(57)【要約】  本発明は、二本鎖核酸を構成する一本鎖核酸が互いに相補的に架橋結合（または共有結合）しており、温度、ｐＨ、塩、イオン強度（ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）などの影響を受けていない安定な二本鎖核酸信号プローブを開示する。また、本発明は、標的分子の検出において、前記安定な二本鎖核酸信号プローブを用いてその信号プローブと標的分子との複合体を形成させた後、加熱などによりその複合体からその信号プローブのみを分離し、信号プローブを検出することにより、標的分子を検出することができる方法を開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）標的分子に特異的に結合する領域と、
（ｉｉ）その標的分子との特異的結合領域に結合された信号発生領域とを含み、
その信号発生領域は、互いに相補的に架橋結合された二本鎖核酸であり、その二本鎖核酸には、同一の信号発生物質で標識された、或いは互いに異なる信号発生物質で標識された２つ以上の領域が存在する標的分子に固有な信号を発生させることができる、二本鎖核酸信号プローブ。
【請求項２】
前記２つ以上の領域は、その一つ以上の領域が残りの領域とは異なる信号を発生させる信号発生物質で標識されたことを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項３】
前記信号発生領域である二本鎖核酸は完全二本鎖核酸または部分的二本鎖核酸であることを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項４】
前記標的分子との特異的結合領域が一本鎖核酸、抗体、抗原またはアプタマーであることを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項５】
前記信号発生物質は、互いに異なる色を有する２種類以上の蛍光物質であることを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項６】
固定領域が、既知の配列であって、信号発生領域に隣接して連結されたことを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項７】
固定領域が、既知の配列であって、前記信号発生領域に隣接してさらに連結され、既知の配列が２回繰り返してなることを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項８】
前記標的分子との特異的結合領域と前記信号発生領域との間にスペーサーが含まれて連結されたことを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項９】
前記標的分子の特異的結合領域の反対側に結合タグが連結されたことを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項１０】
前記標的分子の特異的結合領域の反対側に結合タグが連結され、その結合タグはビオチンまたはビオチン類似体であることを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項１１】
（ａ）分析対象試料に、標的分子との特異的結合領域を有する信号プローブを処理して、試料中の標的分子と信号プローブとの複合体を形成させる段階と、
（ｂ）その複合体の信号プローブを検出する段階とを含み、
前記信号プローブは、（ｉ）標的分子に特異的に結合する領域と、（ｉｉ）その標的分子との特異的結合領域に結合された信号発生領域とを含み、その信号発生領域は、互いに相補的に架橋結合された二本鎖核酸であり、その二本鎖核酸には、同一の信号発生物質で標識された、或いは互いに異なる信号発生物質で標識された２つ以上の領域が存在することにより、前記信号プローブの検出段階は、前記信号発生領域の信号を検出することにより行われる、分析対象試料中の標的分子の検出方法。
【請求項１２】
前記標的分子との特異的結合領域が一本鎖核酸、抗体、抗原またはアプタマーであることを特徴とする、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記信号プローブの検出段階は、（ｉ）前記複合体から信号プローブを分離する段階と、（ｉｉ）その分離された信号プローブの信号を検出する段階とを含む、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１４】
（ａ）分析対象試料をニトロセルロース膜に処理して試料中のタンパク質をニトロセルロース膜に吸着させる段階と、
（ｂ）前記タンパク質が吸着したニトロセルロース膜に遮断剤を処理して、タンパク質が吸着していないニトロセルロース膜の表面を遮断させる段階と、
（ｃ）前記遮断されたニトロセルロース膜に、標的タンパク質との特異的結合領域を有する信号プローブを処理して、試料中の標的タンパク質と信号プローブとの複合体を形成させる段階と、
（ｄ）その複合体の信号プローブを検出する段階とを含み、
前記信号プローブは、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合する領域と、（ｉｉ）その標的タンパク質との特異的結合領域に結合された信号発生領域とを含み、その信号発生領域は、互いに相補的に架橋結合された二本鎖核酸であり、その二本鎖核酸には、同一の信号発生物質で標識された、或いは互いに異なる信号発生物質で標識された２つ以上の領域が存在することにより、前記信号プローブの検出段階は、前記信号発生領域の信号を検出することにより行われる、分析対象試料中の標的タンパク質の検出方法。
【請求項１５】
前記標的分子との特異的結合領域が抗体または抗原であることを特徴とする、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記（ａ）段階の後に、ニトロセルロース膜に吸着したタンパク質以外の他の分子を除去するための洗浄段階が行われることを特徴とする、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１７】
前記（ｃ）段階の後に、非特異的結合分子を除去するための洗浄段階が行われることを特徴とする、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記（ｄ）段階の信号プローブ検出段階が、（ｄ−１）前記複合体から信号プローブを分離させる段階と、（ｄ−２）その分離された信号プローブを検出する段階とを含んで行われることを特徴とする、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１９】
前記信号プローブは、その標的分子の特異的結合領域の反対側に結合タグが連結されており、
前記（ｄ）段階の信号プローブ検出段階が、（ｄ−１）前記複合体から信号プローブを分離させる段階と、（ｄ−２）その分離された信号プローブを検出する段階とを含んで行われ、
前記（ｄ−２）信号プローブ検出段階は、
（ｄ−２−ｉ）その分離された信号プローブを、その信号プローブの結合タグを介して、その結合タグに対する結合パートナーがコーティングされている分析用支持体に処理して、結合タグと結合パートナーとの特異的結合によって分析用支持体に固定する段階と、
（ｄ−２−ｉｉ）その支持体に固定された信号プローブの信号を検出する段階とを含んで行われることを特徴とする、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項２０】
前記結合タグがビオチンまたはビオチン類似体であることを特徴とする、請求項１９に記載の検出方法。
【請求項２１】
前記結合パートナーがストレプトアビジンまたはストレプトアビジン類似体であることを特徴とする、請求項１９に記載の検出方法。
【請求項２２】
固定領域が、既知の配列であって、前記信号発生領域に隣接してさらに連結されており、
前記（ｄ−２−ｉｉ）信号プローブの信号検出段階は、
前記固定領域に相補的な一本鎖核酸配列を有し、その配列に前記結合パートナーと特異的に結合することができる結合タグを有する固定核酸分子を前記支持体に処理する段階と、
その処理段階の後、信号プローブの信号を検出する段階とを含んで行われることを特徴とする、請求項１９に記載の検出方法。
【請求項２３】
前記固定核酸分子の結合タグがビオチンまたはビオチン類似体であることを特徴とする、請求項２２に記載の検出方法。
【請求項２４】
（ａ）分析対象試料に、その標的分子に特異的に結合する信号プローブ、およびその信号プローブが特異的に結合する標的分子の部位とは異なる部位に特異的に結合する領域とその領域に連結された磁性粒子とからなる捕捉プローブを処理して、前記標的分子と前記信号プローブと前記捕捉プローブの複合体を形成させるとともに、その複合体、複合体を形成していない信号プローブ及び捕捉プローブを含む混合物を得る段階と、
（ｂ）その混合物中の複合体の信号プローブを検出する段階とを含み、
前記信号プローブは、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合する領域と、（ｉｉ）その標的タンパク質との特異的結合領域に結合された信号発生領域とを含み、その信号発生領域は、互いに相補的に架橋結合された二本鎖核酸であり、その二本鎖核酸には、同一の信号発生物質で標識された、或いは互いに異なる信号発生物質で標識された２つ以上の領域が存在することにより、前記信号プローブの検出段階は、前記信号発生領域の信号を検出することにより行われる、分析対象試料中の標的タンパク質の検出方法。
【請求項２５】
前記標的分子との特異的結合領域が一本鎖核酸、抗体、抗原またはアプタマーであることを特徴とする、請求項２４に記載の検出方法。
【請求項２６】
前記（ｂ）信号プローブ検出段階は、
（ｂ−１）前記混合物中の複合体から信号プローブのみを分離させる段階と、
（ｂ−２）その分離された信号プローブを検出する段階とを含んで行われることを特徴をする、請求項２４に記載の検出方法。
【請求項２７】
前記（ｂ）信号プローブ検出段階は、
（ｂ−１）前記混合物中の複合体から信号プローブのみを分離させる段階と、
（ｂ−２）その分離された信号プローブを検出する段階とを含んで行われ、
前記（ｂ−１）信号プローブのみを分離させる段階は、
（ｂ−１−ｉ）前記混合物に磁石を適用して、前記複合体と該複合体を形成していない捕捉プローブのみを磁石に結合させることにより、混合物の残りの成分を除去する段階と、
（ｂ−１−ｉｉ）磁石に結合されている複合体から信号プローブのみを分離させる段階とを含んで行われることを特徴とする、請求項２４に記載の検出方法。
【請求項２８】
前記信号プローブは、その標的分子の特異的結合領域の反対側に結合タグが連結されており、
前記（ｂ−２）の信号プローブ検出段階は、
（ｂ−２−ｉ）その分離された信号プローブを、その信号プローブの結合タグを介して、その結合タグに対する結合パートナーがコーティングされている分析用支持体に処理して、結合タグと結合パートナーとの特異的結合を介して分析用支持体に固定する段階と、
（ｂ−２−ｉｉ）その支持体に固定された信号プローブの信号を検出する段階とを含んで行われることを特徴とする、請求項２７に記載の検出方法。
【請求項２９】
前記結合タグがビオチンまたはビオチン類似体であることを特徴とする、請求項２８に記載の検出方法。
【請求項３０】
前記結合パートナーがストレプトアビジンまたはストレプトアビジン類似体であることを特徴とする、請求項２８に記載の検出方法。
【請求項３１】
固定領域が、既知の配列であって、前記信号発生領域に隣接してさらに連結されており、
前記（ｂ−２−ｉｉ）信号プローブの信号検出段階は、
前記固定領域に相補的な一本鎖核酸配列を有し、その配列に前記結合パートナーと特異的に結合することができる結合タグを有する固定核酸分子を前記支持体に処理する段階と、
その処理段階の後、信号プローブの信号を検出する段階とを含んで行われることを特徴とする、請求項２８に記載の検出方法。
【請求項３２】
前記固定核酸分子の結合タグがビオチンまたはビオチン類似体であることを特徴とする、請求項３１に記載の検出方法。
【請求項３３】
（ａ）分析対象試料に、その標的分子に特異的に結合する信号プローブ、及びその信号プローブが特異的に結合する標的分子の部位とは同一の部位に特異的に結合する領域とその領域に連結された磁性粒子とからなる捕捉競合分子を定量して処理することにより、前記捕捉競合分子と前記信号プローブとの複合体を形成させるとともに、その複合体を含む混合物を得る段階と、
（ｂ）その混合物中の複合体の信号プローブを検出する段階とを含み、
前記信号プローブは、（ｉ）標的タンパク質に特異的に結合する領域と、（ｉｉ）その標的タンパク質との特異的結合領域に結合された信号発生領域とを含み、その信号発生領域は、互いに相補的に架橋結合された二本鎖核酸であり、その二本鎖核酸には、同一の信号発生物質で標識された、或いは互いに異なる信号発生物質で標識された２つ以上の領域が存在することにより、
前記信号プローブの検出段階は、前記信号発生領域の信号を検出することにより行われ、
前記信号リガンドは、捕捉競合分子と標的分子の両方を検出することができる量以下で処理される、分析対象試料中の標的タンパク質の検出方法。
【請求項３４】
前記標的分子との特異的結合領域が一本鎖核酸、抗体、抗原またはアプタマーであることを特徴とする、請求項３３に記載の検出方法。
【請求項３５】
前記（ｂ）信号プローブ検出段階は、
（ｂ−１）前記混合物中の複合体から信号プローブのみを分離させる段階と、
（ｂ−２）その分離された信号プローブを検出する段階とを含んで行われることを特徴をする、請求項３３に記載の検出方法。
【請求項３６】
前記（ｂ）信号プローブ検出段階は、
（ｂ−１）前記混合物中の複合体から信号プローブのみを分離させる段階と、
（ｂ−２）その分離された信号プローブを検出する段階とを含んで行われ、
前記（ｂ−１）信号プローブのみを分離させる段階は、
（ｂ−１−ｉ）前記混合物に磁石を適用して、前記複合体と該複合体を形成していない捕捉競合分子のみを磁石に結合させることにより、混合物の残りの成分を除去する段階と、
（ｂ−１−ｉｉ）磁石に結合されている複合体から信号プローブのみを分離させる段階とを含んで行われることを特徴とする、請求項３３に記載の検出方法。
【請求項３７】
前記信号プローブは、その標的分子の特異的結合領域の反対側に結合タグが連結されており、
前記（ｂ−２）の信号プローブ検出段階は、
（ｂ−２−ｉ）その分離された信号プローブを、その信号プローブの結合タグを介して、その結合タグに対する結合パートナーがコーティングされている分析用支持体に処理して、結合タグと結合パートナーとの特異的結合によって分析用支持体に固定する段階と、
（ｂ−２−ｉｉ）その支持体に固定された信号プローブの信号を検出する段階とを含んで行われることを特徴とする、請求項３６に記載の検出方法。
【請求項３８】
前記結合タグがビオチンまたはビオチン類似体であることを特徴とする、請求項３７に記載の検出方法。
【請求項３９】
前記結合パートナーがストレプトアビジンまたはストレプトアビジン類似体であることを特徴とする、請求項３７に記載の検出方法。
【請求項４０】
固定領域が、既知の配列であって、前記信号発生領域に隣接してさらに連結されており、
前記（ｂ−２−ｉｉ）信号プローブの信号検出段階は、
前記固定領域に相補的な一本鎖核酸配列を有し、その配列に前記結合パートナーと特異的に結合することができる結合タグを有する固定核酸分子を前記支持体に処理する段階と、
その処理段階の後、信号プローブの信号を検出する段階とを含んで行われることを特徴とする、請求項３７に記載の検出方法。
【請求項４１】
前記固定核酸分子の結合タグがビオチンまたはビオチン類似体であることを特徴とする、請求項４０に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖核酸信号プローブおよびこれを用いた標的分子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞のＤＮＡに暗号化されている遺伝情報は、ＤＮＡ複製によって子孫へ伝達される。また、遺伝情報は、ＤＮＡからＲＮＡ、そしてＲＮＡからタンパク質へのパスを介して発現される。すべての細胞は、遺伝情報の伝達または発現に関連する生体分子から構成されており、これらの存在様相は生物体の機能に重要な影響を与える。
標的分子（またはバイオマーカー）は、臨床的に検出可能であり、特定の用途のために選択された生体分子である。生体分子は、病気の発生または進行に応じて、細胞内で増減したり分泌したりすることができ、特定の組織から末端組織まで血流を介して容易に広がることができる。また、細胞が破壊される場合にも生体分子の変化が現れる。
代表的な生体分子としては、核酸とアミノ酸がある。核酸は、遺伝情報を持つＤＮＡ、および情報の仲介者の役割を果たすＲＮＡを構成し、染色体異常、ＤＮＡメチル化および遺伝子変異（Ｇｅｎｅ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）などは、遺伝情報の発現過程に影響を与える。その中でも、遺伝子変異の種類としては、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）と構造変異（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）などがある。ＳＮＰは、ＤＮＡ塩基配列中の１つの塩基配列（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の差を示す遺伝的変化または変異を意味する。構造変異は、欠失、逆位、添加、複製などのＤＮＡ構造変異を意味する。遺伝子変異は、表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）の変化、病気への感受性、および治療薬剤の反応差など、オブジェクト間の差を決定付けると知られており、特に疾患の発生および進行過程に関与する変異を疾患関連遺伝的変異（Ｄｉｓｅａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ）と呼ぶ。
遺伝子とは、形質を作り出す因子であって、遺伝情報の単位である。それぞれの細胞には５万〜１０万個程度の遺伝子があるが、細胞は選択的に遺伝子を使用する。その中の多くは、細胞自身の生命維持活動や日常的な活動のために使用される遺伝子である。内因性の標準発現遺伝子は、特定の遺伝子または多数の遺伝子の発現量を比較するために使用される遺伝子であり、メッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ、以下、「ｍＲＮＡ」という。）の形態をベースとする。生体内試料の定量分析は、特定の遺伝子の機能探索、特定の機能を示す遺伝子の探索、特定の条件での遺伝子発現様相の確認、およびその他の様々な分子生物学的目的において重要であり、内因性の標準発現遺伝子を活用した様々な遺伝子発現測定法が開発されている。
代表的な遺伝子発現測定法として、高速並列分析技術であるＤＮＡマイクロアレイ方法がある。ＤＮＡマイクロアレイは、単にハイブリダイゼーション方式によって標的配列を検出するから、交差反応による真陽性問題が発生し、ハイブリダイゼーションシグナルの信頼度を改善しなければならないという問題点がある。また、従来のマイクロアレイは、ハイブリダイゼーション方式によって試料内の核酸を検出するから、ハイブリダイゼーションの後に厳しい洗浄過程が要求されるという問題点があり、ハイブリダイゼーションの前に標的配列を一本鎖にする過程が必須的に要求される。一方、最近発表されたｏｎ−ｃｈｉｐ  ＰＣＲは、ハイブリダイゼーションまたはプローブエクステンション（ｐｒｏｂｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）方式によって検出するので、従来のマイクロアレイと同様にヘテロジーニアス・アッセイ・システム（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）であり、リアルタイム検出が不可能で正確な定量が難しいという問題点がある。
生体分子は、核酸に加えて、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質（ｌｉｐｉｄ）、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原菌、毒性物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ａｎａｌｏｇ）、補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）、阻害剤、薬、染料、栄養分、成長因子、細胞、組織などを含み、理論的には、その範囲は制限がない。ほぼ全ての化学的または生物学的エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）が該当し、様々なサイズの分子で構成されている。このような生体分子に対する効率の良いリアルタイム検出および正確な定量についての開発が望まれている。
様々な生体分子分析法は、検出感度の向上および多重分析能の向上の観点から発展を重ねてきたが、依然として分析コストの削減、分析時間の短縮、感度の向上および再現性の増大という技術的課題に直面している。
一方、特許文献１（関連論文は非特許文献１である。）では、標的生体分子を分子係数することが可能な蛍光バーコードプローブを用いたが、この蛍光バーコードプローブは、７つの単位体であるＲＮＡ切片がこれに相補的なＤＮＡバックボーンに相補的であり、連続的に連結されてなる信号発生領域と、標的核酸と特異的に結合する相補的な一本鎖核酸である標的分子結合領域とから構成されている。この蛍光バーコードプローブは、標的核酸と結合して複合体を形成し、標的分子に特異的な検出信号を発生させ、その複合体（すなわち、標的分子）の分子係数を可能にする。前記蛍光バーコードプローブは、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖核酸であって、一本鎖核酸が塩基対間の水素結合によって形成され、その安定性が温度、ｐＨ、塩、イオン強度（ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）などの影響を受ける。すなわち、温度などによって蛍光バーコードプローブの二本鎖核酸が分離される場合、標的分子に対する正確な情報を提供することができない。よって、前記特許文献１に開示されている標的分子の分析方法は、温度、ｐＨ、塩、イオン強度（ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）などを考慮しなければならない内在的な限界を持つ。
本発明は、かかる限界点を克服するために提案されるものである。一本鎖核酸が互いに相補的に二本鎖核酸を形成するが、相補的共有結合を形成して温度、ｐＨ、塩、イオン強度（ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）などの影響を受けていない二本鎖核酸プローブを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第８，５１９，１１５号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８，  ２６：３１７−３２５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、一本鎖核酸が互いに相補的に二本鎖核酸を形成するが、架橋結合（または共有結合）を形成して温度、ｐＨ、塩、イオン強度（ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）などに影響を受けない安定な二本鎖核酸信号プローブを開示する。
本発明の他の目的は、前記二本鎖核酸信号プローブを用いた標的分子の検出方法を開示する。
本発明の別の目的や具体的な目的は、以下で提示される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本発明は、二本鎖核酸信号プローブを提供する。
本発明の二本鎖核酸信号プローブは、前述したように、その二本鎖核酸を構成する一本鎖核酸が互いに相補的に架橋結合（または共有結合）している特徴を持つ。
具体的には、本発明の二本鎖核酸信号プローブは、（ｉ）標的分子に特異的に結合する領域（ここで、「領域」は、場合によっては他の部分の同一または類似の用語と明確に区分するために「モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）」と表示されることもある。）と、（ｉｉ）その標的分子との特異的結合領域に結合され、その信号プローブに固有な（または特異的な）信号を発生させる信号発生領域とを含み、その信号発生領域は、互いに相補的に架橋結合（すなわち、共有結合）された二本鎖核酸であり、その二本鎖核酸には、同一の信号発生物質で標識された、或いは互いに異なる信号発生物質で標識された２つ以上の領域（ここで、「領域」は、場合によっては他の部分の同一または類似の用語と明確に区分するために「セグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）」と表示されることもある。）が存在することを特徴とする。
【０００７】
本発明の信号プローブにおいて、前記標的分子と特異的に結合する領域は、代表的に、一本鎖核酸、抗体、またはアプタマーであり得る。前記特異的結合領域が一本鎖核酸で構成される場合には、その標的分子はｍＲＮＡなどの核酸であり、前記特異的結合領域が抗体で構成される場合には、その標的分子はその抗体が特異的に認識するエピトープを有する抗原であり、前記特異的結合領域がアプタマーで構成される場合には、その標的分子はそのアプタマーが特異的に認識して結合する抗原などのタンパク質であり得る。
【０００８】
標的分子との特異的結合領域としての一本鎖核酸は、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡだけでなく、その標的分子であるｍＲＮＡなどの核酸と特異的な結合能を有する限り、ヌクレアーゼまたは熱に安定なＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＨＮＡ（Ｈｅｘｉｔｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）、ＡＮＡ（Ａｌｔｒｉｔｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）、ＭＮＡ（Ｍａｎｎｉｔｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）などの核酸類似体であってもよい。また、同様に、その標的分子であるｍＲＮＡなどの核酸と特異的な結合能を有する限り、天然ヌクレオチド（ｎａｔｕｒａｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）だけでなく、修飾ヌクレオチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含むことができる。このような修飾ヌクレオチドは、その糖、そのフォスフェイトおよび／またはその塩基で修飾されたものであり得る。このような糖、フォスフェイトおよび／または塩基で修飾されたヌクレオチドは、当業分野にその製造方法を含めて具体的に公知されている。例えば、糖で修飾されたヌクレオチドとしては、その糖のヒドロキシル基（ＯＨ  ｇｒｏｕｐ）がハロゲン基、脂肪族基、エーテル基、アミン基などで修飾されたもの、糖であるリボースまたはデオキシリボース自体がこれに代わることができる糖類似体α−アノマー糖（α−ａｎｏｍｅｒｉｃ  ｓｕｇａｒｓ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）、キシロース（ｘｙｌｏｓｅｓ）またはリキソース（ｌｙｘｏｓｅｓ）などのエピマー糖（ｅｐｉｍｅｒｉｃ  ｓｕｇａｒｓ）、ピラノース糖（ｐｙｒａｎｏｓｅ  ｓｕｇａｒｓ）、フラノース糖（ｆｕｒａｎｏｓｅ  ｓｕｇａｒｓ）などで置換されたものを挙げることができる。また、例えば、フォスフェイトでの修飾は、フォスフェイトがＰ（Ｏ）Ｓ（ｔｈｉｏａｔｅ）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（ａｍｉｄａｔｅ）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）へ修飾されたものなどを挙げることができる。ここで、前記ＲまたはＲ’は、Ｈまたは置換もしくは無置換のアルキルなどであり、フォスフェイトで修飾される場合、その連結基が−Ｏ−、−Ｎ−、−Ｓ−または−Ｃ−であって、このような連結基を介して隣接ヌクレオチドが互いに結合することになる。
【０００９】
核酸類似体または修飾ヌクレオチド、その修飾ヌクレオチドを含む一本鎖核酸などに関しては、文献［Ｓｐｒｏａｔ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：７３３−７３８（１９９１）］、文献［Ｃｏｔｔｅｎ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：２６２９−２６３５（１９９１）］、文献［Ｈｏｂｂｓ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５１３８−５１４５（１９７３］など、当業分野に多くの文献が公知されており、より具体的なことは、これらの文献を参照することができる。これらの文献を含めて、本明細書で引用される文献はいずれも、本明細書の一部として看做される。
【００１０】
標的分子との特異的結合領域としての一本鎖核酸の長さは、その一本鎖核酸が標的分子と特異的結合を維持することができれば、特別な制限はない。通常、５〜７０個のヌクレオチドから構成されるが、プローブの長さがあまり長いか短い場合、非特異的結合が起こるおそれがあるので、好ましくは１５〜５０個の塩基から構成される。
【００１１】
標的分子との特異的結合領域としての抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体だけでなく、多重特異性抗体（すなわち、２つ以上の抗原または２つ以上のエピトープを認識する抗体であって、二重特異性抗体などをいう。）であるか、或いは、標的分子と特異的に結合することが可能な能力を保有する限り、抗体の断片、化学的に修飾された抗体、ヒト化抗体、組み換え抗体などである。抗体断片、化学的に修飾された抗体の様々な形態が当業分野に公知されており、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（重鎖または軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させた抗体）、Ｆｖ、Ｆａｂ／ｃ（１つのＦａｂと完全なＦｃを有する抗体）などや、抗体をタンパク質切断酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理して得られた抗体断片などが挙げられる。
【００１２】
標的分子との特異的結合領域としてのアプタマーは、一本鎖ＤＮＡアプタマーまたは一本鎖ＲＮＡアプタマーであり得る。アプタマーは、抗体と同様に、標的タンパク質などの標的分子に特異的に結合することができる核酸リガンドを意味するが、標的分子と特異的に結合することができれば、アプタマーは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーであってもよい。このような標的分子との特異的結合が可能なアプタマーの製造、選別方法などは、いずれも当該分野に公知されており、特にＳＥＬＥＸ技術を利用することができる。このＳＥＬＥＸ技術は、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」の略語と名付けられた技術であって、当該技術については、文献［Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９  （４９６８）：５０５−５１０，  １９９０］、米国特許第５，４７５，０９６号、米国特許登録第５，２７０，１６３号、国際特許公開ＷＯ９１／１９８１３などを参照することができ、アプタマーの選別のための具体的な方法や適切な試薬、材料などの使用については、文献［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６７：２７５−３０１，  １９９６］、文献［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１８：１９３−２１４，  ２０００］などを参照することができる。アプタマーもその糖、そのフォスフェイトおよび／またはその塩基で修飾されたものであり得る。
【００１３】
標的分子との特異的結合領域は、代表的に、一本鎖核酸、抗体、アプタマーであるが、生体試料中の侵入抗原に対する抗体を標的分子としてこれを検出するための場合には、抗原であってもよい。ここで、侵入抗原は、人体などに侵入した細菌、ウイルスなどに由来したものであり、そのような侵入抗原に対する抗体の検出は、これらの細菌、ウイルスの感染有無を判定するのに有用であり得る。
【００１４】
この他にも、標的分子に特異的に結合することができる能力を有する限り、抗体のＦｃ断片、ペプチド、ペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）などが、特別な制限なく、標的分子の特異的結合領域として使用できる。
【００１５】
本発明の信号プローブが検出することが可能な標的分子は、この標的分子に特異的に結合することができる前述した一本鎖核酸、抗体、アプタマー、抗原など、その信号プローブの標的分子との特異的結合領域が特異的に認識、結合することができる任意の分子である。その分子は、好ましくはヒトまたは動物などの生体分子、さらに好ましくは生体分子中の人体分子である。より好ましくは、疾病の診断に有用なバイオマーカーである。代表的には、ｍＲＮＡなどの核酸、細菌、ウイルスなどに由来した抗原、又はその抗原に対する抗体などである。さらに、標的分子は、本発明の信号プローブの標的分子との特異的結合領域が特異的に結合することができる細菌、ウイルスの表面上のタンパク質であり得る。この場合、細菌やウイルスの検出が可能である。
【００１６】
本発明の信号プローブにおいて、信号発生領域は、二本鎖核酸であって、それらの鎖が互いに架橋結合されており、高温状態でも安定な二重結合を維持し、ｐＨ、塩、イオン強度（ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）などの影響を受けない。これは、標的分子の検出過程で温度などの変化によって二本鎖が解けて検出信号を発生させる一本鎖核酸の消失により標的分子の検出精度が低下する欠点を克服することができるようにし、後述するように、本発明の信号プローブを用いて標的分子を検出するとき、本発明の信号プローブが標的分子と複合体を形成させ、分離した後にその複合体を加熱し、その複合体から分離された信号プローブのみを検出することにより、標的分子を検出することを可能にする。
【００１７】
本発明において、信号発生領域の二本鎖間の架橋結合は、当業分野における公知の方法を用いて誘導できる。具体的には、核酸二本鎖間架橋剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）として知られたソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）、８−メトキシソラレン（８−ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａｌｅｎ）などのソラレン誘導体、マイトマイシン−Ｃ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、ピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、プロフラビン（ｐｒｏｆｌａｖｉｎｅ）、ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）などをハイブリダイゼーションした二本鎖に処理し、適正波長のＵＶを照射して実現できる。以下の本発明の実施例では、８−メトキシソラレンを架橋剤として用いて波長３６５ｎｍのＵＶを照射して二本鎖間架橋結合を誘導した場合、９５℃の温度でも安定的に二本鎖を維持していることを確認した。
【００１８】
本発明において、信号発生領域の信号発生物質（検出可能な標識（ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｌａｂｅｌ））は、検出可能な信号を発生させる当業分野における公知の任意の物質であって、このような物質は、信号発生領域を構成する核酸断片の一本鎖または二本鎖（またはその核酸断片の構成単位であるヌクレオチド）に共有的または非共有的に結合する。  
【００１９】
このような信号発生物質は、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位元素など、公知の様々な物質が使用できる。蛍光物質としては、シアニン蛍光物質（Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、アレクサフルオロ蛍光物質シリーズ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、４０５、４３０、４８８、５１４、５９４、６１０、６４７など；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、米国）、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネートなどを使用することができ、化学発光物質としては、ルミノール（ｌｕｍｉｎｏｌ）、イソルミノール（ｉｓｏｌｕｍｉｎｏｌ）、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）、ルシゲニン（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）、ＣＳＰＤ（３−（２’−Ｓｐｉｒｏａｄａｍａｎｔａｎｅ）−４−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（３’ ’−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ（ＡＭＰＰＤ）、Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ｛１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５’−ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］ｄｅｃａｎ｝−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などを使用することができる。放射性同位元素としては、トリチウム、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、リン（３２Ｐ）、硫黄（３５Ｓ）、金属類（例えば、６８Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇｅ、５４Ｍｎ、９９Ｍｏ、９９Ｔｃ、１３３Ｘｅなど）などを使用することができる。蛍光物質をはじめとする信号発生物質の他の例は、例えば、国際公開特許ＷＯ９２／１５６７３、国際公開特許ＷＯ９５／０７４６３、国際公開特許ＷＯ９８／１４６０５、国際公開特許ＷＯ９８／２６２７７、国際公開特許ＷＯ９９／４９０１９などを始めとして、米国特許第５，２９２，６５８号、米国特許第５，４１８，１５５号、米国特許第５，６８３，８８８号、米国特許第５，７４１，６６８号、米国特許第５，７７７，０７９号、米国特許第５，８７６，９９５号などを参照することができる。
好ましくは、互いに異なる色を持つシアニン蛍光物質またはアレクサフルオロ蛍光物質を使用する場合である。一般に、シアニン蛍光物質またはアレクサフルオロ蛍光物質を核酸で標識するとき、核酸増幅製造の際に、４つのアミノアリルヌクレオチド（ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、塩基にアリルアミンを含むヌクレオチド）のうち特定の一つ（４つのヌクレオチドのいずれか、例えばアミノアリル−ｄＣＴＰまたはアミノアリル−ＵＴＰ）またはそれ以上のアミノアリルヌクレオチドを用いて核酸を増幅製造することにより、そのような一つ以上のアミノアリルヌクレオチドが核酸鎖に一定の間隔で（例えば、アミノアリル−ｄＣＴＰを使用する場合、ｄＣＴＰ位置に）統合されるようにした後、その特定の一つ以上のアミノアリルヌクレオチドのアミン基を蛍光物質と結合（共有結合）させて標識化させることが当業分野に公知されている。本発明の以下の実施例でも、アミノアリル−ｄＣＴＰを用いて核酸を増幅製造し、アミノアリル−ｄＣＴＰにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ｂｌｕｅ）、Ｃｙ３（ｇｒｅｅｎ）などの４種類の蛍光物質を結合させて標識化させた。
【００２０】
本発明において、信号発生領域は、その信号発生領域を含む信号プローブに固有な信号を発生させる。信号プローブは、その標的分子との特異的結合領域を有するので、信号発生領域が発生させる固有信号は、その標的分子に固有な信号となる。したがって、信号発生領域が一つの核酸断片による一つの領域のみで構成され、一つの信号発生物質のみで標識される場合、それが発生させる固有信号は、使用可能な信号発生物質の種類の数に応じて極めて制限されるしかなく、その結果として検出・識別することができる標的分子の種類の数も極めて制限を受ける。よって、信号発生領域が少なくとも２つの領域から構成されることが好ましい。信号発生領域が２つの領域から構成される場合、３種類の互いに異なる信号を発生させることができる蛍光物質（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ｂｌｕｅ）、Ｃｙ３（ｇｒｅｅｎ）およびＣｙ５（ｒｅｄ））を用いて標識化すれば、各領域が発生させる信号の線形順序（ｌｉｎｅａｒ  ｏｒｄｅｒ）に従って９（＝３２）種の固有信号を発生させることができる。よって、それが検出・識別することができる標的分子の種類の数も９種に増える。本発明の以下の実施例では、信号発生領域を６つの領域から構成し、４種類の互いに異なる蛍光物質で標識化し、このように総４，０９６（＝４６）種の互いに異なる信号を発生させる信号発生領域（すなわち、その各信号発生領域を含む４，０９６種の信号プローブ）を製造して使用した。参考までに、米国特許第８，５１９，１１５号（関連論文は、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８，  ２６：３１７−３２５である）の実施例では、信号発生領域を合計７つの領域から構成し、４種類の互いに異なる蛍光物質で標識化して１６，３８４（＝４６）種の信号プローブを使用することが可能な場合を開示している。信号発生領域の各領域が発生させる信号の線形順序（ｌｉｎｅａｒ  ｏｒｄｅｒ）は、本発明の以下の実施例で使用したｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザ（ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）、米国特許第８，５１９，１１５号の実施例またはその関連論文である文献（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８，  ２６：３１７−３２５）で使用したＮｉｃｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｅ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｆｏｃｕｓ、１．４  ＮＡ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ＶＣ  ６０Ｘ  ｏｉｌ−ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｌｅｎｓ（Ｎｉｋｏｎｔｋ社製、日本国）、ａｎＸ−ｃｉｔｅ  １２０  ｍｅｔａｌ  ｈａｌｉｄｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｏｕｒｃｅ（Ｅｘｆｏ社製、米国）、ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｈ１１７  ｓｔａｇｅ（Ｐｒｉｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、英国）、およびＳｍａｒｔ  Ｓｈｕｔｔｅｒ（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、米国）が備えられた装置である。）を用いて、各信号に応じたイメージを取得し、その各イメージを統合して線状に信号を整列、検出することにより、定量化することが可能である。前記米国特許第８，５１９，１１５号またはその関連論文である文献（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８，  ２６：３１７−３２５）も、本明細書の一部として看做される。
【００２１】
前記信号発生領域を２つの領域で構成し、３種類の互いに異なる信号を発生せることができる蛍光物質（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ｂｌｕｅ）、Ｃｙ３（ｇｒｅｅｎ）およびＣｙ５（ｒｅｄ））を用いて標識化すると、信号の線形順序（ｌｉｎｅａｒ  ｏｒｄｅｒ）に従って９（＝３２）種の固有信号を発生させることができる合計９種の信号発生領域（または、各信号発生領域を含む９種の信号プローブ）が得られるが、これらのうち、３種の信号発生領域は同一の信号発生物質で標識され、残りの６種の信号発生領域は互いに異なる信号発生物質が互いに異なる順序で標識される。同様に、本発明の以下の実施例での如く、信号発生領域を６つの領域で構成し、４種類の互いに異なる信号を発生せることができる蛍光物質を用いて標識化すると、信号の線形順序（ｌｉｎｅａｒ  ｏｒｄｅｒ）に従って１６，３８４（＝４６）種の固有信号を発生させることができる合計１６，３８４種の信号発生領域（または、各信号発生領域を含む１６，３８４種の信号プローブ）が得られるが、これらの中の４種は、６つの領域がいずれも同一の信号発生物質で標識されたものが得られる。
したがって、本発明において、信号発生領域が２つ以上の領域を含んで構成される場合、その２つ以上の領域はいずれも同一の信号発生物質で標識されるか、或いはその一つ以上の領域は残りの領域とは異なる信号を発生させる信号発生物質で標識化されると理解できる。
【００２２】
信号発生領域においてこれを構成する各領域の長さ（互いに連結されたヌクレオチドの数）は、信号発生物質が標識化されている程度（すなわち、発生信号の強度）を考慮して決定できる。そのような領域の長さは、通常、０．１ｋｂ（ｋｉｌｏ  ｂａｓｅ）乃至１．５ｋｂの範囲であり得る。本発明の以下の実施例では、天然ヌクレオチド（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ）の３種類とアミノアリル−ｄＣＴＰ１００％（ｄＣＴＰの代わりに、いずれもアミノアリル−ｄＣＴＰを用いる）を用いて核酸増幅製造して、１／４のヌクレオチドがアミノアリル−ｄＣＴＰに統合された９０３ｂｐの長さの核酸断片を得、これを信号発生物質で標識化した。もし２種類のアミノアリル−ＮＴＰを用いて核酸を増幅製造して標識化する場合、その領域の長さは０．２ｋｂ乃至０．５ｋｂの範囲であっても構わない。また、本発明の実施例ではアミノアリル−ｄＣＴＰ１００％を用いたが、３０％乃至７０％のアミノアリル−ｄＣＴＰを用いても、約０．９ｂｐの長さであれば十分な信号を発生させることができるほどに標識化できる。
【００２３】
信号発生領域は、二本鎖核酸であって、完全二本鎖核酸であってもよく、部分的二本鎖核酸であってもよい。本発明の以下の実施例での如く、信号発生領域を構成する二本鎖核酸断片を製造し、これらのそれぞれを標識化させた後、その標識化された二本鎖核酸断片をＴ４リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）などの連結酵素で連結させて製造する場合、その二本鎖核酸をなす２つの一本鎖核酸は、長さが互いに同じ完全二本鎖核酸を形成する。これに対し、米国特許第８，５１９，１１５号（関連論文はＮａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８，  ２６：３１７−３２５である。）の実施例での如く、ＰＣＲで増幅した後に分離して一本鎖核酸を製造し、その一本鎖核酸を鋳型としてＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＳＰ６ポリメラーゼなどで前記鋳型よりも長さが短いＲＮＡ転写物断片を製造し、そのＲＮＡ転写物を標識化させた後に、これを前記鋳型に相補的にハイブリダイゼーションさせて信号発生領域を構成する場合、部分的二本鎖核酸を形成させることもできる。
【００２４】
本発明の信号発生領域は、二本鎖核酸であって、先立って標的分子との特異的な結合領域に関連して説明したように、その二本鎖を構成する核酸は、ＰＮＡなどの核酸類似体であってもよく、修飾ヌクレオチドを含んで構成されてもよい。
【００２５】
本発明の信号プローブにおける、標的分子との特異的結合領域と信号発生領域との結合は、その両方が核酸である場合（すなわち、標的分子との特異的結合領域が標的核酸を検出するための一本鎖核酸である場合）、Ｔ４リガーゼなど、当業分野における公知のリガーゼを用いて連結させることができ、標的分子との特異的結合領域が抗体またはアプタマーである場合、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、カルボニル基、チオール基などの適正官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ、反応性基）を導入し、アミド結合、エステル結合、硫化エステル結合、エーテル結合などを誘導して共有的に信号発生領域と連結させることができる。
【００２６】
本発明の信号プローブにおける、標的分子との特異的結合領域と信号発生領域との間には、図１に示すように、スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）および／または固定領域が存在し得る。図１には、本発明の信号プローブと、この信号プローブを用いた本発明の標的分子の検出方法に使用される主要構成因子が示されている。
スペーサーは、標的分子との特異的結合領域と信号発生領域を離隔させるためのものであり、標的分子との特異的結合領域が標的分子に結合したとき、その結合体が信号発生部の信号検出に障害として作用することを防止して信号発生部の信号検出を容易にするためのものである。スペーサーは、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡなどであってもよく、ＰＮＡなどの核酸類似体であるか或いは修飾ヌクレオチドを含んで構成されてもよい。その長さは、信号発生部の信号検出を容易にすることができる限り、特別な制限はない。通常、２０〜５０ｂｐの長さを有する。
【００２７】
固定領域は、後述する１つ以上の固定核酸分子（または固定分子）が相補的に結合して、本発明の信号プローブを後述する分析用支持体にさらに固定して伸ばす（ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）ために存在する領域であって、既知の配列からなる。したがって、固定領域は、固定核酸分子に相補的な配列の一本鎖核酸で構成され、２つ以上の固定核酸分子が結合し得るように同じ基質の配列が２回以上繰り返し構成され得る。固定領域は、それが固定核酸分子と相補的に結合することができる限り、ＲＮＡ、ＤＮＡなどであってもよく、ＰＮＡなどの核酸類似体であるか或いは修飾ヌクレオチドを含んで構成されてもよい。その長さは、固定核酸分子との十分な結合力を発揮することができる限り、任意の長さであり得る。一般には、長さ２０〜５０ｂｐの同じ基質の配列が２〜２０回繰り返し構成される。  前記スペーサーや固定領域がいずれも本発明の信号プローブに存在する場合、これらはその隣接領域とは共有結合で連結され、その順序は任意の順序であり得るが、固定領域が信号発生領域に隣接して、すなわち信号発生領域の５’側または３’側に存在することが好ましい。それは、固定領域が本発明の信号プローブを分析用支持体にさらに固定するとき、固定領域が信号発生領域に隣接して存在すれば、信号発生領域を線状の形態（ｌｉｎｅａｒ  ｆｏｒｍまたはｓｔｒｅｔｃｈｅｄ  ｆｏｒｍ）で分析用支持体に固定して信号発生領域の信号検出を容易にするためである。
【００２８】
本発明の信号プローブは、その標的分子との特異的な結合領域の反対側に（反対側は、例えば標的分子との特異的結合領域が５’側に存在する場合、３’側を意味する）結合タグが結合することができる。
結合タグは、これと結合することができる結合パートナーがコーティングされた分析用支持体に、その結合パートナーとの特異的結合を介して本発明の信号プローブを固定する作用をする。使用できる結合タグの代表的な物質はビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）であり、これに対する代表的な結合パートナーはストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）である。ストレプトアビジンは、ストレプトマイセスアビディニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ）から分離されたアビジン系の抗生物質のタンパク質であって、４量体構造であり、最大４つのビオチン分子と結合することができる。結合タグは、ビオチンだけでなく、デスチオビオチン（ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）、イミノビオチン（ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）などのビオチン類似体を使用してもよく、分析用支持体にコーティングされる結合パートナーも、ストレプトアビジン以外にも、ビオチンなどと特異的に結合することができるストレプトアビジン類似体であるアビジン、トレプトアビジン（Ｔｒａｐｔａｖｉｄｉｎ）、ニュートラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、米国）などを使用してもよい。
【００２９】
結合タグを本発明の信号プローブに結合させる方法に関連しては、当業分野に様々な方法が公知されており、多くの文献（文献［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９８７  Ｊｕｎ  １１；  １５（１１）：  ４５１３−４５３４］、文献［ＲＮＡ．  ２０１４  Ｍａｒ；  ２０（３）：  ４２１−４２７］、文献［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９；  ４９８：１８５−１９６］など）が蓄積されており、様々なキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、ＡＰＥＸＢＩＯ社製）などが市販されている。
【００３０】
他の態様において、本発明は、前述した信号プローブを用いた試料中の標的分子を検出する方法に関するものである。
具体的には、本発明の検出方法は、（ａ）分析対象試料に前記信号プローブを処理して試料中の標的分子と信号プローブとの複合体を形成させる段階、および（ｂ）その複合体の信号プローブを検出する段階を含んで構成される。
【００３１】
本発明の方法において、分析対象試料は、検出しようとする標的分子を含むか含んでいることが疑われて検出の必要性を持つ任意の混合物または溶液であり得る。試料は、ヒトまたは動物から得られた生体試料だけでなく、そのような生体試料を加工して標的分子の濃度を高めた加工試料であってもよく、ひいては、標的分子が含まれているか含まれているだろうと思われる水、食品、工業廃水など、環境汚染因子、毒性因子などの検査が必要な試料であってもよい。このような試料は、適正の希釈剤、緩衝溶液を含むことができ、細菌やウイルスの存否を検出しようとするときには、培地または培地成分が含まれている細菌培養物、ウイルス培養物であってもよい。
【００３２】
また、本発明の方法において、分析対象試料は、好ましくは、ヒトまたは動物から得られた生体試料またはその加工試料であり得る。生体試料は、血液、尿、唾液、精液、羊水、リンパ液、喀痰、組織など、検出しようとする標的分子を含むか含んでいることが疑われて検出の必要性を持つヒトまたは動物から得られたものであり得る。加工試料は、例えば、血漿、血清、生体試料のタンパク質濃度をタンパク質抽出キットを用いて高めた試料、同様に核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の濃度を高めた試料、組織抽出物、組織から得られた細胞、細胞溶解物、細胞培養物などであり得る。
【００３３】
また、本発明の方法において、前記試料中の標的分子と信号プローブとの複合体を形成させる段階は、試料中に様々な標的分子が含まれている場合、その標的分子にそれぞれ特異的な様々な信号プローブを用いて、多重的に複合体を形成させ、これを検出することが可能である。前述したように、信号プローブの信号発生領域を構成する領域が、本発明の以下の実施例での如く６個であり、４種類の互いに異なる信号発生物質を用いて標識化する場合、１６，３８４（＝４６）種の互いに異なる標的分子を検出する可能性を持つ。
【００３４】
本明細書において、「検出」は、標的分子の存否に対する定性的分析を意味するか、さらに標的分子の存在量、濃度に対する定量的分析まで含む意味として理解される。
【００３５】
本発明の方法において、検出しようとする標的分子がタンパク質である場合、前記（ａ）段階の前に、試料をタンパク質に対する高い結合親和性を有するニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に処理して、標的分子を含む試料中のタンパク質をニトロセルロース膜に吸着させる段階と、次の段階として、適正洗浄溶液を用いて、ニトロセルロース膜に吸着したタンパク質以外の脂質、核酸、代謝産物などの他の分子を除去する段階とが含まれ得る。洗浄溶液は、当業分野で広く用いられるものを購入して使用するか、適切に調製して使用することができるが、洗浄溶液には界面活性剤と塩が含まれる。界面活性剤としては、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ  ９０８、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ＰＥＧ  ９００、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｅｔｈｅｒ  Ｗ−１、Ｓｐａｎ  ２０、Ｓｐａｎ  ４０、Ｓｐａｎ  ８５、これらの混合物が使用できる。塩は、リチウム、ナトリウム、カリウムおよびアンモニウムの酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、塩化物塩、その混合物（特にＳＳＣ、ＳＳＰＥなど）が使用できる。特に、洗浄溶液は、ＴＢＳＴ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）、ＰＢＳＴ溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．０、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）、Ｔｗｅｅｎ  ２０などが含まれているＳＳＰＥ溶液（０．２Ｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、２．９８Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）などを使用することができる。
【００３６】
洗浄段階後には、ウシ血清アルブミンなどの適切な遮断剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含む遮断溶液を処理してニトロセルロース膜のタンパク質非吸着表面を遮断させる段階が含まれ得る。このような遮断段階は、その次の段階である標的分子と信号プローブとの複合体の形成のために、標的分子との特異的結合領域が抗体である信号プローブとして使用する場合、信号プローブの抗体が吸着して検出の精度を低下させることを防止するためのものである。遮断段階の後には、信号プローブを処理して前記（ａ）段階の信号プローブと標的分子との複合体を形成させる段階を行う。ここで、標的分子との特異的結合領域が抗体ではなくアプタマーなどである信号プローブとして使用する場合には、前記遮断段階が必ずしも要求されるのではない。
【００３７】
信号プローブ処理後には、非特異的に結合した信号プローブを除去するために、前述した洗浄溶液などを用いて洗浄工程が行われ得る。
【００３８】
ニトロセルロース膜を用いて標的分子としてのタンパク質を検出する場合、ニトロセルロース膜において前記複合体を形成させた後には、前記（ｂ）段階の信号プローブ検出段階が、（ｂ−１）ニトロセルロース膜に結合されている複合体から信号プローブを分離させる段階と、（ｂ−２）その分離された信号プローブを検出する段階とを含んで行われ得る。複合体から信号プローブを分離する段階は、複合体が結合されているニトロセルロース膜を加熱するか（適正バッファーまたは反応溶液を媒介として加熱するか）、或いは加熱と共に界面活性剤で処理することにより可能である。
【００３９】
本発明の信号プローブは、前述したように、これを構成する二本鎖核酸が互いに架橋結合されており、加熱しても信号発生領域が消失せずに安定な状態を維持して、標的分子検出の精度に影響を与えない。
【００４０】
前記（ｂ−１）分離された信号プローブを検出する段階は、（ｂ−１−ｉ）その分離された信号プローブを、その信号プローブの結合タグを介して、その結合タグに対する結合パートナーがコーティングされている分析用支持体に処理して、結合タグと結合パートナーとの特異的結合によって分析用支持体に固定する段階と、（ｂ−１−ｉｉ）その支持体に固定された信号プローブの信号を検出する段階とを行うことにより実現できる。
【００４１】
ここで、信号プローブの信号は、信号プローブに標識された信号発生物質が発生させる信号であって、前記信号プローブの信号検出段階は、使用された信号発生物質に応じてその信号を検出することができる適正の装置を用いて行われ得る。そのような装置は、信号の特性に応じて分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）、蛍光光度計（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）、吸光度計（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、ルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）、ケミルミノメーター（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）、光量計（ａｃｔｉｎｏｍｅｔｅｒ）などであり得る。信号発生物質としてアレクサフルオロ蛍光物質シリーズまたはシアニン蛍光物質を用いてその信号を検出する場合は、本発明の以下の実施例で使用したｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザ（（ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）、米国特許第８，５１９，１１５号の実施例またはその関連論文である文献（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８，  ２６：３１７−３２５）で使用したＮｉｃｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００Ｅ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｆｏｃｕｓ、１．４  ＮＡ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ＶＣ  ６０Ｘ  ｏｉｌ−ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｌｅｎｓ（Ｎｉｋｏｎ社製、日本国）、ａｎＸ−ｃｉｔｅ  １２０  ｍｅｔａｌ  ｈａｌｉｄｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｏｕｒｃｅ（Ｅｘｆｏ社製、米国）、ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｈ１１７  ｓｔａｇｅ（Ｐｒｉｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、英国）、およびＳｍａｒｔ  Ｓｈｕｔｔｅｒ（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、米国）が備えられた装置である。）を用いることが好ましい。ｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザなどは、各信号発生領域の特異的な信号を線形順序（ｌｉｎｅａｒ  ｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ）で検知し、その検知された信号から標的分子を係数し、定量化することを可能にする。
ｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザなどを用いて信号を線形順序で検出する場合には、そのような信号検出を容易にするために、信号プローブの信号発生領域を線状の形態（ｌｉｎｅａｒ  ｆｏｒｍまたはｓｔｒｅｔｃｈｅｄ  ｆｏｒｍ）で分析用支持体に固定することが好ましいが、これは、信号プローブの固定領域に相補的な一本鎖核酸配列を有し、その相補的な一本鎖核酸配列に連結され、前記分析用支持体にコーティングされた結合パートナーに結合することが可能な結合タグを有する固定分子（または固定核酸分子）を、信号プローブを固定した分析用支持体に処理して行うことができる。固定分子の結合タグも、先立って信号プローブと関連して説明したように、ビオチンまたはビオチン類似体が使用できる。
【００４２】
一方、本発明の方法に使用できる分析用支持体は、信号プローブの結合タグに対する結合パートナー（例えば、ストレプトアビジンなど）が共有結合または非共有結合を介してその表面上にコーティングできれば、その形態や形状、材料において特別な制限はない。  例えば、膜型、ビーズ型、微粒子型、基板型（スライドガラスなど）、カラム型、ウェル型、ウェルプレート型などであり得る。その材料は、プラスチック、レジン、多糖類、シリカ、官能基付きガラス（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｇｌａｓｓ）、改質されたシリコン（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉｌｉｃｏｎ）、炭素、金属、無機ガラス（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｇｌａｓｓｅｓ）、膜、ナイロン、天然樹脂などであり得る。高分子性支持体の材料は、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）、ポリエチレングリコールテトラフタレート（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｔｅｔｒａｐｈｔｈａｌａｔｅ）、ポリビニルアセテート（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）、ポリ塩化ビニル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリアクリロニトリル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ブチルゴム（ｂｕｔｙｌ  ｒｕｂｂｅｒ）、スチレンブタジエンゴム（ｓｔｙｒｅｎｅｂｕｔａｄｉｅｎｅ  ｒｕｂｂｅｒ）、天然ゴム、ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）、（ポリ）テトラフルオロエチレン（（ｐｏｌｙ）ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）、（ポリ）ビニリデンフルオリド（（ｐｏｌｙ）ｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）およびポリメチルペンテン（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔｅｎｅ）などであり得る。
【００４３】
図１には、本発明の方法で使用される、信号プローブ、固定分子を含む主要構成因子が示されており、図２および図３には、前述したニトロセルロース膜を用いて標的分子としてのタンパク質を検出する全体的なプロセスが、それぞれの信号プローブの標的分子との特異的結合領域が抗体である場合とアプタマーである場合に分けられて提示されている。  一方、図４および図５に示すように、本発明の標的分子の検出方法は、前述した信号プローブに加えて、捕捉プローブをさらに用いて行われることも可能である。
このような本発明の捕捉プローブを用いた方法（以下、便宜上、「本発明の捕捉検出方法」という。）は、（ａ）分析対象試料に、その標的分子に特異的に結合する信号プローブと捕捉プローブを処理して、前記標的分子、前記信号プローブおよび前記捕捉プローブの複合体を形成させるとともに、その複合体、複合体を形成していない信号プローブ及び捕捉プローブなどを含む混合物を得る段階と、（ｂ）その混合物中の複合体の信号プローブを検出する段階とを含んで構成される。
【００４４】
本発明の捕捉検出方法において、前記捕捉プローブは、その信号プローブが特異的に結合する標的分子の部位（すなわち、エピトープ）とは異なる部位に特異的に結合する領域と、その領域に連結された磁性粒子（または磁性ビーズ）とからなる構成を有し、図１にその模式図が示されている。
【００４５】
磁性粒子は、米国特許第５，６６５，５５４号、米国特許第６，０２７，９４５号、米国特許第７，０７８，２２４号、韓国公開特許第２００６−００６１４９４号、韓国特許第０５４１２８２号などに開示されているように、当業分野でタンパク質、核酸、細胞、細菌などの分離に広く利用してきた素材であって、ミクロンまたはナノ単位のサイズ（数ミクロンのサイズ、数十乃至数百ナノサイズ）を有する。バイオ物質の分離に代表的に使用されてきた磁性粒子は酸化鉄磁性粒子であり、そのような酸化鉄磁性粒子として、マグネタイト（ｍａｇｎｅｔｉｔｅ；Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（ｍａｇｈｅｍｉｔｅ；Ｆｅ２Ｏ３）、ヘマタイト（ｈｅｍａｔｉｔｅ；Ｆｅ２Ｏ３）などが使用されてきた。磁性粒子は、タンパク質、核酸などの生体分子の分離に使用されるためには、磁性粒子間の相互作用と凝集を防止することができるようにシリカ、ポリマー、金、銀などの非磁性物質で改質され、生体分子であるタンパク質、核酸などと結合できるようにカルボキシ基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、シロキサン基などの官能基やビオチン、ストレプトアビジン結合物質が導入されている必要がある。このような特性を持つ磁性粒子またはその製造方法は、当業分野によく知られており、米国特許第６，０２７，９４５号、米国特許第６，６７３，６３１号、米国特許第７，１８３，００２号、日本国特許第３，２５３，６３８号、日本国特開２００１−１３６９７０号、韓国公開特許第２００９−００８８２９９号などの多くの文献が蓄積されており、また、ストレプトアビジンがコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ磁性ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、米国）、トシル基が導入されたＤＹＮＡＬ  Ｍ−２７０、ＤＹＮＡＬ  Ｍ−２８０（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ社製、Ｎｏｒｗａｙ）などが市販されている。
【００４６】
本発明において、捕捉プローブは、その標的分子との特異的結合領域が、このような磁性粒子と、官能基を介して共有結合されるか或いはビオチンとストレプトアビジン間の非共有結合を介して連結できる。捕捉プローブの標的分子との特異的結合領域は、信号プローブの標的分子との特異的結合領域と標的分子に対して競合的結合を防止するために、信号プローブの標的分子との特異的結合領域が認識して結合する部位とは異なる部位を認識して結合するように設計される。
【００４７】
捕捉プローブの標的分子との特異的結合領域は、前記信号プローブの特異的結合領域と同様に、抗体、アプタマー、一本鎖核酸、標的分子が抗体である場合には抗原などであり、一本鎖核酸である場合にはＰＮＡなどの核酸類似体または修飾ヌクレオチドを含んで構成できる。
【００４８】
本発明の捕捉検出方法において、前記（ａ）段階は、分析対象試料に信号プローブと捕捉プローブを処理して行われるが、そのような場合、標的分子、信号プローブおよび捕捉プローブ間の複合体が形成され、これとともにその複合体、複合体を形成していない信号プローブ、複合体を形成していない捕捉プローブ、非標的分子などを含む混合物が得られる。
【００４９】
標的分子の検出のためには、その次の段階として、前記（ｂ）段階である、その混合物中の複合体の信号プローブの検出を行わなければならない。このような信号プローブの検出は、捕捉プローブが磁性粒子を含んでいるので、前記混合物を磁石に適用すると、捕捉プローブを含む複合体と、複合体を形成していない捕捉プローブのみが磁石に結合することになる。この過程で複合体を形成していない信号プローブや非標的分子などは除去される。この過程で複合体を形成していない信号プローブや非標的分子などの効果的な除去のために、先立って例示した適正の洗浄溶液を用いて洗浄する段階が好ましい。
磁石に複合体などを結合させた後には、その複合体から信号プローブのみを分離するが、これは、前述したように、加熱するか、或いは加熱と共に界面活性剤の処理などによって可能である。信号プローブは、前述したように、これを構成する二本鎖核酸が互いに架橋結合されており、加熱などにも安定な状態を維持する。
【００５０】
前述したところを考慮すると、本発明の捕捉検出方法において、前記（ｂ）段階の信号プローブの検出段階は、（ｂ−１）前記混合物に磁石を適用して、前記複合体、および複合体を形成していない捕捉プローブのみを磁石に結合させて混合物の残りの成分を除去する段階と、（ｂ−２）磁石に結合されている複合体から信号プローブを分離させる段階と、（ｂ−３）その分離された信号プローブを検出する段階とを含んで行われ得る。
前記（ｂ−３）段階の分離された信号プローブのみを検出する段階は、前述したニトロセルロース膜を用いたタンパク質検出方法と同様に、（ｂ−３−ｉ）その分離された信号プローブを、その信号プローブの結合タグを介して、その結合タグに対する結合パートナーがコーティングされている分析用支持体に処理して、結合タグと結合パートナーとの特異的結合を介して分析用支持体に固定する段階と、（ｂ−３−ｉｉ）その支持体に固定された信号プローブの信号を検出する段階とを行うことにより実現できる。このような（ｂ−３−ｉ）分析用支持体への信号プローブの固定段階と、（ｂ−３−ｉｉ）検出段階の具体的な内容は、ニトロセルロース膜を用いたタンパク質検出方法に関連して説明したのをそのまま参照することができる。
【００５１】
他の態様において、本発明の標的分子の検出方法は、図６および図７に示すように、信号プローブに加えて、捕捉競合分子をさらに用いて行われ得る。
【００５２】
本発明の捕捉競合分子を用いた方法（以下、便宜上、「本発明の競合検出方法」という。）は、（ａ）分析対象試料に、その標的分子に特異的に結合する信号プローブと捕捉競合分子を処理して、前記捕捉競合分子と前記信号プローブとの複合体を形成させるとともに、その複合体を含む混合物を得る段階と、（ｂ）その混合物中の複合体の信号プローブを検出する段階とを含んで構成される。
前記混合物は、捕捉競合分子と信号プローブとの複合体に加えて、標的分子と信号プローブとの複合体、複合体を形成していない信号プローブ、複合体を形成していない競合分子、複合体を形成していない標的分子、非標的分子などを含む。
【００５３】
本発明の競合検出方法において、前記捕捉競合分子は、信号プローブが特異的に結合する標的分子の部位（すなわち、エピトープ）と同じ部位に特異的に結合する領域と、その領域に連結された磁性粒子とからなる構成を持つ。前記捕捉競合分子は、一般に標的分子と同じ分子であるが、信号プローブが特異的に結合する標的分子の部位（すなわち、エピトープ）と同じ部位を持って信号プローブとの結合において競合することができる限り、疑似分子であっても構わない。そのような類似分子としては、標的タンパク質が他のタンパク質（抗体のＦｃ）との融合タンパク質などを挙げることができる。
【００５４】
捕捉競合分子は、標的分子と同じ信号プローブの結合部位を持つので、信号プローブとの結合において標的分子と競合し、信号プローブが限界量で試料に処理され且つ捕捉競合分子を定量して処理する場合、捕捉競合分子の検出結果は、分析対象試料中の標的分子に対する情報（すなわち、標的分子の存否、濃度など）を提供することができる。
上記において、「信号プローブが限界量で試料に処理される」というのは、捕捉競合分子と標的分子の両方を検出することができる量以下で処理されることであって、理論的には、定量した捕捉競合分子の濃度（定量値）と、分析対象試料に存在する標的分子の推定された濃度（定量値）とを合算した値未満を検出することが可能な濃度で処理されることを意味するが、実際処理された信号プローブが全て捕捉競合分子または標的分子に結合するのではないので、前記合算値以上で処理されることもある。しかし、一般には、試料中の標的分子の濃度推定が難しいので、前記信号プローブの限界量は、定量した捕捉競合分子の濃度以下を検出することができる濃度になるだろう。
【００５５】
分析対象試料中の標的分子の検出、定量は、同じ反応溶液などを用いた同じ検出条件で信号プローブの処理濃度と捕捉競合分子の処理濃度を異ならせた数回繰り返し実験によって、信号プローブの処理濃度と捕捉競合分子の処理濃度との相関関係を示す標準曲線を作成して得ることができる。一般に、捕捉競合分子の検出・定量値は、試料中の標的分子の濃度に反比例する。
【００５６】
本発明の競合検出方法において、前記（ｂ）段階の混合物中の複合体の信号プローブを検出する段階は、前記本発明の捕捉検出方法での如く行われ得る。
具体的には、（ｂ−１）前記混合物に磁石を適用して捕捉競合分子と信号プローブとの複合体を磁石に結合させる段階と、（ｂ−２）磁石に結合されている複合体から信号プローブのみを分離させる段階と、（ｂ−３）その分離された信号プローブを検出する段階とを含んで行われ得る。前記（ｂ−１）段階で混合物に磁石を適用すると、複合体を形成していない捕捉競合分子も磁石に結合するが、これを加熱する場合、信号プローブのみを分離させることが可能である。
【００５７】
前記（ｂ−３）段階の分離された信号プローブのみを検出する段階は、前述したニトロセルロース膜を用いたタンパク質検出方法、捕捉検出方法と同様に、（ｂ−３−ｉ）その分離された信号プローブを、その信号プローブの結合タグを介して、その結合タグに対する結合パートナーがコーティングされている分析用支持体に処理して、結合タグと結合パートナーとの特異的結合によって分析用支持体に固定する段階と、（ｂ−３−ｉｉ）その支持体に固定された信号プローブの信号を検出する段階とを行うことにより実現できる。このような（ｂ−３−ｉ）分析用支持体への信号プローブの固定段階と（ｂ−３−ｉｉ）検出段階の具体的な内容は、ニトロセルロース膜を用いたタンパク質検出方法に関連して説明したことをそのまま参照することができる。
【発明の効果】
【００５８】
前述したように、本発明は、二本鎖核酸を構成する一本鎖核酸が互いに相補的に架橋結合（または共有結合）しており、温度、ｐＨ、塩、イオン強度（ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）などの影響を受けていない安定な二本鎖核酸信号プローブを提供することができる。
また、本発明は、標的分子の検出において前記安定な二本鎖核酸信号プローブを用いてその信号プローブと標的分子との複合体を形成させた後、加熱などによってその複合体からその信号プローブのみを分離し、信号プローブを検出することにより標的分子を検出することができる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の信号プローブ、およびこの信号プローブを用いた本発明の標的分子の検出方法に使用される主要構成因子を示す。
【図２】ニトロセルロース膜を用いた本発明のタンパク質の検出方法を段階的に示す。
【図３】ニトロセルロース膜を用いた本発明のタンパク質の検出方法を段階的に示す。
【図４】捕捉プローブを用いた標的分子の検出方法を段階的に示す。
【図５】捕捉プローブを用いた標的分子の検出方法を段階的に示す。
【図６】捕捉競合分子を用いた標的分子の検出方法を段階的に示す。
【図７】捕捉競合分子を用いた標的分子の検出方法を段階的に示す。
【図８】本発明の信号プローブが高温でも二本鎖核酸を維持することを示す実験結果である。
【図９】本発明の信号プローブの信号発生領域を構成する二本鎖核酸断片またはその連結体を電気泳動した結果である。
【図１０】本発明の信号プローブを用いて細菌を検出し、その結果をｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザ（ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）を用いて得たイメージである。
【図１１】本発明の信号プローブがｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザ（ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）でイメージされたことを示す模式図である。
【図１２】本発明の信号プローブを用いて２種類の標準標的分子を分析し、標的分子量と信号値をログ−ログスケールで示すグラフである。
【図１３】本発明の信号プローブを用いて１３種類の標的分子を２回分析し、標的分子の量と信号値をログ−ログスケールで示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
以下、本発明を実施例によって説明する。ところが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６１】
実施例の用語
以下の実施例で使用された用語は、請求の範囲を含む本明細書の他の部分で使用された用語とは次の意味的関係を有する。
【００６２】
まず、「信号プローブ」は、以下の実施例で「第１探針」と記載されているか、これと混用されて記載されており、「信号発生領域」は、「色分けバーコード」と記載されているか、これと混用されて記載されており、「信号プローブ」の「標的分子との特異的結合領域」は、「第１プローブ」または「第１リガンド」と記載されているか、これらと混用されて記載されている。
【００６３】
また、「捕捉プローブ」は、以下の実施例で「第２探針」または「捕捉プローブ」と記載されているか、これらと混用されて記載されており、「捕捉プローブ」の「標的分子との特異的な結合領域」は、「第２プローブ」または「第２リガンド」と記載されているか、これらと混用されて記載されている。
【００６４】
信号プローブの信号発生領域を構成する、信号発生物質で標識された各領域は、「信号タグ」と記載されている。
【００６５】
また、「固定核酸分子」は、以下の実施例で「固定分子」と記載されているか、これと混用されて記載されている。
【実施例】
【００６６】
＜実施例１＞試薬の製造
１−１．第１探針（信号プローブ）の製造
第１探針は、標的分子と結合してその標的分子固有の信号を発生させる機能をする。その構成は、標的分子固有の信号を発生させる信号発生領域と、標的分子との特異的結合領域である第１プローブとを結合した構造が基本構成であり、これにさらに固定領域と結合タグが追加された構成であり得る。
【００６７】
１）信号タグの製造
信号タグは、信号発生領域を構成する基本構成単位を指し示し、二本鎖の核酸切片に信号発生物質が標識されている構成である。
本実験では、Ｍ１３  ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）方法で合成したサイズ約９００ｂｐのＰＣＲ産物に信号発生物質が標識された二本鎖核酸を製造して使用した。
信号タグの骨格となるＭ１３  ＤＮＡの塩基配列情報は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データシステム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から確保した（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＣ＿００３２８７）。
１００ｎｇのＭ１３  ＤＮＡ（米国、ＮＥＢ社製）を鋳型として、それぞれ０．１μＭの下記ＰＣＲプライマー対（韓国、バイオニア社製）で１．２５ｕｎｉｔｓのＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（米国、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて標準ＰＣＲ方法によってＤＮＡ切片（９０３ｂｐ）を製造した。
順方向プライマー（配列番号１）：ａｔｃａｇｇｃｇａａｔｃｃｇｔｔａｔｔｇ
逆方向プライマー（配列番号２）：ｔｃｇｇｃｃｔｔｇｃｔｇｇｔａａｔａｔｃ
メーカーから提供した標準方法に基づいて、前記生産されたＰＣＲ産物であるＤＮＡ切片を鋳型として、前記製造されたプライマー対と３種類のｄＮＴＰとａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＣＴＰ（米国、ＴｒｉＬｉｎｋ社製）を用いて再び標準ＰＣＲ方法によってａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＣＴＰ統合されたＤＮＡ切片を製造した。
【００６８】
【表１】
2019526231.tif 000003
【００６９】
前記ＰＣＲ産物の制限酵素地図を作成して、前記ＰＣＲ産物を切断することができない制限酵素（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）を選定した。また、これらの認識部位からなる前記表１のアダプターを購入した（Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ社製、米国）。
【００７０】
前記アダプターを、前記ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＣＴＰが統合されたＰＣＲ産物に、下記の構成となるようにメーカーの標準方法に基づいて連結した。
第１ドメイン：５’−Ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ−ＤＮＡ切片−Ｅｃｏ  Ｒ１／Ｓｍａ  Ｉ  ａｄａｐｔｏｒ−３’
第２ドメイン：５’−Ｅｃｏ  ＲＩ／Ｓｍａ  Ｉ  ａｄａｐｔｏｒ−ＤＮＡ切片−Ｓａｌ  Ｉ／Ｂａｍ  ＨＩａｄａｐｔｏｒ−３’
第３ドメイン：５’−Ｓａｌ  Ｉ／Ｂａｍ  ＨＩ  ａｄａｐｔｏｒ−ＤＮＡ切片−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｎｏｔ  Ｉａｄａｐｔｏｒ−３’
第４ドメイン：５’−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｎｏｔ  Ｉａｄａｐｔｏｒ−ＤＮＡ切片−Ｘｈｏ  Ｉ／Ｐｓｔ１ａｄａｐｔｏｒ−３’
第５ドメイン：５’−Ｘｈｏ  Ｉ／Ｐｓｔ１  ａｄａｐｔｏｒ−ＤＮＡ切片−Ｓａｌ  Ｉ／Ｂａｍ  ＨＩａｄａｐｔｏｒ−３’
第６ドメイン：５’−Ｓａｌ  Ｉ／Ｂａｍ  ＨＩ  ａｄａｐｔｏｒ−ＤＮＡ切片−３’
【００７１】
具体的には、前記３ｎｍｏｌのアダプターと０．３ｎｍｏｌのＰＣＲ産物であるＤＮＡ切片とからなる１９μＬの混合溶液に１μＬの５ｕｎｉｔ／μＬ  Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ（米国、ＮＥＢ社製）を添加して連結反応を行った後、得られた反応産物をＤＮＡおよびＲＮＡ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｐａｃｋ（Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ社製、米国）で精製して、前記アダプターが付き且つａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＣＴＰが統合されたＤＮＡ切片を取得し、前記制限酵素を処理した後、再び精製し、収穫した。  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−ｅｓｔｅｒ（エステル）蛍光物質であるＡｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５９４、Ａｌｅｘａ  ６４７（米国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＣｙ３（米国、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）の４種類の信号発生物質セットを準備した。
メーカーが提供した標準方法に基づいて、まず、前記アダプターが付き且つａｍｉｎｏ−ａｌｌｙｌ  ｄＣＴＰが統合された１６〜２０μｇのＤＮＡ切片を各ドメイン別に２０μＬの滅菌蒸留水に溶かした後、１２μＬの標識溶液（２５ｍｇのＮａＨＣＯ３を１ｍＬの滅菌精製水に溶かした溶液）を添加して反応溶液を製造した。次いで、前記信号発生物質をＤＭＳＯに最終濃度３０μｇ／Ｌで溶かして信号発生物質溶液を製造した。その後、前記反応溶液を４つのチューブに５μＬずつ分けて仕込み、それぞれに１種類の前記２μＬの信号発生物質溶液を入れて暗状態、室温で１時間反応させた。
このような反応でＤＮＡ切片に信号発生物質を標識した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（米国、ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製して、前記アダプターが付き且つ信号発生物質が標識されたＤＮＡ切片を取得した。
このようにして、各ドメイン別に前記４種類の信号発生物質がそれぞれ標識された４種類の二本鎖ＤＮＡ切片の信号タグを製造し、これらを便宜上「Ｈ信号タグ」と呼んだ。
【００７２】
２）共有結合誘導および検証
前記製造された１ｍｇのＨ信号タグを１ｍＬの反応バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）に溶かした。前記溶液を、同じ体積の９５％エタノールに溶かした０．３μｍｏｌの８−ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａｌｅｎ（８−ＭＯＰ；米国、Ｓｉｇｍａ社製）に添加して、暗状態で１時間反応させた。この反応物に波長３６５ｎｍの紫外線（４Ｗ）を３時間照射して、前記Ｈ信号タグ鎖の塩基対間の共有結合を誘導した（Ａ．  Ａｒａｂｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２３７  （２００２）  ４７−５５）。
前記反応溶液に４倍体積のクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）を加えて、抽出工程で未反応ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）が除去された上澄み液を収穫した。前記収穫物に５Ｍ  ＮａＣｌを最終濃度０．２Ｍとなるように添加した後、３倍体積のエタノールを添加して、前記共有結合が誘導されたＨ信号タグを得た。こうして得た共有結合が誘導されたＨ信号タグを便宜上「Ｃ信号タグ」と呼んだ。
Ｈ信号タグとこれに相応するＣ信号タグに対して０．５℃ずつ温度を９５℃まで上昇させながらＵＶ−１８００（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製、日本）にて２６０ｎｍで吸光度を測定した結果、図８のとおりであった。
Ｈ信号タグは、温度が上昇しながら二本鎖核酸が解離されて一本鎖核酸に転換され、Ｔｍが約８５℃であり、９５℃で一本鎖核酸として存在した。これに対し、Ｃ信号タグは、９５℃でも二本鎖核酸を維持していることを分かった。
【００７３】
３）信号発生領域である色分けバーコードの製造
前記製造されたＣ信号タグを用いて、信号発生領域である色分けバーコード（Ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｅｄ  ｂａｒｃｏｄｅ）を以下のとおり製造した。
まず、４種類の第１ドメイン信号タグから選択された１種類を４つのチューブに分けてそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬずつ入れ、各チューブに第２ドメイン信号タグの４種類をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬずつ入れて、最終体積１００ＬのＴ４  ｌｉｇａｓｅの反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５）で混合させた。前記第１ドメイン信号タグの残りの３種類も上述の方法で処理して、第１ドメイン信号タグの４種類と第２ドメイン信号タグの４種類をすべてそれぞれ混合させた。その１６個の反応結果物を第１、２ドメイン混合溶液と命名した。
同様に、４種類の第３ドメイン信号タグから選択された１種類を４つのチューブに分けてそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬずつ入れ、各チューブに第４ドメイン信号タグの４種類をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬずつ入れて、最終体積１００ＬのＴ４  ｌｉｇａｓｅの反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５）で混合させた。前記第３ドメイン信号タグの残りの３種類も上述の方法で処理して、第３ドメイン信号タグの４種類と第４ドメイン信号タグの４種類をすべてそれぞれ混合させ、その１６個の反応結果物を第３、４ドメイン混合溶液と命名した。
また、同様に、４種類の第５ドメイン信号タグから選択された１種類を４つのチューブに分けてそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬずつ入れ、各チューブに第６ドメイン信号タグの４種類をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬずつ入れて、最終体積１００ＬのＴ４  ｌｉｇａｓｅの反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５）で混合させた。前記第５ドメイン信号タグの残りの３種類も上述したような方法で処理して、第５ドメイン信号タグの４種類と第６ドメイン信号タグの４種類をすべてそれぞれ混合させた。その１６個の反応結果物を第５、６ドメイン混合溶液と命名した。
前述したような方法で、第１、２ドメイン混合溶液の１６個のチューブ、第３、４ドメイン混合溶液の１６個のチューブ、および第５、６ドメイン混合溶液の１６個のチューブを完成した。
【００７４】
第１、２ドメイン混合溶液の１６個のチューブから選択されたチューブ、第３、４ドメイン混合溶液の１６個のチューブから選択されたチューブ、および第５、６ドメイン混合溶液の１６個のチューブから選択されたチューブをそれぞれ同じ濃度で混合して得た９５μＬの反応溶液に５μＬの５ｕｎｉｔ／μＬ  Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ（米国、ＮＥＢ社製）を処理し、１２時間連結反応を行い、６つのドメイン信号タグが一列に連続的配列をした最終構造体である合計４，０９６個（１６×１６×１６＝４６）の信号発生領域を製造した。これを便宜上「色分けバーコード」と呼んだ。
【００７５】
前記各反応段階別の反応産物を電気泳動した結果のイメージを図９に示している。
こうして得た色分けバーコードは、その構成因子である信号タグ（信号発生物質が標識された二本鎖の核酸切片）６個が一列に配列された構成であり、各信号タグは４種類の蛍光物質（３種類のＡｌｅｘａ  ｄｙｅおよびＣｙ３）のいずれかで標識されており、各信号の線形順序（ｌｉｎｅａｒ  ｏｒｄｅｒ）によって固有の検出信号を発生させ、下記で説明するように、第１プローブである標的分子との特異的結合領域に連結される場合、合計４，０９６個（１６×１６×１６＝４６）の標的分子を区別することができる。これらの色分けバーコードは、３００ｎｍサイズのスポットを形成し、エピ−蛍光顕微鏡（ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＵＳ８，５１９，１１５  Ｂ２；ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８  Ｍａｒ；２６（３）：２９３−４）によってイメージ化される。
【００７６】
４）探針の製造
第１探針は、標的分子を認識して結合し、固有の信号を発生させて標的分子を検出するための構造体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）であって、標的分子との特異的結合領域である第１プローブが前記信号発生領域と結合した構造である。
このような第１探針は、支持体との結合物質（ビオチンなど）の有無によって非固定型と固定型に分けて製造した。第１プローブとしては、核酸検出のための一本鎖核酸、およびタンパク質などの検出のための抗体とアプタマーを使用した。
【００７７】
（１）非固定の第１探針
非固定の第１探針は、５’−色分けバーコード−スペーサー−第１プローブ−３’の構造で製造した。ここおよび以下において、５’と３’は、色分けバーコード、スペーサーなどの核酸が探針の構成要素として使用された場合、そのような核酸の配列の方向または順序を意味するために使用した。
スペーサーとしては、下記配列の一本鎖核酸を注文製造して使用した。
スペーサー配列：５’−ＡＧＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＣＧＣＡＧＡＡＣＡＣ−３’
【００７８】
＜１＞第１プローブが一本鎖核酸である非固定の第１探針の製造
第１プローブとして一本鎖核酸を用いた非固定の第１探針を、次の通りに製造した。まず、一本鎖核酸である５’−スペーサー−第１プローブ−３’構造体を注文して製造した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）。その後、１ｍｇ／ｍｌ濃度の５’−スペーサー−第１プローブ−３’構造体１０μｌと１ｍｇ／ｍｌ濃度の色分けバーコード１０μｌがある４８μＬの反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５）に２μＬの５ｕｎｉｔ／μＬ  Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ（米国、ＮＥＢ社製）を添加して連結反応を行い、核酸検出のための非固定の第１探針を製造した。
【００７９】
＜２＞第１プローブが抗体である非固定の第１探針の製造
第１プローブとして抗体を用いた非固定の第１探針を、次の通りに製造した。まず、抗体に反応性基（ＤＴＴを用いて抗体のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）を還元させて得られた−ＳＨ基）付加反応をＴｈｕｎｄｅｒ−Ｌｉｎｋ  ｏｌｉｇｏ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、英国）のプロトコルに基づいて実施し、反応性基が付加された抗体を製造した。具体的には、メーカーから提供する標準方法に基づいて、１ｍｇ／ｍｌ濃度の抗体１００μｌを、メーカーから提供するＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔチューブに添加し、室温で１時間反応させて、反応性基が付加された活性化抗体を製造した。次いで、反応性基（ＮＨ２）がある一本鎖核酸のスペーサーである５’−スペーサー−ＮＨ２を注文製造した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）。その後、前記活性化抗体と前記反応性基があるスペーサーをＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌ−ｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ溶液で反応させて５’−スペーサー−抗体−３’構造体を製造した。最後に、１ｍｇ／ｍｌ濃度の５’−スペーサー−抗体−３’構造体１０μｌと１ｍｇ／ｍｌ濃度の色分けバーコード１０μｌがある４８μＬの反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５）に２μＬの５ｕｎｉｔ／μＬ  Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ（米国、ＮＥＢ社製）を添加して連結反応を行い、タンパク質などの検出のための非固定の第１探針を製造した。
【００８０】
＜３＞第１プローブがアプタマーである非固定の第１探針の製造
第１プローブとしてアプタマーを用いた非固定の第１探針を、次の通りに製造した。まず、５’−スペーサー−アプタマー−３’構造体を注文して製造した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）。次いで、１ｍｇ／ｍｌ濃度の５’−スペーサー−アプタマー−３’構造体１０μＬと１ｍｇ／ｍｌ濃度の色分けバーコード１０μＬがある４８μＬの反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５）に２μＬの５ｕｎｉｔ／μＬ  Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ（米国、ＮＥＢ社製）を添加して連結反応を行い、核酸検出のための非固定の第１探針を製造した。
【００８１】
（２）固定の第１探針
固定の第１探針は、５’−第１プローブ−スペーサー−固定領域−色分けバーコード−ビオチン−３’構造で製造した。ここで、固定領域は、既知の配列であって、繰り返し配列で構成されるが、前記固定領域に相補的な配列を含む固定分子（すなわち、固定核酸分子）が相補的に結合して支持体に第１探針を固定するために使用される。
固定領域は、下記配列の一本鎖核酸を使用した。
固定領域：５’−（ＧＣＣＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＣＧＴＡＧＧＡＴＣＴＧ）１０−３’
ここで、１０は、整数であって、前記配列の繰り返し数を意味する。
【００８２】
＜１＞第１プローブが一本鎖核酸である固定の第１探針の製造
第１プローブとして一本鎖核酸を用いた固定の第１探針を、次の通りに製造した。まず、一本鎖核酸の５’−スペーサー−固定領域−３’構造体を注文製造して準備した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）。次いで、色分けバーコードにビオチンを付加する反応をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｂｉｏｔｉｎ  ３  Ｅｎｄ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（米国、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて５’−色分けバーコード−ビオチン−３’構造体を製造した。具体的には、メーカーが提供した標準方法に基づいて、１ｍｇ／ｍｌ濃度の色分けバーコード１００μＬと５μＭ濃度のＢｉｏｔｉｎ−１１−ＵＴＰ（（Ｂｉｏｔｉｎ−１１−Ｕｒｉｄｉｎｅ−５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）５μＬとが混合された４５μＬの反応溶液（５０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．９）に、５μＬの１．５Ｕ／μＬ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）を添加し、３７℃で１時間反応させて製造した。その後、１ｍｇ／ｍｌ濃度の５’−スペーサー−固定領域−３’構造体１０μＬと１ｍｇ／ｍｌ濃度の５’−色分けバーコード−ビオチン−３’構造体１０μＬとが混合された４５μＬの反応溶液（５０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．９）に、２μＬの５ｕｎｉｔ／μＬ  Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ（米国、ＮＥＢ社製）を添加し、連結反応を行って５’−スペーサー−固定領域−色分けバーコード−ビオチン−３’構造体を製造し、精製した。最後に、１ｍｇ／ｍｌ濃度の前記製造精製された構造体１０μＬと１ｍｇ／ｍｌ濃度の第１プローブ１０μＬとが混合された４５μＬの反応溶液（５０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．９）に、２μＬの５ｕｎｉｔ／μＬ  Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ（米国、ＮＥＢ社製）を添加して連結反応を行い、５’−第１プローブ−スペーサー−固定領域−色分けバーコード−ビオチン−３’である第１プローブが一本鎖核酸である固定の第１探針を製造した。
【００８３】
＜２＞第１プローブが抗体である固定の第１探針の製造
第１プローブとして抗体を用いた固定の第１探針を、次の通りに製造した。まず、５’−色分けバーコード−ビオチン−３’構造体と反応性基（ＳＨ基）の付加された抗体とは上記と同様の方法で準備し、反応性基（ＮＨ２）のある一本鎖核酸である５’−ＮＨ２−スペーサー−固定領域−３’構造体は注文製造して準備した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）。次に、１ｍｇ／ｍｌ濃度のＮＨ２−スペーサー−固定領域構造体１００μＬと１ｍｇ／ｍｌ濃度の５’−色分けバーコード−ビオチン−３’構造体１００μＬとが混合された４５μＬの反応溶液（５０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．９）に、２μＬの５ｕｎｉｔ／μＬ  Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ（米国、ＮＥＢ社製）を添加して連結反応を行うことにより、ＮＨ２−スペーサー−固定領域−色分けバーコード−ビオチン−３’構造体を製造した。その後、反応性基の付加された前記抗体と前記構造体を室温で１２〜２４時間反応させ、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、英国）を前記反応混合溶液に添加して１０分間反応させた後、１５，０００ｇで５分間遠心分離を行った。このようなＣｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ  Ｒｅａｇｅｎｔ添加反応と遠心分離を２回行い、精製された状態の５’−第１プローブ−スペーサー−固定領域−色分けバーコード−ビオチン−３’である第１プローブが抗体である固定の第１探針を製造した。
【００８４】
＜３＞第１プローブアプタイマーである固定の第１探針の製造
第１プローブとしてアプタマーを用いた固定の第１探針を、次の通りに製造した。まず、５’−色分けバーコード−ビオチン−３’構造体は上記と同様の方法で準備し、５’−アプタマー−スペーサー−固定領域−３’の一本鎖核酸は注文製造して準備した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）。次に、１ｍｇ／ｍｌ濃度の５’−色分けバーコード−ビオチン−３’構造体１００μＬと１ｍｇ／ｍｌ濃度の５’−アプタマー−スペーサー−固定領域−３’構造体１００μＬとが混合された４５μＬの反応溶液（５０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．９）２μＬの５ｕｎｉｔ／μＬ  Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ（米国、ＮＥＢ社製）を添加して連結反応を行うことにより、５’−第１プローブ−スペーサー−固定領域−色分けバーコード−ビオチン−３’である第１プローブがアプタマーである固定の第１探針を製造した。
【００８５】
１−２．第２探針と捕捉競合分子の製造
第２探針は、捕捉プローブ、または捕捉プローブの標的分子との特異的な結合領域である第２プローブに収穫のための物質（収穫物質）としての磁性ビーズを結合させて製造し、競合分子は、標的分子（または標的分子と競合することが可能な標的分子類似体）に収穫物質としての磁性ビーズを結合させて製造した。
【００８６】
１）第２プローブが一本鎖核酸またはアプタマーである第２探針の製造
第２プローブが一本鎖核酸またはアプタマーである第２探針は、第２プローブにビオチンとストレプトアビジンを媒介物質として製造した。まず、予め準備した単一核酸またはアプタマーに上記と同様の方法でビオチンを付加する反応によってＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｂｉｏｔｉｎ  ３  Ｅｎｄ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（米国、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて５’−第２プローブ−ビオチン−３’を製造した。具体的には、メーカーが提供した標準方法に基づいて、１ｍｇ／ｍｌ濃度の前記構造体１００μＬと５μＭ濃度のＢｉｏｔｉｎ−１１−ＵＴＰ  ５μＬとが混合された４５μＬの反応溶液（５０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  −ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．９）に、５μＬの１．５Ｕ／μＬ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）を添加し、３７℃で１時間反応させて製造した。その後、前記製造した５’−第２プローブ−ビオチン−３’５０ｎｇ／Ｌを、５μｇ／Ｌのストレプトアビジンがコーティングされた磁性ビーズ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ、Ｎｏｒｗａｙ）に同一の体積で添加してメーカーのプロトコルに基づいて連続回転しながら反応させ、磁性ビーズに第２プローブとして一本鎖核酸が連結された第２探針を製造した。
【００８７】
２）第２プローブが抗体である第２探針の製造
第２プローブが抗体である第２探針は、抗体に直接収穫物質としての磁性ビーズを結合させて製造した。まず、１００μｇの抗体と５ｍｇのトシル基（Ｔｏｓｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を持っている活性化（Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ）磁性ビーズ（Ｍ−２８０  Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓ、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ、Ｎｏｒｗａｙ）をバッファー溶液（０．１Ｍ  ｂｏｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ９．５）に入れ、常温で４８時間反応させた。トシル基を介して抗体が結合された磁性ビーズを磁石を用いて分離し、同一のバッファー溶液でビーズを洗浄することにより、結合していない抗体を除去した。分子が結合された磁性ビーズ（以下、「捕捉プローブ」という）は、洗浄後、０．１％のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ社製、米国）溶液にて３７℃で４時間反応させて、分子と結合していないトシル（ｔｏｓｙｌ）基を不活性化させた。次いで、数回洗浄した後、バッファー溶液（０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４）に磁性ビーズを混合して４℃で保管した。
【００８８】
３）競合分子が一本鎖核酸である捕捉競合分子の製造
競合分子が一本鎖核酸である捕捉競合分子は、標的分子である核酸を検出するために使用されるが、これは、前記第２プローブが一本鎖核酸またはアプタマーである第２探針の製造と同様の方法で製造した。
【００８９】
４）競合分子がタンパク質である捕捉競合分子の製造
競合分子がタンパク質である捕捉競合分子は、標的分子であるタンパク質を検出するために使用されるが、これは、前記第２プローブが一本鎖核酸またはアプタマーである第２探針の製造と同様の方法で製造した。ここで、競合分子は標的タンパク質と同一のタンパク質を使用した。
【００９０】
１−３．固定分子の製造
固定分子は、第１探針の固定領域を構成する繰り返し配列に相補的な塩基配列であり、５’末端にビオチンが標識された一本鎖核酸を注文製造して準備した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）。
【００９１】
＜実施例２＞細菌の検出
代表的な食中毒菌である大腸菌、サルモネラ菌、リステリアおよびブドウ球菌を、表２の抗体と表３のアプタマーが第１プローブ（リガンド）として使用されて製造された固定の第１探針を用いて検出した。
【００９２】
【表２】
2019526231.tif 000004
【００９３】
【表３】
2019526231.tif 000005
【００９４】
反応溶液は、抗体リガンドの場合には１０ｍＭ  ＰＢＳバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）を使用し、アプタマーリガンドの場合にはセレックスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．６  ｃｏｎｔａｉｎｅｄ  １００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ａｎｄ  ０．０２％  Ｔｗｅｅｎ）を使用した。反応溶液に細菌繁殖阻害のためのアジド化ナトリウム０．０５〜０．２％（ｗ／ｖ）、および非特異的結合阻害のためのウシ血清アルブミン０．１〜０．３％（ｗ／ｖ）を含ませた。反応は２０〜３０℃の温度で行った。
細菌が含まれている試料７０μＬにビオチン結合の第１探針１５μＬを混合して３０分間振盪しながら反応させた。前記反応溶液２０μＬを、ストレプトアビジンがコーティングされたスライドガラス（Ｎａｎｏｃｓ社製、米国）に処理し、そのスライドガラスを０．１Ｘ  ＳＳＰＥと０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０を含む洗浄溶液で３回洗浄することにより、細菌と結合しないか或いは非特異的結合をしている第１探針を除去した。カバースリップを覆い、第１探針が細菌と結合して形成された複合体にある細菌の存在信号が発生するスポット（ｓｐｏｔｓ）を、ｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザ（ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）を用いてメーカーのプロトコルに基づいてイメージ化させて図９に示した。
【００９５】
＜実施例３＞核酸およびタンパク質の検出
３−１．核酸検出反応
核酸検出のために、下記表４の一本鎖核酸の第１プローブを含む固定の第１探針、および下記表４の一本鎖核酸の第２プローブを含む第２探針を使用し、β−ａｃｔｉｎ、ＩＬ１７およびＩＬ１７ＲＡ  ｍＲＮＡを標的分子とした。下記表４のβ−ａｃｔｉｎ、ＩＬ１７およびＩＬ１７ＲＡ  ｍＲＮＡの一本鎖核酸は、注文製造し、第１探針と第２探針の製造に使用した（バイオニア社製、韓国）。標的分子であるβ−ａｃｔｉｎ、ＩＬ１７およびＩＬ１７ＲＡ  ｍＲＮＡの塩基配列情報は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データシステム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から得ることができる（ＩＬ１７のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒはＮＭ＿００２１９０、およびＩＬ１７ＲＡのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿０１４３３９）。
【００９６】
【表４】
2019526231.tif 000006
【００９７】
試料は、ヒトの軟骨組織（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社製、ドイツ）を使用した。まず、試料から、標的分子であるｍＲＮＡをＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、米国）を用いて分離した。具体的に、メーカーのプロトコルに基づいて、軟骨組織をメーカーから提供されたバッファーで溶解させた後、溶解された試料をカラムに処理し、遠心分離してＲＮＡをカラム膜に結合させた。カラム膜にあるＲＮＡの分離は、ＲＮＡのあるカラムを洗浄し、膜からＲＮＡを抽出した後、遠心分離してＲＮＡを収穫した。
トータルＲＮＡ１００ｎｇ／μＬの第１探針２００ｎｇ／μＬと第２探針２００ｎｇ／μＬとを混合して振盪しながらハイブリダイゼーション反応を介して第１探針−標的ｍＲＮＡ−第２探針複合体を誘導した。ハイブリダイゼーション反応は、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％  ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む反応溶液を用いて６５℃の条件で行った。次に、反応溶液を磁石に処理して、第２探針の磁性ビーズによる前記複合体の磁石への固定を誘導した後、これを洗浄溶液で洗浄することにより、非結合の第１探針、非標的ＲＮＡを除去した。前記洗浄は、６Ｘ  ＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）／０．１％  ＳＤＳを用いて４８℃で１回、０．１Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳを用いて６８℃で１回、０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳを用いて４２℃で１回、合計３回行った。
第１探針−標的ｍＲＮＡ−第２探針複合体が結合された磁石に０．１Ｘ  ＳＳＰＥおよび０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０を含む溶液を処理し、９５℃で５分間加熱して、前記複合体から第１探針の分離を誘導した後、第１探針の含まれている上澄み液を収穫した。
上澄み液を収穫した後には、分子係数アナライザであるｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザ（ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）を用いて、メーカーのプロトコルに基づいて、第１探針をストレプトアビジンのコーティングされたカバースリップに固定し、固定されたスポットをイメージ化させて検出し、定量化した。
【００９８】
具体的には、前記収穫した上澄み液３μＬに、０．１％  Ｔｅｔｒａｓｐｅｃｋ蛍光マイクロスフェア溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）を１：５，０００で希釈した試薬１μＬを添加し、混合して分析試料を準備し、その分析試料を、ストレプトアビジンのコーティングされたカバースリップ（Ｏｐｔｉｃｈｅｍ、Ａｃｃｅｌｒ８  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を備える前記アナライザの流体装置にロードして、第１探針のビオチンとカバースリップのストレプトアビジンとの結合を介して、支持体であるカバースリップに第１探針の結合を誘導した。このように結合を誘導した後、表面を９０μＬの１Ｘ  ＴＡＥ溶液で１回洗浄して、１Ｘ  ＴＡＥ溶液４０μＬをさらに処理して第１探針が伸びるように（ストレッチングされるように）した後、１分間１６０Ｖ／ｃｍを適用した。伸びた第１探針に６０μＬの５００ｎＭ固定分子を添加して、第１探針の繰り返し配列を含む固定領域に相補的結合を誘導することにより、第１探針を表面にさらに固定化させた。このような固定化過程の間に電流を５分間維持させた。固定化の後にＴＡＥ溶液を除去し、次いで撮影用アンチ光漂白剤（ａｎｔｉｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）であるＳｌｏｗＦａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加してイメージ化を準備した。このようにイメージ化を準備した後には、前記アナライザの撮影器を用いて、四つの蛍光物質に対応する４つの互いに異なる励起波長（４８０、５４５、５８０、６２２）で４つのイメージを取得した。取得された４つのイメージを統合して（ｓｐａｔｉａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）、図１１の模式図に示すような第１探針に対するイメージを得た。イメージ化過程で、前記アナライザの解像度は６００ＦＯＶ（ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｖｉｅｗ）に設定した。前記アナライザからデータをダウンロードし、メーカーが提供する分析指針に従ってＥｘｃｅｌ上で分析した。データは、最初に提供された陽性黒対照群の標準曲線を用いて、試料内の基準物質および標的分子を正常化した。正常化された値は、試料に含まれている基準物質の値を用いて標的分子値を全般的に平均正常化した。標的分子の定量値は、３回の繰り返し分析の結果を平均して計算した。
このように前記アナライザを用いて、標的分子であるｍＲＮＡに対して分子係数分析方法で定量的結果を得た。こうして得た結果は、標的ｍＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲの結果と類似であった。
【００９９】
３−２．タンパク質検出反応
３−２−１．第１探針のみを用いたタンパク質検出反応
下記表５のポリクローナル抗体を標的分子に対する第１プローブとして含む固定の第１探針のみを用いて下記表５の標的分子に対する検出反応を行った。このタンパク質検出反応の全体的なプロセスは、図２および図３から確認することができる。
【０１００】
【表５】
2019526231.tif 000007
【０１０１】
まず、１０ｍＭ  ＰＢＳバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、前記表５の標的分子が１００μｇ／ｍｌで含まれた溶液をそれぞれ製造し、この溶液を段階的に希釈して最終生体分子の濃度を１，０００ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、０．１ｐｇ／ｍＬおよび０ｐｇ／ｍＬとなるようにした。分析混合試料は、１３種類の生体分子に対する前記希釈溶液を様々な濃度で混合して準備した。
また、固定の第１探針溶液は、１０ｍＭ  ＰＢＳバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、第１探針を２００ｎｇ／μLの濃度で含むように製造した。
【０１０２】
前記分析試料の含まれた反応溶液にニトロセルロース膜（Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）ディスクを入れて３０分間振盪しながら反応させ、試料中のタンパク質が膜に吸着するようにした。前記ディスクを１５０μＬの０．１Ｘ  ＳＳＰＥ／０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０溶液で洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ［２％（ｗ／ｖ）Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）のある洗浄溶液］に入れて反応させた。各標的分子に対する固定の第１探針溶液７０μＬを添加して振盪しながら１時間反応させ、標的分子−第１探針間の複合体形成を誘導した。次いで、複合体を形成しない過剰の第１探針と非特異的複合体を形成した第１探針を除去するために、前記ディスクに１５０μＬの０．１Ｘ  ＳＳＰＥ／０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０溶液を添加して３回洗浄した。
洗浄されたディスクから第１探針を分離させて収穫するために、前記洗浄されたディスクに０．１Ｘ  ＳＳＰＥ／０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０溶液を添加し、９５℃で５分間加熱して前記複合体から第１プローブの分離を誘導した後、第１探針の含まれている上澄み液を収穫した。
上澄み液を収穫した後には、前記実施例３−１と同様の方法で、分子係数アナライザであるｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザ（ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）を用いて、メーカーのプロトコルに基づいて、第１探針をストレプトアビジンのコーティングされたカバースリップに固定し、固定されたスポットをイメージさせて検出し、定量化した。
【０１０３】
３−２−２．第１探針と第２探針を用いたタンパク質検出反応（捕捉検出反応）
前記表５のポリクローナル抗体を標的分子に対する第１プローブとして含む固定の第１探針と同様に、前記表５のポリクローナル抗体を各標的分子に対して第２プローブとして含む第２探針を用いて、前記表５の標的分子に対する検出反応を行った。このタンパク質検出反応の全体的なプロセスは図４および図５から確認することができる。
分析試料は、前記実施例３−１と同様の方法で準備した。分析試料２５μＬに、各標的分子に対する固定の第１探針溶液７０μＬと第２探針溶液７０μＬとを混合して振盪しながら１時間反応させ、第１探針−標的分子−第２探針間の複合体形成を誘導した。次いで、反応溶液を磁石に処理して、第２探針の磁性ビーズによる前記複合体の磁石への固定を誘導した後、これを洗浄溶液で洗浄することにより、非結合の第１探針、非標的分子を除去した。この際、洗浄は１５０μＬの０．１Ｘ  ＳＳＰＥ／０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０溶液を用いて３回行った。
次に、前記複合体が結合された磁石に０．１Ｘ  ＳＳＰＥ／０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０溶液を処理し、９５℃で５分間加熱して、前記複合体から第１探針の分離を誘導した後、第１探針の含まれている上澄み液を収穫した。
上澄み液を収穫した後は、前記実施例３−１と同様の方法で、分子係数アナライザであるｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザ（ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）を用いて、メーカーのプロトコルに基づいて、第１探針をストレプトアビジンのコーティングされたカバースリップに固定し、固定されたスポットをイメージ化させて検出し、定量化した。
このように定量化した結果を下記表６に示す。
【０１０４】
【表６】
2019526231.tif 000008
【０１０５】
２種類の標準物質（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｅｎｏｙｌ−ＡＣＰ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、Ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ  １）からなる模擬（ｍｏｃｋ）比較区と、標準物質を含み且つ他の標的分子を含む対照区に対して、３回分析を行った。標準物質からなる模擬比較区を、標準濃度曲線の作成と反応、精製および捕集効率の面で差を示すデータを正規化するために使用した。標準物質の線形性、ダイナミックレンジ（ｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｎｇｅ）および再現性を調べて図１２に示した。図１２は模擬比較区の標準物質に対して測定した結果であり（Ｎ＝６）、ログ−ログプロット上の点を重畳して示したように、各分析に対する制御信号の値（カウント）０．１ｐｇ／ｍＬと１００ｐｇ／ｍＬとの間で再現性が非常に高い結果を示した。また、分析結果によれば、濃度対カウントの線形回帰相関係数は濃度の０．１以上ログ・０．９８９以下ログであって、線形性があった。
また、前記表６の１３種類の生体分子を２回の独立反応で検出し、正規化した結果を図１３にログ・ログスケールで示した。それぞれの信号の偏差が０．７〜３５．４であった。
【０１０６】
４−２−３．第１探針と捕捉競合分子を用いたタンパク質検出反応（競合検出反応）
前記表６の抗体を第１プローブとした第１探針と、前記表５の各タンパク質を競合分子とした捕捉競合分子を用いて、前記表５の標的分子に対する検出反応を行った。このタンパク質検出反応の全体的なプロセスは、図６および図７から確認することができる。
分析試料は、前記実施例３−１と同様の方法で準備した。分析試料２５μＬに、各標的分子に対する固定の第１探針溶液７０μＬと予め濃度（３０μｇ／μＬ）を定量した捕捉競合分子７０μＬとを混合して振盪しながら１時間反応させ、第１探針−標的分子と第１探針−捕捉競合分子間の複合体形成を誘導した。次いで、反応溶液を磁石に処理して捕捉競合分子の磁性ビーズによる前記複合体の磁石への固定を誘導した後、これを洗浄溶液で洗浄することにより、非結合の第１探針、標的分子以外の他の標的分子、第１探針−標的分子を除去し、第１探針−捕捉競合分子間の複合体のみを収穫した。この時、洗浄は１５０μＬの０．１Ｘ  ＳＳＰＥ／０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０溶液を用いて３回行った。
その後、前記第１探針−捕捉競合分子が結合された磁石に、０．１Ｘ  ＳＳＰＥ／０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０溶液を処理し、９５℃で５分間加熱することにより、前記複合体から第１探針の分離を誘導した後、第１探針の含まれている上澄み液を収穫した。
上澄み液を収穫した後には、前記実施例３−１と同様の方法で、分子係数アナライザであるｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザ（ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）を用いて、メーカーのプロトコルに基づいて、第１探針をストレプトアビジンのコーティングされたカバースリップに固定し、固定されたスポットをイメージ化させて検出し、定量化した。こうして得た捕捉競合分子の定量結果から標準曲線を用いて標的分子の定量結果を得た。
【図１】
2019526231.tif 000009
【図２】
2019526231.tif 000010
【図３】
2019526231.tif 000011
【図４】
2019526231.tif 000012
【図５】
2019526231.tif 000013
【図６】
2019526231.tif 000014
【図７】
2019526231.tif 000015
【図８】
2019526231.tif 000016
【図９】
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【図１０】
2019526231.tif 000018
【図１１】
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【図１２】
2019526231.tif 000020
【図１３】
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【配列表】
2019526231000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月13日(2019.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）標的分子に特異的に結合する領域と、
（ｉｉ）その標的分子との特異的結合領域に結合された信号発生領域とを含み、
その信号発生領域は、互いに相補的に架橋結合された二本鎖核酸であり、その二本鎖核酸には、同一の信号発生物質で標識された、或いは互いに異なる信号発生物質で標識された２つ以上の領域が存在する標的分子に固有な信号を発生させることができる、二本鎖核酸信号プローブ。
【請求項２】
前記２つ以上の領域は、その一つ以上の領域が残りの領域とは異なる信号を発生させる信号発生物質で標識されたことを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項３】
前記信号発生領域である二本鎖核酸は完全二本鎖核酸または部分的二本鎖核酸であることを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項４】
前記標的分子との特異的結合領域が一本鎖核酸、抗体、抗原またはアプタマーであることを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項５】
前記信号発生物質は、互いに異なる色を有する２種類以上の蛍光物質であることを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項６】
固定領域が、既知の配列であって、前記信号発生領域に隣接して連結されたことを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項７】
前記標的分子との特異的結合領域と前記信号発生領域との間にスペーサーが含まれて連結されたことを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項８】
前記標的分子の特異的結合領域の反対側に結合タグが連結されたことを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項９】
前記標的分子の特異的結合領域の反対側に結合タグが連結され、その結合タグはビオチンまたはビオチン類似体であることを特徴とする、請求項１に記載の信号プローブ。
【請求項１０】
（ａ）分析対象試料に、標的分子との特異的結合領域を有する信号プローブを処理して、試料中の標的分子と信号プローブとの複合体を形成させる段階と、
（ｂ）その複合体の信号プローブを検出する段階とを含み、
前記信号プローブは、（ｉ）標的分子に特異的に結合する領域と、（ｉｉ）その標的分子との特異的結合領域に結合された信号発生領域とを含み、その信号発生領域は、互いに相補的に架橋結合された二本鎖核酸であり、その二本鎖核酸には、同一の信号発生物質で標識された、或いは互いに異なる信号発生物質で標識された２つ以上の領域が存在することにより、前記信号プローブの検出段階は、前記信号発生領域の信号を検出することにより行われる、分析対象試料中の標的分子の検出方法。
【請求項１１】
前記（ｂ）信号プローブ検出段階は、
（ｂ−１）前記複合体から信号プローブのみを分離させる段階と、（ｂ−２）その分離された信号プローブを検出する段階とを含んで行われることを特徴とする、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
前記（ｂ−１）信号プローブのみを分離させる段階は、前記複合体を加熱し、その複合体から信号プローブのみを分離させることを特徴とする請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記信号発生領域である二本鎖核酸は完全二本鎖核酸または部分的二本鎖核酸であることを特徴とする、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記標的分子との特異的結合領域が一本鎖核酸、抗体、抗原またはアプタマーであることを特徴とする、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記信号発生物質は、互いに異なる色を有する２種類以上の蛍光物質であることを特徴とする、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記標的分子との特異的結合領域と前記信号発生領域との間にスペーサーが含まれて連結されたことを特徴とする、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１７】
前記信号プローブは、その標的分子の特異的結合領域の反対側に結合タグが連結されており、
前記（ｂ−２）信号プローブ検出段階は、
（ｂ−２−ｉ）その分離された信号プローブを、その信号プローブの結合タグを介して、その結合タグに対する結合パートナーがコーティングされている分析用支持体に処理して、結合タグと結合パートナーとの特異的結合によって分析用支持体に固定する段階と、
（ｂ−２−ｉｉ）その支持体に固定された信号プローブの信号を検出する段階とを含んで行われることを特徴とする、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記結合タグがビオチンまたはビオチン類似体ており、前記結合パートナーがストレプトアビジンまたはストレプトアビジン類似体であることを特徴とする、請求項１７に記載の検出方法。
【請求項１９】
固定領域が、既知の配列であって、前記信号発生領域に隣接してさらに連結されており、
前記（ｂ−２−ｉｉ）信号プローブの信号検出段階は、
前記固定領域に相補的な一本鎖核酸配列を有し、その配列に連結されており、前記結合パートナーと特異的に結合することができる結合タグを有する固定核酸分子を前記支持体に処理する段階と、
その処理段階の後、信号プローブの信号を検出する段階とを含んで行われることを特徴とする、請求項１９に記載の検出方法。
【請求項２０】
前記固定核酸分子の結合タグがビオチンまたはビオチン類似体ており、前記結合パートナーがストレプトアビジンまたはストレプトアビジン類似体であることを特徴とする、請求項１９に記載の検出方法。
【国際調査報告】
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