(57)【要約】  本発明は、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその免疫学的に活性な部分をコードする新規の核酸分子であって、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号１または２のアミノ酸配列を含む、核酸分子に関する。本発明はさらに、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンとしての、核酸分子、または前記核酸分子を含むベクターの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合前コンフォメーションで安定化されるＲＳＶ  Ｆタンパク質（融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質）をコードする核酸分子であって、前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質は配列番号１または２のアミノ酸配列を含む核酸分子。
【請求項２】
前記融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする前記核酸は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする前記核酸は、配列番号３または４の核酸配列を含む請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
前記ベクターはヒト組換えアデノウイルスである請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
前記組換えヒトアデノウイルスは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域中の欠失、Ｅ３領域中の欠失、またはＥ１およびＥ３の両領域中の欠失を有している請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記アデノウイルスがセロタイプ２６または３５のアデノウイルスである請求項５または６に記載のベクター。
【請求項８】
前記組換えアデノウイルスは、その５’末端に配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含むゲノムを有する請求項５、６または７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項１、２または３に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項５〜８のいずれか一項に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項１１】
対象にＲＳＶに対するワクチンを接種する方法であって、前記対象に請求項９または１０に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記対象にＲＳＶ  Ｆタンパク質を投与することをさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象におけるＲＳＶの感染および／または複製を減少させる方法であって、前記対象に、請求項１、２または３に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項１４】
対象におけるＲＳＶの感染および／または複製を減少させる方法であって、前記対象に、請求項５〜８のいずれか一項に記載のベクターを含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項１５】
請求項１、２または３に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む単離宿主細胞。
【請求項１６】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを作製する方法であって、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む組換えヒトアデノウイルスを用意する工程と、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養物中で増殖させる工程と、前記組換えアデノウイルスを単離および精製する工程と、前記組換えアデノウイルスを薬学的に許容される組成物で製剤化する工程とを含み、前記融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は配列番号１または２のアミノ酸配列を含む方法。
【請求項１７】
融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、組換えヒトアデノウイルスのゲノムを形成する単離組換え核酸であって、前記融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は配列番号１または２のアミノ酸配列を含む単離核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＲＳＶに対するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、毎年約２００，０００人の小児死亡の原因であると考えられている気道の伝染性が高い小児病原体である。２歳未満の小児では、ＲＳＶは呼吸器感染症による入院の約５０％を占め、入院のピークは月齢２〜４ヶ月で生じる。ほとんど全ての小児が２歳までにＲＳＶ感染を経験し、生涯にわたる反復感染は自然免疫の低さに起因すると報告されている。高齢者では、ＲＳＶ疾患の負担は、一般的なインフルエンザＡ感染によって引き起こされるものと類似している。現在、ＲＳＶ感染に対するワクチンは入手できないが、疾患による高い負担のために要望されている。
【０００３】
ＲＳＶは、ニューモウイルス亜科（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）に属するパラミクソウイルスである。そのゲノムは、中和抗体の主要な抗原標的であるＲＳＶ糖タンパク質（Ｇ）およびＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質として知られる膜タンパク質を含む種々のタンパク質をコードする。
【０００４】
ＲＳＶ  Ｇタンパク質とは異なり、Ｆタンパク質はＲＳＶ株間で保存されており、そのことで、広く中和抗体を誘発することができる魅力的なワクチン候補となっている。Ｆタンパク質は膜貫通タンパク質であり、ウイルスの出芽中に細胞膜からビリオン膜に取り込まれる。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ウイルス膜と宿主細胞膜とを融合させることによって感染を促進する。融合プロセスにおいて、Ｆタンパク質は、不安定な融合前コンフォメーションから安定な融合後コンフォメーションに不可逆的にリフォールディングする。タンパク質前駆体Ｆ０は、細胞内成熟の間にフーリン様プロテアーゼによって切断される必要がある。２つのフーリン部位があり、その切断によりｐ２７ペプチドが除去され、２つのドメイン、Ｎ末端Ｆ２ドメインおよびＣ末端Ｆ１ドメインが形成される（図１）。Ｆ２およびＦ１ドメインは、２つのシスチン架橋によって結合される。融合タンパク質に対する抗体は、細胞へのウイルス取り込みを防止することができ、したがって、中和作用を有する。中和抗体の標的であることに加えて、ＲＳＶ  Ｆは、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含む（Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：２１７７−２１８２）。
【０００５】
５０年間の研究にもかかわらず、ＲＳＶに対するワクチンにはまだ認可されたものがない。ワクチン開発の大きな障害の１つは、１９６０年代の臨床試験において、ホルマリン不活化（ＦＩ）ＲＳＶワクチンによる、疾患のワクチン増強があったことが受け継がれていることである。ＦＩ−ＲＳＶワクチン接種を受けた小児は、自然感染から防御されず、感染した小児は、ワクチン接種を受けなかった小児よりも、２人の死亡を含む重篤な病気を経験した。この現象は「疾患の増強」と呼ばれる。
【０００６】
ＦＩ−ＲＳＶワクチンによる試験以来、ＲＳＶワクチンを作製するための種々のアプローチが追求されてきた。試みには、ＲＳＶの古典的生弱毒化低温継代株または温度感受性変異株、（キメラ）タンパク質サブユニットワクチン、ペプチドワクチン、およびアデノウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターから発現されるＲＳＶタンパク質が含まれる。これらのワクチンのいくつかは、有望な前臨床データを示したが、安全性の懸念または有効性の欠如により、いずれのワクチンもヒトへの使用に対しては認可されなかった。
【０００７】
したがって、ＲＳＶに対する効果的なワクチンおよびワクチン接種法、特に疾患の増強をもたらさないワクチンの必要性が依然として存在する。本発明は、ＲＳＶに対するそのようなワクチン、および安全にかつ効果的にワクチン接種するための方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、安定なＲＳＶ融合前Ｆタンパク質をコードする新規の核酸分子であって、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質は配列番号１または２のアミノ酸配列を含む核酸分子を提供する。
【０００９】
特定の実施形態では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質をコードする核酸分子は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。
【００１０】
特定の実施形態では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号３または４の核酸配列を含む。
【００１１】
本発明は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターであって、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は配列番号１または２のアミノ酸配列を含むベクターをさらに提供する。
【００１２】
特定の実施形態では、ベクターはヒト組換えアデノウイルスである。
【００１３】
特定の実施形態では、組換えアデノウイルスはセロタイプ２６または３５のアデノウイルスである。
【００１４】
特定の実施形態では、組換えヒトアデノウイルスは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域中の欠失、Ｅ３領域中の欠失、またはＥ１およびＥ３の両方の領域中の欠失を有している。
【００１５】
特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、その５’末端に配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含むゲノムを有する。
【００１６】
本発明はまた、本発明の核酸分子またはベクターを含む組成物、例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを提供する。
【００１７】
本発明は、対象にＲＳＶに対するワクチンを接種する方法であって、本発明による組成物を対象に投与することを含む方法をさらに提供する。
【００１８】
特定の実施形態では、ＲＳＶに対するワクチンを対象に接種する方法は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質（好ましくは、医薬組成物として製剤化されたもの、したがってタンパク質ワクチン）を対象に投与することをさらに含む。
【００１９】
本発明はまた、対象の例えば鼻道および肺におけるＲＳＶの感染および／または複製を低減する方法であって、本発明による核酸またはベクターを含む組成物をその対象に投与することを含む方法を提供する。これは、対象のＲＳＶ感染から生じる悪影響を軽減し、したがって、組成物の投与により、そのような悪影響から対象を防御することに寄与するであろう。特定の実施形態では、ＲＳＶ感染の悪影響を基本的に予防することができる、すなわち、臨床的に重要でないほどの低レベルに低減することができる。
【００２０】
本発明はまた、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質をコードする核酸分子を含む単離宿主細胞であって、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質は配列番号１または２のアミノ酸配列を含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号３または４の核酸配列を含む。
【００２１】
本発明はさらに、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを作製する方法であって、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む組換えヒトアデノウイルスを用意する工程と、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養物中で増殖させる工程と、組換えアデノウイルスを単離および精製する工程と、組換えアデノウイルスを薬学的に許容される組成物で製剤化する工程とを含み、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質は配列番号１または２のアミノ酸配列を含む方法を提供する。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスはセロタイプ２６または３５のアデノウイルスである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＲＳＶ  Ｆタンパク質の模式図。タンパク質前駆体は、Ｆ２およびＦ１ドメイン、ならびにフーリン様プロテアーゼによる切断によって成熟タンパク質から除去されるｐ２７ペプチドを含む。切断部位を矢印で示す。ボックスの上の数字は、シグナルペプチドを除く完全長タンパク質のアミノ酸の位置を示す。Ｆ１には、構造要素が示されている：融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタドリピートＡ（ＨＲＡ）を含むリフォールディング領域１（ＲＲ１）、およびヘプタドリピートＢ（ＨＲＢ）を含むリフォールディング領域２（ＲＲ２）。
【図２】Ｆタンパク質変異体の相対的表面発現。Ｆタンパク質の完全長変異体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させた。抗ＲＳＶ  Ｆ抗体（ＣＲ９５０３）で細胞を染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を計算し、対照のＦ野生型（Ｆｗｔ）トランスフェクト細胞試料のＭＦＩに対して正規化した。ＦｗｔのＭＦＩを１とした。バーは平均値を意味し、エラーバーは値の範囲を表す。
【図３】細胞表面の融合前Ｆタンパク質の画分。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＦタンパク質の完全長変異体を発現させた。抗ＲＳＶ  Ｆ抗体ＣＲ９５０３および抗融合前ＲＳＶ  Ｆ抗体ＣＲ９５０１で細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を計算し、ＣＲ９５０１によって測定されたＭＦＩを、ＣＲ９５０３によって測定されたＭＦＩに対して正規化した。正規化されたＭＦＩ値は、細胞表面上のｐｒｅ−Ｆの画分を示す。バーは平均値を意味し、エラーバーは値の範囲を表す。
【図４】Ｆタンパク質変異体の相対表面発現。膜貫通領域および細胞質領域を欠失させた可溶性バージョン（Ｆｓｌ）およびＦタンパク質の完全長変異体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させた。可溶性タンパク質の発現レベルを、培養上清中でオクテットにより測定し、完全長変異体を、抗ＲＳＶ  Ｆ抗体（ＣＲ９５０３）を用いた細胞染色で試験し、フローサイトメトリーで分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を計算し、対照のＦ野生型（Ｆｗｔ）トランスフェクト細胞試料のＭＦＩに対して正規化した。ＦｗｔのＭＦＩを１とした。バーは平均値を意味し、エラーバーは値の範囲を表す。
【図５】Ｆタンパク質変異体の温度安定性。Ｆタンパク質の完全長変異体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させた。熱ショックを加えた後、抗ＲＳＶ  Ｆ抗体で細胞を染色し（ＣＲ９５０１−実線およびＣＲ９５０３−破線）、フローサイトメトリーで分析した。染色に対する陽性細胞のパーセンテージを測定した。記号は平均値を意味し、エラーバーは値の範囲を表す。（Ａ）染色に対する陽性細胞のパーセンテージを測定した。（Ｂ）平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を計算し、３７Ｃ細胞試料のＭＦＩに対して正規化した。３７℃試料のＭＦＩを１とした。点線は、６０℃のバックグラウンド染色に対応する。
【図６】Ｆタンパク質の安定性。ＰｒｅＦは、熱ストレスアッセイにおいて、細胞表面上での融合前コンフォメーションでＦＡ２タンパク質よりも安定である。インサートＦＡ２（ｗｔ  ＲＳＶ  Ｆ、灰色のバー）または融合前Ｆ安定化インサート（ｐｒｅＦ２．２、黒色のバー）を含むＡｄ２６およびＡｄ３５を、表示のＭＯＩでＡ５４９細胞に感染させた。染色前に１５分間、表示の温度で細胞を温度処理した。上：表面に融合前Ｆを示す細胞のパーセント（ＣＲ９５０１抗体により検出）；下：融合前および融合後の任意の形態のＦタンパク質を示す細胞のパーセント（ＣＲ９５０３抗体により検出）。値は３７℃の試料に対して正規化した。全てのバーは、単一の測定値を表す。
【図７】Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１およびＦ２．２は、単回投与後、マウスに細胞性免疫応答を誘発する。横棒は、群内の応答の幾何平均を示す。バックグラウンドレベルは、非刺激脾細胞で観察されたスポット形成単位（ＳＰＵ）の９５％パーセンタイルとして計算し、点線で示す。
【図８−１】Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１およびＦ２．２は、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２と比べ、単回の免疫付与後、マウスにより多くのウイルス中和抗体を誘導した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群当たりｎ＝４）に、１０８〜１０１０個のウイルス粒子（ｖｐ）、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２またはＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１またはＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２を表示用量で、または製剤緩衝液で免疫を付与し、免疫付与から８週後に単離した血清中の体液性免疫応答を測定した。（Ａ）ＥＬＩＳＡベースの読み取りを行うマイクロ中和アッセイを用いて、ＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇに対するウイルス中和抗体を決定した。力価をＩＣ５０のｌｏｇ２値として示す。（Ｂ）融合前または融合後のＦ抗体力価をＥＬＩＳＡによって決定し、定量下限（ＬＬｏＱ）を上回る融合前および融合後Ｆ力価を示した全ての試料について、融合前と融合後のＦ抗体の比を計算した。（Ｃ）コーティング試薬として融合後ＲＳＶ  Ｆ  Ａ２を用いてサブクラスＥＬＩＳＡを行い、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比（ｌｏｇ１０）をプロットする。Ｔｈ１（ＲＳＶ  Ｆ発現アデノウイルスベクターで免疫付与した動物由来の血清）およびＴｈ２（ＦＩ−ＲＳＶで免疫付与した動物由来の血清）参照試料で観察された比を破線で示す。ＬＬｏＱを点線で示し（パネルＡ）、横バーは群の平均応答を表す。
【図８−２】Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１およびＦ２．２は、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２と比べ、単回の免疫付与後、マウスにより多くのウイルス中和抗体を誘導した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群当たりｎ＝４）に、１０８〜１０１０個のウイルス粒子（ｖｐ）、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２またはＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１またはＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２を表示用量で、または製剤緩衝液で免疫を付与し、免疫付与から８週後に単離した血清中の体液性免疫応答を測定した。（Ａ）ＥＬＩＳＡベースの読み取りを行うマイクロ中和アッセイを用いて、ＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇに対するウイルス中和抗体を決定した。力価をＩＣ５０のｌｏｇ２値として示す。（Ｂ）融合前または融合後のＦ抗体力価をＥＬＩＳＡによって決定し、定量下限（ＬＬｏＱ）を上回る融合前および融合後Ｆ力価を示した全ての試料について、融合前と融合後のＦ抗体の比を計算した。（Ｃ）コーティング試薬として融合後ＲＳＶ  Ｆ  Ａ２を用いてサブクラスＥＬＩＳＡを行い、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比（ｌｏｇ１０）をプロットする。Ｔｈ１（ＲＳＶ  Ｆ発現アデノウイルスベクターで免疫付与した動物由来の血清）およびＴｈ２（ＦＩ−ＲＳＶで免疫付与した動物由来の血清）参照試料で観察された比を破線で示す。ＬＬｏＱを点線で示し（パネルＡ）、横バーは群の平均応答を表す。
【図８−３】Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１およびＦ２．２は、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２と比べ、単回の免疫付与後、マウスにより多くのウイルス中和抗体を誘導した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群当たりｎ＝４）に、１０８〜１０１０個のウイルス粒子（ｖｐ）、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２またはＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１またはＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２を表示用量で、または製剤緩衝液で免疫を付与し、免疫付与から８週後に単離した血清中の体液性免疫応答を測定した。（Ａ）ＥＬＩＳＡベースの読み取りを行うマイクロ中和アッセイを用いて、ＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇに対するウイルス中和抗体を決定した。力価をＩＣ５０のｌｏｇ２値として示す。（Ｂ）融合前または融合後のＦ抗体力価をＥＬＩＳＡによって決定し、定量下限（ＬＬｏＱ）を上回る融合前および融合後Ｆ力価を示した全ての試料について、融合前と融合後のＦ抗体の比を計算した。（Ｃ）コーティング試薬として融合後ＲＳＶ  Ｆ  Ａ２を用いてサブクラスＥＬＩＳＡを行い、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比（ｌｏｇ１０）をプロットする。Ｔｈ１（ＲＳＶ  Ｆ発現アデノウイルスベクターで免疫付与した動物由来の血清）およびＴｈ２（ＦＩ−ＲＳＶで免疫付与した動物由来の血清）参照試料で観察された比を破線で示す。ＬＬｏＱを点線で示し（パネルＡ）、横バーは群の平均応答を表す。
【図９】Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２は、広範囲のＲＳＶ分離株を中和する抗体応答を誘発する。ウイルス粒子（ｖｐ）が１０１０個のＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２（ｎ＝３）またはＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ（ｎ＝４）または製剤緩衝液（ｎ＝２）で免疫付与したＢａｌｂ／ｃマウス由来の血清を、表示のＲＳＶ  Ａ株（上部パネル）およびＢ株（下部パネル）のウイルス中和アッセイ（ＥＬＩＳＡベースの読み取りを行うマイクロ中和アッセイ）で使用した。力価をＩＣ５０のｌｏｇ２値で示し、横バーは１群当たりの平均応答を表す。ＬＬｏＱは破線で示す。
【図１０−１】コットンラットは、低用量のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２またはＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２による単回の免疫付与により、同種ＲＳＶ  Ａ２によるチャレンジから保護される。コットンラット（シグモドン・ヒスピドゥス（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ））（１群あたりｎ＝７〜９）に、表示の用量（ｖｐ／動物）のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２（左パネル）、Ａｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２またはＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦＡ２（右パネル）を単回筋肉投与して免疫を付与した。対照免疫付与は、製剤緩衝液、ＦＩ−ＲＳＶ、または低用量ＲＳＶ  Ａ２の鼻腔内投与により行った。免疫付与から７週後、動物の鼻腔に１０５ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２によるチャレンジを行った。チャレンジの５日後、プラークアッセイにより肺（Ａ−Ｂ）および鼻（Ｃ−Ｄ）のウイルス力価を決定した。（Ｅ−Ｆ）チャレンジ直前に採取した血清を使用して、ＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇ株のウイルス中和アッセイを行った（ＥＬＩＳＡベースの読み取りを行うマイクロ中和アッセイ）。点線は、定量下限（ＬＬｏＱ）を表す。横バーは群当たりの平均力価を表す。
【図１０−２】コットンラットは、低用量のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２またはＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２による単回の免疫付与により、同種ＲＳＶ  Ａ２によるチャレンジから保護される。コットンラット（シグモドン・ヒスピドゥス（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ））（１群あたりｎ＝７〜９）に、表示の用量（ｖｐ／動物）のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２（左パネル）、Ａｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２またはＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦＡ２（右パネル）を単回筋肉投与して免疫を付与した。対照免疫付与は、製剤緩衝液、ＦＩ−ＲＳＶ、または低用量ＲＳＶ  Ａ２の鼻腔内投与により行った。免疫付与から７週後、動物の鼻腔に１０５ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２によるチャレンジを行った。チャレンジの５日後、プラークアッセイにより肺（Ａ−Ｂ）および鼻（Ｃ−Ｄ）のウイルス力価を決定した。（Ｅ−Ｆ）チャレンジ直前に採取した血清を使用して、ＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇ株のウイルス中和アッセイを行った（ＥＬＩＳＡベースの読み取りを行うマイクロ中和アッセイ）。点線は、定量下限（ＬＬｏＱ）を表す。横バーは群当たりの平均力価を表す。
【図１０−３】コットンラットは、低用量のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２またはＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２による単回の免疫付与により、同種ＲＳＶ  Ａ２によるチャレンジから保護される。コットンラット（シグモドン・ヒスピドゥス（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ））（１群あたりｎ＝７〜９）に、表示の用量（ｖｐ／動物）のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２（左パネル）、Ａｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２またはＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦＡ２（右パネル）を単回筋肉投与して免疫を付与した。対照免疫付与は、製剤緩衝液、ＦＩ−ＲＳＶ、または低用量ＲＳＶ  Ａ２の鼻腔内投与により行った。免疫付与から７週後、動物の鼻腔に１０５ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２によるチャレンジを行った。チャレンジの５日後、プラークアッセイにより肺（Ａ−Ｂ）および鼻（Ｃ−Ｄ）のウイルス力価を決定した。（Ｅ−Ｆ）チャレンジ直前に採取した血清を使用して、ＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇ株のウイルス中和アッセイを行った（ＥＬＩＳＡベースの読み取りを行うマイクロ中和アッセイ）。点線は、定量下限（ＬＬｏＱ）を表す。横バーは群当たりの平均力価を表す。
【図１１】コットンラットにＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２またはＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２で免疫付与を行うと、ＲＳＶ  Ａ２チャレンジ後に肺胞炎のスコアは増加しない。コットンラット（シグモドン・ヒスピドゥス（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ））（１群あたりｎ＝７〜９）に、表示の用量（ｖｐ／動物）のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２（上パネル）、Ａｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２またはＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦＡ２（下パネル）を単回筋肉内投与して免疫を付与した。対照免疫付与は、製剤緩衝液、ＦＩ−ＲＳＶ、または低用量ＲＳＶ  Ａ２の鼻腔内投与により行った。免疫付与から７週後、動物の鼻腔に１０５ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２によるチャレンジを行った。チャレンジの５日後に、１つの肺葉について組織病理学検査を行い、肺胞炎を０〜４の非線形スケールでスコア付けした。水平の点線は、ＥＲＤに至らないＲＳＶへの自然曝露を再現するために、チャレンジ前にＲＳＶ−Ａ２に予め曝露した対照動物の最大スコアを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を含むヒトアデノウイルスを含むＲＳＶワクチンは、既に、国際公開第２０１３／１３９９１１号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１３９９１６号パンフレットで報告されている。その中で、ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を含むセロタイプ２６または３５の組換えアデノウイルスは、十分に確立されたコットンラットモデルにおいてＲＳＶに対して非常に有効なワクチンであり、ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードするＡｄ５について先に報告されたデータと比較して、改善された効力を有することが示された。ＲＳＶ  ＦをコードするＡｄ２６またはＡｄ３５の単回投与でも、筋肉内投与でも、チャレンジＲＳＶの複製を完全に防御するのに十分であることが実証された。
【００２４】
しかしながら、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の不安定性のために、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、未成熟のままより安定な融合後コンフォメーションへとリフォールドする傾向を有する。この現象は、溶液中およびビリオン表面上のいずれの場合にも現れるタンパク質に固有の特徴である。しかしながら、ヒト血清では、大部分のＲＳＶ中和抗体は、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆに向かう。したがって、本発明を導いた研究では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を完全長タンパク質状態で融合前コンフォメーションに安定化する改変がいかなるものかを明らかにする努力がなされた。
【００２５】
融合前コンフォメーションでＲＳＶ  Ｆタンパク質を安定化するいくつかの可能な変異については、既に国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレットおよび国際公開第２０１４／２０２５７０号パンフレットで報告されている。本発明による核酸分子は、変異の特有かつ特定のサブセットを含むＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする。本発明によれば、本発明の変異のこの特有の組み合わせが、ＲＳＶ  Ｆタンパク質発現レベルの増加および融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質の安定性をもたらすことが示された。さらに、本発明による核酸分子が、融合前コンフォメーションで安定化され、かつ、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（国際公開第２０１３／１３９９１１号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１３９９１６号パンフレットで開示されているもの）と比較してより高い力価の中和抗体を誘導する、ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードすることが示された。
【００２６】
したがって、第１の態様では、本発明は、融合前呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質（ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質、またはＲＳＶ  ｐｒｅ−Ｆタンパク質）をコードする新規の核酸分子であって、ＲＳＶ  ｐｒｅ−Ｆタンパク質が配列番号１または２のアミノ酸配列を含む核酸分子を提供する。
【００２７】
特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１または配列番号２のＲＳＶ  ｐｒｅ−Ｆタンパク質をコードする。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、核酸、核酸分子、核酸またはヌクレオチド配列、およびポリヌクレオチドという用語は、同義で使用され、いずれも、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むヌクレオチドから作られる線状生体高分子（鎖）を指す。
【００２９】
多数の異なる核酸分子が、遺伝子コードの縮重の結果として、同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者に理解されている。また、当業者がルーチンの手法を用いて、記述されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行って、ポリペプチドが発現する任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映し得ることも理解されている。したがって、特記されない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配列」には、互いの縮重型であり、かつ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質をコード化するヌクレオチド配列およびＲＮＡは、イントロンを含み得る。本明細書の配列は、当該技術分野における慣習として、５’から３’の方向に示される。
【００３０】
特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１または２のアミノ酸を含む融合前ＲＳＶ  Ｆの断片をコードする
【００３１】
特定の実施形態では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸分子は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化の方法は知られており、既に報告されている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。
【００３２】
特定の実施形態では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号３の核酸配列を含む。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸は、配列番号４の核酸配列を含む。
【００３３】
特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸は、配列番号３または４の核酸配列からなる。
【００３４】
本明細書で使用する「断片」という用語は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端および／または内部が欠失しているが、残りのアミノ酸配列が、完全長ＲＳＶ  Ｆタンパク質配列、例えば、配列番号１または２のＲＳＶ  Ｆタンパク質配列中の対応する位置と同一であるペプチドを指す。免疫応答を誘導するためには、さらに一般的には、ワクチン接種の目的のためには、タンパク質は、完全長である必要も、その野生型の機能を全て有する必要がなく、タンパク質の断片も同等に有用であることは、理解されよう。当業者は、例えばルーチンの分子生物学的手順を用いて、例えばアミノ酸置換、欠失、付加などによりタンパク質を変化させることができることも理解するであろう。一般に、ポリペプチドの機能または免疫原性を喪失させることなく、保存的アミノ酸置換を適用することができる。これは当業者によく知られたルーチンの手順に従って調べることができる。
【００３５】
本発明はまた、配列番号１または２のアミノ酸配列を含む融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターに関する。
【００３６】
本発明によれば、ベクターは、組換えＤＮＡ手順を都合よく受けることができ、本発明の核酸分子の発現をもたらすことができるものであれば、いかなるベクターであってもよい。ベクターの選択は、通常、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存する。
【００３７】
特定の実施形態では、ベクターは、組換えアデノウイルスベクターとも呼ばれるヒト組換えアデノウイルスである。組換えアデノウイルスベクターの調製は、当該技術分野でよく知られている。本明細書で使用される、アデノウイルスに関する用語「組換え」は、アデノウイルスが人為的に改変されていること、例えば、その中に能動的にクローン化された改変末端を有し、かつ／または異種遺伝子を含む、すなわち、天然に存在する野生型アデノウイルスではないことを含意する。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域、例えばＥ１ａ領域および／またはＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能と、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。アデノウイルスベクターは、「多重欠損」であり得、これはアデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれにおいて、１つ以上の必須遺伝子機能が欠損していることを意味する。例えば、前述のＥ１−欠損またはＥ１−、Ｅ３−欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子、および／またはＥ２領域の少なくとも１つの必須遺伝子（例えば、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ２Ｂ領域）がさらに欠損していてよい。
【００３９】
アデノウイルスベクター、その構築方法およびその増殖方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、同第５，８３７，５１１号明細書、同第５，８４６，７８２号明細書、同第５，８５１，８０６号明細書、同第５，９９４，１０６号明細書、同第５，９９４，１２８号明細書、同第５，９６５，５４１号明細書、同第５，９８１，２２５号明細書、同第６，０４０，１７４号明細書、同第６，０２０，１９１号明細書および同第６，１１３，９１３号明細書、それぞれＶｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）の６７および６８章に収録のＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”およびＭ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”、ならびに本明細書で言及している他の参考文献に記載されている。一般的には、アデノウイルスベクターの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ（１９９２），およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、ならびに本明細書で言及している他の参考文献に記載されているものなどの、標準的な分子生物学的手法の使用を含む。
【００４０】
特定の実施形態では、アデノウイルスはセロタイプ２６または３５のヒトアデノウイルスである。これらのセロタイプに基づく本発明のワクチンは、先行技術に記載されている、Ａｄ５に基づいたものより強力であると思われる。というのも、これらは単回筋肉内投与後にＲＳＶチャレンジの複製に対する完全な防御を提供できなかったからである（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：３８０１−３８０８；Ｋｏｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：１２６０１−１２６１０；Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８：３７５）。本発明のセロタイプは、一般に、ヒト集団において低い血清陽性率、および／または低い既存の中和抗体力価をさらに有する。異なる導入遺伝子を有する、これらのセロタイプの組換えアデノウイルスベクターは、臨床試験において評価されており、これまでのところ、卓越した安全性プロファイルを有することが示されている。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットおよびＡｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ  ８１（９）：４６５４−６３に記載されている。Ａｄ２６のゲノム配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ１５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１の中に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製については、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号パンフレット、およびＶｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７（１５）：８２６３−７１に記載されている。Ａｄ３５のゲノム配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ＿００００１９、および国際公開第００／７００７１号パンフレットの図６の中に見出される。
【００４１】
本発明による組換えアデノウイルスは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。特定の実施形態では、アデノウイルスは複製欠損であり、例えば、これはこのアデノウイルスがゲノムのＥ１領域に欠失を含むためである。当業者に知られているように、アデノウイルスゲノムからの必須領域の欠失の場合、これらの領域でコード化された機能は、好ましくはプロデューサー細胞によってトランスに提供される必要がある。すなわちＥ１、Ｅ２および／またはＥ４領域の一部または全部がアデノウイルスから欠失した場合、これらはプロデューサー細胞内に、例えばそのゲノムに組み込まれて、またはいわゆるヘルパーアデノウイルスもしくはヘルパープラスミドの形態で存在する必要がある。アデノウイルスは、Ｅ３領域内の欠失も有し得るが、これは複製に不要であるため、そのような欠失は補完される必要がない。
【００４２】
使用し得るプロデューサー細胞（時々、当該技術分野および本明細書では「パッケージング細胞」または「補完細胞」または「宿主細胞」とも称される）は、所望のアデノウイルスが増殖できる任意のプロデューサー細胞であってよい。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス内の欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われる。そのようなプロデューサー細胞は、好ましくはそれらのゲノム内に少なくとも１つのアデノウイルスＥ１配列を有し、それによりＥ１領域内に欠失を有する組換えアデノウイルスを補完することができる。Ｅ１を補完する任意のプロデューサー細胞、例えば、Ｅ１により不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照）、Ｅ１で形質転換された羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照）、Ｅ１で形質転換されたＡ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：２１３−２１９）、２９３などを使用することができる。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えばＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、または９１１細胞、またはＩＴ２９３ＳＦ細胞などである。
【００４３】
Ａｄ３５（亜群Ｂ）またはＡｄ２６（亜群Ｄ）など、亜群ＣでないＥ１欠損アデノウイルスについては、これらの亜群ＣでないアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列を、Ａｄ５などの亜群ＣのアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６と交換することが好ましい。これにより、例えば、２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞などの、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現する、よく知られた補完細胞株内で、そうしたアデノウイルスの増殖が可能になる（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；国際公開第０３／１０４４６７号パンフレット（これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）。特定の実施形態では、使用することができるアデノウイルスは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原をコードする核酸がクローニングされている、Ｅ１領域中に欠失を有し、かつＡｄ５のＥ４  ｏｒｆ６領域を有する、セロタイプ３５のヒトアデノウイルスである。特定の実施形態では、本発明のワクチン組成物中のアデノウイルスは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原をコードする核酸がクローニングされている、Ｅ１領域中に欠失を有し、かつＡｄ５のＥ４  ｏｒｆ６領域を有する、セロタイプ２６のヒトアデノウイルスである。
【００４４】
代替の実施形態では、アデノウイルスベクター中に異種Ｅ４ｏｒｆ６領域（例えば、Ａｄ５の）を配置する必要はないが、代わりに、Ｅ１欠失の亜群ＣでないベクターをＥ１および両立可能なＥ４ｏｒｆ６の両者を発現する細胞株、例えば、Ａｄ５からＥ１およびＥ４ｏｒｆ６の両方を発現する２９３−ＯＲＦ６細胞株中で増殖させる（例えば、２９３−ＯＲＦ６細胞の生成について記載があるＢｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：６４９７−５０１；そのような細胞株を用いて、Ｅ１欠失の亜群Ｃでないアデノウイルスベクターの生成についてそれぞれ記載があるＡｂｒａｈａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１：８９４６−５１およびＮａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：３２６−３６を参照）。
【００４５】
あるいは、増殖させるべきセロタイプ由来のＥ１を発現する補完細胞を使用することができる（例えば、国際公開第００／７００７１号パンフレット、国際公開第０２／４０６６５号パンフレットを参照）。
【００４６】
Ｅ１領域に欠失を有するＡｄ３５などの亜群Ｂアデノウイルスでは、例えば、ｐＩＸ開始コドンのすぐ上流の２４３ｂｐ断片（Ａｄ３５ゲノム中のＢｓｕ３６Ｉ制限部位によって５’末端で標識される）などの、ｐＩＸオープンリーディングフレームのすぐ上流の１６６ｂｐまたはこれを含む断片など、アデノウイルスのＥ１Ｂ  ５５Ｋオープンリーディングフレームの３’末端を保持することが好ましいが、これはｐＩＸ遺伝子のプロモーターがこの領域に部分的に存在することから、アデノウイルスの安定性を高めるためである（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；国際公開第２００４／００１０３２号パンフレット（これらは参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。
【００４７】
本発明のアデノウイルスにおける「異種核酸」（本明細書では「導入遺伝子」とも称される）は、アデノウイルスに天然には存在しない核酸である。これは、例えば、標準的な分子生物学的手法によって、アデノウイルスに導入される。本発明では、異種核酸は、配列番号１または２のアミノ酸配列を含むＲＳＶ  ｐｒｅ−Ｆタンパク質（またはその断片）をコードする。これは、例えば、アデノウイルスベクターの欠失Ｅ１またはＥ３領域にクローン化され得る。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列と作動可能に連結される。これは、例えば、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで実施され得る。さらなる調節配列を加えることもできる。導入遺伝子の発現のために、多数のプロモーターを使用することができ、それらは当業者に知られている。真核細胞内での発現を得るのに適したプロモーターの非限定的な例として、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書）、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターからのｎｔ．−７３５〜＋９５を含むものが挙げられる。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンのポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）を導入遺伝子の後に存在させることができる。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明の組換えアデノベクターは、５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む。これらの実施形態は、元の５’末端配列（一般にＣＡＴＣＡＴＣＡ）を有するベクター（また２０１２年３月１２日にＣｒｕｃｅｌｌ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂ．Ｖ．の名前で出願された「Ｂａｔｃｈｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄｓ」という名称の、特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５４８４６号明細書および米国特許出願第１３／７９４，３１８号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）と比較して、そのようなベクターが生産プロセスにおいて改良された複製を示し、改良された均質性を有するアデノウイルスのバッチを生じるので有利である。したがって、本発明はまた、ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその一部をコードする組換えアデノウイルスのバッチであって、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は配列番号１または２のアミノ酸配列を含み、かつ基本的にバッチ中のアデノウイルスの全て（例えば、少なくとも９０％）は、末端ヌクレオチド配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを有するゲノムを含むバッチを提供する。
【００４９】
特定の実施形態では、核酸分子は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の断片をコードすることができる。この断片は、アミノ末端の欠失およびカルボキシ末端の欠失のいずれかまたはその両方から生じるものであってよい。欠失の程度は、例えば組換えアデノウイルスがより高収率で得られるように、当業者が決定することができる。この断片は、Ｆタンパク質の免疫学的に活性な断片、すなわち、対象に免疫応答を生じさせる部分を含むように選択されるであろう。これは、当業者には全てルーチン的である、インシリコ、インビトロ、および／またはインビボの方法を使用して容易に決定することができる。
【００５０】
本発明はさらに、配列番号１または２のアミノ酸配列を含む、融合前ＲＳＶ  Ｆをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。
【００５１】
また、本発明は、本明細書に記載のベクターを含む組成物を提供する。
【００５２】
特定の実施形態では、核酸分子および／またはベクターを含む組成物は、対象のＲＳＶの感染および／または複製の低減に使用するものである。特定の好ましい実施形態では、組成物は、ＲＳＶに対するワクチンとしての使用するものである。「ワクチン」という用語は、特定の病原体または疾病に対して治療程度の免疫を対象に誘導する効力がある活性成分を含む薬剤または組成物を指す。本発明では、ワクチンは、配列番号１もしくは２を含むＲＳＶ融合前Ｆタンパク質、またはその抗原フラグメントをコードする有効量の核酸分子を含み、ＲＳＶのＦタンパク質に対する免疫応答を誘導する。これは、入院が必要となる重篤な下気道疾患を予防し、対象のＲＳＶ感染および複製による肺炎および細気管支炎などの合併症の頻度を低減する方法を提供する。したがって、本発明はまた、重篤な下気道疾患を予防または軽減し、入院を予防または軽減（例えば、短縮）し、かつ／またはＲＳＶによって引き起こされる対象の肺炎または細気管支炎の頻度および／もしくは重症度を低減するための方法であって、ＲＳＶ  ｐｒｅ−Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸分子を含む組成物を対象に投与することを含み、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は配列番号１または２のアミノ酸配列を含む方法を提供する。本発明による「ワクチン」という用語は、それが医薬組成物であり、したがって、通常、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含むことを意味する。それは、さらなる活性成分を含んでもよく含まなくてもよい。特定の実施形態では、それは、例えばＲＳＶの他のタンパク質および／または他の感染因子に対する免疫応答を誘導する他の成分をさらに含む組み合せワクチンであってもよい。
【００５３】
特定の実施形態では、核酸分子またはベクターを含む組成物は、１つ以上のアジュバントをさらに含むか、または一緒に投与される。アジュバントは、適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに増大させることが当該技術分野で知られており、アデノウイルスおよび好適なアジュバントを含む医薬組成物は、例えば、国際公開第２００７／１１０４０９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種または複数種の物質と定義される。これに関連して、アジュバントは、本発明のＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に対する免疫応答を増強するために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウム塩などのアルミニウム塩；ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルションをはじめとする油エマルション組成物（または水中油型組成物）（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；例えば、ＱＳ２１および免疫賦活性錯体（ＩＳＣＯＭＳ）などのサポニン製剤（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；その例が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどである、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰリボース化細菌毒素またはそれらの変異体などの細菌または微生物派生物が挙げられる。また、例えば、Ｃ４−結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインと目的の抗原との融合物をコードする異種核酸を使用することにより、ベクターにコードされたアジュバントを使用することも可能である（例えば、Ｓｏｌａｂｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：３８１７−２３）。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれらの組み合わせの形態のアルミニウムを、１用量当たり０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇのアルミニウム含有量となる濃度で、アジュバントとして含む。
【００５４】
他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
【００５５】
本発明によれば、さらなる活性成分を、本発明による組成物、例えばワクチンと組み合わせて投与することも可能である。そのようなさらなる活性成分は、例えば、他のＲＳＶ抗原またはそれらをコードする核酸を含むベクターを含むことができる。そのようなベクターは、非アデノウイルス性またはアデノウイルス性であってよく、後者は任意のセロタイプであってよい。他のＲＳＶ抗原の例としては、ＲＳＶ  ＦもしくはＧタンパク質またはその免疫学的に活性な部分が挙げられる。例えば、Ｇ糖タンパク質の可溶性コアドメイン（アミノ酸１３０〜２３０）を発現する、鼻腔内適用の組換え複製−欠損Ａｄ５ベースのアデノベクターｒＡｄ／３ｘＧは、マウスモデルでは保護的であり（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８２：２３５０−２３５７）、それを筋肉内適用した場合には保護的ではないが、これらのデータから、ＲＳＶ  Ｇが保護応答を誘導するのに好適な抗原であることは明らかである。さらなる活性成分はまた、例えばウイルス、細菌、寄生生物などの他の病原体に由来する非ＲＳＶ抗原を含むことができる。さらなる活性成分の投与は、例えば、個別投与によって行われても、本発明のワクチンおよびさらなる活性成分のワクチンの併用製品を投与することによって行われてもよい。特定の実施形態では、さらなる非アデノウイルス抗原を（ＲＳＶ．Ｆに加えて）、本発明のベクターにコードすることができる。したがって、特定の実施形態では、単一のアデノウイルスから１種を超えるタンパク質の発現が望ましい可能性があり、そのような場合、例えばより多くのコード化配列が結合されて、単一の発現カセットから単一の転写産物が形成され得るか、または、アデノウイルスゲノムの異なる部分内にクローン化された２つの別個の発現カセット内に存在し得る。
【００５６】
本発明の組成物、例えばアデノウイルス組成物は、対象、例えばヒト対象に投与することができる。１回の投与の間に対象に提供されるアデノウイルスの総用量は、当業者に知られているように変化させることができ、一般に１×１０７ウイルス粒子（ｖｐ）〜１×１０１２ｖｐ、好ましくは１×１０８ｖｐ〜１×１０１１ｖｐ、例えば３×１０８〜５×１０１０ｖｐ、例えば１０９〜３×１０１０ｖｐである。
【００５７】
組成物の投与は、標準的な投与経路を用いて行うことができる。非限定的な実施形態は、注射などによる非経口投与、例えば皮内、筋内など、または皮下、経皮、または粘膜投与、例えば鼻腔内、経口などを含む。鼻腔内投与は、一般に、ＲＳＶに対するワクチンの好ましい経路と見なされている。生鼻腔内法の最も重要な利点は、局所呼吸器免疫の直接刺激および付随する疾患増強の欠如である。現在、小児への使用で臨床評価されている唯一のワクチンは、生鼻腔内ワクチンである（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ．「Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ」ｉｎ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４：Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ（Ｅｄ．Ｃａｎｅ，Ｐ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｐｐ２３３−２７７）。鼻腔内投与は、本発明によれば同様に適切な好ましい経路である。筋内投与の利点は、簡単でかつ十分に確立されていることであり、６カ月未満の乳児に対する鼻腔内適用の安全性の懸念がないことである。一実施形態では、組成物は、例えば、腕の三角筋、または大腿の外側広筋への筋肉内注射によって投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、組成物、例えばワクチンを投与する様々な可能性を認識している。
【００５８】
本明細書で使用する対象は、好ましくは哺乳動物、例えば、げっ歯類、例えばマウス、コットンラットなど、または非ヒト霊長類、またはヒトである。対象は、好ましくは、ヒト対象である。対象は、任意の年齢、例えば約１月齢〜１００年齢、例えば約２月齢〜約８０年齢、例えば約１月齢〜約３年齢、約３年齢〜約５０年齢、約５０年齢〜約７５年齢などであり得る。
【００５９】
本発明の１種以上の組成物、例えばワクチンの１回以上の追加免疫投与を提供することも可能である。追加免疫ワクチン接種を行う場合、一般に、そのような追加免疫ワクチン接種は、組成物を対象に最初に投与（これは、こうした場合、「初回ワクチン接種」と称される）した後、１週間〜１年、好ましくは２週間〜４カ月の時点で、同じ対象に投与されるであろう。代替の追加免疫レジメンでは、異なるベクター、例えば異なるセロタイプの１つ以上のアデノウイルス、またはＭＶＡなどの他のベクター、またはＤＮＡ、またはタンパク質を、初回ワクチン接種の後で対象に投与することも可能である。例えば、初回免疫として融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えアデノウイルスベクターを対象に投与し、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む組成物で追加免疫することが可能である。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質はまた、融合前コンフォメーションで安定化される。
【００６０】
特定の実施形態では、投与は、初回免疫投与および少なくとも１回の追加免疫投与を含む。特定の実施形態では、組成物は、初回免疫−追加免疫ワクチン接種レジメンにおいて、初回免疫組成物として、および／または追加免疫組成物として投与される。その特定の実施形態では、初回免疫投与は、ＲＳＶ  ｐｒｅ−Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含むｒＡｄ３５（「ｒＡｄ３５−ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆ」）を用い（ＲＳＶ  Ｆ  ｐｒｅ−Ｆタンパク質は配列番号１または２のアミノ酸配列を含む）、追加免疫投与は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を含むｒＡｄ２６（「ｒＡｄ２６−ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆ」）を用いる（ＲＳＶ  ｐｒｅ−Ｆタンパク質は配列番号１または２のアミノ酸配列を含む）。その、他の実施形態では、初回免疫投与はｒＡｄ２６−ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆを用い、追加免疫投与はｒＡｄ３５−ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆを用いる。他の実施形態では、初回免疫投与および追加免疫投与の両者とも、ｒＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆを用いる。特定の実施形態では、初回免疫投与はｒＡｄ２６−ＲＳＶ．ｐｒｅ−ＦまたはｒＡｄ３５−ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆを用い、追加免疫投与はＲＳＶ  Ｆタンパク質を用いる。これらの全ての実施形態で、同じまたは他のベクターまたはタンパク質を用いてさらなる追加免疫投与を提供することが可能である。ＲＳＶ  Ｆタンパク質を用いる追加免疫が特に有益となり得る実施形態には、例えば、５０歳以上のリスク群（例えば、ＣＯＰＤまたは喘息に罹患）の高齢対象、または例えば６０歳以上もしくは６５歳以上の健常対象におけるものが含まれる。
【００６１】
特定の実施形態では、投与は、さらなる（追加免疫）投与なしでの、本発明による組成物の単回投与を含む。そのような実施形態は、初回免疫−追加免疫レジメンと比較して、単回投与レジメンでは複雑性および費用が低減される点で有利である。本明細書の実施例におけるコットンラットモデルでは、本発明の組換えアデノウイルスベクターの単回投与後、追加免疫投与を行わなくとも、完全な防御が既に観察されている。
【００６２】
さらなる態様では、本発明はさらに、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを作製する方法であって、ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む組換えヒトアデノウイルスを用意する工程と、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養物中で増殖させる工程と、組換えアデノウイルスを単離および精製する工程と、組換えアデノウイルスを薬学的に許容される組成物で製剤化する工程とを含み、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は配列番号１または２のアミノ酸配列を含む方法を提供する。
【００６３】
組換えアデノウイルスは、アデノウイルスで感染させた宿主細胞の細胞培養を含む、よく知られた方法に従って宿主細胞内で調製および増殖され得る。細胞培養は、付着細胞培養、例えば培養容器の表面またはマイクロキャリアに付着した細胞、および懸濁培養を含む、いかなるタイプの細胞培養であってもよい。
【００６４】
大抵の大規模懸濁培養は、操作およびスケールアップが最も簡単であるため、バッチ法または流加法として操作される。最近、灌流原理に基づいた連続法がより一般的となり始め、好適でもある（例えば、国際公開第２０１０／０６０７１９号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０９８５９２号パンフレットを参照。これらには大量の組換えアデノウイルスの獲得および精製に好適な方法が記載されており、いずれも参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６５】
プロデューサー細胞は培養されて、細胞およびウイルスの数、ならびに／またはウイルス力価を増大させる。細胞の培養は、本発明による目的ウイルスの代謝、および／または成長、および／または分裂、および／または生成を可能にするように行われる。これは、当業者によく知られた方法により達成することができ、限定はされないが、例えば適切な培養培地中で細胞に栄養素を供給することを含む。好適な培養培地は当業者によく知られており、一般に、商業的供給源から大量に得られ、または標準的なプロトコルに従ってカスタムメイドすることができる。培養は、例えば、バッチ、流加、連続系などを使用して、シャーレ、ローラーボトルまたはバイオリアクター内で行うことができる。細胞を培養するための好適な条件は知られている（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）、およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９を参照）。
【００６６】
通常、アデノウイルスは、培養物中の適切なプロデューサー細胞に暴露され、ウイルスが取り込まれる。通常、最適な撹拌は約５０〜３００ｒｐｍ、典型的には約１００〜２００、例えば約１５０であり、典型的なＤＯは２０〜６０％、例えば４０％であり、最適ｐＨは６．７〜７．７であり、最適温度は３０〜３９℃、例えば３４〜３７℃であり、最適ＭＯＩは５〜１０００、例えば約５０〜３００である。典型的には、アデノウイルスはプロデューサー細胞に自然に感染し、細胞を感染させるのには、プロデューサー細胞をｒＡｄ粒子と接触させれば十分である。一般に、アデノウイルスのシードストックを培養液に加えて感染を開始させ、その後、アデノウイルスはプロデューサー細胞内で増殖する。これらは全て当業者にはルーチン的である。
【００６７】
アデノウイルスの感染後、ウイルスは細胞内で複製し、それにより増幅され、このプロセスは、本明細書ではアデノウイルスの増殖と称される。アデノウイルス感染は最終的には、感染した細胞の溶解をもたらす。したがってアデノウイルスの溶解特性はウイルス産生の２つの異なるモードを可能にする。第１のモードは、細胞を溶解するのに外部因子を使用し、細胞溶解に先立ってウイルスを回収することである。第２のモードは、生成されたウイルスによって（殆ど）完全に細胞が溶解した後に、ウイルス上清を回収することである（例えば、外部因子によって宿主細胞を溶解しないアデノウイルスの回収を記載している米国特許第６，４８５，９５８号明細書を参照）。外部因子を使用して、細胞を積極的に溶解してアデノウイルスを回収することが好ましい。
【００６８】
積極的な細胞溶解に使用することができる方法は、当業者に知られており、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．２８−３５に論じられている。これに関する有用な方法は、例えば、凍結融解、固体せん断、高張および／または低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出、洗浄剤溶解、上記の組み合わせなどである。本発明の一実施形態では、細胞は、少なくとも１種の洗浄剤を使用して溶解する。溶解のための洗浄剤の使用は、方法が容易であること、および容易に拡大可能であることの利点を有する。
【００６９】
使用できる洗浄剤、およびその使用方法は、一般に当業者に知られている。いくつかの例が、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ２９−３３で論じられている。洗浄剤としては、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性および非イオン性洗浄剤を挙げることができる。洗浄剤の濃度は、例えば約０．１％〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内で変動してもよい。一実施形態では、使用する洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００７０】
ヌクレアーゼを使用して、混入核酸、すなわち、ほとんどがプロデューサー細胞由来の核酸を除去することができる。本発明での使用に好適なヌクレアーゼの例としては、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）、または当該技術分野内で一般に使用されている任意のその他のＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅが挙げられる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）であり、これは特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合の加水分解によって核酸を迅速に加水分解し、それにより細胞溶解産物の粘度を低下させる。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから商業的に入手し得る（コードＷ２１４９５０）。ヌクレアーゼが使用される濃度は、好ましくは１〜１００単位／ｍｌの範囲内である。ヌクレアーゼ処理の代替として、またはヌクレアーゼ処理に加えて、アデノウイルスの精製中に、ドミフェン臭化物などの選択的沈澱剤を使用して、アデノウイルス調製物から宿主細胞ＤＮＡを選択的に沈殿除去することも可能である（例えば、米国特許第７，３２６，５５５号明細書；Ｇｏｅｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９１：１２−２１；国際公開第２０１１／０４５３７８号パンフレット；国際公開第２０１１／０４５３８１号パンフレットを参照）。
【００７１】
プロデューサー細胞の培養物からアデノウイルスを回収する方法は、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットに広範に記載されている。
【００７２】
特定の実施形態では、回収されたアデノウイルスは、さらに精製される。アデノウイルスの精製は、数工程で行うことができ、例えば国際公開第０５／０８０５５６号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーションまたはクロマトグラフィーを用いた分離を含む。清澄化は、ろ過工程により行うことができ、細胞溶解物から細胞デブリおよび他の不純物を除去する。限外ろ過は、ウイルス溶液の濃縮に使用される。限外ろ過装置を使用するダイアフィルトレーション、または緩衝液交換は、塩、糖などの除去および交換のための一方法である。当業者は、各精製工程の最適な条件を見出す方法を知っている。国際公開第９８／２２５８８号パンフレット（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）も、アデノウイルスベクターの生成および精製方法を記載している。これらの方法は、宿主細胞を成長させ、この宿主細胞をアデノウイルスで感染させ、この宿主細胞を回収および溶解し、粗溶解物を濃縮し、粗溶解物の緩衝液を交換し、この溶解物をヌクレアーゼで処理し、クロマトグラフィーを用いてウイルスをさらに精製することを含む。
【００７３】
好ましくは、精製には、例えば国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．６１−７０に論じられているように、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程が使用される。アデノウイルスのさらなる精製に関して多数のプロセスが記載されており、当該プロセスにはクロマトグラフィー工程が含まれている。当業者は、これらのプロセスを知っており、プロセスを最適化するために、クロマトグラフ工程の厳密な使用法を変更することができる。例えば、アニオンイオン交換クロマトグラフィー工程によりアデノウイルスを精製することが可能であり、例えば、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレット、およびＫｏｎｚ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６：１３４６−１３５３を参照されたい。多数の他のアデノウイルス精製方法が報告されており、これらは当業者の手の届く範囲にある。アデノウイルスを生成および精製するさらなる方法は、例えば（国際公開第００／３２７５４号パンフレット；国際公開第０４／０２０９７１号パンフレット；米国特許第５，８３７，５２０号明細書；米国特許第６，２６１，８２３号明細書；国際公開第２００６／１０８７０７号パンフレット；Ｋｏｎｚ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４３４：１３−２３；Ａｌｔａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９９：１９３−２６０）に開示されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
ヒトに投与するために、本発明は、ｒＡｄと薬学的に許容される担体または賦形剤含む医薬組成物を用い得る。この場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体または賦形剤が、使用する投与量および濃度で、それらを投与する対象に望ましくない影響も悪影響も何ら引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照）。精製されたｒＡｄは、好ましくは滅菌溶液として処方されて投与されるが、凍結乾燥製剤を利用することも可能である。滅菌溶液は、滅菌ろ過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によって調製される。その後、溶液は凍結乾燥されるか、または医薬投与容器に充填される。溶液のｐＨは、一般にｐＨ３．０〜９．５、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲内である。ｒＡｄは、通常、好適な薬学的に許容される緩衝剤を含む溶液中にあり、ｒＡｄの溶液は塩を含有することもある。任意選択により、アルブミンなどの安定剤が含まれる。特定の実施形態では、洗浄剤が添加される。特定の実施形態では、ｒＡｄは注射用調製物として製剤してもよい。これらの製剤は有効量のｒＡｄを含み、滅菌液体溶液、液体懸濁液または凍結乾燥バージョンのいずれかであり、任意選択により安定剤または賦形剤を含有する。アデノウイルスワクチンはまた、鼻腔内投与用にエアロゾル化されてもよい（例えば、国際公開第２００９／１１７１３４号パンフレットを参照）。
【００７５】
例えば、アデノウイルスは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｍａｒｃｈ  ２００２，ｐ．４３−４８）にも使用される緩衝液：２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール中に保存することができる。ヒトへの投与に好適な他の有用な製剤緩衝液は、２０ｍＭのトリス、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖのスクロース、０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０である。他の多くの緩衝液を使用できることは明らかであり、保存、および精製（アデノ）ウイルス調製物の医薬品としての投与に好適な製剤の例は、例えば欧州特許第０８５３６６０号明細書、米国特許第６，２２５，２８９号明細書、および国際特許出願の国際公開第９９／４１４１６号パンフレット、国際公開第９９／１２５６８号パンフレット、国際公開第００／２９０２４号パンフレット、国際公開第０１／６６１３７号パンフレット、国際公開第０３／０４９７６３号パンフレット、国際公開第０３／０７８５９２号パンフレット、国際公開第０３／０６１７０８号パンフレットに見出すことができる。
【００７６】
以下の実施例で本発明をさらに説明する。実施例は、決して本発明を限定するものではない。それらは、発明を明確にする役割を果たすのみである。
【実施例】
【００７７】
実施例１．ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションでの安定化
塩基性ＲＳＶ  Ｆ配列をコードするプラスミドを合成し、部位特異的変異誘発によりアミノ酸置換をタンパク質に導入した。タンパク質変異体を、ＨＥＫ２９３細胞内で一時的に発現させた。細胞表面上の相対的なタンパク質発現を、フローサイトメトリーによって評価した。融合前コンフォメーションでのＦタンパク質の安定性を、熱安定性アッセイで評価した。
【００７８】
ＲＳＶ  Ａ２  Ｆタンパク質変異体に使用したタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＯ８３３０１．１から読み出した。アミノ酸置換を部位特異的変異誘発によって配列に導入した（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。変異誘発プライマーを、オンラインツールＰｒｉｍｅｒＸを用いて設計した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＣＲＬ−１１２６８）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入し、標準的な細胞培養条件下（３７℃、１０％ＣＯ２）で培養した。
【００７９】
完全長ヒトＩｇＧ１抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０３を、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）可変領域を単一のＩｇＧ１発現ベクターにクローニングすることによって構築した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）をＩｇＧ１発現コンストラクトでトランスフェクトし、ＰＯＲＯＳ  Ｍａｂｃａｐｔｕｒｅ  Ａクロマトグラフィー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、培養物上清からの発現抗体を精製し、その後、緩衝液を５０ｍＭ  ＮａＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５に交換した。抗体濃度を２８０ｎｍでの光吸収によって測定した。抗体の質も、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動によって確認した。抗体ＣＲ９５０１は、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合し、融合後コンフォメーションには結合しない５８Ｃ５（ＷＯ２０１１／０２００７９に記載されているような）のＶＨおよびＶＬ領域を含む。ＣＲ９５０３は、ＲＳＶ  Ｆの融合前および融合後コンフォメーションの両方を認識するモタビズマブのＶＨおよびＶＬ領域を含む。
【００８０】
タンパク質の発現および温度処理：
供給業者の推奨に従って２９３ｆｅｃｔｉｎｅ（カタログ番号１２３４７−０１９）トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、接着性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にプラスミドを一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ＥＤＴＡ含有ＦＡＣＳ緩衝液（トリプシン含まず、次の節を参照）で剥離することによって細胞を回収し、温度安定性実験のために、水浴またはＰＣＲブロックで１０分間、細胞懸濁液を熱処理した。熱処理後、細胞をフローサイトメトリー分析のために調製した。
【００８１】
アデノ発現Ｆタンパク質の分析のために、Ａｄ２６ウイルスを１００００または５０００ＭＯＩで、またＡｄ３５ウイルスを５０００、２５００または１２５０ＭＯＩで、Ａ５４９細胞に感染させた。４８時間後、細胞を剥離し、３７℃、５０℃および５６℃で１５分間熱処理した。熱処理終了後、ＣＲ９５０１−Ａｌｅｘａ６４７またはＣＲ９５０３−Ａｌｅｘａ６４７およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて細胞を染色した。染色後、細胞を固定し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ  ＩＩ細胞分析器を用いて分析した。
【００８２】
フローサイトメトリー分析：
それぞれの染色には、以下の対照を含めた：１）陰性対照試料。すなわち、いかなる処理にも供されず、フルオロフォアで標識されたいかなる抗体でも染色されなかった細胞；２）陽性対照試料、すなわち、１つのフルオロフォア（実験のために使用されるものの１つ）でのみ染色された細胞。
【００８３】
細胞をフローサイトメトリー（ＦＣ緩衝液、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中１％ＦＢＳ）に再懸濁し、蓋付き９６ウェルプレート（Ｕ底またはＶ底プレート）に１ウェルあたり５０μｌの体積の細胞懸濁液を分配した。２段階または１段階の手順で染色した。
【００８４】
２段階手順の場合、５０μｌの第１のＡｂ（または陰性対照では緩衝液）をウェルに添加し、ＲＴで３０分間インキュベートした。ビオチン化ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０３を２μｇ／ｍｌで使用した（ウェル中の最終濃度は１μｇ／ｍｌ）。インキュベーション後、ＦＣ緩衝液で細胞を２回洗浄した。その後、５０μｌのストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号ＳＡ１００５、０．１ｍｇ／ｍｌを１：１００で使用）または陰性対照では緩衝液をウェルに添加し、ＲＴで３０分間インキュベートした。インキュベーション後、再度、ＦＣ緩衝液で細胞を２回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を１００μｌのＦＣ緩衝液＋／−ライブ−デッド染色液（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＰＩ、カタログ番号Ｐ１３０４ＭＰ、２μｇ／ｍｌで使用）に再懸濁し、ＲＴで１５分間インキュベートした。細胞を２００Ｇ（１０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離し、ＰＩを含む緩衝液を除去し、１５０μｌのＦＣ緩衝液に細胞を再懸濁させた。
【００８５】
１段階手順の場合、製造業者の使用説明書に従って、ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０３抗体を蛍光プローブＡｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ａ−２０１８６）で標識した。ストレプトアビジン−ＡＰＣ工程を除いて、細胞を上記手順に従って染色した。
【００８６】
生細胞集団から、ＣＲ９５０１／ＣＲ９５０３抗体結合が陽性の細胞のパーセンテージを決定した。ＣＲ９５０３結合が陽性の細胞は、それらの表面にＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現する。ＣＲ９５０１結合が陽性の細胞は、それらの表面に融合前ＲＳＶ  Ｆを発現する。
【００８７】
抗体染色の強度（メジアン蛍光強度−ＭＦＩ）は、細胞表面上のＦタンパク質の量に比例する。Ｆタンパク質を発現する生細胞集団からＭＦＩを計算した。
【００８８】
結果：
完全長Ｆタンパク質変異体の表面細胞発現：
融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質外部ドメインの発現または安定性を増加させることが以前に同定された変異のサブセットを、野生型完全長ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ配列（アクセッション番号Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＯ８３３０１）に導入した。変異を単独で、または複数の組み合わせで導入し、タンパク質の発現および安定性に対する効果を評価した。
【００８９】
タンパク質の発現レベルを、融合前および融合後の両Ｆタンパク質を認識するＣＲ９５０３抗体で染色した後、フローサイトメトリーにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定した。可溶性ＲＳＶ  ｐｒｅ−Ｆタンパク質の安定化について以前に記載された２つのアミノ酸置換（すなわち、Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐ）の組み合わせは、また、野生型完全長ＲＳＶ  Ｆと比較して、完全長ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現レベルを２．３倍増加させた（図２）。
【００９０】
発現の顕著な増加は、３つのアミノ酸置換の組み合わせを有する変異体で観察された。興味深いことに、１つの変異体に４つ以上の変異を組み合わせても、タンパク質発現をさらに増加させることはなかった。これは、Ｆタンパク質の多数のコピーを収容する細胞膜の容量が限られていることに起因しているのかもしれない。
【００９１】
細胞表面の融合前Ｆの量を、融合前特異的抗体ＣＲ９５０１で染色することにより評価した（図３）。全てのＦ変異体の細胞へのトランスフェクションは、細胞表面上に多かれ少なかれ類似した量の融合前Ｆタンパク質をもたらした。膜貫通ドメインの存在は完全長タンパク質をある程度安定化し、したがって、融合前安定性の差異は、周囲条件下では完全長Ｆタンパク質間で明らかでない。したがって、以下に記載するように、完全長変異体の安定性をより良く識別するために、熱安定性アッセイを開発した。
【００９２】
以前に報告したＦタンパク質変異体の親配列として使用されたＡ２株（国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレットおよび国際公開第２０１４／２０２５７０号パンフレット）は、２つの特有かつ稀な変異（すなわち、リジン６６およびイソロイシン７６の）を蓄積した細胞株適合実験室株である。本発明では、これら２つの残基を、天然の臨床分離株（Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６Ｖ）に適合するように変異させた。選択されたタンパク質の設計にＫ６６ＥおよびＩ７６Ｖの変異を含めた。Ｌｙｓ６６およびＩｌｅ７６を有する変異体と比較して、６６位にグルタミン酸を有する変異体（Ｋ６６Ｅ）は、わずかに高く発現する傾向を有する。残基７６でのバリンの付加（Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖの二重置換）は、Ｋ６６Ｅ置換のみを有する変異体と比較した場合、発現レベルに影響を与えない（図４）。
【００９３】
細胞表面の完全長Ｆタンパク質変異体の安定性：
短時間スケールの周囲条件では、安定化変異の異なる組み合わせを有する完全長Ｆ変異体間で、融合前コンフォメーションの安定性に有意差は観察されなかった。温度を上げることは、融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへとＲＳＶ  Ｆタンパク質をリフォールディングするための効率的なインビトロトリガーとして働くことが知られている。したがって、熱ショックアッセイを確立し、膜結合完全長タンパク質の安定性を評価するために使用した。簡単に言えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＦタンパク質コンストラクトでトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にアッセイで使用した。細胞を細胞培養皿から剥離し、細胞懸濁液を、温度を上げながら１０分間熱処理した。熱処理後、細胞を抗ＲＳＶ  Ｆ抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリーデータを２つの異なる方法で分析した。抗Ｆ抗体による染色に対して陽性である細胞のパーセンテージを分析し、陽性細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）も計算した（図５）。
【００９４】
フローサイトメトリーアッセイでは、ＣＲ９５０１（融合前Ｆタンパク質のみを認識する抗体）およびＣＲ９５０３（融合前Ｆタンパク質および融合後Ｆタンパク質の両方を認識する抗体）による染色の両方を使用した。ＣＲ９５０３抗体を陽性対照とした。Ｆタンパク質が融合前のコンフォメーションを失って、なお細胞表面上に存在する場合、そのタンパク質は依然ＣＲ９５０３抗体で検出される。両方の抗体による染色の喪失は、タンパク質が、例えば凝集により、細胞表面上で抗体結合に利用できないことを示す。
【００９５】
３つ以上のアミノ酸置換を有する完全長タンパク質をアッセイで試験し、野生型ＲＳＶ  Ｆと比較した。これらの変異体の発現が最も高く、したがってこれらの変異体は好ましい候補であった。全てのタンパク質はＮ６７ＩおよびＳ２１５Ｐ置換を含み、１つまたは２つの追加の安定化変異を加えた。
【００９６】
改変されていない野生型タンパク質は、ＣＲ９５０３抗体でかなり安定に染色された。ＣＲ９５０３染色のＭＦＩは高い温度ほど上昇したが、値の広がりも非常に大きかった。これは、熱ショック後にタンパク質の凝集が起こらなかったことを示した。融合前コンフォメーションの半分は約５５℃での細胞のインキュベーション後に失われ、６０℃でのインキュベーション後には、高温熱ショック後の野生型Ｆ試料へのＣＲ９５０１結合の減少が示すように、全ての融合前コンフォメーションは失われた。
【００９７】
試験した全ての融合前Ｆタンパク質変異体は、ＣＲ９５０１染色の大部分がより高い温度での処理後も保持されており、野生型ＲＳＶ  Ｆよりも安定であった（図５および６）。Ｋ４９８Ｒアミノ酸置換を有するタンパク質は、他のものよりも安定性が低かった。さらに、Ｋ６６Ｅ変異の付加は、Ｋ４９８Ｒアミノ酸置換を有する変異体も他のものと同程度に安定になるのと同じく、タンパク質を安定化させ、６０℃での融合前コンフォメーションの損失は観察されなかった。組み合わされたＫ６６ＥおよびＩ７６Ｖを含む、安定化変異の選択された組み合わせのみを試験した。陽性細胞のパーセントの分析では、試験した４つのタンパク質は全て安定であったが、ＭＦＩの分析では、Ｋ４９８Ｒを有する変異体は６０℃での処理後にＣＲ９５０１結合に明らかな減少を示し、この変異体は温度ストレスアッセイで評価した場合、安定が低いことが示された。
【００９８】
結論として、３つの安定化変異の組み合わせ（Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐを含む）が、高い発現レベルおよび安定性に十分であると考えられた。Ｓ４６ＧまたはＤ４８６Ｎ変異が、タンパク質構造におけるそれらの位置を理由に、第３の安定化変異として選択された。Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖは、タンパク質の発現および安定性に対して負の効果を有さず、天然に存在するものにより近い配列を作製するので、含められた。
【００９９】
したがって、変異Ｋ６６Ｅ、Ｎ６７Ｉ、Ｉ７６Ｖ、Ｓ２１５ＰおよびＤ４８６Ｎを有する融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質（Ｆ２．２）（配列番号２）、ならびに変異Ｋ６６Ｅ、Ｎ６７Ｉ、Ｉ７６Ｖ、Ｓ２１５ＰおよびＳ４６Ｇを有する融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質（Ｆ２．１）（配列番号１）が、アデノウイルスベクターの構築のために選択された。これらのタンパク質は６０℃までの温度安定性アッセイにおいて融合前コンフォメーションで安定であり、かつ高レベルで発現されることが示された。
【０１００】
実施例２．アデノウイルスベクターの調製
Ａｄ３５およびＡｄ２６のＥ１領域へのＲＳＶ  Ｆ遺伝子のクローニング：
本発明の融合前Ｆタンパク質をコードする核酸配列は、Ｇｅｎｅａｒｔにより、ヒトでの発現のために遺伝子が最適化され、合成された。コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ３’）をＡＴＧ開始コドンの直前に含め、２つの停止コドン（５’ＴＧＡ  ＴＡＡ３’）をＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆコード配列の終端に付加した。ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を介して、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵプラスミドおよびｐＡｄＡｐｔ２６プラスミドに挿入した。
【０１０１】
細胞培養：
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
【０１０２】
アデノウイルスの生成、感染、および継代：
全てのアデノウイルスを、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞中で、単一の相同組換えにより生成し、以前に報告されているように生成した（ｒＡｄ３５では：Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；ｒＡｄ２６では：Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：４６５４−４６６３）。簡単に記すと、ＰＥＲ．Ｃ６細胞に、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が提供する説明書に従い、リポフェクタミンを使用して、Ａｄベクタープラスミドをトランスフェクトした。例えば、ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆ導入遺伝子発現カセットを有するＡｄ３５ベクターのレスキューでは、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．ＲＳＶ．ｐｒｅ−ＦプラスミドおよびｐＷＥ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．５ｏｒｆ６コスミドを使用し、ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆ導入遺伝子発現カセットを有するＡｄ２６ベクターでは、ｐＡｄＡｐｔ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅ−ＦプラスミドおよびｐＷＥ．Ａｄ２６．ｄＥ３．５ｏｒｆ６．コスミドを使用した。細胞を、完全なＣＰＥの１日後に回収し、凍結融解し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、−２０℃で保存した。次に、ウイルスをプラーク精製し、マルチウェル２４組織培養プレートの単一ウェル上で培養したＰＥＲ．Ｃ６中で増幅させた。Ｔ２５組織培養フラスコおよびＴ１７５組織培養フラスコを使用して培養したＰＥＲ．Ｃ６中でさらに増幅させた。Ｔ１７５粗溶解物のうちの３〜５ｍｌを使用して、７０％コンフルエント層のＰＥＲ．Ｃ６細胞を含有する２０×Ｔ１７５三層組織培養フラスコに接種した。ウイルスを、２段階ＣｓＣｌ精製法を使用して精製した。最終的に、ウイルスを一定分量に分割して−８５℃で保存した。
【０１０３】
実施例３．インビボでの融合前ＲＳＶ  Ｆを発現する組換えアデノウイルスセロタイプ２６および３５を用いたＲＳＶ  Ｆに対する免疫の誘導。
Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１およびＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ．２．２の免疫原性をマウスで評価し、細胞性および体液性免疫応答を、同一用量のＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２（すなわち、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現）によって誘導される応答と比較した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群当たりｎ＝４）を、１０８〜１０１０個のウイルス粒子（ｖｐ）、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２またはＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１またはＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２の示された用量で、または製剤緩衝液で免疫を付与した。初回免疫から８週後に、ＥＬＩＳｐｏｔを用い、１０６脾細胞当たりＲＳＶ  Ｆ  Ａ２特異的ＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）数を決定した。Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２と比較すると、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１およびＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ．２．２では、広い中和能を有し、かつ細胞応答を維持しながらマウスの体液性免疫応答の誘導が増加することが示された。Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１およびＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ．２．２による単回筋肉内免疫付与は、ＩＦＮγ、ＩＬ２および／またはＴＮＦαに対して陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導によって特徴付けられる（データは示さず）細胞応答を誘発した（図７）。
【０１０４】
細胞応答の量および質は、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ．２．２およびＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２の間で同等であった。対照的に、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１およびＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ．２．２は、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２よりも有意に高いＲＳＶ中和抗体力価を誘導した。抗体応答のより厳密な分析により、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１およびＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ．２．２は、融合前Ｆに対するより高いレベルの抗体を誘導したが、一方で、融合後Ｆの力価はＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２と同等の値に留まり、その結果、ｐｒｅＦ／ｐｏｓｔＦの抗体比は有意に増加することが示された。さらに、抗体応答のＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は変化しないままであり、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２について以前に示されたのと同様の体液性応答のＴｈ１優位を示した（図８）。
【０１０５】
さらに、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２では、誘発された抗体はＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２で観察されたのと同様に、種々のＲＳＶ  ＡおよびＢ株、実験室株、ならびに臨床分離株を中和し得ることが示された（図９）。
【０１０６】
続いて、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２およびＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２ベクターコンストラクトの有効性および免疫原性を、コットンラットモデルで評価した。これらの動物はヒトＲＳＶの複製を許容し、肺におけるＲＳＶ力価は４日目および５日目にピークに達する。低用量のＲＳＶ  Ａ２で鼻腔内感染させ、それによって自然曝露を模倣した群、ならびにＦＩ−ＲＳＶで免疫付与した群を実験の対照群として含め、臨床研究において、コットンラットで重症呼吸器疾患強（ＥＲＤ）を誘導することが示された希釈で、ＥＲＤを誘導したオリジナルロット１００を使用した。
【０１０７】
用量が１０５〜１０８ｖｐ／動物の範囲のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２、または用量が１０６〜１０９ｖｐ／動物の範囲のＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２を用いて、動物の単回筋肉内免疫付与を行うと、１０５ｖｐのＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２で免疫付与した３匹の動物を除いて、ワクチン相同ＲＳＶ  Ａ２株による感染から肺を完全に防御した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。両ベクターで、ＲＳＶ複製に対する鼻の用量依存的防御が観察された。これは、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２では１０８ｖｐ／動物での完全防御から、１０５ｖｐでの部分防御までの範囲にわたったが、Ａｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２では１０９ｖｐで免疫付与した動物の鼻部はＲＳＶ  Ａ２から完全に防御され、１０６ｖｐでは部分防御が得られた（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。用量に関して分析すると、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２およびＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２で免疫付与した動物の鼻部は、両者それぞれの野生型Ｆの対応物であるＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２およびＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦＡ２で免疫付与した場合よりもＲＳＶ  Ａ２からの防御が良好であった（ｐ＝０．０００３およびｐ＝０．０００１）。ＲＳＶ感染からの防御は、ＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇに対するウイルス中和力価の用量依存的誘導を伴うが、これは最低用量のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２またはＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２の適用により既に誘発されている（図１０Ｅおよび１０Ｆ）。ＶＮＡ  Ａ  Ｌｏｎｇの力価について用量に関して統計的な比較を行うと、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２はＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２より免疫原性が高い（ｐ＝０．０４１４）が、ＶＮＡ力価の誘発はＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２とＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦＡ２との間で有意差はなかった。
【０１０８】
さらに、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦおよびＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦは、試験したいずれの濃度でも、ＲＳＶ  Ａ２チャレンジ後に重症呼吸器疾患（ＥＲＤ）の組織病理学的徴候を誘導しないことが示された。コットンラットは、ＥＲＤをモニターするのに最も多く使用され、最もよく研究されているモデルである。この動物モデルで、ＦＩ−ＲＳＶによるワクチン接種は、ＲＳＶチャレンジ後にＥＲＤを一貫して誘導し、これは、主に好中球浸潤物からなる肺胞炎、および主にリンパ球浸潤物からなる細気管支周囲炎のようなパラメータについて、感染した肺の切片の組織病理学的分析を行うことによって可視化される。コットンラットでは、これらのパラメータに対するＦＩ−ＲＳＶ誘導スコアは、ＲＳＶ感染後１日目から観察することができ、ＲＳＶチャレンジ後４〜５日目にピークに達する。
【０１０９】
ＲＳＶ  Ａ２チャレンジ後の５日間、肺の炎症変化（細気管支周囲炎、血管周囲炎、間質性肺炎、肺胞炎）の４つのパラメータをスコア化することによって、ＥＲＤを分析した。ＦＩ−ＲＳＶによる免疫付与は、ほとんどの組織病理学的マーカーについてスコアの増加をもたらし、これは肺胞炎について特に明らかであり（図１１）、このマーカーは、以前にＥＲＤに対して最も識別性のあるマーカーであることが示されたものである。初回免疫のみのレジメンで、ＲＳＶチャレンジ後にＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２またはＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２により免疫を付与した動物では、低親和性および／または低レベルの抗体を誘導し得る低ワクチン用量でさえ、肺胞炎または任意の他のＥＲＤ組織病理学的マーカーの増加は観察されなかった（図１１）。これは、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２およびＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦＡ２ベクターを用いた我々の先の結果を確認するものである。
【０１１０】
したがって、本発明によれば、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦおよびＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦは、融合前コンフォメーションで安定化されるＲＳＶ  Ｆ  Ａ２を発現する、強力なアデノウイルスベクターであることが示された。これらのベクターは、強力な体液性および細胞性免疫応答を誘導する。誘発された免疫応答は、ＲＳＶ  Ａ２のチャレンジに対して保護的であり、ＲＳＶの臨床分離株および実験室分離株に対してインビトロで広範囲のウイルス中和を提供する。ワクチン接種した動物のＲＳＶ曝露後に、コットンラットでＥＲＤ誘導は観察されず、したがって、野生型ＲＳＶ  Ｆ  Ａ２抗原をコードするＡｄ２６およびＡｄ３５で得られたデータが裏付けられた。マウスでもコットンラットでも、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦまたはＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦの注射後に反応原性の明白な徴候を示さなかった。
【０１１１】
表１．本発明の核酸分子によってコードされるＲＳＶ融合前Ｆタンパク質のアミノ酸配列（変異には下線が引かれている）
配列番号１：ＲＳＶ  ｐｒｅＦ２．１アミノ酸配列：
【化１】
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配列番号２：ＲＳＶ  ｐｒｅＦ２．２アミノ酸配列：
【化２】
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【０１１２】
表２．本発明の好ましい核酸分子のヌクレオチド配列
配列番号３：ＲＳＶ  Ｆ  ｐｒｅ−Ｆ２．１融合前タンパク質ＰｒｅＦ２．１をコードするコドン最適化核酸
【化３】
2019510497.tif 000004
配列番号４：ＲＳＶ  Ｆ  ｐｒｅ−Ｆ２．２融合前タンパク質ＰｒｅＦ２．２をコードするコドン最適化核酸
【化４】
2019510497.tif 000005
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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