(57)【要約】本明細書で開示するのは、クラスター増幅を改善するための、パターン化フローセル表面における、一本鎖アダプター領域を有するＰＣＲライブラリなどの核酸の、リコンビナーゼ媒介増幅を改善するためのリコンビナーゼ、ならびに、それを使用する方法およびキットである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む組換えＵｖｓＸリコンビナーゼであって、組換えＵｖｓＸは、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１およびＡｓｐ３３４と機能的に同等の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換変異を含む、組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項２】
前記少なくとも１つの置換変異には荷電残基への変異が含まれる、請求項１に記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項３】
前記少なくとも１つの置換変異には塩基性残基への変異が含まれる、請求項１または２に記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項４】
前記少なくとも１つの置換変異には、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１Ｌｙｓと相同な変異が含まれる、請求項１〜３の何れかに記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項５】
前記少なくとも１つの置換変異には、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＡｓｐ３３４Ｌｙｓと相同な変異が含まれる、請求項１〜４の何れかに記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項６】
前記少なくとも１つの置換変異には、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１ＬｙｓおよびＡｓｐ３３４Ｌｙｓと相同な変異が含まれる、請求項１〜５の何れかに記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項７】
ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と機能的に同等な位置において置換変異をさらに含む、請求項１〜６の何れかに記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項８】
ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ２５６Ｌｙｓと相同な置換変異を含む、請求項７に記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項９】
ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＨｉｓ６３と機能的に同等な位置において置換変異をさらに含む、請求項１〜８の何れかに記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項１０】
ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＨｉｓ６３Ｓｅｒと相同な置換変異を含む、請求項９に記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項１１】
Ｃ末端での１つまたは複数のグルタミン酸残基の付加、Ｃ末端での１つまたは複数のアスパラギン酸残基の付加、およびその組み合わせからなる群から選択される変異をさらに含む、請求項１〜１０の何れかに記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項１２】
Ｔ４、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、エロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ３２、ビブリオファージｎｔ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、およびＲｂ４９からなる群から選択されるマイオウイルス科ファージに由来する、請求項１〜１１の何れかに記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−４のいずれかのアミノ酸配列を含む半保存ドメインへの置換変異を含み、前記置換変異には、位置４におけるＰｈｅもしくはＡｓｐ以外の任意の残基への置換から選択される変異が含まれる、組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−６のいずれかのアミノ酸配列を含む半保存ドメインへの置換変異を含み、前記置換変異には、位置４におけるＡｒｇまたはＡｓｐ以外の任意の残基への置換から選択される変異が含まれる、組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項１４】
前記変異には荷電残基への変異が含まれる、請求項１３に記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項１５】
前記変異には位置４におけるＬｙｓへの置換が含まれる、請求項１３または１４に記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および２２−３５の何れか一つのアミノ酸配列を含む、組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項１７】
ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と機能的に同等な位置において置換変異をさらに含む、請求項１６の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項１８】
ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ２５６Ｌｙｓと相同な置換変異を含む、請求項１７に記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項１９】
ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＨｉｓ６３と機能的に同等な位置において置換変異をさらに含む、請求項１６〜１８の何れかに記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【請求項２０】
ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＨｉｓ６３Ｓｅｒと相同な置換変異を含む、請求項１９に記載の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼ。
【発明の詳細な説明】
【継続出願データ】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／３１４，２７３号の利益を主張するものであり、前記文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
〔配列表〕
本出願は、サイズが９７．７キロバイトで、２０１７年３月２４日に作製した、「1447 SeqLisiting_ST25」というＡＳＣＩＩテキストファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に電子的に提出した配列表を含む。配列表の電子出願により、電子的に提出された配列表は、３７ＣＦＲ§１．８２１（ｃ）により要求されるハードコピーおよび§１．８２１（ｅ）により要求されるＣＲＦの両方として機能する。配列表に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【背景技術】
【０００３】
リコンビナーゼ酵素は、核酸のリコンビナーゼ媒介増幅において有用である。例えば、リコンビナーゼ酵素は、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ標的を標的するのを促進して、ポリメラーゼによるＤＮＡ複製を可能にし得る。特性を改善した修飾リコンビナーゼに対するニーズが残っている。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書で提示するのは、核酸のリコンビナーゼ媒介増幅の改善のためのリコンビナーゼである。本発明者らは、驚くべきことに、核酸をパターン化フローセル表面に播種する際の特徴が著しく改善した、ある改変リコンビナーゼを特定した。ある実施形態では、その改変リコンビナーゼは、クラスター増幅を改善するために、一本鎖アダプター領域を有するＰＣＲライブラリなどのＰＣＲフリーライブラリの、パターン化フローセル表面への播種を改善する。
【０００５】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対し、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する、改変ＵｖｓＸリコンビナーゼを含み、この組換えＵｖｓＸは、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１およびＡｓｐ３３４と機能的に同等の位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換変異を含む。
【０００６】
一部の態様では、その少なくとも１つの置換変異には、荷電残基への変異が含まれる。
【０００７】
一部の態様では、その少なくとも１つの置換変異には、塩基性残基への変異が含まれる。
【０００８】
一部の態様では、その少なくとも１つの置換変異には、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１Ｌｙｓと相同な変異が含まれる。
【０００９】
一部の態様では、その少なくとも１つの置換変異には、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＡｓｐ３３４Ｌｙｓと相同な変異が含まれる。
【００１０】
一部の態様では、その少なくとも１つの置換変異には、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１ＬｙｓおよびＡｓｐ３３４Ｌｙｓと相同な変異が含まれる。
【００１１】
一部の態様では、改変リコンビナーゼは、上記の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼのいずれかを含み、さらに、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と機能的に同等な位置において置換変異を有する。一部の態様では、置換変異には、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ２５６Ｌｙｓと相同な変異が含まれる。
【００１２】
一部の態様では、改変リコンビナーゼは、上記の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼのいずれかを含み、さらに、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＨｉｓ６３と機能的に同等な位置において置換変異を有する。一部の態様では、置換変異には、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＨｉｓ６３Ｓｅｒと相同な変異が含まれる。
【００１３】
一部の態様では、改変リコンビナーゼは上記の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼのいずれかを含み、それは、Ｔ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、Ｔ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、Ｒｂ６９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、Ａｅｈ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ＫＶＰ４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、アシネトバクターファージ１３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、エロモナスファージ６５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、シアノファージＰ−ＳＳＭ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、シアノファージＰＳＳＭ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、シアノファージＳ−ＰＭ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｒｂ３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ビブリオファージｎｔ−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｒｂ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｒｂ４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、およびＲｂ４９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から選択される、マイオウイルス科ファージに由来する。
【００１４】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−４のいずれかのアミノ酸配列を含む半保存ドメインへの置換変異を有し、前記置換変異には、位置４におけるＰｈｅもしくはＡｓｐ以外の任意の残基への置換から選択される変異が含まれる、改変ＵｖｓＸリコンビナーゼ、および／または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−６のいずれかのアミノ酸配列を含む半保存ドメインへの置換変異を有し、前記置換変異には、位置４におけるＡｒｇまたはＡｓｐ以外の任意の残基への置換から選択される変異が含まれる、改変ＵｖｓＸリコンビナーゼを含む。一部の態様では、変異には、荷電残基への変異が含まれる。一部の態様では、変異には、位置４におけるＬｙｓへの置換が含まれる。
【００１５】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、および８−３５のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、改変ＵｖｓＸリコンビナーゼを含む。一部の態様では、その組換えＵｖｓＸリコンビナーゼはさらに、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と機能的に同等の位置における置換変異、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＨｉｓ６３と機能的に同等の位置における置換変異、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１と機能的に同等の位置における置換変異、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＡｓｐ３３４と機能的に同等の位置における置換変異、および／または、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１およびＡｓｐ３３４と機能的に同等の位置における置換変異を含む。一部の態様では、置換変異には、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ２５６Ｌｙｓと相同な置換変異、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＨｉｓ６３Ｓｅｒと相同な置換変異、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１Ｌｙｓと相同な置換変異、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＡｓｐ３３４Ｌｙｓと相同な置換変異、ならびに／またはＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１ＬｙｓおよびＡｓｐ３３４Ｌｙｓと相同な置換変異が含まれる。
【００１６】
一部の態様では、改変リコンビナーゼは上記の組換えＵｖｓＸリコンビナーゼのいずれかを含み、さらに、Ｃ末端での１つまたは複数のグルタミン酸残基の付加、Ｃ末端での１つまたは複数のアスパラギン酸残基の付加、およびその組み合わせから選択される変異を有する。
【００１７】
本発明は、本明細書に記載する改変ＵｖｓＸリコンビナーゼをコードする、単離核酸分子を含む。
【００１８】
本発明は、本明細書に記載する改変ＵｖｓＸリコンビナーゼをコードする単離核酸分子を含む、発現ベクターを含む。
【００１９】
本発明は、１つもしくは複数の本発明に記載の改変ＵｖｓＸリコンビナーゼ、本発明に記載する改変ＵｖｓＸリコンビナーゼをコードする、１つもしくは複数の単離核酸分子、および／または、本明細書に記載する改変ＵｖｓＸリコンビナーゼをコードする単離核酸分子を含む、１つもしくは複数の発現ベクターを含むキットを含む。
【００２０】
１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の説明において記載する。他の特徴、目的、および利点は、説明および図表、ならびに請求項から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号に組み込まれた資料にも記載されている、腸内細菌ファージＴ４（Ｔ４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、腸内細菌ファージＴ６（Ｔ６）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、アシネトバクターファージ１３３（ファージ１３３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、腸内細菌ファージＲＢ６９（Ｒｂ６９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、エロモナスファージＡｅｈ１（Ａｅｈ１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、エロモナスファージ６５（Ａｅ６５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ビブリオファージＫＶＰ４０（Ｋｖｐ４０）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、腸内細菌ファージＲＢ４３（Ｒｂ４３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、プロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ２（ＰＳＳＭ２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、およびプロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ４（ＰＳＳＭ４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）由来のＵｖｓＸアミノ酸配列のアライメントを示す図である。ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１およびＡｓｐ３３４と、位置的および／または機能的に同等である残基を四角で囲み、三角形の記号により示す。
【図１Ｂ】図１Ａに記載するアライメントの続きを示す図である。ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１およびＡｓｐ３３４と、位置的および／または機能的に同等である残基を四角で囲み、三角形の記号により示す。
【図２】腸内細菌ファージＲＢ４９（ＲＢ４９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および腸内細菌ファージＴ４（Ｔ４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）由来のＵｖｓＸアミノ酸配列のアライメントを示す図である。ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１と位置的および／または機能的に同等である残基を強調表示する。ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と位置的および／または機能的に同等な残基を強調表示する。ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１およびＡｓｐ３３４と、位置的および／または機能的に同等である残基を三角形の記号により示す。
【図３】７００ｎＭピッチｖ２．５  ｐＦＣ上でＶ２ケミストリーを用いてクラスター化した１５０ｐＭヒトＰＣＲフリーライブラリの、緑色蛍光（ＧまたはＴの組み込み）および赤色蛍光（ＡまたはＣの組み込み）を測定するｔｙｐｈｏｏｎスキャナで画像化した、第１サイクルＤＮＡシーケンシングのｔｙｐｈｏｏｎ画像である。レーン１はＨ６３Ｓ  Ｐ２５６Ｋである。レーン２は、緩衝液１中のＨ６３Ｓ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋである。レーン３は、緩衝液２中のＨ６３Ｓ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋである。レーン４は、Ｗｔ  ＲＢ６９  ＵｖｓＸである。レーン５はＨ６３Ｓ  Ｐ２５６Ｋである。レーン６は、緩衝液１中のＨ６３Ｓ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋである。レーン７は、緩衝液２中のＨ６３Ｓ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋである。レーン８はＤＮＡなしである。緩衝液１は、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍＭのＢＭＥである。緩衝液２は、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＰＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣＬ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および５０％グリセロールである。
【発明の詳細な説明】
【００２２】
本明細書に提示するのは、核酸のリコンビナーゼ媒介増幅の改善のためのリコンビナーゼである。本発明者らは、驚くべきことに、パターン化フローセル表面に核酸を播種する際の特徴が著しく改善された、ある改変リコンビナーゼを特定した。
【００２３】
本明細書において以下にさらに詳細に記載するように、発明者らは、驚くべきことに、リコンビナーゼにおける、１つまたは複数の残基への１つまたは複数の変異が、例えば、一本鎖アダプター領域を有するＰＣＲライブラリなどのＤＮＡライブラリをパターン化フローセル表面に播種する際に大きな改善をもたらし、クラスター増幅の改善を提供することを発見した。
【００２４】
ある実施形態では、置換変異には、荷電側鎖を有する残基への変異が含まれる。例えば、一部の実施形態では、荷電アミノ酸は、正に荷電したアミノ酸残基である。用語「正に荷電したアミノ酸」は、７超の側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸、つまり、塩基性アミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの関連により、生理学的ｐＨでは、正に荷電した側鎖を有する。天然に存在する（遺伝子的にコードされた）塩基性アミノ酸には、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）が含まれる一方、非天然（遺伝子的にコードされていない、または非標準的な）塩基性アミノ酸には、例えば、オルニチン、２，３,−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２，５，６−トリアミノヘキサン酸、２−アミノ−４−グアニジノ酪酸、およびホモアルギニンが含まれる。用語「負に荷電したアミノ酸」は、キラリティを問わず、Ｃ末端カルボキシル基に加え、少なくとも１つの追加の負に荷電した、カルボキシル、ホスフェート、ホスホネート、またはスルホネートなどの基を含有する、天然または非天然のアミノ酸を指す。
【００２５】
また、本明細書に提示するのは、組換えＵｖｓＸの半保存ドメインへの置換変異を含む、組換えＵｖｓＸリコンビナーゼである。本明細書で使用する場合、用語「半保存ドメイン」は、種々の種の間で完全に保存されている、または、少なくとも部分的に保存されている、組換えＵｖｓＸの一部を指す。驚くべきことに、半保存ドメインにおける１つまたは複数の残基の変異が、特に一本鎖鋳型核酸の存在下でリコンビナーゼ活性に影響を与え、リコンビナーゼ媒介増幅反応における播種および／または増幅の向上をもたらすことが発見された。以下の実施例の項で記載するように、これらの変異リコンビナーゼは、一本鎖アダプター領域を有するＰＣＲライブラリなどのＰＣＲフリーライブラリを、パターン化フローセル表面へ播種する際の性能が改善されており、クラスター増幅の改善をもたらす。
【００２６】
一部の実施形態では、半保存ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−４のいずれかに記載された配列を有するアミノ酸を含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−４は、種々の種の間で半保存ドメイン中の残基に相当する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、Ｔ４  ＵｖｓＸアミノ酸配列の残基３１９−３２３に相当し、これは、本明細書ではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と記載する。半保存ドメインにおける、種々の種の間での保存を示すアライメントを、図１および２に記載する。図１に示すＵｖｓＸ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの受託番号ＮＰ＿０４９６５６（Ｔ４）、ＹＰ＿００４３００６４７（ファージ１３３）；ＮＰ＿８６１７３４（ＲＢ６９）；ＮＰ＿９４３８９４．１（Ａｅｈ１）；ＹＰ＿００４３００８５８（Ａｅ６５）；ＮＰ＿８９９２５６（ＫＶＰ４０）；ＹＰ＿２３９０１３（ＲＢ４３）；ＹＰ＿２１４４１７（Ｐ−ＳＳＭ２）；ＹＰ＿２１４７０８（Ｐ−ＳＳＭ４）；および米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号（Ｔ６）から得た。図２は、腸内細菌ファージＲＢ４９（ＲＢ４９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および腸内細菌ファージＴ４（Ｔ４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）由来のＵｖｓＸアミノ酸配列のアライメントを示す図である。ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と、位置的および／または機能的に同等である残基を強調表示する。ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１およびＡｓｐ３３４と、位置的および／または機能的に同等である残基を、三角形の記号により示す。図２に示すＵｖｓＸ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの受託番号ＮＰ＿８９１５９５（ＲＢ４９）およびＮＰ＿０４９６５６（Ｔ４）から得た。
【００２７】
半保存ドメインにおける１つまたは複数の残基への変異が、驚くべきことに、特に一本鎖鋳型核酸の存在下で、リコンビナーゼの活性を高め、リコンビナーゼ媒介増幅反応における播種および／または増幅の向上をもたらすことが分かった。これらの変異リコンビナーゼは、一本鎖アダプター領域を有するＰＣＲライブラリなどのＰＣＲフリーライブラリを、パターン化フローセル表面へ播種する際の性能が改善されており、以下の実施例の項に記載するように、クラスター増幅の改善をもたらす。例えば、本明細書に提示する組換えＵｖｓＸの一部の実施形態では、置換変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−４のいずれかの位置４において、ＰｈｅまたはＡｓｐ以外の任意の残基への変異を含む。ある実施形態では、組換えＵｖｓＸは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−４のいずれかの位置４において、Ｌｙｓへの変異を含む。
【００２８】
一部の実施形態では、半保存ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−６のいずれかに記載された配列を有するアミノ酸を含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−６は、種々の種の間で半保存ドメイン中の残基に相当する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５は、Ｔ４  ＵｖｓＸアミノ酸配列の残基３３２−３３７に相当し、これを、本明細書では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と記載する。半保存ドメインにおける、種々の種の間での保存を示すアライメントを、図１および２に記載する。
【００２９】
本明細書に提示する組換えＵｖｓＸの一部の実施形態では、置換変異には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−６のいずれかの位置４における、ＡｒｇまたはＡｓｐ以外の残基への変異が含まれる。ある実施形態では、組換えＵｖｓＸは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−６のいずれかの位置４において、Ｌｙｓへの変異を含む。
【００３０】
一部の実施形態では、半保存ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のいずれかに記載された配列を有するアミノ酸を含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、種々の種の間で半保存ドメイン中の残基に相当する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６は、Ｔ４  ＵｖｓＸアミノ酸配列の残基３２９−３３７に相当し、これを、本明細書では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と記載する。半保存ドメインにおける、種々の種の間での保存を示すアライメントを、図１および２に記載する。
【００３１】
本明細書に提示する組換えＵｖｓＸの一部の実施形態では、置換変異には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のいずれかの位置７における、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐ以外の残基への変異が含まれる。ある実施形態では、組換えＵｖｓＸは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のいずれかの位置７において、Ｌｙｓへの変異を含む。
【００３２】
一部の実施形態では、リコンビナーゼは、ＵｖｓＸタンパク質である。例えば、マイオウイルス科ファージに由来するＵｖｓＸまたはＵｖｓＸ様リコンビナーゼなどのファージリコンビナーゼ、例えば、Ｔ４、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、エロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ３２、ビブリオファージｎｔ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、およびＲｂ４９を含む、任意のファージリコンビナーゼを、本明細書に提示する実施形態で使用することが可能である。ある実施形態では、リコンビナーゼは、マイオウイルス科ファージに由来するＵｖｓＸまたはＵｖｓＸ様リコンビナーゼ、例えば、Ｔ２、Ｒｂ１４、エロモナスファージ２５、ｐｈｉ−１、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８Ｔ、ファージＲｂ３、およびファージＬＺ２である。他のリコンビナーゼタンパク質を本明細書に提示する実施形態で使用可能であることが、当業者には容易に明らかであろう。適切なリコンビナーゼタンパク質は、以下でさらに詳細に説明するように、例えば、ＢＬＡＳＴアライメントなどの当技術分野で既知のいくつかの方法をいくつでも使用して、ＵｖｓＸに対する相同性により特定することが可能である。
【００３３】
「機能的に同等」とは、まったく異なるリコンビナーゼを使用する研究の場合、コントロールリコンビナーゼが、酵素において同じ機能的役割を有する、他のリコンビナーゼのアミノ酸位置で起きると考えられるアミノ酸置換を含むことを意味する。一例を挙げると、Ｔ４  ＵｖｓＸの位置３２２におけるプロリンからリシンへの変異（Ｐ３２２Ｋ）は、ＲＢ４９  ＵｖｓＸの位置３２１におけるプロリンからリシンへの置換（Ｐ３２１Ｋ）と機能的に同等であろう。同様に、Ｔ４  ＵｖｓＸの位置３５５におけるアルギニンからリシンへの変異（Ｒ３３５Ｋ）は、ＲＢ４９  ＵｖｓＸの位置３３４におけるアスパルテートからリシンへの置換（Ｄ３３４Ｋ）と機能的に同等であろう。
【００３４】
概して、２つ以上の異なるリコンビナーゼにおける機能的に同等の置換変異は、リコンビナーゼのアミノ酸配列中の相同なアミノ酸位置で起きる。つまり、用語「機能的に同等」の本明細書での使用には、所与の変異と「位置的に同等」または「相同」である変異が包含され、その変異アミノ酸の特定の機能が既知であるか否かは無関係である。配列アライメントおよび／または分子モデリングに基づき、２つ以上の異なるリコンビナーゼのアミノ酸配列中の位置的に同等または相同なアミノ酸残基を特定することが可能である。位置的に同等および／または機能的に同等の残基を特定するための配列アライメントの例は、図１に記載されており、図１は、米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号に組み込まれた資料にも記載されている、腸内細菌ファージＴ４（Ｔ４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、腸内細菌ファージＴ６（Ｔ６）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、アシネトバクターファージ１３３（ファージ１３３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、腸内細菌ファージＲＢ６９（Ｒｂ６９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、エロモナスファージＡｅｈ１（Ａｅｈ１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、エロモナスファージ６５（Ａｅ６５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ビブリオファージＫＶＰ４０（Ｋｖｐ４０）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、腸内細菌ファージＲＢ４３（Ｒｂ４３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、プロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ２（ＰＳＳＭ２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、およびプロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ４（ＰＳＳＭ４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）由来のＵｖｓＸアミノ酸配列のアライメントを記載する。図１に示すＵｖｓＸ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース受託番号ＮＰ＿０４９６５６（Ｔ４）、ＹＰ＿００４３００６４７（ファージ１３３）；ＮＰ＿８６１７３４（ＲＢ６９）；ＮＰ＿９４３８９４．１（Ａｅｈ１）；ＹＰ＿００４３００８５８（Ａｅ６５）；ＮＰ＿８９９２５６（ＫＶＰ４０）；ＹＰ＿２３９０１３（ＲＢ４３）；ＹＰ＿２１４４１７（Ｐ−ＳＳＭ２）；ＹＰ＿２１４７０８（Ｐ−ＳＳＭ４）；および米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号（Ｔ６）から得た。
【００３５】
図２は、腸内細菌ファージＲＢ４９（ＲＢ４９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および腸内細菌ファージＴ４（Ｔ４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）由来のＵｖｓＸアミノ酸配列のアライメントを示す図である。ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と位置的および／または機能的に同等である残基を強調表示する。ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１およびＡｓｐ３３４と位置的および／または機能的に同等である残基を強調表示し、三角形の記号により示す。図２に示すＵｖｓＸ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース受託番号ＮＰ＿８９１５９５（ＲＢ４９）およびＮＰ＿０４９６５６（Ｔ４）から得た。
【００３６】
位置的に同等および／または機能的に同等の残基は、任意の数の他のＵｖｓＸ配列の１つまたは複数について、それらの配列と、Ｔ４およびＲＢ４９などの参照配列を整列させることにより、決定することが可能である。非限定的例として、シネココッカスファージＳ−ＰＭ２、腸内細菌ファージＲＢ３２、ビブリオファージｎｔ−１、腸内細菌ファージＲＢ１６由来のＵｖｓＸ配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２１と記載し、これらの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース受託番号ＹＰ＿１９５１６９．１；ＹＰ＿８０２９８２．１；ＹＰ＿００８１２５２０７．１；ＹＰ＿００３８５８３３６．１から得られ、例えば、Ｔ４  ＵｖｓＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびＲＢ４９ＵｖｓＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）などの参照ＵｖｓＸ配列と整列させることが可能であり、位置的に同等および／または機能的に同等な残基が特定される。例として、以下の表１に示す残基は、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ３２１およびＡｓｐ３３４と位置的に同等および／または機能的に同等であると特定される。他のＵｖｓＸタンパク質の位置的に同等および／または機能的に同等な位置は、以下の同様のアプローチにより確認され得ることが、当業者には容易に理解されよう。
【００３７】
【表１−１】
2019509716.tif 000002
【表１−２】
2019509716.tif 000003
【００３８】
本明細書で上述した組換えＵｖｓＸタンパク質は、リコンビナーゼの活性、安定性、または任意の他の所望の特定のうち１つまたは複数を高めることが知られている追加の置換変異を含み得る。例えば、一部の実施形態では、上記の変異のいずれかに加え、組換えＵｖｓＸはさらに、当技術分野で既知であり、米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号（これは、参照によりその全体が組み込まれるものとする）の開示により例示されるように、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列の機能的に同等な位置Ｈｉｓ６３において置換変異を含み得る。例えば、ある実施形態では、組換えＵｖｓＸは、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＨｉｓ６３Ｓｅｒと相同な置換変異を含む、
【００３９】
一部の実施形態では、上記の変異のいずれかに加え、組換えＵｖｓＸはさらに、当技術分野で既知であり、２０１５年９月２９日に出願され、「リコンビナーゼ変異体」と題された米国出願番号第１４／８６９，７４４号（これは、参照によりその全体が組み込まれるものとする）の開示により例示されるように、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列の機能的に同等の位置Ｐｒｏ２５６において置換変異を含み得る。例えば、ある実施形態では、組換えＵｖｓＸは、ＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列のＰｒｏ２５６Ｌｙｓと相同な置換変異を含む。
【００４０】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｐ３２１Ｋ、改変Ｄ３３４Ｋ、改変Ｐ３２１ＫおよびＤ３３４Ｋ、ならびに改変Ｐ３２１Ｋ、Ｄ３３４Ｋ、Ｐ２５６Ｋを含む、Ｐｒｏ３２１、Ａｓｐ３３４、および／またはＰｒｏ２５６で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する腸内細菌ファージＲＢ４９ＵｖｓＸが含まれる。このような改変リコンビナーゼはさらに、例えば、改変Ｈ６３ＳおよびＰ３２１Ｋ、改変Ｈ６３ＳおよびＤ３３４Ｋ、改変Ｈ６３Ｓ、Ｐ３２１Ｋ、およびＤ３３４Ｋ、改変Ｈ６３ＳおよびＰ２５６Ｋ、ならびに改変Ｈ６３Ｓ、Ｐ３２１Ｋ、Ｄ３３４Ｋ、およびＰ２５６Ｋを含む、改変Ｈ６３Ｓを含み得る。
【００４１】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｐ３２２Ｋ、改変Ｒ３３５Ｋ、改変Ｐ３２２ＫおよびＲ３３５Ｋ、ならびに改変Ｆ２５７Ｋ、Ｐ３２２Ｋ、およびＲ３３５Ｋを含む、Ｐｒｏ３２２、Ａｒｇ３３５、および／またはＰｈｅ２５７で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を有する腸内細菌ファージＴ４  ＵｖｓＸが含まれる。
【００４２】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｐ３２４Ｋ、改変Ｒ３３７Ｋ、改変Ｐ３２４ＫおよびＲ３３７Ｋ、ならびに改変Ｆ２５９Ｋ、Ｐ３２４Ｋ、およびＲ３３７Ｋを含む、Ｐｒｏ３２４、Ａｒｇ３３７、および／またはＰｈｅ２５９で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を有する腸内細菌ファージＴ６  ＵｖｓＸが含まれる。このような改変リコンビナーゼはさらに、例えば、改変Ｈ６６ＳおよびＰ３２４Ｋ、改変Ｈ６６ＳおよびＲ３３７Ｋ、改変Ｈ６６Ｓ、Ｐ３２４Ｋ、およびＲ３３７Ｋ、ならびに改変Ｈ６６Ｓ、Ｆ２５９Ｋ、Ｐ３２４Ｋ、およびＲ３３７Ｋを含む、改変Ｈ６６Ｓを含む。
【００４３】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｐ３２０Ｋ、改変Ｔ３３３Ｋ、改変Ｐ３２０ＫおよびＴ３３３Ｋ、ならびに改変Ｐ２５７Ｋ、Ｐ３２０Ｋ、およびＴ３３３Ｋを含む、Ｐｒｏ３２０、Ｔｈｒ３３３、および／またはＰｒｏ２５７で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を有するアシネトバクターファージ１３３  ＵｖｓＸが含まれる。このような改変リコンビナーゼは、さらに、例えば、改変Ｈ６４ＳおよびＰ３２０Ｋ、改変Ｈ６４ＳおよびＴ３３３Ｋ、改変Ｈ６４Ｓ、Ｐ３２０Ｋ、およびＴ３３３Ｋ、ならびに改変Ｈ６４Ｓ、Ｐ２５７Ｋ、Ｐ３２０Ｋ、およびＴ３３３Ｋを含む、改変Ｈ６４Ｓを含み得る。
【００４４】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｐ３２３Ｋ、改変Ｔ３３６Ｋ、改変Ｐ３２３ＫおよびＴ３３６Ｋ、ならびに改変Ｐ２５８Ｋ、Ｐ３２３Ｋ、およびＴ３３６Ｋを含む、Ｐｒｏ２５８、Ｐｒｏ３２３、および／またはＴｈｒ３３６で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を有する腸内細菌ファージＲＢ６９  ＵｖｓＸが含まれる。このような改変リコンビナーゼは、さらに、例えば、改変Ｈ６４ＳおよびＰ３２３Ｋ、改変Ｈ６４ＳおよびＴ３３６Ｋ、改変Ｈ６４Ｓ、Ｐ３２３Ｋ、およびＴ３３６Ｋ、ならびに改変Ｈ６４Ｓ、Ｐ２５８Ｋ、Ｐ３２３Ｋ、およびＴ３３６Ｋを含む、改変Ｈ６４Ｓを含み得る。
【００４５】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｐ３３４Ｋ、改変Ｄ３４７Ｋ、改変Ｐ３３４ＫおよびＤ３４７Ｋ、ならびに改変Ｐ２６９Ｋ、Ｐ３３４Ｋ、およびＤ３４７Ｋを含む、Ｐｒｏ２６９、Ｐｒｏ３３４、および／またはＡｓｐ３４７で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を有するエロモナスファージＡｅｈ１  ＵｖｓＸに由来する、ＵｖｓＸリコンビナーゼが含まれる。このような改変リコンビナーゼはさらに、例えば、改変Ｈ７６ＳおよびＰ３３４Ｋ、改変Ｈ７６ＳおよびＤ３４７Ｋ、改変Ｈ７６Ｓ、Ｐ３３４Ｋ、およびＤ３４７Ｋ、ならびに改変Ｈ７６Ｓ、Ｐ２６９Ｋ、Ｐ３３４Ｋ、およびＤ３４７Ｋを含む、改変Ｈ７６Ｓを含み得る。
【００４６】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｐ３３３Ｋ、改変Ｎ３４６Ｋ、改変Ｐ３３３ＫおよびＮ２３６Ｋ、ならびに改変Ｄ２６６Ｋ、Ｐ３３３Ｋ、およびＮ２３６Ｋを含む、Ａｓｐ２２６、Ｐｒｏ３３３、および／またはＡｓｎ３４６で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を有するエロモナスファージ６５  ＵｖｓＸに由来する、ＵｖｓＸリコンビナーゼが含まれる。このような改変リコンビナーゼはさらに、例えば、改変Ｈ７３ＳおよびＰ３３３Ｋ、改変Ｈ７３ＳおよびＮ３４６Ｋ、改変Ｈ７３Ｓ、Ｐ３３３Ｋ、およびＮ２３６Ｋ、ならびに改変Ｈ７３Ｓ、Ｄ２６６Ｋ、Ｐ３３３Ｋ、およびＮ２３６Ｋを含む、改変Ｈ７３Ｓを含み得る。
【００４７】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｄ３３２Ｋ、改変Ｒ３４５Ｋ、改変Ｄ３３２ＫおよびＲ３４５Ｋ、ならびに改変Ｐ２６７Ｋ、Ｄ３３２Ｋ、およびＲ３４５Ｋを含む、Ｐｒｏ２６７、Ａｓｐ３３２、および／またはＡｒｇ３４５で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を有するビブリオファージＫＶＰ４０  ＵｖｓＸに由来する、ＵｖｓＸリコンビナーゼが含まれる。このような改変リコンビナーゼはさらに、例えば、改変Ｈ６４ＳおよびＤ３３２Ｋ、改変Ｈ６４ＳおよびＲ３４５Ｋ、改変Ｈ６４Ｓ、Ｄ３３２Ｋ、およびＲ３４５Ｋ、ならびに改変Ｈ６４Ｓ、Ｐ２６７Ｋ、Ｄ３３２Ｋ、およびＲ３４５Ｋを含む、改変Ｈ６４Ｓを含み得る。
【００４８】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｐ３２４Ｋ、改変Ｄ３３７Ｋ、改変Ｐ３２４ＫおよびＤ３３７Ｋ、ならびに改変Ｐ２５９Ｋ、Ｐ３２４Ｋ、およびＤ３３７Ｋを含む、Ｐｒｏ２５９、Ｐｒｏ３２４、および／またはＡｓｐ３３７で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を有する腸内細菌ファージＲＢ４３  ＵｖｓＸが含まれる。このような改変リコンビナーゼさらに、例えば、改変Ｈ６６ＳおよびＰ３２４Ｋ、改変Ｈ６６ＳおよびＤ３３７Ｋ、改変Ｈ６６Ｓｍ  Ｐ３２４Ｋ、およびＤ３３７Ｋ、ならびに改変Ｈ６６Ｓ、Ｐ２５９Ｋ、Ｐ３２４Ｋ、およびＤ３３７Ｋを含む、改変Ｈ６６Ｓを含み得る。
【００４９】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｅ３２８Ｋならびに改変Ｑ２６１ＫおよびＥ３２８Ｋを含む、Ｇｌｎ２６１および／またはＧｌｕ３２８で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を有するプロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ２  ＵｖｓＸに由来するＵｖｓＸリコンビナーゼが含まれる。このような改変リコンビナーゼはさらに、例えば、改変Ｔ６２ＳおよびＥ３２８Ｋならびに改変Ｔ６２Ｓ、Ｑ２６１Ｋ、およびＥ３２８Ｋを含む、改変Ｔ６２Ｓを含み得る。
【００５０】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、Ｋ３３０での改変を含む、Ｌｙｓ３３０で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７を有するプロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ４  ＵｖｓＸが含まれる。このような改変リコンビナーゼはさらに、改変Ｔ６５Ｓを含み得る。
【００５１】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｒ３３１Ｋならびに改変Ｅ２６４ＫおよびＲ３３１Ｋを含む、Ａｒｇ３３１および／またはＧｌｕ２６４で改変を含むアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１8を有するシネココッカスファージＳ−ＰＭ２  ＵｖｓＸが含まれる。このような改変リコンビナーゼはさらに、例えば、改変Ｔ６５ＳおよびＲ３３１Ｋならびに改変Ｔ６５Ｓ、Ｅ２６４Ｋ、およびＲ３３１Ｋを含む、改変Ｔ６５Ｓを含み得る。
【００５２】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｐ３２４Ｋ、改変Ｒ３３７Ｋ、ならびに改変Ｐ３２４ＫおよびＲ３３７Ｋを含む、Ｐｒｏ３２４および／またはＡｒｇ３３７で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９を有する腸内細菌ファージＲＢ３２  ＵｖｓＸが含まれる。このような改変リコンビナーゼはさらに、例えば、改変Ｈ６６ＳおよびＰ３２４Ｋ、改変Ｈ６６ＳおよびＲ３３７Ｋ、ならびに改変Ｈ６６Ｓ、Ｐ３２４Ｋ、およびＲ３３７Ｋを含む、改変Ｈ６６Ｓを含み得る。
【００５３】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｅ３３２Ｋ、改変Ｒ３４５Ｋ、改変Ｅ３３２ＫおよびＲ３４５Ｋ、ならびに改変Ｆ２５９、Ｅ３３２Ｋ、およびＲ３４５Ｋを含む、Ｐｈｅ２５９、Ｇｌｕ３３２、および／またはＡｒｇ３４５で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を有するビブリオファージｎｔ−１  ＵｖｓＸが含まれる。このような改変リコンビナーゼはさらに、例えば、改変Ｈ６４ＳおよびＥ３３２Ｋ、改変Ｈ６４ＳおよびＲ３４５Ｋ、改変Ｈ６４Ｓ、Ｅ３３２Ｋ、およびＲ３４５Ｋ、ならびに改変Ｈ６４Ｓ、Ｆ２５９、Ｅ３３２Ｋ、およびＲ３４５Ｋを含む、改変Ｈ６４Ｓを含み得る。
【００５４】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、例えば、改変Ｐ３２４Ｋ、改変Ｄ３３７Ｋ、改変Ｐ３２４ＫおよびＤ３３７Ｋ、ならびに改変Ｐ２５９Ｋ、Ｐ３２４Ｋ、およびＤ３３７Ｋを含む、Ｐｒｏ２５９、Ｐｒｏ３２４、および／またはＡｓｐ３３７で改変を有するアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１を有する腸内細菌ファージＲＢ１６  ＵｖｓＸが含まれる。このような改変リコンビナーゼはさらに、例えば、改変Ｈ６６ＳおよびＰ３２４Ｋ、改変Ｈ６６ＳおよびＤ３３７Ｋ、改変Ｈ６６Ｓ、Ｐ３２４Ｋ、およびＤ３３７Ｋ、ならびに改変Ｈ６６Ｓ、Ｐ２５９Ｋ、Ｐ３２４Ｋ、およびＤ３３７Ｋを含む、改変Ｈ６６Ｓを含み得る。
【００５５】
一部の実施形態では、改変リコンビナーゼには、本明細書に含まれる表１〜５のいずれか１つに記載するようなＵｖｓＸリコンビナーゼが含まれる。
【００５６】
一部の実施形態では、上記の変異のいずれかに加え、組換えＵｖｓＸは、野生型リコンビナーゼと比較して、追加の置換、欠失、および／または追加の変異を含み得る。１つまたは複数の位置における種々の置換変異の何れも、当技術分野で既知であり、２００９／００２９４２１（これは、参照により組み込まれるものとする）の資料に例示されるように行うことが可能である。例えば、一部の実施形態では、上記の変異に加え、組換えＵｖｓＸはさらに、Ｃ末端における１つまたは複数のグルタミン酸残基の付加；Ｃ末端における１つまたは複数のアスパラギン酸残基の付加；およびその組み合わせからなる群から選択される変異を含み得る。
【００５７】
リコンビナーゼの変異体化
例えば、例えばリコンビナーゼモデルおよびモデル予測に従って、または、ランダムもしくはセミランダムな変異アプローチを使用し、例えば、リコンビナーゼを修飾してバリアントを生成するために、種々の突然変異誘発を任意選択的に本開示において使用する。概して、リコンビナーゼ変異体を作製するために、任意の利用可能な突然変異誘発手順を使用することが可能である。このような突然変異誘発手順には、任意選択的に、１つまたは複数の対象活性（例えば、固体支持体上での播種および／または増幅の強化）のために、変異核酸およびポリペプチドの選択が含まれる。使用可能な手順としては、限定するわけではないが、部位特異的突然変異生、ランダム点突然変異誘発、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの相同組換え（ＤＮＡシャッフリングおよび組み合わせオーバーラップＰＣＲ）、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指向型突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップ入り二重鎖ＤＮＡを使用する突然変異誘発、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択および制限−精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、ディジェネレートＰＣＲ、二本鎖切断修復、ならびに当業者に周知の多くの他のものが挙げられる。変異用出発リコンビナーゼは、例えば、米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号（これは、参照によりその全体が組み込まれるものとする）で特定されているものなどの、利用可能なリコンビナーゼ変異体を含む、本明細書に記載のもののいずれかとすることが可能である。
【００５８】
任意選択的に、突然変異誘発は、天然に存在するリコンビナーゼ分子からの既知の情報、または、既知の改変もしくは変異リコンビナーゼ（例えば、前記参考文献で述べた既存の変異リコンビナーゼを使用する）についての既知の情報、例えば、配列、配列比較、物理的特性、結晶構造、および／または上記で論じたものにより導かれ得る。しかしながら、別の部類の実施形態では、修飾は、本質的にランダムである（例えば、伝統的なまたは「ファミリー」のＤＮＡシャッフリングと同様である。例えば、Crameri et al. (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391:288-291を参照にされたい）。
【００５９】
変異形式についての追加の情報は：Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook")；Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (２０１１年まで増補) ("Ausubel"))、およびPCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990) ("Innis")に見られる。以下の刊行物および中で引用される参考文献は、変異形式についてさらなる詳細を提供する：Arnold, “Protein engineering for unusual environments,” Current Opinion in Biotechnology4:450-455 (1993)；Bass et al., “Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities,” Science242:240-245 (1988)；Bordo and Argos (1991) “Suggestions for "Safe" Residue Substitutions” in Site-directed Mutagenesis 217:721-729；Botstein and Shortle, “Strategies and applications of in vitro mutagenesis,” Science 229:1193-1201 (1985)；Carter et al., “Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors,” Nucl Acids Res13: 4431-4443 (1985)；Carter, “Site-directed mutagenesis,” Biochem J 237:1-7 (1986)；Carter, “Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors,” Methods in Enzymol 154: 382-403 (1987)；Dale et al., “Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method,” Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996)；Eghtedarzadeh and Henikoff, “Use of oligonucleotides to generate large deletions,” Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986)；Fritz et al., “Oligonucleotide-directed construction of mutation : a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro,” Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988)；Grundstrom et al., “Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis,” Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985)；Hayes (2002) “Combining Computational and Experimental Screening for rapid Optimization of Protein Properties,” PNAS 99 (25) 15926-15931；Kunkel, “The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis,” in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)) (1987); Kunkel, “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection,”  PNAS 82:488-492 (1985)；Kunkel et al., “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection,” Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)；Kramer et al., “The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed  mutation construction,” Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)；Kramer and Fritz, “Oligonucleotide-directed construction of mutation  via gapped duplex DNA,” Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987)；Kramer et al., “Point Mismatch Repair,” Cell 38:879-887 (1984)；Kramer et al., “Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutation ,” Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988)；Ling et al., “Approaches to DNA mutagenesis: an overview,” Anal Biochem. 254 (2): 157-178 (1997)；Lorimer and Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)；Mandecki, “Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986)；Nakamaye and Eckstein, “Inhibition of restriction endonuclease NciI cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis,” Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986)；Nambiar et al., “Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein,” Science 223: 1299-1301 (1984)；Sakamar and Khorana, “Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin),” Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988)；Sayers et al., “Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis,” Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988)；Sayers et al., “Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide,” Nucl. Acids Res. 16: 803-814 (1988)；Sieber, et al., Nature Biotechnology19:456-460 (2001)；Smith, “In vitro mutagenesis,” Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985)；Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983)；Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987)；Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994)；Taylor et al., “The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA,” Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985)；Taylor et al., “The rapid generation of oligonucleotide-directed mutation  at high frequency using phosphorothioate-modified DNA,” Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985)；Wells et al., “Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin,” Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)；Wells et al., “Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutation  at defined sites,” Gene 34:315-323 (1985)；Zoller and Smith, “Oligonucleotide-directed mutagenesis using M 13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutation  in any DNA fragment,” Nucleic Acids Res.10:6487-6500 (1982)；Zoller and Smith, “Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors,” Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)；Zoller and Smith, “Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template,” Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987)；Clackson et al., “Making antibody fragments using phage display libraries,” Nature 352:624-628 (1991)；Gibbs et al., “Degenerate oligonucleotide gene shuffling (DOGS): a method for enhancing the frequency of recombination with family shuffling,” Gene 271:13-20 (2001)；およびHiraga and Arnold, “General method for sequence-independent site-directed chimeragenesis,” J. Mol. Biol. 330:287-296 (2003)。上記方法の多くについての追加の詳細は、Methods in Enzymology Volume 154に見られ、これは、種々の突然変異誘発法に伴うトラブルシューティング問題のための有用なコントロールについても記載する。
【００６０】
組換えリコンビナーゼの作製および単離
概して、本明細書に提示するリコンビナーゼをコードする核酸は、クローニング、組換え、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅、および／または他の利用可能な方法により作製することが可能である。本明細書に提示するリコンビナーゼをコードする発現ベクターを発現させるために、種々の組換え方法を使用することが可能である。組換え核酸の作製、発現、および発現産物の単離のための方法は、当技術分野で周知であり、記載されている。いくつかの例示的な変異および変異の組み合わせ、ならびに所望の変異の設計のための戦略について、本明細書で記載する。
【００６１】
変異、組換え、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの核酸操作の方法（クローニング、発現、ＰＣＲなどを含む）についての追加の有用な参考文献としては、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology Volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger)；Kaufman et al. (2003) Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine Second Edition Ceske (ed) CRC Press (Kaufman)；The Nucleic Acid Protocols Handbook Ralph Rapley (ed) (2000) Cold Spring Harbor, Humana Press Inc (Rapley)；Chen et al. (ed) PCR Cloning Protocols, Second Edition (Methods in Molecular Biology, volume 192) Humana Press；およびViljoen et al. (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer, ISBN 1402034032が挙げられる。
【００６２】
加えて、プラスミドまたは他の関連する核酸を細胞から精製するための極めて多量のキットが、商業的に利用可能である（例えば、両方ともＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製であるＥＡＳＹ  ＰＲＥＰ（商標）およびＦＬＥＸＩＰＲＰＥＰ（商標）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製のＳＴＲＡＴＡＣＬＥＡＮ（商標）；およびＱｉａｇｅｎ社製のＱＩＡＰＲＥＰ（商標）を参照されたい）。任意の単離したおよび／または精製した核酸は、さらに操作して他の核酸を精製すること、細胞をトランスフェクトするために使用すること、および／または、発現させるために関連ベクターに組み込んで生物に感染させることなどが可能である。典型的なクローニングベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、転写開始配列および翻訳開始配列、ならびに、特定の標的核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは、任意選択的に、一般的な発現カセットを含み、該カセットは、少なくとも１つの独立したターミネーター配列と、真核生物または原核生物またはその両方において前記カセットの複製を可能にする配列（例えば、シャトルベクター）と、真核生物系および原核生物系の両方のための選択マーカーとを含む。ベクターは、真核生物、原核生物、またはその両方における複製および組込みに適している。
【００６３】
例えば、（例えば、その後の核酸単離のための）細胞単離および培養についての他の有用な参考文献としては、Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York and the references cited therein；Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.；Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)、およびAtlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, Flaが挙げられる。
【００６４】
本明細書に開示する組換えリコンビナーゼをコードする核酸は、また、本明細書で提示する実施形態の特徴でもある。特定のアミノ酸は、多数のコドンによりコードされ得、ある翻訳系（例えば、原核細胞または真核細胞）は、しばしば、コドンバイアスを示し、例えば、別個の生物は、しばしば、同一のアミノ酸をコードするいくつかの同義コドンのうち１つを好む。したがって、本明細書に提示する核酸は、任意選択的に「コドン最適化」されており、これは、リコンビナーゼを発現するために利用する特定の翻訳系が好むコドンを含むように、核酸が合成されることを意味する。例えば、細菌細胞（または、特定の細菌株であっても）においてリコンビナーゼを発現させることが望ましい場合、リコンビナーゼの効率的な発現のために、その細菌細胞のゲノムで最も頻繁に見られるコドンを含むように核酸を合成することが可能である。真核細胞においてリコンビナーゼを発現させることが望ましい場合も、同様の戦略を用いることが可能であり、例えば、核酸は、その真核細胞が好むコドンを含み得る。
【００６５】
たんぱく質を単離し検出する種々の方法が既知であり、該方法を使用して、例えば、本明細書に提示する組換えリコンビナーゼを発現する細胞の組換え培養物から、リコンビナーゼを単離することが可能である。たんぱく質を単離し検出する種々の方法が当技術分野で周知であり、例えば、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)；Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)；Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.；Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY；Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England；Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY；Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY；およびWalker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ；ならびに前記文献で引用されている参考文献に記載されているものが挙げられる。タンパク質を精製し検出する方法に関する追加の詳細は、Satinder Ahuja ed., Handbook of Bioseparations, Academic Press (2000)に見られる。
【００６６】
使用方法
本明細書に提示する改変リコンビナーゼは、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）技法などの、リコンビナーゼ媒介増幅手順で使用することが可能である。簡潔に言うと、ＲＰＡは、標的核酸を、リコンビナーゼと標的核酸分子に特異的な一本鎖核酸プライマーとに接触させることにより開始され得る。次に、ハイブリダイズしたプライマーが、ポリメラーゼ、例えば、ｄＮＴＰの存在下で鎖置換することが可能なポリメラーゼなどにより伸長されて、二本鎖標的核酸分子および核酸分子の置換鎖を生成され得る。リコンビナーゼに媒介されてプライマーが核酸分子の置換鎖を標的し、プライマーが伸長して、二本鎖核酸分子を生成することにより、さらなる増幅が起きる。ＲＰＡプロセスは、上記の成分と、例えば、リコンビナーゼ搭載因子、特異的鎖置換ポリメラーゼ、および頑健なエネルギー再生システムとの組み合わせにより調節することが可能である。本開示の組換えＵｖｓＸタンパク質を用いる使用に容易に適応させることが可能な例示的なＲＰＡ手順、システム、および成分は、例えば、米国特許第８，０７１，３０８号；同第７，３９９，５９０号；同第７，４８５，４２８号；同第７，２７０，９８１号；同第８，０３０，０００号；同第７，６６６，５９８号；同第７，７６３，４２７号；同第８，０１７，３９９号；同第８，０６２，８５０号；および同第７，４３５，５６１号に記載されており、前記文献はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００６７】
一部の実施形態では、排除増幅（ＥｘＡｍｐ）ともいう動力学排除増幅（ＫＥＡ）を使用して、等温増幅を行うことが可能である。本開示の核酸ライブラリは、動力学排除を利用する方法を使用して作製することが可能である。動力学排除は、プロセスが、別の事象またはプロセスが起こるのを効果的に排除するのに十分なほど迅速な速度で起こる場合に起こり得る。核酸アレイの作製を例にとると、アレイの部位に溶液由来の標的核酸がランダムに播種されると、増幅プロセスで標的核酸のコピーが生成されて、各播種部位をいっぱいに満たす。本開示の動力学排除法によれば、増幅速度が播種速度を超える条件下では、播種プロセスと増幅プロセスが同時に進行し得る。したがって、第１標的核酸が播種された部位でコピーが作製される速度が比較的迅速なことにより、第２核酸が増幅のためにその部位に播種されることは効率的に排除されるだろう。動力学排除増幅法は、米国特許出願公開第２０１３／０３３８０４２号（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする）の開示に詳細に記載されているように実行することが可能である。
【００６８】
一部の実施形態では、増幅された標的核酸は完全に二本鎖である。一部の実施形態では、増幅された標的核酸は二本鎖核酸領域を含み、また、一本鎖核酸を有する領域も含む。ある実施形態では、標的核酸は、ライブラリ断片の各端に約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４０超の塩基の一本鎖配列領域を有する、１つまたは複数のフォーク型アダプターを含む。フォーク型アダプターの設計および使用は、米国特許第７，７４２，４６３号および同第８，５６３，７４８号（これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする）の開示により詳細に記載されている。
【００６９】
動力学排除は、標的核酸の第１コピーを作製する速度が比較的遅いのに対し、標的核酸または第１コピーの後続コピーを作製する速度が比較的迅速であることを利用し得る。前記段落の例では、標的核酸の播種速度が比較的遅い（例えば、拡散または移送が比較的遅い）のに対し、増幅が起きて核酸種のコピーで部位を満たす速度が比較的迅速であることにより、動力学排除は起きる。別の例示的な実施形態では、部位に播種された標的核酸の第１コピーの形成が遅れる（例えば、活性化が遅れるまたは遅い）のに対し、後続コピーが作製されて部位を満たす速度が比較的迅速であることにより、動力学排除は起き得る。この例では、個々の部位に、いくつかの異なる標的核酸が播種された可能性がある（例えば、いくつかの標的核酸が、増幅前に各部位に存在し得る）。しかしながら、任意の所与の標的核酸の第１コピーの形成は、ランダムに活性化され得、その結果、第１コピー形成の平均速度は、後続コピーが生成される速度と比較し比較的遅くなる。この場合、個々の部位にいくつかの異なる標的核酸が播種された可能性があっても、動力学排除により、その標的核酸のうち１つのみを増幅することが可能になろう。具体的には、いったん第１標的核酸が増幅のために活性化されると、部位は迅速にそのコピーで満たされ、それにより第２標的核酸のコピーがその部位で作製されるのが防止される。
【００７０】
増幅試薬は、増幅産物の形成を促進し、いくつかの場合では増幅産物の形成速度を上昇させる、さらなる成分を含み得る。例えばＵｖｓＸなどのリコンビナーゼは、反復的な侵入／伸長を可能にすることにより、増幅産物の形成を促進し得る。より具体的には、リコンビナーゼは、ポリメラーゼが標的核酸に侵入することと、標的核酸を増幅産物形成の鋳型として使用する、ポリメラーゼによるプライマー伸長を促進し得る。このプロセスは、侵入／伸長の各ラウンドから生成された増幅産物が、後続のラウンドで鋳型として機能する、連鎖反応として繰り返され得る。このプロセスは、変性サイクル（例えば、加熱または化学変性による）を必要としないため、標準的なＰＣＲよりも迅速に起こり得る。したがって、リコンビナーゼ促進増幅を等温で実行することができる。増幅を促進するため、リコンビナーゼ促進増幅試薬が、ＡＴＰまたは他のヌクレオチド（または、いくつかの場合には、それらの非加水分解性類似体）を含むことが概して望ましい。リコンビナーゼと一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質の混合物は、ＳＳＢがさらに増幅を促進し得ることが可能であるため、特に有用である。リコンビナーゼ促進増幅のための例示的配合物としては、ＴｗｉｓｔＤｘ（英国、ケンブリッジ）がＴｗｉｓｔＡｍｐキットとして商業的に販売しているものが挙げられる。リコンビナーゼ促進増幅試薬の有用な成分および反応条件は、米国特許第５，２２３，４１４号および同７，３９９，５９０号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００７１】
配列比較、同一性、および相同性
用語「同一の」または「同一率（percent identity）」は、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において、最大一致について比較し、整列させた場合に、以下に記載する配列比較アルゴリズム（もしくは当業者が利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用してまたは目視検査により測定した際に、同一であるか、または、特定の同一率である、アミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。
【００７２】
句「実質的に同一の」は、２つの核酸またはポリペプチド（例えば、リコンビナーゼをコードするＤＮＡまたはリコンビナーゼのアミノ酸配列）の文脈において、最大一致について比較し、整列させた場合に、配列比較アルゴリズムを使用してまたは目視検査により測定した際、少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％、またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。このような「実質的に同一の」配列は、典型的には、実際の祖先を参照することなく、「相同」であると考えられる。好適には、「実質的同一性」は、少なくとも約５０残基長の配列領域にわたって、より好適には少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好適には、配列は、比較する２つの配列の少なくとも約１５０残基にわたって、または全長にわって、実質的に同一である。
【００７３】
たんぱく質および／またはタンパク質配列は、共通の祖先タンパク質または祖先タンパク質配列に、天然にまたは人工的に由来する場合は「相同」である。同様に、核酸および／または核酸配列は、共通の祖先核酸または祖先核酸配列に、天然にまたは人工的に由来する場合は相同である。相同性は、概して、２つ以上の核酸またはタンパク質（またはその配列）の間の配列類似性より推測される。相同性を確立するのに有用な配列間の正確な類似率は、問題の核酸およびタンパク質によって異なるが、５０、１００、１５０、またはそれ以上の残基にわたってわずか２５％の配列類似性が、決まって相同性の確立に使用される。より高いレベルの配列類似性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％、またはそれ以上も、相同性の確立に使用することが可能である。配列類似パーセンテージを求める方法（例えば、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）が本明細書に記載され、一般に利用可能である。
【００７４】
配列比較および相同性決定では、典型的には、１つの配列が、テスト配列と比較する参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テスト配列および参照配列がコンピュータにインプットされ、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列を基準としたテスト配列の配列同一率を計算する。
【００７５】
比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局地的相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法によって、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実施（Wisconsin Genetics Software PackageのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.）によって、または、目視検査によって行うことが可能である（概して、２００４年まで増補された、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい）。
【００７６】
配列同一率および配列類似性を求めるのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Altschul et al., J. Mol. Biol.215:403-410 (1990)に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通して好適に利用可能である。このアルゴリズムは、第１に、データベース配列中の長さが同じ文字列と整列させた場合に、いくつかの正の数の閾値スコアＴとマッチするかまたはそれを満たす、検索配列中の長さＷの短い文字列を特定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、隣接文字列スコア閾値と呼ばれる（上記Altschul et al.）。これらの最初の隣接文字列ヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見つける検索を開始するための種として機能する。次に、その文字列ヒットは、累積アライメントスコアが増加する限り、各配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（マッチする残基対に対するリウォードスコア（reward score）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列では、スコアマトリックスを使用して累積スコアが計算される。各方向での文字列ヒットの伸長は、以下の場合：累積アライメントスコアが、その最大達成値から量Ｘ分、低下する場合；１つもしくは複数の負のスコアの残基アライメントの蓄積により、累積スコアが０以下になる場合；または、いずれかの配列の末端に到達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、文字列長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、文字列長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい）。
【００７７】
配列同一率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性についての統計解析も行う（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される１つの類似性尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチが偶然起こるであろう確率の指標を提供する。例えば、テスト核酸と参照核酸の比較における最小合計確率が約０．１未満、より好適には約０．０１未満、最も好適には約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似していると考えられる。
【００７８】
改変リコンビナーゼをコードする核酸
本明細書でさらに提示するのは、本明細書で提示する改変リコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子である。あるリコンビナーゼの変異バージョンであり、そのリコンビナーゼをコードするアミノ酸配列、好ましくは野生型のヌクレオチド配列が既知である、任意の所与の改変リコンビナーゼについては、分子生物学の基本原理に従って、その変異型をコードするヌクレオチド配列を得ることが可能である。例えば、ＲＢ４９  ＵｖｓＸリコンビナーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列が既知であるとすれば、標準的な遺伝暗号を使用して、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する、任意の所与のＲＢ４９  ＵｖｓＸ変異バージョンをコードするヌクレオチド配列を推定することが可能である。同様に、変異バージョンの他のリコンビナーゼ、例えば、Ｔ４、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、エロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ３２、ビブリオファージｎｔ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、Ｔ２、Ｒｂ１４、エロモナスファージ２５、ｐｈｉ−１、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８Ｔ、ファージＲｂ３、およびファージＬＺ２などについて、ヌクレオチド配列を容易に導き出すことが可能である。次に、当技術分野で既知の標準的な分子生物学的技法を使用して、必要とされるヌクレオチド配列を有する核酸分子を構築することができる。
【００７９】
本明細書で提示する実施形態によると、定義される核酸は、同一の核酸だけではなく、任意の軽微な塩基バリエーションも含み、特に、保存性アミノ酸置換において、縮重コードにより同義コドン（同じアミノ酸残基を特定する別のコドン）がもたらされる場合では、置換を含む。用語「核酸配列」にはまた、塩基バリエーションに関してもたらされる任意の一本鎖配列に対する相補的な配列が含まれる。
【００８０】
本明細書に記載の核酸分子はまた、有利なことに、それがコードするリコンビナーゼタンパク質を適切な宿主において発現させるのに適した発現ベクターに含まれ得る。前記細胞のその後の形質転換およびその形質転換細胞のその後の選択に適した発現ベクターに、クローン化ＤＮＡを組み込むことは、Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（これは、参照によってその全体が組み込まれるものとする）で提供されるように当業者にとって周知である。
【００８１】
そのような発現ベクターには、本明細書で示す実施形態の核酸が、そのＤＮＡ断片の発現を生じさせ得るプロモーター領域などの調節配列に作動可能に連結したベクターが含まれる。用語「作動可能に連結した」は、記載される成分が、意図された様式で機能することを可能にする関係にある、並置を指す。そのようなベクターで適切な宿主細胞を形質転換して、本明細書で示す実施形態によるタンパク質を発現させることができる。
【００８２】
核酸分子は、成熟タンパク質をコードしてもよいし、後に宿主細胞により切断されて成熟タンパク質を形成する、タンパク質前駆体のリーダー配列をコードするタンパク質を含む、プロ配列を有するタンパク質をコードしてもよい。ベクターは、例えば、複製起点と、任意選択的に前記ヌクレオチドの発現用プロモーターと、任意選択的に前記プロモーターの制御因子を伴う、プラスミド、ウイルス、またはファージベクターであり得る。ベクターは、例えば、抗生物質耐性遺伝子などの、１つまたは複数の選択マーカーを含み得る。
【００８３】
発現に必要とされる制御エレメントには、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、適切なレベルの転写開始を指示するプロモーター配列が含まれ、また、リボソーム結合のための翻訳開始配列も含まれる。例えば、細菌性発現ベクターは、ｌａｃプロモーターなどのプロモーター、翻訳開始のためのシャイン−ダルガルノ配列、および、開始コドンＡＵＧを含み得る。同様に、真核性発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する異種または同種のプロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソーム脱離のための終止コドンを含み得る。このようなベクターは商業的に得ることができ、または、当技術分野で周知の方法によって、記載の配列から組み立てることができる。
【００８４】
ベクターにエンハンサー配列を含めることによって、リコンビナーゼをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写を最適化することができる。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写レベルを上げる、ＤＮＡのシス作用エレメントである。ベクターは、また、概して、選択マーカーに加えて、複製起点も含む。
【実施例】
【００８５】
〔実施例１〕
Ｐ３２１Ｋと相同な変異を有する変異体の評価
Ｐ３２１Ｋと相同な変異を有するリコンビナーゼ変異体の能力を評価する。この例では、野生型リコンビナーゼを、以下の表の「コントロール」欄に記載するように、ＲＢ４９のＨ６３Ｓと相同な変異を含むように修正することによって、「コントロール」リコンビナーゼを生成する。「Ｐ３２１Ｋ相同体」変異体は、以下の表２の「Ｐ３２１Ｋ相同体」欄に記載するように、ＲＢ４９のＰ３２１Ｋと相同な変異を担持するように、前記コントロールをさらに修正することにより生成する。
【００８６】
例えば、Ｔ６  ＵｖｓＸの場合、野生型Ｔ６  ＵｖｓＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を、Ｈ６６Ｓ変異を担持するように修正することにより、コントロールを生成する。Ｐ３２１Ｋ相同体は、Ｈ６６Ｓ変異およびＰ３２４Ｋ変異の両方を担持するようにさらに修正する。
【００８７】
【表２】
2019509716.tif 000004
【００８８】
パターン化フローセル上でのＰＣＲフリーライブラリのクラスター化を、以下に記載するように、コントロールまたはＰ３２１Ｋ変異体のいずれかを使用してｃＢｏｔ上で行う。次に、シーケンシングをＨｉｓｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）上で行い、シーケンシング結果を以下に記載するように解析して、これまでのシーケンシングデータでは典型的には十分に示されていない、種々の領域のコール可能性を求める。
【００８９】
コントロール対Ｐ２５６Ｋ相同体変異体でのコール可能性データの比較により、Ｐ３２１Ｋ相同体変異体が、コントロールと比較し、フォスミドプロモーター領域、Ｈｉｇｈ  ＧＣ、Ｈｕｇｅ  ＧＣ、Ｌｏｗ  ＧＣ、Ｈｉｇｈ  ＡＴ、Ｈｕｇｅ  ＡＴ、およびＡＴジヌクレオチド反復領域のうち１つまたは複数のコール可能性において、予想外かつ有意な改善を示すことを実証する。
【００９０】
クラスター化の有効性の決定
ＰＣＲフリーライブラリをパターン化フローセル表面に播種する際の変異体リコンビナーゼ配合物の有効性を評価するため、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＤＮＡ  ＰＣＲフリーサンプル調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）を使用してＰＣＲフリーライブラリを生成する。ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＤＮＡ  ＰＣＲフリーサンプル調製キットを使用して生成したＰＣＲフリーライブラリは、ライブラリ断片の各端に約４０塩基の一本鎖配列領域を有するフォーク型アダプターを有する。
【００９１】
ライブラリを、Ｔ４  ＵｖｓＸ配合物または変異リコンビナーゼ配合物と混合して１００ｐＭの終濃度にし、フローセル上に流し、３８℃でｃＢｏｔ上でインキュベートする。１時間のインキュベーション期間後、温度を２０℃に下げ、フローセルをＨＴ２洗浄緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で洗浄する。クラスターを、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／０．１Ｍアスコルビン酸ナトリウム中に１：５，０００で希釈したＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Life Technologies）で染色し、蛍光顕微鏡で画像化した。蛍光強度に基づき、変異リコンビナーゼを含む配合物を使用して、ＰＣＲフリーライブラリをパターン化フローセルに播種することにより生成されたクラスターの密度が、著しく上昇していることを確認する。
【００９２】
次に、Ｈｉｓｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）上でシーケンシングを行い、そのシーケンシング結果を解析して、これまでのシーケンシングデータでは典型的には十分に示されていない種々の領域のコール可能性を求める。
【００９３】
コール可能性は、一塩基多型（ＳＮＰ）が正確にコールされる部位の割合の尺度である。理想的には、この値は１（１００％に相当する）であり、これは、特定のタイプの領域（すなわち、Ｈｉｇｈ  ＧＣなど）内の１００％の部位でＳＮＰが正確にコールされることを意味する。カバー度は、カバー度＞ｎを有する部位の割合の尺度であり、ｎは、典型的には３０×（すなわち、ヒトゲノムに対する標準的なカバー度）である。フォスミドプロモーターは、１００個の遺伝子プロモーターのセットであり、これは、これまでのシークエンシングデータでは十分に示されていないことが確認されている。このプロモーターをフォスミドベクターにクローン化する。Ｈｉｇｈ  ＧＣ領域は、ＧＣ含量が７５％以上（Ｎ５０（Ｇ＋Ｃ≧０．７５）１００  Ｎ５０）である少なくとも１００ｂｐを有する領域と定義され得る。Ｈｕｇｅ  ＧＣ領域は、ＧＣ含量が８５％以上（Ｎ５０（Ｇ＋Ｃ≧０．８５）１００  Ｎ５０）である少なくとも１００ｂｐを有する領域と定義され得る。Ｌｏｗ  ＧＣ領域は、ＧＣ含量が４０％以下（Ｎ５０（Ｇ＋Ｃ≧０．４０）１００  Ｎ５０）である少なくとも１００ｂｐを有する領域と定義され得る。Ｈｉｇｈ  ＡＴ領域は、〜５０ｋ領域にダウンサンプリングされる、ＡＴ含量が７５％以上（Ｎ５０（Ａ＋Ｔ≧０．７５）１００  Ｎ５０）である少なくとも１００ｂｐを有する領域と定義され得る。Ｈｕｇｅ  ＡＴ領域は、〜５０Ｋ領域にダウンサンプリングされる、ＡＴ含量が８５％（Ｎ５０（Ａ＋Ｔ≧０．８５）１００  Ｎ５０）以上少なくとも１００ｂｐを有する領域と定義され得る。ＡＴジヌクレオチド反復領域は、ＡＴＡＴ反復の長いストレッチを含む領域と定義され得る。
【００９４】
コントロール対変異体でのコール可能性データの比較により、変異体が、コントロールと比較して、フォスミドプロモーター領域、Ｈｉｇｈ  ＧＣ、Ｈｕｇｅ  ＧＣ、Ｌｏｗ  ＧＣ、Ｈｉｇｈ  ＡＴ、Ｈｕｇｅ  ＡＴ、およびＡＴジヌクレオチド反復領域のうち１つまたは複数のコール可能性において予想外かつ有意な改善を示すことを実証する。
【００９５】
〔実施例２〕
Ｄ３３４Ｋと相同な変異を有する変異体の評価
Ｄ３３４Ｋと相同な変異を有するリコンビナーゼ変異体の能力を評価する。この例では、野生型リコンビナーゼを、以下の表３の「コントロール」欄に記載するように、ＲＢ４９のＨ６３Ｓと相同な変異を含むように修正することによって、「コントロール」リコンビナーゼを生成する。「Ｄ３３４Ｋ相同体」変異体は、以下の表の「Ｄ３３４Ｋ相同体」欄に記載するように、ＲＢ４９のＤ３３４Ｋと相同な変異を担持するように、前記コントロールをさらに修正することにより生成する。
【００９６】
例えば、Ｔ６  ＵｖｓＸの場合、野生型Ｔ６  ＵｖｓＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を、Ｈ６６Ｓ変異を担持するように修正することにより、コントロールを生成する。Ｄ３３４Ｋ相同体は、Ｈ６６Ｓ変異およびＲ３３７Ｋ変異の両方を担持するようにさらに修正する。
【００９７】
【表３−１】
2019509716.tif 000005
【表３−２】
2019509716.tif 000006
【００９８】
パターン化フローセル上でのＰＣＲフリーライブラリのクラスター化を、上記の実施例１に記載するように、コントロールまたはＤ３３４Ｋ変異体のいずれかを使用してｃＢｏｔ上で行う。次に、シーケンシングをＨｉｓｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）上で行い、シーケンシング結果を上記の実施例１に記載するように解析して、これまでのシーケンシングデータでは典型的には十分に示されていない、種々の領域のコール可能性を求める。
【００９９】
コントロール対Ｄ３３４Ｋ相同体変異体でのコール可能性データの比較により、Ｄ３３４Ｋ相同体変異体が、コントロールと比較し、フォスミドプロモーター領域、Ｈｉｇｈ  ＧＣ、Ｈｕｇｅ  ＧＣ、Ｌｏｗ  ＧＣ、Ｈｉｇｈ  ＡＴ、Ｈｕｇｅ  ＡＴ、およびＡＴジヌクレオチド反復領域のうち１つまたは複数のコール可能性において、予想外かつ有意な改善を示すことを実証する。
【０１００】
〔実施例３〕
Ｐ３２１ＫおよびＤ３３４Ｋの二重変異体と相同な変異を有する変異体の評価
Ｐ３２１ＫおよびＤ３３４Ｋと相同な変異を有するリコンビナーゼ変異体の能力を評価する。この例では、野生型リコンビナーゼを、以下の表の「コントロール」欄に記載するように、ＲＢ４９のＨ６３Ｓと相同な変異を含むように修正することによって、「コントロール」リコンビナーゼを生成する。「Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋ相同体」変異体は、以下の表４の「Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋ相同体」欄に記載するように、ＲＢ４９のＰ３２１ＫおよびＤ３３４Ｋと相同な変異を担持するように、前記コントロールをさらに修正することにより生成する。
【０１０１】
図１により立証されるように、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、およびシアノファージＳ−ＰＭ２は、ＲＢ４９  Ｐｒｏ３２１と相同な領域を有さないことが理解されよう。したがって、以下の表に示す変異体は「二重変異体」というが、あるリコンビナーゼのみがコントロールバックボーンへの２つの変異を含む。
【０１０２】
例えば、Ｔ６  ＵｖｓＸでは、コントロールは、野生型Ｔ６  ＵｖｓＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）をＨ６６Ｓ変異を担持するように修正することによって生成する。Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋ相同体は、Ｈ６６Ｓ変異、Ｐ３２４Ｋ変異、およびＲ３３７Ｋ変異を担持するようにさらに修正する。
【０１０３】
【表４−１】
2019509716.tif 000007
【表４−２】
2019509716.tif 000008
【表４−３】
2019509716.tif 000009
【０１０４】
パターン化フローセル上でのＰＣＲフリーライブラリのクラスター化を、上記の実施例１に記載するように、コントロールまたはＰ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋ変異体のいずれかを使用してｃＢｏｔ上で行う。次に、シーケンシングをＨｉｓｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）上で行い、シーケンシング結果を上記の実施例１に記載するように解析して、これまでのシーケンシングデータでは典型的には十分に示されていない、種々の領域のコール可能性を求める。
【０１０５】
コントロール対Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋ相同体変異体でのコール可能性データの比較により、Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋ相同体変異体が、コントロールと比較し、フォスミドプロモーター領域、Ｈｉｇｈ  ＧＣ、Ｈｕｇｅ  ＧＣ、Ｌｏｗ  ＧＣ、Ｈｉｇｈ  ＡＴ、Ｈｕｇｅ  ＡＴ、およびＡＴジヌクレオチド反復領域のうち１つまたは複数のコール可能性において、予想外かつ有意な改善を示すことを実証する。
【０１０６】
〔実施例４〕
Ｐ２５６Ｋ、Ｐ３２１Ｋ、およびＤ３３４Ｋの三重変異体と相同な変異を有する変異体の評価
Ｐ２５６Ｋ、Ｐ３２１Ｋ、およびＤ３３４Ｋと相同な変異を有するリコンビナーゼ変異体の能力を評価する。この例では、野生型リコンビナーゼを、以下の表の「コントロール」欄に記載するように、ＲＢ４９のＨ６３Ｓと相同な変異を含むように修正することによって、「コントロール」リコンビナーゼを生成する。「Ｐ２５６Ｋ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋ相同体」三重変異体は、以下の表の「Ｐ２５６Ｋ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋ相同体」欄に記載するように、ＲＢ４９のＰ２５６Ｋ、Ｐ３２１Ｋ、およびＤ３３４Ｋと相同な変異を担持するように、前記コントロールをさらに修正することにより生成する。
【０１０７】
図１により立証されるように、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、およびシアノファージＳ−ＰＭ２は、ＲＢ４９  Ｐｒｏ３２１と相同な領域を有さないことが理解されよう。したがって、以下の表５に示す変異体は「三重変異体」というが、あるリコンビナーゼのみがコントロールバックボーンへの３つの変異を含む。
【０１０８】
例えば、Ｔ６  ＵｖｓＸでは、コントロールは、野生型Ｔ６  ＵｖｓＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を、Ｈ６６Ｓ変異を担持するように修正することによって生成する。Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋ相同体を、Ｈ６６Ｓ変異、Ｆ２５９Ｋ変異、Ｐ３２４Ｋ変異、およびＲ３３７Ｋ変異を担持するようにさらに修正する。
【０１０９】
【表５−１】
2019509716.tif 000010
【表５−２】
2019509716.tif 000011
【表５−３】
2019509716.tif 000012
【０１１０】
パターン化フローセル上でのＰＣＲフリーライブラリのクラスター化を、上記の実施例１に記載するように、コントロールまたはＰ２５６Ｋ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋの三重変異体のいずれかを使用してｃＢｏｔ上で行う。次に、シーケンシングをＨｉｓｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）上で行い、シーケンシング結果を上記の実施例１に記載するように解析して、これまでのシーケンシングデータでは典型的には十分に示されていない、種々の領域のコール可能性を求める。
【０１１１】
コントロール対Ｐ２５６Ｋ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋ相同体三重変異体でのコール可能性データの比較により、Ｐ２５６Ｋ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋ相同体変異体が、コントロールと比較し、フォスミドプロモーター領域、Ｈｉｇｈ  ＧＣ、Ｈｕｇｅ  ＧＣ、Ｌｏｗ  ＧＣ、Ｈｉｇｈ  ＡＴ、Ｈｕｇｅ  ＡＴ、およびＡＴジヌクレオチド反復領域のうち１つまたは複数のコール可能性において、予想外かつ有意な改善を示すことを実証する。
【０１１２】
〔実施例５〕
ＲＢ４９  ＵｖｓＸのＨ６３Ｓ  Ｐ２５６ＫおよびＨ６３Ｓ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋを用いたクラスター化
リコンビナーゼ変異体ＲＢ４９  ＵｖｓＸのＨ６３Ｓ  Ｐ２５６ＫおよびＲＢ４９ＵｖのＨ６３Ｓ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋの能力を評価した。パターン化フローセル上でのＰＣＲフリーライブラリのクラスター化を、上記の実施例１〜４に記載するようにｃＢｏｔ上で行った。次に、シーケンシングをＨｉｓｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）上で行い、シーケンシング結果を上記の実施例１〜４に記載するように解析して、これまでのシーケンシングデータでは典型的には十分に示されていない、種々の領域のコール可能性を求める。
【０１１３】
図３は、７００ｎＭピッチｖ２．５ｐＦＣ上でＶ２ケミストリーを用いてクラスター化した１５０ｐＭのヒトＰＣＲフリーライブラリのｔｙｐｈｏｏｎ画像を示す。第１サイクルのＤＮＡシーケンシングを、緑色蛍光（ＧまたはＴの組み込み）Lおよび赤色蛍光（ＡまたはＣの組み込み）を測定するｔｙｐｈｏｏｎスキャナ上で画像化した。レーンの割り当ては以下の通りである。簡潔に言うと、レーン１はＨ６３Ｓ  Ｐ２５６Ｋである。レーン２は緩衝液１中のＨ６３Ｓ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋである。レーン３は、緩衝液２中のＨ６３Ｓ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋである。レーン４はＷｔ  ＲＢ６９  ＵｖｓＸである。レーン５はＨ６３Ｓ  Ｐ２５６Ｋである。レーン６は、緩衝液１中のＨ６３Ｓ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋである。レーン７は、緩衝液２中のＨ６３Ｓ  Ｐ３２１Ｋ  Ｄ３３４Ｋである。レーン８は、ＤＮＡなしである。緩衝液１は、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍＭのＢＭＥである。緩衝液２は、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＰＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣＬ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および５０％のグリセロールである。
【０１１４】
本出願の全体を通して、種々の刊行物、特許、および／または特許出願を参照している。これらの刊行物の開示内容はその全体が、本出願において参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１１５】
用語含む（comprising）は、列挙される要素だけを含むのではなく、任意のさらなる要素もさらに包含する、オープンエンドであることが本明細書で意図される。
【０１１６】
いくつかの実施形態を記載している。とはいえ、種々の修正が行われ得ることを理解されたい。したがって、他の実施形態も、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【０１１７】
配列表フリーテキスト
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１  腸内細菌ファージＲＢ４９  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２  Ｈｉｓ６３Ｓｅｒ（Ｈ６３Ｓ）変異およびＰｒｏ３２１Ｌｙｓ（Ｐ３２１Ｋ）変異を含む、アミノ酸配列腸内細菌ファージＲＢ４９  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３  腸内細菌ファージＴ４  ＵｖｓＸのアミノ酸残基３１９〜３２３に相当する半保存ドメイン
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４  腸内細菌ファージＴ４  ＵｖｓＸの半保存ドメイン３１９〜３２３のバリアント
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５  腸内細菌ファージＴ４  ＵｖｓＸのアミノ酸残基３３２〜３３７に相当する半保存ドメイン
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６  腸内細菌ファージＴ４  ＵｖｓＸの半保存ドメイン３１９〜３２３のバリアント
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７  腸内細菌ファージＴ４  ＵｖｓＸの半保存ドメイン３２９〜３３７のバリアント
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８  腸内細菌ファージＴ４  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９  腸内細菌ファージＴ６  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０  アシネトバクターファージ１３３  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１  腸内細菌ファージＲＢ６９  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２  エロモナスファージＡｅｈ１  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３  エロモナスファージ６５  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４  ビブリオファージＫＶＰ４０  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５  腸内細菌ファージＲＢ４３  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６  プロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ２  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７  プロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ４  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８  シネココッカス ファージＳ−ＰＭ２  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９  腸内細菌ファージＲＢ３２  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０  ビブリオファージｎｔ−１  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１  腸内細菌ファージＲＢ１６  ＵｖｓＸアミノ酸配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２  Ｐｈｅ２５７Ｌｙｓ（Ｆ２５７Ｋ）変異を有する、アミノ酸配列腸内細菌ファージＴ４  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３  Ｐｈｅ２５９Ｌｙｓ（Ｆ２５９Ｋ）変異を有するアミノ酸配列 腸内細菌ファージＴ６  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４  Ｐｒｏ２５７Ｌｙｓ（Ｐ２５７Ｋ）変異を有するアミノ酸配列アシネトバクターファージ１３３  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５  Ｐｒｏ２５８Ｌｙｓ（Ｐ２５８Ｋ）変異を有するアミノ酸配列 腸内細菌ファージＲＢ６９  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６  Ｐｒｏ２６９Ｌｙｓ（Ｐ２６９Ｋ）変異を有するアミノ酸配列 エロモナスファージＡｅｈ１  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７  Ａｓｐ２６６Ｌｙｓ（Ｄ２６６Ｋ）変異を有するアミノ酸配列エロモナスファージ６５  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８  Ｐｒｏ２６７Ｌｙｓ（Ｐ２６６Ｋ）変異を有するアミノ酸配列ビブリオファージＫＶＰ４０ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９  Ｐｒｏ２５９Ｌｙｓ（Ｐ２５９Ｋ）変異を有するアミノ酸配列腸内細菌ファージＲＢ４３  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０  Ｇｌｎ２６１Ｌｙｓ（Ｑ２６１Ｋ）変異を有するアミノ酸配列プロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ２  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１  Ｇｌｕ２６４Ｌｙｓ（Ｅ２６４Ｋ）変異を有するアミノ酸配列プロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ４  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２  Ｇｌｕ２６４Ｌｙｓ（Ｅ２６４Ｋ）変異を有するアミノ酸配列シネココッカスファージＳ−ＰＭ２  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３  Ｐｈｅ２５９Ｌｙｓ（Ｆ２５９Ｋ）変異を有するアミノ酸配列腸内細菌ファージＲＢ３２  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４  Ｐｒｏ２６７Ｌｙｓ（Ｐ２６７Ｋ）変異を有するアミノ酸配列ビブリオファージｎｔ−１  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５  Ｐｒｏ２５９Ｌｙｓ（Ｐ２５９Ｋ）変異を有するアミノ酸配列腸内細菌ファージＲＢ１６  ＵｖｓＸ変異体
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６  腸内細菌ファージＴ４  ＵｖｓＸのアミノ酸残基３２９〜３３７に相当する半保存ドメイン
【図１Ａ】
2019509716.tif 000013
【図１Ｂ】
2019509716.tif 000014
【図２】
2019509716.tif 000015
【図３】
2019509716.tif 000016
【配列表】
2019509716000001.app
【国際調査報告】
2019509716.tif 000017
2019509716.tif 000018
2019509716.tif 000019