(57)【要約】ペリプラズムの体積が増加している修飾グラム陰性細菌が、提供される。細菌において外来遺伝子を発現させ、タンパク質産生をペリプラズム空間に向けるための方法もまた、提供される。一態様では、このスイッチ表現型を示す修飾細菌細胞が、提供され、本発明の細菌細胞におけるペリプラズム空間が、細胞体積全体の少なくとも約２０％または２５％、より好ましくは、細胞体積全体の少なくとも約３０％、３５％、４０％、または４５％、さらにより好ましくは、細胞体積全体の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％、最も好ましくは、細胞体積全体の少なくとも約７５％、８０％、８５％、または９０％を含む。
2019510517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペリプラズムおよび細胞質を有する組換えグラム陰性細菌細胞であって、細胞質内体積に対するペリプラズム体積の比率は、約０．５：１および約１０：１の間にあり、前記細菌細胞は、対象となるタンパク質をコードする外来遺伝子を含む、組換えグラム陰性細菌細胞。
【請求項２】
前記細菌が、ガンマプロテオバクテリアおよびアルファプロテオバクテリアから選択される、請求項１に記載の細菌細胞。
【請求項３】
前記細菌が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびブレブンディモナス・ディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）から選択される、請求項２に記載の細菌細胞。
【請求項４】
前記細菌が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項３に記載の細菌細胞。
【請求項５】
前記細菌が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項４に記載の細菌細胞。
【請求項６】
前記細胞質内体積に対する前記ペリプラズム体積の比率が、約０．５：１および約５：１の間にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項７】
前記細胞質内体積に対する前記ペリプラズム体積の比率が、約０．５：１および約１：１の間にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項８】
前記細胞質内体積に対する前記ペリプラズム体積の比率が、約１：１および約１０：１の間にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項９】
前記細胞質内体積に対する前記ペリプラズム体積の比率が、約１：１および約５：１の間にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項１０】
前記細胞質内体積に対する前記ペリプラズム体積の比率が、約５：１および約１０：１の間にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項１１】
前記細菌細胞が、約２μｍ〜約１６μｍの最長寸法を有する球菌である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項１２】
前記最長寸法が、約４μｍ〜約１６μｍである、請求項１１に記載の細菌細胞。
【請求項１３】
前記最長寸法が、約８μｍ〜約１６μｍである、請求項１１に記載の細菌細胞。
【請求項１４】
前記最長寸法が、約２μｍ〜約８μｍである、請求項１１に記載の細菌細胞。
【請求項１５】
前記最長寸法が、約４μｍ〜約８μｍである、請求項１１に記載の細菌細胞。
【請求項１６】
前記最長寸法が、約２μｍ〜約４μｍである、請求項１１に記載の細菌細胞。
【請求項１７】
前記細菌細胞が、前記外来遺伝子を含む発現ベクターを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項１８】
前記発現ベクターが、細菌細胞ペプチドグリカン生合成の阻害剤に対する抵抗性をコードするマーカーがない、請求項１７に記載の細菌細胞。
【請求項１９】
前記発現ベクターが、ｐＥＴプラスミドを含む、請求項１７または１８に記載の細菌細胞。
【請求項２０】
前記発現ベクターが、プラスミドｐＥＴ２８ａを含む、請求項１９に記載の細菌細胞。
【請求項２１】
前記外来遺伝子が、前記細菌細胞の染色体の中に統合される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項２２】
前記細菌細胞が、ａｍｐＳおよび／またはホスホマイシン感受性桿菌株の球菌形態を含み、前記球菌形態および前記桿菌株が、遺伝的に同一である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項２３】
前記外来遺伝子の発現が、恒常的である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項２４】
前記外来遺伝子の発現が、誘発性である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項２５】
前記外来遺伝子の発現が、イソプロピル−β−ｄ−１−チオガラクトピラノシド、ラクトース、銅、および亜鉛から選択される誘発因子によって誘発性となる、請求項２４に記載の細菌細胞。
【請求項２６】
前記細菌細胞が、前記外来遺伝子に作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、前記シグナルペプチドが、前記細胞質から前記ペリプラズムへの前記タンパク質の同時翻訳による搬出を指示する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項２７】
前記シグナルペプチドが、ペリプラズムジスルフィド結合オキシドレダクターゼである、請求項２６に記載の細菌細胞。
【請求項２８】
前記シグナルペプチドが、ＤｓｂＡである、請求項２７に記載の細菌細胞。
【請求項２９】
前記タンパク質が、コラーゲンである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項３０】
前記コラーゲンが、ヒトコラーゲンである、請求項２９に記載の細菌細胞。
【請求項３１】
前記コラーゲンが、人工コラーゲンである、請求項２９に記載の細菌細胞。
【請求項３２】
前記タンパク質が、治療用タンパク質である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の細菌細胞。
【請求項３３】
前記治療用タンパク質が、抗体である、請求項３２に記載の細菌細胞。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の細菌細胞およびマグネシウム塩を含む培地を含む細胞培養物であって、前記培地中のマグネシウムイオンの濃度が、少なくとも約４ｍＭである細胞培養物。
【請求項３５】
前記培地中のマグネシウムイオンの濃度が、約４ｍＭおよび約２０ｍＭの間にある、請求項３４に記載の細胞培養物。
【請求項３６】
前記培地中のマグネシウムイオンの濃度が、約１０ｍＭである、請求項３４に記載の細胞培養物。
【請求項３７】
前記マグネシウム塩が、硫酸マグネシウムおよび塩化マグネシウムから選択される、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の細胞培養物。
【請求項３８】
前記培地が、浸透圧安定剤をさらに含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の細胞培養物。
【請求項３９】
前記浸透圧安定剤が、糖およびベタインから選択される、請求項３８に記載の細胞培養物。
【請求項４０】
前記培地中の前記浸透圧安定剤の濃度が、少なくとも約５％である、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の細胞培養物。
【請求項４１】
前記培地中の前記浸透圧安定剤の濃度が、約５％〜約２０％（ｗ／ｖ）である、請求項４０に記載の細胞培養物。
【請求項４２】
前記培地中の前記浸透圧安定剤の濃度が、約１０％（ｗ／ｖ）である、請求項４１に記載の細胞培養物。
【請求項４３】
前記培地が、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、カザミノ酸、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マグネシウム、ペプトン、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酵母抽出物から選択される１つ以上の成分をさらに含む、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の細胞培養物。
【請求項４４】
前記培地が、１ｍＬの培養体積当たり約１×１０８細菌細胞〜１ｍＬ当たり約１×１０１０細菌細胞を少なくとも約１Ｌの体積中に含む、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
【請求項４５】
前記培地が、１ｍＬの培養体積当たり約４×１０８細菌細胞〜１ｍＬ当たり約１×１０９細菌細胞を少なくとも約１Ｌの体積中に含む、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
【請求項４６】
前記培地が、１ｍＬの培養体積当たり約４×１０８細菌細胞〜１ｍＬ当たり約１×１０９細菌細胞を少なくとも約１Ｌの体積中に含む、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
【請求項４７】
前記培養物が、細菌細胞ペプチドグリカン生合成の少なくとも１つの外来抗生物質阻害剤を含む、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の細胞培養物。
【請求項４８】
前記細胞培養物が、細菌細胞ペプチドグリカン生合成の少なくとも２つの構造的に別個の外来抗生物質阻害剤を含む、請求項４７に記載の細胞培養物。
【請求項４９】
細菌細胞ペプチドグリカン生合成の少なくとも２つの構造的に別個の外来抗生物質阻害剤が、前記細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成経路の異なる構成要素を阻害する、請求項４７に記載の細胞培養物。
【請求項５０】
前記培養培地が、少なくとも１つの活性酸素種（ＲＯＳ）捕捉剤を含む、請求項３４〜４９のいずれか一項に記載の細胞培養物。
【請求項５１】
前記培地中の前記ＲＯＳ捕捉剤が、還元グルタチオンを含む、請求項５０に記載の細胞培養物。
【請求項５２】
対象となるタンパク質を産生するための方法であって、
ａ）マグネシウム塩を含む培地において組換えグラム陰性細菌細胞を培養することであって、前記培地中のマグネシウムイオンの濃度は、少なくとも約６ｍＭであり、前記細菌細胞は、前記タンパク質をコードする外来遺伝子を含むこと；
ｂ）前記細菌細胞中のペプチドグリカン生合成を阻害すること；および
ｃ）前記培地から前記タンパク質を回収することを含む方法。
【請求項５３】
ステップｂ）およびｃ）が、連続して行われる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ステップｃ）が、ステップｂ）の少なくとも１時間後に実行される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
ステップｂ）およびｃ）が、同時に行われる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記細菌細胞が、前記細菌細胞中のペプチドグリカン生合成を阻害した後に桿菌から球菌に形状を変化させる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記細菌細胞中のペプチドグリカン生合成の阻害が、前記培地に抗生物質を追加することを含み、前記抗生物質が、前記細菌細胞中のペプチドグリカン生合成を阻害する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記細菌細胞中のペプチドグリカン生合成の阻害が、培地に少なくとも２つの構造的に別個の抗生物質を追加することを含み、前記少なくとも２つの構造的に別個の抗生物質が、前記細菌細胞中のペプチドグリカン生合成を阻害する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記少なくとも２つの構造的に別個の抗生物質が、前記細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成経路の異なる構成要素を阻害する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記細菌が、ガンマプロテオバクテリアおよびアルファプロテオバクテリアから選択される、請求項５２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細菌が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびブレブンディモナス・ディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細菌が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記培地中のマグネシウムイオンの濃度が、約４ｍＭおよび約２０ｍＭの間にある、請求項５２〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記培地中のマグネシウムイオンの濃度が、約１０ｍＭである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記マグネシウム塩が、硫酸マグネシウムおよび塩化マグネシウムから選択される、請求項５２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記培地が、浸透圧安定剤をさらに含む、請求項５２〜６５に記載のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記浸透圧安定剤が、糖およびベタインから選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記浸透圧安定剤が、アラビノース、グルコース、およびスクロースから選択される糖である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記浸透圧安定剤が、トリメチルグリシンから選択されるベタインである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記培地中の前記浸透圧安定剤の濃度が、少なくとも約５％である、請求項５２〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記培地中の前記浸透圧安定剤の濃度が、約５％〜約２０％（ｗ／ｖ）である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記培地中の前記浸透圧安定剤の濃度が、約１０％（ｗ／ｖ）である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記培地が、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、カザミノ酸、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マグネシウム、ペプトン、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酵母抽出物から選択される１つ以上の成分をさらに含む、請求項５２〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記培地が、β−ラクタム抗生物質、ホスホン酸抗生物質、ポリペプチド系抗生物質、およびグリコペプチド系抗生物質から選択される抗生物質を含み、前記抗生物質が、前記細菌細胞中のペプチドグリカン生合成を阻害する、請求項５２〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗生物質が、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、およびモノバクタムから選択されるβ−ラクタム抗生物質である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗生物質が、アラホスファリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズトレオナム、バシトラシン、カルベニシリン、セファマンドール、セフォタキシム、セフスロジン、セファロチン、ホスミドマイシン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンｇ、ペニシリンｖ、ホスホマイシン、プリマキシン、およびバンコマイシンから選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記細菌細胞が、前記外来遺伝子を含む発現ベクターを含む、請求項５２〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記培地が、前記発現ベクターの存在を選択する抗生物質を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記発現ベクターの存在を選択する前記抗生物質が、前記細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成の構成要素の阻害剤ではない、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記発現ベクターの存在を選択する前記抗生物質が、タンパク質合成の構成要素の阻害剤であるかまたはＦｔｓＺ重合の阻害剤である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記発現ベクターが、ｐＥＴプラスミドを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記外来遺伝子が、前記細菌細胞の染色体の中に統合される、請求項４２〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記方法が、前記外来遺伝子の発現を誘発することをさらに含む、請求項５２〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記外来遺伝子の発現が、イソプロピル−β−ｄ−１−チオガラクトピラノシド、ラクトース、銅、および亜鉛から選択される誘発因子によって誘発性となる、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記細菌細胞が、前記外来遺伝子に作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、前記シグナルペプチドが、前記細胞質から前記ペリプラズムへの前記タンパク質の同時翻訳による搬出を指示する、請求項５２〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記シグナルペプチドが、ペリプラズムジスルフィド結合オキシドレダクターゼである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記シグナルペプチドが、ＤｓｂＡである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記タンパク質が、コラーゲンである、請求項５２〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記コラーゲンが、ヒトコラーゲンである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記タンパク質が、治療用タンパク質である、請求項５２〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記治療用タンパク質が、抗体である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記培地が、ステップｂ）の後およびステップｃ）の前に約０．５〜約５のＯＤ６００を有する、請求項５２〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
ステップｂ）は、前記培地が約０．５〜約２のＯＤ６００を有する場合に、細菌細胞中のペプチドグリカン生合成を阻害することを含む、請求項５２〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
ステップｃ）が、遠心分離、ろ過、またはその組み合わせによって培地を清澄化することを含む、請求項５２〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
ステップｃ）が、遠心分離、混合、振盪、前記培地への非イオン性界面活性剤の追加、またはその組み合わせによって、前記ペリプラズムから前記タンパク質を抽出することを含む、請求項５２〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記タンパク質の収率が、約１ｇ／培地１Ｌ〜約５００ｇ／培地１Ｌである、請求項５２〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
請求項５２〜９３のいずれか一項に記載の方法のステップａ）およびｂ）によって調製される組換えグラム陰性細菌細胞。
【請求項９８】
請求項５２〜９６のいずれか一項に記載の方法によって調製されるタンパク質。
【請求項９９】
請求項３４〜５１のいずれか一項に記載の細胞培養物を含有する発酵容器であって、前記細胞培養物は、約または少なくとも約１Ｌ；１０Ｌ；１００Ｌ；２５０Ｌ；５００Ｌ；または１，０００Ｌの体積の培地を含む発酵容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペリプラズムの体積が増加している修飾グラム陰性細菌および修飾グラム陰性細菌において外来遺伝子を発現させるための方法に関する。細菌は、組換えタンパク質産生をペリプラズム空間に向けるのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
原核生物発現系を最適化するための長年の努力にもかかわらず、十分な収率の機能的に活性な遺伝子産物を得ることに対する多くの障害が、今もなお残っており、これには封入体の形成、発現タンパク質の間違ったフォールディング、プロデューサー細胞に対する毒性、およびプロテアーゼによる分解が含まれる。様々な代替の発現系が、組換えタンパク質をより効率的に産生するために開発されており、評価されているところである。
【０００３】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、組換えタンパク質の産生に最もよく使用される宿主である。組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において細胞内で発現された標的外来タンパク質を得るためには、しかしながら、細胞破壊が必要であり、これは、発熱性物質レベル（主として細胞膜組成物に由来する）を増加させ、サンプル不純物を増加させ、かつタンパク質活性を減少させ得る。特に、標的タンパク質が細胞内で過剰発現される場合、封入体の形成が生じることが多い。これらの問題を改善するために、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における外来タンパク質の細胞外分泌が、ますます一般的な選択肢になってきている。外来タンパク質の大規模工業生産において、標的タンパク質の細胞外への分泌作用は、細胞破壊ステップをなくし、タンパク質フォールディングのためのよりよい環境を与え、細胞内酵素による分解の危険性を低下させる（Ｍｅｒｇｕｌｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ  ２３：１７７−２０２）。そのうえ、標的タンパク質の蓄積がペリプラズム空間または細胞内空間に制限されないので、標的タンパク質の細胞外への分泌は、組換えタンパク質収率を改善することができる（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ６０：５１２−５３８；Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２１：１４２９−１４３５）。
【０００４】
組換えタンパク質の細胞外分泌での主な課題は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の細胞膜および外膜の両方を横切るタンパク質の移動に固有の問題である（Ｋｏｅｂｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３７：２３９−２５３；Ｃｈｏｉ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，２００４，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６４：６２５−６３５）。組換えタンパク質のペリプラズム発現は、シグナルペプチドの助けを借りて実現することができることが多いが、組換えタンパク質の細胞外産生のために外膜という障壁を克服するために利用可能な方法は、ずっと限られている。この問題を解決するために、様々な遺伝子学的な試みが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えタンパク質の細胞外分泌を容易にするために行われ、これには輸送経路の操作（Ｓｕｇａｍａｔａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｂａ，２００５，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７１：６５６−６６２）、コドンおよびシグナル配列の最適化（Ｔａｋｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ８１：１４５−１５０）、細胞外で通常分泌することができるキャリヤタンパク質の融合発現（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６６：５０２４−５０２９；Ｃｈｏｉ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，２００４）、ならびに外膜タンパク質Ｆ（Ｊｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，２００２，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８：４９７９−４９８５）、ＹｅｂＦ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４：１００−１０４）、または浸透圧誘発性タンパク質Ｙ（Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０１：５８７−６０１）の融合発現が含まれる。そのうえ、バクテリオシン放出タンパク質（ＢＲＰ）（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４４：４５９−４６５）またはコリシンＥ１溶解タンパク質（Ｋｉｌ）（Ｒｏｂｂｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ６”  ４８１−４８６）などのような溶解を促進するタンパク質の同時発現および細胞壁を持たない株（いわゆるＬ型）の使用（Ｇｕｍｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ｈｏｉｓｃｈｅｎ，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：５０６−５０９）もまた、報告された。
【０００５】
一方、多くの発酵技術が、培養培地の組成（Ｆｕ，２０１０，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８８：７５−８６）、温度（Ｒｉｎａｓ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，２０：６７９−６８７）、エアレーションおよびカルシウムイオン（Ｓｈｏｋｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６０：６５４−６６４）、浸透圧および誘発条件（Ｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６１，１９−２６）の変更、ならびにグリシンなどのようなサプリメント（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：２８６９−２８７４）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２１：１４２９−１４３５；Ｆｕ，２０１０）の追加を含めて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えタンパク質の細胞外産生を実現するために探索されてきた。標的タンパク質の細胞外産生のための発酵のコントロールについての大きな不利益は、発酵条件が、様々な標的タンパク質に応じて大幅に変動するということである。
【０００６】
漏出株（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｅｃ経路を含む）は、ペリプラズム指向性組換えタンパク質を発酵条件の不確実性を克服する培地の中に輸送するための代替の手段を与える。漏出株は、細胞壁および細胞膜の生合成に関係する遺伝子、とりわけ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のブラウンのリポタンパク質をコードするｌｐｐなどのような外膜遺伝子をノックアウトすることによって構築することができる（Ｓｈｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０１：１２８８−１２９６）。より最近では、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，７，３６０−３７０）は、それらの標的タンパク質の細胞外分泌レベルを改善するために、インフレーム欠失法によって、ｍｒｃＡ、ｍｒｃＢ、ｐａｌ、およびｌｐｐ（単一遺伝子ノックアウト）ならびにｌｐｐ  ｍｒｃＢ、ｍｒｃＡ  ｌｐｐ、ｌｐｐ  ｐａｌ、ｍｒｃＡ  ｐａｌ、およびｍｒｃＢ  ｐａｌ（二重遺伝子ノックアウト）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ＤＥ３）のいくつかの漏出株を構築した。二重の欠失を有する突然変異体からの組換えタンパク質Ｔｒｘ−ｈＰＴＨ（融合パートナーとしてチオレドキシンとつながれたヒト副甲状腺ホルモン１〜８４）の細胞外収率は、同じ条件下で単一の欠失を有する突然変異体からの収率よりも有意に高かった。そのうえ、遺伝子、ｍｒｃＢおよびｌｐｐのインフレーム単一／二重欠失を有する突然変異体は、ペリプラズムではなく細胞質でのタンパク質発現により、標的タンパク質の効率的な漏出を引き起こすことができなかった。したがって、漏出株の大きな利点は、細胞外タンパク質産生を誘発するために必要とされる添加剤がないということであるが、大きな不利益は、それらの分泌の選択性が高くないということであり、これらの遺伝子が、外膜の構造に影響を与えるが、標的タンパク質の能動輸送には参加しないことを示唆する。
【０００７】
Ｌ型細菌、すなわちＬ型は、細胞壁欠損（スフェロプラストタイプ）細胞としてまたは無細胞壁（プロトプラストタイプ）細胞として成長することができる親の種（Ｎ型）に由来する細菌株である。Ｍａｄｏｆｆ  Ｓ（Ｅｄ）：Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌ−Ｆｏｒｍｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，１９８６；Ｍａｔｔｍａｎｎ  ＬＨ（Ｅｄ）：Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｏｒｍｓ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；１９９３；ａｎｄ  Ｇｕｍｐｅｒｔ  Ｊ，Ｔａｕｂｅｎｅｃｋ  Ｕ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ  ｔｙｐｅ  Ｌ−ｆｏｒｍｓ．Ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，Ｌｅｃｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ：Ｂａｓｅｌ．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  １９８３，４６（ｓｕｐｐｌ）：２２７−２４１を参照されたい。
【０００８】
プロトプラストタイプＬ型は、無細胞壁状態で培養され、細胞壁、莢膜、鞭毛、線毛、芽胞、およびメソソームを形成することができない、変容したコロニーおよび細胞形態、細胞膜の脂質およびタンパク質成分における質的および量的変化、細胞外タンパク分解活性の非存在、バクテリオファージに対する抵抗性、ならびに実験室での条件以外での繁殖が不可能であることを含む、極度の多面的変化を示す遺伝的に安定した突然変異体である。Ｇｕｍｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ｔａｕｂｅｎｅｃｋ（前掲）；およびＨｏｉｓｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｉｄ  ａｎｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ  ｔｙｐｅ  Ｌ−ｆｏｒｍ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９９７，１７９：３４３０−３４３６を参照されたい。
【０００９】
Ｇｕｍｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ｈｏｉｓｃｈｅｎ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，９：５０６−５０９）は、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびストレプトミセス・ヒドロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｄｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）の無細胞壁Ｌ型株をかなりの量の様々な組換えタンパク質を可溶性で機能的に活性な産物として合成するために使用した発現系について記載する。組換えタンパク質は、適切なシグナルペプチドを必要とする能動的な移動プロセスによって、周囲の成長培地の中にＬ型細胞によって分泌された。合成されたタンパク質の中には、正確にプロセシングされた抗体およびミニ抗体があり、適切な翻訳後修飾（正確なフォールディング、ジスルフィド結合の形成、および二量体化）が行われたことを示す。著者らは、Ｌ型株がペリプラズムコンパートメントを欠いたので、これは、翻訳後プロセシングに必要な前提条件ではなく、Ｌ型細胞の細胞膜が、これらの修飾プロセスにおいて役割を果たすと述べた。Ｌ型細胞は、広く使用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系よりも環境の影響に対して、より感受性であり、より注意深い取り扱い、特に、接種材料のコントロール、膜作用性界面活性剤および他の攻撃的な物質との接触の回避、ならびに複雑な成長培地を必要とした。著者らは、それらのＬ型発現系の最も重要な利点が、細胞膜を通した能動的な移動による合成タンパク質の取り出しおよび周囲の成長培地への分泌であり、それは、おそらく大規模発酵には有用ではないと結論づけた。
したがって、タンパク質の発酵調製のための方法の改善の必要性が明らかに今もなおある。本明細書において記載される組換え細菌、細胞培養培地、およびプロセスは、これらの必要性および他の必要性を満たすのを助けるものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｅｒｇｕｌｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ  ２３：１７７−２０２
【非特許文献２】Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ６０：５１２−５３８
【非特許文献３】Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２１：１４２９−１４３５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、組換えタンパク質のペリプラズム産生の増強のための組成物および方法を提供することによって、先行技術における前述の問題を解決する。特に、細胞分裂を阻害し、かつ細胞質内空間と比較してペリプラズム空間の成長を促進する新規な生理学的状態を示す修飾細菌細胞が、提供される。本明細書において初めて実証されたように、これらの細胞における組換えタンパク質産生は、非スイッチ細胞と比較して、劇的に増加する。構造的に、細胞は、内膜および外膜の両方を含むが、機能的なペプチドグリカン細胞壁を欠き、一方、細胞形状は球状で、次第に体積が増加する。特に、ペリプラズム空間は、通常、細胞体積全体の１０〜２０％しか含まれないが、本明細書において記載されるスイッチ状態のペリプラズムコンパートメントは、細胞体積全体の２０％、３０％、４０％、または５０％超、６０％、７０％、８０％、または９０％を含むことができる。ある場合には、このペリプラズム空間の増加は、ペリプラズム空間の中への組換えタンパク質の発現の劇的な増加をもたらす。
【００１２】
一態様では、このスイッチ表現型を示す修飾細菌細胞が、提供され、本発明の細菌細胞におけるペリプラズム空間が、細胞体積全体の少なくとも約２０％または２５％、より好ましくは、細胞体積全体の少なくとも約３０％、３５％、４０％、または４５％、さらにより好ましくは、細胞体積全体の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％、最も好ましくは、細胞体積全体の少なくとも約７５％、８０％、８５％、または９０％を含む。
【００１３】
好ましくは、本発明の修飾細菌細胞は、たとえば、ガンマプロテオバクテリアおよびアルファプロテオバクテリアから選択されるグラム陰性細菌に由来する。特に好ましい実施形態では、細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびブレブンディモナス・ディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）から選択される。特定の実施形態では、細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、たとえば株ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、またはＫ１２である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明による修飾細菌細胞は、約０．５：１および約１０：１の間の、約０．５：１および約５：１の間の、約０．５：１および約１：１の間の、約１：１および約１０：１の間の、約１：１および約５：１の間の、または約５：１および約１０：１の間の、細胞質内体積に対するペリプラズム体積の比率を有する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明の修飾細菌細胞は、約２μｍ〜約１６μｍ、より好ましくは約４μｍ〜約１６μｍ、さらにより好ましくは約８μｍ〜約１６μｍ、または約２μｍ〜約８μｍもしくは約４μｍ〜約８μｍもしくは約２μｍ〜約４μｍの最長寸法を有する球菌である。
【００１６】
好ましくは、本発明の修飾細菌細胞は、対象となるタンパク質をコードする外来遺伝子をさらに含む。対象となるタンパク質は、治療用、たとえば抗体、ホルモン、成長因子、ワクチン、ならびに医学的に対象となる任意の他の機能タンパク質および／または構造タンパク質および酵素ならびに非治療用、たとえばコラーゲンおよびその誘導体、アルブミン、オバルブミン、レンネット、フィブリン、カゼイン（αＳ１、αＳ２、β、κを含む）、エラスチン、ケラチン、ミオシン、フィブロネクチン、ラミニン、ナイドジェン−１、ビトロネクチン、絹フィブロイン、プロリルヒドロキシラーゼ、リシルヒドロキシラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ヘムタンパク質、ならびに商業上および／または学究的に対象となる任意の他の構造もしくは非構造タンパク質または酵素とすることができる。本明細書において対象となるタンパク質は、蛍光タンパク質を除外してもよい。ある実施形態では、タンパク質は、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質以外である。
【００１７】
一実施形態では、外来遺伝子は、宿主細菌細胞ゲノムの中に統合される。別の実施形態では、細菌細胞は、外来遺伝子を含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、細菌細胞ペプチドグリカン生合成の阻害剤に対する抵抗性をコードするマーカーがない。例示的な実施形態では、発現ベクターは、ｐＥＴプラスミドを含む。特定の実施形態では、発現ベクターは、プラスミドｐＥＴ２８ａを含む。
【００１８】
一実施形態では、外来遺伝子の発現は、恒常的である。別の実施形態では、外来遺伝子の発現は、誘発性である。いくつかの実施形態では、外来遺伝子の発現は、たとえばイソプロピル−β−ｄ−１−チオガラクトピラノシド、ラクトース、アラビノース、マルトース、テトラサイクリン、無水テトラサイクリン、バブリシン（ｖａｖｌｙｃｉｎ）、キシロース、銅、亜鉛、およびその他同種のものから選択される誘発因子によって誘発性となる。
【００１９】
一実施形態では、修飾細菌細胞は、外来遺伝子に作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、シグナルペプチドは、細胞質からペリプラズムへのタンパク質の同時翻訳による搬出を指示する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＳｅｃおよびＴａｔ分泌経路のタンパク質成分に由来する。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡ、またはＨｙ１Ａに由来する。たとえば、シグナルペプチドは、細胞質からペリプラズムへのタンパク質の同時翻訳による搬出を指示するＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡ、またはＨｙ１ＡのＮ−末端部分とすることができる。ある場合には、シグナルペプチドは、ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡ、またはＨｙ１Ａから選択されるペプチドの少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９５％、９９％、またはすべてを含有することができる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、修飾細菌細胞は、アンピシリン感受性（ａｍｐＳ）および／またはホスホマイシン感受性桿菌株の球菌形態を含み、球菌形態および桿菌株は、遺伝的に同一である。
【００２１】
別の態様では、マグネシウム塩を含む培養培地中に増大したペリプラズム空間を有する細菌細胞を含む細胞培養物が提供され、培地中のマグネシウムイオンの濃度は、少なくとも約４、５、または６ｍＭである。さらなる実施形態では、培地中のマグネシウムイオンの濃度は、少なくとも約７、８、９、または１０ｍＭである。いくつかの実施形態では、培地中のマグネシウムイオンの濃度は、約６ｍＭおよび約２０ｍＭの間にある。いくつかの実施形態では、マグネシウム塩は、硫酸マグネシウムおよび塩化マグネシウムから選択される。
【００２２】
好ましくは、本発明の細胞培養物は、浸透圧安定剤をさらに含み、たとえば糖（たとえばアラビノース、グルコース、スクロース、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、フルクトース、ガラクトース、サッカロース、マルトトリオースエリトリトール、リビトール、ペンタエリスリトール、アラビトール、ガラクチトール、キシリトール、イジトール、マルトトリオース、およびその他同種のもの）、ベタイン（たとえばトリメチルグリシン）、プロリン、アンモニウム塩、カリウム塩、もしくはナトリウム塩（たとえば塩化ナトリウム）などのような１つ以上の塩、１つ以上のポリマー（たとえばポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリスクロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール）、またはその組み合わせを含む。ある場合には、培地中の浸透圧安定剤の濃度は、少なくとも約４％、５％、６％、または７％（ｗ／ｖ）である。さらなる実施形態では、浸透圧安定剤の濃度は、少なくとも約８％、９％、または１０％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、培地中の浸透圧安定剤の濃度は、約５％から約２０％（ｗ／ｖ）の間にある。
【００２３】
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、アミノ酸、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マグネシウム、ペプトン、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酵母抽出物をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、動物由来成分がない。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、限定培地を含む、本質的にそれからなる、またはその中にある。
【００２４】
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、１ｍＬの培養体積当たり約１×１０８細菌細胞〜１ｍＬ当たり約１×１０１０細菌細胞を少なくとも約１Ｌの体積（たとえば約１Ｌ〜約５００，０００Ｌ、約１Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１Ｌ〜約１，０００Ｌ、約約１Ｌ〜約５００Ｌ、または約１Ｌ〜約２５０Ｌ）中に含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、１ｍＬの培養体積当たり約４×１０８細菌細胞〜１ｍＬ当たり約１×１０９細菌細胞を少なくとも約１Ｌの体積（たとえば約１Ｌ〜約５００，０００Ｌ、約１Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１Ｌ〜約１，０００Ｌ、約約１Ｌ〜約５００Ｌ、または約１Ｌ〜約２５０Ｌ）中に含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、細菌細胞ペプチドグリカン生合成の少なくとも１つの外来抗生物質阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、細菌細胞ペプチドグリカン生合成の少なくとも２つの構造的に別個の外来抗生物質阻害剤を含む。ある場合には、細菌細胞ペプチドグリカン生合成の少なくとも２つの構造的に別個の外来抗生物質阻害剤は、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成経路の異なる構成要素を阻害する（たとえば、少なくとも２つの構造的に別個の外来抗生物質阻害剤は、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成経路の異なる酵素を阻害する）。ある場合には、細胞培養物は、細菌細胞ペプチドグリカン生合成のトランスグリコシラーゼ成分の外来抗生物質阻害剤を含む。ある場合には、細胞培養物は、細菌細胞ペプチドグリカン生合成のトランスペプチダーゼ成分の外来抗生物質阻害剤を含む。ある場合には、細胞培養物は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル（ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ）−ペンタペプチド生合成またはＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）生合成の外来抗生物質阻害剤を含む。
【００２６】
ある場合には、細胞培養物は、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｒａＹ、ＭｕｒＧ、ＦｅｍＸ、ＦｅｍＡ、ＦｅｍＢ、ＦｔｓＷ、またはペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）の外来抗生物質阻害剤を含む。ある場合には、細胞培養物は、少なくとも２つの構造的に別個の外来抗生物質阻害剤を含み、少なくとも２つの構造的に別個の外来抗生物質阻害剤は、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｒａＹ、ＭｕｒＧ、ＦｅｍＸ、ＦｅｍＡ、ＦｅｍＢ、ＦｔｓＷ、またはペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）から選択される異なるタンパク質を阻害する。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、β−ラクタム抗生物質、ホスホン酸抗生物質、ポリペプチド系抗生物質、Ｄ−シクロセリン、およびグリコペプチド系抗生物質から選択される少なくとも１つまたは少なくとも２つの構造的に別個の抗生物質を含み、抗生物質は、細菌細胞においてペプチドグリカン生合成を阻害する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、培養培地は、少なくとも１つの活性酸素種（ＲＯＳ）捕捉剤を含む（たとえば還元グルタチオン（ＧＳＨ）または約７０ｇ／モル〜約３５０ｇ／モルもしくは約７５ｇ／モル〜約１５５ｇ／モルの分子量を有するチオール含有非ペプチド性小分子）。
【００２８】
いくつかの実施形態では、培養培地は、対象となるタンパク質をコードする外来遺伝子を含む発現ベクターにおける選択可能マーカーの存在を選択する抗生物質（たとえば第２または第３の抗生物質）を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターにおける選択可能マーカーの存在を選択する抗生物質は、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成の阻害剤ではない。
【００２９】
別の態様では、対象となる外来タンパク質を産生するための方法（たとえば、１つ以上の前述の細胞培養物および／または細菌細胞を使用して）であって、ａ）マグネシウム塩を含む培地においてグラム陰性細菌細胞を培養することであって、培養培地中のマグネシウムイオンの濃度は、少なくとも約４、５、または６ｍＭであり、細菌細胞は、対象となるタンパク質をコードする外来遺伝子を含むこと；ｂ）細菌細胞中のペプチドグリカン生合成を阻害すること；およびｃ）培地からタンパク質を回収することを含む方法が提供される。さらなる実施形態では、培地中のマグネシウムイオンの濃度は、少なくとも約７、８、９、または１０ｍＭである。いくつかの実施形態では、培地中のマグネシウムイオンの濃度は、約６ｍＭおよび約２０ｍＭの間にある。いくつかの実施形態では、マグネシウム塩は、硫酸マグネシウムおよび塩化マグネシウムから選択される。いくつかの実施形態では、ａ）の培養することもしくはその一部分および／またはｂ）の阻害することもしくはその一部分は、１つ以上の前述の細胞培養物において実行される。いくつかの実施形態では、対象となるタンパク質をコードする外来遺伝子の発現は、たとえば、ステップｂ）の間に培地に誘発因子を追加することによって誘発される。いくつかの実施形態では、対象となるタンパク質をコードする外来遺伝子の発現は、たとえば、ステップｂ）の前に培地に誘発因子を追加することによって誘発される。いくつかの実施形態では、対象となるタンパク質をコードする外来遺伝子の発現は、たとえば、ステップｂ）が開始された後に培地に誘発因子を追加することによって誘発される。
【００３０】
好ましくは、本発明の細胞培養物は、浸透圧安定剤をさらに含み、たとえば糖（たとえばアラビノース、グルコース、スクロース、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、フルクトース、ガラクトース、サッカロース、マルトトリオースエリトリトール、リビトール、ペンタエリスリトール、アラビトール、ガラクチトール、キシリトール、イジトール、マルトトリオース、およびその他同種のもの）、ベタイン（たとえばトリメチルグリシン）、プロリン、アンモニウム塩、カリウム塩、もしくはナトリウム塩（たとえば塩化ナトリウム）などのような１つ以上の塩、１つ以上のポリマー（たとえばポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリスクロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール）、またはその組み合わせを含む。ある場合には、培地中の浸透圧安定剤の濃度は、少なくとも約４％、５％、６％、または７％（ｗ／ｖ）である。さらなる実施形態では、浸透圧安定剤の濃度は、少なくとも約８％、９％、または１０％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、培地中の浸透圧安定剤の濃度は、約５％から約２０％（ｗ／ｖ）の間にある。
【００３１】
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、アミノ酸、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マグネシウム、ペプトン、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酵母抽出物をさらに含んでいてもよい。
【００３２】
細菌細胞は、バッチプロセス、流加プロセス、または反復流加プロセスにおいて、連続的にまたは非連続的に培養されてもよい。いくつかの実施形態では、ステップｂ）およびｃ）は、連続して行われる。他の実施形態では、ステップｂ）およびｃ）は、同時に行われる。いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の少なくとも１時間後に実行される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成の阻害は、培地に抗生物質を追加することによって実行される。ある場合には、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成の阻害は、培地に２つ以上の構造的に別個の抗生物質を追加することによって実行される。ある場合には、抗生物質は、β−ラクタム抗生物質（たとえばペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、およびモノバクタム）、ホスホン酸抗生物質、ポリペプチド系抗生物質、ならびにグリコペプチド系抗生物質から選択される。特定の実施形態では、抗生物質は、アラホスファリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズトレオナム、バシトラシン、カルベニシリン、セファマンドール、セフォタキシム、セフスロジン、セファロチン、ホスミドマイシン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンｇ、ペニシリンｖ、ホスホマイシン、プリマキシン、Ｄ−シクロセリン、およびバンコマイシンから選択される。いくつかの実施形態では、抗生物質は、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｒａＹ、ＭｕｒＧ、ＦｅｍＸ、ＦｅｍＡ、ＦｅｍＢ、ＦｔｓＷ、またはペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）の阻害剤から選択される。いくつかの実施形態では、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成の阻害は、ＭｕｒＡの阻害剤およびペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）の阻害剤を培地に追加することによって実行される。いくつかの実施形態では、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成の阻害は、培地にＭｕｒＡの阻害剤を追加することによって実行される。いくつかの実施形態では、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成の阻害は、培地にＰＢＰの阻害剤を追加することによって実行される。
【００３４】
好ましくは、本発明の修飾細菌細胞は、たとえば、ガンマプロテオバクテリアおよびアルファプロテオバクテリアから選択されるグラム陰性細菌に由来する。特に好ましい実施形態では、細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびブレブンディモナス・ディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）から選択される。特定の実施形態では、細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、たとえば株ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【００３５】
一実施形態では、外来遺伝子は、宿主細菌細胞ゲノムの中に統合される。別の実施形態では、細菌細胞は、外来遺伝子を含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、培地は、発現ベクターの存在を選択する抗生物質を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターの存在を選択する抗生物質は、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成の阻害剤ではない。例示的な実施形態では、発現ベクターは、ｐＥＴプラスミドを含む。特定の実施形態では、発現ベクターは、プラスミドｐＥＴ２８ａを含む。
【００３６】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、外来遺伝子の発現を誘発することを含む。いくつかの実施形態では、外来遺伝子の発現は、たとえばイソプロピル−β−ｄ−１−チオガラクトピラノシド、ラクトース、アラビノース、マルトース、テトラサイクリン、無水テトラサイクリン、バブリシン（ｖａｖｌｙｃｉｎ）、キシロース、銅、亜鉛、およびその他同種のものから選択される誘発因子によって誘発性となる。
【００３７】
一実施形態では、修飾細菌細胞は、外来遺伝子に作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、シグナルペプチドは、細胞質からペリプラズムへのタンパク質の同時翻訳による搬出を指示する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＳｅｃおよびＴａｔ分泌経路に由来する。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡ、またはＨｙ１Ａに由来する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．１から約５００の間の；約０．２から約１００の間の、約０．５から約１０の間の、約１から約２の間のＯＤ６００を有する。例示的な実施形態では、培地は、約１．１のＯＤ６００を有する。
【００３９】
外来遺伝子の発現は、約１時間〜約１週間；約１時間〜約１日；約１時間〜約１０時間；約１０時間〜約１週間；約１０時間〜約１日；約１日〜約１週間、誘発されてもよい。
【００４０】
対象となるタンパク質の収率は、約０．１ｇ／培地１Ｌ〜約５００ｇ／培地１Ｌ；約１ｇ／培地１Ｌ〜約５００ｇ／培地１Ｌ；約１ｇ／培地１Ｌ〜約１００ｇ／培地１Ｌ；約１ｇ／培地１Ｌ〜約１０ｇ／培地１Ｌ；約１０ｇ／培地１Ｌ〜約５００ｇ／培地１Ｌ；約１０ｇ／培地１Ｌ〜約１００ｇ／培地１Ｌ；約１００ｇ／培地１Ｌ〜約５００ｇ／培地１Ｌであってもよい。対象となるタンパク質の収率は、約１０ｍｇ／培地１Ｌ〜約１０３ｍｇ／培地１Ｌ；約２０ｍｇ／培地１Ｌ〜約５００ｍｇ／培地１Ｌ；約１００ｍｇ／培地１Ｌ〜約２５０ｍｇ／培地１Ｌ；または約１ｍｇ／培地１Ｌ〜約１０ｍｇ／培地１Ｌであってもよい。対象となるタンパク質の収率は、未スイッチ状態の遺伝的に同一な細胞から対象となるタンパク質を作製する方法と比較して、少なくとも約２倍、３倍、５倍、８倍、１０倍、増加してもよい。対象となるタンパク質の収率は、約２倍〜約１００倍、約２倍〜約５０倍、約５倍〜約２５倍、または約１０倍〜約２０倍、増加してもよい。対象となるタンパク質の収率は、未スイッチ状態の遺伝的に同一な細胞から対象となるタンパク質を作製する方法と比較して、約２倍〜約１０倍、約２倍〜約２０倍、または約２倍〜約３０倍、増加してもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態では、タンパク質収率の増加は、スイッチＬ型（たとえば、誘発しない条件下で遺伝的に同一な細胞から対象となるタンパク質を作製する方法と比較して、増加し、スイッチ形態を誘発しない前記条件は、対象となるタンパク質の増加をもたらす条件とその他の点では同一である）。ある場合には、スイッチＬ型を誘発しない条件は、細胞におけるペプチドグリカン生合成を阻害する、１つ以上の抗生物質が存在しないまたはその量が不十分であることを含む。ある場合には、スイッチ形態を誘発しない条件は、そのうえまたはその代わりに、６ｍＭ未満、５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、３ｍＭ未満、２ｍＭ未満、または約１ｍＭのマグネシウム濃度を含む。ある場合には、スイッチ形態を誘発しない条件は、そのうえまたはその代わりに、細菌細胞が細胞体積全体の約５％〜約３０％または約１０％〜約２０％であるペリプラズム空間を含む条件を含む。
【００４２】
別の態様では、本発明は、前述の細胞培養物のいずれか１つを含有する発酵容器を提供し、発酵容器によって含有される細胞培養物は、約または少なくとも約１Ｌ；１０Ｌ；１００Ｌ；２５０Ｌ；５００Ｌ；または１，０００Ｌの体積の培地を含む。ある場合には、発酵容器は、発酵系の構成要素である。ある場合には、発酵系は、酸素、炭素、もしくはｐＨまたはその２つもしくは３つの組み合わせをコントロールするためのモジュールをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、スイッチ細胞および未スイッチ細胞の間の生理学的状態の差異を示す図である。Ａ）未スイッチ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞。Ｂ）図Ａと同じ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）集団であるが、生理学的スイッチを受けた。Ｃ）細胞質内ＲＦＰおよびペリプラズムＧＦＰを含有するスイッチ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞の位相差。Ｄ）図Ｃの細胞の蛍光画像は標的タンパク質局在化を示す。
【図２】図２は、スイッチ細胞におけるタンパク質産生の増強を示す図である。Ａ〜Ｂ）Ｔ７誘発性タンパク質産生についての標的タンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１において産生されるペリプラズム発現ＧＦＰである。同じ集団の細胞を使用し、ＯＤ１．１で誘発した。Ａ）タンパク質ラダー（レーン１）、ＩＰＴＧ誘発タンパク質産生（レーン２）、生理学的スイッチによるＩＰＴＧ誘発タンパク質産生（レーン３）。Ｂ）左側のＩＰＴＧのみおよび右側のＩＰＴＧ＋スイッチによる細胞ＧＦＰ誘発培養物の２つのバイアル。Ｃ）タンパク質ラダー（レーン１）、タンパク質産生後の上清（レーン２）、細胞ペレット（レーン３）を示す、スイッチ細胞を使用する２２ＫＤコラーゲンの発現。
【図３】図３は、次第にスイッチしつつある大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞の微速度撮影を示す図である。
【図４】図４は、生理学的スイッチを受ける他の生物体を示す図である。Ａ）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の通常の生理。Ｂ）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のスイッチした生理。Ｃ）緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１の通常の生理。Ｄ）緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１のスイッチした生理。Ｅ）ブレブンディモナス・ディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）の通常の生理。Ｆ）ブレブンディモナス・ディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）のスイッチした生理。Ｇ）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の通常の生理。Ｈ）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のスイッチした生理。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下の説明において、ある特定の詳細な説明は、本開示の様々な実施形態の十分な理解をもたらすために記載される。しかしながら、当業者は、これらの詳細な説明なしで本開示が実施され得ることを理解するであろう。
【００４５】
文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、本明細書および請求項の全体にわたって、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのようなその変形は、オープンで包括的な意味で、すなわち、「〜を含むが、限定されない」と解釈される。
【００４６】
本明細書の全体にわたって「一実施形態」または「１つの実施形態」に言及することにより、実施形態に関して記載される特定の特色、構造、または特徴が、本開示の少なくとも１つの実施形態において含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体にわたる様々な場所に句「一実施形態では」または「１つの実施形態では」と書かれてあっても、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているとは限らない。明確にするために別々の実施形態において記載される本発明のある特色はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが十分に理解されたい。逆に、簡潔にするために単一の実施形態において記載される本発明の様々な特色はまた、別々にまたは任意の適した下位の組み合わせで提供されてもよい。
【００４７】
本明細書において使用されるように、用語「約」は、±１０％を指す。
【００４８】
用語「〜からなる」は、「〜を含むが、限定されない」を意味する。
【００４９】
用語「本質的に〜からなる」は、組成、方法、または構造が、さらなる成分、ステップ、および／または部分を含んでいてもよいことを意味するが、これは、さらなる成分、ステップ、および／または部分が、主張される組成、方法、または構造の基本的で新規な特徴を実質的に変えない場合のみである。
【００５０】
本明細書において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」は、文脈上、明らかに他の意味を示す場合を除いて、複数形の指示内容を含む。たとえば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含む複数の化合物を含んでいてもよい。
【００５１】
本出願の全体にわたって、本開示の様々な実施形態は、範囲形式で提供されてもよい。範囲形式での記載は、単に便宜および簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する制限であり変更できないとして解釈されるべきではないことが理解されたい。したがって、範囲の記載は、詳細に開示されるすべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数的な値を有すると考えられるべきである。たとえば、１〜６などのような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような詳細に開示される部分範囲ならびにその範囲内の個々の数、たとえば１、２、３、４、５、および６を有すると考えられるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【００５２】
数的な範囲が本明細書において示される場合は常に、示される範囲内に挙げられるどんな数字（分数または整数）も含むことが意味される。第１の示される数および第２の示される数「の間の範囲にわたる／範囲」ならびに第１の示される数「〜」第２の示される数「の範囲にわたる／範囲」という句は、本明細書において区別なく使用され、第１および第２の示される数ならびにその間のすべての分数および整数の数字を含むことが意味される。
【００５３】
本明細書において使用されるように、用語「方法」は、化学、薬学、生物学、生化学、および医学の技術の従事者に知られているまたはその従事者らによって知られている方式、手段、技術、および手順から容易に明らかになる方式、手段、技術、および手順を含むが、これらに限定されない、与えられた課題を達成するための方式、手段、技術、および手順を指す。
【００５４】
Ｌ型細菌
本発明は、細胞分裂を阻害し、細胞質内空間と比較してペリプラズム空間の成長を促進する新規な生理学的スイッチ表現型（Ｌ型）を示す修飾細菌細胞を含むタンパク質産生プラットフォームを提供する。これらの細胞における組換えタンパク質産生は、非スイッチ細胞と比較して、劇的に増加する。これは、グラム陰性細菌のいくつかの種（ガンマプロテオバクテリア：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、およびシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）；ならびにアルファプロテオバクテリア：カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびブレブンディモナス・ディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ））において試験され、これは、すべてのグラム陰性組換えタンパク質産生に適用することができる、保存されたメカニズムを示唆する。これらの細胞はなお、内膜および外膜を含有するが、機能的なペプチドグリカン細胞壁を欠く。細胞形状は球状で、次第に体積が増加する。ペリプラズム空間は、通常、細胞体積全体の１０〜２０％しか含んでいないが、本発明のスイッチ状態のペリプラズムコンパートメントは、細胞体積全体の９０％以下を含むことができる。注目すべきことには、また予想外に、細胞は、相変わらず生存可能であり、代謝プロセスを行い、対象となる組換えタンパク質を産生することができる。
【００５５】
本明細書において使用される用語「組換え細菌細胞」は、標的タンパク質を発現するように操作された細胞を指す。
【００５６】
本明細書において使用される用語「球菌」は、球状の形態を有する細菌細胞を指す。一般に、球菌形態をした細菌細胞の最長寸法は、最短寸法よりもわずか２５％、４０％、５０％、または１００％しか大きくない。
【００５７】
本明細書において使用される用語「桿菌」は、棒状の形態を有する細菌細胞を指す。典型的に、桿菌形態をした細菌細胞の最長寸法は、最短寸法の長さの２倍よりも大きい。そのため、桿菌形態をした細菌細胞の最長寸法は、最短寸法の長さの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０倍となり得る。
【００５８】
用語「ペリプラズム体積」は、ペリプラズムに含有される総体積を指し、これは、細菌細胞の外膜および形質膜の間の領域である。
【００５９】
用語「細胞質内体積」は、細胞質に含有される総体積を指し、これは、細菌細胞の形質膜の内側の領域である。
【００６０】
標的タンパク質
本発明は、宿主にとって異種である対象となるタンパク質または「標的タンパク質」を産生するための外来遺伝子を含む組換え細菌細胞のプラットフォームを提供する。タンパク質または核酸（たとえばタンパク質をコードする核酸、発現カセット、または発現ベクター）は、それが宿主中に天然に存在しないまたは天然に存在しない構成（たとえば非天然のゲノム位置もしくは非天然の細胞内位置）で宿主中に存在する場合、宿主にとって異種となる。たとえば、天然に存在する遺伝子は、対応する野生型生物体において天然に存在する遺伝子に作動可能に連結されていないプロモーターに作動可能に連結し、それによって、修飾細菌細胞において異種発現カセットを形成することができる。他の例として、野生型細菌中のプラスミドに天然には存在しない天然に存在するゲノム断片をプラスミドの中にサブクローニングし、その細菌に形質転換し、それによって、修飾細菌細胞において異種プラスミドを形成することができる。用語「外来遺伝子」は、遺伝子導入によって宿主生物体の中に導入される遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、本発明の標的タンパク質をコードする外来遺伝子は、発現ベクターの中に組み込まれ、発現ベクターは、染色体外とすることができるまたは発現ベクターが導入される宿主細胞のゲノムの中に統合するよう設計することができる。外来遺伝子の発現は、恒常的または誘発性であってもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態では、対象となる組換えタンパク質を産生するために使用される外来遺伝子（たとえばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、細菌に適したプロモーターのコントロール下に細菌における発現のために複製可能なベクターに適切に挿入される。多くのベクターが、この目的に利用可能であり、適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸のサイズおよびベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に主として依存するであろう。それぞれのベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびベクターと適合性の特定の宿主細胞に依存して様々な構成要素を含有する。発現ベクターは、任意の数の適切な調節配列（転写および翻訳コントロール配列、プロモーター、リボソームの結合部位、エンハンサー、複製開始点など）または他の構成要素（選択遺伝子など）を含有することができ、すべて、当技術分野においてよく知られているように作動可能に連結される。
【００６２】
発現ベクターは、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含有する。そのような配列は、様々な細菌でよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適している。
【００６３】
発現ベクターはまた、一般に、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含有する。この遺伝子は、選択培養培地において成長させた形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターにより形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中で生き残らないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する抵抗性を与える、（ｂ）栄養要求性の欠乏を補足する、または（ｃ）複合培地から入手可能でない不可欠な栄養素を供給するタンパク質をコードし、たとえば、バチルスについてはＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。選択の手法の１つの例は、宿主細胞の成長を抑えるために薬剤を利用する。外来遺伝子による形質転換に成功した細胞は、薬剤抵抗性を与えるタンパク質を産生し、したがって、選択レジメンを切り抜けて生き残る。一実施形態では、発現ベクター選択遺伝子は、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成の阻害剤に対する抵抗性をコードする遺伝子ではない。
【００６４】
標的タンパク質を産生するための発現ベクターはまた、宿主細菌性生物によって認識され、標的タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された誘発性プロモーターを含有してもよい。細菌宿主による使用に適した誘発性プロモーターは、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９））、ａｒａＢＡＤプロモーターを含むアラビノースプロモーター系（Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｄ．，１７４：７７１６−７７２８（１９９２）；Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｄ．，１７７：４１２１−４１３０（１９９５）；Ｓｉｅｇｅｌｅ  ａｎｄ  Ｈｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：８１６８−８１７２（１９９７））、ラムノースプロモーター（Ｈａｌｄｉｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｄ．，１８０：１２７７−１２８６（１９９８））、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）およびＥＰ  ３６，７７６）、ＰＬｔｅｔＯ−１およびＰｌａｃ／ａｒａ−１プロモーター（Ｌｕｔｚ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：１２０３−１２１０（１９９７））、ならびにｔａｃプロモーターなどのようなハイブリッドプロモーターを含む。ｄｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）。しかしながら、他の既知の細菌誘発性プロモーターおよび低基礎発現プロモーターが、適している。それらのヌクレオチド配列は、公開されており、それによって、当業者は、標的タンパク質をコードするＤＮＡにそれらを作動可能にライゲーションすることができる。
【００６５】
細菌系で使用されるプロモーターはまた、標的タンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列を含有してもよい。プロモーターは、制限酵素消化によって細菌ＤＮＡ供給源から取り出し、所望のＤＮＡを含有するベクターに挿入することができる。
【００６６】
上記に列挙された１つ以上の構成要素を含有する適切なベクターの構築は、当業者らによく知られている標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は、切断され、調整され、必要とされるプラスミドを生成するために所望される形態で再びライゲーションされる。ＤＮＡ、ＤＮＡの消化およびライゲーション、形質転換体の形質転換および選択を取り扱うための説明書は、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）による既知のマニュアルの中に見つけることができる。
【００６７】
本明細書において使用される用語「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、これは、コード領域のみを指してもよいまたはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）調節配列を含んでいてもよい。
【００６８】
用語「発現ベクター」は、外来遺伝子の発現を指示することができるアセンブリーを指す。発現ベクターは、外来遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含んでいてもよい。
【００６９】
本明細書において使用される用語「恒常的」は、ほとんどの環境上のおよび発生上の条件下で発現され、発現の停止を完全に引き起こす調節を受けやすいことが知られていない外来遺伝子を指す。
【００７０】
本明細書において使用される用語「誘発性」は、外因性の化学物質、熱、または光などのような誘発因子の存在に応じて発現される外来遺伝子を指す。本明細書において記載されるＬ型細菌細胞におけるタンパク質産生を誘発するために標準的な手順に従ってもよい。いくつかの実施形態では、プラスミドｐＥＴ２８ａを含有する株ＢＬ２１（ＤＥ３）は、組換えタンパク質のＩＰＴＧ／ラクトース誘発性の産生を駆動するために使用されてもよい。
【００７１】
本明細書において使用される用語「標的タンパク質」は、一般に、約１０を超えるアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質を指す。標的タンパク質は、好ましくは、哺乳動物タンパク質である。標的タンパク質は、一般に、蛍光タンパク質を除外する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ｍＣｈｅｒｒｙ以外のものである。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）以外のものである。
【００７２】
本明細書において使用される用語「治療用タンパク質」は、生物学的活性が実証されており、許容され得る投与ルートによってそれを必要としている患者への送達によって疾患または障害を処置するために用いられてもよいタンパク質を指す。治療用タンパク質の生物学的活性は、インビトロまたはインビボにおいて実証されてもよく、生物学的効果をもたらす、受容体および／または他の細胞内もしくは細胞外構成要素とのタンパク質の相互作用に起因する。治療用タンパク質の例は、たとえばレニン、ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；トロンボポイエチン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォンウィルブランド因子などのような凝固因子；プロテインＣなどのような抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのようなプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−アルファ；腫瘍壊死因子−ベータ；エンケファリナーゼ；ヒト血清アルブミンなどのような血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼなどのような微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子に対する受容体；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、またはＮＧＦ−βなどのような神経成長因子などのような神経栄養因子；カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）などのようなカルジオトロフィン（心肥大因子）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどのような線維芽細胞成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−ベータなどのような形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、およびＣＤ−１９などのようなＣＤタンパク質；エリトロポイエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−アルファ、−ベータ、および−ガンマなどのようなインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、たとえばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、たとえばＩＬ−１〜ＩＬ−１３；抗ＨＥＲ−２抗体；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；たとえばエイズエンベロープの一部分などのようなウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；なら���に調節タンパク質などのような分子を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、抗体である。主張される本発明によって産生される抗体は、特定の抗原決定基（たとえば癌細胞抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、タンパク質、ペプチド、炭水化物、化学物質、核酸、またはその断片）に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体であってもよい。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラスならびにその任意のサブクラスであってもよい。
【００７４】
有用なモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、抗体断片、またはキメラヒト−マウス（もしくは他の種の）モノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
抗体はまた、二重特異性抗体とすることもできる。二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖および他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）を有していてもよい。この非対称の構造は、望まれない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの、所望の二重特異性化合物の分離を容易にし、二重特異性分子の半分にだけ免疫グロブリン軽鎖が存在することにより、分離の容易な方法が提供される（国際公開第９４／０４６９０号パンフレット；Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１：６９５４−６９６１；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６３−４７０；Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：６７７−６８１。
【００７６】
定義される抗体は、癌細胞抗原、ウイルス抗原、もしくは微生物抗原または腫瘍細胞もしくはマトリックスに結合した他の抗体に免疫特異的に結合する抗体の機能的に活性な断片、誘導体、またはアナログとすることができる。この点に関して、「機能的に活性な」は、断片、誘導体、またはアナログが、この断片、誘導体、またはアナログが由来する抗体が認識したものと同じ抗原を認識する抗抗イディオタイプ抗体を誘起することができることを意味する。詳細には、例示的な実施形態では、免疫グロブリン分子のイディオタイプの抗原性は、抗原を特異的に認識するＣＤＲ配列に対してＣ−末端にあるフレームワーク配列およびＣＤＲ配列の欠失によって増強することができる。どのＣＤＲ配列が抗原に結合するかを決定するために、ＣＤＲ配列を含有する合成ペプチドを、当技術分野において知られている任意の結合アッセイ方法、たとえばＢＩＡ  ｃｏｒｅアッセイによって、抗原との結合アッセイにおいて使用することができる（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２５（３）：９６１−９６９）。
【００７７】
他の有用な抗体は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含有し、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）２断片およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することができるＦａｂ断片などのような抗体の断片を含むが、これらに限定されない。他の有用な抗体は、抗体の重鎖および軽鎖の二量体またはＦｖｓもしくは単鎖抗体（ＳＣＡ）などのようなその任意の最小の断片（たとえば米国特許第４，９４６，７７８号明細書；Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４において記載される）または抗体と同じ特異性を有する任意の他の分子である。
【００７８】
抗体は、抗体の融合タンパク質またはその機能的に活性な断片であってもよく、たとえば、抗体は、抗体ではない別のタンパク質のアミノ酸配列（または、タンパク質の少なくとも１０、２０、または５０アミノ酸の一部分などのようなその一部分）にＮ−末端またはＣ−末端で共有結合（たとえばペプチド結合）を介して融合される。抗体またはその断片は、定常ドメインのＮ−末端で他のタンパク質に共有結合されてもよい。
【００７９】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、詳細には、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるまたは相同であるが、鎖の残りが、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるまたは相同である「キメラ」抗体ならびに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１−６８５５）。キメラ抗体は、マウスモノクローナルに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどのような、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；米国特許第４，８１６，３９７号明細書）。キメラ抗体は、非ヒト霊長動物（たとえば旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長動物化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体を含む。
【００８０】
本発明の細菌および方法によって産生されてもよい治療用モノクローナル抗体は、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：４２８５−４２８９；米国特許第５，７２５，８５６号明細書）；キメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」などのような抗ＣＤ２０抗体（米国特許第５，７３６，１３７号明細書）；リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、オクレリズマブ、２Ｈ７抗体のキメラもしくはヒト化変異体（米国特許第５，７２１，１０８号明細書；国際公開第０４／０５６３１２号パンフレット）、またはトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））；抗ＩＬ−８（Ｓｔ  Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｈｅｓｔ，１０３：９３２および国際公開第９５／２３８６５号パンフレット；ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１３などのような他のインターロイキンを標的にする抗体；ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ベバシズマブなどのようなヒト化および／または親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ７：５３−６４；国際公開第９６／３００４６号パンフレット；国際公開第９８／４５３３１号パンフレット）；抗ＰＳＣＡ抗体（国際公開第０１／４０３０９号パンフレット）；Ｓ２Ｃ６およびそのヒト化変異体を含む抗ＣＤ４０抗体（国際公開第００／７５３４８号パンフレット）；抗ＣＤ１１ａ（米国特許第５，６２２，７００号明細書；国際公開第９８／２３７６１号パンフレット；Ｓｔｅｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｌ．４：３−７；Ｈｏｕｒｍａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：３７７−３８０）；抗ＩｇＥ（Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２；国際公開第９５／１９１８１号パンフレット）；抗ＣＤ１８（米国特許第５，６２２，７００号明細書；国際公開第９７／２６９１２号パンフレット）；Ｅ２５、Ｅ２６、およびＥ２７を含む抗ＩｇＥ（米国特許第５，７１４，３３８号明細書および米国特許第５，０９１，３１３号明細書；国際公開第９３／０４１７３号パンフレット；米国特許第５，７１４，３３８号明細書）；抗Ａｐｏ−２受容体抗体（国際公開第９８／５１７９３号パンフレット）；ｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ＣＤＰ５７１、およびＭＡＫ−１９５を含む抗ＴＮＦ−アルファ抗体（米国特許第５，６７２，３４７号明細書；Ｌｏｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（４）：１６４６−１６５３；Ｄｈａｉｎａｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２３（９）：１４６１  −１４６９）；抗組織因子（ＴＦ）（欧州特許第０４２０９３７Ｂ１号明細書）；抗ヒトアルファ−４ベータ７インテグリン（国際公開第９８／０６２４８号パンフレット）；抗ＥＧＦＲ、キメラ化、またはヒト化２２５抗��（国際公開第９６／４０２１０号パンフレット）；ＯＫＴ３などのような抗ＣＤ３抗体（米国特許第４，５１５，８９３号明細書）；ＣＨＩ−６２１  ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標）およびＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）などのような抗ＣＤ２５抗体または抗ｔａｃ抗体（米国特許第５，６９３，７６２号明細書）；ｃＭ−７４１２抗体などのような抗ＣＤ４抗体（Ｃｈｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ３９（１）：５２−５６）；ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈなどのような抗ＣＤ５２抗体（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３３７）；Ｇｒａｚｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２のようなＦｃガンマＲＩに対して特異的なＭ２２抗体などのような抗Ｆｃ受容体抗体；ｈＭＮ−１４などのような抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ；ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ  ３、およびＣＨＬ６を含む乳房上皮細胞に対して特異的な抗体（Ｃｅｒｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３）：５８５２ｓ−５８５６ｓ；およびＲｉｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９１６ｓ−５９２０ｓ）；Ｃ２４２などのような結腸がん細胞に結合する抗体（Ｌｉｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１）：１−９）；抗ＣＤ３８抗体、たとえばＡＴ  １３／５（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：９２５−９３７）；Ｈｕ  Ｍ１９５（Ｊｕｒｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ−５９１０ｓ）およびＣＭＡ−６７６またはＣＤＰ７７１などのような抗ＣＤ３３抗体；ＬＬ２またはＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅなどのような抗ＣＤ２２抗体（Ｊｕｗｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５（２３  Ｓｕｐｐｌ）：５８９９ｓ−５９０７ｓ）；１７−１Ａ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））などのような抗ＥｐＣＡＭ抗体；アブシキシマブまたはｃ７Ｅ３  Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））などのような抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；ＭＥＤＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））などのような抗ＲＳＶ抗体；ＰＲＯＴＯＶＩＲ（登録商標）などのような抗ＣＭＶ抗体；ＰＲＯ５４２などのような抗ＨＩＶ抗体；抗Ｈｅｐ  Ｂ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（登録商標）などのような抗肝炎抗体；抗ＣＡ  １２５の抗体ＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；ｃｈ−Ｇ２５０などのような抗ヒト腎細胞がん抗体；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対して特異的な抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮がん（ＳＦ−２５）；ならびにＳｍａｒｔ  ＩＤ１０および抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）などのような抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、非治療用タンパク質である。非治療用タンパク質は、コラーゲンおよびその誘導体、アルブミン、オバルブミン、レンネット、フィブリン、カゼイン（αＳ１、αＳ２、β、κを含む）、エラスチン、ケラチン、ミオシン、フィブロネクチン、ラミニン、ナイドジェン−１、ビトロネクチン、絹フィブロイン、プロリルヒドロキシラーゼ、リシルヒドロキシラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ヘムタンパク質、ならびに商業上および／または学究的に対象となる任意の他の構造タンパク質および酵素を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、コラーゲンである。本明細書において使用される用語「コラーゲン」は、高抗張力を有し、かつほとんどの多細胞生物において見つけられている結合組織の主要なタンパク質を指す。コラーゲンは、主要な線維性タンパク質であり、それはまた、基底膜において非線維性タンパク質でもある。それは、豊富なグリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、およびヒドロキシリシンを含有する。現在、Ｉ〜ＸＩＸ型コラーゲンが同定されており、それらは、アルファ鎖のアミノ酸構造が異なる。本明細書において使用される用語「コラーゲン」は、自然のものかどうかにかかわらず、すべての型のコラーゲンおよびコラーゲンの任意の形態、アテロコラーゲン、不溶性コラーゲン、コラーゲン線維、可溶性コラーゲン、および酸抽出コラーゲンを意味するとして理解される。
【００８３】
成長培地
本明細書において記載されるＬ型細菌を培養するのに適した成長培地は、少なくとも４ｍＭのマグネシウム、好ましくは４ｍＭ超の、より好ましくは５ｍＭ超の、さらにより好ましくは６ｍＭ超のマグネシウム濃度を含み、これは、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、または当技術分野において知られている他のマグネシウム塩の形態をしていてもよい。培地はまた、スクロース、グルコース、またはベタインなどのような浸透圧安定剤を含有してもよい。いくつかの実施形態では、浸透圧安定剤の濃度は、少なくとも約３％、４％、または５％重量／体積であるべきである。
【００８４】
本明細書において使用される用語「浸透圧安定剤」は、培地の浸透圧の強度をコントロールし、かつ細菌細胞の内側の膨圧を下げるために使用される構成要素を指す。浸透圧安定剤は、たとえば糖（たとえばアラビノース、グルコース、スクロース、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、フルクトース、ガラクトース、サッカロース、マルトトリオースエリトリトール、リビトール、ペンタエリスリトール、アラビトール、ガラクチトール、キシリトール、イジトール、マルトトリオース、およびその他同種のもの）、ベタイン（たとえばトリメチルグリシン）、プロリン、アンモニウム塩、カリウム塩、もしくはナトリウム塩（たとえば塩化ナトリウム）などのような１つ以上の塩、１つ以上のポリマー（たとえばポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリスクロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール）、またはその組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。ある場合には、培地中の浸透圧安定剤の濃度は、少なくとも約４％、５％、６％、または７％（ｗ／ｖ）である。さらなる実施形態では、浸透圧安定剤の濃度は、少なくとも約８％、９％、または１０％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、培地中の浸透圧安定剤の濃度は、約５％から約２０％（ｗ／ｖ）の間にある。
【００８５】
いくつかの実施形態では、浸透圧安定剤（たとえば、上記に記載される１つ以上の浸透圧安定剤）の全濃度は、実施例１において以下に記載されるスイッチ培地１、スイッチ培地２、またはバイオリアクター培地ＭＧＺ１２の浸透圧重量モル濃度と等しい浸透圧重量モル濃度を有する培養培地を提供するのに十分である。いくつかの実施形態では、浸透圧安定剤（たとえば、上記に記載される１つ以上の浸透圧安定剤）の全濃度は、実施例１において以下に記載されるスイッチ培地１、スイッチ培地２、またはバイオリアクター培地ＭＧＺ１２の浸透圧重量モル濃度よりも約５０％低い〜約５０％高い浸透圧重量モル濃度を有する培養培地を提供するのに十分である。いくつかの実施形態では、浸透圧安定剤（たとえば、上記に記載される１つ以上の浸透圧安定剤）の全濃度は、実施例１において以下に記載されるスイッチ培地１、スイッチ培地２、またはバイオリアクター培地ＭＧＺ１２の浸透圧重量モル濃度よりも約２５％低い〜約２５％高いまたは約１０％低い〜約１０％高い浸透圧重量モル濃度を有する培養培地を提供するのに十分である。
【００８６】
本明細書において使用される用語「糖」は、還元糖（たとえばセロビオース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、グリセルアルデヒド、ラクトース、マルトース、およびリボース）、非還元糖（たとえばメレジトース、メリビオース、ラフィノーゼ、ソルボース、スクラロース、スクロース、トレハロース、およびベルバスコース）糖アルコール（たとえばマルチトール、アラビトール、ズルシトール、エリトリトール、グリセロール、グリコール、イジトール、イソマルト、ラクチトール、マンニトール、リビトール、ソルビトール、トレイトール、およびキシリトール）を指す。
【００８７】
本明細書において使用される用語「ベタイン」は、トリメチルグリシンを含むが、これに限定されない、完全にＮ−メチル化されたアミノ酸を指す。
【００８８】
塩および他の栄養素は、成長を補うために培地に追加されるべきである。試験された、生理学的にスイッチされた生理を支える塩および培地組成物は、Ｍ６３塩培地、Ｍ９塩培地、ＰＹＥ培地、およびルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地である。炭素源、窒素源、および無機リン酸源に加えて、任意の必要なサプリメントもまた、適切な濃度で含まれ、単独でまたは複合窒素源などのような別のサプリメントもしくは培地との混合物として導入されてもよい。ある実施形態では、培地は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、カザミノ酸、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マグネシウム、ペプトン、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酵母抽出物から選択される１つ以上の成分をさらに含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、動物由来成分がない。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、限定培地を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、酵母抽出物がない。
【００９０】
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、１ｍＬの培養体積当たり約１×１０８細菌細胞〜１ｍＬ当たり約１×１０１０細菌細胞を少なくとも約１Ｌの体積（たとえば約１Ｌ〜約５００，０００Ｌ、約１Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１Ｌ〜約１，０００Ｌ、約約１Ｌ〜約５００Ｌ、または約１Ｌ〜約２５０Ｌ）中に含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、１ｍＬの培養体積当たり約４×１０８細菌細胞〜１ｍＬ当たり約１×１０９細菌細胞を少なくとも約１Ｌの体積（たとえば約１Ｌ〜約５００，０００Ｌ、約１Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１Ｌ〜約１，０００Ｌ、約約１Ｌ〜約５００Ｌ、または約１Ｌ〜約２５０Ｌ）中に含む。
【００９１】
ある実施形態では、培地はまた、発現ベクターを含有する原核細胞の成長を選択的に可能にするための、発現ベクターの構築に基づいて選ばれた選択薬剤をも含有する。たとえば、カナマイシンは、カナマイシン抵抗性遺伝子を発現する細胞の成長のために培地に追加される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、細菌細胞ペプチドグリカン生合成の少なくとも１つの外来抗生物質阻害剤を含む。外来抗生物質阻害剤は、当技術分野においてよく理解されるように、抗生物質であり、他の病原菌の成長を阻害するもしくは破壊する、細菌（バチルス種を含む）、放線菌（ストレプトマイセスを含む）、もしくは真菌などのような微生物またはその遺伝子操作された、かつそのような天然の供給源から単離された微生物によって天然に産生される抗菌剤を含む。類似する構造および作用様式の物質は、化学的に合成することができるまたは天然の化合物は、半合成抗生物質を産生するために修飾することができる。抗生物質の例示的なクラスは、（１）ペニシリン、セファロスポリン  モノバクタム、メチシリン、およびカルバペネムを含むβ−ラクタム；（２）アミノグリコシド、たとえばゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、トブラマイシン、硫酸ネチルマイシン、パロモマイシン、およびアミカシン；（３）テトラサイクリン、たとえばドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、およびデメクロサイクリン；（４）スルホンアミド（たとえばマフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、およびスルファサラジン）ならびにトリメトプリム；（５）キノロン、たとえばシプロフロキサシン、ノルフロキサシン、およびオフロキサシン；（６）糖ペプチド（たとえばバンコマイシン、テラバンシン、テイコプラニン）；（７）たとえばエリスロマイシン、アジスロマイシン、およびクラリスロマイシンを含むマクロライド；（８）カルバペネム（たとえばエルタペネム、ドリペネム、メロペネム、およびイミペネム）；（９）セファロスポリン（たとえばセファドロキシル、セフェピム、およびセフトビプロール）；（１０）リンコサミド（たとえばクリンダマイシンおよびリンコマイシン）；（１１）モノバクタム（たとえばアズトレオナム）；（１２）ニトロフラン（たとえばフラゾリドンおよびニトロフラントイン）；（１３）ペニシリン（たとえばアモキシシリンおよびペニシリンＧ）；（１４）ポリペプチド（たとえばバシトラシン、コリスチン、およびポリミクシンＢ）；ならびに（１５）他の抗生物質、たとえばアンサマイシン、ポリマイシン、カルバセフェム、クロラムフェニコール、リポペプチド、ならびにマイコバクテリアに対する薬剤（たとえば、結核（結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））およびハンセン病（らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ））を含む、哺乳動物における疾患を引き起こすマイコバクテリア）ならびにその任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。細菌細胞ペプチドグリカン生合成の外来抗生物質阻害剤は、細菌細胞ペプチドグリカン生合成を阻害するまたはブロックするのに有効な量または濃度で、使用する、培養中に存在する、または培養に追加することができる。細菌細胞ペプチドグリカン生合成の外来抗生物質阻害剤は、細菌細胞分裂を阻害するまたはブロックするのに有効な量で、使用する、培養中に存在する、または培養に追加することができる。細菌細胞ペプチドグリカン生合成の外来抗生物質阻害剤は、６、５、４、���ｍＭ未満の、または約１ｍＭのマグネシウムおよび／または浸透圧安定剤を含有する培養培地において細菌細胞を死滅させるのに有効な量または濃度で、使用する、培養中に存在する、または培養に追加することができる。細菌細胞ペプチドグリカン生合成の外来抗生物質阻害剤は、スイッチ形態を誘発しないコントロール培地において抗生阻害剤の最小発育阻止濃度のまたはそれを上回る量または濃度で、使用する、培養中に存在する、または培養に追加することができる。細菌細胞ペプチドグリカン生合成の外来抗生物質阻害剤は、コントロール試験プレートにおける外来抗生物質阻害剤の非存在と比較して、試験プレート（たとえばＬＢ寒天）上での細菌のコロニー形成を少なくとも約９５％または９９％低下させるのに有効な量または濃度で、使用する、培養中に存在する、または培養に追加することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、細菌細胞ペプチドグリカン生合成の少なくとも２つの構造的に別個の外来抗生物質阻害剤を含む。ある場合には、細菌細胞ペプチドグリカン生合成の少なくとも２つの構造的に別個の外来抗生物質阻害剤が、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成経路の異なる構成要素を阻害する（たとえば、少なくとも２つの構造的に別個の外来抗生物質阻害剤は、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成経路の異なる酵素を阻害する）。ある場合には、細胞培養物は、細菌細胞ペプチドグリカン生合成のトランスグリコシラーゼ成分の外来抗生物質阻害剤を含む。ある場合には、細胞培養物は、細菌細胞ペプチドグリカン生合成のトランスペプチダーゼ成分の外来抗生物質阻害剤を含む。ある場合には、細胞培養物は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル（ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ）−ペンタペプチド生合成またはＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）生合成の外来抗生物質阻害剤を含む。
【００９４】
ある場合には、細胞培養物は、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｒａＹ、ＭｕｒＧ、ＦｅｍＸ、ＦｅｍＡ、ＦｅｍＢ、ＦｔｓＷ、またはペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）の外来抗生物質阻害剤を含む。ある場合には、細胞培養物は、少なくとも２つの構造的に別個の外来抗生物質阻害剤を含み、少なくとも２つの構造的に別個の外来抗生物質阻害剤は、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｒａＹ、ＭｕｒＧ、ＦｅｍＸ、ＦｅｍＡ、ＦｅｍＢ、ＦｔｓＷ、またはペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）から選択される異なるタンパク質を阻害する。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、β−ラクタム抗生物質、ホスホン酸抗生物質、ポリペプチド系抗生物質、Ｄ−シクロセリン、およびグリコペプチド系抗生物質から選択される少なくとも１つまたは少なくとも２つの構造的に別個の抗生物質を含み、抗生物質は、細菌細胞においてペプチドグリカン生合成を阻害する。
【００９５】
いくつかの実施形態では、培養培地は、少なくとも１つの活性酸素種（ＲＯＳ）捕捉剤を含む（たとえば還元グルタチオン（ＧＳＨ）または約７０ｇ／モル〜約３５０ｇ／モルもしくは約７５ｇ／モル〜約１５５ｇ／モルの分子量を有するチオール含有非ペプチド性小分子）。
【００９６】
いくつかの実施形態では、培養培地は、対象となるタンパク質をコードする外来遺伝子を含む発現ベクターにおける選択可能マーカーの存在を選択する抗生物質（たとえば第２または第３の抗生物質）を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターにおける選択可能マーカーの存在を選択する抗生物質は、細菌細胞におけるペプチドグリカン生合成の阻害剤ではない。
【００９７】
生理学的スイッチ
理論によって拘束されないが、組換えタンパク質産生を促進し、細胞分裂を阻害する細胞形態は、上記に述べられる培地条件下での細胞壁の除去によって駆動されるように見える。いくつかの実施形態では、細胞壁合成の除去／阻害のための方法は、ペプチドグリカン合成を阻害する抗生物質（アンピシリン、カルベニシリン、ペニシリン、もしくはホスホマイシンなど）の使用または当技術分野において知られている他の方法を通してのものとすることができる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、抗生物質は、β−ラクタム抗生物質、ホスホン酸抗生物質、ポリペプチド系抗生物質、およびグリコペプチド系抗生物質から選択される。いくつかの実施形態では、抗生物質は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、およびモノバクタムから選択される抗生物質である。いくつかの実施形態では、抗生物質は、アラホスファリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズトレオナム、バシトラシン、カルベニシリン、セファマンドール、セフォタキシム、セフスロジン、セファロチン、ホスミドマイシン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンｇ、ペニシリンｖ、ホスホマイシン、プリマキシン、Ｄ−シクロセリン、およびバンコマイシンから選択される。
【００９９】
ペリプラズム標的
適切なシグナル配列を有する場合、組換えで産生されたポリペプチドは、細菌細胞のペリプラズム空間の中に分泌することができる。Ｊｏｌｙ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｌａｉｒｄ，Ｍ．Ｗ．，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｅｒｉｐｌａｓｍ  ｅｄ．Ｅｈｒｍａｎｎ，Ｍ．，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，（２００７）３４５−３６０。ペリプラズムの化学的に酸化する環境では、ジスルフィド結合の形成およびその結果としてのポリペプチドの機能的に正確なフォールディングが促される。
【０１００】
一般に、シグナル配列は、発現ベクターの構成要素であってもよいまたはそれは、ベクターに挿入される外来遺伝子の一部であってもよい。選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、かつプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）シグナル配列であるべきである。外来遺伝子の自然のシグナル配列を認識せず、プロセシングもしない細菌宿主細胞については、シグナル配列は、任意のよく知られている細菌シグナル配列によって置換される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、組換えで産生されたポリペプチドは、ＤｓｂＡシグナル配列を使用して、ペリプラズム空間に向けることができる。Ｄｉｎｈ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，Ｓｅｐｔ．２０１１，４９８４−４９８７。いくつかの実施形態では、組換えで産生されたポリペプチドは、ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡ、またはＨｙ１Ａシグナル配列を使用して、ペリプラズム空間に向けることができる。いくつかの実施形態では、組換えで産生されたポリペプチドは、ペリプラズム空間の中に分泌されるタンパク質をコードする遺伝子の一部分（少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９５％、９９％）を使用して、ペリプラズム空間に向けることができる。たとえば、いくつかの実施形態では、組換えで産生されたポリペプチドは、タンパク質ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡ、またはＨｙ１Ａをコードする遺伝子の一部分（少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９５％、９９％）を使用して、ペリプラズム空間に向けることができ、一部分は、それぞれ、ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡ、またはＨｙ１Ａのシグナル配列を含有する。いくつかの実施形態では、組換えで産生されたポリペプチドは、そのポリペプチドをコードする遺伝子を、ペリプラズム空間の中に分泌されるタンパク質、たとえばＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡ、またはＨｙ１Ａから選択されるタンパク質のすべてまたは実質的にすべてをコードする核酸に融合し、それによって融合タンパク質を産生することによって、ペリプラズム空間に向けることができる。一般に、そのようにペリプラズムに向けるには、シグナル配列またはシグナル配列を含有する一部分が対象となるポリペプチドに対してＮ−末端にあるＮ−末端融合物を用いる。
【０１０２】
発酵によるタンパク質産生
本発明は、タンパク質の発酵による調製のためのプロセスであって、
ａ）マグネシウム塩を含む培地において組換えグラム陰性細菌細胞を培養するステップであって、前記培地中のマグネシウムイオンの濃度は、少なくとも約６ｍＭであり、細菌細胞は、タンパク質をコードする外来遺伝子を含む、ただし、タンパク質が、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質以外であることを条件とするステップ；
ｂ）細菌細胞中のペプチドグリカン生合成を阻害するステップ（たとえば、ペプチドグリカン生合成を阻害する１、２、またはそれ以上の抗生物質を培地に追加することによって）；および
ｃ）培地からタンパク質を回収するステップを含むプロセスをさらに提供する。
【０１０３】
細菌は、たとえば国際公開第０５／０２１７７２号パンフレットにおいて記載されるように連続的にまたはバッチプロセス（バッチ培養）においてまたは流加もしくは反復流加プロセスにおいて非連続的に標的タンパク質を産生する目的で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質産生は、大規模で行われる。様々な大規模発酵手順は、組換えタンパク質の産生に利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１，０００リットルの容量、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素および栄養素、とりわけグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分散させるためにかくはん機のインペラーを使用する。小規模発酵は、わずかおよそ２０リットルの容積の発酵槽における発酵を一般に指す。
【０１０４】
標的タンパク質の蓄積のために、宿主細胞は、標的タンパク質の蓄積に十分な条件下で培養される。そのような条件は、たとえば、細胞によるタンパク質の発現および蓄積を可能にする温度、栄養素、および細胞密度の条件を含む。さらに、そのような条件は、当業者らに知られているように、細胞が、転写、翻訳、および分泌タンパク質については、ある細胞のコンパートメントから別のコンパートメントへのタンパク質の運搬といった基本的な細胞の機能を実行することができる条件である。
【０１０５】
細菌細胞は、適した温度で培養される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の成長については、たとえば、典型的な温度は、約２０℃〜約３９℃の範囲にわたる。一実施形態では、温度は、約２５℃〜約３７℃である。別の実施形態では、温度は、約３０℃である。
【０１０６】
培養培地のｐＨは、主として宿主生物体に依存して、約５〜９の任意のｐＨであってもよい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）については、ｐＨは、約６．８〜約７．４または約７．０である。
【０１０７】
誘発については、典型的に、細胞は、一定の光学濃度、たとえば約１．１のＯＤ６００が実現されるまで培養され、この時点で、誘発は、標的タンパク質をコードする外来遺伝子の発現を誘発するために開始される（たとえば、誘発因子の追加によって、リプレッサー、サプレッサー、または培地の構成要素の除去によってなど）。
【０１０８】
産物蓄積後、細胞は、組換えタンパク質の溶解および放出を誘発するために、勢いよく撹拌するもしくは混合する（たとえばボルテックスする）および／または遠心分離することができる。大部分のタンパク質は、典型的に、上清中に見つけられるが、残りのいかなる膜結合タンパク質も、洗浄剤（たとえば、トリトンＸ−１００などのような非イオン性洗浄剤）を使用して放出させることができる。
【０１０９】
続くステップにおいて、標的タンパク質は、細胞マトリックスから放出された可溶性または不溶性産物として、産物と細胞デブリの同時の回収を最小限にする方式で回収される。回収は、任意の手段によって行われてもよいが、一実施形態では、ニッケルカラムを通したヒスチジンタグ精製を含むことができる。たとえばＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔａｇｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．２０００  ；３２６：２４５−２５４を参照されたい。
【０１１０】
最初の回収ステップにおいて捕捉された標的タンパク質は、次いで、たとえばクロマトグラフィーによってさらに精製されてもよい。一般的なクロマトグラフ法およびそれらの使用は、当業者に知られている。たとえばＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔ  Ａ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｈｅｆｔｍａｎｎ，Ｅ．（ｅｄ），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９２）；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｅｙｌ，Ｚ．（ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，（１９９８）；Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｔｏｄａｙ，Ｐｏｏｌｅ，Ｃ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｐｏｏｌｅ，Ｓ．Ｋ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９１）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。以下の手順は、適した精製手順の例示である：免疫親和性カラムまたはイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥなどのような陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫安塩析；およびたとえばＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−７５を使用するゲルろ過。
【０１１１】
以下の実施例は、限定ではなく例説の目的のために提供される。
【実施例】
【０１１２】
実施例１：修飾細菌の構築。
材料および方法：
株：
試験した生理学的スイッチおよびタンパク質産生：
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＮＥＢ、製品＃ｃ２５２７
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＮＣＭ３７２２−Ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＧＳＣ＃１２３５５
【０１１３】
試験した生理学的スイッチ：
ガンマプロテオバクテリア：
ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）−ＡＴＣＣ、製品＃１４０４８
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）−ＡＴＣＣ、製品＃３１９４８
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１−ＡＴＣＣ、製品＃ＢＡＡ−４７
【０１１４】
アルファプロテオバクテリア：
カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）−ＡＴＣＣ、製品＃１９０８９
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）／リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）−ＡＴＣＣ、製品＃３３９７０
ブレブンディモナス・ディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）−ＡＴＣＣ、製品＃１３１８４
【０１１５】
培地組成物：
１リットルの５×ｍ６３塩：
１０ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４−Ｐ２１２１２１、製品＃７７８３−２０−２
６８ｇ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｐ２１２１２１、製品＃７７７８−７７−０
２．５ｍｇ  ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ−Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃Ｆ７００２
ｍｉｌｌｉＱ水により体積を１リットルにする
ＫＯＨ（Ｐ２１２１２１、製品＃１３１０−５８−３）によりｐＨ７に合わせる
混合物をオートクレーブする
【０１１６】
１リットルの１Ｍ  ＭｇＳＯ４：
２４６．５ｇ  ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ−Ｐ２１２１２１、製品＃１００３４−９９−８
ｍｉｌｌｉＱ水により体積を１リットルにする
混合物をオートクレーブする
【０１１７】
１リットルのスイッチ培地１：
１３３．４ｍＬ  ５×ｍ６３塩
１０ｍＬ  １Ｍ  ＭｇＳＯ４
３８．６ｇグルコース−Ｐ２１２１２１、製品＃５０−９９−７
６６．６ｇスクロース−Ｐ２１２１２１、製品＃５７−５０−１
８．３３ｇ  ＬＢミックス−Ｐ２１２１２１、製品＃ｌｂ−ｍｉｌｌｅｒ
ｍｉｌｌｉＱ水により体積を１リットルにする
０．２２μＭ細孔真空ろ過器（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃ＣＬＳ４３０５１７）を通して混合物をろ過滅菌する
【０１１８】
１リットルのスイッチ培地２：
１３３．４ｍＬ  ５×ｍ６３塩
１０ｍＬ  １Ｍ  ＭｇＳＯ４
３８．６ｇグルコース−Ｐ２１２１２１、製品＃５０−９９−７
６６．６ｇスクロース−Ｐ２１２１２１、製品＃５７−５０−１
１０ｇ酵母抽出物−ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ．ｃｏｍ、製品＃Ｊ６０２８７Ａ１
ｍｉｌｌｉＱ水により体積を１リットルにする
０．２２μＭ細孔真空ろ過器（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃ＣＬＳ４３０５１７）を通して混合物をろ過滅菌する
【０１１９】
バイオリアクターでの成長について：
５リットルのバイオリアクター培地ＭＧＺ１２：
１）ＤＩ水、ＶＷＲ、製品＃９７０６１−１７０中で５００ｇ／Ｌの濃度で１Ｌのグルコースをオートクレーブする。
２）ＤＩ水、Ｇｅｎｅｓｅｅｓｃｉ．ｃｏｍ、製品＃６２−１１２中で５００ｇ／Ｌの濃度で１Ｌのスクロースをオートクレーブする。
３）３９４６ｍＬのＤＩ水中でオートクレーブする：
２０ｇ  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４．ＶＷＲ、製品＃９７０６１−９３２．
６６．５ｇ  ＫＨ２ＰＯ４．ＶＷＲ、製品＃９７０６２−３４８．
２２．５ｇ  Ｈ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７．ＶＷＲ、製品＃ＢＤＨ９２２８−２．５ＫＧ．
２．９５ｇ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ．ＶＷＲ、製品＃９７０６２−１３４．
１０ｍＬ微量金属（Ｔｅｋｎｏｖａ）、１０００×．Ｔｅｋｎｏｖａ、製品＃Ｔ１００１．
オートクレーブ後、４００ｍＬの（１）を（３）に、６５ｍＬの１０Ｍ  ＮａＯＨ（ＶＷＲ、製品＃９７０６４−４８０）を（３）に、６６６ｍＬの（２）を（３）に追加する。
【０１２０】
５００ｇ／Ｌのグルコースの供給を必要に応じて発酵実行の間に使用することができる。
【０１２１】
誘発時に次のものを追加する：
５０ｍＬの１Ｍ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏを５Ｌ  バイオリアクターに
１〜１０ｍＭの濃度のＩＰＴＧ．ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ．ｃｏｍ、製品＃ＥＩ０５９３１
ホスホマイシン（５０μｇ／ｍＬ以上）およびカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ以上）を追加する。
【０１２２】
生理学的スイッチ：
生理学的スイッチは、１Ｌ以下の体積の振盪フラスコにおける成長について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）について１〜１．１のＯＤ６００で最適にオンにされる。試験した他の種については、一旦培養物が最大のＯＤ６００に達したら、培養物をスイッチ培地において成長させ、継代培養した。すべての場合において、生理学的スイッチは、１００〜２００ｕｇ／ｍＬカルベニシリン（Ｐ２１２１２１、製品＃４８００−９４−６）および５０〜１００ｕｇ／ｍＬホスホマイシン（Ｐ２１２１２１、製品＃２６０１６−９９−９）の追加を通してオンにされる。大部分の集団は、数時間以内にスイッチ状態となる。細胞が生理学的スイッチを受けたことを確認するために、細胞は、パーフェクトフォーカスシステム、Ｎｉｋｏｎ  ＣＦＩ６０  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  １００Ｘ  ＮＡ  １．４５対物レンズ、Ｐｒｉｏｒ自動フィルターホイールおよびステージ、ＬＥＤ−ＣＦＰ／ＹＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙおよびＬＥＤ−ＤＡ／ＦＩ／ＴＸフィルターセット（Ｓｅｍｒｏｃｋ）、Ｌｕｍｅｎｃｏｒ  Ｓｏｌａ  ＩＩ  ＳＥ  ＬＥＤ照明システム、ならびにＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｆｌａｓｈ  ４．０  Ｖ２  ＣＭＯＳカメラを備えたＮｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅで画像化した。
【０１２３】
生理学的スイッチの画像解析：
画像は、寸法を測定するためにＩｍａｇｅＪを使用して解析した。スイッチ状態において、総体積（Ｖ＝（４／３）πｒ３）を計算するために、外膜の球状の輪郭を球体として処理する。細胞質内体積は、球体内に存在する楕円体として計算する（Ｖ＝（４／３）π＊（最長の半径）＊（短い半径）２）。ペリプラズム体積を計算するために、細胞質内体積を細胞の総体積から引く。
【０１２４】
タンパク質の発現および定量化：
ｐＥＴ２８ａ（ｅｍｄ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  製品＃６９８６４）を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ  製品＃ｃ２５２７）およびＧＦＰまたはコラーゲン誘導体を持つその誘導体を、５０ｍｇ／ｍＬカナマイシン（ｐ２１２１２１  製品＃２２５１１８０）を含有するスイッチ培地において一晩、３７℃で振盪培養器において成長させた。翌日、５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有する新鮮なスイッチ培地への一晩培養物の１：１０希釈により、継代培養を始めた。培養物は、次いで、生理学的にスイッチされ、タンパク質産生は、１〜１．１のＯＤ６００（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２マイクロプレートリーダーで読み取る）で同時に誘発される。生理学的スイッチおよびタンパク質産生は、１００ｕｇ／ｍＬカルベニシリン、５０ｕｇ／ｍＬホスホマイシン、および１００ｕｇ／ｍＬ  ＩＰＴＧ（ｐ２１２１２１  製品＃３６７−９３−１）の追加を通してオンにされる。タンパク質発現は、オービタルシェーカーで、室温（およそ２２℃）で、８時間〜一晩の間、スイッチ状態で継続される。総タンパク質レベルを定量化するために、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙを、培養の混合した一部分に対して使用し、検量線についてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２マイクロプレートリーダーで定量化する。タンパク質集団の残りと比べた標的タンパク質産生の相対強度を定量化するために、培養物の混合部分を、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）Ｇｅｌ上に流し、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ（商標）クーマシー染色により染色した。
【０１２５】
タンパク質産生の誘発：
生理学的状態でタンパク質産生を誘発するために標準的な手順に従った。発明者らは、組換えタンパク質のＩＰＴＧ／ラクトース誘発性の産生を駆動するプラスミドｐＥＴ２８ａを含有する株ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用し、ＤｓｂＡシグナル配列を使用してそれらをペリプラズム空間に向けた。上記に記載されるようにペリプラズム空間に向けられたＧＦＰタンパク質を使用して、発明者らは、同じ時間、同じ光学濃度で誘発された未スイッチ細胞集団と比較した場合の、タンパク質産生を増す能力およびその５倍の増加を実証した（数量）。誘発は、１．１のＯＤ６００で最適であり、誘発は、１０時間継続させ、この時点で、産生されたタンパク質は、約２００ｍｇ／ｍＬと測定された。
【０１２６】
本明細書において参照される米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物はすべて、本発明の記載と矛盾しない程度まで、本明細書において参照によってそれらの全体が組み込まれる。
【０１２７】
前述から、本明細書において記載される特定の実施形態は、例説の目的のために本明細書において記載されたが、様々な修飾が、本明細書において記載される精神および範囲から逸脱することなくなされてもよいことが十分に理解されるであろう。したがって、本開示は、添付の請求項によるものを除いて、限定されない。
【図１】
2019510517.tif 000003
【図２】
2019510517.tif 000004
【図３】
2019510517.tif 000005
【図４】
2019510517.tif 000006
【国際調査報告】
2019510517.tif 000007
2019510517.tif 000008
2019510517.tif 000009