(57)【要約】  本発明は、レポーター遺伝子の発現の調節のためのポリヌクレオチドカセットを用いて、リガンドと特異的に結合するアプタマーまたはアプタマーと特異的に結合するリガンドを特定する真核細胞系のスクリーニング法を提供し、該ポリヌクレオチドカセットは５’イントロン−選択的エキソン−３’イントロンの背景でリボスイッチを含有する。該リボスイッチは、アプタマーがリガンドと結合するとレポーター遺伝子の発現が生じるようにエフェクター領域とアプタマーとを含む。
2019523013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞にてリガンドと結合するアプタマーを選択する方法であって、以下のステップ：
（ａ）アプタマーのライブラリを提供することと、
（ｂ）レポーター遺伝子の発現であって前記リガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットに、前記アプタマーのライブラリのメンバーを導入してリボスイッチのライブラリを作り出すことと、
（ｃ）真核細胞に前記リボスイッチのライブラリを導入することと、
（ｄ）前記真核細胞をリガンドに接触させることと、
（ｅ）前記レポーター遺伝子の発現を測定することとを含み、
前記ポリヌクレオチドカセットは、５’イントロン及び３’イントロンが隣接する選択的にスプライシングされるエキソンと、（ｉ）前記３’イントロンの５’スプライス部位を含むステムを含むエフェクター領域及び（ｉｉ）アプタマーを含むリボスイッチとを含み、
前記選択的にスプライシングされるエキソンは、前記選択的にスプライシングされるエキソンが前記レポーター遺伝子のｍＲＮＡにスプライシングされる際、前記レポーター遺伝子とインフレームである終止コドンを含む、前記方法。
【請求項２】
前記アプタマーのライブラリが１以上の無作為化されたヌクレオチドを有するアプタマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドが小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンドが、代謝産物、核酸、ビタミン、補因子、脂質、単糖類及びセカンドメッセンジャーから成る群から選択される、前記真核細胞によって産生される分子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記真核細胞が哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞及び酵母細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記レポーター遺伝子の前記発現が、前記リガンドが存在しない場合の前記レポーター遺伝子の発現レベルよりも、前記リガンドが特異的に前記アプタマーと結合する場合の方が約１０倍を超えて高い、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記５’及び３’のイントロンがヒトβ−グロビン遺伝子のイントロン２に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記５’及び３’のイントロンがそれぞれ独立して約５０〜約３００ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記５’及び３’のイントロンがそれぞれ独立して約１２５〜約２４０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記エフェクター領域のステムが約７〜約２０塩基対の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記エフェクター領域のステムが８〜１１塩基対の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択的にスプライシングされるエキソンが、ヒトのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のエキソン２、変異体ヒトウィルムス腫瘍１のエキソン５、マウスのカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩデルタのエキソン１６及びＳＩＲＴ１のエキソン６から成る群に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記選択的にスプライシングされるエキソンが、ヒトＤＨＦＲに由来する修飾されたエクシン２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択的にスプライシングされるエキソンが、合成である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記選択的にスプライシングされるエキソンが、エキソンスプライスエンハンサーの配列を変えること、エキソンスプライスサイレンサーの配列を変えること、エキソンスプライスエンハンサーを付加すること、及びエキソンスプライスサイレンサーを付加することから成る群の１以上によって修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
以下のステップを含む、前記ポリヌクレオチドカセットに導入する前に前記アプタマーのライブラリをさらに小さなアプタマーライブラリに分割する、請求項１に記載の方法：
（ａ）無作為化アプタマーライブラリであって、前記ライブラリにおける前記アプタマーが複数の５’及び３’の定常領域と１以上の無作為化されたヌクレオチドとを含む、前記無作為化アプタマーライブラリを提供すること、
（ｂ）鋳型としての前記無作為化アプタマーライブラリと、前記５’及び３’の定常領域に相補的である第１のプライマーと第２のプライマーとを用いて２サイクルＰＣＲを行うこと、
（ｃ）前記２サイクルＰＣＲの産物を単離すること、及び
（ｄ）前記固有の５’及び３’の定常領域のサブセットに相補的であるプライマーを用いて２サイクルＰＣＲの単離された産物のサブセットをＰＣＲで増幅すること。
【請求項１８】
前記２サイクルＰＣＲにおける前記第１のプライマーまたは第２のプライマーが、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、蛍光色素分子、及びクリック化学で使用される化学基から成る群から選択される標識を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リボスイッチのライブラリが、前記真核細胞に導入される前にリボスイッチの１以上のサブライブラリに分割される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
以下のステップを含む、前記リボスイッチのライブラリをサブライブラリにさらに分割する、請求項１９に記載の方法：
（ａ）前記リボスイッチライブラリを細菌に導入すること、
（ｂ）細菌クローンを回収し、プラスミドＤＮＡを抽出してリボスイッチのプラスミドサブライブラリを得、１以上の一次サブライブラリを生成すること、
（ｃ）任意で、一次サブライブラリを細菌に導入し、細菌クローンを回収し、プラスミドＤＮＡを単離することによってリボスイッチの一次プラスミドサブライブラリからリボスイッチの二次サブライブラリを生成すること。
【請求項２１】
真核細胞にてアプタマーと結合するリガンドを選択する方法であって、
以下のステップ：
（ａ）リガンドのライブラリを提供することと、
（ｂ）レポーター遺伝子の発現であって前記リガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットを提供することと、
（ｃ）前記真核細胞に前記ポリヌクレオチドカセットを導入することと、
（ｄ）前記真核細胞の個々のグループをリガンドの前記ライブラリのメンバーに接触させることと、
（ｅ）前記レポーター遺伝子の発現を測定することとを含み、
前記ポリヌクレオチドカセットは、５’イントロン及び３’イントロンが隣接する選択的にスプライシングされるエキソンと、（ｉ）前記３’イントロンの５’スプライス部位を含むステムを含むエフェクター領域及び（ｉｉ）アプタマーを含むリボスイッチとを含み、
前記選択的にスプライシングされるエキソンは、前記選択的にスプライシングされるエキソンが前記レポーター遺伝子のｍＲＮＡにスプライシングされる際、前記レポーター遺伝子とインフレームである終止コドンを含む、前記方法。
【請求項２２】
前記リガンドが小分子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リガンドが前記真核細胞によって産生される分子である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リガンドが、代謝産物、核酸、ビタミン、補因子、脂質、単糖類及びセカンドメッセンジャーである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記真核細胞が哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞及び酵母細胞から成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼから成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記レポーター遺伝子が、サイトカイン、シグナル伝達分子、成長ホルモン、抗体、調節性ＲＮＡ、治療用のタンパク質またはペプチドから成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記レポーター遺伝子の前記発現が、前記リガンドが存在しない場合の前記レポーター遺伝子の発現レベルよりも、前記リガンドが特異的に前記アプタマーと結合する場合の方が約１０倍を超えて高い、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記５’及び３’イントロンが前記ヒトβ−グロビン遺伝子のイントロン２に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記５’及び３’のイントロンがそれぞれ独立して約５０〜約３００ヌクレオチドの長さである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記５’及び３’のイントロンがそれぞれ独立して約１２５〜約２４０ヌクレオチドの長さである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記エフェクター領域のステムが約７〜約２０塩基対の長さである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記エフェクター領域のステムが８〜１１塩基対の長さである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記選択的にスプライシングされるエキソンが、ヒトのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のエキソン２、変異体ヒトウィルムス腫瘍１のエキソン５、マウスのカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩデルタのエキソン１６及びＳＩＲＴ１のエキソン６から成る群に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記選択的にスプライシングされるエキソンが、ヒトＤＨＦＲに由来する修飾されたエクシン２である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記選択的にスプライシングされるエキソンが合成のものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記選択的にスプライシングされるエキソンが、エキソンスプライスエンハンサーの配列を変えること、エキソンスプライスサイレンサーの配列を変えること、エキソンスプライスエンハンサーを付加すること、及びエキソンスプライスサイレンサーを付加することから成る群の１以上によって修飾されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
以下のステップを含む、無作為化アプタマーライブラリをさらに小さなアプタマーサブライブラリに分ける方法：
（ａ）無作為化アプタマーライブラリであって、前記ライブラリにおける前記アプタマーが複数の５’及び３’の定常領域と１以上の無作為化したヌクレオチドとを含む、前記無作為化アプタマーライブラリを提供すること、
（ｂ）鋳型としての前記無作為化アプタマーライブラリと、前記５’及び３’の定常領域に相補的である第１のプライマーと第２のプライマーとを用いて２サイクルＰＣＲを行うこと、
（ｃ）前記２サイクルＰＣＲの産物を単離すること、及び
（ｄ）前記固有の５’及び３’の定常領域のサブセットに相補的であるプライマーを用いて前記２サイクルＰＣＲの前記単離された産物のサブセットをＰＣＲで増幅することと。
【請求項３９】
前記無作為化アプタマーライブラリが１以上の無作為化したヌクレオチドを有するアプタマーを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記無作為化アプタマーライブラリが約１００，０００を超えるアプタマーを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記無作為化アプタマーライブラリが約１，０００，０００を超えるアプタマーを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記２サイクルＰＣＲにおける第１のプライマーまたは第２のプライマーが、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、蛍光色素分子、及びクリック化学で使用される化学基から成る群から選択される標識を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜２０に記載の方法によって選択されるアプタマー。
【請求項４４】
請求項２１〜３７に記載の方法によって選択されるリガンド。
【請求項４５】
配列番号１４〜２７の配列を含む配列によってコードされるアプタマー。
【請求項４６】
配列番号２４を含む配列によってコードされるアプタマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レポーター遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットを用いて真核細胞にてリガンドと特異的に結合するアプタマーまたはアプタマーと特異的に結合するリガンドを特定するスクリーニング法を提供し、該ポリヌクレオチドカセットは５’イントロン−選択的エキソン−３’イントロンの背景でリボスイッチを含有する。リボスイッチは、アプタマーがリガンドと結合するとレポーター遺伝子の発現が生じるようにエフェクター領域とアプタマーとを含む。
【背景技術】
【０００２】
スプライシングは、イントロン配列が新生プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）から取り除かれ、エキソンが一緒に連結されてｍＲＮＡを形成する過程を指す。スプライス部位はエキソンとイントロンの間の接合部であり、イントロンの５’及び３’末端での異なるコンセンサス配列（すなわち、それぞれスプライスドナーとスプライスアクセプターの部位）によって定義される。選択的プレｍＲＮＡスプライシングまたは選択的スプライシングは複数のエキソンを含有するほとんどのヒト遺伝子にて存在する広範な過程である。それは、スプライソソームと呼ばれる大きな複数の成分の構造体によって実施され、スプライソソームは小型の核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）と多様な補助タンパク質の集まりである。種々のシス調節配列を認識することによって、スプライソソームはエキソン／イントロンの境界を規定し、イントロン配列を取り除き、エキソンを最終的な翻訳可能なメッセージ（すなわち、ｍＲＮＡ）に一緒にスプライスする。選択的スプライシングの場合、ある特定のエキソンが含められ、または排除されて最終的なコーディングメッセージを変化させ、それによって得られる発現タンパク質を変えることができる。
【０００３】
本発明は、選択的スプライシングのリガンド／アプタマーが介在する制御を利用して標的真核細胞の背景にて結合するアプタマー／リガンドのペアを特定する。本発明に先立って、試験管内スクリーニングを介して種々のリガンドに対してアプタマーが生成されているが、細胞にて有効であることが判明したものがほとんどなく、選択した生物にて機能するアプタマーをスクリーニングするシステムについてのニーズを強調している。
【発明の概要】
【０００４】
一態様では、本発明は、以下のステップ：
（ａ）アプタマーのライブラリを提供することと、
（ｂ）アプタマーのライブラリのメンバーを、レポーター遺伝子の発現であってリガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットに導入してリボスイッチのライブラリを作り出すことと、
（ｃ）リボスイッチのライブラリを真核細胞に導入することと、
（ｄ）該真核細胞をリガンドに接触させることと、
（ｅ）レポーター遺伝子の発現を測定することとを含む、真核細胞にてリガンドと結合するアプタマーを選択する方法を提供し、
その際、ポリヌクレオチドカセットは、５’イントロン及び３’イントロンが隣接する選択的にスプライシングされるエキソンと、（ｉ）３’イントロンの５’スプライス部位を含むステムを含むエフェクター領域及び（ｉｉ）アプタマーを含むリボスイッチとを含み、該選択的にスプライシングされるエキソンは、該選択的にスプライシングされるエキソンがレポーター遺伝子のｍＲＮＡにスプライシングされる際、レポーター遺伝子とインフレームである終止コドンを含む。
【０００５】
一実施形態では、アプタマーのライブラリは１以上の無作為化したヌクレオチドを有するアプタマーを含む。一実施形態では、アプタマーのライブラリは完全に無作為化した配列を有するアプタマーを含む。一実施形態では、アプタマーのライブラリは長さ約１５〜約２００ヌクレオチドであるアプタマーを含む。一実施形態では、アプタマーのライブラリは長さ約３０〜約１００ヌクレオチドの間であるアプタマーを含む。一実施形態では、アプタマーのライブラリは１００,０００を超えるアプタマーを含む。一実施形態では、アプタマーのライブラリは１，０００,０００を超えるアプタマーを含む。
【０００６】
一実施形態では、リガンドは小分子である。一実施形態では、小分子リガンドは真核細胞に対して外来性である。別の実施形態では、リガンドは、たとえば、代謝産物、核酸、ビタミン、補因子、脂質、単糖類及びセカンドメッセンジャーを含む、真核細胞によって産生される分子である。
【０００７】
一実施形態では、真核細胞は哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び酵母細胞から選択される。一実施形態では、真核細胞は、マウス、ヒト、ハエ（たとえば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、魚類（たとえば、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）または線虫（たとえば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）に由来する。
【０００８】
一実施形態では、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼから成る群から選択される。一実施形態では、レポーター遺伝子はサイトカイン、シグナル伝達分子、成長ホルモン、抗体、調節性ＲＮＡ、治療用タンパク質、またはペプチドである。一実施形態では、レポーター遺伝子の発現は、リガンドが存在しない場合のレポーター遺伝子の発現レベルよりもリガンドがアプタマーと特異的に結合する場合の方が約１０倍を超えて高い。さらなる実施形態では、レポーター遺伝子の発現は、リガンドが存在しない場合のレポーター遺伝子の発現レベルよりもリガンドがアプタマーと特異的に結合する場合の方が約２０、５０、１００、２００、５００、または１０００倍を超えて高い。
【０００９】
一実施形態では、５’及び３’イントロンはヒトβ−グロビン遺伝子のイントロン２に由来する。一実施形態では、５’イントロンは標的遺伝子とのインフレームで終止コドンを含む。一実施形態では、５’及び３’イントロンはそれぞれ独立して約５０〜約３００ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、５’及び３’イントロンはそれぞれ独立して約１２５〜約２４０ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、５’及び／または３’イントロンは修飾されて、イントロンスプライスエンハンサーの配列、イントロンスプライスエンハンサー、５’スプライス部位、３’スプライス部位、または分岐点配列を含んでいる、または変えている。
【００１０】
一実施形態では、リボスイッチのエフェクター領域ステムは約７〜約２０塩基対の長さである。一実施形態では、エフェクター領域ステムは８〜１１塩基対の長さである。
【００１１】
一実施形態では、選択的にスプライシングされるエキソンは、ヒトジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）のエキソン２、ヒト変異型ウィルムス腫瘍１のエキソン５、マウスのカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩデルタエキソン１６、またはＳＩＲＴ１のエキソン６に由来する。一実施形態では、選択的にスプライシングされるエキソンは修飾されたＤＨＦＲのエキソン２である。一実施形態では、選択的にスプライシングされるエキソンは、エキソンスプライシングサイレンサーの配列を変えること、エキソンスプライシングエンハンサーの配列を変えること、エキソンスプライシングエンハンサーを加えること、及びエキソンスプライスドナーを加えることから成る群の１以上において修飾されている。一実施形態では、選択的にスプライシングされるエキソンは合成である（すなわち、天然に存在するエキソンに由来しない）。
【００１２】
一実施形態では、アプタマーのライブラリは、ポリヌクレオチドカセットに導入する前に、さらに小さなアプタマーのライブラリに分割され、以下のステップを含む：
（ａ）ライブラリにおけるアプタマーが複数の５’及び３’定常領域と１以上の無作為化ヌクレオチドとを含む無作為化アプタマーライブラリを提供すること、
（ｂ）鋳型としての無作為化アプタマーライブラリと５’及び３’定常領域に対して相補的である第１のプライマーと第２のプライマーとを用いた２サイクルＰＣＲを行うこと、
（ｃ）２サイクルＰＣＲの産物を単離すること、及び
（ｄ）固有の５’及び３’定常領域のサブセットに対して相補的な複数のプライマーを用いて２サイクルＰＣＲの単離された産物のサブセットをＰＣＲ増幅すること。
【００１３】
一実施形態では、リボスイッチのライブラリは真核細胞に導入される前にリボスイッチの１以上のサブライブラリに分割される。一実施形態では、リボスイッチのライブラリをサブライブラリに分割する方法は、以下のステップを含む：
（ａ）遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットを含むプラスミドにアプタマーのライブラリを導入してリボスイッチライブラリを作製すること、
（ｂ）細菌（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ）にリボスイッチライブラリを導入すること、及び
（ｃ）細菌クローンを回収し（たとえば、細菌コロニーを摘み取ることによって）、プラスミドＤＮＡを抽出してリボスイッチのプラスミドサブライブラリ（本明細書では一次サブライブラリと呼ぶ）を得ること。
【００１４】
ある実施形態では、リボスイッチの二次サブライブラリは、一次サブライブラリを細菌に導入し、細菌クローンを回収し、プラスミドＤＮＡを単離することによってリボスイッチの一次プラスミドサブライブラリから生成される。次いで一次または二次のサブライブラリを真核細胞に導入し、真核細胞をリガンドに接触させ、レポーター遺伝子の発現を測定して、真核細胞の背景にてライブラリにおける１以上のアプタマーがリガンドと結合するかどうかを判定する。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、アプタマーが上記方法によって選択される、標的リガンドと結合するアプタマーを含む。本発明の実施形態では、アプタマーは配列番号１４〜２７の配列を含む。一実施形態では、アプタマー配列は配列番号２４の配列を含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は、以下のステップ：
（ａ）リガンドのライブラリを提供することと、
（ｂ）レポーター遺伝子の発現であってリガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットを提供することと、
（ｃ）真核細胞にポリヌクレオチドカセットを導入することと、
（ｄ）真核細胞の個々のグループをリガンドのライブラリのメンバーに接触させることと、
（ｅ）レポーター遺伝子の発現を測定することとを含む、真核細胞にてアプタマーと結合するリガンドを選択する方法を提供し、
その際、ポリヌクレオチドカセットは、５’イントロン及び３’イントロンが隣接する選択的にスプライシングされるエキソンと、（ｉ）３’イントロンの５’スプライス部位を含むステムを含むエフェクター領域及び（ｉｉ）アプタマーを含むリボスイッチとを含み、選択的にスプライシングされるエキソンは、選択的にスプライシングされるエキソンがレポーター遺伝子のｍＲＮＡにスプライシングされる際、レポーター遺伝子とのインフレームである終止コドンを含む。
【００１７】
一実施形態では、リガンドは小分子である。一実施形態では、小分子リガンドは真核細胞に対して外来性である。別の実施形態では、リガンドは、たとえば、代謝産物、核酸、ビタミン、補因子、脂質、単糖類及びセカンドメッセンジャーを含む、真核細胞によって産生される分子である。
【００１８】
一実施形態では、真核細胞は哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び酵母細胞から選択される。一実施形態では、真核細胞は、マウス、ヒト、ハエ（たとえば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、魚類（たとえば、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）または線虫（たとえば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）に由来する。
【００１９】
一実施形態では、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼから成る群から選択される。一実施形態では、レポーター遺伝子はサイトカイン、シグナル伝達分子、成長ホルモン、抗体、調節性ＲＮＡ、治療用タンパク質、またはペプチドである。一実施形態では、レポーター遺伝子の発現は、リガンドが存在しない場合のレポーター遺伝子の発現レベルよりもリガンドがアプタマーと特異的に結合する場合の方が約１０倍を超えて高い。さらなる実施形態では、レポーター遺伝子の発現は、リガンドが存在しない場合のレポーター遺伝子の発現レベルよりもリガンドがアプタマーと特異的に結合する場合の方が約２０、５０、１００、２００、５００、または１０００倍を超えて高い。
【００２０】
一実施形態では、５’及び３’イントロンはヒトβ−グロビン遺伝子のイントロン２に由来する。一実施形態では、５’イントロンは標的遺伝子とのインフレームで終止コドンを含む。一実施形態では、５’及び３’イントロンはそれぞれ独立して約５０〜約３００ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、５’及び３’イントロンはそれぞれ独立して約１２５〜約２４０ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、５’及び／または３’イントロンは修飾されて、イントロンスプライスエンハンサー、エキソンスプライスエンハンサーの配列、５’スプライス部位、３’スプライス部位、または分岐点配列を含んでいる、または変えている。
【００２１】
一実施形態では、リボスイッチのエフェクター領域ステムは約７〜約２０塩基対の長さである。一実施形態では、エフェクター領域ステムは８〜１１塩基対の長さである。
【００２２】
一実施形態では、選択的にスプライシングされるエキソンは、ヒトジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）のエキソン２、ヒト変異型ウィルムス腫瘍１のエキソン５、マウスのカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩデルタエキソン１６、またはＳＩＲＴ１のエキソン６に由来する。一実施形態では、選択的にスプライシングされるエキソンは修飾されたＤＨＦＲのエキソン２である。一実施形態では、選択的にスプライシングされるエキソンは、エキソンスプライシングサイレンサーの配列を変えること、エキソンスプライシングエンハンサーの配列を変えること、エキソンスプライシングエンハンサーを加えること、及びエキソンスプライスドナーを加えることから成る群の１以上において修飾されている。一実施形態では、選択的にスプライシングされるエキソンは合成である（すなわち、天然に存在するエキソンに由来しない）。
【００２３】
一実施形態では、本発明は上記方法によって選択されるリガンドを含む。
【００２４】
別の態様では、本発明は、以下のステップを含む、無作為化アプタマーライブラリをさらに小さなアプタマーのサブライブラリに分ける方法を提供する：
（ａ）ライブラリにおけるアプタマーが複数の５’及び３’定常領域と１以上の無作為化ヌクレオチドとを含む無作為化アプタマーライブラリを提供すること、
（ｂ）鋳型としての無作為化アプタマーライブラリと５’及び３’定常領域に対して相補的である第１のプライマーと第２のプライマーとを用いて２サイクルＰＣＲを行うこと、
（ｃ）２サイクルＰＣＲの産物を単離すること、及び
（ｄ）固有の５’及び３’定常領域のサブセットに対して相補的なプライマーを用いて２サイクルＰＣＲの単離された産物のサブセットをＰＣＲ増幅すること。
【００２５】
一実施形態では、無作為化アプタマーライブラリは１以上の無作為化ヌクレオチドを有するアプタマーを含む。一実施形態では、無作為化アプタマーライブラリは約１００，０００を超えるアプタマーを含む。一実施形態では、無作為化アプタマーライブラリは約１，０００，０００を超えるアプタマーを含む。
【００２６】
一実施形態では、２サイクルＰＣＲにおける第１または第２のプライマーは、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、蛍光色素分子、化学基、たとえば、チオール基、またはクリック化学で使用される化学基、たとえば、アジドから成る群から選択される標識を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１ａ】リボスイッチ構築物の模式図である。切り詰めたベータグロビンのイントロン配列をレポーター遺伝子のコーディング配列に挿入し、変異体の終止コドン含有ＤＨＦＲエキソン２（ｍＤＨＦＲ）を挿入したイントロンに配置し、従ってｍＤＨＦＲエキソンの包含／排除によってレポーター遺伝子の発現が調節される３つのエキソン遺伝子の発現プラットフォームを形成した。Ｕ１結合部位に相補的な操作した配列と共にｍＤＨＦＲエキソンのイントロンの下流（３’）にてＵ１結合部位を含むヘアピン／ステム構造を形成し、それはＵ１の結合を阻止し、それによって終止コドンを含有するｍＤＨＦＲエキソンと標的遺伝子発現の排除をもたらす。アプタマー配列はＵ１結合部位とその相補的配列との間に移植され、アプタマー／リガンドの結合によってヘアピン形成の制御を可能とする。
【図１ｂ】様々なアプタマーに基づくリボスイッチを含有するポリヌクレオチドカセットによる構築物の用量反応を示す図である。グアニンリボスイッチは、グアニン処理だけでなくグアノシン処理にも応答することによってレポーター遺伝子の発現を誘導した。
【図１ｃ】ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチがグアニン類似体による処理の際、ルシフェラーゼ活性を誘導することを示すグラフである。
【図１ｄ】ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチがグアニン類似体による処理の際、ルシフェラーゼ活性を誘導することを示すグラフである。
【図１ｅ】化合物による処理の際のｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチによるルシフェラーゼ活性の誘導倍率を示す図である。
【図２】無作為化アプタマー配列を生成するための鋳型の模式図である。アプタマー配列（白棒）には定常領域（黒棒）が隣接し、それはＢｓａＩ部位を含有して遺伝子調節カセットへのアプタマーのクローニングを円滑にし、リボスイッチを生成する。
【図３ａ】大きな無作為化アプタマーライブラリをさらに小さなサブライブラリに分ける方法の模式図。大きなアプタマーライブラリを分けるための２ステップ戦略の模式図である。第１のステップは、各アプタマーのオリゴヌクレオチド鋳型に配列タグの固有のペアを付加することである。第１のステップに続いて、タグ付き配列に特異的であるプライマーを用いて固有のタグ配列を持つ鋳型を増幅する。
【図３ｂ】大きな無作為化アプタマーライブラリをさらに小さなサブライブラリに分ける方法の模式図。鋳型にタグ配列を連結する３つのアプローチ：（Ｉ）プライマーの５’末端でタグ配列を含有するプライマーを用いたＰＣＲを介して組み込まれるタグ配列；（ＩＩ）Ｔ４ＲＮＡリガーゼによる一本鎖鋳型配列の一本鎖タグ配列とのライゲーションによって連結されるタグ配列；（ＩＩＩ）Ｔ４ＲＮＡリガーゼによる二本鎖鋳型配列の二本鎖タグ配列とのライゲーションによって鋳型に連結されるタグ配列を示す図である。
【図３ｃ】大きな無作為化アプタマーライブラリをさらに小さなサブライブラリに分ける方法の模式図。２サイクルＰＣＲの模式図である。サイクル１については、５’末端でタグ配列を含有する逆行プライマーＪＲのみ。第１のサイクルの後、新しく合成された鎖はその５’末端で配列タグを有する。サイクル２については、ビオチン標識した順行プライマーＪＦをＰＣＲ反応に加え、それは新しく合成された鎖のみを鋳型として使用することができる、従って５’及び３’末端双方でタグ配列を有し、５’末端でビオチン分子を有する鋳型を生成する。
【図３ｄ】大きな無作為化アプタマーライブラリをさらに小さなサブライブラリに分ける方法の模式図。タグ付きアプタマーライブラリの生成を示す図である。配列タグ及びビオチン分子で鋳型を標識した後、ストレプトアビジン・ビーズを用いて、オリゴの変性及びビーズの洗浄を介して反応成分の残りから標識され／タグ付けされた一本鎖鋳型を分離する。次いで、タグ付き配列に特異的であるプライマー（Ｆ及びＲプライマー）の混合物を用いてタグ付き鋳型を増幅し、拡張し、従ってタグ配列に特異的なプライマーの単一ペアを用いたその後のＰＣＲにすぐ使えるタグ付きアプタマーライブラリを生成し、元々のアプタマーライブラリのサブライブラリを生成する。
【図３ｅ】大きな無作為化アプタマーライブラリをさらに小さなサブライブラリに分ける方法の模式図。分割戦略を用いてアプタマーのサブライブラリをＰＣＲ増幅することを示す図である。２つの順行プライマー（ＪＦ１〜２）及び８つの逆行プライマー（ＪＲ１〜８）用い、１、２．３または４．６の鋳型コピー数でのＰＣＲによってアプタマーライブラリ（１０６、実施例２で生成された）にタグ付けを行った。単離されたタグ付き鋳型をタグ特異的なプライマーＦ１〜２及びＲ１〜８の混合物によって拡張し、ＰＣＲ産物をユニバーサルプライマー（左のパネル）、タグ特異的なプライマーＦ１及びＲ１の単一ペア（真ん中のパネル）、またはＦ３及びＲ１の無関係なプライマーの単一ペア（右のパネル）のいずれかによるＰＣＲに供した。鋳型についてのブランク対照として水を使用した。
【図４】リボスイッチライブラリのスクリーニングについての細胞系アッセイの感度試験を示す図である。構築物ｘｐｔ−Ｇ１７を構築物ＳＲ−ｍｕｔと様々な分子比で混合し、混合した構築物ＤＮＡをＨＥＫ−２９３細胞に形質移入し、グアニンで処理した。グアニン処理をしないで得られたルシフェラーゼ活性で割ったグアニンによって誘導されたルシフェラーゼ活性としてルシフェラーゼ活性の誘導倍率を算出した。
【図５ａ】リボスイッチを含有するプラスミドライブラリの構築の模式図である。ユニバーサルプライマーを用いて先ず、一本鎖アプタマーのオリゴをＰＣＲ増幅して一本鎖アプタマー鋳型を二本鎖に変換する。次いで二本鎖オリゴをＢｓａＩで消化し、ＢｓａＩ消化したベクターにライゲーションしてリボスイッチを伴った構築物を生成する。次いで電気的に適格なＤＨ５ａ細胞にエレクトロポレーションによってプラスミドＤＮＡを導入する。５×１０６個を超えるコロニーが回収され、当初のアプタマーライブラリ（１０６）の９９％を超えるものを対象とする。
【図５ｂ】リボスイッチのプラスミドライブラリをサブライブラリに分ける模式図である。リボスイッチのプラスミドライブラリで化学的に適格なＤＨ５ａ細胞を形質転換する。次いで形質転換した細菌を寒天プレートに播く。各個々の寒天プレートからある特定の数の細菌コロニーを回収し、個々のコロニーの回収物からプラスミドＤＮＡを別々に抽出する。コロニーの各回収物から得られたプラスミドＤＮＡはリボスイッチのサブライブラリを形成する。所望のサイズのサブライブラリが達成されるまで分割アプローチを繰り返すことができる。
【図５ｃ】次世代配列決定法によって決定されたリボスイッチの二次サブライブラリの固有の配列組成を示す図である。配列決定行程１２を超える読み取りのあった配列が真の配列と見なされた。
【図５ｄ】同一の一次サブライブラリＰ１Ｓ＿００３から生成されている２つの二次サブライブラリ間での固有の配列組成の比較を示す図である。円グラフは、各サブライブラリにおける固有の配列の数及びリボスイッチの２つのライブラリ間で重複する配列の数を示す。
【図５ｅ】それぞれ、異なる一次サブライブラリＰ１Ｓ＿００３及びＰ１Ｓ＿００７から生成されている２つの二次サブライブラリ間での固有の配列組成の比較を示す図である。円グラフは、各サブライブラリにおける固有の配列の数及びリボスイッチの２つのライブラリ間で重複する配列の数を示す。
【図６ａ】１００の一次サブライブラリ（６０ｋ）のうち６に由来するプラスミドＤＮＡを９６穴プレートの形式で並べ、ＨＥＫ−２９３細胞に形質移入した。グアニン処理をしないで得られたルシフェラーゼ活性で割ったグアニンによって誘導されたルシフェラーゼ活性としてルシフェラーゼ活性の誘導倍率を算出した。
【図６ｂ】１００の二次サブライブラリ（６００のサイズ）に由来するプラスミドＤＮＡを９６穴プレートの形式で並べ、ＨＥＫ−２９３細胞に形質移入した。グアニン処理をしないで得られたルシフェラーゼ活性で割ったグアニンによって誘導されたルシフェラーゼ活性としてルシフェラーゼ活性の誘導倍率を算出した。
【図６ｃ】リガンドとしてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を用いたリボスイッチのサブライブラリのスクリーニング結果を示す図である。Ｐ２リボスイッチライブラリのサブライブラリを９６穴形式で並べた。ＨＥＫ−２９３細胞を９６穴プレートに播き、リボスイッチライブラリのＤＮＡで形質移入した。形質移入の４時間後、細胞を１００μＭのＮＡＤ＋で処理した。ＮＡＤ＋処理の２０時間後ルシフェラーゼ活性を測定した。ＮＡＤ＋処理しないで細胞から得られたルシフェラーゼ活性で割ったＮＡＤ＋で処理した細胞から得られたルシフェラーゼ活性の比として誘導倍率を算出した。点プロットにおける各点は、示されるようなサブライブラリまたはＧ１７構築物からの誘導倍率を表す。
【図６ｄ】リガンドとしてＮＡＤ＋を用いたリボスイッチのスクリーニング結果を示す図である。各個々のリボスイッチ構築物を９６穴形式に並べた。ＨＥＫ−２９３細胞を９６穴プレートに播き、リボスイッチ構築物で形質移入した。形質移入の４時間後、細胞を１００μＭのＮＡＤ＋で処理した。ＮＡＤ＋処理の２０時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ＮＡＤ＋処理しないで細胞から得られたルシフェラーゼ活性で割ったＮＡＤ＋で処理した細胞から得られたルシフェラーゼ活性の比として誘導倍率を算出した。点プロットにおける各点は、示されるようなリボスイッチ構築物またはＧ１７構築物からの誘導倍率を表す。
【図６ｅ】新しいアプタマー配列を持つ構築物は、Ｇ１７リボスイッチと比べてＮＡＤ＋処理に対して用量依存的に高い反応を示すことを示す図である。Ｇ１７または新しいアプタマー配列を持つ構築物＃４６でＨＥＫ−２９３細胞に形質移入した。形質移入の４時間後、細胞を様々な用量のＮＡＤ＋で処理した。ＮＡＤ＋処理の２０時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図６ｆ】新しいアプタマー配列を持つ構築物は、Ｇ１７リボスイッチと比べてＮＡＤ＋処理に対して用量依存的に高い反応を示すことを示す図である。Ｇ１７または新しいアプタマー配列を持つ構築物＃４６でＨＥＫ−２９３細胞に形質移入した。形質移入の４時間後、細胞を様々な用量のＮＡＤ＋で処理した。ＮＡＤ＋処理の２０時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ＮＡＤ＋処理しないで細胞から得られたルシフェラーゼ活性で割ったＮＡＤ＋で処理した細胞から得られたルシフェラーゼ活性の比として誘導倍率を算出した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
アプタマー／リガンドをスクリーニングする方法
本発明は、真核性の細胞、組織または生物の背景でリガンドに結合するアプタマー、及びアプタマーに結合するリガンドを特定するスクリーニング法を提供する。一態様では、本発明は、以下のステップを含む、真核細胞にてリガンドと結合するアプタマーを選択する方法を提供する：
（ａ）アプタマーのライブラリを提供すること、
（ｂ）レポーター遺伝子の発現であってリガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットにアプタマーのライブラリのメンバーを導入すること、
（ｃ）真核細胞にアプタマーを含有するポリヌクレオチドカセットを導入すること、
（ｄ）真核細胞をリガンドに接触させること、及び
（ｅ）レポーター遺伝子の発現を測定すること。
【００２９】
別の態様では、本発明は、以下のステップを含む、真核細胞にてアプタマーと結合するリガンドを選択する方法を提供する：
（ａ）リガンドのライブラリを提供すること、
（ｂ）レポーター遺伝子の発現であってリガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットを提供すること、
（ｃ）真核細胞にポリヌクレオチドカセットを導入すること、
（ｄ）真核細胞の個々の基をリガンドのライブラリのメンバーに接触させること、及び
（ｅ）レポーター遺伝子の発現を測定すること。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、以下のステップを含む、細胞内分子に結合するアプタマーを特定する方法を提供する：
（ａ）アプタマーのライブラリを提供すること、
（ｂ）レポーター遺伝子の発現であってリガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットにアプタマーのライブラリのメンバーを導入すること、
（ｃ）アプタマーを含有するポリヌクレオチドカセットを真核細胞に導入すること、及び
（ｄ）レポーター遺伝子の発現を測定すること。
【００３１】
本発明のスクリーニング法は、参照によって全体が本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１６２３４にて開示された遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットを利用する。これらの遺伝子調節カセットは、５’イントロン−選択的エキソン−３’イントロンの背景でリボスイッチを含む。遺伝子調節カセットは、標的遺伝子（たとえば、レポーター遺伝子）のＤＮＡに組み込まれると、得られるプレｍＲＮＡのアプタマー／リガンドが介在する選択的スプライシングによって標的遺伝子の発現を調節する能力を提供する組換えＤＮＡ構築物を指す。遺伝子調節カセットはさらに、アプタマーと結合するリガンドの存在を検知すること及び選択的エキソンへのスプライシングを変えることに一緒に関与するセンサー領域（たとえば、アプタマー）とエフェクター領域とを含有するリボスイッチを含む。これらのアプタマー主導のリボスイッチは、アプタマーと結合するリガンドによる処理に応答して２〜２０００倍の誘導で哺乳類の遺伝子発現の調節を提供する。この合成リボスイッチの無類の高いダイナミックレンジの調節を本発明の方法で使用して、細胞、組織及び生物における所望の種類のリガンドに対する新しいアプタマーならびに既知の及び新規のアプタマーに対する最適なリガンドについてのスクリーニングシステムを提供する。
【００３２】
リボスイッチ
「リボスイッチ」という用語は本明細書で使用されるとき、ＲＮＡポリヌクレオチド（またはＲＮＡポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ）の調節性セグメントを指す。本発明の文脈でのリボスイッチは、リガンド（たとえば、小分子）の存在を検知すること及び選択的エキソンへのスプライシングを変えることに一緒に関与するセンサー領域（たとえば、アプタマー）とエフェクター領域とを含有する。一実施形態では、リボスイッチは、２以上の供給源に由来するポリヌクレオチドを利用する、組換え体である。「合成の」という用語はリボスイッチの文脈にて本明細書で使用されるとき、天然に存在しないリボスイッチを指す。一実施形態では、センサー領域及びエフェクター領域はポリヌクレオチドのリンカーによって連結される。一実施形態では、ポリヌクレオチドのリンカーはＲＮＡステム（すなわち、二本鎖であるＲＮＡポリヌクレオチドの領域）を形成する。
【００３３】
本明細書に記載されているようなリボスイッチのライブラリは、レポーター遺伝子の発現であってリガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットの背景で１以上のヌクレオチドが異なる複数のアプタマー配列を含む。従って、ライブラリにおける各アプタマーはセンサー領域と共に、本明細書に記載されているような５’イントロン−選択的エキソン−３’イントロンという状況下にある。
【００３４】
エフェクター領域
一実施形態では、エフェクター領域は３’イントロンの５’スプライス部位（「５’ｓｓ」）配列（すなわち、選択的エキソンのすぐそばの３’であるイントロンスプライス部位配列）を含む。エフェクター領域は３’イントロンの５’ｓｓ配列と３’イントロンの５’ｓｓ配列に対して相補的な配列とを含む。アプタマーがそのリガンドと結合すると、エフェクター領域はステムを形成し、従って選択的エキソンの３’末端でのスプライスドナー部位へのスプライシングを妨げる。ある特定の条件下では（たとえば、アプタマーがそのリガンドに結合しない場合）、エフェクター領域は選択的エキソンの３’末端でのスプライスドナー部位へのアクセスを提供するという状況下にあり、標的遺伝子ｍＲＮＡにおける選択的エキソンの包含につながる。
【００３５】
エフェクター領域のステム部分は、リガンドがアプタマーと結合する際、選択的エキソンの選択的スプライシングを実質的に妨げるのに十分な長さ（及びＧＣ含量）であるべきである一方で、リガンドが十分な量で存在しない場合スプライス部位へのアクセスも可能とすべきである。本発明の実施形態では、エフェクター領域のステム部分は３’イントロンの５’ｓｓ配列及びその相補的配列に加えてステム配列を含む。本発明の実施形態では、この追加のステム配列はアプタマーのステムに由来する配列を含む。ステム部分の長さ及び配列は、リガンドが存在しない場合、標的遺伝子の許容できるバックグラウンド発現を可能とし、且つリガンドが存在する場合、標的遺伝子の許容できる発現レベルを可能とするステムを特定するために、既知の技法を用いて修飾することができる。ステムが、たとえば、長すぎるのであれば、それはリガンドの存在下または非存在下で３’イントロンの５’ｓｓ配列へのアクセスを隠し得る。ステムが短すぎるのであれば、それは、３’イントロンの５’ｓｓ配列を隔離することができる安定なステムを形成し得ず、その場合、選択的エキソンはリガンドの存在下または非存在下で標的遺伝子のメッセージにスプライシングされるであろう。一実施形態では、エフェクター領域ステムの全長は約７塩基対〜約２０塩基対の間である。一部の実施形態では、ステムの長さは約８塩基対〜約１１塩基対の間である。一部の実施形態では、ステムの長さは８塩基対〜１１塩基対である。ステムの長さに加えて、ステムのＧＣ塩基対の内容を変化させてステムの安定性を修正することができる。
【００３６】
アプタマー／リガンド
「アプタマー」という用語は本明細書で使用されるとき、リガンドに特異的に結合するＲＮＡポリヌクレオチド（またはＲＮＡポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ）またはリガンドへの特異的な結合（すなわち、予想されるアプタマー）を特定するためにスクリーニングされているＲＮＡポリヌクレオチドを指す。アプタマーのライブラリは、ライブラリの他のメンバーとは少なくとも１つのヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を有する複数の予想されるアプタマーを含む予想されるアプタマーの集まりである。
【００３７】
「リガンド」という用語は、アプタマーによって特異的に結合される分子、または１以上のアプタマーに結合する能力についてスクリーニングされている予想されるリガンドを指す。リガンドのライブラリはリガンド及び／または予想されるリガンドの集まりである。
【００３８】
一実施形態では、リガンドは、たとえば、脂質、単糖類、セカンドメッセンジャー、補因子、金属イオン、他の天然の産物及び代謝産物、核酸、ならびに大半の治療薬を含む、低分子量（約１，０００ダルトン未満）の分子である。一実施形態では、リガンドは２以上のヌクレオチド塩基を伴うポリヌクレオチドである。
【００３９】
一実施形態では、リガンドは、８−アザグアニン、アデノシン５’一リン酸一水和物、アンフォテリシンＢ、アベルメクチンＢ１、アザチオプリン、酢酸クロルマジノン、メルカプトプリン、モリシジン塩酸塩、Ｎ６−メチルアデノシン、ナダイド、プロゲステロン、プロマジン塩酸塩、ピルビニウムパモ酸塩、スルファグアニジン、テストステロンプロピオン酸塩、チオグアノシン、チロキサポール及びボリノスタットから成る群から選択される。
【００４０】
ある特定の実施形態では、本発明の方法を用いて、ポリヌクレオチドカセットにてアプタマーに結合して、それによってレポーター遺伝子の発現を生じる細胞内分子であるリガンド（すなわち、内在性リガンド）を特定する。たとえば、アプタマー／リガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットを含有するレポーター遺伝子を伴った細胞を、たとえば、熱、増殖、形質転換または突然変異のような条件に曝露して、アプタマーに結合し、レポーター遺伝子の発現を引き起こすことができる細胞のシグナル伝達分子、代謝産物、ペプチド、脂質、イオン（たとえば、Ｃａ２＋）等での変化をもたらすことができる。従って、本発明の方法を用いて、たとえば、細胞のシグナル伝達、細胞の代謝または細胞内での突然変異における変化を含む細胞の状態での変化に応答して細胞内リガンドに結合するアプタマーを特定することができる。別の実施形態では、本発明を用いて、分化した細胞に存在する細胞内リガンドと結合するアプタマーを特定する。たとえば、本発明の方法を用いて、人工多能性幹細胞に存在するリガンドまたはリガンドと結合するアプタマーを特定してもよい。一実施形態では、本発明の方法を用いて、生体内での細胞分化、または生体内での細胞の生理的変化に対する応答をスクリーニングすることができる。
【００４１】
アプタマーリガンドはまた、たとえば、発癌性形質転換のような特定の生理的な／病的な条件下で有意に増加する細胞内在性の成分であることもでき、それらには、たとえば、ＧＴＰまたはＧＤＰ、カルシウムのようなセカンドメッセンジャー分子；脂肪酸、または乳癌における１３−ＨＯＤＥのような間違って代謝されている脂肪酸（参照によって本明細書に組み入れられるＦｌａｈｅｒｔｙ，ＪＴ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．８，ｅ６３０７６，２０１３，）；アミノ酸またはアミノ酸代謝産物；癌細胞または代謝性疾患の正常細胞にて普通高レベルを有する解糖経路における代謝産物；及び、たとえば、Ｒａｓまたは変異体Ｒａｓタンパク質、肺癌における変異体ＥＧＦＲ、多数の種類のがんにおけるインドールアミン−２,３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）のような癌関連分子が挙げられてもよい。内在性のリガンドにはＪＰ．，Ｗｉｅｂｅ（参照によって本明細書に組み入れられるＥｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ，（２００６），１３：７１７−７３８）によって開示されたような乳癌におけるプロゲステロン代謝産物が挙げられる。内在性リガンドにはまた、Ｍｉｎｔｏｎ，ＤＲ及びＮａｎｕｓ，ＤＭ（参照によって本明細書に組み入れられるＮａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２，２００５）によって開示されたような、たとえば、乳酸塩、グルタチオン、キヌレニンのような腎臓癌における重要な代謝酵素の突然変異から生じる高レベルでの代謝産物も挙げられる。
【００４２】
リガンドへのアプタマーの結合の特異性は、無関係な分子についてのアプタマーの解離定数と比べたそのリガンドについてのアプタマーの相対的な解離定数（Ｋｄ）という点で定義することができる。従って、リガンドは無関係な物質よりも高い親和性でアプタマーに結合する分子である。通常、そのリガンドに関するアプタマーについてのＫｄは無関係な分子とのアプタマーのＫｄよりも少なくとも約１０倍小さいであろう。他の実施形態では、Ｋｄは少なくとも約２０倍小さい、少なくとも約５０倍小さい、少なくとも約１００倍小さい、少なくとも約２００倍小さいであろう。アプタマーは通常、約１５〜約２００ヌクレオチドの間の長さであろう。さらに一般的には、アプタマーは約３０〜約１００ヌクレオチドの間の長さであろう。
【００４３】
リボスイッチの一部として組み込むことができ、本発明の方法によってスクリーニングすることができるアプタマーは、天然に存在するアプタマー、またはその修飾体、または指数関数的増加によるリガンドの系統的展開（ＳＥＬＥＸ）を介して新たに設計されるもしくは合成スクリーニングされるアプタマーであることができる。小分子リガンドと結合するアプタマーの例には、テオフィリン、ドーパミン、スルホローダミンＢ、及びセロビオースカナマイシンＡ、リビドマイシン、トブラマイシン、ネオマイシンＢ、ビオマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、サイトカイン、細胞表面分子、及び代謝産物が挙げられるが、これらに限定されない。小分子を認識するアプタマーの概説については、たとえば、Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，９：３２４−９（１９９９）ならびにＭｃＫｅａｇｕｅ，Ｍ．及びＤｅＲｏｓａ，Ｍ．Ｃ．Ｊ．Ｎｕｃ．Ａｃｉ．２０１２を参照のこと。別の実施形態では、アプタマーは相補的なポリヌクレオチドである。
【００４４】
一実施形態では、アプタマーは試験管内で特定の小分子リガンドと結合するように予備スクリーニングされる。アプタマーを設計するためのそのような方法には、たとえば、ＳＥＬＥＸが挙げられる。ＳＥＬＥＸを用いて小分子を選択的に結合するアプタマーを設計する方法は、たとえば、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，２７０，１６３号及びＡｂｄｕｌｌａｈ，Ｏｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉ．２０１４にて開示されている。ＳＥＬＥＸプロセスの改変は、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，５８０，７３７号及び同第５，５６７，５８８号に記載されている。
【００４５】
アプタマーを特定するための以前の選択法には、無作為化されるまたは変異を起こさせる領域を含有する所望の長さのＤＮＡまたはＲＮＡ分子の大きなプールを調製することが一般に関与する。たとえば、アプタマー選択のためのオリゴヌクレオチドのプールは、長さ約１５〜２５ヌクレオチドであり、ＰＣＲプライマーの結合に有用である定義された配列の領域が隣接する２０〜１００の無作為化ヌクレオチドの領域を含有し得る。オリゴヌクレオチドのプールは標準のＰＣＲ法、または選択された核酸配列を増幅できる他の手段を用いて増幅される。ＤＮＡプールは、ＲＮＡアプタマーが所望である場合、試験管内で転写されてＲＮＡ転写物のプールを生じてもよい。次いで、ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドのプールは、所望のリガンドに特異的に結合するその能力に基づいた選択に供される。選択法には、たとえば、アフィニティクロマトグラフィが挙げられるが、別の分子に特異的に結合するその能力に基づいた核酸の選択を可能とするプロトコールが使用されてもよい。小分子と結合し、且つ細胞内で機能するアプタマーを特定するための選択法には細胞に基づくスクリーニング法が関与してもよい。アフィニティクロマトグラフィの場合、オリゴヌクレオチドをカラムにおける基質に、または磁気ビーズに固定化されている標的リガンドに接触させる。オリゴヌクレオチドは好ましくは、正常な生理的条件を模倣する塩濃度、温度及び他の条件の存在下でリガンド結合について選択される。リガンドに結合するプールにおけるオリゴヌクレオチドはカラムまたはビーズに保持され、非結合配列は洗い流される。次いで、リガンドと結合するオリゴヌクレオチドがＰＣＲによって（普通、溶出後）（ＲＮＡ転写物が利用された場合、逆転写の後）増幅される。選択過程は、選択手順の約３〜１０回の合計反復回数について選択した配列にて繰り返される。次いで、得られたオリゴヌクレオチドは標準の手順を用いて増幅され、クローニングされ、配列決定されて、標的リガンドと結合することができるオリゴヌクレオチドの配列を特定する。いったんアプタマー配列が特定されると、アプタマーは、突然変異を起こしたアプタマー配列を含むオリゴヌクレオチドのプールから出発する追加の回数の選択を行うことによってさらに最適化されてもよい。
【００４６】
一実施形態では、本発明での使用のためのアプタマーまたはアプタマーライブラリは試験管内のアプタマーの選別で特定された１以上のアプタマーを含む。一実施形態では、試験管内のアプタマーの選別で特定されたアプタマーは、本発明の方法で使用するための予想されるアプタマーライブラリを作り出すように無作為化された１以上のヌクレオチドを有する。
【００４７】
選択的エキソン
本発明の遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットの一部である選択的エキソンは、プレｍＲＮＡに転写されることができ、標的遺伝子のｍＲＮＡに選択的にスプライシングされることができるポリヌクレオチド配列であることができる。本発明の遺伝子調節カセットの一部である選択的エキソンは、選択的エキソンが標的遺伝子のｍＲＮＡに含まれる場合、そのｍＲＮＡからの標的遺伝子の発現が妨げられるまたは低減されるように翻訳を抑制する少なくとも１つの配列を含有する。好ましい実施形態では、選択的エキソンがスプライシングによって標的遺伝子のｍＲＮＡに含まれる場合、選択的エキソンは、標的遺伝子とのインフレームである終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）を含有する。ある実施形態では、選択的エキソンがスプライシングによって標的遺伝子のｍＲＮＡに組み込まれ、たとえば、ｍＲＮＡの分解を招くマイクロＲＮＡ結合部位を含む場合、選択的エキソンは、終止コドンに加えて、または終止コドンの代替として、翻訳を低減するまたは実質的に妨げる他の配列を含む。一実施形態では、選択的エキソンは、ｍＲＮＡの分解を生じるｍｉＲＮＡ結合配列を含む。一実施形態では、選択的エキソンは、ポリペプチド配列をコードし、その配列は、このポリペプチド配列を含有するタンパク質の安定性を低減する。一実施形態では、選択的エキソンは、このポリペプチド配列を含有するタンパク質を分解に向けるポリペプチド配列をコードする。
【００４８】
選択的エキソンのスプライシングの基本レベルまたはバックグラウンドレベルは、エキソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）配列及びエキソンスプライスサプレッサー（ＥＳＳ）配列を変えることによって及び／または選択的エキソンにＥＳＥもしくはＥＳＳの配列を導入することによって最適化することができる。選択的エキソンの配列に対するそのような変化は、部位特異的変異誘発を含むが、これらに限定されない当該技術で既知の方法を用いて達成することができる。或いは、所望の配列（たとえば、選択的エキソンの全部または一部を含む）のオリゴヌクレオチドは、商業的供給源から入手し、遺伝子調節カセットにクローニングすることができる。ＥＳＳ及びＥＳＥの配列の特定は、たとえば、ＥＳＥｆｉｎｄｅｒ３．０（Ｃａｒｔｅｇｎｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．ＥＳＥｆｉｎｄｅｒ：ａ  ｗｅｂ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｅｘｏｎｉｃ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，３１（１３）：３５６８−３５７１）及び／または他の利用できる援助を含む当該技術で既知の方法を用いて達成することができる。
【００４９】
一実施形態では、選択的エキソンは標的遺伝子に対して外来性であるが、選択的エキソンは標的遺伝子が発現されるであろう生物を起源とする配列に由来してもよい。一実施形態では、選択的エキソンは合成配列である。一実施形態では、選択的エキソンは天然に存在するエキソンである。別の実施形態では、選択的エキソンは既知のエキソンの全部または一部に由来する。この文脈で、「由来する」は、天然に存在するエキソンまたはその一部に実質的に相同であるが、種々の突然変異を含有して、たとえば、標的レポーター遺伝子配列とインフレームであろう終止コドンを導入してもよく、またはエキソンスプライスエンハンサーを導入するもしくは欠失してもよく、及び／またはエキソンスプライスサプレッサーを導入するもしくは欠失してもよい配列を含有する選択的エキソンを指す。一実施形態では、選択的エキソンは、ヒトのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）のエキソン２、ヒト変異体ウィルムス腫瘍１のエキソン５、マウスのカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩデルタのエキソン１６、またはＳＩＲＴ１のエキソン６に由来する。
【００５０】
５’及び３’のイントロン配列
選択的エキソンには５’及び３’のイントロン配列が隣接する。遺伝子調節カセットで使用することができる５’及び３’のイントロン配列は、アプタマーと結合するリガンドの存在または非存在に応じて、標的遺伝子からスプライシングで切り出され、標的遺伝子ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに選択的エキソンを含む標的遺伝子を作り出す配列であることができる。５’及び３’のイントロンはそれぞれ、スプライシングが生じるのに必要な配列、すなわち、スプライスドナー、スプライスアクセプター及び分岐点配列を有する。一実施形態では、遺伝子調節カセットの５’及び３’のイントロン配列は１以上の天然に存在するイントロンまたはその一部に由来する。一実施形態では、５’及び３’のイントロン配列は切り詰めたヒトベータグロビンのイントロン２（ＩＶＳ２Δ）に由来する。他の実施形態では、５’及び３’のイントロン配列は、ＳＶ４０ｍＲＮＡのイントロン（ＣｌｏｎｔｅｃｈのｐＣＭＶ−ＬａｃＺベクターで使用された）、ヒトのトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）のイントロン６（Ｎｏｔｔ  Ａｊｉｔ，ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ．２００３，９：６０７０６１７）、またはヒトの第ＩＸ因子のイントロン（Ｓｕｍｉｋｏ  Ｋｕｒａｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．１９９５，２７０（１０），５２７６）、標的遺伝子自体の内在性イントロン、または調節されたスプライシングに十分である要素（Ｔｈｏｍａｓ，Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５（３７）：３３１）を含有するゲノム断片もしくは合成イントロン（Ｙｉ  Ｌａｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６：１７（１０）：１０３６）に由来する。
【００５１】
一実施形態では、本発明の選択的エキソン及びリボスイッチを標的遺伝子の内在性イントロンにあるように操作する。すなわち、そのイントロン（または実質的に類似のイントロン配列）が標的遺伝子のその位置で天然に存在する。この場合、選択的エキソンのすぐ上流のイントロン配列は５’イントロンまたは５’イントロン配列と呼ばれ、選択的エキソンのすぐ下流のイントロン配列は３’イントロンまたは３’イントロン配列と呼ばれる。この場合、内在性イントロンを修飾して、選択的エキソンの５’及び３’の末端に隣接するスプライスアクセプター配列及びスプライスドナー配列を含有する。
【００５２】
本発明の遺伝子調節カセットにおけるスプライスドナー及びスプライスアクセプターの部位を強化するまたは弱化するように修飾することができる。すなわち、標準のクローニング法、部位特異的変異誘発等によってスプライスドナーまたはアクセプターについてのコンセンサスにさらに近づくようにスプライス部位を修飾することができる。スプライスコンセンサスにさらに類似するスプライス部位はスプライシングを促進する傾向があり、従って強化される。スプライスコンセンサスにあまり類似しないスプライス部位はスプライシングを妨害する傾向があり、従って弱化される。最も一般的なクラスのイントロン（Ｕ２）のスプライスドナーについてのコンセンサスはＡ／Ｃ  Ａ  Ｇ  ｜｜  Ｇ  Ｔ  Ａ／Ｇ  Ａ  Ｇ  Ｔ（ここで｜｜はエキソン／イントロンの境界を表す）である。スプライスアクセプターについてのコンセンサスはＣ  Ａ  Ｇ  ｜｜  Ｇ（ここで｜｜はエキソン／イントロンの境界を表す）である。スプライスドナー及びアクセプターの部位での特定のヌクレオチドの頻度は当該技術に記載されている（たとえば、Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｑ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９８８．７（５）：９１９−９３２を参照のこと）。５’及び３’スプライス部位の強度を調整して選択的エキソンのスプライシングを調節することができる。
【００５３】
イントロンのスプライシングエンハンサー要素及び／またはイントロンのスプライシングサプレッサー要素を修飾すること、欠失させること及び／または付加すること、及び／または分岐部位配列を修飾することを含む、遺伝子調節カセットにおける５’及び３’イントロンに対する追加の修飾を行ってスプライシングを調節することができる。
【００５４】
一実施形態では、５’イントロンはレポーター遺伝子とインフレームであろう終止コドンを含有するように修飾されている。５’及び３’のイントロン配列は、潜在スプライス部位を取り除くようにも修飾することができ、それは公的に利用できるソフトウエア（たとえば、Ｋａｐｕｓｔｉｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１．１−８を参照のこと）によって特定することができる。たとえば、ウイルスの発現構築物についてのサイズ要件を満たすために５’及び３’のイントロン配列の長さを調整することができる。一実施形態では、５’及び３’のイントロン配列は独立して約５０〜約３００ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、５’及び３’のイントロン配列は独立して約１２５〜約２４０ヌクレオチドの長さである。
【００５５】
レポーター遺伝子
本発明のスクリーニング法は、標的の細胞、組織または生物で発現させることができる標的遺伝子（たとえば、レポーター遺伝子）の発現を調節するのに使用される遺伝子調節カセットを利用する。レポーター遺伝子は、その発現を使用して遺伝子調節カセットにおけるリガンドのアプタマーとの特異的な相互作用を検出することができる任意の遺伝子であることができる。一実施形態では、レポーター遺伝子は、たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質または切替可能な蛍光タンパク質を含む蛍光タンパク質をコードする。別の実施形態では、レポーター遺伝子は、たとえば、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、または分泌型Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを含むルシフェラーゼ酵素をコードする。一実施形態では、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼである。一実施形態では、レポーターは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。一実施形態では、レポーター遺伝子は核タンパク質、トランスポーター、細胞膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、受容体、成長ホルモン、サイトカイン、シグナル伝達分子、調節性ＲＮＡ、抗体、及び治療用のタンパク質またはペプチドから成る群から選択される。
【００５６】
発現構築物
本発明は、レポーター遺伝子をコードし、且つ本発明の遺伝子調節カセットを含有するポリヌクレオチドを標的細胞に導入するための組換えベクターの使用を企図する。多数の実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ構築物には、宿主細胞におけるＤＮＡの複製及びその細胞における適当なレベルでの標的遺伝子の発現を提供するＤＮＡセグメントを含む追加のＤＮＡ要素が含まれる。当業者は、発現制御配列（プロモーター、エンハンサー等）が標的細胞にてレポーター遺伝子の発現を促進するその能力に基づいて選択されることを十分に理解する。「ベクター」は、試験管内または生体内のいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む組換えプラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ミニ染色体、ＤＮＡミニサークルまたはウイルス（ウイルスに由来する配列を含む）を意味する。一実施形態では、組換えベクターはウイルスベクターまたは複数のウイルスベクターの組み合わせである。標的細胞におけるレポーター遺伝子のアプタマーが介在する発現についてのウイルスベクターは当該技術で既知であり、それには、アデノウイルス（ＡＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター、単純性ヘルペス１型（ＨＳＶ１）ベクターが挙げられる。
【００５７】
アプタマーのライブラリをサブライブラリに分割する方法
【００５８】
本発明の別の態様は、大きなオリゴヌクレオチドライブラリを小さなサブライブラリに分割する方法及びアプタマーに基づく合成リボスイッチの細胞系アッセイでスクリーニング可能なプラスミドライブラリを作製するアプローチを提供する。本発明の一態様は、以下のステップを含む、オリゴヌクレオチドライブラリをさらに小さいサブライブラリに分ける方法を提供する：
（ａ）ライブラリにおけるオリゴヌクレオチドが複数の５’及び３’定常領域を含むオリゴヌクレオチドライブラリを提供すること、
（ｂ）鋳型としてのオリゴヌクレオチドライブラリと、５’及び３’定常領域に相補的である第１のプライマーと第２のプライマーとを用いた２サイクルＰＣＲを行うことと、
（ｃ）２サイクルＰＣＲの産物を単離すること、及び
（ｄ）固有の５’及び３’定常領域のサブセットに相補的なプライマーを用いて２サイクルＰＣＲの単離した産物のサブセットをＰＣＲで増幅すること。
【００５９】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドライブラリは１以上の無作為化したヌクレオチドを含有する無作為化アプタマーライブラリである。アプタマー配列には左及び右の定常領域が隣接し、それはその後のクローニングのための制限部位を含有する。
【００６０】
一実施形態では、２サイクルＰＣＲにおける第１または第２のプライマーは、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、蛍光色素分子、化学基、たとえば、チオール基、またはクリック化学で使用される化学基、たとえば、アジドから成る群から選択される標識を含む。これらの分子はオリゴヌクレオチドに連結することができ、それらの相互作用する分子、たとえば、ビオチンのためのストレプトアビジンもしくはアビジンの修飾形態、ＤＩＧもしくはＢｒｄＵもしくは蛍光色素分子に対する抗体、またはジスルフィドを形成するための第２チオール基、アジドのためのアルキン基を固体表面に固定化して標識されたオリゴヌクレオチドの単離を促進することができる。
【００６１】
いったんアプタマーライブラリがアプタマーのサブライブラリに分割されると、１以上のサブライブラリにおけるアプタマーが遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットに導入されてリボスイッチライブラリを生成し、提供される方法によってリガンド結合についてスクリーニングされる。
【００６２】
リボスイッチライブラリをサブライブラリに分割する方法
一態様では、本発明はリボスイッチのライブラリをサブライブラリに分割する方法を提供する。リボスイッチのライブラリは本明細書で使用されるとき、たとえば、本明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１６２３４に記載されているような、ライブラリの個々のメンバーがライブラリの他のメンバーとは異なるアプタマー配列を含む複数のアプタマーを含む遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットを含むプラスミドライブラリである。実施形態では、リボスイッチのライブラリにおけるアプタマーは１以上の無作為化したヌクレオチドを含む。実施形態では、プラスミドリボスイッチライブラリは本明細書に記載されている方法によって作り出されるアプタマーのサブライブラリから生成された。
【００６３】
リボスイッチライブラリをサブライブラリに分割する方法は、以下のステップを含む：
（ａ）本明細書に記載されている遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットを含むプラスミドにアプタマーのライブラリを導入してリボスイッチライブラリを作製すること、
（ｂ）リボスイッチライブラリを細菌（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入すること、
（ｃ）細菌クローンを回収し（たとえば、細菌コロニーを摘み取ることによって）、プラスミドＤＮＡを抽出してリボスイッチのプラスミドサブライブラリ（本明細書では一次サブライブラリと呼ぶ）を得ること、
（ｄ）任意で、一次サブライブラリを細菌に導入し、細菌クローンを回収し、プラスミドＤＮＡを単離することによってリボスイッチの一次プラスミドサブライブラリからリボスイッチの二次サブライブラリを生成すること。
【００６４】
プラスミドに配列を導入してライブラリを生成する方法は当該技術で既知であり、細菌にプラスミドを導入し、細菌クローンを回収する方法も同様である。プラスミドリボスイッチのライブラリのメンバーを含有する細菌クローンは、細菌をプレートに播き、個々のコロニーを摘み取ることによって回収されてもよい。これらのクローンからプールしたプラスミドがサブライブラリを形成する。回収された細菌クローンの数がリボスイッチのサブライブラリのサイズ（固有のメンバーの数）を決定し、複数のサブライブラリが生成されてもよい。１以上の一次サブライブラリをさらに分割して二次サブライブラリが作り出し、サブライブラリのサイズをさらに小さくすることができる。１以上のサブライブラリを真核細胞に導入し、対象とするリガンドに細胞を曝露し、遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットからのレポーター遺伝子の発現を測定することによって本明細書に記載されている方法を用いてサブライブラリをスクリーニングする。リガンドに応答したレポーター遺伝子の発現の上昇は、ライブラリの１以上のメンバーがリボスイッチの状況下でリガンドに結合するアプタマーを含むことを示している。従って、スクリーニングすることができるサブライブラリのサイズはレポーター遺伝子の発現を測定するアッセイの感度によって決定されてもよい。本発明の実施形態では、サブライブラリは約５０〜約６００の固有のメンバーを含む（が、一部のメンバーは他のサブライブラリで反復されてもよいが）。
【００６５】
本明細書で開示されている本発明の原理における変形が当業者によってなされ得、そのような改変が本発明の範囲内に含まれるものであるように意図されることが理解され、期待されるべきである。本明細書で引用されている参考文献はすべてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。以下の実施例は本発明をさらに説明しているが、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１
スプライシングに基づく遺伝子調節リボスイッチを用いたアプタマー／リガンドについての哺乳類細胞系スクリーニング
手順
リボスイッチの構築
リボスイッチは、参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１６２３４（具体的には実施例３〜６）に記載されているように構築した。切り詰めたヒトベータグロビンのイントロン配列を合成し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子のコーディング配列に挿入した。変異体ヒトＤＨＦＲのエキソン２を合成し、ゴールデンゲートクローニング戦略を用いてこの切り詰めたベータグロビンのイントロン配列の真ん中に挿入した。独立して２つの異なるＢｓａＩ部位に相補的であり（ＩＤＴ）、アニーリングし、ＢｓａＩで消化したｍＤＨＦＲ−Ｌｕｃｉ−アクセプターベクターにライゲーションされている５’末端で４ヌクレオチドのオーバーハングを持つオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）としてｘｐｔ−Ｇ／Ａ１、ｙｄｈｌ−Ｇ／Ａ２、ｙｘｊ３、ａｄｄ４、ｇｄｇ６−Ｇ／Ａ５（アプタマーについての引用は参照によって本明細書に組み入れられる）を含むアプタマーを合成した。
【００６７】
形質移入
形質移入の前日に、３．５×１０４個のＨＥＫ−２９３細胞を９６穴平底プレートに播いた。プラスミドＤＮＡ（５００ｎｇ）を試験管または９６穴Ｕ底プレートに加えた。これとは別に、ＴｒａｎｓＩＴ−２９３試薬（Ｍｉｒｕｓ；１．４μＬ）を５０μＬのＯｐｔｉ−ｍｅｍ  Ｉ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に加え、室温（ＲＴ）で５分間静置した。次いで、この希釈した形質移入試薬５０μＬをＤＮＡに加え、混合し、ＲＴで２０分間インキュベートした。最終的にこの溶液７μＬを９６穴プレートの細胞のウェルに加えた。
【００６８】
培養細胞のホタルルシフェラーゼアッセイ
培地交換の２４時間後、プレートをインキュベータから取り出し、実験台にて数分間ＲＴに対して平衡化し、次いで吸引した。Ｇｌｏ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、１００μＬ、ＲＴ）を加え、プレートをＲＴで少なくとも５分間維持した。次いで、ウェルの内容物を５０μＬの倍散剤によって混合し、各試料２０μＬを、Ｇｌｏ溶解緩衝液で１０％に希釈したブライトｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０μＬと混合した。９６のウェルを不透明な白色の３８４穴プレートに配置した。ＲＴでの５分間のインキュベートに続いて、５００ミリ秒の読み取り時間でＴｅｃａｎ機器を用いて発光を測定した。ルシフェラーゼ活性は平均の相対的な光単位（ＲＬＵ）±ＳＤとして表し、誘導倍率はグアニン処理をしないで得られたルシフェラーゼ活性で割ったグアニン処理によって得られたルシフェラーゼ活性として算出した。
【００６９】
結果
レポーター遺伝子としてのルシフェラーゼで出発して、ヒトβ−グロビンのイントロンをホタルルシフェラーゼのコーディング配列の真ん中に挿入し、変異体終止コドンを含有するヒトＤＨＦＲのエキソン２をイントロン部分に挿入することによって遺伝子発現のプラットフォームを作り出した。レポーター遺伝子の発現は、従ってレポーター遺伝子とインフレームである終止コドンを含有するｍＤＨＦＲエキソンの包含または排除によって、制御される。このシステムでは、Ｕ１結合部位及び挿入された相補的配列によって形成されたｍＲＮＡにおけるヘアピン構造がｍＤＨＦＲエキソンの包含を阻止し、よって標的遺伝子の発現を可能にする（図１ａ）。調節可能なヘアピン構造を形成するために、従って小分子によって制御可能な標的遺伝子の発現を行うために、我々は、合成アプタマー（テオフィリン）または天然のアプタマー（ｘｐｔ−Ｇ／Ａ、ｙｘｊ、ｙｄｈｌ−Ａ／Ｇ、ａｄｄ−Ａ／Ｇアプタマー）またはハイブリッドアプタマーｇｄｇ６−Ｇ／Ａを、Ｕ１結合部位とその相補的配列との間で、このスプライシングに基づく遺伝子調節プラットフォームに移植し、哺乳類細胞にて遺伝子発現を調節する合成リボスイッチを生成した。我々のスプライシングに基づく遺伝子調節カセットを用い、我々の合成リボスイッチ構築物に様々なアプタマーを挿入することによって、我々は哺乳類細胞の背景にてリガンドに対する様々な機能的な応答を明らかにした。グアニンアプタマーを持つリボスイッチは図１ｂで示すようにグアニンと同様にグアノシンに応答する。ｘｐｔ−グアニンリボスイッチであるｘｐｔ−Ｇ１７（参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１６２３４で開示されている、たとえば、配列番号１５を参照のこと）は、その天然のリガンド処理によってリガンドに応答してレポーター遺伝子発現の高いダイナミックレンジの誘導を生じた。
【００７０】
天然のアプタマーに基づくリボスイッチは哺乳類細胞にて遺伝子発現を調節することにおいて高いダイナミックレンジを有するが、それら天然のアプタマーについてのリガンドの性質は生体内でのそれらの適用可能性を限定している。リボスイッチによる我々の高度にダイナミックな遺伝子調節のプラットフォームを利用して、我々は先ず、Ｎ２位にて異なる化学基を有するグアニン類似体のリストを選択してｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチにおけるその活性を調べた。図１ｃに示すように、５００μＭの濃度で幾つかのＮ２化合物はｘｐｔ−Ｇ１７構築物を伴う細胞にてルシフェラーゼ活性を誘導し、図１ｄに示すようにＮ２−フェノキシアセチルグアニンが最も強力だった（１３０３倍の誘導）。可能性があるリガンドとして使用するための化合物のリストを拡大するために、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリ（１２８０の臨床的に認可された薬剤の収集）を１００μＭで使用して哺乳類細胞の背景で既知のアプタマーを活性化する最適なリガンドについてスクリーニングした。予備的な選別に由来する図１ｅに示すように、グアニンリボスイッチｘｐｔ−Ｇ１７はグアニンだけでなく、図１ｅに示すように８−アザグアニン、ナダイド、Ｎ６−メチルアデノシン、テストステロンプロピオン酸塩、アデノシン５’一リン酸一水和物、アンフォテリシンＢ、チオグアニン、チロキサポール、プロゲステロン及びクロルマジノン酢酸塩、ならびに表１で列挙するいくつかの他の化合物にも応答した。興味深いことに、ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチに対して活性を示したこれら化合物の一部はグアニンまたはグアノシンとは構造的に非常に異なる。他の８つのプリンリボスイッチによってＰｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリをさらにスクリーニングし、ルシフェラーゼ活性を誘導することにおいてリボスイッチを活性化することができるいくつかの化合物が得られた（表１）。これらの結果は、細胞環境にて既知のアプタマーについて可能性のある最適なリガンドを発見することにおけるリボスイッチシステムの重要な使用を実証しており、さらに、その中でリボスイッチが機能するように求められる細胞の背景にてアプタマーを生成することの重要性を強調している。
【表１Ａ】
2019523013.tif 000003
【表１Ｂ】
2019523013.tif 000004
【表１Ｃ】
2019523013.tif 000005
【表１Ｄ】
2019523013.tif 000006
【表１Ｅ】
2019523013.tif 000007
【００７１】
Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリ選別で使用されたリボスイッチについての配列には、大文字でのステム配列及び小文字でのアプタマー配列が以下で提供されている。
ｘｐｔ−Ａ８（配列番号１）：
ＧＴＡＡＴＧＴａｔａａｔｃｇｃｇｔｇｇａｔａｔｇｇｃａｃｇｃａａｇｔｔｔｃｔａｃｃｇｇｇｃａｃｃｇｔａａａｔｇｔｃｃｇａｔｔＡＣＡＴＴＡＣ
ａｄｄ−Ｇ６（配列番号２）：
ＧＴＡＡＴＧＴＧｔａｔａａｔｃｃｔａａｔｇａｔａｔｇｇｔｔｔｇｇｇａｇｔｔｔｃｔａｃｃａａｇａｇｃｃｔｔａａａｃｔｃｔｔｇａｃｔａＣＡＣＡＴＴＡＣ
ａｄｄ−Ａ６（配列番号３）：
ＧＴＡＡＴＧＴＧｔａｔａａｔｃｃｔａａｔｇａｔａｔｇｇｔｔｔｇｇｇａｇｔｔｔｃｔａｃｃａａｇａｇｃｃｔｔａａａｃｔｃｔｔｇａｔｔａＣＡＣＡＴＴＡＣ
ｇｄｇ６−Ａ８（配列番号４）：
ＧＴＡＡＴＧＴａｃａｇｇｇｔａｇｃａｔａａｔｇｇｇｃｔａｃｔｇａｃｃｃｃｇｃｃｇｇｇａａａｃｃｔａｔｔｔｃｃｃｇａｔｔＡＣＡＴＴＡＣ
ｇｄｇ６−Ｇ８（配列番号５）：
ＧＴＡＡＴＧＴａｃａｇｇｇｔａｇｃａｔａａｔｇｇｇｃｔａｃｔｇａｃｃｃｃｇｃｃｇｇｇａａａｃｃｔａｔｔｔｃｃｃｇａｃｔＡＣＡＴＴＡＣ
Ｙｄｈｌ−Ｇ８（配列番号６）：
ＧＴＡＡＴＧＴａｔａａｃｃｔｃａａｔａａｔａｔｇｇｔｔｔｇａｇｇｇｔｇｔｃｔａｃｃａｇｇａａｃｃｇｔａａａａｔｃｃｔｇａｃｔＡＣＡＴＴＡＣ
Ｙｄｈｌ−Ａ６（配列番号７）：
ＧＴＡＡＴＧＴＧｔａｔａａｃｃｔｃａａｔａａｔａｔｇｇｔｔｔｇａｇｇｇｔｇｔｃｔａｃｃａｇｇａａｃｃｇｔａａａａｔｃｃｔｇａｔｔａＣＡＣＡＴＴＡＣ
ｙｘｊ−Ａ６（配列番号８）：
ＧＴＡＡＴＧＴＧｔａｔａｔｇａｔｃａｇｔａａｔａｔｇｇｔｃｔｇａｔｔｇｔｔｔｃｔａｃｃｔａｇｔａａｃｃｇｔａａａａａａｃｔａｇａｔｔａＣＡＣＡＴＴＡＣ
【００７２】
実施例２
アプタマーライブラリの設計及び合成
手順
アプタマーライブラリを生成するために、リガンド結合に関与する可能性があるような結晶構造６,７から特定されているアプタマーにおける位置でのヌクレオチドを無作為化した。アプタマーのリボスイッチへの構築を促進するために、ＩＩｓ型制限酵素（たとえば、ＢｓａＩ）の切断部位を持つ定常領域をアプタマー領域に隣接させた。無作為化した塩基を持つアプタマー配列を含有するこの１５３ｂｐのウルトラマーオリゴヌクレオチドをＩＤＴによって合成した：ＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡＧＧＴＡＡＴＧＴＡＴＡＮＮＮＧＣＧＴＧＧＡＴＡＴＧＧＣＡＣＧＣＮＮＧＮＮＮＮＣＮＣＣＧＧＧＣＡＣＣＧＴＡＡＡＴＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＴＴＡＣＧＣＡＣＣＡＴＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＣＡＧＴＧＡＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＧＧ（Ｎは無作為ヌクレオチドを表す）（配列番号９）。アプタマーライブラリにてさらなる配列多様性を生成するために、さらなる位置にて塩基を無作為化することができる。完全に無作為な配列を用いてアプタマーライブラリを生成することができる。
【００７３】
結果
実施例１に記載されているように、我々は、小分子リガンドの処理に応答して哺乳類の遺伝子発現を調節する合成リボスイッチを成功裏に作成した。スプライシングに基づく遺伝子発現カセットにてｘｐｔ−Ｇグアニンアプタマーを含有するリボスイッチの１つであるｘｐｔ−Ｇ１７。レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを用いて、我々はグアニン処理に応答して高濃度のグアニンで２０００に誘導倍率を伴う遺伝子調節の高いダイナミックレンジを達成した。アプタマー／リガンドが介在する選択的スプライシングの構築物による遺伝子調節活性のこの例を見ないダイナミックレンジは、哺乳類細胞における所望のリガンドに対するアプタマーについてスクリーニングする、または既知のアプタマーと結合し、活性化するリガンドについてスクリーニングするシステムを提供する。
【００７４】
出発リボスイッチライブラリを作るプラットフォームとしてｘｐｔ−Ｇ１７を選択した。オリゴヌクレオチド配列の構成は次のクローニングステップにて元々のｘｐｔ−Ｇグアニンアプタマーを置き換えるように設計した。結晶学解析に基づいてグアニン結合に重要であることが知られている位置でのｘｐｔ−Ｇグアニンアプタマーにおけるヌクレオチドを無作為化した。最初に、１０の位置を無作為化し、それは１，０４８，５７６のアプタマー配列のライブラリを生成した。１０を超える位置を無作為化すると、１０６配列より大きいライブラリを生成することができる。無作為化するのにｘｐｔ−Ｇグアニンアプタマーの骨格配列をここでは選択的に使用したが、類似のアプローチを用いて、他の既知のアプタマーを伴う、または既知のリガンドがない完全に無作為な配列さえ伴うアプタマーライブラリを生成することができる。我々はここではプラットフォームとしてｘｐｔ−Ｇ１７を選択したが、様々なアプタマーを伴うリボスイッチ、またはスプライシング以外のメカニズムに基づくリボスイッチを出発プラットフォームとして使用して無作為化アプタマー配列を生成することができることも言及することが重要である。
【００７５】
実施例３
大きな無作為化アプタマーライブラリをアプタマーの小さなサブライブラリに分けること
手順
オリゴヌクレオチド（オリゴ）
プライマーのＪＦまたはＪＲのセットは、合成されたアプタマーオリゴにおける定常領域に相補的な３’部分配列及び無作為な２０量体オリゴ配列を含有する５’部分配列を有する。プライマーのＦまたはＲのセットは、ＪＦまたはＪＲのプライマーにおける無作為２０量体オリゴ配列に対して相補的である。プライマーはすべてＩＤＴで合成される。ＪＦプライマーは５’末端にてビオチンで標識された（ＩＤＴ）。合成されたオリゴは、ストック溶液として１００μＭにＤＮＡ分解酵素及びＲＮＡ分解酵素を含まない水にて懸濁し、所望の濃度に希釈し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ機器またはＯｌｉＧｒｅｅｎ法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて定量した。
【００７６】
２サイクルＰＣＲ増殖
ビオチン化オリゴ・タグを付加するために、１０μＬの反応体積にて製造元のプロトコールに従ってＰｆｘプラチナＰＣＲキットを用いて２サイクルＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応では所望のコピー数でオリゴ鋳型を使用した（アプタマーライブラリにてオリゴ配列当たり１〜５コピー）。増幅の第１のサイクルについては逆行プライマーＪＲのみを含めた。増幅は、９４℃で２分間、次いで９４℃で１０秒間、１分当たり０．５℃で６６℃から５２℃まで下降するタッチダウンプログラムによるアニーリングで実行した。次いでポリメラーゼ反応が６８℃で２０秒間あり、その後４℃までの冷却が続いた。次いで鋳型を含まないが、ビオチン化した順行プライマー（ビオチンＪＦ）を含有するＰＣＲ混合物１０μＬを、同じＰＣＲステップを用いた増幅の第２サイクルのために第１サイクルのＰＣＲ試験管に加えた。ＰＣＲ産物はストレプトアビジン・ビーズとのインキュベートの準備ができた。
【００７７】
ビオチン化オリゴヌクレオチド（オリゴ）の単離
２×結合及び洗浄緩衝液（ＢＷ緩衝液）を２ＭのＮａＣｌと共に１×ＴＥ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）で作った。ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２７０ストレプトアビジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）（ＳＡビーズ）を２０μＭの酵母ｔＲＮＡ溶液（Ａｍｂｉｏｎ）で室温にて１０分間ブロックし、１×ＢＷ緩衝液で２回洗浄し、使用したビーズの最初の体積と同じ体積の２×ＢＷ緩衝液に再懸濁した。５０μＬのこれら処理したビーズを１００μＬの２×ＢＷ緩衝液及び３０μＬの水と一緒にＰＣＲ産物に加えた。製造元のプロトコールに従って、２００μＬのビオチン化したオリゴとＳＡビーズの混合物を室温で６０分間インキュベートし、次いで９５℃にて５分間、ビーズを変性させ、直ちに氷上で冷却し、１×ＢＷ緩衝液で１回、水で２回５分間洗浄した。洗浄溶液をできるだけ多く取り除き、洗浄したビーズはＰＣＲ反応の準備ができた。
【００７８】
オリゴ配列のタグに特異的なＰＣＲ
ビオチン化したＰＣＲ産物を伴うビーズを、ＰｆｘプラチナＰＣＲキットを用いて合計５０μＬのＰＣＲミックスに加えた。プライマーはＦ及びＲのセットプライマーの混合物である。ＰＣＲは９４℃で２分間予備加熱し、９４℃で１５秒間、６２℃で３０秒間、６８℃で２０秒間、及び６８℃で２分間の追加の伸長の２８サイクルに供した。ＰＣＲ産物を１２℃に冷却し、ＰＣＲの２回目に備えた。２回目のＰＣＲ増幅については、１回目のＰＣＲに由来するＰＣＲ産物１μＬを鋳型として用い、Ｆ及びＲのプライマーの単一ペアを使用して相補的配列でタグを付けた鋳型を増幅した。ＰＣＲ反応は９４℃で予備加熱し、９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で２０秒間、及び６８℃で２分間の追加の伸長の２５サイクルで増幅した。
【００７９】
結果
指数関数的増加によるリガンドの系統的展開（ＳＥＬＥＸ）８,９を用いた試験管内の選択は、代謝産物、ビタミン補因子、金属イオン、タンパク質、及び全細胞さえも含む広範囲のリガンドに対する多数のアプタマーを生成するための普通１０１３〜１０１４の配列を伴う大きなアプタマーライブラリをスクリーニングするのに広範に適用されているが１０、そのような大きな無作為化アプタマーライブラリの細胞系スクリーニングの方法はまだ開発されていない。さらに、ＳＥＬＥＸによって生成されたアプタマーのほとんどが細胞環境では有効ではないことが判明し、アプタマーを、それらが機能することが求められる細胞環境にてスクリーニングすることの重要性を強調している。選択したアプタマーが細胞内で機能するために、特定のアプタマーのそのリガンドへの結合は機能的な結果を有さなければならず、それは、試験管内の条件下でリガンド結合にのみ基づいてアプタマーを選択するＳＥＬＥＸを介しては調べることができない。アプタマーについての哺乳類細胞に基づく選別を開発する難題の１つは、リガンド処理に応答したアプタマーに基づくリボスイッチの遺伝子調節のダイナミックレンジが低いことである。この基本的な限界に加えて、哺乳類細胞における本質的な低い遺伝子導入効率が１０５配列より大きいスクリーニングライブラリに対して別の障壁を課している。しかしながら、我々は、リガンド処理の際、遺伝子発現の数千倍の誘導まで生成することができる合成リボスイッチを開発した。この高いダイナミックレンジの遺伝子調節はアプタマー／リガンドをスクリーニングするための細胞系システムの基礎を提供する。高い配列多様性を有する大きなアプタマーライブラリから真核細胞にてアプタマーを選択するために、本発明は、大きなアプタマーライブラリを、リボスイッチカセットにクローニングして哺乳類細胞系のアッセイを介してスクリーニング可能であるプラスミドライブラリを生成することができる小さなサブライブラリに分割する／分ける複数の戦略及びアプローチを提供する。
【００８０】
大きなアプタマーライブラリを分ける戦略は、先ず、合成し、無作為化したアプタマーのオリゴ配列の５’末端及び３’末端の両方で固有の配列のペアを付加することである（実施例２に記載されているように）。この戦略の第２のステップでは、固有のオリゴ配列と連結した（それでタグ付けされた／標識された）アプタマー配列を、配列タグの各ペアに相補的であるプライマーの単一ペアを用いて増幅することができ、従ってアプタマーの様々なサブライブラリを生成することができる（図３ａ）。タグ付け及びＰＣＲのこの２ステッププロセスを繰り返して所望のサイズにライブラリを分けることができる。
【００８１】
固有の配列のペアを鋳型に連結するために、我々は複数のアプローチを開発した（図３ｂ）。アプローチの１つは鋳型に固有の配列を組み込むためにＰＣＲを使用することである（ＰＣＲアプローチ）。他のアプローチには、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いて一本鎖鋳型に一本鎖配列タグをライゲーションすること、及び一本鎖オリゴヌクレオチド鋳型のＰＣＲ増幅によって生成される二本鎖鋳型に二本鎖配列タグをＴ４ＲＮＡリガーゼによってライゲーションすることが含まれる（ライゲーションアプローチ）。我々は２サイクルＰＣＲのアプローチを開発し、調べており（図３ｃ）、固有の配列タグを付加することに対するライゲーションアプローチを調べているところである。
【００８２】
ＰＣＲアプローチを用いて配列タグを連結し、アプタマーのタグ付きライブラリを生成するために、ＰＣＲプライマーのセットを１つ（ＪＦ及びＪＲ）を設計した。プライマーのこのセットは、プライマーの５’部分及びプライマーの３’部分にタグ配列、合成されたアプタマーオリゴにおける定常領域に相補的である配列を含有する。高いコピー数の鋳型を用いた複数サイクルの従来のＰＣＲによって生成される不均質性１１を回避するために、２サイクルＰＣＲを開発して各サイクルにて鋳型の一方の末端で配列タグを連結した（図３ｃ）。この２サイクルＰＣＲでは、無作為化したオリゴ鋳型のコピー数を最少に保って各鋳型が１を超えるペアのタグ配列と連結する機会を減らした。タグ付きの鋳型を単離し、精製するために、我々は、ＪＦプライマーをビオチン分子で標識し、それにより磁気ストレプトアビジンのビーズを用いて反応成分の残りからビオチン化したタグ付き鋳型を分離することができる（図３ｄ）。鋳型のコピー数が少ないために、我々は、ＰＣＲのタグ付けで出発し、単離されたビオチン化タグ付き鋳型を、鋳型に連結したタグ配列に特異的であるプライマーのセット（Ｊ及びＦプライマー）の混合物を用いたＰＣＲによって増幅し、拡張して、末端で配列の固有のペアを有するアプタマーのライブラリ（無作為化アプタマーのタグ付きライブラリ）を生成した。次いでこのＰＣＲ産物がＪ及びＲプライマーの単一ペアによるＰＣＲの鋳型として役立ち、各タグ付けされた鋳型を増幅し、従って元々のアプタマーライブラリのサブライブラリを生成する。
【００８３】
２つのビオチン標識したＪＦプライマー（ＪＦ１及びＪＦ２）及び８つの逆行ＪＲプライマー（ＪＲ１〜ＪＲ８）を用いた予備試験では、合計１６の固有のペアの配列タグを生じた。当初の無作為化アプタマーライブラリのそれぞれ６３％、９０％または９９％を表す１、２．３または４．６コピーでの鋳型によるＰＣＲによってタグ付きライブラリを生成した後、様々なプライマーを用いてこの分割戦略を調べた。図３ｅの左のパネルに示すように、ライブラリにてあらゆる鋳型を増幅する、アプタマーにおける定常領域に相補的なプライマー（ユニバーサルプライマー）によってタグ付き鋳型を増幅した。付加されたタグ配列（真ん中のパネル）に特異的であるが、タグ付けに含まれないプライマーのペア（Ｆ３及びＲ１）（右のパネル）に特異的ではないプライマーの単一ペア（Ｆ１及びＲ１）を用いた場合、ユニバーサルプライマーで増幅された産物に比べてはるかに少ない量でタグ付き鋳型が増幅され、これはライブラリの一部（１／１６）のみが増幅されたことを示している。従って、元々のライブラリはさらに小さいサブライブラリに分けられた。
【００８４】
実施例４
ライブラリのスクリーニングに対する細胞系アッセイの感度
手順
ＤＮＡ構築物
ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチを含有するプラスミドＤＮＡ構築物をＤＮＡ構築物ＳＲ−Ｍｕｔにてこれら２つのＤＮＡ構築物の様々な比に希釈した。次いで、混合した構築物Ｇ１７とＳＲ−ｍｕｔのプラスミドＤＮＡをＨＥＫ−２９３細胞に形質移入した。形質移入及びルシフェラーゼアッセイを実施例１に記載されているように行った。
【００８５】
結果
ライブラリのスクリーニングについての細胞系アッセイの感度は、最低１つの陽性のヒットが選別におけるライブラリの残りから突出するためにアプタマー・リボスイッチのプラスミドライブラリがどれほど複雑でそのサイズがどれほど大きくてもよいかを決定する。アッセイは選択されるレポーター遺伝子に応じてルシフェラーゼ活性、蛍光タンパク質の蛍光強度、または成長ホルモン／サイトカインの放出についてのものであることができ、遺伝要素は、一時的な形質移入またはウイルス、たとえば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス等の形質導入によって送達することができる。
【００８６】
ここで、我々は、プラスミドＤＮＡを送達するのに一時的な形質移入を選択し、陽性のリボスイッチ対照ベクターとしてｘｐｔ−Ｇ１７構築物を用い、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼを使用した。これは哺乳類細胞におけるｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチの開発の間に広範に調べられ、使用されてきたアッセイである。グアニンアプタマー配列がないことを除いてｘｐｔ−Ｇ１７構築物と同じ遺伝要素を有する構築物ＳＲ−ｍｕｔを陰性対照ベクターとして使用した。従ってそれはグアニン処理に応答して遺伝子発現を活性化しない。実際のリボスイッチライブラリはヌクレオチドの無作為化によって生成される大きな分子多様性に起因してさらに複雑であるが、これら２つの構築物を一緒に混合してプールしたライブラリの状況を模倣した。１００％ｘｐｔ−Ｇ１７構築物ＤＮＡで形質移入した細胞は、未処理の細胞に比べると５００μＭのグアニンで処理した際、ルシフェラーゼ活性の２０００倍の誘導を生じた。ｘｐｔ−Ｇ１７構築物ＤＮＡをＳＲ−ｍｕｔ構築物ＤＮＡで希釈した場合、混合ＤＮＡで形質移入した細胞はルシフェラーゼ活性の低下した誘導倍率を示した。図３で示すように、グアニン応答性ｘｐｔ−Ｇ１７構築物の非応答性陰性ＳＲ−ｍｕｔ構築物に対する比が低下すると、誘導倍率は低下したが、２０００分子のうち陽性構築物が１つある場合、２．３倍の誘導をそれでも生成することができ、リガンド非応答性リボスイッチの混合物からリガンド応答性リボスイッチを１つ回収する可能性を示している。
【００８７】
上述のもの以外のアッセイについては、アッセイの感度を調べて選別されるサブライブラリのプールのサイズを決定する手引きを提供すべきである。
【００８８】
実施例５
プールしたアプタマーに基づくリボスイッチのプラスミドライブラリの構築及び大きなリボスイッチライブラリの小さなスクリーニング可能なサブライブラリへの分割
手順
リボスイッチのプールしたプラスミドライブラリの構築
二本鎖ＤＮＡ断片を生成するためにプラチナＰｆｘキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、無作為化した塩基を伴ったアプタマー配列（配列の設計及び組成については実施例２を参照のこと）を含有するウルトラマーオリゴをＰＣＲで増幅し、生成したＰＣＲ産物を４％アガロースゲル上で泳動した。１５３ｂｐサイズのＤＮＡをゲル精製（Ｑｉａｇｅｎ）し、ＢｓａＩ酵素（ＮＥＢ）で消化した。次いでＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてベクターの挿入物に対する１：５の比で実施例１に記載されているようにＢｓａＩ消化したＤＮＡ断片をＢｓａＩ消化したアクセプターベクターにライゲーションした（ｍＤＨＦＲ−Ｌｕｃｉ−アクセプター）。製造元の指示書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、エレクトロＭＡＸ  ＤＨ５α−Ｅコンピテント細胞をライゲーション産物で形質転換し、寒天プレート上に播いた。細菌コロニーをプールし、回収し、ＤＮＡを抽出してリボスイッチのプラスミドライブラリ（Ｐ１）を得た。
【００８９】
類似のアプローチを用いて、アプタマーにおける５つの位置でのヌクレオチド塩基が無作為化されて合計１０２４の異なるアプタマー配列を生成する（Ｎが無作為化の位置を意味する）さらに小さなプラスミドリボスイッチライブラリ（Ｐ２）を生成した：ＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡＧＧＴＡＡＴＧＴＡＴＡＮＮＮＧＣＧＴＧＧＡＴＡＴＧＧＣＡＣＧＣＮＮＧＴＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＡＣＣＧＴＡＡＡＴＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＴＴＡＣＧＣＡＣＣＡＴＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＣＡＧＴＧＡＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＧＧ（配列番号１０）。
【００９０】
化学的に適格なＤＨ５αの形質転換
２２７ｐｇのプラスミドＤＮＡを用いて５０μＬのコンピテント細胞を形質転換して１：１０比のプラスミドＤＮＡと細菌細胞を得た。振盪せずに３７℃で３０分間インキュベートした後、形質転換した細胞を寒天プレート上に播き、９６形式のミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡ抽出のためにコロニーをプールし、回収してリボスイッチのプールしたプラスミドサブライブラリを得た。
【００９１】
次世代配列決定（ＮＧＳ）
二次または三次のリボスイッチサブライブラリに由来するプラスミドＤＮＡを鋳型として用い、以下のプライマーを用いて無作為化アプタマー配列を含有するＰＣＲアンプリコンを生成した：ＤＨＦＲ＿Ｆ：５’−ＧＡＣＴＴＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡＧＧＴＡＡＴＧ−３’（配列番号１１）；ＩＶＳ＿Ｒ：５’−ＣＣＧＴＣＴＧＧＴＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＧＡＡＴＧＧＴＧＣＧ−３’（配列番号１２）。ＰＣＲ産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ２×１５０ｂｐのペアエンドプラットフォームを用いたＮＧＳに供して各試料についておよそ７００Ｋの読み取りを生成し、固有の配列の特定及び相対的存在量の算出のためにその後のバイオインフォマティクス解析に供した（Ｇｅｎｅｗｉｚによって提供されているサービス）。配列決定の実行から１２以上の読み取りを示した配列を真の配列と見なす。
【００９２】
結果
細胞系アッセイによってアプタマーをスクリーニングするために、アプタマーライブラリをｍＤＨＦＲ−Ｌｕｃｉ−アクセプターベクターにクローニングすることによってリボスイッチのプラスミドライブラリを生成した（図５ａ）。生成された構築物は構築物ｘｐｔ−Ｇ１７と同じ構成の遺伝要素を含有し、唯一の差異はアプタマー配列にあった。我々は、実施例２に記載されているように生成されたアプタマーライブラリから始め、それは１０６の固有の配列を含む無作為化アプタマーライブラリである。当初のアプタマーライブラリの９９．９％を超える再現を保証するために、アプタマーライブラリにおける配列の数の７．５倍である合計７．５×１０６のコロニーを寒天プレートから回収した。回収したコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡは１０６の固有のリボスイッチから成るプラスミドライブラリ（Ｐ１）を形成する。
【００９３】
開発された細胞系アッセイを用いてスクリーニングするのに十分小さいサブライブラリにプラスミドライブラリを分割するために、少数の形質転換した細菌コロニーをプールし、ＤＮＡを抽出してリボスイッチのプラスミドサブライブラリを作製することが関与する図５ｂにて要点が示されるような戦略を利用した。プラスミドライブラリを分割するこの過程を数回行って必要なサイズのサブライブラリを得ることができ、その際、単一の陽性事象（すなわち、特異的なアプタマー／リガンドの結合がレポーター遺伝子の発現をもたらすこと）を、ライブラリをスクリーニングするために開発された細胞系アッセイの感度に基づいて検出することができ、それぞれ一次、二次または三次のサブライブラリを生成する。サブライブラリのサイズは、ｎ（サブライブラリ）＝ｍ（倍率表現）＊Ｎ（当初のライブラリのサイズ）／ｄ（分割倍率）として算出された。「分割倍率」は得るサブライブラリの総数を表し、所望のような任意の数であることができる。ここで、我々は計算の容易さのために分割倍率として１００を選択した。１回目の分割については、６×１０６のコロニーが得られたが、それは、９９％を超える再現を得るために当初のプラスミドライブラリのリボスイッチの数（１０６）の６倍である。２回目の分割については、一次サブライブラリの１倍の表現が選択された。１０６のリボスイッチを伴うプラスミドライブラリについて我々は、Ｎ＝１０６、ｍ＝６、ｄ＝１００である（Ｐ１）を作り、各個々のサブライブラリのサイズはｎ＝６×１０４である。合計６×１０６の細菌コロニーを１００の個々の試験管に回収し、各個々の試験管からＤＮＡを抽出し、リボスイッチの一次プラスミドサブライブラリ（Ｐ１Ｓ＿００１〜Ｐ１Ｓ＿１００）を生成した。同じ戦略を用い、例としてサブライブラリＰ１Ｓ＿００１で出発して一次サブライブラリをＰ１Ｓ＿００１＿００１〜Ｐ１Ｓ＿００１＿１００と名付けられた１００のさらに小さい二次サブライブラリに分割した。こうして、２回の分割を行うことによって、それぞれ６００のリボスイッチを伴う二次プラスミドサブライブラリを生成した。３回目の分割過程によってリボスイッチのサブライブラリをさらに分割して三次プラスミドサブライブラリを生成することができる。
【００９４】
同じアプローチを使用して１０２４の固有のアプタマー配列を含有するプラスミドリボスイッチライブラリＰ２を分割した。合計５０００コロニーの１００部分を回収することによって１００の一次サブライブラリＰ２Ｓ＿００１〜Ｐ２Ｓ＿１００を生成し、各サブライブラリはおよそ５０のリボスイッチを含有した。
【００９５】
上記で生成したリボスイッチライブラリの組成及び品質を判定するために、各サブライブラリにて６００のリボスイッチ配列を推定上含有するリボスイッチの二次プラスミドサブライブラリに対して次世代配列決定（ＮＧＳ）を行った。４つの二次サブライブラリを無作為に選択し、その際、二次サブライブラリのうち２つは一次サブライブラリＰ１Ｓ＿００３から生成され、残りの２つの二次サブライブラリはそれぞれＰ１Ｓ＿００７及びＰ１Ｓ＿０４８から生成された。図５ｃに示すように、二次サブライブラリのそれぞれはおよそ５００または６００の固有の配列を含有し、二次サブライブラリを生成するために回収されたコロニーの数に一致する。ＮＧＳデータのさらなる解析は、同じ一次サブライブラリ（Ｐ１Ｓ＿００３）から生成された２つの二次サブライブラリ（Ｐ１Ｓ＿００３＿００４とＰ１Ｓ＿００３＿０４１）の間で３９の配列が両方のライブラリに含有されていることを示している（図５ｄ）。異なる一次サブライブラリＰ１Ｓ＿００３及びＰ１Ｓ＿００７に由来した２つの二次サブライブラリＰ１Ｓ＿００３＿００４とＰ１Ｓ＿００７＿０２１を比較すると、３つの配列のみが両方のサブライブラリによって共有されている（図５ｅ）。これらの結果は、上述の戦略を用いて、哺乳類細胞系のスクリーニングができる所望の数の固有の配列を持つプラスミドリボスイッチのサブライブラリが生成されたことを示している。
【００９６】
実施例６
選択したリガンドに対する新しいアプタマーについての哺乳類細胞系スクリーニング
実施例５に記載されているように、各プールにて６０Ｋのリボスイッチを含む１００の一次プラスミドサブライブラリ（Ｐ１Ｓ＿００１〜Ｐ１Ｓ＿１００）を構築し、同じ戦略を用いて一次サブライブラリＰ１Ｓ＿００１をさらに分割することによってそれぞれ６００のリボスイッチから成る１００の二次プラスミドサブライブラリ（Ｐ１Ｓ＿００１＿００１〜Ｐ１Ｓ＿００１＿１００）を生成した。プールしたライブラリを９６穴形式に並べてハイスルースクリーニングを促進することができる。一次サブライブラリＰ１Ｓ＿００１〜００６ならびにＰ１Ｓ＿００１のサブライブラリに対して、当初のアプタマー配列に対するものである、試験リガンドとしてのグアニンに対する、実施例１に記載されているようなルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて予備選別を行った。一次サブライブラリまたは二次サブライブラリに由来する構築物によって生成されたルシフェラーゼ活性の基本レベルはｘｐｔ−Ｇ１７構築物のそれとは有意に異なった（データは示さず）。これは選択された位置で塩基を無作為化することによるアプタマー配列における変化が終止コドン含有エキソンの包含／排除に様々な程度で影響を及ぼし、従ってルシフェラーゼの基底発現に影響を与えることを示唆している。グアニン処理に続いて、６０Ｋの一次サブライブラリＰ１Ｓ＿００５で形質移入した細胞は未処理の細胞に比べてルシフェラーゼ活性の１．８倍の誘導を生成したが（図６ａ）、リガンドとしてグアニンを使用した場合、ルシフェラーゼの２倍を超える誘導は見いだされなかった。しかしながら、１００の二次サブライブラリのうち７つはグアニン処理の際、ルシフェラーゼ活性の２倍を超える誘導を生じ、サブライブラリＰ１Ｓ＿００１＿０７５は７．８倍の誘導を生成した（図６ｂ）。実施例４に記載されている感度アッセイでは、５００のリガンド非応答分子の間でｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチが１つあった場合、６．３倍の誘導が検出された。この感度試験に基づいて、サブライブラリＰ１Ｓ＿００１＿０７５のこの予備スクリーニングからの結果（７．８倍）は６００のうちでｘｐｔ−Ｇ１７と機能的に同等であるリボスイッチが１つある、または誘導されたルシフェラーゼ活性の合計がｘｐｔ−Ｇ１７のそれに匹敵する幾つかの弱いリボスイッチがあることを示唆している。
【００９７】
機能的なアプタマーを含有するリボスイッチに対する本発明の哺乳類細胞系スクリーニングの適用可能性をさらに実証し、所望のリガンドに応答する改善された活性を持つ新しいアプタマーを見いだすために、プラスミドリボスイッチライブラリＰ２のサブライブラリをＮＡＤ＋による９６穴形式でスクリーニングした。ｘｐｔ−グアニンアプタマーにおける無作為化された位置でのヌクレオチド塩基をリボスイッチ活性の調整に結び付け、調整ボックスと名付けた（Ｓｔｏｄｄａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１３，Ｍａｙ，２７；４２５（１０）：１５９６−６１１）。従って、それらの位置でのヌクレオチドの変化はリガンド処理に応答してリボスイッチ活性を変化させている配列を生成する可能性がある。グアニンの性質及びその生体内での低い適用可能性に起因して、可能性のある新しいアプタマーのためのリガンドとしてＮＡＤ＋を選択した。リガンドのこの選択は、親ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチに対してＰｒｅｓｔｗｉｃｋ化合物ライブラリをスクリーニングすること及びＮＡＤ＋がグアニンリボスイッチを調節することができ、１００μＭ濃度にておよそ４０倍の誘導を生成することを見いだしたことに由来する上記の結果に基づいた。ＮＡＤ＋に対する改善されたリボスイッチ活性を有するアプタマー配列を生成する試みにおいて、我々は、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを用いてＰ２（アプタマーにて上述の５つの位置でヌクレオチドの変化を有する）のサブライブラリを生成し、スクリーニングした。図６ｃに示すように、それぞれおよそ５０のリボスイッチの複数のサブライブラリが１００μＭのＮＡＤ＋の処理に応答してルシフェラーゼ発現の１０倍を超える誘導を生じ、サブライブラリの１つ、Ｐ２Ｓ＿００２は３７倍の誘導を生成したのに対して単一のｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチ構築物は同じ濃度でのＮＡＤ＋処理に応答して３２倍の誘導を示した。
【００９８】
これらのスクリーニング結果は、ルシフェラーゼ発現の１０倍を超える誘導を生じたサブライブラリにおけるおよそ５０のリボスイッチの間で、ライブラリにおけるリボスイッチがすべてＮＡＤ＋処理に応答することを想定すると、最低１０倍の誘導を生じることができるリボスイッチがあることを示している。Ｇ１７によって生成された誘導倍率よりも高い３７倍の誘導を生じたサブライブラリＰ２Ｓ＿００２では、Ｇ１７よりもはるかに良好に機能する少なくとも１つのリボスイッチがある。これをさらに証明するために、サブライブラリＰ２Ｓ＿００２に由来する９６の単一構築物をスクリーニングした。図６ｄに示すように、複数の構築物が誘導を失ったまたはＧ１７より少ない誘導を生じたが、いくつかの単一構築物がＧ１７構築物よりも高い誘導倍率を生じており、これは調整ボックスにおけるヌクレオチドの変化が細胞におけるリガンド処理に応答したリボスイッチ活性に劇的に影響を与えることを示している。このアプローチを用いて、我々はいくつかの異なる調整ボックスの配列（表２に示すような）を特定し、それによってリボスイッチはＮＡＤ＋処理の際にＧ１７構築物より高いルシフェラーゼの誘導倍率を生じ、複数のアプタマー配列が１００倍を超える誘導を生じた。
【表２】
2019523013.tif 000008
【００９９】
新しい構築物の１つである＃４６をさらに調べた。図６ｅ及び図６ｆに示すように、新しい構築物＃４６は用量依存的にＮＡＤ＋処理に応答し、Ｇ１７構築物と比べると、誘導したレポーター遺伝子発現のレベル及び誘導倍率にて優れた改善を示した。新しい構築物はグアニン処理に応答した改善された遺伝子調節も有する（データは示さず）。
【０１００】
従って、本発明は、比較的大きなリボスイッチライブラリを、哺乳類細胞系のアッセイを介してスクリーニング可能であるさらに小さいリボスイッチサブライブラリに分割することができるアプローチを提供する。さらに、リボスイッチライブラリから、哺乳類細胞にて改善されたリボスイッチ活性を有する新しい配列が見いだされた。
【０１０１】
参考文献
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
2019523013.tif 000010
【図１ｃ】
2019523013.tif 000011
【図１ｄ】
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【図１ｅ】
2019523013.tif 000013
【図２】
2019523013.tif 000014
【図３ａ】
2019523013.tif 000015
【図３ｂ】
2019523013.tif 000016
【図３ｃ】
2019523013.tif 000017
【図３ｄ】
2019523013.tif 000018
【図３ｅ】
2019523013.tif 000019
【図４】
2019523013.tif 000020
【図５ａ】
2019523013.tif 000021
【図５ｂ】
2019523013.tif 000022
【図５ｃ】
2019523013.tif 000023
【図５ｄ】
2019523013.tif 000024
【図５ｅ】
2019523013.tif 000025
【図６ａ】
2019523013.tif 000026
【図６ｂ】
2019523013.tif 000027
【図６ｃ】
2019523013.tif 000028
【図６ｄ】
2019523013.tif 000029
【図６ｅ】
2019523013.tif 000030
【図６ｆ】
2019523013.tif 000031
【国際調査報告】
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