(57)【要約】  本発明は、１つまたは複数のフルオロ界面活性剤およびリン脂質を含むフルオロカーボンナノエマルジョンの新規な組成物、ならびにその調製方法および酸素供給を向上させるためのその使用方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルオロカーボンナノエマルジョンの組成物であって、
約４〜約８個の炭素の範囲のフルオロカーボン；および
ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールおよび／またはリン脂質から選択される１つ以上の界面活性剤を含む、組成物。
【請求項２】
前記フルオロカーボンはペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、またはそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記フルオロカーボンはペルフルオロペンタンを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記１つ以上の界面活性剤はペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールおよび／または３つのリン脂質の混合物を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールは、以下の１つ以上、
ＣＦ３−（ＣＦ２）ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｈ、
式中、ｎは５であり、各ｑは独立して１〜約１６の整数である、または以下の１つ以上、
Ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−（ＣＦ２）ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｈ、
式中、各ｍは独立して１〜約５０の整数であり、各ｎは独立して１〜約５０の整数であり、各ｑは独立して１〜約５０の整数である、を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールは、以下の１つ以上、
ＣＦ３−（ＣＦ２）ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｈ、
式中、ｎは５であり、各ｑは独立して１〜約８の整数であり、または以下の１つ以上、
Ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−（ＣＦ２）ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｈ、
式中、各ｍは独立して１〜約５０の整数であり、各ｎは独立して１〜約１２の整数であり、各ｑは独立して１〜約５０の整数である、を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記フルオロカーボンは約１％〜約５０％の前記ナノエマルジョン中のｗｔ％を構成する、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記フルオロカーボンは約１％〜約１０％の前記ナノエマルジョン中のｗｔ％を構成する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールは、約０．１０％〜約７．５％の前記ナノエマルジョン中のｗｔ％を構成する、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールは、約０．１０％〜約１．５％の前記ナノエマルジョン中のｗｔ％を構成する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リン脂質は長さが約１２個の炭素〜約１８個の炭素の範囲の炭素鎖を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記リン脂質は約０．１０％〜約７．５％の前記ナノエマルジョン中のｗｔ％を構成する、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記３つのリン脂質の混合物は、約７５〜約８７モル％のホスファチジルコリン、約５〜約１５モル％のホスファチジルエタノールアミンおよび約３〜約２０モル％のホスファチジルエタノールアミン−ＭＰＥＧまたはホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ、または、合計で、全供給リン脂質の約３〜約２０モル％を構成する、ホスファチジルエタノールアミン−ＭＰＥＧまたはホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧの任意の組み合わせを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項１４】
前記３つのリン脂質の混合物は、約８０〜約８５モル％のホスファチジルコリン、約８〜約１３モル％のホスファチジルエタノールアミンおよび約６〜約１１モル％のホスファチジルエタノールアミン−ＭＰＥＧまたはホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ、または、合計で、全供給リン脂質の約６〜約１１モル％を構成する、ホスファチジルエタノールアミン−ＭＰＥＧまたはホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧの任意の組み合わせを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ホスファチジルエタノールアミンは、約３５０〜約５，０００の分子量を有するＭＰＥＧまたはＰＥＧ基を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ホスファチジルエタノールアミンは、約５，０００の分子量を有するＭＰＥＧまたはＰＥＧ基を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ナノエマルジョンを形成する方法であって、
ＰＥＧテロマーＢおよびフルオロカーボンを含む水性の第１の混合物を調製し；
バイパスバルブおよび空気圧ユニットを含むホモジナイザーを介して、前記第１の混合物を、第１の容器と第２の容器の間で移送し、前記第１の容器に戻し、そこでは前記バイパスバルブは開いており；
閉じたバイパスバルブを使用して前記空気圧ユニットを始動させ、前記第１の容器から前記第２の容器への材料の均質化によって均質化された一次ナノエマルジョンを形成し；
任意に、１つより多い均質化の通過が必要とされる場合、前記バイパスバルブを開き、溶液を前記第１の容器に移送し、前記バイパスバルブを閉じ、前記第１の容器から前記第２の容器への均質化の第２の通過を実行し；
前記均質化された一次ナノエマルジョンを、第１の圧力容器内に配置された、スクロースまたは別の粘性物質および任意に１つ以上の薬学的に許容し得る緩衝塩および殺微生物剤の水溶液内に配置して第２の混合物を形成し；
前記第１の圧力容器を前記ホモジナイザーの入口端に取り付け；
第２の圧力容器を前記ホモジナイザーの出口端に取り付け；
前記第２の混合物のすべてを前記第２の圧力容器に移送するまで、前記バイパスバルブを閉じた状態で前記空気圧ユニットを作動させて前記第２の混合物をさらに均質化し；かつ
前記第２の圧力容器を加圧して、０．８／０．２ミクロンのフィルターを通して第３の圧力容器に前記ナノエマルジョンを移送して滅菌する、
ことを含む、方法。
【請求項１８】
前記フルオロカーボンはテトラデカフルオロ−ｎ−ヘキサンを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記フルオロカーボンは任意の割合で存在するその可能性のある構造異性体の２つ以上から選択されるかまたはそれらを含むテトラデカフルオロヘキサンからなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記フルオロカーボンはドデカフルオロ−ｎ−ペンタンを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記フルオロカーボンは任意の割合で存在するその可能な構造異性体の２つ以上から選択されるかまたはそれらを含むドデカフルオロペンタンからなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ナノエマルジョンを形成する方法であって、
オリゴエチレンオキシ部分が１〜１６単位の長さである１つ以上のペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコール、およびフルオロカーボンを含む水性の第１の混合物を調製し；
バイパスバルブおよび空気圧ユニットを含むホモジナイザーを介して、前記第１の混合物を、第１の容器と第２の容器との間で移送し、前記第１の容器に戻し、そこでは前記バイパスバルブは開いており；
閉じたバイパスバルブを使用して前記空気圧ユニットを始動させ、均質化された一次エマルジョンを形成し；
前記均質化された一次エマルジョンを、第１の圧力容器内に配置された任意に１つ以上の薬学的に許容し得る緩衝塩、粘性物質および殺微生物剤を含むスクロース溶液内に配置して第２の混合物を形成し；
前記第１の圧力容器を前記ホモジナイザーの入口端に取り付け；
第２の圧力容器を前記ホモジナイザーの出口端に取り付け；
前記第２の混合物のすべてを前記第２の圧力容器に移送するまで、前記バイパスバルブを閉じた状態で前記空気圧ユニットを作動させてナノエマルジョンを形成し；かつ
前記第２の圧力容器を加圧して、０．８／０．２ミクロンのフィルターを通して第３の圧力容器に前記ナノエマルジョンを移送して滅菌する、
ことを含む、方法。
【請求項２３】
前記フルオロカーボンはテトラデカフルオロ−ｎ−ヘキサンを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記フルオロカーボンは任意の割合で存在するその可能な構造異性体の２つ以上から選択されるかまたはそれらを含むテトラデカフルオロヘキサンからなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記フルオロカーボンはドデカフルオロ−ｎ−ペンタンを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記フルオロカーボンは任意の割合で存在するその可能な構造異性体の２つ以上から選択されるドデカフルオロペンタンからなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールは、任意に製造者によって提供されたままで使用される、ＤｕＰｏｎｔ  Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−３１００フルオロ界面活性剤、またはカスタム改良されたＤｕＰｏｎｔ  Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−３１００フルオロ界面活性剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
ナノエマルジョンを形成する方法であって、
１つまたは複数のリン脂質、およびフルオロカーボンを含む水性の第１の混合物を調製し；
バイパスバルブおよび空気圧ユニットを含むホモジナイザーを介して、前記第１の混合物を、第１の容器と第２の容器との間で移送し、前記第１の容器に戻し、そこでは前記バイパスバルブは開いており；
閉じたバイパスバルブを使用して前記空気圧ユニットを始動させ、均質化された一次エマルジョンを形成し；
前記均質化された一次エマルジョンを、第１の圧力容器内に配置された任意に１つ以上の薬学的に許容し得る緩衝塩、粘性物質および殺生物滅菌剤を含むスクロース溶液内に配置して第２の混合物を形成し；
前記第１の圧力容器を前記ホモジナイザーの入口端に取り付け；
第２の圧力容器を前記ホモジナイザーの出口端に取り付け；
前記第２の混合物のすべてを前記第２の圧力容器に移送するまで、前記バイパスバルブを閉じた状態で前記空気圧ユニットを作動させてナノエマルジョンを形成し；かつ
前記第２の圧力容器を加圧して、０．８／０．２ミクロンのフィルターを通して第３の圧力容器にナノエマルジョンを移送して滅菌する、
ことを含む、方法。
【請求項２９】
前記１つ以上のリン脂質は１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、１，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］ナトリウム塩、および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンからなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つ以上のリン脂質は１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］ナトリウム塩、および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンからなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つ以上のリン脂質は１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］ナトリウム塩、および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンからなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記水性の第１の混合物はペルフルオロ−ｎ−ヘキシルオリゴエチレンオキシアルコールと、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８の飽和または不飽和脂肪酸またはそれらの混合物に由来する１つ以上のリン脂質またはリン脂質混合物との配合物からなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
ナノエマルジョンを形成する方法であって、
ペルフルオロ−ｎ−ヘキシルオリゴエチレンオキシ−アルコール、スクロース、および任意に１つ以上の薬学的に許容し得る緩衝塩、粘性物質および承認された殺微生物剤を含む水性の第１の混合物を調製し；
シリンジおよび前記シリンジに取り付けられた針を用いて前記第１の混合物をバイアル内に配置し；
前記バイアルにフルオロカーボンを添加し、前記バイアルに栓をしかつクリンプキャップをし、
前記バイアルをボルテックスし、超音波処理する、
ことを含む、方法。
【請求項３４】
前記フルオロカーボンはテトラデカフルオロ−ｎ−ヘキサンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記フルオロカーボンは任意の割合でその可能な構造異性体の２つ以上から選択されるかまたはそれらを含むテトラデカフルオロヘキサンからなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記フルオロカーボンはドデカフルオロ−ｎ−ペンタンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記フルオロカーボンは任意の割合でその可能な構造異性体の２つ以上から選択されるかまたはそれらを含むドデカフルオロペンタンからなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
ナノエマルジョンを形成する方法であって、
１つ以上のリン脂質、水、グリセロール、一塩基性リン酸ナトリウムおよび無水二塩基性リン酸ナトリウムを含む混合物を形成し；
前記混合物を０．２ミクロンのフィルターを介して滅菌容器に移し；
前記混合物をバイアル内に配置し；
前記バイアルにフルオロカーボンを添加し、前記バイアルに直ちに栓をしかつクリンプキャップをし；かつ
前記バイアルをボルテックスし、超音波処理する、
ことを含む、方法。
【請求項３９】
前記１つ以上のリン脂質は１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、１，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］ナトリウム塩、および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンからなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ以上のリン脂質は１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］ナトリウム塩、および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンからなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記１つ以上のリン脂質は１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］ナトリウム塩、および１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンからなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法によって形成されたナノエマルジョン。
【請求項４３】
請求項２２〜２７のいずれかに記載の方法によって形成されたナノエマルジョン。
【請求項４４】
請求項２８〜３１のいずれかに記載の方法によって形成されたナノエマルジョン。
【請求項４５】
請求項３２〜３６のいずれかに記載の方法によって形成されたナノエマルジョン。
【請求項４６】
請求項３７〜４０のいずれかに記載の方法によって形成されたナノエマルジョン。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
優先権主張および関連特許出願
本出願は、２０１５年１２月２１日に出願された米国仮出願第６２／２７０，２２６号の優先権の利益を主張し、その全内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、概してフルオロカーボンナノエマルジョンの組成物およびそれらの調製および使用の方法に関する。より詳細には、本発明は、ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールおよびリン脂質の１つ以上で安定化された他とは異なるフルオロカーボンナノエマルジョン、およびそれらの調製および適用の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
一般的な外科手術および介入処置ならびに外傷および自然の病態は、適時にかつ適切に処置しなければ、臓器および組織の損傷を引き起こし、結果的には病的状態そしては死を招く、失血、虚血または低酸素症を招き得る。虚血性症候群として存在する血液損失の出現は、身体および四肢全域および脳内に脳卒中として広く分布する。迅速な血行再建術および酸素供給された血流の回復が、依然として臨床上脳卒中治療で重視されている。加えて、献血された血液の保存期間が限られているため、献血された血液は部分的に不足しているようであり、加えてウィルス汚染が起こりやすい。酸素キャリアまたは人工血液は、放射線療法および化学療法を含む様々な疾患および状態の治療を補助するのに有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
例えば、より大きい分子量のフルオロカーボン（例えば、ペルフルオロデカリンおよびペルフルオロオクチルブロミド）を利用して、乳化フルオロカーボン（ＦＣ）ベースの酸素キャリアが報告されている。しかしながら、これらの組成物は、厳格な臨床上の必要条件を殆ど満たすことができず、安全で信頼性があり、有効な酸素キャリアの緊急の必要性に対処するために多くの課題が残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコール、リン脂質またはそれらの組み合わせから選択される界面活性剤または安定化剤を用いて独自に処方したフルオロカーボンナノエマルジョンが、６個より多い完全フッ素化炭素のペルフルオロアルキル基を有するフルオロ界面活性剤から形成される代謝産物および分解生成物の生物蓄積の重要な問題を解決するという、予測できない発見の一部分に基づく。
【０００６】
本発明のフルオロカーボンナノエマルジョンは界面活性剤のより短いペルフルオロカーボン鎖を用いることから、より長いペルフルオロアルキル部分を有するものが生物蓄積するのとは異なり、排泄および代謝生成物が生物蓄積しないため、有意な利益が得られる。
【０００７】
一態様では、本発明は、概して、約４〜約８個の炭素の範囲のフルオロカーボン；およびペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコール、リン脂質またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の界面活性剤を含むフルオロカーボンナノエマルジョンの組成物に関する。特定の実施形態では、前記１つ以上の界面活性剤はペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシアルコールおよび／または３つのリン脂質の混合物を含む。
【０００８】
さらに別の態様では、本発明は、概してナノエマルジョンを形成する方法に関する。この方法は、ＰＥＧテロマーＢ（ＰＥＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒ  Ｂ）およびフルオロカーボンを含む水性の第１の混合物を調製し；バイパスバルブおよび空気圧ユニットを含むホモジナイザーを介して、前記第１の混合物を、第１の容器と第２の容器の間で移送し、前記第１の容器に戻し、そこでは前記バイパスバルブは開いており；閉じたバイパスバルブを使用して前記空気圧ユニットを始動させ、前記第１の容器から前記第２の容器への材料の均質化によって均質化された一次ナノエマルジョンを形成し；前記均質化された一次ナノエマルジョンを、第１の圧力容器内に配置された、スクロースまたは別の粘性物質および任意に１つ以上の薬学的に許容し得る緩衝塩および殺微生物剤の水溶液内に配置して第２の混合物を形成し；前記第１の圧力容器を前記ホモジナイザーの入口端に取り付け；第２の圧力容器を前記ホモジナイザーの出口端に取り付け；前記第２の混合物のすべてを前記第２の圧力容器に移送するまで、前記バイパスバルブを閉じた状態で前記空気圧ユニットを作動させてナノエマルジョンを形成し；かつ前記第２の圧力容器を加圧して、０．８／０．２ミクロンのフィルターを通して第３の圧力容器に前記ナノエマルジョンを移送して滅菌する、ことを含む。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は、概してナノエマルジョンを形成する方法に関する。この方法は、オリゴエチレンオキシ部分が１〜１６単位の長さである１つ以上のペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコール、およびフルオロカーボンを含む水性の第１の混合物を調製し；バイパスバルブおよび空気圧ユニットを含むホモジナイザーを介して、前記第１の混合物を、第１の容器と第２の容器との間で移送し、前記第１の容器に戻し、そこでは前記バイパスバルブは開いており；閉じたバイパスバルブを使用して前記空気圧ユニットを始動させ、均質化された一次エマルジョンを形成し；前記均質化された一次エマルジョンを、第１の圧力容器内に配置された任意に１つ以上の薬学的に許容し得る緩衝塩、粘性物質および殺微生物剤を含むスクロース溶液内に配置して第２の混合物を形成し；前記第１の圧力容器を前記ホモジナイザーの入口端に取り付け；第２の圧力容器を前記ホモジナイザーの出口端に取り付け；前記第２の混合物のすべてを前記第２の圧力容器に移送するまで、前記バイパスバルブを閉じた状態で前記空気圧ユニットを作動させてナノエマルジョンを形成し；かつ前記第２の圧力容器を加圧して、０．８／０．２ミクロンのフィルターを通して第３の圧力容器に前記ナノエマルジョンを移送して滅菌する、ことを含む。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、概してナノエマルジョンを形成する方法に関する。この方法は、ペルフルオロ−ｎ−ヘキシルオリゴエチレンオキシ−アルコール、スクロース、および任意に１つ以上の薬学的に許容し得る緩衝塩、粘性物質および承認された殺生物滅菌剤を含む水性の第１の混合物を調製し；シリンジおよび前記シリンジに取り付けられた針を用いて前記第１の混合物をバイアル内に配置し；前記バイアルにフルオロカーボンを添加し、前記バイアルに栓をしかつクリンプキャップをし、その後、前記バイアルをボルテックスし、超音波処理する、ことを含む。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は、概してナノエマルジョンを形成する方法に関する。この方法は、１つ以上のリン脂質、水、グリセロール、一塩基性リン酸ナトリウムおよび二塩基性リン酸ナトリウムを含む混合物を形成し；前記混合物を０．２ミクロンのフィルターを介して滅菌容器に移し；前記混合物をバイアル内に配置し；前記バイアルにフルオロカーボンを添加し、前記バイアルに直ちに栓をしかつクリンプキャップをし；その後、前記バイアルをボルテックスし、超音波処理する、ことを含む。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、概して本明細書に開示される方法によって形成されるナノエマルジョンに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明は、図面と関連して以下の詳細な説明を読むことによりよりよく理解されることになり、前記図面では、同様の参照符号が同様の要素を示すために使用される。
【００１４】
【図１】図１は、高圧均質化によってＰＥＧテロマーＢで安定化されたペルフルオロカーボンナノエマルジョンを生成するための、本発明による方法の例示的な実施形態を要約したフローチャートである。
【００１５】
【図２】図２は、図１の本発明による方法の例示的な実施形態における追加のステップを要約したフローチャートである。
【００１６】
【図３】図３は、本発明による方法の例示的な実施形態、４℃で保存したＴＤＦＨ−ＰＴＢナノ粒子エマルジョンおよび２３℃で保存した同エマルジョンの安定性データを図式的に記載する。
【００１７】
【図４】図４は、本発明による方法の例示的な実施形態、４℃で保存したＴＤＦＨ−ＰＴＢナノ粒子エマルジョンおよび４℃で保存したＴＤＦＨ−化合物２０ａ（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−３１００）ナノ粒子エマルジョンの安定性データを図式的に記載する。
【００１８】
【図５】図５は、リン脂質で安定化されたペルフルオロカーボンナノエマルジョンを生成するための、本発明による方法の例示的な実施形態を要約したフローチャートである。
【００１９】
【図６】図６は、ボルテックスおよび超音波処理により最終生成物において混合成分をそれらの濃度で含む安定化されたペルフルオロカーボンナノエマルジョンを形成する本発明による方法の例示的な実施形態を要約したフローチャートである。
【００２０】
【図７】図７は、ペルフルオロカーボンおよび界面活性剤のナノエマルジョンの試験溶液の添加の前後に、溶液からの溶存酸素の取り込みを測定する例示的な装置の図である。
【００２１】
【図８】図８は、実施例５のペルフルオロカーボンナノエマルジョンの添加前後の水溶液の溶存酸素含有量のグラフである。
【００２２】
【図９】図９は、実施例７の製剤の添加後の水溶液中の溶存酸素レベルの低下を示すグラフである。
【００２３】
【図１０】図１０は、実施例８の製剤の添加後の水溶液中の溶存酸素レベルの低下を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールおよびリン脂質から選択される界面活性剤または安定剤を用いて独自に処方されたフルオロカーボンナノエマルジョンを提供する。これらのフルオロカーボンナノエマルジョンは、代謝産物および分解生成物の生物蓄積を含む、従来のフルオロカーボンベースの人工酸素キャリアが直面する重要な課題を解決する。これらの望ましくない不純物は、６個を超える完全フッ素化炭素のペルフルオロアルキル基を有するフルオロ界面活性剤から形成され、厳しい規制基準に照らして継続的に失敗している。本発明のフルオロカーボンナノエマルジョンは界面活性剤のより短いペルフルオロカーボン鎖を用いることから、より長いペルフルオロアルキル部分を有するものが生物蓄積するのとは異なり、排泄および代謝生成物が生物蓄積しないため、有意な利益が得られる。
【００２５】
一態様では、本発明は、概して、約４〜約８個の炭素の範囲のフルオロカーボン；およびペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールおよびリン脂質から選択される１つ以上の界面活性剤を含む、フルオロカーボンナノエマルジョンの組成物に関する。
【００２６】
特定の実施形態において、前記フルオロカーボンはペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、またはそれらの２つ以上の混合物を含む。
【００２７】
特定の好ましい実施形態では、前記フルオロカーボンはペルフルオロペンタンを含む。
【００２８】
特定の実施形態では、前記１つ以上の界面活性剤はペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールおよび／または３つのリン脂質の混合物を含む。
【００２９】
例えば、前記ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールは、以下の１つ以上：
ＣＦ３−（ＣＦ２）ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｈ
式中、ｎは５であり、ｑは１〜約５０の整数である、を含む。
【００３０】
特定の好ましい実施形態において、前記ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールは、
ＣＦ３−（ＣＦ２）ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｈ
式中、ｎは５であり、ｑは１〜約１６の整数（例えば、約３〜約１６、約６〜約１６、約１０〜約１６、約３〜約１０）である、である。
【００３１】
フルオロカーボンは前記ナノエマルジョン中の任意の適切なｗｔ％（ｗｅｉｇｈｔ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）、例えば、約１％〜約５０％（例えば、約１％〜約４０％、約１％〜約３０％、約１％〜約２０％、約１％〜約１０％、約１％〜約５％）を構成していてもよい。
【００３２】
ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールは、前記ナノエマルジョン中の任意の適切なｗｔ％、例えば、約０．１０％〜約７．５％（例えば、約０．１０％〜約５％、約０．１０％〜約４％、約０．１０％〜約３％、約０．１０％〜約１．５％）を構成していてもよい。
【００３３】
前記リン脂質は、例えば、約１２個の炭素〜約１８個の炭素（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）の長さの範囲の、任意の適切な炭素鎖長を有する。
【００３４】
前記リン脂質は前記ナノエマルジョン中の任意の適切なｗｔ％、例えば、約０．１０％〜約７．５％（例えば、約０．１０％〜約５％、約０．１０％〜約４％、約０．１０％〜約３％、約０．１０％〜約１．５％）を構成していてもよい。
【００３５】
発明の名称が“Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ  Ｆｏｒｍｅｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓａｍｅ（リン脂質組成物およびマイクロバブルおよびそれらを用いて形成されたエマルジョン）”の２０１５年６月１２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１５／３５６８１の開示は、あらゆる目的のために参照により明示的に本明細書に援用される。
【００３６】
前記組成物が３つのリン脂質の混合物を含む特定の実施形態において、例示的なリン脂質およびそれらの相対量は、例えば、約７５〜約８７モル％のホスファチジルコリン、約５〜約１５モル％のホスファチジルエタノールアミンおよび約３〜約２０モル％のホスファチジルエタノールアミン−ＭＰＥＧであり、ここで「ＭＰＥＧ」は末端メトキシ基を有するＰＥＧ基を指す。本明細書におけるＭＰＥＧは、約３５０〜約５，０００（例えば、約３５０〜約４，０００、約３５０〜約３，０００、約３５０〜約２，０００、約５００〜約５，０００、約１，０００〜約５，０００、約１，５００〜約５，０００、約２，０００〜約５，０００、約３，０００〜約５，０００、約４，０００〜約５，０００）の分子量を有していてもよい。分子のオリゴエチレンオキシ部分がＭＰＥＧリン脂質に存在するメトキシ末端とは対照的にヒドロキシル基で終結するホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧは、製剤においてホスファチジルエタノールアミン−ＭＰＥＧの代わりに使用することができる。ホスファチジルエタノールアミン−ＭＰＥＧおよびホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧの組み合わせも、これらの製剤のオリゴエチレンオキシ含有リン脂質成分として、任意の相対比で使用することができる。
【００３７】
前記組成物が３つのリン脂質の混合物を含む実施形態において、例示的なリン脂質およびその相対量は、例えば、約８０〜約８５モル％のホスファチジルコリン、約８〜約１３モル％のホスファチジルエタノールアミンおよび約６〜約１１モル％のホスファチジルエタノールアミン−ＭＰＥＧ（またはホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ）であってもよい。
【００３８】
特定の実施形態では、前記ホスファチジルエタノールアミンは約３５０〜約５，０００（例えば、約３５０〜約４，０００、約３５０〜約３，０００、約３５０〜約２，０００、約５００〜約５，０００、約１，０００〜約５，０００、約１，５００〜約５，０００、約２，０００〜約５，０００、約３，０００〜約５，０００、約４，０００〜約５，０００）の分子量を有するＰＥＧ基を含む。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明の組成物はＤｕＰｏｎｔ  Ｚｏｎｙｌ  ＦＳ−１００またはＤｕＰｏｎｔ  ＦＳＯのカスタム精製医療グレードであるＰＥＧテロマーＢ（ＰＴＢ）を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物はペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールを含む。特定の形態のペルフルオロ−ｎ−ヘキシルオリゴエチレンオキシ−アルコールは、ＤｕＰｏｎｔ  Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−３１００として知られているフルオロ界面活性剤製品であり、特定の実施形態において、本発明の組成物はその材料またはその材料のカスタム改良された製品を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物はテトラデカフルオロ−ｎ−ヘキサン（ＴＤＦＨ）を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物は、任意の割合で存在するその可能な構造異性体の２つ以上の混合物からなっていてもよいテトラデカフルオロヘキサンを含む。特定の実施形態において、本発明の組成物はドデカフルオロ−ｎ−ペンタン（ＤＤＦＰ）を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物は、任意の割合で存在するその可能な構造異性体の２つ以上の混合物からなっていてもよいドデカフルオロペンタンを含む。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明の組成物はドデカフルオロ−ｎ−ペンタン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、１，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］塩、例えばそのナトリウム塩、および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンの１つ以上を含む。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明の組成物は１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］塩、例えばそのナトリウム塩、および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンの１つ以上を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物は１，２−ジドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、１，２−ジドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］ナトリウム塩、および１，２−ジドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンの１つ以上を含む。
【００４２】
本発明の態様は、ペルフルオロカーボンナノエマルジョンを調製する方法に関する。単一鎖長のみを含むフルオロカーボン部分を有する１つ以上のフルオロカーボン界面活性剤の水性混合物を使用して、ペルフルオロカーボンのナノエマルジョンを調製する。ここで図１を参照すると、ステップ（１１０）において、この方法により、容器内でマグネチックスターラーを使用して、注射用水（ＷＦＩ）中のフルオロ界面活性剤の約６％ｗｔ／ｖ混合物を調製し、約２〜５℃の浴中に１５〜６０分間置くが、その間、溶液の温度を監視し、２〜５℃の温度で維持する。
【００４３】
特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロカーボンはテトラデカフルオロ−ｎ−ヘキサンを含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロカーボンは、２つ以上の構造異性体の混合物であってもよい、テトラデカフルオロヘキサンを含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロカーボンはドデカフルオロ−ｎ−ペンタンを含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロカーボンは、２つ以上の構造異性体の混合物であってもよい、ドデカフルオロペンタンを含む。
【００４４】
特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロカーボンはテトラデカフルオロ−ｎ−ヘキサンからなる。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロカーボンはテトラデカフルオロヘキサンからなる。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロカーボンはドデカフルオロ−ｎ−ペンタンからなる。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロカーボンはドデカフルオロペンタンからなる。
【００４５】
さらにステップ（１１０）において、次に、本発明の方法では、冷（０〜４℃）ペルフルオロカーボンの一部を容器に迅速に加え、容器のキャップを閉じ、次いで得られた第１の混合物を約１時間撹拌する。
【００４６】
特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロカーボン界面活性剤は、ＰｅｇテロマーＢ（Ｐｅｇ  Ｔｅｌｏｍｅｒ  Ｂ）（ＰＴＢ）、化合物２１、
【化１】
2019502682.tif 000002
【００４７】
特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロカーボン界面活性剤は、ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールを含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロカーボン界面活性剤は、上記に２１で示される化合物の混合物であるＰＥＧテロマーＢからなる。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロカーボン界面活性剤は、ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールからなる。
【００４８】
特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は、ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコール界面活性剤１７であり、前記界面活性剤１７は不変ペルフルオロ−ｎ−ヘキシル部分１８を、可変エチレンオキシド部分１９と組み合わせて有する。
【化２】
2019502682.tif 000003
【００４９】
特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は、ｙが６より大きいペルフルオロ−ｎ−アルキル−オリゴエチレンオキシ−アルコール２０を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は、ｙが７であり、ｎは１以上１６以下である、化合物２０を含む。
【化３】
2019502682.tif 000004
【００５０】
特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は、ｙが６であり、ｎは１以上１６以下である、ペルフルオロ−ｎ−アルキル−オリゴエチレンオキシ−アルコール２０ａ（例えば、ＤｕＰｏｎｔ  Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−３１００フルオロ界面活性剤）を含む。特定の実施形態において、化合物２０ａは製造者から受け取ったままで使用することができる。特定の実施形態において、化合物２０ａは使用前にカスタム改良手順または精製手順に付すことができる。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は、ｙが５であり、ｎが１以上１６以下である、化合物２０ｂを含む。
【００５１】
特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物１を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物２を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物３を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物４を含む。特定の実施形態では、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物５を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物６を含む。特定の実施形態では、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物７を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物８を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物９を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物１０を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物１１を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物１２を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物１３を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物１４を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物１５を含む。特定の実施形態において、ステップ（１１０）のフルオロ界面活性剤は化合物１６を含む。
【化４】
2019502682.tif 000005
【化５】
2019502682.tif 000006
【化６】
2019502682.tif 000007
【化７】
2019502682.tif 000008
【化８】
2019502682.tif 000009
【００５２】
特定の実施形態において、前記フルオロ界面活性剤は化合物１〜１６の混合物からなり、それらの混合物はそれらの化合物の任意の組み合わせを含んでいてもよく、１〜１６の化合物のセットの単独または選択されたメンバーのそれらの化合物のいずれかを省略してもよい。
【００５３】
特定の実施形態では、異なる発泡特性および濡れ特性と組み合わせたペルフルオロ部分１８を含む他のフルオロカーボン界面活性剤を使用して、本発明のペルフルオロカーボンナノエマルジョンを形成する。例えば、スルホン酸（ＤｕＰｏｎｔ  ＦＳ−１０）またはリン酸エステル（ＤｕＰｏｎｔ  ＦＳ−６１、ＦＳ６３、ＦＳ−６４）に基づく他のアニオン性界面活性剤；双性イオン性および両性界面活性剤（それぞれＤｕＰｏｎｔ  ＦＳ−５０およびＤｕＰｏｎｔ  ＦＳ−５１）；ペルフルオロアルキル化ポリエチレンオキシアルコールに基づく、非イオン性界面活性剤、例えばＤｕＰｏｎｔ  ＦＳ−３０、ＤｕＰｏｎｔ  ＦＳ−３１、ＤｕＰｏｎｔ  ＦＳ−３１００、ＤｕＰｏｎｔ  ＦＳ３４およびＤｕＰｏｎｔ  ＦＳ−３５；などを利用することができる。
【００５４】
特定の実施形態において、異なる長さのエチレンオキシド部分１９と組み合わせた部分１８を含むフルオロカーボン化合物を利用して、本発明のペルフルオロカーボンのナノエマルジョンを形成する。特定の実施形態では、ｎは約３〜約６の間にある。他の実施形態では、ｎは１以上で約１６以下であり、低分子量のペルフルオロカーボン、例えばドデカフルオロペンタン（ＤＤＦＰ）、テトラデカフルオロヘキサン（ＴＤＦＨ）、ヘキサデカフルオロヘプタン（ＨＤＦＨ）およびオクタデカフルオロオクタン（ＯＤＦＯ）と共に安定なナノエマルジョンを形成する。
【００５５】
ある実施形態では、化合物２２として示される形態のペグ化ペルフルオロアルキルオリゴエチレンオキシアルコール界面活性剤
【化９】
2019502682.tif 000010
式中、独立して、ｍは１〜約５０の整数（例えば、１〜約２５、１〜約１２、１〜約６、６〜約５０、１２〜約５０、２５〜約５０）であり、ｎは１〜約５０（例えば、１〜約２５、１〜約１２、１〜約６、６〜約５０、１２〜約５０、２５〜約５０）であり、ｑは１〜約５０の整数（例えば、１〜約２５、１〜約１２、１〜約６、６〜約５０、１２〜約５０、２５〜約５０）である、を利用して、本明細書に開示されるペルフルオロカーボンのナノエマルジョンを形成する。
【００５６】
特定のより好ましい実施形態では、使用することができる化合物のクラスは、以下に示す化合物２２のサブセットから選択される：
Ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−（ＣＦ２）ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｈ、
式中、ｍ＝１〜約５０、ｎ＝１〜１２およびｑ＝１〜約５０である。
【００５７】
特定の最も好ましい実施形態では、使用することができる化合物のクラスは、以下に示す化合物２２のサブセットから選択される：
Ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−（ＣＦ２）ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｈ、
式中、ｍ＝１〜約５０、ｎ＝１〜６およびｑ＝１〜約５０である。
【００５８】
特定の実施形態において、化合物２２として表される化合物の群の個々のメンバーまたは前記化合物の群の個々のメンバーの任意の組み合わせは、本明細書に開示されるペルフルオロカーボンナノエマルジョンを形成するために使用されるフルオロカーボン界面活性剤として利用される。
【００５９】
特定の実施形態において、構造２２として表される化合物の混合物は、本明細書に開示されるペルフルオロカーボンのナノエマルジョンを形成するために利用される前に、カスタム改良または精製プロトコルに供され得る。
【００６０】
特定の実施形態では、構造２２によって表される化合物の群の任意の個々の分子種または個々のメンバーの任意の組み合わせは、本明細書に開示されるペルフルオロカーボンのナノエマルジョンを形成するために利用される前に、カスタム改良または精製プロトコルに供され得る。
【００６１】
特定の実施形態では、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘまたは同様の分散装置が、磁気撹拌システムと置き換わって、初期の粗いエマルジョンを生成することができる。Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘは高速撹拌モーター（１，０００〜２５，０００ｒｐｍ）を有し、これに分散要素が軸を介して取り付けられる。したがって、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘを使用して粗いエマルジョンを生成するのに必要な時間は、磁気撹拌システムを使用することによる生成と比較するとあまり時間がかからない（０．５〜５分）。運転中を通して、低沸点のペルフルオロカーボン液の損失を最小限に抑えるために、溶液の温度を２〜６℃で維持する。
【００６２】
さらに、高速モーターおよび分散アッタッチメントからなるホモジナイザーやプローブソニケーターを用いて生じる激しい撹拌により粗エマルジョンを製造することもできる。
【００６３】
次に、図１のステップ（１４０ｃ）〜（１６０ｃ）または（１４０ｄ）〜（１７５ｄ）を参照すると、前記粗エマルジョンを均質化して、４００ｎｍ以下の平均粒径および９９％累積分布が９００ｎｍ以下である微細エマルジョンが得られる。
【００６４】
一実施形態では、ホモジナイザー（ＡｖｅｓｔｉｎモデルＣ５）が使用される。別の実施形態では、ホモジナイザー（ＡｖｅｓｔｉｎモデルＣ５０）が使用される。別の実施形態では、空気圧補助装置を備えたまたは備えていないＫｉｒｋｌａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓのハンドヘルドホモジナイザーが使用される。特定の実施形態において、均質化圧力は１，０００ｐｓｉから１４，０００ｐｓｉの範囲である。さらに、他の実施形態では、ホモジナイザーは連続均質化モードまたは不連続均質化モードで使用される。不連続通過の数または連続均質化の時間は、微細エマルジョンを確実に達成するように調整することができる。
【００６５】
図１、ステップ（１８０）を参照すると、粗エマルジョンの均質化が完了して微細エマルジョンが形成された後、得られた微細エマルジョンは、ＷＦＩからなる冷却された（０〜１０℃の）撹拌連続相を含む別の容器に移される。さらに、前記連続相は、緩衝剤、粘度調整剤、賦形剤、および偶発的に入った微生物種の増殖を阻害するための防腐剤（殺微生物剤）を任意に含有する。
【００６６】
特定の実施形態では、前記エマルジョンを前記第１の容器から前記ホモジナイザーを介して、場合により加圧した状態の前記ホモジナイザーで前記第２の容器に前記エマルジョンを通すことによって移送を行うことができる。分散相の体積は移送した前記エマルジョンの１〜１００倍の間である。特定の実施形態では、前記微細エマルジョンが連続相全体に均一に分散されることを確実にするために、前記微細エマルジョンは窒素圧（２〜１０ｐｓｉ）下で１０〜３０分間撹拌される。当業者であれば、前記装置の構成および準備の規模が、異なる規模の以前の運転で使用された時間の変更または異なる装置の使用を必要とすることがあることを理解するであろう。
【００６７】
ステップ（１８０）において、本方法では、第１の圧力容器（ＰＶ１）に配置されたスクロース溶液に前記微細エマルジョンを注入して第２の混合物を形成する。図２を参照すると、ステップ（２１０）において、本方法では、ステップ（２１０）の第２の混合物を撹拌しながら、第１の圧力容器（ＰＶ１）を加圧する。
【００６８】
ステップ（２２０）および（２３０）において、本方法では、ホモジナイザーを用いて前記第２の混合物を第２の圧力容器（ＰＶ２）に移送する。
【００６９】
ステップ（２４０）および（２５０）において、本方法では、第２の圧力容器（ＰＶ２）を０．８／０．２ミクロンのフィルターを介して第３の圧力容器（ＰＶ３）に接続し、次いで前記第２の圧力容器を加圧して、前記第２の混合物を濾過して滅菌し、その第２の混合物を第３の圧力容器に移送する。特定の実施形態では、濾過ステップはシリンジ膜フィルター、カートリッジ膜フィルター、またはカプセル膜フィルター、または、培地と適合する物質でできておりかつ微生物実体、例えば細菌、カビ、カビ胞子、および約０．２ミクロンまたは０．１ミクロン相当の小さい、真菌汚染物を含む粒子状物質を除去することができる任意の他の膜を利用する。例えば、膜材料は、Ｐａｌｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＳｕｐｏｒ（登録商標）（ポリエーテルスルフォン）膜、Ｐａｌｌ  ＥＫＶ（登録商標）フィルターシリーズ膜、またはＰａｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧＨＰ  Ｐｏｌｙｐｒｏ（登録商標）膜であってもよい。
【００７０】
ステップ（２５０）が完了した後、本方法では、濾過した溶液の均質な分散を確実にするために、得られた滅菌された第２の混合物を窒素の軽い圧力下で撹拌する。特定の実施形態では、本方法では、さらに、蠕動ポンプ、計量ポンプ、ギアポンプ、または他の適切な流体移送装置を用いて、濾過した第２の混合物を、栓をしかつクリンプする（した）バイアルに移送する。これらの操作のすべての間に微生物汚染を回避するための予防措置がとられ、無菌充填操作のためのそのような予防措置は当業者に知られている。
【００７１】
ここで図６を参照すると、特定の実施形態では、例えばフルオロカーボン界面活性剤２０ａまたは２１を含むナノエマルジョンは、組み合わされた成分の超音波処理によって調製することができる。例えば、ＤＤＦＰ（原液として）、リン酸緩衝化水性スクロース（溶液として）、および化合物２０ａ界面活性剤（原液としてまたはリン酸緩衝化スクロース水溶液と予め混合したもの）を用いてＤＤＦＰのナノ粒子エマルジョンを調製する。
【００７２】
ステップ（６１０）において、本方法では、リン酸緩衝化スクロースおよびフルオロ界面活性剤である化合物２１（ＰｅｇテロマーＢ）の水溶液を調製する。ステップ（６２０）において、本方法では、ステップ（６１０）の溶液を複数のバイアルに充填し、各バイアルの口を覆って栓を置く。ステップ（６３０）において、この方法では、前記バイアルの溶液にペルフルオロカーボンが添加された場合、そのペルフルオロカーボンの有意な量の蒸発がないと予想されるような温度に前記バイアルを冷やす冷却環境に前記バイアルを置く。ステップ（６４０）では、前記フルオロカーボンを各バイアルに加え、続いて各バイアルに迅速にクリンプキャップをする。ステップ（６５０）において、本方法では、各バイアルをボルテックスに供した後、超音波処理して本発明のペルフルオロカーボンナノエマルジョンを生成する。ステップ（６５０）では、最初に振盪またはボルテックスすることによって、栓をしかつクリンプキャップをしたバイアル中で成分を混合し、その粒径分布が約２００ナノメートルから約１５ミクロンまでの範囲に及び得る粗エマルジョンを生成する。粒子寸法の大きさは例示的なものであり、当業者であれば、実際の実施における寸法が所定の範囲を下回るかまたは上回る可能性があることを認識する。
【００７３】
次に、本発明の方法では、例えばＶＷＲ  Ａｑｕａｓｏｎｉｃ  ７５ＨＴユニットの超音波洗浄浴中で前記バイアルを超音波処理し、約４０ＫＨｚの音波処理周波数および約７５〜８０ワットの総出力を１秒〜１時間の時間でもたらし、ナノ粒子エマルジョンの所望の粒径分布を形成する。
【００７４】
ここで図５を参照すると、特定の実施形態では、１つ以上のリン脂質が乳化界面活性剤系として使用される。図５を参照すると、ステップ（５１０）において、本方法では、周囲温度〜１００℃の間の温度で撹拌される一塩基性および二塩基性リン酸塩緩衝剤を含む水とグリセロールの第１の混合物を調製する。ステップ（５２０）において、リン脂質を固体材料としてまたは適切な溶媒中の溶液として前記第１の混合物にプロセスに適合する周囲温度〜１００℃の間の温度で添加し第２の混合物を形成する。ステップ（５３０）では、前記第２の混合物を０．２ミクロンのフィルターを通して第２の容器に濾過する。ステップ（５４０）において、濾過した溶液は、その調製物の温度が周囲温度を超える場合、周囲温度まで冷却させる。ステップ（５５０）において、本方法では、ステップ（５４０）の溶液を複数のバイアルに移し、前記バイアルに栓を取り付ける。ステップ（５６０）において、乳化されるべき選択されたフルオロカーボンを前記バイアルに加え、前記バイアルに直ちにクリンプキャップをする。ステップ（５７０）において、本方法では、フルオロカーボンのエマルジョンを提供するためにステップ（５６０）の前記バイアルをボルテックスし、次いで１秒〜１時間の間超音波処理する。超音波処理時間は、特定の用途に最適であり得る所望のサイズの粒径分布を提供するように調整することができる。特定の実施形態において、前記１つ以上のリン脂質は飽和、部分飽和、または完全に不飽和である。例えば、第１のナノエマルジョンは、ＤＰＰＣ（１６：０）、ＤＰＰＥ−ＭＰＥＧ−２０００、またはＤＰＰＥ−ＭＰＥＧ５０００、および場合によりＤＰＰＥ（１６：０）を用いて形成される。第２のナノエマルジョンは、卵黄リン脂質を単独でまたは他の添加リン脂質または誘導体化リン脂質と組み合わせて使用して形成される。第３のナノエマルジョンは、１６：０〜１８：１ＰＣ、１６：０〜１８：１ＰＥおよび１６：０〜１８：１ＰＥ−ＭＰＥＧ２０００、または１６：０〜１８：１ＰＥ−ＭＰＥＧ５０００を使用して形成される。第４のナノエマルジョンは、ＤＰＰＣ（１６：１）、ＤＰＰＥ−ＭＰＥＧ−２０００またはＤＰＰＥ−ＭＰＥＧ−５０００、および場合によりＤＰＰＥ（１６：１）を用いて形成される。第５のナノエマルジョンは、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＥおよびＤＭＰＥ−ＭＰＥＧ２０００、またはＤＭＰＥ−ＭＰＥＧ５０００を使用して形成される。第６のナノエマルジョンは、１４：１（Δ９−Ｃｉｓ）ＰＣ、１４：１（Δ９−Ｃｉｓ）ＰＥ、１４：１（Δ９−Ｃｉｓ）ＭＰＥＧ２０００、または１４：１（Δ９−Ｃｉｓ）ＭＰＥＧ５０００を用いて形成される。第６のナノエマルジョンは、１４：１（Δ９−ｔｒａｎｓ）ＰＣ、１４：１（Δ９−ｔｒａｎｓ）ＰＥ、１４：１（Δ９−ｔｒａｎｓ）ＭＰＥＧ２０００、または１４：１（Δ９−ｔｒａｎｓ）ＭＰＥＧ５０００を用いて形成される。第７のナノエマルジョンは、ＤＬＰＣ（１２：０）、ＤＬＰＥ−ＭＰＥＧ−２０００またはＤＬＰＥ−ＭＰＥＧ−５０００、ＤＬＰＥ（１２：０）を用いて形成される。
【００７５】
さらに、特定の実施形態では、本明細書に記載のリン脂質成分の相対的比率は、溶解性、乳化安定性、および酸素取り込みおよび放出動力学に関して製剤を最適化するように変化させることができる。例えば、前記第１のナノエマルジョンは、水−プロピレングリコール−グリセロール８５／１０／５ｖ／ｖ／ｖおよび０．７５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬまでの総脂質濃度を含む溶液中の８２  ＤＰＰＣ（１６：０）、８  ＤＰＰＥ（１６：０）−ＭＰＥＧ−２０００、および１０  ＤＰＰＥ（１６：０）のモル比で処方することができる。所定の希釈剤において脂溶性が低い場合、プロピレングリコールとグリセロールの相対量は水に対して増加させることができる。使用することができるリン脂質成分は、上記の例示に記載されたものに限定されない。特定の製剤は、所与の画分の完全飽和リン脂質とそれらの不飽和同族体の所与の画分との組み合わせからなるリン脂質混合物を必要としてもよい。ゲル対液晶相転移温度などの特性の調整および調節は、当業者には十分理解されている。
【００７６】
いくつかの実施形態では、一連の例示において言及したものと相同であるヘッド基を有するリン脂質の添加が必要とされてもよい。例えば、ＭＰＥＧ２０００の代わりにＭＰＥＧ３５０が使用される場合、ＭＰＥＧ２０００を使用する系における構成要素の相対的な比率は、コリンヘッド基を有するものと比較して、より大きな割合のＭＰＥＧリン脂質を必要とすることによって異なる可能性がある。ＰＥＧ化リン脂質またはＭＰＥＧリン脂質とＰＥＧリン脂質との組み合わせが界面活性剤系として使用される場合も、これが適用される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、コリン型ヘッド基は、より大きいまたはより小さいアルキル基、または３未満のアルキル基を含んでいてもよい。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質などのそれらのヘッド基にカチオン性部分を有するリン脂質は、ジアシルホスファチジルグリセロールリン脂質などの中性ヘッド基またはジアシルホスファチジン酸などのアニオン性ヘッド基を有するリン脂質で全体的にまたは部分的に置換することができる。
【００７９】
特定の実施形態において、小分子物質は、ナノ粒子フルオロカーボンエマルジョンの沈降（逆クリーミング）を阻害し、溶液の全体的な密度、粘度、および張度を調節して製品溶液が注入される血液の密度、粘度、および張度に近似させる粘性賦形剤として使用することができる。例えば、物質、例えばプロピレングリコール、グリセリン、および糖アルコール、例えばソルビトール、キシリトール、マンニトールおよびエリスリトールを粘性物質として使用することができる。同様に、媒体中に適切な溶解性を有する他のポリヒドロキシ化合物、例えばモノ−、ジ−またはトリサッカライドも粘性物質として役立ち得る。例としては、フルクトース、グルコース、キシロース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、アルギン酸塩、シクロデキストリン、置換シクロデキストリン、およびデキストランが挙げられる。さらに、直鎖または分岐ポリエチレングリコール、例えばＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、およびＭＷ１０，０００までの高分子量のＰＥＧも粘性物質として使用することができる。
【００８０】
特定の実施形態において、医学分野の当業者は、ナノエマルジョンの溶液の注入速度を制御して、ナノエマルジョンの溶液と血液との間の張度のミスマッチの影響を最小にする必要がある。しかしながら、注入されるナノエマルジョンは等張である必要はない。等張性からの逸脱の程度が過渡効果を超えて患者への不快感または組織への損傷をもたらさない限り、前記ナノエマルジョンの注入溶液は、低張または高張性であってもよい。
【００８１】
特定の実施形態では、前記ナノエマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水の調製に使用されるようなリン酸緩衝液などの他の成分を任意に含む０．９％生理食塩水などのより大きな容量の希釈剤に注入することができる。
【００８２】
特定の実施形態では、リン酸ナトリウム緩衝系以外の緩衝液を使用して、前記ナノエマルジョンのｐＨを維持することができる。前記緩衝液は、例えば、酢酸、アルギニン、アスパラギン酸、安息香酸、炭酸、クエン酸、グルコン酸、グルコン酸ラクトン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メグルミン、リン酸、またはトロメタミンの遊離酸形態と塩形態の塩または組合せであってもよく；酸性塩は前記緩衝系の一部である。さらに、対イオンは、一般的に、ナトリウム、メグルミン、または生化学的に適合し、非経口での使用が可能な他のカチオンである。
【００８３】
特定の実施形態では、不飽和リン脂質を含有するナノエマルジョンを保護するために、ＥＤＴＡ二ナトリウムなどのキレート剤を使用して、Ｆｅ３＋などの酸化金属イオンの量を抑制することができる。さらに、他の抗酸化賦形剤、例えばアセトン重硫酸ナトリウム、ヘッドスペース中の１００％アルゴン、パルミチン酸アスコルビル、アスコルベート（アスコルビン酸ナトリウム／アスコルビン酸）、重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、システイン／システイン酸ＨＣｌ、亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａハイドロサルファイト、Ｎａスルホキシレート）、ゲンチシン酸、ゲンチジン酸エタノールアミン、グルタチオン、ホルムアルデヒドスルホキシレート、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、メチオニン、窒素１００％（ヘッドスペース中）、プロピルガレート、亜硫酸ナトリウム、トコフェロールアルファ、コハク酸水素−アルファトコフェロール、またはチオグリコール酸ナトリウムをこの保護を達成するために添加することができる。
【００８４】
さらに、特定の実施形態では、抗菌剤、例えば塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、安息香酸、クロロブタノール、ｍ−クレゾール、塩化ミリスチルガンマピコリニウム、パラベンメチル、パラベンプロピルまたはチメロサールは、０．００５％〜５％ｗ／ｖの範囲でこれらのうちのいずれかが使用されるかに応じて製剤に加えることができる。
【実施例】
【００８５】
実施例１
実験を行い、前記ナノエマルジョンの粒径分布を研究した。ドデカフルオロペンタン［（ＤＤＦＰ）  ＦｌｕｏｒｏＭｅｄ、テキサス州ラウンドロック］を、生理学的ｐＨ（約７）で緩衝化した３０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液中２％（ｗ／ｖ）で乳化させた。精製された医療グレードの形態のフルオロ界面活性剤、化合物２１（ＰＥＧ−テロマーＢ）を、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ−５ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ、カナダ、オンタリオ州）と組み合わせて０．３％（ｗ／ｖ）の濃度で使用し、粒径を小さくして約２５０ｎｍで安定化させた。ＤＤＦＰ（ＢＰ  ２９℃）の揮発性のために、冷却用のジャケットを備えたステンレス鋼（３１６Ｌ）の圧力容器（ＰＶ）を、調合手順の３段階の間、製品の温度および加圧を制御するために設計して製造した。ＰＶ間のすべてのプロセスフロー経路を１／４インチ内径の可撓性ナイロン管材料で計画した。管材料ラインの端は、ホモジナイザーとＰＶの間の流路を円滑かつ無菌的に接続するために選択されたミニ−１／２インチのサニタリートリクランプフィッティングを用いて取り付けた。したがって、製品を製造プロセス全体の間室内環境から完全に遮蔽した。プロセス温度を４〜６℃に制御し、前記容器のヘッドスペース内の圧力を、圧縮窒素を用いて５〜７ｐｓｉに制御した。前記エマルジョンを、均質化バルブを通して１４，０００ｐｓｉで６回通過させ（効果的に）再循環（連続均質化）した後、直ちに０．２μｍの滅菌濾過カプセルを通して濾過した。Ｕｎｉｓｐｅｎｃｅ（登録商標）（Ｗｈｅａｔｏｎ、ニュージャージー州ミルビル）充填機を用いて、得られた生成物を５ｍＬのバイアルに充填し、それらのバイアルに速やかに手で栓をし、空気圧Ｐｏｗｅｒ  Ｃｒｉｍｐｅｒ（Ｋｅｂｂｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いて圧着（ｃｒｉｍｐ）した。
【００８６】
前記エマルジョンの粒径分布を、０、１、２、３週間および１、２、４、６および１１ヶ月間で３回評価した。各時点で、３本のバイアルを無作為に選択し、ＰＳＳ  Ｎｉｃｏｍｐ  ３８０  ＤＬＳサブミクロン粒子サイザー（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、フロリダ州ポートリッチー）を用いて動的光散乱によって分析した。サイズ決定中の漸進的な温度上昇の影響を最小限にするために、試料温度を１９℃に制御した。
【００８７】
強度補正平均径（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｍｅａｎ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）（ＩＷＭＤ）として得られる平均粒径は２６０ｎｍを超えなかった。さらに、研究の全体を通して、粒子の９９％の径が４００ｎｍ以下であると測定された。粒子の総体積の０．８％未満が０．５μ〜５０μの間の粒子からなっていた。
【００８８】
実施例２
実験を行い、ＴＤＦＨ／化合物２１（ＰＴＢ）を使用して、サブミクロン粒子のサイズ、領域０．５〜５０ミクロンの粒子のサイズ、異なる温度でのナノ粒子エマルジョンの安定性を研究した。
【００８９】
カスタム精製された医療グレードの化合物２１（Ｊ．Ｔｅｃｈｎ  Ｓａｌｅｓ、フロリダ州ボカラトン）の６％溶液の調製は、ｙが５であり、ｎが１〜１６である、化合物２１の１．２ｇアリコートを入れ、注射用水（ＨｙＣｌｏｎｅからのＨｙＰｕｒｅ（登録商標））でガラスシンチレーションバイアル中の予め測定した２０ｍＬ容積の目盛まで希釈し、小型の十字形マグネチックスターラーを用いて５℃で０．５時間撹拌することによって行った。得られた溶液を冷蔵庫中４℃で保存した。先に調製した水中の化合物２１の溶液を冷蔵庫から取り出し、小型バレル形磁気撹拌棒を備えた１５ｍＬのＲＢフラスコ（総容量２１ｍＬ）に１２．１２ｍＬの部分を加えた。次いで、冷（４℃）ＴＤＦＨ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）３．１７ｍＬ（５．２９ｇ）を添加し、前記フラスコを１４／２０ゴム製セプタムで覆い、２℃の氷水浴に浸漬した。前記混合物を１時間撹拌した。
【００９０】
撹拌期間中、シリンジ冷却タンクおよびＰＶ１〜ＰＶ３冷却タンクに氷水を充填した。フローティングマグネチックスターラーを入れた前記圧力容器にそれらの栓を取り付け、前記圧力容器の各々が０．２５インチ外径  ３１６ＳＳ浸漬管（容器から製品を出し入れするため）に取り付けられたＳｗａｇｅｌｏｋ（登録商標）ボトムエントリー二位置計器ボールバルブと、窒素入口および通気システムとして働く三方三位置活栓を備える。キャップおよび大型の十字形スターラーを備えたＰＶ１に、リン酸緩衝化スクロースの溶液（２１６．８ｍＬ）を充填し、ＰＶ１〜ＰＶ３冷却タンクに入れ、撹拌を開始した。ＰＶ２を前記タンク内に入れ、両方のスターラーが動くようにＰＶ１の近傍に適切に配置した。ＰＶ２からの生成物を受ける前に、ＰＶ３を冷却用の氷浴に入れた。０．８／０．２ミクロンのＰａｌｌ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）（Ｓｕｐｏｒ膜）をＰＶ３の計器バルブ入口に取り付ける準備をした。
【００９１】
Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓのハンドヘルドホモジナイザー（「ホモジナイザー」）から残留ＷＦＩを除き、次いで冷ＷＦＩ（２５ｍＬ）ですすいだ。ガラス製プランジャーを伴うコールドジャケット付きの２５ｍＬガラス製Ｐｅｒｆｅｋｔｕｍ  ＭｉｃｒｏＭａｔｅ（登録商標）シリンジを、前記ホモジナイザーの入口および出口のルアーロックフィッティングに取り付けた。受けるシリンジを、ルアーフィッティングを備えた二方活栓に取り付けた。供給ガスライン（８０ｐｓｉ）を前記ホモジナイザーの空気圧ピストン部に接続した。一次エマルジョンの撹拌期間の終了時に、出口シリンジを前記ホモジナイザーから取り外し、１７ゲージの針を取り付けた。前記一次エマルジョンを前記シリンジ内に引き込み、次いでその針を外し、前記シリンジを前記ホモジナイザーの入口側に迅速に固定した。ＢｉｏＲａｄ  Ｅｃｏｎｏｐｕｍｐ蠕動ポンプを使用して、シリンジ浴冷却タンクから直列に前記シリンジを通して氷水を送る。前記蠕動ポンプを、３８ｍＬ／分の合計流速に近づくようにＹコネクタを使用して入口側と出口側で接続された、２本の長さ１／８インチ径のＰｈａｒｍｅｄ（登録商標）管材料に取り付けた。前記蠕動ポンプからの冷却材ラインを出口シリンジと入口シリンジに直列に取り付けて、冷却材の循環を開始した。前記ホモジナイザーのバイパスバルブを開け、シリンジプランジャーの押し下げを交互に行うことによって、出口シリンジと入口シリンジの間で前記一次エマルジョンを数回移行させ；前記一次エマルジョンの最終位置は入口シリンジ内であった。前記バイパスバルブを閉じ、空気圧部の操作を約３０ｍＬ／分のポンプ速度で開始した。入口シリンジの内容物が十分に出口シリンジに移されたら、前記バイパスバルブを急速に開き、出口シリンジのプランジャーを押し下げて、均質化された一次エマルジョンを入口シリンジに迅速に戻し、前記バイパスバルブを閉め、第２の通過を開始した。このようにして、前記一次エマルジョンはホモジナイザーを通る２０回の別々の通過に供された。この手順の最後に、前記一次エマルジョンは出口シリンジにあった。
【００９２】
出口シリンジを前記ホモジナイザーの出口から外し、前記針をＰＶ１中の撹拌溶液の表面の約２インチ下に入れた。前記一次エマルジョンを前記シリンジからＰＶ１に注入した。ＰＶ１を窒素で加圧し（約８〜１０ｐｓｉ）、混合物を約５分間撹拌し、その間に１／１６インチの管材料（編み込まれたシリコーン−白金硬化物）を、ＰＶ１の浸漬管活栓から前記ホモジナイザーの入口側へそしてＰＶ２の浸漬管活栓から前記ホモジナイザーの出口側へ接続した。窒素圧をＰＶ１内で維持し、ＰＶ２の通気を大気に向かって行った。ＰＶ２の浸漬管ボールバルブを開け、続いてＰＶ１の浸漬管ボールバルブの開放を前記ホモジナイザーの開始と同時に行った。これにより、３２％スクロース溶液中の前記一次エマルジョンの撹拌溶液がＰＶ１からＰＶ２へ前記ホモジナイザーを通る１回の通過で移された。ＰＶ２への前記溶液の移行の後、Ｐ１をＰＶ１〜ＰＶ３冷却タンクから取り出し、Ｐ２〜Ｐ３のペアを両方において撹拌されるように配置した。Ｐａｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ２０（登録商標）０．８／０．２ミクロンフィルターを浸漬管ボールバルブの入口／出口を介してＰＶ２とＰＶ３の間に取り付けた。その後、ＰＶ２を窒素で最初に約１２ｐｓｉで加圧し、ＰＶ２からＰＶ３への前記溶液の移送濾過を開始した。濾過完了には約３０〜４０分間を要し、移送はほぼ定量的であった。
【００９３】
ＰＶ３中の濾過溶液を、氷水を含む結晶化皿に移し、クランプで安定させ、窒素で約８ｐｓｉまで加圧し、その中の溶液を約１５分間撹拌した。この時間が経過した後、灰色のブチルゴム栓を有する５０個の公称２ｍＬ血清バイアル（総容量３ｍＬ）を有する２枚のＷｈｅａｔｏｎバイアルトレイを冷蔵庫から取り出した。その出口側に１２ゲージのＳＳ管を取り付けた１／１６インチ内径の編込みシリコーンチューブを、ＰＶ３の計器バルブの出口に接続した。ＰＶ３における圧力を約５ｐｓｉに調整し、前記浸漬管活栓を前記チューブに向かって開いた。前記バイアルからノッチ付ストッパーを取り外し、ＰＶ３に取り付けられたチューブの遠位端で前記活栓を開閉し、前記ノッチ付きストッパーを交換することによって前記バイアルを充填した（１０の群において）。
【００９４】
１０本のバイアルを充填した後、それらに栓をしかつクリンプキャップをした。ＰＶ３中の溶液が消費されるまでこれを繰り返した。これにより、２．６〜２．７ｍＬの充填容量を有する６５本のバイアルを得た。前記トレイ中の前記バイアルを、安定性試験のために４℃で保存した。材料の第２の部分を同じ方法で調製し、２３℃で保存して、粒子の安定性に対する保存温度の効果を調べた。
【表１】
2019502682.tif 000011
【００９５】
調製直後に得られたＰＳＳ  Ｎｉｃｏｍｐ  ３８０  ＤＬＳサブミクロン粒子サイザー（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、フロリダ州ポートリッチー）を用いたサブミクロン粒度測定データを表１に示す。ＩＷＭＤで測定したＴＤＦＨ−化合物２１のナノエマルジョンの平均粒径は変化せず、放出に関する仕様の範囲内に十分とどまる。さらに、研究の全体を通して、前記粒子の９９％の径は４００ｎｍ以下であると測定された。
【表２】
2019502682.tif 000012
【００９６】
ＰＳＳ  ７８０  ＳＩＳ光遮蔽装置（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、フロリダ州ポートリッチー）を使用して、０．５〜５０ミクロンの領域の粒径データを得たため、表２に表示する。粒子の総体積の０．８％未満は０．５μ〜５０μの間の粒子からなり、粒子の大部分の体積は０．５ミクロンの閾値よりも小さい粒子からなっていた。
【００９７】
４℃および２３℃での粒径および９９％累積分布に関するデータをそれぞれ表３および表４に示す。
【表３】
2019502682.tif 000013
【００９８】
ＴＤＦＨ−化合物２１ナノエマルジョンを４℃で保存した場合、ＩＷＭＤで測定した粒子の平均粒径は非常にゆっくりと変化し、放出に関する仕様内に十分とどまる。さらに、研究の全体を通して、前記粒子の９９％の径は≦４００ｎｍであると測定された。
【表４】
2019502682.tif 000014
【００９９】
ＴＤＦＨ−化合物２１ナノエマルジョンを２３℃で保存した場合、ＩＷＭＤで測定した粒子の平均粒径はゆっくりと変化するが、依然として放出に関する仕様の範囲内に十分とどまっている。さらに、研究を通して前記粒子の９９％の径が≦５３０ｎｍであることが測定された。
【表５】
2019502682.tif 000015
【０１００】
表３、表４および表５に示した上記データは、ＴＤＦＨ−化合物２１ナノエマルジョンが、放出に関するおよび４℃と２３℃での保存温度での保存可能期間に関する仕様の範囲内に十分とどまることを明確に示す。さらに、データの傾向により、２６週間で保存可能期間の仕様を超えないことが示される。
【０１０１】
実施例３
高圧均質化によって調製されたテトラデカフルオロ−ｎ−ヘキサン（ＴＤＦＨ）および化合物２０ａのナノ粒子エマルジョン
実験を行い、ＴＤＦＨおよび化合物２０ａのナノ粒子エマルジョンの粒径、４℃でのＴＤＦＨおよび化合物２０ａのナノ粒子エマルジョンの粒径、２３℃でのＴＤＦＨおよび化合物２０ａのナノ粒子エマルジョンの粒径の安定性、ならびにＴＤＦＨ−化合物２０ａおよび４℃で保存したＴＤＦＨ−化合物２０ａに関する経時的な粒径および９９％累積分布の変化を示す。
【０１０２】
化合物２０ａ（Ｊ．Ｔｅｃｈ  Ｓａｌｅｓ、フロリダ州ボカラトン）の６％溶液（２０ｍＬ）の調製は、前記界面活性剤の１．２ｇアリコートを添加し、注射用水（ＨｙＣｌｏｎｅからのＨｙＰｕｒｅ）でガラス製のシンチレーションバイアル中の予め測定した２０ｍＬ容量の目盛まで希釈し、小型の十字形マグネチックスターラーを用いて５℃で０．５時間撹拌することによって行った。得られた溶液は５℃で透明であり、冷蔵庫（３℃）で保存した。この溶液を異なる実験のために保存し、使用することができる。
【０１０３】
化合物２０ａの前記溶液の６．２５ｍＬの部分を、小型バレル形磁気撹拌棒を備えた１５ｍＬの血清バイアルに添加した。次いで、冷（４℃）ＴＤＦＨ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）１．５２ｍＬ（２．５３ｇ）を添加し、前記バイアルにゴム製セプタムで栓をし、氷水浴（２℃）に浸漬し、得られた混合物をこの温度で１時間撹拌した。
【０１０４】
シリンジコールドジャケットを通る循環のための冷却浴タンクと、前記圧力容器のための別個の冷却浴とを含む長方形のステンレス鋼パンを冷蔵庫から取り出し、両方を氷水で満たした。それぞれが実施例２に記載した大型の十字形マグネチックスターラーを含むより大きな容器に関する付属品を備えた１２５ｍＬの容器である、ＰＶ１、ＰＶ２およびＰＶ３に、生成物および窒素ガス用の適切なバルブ付き入口および出口を備えるそれらのキャップを付けた。ＰＶ１に１０ｍＭリン酸緩衝化（ｐＨ７）スクロース（３２％ｗｔ／ｖｏｌスクロース、１０４ｍＬ）を充填し、ＰＶ１〜ＰＶ３冷却タンクに入れ、撹拌を開始した。ＰＶ２およびＰＶ３を同様に前記タンクに入れ、撹拌を開始した。
【０１０５】
空気圧ポンプ部に取り付けたホモジナイザーから残留ＷＦＩを除き、次いで冷ＷＦＩ（２５ｍＬ）ですすいだ。ガラス製プランジャーを伴ったコールドジャケット付き１０ｍＬガラス製Ｐｏｐｐｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓシリンジをそのホモジナイザーの入口および出口のルアーロックフィッティングに取り付けた。そのホモジナイザーのバイパスバルブを開き、それらのシリンジプランジャーを交互に押すことにより、出口シリンジと入口シリンジの間で一次エマルジョンを数回移動させ、前記一次エマルジョンの最終位置は前記入口シリンジ内にあった。前記バイパスバルブを閉め、約３０ｍＬ／分のポンピング速度で空気圧部操作を開始した。前記入口シリンジの内容物を前記出口シリンジに十分に移したとき、前記バイパスバルブを急速に開き、次いで、前記出口シリンジのプランジャーを押し下げて、均質化した一次エマルジョンを前記入口シリンジに素早く戻し、その後、前記バイパスバルブを閉じ、第２の通過を開始した。このようにして、前記一次エマルジョンを、ホモジナイザーを通る２０回の別々の通過に供した。この操作の終了時には、前記一次エマルジョンは前記出口シリンジ内にあった。
【０１０６】
前記出口シリンジを前記ホモジナイザーの出口から外し、ＰＶ１に取り付け、前記一次エマルジョンを前記シリンジからＰＶ１に注入した。ＰＶ１を窒素で加圧し（約８〜１０ｐｓｉ）、混合物を約５分間撹拌した。窒素圧をＰＶ１において維持し、ＰＶ２の通気を大気に向かって行った。ＰＶ１からＰＶ２への３２％ショ糖溶液と混合した前記一次エマルジョンの撹拌溶液の移送を、前記ホモジナイザーを一回通過させて達成した。次いで、Ｐａｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３２ｍｍ  ０．８／０．２ミクロンＡｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルターをＰＶ２とＰＶ３の間に取り付けた。ＰＶ２を窒素により約１２ｐｓｉで加圧し、ＰＶ３の通気を大気に向かって行い、ＰＶ２からＰＶ３への溶液の濾過／移送を開始させた。約５分後、圧力を１５ｐｓｉまで上昇させ、約１０分後に２５ｐｓｉまで上昇させた。濾過の完了には約３０〜４０分を要し、移送はほぼ定量的であった。
【０１０７】
約４℃に冷却したＰＶ３を窒素で約８ｐｓｉまで加圧し、溶液を約１５分間撹拌した。この時間の後、灰色のブチルゴム製ノッチ付ストッパーを取り付けた４０本の２ｍＬ（公称容積）の血清バイアルを入れたＷｈｅａｔｏｎバイアルトレイを冷蔵庫から取り出した。その入口側に雄ルアーロックコネクター、その出口側にダブル雄ルアーコネクターに取り付けられる雌ルアーフィッティング、一方向活栓（閉位置にある）、そして最後に１６ゲージの針が取り付けられた１／１６インチ内径の編込みシリコンチューブをＰＶ３の浸漬管活栓に固定した。ＰＶ３中の圧力を５ｐｓｉに調整し、溶液の最初の２ｍＬを除去した。次いで、前記バイアルからノッチ付きストッパーを外し、ＰＶ３に取り付けた管材料の遠位端で前記活栓を開閉し、前記ノッチ付きストッパーを交換することにより前記バイアルに充填した（１０の群において）。１０本のバイアルに充填した後、それらを手で圧着した。ＰＶ３の溶液が消費されるまで、この手順を繰り返し、約２．６〜２．７ｍＬの充填で３４本のバイアルを得た（約８８〜９１％の生成物収率）。前記バイアルをクリンプ圧密性について検査し、必要に応じて、厳密な圧着力を確実にするために再度圧着した。安定性試験のために前記バイアルを４℃で冷蔵庫に保存した。
【表６】
2019502682.tif 000016
【０１０８】
調製直後の生成物の粒径分析は、充填バイアルの全範囲にわたって選択した５本のバイアルについてＮｉｃｏｍｐ  ３８０  ＤＬＳサブミクロン粒子サイザー（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、フロリダ州ポートリッチー）を用いて行った。
【０１０９】
ＩＷＭＤ中で測定した、ＴＤＦＨ−化合物２０ａナノエマルジョンの平均粒径は、約２１６ｎｍであり、異なる試料間であまり変化しない。さらに、ＴＤＦＨ−化合物２０ａナノエマルジョンの平均９９％累積分布は３１８ｎｍ未満である。
【表７】
2019502682.tif 000017
【０１１０】
前記ＰＳＳ  Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ  ７８０  ＳＩＳ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、フロリダ州ポートリッチー）を使用する光遮蔽によって、０．５〜５０ミクロン領域の粒度測定を行った。平均して、ＴＤＦＨ−化合物２０ナノエマルジョン全体の総体積の約０．９％は、５．０２〜５０．４５ミクロンの間の大きさの粒子を含有する。
【表８】
2019502682.tif 000018
【表９】
2019502682.tif 000019
【０１１１】
実施例４
高圧均質化により調製したＤＤＦＰおよび化合物２０ａのナノ粒子エマルジョン
実験を行い、高圧均質化により調製したＤＤＦＰ−化合物２０ａナノエマルジョンのサブミクロン粒径を研究した。ＴＤＦＨに代えてＤＤＦＰ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｄ、テキサス州ラウンドロック）を用いた以外は、実施例３の方法により前記ナノエマルジョンを調製した。サブミクロン粒度測定はＰＳＳ  Ｎｉｃｏｍｐ  ３８０  ＤＬＳサブミクロン粒度測定装置（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、フロリダ州ポートリッチー）を用いて行った。
【表１０】
2019502682.tif 000020
【０１１２】
ＤＤＦＰ−化合物２０ナノエマルジョンのサブミクロン粒径の２３６．４ｎｍの強度補正平均径および４１５．７ｎｍ未満の９９％累積分布は、ＤＤＦＰ−化合物２１、ＴＤＦＨ−化合物２１およびＴＤＦＨ−化合物２０ａのナノエマルジョンについて得られた初期値と本質的に等価である。
【０１１３】
実施例５
ボルテックスし、その後超音波処理することにより調製したＤＤＦＰおよび化合物２０ａのナノ粒子エマルジョン
実験を行い、ボルテックスし、その後超音波処理することにより調製したＤＤＦＰ−化合物２０ａナノエマルジョンのサブミクロン粒径を研究した。２６２ｍＬの総容積の円筒形ガラス瓶は、浮遊式磁気撹拌棒と、２つのガス入口と二位置ボトムエントリーボールバルブ−浸漬管の組み合わせを備えたネジ山の付いた蓋を備え、乾燥した超高純度窒素ガスでパージされた。次いで、水性（ＷＦＩ、ＨｙｃｌｏｎｅからのＨｙｐｕｒｅ）のリン酸緩衝化（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．９）スクロース溶液（３０％ｗ／ｖ）２１０ｍＬと化合物２０（Ｊ．Ｔｅｃｈ  Ｓａｌｅｓ、フロリダ州ボカラトン）溶液（０．２ミクロン濾過蒸留脱イオン水１０．６８ｍＬ中に０．６７２ｇ）を２６２ｍＬ容器中で混合し、４℃で冷却しながら撹拌した。５分間撹拌した後、前記容器を窒素で３ｐｓｉまで加圧した。前記ボールバルブの出口の１つにＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｓｉｌａｓｔｉｃ（登録商標）管材料（１／８インチ外経）を取り付け、これをルアーから１／８インチのバーブアダプターを介して３方向滅菌使い捨て活栓に接続した。残りの２つのポートには、１０ｍＬのＢｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ニュージャージー州フランクリンレイクス）の滅菌使い捨てシリンジおよび１８ゲージの１．５インチの滅菌使い捨て針を取り付けた。
【０１１４】
前記した三方活栓を配置して、７．８ｍＬの容量が前記シリンジに入るまで、前記容器から前記シリンジに溶液を吸引させた。次いで、前記活栓の位置をセットして、前記シリンジから１８ゲージの針を通って溶液を送達させた。トレイの２５本の公称５ｍＬ容量（９ｍＬの全容量）の血清バイアル（乾燥窒素ガスでパージし、ハロブチル栓を取り付け、４℃の冷蔵庫に１時間保持した）に、前記栓をわずかに持ち上げ、前記バイアルの口に針先端を配置し、前記シリンジのプランジャーを押し込み、その後前記栓を迅速に交換することによって、前記溶液の７．８ｍＬアリコートを充填した。すべてのバイアルに前記溶液を充填した後、Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ０．５ｍＬ  Ｌｏ  Ｄｏｓｅ  Ｕ−１００インスリンシリンジを用いて各バイアルに冷（約０℃）ＤＤＦＰ（０．１５６ｇ、０．０８９ｍＬ）を迅速に充填し、直ちに栓をしかつクリンプキャップをした。
【０１１５】
ナノ粒子を調製するために、バイアルを４５００ｒｐｍで１分間直立させ、１分間逆にし、そして１分間直立させてボルテックスした。次いで、前記バイアルを、ＶＷＲ  Ａｑｕａｓｏｎｉｃ  ７５ＨＴ超音波洗浄浴の中央にネック部まで入れ、５分間超音波処理を行った。第２のバイアルを同じ方法で処理し、前記ＰＳＳ  Ｎｉｃｏｍｐ  ３８０  ＤＬＳサブミクロン粒子サイザー（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、フロリダ州ポートリッチー）を用いて粒径および分布を分析した。
【表１１】
2019502682.tif 000021
【０１１６】
ＤＤＦＰ−化合物２０ａナノエマルジョンのサブミクロンの粒径の平均径２７４．５ｎｍおよび６００ｎｍ未満の９９％累積分布は、ＤＤＦＰ−化合物２１、ＴＤＦＨ−化合物２１およびＴＤＦＨ−化合物２０ａのナノエマルジョンについて得られた初期値を超えたが、依然として本明細書に記載されたナノエマルジョンについて検討された放出および保存可能期間の仕様の範囲内にある。
【０１１７】
前記製剤は酸素が豊富な領域のペルフルオロカーボンに酸素を吸収し、酸素欠損があり結果として低酸素圧を生じる組織（低酸素組織）への移送時に酸素を放出するように設計される。したがって、前記製剤が酸素に富んだ環境または酸素濃度が乳化されたペルフルオロカーボンの酸素濃度よりも高い環境に注入されるとき、前記製剤は先ずそれが存在する溶液から溶存酸素を吸収する。前記ナノエマルジョン粒子を低酸素組織、または溶存酸素濃度が前記ナノ粒子における酸素濃度よりも低い組織に移送されるとき、酸素濃度の物理的勾配に基づいて予想されるように前記ナノ粒子から酸素が放出される。この実施例の製剤が水溶液から酸素を吸収することができるかどうかを評価するために、インビトロ試験を図７に示す装置を用いて行った。撹拌棒と共に約２００ｍＬの０．９％生理食塩水を含むジャケット付きビーカーを循環水浴（温度＝３７℃±０．３℃）に接続し、撹拌プレート（速度＝５５０ＲＰＭ）上に置いた。前記ビーカーの上部を、Ｏａｋｔｏｎ  ＤＯ  １１０溶存酸素プローブ（イリノイ州ヴァーノンヒルズ）のためのアクセス穴および前記製剤の供給のためのより小さい穴を含むゴム栓を用いて覆った。温度および溶存酸素測定値が平衡化した後、５ｍＬの製剤をその小さなアクセス穴を通して０．９％生理食塩水に注入した。次いで、前記アクセス孔をルアープラグフィッティングでシールし、前記容器の上部をパラフィルムで包み、酸素が前記容器に入るのを防止した。溶存酸素測定値を３０秒間隔で９０分間取得し、溶存酸素計のシリアルポート接続およびベンダー提供のＣｙｂｅｒＣｏｍｍ  Ｐｏｒｔａｂｌｅデータ収集ソフトウェアを使用してラップトップコンピュータに自動的に転送した。測定期間にわたる酸素レベルの明らかな減少を図８にグラフ形式で示す。生理食塩水対照を用いた対応するグラフは、同じ期間にわたって溶存酸素レベルの低下を示さなかった。
【０１１８】
実施例６
ＤＤＦＰのナノエマルジョンの調製のためのＣ１６ベースのリン脂質界面活性剤系の使用
実験を行い、パルミトイルベースのリン脂質界面活性剤系で調製されたＤＤＦＰナノエマルジョンのサブミクロンの粒径を研究した。５０ｍＬビーカー中のプロピレングリコールの２２ｍＬアリコートを撹拌しながら５５℃まで加熱した。１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（３９９ｍｇ）、１，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］ナトリウム塩（３０５ｍｇ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（４５．８８ｍｇ）を撹拌しながら順次添加し、リン脂質が溶解するまで（５〜１５分間）混合物を撹拌した。次に、前記リン脂質のプロピレングリコール溶液を、約２分間かけて５５℃で一塩基性リン酸ナトリウム・Ｈ２Ｏ（１７３．９ｍｇ）と無水二塩基性リン酸ナトリウム（１３７．８７ｍｇ）を含む水／グリセロール９５／５ｖ／ｖ（２００．７ｍＬ）の撹拌混合物に滴下した。前記リン脂質のグリセロール溶液の添加後、溶液を５分間撹拌した。この溶液を直ちに３２ｍｍ  Ｐａｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧＨ  Ｐｏｌｙｐｒｏ（登録商標）０．２ミクロンフィルターを通して２５０ｍｌボトルに加圧濾過し（ｐｕｓｈ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）、次いでそのボトルを直ちに乾燥超高純度窒素でパージした。前記溶液を周囲温度まで冷却させた。次いで、公称５ｍＬの血清バイアル（実際容量９ｍＬ）にリン脂質懸濁液の７．５６ｍＬアリコートを充填し、続いてヘッドスペースを乾燥超純窒素でパージし、ハロブチルゴム栓を用いて栓をした。栓をしたバイアル（トレイ中）を４℃の冷蔵庫に入れ、それらのバイアルの内容物がその温度に平衡するまで置いた。次いで、前記トレイを取り出し、実施例５に記載したように、前記バイアルにＤＤＦＰ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｄ、テキサス州ラウンドロック）を充填し、クリンプキャップをした。前記ナノエマルジョンを、実施例５に記載したように前記バイアルをボルテックスしかつ超音波処理（異なる時間の期間）することによって調製した。超音波処理時間は２分、８分、および１６分であった。
【表１２】
2019502682.tif 000022
【０１１９】
表１２のデータによれば、１６分間の超音波処理後に得られたナノエマルジョンは、強度補正平均粒径の最適値内にあり、９９％累積分布＜値は、ペルフルオロカーボンベースの界面活性剤系を用いたＤＤＦＰナノエマルジョンの所望の値に匹敵する。
【０１２０】
実施例７
界面活性剤としてのＣ１４ベースのリン脂質系および混合成分のバイアルの超音波処理を用いたＤＤＦＰナノエマルジョンの調製
５０ｍＬビーカー中のプロピレングリコールの２２ｍＬアリコートを撹拌しながら５５℃まで加熱した。１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（６７７．９ｍｇ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］ナトリウム塩（１７４ｍｇ）および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（５０．９５ｍｇ）を撹拌しながら順次添加し、リン脂質が溶解するまで（約１５分間）混合物を撹拌した。次いで、前記リン脂質のプロピレングリコール溶液を、約２分間かけて５５℃で一塩基性リン酸ナトリウム・Ｈ２Ｏ（１７３．９ｍｇ）と無水二塩基性リン酸ナトリウム（１３７．８７ｍｇ）を含む水／グリセロール９５／５ｖ／ｖ（２００．７ｍＬ）の撹拌混合物に滴下した。前記リン脂質のグリセロール溶液の添加後、溶液を５分間撹拌した。この溶液を直ちに３２ｍｍ  Ｐａｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧＨ  Ｐｏｌｙｐｒｏ（登録商標）０．２ミクロンフィルターを通して２５０ｍＬボトルに加圧濾過し、次いでそのボトルを直ちに窒素でパージした。前記溶液を周囲温度まで冷却させた。次いで、公称５ｍＬの血清バイアル（実際容量９ｍＬ）にリン脂質懸濁液の７．５６ｍＬアリコートを充填し、続いてヘッドスペースを乾燥超純窒素でパージし、ハロブチルゴム栓を用いて栓をした。栓をしたバイアル（トレイ中）を４℃の冷蔵庫に入れ、それらのバイアルの内容物がその温度に平衡化するまで置いた。次いで、前記トレイを取り出し、実施例５に記載したように、前記バイアルにＤＤＦＰ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｄ、テキサス州ラウンドロック）を充填し、クリンプキャップをした。前記ナノエマルジョンを、実施例５に記載したようにバイアルをボルテックスしかつ超音波処理することにより調製した。
【表１３】
2019502682.tif 000023
【０１２１】
実施例５の製剤の評価について記載したように、酸素に富んだ環境から酸素を吸収するその能力について前記製剤を評価した。測定期間にわたる酸素レベルの明らかな低下を図９にグラフで示す。生理食塩水対照を用いた対応するグラフは、同じ期間にわたって溶存酸素レベルの低下を示さなかった。
【０１２２】
実施例８
界面活性剤としての化合物２０ａ（ＤｕＰｏｎｔ  ＦＳ−３１００）と組み合わせたＣ１４ベースのリン脂質系および混合成分のバイアルの超音波処理を用いたＤＤＦＰナノエマルジョンの調製
【０１２３】
製剤は１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（６７７．９ｍｇ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］ナトリウム塩（１７４ｍｇ）および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（５０．９５ｍｇ）、および正味のＤｕＰｏｎｔ  Ｃａｐｓｔｏｎｅ  ＦＳ−３１００  化合物２０ａ（１６μＬ、２３ｍｇ、０．３％ｗ／ｖ）、続いてＤＤＦＰ（０．１５３ｇ、８９μＬ、２％ｗ／ｖ）からなった。前記バイアルを直ちに１分間直立してボルテックスし、さらに１分間逆さにして行った。次いで、前記バイアルをＶＷＲ  Ａｑｕａｓｏｎｉｃ  ７５ＨＴ超音波洗浄浴中で８分間超音波処理した。これに続いて、前記エマルジョンの５．２ｍＬアリコートを前記バイアルから取り出し、０．１ｍＬアリコートを前記ＰＳＳ  Ｎｉｃｏｍｐ  ３８０  ＤＬＳサブミクロン粒子サイザーを用いた粒度測定に供し、５ｍＬアリコートを上記の酸素取り込みアッセイに用いた。超音波処理後のこの製剤の粒度測定データを表１４に示す。
【表１４】
2019502682.tif 000024
【０１２４】
測定期間にわたる酸素レベルの明確な減少を図１０にグラフ形式で示す。生理食塩水対照を用いた対応するグラフは、同じ期間にわたって溶存酸素レベルの低下を示さなかった。
【０１２５】
データの裏づけのない実施例１
界面活性剤としてのＣ１４ベースのリン脂質系および一次エマルジョンの均質化、その後の均質化移送およびサブミクロン濾過を用いたＤＤＦＰナノエマルジョンの調製
５０ｍＬビーカー中のプロピレングリコールの２２ｍＬアリコートを撹拌しながら５５℃まで加熱する。１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（６７７．９ｍｇ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］ナトリウム塩（１７４ｍｇ）および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（５０．９５ｍｇ）を撹拌しながら順次添加し、リン脂質が溶解するまで（約１５分）混合物を撹拌する。溶液を周囲温度まで冷却させ、続いて注射用水（２０ｍＬ）を添加して１０℃まで冷却し、冷ＤＤＦＰ（４．５１ｇ、２．６１ｍＬ）を添加し、１０℃で３０分間急速に撹拌する。得られた材料を、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓのハンドヘルドホモジナイザーを用いて５℃で合計２０回通過させて不連続均質化に供する。次いで、この材料を注射用水中のグリセロールの溶液に添加する。次いで、ナノエマルジョンを２０５．４ｍＬの３０％スクロースの撹拌溶液に添加し、窒素雰囲気（５ｐｓｉ）下で１０分間撹拌する。この後、溶液を前記ホモジナイザーを介して２〜５℃に保持した第２の容器に移した後、それを１５分間撹拌し、Ｐａｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ０．８／０．２ミクロンＡｃｒｏｐａｋ  ２００フィルターを通して２〜５℃で第３の容器に濾過して移送後、その温度で１５分間撹拌する。次に前記材料を公称５ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアルに充填し、灰色のハロブチルゴム栓を用いて栓をしかつクリンプキャップをして保存する。
【０１２６】
データの裏づけのない実施例２
界面活性剤としてＣ１４ベースのリン脂質系を用いたＴＤＦＨナノエマルジョンの生成
５０ｍＬビーカー中のプロピレングリコールの２２ｍＬアリコートを撹拌しながら５５℃まで加熱する。実施例１のリン脂質を撹拌しながら添加し、リン脂質が溶解するまで（約１５分間）混合物を撹拌する。次いで、前記リン脂質のプロピレングリコール溶液を、約２分間かけて５５℃で一塩基性リン酸ナトリウム・Ｈ２Ｏ（１７３．９ｍｇ）と無水二塩基性リン酸ナトリウム（１３７．８７ｍｇ）を含む水／グリセロール９５／５ｖ／ｖ（２００．７ｍＬ）の撹拌混合物に滴下する。前記リン脂質のグリセロール溶液の添加後、溶液を５分間撹拌する。この溶液を直ちに３２ｍｍ  Ｐａｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧＨ  Ｐｏｌｙｐｒｏ（登録商標）０．２ミクロンフィルターを通して２５０ｍＬボトルに加圧濾過し、次いで直ちに窒素でパージする。前記溶液を周囲温度まで冷却させる。次いで、公称５ｍＬの血清バイアル（実際容量９ｍＬ）にリン脂質懸濁液の７．５６ｍＬアリコートを充填し、続いてヘッドスペースを乾燥超純窒素でパージし、ハロブチルゴム栓を用いて栓をする。栓をしたバイアル（トレイ中）を４℃の冷蔵庫に入れ、前記バイアルの内容物がその温度に平衡化するまで置く。次いで、前記トレイを取り出し、実施例５に記載したように、前記バイアルにＴＤＦＨ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）を充填し、クリンプキャップをする。前記ナノエマルジョンは、実施例５に記載したようにバイアルをボルテックスしかつ超音波処理することによって調製する。
【０１２７】
データの裏づけのない実施例３
補助界面活性剤としての化合物２０ａを有するＣ１４ベースのリン脂質系および混合成分のバイアルの超音波処理を用いたＤＤＦＰナノエマルジョンの調製
界面活性剤系がＣ１４−リン脂質ベース系に加えて３０モル％の化合物２０ａを含むことを除いて、実施例６の方法に従う。次いで、ナノエマルジョンを同様に調製する。ラウロイル（Ｃ１２）ベースのリン脂質界面活性剤系に基づくナノエマルジョンの調製には、実施例１〜６および理論実験例１および２の類似の手順および技術を用いることができる。
【０１２８】
本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、それらの実施形態に対する修正および適合が行われ得ることは当業者にとって明らかである。
【０１２９】
データの裏づけのない実施例４
界面活性剤としてのＣ１２ベースのリン脂質系および一次エマルジョンの均質化、その後の均質化移送およびサブミクロン濾過を用いたＤＤＦＰナノエマルジョンの調製
５０ｍＬビーカー中のプロピレングリコールの２２ｍＬアリコートを撹拌しながら５５℃まで加熱する。１，２−ジドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（６７７．９ｍｇ）、１，２−ジドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］ナトリウム塩（１７４ｍｇ）および１，２−ジドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（５０．９５ｍｇ）を撹拌しながら順次添加し、リン脂質が溶解するまで（約１５分間）混合物を撹拌する。溶液を周囲温度まで冷却させ、続いて注射用水（２０ｍＬ）を添加して１０℃まで冷却し、冷ＤＤＦＰ（４．５１ｇ、２．６１ｍＬ）を添加し、１０℃で３０分間急速に撹拌する。得られた材料を、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓのハンドヘルドホモジナイザーを用いて５℃で合計２０回通過させて不連続均質化に供する。次いで、この材料を注射用水中のグリセロールの溶液に添加する。次いで、ナノエマルジョンを２０５．４ｍＬの３０％スクロースの撹拌溶液に添加し、窒素雰囲気（５ｐｓｉ）下で１０分間撹拌する。この後、溶液を前記ホモジナイザーを介して２〜５℃に保持した第２の容器に移した後、それを１５分間撹拌し、Ｐａｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ０．８／０．２ミクロンＡｃｒｏｐａｋ  ２００フィルターを通して２〜５℃で第３の容器に濾過して移送後、その温度で１５分間撹拌する。次に前記材料を公称５ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアルに充填し、灰色のハロブチルゴム栓を用いて栓をしかつクリンプキャップをして保存する。
【０１３０】
本出願人の開示は、図面を参照して好ましい実施形態において本明細書に記載され、図中、同様の番号は同じまたは類似の要素を表す。本明細書を通じて、「一実施形態」、「実施形態」、または同様の言語に関する参照は、前記実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じての表現「一実施形態では」、「実施形態では」、および類似の言語が出てくれば、必ずしもそうではないが、すべて同じ実施形態を指す。
【０１３１】
本出願人の開示の記載された特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。本明細書の説明では、本発明の実施形態の完全な理解をもたらすために多数の特定の詳細が列挙される。しかしながら、当業者は、特定の詳細の１つ以上を用いずに、または他の方法、構成要素、材料などを用いて、本出願人の組成物および／または方法を実施できることを認識するであろう。他の例では、周知の構造、材料、または操作は、本開示の態様を不明瞭にすることを避けるために、詳細には示されていないかまたは記載されていない。
【０１３２】
含まれる概略フローチャート図は、一般的に、論理フローチャート図（例えば、図１、２、３、４および５）として示される。このように、示された順序およびラベル付けしたステップは、提示された方法の一実施形態を示す。例示された方法の１つまたは複数のステップまたはその一部に対する機能、ロジック、または効果が等価な他のステップおよび方法も考えられる。さらに、使用するフォーマットおよび記号は、前記方法の論理的ステップを説明するために提供され、前記方法の範囲を限定するものではないことが理解される。フローチャート図には、様々な矢印の種類および線種を採用することができるが、対応する方法（例えば、図１、２、３、４および５）の範囲を限定するものではないことが理解される。実際、いくつかの矢印または他のコネクタを使用して、前記方法の論理的な流れのみを示すことができる。例えば、矢印は、図示された方法の列挙されたステップの間の、指定されていない持続時間の待機期間または監視期間を示すことができる。さらに、特定の方法が生じる順序は、示されている対応するステップの順序に厳密に従うこともあれば、そうでないこともある。
【０１３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の参照を含む。
【０１３４】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料も、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで記載する。本明細書で列挙する方法は、開示された特定の順序に加えて、論理的に可能な任意の順序で実施することができる。
【０１３５】
参照による援用
特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文献への参照および引用は、本開示においてなされている。すべてのそのような文献は、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。本明細書において参照により援用されると言われているが、本明細書に明示的に記載された既存の定義、言及または他の開示材料と矛盾する任意の材料またはその一部分は、援用された材料と本発明の開示材料の間で矛盾が生じない範囲のみ援用される。矛盾が生じた場合、その矛盾は本開示を好ましい開示として支持して解決されるべきである。
【０１３６】
均等物
代表的な実施例は、本発明の説明を補助することを意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、またそのように解釈されるべきものでもない。実際に、本明細書に示され説明されたものに加えて、本発明の様々な変更および多くのそれらのさらなる実施形態は、本明細書に含まれる実施例ならびに科学的文献および特許文献への参照を含む、本明細書の全内容から当業者に明らかになるであろう。前記実施例は、その様々な実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合させることができる重要な追加情報、例示および指針を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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