(57)【要約】  本発明は、３つの融合ポリペプチドを含む新規の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子であって、３つの融合ポリペプチドの各々が、（ａ）４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ及びＧＩＴＲＬからなる群より選択される共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片、（ｂ）三量体化ドメイン、特に配列番号１のヒト軟骨基質タンパク質（ｈＣＭＰ）由来の三量体化ドメイン、及び（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、及びこれらの分子を製造する方法、及びそれらを使用する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つの融合ポリペプチドを含み、３つの融合ポリペプチドの各々が、
（ａ）４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ及びＧＩＴＲＬからなる群より選択される共刺激ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン又はその断片、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）に由来する三量体化ドメイン、及び
（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分
を含む、請求項１に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項２】
三量体化ドメインが配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項３】
三量体化ドメインが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項４】
共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される、請求項１から３に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項５】
共刺激ＴＮＦファミリーリガンドが４−１ＢＢＬである、請求項１から４に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項６】
ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメインが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３又は配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項７】
３つの融合ポリペプチドを含み、３つの融合ポリペプチドの各々が、
（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び
（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項８】
共刺激ＴＮＦファミリーリガンドがＯＸ４０Ｌである、本明細書中で前に記載した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項９】
ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメインが、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１から４の何れか一項又は請求項８に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項１０】
３つの融合ポリペプチドを含み、ここで、３つの融合ポリペプチドの各々が、
（ａ）配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３のアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び
（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む、請求項１から４の何れか一項又は請求項８若しくは９に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項１１】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｎ末端アミノ酸で、三量体化ドメインのＣ末端アミノ酸に融合されている、請求項１から１０の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項１２】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｃ末端アミノ酸で、三量体化ドメインのＮ末端アミノ酸に融合されている、請求項１から１１の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項１３】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分が、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である、請求項１から１２の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項１４】
前記Ｆａｂ分子が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、ＣＨ１ドメインのＣ末端アミノ酸で、三量体化ドメインのＮ末端アミノ酸に融合されている、請求項１３に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項１５】
標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群より選択される、請求項１から１４の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項１６】
標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、請求項１から１３の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項１７】
ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、
（ａ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２及び（ｖｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１から１６の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【請求項１８】
（ａ）４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ及びＧＩＴＲＬからなる群より選択される共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）に由来する三量体化ドメインであって、前記融合ポリペプチドと２つの更なるこのような融合ポリペプチドとの安定な会合を媒介することができる三量体化ドメイン、及び（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む融合ポリペプチド。
【請求項１９】
融合ポリペプチドが、（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨ又はＶＬドメインを含む、請求項１８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
融合ポリペプチドが、
（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び
（ｃ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、又は（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む、請求項１８又は１９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
融合ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び
（ｃ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、又は（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む、請求項１８又は１９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１から１７の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド、又は請求項１８から２１の何れか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、又は請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を製造する方法であって、前記三量体抗原結合分子の発現に適した条件下で、請求項２４に記載の宿主細胞を培養することと、前記三量体抗原結合分子を単離することとを含む方法。
【請求項２６】
請求項１から１７の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項２７】
医薬としての使用のための、請求項１から１７の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
がんの治療における使用のための、請求項１から１７の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
がんの治療のための医薬の製造における、請求項１から１７の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は請求項２６に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項３０】
請求項１から１７の何れか一項に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は請求項２６に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法。
＊＊＊
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３つの融合ポリペプチドを含む新規の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子であって、３つの融合ポリペプチドの各々が、（ａ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片、（ｂ）三量体化ドメイン、特にヒト軟骨基質タンパク質（ｈＣＭＰ、配列番号１）由来の三量体化ドメイン、及び（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、及びこれらの分子を製造する方法、及びそれらを使用する方法に関する。本発明は更に、これらの分子を製造する方法及びそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体スーパーファミリーの分子と相互作用するリガンドは、免疫系の機構及び機能において重要な役割を果たしている。ＴＮＦファミリーのリガンド（サイトカインとも呼ばれる）は、免疫応答、造血及び形態形成などの正常な機能を調節する一方、腫瘍形成、移植拒絶、敗血症ショック、ウイルス複製、骨吸収、関節リウマチ、及び糖尿病において役割を果たしている（Aggarwal, 2003）。ＴＮＦリガンドファミリーは、「ＴＮＦ相同ドメイン」（ＴＨＤ）を作り出す保存されたＣ末端ドメインの存在を特徴とする、１９のＩＩ型（すなわち、細胞内Ｎ末端及び細胞外Ｃ末端）膜貫通タンパク質をコードする１８の遺伝子を含む。このドメインは受容体結合に関与し、従ってＴＮＦリガンドファミリーメンバーの生物学的活性にとって重要である。ファミリー間の配列同一性は〜２０−３０％である（Bodmer, 2002）。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、自己集合性の非共有結合三量体としてのその生物学的機能を発揮する（Banner et al, 1993）。従って、ＴＮＦファミリーのリガンドは、ＴＮＦＲスーパーファミリーの対応する受容体に結合してこれを活性化することができる三量体を形成する必要がある。
【０００３】
組換え抗体又は他のタンパク質の規定された化学量論を有する人工多量体を生成するための幾つかのアプローチが記載されている。国際公開第０１／４９８６６号は、ＴＮＦサイトカイン及び多量体化成分、特にＣ１ｑタンパク質ファミリー由来のタンパク質、例えばＡＣＲＰ３０又はコレクチンを含む組換え融合タンパク質を開示する。しかしながら、これらの融合タンパク質の欠点は、三量体形成ドメインが通常大きな分子量を有すること、及び／又は三量体化がむしろ非効率的であることである。国際公開第２００７／０１４７４４号、国際公開第２００９／０００５３８号及びWyzgol et al. (2009) は、ＴＮＦサイトカイン及びチキンタンパク質テネイシン由来の三量体化ドメインを含む融合タンパク質を開示している。生物学的活性を強く高めることができた。しかしながら、非ヒト起源に由来する三量体化ドメインは、人体において免疫原性反応を引き起こすという欠点を有する可能性がある。ヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＭＰ）は、軟骨に特異的に局在する主要な細胞外マトリックスタンパク質である。そのＣ末端領域は、３本鎖αヘリックスコイルドコイル構造を形成する（Beck, 1996）。
【０００４】
国際公開第２００６／１２１８１０号は、リガンドドメイン、三量体化ドメイン及び免疫グロブリンＦｃドメイン（一本鎖ＣＨ２、ＣＨ３及びヒンジ）を含む三量体ＯＸ４０リガンド融合ポリペプチドに関する。ＯＸ−４０Ｌ融合ポリペプチドの三量体への組み立て時に、２つのＦｃドメインが二量体化し、第３の不対Ｆｃドメインが第２のＯＸ−４０Ｌ融合タンパク質三量体の不対Ｆｃドメインと会合し、安定なＯＸ４０Ｌ融合ポリペプチド六量体が提供される。三量体化ドメインは、酵母ＧＣＮ４に由来するイソロイシンジッパードメインである。イソロイシンジッパードメインの代わりにヒトＴＲＡＦ２三量体ドメインを含む同様のヘキサマーは、国際公開第２０１５／１８３９０２号に開示されている。異なるタイプの三量体化ドメインを有するＯＸ４０Ｌ融合タンパク質も、ＡＵ２０１３／２６３７１７（Ｂ２）に記載されている。
【０００５】
ＴＮＦリガンドファミリーの幾つかのメンバーは、Ｔ細胞に対する共刺激効果を有しており、それらがＴ細胞の初期活性化後にＴ細胞応答を維持することを意味している（Watts, 2005）。４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、及びＬＩＧＨＴは、この共刺激ＴＮＦファミリーリガンドのグループに属する。
【０００６】
幾つかの共刺激分子の中で、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーメンバーＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、エフェクター及び記憶Ｔ細胞の生存及び恒常性において重要な役割を果たしている。ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、感染、腫瘍、及び自己抗原に対する免疫応答を調節し、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞並びに好中球の表面上でその発現が実証されており、種々の刺激シグナルに応答して厳密に誘導可能であるか、又は強力にアップレギュレートされることが示されている。Ｔ細胞受容体トリガーと組み合わせると、その天然リガンド又はアゴニスト抗体によるＴ細胞上のＯＸ４０の結合は、ＰＩ３Ｋ及びＮＦκＢシグナル伝達経路の相乗的活性化をもたらしている。次に、これは増殖の亢進、サイトカイン受容体及びサイトカイン産生の増加、及び活性化Ｔ細胞のより良好な生存をもたらす。
【０００７】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、その発現がＴ細胞活性化によって誘導される分子として最初に同定されている（Kwon and Weissman, 1989）。その後の研究は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球（Snell et al., 2011; Zhang et al., 2010）、ＮＫ細胞（Lin et al., 2008）、ＮＫＴ細胞（Kim et al., 2008）、単球（Kienzle and von Kempis, 2000; Schwarz et al., 1995）、好中球（Heinisch et al., 2000）、マスト細胞（Nishimoto et al., 2005）及び樹状細胞並びに非造血起源の細胞、例えば内皮及び平滑筋細胞（Broll et al., 2001; Olofsson et al., 2008）の発現を実証した。異なる細胞型における４−１ＢＢの発現は、主に誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体トリガー、並びに炎症誘発性サイトカインの共刺激分子又は受容体を介して誘導されるシグナル伝達などの様々な刺激シグナルによって駆動される（Diehl et al., 2002; von Kempis et al., 1997; Zhang et al., 2010）。
【０００８】
４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）の発現はより制限され、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージなどのプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）で観察される。４−１ＢＢＬの誘導性発現は、αβ及びγδＴ細胞サブセットの両方を含むＴ細胞、及び内皮細胞に特徴的である（Shao and Schwarz, 2011に総説される）。
【０００９】
ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌及び増殖を刺激するだけでなく（Buechele et al., 2012; Lin et al., 2008; Melero et al., 1998）、それらの生存の増加並びにサイトカインの分泌と共刺激分子をアップレギュレートする能力によって示されるＤＣ活性化を促進することが知られている（Choi et al., 2009; Futagawa et al., 2002; Wilcox et al., 2002）。しかし、ＣＤ１３７は、Ｔ細胞のＣＤ４＋サブセット及びＣＤ８＋サブセットの両方においてＴＣＲ誘導活性化を調節する共刺激分子として最もよく特徴づけられる。ＴＣＲトリガーと組み合わせて、アゴニスト４−１ＢＢ特異的抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化誘導細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる。
【００１０】
in vitroでのＴ細胞に対する４−１ＢＢ抗体のこれらの共刺激効果に沿って、腫瘍を有するマウスへのそれらの投与は、多くの実験的腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍効果をもたらす（Melero et al., 1997; Narazaki et al., 2010）。しかしながら、４−１ＢＢは、通常、他の免疫調節化合物（Curran et al., 2011; Guo et al., 2013; Morales-Kastresana et al., 2013; Teng et al., 2009; Wei et al., 2013）、化学療法剤（Ju et al., 2008; Kim et al., 2009）、腫瘍特異的ワクチン接種（Cuadros et al., 2005; Lee et al., 2011）、又は放射線療法（Shi and Siemann, 2006）と組み合わせて投与された場合にのみ、抗腫瘍剤としての効力を示す。In vivo枯渇実験は、４−１ＢＢ特異的抗体の抗腫瘍効果において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞が最も重要な役割を果たすことを実証した。しかし、腫瘍モデル又は抗４−１ＢＢを含む併用療法に依存して、ＤＣ、ＮＫ細胞又はＣＤ４＋  Ｔ細胞などの他の型の細胞の寄与が報告されている（Melero et al., 1997; Murillo et al., 2009; Narazaki et al., 2010; Stagg et al., 2011）。
【００１１】
異なるリンパ球サブセットに対するそれらの直接的な効果に加えて、４−１ＢＢアゴニストはまた、腫瘍血管内皮上の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）及び血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）の４−１ＢＢ媒介性アップレギュレーションを介して、腫瘍における活性化Ｔ細胞の浸潤及び保持を誘導することもできる（Palazon A. et al. (2011), Cancer Res. 71, 801-811）。４−１ＢＢトリガーはまた、腫瘍微小環境又は慢性感染の際の免疫寛容の破壊に寄与し得る可溶性抗原への曝露によって誘導されるＴ細胞アネルギーの状態を逆転させ得る（Wilcox et al., 2004）。
【００１２】
これは、ＴＮＦＲ−スーパーファミリーの他のアポトーシス誘導性又は免疫調節性メンバーに特異的なアゴニスト抗体について記載されているように、in vivoでの４−１ＢＢアゴニスト抗体の免疫調節特性は、抗体分子上の野生型Ｆｃ部分の存在を必要とし、それにより、そのような試薬の薬理学的活性に必要な重要な事象としてのＦｃ受容体結合を示唆していると思われる（Li and Ravetch, 2011; Teng et al., 2009）。しかしながら、機能的に活性なＦｃドメインを有する４−１ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与はまた、マウスにおいて機能的Ｆｃ受容体が存在しない場合に、減少されるか又は有意に改善される肝臓毒性に関連するＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を誘導し得る（Dubrot J. et al. (2010)）。ヒト臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、ＮＣＴ００３０９０２３）では、３週間に１回１２週間投与されたＦｃ−コンピテント４−１ＢＢアゴニスト抗体（ＢＭＳ−６６３５１３）は、メラノーマ、卵巣癌、又は腎細胞癌の患者の疾患の安定化を誘導した。しかし、別の試験（ＮＣＴ００６１２６６４）で与えられた同じ抗体は、試験の終了につながるグレード４の肝炎を引き起こした（Simeone and Ascierto, 2012）。
【００１３】
まとめると、利用可能な前臨床及び臨床データは、効果的な４−１ＢＢアゴニストに対する高い臨床的必要性があることを明確に示している。しかしながら、新世代の薬物候補は、４−１ＢＢを造血細胞及び内皮細胞の表面に効果的に結合させるだけでなく、制御不能な副作用を避けるためにＦｃ受容体に結合する以外のメカニズムによってもそれを達成できるはずである。後者は、腫瘍特異的又は腫瘍関連部分に対する優先的結合及びオリゴマー化によって達成され得る。国際公開第２０１１／１０９７８９号は、ＴＮＦリガンドと標的化部分との融合タンパク質を開示しているが、これらの分子は三量体化ドメインを含まない。
【００１４】
本発明の新規三量体抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦリガンドと腫瘍特異的標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分とを組み合わせた融合ポリペプチドからなり、融合ポリペプチドがｈｕＣＭＰ三量体化ドメインによって互いに共有結合されるので安定である。安定なＴＮＦファミリーリガンド三量体は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる３つの部分を含むという事実に基づいて、効果的にだけでなく、所望の部位で非常に選択的にＴＮＦ受容体をトリガーすることができる。従って、副作用が大幅に減少し得る。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子に関し、３つの融合ポリペプチドの各々は、
（ａ）４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ及びＧＩＴＲＬからなる群より選択される共刺激ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン又はその断片、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）に由来する三量体化ドメイン、及び
（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分
を含む。
【００１６】
一態様では、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、３つの融合ポリペプチドを含み、３つの融合ポリペプチドの各々は、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む三量体化ドメインを含む。より具体的には、三量体化ドメインは配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
特に、共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ及びＧＩＴＲＬからなる群より選択され、より具体的には、共刺激ＴＮＦファミリーリガンドメンバーは、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
【００１８】
一態様では、共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは４−１ＢＢＬである。特に、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、３つの融合ポリペプチドを含み、ここで、３つの融合ポリペプチドの各々において、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３又は配列番号７のアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメインを含む。更なる態様では、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、３つの融合ポリペプチドを含み、３つの融合ポリペプチドの各々は、（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む。
【００１９】
別の態様では、共刺激ＴＮＦファミリーリガンドはＯＸ４０Ｌである。特に、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、３つの融合ポリペプチドを含み、ここで、３つの融合ポリペプチドの各々において、ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメインは、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。更なる態様では、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、３つの融合ポリペプチドを含み、ここで、３つの融合ポリペプチドの各々は、（ａ）配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む。
【００２０】
別の態様では、前述の３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供され、ここで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｎ末端アミノ酸で、三量体化ドメインのＣ末端アミノ酸に融合されている。
【００２１】
更なる態様では、前述の３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供され、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｃ末端アミノ酸で、三量体化ドメインのＮ末端アミノ酸に融合されている。
【００２２】
別の態様では、本発明は、前述の３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を提供し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ、及び足場抗原結合タンパク質からなる群より選択される。特定の態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である。更なる態様では、前記Ｆａｂ分子は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、ＣＨ１ドメインのＣ末端アミノ酸で、三量体化ドメインのＮ末端アミノ酸に融合される。
【００２３】
更なる態様では、前述の３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供され、ここで、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群より選択される。特定の態様では、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
【００２４】
更なる態様では、前述の３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供され、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ａ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２及び（ｖｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【００２５】
更なる態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は（ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【００２６】
一態様では、前述の３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供され、ここで、前記３つの融合ポリペプチドは同一である。
【００２７】
別の態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列のヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）に由来する三量体化ドメイン（前記三量体化ドメインは、前記融合ポリペプチドと２つの更なるこのような融合ポリペプチドとの安定な会合を媒介することができる）、及び（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む融合ポリペプチドを提供する。特定の態様では、標的細胞抗原に特異的に結合する部分は、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＶＨドメイン又はＶＬドメインである。
【００２８】
更に別の態様では、融合ポリペプチドが提供され、ここで、融合ポリペプチドは、
（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦリガンドファミリーのエクトドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び
（ｃ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、又は（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、本明細書で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド、又は本明細書に前述した融合ポリペプチドが提供される。本発明は更に、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターと、本発明の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞とを提供する。幾つかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００３０】
別の態様では、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を製造するための方法であって、（ｉ）抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉ）前記三量体抗原結合分子を単離する工程を含む方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって製造された三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を包含する。
【００３１】
本発明は更に、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００３２】
本発明にはまた、医薬としての使用のための、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が包含される。一態様では、必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が提供される。特定の実施態様では、がんの治療における使用のための、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が提供される。
【００３３】
また、必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、特に、がんの治療のための医薬の製造のための、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の使用、並びに薬学的に許容される形態の本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、個体における疾患を治療する方法が提供される。特定の実施態様では、疾患はがんである。上記の実施態様の何れかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】図１Ａは、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド含有融合ポリペプチド（ＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ分子のＶＨ−ＣＨ１）及び軽鎖（ＦＡＰ特異性を有するＶＬ−ＣＬ）をコードする鎖を示す。ジスルフィド結合が、ＦＡＰを標的とする共有結合したＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の形成を導く３つのＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド含有融合ポリペプチド鎖の間に形成される。図１Ｂは、ＦＡＰに特異的に結合することができる（ＦＡＰ標的化）３つのＦａｂを含む三量体４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子を示す。図１Ｃは、実施例３で調製した単量体４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）分子の図である。
【図２Ａ−２Ｆ】図２Ａから２Ｆは、表面プラズモン共鳴によって評価した三量体ＦＡＰ標的化ＣＭＰ−４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の組換え４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）受容体への結合を示す。図２Ａではヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合、図２Ｂではアッセイの設定が示されており、４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）はＣＭ５チップ上に固定化される。図２Ｃは、カニクイザル４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を示し、アッセイの設定を図２Ｄに示す。図２Ｅでは、マウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合、図２Ｆではアッセイの設定が示されている。
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａから３Ｃは、ＦＡＰ標的化ＣＭＰ−４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子への組換え４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）の結合を示す。図３Ａでは、親和性測定の設定が示される。図３Ｂは、ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）のＦＡＰ標的化ＣＭＰ−４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子への結合を示し、図３Ｃは、カニクイザル４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）のＦＡＰ標的化ＣＭＰ−４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子への結合を示す。
【図４Ａ−４Ｄ】図４Ａから図４Ｄは、ＦＡＰ標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子（黒丸）又はＤＰ４７標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子（白丸）又はＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ  Ｐ３２９Ｇ対照（黒三角）の上のパネル（図４Ａ及び４Ｂ）に示される休止（ナイーブ）ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞又は下のパネル（図４Ｃ及び４Ｄ）に示される活性化ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合に関する。示されるのは、ＦＡＰ−又はＤＰ４７−標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の濃度に対して、二次検出抗体として使用される赤色大型植物藻類フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランク対照のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。
【図５Ａ−５Ｃ】図５Ａから５Ｃは、ＦＡＰ標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子（黒丸）又はＤＰ４７標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子（白丸）の、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）発現トランスフェクトマウス胚線維芽細胞株３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９への結合を示す。結合は、二次検出抗体として使用された、ポリクローナルＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片のＭＦＩ（図５Ａ）又はＦＩＴＣ標識モノクローナル抗ヒトＩｇＧκ軽鎖特異的マウスＩｇＧ１κ（クローンＧ１８−１４５）のＭＦＩ（図５Ｂ）又はＰＥ標識抗ヒト４−１ＢＢＬマウスＩｇＧ２ｂのＭＦＩ（図５Ｃ）を試験したＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド構築物のｎＭ濃度に対してプロットすることによって特徴づけられる。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランク対照のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。
【図６】図６のスキームは、レポーター細胞株を使用する実施例５．１．２に記載されたＮＦκＢ活性アッセイの一般原理を示す。レポーター細胞株ＨｅＬａ−ｈｕＣＤ１３７−ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼに対するＦＡＰ発現腫瘍細胞の比は５対１であった。
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａから７Ｃは、ＦＡＰ標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子（ＦＡＰ−ＣＭＰ−４−１ＢＢＬ、黒丸）によるＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化が、ＦＡＰ発現標的細胞へのその結合に厳密に依存すること、及び最大の架橋を誘発する最適な濃度（ベル形状曲線）を示す。ＮＦ−κＢレポーターＨｅＬａ細胞を、異なるレベルの細胞表面ＦＡＰ発現を示す示された腫瘍細胞（図７Ａの３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９、図７ＢのＭＶ−３及び図７ＣのＷＭ−２６６−４）と共培養した。示された濃度の４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子の非存在下又は存在下で細胞を培養した後、実施例５．１．２に記載のようにルシフェラーゼ活性を評価した。白丸は、ＤＰ４７非標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子を示す。活性は、試験した構築物のｎＭの濃度に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロットすることによって特徴づけられる。ＵＲＬはルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化に起因して放出される。
【図８】図８のスキームは、ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を用いた、実施例５．１．３に記載された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイの一般原理を示す。ＮＬＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞に対するＦＡＰ発現腫瘍細胞の比は８対１であった。
【図９Ａ−９Ｆ】図９Ａから９Ｆは、ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の持続的ＩＦＮγ分泌及びＣＤ１３７（４−１ＢＢ）発現は、ＮＬＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体の認識を介したＴ細胞の同時活性化（シグナル１）、及びＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子による４−１ＢＢ−トリガー（シグナル２）に厳密に依存することを示す。黒丸は、ＦＡＰ標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子を象徴する。白丸はＤＰ４７標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子を象徴する。４−１ＢＢアップレギュレーションの効果は、図９Ａ（ＮＬＶ−ペプチドによる活性化なし）、９Ｂ（１０−９Ｍの濃度のＮＬＶペプチドによる活性化）及び９Ｃ（１０−８Ｍの濃度のＮＬＶペプチドによる活性化）のグラフに示されるが、一方、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＩＮＦγ発現の効果は、図９Ｄ（ＮＬＶ−ペプチドによる活性化なし）、９Ｅ（１０−９Ｍの濃度のＮＬＶペプチドによる活性化）及び９Ｆ（１０−８Ｍの濃度のＮＬＶペプチドによる活性化）のグラフに示される。示されるのは、常に全ＣＤ８＋  Ｔ細胞集団における陽性細胞の割合の頻度である。全てのＴ細胞活性化曲線はベル型であり、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子を介した共刺激が約０．６ｎＭの規定された濃度ウィンドウに制限されることを示している。
【図１０】図１０は、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子のＦＡＰ陽性ＷＭ−２６６−４細胞への結合を示す。ＷＭ−２６６−４細胞は、高レベルのヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を発現する。ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子（黒丸）のみが、ＷＭ−２６６−４細胞に結合したが、非標的化ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ  Ｐ３２９Ｇ対照抗体（対照Ｆ、黒菱形）は結合しなかった。示されるのは、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩはフローサイトメトリーによって測定された。ｘ軸は抗原結合分子の濃度を示す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ及び１１Ｂは、それぞれ休止及び活性化ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞へのＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子の結合を示す。ＯＸ４０は、休止ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞上に発現しない。ヒトＯＸ４０発現細胞の非存在下では、結合は観察されなかった（図１１Ａ）。ヒトＰＢＭＣの活性化後、ＯＸ４０はＣＤ４＋  Ｔ細胞上でアップレギュレートされる（図１１Ｂ）。ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子は、ＯＸ４０＋活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合した。示されるのは、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランク対照のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は抗原結合分子の濃度を示す。図１１Ａ及び１１Ｂは、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子の休止及び活性化ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合をそれぞれ示す。ＯＸ４０は、休止ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞上に発現しない。ヒトＯＸ４０発現細胞の非存在下では、結合は観察されなかった（図１１Ｃ）。ヒトＰＢＭＣの活性化後、ＯＸ４０はＣＤ８＋  Ｔ細胞上でアップレギュレートされる（図１１Ｄ）。ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞よりも低く、ドナーと時間点の間で変化する。ＯＸ４０の発現は、示されたＣＤ８＋  Ｔ細胞上で低かった。ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子は、ＯＸ４０＋活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合した。示されるのは、二次検出抗体として使用されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）としての結合である。ＭＦＩをフローサイトメトリーで測定し、ブランク対照のＭＦＩを差し引くことによってベースライン補正した。ｘ軸は抗原結合分子の濃度を示す。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ及び１２Ｂは、それぞれ、ＦＡＰ陽性腫瘍細胞の非存在下（図１２Ａ）又は存在下におけるＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞におけるＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子によるＮＦκＢの活性化を示す。図１２Ｂは、低ＦＡＰ発現ＮＩＨ−３Ｔ３ヒトＦＡＰ細胞の存在下における、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子によるレポーター細胞におけるＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化を示す（比は３つのＦＡＰ＋腫瘍細胞対１つのレポーター細胞）。ＮＦ−κＢ媒介ルシフェラーゼ活性は、試験した化合物のｎＭの濃度に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロットすることによって特徴づけられた。ＵＲＬはルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化に起因して放出される。値は、ブランク対照のＵＲＬを差し引くことによってベースライン補正される。
【００３５】
発明の詳細な記載
定義
特に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆もまた同様である。
【００３６】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
【００３７】
本明細書で使用される用語「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」とは、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合部分は、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合部分は、それが結合するエンティティ（例えば、ＴＮＦファミリーリガンド三量体）を標的部位、例えば抗原決定基を有する特定の型の腫瘍細胞又は腫瘍間質に導くことができる。標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分には、本明細書において更に定義される抗体及びその断片が含まれる。更に、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分としては、本明細書で更に定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメインが挙げられる（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）。
【００３８】
抗体又はその断片に関して、「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む分子の部分を指す。特異的抗原結合が可能な部分は、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。特に、特異的抗原結合が可能な部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００３９】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００４０】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００４１】
本明細書で使用する用語「単一特異性」抗体は、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、その各々は異なる抗原決定基に特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの異なる細胞上に発現される２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００４２】
本出願の範囲において使用される用語「価」は、抗原結合分子内における特定数の結合部位の存在を意味する。そのようなものとして、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、抗原結合分子中にそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を示す。
【００４３】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうちの一つに割当てることができ、それらの幾つかは更にサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。
【００４４】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が含まれる。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、in vivoでの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００４５】
インタクトな抗体のパパイン消化は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）をそれぞれ含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生産する。従って本明細書で使用される場合、用語「Ｆａｂ」とは、ＶＬドメイン及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
【００４６】
「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されるＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる：一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換され、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。他方では、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００４７】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬの１つを有し；前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２〜５０アミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。更に、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化され得る。
【００４８】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬの１つを有し；ここでＶＨ及びＶＬは、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、前記リンカーは少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。更に、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化され得る。
【００４９】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、約１０個〜約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより連結された抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが、並びに溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか、又はその逆に連結することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96）に記載される。更に抗体断片は、ＶＨドメインの特性、すなわちＶＬドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性、又はＶＬドメインの特性、すなわちＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性を有し、それにより全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００５０】
「足場抗原結合タンパク質」は当該技術分野で周知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）が、抗原結合ドメインのための代替の足場として使用されている（例えば、Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeuticsを参照）。Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) and Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）などのプロテインＡ由来分子、Ａ−ドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ））；新規抗原受容体β−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ−クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ノッチンファミリー由来のタンパク質などのミクロボディー、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群より選択される。
【００５１】
ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋  Ｔ細胞上に発現するＣＤ２８ファミリーの受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様のＩｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように改変されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディー（Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ）としても知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７Ｂ１号）。エビボディーは、抗体の単離された可変領域（例えば、ドメイン抗体）とほぼ同じサイズである。更なる詳細については、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照。
【００５２】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように改変することができる円錐構造の開放端に多数のループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０〜１８０アミノ酸のサイズであり、リポカリンに由来する。更なる詳細は、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、米国特許第７２５０２９７Ｂ１号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照。
【００５３】
アフィボディは、抗原に結合するように改変することができる、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。そのドメインは、約５８個のアミノ酸の３つのらせん状の束からなる。ライブラリーは表面残基の無作為化によって生成されている。更なる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)及び欧州特許第１６４１８１８（Ａ１）号を参照。
【００５４】
アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）は、Ａドメインスキャフォールドファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、規定されたジスルフィド結合構造をとる。多様性は、Ａドメインのファミリーによって示される自然のバリエーションをシャッフルすることによって生成される。更なる詳細は、Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)及びExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照。
【００５５】
トランスフェリンは単量体の血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容される表面ループにペプチド配列を挿入することによって、異なる標的抗原に結合するように改変することができる。改変されたトランスフェリン足場の例にはトランスボディ（Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ）が含まれる。更なる詳細は、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照。
【００５６】
設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリン（Ａｎｋｙｒｉｎ）に由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックス及びβターンからなる３３残基のモチーフである。それらは、各リピートの第１のαヘリックス及びβターンの残基を無作為化することによって、異なる標的抗原に結合するように改変することができる。それらの結合界面は、モジュールの数を増加させることによって増加させることができる（親和性成熟の方法）。更なる詳細は、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) 及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８（Ａ１）号を参照。
【００５７】
単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科動物由来の抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ又はＶＨＨ断片）に由来した。更に、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。
【００５８】
フィブロネクチンは、抗原に結合するように改変することができる足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５個の反復単位の第１０ドメインの天然のアミノ酸配列の骨格からなる。β−サンドイッチの一端の３つのループは、アドネクチンが関心のある治療標的を特異的に認識することを可能にするように改変することができる。更なる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８（Ｂ１）号を参照。
【００５９】
ペプチドアプタマーは、定常性の足場タンパク質、典型的には活性部位に挿入された拘束可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細は、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)を参照。
【００６０】
ミクロボディーは、３〜４個のシステイン架橋を含む長さが２５〜５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）に由来し、微小タンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩ及びコノトキシン及びノッチンが含まれる。微小タンパク質は、その微小タンパク質の全体的な折り畳みに影響を与えることなく最大２５個のアミノ酸を含むように改変することができるループを有する。改変されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照。
【００６１】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいて参照分子とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗原結合分子を指し、逆に参照分子は、競合アッセイにおいて抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。
【００６２】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全体に結合し、かつ抗原の一部又は全体に相補的な領域を含む抗原結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は抗原の特定の部分にのみ結合することができ、その部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００６３】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的ストレッチ又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見出すことができる。本明細書の抗原として有用なタンパク質は、他に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質、並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００６４】
「特異的に結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００６５】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表される。この解離定数（Ｋｄ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。従って、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当該技術分野で周知の一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００６６】
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の実施態様では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一実施態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群より選択される。特に、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
【００６７】
特に断りのない限り、プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ ３．４．２１）としても知られている用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＦＡＰを指す。その用語は、「完全長」の未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを包含する。その用語はまた、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体をも包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（www.uniprot.org）アクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号３０）、又はＮＣＢＩ（www.ncbi.nlm.nih.gov/）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１．２に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０に及ぶ。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号３１及び３２に示す。マウスＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号３３）、又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１に及ぶ。配列番号３４及び３５は、それぞれＨｉｓタグ付きマウスＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。配列番号３６及び３７は、それぞれＨｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的な抗ＦＡＰ結合分子は、国際特許出願番号ＷＯ２００２／２０００６（Ａ２）号に記載されている。
【００６８】
特に断りのない限り、がん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている用語「がん胎児性抗原（ＣＥＡ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＥＡを指す。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号３８）に示されている。ＣＥＡは長い間、腫瘍関連抗原として同定されている（Gold and Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002）。もともとは、胎児組織でのみ発現されるタンパク質として分類され、ＣＥＡは現在幾つかの正常な成体組織で同定されている。これらの組織は、胃腸管、呼吸器管及び泌尿生殖器管の細胞、結腸、子宮頸部、汗腺及び前立腺の細胞を含む、主に上皮由来である（Nap et al., Tumour Biol., 9(2-3):145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992）。上皮起源の腫瘍並びにそれらの転移は、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを含む。ＣＥＡ自体の存在はがん性細胞への形質転換を示唆しないが、ＣＥＡの分布は指標である。正常組織では、ＣＥＡは一般に細胞の頂端表面上に発現され（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)）、血流中の抗体に接近できなくなる。正常組織とは対照的に、ＣＥＡは、がん性細胞の表面全体にわたって発現される傾向がある（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)）。発現パターンのこの変化は、がん性細胞においてＣＥＡを抗体に結合しやすくする。加えて、ＣＥＡ発現はがん性細胞において増加する。更に、ＣＥＡ発現の増加は、細胞間癒着の増加を促進し、これは転移をもたらし得る（Marshall J., Semin Oncol., 30(a Suppl. 8):30-6, 2003）。様々な腫瘍実体におけるＣＥＡ発現の有病率は一般に非常に高い。公表されたデータと一致して、組織試料において行われた独自の分析は、その高い有病率を確認し、結腸直腸がん（ＣＲＣ）で約９５％、膵臓がんで９０％、胃がんで８０％、非小細胞肺がん（ＨＥＲ３と同時発現しているＮＳＣＬＣ）で６０％、乳がんで４０％であり；小細胞肺がん及び神経膠芽腫において低発現が見出された。
【００６９】
ＣＥＡは細胞表面から容易に切断され、腫瘍からの血流に直接的に又はリンパ管を介して流される。この特性のために、血清ＣＥＡレベルは、がんの診断、及びがん、特に結腸直腸がんの再発のスクリーニングのための臨床マーカーとして使用されている（Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006）。
【００７０】
特に断りのない限り、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られている用語「メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＭＣＳＰを指す。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン１０３、配列番号３９）に示されている。特に断りのない限り、プロトオンコジーンｃ−ＥｒｂＢ−１又は受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−１とも呼ばれる用語「上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＥＧＦＲを指す。ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５３３（バージョン２１１、配列番号４０）に示されている。
【００７１】
特に断りのない限り、用語「ＣＤ１９」は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ−１２としても知られているＢリンパ球抗原ＣＤ１９を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号４１）に示されている。その用語は、「完全長」で未処理のヒトＣＤ１９、並びに本明細書中に報告された抗体がそれに結合する限り、細胞内でのプロセッシングから生じる任意の形態のヒトＣＤ１９を含む。ＣＤ１９は、限定されないが、プレＢ細胞、発生初期のＢ細胞（すなわち、未成熟Ｂ細胞）、形質細胞への最終分化を介した成熟Ｂ細胞、及び悪性Ｂ細胞を含むヒトＢ細胞の表面に発現される構造的に異なる細胞表面受容体である。ＣＤ１９は、大部分のプレＢ急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、一般的な急性リンパ球性白血病、及び幾つかのＮｕｌｌ急性リンパ芽球性白血病によって発現される。形質細胞上でのＣＤ１９の発現は、多発性骨髄腫などの分化したＢ細胞腫瘍上で発現され得ることを更に示唆する。従って、ＣＤ１９抗原は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び／又は急性リンパ芽球性白血病の治療における免疫療法の標的である。
【００７２】
特に断りのない限り、「ＣＤ２０」は、膜貫通型４ドメインサブファミリーメンバー１（ＭＳ４Ａ１）、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１又は白血球表面抗原Ｌｅｕ−１６としても知られているＢリンパ球抗原ＣＤ２０を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号４２）に示されている。特に断りのない限り、「ＣＤ３３」は、ＳＩＧＬＥＣ３又はｇｐ６７としても知られる骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３を指し、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＣＤ３３を含む。ヒトＣＤ３３のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０１３８（バージョン１５７、配列番号４３）に示されている。
【００７３】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
【００７４】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり、かつ／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の計６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を有し、かつ／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書では交換可能に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)及びChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを指すために何れかの定義を適用することは、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表Ａに明記した。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、何れの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。
2019519196.tif 000002
【００７５】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者は、配列自体を超えた実験データに依存することなく、この「Ｋａｂａｔ番号付け」システムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができるここで使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００７６】
ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、抗原結合分子（例えば、抗体）の文脈における用語「親和性成熟」とは、例えば、突然変異によって、参照抗原結合分子に由来し、同じ抗原に結合し、好ましくは参照抗体と同じエピトープに結合し；かつ参照抗原結合分子よりも抗原に対する親和性が高い抗原結合分子を指す。親和性成熟は、一般に、抗原結合分子の１つ又は複数のＣＤＲにおける１つ又は複数のアミノ酸残基の修飾を含む。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、初期参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【００７８】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）の次の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００７９】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列の変化を含んでもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００８０】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００８１】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００８２】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される他の型の「ヒト化抗体」は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を生成するために、定常領域が元の抗体のそれから更に修飾されるか又は変更されているものである。
【００８３】
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００８４】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域はＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基に及ぶ。一実施態様では、糖鎖がＣＨ２ドメインに結合される。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであり得る。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＣ末端の残基（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）のストレッチを含む。本明細書のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメインであり得る（例えば、１つの鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）を有するＣＨ３ドメイン及び他の鎖の対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するもの；参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第５８２１３３３号を参照）。そのような変異体ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載の２つの同一でない抗体重鎖のヘテロ二量化を促進するために使用され得る．一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書において他に特定されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００８５】
用語「ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「ＴＮＦファミリーリガンド」は、炎症誘発性サイトカインを指す。一般的なサイトカイン、特にＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、免疫系の刺激及び協調に重要な役割を果たす。現在、１９のサイトカインが、配列、機能的及び構造的類似性に基づいてＴＮＦ（腫瘍壊死因子）リガンドスーパーファミリーのメンバーとして同定されている。これらのリガンドは全て、Ｃ末端細胞外ドメイン（エクトドメイン）、Ｎ末端細胞内ドメイン及び単一膜貫通ドメインを有するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）として知られるＣ末端細胞外ドメインは、スーパーファミリーメンバー間で２０〜３０％のアミノ酸同一性を有し、受容体への結合を担う。ＴＮＦエクトドメインはまた、それらの特異的受容体によって認識される三量体複合体を形成するＴＮＦリガンドに関与している。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、リンパ毒素α（ＬＴＡ又はＴＮＦＳＦ１としても知られている）、ＴＮＦ（ＴＮＦＳＦ２としても知られている）、ＬＴβ（ＴＮＦＳＦ３としても知られている）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４としても知られている）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４又はＴＮＦＳＦ５としても知られている）、ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ１７８又はＴＮＦＳＦ６としても知られている）、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０又はＴＮＦＳＦ７としても知られている）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３又はＴＮＦＳＦ８としても知られている）、４−１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９としても知られている）、ＴＲＡＩＬ（ＡＰＯ２Ｌ、ＣＤ２５３又はＴＮＦＳＦ１０としても知られている）、ＲＡＮＫＬ（ＣＤ２５４又はＴＮＦＳＦ１１としても知られている）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２としても知られている）、ＡＰＲＩＬ（ＣＤ２５６又はＴＮＦＳＦ１３としても知られている）、ＢＡＦＦ（ＣＤ２５７又はＴＮＦＳＦ１３Ｂとしても知られている）、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８又はＴＮＦＳＦ１４としても知られている）、ＴＬ１Ａ（ＶＥＧＩ又はＴＮＦＳＦ１５としても知られている）、ＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８としても知られている）、ＥＤＡ−Ａ１（エクトジスプラシンＡ１としても知られている）及びＥＤＡ−Ａ２（エクトジスプラシンＡ２としても知られている）からなる群より選択される。この用語は、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然ＴＮＦファミリーリガンドを指す。
【００８６】
「共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「共刺激ＴＮＦファミリーリガンド」という用語は、Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン産生を共刺激することができるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのサブグループを指す。これらのＴＮＦファミリーリガンドは、対応するＴＮＦ受容体との相互作用時にＴＣＲシグナルを共刺激することができ、その受容体との相互作用は、Ｔ細胞活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを開始するＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）の動員につながる。共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、及びＬＩＧＨＴからなる群より選択され、より具体的には、共刺激ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、及びＧＩＴＲＬＬから選択され、最も具体的には、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
【００８７】
共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの更なる情報、特に配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（www.uniprot.org）のような公的に入手可能なデータベースから得ることができる。例えば、ヒトＴＮＦリガンドは、以下のアミノ酸配列を有する：ヒトＯＸ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２３５１０、配列番号４４）、ヒトＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３２９７０、配列番号４５）、ヒトＣＤ３０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３２９７１、配列番号４６）、４−１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４１２７３、配列番号４７）、ＬＩＧＨＴ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ４３５５７、配列番号４８）、及びＧＩＴＲＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＵＮＧ２、配列番号４９）。
【００８８】
「エクトドメイン」は、細胞外空間（すなわち、標的細胞の外側の空間）へと広がる膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは、通常、表面との接触を開始するタンパク質の一部であり、シグナル伝達につながる。従って、本明細書で定義されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、細胞外空間（細胞外ドメイン）へと広がるＴＮＦリガンドタンパク質の部分を指すが、三量体化及び対応するＴＮＦ受容体への結合の原因となるより短い部分又はその断片も含む。従って、用語「ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片」は、細胞外ドメインを形成するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの細胞外ドメイン、又は受容体に依然として結合することができるそれらの部分（受容体結合ドメイン）を指す。
【００８９】
本明細書において前述されるように、４−１ＢＢＬはＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦリガンドファミリーの１メンバーである。配列番号４７のアミノ酸配列を有する完全長又は全長４−１ＢＢＬは、細胞の表面上に三量体を形成することが記載されている。三量体の形成は、４−１ＢＢＬの外部ドメインの特定のモチーフ（ｍｏｔｉｖｅｓ）によって可能になる。前記モチーフは、本明細書では「三量化領域」と指定される。ヒト４−１ＢＢＬ配列（配列番号５０）のアミノ酸５０−２５４は、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインを形成するが、その断片でさえも三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号６（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−５４４）、配列番号３（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２５４）、配列番号５（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２５４）及び配列番号４（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２５４）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列番号７（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２４８）、配列番号１０（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２４８）、配列番号９（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２４８）及び配列番号８（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２４８）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、又三量体形成能を有するエクトドメインの他の断片も指す。
【００９０】
本明細書において前述されるように、ＯＸ４０Ｌは別のＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦリガンドファミリーの更なるメンバーである。完全長又は全長ヒトＯＸ４０Ｌは、配列番号４４のアミノ酸配列を有する。ヒトＯＸ４０Ｌ配列（配列番号１１）のアミノ酸５１−１８３は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを形成するが、その断片でさえも三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、用語「ＯＸ４０Ｌのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号１１（ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸５１−１８３）又は配列番号１３（ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸５２−１８３）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すが、三量体形成能を有するエクトドメインの他の断片も本明細書に含まれる。
【００９１】
用語「ペプチドリンカー」は、１つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０アミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当該技術分野において周知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎのペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は、一般に１〜１０の数、典型的には２〜４の間の数、特に２であり、すなわち、ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号５１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５２）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５３）、（Ｇ４Ｓ）３又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ又はＧ４（ＳＧ４）２（配列番号５５）、及び（Ｇ４Ｓ）４又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）からなる群より選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号５８）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号５９）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号６０）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号６１）、ＧＧＳＧ（配列番号６２）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号６３）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号６４）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号６５）も含む。特に興味のあるペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）１又はＧＧＧＧＳ（配列番号５１）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５２）、（Ｇ４Ｓ）３又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）及び（Ｇ４Ｓ）４又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）である。
【００９２】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
【００９３】
本明細書で使用される「融合ポリペプチド」は、三量体化ドメインに融合されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインから構成される単鎖ポリペプチドを指す。更に、融合ポリペプチドは、標的細胞抗原、特にＦａｂ断片、より具体的にはＦａｂ断片のＣＨ１及びＶＨドメインに特異的に結合することができる部分を更に含むことができる。融合は、抗原結合部分のＮ又はＣ末端アミノ酸を、ペプチドリンカーを介して、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインのＣ末端又はＮ末端アミノ酸に直接的に連結することによって生じ得る。
【００９４】
「融合された」又は「連結された」とは、構成要素（例えば、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及び外部ドメイン）が、直接的に又は１つ以上のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。
【００９５】
用語「三量化ドメイン」は、三量体を形成するために２つの他の三量化ドメインと会合することによって自己集合を促進するポリペプチド内のアミノ酸配列を指す。この用語はまた、前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを指すためにも使用される。典型的には、三量体化ドメインは、アルファらせんのコイルドコイルドメイン又はイソロイシンジッパードメインを形成することができるアミノ酸配列を含む。適切な三量体化ドメインには、ＴＲＡＦ２（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ１２９３３、配列番号６６）、特にアミノ酸２９９〜３４８又はアミノ酸３１０〜３４９、トロンボスポンジン１（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７９９６、配列番号６７）、特にアミノ酸２９１〜３１４）、マトリリン４（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ９５４６０、配列番号６８）、特にアミノ酸５９４〜６１８；ＣＭＰ（マトリリン１）（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２１９４１、配列番号１）、特にアミノ酸４５４〜４９６及びキュビリン（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ６０４９４、配列番号６９）、特にアミノ酸１０４〜１３８が含まれる。例示的なイソロイシンジッパードメインは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む、Harbury et al. (1993) Science 262, 1401- 1407によって記載された操作された酵母ＧＣＮ４イソロイシン変異体である。
【００９６】
特定の三量体化ドメインは、マトリリン１又はＭＡＴＮ１又はＣＲＴＭ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２１９４１、配列番号１）としても知られているタンパク質である「ｈｕＣＭＰ」又は「ＣＭＰ」又は「ヒト軟骨基質タンパク質」である。用語「ｈｕＣＭＰ三量体化ドメイン」又は「ヒト軟骨基質タンパク質（ＣＭＰ）由来の三量体形成ドメイン」は、２つの類似又は同一のポリペプチドと会合して安定な三量体を形成することができるポリペプチド構造を指す。三量体化は、イオン結合及びポリペプチド鎖の隣接する荷電アミノ酸間に形成される他の非共有結合を介して媒介される。ｈｕＣＭＰの三量体化ドメインは、例えば、Beck et al (1996), J. Mol. Biol. 256, 909-923記載されている。特に重要なｈｕＣＭＰ三量体化ドメインは、配列番号２と少なくとも９５％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む。一実施態様では、前記三量体化ドメインは、配列番号２の配列を含む。
【００９７】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡとＢとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したようにして得られる。
【００９８】
特定の実施態様では、本明細書で提供されるＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基への挿入、及び／又は残基の置換を含む。最終構築物が所望の特性、例えば抗原結合を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを最終構築物に到達させるために行うことができる。置換変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換は表Ｂの「好ましい置換」という見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラス（１）〜（６）を参照して以下で更に説明する。目的の分子にアミノ酸置換を導入し、所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについて産物をスクリーニングすることができる。
2019519196.tif 000003
【００９９】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【０１００】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換する必要があろう。
【０１０１】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般に、更なる研究のために選択された得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に作成することができる。簡潔には、一又は複数のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗原結合分子がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、一又は複数のＨＶＲ内に置換、挿入又は欠失が生じ得る。例えば、実質的に結合親和性を低減させない保存的改変（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。突然変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕのような荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定するために使用される。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１０２】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドへのＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
【０１０３】
特定の態様では、本明細書で提供される三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、１つ又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に得ることができる。特定の態様では、本明細書で提供される三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、当該技術分野において周知であり、容易に入手可能な更なる非タンパク質性部分を含有するように更に修飾することができる。抗原結合分子の誘導体化に適した部分には、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーの何れか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、複数のポリマーが結合する場合、それらは同一又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗原結合分子の特定の特性又は機能を含む（しかしこれらに限定されない）考慮事項に基づいて決定され得る。
【０１０４】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１０５】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、in vivo又はin vitroの本発明のＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖形式及びマイナス鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成されたそのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった調節エレメントであり得るか又はそれらを含み得る。
【０１０６】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに５個までの点突然変異を含み得ることを除いて、同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除され又は別のヌクレオチドで置換されても良く、又は参照配列に含まれる全てのヌクレオチドの最大５％までの複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はそれらの末端位置の間の任意の場所で、参照配列中の残基の間に個別に散在して、又は参照配列内部の一又は複数の連続する群において散在して生じ得る。特定の事項として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。
【０１０７】
「発現カセット」という用語は、標的細胞中の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え技術又は合成技術により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１０８】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現構築物」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞性転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１０９】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる何れかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、更には、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。
【０１１０】
薬剤の「有効量」とは、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１１１】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、減少させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１１２】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１１３】
用語「薬学的組成物」は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効であるような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する追加の成分を含まない調製物を指す。
【０１１４】
「薬学的に許容される賦形剤」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される賦形剤は、限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定剤又は保存剤を含む。
【０１１５】
本明細書で用いられる場合、「治療（treatment）」（及び「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１１６】
本明細書で使用する用語「がん」は、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫などの増殖性疾患を意味し、上記がんの任意の難治性のもの、又は上記がんのうちの一又は複数の組み合わせを含む。
【０１１７】
本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子
本発明は、生産性、安定性、結合親和性、生物学的活性、標的化効率、及び低減された毒性などの特に有利な特性を有する新規な三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を提供する。
【０１１８】
本発明は、３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子であって、３つの融合ポリペプチドの各々が、
（ａ）４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ及びＧＩＴＲＬからなる群より選択される共刺激ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン又はその断片、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）に由来する三量体化ドメイン、及び
（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分
を含む、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を提供する。
【０１１９】
従って、本発明で開示されるのは、３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子であり、３つの融合ポリペプチドの各々は、
（ａ）共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片、
（ｂ）三量体化ドメイン、及び
（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分
を含む。
【０１２０】
三量体化ドメインは、ヒトＴＲＡＦ２、ヒトトロンボスポンジン１、ヒトマトリリン４、ヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）及びヒトキュビリンからなる群より選択されるタンパク質に由来するポリペプチドから誘導することができる。これは、イソロイシンジッパードメイン、例えば配列番号７０のアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、配列番号１のアミノ酸配列のヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）に由来する三量体化ドメインを含む。
【０１２１】
ヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）に由来する三量体化ドメインは、配列番号１の少なくとも一部を含む。一態様では、三量体化ドメインは、配列番号２と少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より具体的には、三量体化ドメインは配列番号２のアミノ酸配列を含む。ヒト軟骨基質タンパク質（ＣＭＰ）に由来する三量体化ドメインは、本明細書において、更に、「ｈｕＣＭＰ三量化ドメイン」と呼ばれる。
【０１２２】
特定の態様では、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、３つの融合ポリペプチドを含み、３つの融合ポリペプチドの各々は、配列番号２と少なくとも９５％の同一性、特に少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む三量体化ドメインを含む。より具体的には、３つの融合ポリペプチドの各々は、配列番号２のアミノ酸配列を含む１つの三量体化ドメインを含む。
【０１２３】
特に、共刺激ＴＮＦファミリーリガンドメンバーは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ及びＧＩＴＲＬからなる群より選択される。より具体的には、共刺激ＴＮＦファミリーリガンドメンバーは、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
【０１２４】
一態様では、共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４−１ＢＢＬである。特に、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、３つの融合ポリペプチドを含み、ここで、３つの融合ポリペプチドの各々において、ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメインは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３又は配列番号７のアミノ酸配列を含む。更なる態様では、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、３つの融合ポリペプチドを含み、３つの融合ポリペプチドの各々は、（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む。
【０１２５】
別の態様では、共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーはＯＸ４０Ｌである。特に、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、３つの融合ポリペプチドを含み、ここで、３つの融合ポリペプチドの各々において、ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメインは、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。更なる態様では、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、３つの融合ポリペプチドを含み、ここで、３つの融合ポリペプチドの各々は、（ａ）配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む。
【０１２６】
別の態様では、前述の３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供され、ここで、ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン又はその断片は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｎ末端アミノ酸で、三量体化ドメインのＣ末端アミノ酸に融合されている。融合は、ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメインと三量体化ドメインとの間の直接結合であり得るか、又はＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメインと三量体化ドメインは、ペプチドリンカーを介して連結される。特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメインと三量体化ドメインは、ペプチドリンカーを介して連結される。
【０１２７】
典型的には、ペプチドリンカーは、２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドである。特に、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号５１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５２）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５３）、（Ｇ４Ｓ）３又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ又はＧ４（ＳＧ４）２（配列番号５５）、及び（Ｇ４Ｓ）４又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）からなる群より選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号５８）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号５９）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号６０）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号６１）、ＧＧＳＧ（配列番号６２）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号６３）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号６４）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号６５）も含む。より具体的には、ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）１又はＧＧＧＧＳ（配列番号５１）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５２）、（Ｇ４Ｓ）３又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）及び（Ｇ４Ｓ）４又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）から選択される。最も具体的には、共刺激ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン又はその断片とｈｕＣＭＰ三量化ドメインは、配列番号５６のペプチドリンカーによって連結される。
【０１２８】
更なる態様では、前述の３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供され、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｃ末端アミノ酸で、三量体化ドメインのＮ末端アミノ酸に融合されている。特定の態様では、三量体化ドメイン及び標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、ペプチドリンカーを介して連結される。
【０１２９】
特に、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号５１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５２）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５３）、（Ｇ４Ｓ）３又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ又はＧ４（ＳＧ４）２（配列番号５５）、及び（Ｇ４Ｓ）４又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）からなる群より選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号５８）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号５９）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号６０）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号６１）、ＧＧＳＧ（配列番号６２）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号６３）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号６４）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号６５）も含む。より具体的には、ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）１又はＧＧＧＧＳ（配列番号５１）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５２）、（Ｇ４Ｓ）３又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）及び（Ｇ４Ｓ）４又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）から選択される。最も具体的には、ｈｕＣＭＰ三量体化ドメイン及び標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、配列番号５２のペプチドリンカーによって連結される。
【０１３０】
別の態様では、本発明は、前述の３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を提供し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、抗体、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質からなる群より選択される。一態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ、及び足場抗原結合タンパク質からなる群より選択される。
【０１３１】
一態様では、本発明は、本明細書で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を提供し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は抗体断片である、特に、抗体断片は、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、及びａＶＨからなる群より選択される。一態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、単鎖Ｆａｂ分子である。一態様では、「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」は、単一ドメイン抗体又はａＶＨである。
【０１３２】
更なる態様では、本発明は、本明細書で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を提供し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は足場抗原結合タンパク質である。特に、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、特別に設計されたアンキリンリピートタンパク質であり得る。
【０１３３】
特定の態様では、本発明は、本明細書で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子に関し、ここで、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分は、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である。従って、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン又はその断片、（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）に由来する三量体化ドメイン、及び（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子を含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１３４】
更なる態様では、前記Ｆａｂ分子は、任意選択的に上に定義されるペプチドリンカーを介して、ＣＨ１ドメインのＣ末端アミノ酸で、三量体化ドメインのＮ末端アミノ酸に融合される。
【０１３５】
更なる態様では、前述の３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供され、ここで、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群より選択される。特定の態様では、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
【０１３６】
更なる態様では、前述の３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供され、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、
（ａ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２及び（ｖｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０１３７】
更なる態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１３８】
別の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１３９】
更なる態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる部分は、（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は（ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１４０】
更なる態様では、前述の３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供され、ここで、前記３つの融合ポリペプチドは同一である。
【０１４１】
別の態様では、本発明は、（ａ）共刺激ＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン又はその断片、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列のヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）に由来する三量体化ドメイン（前記三量体化ドメインは、前記融合ポリペプチドと２つの更なるこのような融合ポリペプチドとの安定な会合を媒介することができる）、及び（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む融合ポリペプチドを提供する。
【０１４２】
別の更なる態様では、融合ポリペプチドが提供され、ここで、融合ポリペプチドは、
（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び
（ｃ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、又は（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む。
【０１４３】
特定の態様では、配列番号７１のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドが提供される。
【０１４４】
別の態様では、融合ポリペプチドが提供され、ここで、融合ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び
（ｃ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、又は（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む。
【０１４５】
特定の態様では、配列番号７２のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドが提供される。
【０１４６】
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１４７】
本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば、２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現され得る。同時発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合して、機能的抗原結合分子を形成し得る。例えば、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分の軽鎖部分は、標的細胞抗原と特異的に結合することができる重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされていてもよい。同時発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を形成する。
【０１４８】
特定の態様では、本発明は、本明細書において前述される融合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。従って、本発明は、（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び（ｃ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、又は（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０１４９】
特定の態様では、配列番号７１のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。より具体的には、配列番号７３のアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
【０１５０】
別の態様では、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供され、ここで、融合ポリペプチドは、（ａ）配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び（ｃ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、又は（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む。
【０１５１】
特定の態様では、配列番号７２のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。より具体的には、配列番号７４のアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
【０１５２】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であり得る。
【０１５３】
本発明の別の態様によれば、本明細書で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド、又は本明細書に前述した融合ポリペプチドが提供される。本発明は更に、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターと、本発明の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞とを提供する。幾つかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【０１５４】
別の態様では、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を製造するための方法であって、（ｉ）抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉ）前記三量体抗原結合分子を単離する工程を含む方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって製造された三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を包含する。
【０１５５】
組換え法
本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする一又は複数のポリヌクレオチドを、例えば上記のように単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用いて容易に単離し、配列決定することができる。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、in vitroでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びin vivoでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片（すなわちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離される一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子若しくはそのポリペプチド断片、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような）２つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるであろう。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０１５６】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連結した最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列に由来するものを含む。更なる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、内部リボソーム侵入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
【０１５７】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができる。例えば、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し、翻訳されたポリペプチドから切断されて分泌型又は「成熟」型のポリペプチドを産生することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド、又はそれに作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０１５８】
後の精製を容易にするため（例えば、ヒスチジンタグ）、又は融合タンパク質を標識するのを補助するために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの内部又は末端に含まれ得る。
【０１５９】
本発明の更なる態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴の何れかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するよう改変できる何れかの種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当該技術分野で周知である。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量の抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で産生され得る。発現後、可溶性画分中の細菌細胞ペーストからポリペプチドを単離し、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む、ポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。
【０１６０】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁状態で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば幾つか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、並びにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術は当該技術分野で周知である。抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗原結合ドメインであるように、免疫グロブリン鎖の他方を発現するように改変することができる。
【０１６１】
別の態様では、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を製造するための方法であって、（ｉ）抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及び（ｉｉ）前記三量体抗原結合分子を宿主細胞又は宿主細胞培養培地から単離する工程を含む方法が提供される。
【０１６２】
三量体抗原結合分子の成分は、互いに遺伝子融合される。三量体抗原結合分子は、その成分が互いに直接的に又はリンカー配列を介して間接的に融合するように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験され得る。三量体抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書で提供される配列中に見出される。望ましい場合、融合物の個々の成分、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を分離するための切断部位を組み込むために、更なる配列を含むこともできる。
【０１６３】
特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分（例えばＦａｂ断片）は、少なくとも抗原に結合することができる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、かつそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。非天然に存在する抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に産生されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得ることができる。
【０１６４】
免疫グロブリンの任意の動物種を本発明において使用することができる。本発明において有用な非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトでの使用を意図する場合、免疫グロブリンの定常領域がヒトに由来する免疫グロブリンのキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の免疫グロブリンも、当分野でよく知られている方法に従って調製することができる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様切片で「覆い隠す」ことが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に例えば、Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号； Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植を記述); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (「リサーフェシング」を記述); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (「ＦＲシャッフリング」を記述); and Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述)に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野において周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、かつそのような抗体から誘導することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生産するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)）。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片の何れかとして、抗体断片を提示する。
【０１６５】
特定の態様では、本発明の抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分（例えば、Ｆａｂ断片）は、例えばＰＣＴ公開国際公開第２００２／２０００６号（親和性成熟に関連する実施例を参照）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示された方法に従って、結合親和性を増強させるように改変される。特定の抗原決定基に結合する本発明の抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）によって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための例示的な方法の詳細が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。例示的な競合アッセイでは、抗原に結合する第一の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第一の抗原結合分子と競合する能力について試験する第二の非標識抗原結合分子とを含む溶液中で固定化した抗原をインキュベートする。第二の抗原結合分子はハイブリドーマ上清に存在してもよい。対照として、固定化抗原が、第一の標識抗原結合分子を含むが第二の非標識抗原結合分子は含まない溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二の抗原結合分子が抗原への結合について第一の抗原結合分子と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０１６６】
本明細書で記載のように調製される本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、当該技術分野で周知の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者には明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用され得る。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを、本質的に実施例に記載されるように抗原結合分子を単離するために使用することができる。三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法の何れかによって決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現された三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されるようにインタクトであり、正しく組み立てられていることが示された。
【０１６７】
本発明はまた、本発明の方法によって製造された三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を包含する。
【０１６８】
アッセイ
本明細書で提供される三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が、同定され、当該技術分野で周知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけられる。
【０１６９】
１．親和性アッセイ
本明細書で提供される三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の、その対応するＴＮＦ受容体に対する親和性を、実施例に説明される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ような標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の、その標的細胞抗原に対する親和性も、実施例に説明される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、実施例３．２で説明される。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０１７０】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
本明細書で提供される三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の、その対応する受容体発現細胞への結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価することができる。一態様では、ＴＮＦ受容体を発現する新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が結合アッセイに使用される。これらの細胞は、単離直後（ナイーブＰＭＢＣ）又は刺激後（活性化ＰＭＢＣ）に使用される。別の態様では、活性化マウス脾細胞（ＴＮＦ受容体分子を発現する）を使用して、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の、その対応するＴＮＦ受容体発現細胞への結合を実証した。
【０１７１】
更なる態様では、標的細胞抗原、例えばＦＡＰを発現するがん細胞株を用いて、抗原結合分子の標的細胞抗原への結合を実証した。
【０１７２】
別の態様では、競合アッセイを使用して、標的又はＴＮＦ受容体にそれぞれ結合する特異的抗体又は抗原結合分子と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗原結合分子は、特異的抗標的抗体又は特異的抗ＴＮＦ受容体抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための代表的な方法が、Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ）に掲載のMorris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」に詳細に示されている。
【０１７３】
３．活性のアッセイ
一態様では、特定の標的細胞抗原及び生物学的活性を有する特定のＴＮＦ受容体に結合する三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、標的細胞抗原を発現する細胞上のＴＮＦ受容体を介したアゴニストシグナル伝達を含み得る。in vitroでこのような生物学的活性を有するものとして本アッセイによって同定されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子も提供される。特に、ヒト４−１ＢＢ又はヒトＯＸ４０を発現し、ＦＡＰ発現腫瘍細胞と共培養されたＨｅｌａ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化を検出するレポーター細胞アッセイが提供される（例えば実施例５．１．２参照）。
【０１７４】
特定の態様において、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、そのような生物学的活性について試験される。本発明の分子の生物学的活性を検出するためのアッセイは、実施例５又は実施例６．３に記載されるものである。更に、細胞溶解を検出するためのアッセイ（例えば、ＬＤＨ放出の測定による）、誘導性アポトーシスキネティクスを検出するためのアッセイ（例えば、カスパーゼ３／７活性の測定による）又はアポトーシスを検出するためのアッセイ（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを用いる）は、当該技術分野において周知である。加えて、そのような複合体の生物学的活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はγδＴ細胞などの様々なリンパ球サブセットの生存、増殖及びリンホカイン分泌に対するそれらの効果を評価することによって、又は樹状細胞、単球／マクロファージ若しくはＢ細胞などの抗原提示細胞の表現型及び機能を調節するそれらの能力を評価することによって評価することができる。
【０１７５】
薬学的組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療法の何れかに使用される、本明細書で提供される三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の何れかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の何れかと、少なくとも１つの追加的な治療剤とを、例えば後述するように含む。
【０１７６】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤中に溶解又は分散された一又は複数の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という句は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも一つの三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、参照により本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990によって例示されているように、本開示に照らして当業者には周知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」は、当業者には周知であるように、任意の及び全ての溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、塩、安定剤及びそれらの組み合わせを含む。
【０１７７】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液中において製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含有することができる。あるいは、融合タンパク質は、使用前は、適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）を用いた組成用の粉末形態であってもよい。滅菌注射溶液は、本発明の融合タンパク質を、必要に応じて、以下に列挙する様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要量で組み込むことによって調製される。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過された液体媒質からの活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要に応じて適切に緩衝されるべきであり、十分な生理食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。内毒素汚染は、安全なレベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれるべきであることが理解されよう。適切な薬学的に許容される賦形剤は、限定されるものではないが、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。
【０１７８】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって作られたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入されてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせなど）を組成物に使用することによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【０１７９】
本明細書における例示的な薬学的に許容される賦形剤は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一又は複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０１８０】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝剤を含む。
【０１８１】
前に記載した組成物に加えて、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子はデポー製剤としても製剤化することができる。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、適切なポリマー性若しくは疎水性物質（例えば、薬学的に許容可能な油中のエマルジョン）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０１８２】
本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる従来の方式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０１８３】
三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、水性及び他のプロトン性溶媒中で、対応する遊離塩基形態よりも可溶性である傾向がある。
【０１８４】
薬学的組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。一態様では、薬学的組成物は、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、及び別の活性な抗がん剤を含む。
【０１８５】
in vivo投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。
【０１８６】
治療的方法及び組成物
本明細書で提供される三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の何れかは、治療方法において使用され得る。治療法における使用のために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、良好な医療行為と一致する様式で処方され、投薬され、投与され得る。これに関連して考慮すべき因子としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。
【０１８７】
一態様では、医薬としての使用のための本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供される。更なる態様では、疾患の治療、特にがんの治療における使用のための、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供される。特定の実施態様では、治療の方法における使用のための本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供される。一実施態様では、本発明は、必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本明細書に記載の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体に、治療的有効量の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法における使用のための三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、治療される疾患はがんである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害、具体的にはがんである。がんの例には、前立腺がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がんが含まれる。本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性障害には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭部及び頸部のがんからなる群より選択される。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
【０１８８】
本発明にはまた、細胞傷害性Ｔ細胞活性のアップレギュレーション又は延長に使用のための本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が包含される。
【０１８９】
更なる態様では、本発明は、必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造又は調製における、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の使用を提供する。一態様では、本医薬は、疾患を有する個体に対し、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの例には、前立腺がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がんが含まれる。本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性障害には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭部及び頸部のがんからなる群より選択される。当業者は、場合によっては、三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は治癒をもたらすことはできず、部分的な利益を提供し得るのみであることを容易に認識する。幾つかの実施態様では、何らかの利益を有する生理学的変化も、治療的に有益であると考えられる。従って、幾つかの実施態様では、生理的変化をもたらす三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。上記の実施態様の何れかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【０１９０】
更なる態様では、本発明は、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、個体における疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、薬学的に許容される形態の本発明の融合タンパク質を含む組成物が、前記個体に対して投与される。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、方法は更に、個体に対して少なくとも１つの追加的治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【０１９１】
疾患の予防又は治療のために、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の適切な用量は（単独で使用されるか、又は１つ以上の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるとき）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、融合タンパク質の種類、疾患の重症度及び経過、融合タンパク質が予防目的又は治療目的で投与されるのか、以前又は同時の治療的介入、患者の病歴及び融合タンパク質に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。何れの場合にも、投与の責任を負う施術者は、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象のための適切な用量を決定するであろう。限定されないが、単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書において考慮される。
【０１９２】
三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。一つの典型的な一日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで一般に持続されるであろう。融合タンパク質の一つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の例では、用量は、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１μｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇ、体重１ｋｇあたり約１０μｇ、体重１ｋｇあたり約５０μｇ、体重１ｋｇあたり約１００μｇ、体重１ｋｇあたり約２００μｇ、体重１ｋｇあたり約３５０μｇ、体重１ｋｇあたり約５００μｇ、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約２００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約３５０ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ以上及びそこから導かれるあらゆる範囲を含み得る。本明細書に列挙した数値からの誘導可能な範囲の例では、上記の数値に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇ〜体重１ｋｇあたり約５００ｍｇなどを投与することができる。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週毎に（例えば患者が三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の約２から約２０用量、例えば約６用量を受けるように）投与され得る。初期の高負荷用量の後、一つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０１９３】
本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるであろう。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９４】
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイのようなin vitroアッセイから最初に推定することができる。次いで用量を、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定するために使用することができる。
【０１９５】
初期投与量は、in vivoデータ、例えば動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０１９６】
投与量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分な本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個々に調整されてもよい。注射による投与のための通常の患者投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０１９７】
局所投与又は選択的取り込みの場合、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【０１９８】
本明細書に記載される本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の治療的に有効な用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療上の利益を提供するであろう。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養アッセイ及び動物試験を使用することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる治療指数である。大きな治療指数を示す三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動し得る。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1参照。この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１９９】
本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療をより高いレベルに調整することも分かっているであろう。関心のある障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。状態の重篤度は、例えば、標準的な予後評価方法によって部分的に評価され得る。更に、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変動するであろう。
【０２００】
その他の薬剤及び治療
本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、治療において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与され得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与されてもよい。用語「治療剤」は、症状又は疾患を治療するために、そのような治療を必要とする個体に投与することができる任意の薬剤を包含する。このような追加的治療剤は、治療される特定の徴候に適した任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。特定の実施態様では、追加的治療剤は別の抗がん剤である。
【０２０１】
このような他の薬剤は、意図される目的に対して効果的な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するタンパク質の量、疾患又は治療の種類、及び上記以外の要因に依存する。本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載された用量の１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路によって使用される。
【０２０２】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起き得る分離投与を包含する。
【０２０３】
製造品
本発明の他の態様では、上述した疾患の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上又は容器に付属するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子である。
【０２０４】
ラベル又は添付文書は、組成物が選択された症状を治療するために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明の三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を含有する組成物を中に含む第１の容器；及び（ｂ）更なる細胞傷害性薬剤又はその他の治療的薬剤を中に含む組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が特定の症状を治療するために使用できることを示す添付文書を更に含んでもよい。
【０２０５】
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望まれる他の材料を更に含んでもよい。
2019519196.tif 000004
2019519196.tif 000005
2019519196.tif 000006
2019519196.tif 000007
2019519196.tif 000008
2019519196.tif 000009
2019519196.tif 000010
2019519196.tif 000011
2019519196.tif 000012
2019519196.tif 000013
【０２０６】
本発明の態様は以下の通りである。
・  ３つの融合ポリペプチドの各々が、
（ａ）共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片、
（ｂ）三量体化ドメイン、及び
（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分
を含む、３つの融合ポリペプチドを含む三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２０７】
・  ３つの融合ポリペプチドの各々が、
（ａ）共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）に由来する三量体化ドメイン、及び
（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分
を含む、３つの融合ポリペプチドを含む、上記第１の項目で定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２０８】
・  三量体化ドメインが配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記の第１及び第２の項目で定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２０９】
・  三量体化ドメインが配列番号２のアミノ酸配列を含む、上記の第１及び第２の項目で定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２１０】
・  共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２１１】
・  共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが４−１ＢＢＬである、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２１２】
・  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３又は配列番号７のアミノ酸配列を含む、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２１３】
・  ３つの融合ポリペプチドを含み、その３つの融合ポリペプチドの各々が、
（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦリガンドファミリーのエクトドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び
（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２１４】
・  共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがＯＸ４０Ｌである、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２１５】
・  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２１６】
・  ３つの融合ポリペプチドを含み、ここで、３つの融合ポリペプチドの各々が、
（ａ）配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含むＴＮＦリガンドファミリーのエクトドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び
（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を含む、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２１７】
・  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｎ末端アミノ酸で、三量体化ドメインのＣ末端アミノ酸に融合されている、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２１８】
・  標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｃ末端アミノ酸で、三量体化ドメインのＮ末端アミノ酸に融合されている、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２１９】
・  標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分が、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ、及び足場抗原結合タンパク質からなる群より選択される、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２２０】
・  標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分が、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２２１】
・  前記Ｆａｂ分子が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、ＣＨ１ドメインのＣ末端アミノ酸で、三量体化ドメインのＮ末端アミノ酸に融合されている、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２２２】
・  標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群より選択される、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２２３】
・  標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２２４】
・  ＦＡＰに特異的に結合することができる部分が、
（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２２５】
・  前記３つの融合ポリペプチドが同一である、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２２６】
・  （ａ）共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片、及び（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）に由来する三量体化ドメイン（前記三量体化ドメインは、前記融合ポリペプチドと２つの更なるこのような融合ポリペプチドとの安定な会合を媒介することができる）を含む融合ポリペプチド。
【０２２７】
・  融合ポリペプチドが、（ｃ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分を更に含む、本明細書中で前に定義した融合ポリペプチド。
【０２２８】
・  融合ポリペプチドが、
（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドのエクトドメイン、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む三量体化ドメイン、及び
（ｃ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、又は（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む、本明細書中で前に定義した融合ポリペプチド。
【０２２９】
・  本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド、又は本明細書中で前に定義した融合ポリペプチド。
【０２３０】
・  本明細書中で前に定義したポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【０２３１】
・  本明細書中で前に定義したポリヌクレオチドを含む宿主細胞、又は本明細書中で前に定義した発現ベクター。
【０２３２】
・  三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子を製造する方法であって、前記三量体抗原結合分子の発現に適した条件下で、本明細書中で前に定義した宿主細胞を培養し、前記三量体抗原結合分子を単離することを含む方法。
【０２３３】
・  本明細書中で前に定義した方法によって製造される三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子。
【０２３４】
・  本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
【０２３５】
・  医薬としての使用のための、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は請求項２９に記載の薬学的組成物。
【０２３６】
・  がんの治療における使用のための、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は本明細書中で前に定義した薬学的組成物。
【０２３７】
・  細胞傷害性Ｔ細胞活性のアップレギュレーション又は延長に使用のための、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は本明細書中で前に定義した薬学的組成物。
【０２３８】
・  がんの治療のための医薬の製造における、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は本明細書中で前に定義した薬学的組成物の使用。
【０２３９】
・  細胞傷害性Ｔ細胞活性のアップレギュレーション又は延長のための医薬の製造における、本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は本明細書中で前に定義した薬学的組成物の使用。
【０２４０】
・  本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は本明細書中で前に定義した薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法。
【０２４１】
・  本明細書中で前に定義した三量体共刺激ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子、又は本明細書中で前に定義した薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体における細胞傷害性Ｔ細胞活性をアップレギュレーション又は延長する方法。
【実施例】
【０２４２】
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２４３】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられている。
【０２４４】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０２４５】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを用いたＰＣＲによって生成されるか、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成された。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異的な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【実施例１】
【０２４６】
１．１．標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の調製及び精製
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの特異的メンバーへのＦａｂ分子の結合を高め、それによりこれらの受容体の架橋を増強するために、４−１ＢＢを標的とする三量体化Ｆａｂ分子が生成された。
【０２４７】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰクローン２８Ｈ１）に対するＦａｂ遺伝子（ＶＨ−ＣＨ１）を、標準的な組換えＤＮＡ技術によって、（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介してヒト軟骨基質タンパク質（ｈｕＣＭＰ）に由来する短い三量体化ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション：Ｐ２１９４１、配列番号１；残基４５４〜４９６、配列番号２）に融合させた。位置４５８及び４６０で鎖間ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基を、残基４６７〜４９５を含むコイルドコイルドメインと一緒に使用した。
【０２４８】
ヒト４−１ＢＢリガンドのエクトドメインの一部（アミノ酸７１−２５４又は７１−２４８）をコードするＤＮＡ配列をＰ４１２７３（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号）に従って合成し、三量体化ドメインの下流の（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して融合させた。
【０２４９】
ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンドをコードする鎖及びＦＡＰ特異性を有する軽鎖を図１ａに示す。ジスルフィド結合が、ＦＡＰを標的とする共有結合したＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド抗原結合分子の形成を導く３つのＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド鎖の間に形成される。図１ｂは三量体形態を示す。
【０２５０】
表１は、ＣＭＰ三量化ドメイン（ＣＭＰｔｄ）を介して三量化し、本発明の三量体ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子を形成する、三量体ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ含有融合ポリペプチドのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
2019519196.tif 000014
2019519196.tif 000015
【０２５１】
三量体ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子をコードする配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
【０２５２】
三量体ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子は、ポリエチレンイミンを用いて、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１の比（「ベクターＦＡＰ（ＶＨＣＨ１）−ＣＭＰｔｄ−４−１ＢＢＬ」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトされた。
【０２５３】
５００ｍＬの振盪フラスコ中での産生のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及びサプリメントを含む７％のＦｅｅｄを加えた。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離して上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように補充し、４℃に保った。
【０２５４】
三量体ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子を、ヒトＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインを介するアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清をＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ−ＣＨ１マトリックスが充填されたカラムにロードし（カラム容量＝１ｍｌ；ＢＡＣ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、５ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ＴＲＩＳ）、１００ｍＭグリシン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で平衡化した。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の同じ緩衝液で洗浄することによって除去した。結合したタンパク質を、５０ｍＭのＴＲＩＳ、１００ｍＭのグリシン、１５０ｍＭの塩化ナトリウムのｐＨ８．０からｐＨ２．０までの２０カラム容量にわたる直線ｐＨ勾配を適用することにより、溶出させた。次いでカラムを１０カラム容量の５０ｍＭのＴＲＩＳ、１００ｍＭグリシン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ２．０で洗浄した。
【０２５５】
収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって中和した。タンパク質を濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ／２０溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０２５６】
タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。三量体ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子の純度及び分子量を、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＳＡ）による染色により分析した。試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファーで２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０２５７】
ｈｕＣＭＰ含有構築物の分子量は、ＴＯＦ６４４１質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ）に連結されたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２００を使用するＬＣ−ＭＳによって非還元及び還元条件下で決定した。還元条件下での分析のために、試料を、１０μｌの８Ｍグアニジン−ＨＣｌ及び４Ｍグアニジン−ＨＣｌで希釈した１０μｌの０．５ｍＭのＴＣＥＰ中で３７℃で３０分間インキュベートした。非還元試料をＬＣ−ＭＳ分析に直接使用した。クロマトグラフ分離は、表２に示すプログラムを使用して、Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ  Ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅカラム；ＲＰ１０００−８（８μｍ粒子サイズ、４．６×２５０ｍｍ；カタログ番号７１９５１０）で行った。溶離液Ａは、水中で５％アセトニトリル及び０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸であり、溶離液Ｂは９５％アセトニトリル、５％水及び０．０５％ギ酸であった。分離は４０℃で、流速１ｍｌ／分で行い、試料７μｇ（１５μｌ）を注入した。
【０２５８】
最初の４分間、溶離液は、質量分析計が塩分汚染するのを防ぐために廃棄物に送られる。ＥＳＩ源は、１２ｌ／分の乾燥ガス流、３５０℃の温度、及び６０ｐｓｉの噴霧器圧力で運転させた。ＭＳスペクトルは、陽イオンモードで３５０Ｖのフラグメンター電圧及び７００〜３２００ｍ／ｚの質量範囲を用いて取得される。ＭＳデータは、機器のソフトウェアによって４〜１７分で取得される。
2019519196.tif 000016
【０２５９】
使用された全ての分析方法は、三量体化分子の均一な調製を確認した。表３は、ＦＡＰ標的化三量体４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子の収率、最終単量体含有量及び質量をまとめたものである。
2019519196.tif 000017
【０２６０】
精製された分子の三量体含有量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）によって決定した。分子の熱安定性は、動的光散乱（ＤＬＳ）実験によって分析した。簡潔には、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する３０μｇの濾過されたタンパク質試料を、Ｄｙｎａｐｒｏプレートリーダーに二通り適用する；（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＵＳＡ）。温度を２５℃から７５℃まで０．０５℃／分で上昇させ、半径及び全散乱強度を収集する。
【０２６１】
１．２．非標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の調製及び精製
三量体ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子について記載されているように、標準的な組換えＤＮＡ技術によって、生殖系列コントロール（ＤＰ４７）由来のＦａｂ遺伝子（ＶＨ−ＣＨ１）を、ヒトＣＭＰに由来する短い三量体化ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション：Ｐ２１９４１；残基４５４〜４９６、配列番号２）に（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して融合させた。
【０２６２】
表４は、ＣＭＰ三量体ドメインを介して三量体化している、三量体非標的化４−１ＢＢＬ（７１−２５４）含有抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示している。
2019519196.tif 000018
2019519196.tif 000019
【０２６３】
非標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子をコードする配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
【０２６４】
非標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子は、ポリエチレンイミンを用いて、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを１：１の比（「ベクターＤＰ４７（ＶＨＣＨ１）−ＣＭＰｔｄ−４−１ＢＢＬ」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトされた。
【０２６５】
非標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の産生、精製及び特徴づけは、ＦＡＰ標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子について上記のように行った。
【０２６６】
使用された全ての分析方法は、三量体化分子の均一な調製を確認した。表５は、非標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンドの最終単量体含有量をまとめたものである。
2019519196.tif 000020
【０２６７】
１．３  対照Ｆとしての非標的化ヒトＩｇＧ１の調製
このアッセイで使用される更なる対照分子は、国際特許出願公開ＷＯ２００５／０１６２１に記載されている方法に従ってＦｃガンマ受容体への結合を排除する、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含む、非標的化ＤＰ４７、生殖系列コントロール、ヒトＩｇＧ１であった。
【０２６８】
表６は、非標的化ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ（対照Ｆ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
2019519196.tif 000021
2019519196.tif 000022
【０２６９】
表７は、非標的化ＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１（対照Ｆ）の収率及び最終単量体含有量をまとめたものである。
2019519196.tif 000023
【０２７０】
実施例２
標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子の調製及び精製
標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子を、４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子と同様に調製した。ヒトＯＸ４０リガンドでは、ヒト４−１ＢＢリガンドのエクトドメインの一部（アミノ酸５１−１８３、配列番号１１）をコードするＤＮＡ配列をＰ２３５１０（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション）に従って合成し、三量体化ドメインの下流の（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して融合させた。２つのＡｓｎ−結合グリコシル化部位（Ｎ９０及びＮ１１４）を突然変異誘発によってアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換した。
【０２７１】
ＦＡＰ標的化ＯＸ４０リガンドをコードする鎖及びＦＡＰ特異性を有する軽鎖は、図１Ａの４−１ＢＢＬについて示されたものと同様である。ジスルフィド結合が、ＦＡＰを標的とする共有結合したＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子の形成を導く３つのＦＡＰ標的化ＯＸ４０リガンド鎖の間に形成される。
【０２７２】
表８は、ｈｕＣＭＰ三量体ドメインを介して三量体化している、ＦＡＰ標的化ヒトＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示している。
2019519196.tif 000024
2019519196.tif 000025
【０２７３】
ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体Ｏｘ４０リガンド含有抗原結合分子の産生、精製及び特徴づけは、ＦＡＰ標的化ヒト４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子について上記のように行った。
【０２７４】
使用された全ての分析方法は、三量体化分子の均一な調製を確認した。表９は、ＦＡＰ標的化ＣＭＰ三量体Ｏｘ４０リガンド含有抗原結合分子の収率及び最終単量体含有量をまとめたものである。
2019519196.tif 000026
【０２７５】
実施例３
表面プラズモン共鳴によるＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の生化学的特徴づけ
３．１．４−１ＢＢの調製、精製及び特徴づけ
ヒト、マウス又はカニクイザル４−１ＢＢのエクトドメインをコードするＤＮＡ配列（表１０）を、ノブについてのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとともにフレーム内にサブクローニングした（Merchant et al., 1998）。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、抗原エクトドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に導入した。指示されたビオチン化のためのＡｖｉタグを抗原−ＦｃノブのＣ末端に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むＦｃホール鎖との組み合わせは、４−１ＢＢエクトドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成を可能にし、従ってＦｃ結合抗原の単量体形態を作り出す（図１Ｃ）。表１１は、図１に示される単量体抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を列挙する。
2019519196.tif 000027
2019519196.tif 000028
2019519196.tif 000029
2019519196.tif 000030
2019519196.tif 000031
【０２７６】
４−１ＢＢ−Ｆｃ融合物をコードする全ての配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。更に、ベクターはプラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
【０２７７】
ビオチン化単量体抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖する懸濁ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、融合タンパク質の２つの成分（ノブ及びホール鎖）、並びにビオチン化反応に必要な酵素であるＢｉｒＡをコードする３つのプラスミドで同時トランスフェクトした。対応するベクターを１：１：０．０５の比（「抗原ＥＣＤ−ＡｃＴＥＶ−Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
【０２７８】
５００ｍｌの振盪フラスコ内でのタンパク質産生のために、４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのため、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、上清を予め温めたＣＤ  ＣＨＯ培地で置換した。発現ベクターを２００μｇのベクターＤＮＡを含有する２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の添加後、溶液を１５秒間混合し、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄを培地に加えた。培養の７日後、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることによって細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加し、４°Ｃに保った。
【０２７９】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム含有緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、２０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ２．５に対して作製された塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（０〜５００ｍＭ）を用いて溶出させた。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０で洗浄した。
【０２８０】
収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を、濃縮し、濾過し、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０２８１】
３．２．表面プラズモン共鳴による生化学的特徴づけ
ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ−三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の組換え４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）への結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
【０２８２】
ｈｕＣＭＰ三量体ヒト４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子と組換え４−１ＢＢ（ヒト、カニクイザル及びマウス）との間の相互作用のアビディティーを以下に記載するように決定し、図２Ａ〜２Ｆに示した。
【０２８３】
抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約６８００ＲＵであった。組換えヒト、カニクイザル及びマウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を２００ｎＭで６０秒間捕捉した。ＦＡＰ標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子を２００μＭで流速３０μＬ／分で１２０秒間フローセルに通した。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、ＦＡＰ標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子を固定化抗ヒトＦｃ抗体を有する表面上に流したが、その上には組換えヒト、カニクイザル及びマウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）でなくＨＢＳ−ＥＰが注入された。
【０２８４】
ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子と組換えヒト及びカニクイザル４−１ＢＢとの間の相互作用の親和性を、以下に記載のように決定し、図３Ａ〜３Ｃに示す。
【０２８５】
抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を、標準的アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接連結させた。固定化レベルは約９２００ＲＵであった。ＦＡＰを２００ｎＭで９０秒間捕捉した。ＦＡＰ標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子を１００ｎＭで１２０秒間フローセルに通した。組換えヒト、カニクイザル及びマウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を０．４９〜１０００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で１８０秒間フローセルを通過させた。解離を１８０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより補正された。ここでは、組換え４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、固定化抗ペンタＨｉｓ抗体を有する表面上に流したが、その上にはＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンドではなくＨＢＳ−ＥＰが注入された。
【０２８６】
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた（表１２）。
2019519196.tif 000032
【０２８７】
実施例４
標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の機能的特徴づけ
４．１．４−１ＢＢ発現細胞への結合：休止（ナイーブ）及び活性化ヒトＰＢＭＣへの結合
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同じ容量のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０  ３２６）で希釈した。５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に、１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）が供給され、希釈したバフィコート溶液をそのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７の上に重ねた。チューブを４００×ｇで３０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを界面から採取し、ＤＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１６０００−０４４、Ｌｏｔ  ９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、及び５６℃で３５分間の熱不活性化）を供給されたＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４０１−０４２）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０ ０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭのβメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。
【０２８８】
ＰＢＭＣは単離直後に使用され（ナイーブ細胞）、又は６ウェル組織培養プレート中で２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｈｗｅｉｚ  ＡＧ、ＣＨＣＬＢ−Ｐ−４７６−７００−１０３４０）及び２ｕｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｌ２７６９）を補充したＴ細胞培地中で４日間培養し、次いで１日間、１０ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３１５）及び２ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９２８）でコーティングされた６ウェル組織培養プレート中、３７℃、５％ＣＯ２で、２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給したＴ細胞培地中において培養することによって、Ｔ細胞の細胞表面で４−１ＢＢ発現を誘導するように刺激された。
【０２８９】
ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子のヒトＰＢＭＣへの結合を決定するために、０．１×１０６個のナイーブ又は活性化されたＰＢＭＣを、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の丸底懸濁細胞の各ウェルに添加した。プレートを４℃で４００×ｇで４分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞がフローサイトメトリーによる取得前に固定された場合、それらを２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで１回洗浄し、次いで１：１０００希釈ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号：Ｌ３４９５７）を含む１００μＬ／ｍＬのＤＰＢＳで４℃で３０分間染色した。細胞が同日に取得され、ＤＡＰＩを用いて死細胞を識別した場合、この染色工程は省略された。その後細胞を、２００μＬの冷ＦＡＣＳ緩衝液（２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）で１回洗浄した。次に、ＦＡＰ標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子、ＤＰ４７標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子又は非特異的結合ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ対照抗体を含む４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ／ウェルを添加し、細胞を４℃で１２０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄した。その後、細胞を、０．２５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ４−ＢＶ４２１（クローンＲＰＡ−Ｔ４、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、０．２５μＬの抗ヒトＣＤ８ａ−ＡＰＣ（クローンＲＰＡ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１κ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５３６９）又は１：２００希釈抗ヒトＣＤ８ａ−ＡＦ４８８（クローンＲＰＡ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１κ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５７７０４）、０．１２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ５６−ＦＩＴＣ（クローンＮＣＡＭ１６．２、マウスＩｇＧ２ｂκ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号３４５８１１）及び２．５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片特異的ヤギＦ（ａｂ｀）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９１１６０９７）を含有する５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液で更に染色し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液／ウェルで２回洗浄した。細胞がＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎで染色された場合、それらは１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで固定され、４℃で一晩保存された。細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて翌日取得した。死細胞を検出するためにＤＡＰＩ染色を使用した場合、細胞は０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  ���ｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有する８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁され、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得された。
【０２９０】
図４に示すように、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子（三量体ＦＡＰ−ｈｕＣＭＰ−４−１ＢＢＬ、黒丸）も非標的化（ＤＰ４７標的化）ｈｕＣＭＰ−三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子（三量体ＤＰ４７−ｈｕＣＭＰ−４−１ＢＢＬ）も休止（ナイーブ）ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞又はＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、両方の構築物は活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋  Ｔ細胞に強く結合したが、後者はＣＤ８＋  Ｔ細胞と比較して、特異的蛍光の約６倍低い強度を示した。これは、ヒト４−１ＢＢがＣＤ４＋  Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋  Ｔ細胞で通常１０−２０倍多く発現される（ドナー及び活性化プロトコルに依存する）という事実と一致する。
【０２９１】
４．２．ＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合
ＦＡＰ発現細胞上での結合アッセイのために、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞株を使用した。この細胞株を生成するために、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞をヒトＦＡＰ（ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９）でトランスフェクトした。細胞は、マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）を、ＣＭＶプロモーター下でヒトＦＡＰをコードする発現ｐＥＴＲ４９２１プラスミドでトランスフェクションすることによって生成した。１．５μｇ／ｍＬピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ａｎｔ−ｐｒ−５）の存在下で細胞を維持した。丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに、０．１×１０６個のＦＡＰ発現腫瘍細胞を添加した。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、異なる濃度の滴定ＦＡＰ標的化又はＤＰ４７標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子を含有する５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。再懸濁した細胞を４℃で２時間インキュベートした。２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄した後、細胞を、６８μｇ／ｍＬのポリクローナルフルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆａｂ断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）又は０．２５ｕｇ／ｍＬのモノクローナルフルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合抗ヒトＩｇＧ特異的マウスＩｇＧ１κ（クローンＧ１８−１４５）又は８．３ｕｇ／ｍＬのモノクローナルフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ヒト４−１ＢＢリガンドマウスＩｇＧ２ｂ（クローン２８２２２０）の何れかを含有する５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液で４℃で１時間染色した。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得した。
【０２９２】
図５に示すように、非標的化ＤＰ４７−Ｆａｂ含有構築物（ＤＰ４７標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド）ではなく、ＦＡＰ標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子は、ヒトＦＡＰ発現細胞に効率的に結合した。１０ｎＭを超える濃度で、ＤＰ４７標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子は、抗ｈｕＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）又は抗ｈｕＩｇＧκ特異的抗体で検出された場合、非特異的結合を示す。
【０２９３】
実施例５
標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の生物活性
５．１．ヒト４−１ＢＢを発現するトランスジェニックレポーター細胞株ＨｅＬａ細胞におけるＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性化
５．１．１．ヒト４−１ＢＢ及びＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞の生成
子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）に、ＣＭＶ−プロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子の制御下にあるヒト４−１ＢＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１）の配列を含む発現ベクターｐＥＴＲ１０８２９に基づくプラスミドを形質導入した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１及び３μｇ／ｍＬのピューロマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。
【０２９４】
４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、フローサイトメトリーによる４−１ＢＢ発現について試験した：０．２×１０６個の生存細胞を、０．１μｇのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合抗ヒト４−１ＢＢマウスＩｇＧ１κクローン４Ｂ４−１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）又はそのアイソタイプコントロール（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５結合マウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール抗体クローンＭＯＰＣ−２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００１５０）を含む１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．０６μｇのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、同日に５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェア）を使用して取得した。限界希釈を行って、記載される単一のクローンを生成した：ヒト４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、１０、５及び２．５細胞／ｍＬの密度まで培地に再懸濁し、細胞懸濁液２００μｌを丸底組織培養処理９６ウェルプレート（６プレート／細胞濃度、ＴＰＰカタログ番号９２６９７）に移した。単一のクローンを収集し、増やし、上記のように４−１ＢＢ発現について試験した。ＮＦκＢ−ルシフェラーゼ発現ベクター５４９５ｐ  Ｔｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢでのその後のトランスフェクションのために、４−１ＢＢ（クローン５）の最高発現を有するクローンを選択した。このベクターは、ＮＦ−κＢ応答エレメント（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、カタログ番号ＬＲ００５１）の制御下で、ハイグロマイシンＢに対する耐性及びルシフェラーゼを発現する能力の両方を有するトランスフェクトされた細胞を与える。ヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａクローン５細胞を７０％コンフルエントになるまで培養した。５０μｇ（４０μＬ）の直線化（制限酵素ＡｓｅＩ及びＳａｌＩ）５４９５ｐＴｒａｎｌｕｃｅｎｔ  ＨｙｇＢ発現ベクターを、滅菌した０．４ｃｍのＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５−２０８１）に添加した。２．５×１０６個のヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａクローン５細胞を４００μｌの無添加ＤＭＥＭ培地に加え、プラスミド溶液と注意深く混合した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌトータルシステム（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５ ２６６０）を用いて以下の設定で細胞のトランスフェクションを行った：指数パルス、容量５００μＦ、電圧１６０Ｖ、抵抗∞。パルスの直後に、トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉを供給された３７℃の温ＤＭＥＭ培地１５ｍＬを含む７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（ＴＰＰ、カタログ番号９００７５）に移した。翌日、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン及び２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０８４３５５５００１）を含有する培地を添加した。生存細胞を増殖させ、上記のように限界希釈を行って単一のクローンを生成した。
【０２９５】
クローンを上記のように４−１ＢＢ発現について、及び以下のようにＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性について試験した：クローンを選択培地で収集し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｖｉ−ｃｅｌｌ  ｘｒ  ２．０３（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号７３１０５０）を用いて計数した。細胞を０．３３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に設定し、１５０μＬのこの細胞懸濁液を、蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移し、−対照として−、翌日生存及び細胞密度を試験するために、通常の９６ウェル平底組織培養プレート（ＴＰＰカタログ番号９２０９６）に移した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、異なる濃度の組換えヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｒｈＴＮＦα、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号３０００１Ａ）を含む培地５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び０ｎｇ／ウェルのｒｈＴＮＦαの最終濃度が得られた。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、次いで２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで３回洗浄した。Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し（４０μｌ）、プレートを−２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞プレート及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温まで解凍した。検出緩衝液１００ｕＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、プレートを可能な限り迅速に測定した。対照（ｒｈＴＮＦαを添加していない）より上の５００ｍｓ／ウェル（ＵＲＬ）の放出光の測定単位をルシフェラーゼ活性とした。ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ−４−１ＢＢ−ＨｅＬａクローン２６は、最も高いルシフェラーゼ活性及びかなりのレベルの４−１ＢＢ発現を示し、更なる使用のために選択された。
【０２９６】
５．１．２．ＦＡＰ発現腫瘍細胞と共培養したヒト４−１ＢＢを発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化
ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼヒト４−１ＢＢ  ＨｅＬａ細胞を収集し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に０．２×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。この細胞懸濁液１００μｌ（２×１０４細胞）を蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに移し、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、異なる濃度の滴定ＦＡＰ標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有分子又はＤＰ４７非標的化ＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有分子を含有する培地５０μＬを添加した。ＦＡＰ発現腫瘍細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に２×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。
【０２９７】
以下のＦＡＰ発現腫瘍細胞を使用した：
・  ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ３（最初の出版： van Muijen GN, Jansen KF, Cornelissen IM, Smeets DF, Beck JL, Ruiter DJ. Establishment and characterization of a human melanoma cell line (MV3) which is highly metastatic in nude mice. Int J Cancer. 1991 Apr 22;48(1):85-91）。
・  ヒト雌メラノーマＷＭ−２６６−４細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６７６）。
・  ヒトＦＡＰ及びピューロマイシン耐性を発現する発現ベクターｐＥＴＲ４９２１でトランスフェクトしたマウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）：実施例４．２に記載のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９。
【０２９８】
５０μＬのＦＡＰ発現腫瘍細胞懸濁液を各ウェルに添加し、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで３回洗浄した。４０μｌの新たに調製したＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し、プレートを−２０℃で一晩保存した。翌日、凍結細胞プレート及び検出緩衝液（ルシフェラーゼ１０００アッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を室温で解凍した。検出緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を可能な限り迅速に測定した。
【０２９９】
図７に示すように、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子（黒丸）は、ＦＡＰ発現腫瘍細胞の存在下でレポーター細胞株におけるＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化を引き起こした。対照的に、同じ分子の非標的化変異体は、試験された濃度の何れにおいてもそのような作用を引き起こさなかった（白丸）。標的化４−１ＢＢＬのこの活性は、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の存在下でさえ、ＮＦ−κＢレポーター細胞株をＦＡＰ陰性腫瘍細胞と共に培養すると、ＮＦκＢ活性化が検出されなかったので、腫瘍細胞の細胞表面でのＦＡＰの発現に厳密に依存していた（データ非表示）。更なる活性化は、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の最大架橋を支持する最適濃度ウィンドウに依存する（ベル型曲線）。最大活性化は、約０．３〜０．４ｎＭの濃度で誘導される。
【０３００】
５．１．３．抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞ベースのアッセイ
ヒトＦＡＰ発現メラノーマ細胞株ＭＶ３細胞株の細胞（実施例５．１．２に記載）を収集し、ＤＰＢＳで洗浄し、２×１０７個の細胞を、ＰＫＨ−２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＰＫＨ２６ＧＬ）の２５０μＬのＣ希釈液に再懸濁した。１μＬのＰＫＨ２６−赤色染色溶液を２５０μＬのＣ希釈液で希釈し、ＭＶ３細胞の懸濁液に添加し、次いでこれを暗所で室温で５分間インキュベートした。０．５ｍＬのＦＢＳを添加し、細胞を１分間インキュベートし、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−１、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸及び５０μＭのβ−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地からなるＴ細胞培地で１回洗浄した。１×１０６個のＭＶ３細胞／ｍＬをＴ細胞培地に再懸濁し、３本のチューブに分けた。合成ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅｓから得た）を１×１０−９Ｍ又は１×１０−８Ｍの最終濃度まで添加し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で回転下で９０分間インキュベートした。ＭＶ３細胞をＴ細胞培地で１回洗浄し、０．５×１０６細胞／ｍＬの密度に再懸濁し、９６ウェル丸底細胞懸濁プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）に分配し（１００μＬ／ウェル）、３７℃及び５％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。
【０３０１】
翌日、異なる濃度のＦＡＰ標的化又はＤＰ４７非標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子を５０μＬのＴ細胞培地で加えた（ＦＡＰ標的化又はＤＰ４７標的化単鎖四量体４−１ＢＢリガンドの最終濃度は５〜０．００２ｎＭであった）。ＮＬＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を収集し、ＣＦＳＥ標識し、５０μＬの培地で各ウェルに添加した（（最終腫瘍：ＣＤ８  Ｔ細胞比は０．１２５）。細胞を２４時間インキュベートし、２．６４μＬ／ｍＬのＧｏｌｇｉ  ｓｔｏｐ（Ｍｏｎｅｓｉｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５４７２４を含有するタンパク質輸送阻害剤）を含有する５０μＬ／ウェルのＴ細胞培地を各ウェルに添加した。細胞を更に４時間インキュベートし、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄し、１：５０００希釈Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ−ｅＦ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６４）を含有する１００μＬの４℃のＤＰＢＳで、４℃で３０分間染色した。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、以下の蛍光色素結合抗体を含む４０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で染色した：抗ヒトＣＤ１３７−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（クローン４Ｂ４−１、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）、抗ヒトＣＤ７０−ＰＥ（クローン１１３−１６、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５５１０４）及び抗ヒトＰＤ−１−ＰＥ／Ｃｙ７（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２９９１８）。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μＬ／ウェルの新たに調製したＦｏｘＰ３  Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−５１２３及び００−５２２３）に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−Ｂｕｆｆｅｒ（２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｗ／ｖ）サポニン（Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓ７９００）及び１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）で２回洗浄し、０．２５μｇ／ｍＬの抗ヒトＩＦＮγ−ＡＰＣ（クローンＢ２７、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号５０６５１０）を含有する５０μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−Ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−８３３３−５６）で染色した。プレートを４℃で１時間インキュベートし、２００μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。固定のために、１％ホルムアルデヒドを含有する５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳを添加し、細胞を４℃で一晩保存した。翌日、細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を用いて取得した。
【０３０２】
図９に示されるように、刺激されていない対照ではなく、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子（黒丸）の存在下で表面４−１ＢＢの発現レベルの増加を示した。標的化されていない対照分子の添加は４−１ＢＢ発現のレベルに影響しなかったので、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子のこの作用は、用量依存性であり、ＦＡＰ標的化を必要とした。更に、ペプチドで活性化されたＴ細胞は、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の存在下で、ＩＮＦγの持続的分泌を示した。まとめると、これらのデータは、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子が、標的特異的様式で抗原特異的Ｔ細胞の表面表現型及び応答性を調節することを実証している。
【０３０３】
実施例６
標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子の機能的特徴づけ
６．１．ヒトＦＡＰ陽性腫瘍細胞への結合
細胞表面ＦＡＰへの結合を、ＷＭ−２６６−４細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６７６）を使用して試験した。丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに５×１０４個のＷＭ−２６６−４細胞を添加した。細胞を、滴定されたｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子を含有する５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＢＳＡ（０．１％ｖ／ｗ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ９４１８）を含むＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０ ３２６））中、暗所で４℃で１２０分間染色した。過剰のＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を暗所で４℃で６０分間、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０９６−０９７）を含有する４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液２５μＬ／ウェル中で染色した。
【０３０４】
プレートは０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有する９０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で最終的に再懸濁され、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得された。
【０３０５】
図１０に示すように、陰性対照（対照Ｆと称する非特異的ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体）ではなく、ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化ｈｕＣＭＰ三量体Ｏｘ４０リガンド含有抗原結合分子（三量体ＦＡＰ−ｈｕＣＭＰ−ＯＸ４０Ｌ）は、ヒトＦＡＰ発現標的細胞に効率的に結合した。ＦＡＰ陽性ＷＭ−２６６−４への結合のＥＣ５０値は１７．３ｎＭであった。
【０３０６】
６．２．ヒトＯｘ４０発現細胞への結合：ナイーブ及び活性化ヒト末梢単核血液白血球（ＰＢＭＣ）
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同じ容量のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０ ３２６）で希釈した。５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に、１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）が供給され、バフィコート溶液をそのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７の上に重ねた。試験管を４００×ｇ、室温で、低加速度でブレーキ無しで３０分間遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを界面から採取し、ＤＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１６０００−０４４、Ｌｏｔ ９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、及び５６℃で３５分間の熱不活性化）を供給されたＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４０１−０４２）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０ ０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭのβメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。
【０３０７】
ＰＢＭＣは単離直後に使用され（休止ヒトＰＢＭＣへの結合）、又はそれらはＴ細胞の細胞表面において強いヒトＯｘ４０発現を受けるように刺激された（活性化ヒトＰＢＭＣへの結合）。従って、ナイーブＰＢＭＣを、６ウェル組織培養プレート中で２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及び２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌ２７６９−１０）を供給したＴ細胞培地中で、３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養した。
【０３０８】
細胞を、滴定した抗Ｏｘ４０抗体構築物を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液中で、暗所で４℃で１２０分間染色した。過剰のＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を、蛍光標識された抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４２８）、抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５３６８）及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０９６−０９７）の混合物を含有する４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液２５μＬ／ウェル中で、４℃で暗所で１時間染色した。プレートは０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有する９０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で最終的に再懸濁され、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを備える）を使用して同日に取得された。
【０３０９】
図１１Ａ〜１１Ｄに示すように、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子は、ＯＸ４０に関して陰性である休止ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞又はＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体Ｏｘ４０リガンド含有抗原結合分子は、ＯＸ４０を発現する活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に対する結合よりもはるかに強力であった。活性化ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞上に検出されたＯＸ４０のレベルのほんの一部のみを発現する。Ｏｘ４０の発現レベルは、動態及び刺激の強さに依存し、ここではＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＯｘ４０発現について条件が最適化されたが、ＣＤ８＋  Ｔ細胞についての条件は最適化されなかった。従って、ＯＸ４０の発現は、ＣＤ８  Ｔ細胞においてわずかしか誘導されなかった。ＯＸ４０陽性ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合のＥＣ５０値は１０．２ｎＭであり、ＯＸ４０陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合のＥＣ５０値は３．０ｎＭであった。
【０３１０】
６．３．ヒトＯＸ４０及びレポーター遺伝子ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞
ＯＸ４０のそのリガンドへのアゴニスト結合は、核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性化を介した下流シグナル伝達を誘導する（A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972）。組換えレポーター細胞株ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１を作成し、その表面にヒトＯＸ４０を発現させた。更に、それはＮＦκＢ感受性エンハンサーセグメントの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドを保有している。ＯＸ４０トリガーは、ＮＦκＢの用量依存的活性化を誘導し、これは核内に移行し、レポータープラスミドのＮＦκＢ感受性エンハンサーに結合して、ルシフェラーゼタンパク質の発現を増加させるルシフェラーゼはルシフェリン酸化を触媒し、光を放出するオキシルシフェリンを生じる。これは、ルミノメーターで定量することができる。従って、様々な抗ＯＸ４０分子がＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞においてＮＦκＢ活性化を誘導する能力を、生物活性の尺度として分析した。
【０３１１】
接着性ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞を、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を用いて３７℃で１０分間収集した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２２５６１−０２１）、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１％（ｖ／ｖ）の非必須アミノ酸を含むアッセイ培地中で２×１０５の細胞密度に調整した。細胞を、蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）にウェルあたり０．３×１０５細胞の密度で播種し、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）中、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩維持した。
【０３１２】
翌日、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１を、滴定ＦＡＰ−Ｏｘ４０Ｌ又は陰性対照Ｆを含有するアッセイ培地を添加することによって６時間刺激した。抗Ｏｘ４０抗体に対する過架橋の効果を試験するために、ＦＡＰ＋腫瘍細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９を含有する培地２５μｌ／ウェルを１：２の比（ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞よりも２倍以上のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９）で添加した。
【０３１３】
ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９は、マウス胎仔線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６５８）を発現ベクターｐＥＴＲ４９２１でトランスフェクションし、１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン選択下でｈｕＦＡＰを発現させることによって生成された。ＦＡＰの表面発現をＱｕｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏカタログ番号Ｋ００７８）を用いて製造者の指示に従って定量した。細胞表面ＦＡＰ発現を検出するために使用された一次抗体は、ヒト／マウス交差反応性クローンＦ１１−２４（マウスＩｇＧ１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号ＯＰ１８８）であった。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９上の表面発現は、１細胞あたり約９００００ｈｕＦＡＰであった。
【０３１４】
インキュベーション後、上清を吸引し、プレートをＤＰＢＳで２回洗浄した。ルシフェラーゼ１００アッセイ系及びレポーター溶解緩衝液（両方ともＰｒｏｍｅｇａであり、カタログ番号Ｅ４５５０及びカタログ番号Ｅ３９７１）を製造者の指示に従って使用して、発光の定量化を行った。簡単には、ウェル当たり３０μＬの１×溶解緩衝液を添加することにより、細胞を−２０℃で１０分間溶解させた。細胞を３７℃で２０分間解凍した後、ウェル当たり９０μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加した。全ての波長を収集するためのフィルターを使用せずに、５００ｍｓの積分時間を使用して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて発光を直ちに定量した。放出された相対光単位（ＵＲＬ）を、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞の基底発光によって補正し、Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて対数一次抗体濃度に対してブロットした。曲線は、組み込みのＳ字状線量応答を用いて適合させた。
【０３１５】
図１２Ａ及び１２Ｂに示されるように、限定された用量依存性のＮＦκＢ活性化は、ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子をレポーター細胞株に添加することによって既に誘導されていた（図１２Ａ）。ＦＡＰ標的化ｈｕＣＭＰ三量体ＯＸ４０リガンド含有抗原結合分子を添加した場合、ＦＡＰ発現腫瘍細胞の存在は、ＮＦκＢ媒介性ルシフェラーゼ活性化の誘導を強く増加させた（図１２Ｂ）。
＊＊＊
引用：
Aggarwal B.B.(2003), Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword.Nat. Rev. Immunol.3(9),745-56.
Banner D. et al (1993), Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor activation.Cell 73, 431-445.
Beck K., Gambee J., Bohan C., Bachinger H.P.(1996), The C-terminal domain of cartilage matrix protein assembles into a triple-stranded a-helical coiled-coil structure.J. Mol.Biol.256, 909-923.
Bodmer J., Schneider P. and Tschopp, J. (2002), The molecular architecture of the TNF superfamily.Trends in Biochemical Sciences 27(1), 19-26.
Broll, K., Richter, G., Pauly, S., Hofstaedter, F., and Schwarz, H. (2001).CD137 expression in tumor vessel walls.High correlation with malignant tumors.Am J Clin Pathol 115, 543-549.
Buechele, C., Baessler, T., Schmiedel, B.J., Schumacher, C.E., Grosse-Hovest, L., Rittig, K., and Salih, H.R.(2012).4-1BB ligand modulates direct and Rituximab-induced NK-cell reactivity in chronic lymphocytic leukemia.Eur J Immunol 42, 737-748.
Choi, B.K., Kim, Y.H., Kwon, P.M., Lee, S.C., Kang, S.W., Kim, M.S., Lee, M.J., and Kwon, B.S.(2009).4-1BB functions as a survival factor in dendritic cells.J Immunol 182, 4107-4115.
Cuadros, C., Dominguez, A.L., Lollini, P.L., Croft, M., Mittler, R.S., Borgstrom, P., and Lustgarten, J. (2005).Vaccination with dendritic cells pulsed with apoptotic tumors in combination with anti-OX40 and anti-4-1BB monoclonal antibodies induces T cell-mediated protective immunity in Her-2/neu transgenic mice.Int J Cancer 116, 934-943.
Curran, M.A., Kim, M., Montalvo, W., Al-Shamkhani, A., and Allison, J.P. (2011).Combination CTLA-4 blockade and 4-1BB activation enhances tumor rejection by increasing T-cell infiltration, proliferation, and cytokine production.PLoS One 6, e19499.
Diehl, L., van Mierlo, G.J., den Boer, A.T., van der Voort, E., Fransen, M., van Bostelen, L., Krimpenfort, P., Melief, C.J., Mittler, R., Toes, R.E., and Offringa, R. (2002).In vivo triggering through 4-1BB enables Th-independent priming of CTL in the presence of an intact CD28 costimulatory pathway.J Immunol 168, 3755-3762.
Dubrot, J., Milheiro, F., Alfaro, C., Palazon, A., Martinez-Forero, I., Perez-Gracia, J.L., Morales-Kastresana, A., Romero-Trevejo, J.L., Ochoa, M.C., Hervas-Stubbs, S., et al.(2010).Treatment with anti-CD137 mAbs causes intense accumulations of liver T cells without selective antitumor immunotherapeutic effects in this organ.Cancer Immunol Immunother 59, 1223-1233.
Futagawa, T., Akiba, H., Kodama, T., Takeda, K., Hosoda, Y., Yagita, H., and Okumura, K. (2002).Expression and function of 4-1BB and 4-1BB ligand on murine dendritic cells.Int Immunol 14, 275-286.
Guo, Z., Cheng, D., Xia, Z., Luan, M., Wu, L., Wang, G., and Zhang, S. (2013).Combined TIM-3 blockade and CD137 activation affords the long-term protection in a murine model of ovarian cancer.J Transl Med 11, 215.
Heinisch, I.V., Daigle, I., Knopfli, B., and Simon, H.U.(2000).CD137 activation abrogates granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-mediated anti-apoptosis in neutrophils.Eur J Immunol 30, 3441-3446.
Ju, S.A., Cheon, S.H., Park, S.M., Tam, N.Q., Kim, Y.M., An, W.G., and Kim, B.S.(2008).Eradication of established renal cell carcinoma by a combination of 5-fluorouracil and anti-4-1BB monoclonal antibody in mice.Int J Cancer 122, 2784-2790.
Kienzle, G., and von Kempis, J. (2000).CD137 (ILA/4-1BB), expressed by primary human monocytes, induces monocyte activation and apoptosis of B lymphocytes.Int Immunol 12, 73-82.
Kim, D.H., Chang, W.S., Lee, Y.S., Lee, K.A., Kim, Y.K., Kwon, B.S., and Kang, C.Y.(2008).4-1BB engagement costimulates NKT cell activation and exacerbates NKT cell ligand-induced airway hyperresponsiveness and inflammation.J Immunol 180, 2062-2068.
Kim, Y.H., Choi, B.K., Oh, H.S., Kang, W.J., Mittler, R.S., and Kwon, B.S.(2009).Mechanisms involved in synergistic anticancer effects of anti-4-1BB and cyclophosphamide therapy.Mol Cancer Ther 8, 469-478.
Kwon, B.S., and Weissman, S.M.(1989). cDNA sequences of two inducible T-cell genes.Proc Natl Acad Sci U S A 86, 1963-1967.
Lee, H., Park, H.J., Sohn, H.J., Kim, J.M., and Kim, S.J.(2011).Combinatorial therapy for liver metastatic colon cancer: dendritic cell vaccine and low-dose agonistic anti-4-1BB antibody co-stimulatory signal.J Surg Res 169, e43-50.
Li, F., and Ravetch, J.V.(2011).Inhibitory Fcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies.Science 333, 1030-1034.
Lin, W., Voskens, C.J., Zhang, X., Schindler, D.G., Wood, A., Burch, E., Wei, Y., Chen, L., Tian, G., Tamada, K., et al.(2008).Fc-dependent expression of CD137 on human NK cells: insights into "agonistic" effects of anti-CD137 monoclonal antibodies.Blood 112, 699-707.
Melero, I., Johnston, J.V., Shufford, W.W., Mittler, R.S., and Chen, L. (1998).NK1.1 cells express 4-1BB (CDw137) costimulatory molecule and are required for tumor immunity elicited by anti-4-1BB monoclonal antibodies.Cell Immunol 190, 167-172.
Melero, I., Shuford, W.W., Newby, S.A., Aruffo, A., Ledbetter, J.A., Hellstrom, K.E., Mittler, R.S., and Chen, L. (1997).Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors.Nat Med 3, 682-685.
Merchant, A.M., Zhu, Z., Yuan, J.Q., Goddard, A., Adams, C.W., Presta, L.G., and Carter, P. (1998).An efficient route to human bispecific IgG.Nat Biotechnol 16, 677-681.
Morales-Kastresana, A., Sanmamed, M.F., Rodriguez, I., Palazon, A., Martinez-Forero, I., Labiano, S., Hervas-Stubbs, S., Sangro, B., Ochoa, C., Rouzaut, A., et al.(2013).Combined immunostimulatory monoclonal antibodies extend survival in an aggressive transgenic hepatocellular carcinoma mouse model.Clin Cancer Res 19, 6151-6162.
Murillo, O., Dubrot, J., Palazon, A., Arina, A., Azpilikueta, A., Alfaro, C., Solano, S., Ochoa, M.C., Berasain, C., Gabari, I., et al.(2009).In vivo depletion of DC impairs the anti-tumor effect of agonistic anti-CD137 mAb.Eur J Immunol 39, 2424-2436.
Narazaki, H., Zhu, Y., Luo, L., Zhu, G., and Chen, L. (2010).CD137 agonist antibody prevents cancer recurrence: contribution of CD137 on both hematopoietic and nonhematopoietic cells.Blood 115, 1941-1948.
Nishimoto, H., Lee, S.W., Hong, H., Potter, K.G., Maeda-Yamamoto, M., Kinoshita, T., Kawakami, Y., Mittler, R.S., Kwon, B.S., Ware, C.F., et al.(2005).Costimulation of mast cells by 4-1BB, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, with the high-affinity IgE receptor.Blood 106, 4241-4248.
Olofsson, P.S., Soderstrom, L.A., Wagsater, D., Sheikine, Y., Ocaya, P., Lang, F., Rabu, C., Chen, L., Rudling, M., Aukrust, P., et al.(2008).CD137 is expressed in human atherosclerosis and promotes development of plaque inflammation in hypercholesterolemic mice.Circulation 117, 1292-1301.
Palazon, A., Teijeira, A., Martinez-Forero, I., Hervas-Stubbs, S., Roncal, C., Penuelas, I., Dubrot, J., Morales-Kastresana, A., Perez-Gracia, J.L., Ochoa, M.C., et al.(2011).Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes.Cancer Res 71, 801-811.
Schwarz, H., Valbracht, J., Tuckwell, J., von Kempis, J., and Lotz, M. (1995).ILA, the human 4-1BB homologue, is inducible in lymphoid and other cell lineages.Blood 85, 1043-1052.
Shao, Z., and Schwarz, H. (2011).CD137 ligand, a member of the tumor necrosis factor family, regulates immune responses via reverse signal transduction.J Leukoc Biol 89, 21-29.
Shi, W., and Siemann, D.W.(2006).Augmented antitumor effects of radiation therapy by 4-1BB antibody (BMS-469492) treatment.Anticancer Res 26, 3445-3453.
Simeone, E., and Ascierto, P.A.(2012).Immunomodulating antibodies in the treatment of metastatic melanoma: the experience with anti-CTLA-4, anti-CD137, and anti-PD1.J Immunotoxicol 9, 241-247.
Snell, L.M., Lin, G.H., McPherson, A.J., Moraes, T.J., and Watts, T.H.(2011).T-cell intrinsic effects of GITR and 4-1BB during viral infection and cancer immunotherapy.Immunol Rev 244, 197-217.
Stagg, J., Loi, S., Divisekera, U., Ngiow, S.F., Duret, H., Yagita, H., Teng, M.W., and Smyth, M.J.(2011).Anti-ErbB-2 mAb therapy requires type I and II interferons and synergizes with anti-PD-1 or anti-CD137 mAb therapy.Proc Natl Acad Sci U S A 108, 7142-7147.
Teng, M.W., Sharkey, J., McLaughlin, N.M., Exley, M.A., and Smyth, M.J.(2009).CD1d-based combination therapy eradicates established tumors in mice.J Immunol 183, 1911-1920.
von Kempis, J., Schwarz, H., and Lotz, M. (1997).Differentiation-dependent and stimulus-specific expression of ILA, the human 4-1BB-homologue, in cells of mesenchymal origin.Osteoarthritis Cartilage 5, 394-406.
Watts, T.H.(2005).TNF/TNFR family members in costimulation of T cell responses.Annu.Rev. Immunol.23, 23-68
Wei, H., Zhao, L., Li, W., Fan, K., Qian, W., Hou, S., Wang, H., Dai, M., Hellstrom, I., Hellstrom, K.E., and Guo, Y. (2013).Combinatorial PD-1 blockade and CD137 activation has therapeutic efficacy in murine cancer models and synergizes with cisplatin.PLoS One 8, e84927.
Weinberg A.D., Evans D.E., Thalhofer C, Shi T., and Prell R.A.(2004).The generation of T cell memory: a review describing the molecular and cellular events following OX40 (CD134) engagement.J. Leukoc.Biol.75, 962-972.
Wilcox, R.A., Chapoval, A.I., Gorski, K.S., Otsuji, M., Shin, T., Flies, D.B., Tamada, K., Mittler, R.S., Tsuchiya, H., Pardoll, D.M., and Chen, L. (2002).Cutting edge: Expression of functional CD137 receptor by dendritic cells.J Immunol 168, 4262-4267.
Wilcox, R.A., Tamada, K., Flies, D.B., Zhu, G., Chapoval, A.I., Blazar, B.R., Kast, W.M., and Chen, L. (2004).Ligation of CD137 receptor prevents and reverses established anergy of CD8+ cytolytic T lymphocytes in vivo.Blood 103, 177-184.
Wyzgol A., Muller N., Fick A., Munkel S., Grigoleit G.U., Pfizenmaier K., Wajant H. (2009), Trimer Stabilization, Oligomerization, and Antibody-mediated cell surface immobilization improve the activity of soluble trimers of CD27L, CD40L, 41BBL and Glucocorticoid-induced TNF receptor ligand.J. Immunol.183, 1851-1861.
Zhang, X., Voskens, C.J., Sallin, M., Maniar, A., Montes, C.L., Zhang, Y., Lin, W., Li, G., Burch, E., Tan, M., et al.(2010).CD137 promotes proliferation and survival of human B cells.J Immunol 184, 787-795.
＊＊＊
【図１Ａ−１Ｃ】
2019519196.tif 000033
【図２Ａ−２Ｂ】
2019519196.tif 000034
【図２Ｃ−２Ｄ】
2019519196.tif 000035
【図２Ｅ−２Ｆ】
2019519196.tif 000036
【図３Ａ−３Ｃ】
2019519196.tif 000037
【図４Ａ−４Ｄ】
2019519196.tif 000038
【図５Ａ−５Ｃ】
2019519196.tif 000039
【図６】
2019519196.tif 000040
【図７Ａ−７Ｃ】
2019519196.tif 000041
【図８】
2019519196.tif 000042
【図９Ａ−９Ｆ】
2019519196.tif 000043
【図１０】
2019519196.tif 000044
【図１１Ａ−１１Ｄ】
2019519196.tif 000045
【図１２Ａ−１２Ｂ】
2019519196.tif 000046
【配列表】
2019519196000001.app
【国際調査報告】
2019519196.tif 000047
2019519196.tif 000048
2019519196.tif 000049
2019519196.tif 000050