(57)【要約】  ヒト高親和性ＩｇＥ受容体アルファ鎖（ＦｃｅＲＩａ）であって、ここで、位置４３のアミノ酸リシン（Ｋ４３）が、アラニン、セリン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸、好ましくはアラニン、グリシン、セリンまたはチロシン、とりわけアラニンで置換されている、ＦｃｅＲＩａを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト高親和性ＩｇＥ受容体アルファ鎖（ＦｃｅＲＩａ）であって、ここで、位置４３のアミノ酸リシン（Ｋ４３）が、アラニン、セリン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸、好ましくはアラニン、グリシン、セリンまたはチロシン、とりわけアラニンで置換されている、ＦｃｅＲＩａ。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列を有するＦｃｅＲＩａであって、ここで、位置４３のアミノ酸リシン（Ｋ４３）が、アラニン、セリン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸、好ましくはアラニン、グリシン、セリンまたはチロシン、とりわけアラニンで置換されている、請求項１に記載のＦｃｅＲＩａ。
【請求項３】
さらなるアミノ酸、好ましくは位置３１のリシン（Ｋ３１）、位置４０のアルギニン（Ｒ４０）、位置４１のイソロイシン（Ｉ４１）、位置４２のフェニルアラニン（Ｆ４２）、位置４４のグリシン（Ｇ４４）、位置４５のグルタミン酸（Ｅ４５）、位置１４２のリシン（Ｋ１４２）、位置１９６のリシン（Ｋ１９６）、位置１９９のアルギニン（Ｒ１９９）および位置２０１のリシン（Ｋ２０１）からなる群より選択されるアミノ酸、とりわけ位置３１のリシン（Ｋ３１）、位置４０のアルギニン（Ｒ４０）、位置１４２のリシン（Ｋ１４２）、位置１９６のリシン（Ｋ１９６）、位置１９９のアルギニン（Ｒ１９９）および位置２０１のリシン（Ｋ２０１）からなる群より選択されるアミノ酸が置換されている、請求項１または２に記載のＦｃｅＲＩａ。
【請求項４】
ＦｃｅＲＩａが固体表面上に固定化されている、請求項１から３のいずれか一項に記載のＦｃｅＲＩａ。
【請求項５】
アルファ鎖、ベータ鎖および２つのジスルフィド架橋によって連結された２つのガンマ鎖を含むＦｃｅＲＩであって、ここで、該アルファ鎖が、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾アルファ鎖である、ＦｃｅＲＩ。
【請求項６】
ＩｇＥ媒介性疾患の予防および／または処置における使用のための、請求項１から４のいずれか一項に記載のＦｃｅＲＩａであって、ここで、該ＦｃｅＲＩａが、アフェレシスにおいて、ヒト体液、とりわけヒト血漿または血清から過剰のＩｇＥを枯渇させるために使用される（抗ＩｇＥ療法）、ＦｃｅＲＩａ。
【請求項７】
ＩｇＥ媒介性疾患が、アレルギー性疾患、好ましくは季節性、食物、花粉、カビ胞子、有毒植物、薬物／薬剤、昆虫の毒、サソリ毒または蜘蛛毒、ラテックスまたはハウスダストダニアレルギー、ペットアレルギー、アレルギー性鼻炎および結膜炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性気管支喘息、非アレルギー性喘息、チャーグ・ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、鼻のポリープ症、木村病；接着剤、抗菌剤、香料、染髪剤、金属、ゴム成分、局所用医薬、ロジン、ワックス、艶出し剤、セメントおよび皮革に対する接触性皮膚炎；性鼻副鼻腔炎、アトピー性湿疹、ＩｇＥ関連自己免疫性疾患、好ましくは慢性（特発性）および自己免疫性蕁麻疹、コリン作動性蕁麻疹、肥満細胞症、とりわけ皮膚肥満細胞症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、慢性または再発性特発性血管浮腫、間質性膀胱炎、アナフィラキシー、とりわけ特発性および運動誘発性アナフィラキシー、免疫療法、好酸球関連疾患、好ましくは好酸球性喘息、好酸球性胃腸炎、好酸球性中耳炎および好酸球性食道炎；リンパ腫、好ましくは胃または十二指腸の潰瘍または逆流のための抗酸性療法の感作副作用からなる群より選択される、請求項６に記載の使用のためのＦｃｅＲＩａ。
【請求項８】
ヒト個体の血流と接触するのに適した固体担体に結合されている、請求項６または７に記載の使用のためのＦｃｅＲＩａ。
【請求項９】
血流または血漿流と接触することができる固体担体を含むアフェレシス装置であって、該固体担体が、請求項１から４のいずれか一項に記載のＦｃｅＲＩａを含むことを特徴とする、アフェレシス装置。
【請求項１０】
ＩｇＥ関連疾患の予防および／または処置のための、とりわけ抗ＩｇＥ療法を行うための、予防および／または処置装置を提供するための請求項９に記載の装置の使用。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＦｃｅＲＩａを含む固体アフェレシス担体を含む、ＩｇＥ関連疾患の予防および／または処置における使用のためのキットであって、ここで、該担体が無菌かつ発熱物質不含有のカラムである、キット。
【請求項１２】
治療方法における使用、とりわけＩｇＥ関連疾患の予防または処置における使用のための、請求項１から４のいずれか一項に記載のＦｃｅＲＩａ。
【請求項１３】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＦｃｅＲＩａおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
−リンカー分子、好ましくはペプチドリンカー、とりわけ１から１０個、好ましくは２から５個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカー；および／または
−治療分子もしくは診断分子、好ましくはモノクローナル抗体もしくは抗体フラグメント、サイトカイン、抗体様構造、細胞毒性薬もしくは阻害剤、光学トレーサー；および／または
−担体、好ましくは担体タンパク質、とりわけヒト血清アルブミン、トランスフェリンもしくはＦｃドメイン
に結合された、請求項１から４のいずれか一項に記載のＦｃｅＲＩａ。
【請求項１５】
アレルギー性疾患、好ましくは季節性、食物、花粉、カビ胞子、有毒植物、薬物／薬剤、昆虫の毒、サソリ毒または蜘蛛毒、ラテックスまたはハウスダストダニアレルギー、ペットアレルギー、アレルギー性鼻炎および結膜炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性気管支喘息、非アレルギー性喘息、チャーグ・ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、鼻のポリープ症、木村病；接着剤、抗菌剤、香料、染髪剤、金属、ゴム成分、局所用医薬、ロジン、ワックス、艶出し剤、セメントおよび皮革に対する接触性皮膚炎；性鼻副鼻腔炎、アトピー性湿疹、ＩｇＥ関連自己免疫性疾患、好ましくは慢性（特発性）および自己免疫性蕁麻疹、コリン作動性蕁麻疹、肥満細胞症、とりわけ皮膚肥満細胞症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、慢性または再発性特発性血管浮腫、間質性膀胱炎、アナフィラキシー、とりわけ特発性および運動誘発性アナフィラキシー、免疫療法、好酸球関連疾患、好ましくは好酸球性喘息、好酸球性胃腸炎、好酸球性中耳炎および好酸球性食道炎；リンパ腫、好ましくは胃または十二指腸の潰瘍または逆流のための抗酸性療法の感作副作用からなる群より選択される疾患の処置における使用のための、請求項１４に記載のＦｃｅＲＩａ。
【請求項１６】
配列番号２または３の、少なくともＩｇＥ結合領域およびプロテアーゼ抵抗性領域を含む、請求項１から４、１４および１５のいずれか一項に記載のＦｃｅＲＩａのフラグメント。
【請求項１７】
配列番号２または３の、アミノ酸２６〜２０５、好ましくはアミノ酸３０〜１９３を含む、請求項１６に記載のフラグメント。
【請求項１８】
ヒト個体の血流と接触するのに適した固体担体に結合されている、請求項１６または１７に記載のＦｃｅＲＩａフラグメント。
【請求項１９】
血流または血漿流と接触することができる固体担体を含むアフェレシス装置であって、該固体担体が、請求項１６または１７に記載のＦｃｅＲＩａフラグメントを含むことを特徴とする、アフェレシス装置。
【請求項２０】
ＩｇＥ関連疾患の予防および／または処置のための、とりわけ抗ＩｇＥ療法を行うための、予防および／または処置装置を提供するための請求項１９に記載の装置の使用。
【請求項２１】
請求項１６または１７に記載のＦｃｅＲＩａフラグメントを含む固体アフェレシス担体を含む、ＩｇＥ関連疾患の予防および／または処置における使用のためのキットであって、ここで、該担体が無菌かつ発熱物質不含有のカラムである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高親和性ＩｇＥ受容体アルファ鎖（ＦｃｅＲＩａ）の改良された形態およびこれらの改良形態の使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＥ媒介性疾患
産業社会において、アレルギーの有病率は、現在、人口の３０％に達しようとしている。アレルギーは、一般的に、アレルギー性鼻結膜炎のような軽度のものから、生活の質の強い制限を伴うアレルギー性喘息気管支炎のような重篤な状態に進行する。結果として、アレルギー性免疫応答の重要なメディエーターとして血漿ＩｇＥを標的とする新たな治療戦略を開発するために多大な努力がなされてきた。種々の（アレルギー性）疾患およびそれらの併存疾患における抗ＩｇＥ臨床治験の出現により、ＩｇＥ依存性を特徴とする病状の数が増えている（Holgate 2014）。最近では、ＩｇＥが、慢性蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸疾患および他の種々の（自己）免疫介在状態を含む炎症性およびアレルギー関連疾患の広範囲の領域でも役割を果たすという証拠が、示されている。ＩｇＥが原因となる役割を有する、さらなる症例および徴候の証拠は、例えば過敏性腸症候群（Pearson et al. 2015）または特発性血管浮腫（Shroba et al. 2015）のような病状から得られる。結果として、ＩｇＥおよびその下流のシグナル伝達の中心的役割は、最初に考えられたよりも広い疾患範囲のための重要な標的化目標として認識されている。
【０００３】
重篤なアレルギー状態の典型例として、アレルギー性気管支喘息は、自然免疫系、Ｔ細胞、上皮細胞機能およびＩｇＥの産生をもたらすＢ細胞免疫間の複雑な相互作用によって制御される。ＩｇＥは、１９６０年代のアレルギーの重要なメディエーターとして認識されていたため（Bennich and Ishizaka 1968）、ＩｇＥは、その臨床および分子構造の両面で広く研究されてきた。この分子の構造および生化学的特性はよく理解されており、細胞受容体、とりわけ高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）を介するその生理的作用様式は、よく解明されている（Miller et al. 1989; Wurzburg et al. 2002; Sutton et al. 2015）。ＩｇＥ産生は、ＩｇＥ自体によって強力に制御されており（Dullaers et al. 2012）、このことは、ＩｇＥ／ＦｃｅＲＩ経路が、アレルギー性疾患およびＩｇＥ依存性疾患における魅力的な標的化目標であることを示唆している。ＩｇＥの１つの特別な特徴は、ＦｃｅＲＩと称される高親和性ＩｇＥ受容体、より具体的にはアルファ鎖（他に特記されない限り、ＦｃｅＲＩａと記載される）に対する顕著に高い親和性である。該受容体は、肥満細胞および好塩基性顆粒球で主に発現されるが、抗原提示細胞でも発現される。四量体の高親和性ＩｇＥ受容体は、１つのアルファ鎖、１つのベータ鎖および２つのガンマ鎖から構成され、アレルゲンまたは免疫複合体に結合したＩｇＥの架橋時に細胞内シグナル伝達を仲介する（Galli ＆ Tsai 2012）。従って、アレルゲンによる架橋は、肥満細胞脱顆粒によるアレルギーメカニズムの活性化、とりわけヒスタミン放出およびサイトカイン放出をもたらす。
【０００４】
抗ＩｇＥ療法および制限
治療用抗ＩｇＥモノクローナル抗体オマリズマブ（登録商標）（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））の臨床および市場の成功により（Licari et al. 2015; Incorvaia et al. 2014）、安価かつ広く適用可能な抗ＩｇＥ療法薬に対する需要が高まっている。改善された第２世代の治療用抗体（例えばモノクローナル抗体リゲリズマブ（登録商標）、ＸｍＡＢ７１９５（登録商標）、ＭＥＤＩ４２１２（登録商標）、クイリズマブ（登録商標）または活性抗ＩｇＥワクチンなど）は、現在、前臨床段階、臨床開発段階および評価段階にある。
【０００５】
オマリズマブ（登録商標）による受動抗ＩｇＥ抗体療法の主な欠点は、数百ミリグラムまでの組換え抗体を患者に繰り返し注射する必要があるという条件で、高コストで、かつ比較的高投与量を要することである。いくつかの理由から、受動的に投与したオマリズマブ（登録商標）などの組換え生物学的製剤の高用量に関連する一般的なリスクがある：第１に、組換え分子は、患者の免疫系によって潜在的に認識される外来配列を含む。第２に、凝集性は常にタンパク質の構造および品質とのバランスを取らなければならない。最後に、特に、オマリズマブ（登録商標）療法は現在、６００ＩＵ／ｍｌの血漿ＩｇＥを超えない重篤なコルチコイド耐性喘息患者に限定されている。ノンレスポンダーに加えて、オマリズマブ（登録商標）の最大許容用量は隔週で３７５ｍｇであり、重大な制限をもたらし得る。他の制限には、アナフィラキシーのリスク、および継続的なよく管理された処置レジメンの必要性が含まれる（Drugs.com http://www.drugs.com/dosage/xolair.htmlを参照のこと）。商品の価格は、例えばあまり重篤ではないが、最も厄介なアレルギー兆候に対する、オマリズマブ（登録商標）のより広範な使用に重大な制限を課す。例えば、４００−５００ＩＵ／ｍｌの血漿ＩｇＥを有する７０−８０ｋｇの患者に対する一般的な処置プロトコールは、隔週、３７５ｍｇのオマリズマブ（登録商標）の抗ＩｇＥ用量の皮下投与（ｓ.ｃ）からなる。用量および価格のため、該薬剤は、ＩｇＥレベルが顕著に高い患者だけでなく、体重過多（heavy and overweight）の患者に対しても承認され得ない。オマリズマブ（登録商標）の使用が制限される他の理由としては、食物アレルギー、有効性もしくは患者のコンプライアンスの欠如または喘息患者のサブグループにおける単なる有効性の欠如などの何れの条件でも不利なリスク対効果比が含まれる。定義上、受動的に投与したオマリズマブ（登録商標）などの抗ＩｇＥ抗体は、効果および薬力学的要件を満たすために本質的に高い用量を必要とする。オマリズマブ（登録商標）などの組換え抗体の半減期および薬物動態は、制限された枠内にあり、多くの開発努力なしには容易に改善することができない。オマリズマブ（登録商標）投薬スキームの改変により、現在の抗ＩｇＥ療法の投薬制限が顕著に改善されるか、または経済的負担が軽減されることは期待できない（Lowe et al. 2015）。
【０００６】
抗ＩｇＥ ｍＡＢの制限を回避または軽減するために、別のＩｇＥ低下戦略の組み合わせが提案されている。それは、高ＩｇＥレベルを体外で予め枯渇低下させた後に、受動的ＩｇＥ低下を行う抗ＩｇＥ療法である。
【０００７】
アフェレシス（apheresis）によるＩｇＥ低下の基本は、選択的アフェレシス吸着剤としてのポリクローナル抗ＩｇＥ抗体の使用可能性を試験した研究者により、２５年以上前に提案された（Sato et al. 1989）。これらの初期の研究における主な問題には、血漿からのＩｇＥ枯渇の低効率だけでなく、患者の循環血中に漏出する傾向を有する吸着剤分子であるポリクローナルヤギ抗ＩｇＥ抗体の性質から想定される安全性への懸念もあった。従って、この非ヒト吸着剤は、免疫複合体形成の可能性を伴う外来エピトープに対する免疫応答を誘導するリスクを有していた。同様に、Lebedinらは、単一特異性ウサギポリクローナル抗ＩｇＥ抗血清およびモノクローナル抗体もしくはそのＦａｂフラグメントを吸着剤として用いた（Lebedin et al. 1991）。ほとんどの場合、主な関心事は、担体マトリクスへの吸着剤の不十分な固定化またはタンパク質分解による切断による低い血漿枯渇効果および吸着剤（すなわち、非ヒト抗体物質）の血漿中への漏出または流出であった。
【０００８】
最近では、Kerzelら（Kerzel et al. 2011）が、オマリズマブ（登録商標）処置に通常選択されなかった顕著に高いＩｇＥ患者であっても、抗ＩｇＥ療法前の特異的ＩｇＥ除去がオマリズマブ（登録商標）療法を可能にすることを提案した。該著者らは、抗ＩｇＥ療法前の血漿交換が、とりわけオマリズマブ（登録商標）単独では実用的ではないとき、従来の抗ＩｇＥ療法を補い得る臨床的組立を適用した（Kerzel et al. 2011; Kasperkiewicz et al. 2011）。このパイロット試験は、抗ＩｇＥ処置前のＩｇＥ特異的枯渇が、高ＩｇＥ患者にとって有益であり得ることを示唆した。Zinkらは、アフェレシスとオマリズマブ（登録商標）との組み合わせを用いて重症のアトピー性皮膚炎患者においてＩｇＥを標的とすることが可能であることを示した（Zink et al. 2012 [Thesis] および Zink et al. 2015）。
【０００９】
これに関して、ＦｃｅＲＩ架橋活性を欠く一本鎖抗体吸着剤（ｓｃＦｖ１２と称される）は、従来の抗体の代替物としてＬｕｐｉｎｅｋら（Lupinek et al. 2009）により提案された（Lupinek et al. ＵＳ２０１４／１２４４４８Ａ１）。Fresenius Medical Care Deutschland GmbH（臨床治験番号NCT０２０９６２３７；ＥＳＰＩＲＡ研究；Derfler et al. 2015）による“新しいＩｇＥ吸着剤の安全性および有効性を調べるための最初のヒト治験”（“First in Man Trial to Investigate Safety and Efficacy of the New IgE Adsorber”）という表題の最近の着想実証試験により、ｓｃＦｖ１２が、ＩｇＥアフェレシスのための吸着剤として成功裏に適用可能でありことが実証された。“ＩｇＥｎｉｏ（登録商標）”（https://www.fresenius.com/5689_5968.htm）と名付けられた市販の吸着カラムを作製し、一価の高親和性ｓｃＦｖ１２吸着剤に基づいて評価した。該著者らは、ＩｇＥを８６．２％減少させ、皮膚試験反応性の低下およびアレルギー患者におけるアレルギー症状の減少を主張した。この特定の治験は、ＩｇＥアフェレシスと、その後の抗ＩｇＥ処置の併用療法として設計されたものではなかった。重要なことには、外来吸着タンパク質（例えば、一般的な抗ＩｇＥ抗体など）が血液循環中に漏れる可能性がある場合、ＦｃｅＲＩ架橋のリスクを有さない最初の一価のＩｇＥ吸着剤を用いてＩｇＥアフェレシスの原理を検証することができた。ｓｃＦｖ１２治験と並行して、ＩｇＥ吸着のために非ヒト種由来のポリクローナル抗体物質を用いた最初のパイロット治験と同様のヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体をベースとする吸着剤（Miltenyi社のTherasorb−IgEと称される、製品番号330-000-571または30-000-572； Morren, Clinical Trial NCT02365246）を用いる１５名のアトピー性皮膚炎患者における臨床的ＩｇＥ枯渇治験が開始された。これらの場合にも、外来の非ヒト吸着抗剤（ヒツジ由来）の使用は、抗ヒツジＩｇＧ反応性抗体を誘導するリスクおよび患者の血液循環へのカラムからの吸着物質の放出時のＦｃｅＲＩ架橋のリスクを伴っていた。
【００１０】
ポリクローナル抗体のような非ヒトタンパク質は、血清病の誘発のために受動的ワクチン療法剤としての用途には適していないことが十分に確立されている。これに関して、選択的吸着剤を用いる治療的アフェレシスにおいて、例えば、動物由来のポリクローナル抗体などの非ヒトタンパク質は、いくつかのリスクと欠点を有することが強調されなければならない：第一に、注意深い精製および品質評価手順を要すること。第二に、それらの親和性は、スクリーニングされ合理的に最適化された組み換え吸着タンパク質の親和性よりも一般的に低いこと。第三に、吸着剤は、アフェレシス処置の間、患者の血液循環中に流出してはならないこと。最後に、商品のコストがアフェレシスの実用性にとって決定的な基準であること。今日では、新しい選択的吸着分子が、十分な品質で製造および精製され、かつ現実的な価格であることが前提条件である。イムノアフェレシスまたは選択的吸着剤によるアフェレシスは、一般的に、いくつかのその後の連続的アフェレシス工程で行われるため、高価な一回使用の吸着装置よりもリサイクル可能な、または再使用可能な吸着カラムが好ましい。
【００１１】
これらの特徴のいくつかは、残念ながら最近提案された一本鎖の抗体ベースの吸着剤（Lupinek et al. 2009; ＷＯ２０１２／１４０２１４Ａ１および“IgEnio（登録商標）”；Fresenius Medical Care https://www.fresenius.com/5689_5968.htm）では利用できない：重要なことに、ＩｇＥｎｉｏ（登録商標）は、低ｐＨ処理後には効率よく再折り畳みされないため、再利用およびリサイクルすることができない（本明細書の実施例セクションの実施例８に記載の通り（下記参照））。さらに、細菌により産生されたｓｃＦｖ構築物は、それらの非ヒト構造、および血流中に流出する吸着剤の場合に抗体誘導のリスクを有する配列物質の起源であり、それらが“外来物”として認識されるため、ヒトに対して本来的に免疫原性である。結果として、ＩｇＥｎｉｏ（登録商標）は、血流中に流出する際に免疫原性のリスクを有するアフェレシス用の単回使用製品として開発されてきた。ｓｃＦｖ１２は、例えばオマリズマブ（登録商標）などの受動的治療用途のための一本鎖ＩｇＥブロッカーとして意図されていない。
【００１２】
体外または体内適用のための抗体ベースのＩｇＥ結合剤の代替物：
ｍＡＢまたは一本鎖抗体ベースの生体物質の代替物として、ヒト高親和性ＩｇＥ受容体の組換え可溶性アルファ鎖（ＦｃｅＲＩａと称される）を、治療におけるプロトタイプの高度アフィンおよび特異的ＩｇＥ結合分子ならびに診断薬として使用することが以前から提案されていた。重要な特徴として、ＦｃｅＲＩａは、潜在的に免疫原性（すなわち非自己）の配列物質を含まない。本来、ＦｃｅＲＩは、ＩｇＥのヘテロ四量体受容体として好塩基球および肥満細胞上に存在するのが一般的である。文献に広く記載されているような複雑な構造ダイナミクスを有するＩｇＥに対する一価の高親和性受容体である（概要については、Sutton et al. 2015を参照のこと）。当然、ＦｃｅＲＩａ鎖は、正確な折り畳みおよびＩｇＥに対する高親和性結合性の両方に必須の２つの免疫グロブリン様ドメインを含む細胞外領域に伸びる高親和性ＩｇＥ膜受容体の一部として存在する（Mallamaci et al. 1993）。細菌により産生される組換えＦｃｅＲＩを作製し、再折り畳みすること、または改変された特徴を有する切断型もしくは変異型変異体を作成するための、人為的方法が提案されているが、ＦｃｅＲＩの両ドメインは、ＦｃｅＲＩａの正確な折り畳みに必要であり、タンパク質の折り畳みおよびグリコシル化が、強力な、“天然の”ＩｇＥ吸着剤またはブロッキング分子の候補の前提条件であることが強調される。最近、自然形態の流出したｓＦｃｅＲＩ（ｓＦｃｅＲＩと称される）が、ヒト血漿中に遊離形態またはＩｇＥとの複合体形態で見いだされた。ｓＦｃｅＲＩは、発現した受容体の表面へのＩｇＥ結合を阻止するか、または例えばオマリズマブ（登録商標）と同様に特異的なリガンド阻害に寄与する可能性がある点で、ＩｇＥ経路の調節的役割を果たし得ることが提案された。しかしながら、膜に固定化されたＦｃｅＲＩから遊離した天然ｓＦｃｅＲＩの正確な生理的役割は、未だ解明されていない（Platzer et al. 2011）。
【００１３】
従って、ＦｃｅＲＩａが、治療用途のための候補ＩｇＥブロッカーまたはＩｇＥ吸着剤として直ちに認識されたことは驚くべきことではない。Ｄｉｇａｎら（ＷＯ１９９８／００４７１８Ａ１）は、以前に、抗体ベースの療法（例えば、オマリズマブ（登録商標））の前に受動的抗ＩｇＥ療法のための可溶性ＩｇＥ阻害剤として用いられ得る、単量体または二量体のＦｃｅＲＩａ／ＨＳＡ−融合構築物を提案している。Ｄｉｇａｎらは、さらに、ＦｃｅＲＩベースのインビトロ診断アッセイ（例えばＥＬＩＳＡなど）を提案している。ＦｃｅＲＩベースの生物製剤の開発が、本質的に継続されなかった主な理由の１つは、血清アルブミンへの融合などの人工操作にも関わらず、（ヒト化された）治療用抗体の血漿半減期を達成しなかったという薬物動態挙動であった（ＷＯ１９９８／００４７１８Ａ１）。その分子サイズのために、ＦｃｅＲＩａの血漿半減期は、ＩｇＥブロッカーとして受動的に適用されたとき、ＩｇＧよりも短い。従って、増大したサイズを有する改変されたＦｃｅＲＩａベースの構築物または別の修飾物および製剤の開発が、血漿半減期を改善するために必要とされ得る。McKenzieら（米国特許ＵＳ５，９８５，５９９Ａ）はまた、 “血漿交換法”（すなわち、体外のＩｇＥ枯渇）において免疫複合体を除去するための吸着剤としてのＦｃｅＲＩａまたはそのフラグメントの使用、またはＩｇＥシグナル伝達を阻止するための一価のＩｇＥブロッカーとしての遊離形態の使用を提案している。
【００１４】
Ｈｕｂｅｒ Ｒらは、以前に、診断使用または治療使用のため、またはＩｇＥを吸着するための、細菌により産生されたＦｃｅＲＩａの使用を提案している（ＷＯ２０００／０３２７６７Ａ１）。治療使用または診断使用のためのＦｃｅＲＩおよびその変異体を示唆する他の先行技術文献には、例えば、Ｇｏｕｌｄら（ＷＯ９９／０５２７１Ａ１）およびHogarthら（ＷＯ９６／０８５１２Ａ１、ＵＳ８，７２９，２４７Ｂ２）が含まれる。さらに、他の国際特許出願、例えば、Siraganianら（ＷＯ８９／０５３５２Ａ１）は、ＩｇＥ受容体アルファ−サブユニット“またはそのＩｇＥ結合フラグメント”をコードするｃＤＮＡを開示しており、ＦｃｅＲＩａサブユニットを用いてアレルギーを処置するか、またはインビトロ診断のためのもの（entity）を産生することを提案している。その後、Robertsonら(1993)は、両ドメインを含む受容体の可溶性フラグメントよりもはるかに低い親和性でＩｇＥに結合する第２の膜−近位ドメインのみを含む切断型受容体フラグメントが、ＩｇＥへの弱い結合にもかかわらず治療的に適用され得ることを示唆している。さらに、Ｙａｎａｇｉｈａｒａらは、ＩｇＥ合成を下方制御すると考えられて得る、１９９４個のヒトＦｃｅＲＩａ受容体の組換え可溶性フラグメントを提案した。さらに最近、Lingyun Jiaら（ＣＮ１０２６６０５６９Ａ）は、ＦｃｅＲＩａ鎖の一本鎖ドメイン変異体の使用を提案した。ＭｃＫｅｎｚｉｅの出願のように、これらの著者（ＣＮ１０２６６０５６９Ａ参照）は、アフェレシスのためにＦｃｅＲＩａ鎖の１つの一本鎖ドメインを用いる可能性について再び示唆した。しかしながら、詳細な先行技術の構造的および機能的研究に基づいて、ＦｃｅＲＩａが、適切な折り畳みおよびＩｇＥへの高親和性結合のために２つの免疫グロブリンドメインを必要とすることは、以前に十分に確立されていた（Mallamaci et al. 1993; Garman et al. 1998; Sutton et al. 2015）。これらの著者が、アフェレシスのために機能的であり、適切に折り畳まれた高親和性のＦｃｅＲＩａ鎖をどのように産生し得たかは明らかでなく、証明されていない。従って、この文献は、これらの一本鎖ドメインＦｃｅＲＩａ分子に関して実施可能には記載されていないとみなされるべきである。
【００１５】
この先行技術の知見に基づいて、抗体由来ＩｇＥ結合剤よりも優れたＦｃｅＲＩａベースの生物製剤の主な異なる特徴は、（１）それが天然の“自己”分子であり、外来抗原物質、例えばｓｃＦｖ、ナノボディまたは他の非天然の、非ヒトタンパク質配列物質を含むＡＢ様形態として免疫系に認識されないこと、（２）そのＩｇＥ結合挙動が、ＩｇＥ結合親和性を増加もしくは減少させ、または正しい折り畳みに影響を与えるような構造変化、例えば変異に厳密に依存し得ること、ならびに（３）ＦｃｅＲＩａが、架橋活性を欠いている、優れた高親和性一価ＩｇＥ結合剤であること、であることが明らかである。本発明において、これらの利点と共に、ＦｃｅＲＩａは、例えば単鎖吸着剤ｓｃＦｖ１２とは対照的に、リフォールディング挙動（実施例８（下記））において高いロバスト性を示すことが実証されている。従って、アフェレシスに適用するとき再使用可能であり、それ故に、吸着されたタンパク質材料（すなわち、ＩｇＥ）が、分析および品質管理の目的で低ｐＨ処理により容易に溶離され得るという利点とコスト効率とを組み合わせ得る。このことは、実施例７および８（以下の実施例セクション参照）に示すように、変性によって溶離後に分解される吸着剤では実現できない。ＦｃｅＲＩａタンパク質のさらなる側面は、その主要リガンド、すなわち可溶性ＩｇＥに加えて、ＦｃｅＲＩａタンパク質がまた、慢性自己免疫性蕁麻疹患者からの血漿中の抗ＦｃｅＲＩａ−自己抗体とも結合し得て（Zubebier et al. 2000）、抗ＦｃｅＲＩａ自己抗体およびＩｇＥを組み合わせて体外枯渇を可能にすることである。まとめると、ＦｃｅＲＩａは、体外ＩｇＥおよび／または自己抗体枯渇目的で、または例えばオマリズマブ（登録商標）のような生物製剤と同様に投与され得る可溶性抗ＩｇＥ療法剤を提供するために、優れた一価のＩｇＥ結合剤となる特徴を併せ持つ。
【００１６】
選択的ＩｇＥアフェレシスのための抗体関連吸着剤形態（例えば、Sato et al. 1989, Lebedin et al. 1991 または Lupinek et al. 2009により以前に提案されたものなど）は、上記のようなＦｃｅＲＩａベースの吸着剤の特徴および利点を提供しない。他方、受動的ＩｇＥ標的化のためのＦｃｅＲＩａベースの生物製剤を含む非経腸投与される治療剤開発は、オマリズマブ（登録商標）の成功によるだけでなく、Ｄｉｇａｎら（ＷＯ１９９８／００４７１８Ａ１）により以前に実証されている組換えＦｃｅＲＩａ（血清アルブミン融合タンパク質でさえ）の低い血清安定性のために、数年前に中止されている。
【００１７】
ＷＯ０２／０６２９８Ａ１は、可溶性ＩｇＥ受容体アルファ鎖様分子を開示している。ＷＯ９６／０８５１２Ａ１は、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを開示する。Ｒａら（J. Biol. Chem. 264 (1989): 15323−15327）は、ＩｇＥに対するマウスマスト細胞受容体（ＦｃｅＲＩ）の完全な構造を開示している。ＷＯ９９／３８９７４Ａ１は、ウシＦｃｅＲＩａに関する。ＷＯ０１／２１８１６Ａ１は、ＦｃｅＲＩβ鎖変異体によるＩｇＥ受容体細胞表面制御の調節を開示している。Ｌｉｕら（PNAS 85 (15) (1988): 5639−5643）は、高親和性ＩｇＥ受容体に関連する構造変異体を示唆していると報告している。
【発明の概要】
【００１８】
本発明の目的は、ＩｇＥ関連疾患の予防および処置のための改善された手段を提供することである。
【００１９】
従って、本発明は、高親和性ＩｇＥ受容体の修飾されたアルファ鎖（ＦｃｅＲＩａ）、とりわけヒトＦｃｅＲＩａを提供し、ここで、位置４３のアミノ酸であるリシン（Ｋ４３）が、アラニン、セリン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸、好ましくはアラニン、グリシン、セリンまたはチロシン、とりわけアラニンで置換されている。
【００２０】
本発明により提供される新規のＦｃｅＲＩａ分子は、従来技術よりも顕著な利点を有する：それは、ＦｃｅＲＩａの既存の形態と比較して、顕著に高いプロテアーゼ抵抗性を有する。しかし、それは、新しい免疫原性部位を導入するものではなく、野生型（ｗｔ）ＦｃｅＲＩの吸着および再折り畳みおよびＩｇＥ結合特性を保存する。このことは、本発明の分子を、とりわけＩｇＥを結合するために用いるとき、例えばＩｇＥアフェレシスにおいて、ｗｔ  ＦｃｅＲＩａ、従来技術のｍＡＢまたはｓｃＦｖベースの抗体ベースの吸着剤を凌ぐ有用性を有する。
【００２１】
本発明の分子は、プロテアーゼ抵抗性であり、再使用可能な吸着剤および器具として驚くべき性能および能力を示し、カラムに結合された場合に容易かつ効率よく再生され得て、治療効果の臨床モニタリングのために溶離物質の分析に用いられ得て、ＦｃｅＲＩａと血漿とのより長い接触（ＦｃｅＲＩａの体外および体内使用）を可能にするなど、優れた特性を有する。
【００２２】
従って、本発明は、プロテアーゼ抵抗型のＦｃｅＲＩａを初めて提供する。これは、ＦｃｅＲＩａの点変異が、その結合特性を機能的に改変し得るため（例えば、Mackay et al 2002および同様の論文）、プロテアーゼ抵抗性および低免疫原性を同時に提供し、かつ機能性（＝ＩｇＥ結合、ｐＨ抵抗性）の損失をもたらさない、わずかな特異的変異を導入することによって本発明を実現した。
【００２３】
ＦｃｅＲＩａの位置Ｋ４３でのプロテアーゼ切断部位の問題は、従来技術では認識されていなかったため、このことは特に驚くべきことである。実際に、本発明で提供されたデータは、新たに発見されたプロテアーゼ切断位置Ｋ４３が、他の予測されたか、または経験的に決定された切断部位と比べて、最も関連性の高い血漿プロテアーゼ切断部位であることを示す（以下の実施例２を参照のこと）。
【００２４】
特に、ＩｇＥアフェレシスについて、プロテアーゼに不安定なＩｇＥを捕捉する分子（天然のＦｃｅＲＩａなど）の使用は問題である。従って、ＦｃｅＲＩａは、分子がプロテアーゼ活性によって分解されるリスクのためにアフェレシスに用いるのに問題があるＩｇＥを捕捉する分子である。このような分解は、ＩｇＥに対するアフェレシス装置の結合能の低下をもたらすだけでなく、これらの分解生成物がアフェレシス患者の血流を汚染する可能性があるため、重大な安全性の問題となる。本発明では、ＦｃｅＲＩａの新しいプロテアーゼ切断部位が検出された（位置４３）。プロテアーゼ切断を排除するためのこのプロテアーゼ切断部位の改変は、本発明によるＦｃｅＲＩａのより安定した形態をもたらした。ＩｇＥアフェレシスのための適切な手段を提供する問題の解決策として、本発明は、２つの本質的特徴を組み合わせたＦｃｅＲＩａの改良された変異体を提供する：第１に、ＦｃｅＲＩａのＮ末端部分内の新たに認識されるタンパク質分解切断部位での切断を最小限にしなければならないと同時に、以下の実施例５、６および８に示すように、ＩｇＥ結合、ｐＨ安定性および再折り畳み特性を保持するために、ＦｃｅＲＩａの構造を変えるべきではない。ＦｃｅＲＩａにプロテアーゼ抵抗性を付与するために、野生型ＦｃｅＲＩａ配列内に通常存在しない新しいエピトープの形成を避けることが特に重要である。血液、血漿または血清中のプロテアーゼ抵抗性に加えて、本発明の改変は、新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）の免疫原性部位のリスクを最小限にするために最小の構造的変化を保証しなければならない。従って、僅かなアミノ酸変化が、非ＦｃｅＲＩａ配列のより長い配列を含む複数の変化またはキメラＦｃｅＲＩａ変異よりも好ましい。同時に、ＦｃｅＲＩが提供することができるのと同じ有利な溶離および再折り畳み特性を保持しなければならない。このことは、以下の実施例５、６および８に示されている。
【００２５】
本発明は、ＦｃｅＲＩａが血漿プロテアーゼによって優先的に切断され、分子のＮ末端部分に位置する位置Ｋ４３（ＵｎｉＰｒｏｔによる）でプラスミンによって特異的に切断されるという予期されない発見に基づく。従って、本発明は、天然に存在する配列（複数可）から逸脱し、天然の対応物と比較して、増加したプロテアーゼ抵抗性を有する配列を有する新規のＦｃｅＲＩａタンパク質（または、そのＩｇＥ結合フラグメント）に関する。
【００２６】
天然ヒトＦｃｅＲＩａのアミノ酸配列は、
【化１】
2019510737.tif 000002
である。
【００２７】
本発明のヒトＦｃｅＲＩａ変異体のアミノ酸配列は、
【化２】
2019510737.tif 000003
であり、ここで、位置４３の“Ｘ”は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｑ、Ｗ、ＧおよびＶから選択されるアミノ酸であり得る。好ましくは、“Ｘ”は、Ａ、Ｇ、ＳおよびＴである；“Ｘ”をＡとすると最も有望な結果が得られた。従って、ヒトＦｃｅＲＩａに関するこの好ましい態様は、以下のアミノ酸配列を有する：
【化３】
2019510737.tif 000004
【００２８】
注目すべきことに、実施例３に示されるように、Ｋ４３での切断によってＩｇＥ結合が損なわれる。この以前は知られていない特徴は、実施例３で実証されるように、組換えタンパク質と血漿との接触時にＩｇＥ結合が減少するため、組換えＦｃｅＲＩａを一般的に治療目的に用いることの有用性に重大な制限を加えている。本発明の過程で、体外枯渇または体内ＩｇＥ特異的阻害もしくは枯渇のためのＦｃｅＲＩａ（例えば、オマリズマブ（登録商標）など）の実際的な使用は、本発明において見いだされたＫ４３における新しい切断機序のために制限されていることが認識されている。本発明で提供される切断部位に関連する重要なプロテアーゼ（複数可）は、これまでに開示された“天然”フラグメントが、そのＩｇＥ結合能を維持するために膜近位領域で切断されなければならないので、分断ｓＦｃｅＲＩを生成する想定される（メタロ）プロテアーゼとは明らかに異なる（Platzer et al. 2011）。重要なことに、実施例２−５において実証されるように、組み換えＦｃｅＲＩが、ヒト血漿と接触することにより、プラスミンおよびトロンビンなどの血漿プロテアーゼと結合し（実施例１にて実証される通り）、血漿プロテアーゼ、とりわけプラスミンによりＫ４３でのＦｃｅＲＩａの切断が引き起こされることは、本発明において見いだされた。その結果、組換えＦｃｅＲＩａは、実施例３に示すように、血液、血漿または血清と接触するとき、そのＩｇＥ結合能力を失う。
【００２９】
従って、ＦｃｅＲＩａが血漿プロテアーゼによって位置Ｋ４３で切断されるのを防ぐために、本発明は、天然ＦｃｅＲＩａの全ての機能的および実用的特性を維持する、ＦｃｅＲＩａの新規に開発されたプロテアーゼ抵抗性変異体を提供する。この新規のプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａ変異体は、ＩｇＥまたは抗ＦｃｅＲＩ自己抗体の体外枯渇（例えば、治療的アフェレシスによる）またはオマリズマブ（登録商標）に類似した可溶性ＩｇＥのＩｇＥ阻害剤としての体内使用のいずれかのために特に有益である。
【００３０】
従って、本発明のＦｃｅＲＩａは、好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列（ヒトＦｃｅＲＩａ）を有し、ここで、位置４３のアミノ酸リシン（Ｋ４３）は、アラニン（すなわち、配列番号３）、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸と（配列番号２になるように）置換されている。
【００３１】
ＦｃｅＲＩａ鎖は、好ましくは、（実施例４に示されるように）吸着剤の繰り返しまたは長期使用を可能にするためにタンパク質を完全にプロテアーゼ非感受性にする１つの最もわずかな配列修飾を含むべきである。このＦｃｅＲＩａの最も好ましい変異体は、Ｋ４３→Ａ４３変異体（配列番号３）が実施例の部分に例示されている。しかしながら、Ｋ４３部位の３つのアミノ酸のＮ末端または２つのアミノ酸のＣ末端内で、追加のまたは別の修飾を用いることも可能であるが、あまり好ましくない。正に荷電したＫ４３切断部位を取り囲むプラスミン基質部位コンセンサス内で、Ｋ４３のプラスミン感受性を低下させるために、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを除く他のアミノ酸によるＦ４２単独でまたは他の置換との組合せで置換することも可能である。他の置換基と組み合わせて、または加えて、Ｋ４３のプラスミン感受性も低下させる荷電アミノ酸またはプロリンまたはシステインでＩ４１を置換することも可能である。他の置換と組み合わせて、またはこれに加えて、例えばBackes at al. 2000およびHervio et al. 2000のような、以前のプラスミン基質コンセンサス部位研究に基づいて、Ｋ４３でプラスミン感受性を低下させるために、アルギニン、スレオニン、バリン、グリシン、リジン、フェニルアラニンおよびイソロイシンを除く他のアミノ酸にＲ４０を変更することも可能である。上記の置換と組み合わせて、またはそれに加えて、プラスミン基質認識を低下させるために、グリシン、アルギニン、リシンまたはセリン以外の他のアミノ酸にＧ４４を変更することも可能であるが、あまり好ましくない。この領域の進化的保存性（上記のｚｏｏ−アライメントを参照のこと）およびBackes at al. 2000, Yuan et al. 2009またはHervio et al. 2000により示唆されるプラスミン基質部位コンセンサスによると、例えば、上記のようにＫ４３に隣接する１つまたは複数の隣接アミノ酸をＮ末端またはＣ末端で変化させることによってタンパク質分解的切断を減少させることが可能である。
【００３２】
Backes et al. 2000, Hervio 2000 et al. またはYuan et al. 2009によって提案されたようなプラスミン基質コンセンサス配列に関する知識にもかかわらず、いくつかのプロテアーゼコンセンサス部位があるが、Ｋ４３部位は、同定された他の部位よりも特に強力に切断される（実施例２参照）ことを示す、本発明の実施例２において実証されたように、プラスミン消化は、一次配列に依存するだけでなく、基質の構造的接近性に大きく依存することに留意することが重要である。これは、可能性のある切断部位の全てが等しく接近可能であるわけではないことを示す。加えて、基質認識は、翻訳後修飾にも依存する。
【００３３】
しかしながら、Ｋ４３の隣接アミノ酸の変化または組み合わせの変化とは対照的に、最も好ましい置換Ｋ４３→Ａ４３は僅かであり、実施例５−７に示されるようにＦｃｅＲＩａ分子の全ての所望の物理化学的特性を維持しながら、実施例４に示されるように完全消化阻害の本質的利点を提供する。同時に、この置換は、プロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａに対する免疫原性を最小化する。まとめると、親和性（すなわち、結合および解離速度）、ｐＨ安定性および折り畳み特性を失わないように、野生型ＦｃｅＲＩａ構造をできるだけ“天然”のままにすることが好ましい。
【００３４】
また、最も好ましい置換は、ＦｃｅＲＩａの抗原性または構造的変化を導入しない僅かなＫ４３→Ａ４３置換である。
【００３５】
本発明のデータは、Ｋ４３切断部位が最も重要なプロテアーゼ切断部位であることを示しているが、他のプロテアーゼ切断部位が開示または想定されているので、さらなるアミノ酸置換が導入されてもよい。例えば、ＦｃｅＲＩａ分子をこれらの部位での切断に対しても抵抗性にすること、またはこの分子の他の特性を改善することができる。好ましくは、さらなるアミノ酸が、位置３１のリシン（Ｋ３１）、位置４０のアルギニン（Ｒ４０）、位置４１のイソロイシン（Ｉ４１）、位置４２のフェニルアラニン（Ｆ４２）、位置４４のグリシン（Ｇ４４）、位置４５のグルタミン酸（Ｅ４５）、位置１４２のリシン（Ｋ１４２）、位置１９６のリシン（Ｋ１９６）、位置１９９のアルギニン（Ｒ１９９）、および位置２０１のリシン（Ｋ２０１）から選択されるアミノ酸、とりわけ、位置３１のリシン（Ｋ３１）、位置４０のアルギニン（Ｒ４０）、位置１４２のリシン（Ｋ１４２）、位置１９６のリシン（Ｋ１９６）、位置１９９のアルギニン（Ｒ１９９）、および位置２０１のリシン（Ｋ２０１）（全ての番号付けは、上記の配列番号１から３を参照しており、実施例セクションで言及したUniProt Sequence P12319に対応している）からなる群より選択されるアミノ酸で置換される。もちろん、ＦｃｅＲＩａの特性を改善するが、本発明によるプロテアーゼ抵抗性ならびにＦｃｅＲＩａの機能的特徴、とりわけ効率的にＩｇＥに結合し、新しいエピトープの導入を回避し、そしてアフェレシス吸着剤を変性によってリサイクルするときに正確に再折り畳みする特徴を維持することが知られている他の改変体もまた、導入されてよい。
【００３６】
本発明のプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩ変異体は、好ましくはアフェレシス吸着手段として用いられるため、本発明のＦｃｅＲＩａ変異体のＩｇＥ結合フラグメントはまた有益であり、本発明で提供される。そのフラグメントに関しても、本発明は、主として、ヒトの側面に関する。従って、全タンパク質としてのＦｃｅＲＩａの記載に関して、フラグメントの側面もまた、とりわけヒトＦｃｅＲＩａに関係している。
【００３７】
本発明のフラグメントのアフェレシス使用は重要であるため、本発明による特に適切なフラグメントは、免疫グロブリン結合ドメイン１（アミノ酸３０−１１０）および２（アミノ酸１１１−１９３）を含んでいなければならない。両免疫グロブリン結合ドメインは、正確な折り畳みに必須であり、適切な結合のために存在しなければならない。もちろん、本発明の任意のフラグメントもまた、配列番号２または３の位置４３に対応するアミノ酸位置にプロテアーゼ抵抗性バリエーションを含まなければならない。アミノ酸５１−９３および１３２−１７６は、必須ジスルフィド架橋を含み、適切な折り畳みに適している。最後に、アミノ酸位置４６、６７、７５、９９、１６０、１６５、１９１は、グリコシル化部位（ＧｌｃＮＡｃ）を含み、それ故に、適切な折り畳みおよび安定性にも関係する。
【００３８】
従って、顕著な安定性および天然の折り畳みも示す本発明の好ましいフラグメントは、配列番号１のアミノ酸２６〜２０５、好ましくはアミノ酸３０〜１９３を含む。
【００３９】
位置Ｋ４３にＮ末端およびＣ末端それぞれに隣接する８個までのアミノ酸の領域内の配列類似性の保存は、この領域の構造的および機能的保存を示す（以下の、選択された種からのＦｃｅＲＩａ  Ｎ末端配列の部分的アライメントを参照のこと）。従って、この段階でプロテアーゼ感受性を不活性化するために、特にＫ４３のＮ末端およびＣ末端の４アミノ酸位置までを囲む、プロテアーゼコンセンサス配列内のアミノ酸置換を最小にすることが好ましい。しかしながら、同時に、構造変化による新しいエピトープの形成のリスクを最小にするか、またはＩｇＥ結合挙動を減少させることが必要である。このリスクを最小にするために、Ｋ４３を、他の哺乳動物種に見出されるような、例えばモルモット（Ｅ；グルタミン酸）またはマウスおよびラット（Ｔ；スレオニン）に存在する、親水性／極性／塩基性または酸性のホモログ残基で置換することが好ましい。しかしながら、いくつかの非ヒト霊長動物種またはブタに見られるようなＲ（アルギニン）による最も保存的な置換は、以下にさらに述べるように、アルギニンがプラスミンコンセンサスの一部であることが知られているため、有効なプロテアーゼ抵抗性を提供しない（例えば、Bakes et al 2000参照）。
【００４０】
ヒトＦｃｅＲＩａのＫ４３部位（下線部）をカバーするＮ末端ＦｃｅＲＩａ配列の種アライメント（もちろん、用語“Ｋ４３”は常に他の非ヒト種の対応する位置に関連する）：
【表１】
2019510737.tif 000005
【００４１】
従って、本発明は、一般的に、ヒト以外の全ての同種のＦｃｅＲＩａ種に適用可能である。しかしながら、本発明の最も好ましい態様は、上に既に記載した通り、ヒトＦｃｅＲＩａ種のＫ４３変異体である。このことは、外来（すなわち、非自己）の治療タンパク質に対する免疫応答を避けるために、治療タンパク質中の他の種由来の相同配列の使用を可能な限り厳密に回避することが今日の当分野の技術水準であるという事実によってさらに強まる。従って、これは、例えば初期世代のマウス／ヒトキメラ治療抗体においてみられるような、ＡＤＡ（＝抗薬物抗体）を誘導するリスクを有するために、ヒトにおいて、非ヒトＦｃｅＲＩａ鎖を治療目的（すなわち、注射可能またはアフェレシス吸着剤のいずれかとして）で使用することは望ましくない。さらに、非ヒト起源からの治療タンパク質のヒトにおける治療的使用は、例えば非ヒトＦｃｅＲＩａ配列のようないくつかのアミノ酸置換を含む外来タンパク質に対するＴ細胞寛容（tolerance）は期待できないため、Ｔ細胞エピトープを介したＴ細胞誘導のリスクを有する。
【００４２】
ＦｃｅＲＩ配列中のＫ４３を置換することによるプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａ変異体の提供は、ＦｃｅＲＩａ配列を設計する全く新しいアプローチである。第１に、同種のいずれも、この領域においてこのようなプロテアーゼ抵抗性の置換を有するヒト配列を含まない。第２に、ＦｃｅＲＩａ配列の以前の設計提案のいずれも、プロテアーゼ切断を妨げるような置換を提供しない。これは、現在のＦｃｅＲＩａ分子が画期的な技術革新を具現し、（例えば、ＷＯ０２／０６２９８Ａ１、ＷＯ９６／０８５１２Ａ１、Raら（J. Biol. Chem. 264 (1989): 15323-15327）、ＷＯ９９／３８９７４Ａ１、ＷＯ０１／２１８１６Ａ１、Liuら（PNAS 85 (15) (1988): 5639-5643）に記載されるＦｃｅＲＩａ分子のような）先行技術に開示されている全てのＦｃｅＲＩａ配列とは顕著に異なるためである。
【００４３】
本発明のＦｃｅＲＩａは、好ましくは、例えばＩｇＥの表面捕捉が可能なように固体表面上に固定化される。該固体表面は、ポリペプチド分子（例えば、マイクロビーズ、微粒子、フィルター、ガラス、シリコン、金属、金属合金、アノード、ポリマー、ナイロンまたはプラスチック）を固定することができる表面であり得る。そのような固体表面材料およびかかる材料にＦｃｅＲＩａを結合させる方法は、当業者に十分に利用可能である；先行技術における天然ＦｃｅＲＩａに用いられる全ての材料および方法は、本発明によって用いられ得る。
【００４４】
別の側面により、本発明は、ＩｇＥ媒介性疾患の予防および／または処置に用いるための本発明のＦｃｅＲＩａに関し、ここで、ＦｃｅＲＩａは、アフェレシスにおいて、ヒト体液、とりわけヒト血漿または血清から過剰のＩｇＥを枯渇させるために用いられる（抗ＩｇＥ療法）。
【００４５】
本発明のＦｃｅＲＩａは、天然ＦｃｅＲＩａについて示唆され実施された医学的／治療的／診断的使用のために使用されてもよく、とりわけ天然の折り畳みおよび完全な機能性を維持しながら、プロテアーゼ抵抗性および構造的に天然のままであるという、本発明の利点を提供する。
【００４６】
従って、本発明のＦｃｅＲＩａは、アレルギー性疾患、好ましくは季節性、食物、花粉、カビ胞子、有毒植物、薬物／薬剤、昆虫毒素、サソリ毒素または蜘蛛毒素、ラテックスまたはハウスダストダニアレルギー、ペットアレルギー、アレルギー性鼻炎および結膜炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性気管支喘息、非アレルギー性喘息、チャーグ・ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、鼻のポリープ症、木村病；接着剤、抗菌剤、香料、染髪剤、金属、ゴム成分、局所用医薬、ロジン、ワックス、艶出し剤、セメントおよび皮革に対する接触性皮膚炎；性鼻副鼻腔炎、アトピー性湿疹、ＩｇＥ関連自己免疫性疾患、好ましくは慢性（特発性）および自己免疫性蕁麻疹、コリン作動性蕁麻疹、肥満細胞症、とりわけ皮膚肥満細胞症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、慢性または再発性特発性血管浮腫、間質性膀胱炎、アナフィラキシー、とりわけ特発性および運動誘発性アナフィラキシー、免疫療法、好酸球関連疾患、好ましくは好酸球性喘息、好酸球性胃腸炎、好酸球性中耳炎および好酸球性食道炎；リンパ腫、好ましくは胃または十二指腸の潰瘍または逆流のための抗酸性療法の感作副作用の予防または治療のための薬剤の製造のために用いられ得る。
【００４７】
本発明によって、本発明のＦｃｅＲＩａの有効量が、それを必要とする患者、とりわけヒト患者（現在の治療的使用の中心にいるヒト）に投与される（例えば、注射可能な、経口的に、または他の非経腸的に送達される治療剤として投与される）。
【００４８】
本発明のＦｃｅＲＩａの利点は、それを、ＩｇＥ関連疾患の患者の血液中のＩｇＥ含量を低下させるアフェレシス技術に特に適したものとする。従って、ＦｃｅＲＩａは、好ましくは、ヒト個体の血流との接触に適した固体担体に結合される。
【００４９】
従って、本発明の別の側面は、血流または血漿流と接触することができる固体担体を含むアフェレシス装置に関し、該固体担体が、本発明のＦｃｅＲＩａを含むことを特徴とする装置に関する。
【００５０】
アフェレシス装置の適切な使用はまた、ｐＨショックによって行われ得るリサイクル（溶離）を必要とするので、好ましい吸着剤はｐＨ抵抗性でなければならず、すなわち、ＦｃｅＲＩａ分子は、その親和性および特異性が妨げられないように正確に再折り畳みされるべきである。
【００５１】
本発明のＦｃｅＲＩａは、好ましくは共有結合、配向／方向性固定化により（とりわけ、例えばシステインのチオール基、リシンの第一級アミン、人為的に導入されたアルデヒドなどのような分子上の１つの定義された反応基により）、アフェレシスマトリックス担体（すなわち、固体担体）上に効果的に固定化され得る。タンパク質上の側鎖基の官能化については、例えば、任意の組換えタンパク質に対する一般的な応用が列挙されている（van Vughtら、2014を参照のこと）。固定化の過程で、例えば、固定化タンパク質の負の機能的結果を可能な限り防ぐために注意を払わなければならないことも明らかである。例えば、機能的に関連するシステインまたはリシンが、そのような固定化の過程で十分に保護されていることは明らかである。
【００５２】
ＩｇＥ関連疾患を有する患者の血液から除去すべきＩｇＥを含む（体外）血流または血漿流を、本発明のアフェレシス装置に導き、固体表面上で本発明のＦｃｅＲＩａ変異体分子にＩｇＥを結合させることにより該ＩｇＥを特異的に除去する。
【００５３】
本発明の装置には、好ましくは担体として滅菌の、および発熱物質を含まないカラムが含まれる。
【００５４】
本発明により、アフェレシスまたは血漿アフェレシスとは、患者の血液が、１つの特定の成分を分離し、残りを循環系に戻す装置を通過する医療技術と定義される。本発明により、アフェレシスを用いて、本発明で提供されるＦｃｅＲＩａ分子の使用により血漿からＩｇＥ分子を分離する。本発明により、アフェレシス装置は、血流または血漿流と接触させることができ、かつＩｇＥに結合する受容体としての本発明のＦｃｅＲＩａ変異体を有する、固体カラムを含む。滅菌の、および発熱物質を含まないカラムは、好ましくは、アフェレシス担体として用いられる。本明細書中、“カラム”は、タンパク質が化学的に結合され得るマトリックス材料を有する形状のモジュールとして定義される。
【００５５】
好ましくは、固体担体のマトリックス材料は、セファロース(商標)、デキストラン、アガロースまたはセルロースのような炭水化物ベースの材料である。他の好適なマトリックス材料には、ガラス製、またはポリメタクリレート、ポリスチレンおよびポリアミドなどの合成ポリマー製の、ビーズ、繊維および膜またはフィルムなどのオートクレーブ可能なマトリックスが含まれる。ビーズが使用される場合、該ビーズの直径は、アフェレシスの液相が循環できる限り、限定されない。しかしながら、流動抵抗を小さくするためには、直径５０〜３０００μｍ、とりわけ２００〜３０００μｍのビーズを用いることが好ましい。マトリックス材料は、米国特許第５，８１７，５２８号による滅菌溶液による予備洗浄および低温でのさらなるスチーム処理により、あるいは当業者に知られている何らかの他の技術によって滅菌される。次いで、滅菌した発熱物質を含まないマトリックス材料は、米国特許第５，８１７，５２８号に記載されているような臭化シアン溶液を用いたインキュベーションまたは当業者に知られている他の任意の技術によって活性化される。次いで、インキュベーションにより所望の抗原結合分子を該カラムにカップリングさせる。あるいは、ＵＳ５，８１７，５２８Ａに記載のように、抗原結合分子を１，１’カルボニルジイミダゾールと共にインキュベートするか、または当業者に公知の任意の他の技術により、活性化およびカップリングを同時に達成することもできる。カップリング法が一旦終了すると、それに結合した抗体を有するマトリックス材料をよく洗浄し、シアン酸エステル、無菌性および発熱性について試験する。カラムに固定化される吸着分子の量およびカラムのサイズは制限されない。カップリングしたマトリックス材料についても、全結合タンパク質、および該結合タンパク質の結合活性について試験する。次いで、カップリングしたマトリックス材料を、無菌条件下で滅菌し、発熱物質を除去したシラン処理済ガラス容器に充填して、滅菌の、かつ発熱物質を含まないタンパク質結合カラムを形成する。アフェレシス装置を通過する流量は、回路のチューブの内径を適切に選択することによって、または補助ポンプを使用することによって制御され得る（ＵＳ４，７７０，７７４Ａ）。本発明のカラムは、使用後に吸収されたＩｇＥを溶出することによって繰り返し使用され得て、リサイクルされ得る。
【００５６】
本発明のアフェレシス装置は、必要に応じて、さらなるＩｇＥ結合分子（例えば、抗体、天然のＦｃｅＲＩａまたは他の公知のＩｇＥ結合分子など）を含んでいてよい。しかしながら、本発明のＦｃｅＲＩａ分子のプロテアーゼ抵抗性のために、これらの分子を唯一の分子種として（または利用可能であれば、他のプロテアーゼ抵抗性ＩｇＥ結合分子と共に）用いることが最も好ましい。
【００５７】
本発明はまた、ＩｇＥ関連疾患を予防および／または処置するための、とりわけ抗ＩｇＥ療法を行うための、予防および／または治療装置を提供することを目的とする本発明のアフェレシス装置の使用に関する。
【００５８】
別の側面により、本発明は、本発明のＦｃｅＲＩａを含む固体アフェレシス担体を含むＩｇＥ関連疾患の予防および／または処置における使用を目的とするキットであって、ここで、該担体が、滅菌かつ発熱物質を含まないカラムであるキットに関する。
【００５９】
該キットは、患者から採血し、その血液（低減された量のＩｇＥを含む）を患者に戻すための接続手段および運搬手段、本発明のＦｃｅＲＩ変異体を有する固体表面上に血液または血漿を送り込むためのポンピング手段、ならびに患者の処置前、処置中および処置後の（例えば、その後のアフェレシスカラムの再生過程においても）、血流または血漿流速度およびアフェレシス性能（吸着など）を制御するための適切な制御装置をさらに含んでいてよい。
【００６０】
本発明はまた、とりわけＩｇＥ関連疾患の予防または処置における使用のための、および／またはＩｇＥ関連疾患の予防または処置のための医薬の製造における使用のための、本発明のＦｃｅＲＩａに関する。
【００６１】
本発明の対象は、さらなるＩｇＥ低下療法、例えば上記の“抗ＩｇＥ療法および制限”に記載の抗ＩｇＥ療法、とりわけ、例えばKerzel et al., 2011に記載の、抗ＩｇＥ抗体（オマリズマブ（登録商標）など）に血漿交換を適用する併用療法と組み合わせるのに特に適している。
【００６２】
ＩｇＥアフェレシスのための本発明のＦｃｅＲＩａ変異体の使用は、特に好ましい態様であるが、本発明のＦｃｅＲＩａ分子は、天然のＦｃｅＲＩａまたは天然ＦｃｅＲＩａを含む組成物について先行技術において示唆および実施される（治療または診断）目的の何れかのための使用であり得る。例えば、本発明のＦｃｅＲＩａは、（例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、ポンプ、経皮、吸入などの生物学的治療剤の送達に使用される注射、経口送達または他の任意の非経腸経路により）投与される生物学的治療剤として用いられ得る。従って、本発明はまた、本発明のＦｃｅＲＩａおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００６３】
好ましくは、本発明の医薬組成物はさらに、組成物が投与される患者において、本発明のＦｃｅＲＩａ変異体の半減期を増加させる薬剤を含む。そのような半減期増加剤の例は、当業者に知られている。例としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＰＥＧ基の導入（“ＰＥＧ化”）である。
【００６４】
別の側面により、本発明は、プロテアーゼ含有サンプル、とりわけ血漿サンプルまたはＩｇＥ含有および膜ＩｇＥ含有組織および細胞におけるＩｇＥ検出用のリサイクル可能なプローブとしての本発明のＦｃｅＲＩａの使用に関する。本発明のプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａ変異体は、例えば、サンプルを、一般的なＢｉａｃｏｒｅ設定のように並行ではなく順次に測定しなければならないとき、変性／再生によってリサイクルすることができる。アフェレシスに関して、変性後の重要性または再使用可能性もまた、このようなプローブ用途に関係する。本発明のプローブは、サンプル中のプロテアーゼによって、または変性／再生を含む後のリサイクル工程によって傷つかない。一旦ＩｇＥが捕捉され測定されると、ＩｇＥは、本発明のＦｃｅＲＩａを傷つけることなく変性によって放出され得る。（例えばｓｃＦｖ１２とは対照的に機能性を失うことなく）再生後、以下の例（例えば、図７Ａ参照）に示すように、次の測定を実行し得る。
【００６５】
ＩｇＥ（好ましくは、血漿および他の全てのプロテアーゼ含有サンプル由来）を検出するプローブとしての、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａの適用は、任意の捕捉／検出ベースの方法に適用することができる。従って、本発明のプローブをＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）またはＳＰＲ（表面プラズモン共鳴；Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイで使用することが特に好ましい。
【００６６】
診断またはバイオマーカー分析の目的のためのＩｇＥもしくは膜ＩｇＥ含有組織または体液およびコンパートメントのインビボ検出を可能にするフルオロフォアと組み合わせた分子イメージングトレーサーとしての、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａの適用は、本発明の好ましい使用である。標識されたＦｃｅＲＩａは、光学的インビボイメージングによく適した比較的小さいトレーサーを表す。一般的に、より小さいトレーサーは、Oliveira 2015によって詳細に記載されるような分子イメージングの利点を提供する。
【００６７】
さらに、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａは、例えば、二機能性ｍＡＢまたはモジュラーシステムのためにいくつかの機能を組み合わせる幾つかの他の最先端の生物製剤の一部として、現代の治療薬として、より洗練された（多）機能性構築物の一部として提供され得る。従って、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａはまた、体内または体外の治療および診断または画像化目的のための複合体または多機能性構築物の一部として使用することもできる。組み換え融合タンパク質として、それは二機能性または多機能性タンパク質の一部であり得て、それにより、一般的技術に従って、機能的ドメインは、Chen et al. 2013により記載されるような不活性な柔軟性または剛性のペプチドリンカーを介して、互いに遺伝子的に融合され得る。かかるリンカーおよび結合ドメインは、安定性、溶解性、発現収率、生物学的活性、抗原性および薬物動態に影響を及ぼし得る。かかるリンカーはまた、制御された活性化または標的細胞もしくは組織への送達を達成するために、例えば治療的機能の局所活性化またはインビボ画像化のために必要とされるようなインサイチュでの特異的標識活性化を提供するために、インビボで切断可能であるように設計され得る。
【００６８】
ＦｃｅＲＩａと組み合わせることができる機能的ドメインのプロトタイプの例は、ヒト血清アルブミンである。これはDiganらによって最初に提案された（ＷＯ１９９８／００４７１８Ａ１）。好ましい選択肢として、トランスフェリンまたはＦｃドメインを用いて、生物製剤の薬力学的挙動を調節することもできる。一般的な技術によれば、ＦｃｅＲＩａは、他の機能性タンパク質またはペプチド物質、例えば、サイトカイン（一般的に、Bootz ＆ Neri 2015に記載される通り、“イムノサイトカイン”と称される）、あるいはSpiess et al 2015に広く記載されている抗体様構造体に、遺伝子的または化学的に連結またはヘテロ二量体化され得る。二重または多特異性治療剤の設計のための新たに作成されたフォーマットには、（抗体、抗体フラグメントまたは抗体様構造体の例として）ナノボディ、（タンデム型）ｓｃＦｖ’ｓ、（四価の二重特異性のタンデム型）ＩｇＧ、二重標的化ドメイン、ＢｉＴＥ’ｓ、Ｔｒｉｏｍａｂ’ｓ、ＤＡＲＴ’ｓ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＩｇＧ−フィノマーなどが含まれる。現在臨床評価中の一般的なフォーマットについて詳しいレビューは、Spiess et al. 2015に記載されている。それらの技術的な柔軟性に基づき、そのようなフォーマットは、ＦｃｅＲＩａに新しい複数の治療的機能を提供し、それらを組み合わせるために、ＦｃｅＲＩａとの融合タンパク質として使用され得る。従って、本発明のＦｃｅＲＩａは、（以下の機能性分子群の各々の１以上）にカップリングされてよい：
−リンカー分子、好ましくはペプチドリンカー、とりわけ１〜１０個、好ましくは２〜５個のアミノ酸酸基からなるペプチドリンカー；および／または
−治療分子もしくは診断分子、好ましくはモノクローナル抗体もしくは抗体フラグメント、サイトカイン、抗体様構造体、細胞毒性剤、好ましくは毒素もしくは細胞毒性薬、光学トレーサー；および／または
−担体、好ましくは担体タンパク質、とりわけヒト血清アルブミン、トランスフェリンもしくはＦｃドメイン。
【００６９】
この側面の好ましい態様により、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａは、ＩｇＥスイッチしたＢ細胞などのＩｇＥ Ｂ細胞受容体発現細胞を標的とするための抗体薬物複合体（ＡＤＣ）治療剤と同様の方法で用いられ得る。これにより、これらの細胞を死滅もしくは（細胞周期）停止させるか、または最終的にＩｇＥを低下させる阻害シグナル伝達を提供する。ＡＤＣ治療剤は、一般的に、Peters ＆ Brown, 2015に記載されるように、機能的活性剤、特に細胞毒性剤を特定の標的細胞に送達するための抗癌剤として使用される。従って、本発明のＦｃｅＲＩａは、少なくとも１つの細胞毒性剤と化学的に、または遺伝子的に結合されている。この結合した分子は、例えばＩｇＥ Ｂ細胞受容体を発現する細胞を標的とするのに好適であり、それ故に、ＩｇＥ Ｂ細胞受容体を発現する細胞を死滅させるまたは抑制することにより最終的にＩｇＥを産生する血漿細胞数が減少し、それにより患者における可溶性ＩｇＥレベルが低下するという事実に基づいて、上記のようなアレルギーまたは他のＩｇＥ関連疾患の処置に必要なようなＩｇＥ低下を可能にする。あるいは、稀少癌形態のようなＩｇＥ Ｂ細胞受容体を発現する他の細胞もまた、抗体薬物複合体法と同様の方法でＦｃｅＲＩａ薬物複合体によって標的化され得る。本発明のＦｃｅＲＩａとそのようなさらなる（機能的）分子との組み合わせは、好ましくはＩｇＥ Ｂ細胞受容体を発現する細胞に対して細胞傷害剤を特異的に標的化するための本発明のＦｃｅＲＩａを含むＡＤＣ様物質（Peters ＆ brown, 2015によって定義される）として見なされ得る。
【００７０】
上記の問題および側面は、本発明のＦｃｅＲＩａフラグメントについても同様に適用される。従って、本発明は、本発明のＦｃｅＲＩａフラグメントにも関し、ここで、該ＦｃｅＲＩａフラグメントは、ヒト個体の血流との接触に適する固体担体にカップリングされている。
【００７１】
本発明のフラグメントは、好ましくは、アフェレシス装置に適用される。従って、本発明は、血流または血漿流と接触することができる固体担体を含むアフェレシス装置であって、該固体担体が本発明のＦｃｅＲＩａフラグメントを含むことを特徴とするアフェレシス装置にも関する。従って、本発明はまた、ＩｇＥ関連疾患を予防および／または処置するための、とりわけ抗ＩｇＥ療法を実行するための、予防および／または処置装置を提供するための、本発明のＦｃｅＲＩａフラグメント含有装置の使用にも関する。本発明はまた、本発明のＦｃｅＲＩａフラグメントを含む固体アフェレシス担体を含むＩｇＥ関連疾患の予防および／または処置における使用のためのキットであって、ここで、該担体は、滅菌かつ発熱物質を含まないカラムである、キットにも関する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、ＦｃｅＲＩａによるプラスミンの共沈を示す。
【図２】図２は、集められたヒト血清（Ａ）およびプラスミン（Ｂ）と組換えＦｃｅＲＩａとのインキュベーション／消化を示す。
【図３】図３は、野生型またはプロテアーゼ抵抗性Ａ４３−ＦｃｅＲＩａ吸着剤をプラスミンとともにインキュベートするとき、ＩｇＥ枯渇が異なる程度まで減少することを示す。
【図４】図４は、野生型受容体消化ピークが３０分に現れるのに対して（灰色線）、組換えＡ４３−ＦｃｅＲＩａの変異体であるプロテアーゼ抵抗性変異体（黒線）には切断産物が完全に存在しないことを示す塩基ピーククロマトグラムを示す。
【図５】図５は、Ａ４３−ＦｃｅＲＩａに結合するＩｇＥの計算されたＥＣ５０値（ＦｃｅＲＩａ、Ａ４３−ＦｃｅＲＩａおよびＳｃＦｖ１２のそれぞれについて、２４．５ｎｇ／ｍｌ、３４．４ｎｇ／ｍｌおよび４２．８ｎｇ／ｍｌ）および曲線形状が、ｗｔ−ＦｃｅＲＩａまたはｓｃＦｖ１２と同様に、ＦｃｅＲＩａ配列の位置４３でのＫ→Ａ変化が負の効果を示さないことを証明することを示す。
【図６】図６は、ＩｇＥは、（ＦｃｅＲＩａおよびｓｃＦｖ１２のビーズへの等価固定化、その後のインビトロでのＩｇＥ吸着による）ｐＨ３．４処理によりＦｃｅＲＩａからほぼ完全に溶離され得るが、一方、ＩｇＥは、ＳｃＦｖ１２から遊離されなかったことを示す。
【図７】図７は、血清の有無に関わらず再生性能を示す；プロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩ吸着剤に対する血清環境の安定化／再生効果は、血清再生を伴わない状態（図７Ｂ）と比較して、血清再生（図７Ａ）によるＩｇＥ結合能の中程度の低下に反映される。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本発明は、２つの本質的特徴を組み合わせた改良されたＦｃｅＲＩａの変異体を提供する：第１に、ＦｃｅＲＩａのＮ末端部分内の新たに認識されるタンパク質分解切断部位での切断は解除されるが、同時に、ＦｃｅＲＩａの構造は、ＩｇＥ結合性、ｐＨ安定性および再折り畳み特性を保持するために変化させない（実施例５、６および８で証明される通り）。ＦｃｅＲＩａプロテアーゼ抵抗性を付与するために、野生型（ｗｔ）ＦｃｅＲＩａ配列内に通常は存在しない新たなエピトープの形成を避けることが特に重要である。血中、血漿中または血清中のプロテアーゼ抵抗性に加えて、本発明の改変は、新規の免疫原性部位のリスクを最小化するために、構造変化がないかまたは最小限であることを保証しなければならない。同時に、ｗｔ ＦｃｅＲＩを提供することができるのと同じ有利な溶離および再折り畳み特性を保持するはずである（実施例５、６および８で証明される通り）。
【００７４】
ＦｃｅＲＩと血漿プロテアーゼとの間の物理的結合は、実施例１にて見出された。ＦｃｅＲＩａのＮ末端部分における血漿プロテアーゼ感受性部位の同定は、実施例２において実証され説明されている。実施例３は、組換えＦｃｅＲＩａのタンパク質分解切断が、ＩｇＥ阻害（例えば、治療用ＩｇＥブロッカーとして使用されるとき）または体外ＩｇＥ除去（例えば、選択的ＩｇＥ吸着剤として使用されるとき）に有害なＩｇＥ結合低減をもたらすことを示す。この実施例では、切断されたＦｃｅＲＩ吸着剤が、ＦｃｅＲＩａのＮ末端ドメインが有効なＩｇＥ結合に必要な部分を含むことを示す先の機能的／構造的研究によって確証される吸着効率の損失を被ることが示されている（Mallamaci et al. 1993）。本発明は、新しいプロテアーゼ感受性部位（Ｋ４３と称する）の現在の知見およびＩｇＥ結合に対するその機能的関連性の評価に基づいて、実施例４および５で実証される通り、ＦｃｅＲＩａ吸着剤をＫ４３におけるプロテアーゼ消化に対してプロテアーゼ抵抗性にして、血液、血漿または血清との接触を維持するのを可能にするという技術的解決法を提供する。実施例５および６は、プロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａが、従来技術のｓｃＦｖ１２（Lupinek et al. 2009およびＵＳ２０１４／１２４４４８Ａ１）と比較したとき、それと匹敵するＩｇＥ結合および吸着特性を有することを実証する。しかしながら、ｓｃＦｖ１２とは対照的に、プロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａ吸着剤は、ｓｃＦｖ１２よりも高いｐＨ安定性を示し、例えばアフェレシスにおいて、使用時に溶離／再生およびリサイクルが可能となる。実施例７および８は、従来技術の単鎖抗体吸着剤ｓｃＦｖ１２が、低ｐＨでのその分解のためにＩｇＥ溶離後にリサイクルできないことを示している。しかしながら、コストを節約するために１つのカラムを複数回使用できるようにするためには、実施例８に示すように吸着分子を不可逆的に損傷または変性することなく溶離（例えば、低ｐＨによる）および再生を可能にするアフェレシスカラムを提供することが重要である。実際に、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａ吸着剤はまた、治療的アフェレシスによって抗ＦｃｅＲＩ自己抗体を枯渇させることができる。このような自己抗体は、例えば、慢性自己免疫蕁麻疹などの病状において見いだされ得る（Zuberbier et al. 2000）。この特徴は、抗ＩｇＥ抗体または抗体の誘導体、例えば例えばＳｃＦｖまたはＦａｂなどに基づくＩｇＥ吸着剤によっては提供されない。最も重要なことには、本発明は、分子のＩｇＥ結合および再折り畳みを変化させないＦｃｅＲＩａ配列の僅かな修飾を提供する。免疫系に“非自己”の、新しい抗原構造を提示するリスクは、プロテアーゼ切断を完全に無効にするために、１つの小型の非荷電アミノ酸が用いられ得るという事実によって最小限に抑えられる。従って、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａは、体外治療処置、例えば選択的ＩｇＥアフェレシスまたは自己抗体の枯渇などだけでなく、血流への受動的投与のための（例えば、非経腸、経口または他の一般的に使用される投与経路によって）投与された治療薬を産生するための基礎としても使用することができる。
【００７５】
まとめると、本発明は、その機能性およびｐＨ安定性を維持しつつ、かつ天然ＦｃｅＲＩａ構造を改変するリスクを有する“外来”アミノ酸置換によって誘導される免疫原性のリスクを最小限に抑えながら、血漿プロテアーゼによる消化に対して抵抗性であるＦｃｅＲＩａ 鎖の人為的修飾に関する。従って、新規のプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａ変異体は、ＩｇＥ結合が必要とされる治療用途におけるＦｃｅＲＩａ鎖の使用の利点を提供する。
【実施例】
【００７６】
実施例
実施例１：ＦｃｅＲＩａと血漿プロテアーゼとの結合
組換えＦｃｅＲＩａは、いくつかの血漿タンパク質、例えば、プラスミノーゲンまたはプロトロンビンなどの血清プロテアーゼと共沈する。この関連性は、ＦｃｅＲＩａが、血液、血漿または血清との接触中にこれらのプロテアーゼによって切断されることを可能にする。表１．１は、以下の材料および方法で説明するように、ヒト血清とインキュベートした組換えＦｃｅＲＩａの共沈において同定されたタンパク質を列挙する。
【００７７】
【表２】
2019510737.tif 000006
【００７８】
結果として、少なくとも２つの関連するプロテアーゼ、すなわちプラスミノーゲン／プラスミンおよびプロトロンビン／トロンビンは、ヒト血清とのインキュベーションにより組換えＦｃｅＲＩａと結合する。このことは、血中に投与されるか、またはアフェレシスの吸着剤として適用されたとき、ＦｃｅＲＩａタンパク質の望ましくないタンパク質分解切断および分解の可能性を示唆する。実施例２および３の結果は、ＦｃｅＲＩａが、タンパク質分解的に切断されて、ＩｇＥ結合に実際に支障を来すことを示している。
【００７９】
図１は、１０μｇ／ｍｌでのインキュベーション時のＦｃｅＲＩａによるプラスミン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ１８６７）の共沈が、血清インキュベーションで同定されたような吸着剤と血漿プロテアーゼ（複数可）との直接的な物理的相互作用の証拠を提供することを示す（表１参照）。共沈したプラスミンをウェスタンブロット分析によって分析した；レーンには、以下のものを充填した：Ｍ、タンパク質マーカー；レーンＰ、プラスミン；レーン１、ＦｃｅＲＩａ（ビーズ上に５０μｇ）＋１μｇ プラスミン；レーン２、ＦｃｅＲＩａ＋１００ｎｇ プラスミン；レーン３、ＨＳＡ＋１μｇ プラスミン；レーン４、ＨＳＡ＋１００ｎｇ プラスミン。血清共沈試験の結果と一致して、共沈したプラスミンは、ＨＳＡでコーティングされた対照ビーズ（レーン３および４）とは対照的に、組換えＦｃｅＲＩａでコーティングされたビーズ（レーン１）を用いたとき、２５ｋＤバンドとして現れ得る。ＦｃｅＲＩａとプラスミンとのインビトロでの結合は、表１（上記）に示す通り、血清共沈法の結果を裏付けている。
【００８０】
材料および方法：
組換えＦｃｅＲＩａの発現および精製：
ＨＥＫ２９３フリースタイル細胞（Invitrogen R790-07）を、適切な培地（Invitrogen 12338-026）中の１２５ｍｌおよび２５０ｍｌのフラスコ中、回転下（１８０ｒｐｍ）、３７℃で増殖させた。２日毎に１：３〜１：５のスプリットによって、２ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌの最大細胞密度となるように細胞を維持した。トランスフェクションのために、３０μgのプラスミドＤＮＡ、３０μlのＭＡＸ試薬（Invitrogen 16447-100）および１ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ（Invitrogen 31983-062）を含む３０ｍｌの培地中で処理する前に、該細胞を５ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌで２４時間スプリットした。組換えＦｃｅＲＩａを、真核発現ベクターｐＴＴ５（NRC National Research Council Canada）のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとの間にクローニングした。構築物は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＢＡＡ７５０５４．１に由来するシグナルペプチドと、それに続くアミノ酸２０（本明細書中全ての番号付けは、ＵｎｉＰｒｏｔ配列 Ｐ１２３１９に従う）から始まり、ＦｃｅＲＩａの細胞外領域と、それに続くスペーサーおよび標準的なＮｉ−ＮＴＡ精製のための６個のＨｉｓをカバーするアミノ酸２０５までのＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｐ１２３１９［FCERA_HUMAN］から構成された。前洗浄後、１ｍｌのＮｉ２＋ＮＴＡアガロースビーズ（Qiagen 30210）および２−５ｍｌの予め濃縮した細胞培養上清を、２ｍｌのＴａｌｏｎ ｇｒａｖｉｔｙ カラム（Takara 635696）に適用し、６ ｘ ＨＩＳ洗浄緩衝液（５０ｍＭ リン酸緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８）で数回洗浄した。溶出は、非変性条件下（製造業者のプロトコールＱｉａｇｅｎ ３０２１０に従う）で、６ ｘ ＨＩＳ溶出緩衝液（５０ｍＭ リン酸緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８）を用いて行った。溶出液を、ＡＭＩＣＯＮ−ＵＬＴＲＡ−１５−遠心フィルター（１０Ｋ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号：ＵＦＣ８０１０２４）を用いて１００−２００μｌに濃縮し、６ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、１００−１５０μｌに再度濃縮し、免疫沈降に用いた。
【００８１】
組換えＦｃｅＲＩａとヒト血清とのインキュベーションにおける共沈した血漿プロテアーゼの検出。
吸着剤でコーティングされたビーズ（Bioclone FG-102）を、５０μｌの１７ヒト血清ミックス、または５０μｌのＩｇＥ枯渇血清ミックスのいずれかと、または５０μｌのＰＢＳと共に２１時間、２７℃にて、９００ｒｐｍで振盪しながら、インキュベートした。インキュベーション後、ビーズをＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡ／０．５％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄した。
【００８２】
タンパク質を固定化したビーズを、１５ｍＭのＤＴＴ（Ｒｏｔｈ、＃６９０８．３）を含む重炭酸アンモニウム緩衝液（ABC緩衝液；Ａｃｒｏｓ有機物カタログ番号１０６６−３３−７）と混合し、５６℃で４５分間インキュベートして、ジスルフィド結合を還元した。１００ｍＭのＡＢＣ中のヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ ＃ Ｉ１１４９−５Ｇ）を加え、混合物を暗所で３０分間インキュベートして、システインのカルバミドメチル化を行った。ビーズを１００ｍＭのＡＢＣ緩衝液で２回洗浄し、５μgのトリプシン（Promega ＃９００５８）と共に一晩インキュベートした。消化したサンプルを、水性溶媒として０．１％ギ酸を用いてBioBasic Ｃ１８カラム（ＢｉｏＢａｓｉｃ−１８、１５０ｘ０．３２ｍｍ、５μｍ、Thermo Scientific）に充填した。５％のＢ（溶媒Ａ：０．１％ＦＡ水溶液、ＡＣＣＮ中０．１％ＦＡ）から３２％のＢへの勾配を３５分間適用し、その後、３２％のＢから７５％のＢへの勾配を１５分間適用して、６μＬ／分の流速で、大きなペプチドの溶出を容易にした。検出を、陽イオンのＤＤＡモード（＝溶出ピークのＭＳＭＳモードへの切り替え）で標準ＥＳＩ供給源を備えたＱＴＯＦ ＭＳ（Bruker maXis 4G ETD）を用いて行った。ＭＳ−スキャンを記録し（範囲：１５０−２２００Ｄａ）、断片化のために６個の最高ピークを選択した。装置の校正（キャリブレーション）を、ＥＳＩキャリブレーション混合物（Agilent）を用いて実施した。データファイルは、（Data Analysis、Brukerを用いて）ＧＰＭを用いてＭＳ／ＭＳイオン検索を実行するのに適するｍｇｆファイルに変換された。ＧＰＭは、タンパク質識別データを分析して表示するためのウェブベースのオープンソースユーザインタフェースである（http://human.thegpm.org）。このインターフェースは、タンパク質配列に割り当てられたタンデム質量分析データの一連のウェブブラウザページビューを作成する。同定されたタンパク質のうち、トリプシンと同一の理論上の切断部位を有する２種のプロテアーゼ（すなわち、プロトロンビンおよびプラスミノーゲン）が同定されている（Perkins et al. 1999参照）。トリプシン消化がプロテアーゼ切断部位を同定するためのアプローチを妨害した可能性があるので、代替消化（ＧｌｕＣ、Ｒｏｃｈｅ、＃１１０４７８１７００）を実施して、ペプチドを放出させた。表１は、同定されたタンパク質をそれらのＭＡＳＣＯＴスコア（http://www.matrixscience.com/help/scoring_help.html）と共にそれぞれ示す。ＭＡＳＣＯＴスコアが高いほど、検出されたタンパク質と理論的なタンパク質スペクトルとがよく一致している。スコアは、ＰＢＳサンプルに対してランク付けされた（ＭＡＳＣＯＴスコア３）。（ＭＳ法の詳細については、Botelho et al. 2010を参照のこと）。
【００８３】
プラスミンの共沈：
ＦｃｅＲＩａでコーティングされたビーズ（Bioclone FG-102）を、５０μｌのヒト血清ミックス（実施例１の通り）中または５０μｌのＰＢＳ中で、２１時間、９００ｒｐｍで振盪しながら、３７℃にてインキュベートし、次いでＰＢＳで４回洗浄した。還元、Ｓ−アルキル化、ＧｌｕＣ消化および質量分光分析のプロトコールは、実施例１に記載の通りに行った。組換えＦｃｅＲＩａタンパク質を、製造業者のプロトコールに従い、ビーズ１ｍｌ当たり１ｍｇのタンパク質で、１μｍのＢｃＭａｇヨードアセチル活性化磁気ビーズ（Bioclone FG-102）に結合させた。８ｍｇ／ｍｌのシステインでブロッキング後、ビーズをＰＢＳ＋０．５％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。１ｘプラスミン消化緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）をビーズに添加し、次いで、３７℃にて１時間、示されたプラスミン濃度でインキュベートした。ウェスタンブロット分析のために、ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、ＬＤＳ緩衝液（Invitrogen カタログ番号ＮＰ０００７）およびサンプル還元剤（Invitrogen カタログ番号ＮＰ０００９）を添加した。９５℃で１０分間変性させた後、サンプルをＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen ＮＰ０３２２ＢＯＸ）に負荷し、２時間／７０Ｖで泳動した。ゲルを、ＱＵＩＣＫ−ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＳＹＳＴＥＭ（Biorad、設定：標準、混合ＭＷ、１．３Ａ、２５Ｖ、７分）を用いて膜にブロッティングし、ＰＢＳ−Ｔ（１ｘＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中、１％の脱脂粉乳で２時間、ＲＴ（室温）にてブロッキングした。膜を４℃でインキュベートすることにより、プラスミンの検出を、ＰＢＳ−Ｔ中、１：５０００のマウス抗プラスミノーゲン（R＆D System、ＭＡＢ１９３９）を用いて行った。ＰＢＳ−Ｔで３０分間洗浄後、１：１００００希釈した抗マウスＨＲＰＯ（Jackson、カタログ番号１１５−０３５−０６８）を、ＴＢＳ−Ｔ中に２時間加え、その後、ＴＢＳ−Ｔで最終洗浄し、ＣｌａｒｉｔｙウェスタンＥＣＬ基質（BioRad 170-5060）により検出した。膜を検出スクリーン（UVP BioImaging Systems、AutoChemi System）に、１〜１０分間暴露した。
【００８４】
実施例２：血漿プロテアーゼによるＦｃｅＲＩａの切断
ＦｃｅＲＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｐ１２３１９に基づく番号付け）を、血清およびプラスミンとのインキュベーションにより切断した。プロテアーゼ感受性が、組換えＦｃｅＲＩａを種々の炎症状態の患者に由来する集められたヒト血清と共にインキュベートしたとき観察されたが、ＰＢＳと共にインキュベートしたときは観察されなかった。Ｋ４３での強力な消化のピークが同定された（図２Ａ）。プラスミンインキュベーション（表２．１および表２．２）は、プラスミンが血漿プロテアーゼの優先的な候補である証拠を提供し、Ｋ４３を、同定された他の切断部位と比較したとき、ＦｃｅＲＩａ配列の最も感受性の高いプロテアーゼ切断部位として同定した。
【００８５】
組換えｗｔＦｃｅＲＩａの位置Ｋ４３（図２Ｂにおいて、ペプチドＫと示される）は、優先的に切断されたが、プラスミン切断部位Ｋ３１、Ｒ４０、Ｋ２０１、Ｒ１９９、Ｋ１９６およびＫ１４２（図２Ｂにおいて、ペプチド１−８と示される）は、図２Ｂに示す通り、３７℃にて１時間、プラスミンとインキュベートしたとき、より低度で切断された。従って、Ｋ４３は、表２．１および表２．２にまとめられるように、ＦｃｅＲＩａの主要な血漿プロテアーゼ超感受性部位として定義される。重要なことに、Ｎ末端領域（プロテアーゼ感受性Ｋ４３部位を含む）は、例えば、ＦｃｅＲＩａの構造／機能の考察を提供するために種々の欠失およびキメラ受容体変異体を用いて試験したMallamaciら（1993）の文献に記載の通り、ＦｃｅＲＩａによる適切なＩｇＥ結合に関連することが既に示されている。図２Ａは、ベースピーククロマトグラム（ｘ軸＝時間；ｙ軸＝ピーク強度）に示されるように、組換えＦｃｅＲＩａの血清インキュベーションが未処理ＦｃｅＲＩａ（黒線）と比較して消化産物（灰色線）を生じたことを示す。従って、ＦｃｅＲＩａの消化は、ヒト血清の存在下でのみ起こり、ＰＢＳ中では起こらなかった。図２Ｂは、この血清プロテアーゼ活性がプラスミンによって少なくとも部分的に寄与していることを示している。なぜなら、１２．５μｇ／ｍｌのプラスミンでの組換えＦｃｅＲＩａの処理により、予期しないことに、Ｋ４３切断に関連する“ペプチドＫ”（図２Ｂに示す通り）が、ベースピーククロマトグラムにおいてより高いピークシグナルを提供したので、他の残基（例えば、ペプチド１〜８など）よりもプロテアーゼ切断に対してより感受性であったことが示されたからである。他の８つの同定されたプラスミン切断部位は、先行技術文献に従い（例えばBackes at al. 2000, Yuan et al 2009またはHervio et al 2000参照）、プラスミン基質認識コンセンサス配列を一貫して保持したが、それらは、プラスミン消化による“ペプチドＫ”と比較したとき、顕著に低い程度で放出された。従って、ＦｃｅＲＩａ血清プロテアーゼおよび／またはプラスミン抵抗性を付与するために、９つの同定されたプラスミン切断部位のうち何れかが、修飾されるべきであるかは予測できなかった。複数の変異を有するＦｃｅＲＩａ変異体は、受容体の構造および機能性に影響を与えるため、同時にいくつかのプラスミン切断部位を修飾することは可能であるが望ましくない。
【００８６】
従って、ＦｃｅＲＩａ血漿または血清−プロテアーゼ安定性を改善するために、Yuan et al. 2009またはBackes et al. 2000などにより記載されているような、以前に同定されたプラスミンに対する基質特異性と一致する、プラスミンなどのプロテアーゼによる基質部位認識を顕著に低下させるアミノ酸変化を導入することが必要である。しかしながら、本発明で同定された最も感受性が高くかつ関連する切断部位、すなわちＫ４３において、実施例２に記載されるように、プロテアーゼに対する基質部位特異性を低下させることが最も重要である。また、Ｋ３１、Ｒ４０、Ｋ１４２およびＫ１９６、Ｒ１９９およびＫ２０１を含む、同定されたより感受性の低いプラスミン切断部位を、単独でまたは組み合わせて置換することは可能ではあるが、それほど好ましくない。一般に、位置４３のリシン（すなわち、Ｋ４３）を、他のアミノ酸（プラスミンの基質部位認識モチーフに属するアルギニンおよびヒスチジンを除く）に変化させると、プラスミン開裂が正電荷アミノ酸を必要とすることが知られているため、Ｋ４３でプラスミン切断感受性を阻害することができる。しかしながら、プラスミン切断部位での正に荷電したアミノ酸の置換は、ＦｃｅＲＩの折り畳みまたはＩｇＥ親和性を変化させるリスクが増すため、ＦｃｅＲＩａ機能およびリサイクル可能性に影響を及ぼさない修飾を導入することが最も好ましい。１つの基質認識配列のいくつかの残基を同時に変異させることが可能である。しかしながら、誤って導入される可能性のある望ましくないネオエピトープまたは構造変化のリスクを伴うかもしれない先験的構造変化を最小にすることが好ましい。また、Ｏ結合型またはＮ結合型のオリゴ糖の望ましくない付加を可能にする外来アミノ酸を導入することも望ましくない。
【００８７】
従って、アラニン（Ａ４３）による最も好ましい置換は、望ましくない免疫原性のリスクを最小にするために選択された。Ａ４３変異したプロテアーゼ抵抗性のＦｃｅＲＩａ（Ａ４３−ＦｃｅＲＩａと示される）を、そのタンパク質構造および物理化学的特性に関して可能な限り“天然”のものとして維持するため、Ａ４３は、実施例２で実証されているように、ＦｃｅＲＩａ血漿／血清−プロテアーゼ抵抗性を供する最も好ましい置換として選択された。アラニン置換は、望ましくない免疫原性、固定化の困難性またはＩｇＥ結合の変化をもたらし得る予期せぬ構造変化を導入しない。ネガティブな例として、システインは、予期しない分子間または分子内のジスルフィド架橋を引き起こし得るが、一方、プロリンは、この領域における柔軟なキンク帯形成に起因する構造的アーチファクトを引き起こし得る。アルギニン置換は、例えば、それが、プラスミンまたは他のプロテアーゼの基質認識部位に対応するので、少なくとも一部分の消化を提供し得る（例えば、Backes et al 2000参照）。実施例８は、低ｐＨによる溶離後の適切な再折り畳みの必要性および重要性を実証する。
【００８８】
プラスミン切断部位は、リシンまたはアルギニンの存在（上記の種の比較と一致する）または時には切断位置のヒスチジンに依存するだけでなく、Backes at al. 2000およびYuan et al 2009によって以前に探索された基質認識配列にも依存する。例として、プラスミン切断部位の位置での必須の正に荷電したアミノ酸と組み合わせて、位置−３のＬｙｓ、位置−１のチロシン、トリプトファンまたはフェニルアラニンの富化（これは、上記の相同性アラインメントに従って一貫して見出される）は、該部位がプロテアーゼによって構造的に接近可能である限り、基質認識のためのコンセンサスを構成することができる。Yuan et al. 2009はさらに、プラスミン切断部位の位置−３でのアミノ酸の６９％が非極性（Backes et al. これらの位置で、リシン、バリン、イソロイシンまたはフェニルアラニンを提案した）であり、位置−２でのアミノ酸の８５％が極性であり、位置−１でのアミノ酸の８１％が非極性であることを提案した。加えて、Hervio et al. 2000は、バリンが位置−２で富化される一方、セリンが位置＋１で富化されることを示唆し、このことは、かかる置換が、ＦｃｅＲＩａのＫ４３切断コンセンサス内で有利ではないことを示唆した。タンパク質構造、切断部位の接近可能性およびグリコシル化のような近くの翻訳後修飾は、プロテアーゼ切断に対する感受性にとって必須の役割を果たす。これは、本発明によって、Ｋ４３が、表２．２に示すように最も感受性の高いプラスミン切断部位である理由を説明することができる。
【００８９】
実施例３からの結果に基づき、Ｋ４３は、上記に列挙されたいくつかの他の比較的関連性の低いプラスミン切断部位とは対照的に、実際に最も関連性の高いプラスミン切断部位であることが明らかとなった。従って、本発明の主要な目的は、Ｋ４３切断部位をプロテアーゼ非感受性にすることである。同時に、ＦｃｅＲＩａの構造的および機能的性質を低下させることなく、ＦｃｅＲＩａの構造および機能を維持しなければならない。治療用アフェレシスによる対外ＩｇＥ枯渇のため、または血流への受動的投与のためにプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａを用いるとき、ＩｇＥ結合を低下させる（新たな）抗原性部位または機能的変化を避けることが重要である。
【００９０】
表２．１：１２．５μｇ／ｍｌのプラスミンによる組換えＦｃｅＲＩａのインビトロでの消化により、第４列に示されるような、他のペプチドからのピーク面積と比較したとき、ペプチドＫのより高いピーク面積がもたらされる。図２Ａに示されるようにヒト血漿とのインキュベーション後に同定されたリシンＫ４３切断は、示されたように他の残基よりもプロテアーゼ開裂に対してより感受性であることが判明した。
【表３】
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【００９１】
表２．２：８種の異なるペプチドのピーク面積を比較して、ペプチドＫとペプチド１、２、３等との間の比としてそれぞれ表した。過剰なプロテアーゼ濃度（第１列）は、全ての組み合わせの間で同様の比を示したが、より低いプロテアーゼ濃度（第４列）は、異なる切断部位間の有意な差異をもたらし、それ故に、Ｋ４３部位がより低い濃度で優先的に切断されることが確認された。血清プロテアーゼ切断と一致して、Ｋ４３は、図２Ａからの予想外の発見を裏付ける、他の同定された切断部位よりもプラスミン切断に対してより感受性であった。従って、ＦｃｅＲＩａの治療的使用のためのより高いプロテアーゼ安定性を達成するために、ＦｃｅＲＩａのプロテアーゼ抵抗性変異体を提供することが望ましい。
【表４】
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【００９２】
材料および方法：
ＦｃｅＲＩａでコーティングされたビーズ（Bioclone FG-102）を、５０μｌのヒト血清混合物（実施例１に記載のように）と共に、または５０μｌのＰＢＳ中、３７℃にて２１時間、９００ｒｐｍで振盪しながら、インキュベートし、その後、ＰＢＳで４回洗浄した。還元、Ｓ−アルキル化、ＧｌｕＣ消化および質量分光分析のプロトコールを、実施例１と同様に行った。
【００９３】
インビトロでのプラスミン消化。
組換えＦｃｅＲＩａタンパク質を、５０ｍＭ ＮＨ４Ａｃ緩衝液〜ｐＨ８中、０．１２５単位のＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｒｏｃｈｅ ＃０６５３８３５５１０３）と共に、３７℃にて一晩インキュベートすることにより脱グリコシル化した。タンパク質溶液を、プラスミン反応緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）で希釈することにより終濃度１μｇ／μＬにした。反応混合物を、４つの異なるプラスミン濃度（１．２５−９μｇ）で、３７℃にて１時間、インキュベートした。９９℃にて５分間の熱不活性化により、消化を停止させた。ＢｉｏＢａｓｉｃ Ｃ１８カラムへのサンプル充填および質量分光分析を、実施例１と同様に行った。
【００９４】
実施例３：プロテアーゼ消化ＦｃｅＲＩａに対するＩｇＥ結合の低下
ビーズ固定化吸着タンパク質のプラスミン消化によるＦｃｅＲＩａおよびプロテアーゼ抵抗性Ａ４３−ＦｃｅＲＩａのＩｇＥ結合能（％で表す；図３参照）。ＦｃｅＲＩａのＩｇＥ結合能は、プロテアーゼ抵抗性Ａ４３−ＦｃｅＲＩａと比較したとき、プラスミン暴露後に顕著に減少し、それ故に、ｗｔ構築物の感受性の増加を示した。
【００９５】
図３は、野生型（ｗｔ）またはプロテアーゼ抵抗性Ａ４３−ＦｃｅＲＩａ吸着剤をプラスミンと共にインキュベートしたとき（それぞれ黒線および灰色線）、ＩｇＥ枯渇が異なる程度まで減少することを示す。高濃度のプラスミンとのインキュベーション後、ｗｔ吸着剤のＩｇＥ枯渇能は２３％（最初の５０ｎｇ ＩｇＥのうち、１２ｎｇに相当）に減少するが、一方で、プロテアーゼ抵抗性変異体Ａ４３−ＦｃｅＲＩａの枯渇能は、およそ６０％で維持された。ｘ軸は、固定化された吸着剤を消化するために用いられるプラスミンの量（μg）を示し、ｙ軸は、相対的ＩｇＥ枯渇能を示す。結論として、野生型ＦｃｅＲＩａ吸着剤のプラスミン消化は、用量依存的にそのＩｇＥ枯渇能を低下させ、それにより、タンパク質分解およびＩｇＥ結合能から吸着分子を保護することの重要性を強調する。
【００９６】
材料および方法：
組換え野生型ＦｃｅＲＩａおよびＡ４３−ＦｃｅＲＩａタンパク質を、製造業者のプロトコールに従って、ビーズ１ｍｌ当たり、１−２ｍｇのタンパク質で、１μｍ ＢｃＭａｇヨードアセチル活性化磁性ビーズ（Bioclone FG-102）に結合させた。８ｍｇ／ｍｌのシステインでブロッキングした後、ビーズをＰＢＳ＋０．５％ Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。同じ量（１８μｇ）のＦｃｅＲＩａ結合ビーズを、ＲＴ／９００ｒｐｍで１時間、１ｘプラスミン消化緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中、９μｇ／３μｇ／１μｇおよびｗ／ｏプラスミン（Sigma P1867）と共にインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、５μｇ／ｍｌのＩｇＥを添加したＰＢＳ−Ｔ中、２０％のヒト血清溶液を、ＲＴ／９００ｒｐｍで１時間、被覆ビーズとともにインキュベートした。ＩｇＥマスターミックスのＩｇＥ含有量は、吸着剤のＩｇＥ枯渇効率を決定するために、ビーズインキュベーション前後それぞれのＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡ ＥＣ５０およびプラスミン処理した吸着剤で枯渇させた後の上清に残った推定ＩｇＥ量から、相対枯渇能を計算した。
【００９７】
ＩｇＥ結合アッセイ：
ＩｇＥ結合を、ＥＬＩＳＡプレート上に２μｇ／ｍｌのＢＳＷ１７マウス抗ヒトＩｇＥ抗体（NBS-C 0910-1-100）５０μｌをコーティングし、その後ブロッキングし（１ｘＰＢＳ／１％ＢＳＡブロッキング緩衝液）、そしてＲＴで１時間、“ビーズインキュベーション前後のＩｇＥサンプル”と共にインキュベートして、ＥＬＩＳＡにより測定した。その後、ＩｇＥ検出のために、１μｇ／ｍｌの抗ＩｇＥ−ＨＲＰＯ ｍＡＢ（Novus Biologicals NBP1-74934）を、ＲＴで１時間インキュベートし、次いで、標準ＡＢＴＳ（Merck 8.22287.100）反応を行った（ＯＤ４０５で測定）。ＥＣ５０を、非線形回帰曲線フィッティングモデル（Ｇｒａｐｈｐａｄ(登録商標)）に基づいて計算した。
【００９８】
実施例４：プロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａ変異体の作製
主なプロテアーゼ感受性Ｋ４３部位のプラスミンによる切断を防ぐために、正に荷電した切断部位を、上記の実施例２に記載のように、プラスミンのタンパク質基質特異性に関する知識に基づいて、アミノ酸位置４３の小さい非荷電部位、例えばアラニン、グリシン、セリンまたはチロシンに交換することが必要であった。これに対して、これらのアミノ酸は望ましくないタンパク質折り畳みアーチファクト（例えば、予測できないジスルフィド結合による）を提供し得るか、またはエピトープに参加する一般的な傾向のためにそれらが望ましくないネオエピトープを提供し得るため、位置Ｋ４３を荷電芳香脂肪族アミノ酸またはシステインで交換することは望ましくない。例えば、プロリンまたはグリシンは、エピトープ領域における屈曲または可撓性が形成されている可能性があるため、Singhら（２０１３）によって以前に決定されたように、コアエピトープ構造に頻繁に関与することが知られている。そのようなネオエピトープは、アフェレシス処理の間に吸着タンパク質を放出することにより該生体に関連するようになり、吸着タンパク質の人工ネオエピトープに対する望ましくない抗体の誘導をもたらす。不適切なタンパク質折り畳みおよび望ましくないネオエピトープの出現の可能性を最小限に抑えながら、同時に折り畳みおよび抗原性についての最小限の構造変化を可能にするために、Ｋ４３部位を、最も優先的に、アラニンまたはセリンもしくはチロシンのような別の小さなアミノによって、あるいは可能ではあるが、あまり好ましくはないグリシンによって突然変異誘発することが必要である。最も好ましい実例としては、Ｋ４３→Ａ４３変異が実施例２に示され、この置換が、ＦｃｅＲＩａの最小の構造変化のためにＩｇＥ吸着の完全な機能性を保持しながら、同時にプロテアーゼ抵抗性を提供することが実証されている。異なる部位における多くの他の突然変異（例えばMackay et al 2002参照）とは対照的に、本発明の最も好ましいＫ４３→Ａ４３修飾は、タンパク質を血漿プロテアーゼ抵抗性にすることを除いて、ＦｃｅＲＩａの機能的特性を変化させない。さらに、この置換は、実施例２および４に示されるように、哺乳動物の発現系による組換えＦｃｅＲＩａの沈降傾向に影響を及ぼさない。Ｋ４３→Ａ４３変異は、実施例５−７に示されるように、ＩｇＥ結合および変性／リサイクル後の適切な再折り畳みを維持しながら、Ｋ４３でのプロテアーゼ切断からの保護を提供する。この部位における構造変化および抗原性のリスクを最小限に抑えるために、周囲のアミノ酸（すなわち、Ｋ４３のＮ末端またはＣ末端の４つまでのアミノ酸位置）を置換または欠失することは可能であるが望ましくなく、不要である。
【００９９】
実用性を証明するために、位置Ｋ４３でプラスミンによって切断することができないＡ４３−ＦｃｅＲＩａ吸着変異体を構築した。プロテアーゼ抵抗性吸着剤は、アフェレシス中の血清への吸着剤フラグメントの望ましくない流出のリスクの低下と併せて増大した安定性、より長い耐久性、または投与された生物学的治療剤として適用されたときの分解傾向の低下をもたらす。同時に、改善された吸着剤Ａ４３−ＦｃｅＲＩａは、実施例６に示されるようにＩｇＥに対する高い親和性を維持する。
【０１００】
図４は、野生型受容体消化ピークが３０分に現れるのに対して（灰色線）、組換えＡ４３−ＦｃｅＲＩａの変異体であるプロテアーゼ抵抗性変異体（黒線）において切断産物が完全に存在しないことを示す塩基ピーククロマトグラムを示す。
【０１０１】
材料および方法：
分析は、実施例２に記載のように、プロテアーゼ抵抗性Ａ４３−ＦｃｅＲＩａとプラスミンとのインキュベーション後の質量分析によって行った。
【０１０２】
実施例５：Ａ４３−ＦｃｅＲＩａは、ＦｃｅＲＩａの特性を変化させず、ｓｃＦｖ１２よりもその利点を維持する（ＥＬＩＳＡ）
プロテアーゼ抵抗性Ａ４３−ＦｃｅＲＩａ吸着剤は、捕捉ＥＬＩＳＡによるＩｇＥ結合を比較するとき、野生型ＦｃｅＲＩａまたは先行技術の一本鎖抗体ｓｃＦｖ１２（ＷＯ２０１２／１４０２１４Ａ１）と比較した場合にＩｇＥと同様の親和性、アビディティー（Avidity）および特異性を有する。プレートを捕捉抗体でコーティングし、ＳｃＦｖ１２およびＦｃｅＲＩａトランスフェクト細胞に由来するＨＥＫ細胞精製組換えタンパク質をブロックした後、コーティングしたタンパク質を、ＲＴにて１時間、インキュベートした。１μｇ／ｍｌのＩｇＥ（ＮＢＳ−Ｃ０９１１−０−１００）を、ＲＴにて１時間捕捉し、１μｇ／ｍｌの抗ＩｇＥ−ＨＲＰＯ ｍＡＢ（Novus Biologicals ＮＢＰ１−７４９３４）を用いて、ＲＴにて１時間、ＩｇＥ結合を検出した。図５は、計算されたＥＣ５０値（ＦｃｅＲＩａ、Ａ４３−ＦｃｅＲＩａおよびＳｃＦｖ１２それぞれについて、２４．５ｎｇ／ｍｌ、３４．４ｎｇ／ｍｌおよび４２．８ｎｇ／ｍｌ）およびＡ４３−ＦｃｅＲＩａへのＩｇＥ結合の曲線形状は、ＦｃｅＲＩａ配列の位置４３でのＫ→Ａ変異の負の効果を示さない、ｗｔ−ＦｃｅＲＩａまたはｓｃＦｖ１２と同様であることを示す。
【０１０３】
実施例６：可溶性ＩｇＥに対するＡ４３−ＦｃｅＲＩａ、ＦｃｅＲＩａおよびｓｃＦｖ１２の同等の親和性
ＩｇＥ／ＦｃｅＲＩａおよびＩｇＥ／ＳｃＦｖ１２相互作用の親和性および動態。両組換えＦｃｅＲＩａ変異体（すなわち、ｗｔおよびＡ４３変異体）のＫＤおよび結合／解離動態は、高度に同等であり（ＫＤ〜４ｘ１０ｅ−１０）、実施例６、表３を参照すると、位置４３でのＡＡ−交換がＩｇＥ結合能または質に影響を及ぼさないことが示されている。表３において、３つの構築物の各々について計算されたＫＤと共に、オンレート値およびオフレート値が列挙されている。ＳｃＦｖ１２結合動態は、ＦｃｅＲＩａ結合動態とは異なる。
【表５】
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【０１０４】
ＦｃｅＲＩａ変異体について、オンレートは、ｓｃＦｖ１２（ｋａ値 〜４ｘ１０ｅ５）と比較して、より速かった（ｋａ値 〜１ｘ１０ｅ６）。同時に、解離速度は、ｓｃＦｖ１２（ｋｄ〜１，６ｘ１０ｅ−４）と比較したとき、ＦｃｅＲＩａ変異体（ｋｄ値 〜５ｘ１０ｅ−４）においてより速かった。反対に、ＩｇＥ結合のオフレートは、ｓｃＦｖ１２と比較したとき、ＦｃｅＲＩについて増加した。原則として、これは、カラムへのより速いＩｇＥ吸着が望まれる治療的アフェレシス設定に影響を与える可能性がある。注目すべきことに、より速いオフレートは、臨床アフェレシスにおける流速について、およびアフェレシスカラムの固体支持マトリックス上の吸着剤分子の必要なコーティング密度について、吸着剤のリサイクル（実施例７で実証されているように）に対する顕著な実際的な影響を有する。あるいは、例えば、ＩｇＥブロッキングのための生物学的治療剤としてＡ４３−ＦｃｅＲＩを投与するとき、顕著な影響を及ぼし得る。
【０１０５】
材料および方法：
ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ） 界面活性剤Ｐ２０（ｐＨ７．４）（GE Healthcare カタログ番号ＢＲ−１００１−８８）中で２μｇ／ｍｌまで希釈したビオチニル化抗Ｔａｇ−ｍＡＢ（Abcam ab10241）の２００μｌ注入に続いて２０μｌの５０ｍＭ ＮａＯＨを３回注入することにより、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップ（GE Healthcare Biacore、カタログ番号ＢＲ−１０００−３２）の表面を調製して、フローセル４上に捕捉するための〜２５００ＲＵの固定化レベルが得られた。１ｍＭ Ｄ−ビオチン（Sigma ＃４７８６８）の２回の連続した１００μｌ注入により、遊離ＳＡ結合部位を飽和させた。フローセル３を遊離Ｄ−ビオチンで飽和させ、対照セルとして用いた。１００ＲＵのＩｇＥ結合の最大応答を得るために必要とされる、ＦｃｅＲＩａ変異体およびＳｃＦｖ１２の捕捉レベルを、それぞれ７５ＲＵおよび８０ＲＵと算出した。従って、ＦｃｅＲＩａ、Ａ４３−ＦｃｅＲＩａおよびｓｃＦｖ１２をＨＢＳ−ＥＰで希釈し、９０ＲＵの固定化レベルに達するまで、フローセル３および４（３０μｌ／分）に注入した。ランニングバッファーの注入で１０分の安定化後、それぞれ７５ＲＵおよび８０ＲＵの最終捕捉レベルが得られた。最後に、ＦｃｅＲＩａ、Ａ４３−ＦｃｅＲＩａおよびｓｃＦｖ１２の、２倍増加濃度（出発濃度、０．５ｎＭ；最大濃度、６４ｎＭ）でＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液を用いて希釈したＩｇＥ（ＮＢＳ−Ｃ０９１１−０−１００）との個々の相互作用を、３０μｌ／分の流速で３分間のＩｇＥ結合相で評価した。解離相を、３０μｌ／分の流速で３０分間のＨＢＳ−ＥＰの注入により調べた。センサーチップ表面を、１５μｌの１０ｍＭ グリシン−ＨＣｌ ｐＨ１．８を同様に注入することにより再生させた。解離定数（ＫＤ値）、オンレート（ｋａ）およびオフレート（ｋｄ）を、１：１相互作用モデルを用いてＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１（GE Healthcare Biacore）を用いて計算した。全ての測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００装置で２５℃にて実行した。
【０１０６】
実施例７：ＦｃｅＲＩａは、低ｐＨ処理に抵抗性であり、それ故に、臨床ＩｇＥアフェレシスにおける吸着／溶離のリサイクルおよび品質モニタリングが可能になる。
ビーズ上にＦｃｅＲＩａおよびｓｃＦｖ１２を等しく固定化した後、インビトロでＩｇＥ吸着させると、ＩｇＥはｐＨ３．４処理によってＦｃｅＲＩａからほぼ完全に溶離することができ、一方で、ＩｇＥは図６に示すようにＳｃＦｖ１２からは放出されなかった。図６のｙ軸は、溶出前および溶出後のビーズ上で測定されたＩｇＥシグナル（それぞれ黒色バーおよび白色バー）を示す。ｘ軸は、使用した固定化吸着剤をそれぞれ示す。この結果は、実施例６に示されるように、ｓｃＦｖ１２と比較したときのＦｃｅＲＩａの短いオフレートと一致する。低ｐＨはｓｃＦｖ１２を分解し得るため（実施例８に示されるように）、ｓｃＦｖ１２は、ｓｃＦｖ１２ベースのアフェレシスカラムが、一回のみ使用するように設計されているという製造業者の注記（https://www.fresenius.com/5689_5968.htm）と一致して、低ｐＨ条件下でのＩｇＥ吸着には適していないと結論づけられる。一本鎖ベースの吸着剤に対するＦｃｅＲＩベースの吸着剤のこの予期されない利点は、高価なアフェレシスカラムのリサイクルおよび再利用のための重要な実用的側面を表す。さらに、吸着剤を分解することなく、各アフェレシスサイクル後に、溶離したＩｇＥまたは自己抗体物質の正確な定量化は、処置効果をモニタリングするための極めて重要な臨床的数値を提供し得る。本発明により、ＦｃｅＲＩベースの吸着剤は、この側面を容易にするが、ｐＨ感受性のｓｃＦｖベースの吸着剤は容易にしない。
【０１０７】
材料および方法：
組換えＦｃｅＲＩａおよびＳｃＦｖ１２タンパク質は、１μｍのＢｃＭａｇヨードアセチル活性化磁気ビーズ（Bioclone FG-102）に、製造業者のプロトコールに従って、１ｍｌのビーズ当たり１ｍｇのタンパク質で結合させた。１μｇ／ｍｌのマウス抗ＦｃｅＲＩ抗体（Acris SM2251PS）および５０μlの０．４μｇ／ｍｌヤギのマウスＩｇＧ ＨＲＰＯを検出用に用いて、ビーズ上への等量のタンパク質ローディングをビーズＥＬＩＳＡにより評価した。８ｍｇ／ｍｌのシステインでブロッキングした後、ビーズをＰＢＳ＋０．５％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。５μｇ／ｍｌのＩｇＥをスパイクしたＰＢＳ−Ｔ中の２０％ヒト血清溶液を、コーティングビーズと共に１時間／室温／９００ｒｐｍでインキュベートした。ビーズを３００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＩｇＥを１００ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ３．４）で溶出して、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で中和した。溶出前および溶出後のビーズ上のＩｇＥ量を確認するために、ビーズＥＬＩＳＡを行った。ビーズＥＬＩＳＡのために、ビーズをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−１％ＢＳＡ）で１時間／ＲＴ／９００ｒｐｍでブロッキングした。５０μｌの１μｇ／ｍｌ ＩｇＥ（NBS-C0911-0-100）をビーズに添加し、１時間／ＲＴ／９００ｒｐｍでインキュベートした。ビーズをＰＢＳ−０．５％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、１μg／ｍｌの抗ＩｇＥ−ＨＲＰＯ ｍＡＢ（Novus Biologicals NBP1-74934）と共にインキュベートし、その後、４０５ｎｍで標準ＡＢＴＳ（Merck 8.22287.100）反応検出を行った。
【０１０８】
実施例８：ＩｇＥ吸着剤の低ｐＨ処理および血清を伴うまたは伴わない再生
アフェレシスにおける吸着効率をモニタリングするためには、血漿パラメーターを測定する必要があるだけでなく、吸着された物質についての定量的な情報を提供することも必要である。分析目的のために分解する必要のない臨床診療のための吸着剤を提供することが好ましい。ＦｃｅＲＩａは、これらの基準を満たしており、臨床診療における吸着効率をモニタリングするためのＩｇＥまたは可能性のある自己抗体（例えば、慢性自己免疫性蕁麻疹に見出だされる）の溶離を可能にする。従って、アフェレシスサイクルの間に実際的な変性条件を適用するには強すぎない吸着剤を提供することが必要である。これは、吸着剤が、例えば低ｐＨ処理などの過酷な条件下で、その結合能力を失うことなく、溶離後に再生する能力を有する場合にのみ達成することができる。同時に、そのような吸着カラムの使用者は、例えば、捕捉されたＩｇＥまたは自己抗体物質の臨床目的および有効性評価の定量化を可能にするために、捕捉された材料がリサイクル後どの程度放出されたかを確認しなければならない。先行技術のｓｃＦｖ１２吸着剤に対する野生型およびプロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩａ吸着剤の再生能を試験するために、これらの吸着剤のＩｇＥ結合能を、数サイクルの変性／再生後に直接比較した。１００ｍＭのグリシンｐＨ１．８の反復注射は、図７Ａに示すように、両ＦｃｅＲＩａ吸着剤のＩｇＥ結合能を適度に低下させたが、ＳｃＦｖ１２のＩｇＥ結合能は＜１５％に劇的に低下した。さらに、この実験は、プロテアーゼ抵抗性を提供する修飾が、ＦｃｅＲＩａベースの吸着剤に対するｐＨ感受性またはＩｇＥ結合能に何ら不利益を与えないことを確認する。図７Ｂは、数サイクルにわたって吸着剤の能力を維持するために、生理的条件下での変性／再生条件の重要性を裏付けるＢｉａｃｏｒｅチップ（血清注射なし）上の穏やかな酸性条件（ｐＨ３）下でのＩｇＥ結合の相対的損失を示す。プロテアーゼ抵抗性ＦｃｅＲＩ吸着剤に対する血清環境の安定化／再生効果は、図７Ｂに示す血清再生のない条件と比較して、図７Ａ（血清再生を伴う）においてＩｇＥ結合能の中程度の低下に反映される。実施例７の結果と一致して、これらの条件のいずれも、ｐＨ３またはｐＨ１．８のＩｇＥの溶離後の先行技術のｓｃＦｖ１２吸着剤を再生できなかった。その改善された安定性のために、Ａ４３−ＦｃｅＲＩａは、野生型ＦｃｅＲＩａまたはｓｃＦｖ１２のリサイクル可能な代替物として提案されている。本発明は、各アフェレシスサイクルの後に改善された商品コストおよび容易化された吸着効力のモニタリングを提供する。より一般的には、Ａ４３−ＦｃｅＲＩａはまた、注射用生物学的治療剤（の成分）として意図されるとき、改善された血液、血漿または血清プロテアーゼ安定性も提供する。
【０１０９】
材料および方法：
Ｂｉａｃｏｒｅを用いた血清注射の有無における、ｐＨ３での繰り返し再生後のＩｇＥ結合能の相対的損失。
チオール−リガンド−カップリングを、製造者の指示（GE-Healthcare BR-1005-57から購入したチオールカップリングキット）に従って実施した。簡潔には、ＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare Biacore、ＢＲ１０００−１２）の個々のフローセル（Ｆｃ）の表面を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の１：１混合物を３５μｌ注入し、次いで、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した８０ｍＭの２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン塩酸塩（ＰＤＥＡ）を３５μｌ注入した。リガンドを、５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．５に溶解した１０μｇ／ｍｌの濃度で、約１２００ＲＵのレベルまで注入した。チップ表面は、約１０００ＲＵの最終的な固定化レベルをもたらす５０ｍＭのＬ−システインを３５μｌ注入することにより飽和した。固定化されたリガンドの順序：Ｆｃ１：Ｋ４３ｄｅｌ−ＦｃｅＲＩａ（すなわち、アミノ酸１−３７からの欠失を有する陰性対照）；Ｆｃ２：（野生型）ＦｃｅＲＩａ；Ｆｃ３：（プロテアーゼ抵抗性）Ａ４３−ＦｃｅＲＩａ；Ｆｃ４：ｓｃＦｖ１２（すなわち、先行技術の一価ＩｇＥ吸着剤）。ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰを用いて、５μｌ／分の流速で完全な固定化手順を実施した。固定化後、ＩｇＥ結合後の１００ｍＭのグリシンｐＨ３の反復注射を用いて、リガンドに対するＩｇＥ結合能の安定性を評価した。従って、図７に示すように、１００ｍＭのグリシンｐＨ３（＝サイクル１）を２０μｌ注入した後、Ｆｃ２、３および４の飽和レベルに達するまで、ＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）を注入した。次いで、再び６００μｌのＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）および２ｘ５μｌの１００ｍＭグリシンｐＨ３を注入した（＝サイクル２）。３回目のＩｇＥ／再生サイクルは、２００μｌのＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）および５μｌの１００ｍＭグリシンｐＨ３（＝サイクル３）を含み、４回目のＩｇＥ／再生サイクルは、１００μｌのＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）および５μｌの１００ｍＭグリシンｐＨ３を含んだ。最大ＩｇＥ結合能を各サイクルについて評価した。各リガンド／フローセルについての最大ＩｇＥ結合能の参照減算ＲＵ（Ｆｃ２−１、３−１、４−１）を、各フローセル上の１００ｍＭグリシンｐＨ３での最初の再生前の飽和レベルに対して正規化し、図７Ａ／７Ｂにパーセントで示す。流速および緩衝液を、実施例６と同様のものを用いた。
【０１１０】
血清を用いてｐＨ３で反復再生した後のＩｇＥ結合能の相対的損失。
チップの固定化を、非血清条件について上記のように行った。固定化後、６００μｌのＩｇＥ（１０μｇ／ｍｌ）、その後５０μｌの健常ドナー由来の純粋なヒト血清を注入し、１０μｌの１００ｍＭグリシンｐＨ１．８を用いて再生を行った。６００μｌのＩｇＥ（１０μｌ／ｍｇ）および１０μｌの１００ｍＭグリシンｐＨ１．８それぞれを用いたさらに２回の連続したＩｇＥ／再生−注入サイクルを行い、最大ＩｇＥ結合能を評価した。各リガンド／フローセルの最大ＩｇＥ結合能を、各フローセル上の１００ｍＭグリシンｐＨ１．８での最初の再生前胃の飽和レベルに対して正規化し、パーセントで示した。固定化後の全ての注入を、ＨＢＳ−ＥＰをランニング緩衝液および希釈緩衝液として用いて３０μｌ／分の流速で行った。
【０１１１】
実施例９：組換えＦｃｅＲＩａを用いるＩｇＥアフェレシスのインビボ適用
体外ＩｇＥ枯渇のための選択的ＩｇＥ吸着剤としての組換えＦｃｅＲＩａの有用性を実証するために、８０μｇのヒトＩｇＥ（ＮＢＳ−Ｃ０９１１−０−１００）を、６匹のＷｉｓｔａｒラットの血流に完成的に埋め込まれたカニューレを介して注入した。治療アフェレシスのこの前臨床モデルでは、４匹の動物を、ＦｃｅＲＩａ結合ＣＩＭモノリスカラム（BIA Separations  ＃３４００３）を有するアフェレシス装置に繋ぎ、そして２匹の対照ラットをＭｏｃｋ（空の）カラムを有するアフェレシス装置に繋いだ。アフェレシス時間、流速および濾過血漿容量を、表４に示す。
【０１１２】
【表６】
2019510737.tif 000010
【０１１３】
このインビボでの設定（例えばWallukat et al. 2012に既報の通り）を用いて、最後のカラムに示すように、６μｇから２１μｇの間のＩｇＥ（アフェレシスカラムからの“ｍｏｃｋ−ｒａｔｓ”溶出液のバックグラウンドシグナルを差し引いた後）を溶出させることができる。結論として、このことは、ＦｃｅＲＩａが、アフェレシスのためのインビボモデルにおける末梢血からの体外ＩｇＥ枯渇のために用いられ得ることを初めて実証する。注射可能な治療剤として用いるための先行例に加えて、これは、治療的使用におけるＦｃｅＲＩａの有用性を裏付けるものである。
【０１１４】
材料および方法：
体重が２５０ｇまでのＷｉｓｔａｒラットを１週間馴化させた。動脈および静脈カテーテルは、アフェレシスセッションが始まる１週間前に慢性的に移植された。使用したカラムは、ＣＩＭモノリスカラム（BIA Separations 313.7175）であり、製造業者のプロトコールに従ってＦｃｅＲＩａとカップリングさせた。ブロッキングのために、０．５Ｍのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ８．０）中の１００ｍＭのシステインを用いた。最後に、３．５ｍｇのタンパク質を１ｍｌカラムに結合させた（BIA Separationsプロトコールに従って）。２匹の動物がｍｏｃｋカラムで処理した対照群を構成し、４匹の動物を示したように“処置群”（ＦｃｅＲＩａカラム）に用いた。体重を、カニューレの移植から、アフェレシス後まで、週２〜３回定期的に測定した。血漿中のＩｇＥ濃度を実施例３に記載のようにＥＬＩＳＡによって測定した。観察後、動物を麻酔し（セボラン）、心臓穿刺により血漿を採取し、さらなる分析のために凍結した。アフェレシス設定：ＩｇＥ適用の５分前に、ラットから血清を採取した。０時点で、８０μｇのヒトＩｇＥ（ＮＢＳ−Ｃ０９１１−０−１００）を各動物に適用した。ＩｇＥ適用の１５分／２０分／２５分後に、血漿ＩｇＥ測定のために血液サンプルを採取した。ＩｇＥ注射の３０分後、動物をアフェレシスカラムに接続し、アフェレシスを流速に応じて６０−７５分間行った。血液サンプルを、手順中のアフェレシス開始の３０分後およびアフェレシス後のいくつかの時点で採取した。
【０１１５】
本発明の好ましい態様は、以下のとおりである：
１．高親和性ＩｇＥ受容体アルファ鎖（ＦｃｅＲＩａ）、とりわけヒトＦｃｅＲＩａであって、ここで、位置４３のアミノ酸リシン（Ｋ４３）が、アラニン、セリン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸、好ましくはアラニン、グリシン、セリンまたはチロシン、とりわけアラニンで置換されている、ＦｃｅＲＩａ。
２．配列番号１のアミノ酸配列を有するＦｃｅＲＩａであって、ここで、位置４３のアミノ酸リシン（Ｋ４３）が、アラニン、セリン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸、好ましくはアラニン、グリシン、セリンまたはチロシン、とりわけアラニンで置換されている、態様１に記載のＦｃｅＲＩａ。
３．さらなるアミノ酸、好ましくは位置３１のリシン（Ｋ３１）、位置４０のアルギニン（Ｒ４０）、位置４１のイソロイシン（Ｉ４１）、位置４２のフェニルアラニン（Ｆ４２）、位置４４のグリシン（Ｇ４４）、位置４５のグルタミン酸（Ｅ４５）、位置１４２のリシン（Ｋ１４２）、位置１９６のリシン（Ｋ１９６）、位置１９９のアルギニン（Ｒ１９９）および位置２０１のリシン（Ｋ２０１）からなる群より選択されるアミノ酸、とりわけ位置３１のリシン（Ｋ３１）、位置４０のアルギニン（Ｒ４０）、位置１４２のリシン（Ｋ１４２）、位置１９６のリシン（Ｋ１９６）、位置１９９のアルギニン（Ｒ１９９）および位置２０１のリシン（Ｋ２０１）からなる群より選択されるアミノ酸が置換されている、態様１または２に記載のＦｃｅＲＩａ。
４．ＦｃｅＲＩａが固体表面上に固定化されている、態様１から３のいずれかに記載のＦｃｅＲＩａ。
５．アルファ鎖、ベータ鎖および２つのジスルフィド架橋によって連結された２つのガンマ鎖を含むＦｃｅＲＩであって、ここで、該アルファ鎖が、態様１から４のいずれかに記載の修飾アルファ鎖である、ＦｃｅＲＩ。
６．ＩｇＥ媒介性疾患の予防および／または処置における使用のための、態様１から４のいずれかに記載のＦｃｅＲＩａであって、ここで、該ＦｃｅＲＩａが、アフェレシスにおいて、ヒト体液、とりわけヒト血漿または血清から過剰のＩｇＥを枯渇させるために使用される（抗ＩｇＥ療法）、ＦｃｅＲＩａ。
７．ＩｇＥ媒介性疾患が、アレルギー性疾患、好ましくは季節性、食物、花粉、カビ胞子、有毒植物、薬物／薬剤、昆虫の毒、サソリ毒または蜘蛛毒、ラテックスまたはハウスダストダニアレルギー、ペットアレルギー、アレルギー性鼻炎および結膜炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性気管支喘息、非アレルギー性喘息、チャーグ・ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、鼻のポリープ症、木村病；接着剤、抗菌剤、香料、染髪剤、金属、ゴム成分、局所用医薬、ロジン、ワックス、艶出し剤、セメントおよび皮革に対する接触性皮膚炎；性鼻副鼻腔炎、アトピー性湿疹、ＩｇＥ関連自己免疫性疾患、好ましくは慢性（特発性）および自己免疫性蕁麻疹、コリン作動性蕁麻疹、肥満細胞症、とりわけ皮膚肥満細胞症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、慢性または再発性特発性血管浮腫、間質性膀胱炎、アナフィラキシー、とりわけ特発性および運動誘発性アナフィラキシー、免疫療法、好酸球関連疾患、好ましくは好酸球性喘息、好酸球性胃腸炎、好酸球性中耳炎および好酸球性食道炎；リンパ腫、好ましくは胃または十二指腸の潰瘍または逆流のための抗酸性療法の感作副作用からなる群より選択される、態様６に記載の使用のためのＦｃｅＲＩａ。
８．ヒト個体の血流と接触するのに適した固体担体に結合されている、態様６または７に記載の使用のためのＦｃｅＲＩａ。
【０１１６】
９．血流または血漿流と接触することができる固体担体を含むアフェレシス装置であって、該固体担体が、態様１から４のいずれかに記載のＦｃｅＲＩａを含むことを特徴とする、アフェレシス装置。
１０．担体が無菌かつ発熱物質不含有のカラムであることを特徴とする、態様９に記載の装置。
１１．ＩｇＥ結合分子をさらに含むことを特徴とする、態様９または１０に記載の装置。１２．ＩｇＥ関連疾患の予防および／または処置のための、とりわけ抗ＩｇＥ療法を行うための、予防および／または処置装置を提供するための、態様９から１１のいずれかに記載の装置の使用。
１３．態様１から４のいずれかに記載のＦｃｅＲＩａを含む固体アフェレシス担体を含む、ＩｇＥ関連疾患の予防および／または処置における使用のためのキットであって、ここで、該担体が無菌かつ発熱物質不含有のカラムである、キット。
１４．治療方法における使用、とりわけＩｇＥ関連疾患の予防または処置における使用のための、態様１から４のいずれかに記載のＦｃｅＲＩａ。
１５．注射可能な生物学的治療剤としての、態様１４に記載の使用のためのＦｃｅＲＩａ。
１６．さらなるＩｇＥ低下療法と組み合わせて用いられる、態様１４または１５に記載の使用のためのＦｃｅＲＩａ。
１７．態様１から４のいずれかに記載のＦｃｅＲＩａおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
１８．組成物が投与される患者において半減期を増加させる薬剤をさらに含む、態様１７に記載の医薬組成物。
１９．半減期を増加させる薬剤が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＰＥＧ化などの化学修飾である、態様１８に記載の医薬組成物。
２０．サンプル、とりわけ血漿サンプルを含むプロテアーゼにおけるＩｇＥ検出のためのリサイクル可能なプローブとしての、態様１から４のいずれかに記載のＦｃｅＲＩａの使用。
２１．該プローブが、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲアッセイにおいて用いられる、態様２０に記載の使用。
【０１１７】
２２．−リンカー分子、好ましくはペプチドリンカー、とりわけ１から１０個、好ましくは２から５個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカー；および／または
−治療分子もしくは診断分子、好ましくはモノクローナル抗体もしくは抗体フラグメント、サイトカイン、抗体様構造、細胞毒性薬もしくは阻害剤、光学トレーサー；および／または
−担体、好ましくは担体タンパク質、とりわけヒト血清アルブミン、トランスフェリンもしくはＦｃドメイン
に結合された、態様１から４のいずれかに記載のＦｃｅＲＩａ。
２３．ＦｃｅＲＩａが細胞毒性薬と結合されている、態様２２に記載のＦｃｅＲＩａ。
２４．アレルギー性疾患または他のＩｇＥ媒介性疾患の処置における使用のための、態様２２または２３に記載のＦｃｅＲＩａであって、ここで、ＦｃｅＲＩａが、ＩｇＥ Ｂ細胞受容体発現細胞へ細胞毒性薬もしくは阻害剤を送達して、これらの細胞のＩｇＥ産生血漿細胞への分化を阻止するために用いられる、ＦｃｅＲＩａ。
２５．アレルギー性疾患、好ましくは季節性、食物、花粉、カビ胞子、有毒植物、薬物／薬剤、昆虫の毒、サソリ毒または蜘蛛毒、ラテックスまたはハウスダストダニアレルギー、ペットアレルギー、アレルギー性鼻炎および結膜炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性気管支喘息、非アレルギー性喘息、チャーグ・ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、鼻のポリープ症、木村病；接着剤、抗菌剤、香料、染髪剤、金属、ゴム成分、局所用医薬、ロジン、ワックス、艶出し剤、セメントおよび皮革に対する接触性皮膚炎；性鼻副鼻腔炎、アトピー性湿疹、ＩｇＥ関連自己免疫性疾患、好ましくは慢性（特発性）および自己免疫性蕁麻疹、コリン作動性蕁麻疹、肥満細胞症、とりわけ皮膚肥満細胞症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、慢性または再発性特発性血管浮腫、間質性膀胱炎、アナフィラキシー、とりわけ特発性および運動誘発性アナフィラキシー、免疫療法、好酸球関連疾患、好ましくは好酸球性喘息、好酸球性胃腸炎、好酸球性中耳炎および好酸球性食道炎；リンパ腫、好ましくは胃または十二指腸の潰瘍または逆流のための抗酸性療法の感作副作用からなる群より選択される疾患の処置における使用のための、態様２２から２４のいずれかに記載のＦｃｅＲＩａ。
２６．配列番号２または３の、少なくともＩｇＥ結合領域およびプロテアーゼ抵抗性領域を含む、態様１から２５のいずれかに記載のＦｃｅＲＩａのフラグメント。
２７．配列番号２または３の、アミノ酸２６〜２０５、好ましくはアミノ酸３０〜１９３を含む、態様２６に記載のフラグメント。
２８．ヒト個体の血流と接触するのに適した固体担体に結合されている、態様２６または２７に記載のＦｃｅＲＩａフラグメント。
２９．血流または血漿流と接触することができる固体担体を含むアフェレシス装置であって、該固体担体が、態様２６または２７に記載のＦｃｅＲＩａフラグメントを含むことを特徴とする、アフェレシス装置。
３０．ＩｇＥ関連疾患の予防および／または処置のための、とりわけ抗ＩｇＥ療法を行うための、予防および／または処置装置を提供するための、態様２９に記載の装置の使用。
３１．態様２６または２７に記載のＦｃｅＲＩａフラグメントを含む固体アフェレシス担体を含む、ＩｇＥ関連疾患の予防および／または処置における使用のためのキットであって、ここで、該担体が無菌かつ発熱物質不含有のカラムである、キット。
【０１１８】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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