的な核局在と相関すると仮定することである。
【０００４】
これらの分子のいずれかを分析する際に重要な要因は、それらが実際に存在するか否か又は核内へ移行される否かである。シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）ファミリーのメンバーを伴うなどのいくつかの事例では、ＳＴＡＴは、リン酸化されるとただちに核内へ移行するため、この情報は、かなり正確であり得る。しかし、細胞シグナル伝達は、多くの場合非常に複雑であることから、これは必ずしも当てはまらず、ほとんどのタンパク質は、核内への移行の前に必要とされる遠回りの事象のセットを有する。付加的な活性化工程も、核内で一度、転写修飾を開始するために必要とされ得る。
【０００５】
更に、細胞内局在の情報なしに、修飾状態にのみ依存するあらゆる方法は、１）かかる修飾に対する有用な抗体の必要性と、２）それぞれの及び全てのタンパク質／分子に多数の異なる種類の修飾が存在し、全てが、存在し得ないそれら独自の抗体を必要とする、という事実（例えば、リン酸化、カルバミル化、メチル化、アセチル化、スルホン化、ニトロシル化、ユビキチン化など）と、３）ほとんどのタンパク質／分子に関してほとんどの修飾が実際には識別されていない、という事実と、４）経時的なタンパク質の細胞内局在と、又はタンパク質の発現レベル自体と、必ずしも直接相関しない、修飾状態の短命な性質（すなわち、修飾されなくなったタンパク質がなお存在し、標的コンパートメント内で機能している場合がある）と、５）かかる修飾を評価するために利用される透過処理キットの適合性と、６）染色のための修飾に対する抗体のアクセスを可能にするために、分析される分子の表面に修飾が存在するか、又はかかる修飾の生化学的曝露のいずれかの必要性と、を含む、様々な問題によって妨害される。実際に、リン酸化は、ＳＴＡＴファミリーの核内移行の誘発と完全に相関するが、後半の問題は、市場で最も荒い固着／透過処理キット以外でのＳＴＡＴリン酸化の評価を不可能にし、これらのキットは、典型的に、その荒さによって他のタンパク質を検出するという問題を有する。
【０００６】
細胞がサイトメーターを通過するときの細胞の低解像度から中解像度の顕微鏡画像を用いたイメージングフローサイトメトリーは、タンパク質の細胞内局在を視覚的に評価するために使用されてきた。あるいは、細胞は、精製されてから、従来の顕微鏡法、生化学的細胞亜分画に続くタンパク質溶解物のウェスタンブロッティング、又は他の分子生化学的方法のいずれかによって分析されてきた。
【０００７】
これらの先行技術の方法はいずれも、欠点を有する。イメージングフローサイトメトリーは、高価な器具類を必要とする。また、これは主に定性的であり、三次元細胞の二次元画像を撮るため、画像中の核の前方又は後方に位置する核周囲タンパク質又はコンパートメント内のタンパク質の細胞質対核の局在を効果的に区別することができない。同様に、従来の顕微鏡法は良好に作用するが、ほぼ定性的であり、核周囲タンパク質の三次元局在を解決することが困難である。共焦点顕微鏡法などのより高度な顕微鏡技術は、細胞の多数の画像スライスを撮り、その後、それらを三次元画像に再生させることにより、この問題をほぼ解決するが、これらの顕微鏡は、イメージサイトメーターよりもはるかに高価であり、顕微鏡スライドに付着する細胞に最もよく作用する。加えて、最先端の顕微鏡でも、核周囲膜結合タンパク質が核膜の内部に位置するか、外部に位置するかを見分けることはなお困難である。
【０００８】
分子生化学的手法の主な欠点は、分析用のタンパク質抽出物を処理し、調製するために必要な時間と手間であり、ウェスタンブロッティングを含むほとんどの手法が数日を要し得る。加えて、全血などの複雑な試料を分析するために使用される場合、顕微鏡法及び分子生化学的手法の両方に共通する主要な欠点は、標的細胞集団を最初に精製してから、更なる実験及び分析に先立って数日間から数週間、細胞を休止させ、培養し、できる限り増殖させる必要があるという点である。
【０００９】
本発明は、活性化可能なタンパク質などの標的検体の細胞内局在を検出するための従来技術による方法のこれらの欠点及び他の欠点に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、細胞の試料内の検体を定量化する方法を提供する。この方法は、細胞の第１のアリコートを、細胞質膜を透過処理するが核膜を透過処理しない、第１の透過処理試薬で処理することと、細胞の第２のアリコートを、細胞質膜と核膜との両方を透過処理する第２の透過処理試薬で処理することと、第１及び第２のアリコートを、ＢＳＡ若しくはＦＢＳを有する又は有しないＰＢＳなどの洗浄緩衝液で洗浄することと、第１のアリコート及び第２のアリコートを、検体に特異的に結合可能な標識化試薬で染色することと、第１のアリコートの細胞における標識化試薬からの第１のシグナルと、第２のアリコートの細胞における標識化試薬からの第２のシグナルと、を測定することと、第１のシグナルを第２のシグナルと比較して検体の分布を判定することと、を含む。検体は、限定するものではないが、ＮＦ−κＢ、Ｒｅｌ、ＳＴＡＴ、ＴＲＡＦ、ＦｏｘＯ、カテニン、ＣＲＥＢ、ＡＴＦ、ステロイド受容体、ＨＯＸ、ＴＦＩＩ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素、ＳＰ−１、活性化因子タンパク質、Ｃ／ＥＢＰ、Ｅ４ＢＰ、ＮＦＩＬ、ｐ５３、熱ショック因子、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｏｃｔ、ＮＦ−Ｉ、又はＮＦＡＴファミリーのメンバーなどの転写因子又は調節因子；ＥＲＫ、ＡＫＴ、ＧＳＫ、ＭＡＰＫ、ＭＡＰ２Ｋ、ＭＡＰ３Ｋ、ＭＡＰ４Ｋ、ＭＡＰ５Ｋ、ＭＡＰ６Ｋ、ＭＡＰ７Ｋ、ＭＡＰ８Ｋ、ＰＩ３Ｋ、ＣａＭ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＫＧ、ＣＤＫ、ＣＬＫ、ＴＫ、ＴＫＬ、ＣＫ１、ＣＫ２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＧＰＣＲ、又は受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーなどのキナーゼ；ＭＫＰ、ＳＨＰ、カルシニューリン、ＰＰ１、ＰＰ２、ＰＰＭ、ＰＴＰ、ＣＤＣが、ＣＤＣ１４、ＣＤＫＮ３、ＰＴＥＮ、ＳＳＨ、ＤＵＳＰ、タンパク質セリン／スレオニンホスファターゼ、ＰＰＰ１−６、アルカリ性ホスファターゼ、ＣＴＤＰ１、ＣＴＤＳＰ１、ＣＴＤＳＰ２、ＣＴＤＳＰＬ、ＤＵＬＬＡＲＤ、ＥＰＭ２Ａ、ＩＬＫＡＰ、ＭＤＳＰ、ＰＧＡＭ５、ＰＨＬＰＰ１−２、ＰＰＥＦ１−２、ＰＰＴＣ７、ＰＴＰＭＴ１、ＳＳＵ７２、ＵＢＬＣＰ１、ミオチューブラリン、受容体チロシンホスファターゼ、非受容体型ＰＴＰｓ、ＶＨ−１様若しくはＤＳＰ、ＰＲＬ、又は非定型ＤＳＰファミリーのメンバーなどのホスファターゼ；ヒストン、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ジンクフィンガータンパク質、ｂＺＩＰタンパク質、ＨＭＧボックスタンパク質、ロイシンジッパータンパク質、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、転写因子、共活性化因子、共抑制因子、足場タンパク質、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、テロメラーゼ、ポリアデニラーゼ、ＲＮＡスプライシング酵素、及びリボソームファミリーのメンバーなどのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合並びに修飾タンパク質；核内及び核外輸送受容体；ＢＣＬ２ファミリーのメンバー及び多様なチェックポイントタンパク質を含む、アポトーシス又は生存の調節因子；並びにユビキチン及びユビキチン様タンパク質ファミリーのリガーゼ及びそれらの対応する、デユビキチナーゼ、脱ＳＵＭＯ化酵素、脱ＩＳＧ化酵素、ＵＳＰ、及びシステインプロテア���ゼファミリーのメンバーなどの脱共役酵素を含む、活性化可能なタンパク質又は疾患細胞若しくは異常細胞内で差次的に発現又は活性化されるタンパク質であり得る。検体はまた、限定するものではないが、構造的微小繊維、微小管、及び中間径フィラメントタンパク質、小器官特異的マーカー、プロテアソーム、膜貫通タンパク質、表面受容体、核膜孔タンパク質、タンパク質／ペプチド転位酵素、タンパク質フォールディングシャペロン、シグナル伝達足場、及びイオンチャネルを含む、典型的にいずれかのコンパートメントに恒常的に存在するタンパク質であってもよい。検体はまた、ＤＮＡ、染色体、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、イオン、糖類（単糖類、少糖類、又は多糖類など）、リポタンパク質、糖タンパク質、糖脂質又はそれらのフラグメントあってもよい。
【００１１】
この方法は、フローサイトメトリー、イメージングフローサイトメトリー、又はマスサイトメトリーなどによって、細胞ごとにシグナルを測定することを含み得る。試料はまた、顕微鏡法などの他のサイトメトリック法を使用して分析されてもよい。
【００１２】
この方法はまた、細胞の第３のアリコートを、核の透過処理を伴い又は伴わずに、細胞質及び１つ以上の小器官膜を透過処理する第３の透過処理試薬で処理することを含み得る。
【００１３】
第１の透過処理試薬は、ジギトニンを０．００１〜０．２５％含んでもよい。例えば、第１の試薬は、約０．０１〜０．１５％のジギトニン、ｐＨ４．５〜６．５を有する約１〜１００ｍＭのＭＥＳ、０〜２７４ｍＭのＮａＣｌ及び０〜５．２ｍＭのＫＣｌを含んでもよい。
【００１４】
第２の透過処理試薬は、＞０．０１％のジギトニン又は＞０．０１２５％のＴＸ−１００のうちの１つを含んでもよい。いくつかの実施形態では、第２の試薬は、約０．０２５〜０．５％のジギトニン又は約０．０１２５〜０．２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のうちの１つを含んでもよい。第２の試薬はまた、ｐＨ４．５〜６．５を有する約１〜１００ｍＭのＭＥＳ、０〜２７４ｍＭのＮａＣｌ及び０〜５．２ｍＭのＫＣｌを含んでもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞を１〜１０％のパラホルムアルデヒドなどの固定剤で固定する工程を含む。
【００１６】
標的細胞は、多形核細胞（例えば、顆粒球）から構成されてもよく、その場合、第１の透過処理試薬は、細胞質膜を透過処理するための約０．０１〜０．１５％のジギトニンと約０．０１２５〜０．２５％のＴＸ−１００との混合物のうちの１つを含み、第２の試薬は、細胞質膜＋核膜を透過処理するための約０．０１〜０．１５％のジギトニン及び＞０．０１２５％のＴｗｅｅｎ  ２０の混合物又は細胞質膜＋ミトコンドリア膜を透過処理するための＞０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含み得る。
【００１７】
この方法は、第１のアリコート及び第２のアリコートを、細胞の表面マーカーに特異的に結合可能な標識化試薬で染色する工程を含んでもよい。
【００１８】
本発明はまた、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。キットは、細胞の細胞質膜を透過処理し、核膜を透過処理しない第１の透過処理試薬と、細胞の細胞質膜及び核膜の両方を透過処理する第２の透過処理試薬と、を含んでもよい。第１の透過処理試薬は、約０．０１〜０．１５％のジギトニン、又は約０．０１〜０．１５％のジギトニン及び約０．０１２５〜０．２５％のＴＸ−１００の混合物のうちの１つを含んでもよい。第２の透過処理試薬は、約０．０２５〜０．５％のジギトニン、０．０１２５〜０．２５％のＴＸ−１００、０．０１〜０．１５％のジギトニン及び＞０．０１２５％のＴｗｅｅｎ  ２０、又は＞０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０のうちの１つを含んでもよい。キットは、固定剤を更に含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の方法を使用して、全血を溶解するワークフローである。
【００２０】
【図２Ａ】細胞質膜対核膜の透過処理に最適な濃度を決定するためのジギトニン及びＴＸ−１００の滴定。Ａ）全血中の細胞質膜は、およそ０．０３１％のジギトニンで完全に透過処理され、核はまた、およそ０．５％のジギトニン又は０．１２５％のＴＸ−１００で透過処理される。Ｂ）ＰＢＭＣ中の細胞質膜は、およそ０．００１６％のジギトニンで完全に透過処理され、核はまた、およそ０．０５％のジギトニン又は０．０２５％のＴＸ−１００で透過処理される。この図において、カルセインシグナルの減少は原形質膜の透過処理を示し、ＨＤＡＣ１染色のピークは、完全な核の透過処理を示している。完全な溶解の前にＨＤＡＣ１で生じる出っ張りは、同じくＨＤＡＣ１を含む小胞体の溶解によるものである。
【図２Ｂ】細胞質膜対核膜の透過処理に最適な濃度を決定するためのジギトニン及びＴＸ−１００の滴定。Ａ）全血中の細胞質膜は、およそ０．０３１％のジギトニンで完全に透過処理され、核はまた、およそ０．５％のジギトニン又は０．１２５％のＴＸ−１００で透過処理される。Ｂ）ＰＢＭＣ中の細胞質膜は、およそ０．００１６％のジギトニンで完全に透過処理され、核はまた、およそ０．０５％のジギトニン又は０．０２５％のＴＸ−１００で透過処理される。この図において、カルセインシグナルの減少は原形質膜の透過処理を示し、ＨＤＡＣ１染色のピークは、完全な核の透過処理を示している。完全な溶解の前にＨＤＡＣ１で生じる出っ張りは、同じくＨＤＡＣ１を含む小胞体の溶解によるものである。
【００２１】
【図３】ＭＣＦ−７細胞の細胞質対核を透過処理するのに最適な濃度を測定するためのジギトニン及びＴＸ−１００の滴定。Ａ）ジギトニンは０．０３１％で細胞質を、また０．２５％で核を透過処理した。Ｂ）ＴＸ−１００は、０．０１５６％で細胞質を、また０．１２５％で核を透過処理した。この図において、細胞質膜の透過処理は、ＨＳＰ６０染色によって示され、核膜の透過処理は、ＨＤＡＣ１染色によって示されている。
【００２２】
【図４】ＭＣＦ−７細胞を用いた原形質膜の透過処理を評価するために変更されたプロトコル。細胞には、ＣｙｔｏＣａｌｃｅｉｎ  Ｖｉｏｌｅｔが予め装填されており、細胞質膜の透過処理は、このシグナルの損失により示されている。この実験では、０．０２５％のジギトニン又はＴＸ−１００が細胞質のみを透過処理し、いずれかの０．２５％が細胞質膜及び核膜の両方を完全に透過処理した。
【００２３】
【図５Ａ】最適な緩衝液組成物を使用した全血試料中の細胞質膜対核膜の透過処理。Ａ）溶解後の試料のＣＤ４５対ＳＳ及びＦＳ対ＳＳの特性。Ｂ）Ｔ細胞におけるミトコンドリア対核膜の透過処理の度合い。Ｃ）単球におけるミトコンドリア対核膜の透過処理の度合い。この実験で使用された全ての洗剤濃度は、原形質膜を完全に透過処理し、ＨＳＰ６０及びラミンＡ／Ｃは、それぞれミトコンドリア内膜及び核膜の透過処理の度合いを示している。
【図５Ｂ】最適な緩衝液組成物を使用した全血試料中の細胞質膜対核膜の透過処理。Ａ）溶解後の試料のＣＤ４５対ＳＳ及びＦＳ対ＳＳの特性。Ｂ）Ｔ細胞におけるミトコンドリア対核膜の透過処理の度合い。Ｃ）単球におけるミトコンドリア対核膜の透過処理の度合い。この実験で使用された全ての洗剤濃度は、原形質膜を完全に透過処理し、ＨＳＰ６０及びラミンＡ／Ｃは、それぞれミトコンドリア内膜及び核膜の透過処理の度合いを示している。
【００２４】
【図６】顆粒球の細胞質膜対核膜の透過処理に最適な濃度を識別するための洗剤の滴定。細胞質＋核の最適な透過処理は、０．０６２５％のジギトニン＋０．５％のＴｗｅｅｎ  ２０に見ることができる。全細胞緩衝液に匹敵する、細胞質のみの最適な透過処理は、０．０６２５％のジギトニン＋０．２５％のＴＸ−１００である。＞０．５％のＴｗｅｅｎ  ２０のみが、細胞質＋ミトコンドリアを完全に透過処理することになる。これらのグラフでは、Ｔｗｅｅｎ  ２０の濃度は、他の洗剤に対して示された数字の２倍であり、０．０６２５％〜１％で滴定された。図５に示すように、ＨＳＰ６０及びラミンＡ／Ｃが、それぞれミトコンドリア内膜及び核膜の透過処理の度合いを示すために使用された。
【００２５】
【図７Ａ】１μｇ／ｍＬのＬＰＳによる単球の刺激。Ａ）緩衝液１の溶解と緩衝液２の溶解との間の散乱特性の比較、並びにゲーティングワークフロー。Ｂ）全血単球における細胞質対核シグナル伝達。Ｃ）Ｔ細胞における細胞質対核シグナル伝達。ＬＰＳは、予期されたとおり、単球におけるＮＦ−κＢ及びＡＫＴシグナル伝達を刺激したが、Ｔ細胞は刺激しなかった。
【図７Ｂ】１μｇ／ｍＬのＬＰＳによる単球の刺激。Ａ）緩衝液１の溶解と緩衝液２の溶解との間の散乱特性の比較、並びにゲーティングワークフロー。Ｂ）全血単球における細胞質対核シグナル伝達。Ｃ）Ｔ細胞における細胞質対核シグナル伝達。ＬＰＳは、予期されたとおり、単球におけるＮＦ−κＢ及びＡＫＴシグナル伝達を刺激したが、Ｔ細胞は刺激しなかった。
【００２６】
【図８】１μｇ／ｍＬのＬＰＳ対１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦによって誘発される単球における示差的シグナル伝達。Ａ）ＬＰＳ及びＧＭ−ＣＳＦはいずれも、Ｓ１３３でＣＲＥＢリン酸化を誘発し、１０分で核内に最大限に蓄積した。Ｂ）ＬＰＳ刺激は、優勢に核内ではあるが、細胞質及び核の両方において１０分でＲｅｌＡリン酸化を最大限に誘発した。Ｃ）ＬＰＳ及びＧＭ−ＣＳＦはいずれも、主に細胞質においてＥＲＫリン酸化を、ＧＭ−ＣＳＦの場合は５分、ＬＰＳの場合は１０分で最大限に刺激した。
【００２７】
【図９】ＣＤ３／ＣＤ２８によるＴ細胞における細胞内シグナル伝達の刺激。ＣＤ３／ＣＤ２８は、ＣＲＥＢ  Ｓ１３３リン酸化を２．５分で最大限に誘発し、ＲｅｌＡ  Ｓ５３６リン酸化を５分で最大限に誘発し、いずれも主に核内に蓄積した。ＨＤＡＣ１コントロールも、優勢に核内にあることが示されている。
【００２８】
【図１０】ＩＬ２刺激に続くＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５核内移行の分析。Ａ）ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞集団における異なるＣＤ２５サブセットのゲーティング。Ｂ）パートＡでゲーティングされた異なるＴ細胞サブセットにおけるＦｏｘＰ３の発現の分析。このグラフでは、ＦｏｘＰ３は、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ集団の核内に優勢に見ることができ、これは、Ｔｒｅｇ集団であることから予期される。Ｃ）異なるＣＤ４  Ｔ細胞集団におけるＩＬ２刺激に続くＳＴＡＴ５の核内移行。ＩＬ２刺激は、Ｔｒｅｇ集団内で最大のＳＴＡＴ５移行を最も迅速に誘発し、２．５分でピークに達した。ＣＤ２５＋集団をＣＤ２５ｌｏｗ集団よりも強く刺激した状態で、残りのＣＤ４  Ｔ細胞は１０分でピークに達した。Ｄ）異なるＣＤ８  Ｔ細胞集団におけるＳＴＡＴ５の核内移行。ＳＴＡＴ５の移行は、ＣＤ８＋ＣＤ２５ｌｏｗ集団では誘発されなかったが、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋集団では１０分でピークに達した。これらの結果はいずれも予期される。この実験でＳＴＡＴ５染色に使用された抗体は、リン酸化部位ではなく、ＳＴＡＴ５タンパク質全体を対象とした。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
概要
本発明は、フローサイトメトリーなどの多様なコンテキストにおいて標準的な標識手法を使用して、細胞内のタンパク質の細胞内局在の定量的測定を有効にする。本発明は、特定の洗剤の差次的能力を利用して、それぞれ異なる脂質組成物からなる、異なる細胞内小器官の膜を透過処理する。
【００３０】
例えば、本発明は、数時間で全血に直接使用して、時間及び資源を節約し、それによって、処理量を高め、コストを削減することができる。本発明はまた、最初に精製を必要とする従来の手法による調査を効果的に可能にするのに十分な量では存在し得ない、血液中の希少細胞集団の分析に非常に有用である。均質な細胞集団の精製を必要としないため、本発明は、従来の手法に比べて必要とされるよりもはるかに少ない試料量で、内因性状態での細胞の分析を可能にする。このように、本発明は、少ない試料容量での調査を可能にし、希少かつ貴重な試料（例えば、小児患者からの血液）中の細胞シグナル伝達を研究するために使用することができ、試料の全容量は、典型的に、従来の調査研究を実施することができないほど少なくなる。
細胞試料
【００３１】
本発明の方法における細胞試料は、例えば、血液、骨髄、脾臓細胞、リンパ節細胞、骨髄穿刺液（又は骨髄から得た任意の細胞）、尿（洗浄）、唾液、脳脊髄液、尿、羊水、間質液、糞便、粘液、組織（例えば、腫瘍試料、分離した組織、分離した充実性腫瘍）、又は細胞株であり得る。特定の実施形態では、試料は血液試料である。いくつかの実施形態では、血液試料は全血である。標準的な臨床手順を使用して、被験者から全血を得ることができる。いくつかの実施形態では、試料は、全血からの１つ以上の細胞のサブセット、又は細胞由来の微小胞若しくはエキソソーム（例えば赤血球、白血球、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞）、食細胞、単球、マクロファージ、顆粒球、塩基好性白血球、好中球、好酸球、血小板、又は１つ以上の検出可能なマーカーを有する任意の他の細胞、小胞、若しくはエキソソーム）である。いくつかの実施形態では、細胞、又は細胞由来の微小胞若しくはエキソソームは、細胞培養のものであり得る。
【００３２】
被験体は、ヒト（例えば、癌に罹患した患者）、又は商業的に有意な哺乳動物、例えば、サル、ウシ若しくはウマであり得る。また、試料は、例えば、イヌ又はネコを含む家庭で飼育されるペットから得ることもできる。いくつかの実施形態では、被験体は、疾患の動物モデルとして使用される又は薬物スクリーニング用の実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はモルモットである。試料は、かかる生物由来の一次又は二次組織若しくは細胞であってもよい。
標的検体及びシグナル伝達経路の活性化
【００３３】
本発明の標的検体は、典型的には「シグナル伝達経路タンパク質」又は「活性化可能タンパク質」である。これらの用語は、特定の生物学的、生化学的、又は物理的特性、例えば、酵素活性、修飾（例えば、リン酸化などの翻訳後修飾）、又はコンフォメーションを有するタンパク質の特異的な形態に対応する、少なくとも１つのイソ型を有するタンパク質を指すときに使用される。典型的な実施形態では、タンパク質はリン酸化を介して活性化される。活性化の結果として、タンパク質は、異なる細胞コンパートメントに（例えば、細胞質から核へ）移行される。
【００３４】
本発明の方法において標的とされる特定の活性化可能なタンパク質は、本発明に重要ではない。例としては、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５Ａ及びＳＴＡＴ５Ｂ）、及びＳＴＡＴ６などのＳＴＡＴファミリーのメンバーが挙げられる。サイトカインの細胞外結合は、ＳＴＡＴタンパク質内の特異的なチロシン残基をリン酸化する、受容体関連のヤーヌスキナーゼの活性化を誘発する。活性化タンパク質は次いで、核に輸送される。
【００３５】
他の活性化可能なタンパク質の例としては、限定するものではないが、ヒストン脱アセチル化酵素１（ＨＤＡＣ１）、ＲＥＬＡ（ｐ６５）、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）、フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）、ＥＲＫ、Ｓ６、ＡＫＴ、及びｐ３８が挙げられる。
【００３６】
別のシグナル伝達経路の例としては、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路が挙げられ、これは、遺伝子調節に影響を与えるシグナル伝達経路であり、細胞外シグナルに応答して細胞の増殖及び分化を制御する。この経路は、ＥＲＫ１／２などの活性化可能なタンパク質を含む。この経路は、リポ多糖（ＬＰＳ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）などのサイトカイン、ＣＤ４０配位子、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ）によって活性化され、Ｍｏｓ、Ｒａｆ、Ｒａｓ、ＴＰＬ２、及びＶ１２ＨａＲａｓなどのタンパク質によって恒常的に活性化され得る。
【００３７】
別のシグナル伝達経路は、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路である。ＰＩ３Ｋ経路は、細胞アポトーシスを媒介し、調節する。ＰＩ３Ｋ経路はまた、増殖、成長、分化、運動性、血管新生、有糸分裂誘発、形質転換、生存力、及び老化を含む、細胞プロセスを媒介する。ＰＩ３Ｋ経路を媒介する細胞因子としては、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ及びＢＡＤが挙げられる。
【００３８】
このように、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞試料への活性化試薬の添加を含む、活性化工程を含んでもよい。活性化試薬は、細胞内の少なくとも１つのシグナル伝達経路をトリガー／活性化するように適合される。適切な活性化試薬として、例えば、ＬＰＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＰＭＡ又はサイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ又はＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられる。活性化試薬はまた、シグナル伝達経路を恒常的に活性化するものであってもよい。例としては、Ｍｏｓ、Ｒａｆ、Ｒａｓ、ＴＰＬ２及びＶ１２ＨａＲａｓなどのタンパク質が挙げられる。
固定及び透過処理
【００３９】
本発明の方法は、タンパク質、脂質、及び核酸分子を架橋するのに十分な量の固定剤に試料を接触させることを含み得る、固定（又は保存）工程を含んでもよい。試料中に細胞を固定するための試薬は、当業者に周知である。例としては、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドなどのアルデヒド系固定剤が挙げられる。他の固定剤としては、エタノール、メタノール、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、クロム酸及び過マンガン酸カリウムが挙げられる。いくつかの実施形態では、固定剤は、加熱型、凍結型、乾燥型、架橋剤、又は酸化剤であってもよい。
【００４０】
前述のように、本発明の方法は、少なくとも２つの透過処理工程を含む。この方法は、それぞれ異なる脂質組成物からなる、異なる細胞内小器官の膜を透過処理するための洗剤の差次的能力を利用する。典型的な実施形態では、細胞試料からの細胞の１つのアリコートを、細胞質膜（並びにおそらくはミトコンドリア膜及びＥＲ膜などの他の膜）を破壊又は溶解するが、核膜を破壊せず、溶解もしない、第１の透過処理試薬と接触させる。細胞の第２のアリコートは、細胞質膜（及び第１の透過処理試薬によって溶解された他の膜）に加え、核膜を破壊又は溶解する第２の透過処理試薬と接触させる。いくつかの実施形態では、核膜の透過処理を伴い又は伴わずに細胞質膜及び付加的な小器官膜を溶解するために、第３の透過処理試薬を使用してもよい。
【００４１】
典型的な実施形態では、それぞれの後続の透過処理試薬は、前の透過処理試薬よりも高濃度の洗剤を有することになる。あるいは、透過処理試薬は、異なる濃度の複数の洗剤で構成されてもよい。いくつかの実施形態では、透過処理工程は、同一試料に対して順次実行されてもよい。
【００４２】
細胞を透過処理するために使用される透過処理試薬（例えば、洗剤）は、様々な要因に基づいて選択することができ、例えば、イオン性又は非イオン性の洗剤にすることができる。好適な洗剤は、細胞を透過処理し、検出されるタンパク質の表面エピトープの完全性を維持するものである。洗剤は、典型的には非イオン性洗剤である。例示的な非イオン性洗剤としては、ジギトニン及びエトキシル化オクチルフェノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標））が挙げられる。他の有用な透過処理剤（例えば、洗剤）としては、サポニン、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、オクチルフェノール（エチレンオキシ）エタノール（ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−６３０）又はＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、Ｂｒｉｊ−５８、及びＰＬＵＲＡＦＡＣ（登録商標）Ａ−３８（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ）又はＰＬＵＲＡＦＡＣ（登録商標）Ａ−３９（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ）として市販されているリニアアルコールアルコキシレートが挙げられる。いくつかの実施形態では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコリン酸ナトリウム又はＮ−ラウロイルサルコシンなどのイオン性洗剤を使用することができる。
結合剤
【００４３】
本発明の「結合剤」は、標的検体（例えば、活性化可能なタンパク質）に特異的に結合できる任意の分子又は分子の複合体であり得る。本発明の結合剤としては、タンパク質、小有機分子、炭水化物（多糖類を含む）、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質などの任意の分子が挙げられる。いくつかの実施形態では、結合剤は、抗体又はそのフラグメントである。本発明のコンテキストにおける特異的結合は、タンパク質及び他の生物学的分子の異種集団の存在下で標的タンパク質の存在の決定要因である結合反応を指す。このように、指定されたアッセイ条件下において、指定の結合剤は、特定のタンパク質又は特定のタンパク質のイソ型に優先的に結合し、試料中に存在する他のタンパク質又は他のイソ型に有意な量では結合しない。
【００４４】
結合剤が抗体である場合、それらはモノクローナル又はポリクローナル抗体であってもよい。本明細書で使用するとき、抗体という用語は、免疫グロブリン及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分を指す。このような抗体としては、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的ポリクローナル抗体、抗体模倣、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖ、並びにＦａｂ発現ライブラリが挙げられる。
【００４５】
本発明の結合剤は、標識されてもよく、その場合、「標識結合剤」と称される。標識は、直接的に（すなわち、一次標識）又は間接的に（すなわち、二次標識）検出され得る分子である。標識は、検出可能なシグナルによってその有無を検出され得るように、可視化及び／若しくは測定されるか、ないしは別の方法で識別され得る。例としては、蛍光分子、酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ）、粒子（例えば、磁性粒子）、金属タグ、発色団、蛍光体、化学発光体、特異的結合分子（例えば、ビオチン及びストレプトタビジン、ジゴキシン及び抗ジゴキシン）などが挙げられる。
【００４６】
典型的な実施形態では、標識は、その固有の蛍光特性を介して検出され得る任意の分子である、蛍光標識である。好適な蛍光標識としては、限定するものではないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、Ｃｙ  ５、Ｃｙ  ５．５、ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５、オレゴングリーン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、及びルシフェラーゼが挙げられる。本発明に使用するための付加的な標識としては、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ染料（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０など）、共益高分子染料、デントリマー系染料、量子ドット、ポリマードット、及びフィコエリトリン（ＰＥ）が挙げられる。
【００４７】
特定の実施形態では、複数の蛍光標識が、本発明の捕捉分子に採用される。いくつかの実施形態では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペアのメンバーである、少なくとも２つの蛍光標識が使用されてもよい。本発明に有用なＦＲＥＴペア（ドナー／受容体）としては、限定するものではないが、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｃｙ５、ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−ＡＦ７００、ＡＰＣ−ＡＦ７５０、ＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、フルオレセイン／ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ５．５、及びフルオレセイン／ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５が挙げられる。
【００４８】
捕捉分子への標識の接合は、当該技術分野において周知の標準手順を使用して実施され得る。例えば、従来の方法は、標識部分をタンパク質又はポリペプチドに共有結合させるために利用できる。カップリング剤、例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビスイミダート、ビスジアゾ化ベンチジンなどを使用して、前述の蛍光標識、化学発光標識、及び酵素標識により抗体を標識することができる。
【００４９】
本発明の方法は、結合剤を本願の方法で使用できるように、結合剤を活性化可能なタンパク質の活性化（例えば、リン酸化）形態に特定することを必要としない。抗体は、タンパク質のリン酸化イソ型に特異的に結合するが、タンパク質の非リン酸化イソ型には特異的に結合しないものが産生されており、その多くは市販されている。ｐ−ＥＲＫに対する例示的な抗体としては、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから市販されている、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）クローンＥ１０又はＤ１３．１４．４Ｅが挙げられる。
【００５０】
標識結合剤の他の例としては、限定されないが、以下の抗体が挙げられる：Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  Ｃａｌｉｆ．）、Ｍｏｕｓｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｅ１０）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８  ＭＡＰＫ（Ｔ１８０／Ｙ１８２）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）（５８Ｄ６）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）（３Ｅ２）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，Ｍａｓｓ．）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）（Ａ８８９１５）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ａ８８９２１）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）（Ａ８８９２５）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８  ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）（Ａ８８９３３）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｅｒ２３５／２３６）（Ａ８８９３６）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）（Ａ８８９４１）、及びＰｈｏｓｐｈｏ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）（Ａ８８９４４，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．（ＢＣＩ），Ｂｒｅａ，Ｃａｌｉｆ．）。
【００５１】
いくつかの実施形態では、細胞表面抗原又は表面マーカーを特異的に結合する結合剤を使用することができる。表面マーカーの例としては、膜貫通タンパク質（例えば、受容体）、膜関連タンパク質（例えば、受容体）、膜成分、細胞壁成分、及び少なくとも部分的に細胞外にある薬剤によってアクセス可能な細胞の他の成分が挙げられる。いくつかの実施形態では、表面マーカーは、細胞のタイプ又はサブタイプ（例えば、リンパ球又は単球のタイプ）のマーカー又は識別子である。いくつかの実施形態では、表面マーカーは、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４９ａ−ｆ、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６４、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ１１４、ＣＤ１１７、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２７、ＣＤ１３４、ＣＤ１３８、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１６１、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤ１９８、ＣＤ１９９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５７、ＣＤ２６８、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ３２６、及びＣＤ３５７からなる群から選択される。
測定システム
【００５２】
細胞内で結合した分子を定量化するための結合剤及び標識を利用した測定システムは、周知である。かかるシステムの例としては、フローサイトメーター、スキャニングサイトメーター、イメージングサイトメーター、イメージングフローサイトメーター、蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡、及びマスサイトメーターが挙げられる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーを使用して、蛍光を検出することができる。この用途に好適な多くのデバイスが使用可能であり、当業者に既存である。例としては、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｎａｖｉｏｓ、Ｇａｌｌｉｏｓ、Ａｑｕｉｏｓ、及びＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、金属タグ付き抗体を利用する場合、細胞は、マスサイトメトリーを使用して分析することもできる。
キット
【００５４】
本発明の方法において有用な試薬はまた、キットの形で製造することもできる。かかるキットは、例えば、（ａ）細胞の細胞質膜を透過処理するが細胞の核膜を透過処理しない、第１の透過処理試薬と、（ｂ）細胞の細胞質膜と核膜との両方を透過処理する、第２の透過処理試薬と、の基本要素を含む、パッケージ化された組み合わせである。キットはまた、（ｃ）コントロール（例えば、小器官特異的又は細胞骨格タンパク質）又は活性化可能なタンパク質（例えば、リン酸化形態、非リン酸化形態、又はその両方）を特異的に結合する、標識結合剤と、（ｄ）固定剤と、（ｅ）これらの試薬を使用した方法の実施方法に関する説明書と、を含んでもよい。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液も含まれてよい。
【００５５】
例示的なキットは、全血単核球（すなわち、リンパ球＋単球）に対する２つの別個の緩衝液で構成される。１）第１の緩衝液は、ＥＲ、エンドソーム系、及びミトコンドリア外膜を含む、細胞質を透過処理するためのものであり、２）第２の緩衝液は、第１の緩衝液で透過処理される全てに加えて、核（及び、いくつかの実施形態では、内部ミトコンドリア基質）を透過処理するためのものである。緩衝液１（細胞質）は、１〜１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ  ４．５〜６．５、０〜２７４ｍＭ  Ｎａｃｌ、０〜５．４ｍＭ  ＫＣｌ、及び０．０１〜０．１５％ジギトニンで構成され得る。緩衝液１に最適な洗剤濃度は、０．００１〜０．２５％ジギトニンであり、細胞質は溶解されるが、核は溶解されない。緩衝液２（全細胞）は、１〜１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ  ４．５〜６．５、０〜２７４ｍＭ  Ｎａｃｌ、０〜５．４ｍＭ  ＫＣｌ、及び＞０．０１％ジギトニン又は＞０．０１２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で構成され得る。緩衝液２に最適な洗剤濃度は、試料タイプによって異なり、上界は、発生する表面マーカーの損失及び細胞の崩壊によって制限され、いずれもおよそ２％で発生する。
【００５６】
緩衝液１及び緩衝液２のいずれの塩濃度も、生理食塩水の所与の１倍濃度の０〜４倍のいずれであってもよく、すなわち、０〜２７４ｍＭ  Ｎａｃｌ＋０〜５．２ｍＭ  ＫＣｌとなる。いくつかの洗剤では、塩濃度の差異が、特定の細胞質膜の標的化の効率に影響を及ぼすことがある。固定剤は、例えば、１Ｘ  ＰＢＳ（１０〜２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ  ７．４、１３７ｍＭ  Ｎａｃｌ、及び２．７ｍＫ  ＫＣｌ）に８〜１０％のパラホルムアルデヒドで構成され、最終固定剤濃度４〜５％を提供し得る。緩衝液１及び２はまた、１〜１０％のいずれの最終固定剤濃度でも作用するが、細胞シグナル伝達を伴うタンパク質修飾は、濃度が低いほど保存されにくく、ＲＢＣの溶解は、濃度＞４％でより効率的になる。固定剤中の塩濃度は、所与の１倍濃度の０〜２倍で作用するが、ＷＢＣの光散乱特性は低い濃度で少しの影響を受け得、洗剤の有効性は、濃度が２倍に近づくにつれて減少する。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例は、限定するものではないが、本願の発明を例示するために提供される。
【００５８】
本発明の目的は、フローサイトメトリー並びに他のサイトメトリック手法によって、細胞内のタンパク質の細胞内局在の定量的測定を可能にすることである。本システムは、特定の洗剤の差次的能力を利用して、それぞれ異なる脂質組成物からなる、異なる細胞内小器官の膜を透過処理することによって機能する。
【００５９】
全血試料を処理するためのプロトコルは以下のとおりである（ワークフローについては図１を参照のこと）。１）試料を最初に固定剤と１：１で混合し、ボルテックスし、次いで１０分間インキュベートする。余分のコントロール管を緩衝液ごとに取り入れ、バックグラウンドシグナルを差し引くため、試験される特異的なシグナル伝達又は標的抗体を除く全ての抗体を用いて染色する。バックグラウンドコントロールはまた、特に好中球のような特徴的に高い非特異的結合を有する細胞における、非特異的結合のより正確な測定のために、イソ型コントロール抗体で標識されてもよい。間接抗体標識のため、一次抗体を省略するが、なお二次抗体を利用することは、二次抗体に起因する非特異的バックグラウンドシグナルの度合いを測定するための一般的な方法であり、この度合いは、標的抗体の直接共役よりも典型的に高くなる。２）固定期間中、試料を、一方は細胞質溶解用、及び他方は全細胞溶解用の２つの別個の分画に分裂させる。あるいは、それぞれの試料がいずれも同様に処理されることを前提として、２つの別個の管を試料ごとに予め設定してもよい。３）固定後、それぞれの管内の試料を緩衝液１又は緩衝液２とそれぞれ１：５で混合する（例えば、２００μＬの試料（固定剤を含む）＋１ｍＬの溶解緩衝液）バックグラウンドコントロールはまた、それぞれの緩衝液で溶解されるが、両方の緩衝液が同じ洗剤で構成されている場合（異なる濃度であっても）、２つのうちの１つで溶解することのみが必要であり得る。次いで、管を１５〜３０秒間、室温でボルテックスし、インキュベートする。４）溶解後、試料を２倍のＰＢＳ又は標準的な洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ）で洗浄し、次いで、所望の抗体カクテルで３０分間染色する。５）非共役の一次抗体を使用する場合は、試料を洗浄し、免疫表現型検査用抗体のある／ない二次抗体で染色してもよい。免疫表現型検査用抗体は、それらの宿主種を標的とするあらゆる二次抗体への非特異的な結合を防止するため、別の洗浄とその後の遮断工程を必要とし得る。６）染色した後は、試料を再び２倍のＰＢＳ又は洗浄緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ＋０．５％のＰＦＡで再懸濁し、フローサイトメーターを読み取る。
【００６０】
データ収集後、試料をゲーティングし、補正し、標準的なフローサイトメトリー試料として分析する。細胞質局在対核局在を判定するため、結果のデータを以下のように更に処理する。１）細胞質の場合：緩衝液１に対するバックグラウンドコントロールからの標的シグナルを未処理の細胞質データから差し引く。２）核の場合：緩衝液２に対するバックグラウンドコントロールからの標的シグナルを最初に全細胞データから差し引き、次いで、この結果から処理済みの細胞質データを更に差し引く。例えば、細胞質及び全細胞のバックグラウンドＭＦＩが１．５で、未処理のＦｏｘＰ３シグナルが、それぞれ、細胞質の場合は３．５、全細胞の場合は３１．５である、ＦｏｘＰ３の細胞内分布に対する染色の場合、細胞質膜のＭＦＩは、２（すなわち、３．５（未処理）−１．５（バックグラウンド）＝２）として計算され、核のＭＦＩは、２８（すなわち、３１．５（未処理）−１．５（バックグラウンド）−２（細胞質）＝２８）として計算されることにある。緩衝液１及び２の両方に同じ洗剤を使用する場合、バックグラウンドを断続的に差し引かずに、全血から未処理の細胞質データを差し引いて核データを得ることにより、データ処理を簡略化することができ得る。このことはまた、前の例にも示されている（すなわち、核のＭＦＩは、３１．５（未処理）−３．５（未処理の細胞質）＝２８）のように単純に計算されることになる）。いくつかの選出されたタンパク質がわずかな割合で内部ミトコンドリア基質内に存在し得るが、これは、（シグナルの非常に小さいフラグメントが）存在する場合は、このようなタンパク質の核局在データにごくわずかな影響しか与えないことが予期され、ミトコンドリア外膜及びミトコンドリア内膜の両方を交差させるためのタンパク質の変性の必要条件と、機能を実施するために内部ミトコンドリア基質内でリフォールディングさせる必要性と、ミトコンドリアは、ほとんどの細胞タンパク質を利用しない、単純に異なる系である（残存細菌である）という事実と、により、転写因子を含む、ほとんどのタンパク質に関する活性化依存の移行シグナルを変更しないことが期待される。
【００６１】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、細胞株、及び他の精製細胞の場合、緩衝液１及び緩衝液２は、全血の場合と異なる組成物を有するが、プロトコルはその他の点では同じである。ほとんどの細胞株は、ＰＢＭＣと同様に機能する。加えて、全血顆粒球は、その細胞質対核のコンパートメントを適切に透過処理するために、異なる緩衝液の組み合わせを必要とする場合がある。具体的には、０．０６２５％ジギトニン＋０．２５％ＴＸ−１００で構成される緩衝液１は、ミトコンドリア又は核を溶解せずに原形質膜を溶解する一方、０．０６２５％ジギトニン＋＞０．１２５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で構成される緩衝液２は、原形質膜を溶解し（緩衝液１に相当）、核も完全に溶解する。また、＞０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０自体は、核を溶解せずに、原形質膜を溶解し、ミトコンドリアを完全に溶解する一方、低濃度のＴＸ−１００又はジギトニンのみは、それぞれミトコンドリア又は核を溶解するが、高濃度では溶解しない。
実施例１
【００６２】
図２は、異なる濃度のジギトニン又はＴＸ−１００によるＴ細胞及び単球の細胞質対核の透過処理の効率の比較である。図２Ａは、全血に対して実施された滴定であり、図２Ｂは、ＰＢＭＣに対して実施された滴定である。いずれの場合も、試料には最初に１時間、ＣＯ２調節した３７℃のインキュベータ内で１μＭのＣｙｔｏＣａｌｃｅｉｎ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ）を予め装填した。１時間後、試料を４％のＰＦＡで１０分間固定し、次いで、試料混合物と１：５の比率でｄｉＨ２Ｏ中に希釈した、異なる濃度の洗剤を用いて、常温で３０分間インキュベートした。次いで、試料を洗浄し、抗ＨＤＡＣ１−ＦＩＴＣ（Ａｂｃａｍ，Ｐｌｃ）で染色し、再び洗浄し、最終的にＧａｌｌｉｏｓフローサイトメーター（ＢＣＩ）を読み取った。この図では、細胞質溶解は、原形質膜が透過処理された後に細胞から放出されるＣｙｔｏＣａｌｃｅｉｎ  Ｖｉｏｌｅｔシグナルの損失によって示され、核溶解は、核膜が透過処理されたときに増加したＨＤＡＣ１シグナルによって示される。ジギトニン溶解の場合、原形質膜が溶解された後、完全な核溶解の前に、ＨＤＡＣ１染色の出っ張りがあるが、これは、ＨＤＡＣ１の貯蔵所も含む小胞体の溶解を示している。全血では、略０．０１５％〜０．１２５％のジギトニンの作用範囲があり、原形質膜は溶解されるが、核は溶解されない。ＰＢＭＣの場合、この範囲は略０．００１％〜０．０１２５％である。ＴＸ−１００は、この作用範囲を提供せず、原形質膜の透過処理に十分な濃度に達したほぼ直後に、核の溶解を開始する。細胞の完全な溶解は、全血の場合は０．２５％のジギトニン又は０．１２５％のＴＸ−１００のいずれか、ＰＢＭＣの場合は０．０２５％のジギトニン又は０．０２５％のＴＸ−１００のいずれかの濃度で達成される。
実施例２
【００６３】
図３は、ＭＣＦ−７細胞、乳癌細胞株を用いたジギトニン又はＴＸ−１００の滴定を示す。図３Ａは、ジギトニンの滴定であり、図３Ｂは、ＴＸ−１００の滴定である。いずれの事例でも、細胞を、実験の前に２４時間、８ウェルガラス顕微鏡スライド（Ｎｕｎｃ）で培養した。実験の日には、細胞を最初に４％のＰＦＡで１０分間固定し、次いで、１Ｘ  ＰＢＳで稀釈した異なる濃度の洗剤を用いて常温で３０分間インキュベートした。次いで、試料を洗浄し、マウス抗ヒトＨＳＰ６０及びウサギ抗ヒトＨＤＡＣ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて常温で１時間標識した。１時後、試料を再び洗浄し、ニワトリ抗マウスＡＦ４８８及びニワトリ抗ウサギＡＦ６４７抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて常温で３０分間標識した。最後に、試料を洗浄し、ＶｅｃｔａｓｈｅｌｄのＤＡＰＩ入り封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で封入処理し、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２  Ｐｌｕｓ蛍光顕微鏡を６３倍油浸レンズと一緒に使用して画像を取り込んだ。図３Ａでは、ジギトニンは、細胞質及びミトコンドリアにおけるＨＳＰ６０染色によって示されているように、およそ０．０３１％から細胞質を透過処理し始め、核内で増加したＨＤＡＣ１染色によって示されるように、およそ０．２５％で核を完全に透過処理し始めたことが見られ得る。図３Ｂでは、ＴＸ−１００は、およそ０．０１６％から細胞質を透過処理し始め、次いで、核をおよそ０．１２５％から透過処理し始めたことが見られ得る。
実施例３
【００６４】
図４は、原形質膜の透過処理をより明瞭に示すために、かつ、二次抗体の非特異的結合によって明白なＨＳＰ６０染色のレベルが低下し得る可能性を除去するために、ＭＣＦ−７細胞を染色するためのプロトコルを変更したものである。この実験では、細胞を２４時間プレーティングした後、１μＭのＣｙｔｏＣａｌｃｅｉｎ  Ｖｉｏｌｅｔを用いて１時間予め装填し、次いで、図３に示すように処理した。試料を封入処理用に準備する際に、ＤＡＰＩなしの封入剤を使用した。画像は、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２  Ｐｌｕｓ顕微鏡に６３倍油浸レンズを用いて取り込んだ。この図では、透過処理されなかったＭＣＦ−７細胞は、ＣｙｔｏＣａｌｃｅｉｎが装填されていることが見られ得、この染色は、原形質膜が透過処理されると失われる。ＣｙｔｏＣａｌｃｅｉｎ  Ｖｉｏｌｅｔの細胞内局在の精密検査は、細胞に装填するときに利用した時間枠に予期されるように、ＣｙｔｏＣａｌｃｅｉｎ  Ｖｉｏｌｅｔがエンドソーム系内に装填されることを示している。次いで、細胞質透過処理時のＣｙｔｏＣａｌｃｅｉｎ  Ｖｉｏｌｅｔ染色の損失は、エンドソーム系も透過処理されることを示しており、このことは、エンドソーム膜が原形質膜から摘み取られることから予期される。この実験では、ジギトニン及びＴＸ−１００のいずれも０．０２５％で、原形質膜を透過処理することが見られ得ると同時に、いずれも０．２５％で全細胞を透過処理することが見られ得る。この変更されたプロトコルは、図２の結果に対するものも含め、フローサイトメトリーによる全血及びＰＢＭＣを用いた、異なる洗剤の性能の後続試験に使用された。
実施例４
【００６５】
図５は、ＲＢＣの溶解を改善するために変更された緩衝液条件を含む、全血に最適な溶解パラメータを示している。洗剤は、ｄｉＨ２Ｏで希釈したときに細胞質膜を差次的に透過処理するために良好に機能することが発見されたが、ｄｉＨ２Ｏは、固定時間がプロトコルより２〜３分を超えて延長された場合は特に、非常に低い洗剤濃度でのＲＢＣの溶解の有効性に矛盾があることが発見された。ＲＢＣの溶解を改善するため、溶液を、最終的にｐＨ  ４．５〜６．５（例えば、ｐＨ５．５）のＭＥＳを用いて緩衝し、これによって塩濃度も生理的レベルまで増加した。これにより、更に、ＷＢＣの散乱特性が改善され、完全な溶解に必要な時間が約１５分まで減少し、固定時間がプロトコルをはるかに超えて延長された場合に（＞２０分）緩衝液がなお作用するところまで、ＲＢＣの溶解効率が改善された。同時に、性能の改善により、固定剤濃度を５％まで増加させた。図５Ａでは、最適な溶解パラメータの散乱特性が見られ得、細胞質膜の透過処理には０．０６２５％のジギトニンが最適であり、全細胞膜の透過処理には、０．５％のジギトニン又は０．２５％のＴＸ−１００のいずれかが最適である。ＣＤ４５対ＳＳのプロットでは、ＲＢＣは完全に溶解されていることが見られ得、ＦＳ対ＳＳのプロットは、異なる濃度で保持されたＷＢＣ散乱特性を示している。図５Ｂは、Ｔ細胞におけるミトコンドリア（ＨＳＰ６０）及び核（ラミンＡ／Ｃ）膜の透過処理の有効性を示し、図５Ｃは、単球における同様の有効性を示している。いずれの場合も、透過処理特性は、規定の最適な洗剤濃度と一致することが見られ得る。
実施例５
【００６６】
図６は、顆粒球の特異的な透過処理のための最適な洗剤の組み合わせを示している。いくつかの事例では、細胞内局在キットに規定の緩衝液を使用と、単核球に対するようには顆粒球を有効にかつ再現性よく透過処理することができず、異なる洗剤濃度でより良好に標的化され得る。図６に見られ得るように、顆粒球の細胞質膜＋核膜は、０．０６２５％のジギトニン＋０．５％のＴｗｅｅｎ  ２０（グラフ中のＴｗｅｅｎ  ２０の濃度は、他の洗剤に示された濃度の２倍である）によって最適に透過処理され、細胞質膜のみは、０．０６２５％のジギトニン＋０．２５％のＴＸ−１００によってほとんど同等に透過処理される。濃度＞０．５％のＴｗｅｅｎ  ２０は、核膜を透過処理せずに細胞質膜＋ミトコンドリア膜を透過処理したことが見られ得、低濃度のジギトニン及びＴＸ−１００のみは、核膜又はミトコンドリア膜をそれぞれ透過処理することになる。最終的に、標的小器官に応じて、顆粒球の差次的な透過処理は単核球よりも複雑になり得る。
実施例６
【００６７】
図７は、ＬＰＳで刺激された単球における細胞シグナル伝達の分析を示している。全血を、指示された時間、１μｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激した。次いで、試料を５％のＰＦＡで固定し、緩衝液１の場合は０．０６２５％のジギトニン、緩衝液２の場合は０．５％のジギトニンを使用して、細胞内局在キットの緩衝液組成物で処理した。図７Ａでは、異なるＷＢＣ集団に対するゲーティングワークフローと共に、緩衝液１対緩衝液２の溶解の散乱特性が見られ得る。図７Ｂでは、ＩκＢαは、細胞質及び核の両方において劣化し、ＡＫＴは、細胞質及び核の両方においてＳ４７３でリン酸化し、Ｓ５２９でリン酸化したＲｅｌＡは、核内に蓄積して１０分で最大限になることが見られ得る。対照的に、図７Ｃは、Ｔ細胞内で誘発されるシグナル伝達の欠如を示している。ＬＰＳは、ＣＤ１４を共受容体として使用して、Ｔ細胞には存在しない単球のＴＬＲ４受容体を刺激するため、これらの結果は予期される。
実施例７
【００６８】
図８は、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ又は１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦのいずれかを用いた、単球の別の刺激を示している。この実験では、細胞を４％のＰＦＡで固定し、いずれもｄｉＨ２Ｏで稀釈した、緩衝液１の場合は０．０５％のジギトニン、及び緩衝液２の場合は０．５％のジギトニンを用いて処理した。図８Ａでは、Ｓ１３３でのＣＲＥＢリン酸化の誘発が示されており、いずれの刺激でも１０分で核内に最大に蓄積している。図８Ｂでは、Ｓ５３６でのＲｅｌＡリン酸化の誘発は、ＬＰＳ刺激に続き、核内においておよそ１０分でピークに達し、細胞質内にはより低い度合いで蓄積していることが見られ得る。ＧＭ−ＣＳＦは、Ｓ５３６ではＲｅｌＡリン酸化を刺激しなかった。図８Ｃでは、Ｓ２０２／Ｔ２０４でのＥＲＫリン酸化は、主に細胞質内でＬＰＳ及びＧＭ−ＣＳＦの両方によって誘発され、核内にはより小さい度合いであることが見られ得る。このリン酸化は、ＧＭ−ＣＳＦの場合は５分、ＬＰＳの場合は１０分でピークに達した。
実施例８
【００６９】
図９は、０．２５μｇ／ｍＬのＣＤ３（ＯＫＴ３）＋２．５μｇ／ｍＬのＣＤ２８（ＣＤ２８．２）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋１０μｇ／ｍＬのヤギ抗マウス架橋剤（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いたＴ細胞の刺激を示している。この実験では、試料を４％のＰＦＡで固定し、いずれもｄｉＨ２Ｏで希釈した、緩衝液１の場合は０．０５％のジギトニン、緩衝液２の場合は０．５％のジギトニンを用いて処理した。ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に続いて、ｐＣＲＥＢ  Ｓ１３３は、核内に２．５分で最大限に蓄積し、ｐＲｅｌＡ  Ｓ５３６は、５分で核内に、及びより小さい度合いで細胞質内に蓄積した。ＨＤＡＣ１染色はまた、予期されるとおり、核内に優勢に位置することが示されている。
実施例９
【００７０】
図１０は、５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ２による刺激に続く、ＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５核内移行の優先活性化を示している。この実験では、試料を４％のＰＦＡで固定し、いずれもｄｉＨ２Ｏで希釈した、緩衝液１の場合は０．０５％のジギトニン、緩衝液２の場合は０．５％のジギトニンを用いて処理した。図１０Ａは、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞のＣＤ２５ｈｉ、ＣＤ２５＋、及びＣＤ２５ｌｏｗのゲーティングを示している。図１０Ｂは、抗ＦｏｘＰ３−ＡＦ６４７（ＢＣＩ）で染色された、ＦｏｘＰ３＋の細胞質対核の局在を示している。このグラフでは、ＦｏｘＰ３は、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ細胞の核内に優勢に局在することが見られ得、このことは、これが核内のＦｏｘＰ３発現によって画成されるＴｒｅｇ集団であることから予期される。図１０Ｃは、抗ＳＴＡＴ５−ＦＩＴＣ（Ａｂｃａｍ）を使用して検出されたＳＴＡＴ５タンパク質全体の核内移行を示している。この図では、ＳＴＡＴ５は、Ｔｒｅｇ集団の核内へ最も迅速に移行し、２．５分近くでピークに達したことが見られ得る一方、その移行は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞ではよりゆっくり誘発され、１０分でピークに達した。ＳＴＡＴ５の移行はまた、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞において、軽度ではなるが、１０分で最大限に誘発された。ＳＴＡＴ５リン酸化の検出を必要とせずに、ＳＴＡＴ５タンパク質全体の核内移行を検出する能力は、タンパク質修飾における差異のみを検出できる既存の手法の制限を回避するためのこの手法の力を実証するものであり、タンパク質全体に対する抗体のエピトープが露出していない場合、常に、使用可能な異なるエピトープに対する別の抗体が存在する。これは、特異的なタンパク質修飾部位に当てはまることではない。
代替アプローチ：
【００７１】
本発明の方法は、１つの管で細胞質膜に加え、可能な限り多くの細胞質成分を、また他の管で核を含む全細胞を、緩やかに溶解するため、異なる洗剤又は洗剤濃度に依存する。このことから、このタスクを達成するために、様々な洗剤が作用することになる。いくつかは、以下のように、全血での性能を基準とする。
細胞質：
【００７２】
サポニン（キラヤ樹皮）：＞０．０３％は、何らかの明らかな細胞内小器官を透過処理せずに、リンパ球及び単球の細胞質膜を透過処理する。顆粒球の場合、低濃度で核膜も透過処理する。これは、細胞質膜の透過処理のためのジギトニン（サポニンファミリーの別のメンバー）の生存可能な代替物であり得るが、高濃度では核膜を透過処理しない。高濃度のサポニンはまた、必要に応じて２つの緩衝液の容量オスモル濃度に一致させるために、緩衝液１に使用され得る。ただし、サポニンは、ジギトニンよりも高いバックグラウンドシグナルを産生する。
【００７３】
Ｔｗｅｅｎ  ２０：略０．０６２５％〜０．２５％の範囲で、リンパ球及び単球の原形質膜を完全に透過処理し、核には影響を与えない。上に示したように、濃度が上がるにつれ、顆粒球における細胞質膜＋ミトコンドリア膜は完全に透過処理される。Ｔｗｅｅｎ  ２０はまた、溶液の表面張力を大きく変化させ、試験管をコーティングしてそれらを非常に滑らかにする。これは、洗浄間のデカント時にほとんど労力を掛けずに緩衝液の管を完全に空にするのに役立つという１つの利益をもたらすが、染色用の小容量の抗体カクテルで試料を適切に再懸濁することは困難であるという大きな欠点を生む。
【００７４】
ＴＸ−１００：ちょうど０．０３１３％からおそらく最大０．０６２５％と狭い範囲で、リンパ球及び単球の核に影響せずに細胞質膜を透過処理する。ただし、これは、異なるドナーとの一貫した性能を得るには狭すぎる可能性がある。
【００７５】
ＮＰ−４０（Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０）は、ＴＸ−１００と同等に機能する。
【００７６】
ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコリン酸ナトリウム、又はＮ−ラウロイルサルコシンなどの低レベルのイオン性洗剤を、細胞質膜を透過処理するための低レベルの非イオン性洗剤と一緒に滴定することにより、細胞質膜＋ミトコンドリア膜は完全に透過処理されるが、低い濃度では核膜の透過処理は阻害される。略０．１２５％〜０．２５％よりも高い濃度では、イオン性洗剤は、核を透過処理するのに十分な高さの濃度に達する前にタンパク質を変性させ始める。核を透過処理する濃度に達すると、散乱特性が劣化し始め、典型的に追加の１回の滴定工程で試料は完全に崩壊される。これは、低濃度の緩衝液１を用いてミトコンドリアを区画化するのに有用であり得るが、緩衝液１と緩衝液２との間のタンパク質変性のレベルの差異が、最終的にアッセイの信頼性を複雑化させることになる。また、異なるタンパク質が異なる濃度のイオン性洗剤で変性されるため、プロテオーム全体に対して期待される性能を事前に定義することが不可能であり得る。
全細胞：
【００７７】
０．０６２５％のジギトニン＋０．１２５〜０．２５％のＴＸ−１００は、ジギトニンのみ又はＴＸ−１００のみのいずれかよりも細胞を完全に透過処理する。しかし、試料の散乱特性は、いずれかの洗剤のみよりも劣化し、試料品質の劣化の度合いは必ずしも一貫していない。
【００７８】
０．０６２５％のジギトニンを用いて細胞質膜を透過処理することにより、ＣＨＡＰＳ及びデオキシコール酸ナトリウムなど、低レベルの他の洗剤と組み合わせて、核を透過処理することも可能になる。しかし、ＣＨＡＰＳの性能は、低ｐＨでは低下し、デオキシコール酸ナトリウムは、濃度にかかわらず〜７．０よりも低いｐＨでは溶液からただちに沈降する。したがって、これらは、全血ではなく、低下したｐＨを必要としないＰＢＭＣ又は細胞株には有用であり得る。
【００７９】
サポニンは、他の洗剤と組み合わせて全細胞の透過処理を実現することに関して、ジギトニンとの互換性があり得る。しかし、前述のとおり、バックグラウンドは典型的に他の洗剤のものよりも少し高くなる。
【００８０】
ＮＰ−４０は、全細胞の透過処理に関してＴＸ−１００との互換性がある。
【００８１】
ドデシル硫酸ナトリウム及びＮ−ラウロイルザルコシンなどのイオン性洗剤は、高濃度で単独使用すると、細胞を完全に透過処理する。しかし、前述のとおり、これらはまた、タンパク質を変性し、緩衝液１と緩衝液２との間の同等性の実現を困難にし得る。
【００８２】
緩衝液のｐＨは、ＲＢＣ及び血小板溶解での性能に影響を及ぼす。緩衝液に最適なｐＨ範囲は、４．５〜６．５である。４．５を下回るｐＨは、散乱特性に大きな障害を与え、血小板粒度を増加し始める一方、６．５を上回るｐＨは、１０〜１５分の固定後に、ＲＢＣ溶解効率の減少をもたらす。最適なｐＨは、５〜６である。このｐＨ範囲は、クエン酸塩、リン酸塩、及びｐＨ４．５〜６．５の範囲と少なくとも部分的に重なっている有用な範囲を有するその他の緩衝液を含む、ＭＥＳ以外の様々な緩衝液を使用して実現され得る。
【００８３】
プロトコルはまた、以下のように必要な洗剤量を低減するように変更されてもよい。１）最初に、試料を固定し、いずれの付加洗剤も用いずに、ＭＥＳ緩衝生理食塩水（すなわち、１〜１００ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ４．５〜６．５、０〜２７４ｍＭ  Ｎａｃｌ、及び０〜５．４ｍＭ  ＫＣｌ）のみでＲＢＣを溶解する。２）次いで、試料を洗浄し、遠心分離によってＷＢＣを濃縮し、緩衝液及び壊死組織片をデカントする。３）最後に、細胞質又は全細胞に対して、ＭＥＳ緩衝生理食塩水又は更にはＰＢＳのいずれかに０．０１〜０．１５％のジギトニン５０〜２００ｕＬなど、それぞれ小容量の洗剤中で濃縮されたＷＢＣを透過処理する。小容量の場合には、染色抗体は、透過処理緩衝液と一緒に含まれてもよく、その結果、略同等の処理時間となる。ＭＥＳ緩衝食塩水のみによるＲＢＣ溶解の速度は、ＭＥＳ又は他の緩衝液の濃度を増加させるか、緩衝液を切り換えるか（例えば、クエン酸塩は同等の濃度ではＭＥＳよりも速い）、塩濃度を変更するか、又はおそらくは低濃度のサポニン又はジギトニンで緩衝液を補うか、のいずれかによって、実際には増加され得るが、これらの変更が、工程３における細胞質膜と全細胞との透過処理の特異性に影響しない場合に限られる。ＲＢＣ溶解工程中に細胞質膜をサポニンなどで透過処理する場合、第２の透過処理工程は、細胞質管に必要とされるいっさいの付加的な洗剤を用いずに、最初に原形質膜を克服する必要がある場合に典型的に可能である濃度よりも低い濃度の洗剤を用いて特定の膜を標的にする可能性を伴い、特定の細胞内小器官を標的にするように変更することができる。しかし、複数の洗剤の使用及び／又は複数の洗剤溶解工程の使用は、洗剤の組み合わせに関係なく、試料の品質、エピトープ、及び散乱特性を大幅に劣化させる傾向にある。
【００８４】
プロトコルはまた、個々の細胞内でシグナルを見て比較できるように、順次実施することができる。この方法は、以下のように実施され得る。１）試料を固定し、０．０６２５％のジギトニンで細胞質膜＋ＲＢＣを透過処理する。２）試料を洗浄する。３）第１の抗体又は他のマーカーを用いて細胞質検体を染色する。４）試料を再び洗浄し、好ましくは続行する前に、工程３から抗体又は他のマーカーを架橋する。５）残りの検体を染色するための残りの抗体又はマーカーあり又はなしのいずれかで、核を透過処理する。６）任意：核の透過処理と一緒に染色しなかった場合は、この工程で残りの検体を染色する。７）ＰＢＳ／０．５％のＰＦＡで洗浄及び再懸濁する。８）フローサイトメーター又は顕微鏡で試料を分析する。第２の透過処理工程は、１ｍＬの容量を使用して溶解した場合は第１の工程と同じ０．０６２５％のジギトニン濃度、又は上記のように、より少ない５０〜２００μＬの容量を利用する場合は＞０．０６２５％のジギトニンのいずれかを必要とし得る。この事例では、核シグナルから細胞質を弁別するため、２つの抗体は異なる標識を必要とし、ゆえに２つのコンパートメントのシグナルを直接、定量的に比較することができない（すなわち、これらはコンパートメント間で定性的となる）。ただし、コンパートメント内の差異は定量的となる。このプロトコルの主な欠点は、連続的な透過処理の実施に要する時間であり、染色及び洗浄の工程は、標準のプロトコルの略２倍になる。
【００８５】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示的な目的のみのものであり、その範囲内での様々な改良又は変更は、当業者に対して示唆され、また、本出願の趣旨及び範囲内に、かつ添付された請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書に記載の全ての公開、特許、及び特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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