(57)【要約】  本発明は、（ｉ）１つ以上のポリマーナノファイバーから作られた基体を提供すること、（ｉｉ）前記基体から１つ以上の中性ポリマー鎖をグラフト化すること、及び（ｉｉｉ）前記グラフト化された生成物を、クロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させることを含み、ここで、工程（ｉｉ）が、複数の式の化合物、及び／又はそのエナンチオマー、及び／又は式（Ｉ）のその誘導体、及び／又はそのエナンチオマー及び／又はジアステレオマーを：前記ナノファイバー上に存在する１つ以上の官能基と接触させることを含み、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択され、但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５の少なくとも１つが水素ではない、方法によって作製される、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を提供する。【選択図】なし
2019527617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法であって、
（ｉ）１以上のポリマーナノファイバーから形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）基体から１以上の中性のポリマー鎖をグラフト化すること、及び
（ｉｉｉ）前記グラフト化生成物と、クロマトグラフィー媒体として前記工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬とを接触させることを含み、
ここで、工程（ｉｉ）は、式
【化１】
2019527617.tif 000089
の化合物の複数、及び／又はそのエナンチオマー、及び／又は式（Ｉ）のその誘導体及び／又はそのエナンチオマー及び／又はジアステレオマーと：
【化２】
2019527617.tif 000090
前記ナノファイバー基体上に存在する１以上の官能基と反応させることを含み、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択され、但しＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５の少なくとも１つは水素ではなく、
任意に、前記工程（ｉｉ）が、式
【化３】
2019527617.tif 000091
の化合物、及び／又はそのエナンチオマーの複数を、前記ナノファイバー基体上に存在する１つ以上の官能基と反応させることを含む、
官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって：
ａ）前記ポリマーナノファイバーが、セルロース、酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリエチレンオキシド及びその混合物からなる群から選択されるポリマーを含み、好ましくは前記ポリマーが、セルロース、酢酸セルロース及びその混合物からなる群から選択され；
ｂ）前記ナノファイバー基体上に存在する１つ以上の官能基がヒドロキシル基を含み；
ｃ）前記ポリマー鎖の１つ以上が分岐鎖であり；
ｄ）前記基体がメンブレンの形態であり；及び／又は
ｅ）前記ナノファイバーが１０ｎｍ〜１０００ｎｍの平均径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グラフト化生成物を試薬と接触させる工程が、グラフト化生成物への１つ以上のリガンド基を導入し、それがクロマトグラフィー媒体としての使用に適した１つ以上のリガンド基を含む前記官能化生成物を与え、任意に、前記工程（ｉｉｉ）の生成物における前記リガンド基の密度が、クロマトグラフィー媒体の１００μｍｏｌ／ｇ〜２，５００μｍｏｌ／ｇである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ａ）液相を毎分１メンブレン体積〜６４０メンブレン体積の流量で０．０５ｍｍ〜１０ｍｍの厚さの媒体の通過させる場合、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体に対する圧力低下が２ＭＰａ未満であり；
ｂ）前記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の生産性が５０ｍｇ／ｍＬ／分〜７５，０００ｍｇ／ｍＬ／分であり；
ｃ）前記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の生産性が２００ｍｇ／ｍＬ／分超であり；
ｄ）前記グラフト化工程（ｉｉ）が、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の動的結合容量（ＤＢＣ）を増加させる効果を有し；及び／又は
ｅ）工程（ｉｉ）で導入された前記ポリマーの量が、グラフト化生成物の５００μｍｏｌ／ｇ〜６０，０００μｍｏｌ／ｇである、
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記基体が、工程（ｉ）〜工程（ｉｉ）の間に処理されて１つ以上の官能基が導入される、又は前記基体が工程（ｉ）〜工程（ｉｉ）の間に処理されて前記基体上任意の官能基が脱保護若しくは活性化される、又は前記基体が工程（ｉ）〜（ｉｉ）の間に処理されて、前記基体上の前記官能基の数／密度が増加される、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記グラフト化工程（ｉｉ）が、更に同じ工程において、１つ以上の官能基を導入する、又は前記基体上の任意の官能基を脱保護若しくは活性化する、又は前記基体上の官能基の数／密度を増加させる条件下で実行され、任意に、前記グラフト化工程（ｉｉ）が、水又は水：エタノール中、好ましくは水中で、水性アルカリ、好ましくはＮａＯＨ又はＫＯＨの存在下で達成される、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
官能化工程（ｉｉｉ）において、官能化試薬が、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＭＡＣ）、１，４−ブタンスルホン、クロロ酢酸ナトリウム、ＮａＩＯ４に続いてプロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にハロヒドリン形成試薬、好ましくはＮ−ブロモスクシンアミド、その後プロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にエポキシド形成試薬、その後プロテインＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉｉ）において、前記試薬が、結果として生じる官能化されたクロマトグラフィー媒体が、イオン交換、親和性捕捉、疎水的相互作用及びミックスモード法からなる群から選択されるクロマトグラフィー法における使用に適したものとなるように、前記グラフト化生成物を官能化する、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｉｉ）において、前記試薬が、１つ以上のプロテインＡ分子によって前記グラフト化生成物を官能化する、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉｉｉ）が、クロマトグラフィー媒体として、工程（ｉｉ）の生成物を共に官能化する複数の工程を含み、任意に、工程（ｉｉｉ）において：
（ａ）前記グラフト化生成物を、ジビニルスルホン、アリルグリシジルエーテル及びそれらの組み合わせから選択される群から選択される試薬と接触させ；
（ｂ）前記工程（ａ）の生成物を、ハロヒドリン形成試薬によって任意に処理し；及び
（ｃ）前記工程（ｂ）の生成物をプロテインＡと接触させる、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法によって入手可能な、官能化されたクロマトグラフィー媒体。
【請求項１２】
移動相から１つ以上の生体分子を単離する方法であって、移動相中の１つ以上の生体分子と、請求項１１に記載の官能化されたクロマトグラフィー媒体とを接触させることを含み、任意に、移動相中の１つ以上の前記生体分子が、１分以下の期間に亘って、前記官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触される、移動相から１つ以上の生体分子を単離する方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の生体分子が、１つ以上のモノクローナル抗体、又はプロテインＡ結合に対する親和性を有する部位を示すように操作されたタンパク質であり、前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が少なくとも１つのプロテインＡリガンド基を持つ、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移動相から生体分子を単離するのに適した、官能化されたクロマトグラフィー媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー市場は、２０１２年に全ての市場販売の２０％（１５３０億ドル）を占める世界製薬市場内のうち最も急成長している分野である。２００２年のマーケットシェアの１０％からのこの成長は、２０１２年〜２０１８年の間に１５３０億ドルから２１５０億ドルと４１％の上昇を示す。現在、市場には約２００のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）製品が存在し、１０００を超える製品が臨床試験中であり、この領域の技術的な進歩のニーズは明らかである。最近の数十年間以上に亘って、工業環境における生体分子の典型的な発酵力価は０．５ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌから成長し、分子生物学の活発化された進歩に基づいて、近い将来、１０ｇ／Ｌ以内のレベルで達成可能であると考えられる。さらに、下流の精製工程もまた、幾つかの研究開発を受けているが、この領域における改善は上流のものと一致していない。
【０００３】
治療用タンパク質の製造は、投与されるタンパク質に有害汚染物質が実質的に存在しないように、高い純度が処理の間に達成されることを必要とする。現在、工業規模では、クロマトグラフィーは高純度タンパク質を達成するために用いられる主要な方法論である。極度にクロマトグラフィーのユニット依存する操作は、経済的な観点から、ＭＡｂ等の生体分子の下流の処理における発達の手掛かりである。クロマトグラフィーは、生物学的製剤の処理のうち最大６０％を占める（Ｒｅ−ｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｒｅｓｉｎ：Ｆｏｕｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍａｒ  ０１，２０１５  ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２８，Ｉｓｓｕｅ  ３，Ａｎｕｒａｇ  Ｓ．Ｒａｔｈｏｒｅ，Ｍｉｌｉ  Ｐａｔｈａｋ，Ｇｕｉｊｕｎ  Ｍａ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｇ．Ｂｒａｃｅｗｅｌｌ）。
【０００４】
かかるクロマトグラフィーの分離は、標的分子及び不純物を含む液相を固相と接触させる際のｉ）標的分子、及び／又は、ｉｉ）１つ以上の不純物の固相への結合を含む。標的分子／不純物と固相の間の相互作用は、電荷、疎水性、親和性又はそれらの組み合わせに基づく場合がある。
【０００５】
歴史的に、多孔質ビーズを使用する従来の充填層クロマトグラフィーは非常に強力な分離手段であった。これらのビーズの多孔性は、標的又は不純物のいずれかを結合するため高い表面積をもたらす。これは、容量の高い材料をもたらし、少量の吸着材料が使用され得ることを意味する。また、高い容量は、充填される懸濁液の相対濃度と比較して、より多くの標的が吸着剤１単位体積当たりに結合され得ることから、分離の間に達成される濃縮効果を増加する。これらの態様は、液体体積が最大２００００Ｌに達し得る１つのバッチ当たり数キログラムの材料を精製する必要がある、工業規模の処理に重要である。多孔質ビーズに対する典型的な結合容量は、固相の官能価又は結合した種に応じて３５ｍｇ／ｍＬ〜１２０ｍｇ／ｍＬの領域にある。
【０００６】
多孔質ビーズ系システムでは、標的分子／不純物と固相との間の結合事象は、多孔質ビーズ中への拡散に依存する。したがって、多孔質ビーズ系システムにおける滞留時間と流量の間に強い相関がある。したがって、結合容量は滞留時間の減少と共に減少する。これは、２分未満の時間が多孔性ビーズ系システムで使用される場合、次いで容量の急速な減少が付随する。また、多リットルのビーズ懸濁液をカラムに詰める場合、短い滞留時間に必要とされる高い流量は、特に製造規模で、多孔質ビーズと適合性ではない可能性がある。ここで、多孔質ビーズの機械的不安定は、圧縮又は崩壊の事象に結びつく場合があり、ひいては不均質なカラム床を生じる。
【０００７】
滞留時間に影響を与える流量により、単位時間当たりの固相に結合され得る標的の量を最大限にすることは極めて重要である。また、これは、より少量の吸着剤を使用すること及び／又はより短時間で分離が行われることのいずれかを可能とする。この測定基準は、単位体積当たり、単位時間当たりの結合されるグラム（ｍｇ／ｍＬ／分）として定義され得る。上で検討される多孔質ビーズに対する典型的な結合容量及び滞留時間は、およそ１０ｍｇ／ｍＬ／分〜１２０ｍｇ／ｍＬ／分の単一カラムの多孔質ビーズシステムに対する全体的な生産性をもたらす。
【０００８】
多孔質ビーズ系システムの代わりに、モノリス又はメンブレンを使用してもよい。かかる材料によるフローは拡散ではなく滞留性であり、したがってそれらの結合容量は多孔質ビーズ系システムよりもフローに対してはるかに感受性が低い。典型的な滞留時間が約０．２分〜０．５分である場合、これらの材料は多孔質ビーズ系材料よりはるかに高い流量で実行され得る。
【０００９】
しかしながら、動的フロー下のモノリス（１０ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ）及びメンブレン（７．５ｍｇ／ｍＬ〜２９ｍｇ／ｍＬ）に対する標的の１０％ブレイクスルーにおける典型的な結合容量は、多孔質ビーズより低い（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｕ．（２００８）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，２４（３），４９６−５０３．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｐ０７０４５２ｇ）。モノリス及びメンブレンの材料の（多孔質ビーズ系材料と比較して）劣った結合容量は、より高い流量を利用することによりある程度まで相殺することができる。
【００１０】
上で検討されたモノリス及びメンブレンに対する典型的な結合容量及び滞留時間は、およそ１０ｍｇ／ｍＬ／分〜１４５ｍｇ／ｍＬ／分のモノリス及びメンブレンシステムに対する結合事象の全体的な生産性をもたらす。
【００１１】
モノリス／メンブレン材料で達成可能な、多孔質ビーズ系材料及びより高い流量と関連する高い結合容量を共有する、クロマトグラフィー材料に対するニーズが存在する。最大の生産性（ｍｇ／ｍＬ／分）を達成するため、かかる材料は高い流量において高い容量を提供し得る。
【００１２】
本発明者らは、驚いたことに、官能化工程がグラフト化工程と無関係に行われる２段階の方法によってもたらされたナノファイバー材料がかかる有利な特性を示すことを見出した。この方法によって製造された材料は、グラフト化されていない材料と比較して、著しく増加した結合容量を有する。本発明の生成物によって示される容量は、多孔質ビーズのみを使用して通常達成可能なものに匹敵する又はそれを超え、現在市販されているメンブレン及びモノリスの技術で達成可能なものより数倍高い。さらに、これらの容量は、１秒未満の滞留時間で達成され得、従来の商業的に入手可能な材料よりも１０〜１００倍、更には１０００倍大きい生産性の値をもたらす。
【００１３】
本発明に従って製造される材料は、多くの驚くべき技術革新に依拠する。はじめに、リガンド基、すなわち、選択的に標的生体分子に結合するクロマトグラフィー媒体に結合した基の設定された密度に対して、グラフト化の量の増加は、クロマトグラフィー材料の結合容量を増加し得ることが本発明者らによって見出された。帯電した基で官能化されたクロマトグラフィー媒体に関して、以前は、それらの帯電した基の量の増加が、材料の電荷密度及び材料の結合容量を増加させると理解されていた。したがって、材料の結合容量を最大にすることに対する先のアプローチは、電荷密度を最大にすることに注目した。しかしながら、本発明者は、グラフト化を増加させることによって、結合容量が材料の電荷密度と無関係に増加され得ることを初めて示した。
【００１４】
他の場合では、官能化工程の変更が電荷密度に影響をほとんど及ぼすことができないが、グラフト化工程と組み合わせた場合、結合容量の著しい増加が、同じ程度の官能化について達成され得ることがわかった。
【００１５】
したがって、クロマトグラフィー材料の電荷密度及び結合容量は、高度に最適化された材料を与えるため、官能化の程度とグラフト率の両方を変化させることによって制御され得ることがわかった。グラフト化工程と後の官能化工程のこの関係は、高い流量で非常に高い結合容量を有する材料を製造するため、本発明者らによって研究され開発された。電荷密度と動的結合容量の関係は、以前に評価されたよりもはるかに微妙とわかった。したがって、同じ電荷密度を有する材料については、グラフト率の制御によって動的結合容量を変えることができるかもしれないことがわかった。これは予期されていない、非常に有利な結果であった。
【００１６】
クロマトグラフィーの材料の容量を増加させる先の試みが、もっぱら材料上のリガンド基の密度を増加させることに注目していたため、これは非常に意義深い。したがって、上記先の試みは、分離された工程としてグラフト化及び官能化の条件を独立して変えることにより、どのように材料の容量を制御し増加することができるかに対処することができない。多くの既知の修飾処理において、クロマトグラフィー材料が帯電したポリマーで改変された、すなわちグラフト化及び官能化の工程は同時に行われたことから、この制御の程度は単純には可能でなかった。
【００１７】
重要なことには、材料の結合容量を増加させることと並んで、グラフト化及び官能化もまた材料の流れ抵抗を調節する効果があり、クロマトグラフィー材料の生産性に不利益な影響を及ぼす。これは、Ｍｅｎｋｈａｕｓら（Ｍｅｎｋｈａｕｓ，Ｔ．Ｊ．，Ｖａｒａｄａｒａｊｕ，Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｍａｎ，Ｓ．，Ｂｊｕｓｔｒｏｍ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，＆Ｆｏｎｇ，Ｈ．（２０１０）．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４６（２１），３７２０−３７２２．ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ００１８０２Ｃ）において検討され、グラフト化を増加することは、伝達性の媒体における流れ抵抗及び物質移動の拡散面の増加と関連し得ることを報告する。これは、クロマトグラフィー材料を修飾する既知の方法が、典型的には、材料の表面から帯電したポリマー鎖をグラフトするためかもしれない。したがって、グラフト率を増加させることもまた、材料の結合容量及び流れ特性を最適化するために、これらを独立して制御する方法のない材料の電荷密度を増加させる。
【００１８】
これらの欠点は、材料を官能化する工程からグラフト化工程を分離することにより、本発明において克服された。グラフト率を増加させることは、それ自体では、材料を通る流れ抵抗を増加させないこともわかった。流れ抵抗が影響を受けるのは、グラフト化された材料が官能化された時だけである。
【００１９】
さらに、本発明者らは、グリシドール及びその誘導体がグラフト化工程で使用するのに特に好ましいモノマー単位であることを発見した。驚いたことに、グラフト化工程がグリシドール重合を使用する場合、結果として生じたクロマトグラフィー媒体は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）等の他のグラフト化法によって製造されたクロマトグラフィー媒体よりも改善された特性（例えば、それらはより高い容量及びより高い生産性から利益を得る）を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１２０３８７号
【発明の概要】
【００２１】
したがって、本発明は、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供する。上記の方法は：
（ｉ）１つ以上のポリマーナノファイバーから作製された基体を提供すること、
（ｉｉ）前記基体から１つ以上の中性ポリマー鎖をグラフト化すること、及び
（ｉｉｉ）前記グラフト化生成物を、クロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させることを含み、
ここで、工程（ｉｉ）が、複数の式
【００２２】
【化１】
2019527617.tif 000003
の化合物、及び／又はそのエナンチオマー、及び／又は式（Ｉ）のその誘導体及び／又はエナンチオマー及び／又はジアステレオマーを：
【００２３】
【化２】
2019527617.tif 000004
ナノファイバー基体上に存在する１つ以上の官能基と反応させることを含み、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択され、但しＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５の少なくとも１つは水素ではない。
【００２４】
また、本発明は以下を提供する：
−本発明のプロセスによって入手可能な官能化されたクロマトグラフィー媒体。
【００２５】
−クロマトグラフィーカートリッジを作製する方法であって、本発明の方法を実施すること、及びそのようにして得られた生成物をカートリッジに組み込むことを含む、方法。
【００２６】
−（ａ）上記方法によって入手可能である、又は（ｂ）本発明の１つ以上の官能化されたクロマトグラフィークロマトグラフィー媒体を含む、クロマトグラフィーカートリッジ。
【００２７】
−クロマトグラフィーにおける本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体又は本発明のクロマトグラフィーカートリッジの使用。
【００２８】
−移動相から１つ以上の生体分子を単離する方法であって、移動相中の１つ以上の生体分子を、本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体又は本発明のクロマトグラフィーカートリッジと接触させることを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】多くの商業的に入手可能な多孔質ビーズ系システムに対する滞留時間の関数として動的結合容量（ＤＢＣ）を示す。
【図２】グラフト化工程がない状態でのトリメチルアンモニウム官能化された材料の電荷密度に対する官能化物質の量を増加することの効果を示す。
【図３】グラフト化工程がない状態でのトリメチルアンモニウム官能化された材料の動的結合容量（ＤＢＣ）に対する電荷密度を増加することの効果を示す。
【図４】本発明に従って作製された多くの材料に関する、電荷密度に対するポリマーグラフト化の程度及びトリメチルアンモニウム官能化物質の量を増加することの効果を示す。
【図５】図４に表示される値の平均を示す。
【図６】本発明に従って作製された多くのトリメチルアンモニウム官能化材料に関する、設定された電荷密度での動的結合容量（ＤＢＣ）に対するポリマーグラフト化を増加することの効果を示す。
【図７】フラグト化されていない材料と比較して、本発明に従って作製された多くの材料に関する、設定されたポリマーグラフトでの動的結合容量（ＤＢＣ）に対する電荷密度を増加することの効果を示す。
【図８】グリシドール／スルホン酸官能化材料に関する、電荷密度に対するポリマーグラフト化の程度及び官能化反応時間を増加すること効果を示す。
【図９】本発明によるグリシドール／スルホン酸官能化材料の動的結合容量に対する独立したグラフト化工程の影響を示す。
【図１０】本発明によるグリシドール／カルボキシメチル官能化材料の動的結合容量（ＤＢＣ）に対するグラフト化の影響を示す。
【図１１】本発明に従って作製された多くの材料に関する、流れ抵抗に対する電荷密度及びポリマーグラフト化の程度を増加することの効果を示す。
【図１２】多くの非荷電材料における流れ抵抗に対するポリマーグラフト化の程度を増加することの効果を示す。
【図１３】グラフト化生成物中の−ＯＨ基の密度に対するグリシドール試薬量を増加することの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、ポリマーナノファイバー基体から官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する二段階法を含む。２段階とは、ポリマーグラフト化工程、及び官能化工程である。
【００３１】
ポリマーナノファイバー
本発明の官能化された高分子クロマトグラフィー媒体は、ポリマーナノファイバー基体から形成される。各基体は、１つ以上のポリマーナノファイバーから形成される。
【００３２】
ポリマーナノファイバーは、典型的には電界紡糸ポリマーナノファイバーである。かかる電界紡糸ポリマーナノファイバーは、当業者によく知られており、それらの産生に対する最適化された条件は、例えば、Ｏ．Ｈａｒｄｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．４６（２０１１）３８９０に見られ、その全体が参照することにより本明細書の一部をなす。本発明の方法は、典型的には１つ以上のポリマーナノファイバーを生産するため、ポリマーを電界紡糸する最初の工程を含む。これは、それぞれ１つ以上のポリマーナノファイバーを含む、１つ以上の不織布のシートを生産するための電界紡糸を含む。
【００３３】
本発明で使用されるポリマーナノファイバーは、典型的には１０ｎｍ〜１０００ｎｍの平均径を有する。幾つかの適用に対して、２００ｎｍ〜８００ｎｍの平均径を有するポリマーナノファイバーが適している。２００ｎｍ〜４００ｎｍの平均径を有するポリマーナノファイバーは、特定の適用に適している場合がある。
【００３４】
本発明で使用されるポリマーナノファイバーの長さは特に制限されない。したがって、従来の電界紡糸方法は、数百メートル、更には数キロメートルの長さのポリマーナノファイバーを生産することができる。しかしながら、典型的には、１つ以上のポリマーナノファイバーは、最長１０ｋｍ、好ましくは１０ｍ〜１０ｋｍの長さを有する。
【００３５】
典型的には、１つ以上のポリマーナノファイバーは、それぞれ１つ以上のポリマーナノファイバーを含む１つ以上の不織布のシートの形態で提供される。したがって、基体は、典型的には、それぞれ１つ以上のポリマーナノファイバーを含む１つ以上の不織布のシートから形成される。１つ以上のポリマーナノファイバーを含む不織布のシートは、本質的に無作為に配向された各ナノファイバーを有する上記１つ以上のポリマーナノファイバーのマットであり、すなわち、ナノファイバー又はナノファイバーが特定パターンを取り入れるように製造されていない。ポリマーナノファイバーを含む不織布のシートは、典型的には、Ｏ．Ｈａｒｄｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．４６（２０１１）３８９０等の既知の方法によって提供される。不織布のシートは、特定の状況では、単独のポリマーナノファイバーからなってもよい。代替的には、不織布のシートは２種以上のポリマーナノファイバー、例えば２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種又は１０種のポリマーナノファイバーを含み得る。
【００３６】
不織布のシートは、典型的には、１〜４０ｇ／ｍ２、好ましくは５〜２５ｇ／ｍ２、幾つかの状況では１〜２０ｇ又は５〜１５ｇ／ｍ２の面密度を有する。
【００３７】
不織布のシートは、典型的には、５μｍ〜１２０μｍ、好ましくは１０μｍ〜１００μｍ、幾つか状況では５０μｍ〜９０μｍ、他の状況では５μｍ〜４０μｍ、１０μｍ〜３０μｍ又は１５μｍ〜２５μｍの厚さを有する。
【００３８】
ナノファイバーを生産するため本発明の方法で使用されるポリマーは、ポリマーがクロマトグラフィーの適用における使用に適しているかぎり、特に限定されない。したがって、典型的には、ポリマーは、クロマトグラフィー法においてクロマトグラフィー媒体、すなわち吸着剤としての使用に適しているポリマーである。好適なポリマーとして、ナイロン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリスルホン、例えばポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）、ポリカプロラクトン、コラーゲン、キトサン、ポリエチレンオキシド、アガロース、酢酸アガロース、セルロース、酢酸セルロース、及びそれらの組み合わせ等のポリアミドが挙げられる。ポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）、セルロース、酢酸セルロース及びそれらの組み合わせが好ましい。幾つかの場合には、セルロース、酢酸セルロース及びそれらの組み合わせが好ましい。
【００３９】
幾つかの実施形態では、基体が、種々のポリマーから形成された１つ以上のポリマーナノファイバーから形成された１つ以上のナノファイバーを含む。したがって、この実施形態では、基体は１つ以上の種々のポリマーを含む。典型的なポリマーは、上に定義される通りである。
【００４０】
典型的には、本発明の方法は、官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体の作製に対するものであり、その方法は１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーから形成された基体を提供することを含む。好ましくは、上記方法は、それぞれ１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含む、１つ以上の不織布のシートで形成された基体を提供することを含む。酢酸セルロースは、容易に電界紡糸され、電界紡糸後に容易にセルロースに変換され得る。したがって、好ましくは、上記方法は、それぞれが１つ以上の電界紡糸された酢酸セルロースナノファイバーを含む、１つ以上の不織布のシートから形成された基体を提供することを含む。
【００４１】
１つ以上のポリマーナノファイバーから形成された基体、典型的には上で検討されるような１つ以上の不織布のシートの形態で、１つ以上のポリマーナノファイバーを含む。特定の実施形態では、１つ以上のポリマーナノファイバー又は１つ以上の不織布のシートは、グラフト化工程前にいかなる物理的な処理工程に供されない。
【００４２】
ナノファイバーの物理的修飾
しかしながら、本発明の特定の好ましい実施形態では、基体の提供は、グラフト化工程に先立って、任意に不織布シート中のポリマーナノファイバーの物理的な修飾を含む。具体的には、物理的な修飾は、ポリマーナノファイバー／不織布シートを加熱及び／又は加圧すること、好ましくはポリマーナノファイバー／不織布シートを加熱及び加圧することを含み得る。これらの工程は、材料の構造安定性を改善する。また、加圧及び加熱の条件は、得られる材料の厚さ及び／又は空隙率を変更するため変化され得る。
【００４３】
ポリマーナノファイバーの複数の不織布シートの使用は、（グラフト化され、官能化されると）吸着に対するより大きな特性を有する、より厚い材料を作製することを可能とする。したがって、基体の提供は、典型的には、一方の上に他方が積層され、上記シートのそれぞれが１つ以上のポリマーナノファイバーを含む２つ以上の不織布シートを提供すること、及びシートの積層物を同時に加熱及び加圧して、隣接するシートのナノファイバー間の接点を融合すること、を含む。
【００４４】
セルロースクロマトグラフィー媒体の場合、基体の提供は、典型的には、一方の上に他方が積層され、上記シートのそれぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含む２つ以上の不織布シートを提供すること、及びシートの積層物を同時に加熱及び加圧して隣接するシートのナノファイバー間の接点を融合することを含む。
【００４５】
ポリマーナノファイバー／不織布シートの加圧及び加熱に対する好ましい処理条件は、国際特許出願公開第２０１５／０５２４６０号パンフレット及び国際特許出願公開第２０１５／０５２４６５号パンフレットに見られ、それらの全体が参照することにより本明細書の一部をなす。
【００４６】
ナノファイバー基体のグラフト化
本発明の方法は、工程（ｉ）出提供された基体から１つ以上の中性ポリマー鎖をグラフト化することを含むグラフト化工程（工程（ｉｉ））を含む。
【００４７】
基体からの１つ以上の中性ポリマー鎖をグラフト化することは、典型的には、任意に１つ以上の触媒の存在下で、基体上に存在する１つ以上の官能基から１つ以上のポリマー鎖を成長させることを含む。したがって、典型的には、基体は、１つ以上の官能基、好ましくはポリマー鎖を成長し得る１つ以上の官能基を含む。１つ以上の官能基からポリマー鎖を成長させるとは、個々のモノマーの基本単位から１つ以上の官能基においてポリマーを構築することを意味する。
【００４８】
したがって、グラフト化工程は、基体に対してポリマー鎖を予備成形した結合ではなく、典型的には基体からポリマー鎖を直接成長させることを含む。したがって、重合が進行するにつれて、個々のモノマーが、基体に対して遠位に固着されるポリマー鎖を成長させる端部に付加される。
【００４９】
基体からの直接のポリマー鎖の成長は、特に重合戦略を使用して、ポリマーコーティングの構造物に対する制御を可能にし、それによってポリマーは全て均一な速度で同時に成長する。これは、密集した境界の明確なポリマーコーティング層の形成を可能にする。
【００５０】
本発明では、グラフト化工程は、式
【００５１】
【化３】
2019527617.tif 000005
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマー、及び／又は式（Ｉ）のその誘導体及び／又はそのエナンチオマー及び／又はジアステレオマーを：
【００５２】
【化４】
2019527617.tif 000006
ナノファイバー基体上に存在する１つ以上の官能基と反応させることを含み、
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なってもよく、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択され、但しＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５の少なくとも１つは水素ではない。したがって、典型的には、１種類のみのポリマーが基体にグラフト化される。しかしながら、他の実施形態では、２種類以上のポリマーが基体にグラフト化されてもよい。
【００５３】
典型的には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なってもよく、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチル又はエチルから選択される。
【００５４】
したがって、式（Ｉ）の化合物において：
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシ、好ましくはＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチル又はエチルである；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシ、好ましくはＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチル又はエチルである；
Ｒ３は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシ、好ましくはＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチル又はエチルである；
Ｒ４は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシ、好ましくはＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチル又はエチルである；及び
Ｒ５は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシ、好ましくはＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチル又はエチルである。
【００５５】
典型的には、グラフト化工程（ｉｉ）が、そこからポリマーが成長され得る１つ以上の官能基を有する基体を、式（Ｉ）の複数の化合物及び／又はそのエナンチオマーと反応させることを含む場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つは水素である。この場合、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうち少なくとも２つは、水素である。より好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうち少なくとも３つは、水素である。更により好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうち４つは、水素である。好ましくは、Ｒ１は水素であり、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つは水素である。代替的には、Ｒ２及びＲ３は水素である。更により好ましくは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は水素である。
【００５６】
より好ましくは、グラフト化工程（ｉｉ）は、そこからポリマーが成長され得る１つ以上の官能基を有する基体を、式
【００５７】
【化５】
2019527617.tif 000007
の複数の化合物及び／又はそのエナンチオマーと反応させることを含む。
【００５８】
基体が種々のポリマーから形成されたナノファイバーから形成される実施形態では、異なる種類のポリマーナノファイバーのそれぞれがグラフト化工程において、異なるポリマーでグラフト化されてもよい。それは、例えば、種々のポリマーナノファイバー上に存在する種々の官能基に起因し得る。代替的には、同じポリマーが、基体中の異なる種類のポリマーナノファイバーの各々にグラフト化され得る。
【００５９】
典型的な官能基としては、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基が挙げられる。基体が１つ以上のセルロース又は酢酸セルロースナノファイバーで形成される場合、官能基は典型的にはヒドロキシル基である。
【００６０】
典型的には、上記基体を工程（ｉ）と工程（ｉｉ）の間に処理して、１つ以上の官能基を誘導する、又は上記基体を工程（ｉ）と工程（ｉｉ）の間に処理して、基体上の任意の官能基を脱保護若しくは活性化する、又は上記基体を工程（ｉ）と工程（ｉｉ）の間に処理して、基体上の官能基の数／密度を増加させる。好ましくは、上記基体を工程（ｉ）と工程（ｉｉ）の間に処理して、１つ以上の官能基を導入する、又は基体上の任意の官能基を脱保護若しくは活性化する。より好ましくは、上記基体を工程（ｉ）と工程（ｉｉ）の間に処理して、基体上の任意の官能基を脱保護若しくは活性化する。更に好ましくは、上記基体を工程（ｉ）と工程（ｉｉ）の間に処理して、基体上の任意の官能基を脱保護する。
【００６１】
しかしながら、代替的な実施形態では、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）の間に追加の処理工程は存在しない。これらの実施形態では、典型的には、グラフト化工程（ｉｉ）は、さらに、同じ工程で１つ以上の官能基を誘導する、又は基体上の任意の官能基を脱保護若しくは活性化する、又は基体上の任意の官能基の数／密度を増加させる条件下で行われる。好ましくは、グラフト化工程（ｉｉ）は、さらに、同じ工程で１つ以上の官能基を誘導する、又は基体上の任意の官能基を脱保護若しくは活性化する条件下で行われる。より好ましくは、グラフト化工程（ｉｉ）は、さらに、同じ工程で、基体上の任意の官能基を脱保護若しくは活性化する条件下で行われる。更により好ましくは、グラフト化工程（ｉｉ）は、さらに、同じ工程で、基体上の任意の官能基を脱保護する条件下で行われる。
【００６２】
特定の好ましい実施形態では、官能基はヒドロキシル基である。この特定の好ましい実施形態では、グラフト化工程（ｉｉ）は、典型的には、更に同じ工程において基体上のヒドロキシル基を脱保護する条件下で行われる。
【００６３】
官能基の脱保護は、典型的には、官能化がそれらからの１つ以上のポリマー鎖を有し得るように達成される。
【００６４】
例えば、クロマトグラフィー媒体がセルロースクロマトグラフィー媒体である場合、典型的には酢酸セルロース基体が提供され、グラフト化工程に先立って、酢酸セルロースを処理してセルロースへと変換させる。これは、ヒドロキシル基を与えるためのアセチル化ヒドロキシル基の脱保護を含む。酢酸セルロースのセルロースへの変換は、典型的には、１２時間超、例えば１２時間〜３６時間の間、水性アルカリ、好ましくは水：エタノール、より好ましくは水：エタノール２：１中のＮａＯＨを使用して達成される。
【００６５】
代替的には、クロマトグラフィー媒体がセルロースクロマトグラフィー媒体である場合、両方の酢酸セルロースがセルロースへと変換される条件下でグラフト化工程（ｉｉ）において、酢酸セルロース基体が提供及び処理され、セルロースが、その後、式
【００６６】
【化６】
2019527617.tif 000008
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマー、及び／又は式（Ｉ）のその誘導体及び／又はそのエナンチオマー及び／又は、ジアステレオマーと反応して、グラフト化ポリマー鎖を生成する。かかる実施形態では、グラフト化工程（ｉｉ）は、典型的には、４時間〜６時間の間、水又は水：エタノール中、好ましくは水中の水性アルカリ、好ましくはＮａＯＨ又はＫＯＨ、より好ましくはＫＯＨの存在下で達成される。
【００６７】
クロマトグラフィー媒体がセルロースクロマトグラフィー媒体である場合、本発明は、典型的には、官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上の酢酸セルロースファイバーで形成された基体を提供し、酢酸セルロースを処理してセルロースへと変換すること、
（ｉｉ）得られたセルロース基体から１つ以上の中性ポリマー鎖をグラフト化すること、及び
（ｉｉｉ）上記グラフト化生成物を、クロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の上記生成物を官能化する試薬と接触させること、を含む。
【００６８】
クロマトグラフィー媒体がセルロースクロマトグラフィー媒体である場合、本発明は、代替的には、官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）上記基体を、両方の酢酸セルロースがセルロースに変換される条件に供すること、その後、１つ以上の中性ポリマー鎖を得られたセルロース基体にグラフト化すること、及び
（ｉｉｉ）上記グラフト化生成物を、クロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の上記生成物を官能化する試薬と接触させること、を含む。
【００６９】
特許請求の範囲に記載される方法の工程（ｉｉｉ）に関して、官能基の活性化を以下で検討する。その検討は、特許請求の範囲に記載される方法の工程（ｉｉ）に対する官能基の活性化にも同様に当てはまる。
【００７０】
基体上の官能基の数及び／又は密度を増加させる方法は、当業者に知られているであろう。
【００７１】
１つ以上の官能基を基体に導入する場合、基体は、基体上の官能基を修飾する更なる工程（ｉ−ａ）において工程（ｉ）と工程（ｉｉ）の間に処理して官能基を導入し、その官能基から１つ以上のポリマー鎖が成長され得、その後、そのように修飾された基体からポリマー鎖を成長させる工程（ｉｉ）が続く。工程（ｉ−ａ）は、基体上に存在する官能基を、それから１つ以上のポリマー鎖を成長させ得る官能基へと共に修飾する単一の工程又は複数の工程を含み得る。
【００７２】
グリシドール重合を含む実施形態では、典型的には、上記基体を工程（ｉ）〜工程（ｉｉ）の間に処理して、基体上に存在する任意の官能基を脱保護する。
【００７３】
また、本明細書には、ＡＴＲＰ又はＲＡＦＴの重合を含む相対的な方法も記載される。これらの方法では、典型的には上記基体を工程（ｉ）〜工程（ｉｉ）の間に処理して、基体上に存在する官能基を、それから１つ以上のポリマー鎖を成長させ得る官能基へと修飾する。またこの工程に先立って、基体を処理して、基体上の任意の官能基を脱保護する。
【００７４】
ＡＴＲＰ重合を含む方法では、典型的には、基体上のヒドロキシル基は修飾されて、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化アリール基を導入する。典型的には、ハロゲン化アルキルは、フッ化アルキル、塩化アルキル、臭化アルキル又はヨウ化アルキルである。臭化アルキルが好ましい。ターシャリーハロゲン化アルキルがより好しい。ターシャリー臭化アルキルが更に好ましい。
【００７５】
基体にグラフト化された１つ以上のポリマー鎖は、中性である。ポリマー鎖は、当業者によって帯電した基と見なされる任意の基、例えば以下で検討される種類の帯電した基を含まない。典型的には、工程（ｉｉ）で基体にグラフト化されるポリマー鎖は、本明細書で定義されるいかなる帯電した基も含まない。
【００７６】
ポリマーの中性は、そのポリマーが、本質的に中性のｐＨ、例えばｐＨ６〜８、典型的にはｐＨ６．５〜７．５、通常ｐＨ６．７５〜７．２５、又は約ｐＨ７においてイオン化可能となり得る、すなわちプロトン化又は脱プロトン化され得る任意の基を含むかどうかによって評価され得る。典型的には、中性ポリマーは、酸性か塩基性の中心を実質的に含まず、すなわち、ｐＨ６〜８、典型的にはｐＨ６．５〜７．５、通常ｐＨ６．７５〜７．２５、又は約ｐＨ７において、プロトン化又は脱プロトン化される官能基が実質的に存在しない。これは、当該技術分野で典型的なアッセイによって当業者によって特定され得る。酸性及び塩基性の評価に対する典型的な手順は、その理論上の側面と共に、“Ａｃｉｄｉｔｙ  ａｎｄ  ｂａｓｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄｓ：Ｔｈｅｏｒｙ，ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｔｙ”Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｊ．Ｆｒａｉｓａｒｄ  ａｎｄ  Ｌ．Ｐｅｔｒａｋｉｓ，ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃ，ｖｏｌｕｍｅ  ４４４，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｂｏｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ｐｐ．５１３において検討され、その全体が参照することにより本明細書の一部をなす。本明細書で使用されるように、実質的には、１モル％未満、好ましくは０．１モル％未満、更に好ましくは０．０１モル％未満、又は更には０．００１モル％未満を意味する
上に言及されるように、グラフト化工程（ｉｉ）は、グリシドール重合として既知の重合の方法を使用して、そこからポリマーを成長させ得る、１つ以上の官能基を有する基体を、式
【００７７】
【化７】
2019527617.tif 000009
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマー、及び／又は式（Ｉ）のその誘導体及び／又はそのエナンチオマー及び／又はジアステレオマーと反応させることを含み、
【００７８】
【化８】
2019527617.tif 000010
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なってもよく、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択され、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５の少なくとも１つは水素ではない。したがって、ポリマー鎖の成長は、グリシドール重合を使用して実行される。
【００７９】
典型的には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なってもよく、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチル又はエチルから選択される。
【００８０】
したがって、式（Ｉ）の化合物において：
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシ、好ましくはＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチル又はエチルである；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシ、好ましくはＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチル又はエチルである；
Ｒ３は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシ、好ましくはＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチル又はエチルである；
Ｒ４は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシ、好ましくはＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチル又はエチルである；及び
Ｒ５は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシ、好ましくはＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチル又はエチルである。
【００８１】
典型的には、グラフト化工程（ｉｉ）が、そこからポリマーが成長され得る１つ以上の官能基を有する基体を、式（Ｉ）の複数の化合物及び／又はそのエナンチオマーと反応させることを含む場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくとも１つは水素である。この場合、好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうち少なくとも２つは、水素である。より好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうち少なくとも３つは、水素である。更により好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうち４つは、水素である。好ましくは、Ｒ１は水素であり、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つは水素である。代替的には、Ｒ２及びＲ３は水素である。更により好ましくは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は水素である。
【００８２】
より好ましくは、グラフト化工程（ｉｉ）は、そこからポリマーが成長され得る１つ以上の官能基を有する基体を、式
【００８３】
【化９】
2019527617.tif 000011
の複数の化合物及び／又はそのエナンチオマーと反応させることを含む。
【００８４】
グリシドール重合は、当業者に知られている手法である。グリシドール重合は、典型的には触媒の存在を必要としない。しかしながら、重合は、任意に１つ以上の適切な触媒の存在下で行われ得る。かかる実施形態では、典型的には、化学的又は生物学的な触媒が使用される。グリシドール重合は、典型的には水性環境で実行される。典型的には、グリシドール重合は室温で行われる。
【００８５】
典型的には、グリシドール重合は穏やかなアルカリ性条件下で行われる。典型的には、グリシドール重合は、約５時間超、好ましくは約１０時間超、より好ましくは約１５時間超、例えば約１６時間に亘って行われる。グリシドール重合の後、典型的には、グラフト化生成物を水に続いて緩酸で洗浄する。
【００８６】
グリシドール重合は、本明細書に定義される１つ以上の官能基からグリシドール及び／又は式（Ｉ）のグリシドール誘導体を重合することを含む。典型的には、それらの官能基はヒドロキシル基である。したがって、典型的には、特許請求の範囲に記載される方法の工程（ｉｉ）は、式
【００８７】
【化１０】
2019527617.tif 000012
の複数の化合物、及びそのエナンチオマー、及び／又は式（Ｉ）のその誘導体及び／又はそのエナンチオマー及び／又はジアステレオマーを、ナノファイバー基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることを含む。好ましくは、特許請求の範囲に記載される方法の工程（ｉｉ）は、式
【００８８】
【化１１】
2019527617.tif 000013
の複数の化合物、及びそのエナンチオマーを、ナノファイバー基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることを含む。
【００８９】
グリシドール重合は、典型的には１つ以上のポリグリセロール鎖をもたらす。
【００９０】
したがって、或る実施形態では、本発明は、官能化高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上のポリマーナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）基体から１つ以上の中性ポリマー鎖をグラフト化すること、及び
（ｉｉｉ）グラフト化生成物を、クロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させること、を含み、
ここで、ポリマー鎖を成長させることは、グリシドール及び／又は式（Ｉ）のグリシドール誘導体、好ましくはグリシドールを、基体上に存在する１つ以上の官能基から重合することを含む。
【００９１】
したがって、或る実施形態では、本発明はまた、官能化高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上のポリマーナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）基体から１つ以上の中性ポリマー鎖をグラフト化すること、及び
（ｉｉｉ）グラフト化生成物を、クロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させること、を含み、
ここで、１つ以上のポリマー鎖は、１つ以上のポリグリセロール鎖である。
【００９２】
グリシドール重合は、必然的にポリマー鎖の分岐をもたらし、「ブッシュ」構造を生じる。したがって、典型的には、１つ以上のポリマー鎖は分岐鎖である。
【００９３】
当業者によく知られている別の重合法は、制御ラジカル重合（ＣＲＰ）である。制御ラジカル重合は当業者によく知られている用語であり、典型的には、モノマーのフリーラジカル付加重合を指し、時間に対して成長するポリマーの分子量の制御の程度が存在する。ＣＲＰの例としては、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、電子移動による原子生成（ＡＧＥＴ）、ＡＴＲＰ、及び可逆的付加−開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）を含んでいる。重合方法論は排他的にＣＲＰとして定義されないが、しかし、フリーラジカル重合（ＦＲＰ）及び開環メタセシス重合（ＲＯＭＰ）を含み得る。
【００９４】
ＡＴＲＰは、水性環境、又は任意に水と、例えば、メタノール、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＤＭＦ又はＮＭＰであり得る別の溶媒との混合物中で行われてもよい。ＡＴＲＰ重合は、好ましくは実質的に酸素を含まない条件下で行われる。典型的には、ＡＴＲＰを室温で行う。典型的には、ＡＴＲＰを行った後、結果として生じる物質を水で洗浄する。
【００９５】
ＡＴＲＰ重合で使用される触媒は、典型的には、１つ以上のリガンドと複合体化された遷移金属又は遷移金属塩である。本明細書で使用されるように、リガンドは、金属イオン（通常、遷移金属イオン）に配位する化合物である。好適な遷移金属として、銅、コバルト、モリブデン、ロジウム、オスミウム、ルテニウム、パラジウム、ニッケル及びレニウムが挙げられる。銅が好ましい。銅配位触媒に適したリガンドの例として、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、４，４’−ジ（５−ノニル）−２，２−ビピリジン（ｄＮｂｐｙ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）、Ｎ−プロピル（２−ピリジル）メタンイミン（ＮＰｒＰＭＩ）、２，２’，６’，２”−テルピリジン（ｔｐｙ）４’，４，４”−トリ（５−ノニル）−２，２’：６’，２”−テルピリジン（ｔＮｔｐｙ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ピリミジルメチル）オクチルアミン（ＢＰＭＯＡ）、１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラアミン（ＨＭＴＥＴＡ）、トリス［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミン（Ｍｅ６ＴＲＥＮ）、トリス［（２−ピリジル）メチル］アミン（ＴＰＭＡ）、及び１，４，８，１１−テトラアザ−１，４，８，１１−テトラメチルシクロテトラデカン（Ｍｅ４ＣＹＣＬＡＭ）が挙げられる。
【００９６】
適切なモノマーの使用、また適用可能な場合、連鎖移動剤は、ポリマー鎖の成長末端においてＣＲＰ法において誘導されるポリマーの分岐を可能とし、ブッシュ型構造の可能性を与える。他の場合、分岐はそれほど好ましいものではなく、本質的に非分岐の「ブッシュ」ポリマー構造が形成され得る。
【００９７】
ＡＴＲＰ重合は、本質的に直鎖のポリマー鎖を与えるように、又はある程度の分岐を与えるように制御され得る。実質的には、非分岐ポリマーは、ポリマー「ブラシ」構造をもたらす。
【００９８】
ＡＴＲＰ重合は、１つ以上の異なる種類のモノマーを採用してもよく、ここで、モノマーはポリマーを形成するため使用される任意の個々の単位である。単量体は、それぞれ１つ以上の重合性基を含み、典型的には、単官能性モノマー及び二官能性モノマーから選択される。重合性基は、典型的にはＣ＝Ｃ二重結合を含む。
【００９９】
好適な単官能性モノマーの例は、メタクリレート及びメタクリルアミド、例えばＮ−［３−（ジメチルアミノプロピル］メタクリルアミドである。他の典型的なメタクリレート及びメタクリルアミドとして、２−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）及びヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）が挙げられる。
【０１００】
二官能性モノマー、例えばジメタクリレート又はジビニルスルホンを使用して、ＡＴＲＰ重合において分岐及び／又は架橋を導入することができる。
【０１０１】
グラフト化生成物の官能化
本発明の方法は、例えば、１つ以上のリガンドをグラフト化生成物に導入することによって、クロマトグラフィー媒体としてその生成物を官能化する、グラフト化生成物の官能化工程（工程（ｉｉｉ））を含む。この工程は、グラフト化生成物を、１つ以上のリガンドをグラフト化生成物に導入することによってクロマトグラフィー媒体としてグラフト化生成物を官能化する試薬と接触させることを含む。
【０１０２】
疑義を避けるため、工程（ｉｉｉ）は、クロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を共に官能化する単一工程又は複数の工程を含み得る。
【０１０３】
試薬は、典型的には、１つ以上のリガンド基を含む官能化生成物をクロマトグラフィー媒体としての使用に適したものとする１つ以上のリガンド基を導入することによってクロマトグラフィー媒体を官能化する。導入される１つ以上のリガンド基は、媒体が使用される特定のクロマトグラフィー手法に依存する。リガンド基は、クロマトグラフィー媒体としての使用に適したものとする、グラフト化生成物に導入される基である。好適なリガンド基及び試薬を以下で更に検討する。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、グラフト化生成物は、１種のみのリガンド基によって官能化される。他の実施形態では、グラフト化生成物は、２種以上のリガンド基によって官能化される。したがって、特許請求の範囲に記載される方法の工程（ｉｉｉ）は、グラフト化生成物を、同一又は異なってもよい１つ以上のリガンド基をグラフト化生成物に導入することによって、クロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させることを含む。
【０１０５】
基体が異なるポリマーから形成された１つ以上のポリマーナノファイバーを含む実施形態では、異なる種類のポリマーナノファイバーは、それぞれ同一又は異なってもよい１つ以上のリガンド基で官能化（グラフト化の後）され得る。
【０１０６】
２種以上のポリマーが基体にグラフト化され得る実施形態では、各ポリマーグラフトは、同一又は異なってもよい１つ以上のリガンド基で官能化され得る。
【０１０７】
本発明は試薬による単一の処理のみを含む方法を意図するが、複数の官能化工程を含む方法も使用され得る。かかる実施形態は、グラフト化生成物を、バッチ方式で２回以上試薬と接触させることによる官能化を含む。バッチ式官能化は、グラフト化生成物を試薬と反応させてそれを官能化し、その反応をその後停止して、得られた（部分的に）官能化された材料を別々のバッチの試薬と反応させることを意味する。バッチ方式での反応は、例えば、単に反応容器に、より多い試薬を添加することを指すものではない。
【０１０８】
バッチ式官能化は、典型的には、２回〜１０回、すなわち、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回又は１０回行われる。
【０１０９】
バッチ式官能化に好ましい処理条件は、国際特許出願公開第２０１５／０５２４６０号パンフレット及び国際特許出願公開第２０１５／０５２４６５号に見ることができ、それらの全体が参照することにより本明細書の一部をなす。
【０１１０】
特定の状況では、試薬との接触は、グラフト化生成物をホルダに入れること、及び試薬フローがグラフト化生成物と接触し、それがクロマトグラフィー媒体としてグラフト化生成物を官能化するように、ホルダを通して試薬を流すことを含み得る。この方式で材料を官能化することは、特定の状況では、単にグラフト化生成物を例えばフラスコ又はビーカーにおいて試薬と接触させるよりも効率的となり得る。
【０１１１】
フロー官能化に対する好ましい処理条件は、国際特許出願公開第２０１５／０５２４６０号パンフレット及び国際特許出願公開第２０１５／０５２４６５号パンフレットに見ることができ、それらの全体が参照することにより本明細書の一部をなす。
【０１１２】
試薬は、グラフト化生成物を官能化して、クロマトグラフィー媒体、具体的には官能化されたクロマトグラフィー媒体をもたらす。典型的には、試薬は、イオン交換、親和性捕捉又は疎水性のクロマトグラフィー法における使用に適するように、グラフト化生成物を官能化する。したがって、試薬との接触は、１つ以上のリガンド基すなわち、負に帯電した１つ以上の部分、正に帯電した１つ以上の部分、１つ以上のタンパク質、タンパク質リガンド、ペプチド、抗体又はそのフラグメント、色素、ヒスチジン、金属陽イオンを含有する基、又は疎水性基を模倣する模倣若しくは合成のリガンドによって官能化されるクロマトグラフィー媒体をもたらす。特に官能化されたクロマトグラフィー媒体が陰イオン交換クロマトグラフィー法における使用に対する場合、２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミンヒドロクロリド（ＤＥＡＣＨ）及びグリシジルトリメチルアンモニウムは試薬として好ましい。他の好ましい試薬は、特に官能化されたクロマトグラフィー媒体が陽イオン交換クロマトグラフィー法における使用に対する場合、１，４−ブタンスルホン、クロロ酢酸ナトリウム、ＴＥＭＰＯに続いて過塩素酸ナトリウム、又はアリルグリシジルエーテルに続いて二亜硫酸ナトリウムである。別の好ましい試薬は、特に官能化されたクロマトグラフィー媒体が親和性クロマトグラフィー法における使用に対する場合、ＮａＩＯ４、ジビニルスルホンに続いてプロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にハロヒドリン形成試薬（例えばＮ−ブロモスクシンアミド）その後プロテインＡ、又はアリルグリシジルエーテルに続いて第１にエポキシド形成試薬その後プロテインＡである。別の好ましい試薬は、特に、官能化されたクロマトグラフィー媒体が疎水性クロマトグラフィー法における使用に対する場合、スチレンオキシドである。
【０１１３】
典型的には、試薬は、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド、１，４−ブタンスルホン、クロロ酢酸ナトリウム、ＮａＩＯ４に続いてプロテインＡ、ジビニルスルホンに続いてプロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にハロヒドリン形成試薬（例えばＮ−ブロモスクシンアミド）その後プロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にエポキシド形成試薬その後プロテインＡである。好ましくは、試薬は、ジビニルスルホンに続いてプロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にハロヒドリン形成試薬（例えばＮ−ブロモスクシンアミド）その後プロテインＡである。
【０１１４】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、官能化工程（ｉｉｉ）は、クロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を共に官能化する複数の工程を含む。
【０１１５】
特定の好ましい実施形態では、本発明は、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、官能化工程（ｉｉｉ）では：
（ａ）グラフト化生成物を、最初に、ジビニルスルホン、アリルグリシジルエーテル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬と接触させ；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を、任意に、ハロヒドリン形成試薬又はエポキシド形成試薬、好ましくはハロヒドリン形成試薬で処理し；
（ｃ）工程（ｂ）の生成物をプロテインＡと接触させる。
【０１１６】
この特定の好ましい実施形態では、グラフト化生成物を工程（ａ）において最初にジビニルスルホンと接触させ、工程（ａ）の生成物を、典型的には、ハロヒドリン形成試薬又はエポキシド形成試薬で処理しない。したがって、幾つかの実施形態では、官能化工程（ｉｉｉ）において、グラフト化生成物を最初にジビニルスルホンと接触させ、この工程の生成物を、その後、プロテインＡと接触させる。この特定の好ましい実施形態では、グラフト化生成物を工程（ａ）において最初にアリルグリシジルエーテルと接触させる場合、工程（ａ）の生成物を、工程（ｂ）において、その後、ハロヒドリン形成試薬又はエポキシド形成試薬、好ましくはハロヒドリン形成試薬で処理する。したがって、幾つかの実施形態では、官能化工程（ｉｉｉ）において、グラフト化生成物を最初にアリルグリシジルエーテルと接触させ、この工程の生成物をハロヒドリン形成試薬で処理し、次いで、この工程の生成物を、その後、プロテインＡと接触させる。
【０１１７】
別の特定の好ましい実施形態では、本発明は、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、官能化工程（ｉｉｉ）では、
（ａ）グラフト化生成物を、ジビニルスルホン、アリルグリシジルエーテル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬と接触させ；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を、任意にハロヒドリン形成試薬又はエポキシド形成試薬、好ましくはハロヒドリン形成試薬で処理し；及び
（ｃ）工程（ｂ）の生成物をプロテインＡと接触させる。
【０１１８】
この特定の好ましい実施形態では、グラフト化生成物を工程（ａ）において最初にジビニルスルホンと接触させ、工程（ａ）の生成物を、典型的には、ハロヒドリン形成試薬又はエポキシド形成試薬で処理しない。したがって、幾つかの実施形態では、官能化工程（ｉｉｉ）において、グラフト化生成物を最初にジビニルスルホンと接触させ、この工程の生成物を、その後、プロテインＡと接触させる。この特定の好ましい実施形態では、グラフト化生成物を工程（ａ）において最初にアリルグリシジルエーテルと接触させる場合、工程（ａ）の生成物を、工程（ｂ）において、その後、ハロヒドリン形成試薬又はエポキシド形成試薬、好ましくはハロヒドリン形成試薬で処理する。したがって、幾つかの実施形態では、官能化工程（ｉｉｉ）において、グラフト化生成物をアリルグリシジルエーテルと接触させ、この工程の生成物をハロヒドリン形成試薬で処理し、次いで、この工程の生成物を、プロテインＡとその後接触させる。
【０１１９】
クロマトグラフィー媒体及び方法
本発明の方法の生成物は、官能化されたクロマトグラフィー媒体、すなわち、それからグラフト化され、その後官能化されて、グラフト化生成物上に１つ以上のリガンド基を導入することによって１つ以上のクロマトグラフィー法における使用に対して適したものとする、ポリマーを有するクロマトグラフィー媒体である。
【０１２０】
具体的な化学的な官能化を、以下により詳細に検討する。大まかには、かかる化学的官能化は、１つ以上の帯電した基を導入することによって官能化されたクロマトグラフィー媒体の化学的及び／又は物理的な特性を変化する。これは、次に、どのようにして官能化されたクロマトグラフィー媒体が、クロマトグラフィー法で使用された場合に作用するかに影響する。修飾は、例えば、その官能化されていない形態と比較した、官能化されたクロマトグラフィー媒体の極性、疎水性又は生物学的結合特性の変化であってもよい。修飾は、特定の状況では、その官能化されていない形態と比較して、官能化されたクロマトグラフィー媒体の極性、疎水性及び生物学的結合特性の２つ以上を変更し得る。或る一つの実施形態では、修飾は、その官能化されていない形態と比較して、官能化されたクロマトグラフィー媒体の極性及び疎水性を変更する。
【０１２１】
官能化されたクロマトグラフィー媒体は、典型的には、メンブレンの形態である。かかるメンブレンは、メンブレンクロマトグラフィー法における使用に適している。メンブレンクロマトグラフィー法は、当業者によく知られており、“Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ”ｅｄ．Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｃｈａｒｃｏｓｓｅｔ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１２において考察され、その全体が参照することにより本明細書の一部をなす。
【０１２２】
典型的には、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体は、イオン交換クロマトグラフィー、親和性捕捉クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー及びミックスモードクロマトグラフィーから選択されるクロマトグラフィー法における使用に適している。特定の状況では、クロマトグラフィー法は「ミックスモード」、すなわち２つ以上の相互作用の形態、すなわちイオン交換、親和性捕捉及び疎水性相互作用を利用して作用する。典型的には、かかる「ミックスモード」クロマトグラフィーは、イオン交換（イオン性）及び疎水性の相互作用を含む。好ましくは、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体は、イオン交換クロマトグラフィー、親和性捕捉クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィー、好ましくはイオン交換クロマトグラフィー及び親和性捕捉クロマトグラフィーから選択されるクロマトグラフィー法における使用に適している。操作では、かかるクロマトグラフィー法は、吸着相、ここでは官能化されたクロマトグラフィー媒体に所望の分子を含む移動相を通過させることを含む。典型的には、所望の分子が、同様に移動相中に存在する他の成分に優先して、吸着相上に保持されるように、吸着相を選択する。
【０１２３】
典型的には、高分子クロマトグラフィー媒体は、ＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、ＣＭ、プロテインＡ、フェニル又はＭＥＰの基、例えばＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、ＣＭ又はプロテインＡの基で官能化される。一般的には、ポリマーはセルロースであり、クロマトグラフィー媒体は、ＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、ＣＭ、プロテインＡ、フェニル又はＭＥＰの基、例えばＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、ＣＭ又はプロテインＡの基で官能化される。したがって、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、ＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、ＣＭ、プロテインＡ、フェニル又はＭＥＰの基、例えばＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ、ＣＭ又はプロテインＡの基で誘導体化され得る。
【０１２４】
好ましい実施形態では、高分子クロマトグラフィー媒体はプロテインＡで官能化される。
【０１２５】
イオン交換クロマトグラフィーは、典型的には、それらのイオン電荷に基づいて、分子、イオン又は極性分子を分離する手法である。したがって、かかる方法における使用に対して官能化されたクロマトグラフィー媒体は、正又は負に帯電している１つ以上の部分を含む。官能化されたクロマトグラフィー媒体における正及び／又は負の電荷は、通常、１つ以上の対イオンによって平衡化される。イオン交換クロマトグラフィーは、１つ以上の陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。
【０１２６】
陽イオン交換クロマトグラフィーにおける使用に対する官能化されたクロマトグラフィー媒体は、負に帯電されている１つ以上の部分を含む。典型的な負に帯電した部分として、カルボキシレート基、スルホネート基若しくはホスホネート基、又はそれらの混合物の１つ以上が挙げられ、すなわち、部分は、典型的には１つ以上の−ＣＯＯ−基、−ＳＯ３−基、又は−Ｐ（ＯＨ）２Ｏ−基、又はそれらの混合物を含む。陽イオン交換クロマトグラフィーにおける使用に対する典型的な官能化されたクロマトグラフィー媒体は、１つ以上の−Ｏ−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、又は−Ｐ（ＯＨ）２Ｏ−の部分を含む。
【０１２７】
陰イオン交換クロマトグラフィーにおける使用に対する官能化されたクロマトグラフィー媒体は、正に帯電している１つ以上の部分を含む。典型的な正に帯電した部分は、１つ以上の第四級アミン基を含む。陰イオン交換クロマトグラフィーにおける使用に対する典型的な官能化されたクロマトグラフィー媒体は、１つ以上の−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）２（ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３）、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３、又は−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）２Ｈの部分を含む。
【０１２８】
疑義を避けるため、「帯電した基」は、正又は負の電荷を持つようにイオン化される部分を含む基を意味し、すなわち「帯電した基」は陰イオン又は陽イオンの部分を含む。帯電した基は、リガンド基の特定の例である。
【０１２９】
典型的には、１つ以上の帯電した基は、１つ以上のカルボキシレート（−ＣＯＯ−）基、スルホネート（−ＳＯ３−）基若しくはホスホネート（−Ｐ（ＯＨ）２Ｏ−）基、又は第四級アミン基、又はそれらの混合物を含む。典型的には、１つ以上の帯電した基は、全てのアニオン基又は全てのカチオン基を含むが、特定の状況では、アニオン基とカチオン基の混合物が意図される。典型的には、１種類のみのアニオン基が使用されるが、混合物も使用され得る。典型的には、１種類のみのカチオン基が使用されるが、混合物も使用され得る。
【０１３０】
代表的な帯電した基として、−Ｏ−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−Ｐ（ＯＨ）２Ｏ−、−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）２（ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３）、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３、及び−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）２Ｈの部分が挙げられる。
【０１３１】
典型的な帯電した基として、ＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ及びＣＭの基が挙げられる。典型的には、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体は、ＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ又はＣＭの基で官能化される。したがって、官能化されたクロマトグラフィー媒体は、ＤＥＡＥ、Ｑ、ＳＰ又はＣＭの基で誘導体化されたセルロースであってもよい。
【０１３２】
親和性捕捉クロマトグラフィーは、通常は生物学的リガンドであるが、そうでない場合もある、特定のリガンドに対するそれらの親和性に基づいて分子を分離するための手法である。この方法は、例えば、抗体と抗原又は酵素と基質の間の引力に依存する。親和性捕捉クロマトグラフィーにおける使用に対する官能化されたクロマトグラフィー媒体は、典型的には、１つ以上のタンパク質、ペプチド、抗体若しくはそのフラグメント、色素、ヒスチジン、又は金属陽イオンを含む基から選択される１つ以上の部分を含む。したがって、１つ以上のリガンド基は、１つ以上のかかる部分を含んでもよい。代替的には、親和性捕捉クロマトグラフィーにおける使用に対する官能化されたクロマトグラフィー媒体は、タンパク質リガンドの作用を模倣する模倣リガンド又は合成リガンドを含んでもよい。
【０１３３】
親和性捕捉クロマトグラフィーにおける使用に対する典型的なタンパク質は、当業者によく知られており、プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬが挙げられる。プロテインＡが好ましい。
【０１３４】
プロテインＡは、当業者によく知られたタンパク質である。本明細書で使用されるように、「プロテインＡ」に対する参照は、組み換えプロテインＡ（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に見られるプロテインＡと比較して変更された配列を有し得る）、及びタグ付けされたプロテインＡ（欧州特許第０８７３３５３号及び米国特許第６３９９７５０号に記載され、それらの全体が参照することにより本明細書の一部をなす）を包含する。プロテインＡは、プロテインＡの改変変異体、例えば、プロテインＡのシステイン改変変異体であってもよい。
【０１３５】
親和性捕捉クロマトグラフィーにおける使用に対する典型的な抗体及びそのフラグメントは、当業者によく知られており、ＩｇＧを含む。
【０１３６】
親和性捕捉クロマトグラフィーにおける使用に対する典型的な色素は、当業者によく知られており、黄ＨＥ−４Ｒ、赤ＨＥ−３Ｂ及びシバクロンブルーＦ３Ｇを含む。
【０１３７】
親和性捕捉クロマトグラフィーにおける使用に対する典型的な金属陽イオンを含む基は、当業者によく知られている。かかる基は、典型的には、金属陽イオンを固定化するためのキレート剤を含む。金属陽イオンは、典型的には、銅、ニッケル、亜鉛及びコバルトの陽イオン、好ましくはＣｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋及びＣｏ２＋から選択される。
【０１３８】
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、それらの疎水性に基づいて分子を分離する手法である。したがって、かかる方法における使用に対する官能化されたクロマトグラフィー媒体は、１つ以上の疎水性基を含む１つ以上の部分を含む。典型的な疎水性基として、プロピル基、ブチル基、フェニル基及びオクチル基が挙げられる。
【０１３９】
ミックスモード（又はマルチモーダル）クロマトグラフィー媒体は、２つ以上の特性、典型的には疎水性及びイオン電荷に基づいて分子を分離する手法である。これは、疎水性と陰イオンの特性の組み合わせ、又は疎水性とカチオンの特性の組み合わせを含んでもよい。したがって、かかる方法における使用に対する官能化されたクロマトグラフィー媒体は、典型的には上に定義される正又は負に帯電した１つ以上の部分、及び典型的には上に定義される１つ以上の疎水性基を含む。官能化されたクロマトグラフィー媒体における正及び／又は負の電荷は、通常、１つ以上の対イオンによって平衡化される。また、かかる方法における使用に対する官能化されたクロマトグラフィー媒体は、いわゆる疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）における使用に対して、イオン化可能な１つ以上の疎水性基を含んでもよい。したがって、或る一つの実施形態では、ミックスモードクロマトグラフィーは、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーである。かかる方法における使用に適した基は、４−メルカプトエチルピリジン（ＭＥＰ）基及びオクチルアミン基である。
【０１４０】
疎水性と陰イオンの相互作用の組み合わせを含むミックスモードクロマトグラフィー法における使用に対する官能化されたクロマトグラフィー媒体は、典型的には上に定義される正に帯電した１つ以上の部分、及び典型的には上に定義される１つ以上の疎水性基を含む。かかる方法における使用に適した基は、Ｎ−ベンジルメチルエタノールアミン基及びＮ−ベンゾイル−ホモシステイン基である。疎水性と陽イオンの相互作用の組み合わせを含むミックスモードクロマトグラフィー法における使用に対する官能化されたクロマトグラフィー媒体は、典型的には上に定義される負に帯電した１つ以上の部分、及び典型的には上に定義される１つ以上の疎水性基を含む。かかる方法における使用に適した基は、Ｎ−ベンゾイル−ホモシステイン基である。
【０１４１】
官能化されたクロマトグラフィー媒体を作製する本発明において特許請求の範囲に記載される方法は、工程（ｉｉｉ）において、１つ以上のリガンド基を含む得られる官能化生成物が、クロマトグラフィー法におけるクロマトグラフィーとしての使用に適するものとなるように、１つ以上のリガンド基をグラフト化生成物に導入することを含む。典型的な部分、媒体、試薬及び方法は上に定義される通りである。１つ以上のリガンド基は、好適な試薬と、グラフト化生成物に含まれる１つ以上の官能基を反応させることによって導入される。典型的な官能基として、ヒドロキシル基、アミノ基、ハロゲン基及びカルボキシル基が挙げられる。上記方法の工程（ｉｉ）がグリシドール重合を含むことから、官能基は、典型的にはヒドロキシル基である。１つ以上のリガンド基を導入するのに適した試薬が、他で検討される。
【０１４２】
１つ以上の官能基は、試薬との反応に先立って活性化され得る。当該技術分野で知られている従来の活性化方法が利用され得る。したがって、官能基がヒドロキシル基である場合、かかる基は、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ビスオキサリン（ｂｉｓｏｘｉｒａｎｅｓ）、シアヌル酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）、２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４スルホネート（ＦＭＰ）、ＮａＩＯ４、ジビニルスルホン又はアリルグリシジルエーテルで処理することによって活性化され得る。官能基がアミノ基である場合、かかる基は、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド又はエポキシドで処理することによって活性化され得る。官能基がカルボキシル基である場合、かかる基は、ＣＤＩ又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で処理することによって活性化され得る。官能基がハロゲン原子である場合、かかる基は、ジビニルスルホンで処理することによって活性化され得る。
【０１４３】
当業者は、例えば、それらのポリマーに含まれる所望のリガンド基及び部分、並びに官能基に基づいて、特定のポリマーに特定の基及び部分を導入するのに適した試薬を選択することができる。典型的な試薬として、２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミンヒドロクロリド（ＤＥＡＣＨ）、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＭＡＣ）、１，４−ブタンスルホン、クロロ酢酸ナトリウム、ＮａＩＯ４に続いてプロテインＡ、ジビニルスルホンに続いてプロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にハロヒドリン形成試薬、その後プロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にエポキシド形成試薬、その後プロテインＡが挙げられる。
【０１４４】
典型的なハロヒドリン形成試薬はハロゲンの求電子源及びヒドロキシルの求核源を含む。したがって、典型的なハロヒドリン形成試薬として、水中の二原子ハロゲン（典型的には、Ｃｌ２、Ｂｒ２又はＩ２）、Ｎ−クロロスクシンアミド、Ｎ−ブロモスクシンアミド又はＮ−ヨードスクシンアミドが挙げられる。典型的には、ハロヒドリン形成試薬は、アルケンからハロヒドリン種を生成する。ハロヒドリン形成試薬は、ポリマー鎖の末端炭素原子にハロゲン原子が結合されるハロヒドリン生成物を主に生じるように位置選択的であってもよく、ポリマー鎖の末端炭素原子にヒドロキシル基が結合されるハロヒドリン生成物を主に生じるように位置選択的であってもよく、又は低位置選択性であってもよい。好ましくは、ハロヒドリン形成反応は、ポリマー鎖の末端炭素原子にハロゲン原子が結合されるハロヒドリン生成物を主に生じる位置選択性であってもよい。
【０１４５】
典型的なエポキシ形成試薬として、ペルオキシ酸（メタ−クロロペルオキシ安息香酸（ｍｃｐｂａ）等）、ＮａＯＨ又はＨ２Ｏの存在下での過酸化水素、バナジルアセチルアセトネートの存在下でのｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、Ｔｉ（ＯｉＰｒ）４及び酒石酸ジエチルの存在下のｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、Ｔｉ（ＯｉＰｒ）４及びジイソプロピルタルトレートの存在下でのｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、又はフルクトース由来触媒及び塩基の存在下でのオキソンが挙げられる。
【０１４６】
典型的には、
−クロマトグラフィー法は陽イオン交換法であり、試薬は、１つ以上のカルボキシレート、スルホネート又はホスホネートの部分を含む１つ以上の帯電した基でクロマトグラフィー媒体を官能化する；又は
−クロマトグラフィー法は陽イオン交換法であり、試薬は、１つ以上の第四級アミノ又はジエチルアミンの部分を含む１つ以上の帯電した基でクロマトグラフィー媒体を官能化する；
−クロマトグラフィー法は親和性捕捉クロマトグラフィー法であり、試薬は、１つ以上のタンパク質、ペプチド、抗体若しくはそのフラグメント、色素、ヒスチジン基又は金属陽イオンを含む基でクロマトグラフィー媒体を官能化する；
−クロマトグラフィー法は疎水性相互作用クロマトグラフィー法であり、試薬は、１つ以上のプロピル基、ブチル基、フェニル基又はオクチル基でクロマトグラフィー媒体を官能化する；又は
−クロマトグラフィー法はミックスモードクロマトグラフィー法であり、試薬は、１つ以上のＭＥＰ基、オクチルアミン基、Ｎ−ベンジルメチルエタノールアミン基又はＮ−ベンゾイルホモシステイン基でクロマトグラフィー媒体を官能化する。
【０１４７】
本発明の特定の実施形態
上で検討されるように、本発明は、ポリマーナノファイバー基体から官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する二段階法を提供し、二段階は（ｉ）ポリマーグラフト化工程、及び（ｉｉ）官能化工程である。
【０１４８】
ポリマーグラフト化工程は、典型的には、基体に５００μｍｏｌ／ｇ〜６０，０００μｍｏｌ／ｇ、好ましくは１０００μｍｏｌ／ｇ〜６０，０００μｍｏｌ／ｇのポリマーを導入する。幾つかの実施形態では、グラフト化工程は１０００μｍｏｌ／ｇ〜２０００μｍｏｌ／ｇを導入する。他の実施形態では、グラフト化工程は５０００μｍｏｌ／ｇ〜１０，０００μｍｏｌ／ｇを導入する。更に他の実施形態では、グラフト化工程は３０，０００μｍｏｌ／ｇ〜６０，０００μｍｏｌ／ｇを導入する。この量は、典型的には、例えばグラフト化法によって基体に付加される特定の官能基、例えばヒドロキシル基の量を測定するアッセイ方法によって決定され得る。当業者は、グラフト化材料の所与の試料中に存在する特定の官能基の量を特定するため使用する好適な方法を知っているであろう。
【０１４９】
ポリマー密度の増加は、量を増加した若しくはより高濃度の重合試薬を使用することによって、又はより高い温度で若しくはより長い時間に亘って反応を行うことによって得ることができる。
【０１５０】
グリシドール重合に関して、グラフト化工程は、典型的には、グラフト化生成物の−ＯＨ密度によって特定される、５００μｍｏｌ／ｇ〜６０，０００μｍｏｌ／ｇのグリシドールをグラフト化生成物に導入する。グラフト化生成物の−ＯＨ密度は、滴定法、典型的にはテトラブチルアンモニウムヒドロキシドを用いる滴定によって特定され得る。
【０１５１】
−ＯＨ密度の増加は、増加した量のグリシドール又は式（Ｉ）を有するグリシドール誘導体を使用することによって得ることができる。
【０１５２】
好ましくは、特定のポリマーの試料の−ＯＨ含有量は、以下のアッセイによって決定される：
１）グラフト化された材料の試料を湿らせた濾紙に入れ、ブフナー濾過用漏斗に置き、水が試料を通って洗浄することを確実にするため真空を印加しながら超純水で洗浄すること：
２）試料を６０℃のオーブンで一定質量まで乾燥させ、試料の質量を特定すること。
【０１５３】
３）試料を細かく裂き、１０ｍｌのｐ−トルエンスルホニルイソシアネート溶液（アセトニトリル５００ｍｌ中のｐ−トルエンスルホニルイソシアネート２０ｍＬ）を含む５０ｍＬの遠心管に懸濁すること；
４）上記管を密閉し、水浴で１時間に亘って加熱しながら（６０℃）混合物を撹拌すること；
５）上記管とその内容物を室温まで冷却し、混合物を滴定カップに移し、イソ−プロピルアルコールで８０ｍＬにする前に１０ｍＬの超純水Ｈ２Ｏで注意深くクエンチすること；
６）混合物を室温にて３０分間撹拌した後、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（メタノール中０．４８１Ｍ溶液）で滴定して存在するヒドロキシル基の絶対濃度を特定すること。
【０１５４】
特定のポリマーの試料の−ＯＨ濃度（モル／ｇ）は、上のアッセイによる上記試料中のヒドロキシル基の絶対濃度を決定し、アッセイの工程（２）で得られる乾燥試料の総質量で割ることによって決定され得る。
【０１５５】
工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に続いて、本発明の方法の工程（ｉｉｉ）で導入されるリガンド基の密度は、典型的には１００μｍｏｌ／ｇ〜２，０００μｍｏｌ／ｇの官能化されたクロマトグラフィー媒体である。密度は、好ましくは３００μｍｏｌ／ｇ〜１，５００μｍｏｌ／ｇ、より好ましくは５００μｍｏｌ／ｇ〜１２００μｍｏｌ／ｇである。幾つかの実施形態では、密度は１００μｍｏｌ／ｇ〜５００μｍｏｌ／ｇである。他の実施形態では、密度は１２００μｍｏｌ／ｇ〜２０００μｍｏｌ／ｇである。２０００μｍｏｌ／ｇよりはるかに大きな官能化されたクロマトグラフィー媒体の密度は、クロマトグラフィー媒体として使用するのが難しい材料をもたらす場合がある。
【０１５６】
密度は、典型的には、官能化された材料中の部分の数を特定する滴定法によって特定される。当業者は、官能化された材料中の所与の試料に存在する特定の部分の量を決定するため、使用するのに好適な方法を知っているであろう。
【０１５７】
トリメチルアンモニウムクロリドによる官能化に関して、密度は、以下のアッセイによって特定され得るトリメチルアンモニウムクロリドの密度として特定され得る：
１）ブフナー濾過用漏斗上で５０ｍｇの材料を１００ｍＬの０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液で洗浄した後、更に１００ｍＬの０．０１Ｍ  ＨＣｌ溶液で洗浄すること；
２）小さく裂く前に一定質量まで７５℃のオーブンで材料を乾燥させ、小さなマグネチックスターラーバーを備える５０ｍＬの遠心管に入れること；
３）１５ｍＬの脱イオン水を、およそ１ｍＬ（乳頭ピペットによって添加される）の混合物を黄色に変色させるクロム酸カリウム溶液と共に添加すること；
４）０．１Ｍの硝酸銀で滴定する前に、混合物を２０分間激しく撹拌し）、滴定のエンドポイントを透明な黄色から褐色がかった色に変色することによって識別すること；
５）トリメチルアンモニウムクロリド含有量（μｍｏｌ／ｇ）エンドポイント／滴定で使用されるナノファイバー材料のグラム数に達するように添加された硝酸銀のマイクロモル数として計算すること。
【０１５８】
スルホン酸（Ｓ）基による官能化に関して、密度は、以下のアッセイによって特定され得るスルホン酸密度として決定することができる：
１）官能化された材料の乾燥試料を０．１Ｍ  ＨＣＬ及び０．０１Ｍ  ＨＣｌで洗浄すること；
２）オーブンで材料を乾燥し、計量すること：
３）ｐＨ７に達するように添加されなければならないＮａＯＨの量によって、材料のモル濃度を決定すること；
４）ｐＨ７に達するように添加されたＮａＯＨのマイクロモルの数／滴定で使用されるナノファイバー材料グラム数として、スルホン酸（Ｓ）含有量（μｍｏｌ／ｇ）を計算すること。
【０１５９】
本発明の二段階法は、上記材料の試料に対する圧力低下に対して高い制御の程度を可能とする。これは、クロマトグラフィー材料に対する絶対圧力低下が工業規模における要因を制限することから、有利である。具体的には、ほとんどの市販のポンプの正常な操作パラメーターは、２ＭＰａの圧力低下が最大の許容可能な圧力低下であるようになっている。本発明者らは、驚いたことに、２ＭＰａの圧力低下において、本発明によって生産された材料により、高い流量の材料が可能であることを見出した。したがって、典型的には、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体に対する圧力低下は、液相を０．０５ｍｍ〜１０ｍｍの厚さの媒体を毎分１メンブレン体積〜６４０メンブレン体積の流量で通過させる場合に、２ＭＰａ未満である。これは、標準的な手段、例えばＡＫＴＡタンパク質精製システムを使用して特定され得る。これは、材料の流れ抵抗の尺度である。
【０１６０】
典型的には、圧力低下は、１ＭＰａ未満であり、好ましくは０．５ＭＰａ未満である。
【０１６１】
典型的には、媒体を通る流量は、毎分１メンブレン体積〜６０メンブレン体積、好ましくは５メンブレン体積〜４０メンブレン体積である。
【０１６２】
媒体を通る液相は、特に重要ではない。典型的な液相として、標準的なバッファー、例えばトリスバッファー、好ましくは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓが挙げられる。
【０１６３】
典型的な液相は、０．１ｍｍ〜５ｍｍの厚さの材料に通される。
【０１６４】
好ましくは、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体に対する圧力低下は、Ｔｒｉｓバッファーを毎分１メンブレン体積〜６０メンブレン体積の流量で、０．１ｍｍ〜５ｍｍの厚さの材料に通す場合に１ＭＰａ未満である
より好ましくは、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体に対する圧力低下は、１０ｍＭのＴｒｉｓを毎分５メンブレン体積〜４０メンブレン体積の流量で、０．１ｍｍ〜５ｍｍの厚さの材料に通す場合に０．５ＭＰａ未満である。
【０１６５】
グラフト化工程と官能化工程の組み合わせは、高い動的結合容量（ＤＢＣ）を有する材料が達成されるのを可能とする。したがって、典型的には、官能化されたクロマトグラフィー材料は、１０ｍｇ／ｍＬ〜２１０ｍｇ／ｍＬ（１０％ブレイクスルー）、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ〜１９５ｍｇ／ｍＬ（１０％ブレイクスルー）、３０ｍｇ／ｍＬ〜１８０ｍｇ／ｍＬ（１０％ブレイクスルー）、４０ｍｇ／ｍＬ〜１６５ｍｇ／ｍＬ（１０％ブレイクスルー）、又は５０ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬ（１０％ブレイクスルー）のＤＢＣを有する。材料について、工程（ｉｉ）がグリシドール重合を含む場合、典型的には、官能化されたクロマトグラフィー材料は、５０ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬ（１０％ブレイクスルー）のＤＢＣを有する。
【０１６６】
１０％ブレイクスルーに対するＤＢＣは、標準的な手段に従って、例えばＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅシステムを使用して特定され得る。
【０１６７】
１０％ブレイクスルーに対するＤＢＣは、典型的には、以下のアッセイ法に従って決定される：
１）充填材料を（陰イオン交換物質に対して、充填材料はｐＨ８まで１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中の１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡであった。陽イオン交換材料に対して、充填材料は、酢酸ナトリウムｐＨ４．７  １０ｍＭ中の１ｍｇ／ｍＬリゾチームであった）ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のホルダ内に含まれる、官能化された材料に通す。
【０１６８】
２）材料を、ホルダアウトレットがＵＶフローセルによって特定されるその充填材料の１０％を超えた後の濃度まで、毎分流量（ｍＶ／分）当たりの所定のメンブレン体積の下で充填する。
【０１６９】
３）システム及びホルダ装置におけるデッドボリュームを考慮して、１０％ブレイクスルーでディスクに充填されたタンパク質の総量を、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるクロマトグラムの分析によって決定した。
【０１７０】
本発明の官能化された材料の高い動的結合容量、及びそれを通過し得る高い流量は、有利に高い生産性が達成されることを可能とする。したがって、典型的には、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の生産性は、５０ｍｇ／ｍＬ／分〜７５０００ｍｇ／ｍＬ／分である。好ましくは、生産性は６００ｍｇ／ｍｌ／分以上である。より好ましくは、生産性は１２００ｍｇ／ｍｌ／分以上である。更により好ましくは、生産性は２４００ｍｇ／ｍｌ／分以上である。生産性は、１００００ｍｇ／ｍｌ／分以上、又は更には１５０００ｍｇ／ｍｌ／分以上、又は２００００ｍｇ／ｍｌ／分以上であってもよい。１００００ｍｇ／ｍｌ／分、１５０００ｍｇ／ｍｌ／分又は２００００ｍｇ／ｍｌ／分以上の生産性は、典型的には、グリシドール重合を使用して達成可能である。
【０１７１】
本明細書で使用されるように、材料の生産性は、単位時間当たり、材料の単位体積当たり、吸着材料にどれだけの材料を充填することができるかによって決定される。実際上、これは、ホルダにおいて充填材料の滞留時間で割ったＤＢＣ（１０％ブレイクスルー）として決定される。滞留時間は、順に、ホルダを通り抜ける材料の流量から特定され得る、
上で検討されるように、本発明者らは、グラフト化工程（ｉｉ）と官能化工程（ｉｉｉ）の関係を徹底的に調査したところ、互いからこれらの工程を分離することによって高度に最適化された材料が生産され得ることを見出した。
【０１７２】
したがって、特定の実施形態では、グラフト化工程は官能化高分子クロマトグラフィー媒体の動的結合容量（ＤＢＣ）を増加させる効果を有することがわかった。したがって、所与の密度のリガンド基の２つの材料に対して、グラフト化の程度がより高い材料は、典型的にはより高いＤＢＣを有することがわかった。これは、特に正に帯電した基で官能化された材料、すなわち、官能化されたクロマトグラフィー材料が陰イオン交換クロマトグラフィー法における使用に適している場合にはなおさらである。
【０１７３】
したがって、或る一つの実施形態では本発明は、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）本明細書に定義されるように、１つ以上のポリマーナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）本明細書に定義されるように、１つ以上の中性ポリマー鎖を基体からグラフト化すること、及び
（ｉｉｉ）本明細書に定義されるように、グラフト化生成物を、工程（ｉｉ）の生成物を、本明細書に定義されるように、クロマトグラフィー媒体として官能化する試薬と接触させること、を含み、
ここで、グラフト化工程（ｉｉ）が、式
【０１７４】
【化１２】
2019527617.tif 000014
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマー、及び／又は式（Ｉ）のその誘導体及び／又はそのエナンチオマー及び／又はジアステレオマーを：
【０１７５】
【化１３】
2019527617.tif 000015
ナノファイバー基体上に存在する１つ以上の官能基と反応させることを含み、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なってもよく、
Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択され、
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５の少なくとも１つは水素ではなく、
官能化されたポリマークロマトグラフィー材料のＤＢＣを増加させる効果を有する。
【０１７６】
他の実施形態では、通常、負に帯電した基で官能化された材料、すなわち、官能化されたクロマトグラフィー材料が陽イオンクロマトグラフィー法における使用に適している場合、特許請求の範囲に記載される方法の工程（ｉｉｉ）に使用される官能化試薬の量を変化させることは、電荷密度に対してわずかな影響しか及ぼさないが、グラフト化工程と組み合わせた場合、同じ程度の官能化に対して、結合容量の著しい増加が達成され得ることがわかった。したがって、ここでも、肯定的にＤＢＣに影響を与えるのは、グラフト化工程と官能化工程の組み合わせであることが明らかである。
【０１７７】
典型的には、官能化されたクロマトグラフィー媒体は官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体であり、基体は１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成され、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）の間に、酢酸セルロースを処理してセルロースへと変換し、基体上から１つ以上の中性ポリマー鎖をグラフト化する工程はグリシドール重合を含み、グラフト化生成物は、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＭＡＣ）、１，４−ブタンスルホン、クロロ酢酸ナトリウム、ＮａＩＯ４に続いてプロテインＡ、ジビニルスルホンに続いてプロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にハロヒドリン形成試薬（例えばＮ−ブロモスクシンアミド）、その後プロテインＡ、又はアリルグリシジルエーテルに続いて第１にエポキシド形成試薬、その後プロテインＡから選択される試薬と接触される。
【０１７８】
代替的には、官能化されたクロマトグラフィー媒体は官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体であり、基体は１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成され、グラフト化工程は酢酸セルロースのセルロースへの変換とグリシドール重合によって得られたセルロース基体上に１つ以上の中性ポリマー鎖をグラフト化することの両方を含み、グラフト化生成物はグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＭＡＣ）、１，４−ブタンスルホン、クロロ酢酸ナトリウム、ＮａＩＯ４に続いてプロテインＡ、ジビニルスルホンに続いてプロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にハロヒドリン形成試薬（例えばＮ−ブロモスクシンアミド）、その後プロテインＡ、又はアリルグリシジルエーテルに続いて第１にエポキシド形成試薬、その後プロテインＡから選択される試薬と接触される。
【０１７９】
好ましい実施形態では、本発明は、官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成された基体を提供し、酢酸セルロースを処理してセルロースに変換すること、
（ｉｉ）本明細書に定義されるように、得られたセルロース基体から１つ以上の中性ポリマー鎖をグラフト化すること、及び
（ｉｉｉ）本明細書に定義されるように、グラフト化生成物を、本明細書に定義されるように、クロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させることを含み、
ここで、グラフト化工程（ｉｉ）は、式
【０１８０】
【化１４】
2019527617.tif 000016
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマーを、ナノファイバー基体上に存在する１つ以上の官能基と反応させることを含む。
【０１８１】
典型的には、この好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、それぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含む、１つ以上の不織布シートで形成された基体を提供することを含む。
【０１８２】
好ましくは、この好ましい実施態様では、工程（ｉ）は、一方の上に他方が積層された２つ以上の不織布シートを提供することを含み、上記シートのそれぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含み、シートの積層物を同時に加熱及び加圧して隣接するシートのナノファイバー間の接触点を融合することを含む。
【０１８３】
代替的な好ましい実施形態では、本発明は官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）上記基体を、両方の酢酸セルロースがセルロースに変換される条件に供すること、その後、１つ以上の中性ポリマー鎖を得られたセルロース基体にグラフト化すること、並びに
（ｉｉｉ）本明細書に定義されるように、グラフト化生成物を、本明細書に定義されるように、クロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させることを含み、
ここで、グラフト化工程（ｉｉ）は、式
【０１８４】
【化１５】
2019527617.tif 000017
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマーを、ナノファイバー基体上に存在する１つ以上の官能基と反応させることを含む。
【０１８５】
典型的には、この代替的な好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、それぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含む、１つ以上の不織布で形成された基体を提供することを含む。
【０１８６】
好ましくは、この代替的な好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、一方の上に他方が積層された２つ以上の不織布シートを提供することを含み、上記シートのそれぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含み、シートの積層物を同時に加熱及び加圧して隣接するシートのナノファイバー間の接触点を融合することを含む。
【０１８７】
より好ましい実施形態では、本発明は官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成された基体を提供し、酢酸セルロースを処理してセルロースに変換すること、
（ｉｉ）式
【０１８８】
【化１６】
2019527617.tif 000018
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマーを、基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることによって、得られたセルロース基体から１つ以上のポリマー鎖をグラフト化すること、並びに
（ｉｉｉ）本明細書に定義されるように、グラフト化生成物を、工程（ｉｉ）の生成物を、本明細書に定義されるように、クロマトグラフィー媒体として官能化する試薬と接触させること、
を含む。
【０１８９】
典型的には、このより好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、それぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含む、１つ以上の不織布シートで形成された基体を提供することを含む。
【０１９０】
好ましくは、このより好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、一方の上に他方が積層された２つ以上の不織布シートを提供することを含み、上記シートのそれぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含み、シートの積層物を同時に加熱及び加圧して隣接するシートのナノファイバー間の接触点を融合することを含む。
【０１９１】
代替的なより好ましい実施形態では、本発明は官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）上記基体を、両方の酢酸セルロースがセルロースに変換される条件に供すること、その後、式
【０１９２】
【化１７】
2019527617.tif 000019
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマーを、基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることによって、１つ以上の中性ポリマー鎖を得られたセルロース基体にグラフト化すること、並びに
（ｉｉｉ）グラフト化生成物を、クロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を官能化する、本明細書に定義される試薬と接触させること、を含む。
【０１９３】
典型的には、この代替的なより好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、それぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含む、１つ以上の不織布で形成された基体を提供することを含む。
【０１９４】
好ましくは、この代替的なより好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、一方の上に他方が積層された２つ以上の不織布シートを提供することを含み、上記シートのそれぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含み、シートの積層物を同時に加熱及び加圧して隣接するシートのナノファイバー間の接触点を融合することを含む。
【０１９５】
更により好ましい実施形態では、本発明は、官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成された基体を提供し、酢酸セルロースを処理してそれをセルロースに変換することを含み、
（ｉｉ）式
【０１９６】
【化１８】
2019527617.tif 000020
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマーを、基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることによって、得られたセルロース基体から１つ以上のポリマー鎖をグラフト化すること、並びに
（ｉｉｉ）グラフト化生成物を、イオン交換又は親和性クロマトグラフィー法における使用に適したクロマトグラフィー媒体として、工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させること、を含む。
【０１９７】
典型的には、この更により好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、それぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含む、１つ以上の不織布で形成された基体を提供することを含む。
【０１９８】
好ましくは、この更により好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、一方の上に他方が積層された２つ以上の不織布シートを提供することを含み、上記シートのそれぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含み、シートの積層物を同時に加熱及び加圧して隣接するシートのナノファイバー間の接触点を融合することを含む。
【０１９９】
代替的な更により好ましい実施形態では、本発明は、官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）基体を、両方の酢酸セルロースがセルロースに変換され、その後に、式
【０２００】
【化１９】
2019527617.tif 000021
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマーを、基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることによって、得られたセルロース基体に１つ以上の中性ポリマー鎖がグラフト化される、水性アルカリ条件に供すること、並びに
（ｉｉｉ）グラフト化生成物を、イオン交換又は親和性クロマトグラフィー法における使用に適したクロマトグラフィー媒体として、工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させること、を含む。
【０２０１】
典型的には、この代替的な更により好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、それぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含む、１つ以上の不織布で形成された基体を提供することを含む。
【０２０２】
好ましくは、この代替的なより一層好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、一方の上に他方が積層された２つ以上の不織布シートを提供することを含み、上記シートのそれぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含み、シートの積層物を同時に加熱及び加圧して隣接するシートのナノファイバー間の接触点を融合することを含む。
【０２０３】
更により好ましい実施形態では、本発明は、官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成された基体を提供し、酢酸セルロースを処理してそれをセルロースに変換すること、
（ｉｉ）式
【０２０４】
【化２０】
2019527617.tif 000022
の複数の化合物、及びそのエナンチオマーを基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることにより、得られたセルロース基体から１つ以上のポリマー鎖をグラフト化すること、並びに
（ｉｉｉ）グラフト化生成物を、イオン交換又は親和性クロマトグラフィー法における使用に適したクロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させること、を含み、試薬は、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＭＡＣ）、１，４−ブタンスルホン、クロロ酢酸ナトリウム、ＮａＩＯ４に続いてプロテインＡ、ジビニルスルホンに続いてプロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にハロヒドリン形成試薬（例えばＮ−ブロモスクシンアミド）、その後プロテインＡ、又はアリルグリシジルエーテルに続いて第１にエポキシド形成試薬、その後プロテインＡである。
【０２０５】
典型的には、この更に好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、それぞれ１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含む１つ以上の不織布シートで形成された基体を提供することを含む。
【０２０６】
好ましくは、この更により好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、一方の上に他方が積層された２つ以上の不織布シートを含み、上記シートのそれぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含み、シートの積層物を同時に加熱及び加圧して隣接するシートのナノファイバー間の接触点を融合することを含む。
【０２０７】
代替的な更により好ましい実施形態では、本発明は、官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）基体を、両方の酢酸セルロースがセルロースに変換され、その後に、式
【０２０８】
【化２１】
2019527617.tif 000023
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマーを、基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることによって、得られたセルロース基体に１つ以上の中性ポリマー鎖がグラフト化される、水性アルカリ条件に供すること、並びに
（ｉｉｉ）グラフト化生成物を、イオン交換又は親和性クロマトグラフィー法における使用に適したクロマトグラフィー媒体として、工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させること、を含み、
試薬は、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＭＡＣ）、１，４−ブタンスルホン、クロロ酢酸ナトリウム、ＮａＩＯ４に続いてプロテインＡ、ジビニルスルホンに続いてプロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にハロヒドリン形成試薬（例えばＮ−ブロモスクシンアミド）、その後プロテインＡ、又はアリルグリシジルエーテルに続いて第１にエポキシド形成試薬、その後プロテインＡである。
【０２０９】
典型的には、この代替的な更により好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、それぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含む、１つ以上の不織布シートで形成された基体を提供することを含む。
【０２１０】
好ましくは、この代替的な更により好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、一方の上に他方が積層された２つ以上の不織布シートを提供することを含み、上記シートのそれぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含み、シートの積層物を同時に加熱及び加圧して隣接するシートのナノファイバー間の接触点を融合することを含む。
【０２１１】
更により一層好ましい実施形態では、本発明は、官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成された基体を提供し、酢酸セルロースを処理してそれをセルロースに変換すること、
（ｉｉ）式
【０２１２】
【化２２】
2019527617.tif 000024
の複数の化合物、及びそのエナンチオマーを基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることにより、得られたセルロース基体から１つ以上のポリマー鎖をグラフト化すること、並びに
（ｉｉｉ）グラフト化生成物を、イオン交換又は親和性クロマトグラフィー法における使用に適したクロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させること、を含み、
試薬は、ジビニルスルホンに続いてプロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にハロヒドリン形成試薬（例えばＮ−ブロモスクシンアミド）、その後プロテインＡ、又はアリルグリシジルエーテルに続いて第１にエポキシド形成試薬、その後プロテインＡである。
【０２１３】
典型的には、この更により一層好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、それぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含む、１つ以上の不織布シートで形成された基体を提供することを含む。
【０２１４】
好ましくは、この更により一層好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、一方の上に他方が積層された２つ以上の不織布シートを提供することを含み、上記シートのそれぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含み、シートの積層物を同時に加熱及び加圧して隣接するシートのナノファイバー間の接触点を融合することを含む。
【０２１５】
代替的な更により一層好ましい実施形態では、本発明は、官能化されたセルロースクロマトグラフィー媒体を作製する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）基体を、両方の酢酸セルロースがセルロースに変換され、その後に、式
【０２１６】
【化２３】
2019527617.tif 000025
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマーを、基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることによって、得られたセルロース基体に１つ以上の中性ポリマー鎖がグラフト化される、水性アルカリ条件に供すること、並びに
（ｉｉｉ）グラフト化生成物を、イオン交換又は親和性クロマトグラフィー法における使用に適したクロマトグラフィー媒体として工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させること、を含み、
試薬は、ジビニルスルホンに続いてプロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にハロヒドリン形成試薬（例えばＮ−ブロモスクシンアミド）、その後プロテインＡ、又はアリルグリシジルエーテルに続いて第１にエポキシド形成試薬、その後プロテインＡである。
【０２１７】
典型的には、この代替的な更により一層好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、それぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含む、１つ以上の不織布シートで形成された基体を提供することを含む。
【０２１８】
好ましくは、この代替的な更により一層好ましい実施形態では、工程（ｉ）は、一方の上に他方が積層された２つ以上の不織布シートを提供することを含み、上記シートのそれぞれが１つ以上の酢酸セルロースナノファイバーを含み、シートの積層物を同時に加熱及び加圧して隣接するシートのナノファイバー間の接触点を融合することを含む。
【０２１９】
本発明のクロマトグラフィーカートリッジ
また、本発明は、クロマトグラフィーカートリッジを提供する。本発明のクロマトグラフィーカートリッジは、本発明の１つ以上の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む。代替的には、本発明のクロマトグラフィーカートリッジは、本発明の方法を行って、そのようにして得られた生成物をカートリッジに組み込むことにより取得可能である。
【０２２０】
また、本発明の方法を行い、そのようにして得られた生成物をカートリッジに組み込むことを含む、クロマトグラフィーカートリッジを作製する方法が提供される。
【０２２１】
クロマトグラフィーカートリッジは、クロマトグラフィー、典型的には、本明細書に定義されるクロマトグラフィー法における使用に適している。
【０２２２】
本発明のクロマトグラフィーカートリッジは、典型的には、ホルダ、例えば上に定義されるホルダ内に本発明の１つ以上の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む。ホルダは、典型的には円筒状である。
【０２２３】
典型的には、クロマトグラフィーカートリッジは、円筒状のホルダの内部に積層された本発明の１つ以上の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む。
【０２２４】
典型的には、クロマトグラフィーカートリッジは、本発明の２つ以上の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む。典型的には、クロマトグラフィーカートリッジは、最大２０の本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む。
【０２２５】
また、典型的には、クロマトグラフィーカートリッジは、典型的には円筒状のホルダ内に１つ以上のフリットを備える。フリットは当業者によく知られており、堅い多孔質構造、典型的には堅い金属の重合体か又はセラミック、好ましくは堅い金属又はセラミックの多孔質構造を指す。フリットは、典型的には、カートリッジを通るフロー分布を改善するため、及び／又は本発明の１つ以上の官能化されたクロマトグラフィー媒体を支持するため、クロマトグラフィーカートリッジに典型的に備えられる。典型的なフリットにおける孔は、１μｍ〜１０００μｍ、好ましくは５μｍ〜５００μｍ、より好ましくは１０μｍ〜１５０μｍの直径を有する。他の好適なフリット孔は、１μｍ〜２０μｍ、好ましくは５μｍ〜１０μｍ、より好ましくは３μｍ〜７μｍを含む。
【０２２６】
典型的には、カートリッジは、本発明の２つ以上の官能化されたクロマトグラフィー媒体と、１つ以上のフリットを含み、フリットは官能化されたクロマトグラフィー媒体の間に配置される。
【０２２７】
幾つかの実施形態では、カートリッジはフリットを備えていない。
【０２２８】
カートリッジは、フリットに代えて、又はそれに加えて、代替的なスペーサー材料を備えてもよい。典型的な代替スペーサー材料として、不織布及び織布の材料が挙げられる。
【０２２９】
不織布ポリマー材料は、当業者に知られている。かかる不織布材料は多孔質であり、すなわち、典型的には著しい圧力低下を伴わずに液体の通行を可能とする。典型的には、不織布ポリマー材料は、ポリプロピレンである。典型的には、不織布材料は、４５ｇｓｍ〜１５０ｇｓｍの面密度を有する。
【０２３０】
幾つかの実施形態では、カートリッジは、本発明の２つ以上の官能化されたクロマトグラフィー媒体と、上に定義される１つ以上の不織布ポリマー材料を含み、１つ以上の不織布ポリマー材料層は、官能化されたクロマトグラフィー媒体の間に配置される。
【０２３１】
織布材料は、当業者に知られている。かかる織布材料は多孔質であり、すなわち、典型的には著しい圧力低下を伴わずに液体の通行を可能とする。典型的には、織布材料は、織られたポリマー材料、織られたポリプロピレンである。典型的には、織布材料は、１ｍｍ未満の厚さを有する。
【０２３２】
また典型的には、クロマトグラフィーカートリッジは、１つ以上のインレット流体供給手段、及び／又はアウトレット流体収集手段を備えてもよい。かかる手段は、当業者によく知られている。
【０２３３】
本発明のクロマトグラフィー法
また、本発明は、クロマトグラフィー、特に本明細書に定義されるクロマトグラフィー法における本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体、又は本発明のクロマトグラフィーカートリッジの使用を提供する。
【０２３４】
また、本発明は、１つ以上の生体分子を移動相から単離する方法を提供し、該方法は、移動相中の１つ以上の生体分子を、本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体又は本発明のクロマトグラフィーカートリッジと接触させることを含む。クロマトグラフィー媒体又はクロマトグラフィーカートリッジは、移動相中の１つ以上の生体分子に優先的に結合し、典型的には、移動相中に存在する他の成分（例えば、他の生体分子）に対しても結合しやすい。これは、かかるクロマトグラフィー法の結合相に対して知られている従来の方法に従って行われ得る。
【０２３５】
したがって、典型的には、このクロマトグラフィー処理は、イオン（陰イオン又は陽イオン）交換、親和性捕捉、疎水性相互作用、又はミックスモードのクロマトグラフィー処理である。
【０２３６】
好ましくは、クロマトグラフィーの処理は陰イオン交換クロマトグラフィー処理であり、クロマトグラフィー媒体はＤＥＡＥ又はＱで官能化されている；クロマトグラフィー処理は陽イオン交換クロマトグラフィー処理であり、クロマトグラフィー媒体はＳＰ又はＣＭで官能化されている；クロマトグラフィー処理は親和性捕捉クロマトグラフィー処理であり、クロマトグラフィー媒体はプロテインＡで官能化されている；又は、クロマトグラフィー処理は疎水性相互作用クロマトグラフィー処理であり、クロマトグラフィー媒体はフェニル基で官能化されている。
【０２３７】
したがって、本発明は、上の工程を含むクロマトグラフィー方法を提供する。典型的には、クロマトグラフィー方法は、上に定義されるクロマトグラフィー法に従って行われる。
【０２３８】
本発明の有利な知見の１つは、本発明の方法によって生産された官能化されたクロマトグラフィー材料が、高い結合容量を有し、高い流量で操作され得ることである。したがって、典型的には、本発明のクロマトグラフィー方法では、移動相中の１つ以上の生体分子を、１分以下、好ましくは５０秒以下、より好ましくは４０秒以下、より一層好ましくは３０秒以下、更に好ましくは２０秒以下、更には１５秒以下、１２秒以下、１０秒以下、８秒以下、６秒以下、４秒以下、２秒以下、１．５秒以下、更には１秒以下の時間に亘って官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させる。
【０２３９】
クロマトグラフィー方法は、典型的には、官能化されたクロマトグラフィー媒体又はクロマトグラフィーカートリッジから１つ以上の生体分子を回収する更なる工程を含む。この工程は、典型的には、１つ以上の生体分子が吸着される、官能化されたクロマトグラフィー媒体又はクロマトグラフィーカートリッジを、溶離バッファーと接触させることによって達成され得る。これは、かかるクロマトグラフィー法の溶離相について知られている従来の方法に従って行われ得る。したがって、上記方法は、典型的には結合−溶離クロマトグラフ法である。
【０２４０】
結合工程と溶離工程の間に、上記方法は、１つ以上の生体分子が吸着される本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体又はクロマトグラフィーカートリッジを洗浄する工程を更に含み得る。この洗浄工程は、官能化されたクロマトグラフィー媒体又はクロマトグラフィーカートリッジに結合されていない任意の成分を除去するために行われる。これは、かかるクロマトグラフィー法の洗浄相について知られている従来の方法に従って行われ得る。
【０２４１】
溶離工程の後、上記方法は、本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体又はクロマトグラフィーカートリッジを再生する工程を更に含み得る。典型的には、これは、１つ以上の生体分子が溶離された官能化されたクロマトグラフィー媒体又はクロマトグラフィーカートリッジを、バッファーと接触させることによって達成される。これは、かかるクロマトグラフ法の再生相について知られている従来の方法に従って行われ得る。
【０２４２】
典型的には、１つ以上の生体分子は、例えば、組み換えタンパク質、モノクローナル抗体、ウイルスワクチン剤、ウイルスベクター、ＲＮＡ、エクソソーム、細胞及びプラスミドＤＮＡを含む、細胞、タンパク質、ポリペプチド、抗体、アミノ酸、ウイルス及び核酸から選択される。
【０２４３】
モノクローナル抗体は、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）又はドメイン欠失抗体であってもよい。好ましくは、モノクローナル抗体はヒト化抗体又はヒト抗体である。モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを使用してもよい。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、二重特異性抗体及び単鎖抗体が挙げられる。
【０２４４】
典型的には、１つ以上の生体分子は、１つ以上のモノクローナル抗体、又はプロテインＡ結合に対して親和性を有する部位を示すように操作されたタンパク質であり、カートリッジに任意に含まれる官能化されたクロマトグラフィー媒体は、少なくとも１つのプロテインＡリガンド基を持つ。
【０２４５】
典型的には、クロマトグラフィー方法は、疑似又は真の移動床システムを採用する。したがって、典型的には、上記方法は、移動相中の１つ以上の生体分子を、複数の連結されたクロマトグラフィーカラムを有する１つ以上の疑似又は真の移動床クロマトグラフィー装置に導入することを含み、そのクロマトグラフィーカラムは、吸着剤として、本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む。
【０２４６】
任意の既知の疑似又は真の移動床装置を使用して、クロマトグラフィー方法を行ってもよいが、吸着剤として本発明の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む。
【０２４７】
疑似又は真の移動床クロマトグラフィーは、既知の手法であり、当業者によく知られている。動作原理は、液体の溶離相及び固体の吸着相の向流の動きを含んでいる。この操作は、溶媒の使用を最小にして、上記方法を経済的に実行可能とする。かかる分離技術は、メンブレン吸着剤を使用する生体分子の精製を含む、多様な領域での適応を見出した。
【０２４８】
疑似移動床システムは、共に直列に接続される吸着剤を含む、幾つかの個別のカラムからなる。溶離液を、第１の方向でカラムに通過させる。上記システムのフィードストック及び溶離液の射出ポイント、並びに分離された成分の収集ポイントは、一連のバルブによって定期的にシフトされる。全体的な効果は、固体の吸着剤の移動床を含む単一カラムの操作を擬態することである。したがって、疑似移動床システムは、従来の固定床システムと同様に、溶離液を通過させる固体吸着剤の固定床を含むカラムからなるが、疑似移動床システムでは、操作は、連続向流移動床を擬態するものである。
【０２４９】
真の移動床システムは、操作の点では疑似移動床システムに類似する。しかしながら、バルブのシステムによって、フィード混合物及び溶離液の注入ポイント、並びに分離された成分の収集ポイントをシフトさせるのではなく、代わりに一連の吸着ユニット（すなわちカラム）をフィード及び排出のポイントに対して物理的に移動される。ここでも、操作は、連続向流移動床を擬態するものである。
【０２５０】
また、本発明の材料は、固定化された酵素生体触媒、金属捕集及び水処理の方法における使用に適している。したがって、本発明は、本発明の官能化されたクロマトグラフィーの材料を含む、酵素生体触媒作用の方法を提供する。また、本発明は、本発明の官能化されたクロマトグラフ材料を含む、金属捕集方法を提供する。また、本発明は、本発明の官能化されたクロマトグラフ材料を含む、水の処理方法を提供する。生成物をこれらの方法における使用に適するものとするように、特定の小さな修飾が本発明の方法及び生成物に必要とされる場合があることが認識される。
【０２５１】
実施例
以下の実施例は本発明を説明する。
【０２５２】
材料及び装置
別段の指示がないかぎり、全ての化学物質をＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＦｌｕｏｒｏＣｈｅｍ、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ及びＶＷＲ等の会社から得た、又はそれらから入手可能である。
【０２５３】
洗浄プロトコル
洗浄プロトコルＡ
反応媒体を、等体積脱イオン水で置き換え、１時間循環させた。すすぎの手順をもう一度繰り返した。最後に、材料を反応槽から取り出す前に、等体積の水性エタノール（２：１−Ｈ２Ｏ：ＥｔＯＨ）で処理した。
【０２５４】
洗浄プロトコルＢ
反応媒体を、等体積の脱イオン水で置き換え、１時間循環させた。この時間の後、洗浄媒体を０．０１Ｍ  ＨＣｌで置き換え、１時間循環させ、その上、０．００１Ｍ  ＨＣｌで置き換え、１時間循環させた。最後に、上記媒体をＨ２Ｏ：ＥｔＯＨの２：１混合物で置き換え、１時間循環させた。次いで、誘導体化されたナノファイバーを反応容器から取り出した。
【０２５５】
洗浄プロトコルＣ
反応媒体を、等体積の温かい（６０℃）脱イオン水：アセトンの１：１混合物で置き換え、３０分間循環させた。洗浄手順を更に２回繰り返した。最後に、上記媒体をＨ２Ｏ：ＥｔＯＨの２：１混合物で置き換え、１時間循環させた。次いで、誘導体化されたナノファイバーを反応容器から取り出した。
【０２５６】
洗浄プロトコルＤ
２Ｌの超純水を、ナノファイバー材料を通してくみ出した。
【０２５７】
洗浄プロトコルＥ
反応媒体を、等体積の１：１−脱イオン水：ＥｔＯＨで置き換え、１時間循環させた。洗浄手順を更に２回繰り返した。最後に、上記媒体をＨ２Ｏ：ＥｔＯＨの２：１混合物で置き換え、１時間循環させた。次いで、誘導体化されたナノファイバーを反応容器から取り出した。最後に、上記媒体をＨ２Ｏ：ＥｔＯＨの２：１混合物で置き換え、１時間循環させた。次いで、誘導体化されたナノファイバーを反応容器から取り出した。
【０２５８】
洗浄プロトコルＦ
反応媒体を超純度の脱イオン水で置き換えたナノファイバー材料を、３０分間清潔な水中で穏やかに撹拌した。この時間の後、洗浄媒体を置き換え、洗浄サイクルを繰り返した。
【０２５９】
洗浄プロトコルＧ
反応媒体を注ぎ出し、流出液のｐＨが中性又は弱酸性になるまでビーカーに水を補充した。
【０２６０】
洗浄プロトコルＨ（ハロヒドリンナノファイバーに対する）
反応媒体を等体積の脱イオン水：アセトンの１：１混合物で置き換え、それを１時間循環させた。この時間の後、洗浄溶液をリフレッシュさせ、勢いよく撹拌しながら更に１時間、ファイバーを洗浄した。この処理を、脱イオン水で更に１時間洗浄する前に、更に３回繰り返した。次いで、誘導体化されたハロヒドリンナノファイバーを反応槽から取り出したところ、次の工程で使える状態であった。
【０２６１】
Ｉ材料の調製
調製例１
相対分子質量２９，０００ｇ／ｍｏｌを有する酢酸セルロースの溶液を、３００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲の直径を有するファイバーをもたらす電界紡糸に先立って、一般的な溶媒に溶解した。ナノファイバー製造に対する最適化された条件は、例えば、Ｏ．Ｈａｒｄｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．４６（２０１１）３８９０に見ることができ、その全体が参照することにより本明細書の一部をなす。およそ２０ｇ／ｍ２の材料のシートを積層し、加熱と加圧を組み合わせた処理に供した。
【０２６２】
実施例１−グリシドール／トリメチルアンモニウムクロリドの官能化
ナノファイバー材料を以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
【０２６３】
【化２４】
2019527617.tif 000026
工程（ｉ）：再生セルロース（ＲＣ）への酢酸セルロース（ＣＡ）のけん化
【０２６４】
【化２５】
2019527617.tif 000027
調製例１の方法に従って得られた酢酸セルロースシート（４４×３２ｍｍ×１５０ｍｍ）を、２：１−水：エタノール中の０．０７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液５Ｌを含む大きなビーカーに入れた。反応混合物を４８時間室温で撹拌した。次いで、上記材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０２６５】
工程（ｉｉ）：グリシドール重合
【０２６６】
【化２６】
2019527617.tif 000028
（ｉ）からの材料を１Ｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨに懸濁した。異なる量の１回分のグリシドール（１５ｍＬ、３０ｍＬ、６０ｍＬ、１２０ｍＬ、１８０ｍＬ）を注意深く添加する前に、反応媒体を１５分間循環させた。反応媒体を室温で１６時間循環させ、材料を洗浄プロトコルＢに従ってその後洗浄した。
【０２６７】
工程（ｉｉｉ）：グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド誘導体化
【０２６８】
【化２７】
2019527617.tif 000029
工程（ｉｉ）で得られた材料を、典型的には１リットルの０．５Ｍ  ＮａＯＨに懸濁した。１回分のグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（２５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ及び２００ｍＬ）の添加に先立って、反応媒体を１５分間循環させた。反応媒体を室温で更に１６時間循環させた。次いで、材料を洗浄プロトコルＣに従って洗浄した。
【０２６９】
トリメチルアンモニウムクロリド含有量を以下の方法によって特定した。５０ｍｇの材料をブフナーフィルター漏斗上で０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液１００ｍＬで洗浄し、次いで、更に１００ｍＬの０．０１Ｍ  ＨＣｌ溶液で洗浄した。次いで、材料を７５℃の乾燥オーブンに入れ、小片に裂く前に一定質量まで乾燥し、次いで５０ｍＬの遠心分離管に入れた。小さなマグネチックスターラーバー及び１５ｍＬの脱イオン化水を、混合物を黄色に変色させるおよそ１ｍＬのクロム酸カリウム溶液（乳首ピペットによって添加した）と共に添加した。混合物を０．１Ｍ硝酸銀で滴定する前に、２０分間勢いよく撹拌した。滴定のエンドポイントは、透明な黄色から褐色がかった色への変色によって識別される。
【０２７０】
滴定で使用したナノファイバー材料のエンドポイント／グラム数に達するように添加された硝酸銀のマイクロモル数として、トリメチルアンモニウムクロリド含有量（μｍｏｌ／ｇ）を計算した。
【０２７１】
実施例２−グリシドール／Ｓ官能化
ナノファイバー材料を以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
【０２７２】
【化２８】
2019527617.tif 000030
工程（ｉ）：再生セルロース（ＲＣ）への酢酸セルロース（ＣＡ）のけん化
【０２７３】
【化２９】
2019527617.tif 000031
調製例１の方法に従って得られた酢酸セルロースシート（（４４×３２ｍｍ×１５０ｍｍ）を、２：１−水：エタノール中の０．０７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液５Ｌを含む大きなビーカーに入れた。反応混合物を室温で４８時間循環させた。次いで、上記材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０２７４】
工程（ｉｉ）：グリシドールの誘導体化
【０２７５】
【化３０】
2019527617.tif 000032
（ｉ）からの材料を１Ｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨに懸濁した。異なる量の１回分のグリシドール（１５ｍＬ、３０ｍＬ、１２０ｍＬ、１８０ｍＬ）を注意深く添加する前に、反応媒体を１５分間循環させた。反応媒体を室温で１６時間循環させ、材料を洗浄プロトコルＢに従ってその後洗浄した。
【０２７６】
工程（ｉｉｉ）：１，４−ブタンスルホンの誘導体化
【０２７７】
【化３１】
2019527617.tif 000033
１Ｍ  ＮａＯＨ（水性）１５０ｍｌからなる反応媒体を５３℃まで加熱した。これに工程（ｉｉ）で得られたグリシドール官能化材料を、１，４−ブタンスルホン（６ｍｌ、５３℃、５８．６ｍｍｏｌ）と共に懸濁した。反応媒体を６０℃で１５分、３０分及び６０分間撹拌した。次いで、材料を洗浄プロトコルＢに従って洗浄した。
【０２７８】
上記材料のスルホン酸（Ｓ）含有量（μｍｏｌ／ｇ）を、滴定によって計算した。（ｉｉｉ）からの乾燥された材料を、０．１Ｍ  ＨＣＬ及び０．０１Ｍ  ＨＣｌで洗浄した。次いで、上記材料をオーブンで乾燥し、計量する。洗浄後、ｐＨ７に達するように添加されたＮａＯＨの量から材料のモル濃度を特定する。
【０２７９】
実施例３−グリシドール／カルボキシメチル（ＣＭ）官能化
ナノファイバー材料を以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
【０２８０】
【化３２】
2019527617.tif 000034
工程（ｉ）：再生セルロース（ＲＣ）への酢酸セルロース（ＣＡ）のけん化
【０２８１】
【化３３】
2019527617.tif 000035
調製例１の方法に従って得られた酢酸セルロースシート（４４×３２ｍｍ×１５０ｍｍ）を、２：１−水：エタノール中の０．０７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液５Ｌを含む大きなビーカーに入れた。反応混合物を４８時間室温で撹拌した。次いで、上記材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０２８２】
工程（ｉｉ）：グリシドール重合
【０２８３】
【化３４】
2019527617.tif 000036
（ｉ）からの材料を１Ｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨに懸濁した。異なる量の１回分のグリシドール（１５ｍＬ、３０ｍＬ、６０ｍＬ、１２０ｍＬ、１８０ｍＬ）を注意深く添加する前に、反応媒体を１５分間循環させた。反応媒体を室温で１６時間循環させ、材料を洗浄プロトコルＢに従ってその後洗浄した。
【０２８４】
工程（ｉｉｉ）：カルボキシメチル（ＣＭ）の誘導体化
【０２８５】
【化３５】
2019527617.tif 000037
（ｉｉ）からの材料を６２℃の水（６６ｍＬ）に懸濁した。水（２７．５ｍＬ）中のクロロ酢酸ナトリウム（１２．８ｇ）溶液を新たに調製した。水（２７．５ｍＬ）中のＫＯＨ（６．２ｇ）溶液も新たに調製した。両方の溶液を、温度を６２℃に維持しながら、１３．７５ｍＬ／時間の速度で上記反応物に添加した。反応物を合計で４時間に亘り６２℃で勢いよく撹拌した。６２℃で４時間後、反応媒体を除去し、流出物のｐＨが中性になるまで、ナノファイバー材料を水の連続フローで洗浄した。次いで、２〜３の安定したｐＨに到達するまで、ビーカーを０．０１Ｍ塩酸水溶液中で撹拌した。
【０２８６】
参照例１−ジメチルアミノ誘導体化ナノファイバー材料を提供するＡＴＲＰ官能化
ナノファイバー材料を以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
【０２８７】
【化３６】
2019527617.tif 000038
工程（ｉ）：再生セルロース（ＲＣ）への酢酸セルロース（ＣＡ）のけん化
【０２８８】
【化３７】
2019527617.tif 000039
調製例１の方法に従って得られた酢酸セルロースシート（４４×３２ｍｍ×１５０ｍｍ）を、２：１−水：エタノール中の０．０７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液５Ｌを含む大きなビーカーに入れた。反応混合物を４８時間室温で撹拌した。次いで、上記材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０２８９】
工程（ｉｉ）：ジビニルスルホン誘導体化
【０２９０】
【化３８】
2019527617.tif 000040
工程（ｉ）で得られた材料を、Ｋ２ＣＯ３（２４．４ｇ、２７５ｍＬのＨ２Ｏ中、１７６．５４ｍｍｏｌのＫ２ＣＯ３）及びアセトニトリル（７５ｍＬ）の溶液に懸濁した。その混合物を、ジビニルスルホン（５０ｍＬ、４９８．１ｍｍｏｌ）の滴下の１５分前に、２．５時間に亘って撹拌した。ジビニルスルホンの添加の完了に際して、上記反応物を更に１．５時間撹拌した。この時間の後、ナノファイバー材料を洗浄プロトコルＣに従って洗浄した。
【０２９１】
工程（ｉｉｉ）
【０２９２】
【化３９】
2019527617.tif 000041
工程（ｉｉ）で得られた材料を、エチレンジアミン（１２５ｍＬ、１８７０ｍｍｏｌ）又は２−メルカプトエチルアミンヒドロクロリド（３７．５ｇ、１６７ｍｍｏｌ）のいずれかを含む３７５ｍＬのＨ２Ｏに懸濁した。その混合物を室温で一晩撹拌した。この時間の後、誘導体化されたナノファイバー材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０２９３】
工程（ｉｖ）：α−ブロモイソブチリル臭化物の誘導体化：
【０２９４】
【化４０】
2019527617.tif 000042
工程（ｉｉｉ）で得られた乾燥材料を遠心分離管に入れ、２ｍＬのアセトニトリル及び０．４ｍＬ（３．２４ｍｍｏｌ）のα−ブロモイソブチリル臭化物を添加した。遠心管を室温で５分間に亘り、オービタルシェーカー上で穏やかに振盪させ、その際、トリエチルアミン（０．４ｍｌ、２．８６ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を１時間振盪させた。この時間の後、誘導体化されたナノファイバー材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０２９５】
工程（ｖ）：ＡＴＲＰ
【０２９６】
【化４１】
2019527617.tif 000043
典型的には、工程（ｉｖ）で得られた誘導体化されたナノファイバー材料を反応容器に入れ、そこに飽和アスコルビン酸２．５ｍＬ、触媒溶液Ａ０．３３ｍｌ及びＮ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド（１．６６ｍＬ、９．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４時間に亘り、オービタルシェーカーで穏やかに振盪した。この時間の後、誘導体化されたナノファイバー材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０２９７】
触媒溶液Ａ
１０ｍｌのＨ２Ｏ及び０．４５ｍＬ（１．６５０ｍｍｏｌ）の１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチルテトラアミンに溶解させた、ＣｕＢｒ２（０．３ｇ、１．３４３ｍｍｏｌ）。
【０２９８】
実施例４−グリシドールグラフト化、アルデヒド官能化、プロテインＡ連結材料
ナノファイバー材料を以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
【０２９９】
【化４２】
2019527617.tif 000044
工程（ｉ）：再生セルロース（ＲＣ）への酢酸セルロース（ＣＡ）のけん化
【０３００】
【化４３】
2019527617.tif 000045
調製例１の方法に従って得られた酢酸セルロースシート（４４×３２ｍｍ×１５０ｍｍ）を、２：１−水：エタノール中の０．０７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液５Ｌを含む大きなビーカーに入れた。反応混合物を４８時間室温で撹拌した。次いで、上記材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０３０１】
工程（ｉｉ）：グリシドール重合
【０３０２】
【化４４】
2019527617.tif 000046
（ｉ）からの材料を１Ｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨに懸濁した。反応媒体を、１回分のグリシドール１８０ｍＬの注意深い添加に先立って、１５分間循環させた。反応媒体を室温で１６時間循環させ、材料を洗浄プロトコルＢに従ってその後洗浄した。
【０３０３】
工程（ｉｉｉ）：アルデヒドへの酸化
【０３０４】
【化４５】
2019527617.tif 000047
（ｉｉ）からの材料をｐＨ５．５に修正された１７．５Ｌの０．０５Ｍ  ＮａＯＡｃバッファーに懸濁した。ＮａＩＯ４の添加に先立って、反応媒体を３０分間循環させた（２００ｇ、０．９４モル、２Ｌの反応媒体に溶解させた）。反応媒体を更に３０分間循環させた。次いで、材料を洗浄プロトコルＣに従って洗浄し、アルデヒド官能化材料を提供した。
【０３０５】
工程（ｉｖ）：プロテインＡのカップリング
工程（ｉｉｉ）からの材料を６ウェルプレートに添加した。各ウェルに、プロテインＡ溶液（ｒＳＰＡ、脱イオン水中、プロテインＡ５０ｍｇ／ｍｌ）を２ｍＬ添加した。そのプレートを、１時間に亘りオービタルシェーカーで穏やかに振盪させた。この時間の後、上清液を除去し、還元緩衝液Ａで置き換え（１ウェル当たり２．５ｍｌ、０．０６０３ｇのＮａ２ＣＯ３（０．５６９ｍｍｏｌ）及び０．３３７ｇのＮａＨＣＯ３（４．０１２ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの脱イオン水に添加して作製される炭酸バッファー１０ｍＬに０．０７６２ｇのＮａＣＮＢＨ３を添加して作製した）、更に１５分間振盪させた。この時間の後、プロテインＡがカップリングされた材料をプロトコルＤに従って洗浄した。
【０３０６】
実施例５−グリシドールグラフト化、ＤＶＳ官能化、プロテインＡ連結材料
ナノファイバー材料を以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
【０３０７】
【化４６】
2019527617.tif 000048
工程（ｉ）：再生セルロース（ＲＣ）への酢酸セルロース（ＣＡ）のけん化
【０３０８】
【化４７】
2019527617.tif 000049
調製例１の方法に従って得られた酢酸セルロースシート（４４×３２ｍｍ×１５０ｍｍ）を、２：１−水：エタノール中の０．０７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液５Ｌを含む大きなビーカーに入れた。反応混合物を４８時間室温で撹拌した。次いで、上記材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０３０９】
工程（ｉｉ）：グリシドール重合
【０３１０】
【化４８】
2019527617.tif 000050
（ｉ）からの材料を１Ｌの１Ｍ  ＮａＯＨに懸濁した。反応媒体を、１回分のグリシドール１８０ｍＬの添加に先立って、１５分間循環させた。反応媒体を室温で１６時間循環させ、材料を洗浄プロトコルＢに従ってその後洗浄した。
【０３１１】
工程（ｉｉｉ）：ジビニルスルホン誘導体化
【０３１２】
【化４９】
2019527617.tif 000051
（ｉｉ）からの材料を、Ｋ２ＣＯ３（４８．８ｇ、０．３５モル）が溶解された５５０ｍＬのＨ２Ｏ及び１５０ｍＬのアセトニトリルからなる溶液に懸濁した。ジビニルスルホン（１００ｍｌ、０．８６モル）の滴下に先立って、反応媒体を１５分間循環させ、その後、反応媒体を更に１．５時間循環させた。次いで、材料を洗浄プロトコルＣに従って洗浄した。
【０３１３】
工程（ｉｖ）：タンパク質−Ａカップリング：
【０３１４】
【化５０】
2019527617.tif 000052
工程（ｉｉｉ）からの材料を、プロテインＡ溶液７０ｍＬ（５０ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ懸濁液であって、これに６６８ｍｇ（Ｎａ２ＣＯ３）及び５８ｍｇのＮａＨＣＯ３、並びにｐＨ１１．１に達するようにＮａＯＨを添加する）に懸濁した。上記溶液を１６時間循環させた。次いで、材料を洗浄プロトコルＤに従って洗浄した。
【０３１５】
参照例２−ＡＴＲＰグラフト化されたプロテインＡカップリングされた材料
ナノファイバー材料を以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
【０３１６】
【化５１】
2019527617.tif 000053
工程（ｉ）：再生セルロース（ＲＣ）への酢酸セルロース（ＣＡ）のけん化
【０３１７】
【化５２】
2019527617.tif 000054
酢酸セルロースシート（５×６５ｃｍ×１００ｃｍ）を、１７．５Ｌリットルの２：１−Ｈ２Ｏ：ＥｔＯＨ中の０．０７５Ｍ  ＮａＯＨに懸濁した。反応媒体を室温で４８時間撹拌した。次いで、上記材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０３１８】
工程（ｉｉ）：α−ブロモアセチル化
【０３１９】
【化５３】
2019527617.tif 000055
（ｉ）からの乾燥材料を、そこに溶解されたα−ブロモイソブチリル臭化物（６．２４ｍＬ、５０．４ｍｍｏｌ）を含むテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２４０ｍｌに懸濁した。反応混合物を０℃に冷却し、次いで、トリエチルアミン（７．２ｍＬ、５１．６ｍｍｏｌ）を滴下した。上記混合物を室温に温める前に、０℃で２時間撹拌した。上記混合物を、室温で更に１６時間撹拌した。この時間の後、誘導体化されたナノファイバー材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０３２０】
工程（ｉｉｉ）：ＡＴＲＰ重合
【０３２１】
【化５４】
2019527617.tif 000056
容器をアセトン５ｍＬ、飽和アスコルビン酸５ｍＬ、ＣｕＢｒ２（３０ｍｇ、０．１３４ｍｍｏｌ）及び１１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラアミン（４５μＬ、０．１６５ｍｍｏｌ）で満たした。（ｉｉ）からの材料を、ジビニルスルホン（２．５ｍＬ、２４．９ｍｍｏｌ）と共に反応混合物に懸濁した。反応混合物を室温で１時間に亘り、オービタルシェーカーで穏やかに振盪した。この時間の後、ナノファイバー材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０３２２】
工程（ｉｖ）：プロテインＡの誘導体化
【０３２３】
【化５５】
2019527617.tif 000057
工程（ｉｉｉ）からの材料の２６ｍｍディスクを６ウェルプレートに入れた。各ディスクに、炭酸緩衝溶液（上に定義される）１ｍＬと共に、プロテインＡ溶液（上に定義される５０ｍｇ／ｍＬ溶液）１ｍＬを添加した。上記ディスクを、１６時間穏やかに振盪した。この時間の後、洗浄プロトコルＤを使用して上記ディスクを洗浄した。
【０３２４】
参照例３−トリメチルアンモニウムクロリド官能化
ナノファイバー材料を以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
工程（ｉ）：再生セルロース（ＲＣ）への酢酸セルロース（ＣＡ）のけん化
【０３２５】
【化５６】
2019527617.tif 000058
調製例１の方法に従って得られた酢酸セルロースシート（４４×３２ｍｍ×１５０ｍｍ）を、２：１−水：エタノール中の０．０７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液５Ｌを含む大きなビーカーに入れた。反応混合物を室温で４８時間循環させた。次いで、上記材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０３２６】
工程（ｉｉ）：グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド誘導体化
【０３２７】
【化５７】
2019527617.tif 000059
工程（ｉ）で得られた材料を、１Ｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨに懸濁した。１回分のグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（２５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ）の添加に先立って、反応媒体を１５分間循環させた。反応媒体を室温で更に１６時間循環させた。次いで、材料を洗浄プロトコルＢに従って洗浄した。
【０３２８】
トリメチルアンモニウムクロリド含有量を以下の方法によって特定した。５０ｍｇの材料をブフナーフィルター漏斗上で０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液１００ｍＬで洗浄し、次いで、更に１００ｍＬの０．０１Ｍ  ＨＣｌ溶液で洗浄した。次いで、材料を７５℃の乾燥オーブンに入れ、小片に裂く前に一定質量まで乾燥し、次いで５０ｍＬの遠心分離管に入れた。小さなマグネチックスターラーバー及び１５ｍＬの脱イオン化水を、混合物を黄色に変色させるおよそ１ｍＬのクロム酸カリウム溶液（乳首ピペットによって添加した）と共に添加した。混合物を０．１Ｍ硝酸銀で滴定する前に、２０分間勢いよく撹拌した。滴定のエンドポイントは、透明な黄色から褐色がかった色への変色によって識別される。
【０３２９】
滴定で使用したナノファイバー材料のエンドポイント／グラム数に達するように添加された硝酸銀のマイクロモル数として、トリメチルアンモニウムクロリド含有量（μｍｏｌ／ｇ）を計算した。
【０３３０】
参照例４−グリシドールグラフト化
工程（ｉ）：再生セルロース（ＲＣ）への酢酸セルロース（ＣＡ）のけん化
【０３３１】
【化５８】
2019527617.tif 000060
調製例１の方法に従って得られた酢酸セルロースシート（４４×３２ｍｍ×１５０ｍｍ）を、２：１−水：エタノール中の０．０７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液５Ｌを含む大きなビーカーに入れた。反応混合物を４８時間室温で撹拌した。次いで、上記材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０３３２】
工程（ｉｉ）：グリシドール重合
【０３３３】
【化５９】
2019527617.tif 000061
（ｉ）からの材料を１Ｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨに懸濁した。異なる量の１回分のグリシドール（１５ｍＬ、３０ｍＬ、６０ｍＬ、１２０ｍＬ、１８０ｍＬ）を注意深く添加する前に、反応媒体を１５分間循環させた。反応媒体を室温で１６時間循環させ、その材料を洗浄プロトコルＧに従ってその後洗浄した。
【０３３４】
実施例６−グリシドールグラフト化、ＤＶＳ官能化、プロテインＡ連結材料に対する代替プロトコル
ナノファイバー材料を以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
【０３３５】
【化６０】
2019527617.tif 000062
工程（ｉ）：グリシドールの重合及びけん化
ＣＡナノファイバー材料（１１×８０ｍｍ×５０ｍｍ）を取得し、それを１Ｌの脱イオン水に懸濁することによって、ＣＡナノファイバー材料のグリシドールの重合及びけん化を達成した。更に１Ｌの脱イオン水でリフレッシュする前に、溶媒を３時間循環させた。この処理を４回繰り返した後に、ナノファイバー材料を３５０ｍＬの１Ｍ  ＫＯＨに懸濁した。変動する量のグリシドール（１００ｍＬ）を注意深く添加する前に反応媒体を６０分間循環させ、ここでは１回分として２５％のグリシドールを添加し、残部を９０分間に亘って滴下した。反応媒体を室温で４時間循環させ、材料を洗浄プロトコルＢに従ってその後洗浄した。
【０３３６】
工程（ｉｉ）：ジビニルスルホンの誘導体化
【０３３７】
【化６１】
2019527617.tif 000063
（ｉ）からの材料を、Ｋ２ＣＯ３（４８．８ｇ、０．３５モル）が溶解された５５０ｍＬのＨ２Ｏ及び１５０ｍＬのアセトニトリルからなる溶液に懸濁した。ジビニルスルホン（１００ｍｌ、０．８６モル）の滴下に先立って、反応媒体を１５分間循環させ、その後、反応媒体を更に１．５時間循環させた。次いで、材料を洗浄プロトコルＣに従って洗浄した。
【０３３８】
工程（ｉｉｉ）：プロテインＡカップリング：
【０３３９】
【化６２】
2019527617.tif 000064
工程（ｉｉ）からの材料を、プロテインＡ溶液７０ｍＬ（５０ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ懸濁液であって、これに６６８ｍｇ（Ｎａ２ＣＯ３）及び５８ｍｇのＮａＨＣＯ３、並びにｐＨ１１．１に達するようにＮａＯＨを添加する）に懸濁した。上記溶液を１６時間循環させた。次いで、材料を洗浄プロトコルＤに従って洗浄した。
【０３４０】
実施例７−ハロヒドリンの形成及び誘導体化
ナノファイバー材料を以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
【０３４１】
【化６３】
2019527617.tif 000065
工程（ｉ）：再生セルロース（ＲＣ）への酢酸セルロース（ＣＡ）のけん化
【０３４２】
【化６４】
2019527617.tif 000066
調製例１の方法に従って得られた酢酸セルロースシート（１１×８０ｍｍ×５０ｍｍ）を、２：１−水：エタノール中の０．０７５Ｍの水酸化ナトリウム溶液５Ｌを含む大きなビーカーに入れた。反応混合物を４８時間室温で撹拌した。次いで、上記材料を洗浄プロトコルＡに従って洗浄した。
【０３４３】
工程（ｉｉ）：グリシドール重合
【０３４４】
【化６５】
2019527617.tif 000067
（ｉ）からの材料を、３５０の１Ｍ  ＫＯＨに懸濁した。変動する量のグリシドール（６０ｍＬ）を注意深く添加する前に、反応媒体を６０分間循環させ、ここでは１回分として２５％のグリシドールを添加し、残部を９０分間に亘って滴下した。反応媒体を室温で４時間循環させ、材料を洗浄プロトコルＢに従ってその後洗浄した。
【０３４５】
工程（ｉｉｉ）アリルグリシジルエーテル誘導体化
【０３４６】
【化６６】
2019527617.tif 000068
（ｉｉ）からの材料を１Ｌの１Ｍ  ＫＯＨに懸濁した。２５％のアリルグリシジルエーテルを最初に添加し、続いて９０分間に亘って残部を滴下することにより、異なる量（２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬ）のアリルグリシジルエーテルを添加した。室温で４時間撹拌することにより上記反応を維持した。この時間の後、上記材料を洗浄プロトコルＢに従ってその後洗浄した。
【０３４７】
工程（ｉｖ）：ハロヒドリン形成
【０３４８】
【化６７】
2019527617.tif 000069
（ｉｉｉ）からの材料を、２５ｇのＮ−ブロモスクシンイミドが溶解された１Ｌの３：１−Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮに懸濁した。反応媒体を４時間に亘って上記材料を通して循環させた。この時間の後、反応媒体を洗浄プロトコルＨに従って除去し、残りの物質を洗浄した。
【０３４９】
工程（ｖ）：タンパク質の固定化
【０３５０】
【化６８】
2019527617.tif 000070
工程（ｉｖ）からの単一ストリップの材料をポリエチレンパウチに入れた。次いで、このパウチにプロテインＡ溶液２５ｍＬ（５０ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ懸濁液であって、これに６６８ｍｇ（Ｎａ２ＣＯ３）及び５８ｍｇのＮａＨＣＯ３、並びにｐＨ１１．１に達するようにＮａＯＨを添加する）を添加した。パウチを密閉し、得られた混合物を１６時間に亘ってオービタルシェーカーでゆっくりと振盪させた。この時間後、誘導体化された材料をパウチから取り出し、洗浄プロトコルＨに従って洗浄した。
【０３５１】
実施例８−ハロヒドリンの形成及び誘導体化の代替法
ナノファイバー材料を以下に概説されるスキームに従って誘導体化した：
【０３５２】
【化６９】
2019527617.tif 000071
工程（ｉ）：グリシドールの重合及びけん化
【０３５３】
【化７０】
2019527617.tif 000072
ＣＡナノファイバー材料（６×１２０ｍｍ×９０ｍｍ）を取得し、それを１Ｌの脱イオン水に懸濁することによって、ＣＡナノファイバー材料のグリシドールの重合及びけん化を達成した。更に１Ｌの脱イオン水でリフレッシュする前に、溶媒を３時間循環させた。この処理を４回繰り返した後に、ナノファイバー材料を３５０ｍＬの１Ｍ  ＫＯＨに懸濁した。グリシドール１００ｍＬを注意深く添加する前に反応媒体を５分間循環させ、ここでは１回分として２５％のグリシドールを添加し、残部を９０分間に亘って滴下した。反応媒体を室温で４時間循環させ、材料を洗浄プロトコルＢに従ってその後洗浄した。
【０３５４】
工程（ｉｉ）アリルグリシジルエーテル誘導体化
【０３５５】
【化７１】
2019527617.tif 000073
（ｉ）からの材料を３５０Ｌの１Ｍ  ＫＯＨに懸濁した。２５％アリルグリシジルエーテルを最初に添加し、続いて９０分間に亘って残部を滴下することにより、異なる量（２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬ）のアリルグリシジルエーテルを添加した。室温で６時間撹拌することにより上記反応を維持した。この時間の後、上記材料を洗浄プロトコルＢに従ってその後洗浄した。
【０３５６】
より少ない量のアリルグリシジルエーテルの使用は、特に有益な流れ特性を有する材料をもたらした。より多い量のアリルグリシジルエーテルの使用は、より高い結合容量を有する材料をもたらした。
【０３５７】
工程（ｉｉｉ）：ハロヒドリン形成
【０３５８】
【化７２】
2019527617.tif 000074
（ｉｉ）からの材料を、２５ｇのＮ−ブロモスクシンイミドが溶解された１Ｌの３：１−Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮに懸濁した。反応媒体を４時間に亘って上記材料を通して循環させた。この時間の後、反応媒体を洗浄プロトコルＨに従って除去し、残りの物質を洗浄した。
【０３５９】
工程（ｉｖ）：タンパク質の固定化
【０３６０】
【化７３】
2019527617.tif 000075
工程（ｉｉｉ）からの単一ストリップの材料をポリエチレンパウチに入れた。次いで、このパウチにプロテインＡ溶液２５ｍＬ（５０ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ懸濁液であって、これに６６８ｍｇ（Ｎａ２ＣＯ３）及び５８ｍｇのＮａＨＣＯ３、並びに１Ｍ  ＮａＯＨ（ｐＨ１１．１に達するように）を添加する）を添加した。パウチを密閉し、得られた混合物を１６時間に亘ってオービタルシェーカーでゆっくりと振盪させた。この時間後、誘導体化された材料をパウチから取り出し、洗浄プロトコルＨに従って洗浄した。
【０３６１】
ＩＩ分析法
実施例９−動的結合容量の決定
充填材料を、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のホルダ内に含まれる、選択され官能化されたナノファイバーディスクに通した。上記材料を、ホルダアウトレットがＵＶフローセルによって特定されるその充填材料の１０％を超えた後の濃度まで、毎分流量（ｍＶ／分）当たりの所定のメンブレン体積の下で充填した。システム及びホルダ装置におけるデッドボリュームを考慮して、１０％ブレイクスルーでディスクに充填されたタンパク質の総量を、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるクロマトグラムの分析によって決定した。
【０３６２】
陰イオン交換物質については、充填剤は、ｐＨ８までの１０ｍＭのＴｒｉｓ中の１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡであった。陽イオン交換材料については、充填材料は、酢酸ナトリウムｐＨ４．７  １０ｍＭ中の１ｍｇ／ｍＬのリゾチームであった。
【０３６３】
実施例１０−流れ抵抗の決定
選択され官能化されたナノファイバー材料に対する圧力低下（ΔＰ）を、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して決定した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）のバッファーをホルダに含まれる官能化されたナノファイバーディスクに通した。デルタカラム圧力（ΔＰ）が０．５ＭＰａと等しい流量を記録した。
【０３６４】
ＩＩＩ特定材料の分析及び比較
実施例１１−本発明による別々のグラフト化工程の追加による電荷密度とトリメチルアンモニウム官能化の関係
材料が陰イオン交換体として作用することを可能にするトリメチルアンモニウム官能性をもたらすため、参照例３に従って材料を製造し、試験した。これらを、実施例１に従ってもたらされ分析された、本発明のグラフト化材料と比較した。
【０３６５】
トリメチルアンモニウム官能化材料に対して得られた電荷密度を、図４に示す。図４中の測定点のそれぞれに対する平均値を、図５にプロットする。
【０３６６】
設定された量の官能化試薬ＧＭＡＣを使用する場合、グラフト量を増加させることは電荷密度に著しい影響を及ぼさないことが図４及び図５から明らかである。
【０３６７】
参照例５−電荷密度とトリメチルアンモニウム官能化の関係
材料が陰イオン交換体として作用することを可能にするトリメチルアンモニウム官能性をもたらすため、参照例３に従って材料を製造し、試験した。結果を図２に示す。
【０３６８】
グラフト化工程がなかった場合、官能化物質（グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド）の量を増加させることによって電荷密度を増加させることが、図２からわかる。
【０３６９】
実施例１２−本発明による別々のグラフト化工程の追加による動的結合容量（ＤＢＣ）とトリメチルアンモニウム官能化の関係
実施例１１で分析したのと同じ材料に対する動的結合容量（ＤＢＣ）を、実施例９の方法を使用して決定した。
【０３７０】
実施例１に従って製造された本発明の材料のＤＢＣプロットを、図６に示す。これらの材料のＤＢＣを、図７において本発明（すなわち参照例３の材料）の２段階グラフト化処理を経ていないものと比較する。
【０３７１】
本発明に従ってもたらされたグラフト化された材料の結合容量は、グラフト化が使用されていない場合のものの４倍超高いことがわかる。グラフト化されていない材料について参照例６（下記）で見られるものとは対照的に、電荷密度が一定に保持されるであるグラフト化された材料について、グラフト量を増加させることは材料の結合容量の増加を生じさせることが明らかである。
【０３７２】
参照例６−トリメチルアンモニウムクロリド材料に対する、電荷密度と動的結合容量（ＤＢＣ）の関係
材料が陰イオン交換体として作用することを可能にするトリメチルアンモニウム官能性をもたらすため、参照例３に従って材料を製造し、試験した。これらの材料の動的結合容量を実施例９に従って決定した。
【０３７３】
結果を図３に示す。
【０３７４】
当業者によって予想されたように、グラフト化工程がなかった場合、官能化物質の量を増加させることにより、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリドが結合容量を増加させることが図３からわかる。
【０３７５】
実施例１３−本発明による別々のグラフト化工程の追加による電荷密度とスルホン酸（Ｓ）官能化の関係
材料が陽イオン交換材料として作用することを可能とするため、本発明の材料にＳ官能性を与え、実施例２に従って分析した。
【０３７６】
実施例２で述べられるように、材料のスルホン酸含有量を特定した。結果を図８に示す。材料の電荷密度により大きな影響を及ぼすのは、官能化工程よりもグラフト化工程であることを観察することができる。
【０３７７】
実施例１４−本発明による別々のグラフト化工程の追加による動的結合容量（ＤＢＣ）とスルホン酸（Ｓ）官能化の関係
実施例２に従って製造された材料に対する動的結合容量（ＤＢＣ）を、実施例９の方法を使用して決定した。結果を図９に示す。
【０３７８】
また、実施例１３に見られるように、グラフト化工程と官能化工程の間に相互依存があることが図９からわかる。本発明に従って作製されたこれらの材料は、１６０メンブレン体積（ｍＶ）／分の流量で４７ｍｇ／ｍＬ〜２０７ｍｇ／ｍＬの結合容量をもたらした。
【０３７９】
実施例１５−本発明による別々のグラフト化工程の追加による動的結合容量（ＤＢＣ）とカルボキシメチル（ＣＭ）官能化の関係
材料が実施例３に従って陽イオン交換材料として作用することを可能とするため、本発明の材料にカルボキシメチル（ＣＭ）官能性を与えた。本発明に関連するこれらの材料に対する動的結合容量（ＤＢＣ）を、実施例９の方法を使用して決定した。結果を図１０に示す。
【０３８０】
本発明に従って製造される材料は、１６０ｍＶ／分の流量で２０ｍｇ／ｍＬ〜１４９ｍｇ／ｍＬの結合容量に達し得ることが図１０からわかる。
【０３８１】
参照例７−ＡＴＲＰグラフト化を使用するジメチルアミノ−誘導体化材料の結合容量
材料が参照例１に従って陰イオン交換メンブレンとして作用することを可能とするため、本発明による材料にジメチルアミノ基官能性を与えた。本発明のこれらの材料に対する動的結合容量（ＤＢＣ）を、実施例９の方法を使用して決定した。
【０３８２】
実施例１６−ポリマーグラフト化の程度と設定された電荷密度での流れ抵抗の関係
実施例１１において分析されたのと同じ材料の流れ抵抗を、実施例１０の方法を使用して決定した。
【０３８３】
このアッセイによる結果を図１１に示す。これは、電荷−官能化材料に対する、ポリマーグラフト化の程度と流れ抵抗の明らかな関係を示す。また、電荷密度及び流れ抵抗の明らかな関係を見ることができる。
【０３８４】
参照例８−グラフト化後のＯＨ密度の特定
参照例４に従って産生された材料の試料を取り除き、豊富な量の水（ブフナー漏斗を使用して）で洗浄した後、一定質量まで乾燥した。次いで、試料を５０ｍＬ遠心分離管に計量し、断片化した。１０ｍＬちょうどのｐ−トルエンスルホニルイソシアネート（アセトニトリル５００ｍＬ中、ｐ−トルエンスルホニルイソシアネート２０ｍＬ）をチューブに添加した。遠心分離管に小さな撹拌棒を追加し、次いで、密閉して６０℃の水浴に入れ、６０分間撹拌した。この時間の後、試料を２０ｍｌのＨ２Ｏで希釈し、更に１０分間撹拌した。次いで、４０ｍＬのイソプロパノールを添加し、自動滴定装置（ＣＡ  ＯＨ滴定の方法を使用する）で０．４８１Ｍ  Ｂｕ４ＮＯＨを使用して滴定する前に、更に１０分間試料を撹拌した。
【０３８５】
滴定曲線において２つの変曲点が観察される。１つ目はおよそｐＨ５．５（ＶＥＰ１）で生じ、２つ目はおよそｐＨ９．５（ＶＥＰ２）で生じる。試料中に存在する遊離ＯＨの量を以下に従って計算した：
ＯＨＶ＝（（ＶＥＰ２−ＶＥＰ１＊ｆ＊ｃ（ＴＢＡＨ）＊ＭＡ））／ｍｓ
ＯＨＶ：ＫＯＨ／ｇ試料中の試料のヒドロキシ価
ＶＥＰ１：ｍＬ単位の第１の当量点までの滴定液消費量
ＶＥＰ２：ｍＬ単位の第２の当量点までの滴定液消費量
Ｃ（ＴＢＯＡＨ）：ｍｏｌ／Ｌ単位のテトラブチルアンモニウムクロリドの濃度
Ｆ：単位のない補正係数（滴定濃度）
Ｍａ：ＫＯＨの分子量；ここでは５６．１１ｇ／ｍｏｌ
Ｍｓ：ｇ単位の試料サイズ
参照例５に従って産生された材料の分析は、この特定の基体及びグラフト化方法について、グリシドール試薬の量を変動させることにより、６０００μｍｏｌ／ｇ余りの−ＯＨ基密度を有する材料をもたらすことを示す。これを図１３に示す。
【０３８６】
参照例９−帯電していない材料に対する流れ抵抗に対するポリマーグラフト化を増加することの効果
材料を参照例４に従って異なる量のグリシドールで処理し、各材料（及びグラフト化されていないＲＣ材料に対して）の流れ抵抗を実施例１０で述べられるアッセイを使用して測定した。結果を図１２に示す。
【０３８７】
種々のグラフト率を有する帯電していない材料に対するフローに関して圧力低下に認識可能な増加はないことが、図１２からわかる。したがって、グラフト率の増加を伴う材料では、認識可能な閉塞している孔がないと結論付けることができる。一旦、材料が帯電した基で官能化されると、実施例１６（上記）及び図１１で報告されるように、グラフト化量と流れ抵抗の関係が見られることを明確に観察することができる。
【０３８８】
実施例１７−本発明の材料の生産性
本発明の多くの材料に対する、容量（ＤＢＣ）及び生産性の値を特定した。得られた結果を表１に示す。
【０３８９】
表１：本発明において特許請求の範囲に記載される材料の容量及び生産性
【０３９０】
【表１】
2019527617.tif 000076
比較例１
様々な商業的に入手可能な多孔質ビーズ材料に対する結合容量、滞留時間及び生産性の値を、製造業者から得た。得られた結果を表２に示す。
【０３９１】
表２：多孔質ビーズの結合容量及び生産性の例
【０３９２】
【表２】
2019527617.tif 000077
比較例２
Ａ）Ｃａｐｔｏ  Ｑ及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びＢ）Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ９に対して、滞留時間の関数として動的結合容量を決定した。得られた結果を図１に示す。これは、２分未満の滞留時間は、これらの大規模多孔質ビーズカラムおいて可能ではないことを示す。
【０３９３】
１  ２０１６年３月３０日にアクセス：
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｇｅｈｃｌｓ＿ｉｍａｇｅｓ／ＧＥＬＳ／Ｒｅｌａｔｅｄ％２０Ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｆｉｌｅｓ／１３３５３５９５２２４１８／ｌｉｔｄｏｃ１１００２５７６＿２０１２０５１４１８１５４５．ＰＤＦ
２  ５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーｐＨ８．０中、ベッド高さ１０ｃｍのＴｒｉｃｏｒｎ５／１００カラムにおいて６００ｃｍ／時、滞留時間１分で測定される１０％ブレイクスルーにおける動的結合容
３  ２０１６年３月３０日にアクセス：
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｇｅｈｃｌｓ＿ｉｍａｇｅｓ／ＧＥＬＳ／Ｒｅｌａｔｅｄ％２０Ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｆｉｌｅｓ／１３３５３５９５２２４１８／ｌｉｔｄｏｃ１１００２５７６＿２０１２０５１４１８１５４５．ＰＤＦ
４  ３０ｍＭ、ｐＨ６．８のリン酸ナトリウムバッファー中、ベッド高さ１０ｃｍのＴｒｉｃｏｒｎ（商標）５／１００カラムにおいて６００ｃｍ／時、滞留時間１分で測定される１０％ブレイクスルーにおける動的結合容量
５  ２０１６年３月３０日にアクセス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｗｅｂａｐｐ／ｗｃｓ／ｓｔｏｒｅｓ／ｓｅｒｖｌｅｔ／ｃａｔａｌｏｇ／ｅｎ／ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ−ｕｋ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅＰｒｏｄｕｃｔＳｔｒｕｃｔｕｒｅ＿１７３７２／１７５４３８０１
６  ベッド高さ２０ｃｍのカラムにおける５００ｃｍ／時の移動相速度における前端分析による１０％ブレイクスルーでの判定。
７  ２０１６年３月３０日にアクセス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｗｅｂａｐｐ／ｗｃｓ／ｓｔｏｒｅｓ／ｓｅｒｖｌｅｔ／ｃａｔａｌｏｇ／ｅｎ／ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ−ｕｋ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅＰｒｏｄｕｃｔＳｔｒｕｃｔｕｒｅ＿１７３７２／１７５４７４０１
８  ベッド高さ１０ｃｍのカラムにおける１００ｃｍ／時の移動相速度における前端分析による１０％ブレイクスルーでの判定。
９  ２０１６年３月３０日にアクセス
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｇｅｈｃｌｓ＿ｉｍａｇｅｓ／ＧＥＬＳ／Ｒｅｌａｔｅｄ％２０Ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｆｉｌｅｓ／１３３５３５９５２２４１８／ｌｉｔｄｏｃ１１００２５７６＿２０１２０５１４１８１５４５．ＰＤＦ
比較例３
結合容量、滞留時間及び生産性の値を、様々な商業的に入手可能なメンブレン及びモノリス材料について、製造業者のデータから特定した。得られた結果を表３に示す。
【０３９４】
表３：メンブレン及びモノリスの容量及び生産性の例
【０３９５】
【表３】
2019527617.tif 000078
１０  ２０１６年３月３０日にアクセス：：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓａｒｔｏｒｉｕｓ．ｃｏ．ｕｋ／ｆｉｌｅａｄｍｉｎ／ｆｍ−ｄａｍ／ｓａｒｔｏｒｉｕｓ＿ｍｅｄｉａ／Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ＿Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｍｅｍｂｒａｎｅ＿Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｄａｔａ＿Ｓｈｅｅｔｓ／Ｄａｔａ＿Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ−７５−ｐｌｕｓ−１５０ｍｌ＿ＳＬ−２０８６−ｅ．ｐｄｆ
１１  厚さ８ｍｍの１５０ｍＬメンブレンを通る０．７５Ｌ／分の推奨流量
１２  ２０１６年３月３０日にアクセス
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｇｅｈｃｌｓ＿ｉｍａｇｅｓ／ＧＥＬＳ／Ｒｅｌａｔｅｄ％２０Ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｆｉｌｅｓ／１３３５３５９５２２４１８／ｌｉｔｄｏｃ１１００２５７６＿２０１２０５１４１８１５４５．ＰＤＦ
１３  厚さ８ｍｍの１５０ｍＬメンブレンを通る０．７５Ｌ／分の推奨流量
１４  ２０１６年３月３０日にアクセス：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓａｒｔｏｒｉｕｓ．ｃｏ．ｕｋ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｐｒｏｄｕｃｔ−ｄｅｔａｉｌ／９３ｐｒａｐ０６ｈｂ−１２−ａ／
１５  ２ｍＬのベッドボリューム、１０ｍｇ／単位〜１５ｍｇ／単位
１６  ５ｍｌ／分〜１０ｍｌ／分、ベッドボリューム２ｍＬ
１７  ベッドボリューム８ｍＬ、容量が１６ｍＬ／分を示した流量
１８  ２０１６年３月３０日にアクセス  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ／ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ／ｃａｔｅｇｏｒｙ／３０−ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｄｏｗｎｌｏａｄ／ｆｉｌｅ＿ｉｄ−２００８
１９  ２０１６年３月３０日にアクセス  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ／ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ／ｃａｔｅｇｏｒｙ／３０−ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｄｏｗｎｌｏａｄ／ｆｉｌｅ＿ｉｄ−２０２４
２０  ベッドボリューム８ｍＬ、容量が１６ｍＬ／分を示した流量
２１  ２０１６年３月３０日にアクセス  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ／ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ／ｃａｔｅｇｏｒｙ／２９−ａｆｆｉｎｉｔｙ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｄｏｗｎｌｏａｄ／ｆｉｌｅ＿ｉｄ−１９７０
２２  ベッドボリューム８ｍＬ、容量が８ｍＬ／分を示した流量
本発明の更に一般的な態様
１．官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法であって、
（ｉ）１つ以上のポリマーナノファイバーから形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）上記基体から１つ以上の中性のポリマー鎖をグラフト化すること、及び
（ｉｉｉ）１つ以上の帯電した基を前記グラフト化生成物に導入することによって、上記グラフト化生成物を、クロマトグラフィー媒体として上記工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させることを含む、官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法。
【０３９６】
２．工程（ｉｉ）で導入される上記ポリマーの量が、グラフト化生成物の５００μｍｏｌ／ｇ〜６０，０００μｍｏｌ／ｇである、態様１に記載の方法。
【０３９７】
３．上記工程（ｉｉｉ）の生成物の帯電密度が、クロマトグラフィー媒体の１００μｍｏｌ／ｇ〜２，０００μｍｏｌ／ｇである、態様１又は態様２に記載の方法。
【０３９８】
４．上記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体に対する圧力低下が、液相を０．０５ｍｍ〜１０ｍｍの厚さの媒体に毎分１メンブレン体積〜６４０メンブレン体積の流量で通過させる場合、２ＭＰａ未満である、態様１乃至態様３のいずれか一つに記載の方法。
【０３９９】
５．上記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の生産性が、５０ｍｇ／ｍＬ／分〜７５０００ｍｇ／ｍＬ／分である、態様１乃至態様４のいずれか一つに記載の方法。
【０４００】
６．上記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の生産性が、２００ｍｇ／ｍｌ／分超である、態様１乃至態様５のいずれか一つに記載の方法。
【０４０１】
７．上記グラフト化工程（ｉｉ）が、上記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の動的結合容量（ＤＢＣ）を増加させる効果を有する、態様１乃至態様６のいずれか一つに記載の方法。
【０４０２】
８．上記基体からの１つ以上の中性ポリマー鎖のグラフト化が、任意に１つ以上の触媒の存在下で、上記基体上に存在する１つ以上の官能基から１つ以上のポリマー鎖を成長させることを含む、態様１乃至態様７のいずれか一つに記載の方法。
【０４０３】
９．上記基体が、工程（ｉ）〜工程（ｉｉ）の間に処理されて上記１つ以上の官能基が導入される、又は上記基体が工程（ｉ）〜工程（ｉｉ）の間に処理されて上記基体上任意の官能基が脱保護若しくは活性化される、又は上記基体が工程（ｉ）〜（ｉｉ）の間に処理されて、上記基体上の上記官能基の数／密度が増加される、態様８に記載の方法。
【０４０４】
１０．上記官能基がヒドロキシル基、アミノ基又はカルボン酸基である、態様８又は態様９に記載の方法。
【０４０５】
１１．１つ以上のポリマー鎖を成長させることが、任意に、１つ以上の触媒の存在下で、上記基体上に存在する１つ以上の官能基から複数のモノマーを重合することを含む、態様８乃至態様１０のいずれか一つに記載の方法。
【０４０６】
１２．上記１つ以上のポリマー鎖が、分岐鎖である、態様８乃至態様１１のいずれか一つに記載の方法。
【０４０７】
１３．ポリマー鎖を成長させることが、上記基体上に存在する１つ以上の官能基からグリシドールを重合することを含む、態様８乃至態様１２のいずれか一つに記載の方法。
【０４０８】
１４．上記１つ以上のポリマー鎖が１つ以上のポリグリセロール鎖である、態様１乃至態様１３のいずれか一つに記載の方法。
【０４０９】
１５．工程（ｉｉ）が、式
【０４１０】
【化７４】
2019527617.tif 000079
の複数の化合物、及びそのエナンチオマーを、上記ナノファイバー基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることを含む、態様１乃至態様１４のいずれか一つに記載の方法。
【０４１１】
１６．工程（ｉｉｉ）において、上記試薬が、上記得られた官能化クロマトグラフィー媒体が陰イオン交換クロマトグラフィー法における使用に対して適するように、上記グラフト化生成物を官能化する、態様１乃至態様１５のいずれか一つに記載の方法。
【０４１２】
１７．態様１６に記載の方法であって、
−上記クロマトグラフィー法が陽イオン交換法であり、前記試薬が１つ以上のカルボキシレート、スルホネート若しくはホスホネートの部分を含む１つ以上の帯電した基によって上記クロマトグラフィー媒体を官能化する；又は
−上記クロマトグラフィー法が陰イオン交換法であり、上記試薬が１つ以上の第四級アミノ若しくはジエチルアミンの部分を含む１つ以上の帯電した基によって上記クロマトグラフィー媒体を官能化する、態様１６に記載の方法。
【０４１３】
１８．上記基体がメンブレンの形態である、態様１乃至態様１７のいずれか一つに記載の方法。
【０４１４】
１９．上記ポリマーが、セルロース、酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリエチレンオキシド及びそれらの混合物からなる群から選択される、態様１乃至態様１８のいずれか一つに記載の方法。
【０４１５】
２０．上記ナノファイバーが１０ｎｍ〜１０００ｎｍの平均径を有する、態様１乃至態様１９のいずれか一つに記載の方法。
【０４１６】
２１．態様１乃至態様２０のいずれか一つに記載の方法であって、
（ｉ）１つ以上のセルロースナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）式
【０４１７】
【化７５】
2019527617.tif 000080
の複数の化合物、及びそのエナンチオマーを、基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることによって、上記基体から１つ以上のポリグリセロールポリマー鎖をグラフト化すること、及び
（ｉｉｉ）上記グラフト化生成物を、イオン交換クロマトグラフィー法における使用に対して適したクロマトグラフィー媒体として上記工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させること、を含む、態様１乃至態様２０のいずれか一つに記載の方法。
【０４１８】
２２．態様１乃至態様２１のいずれか一つに記載の方法によって入手可能な、官能化されたクロマトグラフィー媒体。
【０４１９】
２３．クロマトグラフィーカートリッジを作製する方法であって、態様１乃至態様２１のいずれか一つに記載の方法を行うこと、そのようにして得られた生成物をカートリッジに組み込むこと、を含むクロマトグラフィーカートリッジを作製する方法。
【０４２０】
２４．（ａ）態様２３の方法によって入手可能である、又は（ｂ）態様２２に記載の１つ以上の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む、クロマトグラフィーカートリッジ。
【０４２１】
２５．クロマトグラフィーにおける、態様２２に記載の官能化されたクロマトグラフィー媒体又は態様２４に記載のクロマトグラフィーカートリッジの使用。
【０４２２】
２６．移動相から１つ以上の生体分子を単離する方法であって、移動相中の１つ以上の生体分子を、態様２２に記載の官能化されたクロマトグラフィー媒体又は態様２４に記載のクロマトグラフィーカートリッジと接触させることを含む、移動相から１つ以上の生体分子を単離する方法
２７．移動相中の上記１つ以上の生体分子を、１分以下の時間に亘って上記官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触させる、態様２６に記載の方法。
【０４２３】
２８．官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法であって、
（ｉ）１つ以上のポリマーナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）上記基体から１つ以上の中性ポリマー鎖をグラフト化すること、及び
（ｉｉｉ）上記グラフト化生成物を、クロマトグラフィー媒体として上記工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させること、を含む官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法。
【０４２４】
２９．工程（ｉｉ）で導入される上記ポリマーの量が、上記グラフト化生成物の５００μｍｏｌ／ｇ〜６０，０００μｍｏｌ／ｇである、態様２８に記載の方法。
【０４２５】
３０．上記グラフト化生成物を試薬と接触させる工程が、クロマトグラフィー媒体としての使用に適した１つ以上のリガンド基を含む上記官能化生成物を与える１つ以上のリガンド基を、上記グラフト化生成物に導入する、態様２８又は態様２９に記載の方法。
【０４２６】
３１．上記工程（ｉｉｉ）の生成物における上記リガンド基の密度が、クロマトグラフィー媒体の１００μｍｏｌ／ｇ〜２，５００μｍｏｌ／ｇである、態様３０に記載の方法。
【０４２７】
３２．上記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体に対する圧力低下が、液相を０．０５ｍｍ〜１０ｍｍの厚さの媒体に毎分１メンブレン体積〜６４０メンブレン体積の流量で通過させる場合、２ＭＰａ未満である、態様２８乃至態様３１のいずれか一つに記載の方法。
【０４２８】
３３．上記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の生産性が、５０ｍｇ／ｍＬ／分〜７５０００ｍｇ／ｍＬ／分である、態様２８乃至態様３２のいずれか一つに記載の方法。
【０４２９】
３４．上記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の生産性が、２００ｍｇ／ｍｌ／分超である、態様２８乃至態様３３のいずれか一つに記載の方法。
【０４３０】
３５．上記グラフト化工程（ｉｉ）が、上記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の動的結合容量（ＤＢＣ）を増加させる効果を有する、態様２８乃至態様３４のいずれか一つに記載の方法。
【０４３１】
３６．上記基体から１つ以上の中性ポリマー鎖をグラフト化することが、任意に、１つ以上の触媒の存在下で、上記基体上に存在する１つ以上の官能基から１つ以上のポリマー鎖を成長させることを含む、態様２８乃至態様３５のいずれか一つに記載の方法。
【０４３２】
３７．上記基体が、工程（ｉ）〜工程（ｉｉ）の間に処理されて上記１つ以上の官能基が導入される、又は上記基体が工程（ｉ）〜工程（ｉｉ）の間に処理されて上記基体上任意の官能基が脱保護若しくは活性化される、又は上記基体が工程（ｉ）〜（ｉｉ）の間に処理されて、上記基体上の上記官能基の数／密度が増加される、態様３６に記載の方法。
【０４３３】
３８．上記官能基がヒドロキシル基、アミノ基又はカルボン酸基である、態様３６又は態様３７に記載の方法。
【０４３４】
３９．１つ以上のポリマー鎖を成長させることが、任意に、１つ以上の触媒の存在下で、上記基体上に存在する１つ以上の官能基から複数のモノマーを重合することを含む、態様３６乃至態様３８のいずれか一つに記載の方法。
【０４３５】
４０．上記１つ以上のポリマー鎖が分岐鎖である、態様３６乃至態様３９のいずれか一つに記載の方法。
【０４３６】
４１．成長しているポリマー鎖が、基体上に存在する１つ以上の官能基からグリシドールを重合することを含む、態様３６乃至態様４０のいずれか一つに記載の方法。
【０４３７】
４２．上記１つ以上のポリマー鎖が１つ以上のポリグリセロール鎖である、態様２８乃至態様４１のいずれか一つに記載の方法。
【０４３８】
４３．工程（ｉｉ）が、式
【０４３９】
【化７６】
2019527617.tif 000081
の複数の化合物、及びそのエナンチオマーを、ナノファイバー基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることを含む、態様２８乃至態様４２のいずれか一つに記載の方法。
【０４４０】
４４．工程（ｉｉｉ）において、上記試薬が、上記得られた官能化クロマトグラフィー媒体がイオン交換、親和性捕捉、疎水的相互作用及びミックスモード法からなる群から選択されるクロマトグラフィー法における使用に適するように、上記生成物を官能化する、態様２８乃至態様４３のいずれか一つに記載の方法。
【０４４１】
４５．−上記クロマトグラフィー法が陽イオン交換法であり、上記試薬が１つ以上のカルボキシレート、スルホネート若しくはホスホネートの部分を含む１つ以上の帯電した基によって上記クロマトグラフィー媒体を官能化する；
−上記クロマトグラフィー法が陰イオン交換法であり、上記試薬が１つ以上の第四級アミノ若しくはジエチルアミンの部分を含む１つ以上の帯電した基によって上記クロマトグラフィー媒体を官能化する；
−上記クロマトグラフィー法が親和性捕捉クロマトグラフィー法であり、上記試薬がタンパク質、ペプチド、抗体若しくはそのフラグメント、色素、ヒスチジン基若しくは金属陽イオンを含む基の１つ以上によって上記クロマトグラフィー媒体を官能化する；
−上記クロマトグラフィー法が疎水性相互作用クロマトグラフィー法であり、上記試薬がプロピル基、ブチル基、フェニル基若しくはオクチル基の１つ以上によって上記クロマトグラフィー媒体を官能化する；
又は
−上記クロマトグラフィー法がミックスモードクロマトグラフィー法であり、上記試薬がＭＥＰ、オクチルアミン基、Ｎ−ベンジルメチルエタノールアミン基若しくはＮ−ベンゾイルホモシステイン基の１つ以上によって、上記クロマトグラフィー媒体を官能化する、態様４４に記載の方法。
【０４４２】
４６．工程（ｉｉｉ）において、上記試薬が１つ以上のプロテインＡ分子によって上記グラフト化生成物を官能化する、態様２８乃至態様４５のいずれか一つに記載の方法。
【０４４３】
４７．上記基体がメンブレンの形態である、態様２８乃至態様４６のいずれか一つに記載の方法。
【０４４４】
４８．上記ポリマーが、セルロース、酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリエチレンオキシド及びそれらの混合物からなる群から選択される、態様２８乃至態様４７のいずれか一つに記載の方法。
【０４４５】
４９．上記ナノファイバーが１０ｎｍ〜１０００ｎｍの平均径を有する、態様２８乃至態様４８のいずれか一つに記載の方法。
【０４４６】
５０．態様２８乃至態様４９のいずれか一つに記載の方法であって、
（ｉ）１つ以上のセルロースナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）式
【０４４７】
【化７７】
2019527617.tif 000082
の複数の化合物、及びそのエナンチオマーを、上記基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることによって、上記基体から１つ以上のポリグリセロールポリマー鎖をグラフト化すること、並びに
（ｉｉｉ）上記グラフト化生成物を、イオン交換、親和性捕捉、疎水的相互作用及びミックスモード法からなる群から選択されるクロマトグラフィー法における使用に適したクロマトグラフィー媒体として、上記工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬と接触させること、を含む、態様２８乃至態様４９のいずれか一つに記載の方法。
【０４４８】
５１．態様２８乃至態様５０のいずれか一つに記載の方法によって入手可能な官能化クロマトグラフィー媒体。
【０４４９】
５２．クロマトグラフィーカートリッジを作製する方法であって、態様２８乃至態様５０のいずれか一つに記載の方法を行うこと、及びそのようにして得られた生成物をカートリッジに組み込むこと、を含む、クロマトグラフィーカートリッジを作製する方法。
【０４５０】
５３．（ａ）態様５２に記載の方法によって入手可能である、又は（ｂ）態様５１に記載される１つ以上の官能化クロマトグラフィー媒体を含む、クロマトグラフィーカートリッジ。
【０４５１】
５４．クロマトグラフィーにおける、態様５１に記載される官能化クロマトグラフィー媒体、又は態様５３に記載のクロマトグラフィーカートリッジの使用。
【０４５２】
５５．移動相から１つ以上の生体分子を単離する方法であって、移動相中の１つ以上の生体分子を、態様５１に記載の官能化クロマトグラフィー媒体、又は態様５３に記載のクロマトグラフィーカートリッジと接触させることを含む、移動相から１つ以上の生体分子を単離する方法。
【０４５３】
５６．移動相中の上記１つ以上の生体分子を、１分以下の時間に亘って官能化クロマトグラフィー媒体と接触させる、態様５５に記載の方法。
【０４５４】
５７．上記１つ以上の生体分子が１つ以上のモノクローナル抗体であるか、又はプロテインＡの結合に対する親和性を有する部位を示すように操作されたタンパク質であり、上記官能化クロマトグラフィー媒体が少なくとも１つのプロテインＡリガンド基を持つ、態様５５又は態様５６に記載の方法。
【０４５５】
５８．上記方法の工程（ｉｉｉ）が、上記グラフト化生成物を、アリルグリシジルエーテル及びハロヒドリン形成試薬と接触させることを含む、態様２８乃至態様５０のいずれか一つに記載の方法。
【０４５６】
５９．工程（ｉｉｉ）において、
（ａ）上記グラフト化生成物をアリルグリシジルエーテルと接触させる；
（ｂ）上記工程（ａ）の生成物を、ハロヒドリン形成試薬で処理する；及び
（ｃ）前記工程（ｂ）の生成物をプロテインＡと接触させる、態様２８から態様５０のいずれか一つに記載の方法。
【０４５７】
６０．工程（ｉｉｉ）が、上記グラフト化生成物を、クロマトグラフィー媒体として、工程（ｉｉ）の生成物を共に官能化する複数の試薬と接触させることを含み、上記複数の試薬がハロヒドリン形成試薬を含む、態様２８乃至態様５０のいずれか一つに記載の方法。
【０４５８】
６１．上記グラフト化生成物を、複数の試薬と連続して接触させる、態様６０に記載の方法。
［実施態様１］
官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法であって、
（ｉ）１以上のポリマーナノファイバーから形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）基体から１以上の中性のポリマー鎖をグラフト化すること、及び
（ｉｉｉ）前記グラフト化生成物と、クロマトグラフィー媒体として前記工程（ｉｉ）の生成物を官能化する試薬とを接触させることを含み、
ここで、工程（ｉｉ）は、式
【０４５９】
【化７８】
2019527617.tif 000083
の化合物の複数、及び／又はそのエナンチオマー、及び／又は式（Ｉ）のその誘導体及び／又はそのエナンチオマー及び／又はジアステレオマーと：
【０４６０】
【化７９】
2019527617.tif 000084
前記ナノファイバー基体上に存在する１以上の官能基と反応させることを含み、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択され、但しＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５の少なくとも１つは水素ではない、
官能化された高分子クロマトグラフィー媒体を作製する方法。
［実施態様２］
前記工程（ｉｉ）が、式
【０４６１】
【化８０】
2019527617.tif 000085
の化合物、及び／又はそのエナンチオマーの複数を、前記ナノファイバー基体上に存在する１つ以上の官能基と反応させることを含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
前記ポリマーナノファイバーが、セルロース、酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリエチレンオキシド及びそれらの混合物、好ましくは前記ポリマーがセルロース、酢酸セルロース及びそれらの混合物からなる群から選択される、実施態様１又は２に記載の方法。
［実施態様４］
工程（ｉｉ）で導入される前記ポリマーの量が、グラフト化生成物の５００μｍｏｌ／ｇ〜６０，０００μｍｏｌ／ｇである、実施態様１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様５］
前記グラフト化生成物を試薬と接触させる工程が、グラフト化生成物への１つ以上のリガンド基を導入し、それがクロマトグラフィー媒体としての使用に適した１つ以上のリガンド基を含む前記官能化生成物を与える、実施態様１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様６］
前記工程（ｉｉｉ）の生成物における前記リガンド基の密度が、クロマトグラフィー媒体の１００μｍｏｌ／ｇ〜２，５００μｍｏｌ／ｇである、実施態様５に記載の方法。
［実施態様７］
前記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体上の圧力低下が、液相を０．０５ｍｍ〜１０ｍｍの厚さの媒体に毎分１メンブレン体積〜６４０メンブレン体積の流量で通過させる場合、２ＭＰａ未満である、実施態様１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様８］
前記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の生産性が、５０ｍｇ／ｍＬ／分〜７５０００ｍｇ／ｍＬ／分である、実施態様１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様９］
前記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の生産性が、２００ｍｇ／ｍｌ／分超である、実施態様１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１０］
前記グラフト化工程（ｉｉ）が、前記官能化された高分子クロマトグラフィー媒体の動的結合容量（ＤＢＣ）を増加させる効果を有する、実施態様１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１１］
前記基体が、工程（ｉ）〜工程（ｉｉ）の間に処理されて１つ以上の官能基が導入される、又は前記基体が工程（ｉ）〜工程（ｉｉ）の間に処理されて前記基体上任意の官能基が脱保護若しくは活性化される、又は前記基体が工程（ｉ）〜（ｉｉ）の間に処理されて、前記基体上の前記官能基の数／密度が増加される、実施態様１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１２］
前記グラフト化工程（ｉｉ）が、更に同じ工程において、１つ以上の官能基を導入する、又は前記基体上の任意の官能基を脱保護若しくは活性化する、又は前記基体上の官能基の数／密度を増加させる条件下で実行される、実施態様１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１３］
前記グラフト化工程（ｉｉ）が、水又は水：エタノール中、好ましくは水中で、水性アルカリ、好ましくはＮａＯＨ又はＫＯＨの存在下で達成される、実施態様１２に記載の方法。
［実施態様１４］
前記１つ以上の官能基が、ナノファイバー基体上に存在するヒドロキシル基を含む、実施態様１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１５］
官能化工程（ｉｉｉ）において、官能化試薬が、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＭＡＣ）、１，４−ブタンスルホン、クロロ酢酸ナトリウム、ＮａＩＯ４に続いてプロテインＡ、ジビニルスルホンに続いてプロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にハロヒドリン形成試薬、好ましくはＮ−ブロモスクシンアミド、その後プロテインＡ、アリルグリシジルエーテルに続いて第１にエポキシド形成試薬、その後プロテインＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１６］
前記ポリマーの１つ以上が分岐鎖である、実施態様１０乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１７］
工程（ｉｉｉ）において、前記試薬が、結果として生じる官能化されたクロマトグラフィー媒体が、イオン交換、親和性捕捉、疎水的相互作用及びミックスモード法からなる群から選択されるクロマトグラフィー法における使用に適したものとなるように、前記グラフト化生成物を官能化する、実施態様１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１８］
実施態様１７に記載の方法であって、
−前記クロマトグラフィー法がカチオン交換法であり、前記試薬が１つ以上のカルボキシレート、スルホネート若しくはホスホネートの部分を含む１つ以上の帯電した基によって前記クロマトグラフィー媒体を官能化する；
−前記クロマトグラフィー法が陰イオン交換法であり、前記試薬が１つ以上の第四級アミノ若しくはジエチルアミンの部分を含む１つ以上の帯電した基によってクロマトグラフィー媒体を官能化する；
−前記クロマトグラフィー法が親和性捕捉クロマトグラフィー法であり、前記試薬がタンパク質、ペプチド、抗体若しくはそのフラグメント、色素、ヒスチジン基若しくは金属陽イオンを含む基の１つ以上によってクロマトグラフィー媒体を官能化する；
−前記クロマトグラフィー法が疎水性相互作用クロマトグラフィー法であり、前記試薬がプロピル基、ブチル基、フェニル基若しくはオクチル基の１つ以上によってクロマトグラフィー媒体を官能化する；又は
−前記クロマトグラフィー法がミックスモードクロマトグラフィー法であり、前記試薬がＭＥＰ、オクチルアミン基、Ｎ−ベンジルメチルエタノールアミン基若しくはＮ−ベンゾイルホモシステイン基の１つ以上によってクロマトグラフィー媒体を官能化する、実施態様１７に記載の方法。
［実施態様１９］
工程（ｉｉｉ）において、前記試薬が、１つ以上のプロテインＡ分子によって前記グラフト化生成物を官能化する、実施態様１乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２０］
工程（ｉｉｉ）が、クロマトグラフィー媒体として、工程（ｉｉ）の生成物を共に官能化する複数の工程を含む、実施態様１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２１］
工程（ｉｉｉ）において：
（ａ）前記グラフト化生成物を、ジビニルスルホン、アリルグリシジルエーテル及びそれらの組み合わせから選択される群から選択される試薬と接触させ；
（ｂ）前記工程（ａ）の生成物を、ハロヒドリン形成試薬によって任意に処理し；及び
（ｃ）前記工程（ｂ）の生成物をプロテインＡと接触させる、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２２］
前記基体が、メンブレンの形態である、実施態様１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２３］
前記ナノファイバーが１０ｎｍ〜１０００ｎｍの平均径を有する、実施態様１乃至２２のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２４］
（ｉ）１つ以上のセルロースナノファイバーで形成された基体を提供すること、
（ｉｉ）式
【０４６２】
【化８１】
2019527617.tif 000086
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマー、及び／又は式（Ｉ）のその誘導体及び／又はそのエナンチオマー及び／又はジアステレオマーを：
【０４６３】
【化８２】
2019527617.tif 000087
基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることによって、前記基体から１つ以上のポリグリセロールポリマー鎖をグラフト化すること、
（ｉｉｉ）前記グラフト化生成物を、イオン交換、親和性捕捉、疎水的相互作用及びミックスモード法からなる群から選択されるクロマトグラフィー法における使用に適したクロマトグラフィー媒体として、工程（ｉｉ）の前記生成物を官能化する試薬と接触させることを含み、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシから選選択され、但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５の少なくとも１つが水素ではない、
実施態様１乃至２３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２５］
工程（ｉｉ）が、式
【０４６４】
【化８３】
2019527617.tif 000088
の複数の化合物、及び／又はそのエナンチオマーと、基体上に存在する１つ以上のヒドロキシル基と反応させることにより、前記基体から１つ以上のポリグリセロールポリマー鎖をグラフトすることを含む、実施態様２４に記載の方法。
［実施態様２６］
実施態様１乃至２５のいずれか１項に記載の方法によって入手可能な、官能化されたクロマトグラフィー媒体。
［実施態様２７］
クロマトグラフィーカートリッジを作製する方法であって、実施態様１乃至２５のいずれか１項に記載の方法を実施すること、及びそのようにしてられた生成物をカートリッジに組み込むこと、を含むクロマトグラフィーカートリッジを作製する方法。
［実施態様２８］
（ａ）実施態様２７に記載の方法によって入手可能である、又は（ｂ）実施態様２６による１つ以上の官能化されたクロマトグラフィー媒体を含む、クロマトグラフィーカートリッジ。
［実施態様２９］
クロマトグラフィーにおける、実施態様２６に記載の官能化されたクロマトグラフィー媒体又は実施態様２８に記載のクロマトグラフィーカートリッジの使用。
［実施態様３０］
移動相から１つ以上の生体分子を単離する方法であって、移動相中の１つ以上の生体分子と、実施態様２６に記載の官能化されたクロマトグラフィー媒体又は実施態様２８に記載のクロマトグラフィーカートリッジとを接触させることを含む、移動相から１つ以上の生体分子を単離する方法。
［実施態様３１］
移動相中の１つ以上の前記生体分子が、１分以下の時間に亘って、前記官能化されたクロマトグラフィー媒体と接触される、実施態様３０に記載の方法。
［実施態様３２］
前記１つ以上の生体分子が、１つ以上のモノクローナル抗体、又はプロテインＡ結合に対する親和性を有する部位を示すように操作されたタンパク質であり、前記官能化されたクロマトグラフィー媒体が少なくとも１つのプロテインＡリガンド基を持つ、実施態様３０又は３１に記載の方法。
【図１】
2019527617.tif 000092
【図２】
2019527617.tif 000093
【図３】
2019527617.tif 000094
【図４】
2019527617.tif 000095
【図５】
2019527617.tif 000096
【図６】
2019527617.tif 000097
【図７】
2019527617.tif 000098
【図８】
2019527617.tif 000099
【図９】
2019527617.tif 000100
【図１０】
2019527617.tif 000101
【図１１】
2019527617.tif 000102
【図１２】
2019527617.tif 000103
【図１３】
2019527617.tif 000104
【国際調査報告】
2019527617.tif 000105
2019527617.tif 000106