(57)【要約】  配列決定装置用のフローセル。このフローセルは、流体入口、流体出口、少なくとも部分的に透明なカバーと基部の間に形成され流体入口を流体出口に流体接続する流体流路、および流体流路内に設けた捕捉基板を含む。捕捉基板は、マイクロスポット直径を有するマイクロスポットをそれぞれ１個受け入れるようになっているマイクロ保持器を含み、マイクロ保持器はマイクロスポット直径以上の隙間距離だけ隣接するマイクロ保持器から離れている。粒子分離装置はフローセルに流体接続することができる。粒子分離装置は、微小柱の配列を有するマイクロ流体流路を含み、複数のマイクロスポットを充填緩衝液に移送し、フローセルに搬送することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列決定装置用のフローセルであって、
流体入口と、
流体出口と、
少なくとも部分的に透明なカバーと基部との間に形成され、前記流体入口を前記流体出口に流体接続する流体流路と、
前記流体流路の内部に設けられた捕捉基板を備え、前記捕捉基板は、
複数のマイクロ保持器を含み、各々はマイクロスポット直径を有する複数のマイクロスポットのうち、それぞれ１つを受け入れるように構成され、各マイクロ保持器は隣接するマイクロ保持器からそれぞれ隙間距離だけ間隔をあけて配置されている、フローセル。
【請求項２】
前記隙間距離はマイクロスポットの直径以上である、請求項１に記載のフローセル。
【請求項３】
前記基部またはカバーは柔軟なフィルムを含む、請求項１に記載のフローセル。
【請求項４】
前記捕捉基板は前記カバーおよび基部から分離し、前記カバーおよび基部のうち少なくとも１つに固定される、請求項１に記載のフローセル。
【請求項５】
前記捕捉基板は、その上に形成されたマイクロ保持器を有する柔軟なフィルムを含む、請求項４に記載のフローセル。
【請求項６】
前記各マイクロ保持器は前記フィルム中に熱成形されている、請求項５に記載のフローセル。
【請求項７】
前記フィルムは重合体を含む、請求項５に記載のフローセル。
【請求項８】
前記フィルムは環状オレフィン共重合体からなる、請求項７に記載のフローセル。
【請求項９】
前記各マイクロ保持器は、隣接する二つのマイクロ保持器の間に広がる隙間表面の下に形成されたウェルを含む、請求項４に記載のフローセル。
【請求項１０】
前記各マイクロ保持器は、隣接する二つのマイクロ保持器の間に広がる隙間表面の上に形成された柱を含み、各柱の上部がそれぞれのマイクロスポットを受け入れるようになっている、請求項４に記載のフローセル。
【請求項１１】
前記各マイクロ保持器は、隙間表面から上方に伸びる微小柱のそれぞれの集団の間に形成された開口部を含む、請求項４に記載のフローセル。
【請求項１２】
前記各マイクロ保持器は、隣接する二つのマイクロ保持器の間に広がる隙間表面から上方に伸びる微小柱のそれぞれの集団の間に形成された開口部を含む、請求項１に記載のフローセル。
【請求項１３】
微小柱のそれぞれの集団は、六角形模様で配列した複数の微小柱を含む、請求項１２に記載のフローセル。
【請求項１４】
前記隙間表面は、前記マイクロスポットの隙間表面への接触を防ぐように構成された複数の追加の微小柱を含む、請求項１３に記載のフローセル。
【請求項１５】
前記各マイクロ保持器は３つの異なる軸に沿って配列された行を有する三角形模様に分布している、請求項１に記載のフローセル。
【請求項１６】
前記３つの異なる軸は互いに１２０°であり、前記マイクロ保持器は正三角形模様である、請求項１５に記載のフローセル。
【請求項１７】
前記捕捉基板は、エンボス加工または射出成形によってマイクロ保持器を形成したプラスチック材料を含む、請求項１に記載のフローセル。
【請求項１８】
前記マイクロスポットは７００ｎｍ〜１μｍの直径を有する、請求項１に記載のフローセル。
【請求項１９】
前記マイクロスポットは５００ｎｍ〜１．５μｍの直径を有する、請求項１に記載のフローセル。
【請求項２０】
前記マイクロスポットは３００ｎｍ〜３μｍの直径を有する、請求項１に記載のフローセル。
【請求項２１】
前記各マイクロ保持器は前記マイクロスポットの直径の約５０％の深さを有する、請求項１に記載のフローセル。
【請求項２２】
前記各マイクロ保持器は前記マイクロスポットの直径の５０％を超える深さを有する、請求項１に記載のフローセル。
【請求項２３】
前記各マイクロ保持器は前記マイクロスポットの直径以上の幅を有する、請求項２２に記載のフローセル。
【請求項２４】
実質的に全てのマイクロ保持器がそれぞれマイクロスポットを含み、各マイクロスポットは鋳型ＤＮＡのハイブリダイゼーションのためにプライマーで官能化されるが、増幅した鋳型ＤＮＡコロニーは含まない、請求項１に記載のフローセル。
【請求項２５】
実質的に全てのマイクロ保持器がそれぞれマイクロスポットを含み、各マイクロスポットが増幅した鋳型ＤＮＡコロニーを含む、請求項１に記載のフローセル。
【請求項２６】
マイクロ流体粒子分離装置であって、
複数のマイクロスポットを含む緩衝液を受け入れるようになっている緩衝液入口と、
充填緩衝液を受け入れるようになっている充填緩衝液入口と、
前記複数のマイクロスポットを含む前記緩衝液および充填緩衝液を受け入れ、放出緩衝液から前記充填緩衝液に複数のマイクロスポットを移送するようになっている微小柱の配列を含むマイクロ流体流路と、
前記複数のマイクロスポットを含む前記充填緩衝液を受け入れるようになっている充填緩衝液出口を含む、マイクロ流体粒子分離装置。
【請求項２７】
前記微小柱の配列は疎水性材料を含む、請求項２６に記載のマイクロ流体粒子分離装置。
【請求項２８】
フローセルおよび請求項２６に記載のマイクロ流体粒子分離装置を含み、前記マイクロ流体粒子分離装置の充填緩衝液出口は前記フローセルの流体入口と流体接続している、配列決定装置用のカートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願への相互参照〕
本出願は、２０１５年１２月２８日に出願した「不連続播種マイクロスポットのためのマイクロ保持器を備えたフローセル」と題する米国仮特許出願第６２／２７１，５４４号、および２０１６年３月１６日に出願した「不連続播種マイクロスポットのためのマイクロ保持器および粒子分離装置を備えたフローセル」と題する米国特許仮出願第６２／３０９，１２２号の優先権を主張し、これらの内容は参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般には、合成による配列決定または他の配列決定方法を実施するための機器に関し、具体的には、このような機器で使用されるフローセルおよび粒子分離装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の分子配列を決定するのにＤＮＡ配列決定装置が使用されている。このような装置は臨床研究、臨床診断、または、いわゆる「オーダーメイド医療」（個人の遺伝的内容に合わせた治療など）等に有用である。現在のＤＮＡ配列決定装置は様々な技術を用いてＤＮＡ配列を形成する塩基対を分析する。例えば、ある装置はフローセル内に固定した一本鎖ＤＮＡ分子断片をクローン化したコロニー（鋳型ＤＮＡコロニー）のライブラリーについて配列決定を行う。フローセルは、基本的には小さな反応容器であり、その中で鋳型ＤＮＡコロニーが一連の核酸塩基伸長反応を受ける。それぞれの連続した伸長反応を検出することで、各鋳型ＤＮＡコロニーの塩基配列を決定する。フローセルは、伸長工程および伸長した塩基対を読み取る検出工程の間に、鋳型ＤＮＡコロニーを保持する環境を提供する。
【０００４】
合成による配列決定装置は非光学的な系も知られてはいるが、その多くは、顕微鏡などの光学系を用いて核酸塩基の伸長を検出する。典型的な光学機器は可視化学標識を用いて各伸長塩基対の配列を決定する。例えば、ＤＮＡ分子（アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン）を構成する各核酸塩基は、顕微鏡を介して識別できる固有の蛍光プローブで標識することができる。標識は鋳型ＤＮＡコロニーが伸長するたびに読み取られ、その後、次の塩基対伸長のために除去される。
【０００５】
現在の「最新」機器では、数百万の鋳型ＤＮＡコロニーを１つのフローセルに固定し、それらを同時に処理することができる。様々なフローセルの形態が開発されて固定した鋳型ＤＮＡコロニーを保持しているが、通常それらにはいくつかの共通の特徴が含まれる。典型的なフローセルは、堅固な流路、流路を囲む光学的に透明なカバー、および適切な試薬が通過して鋳型ＤＮＡコロニーの成長および伸長を制御する流体入口および流体出口を含む。このようなフローセルの例は、米国特許第８，４８１，２５９号、同第８，９４０，４８１号、および同第９，１４６，２４８号、および米国特許出願公開第２００９／０２９８１３１号、および同第２０１４／０２６７６６９号に記載され、これらの全ては参照として本明細書に組み込まれる。
【０００６】
鋳型ＤＮＡコロニーは、様々な方法でフローセル内に固定することができる。例えば、クローン化した鋳型ＤＮＡコロニーを個々のビーズに固定してから、ビーズを無作為にフローセル内の官能化した表面に固定することができる。この技術は有用であるが、ビーズ、つまり鋳型ＤＮＡコロニーの間隔をほとんどか全く制御しないため、データの取得がより困難になることがある。また、この技術ではフローセルの外部で別の処理工程を用いて鋳型ＤＮＡを増幅することがある。また、この工程では、ビーズの捕捉特性が比較的効率的でない可能性があり、そのため鋳型ＤＮＡのライブラリーを調製する際により多くの増幅量を必要とする場合がある。
【０００７】
別の技術では、組織化された微小ウェルの様式を持つフローセルを使用し、鋳型ＤＮＡコロニーを固定化する。各ウェルは、鋳型ＤＮＡを捕捉するプライマーで官能化したゲルを含み、捕捉された鋳型は増幅され、フローセル内部のその場で鋳型ＤＮＡコロニーを形成する。まず基板表面全体をゲルで被覆し、次いで各ウェル間の隙間からゲルを除去することで、ゲルはウェル内に配置される。この方法にはいくつかの欠点がある。例えば、官能化したゲルの大部分を除去する必要があるため、追加の操作および材料費が必要となる可能性があり、隙間に残留したゲルが望ましくない鋳型ＤＮＡ播種部位を形成する可能性がある。また、ゲルがウェルから偶発的に外れることでＤＮＡプライマーの密度が減少する可能性がある。
【０００８】
本発明者らは、配列決定機器および同様の装置のためのフローセルの技術水準を進歩させる必要性が依然として存在すると判断した。
【発明の概要】
【０００９】
例示的な一側面において、配列決定機器のためのフローセルを提示する。フローセルは、流体入口、流体出口、少なくとも部分的に透明なカバーと基部の間に形成され流体入口と流体出口を流体接続する流路、および流路の内部に設けられた捕捉基板を含む。捕捉基板は複数のマイクロ保持器を有し、その各々はマイクロスポット直径を有する複数のマイクロスポットのうち、それぞれ１つを受け入れるように構成され、複数のマイクロ保持器の各々は、隣接するマイクロ保持器から隙間距離だけ間隔を空けて配置される。隙間距離は、マイクロスポットの直径に等しいかまたはそれより大きくてもよい。
【００１０】
実施形態によっては、基部またはカバーは柔軟なフィルムであってもよい。実施形態によっては、捕捉基板はカバーおよび基部から分離し、カバーおよび基部の少なくとも１つに固定してもよい。このような捕捉基板は、その上に形成されたマイクロ保持器を有する柔軟なフィルムであってもよい。このようなフィルムは、フィルム中に熱成形されたマイクロ保持器を有してもよい。そのようなフィルムは重合体、より具体的には環状オレフィン共重合体であってもよい。そのようなフィルムは、１μｍ〜１００μｍ、４μｍ〜５０μｍ、または１０μｍ〜２０μｍの厚さを有することができる。
【００１１】
実施形態によっては、マイクロ保持器は、隣接する二つのマイクロ保持器間の隙間表面の下に形成されるウェルであってもよい。マイクロ保持器はまた、隣接する二つのマイクロ保持器のあいだの隙間表面の上に形成され、その表面を延びる柱状のものであってもよく、各柱の上部は、それぞれマイクロスポットを受け入れるように構成される。また、マイクロ保持器は隙間表面から上方に延びる微小柱のそれぞれの集団の間に形成された開口部であってもよい。このような微小柱のそれぞれの集団は、六角形模様に配列した微小柱であってもよい。隙間表面に追加の微小柱を設けて、マイクロスポットが隙間表面に接触するのを防いでもよい。
【００１２】
実施形態によっては、マイクロ保持器は、３つの異なる軸に沿って配列した行を有する三角形模様で分布してもよい。そのような実施形態では、３つの異なる軸は互いに１２０°であり、マイクロ保持器は正三角形模様となる。
【００１３】
実施形態によっては、捕捉基板は、エンボス加工または射出成形によってマイクロ保持器を形成したプラスチック材料であってもよい。
【００１４】
実施形態によっては、マイクロスポットは、３００ｎｍ〜３μｍ、５００ｎｍ〜１．５μｍ、または７００ｎｍ〜１μｍの直径を有することができる。
【００１５】
実施形態によっては、マイクロ保持器は、マイクロスポット直径の約５０％の深さ、またはマイクロスポット直径の５０％を超える深さを有することができる。
【００１６】
実施形態によっては、マイクロ保持器は、マイクロスポット直径に等しいか、またはそれより大きい幅を有することができる。
【００１７】
実施形態によっては、実質的にすべてのマイクロ保持器がそれぞれのマイクロスポットを含み、各マイクロスポットは鋳型ＤＮＡのハイブリダイゼーションのためにプライマーで官能化されるが、増幅した鋳型ＤＮＡコロニーは含まない。
【００１８】
実施形態によっては、実質的に全てのマイクロ保持器はそれぞれのマイクロスポットを含み、各マイクロスポットは増幅した鋳型ＤＮＡコロニーを含む。
【００１９】
別の例示的な一側面では、マイクロ流体粒子分離装置が提供される。マイクロ流体粒子分離装置は、複数のマイクロスポットを含む緩衝液を受け入れるように構成された緩衝液入口、充填緩衝液を受け入れるように構成された充填緩衝液入口、複数のマイクロスポットおよび充填緩衝液を含む緩衝液を受け入れるように構成されたマイクロ流体流路、および充填緩衝液出口から構成される。マイクロ流体流路は、複数のマイクロスポットを放出緩衝液から充填緩衝液に移送するように構成された微小柱の配列を含むことができ、またその配列は必要に応じて疎水性材料から作製してもよい。充填緩衝液出口は、複数のマイクロスポットを含む充填緩衝液を受け入れるように構成されてもよく、また、マイクロ流体粒子分離装置は、フローセルと組み合わせて、充填緩衝液出口をフローセルの流体入口と流体接続することができる。
【００２０】
その他の代替方法は、本開示を考慮すれば当業者に明らかである。
【００２１】
本発明のこの要約の列挙は、これまたは任意の関連するまたは関連しない出願の特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。請求された発明の他の側面、実施形態、改変および特徴は、本明細書の開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
例示的な実施形態のより良い理解は、添付の図面を参照することで理解することができ、同様の参照番号は同様の部品を示す。図面は例示的なものであり、決して請求項を限定するものではない。
【００２３】
【図１】図１は、捕捉基板および関連するマイクロスポットの第１の例示的な実施形態に関する概略的な立面図である。
【００２４】
【図２】図２は、図１の実施形態の部分平面図である。
【００２５】
【図３Ａ】図３Ａは、捕捉基板および関連するマイクロスポットの第２の例示的な実施形態に関する概略的な立面図である。
【００２６】
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａの実施形態の一部の詳細図である。
【００２７】
【図３Ｃ】図３Ｃは、図３Ａの実施形態の一部の詳細図であり、別のマイクロ保持器の形状を示している。
【００２８】
【図３Ｄ】図３Ｄは、図３Ａの実施形態の一部の詳細図であり、もう一つのマイクロ保持器の形状を示している。
【００２９】
【図３Ｅ】図３Ｅは、図３Ａの実施形態の一部の詳細図であり、さらに別のマイクロ保持器の形状を示している。
【００３０】
【図４】図４は、第１の例示的なフローセルおよび関連器具に関する概略的な立面図である。
【００３１】
【図５】図５は、第２の例示的なフローセルおよび関連器具に関する概略的な立面図である。
【００３２】
【図６】図６は、第３の例示的なフローセルおよび関連器具に関する概略的な立面図である。
【００３３】
【図７Ａ】図７Ａは、捕捉基板および関連するマイクロスポットの別の例示的な実施形態に関する平面図および傾斜図である。
【００３４】
【図７Ｂ】図７Ｂは、捕捉基板および関連するマイクロスポットの別の例示的な実施形態に関する平面図および傾斜図である。
【００３５】
【図８】図８は、捕捉基板および関連するマイクロスポットの別の例示的な実施形態に関する概略的な立面図である。
【００３６】
【図９Ａ】図９Ａは、マイクロ流体粒子分離器の例示的な実施形態に関するマイクロ流体流路の概略的な部分平面図である。
【００３７】
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａの領域Ｂの拡大図である。
【００３８】
【図９Ｃ】図９Ｃは、図９Ｂの微小柱の概略的な部分平面図である。
【００３９】
【図９Ｄ】図９Ｄは、図９Ａのマイクロ流体流路内で発生する粒子分離に関する概略的な部分平面図である。
【００４０】
【図１０】図１０は、図９Ａのマイクロ流体流路を含むマイクロ流体粒子分離装置の概略的な平面図である。
【００４１】
【図１１】図１１は、フローセルと流体接続している複数のマイクロ流体粒子分離装置から構成されるカートリッジの、さらに別の例示的な実施形態に関する概略的な部分平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明者らは、２０１５年１２月２８日に出願された本発明者らの同時係属中の出願第６２／２７１，５４４号に提供したようなＤＮＡ配列決定装置または類似の装置と共に使用できる別の様々なフローセルの構造および方法を明らかにしており、それらの全ての内容は参照として本明細書に組み込まれる。そのような構造および方法の例は、限定されることなく本明細書に提供される。
【００４３】
図１および図２は、捕捉基板１００の側面図および平面図である。捕捉基板１００は、その上面に円錐台形のウェルとして形成した複数のマイクロ保持器１０２を有する。隆起した領域１０４はそれぞれ隣接するマイクロ保持器１０２の間に設けられ、隆起領域１０４の頂部は捕捉基板１００の上面を示す。各マイクロスポット１０６は複数のクローン化した鋳型ＤＮＡ鎖を含む鋳型ＤＮＡコロニーを保持するように構成される。説明のために、図１の左端のマイクロスポット１０６は、それぞれのマイクロ保持器１０２から外れているように示したが、実際には他のマイクロスポット１０６と同様にマイクロ保持器１０２の内部に固定される。以下でさらに詳細に説明するが、捕捉基板１００はフローセルの内部表面を構成してもよく、フローセルに設けられた別の部分であってもよい。
【００４４】
捕捉基板１００は、金属、ガラス、硬質プラスチック、セラミック、フィルム、または任意の別の適切な材料で構成されてもよい。捕捉基板１００は、ＤＮＡ配列決定工程において顕微鏡または他の光学機器が鋳型ＤＮＡコロニーを読み取る際、その被写界深度内の平坦な面に鋳型ＤＮＡコロニーを固定して提示できるように比較的平坦であることが好ましい。
【００４５】
マイクロ保持器１０２は隙間隆起領域１０４で分離している。図１および図２の実施形態では、隆起領域１０４同士が接合して基板１００の連続上面を形成するが、他の実施形態では、隆起領域１０４は下部表面から上に延びる複数の分離した領域から構成してもよい。例えば、隆起領域１０４を分割するように、マイクロ保持器１０２を構成するウェル同士を流路で接合してもよい。それぞれの隆起領域１０４は、隣接する一対のマイクロ保持器１０２の間に隙間Ｇを与える。全ての隙間Ｇの幅は、マイクロスポット直径Ｄに等しいことが好ましく、マイクロスポット直径Ｄより大きいことがより好ましい。しかし、実施形態によっては、マイクロスポットの特定の１つまたはすべての間の隙間Ｇの幅はマイクロスポット直径Ｄ未満であってもよい。
【００４６】
マイクロ保持器１０２および隆起領域１０４は、任意の適切な製造方法で形成してもよい。例えば、マイクロ保持器１０２を捕捉基板１００の上面から選択的にエッチング加工で除去し、隆起領域１０４を捕捉基板１００の未加工部分として残してもよい。湿式（例えば化学的）または乾式（例えばプラズマ）による写真平板法またはエッチング加工法を使用し、捕捉基板１００のエッチング加工しない部分をフォトレジスト層または他の中性層で被覆し、適当なエッチング加工媒体を用いてマイクロ保持器１０２を形成し、その後必要に応じてフォトレジスト層による被覆を除去してもよい。また、マイクロ保持器１０２および隆起領域１０４は、ゾル・ゲル法、微視的材料堆積法、または印刷などの付加的な製造技術によっても作製することができ、その場合は捕捉基板１００の元の上面に材料を堆積させ、マイクロ保持器１０２がそれらの間になるように隆起領域１０４を形成する。プラスチックなど特定の捕捉基板１００の素材は、成形技術（例えば、射出成形）またはエンボス加工を使用して製造することもできる。他の方法は、本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００４７】
マイクロ保持器１０２は、直線、正方形の格子模様、行、列、３つの軸に沿って配向した行を有する三角形模様など、任意の望ましい模様で分布させてよい。好ましい実施形態では、図２に示すように、マイクロ保持器１０２は、相互に１２０°に配向した行からなる正三角形模様で与えられる。この配置は、与えられた基板領域中に設置するマイクロ保持器１０２の数を最大にするとともに、それぞれ隣接するマイクロ保持器１０２の間に必要最低限の隙間Ｇを確保するのに有益である。
【００４８】
マイクロスポット１０６は、鋳型ＤＮＡのハイブリダイゼーションを行うためにプライマーで官能化できるよう、任意の適切な構造からなってよい。好ましい実施形態では、マイクロスポット１０６は球形であるが、他の形状であってもよい。マイクロスポット１０６は、ガラスビーズなどの固体であってもよい。あるいは、マイクロスポット１０６は、マイクロスポット１０６の表面積を増加させマイクロスポット表面上のプライマー密度を高めるために、重合体ビーズのような多孔質材料からなってよい。マイクロスポットは関連する光学顕微鏡などから見える蛍光の強度を潜在的に高められるように透明でもよい。透明なマイクロスポットは、関連する顕微鏡がマイクロスポット１０６の下にある基板から反射する光の検出を可能とする。
【００４９】
マイクロスポット１０６は、任意の適切な直径Ｄを有することができる。好ましい実施形態では、マイクロスポットの直径Ｄは３００ナノメートル（ｎｍ）〜３マイクロメートル（μｍ）の範囲でよい。別の好ましい実施形態では、マイクロスポットの直径Ｄは５００ｎｍ〜１．５μｍの範囲でよい。さらに別の好ましい実施形態では、マイクロスポットの直径Ｄは７００ｎｍ〜１μｍの範囲でよい。本開示では、非球状マイクロスポット１０６の直径Ｄは、その非球状マイクロスポット１０６と同じ容積を有する球状物体の直径（材料が測定可能な多孔質である場合は内部気孔を含む）であると理解される。前述のマイクロスポットの大きさは、蛍光による塩基対伸長検出法に関して有用であることが期待される。他の実施形態では、より小さいまたはより大きいマイクロスポットの直径を使用してもよく、その直径は使用される検出法の種類に応じて具体的に選択することができる。
【００５０】
それぞれのマイクロ保持器１０２は、好ましくはマイクロスポット１０６を１つ保持する大きさである。マイクロ保持器１０２は、好ましくは基板１００の上部表面の上に存在するマイクロスポットの表面がその約半分以下になるように、それぞれのマイクロスポット１０６を保持する。実施形態によっては、図１に示すように、マイクロ保持器１０２は隙間表面１０６の上に突出しないようにマイクロスポット１０６を完全に収容する深さであってもよい。当然のことだが、マイクロスポット１０６が基板１００の上部表面より下に落ちる程度は、マイクロ保持器の形状、マイクロ保持器の深さｄ、およびマイクロ保持器の幅Ｗの１つ以上に影響を受ける。例えば、球状のマイクロスポット１０６を使用し、マイクロ保持器１０２がマイクロスポットの直径Ｄよりも小さい幅Ｗを有する深い円筒形で構成される場合、マイクロスポット１０６はマイクロ保持器１０２の深さｄまで落下することなく上部の縁に留まる。マイクロスポット表面の５０％未満が基板１００の上部表面より上に存在するためには、マイクロ保持器の深さｄは、マイクロスポットの直径Ｄの約５０％以上であることが好ましく、マイクロ保持器の幅Ｗは、マイクロスポット直径Ｄの少なくとも１００％に等しいことが好ましい。マイクロ保持器１０２は、マイクロスポット１０６全体が基板１００の上部表面より下に保持されるように、深さｄおよび幅Ｗをマイクロスポット直径Ｄ以上にすることができる。好ましい実施形態では、マイクロ保持器１０２の深さｄは１５０ｎｍ〜１．５μｍ、および幅Ｗは３００ｎｍ〜３μｍの範囲でよい。別の好ましい実施形態では、マイクロ保持器１０２の深さｄは２５０ｎｍ〜０．７５μｍ、および幅Ｗは５００ｎｍ〜１．５μｍの範囲でよい。さらに別の好ましい実施形態では、マイクロ保持器１０２の深さｄは３５０ｎｍ〜０．５μｍ、および幅Ｗは７００ｎｍ〜１μｍの範囲でよい。
【００５１】
マイクロ保持器１０２は、マイクロスポット１０６の形状に対応して形成してもよい。例えば、マイクロスポット１０６が球形である場合、マイクロ保持器１０２は図３Ｂの実施形態のように半球状であってよい。マイクロ保持器１０２は基板１００に対して垂直に蛍光が配向するように放物線状またはレンズ状の形状であってもよい。マイクロ保持器１０２は異なる平面形状（すなわち、基板１００の平面に対して垂直に見た形）を有してもよい。例えば、マイクロ保持器１０２は、矩形、正方形、または六角形の平面形状を含んでもよい。隆起領域１０４から下方に延びるマイクロ保持器１０２の側面も、直線状、先細り状、湾曲状など、異なる深さ形状（すなわち、基板１００の平面に対して平行に見た形）を有してもよい。
【００５２】
図３Ａおよび図３Ｂは、フィルムから形成された基板３００の別の実施形態を示し、図３Ｂは図３Ａの破線の箱で示した部分の詳細図である。フィルムの例は、１〜１００μｍ、４〜５０μｍ、または１０〜２０μｍの厚みを持つ環状オレフィン共重合体膜などの重合体であるが、他の実施形態では他のものを使用することができる。この例では、マイクロ保持器３０２はフィルムにエンボス加工または熱成形を施すことができる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００４／０１１３３１６号では、フィルムにミクロン単位の形状を形成する方法の例を示しているが、他の技術は本開示を考慮すれば当業者には容易に明らかである。フィルム基板３００の隣り合うマイクロ保持器３０２の隙間部分は、隆起領域３０４を形成する。隆起領域３０４およびマイクロ保持器３０２は、エンボス加工工程、熱成形工程、または他の工程で同時に形成することができる。
【００５３】
各マイクロ保持器３０２は１個のマイクロスポット３０６を保持するように構成される。マイクロスポット３０６およびマイクロ保持器３０２の形状および寸法は、前述の方法または他の基準によって選択することができる。図示の例では、マイクロスポット３０６は球状で、マイクロ保持器３０２は半球状（すなわち、円形の平面形状および半円形の深さを持つ形状）であり、それぞれのマイクロスポット表面の約５０％以上が基板３００の上部表面から下に保持される大きさで作られている。この構成では、主にクローン化した鋳型ＤＮＡコロニー３０８が、マイクロスポット３０６の露出した上部表面に存在すると予想される。
【００５４】
図３Ｃは、別の実施形態として、マイクロ保持器３１４が、半球の代わりに円錐台の杯状（すなわち、先細りまたは台形の深さを持つ形状）に形成されていることを示す。図３Ｄは、別の実施形態としてマイクロ保持器３１６が円筒形の杯状（すなわち、直壁および長方形の深さを持つ形状）であることを示す。あるいは、マイクロ保持器３１４は立方体、六角形、または他の形状であってもよい。これらの形状や他の形状は、前述の実施形態のいずれかまたは他の実施形態で使用することができる。また、マイクロ保持器３０２はフィルム基板３００を貫通する穿孔を含んでもよく、この場合、マイクロスポット３０６はそれぞれ基板３００の下に露出するマイクロスポットの一部で保持される。この構造の例を図３Ｅに示すが、そこではマイクロ保持器３１８は開放底部３２０を有する円錐台の杯状である。穿孔状のマイクロ保持器３０２の利用は試薬に対するより高い反応性を提供し、フィルム基板３００にマイクロ保持器３０２を形成する利用可能な技術範囲を拡大し、また他の利益を提供することができる。その他の方法は本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００５５】
フィルム基板３００は多くの異なる方法でフローセルに一体化可能な柔軟材料を含んでもよい。例えば、基板３００を供給ロール３１０に設け、廃棄ロール３１２で除去してもよい。フローセルにおけるフィルムの詳細な使用方法および他の実施形態は、２０１５年１２月２８日に出願した本発明者らの同時係属出願第６２／２７１，４２３号に記載しており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。その他の方法は本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００５６】
基板の実施形態は、マイクロ保持器にマイクロスポットを任意の適切な方法で固定できるように構成してよい。例えば、ビオチン−ストレプトアビジン結合、共有結合、静電的相互作用、ファンデルワールス力などによって基板とマイクロスポットを結合させてもよい。この目的のために、マイクロ保持器とマイクロスポットの両方あるいは片方を化学的に官能化して互いを結合させてもよい。例えば、基板全体を結合性化合物で官能化し、次いで隆起領域の結合性化合物を除去し、マイクロ保持器以外の場所の結合を防止することができる。別の例として、基板は結合性化合物を作用させる前に隆起領域をマスク処理（例えば、フォトレジストなど）してもよい。この実施形態では、マスクはマイクロ保持器を形成する最初の段階で使用するものと同様であってよく、この場合、マスクを塗布し、マイクロ保持器を形成し、マイクロスポットを固定できるようにマイクロ保持器を官能化し、マスクを除去する。マイクロスポットは重力、磁力、または機構の組み合わせで保持してもよい。その他の方法は本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００５７】
基板の実施形態は、配列決定装置などに使用するフローセルに組み込んでもよい。図４は、流体入口４０２と、流体出口４０４と、入口４０２から出口４０４まで延びる密閉流路４０６を有するフローセル４００を示す。流路４０６はカバー４０８と基部４１０との間に形成される。流路４０６が見えるように、カバー４１０の少なくとも一部分は透明な窓からなる。当技術分野で知られるように、フローセル４００はその内容物を熱的に循環させるのに使用する電気加熱・冷却装置４１２（例えば、いわゆる「ペルチェ」装置）に搭載することができる。フローセル４００は、配列決定工程において、それぞれの核酸塩基伸長反応を識別する蛍光標識を検出するのに用いる顕微鏡４１４または他の光学機器の下に設置することができる。フローセル４００は、器具の残りの部分から完全にまたは部分的に取り外し可能であってもよく、または器具の一部として恒久的に一体化してもよい。その他の方法は本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００５８】
図４の実施形態において、カバー４０８および基部４１０は前述の基板として構成される。例えば、カバー４０８の内側表面（すなわち、流路４０６に面する表面）は、エッチングガラス材料で形成した複数の上部マイクロ保持器４１６からなり、第１集団のマイクロスポット４１８を保持するように構成してもよい。同様に、基部４１０の内側表面（すなわち、流路４０６に面する表面）は、エッチング金属材料で形成した複数の下部マイクロ保持器４２０からなり、第２集団のマイクロスポット４２２を保持するように構成してもよい（本明細書の本図および他の図におけるマイクロ保持器４１６およびマイクロスポット４２２の大きさは、説明のため大きく誇張されている）。第１および第２集団のマイクロスポット４１８、４２２は、フローセル４００内部のそれらの固定位置を除いて概ね同一であってもよいが、上部および下部マイクロ保持器４１６、４２０は、異なる種類、配置、模様、あるいは集団密度のマイクロスポット４２２を保持するように構成できることが予想される。他の実施形態では、マイクロ保持器はカバー４０８のみ、または基部４１０のみに設けてもよい。
【００５９】
図５は基板の実施形態を組み込んだフローセル５００の別の例を示す。繰り返しになるが、フローセル５００は流体入口５０２、流体出口５０４、および流体入口５０２から流体出口５０４への流体通路を形成する流路５０６を含む。流路５０６は少なくとも部分的に透明なカバー５０８と基部５１０の間に設ける。フローセル５００は加熱装置５１２の上部、および顕微鏡５１４または同様の機器の下部に取り付けることができる。
【００６０】
図５の実施形態では、基板５１６は基部５１０および／またはカバー５０８に接合する別の部品として提供される。基板５１６はプラスチック、ガラスまたは金属薄版のような、平坦な形状を維持できる一般に硬い材料を含んでもよい。基板５１６はマイクロスポット５２０を保持する複数のマイクロ保持器５１８を含む。この配置では、基板５１６の形状及び大きさを既存のフローセルに合うように特別に設計することができ、配列決定処理に高い融通性をもたらすことを可能にする。例えば、フローセルに様々に異なる交換可能な基板５１６を設け、本装置の操作者がマイクロ保持器の数、幾何学的な方向、および／または間隔を選択できるようにする。また、複数の異なる基板５１６（または複数の異なる構成を有する１つの基板５１６）を１つのフローセルに配置し同時に処理を行うことができる。これは、基板５１６のある部分を参照領域、また残りの部分を比較領域として機能させる場合に特に有益である。例えば、標識の蛍光強度の基準値を確定させるため、基板５１６の一部に比較的大きな隙間Ｇを設け、より大きなマイクロスポット識別能を有する領域を提供してもよい。マイクロ保持器の間隔または他の特性におけるこのような変化は、他の実施形態でも同様に使用することができる。
【００６１】
図６は、基板の実施形態を組み込んだフローセル６００の別の例を示す。フローセル６００は流体入口６０２、流体出口６０４、および流体入口６０２から流体出口６０４への流体通路を形成する流路６０６を含む。流路６０６は少なくとも部分的に透明なカバー６０８と基部６１０の間に設けられる。フローセル６００は加熱装置６１２の上部、および顕微鏡６１４または同様の機器の下部に取り付けることができる。
【００６２】
本実施形態では基板６１６をフィルムとして提供し、それはマイクロスポット６２０を保持するマイクロ保持器６１８を含むように形成する。フィルムは柔軟であり、他の部品で保持することなく平坦な形を維持する必要はない。基板６１６は任意の適切な構成または部品を用いてフローセル６００に組み込んでもよい。例えば基板６１６を基部に対して平らに引張り、フローセル６００の周囲を構成する垂直壁６２２と基部６１０の上部表面の間に挟んでもよい。また基板６１６は、本発明者らによる上記の同時係属中の出願に記載されるように、フィルムの２つの端の間に加える差圧で定位置に保持してもよい。その他の方法は本開示を考慮すれば当業者には明らかであり、他の実施形態は前述の開示において考察され参照として組み込まれる。
【００６３】
図７Ａおよび図７Ｂは捕捉基板７００の他の例を示す（明確化のため基板の一部のみを示す）。基板７００は複数の微小柱７０４が上方に延びる平坦な下部表面７０２から構成される。基板７００上のマイクロスポット７０８を捕捉するため、マイクロスポット７０８が丁度はまるマイクロ保持器７０６を不連続に形成する模様で微小柱７０４を配置する。具体的には、それぞれのマイクロ保持器７０６は複数の微小柱７０４によって囲まれた開放空間として形成し、その空間はマイクロスポット７０８を１つ受容する大きさである。例えば、マイクロスポット７０８の直径Ｄ２とほぼ等しいかやや大きい直径Ｄ１を有する開口部を形成するように、６個の微小柱７０４の集まりを六角形模様に配置してもよい。マイクロスポット７０８の直径Ｄ２に変動がある（例えば、３％の変動係数など）と予想される場合は、そのマイクロスポット直径Ｄ２のうちの望みの割合を含むようにマイクロ保持器の有効直径Ｄ１を選択してもよい。マイクロ保持器７０６は、互いに１２０°に配向した三角形模様または反復列状に配置される。この模様は所定の格子間距離Ｇに対して最大のマイクロスポット密度を与えると期待される。他の実施形態では、マイクロ保持器７０６を互いに９０°に配向した列で正方形または長方形模様に配置するなど、他の配置を使用することができる。その他の代替方法は本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００６４】
図７Ａおよび図７Ｂの実施形態では、マイクロスポット７０８は自由落下し完全に下部表面７０２と接触するが、これはすべての実施形態で必要ではない。また、他の実施形態では正方形の角に４つの微小柱７０４を配置するなど、微小柱７０４を異なる模様で用いてマイクロ保持器７０６を形成してもよい。マイクロスポット直径Ｄ１の大きさは、上述したマイクロスポットの大きさまたは他の仕様に従って選択することができる。
【００６５】
基板７００の残部（すなわち、マイクロ保持器７０６の間の部分）に微小柱７０４を配置し、マイクロスポット７０８が効果的に定位置に捕捉されるより遠くへ落下するのを防止する。例えばマイクロ保持器７０６の外側の領域では、有効直径Ｄ３を有する三角形の反復模様で微小柱７０４を配置してもよく、その直径Ｄ３は直径Ｄ２の約１０％以下よりも大きいマイクロスポット７０８が微小柱７０４の上部平面より下に落ちるには小さすぎる大きさでもよい。したがって、マイクロ保持器７０６以外の場所で微小柱７０４の上に残ったマイクロスポット７０８は、試薬または他の溶液を流すか、または基板７００を傾けることで容易に除くことができる。マイクロ保持器７０６の間の基板７００の領域は、隣接するマイクロ保持器７０６との間に隙間Ｇを形成する。隙間の汚染によって起きるポリクローナル化を防止するため、隙間Ｇは、好ましくはマイクロビーズ直径Ｄ２に等しく、より好ましくはマイクロビーズ直径Ｄ２よりも大きい。
【００６６】
好ましい微小柱７０４の高さＨは、マイクロビーズ７０８の動きに機械的な抵抗を与えることでマイクロビーズ７０８を定位置に捕捉できるように選択する。例えば微小柱の高さＨはマイクロスポット直径Ｄ２の半分以上、好ましくは半分より大きくてよい。他の例では、微小柱の高さＨはマイクロスポット直径Ｄ２の５０％〜１００％であってもよい。他の実施形態では他の高さを使用することができる。
【００６７】
前述の実施形態は様々な方法で変更してもよい。例えば、下部表面７０２はマイクロスポット７０８を適切に結合させる化学的処理を含んでもよい。この場合、微小柱７０４はマイクロスポット７０８が下部表面７０２と接触できる場所を設けるのに用いるが、マイクロスポット７０８を定位置に捕捉することは期待していない。したがって微小柱の高さＨを低くしてもよい。マイクロスポット７０８の異なる分布模様および密度を得るためにマイクロ保持器７０６の模様を変更してもよい。本明細書に記載する他の実施形態と同様に分布模様および密度を選択し、情報量を増加させるためにマイクロスポットの数を最大化したり、相互干渉などを抑制して情報精度を高めるためにマイクロスポットの数を減らしたりしてもよい。さらに別の例では、マイクロ保持器７０６はその内部に配置した短い微小柱でマイクロスポット７０８を下部表面７０２の少し上に支えてもよく、それにより試薬の暴露および鋳型の成長を促進し、下部表面から反射する可能性のある蛍光模様の大きさおよび強度を低減することができる。さらに別の例では、マイクロスポット７０８を下部表面７０２から様々な異なる距離に保持するように微小柱７０４を構成してもよい。その他の方法は本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００６８】
微小柱７０４を用いてマイクロ保持器７０６を形成することは幾つかの利点をもたらすと期待される。例えば、マイクロスポット７０８の試薬に対する反応性を良くし、潜在的にＤＮＡコロニーを大きく成長させて読み取り工程の視認性を高めることができる。さらに、余分な試薬を拡散のみに頼らずに対流によって容易に除去することができる。
【００６９】
微小柱を有する基板７００は任意の適切な技術を用いて作製することができる。例えば、微小柱７０４は写真平板法および電気めっき法、フィルムの成形あるいは熱成形、パルスまたは時間多重エッチング加工、（鋳型形成用の）深反応性イオンエッチング加工などを用いて形成することができる。その他の方法は本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００７０】
図８は保持器基板８００の別の実施形態を概略的に示すが、それは下部表面８０４から上に延びる柱状のマイクロ保持器８０２を有する。前述の実施形態とは異なり、捕捉に適した化学組成にする等の方法で、マイクロスポット８０６はマイクロ保持器８０２上部の適切な位置に捕捉される。先に説明したように、下部表面８０４は隣接するマイクロスポット８０６との間に隙間Ｇを与える。適切な隙間距離Ｇを維持して隙間の汚染から発生するポリクローナル化を緩和しつつ、マイクロスポット８０６を周辺の下部表面８０４より上に保持するので、本実施形態はマイクロスポット８０６の試薬に対する反応性を良くすることができる。
【００７１】
前述の明細書は３つの異なる一般的な捕捉基板用マイクロ保持器の構成を記載している：隙間表面の下へ延びるウェルとして形成したマイクロ保持器、隙間空間を形成する微小柱の隙間で形成したマイクロ保持器、およびマイクロスポットを捕捉する柱で形成したマイクロ保持器である。実施形態はこれらの構成のうちの１つ、またはこれらの構成の１つ以上の組み合わせを用いることができる。
【００７２】
基板および基板を有するフローセルは任意の適切な方法で使用することができる。一例では、マイクロスポットがフローセルに導入される前に、マイクロスポットを目的の鋳型ＤＮＡに特異的なユニバーサルＤＮＡプライマーで官能化することができる。共有結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、静電的相互作用、またはファンデルワールス力のような任意の適切な結合を用いて、プライマーをマイクロスポットに付加してもよい。例えば、ガラスおよびプラスチックのマイクロスポット表面に対するシラン処理、あるいは金表面に対するチオール化などによってプライマーとの共有結合を形成してもよい。マイクロスポットにプライマーを付加する他の方法は本開示を考慮して当業者に理解されるだろう。
【００７３】
官能化したマイクロスポットはフローセルに導入して充填され、そこでマイクロ保持器はマイクロスポットを捕捉および固定し、好ましくはマイクロ保持器あたり１個以下のマイクロスポットを固定する。いくつかのマイクロ保持器は空のままで、またいくつかのマイクロ保持器は複数のマイクロスポットを保持できるが、大多数のマイクロ保持器は１個のマイクロスポットを保持することが好ましい。マイクロスポットの充填後、目的の鋳型ＤＮＡを徐々にフローセルに充填すると、１つの鋳型ＤＮＡが各マイクロスポットに結合する。次に各鋳型ＤＮＡはフローセル内でプライマーが利用できなくなるまで増幅される。別の実施形態では（鋳型ＤＮＡを装填する）播種工程および増幅を同時に行ってもよい。別の実施形態では、マイクロスポットを官能化しフローセルに導入される前に鋳型ＤＮＡを播種する。さらに別の実施形態では、マイクロスポットをフローセルに導入する前に官能化、播種、および増幅してもよい。その他の方法は本開示を考慮すれば当業者には明らかである。合成工程を用いた配列決定は増幅が完了した後に開始する。
【００７４】
マイクロ保持器およびマイクロスポットの実施形態における前述の方法を使用することにはいくつかの利点がある。例えば、増幅時間ではなくマイクロスポットの露出表面にあるプライマーが利用できるかどうかで増幅量が制限される。この制限は増幅中に形成される異なる鋳型ＤＮＡコロニーの大きさを制御および標準化するのに役立ち、コロニーは同じ形状で、より狭く、より均一な分布となる傾向がある。これは合成工程を用いた配列決定中に均一な蛍光シグナルを与えるのに役立ち、その塩基対の検出と情報処理を改善することができる。
【００７５】
さらに、隙間の汚染によって発生するポリクローナル化（すなわち１個のマイクロスポットに複数の異なる鋳型ＤＮＡが増幅すること）を低減または最小にするために、マイクロ保持器の密度、具体的には隙間Ｇの大きさを選択することができる。これは重複する信号を除去し各マイクロスポットの信号の純度を改善するので、情報の品質を改善するのにも役立つ。このためにはマイクロスポット直径Ｄ以上の隙間Ｇが有効であると期待されるが、マイクロスポット直径Ｄよりも小さい隙間Ｇなど、他の大きさの隙間Ｇを使用してもよい。
【００７６】
マイクロ保持器の分布を選択して配列情報の量および質を変えてもよい。例えば分布の密度を高めて量を増やすか、分布の密度を低めて品質を高めてもよい。様々な配列決定処理装置の個別の要求に応じて、マイクロ保持器の密度を調整してフローセルの情報出力に高い柔軟性を与えてもよい。基板の実施形態によると、追加の費用または不自由さをほとんどまたは全く伴わずにマイクロ保持器の模様および間隔を変更する柔軟性をもち、同じ表面積を持つフローセルの内部で充填と出力を行う能力を変えることができると期待される。さらに、マイクロ保持器の位置が鋳型ＤＮＡコロニーの空間分布を定めるという事実は情報分析工程を単純にするのに利用される、というのは、特に連続する配列決定周期の間でコロニーの位置を再登録する必要がある装置では、各鋳型ＤＮＡコロニーの物理的な位置を確立するのに必要な計算量が少なくて済むからである。
【００７７】
上記の方法の別の利点は、鋳型ＤＮＡコロニーを成長させる支持体が保持基板から分離している間にプライマーで官能化されることである。したがって、プライマーの無駄が少なくなり、特に官能化したゲルを基板全体に加えてから鋳型ＤＮＡコロニーを必要とする領域以外のゲルを除去する装置と比較して、基板上の望まない領域からプライマーを除去する追加の工程が不要となる。
【００７８】
さらに、本明細書に記載された実施形態は、合成による配列決定という状況で一般的に説明したが、好ましくはフローセルにマイクロおよびナノ尺度の物体の配置が必要な他の工程で用いるように実施形態を構成してもよい。例えば本発明のさらに別の実施形態では、図７Ａおよび図７Ｂに示す実施形態と同様に、マイクロ流体粒子分離および／または標的粒子を含む乳濁液試料から少なくとも部分的に油相を除去するために複数の微小柱を有する捕捉基板を用いてもよい。
【００７９】
ここでは図９Ａ〜図９Ｄを参照するが、異なる大きさの粒子の流れを分離できる模様で必要な大きさと形状の微小柱９０４を配置することで、本発明の一実施形態に従ってマイクロ流体粒子分離が達成される（９０２、９０３）。したがって、図７Ａおよび図７Ｂに示した実施形態と異なり、微小柱はマイクロスポットを捕捉する空間を含むように配置しなくてもよい。代わりに、例えば図９Ｂに示すように、マイクロ流体流路９０１に複数の微小柱９０４を等間隔に設けてもよい。好ましくは、流体に含まれる粒子が微小柱の間で力を受けるように微小柱の高さをマイクロ流体流路の高さに実質的に等しくしてもよい。図９Ｂは、図９Ａの領域Ｂ内の微小柱９０４を拡大した平面図である（本図および本明細書中の他の図における微小柱９０４および粒子９０２、９０３の大きさは、説明のために大幅に誇張している）。
【００８０】
図９Ｃの概略図に示すように、一実施形態の微小柱は円筒状でもよく、流体の流れ方向９００に垂直な同じ列の隣接する微小柱の間隔は距離Ｇに等しい。流体の流れ方向に対して同じ列の隣接する微小柱の中心間の距離は、距離λに等しい。各列の微小柱９０４は、隣接する列の微小柱９０４に対して流れに垂直な方向に位置を変えてもよい。例えば第１列と第２列の隣接する微小柱の流れに垂直な方向に対する中心間の距離は、距離δに等しい。微小柱９０４の形状、ならびに寸法Ｇ、λ、およびδを変更して、マイクロ流体流路を流れる粒子の分離を制御する微小柱の配列を得ることができる。例えば、より大きい粒子９０２は、より小さい粒子９０３の少なくとも２倍の直径であってよい。両方の粒子はマイクロ流体流路９０１内の流体によって流れ方向９００に運ばれる。しかし、微小柱９０４の大きさ、形状および配置ならびにマイクロ流体流路９０１の長さのために、大きい粒子９０２は小さい粒子９０３から角度αだけ分離する。図９Ｄに示すように、これは大きな粒子９０２が微小柱９０４に衝突しながらその配列に沿って進むために発生し、一方より小さい粒子９０３は微小柱９０４の間でより滑らかに流れることができる。
【００８１】
一用途では、図１０の装置の平面図に示すように、マイクロ流体粒子分離装置を用いて試料から標的粒子を抽出することができる。標的マイクロビーズ９０２および不要な小粒子９０３を含む流体試料を入口１００３から装置に導入する。マイクロ流体流路１０１０の上半分Ｉまで作動緩衝液を入口１００２に導入する。作動緩衝液および流体試料の層流は、それぞれマイクロ流体流路１０１０の上半分Ｉおよび下半分ＩＩを通り、１００８の方向に平行な実質的に２つに分離した流れになる。マイクロ流体流路１０１０は、標的マイクロビーズ９０２の衝突流が起きるようになっている微小柱（図示せず）の配列を含んでもよい。結果として生じる粒子の分離角αにより、下半分ＩＩの試料流体の流れから上半分Ｉの作動緩衝液の流れまで標的マイクロビーズ９０２が移動できるように、マイクロ流体流路１０１０の長さＬおよび微小柱の構成を選択するべきである。これにより標的マイクロビーズ９０２を本装置の出口１００４から抽出および収集し、不要な小粒子９０３を排出口１００５から除去することが可能となる。当業者にとって当然のことだが、代わりに標的粒子はより小さい粒子でもよいので、実施形態によっては、出口１００４から出る粒子を廃棄し、出口１００５から出るより小さい粒子を収集しさらに処理してもよい。
【００８２】
前述のように、微小柱の大きさおよび形状、ならびに微小柱配列の構成は、標的粒子および不要粒子の大きさに応じた適切な分離角αとなるように変更してよい。実施形態によっては、標的粒子は不要な粒子よりも大きいか小さい直径を有するマイクロスポットまたはマイクロビーズを含んでもよい。例えば、試料流体中の不要な粒子は、細菌（〜２μｍ未満）、白血球、血小板、赤血球（〜３〜７μｍ）、好中球（〜１０μｍ）、寄生虫（約１２μｍ）、または循環性腫瘍細胞（約１５μｍ）の１種以上を含んでもよい。したがって、生物学的流体試料の種類に基づいて微小柱および／または微小柱配列の形状、間隔、および寸法を調整して、装置の能力を最適にし、不要な粒子から標的粒子を分離してもよい。
【００８３】
実施形態によっては、試料流体は乳濁液の形態であってもよく、必要であれば乳濁液の分離は粒子分離と同時に実施してもよい。したがって特定の実施形態では、微小柱は疎水性材料で作製するか疎水性材料で被覆し、試料流体中の油相を引き付けて保持できるようにしてもよい。微小柱配列の製造または被覆に使用する疎水性材料は、当業者に公知の疎水性重合体またはオリゴマーを含んでもよい。当業者にとって当然のことだが、微小柱配列の設計および構成は、油相のろ過および試料流体からの標的粒子の分離を同時に行うために、油脂の保持も考慮すべきである。
【００８４】
本発明のさらに別の実施形態では、標的粒子をフローセルに運ぶために複数のマイクロ流体粒子分離装置をカートリッジなどの１つの装置に直列に配置してもよい。例えば図１１にカートリッジ１１００の平面図を示すが、それらはフローセル１１２８、複数の粒子分離装置１１０４、１１１４、１１２２、および複数の出入口１１０２、１１０４、１１１２、１１２０、１１０８を含み、全て流体接続している。第１粒子分離装置１１０４は図１０に示す分離装置と同様に構成してもよい。標的粒子を含む試料流体は入口１１０２を通して導入し、微小柱配列（図示せず）を有するマイクロ流路で構成される第１分離装置１１０４へ送ることができる。上述したように、標的粒子は例えばプライマーを付加したマイクロスポットまたはマイクロビーズでよい。微小柱の構成により、標的粒子は試料流体から、緩衝液入口１１０４から第１分離装置１１０４に導入された緩衝液流体に分離することができる。入口１１０２に導入した試料流体が乳濁液の形態であり、試料流体から油相をろ過することが望ましい場合、第１分離装置１１０４の微小柱配列は疎水性材料で作製するか被覆してもよい。試料流体中の不要な粒子および廃液（任意の油相を含む）は、第１分離装置１１０４から出口流路１１０６を通り、流体接続している排出口１１０８へ排出される。
【００８５】
次に、標的粒子を含む緩衝液を、標的粒子を捕捉する固体基板で構成される第２分離装置１１１４に搬送してもよい。標的粒子を、ビオチン−ストレプトアビジン結合、共有結合、静電的相互作用、ファンデルワールス力などで固体基板に結合してよい。標的粒子を第２分離装置１１１４で捕捉し、搬送緩衝液を出口流路１１１６を経て排出口１１０８に排出する。標的粒子が捕捉されると、放出緩衝液入口１１１２からＮａＯＨのような放出緩衝液を導入し、標的粒子を第２分離装置１１１４に搬送し、採集した標的粒子を抽出することができる。
【００８６】
放出緩衝液は、入口流路１１１８を通り第３分離装置１１１２に標的粒子を運搬する。第３分離装置１１２２は第１分離装置１１０４と同様に構成してもよく、標的粒子の衝突流を発生させ放出緩衝液からフローセル充填緩衝液に標的粒子を拡散させる微小柱の配列を含み、同時にフローセル充填緩衝液がフローセル充填緩衝液入口１１２０から第３分離装置１１２２に導入される。その後、放出緩衝液は出口流路１１２４を経て排出口１１０８に排出され、標的粒子を運ぶフローセル充填緩衝液は流路１１２６を経てフローセル１１２８に移送される。フローセル１１２８は、標的粒子を捕捉するために本発明の前述の実施形態に従って構成することができる。
【００８７】
当業者にとって当然のことだが、必要に応じて分離装置の入口および／または出口に微小弁を設けて、適切な種類の緩衝液流体が導入されるように制御し、かつ緩衝液流体が間違った入口流路または出口流路に入るのを防止してもよい。他の実施形態では、分離装置およびフローセルは別々のカートリッジに設けてもよいが、便宜上、分離装置およびフローセルを１つのカートリッジに設けることが好ましい。また当業者にとって当然のことだが、１つのカートリッジに３種より多いか少ない分離装置を設けてもよい。
【００８８】
本開示は、単独でまたは併せて使用することができる多数の新規で有用かつ非自明な特徴事項および／または特徴事項の組み合わせを記載している。本明細書では特定の特徴事項および利点を記載しているが、記載した特徴事項および利点がすべての実施形態に存在してはいない。本明細書に記載の実施形態はすべて例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。もちろん、本明細書に記載された発明は、様々な等価な方法で修正および適合させることができ、そのような修正および適合は全て本開示および添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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