(57)【要約】【課題】ミトコンドリア生物発生を刺激する薬物を用いて血小板形成を刺激する方法を提供する。【解決手段】当該薬物は、血小板減少症を抱え、又は血小板数が相対的に低い被験者を治療することに使用され、或いはインビトロ又はエクスビボで血小板産生を刺激することに使用されることができる。ミトコンドリア生物発生を刺激するために、低レベル光（ＬＬＬ）療法は、薬物とともに使用することができる。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア生物発生を刺激する有効量の薬物を被験者へ投与することにより、前記被験者の体内に血小板の形成を刺激する方法。
【請求項２】
前記薬物は、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化剤、カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＶ活性化剤、ＡＭＰ活性化キナーゼ活性化剤、カルシニューリンＡ活性化剤、ペルオキシソーム増殖剤応答エレメント活性化剤及びＳＩＲＴ１活性化剤からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ミトコンドリア生物発生を刺激する前記薬物は、ベザフィブラート、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、フェノフィブラート、ＡＩＣＡＲ、メトホルミン、レスベラトロール、ＳＲＴ１７２０、ＳＲＴ２１８３、ＳＲＴ１４６０及びケルセチン、ならびにそれらの誘導体からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被験者は、血小板減少症を抱えると診断されている請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗血小板減少症薬を前記被験者へ投与することをさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
低レベル光（ＬＬＬ）療法で前記被験者を治療することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記薬物は、薬学的に許容される担体とともに投与される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
血小板の形成を刺激する方法であって、
血小板前駆体をミトコンドリア生物発生を刺激する薬物と接触させることを含む方法。
【請求項９】
前記血小板前駆体は、巨核球又は巨核芽球である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記血小板前駆体も低レベル光治療に露出される請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記血小板前駆体は、インビトロ又はエクスビボである請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本願は２０１６年６月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／３５５,０２７号の権利を主張し、その全ての内容は引用により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
血液において血小板が異常に少ないため、血小板減少症は、制御不能な出血および死亡の原因となっている。これまで、当該疾患は主に血小板の注入によって管理されているが、血小板注入は複数種の合併症に関連しており、命を脅かす疾患抱える患者のみに限定されている。過去２０年間では、血小板減少症を治療するための治療剤の開発においてかなり大きな進歩が遂げられており、これらの薬剤のほとんど全ては、循環血小板数と独立して巨核球を生成するために、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／又は前駆細胞の成長と分化を増強させる。Ｈａｌｌａｍら、Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３，１１７３−１１８５（２０１３）。それ故、高投与量のこれらの薬剤は有害な血栓の形成を引き起こすが、低投与量は適度又は弱い作用を示し、それは、それらの広範囲な臨床適用を厳しく制限する。血栓形成のリスクが小さい効果的な方法は、依然として血小板減少症への対処に対する緊急、且つまだ満足できない医学的ニーズである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
血小板は、小さい無核細胞であり、成人の骨髄（ＢＭ）や新生児の肝臓及びＢＭに主に存在する巨核球（ＭＫ）から生成する。当該細胞は、ＨＳＣから分化して、最大の細胞（５０〜１００μｍ）を表し、生理的条件下で約０.０５％の有核のＢＭ細胞のみからなる最も希少な細胞の1つでもあるが、血小板減少症を抱える患者において、細胞の数は指数的に増殖する。ＭＫの成熟の間では、細胞が分裂していない場合、多数回のＤＮＡ複製が起こり、このプロセスが核内分裂と呼ばれ、当該プロセスでは、その細胞質が広範囲に増幅され、ゲノムＤＮＡが人間において６４Ｎまで、或いはマウスにおいて２５６Ｎまで増幅し、それと同時に、豊富な細胞骨格タンパク質、血小板特異顆粒及び陥入膜システム（ＩＭＳ）を合成する。細胞増幅に続いてプロ血小板の形成が起こり、そこでは、末端成熟ＭＫがその全ての細胞質を多くの長く、分枝したプロ血小板に変換し、それは、数時間内で２５０〜５００μｍの長さに達するまで、約１μｍ／ｍｉｎの速度で伸長する。Ｐａｔｅｌら、Ｊ. Ｃliｎ. Ｉｎveｓt １１５、３３４８−３３５４(２００５)。細胞質の大量のリモデリング及びプロ血小板の激しい突出と伸長は微小管力によって駆動され、ＡＴＰの生成に大きく依存する。これは、ミトコンドリアがこのプロセスでは核心的な作用を果たすことを意味する。これと一致して、ＭＫミトコンドリアの超微細構造異常と機能不足は通常骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）と免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）患者において損なわれた血小板の生成と関連する。ミトコンドリア細胞チトクロームｃにおける点突然変異は、特に人間において調節不全の血小板形成及び血小板減少症を引き起こし、これは、血小板生物合成がミトコンドリア活性に非常に敏感であることを示す。最近の研究では、ミトコンドリアの機能不足によって、マウスがストレスにさらされた際の血小板減少症に対する即時的な早期反応遺伝子Ｘ−１（ＩＥＸ−１）を欠けやすくなる。Ｒａｍｓｅｙら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９９、２８２−２９１(２０１４)。ＩＥＸ−１の主な機能の1つは、ミトコンドリア呼吸鎖におけるＡＴＰシンターゼ活性を増強することであり、また、その無効な突然変異が、ＡＴＰの生成を危殆化し、そして細胞型特異的な方法でミトコンドリアにおける活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を増加させる。ミトコンドリア特異的抗酸化剤ｍｉｔｏｑｕｉｎｏｎｅがＩＥＸ−１欠損のマウスにおいて血小板減少症を完全に逆転させる能力は、ミトコンドリア機能が血小板産生において極めて重要であることを明らかに示している。Ｒａｍｓｅｙら、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ、２６(５)：４５９−６６(２０１５)。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、本願は、被験者にミトコンドリア生物発生を刺激する有効量の薬物を投与することにより、被験者の体内に血小板の形成を刺激する方法を提供する。低レベル光（ｌｏｗ−ｌｅｖｅｌ  ｌｉｇｈｔ）（ＬＬＬ）媒介による血小板生物発生のメカニズムを研究する過程では、発明者は、ＬＬＬが主に巨核球においてミトコンドリア生物発生を増強させ、血小板形成の増加をもたらすことを発見した。巨核球におけるミトコンドリア質量とＡＴＰ生成は、血小板形成のレベルと比例的に相関している。
【０００５】
ミトコンドリア生物発生を促進する多数の薬物が知られている。例としては、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化剤、カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＶ活性化剤、ＡＭＰ活性化キナーゼ活性化剤、カルシニューリンＡ活性化剤、ペルオキシソーム増殖剤応答エレメント活性化剤及びＳＩＲＴ１活性化剤が挙げられる。
【０００６】
いくつかの実施例では、ミトコンドリア生物発生を刺激する薬物で治療される被験者は、血小板減少症を抱えると診断されている。他のいくつかの実施例では、当該方法は、被験者に抗血小板減少症薬を投与することを含む。他の実施例では、当該方法は低レベル光（ＬＬＬ）療法で被験者を治療することを含む。さらなる実施例では、この薬物は薬学的に許容される担体とともに投与される。
【０００７】
別の態様において、本発明は血小板産生を刺激する方法を提供し、血小板前駆体をミトコンドリア生物発生を刺激する薬物と接触させることを含む。いくつかの実施例では、血小板前駆体は巨核球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ）又は巨核芽球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔ）である。他のいくつかの実施例では、血小板前駆体はインビトロ又はエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）である。他の実施例では、血小板前駆体も低レベル光の治療に露出される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ａ〜Ｈは、ＬＬＬがＭＫ成熟と血小板産生を促進することを示すグラフ及び画像である。（Ａ）はＭＫからのエクスビボ血小板分化のタイムラインの模式図である。ＢＭ細胞からＣＤ４１＋ＦＳＣｈｉｇｈ ＭＫを選別し、ＬＬＬ有り又は無しで処理し、ＭＫ培地中で培養する。１時間後、細胞ＡＴＰの測定のためにＭＫを収集し（Ｂ）、１日後、プロ血小板形成（Ｃ〜Ｆ）を研究するためにＭＫを収集し、或いは、３日後、血小板を数えるためにＭＫを収集する（Ｇ）。（Ｂ）異なるエネルギー密度のＬＬＬ処理の５x１０４ＭＫにおけるＡＴＰを測定する。（Ｃ）２４時間分化の前後に前方／側方散乱（ＦＳＣ）のフローサイトメトリー分析によってＣＤ４１＋ＭＫの大きさを分析する。（Ｄ）は１グループ当たり少なくとも６個の試料（各グループにおいて３０個の細胞を有する）のＭＫの代表的な透過型電子顕微鏡写真である。Ｎは、核であり、ＩＭＳは、陥入膜システムである。（Ｅ）はＬＬＬ後２４時間のＰＰＦ−ＭＫの代表的な画像である。ＰＰＦ−ＭＫ直径は、小の場合に、＜１００μｍを満たし、大の場合に、≧１００μｍを満たす。黒塗りの三角形は、プロ血小板シャフト（プロ血小板 ｓｈａｆｔ）上の多くの突起のうちの１つを示す。黒塗りされていない三角形は核を示す。（Ｆ）数値は、それぞれの試料分析の少なくとも５００個のＭＫにおける小さい、又は大きいＰＰＦ−ＭＫの百分率を示し、１グループ当たり６個の試料を有する。###Ｐ＜０.００１、大きいＰＰＦ−ＭＫ、及び＊＊Ｐ＜０.０１、２グループ間で比較した総ＰＰＦ−ＭＫ。（Ｇ）ＣＤ４１発現及びＦＳＣに基づき、ＬＬＬ後の３日目に１x１０４ ＭＫに由来する血小板数を推定する。（Ｈ）選別されたＭＫをＬＬＬ有り又はなしで処理し、ＣＦＳＥで標識し、そしてマウス１匹当たり１x１０５個の細胞でレシピエントマウスに注入する。指定された日数でレシピエントで得られたＣＦＳＥ＋血小板の百分率が示されている。全てのデータはいずれも平均値±ＳＥＭと表され、Ｂ、Ｃ及びＧのｎ＝６、又はＨのｎ＝１０である。対照と比較して、＊＊＊Ｐ＜０.００１である。スケールバーは、Ｄにおいて５μｍであり、又はＥにおいて、２５μｍである。
【０００９】
【図２】Ａ〜Ｈは、ＬＬＬの血小板産生作用がＡＴＰ依存的であることを示すグラフ及び画像を提供する。（Ａ）ＬＬＬ後１時間後のＭＫ ＡＴＰレベルと３日後に測定された血小板との間の相関関係を決定係数により分析する。（Ｂ及びＣ）５μg／ｍｌの阻害剤オリゴマイシンＡ（ＯＡ）により、ＬＬＬが血小板産生（Ｂ）とＡＴＰ合成（Ｃ）に影響することを抑制する。（Ｄ）ＷＴ及びＩＥＸ−１  ＫＯ  ＢＭ細胞を抗ＣＤ４１抗体とＪＣ１で染色する。５９０ｎｍでの赤色Ｊ−凝集体蛍光（ｒｅｄ  Ｊ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のフローサイトメトリー分析によりＣＤ４１＋ＦＳＣｈｉｇｈＭＫのミトコンドリア膜電位を決定する。（Ｅ）選別されたＭＫをＬＬＬ有り又はなしで処理し、図１ＢのようにＡＴＰ測定前に１時間分化する。（Ｆ及びＧ）ＰＰＦ−ＭＫの代表的な画像は、ＬＬＬ後２４時間に１グループ当たり少なくとも６個の試料（１グループ当たり２５個の細胞を有する）から得られる（Ｆ）。スケールバーは、２５μｍである。細胞直径はＧで示され、但し、各記号は単一のＰＰＦ−ＭＫを表す。（Ｈ）ＣＤ４１発現及びＦＳＣ（Ｈ）に基づき、ＬＬＬ後３日後に１ｘ１０４ＭＫに由来する血小板数を推定する。全てのデータは、平均値±ＳＥＭを表す。ｎ＝６、指定されたグループ間で比較し、＊＊Ｐ＜０.０１と＊＊＊Ｐ＜０.００１である。
【００１０】
【図３】Ａ〜Ｌは、ＬＬＬが倍数体ＭＫにおけるミトコンドリア生物発生を刺激することを示すグラフ及び画像を提供する。（Ａ）ＬＬＬ後、ＭＫ、ＢＭ細胞又はＬＳＫにおけるＡＴＰを指定された回数で測定する。（Ｂ及びＦ）ＬＬＬ後２４時間後に、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒで指定された細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析を行う。（Ｃ）リアルタイムＰＣＲによりＭＫのミトコンドリアＤＮＡ含有量を測定し、核ＤＮＡで正規化する。（Ｄ、Ｇ及びＨ）ＬＬＬ後４時間後にＰＧＣ−１α転写物を測定し（Ｄ和Ｇ）、ＬＬＬ後１６時間後にｑＲＴ−ＰＣＲにより他の遺伝子転写物を測定する（Ｄ和Ｈ）。（Ｅ乃至Ｉ）Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とＦＩＴＣ−抗−ＣＤ４１で染色することにより、ＤＮＡ含有量に基づきＭＫを選別し（Ｅ）、ＬＬＬ又は擬似光（ｓｈａｍ  ｌｉｇｈｔ）で処理し、２４時間後にＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒを用いてフローサイトメトリー分析を行い（Ｆ）、或いは、ＬＬＬ後の４時間後にＰＧＣ−１α転写物のＲＴ−qＰＣＲ分析を行い（Ｇ）、及び、上述したようにＬＬＬ後１６時間後に他の遺伝子転写物（Ｈ）の分析を行う。ＬＬＬ後の３日後に１ｘ１０４個のＭＫに由来する血小板数を推定する（Ｉ）。（Ｊ乃至Ｌ）ＬＬＬ後の２４時間後のＭＫの代表的な透過電子顕微鏡図を（Ｊ）に示す。スケールバーは、５μｍである。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアにより、１グループ当たり少なくとも３０個のＭＫから、それぞれのＭＫのミトコンドリア数（Ｋ）及びそれぞれのミトコンドリアと最も近い核領域との間の最短距離（Ｌ）を測定する。他の全てのデータは、独立する３つの実験からのものであり、それぞれの実験は３回繰り返し、平均値±ＳＥＭとして表し、非ＬＬＬ対照と比較して、＊Ｐ＜０．０５と＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【００１１】
【図４】Ａ〜Ｄは、ＬＬＬがマウスの骨に浸透することを示すグラフ及び画像を提供する。（Ａ）レーザーパワーメーターを用いてマウスの新鮮な皮膚と脊椎骨の下で、指定されたＬＬＬモードの透過率（％）を測定する。（Ｂ）図１ＢのようにＡＴＰレベルを測定するために、３０Ｊ／ｃｍ２の全身ＬＬＬ照射後の１時間後に、指定された骨からＢＭ細胞を分離する。（Ｃ及びＤ）全身ＬＬＬ照射後の２４時間後に、マウスにＦＩＴＣ−抗−ＣＤ４１（緑色）とＰＥ−抗−ＣＤ１０５（赤色）抗体を静脈注射し、１５分後に死なせる。続いて、マウスから新鮮な大腿骨を摘出して共焦点顕微鏡により調べる（Ｃ）。矢印はＢＭ ＭＫを示す。スケールバーは、５０μｍである。ＰＰＦ−ＭＫの百分率は、大腿骨当たり少なくとも５０個のＭＫ及び１グループ当たり６個の試料から決定される（Ｄ）。対照と比較し、又は指定されたグループ間で比較し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１且つ＊＊＊Ｐ＜０．００１であり、また、ｎ＝６（Ａ乃至Ｃ）。
【００１２】
【図５】Ａ〜Ｈは、ＬＬＬがインビボでＩＲによって誘発された血小板減少症を緩和することを示すグラフ及び画像を提供する。（Ａ）ＩＲ後２週間後に３−Ｇｙ γ−照射がされたマウスにおける白血球（ＷＢＣ）、リンパ球、単球、顆粒球及び赤血球（ＲＢＣ）の全血球数である。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１５）である。（Ｂ）指定された日数に３−Ｇｙγ−照射がされたマウス（ＩＲ）における血小板数を得て、又はＩＲ後の６時間後にＬＬＬで１回処理されたＩＲマウスにおける血小板数（ＩＲ＋１×ＬＬＬ）を得て、又は０日目及び１日目に１日に１回（ＩＲ＋２×ＬＬＬ）で得て、又は０日目から３日目に１日に１回（ＩＲ＋４×ＬＬＬ）で得る。データは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１５）である。ＩＲに対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。（Ｃ）ＩＲ後の２週間後にそれぞれのマウスの尾部の出血時間を調べ、個々の記号で表す。（Ｄ）ＩＲ後の２週間後にそれぞれのマウスの血小板体積を調べる。データはいずれも平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１０）である。（Ｅ）ＩＲ後の２週間後に指定されたマウスから分離された血小板の代表的な透過電子顕微鏡写真である。スケールバーは、１ｍｍである。（Ｆ）ＬＬＬ後の２週間後に非ＩＲ対照及びＩＲ＋４×ＬＬＬマウスから分離された血小板において、抗ＣＤ９又は抗ＣＤ３１抗体で標識し、混合し、ホルボール１２−ミリステート１３−ミリステート（ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ）（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激する。フローサイトメトリーにより、ダブルカラーイベントによって示される凝集した血小板を定量化し、平均百分率±ＳＥＭで示す（ｎ＝６）。（Ｇ）１日おきにＬＬＬを用いて３０Ｊ／ｃｍ２で１２日間マウスにおける循環血小板及びＢＭ ＭＫを処理して、安定的なレベル内に維持する。データは、ベースラインに対する変化の平均百分率±ＳＥＭ（ｎ＝６）である。（Ｈ）ＬＬＬの４種の用量の、γ−照射がされたマウスにおけるＭＫ数への経時的な影響である。データは、指定された日数におけるそれぞれの大腿骨のＭＫの平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６）である。ＩＲグループに比べ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。Ｐ値は両側スチューデントのｔ検定（Ａ及びＨ）又は一元配置分散分析（oｎe waｙ ＡＮＯＶＡ）（Ｂ乃至Ｄ）により決定される。
【００１３】
【図６】Ａ〜Ｄは、ＬＬＬがマウスにおいて抗ＣＤ４１抗体又は５−ＦＵによって誘発された血小板減少症を軽減することを示すグラフを提供する。（Ａ及びＢ）７日間でマウスに０．１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４１抗体を毎日投与する。３日目から７日目まで、ＬＬＬを毎日与える。（Ｃ及びＤ）０日目にマウスに５０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵを注射する。５−ＦＵ注射後の４時間から３日間連続してＬＬＬを毎日与える。ＬＬＬ後の６時間後に血小板数を毎日測定し（Ａ及びＣ）、５日目（Ｂ）又は４日目（Ｄ）に尾部の出血時間を調べる（Ｂ及びＤ）。ｎ＝６であり、ｎｓ、顕著性がない。指定されたグループ間で比較し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【００１４】
【図７】Ａ〜Ｄは、ＬＬＬがヒトＭＫにおける血小板産生を著しく増強させることを示す画像とグラフを提供する。（Ａ）ヒトＣＤ３４＋細胞からのエクスビボ血小板分化のタイムラインの図である。ＣＤ３４＋細胞は、それぞれ６、１２又は１５日目に主にＭＫ前駆細胞、成熟ＭＫ、及び血小板に分化する。（Ｂ）図１Ｂのように、異なるエネルギー密度のＬＬＬで処理されたＣＤ３４＋由来のＭＫにおけるＡＴＰを測定する。（Ｃ）０、６又は１２日目にＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色を用いてＣＤ３４＋培養物に対して倍数性分析を行う。（Ｄ）ＣＤ３４＋細胞分化期間で、０、６又は１２日目に３ Ｊ／ｃｍ２のＬＬＬを投与する。１５日目にフローサイトメトリーにより血小板を定量化し、１ｘ１０４個のＣＤ３４＋細胞由来の血小板の平均値±ＳＥＭとして表す。全てのデータは、いずれも独立した３つの実験から得られ、それぞれの実験は３回繰り返す。対照と比較して、＊Ｐ＜０．０５と＊＊Ｐ＜０．０１である。
【００１５】
【図８】薬物によって誘導されるＰＧＣ−１α媒介のミトコンドリア生物発生の方案を提供する。核呼吸因子（ＮＲＦ−１及びＮＲＦ−２）は、全ての１０個の核コード化のチトクロームオキシダーゼサブユニットを制御する。ＥＲＲについては、エストロゲン関連受容体α、β、γであり、ＴＣＡについては、トリカルボン酸サイクルであり、また、ＦＡＯについては、脂肪酸酸化である。
【００１６】
【図９】ミトコンドリア薬物（ｍｉｔｏ−ｄｒｕｇ）により、エクスビボでの血小板産生を増強することを示すグラフを提供する。Ｃについては、対照であり、Ｂｅｚについては、ベザフィブラートであり（Ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ）（４００μＭ）、Ｒeｓについては、レスベラトロール（５０μＭ）であり、ＳＲＴ１７２０については、０.１μＭであり、Ａｉｃａｒについては、ＡＩＣＡＲ（５００μＭ）であり、ＬＬＬについては、８１０ｎｍ ３Ｊ／ｃｍ２である。マウスＭＫをＭＫ培地中で指定された薬物の存在下又はＬＬＬＴ後に３日間分化させる。対照と比較して、＊＊、ｐ＜０．０１と＊＊＊、ｐ＜０．００１である。ｎ＝６である。
【００１７】
【図１０】インビボでのミトコンドリア薬物によるｐｌｔ生成の増強を示すグラフを提供する。全てのマウスを２つの用量の５−ＦＵ（ＦＵ）で、指定されたミトコンドリア薬物又はＬＬＬＴとともに４日間連続して処理する（赤い矢印）。指定された薬物又はＬＬＬＴの存在下又は非存在下で、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１及び＊＊＊、ｐ＜０．００１である。それぞれのグループでは、ｎ＝１０である。
【００１８】
【図１１】インビボでのミトコンドリア薬物＋ＬＬＬＴによる血小板産生の増強を示す図を提供する。全てのマウスを、７日間抗ＣＤ４１抗体で０．１ｍｇ／ｋｇで毎日処理する。マウスをＬＬＬＴで（９８０ｎｍ、０.０２５Ｊ／ｃｍ２、１日に１回、４日間連続して（赤い矢印））処理し、ＢＥＺで（１００ｍｇ／ｋｇ、１日に２回、４日間連続して）処理し、或いはその両方で処理する。対照と比較して、＊＊＊、ｐ＜０．００１である。各グループにおいて、ｎ＝１０である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ミトコンドリア生物発生を刺激する薬物を用いて血小板形成を刺激する方法を提供する。当該薬物は、血小板減少症を抱え、又は血小板数が相対的に低いと診断された被験者を治療するために使用することができ、或いは、インビトロ又はエクスビボで血小板産生を刺激するために使用することができる。低レベル光（ＬＬＬ）療法は、ミトコンドリア生物発生を刺激するために、薬物とともに使用することができる。
【００２０】
本明細書に記載の専門用語は、実施例を説明するためのものに過ぎず、全体として本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。特に明記しない限り、「１個」、「前記」、「当該」及び「少なくとも1つ」は互換的に使用することができる。さらに、本発明の説明及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「１個」、「前記」、「当該」は、それらの前後の文脈によって排除されない限り、それらの複数形を含む。
【００２１】
また、本明細書において、端点で説明された数値範囲はその範囲内に含まれた全ての数値を含む（例えば、１〜５は、１、１.５、２、２.７５、３、３.８０、４、５などを含む）。
【００２２】
本明細書で使用されるように、用語「被験者」は、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、類人猿、ブタ、ウサギ、ウシなどを含むが、これらに限定されない任意の温血生物を指すことができる。被験者が本願の組成物の上下文でこの用語を使用することを必要とし、又は要求する場合、この用語は「それを必要とする被験者」と呼ばれ、本願の組成物を必要とする被験者、本願の組成物を必要とすると疑われる被験者、疾患又は病症を抱えるリスクにさらされており、且つ本願の組成物から恵まれる可能性のある被験者及び疾患又は病症を既に抱えており、且つ并本願の組成物から恵まれる可能性のある被験者と臨床診断（例えば、医学専門家、例えば医師により）されたものを含む。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「薬学的に許容される」という用語とは、信頼できる医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題もしくは合併症のない合理的な利益／リスク比に見合った条件で、人類と動物の組織と接触して使用するのに適するこれらの化合物、材料、組成物及び／又は剤型を指す。
【００２４】
本明細書で使用されるように、用語「診断」は、被験者が疾患を発症する可能性、又は被験者における疾患の存在又は特質を確定することを含むことができる。本明細書で使用されるように、用語「診断」は、さらに疾患又は疾患発症の深刻さ及び予想される結果もしくは回復の見込み（一般的に、予後と呼ばれる）を確定することを含む。
【００２５】
本明細書で使用されるように、用語「治療」などは、所望の薬理学的または生理学的作用を得ることを指す。疾患の部分的又は完全な治癒或いはその疾患に起因する副作用に関しては、その作用は、治療的であり得る。本明細書で使用されるように、「治療」は、哺乳動物（特に、人）の疾患のあらゆる治療を含み、そして、疾患又は症状を抑制し、即ち、その進行を阻害し、また、疾患を緩和させ、即ち、疾患を消退させることを含んでもよい。
【００２６】
本明細書で使用されるように、用語「予防」は、臨床上の明らかな疾患（例えば、出血）の発症を完全に予防すること、又は被験者での疾患の臨床前の明らかな段階（例えば、血小板減少症）の発症を予防することを含む。予防的治療は、疾患を発症するリスクが高いと確定された被験者においては、特に有用である。高いリスクは、被験者が血小板減少症などのような疾患を発症するリスクが平均レベルよりも高いことを表す。血小板減少症を発症するリスクが高いと表す要因の例として、ビタミン欠乏症、白血病、敗血症、肝不全を含み、高い血小板破壊率は、免疫又は非免疫疾患、骨髄抑制を誘発することが知られている薬物（例えば、バルプロ酸又はメトトレキサート）による治療、蛇にかまれた傷、輻射、がん患者の放射線治療、化学治療又は化学／放射線治療及びライム病に起因する可能性がある。
【００２７】
用語「治療上有効」は、疾患の重症度を低下させるとともに、有害な副作用（例えば、通常、代替療法に関連すり不良の副作用）を回避する目的を達成するために、各種の薬剤の量を限定することを意図している。治療有効量は、１種又は複数種の用量で投与され得る。当該用語は本明細書で使用される用語の意味の範囲内に含まれていれば、治療上有効な治療は、それ自体が疾患の結果を改善しなくても、被験者の生活の質を改善する治療を含む。
【００２８】
「有効量」は、一般的に、所望の局所的または全身的な作用、例えば、本願に記載された特定の所望の効果を奏することを含む血小板形成を効果的に刺激する作用を果たす量を指す。例えば、有効量は、有益な又は所望の臨床結果を達成るのに十分な量である。
【００２９】
本明細書で使用されるように、接触とは、２つの物体が物理的に隣接し、且つ接触すること、又はそれらを合理的な短時間の範囲内でこのような接触が生じる環境に配置することを指す。例えば、細胞をミトコンドリア生物発生を刺激する薬物と接触させることは、薬物が部位（肺、骨髄、脾臓及び肝臓）での細胞と相互作用して血小板産生刺激するように、薬物を被験者に投与することを含む。但し、接触は、循環媒介の接触により薬物と血小板前駆体との接触をもたらす全身投与をさらに含む。
【００３０】
本願において使用される全ての科学的および技術的用語は、他に特定されない限り、当該分野において一般的に使用される意味を有する。本明細書で提供される定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするためのものであり、本願の範囲を限定することを意味するものではない。
血小板生物発生を刺激する
【００３１】
本発明は、被験者にミトコンドリア生物発生を刺激する有効量の薬物を投与することにより、当該被験者における血小板形成を刺激する方法を提供する。正常な人の血小板数の範囲は、血液１マイクロリットル当たり１５００００〜４５００００個の血小板である。いくつかの実施例において、被験者は少数の血小板を有するため、治療が必要となる被験者である。例えば、正常な血小板レベルの約５〜１５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％又は８５〜９５％を有する被験者は、治療を必要とする可能性がある。正常な血小板レベルの４０〜９５％を有する被験者は、一般的に血小板減少症を抱えるとは考えられないが、血小板形成の刺激から有益性を受けることができる。血液を各種の自動化された血液分析装置に入れることにより、電気インピーダンス又はフローサイトメトリーを用いて血小板濃度（小さすぎるため、数を数えることができない）を測定する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、被験者は既に血小板減少症を抱えると診断されている。血小板減少症が１種の疾患であり、また、被験者は、異常に少量の血小板、例えば、１マイクロリットル当たり５００００個未満の血小板を有し、又は特定の人間の正常（平均又は中央値）な血小板数の２.５％よりも低い血小板を有する。血小板減少症は、一般的に症状を示さないが、血小板減少症を抱える患者は、鼻出血又は歯茎出血、あざ（紫斑病）及び疲労などの外部出血の増加などの症状が現れることがある。血小板減少症は遺伝することが可能であり、又は当業者に知られている複数種の異なる疾患（例えば、膿毒症又は狼瘡）によって引き起こされる。
【００３３】
本発明は、血小板形成を刺激する方法を提供する。血小板（凝血細胞とも呼ばれる）は血液の成分の１種であり、その機能（凝血因子とともに）は、凝集および凝固により、損なわれた血管の出血を止めることである。血小板は細胞核を持たず、巨核球由来の細胞質の断片である。染色された血液塗抹標本では、血小板は濃い紫色の斑点として現れ、赤血球の直径の約２０％である。血小板形成の刺激とは、巨核球により血小板形成の速度を向上させることを指す。刺激は、１〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜１００％、１００〜１５０％、１５０〜２００％又は２００％よりも大きく増加することを指すことができる。
ミトコンドリア生物発生の刺激薬物
【００３４】
本発明の一態様は、ミトコンドリア生物発生を刺激する有効量の薬物を投与することをさらに含む。発明者は、ミトコンドリアが血小板前駆体（例えば、巨核球）による血小板形成において重要な役割を果たすことを既に確定しているため、ミトコンドリア生物発生を刺激する薬物は、血小板形成を刺激するために使用することができる。本明細書に使用されているように、用語「生物発生」とは、生物物質の合成を指すため、用語「ミトコンドリア生物発生」とは、ミトコンドリアの合成を指す。ミトコンドリア生物発生は、ミトコンドリア生物発生に関連する遺伝子の発現増加により実証することができ、これらの遺伝子は、ＰＧＣファミリーメンバー、例えばＰＧＣ−１αとＰＧＣ−１β、ＰＰＡＲδ、ＮＲＦ−１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ３、ＣＯＸとＡＭＰＫを含むが、これらに限定されない。或いは、増加したミトコンドリアＤＮＡの量又はタンパク質含有量、核ＤＮＡに対するミトコンドリアＤＮＡのより高い比率又はミトコンドリア機能の改善（例えば、ミトコンドリア酵素の活性増加又はミトコンドリア呼吸の増加）を指す。ミトコンドリア生物発生の刺激薬物は、ミトコンドリア生物発生に対して一般的な刺激作用を有し得るが、血小板生物形成の刺激については、血小板前駆体（例えば、巨核球）におけるミトコンドリア生物発生の刺激は特に重要である。
【００３５】
いくつかの実施例において、ミトコンドリア生物発生の刺激薬物は、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化剤、カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＶ活性化剤、ＡＭＰ活性化キナーゼ活性化剤、カルシニューリンＡ活性化剤、ペルオキシソーム増殖剤応答エレメント活性化剤及びＳＩＲＴ１活性化剤からなる群より選択される。これらの活性化剤は、いずれもミトコンドリア生物発生の増加を刺激することが可能であると示されている。
【００３６】
いくつかの実施例において、ミトコンドリア生物発生を刺激する薬物は、ミトコンドリア生物発生を刺激すると知られている特定の化合物からなる群より選択される。ミトコンドリア生物発生を刺激すると知られている化合物の例としては、インターロイキン１５（米国特許公開第２０１６／０３５４４４２）、ヒドロキシメチルブチレート（米国特許公開第２０１６／０３４６２３８）、生物活性アルカロイド（米国特許公開第２０１６／０１８４３３８）、レニウムベースの一酸化炭素放出化合物（米国特許公開第２０１６／０２４３１５１）、マスカダイン（ｍｕｓｃａｄｉｎｅ）とレスベラトロール（米国特許公開第２０１３／０１８４２２８）、ヒドロキシチロソール（米国特許公開第２０１５／００３０５７９）、クルクミン化合物（米国特許公開第２０１５／０２９７５３６）、フラボノイド化合物（米国特許公開第２０１４／０２５６７４１）とβ２アドレナリン受容体アゴニスト（米国特許公開第２０１４／００２４６７７）を含む。他の実施例では、ミトコンドリア生物発生を刺激する薬物は、ベザフィブラート、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｅ）、フェノフィブラート（ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ）、ＡＩＣＡＲ、メトホルミン、レスベラトロール、ＳＲＴ１７２０、ＳＲＴ２１８３、ＳＲＴ１４６０、及びケルセチン、並びにそれらの誘導体からなる群より選択される。本明細書に使用されるように、誘導体とは、同じ基本化学骨格バックボーンを有する化合物、例えば特定の芳香族複素環式化合物を指す。但し、その骨格構造上に位置する部分は、化合物の活性を失うことなく変化することができる。小さな変化は、異形同源の変異、例えば異なるハロゲンの使用、硫黄で酸素に代えること、単一のメチル基によるアルキル側鎖の延長などを含む。
【００３７】
動物モデルにおいてミトコンドリア生物発生を刺激するための候補薬物をテストすることができる。一般的に、動物モデルは、血小板減少症又はミトコンドリア生物発生を研究するための動物モデルである。例えば、米国特許公開第２００５／０１７７８８７を参照すると、それには、血小板減少症の動物モデルとして用いることが可能なＰＴＴＧノックアウト齧歯類動物が記述されている。結果は、一般的に、候補薬剤で治療される対照動物と治療を受けていない対照同腹幼畜との間で比較される。例えば、補薬剤の、ＰＧＣ−１αとＰＧＣ−１β、ＰＰＡＲδ、ＮＲＦ−１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ３、ＣＯＸとＡＭＰＫに対する影響をテストすることができ、或いは、ミトコンドリアＤＮＡの量又はタンパク質含有量、核ＤＮＡに対するミトコンドリアＤＮＡの高い比率であり、これらは、全てミトコンドリア生物発生の標識である。トランスジェニック動物モデルも獲得可能であり、そして一般的に人間の疾患のモデルとして受け入れられている（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：３４３９−３４４３(１９９５)を参照）。候補薬剤は、候補試薬がミトコンドリア生物発生を刺激するか否かを確定するために、動物モデルに使用することができる。
抗血小板減少症薬との組み合わせ
【００３８】
いくつかの実施例において、当該方法は、ミトコンドリア生物発生を刺激する薬物と組み合わせて、被験者に第２抗血小板減少症薬を投与することをさらに含む。第２抗血小板減少症薬は、血小板減少症の治療に有用であることが知られている薬物である。「抗血小板減少症薬」は、組み換えＴＰＯとペグ化人間巨核球成長及び発達因子（ＰＥＧ−ｒｈＭＧＤＦ）、及びいわゆるＴＰＯ模倣物を含むトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含み、ＴＰＯ受容体のアゴニストとして、ＴＣＰを効果的に治療するために用いられることがされている。ＴＰＯ模倣物は非ペプチド分子及びペプチドを含む。例えば、ＮｐｌａｔｅＴＭ（ロミプロスチム（ｒｏｍｉｐｌｏｓｔｉｍ）、ＡＭＧ ５３１とも呼ばれる）は、最も十分に開発されているＴＰＯ模倣物の１つであり、ＴＰＯ受容体結合ペプチドとＩｇＧ１抗体のＦｃドメインの融合タンパク質である。エルトロンボパグ（Ｅｌｔｒｏｍｂｏｐａｇ）は、例示的な非ペプチドＴＰＯ模倣物である。
【００３９】
米国特許第７,１６０,８７０号には、抗血小板減少症薬として使用することが可能な他の適切なＴＰＯ模倣物が記載されており、例えば、３’− {Ｎ’− [３−シクロプロピル−１−（３,４−ジメチルフェニル）−５−オキソ−１,５−ジヒドロピラゾール−４−イリデン] ヒドラジノ} −２’− ヒドロキシビフェニル−３−カルボン酸、[１−（４−フルオロ−３−メチルフェニル）−３−メチル−５−オキソ−１,５−ジヒドロピラゾール−４−イリデン] −ヒドラジノ} −２’−ヒドロキシビフェニル−３−カルボン酸、３’ − {Ｎ’ − [３−メチル−５−オキソ−１−（４−トリフルオロメチルフェニル）−１,５−ジヒドロピラゾール−４−イリデン] ヒドラジノ} −２’−ヒドロキシビフェニル−３−カルボン酸、３− {Ｎ’ − [１−（３,４−ジメチルフェニル）−３−メチル−５−オキソ−１,５−ジヒドロピラゾール−４−イリデン−] ヒドラジノ}−２−ヒドロキシ−３’−テトラゾール−５−イルビフェニル、３’ − {Ｎ’−１−（３,４−ジメチルフェニル）−３−メチル−５−オキソ−１,５−ジヒドロピラゾール−４−イリデン−ヒドラジノ} −２’−ヒドロキシビフェニル−３−カルボン酸、３’ − {Ｎ’ − [１−（３−フルオロ−４−メチルフェニル）−３−メチル−５−オキソ−１,５−ジヒドロピラゾール−４−イリデン] ヒドラジノ} −２’−ヒドロキシビフェニル−３−カルボン酸、３’ − {Ｎ’ − [１−（３,４−ジメチルフェニル）−３−エチル−５−オキソ−１,５−ジヒドロピラゾール−４−イリデン]−ヒドラジノ} −２’−ヒドロキシビフェニル−３−カルボン酸、及び３− {Ｎ’ − [１−（３,４−ジメチルフェニル）−３−エチル−５−オキソ−１,５−ジヒドロピラゾール−４−イリデン] −ヒドラジノ} −２−ヒドロキシ−３’− テトラゾール−５−イルビフェニルが記載され、３’− {Ｎ’ − [１−（３,４−ジメチルフェニル）−３−メチル−５−オキソ−１,５−ジヒドロピラゾール−４−イリデン] ヒドラジノ} −２’−ヒドロキシビフェニル− ３−カルボン酸、及びその薬学的に許容できる塩、水化物、溶媒和物又はエステルが好ましい。
【００４０】
「組み合わせ」とは、累積効果又は相乗効果があるように、ミトコンドリア生物発生を刺激する薬物及び一定の量の抗血小板減少症薬を投与し、もし別々に、同時に又は順次に抗血小板減少症薬を投与しない場合に、当該ミトコンドリア生物発生を刺激する薬物を投与すれば、当該累積効果又は相乗効果を得られないことを指す。抗血小板減少症薬の投与は連続的に、順次に又は偶発的であってもよい。従って、本明細書に使用されるように、組み合わせは、本発明の組み合わせを含む単一の製剤に限定されるべきではなく、異なる剤形で本発明の組み合わせの活性剤を投与する方案又は治療は開放的である。
【００４１】
薬物の適切な投与量は、投与経路、年齢、体重、性別、又は被験者の状態に応じて異なるが、最終的には医師によって決定される。経口投与の場合、一日の投与量は一般に体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから約５００ｍｇであり、好ましくは、約０.０１ｍｇから約５０ｍｇであり、より好ましくは、約０.１ｍｇから約１０ｍｇである。非経口投与の場合、一日の投与量は一般に体重１ｋｇ当たり約０.００１ｍｇから約１００ｍgであり、好ましくは、約０.００１ｍｇから約１０ｍｇであり、より好ましくは、約０.０１ｍｇから約１ｍｇである。毎日の投与量は、例えば、毎日１〜４回の個々の投与の典型的な方法で投与することができる。投与量は、目標血清濃度を使用することにより測定することができる。有効量に達する各種の考慮要因は、例えば、ＧｏｏｄｍａｎとＧｉｌｍａｎ著：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、  ８ｔｈ  ｅｄ．,  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、  １９９０、とＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、  １７ｔｈ  ｅｄ．、  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、  Ｅａｓｔｏｎ、  Ｐａ．、１９９０に記載されている。
薬学的に許容される担体
【００４２】
いくつかの実施例において、ミトコンドリア生物発生を刺激する薬物は薬学的に許容される担体とともに投与される。他の薬物（例えば、抗血小板減少症薬）も薬学的に許容される担体とともに投与することができる。薬学的に許容される担体は、薬物を投与すること、または、その薬物動態を改善することに寄与する１種又は複数種の追加的な成分を含む。薬学的に許容される担体に含まれる成分の例には、薬学的に許容される賦形剤および希釈剤が含まれる。適切な賦形剤及び／又は希釈剤は当該分野で熟知されており、医薬グレードのデンプン澱粉、マンニトール、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース（又は他の糖）、炭酸マグネシウム、ゼラチン油、アルコール、洗剤、乳化剤又は水（好ましくは無菌）を含む。薬学的に許容される担体を含む薬物組成物は、防腐剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着臭剤、塩、緩衝剤、コーティング剤又は抗酸化剤も含み得る。
【００４３】
薬物組成物は、任意の適切な経路、例えば、非経口、経口（口腔又は舌下を含む）、直腸または局所（口腔、舌下、皮内又は経皮を含む）の経路によって投与することができる。そのような組成物は、薬学分野で知られている任意の方法によって、例えば無菌条件下で活性成分を担体又は賦形剤と混合することにより調製することができる。
【００４４】
経口投与に適する薬物組成物は、カプセル剤または錠剤などの個別の単位として、粉末又は顆粒として、溶液剤、シロップ剤又は懸濁剤として（水性または非水性液体において、又は食用可能なフォーム剤もしくはホイップ剤として、又は乳液として）提供することができる。錠剤又はハードゼラチンカプセルのための適切な賦形剤としては、乳糖、トウモロコシデンプン又はその誘導体、ステアリン酸その塩が挙げられる。ソフトゼラチンカプセルのための適切な賦形剤としては、例えば植物油、ワックス、脂肪、半固体、または液体ポリオールなどが含まれる。溶液及びシロップ剤を調製するために、使用できる賦形剤には、例えば水、ポリオールおよび糖が含まれる。懸濁液を調製するために、水中油型又は油中水型の懸濁液を提供するように、油（例えば植物油）を使用することができる。
【００４５】
局所投与に適する薬物組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、洗剤、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー剤、エアロゾル又は油として製剤化することができる。薬物は、マイクロニードル又はマイクロニードルアレイ、薬物含有、薬物埋め込み、又は薬物塗布がされたマイクロニードルアレイ（溶解性または非溶解性マイクロニードルアレイ、中空マイクロニードルまたはマイクロニードルアレイ）によって皮膚を介して送達することができる。それは、インスリンポンプ、カテーテル、ウェアラブルシリンジポンプ及びマイクロデリバリー技術により送達することができる（この薬物は、体内で全身的に作用し、大量を必要とするため、皮膚の局所適用によって送達される可能性が低い）。直腸投与に適する薬物組成物は、坐剤又は浣腸剤とすることができる。
【００４６】
非経口投与に適する薬物組成物は、製剤を予定の受容体の血液と実質的に等張にする抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び溶質を含有可能な水性と非水性の無菌注射溶液、及び、懸濁剤と増粘剤を含有可能な水性と非水性の無菌懸濁液を含むことができる。注射液に使用可能な賦形剤には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油が含まれる。組成物は、単位用量又は複数用量の容器、例えば、密封されたアンプルとバイアル中に存在してもよく、凍結乾燥（凍結乾燥された）状態で保存されてもよく、ちょうど使用する前に付けた無菌液体（例えば、注射溶液）を添加することのみを必要とする。即席注射溶液及び懸濁液は、無菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。
低レベル光療法
【００４７】
いくつかの実施例において、当該方法は、低レベル光（ＬＬＬ）療法で被験者を治療することを含む。本明細書で使用されるように、用語「低レベル光（ＬＬＬ）」は、細胞（例えば、幹細胞、他の種類の血小板前駆細胞、血小板など）、組織及び／又は患者の身体の少なくとも一部（例えば、成人の血小板形成骨又は乳児の骨と肝臓）を他の形態のレーザー療法（例えば、アブレーション、切断、熱凝固など）に比べて低いエネルギー密度の低レベルの赤光と近赤外（ＮＩＲ）光に露出するプロセスを指すことができる。本明細書で使用されるように、用語ＬＬＬＴ（「低レベル光療法」）は、ＬＬＬと互換的に使用され得る。
【００４８】
通常、低レベル光（ＬＬＬ）は、（一回の用量又は複数回の用量で）他の形態のレーザー療法（例えば、切除、切断、熱凝固など）に比べて低いエネルギー密度で細胞（例えば、幹細胞、巨核球、他の血小板前駆体細胞、血小板など）、組織（例えば、骨髄及び／又は肝臓）、及び／又は患者の身体の少なくとも一部に投与することができる。例えば、ＬＬＬエネルギー密度は、０.００１ Ｊ／ｃｍ２〜３０ Ｊ／ｃｍ２であってもよい。他の例として、ＬＬＬエネルギー密度は、０.００１ Ｊ／ｃｍ２〜２０ Ｊ／ｃｍ２であってもよい。他の例として、ＬＬＬエネルギー密度は、０.１ Ｊ／ｃｍ２〜０.５ Ｊ／ｃｍ２であってもよい。ＬＬＬは簡単で、非侵襲的で、安全で、便利で、且つ費用効果を有する方式であり、痛みの軽減および他の用途のために何十年も臨床的に使用されてきた。各種の実施例では、本明細書で使用されるＬＬＬは、６００ｎｍ〜１５００ｎｍの波長、６００ｎｍ〜１１００ｎｍの波長又は９００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長を有することができる。
【００４９】
理論に拘束されることを望まないが、ＬＬＬは、少なくともＬＬＬが細胞及び／又は血小板内のＡＴＰ合成を増強可能であるため、インビボ及びインビトロの血小板生物発生を増強させ、血小板寿命を延ばすために使用できると考えられる。発明者は、ミトコンドリアが、ＬＬＬのの初期効果が生じる部位であることを実証した。Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，８（３４９），３４９ｒａ１０１  （２０１６）と本明細書の実施例Ｉを参照するとよい。ＬＬＬは、ミトコンドリア呼吸鎖（ＭＲＣ）において複数種のタンパク質複合物（例えば、Ｉ、ＩＩＩ及び／又はＩＶ）を励起することができる。通常、ＭＲＣは、細胞内で９０％を超えるＡＴＰを産生することができるが、ストレス下の細胞では、ＡＴＰ合成ののレベルが低下するため、ＬＬＬにより、細胞内のＡＴＰの量が増加することが可能である。いくつかの場合では、ＬＬＬは（追加的又は代替的にＡＴＰ合成を増加する）、酸化的リン酸化の増強、ミトコンドリア膜電位の増強、酸化ストレスの減少、及び抗アポトーシスをもたらし得る。
血小板形成を刺激する方法
【００５０】
本発明の別の局面は、血小板前駆体をミトコンドリア生物発生を刺激する薬物と接触させることを含む、血小板形成を刺激する方法を提供する。当該方法により、インビボ、インビトロ、及びエクスビボで血小板形成を刺激することができる。いくつかの実施例において、血小板前駆体も低レベル光処理に露出される。ミトコンドリア生物発生を刺激する薬物は、本明細書に記載のいずれの薬物であってもよい。
【００５１】
「前駆細胞」は、その大半の分化多能性を失って単能的、部分的に分化した細胞になる細胞である。本明細書で使用される「単能性細胞」は、１つの細胞類型にのみ分化する前駆細胞を指す。「血小板前駆体」は、血小板生合成に寄与する任意の細胞を指すことができる。これらの細胞は、通常骨髄及び／又は肝臓内に見られる。血小板前駆体の例には、造血幹細胞、前巨核球、巨核芽球、巨核球などが含まれる。
【００５２】
いくつかの実施例において、血小板前駆体は、巨核球又は巨核芽球である。巨核球は、血小板の産生を担う分葉核を有する大きな骨髄細胞である。巨核球は、典型的な赤血球よりも１０〜１５倍大きく、平均直径が５０〜１００μｍである。その成熟の間に、巨核球はサイズが大きくなり、核内分裂（ｅｎｄｏｍｉｔｏｓｉｓ）というプロセスで、細胞質分裂（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ）せずに、そのＤＮＡを複製する。細胞増大に続いてプロ血小板形成が起こり、但し、末端成熟ＭＫはその全ての細胞質を多くの長く分枝したプロ血小板に変換し、それは約１μｍ／ｍｉｎの速度で増長し、数時間内で２５０〜５００μｍの長さに達する。このような細胞質リモデリング及びプロ血小板の活発な突出と増長は微小管力によって駆動され、ミトコンドリアによるＡＴＰ生成に大きく依存する。トロンボポエチンは、巨核球がプロ血小板形成することを誘導することにおいて役割を果たす。
【００５３】
以下の実施例は、説明のみを目的としており、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例
実施例１：血小板減少症に用いられる非侵襲的な低レベルレーザー療法
【００５４】
我々を含む多くの研究者は、比較的低いエネルギー密度有する特別な近赤外レーザー（低レベルレーザー（ＬＬＬ）又はコールドレーザーと呼ばれる）が、ミトコンドリア呼吸鎖におけるチトクロームｃオキシダーゼを活性化し、ミトコンドリア機能を改善することができると示した。Ｙｕら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．  ６６、８６６−８７１  （１９９７）。Ｚｈａｎｇら、Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ３４、１３９１−１４０１  （２０１４）。ＬＬＬは、ミトコンドリア膜電位を直接向上させ、ＡＴＰ合成を刺激し、そして、細胞ＲＯＳ及びＣａ２＋レベルを調節することができるように思われる。Ｄｏｎｇら、Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．、３５（９）、１４３５−４４  （２０１５）。ＬＬＬは、また酸化ストレスを軽減し、細胞アポトーシスを防ぎ、炎症を減らし、そして細胞増殖及び分化を促進することができる。ＡｌＧｈａｍｄｉら、Ｌａｓｅｒｓ  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  ２７、２３７−２４９  （２０１２）。光照射は、他のシグナル伝達経路を調節し、そして各種のストレス条件下でミトコンドリア機能をより効果的に調節する。Ｓｏｎｇら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、９、２１９  （２０１２）。外傷性脳損傷に対するＬＬＬの有益な効果は、多くの前臨床試験で実証されている。Ｚｈａｎｇら、Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ、３４、１３９１−１４０１  （２０１４）。しかしながら、血小板産生に対するＬＬＬの効果は全く知られていない。
【００５５】
本研究は、非侵襲的全身ＬＬＬ照射が、血小板産生を増加させ、マウスにおいてγ−照射、ＩＴＰ又は５−フルオロラシル（５−ＦＵ）によって引き起こされた血小板減少症を完全に治癒するか、又は大きく改善することを実証した。ＬＬＬは、ＭＫ、ＨＳＣ及びＢＭ細胞において、ＡＴＰ生成を瞬時に増加させるにも関わらず、ＬＬＬは、主にＭＫを標的として特異的に倍数体ＭＫでミトコンドリア生物発生を促進するが、二倍体細胞でミトコンドリア生物発生を促進しない。この発見は、ＬＬＬが血小板減少症を治療する予防と治療方式になることに大きな期待を寄せている。
結果
【００５６】
ＬＬＬは、血小板形成を加速させ、ＭＫの血小板産生を増加させた。
【００５７】
ＬＬＬが血小板生物発生に及ぼす可能性のある影響を調べるために、ＣＤ４１＋及び高前方散乱（ＦＳＣｈｉｇｈ）に基づき、マウスＢＭ細胞から成熟ＭＫを選別し、異なる期間にわたって（図１Ａ）、それらを８１０ｎｍダイオードレーザーにを露出させた。次に、選別されたＭＫを１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含有する無血清拡張培地（以下、ＭＫ培地と呼ばれる）で１時間培養し、そしてＡＴＰ測定を行った（図１Ｂ）。エネルギー密度範囲が１〜１０ Ｊ／ｃｍ２のＬＬＬは、ＭＫにおけるＡＴＰ合成を著しく増強させ、その顕著な効果は３〜５ Ｊ／ｃｍ２（図１Ｂ）である。従って、特に明記しない限り、３Ｊ／ｃｍ２のレーザを選択してその後のエクスビボの研究に用いる。まず、ＬＬＬ又は擬似光で選別されたＭＫを処理し、ＭＫ培地で２４時間培養し、そして、ＣＤ４１＋細胞に基づくＦＳＣにより、５０００個のＭＫのサイズのフローサイトメトリー分析を行った。この分析は、偽処理されたＭＫでわずか３７％のサイズの増加に比べ、ＬＬＬ処理されたＭＫで平均６０％の増加（ｐ＜０.００１、図１Ｃ）を示した。次に、透過型電子顕微鏡により、ＬＬＬ媒介のＭＫ増大（図１Ｄ）が確証された。培養２４時間の培養後に、ＬＬＬの存在下で、ＭＫの大径は７６％増加し、同様な条件でＬＬＬが存在しない場合、わずか３９％増加した（ｐ＜０.００１、図１Ｄ、右下）。
【００５８】
細胞増大を除き、ＬＬＬ処理されたＭＫは、２４時間培養後に、細胞質全体にわたって既にＩＭＳを生成していたが（図１Ｄ、下段中央）、このような膜系は対照ＭＫで少なく形成され、これは、ＬＬＬがＭＫ成熟を加速することを示した。ＩＭＳは、プロ血小板の膜貯蔵庫（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）であり、各ＭＫ３７から生成された血小板数の重要な決定要因の1つである。これによれば、ＬＬＬ処理されたＭＫから生成された血小板数は対照ＭＫの２倍（ｐ＜０.００１、図１Ｇ）であり、これは、大きなプロ血小板を形成するＭＫ（ＰＰＦ−ＭＫ）の割合が増加したためである（図１Ｆ）。ＰＰＦ−ＭＫを位相差顕微鏡で２４時間培養して追跡したところ、その間にＭＫは、それらの細胞質を複数の突起で装飾された多くのプロ血小板に変換し、上記複数の突起は、サイズが異なる「花」のような形態を形成した（図１Ｅ）。ＬＬＬが存在しない場合、約２３.５％のＣＤ４１＋ ＦＳＣｈｉｇｈ ＭＫは、細胞直径≧１００μｍである大きいＰＰＦ−ＭＫを形成する。注目されることは、ＬＬＬが存在する場合、大きいＰＰＦ−ＭＫの百分率が４２.７％まで増加し、これは偽処置と比較して８０％を超える増加を示す（図１Ｆ）。インビボでのこの発見を要約するために、成熟のＭＫを選別し、ＬＬＬ又は擬似光で処理し、生体蛍光色素カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ，ＣＦＳＥ）で標識し、レシピエントマウス３８に静脈内注入した。受容体に注入後の２日目〜５日目に、ＬＬＬ処理されたＭＫは、対照対応物よりも高いレベルの血小板（ｐ＜０.００１、図１Ｈ）を生成した。
【００５９】
血小板形成におけるミトコンドリアＡＴＰ生成の重要な役割
【００６０】
我々のさらなる研究は、決定係数Ｒ２ ＝０.９４４１（Ｐ＜０.００１）で、ＬＬＬ後の１時間に測定されたＭＫ ＡＴＰレベルが３日後に測定された血小板数との間の高度な統計相関を明らかにした（図２Ａ）。ＭＫ培地に５μg／ｍlのオリゴマイシンＡ（Ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ  Ａ（ＯＡ））を含めることにより、ＬＬＬ媒介の血小板産生の増強は著しく弱められた（図２Ｂ）。オリゴマイシンＡは、特異的にミトコンドリアＦ１Ｆ０−ＡＴＰシンターゼを抑制し、細胞内のＡＴＰ合成を減少させた（図２Ｃ）。血小板形成におけるＡＴＰの重要性は、またＩＥＸ−１３９を欠くマウスにおけるストレス時の不可逆的な血小板減少症の発症と一致する。野生型（ＷＴ）対照と比較して、ＩＥＸ−１ノックアウト（ＫＯ）ＭＫは、低下したミトコンドリア膜電位（Δψｍ、図２Ｄ）と減少したＡＴＰ生成（ｐ＜０.０１、図２Ｅ）を有する。ＫＯ ＭＫからのプロ血小板分化は著しく妨げられ、複雑度の低いネットワークの、少なく、短いプロ血小板分枝を形成した（図２Ｆ、中間の図）。２４時間分化培養物におけるＷＴ ＭＫに比べ、ＫＯ  ＭＫの平均サイズは半分減少し（ｐ＜０.００１、図２Ｇ）、プロ血小板形成におけるミトコンドリア活性の中心的役割を実証した。ＬＬＬでＫＯ ＭＫを処理すると、ＡＴＰレベルを８９％上昇した（ｐ＜０.００１、図２Ｅ）。注目すべきことに、単一の用量のＬＬＬ処理は、ＫＯ ＭＫのプロ血小板形成を実質的に回復させ、ＬＬＬ後の２４時間にほぼ正常なＰＰＦ−ＭＫ形態をもたらした（図２Ｆ、右図）。ＫＯ ＰＰＦ−ＭＫの平均直径は、わずか６７.０±１７.８μｍであるが、ＬＬＬ後に９７.６±３１.３μｍまで増加し、細胞が４６％増大したことを示した（Ｐ＜０.０１）。但し、それらは、依然としてＷＴ ＰＰＦ−ＭＫよりも小さい（図２Ｇ）。３日間の培養物における偽処理に比べ、ＬＬＬ媒介のＫＯ ＰＰＦ−ＭＫ増大は、産生された血小板数の２倍の増加に変換した（図２Ｈ）。これらのデータは、ミトコンドリア活性が血小板産生の決定要素であることを裏付けている。
【００６１】
ＬＬＬは、ＭＫにおけるミトコンドリア生物発生を促進する。
【００６２】
我々は次に、ＭＫの短い（３分２０秒）のＬＬＬ処理がいかに何日後の血小板分化を影響するかを調べた。まず、ＡＴＰ生成を測定し、そしてＬＬＬがＭＫにおけるＡＴＰ生成をほんの少しだけ向上させ、６０分でピークに達し、９０分で内で基礎レベルに回復したことを観察した（図３Ａ）。このような瞬時的、且つ安定的なＡＴＰ生成は、またＬＬＬ処理後のＢＭ有核細胞（ＢＭ）、造血幹細胞及び前駆細胞（Ｌｉｎ−Ｓｃａ１  ＋  ｃＫｉｔ  ＋細胞又はＬＳＫ）においても証明された（図３Ａ）。しかしながら、驚いたことに、対照と比較してＬＬＬ後の２４時間にＭＫのみにおいてミトコンドリア含有量が２倍になることで示されているように、ＬＬＬに促進されたミトコンドリア生物発生はＭＫにおいて生じたが、ＬＳＫ又はＢＭにおいて生じなかった（図３Ｂ）。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色（図３Ｂ）及びミトコンドリアＤＮＡの核ＤＮＡに対する相対比率（図３Ｃ）により、ミトコンドリアの質量を定量化した。ＬＬＬ媒介のミトコンドリア生物発生は、分子レベルでさらに実証された。これに関して、ペルオキシソーム増殖物活性化受容体−γ共活性化因子１α（ＰＧＣ−１α）は、ミトコンドリア生物発生及び呼吸機能の主要な調節遺伝子である。Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｐ．  ３（７）．  ｐｉｉ：  ｅ１２４７０  （２０１５）。この遺伝子の発現は、ＬＬＬ後の４時間に強く増強され（図３Ｄ）、その後、ミトコンドリア生物発生に関連する他の遺伝子も細胞において著しく上方制御された（図３Ｄ）。これらの遺伝子は、ミトコンドリア転写因子Ａ（Ｔｆａｍ）、ミトコンドリア分裂関連遺伝子ダイナミン関連タンパク質（Ｄｒｐ１）、ミトコンドリア分裂１タンパク質（Ｆｉｓ１）及びミトコンドリア分裂因子（Ｍｆｆ）を含む。ＰＧＣ−１α発現は、ＢＭ細胞及びＬＳＫにおいてかなり低く、またＬＬＬ処理により上昇した。これは、前述のように、ＬＬＬが異なる細胞種類においてＰＧＣ−１α発現を刺激する能力を証明した。Ｎｇｕｙｅｎら、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ．  １４、４２−４８  （２０１４）。しかしながら、ＭＫとは対照的に、ＰＧＣ−１α４３の下流のＴｆａｍ、Ｄｒｐ１、Ｆｉｓ１及びＭｆｆ遺伝子は、並行して測定されたＢＭ及びＬＳＫにおいて、いずれもアップレギュレートされなかった。Ｎｇｕｙｅｎなどによって記載されたものと同様に、細胞の二倍体がＭＫの倍数体と異なることが原因である可能性がある。
【００６３】
ＬＬＬ媒介のミトコンドリア生物発生におけるＭＫ倍数体の重要な役割を確認するために、本発明者らは、生体蛍光染料Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色した後、ＤＮＡ含有量に基づいてＢＭ細胞からＣＤ４１＋ ＭＫを選別した（図３Ｅ）。Ｂａｃｃｉｎｉら、Ｂｌｏｏｄ  ９８、３２７４−３２８２  （２００１）。図３Ｆと３Ｇに示すように、８Ｎ以上のＤＮＡを有するＭＫは、２Ｎ／４Ｎ ＭＫよりも、ＬＬＬに応答がはるかに強く、同様の条件下で、２Ｎ／４Ｎ ＭＫに対して、倍数体ＭＫにおけるミトコンドリア生物発生及びＰＧＣ−１α発現が著しく増加したことを示した（図３Ｆ）。二倍体細胞と同様に、２Ｎ／４Ｎ細胞の成分には、８４％の２Ｎ ＭＫ及び１６％の４Ｎ ＭＫ（平均＝２.３Ｎ）を含有し、８Ｎ以上の細胞の成分には、６７％の８Ｎ ＭＫ、２８％の１６Ｎ ＭＫ及び５％の３２Ｎ ＭＫ（平均＝１１.４Ｎ）を含有し、倍数体ＭＫであると考えられる。ＬＬＬのＤＮＡコピー数依存性効果は、下流遺伝子Ｔｆａｍ、Ｄｒｐ１、Ｆｉｓ１及びＭｆｆの発現においてより顕著であり、これらの下流遺伝子は、倍数体ＭＫにおいて１００〜２００％増加したが、二倍体ＭＫにおいてわずか０〜２０％増加した（図３Ｈ）。これによれば、擬似光に比べ、ＬＬＬは、倍数体ＭＫにおける血小板産生を２００％増加させ、二倍体ＭＫにおいてわずか２９％を増加させた（図３Ｉ）。これらの結果は、ＬＬＬが倍数体ＭＫにおいてミトコンドリア生物発生を効果的に増強したが、二倍体細胞におけるミトコンドリア生物発生を増強しなかった。
【００６４】
図３Ｊ及び３Ｋに示すように、多核ＭＫにおいてミトコンドリア質量の増加が観察され、ここで、ＩＭＳが完全に発育する前に多核細胞のみにおいてミトコンドリアを数えた。興味深いことに、ミトコンドリア数の増加の以外に、ＬＬＬ治療が細胞におけるミトコンドリア分布も変えた。ミトコンドリアは細胞全体にわたってより均一に分布していた（図３Ｊ、右）、偽処理されたＭＫにおけるミトコンドリアは、主に核周囲領域に集中していた（図３Ｊ、左）。個々のミトコンドリアから最も近い細胞核までの距離を測定したところ、ＬＬＬ処理されたＭＫにおけるミトコンドリアの１６％は、この細胞核から４μｍを超える部位に位置したが、対照ＭＫにおいてこれらの細胞核から離れたミトコンドリアは、わずか４％である（Ｐ ＜０.０５、図３Ｌ）。ＬＬＬにより刺激されるＡＴＰ生成は、ミトコンドリアのより速い移動を促進し、そして、ＭＫの増大中に特定の細胞領域のエネルギー需要を満たすために、任意の２つのミトコンドリア間の距離の増加は、ミトコンドリア分裂を刺激するミトコンドリア要求シグナルを発信することができる。遺伝することにより、数個のミトコンドリアを得るように、ミトコンドリア生物発生は、ＭＫ増大及び各血小板に対する十分なエネルギー供給を保証することができる。
【００６５】
ＬＬＬは、γ−照射により誘発された血小板減少症を速やかに治癒する。
【００６６】
ＬＬＬの治療的可能性を探求するために、我々は、まずマウスの皮膚、筋肉および骨の層を十分に透過し、３ Ｊ／ｃｍ２でＢＭに達することができるレーザー線量を決定した。テストされたいくつかのレーザーには、６６０ｎｍ連続波レーザー、８１０ｎｍ １０Ｈz、１００Ｈzパルスレーザー及び８１０ｎｍ連続波レーザーを含み、後者は、最も有効な透過率を示し、ＢＭに透過するレーザー出力は９.０±０.６％である（図４Ａ）。従って、１００ ｍＷ／ｃｍ２、又は３０ Ｊ／ｃｍ２のフルエンスの８１０ｎｍ連続波レーザーで５分間の全身照射を行い、マウスＢＭ細胞が約３ Ｊ／ｃｍ２のエネルギー密度を得るようにし、エクスビボ培養で使用されるレーザーエネルギーに匹敵する（図１）。レーザー浸透は、全身ＬＬＬ照射後の１時間に、椎骨、大腿骨、脛骨、及び骨盤から分離されたＢＭ細胞におけるＡＴＰ生成の増加によって実証された（図４Ｂ）。その後、共焦点顕微鏡により、大腿骨においてＬＬＬのインビボでのＭＫ分化に対する影響が確認され、ここで、血管とＭＫは、それぞれＰＥ−抗−ＣＤ１０５とＦＩＴＣ−抗−ＣＤ４１抗体で染色された（図４Ｃ）。ＬＬＬ後の２４時間後に、ＢＭ全体において、大きな「花」状のＭＫ、おそらくＰＰＦ−ＭＫ（図４Ｃ、右図）が観察されたが、対照マウスのＢＭにおいてこのような「花」状の細胞がほとんど見られなかった（図４Ｃ、左図）。定量的には、ＬＬＬ処理された大腿骨では約３６％のＭＫがＰＰＦ−ＭＫを形成したが、対照大腿骨では、わずか１９％のＭＫがＰＰＦ−ＭＫを形成した（ｐ＜０.０１、図４Ｄ）。
【００６７】
前述の研究は、ＬＬＬが主にＭＫを標的として、多数のＭＫを有する被験者（例えば、血小板減少症を抱える被験者）に対してより大きく影響し、この病症が補償的巨核球生成を引き起こすためであることを示した。従って、我々は、３−Ｇｙ γ−照射（ＩＲ）により血小板減少症を誘発し（Ｒａｍｓｅｙら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９９、２８２−２９１  （２０１４））、その後、以下の３つの案で上述したように、毎日マウスを５分間全身ＬＬＬ照射処理し、（１）ＩＲ後の６時間後に１回処理し（ＩＲ ＋ １ｘＬＬＬ）、（２）ＩＲ後の６及び２４時間後に２回処理し（ＩＲ ＋  ２ｘＬＬＬ）、（３）０日目から４日連続して４回処理した（ＩＲ ＋ ４ｘＬＬＬ）。全血球数を毎週チェックし、擬似光を受けるγ−照射されたマウスと比較する。実験期間全体にわたって、ＬＬＬの存在下または非存在下で、白血球、リンパ球、単球、顆粒球又は赤血球の数は著しく変化しなかった。しかしながら、血小板の回復は、マウスにおいてレーザー用量依存的にはるかに速かった（図５Ａ）。５週間の偽処理されたマウス（ＩＲ）に比べ、ＩＲ後２週間（ＩＲ＋４xＬＬＬ）又は３週間（ＩＲ＋２xＬＬＬ）の早さで血小板数は、ＩＲ前のレベル又はより高いレベルに達した。ＩＲ後の２週間にチェックしたとき、血小板数が上昇したことと一致していることは、マウスの尾部の出血時間の正規化（図５Ｂ）及びマウスにおける平均血小板体積である。
【００６８】
ＩＲ後の２週間後にチェックしたとき、血小板数が上昇したことと一致していることは、尾部の出血時間の正規化（図５Ｃ）及びマウスにおける平均血小板体積である（図５Ｄ）。４×ＬＬＬ処理されたマウスにおいて産生された血小板は、匹敵するレベルの顆粒、ミトコンドリア及び開放細管系を含む正常な対照血小板とは、超微細構造的に区別がつかなかった（図５Ｅ）。対照的に、ｇ−照射されたマウスから分離された血小板は、少量のミトコンドリアと顆粒を有する異常な形態（正常な血小板より２〜３倍大きい）を示した（図５Ｅ）。血小板の異常な形態は、これらのマウスが正常な対照に比べ、血小板数がわずか４０％低下したが、出血時間が倍増したことを解釈することができる（図５、Ｂ及びＣ）。４×ＬＬＬ処理されたマウスから分離された血小板の全体的な凝集活性も、ＩＲを受けていない正常な対照のものと同一であった（図５Ｆ）。これらの結果は、ＬＬＬ処理により産生された血小板が形態的、及び機能的に無傷のままであることを示した。
【００６９】
なお、ＬＬＬは、血小板減少症のマウスにおける血小板産生を増強したが、偽処理されたマウスに比べ、１２日間まで１日おきにＬＬＬを投与する場合、正常なマウスの血小板数に著しく影響しなかった（図５Ｇ）。ＭＫの数も著しく変化しなかった（図５Ｇ）。これは、このような方法の安全性をサポートし、ＬＬＬを繰り返して使用した後でも、血栓の形成を心配することがほとんどない。
【００７０】
プロ血小板形成の増加及び加速の以外に、ＬＬＬは、またＩＲにより誘導されるアポトーシスからＭＫを保護することができ、ＩＲ後の最初の３日間は、ＬＬＬ処理されたマウスにおけるＭＫ数が偽処理されたマウスにおけるＭＫよりも多いことをもたらした。ＬＬＬの存在下では、ＭＫの数がＩＲ後の２日後にピークに達し、１つの大腿骨で３７３５３から７８１５９まで増加し、これは、ＬＬＬの非存在下での場合より約５０％高い（図５Ｈ）。ＭＫを選別し、３−Ｇｙ ＩＲを行い、そしてカスパーゼ−３／７活性化を測定した場合、非ＩＲ対応物に対して、ｇ−照射がされたＭＫでは、平均して、カスパーゼ−３／７活性の３倍の増加が達成され、ＩＲ後の２４時間内で細胞生存性が同時に著しく低下した。ＩＲ後の６時間後に投与されたＬＬＬは、カスパーゼ−３の活性化を著しく抑制し、γ−照射されたＭＫの細胞生存性を増強させた。ＩＲ誘導の損傷からのＭＫのＬＬＬ媒介の保護は、総ＰＰＦ−ＭＫの百分率を２０.５％から３０.２％まで増加させ、特に大きなＰＰＦ−ＭＫの百分率（５.８から１９.２％まで）を増加させ、エクスビボで培養したγ−照射ＭＫの血小板産生の回復をもたらした。注意すべきことは、ＭＫ数が最初の増加の後にＩＲ後の５日目の最低レベルに急激に低下した（図５Ｈ）。しかしながら、ＬＬＬ処理されたマウスでは、ＭＫの数が再び着実に上昇し、偽処理されたマウスにおけるＭＫの数が減少し続け（図５Ｈ）、それは、ＬＬＬに応答したＨＳＣからのＭＫのより良好な分化に起因する可能性があり、この結論に達するにはさらなる研究が必要である。
【００７１】
ＬＬＬは、抗ＣＤ４１抗体又は５−フルオロウラシルに誘発される血小板減少症を軽減させる。
【００７２】
我々はさらに、ＩＴＰに対する研究を広め、ＬＬＬ媒介の血小板産生がγ−照射に誘導される血小板減少症に特異的であることを排除した。我々は０日目から７日目まで毎日０.１ｍｇ／ｋｇ体重で抗ＣＤ４１抗体を投与して血小板を枯渇させ、よく用いられるＩＴＰ動物モデルを作成した。Ｋａｔｓｍａｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ５０、１２８５−１２９４（２０１０）。毎日擬似光又は３０ Ｊ／ｃｍ２ＬＬＬでマウスを処理、血小板数が著しく低下した３日目に初期照射を行い、ＬＬＬ後の６時間に血小板数を毎日チェックした（図６Ａ）。最終的に補償的血小板産生のため、全てのマウス血小板数が回復したが、わずか２回の処理（４日目）後にＬＬＬが最低点を持ち上げ、抗ＣＤ４１抗体が存在する条件で血小板数の回復を加速させた（図６Ａ）。ＬＬＬ処理された動物では、出血時間も５日目に正常化した（図６Ｂ）。ＩＴＰは血小板減少症の一般的な形態であるため、抗ＣＤ４１抗体の存在かでは、ＬＬＬが血小板再生を増強させる能力は、その適用を非常に大きく広げた。５−ＦＵを受けたマウスにおいても、血小板再生に対するＬＬＬの同様な作用も観察された。化学治療薬物は、４日目に１５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で循環血小板数を４３％減少させたが（Ｃｈｅｎａｉｌｌｅら、Ｂｌｏｏｄ  ７６、５０８−５１５（１９９０））、０日目から２日目まで毎日に１回３つの用量のＬＬＬを投与することにより、薬物治療されるマウスにおける血小板減少症（図６Ｃ）と正常化の出血時間（図６Ｄ）を大きく軽減した。
【００７３】
ＬＬＬは、ヒト細胞において血栓形成のポテンシャルを示す。
【００７４】
我々は続いて、ヒト細胞を用いてこの形態のトランスレーショナルなポテンシャルを評価した。ＣＤ３４＋細胞を１００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＰＯを含有する無血清拡大培地で培養し、これは前述のように巨核球形成の全ての分化段階を再現した。Ｚｅｕｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７、４７６７−４７７３（２００７）。図７Ａに示すように、培養物において、ＣＤ３４＋細胞は、６日間で主にＭＫ前駆細胞に分化し、１２日間でＭＫに分化し、１５日間で血小板に分化した。従って、我々は１２日目の培養物から成熟ＭＫを選別し、異なるエネルギー密度のＬＬＬで細胞を処理した。エネルギー密度０.５〜１０ Ｊ／ｃｍ２（ピーク応答が３ Ｊ／ｃｍ２）のＬＬＬは、ヒトＭＫにおけるＡＴＰ生成を著しく刺激し（図７Ｂ）、マウスＭＫと同様である（図１Ｂ）。従って、０日目（主に培養物におけるＣＤ３４＋細胞）、６日目（ＭＫ前駆細胞）又は１２日目（ＭＫ）に同じレーザー（３ Ｊ／ｃｍ２）を投与し、その後、１５日目に血小板産生を評価した。これらの培養物でのＭＫ分化は、経時的に倍数体が増加することにより（１２日目に倍数体細胞（≧８Ｎ）の最大百分率）、実証された（図７Ｃ）。細胞倍数性の増加は、ＬＬＬの血小板産生に対する影響と関連し、培養の１２日目にＬＬＬ処理により誘導される血小板産生は最高レベルに達した（図７Ｄ）。その結果は、ＭＫがマウスにおけるＬＬＬの優先的標的であり、ＬＬＬがヒトとマウスのＭＫの間の血小板生物の発生に同様な作用を有することを明らかに示した。
討論
【００７５】
現在の研究は、非侵襲的ＬＬＬ照射が血小板減少症のマウスにおける血小板産生を着実に増加させることができるが、正常な対照では、できないと実証している。レーザーは、エクスビボで人及びマウスのＭＫで同様に有効であり、これら２つの種の間のミトコンドリアの進化的保存及び血小板生物発生と一致する。この観察結果は、ＬＬＬが血小板減少症の治療と予防としてのトランスレーショナルなポテンシャルについて、説得力を持って証明している。この研究の最も重要な知見は、ＬＬＬが主にＭＫを標的とし、それが遊離血漿ＴＰＯ（循環血小板の数と逆相関する）のチェック下でＬＬＬ媒介の血小板産生を維持することにある。Ｓｈｉｎｊｏら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １２、２９５−３００（１９９８）。対照的に、臨床中又は血小板減少症を治療する開発条件で使用される現在の薬剤は全て、血小板数と無関係にＨＳＣからのＭＫ前駆体の分化を促進し、それによって、高用量で投与すると、血栓形成の高リスクをもたらす。ＭＫの数が巨核球生成を介して血小板数によって相互に調節されるため、血小板減少症が激しいほど、より強い巨核球生成が誘発され、大量のＭＫが産生し、そして、血小板形成に対するＬＬＬの影響がより顕著になる。逆に、生理学的条件下又は血小板数が正常レベルに戻ったときに、ＬＬＬは、これらの健康な被験者におけるＭＫの数が極めて少ないため、血小板数にほとんど影響を及ぼさない（図５Ｅ）。理論的には、ＬＬＬは、その病因に関係なく、後天性血小板減少症を抱える全ての患者に有益であり、その条件は、現在の研究でＩＲ、ＩＴＰ及び５−ＦＵ誘発性血小板減少症がテストされているが、血小板減少症により巨核球生成を激しく誘発することができる。しかしながら、現在では、こうのような方式が遺伝性血小板減少症に同様に影響するか否かは明らかではない。巨核球生成が不十分な患者に対しては、ＬＬＬと巨核球生成薬物（例えば、組み換えヒトインターロイキン−１１（ｒＨｕＩＬ−１１）、ｒｏｍｉｐｌｏｓｔｉｍ及びｅｌｔｒｏｍｂｏｐａｇ）の組み合わせは、累積的、又は協同的に血小板生物発生を増強させ、これらの薬物の用量依存性の副作用を減少させることができ（Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ、Ｓ．、  Ｓｅｍｉｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．、４６、Ｓ２６−Ｓ３２（２００９））、これは、これらの薬物ＬＬＬと異なる血小板産生の初期分化段階を標的とするためである。我々の知っている限りでは、現在、プロ血小板形成又は巨核生成を特異的に標的とする下流の薬剤が一切存在しない。
【００７６】
ＬＬＬ媒介の血小板産生のメカニズムは、ミトコンドリアに対するその独特の作用に主に依存する。ＬＬＬは、γ−照射によって誘導されるアポトーシスからＭＫを保護する。γ−照射は、多くの研究によって実証されているように、ミトコンドリア依存の経路を介してアポトーシスを誘導する。Ｓｒｉｄｈａｒａｎら、Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．、１８１、３２４−３３４（２０１４）。次に、ＬＬＬは、ＭＫにおけるミトコンドリア生物発生を特異的に増強させ（図３）、これは他の種類の細胞では示されておらず、ＭＫの倍数性（ＭＫのユニークな特徴）に起因する。以前の研究は、近赤外光露出が筋肉細胞におけるＰＧＣ−１α発現を約２０％増加させたが、下流のミトコンドリア成分遺伝子（Ｔfaｍ、ＮＲＦ−１、Ｓｉｒｔ３及びチトクロームｃ）の発現が変化しなかったことを示した。同様に、ＬＬＬはＢＭ及びＬＳＫにおけるＰＧＣ−１α転写を増加させたが、ミトコンドリア生物発生を伴わず（図３Ｂ）、又は他のミトコンドリア成分遺伝子の発現に伴い増加した。倍数体ＭＫにおけるミトコンドリア生物発生に対するＬＬＬのこのユニークな作用は、血小板機能に関連するタンパク質合成に必要なＭＫゲノムを増加する機能的拡大と一致し、細胞増大と並行する。Ｒａｓｌｏｖａら、Ｂｌｏｏｄ、１０１、５４１−５４４(２００３)。ＬＬＬの特異的なＭＫ効果は、ＬＬＬがＭＫに大きく影響し、同様な条件でＢＭとＬＳＫ（図３Ｂ）、リンパ球と赤血球にほとんど影響しないことをよく説明している。
【００７７】
ＭＫミトコンドリア生物発生及びミトコンドリア活性を増強させるＬＬＬの能力は、その血小板産生効果に不可欠であると考えられる（Ｍｏｓｔａｆａら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２９、８７３−８８３（２００１））。これは、ＡＴＰ生成と血小板産生との間の相関性（図２Ａ）から推定される。プロ血小板形成の高エネルギー需要も、インビボ血小板生物発生と一致し、ここで、ＭＫがプロ血小板形成中にＢＭ正弦曲線へ遷移し、ここで、酸素レベルが上昇して大量のミトコンドリア酸化的リン酸化を確保し、骨における低酸素ニッチ（ｌｏｗ−ｏｘｙｇｅｎ  ｎｉｃｈｅ）主に存在するＨＳＣと前駆細胞とは相反する。同様に、ＭＫは高レベルの酸素を含有する肺毛細血管にプロ血小板を形成する傾向がある。対照的に、ＩＥＸ−１を欠くミトコンドリアの不十分な活性はプロ血小板形成を妨げ、これはＬＬＬ処理により著しく正常化することができる（図２）。プロ血小板形成におけるＡＴＰの重要性の直接的な証拠は、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎとＰａｔｅｌらの研究から来ている。Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  １０６、４０６６−４０７５（２００５）。彼らは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に透過処理されたＰＰＦ−ＭＫへＡＴＰを添加することによりプロ血小板伸長を活性化し、プロ血小板成長を著しく増強させることを示した。この研究は、血栓形成の後期におけるＡＴＰの律速因子に関する説得力のある証拠を提供するだけでなく、インビトロとインビボの両方でいかに血小板産生効果を向上させる貴重な示唆を与えている。
【００７８】
ＬＬＬ療法は、既に日常的に臨床において鎮痛、抗炎症及び創傷治癒のために２０年以上使用されており、長期的な安全性記録を有する。殆どの開業医は、このような安全で、薬物なしで、ドナーに依存しない方式を血小板減少症の独立型又は補完治療として容易に採用することができる。人体内のレーザー照射に関しては、なんらの加熱の危険も生じず、スーパーパルス赤外レーザーは１０〜１３ｃｍまで組織を貫通することができる。従って、研究する価値のあることは、スーパーパルスＬＬＬが近い将来で大きな動物において非侵襲的に血小板生物発生を増加させることができるか否かにある。強調すべきことは、このような方式は失血処理における血小板注入に代えることを意図せず、血小板注入の需要を大きく減少させ、血小板減少症の一次又は二次予防を提供するものである。
材料及び方法
【００７９】
研究設計
【００８０】
この研究は、血小板生物発生に対するＬＬＬの決定的作用及び血小板減少症に対するその治療と予防の可能性を確定することを目的とする。全てのエクスビボ研究について、我々はマウスＢＭ又はＣＤ３４＋細胞由来の培養物から選別された初代ＭＫを使用した。実験の数（生物的及び技術的複製を含む）は各図の説明文において定義されている。インビボ実験について、３種の異なるマウスモデルをテストして、照射、免疫枯渇及び５−ＦＵによって誘発された血小板減少症を治癒又は改善するＬＬＬの能力を検証した。各図の説明文においてマウスの数がアウトラインされている。研究者はサンプルの特徴を知らない。研究対象のすべての異常値はいずれもデータ分析に含まれる。
【００８１】
マウス
【００８２】
８〜１２週齢のいずれかの性別のＣ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。１２９Ｓｖ／Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＷＴ及びＩＥＸ−１  ＫＯマウスを我々の研究室で作製した。Ｚｈａｎｇら、Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ３４、１３９１−１４０１（２０１４）。実験動物の看護および使用に関する米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のガイドラインに従って、動物プロトコルは、マサチューセッツ総合病院の研究動物ケアグループ委員会（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）によって承認された。
【００８３】
低レベルレーザー治療
【００８４】
エクスビボ照射について、３Ｊ／ｃｍ２のエネルギー密度を得るために、８１０ｎｍの赤外ダイオードレーザー（Ａｃｃｕｌａｓｅｒ、ＰｈｏｔｏＴｈｅｒａ）を連続波とし、出力密度を１５ｍＷ／ｃｍ２とし、３分２０秒継続した。全身ＬＬＬ照射について、イソフルランで脱毛されたマウスを麻酔し、体幹および四肢全体を覆うレーザーレンズの下に配置した。３０ Ｊ／ｃｍ２のエネルギー密度を得るために、ＬＬＬの出力密度を１００ ｍＷ／ｃｍ２とし、総露光時間を５分間とする。ＩＲ又は５−ＦＵ処理後の４−６時間に、又は１回目の抗ＣＤ４１抗体の注射後の３日後に第１用量のＬＬＬを与えた。ゼネラル・エレクトリックのの小型の柔らかい白色ＬＥＤ電球（３Ｗ、Ａ１５）を用いて擬似光を与えた。レーザパワー伝達を測定するたねに、マウスを死なせた直後に、異なるレーザーに露出した後、直ちに新鮮な皮膚、筋肉及び椎骨の層を除去した。レーザーパワーメーター（Ｏｐｈｉｒ  Ｎｏｖａ  ＩＩ）で透過光をを測定し、皮膚表面と骨層直下の光エネルギー密度の差を透過率（％）として算出した。
【００８５】
プロ血小板形成のアッセイ
【００８６】
ＣＤ４１＋  ＦＳＣｈｉｇｈ  ＭＫを選別し、ＬＬＬ有りまたは無しで処理し、３．７５ｇ／Ｌのメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）が補充されたＭＫ培地に配置した。細胞は、３７℃で５％ＣＯ２を含有するチャンバー内で分化した。低速度撮影の顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１）により４０倍の対物レンズを用いて２４時間まで位相差生細胞画像を記録した。ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）によりＰＰＦ−ＭＫの最長又は大径を測定した。直径＜１００μｍのＰＰＦ−ＭＫは「小」と定義され、直径≧１００μｍのものは「大」と定義される。ＰＰＦ−ＭＫ形成の比率を推定するために、それぞれの孔に５００個のＣＤ４１＋ＦＳＣｈｉｇｈ ＭＫを配置し、処理を知らない研究者によって１グループ当たり少なくとも６個の試料からＰＰＦ−ＭＫの百分率を手動で計算した。
【００８７】
大腿骨ＭＫの追跡
【００８８】
全身ＬＬＬ照射の２４時間後に、マウス１匹当たりそれぞれ１２μｇのＦＩＴＣ抗ＣＤ４１及び１２μｇのＰＥ抗ＣＤ１０５抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を静脈内に投与した。１５分後にマウスを死なせて大腿骨を摘出し、共焦点顕微鏡により検査した。各大腿骨から無作為に選択された６つのビューで少なくとも５０個のＭＫが追跡され、サンプルブラインド（ｓａｍｐｌｅ―ｂｌｉｎｄ）方式で１グループ当たり６個のサンプルからＰＰＦ−ＭＫの百分率が計算された。
【００８９】
ヒト巨核球及び血小板培養物
【００９０】
ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから冷凍ヒトＢＭ ＣＤ３４＋細胞を入手し、前述のように、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＰＯ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補充された無血清拡大培地で分化させた。Ｚｅｕｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６７、４７６７−４７７３  （２００７）。培養中に、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色（Ｓｉｇｍａ）により、及びフローサイトメトリーのＣＤ４１レベルにより巨核球の分化段階を通常的に評価した。それぞれ培養の０、６、１２又は１５日目にＣＤ３４＋細胞、ＭＫ前駆細胞、成熟ＭＫ又は血小板を収集した。
【００９１】
統計分析
【００９２】
結果は、平均値±ＳＥＭとして示されている。両側スチューデントのｔ検定（２グループ間の比較に用いられる）で、又は一元配置分散分析（複数グループの比較に用いられる）により統計的顕著性を評価した。ｐ＜０.０５の値は、統計学的に顕著であると考えられる。回帰分析および相関分析によってＡＴＰレベルと血小板との間の関係を測定し、決定係数（Ｒ２）を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて全ての統計学分析を行った。
実施例２：血小板再生のためのミトコンドリア生物発生を促進する薬物
【００９３】
主に例えば心臓、肝臓、骨格筋、脂肪、及び脳などの高エネルギー需要を有する組織において、何十年にもわたってミトコンドリア生物発生が広く研究されてきた。巨核球（ＭＫ）は最終の分化段階でミトコンドリアも豊富であるが、我々の最近の研究まで血小板生物発生におけるミトコンドリア生物発生の重要性が発見された。Ｙａｎｇら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６：３８２３８（２０１６）、Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、８：３４９ｒａ１０１（２０１６）。我々は、血小板形成の最後の段階で、大量の細胞質リモデリング及びプロ血小板の活発な突出及び伸長がミトコンドリア活性に大きく依存していることを実証している。サポートとして、ミトコンドリアチトクロームｃの点突然変異は、人において血小板形成の調節不全及び血小板減少症を引き起こし、家族では他の疾患が同時に発生することがない。Ｍｏｒｉｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、４０：３８７−３８９（２００８）。我々は、またマウスにおけるストレス時に、ミトコンドリア機能不足が血小板減少を引き起こしやすいことを実証している。Ｒａｍｓｅｙら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９９：２８２−２９１（２０１４）。逆に、低レベルレーザー治療（ＬＬＬＴ）は、ＭＫにおけるミトコンドリア生物発生及び血小板形成を促進するとともに、複数種のマウスモデルにおける血小板減少症を軽減させる。これらの知見は、ミトコンドリア生物発生促進薬物（ここで、ミトコンドリア薬物（ｍｉｔｏ−ｄｒｕｇｓ）と総称する）が血小板再生を増強させ、血小板減少症を治療することができるかもしれないという興味深い可能性を提起する。
【００９４】
図８に示すように、ミトコンドリア生物発生は、ペルオキシソーム増殖剤−活性化受容体（ＰＰＡＲ）−γコアクチベーター１α（ＰＧＣ−１α）の発現を誘導することにより、薬理学的に扱うことができ、上記ペルオキシソーム増殖剤−活性化受容体（ＰＰＡＲ）−γコアクチベーター１α（ＰＧＣ−１α）は、ミトコンドリア生物発生のためのマスター調節遺伝子である。Ｓｃａｒｐｕｌｌａ、Ｒ．Ｃ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １８１３：１２６９−１２７８(２０１１)。この遺伝子は、様々なキナーゼ及びＰＰＡＲアゴニストに転写活性化され、又はＡＭＰ活性化キナーゼ（ＡＭＰＫ）を用いたリン酸化及びサイレントインフォメーションレギュレーター２タンパク質１（ＳＩＲＴ１）を用いた脱アセチル化（Ｄe−Ａｃ）を介して翻訳後修飾されることができる（図８）。Ｋｏｍｅｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７１：１８１８−１８３６（２０１４）。多数の研究は、ミトコンドリア生物合成は、ベザフィブラート（ＢＥＺ）、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン及びフェノフィブラートを含むｐａｎ−ＰＰＡＲアゴニスト、例えばＡＩＣＡＲ（ＡＭＰ模倣物）、メトホルミン、そして恐らくレスベラトロールなどのＡＭＰＫの活性化剤、例えばＳＲＴ１７２０、その誘導体ＳＲＴ２１８３及びＳＲＴ１４６０、ケルセチン、そして恐らくレスベラトロールＳＩＲＴ１など活性化剤によって十分に誘導されることが可能であることを示している。Ｕｉｔｔｅｎｂｏｇａａｒｄ、Ｍ．ａｎｄ  Ｃｈｉａｒａｍｅｌｌｏ、Ａ．、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ. Ｄeｓ, ２０:５５７４−５５９３(２０１４)。Ａｒｂｅｌら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｉａｂｅｔｏｌ．、１５：１１（２０１６）。これらのミトコンドリア薬物のうちの一部は、現在メタボリックシンドローム、肥満症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）及び様々な神経変性疾患を治療する臨床実験に使用されているが、他の薬物（例えば、ＢＥＺ、メトホルミン）は既に臨床で何十年も使用されていた。Ｈｏｆｅｒら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２３：２４００−２４１５（２０１４）。しかしながら、これらの薬物が単独でも又は任意の組み合わせでもＭＫにおけるミトコンドリア生物発生或いは血小板産生を増強させる能力について研究されていない。
【００９５】
テストされたいつくかのミトコンドリア薬物はエクスビボのＭＫの血小板産生を増強させた。我々は、ＬＬＬＴより程度が少し低いが、レスベラトロール（Ｒeｓ）、ＢＥＺ及びＳＲＴ１７２０が、エクスビボのＭＫの血小板産生を著しく増強させることができ、ＡＩＣＡＲができないと発見している（図９）。個々の薬物に使用される濃度は、１００倍低い濃度で使用されるＳＲＴ１７２０を除き、他の細胞培養物でＰＧＣ−１α発現を誘導することによく用いられた濃度である。高い濃度のＳＲＴ１７２０は血小板産生を著しく増強させることができない。血小板産生を増強させるために、各種の薬物的濃度を最適化することができるかもしれない。これらのミトコンドリア薬物も化学療法に有利であることを示しており（Ａｉｒｅｓら、Ｍｏｌ．Ｎｕｔｒ．Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．５８：１７８５−１７９４（２０１４）、Ｌｉｕら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６：１２１４−１２２１、（２０１５）、Ｆｒｅｓｃｏら、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ  １６：１１４−１３４（２０１０）)、それを結論づけるためにさらなる研究が必要であるが、化学療法を受けている癌患者に２重の有益性をもたらすことができる。
【００９６】
一定の遅延があるが、ミトコンドリア薬物はインビボでＬＬＬＴと同様に血小板産生を増強させる、インビボではミトコンドリア薬物媒介の血小板生物発生を実証するために、８週齢のＢ６マウスに２用量の化学薬物５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を投与した。血小板減少症を誘発するために、１日目及び４日目にそれぞれ１２０及び９０ｍｇ／ｋｇ体重を投与した（図９）。１回目の５−ＦＵ注射後の６時間後から、１００ｍｇ／ｋｇ体重のＢＥＺ又はＲeｓ又は溶媒対照で、４日間連続して１日２回５−ＦＵ処理されたマウスに強制経口投与した。比較するために、５−ＦＵ処理されたマウスに並行して４日間連続して毎日ＬＬＬを投与した。ＢＥＺは、７日目及び７日目の後に、ＬＬＬＴと同様のｐｌｔ数を保持する有効性を示したが、７日目前にＬＬＬＴより劣っており、これは恐らくＬＬＬＴがアポトーシスからＭＫ及び血小板を保護し、ＢＥＺがそうしなかったためである。ＬＬＬＴと比較して遅れているにもかかわらず、ＢＥＺは、血小板数を血小板数の非危険レベル（正常値の７０％）以上に維持し、最低点を実質的に減少させた。これは、最低点が最も危険な出血をもたらすポイントになる。Ｒｅｓは、また血小板生物発生を増強させ、最低点を著しく上昇させたが、ＢＥＺ又はＬＬＬＴに比べ、その有効性が相対的に弱い。結果は、ミトコンドリア生物発生の誘導が血小板減少症を軽減させることができると実証している。研究におけるＲeｓ又はＢＥＺの用量は、臨床におけるミトコンドリア薬物の現在の投与量に匹敵する。ＢＥＺのより高い用量又は投与量が有効性をさらに向上させることができるか否かはまだ研究されていない。
【００９７】
ＬＬＬＴとミトコンドリア薬物の組み合わせは、有益性を拡大することができる。ＬＬＬＴの迅速な作用と経口ＢＥＺの利便性により、抗ＣＤ４１抗体に誘発された血小板減少症（よく用いられる免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）モデル）を治療するために、二者を組み合わせることが促進された。０日目から７日目まで毎日抗血小板抗体を投与し、それは２回の注射後に循環血小板が急激に低下し、２日目に最低点に達したことを引き起こした。全体の実験の８日間では、血小板レベルは、正常血小板数の４０％より低く維持された。単独のＢＥＺは血小板数が最低点まで低下することを効果的に防止することができなかったが、それは最低点のすぐ後に、血小板数を著しく増加させた。著しく対照的に、ＬＬＬＴは血小板数レベルを正常レベルの５０％より高く維持し、出血のリスクを大幅に低下させた。ＢＥＺとＬＬＬＴの組み合わせは、血小板再生をさらに改善し、血小板数を正常レベルの７０％（循環血小板数の安全レベル）以上に維持した。これらの結果は、ミトコンドリア薬物が単独で使用され、又はＬＬＬＴ或いは他の巨核球生成を促進する促進薬物と併用することで血小板減少症を治療するミトコンドリア薬物の可能性を示している。これらの結果は、図１０及び１１に示される。
【００９８】
本明細書に引用したすべての特許、特許出願、及び刊行物、ならびに電子的に入手可能な資料の完全な開示は、参照により本明細書に組み入れられる。参照により本明細書に組み込まれている資料と本明細書との間のいかなる不一致も、本明細書に有利である方式で解決される。前述の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にするためだけに与えられている。不必要な制限はそれから理解されるべきではない。当業者に明らかな変形例が特許請求の範囲によって定義される本発明の特許請求の範囲内に含まれるため、本発明は示されて記載された具体的な詳細に限定されない。
【図１】
2019526531.tif 000003
【図２】
2019526531.tif 000004
【図３】
2019526531.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
2019526531.tif 000008
【図７】
2019526531.tif 000009
【図８】
2019526531.tif 000010
【図９】
2019526531.tif 000011
【図１０】
2019526531.tif 000012
【図１１】
2019526531.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月26日(2019.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア生物発生を刺激する有効量の薬物を被験者へ投与することにより、前記被験者の体内に血小板の形成を刺激する方法。
【請求項２】
前記薬物は、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化剤、カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＶ活性化剤、ＡＭＰ活性化キナーゼ活性化剤、カルシニューリンＡ活性化剤、ペルオキシソーム増殖剤応答エレメント活性化剤及びＳＩＲＴ１活性化剤からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ミトコンドリア生物発生を刺激する前記薬物は、ベザフィブラート、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、フェノフィブラート、ＡＩＣＡＲ、メトホルミン、レスベラトロール、ＳＲＴ１７２０、ＳＲＴ２１８３、ＳＲＴ１４６０及びケルセチン、ならびにそれらの誘導体からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被験者は、血小板減少症を抱えると診断されている請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗血小板減少症薬を前記被験者へ投与することをさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
低レベル光（ＬＬＬ）療法で前記被験者を治療することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記薬物は、薬学的に許容される担体とともに投与される請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2019526531.tif 000014
【国際調査報告】
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2019526531.tif 000016
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