(57)【要約】  本発明は、多重特異性分子、例えば長期作用型多重特異性抗体に関する。また、関連した方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉｂ：
【化１】
2019537572.tif 000020
式中、
Ｐは、非免疫原性ポリマーであり；
Ｂは、Ｈ、末端封止基またはボイド(void)であり、前記封止基は、Ｃ１〜５０アルキルおよびアリールから選択され、前記アルキルの１個以上の炭素がヘテロ原子で置き換えられてもよく；
Ｔは、１つ以上の官能基を有する多官能性リンカーであり、Ｔと（Ｌ１）ａとの間の連結およびＴと（Ｌ２）ｂとの間の連結は、同じまたは異なってもよく；
Ｌ１およびＬ２のそれぞれは、独立して二官能性リンカーであり；
ａおよびｂは、それぞれ０〜１０から選択される整数であり；
Ａ１およびＡ２は、任意の２つの異なるまたは同じタンパク質であってもよく；
ｙは、１〜１０から選択される整数である、
の化合物。
【請求項２】
前記タンパク質の少なくとも１つが、認識結合部分を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａ１が、第１の認識結合部分を含み、Ａ２が、第２の認識結合部分を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記２つの異なるタンパク質が、２つの異なる抗体またはその抗原結合部分である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記２つの抗体が、それぞれ、細胞毒性細胞上の受容体に結合する抗ＣＤ３抗体、およびがん細胞の受容体に結合する抗ＣＤ１９抗体である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記２つの抗体が、一本鎖抗体である、請求項４または５に記載の化合物。
【請求項７】
前記非免疫原性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、炭水化物系ポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピル−メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、またはそれらのコポリマーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＰＥＧが、直鎖ＰＥＧである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記ＰＥＧが、分岐状ＰＥＧである、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ＰＥＧの少なくとも１つの末端または分岐が、メチルまたは低分子量アルキル基で封止されている、請求項７〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記ＰＥＧの全分子量が、３，０００〜１００，０００である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ＰＥＧが、パーマネント結合(permanent bond)または切断可能な結合により三官能性部分に連結される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記官能基が、部位特異的結合(site-specific conjugation)のためのものであり、チオール、マレイミド、２−ピリジルジチオ変異体、芳香族またはビニルスルホン、アクリレート、ブロモまたはヨードアセトアミド、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）、カルボニル、２−アミノ−ベンズアルデヒドまたは２−アミノ−アセトフェノン基、ヒドラジド、オキシム、カリウムアシルトリフルオロボレート、Ｏ−カルバモイルヒドロキシルアミン、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、テトラジン、およびトリアリールホスフィンからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
式（Ｉｂ）の化合物を調製する方法であって、
（ｉ）２つの異なるタンパク質またはその修飾型との部位特異的結合が可能な末端二官能性基を有する非免疫原性ポリマーを調製することと；
（ｉｉ）前記非免疫原性ポリマーを２つの異なるタンパク質またはその修飾型と段階的に部位特異的に結合させ、式（Ｉｂ）の化合物を形成することと、を含む方法。
【請求項１５】
式ＩＩ：
【化２】
2019537572.tif 000021
式中、
Ｂは、Ｏ、Ｓ、Ｎまたはそれらの組合せで置換されてもよいアルキルまたは芳香族コアであり；
Ｐは、非免疫原性ポリマーであり；
Ｔは、多官能性リンカーであり、Ｔと（Ｌ１）ａとの間の連結およびＴと（Ｌ２）ｂとの間の連結は、同じまたは異なってもよく；
Ｌ１およびＬ２のそれぞれは、独立して二官能性リンカーであり；
ａおよびｂは、それぞれ０〜１０から選択される整数であり；
ｘは、２〜８から選択される整数であり；
Ａ１およびＡ２は、任意の２つの異なるまたは同じタンパク質であってもよい、
の化合物。
【請求項１６】
ｘが、４、６または８である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｂが、グリセロール、トリメチロール−プロパン、ペンタエリスリトール、ソルビトール、およびグリセロールのオリゴマーから誘導される、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
前記非免疫原性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、炭水化物系ポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピル−メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、またはそれらのコポリマーである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記タンパク質の１つ以上が、単一認識結合部分または複数認識結合部分を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
【請求項２１】
処置を必要とする対象における疾患を処置する方法であって、有効量の請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項２２】
（Ｌ１）ａおよび（Ｌ２）ｂの一方が、アジドおよびアルキンから形成される連結を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項２３】
（Ｌ１）ａおよび（Ｌ２）ｂの他方が、マレイミドおよびチオールから形成される連結を含む、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
前記アルキンが、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｔが、リシンであり、Ｐが、ＰＥＧであり、ｙが、１であり、前記アルキンが、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）である、請求項１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１６年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４０８，８６５号の優先権を主張する。その出願の内容は、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、概して、多重特異性分子に関し、特に、長期作用型多重特異性抗体、ならびに長期作用型多重特異性結合分子を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多重特異性分子、例えば二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＡｂ）は、２つ以上の異なる分子（モノクローナル抗体またはその抗原結合部分等）で構成される人工タンパク質または複合体である。二重特異性抗体は、２つの異なる種類の標的（例えば抗原）に結合し、ある特定の障害を処置するために使用され得る。二重特異性抗体の臨床開発は、９０年代初頭に始まった（Ｃａｎｅｖａｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  ４，４２３−４２７、Ｖａｌｏｎｅ，Ｆ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３，２２８１−２２９２）。１０年後になって初めて、最初の二重特異性抗体「カツマキソマブ」（商品名Ｒｅｍｏｖａｂ）が、２００９年に欧州医薬品庁（ＥＭＡ）により欧州での商業的使用を承認された。第２の二重特異性抗体「ブリナツモマブ」（商品名Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）は、２０１４年に米国ＦＤＡにより承認された。二重特異性抗体は、２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０５（５９３４）：ｐ．５３７−４０）、または２つの異なるモノクローナル抗体もしくは抗体断片の化学的結合（Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８５  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９（４７０８）：ｐ．８１−３、Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８７  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３９（７）：ｐ．２３６７−７５）、または最近の組換えおよび融合技術により作製されている。しかしながら、組換え二重特異性抗体の製造の問題が、そのような有望な治療法を患者にもたらす上での大きな障害であった（Ｋｌｅｉｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．２０１２，ＭＡｂｓ．４（６）：６５３−６６３）。さらに、これらの分子のいくつかの短い半減期もまた、その臨床へのさらなる進展を大きく制限していた。さらに、固形腫瘍用途等のいくつかの疾患用途において、これらの分子のいくつかは、腫瘍組織内に深く貫通するには大きすぎるか、または腫瘍組織内での保持時間が制限されており（Ｔｈｕｒｂｅｒ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．４８（６）：９９５−９９９、Ｍｉｎｃｈｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ．６：５８３−５９２）、これは処置の不良な転帰をもたらす。したがって、新規な長期作用型二重特異性分子および関連した調製方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、多重特異性分子および関連した方法を提供することにより、上述の満たされていない必要性に対処する。
【０００５】
一態様において、本発明は、式Ｉａの多重特異的分子、複合体、または化合物を提供し、
【０００６】
【化１】
2019537572.tif 000002
【０００７】
式中、Ｐは、非免疫原性ポリマーであり；Ｔは、三官能性小分子リンカー部分であり、２つの異なるタンパク質との部位特異的結合(site-specific conjugation)が可能な１つ、２つまたはそれ以上の官能基を有し；Ａ１およびＡ２は、任意の２つの異なるまたは同じタンパク質である。
【０００８】
特に、本発明の一態様は、式Ｉｂの複合体を提供し、
【０００９】
【化２】
2019537572.tif 000003
【００１０】
式中、
Ｐは、非免疫原性ポリマーであり；
Ｂは、Ｈ、末端封止基またはボイド(void)であり、前記封止基は、Ｃ１〜５０アルキルおよびアリールから選択され、前記アルキルの１個以上の炭素がヘテロ原子で置き換えられてもよく；
Ｔは、１つ、２つまたはそれ以上の官能基を有する多官能性リンカーであり、Ｔと（Ｌ１）ａとの間の連結およびＴと（Ｌ２）ｂとの間の連結は、同じまたは異なってもよく；
Ｌ１およびＬ２のそれぞれは、独立して二官能性リンカーであり；
ａおよびｂは、それぞれ０〜１０から選択される整数であり；
Ａ１およびＡ２は、任意の２つの異なるまたは同じタンパク質であってもよい。例えば、Ａ１およびＡ２は互いに異なり、Ａ１およびＡ２はそれぞれ、独立して、抗体断片、一本鎖抗体もしくは任意の他の抗原結合部分またはそれらの組合せを含み、あるいは、Ａ１およびＡ２は同じであり、両方とも多重特異性抗原結合タンパク質であり；
ｙは、１〜１０から選択される整数である。
【００１１】
タンパク質の少なくとも１つは、認識結合部分を含む。例えば、Ａ１は、第１の認識結合部分を含み、Ａ２は、第２の認識結合部分を含む。２つの異なるタンパク質は、２つの異なる抗体またはその抗原結合部分であってもよい。一例において、２つの抗体は、それぞれ、細胞毒性細胞上の受容体に結合する抗ＣＤ３抗体、およびがん細胞の受容体に結合する抗ＣＤ１９抗体である。２つの抗体は、一本鎖抗体（ＳＣＡまたはｓｃＦｖ）であってもよい。
【００１２】
非免疫原性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、炭水化物系ポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピル−メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、およびそれらのコポリマーからなる群から選択され得る。好ましくは、非免疫原性ポリマーは、ＰＥＧ、例えば分岐状ＰＥＧまたは直鎖ＰＥＧまたはマルチアームＰＥＧである。その場合、直鎖ＰＥＧまたは分岐状ＰＥＧの少なくとも１つの末端は、Ｈ、メチルまたは低分子量アルキル基で封止される。ＰＥＧの全分子量は、３，０００〜１００，０００、例えば５，０００〜８０，０００、１０，０００〜６０，０００、および２０，０００〜４０，０００であってもよい。ＰＥＧは、パーマネント結合(permanent bond)または切断可能な結合により多官能性部分に連結されてもよい。
【００１３】
（Ｌ１）ａもしくは（Ｌ２）ｂ内、または（Ｌ１）ａとタンパク質Ａ１との間、または（Ｌ２）ｂとタンパク質Ａ２との間に連結を形成する官能基（例えば２つの部位特異的結合性官能基）は、チオール、マレイミド、２−ピリジルジチオ変異体、芳香族スルホンまたはビニルスルホン、アクリレート、ブロモまたはヨードアセトアミド、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）、カルボニル、２−アミノ−ベンズアルデヒドまたは２−アミノ−アセトフェノン基、ヒドラジド、オキシム、カリウムアシルトリフルオロボレート、Ｏ−カルバモイルヒドロキシルアミン、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、テトラジン、トリアリールホスフィン等からなる群から選択され得る。
【００１４】
いくつかの実施形態において、（Ｌ１）ａおよび（Ｌ２）ｂの一方は、アジドおよびアルキンから形成される連結を含んでもよい。（Ｌ１）ａおよび（Ｌ２）ｂの他方は、マレイミドおよびチオールから形成される連結を含んでもよい。いくつかの例において、アルキンは、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）であってもよい。他の例では、Ｔは、リシンであり、Ｐは、ＰＥＧであり、ｙは、１であり、アルキンは、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）である。いくつかの例において、Ａ１およびＡ２の一方は、アジドタグ化抗体、抗体鎖、抗体断片または一本鎖抗体から誘導されてもよく、一方アジドは、それぞれの（Ｌ１）ａまたは（Ｌ２）ｂにおけるアルキンに結合しており；Ａ１およびＡ２の他方は、チオールタグ化抗体、抗体鎖、抗体断片または一本鎖抗体から誘導されてもよく、チオールは、それぞれの（Ｌ１）ａまたは（Ｌ２）ｂにおけるマレイミドに結合している。
【００１５】
上述の多重特異性分子または化合物は、（ｉ）２つの異なるタンパク質またはその修飾形態との部位特異的結合が可能な末端二官能性基を有する非免疫原性ポリマーを調製することと；（ｉｉ）非免疫原性ポリマーを２つの異なるタンパク質またはその修飾形態と段階的に部位特異的に結合させ、式ＩａまたはＩｂの化合物を形成することとを含む方法に従って作製され得る。いくつかの例において、調製するステップの前に、タンパク質は、まず小分子リンカーで修飾されてもよい。
【００１６】
本発明はまた、上述の多重特異性分子または化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤を提供する。本発明は、さらに、処置を必要とする対象における疾患を処置する方法であって、有効量の上述の多重特異性分子または化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】実施例１に記載の３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−アルキン（化合物２、３、４、５、６）を調製する反応スキームを概略的に示す図である。
【図１Ｂ】実施例２に記載の４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−アルキン（化合物３ａ、４ａ、５ａ、６ａ）を調製する反応スキームを概略的に示す図である。
【図１Ｃ】実施例３に記載の３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−ＤＢＣＯ（化合物４ｂ、５ｂ、６ｂ）を調製する反応スキームを概略的に示す図である。
【図２Ａ】実施例５に記載のＣｕ触媒を用いずにクリックケミストリーによりＰＥＧ化一本鎖抗体３０ｋｍＰＥＧ−ＳＣＡＣＤ３−ＳＣＡＣＤ１９（化合物９〜１２）を調製する反応スキームを概略的に示す図である。
【図２Ｂ】実施例６に記載のＣｕ触媒を用いてクリックケミストリーによりＰＥＧ化一本鎖抗体３０ｋｍＰＥＧ−ＳＣＡＣＤ３−ＳＣＡＣＤ１９（化合物１１ａ〜１２ａ）を調製する反応スキームを概略的に示す図である。
【図３】実施例７に記載のｉｎ−ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞媒介細胞毒性を示す図である。
【図４】実施例７に記載のｉｎ−ｖｉｖｏ薬物動態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、新規な長期作用型多重特異性分子（例えば多重特異性または二重特異性抗体）ならびにそのような分子を作製および使用する関連した方法に関する。特に、本明細書において提供される多重特異性分子は、二重部位特異性ＰＥＧ化二重特異性抗体（ＤＳＰ−ＢｓＡｂ）であり、２つ以上の抗原、または同じ抗原の２つ以上のエピトープに結合することができる。
【００２０】
二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合断片を含む人工タンパク質である。これは、２つの異なる種類の抗原、または同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合する。このアプローチの最も広く使用されている用途はがん免疫治療であり、操作されたＢｓＡｂが細胞毒性細胞の受容体、例えばＣＤ３、およびがん細胞の受容体、例えばＣＤ１９の両方に結合し、細胞毒性細胞、例えばＴ細胞を、がん細胞を破壊するように誘導する。例えば、腫瘍免疫治療薬のうち、Ａｍｇｅｎにより開発された二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であるブリナツモマブは、開発された中で最も成功した治療薬の１つである。
【００２１】
ブリナツモマブは、がんの処置のための二重特異性融合抗体である。これは、それぞれＣＤ１９およびＣＤ３に特異的に結合して、ＣＤ１９陽性Ｂがん細胞を死滅させるようにエフェクターＴ細胞を誘導する、２つの一本鎖モノクローナル抗体で構成される。しかしながら、他の組換え抗体断片タンパク質と同様に、ブリナツモマブは、血液循環の間に極めて迅速に排除され、１日２４時間、１週７日間ずっとポータブルミニポンプで連続静脈内注入により投与されなければならない（Ｐｏｒｔｅｌｌ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５（Ｓｕｐｐｌ  １）：ｐ．５−１１）。この特別な薬物投与は、患者、特に若い子供が順守するには大きな課題であった。さらに、感染の可能性が高いことからこれらの患者は高いリスクに曝され、最悪な場合には死亡する可能性もある。さらに、その極めて短い半減期により、ブリナツモマブ等の融合した一本鎖二重特異性抗体は、典型的には固形腫瘍において非常に低い保持時間を有し；したがって、固形腫瘍を破壊するようにエフェクター細胞を誘導するのに成功する可能性は非常に疑わしい。さらに、ボーラス注射により投与されたブリナツモマブは、おそらくは脳への抗体の漏出に起因して、実質的な中枢神経系（ＣＮＳ）の毒性をもたらす可能性がある（Ａｈｍｅｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｒｉｌ  ２０１５，Ｏｎｃｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４（４））ｅ９８９７７６−１  −ｅ９８９７７６−１１）。それらの問題に対処するために、我々はここに、新規な二重特異性抗体技術−ＤＳＰ−ＢｓＡｂ技術を開示する。
【００２２】
ＢｓＡｂを形成する２つの抗体または抗体断片の化学的結合は、組換え融合法の出現前に先行技術において報告されている。実際に、最初に報告されたＢｓＡｂは、２つのウサギＩｇＧのペプシン消化に続く還元、次いで得られるＦａｂ’断片の再酸化によって得られたＢｓＦ（ａｂ’）２であった。ＢｓＦ（ａｂ’）２断片のより効率的な生成は、システイン反応性ホモおよびヘテロ二官能性架橋試薬（Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（４７０８）：８１−８３、Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９８７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３９（７）：２３６７−２３７５、Ｓ．ＳＯＮＧＳＩＶＩＬＡＩ  ＆  Ｐ．Ｊ．ＬＡＣＨＭＡＮＮ．Ｃｌｉｎ．ｅｘｐ．１９９０，Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９，３１５−３２１）を使用して、または２つの組換え発現Ｆａｂ’断片の間の直接的結合（Ｓｈａｌａｂｙ  Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７５（１）：２１７−２２５）により達成された。いくつかの方法が抗体断片（ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を使用して二重特異性抗体を化学的に作製することが説明されているが、これらのアプローチの多くは、低い結合収率および純度、または大量生成の困難さ等の様々な問題を呈する。
【００２３】
今日、分子生物学の進展により、全てではなくともほとんどの抗体断片または鎖の任意の対が、技術的に二重特異性抗体分子内に統合され得ることが可能となった。しかしながら、組換え融合二重特異性抗体の製造の問題が、臨床開発における大きな障害であった（Ｋｌｅｉｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．２０１２，ＭＡｂｓ．４（６）：６５３−６６３）。さらに、これらの有望な分子の短い半減期もまた、その臨床へのさらなる進展を大きく制限していた。
【００２４】
１９７０年代におけるその発明以来、最も成功しているタンパク質修飾戦略の１つとしてのＰＥＧ化は、製薬産業において広範囲に使用されている（Ｊｅｖｓｅｖａｒ，Ｓ．，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，５（１）：ｐ．１１３−１２８，Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ，２２（５）：ｐ．３１５−３２９）。その循環半減期を延長し、その薬物動態および薬力学を改善するための、タンパク質およびポリペプチド等の治療分子とのＰＥＧの結合は、周知である（米国特許第４，１７９，３３７号明細書）。
【００２５】
直鎖ＰＥＧが使用される場合、ＰＥＧ化二重特異性抗体には２つの可能な形式があり、一方は、２つの異なる抗体または抗原結合部分が直鎖ＰＥＧの両端に結合しており（形式Ｉ）、他方は２つの異なる抗体または抗原結合部分がＰＥＧの一方の末端のみに結合している（形式ＩＩ）。特定の用途に応じて、一方の形式が他方の形式より好ましく選択され得る。相乗効果のための併用治療の場合、別の形式より優先した一方の形式の選択は重要ではないように思われるが、がん細胞を死滅させるために細胞毒性エフェクター細胞を動員する場合、２つの異なる抗体または抗原結合部分がＰＥＧの両端に結合した形式（形式Ｉ）は、少なくとも以下の２つの理由により劣っている。第一に、エフェクター細胞に対する標的細胞の近接性が、エフェクター細胞を直接的溶解に効果的に誘導する免疫学的シナプスの形成に重要であり（Ｗｕｅｌｌｎｅｒ，Ｕ．ｅｔ．ａｌ．，２０１５，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，４，ｐ．４２６−４４０、Ｂｌｕｅｍｅｌ，Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，２０１０，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５９（８）：ｐ．１１９７−２０９）、換言すれば、腫瘍免疫治療が効果的に役立つためには、２つの異なる抗体または二重特異性抗体の抗原結合部分は互いに極めて近接すべきであるが、ＰＥＧ化二重特異性抗体の形式Ｉは、２つの異なる抗原結合部分の間の空間的距離を制御する機構を有さず、したがってこの距離要件を満たすことができない。第二に、この形式におけるＰＥＧ鎖は、典型的には短い排出半減期を有する抗原結合部分を保護するその可能性を十分に利用するために自由に移動することができない。正しいアプローチは、本発明において開示されるように、２つの異なる抗体または抗原結合部分がＰＥＧの一方の末端のみに結合したＰＥＧ化二重特異性抗体（形式ＩＩ）を構築し、ＰＥＧの他の末端（直鎖ＰＥＧの場合）または複数の末端（分岐状もしくはマルチアームＰＥＧの場合）を、ＰＥＧが短命な二重特異性抗体をより効率的に保護し得るように自由なままにすることである。この構造形式（形式ＩＩ）により、がん細胞を死滅させるようにエフェクター細胞を効率的に再標的化するために必要な免疫学的シナプスもまた提供される。したがって、より良好な薬物動態およびより良好な薬力学が期待され得る。
【００２６】
１つのＰＥＧ末端の２つの異なる抗体断片または一本鎖抗体を部位特異的に結合してＰＥＧ化二重特異性抗体を形成するために、ＰＥＧの末端官能基、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基等は、２つの抗体断片または一本鎖抗体との部位特異的結合が可能な末端分岐状へテロ二官能性基に変換されなければならない。末端分岐状ＰＥＧを調製するための方法は、米国特許第６，７５６，０３７号明細書、米国特許第６，６３８，４９９号明細書、および米国特許第６，７７７，３８７号明細書において開示されているが、それらの特許において開示された末端分岐状ＰＥＧはいずれも、２つの異なる抗体断片または一本鎖抗体または他の形式の抗原結合性部分との部位特異的結合を行うことができない。
【００２７】
概念的には、ＰＥＧ化二重特異性抗体は、ＰＥＧを融合二重特異性抗体に結合させることにより調製され得る。このアプローチの問題は、融合抗体の製造が、単一抗体断片または一本鎖抗体の製造よりはるかに課題が多く困難であることである。本発明において開示される代替アプローチは、２つの異なる抗体断片または一本鎖抗体を別個に製造し、次いでこれらの２つの抗体断片または一本鎖抗体の間を、三官能性小分子部分を有するＰＥＧで連結することである。
【００２８】
２つの異なる抗体断片または一本鎖抗体をＰＥＧに化学的に連結してＰＥＧ化二重特異性抗体を形成するために使用され得る２つのアプローチがある。第１のアプローチは、まず２つの異なる抗体断片または一本鎖抗体を部位特異的に連結し、続いて部位特異的ＰＥＧ化を行うことである。このアプローチの問題は、２つの異なる抗体断片または一本鎖抗体のカップリングにある。カップリングプロセスは、典型的には、しばしば標的化合物（例えばｓｃＦｖ１−ｓｃＦｖ２）と類似した分子量および物理的特性を有するそのような抗体断片または一本鎖抗体の二量体（例えば（ｓｃＦｖ１）２および（ｓｃＦｖ２）２）形成の傾向に単に起因して、同定および精製の点ではるかに困難であることが分かる。
【００２９】
他のアプローチは、本発明において開示されるＤＳＰ−ＢｓＡｂ技術を使用することである。ＤＳＰ−ＢｓＡｂ技術によって、まず抗体断片または一本鎖抗体を部位特異的にＰＥＧ化し、続いて別の抗体断片または一本鎖抗体との部位特異的結合を行うことができる。ＰＥＧ化抗体断片またはＰＥＧ化一本鎖抗体は、抗体断片または一本鎖抗体またはそれらの二量体とは極めて異なる特性を有するため、このアプローチによって、精製および特性決定プロセスがはるかに容易となり得る。
【００３０】
本発明は、２つの異なる抗体断片または一本鎖抗体、例えば抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３との部位特異的結合が可能な末端分岐状ＰＥＧを調製する方法を提供する。本明細書において開示されるように、二重特異性抗体の血液循環半減期が改善され得る。さらに、従来の単一特異性／一特異性抗体断片、一本鎖抗体、またはそれらの抗原結合部分が、本発明の二重特異性抗体の製造に使用することができ、これは、組換え融合二重特異性抗体の製造と比較して容易な製造プロセスを意味する。さらに、開示されたＰＥＧ化二重特異性抗体形式は、腫瘍免疫治療のためにがん細胞を死滅させるようにエフェクター細胞を動員する利点を有する。さらに、従来の全長二重特異性抗体またはそれらの誘導体のいずれも、通常、固形腫瘍組織内への深い貫通には大きすぎ、一方従来の一本鎖二重特異性抗体または抗体断片またはそれらの誘導体のいずれも、固形腫瘍組織内での保持時間が制限されているため、本明細書において開示されたＤＳＰ−ＢｓＡｂ技術は、二重特異性抗体のサイズと循環半減期とのバランスをとることができ、固形腫瘍に対するより効果的な処置を提供する可能性がある。
【００３１】
したがって、本発明は、上述の問題に対処し、二重特異性抗体技術を改善する。
【００３２】
Ｉ．複合体
本発明の一態様において、式（Ｉａ）の化合物が提供される。
【００３３】
【化３】
2019537572.tif 000004
【００３４】
式中、Ｐは、非免疫原性ポリマーであり；Ｔは、多官能性部分、例えば三官能性小分子リンカー部分であり、その官能基の２つは、２つの異なるタンパク質との部位特異的結合が可能である。Ａ１およびＡ２は、任意の２つの異なるタンパク質、例えば抗体断片または一本鎖抗体または他の形態の抗体またはそれらの任意の組合せである。
【００３５】
特に、本発明の一態様は、式Ｉｂの複合体を提供し、
【００３６】
【化４】
2019537572.tif 000005
【００３７】
式中、
Ｐは、非免疫原性ポリマーであり；
Ｂは、Ｈ、末端封止基またはボイド(void)であり、前記封止基は、Ｃ１〜５０アルキルおよびアリールから選択され、前記アルキルの１個以上の炭素がヘテロ原子で置き換えられてもよく；
Ｔは、多官能性リンカーであり、Ｔと（Ｌ１）ａとの間の連結およびＴと（Ｌ２）ｂとの間の連結は、同じまたは異なってもよく；
Ｌ１およびＬ２のそれぞれは、独立して二官能性リンカーであり；
ａおよびｂは、それぞれ０〜１０から選択される整数であり；
Ａ１およびＡ２は、互いに同じまたは異なり、Ａ１およびＡ２のそれぞれは、独立して、抗体断片、一本鎖抗体、または任意の他の形態の抗体または多重特異性抗体またはそれらの組合せを含み、
ｙは、１〜１０から選択される整数である。
【００３８】
複合体のＰ部分は、様々な非免疫原性ポリマーから調製され得る。好ましくは、ポリマーは、水溶性である。ポリマーの例は、デキストラン、炭水化物系ポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコールおよび他の同様の非免疫原性ポリマーを含む。さらなる例示的ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカリド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、またはそれらのコポリマーもしくはターポリマーを含む。ポリマーは、直鎖または分岐状であってもよい。ポリマーの平均分子量は、約１００〜約１００，０００ダルトン、例えば約３，０００〜約１００，０００ダルトンの範囲であり、全ての部分範囲が含まれる。
【００３９】
ポリマーは、官能化、活性化または反応パートナーに結合され得る末端基を含んでもよい。末端基の限定されない例は、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオール、およびハライドを含む。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ｙは、１であり、式Ｉｂは、ペンダントポリマー鎖を有する複合体を表す。末端Ｂは、封止基として機能し得る。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ｙは、２、３、４、５または６であり、式Ｉｂは、分岐状ポリマー部分を含む複合体を表す。いくつかの実施形態において、［Ｂ−Ｐ］ｙ中のＢは、低分子量Ｃ１〜１０アルキル基、例えばメチル、エチル、およびブチルであり、炭素の１個以上がヘテロ原子（例えばＯ、Ｓ、およびＮ）により置き換えられてもよい。
【００４２】
ポリマー部分Ｐ
いくつかの実施形態において、Ｐは、ＰＥＧ部分を表す。いくつかの実施形態において、２つの異なるタンパク質、例えば抗体断片または一本鎖抗体との部位特異的結合が可能な末端分岐状へテロ二官能性ＰＥＧを調製する方法が提供される。いくつかの実施形態において、血液循環半減期を延長することができるそのＰＥＧ化二重特異性一本鎖抗体を調製するための方法もまた提供される。
【００４３】
例示的実施形態において、ＰＥＧの末端官能基、例えばヒドロキシルまたはカルボキシル基等は、活性化および三官能性小分子部分、例えばＢｏｃ保護リシンと結合して、末端分岐状ヘテロ二官能性ＰＥＧを形成する。次いで、新たに形成されたカルボキシル基は、アルキン基を有する小分子スペーサーとのカップリングによりアルキン基に変換される。Ｂｏｃ脱保護後の裸のアミノ基は、マレイミド基を有する別の小分子スペーサーと結合して、末端分岐状マレイミド／アルキンヘテロ官能性ＰＥＧを形成する。得られたマレイミド／アルキン末端分岐状へテロ二官能性ＰＥＧは、チオールタグ化一本鎖抗体およびアジドタグ化一本鎖抗体と連続して部位特異的に結合して、ＰＥＧ化一本鎖二重特異性抗体を形成し、これは、非ＰＥＧ化一本鎖二重特異性抗体より長い血液循環半減期を提供する。
【００４４】
式（Ｉａ）または（Ｉｂ）のＰＥＧ化二重特異性抗体は、ＰＥＧ末端官能基、例えばヒドロキシル、カルボキシル基等を末端分岐状へテロ二官能性基に変換して、末端分岐状へテロ二官能性ＰＥＧ、例えば末端分岐状マレイミド／アルキンヘテロ二官能性ＰＥＧを形成することを含む方法により作製され得る。本発明のいくつかの実施形態において、Ｐ部分は、式：
【００４５】
【化５】
2019537572.tif 000006
【００４６】
のＰＥＧから誘導され得、式中、１００００〜４００００または所望によりそれ以上の全分子量を有するポリマーを好ましく提供するためには、ｎは、約１０〜２３００の整数である。Ｂは、メチルまたは他の低分子量アルキル基または−ＣＨ２（ＣＨ２）ｍＦである。Ｂの限定されない例は、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、およびブチルを含む。Ｍは、０〜１０である。Ｆは、官能化、活性化および／または三官能性小分子化合物の結合が可能な末端官能基、例えばヒドロキシル、カルボキシル、チオール、ハライド、アミノ基等である。
【００４７】
本発明の別の実施形態において、方法はまた、代替の分岐状ＰＥＧを用いて行われてもよい。分岐状Ｐ部分は、式：
【００４８】
【化６】
2019537572.tif 000007
【００４９】
の化合物から誘導され得、式中、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールである。１００００〜４００００または所望によりそれ以上の全分子量を有するポリマーを好ましく提供するためには、ｍは、１超の整数である。Ｂは、メチルまたは他の低分子量アルキル基である。Ｌは、２つ以上のＰＥＧが結合する官能性連結部分である。そのような連結部分の例は、任意のアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、リシン、または１，３−ジアミノ−２−プロパノール、トリエタノールアミン、３つ以上の官能基が結合した任意の５または６員芳香環または脂肪族環等である。Ｓは、任意の非切断可能スペーサーである。Ｆは、末端官能基、例えばヒドロキシル、カルボキシル、チオール、アミノ基等である。ｉは、０または１である。ｉが０に等しい場合、式は、
【００５０】
【化７】
2019537572.tif 000008
【００５１】
となり、式中、ＰＥＧ、ｍ、ＢまたはＬの定義は、上記と同じ意味を有する。
【００５２】
関連した態様において、以下の式を有するマルチアームポリマー部分との複合体が提供される。
【００５３】
【化８】
2019537572.tif 000009
【００５４】
式中、Ｂは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのポリマーアームに連結するコアとして機能する。コアＢの構造は、対称的または非対称的な直鎖または環式であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｂは、飽和脂肪族基である。コアの１個以上の炭素が、酸素、硫黄または窒素等のヘテロ原子で置き換えられてもよい。コアＢは、ポリマーアームと一緒になった場合、ポリオール、ポリチオールまたはポリアミンの残基であってもよい。その例は、これらに限定されないが、グリセロール、トリメチロール−プロパン、ペンタエリスリトール、ソルビトール、およびグリセロールのオリゴマーを含む。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態において、マルチアームポリマー部分は、以下の式の構造から誘導され得る。
【００５６】
【化９】
2019537572.tif 000010
【００５７】
式中、１００００〜４００００または所望によりそれ以上の全分子量を有するポリマーを好ましく提供するためには、ｎは、約１０〜１２００の整数であり、ｍは、整数であり、２以上である。Ｆは、末端官能基、例えばヒドロキシル、カルボキシル、チオール、アミノ基等である。Ｂは、２つ以上のＰＥＧが結合した非官能性連結部分である。Ｂの構造は、対称的または非対称的な直鎖または環式飽和脂肪族基であってもよく、Ｂの１個以上の炭素が、酸素、硫黄または窒素等のヘテロ原子で置き換えられてもよい。
【００５８】
本発明の方法はまた、代替のポリマー物質、例えばデキストラン、炭水化物系ポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコールまたは他の同様の非免疫原性ポリマーを用いて行われてもよく、その末端基は、ヘテロ二官能性基に変換されるように官能化または活性化され得る。上記のリストは単に例示であり、本明細書における使用に好適な非抗原性ポリマーの種類を限定することを意図しない。
【００５９】
三官能性リンカーＴ
Ｔは、Ｐ、（Ｌ１）ａおよび（Ｌ２）ｂに接続する三官能性リンカーを表す。Ｔは、３つの官能基の任意の組合せを有する分子から誘導され得、その限定されない例は、ヒドロキシル、アミノ、ヒドラジニル、カルボキシル、チオールおよびハライドを含む。官能基は、三官能性リンカー内で同じまたは異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、官能基の１つまたは２つは、他の反応パートナーとの選択的結合を達成するために保護されてもよい。例えばＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｂｙ  Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を含む文献において、様々な保護基が知られている。官能基はまた、Ｔと別の反応パートナーとの間の反応の前または後に、他の基に変換されてもよい。例えば、ヒドロキシル基は、メシレートまたはトシレート基に変換されてもよい。ハライドは、アジド基で置換されていてもよい。Ｔの酸官能基は、末端アルキンを有するアミノ基とのカップリングによってアルキン官能基に変換されてもよい。
【００６０】
例示的実施形態において、Ｔは、リシン、１，３−ジアミノ−２−プロパノール、またはトリエタノールアミンから誘導される。これらの分子上の官能基の１つ以上が、選択的反応のために保護されてもよい。いくつかの実施形態において、Ｔは、ＢＯＣ−保護リシンから誘導される。
【００６１】
二官能性リンカーＬ１およびＬ２
リンカーＬ１およびＬ２は両方とも、リンカー鎖、内部連結および／または末端連結を含む。リンカー鎖および／または連結（内部もしくは末端）は、−（ＣＨ２）ａＣ（Ｏ）ＮＲ１（ＣＨ２）ｂ−、−（ＣＨ２）ａＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｃ−、−（ＣＨ２）ａヘテロ環−、−（ＣＨ２）ａＣ（Ｏ）−、および−（ＣＨ２）ａＮＲ１−、−ＣＲ１＝Ｎ−ＮＲ１−、−ＣＲ１＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＲ１＝Ｎ−ＮＲ２−ＣＯ−、−Ｎ＝Ｎ−ＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−から独立して選択され、式中、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ、０〜２５から選択される整数であり、全ての部分単位が含まれ、Ｒ１およびＲ２は、水素またはＣ１〜Ｃ１０アルキルを独立して表す。
【００６２】
リンカーＬ１およびＬ２内のヘテロ環連結基（内部位置か末端位置かを問わず）は、マレイミド系部分から誘導され得る。好適な前駆体の限定されない例は、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）を含む。
【００６３】
いくつかの他の限定されない例示的実施形態において、各リンカー単位は、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）、またはＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）から選択されるハロアセチル系部分から誘導されてもよい。
【００６４】
代替として、リンカーのヘテロ環連結基は、異なるリンカー部分の複合体から形成されるテトラゾリルまたはトリアゾリルであってもよい。したがって、ヘテロ環基はまた、連結点として機能する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、（Ｌ１）ａおよび（Ｌ２）ｂはそれぞれ、
Ｘ１−（ＣＨ２）ａＣ（Ｏ）ＮＲ１（ＣＨ２）ｂＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｃ（ＣＨ２）ｄＣ（Ｏ）−または
Ｘ３−（ＣＨ２）ａＣ（Ｏ）ＮＲ１（ＣＨ２）ｂＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｃ（ＣＨ２）ｄＸ２（ＣＨ２）ｅＮ  Ｒ２を含み、
式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、同じまたは異なり、独立してヘテロ環基を表してもよく；
ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは、それぞれ、１〜２５から選択される整数であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素またはＣ１〜Ｃ１０アルキルを表す。
【００６６】
いくつかの実施形態において、Ｘ１および／またはＸ３は、マレイミド系部分から誘導される。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、トリアゾリルまたはテトラゾリル基を表す。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ水素を表す。いくつかの実施形態において、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは、それぞれ独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択される。
【００６７】
連結基
本発明の複合体の異なる部分は、様々な化学的連結により接続され得る。その例は、これらに限定されないが、アミド、エステル、ジスルフィド、エーテル、アミノ、カルバメート、ヒドラジン、チオエーテル、およびカーボネートを含む。例えば、ＰＥＧ部分（Ｐ）の末端ヒドロキシル基は、活性化され、次いでリシン（Ｔ）と結合して、式ＩａまたはＩｂのＰとＴとの間に望ましい連結点を提供し得る。一方で、ＴとＬ１またはＬ２との間の連結基は、リンカーＬ１またはＬ２のアミノ基とリシン（Ｔ）のカルボキシル基との間の反応から得られるアミドであってもよい。また、複合体の所望の特性に依存して、抗体部分（Ａ）と隣接リンカー（Ｌ１またはＬ２）との間、およびＬ１またはＬ２の個々のリンカーの間またはその中に好適な連結基が組み込まれてもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態において、複合体の異なる部分の間の連結基は、互いの固有の化学親和性または選択性を有する官能基の対のカップリングから誘導されてもよい。これらの種類のカップリングまたは環形成は、特定のタンパク質または抗体部分の導入のための部位特異的結合を可能にする。部位特異的結合をもたらすこれらの官能基の限定されない例は、チオール、マレイミド、２’−ピリジルジチオ変異体、芳香族またはビニルスルホン、アクリレート、ブロモまたはヨードアセトアミド、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）、カルボニル、２−アミノ−ベンズアルデヒドまたは２−アミノ−アセトフェノン基、ヒドラジド、オキシム、カリウムアシルトリフルオロボレート、Ｏ−カルバモイルヒドロキシルアミン、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、テトラジン、およびトリアリールホスフィンを含む。
【００６９】
合成
合成の重要なステップは、以下の実施形態により例示され得る。所望のＰＥＧが選択されたら、ＰＥＧの末端官能基、例えばヒドロキシル、カルボキシル基等は、当技術分野において認識されている任意のプロセスを使用して末端分岐状ヘテロ二官能性基に変換される。大まかに説明すると、末端分岐状ヘテロ二官能性ＰＥＧ、例えば末端分岐状ヘテロ二官能性マレイミド／アルキンＰＥＧは、末端ヒドロキシル基の場合にはジ（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネート（ＤＳＣ）、トリホスゲン等の試薬を使用して、または末端カルボキシル基の場合には例えばΝ，Ν’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等のカップリング試薬を使用して、例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ピリジン等の塩基の存在下でＰＥＧの末端ヒドロキシルまたはカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化し、活性化ＰＥＧを形成することにより調製される。
【００７０】
次に、活性化ＰＥＧは、ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥ）等の塩基の存在下、リシン誘導体Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ等の三官能性小分子と反応し、遊離カルボキシル基およびＢｏｃ保護アミノ基を有する末端分岐状へテロ二官能性ＰＥＧを形成する。当業者により認識されるように、所望により同じ目的で、例えばハライド、アミノ、チオール基等のＰＥＧの他の知られている末端官能基、および他の知られている三官能性小分子が代替として使用されてもよい。三官能性小分子の例は、３つの官能基（ＮＨ２、ＮＨＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＯＨ、Ｃ＝ＯＸ、Ｎ＝Ｃ＝Ｘ、Ｓ、無水物、ハライド、マレイミド、Ｃ＝Ｃ、Ｃ≡Ｃ等）またはそれらの保護型の任意の組合せを含む分子を含む。
【００７１】
次いで、末端分岐状カルボキシル／Ｂｏｃアミノヘテロ二官能性ＰＥＧは、１−アミノ−３−ブチンまたはＮＨ２−ＤＢＣＯ等のアルキン基を有する小分子スペーサーとのカップリングにより、末端分岐状アルキン／Ｂｏｃアミノヘテロ二官能性ＰＥＧに変換される。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）等の酸での末端分岐状アルキン／Ｂｏｃアミノヘテロ二官能性ＰＥＧの処理によって、末端分岐状アルキン／アミンヘテロ二官能性ＰＥＧが生じる。末端分岐状アルキン／アミンヘテロ二官能性ＰＥＧを、ＮＨＳ−ＰＥＧ２−マレイミド等のマレイミド基を有する別の小分子スペーサーと反応させることにより、標的末端分岐状アルキン／マレイミドヘテロ二官能性ＰＥＧが得られる。この末端分岐状アルキン／マレイミドヘテロ二官能性ＰＥＧは、チオールタグ化抗体およびアジドタグ化抗体との連続した部位特異的結合が可能である。
【００７２】
別個に、２つの一本鎖抗体（ＳＣＡ）断片、抗ＣＤ３（ＳＣＡＣＤ３）および抗ＣＤ１９（ＳＣＡＣＤ１９）は、当技術分野において知られている様々な技術を使用して生成され得る。一例において、それらは、ｐＰＩＣＺベクターを含むＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｕｓ）における組換えＤＮＡ技術により作製される。抗ＣＤ３  ＶＨ−ＶＬおよび抗ＣＤ１９  ＶＬ−ＶＨ等の抗体の遺伝子が、ｐＰＩＺＡ発現ベクター内に合成およびクローン化され、Ｐ．パストリスＸ３３株において形質転換される。メタノールによりＳＣＡの発現が誘引され、Ｎｉキレート樹脂により精製される。その後の結合を促進するために、チオール等の部位特異性官能基が、組換えＤＮＡ技術により、一本鎖抗体のＶＨとＶＬとの間のリンカーに挿入される（Ｙａｎｇ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １６（１０）：７６１−７７０）。クロマトグラフィープロセスにより、純粋なＳＣＡが得られる。当業者に理解されるように、所望により同じ目的で、他の知られている部位特異性官能基が、組換えＤＮＡ技術により、ＳＣＡのＶＨとＶＬとの間のリンカーに代替として挿入されてもよい。
【００７３】
ＰＥＧ化一本鎖二重特異性抗体を調製するために、末端分岐状アルキン／マレイミドヘテロ二官能性ＰＥＧは、遺伝子的に挿入されたＳＣＡＣＤ３の遊離チオール官能基と部位特異的に反応され、ＰＥＧ−（ＳＣＡＣＤ３）−アルキンをもたらし、一方、ＳＣＡＣＤ１９は、小分子アジド／マレイミド二官能性リンカーと部位特異的に結合され、アジド−ＳＣＡＣＤ１９をもたらす。精製されたアジド−ＳＣＡＤＣＤ１９および精製されたＰＥＧ−（ＳＣＡＣＤ３）−アルキンは、アジド−アルキンクリックケミストリーにより部位特異的に反応され、標的ＰＥＧ化一本鎖二重特異性抗体ＰＥＧ−ＳＣＡＣＤ３／ＳＣＡＣＤ１９を形成する。
【００７４】
本発明において使用されるチオール／マレイミドおよびアジド／アルキン部位特異性結合基対に加えて、当業者に認識されるように、他の知られている部位特異性結合基の対、例えばチオール／２’−ピリジルジチオ対、チオール／スルホン対、ＤＢＣＯ／アジド対、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン／テトラジン対、カルボニル／ヒドラジド対、カルボニル／オキシム対、アジド／トリアリールホスフィン対、カリウムアシルトリフルオロボレート／Ｏ−カルバモイルヒドロキシルアミン対が、同様に設計され、所望により同じ目的で代替として使用され得る。部位特異性結合基対の上記のリストは単に例示であり、本明細書における使用に好適な部位特異性結合基対の種類を限定することを意図しない。
【００７５】
用語の定義
「アルキル」という用語は、本明細書で使用される場合、典型的には長さが約１〜２５原子の範囲の炭化水素鎖を指す。そのような炭化水素鎖は、必須ではないが好ましくは飽和しており、分岐状または直鎖であってもよいが、典型的には直鎖が好ましい。Ｃ１〜１０アルキルという用語は、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０個の炭素を有するアルキル基を含む。同様に、Ｃ１〜２５アルキルは、１〜２５個の炭素を有する全てのアルキルを含む。例示的なアルキル基は、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、２−メチル−１−ブチル、３−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル等を含む。本明細書で使用される場合、「アルキル」は、３個以上の炭素原子が言及される場合、シクロアルキルを含む。別段に指定されない限り、アルキルは、置換または非置換であってもよい。
【００７６】
「官能基」という用語は、本明細書で使用される場合、結合する実体と、典型的にはさらなる官能基を有する別の実体との間の共有結合的連結を形成するために、有機合成の通常条件下で使用され得る基を指す。「二官能性リンカー」は、２つの官能基を有するリンカーが、複合体の他の部分と２つの連結を形成することを指す。
【００７７】
「誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、新たな官能基を導入するために、または元の化合物の特性を調整するために追加の構造部分を有する化学修飾された化合物を指す。
【００７８】
「保護基」という用語は、本明細書で使用される場合、ある特定の反応条件下で分子内の特定の化学反応性官能基の反応を防止またはブロックする部分を指す。様々な保護基が当技術分野において周知であり、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９およびＰ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｔｈｉｅｍｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３、ならびにそれらに引用されている参考文献に記載されている。
【００７９】
「ＰＥＧ」または「ポリ（エチレングリコール）」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリ（エチレンオキシド）を指す。本発明における使用のためのＰＥＧは、典型的には、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−の構造を備える。ＰＥＧは、様々な分子量、構造または形状を有し得る。ＰＥＧ基は、典型的な合成反応条件下では容易には化学転換を生じない封止基を備えてもよい。封止基の例は、−ＯＣ１−２５アルキルまたは−Ｏアリールを含む。
【００８０】
「リンカー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体およびポリマー部分等の相互接続部分を連結するために使用される原子または原子の集合を指す。リンカーは、切断可能または非切断可能であってもよい。複合体のための様々なリンカーの調製は、例えば、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ：Ｆｒｏｍ  Ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，ｉｎ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｎ  ＡＤＣ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＧＬ；  Ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１３）を含む文献において説明されている。切断可能なリンカーは、ある特定の生物学的または化学的条件下で切断され得る基または部分を組み込む。その例は、酵素的に切断可能なジスルフィドリンカー、１，４−または１，６−ベンジル除去、トリメチルロック系、ビシンベースの自己切断可能な系、酸不安定性シリルエーテルリンカーおよび他の光不安定性リンカーを含む。
【００８１】
「連結性基」または「連結基」という用語は、本明細書で使用される場合、化合物または複合体の異なる部分を接続する官能基または部分を指す。連結性基の例は、これらに限定されないが、アミド、エステル、カルバメート、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ヒドラゾン、オキシム、およびセミカルバジド、カルボジイミド、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基を含む。例えば、リンカー部分およびポリマー部分は、アミドまたはカルバメート連結基を介して互いに接続され得る。
【００８２】
「複数アーム」または「マルチアーム」という用語は、本明細書で使用される場合、形状を指し、またはポリマーの全体的構造は、「コア」分子または構造に接続された２つ以上のポリマー含有「アーム」を有するポリマーを指す。したがって、マルチアームポリマーは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれ以上のアームを有し得る。
【００８３】
ＩＩ．多重特異性分子および抗体
本発明は、２つ以上の異なる認識特異性を有する多重特異性分子を包含する。本発明の多重特異性分子は、中でも、第１の標的に結合する第１の認識結合部分、および第２の標的に結合する第２の認識結合部分を含む分子を指す。特定の実施形態において、認識結合部位の一方または両方が、抗体またはその抗原結合部分である。
【００８４】
抗体
本発明の多重特異性分子は、任意の単離された抗体、特にモノクローナル抗体、例えば異なる抗原またはエピトープに結合するヒトモノクローナル抗体を使用して作製され得る。好ましくは、抗体は、ヒト抗体であるが、抗体はまた、例えば、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはそれらの組合せであってもよい。
【００８５】
構造要素
モノクローナル抗体技術は、特異的結合性モノクローナル抗体またはその断片の形態での特異的結合性薬剤の生成を可能にする。モノクローナル抗体またはその断片を形成するためには、従来のハイブリドーマ技術を使用することができる。代替として、モノクローナル抗体またはその断片は、ｓｃＦｖ（一本鎖可変領域）、具体的にはヒトｓｃＦｖのファージライブラリを使用することにより得ることができる（例えば米国特許第５，８８５，７９３号明細書、国際公開第９２／０１０４７号、国際公開第９９／０６５８７号を参照されたい）。
【００８６】
一実施形態において、本発明の多重特異性分子における認識結合部分の少なくとも１つは、一価抗体断片である。一実施形態において、一価抗体断片は、モノクローナル抗体から得られる。一価抗体断片は、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、単一ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片を含む。したがって、一実施形態において、一価抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、単一ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片からなる群から選択される。一実施形態において、本明細書において開示される多重特異性分子の認識結合部分の少なくとも１つは、単一ドメイン抗体、またはｓｃＦｖまたはモノクローナル抗体のＦａｂ断片もしくはＦａｂ’断片である。
【００８７】
多重特異性分子における認識結合部分の１つ以上はまた、ジアボディまたは単一ドメイン抗体であってもよい。ジアボディは、二価または二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を有する抗体断片である（例えば、欧州特許第０４０４０９７号明細書、国際公開第９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９−１３４、およびＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３）６４４４−６４４８を参照されたい）。Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９−１３４に記載のようなトリアボディおよびテトラボディもまた、多重特異性分子における認識結合部分に使用され得る。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．；米国特許第６，２４８，５１６号明細書）。
【００８８】
多重特異性分子における認識結合部分は、Ｆｖであってもよく、これは、完全抗原結合部位を含有し、定常領域を含まない最小抗体断片である。ｓｃＦｖの考察については、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ（ｅｄｓ．），（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５、国際公開第９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号明細書、米国特許第５，５８７，４５８号明細書を参照されたい。一般に、６つの超可変領域（ＨＶＲ）が、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でも、その抗原を認識しそれに結合する能力を有する。
【００８９】
一実施形態において、一価抗体断片は、緊密な非共有結合的会合での１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる二本鎖Ｆｖ種である。一実施形態において、一価抗体断片は、柔軟なペプチドリンカーにより共有結合的に連結した１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインからなる一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種である。
【００９０】
抗体のＦａｂ断片は、重鎖および軽鎖可変ドメイン、ならびに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端におけるいくつかの残基の追加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’を示す。
【００９１】
抗体断片の生成には様々な技術が開発されている。従来、抗体断片は、全長抗体のタンパク質分解により得ることができる（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．２４（１９９２）１０７−１１７、Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（１９８５）８１−８３を参照されたい）。例えば、全長抗体のパパイン分解は、それぞれ単一抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、および残留「Ｆｃ」断片をもたらす。ある特定の抗体断片の考察については、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９−１３４を参照されたい。
【００９２】
抗体断片はまた、組換え手段により直接生成され得る。Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ抗体断片は、例えば大腸菌において発現およびそれから分泌され得、したがって大量のこれらの断片の容易な生成が可能となる。抗体断片は、標準的手順に従って抗体ファージライブラリから単離され得る。代替として、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収され得る（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０（１９９２）１６３−１６７）。哺乳動物細胞系もまた、発現に使用され得、また所望により抗体断片を分泌し得る。
【００９３】
標的
細胞表面分子および／またはそのリガンドに方向付けられたいくつかの治療抗体が知られている。これらの抗体は、多重特異性分子内の特別設計の特異的認識結合部分の選択および構築に使用され得る。その例は、ブリナツモマブ／ＢＬＩＮＣＹＴＯリツキサン／ＭａｂＴｈｅｒａ／リツキシマブ、Ｈ７／オクレリズマブ、Ｚｅｖａｌｉｎ／イブリツモマブ、Ａｒｚｅｒｒａ／オファツムマブ（ＣＤ２０）、ＨＬＬ２／エプラツズマブ、イノツゾマブ（ＣＤ２２）、Ｚｅｎａｐａｘ／ダクリズマブ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ／バシリキシマブ（ＣＤ２５）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ／トラスツズマブ、ペルツズマブ（Ｈｅｒ２／ＥＲＢＢ２）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ／ゲムツズマブ（ＣＤ３３）、Ｒａｐｔｉｖａ／エファリズマブ（Ｃｄ１１ａ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ／セツキシマブ（ＥＧＦＲ、上皮成長因子受容体）、ＩＭＣ−１１２１Ｂ（ＶＥＧＦ受容体２）、Ｔｙｓａｂｒｉ／ナタリズマブ（ａ４β１およびα４β７インテグリンのα４−サブユニット）、ＲｅｏＰｒｏ／アブシキシマブ（ｇｐＩＩｂ−ｇｐＩＩａおよびαｖβ３−インテグリン）、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３／ムロモナブ−ＣＤ３（ＣＤ３）、Ｂｅｎｌｙｓｔａ／べリムマブ（ＢＡＦＦ）、Ｔｏｌｅｒｘ／オテリキシマブ（ＣＤ３）、Ｓｏｌｉｒｉｓ／エクリズマブ（Ｃ５補体タンパク質）、Ａｃｔｅｍｒａ／トシリズマブ（ＩＬ−６Ｒ）、Ｐａｎｏｒｅｘ／エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ、上皮細胞接着分子）、ＣＥＡ−ＣＡＭ５／ラベツズマブ（ＣＤ６６／ＣＥＡ、がん胎児性抗原）、ＣＴ−１１（ＰＤ−１、プログラム死−１  Ｔ細胞阻害受容体、ＣＤ−ｄ２７９）、Ｈ２２４Ｇ１１（ｃ−Ｍｅｔ受容体）、ＳＡＲ３４１９（ＣＤ１９）、ＩＭＣ−Ａ１２／シクスツムマブ（ＩＧＦ−１Ｒ、インスリン様成長因子１受容体）、ＭＥＤＩ−５７５（ＰＤＧＦ−Ｒ、血小板誘導成長因子受容体）、ＣＰ−６７５、２０６／トレメリムマブ（細胞毒性Ｔリンパ球抗原４）、ＲＯ５３２３４４１（胎盤成長因子またはＰＧＦ）、ＨＧＳ１０１２／マパツムマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、ＳＧＮ−７０（ＣＤ７０）、ベドチン（ＳＧＮ−３５）／ブレンツキシマブ（ＣＤ３０）、およびＡＲＨ４６０−１６−２（ＣＤ４４）を含む。
【００９４】
本明細書において開示される多重特異性結合分子／多重特異性抗体は、例えば、腫瘍性疾患、心臓血管疾患、感染性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝（例えば内分泌系）疾患、または神経（例えば神経変性）疾患の処置用の医薬の調製に使用され得る。これらの疾患の例示的な限定されない例は、アルツハイマー病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性および慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、急性および慢性骨髄性白血病、Ｔ細胞リンパ腫および白血病、多発性骨髄腫、神経膠腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、癌腫（例えば口腔、消化管、結腸、胃、肺気道、乳、卵巣、前立腺、子宮、子宮内膜、子宮頸、膀胱、膵臓、骨、肝臓、胆嚢、腎臓および精巣）、黒色腫、肉腫、神経膠腫、および皮膚がん、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グットパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー（Ｗｅｇｅｎｅｒ）肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ロウ、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸状体腎炎、乾癬、または繊維化肺胞炎である。
【００９５】
いくつかの細胞表面マーカーおよびそのリガンドが知られている。例えば、がん細胞は、これらに限定されないが、炭酸脱水酵素ＩＸ、アルファ−フェトプロテイン、アルファ−クチニン−４、Ａ３（Ａ３３抗体に特異的な抗原）、ＡＲＴ−４、Ｂ７−１、Ｂ７−Ｈ１、Ｂａ−７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ８、ＣＤ１−１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１−α、直腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ＧＲＯＢ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２または１ａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４抗原、ＫＳ−１抗原、ＫＳ  １−４、ＬＡＧ３、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、膵臓がんムチン、ＰＤ−１およびその受容体、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、Ｐ１ＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、５１００、スルビビン、スルビビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン−ドメイン含有−３）、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管形成マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、ｃＭＥＴ、がん遺伝子マーカーおよびがん遺伝子産物を含む細胞表面マーカーおよび／またはリガンドの少なくとも１つを発現することが報告されている（例えば、Ｓｅｎｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２（２００６）５０２３−５０３２、Ｐａｒｍｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８（２００７）１９７５−１９７９、Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４（２００５）１８７−２０７を参照されたい）。したがって、そのような特定の細胞表面受容体またはそのリガンドを認識する抗体は、疾患に関連したいくつかの／多数の細胞表面マーカーまたはリガンドを標的化およびそれに結合する、本発明の多重特異性分子における特異的および選択的認識結合分子に使用され得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、がん／腫瘍の処置のために、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ，「Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ」，ｉｎ  Ｆｌｅｉｓｈｅｒ  ｅｄ．，「Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ」，ｐａｇｅ  ３４７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，１９７９）、ならびに米国特許第４，１５０，１４９号明細書、米国特許第４，３６１，５４４号明細書、および米国特許第４，４４４，７４４号明細書において報告されているものを標的化する多重特異性結合分子／多重特異性抗体が使用される。
【００９７】
腫瘍関連抗原に関する報告は、Ｍｉｚｕｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１１（２００５）９９２−９９７、Ｈａｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ５（２００５）２２９−２４８、Ｖａｌｌｂｏｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３（２００５）３５３６−３５４４、およびＲｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２４２（２００５）５５−６３）を含み、これらはそれぞれ、特定されるＴＡＡに関して参照することにより本明細書に組み込まれる。疾患がリンパ腫、白血病または自己免疫障害を含む場合、標的化される抗原は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５４、ＣＤ６７、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＸＣＲ４、Ｂ７、ＭＵＣ１または１ａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、Ｐ１ＧＦ、ＥＤ−Ｂ  フィブロネクチン、がん遺伝子、がん遺伝子産物（例えばｃ−ｍｅｔまたはＰＬＡＧＬ２）、ＣＤ６６ａ−ｄ、壊死抗原、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＧ、ＩＬ−６、ＭＩＦ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）からなる群から選択され得る。
【００９８】
上述の抗原に対する抗体は、本発明の二重特異性抗体を作製するための結合部位または部分として使用され得る。２つの異なる標的に対していくつかの二重特異性抗体が作製され得る。
【００９９】
抗原対の例は、ＣＤ１９／ＣＤ３、ＢＣＭＡ／ＣＤ３、組合せとしてのＨＥＲファミリーの異なる抗原（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３）、ＩＬ１７ＲＡ／ＩＬ７Ｒ、ＩＬ−６／ＩＬ−２３、ＩＬ−１−β／ＩＬ−８、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒ、ＡＮＧ２／ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦＲ−ベータ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体２／ＣＤ３、ＰＳＭＡ／ＣＤ３、ＥＰＣＡＭ／ＣＤ３、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＬＴ３、ｃ−ＦＭＳ／ＣＳＦ１Ｒ、ＲＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＣＲ、インテグリン、およびＭＭＰからなる群から選択される抗原と、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、およびアンジオポイエチンからなる群から選択される水溶性リガンドとの組合せ、ＥＲＢＢ−３／Ｃ−ＭＥＴ、ＥＲＢＢ−２／Ｃ−ＭＥＴ、ＥＧＦ受容体１／ＣＤ３、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３、ＰＳＣＡ／ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ／ＣＤ３、ＥＮＤＯＳＩＡＬＩＮ／ＣＤ３、ＥＰＣＡＭ／ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ／ＣＤ３、ＦＡＰＡＬＰＨＡ／ＣＤ３、ＥＧＦＲ／ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ  １７Ａ／Ｆ、ＥＧＦ受容体１／ＣＤ３、ならびにＣＤ１９／ＣＤ１６を含む。二重特異性抗体のさらなる例は、（ｉ）Ｌｅｗｉｓ  ｘ−、Ｌｅｗｉｓ  ｂ−およびＬｅｗｉｓ  ｙ−構造、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−構造、ＫＨ１、Ｔｎ抗原、ＴＦ抗原およびムチンの炭水化物構造、ＣＤ４４、糖脂質およびスフィンゴ糖脂質、例えばＧｇ３、Ｇｂ３、ＧＤ３、ＧＤ２、Ｇｂ５、Ｇｍ１、Ｇｍ２、およびシアリルテトラオシルセラミドからなる群から選択される抗原のグリコエピトープに方向付けられた第１の特異性、ならびに（ｉｉ）ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる群から選択されるＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼに方向付けられた第２の特異性を有し得る。第２の抗原結合部位と組み合わせたＧＤ２は、Ｔリンパ球ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、間充織幹細胞、神経幹細胞からなる群から選択される免疫細胞に関連している。
【０１００】
多重特異性抗体を作製するために、一特異性または二重特異性抗体は、本明細書において開示される方法を使用して別の一特異性または二重特異性抗体と連結されてもよい。すでに利用可能な一特異性または二重特異性治療結合実体、例えば上述の治療抗体を使用することにより、必要な多重特異性結合分子の迅速で容易な生成が達成され得る。２つ以上の異なるエピトープへの同時の標的化および結合のために２つ以上の単一治療分子を組み合わせることによる多重特異性治療薬のこの特別設計の生成によって、単一治療分子と比較して相加的／相乗的効果が期待され得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本発明の多重特異性分子は、以下の標的対に特異的に相互作用し、それに対する測定可能な親和性を示す抗体対を使用して作製される。
【０１０２】
【表１−１】
2019537572.tif 000011
【０１０３】
【表１−２】
2019537572.tif 000012
【０１０４】
好ましい実施形態において、二重特異性分子は、それぞれＣＤ３およびＣＤ１９に特異的に相互作用し、それらに対する測定可能な親和性を示す２つの抗体またはその抗原結合断片の複合体である。抗体はそれぞれ、１×１０−６Ｍ以下、例えば１×１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１×１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ以下のＫＤ、または１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０Ｍの間のＫＤでヒトＣＤ３またはＣＤ１９に結合する。抗原に対する抗体の結合能力を評価するためのアッセイは当技術分野において知られており、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびＲＩＡを含む。抗体の結合反応速度（例えば結合親和性）はまた、当技術分野において知られている標準的アッセイ、例えばＢｉａｃｏｒｅ分析により評価され得る。
【０１０５】
ある特定の実施形態において、第１または第２の認識結合部分は、対象抗体の重鎖および軽鎖、または対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。例えば、各認識結合部分は、一本鎖抗体Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）であってもよい。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステムを使用して記述される（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。以下に列挙されるのは、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖおよび抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
【０１０６】
【化１０】
2019537572.tif 000013
【０１０７】
【化１１】
2019537572.tif 000014
【０１０８】
修飾
いくつかの実施形態において、抗体のＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、上記の配列に対して８２％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同性であってもよく、また対応する抗原結合活性および特異性を維持し得る。上記の配列のＶＨおよびＶＬ領域に対する高い（すなわち８０％以上の）相同性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、上述の重鎖および軽鎖、または関連したＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をコードする核酸分子の突然変異生成（例えば部位特異的またはＰＣＲ媒介突然変異生成）に続き、本明細書に記載の機能アッセイを使用して保持された機能についてコードされた改変抗体を試験することにより得ることができる。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列間のパーセント相同性は、２つの配列間のパーセント同一性と等価である。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮した、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある配列により共有される同一位置の数の関数（すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×１００）である。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、以下の限定されない例に記載のような数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【０１１０】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびにギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さ重み１、２、３、４、５、または６を使用して決定され得る。
【０１１１】
追加的に、または代替的に、本発明のタンパク質配列は、例えば関連配列を同定するべく公開データベースでの検索を実行するために、「クエリ配列」としてさらに使用され得る。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明の抗体分子に相同性のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３を用いて行うことができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載のＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータが使用され得る（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、本発明の認識結合部分は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、これらのＣＤＲ配列の１つ以上は、本明細書に記載の好ましい抗体に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を含み、抗体は、所望の機能的特性を保持する。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に著しく影響しない、またはそれを変更しないアミノ酸修飾を指す。そのような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当技術分野において知られている標準的技術、例えば部位特異的突然変異生成およびＰＣＲ媒介突然変異生成により、本発明の抗体に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、以下を含む。
【０１１４】
塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）を有するアミノ酸、
酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、
非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、
非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、
ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および
芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。
【０１１５】
したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えられ得、改変された抗体は、本明細書に記載の機能アッセイを使用して保持された機能に関して試験され得る。
【０１１６】
本発明の認識結合部分は、改変抗体の操作のための出発材料として、本明細書において開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列の１つ以上を有する抗体を使用して調製され得、改変抗体は、出発抗体から改変された特性を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内および／または１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することにより操作され得る。追加的または代替的に、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能（複数可）を改変するために、定常領域（複数可）内の残基を修飾することにより操作され得る。
【０１１７】
行うことができる可変領域操作の１つの種類は、ＣＤＲグラフト化である。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖ＣＤＲ内に位置するアミノ酸残基により標的抗体と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間で多様である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体−抗原相互作用を担うため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列上にグラフトされた特定の天然抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄを参照されたい。Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，２２５，５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎらに対する米国特許第５，５３０，１０１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
【０１１８】
そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは刊行された参考文献から入手することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで利用可能）、ならびにＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）「Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ」  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８、およびＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）「Ａ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ」  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６に見出すことができ、これらの内容はそれぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに見出すことができる。
【０１１９】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内に形成される修飾に加えて、またはその代替として、本発明の抗体は、典型的には、抗体の１つ以上の機能的特性、例えば血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞毒性を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作されてもよい。さらに、本発明の抗体は、同じく抗体の１つ以上の機能特性を改変するために、化学修飾されてもよく（例えば、１つ以上の化学部分が抗体に結合されてもよい）、またはそのグリコシル化を改変するように修飾されてもよい。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵ指数の番号付けである。
【０１２０】
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化は修正されてもよい。グリコシル化は、例えば、抗原またはＦｃ受容体に対する抗体の親和性を増加または減少させるように改変され得る。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を改変することにより達成され得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによりその部位でのグリコシル化を排除する、１つ以上のアミノ酸置換が形成されてもよい。そのようなアプローチは、米国特許第８，００８，４４９号明細書および同第６，３５０，８６１号明細書においてより詳細に説明されている。
【０１２１】
エフェクター
いくつかの実施形態において、多重特異性化合物または分子は、１つ以上のエフェクター部分、例えば細胞毒性薬剤、例えば化学治療剤または薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、あるいは放射性同位体にさらに結合されてもよい。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、エフェクター部分は、これらに限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号明細書、米国特許第５，４１６，０６４号明細書、欧州特許第０４２５２３５号明細書）、オーリスタチン、例えばモノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ、米国特許第５，６３５，４８３号明細書、米国特許第５，７８０，５８８号明細書、米国特許第７，４９８，２９８号明細書を参照されたい）、ドラスタチン、カリケアミシン、またはそれらの誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号明細書、米国特許第５，７１４，５８６号明細書、米国特許第５，７３９，１１６号明細書、米国特許第５，７６７，２８５号明細書、米国特許第５，７７０，７０１号明細書、米国特許第５，７７０，７１０号明細書、米国特許第５，７７３，００１号明細書、米国特許第５，８７７，２９６号明細書、Ｈｉｎｍａｎ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３（１９９３）３３３６−３３４２、Ｌｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１９９８）２９２５−２９２８を参照されたい）、アントラサイクリン、例えばダウノマイシンまたはドキソルビシン（Ｋｒａｔｚ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３（２００６）４７７−５２３、Ｊｅｆｆｒｅｙ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６（２００６）３５８−３６２、Ｔｏｒｇｏｖ，Ｍ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１６（２００５）７１７−７２１、Ｎａｇｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（２０００）８２９−８３４、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２（２００２）１５２９−１５３２、Ｋｉｎｇ，Ｈ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（２００２）４３３６−４３４３、および米国特許第６，６３０，５７９号明細書を参照されたい）、メトトレキセート、ビンデシン、タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセル、トリコテセン、およびＣＣ１０６５を含む薬物であってもよい。
【０１２３】
他の実施形態において、エフェクター部分は、これらに限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）起源）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコセセンス（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含む、酵素活性毒素またはその断片であってもよい。
【０１２４】
さらにいくつかの他の実施形態において、エフェクター部分は、放射性原子であってもよい。放射性複合体の生成には、様々な放射性同位体が利用可能である。その例は、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体を含む。検出に放射性複合体が使用される場合、これは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＴｃ９９もしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化、ＭＲＩ）用のスピン標識、例えば同じくＩ１２３、Ｉ１３１、Ｉｎ１１１、Ｆ１９、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄を含み得る。
【０１２５】
エフェクター部分は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド成分（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素成分（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して、本明細書において開示される多重特異性化合物または分子の任意の成分に結合され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８（１９８７）１０９８−１１０４に記載のように調製され得る。炭素１４標識化１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、錯体への放射性ヌクレオチドの結合のための例示的キレート剤である（国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい）。本明細書において報告されるように毒性部分を錯体に結合するためのリンカーは、細胞内の細胞毒性薬の放出を促進する「切断可能性リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２（１９９２）１２７−１３１、米国特許第５，２０８，０２０号明細書）が使用され得る。
【０１２６】
エフェクター部分は、本明細書において開示される多重特異性化合物または分子に結合され得るが、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがそれらに限定されない、市販（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、Ｕ．Ｓ．Ａ製）の架橋試薬を用いて調製されるそのような複合体に限定されない。
【０１２７】
組成物
本発明はまた、薬学的に許容される担体と共に製剤化された、本発明の多重特異性分子を含有する組成物、例えば薬学的組成物を提供する。例えば、本発明の薬学的組成物は、ＣＤ１３およびＣＤ９の両方に結合する多重特異性分子を含んでもよい。
【０１２８】
本発明の治療製剤は、所望の純度を有する多重特異性分子を任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製され得る。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン；モノサッカリド、ジサッカリド、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０１２９】
製剤はまた、処置されている特定の適応症に必要な場合には２種以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。例えば、製剤は、別の抗体、細胞毒性薬剤、または化学治療薬剤をさらに含んでもよい。そのような分子は、好適には、意図される目的に効果的な量で組み合わせて存在する。
【０１３０】
活性成分はまた、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションにおいて、例えばコアセルベーション技術により、または界面重合により、好ましいマイクロカプセル内に、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に捕捉されていてもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）において開示されている。
【０１３１】
持続放出調製物が調製されてもよい。持続放出調製物の好適な例は、多重特異性分子を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを含み、このマトリックスは、成形物、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射用ミクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸等のポリマーは、１００日を超える期間分子の放出を可能にするが、ある特定のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。カプセル化された抗体が長期間体内に残留する場合、それらは３７℃での水分への曝露の結果、変性または凝集し、生物学的活性の喪失および可能な免疫原性の変化をもたらし得る。関与する機序に応じて、安定化のために合理的な戦略が考案され得る。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の使用、および特定のポリマーマトリックス組成物の開発により達成され得る。
【０１３２】
本発明の薬学的組成物は、併用療法において投与されてもよく、すなわち他の薬剤と組み合わされてもよい。併用療法において使用され得る治療薬剤の例は、以下により詳細に記載される。
【０１３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成され得る。無菌注射溶液は、必要に応じて上で列挙された成分の１つまたは組合せと共に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、続いて滅菌精密濾過を行うことにより調製され得る。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上に列挙されたものからの必要なその他の成分を含有する無菌ビヒクルに、活性化合物を導入することにより調製される。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）であり、これにより、活性成分と、以前に滅菌濾過されたその溶液からの追加的な任意の所望の成分との粉末が得られる。
【０１３４】
用量
単回投薬形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置されている対象および特定の投与形態に依存して変動する。単回投薬形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生成する組成物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲である。
【０１３５】
投薬計画は、最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように調節される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割用量が経時的に投与されてもよく、または、用量は、治療状況の要件により示されるように比例的に低減もしくは増加されてもよい。投与の容易性、および投薬の均一性のために、投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用されるような投薬単位形態は、処置される対象への単一用量として好適な、物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果を生成するように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位形態の明細は、（ａ）活性化合物の独特の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためのそのような活性化合物の配合技術に固有の制限により決定付けられ、またそれらに直接依存する。
【０１３６】
本発明の多重特異性分子の投与に関して、用量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（ホスト体重）、より通常では０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ（体重）、１ｍｇ／ｋｇ（体重）、３ｍｇ／ｋｇ（体重）、５ｍｇ／ｋｇ（体重）もしくは１０ｍｇ／ｋｇ（体重）であってもよく、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。例示的な処置計画は、週２回、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月１回、３ヶ月に１回、または３ヶ月〜６ヶ月に１回の投与を伴う。本発明の多重特異性分子の好ましい投薬計画は、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ（体重）または３ｍｇ／ｋｇ（体重）を含み、付与される多重特異性分子は、以下の投薬スケジュールの１つを用いて付与される：（ｉ）４週間に１回で６回の投薬、次いで３ヶ月に１回；（ｉｉ）３週間に１回；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ（体重）を１回、続いて１ｍｇ／ｋｇ（体重）を３週間に１回。
【０１３７】
代替として、多重特異性分子は、持続放出製剤として投与されてもよく、その場合、より少ない頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における多重特異性分子の半減期に依存して変動する。一般に、ヒト抗体が最長の半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。用量および投与頻度は、処置が予防的か治療的かに依存して変動し得る。予防用途においては、長期間にわたり比較的低頻度の間隔で比較的低い用量が投与される。一部の患者は、生涯処置を受け続ける。治療用途においては、疾患の進行が低減または停止されるまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い用量が必要となることがある。その後、患者に予防計画が施されてもよい。
【０１３８】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、患者に有毒となることなく特定の患者、組成、および投与形態に対して所望の治療反応を達成するのに効果的である活性成分の量を得るために変動し得る。選択される投薬レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排泄速度、処置期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康および病歴、ならびに医療分野において周知の同様の因子を含む、様々な薬物動態因子に依存する。
【０１３９】
本発明の多重特異性分子の「治療有効用量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および期間の増加、または疾患の苦痛に起因する不全もしくは障害の防止をもたらす。例えば、腫瘍の処置の場合、「治療有効用量」は、好ましくは、細胞成長または腫瘍成長もしくは転移を、未処置対象と比較して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。腫瘍成長を阻害する薬剤または化合物の能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系において評価され得る。代替として、組成物のこの特性は、化合物の阻害能力を検査することにより評価され得、そのような阻害は、当業者に知られたアッセイによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価され得る。治療有効量の治療化合物は、腫瘍のサイズ、転移を減少させ得、または対象における症状を別様に改善し得る。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与経路等の因子に基づいて、そのような量を決定することができる。
【０１４０】
投与
本発明の組成物は、当技術分野において知られている様々な方法の１つ以上を使用して、１つ以上の投与経路で投与され得る。当業者に理解されるように、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に依存して変動する。本発明の抗体の好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または例えば注射もしくは注入による他の非経口投与経路を含む。「非経口投与」という語句は、本明細書で使用される場合、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、関節内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）、皮膜下、くも膜下（ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ）、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入を含む。代替として、本発明の多重特異性分子は、非経口以外の経路で、例えば局所、表皮または粘膜投与経路で、例えば鼻腔内、経口、経膣、経直腸、舌下または局所的に投与され得る。
【０１４１】
活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤等、急速放出に対して化合物を保護する担体を用いて調製されてもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような製剤の調製のための多くの方法が特許取得済みであり、または当業者に一般に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１４２】
治療組成物は、当技術分野において知られている医療デバイスを用いて投与され得る。例えば、本発明の治療組成物は、無針式皮下注射デバイス、例えば米国特許第５，３９９，１６３号明細書、同第５，３８３，８５１号明細書、同第５，３１２，３３５号明細書、同第５，０６４，４１３号明細書、同第４，９４１，８８０号明細書、同第４，７９０，８２４号明細書、および同第４，５９６，５５６号明細書において開示されているデバイスを用いて投与され得る。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例は、米国特許第４，４８７，６０３号明細書、同第４，４８６，１９４号明細書、同第４，４４７，２３３号明細書、同第４，４４７，２２４号明細書、同第４，４３９，１９６号明細書、および同第４，４７５，１９６号明細書に記載のものを含む。これらの特許は、参照することにより本明細書に組み込まれる。その他多くのそのようなインプラント、送達システム、およびモジュールが、当業者に周知である。
【０１４３】
処置方法
一態様において、本発明は、がん性腫瘍の成長および／または転移が阻害されるような、上述の多重特異性分子を使用したｉｎ  ｖｉｖｏでの対象の処置に関する。一実施形態において、本発明は、対象における腫瘍細胞の成長を阻害する、および／またはその転移拡散を制限する方法であって、治療有効量の多重特異性分子を対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１４４】
処置に好ましいがんの限定されない例は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または球性白血病、リンパ球性リンパ腫、乳がん、卵巣がん、黒色腫（例えば転移性悪性黒色腫）、腎臓がん（例えば明細胞癌）、前立腺がん（例えばホルモン抵抗性前立腺癌）、結腸癌および肺がん（例えば非小細胞肺がん）を含む。さらに、本発明は、その成長が本発明の抗体を使用して阻害され得る抵抗性または再発性悪性腫瘍を含む。本発明の方法を使用して処置され得る他のがんの例は、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、皮膚または眼球内の悪性黒色腫、子宮がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、ファロピウス管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚の癌腫、膣の癌腫、陰門の癌腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児期の固形腫瘍、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎盂癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体アデノーマ、カポジ肉腫、扁平上皮がん、扁平細胞がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発がん、および前記がんの組み合わせを含む。
【０１４５】
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、人間および人間以外の動物を含むことを意図する。人間以外の動物は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば人間以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含むが、哺乳動物、例えば人間以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシおよびウマが好ましい。好ましい対象は、免疫反応の向上を必要とする人間の患者を含む。方法は、免疫反応の増強により処置され得る障害を有する人間の患者の処置に特に好適である。
【０１４６】
上記の処置はまた、標準的ながん処置と組み合わされてもよい。例えば、それは、化学治療計画と効果的に組み合わされ得る。これらの場合、投与される化学治療試薬の用量を低減することが可能となり得る（Ｍｏｋｙｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：５３０１−５３０４）。
【０１４７】
宿主の免疫反応性を活性化するために使用され得る他の抗体が、本発明の多重特異性分子と組み合わせて使用されてもよい。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面を標的化する分子を含む。例えば、抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に代替することができ（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−４７８）、本発明の多重特異性分子と併せて使用され得る（Ｉｔｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１  （５）５２７−４０）。同様に、Ｔ細胞共刺激分子、例えばＣＴＬＡ−４（例えば米国特許第５，８１１，０９７号明細書）、ＣＤ２８（Ｈａａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６２：１０３−１１２）、ＯＸ−４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：２１６０−２１６９）、４−１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：６８２−６８５  （１９９７）、およびＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６２−２６６）、またはＰＤ−１（米国特許第８，００８，４４９号明細書）ＰＤ−１Ｌ（米国特許第７，９４３，７４３号明細書および同第８，１６８，１７９号明細書）を標的化する抗体もまた、Ｔ細胞活性化レベルの増加を提供し得る。別の例において、本発明の多重特異性分子は、抗新生物抗体、例えばＲＩＴＵＸＡＮ（リツキシマブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（トラスツズマブ）、ＢＥＸＸＡＲ（トシツモマブ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（イブリツモマブ）、ＣＡＭＰＡＴＨ（アレムツズマブ）、ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（エプラツズマブ）、ＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ）、およびＴＡＲＣＥＶＡ（エルロチニブ）等と併せて使用され得る。
【０１４８】
用語の定義
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において、ポリマー内のアミノ酸残基の配置を説明するために同義的に使用される。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、希少アミノ酸および合成アミノ酸類似体に加えて、標準的な２０の天然アミノ酸で構成され得る。それらは、長さまたは翻訳後修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）に関わらず、アミノ酸の任意の鎖であってもよい。
【０１４９】
「組換え」ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により生成された、すなわち所望のペプチドをコードする外因性ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞から生成されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。「合成」ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、化学合成により調製されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。「組換え」という用語は、例えば細胞、または核酸、タンパク質もしくはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または天然の核酸もしくはタンパク質の改変により修飾されていること、あるいは細胞が、そのように修飾された細胞から誘導されることを示す。上述の配列および異種配列の１つ以上を含有する融合タンパク質は、本発明の範囲内である。異種ポリペプチド、核酸または遺伝子は、外来種に由来するもの、または、同じ種に由来する場合には、その元の形態から実質的に修飾されたものである。２つの融合したドメインまたは配列は、天然タンパク質または核酸において互いに隣接していない場合、互いに異種である。
【０１５０】
「単離された」ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、自然に関連している他のタンパク質、脂質、および核酸から分離されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。ポリペプチド／タンパク質は、乾燥重量で、精製された調製物の少なくとも１０％（すなわち、１０％〜１００％の間の任意のパーセンテージ、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％）を構成し得る。純度は、任意の適切な標準的方法により、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析により測定され得る。本発明において説明される単離されたポリペプチド／タンパク質は、天然源から精製されてもよく、組換えＤＮＡ技術により生成されてもよく、または化学的方法により生成されてもよい。
【０１５１】
「抗原」は、免疫反応を惹起する、またはその反応の生成物に結合する物質を指す。「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞が結合する抗原の領域を指す。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体断片を包含する。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、無傷抗体の一部を含んでもよく、一般的には、無傷抗体の抗原結合および／もしくは可変領域、ならびに／またはＦｃＲ結合能力を保持する抗体のＦｃ領域を含む。抗体断片の例は、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。好ましくは、抗体断片は、ＩｇＧ重鎖の全定常領域を保持し、ＩｇＧ軽鎖を含む。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ断片」または「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。
【０１５５】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、微量に存在し得る可能な天然突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一抗原部位に方向付けられている。さらに、異なる決定因子（エピトープ）に方向付けられた異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に方向付けられている。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、参照することにより本明細書に組み込まれるＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）により初めて説明されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または、組換えＤＮＡ法（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）によって作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、例えば、それぞれ参照することにより本明細書に組み込まれるＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２２，５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。
【０１５６】
本明細書において、モノクローナル抗体は、具体的には、所望の生物活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖が特定の種から得られる、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一または相同性であり、一方鎖（複数可）の残りが別の種から得られる、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一または相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体の断片を含む（それぞれ参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８１６，５６７号明細書、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５（１９８４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２，６０４−６０８（１９８４）、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４５２−４５４（１９８５）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２号を参照されたい）。
【０１５７】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは人間以外の霊長類等の人間以外の種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに精緻化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ残基の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、それぞれ参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２９（１９８８）、Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，２，５９３−５９６（１９９２）、米国特許第５，２２５，５３９号明細書を参照されたい。
【０１５８】
「ヒト抗体」は、例えばヒトハイブリドーマ、ヒトファージディスプレイライブラリ、またはヒト抗体配列を発現するトランスジェニックマウスから得ることができるような完全にヒト配列を有する任意の抗体を指す。
【０１５９】
「薬学的組成物」という用語は、活性薬剤と、組成物をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断または治療的使用に特に好適とする不活性または活性の担体との組み合わせを指す。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性であるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌薬剤、等張および吸収遅延薬剤等を含む。「薬学的に許容される担体」は、対象に投与された後、または対象上で、望ましくない生理学的効果を引き起こさない。薬学的組成物中の担体はまた、活性成分に適合しそれを安定化させ得るという意味でも「許容され得」なければならない。活性薬剤の送達のための薬学的担体として、１種以上の可溶化剤が利用され得る。薬学的に許容される担体の例は、これらに限定されないが、投薬形態として使用可能な組成物を達成するために、生体適合性ビヒクル、アジュバント、添加剤、および希釈剤を含む。他の単体の例は、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、およびラウリル硫酸ナトリウムを含む。さらなる好適な薬学的担体および希釈剤、ならびにそれらの使用のための薬学的必須成分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または表皮投与（例えば注射または注入による）に好適である。治療化合物は、１種以上の薬学的に許容される塩を含んでもよい。「薬学的に許容される塩」は、特許化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒性効果をもたらさない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。
【０１６１】
「細胞毒性薬剤」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害もしくは防止する、および／または細胞の破壊をもたらす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体Ｌｕ）、化学治療薬剤、ならびに毒素、例えば細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素（それらの断片および／または変異体を含む）を含むことを意図する。
【０１６２】
「化学治療薬剤」は、がんの処置に有用な化学化合物である。化学治療薬剤の例は、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロロメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エレウセロビン；パンクラティスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロラナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質（例えばカリケアミシン、例えばＡｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：１８３−１８６（１９９４）を参照されたい；ジネミシンＡを含むジネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連した色素タンパク質エネジイン抗生物質クロモモフォア（ｃｈｒｏｍｏｍｏｐｈｏｒｅｓ））、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝剤、例えばメトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フルオキシウリジン、５−Ｆ���；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎ステロイド、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリニック酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えばメイタシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２トキシン、ベラキュリンＡ、ロリジンＡおよびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を含む。また、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；ならびに抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびに上記の薬学的に許容される塩、酸または誘導体もまた、この定義に含まれる。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」は、障害、障害の症状、障害に続発する疾患状態、または障害への傾向を治癒、軽減、緩和、治療、発症遅延、予防、または改善することを目的とした、障害を有する、または障害を発症するリスクのある対象への化合物または薬剤の投与を指す。
【０１６４】
「有効量」は、処置される対象に対して治療効果を付与するために必要な活性化合物／薬剤の量を指す。有効用量は、当業者に認識されるように、処置されている状態の種類、投与経路、賦形剤の使用量、および他の治療処置との併用の可能性に依存して変動する。新生物の状態を処置するための組み合わせの治療有効量は、例えば、未処理動物と比較して、腫瘍サイズの低減、腫瘍病巣の数の低減をもたらす、または腫瘍の成長を抑制する量である。
【０１６５】
本明細書において開示されるように、いくつかの値の範囲が提供される。文脈上異なる定義が明示されない限り、下限値の単位の１０分の１まで、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値もまた具体的に開示される。示された範囲内の任意の示された値または介在値と、その示された範囲内の任意の他の示された値または介在値との間のそれぞれのより狭い範囲が、本発明に包含される。これらのより狭い範囲の上限値および下限値は、独立してその範囲に含まれてもよく、または除外されてもよく、より狭い範囲内にいずれかもしくは両方が含まれる、またはいずれも含まれない各範囲もまた、本発明の範囲内に包含され、示された範囲内の任意の具体的に除外される限界値の対象となる。示された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【０１６６】
「約」という用語は、一般に、示された数字のプラスまたはマイナス１０％を指す。例えば、「約１０％」は、９％〜１１％の範囲を示し得、「約１」は、０．９〜１．１を意味し得る。「約」の他の意味は文脈から明らかとなり得、例えば四捨五入であってもよく、したがって、例えば「約１」はまた、０．５〜１．４を意味し得る。
【実施例】
【０１６７】
実施例１．３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−アルキンの調製（図１Ａ）
３０ｋｍＳＣ−ＰＥＧ（化合物２）の調製：
２５ｇの３０ｋｍＰＥＧ−ＯＨ（ＭＷ＝３００００、１当量）を、３６０ｍＬの試薬トルエンと２時間共沸させ、７５ｍＬのトルエン／水を除去した。共沸後、溶液を４５〜５０℃に冷却した。１６６ｍｇのトリホスゲン（０．６７当量）をＰＥＧに添加し、続いて１３１．８ｍｇの無水ピリジン（２当量）を添加した。反応を５０℃で３時間撹拌した。次いで、２３９．８ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２．５当量）を添加し、続いて１６４．８ｇの無水ピリジン（２．５当量）を添加した。反応混合物を、窒素下で５０℃で一晩撹拌した。ピリジン塩を濾過した。Ｒｏｔａｖａｐｏｒで溶媒を除去し、残渣を２−プロパノールから再結晶させた。単離された生成物を真空炉内で４０℃で乾燥させると、２３ｇの３０ｋｍＳＣ−ＰＥＧが得られた。
【０１６８】
３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（化合物３）の調製：
３６９ｍｇのＨ−ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＨ（３当量）、６４６．５ｍｇのＤＩＥＡ（１０当量）および１５ｇの３０ｋｍＳＣＰＥＧ（１当量）を、１００ｍＬのＤＭＦおよび１５０ｍｌのＤＣＭ中で混合した。混合物を室温で一晩撹拌した。不溶性材料を濾過除去した。溶媒を除去し、残渣を２−プロパノールから再結晶させた。単離された生成物を真空下で４０℃で乾燥させると、１２．８ｇの３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨが得られた。
【０１６９】
３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−アルキン（化合物４）の調製：
１１ｇの３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１当量）を、１１０ｍＬのＤＣＭに溶解し、０〜５℃に冷却した。１０１．４ｍｇの１−アミノ−３−ブチン（４当量）を添加し、続いて４０２．６ｍｇのＤＭＡＰ（９当量）および４２２．４ｍｇのＥＤＣ（６当量）を添加した。混合物を０〜５℃で１時間撹拌した。冷却を外し、反応物を室温で一晩放置した。溶媒を除去し、残渣を２−プロパノールから再結晶させた。単離された生成物を真空下で４０℃で乾燥させると、１０．４ｇの３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−アルキンが得られた。
【０１７０】
３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ−アルキン（化合物５）の調製：
１０ｇの３０ｋｍＰＥＧ−ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−アルキンを室温で１時間、１５０ｍＬのＴＦＡ／ＤＣＭ（１：２）で処理する。溶媒を真空下で除去する。残渣をエチルエーテル／ＤＣＭから再結晶させる。単離された生成物を真空下で４０℃で乾燥させると、９．５ｇの３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ−アルキンが得られる。
【０１７１】
３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−アルキン（化合物６）の調製：
９ｇの３０ｋｍＰＥＧ−ｌｙｓ−アルキン（１当量）を、９０ｍＬのＤＣＭに溶解した。７７４ｍｇのＤＩＥＡ（２０当量）、続いて２８１ｍｇのＮＨＳ−ＰＥＧ２−Ｍａｌ（２．２当量）を、０／５℃で添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣を２−プロパノールから再結晶させた。単離された生成物を真空下で乾燥させると、８ｇの３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−アルキンが得られた。
【０１７２】
実施例２．４０ｋＹ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−アルキンの調製（図１Ｂ）
４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（化合物３ａ）の調製：
２４６ｍｇのＨ−ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＨ（４当量）、３２３ｍｇのＤＩＥＡ（１０当量）および１０ｇの４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（１当量）を、１００ｍＬのＤＭＦおよび１００ｍｌのＤＣＭ中で混合した。混合物を室温で一晩撹拌した。不溶性材料を濾過除去した。溶媒を除去し、残渣を２−プロパノールから再結晶させた。単離された生成物を真空下で４０℃で乾燥させると、９．１ｇの４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨが得られた。
【０１７３】
４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−アルキン（化合物４ａ）の調製：
９ｇの４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１当量）を、９０ｍＬのＤＣＭに溶解し、０〜５℃に冷却した。６２．３ｍｇの１−アミノ−３−ブチン（４当量）を添加し、続いて２４７ｍｇのＤＭＡＰ（９当量）および２５９ｍｇのＥＤＣ（６当量）を添加した。混合物を０〜５℃で１時間撹拌した。冷却を外し、反応物を室温で一晩放置した。溶媒を除去し、残渣を２−プロパノールから再結晶させた。単離された生成物を真空下で４０℃で乾燥させると、８．４ｇの４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−アルキンが得られた。
【０１７４】
４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−アルキン（化合物５ａ）の調製：
８．２ｇの４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−アルキンを室温で１時間、１２０ｍＬのＴＦＡ／ＤＣＭ（１：２）で処理した。溶媒を真空下で除去した。残渣をエチルエーテル／ＤＣＭから再結晶させた。単離された生成物を真空下で４０℃で乾燥させると、７．９ｇの４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−アルキンが得られた。
【０１７５】
４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−アルキン（化合物６ａ）の調製：
７．６８ｇの４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−ｌｙｓ−アルキン（１当量）を、８０ｍＬのＤＣＭに溶解した。４９５ｍｇのＤＩＥＡ（２０当量）、続いて２０４ｍｇのＮＨＳ−ＰＥＧ２−Ｍａｌ（２．５当量）を、０／５℃で添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣を２−プロパノールから再結晶させた。単離された生成物を真空下で乾燥させると、７．２４ｇの４０ｋ−Ｙ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−アルキンが得られた。
【０１７６】
実施例３．３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−ＤＢＣＯの調製（図１Ｃ）
３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＤＢＣＯ（化合物４ｂ）の調製：
６ｇの３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１当量）を、６０ｍＬのＤＣＭに溶解し、０〜５℃に冷却した。２２１．１ｍｇのＮＨ２−ＤＢＣＯ（４当量）を添加し、続いて２１９．６ｍｇのＤＭＡＰ（９当量）および２３０．４ｍｇのＥＤＣ（６当量）を添加した。混合物を０〜５℃で１時間撹拌した。冷却を外し、反応物を室温で一晩放置した。溶媒を除去し、残渣を２−プロパノールから再結晶させた。単離された生成物を真空下で４０℃で乾燥させると、５．７ｇの３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−アルキンが得られた。
【０１７７】
３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＤＢＣＯ（化合物５ｂ）の調製：
５．７ｇの３０ｋｍＰＥＧ−ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＤＢＣＯを室温で１時間、８６ｍＬのＴＦＡ／ＤＣＭ（１：２）で処理する。溶媒を真空下で除去した。残渣をエチルエーテル／ＤＣＭから再結晶させた。単離された生成物を真空下で４０℃で乾燥させると、５．５ｇの３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ−アルキンが得られた。
【０１７８】
３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−ＤＢＣＯ（化合物６ｂ）の調製：
５．５ｇの３０ｋｍＰＥＧ−ｌｙｓ−ＤＢＣＯ（１当量）を、５５ｍＬのＤＣＭに溶解した。４７３ｍｇのＤＩＥＡ（２０当量）、続いて１９５ｍｇのＮＨＳ−ＰＥＧ２−Ｍａｌ（２．５当量）を、０／５℃で添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣を２−プロパノールから再結晶させた。単離された生成物を真空下で乾燥させると、５．１ｇの３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−ＤＢＣＯが得られた。
【０１７９】
実施例４．ＳＣＡＣＤ３およびＳＣＡＣＤ１９の調製
ｐＰＩＣＺ  ベクターを含むＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、一本鎖抗体（ＳＣＡ）断片抗ＣＤ３（ＳＣＡＣＤ３）および抗ＣＤ１９（ＳＣＡＣＤ１９）を、ピキア・パストリスにおいて組換えＤＮＡ技術により作製した。抗ＣＤ３  ＶＨ−ＶＬおよび抗ＣＤ１９  ＶＬ−ＶＨをコードする遺伝子を、ｐＰＩＺＡ発現ベクター内に合成およびクローン化し、Ｐ．パストリスＸ３３株において形質転換させた。メタノールによりＳＣＡの発現を誘引し、Ｎｉキレート樹脂により精製する。その後の結合を促進するために、部位特異性官能基チオールを、組換えＤＮＡ技術により、ＳＣＡＣＤ３およびＳＣＡＣＤ１９の両方のＶＨとＶＬとの間のリンカーに挿入した。クロマトグラフィープロセスにより、純粋なＳＣＡＣＤ３およびＳＣＡＤＣＤ１９を得た。ＳＣＡＣＤ３およびＳＣＡＣＤ１９のＤＮＡ配列を、以下に列挙する。
【０１８０】
【化１２】
2019537572.tif 000015
【０１８１】
【化１３】
2019537572.tif 000016
【０１８２】
実施例５．Ｃｕ触媒を用いないクリックケミストリーによる３０ｋｍＰＥＧ−（ＳＣＡＣＤ３）ＳＣＡＣＤ１９の調製（図２Ａ）
アジド−ＰＥＧ１０−マレイミド（化合物９）の調製：
１５ｍｇのＮ−スクシンイミジル４−マレイミドブチレート（１当量）を、２００μｌのＤＭＳＯ中で、室温で４５分間３８ｍｇのアジド−ｄＰＥＧ１０−アミン（１．５当量）と反応させた。得られた化合物アジド−ＰＥＧ１０−マレイミドを、さらに精製することなく直接次のステップで使用した。
【０１８３】
アジド−ＳＣＡＣＤ１９（化合物１０）の調製：
３１ｍｇのＳＣＡＣＤ１９（１当量）（１〜５ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１．５％のＰＥＧ６００、ｐＨ８．０中の２〜８ｍＭのＴＣＥＰ−ＨＣｌにより３０分間還元した。還元したＳＣＡＤＣＤ１９（１当量）を２００μｌの二官能性リンカーアジド−ＰＥＧ１０−マレイミド（５０当量）に添加した。混合物をボルテックスし、室温で３時間シェーカー上で放置した。反応物を１００μｌの２００ｍＭシステインにより室温で１０分間クエンチした。過剰のリンカー、アジド−ＰＥＧ１０−マレイミドを、脱塩カラムＨｉＰｒｅｐ（商標）２６／１０（カタログ番号１７−５０８７−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＮＪ）により、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１．５％のＰＥＧ６００、ｐＨ８．０の緩衝液で除去し、続いてＣａｐｔｏ（商標）Ｑ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＮＪ）カラムで除去した。Ｃａｐｔ（商標）Ｑからの分画を回収し、ＳｉｍｐｌｅｒＢｌｕｅ（商標）で染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルに基づき、所望の化合物アジド−ＳＣＡＣＤ１９分画をプールし、１〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、さらなる使用のために冷蔵庫内で保存した。
【０１８４】
３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＳＣＡＣＤ３）−ＤＢＣＯ（化合物１１）の調製：
２４ｍｇのＳＣＡＣＤ３（１当量）（１〜５ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１．５％のＰＥＧ６００、ｐＨ６．０中の２〜５ｍＭのＴＣＥＰ−ＨＣｌにより３０分間還元した。還元した２４ｍｇのＳＣＡＤＣＤ３（１当量）を、２０ｍＭのリン酸Ｎａ、１．５％のＰＥＧ６００、ｐＨ６．０中で２６４ｍｇの３０ＫｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−ＤＢＣＯ（１０当量）と混合した。混合物をボルテックスし、室温で約３時間シェーカー上で放置した。３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＳＣＡＣＤ３）−ＤＢＣＯを、２０ｍＭのリン酸Ｎａ、１．５％のＰＥＧ６００、ｐＨ６．０で事前に平衡化された２０ｍＬのＣＭ  Ｓｅｐｇｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにより精製した。試料投入後、カラムを１０ＣＶの平衡化緩衝液により洗浄して遊離ＰＥＧを完全に洗い流し、次いで０．５ＭのＮａＣｌにより溶出した。分画を回収し、ＳｉｍｐｌｅｒＢｌｕｅ（商標）およびヨウ素で染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルに基づいて、３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＳＣＡＣＤ３）−ＤＢＣＯをプールし、１〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。さらなる使用のために、緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０１８５】
３０ｋｍＰＥＧ−ＳＣＡＣＤ３／ＳＣＡＣＤ１９（化合物１２）の調製：
３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＳＣＡＣＤ３）−ＤＢＣＯ（化合物１１）とアジド−ＳＣＡＣＤ１９（化合物１０）との結合を、１：１モル比でのＰＢＳ中室温で一晩のクリックケミストリーにより達成した。標的ＰＥＧ化二重特異性抗体３０ｋｍＰＥＧ−ＳＣＡＣＤ３／ＳＣＡＣＤ１９の精製を、まずＨｉＰｒｅｐ（商標）２６／１０脱塩カラムにより、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０緩衝液を、続いてＤＥＡＥ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＮＪ）およびＣＭ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。全てのカラムクロマトグラフィー精製は、上述の手順と同様に行った。分画を回収し、ＳｉｍｐｌｅｒＢｌｕｅ（商標）およびヨウ素で染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルに基づいて、最終二重特異性抗体生成物をプールし、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中約１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。標的化合物を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよび細胞ベース活性アッセイにより確認した。
【０１８６】
実施例６．Ｃｕ触媒を用いたクリックケミストリーによる３０ｋｍＰＥＧ−（ＳＣＡＣＤ３）ＳＣＡＣＤ１９の調製（図２Ｂ）
３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＳＣＡＣＤ３）−アルキン（化合物１１ａ）の調製：
２４ｍｇのＳＣＡＣＤ３（１当量）（１〜５ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１．５％のＰＥＧ６００、ｐＨ６．０中の２〜５ｍＭのＴＣＥＰ−ＨＣｌにより３０分間還元した。還元した２４ｍｇのＳＣＡＤＣＤ３（１当量）を、２０ｍＭのリン酸Ｎａ、１．５％のＰＥＧ６００、ｐＨ６．０中で２６４ｍｇの３０ＫｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（マレイミド）−アルキン（１０当量）と混合した。混合物をボルテックスし、室温で約３時間シェーカー上で放置した。３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＳＣＡＣＤ３）−アルキン（化合物１１ａ）を、２０ｍＭのリン酸Ｎａ、１．５％のＰＥＧ６００、ｐＨ６．０で平衡化された２０ｍＬのＣＭ  Ｓｅｐｇｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにより精製した。試料投入後、カラムを１０ＣＶの平衡化緩衝液により洗浄して遊離ＰＥＧを完全に洗い流し、次いで０．５ＭのＮａＣｌにより溶出した。分画を回収し、ＳｉｍｐｌｅｒＢｌｕｅ（商標）およびヨウ素で染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルに基づいて、３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＳＣＡＣＤ３）−アルキンをプールし、１〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。さらなる使用のために、緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０１８７】
３０ｋｍＰＥＧ−ＳＣＡＣＤ３／ＳＣＡＣＤ１９（化合物１２ａ）の調製：
３０ｋｍＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＳＣＡＣＤ３）−アルキン（化合物１１ａ）とアジド−ＳＣＡＣＤ１９（化合物１０）との結合を、１５μΜのＣｕ（Ｉ）および３０μΜのティス（ベンジルトリアルゾリルメチル）アミン（ＴＢＴＡ）（事前にＤＭＳＯ中で調製）の存在下、１：１モル比でのＰＢＳ中室温で一晩のクリックケミストリーにより達成した。
【０１８８】
標的ＰＥＧ化二重特異性抗体３０ｋｍＰＥＧ−ＳＣＡＣＤ３／ＳＣＡＣＤ１９（化合物１２ａ）の精製を、実施例５で化合物１２に関して説明したものと同様に行った。
【０１８９】
実施例７．生物学的データ（図３および４）
ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞媒介細胞毒性
ＰＥＧ化二重特異性抗体化合物１２の細胞毒性力を評価するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｓｃＣＤ１９ｘＣＤ３細胞毒性アッセイを行った。この試験を用いて、ＤＳＰ−ＢｓＡｂ技術が、腫瘍免疫治療のためにがん細胞を破壊するようにエフェクター細胞を動員することができる二重特異性抗体を調製するための代替技術であることを実証した。測色ＬＤＨ放出アッセイを使用して、化合物１２の細胞毒性を決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６によりフィッティングされた４パラメータ対数非線形回帰モデルを用いて、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）値を分析した。
【０１９０】
簡潔に説明すると、この試験において、３７℃／５％ＣＯ２で完全媒体中に維持された標的Ｒａｊｉ細胞（Ｂリンパ腫細胞株）を、化合物１２（添加前に１％ＦＢＳが加えられたフェノールレッド不含ＭＥＭ培地で希釈）と共に、異なる濃度で３７℃で０．５時間インキュベートした。ＣＤ８＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより（２０人の健常個人からの）ＰＢＭＣから単離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞をエフェクター細胞として添加した（Ｅ：Ｔ比＝５：１）。化合物１２、Ｒａｊｉ細胞およびエフェクター細胞の混合物を、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間さらにインキュベートした。ＬＤＨキットを用いて細胞生存率をアッセイするために、上澄みを回収した。ＯＤ４９２ｎｍおよびＯＤ６５０ｎｍでの吸光度データを読み出した。バックグラウンド（ＯＤ６５０ｎｍ）を差し引いたＯＤ４９２ｎｍデータを分析して、ＬＤＨ放出を調べた。細胞溶解のパーセンテージは、以下の式に従って計算した。
【０１９１】
【数１】
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【０１９２】
結果（平均±ＳＤ、（ｎ＝３））を図３に示す。分析データを表１に列挙する。８．２４ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値は、化合物１２が標的細胞に対して有意に細胞毒性であることを示していた。さらに、化合物１２はまた、標的細胞に対して用量依存性の殺傷力を示した。
【０１９３】
【表２】
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【０１９４】
ｉｎ−ｖｉｖｏ薬物動態
この試験は、本明細書において開示されるＤＳＰ−ＢｓＡｂ技術が従来の一本鎖二重特異性抗体の排除半減期を劇的に延長し得ることを実証するために設計された。ＰＥＧ化一本鎖二重特異性抗体の薬物動態を、ラットへの１ｍｇ／ｋｇの静脈注射後に決定した。ラットにおけるＰＥＧ化複合体の半減期は、典型的にはヒトにおける半減期よりも１／５短い範囲内にあるため、この試験でのラットにおけるＰＥＧ化一本鎖二重特異性抗体の半減期は、ヒトにおける可能な毎週の薬物投与で約１０時間以上に達するはずである。
【０１９５】
試験のために、実験を以下のように行った：腫瘍不含Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（約２５０ｇ、ｎ＝３）に、２つの頚静脈カニューレ（ＪＶＣ）を取り付けた。薬物投与前最低１２時間、投薬後４時間までは動物に食物を与えなかった。水は不断で与えた。ＪＶＣにより１ｍｇ／ｋｇの二重特異性抗体化合物１２を単回注射でラットに静脈内注射した。様々な時点で（投薬前、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間および４８時間）、約０．３ｍｌの血液試料を、頚静脈カニューレまたは尾静脈から採取し、ナトリウムヘパリンを含む冷却管内に入れた。試料を４℃で遠心分離し、結晶を回収してアッセイまで凍結した。
【０１９６】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用することにより、薬物動態分析を行った。簡潔に説明すると、マイクロプレートをまず２〜８℃で一晩ＣＤ１９抗原で被覆し、一方表面上の任意の非特異性結合部位をＰＢＳ中２％のＢＳＡでブロックした。プレートをＰＢＳ、０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０で３×５分間洗浄してから、ラット血漿試料を塗布した。３７℃で１．５時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ、０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０で３×５分間洗浄し、続いて抗ＰＥＧ抗体を３７℃で１時間結合させた。プレートをＰＢＳ、０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０で３×５分間洗浄してから、酵素連結抗体を塗布した。次いで、プレートを酵素基質で処理して発色させ、１Ｎの硫酸により停止させた。化合物１２の血漿濃度を較正曲線から計算し、時間に対してプロットした。結果（図４および表２）は、化合物１２が、ラットにおいて、一本鎖ＣＤ１９／ＣＤ３二重特異性抗体の非ＰＥＧ化型であるブリナツモマブ（ｔ１／２＜０．５時間）よりはるかに長い排除半減期（Ｔ１／２＝２７．４８時間）を提供することを示している。
【０１９７】
【表３】
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【０１９８】
上記実施例および好ましい実施形態の説明は、本発明を特許請求の範囲により定義されるように制限するのではなく、例示として考慮されるべきである。容易に理解れるように、上に記載される特徴の多くの変形例および組み合わせが、特許請求の範囲に記載のように本発明から逸脱せずに利用され得る。そのような変形例は、本発明の範囲からの逸脱とみなされず、そのような変形例は全て、以下の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。本明細書において引用される全ての参考文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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