(57)【要約】  本開示は、それだけには限らないが、白血球接着機能アッセイ(LAFA)を含むアッセイ、デバイス及び/又はこのようなアッセイを使用する方法に関する。本開示の実施形態は、診断的、解析的及び/又は予後的適用に使用し得る。いくつかの実施形態はまた、1人以上の対象が、どの程度薬物に応答する可能性があり、及び/又は薬物に応答しているかを層別化すること、予測すること、及び/又は決定することに関する。本開示はまた、薬物を摂取している1人以上の対象のための投与計画を最適化する1以上の方法に関する。さらに、本開示はまた、薬物副作用を最小にする、又は潜在的に低減することに関連する。【選択図】図７
2019537031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患の進行を制御するのに適した薬物治療に対する対象の応答又は応答の可能性を評価する方法であって、ここで、薬物は、白血球動員、接着及び/又は遊走を変更可能であり、
対象からの血液サンプルを取得するステップ、
血液サンプルを、少なくとも1つの白血球機能アッセイ(LAFA)に付すステップであって、LAFAが、以下:少なくとも1種の内皮分子及び少なくとも1種の細胞のうち少なくとも1種以上への、白血球動員、接着及び/又は遊走を評価する、ステップ、並びに
少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に少なくとも部分的に基づいて、疾患の進行を制御するための薬物治療に対する、対象の応答又は応答の可能性を評価するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
疾患の進行を制御するのに適した薬物治療に対する対象の応答又は応答の可能性を評価する方法であって、ここで、薬物は、白血球動員、接着及び/又は遊走を変更可能であり、
対象からの血液サンプルを取得するステップ、
血液サンプルを、少なくとも1つの白血球機能アッセイ(LAFA)に付すステップであって、少なくとも1つのLAFAが、以下:少なくとも1種の内皮分子及び内皮分子を発現する少なくとも1種の細胞のうち少なくとも1種以上に対する、現実的な生理学的条件下での白血球動員、接着及び/又は遊走を定量的及び/又は半定量的に評価する、ステップ、並びに
少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に少なくとも部分的に基づいて、疾患の進行を制御するための薬物治療に対する、対象の応答又は応答の可能性を評価するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
少なくとも1つのLAFAが、以下の基板:VCAM-1、MAdCAM-1、P-セレクチン、E-セレクチン、IL-8、SDF1α及び内皮分子を発現する1種以上の細胞のうち1以上で実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも1つのLAFAが、以下の基板:VCAM-1、MAdCAM-1、P-セレクチン、E-セレクチン、IL-8、SDF1α及び内皮分子を発現する1種以上の細胞のうち2以上で実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも1つのLAFAが、以下の基板:VCAM-1、MAdCAM-1、P-セレクチン、E-セレクチン、IL-8、SDF1α及び内皮分子を発現する1種以上の細胞のうち3以上で実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも1つのLAFAが、以下のパラメータ:検出されたローリング白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出されたクローリング白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均真直性、検出された個々の白血球細胞の平均転移及び検出された個々の白血球細胞の平均滞留時間のうち1以上を測定する、請求項1〜4の1項以上に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも1つのLAFAが、以下のパラメータ:検出されたローリング白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出されたクローリング白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均真直性、検出された個々の白血球細胞の平均移動及び検出された個々の白血球細胞の平均滞留時間のうち2以上を測定する、請求項1〜4の1項以上に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも1つのLAFAが、以下のパラメータ:検出されたローリング白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出されたクローリング白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均真直性、検出された個々の白血球細胞の平均移動及び検出された個々の白血球細胞の平均滞留時間のうち4以上を測定する、請求項1〜4の1項以上に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも1つのLAFAが、以下のパラメータ:検出されたローリング白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出されたクローリング白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均真直性、検出された個々の白血球細胞の平均移動及び検出された個々の白血球細胞の平均滞留時間のうち6以上を測定する、請求項1〜4の1項以上に記載の方法。
【請求項１０】
対象からの血液サンプルが、Mn2+を用いて処置され、少なくとも1つのLAFAが、Mn2+処置血液サンプルで実施され、その少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、1以上の指数を作製するために使用される1以上のパラメータを作製するために使用される、請求項1〜9の1項以上に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも1つの健常血液サンプルが、Mn2+を用いて処置され、少なくとも1つのLAFAが、少なくとも1つの健常Mn2+血液処置サンプルで実施され、少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、1以上の指数を作製するために使用される1以上のパラメータを作製するために使用される、請求項1〜10の1項以上に記載の方法。
【請求項１２】
対象からの血液サンプルから得た少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、1以上の指数を作製するために使用される1以上のパラメータを作製するための対照として使用される、請求項1〜11の1項以上に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも1つの健常血液サンプルから得た少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、1以上の指数を作製するために使用される1以上のパラメータを作製するための対照として使用される、請求項1〜12の1項以上に記載の方法。
【請求項１４】
以下の1以上の指数のうち1以上が作製される:対象の相対真直性指数(RSTI)、相対速度指数(RSI)及び相対滞留時間指数(RDTI)、請求項1〜13の1項以上に記載の方法。
【請求項１５】
対象の血液の活性化可能性比が、対象のMn2+処置血液サンプルの少なくとも1つのLAFAの1以上の結果によって除された、対象の血液から得た少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に基づいて作製される、請求項1〜14の1項以上に記載の方法。
【請求項１６】
疾患が、以下:異常な白血球動員、接着及び/又は遊走、炎症の進行、自己免疫状態の進行、免疫不全状態の進行及び感染状態の進行のうち1以上を少なくとも部分的に含む、請求項1及び15の1項以上に記載の方法。
【請求項１７】
疾患が、多発性硬化症(MS)を少なくとも部分的に含む、請求項1及び16の1項以上に記載の方法。
【請求項１８】
疾患が、炎症性腸疾患(IBD)を少なくとも部分的に含む、請求項1及び17の1項以上に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、対象を層別化するために、及び疾患の進行を制御するための薬物治療に対する対象の応答又は応答の可能性を評価するために使用される、請求項1〜18の1項以上に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、対象を層別化するために、及び疾患の進行を制御するための薬物治療に対する対象の応答又は応答の可能性を予測するために使用される、請求項1〜19の1項以上に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも1つのLAFAが、静止又は非静止条件下で実施される、請求項1〜20の1項以上に記載の方法。
【請求項２２】
請求項1〜21の1項以上に記載の方法に基づいて少なくとも1つのLAFAを実施するための系。
【請求項２３】
請求項1〜21の1項以上に記載の方法に基づいて少なくとも1つのLAFAを実施するためのデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、それだけには限らないが、白血球接着機能アッセイ(LAFA)を含むアッセイ、デバイス及び/又はこのようなアッセイを使用する方法に関する。本開示はまた、診断的、解析的及び/又は予後的用途における開示された実施形態の使用に関する。本開示はまた、異常な活性化白血球接着分子及び/又はケモカイン受容体を評価することに関する。本開示はまた、1人以上の対象が、どの程度薬物に応答する可能性があり、及び/又は薬物に応答しているかを層別化すること、予測すること、及び/又は決定することに関する。本開示はまた、薬物を摂取している1人以上の対象のための投与計画を最適化する1以上の方法に関する。さらに、本開示はまた、薬物副作用を最小にする、又は潜在的に低減することに関連する。
【０００２】
相互参照
本出願は、2016年10月14日に出願された「Leukocyte Adhesive Function Assays, Devices and/or Uses」と題された豪州特許出願第2016904169号の優先権を主張し、それに関連する。この出願は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本開示において言及される他の参考文献又は刊行物も、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
本明細書において先行技術の刊行物が言及される場合には、その言及は、その刊行物が、オーストラリアにおける、又は任意のその他の国における当技術分野で共通の一般的知識の一部を形成するという承認を構成するものではない。
【０００４】
循環から周囲組織への白血球動員は、炎症の誘導の際の初期ではあるが重大なステップの1つである。白血球は、高速移動する血流から動員されるために、テザリング、ローリング、スローローリング、強固な接着、クローリング及び最終的に、経内皮遊走を含む、血管内皮との一連の相互作用を受けている。これらの白血球及び内皮相互作用は、白血球及び内皮細胞両方によって発現される、特定の膜分子(接着分子、ケモカイン及びケモカイン受容体など)間の物理的相互作用に応じて変わるということは理解される。
【０００５】
第1に、循環白血球は、白血球によって発現されたPSGL-1(P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1)及びその内皮リガンド、P-セレクチン及びE-セレクチン間の相互作用によって、内皮表面に沿ってテザリングし、ローリングする。ローリング白血球は、その後、ケモカインによって誘導された細胞活性化の結果としてそのローリング速度を低減する。これによって、細胞間接着分子-1(ICAM-1)及び血管細胞接着分子-1(VCAM-1)を含むその内皮リガンドとの、白血球β2及びα4インテグリン間の相互作用が可能となり、内皮表面での白血球の強固な接着につながる。接着性白血球は、αLインテグリン(CD11a)及びαMインテグリン(CD11b)を使用して、内皮ICAM-1と相互作用することが可能であり、白血球が内皮表面でクローリングすることを可能にし、その後、白血球血管外漏出のための部位を見出す。
【０００６】
しかし、疾患状態下では、これらの接着分子の機能が変更され、異常な白血球動員及び炎症につながる。多数の研究が、炎症性疾患を有する患者から得た組織生検サンプル中の白血球の異常な外観を実証しており、これは、疾患進行の間の不可逆的臓器損傷と相関している。例えば、α4β1インテグリン発現及び活性の増大が、多発性硬化症(MS)、脳血液関門(BBB)を越える白血球浸潤の増大の結果としての、中枢神経系における脱髄及び軸索の変性を特徴とする慢性自己免疫疾患を有する患者から得た白血球で報告されている。α4インテグリン活性化を減弱するために、抗ヒトα4インテグリン抗体、ナタリズマブが開発されている。
【０００７】
したがって、ナタリズマブ療法は、脳血液関門を越える白血球浸潤を低減し、したがって、疾患進行を排除するとわかっている。したがって、白血球接着機能におけるこのような異常性の同定は、その循環を離れる可能性及び組織損傷を引き起こすその能力に関する情報を提供する。
【０００８】
疾患の病態形成におけるその役割にも関わらず、白血球接着機能を評価する能力は、臨床設定において使用されている現在のモニタリング及び試験体制から欠けている。研究室では、白血球及び内皮細胞の相互作用を研究するために平行平板型フローチャンバー技術を使用できる。しかし、既存の技術は、通常の臨床設定及び制限時間下で白血球遊走及び/又は白血球接着機能を正確に評価する能力を欠く。例えば、白血球の特定のサブセットを研究するためには、研究室において細胞は、通常、全血から単離される必要がある。次いで、単離された白血球は、白血球動員の重要な制御因子であると知られている他の血液成分(例えば、赤血球及び血小板)の不在下で、フローチャンバーアッセイに使用される。この単離プロセスは、大容量のヒト血液を必要とするだけではなく、白血球の活性化状態も変更し、これは、以後のアッセイに影響を及ぼすこともあり、及び/又は損なうこともある。さらに、現在のイメージング技術は、特定の接着分子の接着機能を定量的に評価する能力を欠き、臨床及び薬物の関連でその適用を制限している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当技術分野において、これらの特徴及び/又は不利益のうち1つ以上の解決策が必要である。本開示は、本明細書において開示される特徴及び/又は利益のうち1つ以上に対処する例示的実施形態を説明する。本開示は、本明細書において開示されるこれら及び他の問題を解決することを対象とする。本開示はまた、本明細書における考察から明らかとなるように、先行技術の不利益のうち少なくとも1つを克服及び/又は改善することも対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
例示的実施形態は、白血球接着機能アッセイ及びデバイスのための新規使用に対する。
【００１１】
例示的実施形態は、現実的な生理学的条件下で、又はin vivo条件を模倣する、模倣しようと試みる、若しくは実質的に模倣する条件下で白血球遊走を評価するための1以上の白血球接着機能アッセイに対する。
【００１２】
例示的実施形態は、内皮細胞、内皮接着分子、内皮膜タンパク質又はそれらの組合せと接着する白血球の能力を測定するアッセイに対する。例えば、現実的な生理学的条件又はin vivo条件を模倣する、模倣しようと試みる、若しくは実質的に模倣する条件下で。
【００１３】
例示的実施形態は、少量のみの全血、単離された白血球、培養白血球及び/又は白血球細胞株を必要とする白血球接着機能アッセイに対する。
【００１４】
例示的実施形態は、疾患の進行を制御するのに適した薬物治療に対する対象の応答又は応答の可能性を評価する方法(単数又は複数)であって、薬物が、白血球動員、接着及び/又は遊走を変更可能である方法を提供し、方法は、
対象からの血液サンプルを取得するステップ、
血液サンプルを、少なくとも1つの白血球機能アッセイ(LAFA)に付すステップであって、LAFAが、以下:少なくとも1種の内皮分子及び少なくとも1種の細胞のうち少なくとも1種以上への、白血球動員、接着及び/又は遊走を評価する、ステップ、並びに
少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に少なくとも部分的に基づいて、疾患の進行を制御するための薬物治療に対する、対象の応答又は応答の可能性を評価するステップ
を含む。
【００１５】
例示的実施形態は、疾患の進行を制御するのに適した薬物治療に対する対象の応答又は応答の可能性を評価する方法(単数又は複数)であって、薬物が、白血球動員、接着及び/又は遊走を変更可能である方法を提供し、方法は、
対象からの血液サンプルを取得するステップ、
血液サンプルを、少なくとも1つの白血球機能アッセイ(LAFA)に付すステップであって、少なくとも1つのLAFAが、以下:少なくとも1種の内皮分子及び内皮分子を発現する少なくとも1種の細胞のうち少なくとも1種以上に対する、現実的な生理学的条件下での白血球動員、接着及び/又は遊走を定量的及び/又は半定量的に評価する、ステップ、並びに
少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に少なくとも部分的に基づいて、疾患の進行を制御するための薬物治療に対する、対象の応答又は応答の可能性を評価するステップ
を含む。
【００１６】
例示的実施形態は、1種以上の白血球分子の接着機能を評価する方法(単数又は複数)を提供し、方法は、
対象からの血液サンプルを取得するステップ、
血液サンプルを、少なくとも1つの白血球機能アッセイ(LAFA)に付すステップであって、少なくとも1つのLAFAが、以下:少なくとも1種の内皮分子及び内皮分子を発現する少なくとも1種の細胞のうち少なくとも1種以上に対する、現実的な生理学的条件下での白血球動員、接着及び/又は遊走を定量的及び/又は半定量的に評価する、ステップ、並びに
少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に少なくとも部分的に基づいて、1種以上の白血球分子の活性化のレベルを評価するステップ
を含む。
【００１７】
例示的実施形態は、以下:(1)対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測すること、(2)対象において疾患の進行を制御及び/又は予防するために、薬物を使用できるか否かを決定すること、(3)対象において疾患の進行を予防及び/又は制御するための薬物を選択すること、(4)対象において疾患の進行を予防及び/又は制御するための薬物を同定することのうち1以上のための方法であって、薬物が、1種以上の白血球細胞の内皮分子との白血球接着を少なくとも変更可能である方法を提供し、前記方法は、
対象から得られた少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、並びに
少なくとも1つのアッセイの結果に基づいて、(a)対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測するステップと、(b)対象において疾患の進行を制御及び/若しくは予防するために、薬物を使用できるか否かを決定するステップと、(c)対象において疾患の進行を予防及び/若しくは制御するための薬物を選択するステップと、並びに/又は(d)対象において疾患の進行を予防及び/又は制御するための薬物を同定するステップ
を含む。
【００１８】
例示的実施形態は、以下:(1)1人以上の対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測すること、(2)1人以上の対象において疾患の進行を制御及び/又は予防するために、薬物を使用できるか否かを決定すること、(3)1人以上の対象において疾患の進行を予防及び/又は制御するための1種以上の薬物を選択すること、並びに(4)1人以上の対象において疾患(単数及び/又は複数)の進行を予防及び/又は制御するための1種以上の薬物を同定することのうち1以上のための方法であって、1種以上の薬物が、1種以上の白血球細胞の内皮分子との白血球接着を少なくとも変更可能である方法を提供し、前記方法は、
1人以上の対象から得られた少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、並びに
少なくとも1つのアッセイの結果に基づいて、(a)1人以上の対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測するステップ、(b)1人以上の対象において疾患(単数及び/又は複数)の進行を制御及び/又は予防するために、1種以上の薬物を使用できるか否かを決定するステップ、(c)1人以上の対象において疾患(単数及び/又は複数)の進行を予防及び/又は制御するための1種以上の薬物を選択するステップ及び/又は(d)1人以上の対象において疾患(単数及び/又は複数)の進行を予防及び/又は制御するための1種以上の薬物を同定するステップ
を含む。
【００１９】
例示的実施形態は、(1)対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測する、(2)対象において疾患の進行を制御及び/又は予防するために、薬物を使用できるか否かを決定する、(3)対象において疾患の進行を予防又は制御するための薬物を選択する、及び/又は(4)対象において疾患の進行を予防又は制御するための薬物を同定する方法であって、薬物が、内皮分子との白血球接着を変更可能である方法を提供し、前記方法は、
対象から得られた少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、並びに
アッセイの結果に基づいて、(a)対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測するステップ、(b)対象において疾患の進行を制御及び/又は予防するために、薬物を使用できるか否かを決定するステップ、(c)対象において疾患の進行を予防及び/又は制御するための薬物を選択するステップ及び/又は(d)対象において疾患の進行を予防及び/又は制御するための薬物を同定するステップ
を含む。
【００２０】
例示的実施形態は、疾患の進行を制御するための薬物を投与された対象が、その薬物にどのように応答しているかを決定する方法であって、薬物が内皮分子との白血球接着を変更可能である方法に対し、前記方法は、
対象から得られた薬物を含有する少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、及び
アッセイの結果に基づいて、対象が薬物にどのように応答しているかを決定するステップ
を含む。
【００２１】
例示的実施形態は、疾患の進行を制御するための1種以上の薬物を投与された対象が、その1種以上の薬物にどのように応答しているかを決定する方法であって、1種以上の薬物が、少なくとも1種の内皮分子との白血球接着を変更可能である方法に対し、前記方法は、
対象から得られた薬物を含有する少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、及び
アッセイの結果に基づいて、対象が薬物にどのように応答しているかを決定するステップ
を含む。
【００２２】
例示的実施形態は、1種以上の疾患の進行を制御するために1種以上の薬物を摂取している少なくとも1人の対象の投与計画を最適化する方法であって、1種以上の薬物が、1種以上の内皮分子との白血球接着を少なくとも部分的に変更可能である方法を提供し、前記方法は、
対象から得られた薬物を含有する少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、及び
アッセイの結果に基づいて、疾患の進行を制御するための対象の薬物投与計画を最適化するステップ
を含む。
【００２３】
例示的実施形態は、疾患の進行を制御するために薬物を摂取している対象の投与計画を最適化する方法であって、薬物が、内皮分子との白血球接着を変更可能である方法を提供し、前記方法は、
対象から得られた薬物を含有する少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、及び
アッセイの結果に基づいて、疾患の進行を制御するための対象の薬物投与計画を最適化するステップ
を含む。
【００２４】
例示的実施形態は、患者を有効な薬物用量及び/又は用量範囲を用いて治療し、有効な薬物用量及び/又は用量範囲の投与による副作用を低減する方法であって、薬物が、1種以上の内皮分子との白血球接着を少なくとも部分的に変更可能である方法を提供し、前記方法は、
(1)対象に既知量の薬物を一定期間投与するステップ、
(2)ステップ(1)後、対象から得られた血液サンプルを、in vitroで白血球接着機能アッセイに付すステップ、並びに
(3)アッセイの結果に少なくとも部分的に基づいて、対象の最小有効薬物用量又は薬物用量範囲を決定できるまで、ステップ(1)及び(2)を反復するステップ
を含む。
【００２５】
例示的実施形態は、疾患の進行を制御するための対象の最小有効薬物用量を決定する方法であって、薬物が内皮分子との白血球接着を変更可能である方法を提供し、前記方法は、
(1)対象に既知量の薬物を所定の期間投与するステップ、
(2)ステップ(1)後、対象から得られた薬物を含有する血液サンプルを、in vitroで白血球接着機能アッセイに付すステップ、並びに
(3)アッセイの結果に基づいて、疾患の進行を制御するために対象の最小有効薬物用量を決定できるまで、ステップ(1)及び(2)を反復するステップ
を含む。
【００２６】
例示的実施形態は、本明細書において開示されるような方法のうち1以上を実施するための、1以上のフローアッセイ又は1以上のフローデバイスを提供する。
【００２７】
例示的実施形態は、少なくとも1人の対象の白血球接着プロフィールを作製する方法を提供し、前記方法は、
少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付して、1種以上の種々の内皮分子との種々の白血球サブセットの接着機能を評価するステップ、並びに
以下:1以上の白血球異常性を同定すること、個別化された病態形成の決定、1以上の疾患マーカーの同定、1種以上の疾患の早期徴候を同定すること、疾患予測、疾患予防、早期及び/又は正確診断を補助すること、対象の有効な個別化された治療を開発すること、1人以上の対象の健康状態をモニタリングすること、疾患に関わらず種々の対象を群化すること、疾患診断に関わらず1人以上の対象の治療を開発すること、疾患診断に先立って治療を推奨すること、未知病因論を有する及び/又は疾患診断を伴わない治療を推奨すること、並びに疾患診断が未知である治療を推奨することのうち1以上のためにアッセイ結果を使用するステップ
を含む。
【００２８】
例示的実施形態は、対象の白血球接着プロフィールを作製する方法を提供し、前記方法は、
対象から得られた少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付して、1種以上の種々の内皮分子との種々の白血球サブセットの接着機能を実質的に同時に定量的に評価するステップ、並びに
以下:白血球異常性を同定すること、個別化された病態形成を決定すること、疾患の新規疾患マーカーの同定、疾患の初期徴候を同定すること、疾患予測、疾患予防、早期及び正確診断を補助すること、対象の有効な個別化された治療を開発すること、対象の健康(健康状態)をモニタリングすること、疾患に関わらず種々の対象を群化すること、並びに疾患診断に関わらず対象の治療を開発することのうち1以上のアッセイ結果を使用するステップ
を含む。
【００２９】
本開示の実施形態は、添付の図を参照して単に例として記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１−１】図1A〜Iは、例示的実施形態に従う、VCAM-1基板上でのCD4、CD8及びCD15細胞の遊走プロフィールに対するMn2+処置の多様な効果を例示する図である。図1Aは、全血中の、種々のフルオロフォアにコンジュゲートされた抗体を用いて標識されたCD4(緑色)、CD8(赤色)及びCD15(シアン)細胞を例示し、これによって、これらの白血球サブセットの同時検出が可能となった。マイクロ流体チャネルを使用してVCAM-1基板上での細胞動員を評価した。図1Aでは、対照(左)及びMn2+処置された(右)血液サンプルの代表的なスクリーンショットが示されている。図1Bでは、Mn2+は、相互作用するCD4、CD8及びCD15細胞の数に対して効果を示す。全部の相互作用するCD4(図1C)、CD8(図1D)及びCD15(図1E)細胞を、その細胞平均速度(Smean)に従って4群にわけた:S、静止細胞(Smean<5μm/分)、C、クローリング細胞(Smean=5〜20μm/分)、SR、スローローリング細胞(Smean=20〜300μm/分)及びR、ローリング細胞(Smean=300〜6000μm/分)。各群中の細胞数に対するMn2+効果を決定した。さらに、相互作用するCD4、CD8及びCD15細胞の平均速度(図1F)、滞留時間(図1G)及び真直性(図1H)に対するMn2+効果も評価された。図1B〜1Hでは、データは、群あたりn=10の独立した対象の平均±SEMを表す。図1Iでは、抗ヒトCD16-BV510抗体を導入してCD16+CD15+二重陽性細胞(好中球)を同定した。結果として、対照及びMn2+処置サンプルにおける総CD15+細胞中のCD16+CD15+細胞のパーセンテージを算出し、図1Iに例示されている。図1Iでは、(n=4)、*、p<0.05、**、p<0.01。
【図１−２】図１の続き。
【図２】図2A〜Cは、特定の例示的実施形態に従って、ナタリズマブが、VCAM-1基板上でのCD4、CD8及びCD15細胞動員を阻害することを例示する。実施例1に記載されるマイクロ流体チャネルシステムを使用して、血液を種々の用量のナタリズマブを用いて処置し、その後、解析した。対照(丸)及びMn2+処置した(四角)CD4(図2A)、CD8(図2B)及びCD15(図2C)細胞の動員に対するナタリズマブ効果を決定した。各曲線を上回る数は、ナタリズマブ処置を伴わない場合の相互作用する細胞数を示す。データは、群あたりn=4〜6人の対象の平均±SEMを表す。
【図３】図3A〜Fは、特定の例示的実施形態に従って、TNFα活性化HUVECでの白血球の強固な接着に対する低(10μg/ml)及び高(300μg/ml)用量のナタリズマブの阻害効果を示す図である。平行平板型フローチャンバーシステムを使用して、TNFα活性化HUVECとの白血球の相互作用に対するナタリズマブの効果を評価した。全血において白血球をHoechst33342を用いて標識し、その後、フローアッセイのために使用した。すべての種類の細胞相互作用を捉えるために、高フレームレート(1秒あたり2フレーム)で5分間画像を獲得した。低用量(10μg/ml)のナタリズマブを用いずに、又は用いて全血を処置し、相互作用する白血球数及びその平均速度を決定し、それぞれ、図3A及び図3Bに示されている。同一実施例において、静止、クローリング、スローローリング及びローリング細胞の割合に対する低用量ナタリズマブの効果も評価した(図3C)。データは、群あたりn=7の対象の平均±SEMを表す。別個の実施例では、相互作用する細胞数(図3D)、細胞速度(図3E)及び4つの細胞相互作用の種類(図3F)に対する高用量(300μg/ml)ナタリズマブ効果を決定した。データは、群あたりn=6の対象の平均±SEMを表す。*、p<0.05、**、p<0.01。
【図４】図4A〜Fは、低及び高用量ナタリズマブが、TNFα活性化HUVECでのCD4及びCD15細胞の細胞遊走挙動を変更するが、CD8細胞のものは変更しないことを例示する。特定の例示的実施形態に従って、平行平板型フローチャンバーシステムを使用して、TNFα活性化HUVECでの、低速度移動する(静止及びクローリング)白血球の遊走挙動に対するナタリズマブの効果を評価した。未処理全血において、CD4、CD8及びCD15細胞を、種々のフルオロフォアにコンジュゲートされた抗体を用いて標識し、これによって、これらの白血球サブセットの同時検出が可能となった。データを、低フレームレート(30秒あたり1スタック)で30分間3D画像スタックとして記録し、これによって、低速度移動する細胞の詳細な3D移動を捉えることが可能となった。ヒト全血を低用量(10μg/ml)のナタリズマブを用いずに、又は用いて処置し、その後、フローアッセイのために使用した。相互作用するCD4、CD8及びCD15細胞数(図4A)並びにその真直性(図4B)及び平均速度(図4C)を決定した。データは、n=5人の血液ドナー/群の平均±SEMを表す。別個の実験では、全血を、フローアッセイに先立って、高用量(300μg/ml)のナタリズマブを用いずに、又は用いて処置した。次いで、相互作用する細胞数(図4D)、真直性(図4E)及び速度(図4F)に対するナタリズマブ効果を評価した。データは、群あたりn=6人の対象の平均±SEMを表す。*、p<0.05、**、p<0.01。
【図５】図5A〜Cは、共通の起点グラフが、Mn2+が、VCAM-1基板上でのCD4及びCD8細胞の運動性を阻害するが、CD15細胞のものは阻害しないことを示す図である。特定の例示的実施形態に従って、マイクロ流体システムを使用してVCAM-1によって誘導された白血球動員を調べた。ヒト血液を、アッセイに先立って5mM Mn2+を用いずに、又は用いて処置した。画像を解析し、相互作用する細胞をトラッキングした。検出されたトラックを起点の同一座標に対して正規化することによって、各白血球サブセットの共通の起点グラフを得た。
【図６】図6A〜Cは、共通の起点グラフが、低及び高用量ナタリズマブが、TNFα活性化HUVEC上でのCD4及びCD15細胞の細胞運動性を阻害するが、CD8細胞のものは阻害しないことを示すことを示す図である。特定の例示的実施形態に従って、フローチャンバー技術を使用してTNFα活性化HUVEC上での細胞遊走挙動を調べた。低(10μg/ml)又は高(300μg/ml)用量のナタリズマブを用いずに、又は用いてヒト全血を処置し、その後、フローアッセイのために使用した。図5に記載されたように共通の起点グラフを作製した。
【図７】図7は、例示的実施形態に従う、ポイントオブケア血液検査フローチャートを示す図である。
【図８】図8A及び8Bは、特定の例示的実施形態に従う、CD4リンパ球上のα4インテグリンのナタリズマブ占有を調べるためのリガンド占有アッセイを示す図である。細胞を5mM MnCl2を用いて、又は用いずに活性化し、その後、リガンド占有アッセイのために使用した。細胞を、種々の用量のナタリズマブを用いて処置し、PEがコンジュゲートした抗ヒトIgG二次抗体を使用してナタリズマブ占有を検出した。FACSによって、PE陽性細胞のパーセンテージ(A)及びCD4リンパ球のPE MFI(B)を決定した。データは、群あたりn=3〜4人の対象の平均±SEMを表す。
【図９】図9A〜Hは、特定の例示的実施形態に従う、MAdCAM-1基板上での、CD4及びCD8細胞の遊走プロフィールに対するMn2+処置の効果を示す図である。健常ボランティアから採取した血液サンプルを、5mM Mn2+を用いて、又は用いずに室温でおよそ5分間処置し、その後、LAFAのために使用した。A:相互作用するCD4、CD8、CD15及びCD19細胞数に対するMn2+効果。相互作用するCD4、CD8、CD15及びCD19細胞の平均速度(B)、真直性(C)及び滞留時間(D)も評価した。その遊走の平均速度に基づいて、全部の相互作用する細胞を、静止(<5μm/分)、クローリング(5〜20μm/分)、スローローリング(20〜300μm/分)及びローリング細胞(300〜6000μm/分)にわけた。各種類の相互作用する細胞数に対するMn効果が、それぞれ、9E(CD4)、9F(CD8)、9G(CD15)及び9H(CD19)に示されている。データは、群あたりn=14人の独立した対象の平均±SEMを表す。
【図１０】図10A〜Dは、特定の例示的実施形態に従って、ベドリズマブが、CD4細胞とMAdCAM-1基板間の相互作用を弱めることを例示する図である。図1におけるように、マイクロ流体チャネルシステムを使用して、血液を種々の用量のベドリズマブを用いて処置し、その後、解析した。Mn2+の不在下(青色丸)及び存在下(赤色四角)で、相互作用するCD4(A)及びCD8(C)細胞数並びにCD4(B)及びCD8(D)細胞の速度に対するベドリズマブ効果を決定した。各曲線を上回る数は、ベドリズマブ処置を伴わない場合の相互作用する細胞数及びその速度を示す。データは、群あたりn=3〜4人の対象の平均±SEMを表す。
【図１１】図11は、特定の例示的実施形態に従う、CD4リンパ球上のα4β7インテグリンのベドリズマブ占有を調べるためのリガンド占有アッセイを例示する図である。細胞を5mM MnCl2を用いて、又は用いずに活性化し、その後、リガンド占有アッセイのために使用した。細胞を種々の用量のベドリズマブを用いて処置し、PEがコンジュゲートした抗ヒトIgG二次抗体を使用してベドリズマブ占有を検出した。FACSによってPE陽性CD4細胞のパーセンテージを決定した。データは、群あたりn=2人の対象の平均±SEMを表す。
【図１２】図12は、特定の例示的実施形態に従う、VCAM-1基板上での白血球動員に対するベドリズマブ効果を例示する図である。全血を10及び100μg/mlのベドリズマブを用いて、又は用いずに処置し、その後、白血球接着機能アッセイのために使用した。次いで、相互作用するCD4、CD8、CD15及びCD19細胞数を決定した。データは、群あたりn=3人の対象の平均±SEMを表す。
【図１３】図13は、特定の例示的実施形態に従う、MAdCAM-1基板上での白血球動員に対するナタリズマブ効果を例示する図である。全血を、10μg/mlのナタリズマブを用いて、又は用いずに処置し、その後、基板としてMAdCAM-1を使用する白血球接着機能アッセイのために使用した。次いで、相互作用するCD4及びCD8細胞数を決定した。データは、群あたりn=4人の対象の平均±SEMを表す。
【図１４】図14A〜Dは、特定の例示的実施形態に従う、Pセレクチン及びEセレクチン基板上での白血球動員に対するナタリズマブ及びベドリズマブの効果を示す図である。血液を、10μg/mlのナタリズマブ又はベドリズマブのいずれかを用いて処置し、その後、基板としてPセレクチン及びEセレクチンを使用するLAFA解析のために使用した。次いで、実施例1に記載されたように、相互作用する細胞数(A)、速度(B)、滞留時間(C)及び真直性(D)を決定した。データは、群あたりn=4〜6人の独立した対象の平均±SEMを表す。*、p<0.05。
【図１５】図15A〜Cは、白血球CXCR1及びCXCR4機能の評価を示す図である。特定の例示的実施形態に従って、VCAM-1を、マイクロ流体チャネル上にIL-8又はSDF1αのいずれかとともに同時コーティングし、その後、LAFA解析のために使用した。次いで、実施例1に記載されたように、相互作用するCD4、CD8及びCD15細胞数(A)、その平均真直性(B)及び滞留時間(C)を決定した。データは、群あたりn=6〜8人の独立した対象の平均±SEMを表す。*、p<0.05。
【図１６−１】図16A〜Pは、特定の例示的実施形態に従う、ベドリズマブ処置に対する、個々のIBD患者から得たCD4及びCD8細胞の多様な応答を示す図である。活発な炎症性腸疾患を有する患者から血液サンプルを採取した。0.1μg/mlのベドリズマブを用いて血液を処置し、その後、接着性基板としてMAdCAM-1を使用するLAFA例示的実施形態によって解析した。次いで、実施例10において詳述されるように、IBD患者番号1の相互作用するCD4(A)及びCD8(C)細胞数及びその速度(B及びD)を決定した。IBD患者番号2(E〜H)、患者番号3(I〜L)及び患者番号4(M〜P)の同一パラメータも決定した。
【図１６−２】図１６の続き。
【図１７】図17A〜Bは、特定の例示的実施形態に従う、ナタリズマブ療法を受けているMS患者における薬物効力の検出を示す図である。ナタリズマブ注入後種々の時点で(2、4、6、10週)血液サンプルを採取し、次いで、接着性基板としてVCAM-1を使用するLAFA例示的実施形態によって解析した。次いで、実施例1に記載されるようにCD4相互作用細胞数(図17A)及びその滞留時間(図17B)を決定した。コパキソン療法中の患者から得た血液サンプルを、陰性対照群として含めた。
【図１８−１】図18A〜Jは、特定の例示的実施形態に従って、α4β1 (VCAM-1のリガンド)接着機能の個人プロフィール(白血球接着フィンガープリント)を例示する図である。およそ3カ月の間の種々の時点で単一の健常な血液ドナーから6種の血液サンプルを採取した。この血液ドナーは、血液検査番号5を実施した日に親しらず疼痛に苦しんでいた(四角)。血液検査番号4を、血液検査番号5の7日前に実施した。血液を、実施例1及び4に記載されたように、基板としてVCAM-1を使用して5mMのMnCl2の存在下又は不在下でLAFA例示的実施形態によって解析した。次いで、相互作用するCD4細胞数(A)、細胞速度(B)、真直性(C)、滞留時間(D)及び滞留時間活性化可能性比(DTAPR)(E)を決定した。CD8白血球の同一パラメータ(F〜J)も評価した。
【図１８−２】図１８の続き。
【図１９−１】図19A〜Jは、特定の実施形態に従う、α4β7(MAdCAM-1のリガンド)接着機能の個人プロフィールを例示する。単一の健常血液ドナーからおよそ3カ月の期間の間の種々の時点で6種の血液サンプルを採取した。この血液ドナーは、血液検査番号5を実施した日に親しらず疼痛に苦しんでいた(四角)。血液検査番号4を、血液検査番号5の7日前に実施した。血液を、実施例10及び11に記載されたように、基板としてMAdCAM-1を使用して5mMのMnCl2の存在下又は不在下でLAFA例示的実施形態によって解析した。次いで、相互作用するCD4細胞数(A)、細胞速度(B)、真直性(C)、滞留時間(D)及び真直性活性化可能性比(STAPR)(E)を決定した。CD8白血球の同一パラメータ(F〜J)も評価した。
【図１９−２】図１９の続き。
【図２０−１】図20A〜Lは、特定の例示的実施形態に従う、PSGL-1(P-セレクチンのリガンド)接着機能の個人プロフィールを例示する図である。およそ6週間の間の種々の時点で単一の健常な血液ドナーから4種の血液サンプルを採取した。この血液ドナーは、血液検査番号5を実施した日に親しらず疼痛に苦しんでいた(四角)。血液検査番号4を、血液検査番号5の7日前に実施した。血液を、実施例16に記載されたように、基板としてP-セレクチンを使用してLAFA例示的実施形態によって解析した。次いで、相互作用するCD4細胞数(図20A)、細胞速度(図20B)、真直性(図20C)及び滞留時間を決定した。CD8白血球(図E〜H)及びCD15白血球(図20I〜L)の同一パラメータも評価した。
【図２０−２】図２０の続き。
【図２１】図21A〜Fは、特定の例示的実施形態に従う、多発性硬化症(MS)及び/又は炎症性腸疾患(IBD)を有する患者におけるα4β1インテグリン及びα4β7インテグリンの基礎炎症状態の評価を示す図である。血液サンプルを、健常な対照、MS及びIBD患者から採取し、次いで、特定の例示的実施形態に従う、基板としてVCAM-1及びMAdCAM-1を使用するLAFA例示的実施形態によって解析した。実施例3及び11に詳述されるように、VCAM-1基板上での相対真直性指数(RSTI)(図21A)、相対速度指数(RSI)(図21B)及び相対滞留時間指数(RDTI)(図21C)を算出した。同様に、MAdCAM-1上でのRSTI(図21D)、RSI(図21E)及びRDTI(図21F)を決定した。グラフ上の各ドットは、1人の個々の対象を示す。対応する健常な対照に関連して、*:p<0.05、**:p<0.01。
【図２２】図22A〜Fは、特定の例示的実施形態に従う、多発性硬化症(MS)及び炎症性腸疾患(IBD)を有する患者における、α4β1インテグリン及びα4β7インテグリンのMn2+誘導性活性化可能性の評価を例示する図である。血液サンプルを、健常な対照、MS及びIBD患者から採取し、次いで、基板としてVCAM-1及びMAdCAM-1を使用するLAFA例示的実施形態によって解析した。実施例4に詳述されるように、VCAM-1基板上での真直性活性化可能性比(STAPR)(図22A)、速度活性化可能性比(SAPR)(図22B)及び滞留時間活性化可能性比(DTAPR)(図22C)を算出した。同様に、MAdCAM-1基板上でのSTAPR(図22D)、SAPR(図22E)及びATAPR(図22F)も決定した。グラフ上の各ドットは、1人の個々の対象を示す。対応する健常な対照に関連して、*:p<0.05、**:p<0.01。
【図２３】図23は、特定の例示的実施形態に従う、MAdCAM-1基板上でのIBD患者から得たCD4白血球の動員のベドリズマブ用量依存性阻害を示す図である。血液サンプルを、IBD患者から採取し、次いで、様々な用量のベドリズマブを用いて処置し、その後、基板としてMAdCAM-1を使用するLAFA例示的実施形態のために使用した。次いで、実施例12に詳述されたように、個々のIBD患者においてベドリズマブIC50値を決定した。
【図２４】図24A〜H、特定の例示的実施形態に従って、多発性硬化症(MS)及び/又は炎症性腸疾患(IBD)を有する患者において、CXCR1及びCXCR4を発現する白血球の機能を評価するために。血液を、健常な対象(n=8)、MS患者(n=2)及びIBD患者(n=4)から採取し、次いで、実施例17に詳述されたように、基板としてVCAM-1+IL-8又はVCAM-1+SDF1αを使用するLAFA例示的実施形態のために使用した。次いで、実施例1に詳述されたように、VCAM-1+IL-8基板上での、相互作用するCD4、CD8及びCD15白血球数(図24A)、細胞速度(図24B)、真直性(図24C)及び滞留時間(図D)を決定した。同様に、パラメータ(図E〜H)も、VCAM-1+SDF1α基板上で評価した。*、p<0.05、**、p<0.01。
【図２５】図25A〜Dは、特定の例示的実施形態に従う、MS及び/又はIBD患者における白血球PSGL-1接着機能の評価を例示する図である。血液サンプルを、健常な対象(n=6)、MS患者(n=2)及びIBD患者(n=4)から採取し、次いで、実施例16に詳述されたように、基板としてP及びEセレクチンを使用するLAFA例示的実施形態によって解析した。実施例16に詳述されたように、相互作用する細胞数(図25A)、速度(図25B)、真直性(図25C)及び滞留時間(図25D)を決定した。*:p<0.05。
【図２６】図26は、特定の例示的実施形態に従う、ナタリズマブ誘導性PMLのリスクを低減するモデルを例示する図である。薬物注入後、ナタリズマブ飽和レベルは、最大効力を下回る、完全薬物効力が依然として維持され得る点(例えば、80%)に徐々に減少し、これは、薬物再投薬ウィンドウとして定義され得る。最大薬物効力を下回る薬物飽和の減少は、白血球動員及び/又は免疫応答の再構成につながることがあり、これによって、免疫系が、JCV感染に応答し、それを排除する能力を回復させることが可能となることがあり、これが、PMLのリスクの低減につながる。この薬物再投薬ウィンドウは、LAFA例示的実施形態によって1人以上の対象において正確に同定され得る。
【図２７】図27は、画像及びデータ解析のフローチャートを例示する図である。特定の例示的実施形態に従って、Fiji画像解析ソフトウェアに由来するTrackmateを使用して、白血球接着機能アッセイ(LAFA)において捉えた画像を処理し、解析した。Trackmateからのアウトプットを、Rプログラムによってさらに解析して、記述統計学を作製した。画像解析プロセスに関与する5種のプログラムの使用も示された。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示は、1以上の実施形態を参照してさらに詳細に記載され、そのうちいくつかの実施例が、添付の図面に例示されている。実施例及び実施形態は、説明として提供され、本開示の範囲の制限ととられるべきではない。さらに、一実施形態の一部として例示又は記載される特徴は、それら自体、一実施形態の一部として例示又は記載されるその他の実施形態及び特徴を提供するために使用されてもよく、さらなる実施形態を提供するために1以上のその他の実施形態とともに使用されてもよい。本開示は、これらの変法及び実施形態並びにその他の変法及び/又は改変に及ぶ。
【００３２】
記載されるように、例示的実施形態は、白血球接着機能アッセイ及び/又はデバイスのための新規使用に対する。
【００３３】
白血球接着機能アッセイは、1人以上の対象が、薬物及び/又は薬物の組合せにどのように反応する、又は反応し得るかを決定するために使用され得る。特定の例示的実施形態では、白血球接着機能アッセイが、1人以上の対象が、薬物及び/又は薬物の組合せにどのように反応する、又は反応し得るかを決定するためである場合に、本明細書において論じられる利点のうち1以上が存在し得る。これらの利点のうち1以上はまた、本出願において開示される白血球接着機能アッセイの例示的実施形態のその他の使用においても見出され得る。この利点は、in vivoにおける薬物の作用を予測するために、in vitro機能アッセイが使用され得るということである。この利点は、薬物標的の活性化レベルを定量的に評価することによって薬物非応答者を薬物応答者から区別できるということである。この別の利点は、対象が個別化方式で治療され得るということである。すなわち、薬物投与計画が、各対象のために最適化され得る、又は実質的に最適化され得る、アッセイの結果に少なくとも部分的に基づいて、個々の対象の必要性に対して目的に合わせられ得る。別の利点は、対象が、治療効果を達成するために必要であるものよりも多い薬物が投与される必要がないということである。さらに別の利点は、最小治療上有効量及び/又は範囲を投与することによって、いくつかの薬物によって引き起こされる不要な副作用が低減され得るということである。この利点は、病理学的及び/又は生命を脅かす副作用を有する薬物に関するものであり得る。対象の最小治療上有効量及び/又は範囲を決定することによって、おそらくは、このような薬物は、より少ない副作用しか伴わずにより安全に投与され得る。白血球接着機能アッセイの別の利点は、血清薬物濃度に関わらず、薬物有効性のより正確な評価を提供し得るということである。白血球接着機能アッセイの別の利点は、薬物有効性のより正確な評価を提供し得るということ及び血清薬物濃度に依存しない場合があるということである。例示的LAFA実施形態は、白血球に対する薬物の機能的効果を直接的に評価し、薬物有効性のより有効な評価を提供する。薬物血清レベルの従来の測定とは異なり、特定のLAFA実施形態は、より少ない対象しか、それだけには限らないが、薬物血清濃度及び/又は抗薬物抗体を含むその他の因子によって干渉されない(従来のアプローチと比較して)、薬物効力を示す機能的読み取り値を提供する。例えば、抗薬物抗体の産生は、特定の薬物の薬物活性を有意に低減し得るが、これは、薬物血液血清レベルを簡単に測定することによっては検出され得ない。他方、LAFA例示的実施形態は、抗薬物抗体に由来するこれらの作用を容易に検出でき、これは、他の従来アプローチと比較してLAFA例示的実施形態の正確性及び/又は感度の利点を示す。
【００３４】
例えば、特定の例示的実施形態では、白血球接着機能アッセイは、以下:(a)対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測すること、(b)対象において疾患の進行を制御又は予防するために、薬物を使用できるか否かを決定すること、(c)対象において疾患の進行を予防又は制御するための薬物を選択すること、及び(d)対象において疾患の進行を予防又は制御するための薬物を同定することのうち1以上のために使用され得る。
【００３５】
特定の例示的実施形態では、(a)対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測する、(b)薬物が、対象において疾患の進行を制御又は予防するために使用され得るか否かを決定する、(c)対象において疾患の進行を予防又は制御するための薬物を選択する、又は(d)対象において疾患の進行を予防又は制御するための薬物を同定する方法であって、薬物が、内皮分子との白血球接着を変更可能である方法が提供され、前記方法は、
対象から得られた少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、並びに
アッセイの結果に基づいて、(a)少なくとも1人の対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測するステップ、(b)対象において疾患の進行を制御及び/若しくは予防するために、薬物を使用できるか否かを決定するステップ、(c)対象において疾患の進行を予防若しくは制御するための薬物を選択するステップ又は(d)対象において疾患の進行を予防若しくは制御するための薬物を同定するステップ
を含む。
【００３６】
方法(単数又は複数)を、個別化された医薬のために使用してもよい。
【００３７】
方法(単数又は複数)を、薬物応答者を薬物非応答者から区別するために使用してもよい。
【００３８】
方法(単数又は複数)を、対象層別化(患者群化)のために、多数の対象を試験するために使用してもよい。
【００３９】
方法(単数又は複数)は、アッセイ結果と一致して、疾患の進行を制御するために対象で薬物を試行するステップを含み得る。
【００４０】
方法(単数又は複数)は、アッセイ結果と一致して、疾患の進行を制御するために薬物を用いて対象を治療するステップを含み得る。
【００４１】
方法(単数又は複数)は、アッセイ結果と一致して、薬物によって引き起こされる不要な副作用を最小にしながら、疾患の進行を制御するために対象の薬物の有効最小治療用量を決定するステップを含み得る。薬物用量は、進行性多巣性白質脳症(PML)などの病状を最小にする、又は予防するために、in vivoで内皮細胞との最小の白血球細胞相互作用の回復を可能にし得る。すなわち、薬物は、免疫抑制薬であってもよく、最小治療薬物用量は、例えば、PMLのリスクを最小にするために、in vivoで十分な薬物効力を維持しながら、免疫応答の最小の回復を可能にし得る。
【００４２】
方法(単数又は複数)は、アッセイ結果と一致して、例えば、薬物投与量を変更すること又は連続薬物投与間の時間の長さを変化させることによって、疾患の進行を制御するために対象の薬物の投与計画を最適化するステップを含み得る。
【００４３】
方法(単数又は複数)を、薬物(すなわち、化合物、化学物質、分子、試薬、生物学的物質、抗体又は他のもの)が、薬物がこれまでに示されていない疾患の進行を制御するために有用であり得るか否かを予測する又は決定するために使用してもよい。
【００４４】
方法(単数又は複数)のアッセイ(単数又は複数)は、接着異常又は異常性又は薬物標的を同定するステップ及び次いで薬物標的に基づいて疾患の進行を制御するための適当な薬物を選択するステップを含み得る。
【００４５】
方法(単数又は複数)のアッセイ(単数又は複数)は、接着異常又は異常性又は薬物標的を同定するステップ並びに次いで薬物標的及びそれらの標的のための薬物の参照データベースに基づいて、疾患の進行を制御するための適当な薬物を選択するステップを含み得る。このようにして、疾患自体が、実際に診断される、及び/又は同定される、及び/又は知られている必要はない。
【００４６】
方法(単数又は複数)のアッセイ(単数又は複数)は、薬物標的及び薬物のデータベースを構築するステップを含み得る。データベースは、既知薬物標的及び薬物に基づいて構築されてもよい。データベースは、in vivo薬物治療に基づいて構築されてもよい。
【００４７】
方法のアッセイは、2以上の接着異常又は異常性又は薬物標的を1度に(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又は10種の薬物標的又はそれ以上)アッセイするステップを含み得る。
【００４８】
方法(単数又は複数)のアッセイ(単数又は複数)は、以下:1以上の接着異常、1以上の異常性及び1以上の薬物標的のうち1以上をアッセイするステップを含み得る。例えば、1以上の接着異常、1以上の異常性及び/又は1以上の薬物標的のうち少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10。
【００４９】
方法(単数又は複数)は、複数の接着異常又は異常性又は薬物標的について1度に試験するハイスループットアッセイであり得る。
【００５０】
方法(単数又は複数)を、対象の白血球接着フィンガープリント(白血球接着機能の個人プロフィール)を作製するために使用してもよい。
【００５１】
方法(単数又は複数)を、対象において種々の白血球異常又は異常性を同定するために使用してもよい。
【００５２】
方法(単数又は複数)を、疾患マーカーを同定するために使用してもよい。
【００５３】
方法(単数又は複数)を、個体/対象を群化するために(疾患に関わらず)使用してもよい。
【００５４】
方法(単数又は複数)を、疾患診断に関わらず、対象の治療を開発するために使用してもよい。
【００５５】
方法(単数又は複数)を、in vivo又はin vitroでハイスループット薬物スクリーニングのために使用してもよい。
【００５６】
方法(単数又は複数)を、実験動物における工業規模の薬物スクリーニングのために使用してもよい。
【００５７】
例えば、例示的実施形態では、疾患の進行を制御するための薬物を投与された対象が、その薬物にどのように応答しているかを決定するために白血球接着機能アッセイを使用してもよい。
【００５８】
特定の例示的実施形態では、疾患の進行を制御するための薬物を投与された対象が、その薬物にどのように応答しているかを決定する方法であって、薬物が内皮分子との白血球接着を変更可能である方法が提供され、前記方法は、
対象から得られた薬物を含有する少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、及び
アッセイの結果に基づいて、対象が薬物にどのように応答しているかを決定するステップ
を含む。
【００５９】
方法(単数又は複数)を、個別化された医薬のために使用してもよい。
【００６０】
方法(単数又は複数)を、薬物応答者を薬物非応答者から区別するために使用してもよい。
【００６１】
方法(単数又は複数)を、対象層別化(患者群化)のために、多数の対象を試験するために使用してもよい。
【００６２】
方法(単数又は複数)を、in vivo又はin vitroでハイスループット薬物スクリーニングのために使用してもよい。
【００６３】
方法(単数又は複数)を、実験動物における工業規模の薬物スクリーニングのために使用してもよい。
【００６４】
方法(単数又は複数)は、アッセイ結果と一致して、薬物によって引き起こされる不要な副作用を最小にしながら、疾患の進行を制御するために対象の薬物の有効最小治療用量を決定するステップを含み得る。薬物用量は、進行性多巣性白質脳症(PML)などの病状を最小にする、又は予防するために、in vivoで内皮細胞との最小の白血球細胞相互作用の回復を可能にし得る。
【００６５】
方法(単数又は複数)は、アッセイ結果と一致して、例えば、薬物投与量を変更すること又は連続薬物投与間の時間の長さを変化させることによって、疾患の進行を制御するために対象の薬物の投与計画を最適化するステップを含み得る。
【００６６】
例えば、特定の例示的実施形態では、疾患の進行を制御するための薬物を摂取している対象のために投与計画を最適化するために、白血球接着機能アッセイを使用してもよい。
【００６７】
特定の例示的実施形態では、疾患の進行を制御するための薬物を摂取している対象のために投与計画を最適化する方法であって、薬物が、内皮分子との白血球接着を変更可能である方法が提供され、前記方法は、
対象から得られた薬物を含有する少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、及び
アッセイの結果に基づいて、疾患の進行を制御するための対象の薬物投与計画を最適化するステップ
を含む。
【００６８】
方法(単数又は複数)は、アッセイ結果と一致して、薬物によって引き起こされる不要な副作用を最小にしながら、疾患の進行を制御するために対象の薬物の有効最小治療用量を決定するステップを含み得る。薬物用量は、進行性多巣性白質脳症(PML)などの病状を最小にする、又は予防するために、in vivoで内皮細胞との最小の白血球細胞相互作用の回復を可能にし得る。すなわち、薬物は、免疫抑制薬であってもよく、最小治療薬物用量は、例えば、PMLのリスクを最小にするために、in vivoで十分な薬物効力を維持しながら、免疫応答の最小の回復を可能にし得る。
【００６９】
方法(単数又は複数)は、アッセイ結果と一致して、例えば、薬物投与量を変更すること又は連続薬物投与間の時間の長さを変化させることによって、疾患の進行を制御するために対象の薬物の投与計画を最適化するステップを含み得る。アッセイが実施されるたびに、投与計画又は最小有効薬物用量が、それに応じて最適化され得る。
【００７０】
方法(単数又は複数)は、血清薬物濃度に関わらず、薬物有効性の正確な評価を提供し得る。
【００７１】
例えば、特定の例示的実施形態では、白血球接着機能アッセイを使用して、疾患の進行を制御するための対象の最小有効薬物用量を決定してもよい。
【００７２】
特定の例示的実施形態では、疾患の進行を制御するための対象の最小有効薬物用量を決定する方法であって、薬物が、内皮分子との白血球接着を変更可能である方法が提供され、前記方法は、
(1)対象に既知量の薬物を所定の期間投与するステップ、
(2)ステップ(1)後、対象から得られた薬物を含有する血液サンプルを、in vitroで白血球接着機能アッセイに付すステップ、並びに
(3)アッセイの結果に基づいて、疾患の進行を制御するために対象の最小有効薬物用量を決定できるまで、ステップ(1)及び(2)を反復するステップ
を含む。
【００７３】
方法(単数又は複数)は、薬物によって引き起こされる不要な副作用を最小にすることを含み得る。
【００７４】
方法(単数又は複数)は、アッセイ結果と一致して、疾患の進行を制御するために(これまでに記載されたように)対象の薬物の投与計画を最適化するステップを含み得る。
【００７５】
薬物感受性は、最小有効薬物用量を得るためにIC50又はIC99を使用して対象において試験され得る。
【００７６】
最小有効薬物用量は、進行性多巣性白質脳症(PML)などの病状を最小にする、又は予防するために、in vivoで内皮細胞との最小の白血球細胞相互作用の回復を可能にし得る。すなわち、薬物は、免疫抑制薬であってもよく、最小治療薬物用量は、例えば、PMLのリスクを最小にするために、in vivoで十分な薬物効力を維持しながら、免疫応答の最小の回復を可能にし得る。
【００７７】
特定の例示的実施形態では、本明細書において開示されるその他の例示的実施形態において記載されるような方法を実施するためのフローアッセイ又はフローデバイスが提供される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、方法は、白血球接着機能アッセイを実施して、白血球接着異常性を同定すること、白血球接着異常性の性質に基づいて適した薬物を選択すること、及び白血球接着異常性に対する薬物の効果を決定することを伴い得る。
【００７９】
これは、以下のステップ:1.対象から得られた血液サンプルを白血球接着機能アッセイに付して、白血球異常性を同定するステップ、2.このような異常性について使用され得る可能性がある、適した薬物候補(又は2種以上の薬物候補)を選択するステップ、3.血液サンプルをin vitroで種々の用量の適した薬物候補を用いて処置するステップ、4.さらなる白血球接着機能アッセイを実施して、白血球異常性に対する薬物候補の効果を試験するステップ、5.対象にとって最良の又は最も有効な薬物を選択するステップ、6.薬物を対象に投与するステップ、7.薬物投与後種々の時点で対象から血液を採取するステップ、及び8.白血球接着機能アッセイを実施して、対象において薬物効果を確認するステップを実施することを伴い得る。
【００８０】
ヒト対象において薬物の効果を決定することは、以下のステップ:1.対象から血液を採取するステップ、2.第1の白血球接着機能アッセイを実施して、ベースラインを得るステップ、3.対象に薬物を投与するステップ、及び4.薬物投与後種々の時点で白血球接着機能アッセイを実施して、薬物効果を決定するステップを実施することを伴い得る。
【００８１】
動物モデル/実験動物対象(マウス、霊長類など)において薬物の効果を決定することは、以下のステップ:1.対象から血液を採取するステップ、2.第1の白血球接着機能アッセイを実施して、ベースラインを得るステップ、3.種々の用量で対象に薬物を投与するステップ(各用量は、独立アッセイとなる)及び4.薬物投与後種々の時点で白血球接着機能アッセイを実施して、薬物効果を決定するステップを実施することを伴い得る。
【００８２】
あるいは、in vitroモデルを使用してもよい。これは、以下のステップ:1.対象から血液を採取するステップ、2.種々の用量の薬物を用いて血液を処置するステップ及び3.薬物治療の開始後種々の時点で白血球接着機能アッセイを実施して、薬物効果及びこのような効果に到達するのに必要な時間を決定するステップを実施することを伴い得る。これは、ハイスループット法で行ってもよい。
【００８３】
薬物
用語「薬物」は、本明細書において、薬物機能が既知であるか未知であるかに関わらず、対象に対して生理学的効果を有する、化合物、化学物質、分子、試薬、生物学的物質、抗体、他の部分及びそれらの組合せを含むことは理解されるべきである。薬物機能が既知であるか未知であるかに関わらず、内皮分子との白血球接着を変更可能であるという条件で、適した種類の薬物が、本明細書において記載される方法において利用され得る。特定の例示的実施形態では、薬物は、白血球接着の阻害剤又はプロモーター(アゴニスト)であり得る。特定の例示的実施形態では、薬物は、白血球接着の阻害剤である。例えば、薬物は、白血球接着機能と関連しない目的のために開発される場合もある。しかし、ひとたび対象(単数又は複数)によって投与されると、この薬物は、この対象に対して複数の効果を有し得る。したがって、薬物投与後にこの対象から得た血液サンプルを解析することによって、白血球接着機能に対するこの薬物の潜在的な効果を決定することができる。さらに、白血球接着機能に対する薬物効果はまた、LAFA例示的実施形態によって解析される前に、血液サンプルを用いるこの薬物のin vitro処置によって推定され得る。したがって、LAFA例示的実施形態は、白血球接着機能に対する薬物及び/又は化合物の未知作用及び/又はオフターゲット作用及び/又は副作用を同定するためのツールを提供する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、薬物は、内皮分子との白血球の結合を直接的に干渉し得る。いくつかの実施形態では、薬物は、内皮分子との白血球の結合を間接的に干渉し得る。いくつかの実施形態では、薬物は、白血球接着性分子又は白血球のその他の結合分子を標的とし、結合し、会合し、又はそうでなければ干渉し得る。いくつかの実施形態では、薬物は、内皮分子を標的とし、結合し、会合し、又はそうでなければ干渉し得る。いくつかの実施形態では、薬物は、白血球接着分子又はその他の結合分子及び内皮分子の両方を標的とし、結合し、会合し、又はそうでなければ干渉し得る。さらにその他の実施形態では、薬物は、白血球接着経路の別の部分又は分子に対してその効果を発揮することによって、白血球及び内皮分子の間の接着/相互作用に間接的に影響を及ぼし得る。さらにその他の実施形態では、薬物は、白血球接着に影響を及ぼす遺伝子の発現を調節し得る(例えば、薬物は、細胞内シグナル伝達経路に作用して、白血球接着に影響を及ぼす遺伝子の発現を調節し得る)、白血球接着に影響を及ぼす遺伝子産物(RNA又はタンパク質)の翻訳後修飾に影響を及ぼし得る、白血球接着に影響を及ぼす遺伝子産物の輸送又は転位を調節し得る、及び/又は白血球接着に影響を及ぼす遺伝子産物の細胞内貯蔵からの放出を調節し得る。
【００８５】
適した種類の白血球として、それだけには限らないが、以下:好中球、好酸球、好塩基球、CD4 Tリンパ球、CD8 Tリンパ球、T調節性細胞、Bリンパ球、樹状細胞、単球及びナチュラルキラー細胞のうち1種以上が挙げられる。
【００８６】
適した種類の白血球接着分子又は白血球のその他の結合分子として、以下:セレクチン、インテグリン、ケモカイン、ケモカイン受容体及びその他の種類の分子のうち1種以上が挙げられる。
【００８７】
適した種類の内皮分子として、以下:セレクチン、細胞接着分子(CAM)、ケモカイン、ケモカイン受容体及びその他の種類の分子のうち1種以上が挙げられる。
【００８８】
適した種類の白血球接着分子として、それだけには限らないが、以下:PSGL-1、L-セレクチン、α1インテグリン、α2インテグリン、α3インテグリン、α4インテグリン、α5インテグリン、α6インテグリン、α7インテグリン、α8インテグリン、α9インテグリン、α10インテグリン、α11インテグリン、αDインテグリン、αEインテグリン、αVインテグリン、αXインテグリン、CD11a(αLインテグリン)、CD11b(αMインテグリン)、β1インテグリン、β2インテグリン、β4インテグリン、β5インテグリン、β6インテグリン、β7インテグリン、β8インテグリン、CD44、ESL-1、CD43、CD66、CD15s及びALCAMのうち1種以上が挙げられる。
【００８９】
適した種類の内皮分子として、以下:E-セレクチン、P-セレクチン、VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2、MadCAM-1、PECAM、GlyCAM-1、JAM-A、JAM-B、JAM-C、JAM-4、JAM-L、CD34、CD99、VAP-1、L-VAP-2、ESAM、E-LAM、カドヘリン及びヒアルロン酸のうち1種以上が挙げられる。
【００９０】
適した種類のケモカイン及びケモカイン受容体として、以下:ケモカインCCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL26、CX3CL1、XCL1及びXCL2、ケモカイン受容体CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、CX3CR1及びXCR1のうち1種以上が挙げられる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、薬物は、サイトカイン又はケモカインの活性を調節し得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、薬物は、接着分子又はケモカインの翻訳後修飾を変更し得る、接着分子のタンパク質膜転位を変更し得る、細胞内貯蔵からの接着分子の放出を調節し得る、細胞内シグナル伝達経路に対して作用して、接着分子若しくはケモカイン遺伝子の発現を調節し得る、又は接着分子の動態化を調節し得る。
【００９３】
いくつかの実施形態では、薬物は、白血球α4インテグリン活性化を減弱する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、薬物は、白血球α4インテグリンとその内皮分子間の相互作用を干渉する。白血球α4インテグリンの例として、α4β7インテグリン、CD11a (αLインテグリン)及びCD11b(αMインテグリン)がある。
【００９５】
いくつかの実施形態では、薬物は、白血球によって発現されたPSGL-1(P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1)と、P-セレクチン及び/又はE-セレクチンであるその内皮分子との間の相互作用を干渉する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、薬物は、白血球β2インテグリンと、その内皮分子との間の相互作用を干渉する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、薬物は、細胞間接着分子-1(ICAM-1)及び/又は血管細胞接着分子-1(VCAM-1)と、その白血球接着分子との間の相互作用を干渉する。
【００９８】
薬物の例として、特定の白血球接着分子及び/又は結合分子及び/又は内皮分子を標的とする抗体が挙げられる。例えば、特定の白血球接着分子及び/又は結合分子及び/又は内皮分子を標的とする抗ヒト抗体。
【００９９】
特定の実施形態では、薬物は、α4インテグリンと、その内皮分子の間の結合を干渉する抗体である。薬物は、抗ヒトα4インテグリン抗体であり得る。特定の実施形態では、薬物は、ナタリズマブである。
【０１００】
特定の実施形態では、薬物は、α4β7インテグリンとMAdCAM-1との間の結合を干渉する抗体である。薬物は、ベドリズマブであり得る。
【０１０１】
実施形態では、薬物は、CD11a (αL)とICAM-1との間の結合を干渉する抗体である。薬物は、エファリズマブ又はオデュリモマブ(Odulimomab)であり得る。
【０１０２】
特定の実施形態では、薬物は、CD11b(αM)とICAM-1との間の結合を干渉する抗体である。薬物は、UK279,276であり得る。
【０１０３】
特定の実施形態では、薬物は、β2インテグリンとその内皮分子間の結合を干渉する抗体である。薬物は、エルリズマブ(Erlizumab)又はロベルリズマブ(Roverlizumab)であり得る。
【０１０４】
特定の実施形態では、薬物は、β7インテグリンとその内皮分子の間の結合を干渉する抗体である。薬物は、エトロリズマブ(Etrolizumab)であり得る。
【０１０５】
適した薬物のさらにその他の例として、グルココルチコイド(副腎皮質ステロイド)などのステロイドが挙げられる。適したステロイドとして、それだけには限らないが、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン及び/又はそれらの組合せが挙げられる。
【０１０６】
適した薬物のさらにその他の例として、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)が挙げられる。適したNSAIDとして、それだけには限らないが、セレコキシブ、エトリコキシブ、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、スリンダック及び/又はそれらの組合せが挙げられる。
【０１０７】
適した薬物のさらにその他の例として、免疫選択性抗炎症性誘導体(ImSAID)が挙げられる。適したImSAIDとして、それだけには限らないが、顎下腺ペプチド-T(SGP-T)及びフェニルアラニン-グルタミン-グリシン(FEG)及び/又はそれらの組合せが挙げられる。
【０１０８】
適した薬物のさらにその他の例として、植物(ハーブを含む)由来の生理活性化合物が挙げられる。適した化合物として、それだけには限らないが、プルンバギン(インドマツリ(Plumbago zylanica)由来)及びプルメリシン(Plumericin)(ヒマタントゥス・スクーバ(Himatanthus sucuuba)由来)及び/又はそれらの組合せが挙げられる。
【０１０９】
適した薬物のさらにその他の例として、循環中に入って、白血球生物学及び機能に影響を及ぼし得るもの(関連代謝産物を含む)が挙げられる。
【０１１０】
疾患
本明細書において記載される方法では、薬物は、特定の適した疾患(単数又は複数)の進行を制御するために使用され得る。いくつかの実施形態では、薬物は、異常な白血球動員を伴う疾患を制御するために使用される。いくつかの実施形態では、薬物は、炎症を伴う疾患を制御するために使用される。いくつかの実施形態では、薬物は、自己免疫疾患の進行を制御するために使用され得る。いくつかの実施形態では、薬物は、免疫不全疾患の進行を制御するために使用され得る。いくつかの実施形態では、薬物は、感染性疾患の進行を制御するために使用され得る。感染性疾患を有する患者では、免疫系は、外来病原体の侵入によって高度に活性化され、炎症の増加及び白血球接着機能の増大につながる。病原体が排除された後、活性化された免疫系が、その高レベルの活性を依然として維持する場合があり、組織に対して不必要な損傷をもたらす。この問題に対処するために、活性化された白血球を減弱して、組織損傷を低減するために抗接着療法が使用されてもよい。特定の例示的実施形態では、薬物は、以下:特定の疾患の進行を少なくとも部分的に制御するため、異常な白血球動員を伴う疾患を少なくとも部分的に制御するため、炎症を伴う疾患を少なくとも部分的に制御するため、自己免疫疾患の進行を少なくとも部分的に制御するため、免疫不全疾患の進行を少なくとも部分的に制御するため、感染性疾患の進行を少なくとも部分的に制御するためのうち1以上のために使用され得る。
【０１１１】
対象の疾患として、それだけには限らないが、以下が挙げられる:
【０１１２】
炎症性関節炎-例えば、関節リウマチ、血清陰性脊椎関節炎(spondeloarthritites)(ベーチェット病、ライター症候群など)、若年性関節リウマチ、脈管炎、乾癬性関節炎、多発性皮膚筋炎(polydermatomyositis)又はそれらの組合せ。
【０１１３】
炎症性皮膚疾患-例えば、乾癬、ヘルペス状皮膚炎、湿疹、壊死性及び皮膚性脈管炎、水疱症又はそれらの組合せ。
【０１１４】
全身性エリテマトーデス(SLE)、喘息、再灌流傷害、敗血性ショック(敗血症)、成人性呼吸窮迫症候群(ARDS)、組織移植に関連する組織損傷、心肺バイパス、熱傷(火傷)、ショックを含めて、肺水腫又はそれらの組合せ。
【０１１５】
糸球体腎炎、若年発症糖尿病、多発性硬化症、アレルギー状態、自己免疫性甲状腺炎、同種移植片拒絶(例えば、移植された腎臓、心臓又は肝臓の拒絶)、クローン病、移植片対宿主病などのその他の自己免疫障害又はそれらの組合せ。
【０１１６】
ポンプ後症候群又は灌流後症候群と呼ばれる、臓器機能不全につながり得る心肺バイパス及び血液透析における人工心肺システムの使用と関連する全身性炎症、糖尿病又はそれらの組合せ。
【０１１７】
溶血性貧血、血液透析、輸血、特定の血液学的悪性病変、肺炎、虚血後心筋炎症及び壊死と関連するものを含むその他の疾患及び望ましくない炎症応答の臨床相関物、気圧性外傷(減圧症)、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、サイトカイン誘導性毒性、壊死性腸炎、顆粒球輸血関連症候群、レイノー症候群、敗血症又は外傷に続く多臓器損傷症候群、急性化膿性髄膜炎、その他の中枢神経系炎症性障害又はそれらの組合せ。
【０１１８】
白血球細胞に影響を及ぼすその他の疾患として、それだけには限らないが、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、好酸球増加症、ホジキンリンパ腫又はそれらの組合せを挙げることができる。
【０１１９】
自己免疫疾患として、それだけには限らないが、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗GBM/抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群(APS)、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患(AIED)、軸索&神経細胞神経障害(AMAN)、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病(CD)、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、慢性再発性多巣性骨髄炎(CRMO)、チャーグ・ストラウス、瘢痕性類天疱瘡/良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素疾患、先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、CREST症候群、クローン病、ヘルペス状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病(視神経脊髄炎)、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎(EoE)、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンス症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、巨大細胞動脈炎(側頭動脈炎)、巨大細胞心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎を伴う肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病(HSP)、妊娠ヘルペス又は妊娠性類天疱瘡(PG)、低ガンマグロブリン血症(Hypogammalglobulinemia)、IgA腎症、IgG4関連硬化性疾患、封入体筋炎(IBM)、間質性膀胱炎(IC)、若年性関節炎、若年性糖尿病(1型糖尿病)、若年性筋炎(JM)、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性脈管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状IgA病(LAD)、ループス、ライム病慢性、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎(MPA)、混合性結合組織病(MCTD)、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症(MS)、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ(PR)、PANDAS(小児自己免疫性溶連菌関連精神神経疾患)、腫瘍随伴小脳変性(PCD)、発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)、パリー・ロンベルグ(Parry Romberg)症候群、毛様体扁平部炎(末梢ブドウ膜炎)、パーソネージ・ターナー(Parsonnage-Turner)症候群、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血(PA)、POEMS症候群(多発ニューロパチー、臓器肥大、内分泌疾患、モノクローナル高ガンマグロブリン血症、皮膚変化)、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆(PRCA)、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群(RLS)、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ(RA)、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子&精巣自己免疫、全身硬直症候群(SPS)、亜急性細菌性心内膜炎(SBE)、スザック症候群、交感性眼炎(SO)、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨大細胞動脈炎、血小板減少性紫斑病(TTP)、トロサ・ハント症候群(THS)、横断性脊髄炎、1型糖尿病、潰瘍性大腸炎(UC)、未分化結合組織病(UCTD)、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、ウェジナー肉芽腫症(現在、多発性血管炎(GPA)を伴う肉芽腫症と呼ばれる)、又はそれらの組合せを挙げることができる。
【０１２０】
免疫抑制による(例えば、AIDS、メイサー(maycer)化学療法、放射線療法、副腎皮質ステロイド療法又は自己免疫疾患のためのその他の療法による)疾患又は障害、先天性免疫不全又はそれらの組合せ。
【０１２１】
感染性疾患として、それだけには限らないが、ライノウイルス感染症などのICAM-l媒介性感染症、アメーバ性髄膜脳炎、急性リウマチ熱、炭疽病、非定型マイコバクテリア病、鳥インフルエンザ(Bird Flu)、バベシア症、細菌性腟症、亀頭炎、バーマフォレストウイルス感染症、ブラストシスチス感染症、ボツリヌス中毒、ブルセラ感染症、カンピロバクター感染症、水痘及び帯状疱疹、チクングニアウイルス、口唇ヘルペス(単純ヘルペス1型)、感冒、結膜炎、クリプトスポリジウム感染症、サイトメガロウイルス(CMV)感染症、デング熱、ジアルジア感染症、腺熱、淋病、b型インフルエンザ(Hib)、肝炎、手足口病、ヘンドラウイルス感染症、包虫症、ヒトパピローマウイルス(HPV)、性器疣贅&関連癌、日本脳炎、クンジン/ウエストナイルウイルス感染症、クンジン/ウエストナイルウイルス感染症、らい病、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)感染症、レプトスピラ症、リステリア感染症、ライム病、麻疹、髄膜炎菌感染症、伝染性軟属腫、ムンプス、マイコプラズマ・ジェニタリウム(Mycoplasma genitalium)感染症、肺炎マイコプラズマ感染症、中東呼吸器症候群(MERS)、非特異的尿道炎(NSU)、ノロウイルス感染症、パルボウイルスB19感染症、ペスト、肺炎球菌感染症、ポリオウイルス感染症、オウム病、Q熱、狂犬病ウイルス及びオーストラリアコウモリリッサウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)感染症、リケッチア感染症、突発性発疹、ロスリバーウイルス感染症、ロタウイルス感染症、風疹、サルモネラ菌感染症、とびひ(School sores)、重症急性呼吸器症候群、志賀毒素産生大腸菌(STEC)及び溶血性尿毒症症候群(HUS)、赤痢菌感染症、天然痘、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)を含む黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、連鎖球菌性咽喉痛、梅毒、テタヌス、口腔カンジダ症、毒性ショック症候群、トキソプラズマ感染症、トリコモナス感染症、結核、野兎病(Tularaemia)、腸チフス及びパラチフス、尿路感染症、腸炎ビブリオ感染症、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性出血熱、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性呼吸器感染症、疣贅、百日咳、寄生虫、黄熱、エルシニア感染症、エルシニア感染症、ジカウイルス感染症又はそれらの組合せが挙げられる。
【０１２２】
赤血球障害によって引き起こされる疾患として、それだけには限らないが、貧血、慢性疾患の貧血、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、地中海貧血症、マラリア、鎌形赤血球貧血、真性赤血球増加症、急性胸部症候群、バイマ(Bahima)病、赤血球異形成、ヘモクロマトーシス3型、ヘモグロビンレポア症候群、ヘモグロビン変異体、ヘモグロビン血症、ヘモジデリン尿症、遺伝性熱変形赤血球症、HFE、メトヘモグロビン血症遺伝性ヘモクロマトーシス、マクラウド症候群、小赤血球症、筋腫性赤血球増多症候群、変形赤血球症、多染性、赤血球増加症、オルフィリン症、網状赤血球減少症、Rh欠乏症症候群、病的細胞症候群(Sick cell syndrome)、球状赤血球症、スルフヘモグロビン血症、小児の一過性赤芽球減少症又はそれらの組合せを挙げることができる。
【０１２３】
血小板障害によって引き起こされる疾患として、それだけには限らないが、血小板減少症、血小板減少症、特定の遺伝的障害、心房細動、血友病、フォンウィルブランド病、鼻血、月経過多、点状出血、毛細血管拡張症、出血斑、輸血後紫斑病、周期性(Cyclic)(周期性(cyclical))血小板減少症、播種性血管内凝固障害、血栓性血小板減少性紫斑病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、偽性血小板減少症又はそれらの組合せを挙げることができる。
【０１２４】
特定の実施形態では、薬物は、炎症性疾患の進行を制御するために使用される。特定の実施形態では、薬物は、以下:多発性硬化症、クローン病、喘息、乾癬及び関節リウマチのうち1以上の進行を制御するために使用される。特定の実施形態では、薬物は、以下:臓器移植、卒中、心筋梗塞及び外傷性ショックのうち1以上によって引き起こされる疾患の進行を制御するために使用される。
【０１２５】
血液サンプル
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、少量の全血、例えば、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、300、400、500、750及び1,000μlしか必要としない。
【０１２６】
方法は、対象から得られた2種以上の血液サンプルを、白血球接着機能アッセイ又は2以上の白血球接着機能アッセイに付すことを含み得る。
【０１２７】
方法は、対象から血液サンプルを単離するステップを含み得る。これは、さまざまな適した方法で達成できる。例えば、血液は、指を刺して液滴を採取することによって、又は静脈穿刺によって得てもよい。特定の実施形態では、一滴の血液をこの方法に使用できる。特定の実施形態では、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90又は100など、約100μL未満の血液が、白血球接着機能アッセイに必要であり得る。特定の実施形態では、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90又は100未満など、約100μL未満の血液が、白血球接着機能アッセイに必要であり得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、血液サンプルは、処理されているか否かに関わらず、全血であってもよい。いくつかのその他の実施形態では、血液サンプルは、全血の1種以上の成分が、互いから分離されている処理されたサンプルである。すなわち、いくつかの実施形態では、血液サンプルは、全血であってもよく、その他の実施形態では、血液サンプルは、(処理された/処置された)全血の1以上の白血球細胞成分を含み得る。
【０１２９】
特定の実施形態では、in vivoの血液を模倣するために、血液成分は、全血サンプルから分離されない。特定の実施形態では、単離された血液細胞、培養血液細胞及び/又は血液細胞株を使用してもよい。
【０１３０】
血液サンプルを採取及び貯蔵するために使用してもよい抗凝固薬として、それだけには限らないが、ヘパリン、EDTA、ACD、クエン酸、ヒルジン、ポリアネトール硫酸ナトリウム及びシュウ酸カリウム/フッ化ナトリウムを挙げることができる。
【０１３１】
白血球接着機能アッセイ及びデバイス
白血球接着機能アッセイは、種々の適した種類のアッセイであり得る。方法は、1以上の結果を得るために、2以上の白血球接着機能アッセイを実施することを含み得る。白血球接着機能アッセイは、集合的結果を提供するために1以上の特定の試験を含み得る。
【０１３２】
特定の例示的実施形態では、白血球接着機能アッセイ結果は、半定量的及び/又は定量的であり得る。
【０１３３】
白血球接着機能アッセイは、定量的方法で、以下:白血球細胞動員を特性決定すること、白血球細胞トラッキングを特性決定すること、白血球細胞遊走挙動を特性決定することのうち1以上を達成し得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、白血球遊走を定量的に決定することを伴い得る。これは、白血球細胞テザリング、ローリング、スローローリング、強固な接着、クローリング及び/又は経内皮遊走を検出、測定又は観察することを含み得る。いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、白血球細胞平均速度、転移、加速、減速、方向性、滞留時間及び/又は真直性を検出、測定又は観察することを伴い得る。
【０１３５】
相互作用する白血球を、速度分布によって特性決定できる。例えば、相互作用する白血球を、細胞平均速度(Smean)に従って5種の相互作用種類:静止細胞(Smean<5μm/分)、クローリング細胞(Smean=5〜20μm/分)、スローローリング細胞(Smean=20〜300μm/分)及びローリング細胞(Smean=300〜6000μm/分)にわけることができる。さらに、ヒストグラムを使用して、細胞速度の分布を示してもよい。
【０１３６】
特定の実施形態では、白血球接着機能アッセイは、現実的な生理学的条件下で、白血球遊走を検出、測定及び/又は観察することを伴う。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、アッセイは、種々の白血球サブセットの同時検出を可能にする。
【０１３８】
特定の実施形態では、白血球接着機能アッセイは、フローアッセイを含む。
【０１３９】
白血球接着機能アッセイの一部として、血液サンプルを、1種以上の細胞染色、1種以上の化学物質(例えば、α4インテグリン活性化を誘導するマンガンなど)、1種以上の薬物(検出可能な部分を有する又は有さない)、1種以上の抗体及び/又は1以上の検出可能な部分又はその他の試薬若しくは薬剤を用いて、予め混合し、予め処置し、プレインキュベートしてもよい。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、方法は、in vitroで1種以上の薬物、試薬又は薬剤を用いて対象(ヒト又は動物)血液を処置すること、次いで、白血球接着機能アッセイを実施することを含み得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、方法は、in vivoで対象に1種以上の薬物、試薬又は薬剤を投与すること、次いで、白血球接着機能アッセイを実施することを含み得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、現実的な生理学的条件下で白血球遊走を評価し得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、フルオロフォア又はその他の検出可能部分にコンジュゲートされた抗体を用いて標識された白血球を利用し得る。いくつかの実施形態では、アッセイは、種々のフルオロフォアにコンジュゲートされたサブセット特異的抗体を用いて、白血球の種々のサブセットを検出することを伴い得る。例えば、血液サンプルに抗体又は抗体カクテル及び/又は染色を添加してもよい。例えば、血液サンプルに、特定の白血球膜マーカーに対する蛍光標識された抗体を添加し、その後、フローアッセイを実施してもよい。
【０１４４】
白血球接着機能アッセイ又はフローアッセイは、現実的な生理学的条件下で白血球遊走などを検出、測定又は観察するためを含む、白血球遊走などを検出、測定又は観察するための適した種類の機器を利用し得る。適したマイクロ流体アッセイ及び/又はデバイスの例は、以下の文書:全内容が、相互参照によって本明細書において組み込まれる、US8,940,494、US8,380,443、US7,326,563、W092/21746、Vaidyanathan R1、Shiddiky MJ、Rauf S、Dray E、Tay Z、Trau M.;Tunable「nano-shearing」:a physical mechanism to displace nonspecific cell adhesion during rare cell detection.;Anal Chem. 2014年2月18日;第86巻(4号):2042〜9頁. doi:10.1021/ac4032516. Epub 2014年2月4日に記載されている。
【０１４５】
フローアッセイを実施するために、マイクロ流体デバイスを使用してもよい。いくつかの実施形態では、フローアッセイは、例えば、種々の白血球サブセット及び/又は接着分子を検出するために、1、2、3、4、5、6つ又はそれ以上のマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスを使用することを伴う。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、in vivoでの血流を模倣するために、血液サンプルをマイクロ流体デバイスにおいてアッセイしてもよい。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、フローアッセイは、例えば、好ましくは、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、100、150、200、300ダイン/cm2を含む、およそ0.5〜30ダイン/cm2の剪断応力でシリンジポンプを使用して、血液サンプルを1以上のマイクロ流体チャネル中に引きこむ又は押すことを伴う。
【０１４８】
白血球接着機能アッセイは、内皮接着分子による、白血球細胞遊走挙動を特性決定する、白血球細胞トラッキングを特性決定する、又は白血球細胞動員を特性決定するために目視での解析を可能にし得る。目視での解析は、任意の適した方法で実施してもよい。例えば、可視化は、顕微鏡及び画像記録装置(例えば、ビデオ又は低速度写真)を使用して達成してもよい。白血球遊走挙動、トラッキング、動員などは、画像記録装置によって捉えられた画像のコンピュータ解析によって解析してもよい。接着性及び/又は非接着性白血球の種類及び数を決定してもよく、その個々の速度/挙動を、定量的方法で記録し、解析してもよい。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、すべての種類の白血球細胞相互作用を捉えるのに十分な期間にわたって、高フレームレートで画像を獲得することを伴う。例えば、アッセイは、細胞相互作用の種類を捉えるために、1秒あたり2フレームで5分間画像を獲得することを伴い得る。いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、白血球の詳細な3D移動を捉えることを伴い得る。いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、蛍光顕微鏡を時系列で記録することを伴う。
【０１５０】
白血球細胞動態パラメータは、以下の方法で導かれる:時系列で記録された画像は、検出された相互作用する白血球細胞各々のx、y及びz(位置)及びt(時)座標を提供する。「最近傍」などの数的アルゴリズムを使用していくつかのフレーム間の同一白血球細胞の局在化を関連付けることによって、細胞を継時的にトラッキングし、細胞の動き(トラック方向、長さ、転移、期間、真直性、平均速度、加速/減速、方向付けられた/限局された/ランダムな動きの種類など)を特性決定するために種々のパラメータを得ることができる。次いで、それらのパラメータを使用して、種々の白血球細胞小集団の運動性挙動又は薬物処置の際の運動性の変化を区別できる。
【０１５１】
あるいは、例えば、Nan Sun、Yong Liu、Ling Qin、Guangyu Xu及びDonhee Ham、2012年9月、Solid-State and Biological Systems Interface; Solid-State Device Research Conference (ESSDERC); DOI: 10.1109/ESSDERC.2012.6343324; http://people.seas.harvard.edu/〜donhee/ESSDERC-ESSCIRC-2012-Ham.pdf(その全内容は、相互参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるような白血球細胞を検出するためのその他の方法を使用してもよい。
【０１５２】
内皮分子は、例えば、支持体又は基板に結合された組換えタンパク質の形態であり得る。言い換えれば、いくつかの実施形態では、アッセイは、支持体又は基板(おそらくは、脂質二重層を含む)に固定された複数の内皮分子を使用することを含んでもよく、その他の実施形態では、アッセイは、このような内皮分子を発現する実際の細胞の使用を含み得る。支持体又は基板に固定化された(immobolised)内皮分子に関しては、Dohyun Kim及びAmy Herr、Protein immobilization techniques for microfluidic assays、Biomicrofluidics、2013年においていくつかの技術が言及されており、その全文が参照により本明細書において組み込まれる。また、このような分子は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる以下の文書に記載されている:US8,940,494、US8,380,443、US7,326,563及びW092/21746。
【０１５３】
白血球接着機能アッセイにおいて接着性基板(すなわち、支持体又は基板に結合された)として使用してもよい内皮分子は、それだけには限らないが、以下のうち1以上を含む:
1.本明細書においてすでに記載されている接着分子、
2.本明細書において言及されたようなケモカイン、
3.精製抗原及び人工抗原提示細胞系:
a.精製抗原:i)アルファ、ベータ及びイプシロン毒素並びにii)抗原CFA/I
b.1)Anna Thomas and Marcela Mausら、「A Cell-Based Artificial Antigen-Presenting Cell Coated with Anti-CD3 and CD28 Antibodies Enables Rapid Expansion and Long-Term Growth of CD4 T Lymphocytes」Clinical Immunology、2002年及び2)Turtle, C.、Riddell, S.、「Artificial antigen presenting cells for use in adoptive immunotherapy」Cancer J, 2010年に開示された人工抗原提示細胞系(これらの参考文献は、その全文が参照によって本明細書に組み込まれる)、
4.細胞間相互作用を調節し得るその他の分子(タンパク質を含む)、並びに
5.本明細書において開示されるようなケモカイン受容体。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、白血球によって発現されたPSGL-1(P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1)及びその内皮分子、P-セレクチン及び/又はE-セレクチン間の相互作用を検出、測定又は観察することを伴い得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、α4インテグリン接着機能の定量的評価を伴い得る。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、白血球α4インテグリン発現及び活性の増大を検出、測定又は観察することを伴い得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、白血球α4インテグリン及び内皮VCAM-1間の相互作用を測定、検出及び/又は観察することを伴い得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、CD11a(αLインテグリン)及びICAM-1の間の相互作用を検出、測定及び/又は観察することを伴い得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、CD11b(αMインテグリン)及びICAM-1の間の相互作用を検出、測定又は観察することを伴い得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、α4β7インテグリン及びMAdCAM-1間の相互作用を検出、測定及び/又は観察することを伴い得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、細胞間接着分子-1(ICAM-1)及び/又は血管細胞接着分子-1(VCAM-1)及びその白血球接着分子間の相互作用を検出、測定及び/又は観察することを伴い得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、白血球β2インテグリン及びその内皮分子間の相互作用を検出、測定及び/又は観察することを伴い得る。
【０１６３】
白血球接着機能アッセイは、白血球の1以上の特定のサブセット、例えば、CD4、CD8及びCD15細胞を測定することを伴い得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、サイトカイン又はケモカイン(例えば、TNFα及びIL-4)によって活性化された初代内皮細胞(例えば、HUVEC)又は固定化された内皮細胞株(例えば、ヒト微小循環内皮細胞(HMEC))での白血球遊走挙動を検出、測定又は観察することを伴い得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、TNFα活性化HUVECとの白血球相互作用に対する薬物ナタリズマブの効果を検出、測定及び/又は観察することを伴い得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、白血球上のα4インテグリンとのナタリズマブ特異的結合を検出、測定及び/又は観察することを伴い得る。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、α4インテグリン機能に対するナタリズマブの阻害効果を測定、検出及び/又は観察することを伴い得る。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、白血球接着機能アッセイは、サブセットを特定の膜マーカーを用いて標識することによって、種々の白血球サブセットを同時に検出、測定及び/又は観察することを伴い得る。このようなマーカーは、種々のフルオロフォアにコンジュゲートされた抗体であり得る。
【０１６９】
白血球接着機能アッセイは、1以上の対照を含み得る。使用される対照(複数可)の性質は、アッセイの性質及びアッセイ(essay)を使用する方法の性質に応じて変わり得る。例えば、対照は、疾患又は障害(例えば、炎症性又は自己免疫疾患)を有さない健常個体から得られた血液サンプルであり得る。例えば、対照は、薬物(例えば、抗炎症薬)を用いる医学的治療下にない個体から得られた血液サンプルであり得る。例えば、対照は、薬物を投与される前の、薬物治療を受ける前の、又は投与計画に付される前の、又は投与計画の間の対象から得られた血液サンプルであり得る。対照は、種々の個体(コホート)から得たプールされた血液サンプルを含む血液サンプルであり得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、方法/白血球接着機能アッセイは、以下のステップ:1.フローチャネルを内皮分子を用いてプレコーティングするステップ又は内皮細胞モデルにおける場合には、フローチャネル中に細胞を播種し、培養し、細胞を、試薬若しくは炎症性サイトカイン若しくはケモカイン、例えば、TNFαを用いて処置することによって、内皮接着分子の発現を活性化するステップ、2.フローチャネルを、内皮接着分子機能を変更する種々の用量の薬物(例えば、小分子、抗体など)を伴わずに、又はそれとともにインキュベートするステップ、3.対象から血液を採取するステップ並びに4.薬物治療後種々の時点で白血球接着機能アッセイを実施して、薬物効果を決定する(薬物不含対照に対する比較によって)ステップを実施することを伴い得る。適したアッセイの例は、に記載されている。
【０１７１】
投与計画
投与計画は、通常、薬物の性質、疾患状態及び/又は対象の特性に応じて変わり得る。薬物投与計画を最適化することは、例えば、アッセイ結果によって判断しながら必要に応じて、薬物投与経路、生薬処方、薬物単位用量、投与頻度/投与間の時間の長さ、薬物負荷用量及び/又は治療の長さを改変することを含み得る。
【０１７２】
薬物投与計画(例えば、免疫抑制薬の)を最適化することは、薬物血清レベルが最大効力を下回って低下するが、投薬サイクルの相当な割合又は一割合は各々、薬物効力を含まない、又は薬物効力を実質的に損なうことを可能にすることを含み得る。実施例7に詳述されるように、ひとたび、最大効力閾値を下回ると、対象の免疫応答は、薬物が再投薬される前に特定の期間回復され得る。
【０１７３】
特定の例示的実施形態では、薬物投与計画を最適化すること及び/又は最小有効薬物用量を決定することは、最小量の薬物のみが投与される必要がある、及び/又は連続薬物投与間の時間は、必要に応じて延長又は短縮され得るということを意味し得る。特定の例示的実施形態では、薬物投与計画を最適化すること及び/又は最小有効薬物用量を決定することは、薬物による病理学的又は致死的副作用は、最小にされ得る、及び/又は排除され得るということを意味し得る。例えば、進行性多巣性白質脳症(PML)、ナタリズマブ療法の致死的副作用のリスクは低減され得る。
【０１７４】
対象
対象は、哺乳動物又は任意のその他の適した種類の動物であり得る。哺乳動物は、ヒト、霊長類、家畜及び農場動物(例えば、ウマ、ヒツジ及びブタ)、コンパニオンアニマル(例えば、イヌ及びネコ)及び実験試験動物(例えば、ラット、マウス及びウサギ)を含む。特定の実施形態では、対象は、ヒトであり得る。
【０１７５】
対象の治療
対象は、その特定の疾患のための公知の従来の方法で治療されてもよい。さらに、対象は、非従来方法で治療されてもよい。例えば、LAFA解析からの結果に基づいて、薬物が、通常、この特定の疾患のために使用されなくとも、特定の疾患を有する対象の治療のための薬物の適合性が推定され得る。
【０１７６】
ナタリズマブ
特定の例示的実施形態は、多発性硬化症を有する対象のナタリズマブ治療に関して適用を見出す。例えば、多発性硬化症を有する対象におけるナタリズマブ再投薬は、通常、最初の注入後4週間に1回実施される。ナタリズマブの標準用量は、注入あたり対象あたり300mgである。薬物投与計画を最適化することは、例えば、アッセイ結果によって判断しながら必要に応じて、投与される薬物の量を低減すること及び/又は投与間の長さを増大することを含み得る。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、方法は、ナタリズマブ注入後種々の時点で実施される血液検査として実施され得る。したがって、アッセイ結果は、ナタリズマブ再投薬の必要を決定するために使用され得る。血液検査は、個々の対象において薬物有効性を確実にするために実施され、個々の対象の最適な/個別化された治療計画の開発を促進し得る。血液検査は、患者層別化のために多数の対象のために実施され得る。
【０１７８】
拡張投薬間隔(EDI)研究から得た最近の臨床データは、ナタリズマブ(Natazumab)療法(最大8週間)の拡張された間隔が、疾患進行を標準間隔(4週間)と同程度に効率的に抑制するだけでなく、PMIのリスクを有意に低減することを示した。これらの知見は、その機序は未知のままであるが、EDIがPMLのリスクを低減することを示唆する。ひとたび、ナタリズマブの血清レベルが、特定の閾値(例えば、100%飽和閾値)未満に達すると、最小の免疫応答が回復されて、JCV感染のリスクを低減し得るということを提案することは合理的である。本明細書において記載される方法は、薬物飽和レベル及び再投薬の必要性を正確に示す、ナタリズマブ有効性を定量的に評価し得る。したがって、方法は、薬物効力を含まない免疫応答の回復を促進し、十分な免疫応答、投薬サイクルの相当な割合又は一割合が各々、PMLのリスクを有効に排除する、軽減する、及び/又は低減するのを可能にし得る。
【０１７９】
特定の例示的実施形態は、薬物標的の活性化を検出するための白血球接着機能アッセイの使用に関し、次いで、これを使用して、疾患進行を制御する薬物の能力を予測できる。また、方法/アッセイを使用して、薬物が、その薬物を使用して治療可能であると知られていないさらにその他の疾患の進行を制御するために使用され得るか否かを予測できる。例えば、ナタリズマブは、対象においてα4インテグリン活性化が検出される場合には、いくつかの対象にとって、多発性硬化症及びクローン病を治療するため以外に有用な薬物であり得る。
【０１８０】
多発性硬化症(MS)患者における疾患活動性の制御における早期成功にも関わらず、ナタリズマブレシピエントの25.8%及び17.1%が、治療に対して不十分にしか応答しなかった、及び部分的にのみ応答したということが注目された。今日まで、このような低い薬物有効性率の根底にある機序は未知のままである。MSにおいてα4インテグリンの病理学的役割は確立されたが、α4インテグリン活性化のレベルが、高度に不均一な患者集団において同一であろうことは全くありそうにない。この見解は、ナタリズマブの治療効力の規模は、個々のMS患者間で著しく変わったという知見によって支持され、α4インテグリンの病理学的役割は、これらの患者内で異なり得るということを示唆する。したがって、高レベルのα4活性化を有する患者は、低いα4インテグリン活性化を有する、又はα4インテグリン活性化を有さない患者と比較して、ナタリズマブ療法に応答する可能性がより高い。特定の例示的実施形態は、活性化α4インテグリンを定量的に評価可能であり、対象がナタリズマブ療法にどの程度応答する可能性があるかを予測するための優れたツールを提供し、患者層別化を促進し得る。
【０１８１】
特定の例示的実施形態では、対象の白血球接着プロフィールを作製する方法が提供され、前記方法は、
対象から得られた少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付して、1以上の種々の内皮分子に対する、種々の白血球サブセットの接着機能を実質的に同時に定量的に評価するステップ、並びに
白血球異常性を同定すること、個別化された病態形成の決定、疾患の新規疾患マーカーの同定、疾患の初期徴候の同定、疾患予測、疾患予防、早期の正確な診断を補助すること、対象の有効な個別化された治療を開発すること、対象の健康(健常状態)をモニタリングすること、疾患に関わらず対象を群化すること、又は疾患診断に関わらず対象のための治療を開発することのためにアッセイ結果を使用するステップ
を含む。
【０１８２】
方法(単数又は複数)は、単一対象から得られた血液サンプルで実施されてもよい。方法(単数又は複数)は、複数の異なる対象から得られた血液サンプルで実施されてもよい。対象(単数又は複数)は、健常対象であってもよい。対象(単数又は複数)は疾患を有してもよい。
【０１８３】
アッセイ(単数又は複数)は、対象の血液サンプルで実施されてもよく、血液サンプルは、全血サンプル又は処理された血液サンプルであってもよい。
【０１８４】
白血球接着機能アッセイは、1以上の内皮接着分子及び/又はその他の関連分子及び/若しくはこれらの分子を発現する細胞による白血球細胞遊走挙動、白血球細胞トラッキング又は白血球細胞動員を定量化するためのフロー(セル)アッセイであり得る。
【０１８５】
1以上の内皮分子は、支持体又は基板に結合された組換えタンパク質又は1種以上の内皮接着分子を過剰発現する細胞系の形態である。
【０１８６】
適した種類の白血球として、例えば、本明細書に記載されるものが挙げられる。
【０１８７】
適した種類の白血球接着分子又は白血球のその他の結合分子として、例えば、本明細書に開示されるものが挙げられる。
【０１８８】
1種以上の内皮分子として、例えば、本明細書に開示されるものを挙げることができる。
【０１８９】
方法(単数又は複数)は、特定の内皮分子基板を用いてプレコーティングされてもよい個々のフローチャネルにおいて、種々の白血球サブセットの接着をアッセイすることを含み得る。結果として、特定の白血球サブセット上での接着分子の相当な割合又は一割合各々の細胞遊走プロフィールが作製され得る。
【０１９０】
方法(単数又は複数)のアッセイは、薬物標的を同定するステップ、次いで、薬物標的に基づいて疾患の進行を制御するための適当な薬物を選択するステップを含み得る。
【０１９１】
方法(単数又は複数)のアッセイ(単数又は複数)は、薬物標的を同定するステップ、次いで、薬物標的及びそれらの標的の薬物の参照データベースに基づいて疾患の進行を制御するための適当な薬物を選択するステップを含み得る。このような方法で、疾患自体は、実際に診断され及び/又は同定され及び/又は知られる必要はない。
【０１９２】
方法(単数又は複数)のアッセイ(単数又は複数)は、薬物標的及び薬物のデータベースを構築するステップを含み得る。
【０１９３】
方法(単数又は複数)のアッセイ(単数又は複数)は、2種以上の薬物標的(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又は10種の薬物標的又はそれ以上)を一度にアッセイするステップを含み得る。
【０１９４】
方法(単数又は複数)は、複数の薬物標的について一度に試験するハイスループットアッセイであり得る。
【０１９５】
方法(単数又は複数)は、その他の実施形態について記載されたようなその他の特徴を有し得る。
【０１９６】
本明細書に記載される特徴のいずれも、任意の組合せで、本発明の範囲内で本明細書に記載されるその他の特徴のうち任意の1以上と組み合わせてよい。
【０１９７】
特定の例示的実施形態の材料及び方法
ヒト微小循環を現実的に再現するために、in vitroで血流を模倣するために未処理ヒト全血をマイクロ流体システムにおいて使用した。細胞を特定の膜マーカーを用いて標識し、種々のフルオロフォアにコンジュゲートされた抗体を使用することによって、種々の白血球サブセットが同時に検出された。白血球α4インテグリンと内皮VCAM-1間の相互作用を、VCAM-1基板上での白血球動員のように調べ、細胞動態を使用して、細胞遊走挙動を特性決定し、α4インテグリン接着機能の定量的評価を可能にした。
【０１９８】
材料及び方法
抗体、化学物質及び試薬
ヒト組換えVCAM-1及びTNFαを、R&D Systems(ミネソタ州、ミネアポリス)から購入した。ヒト白血球表面分子、CD4-Alexa488、CD8-PE、CD15-APC及びCD16-BV510に対する抗体(Ab)は、BD Biosciences (カリフォルニア州、サンディエゴ)から入手した。ナタリズマブ(タイサブリ)は、Biogen(マサチューセッツ州、ケンブリッジ)から購入した。代替抗ヒトα4インテグリンAb(クローン:7.2R)は、R&D Systemsから購入した。
【０１９９】
VCAM-1依存性白血球動員を研究するためのフローチャネルシステム
ヒト血液を、健常ボランティアからリチウムヘパリン血液採取管中に採取し、室温で貯蔵し、血液採取後4時間内に使用した。VCAM-1依存性白血球動員を研究するために、Microfluidic ChipShop(ドイツ、イエナ)から購入したポリメチルメタクリレート(PMMA)底マイクロ流体チップ(チャネル幅×深さ×長さ:1,000×200×18,000μm)を使用した。組換えヒトVCAM-1タンパク質(10μg/ml)をチャネル中に穏やかにロードし、4℃で一晩インキュベートした。特定の白血球サブセットを同定するために、100μlの全血を、以下の抗体(Ab)カクテルと室温で5分間(分)混合した、抗CD4-Alex488(1:50希釈)、抗CD8-PE(1:66.7)及び抗CD15-APC(1:33.3)。次いで、血液を、1.5ダイン/cm2の剪断応力でシリンジポンプ(Harvard Apparatus、マサチューセッツ州、ホリストン)によってマイクロ流体チャネル中に引きこんだ。α4インテグリンを活性化するために、全血を、5mM塩化マンガン(Sigma、ミズーリ州、セントルイス)を用いて室温で5分間処置した。α4インテグリン機能に対するナタリズマブの阻害効果を研究するために、血液を種々の用量のナタリズマブとともに室温で5分間インキュベートし、その後フローアッセイのために使用した。好中球(CD15+CD16+)を好酸球(CD15+CD16-)から区別する必要があったそれらの実験では、抗ヒトCD16-BV510 Ab(1:50)も含めた。
【０２００】
蛍光顕微鏡時系列を、臨界照明下で、高速画像獲得を促進するために20MHzカメラ読み出し速度及び4×4ピクセルビニングを用いて、10×対物レンズ及びOlympus IX71ベースを備えたDeltaVision Widefield顕微鏡(Applied Precision、ワシントン州、イサクア)で記録した。データ獲得を、チャネルの中心(チャネル入口から9,000μm)で1秒あたり2フレームで10分間記録した。実験は、温度制御された平衡化環境(37摂氏温度及び5% CO2)において実施した。
【０２０１】
細胞トラッキング及びデータ解析
細胞トラッキングは、Imaris(Bitplane AG)ソフトウェアを使用して達成した。各フレームにおいてクオリティーフィルター処置した蛍光スポットを検出することによって細胞を自動的にトラッキングし、次いで、30μmの最大距離及び2の最大ギャップサイズを用いて関連付けた。続いて、トラックを手作業でチェックし、エラーを補正した。トラックパラメータ並びに滞留時間、真直性及び平均速度などの統計値をGraphPad Prismにおける統計分析のためにエクスポートした。
【０２０２】
相互作用する細胞を、細胞平均速度(Smean)に従って5種の相互作用の種類にわけた:静止細胞(Smean<5μm/分)、クローリング細胞(Smean=5〜20μm/分)、スローローリング細胞(Smean=20〜300μm/分)及びローリング細胞(Smean=300〜6000μm/分)。R Studioを使用して、ナタリズマブの半最大阻害濃度(IC50)値を算出した。R Studioを用いて起点の同一座標(0,0μm)に対して検出されたトラックを正規化することによって共通の起点グラフを得た。
【０２０３】
内皮細胞によって白血球動員を研究するためのフローチャンバーアッセイ
ヒト血管内皮細胞による白血球動員を研究するために、平行平板型フローチャンバーシステム(Glycotech、メリーランド州、ゲイザースバーグ)を使用した。手短には、まず、ヘパリン処理したヒト血液を、Ca2+及びMg2+を含有するHank平衡塩類溶液(HBSS)を用いて1:10希釈した。細胞相互作用の種類(迅速なローリングを含む)を検出するために、高フレームレート記録を使用した。全血を、Hoechst33342のみを用いて室温で5分間標識し、その後、フローアッセイのために使用した。画像を、Hoechstチャネルのみにおいて高フレームレート(1秒あたり2フレーム)で5分間獲得した。ナタリズマブ実験のために、血液を、10又は300ng/mlのナタリズマブのいずれかを用いて室温で5分間処置した。初代ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を100%コンフルエンスに培養し、その後、トリプシン処置し、フィブロネクチンコーティングしたガラスカバーガラス上に播種した。次いで、細胞をさらに24時間培養し、その後、10ng/mlのヒト腫瘍壊死因子α(TNFα)を用いて一晩活性化した。この後、フローチャンバーをカバーガラス上に注意深くおき、次いで、血液を150s-1の剪断速度でシリンジポンプによってチャンバー中に引き入れた。細胞トラッキング及びデータ解析を本明細書において記載されたように実施した。
【０２０４】
種々の白血球サブセットにおいて細胞遊走挙動をさらに研究するために、Hoechst33342並びに抗CD4-Alex488、抗CD8-PE及び抗CD15-APCを含有する抗体カクテルを、全血に添加し、次いで、これを、フローアッセイの前に室温で5分間インキュベートした。白血球及びHUVEC間の相互作用を、20×0.75NA対物レンズを使用して記録した。内皮細胞によってコーティングされた表面の3次元性を説明するために、4チャネル3D zスタックを、20μmの範囲にわたって1μmの間隔で記録した。低フレームレート(30秒あたり1フレーム)を使用して、静止、クローリング及びスローローリング細胞を含む、低速度移動する細胞の3D移動を検出した。画像を、フロー方向に対して垂直に配置された3つの異なる位置で記録した。可視化及びデータ前処理のために、SoftWoRxソフトウェア(Applied Precision)を使用して3Dデータセットをデコンボルーションした。
【０２０５】
[実施例1]
Mn2+は、α4β1インテグリン接着機能を活性化する。
この例示的実施形態では、内皮VCAM-1と相互作用する白血球の能力を評価するために、in vitroで血液微小循環を模倣するために、マイクロ流体ポンプ及びマイクロ流体チップからなるマイクロ流体システムを使用した。チップの底をVCAM-1タンパク質(10μg/ml)を用いて4℃で一晩プレコーティングし、次いで、マイクロ流体ポンプによって駆動し、全血を、10μl/分の流速でチャネル中に灌流した。特に断りのない限り、使用されたプロトコールは、付録Iに示されている。
【０２０６】
CD4、CD8及びCD15細胞のVCAM-1依存性動員の同時検出
本実施例では、細胞単離を避け、複数の特定の白血球サブセットの同時検出を達成するために、特定の白血球膜マーカーに対する蛍光標識された抗体をヒト全血に添加し、その後、フローアッセイを実施した。図1Aに示されるように、白血球のCD4+(緑色)、CD8+(赤色)及びCD15+(シアン)小集団を明確に区別できる。相互作用するCD4及びCD8細胞の数は同様であるが、CD15細胞の数は、CD4及びCD8細胞よりも有意に低い(p<0.05)(図1B)。実際、解析された血液サンプルの50%では、相互作用するCD15細胞は検出されなかった。これらの結果は、VCAM-1が、健常対照血液において、CD15細胞と比較してCD4及びCD8細胞を優先的に動員することを示す。
【０２０７】
Mn2+、vanインテグリンアクチベーターは、α4β1インテグリン活性化を誘導し、したがって、そのリガンド、VCAM-1との結合活性の増大につながる。この系のMn2+誘導性白血球接着機能を検出する能力を試験するために、全血をMn2+を用いて処置し、その後、フローアッセイのために使用した。未処置血液と比較して、Mn2+は、相互作用するCD4細胞の数に対して有意な効果を有さないが、CD8細胞の>50%の低減が検出された(図1B)。対照的に、Mn2+処置は、相互作用するCD15細胞数においてほぼ5倍の増大を誘導し(図1B)、これは、VCAM-1との細胞相互作用を支持するための、CD15細胞に対するα4β1インテグリンの機能的役割を示す。
【０２０８】
細胞遊走挙動を特性決定するために、細胞動態パラメータの範囲を利用して、α4β1インテグリンのリガンド結合活性を評価した。遊走の平均速度に従って、全部の相互作用する細胞を、静止(<5μm/分)、クローリング(5〜20μm/分)、スローローリング(20〜300μm/分)及びローリング細胞(300〜6000μm/分)にわけた。非活性化血液では、極めてわずかな静止CD4細胞(0.2±0.2個細胞/mm2)しか検出されず、相互作用するCD4細胞の大部分は、スローローリング細胞であった(68.8±16.1個細胞/mm2、図1C)。未処置対照と比較して、Mn2+処置は、静止CD4細胞の数を2.9±1.0個細胞/mm2に有意に増大した、p<0.05。対照的に、スローローリング及びローリングCD4細胞の数は、Mn2+によって著しく低下した(図1C)。これらの知見は、Mn2+が、α4β1インテグリンリガンド結合能力及び細胞-VCAM-1相互作用を増強し、細胞遊走速度の低減につながることを示す。CD8細胞では、Mn2+は、スローローリング(p<0.05)及びローリング(p<0.01)CD8細胞の数を有意に減少させるが、静止及びクローリング細胞に対する効果は観察されなかった(図1D)。これらの知見は、Mn2+処置が、α4β1インテグリンの、CD8細胞ローリングを支持する能力を阻害することを示す。さらに、クローリング及びスローローリングCD15細胞の数は、Mn2+によって著しく増大し(図1E)、CD15細胞接着機能の調節におけるα4β1インテグリンの役割を示す。
【０２０９】
相互作用する細胞の速度に対するMn2+の全体的な効果を決定するために、Mn2+の存在下及び不在下での3つの白血球サブセットの平均速度を比較した。Mn2+なし対照と比較して、Mn2+処置は、CD4及びCD8細胞の速度を有意に低減した(図1F)。一貫して、共通の最初のグラフは、CD4及びCD8細胞の運動性が、Mn2+によって著しく阻害されたことを示す(図5A及び5B)。これらの結果は、図1C〜Dにおける知見と一致し、Mn2+の細胞遊走に対する抑制効果を示す。
【０２１０】
さらに、Mn2+処置は、相互作用するCD4及びCD8細胞の滞留時間を有意に増大した(図1G)が、CD4及びCD8細胞の真直性は、Mn2+によって有意に低下した(図1H)。総合すると、これらの結果は、Mn2+処置がα4β1インテグリン接着機能を誘導し、VCAM-1との、より強力な細胞相互作用を可能にすることを示す。他方、相互作用するCD15細胞の速度、運動性、滞留時間及び真直性は、Mn2+によって影響を受けなかった(図1F〜1H、図5C)。これらの知見は、Mn2+処置が、その遊走挙動に影響を及ぼさずにCD15細胞の動員を増強したことを示す。
【０２１１】
[実施例2]
特定の白血球サブセットを同定するための複数の膜マーカーの使用
本実施例は、特定の例示的実施形態に従う、アッセイにおけるCD15及びCD16二重陽性好中球の同定を対象とする。実験を実施するために行われた以下の改変を用いて、付録Iに示されるプロトコールに従った:
1.100μlのヒト全血に、3μlの抗ヒトCD15-APC(BD、カタログ番号:551376)及び2μlの抗ヒトCD16-BV510(BD、カタログ番号:563830)を添加し、室温でおよそ5分間インキュベートし、その後、アッセイのために使用した。
2.Fijiソフトウェアにおいて「Multi_Channel.ijm」と呼ばれるマクロを使用して、CD15CD16二重陽性細胞をトラッキングした。
【０２１２】
相互作用するCD15細胞のほとんどは、好中球である。好酸球は、高い発現レベルのα4インテグリンを有するだけでなく、CD15発現についても陽性であると知られる顆粒球の小さい集団である。相互作用するCD15細胞が好中球又は好酸球であるか否かを決定するために、ヒトCD16に対するさらなる蛍光標識抗体をアッセイに導入し、好中球(CD15+CD16+)と好酸球(CD15+CD16-)間の区別を可能にした。図1Iに示されるように、ほとんどすべての相互作用するCD15細胞はまた、CD16陽性であり、これは、これらのCD15細胞のほとんどが好中球であることを示す。
【０２１３】
この戦略を使用して、2、3、4種又はそれ以上の膜マーカーを使用して、その他の特定の白血球サブセットを検出できる。例えば、CD14及びCD16二重陽性を使用して、炎症性単球を同定できるが、CD4及びCD25二重陽性を使用して、CD4 T調節性(Treg)リンパ球を同定できる。種々のフルオロフォアがコンジュゲートされた、CD14及びCD16(又はTregについてはCD4及びCD25)に対する抗体を全血に添加し、その後LAFA解析のために使用してもよい。結果として、顕微鏡によってCD14CD16二重陽性細胞(炎症性単球)を検出でき、次いで、実施例1に記載されたように、その接着機能を定量的に評価できる。
【０２１４】
[実施例3]
α4β1インテグリンの基礎炎症状態の半定量的評価
本実施例は、特定の例示的実施形態において使用され得る半定量的評価ツールを示すことを対象とする。疾患対象では、健常対象と比較して、活性化されたα4β1インテグリン分子の割合が増大され、白血球細胞のα4β1インテグリン内皮リガンド(例えば、VCAM-1)と結合する能力の増強並びに白血球動員及び/又は炎症応答の増大をもたらす。
【０２１５】
健常対象(単数又は複数)を規定するために、以下の基準が使用される:
1.病歴を含む医学的評価によって決定されるような全体的に健常。
2.妊娠中ではない又は現在授乳中ではない女性
3.何らかの自己免疫、炎症性、血液学的及び血管性障害の診断をなされていない
4.現在、避妊薬を除いて処方薬を摂取していない
5.現在、抗ヒスタミン薬、アスピリンなどを含む、血液細胞機能に影響を及ぼし得る一般用医薬品を摂取していない。ビタミン栄養補助剤はこの研究にとって許容可能である
6.現在、激しい風邪、発熱又は公知のアレルギー反応を有していない
7.最近(過去5年)喫煙歴がない。
【０２１６】
図1G〜1Hに示されるように、α4β1インテグリンの基礎炎症状態を特性決定するために範囲パラメータを使用できる。本明細書において結果は、Mn2+処置が、VCAM-1基板上でのCD4及びCD8細胞の真直性及び速度を有意に低下させたことを示す。自己免疫疾患を有する対象では、α4β1インテグリン機能が活性化されることは知られているが、個々の対象においてα4β1インテグリンがどのように活性であるかは明らかではない。図1Hに示されるように、真直性は、Mn2+処置によって影響を受けた、最良で、最も頑強なパラメータであり、これは、真直性の低減は、Mn2+誘導性α4インテグリン活性化の良好なマーカーであり得ることを示唆する。Mn2+処置は、α4β1インテグリンを最大レベルまで化学的に活性化したので、対象(単数又は複数)から得た白血球の真直性値が、対照及びMn2+処置サンプルの値の間に入る可能性が高い。未処置CD4細胞の平均真直性値は、0.40±0.06であり、これは、Mn2+処置によって0.16±0.03に低減した。したがって、対照及びMn2+処置白血球の平均真直性値を、それぞれ、10及び1であると(相対真直性指数(RSTI))任意に設定すると、対象(単数又は複数)から得た白血球のRSI値は、10と1の間に入る可能性が高く、α4β1インテグリンの基礎炎症状態及び/又は接着機能を評価するための半定量的アプローチを提供する。この場合には、RSTIが1に近いほど、患者のα4β1インテグリンはより活性であり、基礎炎症状態がより高い。したがって、個々の患者におけるα4β1インテグリンの基礎炎症状態を決定できる。
【０２１７】
さらに、図1Fでは、対照及びMn2+処置白血球の平均白血球細胞速度を、それぞれ、10及び1であると(相対速度指数(RSI)とも呼ばれる)任意に設定すると、RSI値は、個々の対象においてα4β1インテグリン接着機能を評価するための半定量的ツールを提供する。例えば、CD4細胞では、平均白血球細胞速度は、Mn2+の不在下及び存在下で135.7及び17.9μm/分であり、これらの2つのデータ点は、CD4細胞のRSI値についてそれぞれ10及び1を規定するために使用できる。対象のCD4細胞RSI値が10と1の間に入る場合には、RSIが1に近いほど、α4β1インテグリンはより活性であり、基礎細胞炎症性状態がより高い。
【０２１８】
同様に、図1Gでは、対照及びMn2+処置白血球の平均滞留時間を、それぞれ、1及び10であると(相対滞留時間指数(RDTI)とも呼ばれる)任意に設定すると、RDTI値も、α4β1インテグリン接着機能を評価するための半定量的ツールを提供する。例えば、CD4細胞では、平均白血球細胞滞留時間は、Mn2+の不在下及び存在下で1.53及び3.52分であり、これらの2つのデータ点を、CD4細胞のRDTI値についてそれぞれ10及び1を規定するために使用できる。この場合には、RDTIが1に近いほど、α4β1インテグリンはより活性である。
【０２１９】
α4β1インテグリンの基礎炎症性レベルを、対象(単数又は複数)、例えば、多発性硬化症、クローン病、大腸炎、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性甲状腺炎、虫垂炎、憩室炎、サルコイドーシス、皮膚疾患、脈管炎、ループス及び強皮症又はそれらの組合せを有する患者のα4β1インテグリン活性化の基礎レベル及び/又は基礎炎症状態を評価するための半定量的ツールとして使用できる。1以上の白血球サブセットにおけるRSI、RDTI、RSTI試験又はそれらの組合せ及び作製されたデータを使用して、炎症性疾患状態と関連するとして対象の状態を評価できる。その他の細胞に関して、この実施例において開示される方法を使用して、1と10の間の範囲パラメータ又はいくつかのその他の適した範囲パラメータ及び/又はRSI、RDTI及び/若しくはRSTIの評価ツールを設定できる。これを行うことができるその他の細胞の限定されない例として、CD8リンパ球、CD15白血球、好中球、CD19 B細胞及びCD14単球などが挙げられる。範囲パラメータを設定するために、その他の方法を使用してもよい。例えば、細胞速度について、500μm/分の固定速度を、10と定義でき、RSIについて、10μm/分を1と定義でき、その結果、次いで、個々の対象のRSI値を決定できる。さらに、真直性については、1及び0.1の真直性値を、それぞれ、RSTIの10及び1として定義できる。
【０２２０】
[実施例4]
α4インテグリンのMn2+誘導性活性化可能性
本実施例は、特定の例示的実施形態において使用され得る半定量的評価ツールを示すことを対象とする。Mn2+は、α4β1及びα4β7インテグリンを含む白血球膜α4インテグリンの活性を増強するインテグリンアクチベーターである。次いで、Mn2+の存在下及び不在下での白血球の、α4インテグリンリガンドと結合する能力の相違を使用して、α4インテグリンの「活性化の可能性」を定義でき、これは、Mn2+によってどの程度のα4インテグリン活性化が誘導され得るかを示す。
【０２２１】
図1F及び実施例1に示されるように、VCAM-1基板上での未処置及びMn2+処置細胞間の平均速度の比を、「速度活性化可能性比(SAPR)」として定義でき、次いで、これを使用して、α4β1インテグリンの活性化可能性を半定量的に評価できる。例えば、CD4細胞の平均速度は、特定の対象の試験した全血についてMn2+の不在下及び存在下でそれぞれ163.9及び23.1μm/分である。したがって、この対象のCD4細胞のSAPR値は、163.9/23.1=7.1である。この場合には、SAPR値が低いほど、活性化可能性は小さく、α4β1インテグリンのより高い割合が活性化形態にある。同様に、同一式を使用して、図9、実施例10におけるデータを使用してα4β7インテグリンのSAPR値を決定できる。
【０２２２】
図1Gに示されるように、VCAM-1基板上での未処置及びMn2+処置細胞間の平均滞留時間の比を、「滞留時間活性化可能性比(DTAPR)」として定義でき、これを使用して、α4β1インテグリンの活性化可能性を半定量的に評価できる。例えば、CD4細胞の平均滞留時間は、特定の対象の試験した全血についてMn2+の不在下及び存在下でそれぞれ1.43及び4.03分である。したがって、この対象の血液のCD4細胞のDTAPR値は、1.43/4.03=0.355となる。この場合には、DTAPR値が高いほど、活性化可能性は小さく、α4β1インテグリンのより高い割合が活性化形態にある。同様に、同一式を使用して、図9、実施例10におけるデータを使用してα4β7インテグリンのDTAPR値を決定できる。
【０２２３】
図1Hに示されるように、VCAM-1基板上での未処置及びMn2+処置細胞間の平均真直性の比を、「真直性活性化可能性比(STAPR)」として定義でき、これを使用して、α4β1インテグリンの活性化可能性を半定量的に評価できる。例えば、CD4細胞の平均真直性は、特定の対象の試験した全血についてMn2+の不在下及び存在下でそれぞれ0.40及び0.12である。したがって、この対象の血液のCD4細胞のSTAPR値は、0.40/0.12=3.33となる。この場合には、STAPR値が低いほど、活性化可能性は小さく、α4β1インテグリンのより高い割合が活性化形態にある。同様に、同一式を使用して、図9、実施例10におけるデータを使用してα4β7インテグリンのDTAPR値を決定できる。
【０２２４】
α4β1及び/又はα4β7インテグリンのMn2+誘導性活性化可能性を、対象(単数又は複数)、例えば、多発性硬化症、クローン病、大腸炎、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性甲状腺炎、虫垂炎、憩室炎、サルコイドーシス、皮膚疾患、脈管炎、ループス及び強皮症又はそれらの組合せを有する患者における活性化されたα4β1及び/又はα4β7インテグリンの割合を評価するための半定量的ツールとして使用できる。1以上の白血球サブセットにおけるSAPR、DTAPR、DTAPR試験又はそれらの組合せ及び作製されたデータを使用して、炎症性疾患状態と関連するとして対象の状態を評価できる。臨床設定におけるMn2+誘導性活性化可能性比の使用は、実施例21、22、24及び25において論じられている。
【０２２５】
[実施例5]
ナタリズマブは、VCAM-1依存性白血球動員を阻害する
本実施例は、白血球接着機能アッセイを使用してナタリズマブ効力を検出することを対象とする。付録Iに示されるプロトコールを以下の改変を用いて使用して、実験を実施した:
【０２２６】
1.血液サンプルを、さまざまな用量のナタリズマブ(Biogen、マサチューセッツ州、ケンブリッジ)を用いて室温で処置し、その後、LAFA解析のために使用した。Mn2+によって活性化されたサンプルについては、血液を、Mn2+を用いておよそ5分間室温で処置し、その後、全血において種々の用量のナタリズマブ(例えば、0.01、0.03、0.1、0.2、0.3、1、3及び10μg/ml)を用いておよそ5分間室温で処置した。
【０２２７】
ナタリズマブ、中和抗ヒトα4インテグリン抗体は、再発寛解型多発性硬化症(RRMS)を有する患者にとって最も有効な治療の1つであると考えられている。ナタリズマブは、α4インテグリンリガンド結合を阻害し、白血球動員の低減につながる。したがって、本実施例において、例示的実施形態に従う、系の、α4インテグリン接着機能のナタリズマブ誘導性低下を検出する能力を試験した。血液サンプルをさまざまな用量のナタリズマブ(0.01、0.03、0.1、0.2、0.3、1、3及び10μg/ml)を用いて処置し、その後、フローアッセイのために使用した。
【０２２８】
Mn2+の不在下で、0.01μg/mlのナタリズマブ処置は、ナタリズマブなし対照(105.6±20.5個細胞/mm2、図2A)と比較して、CD4相互作用細胞の数(69.8±29.4個細胞/mm2)に対して効果がなかった。他方、このレベルのナタリズマブは、ナタリズマブなし対照(73.5±17.1個細胞/mm2、図2B)と比較して、相互作用するCD8細胞の数(36.9±10.1個細胞/mm2)において約50%の低減(p<0.05)を引き起こした。ナタリズマブ投与量の増大は、CD4及びCD8相互作用細胞の数を徐々に低減した。0.3μg/mlで、ナタリズマブは、CD4及びCD8細胞のVCAM-1依存性動員を完全に阻害した(図2A及び2B)。
【０２２９】
しかし、Mn2+処置血液では、0.3μg/mlのナタリズマブは、ナタリズマブなし対照と比較してCD4及びCD8細胞の動員に対して効果がなかった(図2A及び2B)。Mn2+によって活性化されたCD4及びCD8細胞の動員を完全に阻害するのに必要な最小のナタリズマブ用量は、10μg/mlであると決定された(図2A)。さらに、Mn2+処置は、CD4及びCD8細胞の両方においてナタリズマブIC50値の15倍を超える増大を誘導し(図2D)、α4インテグリン接着機能に対するMn2+誘導性活性化を明確に示した。興味深いことに、Mn2+によって活性化されたCD8細胞は、CD4細胞と比較して、IC50値のわずかであるが、有意な(p<0.05)増大を示し、活性化されたCD8細胞が、活性化されたCD4細胞よりもナタリズマブに対してわずかにより耐性であることを示唆した。
【０２３０】
Mn2+の不在下では、少数の相互作用するCD15細胞しか観察されなかった(図1B)。ナタリズマブを用いて処置されると、相互作用するCD15細胞の数は、少ないままであり、0.3μg/mlのナタリズマブが、相互作用するCD15細胞の完全排除につながった(図2C)。Mn2+処置血液では、興味深いことに、0.3μg/mlのナタリズマブが、ナタリズマブなし対照(135.0±35.1個細胞/mm2、図2C)と比較して、CD15細胞の数において18.7±8.6個細胞/mm2へと8倍の減少を引き起こした(p<0.01)。さらに、7μg/mlのナタリズマブで、CD15細胞動員の完全阻害が達成された(図2C)。一貫して、Mn2+処置CD15細胞のIC50値は、CD4及びCD8細胞のものよりも有意に低かった(p<0.05、図2D)。これらの結果は、Mn2+処置CD15細胞は、CD4及びCD8細胞と比較して、ナタリズマブ処置に対してより感受性であることを例示する。
【０２３１】
これらの結果は、LAFA例示的実施形態の、in vitroでナタリズマブ効力を正確に評価する能力を明確に示す。したがって、特定の薬物の薬物動態(PK)研究を補助するために、LAFA例示的実施形態を使用できる。伝統的に、ほとんどの薬物のPK研究は、薬物又は関連薬物代謝産物の血清レベルに基づいて実施される。しかし、量は、必ずしも機能性にならない。本明細書において特定の実施形態は、対象の血液中の薬物濃度とは関係なく、又はそれとは実質的に関係なく、ナタリズマブの主要な機能を評価し、薬物有効性のより正確な評価を可能にするために使用できる技術を対象とする。結果として、本明細書において論じられる技術は、新規/その他の薬物のPK研究の正確性を改善するためのツールとして有用であり得る。
【０２３２】
[実施例6]
LAFAの正確性及び/又は感度の利点
本実施例は、特定の例示的実施形態に従って、従来のリガンド占有アッセイと比較した、ナタリズマブ効力を評価するためのLAFA例示的実施形態の正確性及び/又は感度の利点を例示することを対象とする。
【０２３３】
リガンド占有アッセイを実施するために、100μlの全血を5mM MnCl2を用いて又は用いずにおよそ10分間室温で処置した。血液に、さまざまな用量のナタリズマブ(例えば、0.001、0.01、0.1、1、10、100及び300μg/ml)を添加し、およそ5分間室温でインキュベートした。CD4陽性Tリンパ球を検出するために2μlの抗ヒトCD4-Alexa488抗体も添加した。この後、5mlの赤血球溶解バッファー(NH4Cl)を使用して赤血球を溶解して、赤血球を除去した。PBSバッファーを用いて3回洗浄した後、白血球に、PEがコンジュゲートされた抗ヒトIgG二次抗体(1:500希釈された)を添加し、およそ20分間室温、暗所でインキュベートした。次いで、細胞をPBSバッファーを用いて3回洗浄し、その後、フローサイトメトリーアッセイのために使用した。Alexa488を使用して、CD4陽性Tリンパ球を同定し、PE陽性及び平均蛍光強度を使用して、α4インテグリンとのナタリズマブ結合能を評価した。
【０２３４】
対照(未処置)血液では、0.001μg/mlのナタリズマブは、PE陽性CD4リンパ球につながらず(図8A、丸)、この用量のナタリズマブによってα4インテグリンとのナタリズマブ結合が誘導されなかったことを示した。他方、PE陽性CD4リンパ球のパーセンテージは、ナタリズマブ用量が増大するにつれ徐々に増大し、1μg/mlで73.9%のプラトーに達した(図8A)。さらに、1μg/mlと比較して、より高用量のナタリズマブでPE陽性CD4リンパ球のパーセンテージのさらなる有意な増大は検出されず(図8A)、ナタリズマブのα4インテグリンとの結合が、1μg/mlで飽和であったことを示した。一貫して、CD4リンパ球のPE MFIは、ナタリズマブ用量が増大するにつれて徐々に増大し、1μg/mlでプラトーに達し(図8B、丸)、α4インテグリンでのナタリズマブ占有が、1μg/mlのナタリズマブで飽和したことを示した。
【０２３５】
Mn2+によって活性化された血液では、ナタリズマブによるα4インテグリン占有は、未処置血液において観察されたものとほとんど同一であった。図8A及び9B(四角)に示されるように、PE陽性CD4リンパ球及びPE MFIのパーセンテージの両方とも、1μg/mlのナタリズマブで飽和であり、ナタリズマブのα4インテグリンとの結合に対してMn2+活性化が効果がなかったことを示した。
【０２３６】
総合すると、これらの知見は、従来のリガンド占有アッセイは、未処置対照と比較して、Mn2+によって活性化された細胞においてα4インテグリン機能を完全に阻害するためのナタリズマブのより高い必要条件を検出できなかったということを示す。他方で、Mn2+処置及び未処置細胞間の、α4インテグリン機能を完全に阻害するために必要とされる異なる用量は、LAFA解析を使用した場合には明確に検出可能であった(図2A)。したがって、これらのデータは、従来のリガンド占有アッセイを上回るLAFA例示的実施形態の感度及び正確性の利点を示す。したがって、薬物効力を正確に決定するためのLAFAの使用は、それだけには限らないが、PTG-100及びBio-1211を含むその他の薬物に適用されてもよい。
【０２３７】
[実施例7]
PMLのリスクを低減するためのモデル
本実施例は、ナタリズマブ治療計画を最適化し、したがって、進行性多巣性白質脳症(PML)を含む薬物誘導性副作用のリスクを低減するための白血球接着機能アッセイの使用を対象とする。
【０２３８】
ナタリズマブは、免疫系の機能を抑制し、したがって、疾患進行を制御するが、患者を、PML、ジョン・カニンガムウイルス(JCV)の感染によって引き起こされる稀な、頻繁に致死的である疾患などの副作用のリスクにもさらす。世界中で多発性硬化症患者のおよそ50%が、JCVを保持しており、ナタリズマブ療法を受ける場合にPMLのリスクにある。
【０２３９】
図2に示されるように、LAFAを使用して、ナタリズマブ効力を正確にモニタリングでき、したがって、これを使用して、薬物再投薬の必要性を決定できる。例えば、ナタリズマブの最大効力で、LAFAによって細胞相互作用が検出されない場合には、薬物再投薬の必要性がないことを示す。
【０２４０】
しかし、ひとたび薬物効力が、最大効力(例えば、100%)未満に低減すると、細胞相互作用は、LAFA例示的実施形態によって徐々に検出可能となる。細胞相互作用の回復は、免疫応答の再構成を示し、これは、PMLのリスクを低減するのに有益であり得る。例えば、薬物注入後、ナタリズマブ飽和レベルは、薬物再投薬ウィンドウとして定義され得る、完全薬物効力が維持され得る最大効力を下回る点(例えば、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%又は10%)に徐々に低減する(図26)。最大効力未満までの薬物飽和の低減は、白血球動員及び免疫応答の再構成につながることがあり、これが、免疫系が、JCV感染に応答してこれを排除する能力を回復させることを可能にし、PMLのリスクの低減につながり得る。
【０２４１】
LAFA例示的実施形態は、対象ごとに対象での薬物再投薬ウィンドウを正確に決定するためのツールとして使用でき、薬物効力を損なうことなく免疫応答の必要な再構成を可能にする。薬物投薬サイクルの相当な割合又は一割合各々に、特定の期間(例えば、1、2、3、4、5、6又は7日)の薬物再投薬ウィンドウが許容される場合には、ナタリズマブ療法時の患者におけるPMLのリスクは、有効に低減され得る。長期の投薬間隔(最大5、6、7又は8週間)の患者は、標準投薬間隔患者(4週間)よりもPMLを有する可能性は低い。
【０２４２】
しかし、表1及び5に示されるように、ナタリズマブ感受性は、個々の対象間で著しく変わることがあり、固定投薬間隔は、一部の対象にとって効率的に働かない場合も働く場合もあることを示唆する。これは、MS患者の群において薬物注入の4週間後に種々のレベルのナタリズマブ効力が検出されたことを示す図17中のデータによって支持される。したがって、LAFA例示的実施形態を使用して、個々の対象において薬物再投薬ウィンドウを決定でき、これは、個々の患者のためのより有効な個別化された治療計画及び対象において投薬間隔が延長され得るのでPMLのリスクの低減につながる。
【０２４３】
[実施例8]
低用量(10μg/ml)及び高用量(300μg/ml)ナタリズマブは、TNFαによって活性化されたHUVECでの白血球の強固な接着を阻害する
本実施例は、低及び高用量のナタリズマブが、白血球接着機能に対して同様の効果を有することを確認することを対象とする。LAFA例示的実施形態を使用して、低用量と比較して、高用量のナタリズマブのさらなる治療的利益がないこと、又はさらなる治療的利益が実質的にないことを示す。
【０２４４】
炎症組織への白血球の動員は、複数の接着分子及びその対応するリガンドによって媒介される、白血球及び内皮細胞間の一連の相互作用を含む。α4インテグリンのナタリズマブ阻害によって無効にされたVCAM-1依存性白血球動員が本明細書に示されており、したがって、実験の次のセットにおいて、内皮細胞との白血球相互作用に対するα4インテグリン遮断の効果を評価した。したがって、in vivo微小循環を現実的に再現するために、流動条件下での白血球及び腫瘍壊死因子α(TNFa)によって活性化されたヒト初代HUVEC間の相互作用に対するナタリズマブの効果を、次いで、研究した。
【０２４５】
ヒトにおける最初の薬物動態(PK)研究は、ナタリズマブ血清レベルの平均は、薬物注入の直後に110±52μg/mlに達し得るということを示唆した。したがって、薬物効力の飽和を確実にするために高用量のナタリズマブ(300μg/ml)を選択した。平均ナタリズマブ血清レベルは、最初の注入の28日後に約10μg/mlに低下し、そこでは、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるRudick,R.A.及びA. Sandrock. 2004年、「Natalizumab: alpha 4-integrin antagonist selective adhesion molecule inhibitors for MS. Expert review of neurotherapeutics」第4巻:571〜580頁に開示されるように、通常、ナタリズマブ再投薬が推奨される。したがって、本明細書において低ナタリズマブ用量(10μg/ml)も本明細書に含めた。
【０２４６】
白血球を、未処理ヒト全血においてHoechst33342のみ用いて標識し、1秒あたり2フレームの高フレームレートを使用し、相互作用する細胞の種類を捉えることを可能にした。ナタリズマブ対照と比較して、低用量(10μg/ml)又は高用量(300μg/ml)のナタリズマブのいずれかを用いて処置された場合に、相互作用する白血球の数に対して効果が検出されなかった(図3A及び3D)。ナタリズマブなし対照(図3E)と比較して、低用量ナタリズマブによって平均白血球遊走速度がわずかに低下した(p<0.05)(図3B)という事実にも関わらず、高用量のナタリズマブは、細胞速度を有意に増大した(p<0.01)。さらなる細胞動態解析は、10μg/mlのナタリズマブが、静止細胞のパーセンテージを43.6±7.3%(ナタリズマブなし対照)から31.4±1.4%に有意に低減し(p<0.05)、クローリング細胞の割合は、有意に増大する(p<0.05) (図3C)ことを示した。同様に、高用量ナタリズマブ処置細胞において、静止及びクローリング細胞のパーセンテージに対するほとんど同一の効果も検出された(図3F)。これらの知見は、低及び高用量のナタリズマブの両方が、同様の方法でヒト内皮細胞上での白血球の強固な接着を抑制できることを示す。
【０２４７】
低及び高用量ナタリズマブは、TNFαによって活性化されたHUVEC上での、CD4及びCD15細胞遊走挙動を変更するが、CD8細胞遊走挙動を変更しない。
【０２４８】
特定の白血球サブセットに対する低及び高用量ナタリズマブの効果をさらに特性決定するために、血液サンプルに蛍光標識された抗CD4、CD8及びCD15抗体を添加した。30秒ごとに1フレームで三次元(3D)画像スタックを獲得し、低速度移動する細胞(静止及びクローリング細胞)の3Dデータセットを経時的に提供した。図4A及び4Dに示されるように、10μg/mlも300μg/mlのナタリズマブも、TNFαによって活性化されたHUVEC上での相互作用するCD4、CD8及びCD15細胞の数に影響を及ぼさなかった。ナタリズマブなし対照と比較して、低及び高用量両方のナタリズマブが、CD4(p<0.05)及びCD15(p<0.01)細胞の真直性を有意に低減したが、CD8細胞に対するこのような効果は検出されなかった(図4B及び4E)。さらに、ナタリズマブなし対照と比較して、CD15細胞の遊走速度は、低及び高用量両方のナタリズマブによって有意に低減されたが、高用量のナタリズマブはまた、CD4細胞の速度の低下も引き起こした(図4C及び4F)。これらの知見は、ナタリズマブの、これらの細胞の運動性を阻害する能力を例示する。他方、低又は高用量いずれかのナタリズマブによる細胞速度に対するこのような効果は、CD8細胞では検出されなかった(図4C及び4F)。一貫して、CD4及びCD15細胞運動性に対するナタリズマブの阻害効果はまた、共通の起点グラフによって支持される(図6)。総合すると、これらの結果は、低(10μg/ml)及び高(300μg/ml)用量のナタリズマブが、TNFαによって活性化されたHUVEC上での白血球遊走挙動に対してほとんど同一の効果を有することを例示する。
【０２４９】
[実施例9A]
ナタリズマブ有効性試験
ナタリズマブの標準用量は、一般に、4週間毎に1回投与される、注入あたり患者あたり300mgである。ナタリズマブの承認された投薬計画は、高度に不均一な患者集団における同様の効力及び代謝を仮定して、薬物の血清濃度に基づいている。しかし、最大8週間の長期の間隔の投薬(EID)は、同一の治療効力を維持するだけでなく、進行性多巣性白質脳症(PML)、ナタリズマブ療法の致死的副作用のリスクも低減することが示唆されている。他方、個々の患者において薬物有効性を確実にするために最適の及び/又は個別化された投薬間隔を決定することは、このような改善のために有用である。本開示は、このような技術及び能力を提供する。本明細書において記載されるように、特定の例示的実施形態は、血清薬物濃度に関わらず、ナタリズマブ有効性の迅速な及び/又は正確な評価を可能にする、開発された新規技術を対象とする。
【０２５０】
ナタリズマブを用いて処置された場合に、相互作用する細胞の数の用量依存性低減が観察され(図2A〜2C)、ナタリズマブ有効性を評価するための定量的アプローチを提供する。相互作用する細胞がないことを、ナタリズマブ有効性の陽性の指標として使用できる。さらに、結果は、個々の血液ドナー間のIC50値が、最大10倍変わり得ることを示し(表1)、種々の個体間で薬物感受性の有意な相違があることを例示する。
【０２５１】
表1-個々の血液ドナー間のIC50値。血液を5mM Mn2+を用いて、又は用いずに処置し、その後、一連の用量のナタリズマブ(0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3及び10μg/ml)を用いて処置した。続いて、血液サンプルを、VCAM-1コーティングしたマイクロ流体チャネルにおいて解析し、CD4、CD8及びCD15相互作用細胞の数を決定した。ナタリズマブの半最大阻害濃度(IC50)値を算出した。CD4及びCD8細胞の値と比較して、*、p<0.05;CD4細胞の値と比較して、#、p<0.05。
【０２５２】
【表１】
2019537031.tif 000003
【０２５３】
したがって、患者の安全性を確実にするために、ナタリズマブ有効性試験は、通常、個々の患者において実施される。α4インテグリン機能を完全に遮断するために必要とされる最小ナタリズマブ濃度が、現在推奨されるものよりもかなり低いとわかったこともわかった。これらの結果は、ナタリズマブが、その有効性を、これまで認識されていたものよりもかなり低いレベルで保持し得ることを例示する。
【０２５４】
これらの知見は、ナタリズマブ注入後、種々の時点で実施される新規血液検査に展開され得る。したがって、試験結果を使用して、ナタリズマブ再投薬の必要性を決定できる。この血液検査を、薬物有効性を確実にするために個々の患者において実施して、個々の患者の最適な及び/又は個別化された治療計画の開発を促進できる。
【０２５５】
[実施例9B]
複数の試験から得た単一健常対象におけるナタリズマブ感受性可変性
本実施例は、複数の試験から得た単一対象におけるナタリズマブ感受性を評価することを対象とする。1〜2週間毎に5回、単一健常対象から血液サンプルを採取した。次いで、サンプルを、接着性基板としてVCAM-1を使用する白血球接着機能アッセイ解析のために使用して、実施例5に記載されるようなプロトコールに従い、各試験のIC50を決定した。IC50値は、CD4相互作用細胞の数に対するナタリズマブ阻害効果を使用して例証される。
【０２５６】
表2に示されるように、試験2から得られたIC50値(0.2624μg/ml)は、試験4から得られた値(0.047μg/ml)よりもほぼ6倍高く、これは、単一健常対象におけるナタリズマブ感受性が、経時的に著しく変わり得ることを示す。これらの結果は、異なる時点での同一対象におけるナタリズマブ感受性のわずかな相違を決定するためのLAFA例示的実施形態の良好な感度を示す。これらの相違はまた、定期的に個々の患者においてナタリズマブ効力をモニタリングし、薬物再投薬ウィンドウ(実施例7に詳述される)を決定する必要性を実証した。
【０２５７】
【表２】
2019537031.tif 000004
【０２５８】
[実施例10]
MAdCAM-1基板上での白血球遊走プロフィールに対するMn効果。
本実施例は、白血球の内皮MAdCAM-1と相互作用する能力を評価することを対象とする。付録Aに示されるようなプロトコールに基づいて、以下の改変を行って実験を実施した:
1.ヒトMAdCAM-1タンパク質(R&D、カタログ番号:6056-MC)を使用して、5μg/mlの濃度でマイクロ流体チャネルをプレコーティングした。
2.ヒト全血サンプルに以下の抗体を添加して、特定の白血球サブセットを同定した:
CD4-Alexa488
CD8-PE
CD15-APC
CD19-BV510
【０２５９】
細胞遊走挙動を特性決定するために、さまざまな細胞動態パラメータを利用して、α4β7インテグリンのリガンド結合活性を評価した。図9Aに示されるように、Mn2+処置は、未処置対照と比較して、MAdCAM-1基板上での相互作用するCD4、CD8、CD15及びCD19細胞の数に影響を及ぼさなかった。しかし、CD4及びCD8細胞の平均速度は、未処置対照(CD4、1,227.3±115.0及びCD8、2,248.8±293.2)と比較して、それぞれ167.2±21.4及び375.0±64.1μm/分に有意に(p<0.01)低減されたが、このような低減は、CD15及びCD19細胞では検出されなかった(図9B)。これらの結果は、Mn2+が、α4β7インテグリンのMAdCAM-1基板と結合する能力を増強でき、このことが、より強力な細胞-MAdCAM-1相互作用及びより低速の相互作用する白血球につながり得ることを示す。
【０２６０】
その遊走の平均速度に基づいて、全部の相互作用する細胞を、実施例1に詳細に記載されるように、静止(<5μm/分)、クローリング(5〜20μm/分)、スローローリング(20〜300μm/分)及びローリング細胞(300〜6000μm/分)にわけた。図9E及び9Fに示されるように、Mn2+なし対照と比較して、Mn2+は、静止、クローリング及びスローローリングCD4及びCD8細胞の数を有意に(p<0.01)増大したが、迅速ローリングCD4及びCD8細胞の数は、有意に低減された(図9E及び9F)。これらの結果は、図9Bに示されるように、細胞速度に対するMn2+効果と一致する。相互作用するCD15及びCD19細胞に対する明らかなMn2+効果は検出されなかった(図9G及び9H)。
【０２６１】
さらに、相互作用するCD4、CD8及びCD19細胞の真直性は、未処置対照と比較して、Mn2+処置によって有意に(p<0.01)低減され、より強力なMn2+誘導性細胞及び基板相互作用を示す。同様に、Mn2+はまた、CD4及びCD8細胞の滞留時間を、未処置対照(CD4、54.1±6.0及びCD8、14.2±1.8秒)と比較して、それぞれ135.8±11.4及び138.8±12.9秒に有意に(p<0.01)増大した(図9D)。
【０２６２】
総合すると、これらの知見は、Mn2+の、α4β7インテグリン活性を増強し、より強力な細胞-MAdCAM-1相互作用につながる能力を実証した。これらの結果はまた、LAFA例示的実施形態の、in vitroで全血サンプルを使用してα4β7インテグリン活性を正確に及び/又は定量的に評価する能力を示す。
【０２６３】
さらに、LAFAの使用は、その他の白血球接着分子の接着機能を評価するように拡張できる。本研究では、白血球α4β1及びα4β7インテグリンの、内皮VCAM-1及びMAdCAM-1との相互作用を調べ、α4インテグリンの活性化及び阻害を定量的に検出する能力が、データによって明確に実証された。本明細書において記載される技術は、多数のその他のヒト疾患の病態形成にも関与している、白血球のその他の結合分子としてその他の白血球接着分子に十分に容易に拡張できる(例えば、実施例16及び21)。例えば、白血球接着機能に対する白血球によって発現されたケモカイン受容体の効果も、実施例17及び28に詳述されるものと同一の技術を使用して研究できる。結果として、LAFA例示的実施形態の適用は、多数のその他の薬物及びヒト疾患に相当に拡張され得る。
【０２６４】
潜在的適用として以下が挙げられる:
-その他の既存の薬物のための患者群化/層別化、
-その他のヒト疾患における新規治療標的の同定、及び
-その他の既存の薬物に適用を拡張すること。
【０２６５】
これらの白血球接着分子の候補、その特異的リガンド、関連疾患、これらの分子を標的とする薬物及び薬物製造業者として、以下の表3に示されているものが挙げられる。
【０２６６】
表3-対象の、その他の白血球接着分子候補、リガンド、疾患及び薬物
【０２６７】
【表３】
2019537031.tif 000005
【０２６８】
[実施例11]
α4β7インテグリンの基礎炎症状態の半定量的評価
本実施例は、特定の例示的実施形態において使用され得る半定量的評価ツールを示すことを対象とする。
【０２６９】
図9B〜9Dに示されるように、α4β7インテグリンの基礎炎症状態を特性決定するために範囲パラメータを使用できる。図9Bでは、対照及びMn2+処置白血球の平均白血球細胞速度を、それぞれ、10及び1であると(相対速度指数(RSI)とも呼ばれる)任意に設定すると、RSI値は、個々の対象及び/又は1人以上の対象においてα4β7インテグリン接着機能を評価するための半定量的ツールを提供する。例えば、CD4細胞では、平均白血球細胞速度は、Mn2+の不在下及び存在下で1,127.3及び167.2μm/分であり、次いで、これをそれぞれ、10及び1、CD4細胞のRSI値として定義できる。対象のCD4細胞RSI値が、10及び1の間に入る場合には、RSIが1に近いほど、α4β7インテグリンはより活性であり、基礎細胞炎症性状態はより高い。
【０２７０】
同様に、図9Cでは、対照及びMn2+処置白血球の平均滞留時間を、それぞれ、1及び10であると(相対滞留時間指数(RDTI)とも呼ばれる)任意に設定すると、RDTI値はまた、α4β7インテグリン接着機能を評価するための半定量的ツールを提供する。例えば、CD4細胞では、平均白血球細胞滞留時間は、Mn2+の不在下及び存在下で54.1及び135.9秒であり、次いで、これをそれぞれ、10及び1、CD4細胞のRDTI値として定義できる。この場合には、RDTIが10に近いほど、α4β7インテグリンはより活性である。
【０２７１】
図9Dでは、対照及びMn2+処置白血球の平均真直性値を、それぞれ、10及び1であると(相対真直性指数(RSTI)とも呼ばれる)任意に設定すると、RSTIは、α4β7インテグリン接着機能を評価するための半定量的アプローチを提供する。例えば、CD4細胞では、平均白血球細胞真直性は、Mn2+の不在下及び存在下で0.76及び0.60であり、次いで、これをそれぞれ、10及び1、CD4細胞のRSTI値として定義できる。この場合には、RSTIが1に近いほど、α4β7インテグリンはより活性である。
【０２７２】
α4β7インテグリンの基礎炎症性レベルを、対象(単数又は複数)、例えば、多発性硬化症、クローン病、大腸炎、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性甲状腺炎、虫垂炎、憩室炎、サルコイドーシス、皮膚疾患、脈管炎、ループス及び強皮症又はそれらの組合せを有する患者のα4β7インテグリン活性化の基礎レベル及び/又は基礎炎症状態を評価するための半定量的ツールとして使用できる。1以上の白血球サブセットにおけるRSI、RDTI、RSTI試験又はそれらの組合せ及び作製されたデータを使用して、炎症性疾患状態と関連するとして対象の状態を評価できる。
【０２７３】
[実施例12]
ベドリズマブ効力の検出
本実施例は、白血球接着機能アッセイの例示的実施形態を使用してベドリズマブ効力を検出することを対象とする。実施例10に記載されるプロトコールに基づいて、以下の改変を行って、実験を実施した:
【０２７４】
1.血液サンプルを、さまざまな用量のベドリズマブ(Takeda)を用いて室温でおよそ5分間処置し、その後、LAFA例示的実施形態のために使用した。Mn2+によって活性化されたサンプルについて、血液を、Mn2+を用いて室温でおよそ5分間処置し、その後、種々の用量のベドリズマブを用いて室温でおよそ5分間処置した。
【０２７５】
ベドリズマブ、中和抗ヒトα4β7インテグリン抗体が、クローン病及び大腸炎を含む炎症性腸疾患を有する患者の治療のために使用される。ベドリズマブは、α4β7インテグリン接着機能を阻害し、白血球動員の低減につながる。したがって、本研究では、特定の実施形態に従う系の能力を使用して、接着性基板としてMAdCAM-1を使用して、ベドリズマブによって阻害されたα4β7インテグリン接着機能を検出した。全血サンプルを、全血においてさまざまな用量のベドリズマブを用いて処置し、その後、白血球接着機能アッセイの例示的実施形態のために使用した。
【０２７６】
Mn2+の不在下では、相互作用するCD4及びCD8細胞の数に対する明らかなベドリズマブ(0.01から1μg/mlの範囲)効果は、検出されなかった(図10A及び10C)。ベドリズマブなし対照(906.7±27.6μm/分)と比較して、0.01μg/mlのベドリズマブ処置は、CD4細胞において411.5±85.9μm/分への平均細胞速度の低減につながった(図10B)。同様に、CD8細胞の細胞速度も、同一用量のベドリズマブによって2,974.6±845.3から2,248.6±373.2μm/分に低下した(図10D)。これらの結果は、0.01μg/mlのベドリズマブが、CD4及びCD8細胞とMAdCAM-1基板との間の相互作用をわずかに増強することを示す。1μg/mlで、低減された相互作用するCD4細胞の速度を徐々に増大し、ベドリズマブなし対照と同一レベルに到達し、これは、高用量(>=0.1μg/ml)のベドリズマブが、CD4細胞及びMAdCAM-1基板の間の相互作用に対して阻害効果を有することを示す(図10B)。他方、ベドリズマブの増大は、CD8細胞の速度に対して効果を有さない(図10D)。
【０２７７】
しかし、Mn2+によって活性化された細胞では、ベドリズマブの増大(0.1から10μg/mlへ)は、129.4±30.3個細胞/mm2(ベドリズマブなし対照)から16.9±5.8個細胞/mm2(10μg/mlのベドリズマブ)への、相互作用するCD4細胞の徐々に低下した数をもたらし、これは、MAdCAM-1基板上でのCD4細胞動員に対するベドリズマブの阻害効果を示す(図10A)。また、Mn2+によって活性化されたCD8細胞において、同様のベドリズマブ阻害効果が観察された(図10C)。個々のドナーにおけるMn2+によって活性化されたCD4細胞のIC50値を、実施例5に記載されるように算出した。表4に示されるように、ドナー4のIC50値は、ドナー2よりもほぼ2倍高く、種々の対象においてベドリズマブ感受性レベルを検出するためのLAFA例示的実施形態の良好な能力を示す。
【０２７８】
さらに、CD4細胞の平均速度は、ベドリズマブ濃度の増大につれて徐々に増大し、10μg/mlで、細胞速度は、ベドリズマブなし対照と同一レベル又は実質的に同一のレベルに達した(図10B)。これは、ベドリズマブがα4β7インテグリン機能を阻害し、MAdCAM-1との弱められた細胞相互作用及び増大した細胞速度につながることを示す。同様に、Mn2+処置CD8細胞の平均速度も、ベドリズマブ用量の増大に連れて増強され(図10D)、これは、MAdCAM-1基板上でのCD8細胞動員に対するベドリズマブの同様の阻害効果を示す。ベドリズマブ用量応答曲線は、Mn2+を用いて及び用いずに処置されたCD4細胞の間でわけられ、これが、特定の例示的実施形態の、異なるレベルのベドリズマブ感受性を正確に決定する能力を実証するということも留意された(図10B)。
【０２７９】
総合すると、これらの結果は、LAFA例示的実施形態の、ベドリズマブ効力だけでなく、種々の対象間のベドリズマブ感受性のわずかな相違も正確に及び/又は定量的に評価する能力を示す。
【０２８０】
【表４】
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【０２８１】
さらに、CD4細胞の平均速度は、ベドリズマブ濃度の増大に連れて徐々に増大し、10μg/mlで、細胞速度は、ベドリズマブなし対照と同一レベル又は実質的に同一レベルに達した(図13B)。これは、ベドリズマブがα4β7インテグリン機能を阻害し、MAdCAM-1との弱められた細胞相互作用及び増大した細胞速度につながることを示す。同様に、Mn2+処置CD8細胞の平均速度も、ベドリズマブ用量の増大に連れて増強し(図13D)、これは、MAdCAM-1基板上でのCD8細胞動員に対するベドリズマブの同様の阻害効果を示す。ベドリズマブ用量応答曲線は、Mn2+を用いて及び用いずに処置されたCD4細胞の間でわけられ、これが、特定の例示的実施形態の、異なるレベルのベドリズマブ感受性を正確に決定する能力を実証するということも留意された(図13B)。
【０２８２】
総合すると、これらの結果は、LAFA例示的実施形態の、ベドリズマブ効力だけでなく、種々の対象間のベドリズマブ感受性のわずかな相違も正確に及び/又は定量的に評価する能力を示す。
【０２８３】
[実施例13]
従来のリガンド占有アッセイと比較した、LAFAの正確性及び/又は感度の利点。
本実施例は、従来のリガンド占有アッセイと比較されるような、ベドリズマブ効力を評価するための、特定の例示的実施形態に従うLAFA例示的実施形態の正確性及び/又は感度の利点を示すことを対象とする。実施例6に記載されたプロトコールに基づいて、そのプロトコールに対して以下の改変を行い、実験を実施した:
1.全血を、さまざまなベドリズマブ用量(0.001、0.01、0.1、1、10及び100μg/ml)で処置し、その後、FACS解析のための細胞調製プロセスのために使用した。
【０２８４】
対照細胞では、0.01μg/ml未満のベドリズマブ用量は、PE陽性CD4細胞を引き起こさず、これは、そのリガンド(α4β7インテグリン)とのベドリズマブ結合が誘導されなかったことを示す(図11、丸)。増大した用量のベドリズマブは、リガンド結合を徐々に誘導し、1μg/mlで50.7%のPE陽性CD4細胞のプラトーに到達した。より高いベドリズマブ用量(最大100μg/ml)は、リガンド結合の有意な増大をもたらさず、これは、ベドリズマブリガンド結合が、1μg/ml(図11)で飽和であったことを示す。
【０２８５】
Mn2+によって活性化された細胞では、ベドリズマブによるα4β7インテグリン占有は、未処置細胞において観察されたものとほぼ同一であった。図11(四角)で示されるように、PE陽性CD4リンパ球のパーセンテージも1μg/mlのベドリズマブで飽和であった。これらの結果は、従来のリガンド占有アッセイが、図10及び実施例12に示されるように、LAFA例示的実施形態を使用して検出可能であったα4β7インテグリンのMn2+によって誘導された活性化を検出できなかったことを示す。この実施例は、LAFA例示的実施形態が、従来のリガンド占有アッセイと比較して、in vitroでベドリズマブ効力を決定するためのより正確な及び/又はより高感度アッセイであることを例示する。
【０２８６】
[実施例14]
VCAM-1基板上での白血球動員に対するベドリズマブ効果
本実施例は、VCAM-1基板上での白血球動員に対するベドリズマブの効果を決定することを対象とする。全血サンプルを、実施例1及び12に記載されたように、低(10μg/ml)及び高(100μg/ml)用量のベドリズマブを用いて処置し、その後、白血球接着機能アッセイのために使用した。
【０２８７】
ベドリズマブは、α4β1インテグリンに対して交差反応性を有さない、α4β7インテグリンと特異的に結合するモノクローナル抗体である。ベドリズマブは、VCAM-1基板上で白血球動員に影響を及ぼすと予測されない。これを確認するために、全血を、2用量のベドリズマブ(10及び100μg/ml)を用いて処置し、その後、LAFA解析のために使用した。
【０２８８】
図12に示されるように、相互作用するCD4、CD8、CD15及びCD19細胞の数に対してベドリズマブの効果は検出されなかった。これらの結果は、ベドリズマブが、VCAM-1基板上での白血球動員に影響を及ぼすことができないことを示し、ベドリズマブのその標的分子に対する高い敗血性(septicity)が確認される。これらの知見はまた、薬物開発及び/又はスクリーニングプロセスの際の、LAFA例示的実施形態の、以下:薬物、小分子、抗体、ペプチド及び化合物のうち1種以上の潜在的なオフターゲットを同定する能力を示す。
【０２８９】
[実施例15]
MAdCAM-1基板上での白血球動員に対するナタリズマブ効果
本実施例は、MAdCAM-1基板上での白血球動員に対するナタリズマブの効果を決定することを対象とする。全血サンプルを、実施例5及び12に記載されたように、10μg/mlのナタリズマブを用いて処置し、その後、白血球接着機能アッセイのために使用した。
【０２９０】
ナタリズマブは、α4β1インテグリンに対するモノクローナル抗体であるが、α4β7インテグリンに対して交差反応性を有するとも知られている。ナタリズマブはまた、MAdCAM-1基板上での白血球動員を阻害し得る。これを試験するために、健常全血を、10μg/mlのナタリズマブを用いて又は用いずに処置し、その後、基板としてMAdCAM-1を使用するLAFA解析のために使用し、次いで、相互作用する細胞の数を決定した。
【０２９１】
図13に示されるように、10μg/mlのナタリズマブは、MAdCAM-1上でのCD4及びCD8細胞動員をほぼ完全に阻害した。これらの結果はまた、薬物開発及び/又はスクリーニングプロセスの際の、LAFA例示的実施形態の、以下:薬物、小分子、抗体、ペプチド及び化合物のうち1種以上の潜在的なオフターゲットを同定する優れた能力を示す。
【０２９２】
[実施例16]
Pセレクチン及びEセレクチン基板上での白血球動員に対するナタリズマブ及びベドリズマブ効果。
本実施例は、Pセレクチン及びEセレクチン基板上での白血球動員に対するナタリズマブ及びベドリズマブ効果を検出するために白血球接着アッセイの例示的実施形態を使用することを対象とする。付録Iに示されるプロトコールを、以下の改変を用いて使用し、実験を実施した:
1.マイクロ流体チャネルを、ヒトP-セレクチンタンパク質(R&D System、カタログ番号:ADP3)及びヒトE-セレクチンタンパク質(R&D System、カタログ番号:ADP1)の組合せを、それぞれ、10μg/ml及び0.5μg/mlの濃度で用いてプレコーティングした。
【０２９３】
Pセレクチン及びEセレクチンは、血管内皮細胞によって発現される2種の接着分子である。P及びEセレクチンは、その内皮リガンド、P-セレクチン糖タンパク質リガンド1(PSGL-1)と選択的に結合して、血管内皮上での白血球テザリング及びローリングを誘導する。ナタリズマブ及びベドリズマブは、白血球α4インテグリンと特異的に結合するので、ナタリズマブ又はベドリズマブのいずれかが、PSGL-1を発現する白血球の機能に影響を及ぼす。したがって、ナタリズマブ又はベドリズマブは、P及びEセレクチン(PSGL-1リガンド)基板上での白血球動員に対して影響を有さない場合もある。
【０２９４】
図14に示されるように、ナタリズマブ処置によるCD15細胞の速度のわずかな増大を除いて(図14B)、未処置対照と比較して、相互作用する細胞の数又は速度又は滞留時間又は真直性に対するナタリズマブ又はベドリズマブのいずれかのその他の明らかな効果は検出されなかった。これらの結果は、ナタリズマブもベドリズマブも、P及びEセレクチン基板上での白血球動員に対して影響を及ぼさない場合があることを示す。
【０２９５】
ナタリズマブ及びベドリズマブ効力試験(実施例5及び12に記載された)では、薬物効力が最大に近い又は上回っている場合、細胞相互作用はほとんど又は全く検出されない。血液採取プロセスの際に血液細胞が損傷を受け得る可能性を排除するために、P及びEセレクチンアッセイは、血液細胞の生存力を確実にするための適した内部対照アッセイを提供する。同様に、P及びEセレクチンアッセイをまた、それだけには限らないが、エトロリズマブ(Etrolizumab)、エファリズマブ、PTG-100及びBio-1211を含むその他の抗接着薬の効力の検出のために内部対照として使用してもよい。
【０２９６】
[実施例17]
CXCR1及びCXCR4を発現する白血球の機能の評価。
本実施例は、CXCR1及びCXCR4を発現する白血球の機能並びにVCAM-1基板上での白血球動員に対するその効果を評価するために白血球接着機能アッセイの例示的実施形態を使用することを対象とする。付録Iに示されるプロトコールを、以下の改変を用いて使用し、実験を実施した:
1.マイクロ流体チャネルを以下の基板(単数及び/又は複数)のうち1種を用いてプレコーティングし、その後、アッセイのために使用した:
VCAM-1(10μg/ml)、
VCAM-1(10μg/ml)+IL-8(1μg/ml、R&D System、カタログ番号:208-IL)、
VCAM-1(10μg/ml)+SDF1α(1μg/ml、R&D System、カタログ番号:350-NS)。
【０２９７】
IL-8及びSDF-1αは、濃度勾配を形成することによって白血球の遊走を導き得る2種のケモカインである。IL-8は、主に、好中球走化作用を誘導すると示されているが、SDF-1αは、大部分はTリンパ球走化作用を調節する。CXCR1及びCXCR4、それぞれIL-8及びSDF1αの受容体は、白血球膜上で発現され、白血球遊走の調節において役割を果たし得る。結果として、CXCR1及びCXCR4は、白血球遊走挙動の調節において役割を果たす。この実施例では、IL-8及びSDF1αを、VCAM-1と組み合わせて接着性基板として使用し、その結果、CXCR1及びCXCR4を発現する白血球の機能を評価できる。
【０２９８】
VCAM-1単独と比較して、SDF1α及びVCAM-1は、相互作用するCD4及びCD8細胞の数を有意に(p<0.05)低減したが、CD15細胞の数は有意に増大し(図15A)、これらの白血球細胞でのCXCR4の発現及び機能を示す。一貫して、SDF1αはまた、相互作用するCD4細胞の真直性を有意に(p<0.05)低減し、これは、CD4細胞が、SDF1αからシグナルを受け取ることができることを示し、CXCR4の機能的役割が確認される(図15B)。さらに、相互作用するCD15細胞の滞留時間が、VCAM-1及びIL-8の存在下で、VCAM-1単独と比較して有意に増大し、これは、CD15細胞遊走挙動の調節におけるCXCR1の機能的役割を示す(図15C)。
【０２９９】
総合すると、これらの結果は、LAFA例示的実施形態の、ケモカイン受容体の機能を検出する能力及び特定の白血球サブセットにおける白血球遊走挙動に対するその効果を示す。次いで、同様の戦略を使用して、ケモカイン受容体及び/又はケモカインを発現するその他の白血球の機能を評価できる。特定のケモカイン受容体及び/又はケモカインの発現及び機能は、疾患状態において活性化され得ることが示されている。したがって、LAFA例示的実施形態は、これらの異常な活性化を定量的に同定するための適したツールを提供し、次いで、これを、個人ベースで及び/又は1人以上の対象のための最適治療を開発するために使用できる。
【０３００】
[実施例18]
ベドリズマブ療法に対してIBD患者が応答する可能性を予測するため。
本実施例は、ベドリズマブ療法に応答する患者の可能性を予測するために白血球接着機能アッセイの例示的実施形態を使用することを対象とする。実施例10に記載されたプロトコールに基づいて、以下の改変を行って、実験を実施した:
1.血液を、現在ベドリズマブ療法を受けていない、活発な炎症性腸疾患を有する患者から採取した。患者の白血球の、ベドリズマブに応答する能力を試験するために、血液を、種々の用量のベドリズマブ(例えば、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3及び10μg/ml)を用いて処置し、その後、LAFA解析のために使用した。
【０３０１】
未処置対照と比較して、ベドリズマブ処置(0.1μg/ml)は、IBD患者番号1において相互作用するCD4及びCD8白血球の速度を増大した(図16A及び16D)が、相互作用するCD4及びCD8細胞の数に対する明らかなベドリズマブ効果は検出されなかった。これらの結果は、ベドリズマブが、白血球とMAdcAM-1基板の間の相互作用を弱め、細胞速度の増大につながったことを示した。これらの知見はまた、患者番号1から得たCD4及びCD8白血球の、in vitroでベドリズマブ処置に応答する能力を実証し、これに基づいて、患者番号1はベドリズマブ療法に応答する可能性があり得ると推定され得る。この推定は、IBD患者番号1がまた、ベドリズマブ処置に最良に応答すると推定された実施例24及び25から引き出された結論と一致する。
【０３０２】
IBD患者番号2では、未処置対照と比較して、ベドリズマブ処置によってCD4白血球の速度も増大したが、CD8白血球ではこのような効果は検出されなかった(図16F及び16H)。これらの結果は、患者番号2から得たCD4白血球の、in vitroでベドリズマブ処置に応答する能力を示し、これは、IBD患者番号2もまた、ベドリズマブ療法に応答し得ることを示唆する。
【０３０３】
他方、IBD患者番号3では、未処置細胞と比較して、CD4及びCD8白血球の数に対するベドリズマブの明らかな効果は検出されなかった(図16I及び16K)。ベドリズマブ処置は、CD4細胞の平均速度を変更しなかったが、CD8細胞の速度は鋭く低減した(図16J及び16L)。これらの結果は、患者番号3から得た白血球の、in vitroでベドリズマブ処置に応答する能力がないことを示した。したがって、患者番号3は、ベドリズマブ療法に応答する可能性が低いと予測され得る。
【０３０４】
IBD患者番号4については、未処置対照と比較して、ベドリズマブ処置は、CD4及びCD8白血球の数において中程度の低減を引き起こし、MAdCAM-1基板上でのCD4及びCD8細胞の動員においてベドリズマブの阻害効果を示す。これらの結果に基づいて、患者番号4は、ベドリズマブ療法に応答するであろうと推定され得る。
【０３０５】
総合すると、この実施例における結果は、LAFA例示的実施形態の、ベドリズマブ療法に応答する可能性が高いIBD患者を層別化する能力(alibility)を示し、これは、層別化された患者集団におけるベドリズマブ療法の臨床寛解速度の増大に潜在的に(potential)つながり得る。さらに、同様の戦略を使用して、例えば、以下:PTG-100、ナタリズマブ、Bio-1211、エトロリズマブ(Etrolizumab)及びエファリズマブのうち1以上を含むその他の抗接着療法に、患者がどの程度応答する可能性があるかを予測できる。その他の適した抗接着療法はまた、この実施例及び/又はその他の例示的実施形態における手順概要を使用して評価され得る。
【０３０６】
[実施例19]
ナタリズマブ効力を受けているMS患者における薬物効力の検出
本実施例は、特定の例示的実施形態に従って、ナタリズマブ療法を受けている多発性硬化症(MS)患者においてナタリズマブ効力を評価するために白血球接着機能アッセイの例示的実施形態を使用することを対象とする。実施例1に記載されるプロトコールに基づいて、そのプロトコールに以下の改変を行って、実験を実施した:
1.血液を、現在ベドリズマブ療法を受けていないMS患者から採取した。
【０３０７】
血液サンプルを、薬物注入後種々の時点(2、4、6及び10週)で採取し、次いで、接着性基板としてVCAM-1を使用するLAFA例示的実施形態によって解析した。コパキソンは、α4インテグリン機能に対して何らかの影響を有する可能性が低いので、コパキソン療法中のMS患者を陰性対照群として使用した。
【０３０８】
Mn2+の不在下では、図20Aに示されるように、コパキソン患者において多数の相互作用するCD4細胞(326.9個細胞/mm2)が検出された。他方、ナタリズマブ注入の2週間後ではバックグラウンドレベルのCD4細胞(11.5個細胞/mm2)しか観察されず、この患者においてVCAM-1基板とのCD4細胞相互作用が完全に又は実質的に阻害されたことを示す。同様に、薬物注入の4週後に採取された血液サンプルにおいて、VCAM-1基板上での明らかなCD4動員は検出されず(図20A)、100%ナタリズマブ効力を示した。
【０３０９】
しかし、ナタリズマブ注入の6週後に、少数(23.9個細胞/mm2)の相互作用するCD4細胞が検出され、薬物注入の10週後に、より明らかなCD4細胞動員(70.1個細胞/mm2)が観察され、これは、これらの時点で最大よりも低いナタリズマブ効力を示した(図20A)。ナタリズマブ注入後6及び10週で(2及び4週ではない)、Mn2+処置によって相互作用するCD4細胞の滞留時間が増大され、薬物効力が、6及び10週で最大未満に低減されたと確認されたことも留意された(図20B)。
【０３１０】
総合すると、これらの結果は、ナタリズマブ療法を受けている患者において薬物効力を正確に、定量的に評価するためのLAFA例示的実施形態の優れた能力及び/又は感度を示す。ナタリズマブ感受性は、時間とともに、個々の対象間で著しく変わり得るのでLAFA例示的実施形態は、個人ベースで薬物効力をモニタリングするための迅速な、正確なツールを提供し、薬物治療的利益を最大化し、薬物によって誘導される副作用を最小にするための個別化された治療計画の開発を促進する。さらに、同様の戦略を使用して、以下:ベドリズマブ、エファリズマブ、PTG-100及びBio-1211のうち1以上を含むその他の抗接着薬の効力をモニタリングできる。その他の適した抗接着療法はまた、この実施例及び/又はその他の例示的実施形態における手順概要を使用して評価され得る。
【０３１１】
[実施例20]
臨床設定におけるポイントオブケア検査としてのLAFAの使用。
本実施例は、さまざまなポイントオブケア検査を開発するために白血球接着機能アッセイの例示的実施形態を使用することを対象とする。
【０３１２】
例えば、in vitroでナタリズマブの有効性を検出するポイントオブケア血液検査を開発するために本明細書において記載された技術を使用できる。血液検査は、解析デバイス、マイクロ流体システム(例えば、マイクロ流体ポンプ及びマイクロ流体チップ)、解析アルゴリズム(複数可)、データ送信プラットフォーム及び関連試薬を含み得る。図7に見られるように、ユーザー/患者は、1.指穿刺によって指先から血液サンプルを得、2.血液をチップ中にロードし、3.チップを解析デバイス中に挿入し、4.結果を得ることができる。
【０３１３】
ポイントオブケア血液検査によって、血清薬物濃度に関わらずナタリズマブ機能の直接的な評価が可能となり得る。現在の技術のうち、このような能力を有するものはない。血液検査は、<100μl(指穿刺量、例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900及び1,000μl)の全血しか必要とせず、30分足らず(例えば、5、10、15、20、25、30、40、50、60、90、120、180、240分)で結果を提供し得る。血液検査を、ナタリズマブ投与後種々の時点で利用し、血液検査によって薬物有効性の低減が検出された場合にのみ再投薬ナタリズマブ注入の必要性を知らせてもよいので、それを現在の治療計画に組み入れてもよい。結果として、血液検査は、個々の患者の個別化された治療計画の開発を促進し得る。血液検査を既存のデバイス及び/又はプラットフォーム又はさらにはスマートフォンと適合するように構成して、GP/専門家とのリモートデータ共有を可能にし、多忙なMS専門家の大幅に低減された作業負荷につながることが目的とされる。
【０３１４】
さらに、それだけには限らないが、
1.それだけには限らないが、ベドリズマブ、エトロリズマブ(Etrolizumab)、エファリズマブ、PTG-100及びBio-1211を含むその他の薬物の効力を決定するためのポイントオブケア検査、
2.薬物によって誘導される副作用のリスクを低減するために個人ベースで治療計画を最適化すること、
3.対象(単数又は複数)の健康状態をモニタリングすること、
4.個々の患者において白血球接着機能のマーカーを同定すること、
5.変更された白血球接着機能(健常対照と関連する)を同定すること、
6.対象(単数又は複数)の特定の療法に応答する可能性を推定すること、
7.未知病因論を有する、又は疾患診断を有さない対象(単数又は複数)にとって適した治療を推奨すること
を含むその他の臨床適用も、LAFA例示的実施形態から開発され得る。
【０３１５】
[実施例21]
白血球接着機能の個人プロフィール(白血球接着フィンガープリント)を作製するため。
本実施例は、単一健常対象から種々の時点で採取された複数の血液サンプルを解析するために、特定の例示的実施形態に従って白血球接着機能アッセイの例示的実施形態を使用することを対象とする。本実施例において使用されるLAFA例示的実施形態は、実施例1、10及び16に詳述されている。血液サンプルを基板としてVCAM-1(α4β1インテグリンリガンド)、MAdCAM-1(α4β7インテグリンリガンド)及びP-セレクチン(PSGL-1リガンド)を使用するLAFA例示的実施形態によって解析した。結果として、実施例3及び11に詳述されたように、白血球接着機能の基礎レベルの個人プロフィールを作製した。また、実施例4に詳述されたように、血液を5mM MnCl2を用いて処置し、その後、LAFA解析のために使用し、その結果、Mn2+誘導性活性化可能性を決定できる。
【０３１６】
LAFA例示的実施形態を使用して7回の血液検査(試験1〜試験7)を実施した。血液サンプルを、健常個体から、およそ3カ月の期間の間の、1週目、9週目、11週目、12週目、13週目、15週目及び16週目の種々の時点で採取した。この実施例の元々の目標は、これら7回の血液検査から得たデータを使用して、この健常個体の個人白血球接着機能プロフィールを作製することであった。しかし、この個体は、血液検査番号5(13週目)が実施された当日に、親しらず疼痛(親しらず付近の炎症を起こした歯肉)に苦しんでいた。以下に詳細に示されるように、血液検査番号5だけでなく、血液検査番号5の7日前に実施した血液検査番号4(12週目)においても異常な白血球活性化が検出された。
【０３１７】
VCAM-1基板上では、検査番号1〜6において、CD4及びCD8細胞真直性の極めて少ない変動が観察された量であった。これは、LAFA例示的実施形態の、異なる時点で一貫した結果をもたらす能力を実証する(図18C及び18H)。しかし、休止CD4及びCD8白血球において、その他の血液検査から得た結果と比較して異常に低い白血球速度が、血液検査番号4において観察され、これは、これらの白血球の活性化を示した。さらに、休止CD4及びCD8細胞において高い滞留時間も検出された(図18D及び18I)。また、CD4及びCD8細胞の滞留時間活性化可能性比(DTAPR、実施例4に記載された)も、血液検査番号4において高く、これは、一連で試験したその他の血液サンプルと比較して高い割合の活性化されたα4β1インテグリンを示した。これらの知見は、歯肉炎症の7日前に実施した血液検査番号4におけるCD4及びCD8白血球でのα4β1インテグリンの異常な活性化を示す。これらの結果は、全身及び/又は局所炎症における免疫応答の初期徴候を検出するためのマーカーとしてのDTAPRの使用を実証する。
【０３１８】
MAdCAM-1基板上では、CD4及びCD8白血球において平均細胞速度においてわずかな変動しか検出されず、白血球接着機能を評価するためのLAFA例示的実施形態の良好な一貫性を示した。しかし、親しらず疼痛が生じた血液検査番号5において、休止CD4細胞において低い真直性が観察された(図19C)。休止CD4細胞の滞留時間も、検査番号5において、一連で試験したその他の血液サンプルから見られた値と比較して異常に高かった(図19D)。真直性活性化可能性比(STAPR)の値は、CD4及びCD8白血球の両方において低く、これは、血液検査番号5においてCD4及びCD8白血球で高い割合の活性化されたα4β7インテグリンを示した(図19E及び19J)。これらの結果は、全身及び/又は局所炎症における免疫応答の評価及び/又は予測のためのマーカーとしてのATAPRの使用を実証する。
【０３１９】
P-セレクチン基板上では、血液検査番号4及び番号5において多数の相互作用するCD4及びCD8細胞が検出され、その他の試験結果と比較した場合に、これらの白血球において通常ではないPSGL-1(P-セレクチンリガンド)活性化を示す(図20A及び20E)。さらに、血液検査番号5におけるCD15細胞の数は、その他の検査の平均よりもほぼ8倍高く、これは、CD15白血球上の高度に活性化されたPSGL-1を示す(図20I)。CD4、CD8及びCD15細胞の平均細胞速度は、血液検査番号4及び番号5において異常に低く、これは、これらの白血球とP-セレクチン基板の間の強力な相互作用を示唆した(図20C、20G及び20K)。CD8及びCD15細胞の滞留時間は、血液検査番号5において、その他の血液検査結果と比較して異常に高かった。これは、CD8及びCD15白血球上のPSGL-1が高度に活性化され、白血球とP-セレクチン基板間の相互作用の増強につながることを示す。
【０３２０】
総合すると、これらの知見は、LAFA例示的実施形態の、対象における炎症性状態の基礎レベルの個人プロフィールを作製する能力を実証する。親しらず疼痛にも関わらず、VCAM-1基板上での細胞真直性(図18C及び18H)及びMAdCAM-1基板上での細胞速度(図19B及び19G)を含む、白血球遊走プロフィールのいくつかのパラメータは、この局所歯肉炎症によって影響を受けなかった。これらの知見は、白血球接着機能の検出のためのLAFA例示的実施形態の良好な再現性を実証する。
【０３２１】
しかし、炎症性状態のこの基礎レベルに基づいて、さまざまなその他のパラメータに対する歯肉炎症の効果は、急性炎症の最大7日前で明確に検出可能であった。本発明者らの結果は、血液検査番号4及び番号5におけるα4β1インテグリン、α4β7インテグリン及びPSGL-1の活性化を明確に示した。局所歯肉炎症の効果は、異なる白血球サブセットにおける異なるパラメータ間で著しく異なっているということも留意された。したがって、これらの結果は、異常な免疫応答の初期徴候を決定するための、特定の白血球サブセットでの特定のパラメータの変化の使用の可能性を示し、次いで、これを使用して、特定の疾患の可能性を予測できる。
【０３２２】
「白血球接着フィンガープリント」の作製
特定の白血球サブセットにおいて複数の白血球接着分子の接着機能を評価する能力を用いて、これまでよりもかなりより詳細に白血球接着機能を定量的に特性決定することが可能になる。複数の白血球接着分子の接着機能を、特定の接着性内皮分子基板を用いてプレコーティングされた個々のフローチャネルにおいて研究することができる。結果として、特定の白血球サブセット上での各接着分子の細胞遊走プロフィールを作製できる。先端バイオインフォマティクスと組み合わせて、個々の対象/患者の白血球接着フィンガープリントを作製できる。白血球接着フィンガープリントは、白血球異常性を同定するための有用なツールとして役立ち得る。したがって、白血球接着フィンガープリントの潜在的適用として、以下が挙げられる:
個別化された病態形成の決定
疾患の新規疾患マーカーの同定
疾患の初期徴候の同定
早期の、正確な診断の補助
疾患予測
健常なヒトにおいて健康状態をモニタリングすること(日常的な健康チェック)
【０３２３】
いくつかの実施形態は、未処理全血を使用して、複数の白血球サブセットでの複数の白血球接着分子の接着機能を同時に評価可能である。特定の例示的実施形態の潜在的適用は、特定の白血球分子又は特定の白血球サブセット又は哺乳動物の特定の種に限定されない場合がある。
【０３２４】
[実施例22]
多発性硬化症(MS)及び炎症性腸疾患(IBD)を有する患者において、白血球分子の基礎炎症状態を評価するため
本実施例は、特定の例示的実施形態に従って、健常対象対照と比較して、多発性硬化症(MS)を有する患者及び/又は炎症性腸疾患(IBD)患者における白血球接着機能の異常な活性化を同定することを対象とする。実施例1及び10に詳述されたように、血液サンプルを、MS及び/又はIBD患者から採取し、次いで、基板としてVCAM-1及びMAdCAM-1を使用する白血球接着アッセイ解析のために使用した。実施例3及び11に詳述されたように、α4β1インテグリン及びα4β7インテグリンの基礎炎症状態を算出した。
【０３２５】
実施例3及び11に詳述されたように、健常対象対照の基礎炎症状態を、MS及び/又はIBDを有する患者と比較するために、相対真直性指数(RSTI)、相対速度指数(RSI)及び相対滞留時間指数(RDTI)を使用した。対照群において使用するための健常対象を選択するためにこの実施例において使用された基準が、実施例3に示されている。
【０３２６】
図21Aに示されるように、MS及びIBD患者の両方において、健常対照と比較してCD4及びCD8白血球において有意に低いRSTI値が観察され、これは、MS及びIBD細胞におけるα4β1インテグリン活性化の増強を示した。CD4及びCD8白血球における有意に低いRSI値はまた、MS及びIBD患者においても検出され、これは、MS及びIBD細胞におけるα4β1インテグリンの異常に増大した基礎炎症状態を示した(図21B)。一貫して、低減されたRDTI値もMS及びIBD CD4及びCD8白血球において検出された(図21C)。これらの結果は、MS及びIBD患者におけるα4β1インテグリンの異常な活性化を明確に示す。
【０３２７】
図21Dに示されるように、健常対照と比較して、IBD患者から得たCD4白血球において有意に低いRSTI値が検出され、これは、IBD患者におけるCD4白血球における高度に活性化されたα4β7インテグリンを示す。一貫して、IBD患者から得たCD4白血球において低いRSI及びRDTI値がまた観察された。他方、MS患者では、α4β7インテグリンのこのような活性化は観察されず、これは、健常対照と関連して、MS CD4白血球における正常なα4β7インテグリン機能を示す。
【０３２８】
総合すると、これらの結果は、LAFA例示的実施形態の、MS及びIBD患者における特定の白血球サブセットでのα4β1インテグリン及びα4β7インテグリンの異常な活性化を検出する能力を明確に示す。実施例23において図18C及び18Hに示されるように、白血球真直性は、通常、親しらず疼痛などの局所炎症によってでさえ影響を受けない。したがって、MS及びIBD白血球における低いRSTI値を、以下:1.疾患診断を補助する、2.患者小集団を層別化する、3.疾患の初期徴候を検出する、及び4.個人ベースで治療条件を最適化するのうち1以上のための特定の疾患マーカーとして使用できる。RSTI、RSI及びRDTIの使用は、臨床設定における技術の適用を促進する。
【０３２９】
[実施例23]
多発性硬化症(MS)及び炎症性腸疾患(IBD)を有する患者における、白血球分子のMn2+によって誘導される活性化可能性を評価するため。
本実施例は、MS及びIBD患者における白血球分子のMn2+によって誘導された活性化可能性を評価することを対象とする。実施例1及び10に詳述されたように、血液サンプルを、MS及びIBD患者から採取し、次いで、基板としてVCAM-1及びMAdCAM-1を使用する白血球接着アッセイ解析のために使用した。実施例4に詳述されたように、α4β1インテグリン及びα4β7インテグリンのMn2+活性化可能性を算出した。
【０３３０】
実施例4に詳述されたように、健常対照の基礎炎症状態を、MS及びIBDを有する患者と比較するために、真直性活性化可能性比(STAPR)、速度活性化可能性比(SAPR)及び滞留時間活性化可能性比(DTAPR)を使用した。
【０３３１】
図22Aに示されるように、VCAM-1基板上でのIBD CD8白血球のSTAPR値は、健常対照よりも有意に(p<0.01)低く、これは、IBD CD8細胞における高い割合の活性化されたα4β1インテグリン及び低いMn2+によって誘導された活性化可能性を示唆した。一貫して、健常対照と比較して、IBD CD8白血球において有意に高いDTAPR値が観察された(図22C)。IBD CD4白血球のDTAPR値もまた、健常対照よりも高く、これは、IBD CD4細胞における低いMn2+によって誘導された活性化可能性を示唆した(図22C)ということが注目された。健常対照と比較して、MAdCAM-1基板上でのMS及びIBD患者におけるSTAPR、SAPR又はDTAPRにおいて明らかな相違は検出されなかった(図22D〜22F)。
【０３３２】
総合すると、これらの結果は、LAFA例示的実施形態の、MS及びIBD患者における特定の白血球サブセットでのα4β1インテグリン及びα4β7インテグリンの異常なMn2+によって誘導された活性化可能性を検出する能力を明確に示す。したがって、1.疾患診断を補助する、2.患者小集団を層別化する、3.疾患の初期徴候を検出する、及び4.個人ベースで治療条件を最適化するために、STAPR、SAPR又はDTAPR値を、高度に特異的な疾患マーカーとして使用できる。STAPR、SAPR又はDTAPRの使用は、特定の例示的実施形態の臨床設定への適用を促進するはずである。
【０３３３】
[実施例24]
基礎炎症状態を使用して、抗接着療法に応答する対象(単数又は複数)の可能性を予測するため。
本実施例は、対象(単数又は複数)の、それだけには限らないが、モノクローナル抗体、小分子、化合物及びペプチドを含む抗接着療法に応答する可能性を予測するために、白血球分子の基礎炎症状態を使用することを対象とする。白血球接着分子の基礎炎症状態の算出は、実施例3及び11に詳述されている。
【０３３４】
例示的実施形態では、白血球分子の基礎炎症状態を使用して、それだけには限らないが、α4β1、α4β7インテグリン、αLインテグリン、αMインテグリン、CXCR1及びCXCR4を含むこれらの分子において高度に増強した活性を有する患者小集団を層別化できる。
【０３３５】
白血球接着性分子の機能を阻害し、したがって、疾患進行を減弱するために、いくつかの薬物(それだけには限らないが、ナタリズマブ、ベドリズマブ、エトロリズマブ(Etrolizumab)、PTG-100、Bio-1211及びエファリズマブを含む)が開発されている、又は開発中である。高い基礎炎症状態を有する患者小集団は、これらの分子の機能を阻害する処置に応答する可能性がより高いと予測され得る。
【０３３６】
例えば、図21Aに示されるように、IBD患者番号1は、4人のIBD患者すべての中で(amount)、VCAM-1基板上で最低のRSTI値を有しており、これは、患者番号1が、最も活性化されたα4β1インテグリンを有していたことを示す。この結果に基づいて、IBD患者番号1は、α4β1インテグリン機能を阻害する療法(例えば、ナタリズマブ又はBio-1211)に最良に応答し得ると予測できる。
【０３３７】
同様に、図21Dに示されるように、IBD患者番号1はまた、4人のIBD患者すべての中で(amount)、MAdCAM-1基板上で最低のRSTI値を有しており、これは、患者番号1が、最も活性化されたα4β7インテグリンを有していたことを示唆する。この結果に基づいて、患者番号1は、α4β7インテグリン機能を阻害する療法(例えば、ベドリズマブ又はPTG-100)に最良に応答し得ると予測できる。
【０３３８】
総合すると、本発明者らの結果は、RSI、RDTI及びRSTIの、対象(単数又は複数)が特定の療法に応答する可能性を予測するためのマーカーとしての能力を示す。
【０３３９】
したがって、これらのデータは、患者群化/層別化のためにLAFAを使用できることを明確に示す。例えば、MS患者においてα4β1インテグリンが活性化されているという事実にも関わらず、α4β1インテグリンの基礎炎症状態は、個々の患者の間で著しく変わり得る。本明細書において作製された半定量的ツールによって、個々の患者におけるα4β1インテグリンの活性化のレベルの決定が可能となる。結果として、高度に活性化されたα4β1インテグリンを有する患者を同定し、低α4β7インテグリン活性化を有する又はα4β7インテグリン活性化を有さない患者からわけることができる。次いで、その他の患者群と比較して、高度に活性化されたα4β1インテグリンを有するMS患者において、ナタリズマブ療法がより有効に働くと推定できる。
【０３４０】
[実施例25]
対象(単数又は複数)の、抗接着療法に応答する可能性を予測するための、Mn2+によって誘導される活性化可能性を使用するため。
本実施例は、対象(単数又は複数)の、それだけには限らないが、モノクローナル抗体、小分子、化合物及びペプチドを含む抗接着療法に応答する可能性を予測するための、Mn2+によって誘導される活性化可能性を使用することを対象とする。白血球接着分子のMn2+によって誘導される活性化可能性(例えば、真直性活性化可能性比(STAPR)、速度活性化可能性比(SAPR)及び滞留時間活性化可能性比(DTAPR))の算出は、実施例4に詳述されている。
【０３４１】
例示的実施形態では、それだけには限らないが、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、α3β1インテグリン、αVβ3インテグリン、αLβ2インテグリン、αIIbβ3インテグリン、α6β1インテグリン、α1β1インテグリン、α2β1インテグリン、αvβ3インテグリン及びα5β1インテグリンを含む特定の白血球分子のMn2+によって誘導される活性化可能性はまた、これらの分子の活性化形態の増強された割合(又は低いMn2+によって誘導される活性化可能性)を有する患者小集団を層別化するために使用できる。
【０３４２】
白血球接着性分子の機能を阻害し、したがって、疾患進行を減弱するために、いくつかの薬物(それだけには限らないが、ナタリズマブ、ベドリズマブ、エトロリズマブ(Etrolizumab)、PTG-100、Bio-1211及びエファリズマブを含む)が開発されている、又は開発中である。これらの分子の活性化形態の高い割合(又は低いMn2+によって誘導される活性化可能性)を有する患者小集団は、これらの分子の機能を阻害する処置に応答する可能性がより高いと予測され得る。
【０３４３】
例えば、健常対照とIBD患者間にSTAPRの有意な相違がないにも関わらず、IBD患者番号1は、すべてのIBD患者の中で最低のSTAPR値を有しており、これは、この患者における最高割合の活性化されたα4β1インテグリンを示唆した。この結果に基づいて、IBD患者番号1は、α4β1インテグリン機能を阻害する療法(例えば、ナタリズマブ又はBio-1211)に最良に応答し得ると予測できる。この予測は、同一患者(IBD番号1)が、抗α4β1インテグリン療法に最良に応答すると予測された実施例24におけるRSTI値に基づく予測と一致している。
【０３４４】
総合すると、本発明者らの結果は、対象(単数又は複数)の、特定の療法に応答する可能性を予測するためのマーカーとしての、STAPR、SAPR及びDTAPRの能力を示す。
【０３４５】
[実施例26]
白血球接着機能アッセイ(LAFA)から得た結果に基づく、特定の抗接着療法の推奨。
本実施例は、白血球接着機能アッセイの例示的実施形態を使用して、未知病因論を有する及び/又は疾患診断の前に、疾患診断の後に、又はそれらの組合せで、患者に特定の療法の推奨を提供することを対象とする。
【０３４６】
LAFA例示的実施形態を使用して、対象(単数又は複数)から得た白血球の、それだけには限らないが、モノクローナル抗体、小分子、化合物及びペプチドを含む特定の薬物に応答する能力を直接的に評価できる。これらの結果に基づいて、実施例18に詳述されるように、対象(単数又は複数)の、特定の療法に対する可能性を予測できる。
【０３４７】
LAFA例示的実施形態によって、それだけには限らないが、α4β1インテグリン、α4β7インテグリン、PSGL-1、CXCR1及びCXCR4を含む分子を発現するさまざまな白血球の機能の定量的評価が可能となり、実施例3及び11に詳述されたように、これらの分子の基礎炎症状態の半定量的評価につながる。これらの分子の基礎炎症状態に基づいて、次いで、実施例24に詳述されたように、対象(単数又は複数)の、特定の療法に対する可能性を予測できる。
【０３４８】
同様に、LAFA例示的実施形態はまた、Mn2+によって誘導される活性化可能性を評価するための半定量的ツールを提供し、その結果、特定の白血球サブセットでの活性化された白血球分子の割合を決定できる。これらの結果に基づいて、次いで、実施例25に詳述されたように、対象(単数又は複数)の、特定の療法に対する可能性を予測できる。
【０３４９】
LAFA例示的実施形態を使用して、未知病因論を有する及び/又は疾患診断前の対象(単数又は複数)のための処置を開発できる。例えば、健常対照と比較して、対象(単数又は複数)において変更されたα4β1インテグリン活性化が同定される場合には、抗α4インテグリン療法(例えば、ナタリズマブ)が、対象(単数及び/又は複数)における疾患診断の前に、この対象及び/又はこれらの対象のための治療にとって適したものであり得ると予測できる。
【０３５０】
例示的実施形態では、健常対照と比較して、1以上の対象における変更されたα4β1インテグリン活性の検出は、抗α4インテグリン療法(例えば、ナタリズマブ)が、これらの1人以上の対象の治療のために1人以上の対象に投与されるべきであることを示し得る。例示的実施形態では、1人以上の対象における変更されたα4β1インテグリン活性の検出は、抗α4インテグリン療法(例えば、ナタリズマブ)が、1人以上の対象において疾患進行を減弱するために1人以上の対象に投与されるべきであることを示し、ここで、抗α4インテグリン療法は、1人以上の対象において疾患診断の前に1人以上の対象に投与される。特定の例示的実施形態では、α4β1インテグリン活性化状態の基礎炎症状態の検出を使用して、抗α4インテグリン治療が、未知病因論を有する及び/又は疾患診断の前に、疾患診断の後に、又はそれらの組合せで、1人以上の対象にとって適したものであり得ることを示すことができる。特定の例示的実施形態では、α4β1インテグリンのMn2+によって誘導される活性化可能性の検出を使用して、抗α4インテグリン治療が、未知病因論を有する及び/又は疾患診断の前に、疾患診断の後に、又はそれらの組合せで、1人以上の対象にとって適したものであり得ることを示すことができる。
【０３５１】
表3に示されるように、疾患進行を減弱する目的で、これらの白血球分子の機能を阻害するために、さまざまな抗接着薬が開発されている。したがって、同様の戦略を使用して、対象(単数及び/又は複数)におけるその他の白血球分子(例えば、β1インテグリン、β7インテグリン、PSGL-1、CXCR1及び/又はCXCR4)の変更された活性化を同定でき、それに基づいて、未知病因論及び/又は疾患診断の前に、疾患診断の後に、又はそれらの組合せを用いて適した治療戦略を開発できる。
【０３５２】
さらに、LAFA例示的実施形態を使用して、それだけには限らないが、ナタリズマブ、ベドリズマブ、エファリズマブ、エトロリズマブ(Etrolizumab)、PTG-100及びBio-1211を含む特定の薬物の新規適用を同定できる。例えば、ナタリズマブ療法の適用は、現在MS及びクローン病に制限されている。実施例18、24及び25に詳述されたように、本明細書において開発された定量的アプローチを使用して、その他の炎症性疾患を有する患者から得た血液サンプルを解析してもよく、α4インテグリン機能が増大した患者集団の同定につながる。したがって、ナタリズマブ療法の、これらの患者集団において疾患進行を制御する能力が予測される。結果として、その他のヒト疾患へのナタリズマブ療法の適用が拡張され得る。
【０３５３】
[実施例27]
個々のMS及びIBD患者における抗接着療法の薬物感受性を決定するため。
本実施例は、実施例5及び12に詳述されたように、IC50値を使用して個々の患者において薬物感受性のレベルを決定するために白血球接着機能アッセイの例示的実施形態を使用することを対象とする。
【０３５４】
例えば、多発性硬化症(MS)患者においてナタリズマブ感受性を定量的に評価するために、実施例5に詳述されたように、MS患者から血液サンプルを採取し、次いで、基板としてVCAM-1を使用するLAFA解析のために使用した。表5に示されるように、患者番号1のナタリズマブIC50値(0.2657μg/ml)は、患者番号2(0.06843μg/ml)よりもおよそ4倍高く、これは、患者番号1は、患者番号2よりもナタリズマブに対して4倍より耐性であることを示唆した。さらに、患者番号1のナタリズマブIC50値はまた、表1に示されるように、健常対照における平均IC50値(0.03μg/ml)よりも高い。
【０３５５】
【表５】
2019537031.tif 000007
【０３５６】
別の実施例では、患者におけるベドリズマブ感受性を定量的に評価するためにIBD患者から血液サンプルを採取し、次いで、実施例12に詳述されたように、基板としてMAdCAM-1を使用するLAFAのために使用した。ベドリズマブが、健常対象においてMAdCAM-1基板上で休止CD4白血球の数を阻害しなかったことは図10A及び実施例12に示された。しかし、図23に示されるように、相互作用するCD4白血球の数は、ベドリズマブ濃度が増大するにつれ、徐々に低減し、これは、ベドリズマブの、IBD CD4白血球の動員を阻害する能力を示唆した。3人の個々のIBD患者においてベドリズマブIC50値も決定した。表6に示されるように、ベドリズマブIC50値は、患者番号3(2.573μg/ml)において、患者番号2(1.009μg/ml)よりも2.5倍を超えて高く、これは、異なるIBD患者の中でのベドリズマブ感受性の大きな可変性を示唆した。
【０３５７】
【表６】
2019537031.tif 000008
【０３５８】
総合すると、これらの結果は、LAFA例示的実施形態の、個々の患者における種々のレベルの薬物感受性を定量的に評価するためにIC50値を使用する能力を示す。LAFA例示的実施形態から得た結果は、広範な薬物及び/又は治療の個人ベースでの最適投与計画の開発を促進し得る。
【０３５９】
[実施例28]
多発性硬化症(MS)及び炎症性腸疾患(IBD)を有する患者においてCXCR1及びCXCR4を発現する白血球の機能を評価するため。
本実施例は、MS及びIBD患者においてCXCR1(IL-8受容体)及びCXCR4(SDF1α受容体)を発現する白血球の機能を評価することを対象とする。血液サンプルを患者から採取し、次いで、実施例17に詳述されたように、基板としてVCAM-1+IL-8又はVCAM-1+SDF1αを使用するLAFA例示的実施形態によって解析した。
【０３６０】
図25に示されるように、健常対照と比較して、相互作用するCD4(p<0.01)及びCD15(p<0.05)白血球の数は、VCAM-1+IL-8基板上でMS患者において有意に増大し、これは、MS患者における活性化されたCXCR1機能(図25A)を示唆した。VCAM-1+SDF1α基板上での相互作用するMS CD15細胞の数が増大し、これは、MS CD15白血球でのCXCR4の増大した活性を示唆した(図25E)。
【０３６１】
さらに、健常対照と比較して、IBD患者では、VCAM-1+SDF1α上でのCD4及びCD8白血球の滞留時間は、有意に(p<0.05)増大し、これは、IBD CD4及びCD8白血球におけるCXCR4の増強された活性化を示した。一貫して、IBD CD4及びCD8白血球の真直性は、健常と比較して低減され(統計的に有意にほとんど達した)、これは、IBD CD4及びCD8細胞の、CXCR4を介してSDF1αからのシグナルを受け取る増強された能力を示した。
【０３６２】
総合すると、これらの結果は、LAFA例示的実施形態の、MS及びIBDを有する患者においてCXCR1及びCXCR4を発現する白血球の異常な活性化を検出する能力を明確に示す。したがって、これらの検査を使用してまた、その他の疾患におけるその他の白血球ケモカイン受容体の機能を評価できる。アッセイから得た結果に基づいて、次いで、患者を層別化してもよい、及び/又は個人ベースでより標的化された療法を開発してもよい。例えば、CXCR1機能に対する薬物及び/又は化合物及び/又は抗体及び/又はペプチドの阻害効果が、薬物データベースにおいてLAFAによって同定される場合には(実施例15において詳述されたように)、この薬物は、CXCR1の増強された活性化を有する対象(単数又は複数)にとって治療的利益を有すると推定され得る。
【０３６３】
[実施例29]
MS及びIBD患者における白血球発現PSGL-1の接着機能を評価するため。
本実施例は、実施例16に詳述されたように、多発性硬化症(MS)及び炎症性腸疾患(IBD)を有する患者における白血球P-セレクチン糖タンパク質リガンド1(PSGL-1、P及びEセレクチンのリガンド)の接着機能を評価するために白血球接着機能アッセイの例示的実施形態を使用することを対象とする。
【０３６４】
図25Aに示されるように、健常対照と比較して、MS患者において増大した数のCD4、CD8及びCD15白血球が検出され、これは、これらのMS白血球におけるPSGL-1機能の上昇を示唆した。他方、健常対照と比較して、MS及びIBD白血球において、細胞速度、真直性又は滞留時間では、変化は観察されなかった(図25B〜25D)。
【０３６５】
これらの結果は、LAFA例示的実施形態の、MSを有する患者において増強されたPSGL-1接着機能を検出する能力を示すが、IBDではない。同様の戦略を使用して、その他の疾患においてその他の接着分子の変更された接着機能を検出できる。
【０３６６】
[実施例30]
画像及びデータ解析
本実施例は、さまざまな細胞動態パラメータを決定及び/又は使用して、細胞遊走挙動を特性決定できるように、Fiji画像解析ソフトウェア及びR studioを使用して、特定の例示的実施形態に従う白血球接着機能アッセイ(LAFA)の際に作製された画像を処理及び解析するために使用することを対象とする。さらに、以下の実施例において(toi the example below)画像を解析し、及び/又は結果を作製するためにその他の画像ソフトウェアを使用してもよい。
【０３６７】
例えば、図27に示されるように、画像及びデータ解析プロセスは、以下のステップからなり得る:
1.顕微鏡を用いて捉えられた生TIF画像を、Fiji画像解析ソフトウェアで開き、低速度シーケンスに再編成する。
2.正しいスケーリング情報を適用する。クロッピングによって画像からフローチャネルエッジを除去する。画像統合アルゴリズムを適用して、遍在するバックグラウンド蛍光を除去する。
3.解析のために画像シーケンスを個々のチャネルにわける。
4.Fijiソフトウェア由来のTrackMateプラグインを使用して、チャネルあたりの設定セルサイズ及び強度閾値を用いて個々のセルをトラッキングする。
5.TrackMateからのアウトプットをR統計ソフトウェアパッケージによってさらに解析して、データを、それだけには限らないが、細胞数、速度、真直性、滞留時間、拡散係数を含むさまざまな細胞動態パラメータのための所望の測定単位に変換する。
6.また、記述統計的グラフ(例えば、動態パラメータの箱ひげ図、速度分布ヒストグラム、真直性分布ヒストグラム、期間ヒストグラム、滞留時間分布ヒストグラム、運動性曲線、共通の起点グラフ、外観グラフ)を作製する。
【０３６８】
特許請求の範囲に記載された発明のさらなる利点は、特許請求の範囲に記載された発明の特定の実施形態を説明する以下の実施例から明らかとなる。
【０３６９】
例1A  疾患の進行を制御するのに適した薬物治療に対する対象の応答又は応答の可能性を評価する方法であって、ここで、薬物は、白血球動員、接着及び/又は遊走を変更可能であり、
対象からの血液サンプルを取得するステップ、
血液サンプルを、少なくとも1つの白血球機能アッセイ(LAFA)に付すステップであって、LAFAが、以下:少なくとも1種の内皮分子及び少なくとも1種の細胞のうち少なくとも1種以上への、白血球動員、接着及び/又は遊走を評価する、ステップ、並びに
少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に少なくとも部分的に基づいて、疾患の進行を制御するための薬物治療に対する、対象の応答又は応答の可能性を評価するステップ
を含む、方法。
【０３７０】
2A.疾患の進行を制御するのに適した薬物治療に対する対象の応答又は応答の可能性を評価する方法であって、ここで、薬物は、白血球動員、接着及び/又は遊走を変更可能であり、
対象からの血液サンプルを取得するステップ、
血液サンプルを、少なくとも1つの白血球機能アッセイ(LAFA)に付すステップであって、少なくとも1つのLAFAが、以下:少なくとも1種の内皮分子及び内皮分子を発現する少なくとも1種の細胞のうち少なくとも1種以上に対する、現実的な生理学的条件下での白血球動員、接着及び/又は遊走を定量的及び/又は半定量的に評価する、ステップ、並びに
少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に少なくとも部分的に基づいて、疾患の進行を制御するための薬物治療に対する、対象の応答又は応答の可能性を評価するステップ
を含む、方法。
【０３７１】
3A.少なくとも1つのLAFAが、以下の基板:VCAM-1、MAdCAM-1、P-セレクチン、E-セレクチン、IL-8、SDF1α及び内皮分子を発現する1種以上の細胞のうち1以上で実施される、例1Aの方法。
【０３７２】
4A.少なくとも1つのLAFAが、以下の基板:VCAM-1、MAdCAM-1、P-セレクチン、E-セレクチン、IL-8、SDF1α及び内皮分子を発現する1種以上の細胞のうち2以上で実施される、例1Aの方法。
【０３７３】
5A.少なくとも1つのLAFAが、以下の基板:VCAM-1、MAdCAM-1、P-セレクチン、E-セレクチン、IL-8、SDF1α及び内皮分子を発現する1種以上の細胞のうち3以上で実施される、例1Aの方法。
【０３７４】
6A.少なくとも1つのLAFAが、以下のパラメータ:検出されたローリング白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出されたクローリング白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均真直性、検出された個々の白血球細胞の平均転移及び検出された個々の白血球細胞の平均滞留時間のうち1以上を測定する、例1A〜4Aのうち1以上の方法。
【０３７５】
7A.少なくとも1つのLAFAが、以下のパラメータ:検出されたローリング白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出されたクローリング白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均真直性、検出された個々の白血球細胞の平均移動及び検出された個々の白血球細胞の平均滞留時間のうち2以上を測定する、例1A〜4Aのうち1以上の方法。
【０３７６】
8A.少なくとも1つのLAFAが、以下のパラメータ:検出されたローリング白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出されたクローリング白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均真直性、検出された個々の白血球細胞の平均移動及び検出された個々の白血球細胞の平均滞留時間のうち4以上を測定する、例1A〜4Aのうち1以上の方法。
【０３７７】
9A.少なくとも1つのLAFAが、以下のパラメータ:検出されたローリング白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出されたクローリング白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均真直性、検出された個々の白血球細胞の平均移動及び検出された個々の白血球細胞の平均滞留時間のうち6以上を測定する、例1A〜4Aのうち1以上の方法。
【０３７８】
10A.対象からの血液サンプルが、Mn2+を用いて処置され、少なくとも1つのLAFAが、Mn2+処置血液サンプルで実施され、その少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、1以上の指数を作製するために使用される1以上のパラメータを作製するために使用される、例1A〜9Aのうち1以上の方法。
【０３７９】
11A.少なくとも1つの健常血液サンプルが、Mn2+を用いて処置され、少なくとも1つのLAFAが、少なくとも1つの健常Mn2+血液処置サンプルで実施され、少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、1以上の指数を作製するために使用される1以上のパラメータを作製するために使用される、例1A〜10Aのうち1以上の方法。
【０３８０】
12A.対象からの血液サンプルから得た少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、1以上の指数を作製するために使用される1以上のパラメータを作製するための対照として使用される、1以上の例1A〜11Aの方法。
【０３８１】
13A.少なくとも1つの健常血液サンプルから得た少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、1以上の指数を作製するために使用される1以上のパラメータを作製するための対照として使用される、1以上の例1A〜12Aの方法。
【０３８２】
14A.以下の1以上の指数のうち1以上が作製される:対象の相対真直性指数(RSTI)、相対速度指数(RSI)及び相対滞留時間指数(RDTI)、1以上の例1A〜13Aの方法。
【０３８３】
15A.対象の血液の活性化可能性比が、対象のMn2+処置血液サンプルの少なくとも1つのLAFAの1以上の結果によって除された、対象の血液から得た少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に基づいて作製される、1以上の例1A〜14Aの方法。
【０３８４】
16A.疾患が、以下:異常な白血球動員、接着及び/又は遊走、炎症の進行、自己免疫状態の進行、免疫不全状態の進行及び感染状態の進行のうち1以上を少なくとも部分的に含む、例1A及び15Aのうち1以上の方法。
【０３８５】
17A.疾患が、多発性硬化症(MS)を少なくとも部分的に含む、例1A及び16Aのうち1以上の方法。
【０３８６】
18A.疾患が、炎症性腸疾患(IBD)を少なくとも部分的に含む、例1A及び17Aのうち1以上の方法。
【０３８７】
19A.少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、対象を層別化するために、及び疾患の進行を制御するための薬物治療に対する対象の応答又は応答の可能性を評価するために使用される、例1A〜18Aのうち1以上の方法。
【０３８８】
20A.少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、対象を層別化するために、及び疾患の進行を制御するための薬物治療に対する対象の応答又は応答の可能性を予測するために使用される、例1A〜19Aのうち1以上の方法。
【０３８９】
21A.少なくとも1つのLAFAが、静止又は非静止条件下で実施される、1以上の例1A〜20Aの方法。
【０３９０】
22A.1以上の例1A〜21Aの方法に基づいて少なくとも1つのLAFAを実施するための系。
【０３９１】
23A.1以上の例1A〜21Aの方法に基づいて少なくとも1つのLAFAを実施するためのデバイス。
【０３９２】
例1B.1種以上の白血球分子の接着機能を評価する方法であって、
対象からの血液サンプルを取得するステップ、
血液サンプルを、少なくとも1つの白血球機能アッセイ(LAFA)に付すステップであって、少なくとも1つのLAFAが、以下:少なくとも1種の内皮分子及び内皮分子を発現する少なくとも1種の細胞のうち少なくとも1種以上に対する、現実的な生理学的条件下での白血球動員、接着及び/又は遊走を定量的及び/又は半定量的に評価する、ステップ、並びに
少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に少なくとも部分的に基づいて、1種以上の白血球分子の活性化のレベルを評価するステップ
を含む、方法。
【０３９３】
2B.少なくとも1つのLAFAが、以下の基板:VCAM-1、MAdCAM-1、P-セレクチン、E-セレクチン、IL-8、SDF1α及び内皮分子を発現する1種以上の細胞のうち1以上で実施される、例1Bの方法。
【０３９４】
3B.少なくとも1つのLAFAが、以下の基板:VCAM-1、MAdCAM-1、P-セレクチン、E-セレクチン、IL-8、SDF1α及び内皮分子を発現する1種以上の細胞のうち2以上で実施される、例1Bの方法。
【０３９５】
4B.少なくとも1つのLAFAが、以下の基板:VCAM-1、MAdCAM-1、P-セレクチン、E-セレクチン、IL-8、SDF1α及び内皮分子を発現する1種以上の細胞のうち3以上で実施される、例1Bの方法。
【０３９６】
5B.少なくとも1つのLAFAが、以下のパラメータ:検出されたローリング白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出されたクローリング白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均真直性、検出された個々の白血球細胞の平均移動及び検出された個々の白血球細胞の平均滞留時間のうち1以上を測定する、例1B〜4Bのうち1以上の方法。
【０３９７】
6B.少なくとも1つのLAFAが、以下のパラメータ:検出されたローリング白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出されたクローリング白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均真直性、検出された個々の白血球細胞の平均移動及び検出された個々の白血球細胞の平均滞留時間のうち2以上を測定する、例1B〜4Bのうち1以上の方法。
【０３９８】
7B.少なくとも1つのLAFAが、以下のパラメータ:検出されたローリング白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出されたクローリング白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均真直性、検出された個々の白血球細胞の平均移動及び検出された個々の白血球細胞の平均滞留時間のうち4以上を測定する、例1B〜4Bのうち1以上の方法。
【０３９９】
8B.少なくとも1つのLAFAが、以下のパラメータ:検出されたローリング白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出されたクローリング白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均真直性、検出された個々の白血球細胞の平均移動及び検出された個々の白血球細胞の平均滞留時間のうち6以上を測定する、例1B〜4Bのうち1以上の方法。
【０４００】
9B.対象からの血液サンプルが、Mn2+を用いて処置され、少なくとも1つのLAFAが、Mn2+処置血液サンプルで実施され、その少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、1以上の指数を作製するために使用される1以上のパラメータを作製するために使用される、例1B〜9Bのうち1以上の方法。
【０４０１】
10B.少なくとも1つの健常血液サンプルが、Mn2+を用いて処置され、少なくとも1つのLAFAが、少なくとも1つの健常Mn2+血液処置サンプルで実施され、少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、1以上の指数を作製するために使用される1以上のパラメータを作製するために使用される、例1B〜10Bのうち1以上の方法。
【０４０２】
11B.対象からの血液サンプルから得た少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、1以上の指数を作製するために使用される1以上のパラメータを作製するための対照として使用される、1以上の例1B〜11Bの方法。
【０４０３】
12B.少なくとも1つの健常血液サンプルからの少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、1以上の指数を作製するために使用される1以上のパラメータを作製するための対照として使用される、1以上の例1B〜12Bの方法。
【０４０４】
13B.以下の1以上の指数のうち1以上が作製される:対象の相対真直性指数(RSTI)、相対速度指数(RSI)及び相対滞留時間指数(RDTI)、1以上の例1B〜13Bの方法。
【０４０５】
14B.対象の血液の活性化可能性比が、対象のMn2+処置血液サンプルの少なくとも1つのLAFAの1以上の結果によって除された、対象の血液から得た少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に基づいて作製される、1以上の例1B〜14Bの方法。
【０４０６】
15B.以下:異常な白血球動員、接着及び/又は遊走、炎症の進行、自己免疫状態の進行、免疫不全状態の進行及び感染状態の進行のうち1以上を少なくとも部分的に含む対象における疾患に関して、1種以上の白血球分子の活性化のレベルが、対象から得た血液サンプル中の1種以上の白血球分子の接着機能を評価するために使用される、例1B及び15Bのうち1以上の方法。
【０４０７】
16B.疾患が、多発性硬化症(MS)を少なくとも部分的に含む、例1B及び16Bのうち1以上の方法。
【０４０８】
17B.疾患が、炎症性腸疾患(IBD)を少なくとも部分的に含む、例1B及び17Bのうち1以上の方法。
【０４０９】
18B.少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、対象を層別化するために、及び疾患の進行を制御するための薬物治療に対する対象の応答又は応答の可能性を評価するために使用される、例1B〜18Bのうち1以上の方法。
【０４１０】
19B.少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、対象を層別化するために、及び疾患の進行を制御するための薬物治療に対する対象の応答又は応答の可能性を予測するために使用される、例1B〜19Bのうち1以上の方法。
【０４１１】
20B.少なくとも1つのLAFAが、静止又は非静止条件下で実施される、1以上の例1B〜20Bの方法。
【０４１２】
21B.少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、薬物を用いて処置されている対象において薬物効力を評価するために使用される、1以上の例1B〜20Bの方法。
【０４１３】
22B.少なくとも1つのLAFAの1以上の結果が、薬物を用いて処置されている対象において薬物感受性を評価するために使用される、1以上の例1B〜20Bの方法。
【０４１４】
23B.方法が対象において薬物感受性を評価するために使用され、
(1)対象に既知量の薬物を所定の期間投与するステップ、
(2)ステップ(1)後、対象から得られたさらなる血液サンプルを、少なくとも1つのLAFAに付すステップ、並びに
(3)少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に基づいて、対象において薬物感受性を評価するためにステップ(1)及び(2)を反復するステップ
をさらに含む、例1B〜20Bのうち1以上の方法。
【０４１５】
24B.方法が対象において薬物感受性を評価するために使用され、
(1)対象から得た血液サンプルの1以上の割合に1種以上の既知量の薬物をin vitroで添加するステップ、
(2)ステップ(1)後、血液サンプルの1以上の割合を少なくとも1つのLAFAに付すステップ、及び
(3)少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に基づいて、対象の薬物感受性を決定するステップ
をさらに含む、例1B〜20Bのうち1以上の方法。
【０４１６】
25B.方法が対象において薬物効力をモニタリングするために使用され、
(1)対象に既知量の薬物を所定の期間投与するステップ、
(2)ステップ(1)後、対象から得られたさらなる血液サンプルを、少なくとも1つのLAFAに付すステップ、並びに
(3)少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に基づいて、対象において薬物効力をモニタリングするためにステップ(1)及び(2)を反復するステップ
をさらに含む、例1B〜20Bのうち1以上の方法。
【０４１７】
26B.方法が対象において薬物効力をモニタリングするために使用され、
(1)対象からの血液サンプルの1以上の割合に1種以上の既知量の薬物をin vitroで添加するステップ、
(2)ステップ(1)後、血液サンプルの1以上の割合を少なくとも1つのLAFAに付すステップ、及び
(3)少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に基づいて、対象の薬物効力を決定するステップ
をさらに含む、例1B〜20Bのうち1以上の方法。
【０４１８】
27B.方法が対象の最小有効薬物用量を決定するために使用され、
(1)対象に既知量の薬物を所定の期間投与するステップ、
(2)ステップ(1)後、対象から得られたさらなる血液サンプルを、少なくとも1つのLAFAに付すステップ、並びに
(3)少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に基づいて、対象において最小有効薬物用量を決定するためにステップ(1)及び(2)を反復するステップ
をさらに含む、例1B〜20Bのうち1以上の方法。
【０４１９】
28B.方法が対象の最小有効薬物用量を決定するために使用され、
(1)対象からの血液サンプルに既知量の薬物をin vitroで添加するステップ、
(2)ステップ(1)後、既知量の薬物を含む血液サンプルを少なくとも1つのLAFAに付すステップ、並びに
(3)少なくとも1つのLAFAの1以上の結果に基づいて、対象を治療するための最小有効薬物用量が決定されるまでステップ(1)及び(2)を反復するステップ
をさらに含む、例1B〜20Bのうち1以上の方法。
【０４２０】
29B.方法が治療されている対象において副作用を低減する、例1B〜27Bのうち1以上の方法。
【０４２１】
30B.方法が対象からの血液サンプルにおいて1種以上の白血球分子の接着機能に対する薬物の効果を決定するために使用される、例1B〜28Bのうち1以上の方法。
【０４２２】
31B.対象の疾患マーカーを同定するために使用される、例1B〜29Bのうち1以上の方法。
【０４２３】
32B.方法が対象の健康を一定期間にわたってモニタリングするために使用され、
(1)対象からの1以上のさらなる血液サンプルを取得するステップ及び1以上のさらなる血液サンプルを少なくとも1つのLAFAに付すステップ、並びに
(2)対象の健康をモニタリングするために一定期間にわたってステップ(1)を反復するステップ
をさらに含み、
1以上の血液サンプル間の一定期間が、以下:1週間、2週間、3週間、1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、1年又は2年のうち少なくとも1以上である、例1B〜29Bのうち1以上の方法。
【０４２４】
1以上の例1B〜32Bの方法に基づいて、少なくとも1つのLAFAを実施するための系。
【０４２５】
1以上の例1B〜32Bの方法に基づいて、少なくとも1つのLAFAを実施するためのデバイス。
【０４２６】
例1C.(a)対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測する、(b)対象において疾患の進行を制御若しくは予防するために、薬物を使用できるか否かを決定する、(c)対象において疾患の進行を予防若しくは制御するための薬物を選択する、又は(d)対象において疾患の進行を予防又は制御するための薬物を同定する方法であって、ここで、薬物は、内皮分子との白血球接着を変更可能であり、
対象から得られた少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、並びに
アッセイの結果に基づいて、(a)少なくとも1人の対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測するステップ、(b)対象において疾患の進行を制御若しくは予防するために、薬物を使用できるか否かを決定するステップ、(c)対象において疾患の進行を予防若しくは制御するための薬物を選択するステップ、又は(d)対象において疾患の進行を予防又は制御するための薬物を同定するステップ
を含む、方法。
【０４２７】
2C.個別化された医薬のために使用される、例1Cの方法。
【０４２８】
3C.薬物応答者を薬物非応答者から区別するために使用される、例1Cの方法。
【０４２９】
4C.対象層別化(患者群化)のために、多数の対象を試験するために使用される、例1Cの方法。
【０４３０】
5C.アッセイ結果と一致して、疾患の進行を制御するために対象で薬物を試行するステップを含む、例1Cの方法。
【０４３１】
6C.アッセイ結果と一致して、疾患の進行を制御するために薬物を用いて対象を治療するステップを含む、例1Cの方法。
【０４３２】
7C.アッセイ結果と一致して、薬物によって引き起こされる不要な副作用を最小にしながら、疾患の進行を制御するために対象の薬物の有効最小治療用量を決定するステップを含む、例1Cの方法。
【０４３３】
8C.薬物用量が、進行性多巣性白質脳症(PML)などの病状を最小にする、又は予防するために、in vivoで内皮細胞との最小の白血球細胞相互作用の回復を可能にする、例7Cの方法。
【０４３４】
9C.アッセイ結果と一致して、例えば、薬物投与量を変更すること又は連続薬物投与間の時間の長さを変化させることによって、疾患の進行を制御するために対象の薬物の投与計画を最適化するステップを含む、例1Cの方法。
【０４３５】
10C.薬物(すなわち、化合物、化学物質、分子、試薬、生物学的物質、抗体又は他のもの)が、薬物がこれまでに示されていない疾患の進行を制御するために有用であり得るか否かを予測する又は決定するために使用される、例1Cの方法。
【０４３６】
11C.方法のアッセイが、接着異常又は異常性又は薬物標的を同定するステップ及び次いで薬物標的に基づいて疾患の進行を制御するための適当な薬物を選択するステップを含み得る、例1Cの方法。
【０４３７】
12C.方法のアッセイが、接着異常又は異常性又は薬物標的を同定するステップ並びに次いで薬物標的及びそれらの標的のための薬物の参照データベースに基づいて、疾患の進行を制御するための適当な薬物を選択するステップを含み得る、例1Cの方法。
【０４３８】
13C.薬物標的及び薬物のデータベースを構築するステップを含む、例12Cの方法。
【０４３９】
14C.データベースが、既知薬物標的及び薬物に基づいて構築される、例13Cの方法。
【０４４０】
15C.データベースが、in vivo薬物治療に基づいて構築される、例13Cの方法。
【０４４１】
16C.方法のアッセイが、2以上の接着異常又は異常性又は薬物標的を1度に、好ましくは、2、3、4、5、6、7、8、9又は10種の薬物標的又はそれ以上をアッセイするステップを含む、例1Cの方法。
【０４４２】
17C.複数の接着異常又は異常性又は薬物標的について1度に試験するハイスループットアッセイである、例1Cの方法。
【０４４３】
18C.対象の白血球接着フィンガープリントを作製するために使用される、例1Cの方法。
【０４４４】
19C.対象において種々の白血球異常又は異常性を同定するために使用される、例1Cの方法。
【０４４５】
20C.疾患マーカーを同定するために使用される、例1Cの方法。
【０４４６】
21C.疾患に関わらず、個体/対象を群化するために使用される、例1Cの方法。
【０４４７】
22C.疾患診断に関わらず、対象の治療を開発するステップをさらに含む、例1Cの方法。
【０４４８】
23C.in vivo又はin vitroでハイスループット薬物スクリーニングのために使用される、例1Cの方法。
【０４４９】
24C.実験動物における工業規模の薬物スクリーニングのために使用される、例1Cの方法。
【０４５０】
25C.疾患の進行を制御するための薬物を投与された対象が、その薬物にどのように応答しているかを決定する方法であって、ここで、薬物は内皮分子との白血球接着を変更可能であり、
対象から得られた薬物を含有する少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、及び
アッセイの結果に基づいて、対象が薬物にどのように応答しているかを決定するステップ
を含む、方法。
【０４５１】
26C.個別化された医薬のために使用される、例25Cの方法。
【０４５２】
27C.薬物応答者を薬物非応答者から区別するために使用される、例25Cの方法。
【０４５３】
28C.対象層別化(患者群化)のために、多数の対象を試験するために使用される、例25Cの方法。
【０４５４】
29C.in vivo又はin vitroでのハイスループット薬物スクリーニングのために使用される、例25Cの方法。
【０４５５】
30C.実験動物における工業規模の薬物スクリーニングのために使用される、例25Cの方法。
【０４５６】
31C.アッセイ結果と一致して、薬物によって引き起こされる不要な副作用を最小にしながら、疾患の進行を制御するために対象の薬物の有効最小治療用量を決定するステップを含む、例25Cの方法。
【０４５７】
32C.薬物用量が、進行性多巣性白質脳症(PML)などの病状を最小にする、又は予防するために、in vivoで内皮細胞との最小の白血球細胞相互作用の回復を可能にする、例31Cの方法。
【０４５８】
33C.アッセイ結果と一致して、例えば、薬物投与量を変更すること又は連続薬物投与間の時間の長さを変化させることによって、疾患の進行を制御するために対象の薬物の投与計画を最適化するステップを含む、例25Cの方法。
【０４５９】
34C.疾患の進行を制御するための薬物を摂取している対象のために投与計画を最適化する方法であって、ここで、薬物は、内皮分子との白血球接着を変更可能であり、対象から得られた薬物を含有する少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、及びアッセイの結果に基づいて、疾患の進行を制御するための対象の薬物投与計画を最適化するステップを含む、方法。
【０４６０】
35C.アッセイ結果と一致して、薬物によって引き起こされる不要な副作用を最小にしながら、疾患の進行を制御するための対象の薬物の有効最小治療用量を決定するステップを含む、例34Cの方法。
【０４６１】
36C.薬物用量が、進行性多巣性白質脳症(PML)などの病状を最小にする、又は予防するために、in vivoで内皮細胞との最小の白血球細胞相互作用の回復を可能にする、例34Cの方法。
【０４６２】
37C.アッセイ結果と一致して、例えば、薬物投与量を変更すること又は連続薬物投与間の時間の長さを変化させることによって、疾患の進行を制御するために対象の薬物の投与計画を最適化するステップを含む、例34Cの方法。
【０４６３】
38C.アッセイが実施されるたびに、投与計画又は最小有効薬物用量が、それに応じて最適化される、例34Cの方法。
【０４６４】
39C.血清薬物濃度に関わらず、薬物有効性の正確な評価を提供する、例34Cの方法。
【０４６５】
40C.疾患の進行を制御するための対象の最小有効薬物用量を決定する方法であって、ここで、薬物は、内皮分子との白血球接着を変更可能であり、
(1)対象に既知量の薬物を所定の期間投与するステップ、
(2)ステップ(1)後、対象から得られた薬物を含有する血液サンプルを、in vitroで白血球接着機能アッセイに付すステップ、並びに
(3)アッセイの結果に基づいて、疾患の進行を制御するために対象の最小有効薬物用量を決定できるまで、ステップ(1)及び(2)を反復するステップ
を含む、方法。
【０４６６】
41C.薬物によって引き起こされる不要な副作用を最小にすることを含む、例40Cの方法。
【０４６７】
42C.アッセイ結果と一致して、疾患の進行を制御するために対象の薬物の投与計画を最適化するステップを含む、例40Cの方法。
【０４６８】
43C.薬物感受性が、最小有効薬物用量を得るためにIC50又はIC99を使用して対象において試験される、例40Cの方法。
【０４６９】
44C.最小有効薬物用量が、進行性多巣性白質脳症(PML)などの病状を最小にする、又は予防するために、in vivoで内皮細胞との最小の白血球細胞相互作用の回復を可能にする、例40Cの方法。
【０４７０】
45C.白血球接着機能アッセイを実施して、白血球接着異常性を同定すること、白血球接着異常性の性質に基づいて適した薬物を選択すること及び白血球接着異常性に対する薬物の効果を決定することを伴う、例1Cの方法。
【０４７１】
46C.以下のステップ:1.対象から得られた血液サンプルを白血球接着機能アッセイに付して、白血球異常性を同定するステップ、2.このような異常性について使用され得る可能性がある適した薬物候補(又は2種以上の薬物候補)を選択するステップ、3.血液サンプルをin vitroで種々の用量の適した薬物候補を用いて処置するステップ、4.さらなる白血球接着機能アッセイを実施して、白血球異常性に対する薬物候補の効果を試験するステップ、5.対象にとって最良の又は最も有効な薬物を選択するステップ、6.薬物を対象に投与するステップ、7.薬物投与後種々の時点で対象から血液を採取するステップ、及び8.白血球接着機能アッセイを実施して、対象において薬物効果を確認するステップを含む、例45Cの方法。
【０４７２】
47C.ヒト対象において薬物の効果を決定することが、以下のステップ:1.対象から血液を採取するステップ、2.第1の白血球接着機能アッセイを実施して、ベースラインを得るステップ、3.対象に薬物を投与するステップ及び4.薬物投与後種々の時点で白血球接着機能アッセイを実施して、薬物効果を決定するステップを実施することを伴う、例45Cの方法。
【０４７３】
48C.動物モデル/実験室動物対象(マウス、霊長類など)において薬物の効果を決定することが、以下のステップ:1.対象から血液を採取するステップ、2.第1の白血球接着機能アッセイを実施して、ベースラインを得るステップ、3.種々の用量で対象に薬物を投与するステップ(各用量は、独立アッセイとなる)及び4.薬物投与後種々の時点で白血球接着機能アッセイを実施して、薬物効果を決定するステップを実施することを伴う、例45Cの方法。
【０４７４】
49C.薬物の効果を決定することが、以下のステップ:1.対象から血液を採取するステップ、2.種々の用量の薬物を用いて血液を処置するステップ及び3.薬物治療の開始後種々の時点で白血球接着機能アッセイを実施して、薬物効果及びこのような効果に到達するのに必要な時間を決定するステップを使用してin vitroで実施される、例45Cの方法。
【０４７５】
50C.薬物が、内皮分子との白血球の結合を直接的に干渉する、前記の例のうちいずれか1つの方法。
【０４７６】
51C.薬物が、内皮分子との白血球の結合を間接的に干渉する、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４７７】
52C.薬物が、白血球接着分子又は白血球のその他の結合分子を標的とし、結合し、会合し、又はそうでなければ干渉し得る、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４７８】
53C.薬物が、内皮分子を標的とし、結合し、会合し、又はそうでなければ干渉し得る、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４７９】
54C.薬物が、白血球接着性分子又はその他の結合分子及び内皮分子の両方を標的とし、結合し、会合し、又はそうでなければ干渉し得る、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４８０】
55C.薬物が、白血球接着経路の別の部分又は分子に対してその効果を発揮することによって、白血球及び内皮分子の間の接着/相互作用に間接的に影響を及ぼし得る、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４８１】
56C.薬物が、白血球接着に影響を及ぼす遺伝子の発現を調節し得る(例えば、薬物は、細胞内シグナル伝達経路に作用して、白血球接着に影響を及ぼす遺伝子の発現を調節し得る)、白血球接着に影響を及ぼす遺伝子産物(RNA又はタンパク質)の翻訳後修飾に影響を及ぼし得る、白血球接着に影響を及ぼす遺伝子産物の輸送又は転位を調節し得る、及び/又は白血球接着に影響を及ぼす遺伝子産物の細胞内貯蔵からの放出を調節し得る、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４８２】
57C.白血球が、好中球、好酸球、好塩基球、CD4 Tリンパ球、CD8 Tリンパ球、T調節性細胞、Bリンパ球、樹状細胞、単球及びナチュラルキラー細胞である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４８３】
58C.白血球接着分子又は白血球のその他の結合分子が、セレクチン、インテグリン、ケモカイン、又はケモカイン受容体である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４８４】
59C.内皮分子が、セレクチン、細胞接着分子(CAM)、ケモカイン又はケモカイン受容体である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４８５】
60C.白血球接着分子が、PSGL-1、L-セレクチン、α1インテグリン、α2インテグリン、α3インテグリン、α4インテグリン、α5インテグリン、α6インテグリン、α7インテグリン、α8インテグリン、α9インテグリン、α10インテグリン、α11インテグリン、αDインテグリン、αEインテグリン、αVインテグリン、αXインテグリン、CD11a (αLインテグリン)、CD11b (αMインテグリン)、β1インテグリン、β2インテグリン、β4インテグリン、β5インテグリン、β6インテグリン、β7インテグリン、β8インテグリン、CD44、ESL-1、CD43、CD66、CD15又はALCAMである、例1C〜49のうちいずれか1つの方法。
【０４８６】
61C.内皮分子が、E-セレクチン、Pセレクチン、VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2、MadCAM-1、PECAM、GlyCAM-1、JAM-A、JAM-B、JAM-C、JAM-4、JAM-L、CD34、CD99、VAP-1、L-VAP-2、ESAM、E-LAM、カドヘリン又はヒアルロン酸である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４８７】
62C.ケモカイン及びケモカイン受容体が、ケモカインCCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL26、CX3CL1、XCL1及びXCL2、ケモカイン受容体CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、CX3CR1及びXCR1からなる群から選択される、例59Cの方法。
【０４８８】
63C.薬物が、サイトカイン又はケモカインの活性を調節し得る、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４８９】
64C.薬物が、接着分子又はケモカインの翻訳後修飾を変更し得る、接着分子のタンパク質膜転位を変更し得る、細胞内貯蔵からの接着分子の放出を調節し得る、細胞内シグナル伝達経路に対して作用して、接着分子若しくはケモカイン遺伝子の発現を調節し得る、又は接着分子の動態化を調節し得る、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４９０】
65C.薬物が、白血球α4インテグリン活性化を減弱する、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４９１】
66C.薬物が、白血球α4インテグリン及びその内皮分子間の相互作用を干渉する、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４９２】
67C.薬物が、白血球によって発現されたPSGL-1(P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1)と、P-セレクチン及び/又はE-セレクチンであるその内皮分子との間の相互作用を干渉する、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４９３】
68C.薬物が、白血球β2インテグリンと、その内皮分子との間の相互作用を干渉する、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４９４】
69C.薬物が、細胞間接着分子-1(ICAM-1)及び/又は血管細胞接着分子-1(VCAM-1)と、その白血球接着分子との間の相互作用を干渉する、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４９５】
70C.薬物が、α4β7インテグリンとMAdCAM-1との間の結合を干渉する抗体である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４９６】
71C.薬物がナタリズマブである、例70Cの方法。
【０４９７】
72C.薬物が、α4β7インテグリン及びMAdCAM-1を干渉する抗体である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０４９８】
73C.薬物がベドリズマブである、例72Cの方法。
【０４９９】
74C.薬物が、CD11a (αL)とICAM-1を干渉する抗体である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０５００】
75.薬物が、エファリズマブ又はオデュリモマブ(Odulimomab)である、例74Cの方法。
【０５０１】
76C.薬物が、CD11b(αM)とICAM-1との間の結合を干渉する抗体である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０５０２】
77C.薬物が、UK279,276である、例76の方法。
【０５０３】
78C.薬物が、β2インテグリンとその内皮分子間の結合を干渉する抗体である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０５０４】
79C.薬物が、エルリズマブ(Erlizumab)又はロベルリズマブ(Roverlizumab)である、例78Cの方法。
【０５０５】
80C.薬物が、βインテグリンとその内皮分子の間の結合を干渉する抗体である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０５０６】
81C.薬物がエトロリズマブ(Etrolizumab)である、例80Cの方法。
【０５０７】
82C.薬物が、グルココルチコイド(副腎皮質ステロイド)などのステロイドである、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０５０８】
83.薬物が、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン又はプレドニゾンなどのステロイドである、例82Cの方法。
【０５０９】
84C.薬物が、非ステロイド系抗炎症性薬物(NSAID)である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０５１０】
85C.薬物が、セレコキシブ、エトリコキシブ、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン及びスリンダックである、例84Cの方法。
【０５１１】
86C.薬物が、免疫選択性抗炎症性誘導体(ImSAID)である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０５１２】
87C.薬物が、顎下腺ペプチド-T (SGP-T)又はフェニルアラニン-グルタミン-グリシン(FEG)である、例86Cの方法。
【０５１３】
88C.薬物が、植物由来の生理活性化合物である、例1C〜49Cのうちいずれか1つの方法。
【０５１４】
89C.薬物が、プルンバギン(インドマツリ(Plumbago zylanica)由来)又はプルメリシン(Plumericin)(ヒマタントゥス・スクーバ(Himatanthus sucuuba)由来)である、例88Cの方法。
【０５１５】
90C.薬物が、異常な白血球動員を伴う疾患を制御するために使用される、例1C〜89Cのうちいずれか1つの方法。
【０５１６】
91C.薬物が、炎症を伴う疾患を制御するために使用される、例1C〜89Cのうちいずれか1つの方法。
【０５１７】
92C.薬物が、自己免疫疾患の進行を制御するために使用される、例1C〜89Cのうちいずれか1つの方法。
【０５１８】
93C.薬物が、免疫不全疾患の進行を制御するために使用される、例1C〜89Cのうちいずれか1つの方法。
【０５１９】
94C.薬物が、感染性疾患の進行を制御するために使用される、例1C〜89Cのうちいずれか1つの方法。
【０５２０】
95C.薬物が、多発性硬化症、クローン病、喘息、乾癬又は関節リウマチの進行を制御するために使用される、例1C〜89Cのうちいずれか1つの方法。
【０５２１】
96C.薬物が、臓器移植、卒中、心筋梗塞又は外傷性ショックによって引き起こされる疾患の進行を制御するために使用される、例1C〜89Cのうちいずれか1つの方法。
【０５２２】
97C.血液サンプルが、全血である、前記の例のうちいずれか1つの方法。
【０５２３】
98C.白血球接着機能アッセイ/結果が、半定量的及び/又は定量的である、前記の例のうちいずれか1つの方法。
【０５２４】
99C.白血球接着機能アッセイが、定量的方法で、以下:白血球細胞動員を特性決定すること、白血球細胞トラッキングを特性決定すること、白血球細胞遊走挙動を特性決定することのうち1以上を達成する、前記の例のうちいずれか1つの方法。
【０５２５】
100C.白血球接着機能アッセイが、白血球遊走を定量的に決定することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法。
【０５２６】
101C.白血球遊走が、白血球細胞テザリング、ローリング、スローローリング、強固な接着、クローリング及び/又は経内皮遊走を検出、測定又は観察することを含む、例100Cの方法。
【０５２７】
102C.白血球接着機能アッセイが、白血球細胞平均速度、移動、加速、減速、方向性、滞留時間及び/又は真直性を検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法。
【０５２８】
103C.白血球接着機能アッセイが、現実的な生理学的条件下で、白血球遊走を検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法。
【０５２９】
104C.アッセイが、種々の白血球サブセットの同時検出を可能にする、前記の例のうちいずれか1つの方法。
【０５３０】
105C.白血球接着機能アッセイが、フローアッセイを含む、前記の例のうちいずれか1つの方法。
【０５３１】
106C.白血球接着機能アッセイが、内皮接着分子による、白血球細胞遊走挙動を特性決定する、白血球細胞トラッキングを特性決定する、又は白血球細胞動員を特性決定するために目視での解析を可能にする、前記の例のうちいずれか1つの方法。
【０５３２】
107C.内皮分子が、支持体又は基板に結合された組換えタンパク質の形態である、前記の例のうちいずれか1つの方法。
【０５３３】
108C.白血球接着機能アッセイにおいて接着性基板(すなわち、支持体又は基板に結合された)として使用してもよい内皮分子が、1.接着分子、2.ケモカイン、3.精製抗原及び人工抗原提示細胞系、4.細胞間相互作用を調節し得るその他の分子及び5.ケモカイン受容体からなる群から選択される、前記の例のうちいずれか1つの方法。
【０５３４】
109C.白血球接着機能アッセイが、白血球によって発現されたPSGL-1(P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1)及びその内皮分子、P-セレクチン及び/又はE-セレクチン間の相互作用を検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５３５】
110C.LAFAが、α4インテグリン接着機能の定量的評価を伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５３６】
111C.LAFAが、白血球αインテグリン発現及び活性の増大を検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５３７】
112C.白血球接着機能アッセイが、白血球α4インテグリン及び内皮VCAM-1間の相互作用を測定、検出又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５３８】
113C.白血球接着機能アッセイが、CD11a(αLインテグリン)及びICAM-1の間の相互作用を検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５３９】
114C.白血球接着機能アッセイが、CD11b(αMインテグリン)及びICAM-1の間の相互作用を検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５４０】
115C.白血球接着機能アッセイが、α4β7インテグリン及びMAdCAM-1間の相互作用を検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５４１】
116C.白血球接着機能アッセイが、細胞間接着分子-1(ICAM-1)及び/又は血管細胞接着分子-1(VCAM-1)及びその白血球接着分子間の相互作用を検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５４２】
117C.白血球接着機能アッセイが、白血球β7インテグリン及びその内皮分子間の相互作用を検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５４３】
118C.白血球接着機能アッセイが、白血球の1以上の特定のサブセット、例えば、CD4、CD8及びCD15細胞を測定することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５４４】
119C.白血球接着機能アッセイが、サイトカイン又はケモカイン(例えば、THFα及びIL-4)によって活性化された初代内皮細胞(例えば、HUVEC)又は固定化された内皮細胞株(例えば、ヒト微小循環内皮細胞(HMEC))での白血球遊走挙動を検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５４５】
120C.白血球接着機能アッセイが、TNFα活性化HUVECとの白血球相互作用に対する薬物ナタリズマブの効果を検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５４６】
121C.白血球接着機能アッセイが、白血球上のα4インテグリンとのナタリズマブ特異的結合を検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５４７】
122C.白血球接着機能アッセイが、α4インテグリン機能に対するナタリズマブの阻害効果を測定、検出又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５４８】
123C.白血球接着機能アッセイが、サブセットを特定の膜マーカーを用いて標識することによって、種々の白血球サブセットを同時に検出、測定又は観察することを伴う、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５４９】
124C.方法がナタリズマブ注入後種々の時点で実施される血液検査として実施され、アッセイ結果が、ナタリズマブ再投薬の必要性を決定するために使用され、血液検査が、個々の対象において薬物有効性を確実にするために実施され、個々の対象の最適な/個別化された治療計画の開発を促進する、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５５０】
125C.方法が薬物効力を含まない免疫応答の回復を促進し、十分な免疫応答、各投薬サイクルが、PMLのリスクを有効に排除するのを可能にする、前記の例のうちいずれか1つの方法(それらが関連する限りにおいて)。
【０５５１】
126C.白血球接着機能アッセイが、薬物標的の活性化を検出するために使用され、薬物の、疾患進行を制御する能力が予測される、例1Cの方法。
【０５５２】
127C.方法/アッセイが、薬物が、その薬物を使用して治療可能であると知られていないさらにその他の疾患の進行を制御するために使用され得るか否かを予測するために使用される、例1Cの方法。
【０５５３】
128C.対象の白血球接着プロフィールを作製する方法であって、
対象から得られた少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付して、1以上の種々の内皮分子に対する、種々の白血球サブセットの接着機能を実質的に同時に定量的に評価するステップ、並びに
白血球異常性を同定すること、個別化された病態形成の決定、疾患の新規疾患マーカーの同定、疾患の初期徴候の同定、疾患予測、疾患予防、早期の正確な診断を補助すること、対象の有効な個別化された治療を開発すること、対象の健康(健常状態)をモニタリングすること、疾患に関わらず対象を群化すること、又は疾患診断に関わらず対象のための治療を開発することのためにアッセイ結果を使用するステップ
を含む、方法。
【０５５４】
129C.単一対象から得られた血液サンプルで実施される、例128Cの方法。
【０５５５】
130C.複数の異なる対象から得られた血液サンプルで実施される、例128Cの方法。
【０５５６】
131C.各対象が、健常対象である、例128C〜130Cのうちいずれか1つの方法。
【０５５７】
132.各対象が、疾患を有する、例128C又は例130Cの方法。
【０５５８】
133C.アッセイが、処理された血液サンプルで実施される、例128C〜132Cのうちいずれか1つの方法。
【０５５９】
134C.白血球接着機能アッセイが、1以上の内皮接着分子による白血球細胞遊走挙動、白血球細胞トラッキング又は白血球細胞動員を定量化するためのフロー(セル)アッセイである、例128C〜133Cのうちいずれか1つの方法。
【０５６０】
135C.1以上の内皮分子が、支持体又は基板に結合された組換えタンパク質又は1種以上の内皮接着分子を過剰発現する細胞系の形態である、例128C〜134Cのうちいずれか1つの方法。
【０５６１】
136C.白血球が、例57に記載のとおりである、例128C〜135Cのうちいずれか1つの方法。
【０５６２】
137C.白血球接着分子又は白血球のその他の結合分子が、例58C及び60に記載のとおりである、例128C〜135Cのうちいずれか1つの方法。
【０５６３】
138C.1以上の内皮分子が、例59及び61Cに記載のとおりである、例128C〜135Cのうちいずれか1つの方法。
【０５６４】
139C.特定の内皮分子基板を用いてプレコーティングされてもよい個々のフローチャネルにおいて、種々の白血球サブセットの接着をアッセイする場合に、特定の白血球サブセット上での各接着分子の細胞遊走プロフィールが作製され得る、例128C〜138Cのうちいずれか1つの方法。
【０５６５】
140C.方法のアッセイが、薬物標的を同定するステップ、次いで、薬物標的に基づいて疾患の進行を制御するための適当な薬物を選択するステップを含む、例128C〜139Cのうちいずれか1つの方法。
【０５６６】
141C.方法のアッセイが、薬物標的を同定するステップ、次いで、薬物標的及びそれらの標的の薬物の参照データベースに基づいて疾患の進行を制御するための適当な薬物を選択するステップを含む、例128C〜140Cのうちいずれか1つの方法。
【０５６７】
142C.方法のアッセイが、薬物標的及び薬物のデータベースを構築するステップを含む、例141Cの方法。
【０５６８】
143C.方法のアッセイが、2種以上の薬物標的(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又は10種の薬物標的又はそれ以上)を一度にアッセイするステップを含む、例128C〜142Cのうちいずれか1つの方法。
【０５６９】
144C.複数の薬物標的について一度に試験するハイスループットアッセイである、例128C〜143Cのうちいずれか1つの方法。
【０５７０】
例1D.(a)対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測する、(b)対象において疾患の進行を制御若しくは予防するために、薬物を使用できるか否かを決定する、(c)対象において疾患の進行を予防若しくは制御するための薬物を選択する、又は(d)対象において疾患の進行を予防又は制御するための薬物を同定する方法であって、ここで、薬物は、内皮分子との白血球接着を変更可能であり、
対象から得られた少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、並びに
アッセイの結果に基づいて、(a)少なくとも1人の対象が、疾患の進行を制御するための薬物にどの程度応答する可能性があるかを予測するステップ、(b)対象において疾患の進行を制御若しくは予防するために、薬物を使用できるか否かを決定するステップ、(c)対象において疾患の進行を予防若しくは制御するための薬物を選択するステップ、又は(d)対象において疾患の進行を予防又は制御するための薬物を同定するステップ
を含む、方法。
【０５７１】
2D.疾患の進行を制御するための薬物を投与された対象が、その薬物にどのように応答しているかを決定する方法であって、ここで、薬物は、内皮分子との白血球接着を変更可能であり、
対象から得られた薬物を含有する少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、及び
アッセイの結果に基づいて、対象が薬物にどのように応答しているかを決定するステップ
を含む、方法。
【０５７２】
3D.疾患の進行を制御するために薬物を摂取している対象の投与計画を最適化する方法であって、ここで、薬物は、内皮分子との白血球接着を変更可能であり、
対象から得られた薬物を含有する少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付すステップ、及び
アッセイの結果に基づいて、疾患の進行を制御するための対象の薬物投与計画を最適化するステップ
を含む、方法。
【０５７３】
4D.疾患の進行を制御するための対象の最小有効薬物用量を決定する方法であって、ここで、薬物は、内皮分子との白血球接着を変更可能であり、
(1)対象に既知量の薬物を所定の期間投与するステップ、
(2)ステップ(1)後、対象から得られた薬物を含有する血液サンプルを、in vitroで白血球接着機能アッセイに付すステップ、並びに
(3)アッセイの結果に基づいて、疾患の進行を制御するために対象の最小有効薬物用量を決定できるまで、ステップ(1)及び(2)を反復するステップ
を含む、方法。
【０５７４】
5D.例1〜4のうちいずれか1つにおいて例示されるような方法を実施するためのフローアッセイ又はフローデバイス。
【０５７５】
6D.対象の白血球接着プロフィールを作製する方法であって、
対象から得られた少なくとも1種の血液サンプルを、in vitroで少なくとも1つの白血球接着機能アッセイに付して、1種以上の種々の内皮分子との種々の白血球サブセットの接着機能を実質的に同時に定量的に評価するステップ、及び
白血球異常性を同定すること、個別化された病態形成の決定、疾患の新規疾患マーカーの同定、疾患の早期徴候を同定すること、疾患予測、疾患予防、早期及び正確診断を補助すること、対象の有効な個別化された治療を開発すること、対象の健康(健康状態)をモニタリングすること、疾患に関わらず種々の対象を群化すること又は疾患診断にかかわらず対象の治療を開発することのためにアッセイ結果を使用するステップ
を含む、方法。
【０５７６】
用語「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」又は「含んでいる(comprising)」などのこの用語の変形は、文脈又は使用において、この用語の排他的解釈が必要とされない限り、記載の整数(単数又は複数)を含むが、任意のその他の整数(単数又は複数)を排除しないことを示すように本明細書において使用される。
【０５７７】
付録A
特定の例示的実施形態に従う白血球接着機能アッセイ(LAFA)のプロトコール
VCAM-1アッセイ
1.導入
以下のプロトコールを特定の例示的実施形態とともに使用して、基板としてVCAM-1を使用するLAFA(VCAM-1アッセイ)を実施した。白血球接着機能アッセイは、白血球の、特定の流動条件下で血液中のその他の分子と相互作用する能力を評価するために使用され得るアッセイである。白血球は、通常、1以上の蛍光色素を用いて標識することによって血液中で可視化され、その結果、それらは、例えば、蛍光顕微鏡によって検出され得る。いくつかの例示的実施形態では、このプロトコールの適した変法が考慮される。
【０５７８】
in vitroで血液微小循環を模倣するために、マイクロ流体ポンプ及びマイクロ流体チップ/チャネルからなるマイクロ流体システムを使用してもよい。接着性基板を、マイクロ流体チャネルの底でプレコーティングしてもよく、次いで、血液サンプルを、チャネル中に灌流させてもよく、これによって、白血球がプレコーティングされた接着性基板と相互作用することが可能になる。これらの相互作用を、次いで、顕微鏡によって記録してもよく、次いで、画像を適したソフトウェアによって解析してもよい。結果として、さまざまな細胞動態パラメータを使用して細胞相互作用挙動を記載してもよく、それから、白血球の、特定の接着性基板と相互作用する能力を評価してもよい。評価は、定性的、半-実質的に定量的、定量的又はそれらの組合せであり得る。
【０５７９】
2.試薬及び材料
a)ヒトVCAM-1タンパク質(R&D systemから購入した、カタログ番号: ADP5)
R&D製のバイアルを受け取った後、VCAM-1タンパク質を、1mg/mlの濃度にHBSSバッファー中で再構成した。次いで、VCAM-1溶液をチューブ(0.5遠心管)あたり2μlにアリコートにわけ、-80℃の冷凍庫で貯蔵した。必要な時に、1アリコート/チューブのVCAM-1を解凍し、8時間内に使用する。反復された凍結-解凍は許可されていない。
b)ハンクス平衡塩溶液(HBSS)(Sigma、カタログ番号:H1387)
1パッケージのHBSS粉を1Lの水中に再構成し、4℃冷蔵庫で貯蔵する。
c)マイクロ流体チップ:(Microfluidic ChipShop、カタログ番号:01-0178-0152-01)
PMMA、蓋厚(175μm)
直線チャネルチップ(16平行チャネル)、ミニルアー(Mini Luer)インターフェース
幅(1,000μm)/深さ(200μm)/長さ(18mm)
d)チップ入口
i.ミニルアー(Mini luer)からルアー(luer)アダプター:最大70μlの血液を保持できる
ii.ミニルアー(Mini luer)からルアー(luer)アダプター及び500μlタンク:最大500μlの血液を保持できる
e)MnCl2、(Sigma、カタログ番号:450995)
0.5Mストックを作製し、全血で1:100希釈を使用する(5mMの最終濃度)。
f)蛍光マーカー
i.CD4-Alexa488(BD、カタログ番号:557695)
ii.CD8-PE(BD、カタログ番号:555635)
iii.CD15-APC(BD、カタログ番号:551376)
iv.CD19-BV510(BD、カタログ番号:562947)
【０５８０】
3.マイクロ流体チップ調製
a)VCAM-1タンパク質を-80℃冷凍庫から出して解凍し、HBSSを用いて10μg/mlの濃度に希釈する。
b)15μlの希釈したVCAM-1タンパク質溶液を使用して、各マイクロ流体チャネルを4℃で一晩プレコーティングする。
c)InCellでのオートフォーカスのためにチップ上の第1のチャネルは常に空にしておく。
d)翌日、チャネルをHBSSを用いて1回洗浄する必要があり、その後、LAFAのために使用する。
【０５８１】
4.血液採取
a.静脈穿刺による7〜10mlの全血が必要であり、これには、EDTAチューブ中の2ml(FBE用)、リチウムヘパリンチューブ中の5ml(LAFA用)が含まれる。
b.血液採取のためにバタフライが使用される場合には、最初にEDTAチューブ中に2mlの血液、次いで、ヘパリンチューブ中に5mlを採取することが好ましい。シリンジが使用される場合には、順序は問題にならない。
c.採取後、血液チューブを室温(20℃)で貯蔵する。
d.血液細胞を活性化し得るので血液チューブへの激しい振盪を避ける。
【０５８２】
5.血液前処置及び標識
a.各アッセイのために、130μlのヘパリン処理血液が必要とされる。
b.いくつかの実施例では、血液は、5mM Mnによって室温(RT)で5分間活性化される必要があり、その後、アッセイのために使用される。
c.全血に以下のマーカーを単独で添加してもよく、又は組み合わせて添加してもよく、RTで5分間インキュベートする。
-CD4-Alexa488(2μl/100μl全血)
-CD8-PE(1.5μl/100μl全血)
-CD15-APC(3μl/100μl全血)
-CD19-BV510(2μl/100μl全血)
d.薬物効果(例えば、ナタリズマブ)を試験する場合には、薬物は、アッセイの前に血液にRTで10分間添加される必要がある。Mn実験では、薬物は、Mn処置後少なくとも5分間添加される必要がある。
【０５８３】
6.アッセイ
a.チップをInCell 2200のスライドホルダー中に入れる
b.上部及び底ヒーター両方を39℃につける(スライドに35.5℃を与える)
c.血液サンプルをチップの入口にロードする
d.チップの出口をマイクロ流体ポンプに接続する
e.InCell操作ソフトウェア中のプロトコールを始める
f.フォーカス面を見出す
g.0.6ml/時間でポンプ/血液灌流を開始する
-10mlシリンジ
-16Gニードル
h.記録を開始する
【０５８４】
7.ビデオ解析
a.Fijiオープンソース画像解析ソフトウェアを開く。Fijiを以前に使用したことがない場合には、解析を開始する前に操作システムに適したバージョンをダウンロードし、インストールする(https://imagej.net/Fiji/Downloads)。
b.Fijiにドラッグ及びドロップすることによってマクロ「Re-order Hyperstack.ijm」を開く。
c.Fijiにドラッグ及びドロップすることによってマクロ「Scale Crop Flatten Image.ijm」を開く。
d.B&Cウィンドウを開く(Image>Adjust>Brightness/Contrast)。
e.TrackMateプラグインを開き(Plugins>Tracking>TrackMateファイルをLoad)、「TrackMate_Template.xml」を選択する。
f.ウィンドウブランクを閉じる(V)。
g.画像を開き(Plugins>Bio-Formats>Bio-Formats Importer)、最初の画像のみをダブルクリックし、残りは自動的にロードされる。
h.「Group files with similar names」を動かし、「OK」を押す。他のすべては動かしてはならない、表示は、「Hyperstack」であるべきであり、カラーモードは「Default」であるべきである。
i.「File name contains」を動かし、それぞれのボックスに「A*.tif」をタイピングする。
j.マクロタブ「Re-order Hyperstack.ijm」をクリックし、Runを押す。
k.マクロタブ「Scale Crop Flatten Image.ijm」をクリックし、Runを押す。
l.B&Cウィンドウにおいて、「Auto」を押して、チャネルエッジを見る。ROIをチャネル中心を含み、チャネルエッジを含まないように調整する。「OK」を押す。
m.チャネルを解析されるように選択する(例えば、Dapi)
n.TrackMateウィンドウにおいて、緑色の「左」矢印ボタンを灰色になるまで押す。これが、TrackMate解析ウィザードの開始パネルである。
o.「Refresh source」を押す。
p.緑色の「右」矢印ボタン又は「Please wait」ボタンを2回押す。
q.閾値を以下に設定する
-Dapiについて0.4
-FITCについて1.0
-Cy3について3.0
-Cy5について3.0
r.緑色の「右」矢印ボタン又は「Please wait」ボタンを1回押して、検出が終了するまで待つ。
s.緑色の「右」矢印ボタン又は「Please wait」ボタンを8回押して、ウィザードの残りのステップを終了する。
t.「Analysis」ボタンを押して、最初のテーブルを.csvファイルとしてセーブする(Track statistics)。名前パターンは、実験番号及びチャネルを含まなくてはならない(例:Expt1_Dapi_Tracks.csv)。
u.第2のテーブルを廃棄する(tracks statistics中のリンク)。
v.第3のテーブルを.csvファイルとしてセーブする(tracks statistics中のスポット)。名前パターンは、実験番号及びチャネルを含まなくてはならない(例:Expt1_Dapi_Spots.csv)。
w.すべてのその他のチャネルが解析されるために、ステップm〜vを反復する。
x.次いで、TrackMate.csvファイルを、Rで解析できる。
【０５８５】
図27を参照のこと
・Re-order Hyperstack.ijm
・Scale Crop Flatten Image.ijm
・TrackMate_Template.xml
【０５８６】
8.二次データ解析
a.Rを開く。
b.StickyCellによって開発された「FlowAnalysis_GUI_v6.R」を開く。
c.「FlowAnalysis」ウィンドウに向かう。
d.「Analysis Type」メニューから「Full」を選ぶ。
e.「Browse Working Directory」をクリックして、解析されるべきファイルが位置するフォールドを選択する。
f.「Browse Control」をクリックして、「Trackmate」からエクスポートされた1つのExcelファイルを選択する。
g.「Browse Patient」をクリックして、「Trackmate」からエクスポートされた別のExcelファイルを選択する。
h.「Analyse」ボタンを押す。
i.すべてのパラメータが、同一フォールド中のサブフォールド中に作製される。
【０５８７】
図27を参照のこと。
・FlowAnalysis_GUI_v6.R
【０５８８】
本明細書を通じて「一実施形態」又は「実施形態」への言及は、その実施形態に関連して説明された特定の特徴、構造、又は特性が、本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な箇所での「一実施形態では」又は「実施形態では」という句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、又は特性は、1以上の組み合わせで任意の適切な方法で組み合わせることができる。
【０５８９】
法令に従って、本発明を構造的又は方法的特徴に多少なりとも特有の言語で説明した。本明細書に記載された手段は本発明を実施する好ましい形態を含むので、本発明は示され又は記載された特定の特徴に限定されないことは理解されるべきである。したがって、本発明は、当業者によって適切に解釈される(もしあれば)添付の特許請求の範囲の適切な範囲内のその形態又は改変のいずれかで特許請求される。
【図１−１】
2019537031.tif 000009
【図１−２】
2019537031.tif 000010
【図２】
2019537031.tif 000011
【図３】
2019537031.tif 000012
【図４】
2019537031.tif 000013
【図５】
2019537031.tif 000014
【図６】
2019537031.tif 000015
【図７】
2019537031.tif 000016
【図８】
2019537031.tif 000017
【図９】
2019537031.tif 000018
【図１０】
2019537031.tif 000019
【図１１】
2019537031.tif 000020
【図１２】
2019537031.tif 000021
【図１３】
2019537031.tif 000022
【図１４】
2019537031.tif 000023
【図１５】
2019537031.tif 000024
【図１６−１】
2019537031.tif 000025
【図１６−２】
2019537031.tif 000026
【図１７】
2019537031.tif 000027
【図１８−１】
2019537031.tif 000028
【図１８−２】
2019537031.tif 000029
【図１９−１】
2019537031.tif 000030
【図１９−２】
2019537031.tif 000031
【図２０−１】
2019537031.tif 000032
【図２０−２】
2019537031.tif 000033
【図２１】
2019537031.tif 000034
【図２２】
2019537031.tif 000035
【図２３】
2019537031.tif 000036
【図２４】
2019537031.tif 000037
【図２５】
2019537031.tif 000038
【図２６】
2019537031.tif 000039
【図２７】
2019537031.tif 000040
【国際調査報告】
2019537031.tif 000041
2019537031.tif 000042
2019537031.tif 000043