(57)【要約】  関心領域への生体内送達のためにウイルスを修飾する方法は、少なくとも１つの脂質を、少なくとも１つの親水性化合物と、前記関心領域内に存在する条件下にて開裂可能な結合を介して複合させることによって形成された脂質複合体を含んでいるエンベロープ組成物を形成するステップと、前記ウイルスを前記エンベロープ組成物と合わせて、それにより前記ウイルスをエンベロープ構造内に包囲するステップと、を含んでいる。【選択図】  図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心領域への生体内送達のためにウイルスを修飾する方法であって、
少なくとも１つの脂質を、少なくとも１つの親水性化合物と、前記関心領域内に存在する条件下にて開裂可能な結合を介して複合させることによって形成された脂質複合体を含んでいるエンベロープ組成物を形成するステップと、
前記ウイルスを前記エンベロープ組成物と合わせて、それにより前記ウイルスをエンベロープ構造内に包囲するステップと、
を含んでいる、方法。
【請求項２】
前記エンベロープ組成物が、前記ウイルスを包囲するために、脂質二重層を形成している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エンベロープ組成物が、少なくとも１つの共脂質を含んでいる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの共脂質が、リン脂質である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの脂質が、ｎ−ドコサン酸、アラキジン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、オレイン酸、ビタミンＥ、エンベリン、１−フェニル−２−パルミトイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール、又は、以下の式を有する化合物からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【化１】
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ここで、Ｒ1はファルネシル基、ゲラニル基又はゲラニルゲラニル基であり、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＨ又はＳｅであり、ＺはＣ−Ｒ2又はＮであり、Ｒ2はＨ、ＣＮ、ＣＯ2Ｒ7、ＳＯ3Ｒ7、ＣＯＮＲ7Ｒ8又はＳＯ2ＮＲ7Ｒ8であり、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立してＨ、アルキル基、アルケニル基、ＣＯ2Ｍ又はＳＯ3Ｍであり、Ｍはカチオンであり、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、独立してＨ、カルボキシル基、アルキル基、アルケニル基、アミノアルキル基、ニトロアルキル基、ニトロ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アジド基又はチオシアネート基、又は、それらの誘導体である。
【請求項６】
前記少なくとも１つの脂質が、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸アミド（ＦＴＳ−アミド）、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸メチルアミド（ＦＴＳ−ＭＡ）及びＳ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸ジメチルアミド（ＦＴＳ−ＤＭＡ）からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスの科が、ポックスウイルス科、デノボウイルス科、ヘルペスウイルス科、ピコルナウイルス科、ラブドウイルス科、パラミクソウイルス科、レトロウイルス科、トガウイルス科又はレオウイルス科からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスが、ワクチニアウイルス、粘液腫ウイルス、鳥ポックスウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、コクサッキーウイルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、レオウイルス又はシンドビスウイルスからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスの科が、ポックスウイルス科である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスが、ワクチニアウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスが、成熟ワクチニアウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記関心領域が、腫瘍を含んでおり、前記ウイルスが、前記腫瘍を治療するために修飾される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの脂質が、ファルネシルチオサリチル酸又はファルネシルチオサリチル酸アミドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの親水性化合物が、少なくとも１つの親水性オリゴマー又は少なくとも１つの親水性ポリマーを含んでいる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの親水性オリゴマー又は前記少なくとも１つの親水性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類及びポリペプチドからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの親水性化合物が、ポリアルキレンオキシドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリアルキレンオキシドが、ポリエチレングリコールである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリエチレングリコールが、少なくとも１ＫＤａの分子量を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合が、ｐＨ感受性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記結合が、ヒドラジン基を含んでいる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記エンベロープ構造の安定性を制御するために、前記エンベロープ組成物内に添加剤を含ませるステップをさらに含んでいる、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記添加剤が、コレステロール又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
関心領域への生体内送達のための製剤であって、
ウイルスと、
前記ウイルスを包囲しており、かつ、少なくとも１つの脂質を、少なくとも１つの親水性化合物と、前記関心領域内に存在する条件下にて開裂可能な結合を介して複合させることによって形成された脂質複合体を含んでいる、合成エンベロープ組成物と
を含んでいる、製剤。
【請求項２４】
前記エンベロープ組成物が、前記ウイルスを包囲する脂質二重層を形成している、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
前記エンベロープ組成物が、少なくとも１つの共脂質を含んでいる、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの共脂質が、リン脂質である、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの脂質が、ｎ−ドコサン酸、アラキジン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、オレイン酸、ビタミンＥ、エンベリン、１−フェニル−２−パルミトイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール、又は、以下の式を有する化合物からなる群より選択される、請求項２５に記載の製剤。
【化２】
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ここで、Ｒ1はファルネシル基、ゲラニル基又はゲラニルゲラニル基であり、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＨ又はＳｅであり、ＺはＣ−Ｒ2又はＮであり、Ｒ2はＨ、ＣＮ、ＣＯ2Ｒ7、ＳＯ3Ｒ7、ＣＯＮＲ7Ｒ8又はＳＯ2ＮＲ7Ｒ8であり、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立してＨ、アルキル基、アルケニル基、ＣＯ2Ｍ又はＳＯ3Ｍであり、Ｍはカチオンであり、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、独立してＨ、カルボキシル基、アルキル基、アルケニル基、アミノアルキル基、ニトロアルキル基、ニトロ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アジド基又はチオシアネート基、又は、それらの誘導体である。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの脂質が、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸アミド（ＦＴＳ−アミド）、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸メチルアミド（ＦＴＳ−ＭＡ）及びＳ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸ジメチルアミド（ＦＴＳ−ＤＭＡ）からなる群より選択される、請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
前記ウイルスの科が、ポックスウイルス科、デノボウイルス科、ヘルペスウイルス科、ピコルナウイルス科、ラブドウイルス科、パラミクソウイルス科、レトロウイルス科、トガウイルス科又はレオウイルス科からなる群より選択される、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項３０】
前記ウイルスが、ワクチニアウイルス、粘液腫ウイルス、鳥ポックスウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、コクサッキーウイルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、レオウイルス又はシンドビスウイルスからなる群より選択される、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項３１】
前記ウイルスの科が、ポックスウイルス科からなる群より選択される、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３２】
前記ウイルスが、ワクチニアウイルスである、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３３】
前記ウイルスが、成熟ワクチニアウイルスである、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３４】
前記関心領域が、腫瘍を含んでおり、前記ウイルスが、前記腫瘍を治療するために修飾される、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの脂質が、ファルネシルチオサリチル酸又はファルネシルチオサリチル酸アミドである、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの親水性化合物が、少なくとも１つの親水性オリゴマー又は少なくとも１つの親水性ポリマーを含んでいる、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの親水性オリゴマー又は前記少なくとも１つの親水性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類及びポリペプチドからなる群より選択される、請求項３６に記載の製剤。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの親水性化合物が、ポリアルキレンオキシドである、請求項３７に記載の製剤。
【請求項３９】
前記ポリアルキレンオキシドが、ポリエチレングリコールである、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４０】
前記ポリエチレングリコールが、少なくとも１ＫＤａの分子量を有する、請求項２９に記載の製剤。
【請求項４１】
前記結合が、ｐＨ感受性である、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項４２】
前記結合が、ヒドラジン基を含んでいる、請求項４１に記載の製剤。
【請求項４３】
添加剤をさらに含んでいる、請求項２６に記載の製剤。
【請求項４４】
前記添加剤が、コレステロールである、請求項４５に記載の製剤。
【請求項４５】
ウイルスの関心領域への生体内送達の方法であって、
請求項２３〜４７のいずれか１項に記載の製剤を注射することを含んでいる、方法。
【請求項４６】
関心領域への生体内送達のためにウイルスを修飾する方法であって、
以下の式を有する脂質を含んでいるエンベロープ組成物を形成するステップと、
前記ウイルスを前記エンベロープ組成物と合わせて、それにより前記ウイルスをエンベロープ構造内に包囲するステップと
を含んでいる、方法。
【化３】
2019509326.tif 000013
ここで、Ｒ1はファルネシル基、ゲラニル基又はゲラニルゲラニル基であり、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＨ又はＳｅであり、ＺはＣ−Ｒ2又はＮであり、Ｒ2はＨ、ＣＮ、ＣＯ2Ｒ7、ＳＯ3Ｒ7、ＣＯＮＲ7Ｒ8又はＳＯ2ＮＲ7Ｒ8であり、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立してＨ、アルキル基、アルケニル基、ＣＯ2Ｍ又はＳＯ3Ｍであり、Ｍはカチオンであり、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、独立してＨ、カルボキシル基、アルキル基、アルケニル基、アミノアルキル基、ニトロアルキル基、ニトロ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アジド基又はチオシアネート基、又は、それらの誘導体である。
【請求項４７】
前記エンベロープ組成物が、脂質二重層を形成する、請求項４８に記載の方法。
【請求項４８】
前記エンベロープ組成物が、少なくとも１つの共脂質を含んでいる、請求項４８に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの共脂質が、リン脂質である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５０】
前記脂質が、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸アミド（ＦＴＳ−アミド）、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸メチルアミド（ＦＴＳ−ＭＡ）及びＳ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸ジメチルアミド（ＦＴＳ−ＤＭＡ）からなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５１】
関心領域への生体内送達のための製剤であって、
ウイルスと、
前記ウイルスを包囲しており、かつ、以下の式を有する脂質を含んでいる、合成エンベロープ組成物と
を含んでいる、製剤。
【化４】
2019509326.tif 000014
ここで、Ｒ1はファルネシル基、ゲラニル基又はゲラニルゲラニル基であり、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＨ又はＳｅであり、ＺはＣ−Ｒ2又はＮであり、Ｒ2はＨ、ＣＮ、ＣＯ2Ｒ7、ＳＯ3Ｒ7、ＣＯＮＲ7Ｒ8又はＳＯ2ＮＲ7Ｒ8であり、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立してＨ、アルキル基、アルケニル基、ＣＯ2Ｍ又はＳＯ3Ｍであり、Ｍはカチオンであり、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、独立してＨ、カルボキシル基、アルキル基、アルケニル基、アミノアルキル基、ニトロアルキル基、ニトロ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アジド基又はチオシアネート基、又は、それらの誘導体である。
【請求項５２】
少なくとも１つの脂質を、少なくとも１つの親水性化合物と、関心領域内に存在する条件下にて開裂可能なｐＨ感受性ヒドラジン結合を介して複合させることによって形成されている、組成物。
【請求項５３】
前記組成物が、脂質二重層を形成している、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５４】
前記エンベロープ組成物が、少なくとも１つの共脂質を含んでいる、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５５】
前記少なくとも１つの共脂質が、リン脂質である、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５６】
前記少なくとも１つの脂質が、ｎ−ドコサン酸、アラキジン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、オレイン酸、ビタミンＥ、エンベリン、１−フェニル−２−パルミトイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール、又は、以下の式を有する化合物からなる群より選択される、請求項５６に記載の組成物。
【化５】
2019509326.tif 000015
ここで、Ｒ1はファルネシル基、ゲラニル基又はゲラニルゲラニル基であり、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＨ又はＳｅであり、ＺはＣ−Ｒ2又はＮであり、Ｒ2はＨ、ＣＮ、ＣＯ2Ｒ7、ＳＯ3Ｒ7、ＣＯＮＲ7Ｒ8又はＳＯ2ＮＲ7Ｒ8であり、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立してＨ、アルキル基、アルケニル基、ＣＯ2Ｍ又はＳＯ3Ｍであり、Ｍはカチオンであり、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、独立してＨ、カルボキシル基、アルキル基、アルケニル基、アミノアルキル基、ニトロアルキル基、ニトロ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アジド基又はチオシアネート基、又は、それらの誘導体である。
【請求項５７】
前記少なくとも１つの脂質が、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸アミド（ＦＴＳ−アミド）、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸メチルアミド（ＦＴＳ−ＭＡ）及びＳ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸ジメチルアミド（ＦＴＳ−ＤＭＡ）からなる群より選択される、請求項５８に記載の組成物。
【請求項５８】
前記少なくとも１つの脂質が、ファルネシルチオサリチル酸又はファルネシルチオサリチル酸アミドである、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記少なくとも１つの親水性化合物が、少なくとも１つの親水性オリゴマー又は少なくとも１つの親水性ポリマーを含んでいる、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記少なくとも１つの親水性オリゴマー又は前記少なくとも１つの親水性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類及びポリペプチドからなる群より選択される、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６１】
前記少なくとも１つの親水性化合物が、ポリアルキレンオキシドである、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ポリアルキレンオキシドが、ポリエチレングリコールである、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ポリエチレングリコールが、少なくとも１ＫＤａの分子量を有する、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６４】
前記結合が、ｐＨ感受性である、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって与えられた認可番号ＣＡ１４０２１５の下で、政府の支援によりなされたものである。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／３１３，２７０号の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
以下の情報は、以下に開示される技術及びそのような技術が通常使用され得る環境についての読者の理解を補助するために提供される。本明細書において使用される用語は、本明細書にて別途明記されない限り、特定の狭い解釈に限定されることは意図されていない。本明細書において説明される参考文献は、それらの技術又は背景の理解を容易にし得る。本明細書において引用される全ての参考文献の開示は、参照により組み込まれる。
【０００４】
ウイルスによる療法又はウイルス療法（viral therapies or virotherapies）は、バイオテクノロジーを使用して、疾患を治療するようにウイルスを再プログラミングすることによってウイルスを治療剤へと変換する治療方式である。今日において、ウイルス療法には３つの主要な支流があり、抗癌又は腫瘍溶解性ウイルス、ウイルス免疫療法、及び遺伝子治療用のウイルスベクターが挙げられる。
【０００５】
合理的にデザイン及び設計された腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）療法は、臨床にて２５年以上前に最初に試験された。しかしながら、臨床反応が前臨床モデルにおいて示された見込みに近づき始めたのは、ほんのここ５年の間である。反応の強化及び／又は生存についての実証は、タリモジーン・ラハーパレプベック（talimogene laherparepvec）（Ｔ−Ｖｅｃ）、ペキサスチモジーン・デバシレプベック（pexastimogene devacirepvec）（Ｐｅｘａ−Ｖｅｃ）及びコクサッキーウイルスＡ２１（ＣＶＡ２１）を含むいくつかのベクターを用いた無作為化臨床試験において見られ、このことは、種々の適応症における１つ以上のベクターについて、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認が出されることになる可能性が高いことを示唆している。例えば、転移性黒色腫に対するＴ−Ｖｅｃの投与は、米国ＦＤＡによって近年承認されている。しかしながら、これらの試験の全ては、直接的な腫瘍内注射に頼るものであった。播種性疾患は癌関連死の主要な原因であり、腫瘍内注射では適切に治療することができない。加えて、治療の初期ラウンドでは治療自体に対する免疫応答が高くなるため、その後のサイクル又は治療では、全身送達を達成する能力がさらに制限される。ＯＶ全身送達の可能性については、播種性疾患が寛解に至ったことも臨床にて実証されているが、そのような症例報告は、信頼できて再現性のある全身送達が達成可能であればその分野において将来的な可能性があることを強調するのみに留まっている。
【０００６】
ＯＶ又は他のウイルスベクターによる全身治療の限界を克服するため、種々の異なるアプローチが提案されている。癌患者の免疫抑制を伴うアプローチは、ＯＶベクターの免疫療法効果が腫瘍殺滅の可能性にとって重要な要素であることが明らかになったことから、大部分が断念されている。関連するが血清学的に異なるベクターを連続的に使用することや、事前感染した細胞を送達媒体として使用することにより、ある程度の成功を収めたが、治療の複雑さやコストが増加することになった。腫瘍内送達又は局所領域送達の使用は、いくつかの限定された設定において用いられるものの、典型的には、広範な転移性疾患の治療を行うことができない。ＯＶ療法が腫瘍抗原を標的とする適応免疫応答を高められたたとしても、転移は原発腫瘍とは抗原的に異なることが多い。
【０００７】
ウイルス粒子自体の化学修飾を伴うアプローチは、理論的に有望である。そのような修飾としては、大きな不活性分子（例えばＰＥＧ）をウイルス粒子へと直接化学的に付着させることや、脂質エンベロープ又はポリマー系コーティングを粒子周囲に添加することが挙げられる。このようなアプローチの多くは、ウイルス粒子を保護する能力、及び／又は、ウイルスの標的を標的自然組織（特に、肝臓）から除外させる能力について実証しているが、そのようなアプローチは、通常、ウイルスの進化した細胞進入経路を乱し、結果としてウイルスの腫瘍細胞に感染する能力を制限してしまう。ｐＨ感受性であるカチオン性ポリマーを使用すれば、この制限を緩和できるが、そのようなポリマーは毒性について大きな懸念がある。ウイルス粒子を修飾する技術には大きな需要があるが、これまでのところ臨床の場までは進んでいない。
【発明の概要】
【０００８】
一態様では、関心領域への生体内（in vivo）送達のためにウイルスを修飾する方法は、少なくとも１つの脂質を、少なくとも１つの親水性化合物と、前記関心領域内に存在する条件下にて開裂可能な結合を介して複合させることによって形成された脂質複合体を含んでいるエンベロープ組成物を形成するステップと、前記ウイルスを前記エンベロープ組成物と合わせて、それにより前記ウイルスを構造内に包囲するステップと、を含んでいる。前記エンベロープ組成物は、例えば、前記ウイルスを包囲／エンベロープする脂質二重層を形成していてもよい。
【０００９】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの脂質は、ｎ−ドコサン酸、アラキジン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、オレイン酸、ビタミンＥ、エンベリン、１−フェニル−２−パルミトイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール、又は、以下の式を有する化合物からなる群より選択される。
【化１】
2019509326.tif 000003
ここで、Ｒ1はファルネシル基、ゲラニル基又はゲラニルゲラニル基であり、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＨ又はＳｅであり、ＺはＣ−Ｒ2又はＮであり、Ｒ2はＨ、ＣＮ、ＣＯ2Ｒ7、ＳＯ3Ｒ7、ＣＯＮＲ7Ｒ8又はＳＯ2ＮＲ7Ｒ8であり、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立してＨ、アルキル基、アルケニル基、ＣＯ2Ｍ又はＳＯ3Ｍであり、Ｍはカチオンであり、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、独立してＨ、カルボキシル基、アルキル基、アルケニル基、アミノアルキル基、ニトロアルキル基、ニトロ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アジド基又はチオシアネート基、又は、それらの誘導体である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの脂質は、以下の式を有している。
【化２】
2019509326.tif 000004
前記少なくとも１つの脂質は、例えば、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸アミド（ＦＴＳ−アミド）、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸メチルアミド（ＦＴＳ−ＭＡ）及びＳ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸ジメチルアミド（ＦＴＳ−ＤＭＡ）からなる群より選択されてもよい。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの脂質は、ファルネシルチオサリチル酸又はファルネシルチオサリチル酸アミドである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、前記ウイルスの科は、ポックスウイルス科、デノボウイルス科、ヘルペスウイルス科、ピコルナウイルス科、ラブドウイルス科、パラミクソウイルス科、レトロウイルス科、トガウイルス科又はレオウイルス科からなる群より選択される。前記ウイルスは、例えば、ワクチニアウイルス、粘液腫ウイルス、鳥ポックスウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、コクサッキーウイルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、レオウイルス又はシンドビスウイルスからなる群より選択されてもよい。いくつかの実施形態では、前記ウイルスの科は、ポックスウイルス科である。前記ウイルスは、例えば、ワクチニアウイルスであってもよい。前記ウイルスは、例えば、成熟ワクチニアウイルスであってもよい。
【００１１】
いくつかの実施形態では、前記関心領域は、腫瘍を含んでおり、前記ウイルスは、前記腫瘍を治療するために修飾される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの親水性化合物は、少なくとも１つの親水性オリゴマー又は少なくとも１つの親水性ポリマーを含んでいる。前記少なくとも１つの親水性オリゴマー又は親水性ポリマーは、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類及びポリペプチドからなる群より選択されてもよい。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの親水性化合物は、ポリアルキレンオキシドである。前記ポリアルキレンオキシドは、例えば、ポリエチレングリコールであってもよい。ポリエチレングリコール又は他の親水性ポリマーは、例えば、少なくとも１ＫＤａの分子量を有していてもよい。
【００１３】
いくつかの実施形態では、前記結合は、ｐＨ感受性である。前記結合は、例えば、ヒドラジン基を含んでいてもよい。
【００１４】
前記エンベロープ組成物は、少なくとも１つの共脂質を含んでいてもよい。前記少なくとも１つの共脂質が、例えば、リン脂質であってもよい。該方法は、前記エンベロープ組成物内に添加剤を提供するステップをさらに含んでいてもよい。前記添加剤は、例えば、前記エンベロープ組成物の安定性を増加又は減少させてもよい。添加剤としては、例えば、コレステロールが含まれていてもよい。ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）は、膜融合性脂質であり、脂質の安定性を減少させてウイルスの放出を促進するために使用されてもよい。
【００１５】
別の態様では、製剤（例えば、関心領域への生体内送達のための製剤）は、ウイルスと、前記ウイルスを包囲しており、かつ、少なくとも１つの脂質を、少なくとも１つの親水性化合物と、前記関心領域内に存在する条件下にて開裂可能な結合を介して複合させることによって形成された脂質複合体を含んでいる、（上記のような）合成エンベロープ組成物とを含んでいる。上記のように、前記エンベロープ組成物は、前記ウイルスを包囲する脂質二重層を形成していてもよい。
【００１６】
別の態様では、ウイルスの関心領域への生体内送達の方法は、上記のような製剤を注射することを含んでいる。
【００１７】
別の態様では、関心領域への生体内送達のためにウイルスを修飾する方法は、以下の式を有する脂質を含むエンベロープ組成物を形成するステップと、前記ウイルスを前記エンベロープ組成物と合わせて、それにより前記ウイルスをエンベロープ構造内に包囲するステップとを含んでいる。
【化３】
2019509326.tif 000005
ここで、Ｒ1はファルネシル基、ゲラニル基又はゲラニルゲラニル基であり、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＨ又はＳｅであり、ＺはＣ−Ｒ2又はＮであり、Ｒ2はＨ、ＣＮ、ＣＯ2Ｒ7、ＳＯ3Ｒ7、ＣＯＮＲ7Ｒ8又はＳＯ2ＮＲ7Ｒ8であり、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立してＨ、アルキル基、アルケニル基、ＣＯ2Ｍ又はＳＯ3Ｍであり、Ｍはカチオンであり、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、独立してＨ、カルボキシル基、アルキル基、アルケニル基、アミノアルキル基、ニトロアルキル基、ニトロ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アジド基又はチオシアネート基、又は、それらの誘導体である。前記エンベロープ組成物は、脂質二重層を形成していてもよい。前記脂質は、例えば、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸アミド（ＦＴＳ−アミド）、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸メチルアミド（ＦＴＳ−ＭＡ）及びＳ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸ジメチルアミド（ＦＴＳ−ＤＭＡ）からなる群より選択されてもよい。
【００１８】
前記エンベロープ組成物は、脂質二重層を形成する。いくつかの実施形態では、前記脂質は、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸アミド（ＦＴＳ−アミド）、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸メチルアミド（ＦＴＳ−ＭＡ）及びＳ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸ジメチルアミド（ＦＴＳ−ＤＭＡ）からなる群より選択される。
【００１９】
前記エンベロープ組成物は、例えば、少なくとも１つの共脂質を含んでいてもよい。前記少なくとも１つの共脂質は、例えば、リン脂質であってもよい。該方法は、前記エンベロープ組成物内に添加剤を提供するステップをさらに含んでいてもよい。前記添加剤は、例えば、前記エンベロープ組成物の安定性を増加又は減少させてもよい。添加剤としては、例えば、コレステロールが含まれていてもよい。
【００２０】
さらなる態様では、製剤（例えば、関心領域への生体内送達のための製剤）の実施形態は、ウイルスと、前記ウイルスを包囲しており、かつ、以下の式を有する脂質を含んでいる、合成エンベロープ組成物とを含んでいる。
【化４】
2019509326.tif 000006
ここで、Ｒ1はファルネシル基、ゲラニル基又はゲラニルゲラニル基であり、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＨ又はＳｅであり、ＺはＣ−Ｒ2又はＮであり、Ｒ2はＨ、ＣＮ、ＣＯ2Ｒ7、ＳＯ3Ｒ7、ＣＯＮＲ7Ｒ8又はＳＯ2ＮＲ7Ｒ8であり、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立してＨ、アルキル基、アルケニル基、ＣＯ2Ｍ又はＳＯ3Ｍであり、Ｍはカチオンであり、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、独立してＨ、カルボキシル基、アルキル基、アルケニル基、アミノアルキル基、ニトロアルキル基、ニトロ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アジド基又はチオシアネート基、又は、それらの誘導体である。前記エンベロープ組成物は、さらに上記のような特徴を備えていてもよい。
【００２１】
またさらなる態様では、組成物は、少なくとも１つの脂質を、少なくとも１つの親水性化合物と、前記関心領域内に存在する条件下にて開裂可能なｐＨ感受性ヒドラジン結合を介して複合させることによって形成されている。前記エンベロープ組成物は、例えば、脂質二重層を形成していてもよい。前記少なくとも１つの脂質は、例えば、ｎ−ドコサン酸、アラキジン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、オレイン酸、ビタミンＥ、エンベリン、１−フェニル−２−パルミトイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール、又は、以下の式を有する化合物からなる群より選択されてもよい。
【化５】
2019509326.tif 000007
ここで、Ｒ1はファルネシル基、ゲラニル基又はゲラニルゲラニル基であり、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＨ又はＳｅであり、ＺはＣ−Ｒ2又はＮであり、Ｒ2はＨ、ＣＮ、ＣＯ2Ｒ7、ＳＯ3Ｒ7、ＣＯＮＲ7Ｒ8又はＳＯ2ＮＲ7Ｒ8であり、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立してＨ、アルキル基、アルケニル基、ＣＯ2Ｍ又はＳＯ3Ｍであり、Ｍはカチオンであり、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、独立してＨ、カルボキシル基、アルキル基、アルケニル基、アミノアルキル基、ニトロアルキル基、ニトロ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、メルカプト基、メルカプトアルキル基、アジド基又はチオシアネート基、又は、それらの誘導体である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの脂質は、以下の式を有している。
【化６】
2019509326.tif 000008
前記少なくとも１つの脂質は、例えば、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸アミド（ＦＴＳ−アミド）、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸メチルアミド（ＦＴＳ−ＭＡ）及びＳ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸ジメチルアミド（ＦＴＳ−ＤＭＡ）からなる群より選択されてもよい。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの脂質は、ファルネシルチオサリチル酸又はファルネシルチオサリチル酸アミド（又はその生理活性誘導体）である。
【００２２】
前記少なくとも１つの親水性化合物は、例えば、少なくとも１つの親水性オリゴマー又は少なくとも１つの親水性ポリマーを含んでいてもよい。前記少なくとも１つの親水性オリゴマー又は親水性ポリマーは、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類及びポリペプチドからなる群より選択されてもよい。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの親水性化合物は、ポリアルキレンオキシドである。前記ポリアルキレンオキシドは、例えば、ポリエチレングリコールであってもよい。ポリエチレングリコール又は他の親水性ポリマーは、例えば、少なくとも１ＫＤａの分子量を有していてもよい。いくつかの実施形態では、前記結合は、ｐＨ感受性である。
【００２３】
本明細書における合成脂質由来のリポソームエンベロープ又はそのエンベロープ組成物は、劇的に改善された治療可能性及び新規な特性を有するエンベロープウイルスを作成する。この合成エンベロープ化ウイルスは、エンベロープ化されていないウイルスよりもウイルスの感染力を保持している（いくつかの場合では、むしろ増加させる）。合成エンベロープ化ウイルスは、エンベロープ化されていないウイルスと比較して、生体内での標的組織（腫瘍）における絶対的感染（ウイルス遺伝子発現によって決定される）を増加させる可能性がある。
【００２４】
合成エンベロープウイルスを静脈内経路を介して腫瘍へと送達することは、細網内皮系（ＲＥＳ）によるその迅速なクリアランスの結果として、非効率的となり得る。しかしながら、この問題は、特定の環境条件下（低ｐＨ、ＲＥＤＯＸ電位、プロテアーゼの存在等）で開裂され得る結合を用いて、例えば不活性であり得る（ポリエチレングリコールのような）親水性化学構造体を脂質エンベロープに共有結合させることによって解決され得る。本明細書で使用される場合、用語「不活性」は、意図された遮蔽効果以外の顕著な生物学的効果を有さない親水性化学構造（例えば、ポリマー）のことを称する。このようにして、ウイルスベクターは、循環中にてさらに標的除外化及び保護され得る。合成エンベロープ化ウイルスの親水性外殻からの放出は、標的微小環境（例えば、腫瘍中に典型的に見られる低ｐＨ、炎症中に見られる酸化ストレスの増加など）に対して条件付けされ得る。ウイルスを所定の細胞タイプに対して標的化するために、他の標的因子がこの合成物に添加されてもよい。
【００２５】
本明細書の合成エンベロープ化ウイルスは、外側エンベロープを保持するために特異的なタンパク質−タンパク質相互作用又は共有結合を必要としない。その結果、合成エンベロープは安定であるが、感染段階の間に脱離される能力を保持する。これは、例えば、ＥＶ型を形成するためにＭＶウイルスに添加される天然の脂質エンベロープとは対照的である。この場合、外膜は特異的なタンパク質相互作用を必要とし、依然として非常に不安定である。その点において、ＥＶ型のワクチニアを精製して貯蔵することは、外側エンベロープが不安定過ぎるため、従来では不可能であった。本明細書の合成エンベロープを使用すれば、組成物を少なくともある程度の期間（凍結／解凍等）において貯蔵できる。最適化されていない研究において、組成物を１回の凍結／解凍サイクルにより少なくとも１ヶ月間貯蔵できることが示されている。
【００２６】
本発明のデバイス、システム、方法及び組成物は、その特質及び付随する利点と共に、以下の詳細な説明を添付の図面と併せて考慮することによって最もよく認識及び理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】図１Ａは、ウイルスをエンベロープ化する代表的な実施形態における形成の理想化された概略図を示す。該エンベロープは、脂質二重層である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本明細書のエンベロープにおいて使用される開裂可能な基の代表例を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本明細書のエンベロープにおいて使用される脂質の代表例を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ナイーブマウス又は免疫化マウスにおける静脈内送達後のウイルス遺伝子発現及び抗腫瘍効果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、免疫化させ（野生型ワクチニア株ＷＲの１ｅ６プラーク形成単位又はＰＦＵをＩＰ注射）又は免疫化させず、２８日後、皮下に４Ｔ１腫瘍を移植した。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ナイーブマウス又は免疫化マウスにおける腫瘍内送達後のウイルス遺伝子発現及び抗腫瘍効果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、免疫化させ（野生型ワクチニアWestern Reserve株又はＷＲの１ｅ６ ＰＦＵを腹腔内又はＩＰ注射）又は免疫化させず、２８日後、皮下に４Ｔ１腫瘍を移植した。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ナイーブマウス又は免疫化マウスにおける腫瘍体積を静脈内送達後の時間の関数として示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ナイーブマウス又は免疫化マウスにおける腫瘍体積を腫瘍内送達後の時間の関数として示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ウイルスカプセル化が確認される電子顕微鏡写真を示す。ウイルス（ＷＲ．ＴＫ−Ｌｕｃ＋）は、ＰＥＧ−ＦＴＳ−Ｈ、ｐＨ感受性脂質を含む脂質層によりエンベロープ化され、カプセル化は、電子顕微鏡（ＥＭ）及びゼータサイザーにより確認された。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｐＨ感受性ではない脂質によるウイルスカプセル化が確認される別の電子顕微鏡写真を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、エンベロープ前のウイルスの強度に対するサイズ分布のグラフを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＰＥＧ−ＦＴＳ−Ｈ脂質を含む脂質層によりエンベロープ化ウイルス（ＷＲ．ＴＫ−Ｌｕｃ＋）の強度によるサイズ分布のグラフを示す。
【図３】図３は、種々のコーティング製剤の生体外（in vitro）での比較を示す。ウイルス（ＷＲ．ＴＫ−Ｌｕｃ＋）は、脂質層を含むＰＥＧ−ＦＴＳ又はＤＳＰＥ−ＰＥＧのいずれかによりエンベロープ化されているか、コーティングされていないままである。
【図４Ａ】図４Ａは、裸のウイルス及びエンベロープ化ウイルスの生体内送達を示す。胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスには、ＨＣＴ１１６腫瘍を移植し、触知可能となってから、高用量ワクチニア免疫グロブリン又はＶＩＧを、裸の又はエンベロープ化されたＷＲ．ＴＫ−Ｌｕｃ＋（１ｅ８ ＰＦＵ／マウス、ｎ＝４／群）をＩＶ送達する２４時間前に、ＩＰ注射により送達した。２４時間後に、ウイルス遺伝子発現を生物発光として測定した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、裸のウイルス及びエンベロープ化ウイルスの生体内送達について、ウイルス発現を生物発光として示す。
【図５Ａ】図５Ａは、完全免疫化マウスにおける、腫瘍成長の２４時間後に生物発光として測定されたウイルス遺伝子発現を示す。Ｃ５７／ＢＬ６マウスは、ＭＣ３８腫瘍細胞を移植する２８日前に免疫化されており（又は免疫されておらず）、腫瘍が触知可能になってから、上記と同様の裸の又はエンベロープ化されたＷＲ．ＴＫ−Ｌｕｃ＋をＩＶ注射することよりマウスを処置した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａの研究において（キャリパー測定による）腫瘍体積によって経時的に測定された抗腫瘍効果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、腫瘍保有マウスにおける（キャリパー測定による）腫瘍体積に対する反復送達の効果を示す。マウス（皮下Renca腫瘍を保有するＢＡＬＢ／ｃ）を、ＩＶ用量のＷＲ．ＴＫ−．ＧＦＰ＋により処置し、その後、各処置間における３日間、ＷＲ．ＴＫ−Ｌｕｃ＋で処置した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、腫瘍保有マウスにおける（キャリパー測定による）腫瘍体積に対する反復送達の効果を示す。マウス（皮下Renca腫瘍を保有するＢＡＬＢ／ｃ）を、ＩＶ用量のＷＲ．ＴＫ−．ＧＦＰ＋により処置し、その後、各処置間における１７日間、ＷＲ．ＴＫ−Ｌｕｃ＋で処置した。
【図７】図７は、本明細書のエンベロープ化されていないウイルスと比較した、本明細書の方法でエンベロープ又はカプセル化されたいくつかの型のウイルスにおける感染率のパーセントを示す。
【図８】図８は、本明細書のいくつかのｐＨ感受性複合体の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本願の図面中に全体的に記載及び図示されるような実施形態の構成要素は、記載される代表的な実施形態に加えて、広く様々な異なる構成で配置及び設計されてもよいことが容易に理解されるであろう。したがって、以下に示す代表的な実施形態についてのより詳細な説明は、図面中に図示されるように、実施形態の範囲を特許請求の範囲に記載されるように限定することを意図したものではなく、代表的な実施形態の単なる例示である。
【００２９】
本明細書を通じての「一実施形態」又は「実施形態」（あるいは同様のもの）に対する参照は、その実施形態に関して記載される特定の特徴、構造又は特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じて「一実施形態では」又は「実施形態で」あるいは同等の語句が様々な箇所に現れたとしても、それらが必ずしも全て同じ実施形態を示すとは限らない。
【００３０】
さらに、記載された特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法にて組み合わせることができる。以下の説明では、実施形態が完全に理解されるように、多くの特定の詳細が提供される。しかしながら、当業者であれば、１つ以上の特定の詳細を用いることなく、又は他の方法、構成要素、材料等を用いて、様々な実施形態が実施可能であることを認識するであろう。他の例では、公知の構造、材料又は動作については、理解の妨げにならないように示されていないか、詳細には記載されない。
【００３１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形“a""an"及び"the"は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数に対する言及を含む。したがって、例えば、「ウイルス（an virus）」に対する言及には、複数のそのようなウイルス及びその当業者に既知の均等物等が含まれ、「該ウイルス（the virus）」に対する言及は、１つ又は複数のそのようなウイルス及びその当業者に既知の均等物等である。本明細書における値の範囲についての詳述は、範囲内に含まれる個々の値を個別に参照する簡略な方法として用いられることを単に意図したものである。本明細書中にて他に示されない限り、個々の値及び中間の範囲は、本明細書中で個別に記載されているかのように明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に示されない限り、又は、文中において明らかに逆のことが他に示されていない限り、任意の適切な順序で実施され得る。
【００３２】
用語「ウイルス」、「ビリオン」及び「ウイルス粒子」は、本明細書では交換可能に使用される。多くの場合、用語「ウイルス」が総括して使用される。ウイルスは、宿主細胞の外側で増殖又は複製することができない超顕微鏡的な感染性因子である。ウイルスは、カプシドとして知られる保護タンパク質コート内に、遺伝物質（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含んでいる。カプシドの形状は、単純な螺旋形及び楕円形（多面体又は略球状）の形態から、テール又はエンベロープを備えたより複雑な構造まで様々である。本明細書のシステム、方法及び組成物において使用されるウイルスは、天然のウイルス又は設計／修飾されたウイルスであり得る。
【００３３】
本明細書にて使用される用語「ポリマー」は、複数の小分子又はモノマーからなり、これらの小分子又はモノマーが繰り返し構造によって配置されてより大きな分子を形成している化学化合物のことを称する。ポリマーは天然に存在してもよく、合成により形成されてもよい。用語「ポリマー」の使用には、ホモポリマー及びコポリマーが包含される。用語「コポリマー」は、本明細書では、２つ以上の異なるモノマーを有する任意のポリマーを含むものとして使用される。コポリマーには、例えば、交互共重合体、周期的共重合体、統計的共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体等が含まれ得る。ポリマーの例としては、例えば、ポリアルキレンオキシドが挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「脂質」は、例えば、脂肪、脂肪酸、ワックス、ステロール、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫなど）、モノグリセリド類、ジグリセリド類、トリグリセリド類、リン脂質類を含んでいる分子群のことを称する。脂質は、非極性有機溶媒への溶解性及び水中での一般的な不溶性に関係している。リン脂質は、例えば、全ての細胞膜の主成分を形成する部類の脂質である。リン脂質は、それらの両親媒性の特徴の結果として、脂質二重層を形成し得る。リン脂質分子は、例えば、グリセロール分子によって共に結合された２つの疎水性脂肪酸「テール」と親水性の「ヘッド」とを含み得る。
【００３５】
脂質エンベロープ又はポリマーコーティングを用いて腫瘍崩壊性ウイルスを保護することへの取り組みは、ウイルスベクターを肝臓のような通常の組織から標的解除させることに成功し得ると共に、抗ウイルス免疫をある程度まで回避することにも成功し得る。しかしながら、この利点は、従来では、腫瘍のウイルス感染保持性の著しい損失（典型的には、ウイルスの約５％の回収率）と引き換えに得られるものである。カチオン性ポリマーは、他のカプセル化材料よりも優れたウイルス感染性を示し得るものの、カチオン性ポリマーには毒性の問題が見られる。本明細書のウイルスをカプセル化する戦略は、既存の方法論に関連する多くの制限を克服し、既存の抗ウイルス免疫に直面したとしても、ウイルスを腫瘍標的へと送達する強力な手段を提供し得る。本明細書のウイルスをカプセル化するシステム、方法及び組成物は、腫瘍溶解性ウイルスの代表的な例と結び付けて検討される。しかしながら、当業者は、そのようなウイルスをカプセル化するシステム、方法及び組成物が、任意のウイルス療法に適用可能であることを認識するであろう。
【００３６】
上記のように、本明細書におけるウイルスをカプセル化する戦略は、既存の方法論に関連する多くの制限を克服し、既存の抗ウイルス免疫に直面したとしても、ウイルスを腫瘍標的に送達する強力な機構を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス、ビリオン又はウイルス粒子（総括して、ウイルス）は、疎水性／脂質ドメインと、該疎水性／脂質ドメインに結合した親水性ドメインとを含む組成物から形成された合成エンベロープ内に、エンベロープ又はカプセル化される。親水性ドメインは、例えば、目的の標的領域又は関心領域（すなわち、治療の対象領域）に存在する生理学的条件下にて、疎水性／脂質ドメインから分離可能であってもよい。身体全体に分散している複数の関心領域が存在していてもよい（例えば、播種した癌性腫瘍の場合）。いくつかの実施形態では、合成エンベロープ化ウイルスは、該ウイルスの天然起源かつ感染性のエンベロープ化ウイルス形態の合成バージョンである。そのような実施形態では、標的細胞の感染は、例えば、最適化され得る。
【００３７】
本明細書の合成エンベロープは、例えば、親水性ドメイン（例えば、親水性ポリマードメイン。親水性ポリマードメインとしては、例えば、ポリエチレングリコールのようなポリエチレンオキシドが挙げられる）に、関心領域内に存在する生理学的条件下にて不安定又は開裂可能なリンカーを介して結合又は複合している疎水性／脂質ドメインを含む合成脂質複合体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、ｐＨ感受性リンカーである。そのような修飾されたウイルスは、血液中にて安定であって抗ウイルス抗体を回避可能であり、そのため、例えば酸性腫瘍環境への全身送達が可能となる。腫瘍内において、親水性ドメインがｐＨ感受性リンカーの切断によって脱グラフト化（de-grafted）されると、合成ウイルスエンベロープが不安定化され、感染性の合成エンベロープ化ウイルスが放出されるようになる。本明細書のいくつかの代表的な研究において、そのような合成エンベロープ化ウイルスは、既存の抗ウイルス免疫に直面したとしても、すなわち反復全身送達の間であっても、マウスモデルにおける全身送達及び治療効果が強化されたことを示した。
【００３８】
図１Ａは、ウイルスを包囲する本明細書の合成脂質エンベロープの代表的な実施形態の理想化された概略図を示す。図示の実施形態では、エンベロープは、閉じた脂質二重層を形成する。二重層は、水溶液中における脂質の好ましい構造である。本明細書のいくつかの実施形態では、本明細書の合成脂質複合体は、合成エンベロープを形成するにあたり、１つ以上の共脂質と合わせられる。（１つ以上の）脂質は、例えば、エンベロープ／二重層における主要な脂質成分を形成する。いくつかの実施形態において、リン脂質の形態である共脂質は、エンベロープ／脂質二重層の主要成分である。合成脂質複合体の量を増加させることは、血液成分との相互作用及び循環からの迅速なクリアランスを減少させるのに役立つ。しかしながら、そのような脂質複合体が多く取り込まれ過ぎていると、脂質二重層の安定性が損なわれる可能性がある。本明細書のいくつかの実施形態では、２０モル％以下の親水性化合物−脂質複合体が組み込まれる。親水性化合物−脂質複合体は、例えば、５〜２０モル％の範囲で存在していてもよい。共脂質は、例えば、４０〜９５モル％の範囲で存在していてもよい。ＤＯＰＥ又はコレステロールのような添加剤は、例えば、０〜４０又は１０〜４０モル％の範囲で存在していてもよい。本明細書中の共脂質には、種々のリン脂質が使用可能である。そのようなリン脂質としては、以下に限定されないが、天然及び合成ホスファチジルコリン又はＰＣ（例えば、Ｌ−α−ホスファチジルコリン）、ホスファチジルエタノールアミン又はＰＥ（例えば、Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン）及びホスファチジルイノシトール又はＰＩ（例えば、Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール）が挙げられる。天然ホスファチジルコリンとしては、例えば、卵ＰＣ、心臓ＰＣ、大豆ＰＣ、脳ＰＣ及び肝臓ＰＣが挙げられる。合成ホスファチジルコリンとしては、例えば、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）が挙げられる。天然ホスファチジルエタノールアミンとしては、例えば、卵ＰＥ、心臓ＰＥ、大豆ＰＥ、脳ＰＥ、肝臓ＰＥが挙げられる。合成ホスファチジルエタノールアミンとしては、例えば、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が挙げられる。天然のホスファチジルイノシトールとしては、例えば、肝臓ＰＩ、大豆ＰＩ、脳ＰＩが挙げられる。合成ホスファチジルイノシトールとしては、例えば、１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオ−イノシトール）ＤＰＰＩ、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオ−イノシトール）ＤＯＰＩ、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオ−イノシトール）（ＤＳＰＩ）が挙げられる。エンベロープを有するウイルスの効率は、例えば、特定のエンベロープ、ウイルス及び／又は用途について、エンベロープ／二重層の脂質組成を容易に最適化することによってさらに調整される。
【００３９】
本明細書の合成エンベロープは、例えば、図１Ａの添加剤として広く参照される１つ以上のさらなる置換基を含んでいてもよい。そのような添加剤は、例えば、合成エンベロープの安定性を調節するように機能してもよい。例えば、コレステロールは、脂質二重層の安定化を補助し得る。他方、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、膜融合性脂質である。ＤＯＰＥを含有させることにより、脂質の安定性を低下させて、後の細胞内送達においてエンドソームからのウイルスの放出を促進し得る。本明細書の組成物又は製剤の特性を調節又は調整するために、種々の他の添加剤が同様に使用されてもよい。
【００４０】
種々の添加剤の固有性及び濃度もまた、特定のエンベロープ、ウイルス及び／又は用途のために、既知の活動及び／又は定型的な実験によって最適化される対象となる。例えば、コレステロールのような安定化成分の場合、安定な脂質二重層が望ましいように思われるが、過度に安定な二重層は、後の細胞内移行におけるウイルスのコーティング除去に悪影響を及ぼすことがある。
【００４１】
上記のように、合成脂質エンベロープ（本明細書の合成脂質複合体を含む）は、ウイルスの血清タンパク質との非特異的な相互作用を防止することを補助する。このことは、血液中における循環時間の延長と、腫瘍への効果的なターゲティングとにとって重要である。さらに、本明細書の合成脂質複合体中における不安定又は開裂可能なリンカーによって、合成エンベロープの脱離を制御することが提供される。
【００４２】
いくつかの研究では、代表的なワクチニアウイルスは、本明細書の合成エンベロープによりカプセル化又はエンベロープ化された。ワクチニアウイルスは、複数の臨床ベクターの骨格であり得るものであり、種々異なる感染形態にて存在することができ、ウイルスコアを覆う脂質エンベロープの数によって区別される。これらの形態には、最も基本的な感染形態（細胞内成熟ウイルス、ＩＭＶ又は成熟ウイルスＭＶ）と、追加の宿主細胞由来脂質エンベロープ（エンベロープウイルス、ＥＶ）を有するＩＭＶのバージョンとが含まれる。人工又は合成の疎水性／脂質エンベロープをＩＭＶ形態のウイルスに適用することにより、複数の細胞進入経路を自然に進化させたＥＶ型の合成バージョン又は模倣体が作成される。いくつかの人工的にエンベロープ化又はコーティングされたウイルスとは異なり、合成ＥＶは、腫瘍細胞に感染するより強靭な能力を保持し得る。いくつかの代表的な実施形態では、親水性ドメインを疎水性／脂質エンベロープへと付着させるためのｐＨ感受性リンカーの使用は、循環中にウイルス粒子を保護するように作用するが、酸性腫瘍環境に入ると、又は、エンドソーム経路への進入後において、ウイルス粒子を包囲するエンベロープから切断される。酸性腫瘍環境以外の標的領域又は関心領域の場合には、この開裂可能な結合は、関心領域内に存在する他の微小環境（例えば、還元／酸化電位、低酸素及びマトリクスメタロプロテイナーゼ−９）に対して応答性又は感受性であり得る（代表的な例については、図１Ｃを参照）。天然に存在するウイルス形態の合成的な模倣と、高度な脂質技術の取り込みとを組み合せることは、本明細書の多くの実施形態に存在する。しかしながら、本明細書のシステム、方法及び組成物は、ウイルス療法に広く適用可能であり、天然に存在するエンベロープ化ウイルス形態を模倣することは必須でない。
【００４３】
上記のように、本明細書のいくつかの実施形態におけるワクチニア骨格の取り込みによって、合成脂質エンベロープをウイルスの形態（ＩＭＶ）に加え、その結果、ウイルスの合成バージョン又は天然の進化した形態（ＥＶ）の模倣体を生成することが可能となる。このようにして、天然に存在するウイルスの合成バージョンが形成され、ウイルスの天然の細胞進入経路は乱されない。実際に、「標準」脂質エンベロープ（すなわち、本明細書の合成脂質複合体を含まない脂質エンベロープ）を使用する場合であっても、ワクチニアウイルスの回収率は、従来のモデルにおいて報告されたものより１０倍良好である。
【００４４】
本明細書の合成脂質複合体の親水性ドメインを形成するに際し使用される親水性化合物は、例えば、少なくとも１つの親水性オリゴマー又は少なくとも１つの親水性ポリマーを含んでいてもよい。親水性オリゴマー又は親水性ポリマーは、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類及びポリペプチドからなる群より選択されてもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの親水性化合物は、ポリアルキレンオキシドである。本明細書のいくつかの代表的な実施形態では、ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、親水性化合物（例えば、ＰＥＧ）は、少なくとも１ＫＤａ（例えば、およそ１ＫＤａ〜１０ＫＤａの範囲内）の分子量を有する。いくつかの実施形態では、親水性ドメインは、およそ１ＫＤａ〜５ＫＤａの範囲の分子量を有する。本明細書の合成脂質複合体の（１つ以上の）親水性ドメインは、例えば、単一の又は複数の鎖を含んでいる。
【００４５】
本明細書の合成脂質複合体の疎水性ドメインには、多くの異なる疎水性化合物が使用され得る。そのような疎水性化合物の代表例は、図１Ｂにて提供される。本明細書の合成脂質複合体の疎水性ドメインは、例えば、単一又は複数の鎖を含んでいる。
【００４６】
いくつかの代表的な実施形態では、エンベロープを作成するために使用される合成脂質複合体組成物は、ｐＨ感受性かつ調整可能なヒドラジンリンカーによってＰＥＧに複合された、ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ）又はファルネシルチオサリチル酸誘導体を含んでいた。このような材料を使用することにより、いくつかの利点が提供される。ＦＴＳ又はＦＴＳ誘導体は、例えば、ファルネシルチオサリチル酸の生理活性誘導体であってもよい。そのようなものとしては、例えば、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸アミド、Ｓ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸メチルアミド（ＦＴＳ−ＭＡ）又はＳ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸ジメチルアミド（ＦＴＳ−ＤＭＡ）が挙げられる。他の生理活性ファルネシルチオサリチル酸誘導体もまた、本明細書での使用に適している。これに関し、ＦＴＳ自体は（ｒａｓ阻害剤としての）抗腫瘍活性を有しており、この抗腫瘍活性は、ウイルスのペイロード（payload）によって導入される異なるメカニズムの抗腫瘍活性と組み合わせられ得る。さらに、ｐＨ変化に応答して起こるＰＥＧ−ＦＴＳ−Ｈの開裂は、例えば、種々の長さの炭素鎖又はヒドラゾンリンカーに近い適切な電子吸引基／供与基を選択することによって、容易に微調整され得る。この方法により、エンベロープ化ウイルスを腫瘍組織へと送達した後における、ＰＥＧの脱グラフト率の制御が提供される。
【００４７】
以下に示されるＳ−trans,trans−ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ）は、強力かつとりわけ非毒性のRasアンタゴニストとして作用する合成ファルネシルシステイン模倣体である。
【化７】
2019509326.tif 000009
発癌遺伝子のＲａｓファミリーの突然変異によって生じる恒常的活性型Ｒａｓは、ヒトの癌の３分の１に存在しており、甲状腺癌（９０％）及び結腸癌（５０％）では、検出されるＲａｓの突然変異活性化の発生率が最も高い。Ｒａｓはまた、癌細胞内で他のメカニズムによっても活性化される。特に、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ活性の過活性化は、Ｒａｓ及びＲａｓ媒介シグナル伝達の持続的活性化を引き起こす。活性化形態のＲａｓは、下流のエフェクターを恒常的に活性化させ、細胞の形質転換に寄与する。ＦＴＳは、発癌活性化されたＲａｓ及び成長因子受容体に媒介されるＲａｓ活性化の両方を阻害し、その結果、Ｒａｓに依存する腫瘍成長が阻害される。ＦＴＳは、Ｒａｓの形質転換活性を阻害して、Ｒａｓ形質転換線維芽細胞の形質転換表現型を逆転させることができる。ＦＴＳは、多様な確立された癌モデルにおけるＲａｓレベルの有意な低下と、かつ、動物における有害な毒性のない腫瘍成長の阻害とを実証している。主要な機構の１つは、Ｒａｓエスコートタンパク質へと結合するため、その分解を促進するため及びそれによりＲａｓタンパク質の原形質膜中でのシグナル伝達を妨害するために、Ｒａｓと競合することによってＲａｓの膜相互作用に影響を及ぼすことを伴う。その抗腫瘍活性に加えて、ＦＴＳはまた、抗炎症活性を示す。ＦＴＳ、又は、例えば以下の式を有するＦＴＳ誘導体の複合体は、ウイルス療法とは独立かつ相乗的な抗腫瘍またはＲａｓアンタゴニスト活性を提供し得る。
【化８】
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ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｘ及びＺは、上記の１つ以上の親水性化合物（例えば、親水性オリゴマー又はポリエチレングリコール又はＰＥＧなどのポリマー）について規定されたものである。
【００４８】
本明細書のいくつかの代表的な実施形態において、ｐＨ感受性組成物は、親水性ＰＥＧセグメントを、開裂可能なヒドラジンリンカーを備えた１つ以上の疎水性ＦＴＳ−ヒドラジド又はＦＴＳ−Ｈセグメントと複合させることによって形成された。脂質エンベロープ上に代表的なＰＥＧ−（ＦＴＳ−Ｈ）2（ｐＨ感受性ＰＥＧリンカー）を使用することによって、組織培養において感染性ワクチニアウイルスの１００％回収率が得られた。この回収率は、他のカプセル化技術では従来達成されていなかったものである。このエンベロープはまた、中和抗体に対する保護についても提供し、エンベロープが活性でウイルスを期待通りに保護するように機能することが裏付けられる。
【００４９】
さらに、マウス腫瘍モデルにおける生体内適用は、本明細書のエンベロープ化ワクチニアウイルスの使用によって、（ナイーブマウスにおける裸のウイルスと比較して）非腫瘍組織におけるウイルス取り込みが減少しただけでなく、腫瘍への送達が実際に改善／増加したことを示した。カプセル化技術が実際に腫瘍への送達を向上したことに本発明者が気づいたのは、今回が初めてである。
【００５０】
抗ウイルス免疫に直面している場合において、活性ウイルスを腫瘍又は他の関心領域へと送達することは、ウイルスベクターがエンベロープ化されていた際にのみ可能である。本明細書のいくつかの実施形態では、完全に免疫化されたマウスにおいて全身に送達されたエンベロープウイルスは、ナイーブ（非免疫化）マウスにおいて送達された裸のウイルスと比較して、実際に腫瘍からのウイルス遺伝子発現の増加を示した。このことは、従来報告されたアプローチの劇的な改善である。
【００５１】
本明細書のエンベロープ化ウイルスの改善された送達もまた、いくつかの方法において強化された治療活性に現れた。この点に関し、エンベロープ化ウイルスは、ナイーブ動物で全身に送達された際には、裸のウイルスと比較して強化された治療効果を示した。実際に、完全に免疫化されたマウスにおいてエンベロープ化ウイルスが全身に送達された際に達成される治療効果は、免疫化されていないナイーブのマウスにおける裸のウイルスよりもまだ良好であった（これに対し、免疫化されたマウスにおける裸のウイルスは、治療効果を示さなかった）。さらに、ナイーブの腫瘍保有動物において反復治療サイクルを適用した際に、サイクルを追加した場合、裸のウイルスでは追加の治療利益はなかったが、エンベロープ化ウイルスが使用された場合にはさらなる有意な利益が得られた。このようなデータは、本明細書のシステム、方法及び組成物が、他の報告されているアプローチを超える有意な進歩を提供することを示している。
【００５２】
いくつかの代表的な実験では、裸のウイルスの送達能力（腫瘍内におけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現によって決定される）と、種々異なる経路を介した送達の後の、既存の免疫がある又はない場合における治療成績とが調査された。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、免疫化させ（野生型ワクチニア株ＷＲの１ｅ６ ＰＦＵをＩＰ注射）又は免疫化させず、２８日後、皮下に４Ｔ１腫瘍を移植した。大きな腫瘍（すなわち、約３００〜４００ｍｍ3の体積を有する腫瘍）が形成され次第、マウスを、モデル腫瘍溶解性ワクチニア株（チミジンキナーゼ、ＴＫ遺伝子に欠失があり、レポーターとしてルシフェラーゼを発現する、株ＷＲの１ｅ８ ＰＦＵ。現在臨床試験中の３つ全てのワクチニア株は、ＴＫ遺伝子の欠失を含んでいる）の静脈内注射（尾静脈）又は腫瘍内注射のいずれかにより処置した。その後の腫瘍体積及び腫瘍内からのウイルス遺伝子発現は、図１Ｄ〜１Ｇに示されるようにして追跡した。
【００５３】
ナイーブマウスについては、静脈内又は腫瘍内の送達の間に抗腫瘍効果における有意差はなかった。ウイルス遺伝子発現は静脈内送達後わずかに低下したが、これは有意ではなかった（ｐ＝０．１）。過去に免疫化されたマウスでは、静脈内送達は、腫瘍内におけるウイルス遺伝子発現をほとんど生じなかった（生物発光のバックグラウンドレベルは、１ｅ４ ｐｈ／ｓｅｃ／腫瘍にて決定された）。当然ながら、このことは、治療利益とは相関がなかった。過去に免疫化されたマウスにおける腫瘍内送達は、腫瘍から検出可能なウイルス遺伝子発現を生じたが、それでもこれはナイーブマウスのウイルス遺伝子発現よりも５０倍を超えて少なかった。どのような機構にも限らず、その減少は、主に抗ウイルスＴ細胞に基づく免疫の結果であり得る。イメージングが送達の２４時間後かつ子孫ウイルスが広がる前に行われる際、感染した腫瘍細胞を標的とした。ウイルス遺伝子発現が有意に減少しているにもかかわらず、実際には治療効果が有意に増加している。治療効果の増加は、例えば、ＯＶ治療の免疫療法効果によって媒介され得る（腫瘍溶解効果が低下するため）。これらの結果は、最も効果的なＯＶ療法が主に免疫療法として機能するという仮説を補強するが、免疫化される前の患者の腫瘍へ効果的なＯＶ送達を行うことの潜在的重要性を強調するものでもある。
【００５４】
脂質−アルキレンオキシド複合体のような脂質−親水性ポリマー複合体又は組成物は、小分子化学療法を腫瘍標的へと送達するための担体としてのミセルを形成するのに使用されてもよい。還元感受性（例えば、ジスルフィド）結合のような追加の不安定な結合を、５ｋＤａ ＰＥＧと２つのファルネシルチオサリチル酸基（ＰＥＧ５ｋ−ＦＴＳ２）との複合体のような脂質−親水性ポリマー複合体へと導入することによって、腫瘍細胞成長抑制効果が増加し、例えば、生体外及び生体内におけるパクリタキセル（ＰＴＸ）の腫瘍細胞への送達におけるその性能がさらに改善された。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３０６０３４号及び第２０１５／０２３１２７１号を参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。これらの合成技術は、本明細書の脂質−親水性複合体の合成における使用に適合されてもよい。
【００５５】
上記のように、本明細書のいくつかの代表的な実施形態において、親水性ＰＥＧセグメントを、ｐＨ感受性組成物は、ヒドラジンリンカーのような開裂可能なリンカーを備えた１つ以上の疎水性ＦＴＳ−Ｈセグメントへと複合させることによって形成された。繰り返しになるが、ヒドラジンリンカーの安定性は、種々異なる炭素鎖長又はヒドラジンリンカー周りの適切な電子吸引基／供与基を選択することによって、容易に調節され得る。それによって、例えば腫瘍微小環境に見られる酸性ｐＨに曝された際に開裂されるリンカーを開発することが可能となる。
【００５６】
代表的な方法では、ＤＭＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ５Ｋ−ＦＴＳ−Ｈ２を２：１：０．１の比で含有する脂質膜を、成熟ウイルス（ＭＶ型の腫瘍溶解性ワクチニアＷＲ．ＴＫ−．Ｌｕｃ＋）とＰＢＳバッファ中で混合し、超音波処理して脂質エンベロープ化ウイルス粒子を作成した。このウイルス調製法により９８％超のＭＶを含有するウイルスが生成され、該ウイルスは（エンベロープ化ウイルス、すなわち追加の脂質エンベロープを持つＥＶ型とは対照的に）単一の外側エンベロープを含有している。合成エンベロープ化ＭＶをＥＭによって検査して、ウイルス粒子の１００％近くがエンベロープ化され、ウイルス粒子が（塊又は二重のものがない）単一粒子としてエンベロープ化されたことを確認した（図２Ａ及び２Ｂ参照）。加えて、電子顕微鏡法を用いて、エンベロープの完全性を確認した。図２Ｃ及び２Ｄは、エンベロープ前のウイルス及びＰＥＧ−ＦＴＳ−Ｈ脂質を含む脂質層でエンベロープ化ウイルス（ＷＲ．ＴＫ−Ｌｕｃ＋）についての強度によるサイズ分布をそれぞれ示す。
【００５７】
いくつかの初期の生体外実験では、ＭＶワクチニアウイルスを、エンベロープを含有するＰＥＧ５Ｋ−ＦＴＳ−Ｈ２により再度カプセル化した。これらの実験結果を、裸のウイルス及びより標準的な脂質カプセル化技術（すなわち、本明細書の合成脂質複合体を含み、それにより開裂可能な親水性ドメインを含まないもの以外の脂質カプセル化技術）のＤＭＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋの２：１：０．１Ｍの比と比較した。これにより、ＭＶ型のワクチニアをカプセル化すること及びそのｐＨ感受性エンベロープカプセル化を使用することの利点を調査することができた。
【００５８】
裸のウイルス、ＰＥＧ−ＦＴＳ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧエンベロープ化ウイルスは、フレッシュな細胞層（ＨｅＬａ細胞）に添加する前に、高用量のＶＩＧ（ワクチニア免疫グロブリン）又はＰＢＳと３０分間混合した。ＰＥＧ−ＦＴＳエンベロープ化ウイルス群は、細胞層に添加する前に、中性又はそれより低いｐＨにてさらに処理した。
【００５９】
図３は、異なるコーティング製剤の生体外（in vitro）での比較を示す。ウイルス（ＷＲ．ＴＫ−Ｌｕｃ＋）は、脂質層を含むＰＥＧ−ＦＴＳ又はＤＳＰＥ−ＰＥＧのいずれかによりエンベロープ化されているか、コーティングされていないままである。次に、ウイルスを高用量ＶＩＧと３０分間混合するか、抗体を加えずに放置した。続いて、ＰＥＧ−ＦＴＳエンベロープウイルスにＨＣｌを追加して、ｐＨを低下させた。その後、ウイルスをＨｅＬａ細胞層に添加して、感染させるために２４時間放置し、遺伝子発現を起こさせた後、生物発光を読み取った。図３より、ＤＳＰＥ−ＰＥＧエンベロープ（ＶＩＧなし）を使用することにより、裸のウイルスと比較して約５０％の回収率が得られることが判明した。この結果は、他のウイルス骨格を用いた類似の報告された技術（１〜５％の回復が典型的である）を超える顕著な改善である。そのような結果は、ＭＶ形態のワクチニアをカプセル化し、それによりＥＶの合成バージョンを作成して、天然のウイルス感染経路を保持することの利点の証拠であり得る。
【００６０】
しかしながら、ＰＥＧ−ＦＴＳをウイルスエンベロープとして組み込んだ際には、裸のウイルスと比較して（低ｐＨに曝露してＰＥＧを脱グラフト化した後に）１００％の回収率が達成された。そのため、カプセル化のためのワクチニアＭＶ形態を、ｐＨ感受性ＰＥＧ脱グラフト化技術と組み合わせた結果、ウイルスが完全に回収されたことは明らかである。ＶＩＧへと曝露したことによって、裸のウイルスは完全に中和されたが、ＰＥＧ−ＦＴＳでコーティングされたウイルスは保護されており、約５０％の感染性ウイルスが回収された。この結果は、粒子（＋ＶＩＧ）が感染工程のために細胞層上へと積層する前に、（ｐＨの低下による）ＰＥＧの脱グラフト化が起こった場合であっても得られた。
【００６１】
続く一連の代表的な実験では、裸の又はＰＥＧ−ＦＴＳエンベロープ化ウイルスを、皮下にＨＣＴ１１６腫瘍を保有する無胸腺ヌードマウスへと静脈内送達した（尾静脈、１ｅ８ｐｆｕ／マウス、ｎ＝４。図４Ａ及び４Ｂを参照）。いくつかの群では、動物は、過去にＶＩＧの体内注射を受けていた。このようにして、中和抗体に直面しても、感染した腫瘍細胞を標的とするＣＴＬ応答の結果としての腫瘍シグナルの喪失に対処することなく送達を検査することが可能であった。
【００６２】
意外なことに、本明細書の合成エンベロープ化ウイルス（ｅＶＶ）を裸のウイルス（ＶＶ）とＶＩＧの非存在下で比較した際には、エンベロープ化ウイルスは、腫瘍からの有意に強化された（ｐ＝０．００９）ウイルス遺伝子発現を示した。このことは、送達がより効率的であることを示唆している。マウスの上半身（肝臓、脾臓及び肺のような天然のウイルス標的を含むが、腫瘍は含まない）上に描写される関心領域について同様の比較が行われた際には、ｅＶＶは、正常組織からのシグナルにおいて５倍の減少を示した。この減少は、うまく標的解除されたウイルス粒子には典型的であるが、このことは、通常は腫瘍標的の感染と引き換えに起こることである。本明細書のエンベロープ化ウイルスの場合、実際には腫瘍内における感染の増加が見られる。
【００６３】
ＶＩＧが存在していた際には、裸のウイルスは、腫瘍から検出可能なシグナルを生成しなかった。しかしながら、エンベロープ化ウイルスは、（ナイーブマウスにおけるエンベロープ化ウイルスの送達と比較して約３倍減少したものの）依然として高レベルの腫瘍シグナルを生成可能であった。
【００６４】
代表的な実験の別のセットでは、送達及び抗腫瘍効果を、ナイーブマウス及び完全免疫化マウスにおいて比較した。まず、免疫応答性動物に対して、野生型ワクチニア（ＷＲ株、ＩＰ １ｅ６ＰＦＵ）をワクチン接種したか、対照としてワクチン接種しないままとした。ワクチン接種された動物を２８日間放置し、それによりウイルスが取り除かれて適応応答がメモリー段階(memory phase)に入ったことを確実にして、腫瘍移植に影響されないようにした。次いで、マウスにＭＣ３８腫瘍を皮下移植した。腫瘍が触知可能になってから、マウスを、１ｅ８ ＰＦＵのＷＲ．ＴＫ又はエンベロープ化ＷＲ．ＴＫ−の単回静脈内注射により処置した（図５Ａ及び５Ｂ参照）。
【００６５】
ヌードマウスモデルで観察されるように、エンベロープ化ウイルスは、ナイーブマウスにおいて全身送達後に腫瘍を感染させるにあたり、実際には裸のウイルスと比較してより効率的であることがわかった。予想された通り、過去に免疫化された動物では、全身送達後におけるウイルス遺伝子発現は腫瘍内において検出されなかった。注目すべきことに、腫瘍内の細胞の感染後における、ＣＴＬ応答の予想された抗ウイルス効果にもかかわらず、エンベロープ化ウイルスが免疫化マウスにおける送達後に腫瘍内に生じたウイルス遺伝子発現は、裸のウイルスがナイーブマウスへの送達後に達成したものよりも大きかった。
【００６６】
また、本明細書のエンベロープ化ウイルスの強化されたウイルス遺伝子発現は、強化された治療活性としても解釈される。裸のウイルスは、ナイーブマウスにおける該モデルでは腫瘍成長を若干遅らせたものの、過去に免疫化されたマウスに送達した際には効果がなかった。このエンベロープ化ウイルスは、ナイーブマウス又は過去に免疫化されたマウスにおいて送達されたかどうかにかかわらず、（ナイーブマウスにおける裸のウイルスと比較して）有意に強化された治療効果を生じた。本明細書のエンベロープ化ウイルスは、本明細書のエンベロープ化ウイルスが完全に免疫化された動物において全身送達される際であっても、ナイーブマウスにおいて送達される裸のウイルスと比較して、実際に抗腫瘍効果を増強し得る。
【００６７】
患者が過去にウイルスに曝露されていない可能性がある、又は、ワクチン接種されたのが数十年前で限られた免疫力しか残っていない可能性がある臨床状況について、より正確にモデル化するために、エンベロープ化ウイルス又は裸のウイルスの腫瘍保持マウスへの送達を繰り返す実験を行った。そのような実験は、ほとんどの同系腫瘍が高悪性度であり、腫瘍が触知可能になる時期と動物を屠殺する必要が生じる時期との時間枠が多くの場合約２〜３週間であって、この時間枠が強靭な抗体応答を生じさせるのに必要とされる時間とほぼ同じであるという事実により、繁雑となる。
【００６８】
いくつかの実験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＲＥＮＣＡ腫瘍を皮下移植し、その後、腫瘍が触知可能になってから、尾静脈を介して１ｅ８ ｐｆｕの裸のウイルス又はエンベロープ化ウイルスで処置した。３日間又は１４日間のいずれかの間隔の後、２回目の同じ療法を送達した。腫瘍負荷は、経時的に追跡した。図６Ａ及び６Ｂには、裸のウイルスを反復注射した場合、単回静脈注射（単回注射腫瘍量は、イメージングが行われた１７日目において、１７２０ｍｍ3であった）と比較して追加の治療利益は得られなかったが、エンベロープ化ウイルスでは、全身送達の反復サイクルの後に、有意な追加の治療利益が得られたことが見られる。
【００６９】
図７は、本明細書の方法でエンベロープ又はカプセル化されたウイルスのいくつかのタイプにおける感染率のパーセントを、対照としてそのようなウイルスの本明細書のエンベロープを含まないものと比較して示す。改善された結果は、アデノウイルス（Ａｄ）及びＨＳＶのような代表的なウイルスについて得られている。これらの結果は、他のウイルス骨格（脂質エンベロープ化及びタンパク質エンベロープ化ウイルスの両方を含む）が、感染能力を保持しつつ本明細書に記載の合成脂質エンベロープ内にカプセル化可能であることを示している。保持された感染能力は、従来記載された技術（全身循環を増強するため、及び／又は、ウイルスを（肝臓のような）非標的組織における取り入みから標的解除させるために、ＰＥＧをウイルス表面に付着させるアプローチを含む）について報告されたものよりも大きい。その感染能力は、異なる数の脂質層を備えた異なる形態では天然に存在しないウイルス（例えば、アデノウイルス又はＨＳＶ）に対して合成エンベロープを付加した後では、この能力を有しているウイルス（ワクチニアなど）と比較して減少することがある。
【００７０】
ＨＳＶ及びアデノウイルスは、遺伝子療法又は腫瘍溶解性ウイルス療法のための骨格として一般的に使用される。これらのウイルスによる感染性にはいくらかの損失があるが、その損失は従来のアプローチと比較して比較的少ない。
【００７１】
実験
細胞系及びウイルスベクター：４Ｔ１（マウス乳癌）、Ｒｅｎｃａ（マウス腎癌）、ＨＣＴ１１６（ヒト結腸直腸癌）及びＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）を含む腫瘍細胞株は、ＡＴＣＣから入手した。ＭＣ３８（マウス結腸直腸癌）は、ピッツバーグ大学のDavid Bartlettから入手した。細胞は、推奨された通りに培養した。ワクチニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）は、ＣＤＣからの現物贈与であった。
【００７２】
ワクチニア株ＷＲ．ＴＫ−Ｌｕｃ＋は、ウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子に挿入変異を含有しており、ｐＳＥ／Ｌプロモーター制御下でルシフェラーゼ導入遺伝子を含有し、これは以前に記載されている。ウイルスは、ＨｅＬａ細胞にて増幅し、凍結／解凍により溶解し、超遠心バンディング及び接線流によって精製した。
【００７３】
マウスモデル（Mice and mouse models）。マウス（無胸腺ｎｕ−／ｎｕ−、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７／ＢＬ６）は、Charles Riverから入手し、食物及び水を自由にして収容した。腫瘍は、１ｅ６マウス腫瘍細胞又は１ｅ７ヒト腫瘍細胞の皮下移植によって形成した。他に示されない限り、腫瘍が触知可能になってから（５０〜１００ｍｍ3）、尾静脈注射を介して１ｅ８ ＰＦＵのウイルス又はエンベロープ化ウイルスで動物を処置した。その後の腫瘍体積は、キャリパー測定により決定し、ウイルス遺伝子発現は、生物発光イメージング（ＩＶＩＳ２００（Perkin Elmer社製）、Ｄ−ルシフェリン基質（Gold Bio社製）のＩＰ送達後）により決定した。
【００７４】
代表的なｐＨ感受性又は応答性複合体の合成。脂質性ウイルスエンベロープの形成に適したいくつかの代表的なｐＨ感受性又は応答性複合体の合成を行った。ＰＥＧ１分子にヒドラゾンリンカーを介して結合したＦＴＳ−Ｈの２分子を含有する一連のｐＨ感受性複合体を、図８に示す。増加する炭素鎖長又はヒドラゾンリンカーに近い電子吸引基／供与基を備えた複合体について研究し、それらの調整可能なｐＨ感受性を実証した（図８参照）。図８の４つの複合体の合成は、ＰＥＧ化分子上のケトン基を用いてＦＴＳ−Ｈと反応させるのが直接的であり、通常２時間以内に完了する。合成が成功したことは、複合体の1Ｈ ＮＭＲスペクトル及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより確認した。
【００７５】
ウイルスエンベロープ。材料：ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ）、ヒドラジンリンカーを備えたＰＥＧ５Ｋ−ＦＴＳ−ヒドラジド（ＰＥＧ５Ｋ−ＦＴＳ−Ｈ２）。
【００７６】
プロトコル：ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、コレステロール及びｍＰＥＧ−ＦＴＳ（モル比２：１：０．１）を、ガラス管中のクロロホルムに溶解した。この有機溶媒を窒素気流によりさらに除去して、薄膜を形成した。該薄膜を真空下で１時間乾燥させて、残留溶媒を除去した。ウイルスをＰＢＳにより希釈した後、該管に加えて薄膜を水和させた。水和されたフィルムの入った管を、超音波水浴（出力制御設定４、Ｓｏｎｉｆｅｒ ２５０）内に３０分間配置した。室温で３時間安定化させた後、ウイルスのカプセル化が完了した。
【００７７】
前述の説明及び添付の図面は、現時点におけるいくつかの代表的な実施形態を提示している。当然ながら、様々な修正、追加及び代替設計は、前述の教示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者にとって明らかになるであろう。ここで、本発明の範囲は、前述の説明ではなく、以下の特許請求の範囲によって示唆されている。特許請求の範囲と均等である意味及び範囲内に属する全ての変更及び変形は、それらの範囲内に包含されることになる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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