(57)【要約】本開示は、目的の生体分子を産生する異種細菌グルコース透過酵素遺伝子を発現する微生物株を生成するための方法を記載する。諸態様では、本開示は、その発現が天然Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍプロモーターまたはそれに由来する変異体プロモーターによって制御される異種細菌グルコース透過酵素遺伝子を発現する新規細菌株を提供する。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに由来する複数のプロモーターを含むプロモーターラダーを使用して細菌グルコース透過酵素遺伝子のライブラリーを産生するための方法も本明細書に提供される。
2019519241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のプロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結した異種グルコース透過酵素遺伝子を含む宿主細胞であって、該第１のプロモーターポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
【請求項２】
前記グルコース透過酵素遺伝子が、細菌グルコース透過酵素遺伝子である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記細菌グルコース透過酵素遺伝子が、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９および配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子である、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記細菌グルコース透過酵素遺伝子が、配列番号２３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号１９および配列番号２４から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子である、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項５】
第２のプロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結したヘキソキナーゼ遺伝子をさらに含み、該第２のプロモーターポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記ヘキソキナーゼ遺伝子が、グルコキナーゼ遺伝子である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記グルコキナーゼ遺伝子が、細菌グルコキナーゼ遺伝子である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記細菌グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１５および配列番号１６から選択されるポリペプチド配列をコードする遺伝子である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記細菌グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号２５および配列番号２６から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記第１のプロモーターポリヌクレオチドと前記第２のプロモーターポリヌクレオチドとが異なっている、請求項５から９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記第１のプロモーターポリヌクレオチドと前記第２のプロモーターポリヌクレオチドとが同一である、請求項５から９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
グルコースから生体分子を産生する方法であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を前記生体分子の産生に適した条件下で培養するステップを含む方法。
【請求項１５】
前記生体分子が、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸またはアルコールである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記有機酸が、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
グルコースからの生体分子の産生を増加させることが可能な微生物を生成するための方法であって、
ａ）宿主微生物を遺伝的に改変するステップであって、該改変するステップは、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリー由来のグルコース透過酵素遺伝子を、該宿主微生物のゲノムに導入することを含み、グルコース透過酵素遺伝子の該ライブラリー由来の各グルコース透過酵素遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターに機能的に連結しており、該改変は、該グルコース透過酵素遺伝子を発現する該宿主微生物の株を生成させる、ステップと；
ｂ）該宿主微生物の複数の株が生成するまでステップａ）を複数ラウンド繰り返すステップであって、該宿主微生物の該複数の株の各株は、グルコース透過酵素遺伝子の該ライブラリー由来の別々のグルコース透過酵素遺伝子を発現する、ステップと；
ｃ）該宿主微生物の該複数の株の各株を、発酵条件下で、グルコースを含む炭素源と接触させるステップと；
ｄ）対照微生物によりグルコースから産生された生体分子の量と比較して増加した量の該生体分子をグルコースから産生する該宿主微生物の各株を選択するステップであって、該対照微生物は、グルコース透過酵素遺伝子の該ライブラリー由来のグルコース透過酵素遺伝子を発現しない、ステップと
を含む方法。
【請求項２０】
グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリー内の前記グルコース透過酵素遺伝子のそれぞれが、細菌グルコース透過酵素遺伝子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細菌グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９、配列番号１４またはこれらの組合せのポリペプチド配列をコードする遺伝子を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細菌グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号２３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号１９、配列番号２４またはこれらの組合せのヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ヘキソキナーゼ遺伝子のライブラリー由来のヘキソキナーゼ遺伝子を導入するステップであって、ヘキソキナーゼ遺伝子の該ライブラリー由来の各ヘキソキナーゼ遺伝子が、プロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結しており、該プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択される配列を含む、ステップをさらに含む、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ヘキソキナーゼ遺伝子の前記ライブラリー由来の各ヘキソキナーゼ遺伝子の前記導入が、グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリー由来の各グルコース透過酵素遺伝子の前記導入と同時である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ヘキソキナーゼ遺伝子の前記ライブラリー由来の各ヘキソキナーゼ遺伝子が、グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリー由来のグルコース透過酵素遺伝子を含むキメラ構築物中に存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヘキソキナーゼ遺伝子が、グルコキナーゼ遺伝子である、請求項２３から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記グルコキナーゼ遺伝子が、細菌グルコキナーゼ遺伝子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細菌グルコキナーゼ遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号１５および／または配列番号１６のポリペプチド配列をコードする遺伝子を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細菌グルコキナーゼ遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号２５および／または配列番号２６のヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記グルコース透過酵素遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドと前記ヘキソキナーゼ遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドとが異なっている、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記グルコース透過酵素遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドと前記ヘキソキナーゼ遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドとが同一である、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記宿主微生物が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項１９から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記宿主微生物が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項１９から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記導入するステップが、形質転換、形質導入または電気穿孔によって実施される、請求項１９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記生体分子が、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸またはアルコールである、請求項１９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記有機酸が、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
グルコース透過酵素遺伝子のライブラリーであって、グルコース透過酵素遺伝子の該ライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターに機能的に連結している、ライブラリー。
【請求項４０】
各グルコース透過酵素遺伝子が、細菌グルコース透過酵素遺伝子である、請求項３９に記載のライブラリー。
【請求項４１】
細菌グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９、配列番号１４またはこれらの組合せのポリペプチド配列をコードする遺伝子を含む、請求項４０に記載のライブラリー。
【請求項４２】
細菌グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号２３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号１９、配列番号２４またはこれらの組合せのヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む、請求項４０に記載のライブラリー。
【請求項４３】
グルコース透過酵素遺伝子の前記ライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子が、キメラ構築物の第１の部分であり、該キメラ構築物が、第２の部分を含み、該第２の部分が、ヘキソキナーゼ遺伝子である、請求項３９から４２のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項４４】
前記ヘキソキナーゼ遺伝子が、プロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結しており、該プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択される配列を含む、請求項４３に記載のライブラリー。
【請求項４５】
前記ヘキソキナーゼ遺伝子が、グルコキナーゼ遺伝子である、請求項４３から４４のいずれかに記載のライブラリー。
【請求項４６】
前記グルコキナーゼ遺伝子が、細菌グルコキナーゼ遺伝子である、請求項４５に記載のライブラリー。
【請求項４７】
細菌グルコキナーゼ遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号１５および／または配列番号１６のポリペプチド配列をコードする遺伝子を含む、請求項４６に記載のライブラリー。
【請求項４８】
細菌グルコキナーゼ遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号２５および／または配列番号２６のヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む、請求項４６に記載のライブラリー。
【請求項４９】
前記グルコース透過酵素遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドと前記ヘキソキナーゼ遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドとが異なっている、請求項４４から４８のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項５０】
前記グルコース透過酵素遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドと前記ヘキソキナーゼ遺伝子に機能的に連結した前記プロモーターポリヌクレオチドとが同一である、請求項４４から４８のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項５１】
生体分子を産生する方法であって、請求項３９から５０のいずれか一項に記載のライブラリー由来のグルコース透過酵素遺伝子を宿主細胞に導入するステップと、該宿主細胞を該生体分子の産生に適した条件下で培養するステップとを含む方法。
【請求項５２】
前記生体分子が、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸またはアルコールである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記有機酸が、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記宿主細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記宿主細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記導入するステップが、形質転換、形質導入または電気穿孔によって実施される、請求項５１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
配列番号２３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号１９および配列番号２４から選択されるコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
【請求項６０】
配列番号２５および配列番号２６から選択されるコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
【請求項６１】
第１のコドン最適化ポリヌクレオチドおよび第２のコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチドが、宿主細胞における発現のためにそれぞれコドン最適化されており、該第１のコドン最適化ポリヌクレオチドが、グルコース透過酵素活性を有するポリペプチドをコードし、該第２のコドン最適化ポリヌクレオチドが、グルコキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
【請求項６２】
前記第１のコドン最適化ポリヌクレオチドが、配列番号２３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号１９および配列番号２４から選択される、請求項６１に記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
【請求項６３】
前記第２のコドン最適化ポリヌクレオチドが、配列番号２５および配列番号２６から選択される、請求項６１または６２に記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
【請求項６４】
グルコース透過酵素活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９および配列番号１４から選択される配列を含む、請求項６１に記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
【請求項６５】
グルコキナーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号１５および配列番号１６から選択される配列を含む、請求項６１または６４に記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
【請求項６６】
前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項５９から６５のいずれかに記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年６月３０日に出願された米国仮出願第６２／３５６，９２４号の優先権の利益を主張し、その全体が、すべての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表に関する陳述
【０００２】
本願に添付された配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供されており、参照により本明細書に組み込まれている。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＺＹＭＲ＿００５＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、４９ＫＢであり、２０１７年６月２８日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
分野
【０００３】
本開示は、微生物ゲノム操作を対象とする。開示されるゲノム操作方法は、グルコース透過酵素遺伝子および／またはグルコキナーゼ遺伝子のライブラリーの生成ならびに所望の表現型（例えば、商業的産物の微生物産生）を有する株を産生するために前記ライブラリーを微生物宿主に導入することを必然的に伴う。
【背景技術】
【０００４】
例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの一部の微生物におけるグルコース輸送は、天然ではホスホトランスフェラーゼ輸送系（ＰＴＳ）を使用して達成される。この系ではグルコースのリン酸化は、輸送と同時に実行される。ホスホドナーはホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）であり、それにより輸送を解糖フラックスに直接結びつけている。さらにＰＴＳ系は、いくつかの転写プロセスによって商業的産物の産生のために必ずしも理想的とは限らない方法で天然では調節されている。
【０００５】
グルコースからの様々な商業的産物の産生のための微生物プロセスは、グルコースの炭素骨格が所望の産物に変換される効率を最大化するように努めている。グルコースフラックスの制御は、発酵プロセス、使用される微生物宿主の株（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）および産生される低分子に依存する方法での産物の産生のために極めて重要である。高濃度のグルコース下で解糖によるフラックスが多すぎる場合、産物の収量を減少させる解糖副産物（通常、有機酸）が産生される。細胞へのグルコースの輸送が少なすぎる場合、そのときは産物を高率で産生することが困難である。特定の産物を産生するために様々な方法で操作されている株の遺伝子型は、プロセス条件と相互作用して、収率または生産性を最大化するために理想的であるよりも多いまたは少ないグルコース輸送を生じる状況をもたらす。
【０００６】
微生物株の改善は、商業的産物の収率または生産性を向上させるようにグルコース輸送を変更できる様々なグルコース透過酵素およびグルコキナーゼの発現によって試みられてきた。これは、いくつかの場合において実証されている。例えばグルコース輸送のための天然ＰＴＳ系の欠失および天然Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍキナーゼと併せた天然Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ透過酵素の過剰発現は、グルコースからのリシン産生の収率の増加をもたらした（Linderら、Appl.  Environ.  Microbiol.  ２０１１年６月、７７巻、１１号、３５７１〜３５８１頁を参照されたい。その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の例では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ由来のグルコース透過酵素およびグルコキナーゼの過剰発現が低分子の産生のために使用された（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ５６０２０３０を参照されたい）。
しかし、特定の商業的産物を産生するための所与の代謝プロセスのためのグルコース輸送の理想的なレベルを作り出すための具体的なグルコース透過酵素の選択は、株の遺伝子型と発酵が行われるプロセス環境との相互作用を含むいくつかの相互作用因子の十分な理解に依拠する。さらに、グルコース濃度および他の炭素源濃度との組合せでの正確な発現、親和性および輸送速度は、目的の経路を通じたフラックスに合致するよう細胞にグルコースの均衡のとれたフラックスを送達するために必要であり得る。これらのパラメータを経験的に理解すること、次いでそれらを具体化する単一の透過酵素を選択することは、困難であるまたは不可能である場合がある。
よって、従来の株改善プログラムに固有の上述した欠点を被らない、特定の商業的産物を産生するための工業用微生物を操作する新しい方法についての当技術分野における大きな必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５６０２０３０号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Linderら、Appl.  Environ.  Microbiol.  ２０１１年６月、７７巻、１１号、３５７１〜３５８１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、第１のプロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結した異種グルコース透過酵素遺伝子を含む宿主細胞であって、第１のプロモーターポリヌクレオチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含む、宿主細胞が本明細書に提供される。一部の場合では、グルコース透過酵素遺伝子は、細菌グルコース透過酵素遺伝子である。一部の場合では、細菌グルコース透過酵素遺伝子は、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９および配列番号１４から選択されるポリペプチド配列をコードする遺伝子である。一部の場合では、細菌グルコース透過酵素遺伝子は、配列番号２３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号１９および配列番号２４から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子である。一部の場合では、宿主細胞は、第２のプロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結したヘキソキナーゼ遺伝子をさらに含み、第２のプロモーターポリヌクレオチドは配列番号２、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の場合では、ヘキソキナーゼ遺伝子は、グルコキナーゼ遺伝子である。一部の場合では、グルコキナーゼ遺伝子は、細菌グルコキナーゼ遺伝子である。一部の場合では、細菌グルコキナーゼ遺伝子は、配列番号１５および配列番号１６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子である。一部の場合では、細菌グルコキナーゼ遺伝子は、配列番号２５および配列番号２６から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子である。一部の場合では、第１のプロモーターポリヌクレオチドと第２のプロモーターポリヌクレオチドとは異なっている。一部の場合では、第１のプロモーターポリヌクレオチドと第２のプロモーターポリヌクレオチドとは同一である。一部の場合では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。一部の場合では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。一部の場合では、宿主細胞は、グルコースから生体分子を産生する方法であって、宿主細胞を生体分子の産生に適した条件下で培養するステップを含む方法において使用される。一部の場合では、生体分子は、低分子、ヌクレオチド、アミノ酸、有機酸またはアルコールである。一部の場合では、アミノ酸は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンである。一部の場合では有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである。一部の場合では、アルコールは、エタノールまたはイソブタノールである。
【００１０】
別の態様では、グルコースからの生体分子の産生を増加させることが可能な微生物を生成するための方法であって、ａ）宿主微生物を遺伝的に改変するステップであって、改変は、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリー由来のグルコース透過酵素遺伝子を、宿主微生物のゲノムに導入することを含み、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリー由来の各グルコース透過酵素遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターに機能的に連結しており、改変は、グルコース透過酵素遺伝子を発現する宿主微生物の株を生成させる、ステップと；ｂ）宿主微生物の複数の株が生成するまで、ステップａ）を複数ラウンド繰り返すステップであって、宿主微生物の複数の株の各株は、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリー由来の別々のグルコース透過酵素遺伝子を発現する、ステップと；ｃ）宿主微生物の複数の株の各株を、発酵条件下で、グルコースを含む炭素源と接触させるステップと；ｄ）対照微生物によりグルコースから産生された生体分子（the  biomolecule  produce  from  glucose）の量と比較して増加した量の生体分子をグルコースから産生する宿主微生物の各株を選択するステップであって、対照微生物は、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリー由来のグルコース透過酵素遺伝子を発現しない、ステップとを含む方法が本明細書に提供される。一部の場合では、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリー内のグルコース透過酵素遺伝子のそれぞれは、細菌グルコース透過酵素遺伝子である。一部の場合では、細菌グルコース透過酵素遺伝子のライブラリーは、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９、配列番号１４またはこれらの組合せのポリペプチド配列をコードする遺伝子を含む。一部の場合では、細菌グルコース透過酵素遺伝子のライブラリーは、配列番号２３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号１９、配列番号２４またはこれらの組合せのヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む。一部の場合では、方法は、ヘキソキナーゼ遺伝子のライブラリー由来のヘキソキナーゼ遺伝子を導入するステップであって、ヘキソキナーゼ遺伝子のライブラリー由来の各ヘキソキナーゼ遺伝子がプロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結しており、プロモーターポリヌクレオチドが配列番号２、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択される配列を含む、ステップをさらに含む。一部の場合では、ヘキソキナーゼ遺伝子のライブラリー由来の各ヘキソキナーゼ遺伝子の導入は、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリー由来の各グルコース透過酵素遺伝子の導入と同時である。一部の場合では、ヘキソキナーゼ遺伝子のライブラリー由来の各ヘキソキナーゼ遺伝子は、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリー由来のグルコース透過酵素遺伝子を含むキメラ構築物中に存在する。一部の場合では、ヘキソキナーゼ遺伝子は、グルコキナーゼ遺伝子である。一部の場合では、グルコキナーゼ遺伝子は、細菌グルコキナーゼ遺伝子である。一部の場合では、細菌グルコキナーゼ遺伝子のラ��ブラリーは、配列番号１５および／または配列番号１６のポリペプチド配列をコードする遺伝子を含む。一部の場合では、細菌グルコキナーゼ遺伝子のライブラリーは、配列番号２５および／または配列番号２６のヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む。一部の場合では、グルコース透過酵素遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドとヘキソキナーゼ遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドとは異なっている。一部の場合では、グルコース透過酵素遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドとヘキソキナーゼ遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドとは同一である。一部の場合では、宿主微生物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。一部の場合では、宿主微生物はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。一部の場合では、導入するステップは、形質転換、形質導入または電気穿孔によって実施される。一部の場合では、生体分子は、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸またはアルコールである。一部の場合では、アミノ酸は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンである。一部の場合では、有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである。一部の場合では、アルコールは、エタノールまたはイソブタノールである。
【００１１】
さらに別の態様では、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリーであって、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターに機能的に連結している、ライブラリーが本明細書に提供される。一部の場合では、各グルコース透過酵素遺伝子は、細菌グルコース透過酵素遺伝子である。一部の場合では、細菌グルコース透過酵素遺伝子のライブラリーは、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９、配列番号１４またはこれらの組合せのポリペプチド配列をコードする遺伝子を含む。一部の場合では、細菌グルコース透過酵素遺伝子のライブラリーは、配列番号２３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号１９、配列番号２４またはこれらの組合せのヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む。一部の場合では、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子は、キメラ構築物の第１の部分であり、キメラ構築物は第２の部分を含み、第２の部分はヘキソキナーゼ遺伝子である。一部の場合では、ヘキソキナーゼ遺伝子は、プロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結しており、プロモーターポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択される配列を含む。一部の場合では、ヘキソキナーゼ遺伝子は、グルコキナーゼ遺伝子である。一部の場合では、グルコキナーゼ遺伝子は、細菌グルコキナーゼ遺伝子である。一部の場合では、細菌グルコキナーゼ遺伝子のライブラリーは、配列番号１５および／または配列番号１６のポリペプチド配列をコードする遺伝子を含む。一部の場合では、細菌グルコキナーゼ遺伝子のライブラリーは、配列番号２５および／または配列番号２６のヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む。一部の場合では、グルコース透過酵素遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドとヘキソキナーゼ遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドとは異なっている。一部の場合では、グルコース透過酵素遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドとヘキソキナーゼ遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドとは同一である。一部の場合では、ライブラリーは、生体分子を産生する方法であって、ライブラリー由来のグルコース透過酵素遺伝子を宿主細胞に導入するステップと、宿主細胞を生体分子の産生に適した条件下で培養するステップとを含む方法において使用される。一部の場合では、生体分子は、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸またはアルコールである。一部の場合では、アミノ酸は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンである。一部の場合では、有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである。一部の場合では、アルコールは、エタノールまたはイソブタノールである。一部の場合では宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。一部の場合では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。一部の場合では、導入するステップは、形質転換、形質導入または電気穿孔によって実施される。
【００１２】
別の態様では、配列番号２３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号１９および配列番号２４から選択されるコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドが本明細書に提供される。一部の場合では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【００１３】
さらなる態様では、配列番号２５および配列番号２６から選択されるコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドが本明細書に提供される。一部の場合では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【００１４】
さらに別の態様では、第１のコドン最適化ポリヌクレオチドおよび第２のコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが、宿主細胞における発現のためにそれぞれコドン最適化されており、第１のコドン最適化ポリヌクレオチドが、グルコース透過酵素活性を有するポリペプチドをコードしており、第２のコドン最適化ポリヌクレオチドが、グルコキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドが本明細書に提供される。一部の場合では、第１のコドン最適化ポリヌクレオチドは、配列番号２３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号１９および配列番号２４から選択される。一部の場合では、第２のコドン最適化ポリヌクレオチドは、配列番号２５および配列番号２６から選択される。一部の場合では、グルコース透過酵素活性を有するポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９および配列番号１４から選択される配列を含む。一部の場合では、グルコキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１５および配列番号１６から選択される配列を含む。一部の場合では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１に記載の評価方法におけるグルコース透過酵素の性能を例示する。
【００１６】
【図２】図２は、実施例１に記載の所望の発酵条件におけるグルコース透過酵素の性能を例示する。
【００１７】
【図３】図３は、本開示の形質転換プラスミドのアセンブリー、および宿主生物中へのプラスミドの組込みを例示する。挿入配列挿入ＤＮＡ（insert  sequence  insert  DNA）を、アセンブリー反応において１種または複数種の合成オリゴヌクレオチドを組み合わせることによって生成する。ＤＮＡ挿入体は、続くステップでＤＮＡをループアウトするように設計されているダイレクトリピート領域（すなわち、ホモロジーアーム）が隣接した所望のプロモーター配列を含有する。アセンブルされたプラスミドは、挿入ＤＮＡ（本明細書に提供されるプロモーターに機能的に連結した透過酵素遺伝子および／またはグルコキナーゼ遺伝子）を含有し、必要に応じて、１種または複数種の選択マーカーを含有する。
【００１８】
【図４】図４は、選択された、宿主株に由来するＤＮＡ領域をループアウトするための手順を例示する。挿入されたＤＮＡのダイレクトリピート（ＤＲ）領域は、宿主株のゲノム内の対応する配列とループを形成する。選択マーカーについて対抗選択された細胞は、ループＤＮＡのＤＮＡ欠失を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。
【００２０】
用語「１つの（ある）（ａ）」または「１つの（ある）（ａｎ）」は、その実体の１つまたは複数を指し、すなわち、複数の指示対象を指すことができる。よって、用語「１つの（ある）（ａ）」または「１つの（ある）（ａｎ）」、「１つまたは複数（１種または複数種）（one  or  more）」および「少なくとも１つ（少なくとも１種）（at  least  one）」は、本明細書で互換的に使用される。さらに、不定冠詞「１つの（ある）（ａ）」または「１つの（ある）（ａｎ）」による「１つの（ある）要素（an  element）」への言及は、文脈により唯一の要素が存在することが明確に要求されない限り、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。
【００２１】
文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語およびその変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（comprising）」などは、制限のない、包括的な意味で、すなわち、「これらに限定されないが、〜を含む（including,  but  not  limited  to）」と解釈されるべきである。
【００２２】
本明細書全体を通して「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載されている特定のフィーチャ、構造または特性が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれ得ることを意味する。よって、本明細書全体を通して各所での「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態に関するものではない可能性がある。明確にするために別々の実施形態との関連で記載されている本発明のある特定のフィーチャは、単一の実施形態において組み合わせて提供される場合もあることは理解される。逆に、簡潔のために単一の実施形態との関連で記載されている本発明の様々なフィーチャは、別々にまたは任意の適切な部分組合せで提供される場合もある。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「細胞生物」、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」は、広く解釈されるべきである。これらの用語は、互換的に使用することができ、これらに限定されない可能性があるが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌および原生生物を含む。一部の実施形態では、本開示は、本開示内に存在するリスト／表および図面の「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「細胞生物」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」に言及する。この特徴付けは、表および図面の同定された分類学的な属だけでなく、前記表または図面内の任意の生物の同定された分類学的な種、ならびに様々な新規のおよび新しく同定または設計された株も参照することができる。同じ特徴付けが、実施例などの本明細書の他の部分におけるこれらの用語の記述にも当てはまる。
【００２４】
用語「原核生物」は、当技術分野で認識されており、核または他の細胞小器官を含有しない細胞を指す。原核生物は一般に、２つのドメイン、細菌および古細菌の１つに分類される。古細菌ドメインと細菌ドメインの生物間の決定的な差異は、１６ＳリボソームＲＮＡ内のヌクレオチド塩基配列の基本的な差異に基づく。
【００２５】
用語「古細菌」は、Ｍｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ門の生物の分類を指し、典型的には、普通でない環境内で見つかり、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如を含めたいくつかの判定基準によって原核生物の残りと区別される。ｓｓｒＲＮＡ分析に基づいて、古細菌は、２つの系統学的に別個の群：ＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａからなる。これらの生理機能に基づいて、古細菌は、３つのタイプ：メタン生成菌（メタンを産生する原核生物）；高度好塩菌（非常に高濃度の塩（ＮａＣｌ）で生きる原核生物）；および高度（超）好熱菌（thermophilus）（非常に高温で生きる原核生物）へと組織化することができる。古細菌を細菌と区別する統一的古細菌フィーチャ（すなわち、細胞壁にムレインが無いこと、エステル連結膜脂質など）に加えて、これらの原核生物は、これらをその特定の生息環境に適応させるユニークな構造的または生化学的属性を呈する。Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａは、超好熱性硫黄依存性原核生物から主になり、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａは、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。
【００２６】
「細菌」または「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌は、以下の少なくとも１１の別個の群を含む：（１）２つの主要な亜門：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、その他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）が存在するグラム陽性（グラム＋）細菌；（２）Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む）；（３）シアノバクテリア、例えば、酸素発生型光合成生物；（４）スピロヘータおよび関連種；（５）Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ；（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ；（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も）；（１０）放射線抵抗性ミクロコッカスおよび近縁；（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。
【００２７】
「真核生物」は、細胞が、膜内に囲まれた核および他の小器官を含有する任意の生物である。真核生物は、分類群ＥｕｋａｒｙａまたはＥｕｋａｒｙｏｔａに属する。真核細胞を原核細胞（上記の細菌および古細菌）から分離する決定的なフィーチャは、これらが膜結合型小器官、特に、遺伝物質を含有し、核膜によって囲まれている核を有することである。
【００２８】
用語「遺伝的に改変された微生物」、「組換え微生物」、「組換え宿主細胞」、および「組換え株」は、本明細書で互換的に使用することができ、遺伝的に改変された微生物を指すことができる。よって、この用語は、微生物（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞など）であって、それが由来した自然に存在する微生物と比較して、それが変更された、改変された、または異なる遺伝子型および／または表現型（例えば、遺伝子改変が微生物のコーディング核酸配列に影響するとき）を呈するように遺伝的に変更、改変、または操作された、微生物を含む。この用語は、問題の特定の組換え微生物だけでなく、このような微生物の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。
【００２９】
用語「野生型微生物」は、自然に存在する細胞、すなわち、遺伝的に改変されていない細胞を記述することができる。
【００３０】
用語「遺伝子操作された（genetically  engineered）」は、微生物のゲノムの任意の操作（manipulation）（例えば、核酸の挿入または欠失による）を指すことができる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子（複数可）」は、遺伝子の１つまたは複数の代替形態のいずれかを意味することができ、これらの対立遺伝子すべては、少なくとも１つの形質または特性と関係する。二倍体細胞では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占有し得る。本開示は、諸実施形態においてＱＴＬ、すなわち、１種または複数種の遺伝子または調節配列を含み得るゲノム領域に関するので、一部の例では、「対立遺伝子」の代わりに「ハプロタイプ」（すなわち、染色体セグメントの対立遺伝子）を指すことがより正確であるが、これらの例では、用語「対立遺伝子」が用語「ハプロタイプ」を含むと理解されるべきである。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座（locus）」（複数の遺伝子座（loci））は、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見出される染色体上の具体的な１つもしくは複数の場所または部位を意味し得る。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝的に連結された」は、２種またはそれよりも多くの形質であって、これらが交雑によって分離するのが困難であるように、増殖中に高い割合で共遺伝される、形質を指すことができる。
【００３４】
「組換え」または「組換え事象」は、本明細書で使用される場合、染色体交差または独立組合せを指すことができる。用語「組換え体」は、組換え事象の結果として生じる新しい遺伝子構造を有する生物を指すことができる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「表現型」は、個々の遺伝子構造（すなわち、遺伝子型）と環境との相互作用から生じる個々の細胞、細胞培養物、生物、または生物の群の観察可能な特性を指すことができる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ」または「組換え体」は、核酸配列またはタンパク質配列を記述するとき、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドもしくは２つの異種ポリペプチドを連結して単一の巨大分子にする、または少なくとも１つの自然の核酸もしくはタンパク質配列の１つもしくは複数のエレメントを再編成することができる核酸またはタンパク質配列を指すことができる。例えば、用語「組換え体」は、例えば、化学合成による、または遺伝子操作技法による核酸の単離セグメントの操作による、配列の２つの別の方法で分離されたセグメントの人工の組合せを指すことができる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、自然に存在することが知られていない、または自然に存在しないヌクレオチド配列であり得る。一般に、このような合成ヌクレオチド配列は、任意の他の自然に存在するヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも１つのヌクレオチド差異を含む。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはこれらの類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すことができる。この用語は、分子の一次構造を指すことができ、よって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。これは、修飾核酸、例えば、メチル化および／またはキャッピングされた核酸、修飾塩基、主鎖修飾を含有する核酸なども含み得る。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用することができる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連したＤＮＡの任意のセグメントを指すことができる。よって、遺伝子は、これらに限定されないが、コード配列および／またはこれらの発現に要求される調節配列を含み得る。遺伝子は、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含み得る。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、または公知のもしくは予測された配列情報からの合成を含めた、様々な供給源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含み得る。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「相同の」または「相同体」または「オルソログ」は当技術分野で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指すことができる。用語「相同性」、「相同の」、「実質的に同様の」、および「実質的に対応する」は、本明細書で互換的に使用することができる。これらは、核酸断片であって、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介し、またはある特定の表現型を生じさせる核酸断片の能力に影響しない、核酸断片を指すことができる。これらの用語は、本開示の核酸断片の修飾、例えば、最初の無修飾断片と比べて得られる核酸断片の機能的性質を実質的に変更しない１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入なども指すことができる。したがって、当業者が十分に理解するように、本開示は、具体的な例示的な配列より多くを包含し得ることが理解される。これらの用語は、１つの種、亜種、変種、培養変種、または株内に見出される遺伝子と、別の種、亜種、変種、培養変種、または株内の対応するまたは等価な遺伝子との間の関係を記述することができる。本開示の目的に関して、相同配列を比較することができる。「相同配列」または「相同体」または「オルソログ」は、機能的に関連しているとみなされている、考えられている、または知られている場合がある。機能的関係は、これらに限定されないが、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じもしくは同様の生物学的機能を含めた、いくつかのやり方のいずれか１つにおいて示され得る。好ましくは（ａ）および（ｂ）の両方が示される。相同性は、当技術分野で容易に利用可能なソフトウェアプログラム、例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（F.M.  Ausubelら編、１９８７年）補遺３０、セクション７．７１８、表７．７１に論じられたものを使用して判定することができる。いくつかのアラインメントプログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、およびＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を指すことができる。例えば、変異は、サイレント置換、付加、または欠失を生じさせるが、コードされるタンパク質の性質もしくは活性、またはタンパク質が作製される方法を変更しない変更を含有する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質修飾」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸修飾、欠失、および／または挿入を指すことができる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」は、このような配列の最小限のサイズ特性を有する部分、または最大で全長分子の、および全長分子を含めた、全長分子の任意のより大きい断片を意味することができる。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物活性部分をコードすることができる。遺伝子調節エレメントの生物活性部分は、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの１つの部分を単離し、本明細書に記載の活性を評定することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの部分は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであり得、最大で全長ポリペプチドまで伸び得る。使用される部分の長さは、特定の用途に依存し得る。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の部分は、１２ヌクレオチドという短さであり得；一部の実施形態では、それは、２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの部分は、４アミノ酸という短さであり得る。完全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの部分は一般に、４アミノ酸より長くてよい。
【００４４】
バリアントポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリングなどの変異誘発および組換え誘導手順（recombinogenic  procedure）に由来し得る配列も包含する。このようなＤＮＡシャッフリングのストラテジーは、当技術分野で公知である。例えば、Stemmer（１９９４年）、PNAS、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁；Stemmer（１９９４年）、Nature、３７０巻：３８９〜３９１頁；Crameriら（１９９７年）、Nature  Biotech.、１５巻：４３６〜４３８頁；Mooreら（１９９７年）、J.  Mol.  Biol.、２７２巻：３３６〜３４７頁；Zhangら（１９９７年）、PNAS、９４巻：４５０４〜４５０９頁；Crameriら（１９９８年）、Nature、３９１巻：２８８〜２９１頁；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照。
【００４５】
本明細書に開示のポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に関して、オリゴヌクレオチドプライマーを、目的の任意の生物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応で使用するのに設計することができる。ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲクローニングを設計するための方法は、当技術分野で一般に公知であり、Sambrookら（２００１年）、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual（３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Plainview、New  York）に開示されている。Innisら編（１９９０年）、PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications（Academic  Press、New  York）；InnisおよびGelfand編（１９９５年）、PCR  Strategies（Academic  Press、New  York）；ならびにInnisおよびGelfand編（１９９９年）PCR  Methods  Manual（Academic  Press、New  York）も参照。ＰＣＲの公知の方法は、これらに限定されないが、対合プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを使用する方法を含み得る。
【００４６】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、増幅標的にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼを付着させ、それによって、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための作用物質の存在下で、かつ適当な温度およびｐＨで配置されたとき、ＤＮＡ合成の開始点として機能を果たすことができるオリゴヌクレオチドを指すことができる。（増幅）プライマーは、好ましくは、増幅の効率を最大にするために一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための作用物質の存在下で伸長産物の合成をプライムするのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマーの組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含有量）を含めた多くの因子に依存する。一対の双方向性プライマーは、ＰＣＲ増幅などのＤＮＡ増幅の技術分野で一般に使用されるように、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーからなる。
【００４７】
「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などハイブリッドの安定性に影響を及ぼすハイブリダイゼーション条件を指すことができる。これらの条件は、プライマーまたはプローブとその標的核酸配列との特異的結合が最大になり、かつ非特異的結合が最小になるように経験的に最適化することができる。使用される用語は、プローブまたはプライマーが、その標的配列に、他の配列よりも検出可能に大きな程度（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）までハイブリダイズする条件への言及を含み得る。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり得、異なる環境では異なるものになる。温度がより高いとより長い配列が特異的にハイブリダイズすることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨにおいて、特異的な配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択することができる。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブまたはプライマーとハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度およびｐＨの下で）であり得る。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のＮａ＋イオン、典型的には、約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）のものであり得、温度は、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブまたはプライマー（例えば、５０ヌクレオチドよりも長いもの）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することで実現することもできる。例示的な低ストリンジェント条件または「ストリンジェンシーが低下した条件」は、３０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液を用いた、３７℃でのハイブリダイゼーションおよび２×ＳＳＣ、４０℃での洗浄を含み得る。例示的な高ストリンジェンシー条件は、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ、６０℃での洗浄を含む。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野で周知であり、例えば、Ausubelら、１９９８年およびSambrookら、２００１年によって記載されている。一部の実施形態では、ストリンジェントな条件は、４５℃での、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％などの０．５〜２０％のドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）中でのハイブリダイゼーション、その後の、５５℃〜６５℃での、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５×ＳＳＣでの洗浄である。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」または「プロモーターポリヌクレオチド」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指すことができる。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、多くの場合、エンハンサーと呼ばれ得る。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり得、プロモーターの生来のエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来する場合があり、または自然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成される場合があり、または合成ＤＮＡセグメントを含むことさえできる。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型における、または発生の異なる段階における、または異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を指示することができることが当業者によって理解されている。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は、完全には画定されていないので、あるバリエーションのＤＮＡ断片は、同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識されている。
【００４９】
本明細書で使用される場合、語句「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えＤＮＡ構築物」は、本明細書で互換的に使用することができる。組換え構築物は、核酸断片の人工の組合せ、例えば、自然に一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む。例えば、キメラ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、自然に見出されるものと異なる様式で配列されている調節配列およびコード配列を含み得る。一部の場合では、キメラ構築物は、複数の調節配列（例えば、プロモーター）ならびにコード配列（例えば、グルコース透過酵素遺伝子およびヘキソキナーゼ遺伝子（グルコキナーゼ遺伝子））を含む組換え構築物であり得る。複数のコード配列を含むキメラ構築物中の各コード配列は、別々の調節配列によって制御することができるまたは別々の調節配列に機能的に連結することができる）。本明細書に記載のこのような構築物は、それ自体で使用することができ、またはベクターと併せて使用することができる。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に依存し得る。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本開示の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換する、選択する、および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントをよく知っている。当業者は、異なる独立した形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Jonesら（１９８５年）、EMBO  J.、４巻：２４１１〜２４１８頁；De  Almeidaら（１９８９年）、Mol.  Gen.  Genetics、２１８巻：７８〜８６頁）、よって、所望の発現レベルおよびパターンを表わす系統（line）を得るために、複数の事象がスクリーニングされなければならないことも認識する。このようなスクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析によって達成することができる。ベクターは、自律的に複製する、または宿主細胞の染色体内に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロ−ウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自律複製していない裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡなどでもあり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟）の産生を指す。
【００５０】
「作動可能に連結した」または「機能的に連結した」は、本文脈において、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（例えば、グルコース透過酵素遺伝子および／またはグルコキナーゼ遺伝子）との、前記さらなるポリヌクレオチド（例えば、グルコース透過酵素遺伝子および／またはグルコキナーゼ遺伝子）の転写をもたらす連鎖配列（sequential  arrangement）を意味することができる。言い換えると、「作動可能に連結した」または「機能的に連結した」は、プロモーターにより、前記プロモーターに隣接するまたはその下流またはそれに対して３’側の遺伝子（例えば、グルコース透過酵素遺伝子および／またはグルコキナーゼ遺伝子）の転写が制御されることを意味することができる。
【００５１】
用語「炭素源」は一般に、細胞成長のための炭素の供給源として使用されるのに適した物質を指すことができる。炭素源は、これらに限定されないが、バイオマス加水分解産物、デンプン、スクロース、セルロース、ヘミセルロース、キシロース、およびリグニン、ならびにこれらの基質のモノマーコンポーネントを含み得る。炭素源は、これらに限定されないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含めた様々な形態での種々の有機化合物を含み得る。これらは、例えば、種々の単糖、例えば、グルコース、デキストロース（Ｄ−グルコース）、マルトース、オリゴ糖、多糖、飽和または不飽和脂肪酸、スクシネート、ラクテート、アセテート、エタノールなど、またはこれらの混合物を含み得る。光合成生物は、光合成の産物として炭素源をさらに産生することができる。一部の実施形態では、炭素源は、バイオマス加水分解産物およびグルコースから選択され得る。
【００５２】
用語「供給材料」は、他の産物が作製され得る微生物または発酵プロセスに供給される原料または原料の混合物として定義することができる。例えば、バイオマスまたはバイオマスに由来する炭素化合物などの炭素源は、発酵プロセスにおいて目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）を産生する微生物のための供給材料であり得る。しかし、供給材料は、炭素源以外の栄養分を含有し得る。
【００５３】
用語「体積生産性」または「産生速度」は、単位時間当たり、媒体の体積当たりに形成される産物の量として定義することができる。体積生産性は、１時間当たり１リットル当たりのグラム（ｇ／Ｌ／ｈ）で報告することができる。
【００５４】
用語「比生産性」は、産物の形成の速度として定義することができる。生産性を発酵プロセスではなく微生物の生来のパラメータとして記述するために、生産性は、１時間当たり細胞乾燥重量（ＣＤＷ）１グラム当たりの産物のグラム（ｇ／ｇ  ＣＤＷ／ｈ）での比生産性として本明細書でさらに定義され得る。所与の微生物についてのＯＤ６００に対するＣＤＷの関係式を使用して、比生産性を、１時間当たり６００ｎｍにおける培養ブロスの光学密度（ＯＤ）当たり培養培地１リットル当たりの産物のグラム（ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ）として表現することもできる。
【００５５】
用語「収率」は、原料の単位重量当たりに得られる産物の量として定義することができ、基質１ｇ当たりの産物のｇ（ｇ／ｇ）として表現することができる。収率は、理論的収率のパーセンテージとして表現することができる。「理論的収率」は、産物を作製するのに使用される代謝経路の化学量論によって決まる所与の量の基質あたりに産生され得る産物の最大量として定義される。
【００５６】
用語「力価（titre）」または「力価（titer）」は、溶液の強度または溶液中の物質の濃度として定義することができる。例えば、発酵ブロス中の目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）の力価は、発酵ブロス１リットル当たりの溶液中の目的の産物のｇ（ｇ／Ｌ）として記述することができる。
【００５７】
用語「総力価」は、プロセスにおける初期体積またはプロセスにおける操作体積に対する、プロセスから取り出され、回収される溶液中の目的の産物、適用可能な場合、気相中の目的の産物、および任意の目的の産物を含むがこれらに限定されない、プロセスにおいて産生されるすべての目的の産物の和として定義することができる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「グルコース透過酵素」は、グルコースに親和性を示し、引き続いて宿主細胞の細胞膜を横切るその輸送を促進する任意のトランスポーター（例えば、ｍｙｏ−イノシトールトランスポーターおよび／またはグルコース透過酵素）を指すことができる。グルコース透過酵素は、膜貫通タンパク質であり得る。輸送は、グルコース透過酵素によって促進されてグルコースが宿主細胞の中または外に拡散する受動輸送であり得る。グルコース透過酵素は、原核細胞（すなわち、細菌もしくは古細菌）または真核細胞（例えば、真菌細胞）に由来し得る。原核生物グルコース透過酵素タンパク質は、当技術分野で公知の細菌または古細菌の任意の属および種に由来し得る。真核生物グルコース透過酵素タンパク質は、例えば、当技術分野で公知の真菌の任意の属および種に由来し得る。本明細書で使用される用語「細菌グルコース透過酵素」は、細菌に由来する本明細書に記載のグルコース透過酵素を指すことができる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「グルコース透過酵素遺伝子」は、転写および／または翻訳されたとき、本明細書に記載のグルコース透過酵素タンパク質をコードする任意の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を指すことができる。本明細書で使用される用語「細菌グルコース透過酵素遺伝子」は、細菌に由来する本明細書に記載の細菌グルコース透過酵素タンパク質を指すことができる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「ヘキソキナーゼ」は、原核細胞（すなわち、細菌もしくは古細菌）または真核細胞（例えば、真菌細胞）に由来し、ヘキソース（六炭糖）のリン酸化を促進できる酵素である任意のタンパク質を指すことができる。本明細書に提供される通り、ヘキソキナーゼは、グルコキナーゼであり得る。本明細書で使用される場合、用語「グルコキナーゼ」は、原核細胞（すなわち、細菌もしくは古細菌）または真核細胞（例えば、真菌細胞）に由来し、グルコース−６−リン酸へのグルコースのリン酸化を促進できる酵素である任意のタンパク質を指すことができる。原核生物ヘキソキナーゼタンパク質またはグルコキナーゼタンパク質は、当技術分野で公知の細菌または古細菌の任意の属および種に由来し得る。真核生物ヘキソキナーゼタンパク質またはグルコキナーゼタンパク質は、例えば、当技術分野で公知の真菌の任意の属および種に由来し得る。本明細書で使用される用語「細菌ヘキソキナーゼ」は、細菌に由来する本明細書に記載のヘキソキナーゼを指すことができる。本明細書で使用される用語「細菌グルコキナーゼ」は、細菌に由来する本明細書に記載のグルコキナーゼを指すことができる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「ヘキソキナーゼ遺伝子」は、転写および／または翻訳されたとき、本明細書に記載のヘキソキナーゼタンパク質をコードする任意の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を指すことができる。本明細書で使用される場合、「グルコキナーゼ遺伝子」は、転写および／または翻訳されたとき、本明細書に記載のグルコキナーゼタンパク質をコードする任意の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を指すことができる。本明細書で使用される用語「細菌ヘキソキナーゼ遺伝子」は、細菌に由来する本明細書に記載の細菌ヘキソキナーゼタンパク質を指すことができる。本明細書で使用される用語「細菌グルコキナーゼ遺伝子」は、細菌に由来する本明細書に記載の細菌グルコキナーゼタンパク質を指すことができる。
【００６２】
本明細書で使用される用語「目的の産物」または「生体分子」は、供給材料から微生物によって産生される任意の産物を指す。一部の場合では、目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコールなどであり得る。例えば、目的の産物または生体分子は、任意の一次または二次細胞外代謝産物であり得る。一次代謝産物は、とりわけ、エタノール、クエン酸、乳酸、グルタミン酸、グルタメート、リシン、トレオニン、トリプトファン、および他のアミノ酸、ビタミン、多糖などであり得る。二次代謝産物は、とりわけ、ペニシリンのような抗生物質化合物、またはシクロスポリンＡのような免疫抑制剤、ジベレリンのような植物ホルモン、ロバスタチンのようなスタチン薬、グリセオフルビンのような殺真菌薬などであり得る。目的の産物、または生体分子は、微生物によって産生される任意の細胞内コンポーネント、例えば、カタラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼ、およびその他多くを含めた微生物酵素などでもあり得る。細胞内コンポーネントとして、組換えタンパク質、例えば、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなども挙げることができる。
概要
【００６３】
本開示は、従来の微生物株改善プログラムに関連する無数の問題を被らない微生物ゲノム操作方法を提供する。
【００６４】
本明細書に提供される一態様は、目的の生体分子または産物の産生増加が可能な微生物（例えば、細菌）を生成するための方法である。一般に、本明細書に提供される任意の生体分子の産生において使用するための微生物を生成するための方法は、標的遺伝子のライブラリーのメンバーを前記宿主微生物に導入して、前記微生物の、ゲノムが操作された株を生成することによって宿主微生物を遺伝子改変するステップと、前記操作された株を目的の生体分子または産物を産生させるのに適した条件下で培養するステップと、前記操作された株が増加した量の目的の生体分子または産物を産生する場合、前記操作された株を選択するステップとを伴い得る。量の増加は、宿主微生物の野生型株と比較したものであり得る。量の増加は、標的遺伝子のライブラリーのメンバーを含有しない宿主微生物の株と比較したものであり得る。標的遺伝子のライブラリーは、複数のベクターを含み得、ライブラリー内の各ベクターが、標的遺伝子に機能的に連結またはカップリングした少なくとも１つのプロモーターポリヌクレオチドを含むキメラコンストラクトを含む。
【００６５】
本発明の実施形態の１つの例示的なワークフローは、標的遺伝子を選択すること、標的遺伝子の核酸（例えば、ＤＮＡ）を獲得または合成すること、および前記獲得または合成された標的遺伝子を適切なベクターにクローニングすることを必然的に伴う。標的遺伝子（複数可）を適切なベクター中にアセンブルするまたはクローニングするために、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意の方法を使用することができる。ベクターは、利用される宿主微生物に適合する、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意のベクターであり得る。標的遺伝子（複数可）を含むベクターがアセンブルされたら、宿主微生物に導入することができる。ベクターの導入は、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意の方法を使用することであり得る。宿主微生物は、本明細書に提供される任意の宿主微生物であり得る。宿主微生物に導入されたら、遺伝的に改変された宿主を選択することができ、標的遺伝子（複数可）の挿入は評価することができる。標的遺伝子（複数可）を、宿主微生物のゲノムの特定の場所に挿入されるように操作することができる。一部の場合では、標的遺伝子（複数可）を、宿主微生物内の意図されない経路／プロセスを撹乱せずに標的遺伝子（複数可）の発現を促進する、ゲノムの中立の部位に挿入する。一部の場合では、標的遺伝子（複数可）で宿主微生物内の特定の遺伝子（複数可）を置き換える。特定の遺伝子は、宿主微生物内に通常存在する相同標的遺伝子であり得る。例えば中立の組込み部位などの組込み部位は、経験的に決定することができ、したがって、種々の部位を試験することができ、宿主細胞にとって有害になることなく組み込まれた標的遺伝子（複数可）を発現させることが可能な部位を選択することができる。所望の部位（例えば、中立の部位）への組込みは、標的遺伝子（複数可）を所望の組込み部位と相同の配列の部分（すなわち、ホモロジーアーム）を含むベクターにクローニングし、その後、宿主細胞において組換え事象を行うことによって容易にすることができる。標的遺伝子（複数可）は、相同配列の部分の間に挿入することができる。一実施形態では、ベクターは、所望の組込み部位と相同の約２ｋｂの配列を含む。所望の部位と相同の配列を、グルコース透過酵素遺伝子挿入体および／またはグルコース透過酵素−グルコキナーゼ遺伝子挿入体に、配列の第１の部分が遺伝子挿入体の上流（すなわち、５’側）にあり、配列の第２の部分が遺伝子挿入体の下流（すなわち、３’側）にあるように隣接させることができる。別の実施形態では、ベクターは、所望の組込み部位と相同の約４ｋｂの配列を含む。この実施形態では、ベクターは、グルコース透過酵素遺伝子挿入体および／またはグルコース透過酵素−グルコキナーゼ遺伝子挿入体の上流（すなわち、５’側）にある、所望の組込み部位と相同の約２ｋｂの配列ならびにグルコース透過酵素遺伝子挿入体および／またはグルコース透過酵素−グルコキナーゼ遺伝子挿入体の下流（すなわち、３’側）にある、所望の組込み部位と相同の約２ｋｂの配列を含む。一実施形態では、組込みは、シングルクロスオーバーによる組込み、および続く、ベクター骨格内に存在するマーカーに対する対抗選択によって容易になるプラスミド骨格のループアウトによって実施される。一実施形態では、標的遺伝子は、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意の細菌グルコース透過酵素遺伝子である。一実施形態では、標的遺伝子は、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意の細菌グルコキナーゼ遺伝子である。一実施形態では、標的遺伝子は、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意の細菌グルコース透過酵素遺伝子、ならびに当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意の細菌グルコキナーゼ遺伝子である。
【００６６】
挿入の評価は、例えば、遺伝的に改変された微生物のゲノムまたはその一部の増幅および／または配列決定などの当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施することができる。一部の場合では、本明細書に提供される方法は、本明細書に記載の対抗選択による選択マーカーの除去またはループアウトも伴う。ループアウトは、本明細書に提供される方法のいずれかを使用して実施することができる。
【００６７】
標的遺伝子（複数可）の挿入、および、必要に応じた、選択マーカーの除去の評価後、遺伝的に改変された株を、目的の生体分子または産物を産生するその能力について評価することができる。評価の前に、必要に応じたステップにより、株を増やすことができる。増大は、遺伝的に改変された株をプレート上またはマルチウェルプレートのウェル中、増大に適した成長培地で培養することを伴い得る。評価ステップは、遺伝的に改変された株を、目的の生体分子または産物の産生のための実際の条件を模倣するように設計された成長培地／条件を含むプレート上またはマルチウェルプレートのウェル中で培養することを伴い得る。一部の場合では、このステップにおける成長培地は、グルコースの代謝プロセシングに由来する目的の生体分子または産物の産生に適する。評価ステップにより決定したところ、遺伝的に改変された株が、目的の生体分子または産物の所望のまたは閾値の産生率または収率を有するまたはそれを生じることが予測される場合、その株を選択し、低温貯蔵することができる。予測は、株の培養中の様々な時点で形成された目的の産物およびバイオマスの量を測定することに基づき得、その測定値を使用して、増やされたまたはより大きな規模の条件（例えば、発酵条件）下で前記株がどのように働くかを予測する。一実施形態では、予測は、評価方法中の株の性能の線形回帰分析に基づく。
【００６８】
一部の場合では、目的の生体分子または産物の所望のまたは閾値の産生率または収率を有するまたはそれを生じると予測される、遺伝的に改変された株を、目的の生体分子または産物を産生させるための条件（例えば、発酵条件）下、より大きな培養物に移すまたはその中で成長させる。このステップを、選択された株が、目的の生体分子または産物の産生のための実際の条件下で予測された通りに働くことができるかどうかを決定するために使用することができる。一部の場合では、目的の生体分子または産物の所望のまたは閾値の収率および／または生産率を生じる遺伝的に改変された微生物の１種または複数種の株を選択するために、本明細書に提供されるものなどの標的遺伝子のライブラリー由来の各標的遺伝子の導入および評価のための本明細書に提供されるステップをライブラリー由来の各標的遺伝子に対して繰り返す。
【００６９】
一実施形態では、目的の生体分子または産物は、グルコースおよび微生物によるその代謝プロセシングに由来し、したがって、本明細書に提供される方法は、株（複数可）によるグルコースの代謝プロセシングに由来する増加した量の目的の生体分子または産物を産生する微生物の株（複数可）の生成を必然的に伴う。一実施形態では、本明細書に提供される方法は、グルコース輸送および／または代謝に関与する１種または複数種の標的遺伝子の導入を必然的に伴う。一実施形態では、１種または複数種の標的遺伝子は、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）において利用される。一実施形態では、標的遺伝子は、グルコース透過酵素遺伝子であり、したがって、本明細書に提供される方法でグルコース透過酵素遺伝子を宿主微生物に導入する。グルコース透過酵素遺伝子は、宿主微生物において異種遺伝子であり得る。一実施形態では、標的遺伝子は、ヘキソキナーゼ遺伝子であり、したがって、本明細書に提供される方法でヘキソキナーゼ遺伝子を宿主微生物に導入する。一実施形態では、グルコース透過酵素遺伝子およびヘキソキナーゼ遺伝子の両方は、本明細書に提供される方法で宿主微生物に導入される。一実施形態では、グルコース透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子の宿主微生物への導入により、宿主微生物において非ＰＴＳ組換えグルコース取込系がもたらされる。組換えグルコース取込系は、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）利用からグルコース輸送を切り離すことに役立つことができ、それにより目的の生体分子または産物の合成のためにさらなるＰＥＰを生じさせる。本明細書に提供される方法によって生じる目的の生体分子または産物は、グルコースから産生されたあらゆる商業的産物であり得る。一部の場合では、目的の生体分子または産物は、低分子、アミノ酸、有機酸またはアルコールである。アミノ酸は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンであり得る。有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートであり得る。アルコールは、エタノールまたはイソブタノールであり得る。
【００７０】
一実施形態では、開示される微生物ゲノム操作方法は、グルコース透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子のライブラリーを利用する。グルコース透過酵素遺伝子は、グルコースに対するグルコース透過酵素親和性および／またはグルコース輸送速度に基づいて選択することができる。一部の場合では、微生物は、グルコース透過酵素ライブラリー、ヘキソキナーゼ（例えば、グルコキナーゼ）ライブラリーまたはグルコース透過酵素およびヘキソキナーゼ（例えば、グルコキナーゼ）のライブラリーの組合せを利用して操作される。一実施形態では、ライブラリーは、複数のキメラ構築物挿入体を含有し、それによりライブラリー内の各挿入体は、グルコース透過酵素遺伝子およびヘキソキナーゼ（例えば、グルコキナーゼ）遺伝子を含む。操作後、微生物を、得られる結果、例えば、本明細書に提供されるグルコースからの産物の産生について効率的にスクリーニングまたは評価することができる。本明細書に提供されるライブラリーを利用して特定のゲノム変更を定義し、次いで、変更を有する宿主微生物ゲノムを試験／スクリーニングするこのプロセスは、効率的かつ反復的に実行することができ、宿主細胞におけるその発現がグルコースからの（form）目的の生体分子または産物の所望のまたは閾値のレベルを産生するグルコース透過酵素／ヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）の特定の組合せを同定するために使用することができる。
【００７１】
一実施形態では、本明細書に提供される方法において使用するための本明細書に提供される各グルコース透過酵素遺伝子またはヘキソキナーゼ遺伝子（グルコキナーゼ遺伝子）は、天然プロモーターまたは本明細書に提供されるプロモーターポリヌクレオチドのいずれかの制御下にあるまたはそれに機能的に連結している。「プロモーターポリヌクレオチド」または「プロモーター」または「プロモーター活性を有するポリヌクレオチド」は、転写されるポリヌクレオチドに機能的に連結している場合、コーディングポリヌクレオチド（例えば、グルコース透過酵素遺伝子もしくはグルコキナーゼ遺伝子）の転写の開始の点および頻度を決定し、それにより、制御されるポリヌクレオチドの発現の強度に影響を及ぼすことを可能にする、ポリヌクレオチド、好ましくはデオキシリボポリヌクレオチドまたは核酸、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を意味することができる。一実施形態では、グルコース透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）を含むライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、同じまたは同一のプロモーターの制御下にある。一実施形態では、グルコース透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）を含むライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、別々のまたは異なるプロモーターの制御下にある。さらに別の実施形態では、標的遺伝子を含むキメラ構築物のライブラリー内のキメラ構築物中の各標的遺伝子は、同じまたは同一のプロモーターの制御下にある。さらなる実施形態では、標的遺伝子を含むキメラ構築物のライブラリー内のキメラ構築物の各標的遺伝子は、別々のまたは異なるプロモーターの制御下にある。
【００７２】
一実施形態では、グルコース透過酵素遺伝子またはヘキソキナーゼ遺伝子またはグルコキナーゼ遺伝子のライブラリーの生成において使用するためのプロモーターラダーが本明細書に提供される。本明細書で使用される用語「プロモーターラダー」は、プロモーター活性のレベルが増加的に上昇する複数のプロモーターを指す。本明細書で使用される用語「プロモーター活性」は、ポリヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を開始させるプロモーターの能力を指す。プロモーター活性を評定する方法は当業者に周知であり、例えば、それぞれその全体が本明細書に参照により組み込まれている、２０１５年１２月７日に出願されたＵＳ６２／２６４，２３２の実施例２およびＰＣＴ／ＵＳ１６／６５４６４（すなわち、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１００３７６号）に記載されている方法を挙げることができる。本明細書で使用される用語「構成的プロモーター」は、内部または外部の細胞条件にかかわらず、定速でその関連する遺伝子の転写を指示するプロモーターを指すことができる。
プロモーター
【００７３】
一部の実施形態では、本開示は、ＲＮＡ分解機能をモジュレートし、全体的な宿主株生産性に対する有益な効果を生じさせるために最適な発現性質を有するプロモーターを選択する方法を教示する。
【００７４】
プロモーターは、遺伝子が転写される速度を調節し、様々なやり方で転写に影響を与えることができる。構成的プロモーターは、例えば、内部または外部の細胞条件にかかわらず、定速でこれらの関連する遺伝子の転写を指示し、一方、調節可能プロモーターは、内部および／または外部の細胞条件、例えば、成長速度、温度、具体的な環境化学物質に対する応答などに応じて遺伝子が転写される速度を増減する。プロモーターは、これらの正常な細胞コンテクストから単離することができ、操作されて、実質的に任意の遺伝子の発現を調節することができ、細胞成長、産物収率、および／または目的の他の表現型の有効な改変を可能にする。
【００７５】
一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度（例えば、以下に論じられるプロモーターラダー）、または優れた調節性質（すなわち、選択された遺伝子のより厳格な調節制御）を呈する、宿主細胞内の１つもしくは複数のプロモーターを同定し、かつ／または１つもしくは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を教示する。これらの同定および／または生成されるプロモーターの特定の組合せを、以下でより詳細に説明されるＲＮＡ分解撹乱実験において使用するためのプロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【００７６】
一部の実施形態では、プロモーターラダーは、一連の発現強度を有する目的の標的遺伝子と関連がある自然、天然、または野生型プロモーターを同定することによって作製される。これらの同定されたプロモーターは、プロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【００７７】
一部の実施形態では、プロモーターラダーは、目的の標的遺伝子と関連がある自然、天然、または野生型プロモーターを同定し、次いで、前記プロモーターを変異させて、複数の変異プロモーター配列を誘導することによって、作製される。これらの変異プロモーターのそれぞれは、標的遺伝子発現に対する効果について試験される。一部の実施形態では、編集されたプロモーターは、様々な条件にわたって発現活性について試験され、その結果、各プロモーターバリアントの活性がデータベース内に記録され／特徴付けられ／アノテートされ、かつ記憶される。結果として生じる編集されたプロモーターバリアントは、引き続いて組織化されて、これらの発現の強度に基づいて配列されたプロモーターラダーにされる（例えば、頂部付近に高度発現バリアントおよび底部付近に減弱された発現を有し、したがって、用語「ラダー」をもたらす）。
【００７８】
一部の実施形態では、本開示は、同定された自然に存在するプロモーターおよび変異されたバリアントプロモーターの組合せであるプロモーターラダーを教示する。
【００７９】
一部の実施形態では、本開示は、以下の判定基準：１）構成的プロモーターのラダーを表した；および２）短いＤＮＡ配列、理想的には１００塩基対未満によってコードされ得る、の両方を満たした自然、天然、または野生型プロモーターを同定する方法を教示する。一部の実施形態では、本開示の構成的プロモーターは、２つの選択された成長条件（典型的には、工業的な培養中に経験した条件の間で比較した）にわたって一定の遺伝子発現を呈する。一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、約６０塩基対のコアプロモーターおよび長さが２６から４０塩基対の間の５’ＵＴＲからなる。
【００８０】
一部の実施形態では、上記の同定した自然に存在するプロモーター配列の１つまたは複数が、遺伝子編集のために選択される。一部の実施形態では、自然のプロモーターは、任意の公知の遺伝子変異方法を介して編集される。他の実施形態では、本開示のプロモーターは、所望の配列を有する新しいプロモーターバリアントを合成することによって編集される。
【００８１】
２０１５年１２月７日に出願された米国特許出願第６２／２６４，２３２号および２０１６年１２月７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１６／６５４６４（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１００３７６号）の開示全体は、すべての目的に関してそれぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００８２】
本開示のプロモーターの非網羅的なリストを以下の表１に提供する。表１のプロモーター配列のそれぞれは、異種プロモーターまたは異種プロモーターポリヌクレオチドと呼ぶことができる。
【表１】
2019519241.tif 000003
【００８３】
一部の実施形態では、本発明のプロモーターは、表１由来のプロモーター配列と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％の配列同一性を呈する。
グルコース透過酵素
【００８４】
本明細書に提供される方法において使用するためのグルコース透過酵素遺伝子のライブラリーが本明細書に提供される。グルコース透過酵素遺伝子のライブラリーは、１種または複数種のグルコース透過酵素遺伝子を含み得る。ライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子は、グルコース透過酵素遺伝子の天然形態または変異形態であり得る。変異形態は、挿入、欠失、一塩基多型（ＳＮＰ）または転座から選択される１種または複数種の変異を含み得る。ライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子は、細菌グルコース透過酵素遺伝子であり得る。グルコース透過酵素遺伝子は、当技術分野で公知の原核細胞（すなわち、細菌および／または古細菌）由来の任意のグルコース透過酵素遺伝子であり得る。グルコース透過酵素遺伝子は、当技術分野で公知の真核細胞（例えば、真菌）由来の任意のグルコース透過酵素遺伝子であり得る。グルコース透過酵素は、グルコース透過酵素活性を含む任意のタンパク質と見なされ得る。例えば、本明細書において使用するためのグルコース透過酵素は、グルコースに親和性を示し、引き続いて宿主細胞の細胞膜を横切るその輸送を促進する任意のトランスポーター（例えば、ｍｙｏ−イノシトールトランスポーター）であり得る。宿主細胞は、本明細書に提供される任意の宿主細胞であり得る。一実施形態では、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはこれらの組合せの任意の株／種／亜種由来のグルコース透過酵素遺伝子を含む。一実施形態では、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリーは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４またはこれらの組合せから選択されるポリペプチド配列をコードするグルコース透過酵素遺伝子を含む。
【００８５】
一部の実施形態では、本発明の透過酵素は、本明細書に提供される透過酵素と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％の配列同一性を呈する。
【００８６】
一実施形態では、グルコース透過酵素遺伝子のライブラリーは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４またはこれらの組合せから選択されるグルコース透過酵素遺伝子を含む。
【００８７】
一部の実施形態では、本発明の透過酵素遺伝子は、本明細書に提供される透過酵素遺伝子と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％の配列同一性を呈する。
【００８８】
ライブラリー内の各グルコース透過酵素は、その天然プロモーターまたはその天然プロモーターの変異形態に機能的に連結するまたはその制御下におくことができる。ライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子は、本明細書に提供される任意のプロモーターに機能的に連結するまたはそれにより制御することができる。ライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７および配列番号８から選択される配列を含むプロモーターポリヌクレオチド配列によって制御することができる。ライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択される配列を含有するプロモーターポリヌクレオチド配列によって制御することができる。一実施形態では、ライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子は、グルコース透過酵素遺伝子のセットとして存在し、各セットは、配列番号１に機能的に連結した１つのグルコース透過酵素遺伝子、配列番号２に機能的に連結した１つのグルコース透過酵素遺伝子、配列番号３に機能的に連結した１つのグルコース透過酵素遺伝子、配列番号４に機能的に連結した１つのグルコース透過酵素遺伝子、配列番号５に機能的に連結した１つのグルコース透過酵素遺伝子、配列番号６に機能的に連結した１つのグルコース透過酵素遺伝子、配列番号７に機能的に連結した１つのグルコース透過酵素遺伝子および配列番号８に機能的に連結した１つのグルコース透過酵素遺伝子またはこれらの組合せを有する。グルコース透過酵素遺伝子のライブラリー内の各グルコース透過酵素遺伝子は、キメラ構築物中に、遺伝子が１種または複数種の調節配列および／または宿主細胞のゲノム内に存在する配列と相同の配列と隣接することができるように存在することができる。宿主細胞に存在する配列と相同の配列により、相補配列を含む宿主細胞ゲノムの部位または遺伝子座へのグルコース透過酵素遺伝子の組込みを促進することができる。組込みは、組換え事象を介したものであり得る。調節配列は、例えば、宿主細胞の遺伝機構によって使用される、プロモーター配列、開始配列、停止配列、シグナル配列、分泌配列、および／または終結配列などの、当技術分野で公知のまたは本明細書に提供される任意の調節配列であり得る。
ヘキソキナーゼ
【００８９】
本明細書に提供される方法において使用するためのヘキソキナーゼ遺伝子のライブラリーが本明細書に提供される。ヘキソキナーゼ遺伝子のライブラリーは、１種または複数種のヘキソキナーゼ遺伝子を含み得る。ライブラリー内の各ヘキソキナーゼ遺伝子は、遺伝子の天然形態または変異形態であり得る。変異形態は、挿入、欠失、一塩基多型（ＳＮＰ）または転座から選択される１種または複数種の変異を含み得る。各ヘキソキナーゼ遺伝子は、グルコキナーゼ遺伝子であり得る。ライブラリー内の各グルコキナーゼ遺伝子は、細菌グルコキナーゼ遺伝子であり得る。グルコキナーゼ遺伝子は、当技術分野で公知の原核細胞（すなわち、細菌および／または古細菌）由来の任意のグルコキナーゼ遺伝子であり得る。グルコキナーゼ遺伝子は、当技術分野で公知の真核細胞（例えば、真菌）由来の任意のグルコキナーゼ遺伝子であり得る。グルコキナーゼは、グルコースを基質として利用でき、グルコース−６−リン酸を産生するようにグルコースをリン酸化できる、当技術分野で公知の任意のキナーゼと見なされ得る。一実施形態では、グルコキナーゼ遺伝子のライブラリーは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｇｌｋＡ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｒ．ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｉｕｍ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはこれらの組合せの任意の株／種／亜種由来のグルコキナーゼ遺伝子を含む。一実施形態では、グルコキナーゼ遺伝子のライブラリーは、配列番号１５および／または配列番号１６から選択されるポリペプチド配列をコードするグルコキナーゼ遺伝子を含む。
【００９０】
一部の実施形態では、本発明のヘキソキナーゼ（例えば、グルコキナーゼ）は、本明細書に提供されるヘキソキナーゼ（例えば、グルコキナーゼ）と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％の配列同一性を呈する。
【００９１】
一実施形態では、グルコキナーゼ遺伝子のライブラリーは、配列番号２５および／または配列番号２６から選択されるグルコキナーゼ遺伝子を含む。
【００９２】
一部の実施形態では、本発明のヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、本明細書に提供されるヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％の配列同一性を呈する。
【００９３】
ライブラリー内の各ヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、その天然プロモーターまたはその天然プロモーターの変異形態に機能的に連結するまたはその制御下におくことができる。ライブラリー内の各ヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、本明細書に提供される任意のプロモーターに機能的に連結するまたはそれによって制御することができる。ライブラリー内の各ヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７および配列番号８から選択される配列を含むプロモーターポリヌクレオチド配列によって制御することができる。ライブラリー内の各ヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択される配列を含有するプロモーターポリヌクレオチド配列によって制御することができる。一実施形態では、ライブラリー内の各ヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、ヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）のセットとして存在し、各セットは、配列番号１に機能的に連結した１つのヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）、配列番号２に機能的に連結した１つのヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）、配列番号３に機能的に連結した１つのヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）、配列番号４に機能的に連結した１つのヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）、配列番号５に機能的に連結した１つのヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）、配列番号６に機能的に連結した１つのヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）、配列番号７に機能的に連結した１つのヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）および配列番号８に機能的に連結した１つのヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）またはこれらの組合せを有する。ヘキソキナーゼ遺伝子のライブラリー内の各ヘキソキナーゼ遺伝子は、キメラ構築物中に、遺伝子が１種または複数種の調節配列および／または宿主細胞のゲノム内に存在する配列と相同の配列と隣接することができるように存在することができる。宿主細胞中に存在する配列と相同の配列は、相補配列を含む宿主細胞ゲノムの部位または遺伝子座へのヘキソキナーゼ遺伝子の組込みを促進することができる。組込みは、組換え事象を介したものであり得る。調節配列は、当技術分野で公知の、または本明細書に提供される任意の調節配列、例えば、宿主細胞の遺伝機構によって使用される、プロモーター配列、開始配列、停止配列、シグナル配列、分泌配列、および／または終結配列などであり得る。
【００９４】
本明細書に提供される方法において使用するためのグルコース透過酵素遺伝子およびヘキソキナーゼ遺伝子を含むライブラリーが本明細書に提供される。一実施形態では、グルコース透過酵素遺伝子およびヘキソキナーゼ遺伝子は、単一のキメラ挿入体中に存在する。ライブラリー内のキメラ構築物中の各グルコース透過酵素遺伝子またはヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、いずれかの遺伝子の天然形態または変異形態であり得る。いずれかの遺伝子の変異形態は、挿入、欠失、一塩基多型（ＳＮＰ）または転座から選択される１種または複数種の変異を含み得る。グルコース透過酵素遺伝子は、細菌グルコース透過酵素遺伝子であり得る。グルコース透過酵素遺伝子は、当技術分野で公知の任意の細菌グルコース透過酵素遺伝子であり得る。一実施形態では、キメラ構築物中のグルコース透過酵素遺伝子は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３）またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の任意の株／種／亜種由来のグルコース透過酵素遺伝子を含む。一実施形態では、キメラ構築物中のグルコース透過酵素遺伝子は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４から選択されるポリペプチド配列をコードする遺伝子である。一実施形態では、キメラ構築物中のグルコース透過酵素遺伝子は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４またはこれらの組合せから選択される。各キメラ構築物中のヘキソキナーゼ遺伝子は、グルコキナーゼ遺伝子であり得る。各キメラ構築物中の各グルコキナーゼ遺伝子は、細菌グルコキナーゼ遺伝子であり得る。グルコキナーゼ遺伝子は、当技術分野で公知の任意の細菌グルコキナーゼ遺伝子であり得る。一実施形態では、キメラ構築物中のグルコキナーゼ遺伝子は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｇｌｋＡ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）またはＲｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｒ．ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｉｕｍ）の任意の株／種／亜種由来のグルコキナーゼ遺伝子を含む。一実施形���では、キメラ構築物中のグルコキナーゼ遺伝子は、配列番号１５および／または配列番号１６から選択されるポリペプチド配列をコードするグルコキナーゼ遺伝子を含む。一実施形態では、キメラ構築物中のグルコキナーゼ遺伝子は、配列番号２５および／または配列番号２６から選択される。本明細書に提供されるキメラ構築物では、グルコース透過酵素遺伝子は、本明細書に提供される任意のグルコース透過酵素遺伝子であり得、一方グルコキナーゼ遺伝子は、本明細書に提供される任意のグルコキナーゼ遺伝子であり得る。一実施形態では、キメラグルコース透過酵素遺伝子構築物およびグルコキナーゼ遺伝子構築物を含むライブラリーは、複数の構築物を含み、それにより大多数は、本明細書に提供されるグルコース透過酵素遺伝子とグルコキナーゼ遺伝子とのそれぞれの可能な組合せを含む。
【００９５】
本明細書に提供されるキメラ構築物中の各グルコース透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、その天然プロモーターまたはその天然プロモーターの変異形態に機能的に連結するまたはその制御下におくことができる。本明細書に提供されるキメラ構築物中の各グルコース透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、本明細書に提供される任意のプロモーターに機能的に連結するまたはそれによって制御することができる。本明細書に提供されるキメラ構築物中の各グルコース透過酵素遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７および配列番号８から選択される配列を含むまたは含有するプロモーターポリヌクレオチド配列によって制御することができる。本明細書に提供されるキメラ構築物中の各ヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択される配列を含むまたは含有するプロモーターポリヌクレオチド配列によって制御することができる。本明細書に提供されるキメラ構築物中のグルコース透過酵素遺伝子およびヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、同じ配列を含むまたは含有するプロモーターにそれぞれ機能的に連結することができる。本明細書に提供されるキメラ構築物中のグルコース透過酵素遺伝子およびヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、異なる配列を含むまたは含有するプロモーターにそれぞれ機能的に連結することができる。
グルコース透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子の変異形態の生成
【００９６】
本明細書に提供される通り、本明細書に提供される方法において使用するためのグルコース透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、それが由来する遺伝子の変異形態であり得る。変異遺伝子は、当技術分野で公知のまたは本明細書に提供される任意のやり方で変異させたものであり得る。
【００９７】
一部の実施形態では、本開示は、ゲノムＤＮＡの選択された部分を導入し、欠失させ、または置き換えることによって細胞集団を変異させることを教示する。よって、一部の実施形態では、本開示は、特定の遺伝子座（例えば、グルコース透過酵素またはグルコキナーゼ）に変異を標的化するための方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ領域を選択的に編集するための遺伝子編集技術、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮＳ、またはＣＲＩＳＰＲの使用を教示する。細胞集団を変異させた後、標的化された変異を細胞から単離し、その後、本明細書に記載のグルコース透過酵素および／またはヘキソキナーゼ遺伝子のライブラリーを生成するために使用することができる。
【００９８】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物の外で選択されたＤＮＡ領域（例えば、グルコース透過酵素遺伝子またはグルコキナーゼ遺伝子）を変異させることを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、天然グルコース透過酵素遺伝子またはヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）を変異させることを教示する。
【００９９】
一部の実施形態では、ＤＮＡの選択された領域は、自然バリアントの遺伝子シャッフリング、または合成オリゴとのシャッフリング、プラスミド−プラスミド組換え、ウイルスプラスミド組換えまたはウイルス−ウイルス組換えを介してｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成される。他の実施形態では、ゲノム領域は、エラープローンＰＣＲまたは部位特異的変異誘発を介して生成される。
【０１００】
一部の実施形態では、グルコース透過酵素遺伝子またはヘキソキナーゼ遺伝子を含有する選択された遺伝領域内で変異を生成するステップは、「リアセンブリーＰＣＲ」によって達成される。簡単に言えば、オリゴヌクレオチドプライマー（オリゴ体）が、目的の核酸配列（例えば、グルコース透過酵素遺伝子またはグルコキナーゼ遺伝子）のセグメントをＰＣＲ増幅するために合成され、その結果、オリゴヌクレオチドの配列は、２つのセグメントの接合部と重複する。重複領域は、典型的には、長さが約１０〜１００ヌクレオチドである。セグメントのそれぞれは、一連のこのようなプライマーで増幅される。次いでＰＣＲ産物は、アセンブリープロトコールに従って「リアセンブルされる」。簡単に説明すると、アセンブリープロトコールでは、ＰＣＲ産物は、例えば、ゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーによって最初に精製されてプライマーから離れる。精製産物は、一緒に混合され、追加のプライマーの非存在下で（「セルフプライミング」）、ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）および適切な緩衝塩の存在下で、約１〜１０サイクルの変性、リアニーリング、および伸長に供される。遺伝子に隣接するプライマーを用いた後続のＰＣＲが使用されて、完全にリアセンブルおよびシャッフルされた遺伝子の収量が拡大される。
【０１０１】
本開示の一部の実施形態では、上記に論じたものなどの変異透過酵素またはヘキソキナーゼのＤＮＡ領域は、変異体配列について富化され、その結果、複数の変異体スペクトル、すなわち、変異の可能な組合せが、より効率的にサンプリングされる。一部の実施形態では、変異配列は、アセンブリー反応の前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで親和性精製材料を増幅する好適なステップを用いて、ｍｕｔＳタンパク質親和性マトリックスを介して同定される（Wagnerら、Nucleic  Acids  Res.、２３巻（１９号）：３９４４〜３９４８頁（１９９５年）；Suら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.(U.S.A.)、８３巻：５０５７〜５０６１頁（１９８６年））。次いでこの増幅された材料は、アセンブリーまたはリアセンブリーＰＣＲ反応にかけられる。
グルコース透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子を含むライブラリーの生成
【０１０２】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物（例えば）のグルコース透過酵素遺伝子および／またはグルコキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡセグメントを挿入することおよび／または置き換えることおよび／または欠失させることを教示する。一部の態様では、本明細書に教示の方法は、宿主生物のゲノム内に組み込むことができる目的のオリゴヌクレオチド（すなわち、グルコース透過酵素セグメントまたはグルコース透過酵素−ヘキソキナーゼセグメント）を形成することを伴う。一部の実施形態では、本開示のグルコース透過酵素ＤＮＡセグメントまたはグルコース透過酵素−ヘキソキナーゼＤＮＡセグメントは、公知の鋳型からのコピーもしくはカット、変異、またはＤＮＡ合成を含む、当技術分野で公知の任意の方法を介して得ることができる。一部の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列を生成するための市販の遺伝子合成産物（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）、ＧｅｎｅＭａｋｅｒ（商標）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）、Ａｎａｇｅｎ（商標）、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ（商標）、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（商標）、ＧｅＮＯｓｙｓ，Ｉｎｃ．、またはＱｉａｇｅｎ（商標））に適合する。
【０１０３】
一部の実施形態では、グルコース透過酵素ＤＮＡセグメントまたはグルコース透過酵素−ヘキソキナーゼＤＮＡセグメントは、グルコース透過酵素ＤＮＡセグメントまたはグルコース透過酵素−ヘキソキナーゼＤＮＡセグメントを宿主生物の選択されたＤＮＡ領域に組み込む（例えば、有益な非ＰＴＳグルコース輸送系を加える）ように設計されている。選択されたＤＮＡ領域は、中立の組込み部位であり得る。他の実施形態では、グルコース透過酵素ＤＮＡセグメントまたはグルコース透過酵素−ヘキソキナーゼＤＮＡセグメントは、宿主生物のＤＮＡから天然透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子を除去する（例えば、天然ＰＴＳグルコース輸送系を除去する）ように設計されている。
【０１０４】
一部の実施形態では、本発明の方法で使用されるグルコース透過酵素遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子またはグルコース透過酵素−ヘキソキナーゼ遺伝子は、当技術分野で公知の酵素合成または化学合成の方法のいずれかを使用してオリゴヌクレオチドとして段階的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは、固体支持体、例えば、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレンビーズ、またはＣＰＧを含有し得る熱可塑性ポリマーから構成される膜上で合成することができる。オリゴヌクレオチドは、アレイ上で、マイクロフルイディクスを使用して並列の微小規模で（Tianら、Mol.  BioSyst.、５巻、７１４〜７２２頁（２００９年））、または両方の組合せを提供する公知の技術で（Jacobsenら、米国特許出願第２０１１／０１７２１２７号を参照）合成することもできる。
【０１０５】
アレイ上の、またはマイクロフルイディクスによる合成は、より低い試薬使用を通じてコストを低減することによって、慣例的な固体支持体合成にまさって利点を提供する。遺伝子合成に要求される規模は低く、したがって、アレイから、またはマイクロフルイディクスを通じて合成されるオリゴヌクレオチド産物の規模は、許容される。しかし、合成されるオリゴヌクレオチドは、固体支持体合成を使用するときより低い品質のものである（Tian、以下を参照；Staehlerら、米国特許出願第２０１０／０２１６６４８号も参照）。
【０１０６】
伝統的な４ステップホスホスホルアミダイト化学において、それが１９８０年代に最初に記載されて以来、多数の進歩が実現されている（例えば、ペルオキシアニオンの脱保護を使用するSierzchalaら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１２５巻、１３４２７〜１３４４１頁（２００３年）；代替の保護基についてHayakawaら、米国特許第６，０４０，４３９号；ユニバーサル支持体についてAzhayevら、Tetrahedron、５７巻、４９７７〜４９８６頁（２００１年）；大孔ＣＰＧの使用によるより長いオリゴヌクレオチドの改善された合成についてKozlovら、Nucleosides,  Nucleotides,  and  Nucleic  Acids、２４巻（５〜７号）、１０３７〜１０４１頁（２００５年）；および改善された誘導体化についてDamhaら、NAR、１８巻、３８１３〜３８２１頁（１９９０年）を参照）。
【０１０７】
合成のタイプにかかわらず、次いで結果として生じるオリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド（すなわち、グルコース透過酵素遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子またはグルコース透過酵素−ヘキソキナーゼ遺伝子）のためのより小さいビルディングブロックを形成することができる。一部の実施形態では、より小さいオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知のプロトコール、例えば、ポリメラーゼ連鎖アセンブリー（polymerase  chain  assembly）（ＰＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および熱力学的にバランスのとれたインサイドアウト合成（thermodynamically  balanced  inside-out  synthesis）（ＴＢＩＯ）を使用して一緒に接合することができる（Czarら、Trends  in  Biotechnology、２７巻、６３〜７１頁（２００９年）を参照）。ＰＣＡでは、所望のより長い産物の全長にわたるオリゴヌクレオチドを、複数のサイクル（典型的には約５５サイクル）においてアニールおよび伸長させて完全長産物を最終的に達成する。ＬＣＲは、リガーゼ酵素を使用して２つのオリゴヌクレオチドを接合し、これらはともにアニールされて第３のオリゴヌクレオチドになる。ＴＢＩＯ合成は、所望の産物の中心から開始し、遺伝子の５’末端における順方向鎖と、かつ遺伝子の３’末端における逆方向鎖と相同性である重複オリゴヌクレオチドを使用することによって両方向で漸進性に伸長される。
【０１０８】
より大きい二本鎖ＤＮＡ断片を合成する別の方法は、トップストランドＰＣＲ（ＴＳＰ）によってより小さいオリゴヌクレオチドを組み合わせることである。本方法では、複数のオリゴヌクレオチドが所望の産物の全長にわたり、隣接するオリゴヌクレオチド（複数可）に対して重複領域を含有する。増幅は、ユニバーサル順方向および逆方向プライマーを用いて、かつ複数のサイクルの増幅を通じて実施することができ、全長の二本鎖ＤＮＡ産物が形成される。次いでこの産物は、必要に応じた誤差補正およびさらなる増幅を受けることができ、それにより、所望の二本鎖ＤＮＡ断片最終産物がもたらされる。
【０１０９】
ＴＳＰの一方法では、全長の所望の産物を形成するのに組み合わされるより小さいオリゴヌクレオチドのセットは、４０〜２００塩基の間の長さであり、少なくとも約１５〜２０塩基互いに重複する。実用的な目的のために、重複領域は、オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングを確実にするために最小でも十分長く、使用される反応温度でアニールするために十分高い融解温度（Ｔｍ）を有するべきである。重複は、所与のオリゴヌクレオチドが隣接するオリゴヌクレオチドによって完全に重複されるポイントまで伸長することができる。重複の量は、最終産物の品質に対していずれの効果も有さないようである。アセンブリー内の最初および最後のオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、順方向および逆方向増幅プライマーのための結合部位を含有するべきである。一実施形態では、最初および最後のオリゴヌクレオチドの端末側終端配列は、同じ相補性を有する配列を含有してユニバーサルプライマーの使用を可能にする。
プラスミドのアセンブリング／クローニング
【０１１０】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物のゲノム内に所望のグルコース透過酵素遺伝子および／またはグルコキナーゼ遺伝子のＤＮＡセクションを挿入することができるベクターを構築するための方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、挿入ＤＮＡ（例えば、グルコース透過酵素遺伝子および／またはグルコキナーゼ遺伝子）、ホモロジーアーム、および少なくとも１つの選択マーカーを含むベクターをクローニングする方法を教示する（図３を参照）。
【０１１１】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物内への形質転換に適した任意のベクターに適合する。一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞に適合するシャトルベクターの使用を教示する。一実施形態では、本明細書に提供される方法において使用するためのシャトルベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主細胞に適合するシャトルベクターである。本明細書に提供される方法において使用するためのシャトルベクターは、本明細書に記載の選択および／または対抗選択のためのマーカーを含み得る。マーカーは、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意のマーカーであり得る。シャトルベクターは、任意の調節配列（複数可）および／または当技術分野で公知の前記シャトルベクターのアセンブリーにおいて有用な配列をさらに含み得る。シャトルベクターは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなど本明細書に提供される宿主細胞内での増殖に必要とされ得る任意の複製起点をさらに含むことができる。調節配列は、当技術分野で公知の、または本明細書に提供される任意の調節配列、例えば、宿主細胞の遺伝機構によって使用される、プロモーター配列、開始配列、停止配列、シグナル配列、分泌配列、および／または終結配列などであり得る。終結配列は、配列番号１７または１８であり得る。ある特定の事例では、標的ＤＮＡは、任意のリポジトリまたはカタログ製品から入手可能なベクター、コンストラクト、またはプラスミド、例えば、市販のベクター（例えば、ＤＮＡ２．０特注またはＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクターを参照）内に挿入することができる。
【０１１２】
一部の実施形態では、本開示のアセンブリー／クローニング方法は、以下のアセンブリーストラテジー：ｉ）ＩＩ型従来クローニング、ｉｉ）ＩＩ  Ｓ型媒介または「ゴールデンゲート」クローニング（例えば、Engler,  C.、R.  Kandzia、およびS.  Marillonnet、２００８年、「A  one  pot,  one  step,  precision  cloning  method  with  high  throughput  capability」、PLos  One、３巻：ｅ３６４７頁；Kotera,  I.およびT.  Nagai、２００８年、「A  high-throughput  and  single-tube  recombination  of  crude  PCR  products  using  a  DNA  polymerase  inhibitor  and  type  IIS  restriction  enzyme」、J  Biotechnol、１３７巻：１〜７頁；Weber,  E.、R.  Gruetzner、S.  Werner、C.  Engler、およびS.  Marillonnet、２０１１年、Assembly  of  Designer  TAL  Effectors  by  Golden  Gate  Cloning、PloS  One、６巻：ｅ１９７２２頁を参照）、ｉｉｉ）ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え、ｉｖ）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング、エキソヌクレアーゼ媒介アセンブリー（Aslanidisおよびde  Jong、１９９０年、「Ligation-independent  cloning  of  PCR  products  (LIC-PCR)」、Nucleic  Acids  Research、１８巻、２０号、６０６９頁）、ｖ）相同組換え、ｖｉ）非相同末端接合またはこれらの組合せの少なくとも１つを使用することができる。モジュラーＩＩＳ型ベースアセンブリーストラテジーは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１５４１４７に開示されており、その開示は、参照により本明細書に含まれている。
【０１１３】
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの選択マーカーを有するベクターをクローニングすることを教示する。選択圧下で原核細胞（例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（chloramphenycol）、ゼオシン、スペクチノマイシン／ストレプトマイシンに対する）、または真核細胞（例えば、ジェネテシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン）における選択のための抗生物質耐性機能をコードすることが多い様々な選択マーカー遺伝子が当技術分野で公知である。他のマーカーシステム、例えば、成功裡に形質導入された宿主細胞内で発現されるＸ−ｇａｌまたは緑色もしくは赤色蛍光タンパク質などの蛍光レポーターの存在下で陽性クローンを選択するのに細菌において使用される周知のブルー／ホワイトスクリーニングシステムは、望まれるまたは望まれない細胞のスクリーニングおよび同定を可能にする。そのほとんどが原核生物系内でのみ機能的である選択マーカーの別のクラスは、産生細胞を殺滅する毒性遺伝子産物を発現する、「デス遺伝子（ｄｅａｔｈ  ｇｅｎｅ）」とも呼ばれることが多い対抗選択可能マーカー遺伝子に関する。このような遺伝子の例としては、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｇａｔａ−１、またはｃｃｄＢが挙げられ、その機能は、（Reyratら、１９９８年、「Counterselectable  Markers:  Untapped  Tools  for  Bacterial  Genetics  and  Pathogenesis」、Infect  Immun.、６６巻（９号）：４０１１〜４０１７頁）に記載されている。
【０１１４】
一実施形態では、標的ＤＮＡセグメントがクローニングされるベクターは、本明細書に提供されるプロモーターラダーまたはライブラリーに由来するプロモーターポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８から選択される配列を含むまたは含有するプロモーターラダーが本明細書に提供される。プロモーターポリヌクレオチドは、いずれの場合においても、宿主微生物において原核生物ヘモグロビン遺伝子を過剰発現または過少発現するために使用することができる。
【０１１５】
一実施形態では、ベクターは、第１のプロモーターポリヌクレオチドおよび第２のプロモーターポリヌクレオチドを含む。第１のおよび／または第２のプロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８から選択される配列を含むまたは含有する場合がある。プロモーターポリヌクレオチドは、宿主微生物におけるグルコース透過酵素および／またはヘキソキナーゼを過剰発現または過少発現させるための各場合にも使用することができる。
【０１１６】
一部の実施形態では、異種グルコース透過酵素遺伝子またはグルコース透過酵素遺伝子−グルコキナーゼ遺伝子を含むそれぞれの生成された株は、培養され、本開示の１つまたは複数の判定基準（例えば、目的の生体分子または産物の生産性）下で分析される。分析された宿主株のそれぞれからのデータは、特定のグルコース透過酵素遺伝子またはグルコース透過酵素遺伝子／グルコキナーゼ遺伝子組合せと関連／相関付けられ、将来使用するために記録される。よって、本開示は、任意の数の目的の微生物遺伝的または表現型形質に対するグルコース透過酵素遺伝子またはグルコース透過酵素遺伝子／グルコキナーゼ遺伝子の組合せの効果を同定する、大きい、高度にアノテートされた遺伝的多様性ライブラリー／デポジトリーの作製を可能にする。
【０１１７】
一部の実施形態では、本開示は、開始および／または停止コドンバリアントを有するグルコース透過酵素遺伝子および／またはヘキソキナーゼ遺伝子をクローニングし、その結果、クローニングされた遺伝子が開始および／または停止コドンバリアントを利用するようにするためのベクターの使用を教示する。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物の典型的な停止コドンは、それぞれＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物の典型的な停止コドンは、ＵＧＡであり、一方、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは一般に、停止コドンとしてＵＡＡを使用する（Dalphinら（１９９６年）、Nucl.  Acids  Res.、２４巻：２１６〜２１８頁）。
【０１１８】
一実施形態では、提供した開示の方法は、宿主生物が発現する１種または複数種の遺伝子をコドン最適化すること含む。様々な宿主内での発現を改善するためにコドンを最適化するための方法は、当技術分野で公知であり、文献において記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００７／０２９２９１８号を参照）。特定の原核または真核生物宿主に好適なコドンを含有する最適化コード配列（Murrayら、（１９８９年）、Nucl.  Acids  Res.、１７巻：４７７〜５０８頁も参照）を調製して、例えば、翻訳の速度を増加させ、または非最適化配列から産生される転写物と比較して、より長い半減期などの望ましい性質を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができる。
【０１１９】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるグルコース透過酵素遺伝子またはポリヌクレオチドは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの、本明細書に提供される宿主細胞における翻訳のためにコドン最適化された分子を含む。遺伝子またはポリヌクレオチドは、単離された、合成または組換え核酸であり得る。コドン最適化グルコース透過酵素遺伝子またはポリヌクレオチドは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４から選択することができる。一部の場合では、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４から選択されるポリペプチド配列をコードするようにコドン最適化されている透過酵素遺伝子またはポリヌクレオチドが本明細書に提供される。本明細書に提供されるコドン最適化グルコース透過酵素遺伝子またはポリヌクレオチドは、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）遺伝子設計システムまたはＤＮＡ２．０  ＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ技術などの、コドン最適化ポリヌクレオチドを生成するための当技術分野で公知の方法を使用して生成することができる。
【０１２０】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるヘキソキナーゼ（例えば、グルコキナーゼ）遺伝子またはポリヌクレオチドは、例えばＥ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの本明細書に提供される宿主細胞における翻訳のためにコドン最適化された分子を含む。遺伝子またはポリヌクレオチドは、単離された、合成または組換え核酸であり得る。コドン最適化ヘキソキナーゼ遺伝子（例えば、グルコキナーゼ遺伝子）は、配列番号２５または配列番号２６から選択することができる。一部の場合では、配列番号１５または配列番号１６から選択されるポリペプチド配列をコードするようにコドン最適化されているヘキソキナーゼ（例えば、グルコキナーゼ）遺伝子またはポリヌクレオチドが本明細書に提供される。本明細書に提供されるコドン最適化ヘキソキナーゼ（例えば、グルコキナーゼ）遺伝子またはポリヌクレオチドは、コドン最適化ポリヌクレオチドを生成するための当技術分野で公知の方法、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）遺伝子設計システムまたはＤＮＡ２．０  ＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ技術などを使用して生成され得る。
【０１２１】
タンパク質発現は、転写、ｍＲＮＡプロセシング、ならびに翻訳の安定性および開始に影響するものを含めた多数の因子によって支配される。よって、最適化は、任意の特定の遺伝子のいくつかの配列フィーチャのいずれかに対処することができる。具体例として、希少コドン誘導翻訳休止（rare  codon  induced  translational  pause）は、タンパク質発現を低減し得る。希少コドン誘導翻訳休止は、宿主生物において稀に使用される目的のポリヌクレオチド中のコドンの存在が、利用可能なｔＲＮＡプールにおけるその不足に起因してタンパク質翻訳に対して負の効果を有し得ることを含む。
【０１２２】
代替翻訳開始も、異種タンパク質発現を低減し得る。代替翻訳開始は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として機能することができるモチーフを偶発的に含有する合成ポリヌクレオチド配列を含み得る。これらの部位は、遺伝子内部部位からトランケート型のタンパク質の翻訳を開始することができる。精製中に除去することが困難であり得るトランケート型のタンパク質を産生する可能性を低減する一方法は、最適化ポリヌクレオチド配列から推定上の内部ＲＢＳ配列を排除するステップを含む。
【０１２３】
リピート誘導ポリメラーゼ（repeat-induced  polymerase）のスリッページは、異種タンパク質発現を低減し得る。リピート誘導ポリメラーゼのスリッページは、フレームシフト変異をもたらし得るＤＮＡポリメラーゼのスリッページまたはスタッタリング（stuttering）を引き起こすことが示されているヌクレオチド配列リピートを伴う。このようなリピートは、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページも引き起こし得る。高いＧ＋Ｃ含有量偏りを有する生物では、ＧまたはＣヌクレオチドリピートから構成されるより高い程度のリピートが存在し得る。したがって、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページを誘導する可能性を低減する一方法は、ＧまたはＣヌクレオチドの伸長したリピートを変更するステップを含む。
【０１２４】
干渉二次構造も異種タンパク質発現を低減し得る。二次構造は、ＲＢＳ配列または開始コドンを隔離することができ、タンパク質発現の低減と相関している。ステムループ構造も、転写休止および減衰に関与することができる。最適化ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列のＲＢＳおよび遺伝子コード領域内に最小限の二次構造を含有して、転写および翻訳の改善を可能にすることができる。
【０１２５】
例えば、最適化プロセスは、宿主が発現する所望のアミノ酸配列を同定することによって始めることができる。アミノ酸配列から、候補ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ配列を設計することができる。合成ＤＮＡ配列の設計中に、コドン使用の頻度を、宿主発現生物のコドン使用と比較することができ、希有な宿主コドンを合成配列から除去することができる。さらに、合成候補ＤＮＡ配列を、望ましくない酵素制限部位を除去し、任意の所望のシグナル配列、リンカー、または非翻訳領域を付加または除去するために修飾することができる。合成ＤＮＡ配列は、翻訳プロセスを妨害し得る二次構造、例えば、Ｇ／Ｃリピートおよびステムループ構造の存在について分析することができる。
宿主細胞の形質転換
【０１２６】
一部の実施形態では、本開示のベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはＴｉ媒介遺伝子移入を含めた様々な技法のいずれかを使用して宿主細胞内に導入することができる。特定の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔がある（Davis,  L.、Dibner,  M.、Battey,  I.、１９８６年、「Basic  Methods  in  Molecular  Biology」）。形質転換の他の方法としては、例えば、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔が挙げられる。例えば、Gietzら、Nucleic  Acids  Res.、２７巻：６９〜７４頁（１９９２年）；Itoら、J.  Bacterol.、１５３巻：１６３〜１６８頁（１９８３年）；ならびにBeckerおよびGuarente、Methods  in  Enzymology、１９４巻：１８２〜１８７頁（１９９１年）を参照。一部の実施形態では、形質転換宿主細胞は、組換え宿主株と呼ばれる。
【０１２７】
一部の実施形態では、本開示は、当技術分野で公知の９６ウェルプレートロボットプラットフォームおよび液体ハンドリング機械を使用する細胞のハイスループット形質転換を教示する。
【０１２８】
一部の実施形態では、本開示は、１種または複数種の選択マーカーを有する形質転換細胞をスクリーニングすることを教示する。このような一実施形態では、カナマイシン耐性マーカー（ＫａｎＲ）を含むベクターで形質転換された細胞を、有効量のカナマイシン抗生物質を含有する培地上に蒔く。カナマイシンが入った培地上で目に見えるコロニー形成単位は、ベクターカセットをこれらのゲノム内に組み込んだと推定される。所望の配列の挿入は、ＰＣＲ、制限酵素分析、および／または関連した挿入部位のシーケンシングを介して確認することができる。
選択された配列のループアウト
【０１２９】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物からＤＮＡの選択された領域をループアウトする方法を教示する。ループアウト法は、Nakashimaら、２０１４年、「Bacterial  Cellular  Engineering  by  Genome  Editing  and  Gene  Silencing.」、Int.  J.  Mol.  Sci.、１５巻（２号）、２７７３〜２７９３頁に記載された通りのものであり得る。一部の実施形態では、本開示は、陽性形質転換体から選択マーカーをループアウトすることを教示する。ループアウト欠失技法は、当技術分野で公知であり、（Tearら、２０１４年、「Excision  of  Unstable  Artificial  Gene-Specific  inverted  Repeats  Mediates  Scar-Free  Gene  Deletions  in  Escherichia  coli.」、Appl.  Biochem.  Biotech.、１７５巻：１８５８〜１８６７頁）に記載されている。本明細書に提供される方法で使用されるループアウト法は、シングルクロスオーバー相同組換えまたはダブルクロスオーバー相同組換えを使用して実施することができる。一実施形態では、本明細書に記載の選択された領域のループアウトは、本明細書に記載のシングルクロスオーバー相同組換えを使用することを必然的に伴い得る。
【０１３０】
第１に、ループアウトベクター（loop  out  vector）が、宿主生物のゲノム内の選択された標的領域内に挿入される（例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ、または他の遺伝子編集技法を介して）。一実施形態では、シングルクロスオーバー相同組換えが、図３に表したものなどの環状プラスミドまたはベクターをループインするために、環状プラスミドまたはベクターと宿主細胞ゲノムとの間に使用される。挿入されるベクターは、既存のまたは導入される近傍の宿主配列のダイレクトリピートである配列を用いて設計することができ、その結果、ダイレクトリピートがルーピングおよび欠失を予定しているＤＮＡの領域に隣接する。挿入されると、ループアウトプラスミドまたはベクターを含有する細胞を、選択領域の欠失について対抗選択することができる（例えば、図４；選択遺伝子に対する耐性の欠如を参照）。
宿主微生物
【０１３１】
本明細書に提供されるゲノム操作方法は、工業用微生物細胞培養で例示されるが、所望の形質を遺伝子変異体の集団内で同定することができる任意の生物に適用可能である。
【０１３２】
よって、本明細書で使用される場合、用語「微生物」は、広く解釈されるべきである。これは、これらに限定されないが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌および原生生物を含む。しかし、ある特定の態様では、「高等」真核生物、例えば、昆虫、植物、および動物を本明細書に教示の方法において利用することができる。
【０１３３】
適当な宿主細胞としては、これらに限定されないが、細菌細胞、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。一例示的な実施形態では、適当な宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  ｉｎ  Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．から入手可能なＳＨｕｆｆｌｅ（商標）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ）が含まれる。
【０１３４】
本開示の他の適当な宿主生物としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物が挙げられる。一部の実施形態では、好適なＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株／種としては、寄託基準株がＤＳＭ４４５４９であるＣ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、寄託基準株がＡＴＣＣ１３０３２であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、および寄託基準株がＡＴＣＣ６８７１であるＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓが挙げられる。一部の実施形態では、本開示の好適な宿主は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【０１３５】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の、特に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種の適当な宿主株は、特に、公知の野生型株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ  ＡＴＣＣ１４０２０；ならびにこれらから調製されるＬ−アミノ酸産生変異体または株、例えば、Ｌ−リシン産生株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７１２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６３、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＭ５８−１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＧ５２−５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ５７１４、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ１２８６６などである。
【０１３６】
用語「Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ」も、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍについて使用されている。Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ種のいくつかの代表は、例えば、株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９など、先行技術においてＣ．ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓとも呼ばれている。
【０１３７】
一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、真核細胞である。適当な真核宿主細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、動物細胞、および植物細胞が挙げられる。適当な真菌宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられる。ある特定の好適な真菌宿主細胞には、酵母細胞および糸状菌細胞が含まれる。適当な糸状菌宿主細胞としては、例えば、ＥｕｍｙｃｏｔｉｎａおよびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門の任意のフィラメント形が挙げられる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Hawksworthら、In  Ainsworth  and  Bisby's  Dictionary  of  The  Fungi、８版、１９９５年、CAB  International、University  Press、Cambridge、UKを参照）。糸状菌は、キチン、セルロース、および他の複合多糖から構成される細胞壁を有する栄養菌糸体によって特徴付けられる。糸状菌宿主細胞は、酵母と形態学的に別個のものである。
【０１３８】
ある特定の例示的であるが限定されない実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフおよび同義語もしくは分類学的均等物の種の細胞であり得る。
【０１３９】
適当な酵母宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａが挙げられる。一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、藻類、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．Ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）である。
【０１４１】
他の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。適切な原核細胞としては、グラム陽性、グラム陰性、およびグラム可変性細菌細胞が挙げられる。宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓの種であり得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【０１４２】
一部の実施形態では、細菌宿主株は、工業用株である。多数の細菌工業用株が公知であり、本明細書に記載の方法および組成物において適している。
【０１４３】
一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｒｕｂｉ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｒｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のものである。特定の実施形態では、宿主細胞は、これらに限定されないが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含めた工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｅ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ���である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｚ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、などである。
【０１４４】
様々な実施形態では、原核生物株および真核生物株の両方を含めた本開示の実践において使用され得る株は、いくつかの培養細胞保存機関（culture  collection）、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）から一般人に容易にアクセス可能である。
【０１４５】
一部の実施形態では、本開示の方法は、多細胞生物にも適用可能である。例えば、プラットフォームは、作物の性能を改善するのに使用することができる。生物は、複数の植物、例えば、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ、Ｆｅｔｕｃｏｉｄｅａｅ、Ｐｏａｃｏｉｄｅａｅ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｓｏｒｇｕｍ、Ｓｅｔａｒｉａ、Ｚｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ａｖｅｎａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｐｏａ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｃｏｉｘ、Ｏｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｅａｅ、Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ、またはＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅを含み得る。例えば、植物は、トウモロコシ、イネ、ダイズ、綿、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、エンドウマメ、マメ、レンズマメ、ピーナッツ、ヤムビーン、ササゲ、ハッショウマメ、クローバー、アルファルファ、ルピナス、ベッチ、ハス、スイートクローバー、フジ、スイートピー、モロコシ、キビ、ヒマワリ、セイヨウアブラナなどであり得る。同様に、生物は、複数の動物、例えば、非ヒト哺乳動物、魚、昆虫などを含み得る。
細胞発酵および培養
【０１４６】
本明細書に記載の遺伝的に操作されたものを含む本開示の微生物は、任意の所望の生合成反応または選択のために適切に改変された慣例的な栄養培地中で培養することができる。一部の実施形態では、本開示は、プロモーターを活性化するための誘導培地中での培養を教示する。一部の実施形態では、本開示は、形質転換体の選択剤（例えば、抗生物質）を含めた選択剤を含む培地、または阻害条件（例えば、高エタノール条件）下で成長させるのに適した生物の選択を教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞成長のために最適化された培地中で細胞培養物を成長させることを教示する。他の実施形態では、本開示は、例えば、グルコースの代謝プロセシングに由来する目的の産物または生体分子などの産物の収量に対して最適化された培地中で細胞培養物を成長させることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞成長を誘導することができ、最終産物産生に必要な前駆体（例えば、エタノール産生のための高レベルの糖）も含有する培地中で培養物を成長させることを教示する。本明細書に提供される方法によって生じる目的の生体分子または産物は、グルコースから産生されたあらゆる商業的産物であり得る。一部の場合では、目的の生体分子または産物は、低分子、アミノ酸、有機酸またはアルコールである。アミノ酸は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンであり得る。有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートであり得る。アルコールは、エタノールまたはイソブタノールであり得る。
【０１４７】
温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに使用するのに適したものであり、当業者に明らかである。記載したように、多くの参考文献が、細菌、植物、動物（哺乳動物を含む）、および古細菌起源の細胞を含めた多くの細胞の培養および産生に利用可能である。例えば、Sambrook、Ausubel（すべて上記）、ならびにBerger、Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques、Methods  in  Enzymology、１５２巻、Academic  Press,  Inc.、San  Diego、CA；ならびにFreshney（１９９４年）、Culture  of  Animal  Cells、a  Manual  of  Basic  Technique、３版、Wiley-Liss、New  York、およびそれに引用された参考文献；DoyleおよびGriffiths（１９９７年）、Mammalian  Cell  Culture:Essential  Techniques、John  Wiley  and  Sons、NY；Humason（１９７９年）、Animal  Tissue  Techniques、４版、W.H.  Freeman  and  Company；ならびにRicciardelleら、（１９８９年）、In  Vitro  Cell  Dev.  Biol.、２５巻：１０１６〜１０２４頁を参照。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。植物細胞培養および再生について、Payneら（１９９２年）、Plant  Cell  and  Tissue  Culture  in  Liquid  Systems、John  Wiley  &  Sons,  Inc.、New  York、N.Y.；GamborgおよびPhillips（編）（１９９５年）、Plant  Cell,  Tissue  and  Organ  Culture;  Fundamental  Methods  Springer  Lab  Manual、Springer-Verlag（Berlin  Heidelberg  N.Y.）；Jones編（１９８４年）、Plant  Gene  Transfer  and  Expression  Protocols、Humana  Press、Totowa、N.J．、ならびにPlant  Molecular  Biology（１９９３年）、R.  R.  D.  Croy編、Bios  Scientific  Publishers、Oxford、U.K.  ISBN  0  12  198370  6。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。一般に細胞培養培地は、AtlasおよびParks（編）、The  Handbook  of  Microbiological  Media（１９９３年）、CRC  Press、Boca  Raton、Fla.に示されており、これは、参照により本明細書に組み込まれている。細胞培養の追加の情報は、Sigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのLife  Science  Research  Cell  Culture  Catalogue（「Sigma-LSRCCC」）、および例えば、やはりSigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのThe  Plant  Culture  Catalogue  and  supplement（「Sigma-PCCS」）などの入手可能な商業的文献に見出され、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１４８】
使用される培養培地または発酵培地は、適当な様式で、それぞれの株の要求を満たさなければならない。様々な微生物の培養培地の記載は、American  Society  for  Bacteriology（Washington  D.C.、USA、１９８１年）の「Manual  of  Methods  for  General  Bacteriology」に存在する。用語、培養培地および発酵培地は、互換的である。
【０１４９】
一部の実施形態では、本開示は、生成される微生物を、所望の有機化学化合物を産生させる目的で、例えば、ＷＯ０５／０２１７７２に記載されているように連続的に、あるいはバッチプロセス（バッチ培養）またはフェドバッチもしくは繰り返しフェドバッチプロセスで不連続に培養することができることを教示する。公知の培養方法についての全般的な特質の概要は、Chmiel（Bioprozesstechnik.  1:  Einfuehrung  in  die  Bioverfahrenstechnik（Gustav  Fischer  Verlag、Stuttgart、１９９１年））による教科書、またはStorhas（Bioreaktoren  and  periphere  Einrichtungen（Vieweg  Verlag、Braunschweig/Wiesbaden、１９９４年））による教科書において入手可能である。
【０１５０】
一部の実施形態では、本開示の細胞を、バッチまたは連続発酵条件下で増殖させる。古典的なバッチ発酵は、クローズドシステムであり、培地の組成は、発酵の開始時に設定され、発酵中に人為的な交代に供されない。バッチシステムの変形は、フェドバッチ発酵であり、これは、本開示においても使用を見出す。この変形では、基質は、発酵が進行するにつれて徐々に添加される。フェドバッチシステムは、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害しそうなとき、および培地中の基質の量が制限されていることが望ましい場合、有用である。バッチ発酵およびフェドバッチ発酵は、一般的であり、当技術分野で周知である。連続発酵は、所望のタンパク質を処理および回収するために、規定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、等量の馴化培地が同時に除去されるシステムである。一部の実施形態では、連続発酵は一般に、一定の高密度で培養物を維持し、この場合、細胞は、主に、対数期成長にある。一部の実施形態では、連続発酵は一般に、静止または後期対数／静止期成長で培養物を維持する。連続発酵システムは、定常状態成長条件を維持しようと努める。
【０１５１】
連続発酵プロセスのための栄養分および成長因子をモジュレートするための方法、ならびに産物形成の速度を最大化するための技法は、工業微生物学の技術分野で周知である。
【０１５２】
例えば、本開示の培養のための炭素源の限定されないリストとしては、糖および炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、サトウダイコンまたはサトウキビ加工からのスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物、およびセルロースなど；油および脂肪、例えば、ダイズ油、ヒマワリ油、落花生油、およびココナツ脂肪など；脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸など；アルコール、例えば、グリセロール、メタノール、およびエタノールなど；ならびに有機酸、例えば、酢酸または乳酸などが挙げられる。
【０１５３】
本開示の培養物のための窒素源の限定されないリストとしては、有機窒素含有化合物、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、ダイズ粉、および尿素など；または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、アンモニウムクロリド、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムなどが挙げられる。窒素源は、個々に、または混合物として使用され得る。
【０１５４】
本開示の培養のための可能なリン源の制限されないリストとしては、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩が挙げられる。培養培地は、例えば、金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、および鉄などの塩化物または硫酸塩、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの形態で塩をさらに含み得、これらは、成長に必要である。最後に、アミノ酸などの必須の成長因子、例えば、ホモセリンおよびビタミン、例えば、チアミン、ビオチン、またはパントテン酸を、上記した物質に加えて使用することができる。
【０１５５】
一部の実施形態では、培養物のｐＨは、これらに限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水あるいは適当な様式でのリン酸または硫酸などの酸性化合物を含めた任意の酸もしくは塩基または緩衝塩によって制御することができる。一部の実施形態では、ｐＨは一般に、６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８の値に調整される。
【０１５６】
一部の実施形態では、本開示の培養物は、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を含み得る。一部の実施形態では、本開示の培養物は、例えば、抗生物質などの適当な選択物質を添加することによって、培養物のプラスミドを安定化するように改変される。
【０１５７】
一部の実施形態では、培養は、好気性条件下で実行される。これらの条件を維持するために、酸素または酸素含有気体混合物、例えば、空気などが、培養物に導入される。過酸化水素で富化した液体を使用することが同様に可能である。発酵は、適切な場合、高圧で、例えば、０．０３〜０．２ＭＰａの高圧で実行される。培養の温度は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、特に好ましくは３０℃〜３７℃である。バッチプロセスまたはフェドバッチプロセスでは、培養は、好ましくは、回収されるのに十分な所望の有機−化学化合物の量が形成されるまで継続される。一部の実施形態では、培養は、嫌気性条件下で実行される。
産物回収および定量
【０１５８】
目的の産物の産生についてスクリーニングするための方法は、当業者に公知であり、本明細書全体にわたって論じられている。このような方法は、本開示の株をスクリーニングするとき使用することができる。本明細書に提供される方法によって生じる目的の生体分子または産物は、グルコースから産生されたあらゆる商業的産物であり得る。一部の場合では、目的の生体分子または産物は、アミノ酸、有機酸またはアルコールである。アミノ酸は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンであり得る。有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートであり得る。アルコールは、エタノールまたはイソブタノールであり得る。
【０１５９】
一部の実施形態では、本開示は、非分泌型細胞内産物を産生するように設計された株を改善する方法を教示する。例えば、本開示は、細胞内酵素、油、医薬、または他の貴重な低分子もしくはペプチドを産生する細胞培養物のロバスト性、収率、効率、または全体的な望ましさを改善する方法を教示する。非分泌型細胞内産物の回収または単離は、本明細書に記載のものを含めて当技術分野で周知である溶解および回収技法によって実現することができる。
【０１６０】
例えば、一部の実施形態では、本開示の細胞は、遠心分離、濾過、沈殿、または他の方法によって回収することができる。次いで回収された細胞は、当業者に周知である凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または他の方法を含めた任意の好都合な方法によって破壊される。
【０１６１】
結果として生じる目的の産物、例えば、ポリペプチドは、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって回収／単離および必要に応じて精製することができる。例えば、産物ポリペプチドは、これらに限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、または沈降を含めた慣例的な手順によって栄養培地から単離することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製ステップで使用することができる。（例えば、ともに参照により本明細書に組み込まれている、Parryら、２００１年、Biochem.  J.、３５３巻：１１７頁およびHongら、２００７年、Appl.  Microbiol.  Biotechnol．、７３巻：１３３１頁に記載の細胞内タンパク質の精製を参照）。
【０１６２】
上記した参考文献に加えて、様々な精製方法は、例えば、Sandana（１９９７年）、Bioseparation  of  Proteins、Academic  Press,  Inc.；Bollagら（１９９６年）、Protein  Methods、２版、Wiley-Liss、NY；Walker（１９９６年）、The  Protein  Protocols  Handbook、Humana  Press、NJ；HarrisおよびAngal（１９９０年）、Protein  Purification  Applications:  A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；HarrisおよびAngal  Protein  Purification  Methods:A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；Scopes（１９９３年）、Protein  Purification:  Principles  and  Practice、３版、Springer  Verlag、NY；JansonおよびRyden（１９９８年）、Protein  Purification:  Principles,  High  Resolution  Methods  and  Applications、２版、Wiley-VCH、NY；ならびにWalker（１９９８年）、Protein  Protocols  on  CD-ROM、Humana  Press、NJに示されたものを含めて、当技術分野で周知である。これらの文献のすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１６３】
一部の実施形態では、本開示は、分泌産物を産生させるように設計された株を改善する方法を教示する。例えば、本開示は、貴重な低分子またはペプチドを産生する細胞培養物のロバスト性、収率、効率、または全体的な望ましさを改善する方法を教示する。
【０１６４】
一部の実施形態では、免疫学的方法は、本開示の細胞によって産生される分泌型または非分泌型産物を検出および／または精製するのに使用することができる。一例示的手法では、従来の方法を使用して産物分子に対して（例えば、インスリンポリペプチドまたはその免疫原性断片に対して）産生される抗体は、ビーズ上に固定化され、エンドグルカナーゼが結合する条件下で細胞培養培地と混合され、沈降される。一部の実施形態では、本開示は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の使用を教示する。
【０１６５】
他の関連した実施形態では、米国特許第５，５９１，６４５号、米国特許第４，８５５，２４０号、米国特許第４，４３５，５０４号、米国特許第４，９８０，２９８号、およびSe-Hwan  Paekら、「Development  of  rapid  One-Step  Immunochromatographic  assay,  Methods」、２２巻、５３〜６０頁、２０００年に開示された免疫クロマトグラフィーが使用される。これらの文献のそれぞれは、本明細書に参照により組み込まれている。一般的な免疫クロマトグラフィーは、２つの抗体を使用することによって検体を検出する。第１の抗体は、試験溶液中に、または試験溶液が滴下される、多孔質膜から作製されたおよそ矩形状をした試験片の末端の部分に存在する。この抗体は、ラテックス粒子または金コロイド粒子で標識される（この抗体は、本明細書の以下で標識抗体と呼ばれる）。滴下された試験溶液が検出されるべき検体を含むとき、標識抗体は、検体を認識して検体と結合する。検体と標識抗体との複合体は、吸収体に向けて毛管現象によって流れ、この吸収体は、濾紙から作製され、標識抗体を含んだ末端と反対の末端に付着している。流れている間に、検体と標識抗体との複合体は、多孔質膜の中間に存在している第２の抗体（これは、本明細書の以下でタッピング抗体（tapping  antibody）と呼ばれる）によって認識および捕捉され、この結果として、複合体は、可視シグナルとして多孔質膜上の検出部分に現れ、検出される。
【０１６６】
一部の実施形態では、本開示のスクリーニング方法は、測光検出技法（吸収、蛍光）に基づく。例えば、一部の実施形態では、検出は、抗体に結合したＧＦＰなどのフルオロフォア検出剤の存在に基づき得る。他の実施形態では、測光検出は、細胞培養物からの所望の産物の蓄積に基づき得る。一部の実施形態では、産物は、培養物または前記培養物からの抽出物のＵＶを介して検出可能であり得る。
【０１６７】
一部の実施形態では、産物回収方法は、各候補グルコース透過酵素遺伝子および／またはグルコキナーゼ遺伝子の性能に対する効果の定量的決定を可能にする。一部の実施形態では、産物回収方法は、各候補グルコース透過酵素遺伝子／グルコキナーゼ遺伝子組合せの性能に対する効果の定量的決定を可能にし、それぞれの比較および最適な組合せの選択を可能にする。
選択判定基準および目標
【０１６８】
異種グルコース透過酵素またはグルコース透過酵素およびグルコキナーゼを発現する宿主細胞の特定の株の選択は、具体的な目標に基づき得る。例えば、一部の実施形態では、プログラム目標は、差し迫った期限なしで反応物の単一バッチ収量を最大化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、生合成収量をリバランスして、特異的な産物を産生させ、または特定の比の産物を産生させることであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、性能特性、例えば、収率、力価、生産性、副生成物排除、プロセスエクスカーションに対する寛容性、最適な成長温度、および成長速度を改善することであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、微生物によって産生される目的の産物の体積生産性、比生産性、収率、または力価によって測定した宿主性能の改善である。
【０１６９】
他の実施形態では、プログラム目標は、投入量当たりの最終産物収率（例えば、スクロース１ポンド当たりに産生されるエタノールの合計量）の観点から市販の株の合成効率を最適化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、例えば、バッチ完了率、または連続培養システムにおける歩留まり率の観点から測定した、合成速度を最適化することであり得る。一実施形態では、プログラム目標は、目的の生体分子または産物の最終産物収率および／または産生速度を最適化することである。本明細書に提供される方法によって生じる目的の生体分子または産物は、グルコースから産生されたあらゆる商業的産物であり得る。一部の場合では、目的の生体分子または産物は、低分子、アミノ酸、有機酸またはアルコールである。アミノ酸は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニンまたはリシンであり得る。有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートであり得る。アルコールは、エタノールまたはイソブタノールであり得る。
【０１７０】
当業者は、特定のプロジェクト目標を満たすように株選択判定基準をどのように適合させる（tailor）かを認識する。例えば、反応が飽和しているときの株の単一バッチ最大収量の選択は、単一バッチ収量が高い株を同定するのに適切であり得る。一連の温度および条件にわたる収率の一貫性に基づく選択は、ロバスト性および信頼性が増大した株を同定するのに適切であり得る。
【０１７１】
一部の実施形態では、初期相およびタンクベースの検証の選択判定基準は、同一である。他の実施形態では、タンクベースの選択は、追加のおよび／または異なる選択判定基準下で動作し得る。
【実施例】
【０１７２】
本発明を以下の実施例を参照することによってさらに例示する。しかし、これらの実施例は、上記の実施形態と同じように、例示的なものであり、いかなる形でも本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきでないことに留意するべきである。
（実施例１）
グルコース透過酵素およびグルコキナーゼライブラリーを用いるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換
グルコース透過酵素ライブラリーの生成
【０１７３】
様々な細菌由来のいくつかのグルコース透過酵素を、文献に報告された通り、グルコースに対するそれらの親和性および輸送速度に基づいてグルコース透過酵素ライブラリーの生成のために選択した。ライブラリーに含めるために選択したグルコース透過酵素は、配列番号９をコードするＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ由来；配列番号１１をコードするＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ由来（図１中のＢＬ＿１６３１）；配列番号１３をコードするＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ由来（図１中のｇｌｆ）；配列番号１２をコードするＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３由来（図１中のｇｌｃＰ）；配列番号１０をコードするＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来（図１中のＳＣ０５５７８）のグルコース透過酵素遺伝子；および配列番号１４をコードするＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のｍｙｏ−イノシトールトランスポーター遺伝子であった。加えて、２種のグルコキナーゼを宿主細胞とのそれらの適合性に基づいてグルコース透過酵素ライブラリーの生成における使用のために選択した。選択したグルコキナーゼは、配列番号１６をコードするＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のｐｐｇＫグルコキナーゼ遺伝子、および配列番号１５をコードするＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ由来のｇｌｋキナーゼ遺伝子であった。
【０１７４】
グルコース透過酵素ライブラリーの生成のために、上に記載の各グルコース透過酵素を上に記載のグルコキナーゼと対を形成させ、各遺伝子を、ＩＩ型制限およびライゲーションクローニング技法を使用して単一のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ／Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ適合性発現ベクターにクローニングした。さらに詳細には、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓグルコース透過酵素（配列番号９）、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍグルコース透過酵素（ＢＬ＿１６３１；配列番号１１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３グルコース透過酵素（ｇｌｃＰ；配列番号１２）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｍｙｏ−イノシトールトランスポーター（ｉｏｌＴ１；配列番号１４）およびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒグルコース透過酵素（ＳＣＯ５５７８；配列番号１０）をコードする遺伝子を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｐｇＫグルコキナーゼ（配列番号１６）をコードする遺伝子とすべて個々に対を形成させ、一方Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓグルコース透過酵素（ｇｌｆ；配列番号１０）をコードする遺伝子はＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ  ｇｌｋキナーゼ（配列番号１５）をコードする遺伝子と対を形成させ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｐｇＫグルコキナーゼ（配列番号１６）をコードする遺伝子と別に対を形成させた。さらに、各グルコース透過酵素−グルコキナーゼ構築物内において、各それぞれの透過酵素またはグルコキナーゼ遺伝子が先行するまたは上流のプロモーターに機能的に連結するように、Ｐ１プロモーター（配列番号１）をそれぞれのグルコース透過酵素遺伝子の前にクローニングし、一方Ｐ２プロモーター（配列番号２）をそれぞれのグルコキナーゼ遺伝子の前にクローニングした。最後に構築物中の各透過酵素遺伝子をＴ１終結配列（配列番号１７）で終わらせ、一方構築物中の各グルコキナーゼ遺伝子をＴ２終結配列（配列番号１８）で終わらせた。
Ｅ．ｃｏｌｉ中へのアセンブルされたクローンの形質転換
【０１７５】
正確にアセンブルされたクローンを同定し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換のためのベクターＤＮＡを増幅するために、グルコース透過酵素−グルコキナーゼ遺伝子を含有するベクターをそれぞれ個々に、Ｅ．ｃｏｌｉ中へ形質転換した。増幅されたＤＮＡをＰＣＲにより検証した。陽性クローンを、後に使用するために−２０℃の冷蔵庫で保存した。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中へのアセンブルされたクローンの形質転換
【０１７６】
次いで、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞中へ、検証したクローンを個々に、電気穿孔により形質転換した。構築物の性能に対する株バックグラウンドの影響を試験するために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの２つの異なる株バックグラウンド（すなわち、図１および２中の親１／バックグラウンド２および親２／バックグラウンド１）を、各バックグラウンドに形質転換される各構築物と共に使用した。各ベクターを、異種グルコース透過酵素遺伝子およびグルコキナーゼ遺伝子の発現を可能にするが、宿主細胞にとって有害にならないと経験的に決定されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノム内の中立の組込み部位に組み込まれるように設計した。組込みを容易にするために、発現ベクターは、所望の組込み部位に相同な約２ｋｂの配列（すなわち、ホモロジーアーム）をさらに含み、それによって、上に記載した各グルコース透過酵素−グルコキナーゼ遺伝子カセットを、その間に挿入した。ゲノム中への組込みは、シングルクロスオーバーによる組込み、次いで、プラスミド骨格中に含まれる第２のマーカーに対する対抗選択によって促進されるプラスミド骨格のループアウトによって行った。
【０１７７】
次いで、形質転換した細菌を、アセンブリーの成功（ゲノムへの正確な組込み）について試験した。各Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換プレート由来のコロニーを培養し、正確な組込みについてＰＣＲにより試験した。このプロセスを、各グルコース透過酵素−グルコキナーゼ構築物について実施された形質転換のそれぞれについて繰り返した。各形質転換のゲノムの組込みを、各プラスミドについて標的化されたゲノム場所に関しても分析した。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中の個々のグルコース透過酵素−グルコキナーゼ（Glukokinase）構築物の評価
【０１７８】
次いで、各形質転換体の表現型を、各宿主細胞バックグラウンドにおける各構築物の発現が所望の表現型（すなわち、所望の発酵最終産物を産生する能力の改善）に対して有する効果を決定するために、所望の発酵最終産物を産生するための具体的な発酵プロセスを模倣またはシミュレートするように設計された評価方法で試験した。簡単に言えば、評価方法は、形質転換体を、９６ウェルプレート形式で、発酵条件を模倣することが意図された条件下で培養する実験であった。様々な時点で形成される産物およびバイオマスの量を測定し、それを使用して、発酵条件下で各株がどのように働くかを予測した。この予測は、評価方法において種々の発酵性能を有する株を試験し、測定値と性能の相関を決定することにより生成した線形回帰であった。
【０１７９】
所望の発酵最終産物の産生速度および収率を各透過酵素−グルコキナーゼ形質転換体について決定し、一部の例を図１に示す。図１に示されている通り、示されている具体的な透過酵素−グルコキナーゼ挿入体について、発酵プロセスにおける生産性（上）は、それぞれの対照宿主細胞に対して、示されている各透過酵素−グルコキナーゼ挿入体について各宿主バックグラウンドにおいて増加すると予測され、一方収率（下）は、それぞれの対照宿主細胞に対して、同様（ｇｌｃＰ；ＢＬ１６３１）、増加（ＳＣＯ５５７８）または減少（ｇｌｆ）すると予測された。図１中のＡＵ単位は、小規模での培養で得られた様々な測定値を入力として取り込み、発酵条件下での株の性能を予測する線形回帰の出力値であることに注目されたい。
発酵条件下での個々のグルコース−透過酵素−グルコキナーゼ構築物の評定
【０１８０】
上に記載した評価の後、性能の増大（すなわち、予測生産性および／または予測収率の上昇）が予測される異種グルコース透過酵素−グルコキナーゼ遺伝子を有する形質転換体を選択し、続いて、グルコースを含有する培地中で、発酵および所望の発酵最終産物の産生を促進するように設計した条件下で成長させた。各形質転換体を、所望の最終産物がもたらされるように設計した発酵条件下で所定の時間の長さにわたって成長させた後、次いで、各形質転換体について、最終産物の収率および体積生産性を決定した。簡単に言えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、供給されたある特定の量の基質に対して産生された産物の量（すなわち、平均収率）を決定した。時間および体積データを追加して生産性（すなわち、平均生産性）を同様に決定した。
【０１８１】
図２に示されている通り、ＢＬ＿１６３１グルコース透過酵素−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｐｇＫキナーゼ構築物は、バックグラウンド１を有する宿主細胞の生産性を１５％増加させ、収率を約１％増加させた。さらに、バックグラウンド２を有する宿主細胞では、ｇｌｋ透過酵素−ｇｌｋキナーゼ構築物およびｇｌｃＰ透過酵素−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｐｇＫキナーゼ構築物の両方は、３０％を超えて生産性を増加させたが、収率には影響を与えなかった。したがって、この実施例は、本明細書に提供される方法を使用して、発酵最終産物の産生に関して微生物株の性能を増大させることができることを示す。
参照による組込み
【０１８２】
以下の出願は、すべての説明、参考文献、図面、および請求項を含めたその全体が、すべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれている：２０１６年１２月３０日に出願された米国特許出願第１５／３９６，２３０号；２０１６年１２月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５４６５号；２０１６年４月２７日に出願された米国特許出願第１５／１４０，２９６号；２０１６年７月２９日に出願された米国仮出願第６２／３６８，７８６号；および２０１５年１２月７日に出願された米国仮出願第６２／２６４，２３２号。
【０１８３】
本明細書に引用したすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれる。
【０１８４】
しかし、本明細書に引用した任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、これらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれかの国における共通の一般的知識の一部を形成するという承認または何らかの形式の示唆として解釈されず、かつそのように解釈されるべきでない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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