(57)【要約】本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに関するものであって、より詳細には、動物軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたコラーゲンタイプII  α１基盤のペプチド及びその用途を提供することである。
2019519597.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロキシプロリン（Ｈｙｄ）であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、コラーゲンタイプII  α１由来であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記コラーゲンタイプII  α１は、動物軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたことを特徴とする請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項６】
前記眼球表面疾患は、角膜混濁、角膜血管新生、角膜炎症及び角膜纎維化からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする請求項５に記載の眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項７】
前記ペプチドは、軟骨細胞由来の細胞外基質（ＣＤＥＭ）から分離されたコラーゲンタイプII  α１由来であることを特徴とする請求項５に記載の眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項８】
前記ペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されることを特徴とする請求項５に記載の眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項９】
前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であることを特徴とする請求項５に記載の眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１０】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または改善用健康食品。
【請求項１１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する黄斑変性の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドは、コラーゲンタイプII  α１由来であることを特徴とする請求項１１に記載の黄斑変性の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドは、眼球の新生血管の形成を抑制することを特徴とする請求項１１に記載の黄斑変性の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１４】
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されることを特徴とする請求項１１に記載の黄斑変性の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１５】
前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であることを特徴とする請求項１１に記載の黄斑変性の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する黄斑変性の予防または改善用健康食品。
【請求項１７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１８】
前記ペプチドは、コラーゲンタイプII  α１由来であることを特徴とする請求項１７に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１９】
前記ペプチドは、乾燥ストレスによる涙の生成の減少及び角膜表面の不均衡を回復させ、角膜上皮細胞の剥離及び炎症性因子の生成を抑制することを特徴とする請求項１７に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２０】
前記ペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されることを特徴とする請求項１７に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２１】
前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であることを特徴とする請求項１７に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する乾性眼の予防または改善用健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）は、組織で細胞を除いた残りの成分であって、細胞が分泌した多様な構造的・機能的分子の３次元的な組合わせからなっており、いまだにその特性及び機能が完全には判明しておらず、人工的な製作は不可能である。細胞外基質は、組織の形状を成しながら、組織の物理的性質、すなわち、伸延力、圧縮強度と弾力性とを決定し、浸透圧、イオンの透過などを調節しながら、細胞の環境を保持する重要な役割を果たす。
【０００３】
また、多い成長因子とサイトカインとを保有しており、細胞の機能を決定する役割を行うが、特に、胎児、成長期には、細胞の分化を調節するか、細胞の接着、代謝活動を増減させながら、組織成長の方向を提示する。
【０００４】
細胞外基質は、膠原質（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、エラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）のようなタンパク質で組織の物理的性質を決定し、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）のような糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が、細胞と細胞外基質とを貼り付ける接着剤のような役割を行い、コンドロイチン硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）のような多くのタンパク糖（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）があって、組織の形状と体積とを保持し、組織内で細胞と活発な相互作用を行って、組織や臓器固有の機能を保持し、行うように体積を保持する支持体の役割を果たしているが、細胞外基質の成分と構造は、いまだに完全に究明されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、角膜の血管新生、混濁化、纎維化及び炎症による病理学的変化を抑制または改善して、眼球表面疾患を予防または治療することができる新規なペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。
【０００７】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【０００８】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または改善用健康食品を提供する。
【０００９】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する黄斑変性の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する黄斑変性の予防または改善用健康食品を提供する。
【００１１】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分を含む乾性眼の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００１２】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分を含む乾性眼の予防または改善用健康食品を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の新規なペプチドは、アルカリ火傷で眼球表面の病理学的変化が誘導された動物モデルで、角膜混濁、血管新生及び纎維化を減少させ、炎症誘発因子の発現を抑制する効果を示し、組織変化が誘導された網膜及び脈絡膜で血管新生を効果的に抑制して、黄斑変性を予防及び改善し、眼球の涙量の減少、角膜表面の不規則性及び結膜杯状細胞の損失のような角膜上皮細胞の病理学的変化を抑制または改善すると確認されることによって、それを有効成分として含有する組成物を眼球疾患の予防または治療用薬学組成物及び健康食品として提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】合成されたヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの結果報告書である。
【図２】ＨＰＬＣを用いてヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの純度を分析した結果である。
【図３】Ｉｏｎ−Ｍａｓｓを通じてヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの分子量を確認した結果である。
【図４】アルカリ火傷のウサギの角膜でＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認した結果であって、図４の（Ａ）は、アルカリ火傷後、０、７及び１７日目のウサギの角膜を顕微鏡（ＳＺＸ７、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で撮影した写真であり（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１０ｍｍ）、図４の（Ｂ）は、角膜血管新生の程度を示すグラフであり、図４の（Ｃ）は、角膜混濁化の程度を示すグラフであって、グラフ値は、各実験群（ｎ＝５）の平均±標準偏差を示したものであり、ｔ−テストを通じて＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  アルカリ火傷群値を有意な値として見た。
【図５】アルカリ火傷のウサギの角膜の厚さ変化に対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認した結果であって、図５の（Ａ）は、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０  ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した組織切片写真であり（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１ｍｍ）、図５の（Ｂ）は、角膜の厚さを示すグラフである。
【図６】アルカリ火傷のウサギで纎維化の変化に対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認するために、眼球線維芽細胞をＭａｓｓｏｎ´ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色法で免疫染色し、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０  ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した写真（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１００μｍ）であって、褐色で表われた部分が線維芽細胞である。
【図７】アルカリ火傷のウサギで血管新生マーカーに対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認した結果であって、特異的抗体であるＣＤ３１、ＦＧＦ及びＶＥＧＦで免疫染色された組織切片を仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０  ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した写真である（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝３００μｍ）。
【図８】アルカリ火傷のウサギで炎症マーカーに対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を確認した結果であって、組織切片を大食細胞、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＭＭＰ−９のような特異的抗体で免疫染色した後、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０  ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した写真である（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝３００μｍ）。
【図９】コラーゲン、ＧＤＲＧＤ（ＣＰＩ）及びヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）が処理されたＨＵＶＥＣ細胞で血管形成の抑制効果を確認した結果である。
【図１０】レーザ照射１４日後、レーザ照射による組織崩壊及び新生血管の形成の程度を確認した結果である。
【図１１】動物モデルにレーザ照射後、２、１０及び２０μｇ濃度のコラーゲンまたは２〜２０μｇ濃度のＧＤＲＧＤ（ＣＰＩ）及びヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）をそれぞれ処理して、脈絡膜新生血管の抑制効果を確認した結果である。
【図１２】動物モデルにレーザ照射後、５μｇ濃度のアバスチンまたはヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）をそれぞれ処理して、脈絡膜新生血管の抑制効果を確認した結果である。
【図１３】動物モデルにレーザ照射後、５μｇ濃度のアバスチンまたはヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）をそれぞれ処理し、レーザ照射１４日後、網膜及び脈絡膜からＲＮＡを抽出して、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ及びＭＣＰ−１遺伝子発現レベルを確認したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果である。
【図１４】動物モデルにレーザ照射後、５μｇ濃度のアバスチンまたはヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）をそれぞれ処理し、レーザ照射１４日後、網膜及び脈絡膜抽出物でＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＲ−２（Ｆｌｋ−１）及びＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２タンパク質の発現レベルを確認したウェスタンブロット結果である。
【図１５】乾燥ストレスが除去されたＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスに、それぞれ生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処理による各マウスの涙量の変化を確認した結果であって、ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスに３、５、７及び１０日間生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡを眼球に投与した後、マウスの涙量を測定し、平均±標準偏差で定量的結果を示した。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＤＳ  １０Ｄ群、＃Ｐ＜０．０５  ｖｓ．生理食塩水群、§Ｐ＜０．０５  ｖｓ．Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群、¶Ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＣｓＡ処理群、†Ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＤＱＳ処理群、＆Ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＣｓＡ処理群。
【図１６】Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの角膜表面屈曲性に及ぼす影響を確認した結果であって、図１６の（Ａ）は、乾燥ストレスが除去されたＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウス（ＤＳ）に３、５、７及び１０日間生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡが処理された各グループの眼球イメージ結果（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１ｍｍ）であり、図１６の（Ｂ）は、生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡが処理されたマウスの角膜表面滑らかさ点数の変化を確認した結果であって、平均±標準偏差で定量的結果を示した。＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＤＳ  １０Ｄ群、＃Ｐ＜０．０５  ｖｓ．生理食塩水群、§Ｐ＜０．０５  ｖｓ．Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群、¶Ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＣｓＡ処理群、＆Ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＣｓＡ処理群。
【図１７】角膜上皮細胞の剥離に及ぼすＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの影響を確認した結果であって、図１７の（Ａ）は、ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの角膜に生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ投与し、１０日後、角膜上皮細胞の剥離程度を確認したヘマトキシリン＆エオシン染色結果（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１００μｍ）であり、図１７の（Ｂ）は、角膜上皮細胞の剥離程度を平均±標準偏差で表わした定量的結果である（＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＤＳ  １０Ｄグループ）。
【図１８】結膜杯状細胞の分布に及ぼすＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチド影響を確認した結果であって、図１８の（Ａ）は、生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡが投与されたＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの結膜をＰＡＳ染色した結果（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝２００μｍ）であり、図１８の（Ｂ）は、結膜杯状細胞の分布程度を平均±標準偏差で表わした定量的結果である（＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＤＳ  １０Ｄグループ）。
【図１９】ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの涙腺でＴＮＦ−α、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９発現程度を確認した免疫組織化学の分析結果であって、乾燥ストレスを除去させたマウスに生理食塩水、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ、コラーゲン、ＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡを投与し、１０日後、マウスの涙腺で前記炎症性因子の発現程度を確認した結果である（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１００μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。
【００１６】
前記ペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙ  ｐｒｏｌｉｎｅ；Ｈｙｄ）であり、より望ましくは、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（Ｈｙｄｒｏｘｙ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ）であり得る。
【００１７】
前記ペプチドは、コラーゲンタイプII  α１由来であり、前記コラーゲンタイプII  α１は、動物軟骨細胞由来の細胞外基質から分離される。
【００１８】
前記軟骨細胞由来の細胞外基質は、動物の軟骨組織及び／または軟骨由来軟骨細胞から分泌されて形成された軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたものであり、前記動物は、豚、馬、牛、羊、山羊、及び猿からなる群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明の「ペプチド」は、一般的に２個以上のα−アミノ酸がペプチド結合で連結された形態の化合物であって、構成アミノ酸の数によってジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドなどと言い、約１０個以下のペプチド結合があるものをオリゴペプチド、多数のペプチド結合からなるものをポリペプチドと言う。
【００２０】
本発明のペプチドは、化学方法（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ．Ｍｉｋｏｓ  Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ．）を用いて製造される。例えば、ペプチドは、固相技術（Ｒｏｂｅｒｇｅ  ＪＹ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２−２０４）によって合成され、樹脂から切断され、高性能液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ）によって精製されうる。
【００２１】
また、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００２２】
前記眼球表面疾患は、角膜混濁、角膜血管新生、角膜炎症及び角膜纎維化からなる群から選択される何れか１つであり得る。
【００２３】
本発明の一実施例によれば、アルカリ火傷が誘導された動物モデルは、図４の（Ａ）のように、アルカリ火傷後、即時角膜混濁が表われ、アルカリ火傷７日後、角膜血管新生及び混濁が増加したが、角膜血管新生及び混濁が確認された動物モデルに生理食塩水またはＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドをそれぞれ１０日間処理した結果（アルカリ火傷１７日後）、図４の（Ｂ）及び図４の（Ｃ）のように、対照群の角膜混濁点数が３．０±０．０に相当増加した一方、図４の（Ｂ）のように、ペプチドが処理された実験群で混濁化の減少が表われることを確認することができた。
【００２４】
本発明の他の一実施例によれば、アルカリ火傷によって誘導された角膜の纎維化に及ぼすＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの影響を確認するために、Ｍａｓｓｏｎ´ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を行った結果、図６のように、アルカリ火傷対照群の場合、アルカリ火傷によってストロマ部分に褐色線維芽細胞の形成が増加したことを確認することができたが、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理された実験群では、線維芽細胞の増加が抑制されたことを確認することができた。また、Ｈ＆Ｅ染色を行って、アルカリ火傷による角膜の組織学的変化を確認した結果、図７の上部を参考すれば、アルカリ火傷によって角膜に上皮増殖、炎症性細胞侵入、癲癇浮腫及び新生血管の形成が誘導されたことが確認された。
【００２５】
しかし、前記組織学的変化に対して、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理実験群では、向上した改善効果が表われ、図５の（Ａ）のように、Ｈ＆Ｅ染色結果でも、ペプチドが処理された組織で新生血管の形成が有意に改善されたことを確認することができた。
【００２６】
本発明のさらに他の一実施例によれば、炎症マーカー発現に対する各ペプチドの効果を確認するために、角膜切片に大食細胞、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＭＭＰ−９のような炎症特異的マーカーで免疫染色を行った結果、図８のように、アルカリ火傷は、上皮と上皮下及び増殖性基質で大食細胞の発現を増加させた一方、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理された実験群では、大食細胞の発現が効果的に抑制されたことを確認することができた。また、アルカリ火傷群では、ＴＮＦα、ＩＬ−１β及びＩＬ−６を含む炎症性サイトカインとＩＣＡＭ−１付着分子の発現増加が確認されたが、ペプチドが処理された実験群では、前記炎症性因子の発現が減少したことを確認することができた。追加的に、アルカリ火傷群の角膜では、ＭＭＰ−９の発現が強く表われた一方、ペプチドが処理された実験群で、ＭＭＰ−９の発現が抑制されたことを確認することができた。
【００２７】
前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドは、眼球表面疾患は、角膜混濁、角膜血管新生、角膜炎症及び角膜纎維化の予防または治療に効果的であることが確認された。
【００２８】
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、軟骨細胞由来の細胞外基質（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ；ＣＤＥＭ）から分離されたコラーゲンタイプII  α１（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  II  α１）由来であり得る。
【００２９】
より詳細には、前記軟骨細胞由来の細胞外基質は、動物の軟骨組織及び／または軟骨由来軟骨細胞から分泌されて形成された軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたものであり、前記動物は、豚、馬、牛、羊、山羊、及び猿からなる群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロキシプロリンであるペプチドであり、より望ましくは、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫであり得る。
【００３１】
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されうる。
【００３２】
前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であり得る。
【００３３】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または改善用健康食品を提供することができる。
【００３４】
また、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する黄斑変性の予防または治療用薬学組成物を提供することができる。
【００３５】
前記ペプチドは、コラーゲンタイプII  α１由来であり得る。
【００３６】
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロキシプロリンであるペプチドであり、より望ましくは、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫであり得る。
【００３７】
前記ペプチドは、眼球の新生血管の形成を抑制して黄斑変性を予防または治療し、前記黄斑変性は、老人性黄斑変性であり得るが、これに限定されるものではない。
【００３８】
本発明の一実施例によれば、マウスの眼球内にレーザを照射して損傷を被らせ、１４日後、眼球を摘出して、Ｈ＆Ｅ染色を行った。
【００３９】
その結果、図１０のように、レーザ照射部位の組織が崩壊されながら、新生血管が形成されたことを確認することができた。一方、図１１のように、レーザ照射後、コラーゲン、ＣＰＩ及びＣＰIIをそれぞれ処理した実験群では、いずれも２μｇに処理された時、ＣＮＶ病変が減少したことを確認することができた。
【００４０】
また、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ実験で最も優れた抗血管形成能を示したヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）の脈絡膜新生血管の抑制効果を陽性対照群であるアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）と比較した結果、図１１のように、ＣＰII処理群の病変サイズが対照群の病変サイズよりも有意に減少し、同じ濃度のアバスチンが処理された陽性対照群の病変サイズと類似したレベルであると確認された。
【００４１】
前記結果から、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドは、血管新生によって発病される老人性黄斑変性に優れた治療効果を示すことができる。
【００４２】
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されうる。
【００４３】
前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であり得る。
【００４４】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する黄斑変性の予防または改善用健康食品を提供することができる。
【００４５】
また、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する乾性眼の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００４６】
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、コラーゲンタイプII  α１由来であるものである。
【００４７】
より詳細には、前記ペプチドは、軟骨細胞由来の細胞外基質（ＣＤＥＭ）から分離されたペプチドであり、前記軟骨細胞由来の細胞外基質は、動物の軟骨組織及び／または軟骨由来軟骨細胞から分泌されて形成された軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたものであり、前記動物は、豚、馬、牛、羊、山羊、及び猿からなる群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
前記ペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロキシプロリンであるペプチドであり、より望ましくは、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫであり得る。
【００４９】
前記ペプチドは、乾燥ストレスによる涙の生成の減少及び角膜表面の不均衡を回復させ、角膜上皮細胞の剥離及び炎症性因子の生成を抑制することができる。
【００５０】
本発明の一実施例によれば、図１５のように、乾燥ストレスに露出させたマウスの涙量が正常群（０．２２±０．０１μＬ）よりも約８５．５％減少（ＤＳ  １０Ｄ  ｇｒｏｕｐ、０．０３±０．０１μＬ、ｐ＜０．０５）したが、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫが処理されたマウス群（０．２３±０．０２μＬ）で処理後、１０日目で涙量が７．９倍（ｐ＜０．０５）増加し、陰性対照群である生理食塩水処理群（０．０８±０．０１μＬ）よりも約２．８倍（ｐ＜０．０５）、陽性対照群であるコラーゲン処理群（０．１３±０．０２μＬ）よりも涙量が約１．７倍（ｐ＜０．０５）増加したと確認された。
【００５１】
また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処置群（０．１３±０．０２μＬ；０．１６±０．０２μＬ；０．１４±０．０１μＬ）と比較して、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群の涙量は、それぞれ１．７倍（ｐ＜０．０５）、１．４倍（ｐ＜０．０５）及び１．６倍（ｐ＜０．０５）増加したと確認されることによって、涙量の改善に対するＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果は、現在販売される乾性眼治療剤よりも効果的であることを確認することができた。
【００５２】
前記ペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されうる。
【００５３】
前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であり得る。
【００５４】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する乾性眼の予防または改善用健康食品を提供することができる。
【００５５】
本発明の他の具体例で、前記ペプチドを有効成分として含む眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常使う適切な担体、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤、香味剤、抗酸化剤、緩衝液、靜菌剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤からなる群から選択される１つ以上の添加剤をさらに含みうる。
【００５６】
具体的に、担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を使用し、経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固型製剤は、前記組成物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例を挙げれば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィンの以外に、さまざまな賦形剤、例を挙げれば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。座剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。
【００５７】
本発明の一実施例によれば、前記薬学組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、腹腔内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式で対象体に投与することができる。
【００５８】
前記ペプチドの望ましい投与量は、対象体の状態及び体重、疾患の種類及び程度、薬物形態、投与経路及び期間によって変わり、当業者によって適切に選択されうる。本発明の一実施例によれば、これに制限されるものではないが、１日投与量が０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ、具体的には、０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇであり得る。投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもでき、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない。
【００５９】
本発明において、前記‘対象体ん’は、ヒトを含む哺乳動物であり得るが、これら例に限定されるものではない。
【００６０】
また、本発明において、前記健康食品は、本発明のペプチドの以外に、他の食品または食品添加物と共に使われ、通常の方法によって適切に使われる。有効成分の混合量は、その使用目的、例えば、予防、健康または治療的処置によって適するように決定されうる。
【００６１】
前記健康食品に含有された化合物の有効容量は、前記治療剤の有効容量に準して使用することができるが、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記範囲以下であり、有効成分は、安全性面で何の問題がないために、前記範囲以上の量でも使われうるということは確実である。
【００６２】
前記健康食品の種類には、特別な制限がなく、例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含んだ酪農製品、各種スープ、飲み物、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などが挙げられる。
【００６３】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００６４】
＜実験例１＞眼球表面疾患の動物モデルの製作
目と視力研究のための動物実験は、大韓民国の仁済医科大学及びＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔから承認された動物実験指針書によって行われた（Ｎｏ．；２０１４−０２８）。
【００６５】
２．０〜２．５ｋｇのニュージーランドの白ウサギ２６匹をＳａｍｔａｋｏ（Ｏｓａｎ，Ｋｏｒｅａ）から購入し、ケタミン塩酸塩（３０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ、Ｈｕｏｎｓ，Ｊｅｃｈｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）及びキシラジン塩酸塩（２．５ｍｇ／ｋｇ、Ｂａｙｅｒ  Ｋｏｒｅａ  Ｌｔｄ．，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）混合物を筋肉に注射して、全身麻酔し、アルカリプロパラカイン（Ａｌｃａｉｎｅ  ｐｒｏｐｒａｃａｉｎｅ）点眼液（Ａｌｃｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）を用いて局所麻酔した。
【００６６】
次いで、１Ｎ  ＮａＯＨを濡らした８ｍｍフィルター紙をウサギの右側の角膜中心に１分間露出させて、アルカリ火傷モデルを製作し、火傷７日後、アルカリ火傷による角膜血管新生及び角膜混濁の増加を確認した。
【００６７】
前記ウサギをランダムにアルカリ火傷群（ｎ＝５）及びペプチド処理群（ｎ＝５）に分けた。アルカリ火傷群は、生理食塩水を毎日４回投与し、ペプチド処理群には、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチド１０ｍｇ／ｍＬを毎日４回投与し、左目を対照群として使用した。
【００６８】
前記方法で、それぞれの処理物質を１０日間投与した後、Ｈ＆Ｅ染色、Ｍａｓｓｏｎ´ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色及び免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を行って、纎維化、血管新生、炎症及び角膜構造の変化などを確認した。
【００６９】
＜実験例2＞角膜血管新生及び混濁化の確認
【００７０】
角膜血管新生及び混濁化に対する臨床評価を行った。
【００７１】
角膜血管新生の程度を０点から３点まで評価した。血管新生が表われていない場合、０点、角膜周辺部の血管新生が確認される場合、１点、瞳の縁部まで血管新生が拡張された場合、２点、及び瞳の縁部を越えて角膜中心まで血管新生が拡張された場合、３点と評価し、角膜血管新生の評価時に、相当な混濁及び幅広い瞼球癒着が形成されて、角膜血管新生の程度を評価しにくい場合、３点と評価した。
【００７２】
また、角膜混濁の程度を０点から３点まで評価した。虹彩部分が鮮かに見える透明な角膜の場合、０点、虹彩部分に部分的な混濁が確認される場合、１点、瞳の縁部と虹彩部分とが弱く見える時、２点、虹彩及び瞳の部分が完全に混濁化された場合、３点と評価した。
【００７３】
＜実験例3＞Ｍａｓｓｏｎ´ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色
【００７４】
眼球を３．５％パラホルムアルデヒドで固定させた後、洗浄し、パラフィンが打ち込まれた組織切片（６μｍ）で製作する時まで７０％アルコールに貯蔵した。コラーゲン纎維化及び纎維化の等級程度を視覚化するために、切片にＭａｓｓｏｎｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を行い、仮想顕微鏡（ｖｉｒｔｕａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０  ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で切片のイメージを撮影した。
【００７５】
＜実験例4＞組織学的分析のための化学染色
【００７６】
組織学的分析のために、眼球を３．５％パラホルムアルデヒドで固定させた後、ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＯＣＴ；Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に打ち込み、液体窒素に冷凍させた。
【００７７】
試料を４％ホルムアルデヒドに２４時間固定させ、乾燥させた後、パラフィンワックスに打ち込んだ。次いで、８μｍ厚さの組織切片で準備した後、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、切片のイメージを仮想顕微鏡（ｖｉｒｔｕａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０  ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した。
【００７８】
＜実験例5＞免疫組織化学的分析
【００７９】
組織切片を６μｍ厚さに切断して免疫組織化学分析に使用した。
【００８０】
まず、組織切片を３．５％パラホルムアルデヒドで固定させ、０．１％トリトンＸ−１００、不活性化された２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ；ａｌｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を透過させ、抗ＣＤ３１（１：１，０００；Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、抗ｂＦＧＦ（１：１，０００；Ｂｉｏｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、抗ＩＬ−１β、抗ＩＬ−６（１：１，０００；Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、抗ＭＭＰ−９、抗ＩＣＭＡ−１、抗ＴＮＦα、抗大食細胞／単核（１：１，０００；Ａｂｎｏｖａ  Ｃｒｏｐ．，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）及び抗ＶＥＧＦ−Ａ（Ａｂｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）１次抗体で４℃で一晩インキュベーションした。
【００８１】
次いで、切片に２次抗体を４５分間インキュベーションし、ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）ｃｈｒｏｍｏｇｅｎで免疫学的反応を視覚化し、切片を室温で３０秒間Ｍａｙｅｒ´ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）で対比染色した。
【００８２】
前記方法で染色された切片を仮想顕微鏡（ｖｉｒｔｕａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０  ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した。
【００８３】
＜実験例6＞Ｔｕｂｉｎｇ  ａｓｓａｙ
【００８４】
ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの抗血管形成の効果をヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を利用したＴｕｂｉｎｇ  ａｓｓａｙを行って、確認した。
【００８５】
ＨＵＶＥＣ細胞をｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色した後、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）がコーティングされた４８ウェルプレートに分周し、５０ｎｇ／ｍｌ濃度の組換えヒトＶＥＧＦと共にコラーゲン、ＣＰＩ及びＣＰIIを濃度別に処理し、３７℃インキュベーターで４時間放置した後、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で管（Ｔｕｂｅ）形成を観察し、管長さは、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で分析した。
【００８６】
＜実験例7＞実験動物及び脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）モデルの製作
【００８７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをオリエントバイオから購入し、本動物実験は、目と視力研究のための動物使用に対して大韓民国の仁済医科大学（Ｎｏ，２０１３−０５３）とＡＲＶＯに承認された指針によって行われた。６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスにダイオードグリーンレーザ（ｄｉｏｄｅ  ｇｒｅｅｎ  ｌａｓｅｒ；５３２ｎｍ、１５０ｍＷ、０．１ｓｅｃ、５０μｍ、ｐｈｏｔｏｃｏａｇｕｌａｔｏｒ）を用いて網膜視神経部位に損傷を与えた。レーザ（Ｌａｓｅｒ）照射直後、ＣＰI、ＣＰII及び陽性対照群アバスチンをＰＢＳに溶解して、一日に５ｍｇずつ５日間眼球内に投与した。各実験群は、それぞれ５匹ずつマウスの両目を用いて、前記実験を進行した。
【００８８】
＜実験例8＞組織学的分析
【００８９】
レーザによる組織変化を観察するために、マウス眼球を摘出して、１０％ホルマリンで固定させ、ＯＣＴ混合物に深く打ち込んだ。
【００９０】
前記方法で処理された８μｍ組織試料をヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０  ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いて撮影及び分析した。
【００９１】
＜実験例9＞網膜−脈絡膜フラットマウント（Ｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔ）
【００９２】
レーザ照射１４日後、網膜−脈絡膜フラットマウンドを行って、ＣＰIIのＣＮＶ病変サイズの抑制効果を確認した。マウスを麻酔させ、２５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）をｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌで１００ｍｌ注射した。３０分後、マウスを安楽死し、眼球を摘出して、１０％ホルマリンで固定した後、角膜と水晶体とを除去し、カバーガラスにフラットマウントした。ＦＩＴＣ−デキストランによって染色された新生血管は、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を通じて観察し、その病変サイズをＩｍａｇｅ  Ｊ  ｐｒｏｇｒａｍを通じて測定した。
【００９３】
＜実験例１0＞定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
【００９４】
ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの新生血管関連遺伝子発現の抑制効果を確認するために、摘出されたマウス眼球の網膜と脈絡膜混合物とからＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素とを用いて、ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ産物は、表１の特異的プライマーセット（コスモジンテック，Ｋｏｒｅａ）及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ２Ｘ  ＰｒｅＭｉｘ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を用いて増幅させ、行われたＰＣＲ条件としては、試料を９５℃で１０分間培養した後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒及び７２℃で１５秒間進行して、４０ＰＣＲサイクルを行った。相対定量化を２−（ＤＤＣＴ）方法（Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１；ＤＤＣＴ＝（ＣＴ，ｔａｒｇｅｔ−ＣＴ，ａｃｔｉｎ）処理区（ＣＴ，ｔａｒｇｅｔ−ＣＴ，ａｃｔｉｎ）対照区）で計算した。
【００９５】
【表１】
2019519597.tif 000003
【００９６】
＜実験例１1＞ウェスタンブロット
【００９７】
マウスの網膜と脈絡膜混合物とをプロテアーゼ抑制カクテル及びホスファターゼ抑制カクテルが含まれたＰｒｏ−ＰＲＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ（ｉＮｔＲＯＮ）で溶解した後、タンパク質を抽出した。
【００９８】
抽出されたタンパク質は、ＢＣＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて定量した後、ＳＤＳ  ｇｅｌ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと混合して、１００℃で５分間沸かして変性させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動されたタンパク質は、ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移され、次いで、非特異的タンパク質結合を遮断するために、膜を５％脱脂乳で１時間放置した後、１次抗体でＶＥＧＦ、Ｆｌｋ−１、Ｆｌｔ−１、Ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ−２及びβ−ａｃｔｉｎ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を処理して、一般的な免疫ブロットを行った。次いで、ＥＣＬｋｉｔ（Ａｄｖａｎｓｔａ）及びｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｇｅｌ  ＤＯＣ  ｓｙｓｔｅｍで免疫反応性タンパク質を検出した。
【００９９】
＜実験例１2＞実験動物及び乾性眼モデルの製作
【０１００】
ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。動物実験は、目と視力研究のための動物使用に対して大韓民国の仁済医科大学（Ｎｏ．；２０１４−０２９）とＡＲＶＯに承認された指針によって行われた。１２〜１６週齢のＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスに乾燥ストレスで一日１８時間４０〜５０％の周囲湿度とファンとを利用した通風に露出させ、皮下に０．５ｍｇ／０．２ｍＬムスカリン受容体遮断剤を注射した。また、１０日間、午前９時、午後１２時、午後３時及び午後６時の一日４回スコポラミン臭化水素酸（ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をマウスの尻側に交互に注射した。前記方法で処理されたマウスを１０日後、安楽死させ、実験期間の間の動物の行動と食べ物及び水の摂取とを制限しなかった。
【０１０１】
眼球乾燥ストレス１０日後、スコポラミン注射を中断し、一般湿度と温度環境に転換し、乾燥ストレス除去した後、１０ｍｇ／ｍｌ  Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫとコラーゲンは、生理食塩水（ｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ）に溶解して、５μＬずつ一日に５回１０日間眼球に投与し、生理食塩水及び０．１％ＨＡは、一日に５回１０日間眼球に投与した。６つの実験群は、それぞれ３匹ずつマウスの両目を用いて、前記実験を進行し、あらゆる実験は、繰り返して進められた。
【０１０２】
＜実験例１3＞涙量の確認
【０１０３】
涙の生成をフェノールレッド−浸潤綿スレッド（ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ−ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅｄ  ｃｏｔｔｏｎ  ｔｈｒｅａｄｓ；Ｚｏｎｅ−Ｑｕｉｃｋ；Ｏａｓｉｓ、Ｇｌｅｎｄｏｒａ、ＣＡ）を用いて報告された方法（Ｖｉｌｌａｒｅａｌ  ＡＬ，Ｆａｒｌｅｙ  Ｗ，Ｐｆｌｕｇｆｅｌｄｅｒ  ＳＣ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｅｐｉｎａｓｔｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｌｏｐａｔａｄｉｎｅ  ｏｎ  ｔｅａｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｅｙｅ  Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｌｅｎｓ．２００６；３２（６）：２７２−２７６．）で測定した。涙量は、医療用ピンセットを用いてスレッドを２０秒間側面眼角に位置させ、涙に濡れて赤色に変わったスレッドを顕微鏡（ＳＺＸ７；Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｃｏｒｐ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察して、ｍｍで表示した。前記測定されたｍｍ内の涙液を２０秒間マウスの涙量と予想される容量の塩基性溶液（０．９％塩分１５００ｍＬと５ｍＬの５Ｎ  ＮａＯＨ）を濡らした綿スレッドで表わした標準曲線と比較した。
【０１０４】
＜実験例１4＞角膜表面の屈曲性の評価
【０１０５】
角膜表面の屈曲性は、動物を麻酔後、実体顕微鏡（ＳＺＸ７；Ｏｌｙｍｐｕｓ）の光繊維リング照明から白リングの反射イメージを得た。角膜の滑らかさをデジタルイメージの白リングに反射された角膜上皮細胞の不規則性を等級化して評価した。角膜不規則性の深刻度点数は、反射リングを４等分に分けて不規則性程度によって５等級で計算した。不規則性ないは０等級、１／４等分の不規則性を１等級；２／４等分の不規則性は２等級；３／４等分の不規則性を３等級；いずれも不規則な程度を４等級；深刻な程度を５等級にしてあらゆるリングを確認した。
【０１０６】
＜実施例１＞タンパク質分析及びペプチド合成
【０１０７】
Ｂａｅｋ´ｓ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｓｓ  Ｓｅｐｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｄｉａｔｅｃｈ  Ｋｏｒｅａ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）で動物軟骨細胞由来の細胞外基質のタンパク質分析を行った。
【０１０８】
前記タンパク質分析を通じてコラーゲンタイプII  α１タンパク質のアミノ酸配列の一部に該当するヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ；配列番号１）を得て、前記ペプチドを、図１のように（株）バイオセルトラン（ＢＩＯＣＥＬＴＲＡＮ；Ｃｈｕｎｃｈｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）で合成した。
【０１０９】
ＨＰＬＣを行って、前記合成されたヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの純度を確認した結果、図２のように、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが純度９９．３％に合成されたことを確認することができた。
【０１１０】
また、Ｉｏｎ−Ｍａｓｓを通じてヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの分子量を確認した結果であって、図３のように、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの分子量が６５４．９９であると確認された。
【０１１１】
＜実施例２＞ペプチドによる角膜血管新生及び混濁化の変化確認
【０１１２】
角膜アルカリ火傷７日後、角膜血管新生及び混濁化に対する臨床評価を行った。
【０１１３】
その結果、図４の（Ａ）のように、アルカリ火傷後、即時角膜混濁が表われ、アルカリ火傷７日後、角膜血管新生及び混濁が増加したことを確認することができた。
【０１１４】
角膜血管新生及び混濁が確認された後、生理食塩水またはＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドをそれぞれ１０日間処理した結果（アルカリ火傷１７日後）、図４の（Ｂ）及び図４の（Ｃ）のように、対照群の角膜混濁点数が３．０であって、相当増加し、血管新生点数は２．８であって、新生血管が瞳の縁部を越えて角膜中心まで拡張されたことを確認することができた。
【０１１５】
一方、図４の（Ｂ）のように、ペプチドが処理された実験群で混濁化の減少効果が表われることを確認することができた。
【０１１６】
前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが、角膜混濁化の阻害に効果的であることが確認された。
【０１１７】
＜実施例３＞ペプチドによる角膜の厚さの変化確認
【０１１８】
仮想顕微鏡（ｖｉｒｔｕａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０  ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影したＨ＆Ｅ染色切片の角膜の厚さをＮＤＰ  ｖｉｅｗプログラム（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
【０１１９】
その結果、図５の（Ｂ）のように、アルカリ火傷後、角膜の厚さが正常範囲である５２６．６μｍから９６０．６μｍに増加したことを確認することができた。
【０１２０】
しかし、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチド処理１０日後、ペプチドが処理された実験群では、角膜の厚さが５５０．０μｍ（ｐ＜０．０５）であって、アルカリ火傷群よりも減少したことを確認することができた。
【０１２１】
＜実施例４＞ペプチドの角膜纎維化の抑制効果確認
【０１２２】
アルカリ火傷によって誘導された角膜の纎維化に及ぼすＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの影響を確認するために、Ｍａｓｓｏｎ´ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を行った。
【０１２３】
その結果、図６のように、アルカリ火傷対照群の場合、アルカリ火傷によってストロマ部分に褐色線維芽細胞の形成が増加したことが確認されたが、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理された実験群では、線維芽細胞の増加が抑制されたことを確認することができた。
【０１２４】
前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが線維芽細胞の増加を阻害することにより、角膜纎維化の抑制に効果的であることが確認された。
【０１２５】
＜実施例５＞ペプチドの角膜血管新生の抑制効果確認
【０１２６】
Ｈ＆Ｅ染色を行って、アルカリ火傷による角膜の組織学的変化を確認した。
【０１２７】
その結果、図７の上部を参考すれば、アルカリ火傷によって角膜に上皮増殖、炎症性細胞侵入、癲癇浮腫及び新生血管の形成が誘導されたことが確認された。
【０１２８】
しかし、前記組織学的変化に対して、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが、処理実験群では向上した改善効果が表われ、図５の（Ａ）のように、Ｈ＆Ｅ染色結果でも、ペプチドが処理された組織で新生血管の形成が有意に改善されたことを確認することができた。
【０１２９】
前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが、新生血管の形成に影響を及ぼすと確認されることによって、アルカリ火傷を負わせた角膜でＨｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチド処理し、角膜血管新生の特異的マーカーであるＣＤ３１、ＦＧＦ及びＶＥＧＦを用いて、角膜切片に免疫染色を行った。
【０１３０】
その結果、図７のように、ＣＤ３１、ＦＧＦ及びＶＥＧＦ血管新生マーカーが、アルカリ火傷による纎維化基質細胞で強く発現されることを確認することができた。
【０１３１】
しかし、ペプチドが処理された実験群では、上皮、上皮下及び基質でＣＤ３１、ＦＧＦ及びＶＥＧＦの有意な減少を確認することができた。
【０１３２】
前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが、角膜血管新生の阻害に効果的であることが確認された。
【０１３３】
＜実施例６＞ペプチドの抗炎症の効果確認
【０１３４】
前記Ｈ＆Ｅ染色遂行結果、アルカリ火傷によって炎症細胞が角膜に侵透したことを確認することができた。したがって、炎症マーカー発現に対する各ペプチドの効果を確認するために、角膜切片に大食細胞、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＭＭＰ−９のような炎症特異的マーカーで免疫染色を行った。
【０１３５】
その結果、図８のように、アルカリ火傷は、上皮と上皮下及び増殖性基質で大食細胞の発現を増加させた一方、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドが処理された実験群では、大食細胞の発現が効果的に抑制されたことを確認することができた。また、アルカリ火傷群では、ＴＮＦα、ＩＬ−１β及びＩＬ−６を含む炎症性サイトカインとＩＣＡＭ−１付着分子の発現増加が確認されたが、ペプチドが処理された実験群では、前記炎症性因子の発現が減少したことを確認することができた。追加的に、アルカリ火傷群の角膜では、ＭＭＰ−９の発現が強く表われた一方、ペプチドが処理された実験群で、ＭＭＰ−９の発現が抑制されたことを確認することができた。
【０１３６】
＜実施例７＞ペプチドの血管形成の抑制効果確認
【０１３７】
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を利用したＴｕｂｉｎｇ  ａｓｓａｙを行って、ヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの抗血管形成の効果を確認した。
【０１３８】
その結果、図９のように、ＶＥＧＦ処理群では、ＶＥＧＦ非処理群よりも管形成（Ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が約１．５倍以上増加した一方、コラーゲン、ＣＰＩ及びＣＰIIが処理された実験群では、いずれも有意的に血管形成が抑制された。特に、ＣＰIIは、濃度依存的に管形成を抑制し、ＶＥＧＦ非処理群の血管形成の程度とほぼ同様に減少したと表われた。また、年齢関連黄斑変性治療剤であるアバスチン処理群とも、類似したレベルに確認された。
【０１３９】
＜実施例８＞ペプチドの脈絡膜新生血管の抑制効果確認
【０１４０】
実験例7のような方法でマウス眼球にレーザを照射し、レーザ照射１４日後、眼球を摘出して、Ｈ＆Ｅ染色を行った。
【０１４１】
その結果、図１０のように、レーザ照射部位の組織が崩壊されながら、新生血管が形成されたことを確認することができた。一方、図３のように、コラーゲン、ＣＰＩ及びＣＰIIをそれぞれ眼球内注射で５日間処理した実験群では、いずれも２μｇに処理された時、ＣＮＶ病変が減少したことを確認することができた。
【０１４２】
また、前記実験で確認したように、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ実験で最も優れた抗血管形成能を示したヒドロキシプロリン−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ（ＣＰII）の脈絡膜新生血管の抑制効果を陽性対照群であるアバスチンと比較するために、レーザ照射直後からＣＰII及びアバスチンをそれぞれ５μｇずつ５日間連続して眼球内注射し、レーザ照射１４日後、眼球を摘出した後、血管をＦＩＴＣ−デキストランで染色した後、フラットマウンド実験を行って、ＣＮＶ病変サイズを測定した。
【０１４３】
その結果、図１１のように、ＣＰII処理群の病変サイズが対照群の病変サイズよりも有意に減少し、同じ濃度のアバスチンが処理された陽性対照群の病変サイズと類似したレベルであると確認された。
【０１４４】
＜実施例９＞ペプチドの新生血管関連遺伝子及びタンパク質の抑制効果確認
【０１４５】
マウスにレーザ照射１４日後、網膜と脈絡膜とからＲＮＡを抽出して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで遺伝子発現を分析した。
【０１４６】
その結果、図１２のように、代表的な新生血管関連遺伝子であるＶＥＧＦが、レーザ処理群では５５倍程度発現が増加したが、アバスチン処理群及びＣＰII処理群では、レーザ非処理群と類似しているレベルに減少したことを確認することができた。
【０１４７】
一方、ＩＣＡＭ及びＭＣＰ−１遺伝子は、レーザ処理群でそれぞれ約３００倍及び１０倍の発現増加が確認されたが、これも、ＣＰII処理群では、有意的に減少したことを確認することができた。
【０１４８】
また、新生血管関連タンパク質マーカーの発現において、ＣＰIIの効果を評価するために、レーザ照射１４日後、網膜と脈絡膜とからタンパク質を抽出して、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＲ−２（Ｆｌｋ−１）及びＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ２の免疫ブロッティングを行った。
【０１４９】
その結果、図１３のように、レーザ照射によって新生血管形成促進因子であるＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２とＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２との発現が著しく増加したことを確認することができ、特に、新生血管の形成に最も重要な役割を果たすと知られたＶＥＧＦの発現が著しく増加した。しかし、ＣＰIIが処理された実験群では、前記タンパク質の発現が著しく減少し、年齢関連黄斑変性治療剤アバスチンとほぼ類似したレベルを示した。
【０１５０】
＜実施例１０＞涙の生成の効果確認
【０１５１】
涙の生成程度をフェノールレッド−浸潤綿スレッドで測定した。
【０１５２】
その結果、図１５のように、乾燥ストレスは、ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの涙量を正常群（０．２２±０．０１μＬ）と比較して、約８５．５％有意なレベルに減少したことを確認することができた（ＤＳ  １０Ｄ  ｇｒｏｕｐ、０．０３±０．０１μＬ、ｐ＜０．０５）。一方、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群（０．２３±０．０２μＬ）は、処理１０日目で涙量が７．９倍（ｐ＜０．０５）増加し、陰性対照群であるｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ処理群（０．０８±０．０１μＬ）と比較して、約２．８倍（ｐ＜０．０５）、陽性対照群であるコラーゲン処理群（０．１３±０．０２μＬ）と比較して、涙量が約１．７倍（ｐ＜０．０５）増加したことを確認することができた。
【０１５３】
また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａ；０．１３±０．０２μＬ）、ＤＱＳ（Ｄｉｑｕａｓ；０．１６±０．０２μＬ）及びＨＡ（Ｈｙａｌｕｎｉ；０．１４±０．０１μＬ）と比較して、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群の涙量は、それぞれ１．７倍（ｐ＜０．０５）、１．４倍（ｐ＜０．０５）及び１．６倍（Ｐ＜０．０５）増加したと表われた。
【０１５４】
前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫは、現在販売される乾性眼治療剤よりも高いレベルに減少した涙量を回復させると確認された。
【０１５５】
＜実施例１１＞角膜表面の屈曲性確認
【０１５６】
各実験群の角膜表面の屈曲程度を数値化して、角膜表面の屈曲性を確認した。
【０１５７】
その結果、図１６のように、正常角膜（０．３３±０．５８点）と比較して、１０日間乾燥ストレスに露出されたマウスの角膜表面の屈曲程度は、約１３倍（４．３３±０．５８点；ｐ＜０．０５）増加したことを確認することができた。一方、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群（２．０±０点）１０日目で角膜表面の屈曲性が５３．８％（ｐ＜０．０５）有意的に減少し、陰性対照群であるｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ処理群（３．３３±１．５３点）よりは４０％（ｐ＜０．０５）、陽性対照群であるコラーゲン処理群（３．６７±１．１６点）よりは４５．５％（ｐ＜０．０５）が減少したことを確認することができた。
【０１５８】
また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処理群（３．３３±０．５８点；３．０±１．０点；３．０±０  点）と比較して、それぞれ４０％（ｐ＜０．０５）、３３．３％（ｐ＜０．０５）及び３３．３％（ｐ＜０．０５）に角膜表面の屈曲程度が減少したことを確認することができた。
【０１５９】
前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫは、乾性眼治療剤よりも角膜表面の屈曲性の改善に効果的であると確認された。
【０１６０】
＜実施例１２＞角膜上皮細胞の剥離抑制効果確認
【０１６１】
角膜上皮細胞の剥離に及ぼすペプチドの影響を確認するために、各実験群マウスの角膜をＨ＆Ｅ染色した。
【０１６２】
その結果、図１７のように、乾燥ストレスによって角膜の上皮細胞の剥離が２４倍増加した（２．２９±０．５７／０．１ｍｍ２、ｐ＜０．０５）。一方、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群（０．３８±０．１７／０．１ｍｍ２）で角膜の上皮細胞の剥離が８３．３％（ｐ＜０．０５）減少した。また、陰性対照群であるｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ処理群（１．３３±０．１７／０．１ｍｍ２）と比較して、７１．４％（ｐ＜０．０５）角膜上皮細胞の剥離が減少し、陽性対照群であるコラーゲン処理群（０．８６±０．２９／０．１ｍｍ２）よりは、５５．６％（ｐ＜０．０５）角膜上皮細胞の剥離が減少した。
【０１６３】
また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処理群（１．５２±０．３３／０．１ｍｍ２；０．０９５±０．１７／０．１ｍｍ２；１．７１±０／０．１ｍｍ２）と比較して、それぞれ７５％（ｐ＜０．０５）、６０％（ｐ＜０．０５）及び７７．８％（ｐ＜０．０５）有意的に減少したことを確認することができた。
【０１６４】
前記結果から、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫが、乾性眼治療剤よりも角膜上皮細胞の剥離の減少に効果的であると確認された。
【０１６５】
＜実施例１３＞結膜杯状細胞の分布に及ぼす影響確認
【０１６６】
乾性眼マウスモデルを対象にして点眼による結膜杯状細胞の分布を観察した。
【０１６７】
その結果、図１８のように、乾燥ストレスは、正常結膜（１４．３８±０．４４／０．１ｍｍ２）と比較して、５８．２％（６．０２±０．２９／０．１ｍｍ２、ｐ＜０．０５）杯状細胞を減少させた。一方、乾燥ストレス除去後、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ処理群（１３．９±０．８３／０．１ｍｍ２）では、減少した杯状細胞が２．３倍（ｐ＜０．０５）回復され、陰性対照群であるｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ処理群（５．４３±０．２９／０．１ｍｍ２）と比較して、２．６倍（ｐ＜０．０５）増加し、陽性対照群であるｃｏｌｌａｇｅｎ処理群（１１．０５±０．３３／０．１ｍｍ２）と比較して、１．３倍（ｐ＜０．０５）増加したことを確認することができた。
【０１６８】
また、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡ処理群（１１．１４±０．７６／０．１ｍｍ２；８．８６±０．２９／０．１ｍｍ２；８．６７±０．１７／０．１ｍｍ２）と比較して、それぞれ１．２倍（ｐ＜０．０５）、１．５倍（ｐ＜０．０５）及び１．６倍（ｐ＜０．０５）有意に杯状細胞が回復されたことを確認することができた。
【０１６９】
前記結果から、結膜の杯状細胞の分布は、ｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ処理を除いた残りの処理群でも結膜の杯状細胞の分布が改善されると表われたが、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫが処理された動物の角膜で著しく増加したことを確認することができた。
【０１７０】
＜実施例１４＞乾性眼マウスモデルで抗炎症の効果確認
【０１７１】
乾性眼マウスモデルを対象にして炎症反応因子の発現において、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果を評価するために、涙腺でＴＮＦ−α、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の免疫染色を行った。
【０１７２】
その結果、図１９のように、乾燥ストレスによって涙腺で炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αと付着分子であるＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１の発現が著しく増加したことを確認することができ、乾燥ストレスによって涙腺のＭＭＰ−２とＭＭＰ−９も、顕著に増加した。しかし、Ｈｙｐ−ＧＱＤＧＬＡＧＰＫが処理されたマウスモデルの涙腺では、炎症関連因子の発現が著しく減少したことを確認することができ、乾性眼治療剤であるＣｓＡ、ＤＱＳ及びＨＡが処理されたマウスモデルよりも、顕著に抑制されたことを確認することができた。
【０１７３】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい実施態様であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、下記の特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。
【図１】
2019519597.tif 000004
【図２】
2019519597.tif 000005
【図３】
2019519597.tif 000006
【図４】
2019519597.tif 000007
【図５】
2019519597.tif 000008
【図６】
2019519597.tif 000009
【図７】
2019519597.tif 000010
【図８】
2019519597.tif 000011
【図９】
2019519597.tif 000012
【図１０】
2019519597.tif 000013
【図１１】
2019519597.tif 000014
【図１２】
2019519597.tif 000015
【図１３】
2019519597.tif 000016
【図１４】
2019519597.tif 000017
【図１５】
2019519597.tif 000018
【図１６】
2019519597.tif 000019
【図１７】
2019519597.tif 000020
【図１８】
2019519597.tif 000021
【図１９】
2019519597.tif 000022
【配列表】
2019519597000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月12日(2018.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、最初のアミノ酸がヒドロキシプロリン（Ｈｙｄ）であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、コラーゲンタイプII  α１由来であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記コラーゲンタイプII  α１は、動物軟骨細胞由来の細胞外基質から分離されたことを特徴とする請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項６】
前記眼球表面疾患は、角膜混濁、角膜血管新生、角膜炎症及び角膜纎維化からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする請求項５に記載の眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項７】
前記ペプチドは、軟骨細胞由来の細胞外基質（ＣＤＥＭ）から分離されたコラーゲンタイプII  α１由来であることを特徴とする請求項５に記載の眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項８】
前記ペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されることを特徴とする請求項５に記載の眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項９】
前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であることを特徴とする請求項５に記載の眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１０】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する眼球表面疾患の予防または改善用健康食品。
【請求項１１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドは、コラーゲンタイプII  α１由来であることを特徴とする請求項１１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドは、乾燥ストレスによる涙の生成の減少及び角膜表面の不均衡を回復させ、角膜上皮細胞の剥離及び炎症性因子の生成を抑制することを特徴とする請求項１１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されることを特徴とする請求項１１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１５】
前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であることを特徴とする請求項１１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する乾性眼の予防または改善用健康食品。
【国際調査報告】
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2019519597.tif 000026
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