(57)【要約】  対象の筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させる際に、並びに／又は対象の筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制する際に、使用するための、Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させる際に、並びに／又は対象の筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制する際に、使用するための、Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体。
【請求項２】
前記ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体が、筋肉量を維持又は増加させる、請求項１に記載の使用のためのＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体。
【請求項３】
対象におけるサルコペニア、フレイル、及び／又は筋損傷を治療又は予防する際に使用するためのＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体。
【請求項４】
前記対象が、高齢対象である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体。
【請求項５】
前記対象が、外科的介入及び／若しくは外傷によって、及び／又は薬物若しくは毒素への化学的曝露の副作用として、筋損傷を受けた、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体。
【請求項６】
前記対象が、計画された外科的介入を受けなければならない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体。
【請求項７】
前記ＷＩＳＰ１断片又は変異体が、
（ａ）ＶＷＣ、ＴＳＰ１、及びＣＴドメインを欠き、
（ｂ）ＩＧＦＢ及びＶＷＣドメインを欠き、又は
（ｃ）ＣＴドメインからなる、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のためのＷＩＳＰ１断片又は変異体。
【請求項８】
前記ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体が、配列番号１、３、５、７、又は９と、好ましくは配列番号１、５、７、又は９と、より好ましくは配列番号１と、少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のためのＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体。
【請求項９】
筋幹細胞及び／又は前駆細胞の増殖を増加させるためのＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体の使用。
【請求項１０】
Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象において筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させ、かつ／又は対象において筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制する方法。
【請求項１１】
Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体を、それを必要とする対象に投与することを含む、サルコペニア、フレイル、及び／又は筋損傷を治療若しくは予防する方法。
【請求項１２】
対象におけるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）レベルを増加させることができる作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）細胞集団を、候補となる作用物質と接触させるステップと、
（ｂ）前記細胞集団におけるＷＩＳＰ１のレベルを測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定されたＷＩＳＰ１のレベルを、前記候補となる作用物質と接触していない細胞の対照集団におけるＷＩＳＰ１レベルと比較するステップと、を含む、方法。
【請求項１３】
好ましくは前記作用物質が請求項１２の方法によって同定され、及び／又は好ましくは前記作用物質が栄養補助食品である、対象においてＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）レベルを増加させるための作用物質。
【請求項１４】
（ａ）対象における筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させる際に、
（ｂ）対象における筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制する際に、並びに／又は
（ｃ）対象におけるサルコペニア、フレイル、及び／若しくは筋損傷を治療若しくは予防する際に、使用するための、請求項１３の作用物質。
【請求項１５】
サルコペニア又はフレイルを診断する方法であって、
（ａ）対象から分離された生体試料を準備するステップと、
（ｂ）前記生体試料におけるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）のレベルを測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定されたＷＩＳＰ１のレベルを、１つ以上の対照試料から測定されたＷＩＳＰ１レベル又は基準レベルと比較するステップと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば筋損傷を患う高齢対象及び／又は対象において、筋再生を改善して、筋機能及び／又は筋肉量の維持又は増加を促進するための、Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）の使用に関する。特に、本発明は、サルコペニア若しくは身体的フレイルを治療するための、及び／又は筋損傷を治療するための、ＷＩＳＰ１の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢と関係のある筋機能の低下及び筋肉量の減少は、全ての個体において必ず生じるものの、その進行は、様々な遺伝的要因並びに環境的要因、例えば身体活動及び栄養摂取によって異なる。
【０００３】
一部の対象では、老化が筋肉に影響して、サルコペニア及びフレイルを含む特有の状態である病的状態へと進行する場合もある。サルコペニアとは、加齢による筋機能の低下及び筋肉量の減少が生じ、衰弱をきたしてクオリティ・オブ・ライフに影響を及ぼすようになった時点で生じるものと定義される（Ｓａｙｅｒ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｇｅ  Ａｇｅｉｎｇ  ４２：１４５〜１５０）。対照的に、フレイルは、加齢による筋機能不全という分類であり、筋肉量ではなく、筋力及び筋機能に基づくものである（Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ｄｉｒ．Ａｓｓｏｃ．１４：３９２〜３９７）。
【０００４】
サルコペニア及びフレイルは、神経筋伝達障害、興奮／収縮連関の変化、幹細胞枯渇に関連した再生能の低下、筋線維におけるミトコンドリア代謝及びエネルギー代謝の不全、並びに骨格筋の大理石様脂肪化及び線維化等の病態生理学的変化に関連する多因性の症候群である（Ａｌｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  ６０：２９４〜３０５）。従って、これらの症候群の病因は、複雑であり、また十分に解明されていないが、身体活動が低いこと、タンパク質同化ホルモン（例えばアンドロゲン及びＩＧＦ−１）のホルモン減少及び栄養不良及び／又は栄養失調が重要な役割を果たしている（Ｍｉｔｈａｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．２４：１５５５〜１５６６）。
【０００５】
サルコペニアは、加齢による身体活動の減少と、長寿命化とが特に顕著となっている先進国において主要な健康問題になりつつある。重症の症例では、サルコペニアは、自立して生活する能力を低下させる場合もある。更に、サルコペニアは、集団に基づく研究において広範な身体障害の予測因子であり、平衡障害、歩行速度、転倒及び骨折の発生率の増大と関連がある。
【０００６】
身体活動が減少するとサルコペニアの可能性が増大すると考えられるため、運動量を増やすことが係る状態に抵抗するのに有効であろう。実際に、レジスタンス運動は、骨格筋におけるタンパク質合成の増加と関係がある。しかしながら、治療としての運動は、多くの場合、患者のコンプライアンスがよくない。
【０００７】
現在、サルコペニアの治療用に認可されている薬理作用物質はない。これに関連して数多くの成長ホルモンが試験されているものの、それらのホルモンが示した効果は微々たるものであった。その上、タンパク同化ステロイドは筋肉量及び筋力を増大可能であるものの、前立腺がんのリスク増大などの数多くの副作用を伴う。
【０００８】
同様に、筋機能及び質量に関する負の影響は、例えば外傷後又は医学的介入（例えば手術）後の筋損傷の結果としても起こり得る。係る事象の影響は、損傷後に、より困難及び／又はより長いリハビリを経験し得る高齢対象においては、より深刻な場合がある。
【０００９】
理学療法は筋損傷後のリハビリを補助することができるが、これは、患者コンプライアンスが悪いという欠点も有する。更に、理学療法の容易性及び有効性を高めるために理学療法アプローチを補完する更なる方法が必要な場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、例えば高齢対象において、筋機能及び／又は筋肉量の維持又は増加を促進するために筋再生を改善する方法が依然として大いに必要とされている。特に、サルコペニア及びフレイルを治療する方法、及び／又は筋損傷を治療する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、筋再生時に強く発現されるタンパク質としてＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）を同定した。更に、本発明者らは、ＷＩＳＰ１レベルが経時的に対象において減少することを発見した。
【００１２】
本発明者らは、筋損傷時にいくつかの筋肉常在細胞タイプによってＷＩＳＰ１は発現されるが、大部分は線維／脂肪前駆細胞（ＦＡＰ）によって発現され、そのＷＩＳＰ−１の発現も加齢と共に著しく低下していく、ことを実証した。更に、本発明者らの結果は、ＷＩＳＰ１レベルが高齢の非損傷筋及びサルコペニアのラットの血清において著しく下方制御されることを示しているため、加齢による筋機能全般の劣化におけるＷＩＳＰ１の役割も示唆している。
【００１３】
ＷＩＳＰ１を適用することにより、本発明者らは、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、老齢の衛星細胞（筋幹細胞）の接着不良及び増殖特性を改善し、並びに若齢の衛星細胞の機能を向上させることができた。再生中の老齢対象のＷＩＳＰ１治療により、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、前駆細胞マーカーの活性化が増加し、損傷数日後に再生繊維がより速く回復した。従って、理論に拘束されることを望まないが、ＷＩＳＰ１は、筋幹細胞機能を促進することによって筋再生を増加させるようである。
【００１４】
要約すると、本発明者らは、ＷＩＳＰ１レベルの増加は、特に高齢対象における筋機能及び筋肉量の減少の治療に臨床的に適用可能であることを予想外に見出した。
【００１５】
従って、一態様において、本発明は、対象の筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させる際に、並びに／又は対象の筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制する際に、使用するための、Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体を提供する。一態様では、当該使用は非治療的である。
【００１６】
別の態様では、本発明は、Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象において筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させ、かつ／又は対象において筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制する方法を提供する。
【００１７】
一実施形態では、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は筋肉量を維持又は増加させる。
【００１８】
別の実施形態では、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、筋肉量の減少を実質的に予防又は抑制する。筋肉量の予防又は抑制は、本発明のＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体の非存在下で予想される筋肉量の減少と比較することができる。
【００１９】
別の態様では、本発明は、対象におけるサルコペニア、フレイル、及び／又は筋損傷を治療又は予防する際に使用するためのＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体を、それを必要とする対象に投与することを含む、サルコペニア、フレイル、及び／又は筋損傷を治療若しくは予防する方法を提供する。
【００２１】
一実施形態では、筋肉は骨格筋である。
【００２２】
一実施形態では、対象は高齢対象である。
【００２３】
高齢対象は、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００歳を超えるヒト対象であることができる。
【００２４】
一実施形態では、対象は、外科的介入及び／又は外傷によって、筋損傷を受けている。
【００２５】
別の実施形態では、対象は、計画された外科的介入を受けなければならない。
【００２６】
一実施形態では、このＷＩＳＰ１断片又は変異体は、
（ａ）ＶＷＣ、ＴＳＰ１、及びＣＴドメインを欠き、
（ｂ）ＩＧＦＢ及びＶＷＣドメインを欠き、又は
（ｃ）ＣＴドメインからなる。
【００２７】
一実施形態では、ＷＩＳＰ１断片又は変異体は、ＶＷＣ、ＴＳＰ１、及びＣＴドメインを欠いている。別の実施形態では、ＷＩＳＰ１断片又は変異体は、ＩＧＦＢ及びＶＷＣドメインを欠いている。別の実施形態では、ＷＩＳＰ１断片又は変異体は、ＣＴドメインからなる。
【００２８】
一実施形態では、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、配列番号１、３、５、７、又は９と、好ましくは配列番号１、５、７、又は９と、より好ましくは配列番号１と、少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２９】
好ましくは、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、対象の筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させること、並びに／又は対象の筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制すること、を提供する。好ましくは、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、配列番号１で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００３０】
別の実施形態では、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、配列番号１、３、５、７、又は９と、好ましくは配列番号１、５、７、又は９と、より好ましくは配列番号１と、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、対象の筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させること、並びに／又は対象の筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制すること、を提供する。好ましくは、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、配列番号１で表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
【００３１】
好ましくは、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、配列番号１のタンパク質と比較して、
（ａ）対象における筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させること、
（ｂ）対象における筋萎縮を予防若しくは抑制すること、並びに／又は
（ｃ）対象におけるサルコペニア、フレイル、及び／若しくは筋損傷を治療若しくは予防すること、に関して同様な効果又は増加効果を提供する。
【００３２】
本明細書で開示されるＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、例えば全身的又は局所的に投与することができる。一実施形態では、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、例えば皮下、静脈内、又は筋肉内注射によって、非経口的に投与される。
【００３３】
一実施形態では、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、ウイルスベクター、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルスベクター）を用いて投与される。
【００３４】
別の態様では、本発明は、
（ａ）対象における筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させること、
（ｂ）対象における筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制すること、並びに／又は
（ｃ）対象におけるサルコペニア、フレイル、及び／若しくは筋損傷を治療若しくは予防すること、のための医薬品を製造するための、本明細書で開示されるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体の使用を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、
（ａ）対象における筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させること、
（ｂ）対象における筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制すること、並びに／又は
（ｃ）対象におけるサルコペニア、フレイル、及び／若しくは筋損傷を治療若しくは予防すること、のための本明細書で開示されるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体の使用を提供する。
【００３６】
一実施形態では、本明細書で開示される医薬品又はＷＩＳＰ１は、筋肉量を維持又は増加させる。
【００３７】
別の実施形態では、本明細書で開示される医薬品又はＷＩＳＰ１は、筋肉量の減少を実質的に予防又は抑制する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、その筋幹細胞及び／又は前駆細胞の増殖（例えば衛星細胞（ＳＡＴ）及び／又は線維／脂肪前駆細胞（ＦＡＰ）増殖）を増加させるための本明細書で開示されるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体の使用を提供する。筋幹細胞及び／又は前駆細胞の増殖は、本明細書中に開示されるＷＩＳＰ１又はその断片又は変異体の存在下で、それが存在していない場合に比べて、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、又は１００％を超えることができる。係る細胞増殖は、当該分野で知られている任意の適切な手段を使用して測定することができる。
【００３９】
その使用は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで使用、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することができる。
【００４０】
ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞療法プロトコールにおいて使用することができる。一態様では、本発明は、
（ａ）対象における筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させる際に、
（ｂ）対象における筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制する際に、並びに／又は
（ｃ）対象におけるサルコペニア、フレイル、及び／若しくは筋損傷を治療若しくは予防する
際に、使用するための細胞集団を提供し、
その細胞集団は、本明細書で開示されるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体の存在下、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養される。その細胞集団は、例えば、筋細胞の集団、特に筋幹細胞及び／又は前駆細胞（例えば衛星細胞（ＳＡＴ）及び／又は線維／脂肪前駆細胞（ＦＡＰ））の集団であり得る。細胞集団は、ＷＩＳＰ１の存在下で対象に投与することができる。
【００４１】
別の態様では、本発明は、対象におけるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）レベルを増加させることができる作用物質をスクリーニングする方法を提供し、その方法は、
（ａ）細胞集団を、候補となる作用物質と接触させるステップと、
（ｂ）細胞集団におけるＷＩＳＰ１のレベルを測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定されたＷＩＳＰ１のレベルを、候補となる作用物質と接触していない細胞の対照集団におけるＷＩＳＰ１レベルと比較するステップと、を含む。
【００４２】
別の態様では、本発明は、対象における筋機能及び／又は筋肉量を維持又は増加させることができ、対象における筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制することができ、及び／又は対象におけるサルコペニア、フレイル及び／若しくは筋損傷を治療若しくは予防することができる、作用物質をスクリーニングする方法を提供し、その方法は、
（ａ）細胞集団を、候補となる作用物質と接触させるステップと、
（ｂ）細胞集団におけるＷＩＳＰ１のレベルを測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定されたＷＩＳＰ１のレベルを、候補となる作用物質と接触していない細胞の対照集団におけるＷＩＳＰ１レベルと比較するステップと、を含む。
【００４３】
候補となる作用物質は、例えば、医薬品又は栄養補助食品であり得る。好ましくは、候補となる作用物質は栄養補助食品である。
【００４４】
一実施形態では、候補となる作用物質は、候補となる作用物質のライブラリ中に含まれる。
【００４５】
別の態様では、本発明は、対象においてＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）レベルを増加させるための作用物質を提供し、好ましくは、その作用物質は、本明細書で開示されるスクリーニング方法によって同定される。
【００４６】
好ましくは、作用物質は栄養補助食品である。
【００４７】
別の態様では、本発明は、
（ａ）対象における筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させる際に、
（ｂ）対象における筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制する際に、並びに／又は
（ｃ）対象におけるサルコペニア、フレイル、及び／若しくは筋損傷を治療若しくは予防する際に、使用するために本発明の作用物質を提供する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、サルコペニア又はフレイルを診断する方法を提供し、その方法は、
（ａ）対象から分離された生体試料を準備するステップと、
（ｂ）生体試料におけるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）のレベルを測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定されたＷＩＳＰ１のレベルを、１つ以上の対照試料から測定されたＷＩＳＰ１レベル又は基準レベルと比較するステップと、を含む。
【００４９】
別の態様では、本発明は、対象における筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させ、かつ／又は対象における筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制する方法を提供し、その方法は、サルコペニアを有するか若しくはサルコペニアを発症する危険性があると診断されたか、又はフレイルであるか若しくはフレイルになる危険性があると診断された対象に対して、本明細書で開示される方法を使用して、本明細書で開示されるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体を投与することを含む。
【００５０】
別の態様では、本発明は、サルコペニア、フレイル、及び／若しくは筋損傷を治療若しくは予防する方法を提供し、その方法は、サルコペニアを有するか若しくはサルコペニアを発症する危険性があると診断されたか、又はフレイルであるか若しくはフレイルになる危険性があると診断された対象に対して、本明細書で開示される方法を使用して、本明細書で開示されるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体を投与することを含む。
【００５１】
別の態様では、本発明は、対象の筋機能及び／若しくは筋肉量を維持若しくは増加させる際に、並びに／又は対象の筋萎縮を実質的に予防若しくは抑制する際に、使用するための、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体を含むダイエット製品を提供する。
【００５２】
別の態様では、本発明は、対象におけるサルコペニア、フレイル、及び／又は筋損傷を治療又は予防する際に使用するための本明細書に記載のダイエット製品を提供する。
【００５３】
好ましくは、本発明のダイエット製品は、本明細書で開示される方法を使用して、サルコペニアを有するか若しくはサルコペニアを発症する危険性があると診断されたか、又はフレイルであるか若しくはフレイルになる危険性があると診断された対象において使用するためのものである。
【００５４】
別の態様では、本発明は、好ましくは、単独で、又は本明細書で開示されるＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体と一緒に、例えば全身的又は局所的に投与される内因性ＷＩＳＰ−１のモジュレーターを提供する。
【００５５】
一実施形態では、内因性ＷＩＳＰ−１のモジュレーターは、例えば皮下、静脈内、又は筋肉内注射によって、ＷＩＳＰ１又は断片若しくは変異体と一緒に、非経口的に投与される。
【００５６】
別の態様では、Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）又はその断片若しくは変異体、作用物質、又は本発明のダイエット製品は、運動療法と組み合わせて使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１ａ】ＷＩＳＰ１は加齢と共に示差的に発現される。（ａ）新たに分離された細胞におけるＷＩＳＰ１発現をｑＰＣＲによって評価した。衛星細胞（ＳＡＴｓ；ＣＤ３１−／ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ４５−／Ｓｃａ１−／ＣＤ３４＋／インテグリンα７＋）；線維／脂肪前駆細胞（ＦＡＰｓ；ＣＤ３１−／ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ４５−／Ｓｃａ１＋／ＣＤ３４＋／ＰＤＧＦＲα＋）；系譜細胞（Ｌｉｎ＋；ＣＤ３１＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ４５＋）；及びＰＤＧＦＲα−細胞（ＣＤ３１−／ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ４５−／Ｓｃａ１＋／ＣＤ３４＋／ＰＤＧＦＲα−）を、若齢（Ｙ）及び老齢（Ｏ）マウスから、無傷の筋肉（静止細胞；Ｑ）又は筋損傷３日後（活性化細胞；Ａ）の筋肉のいずれかから分離した。データはＹＱ  ＳＡＴｓに正規化した；＊：ｐ値ｖ．若齢静止各細胞型＜０．０５；＊＊：ｐ値ｖ．若齢静止各細胞型＜０．０１；＊＊＊：ｐ値ｖ．若齢静止各細胞型＜０．００１；＃＃＃：ｐ値老齢ｖ．若齢活性化各細胞型＜０．００１，ｎ＞４。
【図１ｂ】ＷＩＳＰ１は加齢と共に示差的に発現される。（ｂ）左のグラフ−ｑＰＣＲによって評価された全再生筋におけるＷＩＳＰ１発現。若齢及び老齢の筋肉を損傷させ、損傷３日後、７日後、及び１４日後（ｄｐｉ）に、生体分子分析のために筋肉を採取した。データは若齢非損傷筋（対照）に正規化した。＊：ｐ値ｖ．若齢対照＜０．０５＊＊：ｐ値ｖ．若齢対照＜０．０１＊＊＊：ｐ値ｖ．若齢対照＜０．００１＃＃＃：各時点におけるｐ値老齢ｖ．若齢＜０．００１，ｎ＝８。右のグラフ−非損傷筋における発現値をハイライトしている。＃＃：ｐ値老齢ｖ．若齢＜０．０１，ｎ＝８。
【図１ｃ】ＷＩＳＰ１は加齢と共に示差的に発現される。（ｃ）ＳＯＭＡＬＯＧＩＣＳによって測定された再生筋におけるＷＩＳＰ１タンパク質レベル。若齢及び老齢の筋肉を損傷させ、損傷３日後、７日後、及び１４日後（ｄｐｉ）に、生体分子分析のために筋肉を採取した。＊：ｐ値ｖ．若齢対照＜０．０５＊＊：ｐ値ｖ．若齢対照＜０．０１＊＊＊：ｐ値ｖ．若齢対照＜０．００１＃＃：各時点におけるｐ値老齢ｖ．若齢＜０．０１，ｎ＝８。
【図１ｄ】ＷＩＳＰ１は加齢と共に示差的に発現される。（ｄ）ＳＯＭＡＬＯＧＩＣＳによって測定されたラット血清におけるＷＩＳＰ１タンパク質レベル。＊＊：ｐ値ｖｓ．８ヶ月齢ラット＜０．０１、＊＊＊：ｐ値ｖｓ．８ヶ月齢ラット＜０．００１，ｎ＞９。
【図２】ＷＩＳＰ１は筋幹細胞機能を調節する。（ａ）ｍｒＷＩＳＰ１処理時の衛星細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの接着。新たに分離された若齢（上のグラフ）及び老齢（下のグラフ）の衛星細胞を、ＰＢＳ，１μｇ／ｍＬのｍｒＷＩＳＰ１、又は８μｇ／ｍＬのｍｒＷＩＳＰ１のいずれかを含有する培地において、０．２％コラーゲンをコーティングしたプレート上に播種し、固定し、そして播種３６時間後にカウントして接着を評価した。（ｂ、ｃ）ｍｒＷＩＳＰ１処理におけるｅｘ  ｖｉｖｏでの衛星細胞の増殖。新たに分離された若齢（上のグラフ）及び老齢（下のグラフ）の衛星細胞を、ＰＢＳ，１μｇ／ｍＬのｍｒＷＩＳＰ１、又は８μｇ／ｍＬのｍｒＷＩＳＰ１のいずれかを含有する培地において、０．２％コラーゲンをコーティングしたプレート上に播種し、又は３日間増殖させた。１０μＭのＥｄＵパルスを３時間投与した増殖中の細胞を、固定し、細胞の総数（ｂ）又はＥｄＵ＋細胞の割合（ｃ）に基づいて増殖を評価した。データは非処理細胞に正規化した。＊：ｐ値ｖｓ．ＰＢＳ＜０．０５、＊＊：ｐ値ｖｓ．ＰＢＳ＜０．０１、＊＊＊：ｐ値ｖｓ．ＰＢＳ＜０．００１、ｎ＞１６技術的複製。（ｄ）ｍｒＷＩＳＰ１処理におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＳＭＭの増殖。ＨＳＭＭを３日間増殖させ、１０μＭのＥｄＵパルスを３時間投与し、固定し、ＥｄＵを染色した。データは非処理細胞に正規化した。＊：ｐ値ｖｓ．ＰＢＳ＜０．０５、＊＊：ｐ値ｖｓ．ＰＢＳ＜０．０１、＊＊＊：ｐ値ｖｓ．ＰＢＳ＜０．００１、ｎ＞１６技術的複製。（ｅ）ｍｒＷＩＳＰ１処理における若齢衛星細胞の分化。ＳＡＴを増殖培地中で増殖させ、ＷＩＳＰ１を含有する分化培地中で２日間分化誘導させた。データは、非処理細胞に正規化した。ｎ．ｓ：ｐ値ｖｓ．ＰＢＳ＞０．０５、＊＊：ｎ＞１６技術的複製、ｎ＝３独立した生物学的複製による独立した実験。
【図３】ＷＩＳＰ１によるｉｎ  ｖｉｖｏ処理は、生体分子レベルでの老齢マウスの筋再生を改善する。全再生筋における異なる筋原性マーカー（Ｐａｘ７、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、及びＭｙｈ３）のｑＰＣＲ。老齢（Ｏ）の筋肉を損傷させ、損傷３日後、７日後、及び１４日後（ｄｐｉ）に、生体分子分析のために筋肉を採取した。マウスを、ＰＢＳ又は１ｍｇ／ｋｇ／日のｍｒＷＩＳＰ１で毎日処理した。データは、対側非損傷前脛骨筋（ＴＡ  ｃｌ）における遺伝子発現に正規化した。＊：ｐ値ｖ．ＴＡ  ｃｌ＜０．０５；＊＊：ｐ値ｖ．ＴＡ  ｃｌ＜０．０１；＊＊＊：ｐ値ｖ．ＴＡ  ｃｌ＜０．００１；＃：ｐ値ＷＩＳＰ１  ｖ．ＰＢＳ処理マウス＜０．０５；＃＃：ｐ値ＷＩＳＰ１  ｖ．ＰＢＳ処理マウス＜０．０１；＃＃＃：ｐ値ＷＩＳＰ１  ｖ．ＰＢＳ処理マウス＜０．００１，ｎ＞６。
【図４】ＷＩＳＰ１のｉｎ  ｖｉｖｏ処理は、全再生筋におけるＦＡＰｓ活性マーカー（ＰＤＧＦＲａ、フィブロネクチン（ＦＮ）、及びＷＩＳＰ１）のＦＡＰｓ  ｑＰＣＲと相関があるマーカーの発現を増強する。老齢（Ｏ）の筋肉を損傷させ、損傷３日後、７日後、及び１４日後（ｄｐｉ）に、生体分子分析のために筋肉を採取した。マウスを、ＰＢＳ又は１ｍｇ／ｋｇ／日のｍｒＷＩＳＰ１で毎日処理した。データは、対側非損傷前脛骨筋（ＴＡ  ｃｌ）における遺伝子発現に正規化した。＊：ｐ値ｖ．ＴＡ  ｃｌ＜０．０５＊＊：ｐ値ｖ．ＴＡ  ｃｌ＜０．０１＊＊＊：ｐ値ｖ．ＴＡ  ｃｌ＜０．００１＃：ｐ値ＷＩＳＰ１  ｖ．ＰＢＳ処理マウス＜０．０５；＃＃：ｐ値ＷＩＳＰ１  ｖ．ＰＢＳ処理マウス＜０．０１；＃＃＃：ｐ値ＷＩＳＰ１  ｖ．ＰＢＳ処理マウス＜０．００１，ｎ＞６。
【図５】ＷＩＳＰ１によるｉｎ  ｖｉｖｏ処理は、組織学的レベルでの筋再生をレスキューする。筋肉切片を、新たに形成された繊維のマーカーである胚性ミオシン重鎖（ｅＭＨＣ）で染色し、ｅＭＨＣ＋繊維で覆われた領域を定量した。若齢（Ｙ）及び老齢（Ｏ）の筋肉を損傷させた後、７日後、及び１４日後（ｄｐｉ）に、組織学的分析のために筋肉を採取した。マウスを、ＰＢＳ又は１ｍｇ／ｋｇ／日のｍｒＷＩＳＰ１で毎日処理した。＃：ｐ値ＷＩＳＰ１  ｖ．ＰＢＳ処理マウス＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例によって記述する。
【００５９】
本発明の実施は、特に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、微生物学、及び免疫学の従来技術を使用する。係る技術は文献で説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３  ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｒｏｅ，Ｂ．，Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｈｎ，Ａ．（１９９６）ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  ＭｃＧｅｅ，Ｊ．Ｏ’Ｄ．（１９９０）Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、並びに、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．及びＤａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。これらの一般的なテキストの各々は、本明細書に参照により組み込まれる。
【００６０】
Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）
【００６１】
Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）は、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）としても知られている、分泌された細胞外マトリックス関連タンパク質である。
【００６２】
ＷＩＳＰ１は、６つのＣＣＮファミリーマトリックス細胞タンパク質の４番目のメンバーである。ＣＣＮタンパク質は、４つの保存された機能ドメインを含有し、これらは、独立かつ協調的に作用して一連の細胞機能に寄与すると考えられる（Ｈａｌｌ−Ｇｌｅｎｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６８：３２０９〜１７）。４つの機能ドメインは、ＣＣＮタンパク質を、多くのシグナル伝達分子及び細胞外マトリックスタンパク質へ結合させることができ、従って複数の細胞シグナル伝達経路を潜在的に誘導する。
【００６３】
ＷＩＳＰ１は、様々な生物学的プロセス、例えば神経発達、神経発生、幹細胞、生存、及び血管新生を調節することが示されている（Ｍａｉｅｓｅ，Ｋ．（２０１４）Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．１１：３７８〜８９）。ＷＩＳＰ１の腫瘍形成の役割は、乳癌では実証されており（Ｃｈｉａｎｇ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：８６８６；Ｋｌｉｎｋｅ，Ｄ．Ｊ．（２０１４）ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１０；ｅ１００３４０９）、ＷＩＳＰ１機能は腫瘍細胞の増殖及び進行と相関がある（Ｍａｉｅｓｅ，Ｋ．（２０１４）Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．１１：３７８〜８９；Ｎａｇａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３１：９９１〜７）。しかしながら、ＷＩＳＰ１と発癌との直接的な関連性は解明されていない。ＷＩＳＰ１はまた、他の環境において腫瘍サプレッサーの役割を果たすことも示唆されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２８９〜９６）。ＷＩＳＰ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでラット線維芽細胞において分裂促進効果を発揮することが示されており（Ｘｕ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：５８５〜９５）、それは、線維芽細胞から分泌されるＷＩＳＰ１が傍分泌を介して作用し得ることが更に実証された（Ｔａｎａｋａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０：５５２５〜３２）。ＣＣＮタンパク質は、組織修復の環境でも研究されている。実際に、ＷＩＳＰ１発現は、心臓虚血（Ｃｏｌｓｔｏｎ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９３：Ｈ１８３９−４６）、肺上皮の障害（Ｈｅｉｓｅ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：１７４３５〜４４）、骨折（Ｆｒｅｎｃｈ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：８５５〜６７；Ｍａｃｓａｉ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｏｎｅ  ５０：１０８１〜９１）の後、及び神経組織の酸化的ストレス（Ｗａｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．９：９１〜１０１；Ｗａｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．９：２０〜３１）時に、上昇することが示されている。近時、ＷＩＳＰ１の新規な役割が、代謝及び脂肪組織生物学において示唆されている。実際に、ＷＩＳＰ１は、分化の間に脂肪細胞によって分泌され、脂肪組織におけるインスリン抵抗性のマーカーと関連があることが見出された（Ｍｕｒａｈｏｖｓｃｈｉ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６４：８５６〜６６）。マウス及びヒトでの体重減少は、貯蔵脂肪（fat depot）及び血液におけるＷＩＳＰ１レベルの減少と関連があり、またＷＩＳＰ１は脂肪組織内で炎症状態を維持し得ることが示唆された。
【００６４】
しかしながら、骨格筋及び筋幹細胞におけるＷＩＳＰ１の役割はまだ実証されていない。
【００６５】
一実施形態では、ＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、ヒトＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体である。
【００６６】
ＷＩＳＰ１の例示的なアミノ酸配列は：
MRWFLPWTLAAVTAAAASTVLATALSPAPTTMDFTPAPLEDTSSRPQFCKWPCECPPSPPRCPLGVSLITDGCECCKMCAQQLGDNCTEAAICDPHRGLYCDYSGDRPRYAIGVCAQVVGVGCVLDGVRYNNGQSFQPNCKYNCTCIDGAVGCTPLCLRVRPPRLWCPHPRRVSIPGHCCEQWVCEDDAKRPRKTAPRDTGAFDAVGEVEAWHRNCIAYTSPWSPCSTSCGLGVSTRISNVNAQCWPEQESRLCNLRPCDVDIHTLIKAGKKCLAVYQPEASMNFTLAGCISTRSYQPKYCGVCMDNRCCIPYKSKTIDVSFQCPDGLGFSRQVLWINACFCNLSCRNPNDIFADLESYPDFSEIAN
（配列番号１；ヒトＷＩＳＰ１）である。
【００６７】
ＷＩＳＰ１をコードする例示的なポリヌクレオチド配列は：
CCCACGCGTCCGCTGGGCCCAGCTCCCCCGAGAGGTGGTCGGATCCTCTGGGCTGCTCGGTCGATGCCTGTGCCACTGACGTCCAGGCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCACAGGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTGAGGACGACGCCAAGAGGCCACGCAAGACCGCACCCCGTGACACAGGAGCCTTCGATGCTGTGGGTGAGGTGGAGGCATGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACTCATTAAGGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACTAGGCAGGCACAAATCTTGGGTCTTGGGGACTAACCCAATGCCTGTGAAGCAGTCAGCCCTTATGGCCAATAACTTTTCACCAATGAGCCTTAGTTACCCTGATCTGGACCCTTGGCCTCCATTTCTGTCTCTAACCATTCAAATGACGCCTGATGGTGCTGCTCAGGCCCATGCTATGAGTTTTCTCCTTGATATCATTCAGCATCTACTCTAAAGAAAAATGCCTGTCTCTAGCTGTTCTGGACTACACCCAAGCCTGATCCAGCCTTTCCAAGTCACTAGAAGTCCTGCTGGATCTTGCCTAAATCCCAAGAAATGGAATCAGGTAGACTTTTAATATCACTAATTTCTTCTTTAGATGCCAAACCACAAGACTCTTTGGGTCCATTCAGATGAATAGATGGAATTTGGAACAATAGAATAATCTATTATTTGGAGCCTGCCAAGAGGTACTGTAATGGGTAATTCTGACGTCAGCGCACCAAAACTATCCTGATTCCAAATATGTATGCACCTCAAGGTCATCAAACATTTGCCAAGTGAGTTGAATAGTTGCTTAATTTTGATTTTTAATGGAAAGTTGTATCCATTAACCTGGGCATTGTTGAGGTTAAGTTTCTCTTCACCCCTACACTGTGAAGGGTACAGATTAGGTTTGTCCCAGTCAGAAATAAAATTTGATAAACATTCCTGTTGATGGGAAAAGCCCCCAGTTAATACTCCAGAGACAGGGAAAGGTCAGCCCATTTCAGAAGGACCAATTGACTCTCACACTGAATCAGCTGCTGACTGGCAGGGCTTTGGGCAGTTGGCCAGGCTCTTCCTTGAATCTTCTCCCTTGTCCTGCTTGGGTTCATAGGAATTGGTAAGGCCTCTGGACTGGCCTGTCTGGCCCCTGAGAGTGGTGCCCTGGAACACTCCTCTACTCTTACAGAGCCTTGAGAGACCCAGCTGCAGACCATGCCAGACCCACTGAAATGACCAAGACAGGTTCAGGTAGGGGTGTGGGTCAAACCAAGAAGTGGGTGCCCTTGGTAGCAGCCTGGGGTGACCTCTAGAGCTGGAGGCTGTGGGACTCCAGGGGCCCCCGTGTTCAGGACACATCTATTGCAGAGACTCATTTCACAGCCTTTCGTTCTGCTGACCAAATGGCCAGTTTTCTGGTAGGAAGATGGAGGTTTACCAGTTGTTTAGAAACAGAAATAGACTTAATAAAGGTTTAAAGCTGAAGAGGTTGAAGCTAAAAGGAAAAGGTTGTTGTTAATGAATATCAGGCTATTATTTATTGTATTAGGAAAATATAATATTTACTGTTAGAATTCTTTTATTTAGGGCCTTTTCTGTGCCAGACATTGCTCTCAGTGCTTTGCATGTATTAGCTCACTGAATCTTCACGACAATGTTGAGAAGTTCCCATTATTATTTCTGTTCTTACAAATGTGAAACGGAAGCTCATAGAGGTGAGAAAACTCAACCAGAGTCACCCAGTTGGTGACTGGGAAAGTTAGGATTCAGATCGAAATTGGACTGTCTTTATAACCCATATTTTCCCCCTGTTTTTAGAGCTTCCAAATGTGTCAGAATAGGAAAACATTGCAATAAATGGCTTGATTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
（配列番号２；ヒトＷＩＳＰ１）である。
【００６８】
ＷＩＳＰ１の別の例示的なアミノ酸配列は：
MRWLLPWTLAAVAVLRVGNILATALSPTPTTMTFTPAPLEETTTRPEFCKWPCECPQSPPRCPLGVSLITDGCECCKICAQQLGDNCTEAAICDPHRGLYCDYSGDRPRYAIGVCAQVVGVGCVLDGVRYTNGESFQPNCRYNCTCIDGTVGCTPLCLSPRPPRLWCRQPRHVRVPGQCCEQWVCDDDARRPRQTALLDTRAFAASGAVEQRYENCIAYTSPWSPCSTTCGLGISTRISNVNARCWPEQESRLCNLRPCDVDIQLHIKAGKKCLAVYQPEEATNFTLAGCVSTRTYRPKYCGVCTDNRCCIPYKSKTISVDFQCPEGPGFSRQVLWINACFCNLSCRNPNDIFADLESYPDFEEIAN
（配列番号３；マウスＷＩＳＰ１）である。
【００６９】
ＷＩＳＰ１をコードする別の例示的なポリヌクレオチド配列は：
TGCAGGGCTAGTCTGTTGGCCTGACGTCAGATGTCGCTTTGACAAACGCCCCCGGGGGCTGAGGAAGGCTCTCCGCTGCTCTGATGGGCCAGCCCAGTCCTGGCCCAGCTCCCTGGAGAGGCATCCGCATCCTCTGGGCTGAGCCGTAGCTCCTGTGACGCTGACTTCCAGGCATGAGGTGGCTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCCGTGGCAGTCCTGAGGGTGGGCAACATCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAACCCCCACAACAATGACCTTCACCCCAGCACCACTAGAGGAAACGACTACACGCCCCGAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCACAATCCCCACCTCGCTGCCCACTGGGCGTCAGCCTAATCACAGATGGCTGTGAATGCTGTAAGATATGTGCCCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACAGAGGCTGCCATCTGTGACCCACACCGGGGCCTCTACTGCGATTACAGTGGGGATCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCACAGGTGGTCGGTGTGGGCTGTGTCCTGGATGGCGTACGCTACACCAATGGCGAGTCCTTCCAACCCAACTGCAGGTACAACTGTACCTGCATTGATGGCACGGTGGGCTGCACACCGCTGTGCCTAAGCCCCAGGCCCCCACGCCTCTGGTGCCGCCAGCCCCGGCACGTGAGAGTCCCTGGCCAGTGCTGTGAGCAGTGGGTGTGTGATGATGACGCAAGGAGACCACGCCAGACTGCACTGTTGGACACCAGAGCCTTTGCAGCGTCAGGCGCCGTGGAGCAACGGTATGAGAACTGCATAGCCTACACTAGTCCCTGGAGCCCCTGCTCTACCACCTGTGGCCTAGGTATCTCCACTCGGATCTCTAACGTCAATGCCCGGTGCTGGCCAGAGCAGGAAAGTCGCCTCTGCAACCTGCGGCCATGTGATGTGGACATCCAACTACACATCAAGGCAGGGAAGAAATGCCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGAGGCCACGAACTTCACTCTCGCAGGCTGTGTCAGCACACGCACCTACCGACCCAAGTACTGCGGAGTCTGTACTGACAATAGGTGTTGCATCCCCTACAAGTCCAAGACCATCAGTGTGGATTTCCAGTGTCCAGAGGGGCCAGGTTTCTCCCGGCAGGTCCTATGGATTAATGCTTGCTTCTGCAACCTGAGCTGCAGGAATCCTAACGATATCTTTGCTGACTTGGAATCTTACCCTGACTTCGAAGAGATTGCCAATTAGGTGGGTGTGTGGCTCAGGGTAAAGTTCCATGCTGCAAAGCAGCCAGCCCTTTGTGGTCCAGGACTTCACAATTGAGCCTTATTTCATCTACTTCCTACTCGATTCTGAATTCCCAGTTTCTGTTCCTGTTTTGACAATCGTAATGGCCCAGGAGAGTGCTGCTCAGGCTCAGACAATGGGTTCCTCCTTGGGGACATTCTACATCATTCCAAGGAAAACACATCTCTGACTGTTCACAATGGAAGCAAAGCCTGGCCCAGCTAGTCTGGCTCCAGCCTGGGCAAGTTGTCAGAAGTTGTGATGGGATTGTCCAAGGAAAAGCATCAGCTGAAGAACCAGTATCATGAAGTCCTTCCTCAGATGCCAAGCCTAGGGATGCTGGGATCCTTTCAGACAGATGGATGGGATTGGGGACACAGGAATAAGCTATTATTTTACCCTTGCCAAATGATACTATCCTGGGTATTTCTGCCTAAAACATACCAAAAGTGTTCTTGTTCCACTGATCTGTATATCACAAGTCACCAAACATTTTCCAGGTGAGGACCATAGTTGTGTCATTCTGTTTTGCTATTGAAAATCATTTTAAAAAGAAGGAAAAAAAAAAAAGAAAAGAAAAGAAAGTCATTTCATTAACTTGGGCACTTTCTCCTCTCACCCCATATTCTATAAAGGGCTAAACTTGGGTTCTTGTTGATCAGGAATGTAATTTGAGAAGTCTTACTTTTGCAGGGAGATGGTAGCCCTCAATTCATCCCGTAGGGATGGGACAAGGCCAGCCAATCTTTCAAGCCATAGCTGGGCAGGTCACTGAATCTGCTGCTGGCCAAGTTCTTAGGACAATTAGCCAAAATCTGGGCCTCTCTCTCCCTAGGGTTCATGGGAGTTGGTAGGGACCGTAGAGTGACTTGTCTGTTGTCTCAAAAAGTAAGATGGAAAGATGTTCTCATGGCCCTTAGAAGACTCTTTTGAAGTCTACGCCAGACCTAACAGAATATGTGCATCAAACAAACAAGTGGATCACCCTCCCATGGCCTGGGTGACCTCTAGCAGTCACCCAGTGACTGTGGTAAGGCCACAGTAGTCCCTGGACCCAGGACAAATCTTTTTTGTTTCAGTGACCTACTTTACAGCCTCAGTGTCTATGAAGAAAGTTAACTCAGTTTTCTCATCTGAAGACAGAAGTCGACCAGCCATTCAGAAATGGGGATCTATTTAGTAGTGGTAAACGTTAAAGAGTTTGTAAGCTAAAGAAATATTTTTTTTCCTAAGTGATAATGAGGTTGTTACCTATTTTAGAGGTAGAATTTTCTGTCATCATCCTTTTATTGTGTTCTACATACTACCCATTGTTCTCAATATTTGCCACACATTTACTCATTGAAACTTGCTGATAACACAGAGGACTTCCCTTAATGATTTCTGTTCTTGACACTGTGAAATATCAATTCAAAGAGGCTAATAAGTTCAATCAAAGTCACCTATCTGAAGACTCATAGCCAGAGAAGATTGCCTTCATATTTCCCCTTTGCTTCTGGACCTTGTAAACATGTCAGGGCAGGAAAGCATACAGAAGTCAGCAGCTTGCCCTCTTAGTATTGGCTCTCTAGCCCCTTTCACGTAAGAGGAGAGTGTGTCTAGGTACTAAGGATCCAACCTAAACTGGACAGAAAAGGGCATGTGCATTATCCCCTGTGGCTCCTCCTGCCCTGGAATCAGAACTAGCTTACAGCATGCTTTTATATGATGATTCAGTTTGCCCCACACCATACATATGGGCATATGGGAGAACTATACACACACTCATAAATGGATTTGTAAGTAGGAAAGGGGACTTGAGATTTCCCCTCCTTCCTGCAACTTCCCAAAGGCCTGGCCTTATGCAAGGCAAACAGTGGTGCTTAAGATGTATTTTGGGAAGAAAATACTATATATATATATTCCTATTTTTCCTTAGAAGCCTTTTCTTCCAGGATCTCATCTTAACAGTAAGAAATCCTCTCTTAAGAGAGGCCTAGTATTTTGAGTAAACATATGTTCATATGTGTACAAGTACTTGTATGTAAATATAAGTTACCACTGTGGGTTATTAATTAGGTAAATTTTATGTGGTATCATATTTGATTTTCTTCTATTGGAAAAATCTGCCTTAACAGCTAACTCTGTAAGAACTTCCATAGGAGCCATAAGCTAGGGTCTTCCCAGGTATCCATCCTCTTTTGGGAAACTGAGCTGAGCATCTTCAACCAAAGGAGTTAGGGTGATCATTGGGAATAGGAGAAAGGGATGGCCAGGGTAGCTCCATCGTTATTTAGAAACAGACCTGGCATACAGAACGACCAGAGGAACCAACCTTCTTTGAACCAAGGGAAAAAGACTTGGATGTAATATATAGAAGCTTTTTCTAATAGTCAGAAACAGACTTTAATTGTATGGCCTGGTTCAAGGAAAGTTAAGAATGTCCATTATCGTTAAAAACAAAAGTCCATTATTGATAGCTTATTTGGTGCTAAGCCCTACGGTGCATTTTGTCCGGCTATCACTTAGCAGAGCCATGCTCAGTACACAGTCTTTCTCTATTCAATAAATAGAAACGCTGAAGCTCAAAGGCACTGAGGAGCTGAGGCTCAGAAGCATGTTTAGTCCACTCTATCAGGGGGGGAAGAGATCTTGACGGAACCTAAATGACTACTATTGGAAACTCATATTTGAAAGCTTTCAGAAGTCCCACCCCCACCCCATCCCCAGATGCTTAGAAACTAAAGAAGCAATGAGGATGAGCTAGCCTTCAGTGAAGAGGTTCACTACTGCACCAAGAGTGAATGTCTTAGGTGTACTTAGTCATTGGACAGGGAGACCTGAGTGAGTTTGTGAACCTGCAGCTTACTAAACCTTACAATGAGCATTTGGAGAGCCAAGACTGCTTCTCGGCGCTTTACTGACATGGCTTGCTTAATCTTCTCAGTGAGCCCAAGAGTCAGGGCGTTACCACTGCCCATTTTAGGGCTGAGAAAGCAAAATCTCCAGGAGTTAAGTGATTTGCTCAAGTTTTTAACCAACCGAGGCACTGCAGATAAACTCCGAAGCCCAGTGTCATGTAACATGCCCATGCCATCTCTCCGGACACGCAGCCCATTTTCCTGTTCCTAAACCAAAGGCTCAGAGTCACCAGAACCAACTCACAGGACAGTGCAGAAATTCTAATGTCGAGGGTGATTAGAGACTGATCAAAGAAAGTAATTTCAAATGATATGATTGTTTGTAAGCACCCTAGTTAATTCTGGACTACATATGCATAGAGATTGTGAAGAACATTACAGCCTGTGACTATAACGTTGACTTCTGTCATTTCTTTTTAAAGACTTGTTTTTTTTTTTTTACTCAAAGGACCCACAGTGACAGCCCTGAATGGTTGAGAAGCATTGATTAGCTGTGAGTCCTGCATATGTATGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTATTTGTATGTACTTATCTATTTTCAAACTGTGATTGTGTATTTAAATATTCCTCCTGCCATTTTGTAAGTGATTACGCATAAAGAAACACCTTTGAATGTCCTAATAAAGGAGAGCTAGCCCTTGGGCGGCCTGTCACATTTTGCCACTTTCCTCATTTTTCTCATGATCTGTGTAGCAGGGAATGTGTTTGTTCAACCATGATGAGTTTTCATTGTTCAAATTCTTTGTTTACAGCTTTTCTCCTTAAAGCAATAAATCATCAGCAACAGT
（配列番号４；マウスＷＩＳＰ１）である。
【００７０】
ＷＩＳＰ１Ｎ末端ドメインはインスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢ）と相同性を共有するが、組換えヒトＩＧＦはヒトＣＴＧＦに対して親和性が非常に低いことが報告されている（Ｖｏｒｗｅｒｋ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：１６７７〜８５）。
【００７１】
Ｎ末端ドメインの後には、フォン・ウィルブラント因子Ｃ（ＶＷＣ）リピートとしても知られているシステインリッチ（ＣＲ）ドメインが続く。ＣＣＮ  ＶＷＣドメインは、骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）及びトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）と相互作用することが示されている（Ａｂｒｅｕ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：５９９〜６０４）。特に、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）のＣＴＧＦは、受容体へのＢＭＰ４の結合をブロックすることによりＢＭＰ４活性に対抗することができ、ＴＧＦ−β１に結合し、その受容体への結合を増強し、而して下流のシグナル伝達を増強することができる、ことが報告されている（Ａｂｒｅｕ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：５９９〜６０４）。更に、マトリックス細胞タンパク質のＣＣＮ１及びＣＣＮ２メンバーは、インテグリンανβ３、α６β１、並びにヘパリン硫酸プロテオグリカンとも、それらのＣＲドメインを介して相互作用し、内皮細胞の血管新生促進活性又は肝細胞の接着に翻訳されることが示されている（Ｃｈｅｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４４１６６〜７６；Ｌｅｕ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４６２４８〜５５；Ｇａｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：８８４８〜５５；Ｋａｗａｋｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２３：１７５１〜６４）。軟骨細胞では、ＩＧＦＢＰ及びＶＷＣドメインの両方を介してアグリカンに結合するＣＣＮ２は、アグリカン放出を誘発することが更に示唆された（Ａｏｙａｍａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４２０：４１３〜２０）。
【００７２】
第３の機能ドメインはタイプ−１トロンボスポンジンリピート（ＴＳＰ）である。インテグリンα６β１（Ｌｅｕ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３３８０１−８）、フィブロネクチン（Ｓｉｐｅｓ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２１：４６９〜７７）、コラーゲンＶ（Ｔａｋａｇｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５５４４〜９）、ＣＤ３６（Ａｓｃｈ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８２：１２０８〜１７）、ＴＧＦ−β（Ｓｃｈｕｌｔｚ−Ｃｈｅｒｒｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７３０４〜１０）、及びヘパリン（Ｇｕｏ，Ｎ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９３４９〜５５）等のタンパク質の範囲内にあるＴＳＰ１ドメインに結合する多数の標的が報告されている。しかしながら、ＴＳＰ１ドメインに結合するＣＣＮ標的に関しては、その特性があまり明らかにされていない（Ｈｏｌｂｏｕｒｎ，Ｋ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３３：４６１〜７３）。ＣＣＮ２はそのＴＳＰ１ドメインを介してＶＥＧＦ−Ａと相互作用することが実証されており、メタロプロテアーゼは同じドメインと相互作用できることが示唆されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３６２８８〜９５；Ｉｎｏｋｉ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１６：２１９〜２１）が、ＣＣＮ  ＴＳＰ１ドメインの示唆された標的との相互作用に関する直接的なエビデンスは確立されていないままである。
【００７３】
ＣＣＮメンバーのＣ末端ドメインはシステインノットモチーフを有する。このＣＴドメインは、ＣＣＮ２中のＬＲＰ−６、フィブロネクチン、パーリカン、及びフィブリン−１と相互作用することが示された（Ｍｅｒｃｕｒｉｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：２１３７〜４７；Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９６：２６５〜７５；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：８６９〜７４）。
【００７４】
全長ＷＩＳＰ１に加えて、いくつものＷＩＳＰ１スプライス変異体が知られている。
【００７５】
ＶＷＣ、ＴＳＰ１、及びＣＴドメインを欠いているＷＩＳＰ１スプライス変異体の例示的なアミノ酸配列は：
MRWFLPWTLAAVTAAAASTVLATALSPAPTTMDFTPAPLEDTSSRPQFCKWPCECPPSPPRCPLGVSLITDGCECCKMCAQQLGDNCTEAVICDPHRGLYCDYSGDRPRYAIGVCARREEVSGCVPARGIHELHTCGLHQHTLLSTQVLWSLHGQQVLHPLQV
（配列番号５）である。
【００７６】
ＶＷＣ、ＴＳＰ１、及びＣＴドメインを欠いているＷＩＳＰ１スプライス変異体をコードする例示的なポリヌクレオチド配列は：
CCGAGAGGTGGTCGGATCCTCTGGGCTGCTCGGTCGATGCCTGTGCCACTGACGTCCAGGCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACCCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGTCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCACGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAACAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACTAGGCAGGC
（配列番号６）である。
【００７７】
ＩＧＦＢ及びＶＷＣドメインを欠いているＷＩＳＰ１スプライス変異体の例示的なアミノ酸配列は：
MPVPLTSRHEVVPALDAGSSDSSSRQHRPGHDAVGEVEAWHRNCIAYTSPWSPCSTSCGLGVSTRISNVNAQCWPEQESRLCNLRPCDVDIHTLIKAGKKCLAVYQPEASMNFTLAGCISTRSYQPKYCGVCMDNRCCIPYKSKTIDVSFQCPDGLGFSRQVLWINACFCNLSCRNPNDIFADLESYPDFSEIAN
（配列番号７）である。
【００７８】
ＩＧＦＢ及びＶＷＣを欠いているＷＩＳＰ１スプライス変異体をコードする例示的なポリヌクレオチド配列は：
CCGAGAGGTGGTCGGATCCTCTGGGCTGCTCGGTCGATGCCTGTGCCACTGACGTCCAGGCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGATGCTGTGGGTGAGGTGGAGGCATGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACTCATTAAGGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACTAGGCAGGC
（配列番号８）である。
【００７９】
ＣＴドメインのみからなるＷＩＳＰ１スプライス変異体の例示的なアミノ酸配列は：
MRWFLPWTLAAVTAAAASTVLATAGKKCLAVYQPEASMNFTLAGCISTRSYQPKYCGVCMDNRCCIPYKSKTIDVSFQCPDGLGFSRQVLWINACFCNLSCRNPNDIFADLESYPDFSEIAN
（配列番号９）である。
【００８０】
ＣＴドメインのみからなるＷＩＳＰ１スプライス変異体をコードする例示的なポリヌクレオチド配列は：
GCGTCCGCTGGGCCCAGCTCCCCCGAGAGGTGGTCGGATCCTCTGGGCTGCTCGGTCGATGCCTGTGCCACTGACGTCCAGGCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAACAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACTAGGCAGGCACAAATCTTGGGTCTTGGGGACTAACCCAATGCCTGTGAAGCAGTCAGCCCTTATGGCCAATAACTTTTCACCAATGAGCCTTAGTTACCCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
（配列番号１０）である。
【００８１】
筋機能及び筋肉量
本明細書で開示される化合物、組成物、使用、及び方法は、筋機能及び／又は筋肉量の維持又は増加を提供することができる。
【００８２】
用語「筋機能」は、対象の生活に悪影響は及ぼさないような様式で筋肉を機能させる能力を指し、筋力、筋収縮、筋持久力、及び／又は筋弾性のパラメーターを包含する。
【００８３】
筋機能を評価する好適な試験としては、握力計を用いた握力測定、レッグプレス、チェストプレス、又は脚部伸展における１回最大反復測定（one repeat maximum）、歩行速度、６分間歩行検査、ＴＵＧテスト（timeup and go）、簡易身体能力バッテリー、Ｆｒｉｅｄによるフレイル基準、並びに段差を上る時間の測定（ｓｔａｉｒ  ｃｌｉｍｂｉｎｇ  ｔｉｍｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ）が挙げられる。
【００８４】
筋肉量（筋肉体積、筋肉厚、又は筋線維のサイズに等しい）は、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）又は生体インピーダンス試験によって測定することができる。同様にして、筋肉の体積の評価にはＭＲＩを使用でき、筋肉の厚み及び羽状角の評価には超音波を使用できる。
【００８５】
「筋萎縮」とは、筋肉量の減少、例えば筋肉喪失を悪化させる段階までの減少であり得る。一実施形態では、対象は、それらの筋肉量の１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％を超えては喪失しない。
【００８６】
好ましくは、本明細書で開示される化合物、組成物、使用、及び方法は、筋肉量の維持又は増加を提供する。
【００８７】
用語「維持」は、筋機能及び／又は筋肉量などの特定のパラメーターがある程度の期間にわたり（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０年以上）実質的に変化なく保たれることを指す。
【００８８】
一実施形態では、筋肉量は少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、又は２０％増大する。
【００８９】
別の実施形態では、筋肉量は１〜２．５％、１〜５％、１〜１０％、又は１〜２０％増大する。
【００９０】
好ましくは、筋肉は骨格筋である。
【００９１】
サルコペニア及びフレイル
本発明は、加齢と共に生じる筋機能及び筋肉量の低下に対処するための手段を提供する。加齢による筋機能の低下及び筋肉量の減少は、全ての個体において必ず生じるものの、その進行は、広範な遺伝的要因並びに例えば身体活動及び栄養摂取等の環境的要因によって異なる。
【００９２】
サルコペニアに特異的な状態とは、加齢による筋肉量及び筋機能の低下が衰弱性となり、クオリティ・オブ・ライフに影響を及ぼしている時点で発生している状態と定義される（Ｓａｙｅｒ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｇｅ  Ａｇｅｉｎｇ  ４２：１４５〜１５０）。対照的に、フレイルは、加齢による筋機能不全に関する分類であり、それは、筋肉量ではなく、筋力及び筋機能に基づいている（Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ｄｉｒ．Ａｓｓｏｃ．１４：３９２〜３９７）。
【００９３】
サルコペニア及びフレイルは、神経筋伝達障害、興奮／収縮連関の変化、幹細胞枯渇に関連した再生能の低下、筋線維におけるミトコンドリア代謝及びエネルギー代謝の不全、並びに骨格筋の大理石様脂肪化及び線維化などの病態生理学的変化に関連する多因性の症候群である（Ａｌｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  ６０：２９４〜３０５）。従って、これらの症候群の病因は、複雑であり、また十分に解明されていないが、身体活動が低いこと、タンパク質同化ホルモン（アンドロゲン及びＩＧＦ−１）のホルモン減少及び栄養不良及び／又は栄養失調が重要な役割を果たしている（Ｍｉｔｈａｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．２４：１５５５〜１５６６）。
【００９４】
筋損傷
実験的設定において（例えばマウスにおいて）、筋障害は、通常は、ヘビ毒毒素又はグリセロールのいずれかの筋肉内注射によって誘発される。これらの筋肉内注射は、筋損傷後最初の３日以内に急性の筋変性を誘発する。この手順は、自然の筋損傷中に起こる事象をモデル化する。
【００９５】
急性の筋変性の特徴は、筋線維の強力な破壊、及び免疫細胞の筋肉への浸潤である。筋再生中の免疫応答の役割は、重要であり、適切に調整されなければならない。好中球及び前炎症性マクロファージは、まず最初に筋肉に侵入し、損傷後の筋肉片のクリアランスに関与する。次いで、免疫細胞集団は、筋再生を維持する抗炎症性マクロファージに切り替わる。而して、免疫細胞によるサイトカインの連続分泌は、筋損傷後最初の数日の間に細かく統制され、筋肉前駆細胞の活性を調節する。実際に、多数の筋肉常在前駆細胞は、筋肉片が一旦除去されると活性化し増殖し始め、直ちに筋肉を再生する特異的な分化系列決定に関与する。特に、筋幹細胞（衛星細胞、ＳＡＴｓ）は増殖し、最終的には筋線維に分化する。間葉系非筋原性前駆細胞、又は線維／脂肪前駆細胞（ＦＡＰｓ）も、筋形成を維持するために同時に活性化される。筋損傷７日後、殆どの前駆細胞集団が関与し、免疫応答は消散された。損傷１４日後までに、筋肉は新しく形成された筋線維で構成され、殆どのシグナルは基礎レベルに戻った。
【００９６】
本明細書で開示される化合物、組成物、使用、及び方法は、筋損傷の有害な影響を治療、予防、又は抑制するために使用することができる。従って、理論に拘束されることを望まないが、本明細書で開示されるＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体は、（例えば筋幹細胞機能を促進することによって）筋再生を増加させると考えられる。
【００９７】
一実施形態では、対象は、外科的介入及び／又は外傷によって、筋損傷を受けている。
【００９８】
「外科的介入」という用語は、筋肉を障害するいずれかの外科的アプローチを指す。而して、本明細書で開示される化合物、組成物、使用、及び方法は、外科的処置後の回復を助けるために使用することができる。
【００９９】
本明細書で使用される「外傷」という用語は、例えば事故又はスポーツによる損傷等の筋損傷をもたらす予定外の事象を指す。
【０１００】
別の実施形態では、対象は、計画された外科的介入を受けなければならない。例えば、本明細書で開示される化合物、組成物、使用、及び方法は、１ヶ月未満、又は３、２、若しくは１週間未満において手術を受ける予定の対象に適用することができる。
【０１０１】
別の実施形態では、対象は、例えば、スタチン等のコレステロール低下薬に由来する毒素又は薬物への化学的曝露の副作用として、筋障害又は横紋筋融解を発症した。
【０１０２】
治療方法
本明細書において「治療」についてなされる全ての言及は、治癒的、緩和的、及び予防的治療を含むが、本発明の文脈においてなされる「予防」についての言及は、より一般的に予防的治療に関連することが認識されるであろう。治療に、疾患の重症度の進行を停止することもまた更に含んでもよい。
【０１０３】
対象
哺乳類、特にヒトの治療が好ましい。しかしながら、ヒト及び動物の治療の両方が、本発明の範囲内である。
【０１０４】
獣医学的対象に関してはウマ対象が好ましい。
【０１０５】
治療される高齢対象は、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００歳を超えるヒト対象であることができる。獣医学的用途に関しては、動物の齢は、ヒトの場合の状況をもとに、平均寿命を補正に利用して増減される。
【０１０６】
スクリーニング方法
一態様では、本発明は、対象においてＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）レベルを増加させることができる作用物質をスクリーニングする方法を提供する。その方法は、
（ａ）細胞集団を、候補となる作用物質と接触させるステップと、
（ｂ）細胞集団におけるＷＩＳＰ１のレベルを測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定されたＷＩＳＰ１のレベルを、候補となる作用物質と接触していない細胞の対照集団におけるＷＩＳＰ１レベルと比較するステップと、を含むことができる。
【０１０７】
好ましくは、その方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法である。
【０１０８】
候補となる作用物質は、例えば、医薬品又は栄養補助食品であり得る。好ましくは、候補となる作用物質は栄養補助食品である。用語「栄養補助食品」とは、対象の普段の食生活を補助することを意図する製品を指す。
【０１０９】
一実施形態では、候補となる作用物質は、候補となる作用物質のライブラリ中に含まれる。
【０１１０】
一実施形態では、細胞集団は、筋細胞の集団（例えば、Ｃ２Ｃ１２細胞株及び／又はヒト初代筋芽細胞）である。その筋細胞の集団は、例えば、筋幹細胞及び／又は前駆細胞（例えば衛星細胞（ＳＡＴ）及び／又は線維／脂肪前駆細胞（ＦＡＰ））の集団であることができる。
【０１１１】
用語「ＷＩＳＰ１レベル」は、試料中に見られるＷＩＳＰ１タンパク質の量を指す。ＷＩＳＰ１タンパク質の量は、直接的に又は間接的に測定することができる。ＷＩＳＰ１を測定する直接法としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット法、クロマトグラフ法（例えばＨＰＬＣ又はＦＰＬＣ）、マススペクトルベースの方法（例えばＬＣ／ＭＳ）及びＮＭＲが挙げられる。ＷＩＳＰ１を測定する間接的方法としては、ＷＩＳＰ１をコードするポリヌクレオチド、特にｍＲＮＡｓの検出に基づく方法、例えばｑＰＣＲが挙げられる。
【０１１２】
ＷＩＳＰ１レベルに対する、候補となる作用物質の影響は、特定の時間枠にわたって測定を繰り返し実施することにより、時間の関数として評価することができる。
【０１１３】
例えば、候補となる作用物質は、Ｗｎｔリガンド又はＦｒｉｚｚｌｅｄアゴニストを含むことができる。
【０１１４】
診断方法
一態様では、本発明は、サルコペニア又はフレイルを診断する方法を提供し、その方法は、
（ａ）対象から分離された生体試料を準備するステップと、
（ｂ）生体試料におけるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）のレベルを測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定されたＷＩＳＰ１のレベルを、１つ以上の対照試料から測定されたＷＩＳＰ１レベル又は基準レベルと比較するステップと、を含む。
【０１１５】
１つ以上の対照試料を、サルコペニア若しくはフレイルを有する、又は有しない対象から分離することができる。従って、係る対照試料との比較により、サルコペニア若しくはフレイルを有する対象、又はサルコペニア若しくはフレイルの状態まで悪化している対象についての指標を提供することができる。
【０１１６】
代替的又は追加的に、所定の基準レベルを下回るＷＩＳＰ１のレベルは、対象がサルコペニア又はフレイルであることを示すことができ、一方、所定の基準レベルを超えるＷＩＳＰ１のレベルは、対象がサルコペニア又はフレイルではないことを示している。
【０１１７】
用語「ＷＩＳＰ１レベル」は、試料中に見られるＷＩＳＰ１タンパク質の量を指す。ＷＩＳＰ１タンパク質の量は、直接的に又は間接的に測定することができる。ＷＩＳＰ１を測定する直接法としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット法、クロマトグラフ法（例えばＨＰＬＣ又はＦＰＬＣ）、マススペクトルベースの方法（例えばＬＣ／ＭＳ）及びＮＭＲが挙げられる。ＷＩＳＰ１を測定する間接的方法としては、ＷＩＳＰ１をコードするポリヌクレオチド、特にｍＲＮＡｓの検出に基づく方法、例えばｑＰＣＲが挙げられる。
【０１１８】
生体試料は、対象の身体から分離するのに好適な、血液試料（例えば血漿若しくは血清）又は組織生検（特に筋肉生検）等の任意の試料であってよい。
【０１１９】
一実施形態では、本方法は、本明細書で開示されるＷＩＳＰ１又はその断片若しくは変異体を対象に投与する更なるステップを含むことができ、その対象は、サルコペニアを有するか若しくはサルコペニアを発症する危険性があると診断されたか、又はフレイルであるか若しくはフレイルになる危険性があると診断されている。
【０１２０】
別の実施形態では、その方法は、筋機能及び／又は筋肉量を維持又は増加させるための食事療法を適用する更なるステップを含むことができ、その対象は、サルコペニアを有するか若しくはサルコペニアを発症する危険性があると診断されたか、又はフレイルであるか若しくはフレイルになる危険性があると診断された。好ましくは、食事療法は、筋肉量を維持又は増加させるためのものである。食事療法の例としては、高タンパク質食及び／又は高炭水化物食が挙げられる。
【０１２１】
別の態様では、本発明は、（例えば加齢による）筋機能及び／又は筋肉量の低下を診断する方法を提供し、その方法は、
（ａ）対象から分離された生体試料を準備するステップと、
（ｂ）生体試料におけるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）のレベルを測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定されたＷＩＳＰ１のレベルを、１つ以上の対照試料から測定されたＷＩＳＰ１レベル又は基準レベルと比較するステップと、を含む。
【０１２２】
筋機能及び／又は筋肉量の低下は、サルコペニア又はフレイルと関連し得る。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、食事療法を選択する方法を提供し、その方法は、
（ａ）対象から分離された生体試料を準備するステップと、
（ｂ）生体試料におけるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）のレベルを測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定したＷＩＳＰ１レベルを、１つ以上の対照試料から測定されたＷＩＳＰ１レベル又は基準レベルと比較するステップと、
（ｄ）筋機能及び／又は筋肉量を維持又は増加させるための食事療法を適用する更なるステップを含むことができ、その対象は、サルコペニアを有するか若しくはサルコペニアを発症する危険性があると診断されたか、又はフレイルであるか若しくはフレイルになる危険性があると診断された。
【０１２４】
好ましくは、食事療法は、筋肉量を維持又は増加させるためのものである。食事療法の例としては、高タンパク質食及び／又は高炭水化物食、並びにビタミンＢ１２栄養補給剤及び／又はビタミンＤ栄養補給剤が挙げられる。
【０１２５】
対照試料は、同じ対象に由来する、より早い時点で採取されたものであってよい。同様にして、基準レベルは、同じ対象に対してそれまでに実施された分析に基づき決定され得る。従って、別の態様では、本発明は、対象においてサルコペニア又はフレイルの進行を測定する方法を提供し、その方法は、
（ａ）対象から分離された生体試料を準備するステップと、
（ｂ）生体試料におけるＷｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）のレベルを測定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定されたＷＩＳＰ１のレベルを、初期の同じ対象から採取された試料から測定されたＷＩＳＰ１レベルと比較するステップと、を含む。
【０１２６】
食事療法及び食事製品
用語「食事療法」は、対象に与えられ、対象の食生活に変化をもたらす、外部因子を指す。一実施形態では、食事療法は、高カロリー食である。別の実施形態では、食事療法は、高タンパク質食及び／又は高炭水化物食である。別の実施形態では、食事療法は、ビタミン及びミネラル、特にビタミンＢ１２及び／又はビタミンＤが栄養補給された、規定食である。
【０１２７】
規定食は、対象の初期体重に合わせて調整したものであってよい。
【０１２８】
食事療法には、少なくとも１つのダイエット製品の投与が含まれていてもよい。ダイエット製品は、食事代替製品又は栄養補給製品（例えば対象の食欲を増強可能）であってよい。ダイエット製品は、食品製品、飲料、ペットフード製品、食品栄養補給剤、機能性食品、食品添加物、又は栄養配合物を含むことができる。経口栄養補助食品の例としては、Ｎｅｓｔｌｅ製品のブースト及びＭｅｒｉｔｅｎｅが挙げられる。
【０１２９】
変異体、誘導体、類似物、相同体、及び断片
本明細書において言及される特定のタンパク質及びヌクレオチドに加え、本発明は、それらの変異体、誘導体、類似物、相同体、及びそれらの断片の使用を包含する。
【０１３０】
本発明の文脈において、いずれかの所与の配列の変異体は、対象とするポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能が実質的に保持されるような方法で、特定の配列残基（アミノ酸残基又は核酸残基のいずれか）が改変されている配列である。変異体配列は、天然に生じるタンパク質中に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、改変、置き換え、及び／又は多様体化により得ることができる。
【０１３１】
本明細書で使用するとき、本発明のタンパク質又はポリペプチドに関し、用語「誘導体」は、得られるタンパク質又はポリペプチドが、その内在的な機能のうちの少なくとも１つを実質的に保有することを条件として、配列からの、又は係る配列に対しての、１つ（以上の）アミノ酸残基の任意の置換、多様体化、改変、置き換え、欠失、及び／又は付加を含む。
【０１３２】
本明細書で使用するとき、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関し、用語「類似物」は、任意の模倣物を含み、すなわち、模倣するポリペプチド又はポリヌクレオチドの内在的な機能のうちの少なくとも１つを保有する化学的な化合物を含む。
【０１３３】
典型的には、改変された配列が求められる活性又は性能を実質的に保有するという条件で、アミノ酸置換、例えば、１、２、又は３〜１０個又は２０個の置換がなされ得る。アミノ酸置換は、非天然に生じる類似物の使用を含み得る。
【０１３４】
本発明で使用されるタンパク質は、サイレントな変化をもたらし、結果として機能的に等価なタンパク質が得られる、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換も含み得る。内在的な機能が保有されるという条件で、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性をもとに、計画的なアミノ酸置換がなされ得る。例えば、負に帯電したアミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正に帯電したアミノ酸としてはリジン及びアルギニンが挙げられ、並びに帯電しておらず同様の親水性値をもつ極性頭部を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、及びチロシンが挙げられる。
【０１３５】
保存的置換は、例えば、下表によりなされ得る。第２欄の同じブロックにおけるアミノ酸、及び好ましくは第３欄の同じ行内にあるアミノ酸は、互いに置換され得る。
【表１】
2019527193.tif 000002
【０１３６】
本明細書で使用するとき、用語「相同体」は、野生型アミノ酸配列及び野生型核酸配列に対しある程度の相同性を有する対象物を意味する。用語「相同性」は、「同一性」と同一視し得る。
【０１３７】
相同配列は、対象とする配列に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％同一であり得る、好ましくは少なくとも９５％、又は９７％、又は９９％同一であり得る、アミノ酸配列を含む。典型的には、相同体は、対象とするアミノ酸配列と同じ活性部位等を含み得る。相同性は、類似性の点で考慮することもできるものの（すなわち、同様の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の文脈において、相同性は、配列同一性の観点で表現されることが好ましい。
【０１３８】
相同配列は、対象とする配列に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％同一であり得る、好ましくは少なくとも９５％、又は９７％、又は９９％同一であり得る、核酸配列を含む。相同性は、類似性の点で考慮することもできるものの、本発明の文脈において、相同性は、配列同一性の観点で表現されることが好ましい。
【０１３９】
好ましくは、本明細書に記載の配列番号のうちのいずれか１つに対しある程度の同一性（％）を有する配列についての言及は、参照する配列番号の全長に対し記載の同一性（％）を有する配列を指すものである。
【０１４０】
相同性比較は、目で行うこともでき、又はより一般的には、容易に利用できる配列比較プログラムを使用して実施できる。これらの市販のコンピュータプログラムにより、２つ以上の配列間の相同性（％）又は同一性（％）を計算することができる。
【０１４１】
相同性（％）は、連続的な配列にわたって計算することができる。すなわち、一方の配列を他方の配列とアラインメントし、一方の配列中のそれぞれのアミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれている。典型的には、こうしたギャップなしアラインメントは、比較的短い残基数に対してのみ行われる。
【０１４２】
これは、極めて単純かつ一貫した方法であるが、例えば、ヌクレオチド配列中の１つの挿入又は欠失により、それ以外の点では同一の配列ペアにおいて、後続するコドンがアラインメントから外れる場合があることを考慮していないため、グローバルアラインメントを実施する場合には、相同性（％）が大幅に低下する可能性がある。そのため、殆どの配列比較法は、全体的な相同性スコアに過度にペナルティを適用することなく、考えられる挿入及び欠失を考慮に入れた最適アラインメントを生成するように設計されている。これは、局所相同性を最大にするように、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１４３】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一のアミノ酸に対して、２つの比較配列間の関係性がより高いことを反映している可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメントが、多数のギャップを有する配列アラインメントよりも高いスコアを達成するように、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てている。典型的に、ギャップの存在には比較的高いコストを課し、ギャップ中の後続するそれぞれの残基には小さなペナルティを課す、「アフィンギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。当然のことながら、高いギャップペナルティが、ギャップのより少ない最適化アラインメントを生成する。殆どのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較のためにこのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを用いる場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップについては−１２であり、各伸長については−４である。
【０１４４】
従って、最大相同性（％）の算出には、まず、ギャップペナルティを考慮した最適アラインメントの生成が必要である。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同書１８章参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３〜４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートの比較ツールが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡとは２つともオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同書７−５８〜７−６０頁参照）。しかしながら、いくつかの用途については、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用するのが好ましい。ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと称する別のツールもまた、タンパク質とヌクレオチド配列との比較に使用できる（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７４：２４７〜５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７７：１８７〜８参照）。
【０１４５】
最終的な相同性（％）を同一性の点から測定することができるが、アラインメントプロセスそのものは、典型的には、イエスかノーかのペア比較に基づいていない。むしろ、化学的類似性又は進化距離に基づいて、各々のペアワイズ比較にスコアを割り当てる、スケール化類似性スコア行列が通常使用される。一般的に使用されるこのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルト行列）である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、通常、パブリックデフォルト値か、又は提供される場合はカスタムシンボル比較表かのいずれかを使用する（更なる詳細についてはユーザマニュアル参照）。いくつかの用途については、ＧＣＧパッケージ用のパブリックデフォルト値を用いるか、他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用するのが好ましい。
【０１４６】
ソフトウェアにより最適アラインメントが生成されたら、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を算出することができる。典型的に、ソフトウェアは、配列比較の一部としてこれを行い、数値による結果を生成する。
【０１４７】
Ｗｎｔ誘導性シグナル伝達タンパク質１（ＷＩＳＰ１）の「断片」は変異体でもあり、その用語は、典型的には、機能的に又は例えばアッセイにおいてのいずれかで対象とするポリペプチド又はポリヌクレオチドの選択領域を指す。従って、「断片」は、完全長のポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部分であるアミノ酸配列又は核酸配列を指す。
【０１４８】
このような変異体は、部位特異的変異導入などの標準的な組換えＤＮＡ法を用い調製され得る。挿入がなされる場合、挿入部位のいずれかの側の天然に生じる配列に相当する５’及び３’隣接領域と合わせて挿入部位をコードしている、合成ＤＮＡが作製され得る。隣接領域は、適切な酵素（複数可）により配列が切断されて、合成ＤＮＡが切断部分にライゲートされ得るよう、天然に生じる配列中の部位に相当する好便な制限部位を含有し得る。次に、このＤＮＡを本発明により発現させて、コードされているタンパク質を作製する。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作について当該技術分野で既知の数多くの標準法について単に例示するものであり、その他の既知の手法も使用され得る。
【実施例】
【０１４９】
例１
材料及び方法
マウス
全てのマウスを標準条件下で飼育し、自由に飼料及び水を摂取させた。系統にはＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊ（Ｊａｎｖｉｅｒ）を使用した。若齢マウスは９〜１２週齢であり、老齢及び高齢マウスは２０ヶ月齢以上であった。
【０１５０】
５０％ｖ／ｖグリセロール５０μＬを前脛骨筋（ＴＡ）に筋肉内注射することにより筋再生を誘導した。注射後３日、７日、１４日、又は２１日目（ｄｐｉ）にマウスを屠殺し、再生中のＴＡ筋肉を分子レベルで分析した。筋肉前駆細胞を分離させるために、５０μＬ、５０μＬ、及び１００μＬの５０％ｖ／ｖグリセロールを、前脛骨筋、腓腹筋、及び大腿四頭筋にそれぞれ筋肉内注射した。注射３日後にマウスを屠殺し、フローサイトメトリーによる細胞分離のために筋肉を処理した。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＷＩＳＰ１処理のために、１ｍｇ／ｋｇ／日のマウス組換えＷＩＳＰ１タンパク質を、筋損傷後に毎日腹腔内に注射した。対照マウスには、対応する容量のＰＢＳを注射した。
【０１５１】
ラット
全てのラットを標準条件下で飼育し、自由に飼料及び水を摂取させた。系統にはＷＩＳＴＡＲ（Ｊａｎｖｉｅｒ）を使用した。８ヶ月齢、１８ヶ月齢、又は２４ヶ月齢でラットを屠殺し血清を採取した。
【０１５２】
マウス前駆細胞の分離
筋肉は、無傷で又はグリセロール注射３日後に採取し、コラゲナーゼＢ及びディスパーゼＩで消化させた。
【０１５３】
細胞を、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ３１−ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ１１ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ３４−  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１４０ａ−ＰＥ（ＰＤＧＦＲα）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｌｙ−６Ａ／Ｅ−ＰＥＣｙ７（Ｓｃａ１）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びインテグリンα７（Ｒ＆Ｄ）と共に、４℃で３０分間インキュベートした。
【０１５４】
衛星細胞（ＳＡＴｓ）を、ＣＤ３１−／ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ４５−／Ｓｃａ１−／ＣＤ３４＋／インテグリンα７＋として分離した。線維／脂肪前駆細胞（ＦＡＰｓ）を、ＣＤ３１−／ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ４５−／Ｓｃａ１＋／ＣＤ３４＋／ＰＤＧＦＲα＋として分離した。系譜陽性細胞（Ｌｉｎ＋）を、ＣＤ３１＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ４５＋として分離した。ＣＤ３１−／ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ４５−／Ｓｃａ１＋／ＣＤ３４＋／ＰＤＧＦＲα−  細胞も採取し、ＰＤＧＦＲα−細胞と命名した。
【０１５５】
遅いオフ速度（off+rate）の修飾アプタマーアッセイ（ＳＯＭＡＬＯＧＩＣＳ）
筋肉試料を、ｃｒｙｏＰＲＥＰインパクタシステム（Ｃｏｖａｒｉｓ）を使用して粉砕した。次いで、筋肉粉末を、ポリトロンホモジナイザーを使用して機械的に溶解し、タンパク質を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸで抽出した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって測定し、試料を２５０μｇ／ｍＬに希釈した。ラット血清及びマウスタンパク質抽出物を、記載のように、ＳＯＭＡｓｃａｎプラットフォーム（Ｓｏｍａｌｏｇｉｃ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ，ＵＳＡ）によるＤＮＡアプタマーに基づく認識を使用して分析した（Ｇｏｌｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５：ｅ１５００４）。主成分分析及び線形モデルを適用する前に、メジアン正規化相対蛍光単位（ＲＦＵ）をｌｏｇ２＋変換した。Ｒ３．１．３で統計解析を行った。
【０１５６】
定量ＰＣＲ
ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ又はＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）をそれぞれ使用して、凍結筋肉又は新たにソートされた細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料をランダムプライマーを使用して逆転写した（Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＡＢＩ）。全筋肉に対する定量的ＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０においてＳｙｂＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉマスターキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行った。分離した前駆細胞に関する定量的ＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０におけるＳｙｂＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉマスターキット（Ｒｏｃｈｅ）と組み合わせたＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ（ＡＢＩ）を使用して行った。
【０１５７】
衛星細胞培養
Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｓｔｒｉｏｓ  Ｃｅｌｌソーターを使用して衛星細胞を分離し、９６ウェルプレートに１７６５細胞／ｃｍ２の密度で分配した。新たにソートされた衛星細胞を、高グルコースＤＭＥＭ、２０％の熱で不活性化したＦＢＳ、１０％不活性化ウマ血清、２．５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％のＬ＋グルタミン、１％のＮａ＋ピルベート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。ＥｄＵ濃度は、３時間、培地において１０μＭのＥｄＵであった。分化培地（高グルコースＤＭＥＭ、５％不活性化ウマ血清、１％Ｐ／Ｓ）へと２日間切り替えることによって、４日間の増殖後に衛星細胞の分化を誘導した。マウス組換えＷＩＳＰ１タンパク質を培地に添加することによって、ＷＩＳＰ１で細胞を処理し、培地は毎日交換した。
【０１５８】
ヒト骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）培養
ヒト骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）はＬｏｎｚａから購入した。ＨＳＭＭ細胞を９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェルで播種し、増殖アッセイのためにＨＳＭＭ  Ｈａｍｓｂｉｏ（登録商標）増殖培地で３日間増殖させた。ＨＳＭＭ細胞を９６ウェルプレートに３００００細胞／ウェルで播種し、分化アッセイのために翌日に分化培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２、２％不活性化ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ）へと２日間切り替えた。
【０１５９】
免疫細胞化学及び画像解析
ＥｄＵの取り込みは、製造者の指示に従ってＣｌｉｃｋ＋ｉＴアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して示した。簡潔に、細胞を４％ＰＦＡ中で１５分間固定し、０．５％ＰＢＴＸ中で２０分間透過処理し、Ｃｌｉｃｋ＋ｉＴ反応混合物で染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。ＭＨＣ染色のために、細胞を、４％ＰＦＡ中で１０分間固定し、冷ＥｔＯＨ／ＭｅｔＯＨ（ｖ／ｖ）を使用して５分間透過処理し、ＰＢＳ、１％ウマ血清中で一次抗体抗ＭｙＨＣ  １／２００（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅクローンＡ４．１０２５）と共に室温で１時間インキュベートし、そして、ＰＢＳ、１％ウマ血清中で二次抗体１／１０００Ａｌｅｘａ４８８抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．Ａ−１０６８０）及びＨｏｅｓｃｈｓｔ  ３３３４２と共に室温で３０分間インキュベートした。染色された細胞を、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して画像化し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して定量化を行った。
【０１６０】
免疫組織化学及び画像解析
筋肉を採取し、液体窒素で冷却されたイソペンタン中で凍結させ、筋肉切片を１０μｍに切断し、凍結させた。ｅＭＨＣ抗体はＤＳＨＢ（＃ＤＳＨＢ，Ｆ１．６５２）から購入した。筋繊維を区別するために、Ｓｉｇｍａ（＃Ｌ９３９３）から購入したラミニンを使用した。ｅＭＨＣ／ラミニン染色のために、筋肉切片を解凍し、ＰＢＳ、４％ＢＳＡ、１％ウシ胎仔血清中で１時間ブロックした。次いで、切片を、ブロッキング溶液中で室温において３時間、一次抗体中でインキュベートし、洗浄し、そして二次抗体中で室温において１時間インキュベートし、次いで、切片をＰＢＳ中Ｈｏｅｓｃｈｓｔ３３３４２中で対比染色した。染色された切片をＯｌｙｍｐｕｓ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒを使用して画像化し、ｅＭＨＣ＋繊維をＶＳ１２０ソフトウェアを使用して手動で定量化した。
【０１６１】
統計解析
ｑＰＣＲ又は血清レベル分析では、２群間の比較について、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して統計学的有意性を評価した。３群以上の比較について、一元配置ＡＮＯＶＡに続いてＢａｒｔｌｅｔｔ及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を使用した。全てのデータは、平均値＋／−標準誤差で表し、ｎ＞５である。５％未満のｐ値は統計的に有意であるとみなした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析では、２群間の比較について、対応のあるＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって統計学的有意性を評価した。３群の比較のために、一元配置ＡＮＯＶＡに続いてＢａｒｔｌｅｔｔ及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を使用した。数回の反復を表す際には、二元配置ＡＮＯＶＡに続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定を使用した。全てのデータは平均値＋／−標準誤差で表す。５％未満のｐ値は統計的に有意であるとみなした。
【０１６２】
結果
本発明者らは、グリセロール誘発筋損傷のモデルを使用して、若齢及び老齢のマウス由来の筋肉を障害し、筋肉前駆細胞（ＳＡＴｓ、ＦＡＰｓ、ＰＤＧＦＲα−間葉細胞、ＣＤ３１＋内皮細胞）を活性化させた。次いで、これらの筋肉常在細胞、並びに損傷後の筋肉に侵入した細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋細胞、又はいわゆる系譜細胞と称される）は、それらの活性化状態で分離され、無傷の筋肉から分離された細胞（それらの静止状態にある）と比較した。本発明者らは、活性化時に、ＷＩＳＰ１が、ＳＡＴｓ、ＦＡＰｓ、及びＰＤＧＦＲα−間葉細胞において強力に上方制御され、ＦＡＰｓにおいて優性発現することを示した（図１ａ）。しかしながら、活性化時のＦＡＰｓによるＷＩＳＰ１発現は、経時的に有意に低下した。全筋肉レベルでは、ＷＩＳＰ１はまた、老齢の筋肉では重大な欠陥を有するｍＲＮＡ及びタンパク質レベルでの損傷の数日後に強く上方制御され、それは、筋修復におけるＷＩＳＰ１の重要な役割を示唆している（図１ｂ及び図１ｃ）。更に、ＷＩＳＰ１は、経時的に、健康な筋肉において下方制御されることも見出され、それは、経時的な筋肉量維持におけるＷＩＳＰ１の役割を潜在的に示唆している（図１ｂ、右のグラフ）。ラットでは、ＷＩＳＰ１は、循環している血漿中に見出され、その含量は経時的に有意に減少した（図１ｄ）。概して、これらの結果は、経時的に、筋機能において、ＷＩＳＰ１が特異な役割を果たしていることを示している。
【０１６３】
衛星細胞は筋再生に関与する典型的な筋幹細胞であるため、本発明者らは、筋幹細胞ニッチで分泌されるＷＩＳＰ１が衛星細胞機能を制御できるか否かを評価したいと考えた。而して、本発明者らは、若齢及び老齢の非損傷筋から衛星細胞を分離し、それらをマウス組換えＷＩＳＰ１（ｍｒＷＩＳＰ１）によってｅｘ  ｖｉｖｏで接着、活性化、及び増殖させた（図２のａ−ｃ）。３６時間後、衛星細胞数は、ＷＩＳＰ１処理によって若齢細胞と老齢細胞の両方で有意に増加し、それは、衛星細胞の接着及び生存におけるＷＩＳＰ１の役割を示唆している（図２のａ）。ＷＩＳＰ１はまた、衛星細胞増殖（図２のｂ、ｃ）、並びにヒト筋肉前駆細胞増殖（図２のｄ）に関して有意な陽性効果も実証した。結局、ＷＩＳＰ１は筋細胞分化に影響を及ぼさなかった（図２のｅ）。
【０１６４】
而して、ＷＩＳＰ１は、筋再生中の新規の筋肉分泌タンパク質であり、その発現は経時的に失われる。ＷＩＳＰ１は、分化能力に影響を与えることなく筋幹細胞の機能を改善することができる。
【０１６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、本発明者らは、筋障害後にマウス組換えＷＩＳＰ１タンパク質で毎日処理した老齢マウスは、損傷７日後に筋原性マーカー（Ｐａｘ７、すなわち衛星細胞のマーカー；ＭｙｏＤ、すなわち活性化衛星細胞のマーカー；ミオゲニン、すなわち分化している衛星細胞のマーカー；及びＭｙｈ３、すなわち新たに形成された繊維のマーカー）の有意に高い上方制御を呈したことを示した（図３）。この事は、ＷＩＳＰ１によりｉｎ  ｖｉｖｏで衛星細胞の活性化が増強され、それにより筋原性プログラムの記載事項（myogenic program entry）が改善されることを示唆した。更に、ＷＩＳＰ１で処理された筋肉では、ニッチ内の衛星細胞に対して支持的役割を果たすＦＡＰｓのマーカーであるＰＤＧＦＲαのレベルの増加を示した（Ｊｏｅ，Ａ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：１５３〜６３；及びＭｕｒｐｈｙ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３８：３６２５〜３７）（図４）。フィブロネクチンはまた、ＷＩＳＰ１で処理された筋肉において有意に上昇し、筋幹細胞機能に関するフィブロネクチンの有益な効果をおそらく増強した（Ｂｅｎｔｚｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １２：７５〜８７）。結局、ＷＩＳＰ１で処理された筋肉ではＷＩＳＰ１内因性発現もまた増加したため、ＷＩＳＰ１は、正のフィードバックループを介して制御される可能性がある（図４）。ＷＩＳＰ１発現の自己調節はニューロンにおいて既に示されており、従って骨格筋においても起こり得る（Ｗａｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．９：９１〜１０１）。
【０１６６】
組織学的レベルでは、老齢マウスをＷＩＳＰ１で処理すると、新しく形成された再生している繊維のマーカーであるｅＭＨＣ発現を、筋損傷７日後（７ｄｐｉ）の若齢マウスにおけるよりも、同じレベルまで、加速させることができた。それは筋再生の促進を示唆している（図５）。逆に、筋再生の後期時点（１４ｄｐｉ）では、ｅＭＨＣ＋を発現する再生している繊維の割合は、老齢の対照筋肉ではより高く、これは、若齢筋肉と比較して、またＷＩＳＰ１で処理された老齢筋肉においてレスキューされたものと比較して、繊維の成熟が遅延していることを示唆している。
【０１６７】
上記明細書で言及した全ての出版物は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明に記載の化合物、組成物、使用、及び方法の様々な修正及び変更は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を特定の好適な実施形態と共に記載したが、請求される本発明は、こうした特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことは理解すべきである。事実、記載された本発明を実施するための様態の様々な修正は、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明らかであり、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１ａ】
2019527193.tif 000003
【図１ｂ】
2019527193.tif 000004
【図１ｃ】
2019527193.tif 000005
【図１ｄ】
2019527193.tif 000006
【図２】
2019527193.tif 000007
【図３】
2019527193.tif 000008
【図４】
2019527193.tif 000009
【図５】
2019527193.tif 000010
【配列表】
2019527193000001.app
【国際調査報告】
2019527193.tif 000011
2019527193.tif 000012
2019527193.tif 000013
2019527193.tif 000014
2019527193.tif 000015