(57)【要約】哺乳動物の炎症性腸疾患を治療または予防するための方法で使用するための、過酸化水素または過酸化水素発生体系を含む送達系が記載されている。この方法は、哺乳動物に送達系を経口投与するステップを含み、送達系は、経口送達のために、および哺乳動物胃腸管の標的位置において過酸化水素または過酸化水素発生体系をｉｎ  ｓｉｔｕで放出するように製剤化されている。また、過酸化水素または過酸化水素発生体系を含む経口投薬送達系であって、送達系は、哺乳動物への経口投与のために、および哺乳動物胃腸管内の標的位置において過酸化水素または過酸化水素発生体系を放出するように構成されており、それにより哺乳動物の腸または哺乳動物の気道の標的位置での過酸化水素レベルの局所的増加を達成する経口投薬送達系が記載されている。
2019510805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の炎症性腸疾患を治療または予防するための方法で使用するための、過酸化水素または過酸化水素発生体系を含む送達系であって、前記方法は、前記哺乳動物に前記送達系を経口投与するステップを含み、前記送達系は、経口送達のために、および哺乳動物胃腸管の標的位置において前記過酸化水素または過酸化水素発生体系をｉｎ  ｓｉｔｕで放出するように製剤化されている送達系。
【請求項２】
前記送達系は、結腸において前記過酸化水素または前記過酸化水素発生体系をｉｎ  ｓｉｔｕで放出するように製剤化されている、請求項１に記載の使用のための請求項１に記載の送達系。
【請求項３】
前記過酸化水素発生体系は、前記哺乳動物胃腸管の標的位置においてｉｎ  ｓｉｔｕで反応して、過酸化水素を産生するように構成されている酵素および基質を含む、請求項１に記載の使用のための請求項１または２に記載の送達系。
【請求項４】
前記基質がグルコースであり、前記酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項１に記載の使用のための請求項３に記載の送達系。
【請求項５】
前記過酸化水素発生体系は、実質的に水を含まない、請求項１に記載の使用のための請求項３または４に記載の送達系。
【請求項６】
前記過酸化水素発生体系は、前記胃腸管の前記標的位置での前記酵素および基質の放出前は、前記酵素および基質を別々にしておくように構成されている、請求項１に記載の使用のための請求項３から５のいずれかに記載の送達系。
【請求項７】
前記酵素は、第１の微粒子組成物として提供されており、前記基質は、第２の微粒子組成物として提供されている、請求項１に記載の使用のための請求項６に記載の送達系。
【請求項８】
前記第１の微粒子組成物および第２の微粒子組成物は各々独立して、マイクロ粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、および顆粒状粒子から選択される、請求項１に記載の使用のための請求項７に記載の送達系。
【請求項９】
前記第１の微粒子組成物および第２の微粒子組成物は、前記胃腸管内の標的位置で前記組成物を放出するように構成されている容器内に含有されている、請求項１に記載の使用のための請求項７または８に記載の送達系。
【請求項１０】
前記容器は、腸溶性コーティングである、請求項１に記載の使用のための請求項９に記載の送達系。
【請求項１１】
前記第１の微粒子組成物の粒子は、腸溶性コーティングを有し、前記第２の微粒子組成物の粒子は、腸溶性コーティングを有する、請求項１に記載の使用のための請求項７から１０のいずれかに記載の送達系。
【請求項１２】
前記送達系は、過酸化水素を含む、請求項１に記載の使用のための請求項１または２に記載の送達系。
【請求項１３】
前記送達系は、前記胃腸管の前記標的位置において前記過酸化水素をｉｎ  ｓｉｔｕで遅延放出するように構成されているポリマー性マトリックスを含む、請求項１に記載の使用のための請求項１２に記載の送達系。
【請求項１４】
前記過酸化水素発生体系は、哺乳動物上皮組織を局所刺激して、前記胃腸管の前記標的位置において過酸化水素をｉｎ  ｓｉｔｕで産生することが可能な活性作用剤を含む、請求項１に記載の使用のための請求項１または２に記載の送達系。
【請求項１５】
前記活性作用剤は、ＮＯＸ１またはＤＵＯＸ２発現および／または活性を増強するアゴニストである、請求項１に記載の使用のための請求項１４に記載の送達系。
【請求項１６】
前記ＮＯＸ１アゴニストは、Ｔｏｌｌ受容体アゴニスト、プロテインキナーゼＣ刺激因子、または微生物由来の刺激から選択される、請求項１５に記載の送達系。
【請求項１７】
前記ＤＵＯＸ２アゴニストは、Ｇタンパク質共役受容体の刺激によりカルシウム放出またはカルシウム流入を誘導することが可能な作用剤、ならびにＤＵＯＸ２および／またはＤＵＯＸＡ２を上方制御することが可能な作用剤から選択される、請求項１５に記載の送達系。
【請求項１８】
前記過酸化水素発生体系は、過酸化水素を産生する細菌である、請求項１に記載の使用のための請求項１または２に記載の送達系。
【請求項１９】
前記細菌は、過酸化水素を過剰発現するように遺伝子操作されている、請求項１に記載の使用のための請求項１８に記載の送達系。
【請求項２０】
前記送達系は、前記胃腸管の前記標的位置において５ｎｍｏｌから２０μｍｏｌの過酸化水素をｉｎ  ｓｉｔｕで放出または生成するように構成されている、請求項１に記載の使用のための請求項１から１９のいずれかに記載の送達系。
【請求項２１】
前記炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎である、請求項１に記載の使用のための請求項１から２０のいずれかに記載の送達系。
【請求項２２】
前記炎症性腸疾患は、クローン病である、請求項１に記載の使用のための請求項１から２０のいずれかに記載の送達系。
【請求項２３】
前記送達系は、前記疾患の症状の急性再発を予防するために、前記疾患の寛解期中に投与される、請求項１、２１、または２２に記載の使用のための請求項１から２０のいずれかに記載の送達系。
【請求項２４】
過酸化水素または過酸化水素発生体系を含む経口投薬送達系であって、前記送達系は、哺乳動物への経口投与のために、および哺乳動物胃腸管内の標的位置において前記過酸化水素または過酸化水素発生体系を放出するように構成されており、それにより前記哺乳動物の腸の前記標的位置での過酸化水素レベルの局所的増加を達成する経口投薬送達系。
【請求項２５】
結腸において前記過酸化水素または前記過酸化水素発生体系をｉｎ  ｓｉｔｕで放出するように製剤化されている、請求項２４に記載の送達系。
【請求項２６】
前記過酸化水素発生体系は、前記哺乳動物胃腸管の標的位置においてｉｎ  ｓｉｔｕで反応して、過酸化水素を産生するように構成されている酵素および基質を含む、請求項２４または２５に記載の送達系。
【請求項２７】
前記基質はグルコースであり、前記酵素はグルコースオキシダーゼである、請求項２６に記載の送達系。
【請求項２８】
前記過酸化水素発生体系は、実質的に水を含まない、請求項２５、２６、または２７に記載の送達系。
【請求項２９】
前記過酸化水素発生体系は、前記胃腸管の前記標的位置での前記酵素および基質の放出前は、前記酵素および基質を別々にしておくように構成されている、請求項２６から２８のいずれかに記載の送達系。
【請求項３０】
前記酵素は、第１の微粒子組成物として提供されており、前記基質は、第２の微粒子組成物として提供されている、請求項２９に記載の送達系。
【請求項３１】
前記第１の微粒子組成物および第２の微粒子組成物は各々独立して、マイクロ粒子、ナノ粒子、および顆粒状粒子から選択される、請求項３０に記載の送達系。
【請求項３２】
前記第１の微粒子組成物および第２の微粒子組成物は、前記胃腸管内の標的位置で前記組成物を放出するように構成されている容器内に含有されている、請求項３０または３１に記載の送達系。
【請求項３３】
前記容器は、腸溶性コーティングである、請求項３２に記載の送達系。
【請求項３４】
前記第１の微粒子組成物の粒子は、腸溶性コーティングを有し、前記第２の微粒子組成物の粒子は、腸溶性コーティングを有する、請求項３０から３３のいずれかに記載の送達系。
【請求項３５】
前記送達系は、過酸化水素を含む、請求項２４または２５に記載の送達系。
【請求項３６】
前記送達系は、前記胃腸管の前記標的位置において前記過酸化水素をｉｎ  ｓｉｔｕで遅延放出するように構成されているポリマー性マトリックスを含む、請求項３５に記載の送達系。
【請求項３７】
前記過酸化水素発生体系は、哺乳動物上皮組織を局所刺激して、前記胃腸管の前記標的位置において過酸化水素をｉｎ  ｓｉｔｕで産生することが可能な活性作用剤を含む、請求項２４または２５に記載の送達系。
【請求項３８】
前記活性作用剤は、ＮＯＸ１活性またはＤＵＯＸ２活性を増強するアゴニストである、請求項３７に記載の送達系。
【請求項３９】
前記ＮＯＸ１アゴニストは、Ｔｏｌｌ受容体アゴニスト、プロテインキナーゼＣ刺激因子、または微生物由来の刺激から選択される、請求項３８に記載の送達系。
【請求項４０】
前記ＤＵＯＸ２アゴニストは、Ｇタンパク質共役受容体の刺激によりカルシウム放出またはカルシウム流入を誘導することが可能な作用剤、ならびにＤＵＯＸ２および／またはＤＵＯＸＡ２を上方制御することが可能な作用剤から選択される、請求項３８に記載の送達系。
【請求項４１】
前記過酸化水素発生体系は、過酸化水素を産生する細菌である、請求項２４または２５に記載の送達系。
【請求項４２】
前記細菌は、過酸化水素を過剰発現するように遺伝子操作されている、請求項４１に記載の送達系。
【請求項４３】
前記送達系は、前記胃腸管の前記標的位置において５ｎｍｏｌから２０μｍｏｌの過酸化水素をｉｎ  ｓｉｔｕで放出または生成するように構成されている、請求項２４から４２のいずれかに記載の送達系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎およびクローン病を治療するための方法に関する。また、本発明は、胃腸管の炎症性疾患を治療するのに好適な経口薬物送達系に関する。
【背景技術】
【０００２】
障壁上皮と微生物叢との動的相互作用は、腸感染症に対する宿主の免疫応答およびその回復力を形作る。固有層およびその先にある免疫細胞集団の微生物叢誘導性プログラミングは、局所的免疫および全身性免疫に影響を及ぼし、免疫寛容に結び付く。その間の腸上皮は、物理的分離を提供するだけでなく、粘液を分泌することにより、ならびに活性酸素種（ＲＯＳ）、抗菌ペプチド、ケモカイン、およびサイトカインを放出することにより、免疫防御に関与する。共生細菌と上皮との間の絶え間ないクロストークは、栄養上の必要性を支援することにより、ならびに２次代謝産物およびパターン認識受容体に対するリガンドを提供することにより、相互に有益である。上皮シグナルは、微生物叢の組成の決定に重大な役割を果たし、それは、ひいては上皮機能を変更し、腸病原体に対する第１の応答体および防御系として作用する。病原体は、こうした栄養シグナルおよび化学シグナルを悪用して、微生物叢により媒介される定着耐性（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を克服することができ、それにより即時性で全身性の免疫応答（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘導する。感染における重要な防御系は、先天性免疫細胞および上皮によるＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ、ＤＵＯＸ）を介したＲＯＳ生成である。これは、ＮＯＸ２複合体をコードする遺伝子の機能喪失バリアントにより引き起こされる遺伝性免疫障害である慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）により例証される。ＮＯＸ２は、病原体取込み後に好中球ファゴソームで生成される殺細菌濃度のスーパーオキシドおよび関連化合物の産生に必要である。この抗菌性防御系がうまくいかないと、ＣＧＤ患者およびＮｏｘ２ノックアウトマウスで観察されるように、重度の細菌感染症および真菌感染症が生じる。また、ＮＯＸ２複合体（例えば、ＣＹＢＢ、ＣＹＢＡ、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２、ＮＣＦ４）によるＲＯＳ生成の減少は、おそらくは病原性共生生物発生、免疫感知および腸恒常性の変更のため、ならびに感染に対する感受性増加のため、クローン病様疾患および早発性小児ＩＢＤの発症のリスク因子となる。
【０００３】
腸上皮は、主にＮＡＤＰＨオキシダーゼＮＯＸ１、ＮＡＤＰＨオキシダーゼＮＯＸ３、ＮＡＤＰＨオキシダーゼＮＯＸ４、およびＮＡＤＰＨオキシダーゼＤＵＯＸ２を発現する。これらオキシダーゼは、非常により低い濃度のＲＯＳを生成するが、それらの触媒活性は、上皮シグナル伝達、粘液分泌、細菌感知、および創傷治癒応答の維持に関連している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１１０７３９５６号パンフレットＡ２
【特許文献２】欧州特許第２４１８９６８号明細書
【特許文献３】欧州特許第２０９７０７２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１６０５８７０９号明細書
【特許文献５】国際公開第２０１６００３８７０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２０１５１３２４７２号パンフレット
【特許文献７】ＧＢ２５４０１３０
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１５３４３０６７号明細書
【特許文献９】ＩＮ２８２９ＭＵ２００９
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１５１３２３４４号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００８０２００４１号明細書
【特許文献１２】米国特許第６１３２７７１号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ：ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｐｌｏｓ．ｏｒｇ／ｐｌｏｓｏｎｅ／ａｒｔｉｃｌｅ？ｉｄ＝１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４１２１７
【非特許文献２】Ｏｎｇｌｅｙ  ＳＥ，Ｂｉａｎ  Ｘ，Ｎｅｉｌａｎ  ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．３０：１１２１，２０１３
【非特許文献３】Ｇｅｌｄａｒｔ  Ｋ，Ｆｏｒｋｕｓ  Ｂ，ＭｃＣｈｅｓｎｅｙ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ９：６０，２０１６
【非特許文献４】Ａｍｉｒｉ−Ｊａｍｉ  Ｍ，  Ａｂｄｅｌｈａｍｉｄ  ＡＧ，Ｈａｚａａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３６２：１，２０１５
【非特許文献５】Ｓａｔｈｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２０１３；２５８−２６９）
【非特許文献６】Ｋｕｓｈａｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｉｎｔ．Ｒｅｓ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０１３，４（３））
【非特許文献７】Ｐｈｉｌｉｐ  ｅｔ  ａｌ（Ｏｍａｎ  Ｍｅｄ  Ｊ．２０１０，２５（２））
【非特許文献８】Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−Ｐｅｔｅｒ  Ｔａｒｃｈａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２１  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９０）
【非特許文献９】Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  ２７  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９５）
【非特許文献１０】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｌｉｄｅｓｈａｒｅ．ｎｅｔ／Ｂａｌｉｍｕｓａｌｅ／ｏｒａｌ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｄｒｕｇ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｙｓｔｅｍ
【非特許文献１１】Ｂｒａｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７９（２０１５），１０２−１１１
【非特許文献１２】Ｔａｍｂｕｗａｌａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２１７（２０１５）２２１−２２７．
【非特許文献１３】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｇｉｎａｔｅ−ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ｐｉｇｓ（Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．（２０１５）
【非特許文献１４】Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０４（２００５）３３７−３４６
【非特許文献１５】Ｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１（２０１５）１１１７−１１３２
【非特許文献１６】Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，Ｏｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｈｉｌｌａｒｙ  ａｎｄ  Ｂｒａｙｄｅｎ）
【非特許文献１７】Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １８：６９−８２，２００６
【非特許文献１８】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３：３５２７３−８２，２００８
【非特許文献１９】Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３０：９６１−７５，２０１０
【非特許文献２０】Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １２：４７−５９，２０１２
【非特許文献２１】Ｂｉｒｃｈｅｎｏｕｇｈ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５２：１５３５−１５４２，２０１７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願人は、活性酸素種（ＲＯＳ）および特に過酸化水素が、ヒトおよびマウス腸病原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ）のアタッチングおよびエフェーシング（ａｔｔａｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｆｆａｃｉｎｇ）（Ａ／Ｅ）において、ＬＥＥ病原性アイランドの強力な負の制御因子として作用し、細菌性ビルレンス因子の下方制御をもたらすことを発見した。加えて、本出願人は、胃腸病原体を含む多数の細菌でのホスホチロシンシグナル伝達が、過酸化水素に曝露されると下方制御されることを実証した。ＬＥＥ病原性アイランドおよびホスホチロシンシグナル伝達は両方とも、病原因子生成に必要であり、それらの下方制御は、細菌病原性を低減する効果を有し、それにより、特に哺乳動物の腸の上皮組織の炎症性疾患および感染性疾患の病理を減少させる（図２〜４および８）。本出願人は、過酸化水素のｉｎ  ｓｉｔｕ低用量投与が、大腸炎の動物モデルにおいて、損傷後の回復を加速し、炎症を下方制御し、迅速な組織復元を支援することを実証した（図１５）。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、哺乳動物の上皮組織、例えば胃腸管または気道の感染性疾患および炎症性疾患を治療または予防するための方法で使用するための過酸化水素であって、この方法は、過酸化水素または過酸化水素発生体系（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）を含む送達系を哺乳動物に投与するステップを含み、送達系が、任意選択で、経口送達または吸入可能送達のために、および哺乳動物の標的位置（例えば、腸／気道）において過酸化水素または過酸化水素発生体系をｉｎ  ｓｉｔｕで放出するように製剤化されている過酸化水素に関する。
【０００８】
一実施形態では、送達系は、経口送達または吸入送達のために製剤化されている。
【０００９】
一実施形態では、送達系は、結腸で活性作用剤を放出するように製剤化されている。
【００１０】
一実施形態では、送達系は、過酸化水素発生体系を含む。好適な系の例としては、接触すると過酸化水素を産生することが可能な、酵素＋基質組合せが挙げられる。具体的な例は、下記に提供されている。他の例としては、宿主を局所刺激して、肺上皮組織または胃腸上皮組織において過酸化水素をｉｎ  ｓｉｔｕで産生することが可能な活性作用剤が挙げられる。一実施形態では、活性作用剤は、ＮＯＸ１（スーパーオキシド）活性またはＤＵＯＸ２（Ｈ２Ｏ２）活性を増強するアゴニストである。これは、宿主腸上皮層でのＮＯＸ１（スーパーオキシド）活性またはＤＵＯＸ２（Ｈ２Ｏ２）活性を増強する（例えば、Ｔｏｌｌ受容体刺激またはヘテロ三量体Ｇタンパク質共役受容体およびカルシウム流入により）アゴニストを含む送達系を製剤化することより達成することができる。
【００１１】
送達系が過酸化水素を含む一実施形態では、送達系は、任意選択で、放出前に過酸化水素を安定化するように構成されている。一実施形態では、送達系は、胃腸管の標的位置において過酸化水素をｉｎ  ｓｉｔｕで遅延放出するように構成されたポリマー性マトリックス（アルギン酸ゲルマトリックスなど）を含む。ポリマー性マトリックス系の例は、文献において公知であり、下記に記載されている。
【００１２】
一実施形態では、送達系は、経口投薬送達系（ｏｒａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）である。
【００１３】
第２の関連する態様では、本発明は、過酸化水素または過酸化水素発生体系を含む送達系であって、送達系は、哺乳動物への経口投与または吸入可能投与のために、および哺乳動物の腸または哺乳動物の気道内の標的位置において過酸化水素または過酸化水素発生体系を放出するように構成されており、それにより哺乳動物の腸または哺乳動物の気道の標的位置での過酸化水素レベルの局所的増加を達成する送達系に関する。
【００１４】
送達系が過酸化水素を含む一実施形態では、送達系は、典型的には、胃腸管の標的位置において過酸化水素をｉｎ  ｓｉｔｕで遅延放出するように構成されたポリマー性マトリックス（アルギン酸ゲルマトリックスなど）を含む。
【００１５】
さらなる一態様では、本発明は、胃腸管の感染性疾患または炎症性疾患または状態の治療または予防に使用するための、本発明の経口投薬送達系に関する。
【００１６】
一実施形態では、送達系は、標的位置で分解し、標的位置で過酸化水素または過酸化水素発生体系を放出するように構成された１つまたは複数のコーティングを含む。
【００１７】
一実施形態では、コーティングは、ｐＨの変化に応答して、またはファイル酸（ｆｉｌｅ  ａｃｉｄ）、特定の化学物質、もしくは特定のプロテアーゼに応答して分解するように構成されている。
【００１８】
一実施形態では、コーティングは、圧力の変化に応答して分解するように構成されている。
【００１９】
一実施形態では、コーティングは、特定のプロテアーゼの存在に応答して分解するように構成されている。
【００２０】
一実施形態では、コーティングは、細菌性消化、特にある標的位置に存在することが知られている細菌による消化に応答して分解するように構成されている。
【００２１】
一実施形態では、コーティングは、胃腸管での所定の滞留時間に応答して分解するように構成されている。
【００２２】
一実施形態では、コーティングは、結腸で分解するように構成されている。
【００２３】
一実施形態では、コーティングは、回腸で分解するように構成されている。
【００２４】
一実施形態では、コーティングは、肺の肺胞で分解するように構成されている。
【００２５】
好適な過酸化水素発生体系の例としては、生物系（例えば、過酸化水素を産生する細菌（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ）（特に遺伝子操作された細菌またはプロバイオティクス細菌））および基質を過酸化水素に変換することが可能な酵素を含む化学系が挙げられる。後者の場合、過酸化水素発生体系は、好適な基質を含んでいてもよく、または酵素は、患者のＧＩ管に存在する基質（例えば、グルコースまたは他の糖）を利用するように選択されていてもよい。
【００２６】
一実施形態では、過酸化水素発生体系は、反応して過酸化水素を産生するように構成されている酵素および基質であって、典型的には送達系の別々の区画に含有されている酵素および基質を含む。
【００２７】
一実施形態では、過酸化水素発生体系は、中間産物発生体系（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）（例えば、化学的発生体系（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）、または第１の酵素および基質を含み、反応して中間産物を産生するように構成されている酵素的発生体系（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ））、および中間産物を過酸化水素に変換することが可能な第２の酵素を含み、中間産物発生体系の成分は、典型的には送達系の別々の区画に含有されている。一実施形態では、中間産物はスーパーオキシドであり、第２の酵素は、スーパーオキシドを過酸化水素に変換することが可能である（つまりスーパーオキシドジスムターゼ）。一実施形態では、中間産物発生体系は、中間産物、例えば哺乳動物の腸でのＮＯＸ１活性および／またはＤＵＯＸ２活性を増強するアゴニストの産生を刺激する活性作用剤を含む。そのようなアゴニストの例としては、Ｔｏｌｌ受容体アゴニストまたはヘテロ三量体Ｇタンパク質共役受容体アゴニストまたはカルシウム流入刺激因子が挙げられる。
【００２８】
一実施形態では、送達系は、腸下部（典型的には、結腸の近位）で過酸化水素または過酸化水素発生体系を放出するように構成されている。本発明のこの態様での使用に好適な送達系の例は、下記に記載されている。酵素および基質の好適な組合せを含む過酸化水素発生体系の例は、下記でより詳細に記載されている。
【００２９】
一実施形態では、過酸化水素発生体系は、哺乳動物の腸で一般的に見出される基質（つまりグルコース）と反応し、過酸化水素を産生するように構成されている酵素を含み、送達系は、典型的には酵素を回腸に放出するように構成されている。好適な酵素の例は、下記に記載されている。
【００３０】
一実施形態では、送達系は、実質的に水不透過性である。
【００３１】
また、本発明は、過酸化水素を過剰産生するように遺伝子操作された細菌を提供する。細菌は、過酸化水素産生に関与する酵素、例えば、オキシダーゼ酵素、またはスーパーオキシド、過酸化水素を生成することができるか、もしくは過酸化水素を生成する任意の反応を起こすことができる任意の他の酵素系を過剰発現するように操作されていてもよい。一実施形態では、細菌は、酵素が細菌ゲノムに、任意選択でプロモーターの制御下に組み込まれるように操作されている。操作は、安定的であってもよくまたは一過性であってもよい。一実施形態では、プロモーターは、誘導可能プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。一実施形態では、細菌は、Ｈ２０２を産生する細菌（Ｈ２０２  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である。一実施形態では、細菌は、プロバイオティクス細菌である。
【００３２】
本発明の他の態様および好ましい実施形態は、下記に示されている他の請求項に定義および記載されている。
【００３３】
定義：
「感染性疾患」は、上皮組織が最初に感染することを特徴とする疾患を意味し、上皮組織に局限化される疾患、または上皮組織に局限化される感染症により引き起こされ、他の器官に拡散する疾患、例えば、敗血症などの全身性疾患を含む。胃腸感染性疾患の場合、例としては、細菌、ウイルス、寄生動物、および真菌により引き起こされる感染症が挙げられるだろう。細菌感染は、例えば、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の細菌により引き起こされる場合がある。一実施形態では、こうした疾患は、腸中間部および腸下部の感染により引き起こされる。
【００３４】
「炎症性疾患」は、胃腸管に適用される場合、ＧＩ管の全体または一部、特に腸中間部または腸下部の慢性炎症を特徴とする疾患または状態を意味する。一実施形態では、炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）であり、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む。両方とも、一般的に、重度の下痢、疼痛、疲労、および体重減少を伴う。ＧＩ管の他の炎症性疾患としては、コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎（ｌｙｍｐｈｏｃｙｓｔｉｃ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、および炎症性腸症候群が挙げられる。
【００３５】
「ｉｎ  ｓｉｔｕで生成される」は、過酸化水素発生体系を含む送達系であって、胃腸管の標的位置で過酸化水素または過酸化水素発生体系を放出するように構成されている送達系を使用して、腸で過酸化水素を生成させることを意味する。
【００３６】
「標的部位」または「標的位置」は、哺乳動物胃腸管の所定の位置を意味する。一実施形態では、標的部位は、胃の遠位である。一実施形態では、標的部位は、回腸の遠位である。一実施形態では、標的部位は、大腸である。一実施形態では、標的部位は、結腸の近位である。一実施形態では、標的部位は、肛門の近位である。こうした特定の標的部位にペイロードを送達するのに適している薬物送達系は、文献において公知であり、下記で参照されている。
【００３７】
「過酸化水素発生体系」は、体内の、例えばＧＩ管または気道の上皮組織の部位でまたは付近に、過酸化水素をｉｎ  ｓｉｔｕで生成することが可能な系を意味する。この系は、過酸化水素を生成する細菌（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ）または酵素および基質の組合せ、標的位置での過酸化水素活性を増加させることが可能な酵素またはアゴニストであってもよい。好ましい一実施形態では、この系は、基質、および基質の過酸化水素への変換を触媒する酵素である（任意選択で、水または利用可能な任意の流体の存在下で）。
【００３８】
好適な系の例は、下記の表１に提供されている。
【００３９】
【表１】
2019510805.tif 000003
【００４０】
過酸化水素を産生する細菌の例は、Schellenberg et al: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0041217（非特許文献１）の表２に提供されている。
【００４１】
具体的な例としては、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチル・スラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、およびラクトバチルス・ムリヌス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニイＷＴ（ＮＣＣ５３３）が挙げられる。一実施形態では、細菌は、野生型細菌である。一実施形態では、細菌は、プロバイオティクス細菌である。一実施形態では、細菌は、遺伝子改変された細菌である。一実施形態では、細菌は、細菌でのＨ2Ｏ2産生の増加を達成するタンパク質を発現するように遺伝子操作されている。一実施形態では、タンパク質は、過酸化水素の形成を触媒する酵素である（好適な酵素の例は、下記の表１に提供されている）。一実施形態では、細菌は、安定的にトランスフェクトされており、導入遺伝子は、誘導可能プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下にある。一実施形態では、細菌は、一過性にトランスフェクトされている。細菌中でＨ2Ｏ2を産生する実体（Ｈ2Ｏ2  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｅｎｔｉｔｙ）（酵素であることが多い）の異種性発現によるＨ2Ｏ2の組換え体産生は、下記のものに記載されている。
【００４２】
１．Patent WO 2011073956 A2（特許文献１）−異種性宿主
【００４３】
この発明は、細菌の遺伝子操作および有用な化合物の異種性発現に関する。
【００４４】
２．Ongley SE, Bian X, Neilan BA et al. Nat. Prod. Rep. 30:1121, 2013（非特許文献２）
【００４５】
３．Geldart K, Forkus B, McChesney E et al. Pharmaceuticals 9:60, 2016（非特許文献３）
【００４６】
４．Amiri-Jami M, Abdelhamid AG, Hazaa M et al. FEMS Microbiology Letters 362:1, 2015（非特許文献４）
【００４７】
過酸化水素発生体系に使用することができる酵素および基質の組合せの例は、下記の表１に示されている。
【００４８】
【表２】
2019510805.tif 000004
【００４９】
基質の非存在下で過酸化水素発生体系に使用することができる酵素の例は、ＧＩ管に存在する基質の過酸化水素への変換を触媒する酵素である。ＧＩ管、特に回腸は、一般的に、グルコース、アミノ酸、プリン、脂肪酸を含む種々の糖を含有することを考慮すると、上記の表１の酵素のほとんどを、この状況で使用することができる。
【００５０】
「送達系」は、摂取または吸入することができ、過酸化水素または過酸化水素発生体系を含有し、規定の位置において過酸化水素または過酸化水素発生体系をｉｎ  ｖｉｖｏで放出することが可能な薬物剤形を意味する。例としては、経口剤形および吸入可能剤形が挙げられる。
【００５１】
「経口投薬送達系」は、過酸化水素または過酸化水素発生体系を含有し、胃通過中は過酸化水素または発生体系（ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）を保護し、胃のＧＩ管遠位で、例えば回腸または腸下部で過酸化水素または発生体系を放出するように設計されている、経口経路による投与に好適な薬物剤形を意味する。一実施形態では、送達系は、カプセルである。一実施形態では、送達系は、固体剤形である。一実施形態では、送達系は、放出前には２つ以上の成分（つまり酵素および基質）を別々にしておくように構成されている少なくとも２つの区画を含む。一実施形態では、送達系は、水素発生体系（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）を封入するコーティングを含む。一実施形態では、コーティングは、ｐＨ感受性コーティングである。一実施形態では、コーティングは、水感受性コーティングである。一実施形態では、コーティングは、圧力感受性コーティングである。一実施形態では、コーティングは、胆汁酸に感受性である。一実施形態では、発生体系は、基質および酵素を含み、基質は、第１の被膜で被膜されており、酵素は、第２の被膜で被膜されており、被膜された酵素および被膜された基質は、任意選択で第３の被膜で被膜されているか、または胃腸管の標的位置で内容物を放出するように構成されている外側容器（例えば、ゼラチンカプセル）内に含有されている。一実施形態では、送達系は、胃腸管の標的位置でのｉｎ  ｓｉｔｕ分解および過酸化水素または過酸化水素発生体の放出（典型的には遅延放出）を可能にする、マトリックス、特に３Ｄポリマー性マトリックスを含む。一実施形態では、送達系は、ナノ微粒子組成物またはマイクロ微粒子組成物を含む。胃腸管の所定の標的位置で内容物を放出すること、および／または含有されている成分を別々にしておくこと、および／または２つの含有されている成分間の反応を予防することが可能な経口投薬送達系を含めた好適な薬物送達系の例は、文献、例えば、以下である：
・Sathish et al (Int. J. Pharm. Sci.2013; 258-269)（非特許文献５）、
・Kushal et al (Int. Res. J. Pharm. 2013, 4(3))（非特許文献６）、
・Philip et al (Oman Med J. 2010, 25(2))（非特許文献７）、
・Polymers for controlled drug delivery - Peter Tarcha (CRC Press, 21 November 1990)（非特許文献８）、
・Pharmaceutical coating technology - Michael Aulton et al (Taylor & Francis 27 October 1995)（非特許文献９）、
・http://www.slideshare.net/Balimusale/oral-controlled-drug-delivery-system（非特許文献１０）、
・European Patent No: 2418968 (Teagasc)（特許文献２）、および
・European Patent No: 2097072 (RCSI)（特許文献３）において公知である。
・Brayden et al. (European Journal of Pharmaceutical Sciences 79 (2015), 102-111（非特許文献１１）
・Tambuwala et al. (Journal of Controlled Release 217 (2015) 221-227）非特許文献１２）
・Zhang et al. Evaluation of alginate-whey protein microcapsules for intestinal delivery of lipophilic compounds in pigs (J. Sci. Food Agric. (2015)（非特許文献１３）
・Lamprecht et al. (Journal of Controlled Release 104 (2005) 337-346（非特許文献１４）
・Hua et al. (Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 11 (2015) 1117-1132（非特許文献１５）
・Drug Delivery: Fundamentals and Applications (Chapter 7, Oral Drug Delivery, Hillary and Brayden)（非特許文献１６）
・US2016058709（特許文献４）には、１つの成分のコア、および第２の成分を含む腸溶性コーティングを含む経口剤形が開示されている。
・WO2016003870（特許文献５）−二重層二重放出プロバイオティクス錠剤
・WO2015132472（特許文献６）−制御放出層を有するカプセルまたは錠剤
・GB2540130（特許文献７）−酵素および基質の制御放出用の経口剤形
・US2015343067（特許文献８）−モノリス型経口剤形
・IN2829MU2009（特許文献９）−別々にされており胃腸管で放出される２つの成分を含有する経口剤形。
・US2015132344（特許文献１０）−経口レプチン製剤
・US2008020041（特許文献１１）−腸溶性コーティング化組成物
・US6132771（特許文献１２）−経口医薬剤形
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「ＮＯＸ１に対するアゴニスト」は、ＮＯＸ−１遺伝子を活性化することができる作用剤を意味する。アゴニストとしては、Ｔｏｌｌ受容体アゴニスト、プロテインキナーゼＣ、または類似のアゴニストが挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「ＤＵＯＸ２に対するアゴニスト」は、カルシウム放出またはカルシウム流入（例えば、Ｇタンパク質共役受容体の刺激による）を誘導することができるアゴニスト、例えばＡＴＰまたはＳ１Ｐ、ならびにＤＵＯＸ２および／またはＤＵＯＸＡ２の転写上方制御を刺激する作用剤（例えば、種々のサイトカイン、細菌性リガンド、機械的ストレス因子、気体ストレス因子、化学的ストレス因子、内質ストレス因子、または他の細胞ストレス因子）を意味する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその活用形は、任意の表記されている整数（ｉｎｔｅｇｅｒ）（例えば、特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップ、または制限）または整数（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）の群（例えば、特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップ、または制限）を含むが、任意の他の整数または整数の群を除外しないことを示すと理解されるべきである。したがって、本明細書で使用される場合、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的または非限定的であり、追加の表記されていない整数（ｉｎｔｅｇｅｒ）または方法／プロセスステップを除外しない。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「疾患」は、生理機能を損ない、特定の症状と関連する任意の異常な状態を規定するために使用される。この用語は、病因の性質に関わらず（または実際に疾患の病因学的根拠が確立されているか否かに関わらず）、生理学的機能が損なわれている任意の障害、病気、異常、病理、病的状態、状態、または症候群を包括するように幅広く使用される。したがって、それは、感染、外傷、傷害、外科手術、放射線学的アブレーション、中毒、または栄養不足から生じる状態を包含する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患の症状を治癒、改善、もしくは軽減するか、またはその原因を除去（または影響を軽減）するか（例えば、リソソーム酵素の病理学的レベルの蓄積の低減）、または疾患の寛解期間を延長するか、または疾患もしくは症状の再発もしくは「再燃」を予防もしくは遅延する介入（例えば、対象への作用剤の投与）を指す。この場合、この用語は、用語「療法」と同義的に使用される。一実施形態では、送達系は、１日１回もしくは複数回、または２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、もしくは６日毎、１週間に１回、２週間毎に１回、または１か月に１回で、対象に投与される。一実施形態では、送達系は、寛解期間中、および任意選択で疾患の症状の再発の期間中に、対象に投与される。一実施形態では、その使用は、疾患の寛解期間を延長するためである。
【００５６】
加えて、用語「治療」または「治療すること」は、疾患の発症、寛解、または進行を予防もしくは遅延するか、または治療された集団内でのその発症率を低減（または根絶）する介入（例えば、対象への作用剤の投与）を指す。この場合、この治療という用語は、用語「予防投与（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」と同義的に使用される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、作用剤の有効量または治療有効量は、過度の毒性、過敏、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、それに見合った合理的なベネフィット／リスク比で対象に投与することができる量であるが、所望の効果、例えば、対象の状態における恒久的改善または一時的改善により表される治療または予防投与を提供するのに十分な量と定義される。この量は、個体の年齢および一般状態、投与方法、および他の要因に応じて、対象毎に様々であるだろう。したがって、正確な有効量を指定することは可能ではないが、当業者であれば、日常的な実験作業および背景一般知識を使用して、任意の個々の場合において適切な「有効」量を決定することができるだろう。この状況では、治療結果としては、症状の根絶または軽減、疼痛または不快感の低減、生存の延長、可動性の改善、および臨床改善の他のマーカーが挙げられる。療法結果は、完全治癒である必要はない。酵素および基質の点では、過酸化水素発生体系は、治療されている適応症の同一性、位置、または重症度、哺乳動物のサイズ、および他の変数に応じて、０．０１ｍｇから１００ｍｇの、例えば０．０１ｍｇから１．０ｍｇ、または０．１ｍｇから１０ｍｇ、または１ｍｇから１００ｍｇの酵素または基質を含有していてもよい。一実施形態では、過酸化水素発生系（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）は、好適な期間にわたって、例えば、１２時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、または１４日間の期間にわたって、標的部位で、典型的には胃腸管の標的部位で５ｎｍｏｌから２０μｍｏｌの過酸化水素を産生するように構成されている。正確な用量は、主治医により決定することができる。
【００５８】
上記で規定されている治療および有効量の状況では、用語「対象」（状況が許す限り、「個体」、「動物」、「患者」、または「哺乳動物」を含むと理解されるべきである）は、治療が必要である任意の対象、特に哺乳動物対象を規定するものである。哺乳動物対象としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ヒト、家畜、農場動物、動物園動物、スポーツ動物、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギなどのペット動物、ラット、マウス、ウマ、畜牛（ｃａｔｔｌｅ）、雌牛（ｃｏｗ）；類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジーなどの霊長動物；イヌおよびオオカミなどのイヌ科動物；ネコ、ライオン、およびトラなどのネコ科動物；ウマ、ロバ、およびシマウマなどのウマ科動物；雌牛、ブタ、およびヒツジなどの食用動物；シカおよびキリンなどの有蹄動物；ならびにマウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどのげっ歯動物。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００５９】
状況により別様であることが必要とされない限り、本明細書では、単数の使用は複数を含み、その逆も意図されていることが理解されるべきである。実体に関して使用される用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、その実体の１つまたは複数を指すと理解されるべきである。したがって、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」は、本明細書では同義的に使用される。
【００６０】
本明細書で言及されている刊行物、特許、特許出願、および他の文献は全て、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により具体的におよび個々に組み込まれているものとして示され、それらの内容が全て記載されているかのごとく、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）はＨ2Ｏ2を生成する。Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．ムリヌス（Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓ）、およびＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）によるＨ2Ｏ2放出。Ｈ2Ｏ2分解にはカタラーゼ（ＣＡＴ；２５Ｕ／ｍｌ）を使用した；ｎ＝３。
【図２】常在性乳酸桿菌（例えば、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．ムリヌス）の存在量が非常に増加した、Ｃ．ローデンチウム（Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）に感染した遺伝子改変されたマウス（ｃｙｂａf/fＶｉｌｃｒｅ）のＬＥＥ病原性アイランド（ｌｅｒ、ｅｓｃＮ）に位置する病原性遺伝子の下方制御。感染したマウス（６ｄｐｉ）の管腔（Ｉ）または粘液（Ｊ）から単離されたＣ．ローデンチウムでのｌｅｒ発現およびｅｓｃＮ発現のｑＰＣＲ分析；ｎ＝５。
【図３】活性ＮＡＤＰＨオキシダーゼＮＯＸ４を構成的に過剰発現する操作されたＣｏｓ細胞により生成されたＨ2Ｏ2にＣ．ローデンチウムを曝露した後のＬＥＥアイランド遺伝子の下方制御。Ｃｏｓ−ｐ２２（陰性対照）およびＣｏｓ−ＮＯＸ４細胞（４時間、ＤＭＥＭ）に曝露した後のＣ．ローデンチウムでのｌｅｒ発現およびｅｓｃＮ発現のｑＰＣＲ分析：ｎ＝４。細胞および細菌は、フィルターにより隔てられていた。
【図４】Ｈ2Ｏ2に曝露されたＣ．ローデンチウムでのｌｅｒの下方制御。ＤＭＥＭ中のＣ．ローデンチウムを、１ｍＭ  Ｈ2Ｏ2の単一ボーラスで処置し、３時間後にｌｅｒ発現をｑＰＣＲにより分析した。
【図５】ラクトバチルス・ジョンソニイ野生型（ＮＣＣ５３３）およびアイソジェニックＲＯＳ供給源欠失突然変異体（ＮＣＣ９３５９）のＨ2Ｏ2生成。Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＷＴ  ＮＣＣ５３３およびアイソジェニックＮＡＤＨ依存性フラビンレダクターゼ欠失突然変異体ＮＣＣ９３５９によるＨ2Ｏ2放出；ｎ＝３。
【図６】Ｈ2Ｏ2を産生するＬ．ジョンソニイＮＣＣ５３３は、Ｃ．ローデンチウムｌｅｒ遺伝子を下方制御するが、突然変異株（ＮＣＣ９３５９）は下方制御しない。ＮＣＣ５３３またはＮＣＣ９３５９に由来する培養上清で３時間にわたって培養したＣ．ローデンチウムでのｌｅｒ発現のｑＰＣＲ分析；ｎ＝５。
【図７】野生型Ｃ５７ＢＩ／６マウスとＮＣＣ５３３（Ｈ2Ｏ2産生性）との共生は、Ｃ．ローデンチウム病原性遺伝子を下方制御するが、ＮＣＣ９３５９との共生は下方制御しない。６ｄｐｉで感染させたＷＴ３マウスの管腔から単離されたＣ．ローデンチウムでのｌｅｒ発現およびｅｓｃＮ発現のｑＰＣＲ分析。マウスを前処置し、感染中にＮＣＣ５３３またはＮＣＣ９３５９で治療した；ｎ＝４〜５。
【図８】Ｌ．ジョンソニイによるＨ2Ｏ2産生は、Ｃ．ローデンチウム感染中の宿主上皮組織損傷の予防に必要である。Ｃ．ローデンチウムによる感染前および感染中に、毎日経口胃管栄養を使用して、ＮＣＣ５３３またはＮＣＣ９３５９によりＣ５７ＢＩ／６マウスを治療した。代表的な結腸切片の免疫組織化学的画像（Ｈ＆Ｅ染色）、６ｄｐｉ、スケールバー１００μｍ。
【図９】Ｃｏｓ−ＮＯＸ４細胞により生成されたＨ2Ｏ2への曝露による、ヒト病原体ＥＰＥＣのＬＥＥアイランド遺伝子の下方制御。ＣＯＳ−ＮＯＸ４細胞から放出された（しかしながら、Ｃｏｓ−ｐ２２細胞からではない。細胞の説明は、Cell Signal 18:69-82, 2006（非特許文献１７）、J Biol Chem 283:35273-82, 2008（非特許文献１８）、Mol Cell Biol 30:961-75, 2010)（非特許文献１９）で行われている）Ｈ2Ｏ2にＥＰＥＣを３時間にわたって曝露し、その後、ＥＰＥＣでのｌｅｒ発現およびｅｓｃＮ発現のｑＰＣＲ分析を行った。細胞と細菌とは、フィルターにより隔てられていた。
【図１０】病原体曝露中の結腸細胞、ヒト生検により、およびウサギループモデル（ｒａｂｂｉｔ  ｌｏｏｐ  ｍｏｄｅｌ）において生成されたＨ2Ｏ2は、病原性修飾因子として作用する細菌性ホスホチロシンシグナル伝達を下方制御する。ＨＣＴ−８結腸細胞（左パネル）もしくはヒト生検（中央パネル）と共に共培養（３時間）した後の、またはウサギ回腸ループへの注射後の表示されている時点（右パネル）での、細胞外細菌に由来する溶解物の抗ホスホチロシン免疫ブロット。
【図１１】Ｃｏｓ−ＮＯＸ４細胞で産生されたＨ2Ｏ2（Ｃｏｓ−ＮＯＸ４  ｃｅｌｌ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｈ2Ｏ2）は、細菌性ホスホチロシン含有量の顕著な減少に結び付く。ボイデンチャンバーの下部チャンバーに播種されたＣｏｓ−ＮＯＸ４細胞またはＣｏｓ−ｐ２２細胞への曝露後の、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に由来する溶解物の抗ホスホチロシン免疫ブロット。
【図１２】Ｈ2Ｏ2の添加は、鉄が存在する場合（鉄および５％酸素は、腸の通常状態である）、細菌性ホスホチロシン含有量を減少させる。０．７ｍＭのＨ2Ｏ2を添加（３時間）する前に、５％Ｏ2または２１％Ｏ2で（左パネル）または５％Ｏ2での低濃度の鉄条件もしくは高濃度の鉄条件（右パネル）で培養した細菌の抗ホスホチロシン免疫ブロット。
【図１３】結腸細胞のＬ．モノサイトゲネス付着およびＬ．モノサイトゲネス侵入は、Ｈ2Ｏ2への細菌の事前曝露後に低減される。細菌を、０．７ｍＭのＨ2Ｏ2で３時間にわたって前処置した（細菌は、処置後でも依然として完全に生育可能であった）。ＨＣＴ−８細胞への付着およびＨＣＴ−８細胞への侵入は、Cell Host Microbe 12:47-59, 2012（非特許文献２０）に記載されているように分析した。エラーバーはＳＥＭを表し、星印は有意性を示す（**ｐ≦０．０１および*ｐ≦０．０５）。
【図１４】Ｈ2Ｏ2への事前曝露後の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による生物膜形成の低減。細菌を、０．７ｍＭのＨ2Ｏ2で３時間にわたって前処置した（細菌は、処置後でも依然として完全に生育可能であった）後、生物膜形成を評価した。Ｈ2Ｏ2の存在下（赤色）または非存在下（黒色）での肺炎連鎖球菌生物膜の３Ｄ測定が示されている（１３．５μｍ厚スタックでの画像の平均蛍光値）。肺炎連鎖球菌生物膜（緑色）の代表的な共焦点画像を定量化に使用した。スケールバー１０μｍ。
【図１５】Ｈ2Ｏ2は、マウス大腸炎の回復を加速させる。大腸炎（水中の３％ＤＳＳ）の５日前、大腸炎中、および実験の終了時まで（１６日目）、毎日経口胃管栄養により、マウスを１×１０9細菌で治療した。ＤＳＳ治療の７日目に、ＤＳＳを水に取り替えて、治癒プロセスを可能にした。ラクトバチルス・ジョンソニイ野生型（ＮＣＣ５３３、Ｈ2Ｏ2産生）は、組織復元を増強し、炎症を低減するが、アイソジェニックＬ．ジョンソニイ突然変異体（ＮＣＣ９３６０、Δｎｆｒ、Ｈ2Ｏ2を生成する酵素の欠失）は効果的ではない。低ナノモルＨ2Ｏ2の毎日投与は、損傷後の回復を加速させ（ａ−疾患指数、ＮＣＣ５３３  三角、ｃ−体重）、炎症を下方制御し（ｂ、炎症の指標としての結腸長さ）、迅速な組織復元を支援する（ｄ−１１日目での結腸のＨ＆Ｅ染色）。チューキー事後検定による一元配置分散分析；**ｐ＝０．０１、***ｐ＝０．００１。
【図１６】Ｈ2Ｏ2を生成する酵素（ＮＯＸ）の、マウスの結腸上皮における欠乏は、正常な野生型マウス（白色線）と比較して、粘液の低減または消失にさえ結び付く。野生型マウス（およびヒト）では、粘液層は、非透過性障壁を提供し、腸内細菌（微生物叢）を宿主上皮から隔てている。Ｈ2Ｏ2−欠損マウスにおけるこの保護粘液層の喪失は、腺窩での細菌定着に結び付く（矢印）。Ｈ2Ｏ2の添加は、粘液分泌を回復させることができる（Birchenough G. et al., Science 352:1535-1542, 2017（非特許文献２１））。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
マウス：
Ｃｙｂａflox/floxマウスを飼育して、Ｂ６．ＳＪＬ−Ｔｇ（Ｖｉｌ−ｃｒｅ）９９７Ｇｕｍ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）とし、小腸の上皮および結腸の上皮にｐ２２phoxの標的化欠失（ｐ２２ΔΙΕＣ）を有するマウスを生成した。５×１０9シトロバクター・ローデンチウム（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）を含有するルリアベルターニブロスの終夜培養物の０．３ｍｌで、経口胃管栄養によりマウスを感染させ、感染後６日目に分析した。Ｌ．ジョンソニイＮＣＣ５３３／ＮＣＣ９３５９前処置および治療：Ｌ．ジョンソニイＮＣＣ５３３株およびＮＣＣ９３５９株を、Ｃ．ローデンチウム接種の３日前から開始し、Ｃ．ローデンチウム感染中毎日で、経口胃管栄養により、１０9ＣＦＵの濃度でＷＴマウスに投与した。組織病理学について、カルノア固定した遠位結腸をパラフィンに包埋し、５μｍ切片を、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００６３】
細胞実験：
ＤＭＥＭ、５％ＦＢＳ中のＣｏｓ−ＮＯＸ４細胞およびＣｏｓ−ｐ２２細胞（Cell Signal 18:69-82, 2006（非特許文献１７）、J Biol Chem 283:35273-82, 2008（非特許文献１８）、Mol Cell Biol 30:961-75, 2010（非特許文献１９））を、アッセイの４８時間前にボイデンチャンバー（細孔幅０．４μｍ）の下部チャンバーに播種した。ＤＭＥＭ中で増殖させた乳酸桿菌を、上部チャンバーの培地に懸濁した。ＤＭＥＭ、５％ＦＢＳ培地中で３〜４時間の共培養を開始し、その後、ＲＮＡ単離用のフィルターで細菌を回収した。
【００６４】
Ｃ．ローデンチウム病原性に関連する遺伝子（Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）の分析：
管腔内容物および付着物、粘液に関連する剥離物（ｍｕｃｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｃｒａｐｉｎｇ）を、感染したマウス（６ｄｐｉ）から得て、ＲＮＡ単離に使用した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを使用して全ＲＮＡを単離し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キットを使用して逆転写した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックスを使用して、ｌｅｒ発現およびｅｓｃＮ発現の定量的リアルタイムＰＣＲを実施し、Ｃ．ローデンチウムで発現されたｇｆｐの発現に対して正規化した。相対的発現を、ＬＢで増殖させたＣ．ローデンチウムと比較した発現倍数として決定した。
【００６５】
乳酸桿菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析：
無細胞上清（ＣＦＳ）を得るために、乳酸桿菌の培養物（２４時間）を、１００００ｇで３０分間（４℃）遠心分離した。上清を収集し、無菌０．２２μｍフィルターユニットＭｉｌｌｅｘ  ＧＳに通した。Ｃ．ローデンチウム（１０4ＣＦＵ、５００μｌ）の対数期培養物を、３７℃で４時間ＣＦＳ（５００μｌ）と共にインキュベートした。他の実験では、乳酸桿菌を、１０9ＣＦＵ／ｍｌの総密度まで、ＭＲＳ中でｏ／ｎ増殖し、ＰＢＳに再懸濁した。３０分間のインキュベーション後、乳酸桿菌培養物を、１４０００ｒｐｍ（５分間）で遠心分離し、１０ｕｌの上清を使用して、Ａｍｐｌｅｘ  ＲｅｄアッセイによりＨ2Ｏ2を測定した。
【００６６】
通常の条件または鉄で修飾された条件下での腸内細菌と細胞との共培養
３％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０中の細菌（ＯＤ600＝０．４；１０7細菌、１ｍｌ）を、微好気性条件下で３７℃においてＨＣＴ−８細胞と共に、ＭＯＩ  ５０でインキュベートした。ＨＣＴ−８細胞のＤＰＩ前処置は、２０分間（２５μΜ）であった。培地を遠心分離することにより（３３００ｇ、５分間）、非付着細菌を除去し、免疫ブロッティングに使用した。接種物の生存数計数を実施して、同等数の生細菌が各菌株に存在することを保証した。ＮＯＸ４−ｐ２２phox複合体を安定的に発現するＣｏｓ細胞、または陰性対照としての、ｐ２２phoxのみを発現するＣｏｓ細胞により放出されるＨ2Ｏ2への細菌の曝露は、ボイデンチャンバーを使用して実施した。ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ培地中の細胞を、実験を開始する２４時前に底部チャンバーに播種し、その後、３時間にわたって微好気性条件に移行した。微好気性条件で増殖させた細菌を、５％Ｏ2で順化したＤＭＥＭ、３〜１０％ＦＢＳ培地に再懸濁し、フィルター（３μｍ孔径）の上部に置き、３時間インキュベートした。分析のために、細菌をフィルターから回収した。
【００６７】
修飾された鉄条件下でのタンパク質ホスホチロシンレベルの定量化
Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）８１−１７６、Ｌ．モノサイトゲネスＥＧＤｅ、および肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、中期対数期まで最小必須培地中で微好気的に増殖させた。細菌を、遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）により収集し、ＭＥＭでＯＤ600＝０．２に希釈した。硫酸鉄（ＩＩ）（４０μΜ）を、示されているように添加し、ＯＤ600＝０．５に到達するまで、培養物を微好気的に増殖させた。Ｃ．ジェジュニ８１−１７６培養物に５ｍＭ  Ｈ2Ｏ2を添加し、増殖を微好気的に８時間にわたって継続した。Ｌ．モノサイトゲネス培養物および肺炎桿菌培養物を、微好気性条件下で３時間０．７ｍＭのＨ2Ｏ2に曝露した。その後、細菌を、ＯＤ600＝０．２に希釈し、遠心分離により収集し、２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌで２回洗浄し、３０μｌのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁し、９５℃で５分間加熱した。煮沸した試料を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、電気泳動により分離し、免疫ブロットした。対照試料は、同一のプロトコールに従ったが、鉄の補完またはＨ2Ｏ2の添加をしなかった。
【００６８】
種々の方法
侵入および付着アッセイを、以前に報告されているように実施した（Cell Host Microbe 12:47-59, 2012（非特許文献２０））。ＸＴＴ（２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド）アッセイを使用して、細菌細胞生存率を評価した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の場合、Ｃ．ジェジュニ（５ｍＭ）を除いて、細菌を、時点ゼロで１回０．７ｍＭのＨ2Ｏ2に曝露し、示されている期間後（Ｃ．ジェジュニでは最大６時間であったことを除いて、最大３時間）に分析した。
【００６９】
生物膜アッセイ
ＳＹＴＯ９を使用して生物膜を分析した。培養した細菌を、微好気性条件下で終夜増殖させた。その後、細菌培養物を、ＯＤ600＝０．１に調整し、この溶液の１ｍｌを、光学等級プラスチック底μ−プレート２４ウェルに添加した。細菌を、微好気性条件下でさらに７２時間インキュベートした。細菌を、オートクレーブした水で穏やかに洗浄して、浮遊細胞を除去し、ＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドで１時間固定した。その後、画像を、画像化した容積のＳＹＴＯ９蛍光の合計強度について、Ｆｉｊｉを使用して分析した。手短に述べれば、ＳＹＴＯ９で染色した後、Ｚ分解能が０．２２μｍである６０枚の画像の５０個の独立した１３．２μｍスタックを、全ての条件で画像化した。スタック中の異なる切片の平均蛍光を測定し、１切片当たりの集計データから標準偏差を算出した。その後、平均蛍光を、対応する１切片当たりの標準偏差と共に、スタックの開始を０に設定した深さの関数としてプロットした。
【００７０】
Ｅｘ  ｖｉｖｏ生検分析
分極化されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官培養（ｐＩＶＯＣ、Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）：結腸生検のｐＩＶＯＣ実験を、記載されているように実施した（Cell Host Microbe 12:47-59, 2012（非特許文献２０））。細菌感染を、微好気性の事前順化された培地（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）または緩衝液を使用して実施した。最終ＯＤ600＝０．２のＬ．モノサイトゲネスを、生検の先端側に添加し、Ｈ2Ｏ2放出を測定した。対照は、非感染生検、またはＣ．ジェジュニもしくはＬ．モノサイトゲネスを上部チャンバーに添加する前に２０μΜのＤＰＩで２０分間前処置した生検のいずれかであった。
【００７１】
結紮したウサギ回腸ループ
雌ウサギ（チンチラ種）を、感染前に２時間飢餓させた。麻酔は、ケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）を用いてｉｖで実施した。切開線に、２ｍｌキシラジン１％を皮下注射した。開腹後、４つの回腸ループ（長さ５ｃｍ）を単離し、結紮した。ループに、ＰＢＳ、Ｃ．ジェジュニ８１−１７６、またはＬ．モノサイトゲネスＥＤＧｅのいずれかを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＯＤ600＝０．３の培養物を１ｍｌ使用して注射した。各微生物毎に、３羽のウサギを使用した。閉腹後、ウサギを、１８０〜３６０分間（Ｃ．ジェジュニ）または９０〜１８０分間（Ｌ．モノサイトゲネス）ケージに入れた。ウサギを、ナトリウムペントバルビタール（１２０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射により犠牲にした。各ループに蓄積されていた流体を別々に収集し、１０００ｒｐｍで５分間遠心して残屑を除去し、その後、５０００ｒｐｍで遠心分離して、細菌を収集した。
【００７２】
ｉｎ  ｖｉｖｏマウス大腸炎モデル（Ｈ2Ｏ2を産生する細菌の投与）
大腸炎（水中の３％ＤＳＳ）の５日前、大腸炎中、および実験の終了時まで（１６日目）、毎日経口胃管栄養により、野生型マウスを１×１０9細菌で治療した。ＤＳＳ治療の７日目に、ＤＳＳを水に取り替えて、治癒プロセスを可能にした。ラクトバチルス・ジョンソニイ野生型（ＮＣＣ５３３、Ｈ2Ｏ2産生）は、組織復元を増強し、炎症を低減するが、アイソジェニックＬ．ジョンソニイ突然変異体（ＮＣＣ９３６０、Δｎｆｒ、Ｈ2Ｏ2を生成する酵素の欠失）は効果的ではない。低ナノモルＨ2Ｏ2の毎日投与は、損傷後の回復を加速させ（ａ−疾患指数、ＮＣＣ５３３  三角、ｃ−体重）、炎症を下方制御し（ｂ、炎症の指標としての結腸長さ）、迅速な組織復元を支援する（ｄ−１１日目での結腸のＨ＆Ｅ染色）。チューキー事後検定による一元配置分散分析；**ｐ＝０．０１、***ｐ＝０．００１。
【００７３】
ｉｎ  ｖｉｖｏマウス大腸炎モデル（Ｈ2Ｏ2を産生するカプセルの投与）
腸においてＨ2Ｏ2をナノモルから低マイクロモル放出する供給源は、酵素グルコースオキシダーゼおよびその基質グルコースを含有する制御放出カプセルであるが、他の組合せまたは供給源も使用することができる。腸においてＨ2Ｏ2を生成するための供給源を含有するカプセルまたは対照カプセル（例えば、空カプセル、加熱不活性化された酵素、基質の非存在）を、急性疾患の発症時に（０日目）、疾患の最高時点で（時間は、モデルに応じて変化する）、または治癒プロセスが開始した際に（時間は様々である）、経口胃管栄養により１日１回または複数回投与した。
【００７４】
マウスの体重を毎日モニターし、疾患の程度を、動物愛護および大腸炎尺度（ａｎｉｍａｌ  ｗｅｌｆａｒｅ  ａｎｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｓｃａｌｅ）に従ってスコア化した。動物を種々の時点で犠牲にして、炎症および組織傷害／組織復元を評価した。これらパラメーターは、結腸長さ測定、染色による免疫組織化学法（例えば、ＭａｓｏｎのＨ＆Ｅ）、抗体（例えば、抗ムチン２）を使用した免疫蛍光法、または増殖マーカー（例えば、ＢｒｄＵ）による染色を含む手順により決定される。炎症のマーカーとしては、免疫細胞の動員、粘膜および血液中のケモカインレベルおよびサイトカインレベル、粘液密度、レオロジー、および化学的組成の測定、ならびにマイクロバイオーム組成、およびメタボローム組成、および量的パラメーター（例えば、サイトカイン、ケモカイン）も挙げられる。薬物動態を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｖｉｖｏ研究において、報告されている再優良手法に従って実施し、安全性および有効性研究（最大１０週間）を、事前に損傷を加えてまたは加えずに実施して、長期Ｈ2Ｏ2送達により想定される生理学的変化、および急性結腸炎症損傷に抵抗する能力を決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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