(57)【要約】本発明は、脊髄損傷後のGABA仲介性シナプス前抑制の減弱を治療するための治療法を提供する。治療計画は、外傷性または虚血性の脊髄損傷後の患者における慢性的な痙縮を調節するための、GAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）およびVGAT（小胞GABA輸送体）の脊髄分節特異的なアップレギュレーションを含む。2019510047.tif 000010
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
GAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）遺伝子およびVGAT（小胞GABA輸送体）遺伝子をアップレギュレートする段階を含み、それにより対象における痙縮を治療する、対象における痙縮を治療する方法。
【請求項２】
GAD65遺伝子およびVGAT遺伝子のアップレギュレーションがGAD65遺伝子およびVGAT遺伝子の脊髄特異的なアップレギュレーションである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
GAD65遺伝子およびVGAT遺伝子のアップレギュレーションが、GAD65およびVGATをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを対象に投与する段階を含み、ここでGAD65およびVGATが発現され、それにより痙縮が低減される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
GAD65およびVGATが過剰発現される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（AV）、またはアデノ随伴ベクター（AAV）である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記ベクターがAAVである、請求項5記載の方法。
【請求項８】
AAVがAAV9である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスベクターが、対象の脊髄実質に、対象の髄腔内空間に、対象の脊髄軟膜下空間に、または対象の末梢痙直筋肉に直接投与される、請求項3記載の方法。
【請求項１０】
必要とする対象に、GAD65およびVGATをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを治療的有効量で投与する段階を含み、それにより対象における痙縮を治療する、対象における痙縮を治療する方法。
【請求項１１】
前記ベクターが、レンチウイルスベクター、AV、またはAAVである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターがAAVである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
AAVがAAV9である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターが、対象の脊髄実質に、対象の髄腔内空間に、対象の脊髄軟膜下空間に、または対象の末梢痙直筋肉に直接投与される、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
GAD65およびVGATをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを投与する段階を含み、ここでGAD65およびVGATが発現され、それにより脊髄損傷が治療される、脊髄損傷を有する対象を治療するための治療計画。
【請求項１６】
GAD65およびVGATが過剰発現される、請求項15記載の治療計画。
【請求項１７】
前記ベクターが、レンチウイルスベクター、AV、またはAAVである、請求項15記載の治療計画。
【請求項１８】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項17記載の治療計画。
【請求項１９】
前記ベクターがAAVである、請求項17記載の治療計画。
【請求項２０】
AAVがAAV9である、請求項19記載の治療計画。
【請求項２１】
前記ベクターが、対象の脊髄実質に、対象の髄腔内空間に、対象の脊髄軟膜下空間に、または対象の末梢痙直筋肉に直接投与される、請求項15記載の治療計画。
【請求項２２】
GAD65およびVGATをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む、ベクター。
【請求項２３】
レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびAAVベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、請求項22記載のベクター。
【請求項２４】
AAV9-UBI-GAD65+VGATである、請求項23記載のベクター。
【請求項２５】
請求項22記載のベクターを含有する、単離された哺乳動物宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体の内容が参照により本明細書に組み入れられる、2016年3月28日に出願された米国特許出願第62/314,128号に基づいて、米国特許法（35 U.S.C.）第119条（e）の下における優先権の恩典を主張する。
【０００２】
助成金についての情報
本発明は、米国国立衛生研究所により付与された助成金第NS051644-02A2号の下での米国政府の支援を受けてなされた。本発明においては米国政府が一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は脊髄損傷の治療一般に関連し、より具体的には、外傷性または虚血性の脊髄損傷後の患者における慢性的な痙縮を調節するための併用治療計画に関連する。
【背景技術】
【０００４】
背景情報
（外傷性または虚血性の）脊髄損傷は臨床的に定義付けられた痙縮や硬直の発現をもたらし得る。脊髄損傷後に痙縮の出現を導く発症機序の１つは局所的な分節抑制の減弱であり、その結果として起こる：i）緊張性運動ニューロンの発火の増加、ii）筋肉伸張中の一次求心性インプットの増加、および／またはiii）末梢感覚刺激に対する増悪した反応（即ち異痛）であると考えられる。γ-アミノ酪酸（GABA）仲介性シナプス前抑制、シナプス後の反回抑制および相反性抑制の減弱、ならびに屈筋求心経路におけるその抑制効果の減弱が主要な機構の１つであることが示されている。
【０００５】
しかし興味深いことに、過去の研究ではTh12切断ネコの腰髄分節において脊髄実質のGAD67の発現が有意に増加することが示された。同様に、出生後5日目に胸中部脊髄切断を行った成体ラットにおいてはα-運動ニューロン膜と並置する抑制ボタンの密度の増加が認められた。これらのデータから、脊髄の外傷後の脊髄介在ニューロンにおけるGABA合成酵素の静的増加、またはα-運動ニューロンとの抑制性接続の数の増加は、特定の抑制性ニューロン促進活性がなければ、痙縮／反射亢進の発現を妨げるには十分でないことが示される。抑制の低減に加え、以下を含む幾つかの他の潜在的な機構が脊髄の外傷後の痙縮の発現に寄与することが示されている：i）脳由来セロトニン不在下において自発的に活性化した、α-運動ニューロン5-HT2C受容体活性の漸進的な増大、またはii）運動ニューロンにおける塩化カリウム共輸送体KCC2のダウンレギュレーション、およびその結果としてのGABA仲介性脱分極への切り替え。これらのデータを併せみると、（外傷性または虚血性の）脊髄損傷後の痙縮の発現を導く機構が複雑であり、使用されるモデルや損傷が引き起こされたときの実験動物の年齢によって変化し得ることが示される。
【０００６】
臨床薬理学的治験によって、全身投与または脊髄投与されたバクロフェン（GABAB受容体アゴニスト）の使用が最も潜在能の高い抗痙縮薬理学的治療であることが示される。それは脊髄の外傷、筋萎縮性側索硬化症、または脳卒中を含む、異なる病因による痙縮の調節において有効である一方、全身鎮静状態や漸進的な耐性の発現などの主な副作用がしばしばその長期的な使用を制限している。全身投与した、臨床的に許容される用量でのチアガビン（GABA再取り込み阻害剤）のようなGABA模倣化合物の使用は、弱い抗痙縮効果しか示さないか、または効果を全く示さず、それは全身送達後の脳または脊髄実質のGABAの放出に比較的少ない増強しかないことと相関している。加えて、現在利用可能な（硬膜外または髄腔内への送達のような）脊髄への薬物送達システムでは、脊髄分節限定の治療効果を与えることができない。個々の筋肉群に影響する痙縮の起始部は特定の脊髄分節に体性感覚的に位置するため、分節を標的とする抗痙縮治療法の開発は、不必要な副作用を減らすことで、現行の治療的アプローチを上回り明らかに有益となる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、虚血誘導の痙縮を有するラットにおいてGAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）およびVGAT（小胞GABA輸送体）の脊髄分節特異的なアップレギュレーションからなる併用治療が抗痙縮効果を導き、そのような併用治療の結果、筋痙直が低減するという知見に基づく。
【０００８】
したがって、本発明は対象における痙縮を治療する方法を提供する。本方法はGAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）遺伝子およびVGAT（小胞GABA輸送体）遺伝子をアップレギュレーションを含み、それによって対象における痙縮を治療する。GAD65遺伝子およびVGAT遺伝子のアップレギュレーションは、GAD65およびVGATをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを対象に投与することによるGAD65遺伝子およびVGAT遺伝子の脊髄特異的なアップレギュレーションであってよく、GAD65およびVGATが発現され、それにより痙縮が低減される。GAD65遺伝子およびVGAT遺伝子は過剰発現され得る。ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）であってよい。AAVはAAVタイプ9（AAV9）であってよい。様々な態様において、ウイルスベクターは、対象の脊髄実質に、対象の髄腔内空間に、対象の脊髄軟膜下空間に、または対象の末梢痙直筋肉に直接投与される。
【０００９】
別の局面において本発明は対象における痙縮を治療する方法を提供する。本方法は、必要とする対象にGAD65遺伝子およびVGAT遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを治療的有効量で投与し、それにより対象における痙縮を治療する段階を含む。ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）であってよく、対象の脊椎に直接投与することができる。AAVはAAVタイプ9（AAV9）であってよい。様々な態様においてベクターは対象の脊髄実質に、対象の髄腔内空間に、対象の脊髄軟膜下空間に、または対象の末梢痙直筋肉に直接投与される。
【００１０】
別の局面において本発明は脊髄損傷を有する対象を治療するための治療計画を提供する。該治療計画はGAD65およびVGATをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを投与する段階を含み、GAD65およびVGATが発現され、それにより痙縮が低減される。GAD65およびVGATのアップレギュレーションは、GAD65およびVGATをコードするウイルスベクターを投与する段階を含み、GAD65およびVGATが発現され、痙縮が低減される。該ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターであってよく、対象の脊髄実質に、対象の髄腔内空間に、対象の脊髄軟膜下空間に、または対象の末梢痙直筋肉に直接投与することができる。様々な態様において、ベクターは、対象の脊髄実質に、対象の髄腔内空間に、対象の脊髄軟膜下空間に、または対象の末梢痙直筋肉に直接投与される。
【００１１】
別の局面において本発明は、GAD65およびVGATをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターまたは制御配列を含む発現カセットを提供する。GAD65およびVGATをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターのような制御配列を含むAAV9などのベクターも提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、本発明の方法を実施するための例示的な方法を示す図である。
【図２】図2は、腰部軟膜下へのAAV9-UBI-GFPの送達後に得られた導入遺伝子発現の分布を示す図である。灰白質中の介在ニューロンにおいて広範囲に渡るGFP発現が認められる。GAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ65）およびVGAT（小胞GABA輸送体）をコードするAAV9ウイルスが軟膜下送達法を用いて標的分節に注射される。
【図３】図3A〜3Dは、脊髄切断誘導の慢性痙性ラットにおける、腰部軟膜下へのAAV9-UBI-GAD65+VGATの送達後の強い抗痙縮作用および抗侵害受容作用を示すグラフである。
【図４】図4A〜4Dは、腰部軟膜下へのAAV9-UBI-GAD65+VGATの送達による、脊髄の興奮性介在ニューロンにおける抑制性-興奮性混在型の神経伝達物質表現型の誘導を示す図である。8週において、GAD65/VGAT遺伝子を注射された分節の免疫蛍光分析によって、双方の遺伝子の有意なアップレギュレーションおよび抑制性/興奮性混在型の神経伝達物質表現型の出現（GAD65またはVGATのVGLUT2(小胞グルタミン酸輸送体)との共発現）が示された（図4Aおよび4B）。対照AAV9を注射された動物個体において共発現は認められなかった（図4Cおよび4D）。これらのデータから、筋痙直の低減を仲介する可能性のある、GAD65/VGAT過剰発現ニューロンにおける抑制の促進の有効な誘導が確認された。
【図５】図5は、腰部軟膜下へのAAV9-UBI-GAD65+VGAT送達後の、痙性ラットの腰髄における抑制性-興奮性混在型の介在ニューロンおよび突出しているDRGニューロンの数の有意な増加を示す図である。表はGAD65およびVGATの発現の定量解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、虚血誘導の痙縮を有するラットにおけるGAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）遺伝子およびVGAT（小胞GABA輸送体）遺伝子の脊髄分節特異的なアップレギュレーションからなる併用治療が抗痙縮効果をもたらし、そのような併用治療によって筋痙直が低減するという知見に基づく。
【００１４】
本組成物および方法が説明される前に、本発明は説明される特定の組成物、方法、および実験条件には限定されず、そのような組成物、方法、および条件は変化し得ることを理解されるべきである。本明細書において使用される用語は特定の態様を説明する目的のためのものにすぎず、限定を意図しないこと、したがって本発明の範囲は添付の特許請求の範囲においてのみ限定されることも理解されるべきである。
【００１５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、文脈によって特に明らかに指示されない限り、単数形の「a」、「an」、および「the」は複数の言及を含む。したがって、例えば「方法」という言及は１つもしくは複数の方法、および／または本開示等を読めば当業者には明らかとなる、本明細書において説明されるタイプの段階を含む。
【００１６】
「〜を含む（comprising）」という用語は、「〜を含んでいる（including）」、「〜を含有する（containing）」、または「〜によって特徴付けられる」と言い換え可能で使用され、付加的な列挙されない要素または方法段階を包含し、またはそれらと変更可能であり、それらを除外しない言葉である。「〜からなる」という句は、請求項において特定されない、いかなる要素、段階、または成分も除外する。「本質的に〜からなる」という句は、請求項の範囲を特定の材料または段階に、および主張される発明の基本的な新規の特徴には実質的に影響しないものに限定する。本開示によって、これらの句の各々の範囲に相当する本発明の様々な態様の組成物および方法が企図される。したがって、列挙される要素または段階を含む組成物または方法は、該組成物または方法が本質的にそれらの要素もしくは段階からなる、またはそれらの要素もしくは段階からなるような、特定の態様を企図する。
【００１７】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験においては本明細書において説明されるものと同様または同等の、任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料がここで説明される。
【００１８】
本明細書において使用される「対象」という用語は、本方法が行われる任意の個体または患者を指す。一般的に対象はヒトであるが、当業者には理解されるように、対象は動物であってよい。したがって、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、牛、馬、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を含む家畜、ならびに霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む）のような哺乳動物を含む他の動物が対象の定義内に含まれる。
【００１９】
本明細書において使用されるような「治療的効果」は、本明細書において説明されるような治療的利益および／または予防的利益を包含する。
【００２０】
本明細書において使用されるように、ある場合における低減は特定のアッセイの検出レベル以下まで減り得ることが認識されるため、「低減する」および「抑制する」という用語は共に使用される。そのように、発現のレベルまたは活性が、あるアッセイの検出レベル以下に「低減した」のか、または完全に「抑制された」のかは常に明らかではない可能性がある。とはいえ、本方法に従った治療の後にそれを明らかに決定することはできる。
【００２１】
本明細書において使用されるように、「治療」または「治療する」は、望ましくない状態を有する対象または系に組成物を投与することを意味する。該状態は疾患または障害を含み得る。「予防」または「予防する」は、該状態のリスクのある対象または系に組成物を投与することを意味する。該状態は、疾患または障害への素因を含み得る。組成物の対象への投与の効果は（治療および／または予防のいずれでも）、限定しないが、該状態の１つもしくは複数の症状の停止、該状態の１つもしくは複数の症状の低減もしくは予防、該状態の重症度の低下、該状態の完全な消失、特定の事象もしくは特徴の発現もしくは進行の安定化もしくは遅延、または特定の事象もしくは特徴が起こる頻度の最少化であり得る。
【００２２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書においてはアミノ酸残基のポリマーを指し、言い換え可能なように使用される。本用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、相当する天然のアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然には存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【００２３】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに、例えばヒドロキシプロリン、α-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンのような、後に修飾されるアミノ酸である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムと結合したα炭素を有する化合物を指す。そのようなアナログは、修飾されたR基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチドバックボーンを有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有しているが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化合物を指す。
【００２４】
本明細書においてアミノ酸は、その周知の3文字の記号か、または国際生化学分子生物学連合命名法委員会（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission）により推奨される1文字の記号のいずれかで呼ばれ得る。ヌクレオチドは同様に、一般的に認められているその1文字表記で呼ばれ得る。
【００２５】
本明細書において使用されるように、「制御遺伝子」または「制御配列」は、他の遺伝子の発現を調節する産物（例えば転写因子）をコードする核酸配列である。
【００２６】
本明細書において使用されるように、「タンパク質コード配列」または特定のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする配列は、適切な制御配列の調節下に置かれた場合に、インビトロまたはインビボにおいてmRNA（DNAの場合）に転写され、（mRNAの場合）ポリペプチドに翻訳される核酸配列である。コード配列の境界は5’末端（N末端）の開始コドンおよび3’末端（C末端）の翻訳停止ナンセンスコドンによって決定される。コード配列は非限定的に、真核生物mRNA由来のcDNA、真核生物DNA由来のゲノムDNA配列、および合成核酸を含み得る。転写終結配列は通常コード配列の3’側に位置する。
【００２７】
本明細書において使用されるように、「プロモーター」は、RNAポリメラーゼをDNAに結合させてRNA合成を開始させることにより転写開始を仲介する、遺伝子の上流に一般的に位置する制御DNA配列と定義付けられる。プロモーターは構成的に活性なプロモーター（即ち、構成的に活性／「ON」の状態にあるプロモーター）であってよく、誘導性プロモーター（即ち、活性／「ON」または不活性／「OFF」のその状態が外部刺激、例えば特定の化合物またはタンパク質の存在によって調節されるプロモーター）であってよく、空間的に制限されるプロモーター（即ち、転写調節因子、エンハンサー等）（例えば組織特異的プロモーター、細胞タイプ特異的プロモーター等）であってよく、時間的に制限されるプロモーター（即ち、胚発生の特定の段階において、または生物学的プロセスの特定の段階においてプロモーターが「ON」状態または「OFF」状態にある）であってよい。
【００２８】
本明細書において使用されるように、「遺伝子」という用語は構造遺伝子のコード領域を含むデオキシリボヌクレオチド配列を意味する。「遺伝子」は、該遺伝子が全長mRNAの長さに相当するように5’末端および3’末端の双方においてコード領域に隣接して位置する非翻訳配列をも含み得る。コード領域の5’側に位置し、mRNA上に存在する配列は5’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の3’側、すなわち下流に位置し、mRNA上に存在する配列は、3’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語はcDNAと遺伝子のゲノム形態の双方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって分断されたコード領域を含有する。イントロンはヘテロ核RNA（hnRNA）に転写される遺伝子の断片である；イントロンはエンハンサーのような制御因子を含有し得る。イントロンは核転写産物または一次転写産物から除去または「切り出」される；したがってイントロンはメッセンジャーRNA（mRNA）転写産物中にはない。翻訳の間mRNAは、新生ポリペプチドにおける配列またはアミノ酸の順序を特定するよう機能する。
【００２９】
本明細書において使用するように、「機能するように連結された」および「機能的に連結された」という用語は言い換え可能で使用され、2つまたはそれ以上のDNA断片、特に発現される遺伝子配列とその発現を調節する配列の間の機能的な関係を指す。例えば、シス作用性転写調節因子の任意の組み合わせを含むプロモーター／エンハンサー配列が、適切な宿主細胞または他の発現系におけるコード配列の転写を刺激または調節するのであれば、それはコード配列に機能的に連結されている。転写される遺伝子配列に機能的に連結されたプロモーター制御配列は、転写される配列に物理的に隣接している。
【００３０】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列および核酸配列の双方に適用される。特定の核酸配列に関して保存的に修飾された変異体は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一の配列をコードする核酸を指す。遺伝子コードの縮重によって、多数の機能的に同一の核酸が所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが特定される全ての位置において、コードされるポリペプチドを変えることなく、記載した相当コドンの任意のものに該コドンを変えることができる。そのような核酸変異は保存的に修飾された変異の一種である「サイレント変異」である。本明細書における、ポリペプチドをコードする全ての核酸配列は、核酸において可能な全てのサイレント変異をも含めて記載するものである。当業者には、核酸における各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるAUG、および、通常トリプトファンのための唯一のコドンであるTGGを除く）を修飾して機能的に同一の分子を得られることが認識される。したがって、あるポリペプチドをコードするある核酸の各々のサイレント変異は、記載される各配列において黙示的である。
【００３１】
アミノ酸配列については、コードされる配列において1つのアミノ酸または低い割合のアミノ酸を変化させる、加える、または欠失させるような、ある核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、「保存的に修飾された変異」であり、該変化の結果、あるアミノ酸が、化学的に類似したアミノ酸と置換されることが当業者には認識される。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の一覧は、当技術分野においては周知である。そのような保存的に修飾された変異体は本発明の多型変異体、種間相同体、およびアレルに加えられるものであり、それらを除外するものではない。
【００３２】
以下の8群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
1）アラニン(A)、グリシン(G)；
2）アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
3）アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
4）アルギニン(R)、リシン(K)；
5）イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；
6）フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；
7）セリン(S)、スレオニン(T)；および
8）システイン(C)、メチオニン(M)（例えばCreighton, Proteins(1984)を参照のこと）。
【００３３】
保存的置換は、塩基性から塩基性、酸性から酸性、極性から極性等のような置換を含み得る。そのように誘導されるアミノ酸のセットは構造上の理由で保存される可能性がある。これらのセットはベン図の形態において説明できる（Livingstone C.D.およびBarton G.J.(1993)「タンパク質配列アラインメント：残基の保存の階層分析のための戦略」Comput. Appl Biosci.9:745-756；Taylor W.R.(1986)「アミノ酸の保存の分類」J.Theor Biol. 119:205-218）。保存的置換は例えば、一般的に許容されるアミノ酸のベン図分類を説明する以下の表に従って行うことができる。
【００３４】
（表１）アミノ酸の分類
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【００３５】
「配列同一性のパーセンテージ」は、2つの最適にアラインメントされた配列の比較ウィンドウを通した比較によって決定され、2つの配列の最適なアラインメントについて、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分が、付加または欠失を含まない参照配列（例えば本発明のポリペプチド）と比べて付加または欠失（即ちギャップ）を含み得るような比較によって決定される。配列同一性パーセンテージは、双方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、配列同一性パーセンテージを得るために、結果に100をかけることによって計算される。
【００３６】
2つまたはそれ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、同じ配列である2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。2つの配列は、比較ウィンドウで比較し最大の一致についてアラインメントした場合に、または、以下の配列比較アルゴリズムのうち１つを用いて、もしくはマニュアルアラインメントや目視検査によって指定された領域で測定した場合に、もし2つの配列が特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（即ち特定の領域に渡って、または特定しない場合は配列全体に渡って60％の同一性、任意で65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％の同一性を有する）ならば「実質的に同一」である。本発明は、本明細書において例示される各々のポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドと同様に、非限定的に神経性疾患もしくは障害、例えば神経変性疾患もしくは障害の治療もしくは予防、および／またはSCIの治療のための使用を含むその使用をも提供する。任意で、少なくとも約50ヌクレオチド長の領域に渡って、またはより好ましくは100〜500もしくは1000もしくはそれ以上のヌクレオチド長の領域に渡って、または参照配列の全長に渡って同一性がある。
【００３７】
配列比較について、典型的に1つの配列が、試験配列を比較する参照配列となる。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを用いることができ、別のパラメーターを指定することもできる。その後、配列比較アルゴリズムによって、プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが計算される。
【００３８】
本明細書において使用されるように、「比較ウィンドウ」は、20〜600、通常約50〜約200、より普通には約100〜約150からなる群より選択される連続する位置の数のいずれか1つのセグメントに対する参照を含み、ここで配列は、2つの配列が最適にアラインメントされた後に、同じ数の連続する位置を有する参照配列と比較され得る。比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野においては周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えばSmith and Waterman(1970) Adv.Appl.Math. 2:482cの局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch(1970) J.Mol.Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman(1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似度検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター実行によって（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）、またはマニュアルアラインメントおよび目視検査によって（例えばAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995増補版) を参照のこと）行うことができる。
【００３９】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するのに好適なアルゴリズムの2つの例は、Altschul et al.(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al.(1990) J.Mol. Biol. 215:403-410の各々にて説明される、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST解析を実行するためのソフトウェアは米国国立バイオテクノロジー情報センターを介して公的に利用可能である。このアルゴリズムはまず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントした場合にある正値の閾値スコアTにマッチするかまたは満たす、クエリー配列中の長さWのショートワードを特定することによって、ハイスコアリング配列対（HSP）を同定する段階に関与する。Tは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.,前記）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見つける検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加できる限り各配列に沿って両方向に拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターM（マッチした残基対についてのリワードスコア；常に >0）およびN（ミスマッチの残基についてのペナルティスコア；常に <0）を用いて計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリクスが使用される。両方向へのワードヒットの拡張は：累積アラインメントスコアが量Xによってその最大達成値から下落した時点で；1つもしくは複数の負のスコアリング残基アラインメントの累積によって累積スコアがゼロもしくはそれ未満に達した場合に；または、いずれかの配列の末端に達した場合に停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T、およびXによってアラインメントの感度および速度が決定される。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列について）ではデフォルトとしてワード長（W）11、期待値（E）10、M=5、N=-4を用い、双方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムでデフォルトとしてワード長3、および期待値（E）10、およびBLOSUM62スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff(1989) Proc Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照のこと）アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4を用い、双方の鎖の比較を行う。
【００４０】
BLASTアルゴリズムでは2つの配列の類似性の統計解析も行われる（例えば、Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照のこと）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の1つは、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のマッチが偶然生じる確率の指標を与える最小合計確率（P(N)）である。例えば、試験核酸の参照核酸に対する比較における最小合計確率が約0.2未満であれば、より好ましくは約0.01未満であれば、そして最も好ましくは約0.001未満であれば、核酸は参照配列に対して類似であると考えられる。
【００４１】
「核酸」は、単鎖または二重鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマー、ならびにその相補鎖を指す。本用語は、合成の、天然に存在する、および天然には存在しない核酸であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾されたバックボーンの残基もしくは結合を含有する核酸を包含する。そのようなアナログの例は、非限定的に、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホン酸、キラル-メチルホスホン酸、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）を含む。様々な態様において、他の細胞成分または他の混入物質（例えば細胞中に存在する他の核酸もしくはタンパク質）から、アルカリ/SDS処理、CsClを用いたバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知の他の技術を含む標準技術によって精製された場合に、核酸は単離される。例えば、F.Ausubel, et al., ed.(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。様々な態様において核酸は、例えばDNAまたはRNAであり、イントロン配列を含有してもしなくてもよい。好ましい態様において核酸はcDNA分子である。
【００４２】
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、および油／水エマルジョンまたは水／油エマルジョンのようなエマルジョンなどの標準的な薬学的担体の任意のもの、ならびに様々なタイプの湿潤剤を包含する。
【００４３】
本明細書において使用されるように、「ニューロン」という用語はニューロンおよびその部分（例えばニューロン細胞体、軸索、または樹状突起）を含む。本明細書において使用される「ニューロン」という用語は、中心細胞体または神経細胞体、および2つのタイプの伸長または突出（通常神経細胞信号の大部分がそれによって細胞体まで伝達される樹状突起、および通常神経細胞信号の大部分がそれによって細胞体から標的ニューロンまたは筋肉のようなエフェクター細胞まで伝達される軸索）を含む神経系細胞を意味する。ニューロンは、組織および器官から中枢神経系（求心性神経または感覚ニューロン）まで情報を伝達でき、中枢神経系からエフェクター細胞（遠心性神経または運動ニューロン）までシグナルを伝送できる。介在ニューロンと呼ばれる他のニューロンは、中枢神経系（脳および脊柱）内のニューロンを連結する。本発明に従った治療または方法を受けることができるニューロンタイプのある特定の例は、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロン、および皮質ニューロンを含む。
【００４４】
「神経変性」という用語は広く使われ、非限定的に神経細胞の死滅または消失を含む、神経細胞におけるいかなる病理学的変化、細胞死に先行するいかなる変化、および神経細胞の活性または機能のいかなる低減または減弱をも指す。病理学的変化は自発性のものであってよく、またはある事象によって誘導されてもよく、例えばアポトーシスと関連する病理学的変化を含む。ニューロンは非限定的に感覚ニューロン、交感神経細胞、副交感神経細胞、または腸ニューロンを含む任意のニューロンであってよく、例えば後根神経節ニューロン、運動ニューロン、および中枢ニューロン、例えば脊髄からのニューロンであってよい。神経変性または細胞消失は様々な神経性疾患または障害、例えば神経変性疾患または障害の特徴である。ある態様においては、ニューロンは感覚ニューロンである。ある態様においてニューロンは運動ニューロンである。ある態様においてニューロンは損傷脊髄ニューロンである。
【００４５】
本明細書において使用されるように、「痙縮」は、ある筋肉が連続的に収縮する状態を指す。この収縮は筋肉の硬直または緊張を生じ、正常な動作、発話、および歩行運動を妨げ得る。痙縮は、上位運動ニューロンに影響する中枢神経系（CNS）の障害において、痙縮性の両麻痺または上位運動ニューロン症候群のような病変としてほとんどが生じるが、様々なタイプの多発性硬化症においても生じ得、その場合、ミエリン鞘に対する漸進的に悪化する攻撃の症状として現れ、したがって脳性麻痺起源の神経筋の痙縮性障害において認められるタイプの痙縮とは関連しない。理論には縛られないが、脊髄および／または中枢神経系の損傷によって引き起こされる、α運動ニューロンに対する興奮性インプットと抑制性インプットのアンバランスが生じた場合に、痙縮が発現する。損傷は、神経系と筋肉の間のシグナルのバランスにおける変化を引き起こし、筋肉における興奮性の増大を導く。痙縮は、脳および／または脊髄が損傷された状態、または正常に発達できない状態；脳性麻痺、多発性硬化症、脊髄損傷、および脳卒中を含む後天的な脳損傷を含む状態において認められる。
【００４６】
本明細書において使用されるように、「神経変性疾患」または「神経障害」は、神経細胞または神経細胞集団の形態学的および／または機能的な異常を引き起こす障害を指す。神経変性疾患は対象における正常な神経機能の減損もしくは欠如を、または異常な神経機能の存在をもたらし得る。例えば、神経変性疾患は、疾患、損傷、および／または老化の結果として生じ得る。形態学的および機能的な異常の非限定的な例は、神経細胞の物理的劣化および／もしくは死滅、神経細胞の異常な成長パターン、神経細胞間の物理的連絡の異常、神経細胞による例えば神経伝達物質のような物質の産生不足もしくは過剰産生、例えば神経伝達物質のように神経細胞によって正常であれば産生される物質の産生がなされないこと、および／または異常なパターンでのもしくは異常時の電気的刺激の伝達を含む。神経変性は、対象の脳のいかなる領域でも起こり得、例えば頭部外傷、脳卒中、ALS、多発性硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、およびアルツハイマー病を含む多くの疾患について認められる。
【００４７】
本明細書において使用されるように、「痛覚」という用語は、ある有害なまたは潜在的に有害な刺激に対する感覚神経系の反応を指す。痛覚においては、強烈な化学物質（例えば眼の中にチリパウダー）、機械的外傷（例えば切断、挫滅）、または温度（熱および冷たさ）からの、侵害受容器と呼ばれる感覚神経細胞の刺激によってシグナルが生じ、それが一連の神経繊維に沿って脊髄を通って脳まで伝播する。痛覚は様々な生理学的反応および行動学的反応を誘発し、感覚ある生物において痛みの主観的体験を通常もたらす。
【００４８】
γ-アミノ酪酸（GABA）とグルタミン酸は、哺乳動物における主要な抑制性神経伝達物質と興奮性神経伝達物質である。GABAとグルタミン酸の間のバランスによって神経発生、動作、生物時計、組織の発達および血糖調節のような多様な過程が調節される。GABAはピリドキサールリン酸（PLP）依存性酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼの65 kDaおよび67 kDaアイソフォーム（GAD65およびGAD67）によってグルタミン酸から合成される。ヒトGAD65およびGAD67は、Bu et al.(1992) Proc Natl Acad Sci 89:2115-2119によって単離され、クローニングされた。ヒトGAD65 cDNAは、585アミノ酸残基を有するMr65,000ポリペプチド（Genbankアクセッション番号NM000818;M81882）をコードし、ヒトGAD67は594アミノ酸残基を有するMr67,000ポリペプチド（Genbankアクセッション番号NM013445;M81883）をコードする；その各々は参照により本明細書に組み入れられる。参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2016/0081956号も参照のこと。
【００４９】
ヒトGAD65についての付加的な核酸配列およびアミノ酸配列は当技術分野において公知である。例えば以下のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）を提供する、GenBankアクセッション番号:Q05329、ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼ2（GAD2/GAD65）を参照のこと：
2019510047.tif 000004
。
例えば以下の核酸配列（SEQ ID NO.2）を提供する、Genbankアクセッション番号:X69936、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD2/GAD65）についてのホモサピエンスmRNAも参照のこと：
2019510047.tif 000005
。
【００５０】
GABAは、シナプス前およびシナプス後の神経突起の双方の細胞膜における特異的な膜貫通受容体に結合することによって、脳の抑制性シナプスで作用する。この結合によってイオンチャンネルの開口が生じ、負の電荷を帯びた塩化物イオンを細胞に流入させるか、または正の電荷を帯びたカリウムイオンを細胞から流出させる。この作用によって膜電位において負の変化がもたらされ、通常過分極が生じる。GABA受容体には2つの大まかなクラスが知られている：リガンド作動性ゲート開閉イオンチャンネル複合体の一部であるGABAA受容体、および、中間物質（Gタンパク質）を介してイオンチャンネルを開閉するGタンパク質共役受容体であるGABAB代謝調節型受容体である。
【００５１】
脊髄損傷後のGABA仲介性シナプス前抑制の減弱は、脊髄反射の漸進的な増大および痙縮の出現における主要な役割を担う。臨床試験によって、バクロフェン（GABAB受容体アゴニスト）の使用が、痙縮の調節には有効であるが、全身鎮静状態および漸進的な耐性の発現などの主な副作用と関連することが示されている。本試験は、脊髄分節特異的なGAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）遺伝子およびVGAT（小胞GABA輸送体）遺伝子のアップレギュレーションからなる併用療法が抗痙縮効果を導くのかどうかについての評価を提供する。
【００５２】
VGAT（小胞GABA輸送体）（小胞抑制性アミノ酸輸送体(VIAAT)としても知られる）は、ヒトにおいてはSLC32A1遺伝子（VGAT遺伝子としても知られる）によってコードされるタンパク質である。VGATは、脳および脊髄のGABA性ニューロンの神経終末において非常に高濃度であるが、グリシン作動性神経終末にも存在する。参照により本明細書に組み入れられるCaudhry et al., J.Neurosci.,18(23):9733-9750(1998)。ヒトVGATについての核酸配列およびアミノ酸配列は、当技術分野においては公知である。例えば以下のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）を提供する、GenBankアクセッション番号:Q9H598、ヒト小胞抑制性アミノ酸輸送体（VIAAT/VGAT）を参照のこと：
2019510047.tif 000006
。
例えば、以下の核酸配列（SEQ ID NO:4）を提供する、GenBankアクセッション番号:NM_080552、ホモサピエンスsolute carrier family 32 member 1（SLC32A1）mRNAも参照のこと：
2019510047.tif 000007
。
【００５３】
したがって、ある局面において本発明は、GAD65およびVGATをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。GAD65またはその機能的断片に対して少なくとも60％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドも本発明の範囲内である。GAD65またはその断片に対して約70％の相同性、約75％の相同性、約80％の相同性、約85％の相同性、約90％の相同性、約95％の相同性、約99％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド。VGATまたはその断片に対して少なくとも60％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドも本発明の範囲内にある。VGATまたはその断片に対して約70％の相同性、約75％の相同性、約80％の相同性、約85％の相同性、約90％の相同性、約95％の相同性、約99％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド。
【００５４】
脊髄のGABA性抑制性介在ニューロンへの促進的上脊髄性インプットの活性の低下、または完全な消失、およびその結果生じる局所的分節抑制の低減が、脊髄損傷（SCI）を有する患者における筋肉の痙縮の発現を導く主要な機構の1つであると仮定された。同等に、脊髄虚血の一過性のエピソード後に認められるような脊髄の抑制性介在ニューロンの減少は、機能的に定義付けられた筋肉の痙縮や硬直の発現を導く。損傷の性質（例えば脊髄の外傷または虚血）とは無関係に、臨床的および実験的な薬理学的動物試験によって、最も一般的に使用される抗痙縮薬バクロフェン（GABAB受容体アゴニスト）の全身投与または脊髄投与後に相当の強い抗痙縮効果が示された。バクロフェン仲介性過分極作用の主要な部位は、シナプス前Ia求心性神経であると考えられる。
【００５５】
しかし、バクロフェンの全身投与の主な欠点の１つは、局所的な脊髄分節限局性の効果がないことであり、痙縮の臨床的に適切な軽減を達成するために必要とされる比較的高い用量では、鎮静状態のような不要な全身性の副作用がしばしば生じることである。長期的な髄腔内カテーテルを用いたバクロフェンの脊髄への直接的な送達は、顕著な全身作用がより少なく、より部位限定的な効果を与えるが、それには外科的介入が必要であり、脳脊髄液漏出または感染のような、長期的髄腔内カテーテル法に関連する合併症を確実にもたらすと報告されている。さらに重要なことに、髄腔内投与バクロフェンの有効な長期的使用の欠点には、バクロフェン耐性の発現（即ち一定の抗痙縮効果を得るための用量が斬新的に増大すること）、およびバクロフェン治療の突然の中止後に離脱症状が生じることが含まれる。
【００５６】
（ニューロンと対照的に）感染させたアストロサイトにおけるGAD65遺伝子の優先的な発現は、期待されるGABA仲介性抗痙縮効果に関して特定の利益を与えると考えられる（例えば参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第2014/116652号を参照のこと）。インビトロにおいて示されたように、初代のアストロサイトの感染によって細胞外GABA濃度のCa2+非依存的な増加が導かれた。したがって、脊髄実質におけるアストロサイト仲介性GABA放出が、局所的神経抑制回路の機能性や結合性によらず、Ia求心性神経および／またはα-運動ニューロン上で発現されるGABAB受容体に対するその過分極効果を特異的に及ぼすことが期待される。アストロサイトによって産生されるGABAの生物学的活性は、優先的にGABAA受容体を発現する培養hNTニューロンに対するその脱分極誘導効果によって確認された。
【００５７】
GAD65およびVGATの遺伝子併用療法の使用は、局部的な神経抑制を増強させるための、脊髄または脳への作用物質の送達の関係において過去には試されていない新規のアプローチである。本発見の核心は、そうしないと過興奮性となるニューロンの機能的に適切な抑制を達成するために双方の遺伝子をアップレギュレートする必要があることである。本治療効果の効力は、シナプス後膜の抑制を誘導し、α-運動ニューロンの興奮性の低減を導き、結果的に筋肉の痙縮の抑制を導くのに十分な量の遊離可能なGABAをシナプス間隙にて得られるものであることを示す。
【００５８】
したがって別の局面において本発明は、GAD65遺伝子およびVGAT遺伝子の脊髄特異的なアップレギュレーションによって対象における痙縮を治療する方法を提供する。様々な態様において、GAD65およびVGATのアップレギュレーションはGAD65およびVGATをコードするウイルスベクターを投与する段階、ならびに対象の脊髄においてGAD65およびVGATを発現させ、それにより対象における痙縮を低減させる段階を含む。
【００５９】
本発明の方法を実施するために有用なポリヌクレオチドを標的細胞に導入するには、ウイルスベクターが特に有用となり得る。ウイルスベクターは、特定の宿主系において、特に哺乳動物系において使用するために開発され、例えばレトロウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）ベースのもののような他のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（AV）、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等を含む（その各々が参照により本明細書に組み入れられる、Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-990, 1992; Anderson et al., Nature 392:25-30 増補版,1998; Verma and Somia, Nature 389:239-242, 1997; Wilson, New Engl. J.Med. 334:1185-1187 (1996) を参照のこと）。本発明のある局面においてはレンチウイルス、AV、またはAAVが利用される。アデノウイルスは、エンドソームによって輸送できる最大のサイズであり、最も大きな無エンベロープウイルスである（即ち、エンベロープの融合は必要ない）。ウイルス粒子はまた、宿主細胞への付着を助ける、カプシドの各々のペントンベースと関連する特有の「突起」または繊維を有している。AAVは増殖性感染サイクルを開始および維持するために定義上は他のウイルス（典型的にはアデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との共感染を必要とする依存性のパルボウイルスである。そのようなヘルパーウイルスがなくても、受容体が仲介する結合および内部移行、非分裂細胞および分裂細胞双方における核への侵入によって標的細胞に感染または形質導入するのに、AAVはなおもコンピテントである。
【００６０】
一旦核に入ると、ウイルスは脱殻し、多くの異なる形態において導入遺伝子が発現され、その最も持続性のものは環状モノマーである。AAVは安定して形質導入される細胞の1〜5％のゲノムに組み込まれる（Nakai et al., J.Virol. 76:11343-349, 2002）。導入遺伝子の発現は非常に安定である。ヘルパーウイルス不在でのAAV感染からは子孫ウイルスは産生されないため、形質導入の範囲はウイルスに感染した初代の細胞のみに限定される。この特徴により、AAVは本発明にとって好適な遺伝子療法ベクターである。
【００６１】
本発明の方法において使用できる、アデノウイルスベクターおよび他のウイルスベクターを説明する付加的な参照は以下を含む：
2019510047.tif 000008
。例えばMicrobix Biosystems of Toronto, Ontario（例えばMicrobix Product Information Sheet: Plasmids for Adenovirus Vector Construction, 1996を参照のこと。）を含む、商業的供給源からの様々なアデノウイルスプラスミドも利用可能である。
【００６２】
本発明の方法において使用できるAAVベクターを説明する付加的な参照は以下を含む：
2019510047.tif 000009
。
【００６３】
本明細書において使用されるように、「アデノ随伴ウイルス」（AAV）という用語は、非限定的に、AAVタイプ1、AAVタイプ2、AAVタイプ3（タイプ3Aおよび3Bを含む）、AAVタイプ4、AAVタイプ5、AAVタイプ6、AAVタイプ7、AAVタイプ8、AAVタイプ9、AAVタイプ10、AAVタイプ11、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、ヒツジAAV、および現在公知の任意の他のAAVを含む。ある態様においてAAVはAAVタイプ2である。別の態様においてAAVはAAVタイプ9である。
【００６４】
利用される宿主細胞／ベクター系によって、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写終結コドン等を含む、多くの好適な転写因子および翻訳因子のうち任意のものを発現ベクターにおいて使用することができる（Bitter et al., Meth. Enzymol. 153:516-544, 1987）。上記に定義付けられるように、「プロモーター」または「プロモーター配列」という言及は、その最も広い文脈において解釈され、細胞におけるRNAポリメラーゼに結合でき、メッセンジャーRNA、リボソームRNA、核小体低分子RNA、または任意のRNAポリメラーゼの任意のクラスによって転写される任意の種類のRNAのような、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドコード配列の転写を開始できるDNA制御領域を含む。本明細書において企図される「プロモーター」は、CAT box配列および付加的な制御因子（即ち、上流の活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）を含んで、または含まずに、真核細胞における正確な転写開始に必要とされるゴールドバーグ・ホグネス配列（Goldberg-Hogness  box）のような、古典的ゲノム遺伝子の転写制御配列をも含み得る。
【００６５】
プロモーター配列の調節管理下に配列を置くことは、発現が該プロモーター配列によって調節されるように該分子を配置することを意味する。プロモーターは一般的にそれらが調節する遺伝子に対して5’側（上流）に位置する。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築において、一般的にプロモーターの位置は、遺伝子転写開始部位から、その天然の状況における該プロモーターとそれが調節する遺伝子、即ち該プロモーターが由来する遺伝子との間の距離とほぼ同じだけ離れていてよい。当技術分野においては公知のように、プロモーターの機能を損なわずに、この距離に幾らかの変更を適応させることができる。同様に、その調節下に置かれる異種遺伝子に関した制御因子の配置は、その天然の状況における、即ちそれが由来する遺伝子における該因子の配置によって決定される。再度、当技術分野においては公知のように、この距離においても幾らかの変更が可能である。
【００６６】
本発明の方法および治療計画において有用なプロモーターの例は、非限定的に、ヒトユビキチンプロモーターおよびヒトシナプシンプロモーターを含む。しかし、他の公知の組織特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターを使用することもできる。
【００６７】
組み換えAAV粒子を産生させるために好適な宿主細胞は、非限定的に、外因性の核酸分子のレシピエントとして使用できる、またはレシピエントとして使用されてきた、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む。したがって、本明細書において使用される「宿主細胞」は概して、外因性の核酸分子をトランスフェクションされた細胞を指す。宿主細胞は該細胞または該細胞系が発現されるタンパク質、採用される選択系または使用される発酵系と不適合性でない限り、任意の真核細胞または細胞系を含む。
【００６８】
AAVベクターは、それらを適切な、薬学的に許容される担体または希釈剤に溶解、懸濁、または乳化することによって、注射または投与するための調製物に製剤化することができる。そのような薬学的に許容される担体または希釈剤の例は、水性または非水性の溶剤、例えば油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールを含み、必要に応じて、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および保存剤のような従来的な添加剤を共に含む。
【００６９】
細胞タイプに特異的なウイルスベクターが入手可能でない場合、標的細胞上で発現されるリガンド（もしくは受容体）に対して特異的な受容体（もしくはリガンド）を発現するようにベクターを改変できるか、または、そのようなリガンド（もしくは受容体）を含むように同様に改変できるリポソームに封入することができる。例えばペプチドの細胞への移行を促進する、ヒト免疫不全ウイルスTATタンパク質形質導入ドメインのようなタンパク質形質導入ドメインをペプチドが含有するように操作することを含む様々な方法で、ペプチド薬を細胞に導入することができる。さらに、本技術を適応させるようにやはり改変できる、ナノケージおよび薬理学的送達ウエハー（脳腫瘍の化学療法薬において使用されるものなど）のような生体材料に基づく様々な技術が存在する。
【００７０】
レンチウイルスベクターを用いた細胞への組み込み型の遺伝子導入に加えて、視床下核へのAAV-GAD65注射後のGAD65遺伝子の過剰発現が成功したという報告がある。それらの試験においては、持続性のGAD65発現がAAV-GAD65の注射の4〜5か月後まで認められた。より重要なのは、最近の系統的なデータによって、わずかな回数のAAV注射（1〜2回の注射）でさえも、ラットまたはミニブタの線条体へのAAVベースの遺伝子送達の効率が高いと示されることである。したがって別の態様において本発明は、分節特異的なGAD65およびVGATの発現を達成するために、AAVベースのゲノム非組み込み型の、GAD65をコードするベクターおよびVGATをコードするベクターを採用する。
【００７１】
GAD65およびVGATの脊髄への送達を組み合わせることによって、痙性脊髄麻痺の抑制における有意でかつ機能的に適切な増強が達成さられた。脊髄外傷誘導の筋痙直の十分特徴付けられたラットモデルにおいて、脊髄抑制の効力について試験した。この動物モデルは、脊髄損傷後の慢性期において高度に発現した脊髄反射亢進、およびその結果として筋痙直が明らかに生じていることによって特徴付けられる。GAD65＋VGAT（AAV9-UBIベクターにおいて送達された）の脊髄軟膜下注射を受けた慢性痙性動物個体では、遺伝子送達の5週後に痙縮反応の有意な抑制が認められ、この有意な治療効果は少なくとも8週目まで続くことが示された。免疫蛍光分析から、GAD65およびVGATのグルタミン酸作動性マーカーVGLUT1およびVGLUT2との発現の共局在によって証拠付けられるように、脊髄介在ニューロンにおいては抑制性-興奮性混在型の神経伝達物質表現型の出現が示された。対照GFPベクターを注射された動物個体では抗痙縮効果が認められず、GAD65およびVGATとグルタミン酸作動性マーカーVGLUT1およびVGLUT2との発現の共局在は検出されなかった。
【００７２】
本併用療法を投与する段階は、当業者には公知の様々な方法および送達系のうち任意のものを用いて達成または実施することができる。本明細書において使用されるように、「投与」または「投与する段階」という用語は、本発明の方法の実施において対象に本発明の化合物または薬学的組成物を提供する行為を含むよう定義付けられる。投与経路の例は非限定的に、静脈内、関節内、大槽内、眼内、脳室内、髄腔内、軟膜下、筋肉内、腹腔内、皮内、腔内等、およびその任意の2つまたはそれ以上の組み合わせを含む。ある態様においては、GAD65遺伝子およびVGAT遺伝子の脊髄でのアップレギュレーションを達成するために、AAVを脊髄実質、脊椎の髄腔内空間、対象の脊髄軟膜下空間、および／または末梢痙直筋肉に直接送達することができる。例えば参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第2016/122791号を参照のこと。
【００７３】
「治療的有効量」または「有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師、または他の臨床医が目指す組織、系、動物、またはヒトの生物学的反応または医学的反応、例えばGAD65遺伝子およびVGAT遺伝子の脊髄でのアップレギュレーションを誘発する化合物または組成物の量を意味する。したがって、本明細書において「治療的有効量」という用語は、患部に対してある期間に渡って繰り返し適用された場合に、疾患状態の実質的な改善をもたらす製剤の任意の量を意味するように使用される。該量は、治療される状態、状態の進行ステージ、ならびに使用される製剤のタイプおよび濃度によって変化する。いかなる場合も、適切な量は、当業者に容易に明らかとなるか、または常用の実験によって決定できる。例えば、本治療方法に関して、GAD65遺伝子およびVGAT遺伝子をコードするAAVまたはGAD65遺伝子およびVGAT遺伝子をコードするAAVを含む組成物の「治療的有効量」は、望ましい治療計画の一部として使用された場合にGAD65遺伝子およびVGAT遺伝子のアップレギュレーションをもたらす、調製物におけるAAVの量を指す。
【００７４】
送達ベクターの治療的または予防的に有効な量の決定は、常用の計算法を用いて動物データに基づき行うことができる。適切な用量は、数ある要因の中でも選択した導入ベクターの特質、投与経路、治療される哺乳動物（例えばヒトまたは非ヒト霊長類または他の哺乳動物）、年齢、体重、および治療される対象の全身状態、治療される疾患の重篤度、治療される心内の領域の位置、および投与の方法による。したがって適切な投与量は患者ごとに異なる。適切な有効量は当業者によって容易に決定することができる。
【００７５】
投薬治療法は単回投与計画または複数回投与計画であってよい。さらに、対象は適切なだけの数の回数を投与されてよい。当業者は適切な投与回数を容易に決定できる。しかし、投与量は別の投与経路を考慮に入れるように、または副作用に対する治療的利益の均衡が保たれるように調整する必要があり得る。そのような投与量は該組み換えベクターが用いられる治療的適用によって変化し得る。
【００７６】
任意で、本発明に従うAAV仲介性送達は、他のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターによる送達と組み合わせることができる。非限定的にアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクター、およびバキュロウイルスベクターを含むそのような他のウイルスベクターは、当技術分野において公知の方法に従って容易に選択および作製することができる。同様に、非限定的にリポソーム、脂質ベースのベクター、ポリプレックスベクター、分子複合体、ポリアミンおよびポリカチオンベクターを含む非ウイルスベクターは、当技術分野において公知の方法に従って容易に選択および作製することができる。これらの代替経路によって投与された場合、投与量は上記に説明される範囲内にあることが望ましい。
【００７７】
別の局面において本発明は、脊髄損傷を有する対象を治療するための治療計画をも提供する。該治療計画はGAD65遺伝子およびVGAT遺伝子の脊髄特異的なアップレギュレーションを与える段階を含む。詳細を上記で議論したように、GAD65およびVGATのアップレギュレーションは、GAD65およびVGATをコードするウイルスベクターを投与する段階を含み、ここでGAD65およびVGATが発現されて、脊髄損傷が治療される。
【００７８】
さらに、本発明の方法は、重金属（例えば鉛、ヒ素および水銀）および工業用溶剤を含む毒性化合物、ならびに化学療法薬（例えばビンクリスチンおよびシスプラチン）、ダプソン、HIV薬（例えばジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、リトナビル、およびアンプレナビル）、コレステロール降下薬（例えばロバスタチン、インダパミド、およびゲムフィブロジル）、心臓または血圧の薬（例えばアミオダロン、ヒドララジン、ペルヘキシリン）、およびメトロニダゾールを含む薬剤への曝露によって引き起こされる末梢神経障害のような神経損傷の治療において使用できる。
【００７９】
本発明の方法は、物理的、機械的、または化学的外傷によって引き起こされる神経系の損傷を治療するために使用することもできる。したがって、本方法は（例えば火傷、創傷、外科手術、および事故と関連する）物理的損傷、虚血、低温への長期にわたる曝露（例えば凍傷）によって引き起こされる末梢神経損傷、ならびに例えば脳卒中または頭蓋内出血（脳出血など）による中枢神経系の損傷の治療において使用できる。同様に、本発明の方法は、そのような外傷により引き起こされる慢性痛／痛覚の治療において使用できる。
【００８０】
以下の実施例は本発明を例証することを意図するものであり、限定することを意図しない。
【実施例】
【００８１】
実施例1
軟膜下送達法を用いてGAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ65）およびVGAT（小胞GABA輸送体）をコードするAAV9ウイルスを標的分節に注射する（図1）。脊髄損傷誘導の筋痙直を有する動物個体（ラット）を使用した。腰部軟膜下AAV9-UBI-GFP送達後に得られた導入遺伝子発現の分布が図2において示される。灰白質中の介在ニューロンにおける広範囲にわたるGFPの発現が認められる。
【００８２】
GAD65遺伝子およびVGAT遺伝子を送達した後、遺伝子送達の8週後まで痙縮反応について測定を行った。対照痙性動物個体においては対照AAV9-UBI-GFPを使用した。図3A〜3DはAAV9-UBI-GAD65+VGATを注射された動物個体の痙縮反応における漸進的な低減を示す。遺伝子送達後、有意な抗痙縮効果が最短でも8週間続く（図3Aおよび3B）。速度依存的な抑圧（脊髄抑制の変化(altert spinal inhibition)の指標となる）の測定により、対照AAV9注射動物個体と比べて有意な回復が示される（図3C）。
【００８３】
GAD65/VGAT遺伝子注射を行った分節の8週目における免疫蛍光分析から、双方の遺伝子の有意なアップレギュレーションおよび抑制性/興奮性混在型の神経伝達物質表現型の出現（GAD65またはVGATとVGLUT2(小胞グルタミン酸輸送体)との共発現）が示された（図4Aおよび4B）。対照AAV9を注射された動物個体において共発現は認められなかった（図4Cおよび4D）。これらのデータにより、筋痙直の低減を仲介する可能性のあるGAD65/VGAT過剰発現ニューロンにおける抑制の促進の有効な誘導が確証された。
【００８４】
本発明は上記の実施例に関して説明されたが、改変および変更が本発明の精神および範囲内に包含されることは理解される。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月28日(2018.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019510047000001.app
【国際調査報告】
2019510047.tif 000016
2019510047.tif 000017
2019510047.tif 000018