(57)【要約】本発明は、γδＴ細胞集団（複数可）の選択的増殖方法、その組成物及び混合物、ならびにそれを治療薬として使用する方法に関する。本開示の非操作型及び操作型濃縮γδＴ細胞集団は、様々ながん、感染症及び免疫障害の処置に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された混合細胞集団から濃縮γδＴ細胞集団を製造する生体外方法であって、δ１ＴＣＲまたはδ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞またはδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤に、前記混合細胞集団を直接接触させて、臨床上妥当なレベルの濃縮γδＴ細胞集団をもたらすことを含む、前記方法。
【請求項２】
δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤が、
ＴＳ−１及びＴＳ８．２から選択される抗体と同じエピトープに結合する薬剤
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤が、
δ１可変領域を含むエピトープに特異的に結合する薬剤
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤が、図２４中のコンセンサス配列のアミノ酸配列を含むδ１ＴＣＲ可変領域に結合するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤が、δ１可変領域の残基Ａｒｇ７１、Ａｓｐ７２及びＬｙｓ１２０を含むエピトープに結合するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤が、デルタＪ１及びデルタＪ２のＫ１２０に突然変異を含む突然変異体δ１ＴＣＲポリペプチドに対する低減された結合性を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記濃縮γδＴ細胞集団中のδ１Ｔ細胞の百分率が、６０％より高いδ１Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤が、
Ｂ６及び１５Ｄから選択される抗体と同じエピトープに結合する薬剤
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤が、
δ２可変領域を含むエピトープに特異的に結合する薬剤
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤が、前記δ２可変領域のＧ３５に突然変異を含む突然変異体δ２ＴＣＲポリペプチドに対する低減された結合性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記濃縮γδＴ細胞集団中のδ２Ｔ細胞の百分率が、８０％より高いδ２Ｔ細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記濃縮γδＴ細胞集団が、抗原提示細胞またはアミノホスフェートによって増殖させられていない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
δ１Ｔ細胞またはδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる前記１つ以上の薬剤が、抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
δ１Ｔ細胞またはδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる前記１つ以上の薬剤が、表面に固定されている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離された混合細胞集団が、末梢血試料、臍帯血試料または腫瘍から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記濃縮γδＴ細胞集団が多クローン性のＴＣＲ多様性を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記濃縮γδＴ細胞集団がさらに、対象への投与のために製剤化される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記濃縮γδＴ細胞集団が治療的有効量のγδＴ細胞を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記γδＴ細胞集団がさらに、１つ以上の腫瘍認識部分を安定的に発現するように操作されている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
増殖済みγδＴ細胞集団であって、前記増殖済みγδＴ細胞のうち６０％超、７０％超、８０％超または９０％超がδ１Ｔ細胞である、前記増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項２１】
前記δ１Ｔ細胞の６０％超または７０％超が表現型ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ２７＋及び／またはＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ２７＋を発現する、請求項２０に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項２２】
前記増殖済みγδＴ細胞集団が多クローン性のＴＣＲ多様性を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項２３】
増殖済みγδＴ細胞集団であって、前記増殖済みγδＴ細胞のうち８０％超または９０％超がδ２Ｔ細胞である、前記増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項２４】
増殖済みγδＴ細胞集団であって、前記増殖済みγδＴ細胞のうち１０〜９０％がδ１Ｔ細胞であり、前記増殖済みγδＴ細胞のうち９０〜１０％がδ２Ｔ細胞である、前記増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項２５】
腫瘍内浸潤リンパ球に由来する、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項２６】
肝臓への結腸腺癌転移癌、卵巣腫瘍、頭頸部腫瘍または腎腫瘍から単離された腫瘍内浸潤リンパ球に由来する、請求項２５に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項２７】
対象への投与のためにさらに製剤化される、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項２８】
治療的有効量のγδＴ細胞を含む、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項２９】
前記γδＴ細胞集団が、発現カセットによってコードされる１つ以上の腫瘍認識部分を安定的に発現するように操作されている、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項３０】
前記γδＴ細胞が、発現カセットによってコードされる２つ以上の腫瘍認識部分を安定的に発現するように操作されている、請求項２９に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項３１】
前記２つ以上の腫瘍認識部分が異なっており、異なる認識部分の各々が、同じ抗原の異なるエピトープ、または異なる抗原の異なるエピトープを認識する、請求項３０に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項３２】
前記腫瘍認識部分が、
（ｉ）細胞表面腫瘍抗原、もしくは
（ｉｉ）ＭＨＣとの複合体（ペプチド−ＭＨＣ複合体）として前記細胞表面に発現する腫瘍抗原に由来するペプチド
に結合するαβＴＣＲ、γδＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、全抗体もしくはそれらの抗原結合断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、重鎖もしくは軽鎖単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項３３】
前記腫瘍認識部分が、腫瘍内浸潤リンパ球のγδＴＣＲでありかつ非ＭＨＣ拘束的に腫瘍特異抗原を認識するものである、請求項３２に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項３４】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法によって得られる増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項３５】
前記γδＴ細胞集団が、抗原提示細胞またはアミノホスフェートによる抗原刺激を伴わずに生体外で増殖させられている、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項３６】
前記γδＴ細胞集団が、生体外でモノクローナル抗体または融合タンパク質によって活性化させられている、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項３７】
前記γδＴ細胞集団が、ＩＬ−２の共投与を伴わずに対象へ投与されることのために製剤化される、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項３８】
がんの処置を、それを必要とする対象に施す方法であって、先行請求項のいずれか１項に記載の増殖済みγδＴ細胞集団を治療的有効量投与することを含む、前記方法。
【請求項３９】
前記増殖済みγδＴ細胞集団が、前記対象のＭＨＣ遺伝子座に関して同種異系である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記増殖済みγδＴ細胞集団が、発現カセットによってコードされる１つ以上の腫瘍認識部分を安定的に発現するように操作されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記増殖済みγδＴ細胞集団が、少なくとも２つの異なる認識部分を安定的に発現し、異なる認識部分の各々が、（ｉ）同じ抗原の異なるエピトープ、または（ｉｉ）異なる抗原の異なるエピトープを認識する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記腫瘍認識部分が、
（ｉ）細胞表面腫瘍抗原、もしくは
（ｉｉ）ＭＨＣとの複合体（ペプチド−ＭＨＣ複合体）として前記細胞表面に発現した腫瘍抗原に由来するペプチド
に結合するαβＴＣＲ、γδＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、全抗体もしくはそれらの抗原結合断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、重鎖もしくは軽鎖単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
操作型γδＴ細胞であって、腫瘍認識部分を発現するように操作されており、前記腫瘍認識部分が、腫瘍抗原を認識するものであり、前記操作型γδＴ細胞が、ＴＳ．１、ＴＳ８．２、Ｂ６または１５Ｄ抗体と同じエピトープに結合する１つ以上の薬剤の存在下において試験管内で増殖するものである、前記操作型γδＴ細胞。
【請求項４４】
前記操作型γδＴ細胞が、δ１、δ２またはδ３操作型Ｔ細胞である、請求項４３に記載の操作型γδＴ細胞。
【請求項４５】
前記操作型γδＴ細胞が、少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座からの遺伝子発現を欠くようにさらに操作されている、請求項４３に記載の操作型γδＴ細胞。
【請求項４６】
前記１つ以上の薬剤が、１８時間未満に１回の細胞分裂の平均速度で前記操作型γδＴ細胞の増殖を刺激する、請求項４３に記載の操作型γδＴ細胞。
【請求項４７】
前記腫瘍認識部分が腫瘍内浸潤リンパ球に由来する、請求項４３に記載の操作型γδＴ細胞。
【請求項４８】
請求項１に記載の方法であって、
δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤に前記混合細胞集団を直接接触させること
を含み、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤が、
δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５からなる群から選択されかつ場合によってはＴＳ８．２、ＴＳ−１及びＲ９．１２からなる群からも選択される抗体と同じもしくは本質的に同じエピトープに結合するか、または前記抗体と競合する、薬剤
から選択される、前記方法。
【請求項４９】
請求項１に記載の方法であって、
δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤に前記混合細胞集団を直接接触させること
を含み、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤が、
δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７からなる群から選択されかつ場合によってはさらに１５Ｄ及びＢ６から選択される抗体と同じもしくは本質的に同じエピトープに結合するか、または前記抗体と競合する、薬剤
から選択される、前記方法。
【請求項５０】
δ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤に、前記混合細胞集団を直接接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
δ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤が、
δ１−３９からなる群から選択される抗体と同じエピトープに結合する薬剤
から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤に、前記混合細胞集団を直接接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤が、
δ１−１８、及びδ１−３５からなる群から選択される抗体と同じエピトープに結合する薬剤
から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
単離された混合細胞集団から濃縮γδＴ細胞集団を製造する生体外方法であって、
ｉ）第１γδＴ細胞増殖において、
−  δ１ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ１ＴＣＲ、δ３ＴＣＲ、δ４ＴＣＲ及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ１ＴＣＲ及びδ４ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；または
−  δ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の活性化剤
に前記混合細胞集団を直接接触させ、それによって第１濃縮γδＴ細胞集団を製造すること、ならびにその後、
ｉｉ）第２γδＴ細胞増殖において、前記第１濃縮γδＴ細胞集団の少なくとも一部を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に直接接触させ、それによって第２濃縮γδＴ細胞集団を製造すること
を含み、前記第２濃縮γδＴ細胞集団が臨床上妥当な数のγδＴ細胞を含む、前記方法。
【請求項５５】
前記第２γδＴ細胞増殖が、
−  δ１ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ１ＴＣＲ、δ３ＴＣＲ、δ４ＴＣＲ及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ１ＴＣＲ及びδ４ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；または
−  δ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の第２活性化剤
に前記第１濃縮γδＴ細胞集団の少なくとも一部を直接接触させることをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第２活性化剤のうちの１つ以上が、前記第１γδＴ細胞増殖の前記活性化剤のうちの１つ以上とは構造的に異なっている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記第２活性化剤が、前記第１γδＴ細胞増殖の前記第１活性化剤とは構造的に異なっている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ｉ）の前記１つ以上の活性化剤が、
δ１Ｔ細胞、
δ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞；または
δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞
を選択的に増殖させる薬剤であり、かつ
δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５からなる群から選択されかつ場合によってはさらにＴＳ−１、Ｒ９．１２及びＴＳ８．２から選択される抗体と同じエピトープに結合する、薬剤
から選択されるものである、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記第２γδＴ細胞増殖が、
−  δ１ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ１ＴＣＲ、δ３ＴＣＲ、δ４ＴＣＲ及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；または
−  δ１ＴＣＲ及びδ４ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の第２活性化剤
に前記第１濃縮γδＴ細胞集団の少なくとも一部を直接接触させることをさらに含み、
前記第２活性化剤が、
δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５からなる群から選択されかつ場合によってはさらにＴＳ−１、Ｒ９．１２及びＴＳ８．２から選択される抗体
と同じエピトープに結合するものである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ｉ）の前記１つ以上の活性化剤が、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤であり、かつ
δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７からなる群から選択されかつ場合によってはさらにＢ６及び１５Ｄから選択される抗体と同じエピトープに結合する、薬剤
から選択されるものである、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記第２γδＴ細胞増殖が、
δ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の第２活性化剤
に前記第１濃縮γδＴ細胞集団の少なくとも一部を直接接触させることをさらに含み、
前記第２活性化剤が、
δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７からなる群から選択されかつ場合によってはさらにＢ６及び１５Ｄから選択される抗体
と同じエピトープに結合するものである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
単離された混合細胞集団から濃縮γδＴ細胞集団を製造する生体外方法であって、
ｉ）第１γδＴ細胞増殖において、
δ１ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるかまたはδ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の第１薬剤
に前記混合細胞集団を直接接触させ、それによって第１濃縮γδＴ細胞集団を製造すること、ならびにその後、
ｉｉ）第２γδＴ細胞増殖において、
（ａ）γδＴ細胞を増殖させるかまたは、
（ｂ）−  δ１ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、
−  δ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、
−  δ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、もしくは
−  δ１及びδ４ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の第２薬剤
に前記第１濃縮γδＴ細胞集団の少なくとも一部を直接接触させ、それによって第２濃縮γδＴ細胞集団を製造すること
を含む、前記方法。
【請求項６３】
前記第２活性化剤のうちの１つ以上が、前記第１γδＴ細胞増殖の前記活性化剤のうちの１つ以上とは構造的に異なっている、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記第２活性化剤が、前記第１γδＴ細胞増殖の前記第１活性化剤とは構造的に異なっている、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記１つ以上の第１薬剤が、
δ１Ｔ細胞；
δ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞；または
δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞
を選択的に増殖させる薬剤であり、かつ
δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５からなる群から選択されかつ場合によってはさらにＴＳ−１、Ｒ９．１２及びＴＳ８．２から選択される抗体と同じエピトープに結合する、薬剤
から選択されるものである、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記１つ以上の第２薬剤が、
δ１Ｔ細胞；
δ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞；または
δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞
を選択的に増殖させる薬剤であり、かつ
δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５からなる群から選択されかつ場合によってはさらにＴＳ−１、Ｒ９．１２及びＴＳ８．２から選択される抗体と同じエピトープに結合する、薬剤
から選択されるものである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記１つ以上の第１薬剤が、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤であり、かつ
δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７からなる群から選択されかつ場合によってはさらにＢ６及び１５Ｄから選択される抗体と同じエピトープに結合する、薬剤
から選択されるものである、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記１つ以上の第２薬剤が、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤であり、かつ
δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７からなる群から選択されかつ場合によってはさらにＢ６及び１５Ｄから選択される抗体と同じエピトープに結合する、薬剤
から選択されるものである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記濃縮γδＴ細胞集団中のδ１Ｔ細胞の百分率が６０％δ１Ｔ細胞より高い、請求項１、請求項４８、請求項５０〜５９、請求項６２〜６５または請求項６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
δ１Ｔ細胞；
δ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞；または
δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞
を選択的に増殖させる前記薬剤が、
ＴＳ−１もしくはＴＳ８．２抗体と競合しないかまたはＴＳ−１、ＴＳ８．２もしくはＲ９．１２抗体と競合しない薬剤
である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
δ１Ｔ細胞；
δ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞；または
δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞
を選択的に増殖させる前記薬剤が、
ヒトδ１ＴＣＲのδ１ＴＣＲビン１δ１エピトープ、ビン１ｂδ１エピトープ、ビン２δ１エピトープ、ビン２ｂδ１エピトープ、ビン２ｃδ１エピトープ、ビン３δ１エピトープ、ビン４δ１エピトープ、ビン５δ１エピトープ、ビン６δ１エピトープ、ビン７δ１エピトープ、ビン８δ１エピトープまたはビン９δ１エピトープ
に結合する薬剤である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記濃縮γδＴ細胞集団中のδ２Ｔ細胞の百分率が６０％δ２Ｔ細胞より高い、請求項１、請求項４９、請求項５４〜５７、請求項６０〜６４、請求項６７または請求項６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる前記薬剤が、Ｂ６または１５Ｄ抗体と競合しない薬剤である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる前記薬剤が、ヒトδ２ＴＣＲの残基７２〜８３内または残基１〜２７内のδ２ＴＣＲエピトープに結合する薬剤である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる前記薬剤が、
ヒトδ２ＴＣＲのδ２ＴＣＲビン１δ２エピトープ、ビン２δ２エピトープ、ビン３δ２エピトープまたはビン４δ２エピトープ
に結合する薬剤である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
無血清培養条件及び／または懸濁細胞培養条件を含む、請求項１〜１９または請求項４８〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
無血清培養条件を含む、請求項１〜１９または請求項４８〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
−  第１増殖の開始、
−  ドナー試料を提供するステップ、または
−  前記混合細胞集団を１つ以上の活性化剤に直接接触させる第１ステップ
から９０日未満、６０日未満、３０日未満、２１日未満または１９日未満のうちに、前記単離された混合細胞集団から増殖した少なくとも約１０８個のγδＴ細胞を実現する、請求項１〜１９または請求項４８〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
増殖済み操作型γδＴ細胞集団を製造する生体外方法であって、
−  δ１ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、
−  δ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、
−  δ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、または
−  δ１及びδ４ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の薬剤
に１つ以上の操作型γδＴ細胞を直接接触させて臨床上妥当なレベルの操作型γδＴ細胞をもたらすこと
を含む、前記方法。
【請求項７９】
請求項１〜１９または請求項４８〜７８のいずれか１項に記載の方法によって得られる増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項８０】
がん、感染症または炎症性疾患の処置を、それを必要とする対象に施す方法であって、請求項７９に記載の増殖済みγδＴ細胞集団を治療的有効量投与することを含む、前記方法。
【請求項８１】
δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５、δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７からなる群から選択される抗体と同じもしくは本質的に同じエピトープに結合するか、または前記抗体と競合する、抗体。
【請求項８２】
ヒトδ２ＴＣＲのビン１δ２エピトープ、ビン２δ２エピトープ、ビン３δ２エピトープもしくはビン４δ２エピトープ；または、ヒトδ１ＴＣＲのビン１δ１エピトープ、ビン１ｂδ１エピトープ、ビン２δ１エピトープ、ビン２ｂδ１エピトープ、ビン２ｃδ１エピトープ、ビン３δ１エピトープ、ビン４δ１エピトープ、ビン５δ１エピトープ、ビン６δ１エピトープ、ビン７δ１エピトープ、ビン８δ１エピトープもしくはビン９δ１エピトープ
に結合する抗体。
【請求項８３】
前記抗体がＴＳ８．２、ＴＳ−１またはＲ９．１２ではない、請求項８１または請求項８２に記載の抗体。
【請求項８４】
前記抗体が、δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５、δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７からなる群から選択されるいずれか１つの抗体の相補性決定領域を含む、請求項８１または請求項８２に記載の抗体。
【請求項８５】
γδ１Ｔ細胞、γδ２Ｔ細胞及びαβＴ細胞を含有する混合細胞集団において、前記抗体が、γδ２Ｔ細胞と比較して特異的に、かつαβＴ細胞と比較して特異的に、γδ１Ｔ細胞を活性化させる、請求項８１または請求項８２に記載の抗体。
【請求項８６】
γδ１Ｔ細胞、γδ２Ｔ細胞及びαβＴ細胞を含有する混合細胞集団において、前記抗体が、γδ１Ｔ細胞と比較して特異的に、かつαβＴ細胞と比較して特異的に、γδ２Ｔ細胞を活性化させる、請求項８１または請求項８２に記載の抗体。
【請求項８７】
δ１ＴＣＲ；
δ２ＴＣＲ；
δ１及びδ４ＴＣＲ；または
δ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲ
に特有のエピトープに結合する抗体をコードする核酸であって、異種プロモーターに機能可能に繋げられている、前記核酸。
【請求項８８】
（ｉ）前記核酸が、
δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５からなる群から選択されかつ場合によってはさらにＴＳ−１、Ｒ９．１２及びＴＳ８．２から選択される抗体と同じエピトープもしくは本質的に同じエピトープに結合するか、または前記抗体と競合する、抗体
をコードするか；あるいは
（ｉｉ）前記核酸が、
δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７からなる群から選択されかつ場合によってはさらにＢ６及び１５Ｄから選択される抗体と同じエピトープもしくは本質的に同じエピトープに結合するか、または前記抗体と競合する、抗体
をコードする、請求項８７に記載の核酸。
【請求項８９】
（ｉ）前記核酸が、
δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５からなる群から選択されかつ場合によってはさらにＴＳ−１、Ｒ９．１２及びＴＳ８．２から選択される抗体のＣＤＲを含む、抗体
をコードするか；あるいは
（ｉｉ）前記核酸が、
δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７からなる群から選択されかつ場合によってはさらにＢ６及び１５Ｄから選択される抗体のＣＤＲを含む、抗体
をコードする、請求項８７に記載の核酸。
【請求項９０】
請求項８７〜８９のいずれか１項に記載の核酸、及び／または
請求項８１〜８６のいずれか１項に記載の抗体
を含む、宿主細胞。
【請求項９１】
前記核酸が、前記抗体と融合した膜アンカーまたは膜貫通ドメインをコードし、前記抗体が前記宿主細胞の細胞外表面において提示される、請求項９０に記載の宿主細胞。
【請求項９２】
異種核酸を含む抗原提示細胞であって、前記異種核酸がポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドが、抗体に接触している細胞表面受容体であり、前記抗体が、
δ１ＴＣＲ；
δ２ＴＣＲ；
δ１及びδ４ＴＣＲ；または
δ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲ
に特有のエピトープに結合するものである、前記抗原提示細胞。
【請求項９３】
前記細胞表面受容体が前記抗体のＦｃ領域に接触している、請求項９２に記載の抗原提示細胞。
【請求項９４】
前記抗体が、γδＴＣＲの表面に発現したγδＴＣＲのδ鎖に結合している、請求項９２または９３に記載の抗原提示細胞。
【請求項９５】
増殖済みγδＴ細胞集団であって、前記γδＴ細胞集団が、
ＮＫｐ３０活性、ＮＫｐ４４活性及び／またはＮＫｐ４６活性
とは無関係の抗腫瘍性細胞傷害性を含む、前記増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項９６】
前記γδＴ細胞集団が操作型γδＴ細胞の集団である、請求項９５に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項９７】
前記γδＴ細胞集団が非操作型γδＴ細胞の集団である、請求項９５に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項９８】
前記γδＴ細胞集団が、
ＮＫｐ３０活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性、ＮＫｐ４４活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性、及び／またはＮＫｐ４６活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性
を含まない、請求項９５、請求項９６または請求項９７に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項９９】
前記γδＴ細胞集団が、ＮＫｐ３０活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性を含まない、請求項９５、請求項９６または請求項９７に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項９９】
前記γδＴ細胞集団が、ＮＫｐ４４活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性を含まない、請求項９５、請求項９６または請求項９７に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項１０１】
前記γδＴ細胞集団が、抗ＣＤ２０キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む操作型γδＴ細胞の集団である、請求項９５、請求項９６、請求項９８、請求項９９または請求項１００のいずれか１項に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【請求項１０２】
前記細胞のうち４０％未満が、検出可能なレベルのＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及び／またはＮＫｐ４６を発現する、請求項９５〜１０１のいずれか１項に記載の増殖済みγδＴ細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／３３５，５７２号に基づく第１１９条（ｅ）の下での優先権及び利益を主張するものであり、これを以て参照によりその開示全体をあらゆる目的のために全体的に援用する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔリンパ球による抗原認識は、多様性に富む異種二量体受容体であるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって成し遂げられ得る。血液及びリンパ器官の中のヒトＴ細胞のおよそ９５％は、異種二量体αβＴＣＲ受容体（αβＴ細胞系統）を発現する。血液及びリンパ器官の中のヒトＴ細胞のおよそ５％は、異種二量体γδＴＣＲ受容体（γδＴ細胞系統）を発現する。これらのＴ細胞サブセットはそれぞれ「αβ」及び「γδ」Ｔ細胞と呼称されることがある。αβ及びγδＴ細胞は機能が異なる。しかも、αβＴ細胞の活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が抗原をクラスＩ／ＩＩのＭＨＣと関連付けて提示するときに起こる。αβＴ細胞とは対照的に、γδＴ細胞は、ＭＨＣ拘束とは無関係に抗原を認識することができる。さらに、γδＴ細胞は、自然免疫及び養子免疫による認識及び応答を両方とも併せ持っている。
【０００３】
γδＴ細胞は、体細胞再構成された別個の可変遺伝子（Ｖ）、多様性遺伝子（Ｄ）、結合遺伝子（Ｊ）及び定常遺伝子（Ｃ）の組を利用する。γδＴ細胞は、αβＴ細胞よりも少ないＶ、Ｄ及びＪセグメントを含有する。生殖細胞系のＶγ及びＶδ遺伝子の数には、Ｖα及びＶβＴＣＲ遺伝子のレパートリーよりも限りがあるが、ＴＣＲのγ鎖及びδ鎖の再構成中に接合部の多様化プロセスがより大々的であることによって、潜在的なγδＴＣＲレパートリーはαβＴＣＲのそれよりも広くなる（Ｃａｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｇａｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００２）２：３３６）。
【０００４】
ヒトγδＴ細胞は、３つの主要なＶδ（Ｖδ１、Ｖδ２、Ｖδ３）領域遺伝子と、多くて６つのＶγ領域遺伝子とを使用してそれらのＴＣＲを作る（Ｈａｙｄａｙ  ＡＣ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１８，９７５−１０２６）。２つの主要なＶδサブセットは、Ｖδ１及びＶδ２のγδＴ細胞である。種々のＶγを有するＶδ１Ｔ細胞は、粘膜γδＴ細胞の上皮内サブセットの多数を占め、この場合、ＴＣＲは上皮細胞上のストレス分子を認識するようである（Ｂｅａｇｌｅｙ  ＫＷ，Ｈｕｓｂａｎｄ  ＡＪ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８（３）：２３７−２５４）。Ｖγ９を共発現するのが一般的であるＶδ２Ｔ細胞は、末梢血及びリンパ系に豊富に存在している。
【０００５】
疾患細胞上の抗原を直接認識し、腫瘍細胞を殺傷する本来備わっている能力を発揮する、γδＴ細胞の能力は、γδＴ細胞を魅力的な治療ツールにする。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の養子移入は、研究段階でのがんの処置において限られた目標臨床応答をもたらし（Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１０：８４２−８５６，２００８、Ｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ，６０：１４４７−１４６０，２０１１、Ｎａｇａｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，２００９、Ｎｉｃｏｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，１０５：７７８−７８６，２０１１、Ｗｉｌｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００３  Ｊｕｌ  １；１０２（１）：２００−６）、新たなγδＴ細胞集団を単離して臨床において試験する必要性を示唆した。
【０００６】
強力な抗腫瘍活性を有するγδＴ細胞サブセット集団を、向上した純度及び臨床上妥当なレベルで選択的に増殖させる能力は、非常に望ましいものである。抗体とサイトカインとのカクテルは、γδＴ細胞のより多様な組を増殖させるために使用されてきたが、特定のγδＴ細胞サブセットを十分な純度及び臨床上妥当なレベルにまで活性化させることは成し遂げられなかった（Ｄｏｋｏｕｈａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１０、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００９、Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ，２０００、Ｋｒｅｓｓ，２００６）。したがって、特定のγδＴ細胞サブセットを生体外で増殖させる臨床上妥当な方法及びそれによって製造された細胞は、大いに必要とされている。
【０００７】
配列表
本願は、ＥＦＳウェブを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された、これを以て参照により全体的に援用される配列表を含んでいる。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１６年３月３日に作られたものであり、名前が４７１６５−７０１．２０１−ＳＬ．ｔｘｔ、サイズが４，３６６キロバイトである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、一態様において、濃縮γδＴ細胞集団を製造する生体外方法を提供する。濃縮γδＴ細胞集団は、単離された混合細胞集団から、
（ｉ）δ１ＴＣＲに特有のエピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、
（ｉｉ）δ２ＴＣＲに特有のエピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、
（ｉｉｉ）δ１ＴＣＲ及びδ４ＴＣＲに特有のエピトープに結合することによってδ１及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、または
（ｉｖ）δ１ＴＣＲ、δ３ＴＣＲ、δ４ＴＣＲ及びδ５ＴＣＲに特有のエピトープに結合することによってδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の薬剤に混合細胞集団またはその精製済み画分を接触させて濃縮γδＴ細胞集団をもたらすことを含む方法によって、製造することができる。好ましい実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、臨床上妥当なレベルのγδＴ細胞を含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、単離された混合細胞集団から濃縮γδＴ細胞集団を製造する生体外方法であって、
（ｉ）δ１ＴＣＲに特有のエピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、
（ｉｉ）δ２ＴＣＲに特有のエピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、
（ｉｉｉ）δ１ＴＣＲ及びδ４ＴＣＲに特有のエピトープに結合することによってδ１及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、または
（ｉｖ）δ１ＴＣＲ、δ３ＴＣＲ、δ４ＴＣＲ及びδ５ＴＣＲに特有のエピトープに結合することによってδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の薬剤に混合細胞集団を直接接触させて臨床上妥当なレベルの濃縮γδＴ細胞集団をもたらすことを含む、当該方法を提供する。
【００１０】
特定の実施形態では、臨床上妥当なレベルは、少なくとも約１０８個もしくはそれより多いγδＴ細胞、少なくとも約１０９個もしくはそれより多いγδＴ細胞、少なくとも約１０１０個もしくはそれより多いγδＴ細胞、少なくとも約１０１１個もしくはそれより多いγδＴ細胞、または少なくとも約１０１２個もしくはそれより多いγδＴ細胞（例えば、約１０８個〜約１０１２個）を含む。一実施形態では、単離された混合細胞集団は単一ドナーに由来し、方法は、単一ドナー、例えば、単一ドナーからの単一試料、または単一ドナーからの２つ以上の試料から増殖させた、臨床上妥当なレベルの濃縮γδＴ細胞集団を提供する。他の実施形態では、単離された混合細胞集団は、１より多い数または多数のドナーに由来する。いくつかの実施形態では、本発明の第１濃縮ステップの後に濃縮γδＴ細胞集団は、臨床上妥当なレベルの、１０８個より多いγδＴ細胞サブセットを含む。他の実施形態では、本発明の第２、第３、第４、第５などの濃縮ステップの後に濃縮γδＴ細胞集団は、臨床上妥当なレベルの、１０８個より多いγδＴ細胞サブセットを含む。
【００１１】
特定の実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、ＴＳ−１及びＴＳ８．２から選択される抗体と同じエピトープに結合する薬剤から選択される。いくつかの実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、ＴＳ−１及び／またはＴＳ８．２抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する薬剤である。いくつかの実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、ＴＳ−１もしくはＴＳ８．２が結合するエピトープとは重複しないエピトープに結合するかまたはＴＳ−１もしくはＴＳ８．２と競合しない、薬剤である。いくつかの実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、δ１可変領域を含むエピトープに特異的に結合する薬剤から選択される。他の実施形態では、薬剤は、図２４のコンセンサス配列のアミノ酸配列を含むδ１ＴＣＲ可変領域に結合する。さらに他の実施形態では、薬剤は、δ１可変領域の残基Ａｒｇ７１もしくはＡｓｐ７２、及び／またはＪ１もしくはＪ２領域の残基Ｌｙｓ１２０を含むエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、薬剤は、δ１Ｊ１またはδ１Ｊ２のＫ１２０に突然変異、例えば、Ｋ１２０Ａ、Ｋ１２０Ｇ、Ｋ１２０Ｐ、Ｋ１２０Ｖ、Ｋ１２０Ｅ、Ｋ１２０ＤまたはＫ１２０Ｓを含む突然変異体δ１ＴＣＲポリペプチドに対する低減された結合性を有する。
【００１２】
特定の実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、抗体Ｒ９．１２と同じエピトープに結合する薬剤から選択される。いくつかの実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、抗体Ｒ９．１２が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する薬剤である。いくつかの実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、抗体Ｒ９．１２が結合するエピトープとは重複しないエピトープに結合するかまたは抗体Ｒ９．１２と競合しない、薬剤である。
【００１３】
特定の実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、δ１及びδ４Ｔ細胞、もしくδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞に選択的に結合する、及び／またはそれらを選択的に増殖させる、薬剤である。特定の実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２及びδ１−２８５からなる群から選択される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む薬剤である。特定の実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２及びδ１−２８５からなる群から選択される抗体の可変領域を含む薬剤である。特定の実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２及びδ１−２８５からなる群から選択される抗体と同じもしくは本質的に同じエピトープに結合するか、または当該抗体と競合する、薬剤である。特定の実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２及びδ１−２８５からなる群から選択される抗体である。特定の実施形態では、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、ビン１δ１エピトープ、ビン１ｂδ１エピトープ、ビン２δ１エピトープ、ビン２ｂδ１エピトープ、ビン２ｃδ１エピトープ、ビン３δ１エピトープ、ビン４δ１エピトープ、ビン５δ１エピトープ、ビン６δ１エピトープ、ビン７δ１エピトープ、ビン８δ１エピトープまたはビン９δ１エピトープに結合する抗体である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔリンパ球を含んでいる単離された混合細胞集団からのδ１細胞を６０％、７０％、８０％または９０％より多く含む濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔリンパ球を含んでいる単離された、例えば混合された細胞集団からのδ１細胞を６０％、７０％、８０％または９０％より多く含む濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を、例えば、濃縮γδＴ細胞集団（複数可）からのγδＴ細胞の正の選択（例えば、δ１Ｔ細胞、δ１及びδ３γδＴ細胞；δ１及びδ４γδＴ細胞；もしくはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞（例えば、示されているδサブタイプ（複数可）のγδＴ細胞）の正の選択；及び／またはδ２Ｔ細胞の正の選択）によるかまたは濃縮γδＴ細胞集団（複数可）からの非γδＴ細胞（例えば、αβＴ細胞などの非δ１Ｔ細胞）の除去による増殖済みγδＴ細胞集団の精製のステップよりも前に、提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、δ１γδＴ細胞及びδ２γδＴ細胞を含むγδＴ細胞集団を提供し、当該集団の６０％超、７０％超、８０％超または９０％超はδ１γδＴ細胞である。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、δ１γδＴ細胞；δ２γδＴ細胞；δ１及びδ４γδＴ細胞；またはδ１、δ３、δ４及びδ５γδＴ細胞を含むγδＴ細胞集団を提供し、（ｉ）当該集団の６０％超、７０％超、８０％超もしくは９０％超はδ１γδＴ細胞であるか、（ｉｉ）当該集団の６０％超、７０％超、８０％超もしくは９０％超はδ１及びδ３γδＴ細胞であるか、（ｉｉｉ）当該集団の６０％超、７０％超、８０％超もしくは９０％超はδ１及びδ４γδＴ細胞であるか、または（ｉｖ）当該集団の６０％超、７０％超、８０％超もしくは９０％超はδ１、δ３、δ４及びδ５γδＴ細胞である。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、αβＴ細胞を含まないかまたはそれを約２％、約１％、約０．５％、約０．４％、約０．１％、約０．０５％もしくは約０．０１％より少なく含む、γδＴ細胞（例えばδ１γδＴ細胞）の集団を含む組成物を提供する。
【００１６】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約３０％もしくはそれ未満、約２５％もしくはそれ未満、約２０％もしくはそれ未満、約１５％もしくはそれ未満、約１０％もしくはそれ未満、約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、約１．５％もしくはそれ未満、約１．２％もしくはそれ未満、約１％もしくはそれ未満、約０．９％もしくはそれ未満、約０．８％もしくはそれ未満、約０．７％もしくはそれ未満、約０．６％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．４％もしくはそれ未満、約０．３％もしくはそれ未満、約０．２％もしくはそれ未満、または約０．１％もしくはそれ未満のγδＴ細胞（例えば、δ１、δ２、δ１及びδ２、δ１及びδ３、もしくはδ１及びδ４γδＴ細胞、またはそれらの組み合わせ）を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約０．５％〜約５％のγδＴ細胞（例えば、δ１、δ２、δ３、δ４もしくはδ８γδＴ細胞、またはそれらの組み合わせ）を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、単離された混合細胞集団は、中央値より大きいレベルの循環γδＴ細胞または試料内（例えば腫瘍内または上皮試料内）浸潤γδＴ細胞を有する１ドナーまたは多数のドナーからのものである。それゆえ、例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約０．５％〜約１０％のγδＴ細胞（例えば、δ１、δ２、δ３、δ４もしくはδ８γδＴ細胞、またはそれらの組み合わせ）を含む。別の例を挙げると、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約１０％〜約３０％のγδＴ細胞（例えば、δ１、δ２、δ３、δ４もしくはδ８γδＴ細胞、またはそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約１．５％またはそれ未満のγδＴ細胞、好ましくは約１．２％未満のγδＴ細胞、より好ましくは約１％未満のγδＴ細胞、よりいっそう好ましくは約０．５％未満のγδＴ細胞、例えば約０．１％〜約０．４％のγδＴ細胞を含む。
【００１８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％または約２０％のＴリンパ球、及び約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１．２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満、約０．２％未満または約０．１％未満のγδＴ細胞（例えば、δ１、δ２、δ１及びδ２、δ１及びδ３、もしくはδ１及びδ４γδＴ細胞、またはそれらの組み合わせ）を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％または約２０％のＴリンパ球、及び約０．５％〜約５％のγδＴ細胞（例えば、δ１、δ２、δ３、δ４もしくはδ８γδＴ細胞、またはそれらの組み合わせ）を含む。
【００１９】
特定の実施形態では、単離された混合細胞集団は、中央値より大きいレベルの循環γδＴ細胞または試料内（例えば腫瘍内または上皮試料内）浸潤γδＴ細胞を有する１ドナーまたは多数のドナーからのものである。それゆえ、例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％または約２０％のＴリンパ球、及び約０．５％〜約１０％のγδＴ細胞（例えば、δ１、δ２、δ３、δ４もしくはδ８γδＴ細胞、またはそれらの組み合わせ）を含む。別の例を挙げると、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％または約２０％のＴリンパ球、及び約１０％〜約３０％のγδＴ細胞（例えば、δ１、δ２、δ３、δ４もしくはδ８γδＴ細胞、またはそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％または約２０％のＴリンパ球、及び約１．５％以下のγδＴ細胞、好ましくは約１．２％未満のγδＴ細胞、より好ましくは約１％未満のγδＴ細胞、よりいっそう好ましくは約０．５％未満のγδＴ細胞、例えば約０．１％〜約０．４％のγδＴ細胞を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、単離された混合細胞集団は、末梢血試料（例えば、全血、ＰＢＭＣまたはＰＢＬ）、白血球アフェレーシス試料、臍帯血試料、腫瘍試料または組織試料（例えば上皮試料）から選択される。いくつかの実施形態では、単離された混合細胞集団は単一ドナーに由来する。他の実施形態では、単離された混合細胞集団は、１より多い数または多数のドナーに由来する。特定の実施形態では、本発明の方法は、多クローン性のγδＴＣＲ多様性を含む濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を提供する。
【００２１】
他の実施形態では、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、Ｂ６及び１５Ｄから選択される抗体と同じエピトープに結合する薬剤から選択される。さらに他の実施形態では、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、Ｂ６及び１５Ｄから選択される抗体とは異なるエピトープに結合する薬剤から選択される。さらに他の実施形態では、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、Ｂ６及び１５Ｄ抗体が結合するエピトープとは重複しないかまたはＢ６及び１５Ｄ抗体と競合しないエピトープに結合する、薬剤から選択される。一実施形態において、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、δ２可変領域を含むエピトープに特異的に結合する薬剤から選択される。具体的な実施形態において、薬剤は、δ２可変領域のＧ３５に突然変異を含む突然変異体δ２ＴＣＲポリペプチドに対する低減された結合性を有する。
【００２２】
特定の実施形態では、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７（または、δ２−１４、δ２−１７、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７）からなる群から選択される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む薬剤である。特定の実施形態では、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７（または、δ２−１４、δ２−１７、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７）からなる群から選択される抗体の可変領域を含む薬剤である。
【００２３】
特定の実施形態では、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７（または、δ２−１４、δ２−１７、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７）からなる群から選択される抗体と同じもしくは本質的に同じエピトープに結合するか、または当該抗体と競合する、薬剤である。特定の実施形態では、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７（または、δ２−１４、δ２−１７、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６、及びδ２−３７）からなる群から選択される抗体である。特定の実施形態では、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、ビン１δ２エピトープ、ビン２δ２エピトープ、ビン３δ２エピトープまたはビン４δ２エピトープに結合する抗体である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔリンパ球を含んでいる単離された混合細胞集団からのδ２細胞を６０％、７０％、８０％または９０％より多く含む濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔリンパ球を含んでいる単離された、例えば混合された細胞集団からのδ２細胞を６０％、７０％、８０％または９０％より多く含む濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を、例えば、濃縮γδＴ細胞集団（複数可）からのγδＴ細胞の正の選択（例えば、δ２Ｔ細胞の正の選択）によるかまたは濃縮γδＴ細胞集団（複数可）からの非γδＴ細胞の除去（例えば、非δ２Ｔ細胞の除去またはαβＴ細胞の除去）による増殖済みγδＴ細胞集団の精製のステップよりも前に、提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、δ２γδＴ細胞及びδ１γδＴ細胞を含むγδＴ細胞集団を提供し、当該集団の６０％超、７０％超、８０％超または９０％超はδ２γδＴ細胞である。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、αβＴ細胞を含まないかまたはそれを約２％、約１％、約０．５％、約０．４％、約０．１％、約０．０５％もしくは約０．０１％より少なく含む、δ２γδＴ細胞の集団を含む組成物を提供する。
【００２５】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％または約２０％のＴリンパ球、及び約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満、約０．２％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、または約０．０２％未満のδ２細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、末梢血試料（例えばＰＢＭＣまたはＰＢＬ）、白血球アフェレーシス試料、臍帯血試料、腫瘍または組織から選択される。特定の実施形態では、本発明の方法は、多クローン性のＴＣＲ多様性を含む濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を提供する。
【００２６】
特定の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、照射済み抗原提示細胞集団（例えば、照射済みＰＢＭＣ、照射済み固定化細胞株、または照射済みａＡＰＣ）、アミノホスホネート、アミノホスフェート、ビスホスホネートもしくはそれらの組み合わせによって、またはその存在下で増殖させられていない。特定の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、照射済みＰＢＭＣによって、またはその存在下で増殖させられていない。特定の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、照射済みａＡＰＣ（例えば、操作型Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｔ２またはＪＶＭ−３）によって、またはその存在下で増殖させられていない。特定の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、照射済みの固定化細胞株の細胞集団によって、またはその存在下で増殖させられていない。好ましい実施形態では、δ１Ｔ細胞、δ２Ｔ細胞、δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞、またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞（例えばγδＴ細胞）を選択的に増殖させる上記１つ以上の薬剤は、抗体である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、δ１Ｔ細胞、δ２Ｔ細胞、δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞、またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞（例えば、示されているδサブタイプ（複数可）のγδＴ細胞）を選択的に増殖させる上記１つ以上の薬剤は、表面に固定されている。いくつかの実施形態では、δ１Ｔ細胞、δ２Ｔ細胞、δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞、またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞（例えば、示されているδサブタイプ（複数可）のγδＴ細胞）を選択的に増殖させる上記１つ以上の薬剤は、第１及び／または第２あるいはそれに続く増殖において、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ）の表面に固定されている。抗原提示細胞の表面に固定された薬剤は、例えば、ＡＰＣの表面に発現したＦｃ受容体と結合していてもよいし、またはＡＰＣの表面に発現していてもよい。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−３３、ＩＦＮγ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レクチン（例えば、ＰＨＡ−Ｅ、ＰＨＡ−Ｌ、またはＣｏｎＡ）、またはそれらのうちの２つ以上もしくは全ての組み合わせが補充された培養用培地を使用して実施される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＩＬ−２１が補充されていない培養用培地を使用して実施される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−３３、ＩＦＮγ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レクチン（例えば、ＰＨＡ−Ｅ、ＰＨＡ−Ｌ、またはＣｏｎＡ）、またはそれらのうちの２つ以上もしくは全ての組み合わせが補充された培養用培地を使用する第１γδＴ細胞増殖を用いて実施される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＩＬ−２１が補充されていない培養用培地を使用する第１γδＴ細胞増殖を用いて実施される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−３３、ＩＦＮγ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レクチン（例えば、ＰＨＡ−Ｅ、ＰＨＡ−Ｌ、またはＣｏｎＡ）、またはそれらのうちの２つ以上もしくは全ての組み合わせが補充された培養用培地を使用する第２γδＴ細胞増殖を用いて実施される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＩＬ−２１が補充されていない培養用培地を使用する第２γδＴ細胞増殖を用いて実施される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載のγδＴ細胞増殖方法または組成物のいずれかを含む第１γδＴ細胞増殖を用い、その後、δ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ３Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞（例えば、示されているδサブタイプ（複数可）のγδＴ細胞）を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤を含まない培養用培地を使用する第２γδＴ細胞増殖を用いて、実施される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、δ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞（例えば、示されているδサブタイプ（複数可）のγδＴ細胞）を選択的に増殖させる固定された薬剤に操作型もしくは非操作型γδＴ細胞、操作型もしくは非操作型γδＴ細胞集団及び／または単離された混合細胞集団を接触させることを含む本明細書に記載のγδＴ細胞増殖方法あるいは本明細書に記載の組成物（例えば、活性化剤）のいずれかを含む第１γδＴ細胞増殖を用い、その後、ｉ）δ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；もしくはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤を含まないか；ｉｉ）δ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；もしくはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる、構造的に異なる（例えば固定された）薬剤を含有するか；ｉｉｉ）δ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；もしくはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる固定されていない（可溶性の）薬剤を含有するか；またはｉｖ）Ｔ細胞を増殖させる（例えば、αβ及びγδＴ細胞を増殖させる）かもしくはαβＴ細胞と比較して特異的にγδＴ細胞を増殖させる薬剤を含有する培養用培地を使用する第２γδＴ細胞増殖を用いて、実施される。
【００３０】
いくつかの事例では、Ｔ細胞を増殖させる薬剤は、ＣＤ３に結合する薬剤、例えば抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ３）である。いくつかの事例では、γδＴ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、γ鎖定常領域もしくはδ鎖定常領域に結合する薬剤、またはγδＴＣＲに結合する薬剤、例えば、γδＴＣＲに結合する抗体（例えば、ＩＭＭＵ５１０）である。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、第１細胞増殖と第２細胞増殖との間で、及び／または第２細胞増殖の後に、正の選択によって濃縮される。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、第１細胞増殖と第２細胞増殖との間で、及び／または第２細胞増殖の後に、αβＴ細胞の除去によって濃縮される。
【００３１】
本発明の方法の特定の実施形態では、例えば濃縮された、γδＴ細胞集団は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する培養用培地中での第１、第２またはそれに続く増殖において増殖させられている。いくつかの実施形態では、培養用培地は、Ｔ細胞を増殖させるか、γδＴ細胞を増殖させるか、γδＴ細胞を選択的に増殖させるか、またはδ１Ｔ細胞、δ２Ｔ細胞、δ１Ｔ細胞及びδ３Ｔ細胞、もしくはδ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の薬剤（例えば、γδＴＣＲの定常もしくは可変領域に結合する抗体、ＣＤ３に結合する抗体、及び／またはアミノホスホネート）を含有する。特定の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、照射済みＰＢＭＣを含有する培養用培地中で増殖させられている。特定の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、照射済み人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）を含有する培養用培地中で増殖させられている。特定の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、照射済みの固定化細胞株（例えば、Ｋ５６２  ＡＰＣ）の細胞集団を含有する培養用培地中で増殖させられている。いくつかの事例では、ＡＰＣは、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＨＬＡクラスＩＩインバリアント鎖及び／またはＨＬＡ−ＤＭを発現しないか、または低減されたその発現を呈する。いくつかの事例では、ＡＰＣは、接着分子または共刺激分子、例えば、細胞内接着分子−１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４−１ＢＢＬ、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、または膜に係留された１つ以上のγδＴ細胞活性化剤、及び／または白血球機能関連抗原−３を発現する。いくつかの事例では、ＡＰＣは、Ｆｃ受容体、例えば、本明細書に記載のγδＴ細胞発現方法において使用される活性化剤のアイソタイプに対して特異的であるＦｃ受容体を発現する。いくつかの事例では、ＡＰＣは、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｃ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＦｃＲｎ、ＴＲＩＭ２１もしくはＣＤ３０７、またはより高い親和性もしくは改変された特異性を有するそれらの操作型変異体からなる群から選択される１つ以上のＦｃ受容体を発現する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、または照射済みの抗原提示細胞集団（例えば、ＰＢＭＣ、固定化細胞株、またはａＡＰＣ）を含有する培養用培地は、δ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ３Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤をさらに含有する。特定の実施形態では、例えば照射済みの、ＰＢＭＣ、ＡＰＣ、ａＡＰＣ、または固定化細胞株の細胞集団は、δ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤をそれらの細胞表面に発現する。いくつかの好ましい実施形態では、δ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる上記１つ以上の薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、δ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４；またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる上記１つ以上の薬剤は、ＡＰＣの表面に発現するか、またはＡＰＣの表面に発現するＦｃ受容体（例えばＦｃγ受容体）に結合している、抗体である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、単離された、例えば混合された細胞集団から濃縮γδＴ細胞集団を製造する生体外方法であって、（ｉ）第１γδＴ細胞増殖において、（ａ）γδＴ細胞を（例えばγδＴＣＲに結合することによって）増殖させるか、または（ｂ）
−  δ１ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ１ＴＣＲ及びδ４ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；もしくは
−  δ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の薬剤に、例えば混合された細胞集団を、直接接触させ、それによって第１濃縮γδＴ細胞集団を製造すること、ならびにその後、（ｉｉ）第２γδＴ細胞増殖において、（ａ）Ｔ細胞を増殖させるか、（ｂ）γδＴ細胞を（例えばγδＴＣＲに結合することによって）増殖させるか、または（ｃ）
−  δ１ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ１ＴＣＲ及びδ４ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；もしくは
−  δ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の可溶性であるかまたは固定された薬剤の任意での存在下で、第１濃縮γδＴ細胞集団の少なくとも一部を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に直接接触させ、それによって第２濃縮γδＴ細胞集団を製造することを含み、第２濃縮γδＴ細胞集団が臨床上妥当な数の（例えば１０８個より多い）δ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を含む、当該方法を提供する。
【００３４】
いくつかの事例では、臨床上妥当な数の（例えば１０８個より多い）γδＴ細胞は、単一ドナー、例えば、単一ドナーからの単一試料または２つ以上の試料から得られる。いくつかの事例では、臨床上妥当な数の（例えば１０８個より多い）γδＴ細胞は、単一ドナー、例えば単一ドナーからの単一試料または２つ以上の試料から、３０日未満の増殖、好ましくは２１日未満の増殖のうちに、より好ましくは１９日間の増殖のうちに得られる。
【００３５】
いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、（ｉ）と（ｉｉ）との間で、または（ｉｉ）の後に、正の選択によって濃縮される。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、（ｉ）と（ｉｉ）との間で、または（ｉｉ）の後に、αβＴ細胞の除去によって濃縮される。いくつかの事例では、Ｔ細胞を増殖させる薬剤は、ＣＤ３に結合する薬剤、例えば、抗ＣＤ３抗体である。いくつかの事例では、γδＴ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、γ鎖定常領域もしくはδ鎖定常領域に結合する薬剤、またはγδＴＣＲに結合する薬剤、例えば、γδＴＣＲに結合する抗体（例えば、ＩＭＭＵ５１０）である。
【００３６】
本発明の方法の特定の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、（ｉ）第１γδＴ細胞増殖において、（ａ）γδＴ細胞を（例えばγδＴＣＲに結合することによって）増殖させるか、または（ｂ）
−  δ１ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ１ＴＣＲ及びδ４ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；もしくは
−  δ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の第１薬剤に、単離された、例えば混合された細胞集団を接触させて、第１濃縮γδＴ細胞集団を提供すること、ならびにその後、（ｉｉ）第２γδＴ細胞増殖において、（ａ）Ｔ細胞を増殖させるか、（ｂ）γδＴ細胞を（例えばγδＴＣＲに結合することによって）増殖させるか、または（ｃ）
−  δ１ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；
−  δ１ＴＣＲ及びδ４ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させるか；もしくは
−  δ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の第２薬剤に、第１濃縮γδＴ細胞集団またはその一部を接触させ、この場合、１つ以上の第２薬剤が、１つ以上の第１薬剤とは構造的に異なるものであり、それによって第２濃縮γδＴ細胞集団を提供することによって、製造される。いくつかの事例では、１つ以上の第２薬剤は、１つ以上の第１薬剤と比較して異なっているγδＴＣＲエピトープに結合する。
【００３７】
いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、（ｉ）と（ｉｉ）との間で、または（ｉｉ）の後に、正の選択によって濃縮される。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、（ｉ）と（ｉｉ）との間で、または（ｉｉ）の後に、αβＴ細胞の除去によって濃縮される。いくつかの事例では、Ｔ細胞を増殖させる薬剤は、ＣＤ３に結合する薬剤、例えば、抗ＣＤ３抗体である。いくつかの事例では、γδＴ細胞を選択的に増殖させる薬剤は、γ鎖定常領域もしくはδ鎖定常領域に結合する薬剤、またはγδＴＣＲに結合する薬剤、例えば、γδＴＣＲに結合する抗体（例えば、ＩＭＭＵ５１０）である。
【００３８】
いくつかの事例では、第１γδＴ細胞増殖は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する培養用培地中で実施される。いくつかの事例では、第２γδＴ細胞増殖は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する培養用培地中で実施される。いくつかの事例では、第１γδＴ細胞増殖は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有しない培養用培地中で実施される。いくつかの事例では、第１γδＴ細胞増殖は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有しない培養用培地中で実施され、第２γδＴ細胞増殖は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する培養用培地中で実施される。いくつかの事例では、第１及び第２γδＴ細胞増殖は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する培養用培地中で実施される。いくつかの事例では、第１及び第２γδＴ細胞増殖は、アミノホスフェート、アミノホスホネート、ビスホスホネートまたはそれらの組み合わせを含有する培養用培地中で実施される。
【００３９】
別の実施形態では、本発明の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）は、対象への投与のためにさらに製剤化され得る。本発明の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）は、治療的有効量のγδＴ細胞を含む。特定の実施形態では、当該γδＴ細胞集団（複数可）は、１つ以上の構造的に別個の腫瘍認識部分を安定的に発現するように操作されている。特定の実施形態では、操作型γδＴ細胞（複数可）は本明細書に記載のとおりに、増殖させられており、かつ／またはさらに増殖させられる。
【００４０】
上記の態様、実施形態、事例及び例のうちのいくつかでは、１つ以上の薬剤は、３０時間未満、例えば約１７時間超〜約３０時間未満に１回の細胞分裂の平均速度でγδＴ細胞の増殖を刺激する。いくつかの実施形態では、分裂の上記平均速度は、連続する０〜４、０〜５、０〜７日間のγδＴ細胞増殖、連続する０〜１３日間のγδＴ細胞増殖、連続する０〜１９日間のγδＴ細胞増殖、連続する０〜２１日間のγδＴ細胞増殖についてのもの、または連続する少なくとも３、４、５、６、７、１０、１３、１９もしくは２１日間のγδＴ細胞増殖についてのものである。他の実施形態では、１つ以上の薬剤は、２４時間未満、例えば約１７時間超〜約２４時間未満に１回の細胞分裂の平均速度でγδＴ細胞の増殖を刺激する。他の実施形態では、１つ以上の薬剤は、１８時間未満または約１８時間に１回の細胞分裂の平均速度でγδＴ細胞の増殖を刺激する。
【００４１】
例えば、γδＴ細胞操作型クローンもしくは細胞株、１つ以上の（例えば構造的に異なる）操作型γδＴ細胞を含有する集団の確立後、またはγδＴ細胞を含有する細胞集団の負もしくは正の選択の１つ以上のステップの後の、実質的に一様な細胞集団からのγδＴ細胞増殖（例えば、選択的γδＴ細胞増殖）に、上記の態様、実施形態、事例及び例のうちの１つ以上を容易に適合させることができることは、理解されよう。したがって、上記方法のうちの１つ以上またはその組み合わせを用いて、可溶性形態または固定化形態にある（例えば、ＡＰＣの表面に固定された）本明細書に記載の１つ以上の抗体を含めた本明細書に記載の活性化剤のいずれか１つ以上に操作型γδＴ細胞またはその集団を接触させることによって操作型γδＴ細胞を増殖させることができる。
【００４２】
かくして、いくつかの実施形態では、単離された混合細胞集団は、本明細書に記載の方法または組成物において、γδＴ細胞操作型クローンもしくは細胞株、または１つ以上の（例えば構造的に異なる）操作型γδＴ細胞を含有する集団で置き換えられる。
【００４３】
他の態様では、本発明は、増殖済みγδＴ細胞の６０％超、７０％超、８０％超または９０％超がδ１Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；またはδ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞である、選択的に増殖させたγδＴ細胞集団（複数可）を提供する。特定の実施形態では、選択的に増殖させたγδＴ細胞集団（複数可）は、δ１Ｔ細胞及びδ２Ｔ細胞を含み、増殖済みγδＴ細胞のうち６０％超、７０％超、８０％超または９０％超が、δ１Ｔ細胞  δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；またはδ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞である。特定の実施形態では、選択的に増殖させたγδＴ細胞集団（複数可）は、濃縮γδＴ細胞集団からのγδＴ細胞の正の選択（例えば、δ１Ｔ細胞、δ１Ｔ細胞及びδ３Ｔ細胞、またはδ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞の正の選択）によるかまたは濃縮γδＴ細胞集団からの非γδＴ細胞の除去（例えば、αβＴ細胞などの非δ１Ｔ細胞の除去）による精製がなされていない。
【００４４】
特定の実施形態では、選択的に増殖させたγδＴ細胞集団（複数可）は、Ｔリンパ球を含む単離された混合細胞集団から直接増殖させられている。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％のＴリンパ球、及び約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１．２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満、約０．２％未満または約０．１％未満のδ１細胞を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１．２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満、約０．２％未満または約０．１％未満のδ１細胞を含む。いくつかの実施形態では、単離された混合細胞集団は、末梢血試料、臍帯血試料、腫瘍、上皮組織または、皮膚、肝臓もしくはその他の組織の生検材料から選択される。いくつかの実施形態では、単離された混合細胞集団は、単一ドナーに由来する。他の実施形態では、単離された混合細胞集団は、１より多い数または多数のドナーに由来する。一実施形態では、増殖済みγδＴ細胞集団（複数可）は、例えば結腸腺癌転移、肝臓、卵巣、頭頸部または腎臓のがんから単離され得る、腫瘍内浸潤リンパ球に由来する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明の選択的に増殖させたγδＴ細胞集団（複数可）は、ナイーブ表現型またはＴセントラルメモリー（ＴＣＭ）表現型であるそれぞれＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ２７＋及び／またはＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ２７＋を発現するδ１Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；またはδ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞を６０％または７０％より多く含む。いくつかの実施形態では、増殖済みγδＴ細胞集団は多クローン性のγδＴＣＲ多様性を含む。
【００４６】
他の態様では、本発明は、増殖済みγδＴ細胞の８０％超または９０％超がδ２Ｔ細胞である、選択的に増殖させたγδＴ細胞集団（複数可）を提供する。特定の実施形態では、選択的に増殖させたγδＴ細胞集団（複数可）は、濃縮γδＴ細胞集団からのγδＴ細胞の正の選択（例えば、δ２Ｔ細胞の正の選択）によるかまたは濃縮γδＴ細胞集団からの非γδＴ細胞の除去（例えば、αβＴ細胞などの非δ２Ｔ細胞の除去）による精製がなされていない。特定の実施形態では、選択的に増殖させたγδＴ細胞集団（複数可）は、Ｔリンパ球を含む単離された混合細胞集団から直接増殖させられている。特定の実施形態では、γδＴ細胞集団（複数可）を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％または約２０％のＴリンパ球、及び約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１．２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満、約０．２％未満または約０．１％未満のδ２細胞を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法でγδＴ細胞を増殖させる元となる単離された混合細胞集団は、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１．２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満、約０．２％未満または約０．１％未満のδ２細胞を含む。いくつかの実施形態では、単離された混合細胞集団は、末梢血試料、臍帯血試料または腫瘍から選択される。一実施形態では、増殖済み混合細胞集団（複数可）は、例えば結腸腺癌転移、肝臓、卵巣、頭頸部または腎臓のがんから単離され得る、腫瘍内浸潤リンパ球に由来する。
【００４７】
他の態様では、本発明は、増殖済みγδＴ細胞のうち１０〜９０％がδ１Ｔ細胞であり、増殖済みγδＴ細胞のうち９０〜１０％がδ２Ｔ細胞である、選択的に増殖させたγδＴ細胞集団（複数可）を提供する。
【００４８】
特定の実施形態では、上記集団は、例えばδ１細胞；δ１Ｔ細胞及びδ３Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；またはδ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる薬剤と、δ２細胞を選択的に増殖させる薬剤とに同時に、あるいは別々の接触ステップにおいて混合細胞集団を接触させることによって、まとめて増殖させられている。他の実施形態では、集団は、単離された混合細胞集団から別々に選択的に増殖させられた、δ１及びδ２Ｔ細胞集団の混合物である。全ての実施形態において、本発明の増殖済みγδＴ細胞集団（複数可）またはその混合物はさらに、対象への投与のために製剤化され得る。
【００４９】
特定の実施形態では、本発明のγδＴ細胞またはγδＴ細胞集団（複数可）は、発現カセットによってコードされる１つ以上の構造的に別個の腫瘍認識部分を安定的に発現するように操作されている。一実施形態では、当該γδＴ細胞は、発現カセットによってコードされる２つ以上の構造的に別個の腫瘍認識部分を安定的に発現するように操作されている。いくつかの実施形態では、２つ以上の構造的に別個の腫瘍認識部分は、同じ抗原の異なるエピトープ、または異なる抗原の異なるエピトープを認識する。腫瘍認識部分は、（ｉ）細胞表面腫瘍抗原、もしくは（ｉｉ）ＭＨＣとの複合体（ペプチド−ＭＨＣ複合体）として細胞表面に発現する腫瘍抗原に由来するペプチドに結合する、αβＴＣＲ、γδＴＣＲ、αβＴＣＲもしくはγδＴＣＲの断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、全抗体もしくはそれらの抗原結合断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、重鎖もしくは軽鎖単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。特定の実施形態では、腫瘍認識部分は、非ＭＨＣ拘束的に腫瘍特異抗原を認識する腫瘍内浸潤リンパ球のγδＴＣＲである。
【００５０】
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる増殖済みγδＴ細胞集団（複数可）を提供する。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞集団は、抗原提示細胞またはアミノホスホネートによる抗原刺激を伴わずに生体外で増殖させられている。特定の実施形態では、γδＴ細胞集団は、生体外でモノクローナル抗体、抗体断片または融合タンパク質によって活性化させられている。本発明のγδＴ細胞集団（複数可）はさらに、ＩＬ−２の共投与を伴わずに対象へ投与されることのために製剤化され得る。あるいは、本発明のγδＴ細胞集団（複数可）はさらに、ＩＬ−２の共投与を伴って対象へ投与されることのために製剤化され得る。
【００５１】
他の態様では、本発明は、がんの処置を、それを必要とする対象に施す方法であって、本発明に係る増殖済みγδＴ細胞集団を治療的有効量投与することを含む、当該方法を提供する。一実施形態では、増殖済みγδＴ細胞集団は、対象のＭＨＣ遺伝子座に関して同種異系である。特定の実施形態では、増殖済みγδＴ細胞集団は、１つ以上の発現カセットによってコードされる１つ以上または２つ以上の腫瘍認識部分を安定的に発現するように操作されている。さらなる実施形態では、増殖済みγδＴ細胞集団は、少なくとも２つの構造的に異なる認識部分を安定的に発現し、構造的に異なる認識部分の各々が、（ｉ）同じ抗原の異なるエピトープ、または（ｉｉ）異なる抗原の異なるエピトープを認識する。腫瘍認識部分は、（ｉ）細胞表面腫瘍抗原、または（ｉｉ）ＭＨＣとの複合体（ペプチド−ＭＨＣ複合体）として細胞表面に発現した腫瘍抗原に由来するペプチドに結合する、αβＴＣＲ、γδＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（全抗体もしくはそれらの抗原結合断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、重鎖もしくは軽鎖単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、またはそれらの任意の組み合わせも含む）からなる群から選択され得る。
【００５２】
別の態様では、本発明は操作型γδＴ細胞を提供し、当該操作型γδＴ細胞は腫瘍認識部分を発現するように操作されており、当該腫瘍認識部分は腫瘍抗原を認識するものであり、かつ／または当該操作型γδＴ細胞は、ＴＳ−１、ＴＳ８．２、Ｂ６もしくは１５Ｄ抗体と同じエピトープに結合する１つ以上の薬剤の存在下において（例えば、試験管内で当該１つ以上の薬剤と接触して）試験管内で増殖するものである。別の態様では、本発明は操作型γδＴ細胞を提供し、当該操作型γδＴ細胞は腫瘍認識部分を発現するように操作されており、当該腫瘍認識部分は腫瘍抗原を認識するものであり、かつ／または当該操作型γδＴ細胞は、ＴＳ−１、ＴＳ８．２、Ｂ６もしくは１５Ｄ抗体と結合するエピトープとは異なるエピトープもしくは重複しないエピトープに結合する１つ以上の薬剤の存在下において（例えば、試験管内で当該１つ以上の薬剤と接触して）試験管内で増殖するものである。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞は、ＴＳ−１、ＴＳ８．２、Ｂ６または１５Ｄ抗体によるγδＴ細胞への結合と競合しない１つ以上の薬剤の存在下において（例えば、試験管内で当該１つ以上の薬剤と接触して）試験管内で増殖する。一実施形態では、薬剤は、本明細書に記載の可溶性であるかまたは固定された活性化剤のいずれか１つ以上である。一実施形態では、操作型γδＴ細胞は、δ１、δ２、δ３またはδ４操作型Ｔ細胞である。
【００５３】
特定の実施形態では、操作型γδＴ細胞は、少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座からの遺伝子発現を欠くようにさらに操作されている。一実施形態では、１つ以上の薬剤は、３０時間未満、例えば約１７時間超〜約３０時間未満に１回の細胞分裂の平均速度で操作型γδＴ細胞の増殖を刺激する。いくつかの実施形態では、分裂の上記平均速度は、連続する０〜４、０〜５、０〜７日間のγδＴ細胞増殖、連続する０〜１３日間のγδＴ細胞増殖、連続する０〜１９日間のγδＴ細胞増殖、連続する０〜２１日間のγδＴ細胞増殖におけるもの、または連続する少なくとも３、４、５、６、７、１０、１３、１９もしくは２１日間のγδＴ細胞増殖におけるものである。他の実施形態では、１つ以上の薬剤は、２４時間未満、例えば約１７時間超〜約２４時間未満に１回の細胞分裂の平均速度で操作型γδＴ細胞の増殖を刺激する。他の実施形態では、１つ以上の薬剤は、１８時間未満または約１８時間に１回の細胞分裂の平均速度で操作型γδＴ細胞の増殖を刺激する。特定の実施形態では、腫瘍認識部分は腫瘍内浸潤リンパ球に由来する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、増殖済みγδＴ細胞集団であって、γδＴ細胞集団が抗腫瘍性細胞傷害性を含む、当該増殖済みγδＴ細胞集団を提供する。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、ＮＫｐ３０活性、ＮＫｐ４４活性及び／またはＮＫｐ４６活性とは無関係の抗腫瘍性細胞傷害性を含む。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は抗腫瘍性細胞傷害性を含み、抗腫瘍性細胞傷害性は、ＮＫｐ３０活性、ＮＫｐ４４活性及び／またはＮＫｐ４６活性とは無関係の抗腫瘍活性から構成されるかまたはそれから本質的に構成される。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は抗腫瘍性細胞傷害性を含み、抗腫瘍性細胞傷害性の少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、９０％または９９％は、ＮＫｐ３０活性、ＮＫｐ４４活性及び／またはＮＫｐ４６活性とは無関係である。
【００５５】
いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、操作型γδＴ細胞の集団である。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、非操作型γδＴ細胞の集団である。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、ＮＫｐ３０活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性、ＮＫｐ４４活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性、及び／またはＮＫｐ４６活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性を含まない。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、ＮＫｐ３０活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性を含まない。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、ＮＫｐ４４活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性を含まない。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、抗ＣＤ２０キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む操作型γδＴ細胞の集団である。いくつかの事例では、集団中のγδＴ細胞のうち９０％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満が、検出可能なレベルのＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及び／またはＮＫｐ４６を発現する。
【００５６】
参照による組込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許及び特許出願を参照により援用することを具体的かつ個別に示したのと同じ程度に、参照により本明細書に援用される。
【００５７】
本発明の新規な特徴は別記の特許請求の範囲において詳しく明示されている。本発明の特徴及び利点についてのよりよい理解は、本発明の原理が利用されている例示的実施形態を示す以下の詳細な説明、及び添付の図面（さらに、本明細書中の「図（ｆｉｇｕｒｅ）」及び「図（ＦＩＧ．）」）を参照することによって得られよう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】操作型γδＴ細胞を模式的に示す。パネルＡは、１つの腫瘍認識部分を発現している操作型γδＴ細胞を示す。パネルＢは、２つの構造的に別個の腫瘍認識部分を発現している操作型γδＴ細胞を示す。
【図２】対象を処置する方法を模式的に示す。
【図３】操作型γδＴ細胞の集団を対象に投与する方法を模式的に示す。
【図４】肝臓への結腸腺癌転移癌（ＴＩＬ１）及び腎腫瘍（ＴＩＬ２）から単離された、ＣＣＲ４及びＣＣＲ７を発現することが示されているγδ１及びγδ２リンパ球の成長を示すグラフを描写する。
【図５】血清含有培地及び無血清培地でのγδＴ細胞成長を示すグラフを描写する。
【図６】５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ３、Ｂ６、ＴＳ−１、γ３．２０、ＩＭＭＵ５１０、または１１Ｆ２を使用する抗γδＴＣＲ抗体遮断実験を示すグラフを描写する。
【図７】５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ３、Ｂ６、ＴＳ−１、γ３．２０、ＩＭＭＵ５１０、または１１Ｆ２を使用する抗γδＴＣＲ抗体遮断実験を示すグラフを描写する。
【図８】抗ＴＣＲ  Ｖδ１  ＴＳ−１抗体を使用する競合実験を描写する。
【図９】抗ＴＣＲ  Ｖδ１  ＴＳ８．２抗体を使用する競合実験を描写する。
【図１０】ＰＢＭＣからのδ１Ｔ細胞の活性化及び増殖を示すグラフを描写する。
【図１１】ＰＢＭＣからのδ２Ｔ細胞の活性化及び増殖を示すグラフを描写する。
【図１２】ＰＢＭＣからのδ１Ｔ細胞の増殖倍率を示すグラフを描写する。
【図１３】ＰＢＭＣからのδ２Ｔ細胞の増殖倍率を示すグラフを描写する。
【図１４】ヒトＶδ１アミノ酸配列を描写する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ３及びＣＤＲ３領域に下線を引いてある。
【図１５】ヒトＶδ２アミノ酸配列を描写する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ３及びＣＤＲ３領域に下線を引いてある。
【図１６】ＴＳ−１またはＴＳ８．２抗体によるＰＢＭＣの活性化がＶδ１＋Ｔ細胞の顕著かつ特異的な増殖をもたらすことを描写する。（Ａ）２４ウェルプレートにおいてＭＡｂ（ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｂ６及び１５Ｄ）を直接塗布（１μｇ／ｍＬ）したかまたはヤギ抗マウスＦｃ（５μｇ／ｍＬ）（ＴＳ１Ｆｃ、ＴＳ８．２Ｆｃ、Ｂ６Ｆｃ及び１５ＤＦｃ）に捕捉（０．１μｇ／ｍＬ）させた。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６細胞／ｍＬのＰＢＭＣを播種した。７日目に、抗体を含まない新しいプレートへ細胞を移し、１４日目までさらに増殖させた。培養用培地は２〜３日ごとに補給した。データは、１４日間にわたるＶδ１＋細胞の増殖を描写する。（Ｂ）Ａと同じ培養であり、１４日目及び０日目（ｄ０）のＶδ１＋細胞の百分率を示す。（Ｃ）異なるドナーからの単離されたＰＢＭＣからＶδ１＋細胞を増殖させた。２４ウェルプレートにおいてＭＡｂ（ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｂ６及び１５Ｄ）を直接塗布（１μｇ／ｍＬ）したかまたはヤギ抗マウスＦｃ（５μｇ／ｍＬ）（ＴＳ１Ｆｃ、ＴＳ８．２Ｆｃ、Ｂ６Ｆｃ及び１５ＤＦｃ）に捕捉（０．１μｇ／ｍＬ）させた。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６細胞／ｍＬのＰＢＭＣ  ｆを播種した。７日目に、抗体を含まない新しいプレートへ細胞を移し、新鮮な培地で１０６細胞／ｍＬに調節した。培養用培地は２〜３日ごとに補給し、１０６細胞／ｍＬに調節した。データは、１４日間にわたるＶδ１＋細胞増殖を描写する。（Ｄ）１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６細胞／ｍＬのＰＢＭＣを播種した。７日目に、抗体を含まない新しいプレートへ細胞を移し、１０６細胞／ｍＬに調節し、２３日目までさらに増殖させた。培養用培地は２〜３日ごとに補給した。
【図１７−１】Ｂ６及び１５Ｄ抗体によるＰＢＭＣの活性化がＶδ２＋Ｔ細胞の顕著で特異的な活性化及び増殖をもたらすことを描写する。（Ａ）２４ウェルプレートにおいてＭＡｂ（ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｂ６及び１５Ｄ）を直接塗布（１μｇ／ｍＬ）したかまたはヤギ抗マウスＦｃ（５μｇ／ｍＬ）（ＴＳ１Ｆｃ、ＴＳ８．２Ｆｃ、Ｂ６Ｆｃ及び１５ＤＦｃ）に捕捉（０．１μｇ／ｍＬ）させた。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６細胞／ｍＬのＰＢＭＣを播種した。７日目に、抗体を含まない新しいプレートへ細胞を移し、１４日目までさらに増殖させた。培養用培地は２〜３日ごとに補給した。データは、１４日間にわたるＶδ２＋Ｔ細胞増殖を描写する。（Ｂ）Ａと同じ培養であり、１４日目及び０日目（ｄ０）のＶδ２＋細胞の百分率を示す。（Ｃ）２４ウェルプレートにおいてＭＡｂ（１５Ｄ及び、汎γδＴＣＲ  Ｍａｂ  Ｉｍｍｕ５１０）を直接塗布（１μｇ／ｍＬ）した。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６細胞／ｍＬの、異なるドナーからの単離されたＰＢＭＣを播種した。７日目に、抗体を含まない新しいプレートへ細胞を移した。培養物は２〜３日ごとに補給され、新鮮な培地で１０６細胞／ｍＬに調節された。データは、１４日間にわたるＶδ２＋Ｔ細胞増殖を描写する。（Ｄ）Ｃと同じ培養であり、１４日目及び０日目（ｄ０）のＶδ２＋Ｔ細胞の百分率を示す。（Ｅ）２４ウェルプレートにおいてＭＡｂ（ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｂ６及び１５Ｄ）を直接塗布（１μｇ／ｍＬ）したかまたはヤギ抗マウスＦｃ（５μｇ／ｍＬ）（ＴＳ１Ｆｃ、ＴＳ８．２Ｆｃ、Ｂ６Ｆｃ及び１５ＤＦｃ）に捕捉（０．１μｇ／ｍＬ）させた。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６細胞／ｍＬの、別のドナーからのＰＢＭＣを播種した。７日目に、抗体を含まない新しいプレートへ細胞を移し、新鮮な培地で１０６細胞／ｍＬに調節した。培養用培地を２〜３日ごとに補給し、１０６細胞／ｍＬに調節した。データは、１４日間にわたるＶδ２＋Ｔ細胞増殖を描写する。
【図１７−２】Ｂ６及び１５Ｄ抗体によるＰＢＭＣの活性化がＶδ２＋Ｔ細胞の顕著で特異的な活性化及び増殖をもたらすことを描写する。（Ａ）２４ウェルプレートにおいてＭＡｂ（ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｂ６及び１５Ｄ）を直接塗布（１μｇ／ｍＬ）したかまたはヤギ抗マウスＦｃ（５μｇ／ｍＬ）（ＴＳ１Ｆｃ、ＴＳ８．２Ｆｃ、Ｂ６Ｆｃ及び１５ＤＦｃ）に捕捉（０．１μｇ／ｍＬ）させた。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６細胞／ｍＬのＰＢＭＣを播種した。７日目に、抗体を含まない新しいプレートへ細胞を移し、１４日目までさらに増殖させた。培養用培地は２〜３日ごとに補給した。データは、１４日間にわたるＶδ２＋Ｔ細胞増殖を描写する。（Ｂ）Ａと同じ培養であり、１４日目及び０日目（ｄ０）のＶδ２＋細胞の百分率を示す。（Ｃ）２４ウェルプレートにおいてＭＡｂ（１５Ｄ及び、汎γδＴＣＲ  Ｍａｂ  Ｉｍｍｕ５１０）を直接塗布（１μｇ／ｍＬ）した。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６細胞／ｍＬの、異なるドナーからの単離されたＰＢＭＣを播種した。７日目に、抗体を含まない新しいプレートへ細胞を移した。培養物は２〜３日ごとに補給され、新鮮な培地で１０６細胞／ｍＬに調節された。データは、１４日間にわたるＶδ２＋Ｔ細胞増殖を描写する。（Ｄ）Ｃと同じ培養であり、１４日目及び０日目（ｄ０）のＶδ２＋Ｔ細胞の百分率を示す。（Ｅ）２４ウェルプレートにおいてＭＡｂ（ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｂ６及び１５Ｄ）を直接塗布（１μｇ／ｍＬ）したかまたはヤギ抗マウスＦｃ（５μｇ／ｍＬ）（ＴＳ１Ｆｃ、ＴＳ８．２Ｆｃ、Ｂ６Ｆｃ及び１５ＤＦｃ）に捕捉（０．１μｇ／ｍＬ）させた。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６細胞／ｍＬの、別のドナーからのＰＢＭＣを播種した。７日目に、抗体を含まない新しいプレートへ細胞を移し、新鮮な培地で１０６細胞／ｍＬに調節した。培養用培地を２〜３日ごとに補給し、１０６細胞／ｍＬに調節した。データは、１４日間にわたるＶδ２＋Ｔ細胞増殖を描写する。
【図１８】γδ特異的抗体ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｂ６及び１５Ｄと共に培養されたＰＢＭＣ中のαβＴ細胞の百分率の顕著な低下を描写する。（Ａ）２４ウェルプレートにおいてＭＡｂ（ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｂ６及び１５Ｄ）を直接塗布（１μｇ／ｍＬ）したかまたはヤギ抗マウスＦｃ（５μｇ／ｍＬ）（ＴＳ１Ｆｃ、ＴＳ８．２Ｆｃ、Ｂ６Ｆｃ及び１５ＤＦｃ）に捕捉（０．１μｇ／ｍＬ）させた。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６細胞／ｍＬのＰＢＭＣを播種した。７日目に、抗体を含まない新しいプレートへ細胞を移し、１４日目までさらに増殖させた。培養用培地は２〜３日ごとに補給した。データは、１４日間にわたるαβＴ細胞増殖を描写する。（Ｂ）Ａと同じ培養であり、１４日目及び０日目（ｄ０）のαβＴ細胞の百分率を示す。
【図１９】γδＴＣＲの活性化がγδＴ細胞倍加時間の短縮をもたらすことを描写する。２４ウェルプレートにおいてＭＡｂ（ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｂ６及び１５Ｄ）を直接塗布（１μｇ／ｍＬ）したかまたはヤギ抗マウスＦｃ（５μｇ／ｍＬ）（ＴＳ１Ｆｃ、ＴＳ８．２Ｆｃ、Ｂ６Ｆｃ及び１５ＤＦｃ）に捕捉（０．１μｇ／ｍＬ）させた。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６細胞／ｍＬのＰＢＭＣを播種した。７日目に、抗体を含まない新しいプレートへ細胞を移し、新鮮な培地で１０６細胞／ｍＬに調節した。培養物は２〜３日ごとに補給され、新鮮な培地で１０６細胞／ｍＬに調節された。Ｖδ１、Ｖδ２及びαβＴ細胞の倍加時間をそれぞれ（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。
【図２０】ＴＳ８．２及びＴＳ１によるＶδ１の活性化が主にナイーブ表現型及びセントラルメモリー表現型をもたらすことを描写する。２４ウェルプレートにおいて抗体（ＴＳ８．２、Ｒ９．１２及び汎γδＩｍｍｕ５１０）を直接塗布（１μｇ／ｍＬ）した。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６個／ｍＬのＰＢＭＣを播種した。培地は、新鮮な培地で１：２に希釈した１５日目は別として２３日目まで２〜３日ごとに補給した。フローサイトメトリー分析を用いて、１４日目及び２３日目の細胞表現型をＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２７の発現によって決定した。
【図２１】ＴＳ８．２及びＭＩＣＡによるＰＢＭＣの活性化がαβＴ細胞ではなくＶδ１Ｔ細胞の増殖を強化することを描写する。２４ウェルプレートにおいて抗体ＴＳ８．２（１μｇ／ｍＬ）、またはＴＳ８．２とＭＩＣＡ−Ｆｃ（１及び５μｇ／ｍＬ）を直接塗布した。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６個／ｍＬのＰＢＭＣを播種した。培地は２〜３日ごとに補給する。（Ａ）はＶδ１Ｔ細胞増殖であり、（Ｂ）はαβＴ細胞増殖である。
【図２２】δ１及びδ２特異的抗体による臍帯血単核細胞の活性化がＶδ１＋及びＶδ２＋Ｔ細胞の顕著かつ特異的な増殖をもたらすことを描写する。２４ウェルプレートにおいて１μｇ／ｍＬのＭＡｂ  ＴＳ８．２、Ｒ９．１２、Ｂ６及び１５Ｄを直接塗布した。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６個／ｍＬの臍帯血単核細胞を活性化させた。Ｖδ１及びＶδ２Ｔ細胞増殖をそれぞれ（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
【図２３】Ｖδ１Ｊ１、Ｖδ１Ｊ２及びＶδ１Ｊ３鎖と、γ８鎖との対合によって生み出された可溶性ＴＣＲの結合性を描写する。データは、ＴＳ１及びＴＳ８．２が、Ｖδ１Ｊ１及びＶδ１Ｊ２鎖から生み出された可溶性ＴＣＲを認識するがしかしＶδ１Ｊ３鎖には結合し損なった、ということを示しており、Ｊ１及びＪ２遺伝子セグメントがＴＳ１及びＴＳ８．２の結合性に肝要であることを示唆している。Ｖδ１に結合するＲ９．１２及び、δ定常領域に結合するものである汎抗体Ｉｍｍｕｎｏ５１０は、特定Ｊ領域による影響を受けない。
【図２４】ヒトＶδ１のＪ１、Ｊ２及びＪ３領域の配列アラインメント、ならびにＶδ１Ｊ１鎖の選定位置に生じさせた変異を描写する。ＢＥ−１３は、δ１γ８ＴＣＲを発現しているＴ細胞白血病細胞株（ＤＳＭＺ受託番号ＡＣＣ３９６）からのδ１Ｊ領域を指す。Ｖδ１Ｊ１及びＶδ１Ｊ２領域における位置Ｌｙｓ１２０の単一アミノ酸のＴｈｒまたはＡｌａによる置き換えは、ＴＳ−１及びＴＳ８．２  ＭＡｂの結合性を完全に消滅させ、Ｖδ１Ｊ１及びＶδ１Ｊ２領域にあるこのアミノ酸がＴＳ−１及びＴＳ８．２の結合性に寄与していることが示唆された。Ｖδ１Ｊ３領域における位置Ｔｈｒ１２０の単一アミノ酸のＬｙｓによる置き換えは、ＴＳ−１及びＴＳ８．２  ＭＡｂの結合性の獲得をもたらし、Ｖδ１Ｊ１及びＶδ１Ｊ２領域にあるこのアミノ酸がＴＳ−１及びＴＳ８．２の結合性に寄与していることがさらに示唆された。
【図２５】Ｖδ１Ｊ１におけるＬｙｓ１２０からＴｈｒまたはＡｌａへの点突然変異がＴＳ−１及びＴＳ８．２  ＭＡｂによる結合性の喪失を招くことを描写する。
【図２６】ヒトＶδ１タンパク質配列及び、ヒトＶδ１アミノ酸配列とウシＶδ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＰ２５１６２．１）との差異に基づく６つの突然変異型ヒトＶδ１配列を描写する。突然変異は太字で示されている。
【図２７】ヒトＶδ１突然変異鎖に対するＴＳ−１及びＴＳ８．２の結合性の喪失を描写する。
【図２８】種々のＶδ２／γ鎖対合（γ３、γ８、γ９）に対するＢ６  ＭＡｂの結合性を描写する。
【図２９】ヒトＶδ２可変領域（ＩＭＧＴ  ヒトＴＲＤＶ２）とアカゲザルＶδ２可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ１９００２８．１）とのタンパク質配列アラインメント、ならびにＶδ２のＣＤＲ１（Ｇ３５Ｓ）、ＣＤＲ２（Ｄ６５Ｇ）及びＣＤＲ３（Ｃ１０４Ｓ）に生じた変化を描写する。
【図３０】ＣＤＲ１において突然変異したＶδ２（Ｇ３５Ｓ）に対する１５Ｄの結合性の喪失を描写する。
【図３１】δ１、δ２及びαβのためにそれぞれＴＳ８．２、Ｂ６及びＩＰ２６を使用する、高度に濃縮されたＶδ１＋、Ｖδ２＋及びαβＴ細胞培養物の特性評価を描写する。δ１細胞を増殖させるＴＳ−１とＴＳ８．２との組み合わせ、またはδ２細胞を増殖させる１５ＤとＢ６との組み合わせを使用して、ＰＢＭＣに由来する集団を増殖させた。ＩＰ２６マイクロビーズを使用して、増殖済み培養物からαβＴ細胞を除去した。正の選択がなされたαβＴ細胞も採集した（αβを濃縮した）。
【図３２】固形腫瘍（ＢｘＰＣ３、ＳＫＭＥＬ５）細胞株及び形質細胞腫（ＲＰＭＩ８２２６）細胞株に対するＶδ１＋集団、Ｖδ２＋集団の細胞傷害性を描写する。
【図３３−１】δ１特異的ＭＡｂの重鎖のフレームワーク及び相補性決定領域のアミノ酸配列を描写する。
【図３３−２】δ１特異的ＭＡｂの重鎖のフレームワーク及び相補性決定領域のアミノ酸配列を描写する。
【図３４−１】図３３に記載のδ１特異的ＭＡｂの軽鎖のフレームワーク及び相補性決定領域のアミノ酸配列を描写する。
【図３４−２】図３３に記載のδ１特異的ＭＡｂの軽鎖のフレームワーク及び相補性決定領域のアミノ酸配列を描写する。
【図３５−１】δ２特異的ＭＡｂの重鎖のフレームワーク及び相補性決定領域のアミノ酸配列を描写する。
【図３５−２】δ２特異的ＭＡｂの重鎖のフレームワーク及び相補性決定領域のアミノ酸配列を描写する。
【図３６−１】δ２特異的ＭＡｂの軽鎖のフレームワーク及び相補性決定領域のアミノ酸配列を描写する。
【図３６−２】δ２特異的ＭＡｂの軽鎖のフレームワーク及び相補性決定領域のアミノ酸配列を描写する。
【図３７】ＥＬＩＳＡによって決定した、示されているδ１特異的抗体と他のγδＴＣＲとの交差反応性を描写する。
【図３８】ヒトとイルカとのＶδ１推測アミノ酸配列のアラインメントを描写する。
【図３９】本明細書に記載のγδＴ細胞増殖方法によって得られた、増殖しているＶδ１細胞（Ａ）またはＶδ２細胞（Ｂ）の百分率を描写する。
【図４０】本明細書に記載のγδＴ細胞増殖方法によって得られた、単離された混合細胞集団からのＶδ１細胞（Ａ）またはＶδ２細胞（Ｂ）の増殖倍率を描写する。
【図４１】本明細書に記載のγδＴ細胞増殖方法によって得られた、単離された混合細胞集団からの表現型データを描写する。細胞表現型は、フローサイトメトリー分析を用いてＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２７の発現によって判定される。
【図４２】本明細書に記載のγδＴ細胞増殖方法によって活性化及び増殖させたδ１Ｔ細胞が腫瘍細胞株に対して堅牢な細胞傷害性を示すことができることを例示する。
【図４３】本発明の方法によって実現される１９日目のＶδ１の増殖倍率及び純度を例示する。
【図４４】本発明の方法によって実現される１９日目のＶδ１の増殖倍率及び積算倍加時間を例示する。
【図４５】本発明の方法によって実現される１４日目から１９日目までのＶδ１の増殖倍率及び積算倍加時間を例示する。
【図４６】δ１Ｔ細胞上の抗ＣＤ２０キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現を例示する。ＣＡＲレトロウイルス構築物による形質導入後から７日目に、増殖済み細胞をＶδ１特異的抗体（Ｒ９．１２）及び抗リツキシマブＦＩＴＣ結合体で染色した。Ｖδ１細胞のうち最大３５％がＣＤ２０ＣＡＲ＋であった。
【図４７−１】Ａ〜Ｂは、δ−１特異的γδＴ細胞活性化物質についてのエピトープ結合特異性データを描写する。
【図４７−２】Ａ〜Ｂは、δ−１特異的γδＴ細胞活性化物質についてのエピトープ結合特異性データを描写する。
【図４７−３】Ａ〜Ｂは、δ−１特異的γδＴ細胞活性化物質についてのエピトープ結合特異性データを描写する。
【図４８】δ−２特異的γδＴ細胞活性化物質についてのエピトープ結合特異性データを描写する。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
発明の詳細な説明
本明細書には本発明の様々な実施形態が示され記載されているが、当業者であれば、そのような実施形態が単に例として提供されているに過ぎないことは明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく多くの変型、変更及び代用を着想し得る。本発明の実施形態の様々な代替策を採用してもよいことは理解されるべきである。
【００６０】
定義
特に定義されない限り、本明細書中で使用する全ての科学技術用語は、本明細書に記載の本発明が属する分野において通常の技量を有する者に普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書を解説する目的のために以下の定義を適用することとし、適当と認められる場合には、単数形で使用される用語に複数形も含めることとし、その逆もまた同様である。明示されている何らかの定義が、参照により本明細書に援用される何らかの文献と矛盾する場合、以下に明示する定義が優先されることとする。
【００６１】
本明細書中で使用する「γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）」という用語は、１つのγ鎖と１つのδ鎖とからなる独特のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であるγδＴＣＲを表面に発現するＴ細胞のサブセットを指す。「γδＴ細胞」という用語は、具体的には、限定することなくＶδ１及びＶδ２、Ｖδ３γδＴ細胞、ならびにナイーブ、エフェクターメモリー、セントラルメモリー及び終末分化γδＴ細胞を含めた、γδＴ細胞の全てのサブセットを含む。さらに例を挙げると、「γδＴ細胞」という用語は、Ｖδ４、Ｖδ５、Ｖδ７及びＶδ８γδＴ細胞、ならびにＶγ２、Ｖγ３、Ｖγ５、Ｖγ８、Ｖγ９、Ｖγ１０、Ｖγ１１γδＴ細胞を含む。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ３を発現しており（ＣＤ３＋）かつＴ細胞受容体を発現している（ＴＣＲ＋）免疫細胞を指す。Ｔ細胞は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「ＴＣＲ」または「Ｔ細胞受容体」という用語は、アルファ−ベータまたはガンマ−デルタ受容体を形成している異種二量体型の細胞表面シグナル伝達タンパク質を指す。αβＴＣＲが、ＭＨＣ分子によって提示される抗原を認識するのに対して、γδＴＣＲは、ＭＨＣ提示とは無関係に抗原を認識する。
【００６４】
「ＭＨＣ」（主要組織適合性複合体）という用語は、細胞表面抗原提示タンパク質をコードする遺伝子のサブセットを指す。ヒトにおいてはこれらの遺伝子はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ばれる。本明細書において、略語ＭＨＣまたはＨＬＡは互換的に使用される。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、「末梢血リンパ球（複数可）」または「ＰＢＬ（複数可）」という用語は、最も広い意味で使用され、幅広い分化段階及び機能的段階のＴ細胞及びＢ細胞、形質細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好塩基球、好酸球などを含めた白血球細胞（複数可）を指す。末梢血中のＴリンパ球の範囲は約２０〜８０％である。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「細胞集団」という用語は、適切な供給源から（大抵、哺乳動物から）直接単離によって得られた多くの細胞を指す。単離された細胞集団は、その後、試験管内で培養され得る。当業者であれば、本発明と共に用いられる、細胞集団を単離及び培養する様々な方法、ならびに本発明で用いられるのに適する、細胞集団中の細胞の様々な数を熟知していよう。細胞集団は、例えば、末梢血試料、臍帯血試料、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検材料、組織、リンパに由来するか、または外部環境に直接接している対象の上皮部位に由来するか、または幹前駆細胞に由来する、混合異種細胞集団であり得る。あるいは、混合細胞集団は、末梢血試料、臍帯血試料、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検材料、組織、リンパから、または外部環境に直接接している対象の上皮部位から、または幹前駆細胞から確立された、哺乳動物細胞の試験管内培養物に由来するものであり得る。
【００６７】
「濃縮」細胞集団または製剤は、出発混合細胞集団に由来する、含有している特定細胞種の百分率が出発集団中のその細胞種の百分率よりも高い細胞集団を指す。例えば、出発混合細胞集団を特定γδＴ細胞集団に関して濃縮することができる。一実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、含有しているδ１細胞の百分率が出発集団中の細胞種の百分率よりも高い。別の例を挙げると、濃縮γδＴ細胞集団は、含有しているδ１細胞の百分率及びδ３細胞の百分率が両方とも出発集団中のその細胞種の百分率よりも高いものであり得る。さらに別の例を挙げると、濃縮γδＴ細胞集団は、含有しているδ１細胞の百分率及びδ４細胞の百分率が両方とも出発集団中のその細胞種の百分率よりも高いものであり得る。さらに別の例を挙げると、濃縮γδＴ細胞集団は、含有しているδ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞及びδ５Ｔ細胞の百分率が出発集団中のその細胞種の百分率よりも高いものであり得る。別の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、含有しているδ２細胞の百分率が出発集団中のその細胞種の百分率よりも高い。さらに別の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、含有しているδ１細胞及びδ２細胞の百分率が両方とも出発集団中のその細胞種の百分率よりも高い。全ての実施形態において、濃縮γδＴ細胞集団は、αβＴ細胞集団をより低い百分率で含有する。
【００６８】
本明細書中で使用する「増殖済み」とは、濃縮済み製剤中の所望の細胞種すなわち標的細胞種（例えば、δ１及び／またはδ２Ｔ細胞）の数が、初期細胞集団中すなわち出発細胞集団中での数よりも大きいことを意味する。「選択的に増殖させる」とは、標的細胞種（例えば、δ１及び／またはδ２Ｔ細胞）を他の非標的細胞種、例えばαβＴ細胞またはＮＫ細胞よりも優先的に増殖させることを意味する。特定の実施形態では、本発明の活性化剤は、δ２Ｔ細胞の顕著な増殖を伴わずに、例えば操作型または非操作型の、δ１Ｔ細胞を選択的に増殖させる。他の実施形態では、本発明の活性化剤は、δ１Ｔ細胞の顕著な増殖を伴わずに、例えば操作型または非操作型の、δ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる。特定の実施形態では、本発明の活性化剤は、δ２Ｔ細胞の顕著な増殖を伴わずに、例えば操作型または非操作型の、δ１及びδ３Ｔ細胞を選択的に増殖させる。特定の実施形態では、本発明の活性化剤は、δ２Ｔ細胞の顕著な増殖を伴わずに、例えば操作型または非操作型の、δ１及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させる。特定の実施形態では、本発明の活性化剤は、δ２Ｔ細胞の顕著な増殖を伴わずに、例えば操作型または非操作型の、δ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる。これとの関連において、「顕著な増殖を伴わずに」という用語は、優先的に増殖した細胞集団が  基準細胞集団よりも少なくとも１０倍、好ましくは１００倍、より好ましくは１，０００倍多く増殖させられていることを意味する。
【００６９】
本明細書中で使用する「混合物」という用語は、混合異種細胞集団に由来する２つ以上の単離された濃縮細胞集団の組み合わせを指す。特定の実施形態によれば、本発明の細胞集団は、単離されたγδＴ細胞集団である。
【００７０】
細胞集団に対して適用される「単離された」という用語は、生体内または試験管内で上記細胞集団に関連付けられる１つ以上の細胞集団を実質的に含まない、ヒトまたは動物の体から単離された細胞集団を指す。
【００７１】
細胞集団との関連において、「接触させること」という用語は、本明細書中で使用される場合、単離された細胞集団を試薬、例えば、ビーズか細胞かのどちらかに繋げられることができる抗体、サイトカイン、リガンド、マイトジェンまたは共刺激分子と共にインキュベートすることを指す。抗体またはサイトカインは、可溶性形態であってもよいし、または固定されていてもよい。一実施形態では、固定されている抗体またはサイトカインは、ビーズまたはプレートに緊密に結合または共有結合している。一実施形態では、抗体はＦｃ被覆ウェルに固定されている。望ましい実施形態では、接触は、生体外（例えば試験管内）または生体内で起こる。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。「特異的に結合する」または「免疫反応する」または「指向する」とは、抗体が、所望の抗原の１つ以上の抗原決定基とは反応するが、他のポリペプチドとは反応しないかまたははるかに低い親和性（ＫＤ＞１０−６モーラー）で結合する、ということを意味する。抗体としては、限定されないが例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｓｄＡｂ（重鎖または軽鎖単一ドメイン抗体）、一本鎖のＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。
【００７３】
本明細書中で使用する「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、人工Ｔ細胞受容体、Ｔボディ、一本鎖免疫受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を指し得、例えば、特定の免疫エフェクター細胞に人工的な特異性を融合させる操作型受容体を包含し得る。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与してそれによって例えば養子細胞療法用の多数の特異的Ｔ細胞を生じさせるために採用され得る。具体的な実施形態において、ＣＡＲは、細胞の特異性を例えば腫瘍関連抗原へ差し向ける。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（標的指向性部分と標的腫瘍細胞などの標的細胞との係合に際してＴ細胞を活性化させる）細胞内活性化ドメインと、膜貫通ドメインと、疾患または障害関連抗原結合領域、例えば腫瘍抗原結合領域を含んでおり長さが様々であり得る細胞外ドメインとを含む。詳しい態様において、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ  膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインと融合した、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体を含む。他のＣＡＲ設計の特異性は、受容体（例えばペプチド）のリガンド、またはデクチンなどのパターン認識受容体に由来し得る。特定の事例では、抗原認識ドメインの間隔を調整して活性化誘導細胞死を低減することができる。特定の事例では、ＣＡＲは、追加の共刺激シグナル伝達のためのドメイン、例えばＣＤ３−ゼータ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０／１２、及び／またはＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＴＬＲなどを含む。いくつかの事例では、共刺激分子、造影用（例えばポジトロン断層撮影用）のレポーター遺伝子、プロドラッグの添加によってＴ細胞を条件的に取り除く遺伝子産物、帰巣受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン及びサイトカイン受容体を含めた分子をＣＡＲと一緒に共発現させることができる。
【００７４】
基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一対からなり、各対は１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）と１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主として担う、約１００〜１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主として担う定常領域を画定している。一般に、ヒトから得られた抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤのいずれかに関係しており、それらは分子中に存在する重鎖の性質が互いに異なっている。特定のクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などといったサブクラスも有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。
【００７５】
「Ｆａｂ」という用語は、Ｌ鎖全体（ＶＬ及びＣＬ）に加えてＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）と１本の重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とから構成される抗体断片を指す。完全抗体のパパイン消化を用いて２つのＦａｂ断片を生じさせることができ、その各々は、１つの抗原結合部位を含有する。典型的には、パパイン消化によって生成するＦａｂのＬ鎖とＨ鎖断片は鎖間ジスルフィド結合によって繋がっている。
【００７６】
「Ｆｃ」という用語は、スルフィド結合によってまとめ合わされた、両Ｈ鎖のカルボキシ末端部分（ＣＨ２及びＣＨ３）とジヒンジ領域の一部とを含む、抗体断片を指す。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決まり、この領域は、特定の種類の細胞上に見受けられるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。１つのＦｃ断片は、完全抗体のパパイン消化によって得られる。
【００７７】
「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、完全抗体のペプシン消化によって生成する抗体断片を指す。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ジスルフィド結合によってまとめ合わされた、２つのＦａｂ断片とヒンジ領域の一部とを含有する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、二価の抗原結合活性を有し、抗原を架橋することができる。
【００７８】
Ｆａｂ’という用語は、Ｆ（ａｂ’）２断片の還元の生成物である抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含んでいるＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の追加残基を有する点においてＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有しているＦａｂ’に対する本明細書中での呼称である。
【００７９】
「Ｆｖ」という用語は、緊密に非共有結合的に会合している１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインとの二量体から構成される抗体断片を指す。これらの２つのドメインの折りたたみによって、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与しかつ抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３つずつのループ）が生まれる。しかしながら、一本の可変ドメイン（または抗原に対して特異的であるＣＤＲを３つしか含んでいないＦｖの半分）であっても、完全な結合部位よりも親和性が大抵低いものの、抗原を認識して抗原に結合する能力は有している。
【００８０】
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「一本鎖Ｆｖ」という用語は、１本のポリペプチド鎖として連結されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片を指す。典型的には、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、抗原結合のための所望の構造をｓｃＦｖが形成することを可能にするものであるポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）、及びＭａｌｍｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３：７−１３，１９９５を参照されたい。
【００８１】
「直鎖状抗体」という表現は、１対の抗原結合領域を形成する１対のタンデムＶＨ−ＣＨ１セグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含むポリペプチドを指して使用される。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得、例えば、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）において記載がなされている。
【００８２】
「可変」という用語は、可変ドメインの特定部分が、抗体間での配列の違いを広範囲に有しており、各特定抗体のその特定抗原に対する結合性及び特異性において使用される、という事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって一様に分布してはいない。それは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの両方において、超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。より高度に保存されている可変ドメインの部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、概ねベータシート配置を採っている４つのＦＲを含み、それらは、ベータシート構造を連結しかついくつかの事例においてはベータシート構造の一部を形成するループを形成している３つの超可変領域によって連結されている。各鎖の中の超可変領域は、ＦＲによってごく近傍にまとめ合わされており、他方の鎖からの超可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．を参照のこと）。定常ドメインは、抗体を抗原と結合させるのに直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与を呈する。
【００８３】
「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端の可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重軽鎖のＶ領域内の差異の大きい３つの範囲は、「超可変領域」と呼ばれており、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られる両脇のより保存された範囲の間に挟まれている。このように、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域同士の間でそれらに隣接して天然に見受けられるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域と、重鎖の３つの超可変領域は、互いに関して三次元空間に配置されて抗原結合表面を形成している。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に対して相補的であり、重軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７），Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義による。
【００８４】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」という用語は、配列が超可変性であり、かつ／または構造的に画定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つと、ＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つとの、６つのＨＶＲを含む。天然抗体においては、６つのＨＶＲの中ではＨ３及びＬ３が最大の多様性を呈し、特にＨ３は、抗体に微妙な特異性を付与する独特の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１−２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。実際、重鎖のみから構成される天然に存在するラクダ抗体は軽鎖の不在下で機能的かつ安定である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）、Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。
【００８５】
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的には、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として同定される４つのＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔによって定義される場合、軽鎖ＦＲ残基は、残基約１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）及び９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）のところに位置しており、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基の残基約１〜３０（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）、及び１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）のところに位置している。ＣＤＲが超可変ループからのアミノ酸残基を含む場合、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖の残基約１〜２５（ＬＣＦＲ１）、３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、５３〜９０（ＬＣＦＲ３）及び９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）のところに位置しており、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基の残基約１〜２５（ＨＣＦＲ１）、３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、５６〜９５（ＨＣＦＲ３）、及び１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）のところに位置している。ある場合には、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔによる定義に倣うＣＤＲと超可変ループのそれとの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれに応じて調節されることになる。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６〜Ｈ３５を含む場合、重鎖ＦＲ１残基は位置１〜２５にあり、ＦＲ２残基は位置３６〜４９にある。
【００８６】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンのＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択肢のうち最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンのＶＬまたはＶＨ配列の選択肢は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。通常、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔにおけるようなサブグループである。特定の事例では、ＶＬの場合のサブグループは、Ｋａｂａｔにおけるような、サブグループカッパＩである。特定の事例では、ＶＨの場合のサブグループは、ＫａｂａｔにおけるようなサブグループＩＩＩである。
【００８７】
本明細書中で使用する場合、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、例えばＢＩＡｃｏｒｅ．ＴＭ．−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ．ＴＭ．−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、約１０応答ユニット（ＲＵ）の抗原または抗体が固定されたＣＭ５チップによって２５℃で測定される、解離定数を指す。二価抗体または他の多価抗体の場合には、アビディティーによって誘導される解離定数の測定結果との干渉を回避するために抗体を固定するのが典型的である。さらなる詳細については例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。
【００８８】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体と特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基、脂質または炭化水素決定基を含む。エピトープ決定基は大抵、アミノ酸、脂質または糖側鎖などの分子の活性表面群から構成され、大抵、特有の三次元構造特徴及び特有の電荷特徴を有する。抗体は、平衡解離定数（ＫＤ）が１０−６〜１０−１２Ｍの範囲である場合、抗原に特異的に結合するとされる。「活性化エピトープ」は、結合によって特定のγδＴ細胞集団を活性化させることができる。
【００８９】
抗体が基準抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合するというのは、２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合である。２つのエピトープが同一または立体的に重複するエピトープと結合するか否かを判定するための最も広く用いられている迅速な方法は、標識抗原か標識抗体かのどちらかを使用する、多種多様な方式で構成され得る競合アッセイである。いくつかの実施形態では、抗原を９６ウェルプレートに固定し、標識抗体の結合を遮断する未標識抗体の能力を、放射性標識または酵素標識を使用して測定する。あるいは、標識抗体及び未標識抗体を使用する競合試験は、抗原発現細胞に対するフローサイトメトリーを用いて実施する。
【００９０】
「エピトープ位置特定」は、抗体の標的抗原にある、抗体の結合部位またはエピトープを特定するプロセスである。抗体エピトープは、直鎖状エピトープまたは配座エピトープであり得る。直鎖状エピトープは、プロテイン中のアミノ酸の連続配列によって形成される。配座エピトープは、タンパク質配列中では不連続であるがタンパク質のその三次元構造体への折りたたみによって寄せ集められるアミノ酸から形成される。
【００９１】
本明細書において定義されるところの「エピトープビニング」は、抗体が認識するエピトープに基づいて抗体を分類するプロセスである。より詳しくは、エピトープビニングは、抗体のエピトープ認識特性に基づいて抗体をクラスター化するため及び別個の結合特異性を有する抗体を識別するためのコンピュータプロセスと組み合わせられた、異なる抗体のエピトープ認識特性を区別するための方法及びシステムを含む。
【００９２】
本発明による「薬剤」または「化合物」は、小分子、ポリペプチド、タンパク質、抗体または抗体断片を含む。小分子は、本発明との関連において、一実施形態では分子量１０００ダルトン未満、詳しくは８００ダルトン未満、より詳しくは５００ダルトン未満の化学物質を意味する。「治療剤」という用語は、生物学的活性を有する薬剤を指す。「抗がん剤」という用語は、がん細胞に対する生物学的活性を有する薬剤を指す。
【００９３】
本明細書中で使用する場合、「細胞培養物」という用語は、細胞の任意の試験管内培養物を指す。この用語には、（例えば、不死化表現型を有する）連続細胞株、初代細胞培養物、有限細胞株（例えば、非形質転換細胞）、及び試験管内で維持される他の細胞集団、例えば、幹細胞、血液細胞、胚性臍帯血細胞、腫瘍細胞、形質導入細胞などが含まれる。
【００９４】
「処置する」または「処置」という用語は、望ましくない生理学的変化または障害を防止するかまたは鈍化（減少）させることを目的とする、治療的処置と予防的または防止的手段との両方を指す。有益な、または所望の臨床結果としては、限定されないが例えば、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず、症候の軽減、疾患度合いの減弱（例えば、腫瘍の大きさ、腫瘍負荷または腫瘍分布の低減）、安定化された（つまり、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延または鈍化、疾患状態の改善または緩和、及び（部分的であるか完全であるかにかかわらない）寛解が挙げられる。「処置」は、生存期間を、処置を受けていない場合に予想される生存期間よりも長くすることも意味し得る。処置を必要とする者には、症状または障害を既に有する者の他に、症状もしくは障害を有する傾向にある者または症状または障害が防止されるべき者が含まれる。
【００９５】
１つ以上のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（同時発生的）投与及び任意の順序での連続投与を含む。
【００９６】
「同一」という用語は、本明細書中で使用される場合、同じである２つ以上の配列または小配列を指す。さらに、「実質的に同一」という用語は、本明細書中で使用される場合、比較窓または比較アルゴリズムを使用するかもしくは手動での整列及び目視検査によって測定される指定領域にわたって最大の一致が得られるように比較及び整列されたときに同じである配列単位の百分率を有する２つ以上の配列を指す。単なる例を示すと、２つ以上の配列は、配列単位が特定領域にわたって約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一または約９５％同一である場合に「実質的に同一」であり得る。そのような百分率は、２つ以上の配列の「同一性パーセント」を表現する。配列の同一性は、長さが少なくとも約７５〜１００配列単位である領域、長さが少なくとも約５０配列単位である領域または、指定のない場合には配列全体にわたって、存在し得る。この定義は、試験配列の相補体にも言及するものである。さらに、単なる例を示すと、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が同じである場合には同一であるが、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が特定領域にわたって約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一である場合には「実質的に同一」である。同一性は、少なくとも約７５〜約１００核酸の長さの領域、約５０核酸の長さの領域または、指定のない場合にはポリヌクレオチド配列の配列全体にわたって、存在し得る。
【００９７】
「薬学的に許容できる」という用語は、本明細書中で使用される場合、化合物の生物学的活性または特性を無効にせずしかも比較的無毒である材料、すなわち、望ましくない生物学的作用を引き起こすことまたは組成物中に含まれているいずれかの成分と有害な相互作用をすることを伴わずに個体に投与され得る、材料、限定されないが例えば、塩、担体または希釈剤を指す。
【００９８】
「対象」または「患者」という用語は、本明細書中で使用される場合、脊椎動物を指す。特定の実施形態では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが例えば、ヒト、非ヒト霊長類、家畜動物（例えばウシ）、競技用動物、及びペット（例えば、ネコ、イヌ及びウマ）が挙げられる。特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００９９】
「治療的有効量」という用語は、本明細書中で使用される場合、疾患、症状または障害を既に患っている対象、例えばヒト患者に投与される本発明の増殖済み細胞集団を含有する組成物及び／または混合物の、処置されている疾患、障害もしくは症状の１つ以上の症候を治癒させるか少なくとも部分的に停止させるかまたはある程度緩和するのに十分な量を指す。そのような組成物の有効性は、条件、限定されないが例えば、疾患、障害または症状の重症度及び経過、以前の療法、患者の健康状態及び薬物への応答、ならびに処置する医師の判断に依存する。単なる例を示すと、治療的有効量は、慣習的な実験、限定されないが例えば、用量漸増治験によって決定され得る。
【０１００】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）という用語は、野生型ＡＰＣまたは、操作型もしくは人工の抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を指す。ＡＰＣは、ＡＰＣの照射済み集団として提供されることができる。ＡＰＣは、固定化細胞株から提供されることができ（例えば、固定化細胞株に由来するＫ５６２または操作型ａＡＰＣ）、または、ドナーからの細胞の画分として提供されることができる（例えば、ＰＢＭＣ）。
【０１０１】
本明細書中で使用する場合、タンパク質もしくはそのポリペプチド断片またはエピトープに関して「構造的に異なる」及び「構造的に別個」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質、そのポリペプチド断片またはエピトープの間での共有結合的な（つまり構造的な）差異を指す。例えば、２つの構造的に異なるタンパク質（例えば抗体）は、異なる一次アミノ酸配列を有する２つのタンパク質を指し得る。いくつかの事例では、構造的に異なる活性化剤は、構造的に異なるエピトープ、例えば異なる一次アミノ酸配列を有するエピトープに結合する。
【０１０２】
本明細書中で使用する場合、特定受容体活性（例えば、ＮＫｐ３０活性、ＮＫｐ４４活性及び／またはＮＫｐ４６活性）とは「無関係」な「抗腫瘍性細胞傷害性」という用語は、特定受容体または受容体の特定の組み合わせが細胞で発現するかまたは機能的であるか否かにかかわらず発揮される抗腫瘍性細胞傷害性を指す。このように、ＮＫｐ３０活性、ＮＫｐ４４活性及び／またはＮＫｐ４６活性とは無関係な抗腫瘍性細胞傷害性を呈するγδＴ細胞は、ＮＫｐ３０活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性、ＮＫｐ４４活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性及び／またはＮＫｐ４６活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性を呈するものでもあり得る。
【０１０３】
本明細書中で使用する場合、「ＮＫｐ３０活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性」、「ＮＫｐ４４活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性」及び「ＮＫｐ４６活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性」という用語は、特定受容体の機能的発現を必要とする抗腫瘍性細胞傷害性を指す。そのような受容体依存性の抗腫瘍性細胞傷害性の存否は、実施例４８で実施するような標準的な試験管内細胞傷害性アッセイを特定受容体に対する拮抗薬の存在下または非存在下で実施することによって判定することができる。例えば、ＮＫｐ３０活性依存性の抗腫瘍性細胞傷害性の存否は、実施例４８で実施するような試験管内細胞傷害性アッセイの抗ＮＫｐ３０拮抗薬の存在下での結果と、抗ＮＫｐ３０拮抗薬の非存在下で得られた結果とを比較することによって判定することができる。
【０１０４】
抗腫瘍性細胞傷害性の少なくとも特定「％」分が特定受容体活性（例えば、ＮＫｐ３０活性、ＮＫｐ４４活性及び／またはＮＫｐ４６活性）と「無関係」である、抗腫瘍性細胞傷害性を含むγδＴ細胞集団は、本明細書中で使用される場合、特定受容体を遮断することによって測定抗腫瘍性細胞傷害性がその数値％値分より大きく低下することがない細胞を指す。したがって、抗腫瘍性細胞傷害性のうち少なくとも５０％がＮＫｐ３０活性とは無関係である、抗腫瘍性細胞傷害性を含むγδＴ細胞集団は、ＮＫｐ３０拮抗薬の存在下では、ＮＫｐ３０拮抗薬の非存在下における場合と比べて試験管内での抗腫瘍性細胞傷害性の５０％以下の低下を示すであろう。
【０１０５】
概説
ヒトにおいて、γδＴ細胞（複数可）は、自然免疫応答と適応免疫応答との関連性を提供するＴ細胞のサブセットである。これらの細胞は、Ｖ−（Ｄ）−Ｊセグメント再構成を経て抗原特異的なγδＴ細胞受容体（γδＴＣＲ）を生み出し、γδＴ細胞（複数可）は、γδＴＣＲか、独立もしくは協働して作用してγδＴ細胞エフェクター機能を活性化させる他の非ＴＣＲタンパク質かのどちらかによる抗原認識によって直接活性化されることができる。γδＴ細胞は、哺乳類においてＴ細胞集団全体の小画分を占め、末梢血中及びリンパ器官中のＴ細胞のおよそ１〜５％を占めており、またそれらは、皮膚、肝臓、消化管、気道及び生殖管のような上皮細胞に富む区画に主として存在しているようである。主要組織適合性複合体分子（ＭＨＣ）に結合している抗原を認識するαβＴＣＲとは違い、γδＴＣＲは、細菌抗原、ウイルス抗原、疾患細胞で発現するストレス抗原、及び完全タンパク質または非ペプチド化合物の形態の腫瘍抗原を直接認識することができる。
【０１０６】
ＴＳ−１、ＴＳ８．２、Ｂ６及び１５Ｄは、γδＴ細胞を活性化させることができる。理論に拘泥しないが、異なるドナーから生じる培養物の活性化及び増殖の異なるレベルは、ドナーのγδ可変ＴＣＲレパートリー、及び抗体結合エピトープに起因するものであり得る。特定のγδＴ細胞サブセットに結合する全ての薬剤が、特定のγδＴ細胞を活性化させること、特に、濃縮培養物中の特定のγδＴ細胞集団を臨床上妥当なレベル、すなわち１０８個超の標的γδＴ細胞にまで活性化させることができるわけでない、ということが発見された。同様に、γδＴ細胞集団の全ての結合エピトープが、活性化エピトープである、つまり結合によって特定のγδＴ細胞集団を活性化させることができる、というわけではない。
【０１０７】
本発明者らは、特定のγδＴ細胞サブタイプの強力な活性化に関連する特定のγδ可変ＴＣＲ結合領域を同定し、かくして、患者へ投与されることができる、純度の向上した臨床上妥当なレベルの高濃縮γδＴ細胞集団及びその混合物を生じさせるγδＴ細胞サブタイプの特異的活性化を可能にした。γδＴ細胞サブタイプの強化された活性化及び増殖を誘導することができる活性化エピトープに特異的に結合する、抗体を含めた新規活性化リガンドも企図され、本明細書中にさらなる記載がある。
【０１０８】
いくつかの事例では、本発明の方法を使用する臨床上妥当なレベル（すなわち、１０８個超）のγδＴ細胞の製造は、比較的少ない量の培養用培地を使用して達成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、臨床上妥当なレベルのγδＴ細胞は、およそ２５Ｌ；２０Ｌ；１０Ｌ；５Ｌ；３Ｌ；２Ｌ；１，５０００ｍＬ；１，０００ｍＬ；５００ｍＬ；２００ｍＬ；１５０ｍＬ；１００ｍＬまたはそれ未満（例えば、約１０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約１００ｍＬ〜約５００ｍＬ、約５００ｍＬ〜約５，０００ｍＬ，または約５Ｌ〜約２５Ｌ）の採集培養体積で、細胞集団（例えば、単離された混合細胞集団）の増殖によって得ることができる。別の例を挙げると、いくつかの実施形態では、臨床上妥当なレベルのγδＴ細胞は、１ドナーまたは多数のドナーから得られた単離された混合細胞集団を増殖させるのに使用する培養用培地の総体積が約５０Ｌ未満、約２５Ｌ未満、約２０Ｌ未満、約１０Ｌ未満、約５Ｌ未満、約１Ｌ未満または約７５０ｍＬ未満（例えば、約７５０ｍＬ〜約５０Ｌ未満、約１００ｍＬ〜約７５０ｍＬ、約７５０ｍＬ〜約５Ｌ、約１Ｌ〜約１０Ｌ、約１０Ｌ〜約５０Ｌ、または約１０Ｌ〜約２５Ｌ）となるような条件下で得ることができる。
【０１０９】
本明細書では、例えば事前の非標的細胞種の除去を伴わずに、細胞傷害特性を有する臨床上妥当なレベルの濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を提供する、単離された混合細胞集団からのγδＴ細胞サブタイプの選択的活性化及び増殖のための方法について記載する。特定γδ細胞集団（複数可）のγδ可変ＴＣＲエピトープを活性化させることについても記載する。本発明はさらに、本発明の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を含む組成物による処置方法を提供する。
【０１１０】
本発明では、γδＴ細胞の１つ以上の特定サブセットを含む臨床上妥当なレベル（１０８個超）の操作型または非操作型γδＴ細胞を製造または提供する方法について記載する。そのような方法を用いて、単一ドナーから、例えば単一ドナーの単一試料からそのような臨床上妥当なレベルをもたらすことができる。さらに、そのような方法を用いて、１０８個より著しく多い操作型または非操作型γδＴ細胞を製造することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で、γδＴ細胞の１つ以上の特定サブセットを含む操作型または非操作型γδＴ細胞を約もしくは少なくとも約１０９個、約もしくは少なくとも約１０１０個、約もしくは少なくとも約１０１１個、または約もしくは少なくとも約１０１２個製造することができる。いくつかの事例では、集団のそのような大きさを、１９〜３０日という短さで、かつ／または使用する培養用培地の総体積を約１Ｌ未満にして、実現することができる。
【０１１１】
γδＴ細胞の単離
いくつかの態様では、本発明は、操作型または非操作型γδＴ細胞を増殖させる生体外方法を提供する。いくつかの事例では、方法は、ＩＬ−４、ＩＬ−２もしくはＩＬ−１５またはそれらの組み合わせなどの、γδＴ細胞の特定集団の増殖に役立つサイトカインを含まない、１つ以上の（例えば、第１及び／または第２の）増殖ステップを採用する。いくつかの実施形態では、本発明は、単離された混合細胞集団から濃縮γδＴ細胞集団を製造する生体外方法であって、δ１ＴＣＲ；δ１及びδ４ＴＣＲ；またはδ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲに特有のエピトープに結合することによってそれぞれδ１Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ３Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤に、混合細胞集団を接触させて、濃縮γδＴ細胞集団をもたらすことを含む、当該方法を提供する。他の態様では、本発明は、単離された混合細胞集団から濃縮γδＴ細胞集団を製造する生体外方法であって、δ２ＴＣＲに特有のエピトープに結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤に、混合細胞集団を接触させて、濃縮γδＴ細胞集団をもたらすことを含む、当該方法を提供する。
【０１１２】
他の態様では、本開示は、対象から単離されたγδＴ細胞を遺伝子操作する方法を提供する。濃縮、活性化、増殖または遺伝子操作の方法は、単独で、または組み合わせて、任意の順序で実施することができる。一実施形態では、γδＴ細胞を、単離し、遺伝子操作し、その後、活性化及び増殖させることができる。好ましい実施形態では、γδＴ細胞を、単離し、活性化及び増殖させ、その後、任意で遺伝子操作することができる。いくつかの実施形態では、そのような活性化及び増殖させその後に遺伝子操作したγδＴ細胞をさらに活性化及び増殖させることができる。
【０１１３】
例えば非操作型の、γδＴ細胞集団を、対象の複合試料から増殖させることができる。複合試料は、末梢血試料（例えば、ＰＢＬまたはＰＢＭＣ）、白血球アフェレーシス試料、臍帯血試料、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検材料、組織、リンパ、または外部環境に直接接している対象の上皮部位からのもの、または幹前駆細胞に由来するものであり得る。いくつかの事例では、本開示は、Ｖδ１＋細胞、Ｖδ２＋細胞、Ｖδ１＋細胞及びＶδ３＋細胞、Ｖδ１＋細胞及びＶδ４＋細胞、Ｖδ１＋細胞、Ｖδ３＋細胞、Ｖδ４＋細胞及びＶδ５＋細胞、またはそれらの任意の組み合わせを選択的に増殖させる方法を提供する。
【０１１４】
末梢血単核細胞は、例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムまたは別の適切な装置／システムを含めたアフェレーシス機械で、対象から採集することができる。採集した試料からγδＴ細胞（複数可）、またはγδＴ細胞（複数可）の所望の亜集団を例えばフローサイトメトリー技術によって精製することができる。対象が誕生する間に臍帯血から臍帯血細胞を得ることもできる。ＰＢＭＣ単離、γδＴ細胞活性化ならびにγδＴ細胞活性化剤の製造及び使用のための方法及び組成物を含めるが限定はされないあらゆる目的のために参照により本明細書に援用される、ＷＯ２０１６／０８１５１８を参照されたい。
【０１１５】
γδＴ細胞は、例えば第１増殖ステップにおいて、γδＴＣＲのエピトープに特異的に結合することによってγδＴ細胞を増殖させる１つ以上の薬剤に混合細胞集団を接触させることによって試験管内で培養される単離された複合試料または混合細胞集団から増殖させられて、濃縮γδＴ細胞集団をもたし得る。いくつかの実施形態では、全ＰＢＭＣ集団中に含まれているγδＴ細胞を、１つ以上の特定細胞集団、例えば、次の非γδＴ細胞単球：αβＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞のうちの１つ以上または全ての事前の除去を伴うことなく活性化及び増殖させることができ、結果として濃縮γδＴ細胞集団が得られる。いくつかの態様では、γδＴ細胞の活性化及び増殖は、天然型または操作型ＡＰＣの存在を伴わずに実施される。いくつかの態様では、腫瘍検体からのγδＴ細胞の単離及び増殖は、本明細書において提供されるγδＴＣＲの活性化エピトープに結合する固定化γδＴ細胞マイトジェン、例えば、γδＴＣＲの活性化エピトープに特異的な抗体及びレクチンを含めた他の活性化剤を使用して実施することができる。
【０１１６】
特定の実施形態では、γδＴ細胞を増殖させる１つ以上の薬剤に、単離された混合細胞集団を、約もしくは少なくとも約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１７日間、約１９日間、約２１日間、約２５日間、約２９日間、約３０日間またはその中の任意の範囲にわたって接触させる。例えば、γδＴ細胞を増殖させる１つ以上の薬剤に、単離された混合細胞集団を、約１日間〜約４日間、約２日間〜約４日間、約２日間〜約５日間、約３日間〜約５日間、約５日間〜約２１日間、約５日間〜約１９日間、約５日間〜約１５日間、約５日間〜約１０日間、または約５日間〜約７日間にわたって接触させて、第１濃縮γδＴ細胞集団をもたらす。別の例を挙げると、γδＴ細胞を増殖させる１つ以上の薬剤に、単離された混合細胞集団を、約７日間〜約２１日間、約７日間〜約１９日間、約７日間〜約２３日間、または約７日間〜約１５日間にわたって接触させて、第１濃縮γδＴ細胞集団をもたらす。
【０１１７】
いくつかの事例では、第１増殖ステップと第２増殖ステップとの間で精製または単離ステップを実施する。いくつかの事例では、単離ステップは１つ以上の活性化剤の除去を含む。いくつかの事例では、単離ステップは、γδＴ細胞またはそのサブタイプの特異的な単離を含む。いくつかの事例では、１つ以上（例えば全て）の活性化剤（例えば、細胞培養用培地の一般的成分でない全ての活性化剤、例えば血清成分及び／またはＩＬ−２）が第１増殖ステップと第２増殖ステップとの間で除去されるが、γδＴ細胞は他の細胞種（αβＴ細胞）から特異的に単離されない。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、第１濃縮ステップ及び場合によっては第２濃縮ステップにおいてγδＴＣＲの活性化エピトープに結合する活性化剤を使用してγδＴ細胞を活性化及び増殖させた後、第２、第３、第４、第５などの濃縮ステップにおいて当技術分野で知られている技術を用いて本発明の例えば第１の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）をさらに濃縮または精製して第２またはさらなる濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を得てもよい。例えば、αβＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を例えば第１の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）から除去してもよい。採集されたγδＴ細胞（複数可）上に発現される細胞表面マーカーの正及び／または負の選択を用いて例えば第１の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）から、同様の細胞表面マーカーを発現しているγδＴ細胞またはγδＴ細胞（複数可）の集団を直接単離することができる。例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ４４、Ｋｉｔ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ（１つ以上のＴＣＲγサブタイプを含む）、ＴＣＲδ（１つ以上のＴＣＲδサブタイプを含む）、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ４６、ＣＤ１６１、ＣＣＲ７、ＣＣＲ４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ−１、ＣＤ２４２、ＪＡＭＬ及びその他の適切な細胞表面マーカーなどのマーカーの陽性または陰性発現に基づいてγδＴ細胞を（例えば第１及び／または第２増殖ステップの後の）濃縮γδＴ細胞集団から単離することができる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、第１増殖ステップの後（例えば、第１増殖ステップに続いて実施される単離ステップの後）に、増殖済み細胞を場合によって希釈し、第２増殖ステップにおいて培養する。好ましい実施形態では、第２増殖ステップは、培養用培地が第２増殖ステップにおいて約１〜２日、約１〜３日、約１〜４日、約１〜５日、約２〜５日、約２〜４日または約２〜３日ごとに補給される条件下で実施される。いくつかの実施形態では、第２増殖ステップは、γδＴ細胞のさらなる１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍またはそれ以上の増殖を支援する密度に細胞が希釈または調節される条件下で実施される。いくつかの事例では、細胞密度調節は、培養用培地の補給と同時期（すなわち、同日または同時）に実施される。例えば、細胞密度は第２増殖ステップにおいて１〜２日、１〜３日、１〜４日、１〜５日、２〜５日、２〜４日または２〜３日ごとに調節され得る。γδＴ細胞のさらなる増殖を支援する典型的な細胞密度としては、限定されないが例えば、培養物に対して約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６細胞／ｍＬ、１０×１０６細胞／ｍＬ、１５×１０６細胞／ｍＬ、２０×１０６細胞／ｍＬ、または３０×１０６細胞／ｍＬが挙げられる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、細胞密度は、約０．５×１０６〜約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０６〜約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、約０．７５×１０６〜約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．７５×１０６〜約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．７５×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、または約１×１０６〜約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約３×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約４×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約１０×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約１５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍＬ、または約１×１０６〜約３０×１０６細胞／ｍＬの密度に調節される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、第２増殖ステップは、細胞を追跡評価して所定細胞密度（または密度区間）に維持する条件、及び／または所定グルコース含有量を有する培養用培地中に細胞を維持する条件のもとに実施される。例えば、細胞は、約０．５×１０６〜約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０６〜約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、約０．７５×１０６〜約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．７５×１０６〜約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．７５×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、または約１×１０６〜約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約３×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約４×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約１０×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約１５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約３０×１０６細胞／ｍＬの生細胞密度に維持され得る。
【０１２２】
いくつかの事例では、細胞は、増殖の少なくとも一部にわたってより高い濃度で維持され得る。例えば、第１または第２増殖の第１部分にわたって細胞の生存能はより高い細胞濃度で増強される可能性がある。別の例を挙げると、第１または第２増殖の最終部分にわたってより高い細胞濃度で最も効率的に培養物体積が利用される可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、第１もしくは第２増殖培養の少なくとも一部または第１もしくは第２増殖培養の全体にわたって細胞は約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍＬの生細胞密度で維持され得る。
【０１２３】
別の例を挙げると、細胞は、約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、または約１ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌのグルコース含有量を有する培養用培地中で維持され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、約１．２５ｇ／Ｌのグルコース含有量を有する培養用培地中で維持され得る。いくつかの事例、例えば、高細胞密度培養を維持する場合において、細胞は、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、または約２ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌのグルコース含有量を有する培養用培地中で維持され得る。
【０１２４】
典型的には、グルコース含有量は、新鮮な血清を含有する培養用培地、または無血清培養用培地を培養物に添加することによって維持される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば各パラメータを追跡評価すること及び新鮮な培地を添加してパラメータを所定限界内に維持することによって、所定の生細胞密度区間で、所定のグルコース含有量区間を有する培養用培地中で維持され得る。いくつかの実施形態では、グルコース含有量は、灌流バイオリアクターで細胞を内部に保持しつつ使用済み培地を除去する間に、新鮮な血清を含有する培養用培地、または無血清培養用培地を培養物に添加することによって、維持される。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞増殖（例えば、選択的γδＴ細胞増殖）中、または本明細書に記載の第１もしくは第２γδＴ細胞増殖（例えば、選択的γδＴ細胞増殖）ステップ中に、ｐＨ、Ｏ２の分圧、Ｏ２飽和度、ＣＯ２の分圧、ＣＯ２飽和度、ラクテート、グルタミン、グルタメート、アンモニウム、ナトリウム、カリウム及びカルシウムのうちの１つ以上を非限定的に含めた追加パラメータを追跡評価及び／または維持する。
【０１２５】
γδＴ細胞サブタイプは、例えば第１増殖ステップにおいて、
ｉ）δ１ＴＣＲのエピトープに特異的に結合することによってδ１Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、
ｉｉ）δ２ＴＣＲのエピトープに特異的に結合することによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、
ｉｉｉ）δ１及びδ４ＴＣＲのエピトープに特異的に結合することによってδ１及びδ４Ｔ細胞を選択的に増殖させるか、または
ｉｖ）δ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲのエピトープに特異的に結合することによってδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の薬剤
に混合細胞集団を接触させることによって試験管内で培養される単離された複合試料または混合細胞集団から選択的に増殖させられて、濃縮γδＴ細胞集団をもたし得る。いくつかの事例では、１つ以上の薬剤は、δ１Ｊ１、δ１Ｊ２もしくはδ１Ｊ３  ＴＣＲ、またはそれらのうちの２つ、またはそれらの全てに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、全ＰＢＭＣ集団中のγδ細胞を、特定の細胞集団、例えば、単球、αβＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞の事前の除去を伴わずに活性化及び増殖させることができ、その結果として濃縮γδＴ細胞集団を生じさせることができる。いくつかの態様では、γδＴ細胞の活性化及び増殖は、天然型または操作型ＡＰＣの存在を伴わずに実施される。いくつかの態様では、腫瘍検体からのγδＴ細胞の活性化及び増殖は、δ１ＴＣＲ；δ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲ、δ１及びδ４ＴＣＲ；またはδ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに対して特異的である抗体ならびに、δ１ＴＣＲ；δ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲ、δ１及びδ４ＴＣＲ；またはδ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合するレクチンを含めた他の活性化剤を含む固定化γδＴ細胞マイトジェンを使用して実施され得る。
【０１２６】
特定の実施形態では、δ１、δ１及びδ４、δ２、またはδ１及びδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤に、単離された混合細胞集団を約５日間、６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間またはそれらの間の任意の範囲にわたって接触させる。例えば、δ１またはδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の薬剤に、単離された混合細胞集団を約１〜約３日間、約１〜約４日間、約１〜約５日間、約２〜約３日間、約２〜約４日間、約２〜約５日間、約３〜約４日間、約３〜約５日間、約４〜約５日間、約５〜約１５日間、または約５〜約７日間にわたって接触させて、第１濃縮γδＴ細胞集団をもたらす。いくつかの実施形態では、選択的に増殖させたδ１、δ１及びδ３、δ１及びδ４、δ２、またはδ１及びδ２Ｔ細胞を第２増殖ステップにおいてさらに、本明細書において記載されているように増殖させる。
【０１２７】
特定の実施形態では、単離された出発混合細胞集団、例えば、末梢血試料は、約２０〜８０％の範囲のＴリンパ球を含む。特定の実施形態では、本発明の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）中の残留αβＴ細胞及びＮＫ細胞のパーセントはそれぞれ、約２．５％またはそれ未満、及び約１％またはそれ未満である。本発明の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）中の残留αβＴ細胞またはＮＫ細胞のパーセントは、約１％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．４％もしくはそれ未満、約０．２％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、または約０．０１％もしくはそれ未満である。特定の実施形態では、本発明の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）中の残留αβＴ細胞のパーセントは、（例えば、γδＴ細胞もしくはそのサブタイプの正の選択のステップの後、またはαβＴ細胞の除去の後で）約０．４％もしくはそれ未満、約０．２％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、または約０．０１％もしくはそれ未満である。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２γδＴ細胞増殖の前または後に、αβＴ細胞は除去されるが、ＮＫ細胞は除去されない。特定の態様では、単離された混合細胞集団は、単一ドナーに由来する。他の態様では、単離された混合細胞集団は、１より多い数のドナーまたは多数のドナー（例えば、２、３、４、５、または２〜５、２〜１０、または５〜１０、またはそれより多い数のドナー）に由来する。
【０１２８】
かくして、いくつかの実施形態において本発明の方法は、臨床上妥当な数（１０８超、１０９超、１０１０超、１０１１超または１０１２超、または約１０８〜約１０１２）の増殖済みγδＴ細胞をたったの１ドナーからもたらすことができる。いくつかの事例では、本発明の方法は、臨床上妥当な数（１０８超、１０９超、１０１０超、１０１１超または１０１２超、または約１０８〜約１０１２）の増殖済みγδＴ細胞を、ドナー試料を得た時から１９日未満または２１日未満のうちにもたらすことができる。
【０１２９】
δ１、δ１及びδ３ＴＣＲ、δ１及びδ４ＴＣＲ、またはδ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合する活性化剤を使用する第１濃縮ステップにおける特定γδＴ細胞サブセットの特異的活性化及び増殖に続いて、第２、第３、第４、第５などの濃縮ステップにおいて当技術分野で知られている技術を用いて本発明の第１濃縮γδＴ細胞集団（複数可）をさらに濃縮または精製して第２またはさらなる濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を得てもよい。例えば、第１濃縮γδＴ細胞集団（複数可）からαβＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を除去してもよい。採集されたγδＴ細胞（複数可）上に発現される細胞表面マーカーの正及び／または負の選択を用いて第１濃縮γδＴ細胞集団（複数可）から、同様の細胞表面マーカーを発現しているγδＴ細胞またはγδＴ細胞（複数可）の集団を直接単離することができる。例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ４４、Ｋｉｔ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ（またはその１つ以上のサブタイプ）、ＴＣＲδ（またはその１つ以上のサブタイプ）、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ４６、ＣＤ１６１、ＣＣＲ７、ＣＣＲ４、ＤＮＡＭ−１、ＪＡＭＬ及びその他の適切な細胞表面マーカーなどのマーカーの陽性または陰性発現に基づいてγδＴ細胞を第１濃縮γδＴ細胞集団から単離することができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明の第１γδＴ細胞増殖、第１濃縮ステップ、第２γδＴ細胞増殖及び／または第２濃縮ステップの後に濃縮γδＴ細胞集団は、例えば１０ｍＬ未満、２５ｍＬ未満、５０ｍＬ未満、１００ｍＬ未満、１５０ｍＬ未満、２００ｍＬ未満、５００ｍＬ未満、７５０ｍＬ未満、１Ｌ未満、２Ｌ未満、３Ｌ未満、４Ｌ未満、５Ｌ未満、１０Ｌ未満、２０Ｌ未満または２５Ｌ未満の培養物体積において臨床上妥当なレベルの、１０８細胞より多いγδＴ細胞サブセットを含む。例えば、本発明の方法は、１０〜１００ｍＬ、２５〜１００ｍＬ、５０〜１００ｍＬ、７５〜１００ｍＬ、１０〜１５０ｍＬ、２５〜１５０ｍＬ、５０〜１５０ｍＬ、７５〜１５０ｍＬ、１００〜１５０ｍＬ、１０〜２００ｍＬ、２５〜２００ｍＬ、５０〜２００ｍＬ、７５〜２００ｍＬ、１００〜２００ｍＬ、１０〜２５０ｍＬ、２５〜２５０ｍＬ、５０〜２５０ｍＬ、７５〜２５０ｍＬ、１００〜２５０ｍＬ、１５０〜２５０ｍＬ、５〜１，０００ｍＬ、１０〜１，０００ｍＬ、または１００〜１，０００ｍＬ、１５０〜１，０００ｍＬ、２００〜１，０００ｍＬ、２５０〜１，０００ｍＬ、４００ｍＬ〜１Ｌ、１Ｌ〜２Ｌ、２Ｌ〜５Ｌ、２Ｌ〜１０Ｌ、４Ｌ〜１０Ｌ、４Ｌ〜１５Ｌ、４Ｌ〜２０Ｌ、または４Ｌ〜２５Ｌの体積の増殖培養物において臨床上妥当なレベルの、１０８細胞より多いγδＴ細胞サブセットをもたらすことができる。他の実施形態では、本発明の第２、第３、第４、第５などの濃縮ステップの後に濃縮γδＴ細胞集団は、臨床上妥当なレベルの、１０８個より多いγδＴ細胞サブセットを含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、γδＴ細胞（複数可）は、１つ以上の抗原との接触に応答して急速に増殖することができる。いくつかのγδＴ細胞（複数可）、例えばＶγ９Ｖδ２＋のγδＴ細胞（複数可）は、プレニルピロリン酸、アルキルアミン、及び組織培養中の代謝産物または微生物抽出物のようないくつかの抗原との接触に応答して試験管内で急速に増殖する。さらに、いくつかの野生型γδＴ細胞（複数可）、例えばＶγ２Ｖδ２＋のγδＴ細胞（複数可）は、特定種類のワクチン接種（複数可）に応答してヒトの生体内で急速に増殖する。刺激されたγδＴ細胞は、数々の抗原提示、共刺激及び、複合試料からのγδＴ細胞（複数可）の単離を容易にすることができる接着分子を呈することができる。例えば抗体または固定化抗体などの本明細書に記載の選択的γδＴ細胞増殖剤による増殖との組み合わせ、その前、またはその後において、複合試料中のγδＴ細胞（複数可）を少なくとも１つの抗原で１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、約５〜１５日間、５〜１０日間または５〜７日間、または別の適切な期間にわたって試験管内で刺激することができる。適切な抗原によるγδＴ細胞の刺激は、試験管内でγδＴ細胞集団を増殖させることができる。
【０１３２】
複合試料からのγδＴ細胞（複数可）の試験管内での増殖を刺激するために使用され得る抗原の非限定的な例としては、プレニルピロリン酸、例えばイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、アルキルアミン、ヒト微生物病原体の代謝産物、共生細菌の代謝産物、−メチル−３−ブテニル−１−ピロリン酸（２Ｍ３Ｂ１ＰＰ）、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニルピロリン酸（ＨＭＢ−ＰＰ）、エチルピロリン酸（ＥＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、ジメチルアリルリン酸（ＤＭＡＰ）、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）、エチル−アデノシン三リン酸（ＥＰＰＰＡ）、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、イソペンテニル−アデノシン三リン酸（ＩＰＰＰＡ）、モノエチルリン酸（ＭＥＰ）、モノエチルピロリン酸（ＭＥＰＰ）、３−ホルミル−１−ブチル−ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ１）、Ｘ−ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ２）、３−ホルミル−１−ブチル−ウリジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ３）、３−ホルミル−１−ブチル−デオキシチミジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ４）、モノエチルアルキルアミン、アリルピロリン酸、クロトイルピロリン酸、ジメチルアリル−γ−ウリジン三リン酸、クロトイル−γ−ウリジン三リン酸、アリル−γ−ウリジン三リン酸、エチルアミン、イソブチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、イソアミルアミン、及び窒素を含有するビスホスホネートが挙げられる。
【０１３３】
本明細書に記載の活性化剤及び共刺激剤を使用してγδＴ細胞の活性化及び増殖を実施して、特異的γδＴ細胞増殖及び持続性の集団を誘発することができる。いくつかの実施形態では、異なる培養物からのγδＴ細胞の活性化及び増殖は、別個のクローン性または混合ポリクローン性の集団サブセットを実現することができる。いくつかの実施形態では、種々の作動薬を使用して、特異的γδ活性化シグナルをもたらす薬剤を同定することができる。一態様では、特異的γδ活性化シグナルをもたらす薬剤は、γδＴＣＲを指向する種々のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）であり得る。
【０１３４】
一態様では、ＭＡｂはγＴＣＲ及び／またはδＴＣＲの定常または可変領域上の異なるエピトープに結合することができる。一態様では、ＭＡｂはγδＴＣＲ汎ＭＡｂを含み得る。一態様では、γδＴＣＲ汎ＭＡｂは、δ１及びδ２細胞集団を含めたγ鎖上かδ鎖上かのどちらかまたは両鎖上の種々のγ及びδＴＣＲに共通しているドメインを認識し得る。一態様では、抗体は、５Ａ６．Ｅ９（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｂ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＭＭＵ５１０及び／または１１Ｆ２（１１Ｆ２）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）であり得る。一態様では、ＭＡｂを、γ鎖の可変領域に固有の特定ドメイン（Ｖγ９ＴＣＲ類似体を指向する７Ａ５  ＭＡｂ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃ＴＣＲ１７２０））、またはＶδ１可変領域上のドメイン（Ｍａｂ  ＴＳ８．２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃ＴＣＲ１７３０）；ＭＡｂ  ＴＳ−１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＃ＴＣＲ１０５５）、ＭＡｂ  Ｒ９．１２（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＃ＩＭ１７６１））、またはＶδ２鎖（ＭＡｂ  １５Ｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃ＴＣＲ１７３２またはＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃ＴＣＲ２７３２）、Ｂ６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３３１４０２）、図３３〜３４中に記載されているδ１−＃抗体のうちの１つ、または図３５〜３６中に記載されているδ２−＃抗体のうちの１つ）に差し向けることができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、γδＴＣＲの種々のドメインに対する抗体（汎抗体及び、サブセット集団上の特有の可変領域エピトープを認識する抗体）を組み合わせて、γδＴ細胞の活性化を強化するそれらの能力を評価することができる。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞活性化物質は、γδＴＣＲ結合剤、例えばＭＩＣＡ、ＮＫＧ２Ｄに対する作動薬抗体、ＭＩＣＡと例えばＦｃタグとの融合タンパク質、ＵＬＢＰ１、またはＵＬＢＰ３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）ＵＬＢＰ２、またはＵＬＢＰ６（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞のアネルギー及びアポトーシスを誘導することなく特異的γδＴ細胞増殖を誘発するのを支援するコンパニオン共刺激剤を同定することができる。これらの共刺激剤は、γδ細胞上に発現する受容体に対するリガンド、例えば、以下のうちの１つ以上に対するリガンド（複数可）を含み得る：ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６１、ＣＤ７０、ＪＡＭＬ、ＤＮＡＸ、ＣＤ８１補助分子−１（ＤＮＡＭ−１）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１９６、ＣＤ１３７、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ１２２、ＤＡＰ、及びＣＤ２８。いくつかの態様では、共刺激剤は、ＣＤ２及びＣＤ３分子上の独特のエピトープに対する特異的抗体であり得る。ＣＤ２及びＣＤ３は、αβまたはγδＴ細胞（複数可）上で発現する場合に異なる配座構造を有し得、いくつかの事例では、ＣＤ３及びＣＤ２に対する特異的抗体はγδＴ細胞の選択的活性化をもたらすことができる。
【０１３６】
γδＴ細胞（複数可）の集団を、γδＴ細胞（複数可）の操作に先立って生体外で増殖させてもよい。γδＴ細胞集団の試験管内での増殖を促進するために使用することができる試薬の非限定的な例としては、抗ＣＤ３または抗ＣＤ２、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ７０、抗ＯＸ４０抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２１、ＩＬ２３、ＩＬ−３３、ＩＦＮγ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）、コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ポークウィード（ＰＷＭ）、ピーナッツ凝集素タンパク質（ＰＮＡ）、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）、Ｌｅｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ凝集素（ＬＣＡ）、Ｐｉｓｕｍ  Ｓａｔｉｖｕｍ凝集素（ＰＳＡ）、Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ凝集素（ＨＰＡ）、Ｖｉｃｉａ  ｇｒａｍｉｎｅａレクチン（ＶＧＡ）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  Ｖｕｌｇａｒｉｓエリスロアグルチニン（ＰＨＡ−Ｅ）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  Ｖｕｌｇａｒｉｓロイコアグルチニン（ＰＨＡ−Ｌ）、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａレクチン（ＳＮＡ、ＥＢＬ）、Ｍａａｃｋｉａ  Ａｍｕｒｅｎｓｉｓ，レクチンＩＩ（ＭＡＬ  ＩＩ）、Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ凝集素（ＳＪＡ）、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  Ｂｉｆｌｏｒｕｓ凝集素（ＤＢＡ）、Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ凝集素（ＬＣＡ）、Ｗｉｓｔｅｒｉａ  Ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａレクチン（ＷＦＡ、ＷＦＬ）、またはＴ細胞増殖を刺激することができる別の適切なマイトジェンが挙げられる。
【０１３７】
γδＴ細胞（複数可）の遺伝子操作は、αβＴＣＲや、γδＴＣＲや、抗体、その抗原結合断片またはリンパ球活性化ドメインをコードするＣＡＲなどの腫瘍認識部分を発現する構築物を、単離されたγδＴ細胞（複数可）のゲノムの中に安定的に組み込むことを含み得、Ｔ細胞の生体外及び生体内での増殖、生存及び機能を強化するサイトカイン（例えば、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−３３、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−２３またはＩＬ１β）を含み得る。単離されたγδＴ細胞の遺伝子操作はさらに、単離されたγδＴ細胞のゲノムの中の１つ以上の内在性遺伝子、例えばＭＨＣ遺伝子座（複数可）の遺伝子発現を欠失させるかまたは妨害することを含み得る。
【０１３８】
γδＴ細胞の生体外増殖
他の態様では、本開示は、養子移入療法のために非操作型及び操作型γδＴ細胞の集団を生体外で増殖させる方法を提供する。本開示の非操作型または操作型γδＴ細胞は、生体外で増殖させられ得る。本開示の非操作型または操作型γδＴ細胞は、ＡＰＣによる活性化を伴わずに、またはＡＰＣ及び／またはアミノホスホネートとの共培養を伴わずに、試験管内で増殖させられることができる。さらに、またはあるいは、本開示の非操作型または操作型γδＴ細胞は、ＡＰＣ及び／または１つ以上のアミノホスホネートによる活性化またはそれとの共培養を含む少なくとも１つの増殖ステップによって試験管内で増殖させられることができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本開示の非操作型または操作型γδＴ細胞は、第１γδＴ細胞増殖においてＡＰＣによる活性化を伴わずに試験管内で増殖させられることができ、その後、第２γδＴ細胞増殖においてＡＰＣによる活性化を伴って試験管内で増殖させられることができる。いくつかの事例では、第１γδＴ細胞増殖は、（ａ）γδＴ細胞を増殖させるか、または（ｂ）δ１ＴＣＲ；δ２ＴＣＲ；δ１及びδ４ＴＣＲ；もしくはδ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってそれぞれδ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ３Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；もしくはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つ以上の薬剤に、γδＴ細胞を接触させることを含む。
【０１４０】
いくつかの事例では、第２γδＴ細胞増殖は、第１γδＴ細胞増殖で使用される１つ以上の薬剤を含まない培養用培地中で実施される。いくつかの事例では、第２γδＴ細胞増殖は、（ａ）Ｔ細胞を増殖させるか、（ｂ）γδＴ細胞を増殖させるか、または（ｃ）δ１ＴＣＲ；δ２ＴＣＲ；δ１及びδ４ＴＣＲ；もしくはδ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってそれぞれδ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ３Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；もしくはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の第２薬剤を含有する培養用培地中で実施される。
【０１４１】
いくつかの事例では、第２薬剤は、第１γδＴ細胞増殖で使用される薬剤と比べて異なっている（例えば、異なる一次アミノ酸配列を有し、かつ／または構造的に異なるγδＴＣＲエピトープに結合する）。いくつかの事例では、第２薬剤は、第１γδＴ細胞増殖で使用される薬剤と重複するγδＴＣＲエピトープもしくは同じγδＴＣＲエピトープに結合するものであるか、またはγδＴＣＲへの結合を当該薬剤と競合することができるものである。いくつかの事例では、第２薬剤はＡＰＣの細胞表面に発現する。いくつかの事例では、第２薬剤は、例えば第２薬剤の定常領域とＡＰＣの表面上のＦｃ受容体との結合相互作用によって、ＡＰＣの表面に結合している。いくつかの事例では、第２薬剤は可溶性である。いくつかの事例では、第２γδＴ細胞増殖は、可溶性の第２薬剤とＡＰＣとを含有する培養用培地中で実施され、場合によってＡＰＣは、γδＴ細胞集団を増殖または選択的に増殖させる薬剤をその細胞表面上に発現するかまたはその表面に結合させる。
【０１４２】
いくつかの事例では、第１γδＴ細胞増殖は、ＡＰＣを伴わずに実施され、第２γδＴ細胞増殖は、ＡＰＣを伴って実施される。いくつかの事例では、第２γδＴ細胞増殖は、ＡＰＣと、（ａ）Ｔ細胞を増殖させるか、（ｂ）γδＴ細胞を増殖させるか、または（ｃ）δ１ＴＣＲ；δ２ＴＣＲ；δ１及びδ４ＴＣＲ；もしくはδ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってそれぞれδ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ３Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；もしくはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つ以上の第２薬剤とを使用して実施される。
【０１４３】
当業者であれば、特定の実施形態では本明細書に記載の第２増殖ステップの方法を第１増殖ステップとして実施してもよく、本明細書に記載の第１ステップの方法を第２増殖ステップとして実施してもよいということを理解するであろう。限定することなく一例を挙げると、いくつかの実施形態では、細胞の混合集団（例えばＰＢＭＣ）を、第１ステップにおいてＡＰＣと接触させることによって増殖させることができ、その後、例えばδ１ＴＣＲ；δ２ＴＣＲ；δ１及びδ４ＴＣＲ；またはδ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってそれぞれδ１Ｔ細胞；δ２Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ３Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞及びδ４Ｔ細胞；またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させる固定化薬剤に第１増殖ステップからの増殖済み集団を接触させることによって、ＡＰＣの非存在下で増殖させることができる。
【０１４４】
本発明の方法は、様々なγδＴ細胞（複数可）集団、例えば、Ｖγ１＋、Ｖγ２＋またはＶγ３＋  γδＴ細胞集団を増殖させることができる。いくつかの事例では、本発明の方法は、Ｖδ１＋Ｔ細胞集団；Ｖδ１＋及びＶδ３＋Ｔ細胞集団；Ｖδ１＋及びＶδ４＋Ｔ細胞集団；Ｖδ１＋及びＶδ２＋Ｔ細胞集団；またはＶδ１＋、Ｖδ３＋、Ｖδ４＋及びＶδ５＋Ｔ細胞集団を増殖させることができる。
【０１４５】
ある場合には、γδＴ細胞集団を３６日未満、３５日未満、３４日未満、３３日未満、３２日未満、３１日未満、３０日未満、２９日未満、２８日未満、２７日未満、２６日未満、２５日未満、２４日未満、２３日未満、２２日未満、２１日未満、２０日未満、１９日未満、１８日未満、１７日未満、１６日未満、１５日未満、１４日未満、１３日未満、１２日未満、１１日未満、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満または３日未満の間、試験管内で増殖させることができる
【０１４６】
いくつかの態様では、混合細胞集団からのγδＴ細胞を活性化剤と接触させることによって操作型及び非操作型γδＴ細胞を含めた様々なγδＴ細胞を選択的に増殖させる方法が提供される。いくつかの事例では、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）または活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）剤は、γδＴ細胞の細胞表面受容体上の特有のエピトープに結合する。活性化剤は、抗体、例えばモノクローナル抗体であり得る。活性化剤は、１種類以上のγδＴ細胞、例えば、δ１、δ２、δ１及びδ３、またはδ１及びδ４細胞集団の成長を特異的に活性化させることができる。いくつかの実施形態では、活性化剤はδ１細胞集団の成長を特異的に活性化させて濃縮δ１Ｔ細胞集団をもたらす。他の事例では、活性化剤はδ２細胞集団の成長を特異的に活性化させて濃縮δ２Ｔ細胞集団をもたらす。
【０１４７】
活性化剤は、操作型及び非操作型γδＴ細胞の増殖を速い成長速度で刺激し得る。例えば、薬剤は、３０時間未満に１回の細胞分裂、２９時間未満に１回の細胞分裂、２８時間未満に１回の細胞分裂、２７時間未満に１回の細胞分裂、２６時間未満に１回の細胞分裂、２５時間未満に１回の細胞分裂、２４時間未満に１回の細胞分裂、２３時間未満に１回の細胞分裂、２２時間未満に１回の細胞分裂、２１時間未満に１回の細胞分裂、２０時間未満に１回の細胞分裂、１９時間未満に１回の細胞分裂、１８時間未満に１回の細胞分裂、１７時間未満に１回の細胞分裂、１６時間未満に１回の細胞分裂、１５時間未満に１回の細胞分裂、１４時間未満に１回の細胞分裂、１３時間未満に１回の細胞分裂、１２時間未満に１回の細胞分裂、１１時間未満に１回の細胞分裂、１０時間未満に１回の細胞分裂、９時間未満に１回の細胞分裂、８時間未満に１回の細胞分裂、７時間未満に１回の細胞分裂、６時間未満に１回の細胞分裂、５時間未満に１回の細胞分裂、４時間未満に１回の細胞分裂、３時間未満に１回の細胞分裂、２時間未満に１回の細胞分裂の平均速度でγδＴ細胞集団の増殖を刺激する。
【０１４８】
いくつかの事例では、活性化剤は、約４時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約５時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約６時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約７時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約８時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約９時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１０時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１１時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１２時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１３時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１４時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１５時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１６時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１７時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１８時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１９時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２０時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２１時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２２時間ごとに約１回の分裂の速度、約２３時間ごとに約１回の分裂の速度、約２４時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２５時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２６時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２７時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２８時間ごとに約１回の分裂の速度、約２９時間ごとに約１回の分裂の速度、約３０時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約３１時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約３２時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約３３時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約３４時間ごとに約１回の分裂の速度、約３５時間ごとに約１回の分裂の速度、約３６時間ごとに約１回の分裂の平均速度で操作型及び非操作型γδＴ細胞の増殖を刺激し得る。
【０１４９】
いくつかの事例では、活性化剤はγδＴ細胞増殖培養物における操作型及び／または非操作型γδＴ細胞の急速な増殖を刺激し得、当該急速な増殖は、細胞分裂の上記平均速度のいずれか１つで約１連続日〜約１９連続日、約１連続日〜約１４連続日、約１連続日〜約７連続日、約１連続日〜約５連続日、約２連続日〜約１９連続日、約２連続日〜約１４連続日、約２連続日〜約７連続日、約２連続日〜約５連続日、約４連続日〜約１９連続日、約４連続日〜約１４連続日、約４連続日〜約７連続日、または約４連続日〜約５連続日にわたって維持されるものである。
【０１５０】
いくつかの事例では、活性化剤は、約２連続日〜約７連続日、または約２〜約５連続日にわたって維持されているγδＴ細胞増殖培養物において約１２時間（例えば１０〜１２時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１３時間（例えば１０〜１３時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１４時間（例えば１０〜１４時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１５時間（例えば１０〜１５時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１６時間（例えば１０〜１６時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１７時間（例えば１０〜１７時間または１２〜１７時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１８時間（例えば１０〜１８時間または１２〜１８時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１９時間（例えば１０〜１９時間または１２〜１９時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２０時間（例えば、１２〜２０時間、１６〜２０時間または１８〜２０時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２１時間（例えば、１２〜２１時間、１６〜２１時間または１８〜２１時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２２時間（例えば、１２〜２２時間、１６〜２２時間または１８〜２２時間）ごとに約１回の分裂の速度、約２３時間以下（例えば、１２〜２３時間、１６〜２３時間または１８〜２３時間）ごとに約１回の分裂の速度、約２４時間（例えば、１２〜２４時間、１６〜２４時間または１８〜２４時間）ごとに約１回の分裂の平均速度で操作型及び／または非操作型γδＴ細胞の増殖を刺激し得る。
【０１５１】
いくつかの事例では、活性化剤は、約２連続日〜約７連続日、または約２〜約５連続日にわたって維持されているγδＴ細胞増殖培養物において約２５時間（例えば、１２〜２５時間、１６〜２５時間、１８〜２５時間または２０〜２５時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２６時間（例えば、１２〜２６時間、１６〜２６時間、１８〜２６時間または２０〜２６時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２７時間（例えば、１２〜２７時間、１６〜２７時間、１８〜２７時間または２０〜２７時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２８時間（例えば、１２〜２８時間、１６〜２８時間、１８〜２８時間、２０〜２８時間または２２〜２８時間）ごとに約１回の分裂の速度、約２９時間（例えば、１６〜２９時間、１８〜２９時間、２０〜２９時間または２２〜２９時間）ごとに約１回の分裂の速度、約３０時間（例えば、１６〜３０時間、１８〜３０時間、２０〜３０時間または２２〜３０時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約３１時間（例えば、１６〜３１時間、１８〜３１時間、２０〜３１時間、２２〜３１時間または２４〜３１時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約３２時間（例えば、１８〜３２時間、２０〜３２時間、２２〜３２時間または２４〜３２時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約３３時間（例えば、１８〜３３時間、２０〜３３時間、２２〜３３時間または２４〜３３時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約３４時間（例えば、１８〜３４時間、２０〜３４時間、２２〜３４時間または２４〜３４時間）ごとに約１回の分裂の速度、約３５時間（例えば、１８〜３５時間、２０〜３５時間、２２〜３５時間または２４〜３５時間）ごとに約１回の分裂の速度、約３６時間（例えば、１８〜３６時間、２０〜３６時間、２２〜３６時間または２４〜３６時間）ごとに約１回の分裂の平均速度で操作型及び／または非操作型γδＴ細胞の増殖を刺激し得る。
【０１５２】
いくつかの事例では、活性化剤は、少なくとも１４連続日にわたって維持されているγδＴ細胞増殖培養物において約１２時間（例えば１０〜１２時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１３時間（例えば１０〜１３時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１４時間（例えば１０〜１４時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１５時間（例えば１０〜１５時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１６時間（例えば１０〜１６時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１７時間（例えば１０〜１７時間または１２〜１７時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１８時間（例えば１０〜１８時間または１２〜１８時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１９時間（例えば１０〜１９時間または１２〜１９時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２０時間（例えば、１２〜２０時間、１６〜２０時間または１８〜２０時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２１時間（例えば、１２〜２１時間、１６〜２１時間または１８〜２１時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２２時間（例えば、１２〜２２時間、１６〜２２時間または１８〜２２時間）ごとに約１回の分裂の速度、約２３時間以下（例えば、１２〜２３時間、１６〜２３時間または１８〜２３時間）ごとに約１回の分裂の速度、約２４時間（例えば、１２〜２４時間、１６〜２４時間または１８〜２４時間）ごとに約１回の分裂の平均速度で操作型及び／または非操作型γδＴ細胞の増殖を刺激し得る。
【０１５３】
いくつかの事例では、活性化剤は、少なくとも１４連続日にわたって維持されているγδＴ細胞増殖培養物において約２５時間（例えば、１２〜２５時間、１６〜２５時間、１８〜２５時間または２０〜２５時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２６時間（例えば、１２〜２６時間、１６〜２６時間、１８〜２６時間または２０〜２６時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２７時間（例えば、１２〜２７時間、１６〜２７時間、１８〜２７時間または２０〜２７時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２８時間（例えば、１２〜２８時間、１６〜２８時間、１８〜２８時間、２０〜２８時間または２２〜２８時間）ごとに約１回の分裂の速度、約２９時間（例えば、１６〜２９時間、１８〜２９時間、２０〜２９時間または２２〜２９時間）ごとに約１回の分裂の速度、約３０時間（例えば、１６〜３０時間、１８〜３０時間、２０〜３０時間または２２〜３０時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約３１時間（例えば、１６〜３１時間、１８〜３１時間、２０〜３１時間、２２〜３１時間または２４〜３１時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約３２時間（例えば、１８〜３２時間、２０〜３２時間、２２〜３２時間または２４〜３２時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約３３時間（例えば、１８〜３３時間、２０〜３３時間、２２〜３３時間または２４〜３３時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約３４時間（例えば、１８〜３４時間、２０〜３４時間、２２〜３４時間または２４〜３４時間）ごとに約１回の分裂の速度、約３５時間（例えば、１８〜３５時間、２０〜３５時間、２２〜３５時間または２４〜３５時間）ごとに約１回の分裂の速度、約３６時間（例えば、１８〜３６時間、２０〜３６時間、２２〜３６時間または２４〜３６時間）ごとに約１回の分裂の平均速度で操作型及び／または非操作型γδＴ細胞の増殖を刺激し得る。
【０１５４】
いくつかの事例では、活性化剤は、少なくとも１９連続日にわたって維持されているγδＴ細胞増殖培養物において約１２時間（例えば１０〜１２時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１３時間（例えば１０〜１３時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１４時間（例えば１０〜１４時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１５時間（例えば１０〜１５時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１６時間（例えば１０〜１６時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１７時間（例えば１０〜１７時間または１２〜１７時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１８時間（例えば１０〜１８時間または１２〜１８時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約１９時間（例えば１０〜１９時間または１２〜１９時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２０時間（例えば、１２〜２０時間、１６〜２０時間または１８〜２０時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２１時間（例えば、１２〜２１時間、１６〜２１時間または１８〜２１時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２２時間（例えば、１２〜２２時間、１６〜２２時間または１８〜２２時間）ごとに約１回の分裂の速度、約２３時間以下（例えば、１２〜２３時間、１６〜２３時間または１８〜２３時間）ごとに約１回の分裂の速度、約２４時間（例えば、１２〜２４時間、１６〜２４時間または１８〜２４時間）ごとに約１回の分裂の平均速度で操作型及び／または非操作型γδＴ細胞の増殖を刺激し得る。
【０１５５】
いくつかの事例では、活性化剤は、少なくとも１９連続日にわたって維持されているγδＴ細胞増殖培養物において約２５時間（例えば、１２〜２５時間、１６〜２５時間、１８〜２５時間または２０〜２５時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２６時間（例えば、１２〜２６時間、１６〜２６時間、１８〜２６時間または２０〜２６時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２７時間（例えば、１２〜２７時間、１６〜２７時間、１８〜２７時間または２０〜２７時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約２８時間（例えば、１２〜２８時間、１６〜２８時間、１８〜２８時間、２０〜２８時間または２２〜２８時間）ごとに約１回の分裂の速度、約２９時間（例えば、１６〜２９時間、１８〜２９時間、２０〜２９時間または２２〜２９時間）ごとに約１回の分裂の速度、約３０時間（例えば、１６〜３０時間、１８〜３０時間、２０〜３０時間または２２〜３０時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約３１時間（例えば、１６〜３１時間、１８〜３１時間、２０〜３１時間、２２〜３１時間または２４〜３１時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約３２時間（例えば、１８〜３２時間、２０〜３２時間、２２〜３２時間または２４〜３２時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約３３時間（例えば、１８〜３３時間、２０〜３３時間、２２〜３３時間または２４〜３３時間）ごとに約１回の分裂の平均速度、約３４時間（例えば、１８〜３４時間、２０〜３４時間、２２〜３４時間または２４〜３４時間）ごとに約１回の分裂の速度、約３５時間（例えば、１８〜３５時間、２０〜３５時間、２２〜３５時間または２４〜３５時間）ごとに約１回の分裂の速度、約３６時間（例えば、１８〜３６時間、２０〜３６時間、２２〜３６時間または２４〜３６時間）ごとに約１回の分裂の平均速度で操作型及び／または非操作型γδＴ細胞の増殖を刺激し得る。
【０１５６】
活性化剤は、操作型または非操作型γδＴ細胞の亜集団の増殖を様々な成長速度で刺激し得る。例えば、薬剤はδ１細胞集団の成長を、１日〜９０日の培養（例えば、約１日〜約１９、２１または２３日の培養）の期間にわたる増殖が別のγδＴ細胞集団、例えばδ２またはδ３集団よりも；増殖前のγδＴ細胞の開始時個数よりも；増殖前のγδ１Ｔ細胞の開始時個数よりも；または培養物中のαβＴ細胞集団よりも約１０倍超、約１００倍超、約２００倍超、約３００倍超、約４００倍超、約５００倍超、約６００倍超、約７００倍超、約８００倍超、約９００倍超、約１，０００倍超、約１０，０００倍超、約２０，０００倍超、約３０，０００倍超、約５０，０００倍超、約７０，０００倍超、約１００，０００倍超または約１，０００，０００倍超だけ大きい増殖をもたらすようなより速い速度で刺激し得る。
【０１５７】
他の事例では、薬剤はδ１及びδ４集団の成長を、１日〜９０日の培養（例えば、約１日〜約１９、２１または２３日の培養）の期間にわたる増殖がδ２Ｔ細胞集団よりも；別のγδＴ細胞亜集団よりも；増殖前のγδＴ細胞の開始時個数よりも；増殖前のγδ１Ｔ細胞の開始時個数よりも；増殖前のγδ１及びγδ３Ｔ細胞の開始時個数よりも；または培養物中のαβＴ細胞集団よりも１０倍超、１００倍超、２００倍超、３００倍超、４００倍超、５００倍超、６００倍超、７００倍超、８００倍超、９００倍超、１，０００倍超、１０，０００倍超、２０，０００倍超、３０，０００倍超、５０，０００倍超、７０，０００倍超、１００，０００倍超または１，０００，０００倍超だけ大きい増殖をもたらすようなより速い速度で刺激し得る。
【０１５８】
他の事例では、薬剤はδ１及びδ４集団の成長を、１日〜９０日の培養（例えば、約１日〜約１９、２１または２３日の培養）の期間にわたる増殖がδ２Ｔ細胞集団よりも；別のγδＴ細胞亜集団よりも；増殖前のγδＴ細胞の開始時個数よりも；増殖前のγδ１Ｔ細胞の開始時個数よりも；増殖前のγδ１及びγδ４Ｔ細胞の開始時個数よりも；または培養物中のαβＴ細胞集団よりも１０倍超、１００倍超、２００倍超、３００倍超、４００倍超、５００倍超、６００倍超、７００倍超、８００倍超、９００倍超、１，０００倍超、１０，０００倍超、２０，０００倍超、３０，０００倍超、５０，０００倍超、７０，０００倍超、１００，０００倍超または１，０００，０００倍超だけ大きい増殖をもたらすようなより速い速度で刺激し得る。
【０１５９】
他の事例では、薬剤はδ１、δ３、δ４及びδ５集団の成長を、１日〜９０日の培養（例えば、約１日〜約１９、２１または２３日の培養）の期間にわたる増殖がδ２Ｔ細胞集団よりも；別のγδＴ細胞亜集団よりも；増殖前のγδＴ細胞の開始時個数よりも；増殖前のγδ１Ｔ細胞の開始時個数よりも；増殖前のγδ１及びγδ３Ｔ細胞の開始時個数よりも；増殖前のγδ１、γδ３、γδ４及びγδ５Ｔ細胞の開始時個数よりも；または培養物中のαβＴ細胞集団よりも１０倍超、１００倍超、２００倍超、３００倍超、４００倍超、５００倍超、６００倍超、７００倍超、８００倍超、９００倍超、１，０００倍超、１０，０００倍超、２０，０００倍超、３０，０００倍超、５０，０００倍超、７０，０００倍超、１００，０００倍超または１，０００，０００倍超だけ大きい増殖をもたらすようなより速い速度で刺激し得る。
【０１６０】
他の事例では、薬剤はδ２集団の成長を、１日〜９０日の培養（例えば、約１日〜約１９、２１または２３日の培養）の期間にわたる増殖がδ１Ｔ細胞集団よりも；δ３Ｔ細胞集団よりも；別のγδＴ細胞亜集団よりも；増殖前のγδＴ細胞の開始時個数よりも、増殖前のγδ２Ｔ細胞の開始時個数よりも、またはαβＴ細胞よりも１０倍超、１００倍超、２００倍超、３００倍超、４００倍超、５００倍超、６００倍超、７００倍超、８００倍超、９００倍超、１，０００倍超、１０，０００倍超、２０，０００倍超、３０，０００倍超、５０，０００倍超、７０，０００倍超、１００，０００倍超または１，０００，０００倍超だけ大きい増殖をもたらすようなより速い速度で刺激し得る。
【０１６１】
いくつかの態様では、本開示は、急速な速度、例えば、３０時間ごとに約１回の細胞分裂、またはそれより速い速度でγδＴ細胞集団の増殖を刺激する薬剤に接触している操作型または非操作型γδＴ細胞集団を提供する。いくつかの事例では、薬剤は、δ１；δ２；δ１及びδ４；またはδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞のいずれかの増殖を選択的に刺激する。γδＴ細胞集団は、ある量の非操作型γδＴ細胞及びある量の操作型γδＴ細胞を含み得る。いくつかの事例では、γδＴ細胞集団は、δ１、δ２、δ３及びδ４Ｔ細胞を異なる百分率で含む。操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、例えば、９０％未満のδ１Ｔ細胞、８０％未満のδ１Ｔ細胞、７０％未満のδ１Ｔ細胞、６０％未満のδ１Ｔ細胞、５０％未満のδ１Ｔ細胞、４０％未満のδ１Ｔ細胞、３０％未満のδ１Ｔ細胞、２０％未満のδ１Ｔ細胞、１０％未満のδ１Ｔ細胞または５％未満のδ１Ｔ細胞を含み得る。あるいは、操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、５％超のδ１Ｔ細胞、１０％超のδ１Ｔ細胞、２０％超のδ１Ｔ細胞、３０％超のδ１Ｔ細胞、４０％超のδ１Ｔ細胞、５０％超のδ１Ｔ細胞、６０％超のδ１Ｔ細胞、７０％超のδ１Ｔ細胞、８０％超のδ１Ｔ細胞または９０％超のδ１Ｔ細胞を含み得る。いくつかの事例では、薬剤は、本明細書に記載の選択的増殖剤のうちの１つである。いくつかの事例では、薬剤は、細胞培養表面またはＡＰＣの表面などの表面に固定されている（例えば、ＡＰＣの表面に発現しているかまたは、ＡＰＣの表面に発現したＦｃ受容体と結合している）。
【０１６２】
操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、例えば、９０％未満のδ２Ｔ細胞、８０％未満のδ２Ｔ細胞、７０％未満のδ２Ｔ細胞、６０％未満のδ２Ｔ細胞、５０％未満のδ２Ｔ細胞、４０％未満のδ２Ｔ細胞、３０％未満のδ２Ｔ細胞、２０％未満のδ２Ｔ細胞、１０％未満のδ２Ｔ細胞または５％未満のδ２Ｔ細胞を含み得る。あるいは、操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、５％超のδ２Ｔ細胞、１０％超のδ２Ｔ細胞、２０％超のδ２Ｔ細胞、３０％超のδ２Ｔ細胞、４０％超のδ２Ｔ細胞、５０％超のδ２Ｔ細胞、６０％超のδ２Ｔ細胞、７０％超のδ２Ｔ細胞、８０％超のδ２Ｔ細胞または９０％超のδ２Ｔ細胞を含み得る。
【０１６３】
操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、例えば、９０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、８０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、７０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、６０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、５０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、４０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、３０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、２０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、１０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、または５％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞を含み得る。あるいは、操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、５％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、１０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、２０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、３０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、４０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、５０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、６０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、７０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、８０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、または９０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞を含み得る。
【０１６４】
操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、例えば、９０％未満のδ４Ｔ細胞、８０％未満のδ４Ｔ細胞、７０％未満のδ４Ｔ細胞、６０％未満のδ４Ｔ細胞、５０％未満のδ４Ｔ細胞、４０％未満のδ４Ｔ細胞、３０％未満のδ４Ｔ細胞、２０％未満のδ４Ｔ細胞、１０％未満のδ４Ｔ細胞または５％未満のδ４Ｔ細胞を含み得る。あるいは、操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、５％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、１０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、２０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、３０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、４０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、５０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、６０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、７０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、８０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、または９０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞を含み得る。操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、例えば、９０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、８０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、７０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、６０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、５０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、４０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、３０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、２０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、１０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、または５％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞を含み得る。
【０１６５】
特定の実施形態では、本発明は、１０〜９０％のδ１Ｔ細胞及び９０〜１０％のδ２Ｔ細胞を含む増殖済みγδＴ細胞集団の混合物を提供する。特定の実施形態では、本発明は、１０〜９０％のδ１及びδ３Ｔ細胞ならびに９０〜１０％のδ２Ｔ細胞を含む増殖済みγδＴ細胞集団の混合物を提供する。特定の実施形態では、本発明は、１０〜９０％のδ１及びδ４Ｔ細胞ならびに９０〜１０％のδ２Ｔ細胞を含む増殖済みγδＴ細胞集団の混合物を提供する。特定の実施形態では、本発明は、１０〜９０％のδ１、δ３、δ４及びδ５Ｔ細胞ならびに９０〜１０％のδ２Ｔ細胞を含む増殖済みγδＴ細胞集団の混合物を提供する。
【０１６６】
１つ以上の活性化剤がγδＴ細胞（例えば、活性化物質γδＴ細胞天然受容体）に接触し得、その後、共刺激分子がγδＴ細胞に接触してさらなる刺激を提供し得、かつγδＴ細胞を増殖させ得る。いくつかの実施形態では、活性化剤及び／または共刺激剤は、植物及び非植物に由来するレクチン、γδＴ細胞を活性化させるモノクローナル抗体、及びその他の非レクチン／非抗体剤であり得る。他の事例では植物レクチンはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）であり得るが、他の植物レクチンなどが使用されてもよい。レクチンの他の例としては、ピーナッツ凝集素タンパク質（ＰＮＡ）、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）、ｌｅｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ凝集素（ＬＣＡ）、ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ凝集素（ＰＳＡ）、Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ凝集素（ＨＰＡ）、Ｖｉｃｉａ  ｇｒａｍｉｎｅａレクチン（ＶＧＡ）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  Ｖｕｌｇａｒｉｓエリスロアグルチニン（ＰＨＡ−Ｅ）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  Ｖｕｌｇａｒｉｓロイコアグルチニン（ＰＨＡ−Ｌ）、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａレクチン（ＳＮＡ、ＥＢＬ）、Ｍａａｃｋｉａ  Ａｍｕｒｅｎｓｉｓ，レクチンＩＩ（ＭＡＬ  ＩＩ）、Ｓｏｐｈｏｒａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ凝集素（ＳＪＡ）、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  Ｂｉｆｌｏｒｕｓ凝集素（ＤＢＡ）、Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ凝集素（ＬＣＡ）、Ｗｉｓｔｅｒｉａ  Ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａレクチン（ＷＦＡ、ＷＦＬ）が挙げられる。
【０１６７】
活性化剤及び共刺激分子の非限定的な例としては、本明細書に記載のδもしくはγ鎖またはそれらのサブタイプに対して選択的である任意の１つ以上の抗体、５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、Ｂ３、ＴＳ−１、γ３．２０、７Ａ５、ＩＭＭＵ５１０、Ｒ９．１２、１１Ｆ２などの抗体、またはそれらの組み合わせが挙げられる。活性化剤及び共刺激分子の他の例としては、ゾレドロネート、ホルボール  １２−ミリステート−１３−アセテート（ＴＰＡ）、メゼレイン、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、連鎖球菌プロテインＡまたはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１６８】
他の事例では、活性化剤及び／または共刺激剤は、αＴＣＲ、βＴＣＲ、γＴＣＲ、δＴＣＲ、ＣＤ２７７、ＣＤ２８、ＣＤ４６、ＣＤ８１、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、ＣＤ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＨＶＥＭ、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ、ＣＤ１２２、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１、ＣＤ１６、ＣＤ１６１、ＤＮＡＸ、補助分子−１（ＤＮＡＭ−１）、１つ以上のＮＣＲ（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６）、ＳＬＡＭ、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体、またはそれらの組み合わせに対する抗体またはリガンドであり得る。
【０１６９】
操作型γδＴ細胞
操作型γδＴ細胞（例えば図１参照）は、当技術分野で知られている様々な方法によって生成され得る。操作型γδＴ細胞は、特定の腫瘍認識部分を安定的に発現するように設計され得る。腫瘍認識部分または別のタイプの認識部分を含む発現カセットをコードするポリヌクレオチドは、トランスポゾン／トランスポゼース系またはウイルスに基づく遺伝子移入系、例えばレンチウイルスもしくはレトロウイルス系、または別の適切な方法、例えばトランスフェクション、電気穿孔、形質導入、リポフェクション、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）、ナノ操作型物質、例えばＯｒｍｏｓｉｌ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスを含めたウイルス送達方法、または別の適切な方法によってγδＴ細胞内へ安定的に導入され得る。αβかγδかのどちらかである抗原特異的ＴＣＲは、抗原特異的ＴＣＲの遺伝コードを含むポリヌクレオチドをγδＴ細胞のゲノムの中に安定的に挿入することによって操作型γδＴ細胞内に導入されることができる。腫瘍認識部分を有するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドをγδＴ細胞のゲノムの中に安定的に挿入することによって操作型γδＴ細胞内に導入され得る。いくつかの事例では、操作された腫瘍認識部分は操作型Ｔ細胞受容体であり、操作型γδＴ細胞のゲノムの中に組み込まれる発現カセットは、操作されたＴＣＲα（ＴＣＲアルファ）遺伝子、操作されたＴＣＲβ（ＴＣＲベータ）遺伝子、ＴＣＲδ（ＴＣＲデルタ）遺伝子または操作されたＴＣＲγ（ＴＣＲガンマ）遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞のゲノムの中に組み込まれる発現カセットは、抗体断片またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの事例では、抗体断片またはその抗原結合断片は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物の、またはＣＡＲとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とを含んでいるかもしくは異なる抗原を指向する抗体を有するＣＡＲを含んでいる二重特異性構築物の一部として、細胞表面腫瘍抗原に結合する、全抗体、抗体断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｃ、抗体上の軽鎖もしくは重鎖、抗体の可変もしくは定常領域、またはそれらの任意の組み合わせをコードする、ポリヌクレオチドである。いくつかの事例では、ポリヌクレオチドは、ヒトに由来するかまたは別の種に由来する。非ヒト種に由来する抗体断片または抗原結合断片のポリヌクレオチドは、ヒトにおいて天然に産生する抗体変異型とそれらとの類似性を向上させるように改変されることができ、抗体断片または抗原結合断片は、部分的または完全にヒト化されることができる。抗体断片または抗原結合断片のポリヌクレオチドは、キメラ、例えばマウス−ヒト抗体キメラであることもできる。ＣＡＲを発現する操作型γδＴ細胞は、腫瘍認識部分によって認識される抗原に対するリガンドを発現するように操作されることもできる。
【０１７０】
当技術分野で知られている様々な技術を使用して、腫瘍認識部分の遺伝コードを含んでいるクローニングされたかまたは合成的に操作された核酸を操作型γδＴ細胞のゲノム内の特定位置に導入することができる。ＷＯ２０１４０９３７０、ＷＯ２００３０８７３４１、ＷＯ２０１４１３４４１２及びＷＯ２０１１０９０８０４（参照によりそれらの各々の全体を本明細書に援用する）にそれぞれ記載されている、微生物の規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）システムからのＲＮＡガイドＣａｓ９ヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びメガヌクレアーゼの技術を用いてγδＴ細胞（複数可）における効率的なゲノム操作をもたらすことができる。本明細書に記載の技術は、ある遺伝子のノックアウトと別の遺伝子のノックインとを同時にもたらすゲノム位置への発現カセットの挿入のために用いられることもできる。例えば、ＭＨＣ遺伝子をコードするゲノム領域内に、本開示の発現カセットを含むポリヌクレオチドを挿入することができる。そのような操作は、１つ以上の遺伝子、例えば発現カセット内に含まれている遺伝子のノックインと、別の遺伝子、例えばＭＨＣ遺伝子座のノックアウトとを同時にもたらすことができる。
【０１７１】
１つの事例では、腫瘍認識部分をコードする核酸を含むＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを、操作されようとしているγδＴ細胞の細胞内に導入する。野生型Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙと比較して強化された組込みを提供する突然変異体Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゼース、例えばＵＳ７，９８５，７３９（参照によりその全体を本明細書に援用する）に記載されているトランスポゼースを使用してポリヌクレオチドを操作型γδＴ細胞に導入してもよい。
【０１７２】
いくつかの事例では、ウイルスによる方法を用いて操作型γδＴ細胞のゲノムの中に、腫瘍認識部分を含むポリヌクレオチドを導入する。ウイルスによる多くの方法、例えばＷＯ１９９３０２０２２１（参照によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法がヒト遺伝子療法のために使用されている。γδＴ細胞を操作するために用いることができる、ウイルスによる方法の非限定的な例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスまたはアデノウイルス随伴ウイルスによる方法が挙げられる。
【０１７３】
腫瘍認識部分の遺伝コードを含有するポリヌクレオチドは、操作型γδＴ細胞の成長、増殖、活性化状態に影響を与える突然変異もしくはその他の導入遺伝子、または精巣特異的がん抗原などの腫瘍細胞特異的な抗原を含み得る。本開示のγδＴ細胞は、抗原認識部分に繋げられた活性化ドメイン、例えば、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体中の分子、または共刺激因子を含んでいるポリヌクレオチドを発現するように操作され得る。操作型γδＴ細胞は、Ｔリンパ球活性化ドメインである細胞内シグナル伝達ドメインを発現することができる。γδＴ細胞は、細胞内活性化ドメイン遺伝子または細胞内シグナル伝達ドメインを発現するように操作され得る。細胞内シグナル伝達ドメイン遺伝子は、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ４、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＬ−２ＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ分子、ＣＤ７０、サイトカイン受容体、ＣＤ４０、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞は、サイトカイン、抗原、細胞受容体、または他の免疫調節分子を発現するようにさらに操作される。
【０１７４】
操作型γδＴ細胞で発現させる適切な腫瘍認識部分は、処置すべき疾患に基づいて選択することができる。例えば、いくつかの事例では、腫瘍認識部分はＴＣＲである。いくつかの事例では、腫瘍認識部分は、がん細胞上に発現するリガンドに対する受容体である。適切な受容体の非限定的な例としては、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ−１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６及びＮＫｐ８０が挙げられる。いくつかの事例では、腫瘍認識部分は、リガンド、例えばＩＬ−１３リガンド、または腫瘍抗原に対するリガンド模倣体、例えばＩＬ１３Ｒに対するＩＬ−１３模倣体を含むことができる。
【０１７５】
γδＴ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ−１、または抗腫瘍抗体、例えば抗Ｈｅｒ２ｎｅｕもしくは抗ＥＧＦＲに由来するリガンド結合ドメインと、ＣＤ３−ζ、Ｄａｐ１０、Ｄａｐ１２、ＣＤ２８、４１ＢＢ及びＣＤ４０Ｌから得られるシグナル伝達ドメインとを含むキメラ腫瘍認識部分を発現するように操作され得る。いくつかの例では、キメラ受容体は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソテリン、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＰＳＡ、ＲＯＮ、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＡ６、ＧＤ２、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＣＳ１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＰＬＩＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ−１、糖脂質Ｆ７７、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、ＣＤ４４ｖ６、ＰＶＲＬ−４、ＶＥＧＦＲ２、Ｃ４．４ａ、ＰＳＣＡ、葉酸結合タンパク質／受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−３Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＳＬＴＲＫ６、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ−１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＭＡＧＥＡファミリー遺伝子（例えば、ＭＡＧＥＡ３．ＭＡＧＥＡ４）、ＫＫＬＣ１、突然変異型ｒａｓ（Ｈ、Ｎ、Ｋ）、ＢＲａｆ、ｐ５３、β−カテニン、ＥＧＦＲＴ７９０、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ（ＭＩＣＡ）もしくはＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ｂ（ＭＩＣＢ）、またはＨＰＶ、ＣＭＶもしくはＥＢＶの１つ以上の抗原に結合する。
【０１７６】
いくつかの事例では、腫瘍認識部分は、腫瘍関連ペプチドと複合体化したＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃ）を標的とする。ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した腫瘍関連ペプチドを標的とする腫瘍認識部分を生成及び使用するための方法及び組成物としては、例えば、Ｗｅｉｄａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３２８−４０，２０１１、Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．４（５）：６４７−８，２０１３、Ｃｈｅｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５（１７）：５３２３−３７，２００９、Ｄｏｈａｎ  ＆  Ｒｅｉｔｅｒ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１４：ｅ６，２０１２、Ｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３  Ｍａｒ  １３；５（１７６）：１７６ｒａ３３、Ｕ．Ｓ．９，５４０，４４８、及びＷＯ２０１７／０１１８０４に記載されているものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ペプチドＭＨＣ複合体の標的化腫瘍関連ペプチドは、ウィルムス腫瘍タンパク質１（ＷＴ１）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、サバイビン、マウス二重微小染色体２相同体（ＭＤＭ２）、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１Ｂ）、ＫＲＡＳまたはＢＲＡＦのペプチドである。
【０１７７】
遺伝学的に異なるか実質的に異なるかもしくは実質的に同一である、操作型γδＴ細胞から安定的に発現するαβＴＣＲポリヌクレオチドから、または操作型γδＴ細胞に安定的に組み込まれた遺伝学的に別個のαβＴＣＲポリヌクレオチドから、２つ以上の腫瘍認識部分をγδＴ細胞で発現させてもよい。遺伝学的に別個のαβＴＣＲ（複数可）の事例では、同じ症状に関連している異なる抗原を認識するαβＴＣＲ（複数可）を利用してもよい。１つの好ましい実施形態では、γδＴ細胞は、異なるＭＨＣハプロタイプとの関連において同じ抗原を認識する１つ以上の発現カセットから、ヒトまたはマウスを起源とする異なるＴＣＲを発現するように操作される。別の好ましい実施形態では、γδＴ細胞は、１つのＴＣＲと、異なるＭＨＣハプロタイプと複合体化している所与の抗原からの同じまたは異なるペプチドを指向する２つ以上の抗体とを発現するように操作される。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞による単一のＴＣＲの発現は、適切なＴＣＲ対合を促進する。異なるＴＣＲを発現する操作型γδＴ細胞は、普遍的な同種異系操作型γδＴ細胞を提供することができる。もう１つの好ましい実施形態では、γδＴ細胞は、ペプチド−ＭＨＣ複合体を指向する１つ以上の異なる抗体を発現するように操作され、各抗体は、同じまたは異なるＭＨＣハプロタイプと複合体化した同じまたは異なるペプチドを指向するものである。いくつかの事例では、腫瘍認識部分は、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体であり得る。
【０１７８】
γδＴ細胞は、異なるＭＨＣハプロタイプとの関連において同じ抗原を認識する１つ以上の発現カセットからのＴＣＲを発現するように操作され得る。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞は、操作型細胞内でのＴＣＲ誤対合の可能性を最小限に抑えるために、単一のＴＣＲまたは、ＣＡＲと組み合わせたＴＣＲを発現するように設計される。２つ以上の発現カセットから発現する腫瘍認識部分は、好ましくは、異なるポリヌクレオチド配列を有し、例えば異なるＨＬＡハプロタイプとの関連において同じ標的の異なるエピトープを認識する腫瘍認識部分をコードする。そのような異なるＴＣＲまたはＣＡＲを発現する操作型γδＴ細胞は、普遍的な同種異系操作型γδＴ細胞を提供することができる。
【０１７９】
いくつかの事例では、γδＴ細胞は、１つ以上の腫瘍認識部分を発現するように設計される。γδＴ細胞において操作された遺伝学的に同一または実質的に同一の抗原特異的キメラ（ＣＡＲ）ポリヌクレオチドから、２つ以上の腫瘍認識部分を発現させてもよい。γδＴ細胞において操作された遺伝学的に別個のＣＡＲポリヌクレオチドから２つ以上の腫瘍認識部分を発現させてもよい。遺伝学的に別個のＣＡＲ（複数可）は、同じ症状に関連している異なる抗原を認識するように設計されてもよい。
【０１８０】
γδＴ細胞は、あるいは二重特異性であってもよい。二重特異性操作型γδＴ細胞は、２つ以上の腫瘍認識部分を発現することができる。二重特異性操作型γδＴ細胞は、ＴＣＲ腫瘍認識部分とＣＡＲ腫瘍認識部分との両方を発現することができる。二重特異性操作型γδＴ細胞は、同じ症状に関連している異なる抗原を認識するように設計されることができる。操作型γδＴ細胞は、同一または実質的に同一の抗原を認識する２つ以上のＣＡＲ／ＴＣＲ（複数可）二重特異性ポリヌクレオチドを発現することができる。操作型γδＴ細胞は、別個の抗原を認識する２つ以上のＣＡＲ／ＴＣＲ（複数可）二重特異性構築物を発現することができる。いくつかの事例では、本開示の二重特異性構築物は、標的細胞の活性化及び不活性化ドメインに結合し、それにより、向上した標的特異性を提供する。γδＴ細胞は、少なくとも１個の腫瘍認識部分、少なくとも２個の腫瘍認識部分、少なくとも３個の腫瘍認識部分、少なくとも４個の腫瘍認識部分、少なくとも５個の腫瘍認識部分、少なくとも６個の腫瘍認識部分、少なくとも７個の腫瘍認識部分、少なくとも８個の腫瘍認識部分、少なくとも９個の腫瘍認識部分、少なくとも１０個の腫瘍認識部分、少なくとも１１個の腫瘍認識部分、少なくとも１２個の腫瘍認識部分、または別の適切な数の腫瘍認識部分を発現するように操作され得る。
【０１８１】
適切なＴＣＲ機能は、ＩＴＡＭモチーフを含む２つの機能性ζ（ゼータ）タンパク質によって強化され得る。適切なＴＣＲ機能は、αβまたはγδ活性化ドメイン、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＪＡＭＬ、ＰＤ−１、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４１−ＢＢ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４６、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＩＬ−２ＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ分子、及びＣＤ７０によっても強化され得る。発現したポリヌクレオチドは、腫瘍認識部分、リンカー部分及び活性化ドメインの遺伝コードを含み得る。操作型γδＴ細胞によるポリヌクレオチドの翻訳は、タンパク質リンカーによって繋ぎ合わされた腫瘍認識部分と活性化ドメインとを提供し得る。大抵、リンカーは、腫瘍認識部分及び活性化ドメイン折りたたみを妨げないアミノ酸を含む。リンカー分子は、長さが少なくとも約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、約１０アミノ酸、約１１アミノ酸、約１２アミノ酸、約１３アミノ酸、約１４アミノ酸、約１５アミノ酸、約１６アミノ酸、約１７アミノ酸、約１８アミノ酸、約１９アミノ酸または約２０アミノ酸であり得る。いくつかの事例では、リンカー中のアミノ酸のうち少なくとも５０％、少なくとも７０％または少なくとも９０％がセリンまたはグリシンである。
【０１８２】
いくつかの事例では、活性化ドメインは１つ以上の突然変異を含み得る。適する突然変異は、例えば、活性化ドメインを恒常的に活性にする突然変異であり得る。１つ以上の核酸の同一性を変更することは、翻訳されるアミノ酸のアミノ酸配列を変化させる。コードされるアミノ酸を極性、無極性、塩基性または酸性のアミノ酸に改変するような核酸突然変異をもたらすことができる。腫瘍からのエピトープを認識するように腫瘍認識部分を最適化するような核酸突然変異をもたらすことができる。操作された腫瘍認識部分、操作された活性化ドメイン、またはγδＴ細胞の別の操作された構成要素は、１個より多いアミノ酸突然変異、２個のアミノ酸突然変異、３個のアミノ酸突然変異、４個のアミノ酸突然変異、５個のアミノ酸突然変異、６個のアミノ酸突然変異、７個のアミノ酸突然変異、８個のアミノ酸突然変異、９個のアミノ酸突然変異、１０個のアミノ酸突然変異、１１個のアミノ酸突然変異、１２個のアミノ酸突然変異、１３個のアミノ酸突然変異、１４個のアミノ酸突然変異、１５個のアミノ酸突然変異、１６個のアミノ酸突然変異、１７個のアミノ酸突然変異、１８個のアミノ酸突然変異、１９個のアミノ酸突然変異、２０個のアミノ酸突然変異、２１個のアミノ酸突然変異、２２個のアミノ酸突然変異、２３個のアミノ酸突然変異、２４個のアミノ酸突然変異、２５個のアミノ酸突然変異、２６個のアミノ酸突然変異、２７個のアミノ酸突然変異、２８個のアミノ酸突然変異、２９個のアミノ酸突然変異、３０個のアミノ酸突然変異、３１個のアミノ酸突然変異、３２個のアミノ酸突然変異、３３個のアミノ酸突然変異、３４個のアミノ酸突然変異、３５個のアミノ酸突然変異、３６個のアミノ酸突然変異、３７個のアミノ酸突然変異、３８個のアミノ酸突然変異、３９個のアミノ酸突然変異、４０個のアミノ酸突然変異、４１個のアミノ酸突然変異、４２個のアミノ酸突然変異、４３個のアミノ酸突然変異、４４個のアミノ酸突然変異、４５個のアミノ酸突然変異、４６個のアミノ酸突然変異、４７個のアミノ酸突然変異、４８個のアミノ酸突然変異、４９個のアミノ酸突然変異、または５０個のアミノ酸突然変異を含み得る。
【０１８３】
いくつかの事例では、本開示のγδＴ細胞は１つ以上のＭＨＣ分子を発現しない。操作型γδＴ細胞における１つ以上のＭＨＣ遺伝子座の欠失は、宿主免疫系によって操作型γδＴ細胞が認識される可能性を低減することができる。ヒトの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子座は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系として知られ、γδＴ細胞を含めた抗原提示細胞において発現する大きな遺伝子ファミリーを構成する。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ分子は、抗原としての細胞内ペプチドを抗原提示細胞に提示するように機能する。ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＲ分子は、抗原としての細胞外ペプチドを抗原提示細胞に提示するように機能する。ＨＬＡ遺伝子のいくつかの対立遺伝子は、ＧＶＨＤ、自己免疫障害及びがんと関連付けられてきた。本明細書に記載の操作型γδＴ細胞は、１つ以上のＨＬＡ遺伝子の遺伝子発現が欠如するかまたは妨害されるようにさらに操作されることができる。本明細書に記載の操作型γδＴ細胞は、ＭＨＣ複合体の１つ以上の構成要素の遺伝子発現が欠如するかまたは妨害されるように、例えば、ＭＨＣ遺伝子のうちの１つ以上が完全に欠失するか、特定のエクソンが欠失するかまたはβ２マイクログロブリン（Ｂ２ｍ）が欠失するように、さらに操作されることができる。少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子の遺伝子切除または遺伝子妨害は、宿主対移植片疾患を引き起こすことなく任意のＨＬＡハプロタイプを有する対象に投与されることができる臨床上治療的なγδＴ細胞をもたらすことができる。本明細書に記載の操作型γδＴ細胞は、任意のＨＬＡハプロタイプを有するヒト対象のための普遍的ドナーとなることができる。
【０１８４】
γδＴ細胞は、１つまたは様々なＨＬＡ遺伝子座（複数可）が欠如するように操作されることができる。操作されたγδＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱ対立遺伝子またはＨＬＡ−ＤＰ対立遺伝子が欠如するように操作されることができる。いくつかの事例では、ＨＬＡ対立遺伝子は、ヒトの症状、例えば自己免疫症状に関連している。例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子は関節炎及びぶどう膜炎と関連付けられており、ＨＬＡ−ＤＲ２対立遺伝子は全身性紅斑性狼瘡及び多発性硬化症に関連付けられており、ＨＬＡ−ＤＲ３対立遺伝子は２１−水酸化酵素欠損症に関連付けられており、ＨＬＡ−ＤＲ４は関節リウマチ及び１型糖尿病に関連付けられている。例えばＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子が欠如している操作型γδＴ細胞は、対象の免疫系によってすぐに認識されることなく、関節炎を患う対象に投与されることができる。いくつかの事例では、１つ以上のＨＬＡ遺伝子座の欠失は、任意のＨＬＡハプロタイプを有する任意の対象のための普遍的ドナーである操作型γδＴ細胞をもたらす。
【０１８５】
いくつかの事例では、γδＴ細胞を操作することは、γδＴ細胞ゲノムの一部の欠失を必要とする。いくつかの事例では、ゲノムの欠失部分は、ＭＨＣ遺伝子座（複数可）の一部を含む。ある場合には、操作型γδＴ細胞は野生型ヒトγδＴ細胞に由来し、ＭＨＣ遺伝子座はＨＬＡ遺伝子座である。いくつかの事例では、ゲノムの欠失部分は、ＭＨＣ複合体中のタンパク質に対応する遺伝子の一部を含む。いくつかの事例では、ゲノムの欠失部分は、β２マイクログロブリン遺伝子を含む。ある場合には、ゲノムの欠失部分は、免疫チェックポイント遺伝子、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４及びＣＥＣＡＭ−１を含む。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞は、Ｔ細胞の活性化及び細胞傷害性を強化する活性化ドメインを発現するように設計されることができる。操作型γδＴ細胞で発現させることができる活性化ドメインの非限定的な例としては、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ分子、ＣＤ１２２、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩγが挙げられる。
【０１８６】
操作型γδＴ細胞のゲノムの任意の部分を欠失させて内在性γδＴ細胞遺伝子の発現を妨害することができる。γδＴ細胞のゲノムにおいて欠失させるかまたは妨害することができるゲノム領域の非限定的な例としては、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、エクソン、イントロン、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、可変数縦列型反復配列（ＶＮＴＲ）、短鎖縦列型反復配列（ＳＴＲ）、ＳＮＰパターン、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復配列、トリヌクレオチド反復配列、テトラヌクレオチド反復配列、または単純反復配列が挙げられる。いくつかの事例では、ゲノムの欠失部分は、１核酸〜約１０核酸、１核酸〜約１００核酸、１核酸〜約１，０００核酸、１核酸〜約１０，０００核酸、１核酸〜約１００，０００核酸、１核酸〜約１，０００，０００核酸の範囲、または他の適切な範囲である。
【０１８７】
操作型γδＴ細胞におけるＨＬＡ遺伝子発現は、当技術分野で知られている様々な技術を用いて妨害することもできる。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞ゲノムから遺伝子を切除するかまたは操作型γδＴ細胞における少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座の遺伝子発現を妨害するために、広い遺伝子座の遺伝子編集技術が用いられる。操作型γδＴ細胞のゲノム上の所望の遺伝子座を編集するために用いることができる遺伝子編集技術の非限定的な例としては、ＷＯ２０１４０９３７０、ＷＯ２００３０８７３４１、ＷＯ２０１４１３４４１２及びＷＯ２０１１０９０８０４（参照によりそれらの各々の全体を本明細書に援用する）にそれぞれ記載されている、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びメガヌクレアーゼの技術が挙げられる。
【０１８８】
γδＴ細胞は、腫瘍認識部分を既に発現する単離された非操作型γδＴ細胞から操作されてもよい。操作型γδＴ細胞は、単離された、例えば腫瘍試料の腫瘍内浸潤リンパ球から単離された野生型γδＴ細胞で内在的に発現する腫瘍細胞認識部分を保持することができる。いくつかの事例では、野生型γδＴＣＲが操作型γδＴ細胞の腫瘍細胞認識部分で置き換えられる。
【０１８９】
γδＴ細胞は、１つ以上の帰巣分子、例えばリンパ球帰巣分子を発現するように操作されることができる。帰巣分子は、例えば、リンパ球帰巣受容体または細胞接着分子であり得る。帰巣分子は、操作型γδＴ細胞を対象に投与した時に操作型γδＴ細胞が遊走して標的化固形腫瘍を含めた固形腫瘍に浸潤することを助けることができる。帰巣受容体の非限定的な例としては、ＣＣＲファミリーのメンバー、例えば、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＬＡ、ＣＤ４４、ＣＤ１０３、ＣＤ６２Ｌ、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、インテグリン、例えばＶＬＡ−４及びＬＦＡ−１が挙げられる。細胞接着分子の非限定的な例としては、ＩＣＡＭ、Ｎ−ＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＥ−ＣＡＭ、Ｌ１−ＣＡＭ、ネクチン（ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ２、ＰＶＲＬ３）、ＬＦＡ−１、インテグリン  アルファＸベータ２、アルファｖベータ７、マクロファージ−１抗原、ＣＬＡ−４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａが挙げられる。細胞接着分子のさらなる例としては、Ｔ−カドヘリンなどのカルシウム依存分子及び、ＭＭＰ９またはＭＭＰ２などのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する抗体が挙げられる。
【０１９０】
Ｔ細胞の成熟、活性化、増殖及び機能に関係するステップは、免疫チェックポイントタンパク質を介する共刺激性及び抑制性のシグナルによって調節され得る。免疫チェックポイントは、免疫系に本来備わっている共刺激性及び抑制性の要素である。免疫チェックポイントは、疾患症状、例えば細胞形質転換または感染に免疫系が応答するときに組織に対する損傷を防止すべく自己寛容を維持しかつ生理学的免疫応答の持続期間及び大きさを調節するのを助ける。γδＴ細胞かαβＴ細胞かのどちらかからの免疫応答を制御するために用いられる共刺激シグナルと抑制シグナルとの平衡は、免疫チェックポイントタンパク質によって調節され得る。免疫チェックポイントタンパク質、例えばＰＤ１及びＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞の表面に存在しており、免疫応答の「入」または「切」を切り替えるために使用され得る。腫瘍は、とりわけ腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対して、チェックポイントタンパク質機能を免疫耐性機序として調節不全にし得る。本開示の操作型γδＴ細胞は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子座（複数可）、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、ＣＥＡＣＡＭ１、Ｂ７−Ｈ３、及びＢ７−Ｈ４が欠如するようにさらに操作されることができる。あるいは、本開示の操作型γδＴ細胞における内在性免疫チェックポイント遺伝子の発現を遺伝子編集技術によって妨害することができる。
【０１９１】
免疫学的チェックポイントは、本開示の操作型γδＴ細胞において抑制シグナル伝達経路を調節する分子（例を挙げると、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１及びＬＡＧ３）または刺激シグナル伝達経路を調節する分子（例を挙げると、ＩＣＯＳ）であり得る。幅広い免疫グロブリンスーパーファミリー内のいくつかのタンパク質は、免疫学的チェックポイントのリガンドとなり得る。免疫チェックポイントリガンドタンパク質の非限定的な例としては、Ｂ７−Ｈ４、ＩＣＯＳＬ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＭｅｇａＣＤ４０Ｌ、ＭｅｇａＯＸ４０Ｌ、及びＣＤ１３７Ｌが挙げられる。いくつかの事例では、免疫チェックポイントタンパク質は、腫瘍で発現する抗原である。いくつかの事例では、免疫チェックポイント遺伝子はＣＴＬＡ−４遺伝子である。いくつかの事例では、免疫チェックポイント遺伝子はＰＤ−１遺伝子である。
【０１９２】
ＰＤ１は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーに属する抑制性受容体であり、活性化されたＴリンパ球、Ｂ細胞、単球、ＤＣ及びＴ−ｒｅｇにおいて発現する。ＰＤ１に対する２つの既知のリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２が存在し、それらはＴ細胞、ＡＰＣ及び悪性細胞において発現するものであり、自己反応性リンパ球を抑制しかつＴＡＡ特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のエフェクター機能を抑制するように機能する。したがって、ＰＤ１が欠如している操作型γδＴ細胞はその細胞傷害活性を、腫瘍細胞によるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の発現に関係なく保持することができる。いくつかの事例では、本開示の操作型γδＴ細胞にはＰＤ−１遺伝子の遺伝子座が欠如している。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞におけるＰＤ−１遺伝子の発現は遺伝子編集技術によって妨害される。
【０１９３】
ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）は、ＣＤ１５２（分化抗原１５２）としても知られている。ＣＴＬＡ４は、配列相同性及びリガンド（ＣＤ８０／Ｂ７−１及びＣＤ８６／Ｂ７−２）を共刺激分子ＣＤ２８と共有しているものの、ＣＴＬＡ４を受容体として発現しているＴ細胞に抑制シグナルを送達する点で異なる。ＣＴＬＡ４は、両リガンドに対する全親和性がよりはるかに高く、リガンド密度が限られている場合に結合に関してＣＤ２８を凌駕することができる。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の表面に発現することが多く、ナイーブ及びメモリーＴ細胞の両方の初期活性化段階において機能的役割を果たす。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞活性化の初期段階の間、ＣＤ８０及びＣＤ８６に対する増加した親和性によってＣＤ２８の活性を打ち消す。ＣＴＬＡ４の主要な機能には、ヘルパーＴ細胞の下方制御及び調節性Ｔ細胞の免疫抑制活性の強化が含まれる。ある場合には、本開示の操作型γδＴ細胞にはＣＴＬＡ４遺伝子が欠如している。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞におけるＣＴＬＡ４遺伝子の発現は遺伝子編集技術によって妨害される。
【０１９４】
ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）は、活性化された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞上に発現し、調節性Ｔ細胞の機能を強化することができ、独立してＣＤ８＋エフェクターＴ細胞活性を抑制することができる。ＬＡＧ３は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する高い結合親和性を有するＣＤ４様の負の調節性タンパク質であり、いくつかの上皮癌では上方制御されており、Ｔ細胞増殖及び恒常性の寛容をもたらす。ＬＡＧ−３−ＩＧ融合タンパク質を使用するＬＡＧ−３／クラスＩＩ相互作用の軽減は、抗腫瘍免疫応答を強化し得る。いくつかの事例では、本開示の操作型γδＴ細胞にはＬＡＧ３遺伝子の遺伝子座が欠如している。ある場合には、操作型γδＴ細胞におけるＬＡＧ３遺伝子の発現は遺伝子編集技術によって妨害される。
【０１９５】
非操作型及び操作型γδＴ細胞の表現型
操作型γδＴ細胞は、対象の体の特定の身体位置に帰巣し得る。操作型γδＴ細胞の遊走及び帰巣は、特定のケモカイン及び／または接着分子の発現と作用との複合に依存し得る。操作型γδＴ細胞の帰巣は、ケモカインとその受容体との相互作用によって制御され得る。例えば、限定されないがＣＸＣＲ３（そのリガンドはＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０及び６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ／ＣＣＬ２１で表される）、ＣＣＲ４＋  ＣＸＣＲ５＋（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βの受容体）、ＣＣＲ６＋及びＣＣＲ７を含めてサイトカインは操作型γδＴ細胞の帰巣に影響を与え得る。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞は、炎症及び損傷の部位ならびに疾患細胞に帰巣して修復機能を発揮し得る。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞はがんに帰巣することができる。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞は、胸腺、骨髄、皮膚、喉頭、気管、胸膜、肺、食道、腹部、胃、小腸、大腸、肝臓、膵臓、腎臓、尿道、膀胱、精巣、前立腺、精管、卵巣、尿管（ｕｒｅｔｕｓ）、乳腺、副甲状腺、脾臓または対象の体の別の部位に帰巣し得る。操作型γδＴ細胞は１つ以上の帰巣部分、例えば特定のＴＣＲ対立遺伝子及び／またはリンパ球帰巣分子を発現することができる。
【０１９６】
操作型γδＴ細胞は特定の表現型を有し得、表現型は細胞表面マーカー発現の観点から表されることができる。様々なタイプのγδＴ細胞を本明細書で記載されているとおりに操作することができる。好ましい実施形態では操作型γδＴ細胞はヒトに由来するが、操作型γδＴ細胞が別の供給源、例えば哺乳動物または合成細胞に由来するものであってもよい。
【０１９７】
増殖済み細胞集団の免疫表現型は、限定されないがＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌを含めたマーカーを使用して決定され得る（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２１１：２１４  ２００６）。ＣＤ４５ＲＡはナイーブＴリンパ球上に発現し、抗原との遭遇によってＣＤ４５ＲＯに置き換えられるが、後のエフェクター細胞において再発現する（Ｍｉｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６０，２６４−２６５（１９９２））。ＣＤ６２Ｌは、二次リンパ組織に進入する帰巣分子として振舞う細胞接着分子であり、Ｔ細胞がエフェクター機能を獲得するときのＴ細胞活性化の後に消失する（Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４０１：７０８（１９９９））。ＣＤ２７は、Ｔ細胞分化中に消失する共刺激マーカーである（Ａｐｐａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．８：３７９（２００２）、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２１１：２１４  ２００６）。
【０１９８】
抗原
本明細書において開示される本発明は、抗原認識部分を発現する操作型γδＴ細胞を提供し、この場合、抗原認識部分は、疾患に特有のエピトープを認識する。抗原は、免疫応答を惹起する分子であり得る。この免疫応答は、抗体産生か、免疫応答能を有する特定細胞の活性化かのどちらか、またはその両方を伴い得る。抗原は、例えば、ペプチド、タンパク質、ハプテン、脂質、炭水化物、細菌、病原体またはウイルスであり得る。抗原は腫瘍抗原であり得る。腫瘍エピトープは、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ複合体によって腫瘍細胞の表面に提示され得る。エピトープは、細胞表面に発現して腫瘍認識部分によって認識される、抗原の一部であり得る。
【０１９９】
操作型γδＴ細胞によって認識される抗原の非限定的な例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＡ６、ＧＤ２、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＲＯＮ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＰＬＩＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ−１、糖脂質Ｆ７７、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、メソテリン、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、ＰＶＲＬ−４、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＣＡ、ＣＬＥＣ１２ａ、Ｌ１ＣＡＭ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、葉酸結合タンパク質／受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−３Ｒα２、ＳＬＴＲＫ６、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ−１、ＷＴ−１、ＰＲＡＭＥ、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＭＡＧＥＡファミリー遺伝子（例えば、ＭＡＧＥＡ３．ＭＡＧＥＡ４）、ＫＫＬＣ１、突然変異型ｒａｓ、□□ａｆ、ｐ５３、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ（ＭＩＣＡ）もしくはＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ｂ（ＭＩＣＢ）または、ＨＰＶ、ＣＭＶもしくはＥＢＶの１つ以上の抗原が挙げられる。
【０２００】
抗原は細胞の細胞内区画または細胞外区画において発現し得、操作型γδＴ細胞は細胞内または細胞外腫瘍抗原を認識することができる。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞のαβＴＣＲは、細胞内腫瘍抗原か細胞外腫瘍抗原かのどちらかに由来するペプチドを認識する。例えば、抗原は、ウイルスに感染した細胞によって細胞内または細胞外に産生されるタンパク質、例えば、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶまたはＨＰＶタンパク質であり得る。抗原は、がん細胞で細胞内または細胞外に発現するタンパク質であってもよい。
【０２０１】
抗原認識部分は、ストレス下にある細胞、例えば、がん細胞またはウイルスに感染している細胞からの抗原を認識し得る。例えば、ヒトＭＨＣクラスＩ鎖関連遺伝子（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）は６番染色体のＨＬＡクラスＩ領域内に位置している。ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢタンパク質は、ヒト上皮での「ストレス」のマーカーであると考えられ、一般的なナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＧ２Ｄ）を発現する細胞にとってのリガンドとして作用する。ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢは、がん細胞からストレスマーカーとして高発現し得る。操作型γδＴ細胞はＭＩＣＡまたはＭＩＣＢ腫瘍エピトープを認識することができる。
【０２０２】
腫瘍認識部分は、特定のアビディティーで抗原を認識するように操作され得る。例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ構築物によってコードされる腫瘍認識部分は、少なくとも少なくとも１０ｆＭ、少なくとも１００ｆＭ、少なくとも１ピコモーラー（ｐＭ）、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも２０ｐＭ、少なくとも３０ｐＭ、少なくとも４０ｐＭ、少なくとも５０ｐＭ、少なくとも６０ｐＭ、少なくとも７ｐＭ、少なくとも８０ｐＭ、少なくとも９０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも２００ｐＭ、少なくとも３００ｐＭ、少なくとも４００ｐＭ、少なくとも５００ｐＭ、少なくとも６００ｐＭ、少なくとも７００ｐＭ、少なくとも８００ｐＭ、少なくとも９００ｐＭ、少なくとも１ナノモーラー（ｎＭ）、少なくとも２ｎＭ、少なくとも３ｎＭ、少なくとも４ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも６ｎＭ、少なくとも７ｎＭ、少なくとも８ｎＭ、少なくとも９ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも３０ｎＭ、少なくとも４０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも６０ｎＭ、少なくとも７０ｎＭ、少なくとも８０ｎＭ、少なくとも９０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも３００ｎＭ、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも６００ｎＭ、少なくとも７００ｎＭ、少なくとも８００ｎＭ、少なくとも９００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも４μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも６μＭ、少なくとも７μＭ、少なくとも８μＭ、少なくとも９μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも９０μＭまたは少なくとも１００μＭの解離定数で抗原を認識し得る。
【０２０３】
ある場合には、腫瘍認識部分は、１０ｆＭ以下、１００ｆＭ以下、１ピコモーラー（ｐＭ）以下、１０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、７ｐＭ以下、８０ｐＭ以下、９０ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、８００ｐＭ以下、９００ｐＭ以下、１ナノモーラー（ｎＭ）以下、２ｎＭ以下、３ｎＭ以下、４ｎＭ以下、５ｎＭ以下、６ｎＭ以下、７ｎＭ以下、８ｎＭ以下、９ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、６００ｎＭ以下、７００ｎＭ以下、８００ｎＭ以下、９００ｎＭ以下、１μＭ以下、２μＭ以下、３μＭ以下、４μＭ以下、５μＭ以下、６μＭ以下、７μＭ以下、８μＭ以下、９μＭ以下、１０μＭ以下、２０μＭ以下、３０μＭ以下、４０μＭ以下、５０μＭ以下、６０μＭ以下、７０μＭ以下、８０μＭ以下、９０μＭ以下または１００μＭ以下の解離定数で抗原を認識するように操作され得る。
【０２０４】
新規活性化剤
本発明の発明者らは、特定サブタイプのγδＴＣＲに結合しそれゆえγδＴ細胞の特定集団を活性化する、活性化剤を同定した。一態様において、本発明は、本明細書の実施例１４及び実施例３９ならびに図２３〜３０及び図３３〜３６において同定され記載されている新規活性化エピトープに結合する新規活性化剤を提供する。活性化剤としては、限定されないが例えば、ＭＡｂ  ＴＳ８．２、ＴＳ−１、１５Ｄ、Ｂ６、Ｒ９．１２、δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５、δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６及びδ２−３７が挙げられる。
【０２０５】
これらの活性化剤にはさらに、限定されないが、ＴＳ８．２、ＴＳ−１、１５Ｄ、Ｂ６、Ｒ９．１２、δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５、δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６及びδ２−３７からなる群から選択される１つ以上のＭＡｂと同じエピトープに結合するかまたは当該１つ以上のＭＡｂと競合する活性化剤が含まれる。
【０２０６】
これらの活性化剤にはさらに、限定されないが、ＴＳ８．２、ＴＳ−１、１５Ｄ、Ｂ６、Ｒ９．１２、δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５、δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６及びδ２−３７からなる群から選択されるＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／または可変領域を含有する活性化剤が含まれる。
【０２０７】
本発明はさらに、（ｉ）ＴＳ８．２、ＴＳ−１、１５Ｄ、Ｂ６、Ｒ９．１２、δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５、δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６及びδ２−３７からなる群から選択されるＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／もしくは可変領域を含有するか、（ｉｉ）当該ＭＡｂと同じエピトープに結合するかもしくは当該ＭＡｂと競合するか、または（ｉｉｉ）当該ＭＡｂである、活性化剤をコードする核酸を提供する。いくつかの事例では、核酸は、宿主細胞内（例えば異種宿主細胞内）にある。いくつかの事例では、核酸は、異種プロモーターに機能可能に繋げられているか、または異種ポリペプチドをコードする核酸に機能可能に繋げられている。本明細書中で使用する場合、「異種」という用語は、一緒に天然に存在することが全くない２つの構成要素を指す。
【０２０８】
特定の実施形態では、活性化剤（例えば抗体）は、１つ以上のγδＴ細胞集団（例えば、δ１Ｔ細胞またはδ２Ｔ細胞）を増殖または活性化させる。特定の実施形態では、活性化剤は、δ１及びδ３Ｔ細胞を選択的に活性化させる。特定の実施形態では、活性化剤は、δ１及びδ４Ｔ細胞を選択的に活性化させる。特定の実施形態では、活性化剤は、δ１Ｔ細胞を選択的に活性化させる。特定の実施形態では、活性化剤は、δ１、δ３、δ５及びδ５Ｔ細胞を選択的に活性化させる。特定の実施形態では、活性化剤は、δ２Ｔ細胞を選択的に活性化させる。
【０２０９】
本発明はさらに、上記活性化剤のうちの１つ以上を製造する方法を提供する。例えば、活性化剤をコードする核酸を含有する宿主細胞を培養して上記活性化剤のうちの１つ以上を製造することができる。
【０２１０】
ＡＰＣ
本明細書ではさらに、操作型または非操作型γδＴ細胞、例えばγδＴ細胞の１つ以上の亜集団の増殖のためのＡＰＣについて記載する。いくつかの実施形態において、本明細書では、上記活性化剤のうちの１つ以上をコードする異種核酸を含有するＡＰＣについて記載する。いくつかの実施形態において、本明細書では、上記活性化剤のうちの１つ以上を細胞表面に発現するＡＰＣについて記載する。いくつかの実施形態において、本明細書では、１つ以上のＦｃ受容体を細胞表面に発現するＡＰＣであって、Ｆｃ受容体（複数可）が上記活性化剤のうちの１つ以上と接触及び／または結合している、当該ＡＰＣについて記載する。
【０２１１】
いくつかの事例では、ＡＰＣ（例えば、上記活性化剤のうちの１つ以上が細胞表面に発現しているかまたは細胞表面に発現したＦｃ受容体に結合している、ＡＰＣ）は、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩのインバリアント鎖及び／またはＨＬＡ−ＤＭを発現しないか、または低減されたその発現を呈する。いくつかの事例では、ＡＰＣは、接着分子、例えば、接着分子−１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ５４及び／または白血球機能関連抗原−３を発現する。いくつかの事例では、ＡＰＣは、Ｆｃ受容体、例えば、本明細書に記載のγδＴ細胞増殖方法において使用される活性化剤のアイソタイプに対して特異的であるＦｃ受容体を発現する。いくつかの事例では、ＡＰＣは、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｃ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＦｃＲｎ、ＴＲＩＭ２１もしくはＣＤ３０７、またはより高い親和性を有するかもしくは変化した特異性を有するその操作された変異型からなる群から選択される１つ以上のＦｃ受容体を発現する。
【０２１２】
さらに本明細書では、上記ＡＰＣのうちの１つ以上を含む培養物について記載する。培養物は、増殖済みまたは未増殖の操作型または非操作型γδＴ細胞をさらに含有し得る。培養物は、追加で、または代わりに、本明細書に記載のγδＴ細胞活性化剤のいずれか１つを含む選択的または非選択的なγδＴ細胞活性化剤を含有し得る。いくつかの事例では、培養物はＩＬ−２１を含有しない。いくつかの事例では、培養物は、ＩＬ−４、ＩＬ−２もしくはＩＬ−１５またはそれらの組み合わせを含有しない。いくつかの事例では、培養物は、γδＴ細胞の亜集団を選択的に増殖させるサイトカインを含有しない。
【０２１３】
エピトープ同定
本発明の発明者らは、γδＴＣＲ活性化ＭＡｂ  ＴＳ８．２、ＴＳ−１、１５Ｄ、Ｂ６、Ｒ９．１２、δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５、δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６及びδ２−３７のエピトープ内の結合領域を同定した。典型的なエピトープとしては、限定されないが例えば、γδＴＣＲ活性化ＭＡｂ  ＴＳ８．２、ＴＳ−１、１５Ｄ、Ｂ６、Ｒ９．１２、δ１−０５、δ１−０８、δ１−１８、δ１−２２、δ１−２３、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２３９、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５、δ２−１４、δ２−１７、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６及びδ２−３７のエピトープが挙げられる。いくつかの実施形態では、エピトープは、γδＴＣＲ活性化ＭＡｂ  ＴＳ８．２、ＴＳ−１、１５Ｄ、Ｂ６、Ｒ９．１２、δ１−０５、δ１−０８、δ１−２２、δ１−２６、δ１−３５、δ１−３７、δ１−３９、δ１−１１３、δ１−１４３、δ１−１４９、δ１−１５５、δ１−１８２、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−１９２、δ１−１９５、δ１−１９７、δ１−１９９、δ１−２０１、δ１−２０３、δ１−２５３、δ１−２５７、δ１−２７８、δ１−２８２、δ１−２８５、δ２−１４、δ２−１７、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３２、δ２−３３、δ２−３５、δ２−３６及びδ２−３７のうちの１つ以上に特異的に結合するエピトープである。
【０２１４】
一態様において、本開示は、操作型及び非操作型γδＴ細胞の増殖を速い成長速度で刺激する薬剤のエピトープを同定する方法を提供する。エピトープは、独特の空間配座にある少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸を含み得る。エピトープは、連続アミノ酸、またはタンパク質の三次折りたたみによって並置された不連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、通常、変性溶媒に曝露された際に保持され得るが、三次折りたたみによって形成されるエピトープは、通常、変性溶媒で処理されると消失し得る。
【０２１５】
関心対象の活性化剤、例えば、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、ＴＳ−１及びＲ９．１２抗体によって（例えば特異的に）認識される直鎖状または非直鎖状の不連続アミノ酸配列（複数可）すなわちエピトープを同定するために、エピトープ位置特定を実施することができる。エピトープ位置特定の一般的手法は、関心対象の抗体またはリガンドによって認識される完全長ポリペプチド配列、及びポリペプチド配列の様々な断片すなわち切詰形態を、大抵は異種発現系において、発現させることを必要とし得る。その後、これらの様々な組換えポリペプチド配列またはその断片（例えば、Ｎ末端タンパク質（例えばＧＦＰ）と融合したもの）を使用して、関心対象の抗体またはリガンドがポリペプチド配列の１つ以上の切詰形態と結合できるか否かを判定することができる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド配列は、２つ以上の相同性親ポリペプチドを接合した断片を含有するキメラであり、少なくとも１つの親ポリペプチドが、関心対象の活性化剤に結合するものであり、少なくとも１つの親ポリペプチドが、関心対象の活性化剤に結合しないものである。例えば、ヒトδ１鎖遺伝子のセグメントを相同イルカδ鎖遺伝子のセグメントと接合することができ、組換え発現系においてキメラＴＣＲを生み出す能力に関して試験することができる。例えば細胞表面での汎γδＴＣＲ抗体による検出によって指し示されるところの、ＴＣＲを形成するキメラＴＣＲ遺伝子は、その後、関心対象の活性化剤との結合性に関して試験され得る。別の例を挙げると、ヒトδ２鎖遺伝子のセグメントを相同マカクδ鎖遺伝子のセグメントと接合することができ、キメラＴＣＲを生み出す能力を組換え発現系において試験することができる。例えば細胞表面での汎γδＴＣＲ抗体による検出によって指し示されるところの、ＴＣＲを形成するキメラＴＣＲ遺伝子は、その後、関心対象の活性化剤との結合性に関して試験され得る。
【０２１７】
重複アミノ酸領域を有する組換えポリペプチド配列の反復的な切詰め及び作出を用いることにより、関心対象の抗体によって認識されるポリペプチド配列の領域を同定することが可能である（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ（１９９６）を参照のこと）。方法は、エピトープライブラリー、例えば、膜担体上の合成ペプチドアレイやコンビナトリアル式ファージディスプレイペプチドライブラリーに由来するエピトープライブラリーから再作出された配列に関心対象の抗体などの薬剤が結合する能力に依拠している。そうして、エピトープライブラリーは、抗体に対してスクリーニングされる様々な可能性を提供する。さらには、エピトープの１つ以上の残基を標的とする部位特異的な突然変異誘発またはランダムＡｌａスキャンを遂行してエピトープの同一性を確認することができる。
【０２１８】
γδＴ細胞受容体（γδＴＣＲ）の可能な様々な組換えをｃＤＮＡ構築物として合成設計し、それらを適切な系で発現させることにより、エピトープのライブラリーを作出することができる。例えば、Ｊδ領域が異なっている複数のＶδ１遺伝子セグメント、例えば、Ｊδ１、Ｊδ２及びＪδ３遺伝子セグメントを合成設計することができる。あるいは、Ｖδ２Ｊδ１及びＶδ３Ｊδ１鎖を合成遺伝子として注文して適切なベクターの中にクローニングすることもできる。合成的にクローニングされた複数のδＴＣＲ鎖、例えば、Ｖδ１Ｊδ１、Ｖδ１Ｊδ２、Ｖδ１Ｊδ３、Ｖδ１Ｊδ４、Ｖδ２及びＶδ３鎖を、合成的にクローニングされたγＴＣＲ鎖、例えば、Ｖγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、Ｖγ５、Ｖγ８、Ｖγ９及びＶγ１０合成設計遺伝子セグメントと一緒に宿主系に共トランスフェクトすることができる。他の事例では、ヒトＰＢＭＣまたはヒトの正常及び悪性組織から単離されたγδＴ細胞から抽出した全ＲＮＡから、δＴＣＲ鎖、例えば、Ｖδ１Ｊδ１、Ｖδ１Ｊδ２、Ｖδ１Ｊδ３、Ｖδ１Ｊδ４、Ｖδ２及びＶδ３鎖を増幅することができる。
【０２１９】
宿主系は、任意の適切な発現系、例えば、２９３細胞、昆虫細胞または適切な試験管内翻訳系であり得る。宿主系にトランスフェクトされる合成設計γδＴ細胞セグメントの可能な多種多様な組換えは、γδＴＣＲの可能な対合の組み合わせを例えば２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０通りより多くもたらすことができる。前述のライブラリーの中のエピトープのうちの１つに対する薬剤の結合は、標識された抗体、例えばＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、ＴＳ−１及びＲ９．１２をライブラリーのエピトープと接触させること、ならびに標識からの信号を検出することによって検出することができる。
【０２２０】
エピトープ位置特定のために、配座的に不連続なエピトープを位置特定することが示されたコンピュータ計算アルゴリズムも開発された。配座エピトープは、例えばＸ線結晶学及び二次元核磁気共鳴を含めた方法を用いてアミノ酸の空間配座を決定することによって同定され得る。いくつかのエピトープ位置特定方法、例えば、抗原：抗体複合体の結晶のＸ線解析は、エピトープの原子的分解能を提供することができる。他の事例では、エピトープ位置特定のためのコンピュータ計算によるコンビナトリアル式方法を採用して潜在的なエピトープを抗体、例えばＴＳ−１抗体またはＴＳ８．２抗体の配列に基づいてモデリングすることができる。そのような事例では、抗体の抗原結合部分を配列決定し、コンピュータ計算モデルを使用して抗体の潜在的結合部位を再構築及び予測する。
【０２２１】
いくつかの事例では、本開示は、γδＴ細胞受容体のエピトープを決定する方法であって、（ａ）γδＴ細胞受容体からエピトープのライブラリーを調製することと、（ｂ）エピトープのライブラリーを抗体と接触させることと、（ｂ）エピトープのライブラリーの中で抗体と結合している少なくとも１つのエピトープのアミノ酸配列を同定することとを含む、当該方法を提供する。いくつかの事例では、抗体は、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、ＴＳ−１及びＲ９．１２抗体からなる群から選択される。ある場合には、抗体は固体担体に付着している。エピトープのライブラリーは、Ｔ細胞受容体、例えばγＴＣＲまたはδＴＣＲの連続または不連続エピトープに対応する配列を含み得る。いくつかの事例では、エピトープのライブラリーは、約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸にわたる長さ、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸にわたる長さ、または約５アミノ酸〜約１２アミノ酸にわたる長さのγδＴ細胞受容体からの断片を含む。いくつかの事例では、抗体は標識されており、標識は放射性分子、発光分子、蛍光分子、酵素またはビオチンである。
【０２２２】
δ１エピトープビン
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ１のアミノ酸４７〜７０（ＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡ）とＪ１（ＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ）またはＪ２（ＬＴＡＱＬＦＦＧＫＧＴＱＬＩＶＥＰ）とからなるエピトープであり、当該活性化剤は、Ｊ１またはＪ２にＫ１２０Ｔ突然変異を含有するエピトープには結合しないものである。このエピトープは、本明細書においてビン１δ１エピトープと呼称される。ビン１δ１エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、ＴＳ−１、及びδ１−１８が挙げられる。ヒトＶδ１Ｊ領域は、（Ｄ）（Ｊ）再構成によって様々であり得、ビン１δ１エピトープを有するγδＴＣＲのδ１鎖のＶδ１Ｊ領域の一例は、
ＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
であり、γδＴＣＲのδ１鎖のＶδ１Ｊ領域ビン１δ１エピトープの別の例は、
ＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＥＡＰＳＡＷＧＫＨＬＴＡＱＬＦＦＧＫＧＴＱＬＩＶＥＰ
である。
【０２２３】
いくつかの事例では、ビン１δ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１に結合するが、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＳＷＤＴＲＱＭＦＦＧＴＧＩＫＬＦＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１には結合しない。
【０２２４】
ビン１δ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＥＡＰＳＡＷＧＫＨＬＴＡＱＬＦＦＧＫＧＴＱＬＩＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１にも結合することができる。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ１のアミノ酸４７〜７０（ＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡ）とＪ１（ＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ）とからなるエピトープであり、当該活性化剤は、Ｊ１にＫ１２０Ｔ突然変異を含有するエピトープには結合しないものである。このエピトープは、本明細書においてビン１ｂδ１エピトープと呼称される。ビン１ｂδ１エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、δ１−３７が挙げられる。ビン１ｂδ１エピトープを有するγδＴＣＲのδ１鎖のＶδ１Ｊ領域の一例は、
ＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
である。
【０２２６】
いくつかの事例では、ビン１ｂδ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖に結合するが、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＳＷＤＴＲＱＭＦＦＧＴＧＩＫＬＦＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖には結合しない。
【０２２７】
ビン１ｂδ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳ．ＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＥＡＰＳＡＷＧＫＨＬＴＡＱＬＦＦＧＫＧＴＱＬＩＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖にも結合しない。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ１のアミノ酸１１〜２１（ＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬ）からなるエピトープである。このエピトープは、本明細書においてビン２δ１エピトープと呼称される。ビン２δ１エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、δ１−２８５が挙げられる。
【０２２９】
いくつかの事例では、ビン２δ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖に結合するが、
ＡＱＫＶＴＱＶＱＲＡＭＳＳＱＬＧＥＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰＲＳＱＰＨＴＫＰＳＶＦＶＭＫＮＧＴＮＶＡＣＬＶＫＥＦ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖には結合しない。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ１のアミノ酸１１〜２１（ＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬ）からなるエピトープであり、当該活性化剤は、Ｖδ１にＲ１６の突然変異、例えばＲ１６Ｎ突然変異を含有するエピトープには結合しないものである。このエピトープは、本明細書においてビン２ｂδ１エピトープと呼称される。ビン２ｂδ１エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、Ｒ９．１２が挙げられる。
【０２３１】
いくつかの事例では、ビン２ｂδ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖に結合するが、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＮＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖には結合せず、かつ／または
ＡＱＫＶＴＱＶＱＲＡＭＳＳＱＬＧＥＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰＲＳＱＰＨＴＫＰＳＶＦＶＭＫＮＧＴＮＶＡＣＬＶＫＥＦ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖には結合しない。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ１のアミノ酸１１〜２１（ＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬ）からなるエピトープであり、このエピトープに結合する活性化剤は、δ３、δ４及びδ５γδＴＣＲとも結合（交差反応）する。このエピトープは、本明細書においてビン２ｃδ１エピトープと呼称される。ビン２ｃδ１エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、δ１−３９が挙げられる。
【０２３３】
いくつかの事例では、ビン２ｃδ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖に結合するが、
ＡＱＫＶＴＱＶＱＲＡＭＳＳＱＬＧＥＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰＲＳＱＰＨＴＫＰＳＶＦＶＭＫＮＧＴＮＶＡＣＬＶＫＥＦ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖には結合しない。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ１のアミノ酸８０〜９５（ＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱ）またはヒトＶδ１のアミノ酸７０〜９５（ＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱ）からなるエピトープである。このエピトープは、本明細書においてビン３δ１エピトープと呼称される。ビン３δ１エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、δ１−０８、及びδ１−２３が挙げられる。
【０２３５】
いくつかの事例では、ビン３δ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖に結合するが、
ＡＱＫＶＴＱＶＱＲＡＭＳＳＱＬＧＥＡＶＴＬＳＣＱＹＥＴＳＬＳＷＹＤＩＦＷＹＫＱＬＰＳＧＥＭＴＦＬＩＨＱＩＳＳＤＱＮＡＫＮＧＲＹＳＶＮＦＱＥＲＨＫＦＩＳＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰＲＳＱＰＨＴＫＰＳＶＦＶＭＫＮＧＴＮＶＡＣＬＶＫＥＦＹＰＫＤ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖には結合しない。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ１のアミノ酸１〜１１（ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶ）とＪ１またはＪ２とからなるエピトープである。このエピトープは、本明細書においてビン４δ１エピトープと呼称される。いくつかの事例では、ビン４δ１エピトープに結合する活性化剤は、Ｊ１またはＪ２にＫ１２０Ｔ突然変異を含有するエピトープには結合しない。ビン４δ１エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、δ１−３５、及びδ１−２０３が挙げられる。
【０２３７】
いくつかの事例では、ビン４δ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖に結合するが、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＳＷＤＴＲＱＭＦＦＧＴＧＩＫＬＦＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖には結合しない。
【０２３８】
いくつかの事例では、ビン４δ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＥＡＰＳＡＷＧＫＨＬＴＡＱＬＦＦＧＫＧＴＱＬＩＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖に結合する。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ１のアミノ酸２８〜４７（ＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳ）とＪ１とからなるエピトープである。このエピトープは、本明細書においてビン５δ１エピトープと呼称される。ビン５δ１エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、δ１−１１３、δ１−１５５、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−２７８、及びδ１−２８２が挙げられる。ビン５δ１エピトープを有するγδＴＣＲのδ１鎖のＶδ１Ｊ１領域の一例は、
ＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
である。
【０２４０】
いくつかの事例では、ビン５δ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖に結合するが、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＥＡＰＳＡＷＧＫＨＬＴＡＱＬＦＦＧＫＧＴＱＬＩＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖には結合しない。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ１のアミノ酸２１〜２８（ＬＮＣＬＹＥＴＳ）とＪ１とからなるエピトープである。このエピトープは、本明細書においてビン６δ１エピトープと呼称される。ビン６δ１エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、ＴＳ８．２及びδ１−１４３が挙げられる。ビン６δ１エピトープを有するγδＴＣＲのδ１鎖のＶδ１Ｊ１領域の一例は、
ＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
である。
【０２４２】
いくつかの事例では、ビン６δ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖に結合するが、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＳＷＤＴＲＱＭＦＦＧＴＧＩＫＬＦＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖には結合しない。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ１のアミノ酸４７〜７０（ＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡ）とＪ１またはＪ２とからなるエピトープである。このエピトープは、本明細書においてビン７δ１エピトープと呼称される。ビン７δ１エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、δ１−１４９、δ１−２５３、及びδ１−２５７が挙げられる。ビン７δ１エピトープを有するγδＴＣＲのδ１鎖のＶδ１Ｊ領域の一例は、
ＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰであり、γδＴＣＲのδ１鎖のＶδ１Ｊ領域ビン７δ１エピトープの別の例は、
ＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＥＡＰＳＡＷＧＫＨＬＴＡＱＬＦＦＧＫＧＴＱＬＩＶＥＰ
である。
【０２４４】
いくつかの事例では、ビン７δ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖に結合するが、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＳＷＤＴＲＱＭＦＦＧＴＧＩＫＬＦＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖には結合しない。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ１のアミノ酸７０〜８０（ＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦ）とＪ１またはＪ２とからなるエピトープである。このエピトープは、本明細書においてビン８δ１エピトープと呼称される。ビン８δ１エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、δ１−１９２が挙げられる。ビン８δ１エピトープを有するγδＴＣＲのδ１鎖のＶδ１Ｊ領域の一例は、
ＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
であり、γδＴＣＲのδ１鎖のＶδ１Ｊ領域ビン８δ１エピトープの別の例は、
ＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＥＡＰＳＡＷＧＫＨＬＴＡＱＬＦＦＧＫＧＴＱＬＩＶＥＰ
である。
【０２４６】
いくつかの事例では、ビン８δ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖に結合するが、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＳＷＤＴＲＱＭＦＦＧＴＧＩＫＬＦＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖には結合しない。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ１のアミノ酸８０〜９５（ＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱ）からなるエピトープである。このエピトープは、本明細書においてビン９δ１エピトープと呼称される。ビン９δ１エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、δ１−２０１が挙げられる。
【０２４８】
いくつかの事例では、ビン９δ１エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖に結合するが、
ＡＱＫＶＴＱＶＱＲＡＭＳＳＱＬＧＥＡＶＴＬＳＣＱＹＥＴＳＬＳＷＹＤＩＦＷＹＫＱＬＰＳＧＥＭＴＦＬＩＨＱＩＳＳＤＱＮＡＫＮＧＲＹＳＶＮＦＱＥＲＨＫＦＩＳＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ１鎖には結合しない
【０２４９】
本明細書に記載のδ１特異的抗体は、δ２含有γδＴＣＲよりもδ１含有γδＴＣＲに対して選択的に結合する。このため、上記δ１特異的抗体は、例えば、
ＡＩＥＬＶＰＥＨＱＴＶＰＶＳＩＧＶＰＡＴＬＲＣＳＭＫＧＥＡＩＧＮＹＹＩＮＷＹＲＫＴＱＧＮＴＭＴＦＩＹＲＥＫＤＩＹＧＰＧＦＫＤＮＦＱＧＤＩＤＩＡＫＮＬＡＶＬＫＩＬＡＰＳＥＲＤＥＧＳＹＹＣＡＣＤＰＬＧＧＰＰＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列及び／または当該配列を含むγδＴＣＲには結合しない。
【０２５０】
δ２エピトープビン
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ２のアミノ酸８３〜９４（ＡＫＮＬＡＶＬＫＩＬＡＰ）からなるエピトープである。このエピトープは、本明細書においてビン１δ２エピトープと呼称される。いくつかの事例では、ビン１δ２エピトープに結合する活性化剤は、Ｖδ２にＫ９０の突然変異、例えばＫ９０Ｎ突然変異を含有するエピトープとは結合しない。ビン１δ２エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、δ２−１７、及びＢ６が挙げられる。
【０２５１】
いくつかの事例では、ビン１δ２エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＩＥＬＶＰＥＨＱＴＶＰＶＳＩＧＶＰＡＴＬＲＣＳＭＫＧＥＡＩＧＮＹＹＩＮＷＹＲＫＴＱＧＮＴＭＴＦＩＹＲＥＫＤＩＹＧＰＧＦＫＤＮＦＱＧＤＩＤＩＡＫＮＬＡＶＬＫＩＬＡＰＳＥＲＤＥＧＳＹＹＣＡＣＤＰＬＧＧＰＰＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ２鎖に結合するが、
ＡＩＥＬＶＰＥＨＱＴＶＰＶＳＩＧＶＰＡＴＬＲＣＳＭＫＧＥＡＩＧＮＹＹＩＮＷＹＲＫＴＱＧＮＴＭＴＦＩＹＲＥＫＤＩＹＧＰＧＦＫＤＮＦＱＧＤＩＤＦＬＮＮＱＡＶＬＮＩＬＥＡＳＥＲＤＥＧＳＹＹＣＡＣＤＰＬＧＧＰＰＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ２鎖には結合しない。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ２のアミノ酸２８〜３８（ＥＡＩＧＮＹＹ）からなるエピトープである。このエピトープは、本明細書においてビン２δ２エピトープと呼称される。いくつかの事例では、ビン２δ２エピトープに結合する活性化剤は、Ｖδ２にＧ３５突然変異、例えばＧ３５Ｓ突然変異を含有するエピトープには結合しない。ビン２δ２エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、１５Ｄが挙げられる。
【０２５３】
いくつかの事例では、ビン２δ２エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＩＥＬＶＰＥＨＱＴＶＰＶＳＩＧＶＰＡＴＬＲＣＳＭＫＧＥＡＩＧＮＹＹＩＮＷＹＲＫＴＱＧＮＴＭＴＦＩＹＲＥＫＤＩＹＧＰＧＦＫ．ＤＮＦＱＧＤＩＤＩＡＫＮＬＡＶＬＫＩＬＡＰＳＥＲＤＥＧＳＹＹＣＡＣＤＰＬＧＧＰＰＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ２鎖に結合するが、
ＡＩＥＬＶＰＥＨＱＴＶＰＶＳＩＧＶＰＡＴＬＲＣＳＭＫＧＤＳＩＳＮＹＹＴＦＷＹＲＲＴＰＧＮＴＭＴＬＩＹＲＥＧＧＴＹＧＰＧＦＥＤＮＬＱＧＥＩＤＦＬＮＮＱＡＶＬＮＩＬＥＡＳＥＲＤＥＧＳＹＹＣＡＣＤＰＬＧＧＰＰＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ２鎖には結合しない。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ２のアミノ酸７２〜８３（ＫＤＮＦＱＧＤＩＤＩＡ）からなるエピトープである。このエピトープは、本明細書においてビン３δ２エピトープと呼称される。ビン３δ２エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、δ２−３２が挙げられる。
【０２５５】
いくつかの事例では、ビン３δ２エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＩＥＬＶＰＥＨＱＴＶＰＶＳＩＧＶＰＡＴＬＲＣＳＭＫＧＥＡＩＧＮＹＹＩＮＷＹＲＫＴＱＧＮＴＭＴＦＩＹＲＥＫＤＩＹＧＰＧＦＫ．ＤＮＦＱＧＤＩＤＩＡＫＮＬＡＶＬＫＩＬＡＰＳＥＲＤＥＧＳＹＹＣＡＣＤＰＬＧＧＰＰＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ２鎖に結合するが、
ＡＩＥＬＶＰＥＨＱＴＶＰＶＳＩＧＶＰＡＴＬＲＣＳＭＫＧＥＡＩＧＮＹＹＩＮＷＹＲＫＴＱＧＮＴＭＴＦＩＹＲＥＫＤＩＹＧＰＧＦＥＤＮＬＱＧＥＩＤＦＬＮＮＱＡＶＬＮＩＬＥＡＳＥＲＤＥＧＳＹＹＣＡＣＤＰＬＧＧＰＰＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ２鎖には結合しない。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、関心対象の活性化剤によって（例えば特異的に）認識されるエピトープは、ヒトＶδ２のアミノ酸１〜２７（ＡＩＥＬＶＰＥＨＱＴＶＰＶＳＩＧＶＰＡＴＬＲＣＳＭＫＧ）からなるエピトープである。このエピトープは、本明細書においてビン４δ２エピトープと呼称される。ビン４δ２エピトープに結合する活性化剤の例としては、限定されないが、δ２−１４、δ２−２２、δ２−３０、δ２−３１、δ２−３６、及びδ２−３７が挙げられる。
【０２５７】
いくつかの事例では、ビン４δ２エピトープに結合する活性化剤は、
ＡＩＥＬＶＰＥＨＱＴＶＰＶＳＩＧＶＰＡＴＬＲＣＳＭＫＧＥＡＩＧＮＹＹＩＮＷＹＲＫＴＱＧＮＴＭＴＦＩＹＲＥＫＤＩＹＧＰＧＦＫ．ＤＮＦＱＧＤＩＤＩＡＫＮＬＡＶＬＫＩＬＡＰＳＥＲＤＥＧＳＹＹＣＡＣＤＰＬＧＧＰＰＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ２鎖に結合するが、
ＡＶＴＬＶＰＱＮＱＡＲＳＶＳＶＧＥＳＶＴＬＲＣＳＭＫＧＤＳＩＳＮＹＹＴＦＷＹＲＲＴＰＧＮＴＭＴＬＩＹＲＥＧＧＴＹＧＰＧＦＥＤＮＬＱＧＥＩＤＦＬＮＮＱＡＶＬＮＩＬＥＡＳＥＲＤＥＧＳＹＹＣＡＣＤＰＬＧＧＰＰＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列を有するγδＴＣＲのδ２鎖には結合しない。
【０２５８】
本明細書に記載のδ２特異的抗体は、δ１含有γδＴＣＲよりもδ２含有γδＴＣＲに対して選択的に結合する。このため、上記δ２特異的抗体は、例えば、
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＴＧＶＲＧＬＱＤＴＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰ
の配列及び／または当該配列を含むγδＴＣＲには結合しない。
【０２５９】
総じて、本明細書に記載のδ１−及びδ２−特異的抗体は、γδＴＣＲに関連する配座エピトープを認識する。いくつかの事例では、本明細書に記載のδ１−及びδ２−特異的抗体は、それぞれγδ１−またはγδ２−ＴＣＲの１つ以上の対に対して特異的である。例えば、いくつかの事例では、本明細書に記載のδ１特異的抗体は、γ８δ１ＴＣＲに対して特異的である。いくつかの事例では、本明細書に記載のδ１特異的抗体は、γ８δ１ＴＣＲに結合するが、γ９δ１ＴＣＲには結合しない。
【０２６０】
処置方法
非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物を含有する、本明細書に記載の医薬組成物は、予防及び／または治療処置のために投与され得る。治療用途では、疾患または症状を既に患っている対象に、疾患または症状の症候を治癒させるかまたは少なくとも部分的に阻止するのに十分な量の組成物を投与することができる。症状の発症、罹患または悪化の可能性を低くするために非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物を投与することもできる。治療に使用する非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物の有効量は、疾患または症状の重症度及び経過、以前の療法、対象の健康状態、体重及び／または薬物への応答、及び／または処置する医師の判断に基づいて様々であり得る。
【０２６１】
本開示の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、症状の処置を必要とする対象を処置するために使用されることができる。症状の例としては、がん、感染症、自己免疫障害及び敗血症が挙げられる。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー及びその他の類人猿ならびにサル種；畜産動物、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；飼育動物、例えば、ウサギ、イヌ及びネコ；実験動物、例えば齧歯動物、例えば、ラット、マウス及びモルモットなどであり得る。対象は任意の年齢であり得る。対象は、例えば、高齢成体、成体、青年、少年、小児、幼年、乳児であり得る。
【０２６２】
本発明の濃縮γδＴ細胞集団によって対象の症状（例えば病気）を処置する方法は、対象に非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物を治療的有効量投与することを含み得る。本開示の濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、様々な投薬計画（例えば、タイミング、濃度、投薬量、処置間隔、及び／または剤形）で投与され得る。本開示の濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物を受ける前の対象を例えば化学療法、放射線またはその両方の併用によって前処置することもできる。処置の一部として非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物を第１投薬計画において対象に投与してもよく、第１投薬計画において処置が治療有効性の所与のレベルを満たしているか否かを判定すべく対象を追跡評価してもよい。いくつかの事例では、操作型γδＴ細胞または別の操作型γδＴ細胞を第２投薬計画において対象に投与してもよい。図２は、対象を処置する方法を模式的に示す。第１操作２０１では、所与の症状（例えば、がん）を有するかまたはその疑いのある対象に少なくとも１つの操作型γδＴ細胞を投与する。第１投薬計画において操作型γδＴ細胞を投与してもよい。第２操作２０２では、対象は例えば医療提供者（例えば、処置する医師または看護師）によって追跡評価され得る。ある例においては、対象は、対象の症状の処置における操作型γδＴ細胞の有効性を決定または測定するために追跡評価される。ある状況では、対象におけるγδＴ細胞集団の生体内増殖を判定するために対象を追跡評価してもよい。次に、第３操作２０３では、少なくとも１つの他の操作型γδＴ細胞を第２投薬計画において対象に投与する。第２投薬計画は、第１投薬計画と同じであってもよいし、または第１投薬計画とは異なっていてもよい。ある状況においては、例えば第１操作２０１における操作型γδＴ細胞の投与が効果的である（例えば、症状を処置するのに１回目の投与で十分であり得る）と判明している場合には、第３操作２０３を実施しない。同種異系で普遍的なドナー特性ゆえに、操作型γδＴ細胞の集団は、種々のＭＨＣハプロタイプを有する様々な対象に投与され得る。操作型γδＴ細胞は、対象に投与される前に冷凍または凍結保存され得る。
【０２６３】
γδＴ細胞（すなわち操作型または非操作型）の濃縮集団及び／またはその混合物は、対象に投与される前に冷凍または凍結保存されてもよい。特定の実施形態では、操作型濃縮γδＴ細胞の集団は、同一の腫瘍認識部分、異なる腫瘍認識部分、または同一の腫瘍認識部分と異なる腫瘍認識部分との組み合わせを発現する２つ以上の細胞を含み得る。例えば、操作型濃縮γδＴ細胞の集団は、異なる抗原、または同じ抗原の異なるエピトープを認識するように設計されたいくつかの別個の操作型γδＴ細胞を含み得る。例えば、メラノーマに罹患しているヒト細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１がん遺伝子を発現し得る。ヒトの中の感染細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１腫瘍性タンパク質をより小さい断片にプロセシングすることができ、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の様々な部分を抗原認識のために提示することができる。操作型濃縮γδＴ細胞の集団は、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の異なる部分を認識するように設計された異なる腫瘍認識部分を発現する様々な操作型γδＴ細胞を含むことができる。図３は、メラノーマ抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１の異なるエピトープを認識する操作型γδＴ細胞の集団によって対象を処置する方法を模式的に示す。第１操作３０１では、同じ抗原の異なるエピトープを認識する操作型γδＴ細胞の集団を選択する。例えば、操作型γδＴ細胞の集団は、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の異なる部分を認識する異なる腫瘍認識部分を発現している２つ以上の細胞を含み得る。第２操作３０２では、操作型γδＴ細胞の集団が第１投薬計画において投与され得る。第２操作３０３では、対象は例えば医療提供者（例えば、処置する医師または看護師）によって追跡評価され得る。
【０２６４】
本開示の濃縮γδＴ細胞集団、すなわち非操作型または操作型の当該集団、及び／またはその混合物は、様々な症状を処置するために使用され得る。いくつかの事例では、本開示の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、固形腫瘍及び血液悪性腫瘍を含めたがんを処置するために使用され得る。がんの非限定的な例としては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、神経芽腫、基底細胞癌腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、例えば、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視路視床下部神経膠腫、乳癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明の癌腫、中枢神経リンパ腫、小脳星細胞腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、膵島細胞癌腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、例えば非小細胞及び小細胞肺癌、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、メラノーマ、中皮腫、原発不明の転移性扁平頸部癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維組織球腫、卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓癌、膵島細胞癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、クロム親和性細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞性新生物、中枢神経原発リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫、腎盂及び尿管移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、皮膚メルケル細胞癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌腫、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉癌、胸腺腫、胸腺癌腫、甲状腺癌、栄養膜腫瘍（妊娠性）、原発部位不明のがん、尿道癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。
【０２６５】
いくつかの事例では、本開示の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、感染症を処置するために使用され得る。感染症は、例えば、病原性細菌またはウイルスによって引き起こされ得る。様々な病原性タンパク質、核酸、脂質またはその断片が疾患細胞で発現し得る。抗原提示細胞は、そのような病原性分子を例えば食作用または受容体媒介性エンドサイトーシスによって内在化させることができ、適切なＭＨＣ分子に結合した抗原断片を提示することができる。例えば、病原性タンパク質の様々な９ｍｅｒ断片がＡＰＣによって提示され得る。本開示の操作型濃縮γδＴ細胞は、病原性細菌またはウイルスの様々な抗原及び抗原断片を認識し得る。病原性細菌の非限定的な例は、ａ）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、例えばＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ種；ｂ）Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、例えばＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ種；ｃ）Ｂｒｕｃｅｌｉａ属、例えばＢｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌａ  ｍｅｌｉｔｅｒｉｓｉｓ、及び／またはＢｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ種；ｄ）Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、例えばＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ種；ｅ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ及びＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ属、例えばＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、及び／またはＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ種；ｆ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ種；ｇ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ種；ｈ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、例えばＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、及び／またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ種；ｉ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ種；ｊ）Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、例えばＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ種；ｋ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ種など；ｌ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、例えばＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ種；ｍ）Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、例えばＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ種；ｎ）Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、例えばＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ種；ｏ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種；ｐ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、及び／またはｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ種；ｑ）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、例えばＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ種；ｒ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉａ種；ｓ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ���ｅｒｕｇｉｎｏｓａ種；ｔ）Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、例えばＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ種；ｕ）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ及び／またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ種；ｖ）Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、例えばＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ種；ｗ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、及び／またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ種；ｘ）Ｓｔｒｅｐｔｐｃｏｃｃｕｓ属、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、及び／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ種；ｙ）Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、例えばＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ種；ｚ）Ｖｉｂｒｉｏ属、例えばＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ；及び／またはａａ）Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、例えばＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ種に見出すことができる。
【０２６６】
いくつかの事例では、本開示の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはその混合物は感染症を処置するために使用され得、感染症はウイルスによって引き起こされるものであり得る。ウイルスの非限定的な例は、以下のウイルスの科に見出すことができ、典型的な種と共に示す：ａ）Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えばアデノウイルス種；ｂ）Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型種；ｃ）Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科、例えばヒトパピローマウイルス種；ｄ）Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス種；ｅ）Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科、例えば天然痘種；ｆ）Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科、例えばＢ型肝炎ウイルス種；ｇ）Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ヒトボカウイルス、パルボウイルスＢ１９種；ｈ）Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ヒトアストロウイルス種；ｉ）Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科、例えばノーウォークウイルス種；ｊ）Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、黄熱ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス種；ｋ）Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科、例えば風疹ウイルス種；ｌ）Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ科、例えばＥ型肝炎ウイルス種；ｍ）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）種；ｎ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｗ科、例えばインフルエンザウイルス種；ｏ）Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、及び／またはサビアウイルス種；ｐ）Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ科、例えばクリミア・コンゴ出血熱ウイルス種；ｑ）Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えばエボラウイルス及び／またはマールブルグウイルス種；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス及び／またはニパウイルス種；ｒ）Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ属、例えば狂犬病ウイルス種；ｓ）Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えばロタウイルス、オルビウイルス、コルチウイルス及び／またはバンナウイルス種。いくつかの例では、ウイルスは、Ｄ型肝炎など、ウイルス科に割り当てられないものである。
【０２６７】
いくつかの事例では、本開示の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、免疫疾患、例えば自己免疫疾患を処置するために使用され得る。自己免疫疾患を含めた炎症性疾患は、Ｂ細胞障害に関連する疾患の部類でもある。自己免疫症状を含めた免疫疾患または症状の例としては、関節リウマチ、リウマチ熱、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、乾癬、ぶどう膜炎、真性糖尿病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、狼瘡腎炎、湿疹、強皮症、多発性筋炎／強皮症、多発性筋炎／皮膚筋炎、潰瘍性直腸炎（ｕｎｃｅｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｉｔｉｓ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ディ・ジョージ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、季節性アレルギー、通年性アレルギー、食物アレルギー、アナフィラキシー、肥満細胞症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、脾機能亢進症、白血球接着不全症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、選択的免疫グロブリンＡ欠損症、高ＩｇＭ症候群、ＨＩＶ、自己免疫性リンパ増殖症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、慢性肉芽腫症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、高免疫グロブリンＥ症候群、橋本甲状腺炎、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、多形性紅斑、ｇＡ腎症、高安動脈炎、アジソン病、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、慢性活動性肝炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡（ｐａｍｐｈｉｇｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発筋痛症、悪性貧血（ｐｅｒａｉｃｉｏｕｓａｎｅｍｉａ）、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、線維化肺胞炎、及びがんが挙げられる。
【０２６８】
本開示のγδＴ細胞集団及び／またはその混合物による処置は、症状の臨床的発症の前、間及び後に対象に提供され得る。処置は、疾患の臨床的発症から１日後、１週間、６ヶ月後、１２ヶ月後または２年後に対象に提供され得る。処置は、疾患の臨床的発症の後、１日間、１週間、１ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間またはそれ以上にわたって対象に提供され得る。処置は、疾患の臨床的発症の後、１日未満、１週間未満、１ヶ月未満、６ヶ月未満、１２ヶ月未満または２年未満にわたって対象に提供され得る。処置は治験でヒトを処置することも含み得る。処置は、本開示の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物を対象に投与することを含むことができる。
【０２６９】
いくつかの事例では、本開示の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物の対象への投与は、対象の体内での内在性リンパ球の活性を調節する。いくつかの事例では、非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物の対象への投与は、内在性Ｔ細胞に抗原を提供し、免疫応答を増強し得る。いくつかの事例では、メモリーＴ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの事例では、メモリーＴ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの事例では、非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物の対象への投与は、別の免疫細胞の細胞傷害性を活性化させる。いくつかの事例では、他の免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの事例では、他の免疫細胞は、ナチュラルキラーＴ細胞である。いくつかの事例では、非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物の対象への投与は、調節性Ｔ細胞を抑制する。いくつかの事例では、調節性Ｔ細胞は、Ｆｏｘ３＋Ｔｒｅｇ細胞である。いくつかの事例では、調節性Ｔ細胞は、Ｆｏｘ３−Ｔｒｅｇ細胞である。本開示の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物によって活性を調節されることができる細胞の非限定的な例としては、造血幹細胞、Ｂ細胞、ＣＤ４、ＣＤ８、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）、樹状細胞、例えば樹状抗原提示細胞、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、マクロファージ、メモリーＢ細胞、メモリーＴ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中性顆粒球、Ｔヘルパー細胞、及びＴキラー細胞が挙げられる。
【０２７０】
大抵の骨髄移植の間、対象の免疫系による移植物中の造血幹細胞（ＨＳＣ）の拒絶反応を防止するためにシクロホスファミドと全身照射との組合せが慣例的に採用される。いくつかの事例では、生体外でのドナー骨髄とインターロイキン−２（ＩＬ−２）とのインキュベーションを実施して骨髄でのキラーリンパ球の産生を強化する。インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、野生型リンパ球の成長、増殖及び分化に必要とされるサイトカインである。ヒトにγδＴ細胞を養子移入する現在の研究は、γδＴ細胞とインターロイキン−２との共投与を要求し得る。しかしながら、低投薬量及び高投薬量のＩＬ−２はどちらも有毒な副作用を有し得る。ＩＬ−２毒性は、多数の臓器／系、最も顕著には心臓、肺、腎臓及び中枢神経系において顕在化し得る。いくつかの事例では、本開示は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２またはＩＬ−２１の共投与を伴わずに非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物を対象に投与する方法を提供する。いくつかの事例では、非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、ＩＬ−２の共投与を伴わずに対象へ投与されることができる。いくつかの事例では、非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、骨髄移植などの手順の間に、ＩＬ−２の共投与を伴わずに対象へ投与される。
【０２７１】
投与方法
本発明の１つまたは多数の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、任意の順序で、または同時に対象へ投与されることができる。同時の場合、本発明の多数の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物を、静脈注射などの単回分の１まとまりの形態で、または多回分形態で、例えば、多回分の静脈内点滴、皮下注射もしくは錠剤として、提供することができる。本発明の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、単一のパッケージまたは複数のパッケージに一緒または別々に包装することができる。本発明の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物のうちの１つまたは全てを多回用量で与えることができる。同時でない場合、多回用量間のタイミングは、約１週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月または約１年もの長さまで様々であり得る。いくつかの事例では、本発明の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、対象への投与の後に対象の体内で生体内増殖することができる。非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、冷凍されて、同じ細胞製剤による多回処置のための細胞を提供することができる。本開示の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物、ならびにそれを含む医薬組成物は、キットとして包装されることができる。キットは、非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物ならびにそれを含む医薬組成物の使用に関する取扱説明（例えば、取扱説明書）を含み得る。
【０２７２】
いくつかの事例では、がんを処置する方法は、治療的有効量の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物を対象に投与することを含み、当該投与によってがんが処置される。いくつかの実施形態では、治療的有効量の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、少なくとも約１０秒間、３０秒間、１分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間または１年間にわたって投与される。いくつかの実施形態では、治療的有効量の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、少なくとも１週間にわたって投与される。いくつかの実施形態では、治療的有効量の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、少なくとも２週間にわたって投与される。
【０２７３】
本明細書に記載の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、疾患または症状の発生の前、間または後に投与されることができ、非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物を含有する医薬組成物を投与するタイミングは様々であり得る。例えば、非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、予防薬として使用されることができ、疾患または症状の発生の可能性を低くするために症状または疾患の傾向を有する対象に継続的に投与されることができる。非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、症候の発症の間、またはその後できるだけ早く、対象へ投与され得る。非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物の投与は、症候発症時まで、症候発症後の最初の３時間以内、症候発症後の最初の６時間以内、症候発症後の最初の２４時間以内、症候発症から４８時間以内、または症候発症から任意の時間までに、早急に開始され得る。初回投与は、任意の実用的経路によって、例えば本明細書に記載の任意の剤形を使用して本明細書に記載の任意の経路によって行うことができる。いくつかの事例では、本開示の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物の投与は、静脈内投与である。非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物の１回分または多回分の投薬量は、がん、感染症、免疫疾患、敗血症の発症後に実施可能になり次第、または骨髄移植と共に、かつ免疫疾患の処置に必要な長さの時間にわたって、例えば、約２４時間〜約４８時間、約４８時間〜約１週間、約１週間〜約２週間、約２週間〜約１ヶ月間、約１ヶ月間〜約３ヶ月間にわたって、投与され得る。がんの処置のためには、非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物の１回分または多回分の投薬量を、がんの発症から数年後であって他の処置の前または後に投与することができる。いくつかの例では、非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物を少なくとも約１０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間にわたって投与することができる。処置の長さは対象ごとに異なり得る。
【０２７４】
投薬量
本明細書において開示される非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、正確な投薬量の単回投与に適した単位剤形として製剤化され得る。いくつかの事例では、単位剤形はさらなるリンパ球を含む。単位剤形では製剤が、１つ以上の化合物を適切な量で含有する単位用量に分割されている。単位投薬量は、製剤の個々の量を含有するパッケージの形態とすることができる。非限定的な例は、包装された錠剤またはカプセル、及びバイアルまたはアンプルに入った粉末である。水性懸濁液組成物は単回用量の再封不可能容器に入れることができる。多回用量の再封可能容器を、例えば保存料と組み合わせて、または保存料なしで使用することができる。いくつかの例では、医薬組成物は保存料を含まない。非経口注射用製剤は、単位剤形、例えばアンプルで、または保存料と共に多回用量容器で提供することができる。
【０２７５】
本明細書に記載の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、少なくとも５細胞、少なくとも１０細胞、少なくとも２０細胞、少なくとも３０細胞、少なくとも４０細胞、少なくとも５０細胞、少なくとも６０細胞、少なくとも７０細胞、少なくとも８０細胞、少なくとも９０細胞、少なくとも１００細胞、少なくとも２００細胞、少なくとも３００細胞、少なくとも４００細胞、少なくとも５００細胞、少なくとも６００細胞、少なくとも７００細胞、少なくとも８００細胞、少なくとも９００細胞、少なくとも１×１０３細胞、少なくとも２×１０３細胞、少なくとも３×１０３細胞、少なくとも４×１０３細胞、少なくとも５×１０３細胞、少なくとも６×１０３細胞、少なくとも７×１０３細胞、少なくとも８×１０３細胞、少なくとも９×１０３細胞、少なくとも１×１０４細胞、少なくとも２×１０４細胞、少なくとも３×１０４細胞、少なくとも４×１０４細胞、少なくとも５×１０４細胞、少なくとも６×１０４細胞、少なくとも７×１０４細胞、少なくとも８×１０４細胞、少なくとも９×１０４細胞、少なくとも１×１０５細胞、少なくとも２×１０５細胞、少なくとも３×１０５細胞、少なくとも４×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも６×１０５細胞、少なくとも７×１０５細胞、少なくとも８×１０５細胞、少なくとも９×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも３×１０６細胞、少なくとも４×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも６×１０６細胞、少なくとも７×１０６細胞、少なくとも８×１０６細胞、少なくとも９×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも２×１０７細胞、少なくとも３×１０７細胞、少なくとも４×１０７細胞、少なくとも５×１０７細胞、少なくとも６×１０７細胞、少なくとも７×１０７細胞、少なくとも８×１０７細胞、少なくとも９×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも２×１０８細胞、少なくとも３×１０８細胞、少なくとも４×１０８細胞、少なくとも５×１０８細胞、少なくとも６×１０８細胞、少なくとも７×１０８細胞、少なくとも８×１０８細胞、少なくとも９×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞またはそれより多い量で組成物中に存在し得る。
【０２７６】
本発明の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物の治療的有効用量は、約１細胞〜約１０細胞、約１細胞〜約１００細胞、約１細胞〜約１０細胞、約１細胞〜約２０細胞、約１細胞〜約３０細胞、約１細胞〜約４０細胞、約１細胞〜約５０細胞、約１細胞〜約６０細胞、約１細胞〜約７０細胞、約１細胞〜約８０細胞、約１細胞〜約９０細胞、約１細胞〜約１００細胞、約１細胞〜約１×１０３細胞、約１細胞〜約２×１０３細胞、約１細胞〜約３×１０３細胞、約１細胞〜約４×１０３細胞、約１細胞〜約５×１０３細胞、約１細胞〜約６×１０３細胞、約１細胞〜約７×１０３細胞、約１細胞〜約８×１０３細胞、約１細胞〜約９×１０３細胞、約１細胞〜約１×１０４細胞、約１細胞〜約２×１０４細胞、約１細胞〜約３×１０４細胞、約１細胞〜約４×１０４細胞、約１細胞〜約５×１０４細胞、約１細胞〜約６×１０４細胞、約１細胞〜約７×１０４細胞、約１細胞〜約８×１０４細胞、約１細胞〜約９×１０４細胞、約１細胞〜約１×１０５細胞、約１細胞〜約２×１０５細胞、約１細胞〜約３×１０５細胞、約１細胞〜約４×１０５細胞、約１細胞〜約５×１０５細胞、約１細胞〜約６×１０５細胞、約１細胞〜約７×１０５細胞、約１細胞〜約８×１０５細胞、約１細胞〜約９×１０５細胞、約１細胞〜約１×１０６細胞、約１細胞〜約２×１０６細胞、約１細胞〜約３×１０６細胞、約１細胞〜約４×１０６細胞、約１細胞〜約５×１０６細胞、約１細胞〜約６×１０６細胞、約１細胞〜約７×１０６細胞、約１細胞〜約８×１０６細胞、約１細胞〜約９×１０６細胞、約１細胞〜約１×１０７細胞、約１細胞〜約２×１０７細胞、約１細胞〜約３×１０７細胞、約１細胞〜約４×１０７細胞、約１細胞〜約５×１０７細胞、約１細胞〜約６×１０７細胞、約１細胞〜約７×１０７細胞、約１細胞〜約８×１０７細胞、約１細胞〜約９×１０７細胞、約１細胞〜約１×１０８細胞、約１細胞〜約２×１０８細胞、約１細胞〜約３×１０８細胞、約１細胞〜約４×１０８細胞、約１細胞〜約５×１０８細胞、約１細胞〜約６×１０８細胞、約１細胞〜約７×１０８細胞、約１細胞〜約８×１０８細胞、約１細胞〜約９×１０８細胞、または約１細胞〜約１×１０９細胞であり得る。
【０２７７】
いくつかの事例では、本発明の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物の治療的有効用量は、約１×１０３細胞〜約２×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約３×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約４×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約５×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約６×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約７×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約８×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約９×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約１×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約２×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約３×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約４×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約５×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約６×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約７×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約８×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約９×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約１×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約２×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約３×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約４×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約５×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約６×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約７×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約８×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約９×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約１×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約２×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約３×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約４×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約５×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約６×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約７×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約８×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約９×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約１×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約２×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約３×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約４×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約５×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約６×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約７×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約８×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約９×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約１×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約２×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約３×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約４×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約５×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約６×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約７×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約８×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約９×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約１×１０９細胞であり得る。
【０２７８】
いくつかの事例では、本発明の非操作型濃縮γδＴ細胞集団、操作型濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物の治療的有効用量は、約１×１０６細胞〜約２×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約３×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約４×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約５×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約６×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約７×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約８×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約９×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約１×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約２×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約３×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約４×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約５×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約６×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約７×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約８×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約９×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約１×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約２×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約３×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約４×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約５×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約６×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約７×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約８×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約９×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約１×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約２×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約３×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約４×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約５×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約６×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約７×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約８×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約９×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約１×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約２×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約３×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約４×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約５×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約６×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約７×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約８×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約９×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約１×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約２×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約３×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約４×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約５×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約６×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約７×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約８×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約９×１０９細胞、または約１×１０９細胞〜約１×１０１０細胞であり得る。
【０２７９】
保存
いくつかの実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団及び／またはその混合物は、冷凍用培地で製剤化されて、少なくとも約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年または少なくとも５年の長期保管のために液体窒素冷凍庫（−１９５℃）または超低温冷凍庫（−６５℃、−８０℃または、−１２０℃）などの凍結保管ユニット内に置かれ得る。冷凍用培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び／または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及び／またはデキストロース及び／またはデキストランサルフェート及び／またはヒドロキシエチルデンプン（ｈｙｄｒｏｙｅｔｈｙｌ  ｓｔａｒｃｈ）（ＨＥＳ）を生理学的ｐＨ緩衝剤と共に含有してｐＨを約６．０〜約６．５、約６．５〜約７．０、約７．０〜約７．５、約７．５〜約８．０または約６．５〜約７．５に維持することができる。凍結保存されたγδＴ細胞は、解凍されて、本明細書に記載の抗体、タンパク質、ペプチド及び／またはサイトカインによる刺激によってさらに処理されることができる。凍結保存されたγδＴ細胞は、解凍されて、本明細書に記載のウイルスベクター（レトロウイルス及びレンチウイルスベクターを含む）または非ウイルス的手段（ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質を含む）によって遺伝子改変されることができる。あるいは、非操作型γδＴ細胞を本明細書に記載の方法によって増殖させて、遺伝子改変して、凍結保存することができる。
【０２８０】
このようにして、遺伝子操作型及び／または非操作型γδＴ細胞をさらに凍結保存して、凍結溶媒地中１ｍＬあたり少なくとも約１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９または少なくとも約１０１０細胞の、少なくとも１、５、１０、１００、１５０、２００、５００バイアルの量の細胞バンクを生成することができる。凍結保存された細胞バンクは、その機能性を保持し得、解凍されてさらに刺激され増殖することができる。いくつかの態様では、解凍された細胞を細胞培養バッグ及び／またはバイオリアクターなどの適切な閉鎖容器内で刺激して増殖させて、多量の細胞を同種異系細胞製品として作り出すことができる。凍結保存されたγδＴ細胞は、凍結保管条件下でその生物学的機能を少なくとも約６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１５ヶ月間、１８ヶ月間、２０ヶ月間、２４ヶ月間、３０ヶ月間、３６ヶ月間、４０ヶ月間、５０ヶ月間または少なくとも約６０ヶ月間にわたって維持することができる。いくつかの態様では、製剤に保存料を使用しない。凍結保存されたγδＴ細胞は、解凍されて、同種異系の在庫細胞製品として多数の患者に点滴されることができる。
【０２８１】
本明細書中で言及する全ての刊行物及び特許は、参照によりそれらの全体が、例えば本明細書に記載の本発明に関連して用いられる可能性のある当該刊行物に記載の構築物及び方法論を記述及び開示することを目的として本明細書に援用される。本明細書において述べられている刊行物は、単に本願の出願日の前でのその開示のために提供されているに過ぎない。本明細書中のいかなるものも、本明細書に記載の本発明者らが先行発明またはその他任意の理由のためにそのような開示に先行する権利を有さないということの承認として解釈されるべきではない。
【０２８２】
本発明を以下の非限定的な実施例によってより詳しく説明する。
【実施例】
【０２８３】
実施例１．初代細胞の単離、消化及び培養
アフェレーシス機械を使用して健常ドナーから初代ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採集する。Ｆｉｃｏｌｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）システムまたは同様のシステムを使用してＰＢＭＣを精製する。その後、細胞を適切な成長培地中に再懸濁させる。
【０２８４】
あるいは、末梢血、臍帯血、骨髄、正常組織、または疾患に罹患した組織、例えば、がん組織から末梢血初代ヒト細胞を採集する。
【０２８５】
健常ドナーからの組織
健常ドナーからの新鮮な組織を、Ｔｈｅ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から受け取り、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で研究所へ搬送する。外科用メスで組織を１〜３ｍｍ３の切片に薄切する。２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）において、ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０％のヒトＡＢ血清及び１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２が補充された２ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０中に２〜５切片／ウェルを入れるかまたは下記のとおりに消化する。プレートを加湿インキュベータ内で３７℃及び空気中５％のＣＯ２でインキュベートする。リンパ球の増殖を追跡するために培養物を１日おきに検査する。培養開始後７日ごとに全てのウェルにおいて培地の半分を入れ替える。密に敷き詰められたリンパ球が切片の周囲を覆っているとき、または下記のとおり消化組織に由来するリンパ球集団が適度な濃度に達したときに、リンパ球を採集する。
【０２８６】
組織の酵素的消化
健常ドナーからの新鮮な組織試料を、Ｔｈｅ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から受け取り、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で研究所へ搬送した。２酵素ブレンドであるＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）ＤＬ研究用（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）ＴＭ研究用（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、またはｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離装置を備えたＭｉｌｔｅｎｙｉ腫瘍解離キット（１３０−０９５−９２９）を使用して酵素的消化によってリンパ球を単離した。
【０２８７】
組織を２〜３ｍｍ３の切片に切断し、３７℃及び５％ＣＯ２で１時間消化した。消化された細胞懸濁液を４０ミクロンフィルターに通し、遠心沈降させ、ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。細胞を計数し、１０％のヒトＡＢ血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）及び１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２が補充されたＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中に再懸濁させた。採集した細胞集団を０．５〜１×１０６細胞／ｍｌで２４ウェル組織培養プレートに播種した。細胞が１．５×１０６細胞／ｍｌの濃度を超えたときに細胞を分割してＲＰＭＩ−ＩＬ２含有培地に入れた。
【０２８８】
腫瘍検体の培養
結腸、乳房、卵巣、腎臓、頭頸部、口腔、膵臓及び肝臓のものを含めた原発性及び転移性のがんを有する患者からの新鮮な腫瘍検体を、Ｔｈｅ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から受け取り、ＲＰＭＩ培地中で研究所へ搬送した。外科用メスで腫瘍検体を１〜３ｍｍ３の切片に薄切した。２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）において、ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０％のヒトＡＢ血清及び１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２が補充された２ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０中に２〜５切片／ウェルを入れた。プレートを加湿インキュベータ内で３７℃及び空気中５％のＣＯ２でインキュベートした。リンパ球の増殖を追跡するために培養物を１日おきに検査した。培養開始後７日ごとに全てのウェルにおいて培地の半分を入れ替えた。密に敷き詰められたリンパ球が切片の周囲を覆っているときにリンパ球を採集した。
【０２８９】
新鮮な腫瘍検体の酵素的消化
結腸、乳房、卵巣、腎臓、頭頸部、口腔、膵臓及び肝臓のものを含めた原発性及び転移性のがんを有する患者からの新鮮な腫瘍検体を、Ｔｈｅ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から受け取り、ＲＰＭＩ培地中で研究所へ搬送した。酵素ブレンドであるＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）ＤＬ研究用（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）ＴＭ研究用（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、またはｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離装置を備えたＭｉｌｔｅｎｙｉ腫瘍解離キット（１３０−０９５−９２９）を使用して酵素的消化によってリンパ球を単離した。組織を２〜３ｍｍ３の切片に切断し、３７℃及び空気中５％のＣＯ２で１時間消化した。消化された細胞懸濁液を４０ミクロンフィルターに通し、遠心沈降させ、ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。細胞を計数し、１０％のヒトＡＢ血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）及び１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２が補充されたＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中に再懸濁させた。採集した細胞集団を０．５〜１×１０６細胞／ｍｌで２４ウェル組織培養プレートに播種した。細胞が１．５×１０６細胞／ｍｌの濃度を超えたときに細胞を分割してＲＰＭＩ−ＩＬ２含有培地に入れた。
【０２９０】
典型的な血清補充培地中での初代細胞の培養
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して健常ドナーに由来するバッフィーコートからの分離によってＰＢＭＣ集団を生じさせた。２４ウェル組織培養プレートにおいて、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン及び１００ＩＵのｒｈＩＬ−２／ｍｌが補充されたＲＰＭＩ−１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＣｅｌｌＧｒｏ）中１×１０６細胞／ｍＬのＰＢＭＣを培養した。
【０２９１】
末梢血、臍帯血、骨髄、正常組織、または疾患に罹患した組織、例えば前述のがん組織から採集した初代ヒト細胞を成長させるために同様の培養条件を用いることができる。
【０２９２】
典型的な無血清培地中での初代細胞の培養
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して健常ドナーに由来するバッフィーコートからの分離によってＰＢＭＣ集団を生じさせた。２４ウェル組織培養プレートにおいて、ＣＴＳ−ＯｐＴｍｉｚｅｒ補充剤を含むＣＴＳ無血清培地中１×１０６細胞／ｍＬのＰＢＭＣを培養した。
【０２９３】
末梢血、臍帯血、骨髄、正常組織、または疾患に罹患した組織、例えば前述のがん組織から採集した初代ヒト細胞を成長させるために同様の培養条件を用いることができる。
【０２９４】
実施例２：付着している単球ならびにマクロファージならびにＣＤ４＋及びＣＤ８＋のαβＴ細胞の除去
前述したようなアフェレーシス法によってＰＭＢＣを採集し、低張処理、またはＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離法を用いる密度分離によって赤血球を除去する。赤血球不含ＰＢＭＣを、１０段または４０段Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ）、ローラーボトル（Ｎｕｎｃ）などの大型培養容器内でインキュベートする。マクロファージ及び単球を含む付着性集団は、通常は細胞培養容器の表面に結合したままとなる。懸濁集団中で成長した細胞集団はγδＴ細胞が濃縮されている。およそ１０８、１０９または１０１０個のＰＢＭＣを、抗ヒトＣＤ４及び抗ヒトＣＤ８で被覆された鉄含有マイクロビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈマイクロビーズ）と共にインキュベートする。インキュベートした細胞集団を流して磁場に通し、そこにＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞が保持される。「貫流」細胞集団はγδＴ細胞が濃縮されている。
【０２９５】
実施例３：単球及びマクロファージの除去
前述したようなアフェレーシス法によってＰＭＢＣを採集し、低張処理、またはＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離法を用いる密度分離によって赤血球を除去する。赤血球不含ＰＢＭＣを、１０段または４０段Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ）、ローラーボトル（Ｎｕｎｃ）などの大型培養容器内でインキュベートする。単球及びマクロファージは、赤血球が除去されたＰＢＭＣを充填ガラスウールカラムに流すことによって除去される。「貫流」細胞集団は、さらなる処理のためにγδＴ細胞が濃縮されている。
【０２９６】
実施例４：γδＴ細胞の濃縮
前述したようなアフェレーシス法によってＰＭＢＣを採集し、低張処理、またはＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離法を用いる密度分離によって赤血球を除去する。赤血球不含ＰＢＭＣを、１０段または４０段Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ）、ローラーボトル（Ｎｕｎｃ）などの大型培養容器内でインキュベートする。単球及びマクロファージは、実施例２または実施例３に記載の方法のどちらかを用いて除去される。およそ１０８、１０９または１０１０個のＰＢＭＣを、ＣＤ４及びＣＤ８で被覆された鉄含有マイクロビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈマイクロビーズ）と共にインキュベートする。インキュベートした細胞集団を流して磁場に通し、そこに抗ヒトＣＤ４＋及び抗ヒトＣＤ８＋のＴ細胞が保持される。「貫流」細胞集団はγδＴ細胞が濃縮されている。不要な細胞、例えば、ＮＫ、γδＴ細胞、Ｂ細胞、単球及びマクロファージは、不要な細胞種を指向する抗体のカクテルを使用して免疫磁気ビーズ分離（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡｕｔｏＭＡＣＳシステム）によって除去される。
【０２９７】
あるいは、不要な細胞種は、マウス抗ヒトαβＴＣＲ（ＩＰ２６、ＢＷ２４２／４１２）抗体を使用するかまたは、ＮＫ上、αβＴ細胞上、Ｂ細胞上、単球上もしくはマクロファージ上の表面受容体を指向しかつ抗マウスＩｇＧマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  １３０−０４８−４０１）に取り付けられている１つ以上の他の抗体を使用するかまたは、ＮＫ上、αβＴ細胞上、Ｂ細胞上、単球上もしくはマクロファージ上の表面受容体を指向する１つ以上の四量体型抗体複合体もしくは二重特異性抗体を使用するかまたは、それらの組み合わせを使用することによって、除去される。
【０２９８】
抗体による初代細胞からのγδＴ細胞の単離
一例を挙げると、天然γδＴ細胞は、細胞表面マーカーの陽性（つまり、γδＴＣＲ）または陰性（つまり、αβＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６）の発現に基づいてフローサイトメトリー選別によって初代培養物から単離される。
【０２９９】
実施例５．原発腫瘍からのγδＴ細胞の単離
γδＴ細胞を、実施例１で詳述されている方法に従って単離した。手短に述べると、採取して間もない腫瘍検体をＮＣＩ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から入手した。肝臓への結腸腺癌転移癌（ＴＩＬ１）及び腎腫瘍（ＴＩＬ２）をＲＰＭＩ−１６４０培地中で出荷した。平刃を使用して腫瘍組織を大きさ２ｍｍ３の小片に刻み、続いて、２ｍＬのＲＰＭＩ中Ｌｉｂｅｒａｓｅ酵素カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び３０００ユニットのＤＮａｓｅによる消化を記載のとおりに行った。消化後、腫瘍を無菌ガーゼ４０ミクロンナイロン製メッシュで濾過し、ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した。細胞を計数し、Ｌ−グルタミンが補充された１０％のヒトＡＢ血清及び１００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ−１６４０中１×１０６個／ｍｌで２４ウェルプレートに播種した。６日間培養した後に腫瘍内浸潤リンパ球を採集した。γδＴリンパ球の存在をフローサイトメトリーで抗δ１ＴＣＲ（ＦＩＴＣ結合抗Ｖδ１  ＴＳ８．２、（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））及び抗Ｖδ２Ｂ６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって分析した。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって解析した。
【０３００】
図４は、肝臓への結腸腺癌転移癌（ＴＩＬ１）及び腎腫瘍（ＴＩＬ２）から単離したγδ１及びγδ２リンパ球の成長を示すグラフを描写する。これらのリンパ球は、ＣＣＲ４及びＣＣＲ７を発現することが示された（データ示さず）。図４で示されているように、Ｖδ１サブセットは、両タイプの腫瘍から単離された主たる集団であった。
【０３０１】
実施例６．γδＴ細胞の刺激及び増殖
サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、またはＩＬ−３３）、成長因子（インスリン及びトランスフェリン、インスリン様成長因子）、アルブミン、脂質（コレステロール、脂質溶液、脂質前駆体）、ビタミン、銅、鉄、セレン、タンパク質加水分解物、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、及び剪断保護剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）を含有する、Ｅｘ−Ｖｉｖｏ１０（Ｌｏｎｚａ  ０４−３８０Ｑ）、Ｅｘ−Ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ  ０４−７４４Ｑ）、Ｅｘ−Ｖｉｖｏ２０（Ｌｏｎｚａ  ０４−４４８Ｑ）、ＡＩＭＶ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  １２０５５０９１）、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａ１０４８５０１）などの無血清培地中でγδＴ細胞を刺激し、増殖させる。
【０３０２】
本明細書中の実施例に記載の無血清培地には、γδＴ細胞の生物学的機能性を維持しながら懸濁培養（例えば、ＷＡＶＥバイオリアクター）における１０５〜２×１０７細胞／ｍＬの高細胞密度でのγδＴ細胞成長を支援する添加剤を補充することもできる。
【０３０３】
堅牢なγδＴ細胞成長をもたらした追加の添加剤としては、例えば、塩化カルシウム，無水、硝酸カルシウム、硫酸銅，五水和物、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛及び／またはプトレシンが挙げられる。
【０３０４】
血清に取って代わる低レベルの元素成分を供給するために、パラモリブデン酸アンモニウム、バナジウム、マンガン、ニッケル、セレン酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム，九水和物、塩化スズ、塩化アルミニウム、酢酸バリウム、塩化カドミウム、塩化クロム、コバルト、二酸化ゲルマニウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、塩化ルビジウム、硝酸銀、フッ化ナトリウム及び／または塩化ジルコニウムを含む微量金属を無血清培地に供給した。
【０３０５】
細胞培養用培地に追加される、γδＴ細胞の堅牢な成長を支援する他の成分は、例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、ベタイン、タウリン、フォリン酸、エタノールアミン、リノレン酸、オレイン酸ヒドロコルチゾン、ピルベート、植物加水分解物、酵母加水分解物及び／またはβ−メルカプトエタノールである。
【０３０６】
堅牢なγδＴ細胞成長を促進するために追加されるビタミンとしては、例えば、ビオチン（Ｂ７）、Ｄ−パントテン酸カルシウム（Ｂ５）、塩化コリン、シアノコバラミン（Ｂ１２）、葉酸（Ｂ９）、ｉ−イノシトール（ｍｙｏ−イノシトール）、ナイアシンアミド（Ｂ３）、ピリドキサール，一塩酸塩、ピリドキシン，一塩酸塩（Ｂ６）、リボフラビン（Ｂ２）、チアミン及び／または一塩酸塩（Ｂ１）が挙げられる。
【０３０７】
実施例７：増殖済みγδＴ細胞の特性評価：免疫表現型
増殖済みＴ細胞集団は、例えば、異なる集団同士を区別する細胞表面マーカーに対するＦＡＣＳ染色によって特性評価され得る。細胞を、２％のウシ胎仔血清を含有するＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）で１回洗浄し、適量のＭＡｂと共に４℃で３０分間インキュベートし、ＨＢＳＳで再洗浄した。手短に述べると、ＣＤ２、ＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＯＫＴ３）、ＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  クローンＯＫＴ４）、ＣＤ７、ＣＤ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＲＰＡＴ８）、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ９５、ＣＤ１０７、ＩＣＡＭ−１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＫＧ２Ｄ  ＤＲ５、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５  ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、Ｋｉ６７、Ｌ−セレクチン、ＶＬＡ−４、ＪＡＭＬ、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ−４、Ｏｘ４０、ＴＣＲ  Ｖδ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、クローンＴＳ８．２）、またはＴＣＲ  Ｖδ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＢ６）を指向する、フルオロイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリスリン（ＰＥ）と結合したＭＡｂを含有している、体積１００μｌのＦＡＣＳ染色培地（ＦＳＭ；２％のウシ胎仔血清を含有するＨＢＳＳ）中で、１×１０６個の細胞を染色する。
【０３０８】
表面マーカー以外にも、当技術分野で知られている方法に従ってサイトカイン分泌、細胞内サイトカイン及び／または膜結合サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、またはＩＬ−２１を評価してもよい。
【０３０９】
本明細書中の特定の実施形態では、ｚｏｍｂｉｅ  ｖｉｏｌｅｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）アミン染料の非存在または少ない取込みによって生細胞を判定した。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｏｎｅ（ＦＭＯ）対照を使用して各抗原の表面発現の陽性と陰性と区切る境界を画定する。染色された細胞をＳｏｎｙ  ＳＨ８００サイトメータで採集し、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０．１を使用してデータを解析する。フローサイトメトリーデータをドットプロットとして視覚化する。
【０３１０】
実施例８．血清含有培地中及び無血清培地中でのδ２Ｔ細胞増殖
種々のδ２Ｔ細胞の成長及び増殖速度を血清含有培地（Ｒ２：ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）及び無血清培地（ＡＩＭＶ＋ウシアルブミン；ＣＴＳ無血清補充剤）において評価した。図５は、δ２Ｔ細胞の成長を示すグラフを描写する。当実験で使用した培地は全て、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、２ｍＭのグルタミン及び１×のペニシリン／ストレプトマイシンを含有していた。さらに、１、５及び２０μＭのゾレドロン酸で細胞を０日目に刺激した。２〜３日ごとに、さらなるゾレドロン酸を添加せずに培地を補給した。１０６個のＰＢＭＣから増殖したδ２Ｔ細胞の総数、及び１３日間の期間の後における各処理の増殖倍率を図５に示す。これらの結果は、δ２Ｔ細胞を無血清培地中で増殖させることができることを示唆している。
【０３１１】
実施例９．抗γδＴＣＲ抗体の遮断アッセイ及び競合アッセイ
図６及び図７は、抗γδＴＣＲ抗体遮断実験を示すグラフを描写し、図８及び図９は、抗体競合アッセイを描写する。図６及び図７は、様々な抗体、すなわち、５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ３、Ｂ６、ＴＳ−１、γ３．２０、ＩＭＭＵ５１０、または１１Ｆ２と共にＰＢＭＣを前インキュベートした場合の遮断実験の結果を示す。続いて細胞を洗浄し、ＴＳ８．２−ＦＩＴＣ（δ１特異的）またはＢ６−ＰＥ（δ２特異的）二次抗体で染色した。ＰＢＭＣ試料をフローサイトメトリーで分析した。幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）の低下を用いて遮断度合いを見積もった。ＴＳ８．２−ＦＩＴＣ（図６）及びＢ６−ＰＥ（図７）に対する抑制のレベルを図で示す。
【０３１２】
γδ１ＴＣＲ発現細胞株ＢＥ１３に対する結合に関する、ＭＡｂ  ＴＳ−１及びＴＳ８．２と、抗体５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＩＭＭＵ５１０、Ｒ９．１２−２、または１１Ｆ２との競合試験は、１、２または１０μｇの未標識競合抗体（ＩｇＧ１、５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、ＴＳ−１、Ｒ９．１２、ＩＭＭＵ５１０または１１Ｆ２）と、ＦＩＴＣに結合した０．２μｇの抗Ｖδ１ＴＣＲクローンＴＳ８．２（図８）または抗Ｖδ１ＴＣＲクローンＴＳ−１（図９）とを同時に１×１０５個の細胞と共に氷上で３０分間インキュベートすることによって行った。競合％は、幾何平均蛍光の変化を幾何平均蛍光の最大変化で割ることによって算出される。図９で描写されているように、ＴＳ−１抗体は、ＴＳ８．２自体と同じくらい効果的に、細胞に対するＴＳ８．２の結合と競合した。試験した他のどの抗体も、ＴＳ８．２の結合と競合することができなかった。ＴＳ８．２抗体は、ＴＳ−１自体ほど効果的ではないが、細胞に対するＴＳ−１の結合と競合した。ＴＳ−１の結合とのいくらかのレベルの競合は１１Ｆ２抗体においても認められた。これらの結果は、ＴＳ−１抗体及びＴＳ８．２抗体がどちらもγδ１に結合するがしかし同じエピトープには結合していない可能性がある、ということを示唆している。
【０３１３】
実施例１０．腫瘍検体の酵素的消化及び、特異γδエピトープに対する抗体によるγδＴ細胞増殖
２４ウェルプレートに０．５〜１μｇの抗γδＴＣＲ抗体を塗布した。実施例４に記載の消化された腫瘍組織から単離した細胞を計数し、１０％のヒトＡＢ血清及びｒｈＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍＬ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０中０．５〜１×１０６細胞／ｍｌで抗体被覆ウェルに播種した。培養物を３７℃、５％ＣＯ２で７〜２１日間インキュベートした。
【０３１４】
実施例１１．腫瘍検体の酵素的消化及び、特異γδエピトープに対する抗体によるγδＴ細胞増殖
実施例１の「新鮮な腫瘍検体の酵素的消化」の節に記載されている消化された腫瘍組織から単離した細胞を計数し、１０％のヒトＡＢ血清及びｒｈＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍＬ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中０．５〜１×１０６細胞／ｍｌで、３Ｄ細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）超低付着性マルチウェルプレート）の抗体被覆ウェルに播種した。培養物を３７℃、５％ＣＯ２で７〜２１日間インキュベートした。
【０３１５】
実施例１２．ＰＢＭＣからのγδＴ細胞の活性化及び増殖
活性化剤を可溶性薬剤または培養ウェル上に固定された薬剤として試験した。１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で２４ウェルプレートにて培養したヒトＰＢＭＣに、可溶性抗原及び抗体を０．１〜５μｇ／ｍｌの終濃度で添加した。あるいは、同じ抗γδＴＣＲ抗体を、２４ウェル組織培養プレートのウェルに塗布することによって固定した。抗γδＴＣＲ抗体は０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で添加された。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、次いで、上記のＲＰＭＩ−１６４０、ＡＩＭ−ＶまたはＣＴＳ−ＯｐＴｍｉｚｅｒのいずれかの培地中でＰＢＭＣをプレートに移して培養した。培養される培地には１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を補充した。
【０３１６】
具体例を挙げると、０日目にドナーＢ３からの百万個ＰＢＭＣ／ｍｌを、２４ウェルプレートに固定された１ウェルあたり０．５、１及び２μｇの様々な抗体で刺激した。試験した抗体は、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照クローンＭＧ１−４５（Ｂｉｏ  Ｌｅｇｅｎｄ）、ＵＣＨＴ−１、５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、Ｂ３、ＴＳ−１、γ３．２０、７Ａ５、及びゾレドロネートであった。図１０及び図１１は、ＰＢＭＣからのそれぞれδ１及びδ２Ｔ細胞の活性化及び増殖を示すグラフを描写する。細胞は、１０％のＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２、グルタミン及び１×のペニシリンストレプトマイシンと共にＲＰＭＩを含有する培地中で活性化されかつ増殖した。初回刺激後７日目に、細胞を新しい培地に継代し、同じ濃度の同じ抗体で新たに塗布された２４ウェルプレートに入れた。再刺激された培養物の中の培地を１３日目まで２〜３日ごとに補給し、フローサイトメトリーで分析した。
【０３１７】
図１２はδ１Ｔ細胞の総数を示し、図１３は１３日間の成長及び増殖の後でのδ２Ｔ細胞の総数を示す。γδＴ細胞の総数は、δ１及びδ２Ｔ細胞の百分率（それぞれ、ＴＳ８．２−ＦＩＴＣ及びＢ６−ＰＥを使用してフローサイトメトリーで決定した）に生細胞総数を掛け、非特異的マウスＩｇＧ  ＭＧ１−４５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ４０１４０３）によって活性化されたδ１及びδ２Ｔ細胞による陰性対照値を差し引くことにより、算出した。
【０３１８】
細胞増殖のための活性化は、抗体を培養プレート上に固定した場合にのみ得られ、これらの抗体を可溶性形態で培養物に添加した場合には、全ＰＢＭＣ細胞集団における場合を含めて増殖は検出されなかった（データ示さず）。汎γδＴＣＲ  ＭＡｂ  ５Ａ６．Ｅ９及びＢ１は、δ１及びδ２細胞集団のどちらの成長も活性化させた。ＭＡｂ  １５Ｄ及びＢ６は、δ２細胞集団の選択的成長を誘導した。ＭＡｂ  ＴＳ８．２及びＴＳ−１は、δ１細胞集団の選択的成長を誘導した。興味深いのは、ＭＡｂ  ＴＳ−１及びＴＳ８．２が細胞表面ＴＣＲへの結合時に互いに競合するにもかかわらず、ＴＳ−１によって誘導される増殖の方が３倍大きかったということである。同様に、抗体Ｂ１、５Ａ６．Ｅ９、１５Ｄ、Ｂ６及びＢ３において様々な程度のδ２細胞集団増殖誘導が検出された。このデータは、γδ細胞集団の特異的かつ堅牢な増殖を誘発するには独特のエピトープが必要とされることを示唆している。
【０３１９】
実施例１３：ＰＢＭＣからの特異γδＴ細胞集団の活性化及び増殖、ＰＢＭＣからのＶδ１Ｔ細胞の活性化及び増殖
０．２５もしくは１μｇ／ｍＬ（０．２５μｇ／ｍＬの場合のデータを示す）の活性化抗体（ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｒ９．１２、Ｂ６及び１５Ｄ）をプラスチック製２４ウェルプレートに直接固定したか、または２４ウェルプレートにおいて０．０５もしくは０．１ｍｇ／ｍＬ（０．０５μｇ／ｍＬの場合のデータを示す）の当該活性化抗体を、プレートに結合したヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ（５μｇ／ｍＬ）に捕捉させた。１０％のＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２と共にＲＰＭＩを含有する培地中で１×１０６細胞／ｍｌのヒトＰＢＭＣを活性化させた。培養物中の培地は２〜３日ごとに補給した。７日目に、活性化抗体を有さない新しいプレートに細胞を移し、合計１４日間または２３日間にわたって２〜３日ごとに新鮮な培地を補給することによってさらに増殖させた。細胞計数及びフローサイトメトリー分析を０、７、１４及び２３日目に行ってＶδ１及びＶδ２Ｔ細胞の百分率及び数を決定した。増殖倍率は、γδＴ細胞の数を、各ウェルに播種された出発ＰＢＭＣ中の同じ型のγδＴ細胞の数で割ったものとして定義される。図１６は、異なるドナーからのＰＢＭＣからのＶδ１Ｔ細胞の活性化及び増殖を示すグラフを描写する。ＭＡｂ  ＴＳ−１、Ｒ９．１２及びＴＳ８．２は、Ｖδ１Ｔ細胞集団の顕著な選択的成長を誘導した。Ｖδ１Ｔ細胞は、４００〜１４，５００倍に増殖し（図１６Ａ、図１６Ｃ）、１４日間で細胞集団全体の約９５％を占めるＴリンパ球集団の１．２％から８７．０％にまで濃縮された（図１６Ｂ）。Ｖδ１Ｔ細胞は、２３日間で２６，３３０倍に増殖した（図１６Ｄ）。
【０３２０】
ＰＢＭＣからのＶδ２Ｔ細胞の活性化及び増殖
０．２５もしくは１μｇ／ｍＬ（０．２５μｇ／ｍＬの場合のデータを示す）の活性化抗体（ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｒ９．１２、Ｂ６及び１５Ｄ）をプラスチック製２４ウェルプレートに直接固定したか、または０．０５もしくは０．１μｇ／ｍＬ（０．０５μｇ／ｍＬの場合のデータを示す）の当該活性化抗体を、プレートに結合したヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ（５μｇ／ｍＬ）に捕捉させた。１０％のＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２と共にＲＰＭＩを含有する培地中で１×１０６細胞／ｍｌのヒトＰＢＭＣを活性化させた。培養物中の培地は２〜３日ごとに補給した。７日目に、活性化抗体を有さない新しいプレートに細胞を移し、合計１４日間にわたって２〜３日ごとに新鮮な培地を補給することによってさらに増殖させた。図１７は、異なるドナーからの１４日後のＶδ２Ｔ細胞の増殖倍率及び百分率を示す。ＭＡｂ  Ｂ６及び１５Ｄは、１４日間を経てＶδ２Ｔ細胞集団の７０〜４，７４０倍の選択的増殖を誘導し（図１７Ａ、図１７Ｃ及び図１７Ｅ）、細胞集団全体の約９５％を占めるＴリンパ球集団の８０％にまでδ２集団を濃縮した（図１７Ｂ及び図１７Ｄ）。
【０３２１】
γδＴＣＲ活性化ＰＢＭＣにおけるαβＴ細胞の百分率の低減
細胞培養ウェルにおいて固定された活性化剤を試験した。２４ウェルプレートにおいてＭＡｂ（ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｂ６及び１５Ｄ）を、直接塗布した（１μｇ／ｍＬ）かまたはヤギ抗マウスＦｃ（５μｇ／ｍＬ）に捕捉させた（０．１μｇ／ｍＬ）。１０％のＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２と共にＲＰＭＩを含有する培地中で１×１０６細胞／ｍｌのヒトＰＢＭＣを活性化させた。培養物中の培地は２〜３日ごとに補給した。７日目に、抗体を有さない新しいプレートに細胞を移し、１４日目まで２〜３日ごとに培地を補給することによってさらに増殖させ、フローサイトメトリーで分析した。図１８は、１４日後のαβＴ細胞の増殖倍率及び百分率を示す。ＭＡｂ  ＴＳ１、ＴＳ８．２、Ｂ６及び１５Ｄと共に培養されたＰＢＭＣは、１４日間の培養期間を経て９２％から９％もの低さまでのαβＴ細胞の顕著な低減をもたらした。
【０３２２】
δ１及びδ２特異的抗体による活性化はδ１及びδ２Ｔ細胞の集団倍加時間を短縮する
ＭＡｂの直接塗布（１μｇ／ｍＬ）またはヤギ抗マウスＦｃ（５μｇ／ｍＬ）による捕捉（０．１μｇ／ｍＬ）を２４ウェルプレートにおいて行った。１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中１０６細胞／ｍＬのＰＢＭＣを播種した。７日目に、抗体を有さない新しいプレートに細胞を移し、新鮮な培地で１０６細胞／ｍＬに調節した。７日目に、抗体を有さない新しいプレートに細胞を移し、１０６細胞／ｍＬに調節し、２〜３日ごとに新鮮な培地を補給した。結果を図１９に描写する。Ｖδ１Ｔ細胞集団倍加時間は、活性化抗体が存在しないときの３７時間から、固定化ＴＳ１抗体が存在するときの２４時間に短縮された。Ｖδ２Ｔ細胞集団倍加時間は、活性化抗体が存在しないときの１２５時間から、固定化１５Ｄ抗体が存在するときの２７．５時間に短縮された。アルファベータＴ細胞集団倍加時間は、γδＴＣＲ抗体による活性化によって大して影響を受けなかった。
【０３２３】
ＴＳ８．２及びＴＳ１抗体を使用する活性化は主としてナイーブ表現型及びセントラルメモリー表現型をもたらす
抗体ＴＳ８、Ｒ９．１２及びＩｍｍｕｎｏ５１０を１．０μｇ／ｍＬの濃度でプラスチック製ウェルに直接固定した。１０％のＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２と共にＲＰＭＩを含有する培地中で１×１０６細胞／ｍｌのヒトＰＢＭＣを活性化させ、培養した。培養物中の培地を２３日目まで２〜３日ごとに補給し、０、１４及び２３日目にフローサイトメトリーで分析した。図２０は、フローサイトメトリーによるＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２７発現分析によって決定された、１４及び２３日目のＶδ１Ｔ細胞の表現型を描写する。γδ細胞の表現型は、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ２７＋）、セントラルメモリー（ＴＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ２７＋）、エフェクターメモリー（ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ２７−）、及びエフェクターメモリー発現性（ＴＥＭＲＡ、ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ２７−）として定義した。ＴＳ８．２及びＲ９．１２による活性化は、２３日間の増殖期間を経てＶδ１Ｔ細胞表現型を維持し、ナイーブ集団が４３〜６３％であり、セントラルメモリー集団が２３〜２７％であった。対照的に、汎γδ抗体Ｉｍｍｕｎｏ５１０は、４７％から８〜３３％へのナイーブＶδ１−Ｔ細胞の減少を招いた。
【０３２４】
ＭＩＣＡ−ＦｃによるＶδ１Ｔ細胞集団の特異的な強化された増殖
プレートに結合したＴＳ８．２抗体（１μｇ／ｍＬ）によって、またはプレートに結合したＴＳ８．２とＭＩＣＡ−Ｆｃ融合タンパク質と（それぞれ、１及び５μｇ／ｍＬ）によって、ヒトＰＢＭＣを活性化させた。１０％のＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ培地中で培養物を増殖させた。図２１は、１０日後の細胞増殖を描写する。ＴＳ８．２とＭＩＣＡ−Ｆｃとの組み合わせは、αβＴ細胞集団（Ｂ）に対して影響を与えることなく、ＴＳ８．２のみの対照（Ａ）の場合よりも２倍強くＶδ１Ｔ細胞集団の増殖を強化した。
【０３２５】
臍帯血からのδ１及びδ２Ｔ細胞の特異的かつ顕著な活性化
ヒト臍帯血からの単核細胞を、Ｆｉｃｏｌを使用する密度勾配遠心分離法によって単離し、ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を含有する培地中で抗体ＴＳ８．２、Ｒ９．１２、Ｂ６及び１５Ｄによって活性化させた。図２２は、７日間を経てＶδ１Ｔ細胞がδ１特異的抗体によって１５２倍にまで増殖し、Ｖδ２Ｔ細胞がδ２特異的抗体によって９３倍にまで増殖したことを示す。
【０３２６】
実施例１４．活性化γδＴＣＲ  ＭＡｂのエピトープ位置特定
γδＴＣＲ活性化抗体のエピトープ結合ドメインを決定した。γδＴＣＲδ１特異的活性化ＭＡｂ  ＴＳ８．２、ＴＳ１、ならびにδ２特異的活性化ＭＡｂ  １５Ｄ及びＢ６の結合エピトープを、野生型及び突然変異型のγδＴＣＲ対合鎖の様々な組み合わせを使用してＥＬＩＳＡ結合アッセイで決定した。ＴＳ１、ＴＳ８．２及びＲ９．１２は、フローサイトメトリーによって検出（データ示さず）されるところの、δ１ＴＣＲを発現するヒトＴ白血病細胞株ＢＥ１３の表面に結合するδ１特異的ＭＡｂである。ＢＥ１３のＴＣＲ鎖δ１Ｊ１及びγ８Ｊ２をクローニングし、δ１特異的ＭＡｂのエピトープ位置特定のために使用した。
【０３２７】
δ及びγ鎖の細胞外のＶ、多様性（Ｄ）、結合（Ｊ）及びＣ領域ドメインを含有する可溶性ＴＣＲ構築物をクローニングし、２９３細胞の一過的トランスフェクションによって発現するヒトＩｇＧ１重鎖融合γδＴＣＲ−ＦＣタンパク質のヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインと融合させた。
【０３２８】
δ１特異的ＭＡｂについての位置特定のために、Ｖδ１Ｊ１、Ｖδ１Ｊ２及びＶδ１Ｊ３を含めた種々のδ１鎖を発現させた。Ｖ及びＪ領域において突然変異させたさらなるＶδ１Ｊ１鎖を作り出した。種々のδ１鎖は全て、ＢＥ１３細胞株からクローニングされたγ８ＴＣＲ鎖と対合し、δ１特異的ＭＡｂの結合性はγ鎖との対合による影響を受けなかった。
【０３２９】
種々のγδＴＣＲは、２９３細胞に共トランスフェクトされ、正確に組み立てられることができ、正確に対合した受容体鎖として分泌されるジスルフィド結合した異種二量体を形成することができた。ＴＣＲγδ−ＦＣ異種二量体の正確な折りたたみは、あらゆるγδＴ細胞受容体を認識するＢ１．１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３３１２０２）、５Ｅ６．Ｅ９（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃ＴＣＲ１０６１）、１１Ｆ２（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＃３４０８８４）及びＩＭＭＵ５１０（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＃ＩＭ１３４９）抗体を含めた抗ＴＣＲ汎γδ抗体を使用してＥＬＩＳＡ結合アッセイによって確認した。
【０３３０】
全事例において、全てのγδＴＣＲ  ＭＡｂの結合はγδＴＣＲ異種二量体に限られ、適切な結合構造にはδ１及びδ２鎖と、γ鎖との対合が必要とされることを示唆していた。
【０３３１】
２９３細胞の一過的トランスフェクション及びキメラタンパク質の製造。２３９細胞を、１０％のウシ胎仔血清が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。トランスフェクションの前日に１×１０５細胞／ウェルの付着性２９３細胞を２４ウェルプレートに播種し、３７℃（５％ＣＯ２）で一晩インキュベートした。１μｇずつのＴＣＲγ−ＦｃとＴＣＲδ−ＦＣプラスミドとを混ぜ合わせた。プラスミドＤＮＡ及びｆｅｃｔｉｎ２９３トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃１２３４７０１９）を無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地で５分間掛けて希釈し、その後、室温で２０〜３０分間複合体化させた。調製した細胞に、トランスフェクション混合物の全体積を滴加した。トランスフェクトされた２９３細胞を３７℃（５％ＣＯ２）で４８〜７２時間インキュベートした。トランスフェクションから４８時間後に細胞上清を採集し、選定した抗ヒトγδＴＣＲモノクローナル抗体との結合性に関してＥＬＩＳＡアッセイで試験した。
【０３３２】
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ。細胞培養物上清を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で試験した。アッセイ用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ高結合能マイクロプレート）を、１００μｌの１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃγ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ＃１０９−００５−００８）と共に４℃で一晩インキュベートした。２００μｌ／ウェルの遮断用緩衝液（３％のＢＳＡを含有するＰＢＳ）を使用して室温で１時間プレートの遮断を行った。可溶性γδＴＣＲを含有する上清をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ中０．５ｍｌ／ＬのＴｗｅｅｎ）中に添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄し、選定したマウス抗ヒトγδＴＣＲ特異的ｍａｂと共にインキュベートした。可溶性ＴＣＲのセットに対するγδＴＣＲ  ｍＡｂの結合は、遮断用緩衝液で１：１０，０００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＦＣ特異体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＃１１５−０３５−００８）を使用して１時間掛けて検出した。その後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ試薬で発色させた。プレートにおける色の変化をＶｉｃｔｏｒ  Ｘ３プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって波長４５０ｎｍで測定した。
【０３３３】
図２３で示されているように、可溶性ＴＣＲに対するＴＳ１及びＴＳ８．２の結合は、δ１鎖がＶδ１Ｊ１及びＶδ１Ｊ２配列を含む場合には検出されたが、Ｖδ１Ｊ３鎖に対しては検出されず、デルタＪ３に欠けているデルタＪ１及びデルタＪ２領域内の肝要な残基がＴＳ１及びＴＳ８．２の結合に関与していることが示唆された。データは、ＴＳ１及びＴＳ８．２がδ１Ｊ１及びδ１Ｊ２のＴＣＲに結合し、Ｒ９．１２がδ１Ｊ１、δ１Ｊ２及びδ１Ｊ３のＴＣＲに結合すること、ならびにＪ１及びＪ２セグメントがＴＳ１及びＴＳ８．２の結合に肝要な配列を含有することを示唆している。
【０３３４】
ＴＳ８．２及びＴＳ１の結合に必要なＪ１／Ｊ２領域内の肝要なアミノ酸（複数可）を同定すべく、ヒトのデルタＪ領域の配列アラインメントは、Ｊ１とＪ２とに共通しているがＪ３配列とは異なっている４つの可能な残基  ９つのＪ１／Ｊ２残基  Ｌｅｕ１１６、Ｌｙｓ１２０及びＴｈｒ１２２を指し示した。δＪ１配列をＪ３配列に照らして改変し、Ｌｅｕ１１６をＭｅｔに改変し、Ｌｙｓ１２０をＴｈｒ及びＡｌａに改変し、Ｔｈｒ１２２をＩｌｅで置き換えた。Ｌｙｓ１２０をＴｈｒに変更するとＴＳ８．２及びＴＳ１の結合性はどちらも消滅したが、Ｒ９．１２の結合性は消滅しなかった。図２４及び図２５で示されているように、デルタＪ１及びデルタＪ２の位置１２０のリジン残基はＴＳ−１及びＴＳ８．２抗体の結合に肝要である。
【０３３５】
ＴＳ８．２及びＴＳ１の結合にとって重要なＶδ１配列をさらに同定するために、さらなる突然変異型Ｖδ１ＴＣＲ構築物を作った。図２６に示すように、６本の突然変異型Ｖδ１鎖を構築した。突然変異は、相同性の高いウシＶδ１Ｓ１とヒトＶδ１とのアミノ酸配列の差異（６８％の同一性）に基づいて考案した。合成遺伝子（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して突然変異型Ｖδ１鎖を生じさせた。可溶性ＴＣＲは、ヒトγ８ＴＣＲ  Ｆｃ鎖と対合したＶδ１鎖として発現した。
【０３３６】
図２７で示されているように、ＴＳ−１及びＴＳ８．２抗体は、突然変異型Ｖδ１鎖のうちの２本であるＶδ１Ｍｕｔ１及びＶδ１Ｍｕｔ６に結合し損なった。Ｖδ１Ｍｕｔ１は、ヒトδ１鎖の可変領域のＧｌｙ５７〜Ａｌａ８８の領域にある残基の並びにおいて９つの残基の変化を呈しており、Ｖδ１Ｍｕｔ６は、位置７１及び位置７２（付番は図１４に示すとおり）の２つの残基の変化を呈している。Ｖδ１ＭＡｂ  Ｒ９．１２、及び汎δ鎖構築物ＭＡｂ  Ｉｍｍｕｎｏ５１０の結合性は、Ｖδ１に対するどの変更によっても影響を受けなかった。したがって、位置Ａｒｇ７１及び位置Ａｓｐ７２のＶδ１残基は、Ｊ１／Ｊ２領域にあるＬｙｓ１２０とともに、Ｔｓ−１及びＴＳ８．２  ＭＡｂのどちらの結合性にも肝要である。
【０３３７】
まとめると、データは、ＴＳ−１及びＴＳ８．２のどちらの肝要な結合及び活性化エピトープもδ１鎖のＶ及びＪ１／Ｊ２領域内に位置していることを示唆している。
【０３３８】
Ｖδ２特異的活性化ＭＡｂ  １５Ｄ及びＢ６のエピトープ位置特定
Ｍａｂ  Ｂ６及び１５Ｄの特異的結合は、ゾレドロン酸によって活性化されたδ２Ｔ細胞集団に対してはフローサイトメトリーで検出されたが、δ１ＴＣＲを発現しているＢＥ１３細胞株に対する結合は検出されなかった（データ示さず）。さらに、競合結合アッセイデータからは、Ｂ６及び１５Ｄが互いに競合せず、異なるエピトープに結合することが示された。
【０３３９】
γδＴＣＲ鎖の組み合わせ
１５Ｄ及びＢ６のＭＡｂにとっての結合エピトープを同定するために、種々のγδ２ＴＣＲ構築物を作り出した。γ３、γ４、γ８、γ９Ｊ１及びγ９ＪＰ  ＦＣ融合鎖と共にＶδ２鎖を共トランスフェクトした。分泌されたδ２ＴＣＲ異種二量体の正確な折りたたみは、γ９特異的ＭＡｂである７Ａ５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃ＴＣＲ１７２０）と共に抗ＴＣＲ汎γδ抗体ＩＭＭＵ５１０（Ｂａｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＃ＩＭ１３４９）を使用してＥＬＩＳＡ結合アッセイによって確認された。
【０３４０】
Ｂ６の結合性は、δ２鎖との対合のために選定されたγ鎖によって影響を受けた。Ｂ６の結合は、δ２鎖をγ９鎖と対合させた場合にγ９のＪ配列に関係なく検出された。γ３δ２ＴＣＲ対の結合性は大きく低下し、γ８と対合したδ２鎖の結合は検出不可能であった。図２８で示されているように、Ｂ６  ＭＡｂが最も安定化されて結合するのは、δ２γ９ＴＣＲに対する場合である。γ３及びγ８は、どちらもガンマファミリー１に属し、互いに高い配列相同性（７５％）を共有しており、γ９は、ガンマ２ファミリーのメンバーであり、γ３及びγ８との低い配列相同性（約２０％）を共有している。Ｂ６の高い結合親和性には、δ２鎖及びγ９鎖の両方の残基が関与している。陽性対照ＭＡｂは、δ鎖の定常領域に結合しかつあらゆるγδＴＣＲを認識する汎γδＴＣＲであるＩＭＭＵ５１０、及びγ９特異的ＭＡｂである７Ａ５  ＭＡｂであった。Ｂ６  ＭＡｂの結合は、δ２γ９ＴＣＲに対して検出された。Ｂ３はＶγ９抗体である。
【０３４１】
近年、ヒト及びアカゲザルのγδ２Ｔ細胞がＴＣＲ遺伝子セグメントの高度な生殖細胞系配列相同性、及びＣＤＲ３領域の多様性を示すことが示された（Ｄａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１；１６７：６４２１−３０）。１５Ｄの結合に必要とされる肝要な配列を同定するために、部位特異的変異導入法によって特定の点突然変異をヒトＶδ２鎖のＣＤＲドメインに導入して位置Ｇｌｙ３５（Ｖδ２のＣＤＲ１）、Ａｓｐ６５（Ｖδ２のＣＤＲ２）及びＣｙｓ１０４（Ｖδ２のＣＤＲ３）をアカゲザル配列で置き換えた。図２９は、ヒトＶδ２可変領域（ＩＭＧＴ  ヒトＴＲＤＶ２）とアカゲザルＶδ２可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ１９００２８．１）とのタンパク質配列アラインメントを示す。ＣＤＲ１（Ｇ３５Ｓ）、ＣＤＲ２（Ｄ６５Ｇ）、及びＣＤＲ３  Ｃ１０４Ｓにおいて変更がなされた（付番は図１５に示すとおり）。ヒトＶδ２のＣＤＲ１におけるＧｌｙからＳｅｒへの単一残基の置き換えは、１５Ｄによる結合活性の完全な喪失を招いた。図３０で示されているように、Ｇｌｙ３５は、１５Ｄの結合に肝要な残基として同定された。Ｖδ２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３における変化は、Ｂ６、γδＴＣＲ汎ＭＡｂであるＩＭＭＵ５１０、及びγ９特異的ＭＡｂである７Ａ５の結合性に影響を与えなかった。
【０３４２】
実施例１５．γδＴ細胞の活性化及び増殖の新規調節剤のエピトープ位置特定
ＣＤ２エピトープ：
ＣＤ２分子は、２つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメインであるＩｇ様Ｖ型ドメイン及びＩｇ様Ｃ型ドメインからなり、そこに存在している３つの主要な免疫原性領域についての記載がなされている（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １９９６；１７：１７７−１８７）。領域１及び領域２は１つ目のドメインに位置しており、領域３は２つ目のドメインに位置している。領域１を認識するＭＡｂは、休止Ｔ細胞と活性Ｔ細胞との両方に結合し、ＣＤ２に対するＣＤ５８の結合を強く抑制することができる。領域２を認識するモノクローナル抗体は、同様の結合特性を有するものの、ＣＤ５８結合の遮断に効果的ではない。領域３を認識するモノクローナル抗体は、活性Ｔ細胞上のＣＤ２のみを認識し、ＣＤ５８結合を遮断しない。
【０３４３】
ＣＤ５８に対する競合アッセイ、ＣＤ２の天然のリガンド、及び活性化アッセイによって、ＣＤ２作動薬ＭＡｂの結合エピトープの位置特定を行う。さらに、ＭＡｂの結合性に関して、ＣＤ５８の結合性の喪失を招く肝要なＣＤ２結合残基の部位特異的変異導入の試験を行う。突然変異の例としては、位置６７（ＫからＲへ）、位置７０（ＱからＫへ）、位置１１０（ＹからＤへ）、及び位置１１１（ＤからＨへ）におけるＣＤ２配列の変異導入が挙げられる。ＣＤ２の結合エピトープの位置特定のための構築物を設計するために、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してヒトとマウスとのＣＤ２の配列アラインメントを実施する。アラインメントは、ヒトとマウスとでＣＤ２の５０％の配列相同性を示す。ヒトＣＤ２の細胞外ドメインに結合するＭＡｂは、マウスＣＤ２と交差反応するとは予想されない。結合エピトープを同定するために本発明者らはマウス／ヒトキメラＣＤ２構築物のドメイン交換物を作出する。そのような構築物では、ヒトＮ末端Ｉｇ様Ｖ型ドメイン（残基２５〜１２８）は、ＣＤ２の細胞外ドメインを発現する発現ベクターにおいてマウス残基（２３〜１２１）で置き換わっている。キメラｃＤＮＡ種をＣＨＯまたは２９３細胞に一過的にトランスフェクトする。ヒト野生型ＣＤ２及びヒトマウスキメラ構築物はＣＨＯ細胞の表面に発現する。キメラＣＤ２細胞表面発現をＦＡＣＳｃａｎｔｏによって分析する。キメラ分子に対する結合性または結合性喪失をフローサイトメトリーによって検出し、活性化アッセイによって検証する。
【０３４４】
ＮＫＧ２Ｄエピトープ
ＮＫＧ２Ｄに対する活性化ＭＡｂのエピトープ位置特定は、ＮＫＧ２Ｄとそのリガンド（ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ）のうちの１つ以上との相互作用を軽減または遮断する抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の能力によって、またはｈＮＫＧ２Ｄリガンド相互作用を遮断することが知られている抗体との競合によって、試験される。作動薬ＭＡｂは、ＮＫＧ２Ｄによって媒介されるＮＫまたはＴ細胞の活性化を軽減するその能力によって同定される。これは、典型的な細胞毒性アッセイ、リガンド遮断抗体の添加、またはγδＴ細胞によって媒介されるＭＩＣＡ発現腫瘍細胞の殺傷の遮断によって用量依存的に評価することができる。
【０３４５】
ＣＤ２７エピトープ
ＣＤ２７に対する作動薬抗体のエピトープ位置特定は、機能アッセイ及び、ヒトＣＤ２７とその天然のリガンドであるヒトＣＤ７０との相互作用を遮断する当該抗体の能力によって行う。ＣＤ２７発現細胞を５μｇのＭＡｂと共に４℃で３０分間インキュベートし、その後、１μｇのビオチン化ＣＤ７０をチューブに加える。混合物を４℃でさらに１５分間インキュベートし、その後、洗浄する。次に、細胞を（ＣＤ７０リガンド結合の検出のための）ストレプトアビジン−ＰＥの混合物と共に３０分間インキュベートし、続いて洗浄ステップを数回行い、ＦＡＣＳを用いて分析する。ＣＤ７０結合の遮断は、ＭＡｂとＣＤ７０とが同じエピトープを共有していることを示唆するものである。
【０３４６】
実施例１６：増殖済みγδＴ細胞の集団のＴＣＲ  Ｖδレパートリーの特性評価
個々のドナーから増殖したγδＴ細胞のクローン多様性をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって評価する。健常ドナーから単離されて間もないＰＢＭＣのクローン多様性を、抗ＴＣＲ特異的抗体を含めた本明細書に記載の種々の活性化剤、リガンド及びレクチンで７〜１３日間刺激された培養物のクローン多様性と比較する。
【０３４７】
上記γδＴ細胞からのＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへと逆転写し、Ｖδ１、Ｖδ２及びＶδ３に対して特異的であるプライマー対を使用してＰＣＲによって増幅する。Ｖδ１順方向プライマー（５’ＡＴＧＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＴＡＴＴＴ３’；配列番号：１）、Ｖδ２順方向プライマー（５’ＡＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＴ３’；配列番号：２）及びＶδ３順方向プライマー（５’ＡＴＧＡＴＴＣＴＴＡＣＴＧＴＧＧＧＣＴＴＴＡＧＣＴＴＴＴＴＧ３’；配列番号：３）をＣδ逆方向プライマー（５’ＣＴＴＧＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣ３’；配列番号：４）と組み合わせて使用して５００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
【０３４８】
γ鎖は別個のＲＴ−ＰＣＲ反応において、Ｖγ２、Ｖγ３、Ｖγ４及びＶγ５（５’ＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＧＣＴＴＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣ３’（配列番号：１０））、Ｖγ８（５’ＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＡ３’（配列番号：１１））ならびにＶγ９（５’ＡＴＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡＴＣＡＡＣＧ３’（配列番号：１２））を増幅するＶγ特異的プライマーを使用して増幅され、ＶｒプライマーはＣγ逆方向プライマー（５’ＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＧＴＧＧＧＣＴＴＧＧＧＧＧＡＡ３’（配列番号：１３））との対にされた。γ逆方向プライマーはＣγ１及びＣγ２のコンセンサス配列に基づいていた。ＰＣＲ断片をクローニングし、８０個の独立したＶγインサートのヌクレオチド配列が得られる。ＣＤＲ３配列アラインメントと併せて、Ｖδ、Ｄδ及びＪδの接合部の配列を解析する。
【０３４９】
実施例１７：γδＴ細胞の操作のためのＭＡｂ及び関連する標的指向性構築物
ヒトＣＤ２０遺伝子をｃＤＮＡクローン（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，６  Ｔａｆｔ  Ｃｏｕｒｔ，Ｓｕｉｔｅ  １００，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５０）から得る。順方向プライマー（５’ＡＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＡＧＴＡＡＡＴＧＧ３’（配列番号：１４））及び逆方向プライマー（５’ＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＧＧＴＧ３’（配列番号：１５））を使用してＣＤ２０遺伝子を増幅し、増幅されたＣＤ２０  ｃＤＮＡを、哺乳動物細胞用の高発現ベクターとしてのｐＣＤＮＡ３．４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中に組み込み、宿主細胞としてのＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。ＣＤ２０分子を細胞表面に高レベルで発現している組換えＣＨＯ細胞（ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞）は、ＦＡＣＳ分析によって同定される。
【０３５０】
ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞を使用して、ＢＡＬＢ／Ｃマウス、またはＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ａｎｄ  Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５  ６：５６１−６；Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ．２０１０  ２８：５６１−７４．）に記載されているような完全ヒト抗体を産生するように操作された遺伝子導入マウスを免役する。ヒトＣＤ２０に対する高い親和性及び特異性を有する抗体をＦＡＣＳアッセイによってスクリーニングする。マウス抗体をＣＤＲグラフトによってヒト化する（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｈｏｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；９０７：２３７−４５）。さらに、ヒト重鎖単一ドメイン抗体を産生するように操作されたマウスまたはラットからヒト単一ドメインＣＤ２０抗体を生じさせる（Ｊａｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００６  ｖｏｌ．１０３：１５１３０）。
【０３５１】
上記の高親和性／特異性ＣＤ２０抗体をコードする遺伝子をＭＳＧＶ１レトロウイルスベクター骨格またはｐＣＡＧレンチウイルスベクターの中にクローニングする。選定ＭＡｂを発現するマウスハイブリドーマか、ヒト化抗体鎖かのどちらかからＶＨ及びＶＬドメインをクローニングする。本明細書に記載のＣＤ２０  ＭＡｂによってγδＴ細胞を操作する。
【０３５２】
実施例１８：γδＴ細胞の操作のためのＴＣＲ構築物
高反応性αβＴＣＲ鎖の配列を含むＴＣＲを発現する構築物を、ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＭＨＣ特異ペプチド複合体を発現するＴリンパ球から単離する。ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＭＨＣ特異ペプチド複合体は、様々なＮＹＥＳＯ−１発現腫瘍に対する試験管内及び生体内での強力な抗腫瘍活性を誘導する。
【０３５３】
高反応性αβＴＣＲ鎖は、メラノーマ患者から、肉腫患者から、またはヒトのメラノーマもしくは肉腫の腫瘍に由来する患者由来異種移植片を保有するマウスから単離される。あるいは、当該ＴＣＲは、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドまたはＮＹＥＳＯ−１ペプチド複合体を発現するヒト化免疫系を有するように変化させたマウスに由来するものである（Ｇｏｎｚａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１３  ５７：３２６−３３４；Ｂｏｕｃｈｅｒｍａ  ｅｔａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏ．２０１３．１９１；５８３−５９３；Ｌｉａｎｇ−ＰｉｎｇＬ．Ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２０１０，１６：１０２９−１０３５を参照のこと）。優勢クラスＩ対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ＊０２（例えば、ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣ残基１５７〜１６７（配列番号：１６））及び優勢ＨＬＡ−Ａ＊０１関連ペプチドと関連付けてＮＹ−ＥＳＯ−１のエピトープを認識するＴ細胞を同定する。
【０３５４】
ＴＣＲα転写産物及びＴＣＲβ転写産物の配列は、Ｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｌｄｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の提言に従って使用することで逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって生じる。第一鎖ｃＤＮＡは、反応性Ｔ細胞から単離されたＲＮＡから生じる。完全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＣＴＬクローンから抽出される。ＴＣＲのα及びβ鎖の増幅は、アミノ酸位置３４及び３５（Ｋａｂａｔ付番）のトリプトファン−チロシン残基周辺を中心とするＴＣＲのα及びβ鎖のＶ領域の高度に保存された領域に結合することができる１組の縮重プライマーと、α及びβ定常領域逆方向プライマーとを組み合わせて使用することによって行われる（Ｍｏｏｎｋａ  ａｎｄ  Ｌｏｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６９（１９９４）４１−５１）。増幅されたＰＣＲ断片をゲル精製し、そのまま配列決定に供する。配列情報を用いて、個々の完全長ｃＤＮＡのクローニングに適するＰＣＲプライマーを設計する。
【０３５５】
ＴＣＲ遺伝子をクローニングし、ＭＳＧＶ系レトロウイルスベクターに挿入し、選定Ｔ細胞から完全長ｃＤＮＡを増幅する。野生型ＮＹ−ＥＳＯ−１反応性ヒトＴＣＲのα鎖とβ鎖との両方をコードするレトロウイルスベクターを、ＭＳＧＶ１骨格を使用して構築する。ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖との連結は、１つの構築物において配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントによって、または切断可能なピコロウイルス（ｐｉｃｏｒｏｖｉｒｕｓ）ペプチド配列を使用して分断によって、行われる。
【０３５６】
以前に記載されているようなＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、またはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用する電気穿孔法によって、ＭＭＬＶのｇａｇ及びｐｏｌタンパク質を安定的に発現した２９３細胞に各ＭＳＧＶ１  ＴＣＲベクターと、内在性ウイルスのレトロウイルスエンベロープタンパク質をコードするベクターとを共トランスフェクトすることにより、レトロウイルス上清を生じさせる。トランスフェクション後の２日目または３日目に上清を採集し、１０％のＦＣＳを含有する新鮮なＤＭＥＭで１：１に希釈した。操作型γδＴ細胞は、さらなる操作を何ら伴わずに、ＴＣＲのα及びβ鎖をコードする遺伝子を適切に発現することができる。
【０３５７】
実施例１９．αβＴＣＲ構築物によるγδＴ細胞の操作
αβＴＣＲ（腫瘍認識部分）を含むポリヌクレオチドを、所望の抗原に特異的であるように選定したＴ細胞から標準的技術を用いてクローニングする。単離した内在性野生型γδＴ細胞を、以前の実施例に記載されている方法によって少なくとも６×１０６細胞にまで成長させ、その後、腫瘍認識部分をコードする発現カセットを含むレトロウイルスまたはレンチウイルスに感染させる。ウイルス感染のための標準的プロトコールを用いてベクターシステムを野生型γδＴ細胞に導入することができる。選択マーカーの発現を用いて、好結果にトランスフェクトされた細胞を選択する。
【０３５８】
操作型αβＴＣＲの発現は、フローサイトメトリー及び／または定量的ＱＲＴ−ＰＣＲによって、ならびに細胞毒性及びサイトカイン分泌に関する標的細胞についての機能アッセイによって、評価することができる。操作型活性化ドメインの発現も、フローサイトメトリー及び／または定量的ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。関心対象の細胞表面マーカーを発現している操作型γδＴ細胞をフローサイトメトリーにより判定する。操作型γδＴ細胞を本明細書に記載の適切な方法論、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ、ｔａｌｅｎ、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガー、またはｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾン技術によってさらに操作してＨＬＡ遺伝子またはβ２Ｍ遺伝子に関連するエクソンを欠失させる。
【０３５９】
実施例２０：ＣＡＲ及びＴＣＲ構築物によるγδＴ細胞の操作
腫瘍細胞を特異的に認識して活性化されてそれを殺傷するように操作型γδＴ細胞を導くことができる標的指向性部分を発現させるために、レトロウイルスまたはレンチウイルスに基づくベクターをγδＴ細胞に形質導入する。形質導入された標的指向性部分は、腫瘍に特有の表面タンパク質または腫瘍に特有の細胞内ペプチドを指向するＭＡｂを含む。γδＴ細胞は、ペプチド−ＭＨＣ複合体を指向する高親和性ＴＣＲによってさらに操作される。
【０３６０】
あるいは、非ウイルス性ベクターによる形質導入によって細胞を操作することができる。
【０３６１】
実施例２１：単離されたγδＴ細胞の標的指向性部分による操作
ＣＡＲ構築物の構造は、種々の主要な機能的ドメイン、腫瘍細胞上に提示された関心対象のタンパク質またはＭＨＣ結合ペプチドを認識する標的部分、細胞膜を横切って細胞内活性化シグナル伝達ドメインと繋がっている膜貫通ドメインに細胞外受容体標的指向性要素を連結する短いスペーサーを含む。
【０３６２】
γδＴ細胞の表面に発現する標的部分受容体は、がん細胞上に発現する標的タンパク質に特異的に結合するように設計されることになる。腫瘍認識部分は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＡ６、ＧＤ２、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、５Ｔ４、ＰＬＩＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ−１、糖脂質Ｆ７７、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、メソテリン、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、ＰＶＲＬ−４、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＣＡ、葉酸結合タンパク質／受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−３Ｒ及びＳＬＴＲＫ６を含めた標的に対するものとして設計されることになる。
【０３６３】
標的部分受容体は、腫瘍細胞の表面に発現した腫瘍糖タンパク質に対して特異的である抗体の一部に由来するものであり得、あるいは操作型受容体は、既知の特異性を有するＴＣＲ受容体に由来するものであり得るかまたは、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ−１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＭＡＧＥＡファミリー遺伝子（例えば、ＭＡＧＥＡ３．ＭＡＧＥＡ４）、ＫＫＬＣ１、突然変異したＮ及びＫ及びＨ  ｒａｓ、ＢＲａｆ、ｐ５３、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ｂ（ＭＩＣＢ）もしくは、ＨＰＶ、ＥＢＶもしくはＣＭＶの１つ以上の抗原を含めた、ＭＨＣ複合体と結び付いて表面に提示される細胞内腫瘍特異抗原に由来する特異ペプチド配列を認識する抗体に由来するものであり得る。そのような高親和性のＴ細胞受容体様腫瘍認識部分は、ペプチド−ＭＨＣ複合体を高度な特異性で以て認識するであろう。
【０３６４】
実施例２２：スペーサー及び膜貫通ドメインを有する標的指向性部分構築物
操作型Ｔ細胞のがん細胞に対する効力を最適化すべく、種々のスペーサーは腫瘍認識部分構築物の中へと操作されることになる。各スペーサーの大きさは、標的タンパク質の大きさ、受容体によって認識されるエピトープ、操作される腫瘍認識部分の大きさ、及び受容体の親和性によって様々であろう。配座変化を許容できるスペーサーは、ヒトＩｇＧ、ＣＤ８ａ及びＣＤ４ヒンジ領域の配列を含む。
【０３６５】
試験されるスペーサーは、向上した結合親和特性を有するキメラ受容体を提供するために、異なる長さ（１９〜９残基）で使用されるＧｌｙ、Ｓｅｒ及びＴｈｒアミノ酸からなる。各構築物のヒンジ及び膜貫通部分は、ＣＤ８ａ配列（ヒトＣＤ８ａの残基１１７〜１７８）に由来するか、あるいはＣＤ２８膜貫通ドメイン（残基１５３〜１７９）を有するヒトＩｇＧ１ヒンジ−Ｆｃ  ｃＤＮＡに由来する。
【０３６６】
実施例２３：共刺激ドメインを有する標的指向性部分構築物
種々の共刺激ドメインは、腫瘍認識部分を含む構築物の中へと操作されることになる。ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ１６１、ＣＤ３０、ＪＡＭＬ、ＴＬＲ、ＣＤ２４４またはＣＤ１００共刺激シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインをγδＴ細胞の中へと操作して、キメラ受容体を介して活性化を増幅する「第２シグナル」を模倣し、結果として、より堅牢なシグナルが増大してがん細胞を殺傷することにつながる。
【０３６７】
細胞質側領域は、ＣＤ２８（残基１８０〜２２０）、ＣＤ１３７（残基２１４〜２５５）、ＩＣＯＳ（残基１６５〜１９９）  ＣＤ２７（残基２１３〜２６０）  ＮＫＧ２Ｄ（残基１〜５１）、ＪＡＭＬ（残基２９７〜３９４）  ＣＤ２（残基２３６〜３５１）、ＣＤ３０（残基４０８〜５９５）  ＯＸ４０（残基１〜２３）、ＨＶＥＭ（残基２２４〜２８３）またはＣＤ４６分子を含めたαβ及び／またはγδＴ細胞共刺激分子の細胞内ドメインに由来するものである。最適な構築物は、誘導される細胞の細胞傷害性に関する操作型γδＴ細胞集団の活性化度に基づいて、かつ試験管内及び生体内でのサイトカイン分泌度に基づいて選択される。
【０３６８】
実施例２４：ＣＤ３ζ活性化ドメインを含む標的指向性部分
３つのＩＴＡＭドメイン（ＩＴＡＭ１：ＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲ、（配列番号：５）；ＩＴＡＭ２：ＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭ、（配列番号：６）；及びＩＴＡＭ３：ＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱ、（配列番号：７））を含有する細胞内ＣＤ３ζ（残基５２〜１６４）をクローニングした。
【０３６９】
ＴＣＲζの細胞内ドメインを、プライマー５’ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡ−３’（配列番号：８）及び逆方向プライマー５’ＣＴＣＧＡＧＴＧＧＣＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＡ−３’（配列番号：９）を使用して精製した。
【０３７０】
マルチステップオーバーラップ伸長ＰＣＲによってＣＡＲ構築物を作り出す。オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応プロトコールを用いてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を後に伴うプライマーによって促される別個のＰＣＲ反応において、生成物を融合させた。完全長構築物をコードするＤＮＡをＭＳＧＶ１レトロウイルスベクターにライゲートした。構築物は、ＣＤ３ζ活性化ドメインを含んでいるＣＡＲ標的指向性部分をもたらす。
【０３７１】
実施例２５：１つより多い認識部分によるγδＴ細胞の操作
同じ細胞内腫瘍特異タンパク質を指向する腫瘍認識部分を含んでいる１つより多い構築物（ＴＣＲ及びＭＡｂを含む）を、γδＴ細胞に形質導入する。各構築物は、Ａ２及びＡ１などの種々のＭＨＣハプロタイプと関連付けて特異ペプチドを認識するように選択され、同じ腫瘍細胞に発現する異なる標的を指向する抗体であるかまたは、同じ標的上の異なるエピトープを指向する抗体である。
【０３７２】
実施例２６：操作型γδＴ細胞の試験管内での増殖
適切な組織培養用培地、例えば以前の実施例に記載されている組織培養用培地を使用して操作型γδＴ細胞を成長及び増殖させる。３７℃で５％ＣＯ２のインキュベータ内で操作型γδＴ細胞を、外部抗原による刺激を伴うかまたは伴わずに、かつＡＰＣまたはアミノホスフェートとの共培養を伴わずに、約１×１０６個にまで指数関数的に成長させる。
【０３７３】
実施例２７：活性化された操作型及び非操作型γδＴ細胞によって放出されるサイトカインの機能特性評価
ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＩＬ−１２（Ｄｉａｃｌｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＩＬ−６、及びＩＬ−１８の発現は、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して測定されることになる。酵素結合免疫吸着アッセイは、製造業者による指示事項に従って実施されることになる。ヒトサイトカインに対するモノクローナルマウスＩｇＧ１が０．０５Ｍの炭酸水素ナトリウム緩衝液中１μｇ／ｍＬの濃度で塗布されて４℃で一晩経ったポリスチレン製９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）において、（２４〜７２時間の）様々な時点でサイトカインの量が測定されることになる。０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳによる洗浄後にプレートは、ＰＢＳＴ中３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ｗｔ／ｖｏｌ、Ｓｉｇｍａ）による遮断が３７℃で１時間行われることになる。標準（Ｒ＆Ｄ提供の組換えヒトサイトカイン）及び、γδ培養物試料からの上清が添加されることになり、プレートは室温で２時間インキュベートされることになる。検出は、組換えヒトサイトカイン標準に関して適合した抗体対を使用して実施する。
【０３７４】
実施例２８．共刺激剤の同定
種々の共刺激剤が操作型及び非操作型γδＴ細胞の活性化、増殖及び生存能を支援する能力を、全ＰＢＭＣまたは濃縮された操作型もしくは非操作型γδＴ細胞集団に対して共刺激剤を添加することによって試験する。抗γδＴＣＲ特異的ＭＡｂを含めた種々の活性化剤に可溶性形態または固定化形態の共刺激剤を添加する。１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２が補充された完全ＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍＬ中２×１０６個の、以前の実施例に記載されているような健常ドナーのバッフィーコートから精製されたヒトＰＢＭＣ、または組織から単離されたリンパ球を、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６１、ＣＤ１２２、ＣＤ２４４及びＮＫＧ２Ｄに対する作動性抗体または、刺激リガンド、例えば、ＣＤ７０−ＦＣ（ＣＤ２７に対するリガンド）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ及びＵＬＢＰ（ＮＫＧ２Ｄに対するリガンド）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７に対するリガンド）ならびにＰｉｌａｒ９（ＣＤ１６１に対するリガンド）が可溶性であるかまたは固定された状態で存在しているかまたは存在していない、２〜１０μｇの抗γδＴＣＲ抗体を有する２４ウェル平底組織に播種する。
【０３７５】
実施例２９．サイトカイン支援による活性化
種々のサイトカインが操作型及び非操作型γδＴ細胞の活性化、増殖及び生存能を支援する能力を、全ＰＢＭＣまたは濃縮された操作型もしくは非操作型γδＴ細胞集団に対してサイトカインを添加することによって試験する。サイトカインによる活性化支援を試験するために、別個の細胞培養物に１００ＩＵ／ｍＬの種々のサイトカインを３日ごとに個別に添加する。試験されるサイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−３３、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−２３、ＩＦＮ−γ及びＩＬ１βが含まれる。選定された期間の最後に細胞の試料を採取し、細胞集団の組成、すなわちγδＴ細胞、αβＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞の百分率をフローサイトメトリーによって決定する。
【０３７６】
細胞を培養下に保ち、選択された集団の増殖を１４日目及び２１日目に試験する。
【０３７７】
実施例３０：活性化によって誘導されるＶδ１＋、Ｖδ２＋Ｔ細胞集団は腫瘍細胞に対して細胞傷害性である
選択的に活性化され濃縮された本発明のδ１及びδ２Ｔ細胞集団の細胞傷害性を決定するために、Ｆｉｃｏｌｌ  ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃１７−１４４０−０２）密度勾配遠心分離法を用いて、正常ドナーから得られたバッフィーコートからＰＢＭＣを単離し、（ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン及び１００ＩＵ／ｍＬのヒト組換えＩＬ２が補充されたＲＰＭＩ１６４０中に１０％のウシ胎仔血清を含む）Ｒ２培地中１×１０６細胞／ｍＬで２４ウェルプレートに播種した。
【０３７８】
０日目に、１μｇ／ｍｌのδ１特異的ＭＡｂ（ＴＳ１、ＴＳ８．２）またはδ２特異的ＭＡｂ（１５Ｄ、Ｂ６）のどちらかが塗布されたプレートに細胞を播種してＰＢＭＣ集団中のγδ細胞を活性化させた。５０％の培地交換を３日目及び５日目に実施した。７日目に、活性化させた細胞を、いかなるＭＡｂ被覆も有さない６ウェル培養皿に移し、増殖させ、１４日目まで約１×１０６細胞／ｍＬに維持した。Ｖδ１＋及びＶδ２＋の活性Ｔ細胞の培養を進行させるために、抗マウスＩｇＧマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＃１３０−０４８−４０１）に結合させたＩＰ２６モノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３０６７０２）を使用して、αβＴ細胞の、正の選択ならびにδ１及びδ２活性培養物からの除去を行った。これにより、図３１で示されているように高度に濃縮されたＶδ１＋及びＶδ２＋Ｔ細胞集団がもたらされた。正の選択がなされたαβＴ細胞も採集した（αβを濃縮した）。これらの濃縮されたＶδ１＋、Ｖδ２＋及びαβＴ細胞培養物を２２日目までＲ２培地中に維持した。
【０３７９】
２２日目に、濃縮された培養物のγδ及びαβＴ細胞組成を、フローサイトメトリー表面ＴＣＲ染色によってδ１、δ２及びαβに対するそれぞれＴＳ８．２、Ｂ６及びＩＰ２６抗体を使用して決定した。高度に濃縮された培養物は、Ｖδ１＋（ＴＳ８．２＋）、Ｖδ２＋（Ｂ６＋）及びαβ（ＩＰ２６＋）Ｔ細胞をそれぞれ９２％、９８％及び９９％含有していた。
【０３８０】
Ｖδ１＋、Ｖδ２＋及びαβＴ細胞集団についての試験管内での細胞毒性アッセイ
Ｖδ１＋、Ｖδ２＋及びαβＴ細胞培養物の細胞傷害性を評価するために、エフェクター細胞を標的細胞株と共に１０：１の比で６時間インキュベートした。このアッセイで試験した標的細胞株は、固形腫瘍細胞株ＢｘＰｃ３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６８７（商標））膵臓腺癌及びＳＫ−ＭＥＬ−５（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−７０（商標））ヒトメラノーマ、ならびに血液Ｂ腫瘍細胞株ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５５（商標））を含んでいた。ＣｙｔｏＴｏｘ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ＃）を使用して細胞死を測定した。特異的溶解％は、以下の式：
2019519210.tif 000003
を使用して算出した。
【０３８１】
高度に濃縮されたＶδ１＋、Ｖδ２＋及びαβＴ細胞培養物を、ＢｘＰＣ３、ＳＫＭＥＬ５及びＲＰＭＩ８２２６細胞株の殺傷に関して試験した。図３２で示されているように、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、上皮腫瘍細胞株ＢｘＰＣ３及びＳＫＭＥＬ５ならびに形質細胞腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６の殺傷を示すが（図３２Ａ）、Ｖδ２＋Ｔ細胞は、主にＲＰＭＩ８２２６に対する効力を示し、固形腫瘍細胞株に対する効果がより小さかった。αβＴ細胞は細胞傷害活性を何ら示さない。
【０３８２】
実施例３１：増殖済みγδＴ細胞の試験管内での抗腫瘍活性
様々な腫瘍細胞株及び原発腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を、エフェクター対標的の１：１〜４０：１の比で試験した。腫瘍細胞株及び原発腫瘍細胞の溶解を、細胞内酵素である乳酸脱水素酵素の遊離を検出することによって測定する。操作された腫瘍認識部分を培養物中で発現しているγδＴ細胞の百分率をフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ及び／またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定する。
【０３８３】
実施例３２：生体内での抗腫瘍活性
ヒト腫瘍異種移植片が生着した免疫不全マウス、またはｈｕＰＢＭＣ−ＮＯＧ（Ｔａｃｏｎｉｃ）マウス、または上記のようなヒト化免疫系を有するマウスのコホートに、結腸、乳房、卵巣、腎臓、頭頸部、前立腺、膀胱、口腔、膵臓及び肝臓のがんを含めた患者由来の腫瘍または腫瘍細胞株から得られた細胞を皮下または同所に注射し、平均の大きさを５０〜１００ｍｍ３に達せしめる。濃縮または単離された、ナイーブγδ−Ｔ細胞か操作型γδ−Ｔ細胞かのどちらかを、様々な用量でマウスに静脈注射するかまたは腫瘍内に直接注射する。腫瘍退行は、γδ−Ｔ細胞投薬後の腫瘍体積の減少として定義され、特定兆候に対する未処置の標準的医療と比較される。ある実験では、ナイーブγδＴ細胞または操作型γδＴ細胞をＧＦＰまたはルシフェラーゼで標識して腫瘍保有マウスに注射し、それらの持続及び帰巣を追跡する。研究の最後に腫瘍を採取し、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリー及び免疫組織化学によって分析した。
【０３８４】
実施例３３．抗体特異的活性化によって誘導されるＶδ１及びＶδ２集団の多クローン性ＴＣＲ多様性
ＴＳ８．２及びＢ６で活性化された集団からＴＣＲ鎖を増幅してクローニングした。δ１特異的活性化ｍＡｂ  ＴＳ８．２及び、δ２特異的ＭＡｂ  Ｂ６による１４日間の特異的活性化の後にＰＢＭＣ培養物を採取した。ＰＢＭＣ培養物を３５０μｌのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中に溶解させ、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０６）を製造業者による指示事項に従って使用して５×１０５個の細胞から全てのＲＮＡを精製した。手短に述べると、３５０μｌの７０％エタノールを細胞溶解物に添加して理想的な結合条件を提供した。その後、溶解物をＲＮｅａｓｙシリカ膜スピンカラムに装填した。汚染物質を洗い流した。濃縮されたＲＮＡを５０μｌの水中に溶出させた。
【０３８５】
Ｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ  ＰＣＲ：完全長デルタ鎖は、５’δ１（５’ＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＴＡＣＴＣＡＡＧＣＣＣＡＧＴＣ３’）及び５’δ２（５’ＧＣＣＡＴＴＧＡＧＴＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣ３’）プライマーを３’ヒトＣδ（５’ＴＴＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡ３’）プライマーと組み合わせて使用して増幅された。完全長デルタ鎖の８００ｂｐのＰＣＲ断片をｐＣＩ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号Ｅ１８４１）の中にクローニングした。同様に、完全長ガンマ鎖は、５’プライマーγ２、γ３、γ４（５’ＴＣＴＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＡＡＧＴＣ３’）、γ５（５’ＴＣＴＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＣＧＡ３’）、γ８（５’ＴＣＴＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＡＡＡＧＴＣ３’）、γ９（５’ＧＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＡＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＴＴＴＣＣ３’）を単一の３’Ｃガンマプライマー（５’ＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＧＴＧＧＧＣＴＴＧＧＧＧＧＡＡ３’）と組み合わせて使用して増幅された。
【０３８６】
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて１００ｎｇの全ＲＮＡからデルタ及びガンマ転写産物を増幅した。ＴＳ８．２  ＭＡｂで活性化された各試料（δ１、γ２〜γ４、γ５、γ８及びγ９）につき合計５つのＲＴ−ＰＣＲ反応を進行させ、Ｂ６  ＭＡｂで活性化された各試料（δ２及びγ９）につき２つのＲＴ−ＰＣＲ反応を進行させた。ＱＩＡＧＥＮ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットを増幅のために使用した（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）。このキットは、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素及びＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、緩衝液及び、「困難な」（例えばＧＣに富む）鋳型の効率的な増幅を可能にする新規添加剤であるＱ液の混合物を提供するものである。５μｌのＲＮＡ、０．５の１００μＭのデルタ鎖プライマーかガンマ鎖プライマーかのどちらか（ＩＤＴによる特注合成）、５μｌの５×のＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼとを含有する１μｌの酵素ミックス、及び０．４μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１ユニット）を含む、反応混合物を調製した。反応混合物は、逆転写及びＰＣＲの両方に必要とされる試薬を全て含有する。熱サイクラーのプログラムは、ＲＴステップ  ５０℃を３０分間、９５℃を１５分間、続いて３０サイクルの（９５℃を３０秒間、４８℃を３０秒間、７２℃を１．０分間）であった。その後には、７２℃で１０分間の最終インキュベーションが存在した。抽出されたＰＣＲ産物をｐＣＩ発現ベクターの中に直接クローニングした。ＩＭＧＴを用いてヌクレオチド配列を解析し、最も高い配列相同性を有する生殖細胞系Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子メンバーを同定した。
【０３８７】
ＴＳ８．２で活性化されたＶδ１鎖のＣＤＲ３の配列の例（接合部の多様性を太字で示す）：
ＴＳ８．２で活性化されたクローン１  Ｖδ１、Ｊ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン２  Ｖδ１、Ｄ３、Ｊ１
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ＴＳ８．８２で活性化されたクローン３  Ｖδ１、Ｄ２＋Ｄ３、Ｊ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン４  Ｖδ１、Ｄ３、Ｊ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン５  Ｖδ１  Ｄ１＋Ｄ３、Ｊ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン６  Ｖδ１  Ｄ１＋Ｄ３、Ｊ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン７  Ｖδ１、Ｄ２及びＤ３、Ｊ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン８  Ｖδ１、Ｄ２及びＤ３、Ｊ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン９  Ｖδ１、Ｄ２及びＤ３、Ｊ１
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【０３８８】
ＴＳ８．２  Ｍａｂで活性化されたガンマ鎖の例：
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Ｂ８  ＴＳ８．８２で活性化されたクローン−２  γ９、ＪＰ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン−３  γ４、Ｊ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン−４  γ９、Ｊ１／Ｊ２
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン５  γ２、Ｊ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン６  γ３、ＪＰ２
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン７  γ２、ＪＰ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン８  γ４、Ｊ１／Ｊ２
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン９  γ９、ＪＰ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン１０  γ３、Ｊ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン１１  γ３、ＪＰ２
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン１２  γ４、Ｊ２
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン１３  γ２、ＪＰ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン１４  γ４、Ｊ１／Ｊ２
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン１５  γ９、Ｊ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン１６  γ２、Ｊ１
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ＴＳ８．２で活性化されたクローン１７  γ４、ＪＰ１
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【０３８９】
Ｂ８（バッフィーコート８）−Ｂ６で活性化されたクローン：
Ｂ６で活性化されたクローン  δ２、Ｄ３、Ｊ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  δ２、Ｄ３、Ｊ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  δ２、Ｄ２＋Ｄ３、Ｊ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  δ２、Ｄ３、Ｊ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  δ２、Ｄ３、Ｊ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  δ２、Ｄ３、Ｊ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  δ２、Ｄ２＋Ｄ３、Ｊ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  δ２、Ｄ３、Ｊ３
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Ｂ６で活性化されたクローン  δ２、Ｄ２＋Ｄ３、Ｊ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  δ２、Ｄ１＋Ｄ３、Ｊ１
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【０３９０】
Ｂ６で活性化されたガンマ鎖：
Ｂ６で活性化されたクローン  γ９、ＪＰ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  γ９、ＪＰ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  γ９、ＪＰ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  γ９、ＪＰ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  γ９、ＪＰ１
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Ｂ６で活性化されたクローン  γ９、
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Ｂ６で活性化されたクローン  γ９、
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Ｂ６で活性化されたクローン  γ９、
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Ｂ６で活性化されたクローン  γ９、
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Ｂ６で活性化されたクローン  γ９、ＪＰ１
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【０３９１】
実施例３４．さらなる処理のための細胞バンクを生成するための、凍結保存用培地中でのγδＴ細胞の凍結保存
非改変型γδＴ細胞は、凍結保存用培地で製剤化されて、長期保管のために液体窒素冷凍庫（−１９５℃）または超低温冷凍庫（−６５℃、−８０℃または、−１２０℃）などの凍結保管ユニット内に置かれることになる。凍結保存用培地は、６．５〜７．５の範囲の生理学的ｐＨ緩衝剤と共に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、デキストロース、デキストランサルフェートまたはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含有することになる。
【０３９２】
凍結保存されたγδＴ細胞は、解凍されて、抗体、タンパク質、ペプチド及びサイトカインによる刺激によってさらに処理されることになる。凍結保存されたγδＴ細胞は、解凍されて、本願において前述したように遺伝子改変されることになる。操作型γδＴ細胞は、凍結保存用培地中に１ｍＬあたり１０６〜１０８細胞で１０個、１００個、２００個のバイアル量の細胞バンクを生成するためにさらに凍結保存されることになる。非操作型及び／または操作型γδＴ細胞は、凍結保存用培地中に１ｍＬあたり１０６〜１０８細胞で１０個、１００個、２００個、５００個及び１，０００個のバイアルまたはバッグの量の細胞バンクを生成するためにさらに凍結保存されることになる。
【０３９３】
実施例３５．さらなる処理のための細胞バンクを生成するための、凍結保存用培地中でのγδＴ細胞の代替的凍結保存
栄養補助及び、凍結解凍プロセス中の溶解からの生物物理学的細胞保護を提供するために、以前の実施例に記載されている凍結保護担体に他の凍結保護剤を添加する。これらとしては、例えば、Ｄ−グルコース、マンニトール、蔗糖、アデニン、グアノシン、組換えヒトアルブミン、シトレート、抗凝固剤、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ、ＤＮａｓｅ、プロピレングリコール、エチレングリコール、２−メチル−２，４−ペンタンジオールが挙げられる。高細胞密度凍結製品に緩衝能を提供するように設計された追加の添加剤としては、例えば、無機リン酸塩、炭酸水素ナトリウム及びＨＥＰＥＳが挙げられる。
【０３９４】
実施例３６．さらなる処理のための細胞バンクを生成するための、凍結保存用培地中でのγδＴ細胞の凍結保存
γδＴ細胞の初回凍結は、１分あたり−０．１〜−５℃の凍結速度を実現するように設計された温度制御式定速法で、速度制御冷凍庫（例えば、ＣｒｙｏＭｅｄ速度制御冷凍庫）または所望の凍結速度を提供する略遮熱型棚入システムを備えた機械的な−７０℃の冷凍庫を使用して実施される。凍結細胞は、３０〜６０日間以内の短期保管のために−７０℃の冷凍庫に入れられる。１２、２４、３６及び４８ヶ月間までのより長い期間にわたって保管するためには、以前の節において記載されている方法によって測定されるγδＴ細胞数及び細胞機能を低下させずに維持しつつ、凍結細胞を液体Ｎ２保管タンクに入れる。
【０３９５】
この実施例に記載されている凍結保存細胞は、解凍され、適切な密閉容器内、例えば培養バッグ内及び／またはバイオリアクター内でさらに刺激されかつ増殖して、対象への投与のための適切な量の操作型γδＴ細胞を生じさせることになる。
【０３９６】
実施例３７．患者への直接輸注のためのγδＴ細胞の製剤化
操作型γδＴ細胞を遠心分離及び／または膜透析濾過によって、凍結保護用賦形剤を含有する生理学的緩衝液中５×１０６細胞／ｍＬ〜１０８細胞／ｍＬに濃縮し、長期保管のために凍結保管ユニット、例えば液体窒素または超低温冷凍庫の中に入れる。
【０３９７】
実施例３８．がんに罹患しているヒト対象の処置
新鮮な、または凍結した操作型及び／または非操作型γδＴ細胞をベッド脇で解凍し、ヒト対象に静脈内輸注する。１キログラムあたり約１細胞〜１キログラムあたり約１×１０１０細胞の操作型及び／または非操作型γδＴ細胞を３０〜６０分の期間にわたってヒト対象に輸注する。操作型γδＴ細胞は、共刺激性サイトカインＩＬ−２またはその他のサイトカインの支援を伴うかまたは伴わずに投与される。場合によっては手順を繰り返す。対象の生体内でのγδＴ細胞の増殖は、フローサイトメトリーによって測定する。
【０３９８】
実施例３９．特異的γδＴ細胞活性化物質の作出
マウス抗体の形態のγδＴ細胞活性化物質を、組換え可溶性ヒトγδＴＣＲの免疫化によって生じさせた。γ８δ１−ＴＣＲ−ＦＣを使用する免疫化によってδ１特異的活性化物質を作り出し、γ９δ２−ＴＣＲ−ＦＣを使用する免疫化によってδ２特異的活性化物質を作り出し、どちらの構築物も、ヒトＩｇＧ１ＦＣと融合したγδＴＣＲ鎖の成熟ＥＣＤを含むものであった。３系統のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１及びＦＶＢ）にヒト組換えγδＴＣＲを接種して、高親和性のマウスモノクローナル抗体活性化物質を分泌するハイブリドーマを生じさせた。
【０３９９】
ｈγδＴＣＲ−Ｆｃ融合構築物をＰＣＲ増幅によって作り出した。γ８δ１ＴＣＲ鎖は、γ８δ１ＴＣＲを発現しているＴ細胞白血病の細胞株であるＢＥ１３（ＤＳＭＺ  ＃ＡＣＣ３９６）から単離したＲＮＡから増幅された。γ９δ２ＴＣＲ鎖は、ゾレドロン酸活性化ヒトＰＢＭＣから単離したＲＮＡから増幅された。可溶性δ１ＴＣＲ−ＦＣ及びδ２ＴＣＲ−ＦＣは、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の上清から精製された。１０μｇの可溶性ＴＣＲを等体積のＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＩｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で乳化させて各マウスの免疫化のために使用した。結果として生じた乳剤をその後、６匹のマウス（各々２匹ずつ：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１及びＦＶＢ）に足蹠を介して注射した。
【０４００】
固相ＥＬＩＳＡアッセイを用いてヒトγδＴＣＲに特異的なマウスＩｇＧ抗体のためにマウス血清をスクリーニングした。手短に述べると、ＥＬＩＳＡ塗布用緩衝液中１μｇ／ｍｌの組換えγδＴＣＲを９６ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号６１０７４４）に塗布して一晩置いた。０．０２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡによるウェルの遮断を室温（ＲＴ）で１時間行った。マウス血清の力価測定（１：１００、１：２００、１：４００、及び１：８００）を行い、５０μＬ／ウェルを、γδＴＣＲが塗布されたプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、その後、３％ＢＳＡ−ＰＢＳまたはＦＣＳを２％含むＰＢＳによるＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧの１：１０，０００希釈物５０μＬ／ウェルと共に、室温で１時間インキュベートする。再びプレートを洗浄し、室温で１５分間、４０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３４０２８）を添加しておく。発色後、等体積の２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して基質発色を止め、プレートを分光光度測定器によってＯＤ４５０で分析した。
【０４０１】
血清陽性免疫化マウスを屠殺し、（膝窩部及び鼠径部の）流入領域リンパ節を切り出して抗体産生細胞源として使用した。Ｂ細胞の単一細胞懸濁液（７６６×１０６細胞）を電気的融合によって非分泌性Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１５８０）と１：１の比で融合させた。電気的融合は、ＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ（商標）システム（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を製造業者の指示事項に従って使用して実施した。融合後、アザセリン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ９６６６）、ピルビン酸ナトリウムを含む高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ  カタログ番号１５−０１７−ＣＭ）が補充された、１５％のＦｅｔａｌ  ＣｌｏｎｅＩ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％のＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシン及び５０μＭの２−メルカプトエタノールを含有するハイブリドーマ選択培地中に、細胞を再懸濁させ、その後、３本のＴ１５０フラスコにおいてフラスコ１本につき５０ｍＬの選択培地中に播種した。その後、５％のＣＯ２及び９５％の空気を含有する３７℃の加湿インキュベータ内にフラスコを６〜７日間置いた。
【０４０２】
６日間成長させた後、Ｔ１５０フラスコ内でまとまって成長した細胞からなるライブラリーを、ＡｒｉａＩＩ細胞選別機を使用して１ウェルあたり１細胞でＦａｌｃｏｎ３８４ウェル平底プレートに播種した。その後、１５％のＦｅｔａｌ  ＣｌｏｎｅＩ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％のＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール及び１００μＭのヒポキサンチンを含有する９０μＬの培養用培地中で、選択されたハイブリドーマを成長させた。残った未使用のハイブリドーマライブラリー細胞は全て将来のライブラリー試験のために冷凍した。１０日間成長させた後、細胞が播種された各ウェルの上清を、δ１ＴＣＲに対して反応する抗体に関してＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳアッセイで評価した。
【０４０３】
ＦＡＣＳによるスクリーニングのために、フローサイトメトリーに基づくアッセイを用いて、マウス免疫グロブリンを分泌しているハイブリドーマのウェルをヒトδ１／ＴＣＲ特異性に関してスクリーニングした。δ１γ８ＴＣＲを発現しているＢＥ１３細胞、またはδ２γ９ＴＣＲを発現しているゾレドロン酸処理済みヒトＰＢＭＣを氷上で２５μＬのハイブリドーマ上清と共に６０分間インキュベートした。細胞を２％ＦＣＳのＰＢＳで２回洗浄し、その後、ＰＥに結合した二次ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ断片特異体のＰＢＳ／２％ＦＣＳによる１：３００希釈物５０μＬと共にインキュベートした。１５分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏを製造業者の指示事項に従って使用してフローサイトメトリーで分析した。ＢＥ１３細胞に優先的に結合した免疫グロブリンを含んでいるウェルを増殖させ、ＥＬＩＳＡアッセイによってδ１特異性に関してさらに試験した。ゾレドロン酸で活性化されたＰＢＭＣ細胞に優先的に結合した免疫グロブリンを含んでいるウェルを増殖させ、ＥＬＩＳＡアッセイによってδ２特異性に関してさらに試験した。
【０４０４】
下記γδＴＣＲ鎖：γ８δ１、γ８δ２、γ９δ１及びγ９δ２を対合させることによって作り出した可溶性γδＴＣＲタンパク質を、高結合能ＥＬＩＳＡ９６ウェルプレートに塗布した。可溶性ＴＣＲは、炭酸水素ナトリウム緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈して４℃で一晩置いてから使用した。プレートを洗浄し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中３％のＢＳＡによる遮断を３７℃で１時間行い、すぐさま使用したか、または４℃に保った。プレート上で未希釈のハイブリドーマ上清を室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、３％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：１０，０００に希釈されたＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧによる探査を室温で１時間行った。その後、プレートを上記の基質溶液と共にインキュベートし、ＯＤ４５０で読み取った。バックグラウンドより高い信号によって判定された、ヒトδ１ＴＣＲ鎖に優先的に結合した免疫グロブリンを含んでいるウェルを移し、増殖させた。
【０４０５】
結果として生じたδ１及びδ２ＴＣＲ特異的クローン性ハイブリドーマをＣＳ−１０凍結保存用培地（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中で凍結保存し、液体窒素中で保管した。
【０４０６】
実施例４０．δ１−及びδ２−特異的活性化物質の配列決定
特異的にδ１Ｔ細胞に結合してそれを活性化及び増殖させる典型的な別個のモノクローナル抗体を配列決定及びさらなる解析のために選択した。以下の表に示すように、実施例３９で作り出した選定δ１−γδＴＣＲ特異的モノクローナル抗体の重鎖可変領域（図３３）及び軽鎖可変領域（図３４）の配列解析は、新規な相補性決定領域及び、新規なＶＤＪ構成の提示を裏付けた。図３３〜３４に示す相補性決定領域は、Ｋａｂａｔによる定義に倣うものである。特異的にδ２Ｔ細胞に結合してそれを活性化及び増殖させる典型的な別個のモノクローナル抗体を配列決定及びさらなる解析のために個別に選択した。以下の表に示すように、実施例３９で作り出した選定δ２−γδＴＣＲ特異的モノクローナル抗体の重鎖可変領域（図３５）及び軽鎖可変領域（図３６）の配列解析は、新規な相補性決定領域、及び新規なＶＤＪ構成の提示を裏付けた。図３５〜３６に示す相補性決定領域は、Ｋａｂａｔによる定義に倣うものである。
【０４０７】
ＲＮｅａｓｙ単離キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  Ｑｉａｇｅｎ  ＃７４１０６）を使用して、選択されたハイブリドーマ細胞から全てのＲＮＡを抽出した。１０４個のハイブリドーマ細胞を３５０μｌのＲＬＴ緩衝液中に溶解させ、等体積の７０％エタノールを添加し、試料をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉスピンカラムに装填した。カラムを２回洗浄し、直接スピンカラム膜に掛けた１００μｌのＲＮａｓｅ不含水でＲＮＡを溶離させた。ＲＮＡ製剤の品質は、使用時まで−８０℃で保管する前に３μＬを１％アガロースゲルに分取することによって決定した。
【０４０８】
完全マウスＶＨレパートリーを標的とするように設計された３２個のマウス特異的リーダー配列プライマーを含んでいる５’プライマーミックスを、全てのマウスＩｇアイソタイプに対して特異的である３’マウスＣγプライマーと組み合わせて使用して、各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を増幅した。同じＰＣＲプライマーを使用して、ＶＨの４００ｂｐのＰＣＲ断片の配列決定を両端から行った。同様に、各Ｖκマウスファミリーを増幅するように設計された３２個の５’Ｖκリーダー配列プライマーのミックスを、マウスκ定常領域に対して特異的である単一の逆方向プライマーと組み合わせて使用して、κ軽鎖の増幅及び配列決定を行った。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してＶＨ及びＶＬ転写物を１００ｎｇの全ＲＮＡから増幅した。
【０４０９】
各ハイブリドーマにつき合計８つのＲＴ−ＰＣＲ反応を進行させた：Ｖκ軽鎖に対する４つと、Ｖγ重鎖に対する４つ。Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＯｎｅＳｔｅｐ  Ａｈｅａｄ  ＲＴ−ＰＣＲキットを増幅に使用した（Ｑｉａｇｅｎ  ＃２２０２１３）。５μＬのＲＮＡ、０．５の１００μＭの重鎖プライマーまたはκ軽鎖プライマーのどちらか（ＩＤＴによる特注合成）、ＤＮＡポリメラーゼと緩衝剤とｄＮＴＰとを含む１２．５μＬのｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼとを含有する１μＬの酵素ミックス、及び０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１ユニット）を含む、反応混合物を調製した。反応混合物は、逆転写及びＰＣＲの両方に必要とされる試薬を全て含有する。熱サイクラーのプログラムは、ＲＴステップ  ５０℃を１０分間、９５℃を５分間、続いて３０サイクルのＰＣＲ（９５℃を３０秒間、５８℃を３０秒間、７２℃を１分間）に設定した。その後には、７２℃で１０分間の最終インキュベーションが存在した。
【０４１０】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、ＤＮＡ配列決定を直接行うためにＰＣＲ産物を調製した。５０μＬの滅菌水を使用してＤＮＡをスピンカラムから溶離させ、その後、両鎖から直接、特異的Ｖ領域プライマーを使用して配列決定を行った。ＶＢａｓｅ２を使用してヌクレオチド配列を解析し、最も高い配列相同性を有する生殖細胞系Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子メンバーを同定した。
【０４１１】
図３３は、δ１特異的抗体からの重鎖可変領域の連続アミノ酸配列を描写する。図３４は、軽鎖可変領域の対応する連続アミノ酸配列を描写する。まとめ合わせると、図３３〜３４は、同定された機能可能な抗δ１ＴＣＲ抗体の注記付きの配列を提供する。
【０４１２】
図３５は、δ２特異的抗体からの重鎖可変領域の連続アミノ酸配列を描写する。図３６は、軽鎖可変領域の対応する連続アミノ酸配列を描写する。まとめ合わせると、図３５〜３６は、同定された機能可能な抗δ２ＴＣＲ抗体の注記付きの配列を提供する。
【０４１３】
実施例４１．δ１特異的活性化物質の交差反応性
３つ目のガンマデルタ集団はＶδ３Ｔ細胞であり、それは循環Ｔ細胞の約０．２％を占めている。
【０４１４】
Ｖδ３Ｔ細胞は、血中では稀であるが、肝臓中ならびに、白血病及びいくつかの慢性ウイルス感染症を患う患者において豊富に存在する。他の小サブセットは、Ｖδ４、Ｖδ５、Ｖδ６、Ｖδ７及びＶδ８のγδＴ細胞を含み、Ｃδに各々接合されたＶＪα遺伝子からなり、別個のＴＣＲアルファタンパク質及びデルタタンパク質をコードしている。
【０４１５】
８つの異なるデルタ鎖（Ｖδ１、Ｖδ２、Ｖδ３、Ｖδ４、Ｖδ５、Ｖδ６、Ｖδ７及びＶδ８）からなる可溶性ＴＣＲとδ１特異的な特異的活性化物質との結合を検出する結合アッセイによって、交差反応性及び、δ１特異的活性化物質が他のγδＴ細胞集団と交差反応する能力について試験した。８つ全てのデルタ鎖をＣ末端Ｆｃ融合物としてクローニングし、γ−ＦＣ鎖と共に２９３細胞中へ共トランスフェクトして、可溶性ＴＣＲ−ＦＣを培地中へと分泌させた。
【０４１６】
トランスフェクションの前日に、１×１０５細胞／ウェルの２９３付着細胞を１２ウェルプレートに播種した。
【０４１７】
トランスフェクションの日に、無血清培地中の２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＃１２３４７０１９）を使用して０．５μｇずつの各プラスミド（デルタ＋  ガンマ鎖）を共トランスフェクトした。
【０４１８】
トランスフェクションの３日後に、分泌されたＴＣＲをＥＬＩＳＡアッセイにおける結合性分析のために採集した。
【０４１９】
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
１μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＦＣ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃγ断片特異体−Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ＃１０９−００５−０９８）が塗布されたＥＬＩＳＡ用プレートの表面に、可溶性ＴＣＲ−ＦＣタンパク質を捕捉させた。結合は４℃で一晩実施した。プレートに捕捉された可溶性γδＴＣＲと、δ１特異的な特異的活性化物質との結合を、遮断用緩衝液で１：１０，０００に希釈されたＨＲＰ結合二次抗体：ヤギ抗マウスＦＣ特異体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ，Ｆｃγ断片特異体  ＃１１５−０３５−００８）による検出及びその後の各ウェルへのＴＭＢの添加によって試験した。結果を図３７に示す。
【０４２０】
δ１Ｔ細胞に加えて他のサブセットのγδＴ細胞と交差反応してそれを活性化させる能力は重要であり得る、というのも、クローン的に増殖したＴＲＤＶ４及びＴＲＤＶ８  Ｔ細胞は、ＡＭＬを指向する免疫応答に寄与するが、ＴＲＤＶ５及びＴＲＤＶ６は、再発を被っている患者において発生する可能性がある、ということが示されたからである。（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１６）９：１２６）。
【０４２１】
実施例４２．活性化及び増殖についてのアッセイ
γδＴ細胞の活性化及び増殖の誘導に関してδ１及びδ２ＴＣＲ特異的抗体を試験した。手短に述べると、５０ｍＭのＮａＨＣＯ３中またはＰＢＳ中５μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＦｃ−γポリクローナル抗体を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に塗布して一晩置いた。ウェルをＰＢＳで洗浄し、さらに、ＰＢＳ中１％のＢＳＡによる遮断を３７℃で１時間行い、０．１％ＢＳＡ中１μｇ／ｍＬのγδ−ＴＣＲ特異的抗体を２時間添加しておいた。細胞標識のために、新鮮な、または凍結したヒトＰＢＭＣを、完全培地中に一晩置いてその後に洗浄し、５μＭのＣＦＳＥ（ＰＢＳ）で再構成し、暗所にて常温で５分間インキュベートした。細胞をＦＢＳ含有培地で洗浄し、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ−１６４０培養用培地で１０６個／ｍＬに再構成した。０．５×１０６／ウェルのＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを播種し、５日間培養した。
【０４２２】
５日後に細胞を採取し、汎γδ、Ｖδ１、Ｖδ２及びαβＴＣＲに対する特異的表面マーカーで染色し、細胞増殖をＣＦＳＥ蛍光の漸進的変化によって評価した。活性化の結果として５日間で分裂した細胞の百分率を図３９に示し、活性化の効力に関して抗体を順位付けるために役立てる。
【０４２３】
実施例４３．特異的ＭＡｂを使用するヒトＰＢＭＣ由来のＶδ１及びＶδ２Ｔ細胞の１ステップ増殖
２％ＦＢＳ（ＰＢＳ）中１μｇ／ｍＬの選定された活性化δ１−ＴＣＲ抗体及びδ２−ＴＣＲ抗体（Ｄ１−０８、Ｄ１−３５、Ｄ１−３９、Ｄ２−１４、Ｄ２−１７、Ｄ２−２２、Ｄ２−３０、Ｄ２−３２、Ｄ２−３３、Ｄ２−３３、Ｄ２−３５、Ｄ２−３６、Ｄ２−３７）及びＯＫＴ３を、上記実施例２と同様に、２４ウェルプレートにおいて予め塗布されたヤギ抗マウスＦｃγ抗体に捕捉させた。細胞全体の０．２〜０．２８％の初期δ１集団及び細胞全体の約０．２〜４％のＶδ２集団を有する数名のドナーからのヒトＰＢＭＣを、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中１０６個／ｍＬ／ウェルで播種した。２〜３日ごとの培地補給によって、培養中の細胞に栄養補給した。７日目に細胞を採取し、活性化抗体を有さない新しいプレートに１０６個／ｍＬで再播種し、栄養補給の継続及び１４日目の再播種によって１０６個／ｍＬの細胞密度にまでさらに増殖させた。２１日目に細胞分析（計数及びフローサイトメトリー）を実施してδ１及びδ２細胞の純度及び増殖倍率を決定した。図４０は、ＰＢＭＣ培養物中のδ１（Ａ）及びδ２（Ｂ）細胞の増殖倍率を示す。Ｖδ１ＭＡｂ及びＶδ２ＭＡｂは、２１日間でＶδ１Ｔ細胞については約１２０００倍、Ｖδ２Ｔ細胞については６７００倍にまでδ１及びδ２Ｔ細胞の増殖を誘導した。
【０４２４】
２１日目の増殖済みδ１細胞の表現型をＣＤ２７表面マーカー発現によって評価した。図４１は、ＭＡｂで活性化されたＶδ１Ｔ細胞の２１日目の表現型が主として（＞５０％）ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋（ナイーブ）及びＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ−（セントラルメモリー）であることを示している。
【０４２５】
実施例４４．臍帯血由来のδ１−Ｔ細胞の１ステップ増殖
０．４％のＶδ１細胞を含有するヒト臍帯血からの単核細胞をＦｉｃｏｌｌ密度勾配法によって単離し、実施例４３に記載されているように、捕捉されたδ１ＴＣＲ特異的抗体で活性化させた。以下の表に示すとおり、Ｖδ１Ｔ細胞は、δ１特異的ＭＡｂによる活性化後に２１日で１５０３倍にまで増殖した。
2019519210.tif 000050
【０４２６】
実施例４５．フィーダー細胞を使用するＶδ１Ｔ細胞の２ステップ増殖
この実施例では、実施例４に記載のプロトコールに従って、ヒトＰＢＭＣを活性化させ、δ１細胞を１４日間増殖させた。手短に述べると、塗布されたヤギ抗マウスＦｃγポリクローナル抗体によってＶδ１抗体ＴＳ−１、Ｄ１−０８、Ｄ１−３７、Ｄ１−３９を２４ウェルプレートに捕捉し、記載されているように細胞を活性化及び増殖させた。１４日目に細胞培養物を採取し、ビオチン化抗ＴＣＲαβ抗体と磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とを使用してαβＴ細胞を除去することによってδ１Ｔ細胞を濃縮した。濃縮されたＶδ１細胞を、照射済みＰＢＭＣフィーダー細胞を使用して第２ステップの活性化／増殖に供した。手短に述べると、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬのＤ１−３５ＭＡｂを含有する２０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地中で１３０，０００個の全ての濃縮細胞を、照射済みヒト同種異系ＰＢＭＣが２００：１の比で存在する状態で培養した。培養物をＴ２５フラスコ内に縦に入れた。１８日目に、培地の７０％を置き換えることによって細胞に栄養補給した。その時から２〜３日ごとに培地の５０％を交換すること及び生細胞密度を１×１０６個／ｍＬに調節することによって細胞に栄養補給し、２８日目に細胞を採取した。以下の表に示すように、δ１細胞は２ステップ増殖手順において約２８，０００倍にまで増殖した。
2019519210.tif 000051
【０４２７】
実施例４６．αβＴ細胞除去を伴わない、フィーダー細胞を使用するＶδ１Ｔ細胞の２ステップ増殖
この実施例では、実施例６に記載のプロトコールに従って、０．２％の出発Ｖδ１集団を含むヒトＰＢＭＣを活性化させ、δ１細胞を７日間増殖させた。手短に述べると、塗布されたヤギ抗マウスＦｃγポリクローナル抗体によってＶδ１抗体ＴＳ−１、Ｄ１−０８、Ｄ１−３７、Ｄ１−３９を２４ウェルプレートに捕捉し、記載されているように細胞を活性化及び増殖させた。７日目に細胞培養物を採取し、増殖済み細胞を、照射済みフィーダー細胞を使用して第２ステップの活性化／増殖に供した。手短に述べると、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００ＩＵのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬのＤ１−３５ＭＡｂを含有する２０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で１３０，０００個の全ての細胞を、照射済みヒト同種異系ＰＢＭＣが２００：１の比で存在する状態で培養した。培養物をＴ２５フラスコ内に縦に入れた。１２日目に、培地の７０％を置き換えることによって細胞に栄養補給した。その時から２１日目の採取まで、２〜３日ごとに培地の５０％を交換すること及び生細胞密度を１０６個／ｍＬに調節することによって細胞に栄養補給した。以下の表に示すように、δ１細胞は２ステップ増殖手順において約１１４，０００倍にまで増殖した。
2019519210.tif 000052
【０４２８】
実施例４７．αβＴ細胞除去を伴いフィーダー細胞を使用するＶδ１Ｔ細胞の２ステップ増殖
この実施例では、実施例４に記載のプロトコールに従って、０．３６％の出発Ｖδ１集団を含むヒトＰＢＭＣを活性化させ、Ｖδ１細胞を１４日間増殖させた。１４日目に細胞培養物を採取し、ビオチン化抗ＴＣＲαβ抗体と磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とを使用してαβＴ細胞を除去することによってδ１Ｔ細胞を濃縮した。濃縮されたＶδ１細胞を、照射済みフィーダー細胞を使用して第２ステップの活性化／増殖に供した。手短に述べると、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬのＤ１−３５ＭＡｂを含有する２０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地中で濃縮細胞を、照射済みＫ５６２細胞が４９：１、９：１及び２：１の比で存在する状態で培養した。指定比の培養物（それぞれ２５×１０６個の全ての生細胞）を６ウェルＧ−Ｒｅｘフラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）内に入れた。１８日目に、培地の７５％を置き換えることによって細胞に栄養補給し、２１日目に細胞を採取した。以下の表に示すように、δ１細胞は２ステップ増殖手順において約３１，０００倍にまで増殖した。
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【０４２９】
実施例４８．Ｖδ１ＭＡｂによって活性化されかつ増殖したδ１Ｔ細胞は腫瘍細胞株に対して堅牢な細胞傷害性を示す
ヒトＰＢＭＣを固定化Ｄ１−０８ＭＡｂによって７日間活性化させ、培養物を、定常状態において２日ごとに栄養補給することによって増殖させた。増殖の最後に、抗ＴＣＲαβ抗体と磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）とを使用してαβＴ細胞を除去することによってδ１Ｔ細胞を濃縮した。精製されたδ１細胞を、Ｊｕｒｋａｔ（白血病）及びＣｏｌｏ２０５（結腸癌）細胞株に対する細胞傷害性アッセイにおいて使用した。手短に述べると、増殖済みδ１Ｔ細胞を、９６ウェル丸底プレート（懸濁液）において１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する完全培地中でＣＦＳＥ標識標的細胞と共に、１０：１、５：１、２：１、１：１及び１：５のエフェクター：標的細胞の比で４時間インキュベートした。インキュベーションの最後に細胞懸濁液をアネキシン−Ｖ−ＡＰＣ結合体及びＺｏｍｂｉｅ  Ｖｉｏｌｅｔ生存能染料で染色し、フローサイトメトリーで分析して死細胞／死滅しつつある細胞を検出した。図４２で示されているように、Ｖδ１細胞は、様々な比率のどちらの腫瘍細胞株に対しても４時間のアッセイにおいて最大４５％の細胞傷害性を実証した。
【０４３０】
実施例４９．振盪を伴う第２ステップを含む２ステップ手順によって活性化されかつ増殖したδ１Ｔ細胞
末梢血単核細胞の単離
アフェレーシス機械によって採集した新鮮な血液産物を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳで１：３に希釈する。その後、Ｓｅｐｍａｔｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）を使用しＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、希釈された血液産物を精製する。その後、濃縮リンパ球層を濃縮し、２回の洗浄、すなわち、まずはＣａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳによる洗浄、その後にはＣａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳ中０．２５％のヒト血清アルブミンによる洗浄を行う。最後に、超低付着性の２４ウェルプレート、６ウェルプレート及びＴ−７５フラスコにおいてウシ胎仔血清含有培地中及び無血清培地中で１×１０７細胞／ｍＬの精製血液産物を一晩置く。
【０４３１】
Ｔ細胞活性化
Ｔ細胞活性化の前日に、組織培養用処理済みの２４ウェルプレート、６ウェルプレート、Ｔ７５フラスコまたはガス透過性バッグを含めた適切な細胞培養容器に抗Ｆｃ抗体を塗布する。初回塗布の後に容器を暗所にて２〜８℃で一晩保管する。初回の抗Ｆｃ塗布の後、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳ中５％のウシ胎仔血清による遮断を容器に対して行い、３７℃のＣＯ２インキュベータにおいて１時間インキュベートする。１時間のインキュベート後に、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳで容器を１回洗浄し、その後、Ｖδ１特異的モノクローナル抗体による捕捉を容器に対して行う。その後、振盪を伴うかまたは伴わずに容器を室温で最長４時間インキュベートする。捕捉の最後に容器は、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳで２回洗浄され、Ｔ細胞活性化の準備が整う。
【０４３２】
ウシ胎仔血清含有培地か無血清培地かのどちらかを使用して、一晩置いたＰＢＭＣを０．５×１０６〜２×１０６細胞／ｃｍ２に希釈する。その後、希釈済みＰＢＭＣを、Ｖδ１特異的モノクローナル抗体が固定された容器に添加する。ＰＢＭＣを３〜７日間静置した状態に維持する。グルコース及びグルタミンなどの十分な栄養レベルを維持しかつ毒性副産物、例えばラクテート及びアンモニウムの蓄積を薄めるために、新鮮な細胞培養用培地を３日目から毎日追加する。初回活性化の最後に細胞を力学的または化学的な方法で採取する。その後、次の増殖のために細胞を新しいフラスコへ移す。
【０４３３】
Ｔ細胞増殖
初回Ｔ細胞活性化の後、細胞培養物を３７℃のＣＯ２インキュベータに最長２１日間維持する。まず、活性化された細胞培養物を、ウシ胎仔血清含有培地及び無血清培地で１ｅ６細胞／ｍＬに希釈する。Ｔ細胞は、Ｔ−２５、Ｔ−７５、Ｔ−１５０及びＴ−２２５フラスコを含めた、超低付着性表面もしくは組織培養用処理済み表面を有する静置式Ｔフラスコにおいて、または容器全体の容積が１２５ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、１０００ｍＬ、２０００ｍＬ及び３０００ｍＬであるものを含めた、邪魔板なしもしくは邪魔板付きの標準的な振盪式フラスコにおいて、培養されることができる。静置式Ｔフラスコでは、培養物の十分な酸素負荷を確保するために、表面に対する使用体積の比率を０．５ｍＬ／ｃｍ２以下に維持する。振盪式フラスコでは、十分な混合及び曝気を確保するために、楕円運動する振盪架台上での容器全体の容積に対する使用体積の比率を１〜２以下に維持する。
【０４３４】
生細胞培養物密度（ＶＣＤ）、代謝産物、ｐＨ及びガスの測定を毎日行う。代謝産物測定は、グルコース、ラクトース、グルタミン、グルタメート、アンモニウム、ナトリウムイオン、カリウムイオン及びカルシウムイオンについて行う。酸素、ＣＯ２の分圧及びｐＨを含めたｐＨ及びガスの測定も行う。酸素、ＣＯ２及びｐＨの測定は、温度補償を伴って行われる。細胞培養物を維持するために、ＶＣＤまたは代謝産物に基づく栄養補給を用いることができる。ＶＣＤに基づく栄養補給策としては、ＶＣＤが１．５×１０６細胞／ｍＬ以上に増大した場合に新鮮な培地を使用して培養物を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。代謝産物に基づく栄養補給策としては、グルコースレベルが１ｇ／Ｌ未満である場合に新鮮な培地を添加して１．５ｇ／Ｌに高める。
【０４３５】
細胞採取及びバンク生成
１９日間または２１日間の増殖の最後には常に９０％より高い細胞生存能が認められる。細胞増殖後に細胞培養物を洗浄し、細胞バンク生成用培地中に再懸濁させる。その後、細胞を２０×１０６細胞／ｍＬより高い細胞密度で等分する。液体窒素の気相中での凍結保存は、速度制御冷凍庫または冷凍容器を使用する凍結制御によって進められる。
【０４３６】
実施例４９ａ
この実施例では、０．４％の出発Ｖδ１組成を有していたドナーＡの新鮮な血液産物をＦｉｃｏｌｌによって精製し、超低付着性Ｔ７５フラスコ内に一晩置いた。固定化δ１特異的モノクローナル抗体δ１−３５及びδ１−０８による０日目から５日目までの活性化の後、培養物を振盪式フラスコに移した。５日目から１９日目まで毎日培養物をサンプリングし、新鮮な血清培地を使用してＶＣＤに基づく栄養補給策によって栄養分及び老廃物の濃度を維持した。Ｖδ１増殖倍率ならびに、δ１−３５及びδ１−０８によって活性化された培養物の純度を図４３に示す。
【０４３７】
実施例４９ｂ
この実施例では、０．１％の出発Ｖδ１組成を有していたドナーＢの新鮮な血液産物をＦｉｃｏｌｌによって精製し、超低付着性Ｔ７５フラスコ内に一晩置いた。固定化δ１特異的モノクローナル抗体δ１−０８による０日目から５日目までの活性化の後、培養物を振盪式フラスコに移した。５日目から１９日目まで毎日培養物をサンプリングし、新鮮な血清含有培地か新鮮な無血清培地かのどちらかを使用してＶＣＤに基づく栄養補給策によって栄養分及び老廃物の濃度を維持した。血清含有培地中及び無血清培地中で増殖させた培養物におけるＶδ１増殖倍率及び倍加時間（ＤＴ）（０日目から１９日目までの積算）を図４４に示す。
【０４３８】
実施例４９ｃ
この実施例では、０．５％の出発Ｖδ１組成を有していたドナーＣの新鮮な血液産物をＦｉｃｏｌｌによって精製し、超低付着性Ｔ７５フラスコ内に一晩置いた。固定化δ１特異的モノクローナル抗体δ１−０８による０日目から７日目まで（４９ｃ．１）及び０日目から５日目までの活性化の後、培養物を振盪式フラスコに移した。７日目から１９日目まで毎日培養物をサンプリングし、新鮮な血清培地を使用してグルコースに基づく栄養補給策によって栄養分及び老廃物の濃度を維持した。他の２つの培養物については、７日目から１９日目まで毎日培養物をサンプリングし、新鮮な血清培地を使用してＶＣＤに基づく栄養補給策かグルコースに基づく栄養補給策かのどちらかによって栄養分及び老廃物の濃度を維持した。Ｖδ１増殖倍率及び倍加時間（ＤＴ）（１４日目から１９日目までの積算）を図４５に示す。
【０４３９】
図４５の部分４９ｃ．１は、７日間活性化されてその後に７日目から１９日目までグルコースに基づく栄養補給策を用いて維持された培養物からのＶδ１増殖及びＤＴ（１４日目から１９日目までの積算）を示す。図４５の部分４９ｃ．２は、５日間活性化されてその後に７日目から１９日目までＶＣＤに基づく栄養補給策を用いて維持された培養物のＶδ１増殖倍率及びＤＴ（１４日目から１９日目までの積算）を示す。図４５の部分４９ｃ．３は、５日間活性化されてその後に７日目から１９日目までＶＣＤに基づく栄養補給策を用いて維持された培養物のＶδ１増殖倍率及びＤＴ（１４日目から１９日目までの積算）を示す。
【０４４０】
実施例５０．レトロウイルスキメラ抗原受容体構築物によるＶδ１Ｔ細胞の形質導入
健常ドナーからの末梢血単核細胞を固定化抗Ｖδ１特異的モノクローナル抗体（δ１−０８）で刺激し、実施例４９ａに記載されているように、ｒｈＩＬ−２が補充された培地中で１９日間培養した。手短に述べると、単離したＰＢＭＣを、２４ウェルプレートにおいて予め塗布されたヤギ抗マウスＦｃγ抗体によって捕捉させたＤ１−０８Ｖδ１ＭＡｂで活性化させた。細胞を、１０％のＦＢＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのグルタミン及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０中１ｅ６個／ｍＬ／ウェルで播種した。５日後に細胞を振盪式フラスコに移し、実施例４９ａに記載されているように増殖させた。１９日目に細胞を採取し、洗浄し、ＰＨＡ（２μｇ／ｍＬ）で２日間再刺激し、続いて、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）由来キメラ抗原受容体（ＣＤ２８−ＣＤ３ζに繋げられたｓｃＦｖ）をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。手短に述べると、２４ウェルプレートのウェルにｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ）を前もって塗布し、レトロウイルスを含有する上清（１ｍＬ）を３２℃で４時間インキュベートしてウイルス粒子を付着させ、その後、上清を除去した（ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎプレート）。増殖済みδ１Ｔ細胞を洗浄し、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する１ｍＬのウイルス懸濁液中に０．５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させ、ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎプレートに播種した。プレートを１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、３７℃のインキュベータ内に置いた。細胞をさらに７日間、２日ごとに栄養補給しながらインキュベートし、その後、Ｔ細胞表面に発現したＣＤ２０特異的ＣＡＲを認識する蛍光ラット抗リツキシマブ  イディオタイプ抗体（ＦＩＴＣ結合体）を使用して形質導入パーセントに関してフローサイトメトリーで分析した。図４６で示されているように、Ｖδ１＋生細胞のうち３４％超がＣＡＲ構築物を発現した。
【０４４１】
実施例５１．γδＴ細胞ＴＣＲに対する抗体のエピトープ位置特定
目的は、δ１特異的活性化物質のエピトープ特異性を位置特定することであった。全てのδ１特異的活性化物質はγδＴＣＲのδ１鎖を指向する。位置特定は、ヒト及びイルカのδ１ＴＣＲ鎖の組換えキメラ分子を使用することによって行った。ヒトとイルカとでδ１鎖のアミノ酸同一性が高いにもかかわらず、δ１特異的活性化物質はイルカδ１鎖に結合しなかった。それゆえ、本発明者らはヒトＶδ１とイルカＶδ１との配列及び配座の類似性（６５％の配列類似性）を利用して組換えキメラ分子を構築し、この場合、本発明者らは、ヒト残基の異なるセグメントをそれらのイルカδ１ＴＣＲ鎖由来の相同対応物で置き換えた。
【０４４２】
全てのｍＡｂはγδＴＣＲのδ１鎖の可変領域に特異的に結合することがフローサイトメトリー分析によって確認された。δ１γ８ＴＣＲを、正確に折りたたまれた配座の可溶性ＦＣ融合タンパク質として発現させ、抗δ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の全パネルの結合によって決定した。これらのｍＡｂは、γδＴＣＲの配座依存性エピトープを標的とすることが示された。
【０４４３】
ヒトδ１ＴＣＲの不連続なエピトープを発現させるために、７つの組換えキメラδ１鎖の組をクローニングしてヒト／イルカδ１−ＦＣ  ＴＣＲ鎖を生じさせた。図３８で示されているように、イルカ残基はそれぞれ、Ｔ細胞受容体可変ドメインについてのＩＭＧＴ独特の付番（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７（２００３）５５−７７）によるアミノ酸１〜１１、１〜２１、１〜２８、１〜４７、１〜７０、１〜８０及び１〜９５を含んでいた。
【０４４４】
これらのδ１特異的結合ドメインは、潜在的な接触残基についての予備知識なしでＥＬＩＳＡ結合アッセイ及び結合性喪失の検出によって同定された。本発明者らは、選定したδ１活性化物質の結合性に影響を与えた肝要なイルカ残基を重ね合わせることにより、δ１ＴＣＲ鎖のＶ及びＪ領域内の８つの可能な結合ビンを特定した。
【０４４５】
この研究で使用した発現ベクターは、ｐＣＩ−Ｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｅ１８４１）であり、可溶性ＴＣＲの発現はＣＭＶプロモーターに起因するものであった。可溶性ＴＣＲタンパク質を培地中へ搬出するためにマウスＩｇＨシグナルペプチドを使用し、続いて可溶性ＴＣＲをＥＬＩＳＡ用プレートに捕捉するためにヒトＦＣドメインを使用した。
【０４４６】
ヒトδ１鎖のＥＣＤをγδ１ＢＥ−１３Ｔ細胞株から増幅した。イルカＶδ１配列は、公開済みの配列（Ｔｕｒｓｉｏｐｓ  ｔｒｕｎｃａｔｕｓのＴ細胞受容体デルタ鎖（ＴＲＤ遺伝子）のｍＲＮＡ、単離体５Ｒ１Ｄ８０）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＮ６１０７４８．１）に基づいて合成遺伝子として注文したものであった。鋳型としてのこれらのｃＤＮＡを使用して、シグナルペプチドの５’ＡｇｅＩ部位及びデルタ定常領域の３’Ｅ．ｃｏＲＩへクローニングされる合成断片（ＩＤＴ  ＤＮＡ）から新たなキメラ分子をクローニングした。イルカ／ヒトδ１鎖からなる６つの構築物をクローニングし、γ８−ＦＣ鎖と一緒に共トランスフェクトして２９３細胞において可溶性δ１γ８ＴＣＲタンパク質を発現させた。
【０４４７】
ＨＥＫ−２９３細胞を９０ｍｍ細胞培養用プレートにおいて１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）ＦｅｔａｌＣｌｏｎｅ（商標）Ｉ  Ｓｅｒｕｍ（Ｕ．Ｓ．）−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。全ての構築物について、２９３Ｆｅｃｔｉｎをトランスフェクション試薬として使用して１×１０６個のＨＥＫ−２９３細胞に１０μｇのプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に上清を採取した。
【０４４８】
δ１特異的活性化物質−モノクローナル抗体はキメラに対するそれらの結合パターンが異なっており、各モノクローナル抗体の別個の結合パターンについてはＥＬＩＳＡアッセイで試験して同定することができた。
【０４４９】
ポリスチレン製マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＃６５５０６１）に、ＥＬＩＳＡ塗布用緩衝液（５０ｍｍのＮａ２ＣＯ３、０．０５％のＮａＨ３、ｐＨ９．６）中１μｇ／ウェルのヤギ抗ヒトＦＣ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ＃１０９−００５−０９８）を塗布して室温で１晩置いた。プレートを洗浄用緩衝液（ＰＢＳ  ０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、その後、１００μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡ遮断用緩衝液（ＰＢＳＴ中３％のＢＳＡ）による遮断を室温（ＲＴ）で１時間行った。遮断されたプレートに対する可溶性ＴＣＲの結合は、１００ｍｌの各上清を添加して室温で１時間インキュベートすることによって行った。各抗体をＥＬＩＳＡ遮断用緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈し、各γδＴＣＲキメラ分子に対する結合性を試験した。
【０４５０】
結合の検出は、ＨＲＰ結合二次抗体としてヤギ抗マウスＦＣ特異体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＃１１５−０３５−００８）を遮断用緩衝液で１：１０，０００に希釈したものを１００μｌ／ウェルで添加することによって行った。結合した抗体の量は、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＃３４０２９）の使用によって検出した。発色は１０分後に分光光度測定によって４５０ｎｍで測定した。全てのアッセイは２反復で行った。
【０４５１】
全ての構築物の配列
δ１−Ｄ３−Ｊ１  ＦＣ−完全ヒトＴＣＲ
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【０４５２】
イルカＴＲＤ単離体５Ｒ１Ｄ８
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【０４５３】
イルカ／ヒトキメラ−可溶性ＴＣＲの組をクローニングした−ヒト配列は青色
イルカ／ヒト  １−１１
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【０４５４】
イルカ／ヒト  １−２１
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【０４５５】
イルカ／ヒト  １−２８
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【０４５６】
イルカ／ヒト  １−４７
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【０４５７】
イルカ／ヒト  １−７０
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【０４５８】
イルカ／ヒト  １−８０
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【０４５９】
イルカ／ヒト  １−９５
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【０４６０】
結果
機能性ＴＣＲ遺伝子を別個のＶ、Ｄ及びＪ領域セグメントから遺伝子組換えによって組み立てる。ＴＣＲデルタ鎖遺伝子が組み立てられるとき、Ｄ遺伝子セグメントはＪセグメントに並置され、これに続いて、組み立てられた下流のＤＪセグメントに対してＶセグメントの再構成が行われる。ＴＣＲ鎖の免疫グロブリン様の折りたたみは、各鎖からの３つのループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を互いの近傍に配置し、抗原と接触することになる結合面を作り出す。これらのＣＤＲループのうちの２つ、すなわち１及び２は、Ｖ遺伝子セグメントによってコードされＶδ１領域遺伝子セグメントによって提供される多様性のみを有する。３つ目のＣＤＲループは、Ｖ（Ｄ）Ｊセグメントの並置によって作り出され、よりはるかに高い多様性を提供し、それは、任意の（Ｄ）Ｊセグメントに対して再構成する各Ｖセグメントの能力と、コード配列同士の結合が不正確である事実とが合わさった結果である。これらの接合部の各々にヌクレオチドの追加または欠失があってもよい。エピトープ結合特異性はＥＬＩＳＡによって示される（図４７Ａ〜Ｂ）。
【０４６１】
本発明者らは、γδＴＣＲ分子のδ１鎖のフレームワーク領域上の異なるエピトープに結合する活性化物質を同定した。モノクローナル抗体の１つのグループはＴＣＲのデルタ鎖のδ１可変領域に対して反応性である。詳しくは、本発明は、接合部の多様性（あらゆるγδＴＣＲ構成の並置（Ｄ）Ｊ１、Ｖ（Ｄ）Ｊ２及びＶ（Ｄ）Ｊ３）に関係なくδ１鎖可変領域に結合するモノクローナル抗体、例えば、ｄ１−０８、ｄ１−３９、ｄ１−１９２、ｄ１−２０１、ｄ１−２８５を提供する。これらのモノクローナル抗体は、デルタＴＣＲの「可変領域」に対して反応性であり、それゆえ、Ｖ領域のエピトープとの反応性を有するモノクローナル抗体である。
【０４６２】
他のδ１活性化物質は、δ１鎖可変領域及び、制限されたＶ（Ｄ）Ｊ１セグメントの並置によって作り出されるＣＤＲ３ループを特異的に認識する。これらのモノクローナル抗体は、Ｖ−ＤまたはＶ−Ｄ−Ｊ領域の連合エピトープにおいてＴＣＲの「可変領域」との反応性を有する：ｄ１−３７、ｄ１−１１３、ｄ１−１５５、ｄ１−１８２、ｄ１−１８３、ｄ１−１９１、ｄ１−２７８及びｄ１−２８２。
【０４６３】
他のδ１活性化物質は、δ１鎖可変領域ならびに、Ｖ（Ｄ）Ｊ３ではなくＶ（Ｄ）Ｊ１及びＶ（Ｄ）Ｊ１セグメントの並置によって作り出されるＣＤＲ３ループを特異的に認識する：ｄ１−３５、ｄ１−１４３、ｄ１−１４９、ｄ１−２０３。
【０４６４】
δ１に対して特異的である抗体は、以下のエピトープビンに分類される：
ビン１：ＶＤＪ接合部−ＪＨ１／ＪＨ２：ＴＳ−１、及びδ１−１８
ビン１ｂ：ＶＤＪ接合部−Ｊ３ではなくＪ１、Ｋ１２０Ｔ／Ａ突然変異体に対する結合性の喪失：δ１−３７
ビン２：（ａａ１１〜２１）：δ１−２８５
ビン２ｂ：（ａａ１１〜２１）、Ｒ１６Ｎ突然変異体に対する結合性の喪失：Ｒ９．１２
ビン２ｃ：（ａａ１１〜２１）、δ３、δ４及びδ５のγδＴＣＲと交差反応する：δ１−３９
ビン３：（ａａ８０〜９５または７０〜９５）：δ１−０８；δ１−２３
ビン４：（ａａ１〜１１）、Ｋ１２０Ｔ／Ａ突然変異体に対する結合性の喪失：δ１−３５、δ１−２０３
ビン５：（ａａ２８〜４７＋Ｊ１領域）：δ１−１１３、δ１−１５５、δ１−１８３、δ１−１９１、δ１−２７８、δ１−２８２
ビン６：（ａａ２１〜２８＋Ｊ１領域）：ＴＳ８．２、δ１−１４３
ビン７：（ａａ４７〜７０＋Ｊ１／Ｊ２領域）：δ１−１４９、δ１−２５３、及びδ１−２５７
ビン８：（ａａ７０〜８０）＋Ｊ１／Ｊ２：δ１−１９２
ビン９：（ａａ８０〜９５）：δ１−２０１。
【０４６５】
Ｌｉｎｇｕｉｔｉ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２０１６．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｕｒｓｉｏｐｓ  ｔｒｕｎｃａｔｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  （ＴＲＧ）  ａｎｄ  ａｌｐｈａ／ｄｅｌｔａ（ＴＲＡ／ＴＲＤ）  ｌｏｃｉ  ｒｅｖｅａｌ  ａ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｕｂｌｉｃ；ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎ  ｄｏｌｐｈｉｎ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．に基づくｄ１エピトープ位置特定と同様である。５つの組換えキメラδ２鎖の組をクローニングしてヒト／イルカδ２−ＦＣ  ＴＣＲ鎖を生じさせた。図１５に示すＴ細胞受容体可変ドメインのためのＩＭＧＴ独特の付番（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７（２００３）５５−７７）によれば、それぞれのイルカ残基はアミノ酸２８〜９４、４４〜９４、７２〜９４、及び８２〜９４を含んでいた。
【０４６６】
δ２／γ９−ＦＣ構築物のトランスフェクション
ヒトＴＲＧＶ９−ＪＰ−ＦＣ
2019519210.tif 000054
ヒトＶδ２１Ｊ１−ＦＣ
2019519210.tif 000055
イルカＶδ２Ｊ１−ＦＣ
2019519210.tif 000056
ヒト／イルカＶδ２Ｊ１−ＦＣ（２８〜９４）
2019519210.tif 000057
ヒト／イルカＶδ２Ｊ１−ＦＣ（４４〜９４）
2019519210.tif 000058
ヒト／イルカＶδ２Ｊ１−ＦＣ（７２〜９４）
2019519210.tif 000059
ヒト  イルカ  Ｖδ２Ｊ１−ＦＣ（８２〜９４）
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ヒトＶδ２１Ｊ１−ＦＣ（ＣＤＲ１−Ｓ）
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ヒトＶδ２１Ｊ１−ＦＣ（ＣＤＲ２−Ｇ）
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ヒトＶδ２１Ｊ１−ＦＣ（ＣＤＲ３−Ｓ）
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以下のエピトープビン：
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を同定するＥＬＩＳＡ結果を図４８に示す。
【０４６７】
本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し記載してきたが、当業者にはそのような実施形態が単なる例として提供されているに過ぎないことが明らかであろう。今や当業者は、本発明から逸脱することなく数値の変動、変化及び置換を思い付くであろう。本発明の実施において本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な変更が採用され得ることは理解されるべきである。以下の請求項によって本発明の範囲が画定されること、ならびにそれによってこれらの請求項の範囲内にある方法及び構造体とそれらの均等物とを包含することが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７−１】
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【図４７−２】
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【図４７−３】
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【図４８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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