(57)【要約】二特異性抗体における重軽鎖誤対合に対する解決策を本明細書において提供する。解決策の一部は、Ｆｃ領域をそのＣＨ３ドメインにおけるリジン再配置によって操作して二特異性抗体の２本の重鎖のヘテロ二量体化を引き起こすことを含む。解決策の別の部分は、二特異性抗体の軽鎖の誤対合を防止すべく二特異性抗体の２つのＦａｂアームのうちの片方を改変することを含む。具体的には、二特異性抗体の片方のＦａｂアームのＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインをＩｇＥ  ＣＨ２ドメインまたはＩｇＭ  ＣＨ２ドメインで置き換える。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）と第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）とを含んでいる、抗体またはその抗原結合性断片であって、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成しており、前記第１ＶＨが、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ＶＬが、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドとが対合して二量体を形成している、前記抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記第１ポリペプチドがＦｃドメインに直接繋げられている、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記第２ポリペプチドがＦｃドメインに直接繋げられている、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
前記第１ポリペプチドが、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
前記第１ポリペプチドが、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
前記第２ポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
前記第２ポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸９〜１０７に示すアミノ酸配列とは１２個以下のアミノ酸残基が異なっている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１２】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、鎖内ジスルフィド結合を形成しない配列番号１の２つのシステイン残基のうちの少なくとも１つにおいてシステイン以外のアミノ酸を含有している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１３】
（ｉ）前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドがＮグリコシル化されないように、前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドが各々、アスパラギン及び／もしくはスレオニンもしくはセリンを除く他のアミノ酸を配列番号１のＮグリコシル化モチーフ内に含有するか；または
（ｉｉ）前記第１ポリペプチドもしくは前記第２ポリペプチドがＮグリコシル化されないように、前記第１ポリペプチドもしくは前記第２ポリペプチドが、アスパラギン及び／もしくはスレオニンもしくはセリンを除く他のアミノ酸を配列番号１のＮグリコシル化モチーフ内に含有する、
請求項１〜３、請求項５、請求項１１または請求項１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１４】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、第２重鎖可変ドメイン（第２ＶＨ）と第２軽鎖可変ドメイン（第２ＶＬ）とを含み、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１５】
前記第２ＶＨがＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＶＬがＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである、請求項１４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１６】
第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）と第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）とを含んでいる、抗体またはその抗原結合性断片であって、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成しており、前記第１ＶＨが、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ＶＬが、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドとが対合して二量体を形成している、前記抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１７】
前記第１ポリペプチドがＦｃドメインに直接繋げられている、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
前記第２ポリペプチドがＦｃドメインに直接繋げられている、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１９】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２０】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２１】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２を含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２２】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸７〜１１２に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２３】
（ｉ）前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドがＮグリコシル化されないように、前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドが各々、アスパラギン及び／もしくはスレオニンもしくはセリンを除く他のアミノ酸を配列番号２のＮグリコシル化モチーフ内に含有するか；または
（ｉｉ）前記第１ポリペプチドもしくは前記第２ポリペプチドがＮグリコシル化されないように、前記第１ポリペプチドもしくは前記第２ポリペプチドが、アスパラギン及び／もしくはスレオニンもしくはセリンを除く他のアミノ酸を配列番号２のＮグリコシル化モチーフ内に含有する、
請求項１６〜１８、請求項２０または請求項２２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２４】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、第２重鎖可変ドメイン（第２ＶＨ）と第２軽鎖可変ドメイン（第２ＶＬ）とを含み、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２５】
前記第２ＶＨがＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＶＬがＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合性断片
【請求項２６】
二特異性抗体であって、
（ｉ）第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）と第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）とを含んでいる第１抗原結合性断片（第１Ｆａｂ）を含み、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して第１可変領域を形成しており、前記第１ＶＨが、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ＶＬが、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり；さらに、
（ｉｉ）第２ＶＨと第２ＶＬとを含んでいる第２Ｆａｂを含み、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して第２可変領域を形成しており、前記第２ＶＨがＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＶＬがＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、
前記第１Ｆａｂ及び前記第２Ｆａｂが、異なる抗原、または同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合するものであり、
前記第１Ｆａｂが前記第２Ｆａｂに連結されている、前記二特異性抗体。
【請求項２７】
前記第１Ｆａｂがリンカーによって前記第２Ｆａｂに連結されている、請求項２６に記載の二特異性抗体。
【請求項２８】
前記第１Ｆａｂが異種ポリペプチドによって前記第２Ｆａｂに連結されている、請求項２６に記載の二特異性抗体。
【請求項２９】
前記異種ポリペプチドがヒト血清アルブミンである、請求項２８に記載の二特異性抗体。
【請求項３０】
前記異種ポリペプチドがＸＴＥＮである、請求項２８に記載の二特異性抗体。
【請求項３１】
前記第１Ｆａｂがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって前記第２Ｆａｂに連結されている、請求項２６に記載の二特異性抗体。
【請求項３２】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが各々、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項３３】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項３４】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７を含む、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項３５】
前記第１ポリペプチドが、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２６〜３４のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項３６】
前記第１ポリペプチドが、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む、請求項２６〜３４のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項３７】
前記第２ポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項３８】
前記第２ポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む、請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項３９】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸９〜１０７に示すアミノ酸配列とは１２個以下のアミノ酸残基が異なっている、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項４０】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合を形成することができる配列番号１の２つのシステイン残基のうちの少なくとも１つにおいてシステイン以外のアミノ酸を含有している、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項４１】
（ｉ）前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドがＮグリコシル化されないように、前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドが各々、アスパラギン及び／もしくはスレオニンもしくはセリンを除く他のアミノ酸を配列番号１のＮグリコシル化モチーフ内に含有するか；または
（ｉｉ）前記第１ポリペプチドもしくは前記第２ポリペプチドがＮグリコシル化されないように、前記第１ポリペプチドもしくは前記第２ポリペプチドが、アスパラギン及び／もしくはスレオニンもしくはセリンを除く他のアミノ酸を配列番号１のＮグリコシル化モチーフ内に含有する、
請求項２６〜３１、請求項３３、請求項３９または請求項４０のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項４２】
二特異性抗体であって、
（ｉ）第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）と第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）とを含んでいる第１抗原結合性断片（第１Ｆａｂ）を含み、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して第１可変領域を形成しており、前記第１ＶＨが、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ＶＬが、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり；さらに、
（ｉｉ）第２ＶＨと第２ＶＬとを含んでいる第２Ｆａｂを含み、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して第２可変領域を形成しており、前記第２ＶＨがＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＶＬがＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、
前記第１Ｆａｂ及び前記第２Ｆａｂが、異なる抗原、または同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合するものであり、
前記第１Ｆａｂが前記第２Ｆａｂに連結されている、前記二特異性抗体。
【請求項４３】
前記第１Ｆａｂがリンカーによって前記第２Ｆａｂに連結されている、請求項４２に記載の二特異性抗体。
【請求項４４】
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項４３に記載の二特異性抗体。
【請求項４５】
前記第１Ｆａｂが異種ポリペプチドによって前記第２Ｆａｂに連結されている、請求項４２に記載の二特異性抗体。
【請求項４６】
前記異種ポリペプチドがヒト血清アルブミンである、請求項４５に記載の二特異性抗体。
【請求項４７】
前記異種ポリペプチドがＸＴＥＮである、請求項４５に記載の二特異性抗体。
【請求項４８】
前記第１Ｆａｂがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって前記第２Ｆａｂに連結されている、請求項４２に記載の二特異性抗体。
【請求項４９】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが各々、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項５０】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項５１】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２を含む、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項５２】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項５３】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合を形成することができる配列番号２のシステイン残基においてシステイン以外のアミノ酸を含有している、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項５４】
（ｉ）前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドがＮグリコシル化されないように、前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドが各々、アスパラギン及び／もしくはスレオニンもしくはセリンを除く他のアミノ酸を配列番号２のＮグリコシル化モチーフ内に含有するか；または
（ｉｉ）前記第１ポリペプチドもしくは前記第２ポリペプチドがＮグリコシル化されないように、前記第１ポリペプチドもしくは前記第２ポリペプチドが、アスパラギン及び／もしくはスレオニンもしくはセリンを除く他のアミノ酸を配列番号２のＮグリコシル化モチーフ内に含有する、
請求項４２〜４８、請求項５０、請求項５２または請求項５３のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項５５】
四価二特異性抗体であって、
（ｉ）第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する全ＩｇＧ抗体を含み、前記全ＩｇＧ抗体が第１ＣＨ３ドメイン及び第２ＣＨ３ドメインを含むものであり；さらに、
（ｉｉ）第１Ｆａｂ及び第２Ｆａｂを含み、
前記第１Ｆａｂが第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）及び第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）を含むものであり、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、前記第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第１可変領域を形成しており、
前記第２Ｆａｂが第２重鎖可変ドメイン（第２ＶＨ）及び第２軽鎖可変ドメイン（第２ＶＬ）を含むものであり、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１Ｆａｂと同じエピトープに特異的に結合する第２可変領域を形成しており；
前記第１ＶＨが、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ＶＬが、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＶＨが、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第３ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＶＬが、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第４ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり；
前記第１Ｆａｂが前記全ＩｇＧ抗体の前記第１ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、前記第２Ｆａｂが前記全ＩｇＧ抗体の前記第２ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、前記四価二特異性抗体。
【請求項５６】
前記第１Ｆａｂが第１リンカーによって前記全抗体の前記第１ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、前記第２Ｆａｂが第２リンカーによって前記全抗体の前記第２ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、請求項５５に記載の四価抗体。
【請求項５７】
前記第１及び第２リンカーがペプチドリンカーである、請求項５６に記載の四価抗体。
【請求項５８】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項５９】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項６０】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７を含む、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項６１】
前記第１ポリペプチド及び前記第３ポリペプチドが各々、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５５〜６０のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項６２】
前記第１ポリペプチド及び前記第３ポリペプチドが各々、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む、請求項５５〜６０のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項６３】
前記第２ポリペプチド及び前記第４ポリペプチドが各々、配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５５〜６２のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項６４】
前記第２ポリペプチド及び前記第４ポリペプチドが各々、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む、請求項５５〜６２のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項６５】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸９〜１０７に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項６６】
四価二特異性抗体であって、
（ｉ）第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する全ＩｇＧ抗体を含み、前記全ＩｇＧ抗体が第１ＣＨ３ドメイン及び第２ＣＨ３ドメインを含むものであり；さらに、
（ｉｉ）第１Ｆａｂ及び第２Ｆａｂを含み、
前記第１Ｆａｂが第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）及び第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）を含むものであり、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、前記第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第１可変領域を形成しており、
前記第２Ｆａｂが第２重鎖可変ドメイン（第２ＶＨ）及び第２軽鎖可変ドメイン（第２ＶＬ）を含むものであり、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１Ｆａｂと同じエピトープに特異的に結合する第２可変領域を形成しており；
前記第１ＶＨが、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ＶＬが、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＶＨが、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第３ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＶＬが、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第４ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり；
前記第１Ｆａｂが前記全ＩｇＧ抗体の前記第１ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、前記第２Ｆａｂが前記全ＩｇＧ抗体の前記第２ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、前記四価二特異性抗体。
【請求項６７】
前記第１Ｆａｂが第１リンカーによって前記全抗体の前記第１ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、前記第２Ｆａｂが第２リンカーによって前記全抗体の前記第２ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、請求項６６に記載の四価抗体。
【請求項６８】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが各々、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項６９】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６６または請求項６７に記載の四価抗体。
【請求項７０】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２を含む、請求項６６または請求項６７に記載の四価抗体。
【請求項７１】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸７〜１１２に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている、請求項６６または請求項６７に記載の四価抗体。
【請求項７２】
四価二特異性抗体であって、
（ｉ）第１Ｆａｂ及び第２Ｆａｂを含み、
前記第１Ｆａｂが第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）及び第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）を含むものであり、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成しており、
前記第２Ｆａｂが第２重鎖可変ドメイン（第２ＶＨ）及び第２軽鎖可変ドメイン（第２ＶＬ）を含むものであり、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１抗原の前記第１エピトープに特異的に結合する第２可変領域を形成しており；さらに、
（ｉｉ）第１ＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン及び第１ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含んでいる第１重鎖と、第２ＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含んでいる第２重鎖と、第１軽鎖と、第２軽鎖とを含む、全抗体を含み、前記抗体が第３ＶＨ及び第３ＶＬならびに第４ＶＨ及び第４ＶＬを含むものであり、前記第３ＶＨと前記第３ＶＬとが対合して、第２抗原のエピトープに特異的に結合する第３可変領域を形成しており、前記第４ＶＨと前記第４ＶＬとが対合して、前記第２抗原の同じエピトープに特異的に結合する第４可変領域を形成しており、
前記第３ＶＨが、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第３ＶＬが、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第４ＶＨが、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第３ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第４ＶＬが、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第４ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ポリペプチドが前記第１ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されており、前記第３ポリペプチドが前記第２ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されており；
前記第１Ｆａｂが前記第１ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、前記第２Ｆａｂが前記第２ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、前記四価二特異性抗体。
【請求項７３】
前記第１Ｆａｂが第１リンカーによって前記第１ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、前記第２Ｆａｂが第２リンカーによって前記第２ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、請求項７２に記載の四価抗体。
【請求項７４】
前記第１及び第２リンカーがペプチドリンカーである、請求項７３に記載の四価抗体。
【請求項７５】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項７６】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項７７】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７を含む、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項７８】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第３ポリペプチドが、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７２〜７７のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項７９】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第３ポリペプチドが、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む、請求項７２〜７７のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項８０】
前記第２ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７２〜７９のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項８１】
前記第２ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む、請求項７２〜７９のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項８２】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項８３】
四価二特異性抗体であって、
（ｉ）第１Ｆａｂ及び第２Ｆａｂを含み、
前記第１Ｆａｂが第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）及び第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）を含むものであり、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成しており、
前記第２Ｆａｂが第２重鎖可変ドメイン（第２ＶＨ）及び第２軽鎖可変ドメイン（第２ＶＬ）を含むものであり、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１抗原の前記第１エピトープに特異的に結合する第２可変領域を形成しており；さらに、
（ｉｉ）第１ＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン及び第１ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含んでいる第１重鎖と、第２ＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含んでいる第２重鎖と、第１軽鎖と、第２軽鎖とを含む、全抗体を含み、前記抗体が第３ＶＨ及び第３ＶＬならびに第４ＶＨ及び第４ＶＬを含むものであり、前記第３ＶＨと前記第３ＶＬとが対合して、第２抗原のエピトープに特異的に結合する第３可変領域を形成しており、前記第４ＶＨと前記第４ＶＬとが対合して、前記第２抗原の同じエピトープに特異的に結合する第４可変領域を形成しており、
前記第３ＶＨが、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第３ＶＬが、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第４ＶＨが、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第３ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第４ＶＬが、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第４ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ポリペプチドが前記第１ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されており、前記第３ポリペプチドが前記第２ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されており；
前記第１Ｆａｂが前記第１ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、前記第２Ｆａｂが前記第２ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、前記四価二特異性抗体。
【請求項８４】
前記第１Ｆａｂが第１リンカーによって前記第１ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、前記第２Ｆａｂが第２リンカーによって前記第２ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている、請求項８３に記載の四価抗体。
【請求項８５】
前記第１及び第２リンカーがペプチドリンカーである、請求項８４に記載の四価抗体。
【請求項８６】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項８７】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項８８】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２を含む、請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項８９】
前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド及び／または前記第４ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている、請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の四価抗体。
【請求項９０】
ヘテロ二量体化モジュールであって、
（ｉ）配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３６４及び３７０のアミノ酸がリジンであり、位置４０９のアミノ酸がセリンであり；さらに、
（ｉｉ）配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３７０のアミノ酸がセリンであり、位置４０５及び４０９のアミノ酸がリジンであり、
（ｉ）及び（ｉｉ）においてアミノ酸位置がＥＵ付番方式に基づくものであり、
前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインと前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３とが対合してヘテロ二量体を形成している、前記ヘテロ二量体化モジュール。
【請求項９１】
第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインをさらに含み、前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインが前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインが前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである、請求項９０に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項９２】
２本のポリペプチド鎖を含んでいる第１Ｆａｂをさらに含み、前記Ｆａｂの前記２本のポリペプチド鎖のうちの１本のＣ末端が、第１ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、前記第１ヒンジ領域が前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている、請求項９１に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項９３】
前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＣ末端と、前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２ヒンジ領域のＮ末端とを繋げるリンカーをさらに含む、請求項９２に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項９４】
第２ヒンジ領域を介して前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２Ｆａｂをさらに含む、請求項９２に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項９５】
ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＶＬドメイン及びＣＬドメインをさらに含み、（ｉ）前記ＶＨドメインのＣ末端がＣＨ１ドメインのＮ末端に繋げられており、前記ＣＨ１ドメインのＣ末端が第１ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、前記第１ヒンジ領域のＣ末端が、前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられており、（ｉｉ）前記ＶＬドメインのＣ末端が前記ＣＬドメインのＮ末端に繋げられており、前記ＣＬドメインのＣ末端が第２ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、前記第２ヒンジ領域のＣ末端が、前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられており、（ｉｉｉ）前記ＶＨドメインと前記ＶＬドメインとが対合して、抗原に特異的に結合する可変領域を形成している、請求項９１に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項９６】
第１ＶＨ及び第１ＶＬならびに第２ＶＨ及び第２ＶＬをさらに含み、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、第１抗原に特異的に結合する第１可変領域を形成しており、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１抗原の別のエピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している、請求項９１に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項９７】
前記第１ＶＬのアミノ酸配列が前記第２ＶＬのアミノ酸配列と同一である、請求項９６に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項９８】
第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインをさらに含み、前記第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインが前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインが、前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである、請求項９０に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項９９】
２本のポリペプチド鎖を含んでいる第１Ｆａｂをさらに含み、前記Ｆａｂの前記２本のポリペプチド鎖のうちの１本のＣ末端が、第１ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、前記第１ＩｇＧ４ヒンジ領域が第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている、請求項９８に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１００】
前記第１ＩｇＧ４ヒンジ領域がＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む、請求項９９に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１０１】
前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＣ末端と、前記第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端とを繋げるリンカーをさらに含む、請求項９８に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１０２】
前記第２ＩｇＧ４ヒンジ領域がＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む、請求項１０１に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１０３】
第２ＩｇＧ４ヒンジ領域を介して前記第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２Ｆａｂをさらに含む、請求項９９に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１０４】
前記第２ＩｇＧ４ヒンジ領域がＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む、請求項１０３に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１０５】
ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＶＬドメイン及びＣＬドメインをさらに含み、（ｉ）前記ＶＨドメインのＣ末端が前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に繋げられており、前記ＣＨ１ドメインのＣ末端が第１ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、前記第１ＩｇＧ４ヒンジ領域のＣ末端が、前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた前記第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられており、（ｉｉ）前記ＶＬドメインのＣ末端がＣＬドメインのＮ末端に繋げられており、前記ＣＬドメインのＣ末端が第２ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、前記第２ＩｇＧ４ヒンジ領域のＣ末端が、前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた前記第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられており、（ｉｉｉ）前記ＶＨドメインと前記ＶＬドメインとが対合して、抗原に特異的に結合する可変領域を形成している、請求項９８に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１０６】
前記第１ＩｇＧ４ヒンジ領域及び前記第２ＩｇＧ４ヒンジ領域が各々、Ｓ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む、請求項１０５に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１０７】
第１ＶＨ及び第１ＶＬならびに第２ＶＨ及び第２ＶＬをさらに含み、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、第１抗原に特異的に結合する第１可変領域を形成しており、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１抗原の別のエピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している、請求項９８に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１０８】
前記第１ＶＬのアミノ酸配列が前記第２ＶＬのアミノ酸配列と同一である、請求項１０７に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１０９】
ヘテロ二量体化モジュールであって、
（ｉ）配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３６４及び３７０のアミノ酸がリジンであり、位置４０９のアミノ酸がロイシンであり；さらに、
（ｉｉ）配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３７０のアミノ酸がセリンであり、位置３９７のアミノ酸がイソロイシンであり、位置４０５及び４０９のアミノ酸がリジンであり、
（ｉ）及び（ｉｉ）においてアミノ酸位置がＥＵ付番方式に基づくものであり、
前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインと前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３とが対合してヘテロ二量体を形成している、前記ヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１１０】
第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインをさらに含み、前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインが前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインが前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである、請求項１０９に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１１１】
第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインをさらに含み、前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインが前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に直接繋げられており、前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインが前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に直接繋げられている、請求項１１０に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１１２】
２本のポリペプチド鎖を含んでいる第１Ｆａｂをさらに含み、前記Ｆａｂの前記２本のポリペプチド鎖のうちの１本のＣ末端が、第１ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、前記第１ヒンジ領域が前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている、請求項１１０に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１１３】
前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＣ末端と、第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２ヒンジ領域のＮ末端とを繋げるリンカーをさらに含む、請求項１１２に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１１４】
第２ヒンジ領域を介して前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２Ｆａｂをさらに含む、請求項１１２に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１１５】
ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＶＬドメイン及びＣＬドメインをさらに含み、（ｉ）前記ＶＨドメインのＣ末端がＣＨ１ドメインのＮ末端に繋げられており、前記ＣＨ１ドメインのＣ末端が第１ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、前記第１ヒンジ領域のＣ末端が、前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられており、（ｉｉ）前記ＶＬドメインのＣ末端が前記ＣＬドメインのＮ末端に繋げられており、前記ＣＬドメインのＣ末端が前記第２ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、前記第２ヒンジ領域のＣ末端が、前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられており、（ｉｉｉ）前記ＶＨドメインと前記ＶＬドメインとが対合して、抗原に特異的に結合する可変領域を形成している、請求項１１０に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１１６】
第１ＶＨ及び第１ＶＬならびに第２ＶＨ及び第２ＶＬをさらに含み、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、第１抗原に特異的に結合する第１可変領域を形成しており、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１抗原の別のエピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している、請求項１１０に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１１７】
前記第１ＶＬのアミノ酸配列が前記第２ＶＬのアミノ酸配列と同一である、請求項１１６に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１１８】
第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインをさらに含み、前記第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインが前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインが前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである、請求項１０９に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１１９】
２本のポリペプチド鎖を含んでいる第１Ｆａｂをさらに含み、前記Ｆａｂの前記２本のポリペプチド鎖のうちの１本のＣ末端が、第１ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、前記第１ＩｇＧ４ヒンジ領域が前記第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている、請求項１１８に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１２０】
前記第１ＩｇＧ４ヒンジ領域がＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む、請求項１１９に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１２１】
前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＣ末端と、前記第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端とを繋げるリンカーをさらに含む、請求項１１８に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１２２】
前記第２ＩｇＧ４ヒンジ領域がＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む、請求項１２１に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１２３】
第２ＩｇＧ４ヒンジ領域を介して前記第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２Ｆａｂをさらに含む、請求項１１９に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１２４】
前記第２ＩｇＧ４ヒンジ領域がＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む、請求項１２３に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１２５】
ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＶＬドメイン及びＣＬドメインをさらに含み、（ｉ）前記ＶＨドメインのＣ末端が前記ＣＨ１ドメインのＮ末端に繋げられており、前記ＣＨ１ドメインのＣ末端が第１ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、前記第１ＩｇＧ４ヒンジ領域のＣ末端が、前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた前記第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられており、（ｉｉ）前記ＶＬドメインのＣ末端が前記ＣＬドメインのＮ末端に繋げられており、前記ＣＬドメインのＣ末端が第２ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、前記第２ＩｇＧ４ヒンジ領域のＣ末端が、前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた前記第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられており、（ｉｉｉ）前記ＶＨドメインと前記ＶＬドメインとが対合して、抗原に特異的に結合する可変領域を形成している、請求項１１８に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１２６】
前記第１ＩｇＧ４ヒンジ領域及び前記第２ＩｇＧ４ヒンジ領域が各々、Ｓ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む、請求項１２５に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１２７】
第１ＶＨ及び第１ＶＬならびに第２ＶＨ及び第２ＶＬをさらに含み、
前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、第１抗原に特異的に結合する第１可変領域を形成しており、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１抗原の別のエピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している、請求項１１８に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１２８】
前記第１ＶＬのアミノ酸配列が前記第２ＶＬのアミノ酸配列と同一である、請求項１２７に記載のヘテロ二量体化モジュール。
【請求項１２９】
二特異性抗体であって、
（ｉ）第１ＶＨ及び第１ＶＬを含み、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成しており、前記第１ＶＨが、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ＶＬが、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドとが対合して二量体を形成しており；
（ｉｉ）第２ＶＨ及び第２ＶＬを含み、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成しており、前記第２ＶＨがＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＶＬがＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記ＣＨ１ドメインと前記ＣＬドメインとが対合して二量体を形成しており；さらに、
（ｉｉｉ）ヘテロ二量体化モジュールであって、
（ａ）配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３６４及び３７０のアミノ酸がリジンであり、位置４０９のアミノ酸がロイシンであり；さらに
（ｂ）配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３７０のアミノ酸がセリンであり、位置４０５及び４０９のアミノ酸がリジンであり、
（ａ）及び（ｂ）において前記アミノ酸位置がＥＵ付番方式に基づくものである、前記ヘテロ二量体化モジュール
を含む、前記二特異性抗体。
【請求項１３０】
二特異性抗体であって、
（ｉ）第１ＶＨ及び第１ＶＬを含み、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成しており、前記第１ＶＨが、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ＶＬが、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドとが対合して二量体を形成しており；そして、
（ｉｉ）第２ＶＨ及び第２ＶＬを含み、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成しており、前記第２ＶＨがＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＶＬがＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記ＣＨ１ドメインと前記ＣＬドメインとが対合して二量体を形成しており；さらに、
（ｉｉｉ）ヘテロ二量体化モジュールであって、
（ａ）配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３６４及び３７０のアミノ酸がリジンであり、位置４０９のアミノ酸がロイシンであり；さらに
（ｂ）配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３７０のアミノ酸がセリンであり、位置３９７のアミノ酸がイソロイシンであり、位置４０５及び４０９のアミノ酸がリジンであり、
（ａ）及び（ｂ）において前記アミノ酸位置がＥＵ付番方式に基づくものである、前記ヘテロ二量体化モジュール
を含む、前記二特異性抗体。
【請求項１３１】
２つのＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項１２９または請求項１３０に記載の二特異性抗体。
【請求項１３２】
２つのＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項１２９または請求項１３０に記載の二特異性抗体。
【請求項１３３】
単一のポリペプチド鎖が前記第１ＶＨと前記第１ポリペプチドと前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１２９〜１３２のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１３４】
単一のポリペプチド鎖が前記第１ＶＨと前記第１ポリペプチドと前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１２９〜１３２のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１３５】
単一のポリペプチド鎖が前記第１ＶＬと前記第２ポリペプチドと前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１２９〜１３２のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１３６】
単一のポリペプチド鎖が前記第１ＶＬと前記第２ポリペプチドと前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１２９〜１３２のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１３７】
別の単一のポリペプチド鎖が前記第２ＶＨと前記ＣＨ１ドメインと前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１３３に記載の二特異性抗体。
【請求項１３８】
別の単一のポリペプチド鎖が前記第２ＶＨと前記ＣＨ１ドメインと前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１３４に記載の二特異性抗体。
【請求項１３９】
別の単一のポリペプチド鎖が前記第２ＶＬと前記ＣＬドメインと前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１３５に記載の二特異性抗体。
【請求項１４０】
別の単一のポリペプチド鎖が前記第２ＶＬと前記ＣＬドメインと前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１３６に記載の二特異性抗体。
【請求項１４１】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１２９〜１４０のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１４２】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２９〜１４０のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１４３】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７を含む、請求項１２９〜１４０のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１４４】
前記第１ポリペプチドが、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２９〜１４０のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１４５】
前記第１ポリペプチドが、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む、請求項１２９〜１４０のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１４６】
前記第２ポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２９〜１４５のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１４７】
前記第２ポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む、請求項１２９〜１４５のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１４８】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている、請求項１２９〜１４０のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１４９】
前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドが各々、鎖内ジスルフィド結合を形成しない配列番号１の２つのシステイン残基のうちの少なくとも１つにおいてシステイン以外のアミノ酸を含有している、請求項１２９〜１４０のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１５０】
（ｉ）前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドがＮグリコシル化されないように、前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドが各々、アスパラギン及び／もしくはスレオニンもしくはセリンを除く他のアミノ酸を配列番号１のＮグリコシル化モチーフ内に含有するか；または、
（ｉｉ）前記第１ポリペプチドもしくは前記第２ポリペプチドがＮグリコシル化されないように、前記第１ポリペプチドもしくは前記第２ポリペプチドが、アスパラギン及び／もしくはスレオニンもしくはセリンを除く他のアミノ酸を配列番号１のＮグリコシル化モチーフ内に含有する、
請求項１２９〜１４０または請求項１４２のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１５１】
二特異性抗体であって、
（ｉ）第１ＶＨ及び第１ＶＬを含み、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成しており、前記第１ＶＨが、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ＶＬが、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドとが対合して二量体を形成しており；そして、
（ｉｉ）第２ＶＨ及び第２ＶＬを含み、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成しており、前記第２ＶＨがＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＶＬがＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記ＣＨ１ドメインと前記ＣＬドメインとが対合して二量体を形成しており；さらに、
（ｉｉｉ）ヘテロ二量体化モジュールであって、
（ａ）配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３６４及び３７０のアミノ酸がリジンであり、位置４０９のアミノ酸がセリンであり；さらに
（ｂ）配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３７０のアミノ酸がセリンであり、位置４０５及び４０９のアミノ酸がリジンであり、
（ａ）及び（ｂ）において前記アミノ酸位置がＥＵ付番方式に基づくものである、前記ヘテロ二量体化モジュール
を含む、前記二特異性抗体。
【請求項１５２】
二特異性抗体であって、
（ｉ）第１ＶＨ及び第１ＶＬを含み、前記第１ＶＨと前記第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成しており、前記第１ＶＨが、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ＶＬが、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドとが対合して二量体を形成しており；
（ｉｉ）第２ＶＨ及び第２ＶＬを含み、前記第２ＶＨと前記第２ＶＬとが対合して、前記第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成しており、前記第２ＶＨがＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記第２ＶＬがＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、前記ＣＨ１ドメインと前記ＣＬドメインとが対合して二量体を形成しており；さらに、
（ｉｉｉ）ヘテロ二量体化モジュールであって、
（ａ）配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３６４及び３７０のアミノ酸がリジンであり、位置４０９のアミノ酸がロイシンであり；さらに
（ｂ）配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３７０のアミノ酸がセリンであり、位置３９７のアミノ酸がイソロイシンであり、位置４０５及び４０９のアミノ酸がリジンであり、
（ａ）及び（ｂ）において前記アミノ酸位置がＥＵ付番方式に基づくものである、前記ヘテロ二量体化モジュール
を含む、前記二特異性抗体。
【請求項１５３】
２つのＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項１５１または請求項１５２に記載の二特異性抗体。
【請求項１５４】
２つのＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項１５１または請求項１５２に記載の二特異性抗体。
【請求項１５５】
単一のポリペプチド鎖が前記第１ＶＨと前記第１ポリペプチドと前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１５１〜１５４のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１５６】
単一のポリペプチド鎖が前記第１ＶＨと前記第１ポリペプチドと前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１５１〜１５４のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１５７】
単一のポリペプチド鎖が前記第１ＶＬと前記第２ポリペプチドと前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１５１〜１５４のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１５８】
単一のポリペプチド鎖が前記第１ＶＬと前記第２ポリペプチドと前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１５１〜１５４のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１５９】
別の単一のポリペプチド鎖が前記第２ＶＨと前記ＣＨ１ドメインと前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１５５に記載の二特異性抗体。
【請求項１６０】
別の単一のポリペプチド鎖が前記第２ＶＨと前記ＣＨ１ドメインと前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１５６に記載の二特異性抗体。
【請求項１６１】
別の単一のポリペプチド鎖が前記第２ＶＬと前記ＣＬドメインと前記第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１５７に記載の二特異性抗体。
【請求項１６２】
別の単一のポリペプチド鎖が前記第２ＶＬと前記ＣＬドメインと前記第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む、請求項１５８に記載の二特異性抗体。
【請求項１６３】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項１５１〜１６２のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１６４】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５１〜１６２のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１６５】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２を含む、請求項１５１〜１６２のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１６６】
前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている、請求項１５１〜１６２のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１６７】
前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドが各々、鎖内ジスルフィド結合を形成しない配列番号２のシステイン残基においてシステイン以外のアミノ酸を含有している、請求項１５１〜１６２のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【請求項１６８】
（ｉ）前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドがＮグリコシル化されないように、前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドが各々、アスパラギン及び／もしくはスレオニンもしくはセリンを除く他のアミノ酸を配列番号２のＮグリコシル化モチーフ内に含有するか；または、
（ｉｉ）前記第１ポリペプチドもしくは前記第２ポリペプチドがＮグリコシル化されないように、前記第１ポリペプチドもしくは前記第２ポリペプチドが、アスパラギン及び／もしくはスレオニンもしくはセリンを除く他のアミノ酸を配列番号２のＮグリコシル化モチーフ内に含有する、
請求項１５１〜１６２または請求項１６６のいずれか１項に記載の二特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／２６９，６６４号に対する優先権の利益を主張するものであり、その内容を参照により全体的に本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
二特異性抗体の生物学的薬剤としての使用は、主に、従来型の２つの単一特異性抗体の併用によって獲得することができない新規作用機序をもたらす潜在性ゆえに、益々関心を集めている。そのため、二特異性抗体を生成する効率的な方法が模索されている。生物学的薬剤としての二特異性抗体を作製する初期の試みは、単一特異性抗体の化学的結合とｍＡｂ発現細胞の融合とを伴うものであったが、効率の低さ及び大量の副生成物による精製の必要性がこれらの方策の欠点である。タンパク質工学及び分子生物学において進歩した方法は、多様な新規二特異性抗体構成の作製を可能にした。しかしながら、これらの操作された二特異性抗体構成の、変化した生化学的／生物物理学的特性、血中半減期または安定性は、好ましくない場合がある。よって、これらの問題のいくつかを克服し得る二特異性抗体を作製するための効率的な基幹は有用であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本願は、異なるエピトープに結合する任意の２つの抗体を二特異性抗体に変換することができる抗体基幹技術に関する。この基幹技術は、一部において、Ｆｃ領域をそのＣＨ３ドメインにおけるリジン再配置によって操作して二特異性抗体の２本の重鎖のヘテロ二量体化を引き起こすことを含む。さらに、この技術は、二特異性抗体の軽鎖の誤対合を防止すべく二特異性抗体の２つのＦａｂアームのうちの一方を改変することを含む。具体的には、二特異性抗体の片方のＦａｂアームのＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインをＩｇＥ  ＣＨ２ドメインまたはＩｇＭ  ＣＨ２ドメインで置き換える。ある場合には、二特異性抗体の片方のＦａｂアームのＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインがＩｇＥ  ＣＨ２ドメイン（またはＩｇＭ  ＣＨ２ドメイン）の断片で置き換わっており、当該断片は、なおもＩｇＥ  ＣＨ２ドメイン（またはＩｇＭ  ＣＨ２ドメイン）と二量体化することができるものである。
【０００４】
一態様において、本開示は、第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）と第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）とを含んでいる、抗体またはその抗原結合性断片であって、第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成している、当該抗体またはその抗原結合性断片を提供する。第１ＶＨは、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに直接繋げられているかまたはリンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ＶＬは、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに直接繋げられているかまたはリンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとが対合して二量体を形成している。
【０００５】
この態様の特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドはＦｃドメインに直接繋げられている。ある場合には、ＦｃドメインはＩｇＧ１抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。ある場合には、ＦｃドメインはＩｇＧ４抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。ある場合には、ＦｃドメインはＩｇＧ４抗体のＣＨ２とＩｇＧ１抗体のＣＨ３ドメインとを含む。これら全ての実施形態のうちのいくつかでは、ＦｃドメインはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域（例えばＩｇＧ４Ｐ−すなわち、Ｓ２２８Ｐ突然変異を有するＩｇＧ４ヒンジ領域）を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態において、第１ポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２ポリペプチドは、配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態において、第２ポリペプチドは、配列番号６に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸９〜１０７に示すアミノ酸配列とは１２個以下のアミノ酸残基が異なっている。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、鎖内ジスルフィド結合を形成しない配列番号１の２つのシステイン残基のうちの少なくとも１つにおいてシステイン以外のアミノ酸を含有している。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは各々、Ｎ結合型グリコシル化部位がグリコシル化されないように、ＩｇＥ  ＣＨ２ドメインまたはその断片においてＮ結合型グリコシル化部位の突然変異を含有している（例えば、アスパラギン及び／またはスレオニン残基が別のアミノ酸で置換されている）。特定の実施形態では、第１ポリペプチドまたは第２ポリペプチドは、Ｎ結合型グリコシル化部位がグリコシル化されないように、ＩｇＥ  ＣＨ２ドメインまたはその断片においてＮ結合型グリコシル化部位の突然変異を含有している。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、第２重鎖可変ドメイン（第２ＶＨ）と第２軽鎖可変ドメイン（第２ＶＬ）とを含み、第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している。特定の実施形態では、第２ＶＨはＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、第２ＶＬはＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。特定の実施形態では、本開示は、��記の抗体または抗原結合性断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、上記の１つ以上のポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターが提供される。他の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含んでいる宿主細胞が提供される。さらに他の実施形態では、上記の抗体または抗原結合性断片を作る方法であって、上記の抗体または抗原結合性断片の発現をもたらす条件下で上記宿主細胞を培養することと、細胞培養物から抗体または抗原結合性断片を単離することとを含む、当該方法が提供される。特定の実施形態では、単離された抗体または抗原結合性断片は、無菌組成物として、それを必要とするヒト対象への投与のために製剤化される。
【０００６】
第２の態様において、本開示は、第１ＶＨと第１ＶＬとを含んでいる、抗体またはその抗原結合性断片を提供し、第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成している。第１ＶＨは、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ＶＬは、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとが対合して二量体を形成している。
【０００７】
この態様の特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドはＦｃドメインに直接繋げられている。ある場合には、ＦｃドメインはＩｇＧ１抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。ある場合には、ＦｃドメインはＩｇＧ４抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。ある場合には、ＦｃドメインはＩｇＧ４抗体のＣＨ２とＩｇＧ１抗体のＣＨ３ドメインとを含む。これら全ての実施形態のうちのいくつかでは、ＦｃドメインはＩｇＧ４抗体のヒンジ領域（例えばＩｇＧ４Ｐ−すなわち、Ｓ２２８Ｐ突然変異を有するＩｇＧ４ヒンジ領域）を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸７〜１１２に示すアミノ酸配列とは１２個以下のアミノ酸残基が異なっている。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、鎖内ジスルフィド結合を形成しない配列番号２のシステイン残基においてシステイン以外のアミノ酸を含有している。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは各々、Ｎ結合型グリコシル化部位がグリコシル化されないように、ＩｇＭ  ＣＨ２ドメインまたはその断片においてＮ結合型グリコシル化部位の突然変異を含有している（例えば、アスパラギン及び／またはセリン残基が別のアミノ酸で置換されている）。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドまたは第２ポリペプチドは、Ｎ結合型グリコシル化部位がグリコシル化されないように、ＩｇＭ  ＣＨ２ドメインまたはその断片においてＮ結合型グリコシル化部位の突然変異を含有している。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、第２重鎖可変ドメイン（第２ＶＨ）と第２軽鎖可変ドメイン（第２ＶＬ）とを含み、第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している。特定の実施形態では、第２ＶＨはＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、第２ＶＬはＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。特定の実施形態では、本開示は、上記の抗体または抗原結合性断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、上記の１つ以上のポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターが提供される。他の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含んでいる宿主細胞が提供される。さらに他の実施形態では、上記の抗体または抗原結合性断片を作る方法であって、上記の抗体または抗原結合性断片の発現をもたらす条件下で上記宿主細胞を培養することと、細胞培養物から抗体または��原結合性断片を単離することとを含む、当該方法が提供される。特定の実施形態では、単離された抗体または抗原結合性断片は、無菌組成物として、それを必要とするヒト対象への投与のために製剤化される。
【０００８】
別の態様において、本開示は、二特異性抗体であって、第１ＶＨと第１ＶＬとを含んでいる第１抗原結合性断片（第１Ｆａｂ）を含み、第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して第１可変領域を形成している、当該二特異性抗体を提供する。第１ＶＨは、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ＶＬは、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。二特異性抗体はさらに、第２ＶＨと第２ＶＬとを含んでいる第２Ｆａｂを含み、第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して第２可変領域を形成しており、第２ＶＨはＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、第２ＶＬはＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１Ｆａｂ及び第２Ｆａｂは、異なる抗原、または同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合するものであり、第１Ｆａｂは第２Ｆａｂに連結されている。
【０００９】
この態様のいくつかの実施形態では、第１Ｆａｂはリンカーによって第２Ｆａｂに連結される。特定の実施形態では、第１Ｆａｂは異種ポリペプチドによって第２Ｆａｂに連結される。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドはヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドはＸＴＥＮ（例えば、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８）である。いくつかの実施形態では、第１Ｆａｂはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって第２Ｆａｂに連結される。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは各々、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第２ポリペプチドは、配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２ポリペプチドは、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸９〜１０７に示すアミノ酸配列とは１２個以下のアミノ酸残基が異なっている。他の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合を形成することができる配列番号１の２つのシステイン残基のうちの少なくとも１つにおいてシステイン以外のアミノ酸を含有している。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、Ｎ結合型グリコシル化部位がグリコシル化されないように、ＩｇＥ  ＣＨ２ドメインまたはその断片においてＮ結合型グリコシル化部位の突然変異を含有している。例えば、ＩｇＥ  ＣＨ２ドメインのＮ結合型グリコシル化部位のアスパラギン及び／またはスレオニンが別のアミノ酸で置換されてこのモチーフのグリコシル化を防止していてもよい。特定の実施形態では、本開示は、上記二特異性抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、上記二特異性抗体を含んでいる発現ベクターが提供される。他の実施形態では、二特異性抗体または発現ベクターを含んでいる宿主細胞が提供される。さらに他の実施形態では、二特異性抗体を作る方法であって、二特異性抗体の発現をもたらす条件下で上記宿主細胞を培養することと、細胞培養物から二特異性抗体を単離することとを含む、当該方法が提供される。特定の実施形態では、単離された二特異性抗体は、無菌組成物として、それを必要とするヒト対象への投与のために製剤化される。
【００１０】
別の態様において、本開示は、二特異性抗体であって、第１ＶＨと第１ＶＬとを含んでいる第１抗原結合性断片（第１Ｆａｂ）を含み、第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して第１可変領域を形成している、当該二特異性抗体を提供する。第１ＶＨは、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ＶＬは、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。二特異性抗体はさらに、第２ＶＨと第２ＶＬとを含んでいる第２Ｆａｂを含む。第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して第２可変領域を形成しており、第２ＶＨはＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、第２ＶＬはＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１Ｆａｂ及び第２Ｆａｂは、異なる抗原、または同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合する。第１Ｆａｂは第２Ｆａｂに連結されている。
【００１１】
この態様のいくつかの実施形態では、第１Ｆａｂはリンカーによって第２Ｆａｂに連結される。特定の実施形態では、第１Ｆａｂは異種ポリペプチドによって第２Ｆａｂに連結される。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドはヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドはＸＴＥＮ（例えば、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８）である。いくつかの実施形態では、第１Ｆａｂはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって第２Ｆａｂに連結される。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは各々、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸７〜１１２に示すアミノ酸配列とは１２個以下のアミノ酸残基が異なっている。他の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合を形成することができる配列番号２のシステイン残基においてシステイン以外のアミノ酸を含有している。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、Ｎ結合型グリコシル化部位がグリコシル化されないように、ＩｇＭ  ＣＨ２ドメインまたはその断片においてＮ結合型グリコシル化部位の突然変異を含有している。例えば、ＩｇＭ  ＣＨ２ドメインのＮ結合型グリコシル化部位のアスパラギン及び／またはセリンが別のアミノ酸で置換されてこのモチーフのグリコシル化を防止していてもよい。特定の実施形態では、本開示は、上記二特異性抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、上記二特異性抗体を含んでいる発現ベクターが提供される。他の実施形態では、二特異性抗体または発現ベクターを含んでいる宿主細胞が提供される。さらに他の実施形態では、二特異性抗体を作る方法であって、二特異性抗体の発現をもたらす条件下で上記宿主細胞を培養することと、細胞培養物から二特異性抗体を単離することとを含む、当該方法が提供される。特定の実施形態では、単離された二特異性抗体は、無菌組成物として、それを必要とするヒト対象への投与のために製剤化される。
【００１２】
別の態様において、本開示は、四価二特異性抗体であって、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する全ＩｇＧ抗体を含み、全ＩｇＧ抗体が第１ＣＨ３ドメイン及び第２ＣＨ３ドメインを含むものであり；さらに、第１Ｆａｂ及び第２Ｆａｂを含む、当該四価二特異性抗体を提供する。第１Ｆａｂは、第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）及び第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）を含み、第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第１可変領域を形成している。第２Ｆａｂは、第２重鎖可変ドメイン（第２ＶＨ）及び第２軽鎖可変ドメイン（第２ＶＬ）を含み、第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１Ｆａｂと同じエピトープに特異的に結合する第２可変領域を形成している。第１ＶＨは、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ＶＬは、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第２ＶＨは、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第３ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第２ＶＬは、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第４ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１Ｆａｂは、全ＩｇＧ抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、第２Ｆａｂは、全ＩｇＧ抗体の第２ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている。
【００１３】
この態様のいくつかの実施形態では、第１Ｆａｂは第１リンカーによって全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、第２Ｆａｂは第２リンカーによって全抗体の第２ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている。特定の実施形態では、第１リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第１ＶＨのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第１リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第１ＶＬのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第１リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第１ポリペプチドのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第１リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第２ポリペプチドのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第２リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第２ＶＨのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第２リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第２ＶＬのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第２リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第３ポリペプチドのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第２リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第４ポリペプチドのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第１及び第２リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び第３ポリペプチドは各々、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び第３ポリペプチドは各々、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第２ポリペプチド及び第４ポリペプチドは各々、配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２ポリペプチド及び第４ポリペプチドは各々、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸９〜１０７に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている。特定の実施形態では、本開示は、上記二特異性抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、上記二特異性抗体を含んでいる発現ベクターが提供される。他の実施形態では、二特異性抗体または発現ベクターを含んでいる宿主細胞が提供される。さらに他の実施形態では、二特異性抗体を作る方法であって、二特異性抗体の発現をもたらす条件下で上記宿主細胞を培養することと、細胞培養物から二特異性抗体を単離することとを含む、当該方法が提供される。特定の実施形態では、単離された二特異性抗体は、無菌組成物として、それを必要とするヒト対象への投与のために製剤化される。
【００１４】
別の態様において、本開示は、四価二特異性抗体であって、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する全ＩｇＧ抗体を含み、全ＩｇＧ抗体が第１ＣＨ３ドメイン及び第２ＣＨ３ドメインを含むものであり；さらに、第１Ｆａｂ及び第２Ｆａｂを含む、当該四価二特異性抗体を提供する。第１Ｆａｂは、第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）及び第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）を含み、第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第１可変領域を形成している。第２Ｆａｂは、第２重鎖可変ドメイン（第２ＶＨ）及び第２軽鎖可変ドメイン（第２ＶＬ）を含み、第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１Ｆａｂと同じエピトープに特異的に結合する第２可変領域を形成している。第１ＶＨは、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ＶＬは、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第２ＶＨは、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第３ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第２ＶＬは、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第４ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１Ｆａｂは、全ＩｇＧ抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、第２Ｆａｂは、全ＩｇＧ抗体の第２ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている。
【００１５】
この態様のいくつかの実施形態では、第１Ｆａｂは第１リンカーによって全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、第２Ｆａｂは第２リンカーによって全抗体の第２ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている。特定の実施形態では、第１リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第１ＶＨのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第１リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第１ＶＬのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第１リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第１ポリペプチドのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第１リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第２ポリペプチドのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第２リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第２ＶＨのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第２リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第２ＶＬのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第２リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第３ポリペプチドのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第２リンカーは、全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端と第４ポリペプチドのＮ末端とを繋げている。特定の実施形態では、第１及び第２リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸７〜１１２に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている。特定の実施形態では、本開示は、上記二特異性抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、上記二特異性抗体を含んでいる発現ベクターが提供される。他の実施形態では、二特異性抗体または発現ベクターを含んでいる宿主細胞が提供される。さらに他の実施形態では、二特異性抗体を作る方法であって、二特異性抗体の発現をもたらす条件下で上記宿主細胞を培養することと、細胞培養物から二特異性抗体を単離することとを含む、当該方法が提供される。特定の実施形態では、単離された二特異性抗体は、無菌組成物として、それを必要とするヒト対象への投与のために製剤化される。
【００１６】
別の態様において、本開示は、四価二特異性抗体であって、第１Ｆａｂ及び第２Ｆａｂを含み、第１Ｆａｂが第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）及び第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）を含むものであり、第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成しており、第２Ｆａｂが第２重鎖可変ドメイン（第２ＶＨ）及び第２軽鎖可変ドメイン（第２ＶＬ）を含むものであり、第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第２可変領域を形成している、当該四価二特異性抗体に関する。四価二特異性抗体はさらに、第１ＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン及び第１ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含んでいる第１重鎖と、第２ＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含んでいる第２重鎖と、第１軽鎖と、第２軽鎖とを含む、全抗体を含み、当該抗体が、第３ＶＨ及び第３ＶＬならびに第４ＶＨ及び第４ＶＬを含むものであり、第３ＶＨと第３ＶＬとが対合して、第２抗原のエピトープに特異的に結合する第３可変領域を形成しており、第４ＶＨと第４ＶＬとが対合して、第２抗原の同じエピトープに特異的に結合する第４可変領域を形成している。第３ＶＨは、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第３ＶＬは、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第４ＶＨは、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第３ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第４ＶＬは、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第４ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ポリペプチドは第１ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されており、第３ポリペプチドは第２ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されている。第１Ｆａｂは第１ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、第２Ｆａｂは第２ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている。
【００１７】
この態様のいくつかの実施形態では、第１Ｆａｂは第１リンカーによって全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、第２Ｆａｂは第２リンカーによって全抗体の第２ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている。特定の実施形態では、第１及び第２リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び第３ポリペプチドは各々、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び第３ポリペプチドは各々、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第２ポリペプチド及び第４ポリペプチドは各々、配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２ポリペプチド及び第４ポリペプチドは各々、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸９〜１０７に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている。特定の実施形態では、本開示は、上記二特異性抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、上記二特異性抗体を含んでいる発現ベクターが提供される。他の実施形態では、二特異性抗体または発現ベクターを含んでいる宿主細胞が提供される。さらに他の実施形態では、二特異性抗体を作る方法であって、二特異性抗体の発現をもたらす条件下で上記宿主細胞を培養することと、細胞培養物から二特異性抗体を単離することとを含む、当該方法が提供される。特定の実施形態では、単離された二特異性抗体は、無菌組成物として、それを必要とするヒト対象への投与のために製剤化される。
【００１８】
別の態様において、本開示は、四価二特異性抗体であって、第１Ｆａｂ及び第２Ｆａｂを含み、第１Ｆａｂが第１重鎖可変ドメイン（第１ＶＨ）及び第１軽鎖可変ドメイン（第１ＶＬ）を含むものであり、第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成しており、第２Ｆａｂが第２重鎖可変ドメイン（第２ＶＨ）及び第２軽鎖可変ドメイン（第２ＶＬ）を含むものであり、第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第２可変領域を形成している、当該四価二特異性抗体に関する。四価二特異性抗体はさらに、第１ＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン及び第１ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含んでいる第１重鎖と、第２ＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含んでいる第２重鎖と、第１軽鎖と、第２軽鎖とを含む、全抗体を含み、当該抗体が、第３ＶＨ及び第３ＶＬならびに第４ＶＨ及び第４ＶＬを含むものであり、第３ＶＨと第３ＶＬとが対合して、第２抗原のエピトープに特異的に結合する第３可変領域を形成しており、第４ＶＨと第４ＶＬとが対合して、第２抗原の同じエピトープに特異的に結合する第４可変領域を形成している。第３ＶＨは、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第３ＶＬは、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第４ＶＨは、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第３ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第４ＶＬは、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第４ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ポリペプチドは第１ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されており、第３ポリペプチドは第２ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されている。第１Ｆａｂは第１ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、第２Ｆａｂは第２ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている。
【００１９】
この態様のいくつかの実施形態では、第１Ｆａｂは第１リンカーによって全抗体の第１ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されており、第２Ｆａｂは第２リンカーによって全抗体の第２ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結されている。特定の実施形態では、第１及び第２リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド及び／または第４ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸７〜１１２に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている。特定の実施形態では、本開示は、上記二特異性抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、上記二特異性抗体を含んでいる発現ベクターが提供される。他の実施形態では、二特異性抗体または発現ベクターを含んでいる宿主細胞が提供される。さらに他の実施形態では、二特異性抗体を作る方法であって、二特異性抗体の発現をもたらす条件下で上記宿主細胞を培養することと、細胞培養物から二特異性抗体を単離することとを含む、当該方法が提供される。特定の実施形態では、単離された二特異性抗体は、無菌組成物として、それを必要とするヒト対象への投与のために製剤化される。
【００２０】
さらに別の態様において、本開示は、ヘテロ二量体化モジュールであって、配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３６４及び３７０のアミノ酸がリジンであり、位置４０９のアミノ酸がセリンであり；さらに、配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３７０のアミノ酸がセリンであり、位置４０５及び４０９のアミノ酸がリジンである、当該ヘテロ二量体化モジュールを提供する。アミノ酸位置はＥＵ付番方式に基づくものである。第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインと第２ＩｇＧ１  ＣＨ３とが対合してヘテロ二量体を形成している。
【００２１】
この態様の特定の実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含み、第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインは第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインは第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、２本のポリペプチド鎖を含んでいる第１Ｆａｂを含み、Ｆａｂの２本のポリペプチド鎖のうちの１本のＣ末端が、第１ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、第１ヒンジ領域が第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている。
【００２３】
他の実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＣ末端と、第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２ヒンジ領域のＮ末端とを繋げるリンカーを含む。特定の実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、第２ヒンジ領域を介して第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２Ｆａｂを含む。
【００２４】
特定の実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む。ＶＨドメインのＣ末端はＣＨ１ドメインのＮ末端に繋げられており、ＣＨ１ドメインのＣ末端は第１ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、第１ヒンジ領域のＣ末端は、第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている。ＶＬドメインのＣ末端はＣＬドメインのＮ末端に繋げられており、ＣＬドメインのＣ末端は第２ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、第２ヒンジ領域のＣ末端は、第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている。ＶＨドメインとＶＬドメインとが対合して、抗原に特異的に結合する可変領域を形成している。
【００２５】
特定の実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、第１ＶＨ及び第１ＶＬならびに第２ＶＨ及び第２ＶＬを含む。第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原に特異的に結合する第１可変領域を形成している。第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１抗原の別のエピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している。いくつかの実施形態では、第１ＶＬのアミノ酸配列は第２ＶＬのアミノ酸配列と同一である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインを含み、第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインは第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインは第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。ある場合には、ヘテロ二量体化モジュールは、２本のポリペプチド鎖を含んでいる第１Ｆａｂを含み、Ｆａｂの２本のポリペプチド鎖のうちの１本のＣ末端が、第１ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、第１ＩｇＧ４ヒンジ領域が第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている。ある場合には、第１ＩｇＧ４ヒンジ領域はＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む。ある場合には、ヘテロ二量体化モジュールは、第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＣ末端と、第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端とを繋げるリンカーを含む。特定の場合には、第２ＩｇＧ４ヒンジ領域はＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む。ある場合には、ヘテロ二量体化モジュールは、第２ＩｇＧ４ヒンジ領域を介して第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２Ｆａｂを含む。特定の場合には、第２ＩｇＧ４ヒンジ領域はＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む。ＶＨドメインのＣ末端はＣＨ１ドメインのＮ末端に繋げられており、ＣＨ１ドメインのＣ末端は第１ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、第１ＩｇＧ４ヒンジ領域のＣ末端は、第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている。ＶＬドメインのＣ末端はＣＬドメインのＮ末端に繋げられており、ＣＬドメインのＣ末端は第２ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、第２ＩｇＧ４ヒンジ領域のＣ末端は、第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている。ＶＨドメインとＶＬドメインとが対合して、抗原に特異的に結合する可変領域を形成している。ある場合には、第１ＩｇＧ４ヒンジ領域及び第２ＩｇＧ４ヒンジ領域は各々、Ｓ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、第１ＶＨ及び第１ＶＬならびに第２ＶＨ及び第２ＶＬを含む。第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原に特異的に結合する第１可変領域を形成している。第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１抗原の別のエピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している。ある場合には、第１ＶＬのアミノ酸配列は第２ＶＬのアミノ酸配列と同一である。
【００２９】
特定の実施形態では、本開示は、上記ヘテロ二量体化モジュールをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを特徴とする。ある場合には、１つ以上のポリヌクレオチドを含んでいる１つ以上の発現ベクターを特徴とする。他の場合には、１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上の発現ベクターを含んでいる宿主細胞が提供される。ある場合には、ヘテロ二量体化モジュールを製造する方法が包含される。方法は、ヘテロ二量体化モジュールの発現をもたらす条件下で宿主細胞を培養すること及びその単離を含む。
【００３０】
別の態様において、本開示は、ヘテロ二量体化モジュールであって、配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３６４及び３７０のアミノ酸がリジンであり、位置４０９のアミノ酸がロイシンであり；さらに、配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３７０のアミノ酸がセリンであり、位置３９７のアミノ酸がイソロイシンであり、位置４０５及び４０９のアミノ酸がリジンである、当該ヘテロ二量体化モジュールに関する。アミノ酸位置はＥＵ付番方式に基づくものである。第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインと第２ＩｇＧ１  ＣＨ３とが対合してヘテロ二量体を形成している。
【００３１】
この態様の特定の実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含み、第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインは第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインは第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、２本のポリペプチド鎖を含んでいる第１Ｆａｂを含み、Ｆａｂの２本のポリペプチド鎖のうちの１本のＣ末端が、第１ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、第１ヒンジ領域が第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている。
【００３３】
他の実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＣ末端と、第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２ヒンジ領域のＮ末端とを繋げるリンカーを含む。特定の実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、第２ヒンジ領域を介して第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２Ｆａｂを含む。
【００３４】
特定の実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む。ＶＨドメインのＣ末端はＣＨ１ドメインのＮ末端に繋げられており、ＣＨ１ドメインのＣ末端は第１ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、第１ヒンジ領域のＣ末端は、第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた第１ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている。ＶＬドメインのＣ末端はＣＬドメインのＮ末端に繋げられており、ＣＬドメインのＣ末端は第２ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、第２ヒンジ領域のＣ末端は、第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた第２ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている。ＶＨドメインとＶＬドメインとが対合して、抗原に特異的に結合する可変領域を形成している。
【００３５】
特定の実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、第１ＶＨ及び第１ＶＬならびに第２ＶＨ及び第２ＶＬを含む。第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原に特異的に結合する第１可変領域を形成している。第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１抗原の別のエピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している。ある場合には、第１ＶＬのアミノ酸配列は第２ＶＬのアミノ酸配列と同一である。
【００３６】
特定の実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン及び第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインを含み、第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインは第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインは第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＮ末端に（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。ある場合には、ヘテロ二量体化モジュールは、２本のポリペプチド鎖を含んでいる第１Ｆａｂを含み、Ｆａｂの２本のポリペプチド鎖のうちの１本のＣ末端が、第１ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、第１ＩｇＧ４ヒンジ領域が第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている。ある場合には、第１ＩｇＧ４ヒンジ領域はＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む。ある場合には、ヘテロ二量体化モジュールは、第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのＣ末端と、第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端とを繋げるリンカーを含む。特定の場合には、第２ＩｇＧ４ヒンジ領域はＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む。ある場合には、ヘテロ二量体化モジュールは、第２ＩｇＧ４ヒンジ領域を介して第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられた第２Ｆａｂを含む。特定の場合には、第２ＩｇＧ４ヒンジ領域はＳ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む。ＶＨドメインのＣ末端はＣＨ１ドメインのＮ末端に繋げられており、ＣＨ１ドメインのＣ末端は第１ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、第１ＩｇＧ４ヒンジ領域のＣ末端は、第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた第１ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている。ＶＬドメインのＣ末端はＣＬドメインのＮ末端に繋げられており、ＣＬドメインのＣ末端は第２ＩｇＧ４ヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、第２ＩｇＧ４ヒンジ領域のＣ末端は、第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに直接繋げられた第２ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのＮ末端に繋げられている。ＶＨドメインとＶＬドメインとが対合して、抗原に特異的に結合する可変領域を形成している。ある場合には、第１ＩｇＧ４ヒンジ領域及び第２ＩｇＧ４ヒンジ領域は各々、Ｓ２２８Ｐ突然変異（ＥＵ付番）を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化モジュールは、第１ＶＨ及び第１ＶＬならびに第２ＶＨ及び第２ＶＬを含む。第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原に特異的に結合する第１可変領域を形成している。第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１抗原の別のエピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している。ある場合には、第１ＶＬのアミノ酸配列は第２ＶＬのアミノ酸配列と同一である。
【００３９】
特定の実施形態では、本開示は、上記ヘテロ二量体化モジュールをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを特徴とする。ある場合には、１つ以上のポリヌクレオチドを含んでいる１つ以上の発現ベクターを特徴とする。他の場合には、１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上の発現ベクターを含んでいる宿主細胞が提供される。ある場合には、ヘテロ二量体化モジュールを製造する方法が包含される。方法は、ヘテロ二量体化モジュールの発現をもたらす条件下で宿主細胞を培養すること及びその単離を含む。
【００４０】
別の態様において、本開示は、二特異性抗体であって、第１ＶＨ及び第１ＶＬを含み、第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成している、当該二特異性抗体を提供する。第１ＶＨは、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ＶＬは、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとが対合して二量体を形成している。二特異性抗体はさらに、第２ＶＨ及び第２ＶＬを含み、第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している。第２ＶＨはＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第２ＶＬはＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとが対合して二量体を形成している。二特異性抗体はさらに、ヘテロ二量体化モジュールであって、配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３６４及び３７０のアミノ酸がリジンであり、位置４０９のアミノ酸がロイシンである、当該ヘテロ二量体化モジュールを含む。ヘテロ二量体化モジュールはさらに、配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３７０のアミノ酸がセリンであり、位置４０５及び４０９のアミノ酸がリジンである。上記のアミノ酸位置は全てＥＵ付番方式に基づくものである（ＩｇＥ  ＣＨ２ドメインが、第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインまたは第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含んでいるポリペプチドの一部であってもよいことに留意することが重要である。）
【００４１】
別の態様において、本開示は、二特異性抗体であって、第１ＶＨ及び第１ＶＬを含み、第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成している、当該二特異性抗体を提供する。第１ＶＨは、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ＶＬは、ヒトＩｇＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸９〜１０７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとが対合して二量体を形成している。二特異性抗体はさらに、第２ＶＨ及び第２ＶＬを含み、第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している。第２ＶＨはＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第２ＶＬはＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとが対合して二量体を形成している。二特異性抗体はさらに、ヘテロ二量体化モジュールであって、配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３６４及び３７０のアミノ酸がリジンであり、位置４０９のアミノ酸がロイシンである、当該ヘテロ二量体化モジュールを含む。ヘテロ二量体化モジュールはさらに、配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３７０のアミノ酸がセリンであり、位置３９７のアミノ酸がイソロイシンであり、位置４０５及び４０９のアミノ酸がリジンである。上記のアミノ酸位置は全てＥＵ付番方式に基づくものである（ＩｇＥ  ＣＨ２ドメインが、第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインまたは第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含んでいるポリペプチドの一部であってもよいことに留意することが重要である。）
【００４２】
上記２つの態様のいくつかの実施形態では、二特異性抗体は２つのＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む。上記２つの態様のいくつかの実施形態では、二特異性抗体は２つのＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチド鎖が第１ＶＨと第１ポリペプチドと第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチド鎖が第１ＶＨと第１ポリペプチドと第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。他の実施形態では、単一のポリペプチド鎖が第１ＶＬと第２ポリペプチドと第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。さらに他の実施形態では、単一のポリペプチド鎖が第１ＶＬと第２ポリペプチドと第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、別の単一のポリペプチド鎖が第２ＶＨとＣＨ１ドメインと第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、別の単一のポリペプチド鎖が第２ＶＨとＣＨ１ドメインと第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、別の単一のポリペプチド鎖が第２ＶＬとＣＬドメインと第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、別の単一のポリペプチド鎖が第２ＶＬとＣＬドメインと第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸９〜１０７を含む。他の実施形態では、第１ポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第１ポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第２ポリペプチドは、配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２ポリペプチドは、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは各々、鎖内ジスルフィド結合を形成しない配列番号１の２つのシステイン残基のうちの少なくとも１つにおいてシステイン以外のアミノ酸を含有している。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドがＮ結合型グリコシル化部位においてグリコシル化されないように、Ｎ結合型グリコシル化部位において１つ以上の突然変異を有する。他の実施形態では、第１ポリペプチドまたは第２ポリペプチドは、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドがＮ結合型グリコシル化部位においてグリコシル化されないように、Ｎ結合型グリコシル化部位において１つ以上の突然変異を有する。これらの突然変異は、Ｎ結合型グリコシル化部位のアスパラギンまたはスレオニンまたはセリンからその他���アミノ酸（複数可）への突然変異であり得る。
【００４３】
別の態様において、本開示は、二特異性抗体であって、第１ＶＨ及び第１ＶＬを含み、第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成している、当該二特異性抗体を提供する。第１ＶＨは、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ＶＬは、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとが対合して二量体を形成している。二特異性抗体はさらに、第２ＶＨ及び第２ＶＬを含み、第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している。第２ＶＨはＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第２ＶＬはＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとが対合して二量体を形成している。二特異性抗体はさらに、ヘテロ二量体化モジュールであって、配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３６４及び３７０のアミノ酸がリジンであり、位置４０９のアミノ酸がセリンであり；さらに、配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３７０のアミノ酸がセリンであり、位置４０５及び４０９のアミノ酸がリジンである、当該ヘテロ二量体化モジュールを含む。上記のアミノ酸位置はＥＵ付番方式に基づくものである。
【００４４】
別の態様において、本開示は、二特異性抗体であって、第１ＶＨ及び第１ＶＬを含み、第１ＶＨと第１ＶＬとが対合して、第１抗原の第１エピトープに特異的に結合する第１可変領域を形成している、当該二特異性抗体に関する。第１ＶＨは、ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第１ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ＶＬは、ヒトＩｇＭのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸７〜１１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる第２ポリペプチドに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとが対合して二量体を形成している。二特異性抗体はさらに、第２ＶＨ及び第２ＶＬを含み、第２ＶＨと第２ＶＬとが対合して、第１抗原の第２エピトープまたは第２抗原に特異的に結合する第２可変領域を形成している。第２ＶＨはＣＨ１ドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかである。第２ＶＬはＣＬドメインに（ｉ）直接繋げられているかまたは（ｉｉ）リンカーを介して繋げられているかのどちらかであり、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとが対合して二量体を形成している。二特異性抗体はさらに、ヘテロ二量体化モジュールであって、配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３６４及び３７０のアミノ酸がリジンであり、位置４０９のアミノ酸がロイシンであり；さらに、配列番号１１に示す配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み、位置３７０のアミノ酸がセリンであり、位置３９７のアミノ酸がイソロイシンであり、位置４０５及び４０９のアミノ酸がリジンである、当該ヘテロ二量体化モジュールを含む。上記のアミノ酸位置はＥＵ付番方式に基づくものである。
【００４５】
上記２つの態様のいくつかの実施形態では、二特異性抗体は２つのＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む。上記２つの態様のいくつかの実施形態では、二特異性抗体は２つのＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチド鎖が第１ＶＨと第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチド鎖が第１ＶＨと第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。他の実施形態では、単一のポリペプチド鎖が第１ＶＬと第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。さらに他の実施形態では、単一のポリペプチド鎖が第１ＶＬと第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチド鎖が第２ＶＨと第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチド鎖が第２ＶＨと第１ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチド鎖が第２ＶＨと第２ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸７〜１１２を含む。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び／または第２ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列とは少なくとも１２個のアミノ酸残基が異なっている。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは各々、鎖内ジスルフィド結合を形成しない配列番号２のシステイン残基においてシステイン以外のアミノ酸を含有している。特定の実施形態では、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドがＮ結合型グリコシル化部位においてグリコシル化されないように、Ｎ結合型グリコシル化部位において１つ以上の突然変異を有する。他の実施形態では、第１ポリペプチドまたは第２ポリペプチドは、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドがＮ結合型グリコシル化部位においてグリコシル化されないように、Ｎ結合型グリコシル化部位において１つ以上の突然変異を有する。これらの突然変異は、Ｎ結合型グリコシル化部位のアスパラギンまたはスレオニンまたはセリンからその他のアミノ酸（複数可）への突然変異であり得る。特定の実施形態では、本開示は、上記二特異性抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、上記二特異性抗体を含んでいる発現ベクターが提供される。他の実施形態では、二特異性抗体または発現ベクターを含んでいる宿主細胞が提供される。さらに他の実施形態では、二特異性抗体を作る方法であって、二特異性抗体の発現をもたらす条件下で上記宿主細胞を培養することと、細胞培養物から二特異性抗体を単離することとを含む、当該方法が提供される。特定の実施形態では、単離された二特異性抗体は、無菌組成物として、それを必要とするヒト対象への投与のために製剤化される。
【００４６】
特に定義していない限り、本明細書中で使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野において通常の技量を有する者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法または材料と同様または等価である方法または材料を本発明の実施または試験において使用することはできるが、典型的な方法及び材料を以下に記載する。本明細書中で言及する全ての刊行物、特許出願、特許及びその他の参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。係争の場合には、定義を含めた本願によって立証されよう。材料、方法及び実施例は、例示的なものに過ぎず、限定することは意図されない。
【００４７】
本発明のその他の特徴及び利点は以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】非対称抗体における誤対合による望ましくない副生成物の模式図である。この図は、２つの抗体が共発現する場合に軽鎖及び／または重鎖の誤対合によっていくつかの望ましくない副生成物が形成され得ることを示す。所望の非対称抗体は少ない部分を構成し得、その所望の抗体の精製は困難を呈し得る。
【図２】リジン再配置によるＣＨ３ヘテロ二量体化の模式図である。ヒトＩｇＧ１の野生型ＣＨ３ドメインの通常の頭−尾ホモ二量体においてリジン３７０及びリジン４０９は積み重なっている。単量体Ａにおける突然変異Ｓ３６４Ｋ／Ｋ４０９Ｓ及び単量体Ｂにおける突然変異Ｋ３７０Ｓ／Ｆ４０５Ｋは、積み重なったリジンの配向を逆転させて、Ａ／Ｂヘテロ二量体の形成を可能としながらホモ二量体における衝突をもたらす（下側）。こうしてリジン再配置は重鎖ヘテロ二量体化に効果的である方策を提供する。上に言及したアミノ酸位置はＥＵ付番に基づくものである。
【図３Ａ】ＩｇＧ／Ｆｃヘテロ二量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の描写である。プロテインＡ精製した分量分のヘテロ二量体をＳＤＳｐａｇｅで分析した。ＩｇＧ１とＦｃとのヘテロ二量体が主な種である。ノブ・イントゥ・ホール型である２つの画分を装填した。不完全設計ＭＰ１は、多量のヘテロ二量体を示すが、Ｆｃ二量体の形成を抑制する突然変異が欠けておりそれゆえにＦｃ単量体を含有していない。
【図３Ｂ】ＬＣ−ＭＳによって推定された成分のモル比及び相対量を示す棒グラフである。
【図３Ｃ】ＤＳＣによって決定された精製テロ二量体の融解温度の描写である。
【図４Ａ】ヘテロ二量体化突然変異体の発現及び半抗体形成を示す。ＣＨＯ細胞を、同じＦａｂ（Ｍ６０−Ａ０２抗ＥＧＦＲ）を含有する様々な比率のｍｐ４ａ及びｍｐ４ｂ重鎖でトランスフェクトした。発現したタンパク質における半抗体形成をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した。
【図４Ｂ】半抗体形成を定量するために使用した一連の質量スペクトルを示す。試料のＭＳスペクトルは、トランスフェクション比１：１で最大量のヘテロ二量体と最少のホモ二量体とが存在することを示した。
【図５Ａ】軽鎖対合問題に対する本願の解決策の１つであるＥ−ｆａｂの作出の模式図である。Ｅ−ｆａｂにおいてＣＨ１及びＣＬは、天然の二量体を形成するものであるＩｇＥ  ＣＨ２（Ｃε２）ドメインで置き換わっている。
【図５Ｂ】Ｉｇフォールドの全体的類似性を示す、ヒトＣε２ドメイン（白）とヒトＩｇＧ１  ＣＨ１／カッパ定常ドメイン（黒）との構造の重ね合わせである。Ｃε２ドメインは、界面の上側部分では様々な角度及びより長い距離で対合しているが、下側の界面ではより密にパッキングされている。βストランドＡの始まるところにあるＰｒｏ（球として表されている）は、ＣＨ１／ＣＬ及びＣε２ドメインにおいて非常に似通った位置及び配向にある。
【図５Ｃ】ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１及びカッパ定常ドメインならびにＣε２ドメインならびにＥ−Ｆａｂ重軽鎖の配列アラインメントである。配列は上に示されているＩＭＧＴ付番に整列しており、Ｉｇフォールドの７つのβストランドは矢印で示されており、βストランドＡの始まるところにある保存されたＰｒｏは下線の付いた太字で示されている。Ｅ−Ｆａｂにおけるａｇｌｙ突然変異（Ｎ３８Ｑ）及び鎖間ジスルフィドシステインも下線の付いた太字で示されている。
【図５Ｄ】ヒト、チンパンジー、マウス、ラット及びウサギに由来するＩｇＥ  ＣＨ２ドメインの配列アラインメントである。同一の残基は点で示されている。
【図６Ａ】軽鎖対合について試験する方策の模式図である。Ｆａｂ  Ａの重鎖（ＨＣＡ）はＨＳＡと融合しており、他方、Ｆａｂ  Ｂの軽鎖（ＬＣＢ）はＮ末端においてＧＦＰでタグ付けした。鎖の正しい対合はＦａｂの分子量によって確認することができる。
【図６Ｂ】ＳＤＳ−ｐａｇｅによるＦａｂ対合の分析である。示されているＨＳＡタグ付抗ＥＧＦＲ  Ｍ６０−Ａ０２  ＦａｂまたはＥ−Ｆａｂは、ＧＦＰタグ付Ｆａｂ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｃ０６と共発現させた（表３も参照のこと）。重軽鎖の正しい対合によって非還元条件下で１１４ｋＤａ及び７４ｋＤａにバンドが生じ、他方、４７ｋＤａまたは１４０ｋＤａのバンドは誤対合を指し示している。
【図６Ｃ】ＳＤＳ−ｐａｇｅによるＦａｂ対合の分析である。抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ  Ｃ０６をＥ−ｆａｂとして組み立て、別の抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ（Ｇ１１）との軽鎖対合を、図６Ｂに示すように試験した。
【図６Ｄ】Ｏｃｔｅｔによって試験したときの抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｅ−Ｆａｂの結合性を描写するグラフである。Ｆａｂを個々に発現させ、プロテインＡスピンカラムで精製し、Ｈｉｓチップ上に装填した可溶性ＩＧＦ１−Ｒに対するＯｃｔｅｔ結合性（３００ｎＭ、１００ｎＭ及び３０ｎＭ）において使用した。
【図７】Ｅ−Ｆａｂ及びリジン再配置を有する非対称ＩｇＧの模式図である。軽鎖対合の問題を解決するために、片方のＦａｂアームの定常ドメインがＥ−Ｆａｂで置き換わっている一方で、もう片方のＦａｂアームは野生型ＩｇＧ  ＣＨ１／ＣＬドメインを含有する。ヘテロ二量体化を強化すべくリジン再配置突然変異が２本の重鎖のＣＨ３ドメインに含まれている。
【図８Ａ】ＣＨＯ−Ｓ細胞で発現したＥＧＦＲ／ＩＧＦ−ＩＲ二特異性抗体及び上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析である。Ｅ体であるＥ０及びＥ２がＥ−Ｆａｂとして抗ＥＧＦＲを含有する一方、ＩｇＧ１ヘテロ二量体対照は軽鎖解決策を含有していない。
【図８Ｂ】図８Ａの非対称ＩｇＧについての質量分析を表したもの、それは、Ｅ体では軽鎖誤対合を示していないが、対照では誤対合ＬＣを有する抗体を著しい量で示している。重鎖ホモ二量体はどちらの試料においても検出できなかった。
【図８Ｃ】Ｈｉｓタグ付ＥＧＦＲに対する二特異性抗体の結合性を描写するグラフである。ＣＨＯ−Ｓ細胞からの未希釈の上清を、ｈｉｓタグ付リガンド（５μｇ／ｍＬ）装填後にＯｃｔｅｔ結合性において使用した。
【図８Ｄ】Ｈｉｓタグ付ＩＧＦ−１Ｒに対する二特異性抗体の結合性を描写するグラフである。ＣＨＯ−Ｓ細胞からの未希釈の上清を、ｈｉｓタグ付リガンド（５μｇ／ｍＬ）の装填後のＯｃｔｅｔ結合性において使用した。
【図９】図９Ａは、トラスツズマブ／セツキシマブ二特異性抗体と２つの抗原との同時結合性を描写するグラフである。Ｈｉｓタグ付可溶性ＨＥＲ２（５μｇ／ｍｌ）をＯｃｔｅｔチップ上に装填して、次のステップでの二特異性抗体（２００ｎＭ）の捕捉に備えた。その後のＥＧＦＲ（１５μｇ／ｍｌ）の結合性は、二特異体による両方のリガンドとの同時結合性を実証している。図９Ｂは、図９Ａに示す実験とは逆の結果を描写するグラフである。最初にＥＧＦＲを装填し、その後に二特異性抗体及びＨＥＲ２を結合させた。
【図１０】図１０Ａは、様々なエルボーリンカー配列を有するＥｆａｂ構築物を示す。抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブをＥｆａｂとして操作した。軽鎖中に含ませた様々なエルボーリンカー配列を表中に列挙する。配列は、エルボー配列（太字）の他に可変ドメインの最後の５つのアミノ酸とＩｇＥ  ＣＨ２ドメインの最初の５つのアミノ酸とを含む。図１０Ｂは、Ｏｃｔｅｔ結合性試験のグラフである。ＣＨＯ細胞において（図９の場合と同様に）Ｅｆａｂをセツキシマブとの非対称ＩｇＧとして発現させ、精製し、抗Ｈｉｓチップ上に装填したＨｉｓタグ付ＨＥＲ２（５μｇ／ｍｌ）と共にＯｃｔｅｔ結合性試験において使用した（１００ｎＭ）。図１０Ｃは、ＳＤＳ−ｐａｇｅによるＦａｂ対合の分析である。ＩｇＭ  ＣＨ２ドメインがＩｇＥ  ＣＨ２ドメインと同じく良好に軽鎖対合を解決することができるか否かを評価するために、２つのＦａｂ（抗ＥＧＦＲ  Ｍ６０及び抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｃ０６）を共発現させた（片方のＦａｂはＨＳＡと融合させ、もう片方のＦａｂはＧＦＰと融合させた）。Ｆａｂのカッパ及びＣＨ１定常ドメインをＩｇＭ  ＣＨ２ドメインで置き換えた（結果として生じた分子はＭ−Ｆａｂと命名した）。鎖対合についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって、Ｍ−Ｆａｂは、対照において顕著に認められたＭ６０とＣ０６との間での軽鎖誤対合を解決したことが示された。図１０Ｄは、Ｏｃｔｅｔ結合性試験のグラフである。ＣＨＯ−ＳにおいてＥｆａｂ及びＭ−ＦａｂをＦａｂ（Ｆｃを欠く）として発現させ、ＨＥＲ２との結合性をＯｃｔｅｔによって試験するために上清を使用した。
【図１１】図１１Ａは、ｍｐ３ヘテロ二量体突然変異を含有するＩｇＧ１  ａｇｌｙ（Ｔ２９９Ａ）定常領域と共に通常のＦａｂとしての抗ＥＧＦＲ  Ｍ６０−Ａ０２  Ｅｆａｂ及び抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｍ１３．Ｃ０６を含んでいる、ＣＨＯ細胞において発現させプロテインＡによって精製した二特異性抗体のゲルの写真を示す。図１１Ｂは、同時結合性に関して二特異体を試験したＯｃｔｅｔ試験の結果を示す。上側のパネルでは、Ｈｉｓタグ付可溶性ＩＧＦ１Ｒ（５μｇ／ｍｌ）をＯｃｔｅｔチップに結合させ、次いで二特異性抗体またはそれぞれのｍＡｂと結合させた。第３ステップでは、第２抗原（ＥＧＦＲ）を、示されているような抗体−抗原複合体と結合させた。第３ステップにおいてＥＧＦＲのない対照と比較したときの陽性信号は、同時結合性を実証している。下側のパネルでは、Ｈｉｓタグ付可溶性ＥＧＦＲ（５μｇ／ｍｌ）をＯｃｔｅｔチップに結合させ、次いで二特異性抗体またはそれぞれのｍＡｂと結合させた。第３ステップでは、第２抗原（ＩＧＦ１Ｒ）を、示されているような抗体−抗原複合体と結合させた。第３ステップにおいてＩＧＦ１Ｒのない対照と比較したときの陽性信号は、同時結合性を実証している。
【図１２】図１２Ａは、Ｅｆａｂとｍｐ４ヘテロ二量体を含有するＩｇＧ４Ｐ／ＩｇＧ１定常領域とを有する二特異性抗体の模式図である。抗体はさらに、定常ドメイン（ＩｇＧ４Ｐ／ＩｇＧ１  ａｇｌｙ）にＮ２９７Ｑ置換を含む。図１２Ｂは、抗ＨＥＲ２抗体ペルツズマブと抗ＩＧＦ１Ｒ抗体Ｃ０６とを両配向で使用して作製した、（Ａ）に示すような二特異性抗体のゲルの写真であり、最初に付ける抗体の名前を常にＥｆａｂとした。プロテインＡ精製した分量分のＣＨＯ細胞由来のヘテロ二量体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図１２Ｃは、可溶性ＩＧＦ１ＲとＨＥＲ２タンパク質とを使用するＯｃｔｅｔによって試験したときの結合性の結果を示す。上側のパネルでは、Ｈｉｓタグ付可溶性ＩＧＦ１Ｒ（５μｇ／ｍｌ）をＯｃｔｅｔチップに結合させ、次いで二特異性抗体またはそれぞれのｍＡｂと結合させた。第３ステップでは、第２抗原（ＨＥＲ２）を、示されているような抗体−抗原複合体と結合させた。第３ステップにおいてＨＥＲ２のない対照と比較したときの陽性信号は、同時結合性を実証している。下側のパネルでは、Ｈｉｓタグ付可溶性ＨＥＲ２（５μｇ／ｍｌ）をＯｃｔｅｔチップに結合させ、次いで二特異性抗体またはそれぞれのｍＡｂと結合させた。第３ステップでは、第２抗原（ＩＧＦ１Ｒ）を、示されているような抗体−抗原複合体と結合させた。第３ステップにおいてＩＧＦ１Ｒのない対照と比較したときの陽性信号は、同時結合性を実証している。
【図１３】図１３Ａは、重鎖のＣ末端と融合しているＥｆａｂを有するＩｇＧ（「Ｍａｂ−Ｆａｂ」）の模式図である。図１３Ｂは、トラスツズマブと抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体Ｃ０６とのＭａｂ−Ｆａｂのゲルの写真である。トラスツズマブと抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体Ｃ０６とのＭａｂ−Ｆａｂを、ＣＨＯ細胞で一過的に発現させ、プロテインＡで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質が正しく会合して約２４０ｋＤａのＭａｂ−Ｆａｂを形成したことを示している。図１３Ｃは、Ｏｃｔｅｔによって試験した場合の結果を示す。Ｈｉｓタグ付可溶性ＩＧＦ１ＲまたはＨＥＲ２（５μｇ／ｍｌ）をＯｃｔｅｔチップ上に装填して次のステップでの二特異性抗体（２００ｎＭ）の捕捉を可能にした。その後の第２リガンド（１５μｇ／ｍｌ）の結合性は、二特異性抗体による両リガンドの同時結合性を実証している。
【図１４】図１４Ａは、ＬＣ−Ｆｃ融合及びＦｃヘテロ二量体突然変異を含んでいる一価抗体の模式図である。図１４Ｂは、ＣＨＯ細胞から産生されたＬＣ−Ｆｃ一価抗体及び対応する二価ＩｇＧ１（抗ＥＧＦＲ  Ｍ６０−Ａ０２）についてのゲルの写真である。プロテインＡ精製した材料のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、一価ＬＣ−Ｆｃ抗体の巧みな会合を示している。図１４Ｃは、様々な濃度でのＯｃｔｅｔ結合性試験において一価ＬＣ−Ｆｃ及び二価ＩｇＧを描写するグラフである。一価ＬＣ−Ｆｃは強い結合性を欠き、抗原−抗体複合体の解離がみられる。
【図１５】図１５Ａは、ＨＡＳ（左）、ペプチドリンカー（右）によって通常のＦａｂに繋げられたＥｆａｂを有する二特異性抗体の模式図を提供する。図１５Ｂは、ＣＨＯ細胞で発現させ、プロテインＡ精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した、図１５Ａに示すような２例の二特異体のゲルの写真である。抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ＩＧＦ１Ｒ抗体であるＭ６０−Ａ０２及びＭ１３．Ｃ０６を、両配向でそれぞれＥｆａｂまたは通常のＦａｂとして使用した。図１５Ｃは、Ｏｃｔｅｔ結合性試験において使用した精製二特異体のグラフである。これらの二特異体による両抗原の同時結合性は、二特異体が最初にＥＧＦＲと結合してその後にＩＧＦ−１Ｒと結合した場合にのみ認められた。図１５Ｄは、Ｏｃｔｅｔ結合性試験において使用した精製二特異体のグラフである。これらの二特異体による両抗原の同時結合性は、二特異体が最初にＩＧＦ−１Ｒと結合してその後にＥＧＦＲと結合した場合には認められなかった。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
詳細な説明
二特異性抗体は、新しい治療作用機序を獲得する潜在性を有する、新興の部類の生物学的薬剤である。しかしながら、二特異性抗体を発現させかつ適切に形成させることに関連するいくつかの課題が存在する。具体的には、４つの異なる鎖からなる非対称ＩｇＧの形態で二特異性抗体を効率的に発現させるには２つの問題：いわゆる重鎖誤対合問題、及び軽鎖誤対合問題を解決しなくてはならない。２つの異なる重鎖及び２つの異なる軽鎖が存在する場合、それらは異なるいくつかの並び替えで誤対合する可能性がある（図１を参照のこと）。したがって、適切に対合した二特異性抗体を形成させるには、２つの重鎖がヘテロ二量体を形成せねばならず、各重鎖はその同族軽鎖と対合せねばならない。本開示は、異なるエピトープと結合するいかなる２つの抗体も非対称ＩｇＧの形態の二特異性抗体に変換することができる二特異性抗体基幹を提供する。基幹は、リジン再配置と呼ばれる重鎖ヘテロ二量体化方策及び、抗体の可変ドメインの操作を必要としない軽鎖誤対合問題の解決策に基づく。一実施形態において、基幹は、二特異性抗体の２本の重鎖のヘテロ二量体化を引き起こすべくＣＨ３ドメインにおいてリジン再配置によって操作された、Ｆｃ領域を含有している。別の実施形態では、片方のＦａｂアームのＣＨ１及びＣＬドメインが、ＩｇＥ  ＣＨ２ドメイン（またはＩｇＭ  ＣＨ２ドメイン）またはＩｇＥ  ＣＨ２ドメイン（またはＩｇＭ  ＣＨ２ドメイン）となおも対合することができるその断片で置き換わっている。このＦａｂの操作は、二特異性抗体の軽鎖の誤対合を軽減または防止することができる。本開示は、二特異性抗体基幹の設計、操作及び試験について記載し、それは共発現によって２つの抗体から非対称ＩｇＧを効率的に生み出すことができる。
【００５０】
軽鎖誤対合問題に対する解決策
図１に示されているような二特異性抗体における軽鎖（ＬＣ）：重鎖（ＨＣ）対の正しい会合をもたらすために、本明細書において開示する解決策は、軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を、これらの鎖の定常ドメイン（すなわち、ＣＬ及びＣＨ１ドメイン）がＩｇフォールドドメイン（または重軽鎖のＩｇフォールドドメイン間で安定なジスルフィド結合型二量体をなおも形成することができるその断片）で置き換えられるように軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を改変することである。
【００５１】
ある場合には、ＣＨ１及びＣＬドメインを置き換えるＩｇフォールドドメインは、ＩｇＥのＣＨ２ドメイン（「ＣＨ２Ｅ」）、またはもう１つのＣＨ２Ｅとの安定なジスルフィド結合型二量体を形成することができるその断片である。典型的なＣＨ２Ｅドメインのアミノ酸配列を以下に示す。
【化１】
2019502694.tif 000003
上に示す配列において、鎖間ジスルフィド結合の形成に関与することができる２つのシステインは太字で示され；ドメイン内ジスルフィド結合を形成することができる２つのシステインは太字のイタリック体で示され；Ｎ結合型グリコシル化部位には下線を引いている。
【００５２】
別の場合には、重軽鎖のＣＨ１及びＣＬドメインを置き換えるＩｇフォールドドメインは、ＩｇＭのＣＨ２ドメイン（「ＣＨ２Ｍ」）、または安定なジスルフィド結合型二量体を形成することができるその断片である。典型的なＣＨ２Ｍドメインのアミノ酸配列を以下に示す。
【化２】
2019502694.tif 000004
上に示す配列中、鎖間ジスルフィド結合の形成に関与することができるシステインは太字で表され；ドメイン内ジスルフィド結合を形成することができる２つのシステインはイタリック体で示され；Ｎ結合型グリコシル化部位には下線を引いている。
【００５３】
本開示は、軽鎖対合問題に対する解決策を利用する数例の抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、次式：
ＶＨ１構築物：ＶＨ１−Ｌ−Ｘ−ＣＨ２Ｅ（またはＣＨ２Ｍ）；及び
ＶＬ１構築物：ＶＬ１−Ｌ−Ｘ−ＣＨ２Ｅ（またはＣＨ２Ｍ）
を有するアミノ酸配列を特徴とし、式中、「ＶＨ１」及び「ＶＬ１」は、対合して第１エピトープに対する第１抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインであり；「Ｌ」は任意でのリンカー（以下でさらに説明する）であり；「Ｘ」は任意でのエルボー領域（以下でさらに説明する）であり；「ＣＨ２Ｅ」は、配列番号１、または配列番号１（例えば配列番号１のアミノ酸９〜１０７）と安定なジスルフィド結合型二量体を形成することができるその断片を指し、「ＣＨ２Ｍ」は、配列番号２、または配列番号２（例えば配列番号２のアミノ酸７〜１１２）と安定なジスルフィド結合型二量体を形成することができるその断片を指す。特定の実施形態では、ＶＨ１及びＶＬ１構築物には「Ｌ」及び「Ｘ」の片方または両方が存在していない。
【００５４】
別の実施形態では、抗体は、次式：
ＶＨ１構築物：ＶＨ１−Ｘ−Ｌ−ＣＨ２Ｅ（またはＣＨ２Ｍ）、及び
ＶＬ１構築物：ＶＬ１−Ｘ−Ｌ−ＣＨ２Ｅ（またはＣＨ２Ｍ）
を有するアミノ酸配列を特徴とする。
【００５５】
さらなる実施形態において、抗体は、次式：
ＶＨ１構築物：ＶＨ１−Ｌ−Ｘ−Ｌ−ＣＨ２Ｅ（またはＣＨ２Ｍ）、及び
ＶＬ１構築物：ＶＬ１−Ｌ−Ｘ−Ｌ−ＣＨ２Ｅ（またはＣＨ２Ｍ）
を有するアミノ酸配列を特徴とする。
【００５６】
上記ＶＨ１構築物においてＣＨ２Ｅを使用する場合には、対応するＶＬ１構築物においてもＣＨ２Ｅを使用する、ということは理解されるべきである。同様に、上記ＶＨ１構築物においてＣＨ２Ｍを使用する場合には、対応するＶＬ１構築物においてもＣＨ２Ｍを使用する。上記の対合したＶＨ１及びＶＬ１の構築物においてＣＨ２Ｅ及びＣＨ２Ｍドメインは、アミノ酸配列が同一であってもよいものの、それらが同一である必要はない。それらは例えば、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個もしくは１２個のアミノ酸が異なっていてもよい。特定の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメインは、配列番号１とは１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個のアミノ酸位置（複数可）で異なっている。特定の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物のＣＨ２Ｍドメインは、配列番号２とは１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個のアミノ酸位置（複数可）で異なっている。これらの違いは、アミノ酸の置換、欠失及び／または挿入の結果であり得る。例えば、配列番号１または２のＮグリコシル化部位を改変することができる（例えば、配列番号１のＮＩＴ配列において、Ｎ残基をＱに変更することができ、またはＴ残基をＡまたはＣに変更することができ；配列番号２のＮＡＳ配列において、Ｎ残基をＱに変更することができ、またはＳ残基をＡまたはＣに変更することができる）。あるいは、またはさらに、ドメイン内ジスルフィド結合を形成する１つ以上のシステインをＶＨ１及びＶＬ１構築物のうちの片方のＣＨ２Ｅ（またはＣＨ２Ｍ）ドメインにおいてのみ突然変異させてもよい。特定の場合には、ＶＨ１及びＶＬ１構築物の両方のＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）において鎖間ジスルフィド結合形成に関与する１つ以上のシステインを（例えば保存性のアミノ酸で）置換する。また、ＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）のホモ二量体化を防止する突然変異（例えば、配列番号１の位置１７においてセリンを例えばイソロイシンまたはスレオニンで置換すること；及び配列番号１の位置１０３においてスレオニンを例えばグリシンまたはセリンで置換すること）を生じさせてもよい。ヒト、チンパンジー、マウス、ラット及びウサギに由来するＩｇＥ  ＣＨ２ドメインのアラインメント（図５Ｄ）により、全ての種の間で保存されておらず生物活性を排除せずに置換することができる可能性のあるアミノ酸残基が、識別される。
【００５７】
ある場合には、ＣＨ２Ｅドメインに対するアミノ酸置換は保存的であることができる。保存的な置換とは、あるアミノ酸で同様の特性を有する別のアミノ酸を置換することである。保存的な置換としては、例えば、以下の群のうちに含まれる置換が挙げられる：バリン、アラニン及びグリシン；ロイシン、バリン及びイソロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン及びグルタミン；セリン、システイン及びスレオニン；リジン及びアルギニン；ならびにフェニルアラニン及びチロシン。非極性疎水性アミノ酸としては、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、例えば、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。上記の極性、塩基性または酸性の群のうちの１つのメンバーに対する、同じ群の別のメンバーによるいかなる置換も、保存的な置換として見なすことができる。
【００５８】
ある場合には、ＣＨ２Ｅドメインに対するアミノ酸置換は非保存性であり得る。非保存性の置換としては、例えば、（ｉ）電気的に陽性の側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）を（またはそれによって）電気的に陰性の残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）で（またはそれを）置換するもの、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）を（またはそれによって）疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）で（またはそれを）置換するもの、（ｉｉｉ）システインまたはプロリンを（またはそれによって）その他の任意の残基で（またはそれを）置換するもの、または（ｉｖ）嵩高い疎水性または芳香族の側鎖を有する残基（例えば、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＴｒｐ）を（またはそれによって）より小さい側鎖を有する（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）かもしくは側鎖を有しない（例えば、Ｇｌｙ）残基で（またはそれを）置換するものが挙げられる。
【００５９】
特定の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメインは、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり、ＶＨ１及びＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメインはなおも対合し合うことができる。特定の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメインは、配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり、ＶＨ１及びＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメインはなおも対合し合うことができる。
【００６０】
特定の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物においてＣＨ２Ｍドメインを採用する場合、ＣＨ２Ｍドメインは、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり、ＶＨ１及びＶＬ１構築物のＣＨ２Ｍドメインはなおも対合し合うことができる。
【００６１】
アミノ酸配列同士のパーセント同一性は、ＢＬＡＳＴ２．０プログラムを使用して決定することができる。配列比較は、ギャップなしのアラインメントを用いかつデフォルトパラメータ（Ｂｌｏｓｓｏｍ６２行列、ギャップ存在コストは１１、１残基あたりのギャップコストは１、ラムダ比率は０．８５）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴプログラムで使用する数学的アルゴリズムについては、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：３３８９−３４０２（１９９７）に記載されている。
【００６２】
特定の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物の両方において使用されるＣＨ２Ｅドメインは配列番号１と１００％同一である。いくつかの実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｅドメインは、配列番号１の断片、例えば、配列番号１のＮ及び／またはＣ末端のアミノ酸が欠けたものであり、なおかつそれは配列番号１によってコードされるポリペプチドと安定なジスルフィド結合型二量体を形成することができる。例えば、配列番号１の断片は、配列番号１のＮ及び／またはＣ末端において２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸（複数可）が欠けたものであってもよい。特定の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｅドメインは、配列番号１のアミノ酸２〜１０７、３〜１０７、４〜１０７、５〜１０７、６〜１０７、７〜１０７、８〜１０７、９〜１０７、１０〜１０７、１１〜１０７、１２〜１０７、１３〜１０７、１４〜１０７、１５〜１０７、１６〜１０７、１７〜１０７、１８〜１０７、１９〜１０７、または２０〜１０７を含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｅドメインは、配列番号１のアミノ酸２〜１０６、３〜１０６、４〜１０６、５〜１０６、６〜１０６、７〜１０６、８〜１０６、９〜１０６、１０〜１０６、１１〜１０６、１２〜１０６、１３〜１０６、１４〜１０６、１５〜１０６、１６〜１０６、１７〜１０６、１８〜１０６、１９〜１０６、または２０〜１０６を含むかまたはそれからなる。さらに他の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｅドメインは、配列番号１のアミノ酸２〜１０５、３〜１０５、４〜１０５、５〜１０５、６〜１０５、７〜１０５、８〜１０５、９〜１０５、１０〜１０５、１１〜１０５、１２〜１０５、１３〜１０５、１４〜１０５、１５〜１０５、１６〜１０５、１７〜１０５、１８〜１０５、１９〜１０５、または２０〜１０５を含むかまたはそれからなる。特定の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｅドメインは、配列番号１のアミノ酸９〜１０７、９〜１０６、９〜１０５、９〜１０４、９〜１０３、９〜１０２、９〜１０１、９〜１００、９〜９９、９〜９８、または９〜９７を含むかまたはそれからなる。これら全ての実施形態では、配列番号１に示すアミノ配列と比べて１〜１２個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個）の置換が、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用される片方または両方のＣＨ２Ｅドメインに存在していてもよい。例えば、Ｎ結合型グリコシル化部位が突然変異していてもよく（例えば、ＮＩＴ部位のアスパラギンがグルタミンで置換されていてもよく、またはＮＩＴ部位のスレオニンがアラニンまたはシステインで置換されていてもよく）；鎖間ジスルフィド結合形成に関与するシステインのうちの片方もしくは両方が別のアミノ酸（例えば、保存性アミノ酸）で置換されていてもよく；または、（ＣＨ２Ｅドメインが重鎖及び軽鎖の一部である場合に）重鎖：重鎖二量体もしくは軽鎖：軽鎖二量体の形成を防止する突然変異がＣＨ２Ｅの中に導入されていてもよい。
【００６３】
特定の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｍドメインは配列番号２と１００％同一である。いくつかの実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｍドメインは、配列番号２の断片、例えば、配列番号２のＮ及び／またはＣ末端のアミノ酸が欠けたものであり、なおかつそれは配列番号２によってコードされるポリペプチドと安定なジスルフィド結合型二量体を形成することができる。例えば、配列番号２の断片は、配列番号２のＮ及び／またはＣ末端において２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸（複数可）が欠けたものであってもよい。特定の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｍドメインは、配列番号２のアミノ酸２〜１１２、３〜１１２、４〜１１２、５〜１１２、６〜１１２、７〜１１２、８〜１１２、９〜１１２、１０〜１１２、１１〜１１２、１２〜１１２、１３〜１１２、１４〜１１２、１５〜１１２、１６〜１１２、１７〜１１２、１８〜１１２、１９〜１１２、または２０〜１１２を含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｍドメインは、配列番号２のアミノ酸２〜１１１、３〜１０６、４〜１１１、５〜１１１、６〜１１１、７〜１１１、８〜１１１、９〜１１１、１０〜１１１、１１〜１１１、１２〜１１１、１３〜１１１、１４〜１１１、１５〜１１１、１６〜１１１、１７〜１１１、１８〜１１１、１９〜１１１、または２０〜１１１を含むかまたはそれからなる。さらに他の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｍドメインは、配列番号２のアミノ酸２〜１１０、３〜１１０、４〜１１０、５〜１１０、６〜１１０、７〜１１０、８〜１１０、９〜１１０、１０〜１１０、１１〜１１０、１２〜１１０、１３〜１１０、１４〜１１０、１５〜１１０、１６〜１１０、１７〜１１０、１８〜１１０、１９〜１１０、または２０〜１１０を含むかまたはそれからなる。特定の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｍドメインは、配列番号１のアミノ酸７〜１１２、７〜１１１、７〜１１０、７〜１０９、７〜１０８、７〜１０７、７〜１０５、７〜１０４、７〜１０３、７〜１０２、７〜１０１、７〜１００または７〜９９を含むかまたはそれからなる。これら全ての実施形態では、配列番号２に示すアミノ配列と比べて１〜１２個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個）の置換が、上記のＶＨ１及びＶＬ１の構築物において使用される片方または両方のＣＨ２Ｍドメインに存在していてもよい。例えば、Ｎ結合型グリコシル化部位が突然変異していてもよく（例えば、ＮＡＳ部位のアスパラギンがグルタミンで置換されていてもよく、またはＮＡＳ部位のセリンがアラニンまたはシステインで置換されていてもよく）；鎖間ジスルフィド結合形成に関与するシステインのうちの片方もしくは両方が別のアミノ酸（例えば、保存性アミノ酸）で置換されていてもよく；または、（ＣＨ２Ｍドメインが重鎖及び軽鎖の一部である場合に）重鎖：重鎖二量体もしくは軽鎖：軽鎖二量体の形成を防止する突然変異がＣＨ２Ｍの中に導入されていてもよい。
【００６４】
一実施形態において、上記ＶＨ１構築物において使用されるＣＨ２ドメインは、ヒト免疫グロブリンＥのＣＨ２ドメインであり、そのＮグリコシル化部位はグルタミンへと突然変異しており、最初の８つのアミノ酸はヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインの最初の５つのアミノ酸で置き換わっている。このＣＨ２Ｅドメインのアミノ酸配列を以下に示す。
【化３】
2019502694.tif 000005
【００６５】
一実施形態において、上記ＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２ドメインはヒト免疫グロブリンＥのＣＨ２ドメインであり、この場合、そのＮグリコシル化部位がグルタミンへと突然変異しており、最初の８つのアミノ酸がヒトカッパドメインの最初の５つのアミノ酸で置き換わっている。このＣＨ２Ｅドメインのアミノ酸配列を以下に示す。
【化４】
2019502694.tif 000006
【００６６】
別の実施形態では、上記ＶＨ１構築物において使用されることになる、上記ＶＬ１構築物とのヘテロ二量体を形成すべく操作されたヒト免疫グロブリンＥの典型的なＣＨ２ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１の位置１７にあるセリンをイソロイシンで置き換えることによって作られる。このＣＨ２Ｅドメインのアミノ酸配列を以下に示す（この配列ではＮ結合型グリコシル化部位も突然変異しており、配列番号１の最初の８つのアミノ酸がＩｇＧ１  ＣＨ１の最初の５つのアミノ酸で置き換わっていることに留意されたい）。
【化５】
2019502694.tif 000007
【００６７】
上記ＶＬ１構築物のＶＬドメインに連結されることになる、上記ＶＨ１構築物とのヘテロ二量体を形成すべく操作されたヒト免疫グロブリンＥの典型的なＣＨ２ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１の位置１０３にあるスレオニンをグリシンで置き換えることによって作られる。このＣＨ２Ｅドメインのアミノ酸配列を以下に示す（この配列ではＮ結合型グリコシル化部位も突然変異しており、配列番号１の最初の８つのアミノ酸がカッパ鎖の最初の５つのアミノ酸で置き換わっていることに留意されたい）。
【化６】
2019502694.tif 000008
【００６８】
特定の実施形態では、上記のＶＨ１及びＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｅドメインは、配列番号５及び／または６のＣ末端切断を含む。特定の場合には、配列番号５及び／または配列番号６のＣ末端から９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つまたは１つのアミノ酸が欠失している。具体的な実施形態において、上記ＶＨ１構築物において使用されるＣＨ２Ｅドメインは、配列番号５のアミノ酸１〜１０３、１〜１０２、１〜１０１、１〜１００、１〜９９、１〜９８、１〜９７、１〜９６、または１〜９５を含むかまたはそれからなる。別の具体的な実施形態において、上記ＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｅドメインは、配列番号６のアミノ酸１〜１０３、１〜１０２、１〜１０１、１〜１００、１〜９９、１〜９８、１〜９７、１〜９６、または１〜９５を含むかまたはそれからなる。さらに他の実施形態では、上記ＶＨ１構築物において使用されるＣＨ２Ｅドメインは、配列番号５のアミノ酸６〜１０３、７〜１０３、８〜１０３、９〜１０３、または１０〜１０３を含むかまたはそれからなる。さらに他の実施形態では、上記ＶＬ１構築物において使用されるＣＨ２Ｅドメインは、配列番号６のアミノ酸６〜１０３、７〜１０３、８〜１０３、９〜１０３、または１０〜１０３を含むかまたはそれからなる。特定の実施形態では、配列番号５及び／もしくは配列番号６またはそれらの上記の断片は、配列番号１に関してさらに５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下または１つの突然変異を追加で含有し得る。
【００６９】
特定の実施形態では、上記抗体はさらに、重鎖可変ドメイン「ＶＨ２」及び軽鎖可変ドメイン「ＶＬ２」を含み、ＶＨ２はＣＨ１ドメインに連結されており、ＶＬ２ドメインはＣＬドメインに連結されており、ＶＨ２とＶＬ２とが対合して第２エピトープに対する第２抗原結合部位を形成している。いくつかの実施形態では、上記抗体はさらに、２つのＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、抗体のヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。特定の場合には、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインはＩｇＧ１に由来するものである。特定の場合には、ヒンジ及びＣＨ３ドメインはＩｇＧ４に由来するものであり、ＣＨ２ドメインはＩｇＧ１に由来するものである。具体的な実施形態において、ヒンジ領域がＩｇＧ４に由来するものである場合、それはＳ２２８Ｐ（ＥＵ付番）突然変異を含む。抗体の２つのＦｃドメインのうちの片方は、抗体の２つのＦａｂのうちの片方の、ＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）のうちの片方に直接繋げられていてもよいし、リンカーを介して繋げられていてもよい。Ｆｃ領域は、ＶＨ１構築物またはＶＬ１構築物に繋げられ得る。Ｆｃ領域は、突然変異（複数可）を有さない同じＦｃ領域と比べて二特異性抗体の重鎖同士のヘテロ二量体化を増すいかなる突然変異（複数可）を含んでいてもよい。例えば、Ｆｃ領域は、ノブ・イントゥ・ホール型突然変異、電気指向型突然変異、または本願の実施例１の表２に記載されているその他の突然変異を含み得る。具体的な実施形態において、二特異性抗体のＦｃ領域は、本明細書に記載のリジン再配置突然変異を含む。
【００７０】
特定の実施形態では、上記抗体はさらに、重鎖可変ドメイン「ＶＨ２」及び軽鎖可変ドメイン「ＶＬ２」を含み、ＶＨ２はＣＨ１ドメインに連結されており、ＶＬ２ドメインはＣＬドメインに連結されており、ＶＨ２とＶＬ２とが対合して第２エピトープに対する第２抗原結合部位を形成しているが、抗体にはＦｃドメイン（複数可）が欠けている。上記構築物のＶＨ１またはＶＬ１ドメインに繋げられたＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）は、ＶＨ２及びＶＬ２ドメインを含む抗体に繋げられることができる。例えば、ＶＨ１構築物のＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）のＣ末端が、ＶＨ２に連結されているＣＨ１ドメインのＣ末端に繋げられていてもよいし、ＶＨ１構築物のＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）のＣ末端がＶＨ２ドメインのＮ末端に繋げられていてもよい。その他の典型的な配置として、ＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）のＣ末端が、ＶＨ２に連結されているＣＨ１ドメインのＣ末端に繋げられていてもよいし、ＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）のＣ末端がＶＨ２ドメインのＮ末端に繋げられていてもよい。その他の典型的な配置としては、例えば、ＶＬ２に連結されているＣＬドメインのＣ末端に繋げられた、ＶＨ１構築物のＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）のＣ末端、または、ＶＬ２ドメインのＮ末端に繋げられた、ＶＨ１構築物のＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）のＣ末端が挙げられる。さらなる典型的な配置としては、ＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）のＣ末端を、ＶＬ２に連結されているＣＬドメインのＣ末端に繋げた配置、または、ＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）のＣ末端をＶＬ２ドメインのＮ末端に繋げた配置がある。ある場合には、ＶＨ１構築物またはＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）と、第２Ｆａｂとの間のリンカーは、ペプチドリンカーである。他の場合には、ＶＨ１構築物またはＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）と、第２Ｆａｂとの間のリンカーは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。ある場合には、ＶＨ１構築物またはＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）と、第２Ｆａｂとの間のリンカーは、ポリエチレングリコールである。さらに他の場合には、ＶＨ１構築物またはＶＬ１構築物のＣＨ２Ｅドメインと、第２Ｆａｂとの間のリンカーは、ＸＴＥＮ分子（例えば、ＡＥ−１４４、ＡＥ−２８８）である。
【００７１】
特定の場合には、ＶＨ１及びＶＬ１構築物は四価二特異性抗体の一部である。これらの四価抗体は、（ｉ）全抗体であって、その可変ドメインが抗原の１つのエピトープに結合する、当該全抗体と、（ｉｉ）同じ抗原または異なる抗原の別のエピトープに各々結合する２つのＦａｂとを含む。いくつかの実施形態では、全抗体はＩｇＧ１である。他の実施形態では、全抗体はＩｇＧ４（Ｇ１）、すなわち、ＩｇＧ４のヒンジ及びＣＨ２領域を含む一方でＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを含む抗体である。特定の実施形態では、全抗体はＩｇＧ４（Ｇ１）Ｐ、すなわち、ヒンジ領域にＳ２２８Ｐ（ＥＵ付番）突然変異を有することを別とすればＩｇＧ４（Ｇ１）である、抗体である。２つのＦａｂは、全抗体のＣＨ３ドメインのＣ末端に繋げられている。２つのＦａｂは、各Ｆａｂの２つの可変ドメイン（すなわちＶＨまたはＶＬ）のうちの１つのＮ末端を介するかまたは２つのＦａｂのそれぞれの定常ドメインのうちの１つのＣ末端を介するかのどちらかで全抗体のＣＨ３ドメインに繋げられ得る。Ｆａｂ定常ドメインがＣＨ２Ｅ（またはＣＨ２Ｍドメイン）で置き換わっていない場合には、ＣＨ１ドメインのＣ末端またはＣＬドメインのＣ末端のどちらかと繋げられ得る。Ｆａｂ定常ドメインがＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）で置き換わっている場合には、ＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）のＣ末端と繋げられることができる。四価二特異性抗体は、上に詳述したＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）を全抗体の２つのアーム内かまたは２つのＦａｂ内かのどちらかに含むことができる。この場合には、「全抗体」という用語を通常の意味（すなわち、４本の鎖：ＶＬ１−ＣＬ、ＶＨ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ＶＬ２−ＣＬ、及びＶＨ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む抗体）とは違う意味で使用して４本の鎖：ＶＬ１−ＣＨ２Ｅ（またはＣＨ２Ｍ）、ＶＨ１−ＣＨ２Ｅ（またはＣＨ２Ｍ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ＶＬ２−ＣＨ２Ｅ（またはＣＨ２Ｍ）、及びＶＨ２−ＣＨ２Ｅ（またはＣＨ２Ｍ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む抗体も包含していることに留意されたい。
【００７２】
上記の構築物において使用することができるリンカーは特に限定されない。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。１〜２５個の残基（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個のアミノ酸）を含むいかなる任意の一本鎖ペプチドも、リンカーとして使用することができる。特定の場合には、リンカーはグリシン及び／またはセリン残基のみを含有する。そのようなペプチドリンカーの例としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ；Ｇｌｙ  Ｓｅｒ；Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ；Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ；Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（配列番号１０）；Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号５５）；Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（配列番号５６）；Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号５７）；Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（配列番号５８）；Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号５９）；Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（配列番号６０）；Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号６１）；（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）ｎ  （配列番号５６）ｎ（ここで、ｎは１以上の整数である）；及び（Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ）ｎ  （配列番号５７）ｎ（ここで、ｎは１以上の整数である）が挙げられる。他の実施形態では、リンカーペプチドは、（従来のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーペプチドリピートの接合部に生じる）アミノ酸配列ＧＳＧが存在しないように改変される。例えば、ペプチドリンカーは（ＧＧＧＸＸ）ｎＧＧＧＧＳ（配列番号６２）及びＧＧＧＧＳ（ＸＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、式中、Ｘは、配列中に挿入されることができる、配列ＧＳＧを含むポリペプチドをもたらさない任意のアミノ酸であり、ｎは０〜４である。一実施形態において、リンカーペプチドの配列は（ＧＧＧＸ１Ｘ２）ｎＧＧＧＧＳであり、Ｘ１はＰであり、Ｘ２はＳであり、ｎは０〜４（配列番号６４）である。別の実施形態では、リンカーペプチドの配列は（ＧＧＧＸ１Ｘ２）ｎＧＧＧＧＳであり、Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＱであり、ｎは０〜４（配列番号６５）である。別の実施形態では、リンカーペプチドの配列は（ＧＧＧＸ１Ｘ２）ｎＧＧＧＧＳであり、Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＡであり、ｎは０〜４（配列番号６６）である。さらに別の実施形態では、リンカーペプチドの配列はＧＧＧＧＳ（ＸＧＧＧＳ）ｎであり、ＸはＰであり、ｎは０〜４である（配列番号６７）。一実施形態において、本発明のリンカーペプチドはアミノ酸配列（ＧＧＧＧＡ）２ＧＧＧＧＳ（配列番号６８）を含むかまたはそれからなる。別の実施形態では、リンカーペプチドはアミノ酸配列（ＧＧＧＧＱ）２ＧＧＧＧＳ（配列番号６９）を含むかまたはそれからなる。さらに別の実施形態では、リンカーペプチドはアミノ酸配列（ＧＧＧＰＳ）２ＧＧＧＧＳ（配列番号７０）を含むかまたはそれからなる。さらなる実施形態では、リンカーペプチドはアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（ＰＧＧＧＳ）２（配列番号７１）を含むかまたはそれからなる。
【００７３】
特定の実施形態では、リンカーは合成化合物リンカー（化学的架橋剤）である。市場で入手することができる架橋剤の例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、及びビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）が挙げられる。
【００７４】
ＶＨ１構築物のエルボー領域は、例えば、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインの断片（例えば、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインからの１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個の連続アミノ酸）であることができる。一実施形態において、エルボードメインはＩｇＧ１に由来するものであり、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインのＮまたはＣ末端からの１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個の連続アミノ酸である。ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列を以下に示す。
【化７】
2019502694.tif 000009
上記ＶＨ１構築物のエルボー領域の非限定的な例は、ＡＳＴＫＧ（配列番号７）である。一実施形態において、ＶＨ１構築物は以下のアミノ酸配列：
【化８】
2019502694.tif 000010
を含み、この場合、ＣＨ２Ｅ（ＶＣＳＲＤＦＴＰ（配列番号８））の最初の８つのアミノ酸がヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインの最初の５つのアミノ酸（エルボー領域ＡＳＴＫＧ（配列番号７））で置き換わっている。別の実施形態では、上記ＶＨ１構築物のエルボー領域はＳＲＤＦＴ（配列番号７７）である。特定の実施形態では、ＶＨ１構築物は、エルボー領域を有さないリンカーを有する。そのような場合、リンカーは例えば配列番号５６または配列番号５８であり得る。
【００７５】
ＶＬ１構築物のエルボー領域は、例えば、カッパまたはラムダＣＬドメインの断片（例えば、カッパまたはラムダドメインからの１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個の連続アミノ酸）であることができる。一実施形態において、エルボードメインはカッパドメインに由来するものであり、カッパドメインのＮまたはＣ末端からの１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個の連続アミノ酸を含むかまたはそれからなる。ヒトカッパＣＬドメインのアミノ酸配列を以下に示す。
【化９】
2019502694.tif 000011
【００７６】
ヒトラムダＣＬドメインのアミノ酸配列を以下に示す（エルボー領域は、太字／下線付きで示されている最初の６つのアミノ酸である）。
【化１０】
2019502694.tif 000012
上記ＶＬ１構築物のエルボー領域の非限定的な例はＲＴＶＡＡ（配列番号９）である。一実施形態において、ＶＬ１構築物は以下のアミノ酸配列：
【化１１】
2019502694.tif 000013
を含み、この場合、ＣＨ２Ｅ（ＶＣＳＲＤＦＴＰ（配列番号８））の最初の８つのアミノ酸がヒトカッパドメインの最初の５つのアミノ酸（エルボー領域ＲＴＶＡＡ（配列番号９））で置き換わっている。別の実施形態では、上記ＶＬ１構築物のエルボー領域はＧＱＰＫＡＡ（配列番号７８）である。特定の実施形態では、ＶＬ１構築物は、エルボー領域を有さないリンカーを有する。そのような場合、リンカーは例えば配列番号５６または配列番号５８であり得る。
【００７７】
重鎖誤対合問題に対する解決策
本願はさらに、重鎖ヘテロ二量体化に有効な方策としてリジン再配置を開示する。ＣＨ３ドメインの構造解析、モデリング、及び潜在的な界面突然変異の解析に基づいてリジン再配置の方策を考案して非対称な相補的ＣＨ３界面の操作をした（図２を参照のこと）。具体的には、ＣＨ３単量体ＡにおけるＬｙｓ４０９（ＥＵ付番）のＳｅｒによる置換及びＳｅｒ３６４（ＥＵ付番）のＬｙｓによる置換は、リジンをβストランドＥから隣接する逆平行βストランドＢへと再配置する。反対に、ＣＨ３単量体ＢにおけるＬｙｓ３７０（ＥＵ付番）のＳｅｒによる置換及びＰｈｅ４０５（ＥＵ付番）のＬｙｓによる置換は、リジンをβストランドＢからβストランドＥへと再配置する。他の実施形態では、リジン再配置には表２のＭＰ４の突然変異を伴う。再配置されたリジンは、ヘテロ二量体では積み重なるが、ホモ二量体では立体的衝突及び電荷の衝突を引き起こし、それは、ホモ二量体の形成を防止し、それにゆえＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化をもたらす。このように、抗体のＣＨ３ドメイン（例えば、ＩｇＧ１抗体のＣＨ３）の中にこれらの変更を組み込むことによって、これらの突然変異を有さない抗体に関して抗体の重鎖のヘテロ二量体化を増すことができる。この方策は、公開されているＦｃヘテロ二量体化突然変異よりも勝るかまたはそれと同程度の効率で重鎖ヘテロ二量体化に非常に効果的な方策であるということが判明した。
【００７８】
野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列を以下に示す。
【化１２】
2019502694.tif 000014
【００７９】
野生型ヒトＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列を以下に示す。
【化１３】
2019502694.tif 000015
【００８０】
一実施形態において、抗体のＦｃ領域の２つのＣＨ３ドメインのうちの片方は、以下に示すアミノ酸配列：
【化１４】
2019502694.tif 000016
を含む。
【００８１】
この実施形態では、抗体のＦｃ領域の２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方は、以下に示すアミノ酸配列：
【化１５】
2019502694.tif 000017
を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、上記の２つのＣＨ３ドメインは５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つのアミノ酸置換をＣＨ３ドメインの片方または両方の中に含み得る。例えば、ＣＨ３ドメインを突然変異させて抗体の１つ以上のエフェクター機能を変化させることができる。１つ以上のエフェクター機能を変化させるためにＣＨ３ドメインにおいて改変されることができる位置（ＥＵ付番による）の非限定的な例としては、位置３４２、３４４、３５６、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３３、４３４、４３５、４３７、４３８及び４３９が挙げられる。米国特許第８，５８６，７１３Ｂ２号の第１０列、第３２〜６４行目に記載されている置換可能部位の例及び突然変異の例も参照されたい。１つ以上のエフェクター機能を変化させるためにＣＨ３ドメインに対して行うことができる置換のその他の非限定的な例（ＥＵ付番によって列挙する）としては、Ｅ３４５Ｒ、Ｈ４３３Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ａ、Ｙ４３６Ｄ、Ｑ４３８Ｄ、Ｋ４３９Ｅ、Ｓ４４０Ｋ及び／またはＫ４３９Ｅ／Ｓ４４０Ｋが挙げられる（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ  ＣＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１７６）：１２６０−１２６３（２０１４）を参照のこと）。ＣＨ３ドメインに対して行うことができるその他の置換としては、例えば、プロテインＡとの結合性に影響を与えるものが挙げられる。そのような置換の非限定的な例としては、Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３５Ｒ及び／またはＹ４３６Ｆ（米国特許第８，５８６，７１３Ｂ２号）（全てＥＵ付番）が挙げられる。人工的なジスルフィド結合を導入する置換を行ってもよい。そのような置換の非限定的な例としては、Ｐ４４５Ｇ、Ｇ４４６Ｅ及びＫ４４７Ｃ；Ｐ３４３Ｃ及びＡ４３１Ｃ；ならびにＳ３７５Ｃ及びＰ３９６Ｃ（ＷＯ２０１１／００３８１１Ａ１）（全てＥＵ付番）が挙げられる。表面残基が変化するようにＣＨ３ドメインを突然変異させてもよい。これは、例えば、抗体の等電点（ｐＩ）を変化させるためのものであり得る。そのような置換の非限定的な例としては、Ｅ３４５Ｋ、Ｑ３４７Ｅ／Ｋ／Ｒ、Ｒ３５５Ｅ、Ｒ３５５Ｑ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｎ、Ｑ４１９Ｅ  （ＵＳ２０１４／０２９４８３５Ａ１）（全てＥＵ付番）が挙げられる。ある場合には、ＣＨ３ドメインのＣ末端は、切断及び／または改変されることができる。例えば、Ｋ４４７（ＥＵ付番）を欠失させかつ／またはペプチドＤＥＤＥまたはその他のアミノ酸をＣＨ３ドメインのＣ末端に追加することができる。特定の場合にはＣＨ３ドメインのグリコシル化に影響を与えるように当該ドメインを突然変異させることができる。そのような突然変異の非限定的な例はＹ４０７Ｅ（ＥＵ付番）（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ，５（２）：２１９−２８（２０１３））である。
【００８３】
上記ＣＨ３ドメインはＦｃドメインの一部であり得る。抗体の重鎖のＦｃドメインは、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインは、上に述べたリジン再配置突然変異以外の突然変異も含んでいてよい。
【００８４】
Ｆｃドメインのヒンジ領域は、いかなる抗体クラスのヒンジ領域であることもできる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体のヒンジ領域は、一般に、位置２１６のアミノ酸から位置２３０のアミノ酸まで延びている（ＥＵ付番による位置付番）。特定の実施形態では、ヒンジ領域はＩｇＧ１抗体由来のヒンジである。その他の実施形態では、ヒンジ領域はＩｇＧ４抗体由来のヒンジである。ヒンジ領域がＩｇＧ４クラスに由来するものである場合、それはＳ２２８Ｐ（ＥＵ付番）突然変異を含有し得る。以下は、全体または一部のどちらかが採用され得る典型的なヒンジ領域である（例えば、Ｎ及び／またはＣ末端切断があってもよい）。
ヒトＩｇＧ１ヒンジ：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ  （配列番号１５）
ヒトＩｇＧ４ヒンジ：ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ  （配列番号１６）
突然変異体ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）ヒンジ：ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ  （配列番号１７）
特定の場合には、上記のヒンジ配列のＮ及び／またはＣ末端において１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸を欠失させてもよい。特定の場合には、ヒンジ配列またはそのＮ及び／もしくはＣ末端において４つ以下、３つ以下、２つ以下、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸の置換、欠失及び／または挿入があってもよい。
【００８５】
ＣＨ２ドメインは、いかなるクラスの抗体に由来するものであってもよい。特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインはＩｇＧ１抗体に由来するものである。他の実施形態では、ＣＨ２ドメインはＩｇＧ４抗体に由来するものである。ＣＨ２ドメインは、１つ以上の突然変異を含有していてもよい。例えば、ＣＨ２ドメインは、Ｎ結合型グリコシル化部位がグリコシル化されないように当該部位の突然変異を有していてもよい。特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインのＮ結合型グリコシル化部位のアスパラギンがグルタミンへと突然変異している（例えば、Ａｓｎ２９７Ｇｌｎ）。他の実施形態では、ＣＨ２ドメインのＮ結合型グリコシル化部位にあるスレオニンがアラニンまたはシステインへと突然変異している（例えば、Ｔｈｒ２９９ＡｌａまたはＴｈｒ２９９Ｃｙｓ）。他の例では、エフェクター機能を変化させるべくＣＨ２ドメインを突然変異させてもよい（例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ／Ｌｅｕ２３５Ａｌａ、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、及び／またはＰｒｏ３３１Ｓｅｒ）。ＦｃＲｎに対する結合性を変化させるべくＣＨ２ドメインを突然変異させることもできる。
【００８６】
特定の実施形態では、定常ドメインはＩｇＧ４Ｐ／ＩｇＧ１ハイブリッドである。特定の場合には、定常ドメインはＩｇＧ４Ｐ／ＩｇＧ１（ａｇｌｙ）ハイブリッドである。これらのハイブリッドは、ＩｇＧ４のヒンジ領域及びＣＨ２ドメインならびにＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＧ４のヒンジ領域はＳ２２８Ｐ突然変異を有する。ａｇｌｙ構築物においてそれはさらに突然変異Ｎ２９７Ｑ、Ｔ２９９ＡまたはＴ２９９Ｃのうちの１つを含む。
【００８７】
一実施形態において、２つのＦｃ領域のうちの片方は、以下に示すアミノ酸配列（ヒンジ領域をイタリック体で示し；Ｎ結合型グリコシル化部位には下線を付け；ＣＨ２領域を通常のフォントで示し；ＣＨ３ドメインを太字で示す）：
【化１６】
2019502694.tif 000018
を含む。
【００８８】
この実施形態では、２つのＦｃ領域のうちのもう片方は、以下に示すアミノ酸配列（ヒンジ領域をイタリック体で示し；Ｎ結合型グリコシル化部位には下線を付け；ＣＨ２領域を通常のフォントで示し；ＣＨ３ドメインを太字で示す）：
【化１７】
2019502694.tif 000019
を含む。
【００８９】
別の実施形態では、２つのＦｃ領域のうちの片方は、以下に示すアミノ酸配列（ヒンジ領域をイタリック体で示し；突然変異Ｎ結合型グリコシル化部位には下線を付け；ＣＨ２領域を通常のフォントで示し；ＣＨ３ドメインを太字で示す）：
【化１８−１】
2019502694.tif 000020
【化１８−２】
2019502694.tif 000021
を含む。
【００９０】
この実施形態では、２つのＦｃ領域のうちのもう片方は、以下に示すアミノ酸配列（ヒンジ領域をイタリック体で示し；ＣＨ２領域を通常のフォントで示すとともに、ＣＨ２ドメインの突然変異Ｎ結合型グリコシル化部位には下線を付け；ＣＨ３ドメインを太字で示す）：
【化１９】
2019502694.tif 000022
を含む。
【００９１】
これらのＦｃ領域は、Ｆｃドメインがヘテロ二量体化できる限り、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つのアミノ酸の置換、挿入及び／または欠失を含むことができる。アミノ酸置換は、保存的または非保存的なアミノ酸置換であり得る。
【００９２】
上記のＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインのいずれかは、ＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）で置き換えられたＣＬドメインを有する上記軽鎖と対合する重鎖の一部であることができる。具体的には、重鎖は、ＶＨドメインに直接繋げられているかまたは間に介在する配列を介して繋げられている第２ＣＨ２ドメインを含むことができ、ここで、第２ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２Ｅドメインまたは、ＣＨ２Ｅドメインと二量体化することができるその断片である。特定の場合には、重鎖は、ＶＨドメインに直接繋げられているかまたは間に介在する配列を介して繋げられている第２ＣＨ２ドメインを含むことができ、ここで、第２ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２Ｍドメインまたは、ＣＨ２Ｍドメインと二量体化することができるその断片である。上記のＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインのいずれかは、ＣＨ１及びＣＬドメインを有する上記軽鎖と対合する重鎖の一部であることもできる。特定の場合には、上記のＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインのいずれかは、ＣＨ２Ｅドメイン（またはＣＨ２Ｍドメイン）で置き換えられたＣＬドメインを有する上記軽鎖と対合する第１重鎖の一部であり、上記のＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインのいずれかは、ＣＨ１及びＣＬドメインを有する上記軽鎖と対合する第２重鎖の一部である。
【００９３】
一実施形態において重鎖は以下のアミノ酸配列：
【化２０】
2019502694.tif 000023
を含む。
【００９４】
一実施形態において、この重鎖は、以下のアミノ酸配列：
【化２１】
2019502694.tif 000024
を含んでいる軽鎖と二量体化する。
【００９５】
これらの重軽鎖配列は各々、重軽鎖がヘテロ二量体化できる限り、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つのアミノ酸の置換、挿入及び／または欠失を含むことができる。アミノ酸置換は、保存的または非保存的なアミノ酸置換であり得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化する上記のＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインは、一価抗体の一部であることができる。一価抗体は、抗体の２つのＦｃ領域のうちの一方に直接繋げられているかまたは間に介在するリンカー配列を介して繋げられているＦａｂを含み；他方のＦｃ領域は、それに取り付けられたＦａｂ領域を有さない。
【００９７】
他の実施形態では、ヘテロ二量体化する上記のＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインは、一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）の一部であることができる。特定の場合には、ＦａｂのＣＨ１またはＣＬドメインは第１Ｆｃ領域に直接繋げられているかまたは間に介在するリンカーを介して繋げられており、当該Ｆｃ領域は第２Ｆｃ領域に繋げられている（例えば、第１Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＣ末端は、第２Ｆｃ領域のヒンジ領域のＮ末端に繋げられている）。
【００９８】
特定の実施形態では、ヘテロ二量体化する上記Ｆｃドメインは、Ｆａｂに直接繋げられているかまたはリンカーを介して繋げられている。つまり、ＦａｂのＶＨ／ＣＨ１含有部分は、そのＣ末端を介して第１Ｆｃのヒンジ領域のＮ末端に繋げられており、ＦａｂのＶＬ／ＣＬ含有部分はそのＣ末端を介して第２Ｆｃ領域のヒンジ領域のＮ末端に繋げられている。
【００９９】
さらに他の実施形態では、ヘテロ二量体化する上記のＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインは、第１重鎖及び第２重鎖を含む抗体の一部であり、ここで、第１及び第２重鎖は通常の軽鎖と対合している。
【０１００】
核酸
本開示は、本明細書に記載のヘテロ二量体型の二特異性抗体及び一価抗体の重軽鎖をコードする核酸も包含する。ＶＨ、ＶＬ、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４領域を含む免疫グロブリン領域をコードする多くの核酸配列が当該技術分野において既知である。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎ．Ｉ．Ｈ．，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１を参照されたい。本明細書において提供される指針を用いれば、当業者はそのような核酸配列及び／または当該技術分野において知られているその他の核酸配列を組み合わせて本明細書に記載のヘテロ二量体型二特異性抗体をコードする核酸配列を作出することができよう。
【０１０１】
さらに、本明細書に記載のヘテロ二量体型二特異性抗体をコードする核酸配列は、本明細書において提供されるアミノ酸配列及び当該技術分野の知識に基づいて当業者によって決定されることができる。特定のアミノ酸配列をコードするクローニングされたＤＮＡセグメントを生じさせる、より慣例的な方法の他、諸会社は現在、任意の所望の配列からなる化学合成された遺伝子サイズのＤＮＡを日々受注生産しており、よってそのようなＤＮＡを生産する工程は効率化されている。
【０１０２】
二特異性抗体を作る方法
本明細書に記載の二特異性抗体及び一価抗体は、当該技術分野においてよく知られている方法を用いて作ることができる。例えば、二特異性抗体の４本のポリペプチド鎖をコードする核酸を様々な既知の方法、例えば、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔法、核酸で被覆された微粒子の撃ち込みなどによって宿主細胞内に導入することができる。ある場合には、二特異性抗体をコードする核酸は、宿主細胞内に導入される前に宿主細胞での発現に適したベクターの中に挿入される。典型的には、そのようなベクターは、挿入された核酸をＲＮＡレベル及びタンパク質レベルで発現するのを可能にする配列エレメントを含有することができる。そのようなベクターは当該技術分野においてよく知られており、多くは市販されている。核酸を含有する宿主細胞は、核酸を細胞が発現することを可能にするような条件下で培養することができる。結果として生じるヘテロ二量体型二特異性抗体は、細胞塊または培地から回収することができる。あるいは、ヘテロ二量体型二特異性抗体を生体内で、例えば、植物の葉（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：５７３−５７７  （２００１）及びその中で引用される参考文献を参照のこと）、鳥の卵（例えば、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：１１５９−１１６９（２００５）及びその中で引用される参考文献を参照のこと）、または哺乳動物の乳（例えば、Ｌａｉｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．２５（１）：３１５（２０１２））において産生させることができる。単離した抗体は、ヒト対象への投与のために無菌組成物として製剤化することができる。
【０１０３】
数多くある中でも例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなどの細菌細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅもしくはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの真菌細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を含めた鱗翅目昆虫細胞などの昆虫細胞または、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎由来（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞、Ｈｅｌａ細胞、ヒト肝癌由来細胞もしくは２９３細胞を含めた、数種類の宿主細胞を使用することができる。
【０１０４】
以下は本発明の実施例である。それは決して、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきでない。
【実施例】
【０１０５】
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載の本発明をよりよく例示するために提供されており、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。具体的な材料に言及している限りにおいて、それは単に例示を目的としており、本発明を限定することは意図されない。当業者であれば、発明の才を行使することなく、本発明の範囲から逸脱せずに、等価な手段及び反応物質を開発することができる。
【０１０６】
実施例１：重鎖ヘテロ二量体化の操作
ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧの２本の重鎖同士が接触する主要な場所の１つである。２つのＣＨ３ドメインは、界面にある接触残基が密にパッキングされた状態で頭−尾配向で結合し合う。重鎖ヘテロ二量体化は、２つのＣＨ３ドメイン同士の接触のコアにある疎水性表面を操作すること、または接触面の周辺にある荷電残基を変化させることによって達成することができる。疎水性接触残基の密なパッキングを維持すべく、非対称性の操作をするためにＣＨ３界面の周辺を選択した。ＣＨ３ドメインの突然変異のためのさらなる設計基準には、（ｉ）ヘテロ二量体化の効率的誘因、（ｉｉ）少ない突然変異、及び（ｉｉｉ）全体的に電荷中立的な変化が含まれた。ＣＨ３ドメインの構造解析及び突然変異の設計は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（ＰＤＢコード３ＡＶＥ）の結晶構造を使用して行った。比較解析により、公開されている多数のヒトＦｃドメイン同士で構造の同一性が高いことが示され、構造の選択がＣＨ３の操作にとって必須でない可能性があることが示唆された。潜在的な界面突然変異のモデリング及び解析に基づき、リジン再配置の方策を考案して非対称な相補的ＣＨ３界面の操作をした（図２）。単量体ＡにおけるＬｙｓ４０９（ＥＵ付番）のＳｅｒによる置換及びＳｅｒ３６４（ＥＵ付番）のＬｙｓによる置換は、リジンをβストランドＥから隣接する逆平行βストランドＢへと再配置する。反対に、単量体ＢにおけるＬｙｓ３７０（ＥＵ付番）のＳｅｒによる置換及びＰｈｅ４０５（ＥＵ付番）のＬｙｓによる置換は、リジンをβストランドＢからβストランドＥへと再配置する。再配置されたリジンは、ヘテロ二量体では積み重なるが、ホモ二量体では立体的衝突及び電荷の衝突を引き起こし、それは、ホモ二量体の形成を防止すべきものであり、それゆえヘテロ二量体化をもたらすべきものである。
【０１０７】
リジン再配置によるヘテロ二量体化の有効性を実験的に試験するために、一方が完全なヒトＩｇＧ１重鎖でありかつ他方がＦａｂなしの遊離Ｆｃである一価ｍＡｂとして試験抗体を構築した。結果として生じるヘテロ二量体は、ホモ二量体とは分子量の顕著な差で簡単に区別することができ、ヘテロ二量体化はＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離によって評価することができる。抗ＥＧＦＲ抗体Ｍ６０−Ａ０２をこれらの試験構築物において使用した。表１に列挙するプライマーを使用してＰＣＲに基づく突然変異誘発によってＣＨ３ドメインにおける突然変異を生じさせた。
【表１−１】
2019502694.tif 000025
【表１−２】
2019502694.tif 000026
【０１０８】
増幅は、Ｑ５  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０４９３Ｌ）を用いて行い、ＰＣＲ産物をＨｉＦｉ  Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙキット（ＳＧＩ＃ＧＡ１１００−５０）と共に使用して構築物を組み立てた。
【０１０９】
再配置されたリジンの個別の効果についての洞察をいくらか得るために、個別の突然変異を有する構築物を同様に組み立てた。これらの不完全設計をそれぞれＭＰ１及びＭＰ２と命名した（表２）。
【表２−１】
2019502694.tif 000027
【表２−２】
2019502694.tif 000028
完全設計は、再配置されたリジンを両方とも有し（ｐＭＰ２３７は突然変異Ｓ３６４Ｋ／Ｋ４０９Ｓを有し、ｐＭｐ２３８は突然変異Ｋ３７０Ｓ／Ｆ４０５Ｋを有する）、ヘテロ二量体化を引き起こす上で最も効果的であるはずである。この設計をＭＰ３と命名した。ＭＰ３のＣＨ３ドメインのペプチド配列を以下に示す。
ＭＰ３単量体ＡのＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（突然変異は下線付きの太字）
【化２２】
2019502694.tif 000029
ＭＰ３単量体ＢのＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（突然変異は下線付きの太字）
【化２３】
2019502694.tif 000030
さらに、比較のために、公開されているいくつかのＣＨ３ヘテロ二量体化突然変異を生じさせた（Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０：２６−３５，１９９７；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５：１９６３７−１９６４６，２０１０；Ｖｏｎ  Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ５：６４６−６５４，２０１３）。さらに、野生型ＩｇＧ１対照に相当する構築物ｐＭＰ２２１及びｐＭＰ２２２を組み立てた。ヘテロ二量体化のこの最初の試験のために作製した全ての構築物を表２にまとめて示すが、プラスミドは全てＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１１０】
抗体を一過的なトランスフェクションによってＣＨＯ細胞で発現させた。全ての抗体は良好に発現し、Ｆｅｃｔｏｐｒｏ及びＤＮＡを２：１の比で使用して６×１０６細胞／ｍｌでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を使用する９日間の発現及び翌日の２８℃への温度遷移の後に１００〜２００ｍｇ／Ｌの力価が得られた。上清をプロテインＡカラムで精製し、分量分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図３Ａ）。全ての試料において、ＩｇＧ１重鎖と遊離Ｆｃとのヘテロ二量体が主として見つかった。さらに、野生型のＩｇＧ１とＦｃとの共トランスフェクションは、両者のホモ二量体に対応する強いバンドも生じさせた。これらのバンドは、公開されている突然変異体、及び全てのリジン再配置突然変異体では、著しくより弱かった。したがって、リジン再配置突然変異体及び公開されている突然変異体は重鎖ヘテロ二量体の形成を推し進め、ホモ二量体化を減少させる。プロテインＡ精製された材料を質量分析によってさらに分析し、主成分の相対量を推定した。試料中のヘテロ二量体の量は、３５〜８０％の範囲であり、公開されている設計と比べてリジン再配置突然変異体ＭＰ１、ＭＰ２及びＭＰ３ではわずかにより高かった（図３Ｂ）。但し、個々の鎖の発現レベルを変化させることによってこれらの結果が影響を受けて直接的な比較が難しくなる可能性がある。重要なことには、設計ＭＰ２及びＭＰ３ならびにＺＷ１及びノブ・イントゥ・ホール型突然変異体は全て単量体Ｆｃを含有していた。単量体Ｆｃの存在は、Ｆｃ二量体が、ＣＨ３における突然変異によって不安定化され、したがって形成される可能性がより低い、ということを実証している。総じてこれらの結果は、リジン再配置が、公開されているいくつかの突然変異と同じくらい効率的にホモ二量体化を防止する効率的な重鎖ヘテロ二量体化方策である、ということを示している。
【０１１１】
この最初の試験の後、界面残基のパッキングを改良することができる突然変異を同定するためにさらなる構造モデリングを行った。そのような突然変異は、潜在的にヘテロ二量体化の効率または二量体の安定性を向上させることができるであろうし、それゆえに有益であろう。元のリジン再配置設計ＭＰ３を改良できるであろう２つの変化が同定された。この新しい設計をＭＰ４と命名し、アミノ酸変化を表２に示す。ＭＰ４突然変異を有するＩｇＧ１／Ｆｃヘテロ二量体を上記のようにＣＨＯ細胞で発現させ、上清からプロテインＡで精製した。質量分析から、ＭＰ４がＭＰ３と同じくらい効率的にＩｇＧ１重鎖と遊離Ｆｃとのヘテロ二量体を生じさせたことが実証された（図３Ｂ）。
【０１１２】
全てのヘテロ二量体タンパク質をＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムでさらに精製してＦｃの二量体及び単量体を除去し、続いてＴａｎｄｅｍ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００での精製ステップを行った。この３ステップの精製により、融点を決定する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）のために使用される比較的純粋なヘテロ二量体が得られた。野生型ＩｇＧ１対照は、ＣＨ３ドメインの予測Ｔｍである約８３℃を示した（図３Ｃ）。ＺＷ１設計は同程度のＣＨ３融点を有する（図３Ｃ）、というのも、それは野生型ＩｇＧ１の熱安定性を再獲得すべく反復的なプロセスにおいて大幅に操作されたものであるからである（Ｖｏｎ  Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｍＡｂｓ  ５：６４６−６５４，２０１３）。ノブ・イントゥ・ホール型及び静電指向型の比較分子は、ＤＳＣプロファイルにおいてたった１本のピークを示し、ＣＨ３ドメインのＴｍが約７０℃に低下したこと及び、当該ドメインがＣＨ２及びＦａｂドメインと共に融解してＤＳＣにおいて単一ピークをもたらしたことを示唆した（図３Ｃ）。ＭＰ３分子も同様に、ＤＳＣプロファイルにおいてたった１本のピークを約７０℃に示し、ＣＨ３のＴｍが同様に低下したことを指し示していた（図３Ｃ）。タンパク質ＭＰ４及びＭＰ４ａ３ｂ（ＭＰ４の単量体ＡとＭＰ３の単量体Ｂ）は、ＣＨ２／Ｆａｂピークの右側に肩を現し（図３Ｃ）、突然変異Ｋ４０９Ｌが元の突然変異Ｋ４０９Ｓよりもわずかに向上した安定性を付与すること、及びさらなる操作によってＴｍを向上させるのが可能であり得ることを示唆した。それでもなお、設計ＭＰ４は野生型ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインと比べてＴｍがより低い。
ＭＰ４のＣＨ３ドメインのペプチド配列を以下に示す。
ＭＰ４の単量体ＡのＣＨ３ドメインの配列（突然変異は下線付きの太字）
【化２４】
2019502694.tif 000031
ＭＰ４の単量体ＢのＣＨ３ドメインの配列（突然変異は下線付きの太字）
【化２５】
2019502694.tif 000032
【０１１３】
ＭＰ４をコードするプラスミド（ｐＭＰ２５４及びｐＭＰ２５９）のＤＮＡ分子配列を以下に示す。
ＭＰ４Ａ突然変異（Ｓ６３４Ｋ、Ｋ４０９Ｌ）を有する抗ＥＧＦＲ  Ｍ６０−Ａ０２  ＩｇＧ１重鎖、ｐＭＰ２５４のＤＮＡ配列：
【化２６−１】
2019502694.tif 000033
【化２６−２】
2019502694.tif 000034
【化２６−３】
2019502694.tif 000035
【化２６−４】
2019502694.tif 000036
【化２６−５】
2019502694.tif 000037
【化２６−６】
2019502694.tif 000038
【化２６−７】
2019502694.tif 000039
【化２６−８】
2019502694.tif 000040
【化２６−９】
2019502694.tif 000041
【化２６−１０】
2019502694.tif 000042
ＭＰ４Ｂ突然変異（Ｋ３７０Ｓ、Ｖ３９７Ｉ、Ｆ４０５Ｋ）を有するＩｇＧ１  Ｆｃ、ｐＭＰ２５９のＤＮＡ配列：
【化２７−１】
2019502694.tif 000043
【化２７−２】
2019502694.tif 000044
【化２７−３】
2019502694.tif 000045
【化２７−４】
2019502694.tif 000046
【化２７−５】
2019502694.tif 000047
【化２７−６】
2019502694.tif 000048
【化２７−７】
2019502694.tif 000049
【化２７−８】
2019502694.tif 000050
【化２７−９】
2019502694.tif 000051
【０１１４】
実施例２：重鎖ヘテロ二量体化突然変異の試験
リジン再配置設計のさらなる特性評価を行うために、突然変異を完全なＩｇＧ１重鎖の中に組み込んだ。これらの構築物は、潜在的影響を制限しかつ軽鎖対合問題を回避するために両方の重鎖上に同じＦａｂ（抗ＥＧＦＲ  Ｍ６０−Ａ０２）を含有していた。等量の２つの重鎖、及びＭ６０−Ａ０２の軽鎖をＣＨＯ一過性発現体において発現させ、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。どの上清も、１本の重鎖と１本の軽鎖とからなる半抗体をかなりの量で含有していたが、ＬＣ−ＭＣピーク（データ示さず）の定量によって示されるとおり設計ＭＰ４はＭＰ３と比べてより少ない量の半抗体を生成した。さらに、質量分析からは、これらの試料において半抗体が重鎖Ｂによってのみ形成されていることが明らかになった（データ示さず）。これは、半抗体形成が重鎖Ｂの過剰発現の結果であり得ることを示唆しており、それは、２つの重鎖同士の比を最適化することによって半抗体のレベルを低減する可能性を切り開くものである。それゆえ、同一のＦａｂを有する設計ＭＰ４の重鎖（プラスミドｐＭＰ２５４及びｐＭＰ３９９）を１：５〜５：１の様々な比でＣＨＯ−Ｓ細胞内にトランスフェクトした。重鎖の総量（１４μｇ）及び軽鎖の量は、これらのトランスフェクションにおいて一定に保った。鎖Ａの過剰発現は、半抗体の形成を減少させて上清中の完全ＩｇＧの量を増加させ、半抗体形成が鎖同士の示差的発現によって影響を受けることを裏付けた（図４Ａ）。これらの実験ではどちらの重鎖も同じＦａｂ（抗ＥＧＦＲ  Ｍ６０）を含有していたことから、２つの重鎖の示差的発現はＣＨ３突然変異に起因している可能性がある。しかしながら、質量分析は、どちらの鎖の過剰発現もそれぞれのホモ二量体の形成の増加を招くということも実証した（図４Ｂ）。したがって、２本の重鎖間で等しい比率は、望ましくない副生成物を最小限にする好適な妥協点である。
【０１１５】
実施例３：軽鎖対合問題に対する解決策の開発
図１に示されているような二特異性抗体における軽鎖：重鎖（ＬＣ：ＨＣ）対の正しい会合を引き起こすためには、誤った会合が立体的衝突または電荷の反発によって防止されるように鎖間の界面が操作され得る。抗体の軽鎖は可変ドメイン及び定常ドメインにおいて重鎖と接触し、どちらの接触（ＶＬ：ＶＨ及びＣＬ：ＣＨ１）も認識及び係合に寄与する。それゆえ、定常ドメインにおける点突然変異は、各軽鎖を正しい対合へと導くのに十分でない可能性があり、可変ドメインの操作が必要となる可能性がある。したがって、軽鎖対合を解決するための代替方策を探究した。
【０１１６】
抗体の可変ドメインは、定常領域の不在下で、または異種タンパク質と融合している場合に、それらの結合性を維持することができる。本発明者らは、軽鎖の誤対合を防止する方策としてＣＨ１／ＣＬの代わりにＩｇフォールドドメインが使用され得るという仮説を立て、ＣＨ１：ＣＬドメインを置き換える候補ＩｇフォールドドメインとしてＩｇＥ（Ｃε２）のＣＨ２ドメインを選択した（図５Ａ）。ＩｇＥ（Ｃε２）のＣＨ２ドメインは、２つの鎖間ジスルフィドによって繋げられたホモ二量体を形成する。このドメインは、（ＩｇＥには存在していない）ヒンジ領域の代わりとして、ＩｇＥ重鎖間の二量体化界面の役割を果たす。さらに、ＩｇＧのＣＨ２ドメインとは違い、Ｃε２ドメインはエフェクター機能に関与せず、ＦｃεＲＩαと接触しない（Ｈｏｌｄｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８：５７１−５７６，２０１１）。
【０１１７】
Ｃε２ドメインの構造は他のＩｇフォールドドメイン、例えばＣＬ及びＣＨ１ドメインと類似しているが、二量体のユニット間の界面及び角度は異なっている（図５Ｂ）。二量体の２つのＣε２ドメインは他のＩｇフォールドドメインと比べて広範囲の相互作用がより少なく、相互作用には通常の無極性残基ではなく極性残基が優勢である。このように、Ｃε２とＣＨ１：ＣＬとは全体的に非常に異なっているため、Ｉｇフォールドドメインの交差対合の可能性は低い。しかしながら、Ｉｇフォールドの第１βストランドの始まりを示す２つのプロリン（図５Ｃ中で下線付きの太字で強調されている）は、Ｃε２定常ドメイン及びＣＨ１／カッパ定常ドメインの構造において類似した位置にある。したがって、抗体の可変ドメインをＣε２ドメインと融合させること及び、ＶＨ：ＶＬ対の形状、したがってその結合性を維持することは、可能であると見受けられる。Ｃε２ドメインと融合した抗体の可変ドメインからなるこのハイブリッドＦａｂ構築物を「Ｅ−Ｆａｂ」と命名した（図５Ｃ）。ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列を以下に示す（Ｎ結合型グリコシル化部位に下線を引いてある）。
【化２８】
2019502694.tif 000052
【０１１８】
ＶＨドメインをＣε２ドメインと融合させるために、ＩｇＧ１  ＣＨ１定常領域のコネクタ配列（ＡＳＴＫＧ（配列番号７））と、Ｐｒｏ２（ＣドメインのＩＭＧＴ特有の付番、図５Ｃ）から始まるＣε２ドメインの第１βストランドとを結び合わせた。最初の８つのアミノ酸（ＶＣＳＲＤＦＴＰ（配列番号８））がヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインの最初の５つのアミノ酸（エルボー領域ＡＳＴＫＧ（配列番号７）に下線を引いてある）で置き換わったヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列を以下に示す。
【化２９】
2019502694.tif 000053
【０１１９】
カッパ定常領域由来のコネクタ（ＲＴＶＡＡ（配列番号９））を使用して、同じ方策を用いてＶＬをＣε２ドメインと融合させた。最初の８つのアミノ酸（ＶＣＳＲＤＦＴＰ（配列番号８））がヒトカッパドメインの最初の５つのアミノ酸（エルボー領域ＲＴＶＡＡ（配列番号９）に下線を引いてある）で置き換わったヒト免疫グロブリンＥのＣＨ２ドメインのアミノ酸配列を以下に示す。
【化３０】
2019502694.tif 000054
【０１２０】
ヒトＣε２ドメインは１つのＮ結合型グリコシル化部位をＡｓｎ３８（ＩＭＧＴ付番）に有し、Ｅ−ＦａｂではそれをＧｌｎに突然変異させてこの部位のグリコシル化を防止した。この最初の設計では、可変ドメインがＣε２ドメインと結び付けられており、当該Ｃε２ドメインは、ａｇｌｙ突然変異以外には変更されておらず、重軽鎖間で同一である。この最初の設計をＥ−Ｆａｂ  Ｅ０と命名した。Ｅ−Ｆａｂの重鎖のＥ０設計のアミノ酸配列を以下に示す（Ｎグリコシル化部位がグルタミンへと突然変異している）。
【化３１】
2019502694.tif 000055
Ｅ−Ｆａｂの軽鎖のＥ０設計のアミノ酸配列を以下に示す（Ｎグリコシル化部位がグルタミンへと突然変異している）。
【化３２】
2019502694.tif 000056
【０１２１】
しかしながら、Ｃε２ドメインは通常はホモ二量体化するため、ＨＣ：ＨＣまたはＬＣ：ＬＣ二量体の形成を防止すべく追加の突然変異を当該ドメインに導入し、これらの設計をＥ−Ｆａｂ  Ｅ１〜Ｅ３と命名した（表３；位置はＩＭＧＴ付番方式による）。
【表３】
2019502694.tif 000057
【０１２２】
Ｅ−Ｆａｂの重鎖のＥ１設計のアミノ酸配列を以下に示す。
【化３３】
2019502694.tif 000058
【０１２３】
Ｅ−Ｆａｂの軽鎖のＥ１設計のアミノ酸配列を以下に示す。
【化３４】
2019502694.tif 000059
【０１２４】
Ｅ−Ｆａｂの重軽鎖のＥ２設計のアミノ酸配列はこの実施例の最後に示されている。
【０１２５】
Ｅ−Ｆａｂの重鎖のＥ３設計のアミノ酸配列を以下に示す。
【化３５−１】
2019502694.tif 000060
【化３５−２】
2019502694.tif 000061
Ｅ−Ｆａｂの軽鎖のＥ３設計のアミノ酸配列を以下に示す。
【化３６】
2019502694.tif 000062
【０１２６】
軽鎖対合の制御においてＥ−Ｆａｂを評価するために、Ｍ６０−Ａ０２抗ＥＧＦＲとＭ１３．Ｃ０６抗ＩＧＦ１Ｒとの２つのＦａｂを使用して試験構築物を組み立てた。どちらの重鎖もサブグループＨＶ３に属し、それゆえプロテインＡを使用して精製することができる。正しい対合と誤った対合とをＳＤＳｐａｇｅでの移動によって簡単に区別するのを可能にするために、試験分子をＧＦＰ（３０ｋＤａ、Ｆａｂ  Ｂ  抗ＩＧＦ−１ＲのＬＣ）またはＨＳＡ（６６ｋＤａ、Ｆａｂ  ＡまたはＥ−ＦａｂのＨＣ、抗ＥＧＦＲ）でタグ付けした（図６Ａ）。Ｅ−Ｆａｂ構築物をｇＢｌｏｃｋによって組み立てた。ＰＣＲに基づく突然変異によってＣε２ドメインに追加の突然変異を導入し、生成物を制限酵素に基づく方法によってｐＶ９０／ｐＶ１００に由来するＣＨＯ発現ベクターにクローニングした（表３）。４０ｍｌ規模のＣＨＯ−Ｓでの一過的なトランスフェクションによってＦａｂを共発現させた。トランスフェクションから２４時間後に発現のために細胞を２８℃に遷移させ、８日後に上清を採取し、遠心分離及び濾過（０．２２μｍ）によって浄化した。
【０１２７】
発現したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、Ｃε２ドメインと融合した通常の抗体の可変ドメインからなるＥ−Ｆａｂが軽鎖対合の制御において非常に効率的であったことを示した。Ｍ６０−Ａ０２とＭ１３−Ｃ０３６との２つのＦａｂを野生型ＩｇＧ１／カッパＦａｂとして共発現させた場合には、Ｍ６０−Ａ０２軽鎖とＭ１３−Ｃ０６重鎖との誤対合が容易に検出された（図６Ｂ）。しかしながら、Ｍ６０−Ａ０２をＥ−Ｆａｂとして作った場合には誤対合はみられなかった。対照的に、ＣＨ１／ＣＬドメインでの点突然変異は、この実験において軽鎖誤対合をなくすことができなかった（データ示さず）。同様に、抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｍ１３−Ｃ０６をＥ−Ｆａｂとして構築すると、それを別のＦａｂ（抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｇ１１）と共発現させた場合に誤対合は検出されなかった（図６Ｃ）。重要なことに、Ｆａｂを個別に発現させて抗原との結合性をＯｃｔｅｔによって試験した場合、Ｅ−ｆａｂ及び野生型Ｆａｂは、抗Ｈｉｓチップ上に装填されたＨｉｓタグ付ＩＧＦ−１Ｒに対して同程度に結合した（図６Ｄ）。
【０１２８】
したがって、上記データに基づくと、Ｅ−Ｆａｂは、二特異性抗体の軽鎖対合問題を解決する優れた方策である、というのも、それが厳密に正しい鎖対合を強化し、Ｆａｂの結合性が維持されるからである。興味深いことに、Ｃε２ドメインはＥ−Ｆａｂの鎖同士のホモ二量体の形成を強く誘導しなかった。それにもかかわらず、重軽鎖間でヘテロ二量体を形成するように操作されている設計Ｅ２及びＥ３を先に進めて完全二特異体との関連において試験した。重鎖同士の二量体化をいくらか誘導すると見受けられた設計Ｅ１（図６Ｂ）のみ、さらなる試験を行わなかった。Ｅ−Ｆａｂ設計Ｅ２の定常ドメインのペプチド配列を以下に示す。
Ｅ−Ｆａｂ軽鎖定常領域ａｇｌｙ  Ｎ３８Ｑ（設計Ｅ２、Ｔ１２１Ｇ、ｐＭＰ４６３）のアミノ酸配列
【化３７】
2019502694.tif 000063
Ｅ−Ｆａｂ重鎖定常領域ａｇｌｙ  Ｎ３８Ｑ（設計Ｅ２、Ｓ１０１、ｐＭＰ３９２）のアミノ酸配列
【化３８】
2019502694.tif 000064
【０１２９】
実施例４：二特異性非対称ＩｇＧの組立て及び試験
Ｅ−Ｆａｂとリジン再配置構築物とを組み合わせて完全ＩｇＧ様二特異性抗体を作製した。そのような二特異性抗体は４本の異なる鎖からなり、軽鎖対合解決策と重鎖ヘテロ二量体化解決策とを両方含有している（図７）。抗ＥＧＦＲ抗体Ｍ６０−Ａ０２と抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｍ１３．Ｃ０６またはＧ１１とを再び使用して、ヘテロ二量体化突然変異ＭＰ３を有する２本の異なるＩｇＧ１重鎖を組み立てた。
成熟Ｍ６０−Ａ０２  Ｅ体  重鎖（ＥＦａｂ  Ｅ２、ｍｐ３ａヘテロ二量体化、ｐＭＰ４０１）のアミノ酸配列（ＣＨ２ドメインに下線を引き、ＣＨ３ドメインを太字で示している）
【化３９−１】
2019502694.tif 000065
【化３９−２】
2019502694.tif 000066
成熟Ｍ６０−Ａ０２  Ｅ体  軽鎖（ＥＦａｂ  Ｅ２、ｐＭＰ４６３）のアミノ酸配列（ＣＨ２ドメインに下線を引いている）
【化４０】
2019502694.tif 000067
成熟Ｍ１３．Ｃ０６  ＩｇＧ１重鎖（ｍｐ３ｂヘテロ二量体化、ｐＭＰ４０４）のアミノ酸配列（ＣＨ３ドメインを太字で示している）
【化４１】
2019502694.tif 000068
成熟Ｍ１３．Ｃ０６  カッパ軽鎖（ｐＭＰ４０７）のアミノ酸配列
【化４２−１】
2019502694.tif 000069
【化４２−２】
2019502694.tif 000070
【０１３０】
異なる軽鎖の対合を制御するために、抗ＥＧＦＲ  ＦａｂをＥｆａｂとして構築した（図７）。リジン再配置突然変異を有する対照抗体を組み立てて、軽鎖対合解決策を欠くＩｇＧ１重鎖ヘテロ二量体を作製した。
【０１３１】
抗体を再びＣＨＯ−Ｓ細胞で一過的なトランスフェクションによって発現させ、上清を採取し、８日間培養した後に浄化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離は、完全なＩｇＧの大きさで移動するバンドと、半抗体に対応するさらなるバンドを示した（図８Ａ）。質量分析は、これらの実験において重鎖Ｂによる半抗体が再び形成されたことを実証した。重要なことに、Ｅ−Ｆａｂでは軽鎖誤対合はＬＣ−ＭＳによって検出されなかった。ＩｇＧ１ヘテロ二量体は、重鎖とそれらの軽鎖との正しい対合をいくらか示したが、２本の抗ＥＧＦＲ軽鎖を有する重鎖ヘテロ二量体の強いピークも検出できた（図８Ｂ）。これらの結果は、Ｅ−Ｆａｂが軽鎖対合問題を解決するということを再び裏付けている。
【０１３２】
重要なことに、質量分析プロファイルにおいて重鎖同士のホモ二量体は検出できず、リジン再配置による重鎖ヘテロ二量体化はＥ−Ｆａｂと組み合わされた場合に非常に効率的であることが実証された（図８Ｂ）。但し、質量分析からは、ＩｇＧ１対照には存在しないがＥｆａｂ二特異体には存在している低レベルのＯ−グリカンも明らかになった。
【０１３３】
次に、可溶性Ｈｉｓタグ付ＥＧＦＲ（図８Ｃ）及びＩＧＦ−１Ｒ（図８Ｄ）によるＯｃｔｅｔ結合性実験において粗上清を使用した。二特異性Ｅ体及びＩｇＧ１対照は、ＥＧＦＲともＩＧＦ−１Ｒとも結合したが、結合性はＥ体と対照とでいくぶん異なっているようであった。但し、これらの結果の解釈は、これらの粗試料において異なっている発現、半抗体の量及び軽鎖誤対合ゆえに、複雑である。
【０１３４】
総じて、結合性データと合わせて質量分析による分析は、Ｅ体が非対称ＩｇＧへと正しく会合したことを実証している。これは、ＣＨＯ細胞における４つの異なる鎖（２つのＨＣ及び２つのＬＣ）の発現によって単純に成し遂げられる。Ｅ−Ｆａｂは軽鎖対合を完全に解決し、リジン再配置はこれらの実験において重鎖ヘテロ二量体化を厳密に強化した。
【０１３５】
実施例５：二特異性基幹のさらなる試験
Ｅｆａｂ及びＦｃヘテロ二量体化を用いて二特異性基をさらに試験するために、別のＩｇＧ様二特異性抗体を、種々のがんの治療のために認可されているトラスツズマブとセツキシマブとの２つの治療抗体から作製した。二特異体を作製するために、軽鎖対合解決策Ｅｆａｂを用いて抗ＨＥＲ抗体であるトラスツズマブをクローニングし、次にｍｐ４重鎖ヘテロ二量体化突然変異（Ｓ３６４Ｋ／Ｋ４０９Ｓ及びＫ３７０Ｓ／Ｖ３９７Ｉ／Ｆ４０５Ｋ）を用いて抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブと組み合わせた。その後、抗体の２本の重鎖及び２本の軽鎖をコードする４つのプラスミド（ｐＭＰ５２１、ｐＭＰ５２６、ｐＭＰ５２８及びｐＭＰ５３０）をＣＨＯ−Ｓ細胞において一過的なトランスフェクションによって共発現させ、結果として生じた二特異性抗体をプロテインＡで精製した。この抗体は次に、可溶タイプのＨＥＲ２とＥＧＦＲとの２つの抗原を使用するＯｃｔｅｔ結合性試験において使用した（図９Ａ及び図９Ｂを参照されたい）。図９Ａ及び図９Ｂに示されているように、二特異性抗体はその両方の抗原に同時に結合することができる。
ｐＭＰ５３０  トラスツズマブ  Ｅｆａｂ  ＩｇＧ１  ｍｐ４ａ
【化４３】
2019502694.tif 000071
ｐＭＰ５２８  トラスツズマブ  Ｅｆａｂ  軽鎖
【化４４】
2019502694.tif 000072
ｐＭＰ５２１  セツキシマブ  ＩｇＧ１  ｍｐ４ｂ
【化４５】
2019502694.tif 000073
ｐＭＰ５２６  セツキシマブ  カッパ
【化４６】
2019502694.tif 000074
【０１３６】
実施例６：軽鎖対合解決策のさらなる試験
Ｅｆａｂの構築をさらに最適化するために、ＩｇＥの可変ドメインとＣＨ２ドメインとの間のリンカーをさらに調査した。先の実施例ではヒトカッパ及びＣＨ１ドメインに由来するエルボー領域を可変ドメインとＩｇＥ  ＣＨ２との間のリンカーとして使用した。しかしながら、その他のリンカー配列は潜在的に形状を変化させるかまたは異なる度合いの柔軟性を提供する可能性があり、よって鎖の正しい会合またはＥｆａｂと抗原との結合性に影響を与える可能性がある。これを試験するために、抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブをＥｆａｂとして操作し、軽鎖内に様々なエルボー配列を含めた。使用したリンカーは、ラムダ軽鎖もしくはヒトＩｇＥ  ＣＨ２ドメインに由来するもの、または様々な長さのＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーであった（図１０）。ＥｆａｂはＣＨＯ細胞において一過的なトランスフェクションにより(図９に示すように)セツキシマブとの非対称ＩｇＧとして発現した。興味深いことに、様々なエルボーリンカー配列は、トラスツズマブがＨＥＲ２と結合する能力にほとんど影響を与えず、どの構築物も野生型トラスツズマブＦａｂと比べて同程度の結合性を示した。
【０１３７】
ＩｇＭクラスの抗体はＩｇＥと類似したＣＨ２ドメインを有し、それはヒンジ領域の代わりにジスルフィド架橋によって２本の重鎖を対合させる役割を果たす。それゆえ、ＩｇＭ  ＣＨ２ドメインを使用することでＩｇＥ  ＣＨ２ドメインと同じく良好に軽鎖対合が解決されるか否かを試験した。これを試験するために、片方のＦａｂをＨＳＡと融合させかつもう片方のＦａｂをＧＦＰと融合させた状態で２つのＦａｂ（Ｍ６０及びＣ０６）を図６Ａに示されているように再び共発現させた。但し、この場合は、片方のＦａｂのカッパ及びＣＨ１定常ドメインをＩｇＭ  ＣＨ２ドメインで置き換え、結果として生じる分子をＭ−Ｆａｂと命名した（図１０Ｃ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる鎖対合の分析は、対照において顕著に認められたＭ６０とＣ０６との間での軽鎖誤対合をＭ−Ｆａｂが解決したことを示した（図１０Ｃ）。このように、Ｍ−Ｆａｂは、軽鎖対合問題を解決する上でＥｆａｂと同様に効率的に機能すると見受けられた。
【０１３８】
次に、Ｍ−Ｆａｂが抗原と結合する能力を、様々なエルボー領域を軽鎖に有しているＥｆａｂと比較した。これらのＥｆａｂ及びＭ−Ｆａｂは、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブの可変ドメインを使用して再び構築した。Ｍ−Ｆａｂ構築物の重軽鎖の成熟ペプチド配列を以下に示す。
６ｘＨｉｓタグを有するトラスツズマブＭ−ｆａｂ重鎖（ｐＭＰ６２３）のアミノ酸配列（エルボー領域を太字で示し、ＩｇＭ  ＣＨ２ドメインには下線を引き、６ｘＨｉｓをイタリック体で示す）
【化４７】
2019502694.tif 000075
トラスツズマブＭ−ｆａｂ軽鎖（ｐＭＰ５９６）のアミノ酸配列（エルボー領域を太字で示し、ＩｇＭ  ＣＨ２ドメインには下線を引いてある）
【化４８−１】
2019502694.tif 000076
【化４８−２】
2019502694.tif 000077
【０１３９】
Ｅｆａｂ及びＭ−ＦａｂをＣＨＯ−Ｓにおいて（Ｆｃのない）Ｆａｂとして発現させ、上清をＯｃｔｅｔによるＨＥＲ２との結合性の試験に使用した。この結合アッセイにおいてＭｆａｂ及び様々なＥｆａｂ構築物は非常に似通った結合性を示した（図１０Ｄ）。
【０１４０】
総じてこれらの結果は、ＩｇＭ  ＣＨ２ドメインをＦａｂ（Ｍ−ｆａｂ）の定常ドメインとして使用することによって軽鎖対合問題が解決されかつＦａｂの結合特性が維持されるということを示している。したがって、Ｍ−Ｆａｂはもう１つの有用な軽鎖対合解決策である。
【０１４１】
実施例７：重軽鎖対合技術のさらなる用途
次に、重軽鎖対合解決策を、他の様々な二特異性構成及び一価特異性構成との関連においてさらに試験して、これらの技術がどのくらい多目的かつ機能的であるかを探究した。
【０１４２】
第１に、Ｆｃヘテロ二量体化突然変異を他のＦｃ領域のＣＨ３ドメインに導入し、結合性試験においてそのような二特異性抗体の機能性を試験した。この目的のために、Ａｓｎ２９７においてＮ結合型グリコシル化を欠いておりそのためにエフェクター機能がグリコシル化ＩｇＧ１と比べて低下しているＩｇＧ１  ａｇｌｙ  Ｔ２９９Ａ足場の中に、ｍｐ３ヘテロ二量体突然変異（Ｓ３６４Ｋ／Ｋ４０９Ｓ及びＫ３７０Ｓ／Ｆ４０５Ｋ）をクローニングした。抗ＥＧＦＲ抗体Ｍ６０−Ａ０２のＥｆａｂと、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体Ｍ１３．Ｃ０６の通常のＦａｂとを有する非対称ＩｇＧの形態でこのＦｃ領域を有する二特異性抗体を、ＣＨＯ細胞における一過的なトランスフェクションによって作った（図１１Ａ）。結果として生じた二特異性抗体は、サンドイッチ構成型Ｏｃｔｅｔ結合性アッセイにおいて両リガンドに対する堅牢な同時結合性を示し（図１１Ｂ）、共発現させた４本の鎖（プラスミドｐＭＰ４６３、ｐＭＰ４０２、ｐＭＰ４０５、ｐＭＰ４０７）から二特異性抗体が効率的に形成されたことを実証した。したがって、リジン再配置によるＦｃヘテロ二量体化方策はＦｃグリコシル化とは無関係に機能すると見受けられる。
ｐＭＰ４０２  Ｍ６０  Ｅｆａｂ  ＩｇＧ１  ａｇｌｙ  Ｔ２９９Ａ  ｍｐ３ａ  Ｓ３６４Ｋ／Ｋ４０９Ｓ
【化４９−１】
2019502694.tif 000078
【化４９−２】
2019502694.tif 000079
ｐＭＰ４０５  Ｃ０６  ＩｇＧ１  ａｇｌｙ  Ｔ２９９Ａ  ｍｐ３ｂ  Ｋ３７０Ｓ／Ｆ４０５Ｋ
【化５０】
2019502694.tif 000080
【０１４３】
第２に、別のＦｃ構成における重鎖ヘテロ二量体化を試験するために、非グリコシル化ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインの最小のエフェクター機能とＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの安定性とを組み合わせたものであるＩｇＧ４Ｐ／ＩｇＧ１  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）ハイブリッド定常ドメインの中に、ｍｐ４ヘテロ二量体突然変異（Ｓ３６４Ｋ／Ｋ４０９Ｌ及びＫ３７０Ｓ／Ｖ３９７Ｉ／Ｆ４０５Ｋ）をクローニングした（図１２）。このＦｃもヒンジ安定化突然変異Ｓ２２８Ｐを含有する。こうして、このハイブリッドＩｇＧ４Ｐ／ＩｇＧ１定常ドメインと、抗ＨＥＲ２抗体ペルツズマブの可変ドメインと、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体Ｃ０６とを有する二特異性抗体が作製された。可変ドメインは両方の配向で、それぞれＥｆａｂとしての鎖Ａ上または通常のＦａｂとしての鎖Ｂ上で使用した。抗体をＣＨＯ細胞において再び生成し、プロテインＡ精製材料をＯｃｔｅｔ結合性試験において使用した（図１２）。興味深いことに、精製された二特異性抗体は、ＩＧＦ１Ｒを最初に装填してその後に抗体及びＨＥＲ２を装填した場合にのみ両抗原との同時結合性を示したが（図１２Ｃ）、逆の順序で試験した場合にはそれが示されず、それは可溶性抗原上のタグの位置が異なることに起因している可能性がある。
【０１４４】
第３に、二特異性技術をＭａｂ−Ｆａｂとの関連において検討した。二特異性抗体を構築する別の方法がＭａｂ−Ｆａｂであり、それは、重鎖のＣ末端に融合したＦａｂを有しているＩｇＧを含有する（図１３Ａ）。この構成は、２本の同一の重鎖を有する対象分子と類似しており、Ｆｃヘテロ二量体技術を不要にする。しかしながら、各々特有の軽鎖を含有している２つの異なるＦａｂには軽鎖対合解決策が必要である。これとの関連においてＥｆａｂが正しい軽鎖会合を促進するように機能するか否かを試験するために、Ｃ末端に融合した抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体Ｃ０６のＥｆａｂを有している、ＩｇＧ１としてのトラスツズマブを使用して、Ｍａｂ−Ｆａｂを構築した（図１３）。さらに、Ｃ末端に融合したトラスツズマブのＥｆａｂを有している、ＩｇＧ１としてのＣ０６の逆構築物も作製した。どちらの場合においても、単一のＧ４Ｓ（配列番号５６）リンカーを使用してＥｆａｂの重鎖のＮ末端においてＥｆａｂをＩｇＧ重鎖のＣ末端に繋げた。Ｍａｂ−Ｆａｂを、またしてもＣＨＯ一過性発現体において３つのプラスミド（１本の重鎖と２本の軽鎖、ｐＭＰ７５９／ｐＭＰ５１９／ｐＭＰ５１１またはｐＭＰ７６０／ｐＭＰ５２８／ｐＭＰ４０７）の共発現によって生じさせ、プロテインＡで精製した。精製した材料のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、Ｍａｂ−Ｆａｂの３本の鎖が２５０ｋＤａのタンパク質へと正しく会合したことを示した（図１３Ｂ）。二特異性抗体はさらに、サンドイッチＯｃｔｅｔ結合性アッセイにおいてある程度の同時結合性を示した（図１３Ｃ）。しかしながら、この同時結合性は、ＥｆａｂがＣ０６であるかトラスツズマブであるかにかかわらず、Ｅｆａｂを最初に結合させた場合にのみ認められ、この構成において何らかの形態の立体障害が両抗原との同時結合性に影響を与えている可能性があることを示唆していた。
ｐＭＰ７５９  トラスツズマブ  ＩｇＧ１−Ｃ０６  ＥＦａｂ
【化５１−１】
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【化５１−２】
2019502694.tif 000082
ｐＭＰ５１１  Ｃ０６  Ｅｆａｂ  軽鎖
【化５２】
2019502694.tif 000083
ｐＭＰ５１９  トラスツズマブ  カッパ軽鎖
【化５３−１】
2019502694.tif 000084
【化５３−２】
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ｐＭＰ７６０  Ｃ０６−ＩｇＧ１−トラスツズマブ  Ｅｆａｂ
【化５４】
2019502694.tif 000086
【０１４５】
第４に、Ｆｃヘテロ二量体化技術は、二特異体の作製における様々な用途に加えて、単一特異性一価抗体を作製するために利用することもできる。図３に示すような半抗体と遊離Ｆｃとのヘテロ二量体はそのような単一特異性一価抗体の一例である。別の例は、ＦｃにＬＣを直接融合して後にそれを適合する重鎖と共発現させるものである（図１４Ａ）。この構成では軽鎖または重鎖のホモ二量体の形成を防止するためにＦｃヘテロ二量体化方策が必要とされる。ｍｐ４  Ｆｃヘテロ二量体がこの種の一価単一特異性抗体の構築にも適しているか否かを試験するために、抗ＥＧＦＲ抗体Ｍ６０−Ａ０２の可変ドメインを使用してＬＣ−Ｆｃ融合構築物を作製した。このプラスミド（ｐＭＰ５３３）を、対応するＦｃヘテロ二量体突然変異を含有するＭ６０−Ａ０２の重鎖（プラスミドｐＭＰ２５４）と共にＣＨＯ細胞において発現させることによって、単一のタンパク質種が生成した（図１４Ｂ）。このタンパク質をＯｃｔｅｔ結合性試験において分析したところ、一価結合性の特徴が示された。（図１４Ｃ）。全体として、このデータは、リジン再配置によるＦｃヘテロ二量体化が、一価単一特異性抗体を作製する多目的かつ有効な方法であるらしいということを示している。
【０１４６】
最後に、ＩｇＧのＦｃ部分を欠く二特異性抗体におけるＥｆａｂ軽鎖対合解決策の使用についても試験した。そのような二特異体は例えば、２つのＦａｂとペプチドリンカーとの直接的融合によって作製することができる（図１５Ａ、右図）。あるいは、２つのＦａｂを繋げるペプチドは異種タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）であってもよい（図１５Ａ、左図）。どちらの場合であっても、二特異体が機能するには２つのＦａｂの重軽鎖の対合が正しいことが必要である。それゆえ、Ｅｆａｂ軽鎖対合解決策は、二特異性分子への２つのＦａｂのそのような融合を可能にし得る。これを試験するために、Ｍ６０−Ａ０２抗体及びＭ１３．Ｃ０６抗体を再び使用し、２つのＦａｂを両方の配向で使用して二特異体を作製した。これらの二特異体をＣＨＯ細胞において発現させた場合、それは単一のタンパク質を生成し、抗体鎖が正しく会合したことを再び示唆した（図１５Ｂ）。Ｏｃｔｅｔ結合性試験において抗体を試験した場合、同時結合性がまたしても１つの特定の配向でのみ認められた（図１５Ｃ）。それでもなお、本データは、通常のＩｇＧのＦｃを欠く様々な構成で２つのＦａｂから二特異体を効率的に作製するためにＥｆａｂ軽鎖対合解決策を採用できることを示している。
【０１４７】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、上記記載は例示を意図するものであり、添付の特許請求の範囲によって定義付けられる本発明の範囲の限定を意図するものではない。他の態様、利点及び改変は、別記の請求項の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
2019502694.tif 000098
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019502694.tif 000115
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