(57)【要約】本発明は、イネの好適な異種の内胚乳中の増強された食物繊維および難消化性デンプンレベルと関連するデンプン合成酵素遺伝子における突然変異を開示する。食物繊維および難消化性デンプンは、イネ顆粒の加水分解指数値を３５〜４０％に有意に低下させる程度まで増強される。これらのイネ異種は、糖尿病集団について多大な需要があり、多くの他の健康上の利益、例えば体重増加の減少、心臓の健康および結腸の健康を提供する。この方略は遺伝子操作技術の使用を含まないので、それを、いかなる制限をも伴わずにイネ育種プログラムにおいて直接用いることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＳＩ、ＳＳ  ＩＩＩａ、ＳＢＥ  Ｉ、およびＳＢＥ  ＩＩｂを含む２つ、３つ、または４つの遺伝子の組み合わせにおいて１つ以上の突然変異を含むイネ植物であって；前記イネ植物が、発芽する種子を産生し、さらに前記イネ植物からの穀粒が、野生型イネ植物からの穀粒と比較して増加した難消化性デンプンまたは総食物繊維レベルを有する、前記イネ植物。
【請求項２】
さらに、野生型イネ植物のデンプン顆粒と比較して、低下したレベルの酵素デンプン合成酵素Ｉおよび／またはデンプン合成酵素ＩＩＩａを、前記植物のこれらの酵素をコードする２つ、３つまたは４つの遺伝子の組み合わせにおける突然変異から生じたデンプン顆粒中の低下したレベルのデンプン分枝酵素Ｉおよび／またはデンプン分枝酵素ＩＩｂとの組み合わせにおいて含む、請求項１に記載のイネ植物。
【請求項３】
穀物のデンプンが、野生型イネ植物の穀粒と比較して２６％を超える増加したアミロース含量を有する、請求項１に記載のイネ植物。
【請求項４】
穀物中のデンプンが、野生型イネ植物の穀粒と比較して６％を超える増加した難消化性デンプン含量を有する、請求項１に記載のイネ植物。
【請求項５】
品種インディカタイプのＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａである、請求項１に記載のイネ植物。
【請求項６】
請求項１に記載のイネ植物からの、イネ穀粒。
【請求項７】
請求項１に記載のイネ穀粒のセルを含む、小麦粉。
【請求項８】
請求項１に記載のイネ植物のセルを含む、食物または飲料製品。
【請求項９】
植物育種もしくは分子育種またはそれらの任意の生物工学的アプローチのいずれかにより請求項１に記載のイネ植物から任意の形態において誘導される、イネ種子、花粉顆粒、植物部分または子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増加した食物繊維および難消化性デンプン発現を有するイネ植物に関する。より特定的には、本発明は、アミロペクチン構造を修飾することによって増加したアミロース含量、難消化性デンプンおよび食物繊維をもたらし、加水分解指数を減少させる、デンプン合成酵素をコードする遺伝子における化学的に誘発された突然変異を、イネのデンプン分枝酵素をコードする遺伝子における突然変異と組み合わせた方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
穀類、例えばイネは、ヒト食事の基本的な食物成分であり、重要な栄養素、例えば食物繊維および炭水化物を含む。食物繊維の消費は、消化のために特に重要であり、特定の疾患、例えば糖尿病、肥満および結腸がんの防止または処置に有用であると暗示されてきた。一般に、食物繊維は、非デンプン多糖類、難消化性デンプン、リグニン、ならびに微量成分、例えばろう、クチンおよびスベリンを含む、ヒト消化酵素による消化に対して耐性である植物材料の残余物であると定義される。食物繊維に富む食品の潜在的な健康上の利益のために、多くの国々は、かかる食品の増加した消費を当該国々の食事ガイドラインの一部として推奨している。
【０００３】
白米は、世界の人口の半分超のための主食である。ハーバード大学公衆衛生学部からの新たな研究によって、白米を定期的に食べる人々について２型糖尿病を発症する彼らのリスクが有意に高められ得ることが示される。彼らはまた、より多量の米を食べた人々は、最小量の米を食べた人々よりも糖尿病にかかる可能性が１．５倍超高いことを見出した。当該研究のもっと深刻な結果であることは、ヒトが毎日食べた白米の５．５オンスの一杯毎に、リスクが１０％上昇したことである。「アジア諸国はより高いリスクにある」、当該研究者らは、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌの２０１５年３月号に発表された研究において著述した。
【０００４】
白米は、ほとんどすべての繊維およびミネラルを欠く高度に精製された食糧穀物である。繊維およびミネラルの主要部分は、現代のコメ粉砕および精米機械類によって完全に除去されるコメの糠層中に存在する。消費者は、未精米または部分的に精米されたコメの穀粒よりもその良好なおいしさのために十分に精米されたコメを好むので、高度の精米を採用することは、現代の精米所において一般的な慣習であった。健康とおいしさとの間のジレンマの問題の文脈において、世界中のコメを食べる集団は、両方の問題に積極的に取り組む選択肢を探している。
【０００５】
糖尿病として一般に知られている真性糖尿病は、発展途上国および先進国の両方における最も一般的な内分泌障害である。糖尿病は慢性疾患であり、それは、膵臓が十分なインスリンを産生できない場合、または身体がそれが産生するインスリンを有効に使用することができない場合に起こる。これによって、血液中のグルコースの増加した濃度（高血糖症）がもたらされる。以前はインスリン依存性または小児期発症の糖尿病として知られていた１型糖尿病は、インスリン産生の欠如によって特徴づけられ、一方以前は非インスリン依存性または成人発症の糖尿病と称されていた２型糖尿病は、インスリンを有効に使用する身体の不能によって引き起こされる。これは、過度の体重および運動不足により起こる。妊娠糖尿病と称される別のタイプの糖尿病は、妊娠中に最初に認識される高血糖症である。
【０００６】
糖尿病患者のための適切な食事を計画し、達成することは、糖尿病管理の臨床的戦略における主要な支持である。炭水化物が食物の主要な部分を形成し、グルコース放出のための不可欠な原因因子であるので、現在の食事的な糖尿病管理方略は、ヒトにおける炭水化物代謝を変化させることに焦点を当てて、グルコースの血流中へのゆっくりとした放出を達成する。
この方略によって、食品中の炭水化物化学および組成が変化してそれらが糖尿病を管理するのに医学的に許容し得るようにすることが保証される。
【０００７】
血糖指数（ＧＩ）は、血中グルコースレベルに対する炭水化物の即時効果に基づく炭水化物の序列である。血糖含量を急速に上昇させる食物は、高いＧＩ値を有する。逆に、血糖含量をゆっくり上昇させる食物は、低いＧＩ値を有する。その結果、ＧＩは、食物ベースの製品のデンプン消化の有用な指標であり得る。世界の健康組織は、ＧＩを、同一の対象によって消費された標準的な食物からの同一量の炭水化物に対する応答のパーセントとして表した、試験食物の５０ｇの利用可能な炭水化物部分の血中グルコース応答曲線下の増分面積として定義する。ＧＩは、１〜１００の尺度からなり、特定の食物中の５０グラムの炭水化物が血流中に血糖として吸収される速度を示す。グルコース自体を、主要な基準点として使用し、１００と評価する。食物のＧＩ値を、低ＧＩ（＜５５）、中程度（５５〜７０）、および高（＞７０）に分類する（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。消化中、急速に分解する炭水化物は、高いＧＩを有する。他方、ゆっくりと分解する炭水化物は、低いＧＩを有する。低いＧＩの食物を消費することによる食後の血中グルコースを低下させることは、健康な対象およびインスリン抵抗性を有する患者の両方に対して正の健康アウトカムを有する。
【０００８】
調理したコメは、それがより高い百分率の可消化性デンプン（ＤＳ）およびより低い百分率の難消化性デンプン（ＲＳ）を含有するので、容易に消化され、その結果コメは、栄養学的および医学的表現において最もふさわしい食物ではない。コメは、他のデンプン質食品と比較して比較的高い血糖反応を保有することは、周知の事実である通りである。精米したコメの高いデンプンおよび低い非デンプン多糖含量は、コメが典型的に高い血糖反応を付与し、低レベルの食物繊維および難消化性デンプンを含有することを意味する。Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）は、白米についての８３の極めて高いＧＩ値を報告した。より多数のイネ異種で行われた多くの他の研究もまた、その高いＧＩ状態を示した。
【０００９】
したがって、イネの高ＧＩの問題に対処するために、実行可能な解決策は、イネ植物における食物繊維および難消化性デンプン（ＲＳ）の割合を増加させることであろう。食物繊維およびＲＳは、食事中に含まれる場合、食事的代謝可能エネルギーの希釈、増量効果、および短鎖脂肪酸への発酵、ならびに腸におけるペプチドＹＹ（ＰＹＹ）およびグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１の発現の増加という３つの主要な効果を引き出すことができる。繊維に類似した生理学的効果を有するＲＳは、コメベースの食事において最上に重要である。イネにおける食物繊維およびＲＳ蓄積の遺伝的制御を理解することは、その栄養品質を高めるために最上に重要である。イネにおける食物繊維およびＲＳ含量に関する研究によって、西洋式の食事をますます採用している東南アジア諸国において、ＩＩ型糖尿病および結腸直腸がんの発生率が劇的に増加していることから、かなりの有意性が推測される。
【００１０】
したがって、現在の技術水準において存在する問題を見ると、高い食物繊維、難消化性デンプンおよび低い血糖指数などの特徴を有するコメを製造することが、望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
現在の技術水準において存在する問題を調べると、アミロペクチン構造を修飾し、アミロース含量を増加させることができる重要な候補遺伝子における誘発された突然変異を利用することが望ましく、その結果、次にイネの穀粒における難消化性デンプンおよび食物繊維の増強がもたらされる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、好適なイネ異種のデンプン分枝酵素と組み合わせた、種々のデンプン合成酵素をコードする遺伝子における誘発された突然変異の方法を記載する。これらの突然変異は、穀物デンプン生合成における当該重要な酵素のダウンレギュレーションと関連する。かかる標的酵素のダウンレギュレーションによって、コメ穀粒における増加した難消化性デンプンおよび食物繊維蓄積がもたらされる。増加した食物繊維および難消化性デンプンによって、加水分解指数が３５〜４０％の極めて低いレベルに低下する。
【００１３】
本発明の１つ以上の態様によれば、二重および三重イネ突然変異体は、１種以上のデンプン合成酵素をコードする遺伝子における突然変異を、突然変異に供される好適なイネ異種の１種以上のデンプン分枝酵素をコードする遺伝子における突然変異と組み合わせて有する。突然変異は、好適なイネ異種における種子を、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）またはＮ＝Ｎ＝ニトロソメチル尿素（ＮＭＵ）である突然変異原で処理することによって行う。突然変異誘発は無秩序な事象であるため、様々な突然変異体が突然変異原処理によって産生され、突然変異体集団を、次に配列決定によって標的誘発局所的病変（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｏｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎ）（ＴＩＬＬＩＮＧ）に供して、増強された食物繊維および難消化性デンプンについて潜在的な突然変異を有する突然変異体をスクリーニングする。これらの突然変異を、次にデンプン生合成における特定の重要な酵素のダウンレギュレーションにおけるそれらの役割について機能的に検証した。かかる標的酵素のダウンレギュレーションによって、コメ穀粒における増加した食物繊維および難消化性デンプン蓄積がもたらされる。
【００１４】
本発明は、１０％を超える総食物繊維を、あらゆる異種のコメにおいて８％を超える難消化性デンプン含量と共に増強するために用いられ得る。これらの望ましい特徴によって、コメ穀粒の血糖反応が低下し得、したがって糖尿病患者に適している。さらに、高食物繊維によって、多くの健康上の利益、例えば減少した体重、心臓の健康および結腸の健康などが提供される。したがって、これらの変異型イネ異種は、一般大衆にとっても同様に健康的な代替の穀物食糧としての役割を果たすことができる。
【００１５】
態様の前述および他の特徴は、添付の図面と併せて読んだ際に、態様の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。図面において、同様の参照番号は、同様の要素を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の１つ以上の態様による、イネ変異株Ｌｏｔｕｓ１〜４および野生型ＧＦＲＬ７８の種子におけるアミロペクチン鎖分布、アミロース含量、難消化性デンプン含量、総食物繊維および加水分解指数を示す表を示す。
【図２】図２は、本発明の１つ以上の態様によるフローチャートを示す。
【図３】図３は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  １突然変異体のクロマトグラムグラフを示す。
【図４】図４は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  ２突然変異体のクロマトグラムグラフを示す。
【図５】図５は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  ３突然変異体のクロマトグラムグラフを示す。
【図６】図６は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  ４突然変異体のクロマトグラムグラフを示す。
【図７】図７は、本発明の１つ以上の態様による野生型異種ＧＦＲＬ７８のクロマトグラムグラフを示す。
【図８】図８は、本発明の１つ以上の態様による、野生型ＧＦＲＬ７８と比較したＬｏｔｕｓ  １突然変異体のアミロペクチン鎖長分布のグラフを示す。
【図９】図９は、本発明の１つ以上の態様による、野生型ＧＦＲＬ７８と比較したＬｏｔｕｓ  ２突然変異体のアミロペクチン鎖長分布のグラフを示す。
【図１０】図１０は、本発明の１つ以上の態様による、野生型ＧＦＲＬ７８と比較したＬｏｔｕｓ  ３突然変異体のアミロペクチン鎖長分布のグラフを示す。
【図１１】図１１は、本発明の１つ以上の態様による、野生型ＧＦＲＬ７８と比較したＬｏｔｕｓ  ４突然変異体のアミロペクチン鎖長分布のグラフを示す。
【図１２】図１２は、本発明の１つ以上の態様による、イネ植物における食物繊維および難消化性デンプン含量の増加をもたらす、突然変異体Ｌｏｔｕｓ１〜４の重要な候補遺伝子において同定した変異のリストを示す表を示す。
【図１３】図１３は、本発明の１つ以上の態様による、タンパク質を基準とした、突然変異体Ｌｏｔｕｓ１〜４の重要な候補遺伝子において同定した変異のリストを示す表を示す。
【図１４】図１４は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン合成酵素ＩのｍＲＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図１５】図１５は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン合成酵素Ｉのタンパク質配列を突然変異と共に示す。
【図１６】図１６は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン合成酵素ＩのＤＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図１７】図１７は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン合成酵素ＩＩＩａのｍＲＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図１８】図１８は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン合成酵素ＩＩＩａのタンパク質配列を突然変異と共に示す。
【図１９】図１９は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン合成酵素ＩＩＩａのＤＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図２０】図２０は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン分枝酵素ＩのｍＲＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図２１】図２１は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン分枝酵素Ｉのタンパク質配列を突然変異と共に示す。
【図２２】図２２は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン分枝酵素ＩのＤＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図２３】図２３は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン分枝酵素ＩＩｂのｍＲＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図２４】図２４は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン分枝酵素ＩＩｂのタンパク質配列を突然変異と共に示す。
【図２５】図２５は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン分枝酵素ＩＩｂのＤＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ここで、本主題の説明を詳細に参照し、その１つまたは複数の例を図面において示す。各例を、主題を説明するために提供し、限定するものではない。本発明が関係する当業者に明らかな種々の変更および修正を、本発明の精神、範囲および意図内であると見なす。
【００１８】
クレームした発明の主題をより明確かつ簡潔に説明し、指摘するために、以下の定義を特定の表現のために提供し、それらを以下の記述した記載において使用する。
【００１９】
用語「難消化性デンプン」は、小腸においてヒト酵素によって分解されないデンプンの部分を意味する。それは、大腸に進入し、ここでそれは、文脈が必要とするように部分的に、または全体的に発酵する。
【００２０】
用語「突然変異」は、文脈が必要とするように、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させることができる遺伝子のＤＮＡ配列の永久的な遺伝的変化を意味する。
【００２１】
用語「血糖指数」、本発明者らは、文脈が必要とするように、特定の食物が血中グルコース（血糖）レベルをどの程度迅速に、どの程度高く上昇させることができるかを示すために使用する数値的尺度を意味する。
【００２２】
用語「加水分解指数」は、文脈が必要とするように、食料品の血糖指数を予測するためのＩｎ  Ｖｉｔｒｏ実験室法を意味する。
【００２３】
本発明は、デンプン生合成の原因となる２種の主要な重要な標的遺伝子群、デンプン合成酵素およびデンプン分枝酵素における組み合わせにおける突然変異を示すことによって、現存する最新技術の欠点を克服する。これらの突然変異は、組み合わせにおいて、同時にアミロペクチン構造を修飾し、アミロース含量を増加させ、その結果コメ穀粒中の増加した食物繊維（ＤＦ）および難消化性デンプン（ＲＳ）含量をもたらすことができる。上記の方法論は、加水分解指数（ＨＩ）値を３３〜４０％に有意に低下させる程度まで、食物繊維および難消化性デンプンレベルを達成することに成功している。
【００２４】
図１は、本発明の１つ以上の態様による、イネ系突然変異体Ｌｏｔｕｓ１〜４および野生型ＧＦＲＬ７８の種子中のアミロペクチン鎖分布、アミロース含量、難消化性デンプン含量、総食物繊維および加水分解指数を示す表を示す。アミロース含量を、単純化されたＩ２／ＫＩアッセイを用いて測定した。難消化性デンプンの評価を、ＡＯＡＣが承認した方法２００２．０２を用い、Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄのキットを用いて行った。
【００２５】
図２は、本発明の１つ以上の態様による、好適なイネ異種のデンプン合成酵素およびデンプン分枝酵素をコードする遺伝子における突然変異（単数または複数）を誘発し、スクリーニングする方法を示すフローチャートを例示する。図２に示すように、好適なイネ異種の種子を採取して、ステップ（２０１）で突然変異を行う。ステップ（２０２）で、突然変異誘発を、好適なイネ異種の種子をエチルメタンスルホネートおよびまたはＮ−Ｎ−ニトロソメチル尿素である突然変異原で曝露することによって行う。ステップ２０３で、多数の突然変異体を、突然変異法により作製する。ステップ（２０４）で、配列決定（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）による標的誘発局所的病変（ＴＩＬＬＩＮＧ）を展開し、増強された食物繊維および難消化性デンプンについての潜在的な突然変異を有する突然変異体をスクリーニングする。これらの突然変異を、次に、デンプン生合成における特定の重要な酵素のダウンレギュレーションにおけるそれらの役割について、生物情報学ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏツールＳＩＦＴ（Ｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，２００３）およびＰｒｏｖｅａｎ  （Ｃｈｏｉ  ａｎｄ  Ｃｈａｎ，２０１５）を通して機能的に検証する。かかる標的酵素のダウンレギュレーションによって、コメ穀粒における増加した食物繊維および難消化性デンプン蓄積がもたらされる。ステップ（２０５）で、選択した推定の突然変異体を、増強された食物繊維および難消化性デンプン発現について生化学的に特徴付けた。
【００２６】
図３、図４、図５、図６および図７は、Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＦＡＣＥ）から作成したクロマトグラムグラフを例示する。グラフは、より低い鎖長（ＤＰ６〜１２）を有するアミロペクチン鎖の割合が、野生型異種と比較して、すべての突然変異体の中で優勢であることを示す。野生型異種は、中程度（ＤＰ１３〜１８）およびより長い（ＤＰ＞１９）アミロペクチン鎖のより高い割合を示した。鎖長の一般的な傾向は、突然変異体によって保有される突然変異に対する関連において明らかである。デンプン合成酵素において突然変異を有する当該変異体は、短鎖アミロペクチンの方向へのより高い傾向を示し、当該傾向は、デンプン合成酵素における突然変異の存在にもかかわらず、分枝酵素における突然変異に伴って逆転した。分枝酵素のみにおける突然変異を有する突然変異体は単離されなかったので、野生型と比較してのアミロペクチン長さの増加についての傾向には、遭遇しなかった。突然変異体の中で、ＳＳＩおよびＳＳＩＩＩａであるデンプン合成酵素の両方において突然変異を保有する第４の突然変異体異種（Ｌｏｔｕｓ  ４）は、４２．３４％の最も高い割合の短鎖を示し、すべてのその生化学的パラメーターは、ＡＣ（２９．３％）、ＲＳ（１１．９２％）およびＴＤＦ（１３．２１％）についての高い値で、ならびに３３．２の最も低いＨＩで最も望ましかった。それに、ＨＩ＝３５．７５％を有する第１の突然変異異種（Ｌｏｔｕｓ  １）が後続し、それは、１つのデンプン合成酵素突然変異（ｓｓＩＩＩａ）ならびに２つのデンプン分枝突然変異（ｓｂｅＩおよびｓｂｅＩＩｂ２）を保有していた。突然変異の数および関与する遺伝子の数にかかわらず、すべての突然変異体は、野生型異種と比較して高いＡＣ、ＲＳ、ＴＤＦおよび減少したＨＩを示した。
【００２７】
図８は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  １突然変異体のアミロペクチン鎖長分布のグラフを示す。当該グラフは、野生型異種ＧＦＲＬ７８とは対照的に、Ｌｏｔｕｓ  １突然変異体のアミロペクチン鎖の重合度を示す。
【００２８】
図９は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  ２突然変異体のアミロペクチン鎖長分布のグラフを示す。当該グラフは、野生型異種ＧＦＲＬ７８とは対照的に、Ｌｏｔｕｓ  ２突然変異体のアミロペクチン鎖の重合度を示す。
【００２９】
図１０は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  ３突然変異体のアミロペクチン鎖長分布のグラフを示す。当該グラフは、野生型異種ＧＦＲＬ７８とは対照的に、Ｌｏｔｕｓ  ３突然変異体のアミロペクチン鎖の重合度を示す。
【００３０】
図１１は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  ４突然変異体のアミロペクチン鎖長分布のグラフを示す。当該グラフは、野生型異種ＧＦＲＬ７８とは対照的に、Ｌｏｔｕｓ  ４突然変異体のアミロペクチン鎖の重合度を示す。
【００３１】
図１２は、本発明の１つ以上の態様による、内胚乳中の食物繊維および難消化性デンプン含有量を増加させる可能性が高い突然変異体Ｌｏｔｕｓ異種の重要な候補遺伝子において同定した突然変異のリストを示す表を示す。当該表は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質配列に関する突然変異の位置を示す。
【００３２】
図１３は、参照タンパク質配列、Ｐｒｏｖｅａｎスコア、ＳＩＦＴスコア、および機能予測と共に、タンパク質に関して、突然変異体Ｌｏｔｕｓ異種の重要な候補遺伝子において同定した突然変異のリストを示す表を示す。−１．３未満のＰｒｏｖｅａｎスコアは、アミノ酸変化がポリペプチドの当該位置において耐容不能であると結論付け、したがって突然変異を有害であると結論付けるために設定したしきい値である。ＳＩＦＴは、アミノ酸置換がタンパク質機能に影響するか否かを予測する。ＳＩＦＴ予測は、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴによって収集された、密接に関連した配列から誘導される配列アライメントにおけるアミノ酸残基の保存の程度に基づく。ＳＩＦＴを、天然に存在する非同義の多型または実験室で誘発されたミスセンス変異に適用することができる。ＳＩＦＴは、非耐容性アミノ酸置換を耐容性アミノ酸置換から選別し、タンパク質中のアミノ酸置換が表現型効果を有するか否かを予測する、配列相同性に基づくツールである。ＳＩＦＴスコアは、０〜１の範囲内である。アミノ酸置換を、スコアが≦０．０５である場合には損傷していると、およびスコアが＞０．０５である場合には耐容されていると予測する。
【００３３】
図１４、図１５、図１６、図１７、図１８、図１９、図２０、図２１、図２２、図２３、図２４および図２５は、デンプン合成酵素Ｉ、デンプン合成酵素ＩＩＩａ、デンプン分枝酵素Ｉおよびデンプン分枝酵素ＩＩｂのｍＲＮＡ、タンパク質およびＤＮＡ配列を、配列において強調した単一、二重または三重突然変異と共に示す。
【００３４】
本発明を一般的に記載してきたが、さらなる理解を、特定の具体例を参照することにより得ることができ、それを、例示の目的のみのために本明細書中に提供し、他に特定しない限り限定を意図するものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ＲＳ評価手順
ＲＳ含量を、Ｍｅｇａｚｙｍｅキットを用いて評価した。キットを、Ｍ／ｓ  Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．，Ｂｒａｙ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ，Ｂｒａｙ，Ｃｏ．  Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手した。１００±１ｍｇの小麦粉試料を、スクリューキャップ管中に複製して採取し、穏やかに軽くたたいて、試料が管の側面に付着しないのを確実にした。アミログルコシダーゼ（ＡＭＧ）（３Ｕ  ｍｌ−１）を含む４ｍｌの膵臓α−アミラーゼ（３  Ｃｅｒａｌｐｈａ  Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、１０ｍｇ／ｍｌ）を、各管に添加した。管にしっかりと蓋をし、ボルテックスミキサー上で完全に分散させ、運動の方向に整列した振盪水浴中に水平に取り付けた。管を、３７℃で継続的に振盪しながら（２００ストローク  分−１）１６時間インキュベートした。インキュベーション後、管を、ボルテックスミキサーを用いて激しく混合しながら４．０ｍｌのエタノール（９９パーセント）で処理した。この後、管を、１，５００×ｇ（約３，０００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離した（蓋をしていない）。上清を注意深くデカントし、ペレットを８ｍｌの５０％エタノールに再懸濁した。管を、再び１，５００×ｇ（約３，０００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離した。再び、上清をデカントし、懸濁および遠心分離ステップを繰り返した。上清をデカントし、管を吸収紙上で倒立させて、過剰の液体を排出した。磁気撹拌棒（５×１５ｍｍ）を各管に加え、続いて２ｍｌの２Ｍ  ＫＯＨ溶液を加えた。ペレットを、氷または水浴中で磁気撹拌機上で約２０分間撹拌することによって再懸濁した（かつＲＳを溶解した）。次に、８ｍｌの１．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）を、各管に添加した。直ちに、０．１ｍＬのＡＭＧ（３３００Ｕ  ｍｌ−１）を添加し、内容物をマグネチックスターラー下で十分に混合し、管を５０℃で水浴中に配置した。管を、ボルテックスミキサー上で断続的に混合しながら３０分間インキュベートした。次に、それらを、１，５００×ｇで１０分間直接遠心分離した。各管中の最終容量は、約１０．３（±０．０５）ｍｌであった。各試験管から、上清の０．１ｍｌアリコート（複製して）を、ガラス試験管中に移し、３．０ｍｌのＧＯＰＯＤ試薬を加え、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合した。試薬ブランクを、０．１ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）および３．０ｍｌのＧＯＰＯＤ試薬を混合することによって調製した。グルコース標準を、０．１ｍｌのグルコース（１ｍｇ  ｍｌ−１）および３．０ｍｌのＧＯＰＯＤ試薬を混合することによって調製した。試料、ブランクおよび標準を、５０℃で２０分間インキュベートした。吸光度を、試薬ブランクに対して５１０ｎｍで測定した。ＭｅｇａｚｙｍｅからのＭｅｇａ−Ｃａｌｃを使用して、試料のＲＳ含量を計算した。
【００３６】
実施例２：アミロペクチン鎖の重合度
純粋なデンプンを、ＬｕｍｄｕｂｗｏｎｇおよびＳｅｉｂ  （２０００）によって記載された方法に従って、すべての変異体および野生型から単離した。単離したデンプンのアミロペクチン鎖長分布を、Ｍｏｒｅｌｌ，ＳａｍｕｅｌおよびＯ’Ｓｈｅａ  （１９９８）によって記載されているように、Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  （ＦＡＣＥ）によって分析した。単離したデンプンを、イソアミラーゼ酵素（１０Ｕ）を用いて脱分枝し（３７℃で２時間）、１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）で標識した。ＦＡＣＥを、４８８ｎｍのレーザーモジュールを備えたＰ／ＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ５０１０  （Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。予め燃焼させた（ｐｒｅｂｕｒｎｅｄ）窓を有するＮ‐ＣＨＯ（ＰＶＡ）毛細管（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）  （５０μｍＩＤおよび４７ｃｍ全長）を、脱分枝試料の分離のために使用した。マルトースを、内部標準として使用した。分離を、１０℃で３０分間行った。重合度（ＤＰ）を、マルトースの移動時間に基づいてピークに割り当てた。
【００３７】
少なくとも１つの例示的な態様が、前記の概要および詳細な説明において提示されている一方、膨大な数の変形が存在することを、認識するべきである。例示的な態様（単数）または例示的な態様（複数）は、例であるに過ぎず、いかなる方法においても範囲、適用可能性または構成を限定することを意図しないことをまた、認識するべきである。むしろ、前記の概要および詳細な説明は、当業者に例示的な態様を実行するための好都合な指針を提供し、様々な変更が、添付した特許請求の範囲およびそれらの法的に等価なものに述べられている範囲から逸脱せずに例示的な態様に記載される要素の機能および配置においてなされ得ることが、理解される。
【図１】
2019509035.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１５−１】
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【図１６】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１７−１】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２０−１】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２４−１】
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【図２５】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月2日(2017.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増加した食物繊維および難消化性デンプン発現を有する突然変異イネ植物から得られたイネ穀粒に関する。より特定的には、本発明は、アミロペクチン構造の修飾をもたらし、その結果増加した難消化性デンプンおよび食物繊維含量をもたらし、それにより加水分解指数を減少させる、デンプン合成酵素（ｓｓＩおよび／またはｓｓＩＩＩａ）をコードする遺伝子における化学的に誘発された二重または三重突然変異を、イネのデンプン分枝酵素（ｓｂｅＩおよび／またはｓｂｅＩＩｂ）をコードする遺伝子における突然変異と組み合わせた方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
穀類、例えばイネは、ヒト食事の基本的な食物成分であり、重要な栄養素、例えば食物繊維および炭水化物を含む。食物繊維の消費は、消化のために特に重要であり、特定の疾患、例えば糖尿病、肥満および結腸がんの防止または処置に有用であると暗示されてきた。一般に、食物繊維は、非デンプン多糖類、難消化性デンプン、リグニン、ならびに微量成分、例えばろう、クチンおよびスベリンを含む、ヒト消化酵素による消化に対して耐性である植物材料の残余物であると定義される。食物繊維に富む食品の潜在的な健康上の利益のために、多くの国々は、かかる食品の増加した消費を当該国々の食事ガイドラインの一部として推奨している。
【０００３】
白米は、世界の人口の半分超のための主食である。ハーバード大学公衆衛生学部からの新たな研究によって、白米を定期的に消費する人々が２型糖尿病を発症する彼らのリスクが有意に高め得ることが示される。彼らはまた、米を消費した人々は、最小量の米を食べた人々よりも糖尿病にかかる可能性が１．５倍超高いことを見出した。当該研究のもっと深刻な結果であることは、ヒトが毎日消費した白米の５．５オンスの一杯毎に、リスクが１０％上昇したことである。「アジア諸国はより高いリスクにある」、当該研究者らは、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌの２０１５年３月号に発表された研究において著述した。
【０００４】
白米は、ほとんどすべての繊維およびミネラルを欠く高度に精製された食糧穀物である。繊維およびミネラルの主要部分は、現代のコメ粉砕および精米機械類によって完全に除去されるコメの糠層中に存在する。消費者は、未精米または部分的に精米されたコメの穀粒よりもその良好なおいしさのために十分に精米されたコメを好むので、高度の精米を採用することは、現代の精米所において一般的な慣習であった。健康とおいしさとの間のジレンマの問題の文脈において、世界中のコメを食べる集団は、両方の問題に積極的に取り組む選択肢を探している。
【０００５】
糖尿病として一般に知られている真性糖尿病は、発展途上国および先進国の両方における最も一般的な内分泌障害である。糖尿病は慢性疾患であり、それは、膵臓が十分なインスリンを産生できない場合、または身体がそれが産生するインスリンを有効に使用することができない場合に起こる。これによって、血液中のグルコースの増加した濃度（高血糖症）がもたらされる。以前はインスリン依存性または小児期発症の糖尿病として知られていた１型糖尿病は、インスリン産生の欠如によって特徴づけられ、一方以前は非インスリン依存性または成人発症の糖尿病と称されていた２型糖尿病は、インスリンを有効に使用する身体の不能によって引き起こされる。これは、過度の体重および運動不足により起こる。妊娠糖尿病と称される別のタイプの糖尿病は、妊娠中に最初に認識される高血糖症である。
【０００６】
糖尿病患者のための適切な食事を計画し、達成することは、糖尿病管理の臨床的戦略における主要な支持である。炭水化物が食物の主要な部分を形成し、グルコース放出のための不可欠な原因因子であるので、現在の食事的な糖尿病管理方略は、ヒトにおける炭水化物代謝を変化させることに焦点を当てて、グルコースの血流中へのゆっくりとした放出を達成する。
この方略によって、食品中の炭水化物化学および組成が変化してそれらが糖尿病を管理するのに医学的に許容し得るようにすることが保証される。
【０００７】
血糖指数（ＧＩ）は、血中グルコースレベルに対する炭水化物の即時効果に基づく炭水化物の序列である。血糖含量を急速に上昇させる食物は、高いＧＩ値を有する。逆に、血糖含量をゆっくり上昇させる食物は、低いＧＩ値を有する。その結果、ＧＩは、食物ベースの製品のデンプン消化の有用な指標である。世界の健康組織は、ＧＩを、同一の対象によって消費された標準的な食物からの同一量の炭水化物に対する応答のパーセントとして表した、試験食物の５０ｇの利用可能な炭水化物部分の血中グルコース応答曲線下の増分面積として定義する。ＧＩは、１〜１００の尺度からなり、特定の食物中の５０グラムの炭水化物が血流中に血糖として吸収される速度を示す。グルコース自体を、主要な基準点として使用し、１００と評価する。食物のＧＩ値を、低ＧＩ（＜５５）、中程度（５５〜７０）、および高（＞７０）に分類する（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。消化中、急速に分解する炭水化物は、高いＧＩを有する。他方、ゆっくりと分解する炭水化物は、低いＧＩを有する。低いＧＩの食物を消費することによる食後の血中グルコースを低下させることは、健康な対象およびインスリン抵抗性を有する患者の両方に対して正の健康アウトカムを有する。
【０００８】
調理したコメは、それがより高い百分率の可消化性デンプン（ＤＳ）およびより低い百分率の難消化性デンプン（ＲＳ）を含有するので、容易に消化され、その結果コメは、栄養学的および医学的表現において最もふさわしい食物ではない。コメは、他のデンプン質食品と比較して比較的高い血糖反応を保有することは、周知の事実である通りである。精米したコメの高いデンプンおよび低い非デンプン多糖含量は、コメが典型的に高い血糖反応を付与し、低レベルの食物繊維および難消化性デンプンを含有することを意味する。Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）は、白米についての８３の極めて高いＧＩ値を報告した。より多数のイネ異種で行われた多くの他の研究もまた、その高いＧＩ状態を示した。
【０００９】
したがって、イネの高ＧＩの問題に対処するために、実行可能な解決策は、イネ植物における食物繊維および難消化性デンプン（ＲＳ）の割合を増加させることである。食物繊維およびＲＳは、食事中に含まれる場合、食事的代謝可能エネルギーの希釈、増量効果、および短鎖脂肪酸への発酵、ならびに腸におけるペプチドＹＹ（ＰＹＹ）およびグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１の発現の増加という３つの主要な効果を引き出す。繊維に類似した生理学的効果を有するＲＳは、コメベースの食事において最上に重要である。イネにおける食物繊維およびＲＳ蓄積の遺伝的制御を理解することは、その栄養品質を高めるために最上に重要である。イネにおける食物繊維およびＲＳ含量に関する研究によって、西洋式の食事をますます採用している東南アジア諸国において、ＩＩ型糖尿病および結腸直腸がんの発生率が劇的に増加していることから、かなりの有意性が推測される。
【００１０】
したがって、現在の技術水準において存在する問題を見ると、高い食物繊維、難消化性デンプンおよび低い血糖指数などの特徴を有するコメを製造することが、望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
現在の技術水準において存在する問題を調べると、アミロペクチン構造を修飾する重要な候補遺伝子における誘発された突然変異を利用することが望ましく、その結果、次にイネの穀粒における難消化性デンプンおよび食物繊維の増強がもたらされる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、好適なイネ異種のデンプン分枝酵素（ｓｂｅＩおよび／またはｓｂｅＩＩｂ）と組み合わせた、種々のデンプン合成酵素（ｓｓＩおよび／またはｓｓＩＩＩ）をコードする遺伝子における誘発された二重または三重突然変異の方法を記載する。これらの突然変異は、穀物デンプン生合成における当該重要な酵素のダウンレギュレーションと関連する。かかる標的酵素のダウンレギュレーションによって、コメ穀粒における増加した難消化性デンプンおよび食物繊維蓄積がもたらされる。増加した食物繊維および難消化性デンプンによって、加水分解指数（ＨＩ）が、７２．６％のＨＩを有する野生型イネ異種（対照）と比較して３５〜４０％の極めて低いレベルに低下する。ＨＩは、任意の食物の血糖指数（ＧＩ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏの予測された同等の指標である。
【００１３】
１つ以上の態様によれば、本発明は、２つの異なる遺伝子ファミリーにおける突然変異、すなわち１種以上のデンプン合成酵素（ＳＳＩおよび／またはＳＳＩＩＩａ）をコードする遺伝子における突然変異を、配列決定によりＴａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＴＩＬＬＩＮＧ）と称されるゲノミクス支援突然変異スクリーニング法により、突然変異誘発およびさらなる選択に供される好適なイネ異種の１種以上のデンプン分枝酵素（ｓｂｅＩおよび／またはｓｂｅＩＩｂ）をコードする遺伝子における突然変異と組み合わせて有する二重および三重イネ突然変異体を記載する。突然変異は、好適なイネ異種における種子を、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）またはＮ＝Ｎ＝ニトロソメチル尿素（ＮＭＵ）である突然変異原で処理することによって行う。突然変異誘発は無秩序な事象であるため、様々な突然変異体が突然変異原処理によって産生され、突然変異体集団を、次に配列決定によってＴＩＬＬＩＮＧに供して、２種の遺伝子ファミリー、すなわちデンプン合成酵素およびデンプン分枝酵素における二重または三重突然変異体をスクリーニングする。これらの突然変異は、生物情報学パイプラインＳＩＦＴによって機能的に検証され、デンプン合成酵素およびデンプン分枝酵素の組み合わせのダウンレギュレーションにおける役割について証明され、それによって、コメ穀粒における増加した食物繊維および難消化性デンプン蓄積がもたらされる。
【００１４】
本発明は、７％〜１３％の総食物繊維を、あらゆる異種のコメにおいて５％〜１２％の難消化性デンプン含量と共に増強するために用いられる。これらの望ましい特徴によって、コメ穀粒の血糖反応因子、すなわち加水分解指数が低下し、したがってイネが糖尿病患者に適しているようになる。さらに、高食物繊維含量によって、多くの健康上の利益、例えば減少した体重、心臓の健康および結腸の健康などが提供される。したがって、これらの変異型イネ異種は、一般大衆にとっても同様に健康的な代替の穀物食糧としての役割を果たす。
【００１５】
態様の前述および他の特徴は、添付の図面と併せて読んだ際に、態様の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。図面において、同様の参照番号は、同様の要素を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の１つ以上の態様による、イネ変異株Ｌｏｔｕｓ１〜４および野生型ＧＦＲＬ７８の穀粒におけるアミロペクチン鎖分布、アミロース含量、難消化性デンプン含量、総食物繊維および加水分解指数を示す表を示す。
【図２】図２は、本発明の１つ以上の態様によるイネ穀粒における増大した難消化性デンプンおよび総食物繊維発現についての可能性を有する２つの遺伝子ファミリー、すなわちデンプン合成酵素およびデンプン分枝酵素中の突然変異体を単離するために使用するワークフローを説明するフローチャートを示す。
【図３】図３は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  １突然変異体のアミロペクチン鎖長を示す蛍光補助毛細管電気泳動（ＦＡＣＥ）によって作成したクロマトグラムを示す。
【図４】図４は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  ２突然変異体のアミロペクチン鎖長を示す蛍光補助毛細管電気泳動（ＦＡＣＥ）によって作成したクロマトグラムを示す。
【図５】図５は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  ３突然変異体のアミロペクチン鎖長を示す蛍光補助毛細管電気泳動（ＦＡＣＥ）によって作成したクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  ４突然変異体のアミロペクチン鎖長を示す蛍光補助毛細管電気泳動（ＦＡＣＥ）によって作成したクロマトグラムを示す。
【図７】図７は、本発明の１つ以上の態様による野生型異種ＧＦＲＬ７８のアミロペクチン鎖長を示す蛍光補助毛細管電気泳動（ＦＡＣＥ）によって作成したクロマトグラムを示す。
【図８】図８は、本発明の１つ以上の態様による、野生型ＧＦＲＬ７８と比較したＬｏｔｕｓ  １突然変異体のアミロペクチン鎖長分布のグラフを示す。
【図９】図９は、本発明の１つ以上の態様による、野生型ＧＦＲＬ７８と比較したＬｏｔｕｓ  ２突然変異体のアミロペクチン鎖長分布のグラフを示す。
【図１０】図１０は、本発明の１つ以上の態様による、野生型ＧＦＲＬ７８と比較したＬｏｔｕｓ  ３突然変異体のアミロペクチン鎖長分布のグラフを示す。
【図１１】図１１は、本発明の１つ以上の態様による、野生型ＧＦＲＬ７８と比較したＬｏｔｕｓ  ４突然変異体のアミロペクチン鎖長分布のグラフを示す。
【図１２】図１２は、本発明の１つ以上の態様による、イネ植物における食物繊維および難消化性デンプン含量の増加をもたらす、突然変異体Ｌｏｔｕｓ１〜４の重要な候補遺伝子において同定した変異のリストを示す表を示す。
【図１３】図１３は、本発明の１つ以上の態様による、野生型タンパク質を基準とした、突然変異体Ｌｏｔｕｓ１〜４およびそれらの生物情報学的検証において観察されたアミノ酸配列における変化のリストを示す表を示す。
【図１４】図１４は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン合成酵素Ｉ遺伝子のｃＤＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図１５】図１５は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン合成酵素Ｉのタンパク質配列を変化したアミノ酸と共に示す。
【図１６】図１６は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン合成酵素Ｉをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図１７】図１７は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン合成酵素ＩＩＩａのｃＤＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図１８】図１８は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン合成酵素ＩＩＩａのタンパク質配列を変化したアミノ酸と共に示す。
【図１９】図１９は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン合成酵素ＩＩＩａをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図２０】図２０は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン分枝酵素Ｉ遺伝子のｃＤＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図２１】図２１は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン分枝酵素Ｉのタンパク質配列を変化したアミノ酸と共に示す。
【図２２】図２２は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン分枝酵素Ｉをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図２３】図２３は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン分枝酵素ＩＩｂのｃＤＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図２４】図２４は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン分枝酵素ＩＩｂのタンパク質配列を変化したアミノ酸と共に示す。
【図２５】図２５は、本発明の１つ以上の態様による、デンプン分枝酵素ＩＩｂをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を突然変異と共に示す。
【図２６ａ】図２６ａは、野生型イネ異種ＧＦＲＬ１からの米粉のデンプンの糊化温度を示す示差走査熱量計（ＤＳＣ）によって作成したサーモグラフを示す。
【図２６ｂ】図２６ｂは、突然変異体Ｌｏｔｕｓ  １からの米粉のデンプンの糊化温度を示す示差走査熱量計（ＤＳＣ）によって作成したサーモグラフを示す。
【図２６ｃ】図２６ｃは、突然変異体Ｌｏｔｕｓ  ２からの米粉のデンプンの糊化温度を示す示差走査熱量計（ＤＳＣ）によって作成したサーモグラフを示す。
【図２６ｄ】図２６ｄは、突然変異体Ｌｏｔｕｓ  ３からの米粉のデンプンの糊化温度を示す示差走査熱量計（ＤＳＣ）によって作成したサーモグラフを示す。
【図２６ｅ】図２６ｅは、突然変異体Ｌｏｔｕｓ  ４からの米粉のデンプンの糊化温度を示す示差走査熱量計（ＤＳＣ）によって作成したサーモグラフを示す。
【図２７ａ】図２７ａは、野生型イネ異種ＧＦＲＬ１からの種々の温度型での米粉試料におけるデンプンの糊化特性を示すＲａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＶＡ）によって作成した粘度グラフを示す。
【図２７ｂ】図２７ｂは、変異体Ｌｏｔｕｓ  １からの種々の温度型での米粉試料におけるデンプンの糊化特性を示すＲａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＶＡ）によって作成した粘度グラフを示す。
【図２７ｃ】図２７ｃは、変異体Ｌｏｔｕｓ  ２からの種々の温度型での米粉試料におけるデンプンの糊化特性を示すＲａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＶＡ）によって作成した粘度グラフを示す。
【図２７ｄ】図２７ｄは、変異体Ｌｏｔｕｓ  ３からの種々の温度型での米粉試料におけるデンプンの糊化特性を示すＲａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＶＡ）によって作成した粘度グラフを示す。
【図２７ｅ】図２７ｅは、変異体Ｌｏｔｕｓ  ４からの種々の温度型での米粉試料におけるデンプンの糊化特性を示すＲａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＶＡ）によって作成した粘度グラフを示す。
【図２８】図２８は、野生型イネ異種ＧＦＲＬ１および変異体Ｌｏｔｕｓ  １〜４の粒径分析器によって測定した米デンプンの顆粒サイズの分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ここで、本主題の説明を詳細に参照し、その１つまたは複数の例を図面において示す。各例を、主題を説明するために提供し、限定するものではない。本発明が関係する当業者に明らかな種々の変更および修正を、本発明の精神、範囲および意図内であると見なす。
【００１８】
クレームした発明の主題をより明確かつ簡潔に説明し、指摘するために、以下の定義を特定の表現のために提供し、それらを以下の記述した記載において使用する。
【００１９】
用語「難消化性デンプン」は、小腸においてヒト酵素によって分解されないデンプンの部分を意味する。それは、大腸に進入し、ここでそれは、文脈が必要とするように部分的に、または全体的に発酵する。
【００２０】
用語「突然変異」は、文脈が必要とするように、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させることができる遺伝子のＤＮＡ配列の永久的な遺伝的変化を意味する。
【００２１】
用語「血糖指数」、本発明者らは、文脈が必要とするように、特定の食物が血中グルコース（血糖）レベルをどの程度迅速に、どの程度高く上昇させることができるかを示すために使用する数値的尺度を意味する。
【００２２】
用語「加水分解指数」は、文脈が必要とするように、食料品の血糖指数を予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験室法を意味する。
【００２３】
本発明は、デンプン生合成に関与する２種の主要な重要な標的遺伝子ファミリー、デンプン合成酵素およびデンプン分枝酵素における組み合わせにおける突然変異を示すことによって、現存する最新技術の欠点を克服する。これらの突然変異は、組み合わせにおいて、アミロペクチン構造を修飾し、それによってコメ穀粒中の増加した食物繊維（ＤＦ）および難消化性デンプン（ＲＳ）含量をもたらす。上記の方法論は、加水分解指数（ＨＩ）値を３３％〜４０％に有意に減少させるための極めて高いレベルまで、食物繊維および難消化性デンプンレベルを増強することに成功している。
【００２４】
図１は、本発明の１つ以上の態様による、イネ突然変異体系Ｌｏｔｕｓ１〜４および野生型ＧＦＲＬ７８の穀粒中のアミロペクチン鎖分布、アミロース含量、難消化性デンプン含量、総食物繊維および加水分解指数を示す表を示す。アミロース含量を、単純化されたＩ２／ＫＩアッセイを用いて測定する。難消化性デンプンの評価を、ＡＯＡＣが承認した方法２００２．０２を用い、Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄのキットを用いて行う。
【００２５】
図２は、本発明の１つ以上の態様による、好適なイネ異種のデンプン合成酵素およびデンプン分枝酵素をコードする遺伝子における突然変異（単数または複数）を誘発し、スクリーニングする方法を示すフローチャートを例示する。図２に示すように、好適なイネ異種の種子を採取して、ステップ（２０１）で突然変異を行う。ステップ（２０２）で、突然変異誘発を、好適なイネ異種の種子をエチルメタンスルホネートおよびまたはＮ−Ｎ−ニトロソメチル尿素である突然変異原で曝露することによって行う。ステップ２０３で、多数の突然変異体を、突然変異法により作製する。ステップ（２０４）で、配列決定（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）による標的誘発局所的病変（ＴＩＬＬＩＮＧ）を展開し、デンプン合成酵素およびデンプン分枝酵素をコードする重要な候補遺伝子をダウンレギュレートする潜在的な突然変異を有する突然変異体をスクリーニングする。これらの突然変異を、次に、標的遺伝子のダウンレギュレーションにおけるそれらの役割について、生物情報学的ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏツールＳＩＦＴ（Ｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，２００３）およびＰｒｏｖｅａｎ  （Ｃｈｏｉ  ａｎｄ  Ｃｈａｎ，２０１５）を通して機能的に検証する。かかる標的酵素のダウンレギュレーションによって、コメ穀粒における増加した食物繊維および難消化性デンプン蓄積がもたらされる。ステップ（２０５）で、選択した推定の突然変異体を、増強された食物繊維および難消化性デンプン発現について生化学的に特徴付ける。
【００２６】
図３、図４、図５、図６および図７は、Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＦＡＣＥ）から作成したクロマトグラムを例示する。グラフは、より低い鎖長（ＤＰ６〜１２）を有するアミロペクチン鎖の割合が、野生型異種と比較して、すべての突然変異体の中で優勢であることを示す。野生型異種は、中程度（ＤＰ１３〜１８）およびより長い（ＤＰ＞１９）アミロペクチン鎖のより高い割合を示した。鎖長の一般的な傾向は、突然変異体によって保有される突然変異に対する関連において明らかであり、より高い突然変異体によって保有される突然変異のより多い数は、難消化性デンプンおよび食物繊維レベルである。突然変異体の中で、デンプン合成酵素ｓｓＩおよびｓｓＩＩＩａをコードする２つの遺伝子における突然変異をデンプン分枝酵素ｓｂｅ  ＩＩｂにおける１つの突然変異と共に保有する三重突然変異体である第４の突然変異種（Ｌｏｔｕｓ  ４）は、４２．３４％の最も高い割合の短鎖を示し、すべてのその生化学的パラメーターは、ＡＣ（２９．３％）、ＲＳ（１１．９２％）およびＴＤＦ（１３．２１％）についての高い値で、ならびに３３．２％の最も低いＨＩで最も望ましい。それに、ＨＩ＝３５．７５％を有する第１の突然変異異種（Ｌｏｔｕｓ  １）が後続し、それは、１つのデンプン合成酵素突然変異（ｓｓＩＩＩａ）ならびに２つのデンプン分枝突然変異（ｓｂｅＩおよびｓｂｅＩＩｂ２）を保有していた。突然変異の数および関与する遺伝子の数にかかわらず、すべての突然変異体は、野生型異種と比較して高いＡＣ、ＲＳ、ＴＤＦおよび減少したＨＩを示した。デンプン合成酵素ＳＳＩａおよびＳＳＩＩＩａは、インディカタイプのイネ変種中に一般的に存在するＬタイプのアミロペクチンの鎖長の伸長において役割を果たすことを前提としており（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）、突然変異体におけるそれらのダウンレギュレーションによって、アミロペクチン鎖長の減少がもたらされる。デンプン分枝酵素ＳＢＥ  ＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂにおける突然変異およびそれらのダウンレギュレーションは、イネを含む多くの穀物においてアミロペクチン鎖長の減少と関連してアミロース含量を増加させることが証明されている（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ  ２００３，Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）。高レベルのアミロース発現および減少したアミロペクチン鎖長は、共に４〜６％の中程度から高いレベルの難消化性デンプンの増強をもたらすことを前提とされていた（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９３，Ｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００１  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ  ２００７）。突然変異が両方の遺伝子ファミリー、デンプン合成酵素およびデンプン分枝酵素において保有されている本発明の二重および三重突然変異体の結果、一緒に、１１．９２％までの難消化性デンプンおよび１３．２１％までの食物繊維含量の有意な増加がもたらされた。
【００２７】
図８、図９、図１０および図１１は、本発明の１つ以上の態様によるＬｏｔｕｓ  １、Ｌｏｔｕｓ  ２、Ｌｏｔｕｓ  ３およびＬｏｔｕｓ  ４突然変異体のアミロペクチン鎖長分布を、野生型イネ異種ＧＦＲＬ  ７８と比較するグラフを示す。アミロペクチンの鎖長に関するデータの比較は、野生型と比較して突然変異体における短鎖アミロペクチンの優勢を明らかに示す。
【００２８】
図１２は、本発明の１つ以上の態様による、内胚乳中の食物繊維および難消化性デンプン含有量を増加させる可能性が高い突然変異体Ｌｏｔｕｓ異種の重要な候補遺伝子において同定した突然変異のリストを示す表を示す。当該表は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質配列に関する突然変異の位置を示す。
【００２９】
図１３は、参照タンパク質配列、Ｐｒｏｖｅａｎスコア、ＳＩＦＴスコア、および機能予測と共に、タンパク質に関して、突然変異体Ｌｏｔｕｓ異種の重要な候補遺伝子において同定した突然変異のリストを示す表を示す。−１．３未満のＰｒｏｖｅａｎスコアは、アミノ酸変化がポリペプチドの当該位置において耐容不能であると結論付け、したがって突然変異を有害であると結論付けるために設定したしきい値である。ＳＩＦＴは、アミノ酸置換がタンパク質機能に影響するか否かを予測する。ＳＩＦＴ予測は、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴによって収集された、密接に関連した配列から誘導される配列アライメントにおけるアミノ酸残基の保存の程度に基づく。ＳＩＦＴを、天然に存在する非同義の多型または実験室で誘発されたミスセンス変異に適用する。ＳＩＦＴは、非耐容性アミノ酸置換を耐容性アミノ酸置換から選別し、タンパク質中のアミノ酸置換が表現型効果を有するか否かを予測する、配列相同性に基づくツールである。ＳＩＦＴスコアは、０〜１の範囲内である。アミノ酸置換を、スコアが≦０．０５である場合には損傷していると、およびスコアが＞０．０５である場合には耐容されていると予測する。
【００３０】
図１４、図１５、図１６、図１７、図１８、図１９、図２０、図２１、図２２、図２３、図２４および図２５は、デンプン合成酵素Ｉ、デンプン合成酵素ＩＩＩａ、デンプン分枝酵素Ｉおよびデンプン分枝酵素ＩＩｂのｍＲＮＡ、タンパク質およびＤＮＡ配列を、配列において強調した単一、二重または三重突然変異と共に示す。
【００３１】
図２６は、イネ試料からのデンプンの糊化特性を例示する。各イネ試料の糊化および老化特性を、示差走査熱量計を用いて分析する。結果は、デンプンの糊化が、水中のデンプンが固体から粘稠なペースト様状態へと連続的に加熱することにより相転移を受ける動的プロセスであることを示した。ゼラチン化開始、ピークおよびまた終点は、水の温度およびデンプンの化学的組成に同様に依存する。図２６（ａ〜ｅ）は、それぞれ野生型ＧＦＲＬ７８と共に４種の突然変異体（Ｌｏｔｕｓ  １〜４）の糊化プロフィールを示す。野生型と比較して突然変異体における１２℃（Ｌｏｔｕｓ  １）〜２４℃（Ｌｏｔｕｓ  ３）の糊化温度の有意な上昇があることが、観察される。
【００３２】
図２７は、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒによって決定した、イネ試料からのデンプンの粘度およびペースト特性を示す。結果は、水中に分散したデンプンの粘度および糊化特性および種々の温度型（低温から高温、および次に低温状態に戻る）の下で測定した際に、その化学的組成について明確な指示を付与することを示す。図２７（ａ〜ｅ）は、Ｌｏｔｕｓ  １〜Ｌｏｔｕｓ  ４の４種の突然変異体イネ異種のＲＶＡ結果を、野生型品種ＧＦＲＬ７８と共に示す。ピーク粘度（ＰＶ）、ブレークダウン粘度（ＢＤＶ）および最終的なクールペースト粘度（ＣＰＶ）は、野生型よりも４種の高ＲＳ変異体のすべてにおいて有意に低い値を示すことが、明らかである。
【００３３】
図２８は、イネのデンプンの穀粒サイズ分布を例示する。４種の突然変異体（Ｌｏｔｕｓ  １〜４）が野生型ＧＦＲＬ  ７８と比較してよりそれらのより小さい同等のものである大きなサイズの顆粒のより高い画分を示す、様々なサイズのデンプン穀粒によって占有される体積の百分率比のグラフ表示。種々のデンプンの粒子サイズの特徴付けに関する多くの研究によって、顆粒サイズと難消化性デンプン含有量との間に負の相関が示された。これは、表面積および酵素的相互作用に起因している。より小さい顆粒状組成物のより大きい割合を有するデンプンは、酵素と相互作用するためのより大きな表面積を示し、逆もまた同様である。
【００３４】
本発明を一般的に記載してきたが、さらなる理解を、特定の具体例を参照することにより得ることができ、それを、例示の目的のみのために本明細書中に提供し、他に特定しない限り限定を意図するものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ＲＳ評価手順
ＲＳ含量を、Ｍｅｇａｚｙｍｅキットを用いて評価する。１００±１ｍｇの小麦粉試料を、スクリューキャップ管中に複製して採取し、穏やかに軽くたたいて、試料が管の側面に付着しないのを確実にする。アミログルコシダーゼ（ＡＭＧ）（３Ｕ  ｍｌ−１）を含む４ｍｌの膵臓α−アミラーゼ（３  Ｃｅｒａｌｐｈａ  Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、１０ｍｇ／ｍｌ）を、各管に添加した。管にしっかりと蓋をし、ボルテックスミキサー上で完全に分散させ、運動の方向に整列した振盪水浴中に水平に取り付けた。管を、３７℃で継続的に振盪しながら（２００ストローク  分−１）１６時間インキュベートする。インキュベーション後、管を、ボルテックスミキサーを用いて激しく混合しながら４．０ｍｌのエタノール（９９パーセント）で処理する。この後、管を、１，５００×ｇ（約３，０００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離する（蓋をしていない）。上清を注意深くデカントし、ペレットを８ｍｌの５０％エタノールに再懸濁する。管を、再び１，５００×ｇ（約３，０００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離する。再び、上清をデカントし、懸濁および遠心分離ステップを繰り返す。上清をデカントし、管を吸収紙上で倒立させて、過剰の液体を排出する。磁気撹拌棒（５×１５ｍｍ）を各管に加え、続いて２ｍｌの２Ｍ  ＫＯＨ溶液を加える。ペレットを、氷または水浴中で磁気撹拌機上で約２０分間撹拌することによって再懸濁する（かつＲＳを溶解した）。次に、８ｍｌの１．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）を、各管に添加する。直ちに、０．１ｍＬのＡＭＧ（３３００Ｕ  ｍｌ−１）を添加し、内容物をマグネチックスターラー下で十分に混合し、管を５０℃で水浴中に配置する。管を、ボルテックスミキサー上で断続的に混合しながら３０分間インキュベートし、１，５００×ｇで１０分間直接遠心分離する。各管中の最終容量は、約１０．３（±０．０５）ｍｌである。各試験管から、上清の０．１ｍｌアリコート（複製して）を、ガラス試験管中に移し、３．０ｍｌのＧＯＰＯＤ試薬を加え、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合した。試薬ブランクを、０．１ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）および３．０ｍｌのＧＯＰＯＤ試薬を混合することによって調製した。グルコース標準を、０．１ｍｌのグルコース（１ｍｇ  ｍｌ−１）および３．０ｍｌのＧＯＰＯＤ試薬を混合することによって調製する。試料、ブランクおよび標準を、５０℃で２０分間インキュベートする。吸光度を、試薬ブランクに対して５１０ｎｍで測定する。ＭｅｇａｚｙｍｅからのＭｅｇａ−Ｃａｌｃを使用して、試料のＲＳ含量を計算する。
【００３６】
実施例２：アミロペクチン鎖の重合度
純粋なデンプンを、すべての変異体および野生型から単離し、単離したデンプンのアミロペクチン鎖長分布を、Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  （ＦＡＣＥ）によって分析する。単離したデンプンを、イソアミラーゼ酵素（１０Ｕ）を用いて脱分枝し（３７℃で２時間）、１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）で標識する。ＦＡＣＥを、４８８ｎｍのレーザーモジュールを備えたＰ／ＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ５０１０を用いて行う。予め燃焼させた（ｐｒｅｂｕｒｎｅｄ）窓を有するＮ‐ＣＨＯ（ＰＶＡ）毛細管を、脱分枝試料の分離のために使用する。マルトースを、内部標準として使用する。分離を、１０℃で３０分間行う。重合度（ＤＰ）を、マルトースの移動時間に基づいてピークに割り当てる。
【００３７】
実施例３。糊化温度の評価
各イネ試料の糊化および老化特性を、示差走査熱量計、ＤＳＣ６０００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を用いて分析する。５０μｌのアルミニウムパン中の熱特性を調査するために、突然変異体Ｌｏｔｕｓ  １〜４および対照異種ＧＦＲＬ  ７８の精米した生のイネ試料から得られた１５ｍｇの粉試料を添加し、３５μＬの脱イオン水と合わせ、試料濃度を、３０％に調整する。基準値として、５０μＬの脱イオン水を加え、等重量に調整する。測定条件に関して、温度を、３℃／分の率で３０℃から１００℃まで昇温させる。測定した分析特性は、糊化開始、ピークおよび終了温度（それぞれＴｏ、Ｔｐ、およびＴｅ）である。
【００３８】
実施例４  粘度および糊化特性評価
イネ試料を、前に記載した方法を用いて製粉し、粉砕する。ペースト粘度を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＡＡＣＣ）（１９９５）標準法６１−０２を用いて、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＶＡ）装置で決定する。ＲＶＡ  ４５００モデルを、使用する（Ｐｅｒｔｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）。ＲＶＡは、２５ｍｌの水中で３ｇの米粉を使用する（Ｊｕｌｉａｎｏ，１９９６）。温度を、５０℃で１分間設定し、９５℃に毎分１２℃で、および９５℃で２．５分に加熱する。冷却は、毎分１２℃で５０℃である。加熱は、５０℃で５４秒間、全実行時間１２．５分間である。５０℃および３０℃でのＲＶＡ分解、一貫性および後退を、計算する。すべての計算したパラメータについての単位は、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ｕｎｉｔｓ（ＲＶＵ）にある。１単位ＲＶＵ＝１０ｃｐ。ＲＶＡから得られる粘度特性を、３つの重要なパラメータによって記載することができる：ピーク（糊化後の最初のピーク粘度）、高温ペースト（９５℃の保持期間の終了時のペースト粘度）、および低温ペースト粘度（試験の終了時のペースト粘度）。分解は、ピークから高温ペースト粘度を減ずることから誘導され、後退は、低温ペースト粘度からピーク粘度値、一貫性を減ずることから誘導される。粘度は、低温ペースト粘度から高温ペースト粘度を減ずることから誘導される。得られた種々のパラメータを、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ｕｎｉｔｓ（ＲＶＵ）において測定する。
【００３９】
実施例５。デンプン顆粒サイズ分布分析
デンプン抽出
デンプン抽出を、Ｌｕｍｄｕｂｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｉｂ（２０００）によって記載されているように、いくつかの変更を加えて行う。粉砕した米ミール（１ｇ）を、０．０１ＭＮａＯＨ（５ｍＬ）および１００μＬの１％プロテアーゼで３７℃で一晩浸漬し、１ＭＨＣｌを用いて中和する。溶液を３，０００ｇで遠心分離し、上清を廃棄する。沈殿物を、水（１ｍＬ）に懸濁させ、８０％（ｗ／ｖ）塩化セシウム溶液（１ｍＬ）上に層状にし、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。得られたペレットを、水で懸濁させ、１００μｍの細孔径のナイロンフィルターで濾過する。上清を廃棄し、暗色の尾部層をスパチュラで除去する。デンプンペレットを、１ｍＬの水で３回洗浄し、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、続いてアセトン（１ｍＬ）および１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、最後に一晩空気乾燥させる。
【００４０】
デンプン顆粒サイズ分布
抽出したデンプンのデンプン顆粒サイズ分布を、粒度分析器（Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用するレーザー回折手法によって決定する。純粋なデンプン（３０ｍｇ）を秤量し、１ｍｌの１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）中に分散させる。約２００μｌのデンプンスラリーを、１７００ｒｐｍのポンプ速度でサイズ分析のために使用した（Ａｓａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００４１】
少なくとも１つの例示的な態様が、前記の概要および詳細な説明において提示されている一方、膨大な数の変形が存在することを、認識するべきである。例示的な態様（単数）または例示的な態様（複数）は、例であるに過ぎず、いかなる方法においても範囲、適用可能性または構成を限定することを意図しないことをまた、認識するべきである。むしろ、前記の概要および詳細な説明は、当業者に例示的な態様を実行するための好都合な指針を提供し、様々な変更が、添付した特許請求の範囲およびそれらの法的に等価なものに述べられている範囲から逸脱せずに例示的な態様に記載される要素の機能および配置においてなされ得ることが、理解される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプン合成酵素（ＳＳＩ、ＳＳ  ＩＩＩａ）ならびにデンプン分枝酵素（ＳＢＥ  ＩおよびＳＢＥ  ＩＩｂ）をコードする２つの遺伝子ファミリーの２つまたは３つの遺伝子の組み合わせにおいて２つまたは３つの突然変異を担持する突然変異体イネ植物から得られるイネ穀粒であって、かかる穀粒が野生型イネ植物からの穀粒と比較して増加した難消化性デンプンおよび総食物繊維レベルを示す、イネ穀粒。
【請求項２】
さらに、野生型イネ穀粒の内胚乳と比較して、低下したレベルの酵素デンプン合成酵素Ｉおよび／またはデンプン合成酵素ＩＩＩａを、内胚乳中の低下したレベルのデンプン分枝酵素Ｉおよび／またはデンプン分枝酵素ＩＩｂとの組み合わせにおいて含む、請求項１に記載のイネ穀粒。
【請求項３】
野生型と比較してＤＰ６−１２の短いアミロペクチン鎖の優勢がある、請求項１に記載のイネ穀粒。
【請求項４】
穀物中のデンプンが、野生型イネ植物の穀粒と比較して４％〜１０％を超える増加した難消化性デンプン含量および５％〜１１％を超える食物繊維含量を有する、請求項１に記載のイネ穀粒。
【請求項５】
そのデンプンの加水分解指数が３３％〜４８％程度に低い、請求項１に記載のイネ穀粒。
【請求項６】
穀粒が品種インディカタイプのＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａから得られた、請求項１に記載のイネ穀粒。
【請求項７】
請求項１に記載のイネ植物のセルを含む、食物もしくは飲料または産業的使用のために誘導される任意の他の製品。
【請求項８】
植物育種もしくは分子育種またはそれらの任意の生物工学的アプローチのいずれかにより請求項１に記載のイネ植物から任意の形態において誘導される、イネ種子、花粉顆粒、植物部分または子孫。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2019509035.tif 000041
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2019509035.tif 000042
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
2019509035.tif 000043
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３】
2019509035.tif 000044
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２６ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図２６ａ】
2019509035.tif 000045
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２６ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図２６ｂ】
2019509035.tif 000046
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２６ｃ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図２６ｃ】
2019509035.tif 000047
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２６ｄ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図２６ｄ】
2019509035.tif 000048
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２６ｅ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図２６ｅ】
2019509035.tif 000049
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図２７ａ】
2019509035.tif 000050
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図２７ｂ】
2019509035.tif 000051
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７ｃ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図２７ｃ】
2019509035.tif 000052
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７ｄ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図２７ｄ】
2019509035.tif 000053
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７ｅ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図２７ｅ】
2019509035.tif 000054
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２８
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図２８】
2019509035.tif 000055
【国際調査報告】
2019509035.tif 000056
2019509035.tif 000057
2019509035.tif 000058
2019509035.tif 000059