(57)【要約】本開示は、概して、ヒト副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に対するヒト抗体、ならびに、癌、悪性腫瘍随伴体液性高カルシウム血症（ＨＨＭ）、または原発性副甲状腺機能亢進症（ＰＨＰＴ）および二次性副甲状腺機能亢進症（ＳＨＰＴ）、ならびに悪液質の治療における前記抗体の使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２×１０−８Ｍ以下の親和性Ｋｄで副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する、抗体。
【請求項２】
ＰＴＨ１ＲのＮ末端部分に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
副甲状腺ホルモン受容体２（ＰＴＨ２Ｒ）に結合しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
細胞表面上のＰＴＨ１Ｒに結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
ＰＴＨ１Ｒにアロステリックに結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
負の調節因子抗体であり、任意で、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰとＰＴＨ１Ｒとの間の結合親和性を少なくとも約２分の１に、任意で最大１０００分の１に低下させることができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）または副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）による前記受容体の刺激に応答した細胞内のカルシウム流動を阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ媒介環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）蓄積を阻害する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、
（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３に記載される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、
（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４に記載される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と
を含む、前記抗体。
【請求項１１】
副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、
（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３に記載される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、
（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４に記載される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と
を含む、前記抗体。
【請求項１２】
副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、
（ｂ）配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３に記載される、独立して選択された重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、
（ｃ）配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４に記載される、独立して選択された重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と
を含む、前記抗体。
【請求項１３】
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの少なくとも２つが、配列番号２７〜１０４のうちのいずれか１つに記載されている、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列の３つが、配列番号２７〜１０４のうちのいずれか１つに記載されている、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
配列番号１〜２６に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
配列番号１〜２６に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
重鎖可変領域中の３つ全てのＨＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含む抗体であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号２７〜１０４のうちのいずれか１つに記載されている、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
１つまたは複数の重鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列に由来する対応するアミノ酸と置換されている、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
配列番号１３１〜２０８のうちのいずれか１つに記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれか１つをさらに含む、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
配列番号１３１〜２０８のうちのいずれか１つに記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも２つを含む、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
配列番号１３１〜２０８のうちのいずれか１つに記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも３つを含む、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
（ａ）配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６に記載される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、
（ｂ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域に由来する、配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７に記載される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、
（ｃ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域に由来する、配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８に記載される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と
を含む、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２３】
（ａ）配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６に記載される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、
（ｂ）配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７に記載される、独立して選択された軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、
（ｃ）配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８に記載される、独立して選択された軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と
を含む、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの少なくとも２つが、配列番号１３１〜２０８のうちのいずれか１つに記載されている、請求項２２または２３に記載の抗体。
【請求項２５】
配列番号１０５〜１３０のうちのいずれか１つに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
配列番号１０５〜１３０のうちのいずれか１つに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
配列番号１０５〜１３０のうちのいずれか１つに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２８】
配列番号１０５〜１３０のうちのいずれか１つに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
軽鎖可変領域の３つ全てのＬＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含む抗体であって、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１３１〜２０８に記載されている、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３０】
（ｉ）軽鎖可変領域の３つ全てのＬＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一のアミノ酸配列であって、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１３１〜２０８のうちのいずれか１つに記載されている、前記アミノ酸配列と、
（ｉｉ）重鎖可変領域の３つ全てのＨＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一のアミノ酸配列であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２７〜１０４のうちのいずれか１つに記載されている、前記アミノ酸配列と
を含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する抗体であって、
（ａ）前記軽鎖可変領域が、配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、および／または
（ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、
前記抗体。
【請求項３２】
（ａ）前記軽鎖可変領域が、配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、および／または
（ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、
請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
（ａ）前記軽鎖可変領域が、配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、および／または
（ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、
請求項３１に記載の抗体。
【請求項３４】
重鎖定常領域をさらに含む抗体であって、前記重鎖定常領域が、改変されたまたは改変されていないＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらの断片、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３５】
１つまたは複数の軽鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列に由来する対応するアミノ酸と置換されており、任意で前記フレームワークが、図２１に示される変更のうちの１つまたは複数を含む、請求項２２〜３４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３６】
ＸＰＡ．８５．０１２、ＸＰＡ．８５．０１７、ＸＰＡ．８５．２８８、ＸＰＡ．８５．３８８、ＸＰＡ．８５．３８９、およびＸＰＡ．８５．３９０からなる群から選択される、請求項１０〜１２、２２〜２３、または３１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３７】
前記軽鎖可変領域に結合したヒト軽鎖定常領域をさらに含む、請求項２２〜３６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３８】
前記軽鎖定常領域が、改変されたまたは改変されていないλ軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域、それらの断片、またはそれらの組み合わせである、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
１０−６Ｍ以下の親和性Ｋｄで副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する、請求項１０〜２８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載の重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４１】
発現制御配列に機能的に連結された請求項４０に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項４２】
請求項４１に記載のベクターまたは請求項３８に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項４３】
重鎖および軽鎖の可変領域をコードする核酸分子を含む宿主細胞であって、前記重鎖および軽鎖の核酸が、別個の核酸で、または同じ核酸で発現される、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
抗体を産生するために請求項４２または４３に記載の宿主細胞を使用する方法であって、請求項４２または４３に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養することと、抗体を回収することとを含む、前記方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法によって産生される抗体。
【請求項４６】
請求項１〜３９および４５のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、滅菌した薬学的組成物。
【請求項４７】
副甲状腺ホルモンまたは副甲状腺ホルモン関連タンパク質発現の増加に関連する高カルシウム血症を治療するための方法であって、その必要がある対象に、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の抗体または請求項４６に記載の薬学的組成物の治療有効量を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項４８】
副甲状腺ホルモン発現の増加、副甲状腺ホルモン関連タンパク質発現または副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）発現の増加に関連する疾患、状態、または障害を治療するための方法であって、その必要がある対象に、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の抗体または請求項４６に記載の薬学的組成物の治療有効量を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項４９】
前記疾患、状態、または障害が、癌、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ誘導性高カルシウム血症、悪性腫瘍随伴体液性高カルシウム血症（ＨＨＭ）、家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症、結核、サルコイドーシス、原発性副甲状腺機能亢進症（ＰＨＰＴ）、二次性副甲状腺機能亢進症（ＳＨＰＴ）、および悪液質からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記疾患がＰＨＰＴであり、かつ前記対象が非外科的患者または外科手術不成功の患者である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患がＳＨＰＴであり、かつ前記対象が慢性腎疾患を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記投与が、前記対象における癌転移の発生率を、前記抗体を受けていない対象と比較して低下させる、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記転移が、骨もしくは骨格組織、肝臓、肺、腎臓、または膵臓への転移を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記投与が、高カルシウム血症の１つまたは複数の症状を改善する、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記投与が、高カルシウム血症および／または消耗症候群の軽減によりＨＨＭの生存を延長する、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体が、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、または皮下に投与される、請求項４７〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体が、第２の薬剤と組み合わせて投与される、請求項４７〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体が、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、または３ヶ月に１回投与される、請求項４７〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
副甲状腺ホルモン発現の増加または副甲状腺ホルモン関連タンパク質発現の増加に関連する状態または障害の治療に使用するための、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の抗体または請求項４６に記載の薬学的組成物を含む、組成物。
【請求項６０】
高カルシウム血症に関連する状態または障害の治療に使用するための、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の抗体または請求項４６に記載の薬学的組成物を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年８月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３６９，７４５号、２０１６年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４３２，３３８号、および２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４７９，６３７号の優先権の利益を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、２０１７年７月２８日作成されたファイル名：５０９８６＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：１０８，５４０バイトとして特定されるコンピューター読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本開示は、概して、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）抗体、および副甲状腺ホルモン発現の増加、副甲状腺ホルモン関連タンパク質発現またはＰＴＨ１Ｒ発現の増加に関連する状態を治療するための療法に関し、この療法は、その必要がある対象に治療有効量のＰＴＨ１Ｒ抗体を投与することを含む。
【背景技術】
【０００４】
背景
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞外リガンドからのシグナルを細胞内リレータンパク質、ヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）中のシグナルに変換する原形質膜受容体の群である。ＧＰＣＲは、哺乳動物ゲノムのうちの最大かつ最も多様なタンパク質ファミリーのうちの１つに相当する。（Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ｍＡｂｓ  ２：６，５９４−６０６（非特許文献1）、Ｓｔｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６３：１０１−１３２（非特許文献2））。ＧＰＣＲは、細胞外Ｎ末端、７回膜貫通スパニング（ＴＭ）ドメイン、および細胞内Ｃ末端を有することを特徴とする（Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ｍＡｂｓ  ２：６，５９４−６０６（非特許文献1））。脊椎動物では、これらの受容体は、７ＴＭドメイン、クラス１（ロドプシン様ファミリー）、クラス２（セクレチンおよび接着ファミリー）、クラス３（グルタミン酸ファミリー）、およびクラスＦ（フリッツルドファミリー）内のそれらの配列類似性に基づいたファミリーに分類できる（Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ｍＡｂｓ  ２：６，５９４−６０６（非特許文献1）；Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３（６）：１２５６−７２（非特許文献3））。
【０００５】
副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲ）は、アデニリルシクラーゼ／ｃＡＭＰシグナル伝達経路を活性化するクラス２のＧＰＣＲである。ペプチドホルモンを結合する全てのクラス２  ＧＰＣＲと同様に、ＰＴＨＲは、本明細書においてＮドメインと呼ばれる比較的大きい（約１６０アミノ酸）Ｎ末端細胞外ドメインを有し、これはホルモン結合において主要な役割を果たす（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２８０（３）：１７９７−８０７（非特許文献4））。２種類のＰＴＨＲ、１型（ＰＴＨ１Ｒ）および２型（ＰＴＨ２Ｒ）が同定されている。ＰＴＨ１Ｒは２つのポリペプチドリガンド、骨や腎臓に作用して血中のカルシウムや無機リン酸の濃度を調節する副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（内分泌ホルモン）と、骨および他の組織の成長における細胞分化および増殖プログラムを調節するＰＴＨ関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）（パラクリン因子）との作用を媒介する（Ｇａｒｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．６７（２）：３１０−３３７（非特許文献5））。骨リモデリングおよびカルシウムイオン恒常性の主な調節因子であるＰＴＨは、ＰＴＨＲを結合および活性化することによってその効果を発揮する（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２８０（３）：１７９７−８０７（非特許文献4））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ｍＡｂｓ  ２：６，５９４−６０６
【非特許文献２】Ｓｔｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６３：１０１−１３２
【非特許文献３】Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３（６）：１２５６−７２
【非特許文献４】Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２８０（３）：１７９７−８０７
【非特許文献５】Ｇａｒｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．６７（２）：３１０−３３７
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に対する抗体に関する材料、方法、および使用を提供する。本開示は、ＰＴＨ１Ｒに結合する抗体を提供する。特に、本開示は、癌、悪性腫瘍随伴体液性高カルシウム血症（ＨＨＭ）、原発性副甲状腺機能亢進症（ＰＨＰＴ）、二次性副甲状腺機能亢進症（ＳＨＰＴ）、および悪液質の治療におけるそのような抗体の使用方法を提供する。
【０００８】
様々な実施形態において、本開示は、１０−６Ｍ以下の親和性Ｋｄを有するＰＴＨ１Ｒに特異的な抗体を提供する。様々な実施形態において、本開示は、２×１０−６Ｍ以下の親和性Ｋｄを有するＰＴＨ１Ｒに特異的な抗体を提供する。例示的な実施形態において、本明細書において記載される抗ＰＴＨ１Ｒ抗体は、少なくとも１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ以下の親和性で結合する。他の実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＰＴＨ２Ｒへの結合と比較して、少なくとも２〜５０倍、１０〜１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、もしくは１００倍、または２０〜５０％、５０〜１００％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％高い親和性（例えば、ＰＴＨ１Ｒに優先的に結合する）でＰＴＨ１Ｒに結合する。特定の実施形態において、親和性は、表面プラズモン共鳴またはＫｉｎＥｘＡアッセイによって測定される。
【０００９】
関連する態様において、抗体は、ＰＴＨ１ＲのＮ末端部分に結合する。さらなる態様において、本開示は、副甲状腺ホルモン受容体２（ＰＴＨ２Ｒ）に結合しない抗体を企図する。様々な態様において、抗体は、細胞表面のＰＴＨ１Ｒに結合する。特定の態様において、抗体は、ＰＴＨ１Ｒにアロステリックに結合する。
【００１０】
好ましい態様において、抗体は、負の調節因子抗体であり、任意で抗体がＰＴＨまたはＰＴＨｒＰとＰＴＨ１Ｒとの間の結合親和性を少なくとも約２分の１に、任意で最大１０００分の１に低下させることができる。他の実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ間の結合親和性を少なくとも２分の１〜１０００分の１、１０分の１〜１００分の１、２分の１、５分の１、１０分の１、２５分の１、５０分の１、１００分の１、２００分の１、３００分の１、４００分の１、５００分の１、６００分の１、７００分の１、８００分の１、９００分の１、または１０００分の１に低下させることができる。
【００１１】
様々な実施形態において、抗体は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）または副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）による受容体の刺激に応答した細胞内のカルシウム流動を阻害する。関連する実施形態において、抗体は、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ媒介環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）蓄積を阻害する。
【００１２】
一実施形態において、ＰＴＨ１Ｒ抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１３】
一態様において、本開示は、（ａ）図２１、もしくは配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２に記載される重鎖相補性決定反復（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、図２１、もしくは配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３に記載される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、図２１、もしくは配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４に記載される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体とを含む、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する抗体を提供する。
【００１４】
関連する態様において、本開示は、（ａ）図２１、もしくは配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３に記載される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４に記載される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体とを含む、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する抗体を提供する。
【００１５】
さらなる態様において、本開示は、（ａ）配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、（ｂ）図２１、もしくは配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３に記載される、独立して選択された重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、（ｃ）図２１、もしくは配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４に記載される、独立して選択された重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体とを含む、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する抗体に結合する抗体を企図する。
【００１６】
特定の実施形態において、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの少なくとも２つが、図２１または配列番号２７〜１０４に記載される。関連する実施形態において、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列の３つが、図２１または配列番号２７〜１０４に記載される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本明細書において企図される抗体は、図２１または配列番号１〜２６に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、図２１または配列番号１〜２６に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む抗体である。
【００１８】
さらに、本明細書において記載される抗体は、重鎖可変領域中の３つ全てのＨＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含むことが企図され、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が図２１または配列番号２７〜１０４に記載される。
【００１９】
特定の実施形態において、本明細書において企図される抗体は、別のヒト抗体アミノ酸配列に由来する対応するアミノ酸と置換されている、１つまたは複数の重鎖フレームワークアミノ酸を含む。
【００２０】
一実施形態において、本明細書において企図される抗体は、図２１または配列番号１３１〜２０８に記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれか１つをさらに含む。いくつかの実施形態において、抗体は、図２１または配列番号１３１〜２０８に記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも２つを含む。他の実施形態において、抗体は、図２１または配列番号１３１〜２０８に記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも３つを含む。
【００２１】
別の態様において、本明細書において記載される抗体は、（ａ）図２１、もしくは配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６に記載される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体、または図２１に示されるそのコンセンサス配列と、（ｂ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域に由来する、図２１、もしくは配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７に記載される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体、または図２１に示されるそのコンセンサス配列と、（ｃ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域に由来する、図２１、もしくは配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８に記載される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体、または図２１に示されるそのコンセンサス配列とを含む。
【００２２】
代替実施形態において、本明細書において企図される抗体は、（ａ）図２１、もしくは配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６に記載される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、（ｂ）図２１、もしくは配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７に記載される、独立して選択された軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、（ｃ）図２１、もしくは配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８に記載される、独立して選択された軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体とを含む。
【００２３】
特定の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの少なくとも２つが、図２１または配列番号１３１〜２０８に記載される。
【００２４】
さらに、本明細書おいて記載される抗体は、図２１または配列番号１０５〜１３０に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むことが企図される。関連する実施形態において、抗体は、図２１または配列番号１０５〜１３０に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、抗体は、図２１または配列番号１０５〜１３０に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、抗体は、図２１または配列番号１０５〜１３０に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【００２５】
さらなる実施形態において、本明細書において記載される抗体は、軽鎖可変領域の３つ全てのＬＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、図２１または配列番号１３１〜２０８に記載される。
【００２６】
特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体は、（ｉ）軽鎖可変領域の、３つ全てのＬＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一のアミノ酸配列（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、図２１または配列番号１３１〜２０８に記載される）と、（ｉｉ）重鎖可変領域の３つ全てのＨＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一のアミノ酸配列（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、図２１、もしくは配列番号２７〜１０４に記載される）とを含む。
【００２７】
別の態様において、本開示は、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する抗体を提供し、（ａ）軽鎖可変領域が、配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、および／または（ｂ）重鎖可変領域が、配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む。
【００２８】
関連する実施形態において、本明細書において記載される抗体は、（ａ）配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む軽鎖可変領域、および／または（ｂ）配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、重鎖定常領域をさらに含み、重鎖定常領域は、改変されたまたは改変されていないＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらの断片、またはそれらの組み合わせである。
【００３０】
特定の実施形態において、１つまたは複数の軽鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列に由来する対応するアミノ酸と置換されている抗体が提供され、任意でフレームワークが図１Ａおよび図１Ｂに示される変更のうちの１つまたは複数を含む。
【００３１】
一態様において、本開示の抗体は、ＸＰＡ．８５．０１２、ＸＰＡ．８５．０１７、ＸＰＡ．８５．２８８、ＸＰＡ．８５．３２８、ＸＰＡ．８５．３２９、ＸＰＡ．８５．３３０、およびＸＰＡ．８５．３４９からなる群から選択される。
【００３２】
一実施形態において、本明細書において記載される抗体は、該軽鎖可変領域に結合したヒト軽鎖定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、軽鎖定常領域は、改変されたもしくは改変されていないλ軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域、それらの断片、またはそれらの組み合わせである。
【００３３】
別の態様において、本開示は、本明細書において記載される重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。様々な実施形態において、抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０９〜２３４（重鎖）および２３５〜２６０（軽鎖）に示される。
【００３４】
様々な実施形態において、核酸分子は、配列番号１０５〜１３０のうちのいずれか１つの軽鎖可変領域アミノ酸配列またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、核酸分子は、配列番号２３５〜２６０のうちのいずれか１つの軽鎖可変領域ヌクレオチド配列またはその断片を含む。さらなる実施形態において、核酸分子は、配列番号１〜２６のうちのいずれか１つの重鎖可変領域アミノ酸配列またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、核酸分子は、配列番号２０９〜２３４のうちのいずれか１つの重鎖可変領域ヌクレオチド配列またはその断片を含む。本開示の核酸分子はさらに、配列番号２０９〜２６０の配列と、本明細書において記載される抗体または本明細書において記載される任意のＨＣＤＲもしくはＬＣＤＲの重鎖ならびに軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、かつ配列番号２７〜１０４および１３１〜２０８に示されるようなＣＤＲアミノ酸配列をコードする遺伝子コードの多様性に基づく縮重コドン、ならびに本明細書において記載され、配列番号１〜２６もしくは１０５〜１３０に示される抗体、または本明細書において記載され、配列番号２７〜１０４もしくは１３１〜２０８に示される任意のＨＣＤＲもしくはＬＣＤＲの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸配列に、本明細書において記載されるものなどの高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含む核酸配列とを含む、全ての核酸配列を含む。
【００３５】
いくつかの態様において、核酸分子は、配列番号１０５〜１３０に記載されるＶＬアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるＶＬアミノ酸配列をコードする。関連する態様において、ＶＬアミノ酸配列は、コンセンサス配列である。本開示の核酸分子は、配列番号１０５〜１３０の軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする核酸配列に、本明細書において記載されるものなどの高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、あるいは配列番号２３５〜２６０の軽鎖可変領域核酸配列を有する核酸が含まれる。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号１３１〜２０８に記載される該抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする。
【００３６】
本開示の核酸分子は、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つのＶＨアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはその断片を含むことが企図される。いくつかの態様において、核酸は、該抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、該断片は、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む連続した断片である。一実施形態において、該断片は、任意で異なるヒトまたはヒトコンセンサスフレームワークとともに、かつ任意でＣＤＲ中の１つ、または最大２つ、または最大３つの変異とともに、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つを含む。ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号２７〜１０４および１３１〜２０８に示される。
【００３７】
関連する態様において、核酸分子は、配列番号１〜２６の重鎖のうちの１つの重鎖可変領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはその断片を含む。一実施形態において、核酸分子は、配列番号２０９〜２３４に記載されるヌクレオチド配列を有する重鎖可変領域、またはその断片を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１〜２６に記載されるＶＨアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＨアミノ酸配列をコードする。関連する態様において、ＶＨアミノ酸配列は、コンセンサス配列である。本開示の核酸分子は、配列番号１〜２６の重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする核酸配列に、本明細書において記載されるものなどの高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、あるいは配列番号２０９〜２３４のうちのいずれか１つの重鎖可変領域核酸配列を有する核酸をさらに含む。
【００３９】
本開示の核酸が、図２１に示される抗体から選択される抗体の全長軽鎖または重鎖をコードし得ることがさらに企図され、全長軽鎖または全長重鎖が、軽鎖定常領域または重鎖定常領域を含み、それぞれ、軽鎖定常領域が、任意で、改変されていないまたは改変されたκまたはλ領域を含み、重定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥなどのクラスのうちのいずれかの改変されていないまたは改変された定常領域を含む。改変されたＩｇＧ４定常領域は、変異Ｓｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ｇｌｕのうちの１つまたは複数を含む定常領域が含まれる（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８、Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５−１９３３）。
【００４０】
一態様において、全長可変軽鎖抗体は、配列番号１０５〜１３０に示されるアミノ酸配列を含む。全長軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０５〜１３０に示されるアミノ酸配列をコードし、かつ配列番号２３５〜２６０に記載されるヌクレオチド配列を含むことがさらに企図される。
【００４１】
一態様において、全長可変重鎖抗体は、配列番号１〜２６のうちのいずれか１つの配列を含む。さらに提供されるのは、配列番号１〜２６に示される全長重鎖可変領域アミノ酸配列をコードし、配列番号２０９〜２３４のうちのいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。
【００４２】
さらなる態様において、本開示は、発現制御配列に機能的に連結された、本明細書において企図される核酸分子を含む、発現ベクターを提供する。本開示の発現ベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞も企図される。特定の実施形態において、本開示は、重鎖および軽鎖の可変領域をコードする核酸分子を含む宿主細胞を提供し、重鎖および軽鎖の核酸は、別個の核酸で、あるいは同じ核酸で発現される。
【００４３】
関連する態様において、本開示は、抗体を産生するために本明細書中において記載されるような宿主細胞を使用する方法を提供し、方法は、適切な条件下で宿主細胞を培養することと、抗体を回収することとを含む。本明細書に開示される方法によって産生される抗体も提供される。
【００４４】
本開示は、本明細書において開示されるような抗体と薬学的に許容される担体とを含む、滅菌した薬学的組成物をさらに企図する。
【００４５】
別の態様において、本開示は、副甲状腺ホルモンまたは副甲状腺ホルモン関連タンパク質発現の増加に関連する高カルシウム血症を治療するための方法であって、その必要がある対象に、本明細書において企図される抗体または薬学的組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００４６】
別の態様において、本開示は、副甲状腺ホルモン発現の増加、副甲状腺ホルモン関連タンパク質発現の増加、またはＰＴＨ１Ｒ発現の増加に関連する疾患、状態、または障害を治療するための方法であって、その必要がある対象に、本明細書において企図される抗体または薬学的組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００４７】
別の態様において、本開示は、癌、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ誘導性高カルシウム血症、悪性腫瘍随伴体液性高カルシウム血症（ＨＨＭ）、家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症、結核、サルコイドーシス、原発性副甲状腺機能亢進症（ＰＨＰＴ）、二次性副甲状腺機能亢進症（ＳＨＰＴ）、および悪液質からなる群から選択される疾患、状態、または障害を治療するための方法を提供する。
【００４８】
様々な実施形態において、疾患はＰＨＰＴであり、対象が非外科的患者または外科手術不成功の患者である。様々な実施形態において、疾患はＳＨＰＴであり、対象が慢性腎疾患を有する。
【００４９】
様々な実施形態において、本開示は、投与が、対象における癌転移の発生率を、抗体を受けていない対象と比較して低下させる、癌を治療するための方法を提供する。
【００５０】
関連する態様において、本開示は、癌を治療するための方法であって、その必要がある対象に、本明細書において企図される抗体または薬学的組成物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、癌は、骨癌、肺癌、肝細胞癌、膵臓癌、腎臓癌、線維性癌、乳癌、骨髄腫扁平上皮癌、結腸直腸癌、および前立腺癌からなる群から選択される。関連する態様において、癌は転移性である。関連する態様において、転移は、骨もしくは骨格組織、肝臓、肺、腎臓、または膵臓への転移を含む。
【００５１】
様々な実施形態において、本明細書で企図される抗体または薬学的組成物の治療有効量を、その必要がある対象に投与することは、高カルシウム血症の１つまたは複数の症状を改善する。
【００５２】
様々な実施形態において、本明細書において企図される抗体または薬学的組成物の治療有効量を、その必要がある対象に投与することは、ＰＴＨｒＰ誘導性ＨＨＭの消耗症候群または悪液質の１つまたは複数の症状を改善する。
【００５３】
様々な実施形態において、本明細書において企図される抗体または薬学的組成物の治療有効量を、その必要がある対象に投与することは、低カルシウム血症および／または消耗症候群の軽減によりＨＨＭ生存を延長する。
【００５４】
様々な実施形態において、本明細書において開示される抗体は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、または皮下に投与される。関連する実施形態において、本明細書において開示される抗体は、第２の薬剤と組み合わせて投与される。関連する実施形態において、本明細書において開示される抗体は、週に１回、２週間に１回、月に２回、月に１回、２ヶ月に１回、または３ヶ月に１回投与される。
【００５５】
様々な実施形態において、抗体組成物は、１週間に２回、または１、２、もしくは４週間毎に、０．３〜３０ｍｇ／ｋｇの投与量範囲で、静脈内、皮下、または筋肉内に投与され得る。様々な実施形態において、投与量は、０．３、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または３０ｍｇ／ｋｇであり得る。様々な実施形態において、抗体組成物は、１週間に２回、または１、２、もしくは４週間毎に、０．３〜３ｍｇ／ｋｇ、１〜６ｍｇ／ｋｇ、または２〜６ｍｇ／ｋｇの投与量範囲で、静脈内に投与され得る。あるいは、抗体組成物は、１週間に２回、または１、２、もしくは４週間毎に、０．５〜５ｍｇ／ｋｇの投与量範囲で、静脈内、皮下、または筋肉内に投与され得る。
【００５６】
様々な実施形態において、本開示は、副甲状腺ホルモン発現の増加または副甲状腺ホルモン関連タンパク質発現の増加に関連する状態または障害の治療において、本明細書において開示される抗体または薬学的組成物を含む組成物を投与するための方法を提供する。
【００５７】
様々な実施形態において、本開示は、高カルシウム血症に関連する状態または障害の治療において、本明細書において開示される抗体または薬学的組成物を含む組成物を投与するための方法を提供する。
【００５８】
一態様において、ＰＴＨ１Ｒ抗体は、複数の種からのＰＴＨ１Ｒと交差反応、検出、結合し、中和することができるモノクローナル抗体（またはその活性断片）である（例えば、本明細書において開示されるヒトＰＴＨ１Ｒ抗体は、マウスＰＴＨ１Ｒと交差反応、検出、結合し、中和することができる。本明細書において開示されるマウスＰＴＨ１Ｒ抗体は、ヒトＰＴＨ１Ｒと交差反応、検出、結合し、中和することができる）。
【００５９】
本明細書において記載される各特徴もしくは実施形態、または組み合わせは、本発明の態様のいずれかの非限定的で例示的な例であり、したがって、本明細書において記載される他のあらゆる特徴もしくは実施形態、または組み合わせとも組み合わせることができることを意味することを理解されたい。例えば、特徴が「一実施形態」、「いくつかの実施形態」、「特定の実施形態」、「さらなる実施形態」、「特定の例示的実施形態」、および／または「別の実施形態」などの言語で説明される場合、これらの種類の実施形態のそれぞれは、あらゆる可能な組み合わせをも列挙する必要なしに、本明細書において記載される他のあらゆる特徴、または特徴の組み合わせとも、組み合わされることが意図される特徴の非限定的な例である。そのような特徴または特徴の組み合わせは、本発明の態様のうちのいずれにも当てはまる。範囲内に入る値の例が開示されている場合、これらの例のいずれもが可能な範囲の終点として企図され、そのような終点間のありとあらゆる数値が企図され、上限および下限のありとあらゆる組み合わせが想定される。
【００６０】
本明細書中の見出しは、読者の便宜のためであり、限定することを意図しない。本発明のさらなる態様、実施形態、および変形は、詳細な説明および／または図面および／または特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】親配列に対して選択されたクローンの軽鎖の多重配列アラインメント。ＸＰＡ．８５．０１２に関するクローン（図１Ａ）の、あるいはＸＰＡ．８５．０１７に関するクローン（図１Ｂ）からの軽鎖アミノ酸の多重配列アラインメント（ＭＳＡ）を、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて親配列に対して実施した。このアラインメントを使用し、ＣＬＣＢｉｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを使用して系統ツリーを作成した。ツリーをＮｅｗｉｃｋ形式でエクスポートした。ＭＳＡをＦＡＳＴＡ形式でエクスポートし、ＥＭＢＯＳＳプログラムＳｈｏｗａｌｉｇｎを実行し、アラインメントをドット識別形式に変換した。スクリプトを、Ｒ言語を使用して記述して、ツリーを、対応するドット識別アライメント配列（軽鎖ファミリーによって色分けされたもの）と結合した。支線形式はまた、軽鎖ファミリーにも対応し、白黒形式でも読みやすくする。表示されたアラインメントにおいて、親配列が完全に示される。他の配列が同一である場合、残基はドットとして示される。違いが表示される。ＩＭＧＴ番号付けシステムを使用して同定されたＣＤＲ領域は、アラインメント上のボックスによって呼び出される。親とのフレームワークの違いが識別される。これを、ソフトウェアプログラム（ＰＨＥｎｏｍ、ＸＯＭＡ（ＵＳ）ＬＬＣ）を用いて親軽鎖を実行し、結果に表示された位置周波数マトリクスを見ることによって行った。配列内のフレームワークの変化が標準アミノ酸に向かった場合は、（＋）として示され、標準配列から離れている場合（頻度に関して）は、（−）として示される。残基が頻度マトリクスに見られない場合、それはその位置では滅多に使用されないアミノ酸であり、それは（Ｒ）によって表示され、アミノ酸は角括弧で表示される。配列が親である異なるファミリーに属する場合、親に最も近い親メンバーが、このＰＨＥｎｏｍ分析の「種」として使用される。
【図１Ｂ】親配列に対して選択されたクローンの軽鎖の多重配列アラインメント。ＸＰＡ．８５．０１２に関するクローン（図１Ａ）の、あるいはＸＰＡ．８５．０１７に関するクローン（図１Ｂ）からの軽鎖アミノ酸の多重配列アラインメント（ＭＳＡ）を、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて親配列に対して実施した。このアラインメントを使用し、ＣＬＣＢｉｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを使用して系統ツリーを作成した。ツリーをＮｅｗｉｃｋ形式でエクスポートした。ＭＳＡをＦＡＳＴＡ形式でエクスポートし、ＥＭＢＯＳＳプログラムＳｈｏｗａｌｉｇｎを実行し、アラインメントをドット識別形式に変換した。スクリプトを、Ｒ言語を使用して記述して、ツリーを、対応するドット識別アライメント配列（軽鎖ファミリーによって色分けされたもの）と結合した。支線形式はまた、軽鎖ファミリーにも対応し、白黒形式でも読みやすくする。表示されたアラインメントにおいて、親配列が完全に示される。他の配列が同一である場合、残基はドットとして示される。違いが表示される。ＩＭＧＴ番号付けシステムを使用して同定されたＣＤＲ領域は、アラインメント上のボックスによって呼び出される。親とのフレームワークの違いが識別される。これを、ソフトウェアプログラム（ＰＨＥｎｏｍ、ＸＯＭＡ（ＵＳ）ＬＬＣ）を用いて親軽鎖を実行し、結果に表示された位置周波数マトリクスを見ることによって行った。配列内のフレームワークの変化が標準アミノ酸に向かった場合は、（＋）として示され、標準配列から離れている場合（頻度に関して）は、（−）として示される。残基が頻度マトリクスに見られない場合、それはその位置では滅多に使用されないアミノ酸であり、それは（Ｒ）によって表示され、アミノ酸は角括弧で表示される。配列が親である異なるファミリーに属する場合、親に最も近い親メンバーが、このＰＨＥｎｏｍ分析の「種」として使用される。
【図２】親クローンＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７を、それらのそれぞれの高親和性軽鎖変異体ＸＰＡ．８５．２８８およびＸＰＡ．８５．２８７とそれぞれ比較した代表的なＳＰＲ由来の動力学データ。ＩｇＧを、Ｆｃ領域を介してセンサー表面に捕捉し、実施例の方法に記載されるように組み換えＰＴＨ１Ｒ  Ｎ末端ＥＣＤを２００、５０、１２．５、および３．１２５ｎＭで注射した。
【図３】図3A〜3B：ＣＨＯＫ１（白丸）およびＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ（黒四角形）細胞上のＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の結合曲線。ＸＰＡ．８５．０１２の結合曲線（図３Ａ）。ＸＰＡ．８５．０１７の結合曲線（図３Ｂ）。両抗体は、ＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ細胞上に発現されたＰＴＨ１Ｒに特異的に結合する。
【図４】図4A〜4B：ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの存在下でのＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７結合。漸増濃度の抗ＰＴＨ１Ｒ抗体を、飽和濃度のＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの存在下または非存在下で、ＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ細胞とともにインキュベートした。抗体結合を、Ｒ−フィコエリスリン抗ヒトＩｇＧ抗体単独（白丸）、２．５μＭ  ＰＴＨを有する抗体（黒四角形）、および２．５μＭＰＴＨｒＰを有する抗体（黒菱形）を用いて検出した。ＸＰＡ．８５．０１２の結合曲線（図４Ａ）。ＸＰＡ．８５．０１７の結合曲線（図４Ｂ）。両方の抗体が、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰのいずれかの存在下でＰＴＨ１Ｒに結合したが、ＰＴＨ１Ｒへの抗体結合はいずれかのリガンドの存在下で低下した。
【図５】図5A〜5B：フローサイトメトリーによるＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７のオン速度。漸増濃度の抗体を、ＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ細胞とともに一定時間インキュベートした。抗体結合を抗ヒトＩｇＧ  ＡＰＣで検出した。ＸＰＡ．８５．０１２に比べて速度が遅いため、ＸＰＡ．８５．０１７のタイムコースを実行した（図５Ａ）。グラフ中、インキュベーション時間が増加するにつれて、抗体結合曲線は左にシフトする。これは、抗体が平衡に達しておらず、抗体が結合するのに時間がかかることを示している。ＸＰＡ．８５．０１２はより速いオン速度を有する（図５Ｂ）。１時間での抗体結合（白丸）は、２４時間のインキュベーション時点（黒六角形）と同様のＥＣ５０値を有する。ＸＰＡ．８５．０１２は１時間以内に結合平衡に達することができるが、ＸＰＡ．８５．０１７は結合平衡に達するのに２４時間かかることがある。両方の抗体が平衡に達すると、それらは同様のＥＣ５０値を有する。
【図６Ａ】ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の種交差反応および差次的結合プロファイル。漸増濃度の抗ＰＴＨ１Ｒ抗体を、飽和濃度のＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの存在下または非存在下で、ＰＴＨ１Ｒオルソログを発現する細胞とともに２４時間インキュベートした。抗体結合を、Ｒ−フィコエリスリン抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の両方は、異なるＰＴＨ１Ｒオーソログに交差反応性であり、両抗体は、リガンド、ＰＴＨ（四角形シンボル）、またはＰＴＨｒＰ（菱形シンボル）の非存在下でより良好に結合する。ヒトＰＴＨ１Ｒ±ＰＴＨ（図６Ａ）または±ＰＴＨｒＰ（図６Ｂ）を発現するＣＨＯ細胞に結合する抗体。
【図６Ｂ】ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の種交差反応および差次的結合プロファイル。漸増濃度の抗ＰＴＨ１Ｒ抗体を、飽和濃度のＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの存在下または非存在下で、ＰＴＨ１Ｒオルソログを発現する細胞とともに２４時間インキュベートした。抗体結合を、Ｒ−フィコエリスリン抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の両方は、異なるＰＴＨ１Ｒオーソログに交差反応性であり、両抗体は、リガンド、ＰＴＨ（四角形シンボル）、またはＰＴＨｒＰ（菱形シンボル）の非存在下でより良好に結合する。ヒトＰＴＨ１Ｒ±ＰＴＨ（図６Ａ）または±ＰＴＨｒＰ（図６Ｂ）を発現するＣＨＯ細胞に結合する抗体。
【図６Ｃ】ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の種交差反応および差次的結合プロファイル。漸増濃度の抗ＰＴＨ１Ｒ抗体を、飽和濃度のＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの存在下または非存在下で、ＰＴＨ１Ｒオルソログを発現する細胞とともに２４時間インキュベートした。抗体結合を、Ｒ−フィコエリスリン抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の両方は、異なるＰＴＨ１Ｒオーソログに交差反応性であり、両抗体は、リガンド、ＰＴＨ（四角形シンボル）、またはＰＴＨｒＰ（菱形シンボル）の非存在下でより良好に結合する。マウスＰＴＨ１Ｒ±ＰＴＨ（図６Ｃ）または±ＰＴＨｒＰ（図６Ｄ）を発現するＣＨＯ細胞に結合する抗体。
【図６Ｄ】ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の種交差反応および差次的結合プロファイル。漸増濃度の抗ＰＴＨ１Ｒ抗体を、飽和濃度のＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの存在下または非存在下で、ＰＴＨ１Ｒオルソログを発現する細胞とともに２４時間インキュベートした。抗体結合を、Ｒ−フィコエリスリン抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の両方は、異なるＰＴＨ１Ｒオーソログに交差反応性であり、両抗体は、リガンド、ＰＴＨ（四角形シンボル）、またはＰＴＨｒＰ（菱形シンボル）の非存在下でより良好に結合する。マウスＰＴＨ１Ｒ±ＰＴＨ（図６Ｃ）または±ＰＴＨｒＰ（図６Ｄ）を発現するＣＨＯ細胞に結合する抗体。
【図７】図7A〜7C：ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの存在下または非存在下でＳａｏｓ−２過剰発現ヒトＰＴＨ１Ｒに結合する抗体。漸増濃度の抗ＰＴＨ１Ｒ抗体を、飽和濃度のＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの存在下または非存在下でＳａｏｓ−２ヒトＰＴＨ１Ｒ細胞とともにインキュベートした。ＸＰＡ．８５．３２８（図７Ａ）、ＸＰＡ．８５．３２９（図７Ｂ）、ＸＰＡ．８５．３３０（図７Ｃ）。抗体結合を、Ｒ−フィコエリスリン抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。抗体単独（白丸）、１μＭのＰＴＨを有する抗体（黒四角形）、および３μＭのＰＴＨｒＰを有する抗体（黒菱形）。３つ全ての抗体は、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰのいずれかの存在下でＰＴＨ１Ｒへの結合の減少を示した。
【図８】抗ＰＴＨ１Ｒ抗体は、ＰＴＨ１Ｒに特異的に結合する。漸増濃度の抗ＰＴＨ１Ｒ抗体を、ヒトＰＴＨ２Ｒを過剰発現しているＣＨＯ細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした（図８）。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、抗体結合を抗ヒトＩｇＧ  ＡＰＣで検出した。試験した抗体はいずれも、ヒトＰＴＨ２Ｒを過剰発現しているＣＨＯ細胞への特異的結合を示さなかった。抗ＫＬＨ．Ｇ２を結合への陰性対照として用いた。試験した抗体は、全てＰＴＨ１Ｒに特異的であった。
【図９Ａ】抗ＰＴＨ１Ｒ抗体は、リガンド媒介ｃＡＭＰ蓄積およびカルシウム動員を阻害する。ヒトＰＴＨ１Ｒ  ＣＨＯＫ１細胞を、２６７ｎＭ（４０μｇ／ｍｌ）のＸＰＡ．８５．０１２（黒四角形）またはＸＰＡ．８５．０１７（黒三角形）のいずれかとともに３７℃で３０分間プレインキュベートし、続いて漸増濃度のＰＴＨ（１−３４）（図９Ａおよび９Ｃ）を用いて誘導した。両抗体は、リガンド媒介ｃＡＭＰ蓄積（Ｇｓ／ＰＫＡ経路、図９Ａおよび９Ｂ）を阻害した。
【図９Ｂ】抗ＰＴＨ１Ｒ抗体は、リガンド媒介ｃＡＭＰ蓄積およびカルシウム動員を阻害する。ヒトＰＴＨ１Ｒ  ＣＨＯＫ１細胞を、２６７ｎＭ（４０μｇ／ｍｌ）のＸＰＡ．８５．０１２（黒四角形）またはＸＰＡ．８５．０１７（黒三角形）のいずれかとともに３７℃で３０分間プレインキュベートし、続いて漸増濃度のＰＴＨｒＰ（１−３４）（図９Ｂおよび９Ｄ）を用いて誘導した。両抗体は、リガンド媒介ｃＡＭＰ蓄積（Ｇｓ／ＰＫＡ経路、図９Ａおよび９Ｂ）を阻害した。
【図９Ｃ】抗ＰＴＨ１Ｒ抗体は、リガンド媒介ｃＡＭＰ蓄積およびカルシウム動員を阻害する。ヒトＰＴＨ１Ｒ  ＣＨＯＫ１細胞を、２６７ｎＭ（４０μｇ／ｍｌ）のＸＰＡ．８５．０１２（黒四角形）またはＸＰＡ．８５．０１７（黒三角形）のいずれかとともに３７℃で３０分間プレインキュベートし、続いて漸増濃度のＰＴＨ（１−３４）（図９Ａおよび９Ｃ）を用いて誘導した。両抗体は、リガンド媒介カルシウム動員（Ｇｑ／ＰＫＣ経路、図９Ｃおよび９Ｄ）を阻害した。
【図９Ｄ】抗ＰＴＨ１Ｒ抗体は、リガンド媒介ｃＡＭＰ蓄積およびカルシウム動員を阻害する。ヒトＰＴＨ１Ｒ  ＣＨＯＫ１細胞を、２６７ｎＭ（４０μｇ／ｍｌ）のＸＰＡ．８５．０１２（黒四角形）またはＸＰＡ．８５．０１７（黒三角形）のいずれかとともに３７℃で３０分間プレインキュベートし、続いて漸増濃度のＰＴＨｒＰ（１−３４）（図９Ｂおよび９Ｄ）を用いて誘導した。両抗体は、リガンド媒介カルシウム動員（Ｇｑ／ＰＫＣ経路、図９Ｃおよび９Ｄ）を阻害した。
【図１０】図10A〜10D：軽鎖シャッフリングによるＸＰＡ．８５．０１７（白丸）の親和性操作に続いて、ヒト（図１０Ａおよび１０Ｂ）またはマウスＰＴＨ１Ｒ（図１０Ｃおよび１０Ｄ）のいずれかを安定的に過剰発現しているＣＨＯＫ１細胞を、２６７ｎＭ（４０μｇ／ｍｌ）の変異体ＩｇＧとともに３７℃で３０分間プレインキュベートし、続いて３７℃で４５分間、漸増濃度のＰＴＨ（１−３４）で誘導した。変異体ＩｇＧは、ヒトおよびマウスＰＴＨ１Ｒを介してリガンド媒介ｃＡＭＰ蓄積（Ｇｓ／ＰＫＡ経路）の阻害の範囲を呈した。
【図１１】図11A〜11D：天然のヒトおよびラットのＰＴＨ１Ｒをそれぞれ内因的に発現するＳａＯＳ−２およびＵＭＲ１０６細胞を用いた、ｃＡＭＰアッセイの変異体および親ＩｇＧ活性の比較。ＩｇＧ（２６７ｎＭまたは４０μｇ／ｍｌ）を３７℃で３０分間、細胞でプレインキュベートした後、３７℃で４５分間、ＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨｒＰ（１−３４）によりｃＡＭＰ蓄積を誘導した。データは平均＋ＳＥＭとして提示され、一連（図１１Ａおよび１１Ｄ）または二連（図１１Ｂおよび１１Ｃ）のウェルで測定されたＲＬＵの平均を表す。軽鎖シャフリングによるＸＰＡ．８５．０１７の親和性操作により、ＸＰＡ．８５．２８７が得られた。この変異体は、ヒトＰＴＨ１Ｒ（図１１Ｂ）（白四角形）対親（黒四角形）に対する活性の顕著な改善を示し、ラットＰＴＨ１Ｒに対する活性の変化はほとんどなかった（図１１Ｃ）。対照的に、ＸＰＡ．８５．０１２（黒三角形）の親和性操作は変異体ＸＰＡ．８５．２８８（白三角形）をもたらし、天然のヒトＰＴＨ１Ｒ（図１１Ａ）ならびに天然のラットＰＴＨ１Ｒ（図１１Ｃ）の両方に対する活性の顕著な改善を示した。ＸＰＡ．８５．２８８はまた、天然のヒトＰＴＨ１Ｒ（図１１Ｄ）を発現するＳａＯＳ−２細胞の、ＰＴＨｒＰ誘導性ｃＡＭＰを顕著に阻害することが見い出された。
【図１２】図12A〜12B：ヒトＰＴＨ１Ｒ  ＣＨＯＫ１（図１２Ａ）およびマウスＰＴＨ１Ｒ  ＣＨＯＫ１（図１２Ｂ）細胞を用いたｃＡＭＰアッセイにおける、ＰＴＨｒＰ（１〜３４）および漸増濃度のＸＰＡ．８５．２８７（ＸＰＡ．８５．０１７の親和性操作変異体）の濃度応答曲線。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、シルト回帰分析を実施し、濃度応答曲線の非平行な右方向シフトを明らかにした。これらの結果は、変異体ＩｇＧの非競合的（アロステリック）作用機序と一致する。
【図１３】図13A〜13B：ヒトＰＴＨ１Ｒ  ＣＨＯＫ１（図１３Ａ）およびマウスＰＴＨ１Ｒ  ＣＨＯＫ１（図１３Ｂ）細胞を用いたｃＡＭＰアッセイにおける、ＰＴＨｒＰ（１−３４）および漸増濃度のＸＰＡ．８５．２８８（ＸＰＡ．８５．０１２の親和性変異体）の濃度応答曲線。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、シルト回帰分析を実施し、濃度応答曲線の非平行な右方向シフトを明らかにした。これらの結果は、変異体ＩｇＧの非競合的（アロステリック）作用機序と一致する。
【図１４】図14A〜14B：ＰＴＨでのＰＴＨ１Ｒ抗体の効果は、Ｓａｏｓ−２細胞によってＭ−ＣＳＦの分泌を刺激した。集密後のＳａｏｓ−２細胞を、４０μｇ／ｍＬの抗体の存在下で特定の濃度のＰＴＨ（１−３４）ペプチドで４８時間処理した。クローンＸＰＡ．８５．０１７（三角形）が、軽鎖交換変異体ＸＰＡ．８５．２８７（黒丸）および陰性対照ＩｇＧ（白丸）に沿って示される（図１４Ａ）。ＸＰＡ．８５．０１２重鎖を含有する５つの親和性強化軽鎖交換変異体が、ＰＴＨ刺激Ｍ−ＣＳＦ分泌を阻害することが示された（図１４Ｂ）。対照ＩｇＧ（白丸）、ＸＰＡ．８５．２８８（黒丸）、ＸＰＡ．８５．３４２（逆三角形）、ＸＰＡ．８５．３４６（白四角形）、ＸＰＡ．８５．３３１（白三角形）、およびＸＰＡ．８５．３２７（黒四角形）。
【図１５】図15A〜15B：ＰＴＨｒＰでのＰＴＨ１Ｒ抗体の効果は、Ｓａｏｓ−２細胞によってＭ−ＣＳＦの分泌を刺激した。集密後のＳａｏｓ−２細胞を、４０μｇ／ｍＬの抗体の存在下で、特定の濃度のＰＴＨｒＰ（１−３６）ペプチドで４８時間処理した。陰性対照ＩｇＧ（白丸）、ＸＰＡ．８５．３２８（逆三角形）、ＸＰＡ．８５．３２９（黒丸）、ＸＰＡ．８５．３３０（四角形）。ＸＰＡ．８５．０１２重鎖を有する親和性強化軽鎖交換変異体のうちの３つが、４０μｇ／ｍＬの固定抗体濃度でのＰＴＨｒＰ刺激Ｍ−ＣＳＦ分泌を阻害することが示された（図１５Ａ）。１２．５ｎＭの固定ＰＴＨｒＰ（１〜３６）濃度を、様々な濃度の抗体に対して試験した（図１５Ｂ）。別の実験において、親クローンＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７を、それらの親和性成熟変異体ＸＰＡ．８５．２８８およびＸＰＡ．８５．２８７と、それぞれ４０μｇ／ｍＬ比較した（図１５Ｃ）。
【図１６】図16A〜16B：２００ｎＭの抗体の存在下での、ＥＲＫ１／２の媒介リン酸化のＰＴＨ（図１６Ａ）およびｈＰＴＨ１ＲのＰＴＨｒＰ（図１６Ｂ）ペプチド刺激の濃度応答曲線。ＣＨＯ−ｈＰＴＨ１Ｒ細胞を、抗体とともに３７℃で１０分間インキュベートし、続いて漸増濃度のペプチドリガンドとともに５分間インキュベートし、次いで細胞を溶解し、免疫アッセイによってＥＲＫ１／２リン酸化の濃度を決定した。示されたデータ点は、平均値±ＳＥＭである。抗体：陰性対照ＩｇＧ（白丸）、ＸＰＡ．８５．０１２（黒丸）、およびＸＰＡ．８５．０１７（黒三角形）。
【図１７】甲状腺機能亢進症（ＴＰＴｘ）モデルを用いてインビボで測定された血清カルシウム濃度のＰＴＨ（１−３４）誘導性上昇を低下させるＰＴＨ１Ｒ抗体能力。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）雄ラット（ｎ＝５〜６／群）に、ＰＴＨ（１−３４）注入開始の１８時間前に、ＰＴＨ１Ｒ抗体ＸＰＡ．８５．０１７（Ａｂ０１７）、ＸＰＡ．８５．２８７（Ａｂ２８７）、ＸＰＡ．８５．２８８（Ａｂ２８８）、およびＢＭ２、またはアイソタイプ対照を静脈内に投与した（１５ｍｇ／ｋｇ）。血清カルシウムを、投与前（ベースライン）、注入前（Ｔ０）、注入開始から２、４、および６時間後に測定した。
【図１８】図18A〜18B：副甲状腺機能亢進症患者のＰＴＨ過剰分泌を模倣するために、持続注入モデルを用いてインビボで測定された血清カルシウム濃度のＰＴＨ（１−３４）誘導性上昇を低下させるＰＴＨ１Ｒ抗体の能力。図１８Ａ、ｈＰＴＨ（１−３４）を７日間、正常なＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ）に連続的に皮下注入して（Ａｌｚｅｔ  ｍｉｎｉ  ｐｕｍｐ、モデル２ＭＬ１、１０μｌ／時、１０μｇ／ｋｇ／日）、副甲状腺機能亢進症を有する患者のＰＴＨ過剰分泌を模倣した。カルシウムを、ポンプ移植の２４時間後、Ａｂ２８８（２または１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５／群）、ＢＭ２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５）、またはアイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２）の単回静脈内投与によるインビボ中和を評価するために、バイオマーカーとして測定した。血清カルシウムを、ポンプ移植の前（投与前）、ポンプ移植の２４、２７（投与の３時間後）、４８、７２、９６、１２０、１４４、および１６８時間後に測定した。図１８Ｂ、抗体、Ａｂ３２８、Ａｂ３２９、およびＡｂ３３０（２ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）をＡｂ２８８と一緒に、同様の研究で試験して、血清カルシウムをポンプ移植前（投与前）、ポンプ移植の２４、２７（投与の３時間後）、４８、７２、９６、および１２０時間後に測定した。全ての抗体は、投与の２４時間後および注入の間中にカルシウム濃度を顕著に低下させ、Ａｂ２８８およびＡｂ３２８が最も劇的な低下をもたらした。
【図１９】図19A〜19B：副甲状腺機能亢進症を有する患者における高カルシウム血症を模倣するために、持続注入モデルを用いてインビボで測定された血清カルシウム濃度のＰＴＨｒＰ（１−３４）誘導性上昇を低下させるＰＴＨ１Ｒ抗体の能力。ＰＴＨｒＰ活性の阻害での抗ＰＴＨ１Ｒ受容体抗体の効果は、ｈＰＴＨｒＰ（１−３６）を６日間、正常なＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ）に連続的に皮下注入（Ａｌｚｅｔミニポンプ、モデル２ＭＬ１、１０μｌ／時、１００μｇ／ｋｇ／日）して、副甲状腺機能亢進症を有する患者の高カルシウム血症を模倣することによって評価した。図１９Ａ、カルシウムを、ポンプ移植の２４時間後、Ａｂ２８８（２または１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝４／群）、抗ＰＴＨｒＰ抗体ＭＣＢ１．１（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５）、またはアイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝３）の単回静脈内投与によるインビボ中和を評価するために、バイオマーカーとして測定した。血清カルシウムを、ポンプ移植の前（投与前）、ポンプ移植の２４、２６（投与の２時間後）、４８、７２、９６、１２０、および１４４時間後に測定した。図１９Ｂ、体重を、ポンプ移植前（投与前）、ポンプ移植の２６（投与の２時間後）、４８、９６、および１４４時間後に測定した。
【図２０Ａ】ＰＴＨ１Ｒ抗体ＸＰＡ．８５．３４９は、マウスｃｏｌｏｎ  ２６腫瘍関連高カルシウム血症を持続期間に強力に低下させる。全血清カルシウムを、ポンプ移植の２４時間後、ＰＴＨ１Ｒ抗体ＸＰＡ．８５．３４９（２ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６〜８／群または６ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５〜８／群）、結合に対する抗ＫＬＨ．Ｇ２陰性対照（６ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２〜３）、非処理対照（ｎ＝５）の単回静脈内投与によるインビボ中和を評価するためのバイオマーカーとして測定した（図２０Ａは平均血清全濃度±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す）。
【図２０Ｂ】ＰＴＨ１Ｒ抗体ＸＰＡ．８５．３４９は、マウスｃｏｌｏｎ  ２６腫瘍関連高カルシウム血症を持続期間に強力に低下させる。マウス体重（図２０Ｂ）および腫瘍重量（図２０Ｃ）を、経時的（投与の４８時間前および投与の４８、７２、および１２０時間後）に測定した。
【図２０Ｃ】ＰＴＨ１Ｒ抗体ＸＰＡ．８５．３４９は、マウスｃｏｌｏｎ  ２６腫瘍関連高カルシウム血症を持続期間に強力に低下させる。マウス体重（図２０Ｂ）および腫瘍重量（図２０Ｃ）を、経時的（投与の４８時間前および投与の４８、７２、および１２０時間後）に測定した。
【図２０Ｄ】ＰＴＨ１Ｒ抗体ＸＰＡ．８５．３４９は、マウスｃｏｌｏｎ  ２６腫瘍関連高カルシウム血症を持続期間に強力に低下させる。ＰＴＨｒＰ（図２０Ｄ）およびＰＴＨ１−８４（図２０Ｅ）の濃度もまた、２または６ｍｇ／ｋｇのＰＴＨ１Ｒ抗体ＸＰＡ．８５．３４９、抗ＫＬＨ．Ｇ２対照抗体を用いて、投与の２４、４８、７２、および１２０時間後にマウスか、あるいは治療前に腫瘍のない動物の血清中で測定した。
【図２０Ｅ】ＰＴＨ１Ｒ抗体ＸＰＡ．８５．３４９は、マウスｃｏｌｏｎ  ２６腫瘍関連高カルシウム血症を持続期間に強力に低下させる。ＰＴＨｒＰ（図２０Ｄ）およびＰＴＨ１−８４（図２０Ｅ）の濃度もまた、２または６ｍｇ／ｋｇのＰＴＨ１Ｒ抗体ＸＰＡ．８５．３４９、抗ＫＬＨ．Ｇ２対照抗体を用いて、投与の２４、４８、７２、および１２０時間後にマウスか、あるいは治療前に腫瘍のない動物の血清中で測定した。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
詳細な説明
本発明は、ＰＴＨ１Ｒに対するヒト抗体に関する材料、方法、および使用を提供する。特に、本開示は、高カルシウム血症、癌、悪性腫瘍随伴体液性高カルシウム血症（ＨＨＭ）、原発性副甲状腺機能亢進症（ＰＨＰＴ）、および二次性副甲状腺機能亢進症（ＳＨＰＴ）、ならびに悪液質の治療におけるそのような抗体の使用方法を提供する。
【００６３】
本開示は、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）と相互作用し、例えば結合パートナー、ＰＴＨ、およびＰＴＨｒＰを介したシグナル伝達などの１つまたは複数の機能的効果を阻害または遮断する分子または薬剤を提供する。本開示は、高カルシウム血症、癌、悪性腫瘍の体液性悪性高カルシウム血症（ＨＨＭ）、または原発性副甲状腺機能亢進症（ＰＨＰＴ）、二次性副甲状腺機能亢進症（ＳＨＰＴ）、および悪液質を治療するための治療薬を提供する。
【００６４】
定義
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していない。
【００６５】
本明細書において使用される「ｃＡＭＰ」は、環状アデノシン一リン酸を指す。
【００６６】
本明細書において使用される「ＣＨＯ」は、チャイニーズハムスター卵巣細胞を指す。
【００６７】
本明細書において使用される「ＣＨＯＫ１」は、成体チャイニーズハムスターの卵巣に由来する、親ＣＨＯ細胞株のサブクローンを指す。
【００６８】
本明細書において使用される「ＥＲＫ１／２」は、細胞外シグナル調節キナーゼを指す。
【００６９】
本明細書において使用される「ＦＬＡＧ」は、組み換えＰＴＨ１Ｒタンパク質に付加することができる、ポリペプチドタンパク質タグである。
【００７０】
本明細書において使用される「ＨＨＭ」は、悪性腫瘍随伴体液性高カルシウム血症を指す。
【００７１】
本明細書において使用される「ＭＡＰＫ」は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼを指す。
【００７２】
本明細書において使用される「ＰＴＨ」は、副甲状腺ホルモンを指す。
【００７３】
本明細書において使用される「ＰＴＨ１Ｒ」は、副甲状腺ホルモン受容体１を指す。また、ＰＴＨＲ１としても知られる。
【００７４】
本明細書において使用される「ＰＨＰＴ」は、原発性副甲状腺機能亢進症を指す。
【００７５】
本明細書において使用される「ＰＴＨｒＰ」は、副甲状腺ホルモン関連タンパク質を指し、また、副甲状腺ホルモン様タンパク質（ＰＴＨＬＰ）または副甲状腺ホルモン様ホルモン（ＰＴＨＬＨ）としても知られる。
【００７６】
「免疫グロブリン」または「天然の抗体」は、四量体糖タンパク質である。天然発生の免疫グロブリンでは、各四量体は２つの同一の対のポリペプチド鎖からなり、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を画定する。ヒト軽鎖はカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびイプシロン（ε）として分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして画定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、無傷の免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【００７７】
各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後にいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、かつ他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと整列しており、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７）。
【００７８】
免疫グロブリン可変ドメインは、３つの超可変領域またはＣＤＲによって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一一般構造を呈する。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖と重鎖の両方はドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３，１９８９の定義に従う。
【００７９】
抗体の超可変領域は、抗原結合に関与する抗体のＣＤＲアミノ酸残基を指す。超可変領域は、ＣＤＲからのアミノ酸残基［例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）によって記載されるような、軽鎖可変ドメイン中の２４〜３４位（Ｌ１）、５０〜５６位（Ｌ２）、および８９〜９７位（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５位（Ｈ１）、５０〜６５位（Ｈ２）、および９５〜１０２位（Ｈ３）の残基］かつ／または超可変ループからのそれらの残基（例えば、［Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）］によって記載されるような、軽鎖可変ドメイン中の２６〜３２位（Ｌ１）、５０〜５２位（Ｌ２）、および９１〜９６位（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２位（Ｈ１）、５３〜５５位（Ｈ２）、および９６〜１０１位（Ｈ３）の残基を含む。ＣＤＲはまた、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付けに従って同定および番号付けされている（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）、軽鎖および重鎖可変ドメイン中のＣＤＲ位置を以下のように記載している：ＣＤＲ１、およそ２７〜３８位の残基、ＣＤＲ２、およそ５６〜６５位の残基、ＣＤＲ３、およそ１０５〜１１６位の残基（生殖細胞系列）または１０５〜１１７位の残基（再編成）。一実施形態において、ＣＤＲが、本明細書において開示されるものとほぼ同様の長さの抗体重鎖または軽鎖の、軽鎖可変ドメイン中のおよそ２６〜３１位（Ｌ１）、４９〜５１位（Ｌ２）、および８８〜９８位（Ｌ３）の残基、ならびに重鎖可変ドメイン中のおよそ２６〜３３位（Ｈ１）、５０〜５８位（Ｈ２）、および９７〜１１１位（Ｈ３）の残基に位置することが企図される。しかしながら、当業者は、特定の抗体の配列が同定された場合、ＣＤＲ残基の実際の位置が上記の予想される残基とは異なり得ることを理解する。
【００８０】
フレームワークまたはＦＲ残基は、超可変領域残基以外の、その可変ドメイン残基である。
【００８１】
本明細書において使用される「重鎖可変領域」は、該抗体重鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体分子の領域を指す。重鎖可変領域は、該抗体重鎖の１、２、または３つのＣＤＲを含有し得る。
【００８２】
本明細書において使用される「軽鎖可変領域」は、該抗体軽鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体分子の領域を指す。軽鎖可変領域は、該抗体軽鎖の１、２、または３つのＣＤＲを含有し得、それは抗体に応じてκまたはλ軽鎖のいずれかであり得る。
【００８３】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、完全に組み立てられた抗体、四量体抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原に結合できる抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディ、Ｆｃａｂ）、および（それらが所望の生物学的活性を呈する限り）先述を含む組み換えペプチドを含む。「免疫グロブリン」または「四量体抗体」は、それぞれ可変領域および定常領域を含む２本の重鎖および２本の軽鎖からなる四量体糖タンパク質である。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術によってか、あるいは無傷の抗体の酵素的または化学的切断によって産生され得る。抗体断片または抗原結合部分としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ＣＤＲ移植抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体断片、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、線状抗体、キレート化組み換え抗体、トリボディもしくはバイボディ、イントラボディ、ナノボディ、小型モジュラー免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはそれらの変異体もしくは誘導体、および抗体が所望の生物学的活性を保持している限り、１、２、３、４、５、もしくは６つのＣＤＲ配列などの、ポリペプチドに結合する特異的抗原を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが挙げられる。
【００８４】
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る天然に発生する可能性のある変異を除いて同一である。
【００８５】
本明細書において使用される「抗体変異体」は、参照抗体可変領域ドメインの可変領域に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、抗体ポリペプチド配列を指す。変異体は、非改変抗体と実質的に相同的または実質的に同一であり得る。
【００８６】
本明細書において使用される「キメラ抗体」は、典型的には異なる種を起源とする２つの異なる抗体（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）由来の配列を含有する、抗体を指す。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒトおよびげっ歯類の抗体断片、一般的にはヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【００８７】
「中和抗体」は、それが結合する標的抗原の生物学的機能を排除するか、あるいは著しく低下させることができる抗体分子である。したがって、「中和」抗標的抗体は、酵素活性、リガンド結合、または細胞内シグナル伝達などの生物学的機能を、排除または有意に低下させることができる。
【００８８】
「アロステリック抗体」または「アロステリックに結合する抗体」は、活性リガンド結合部位とは異なるＰＴＨ１Ｒの一部に結合する、すなわち、受容体に対して天然リガンドと競合しない抗体である。アロステリック抗体が、ＰＴＨ、またはＰＴＨｒＰ、およびＰＴＨ１Ｒの結合親和性を２倍を超えてはっきりとは変えないことが企図される。様々な実施形態において、抗体は、場合によりＰＴＨ１Ｒにアロステリックに結合する負の調節因子であり、抗体が、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰとＰＴＨ１Ｒとの間の結合親和性を少なくとも約２分の１に、任意で最大１０００分の１に低下させることができる。
【００８９】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され、分離され、回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断上または治療上の使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）ローリー法によって決定される抗体の９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超へ、（２）スピニングカップシークエンテーターの使用によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより還元条件下もしくは非還元条件下でクマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して均一に、精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しなくなるため、組み換え細胞内のインビボの抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
【００９０】
本明細書において使用される「特異的に結合する」か、「標的特異的」であるか、標的「に特異的」であるか、あるいは標的抗原と「免疫反応性」である抗体は、同様の抗原より大きな親和性で標的抗原に結合する、抗体または抗体物質を指す。本開示の一態様において、標的結合ポリペプチドまたはその断片、変異体またはその誘導体は、他の、すなわち非ヒト種の標的への結合親和性と比較して、ヒト標的へはより大きい親和性で結合するが、標的のオーソログを認識し、結合する結合ポリペプチドは、提供される範囲内にある。
【００９１】
例えば、その同族抗原に「特異的な」抗体またはその断片であるポリペプチドは、抗体の可変領域が検出可能な優先度で目的のポリペプチドを認識および結合することを示す（すなわち、目的のポリペプチドを、局在化配列の同一性、相同性、またはファミリーメンバー間の類似性の存在の可能性にもかかわらず、結合親和性における測定可能な差異のために、同じファミリーの他の既知のポリペプチドと区別できる）。特異的な抗体はまた、抗体の可変領域の外側の配列との相互作用を介して、特に、分枝の定常領域中、他のタンパク質（例えば、黄色ブドウ球菌プロテインＡまたはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）と相互作用し得ることが理解されるであろう。本開示の方法において使用するための抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当該技術分野において周知であり、日常的に実施されている。そのようなアッセイの包括的な考察については、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。本方法に使用するための抗体は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して産生することができる。
【００９２】
「エピトープ」という用語は、１つまたは複数の抗原結合領域で、選択的結合剤によって認識され、結合することのできる任意の分子のその部分を指す。エピトープは通常、アミノ酸または炭水化物側鎖などの分子の化学的に活性な表面群から構成され、特定の三次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。本明細書において使用されるエピトープは、連続的または非連続的であり得る。さらには、エピトープは、それらが抗体を生産するために使用されるエピトープと、同一である三次元構造を含むが、抗体免疫応答を刺激するために使用された標的内に発見されたアミノ酸残基を、全く含まないか、または少しだけ含むという点で擬似体（ミモトープ）であり得る。本明細書において使用される場合、ミモトープは、選択的結合剤によって結合されるエピトープとは異なる抗原と見なされず、選択的結合剤がエピトープおよびミモトープの同じ三次元構造を認識する。
【００９３】
本開示の抗体物質およびポリペプチドに関連して使用される場合の「誘導体」という用語は、ユビキチン化、治療薬または診断薬への結合、標識（例えば、放射性核種または様々な酵素を用いて）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールを用いた誘導体化）などの共有結合ポリマー付着、およびヒトのタンパク質では通常起こらない、オルニチンなどのアミノ酸の化学合成による挿入または置換などの技術によって化学的に改変されたポリペプチドを指す。誘導体は、本開示の非誘導体化分子の結合特性を保持する。
【００９４】
「治療有効量」という用語は、本明細書において、治療される疾患の症状または徴候を改善または軽減するのに有効である、本開示の標的特異的組成物の量を示すために使用される。
【００９５】
本明細書における方法に関して使用される「治療する」、「治療された」、「治療すること」、および「治療」という用語は、一時的または恒久的のいずれかで、部分的または完全のいずれかで、臨床症状、事象の兆候もしくは進行、病気もしくは状態を排除、軽減、抑制、または改善することを指す。そのような治療は絶対に有用である必要はない。
【００９６】
本方法は、標的特異的抗体（本明細書において記載されるそれらの例示的な配列、断片、それらの変異体および誘導体、本明細書において列挙される標的特異的抗体を含む薬学的製剤を含み得る）の使用を提供する。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てることができ、サブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は、周知である。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有し、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプはＡＤＣＣ活性を有する。本明細書において開示される抗体は、それが定常ドメインを含む場合、これらのサブクラスまたはアイソタイプの任意のものであり得る。
【００９７】
本方法で使用される抗体は、約２×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、または約１０−７Ｍ以下、または約１０−８Ｍ以下、または約１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ以下のＫｄの１つまたは複数のＰＴＨ１Ｒ抗原に対して、結合親和性を呈し得る。一実施形態において、抗体は少なくとも２×１０６ＭのＫｄを有する。そのような親和性は、平衡透析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、製造業者によって概説された一般的な手順を使用するＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００機器）の使用、１２５Ｉ標識標的抗原を使用したラジオイムノアッセイ、または以下の実施例に記載されているか、あるいは当業者に知られている別の方法、などによる従来の技術を使用して容易に決定することができる。親和性データは、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０，１９４９）によって分析することができる。
【００９８】
ＫｉｎＥｘＡ動力学排除アッセイもまた、その抗原に対する抗体の親和性を測定するのに有用である。ＫｉｎＥｘＡ技術は、液相と固相の間の結合事象よりも、液相の結合事象を測定する。加えて、結合事象を測定するための多くの方法が、少なくとも１つの反応物を固定化または標識化を通して改変することを必要とするが、一方、ＫｉｎＥｘＡ方法は研究中の分子の改変を必要としない。ＫｉｎＥｘＡ方法は、現在利用可能な他の方法よりも広範囲の結合定数を測定することを可能にすると考えられている。ＫｉｎＥｘＡ装置および抗体の特徴付けのための操作についての追加の説明は、製造業者（アイダホ州、ボイズ、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．）から入手可能であり、公開された文献、例えば、米国特許第６，６６４，１１４号およびＤａｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２００４，２：６４７−６５７に見出すことができる。
【００９９】
副甲状腺ホルモン受容体１
副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）は、Ｎ末端細胞外ドメイン（Ｎ−ＥＣＤ）、７つのＴＭヘリックス、３つのＥＣ、３つの細胞内ループ（ＩＣ）、およびＣ末端細胞内ドメイン（Ｃ−ＩＣＤ）から構成される（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２４（５）：９２５−９３４）。このタンパク質は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）のための受容体である。ＰＴＨ１Ｒの活性は、アデニリルシクラーゼおよびホスファチジルイノシトールカルシウムセカンドメッセンジャー系もまた活性化するＧタンパク質によって媒介される。ＰＴＨ１Ｒは、骨、腎臓、および成長板において高度に発現され、他の組織においては、発達を通して様々な時点でより低い濃度で発現される（例えば、骨格、心臓、および乳腺）（Ｃｈｅｌｏｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１，７１２−７２４、Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  ＪＢＣ  ２８０（３）：１７９７−８０７）。ＰＴＨとＰＴＨｒＰの両方の上昇は、高カルシウム血症を引き起こし、結石（腎臓結石）、骨量減少（骨吸収）、および精神病性オーバートーン（うつ病、不安、認識機能障害、不眠症、昏睡）の症状をもたらす。癌患者では、ＰＴＨｒＰ濃度の上昇は、破骨細胞性骨吸収および高カルシウム血症の増加、悪性腫瘍随伴体液性高カルシウム血症として知られる状態に繋がる（Ｃｈｅｌｏｈａ  ｅｔ  ａｌ，２０１５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１，７１２−７２４）。
【０１００】
悪性腫瘍随伴体液性高カルシウム血症
悪性腫瘍随伴体液性高カルシウム血症（ＨＨＭ）は、特定の腫瘍によるＰＴＨｒＰの過剰産生に起因する（Ｈｏａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２３：９８９−９９８）。ＨＨＭは、乳癌、および多発性骨髄腫、ならびに肺癌などの特定の癌の、非常に一般的な合併症である（Ｆｉｎｄｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０，１３１１−１３１７）。２０１２年には、米国の癌患者の２．７％がＨＨＭを有した（固形腫瘍および血液悪性腫瘍）。
【０１０１】
原発性副甲状腺機能亢進症
副甲状腺の障害としては、副甲状腺機能亢進症および副甲状腺機能低下症が挙げられる。原発性副甲状腺機能亢進症（ＰＨＰＴ）は、原発性欠陥が副甲状腺自体にある場合に起こり、過剰なＰＴＨの放出をもたらす（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  ＪＢＣ  ２８０（３）：１７９７−８０７）。ＰＨＰＴは、カルシウムの代謝異常を引き起こし、それによって高カルシウム血症、低リン血症、線維性骨炎、腎結石症、および高血圧などの障害を引き起こす場合がある。ＰＨＰＴは、高カルシウム血症の最も一般的な原因でもある（Ｍａｒｃｏｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  ＮＥＪＭ  ３６５：２３８９−２３９７）。副甲状腺機能亢進症の場合に起こるようなＰＴＨ、または悪性腫瘍による分泌のために癌で頻繁に起こるようなＰＴＨｒＰの過度の循環濃度は、高カルシウム血症状態を生じ、ひどく衰弱させ、潜在的に致命的であり得る（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  ＪＢＣ  ２８０（３）：１７９７−８０７）。
【０１０２】
副甲状腺機能亢進症の治療は、通常、原因となる副甲状腺組織の外科的切除を目的とする。ＨＨＭを有する患者は、通常外科的に治癒することはできず、通常は、様々な有効性とともに、骨吸収の抑制（ビスホスホネートまたはカルシトニン）または腎臓によるカルシウム排泄の促進（食塩利尿）を目的として医学的に管理される必要がある（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．６１，４５５−４５９）。
【０１０３】
ＰＴＨ１Ｒ阻害剤
ＰＴＨ１Ｒアンタゴニストは、ＨＨＭおよび副甲状腺機能亢進症の場合に有益であることが示されている（Ｄｒｅｓｎｅｒ−Ｐｏｌｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９６Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１１，１０６１−１０６５；Ｃｈｅｌｏｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１，７１２−７２４）。アゴニストペプチドの作用を模倣する小分子リガンドの開発は、ＰＴＨ１Ｒのための難しい目標であった。ＨＨＭおよびＰＨＰＴを治療するのに使用するためのＰＴＨ１Ｒのいくつかの阻害剤は、当該技術分野において既知である（ＵＳ７，１５０，９７４、ＵＳ７，９８５，８３５、ＵＳ７，９１０，５４４）。
【０１０４】
ＰＴＨ１Ｒ抗体
様々な実施形態において、本開示は、１０−６Ｍ以下の親和性Ｋｄを有するＰＴＨ１Ｒに特異的な抗体を提供する。様々な実施形態において、本開示は、２×１０−６Ｍ以下の親和性Ｋｄを有するＰＴＨ１Ｒに特異的な抗体を提供する。例示的な実施形態において、本明細書において記載される抗ＰＴＨ１Ｒ抗体は、少なくとも１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ以下の親和性で結合する。他の実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＰＴＨ２Ｒへの結合と比較して、少なくとも２〜５０倍、１０〜１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、もしくは１００倍、または２０〜５０％、５０〜１００％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％高い親和性（例えば、ＰＴＨ１Ｒに優先的に結合する）でＰＴＨ１Ｒに結合する。特定の実施形態において、親和性は、表面プラズモン共鳴またはＫｉｎＥｘＡアッセイによって測定される。
【０１０５】
関連する態様において、抗体は、ＰＴＨ１ＲのＮ末端部分に結合する。さらなる態様において、本開示は、副甲状腺ホルモン受容体２（ＰＴＨ２Ｒ）に結合しない抗体を企図する。様々な態様において、抗体は、細胞表面のＰＴＨ１Ｒに結合する。特定の態様において、抗体は、ＰＴＨ１Ｒにアロステリックに結合する。
【０１０６】
好ましい態様において、抗体は、負の調節因子抗体であり、任意で抗体がＰＴＨまたはＰＴＨｒＰとＰＴＨ１Ｒとの間の結合親和性を少なくとも約２分の１に、任意で最大１０００分の１に低下させることができる。他の実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ間の結合親和性を少なくとも２分の１〜１０００分の１、１０分の１〜１００分の１、２分の１、５分の１、１０分の１、２５分の１、５０分の１、１００分の１、２００分の１、３００分の１、４００分の１、５００分の１、６００分の１、７００分の１、８００分の１、９００分の１、または１０００分の１に低下させることができる。
【０１０７】
様々な実施形態において、抗体は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）または副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）による受容体の刺激に応答した細胞内のカルシウム流動を阻害する。関連する実施形態において、抗体は、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ媒介環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）蓄積を阻害する。
【０１０８】
一実施形態において、ＰＴＨ１Ｒ抗体は、モノクローナル抗体である。
【０１０９】
一態様において、本開示は、（ａ）図２１もしくは配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２に記載される重鎖相補性決定反復（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、（ｂ）図２１もしくは（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３に記載される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、図２１もしくは配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４に記載される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体とを含む、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する抗体を提供する。
【０１１０】
関連する態様において、本開示は、（ａ）図２１、もしくは配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３に記載される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域に由来する、配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４に記載される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体とを含む、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する抗体を提供する。
【０１１１】
さらなる態様において、本開示は、（ａ）配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、（ｂ）図２１、もしくは配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３に記載される、独立して選択された重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体と、（ｃ）図２１、もしくは配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４に記載される、独立して選択された重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその変異体とを含む、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する抗体に結合する抗体を企図する。
【０１１２】
特定の実施形態において、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの少なくとも２つが、図２１または配列番号２７〜１０４に記載される。関連する実施形態において、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列の３つが、図２１または配列番号２７〜１０４に記載される。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、本明細書において企図される抗体は、図２１または配列番号１〜２６に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、図２１または配列番号１〜２６に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む抗体である。
【０１１４】
さらに、本明細書において記載される抗体は、重鎖可変領域中の３つ全てのＨＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含むことが企図され、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が図２１または配列番号２７〜１０４に記載される。
【０１１５】
別の実施形態において、図２１の抗体配列の重鎖可変領域中の３つ全てのＨＣＤＲ、または配列番号２７〜１０４に示されるＣＤＲと、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供される。
【０１１６】
関連する実施形態において、図２１の抗体配列の軽鎖可変領域中の３つ全てのＬＣＤＲ、または配列番号１３１〜２０８に示されるＣＤＲと、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供される。
【０１１７】
さらなる実施形態において、図２１の抗体配列の重鎖および軽鎖可変領域中の６つ全てのＣＤＲ、または配列番号２７〜１０４および１３１〜２０８に示されるＣＤＲと、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供される。
【０１１８】
特定の実施形態において、本明細書において企図される抗体は、１つまたは複数の重鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列に由来する対応するアミノ酸と置換されているものである。
【０１１９】
一実施形態において、本明細書において企図される抗体は、図２１または配列番号１３１〜２０８に記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれか１つをさらに含む。いくつかの実施形態において、抗体は、図２１または配列番号１３１〜２０８に記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも２つを含む。他の実施形態において、抗体は、図２１または配列番号１３１〜２０８に記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも３つを含む。
【０１２０】
別の態様において、本明細書において記載される抗体は、（ａ）図２１、もしくは配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６に記載される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体、または図２１に示されるそのコンセンサス配列と、（ｂ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域に由来する、図２１、もしくは配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７に記載される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体、または図２１に示されるそのコンセンサス配列と、（ｃ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域に由来する、図２１、もしくは配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８に記載される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体、または図２１に示されるそのコンセンサス配列とを含む。
【０１２１】
代替実施形態において、本明細書において企図される抗体は、（ａ）図２１、もしくは配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６に記載される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、（ｂ）図２１、もしくは配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７に記載される、独立して選択された軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体と、（ｃ）図２１、もしくは配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８に記載される、独立して選択された軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が変更されているその変異体とを含む。
【０１２２】
特定の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの少なくとも２つが、図２１または配列番号１３１〜２０８に記載される。
【０１２３】
さらに、本明細書おいて記載される抗体は、図２１または配列番号１０５〜１３０に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むことが企図される。関連する実施形態において、抗体は、図２１または配列番号１０５〜１３０に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、抗体は、図２１または配列番号１０５〜１３０に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、抗体は、図２１または配列番号１０５〜１３０に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【０１２４】
さらなる実施形態において、本明細書において記載される抗体は、軽鎖可変領域の３つ全てのＬＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、図２１または配列番号１３１〜２０８に記載される。
【０１２５】
特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体は、（ｉ）軽鎖可変領域の、３つ全てのＬＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一のアミノ酸配列（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、図２１または配列番号１３１〜２０８に記載される）と、（ｉｉ）重鎖可変領域の３つ全てのＨＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一のアミノ酸配列（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、図２１もしくは配列番号２７〜１０４に記載される）とを含む。
【０１２６】
別の態様において、本開示は、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）に結合する抗体を提供し、（ａ）軽鎖可変領域が、配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、および／または（ｂ）重鎖可変領域が、配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む。
【０１２７】
関連する実施形態において、本明細書において記載される抗体は、（ａ）配列番号１３１、１３４、１３７、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１３２、１３５、１３８、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号１３３、１３６、１３９、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む軽鎖可変領域、および／または（ｂ）配列番号２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、および配列番号２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、もしくはそれらと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、重鎖定常領域をさらに含み、重鎖定常領域は、改変されたまたは改変されていないＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらの断片、またはそれらの組み合わせである。
【０１２９】
特定の実施形態において、１つまたは複数の軽鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列に由来する対応するアミノ酸と置換されている抗体が提供され、任意でフレームワークが図１Ａおよび図１Ｂに示される変更のうちの１つまたは複数を含む。
【０１３０】
一態様において、本開示の抗体は、ＸＰＡ．８５．０１２、ＸＰＡ．８５．０１７、ＸＰＡ．８５．２８８、ＸＰＡ．８５．３２８、ＸＰＡ．８５．３２９、ＸＰＡ．８５．３３０、およびＸＰＡ．８５．３４９からなる群から選択される。
【０１３１】
一実施形態において、本明細書において記載される抗体は、該軽鎖可変領域に結合したヒト軽鎖定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、軽鎖定常領域は、改変されたもしくは改変されていないλ軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域、それらの断片、またはそれらの組み合わせである。
【０１３２】
別の態様において、本開示は、本明細書において記載される重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。様々な実施形態において、抗体可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０９〜２３４（重鎖）および２３５〜２６０（軽鎖）に示される。
【０１３３】
様々な実施形態において、核酸分子は、配列番号１０５〜１３０のうちのいずれか１つの軽鎖可変領域アミノ酸配列またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、核酸分子は、配列番号２３５〜２６０のうちのいずれか１つの軽鎖可変領域ヌクレオチド配列またはその断片を含む。さらなる実施形態において、核酸分子は、配列番号１〜２６のうちのいずれか１つの重鎖可変領域アミノ酸配列またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、核酸分子は、配列番号２０９〜２３４のうちのいずれか１つの重鎖可変領域ヌクレオチド配列またはその断片を含む。本開示の核酸分子はさらに、配列番号２０９〜２６０の配列を含む全ての核酸配列を含み、核酸配列は、本明細書において記載される抗体または本明細書において記載される任意のＨＣＤＲもしくはＬＣＤＲの重鎖ならびに軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、かつ配列番号２７〜１０４および１３１〜２０８に示されるようなＣＤＲアミノ酸配列をコードする遺伝子コードの多様性に基づく縮重コドンと、ならびに本明細書において記載され、配列番号１〜２６もしくは１０５〜１３０に示される抗体、または本明細書において記載され、配列番号２７〜１０４もしくは１３１〜２０８に示される任意のＨＣＤＲもしくはＬＣＤＲの、重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸配列に、本明細書において記載さるものなどの高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸とを含む。
【０１３４】
いくつかの態様において、核酸分子は、配列番号１０５〜１３０に記載されるＶＬアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるＶＬアミノ酸配列をコードする。関連する態様において、ＶＬアミノ酸配列は、コンセンサス配列である。本開示の核酸分子は、配列番号１０５〜１３０の軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする核酸配列に、本明細書において記載されるものなどの高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、あるいは配列番号２３５〜２６０の軽鎖可変領域核酸配列を有する核酸が含まれる。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号１３１〜２０８に記載される該抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする。
【０１３５】
本開示の核酸分子は、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つのＶＨアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはその断片を含むことが企図される。いくつかの態様において、核酸は、該抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、該断片は、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む連続した断片である。一実施形態において、該断片は、任意で異なるヒトまたはヒトコンセンサスフレームワークとともに、かつ任意でＣＤＲ中の１つ、または最大２つ、または最大３つの変異とともに、重鎖および／もしくは軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域うちの少なくとも１つ、２つ、または３つを含む。ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号２７〜１０４および１３１〜２０８に示される。
【０１３６】
関連する態様において、核酸分子は、配列番号１〜２６の重鎖のうちの１つの重鎖可変領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはその断片を含む。一実施形態において、核酸分子は、配列番号２０９〜２３４に記載されるヌクレオチド配列を有する重鎖可変領域、またはその断片を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１〜２６に記載されるＶＨアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＶＨアミノ酸配列をコードする。関連する態様において、ＶＨアミノ酸配列は、コンセンサス配列である。本開示の核酸分子は、配列番号１〜２６の重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする核酸配列に、本明細書において記載されるものなどの高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、あるいは配列番号２０９〜２３４のうちのいずれか１つの重鎖可変領域核酸配列を有する核酸をさらに含む。
【０１３８】
本開示の核酸が、図２１に示される抗体から選択される抗体の全長軽鎖または重鎖をコードし得ることがさらに企図され、全長軽鎖または全長重鎖が、軽鎖定常領域または重鎖定常領域を含み、それぞれ、軽鎖定常領域が、任意で、改変されていないもしくは改変されたκまたはλ領域を含み、重定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥなどのクラスのうちのいずれかの改変されていないまたは改変された定常領域を含む。
【０１３９】
一態様において、全長可変軽鎖抗体は、配列番号１０５〜１３０に示されるアミノ酸配列を含む。全長軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０５〜１３０に示されるアミノ酸配列をコードし、かつ配列番号２３５〜２６０に記載されるヌクレオチド配列を含むことがさらに企図される。
【０１４０】
一態様において、全長可変重鎖抗体は、配列番号１〜２６のうちのいずれか１つの配列を含む。さらに提供されるのは、配列番号１〜２６に示される全長重鎖可変領域アミノ酸配列をコードし、配列番号２０９〜２３４のうちのいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。
【０１４１】
本開示の抗体が、当該技術分野において周知であり、本明細書において記載される抗体より小さな抗原結合断片、ならびに本明細書において記載されるような誘導体および改変抗体として使用され得ることがさらに企図される。
【０１４２】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は、一般的に非常に特異的であり、同一または異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、単一の抗原部位に対して向けられ得る。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが異なる特異性および特徴を有する他の免疫グロブリンによって汚染されていない均質培養によって合成されるという点で、有利である。
【０１４３】
以下に記載されるように、本明細書において記載されるモノクローナル抗体、ヒト化抗体、および本明細書において記載される他の抗体を含む、抗体は、典型的には組み換え的にまたは遺伝子コードをインビトロもしくはインビボで操作する他の方法により産生され、それゆえに必ずしも自然の中で見つかる特定の抗体を反映する必要はない。
【０１４４】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒらによって最初に記載されるハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−７，１９７５）（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）によって作製することができるか、あるいは組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって作製することができる。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８，１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７，１９９１）に記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することができる。モノクローナル抗体を産生するための追加の方法は、当業者に周知である。
【０１４５】
上記の方法によって産生されるものなどのモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および／または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培地、腹水、または血清から適切に分離される。
【０１４６】
本開示の抗体は、当該技術分野で周知であり、本明細書中において記載される抗体の、より小さな抗原結合断片として使用され得ることがさらに企図される。
【０１４７】
抗体断片
抗体断片は、無傷の全長抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃａｂ；およびＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；二重特異性抗体、三重特異性抗体などの多重特異性抗体断片、抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）；ミニボディ；キレート化組み換え抗体；トリボディまたはバイボディ；イントラボディ；ナノボディ；小モジュラー免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質；ラクダ化抗体；ＶＨＨ含有抗体；抗体断片から形成された他のポリペプチドが挙げられる。例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１２６−３６；Ｅｙｅｒ＆Ｈｒｕｓｋａ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｎｉ  Ｍｅｄｉｃｉｎａ  ５７：４３９−５１３，２０１２を参照されたい。
【０１４８】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、それぞれ単一の抗原結合部位を有するＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨドメインからなる一価の断片、ならびにその名称が容易に結晶化するその能力を反映している、残基「Ｆｃ」断片を産生する。ペプシン処理により、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む２価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片が生じ、これは２つの「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片を有し、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、Ｆｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするＶＨおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、その結果、ＶＬおよびＶＨ領域が対になり、それらを単一タンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーを介して、一価分子を形成する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をもたらす（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８）。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．ｌ  １３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。Ｆｄ断片は、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる。
【０１４９】
追加の抗体断片としては、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）が挙げられる。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用する二価抗体であり、したがってドメインに、別の鎖の相補性ドメインと対合するように強制し、２つの抗原結合部位を産生する（例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３、およびＰｏｌｊａｋｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３，１９９４を参照されたい）ダイアボディは、二重特異性または単一特異性であり得る。
【０１５０】
軽鎖を欠く機能的重鎖抗体は、コモリザメ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８−７３，１９９５）、テンジクザメ（Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：３１３−２６，２００１）、ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびラマのようなラクダ科（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−８，１９９３；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：４１３，１９９８）内で、天然に発生する。これらの動物では、抗原結合部位は単一ドメイン、ＶＨＨドメインに減少している。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを用いて抗原結合領域を形成する、すなわち、これらの機能的抗体は、構造Ｈ２Ｌ２のみを有する重鎖のホモ二量体である（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と称される）。ラクダ科ＶＨＨは、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含有し、かつＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ２およびＩｇＧ３定常領域と組み換えられると報告されている（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。例えば、ラマＩｇＧ１は、ＶＨがヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含有する定常領域と再結合する従来の（Ｈ２Ｌ２）抗体アイソタイプであり、ラマＩｇＧ２およびＩｇＧ３は、ＣＨ１ドメインを欠き、かつ軽鎖を含まない重鎖のみのアイソタイプである。ラクダ科ＶＨＨドメインは、抗原に高親和性で結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０，２００１）、溶液中で高い安定性を保有する（Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：３６２８−３６，２００２）ことが見い出された。古典的なＶＨのみの断片は、可溶性形態で産生するのが困難であるが、フレームワーク残基がよりＶＨＨ様になるように変更される場合、溶解性および特異的結合における改善が得られ得る。（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９，２３１：２５−３８を参照されたい）。ラクダ重鎖を有する抗体を産生する方法は、例えば、米国特許公開第２００５０１３６０４９号および同第２００５００３７４２１号に記載される。
【０１５１】
わずか１５ｋＤａの分子量を有する、抗体重鎖、完全に機能的な抗原結合断片の可変ドメインは、ナノボディと称される（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：２８５３−５７，２００４）。ナノボディーライブラリーは、Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５：２８０７−１２，２００１）に記載されるように免疫化ヒトコブラクダから、あるいはＲｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５（１）：１１１−２４（２００５）に記載されるような組み換え方法を使用して産生することができる。
【０１５２】
二重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「バイボディ」）および三重特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディ」）の産生は、Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−５７，２０００）およびＷｉｌｌｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８６：１６１−７６，２００３）に記載されている。バイボディまたはトリボディについては、ｓｃＦｖ分子をＶＬ−ＣＬ（Ｌ）およびＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖の一方または両方に融合させ、例えば、トリボディを作製するために、２つのｓｃＦｖをＦａｂのＣ末端に融合させ、一方で、バイボディにおいては１つのｓｃＦｖを、ＦａｂのＣ末端に融合させる。追加のＦａｂ系二重特異性形式は、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ７：４７０−４８２，２０１５に記載される。
【０１５３】
ペプチドリンカー（ヒンジレス）を介して、あるいはＩｇＧヒンジを介してＣＨ３に融合したｓｃＦｖからなる「ミニボディ」は、Ｏｌａｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．１７（４）：３１５−２３，２００４に記載されている。
【０１５４】
細胞内抗体は、細胞内発現を実証し、細胞内タンパク質機能を操作することができる一本鎖抗体である（Ｂｉｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．９：１０１−１０８，１９９０；Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０１：１７６１６−２１，２００４）。細胞内領域に抗体構築物を保持する細胞シグナル配列を含む細胞内抗体は、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５４２−５１，１９９５）およびＷｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（ＦＡＳＥＢＪ．１７：１７３３−５．２００３）に記載されているように産生され得る。トランスボディは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）が一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体と融合している細胞透過性抗体である、Ｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５−８、２００５）。
【０１５５】
さらに意図されるのは、標的タンパク質に特異的なＳＭＩＰまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体である。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を実行するのに必要な免疫グロブリンドメインに融合した抗原結合ドメインを含む、一本鎖ポリペプチドである。例えば、ＷＯ０３／０４１６００、米国特許公開第２００３０１３３９３９号、および米国特許公開第２００３０１１８５９２号を参照されたい。
【０１５６】
それをイムノアドヘシンにするために、共有結合的または非共有結合的のいずれかで１つまたは複数のＣＤＲを分子に組み込むことができる。イムノアドヘシンは、ＣＤＲをより大きなポリペプチド鎖の一部として組み込むことができるか、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合させることができるか、あるいはＣＤＲを非共有結合で組み込むことができる。ＣＤＲは、イムノアドヘシンが目的の特定の抗原に特異的に結合することを可能にする。
【０１５７】
したがって、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の１、２、および／または３つのＣＤＲ（例えば、単一のＣＤＲ単独もしくはタンデム、２、３、または他の複数のＣＤＲの反復、あるいは２つの組み合わせ、あるいは３つのＣＤＲの単独、あるいはタンデム反復、任意で、ＣＤＲ間または反復間のスペーサーアミノ酸配列とともに）を含む様々な組成物を、当該技術分野で既知の技術によって産生することができる。
【０１５８】
キメラ抗体およびヒト化抗体
キメラ抗体またはヒト化抗体は、親の非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体よりもヒト中で免疫原性が低いので、それらはアナフィラキシーの危険性がはるかに低いヒトの治療に使用することができる。
【０１５９】
非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインが、ヒト定常Ｉｇドメインに融合されているキメラモノクローナル抗体は、当該技術分野において既知の標準的な手順を用いて産生することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８４１−６８５５（１９８４）、およびＢｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６４３−６４６，（１９８４）を参照されたい）。
【０１６０】
ヒト化抗体は、例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のヒトフレームワークおよび定常領域への移植（当該技術分野において「ＣＤＲ移植」によるヒト化と呼ばれるプロセス）、（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、しかし表面残基を置換することによってそれらをヒト様表面で「クローキング」すること（当該技術分野において「ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれるプロセス）、あるいは（３）抗原結合またはタンパク質フォールディングのいずれかに悪影響を及ぼす可能性は低いが、ヒト環境における免疫原性を減少させる可能性が高いと決定された位置でヒトアミノ酸を置換すること（例えば、ＨＵＭＡＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（商標））を含む様々な方法によって達成することができる。本開示において、ヒト化抗体は、「ヒト化」抗体、「ベニア化」抗体、および「ＨＵＭＡＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ（商標）」抗体の両方を含むであろう。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５（１９８６）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１−６８５５（１９８４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９−２１７（１９９４）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａらの米国特許第５，７６６，８８６号、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４，１９９４、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６（１９９４）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７（１９８８）、ならびにＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４：７７３−７８３（１９９１）において開示されており、それらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤＲグラフト技術は当該技術分野で知られており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７を参照されたい。追加の抗体ヒト化方法は、Ｓａｆｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．２９：１７５−８６，２０１３に概説される。
【０１６１】
トランスジェニック動物からのヒト抗体
標的タンパク質に対するヒト抗体はまた、内因性免疫グロブリン産生を有さず、かつヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように操作されているトランスジェニック動物を使用して産生され得る。例えば、ＷＯ９８／２４８９３は、動物が内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の不活性化に起因して機能的内因性免疫グロブリンを産生しないヒトＩｇ遺伝子座を有する、トランスジェニック動物を開示する。ＷＯ９６／００９０６はまた、免疫原に対する免疫応答を高めることができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示し、抗体は霊長類定常および／または可変領域を有し、内因性免疫グロブリンコード遺伝子座は置換または不活性化される。ＷＯ９６／３０４９８および米国特許第６，０９１，００１号は、哺乳動物において免疫グロブリン遺伝子座を改変するための、例えば、定常または可変領域の全部または一部を置換して、改変抗体分子を形成するためのＣｒｅ／Ｌｏｘシステムの使用を開示する。ＷＯ９４／０２６０２は、不活性化内因性Ｉｇ遺伝子座および機能性ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示する。米国特許第５，９３９，５９８号は、マウスが内因性重鎖を欠き、１つまたは複数の異種の定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現する、トランスジェニックマウスを作製する方法を開示する。米国特許第６，１１４，５９８号、同第６，６５７，１０３号、および同第６，８３３，２６８号、Ｇｒｅｅｎ  ＬＬ，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１（１），７４−８４，２０１４、Ｌｅｅ  ＥＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２：３５６−３６３，２０１４、Ｌｅｅ  ＥＣ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎ  Ｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，９０１：１３７−４８，２０１２）もまた、参照されたい。
【０１６２】
上記のトランスジェニック動物を用いて、選択された抗原分子に免疫応答を生じさせることができ、抗体産生細胞を動物から取り出し、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用することができる。免疫化プロトコル、アジュバントなどは当該技術分野において既知であり、例えば、ＷＯ９６／３３７３５に記載されるようなトランスジェニックマウスの免疫化で使用される。この公開は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ヒトＣＤ４、Ｌセレクチン、ｇｐ３９、および破傷風毒素を含む様々な抗原分子に対するモノクローナル抗体を開示する。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物学的活性または生理学的効果を阻害または中和する能力について試験することができる。ＷＯ９６／３３７３５は、ＩＬ−８で免疫化したトランスジェニックマウスの免疫細胞由来のＩＬ−８に対するモノクローナル抗体が、好中球のＩＬ−８誘導性機能を遮断することを開示する。トランスジェニック動物を免疫化するのに使用される抗原に対して特異性を有するヒトモノクローナル抗体はまた、ＷＯ９６／３４０９６、および米国特許出願第２００３０１９４４０４号、および米国特許出願第２００３００３１６６７号に開示される。
【０１６３】
モノクローナル抗体を作製するのに有用な追加のトランスジェニック動物としては、ヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードする非再配列ヒト抗体遺伝子からの遺伝子配列を含む、Ｍｅｄａｒｅｘ  ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）（米国特許第５，７７０，４２９号およびＦｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６））に記載される）が挙げられる。ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）の免疫化は、標的タンパク質に対する完全ヒトモノクローナル抗体の産生を可能にする。
【０１６４】
また、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ４：９１−１０２（２００２））は、メガベースサイズセグメントのヒトＤＮＡを含み、ヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ）遺伝子座全体を組み込むトランスクロモマウス（ＴＣＭＯＵＳＥ（商標））を記載する。ＴＣＭＯＵＳＥ（商標）は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１−Ｇ４）の全てのサブクラスを含む、完全に多様なｈＩｇのレパートリーを有する。様々なヒト抗原を有するＴＣＭＯＵＳＥ（商標）の免疫化は、ヒト抗体を含む抗体応答を生じる。
【０１６５】
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）、および米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号、および米国特許出願公開第２００２０１９９２１３号もまた、参照されたい。米国特許公開第２００３００９２１２５号は、動物の免疫応答を所望のエピトープに偏らせるための方法を記載する。ヒト抗体はまた、インビトロで活性化されたＢ細胞によっても産生され得る（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照されたい）。
【０１６６】
ディスプレイ技術からのヒト抗体
組み換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製するための技術の開発、および繊維状バクテリオファージの表面上のコードされた抗体断片のディスプレイは、ヒト抗体を直接作製するための手段を提供している。ファージ技術によって産生される抗体は、細菌中で抗原結合断片−通常はＦｖまたはＦａｂ断片−として産生され、したがってエフェクター機能を欠く。エフェクター機能は２つの戦略のうちの１つによって導入することができ、断片は、例えば、哺乳動物細胞中での発現のための完全な抗体へと、あるいはエフェクター機能を誘導することができる第２の結合部位を有する二重特異性抗体断片へと操作することができる。
【０１６７】
例として、ファージディスプレイ技術において使用するための抗体のライブラリーを調製するための１つの方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を、標的抗原またはその抗原性部分で免疫化して免疫応答を生じさせる工程、免疫化動物由来の細胞を産生する抗体を抽出する工程、ＲＮＡを抽出された細胞から単離し、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを産生する工程、ｃＤＮＡを、プライマーを使用して増幅する工程、およびファージ上で抗体が発現するようにｃＤＮＡをファージディスプレイベクターに挿入するステップを含む。本開示の組み換え標的特異的抗体は、この方法で得ることができる。
【０１６８】
別の例では、抗体産生細胞を免疫化されていない動物から抽出し、ＲＮＡを抽出した細胞から単離して、逆転写し、プライマーを用いて増幅されたｃＤＮＡを産生し、抗体がファージ上で発現するようにファージディスプレイベクターに挿入することができる。ファージディスプレイプロセスは、繊維状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイ、および選択された抗原へのそれらの結合による、その後のファージの選択を通して、免疫選択を模倣する。あるそのような技術が、ＷＯ９９／１０４９４に記載され、そのようなアプローチを用いたＭＰＬおよびｍｓｋ受容体への高親和性および機能的アゴニスト抗体の単離を記載する。本開示の抗体は、ヒトリンパ球由来のｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡを使用して、調製された組み換えコンビナトリアル抗体ライブラリー、例えばｓｃＦｖまたはＦａｂファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって単離することができる。そのようなライブラリーを調製およびスクリーニングするための方法論は、当該技術分野において既知である。例えば、米国特許第５，９６９，１０８号を参照されたい。ファージディスプレイライブラリーを産生するための市販のキットがある（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ．ＴＭ．ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーを産生およびスクリーニングするのに使用され得る他の方法および試薬もまた存在する（例えば、Ｌａｄｎｅｒら米国特許第５，２２３，４０９号、ＫａｎｇらＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号、ＤｏｗｅｒらＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７２７１号、ＷｉｎｔｅｒらＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２０７９１号、ＭａｒｋｌａｎｄらＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１５６７９号、ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０１２８８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号、ＧａｒｒａｒｄらＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０９６９０号、Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２、Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８、Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０、Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７、およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ��（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２、およびＯｍｉｄｆａｒ＆Ｄａｎｅｓｈｐｏｕｒ，Ｅｘｐ．Ｏｐ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．１０：６５１−６６９，２０１５を参照されたい。
【０１６９】
一実施形態において、所望の特徴を有する標的抗原に特異的なヒト抗体を単離するために、ヒトＶＨおよびＶＬライブラリーをスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体断片を選択する。この方法において使用される抗体ライブラリーは、本明細書および当該技術分野において記載されるように調製およびスクリーニングされたｓｃＦｖライブラリーであり得る（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））、およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，（ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４（１９９３））。抗体ライブラリーは、好ましくは標的タンパク質を抗原として用いてスクリーニングされる。
【０１７０】
あるいは、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）を、別々にＰＣＲによってクローン化し、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリー中でランダムに組み換え、次に特定の抗原への結合のために選択することができる。Ｆａｂ断片はファージ表面上に発現され、すなわちそれらをコードする遺伝子に物理的に連結される。したがって、抗原結合によるＦａｂの選択は、Ｆａｂをコードする配列のために同時選択し、続いて増幅され得る。数回の抗原結合および再増幅（パンニングと呼ばれる手順）を通して、抗原に特異的なＦａｂが濃縮され、最後に単離される。
【０１７１】
１９９４年に、「ガイド選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる抗体のヒト化のためのアプローチが、記載された。ガイド選択は、マウスモノクローナル抗体のヒト化のためのファージディスプレイ技術の力を利用する（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，８９９−９０３（１９９４））を参照されたい）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片を、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて提示することができ、次いで得られたハイブリッドＦａｂライブラリーを抗原で選択することができる。それにより、マウスＦｄ断片は選択をガイドするためのテンプレートを提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖を、ヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わせる。得られたライブラリーの選択により、完全なヒトＦａｂを生じる。
【０１７２】
ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を誘導するための様々な手順が記載されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）、米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２，１７３−１８４（１９９４）を参照されたい）。特に、ファージディスプレイライブラリー由来の抗体のインビトロでの選択および進化は、強力なツールとなっている（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  ＢａｒｂａｓＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７，１９１−２８０（１９９４）、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３−４５５（１９９４）、米国特許公開第２００２０００４２１５号およびＷＯ９２／０１０４７、米国特許公開第２００３０１９０３１７号、ならびに米国特許第６，０５４，２８７号および同第５，８７７，２９３号を参照されたい。
【０１７３】
Ｆｖ断片は、ファージタンパク質融合物として発現される一本鎖と、可溶性断片として発現される相補性鎖と（例えば、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩと）の会合によって、ファージの表面に提示される。ファージは、クラスＩファージ：ｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、ＺＪ／Ｚ、Ｆｆのうちの１つ、およびクラスＩＩファージＸｆ、Ｐｆ１、およびＰｆ３のうちの１つなどの繊維状ファージであり得ることが企図される。ファージは、Ｍ１３、またはｆｄ、またはその誘導体であり得る。
【０１７４】
最初のヒトＶＬおよびＶＨセグメントが選択されると、選択されたＶＬおよびＶＨセグメントの異なる対を標的結合のためにスクリーニングする「混合および適合」実験により、好ましいＶＬ／ＶＨ対の組み合わせを選択する（例えば、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１１２０−１１１２３，１９９１）。加えて、抗体の質をさらに向上させるために、天然の免疫応答の間の抗体の親和性成熟に関与するインビボ体細胞変異プロセスに類似したプロセスにおいて、好ましいＶＬ／ＶＨ対のＶＬおよびＶＨセグメントを、好ましくはＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域のうちのいずれかの内でランダムに変異させることができる。このインビトロ親和性成熟は、それぞれ、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ＶＬおよびＶＨ領域を増幅することによって達成することができ、ランダム変異がＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３領域に導入されているＶＬおよびＶＨセグメントを、得られたＰＣＲ産物がコードするように、プライマーが、特定の位置にある４つのヌクレオチド塩基のランダム混合で「スパイクされ」ている。これらのランダムに変異したＶＬおよびＶＨセグメントは、標的抗原への結合のために再スクリーニングされ得る。
【０１７５】
組み換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーからの標的特異的抗体のスクリーニングおよび単離に続いて、選択された抗体をコードする核酸を、ディスプレイパッケージから（例えば、ファージゲノムから）回収し、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって他の発現ベクターにサブクローニングすることができる。望まれる場合、以下に記載されるように、核酸をさらに操作して、本開示の他の抗体形態を産生することができる。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離された組み換えヒト抗体を発現させるために、本明細書において記載されるように、抗体をコードするＤＮＡを組み換え発現ベクターにクローニングし、哺乳動物宿主細胞に導入する。
【０１７６】
ファージディスプレイ法は、細菌のミューテーター株または宿主細胞において実施され得ることが企図される。ミューテーター株は、その中で複製されるＤＮＡをその親ＤＮＡに関して変異させる遺伝的欠陥を有する、宿主細胞である。ミューテーター株の例は、ＮＲ９０４６ｍｕｔＤ５およびＮＲ９０４６  ｍｕｔ  Ｔ１である。
【０１７７】
ファージディスプレイ方法が、ヘルパーファージを用いて実施され得ることもまた企図される。これは、欠損ファージゲノムを含有する細胞に感染させるために使用され、欠損を補完するために機能するファージである。欠損ファージゲノムは、ファージミド、または遺伝子配列をコードするいくつかの機能が除去されたファージであり得る。ヘルパーファージの例は、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩ番号３、およびキャプシドタンパク質に融合した結合分子を提示またはコードするファージである。
【０１７８】
Ｈ鎖またはＬ鎖クローンのいずれかを含有する個々のコロニーを使用して、他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの、完全なライブラリーを感染させる、ＷＯ９２／０１０４７に開示されているような、階層デュアルコンビナトリアルアプローチを使用するファージディスプレイスクリーニング方法を介して、抗体が産生され、得られた二本鎖特異性結合メンバーは、そこに記載されているものなどのファージディスプレイ技術に従って選択される。この技術はまた、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））にも開示される。
【０１７９】
酵母、微生物、および哺乳動物細胞の表面にペプチドを提示する方法もまた、抗原特異的抗体を同定するために使用されてきた。例えば、米国特許第５，３４８，８６７号、同第５，７２３，２８７号、同第６，６９９，６５８号、Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：３９５−９９（２００１）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（１）４５−５２（２００３）、Ｓｕｒｇｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８：１６２２−５４（２００６）を参照されたい。抗体ライブラリーは、免疫系におけるＢ細胞による抗体の細胞表面ディスプレイを効果的に模倣して、凝集素などの酵母タンパク質に結合することができる。
【０１８０】
ファージディスプレイ法に加えて、抗体を、インビトロディスプレイ法、ならびにリボソームディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイを含む微生物細胞ディスプレイを用いて単離することができる（Ａｍｓｔｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４００−０５（２００１））。リボソームディスプレイを用いたポリペプチドの選択は、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：４９３７−４９４２（１９９７））、ならびにＫａｗａｓａｋｉに発行された米国特許第５，６４３，７６８号および同第５，６５８，７５４号に記載される。リボソームディスプレイはまた、抗体の迅速な大規模変異分析にも有用である。選択的変異誘発アプローチはまた、リボソームディスプレイ技術を用いて選択することができる改善された活性を有する抗体を、産生する方法を提供する。
【０１８１】
アミノ酸配列変異体
抗体の１、２、３、４、５、および／または６つのＣＤＲを含む改変ポリペプチド組成物を生成することができ、ＣＤＲは標的分子に対する増加した特異性または親和性を提供するように変更される。抗体ＣＤＲ内の部位は、典型的には、例えば、最初に保存的選択（例えば、同一でない疎水性アミノ酸に置換された疎水性アミノ酸）で置換し、次いでより異なる選択（例えば、荷電アミノ酸に置換された疎水性アミノ酸）で置換することによって連続的に改変され、次いで、標的部位に欠失または挿入を行うことができる。例えば、ＣＤＲを囲む保存されたフレームワーク配列を使用して、これらのコンセンサス配列に相補的なＰＣＲプライマーを生成して、プライマー領域間に位置する抗原特異的ＣＤＲ配列を増幅する。ヌクレオチドおよびポリペプチド配列をクローニングおよび発現するための技術は、当該技術分野で十分に確立されている［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照されたい］。増幅されたＣＤＲ配列を、適切なプラスミドに結紮する。１、２、３、４、５、および／または６つのクローン化ＣＤＲを含むプラスミドは任意で、ＣＤＲに結合した追加のポリペプチドコード領域を含有する。
【０１８２】
改変は、以下により詳細に記載される保存的または非保存的アミノ酸置換によって行うことができる。「挿入」または「欠失」は、好ましくは約１〜２０のアミノ酸、より好ましくは１〜１０のアミノ酸の範囲である。変異体は、組み換えＤＮＡ技術を用いて抗体ポリペプチド分子中のアミノ酸の置換を系統的に行い、活性のために得られた組み換え変異体をアッセイすることによって導入することができる。核酸変更は、異なる種からの核酸（可変位置）で、あるいは高度に保存された領域（定常領域）での異なる部位で行うことができる。本開示において有用な、抗体配列を変更し、抗体ポリペプチド組成物を発現させるための方法は、当該技術分野において記載される。例えば、米国特許第８，５６９，４６２号を参照されたい。
【０１８３】
本明細書中で使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の増加に関与する、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０１８４】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。超可変領域、またはＣＤＲ領域、またはフレームワーク領域のうちの任意の領域内で置換変異誘発が企図される。保存的置換は、アミノ酸をそのクラスの別のメンバーと置き換えることを含む。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと置き換えることを含む。
【０１８５】
保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行われる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、およびメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）が挙げられ、極性中性アミノ酸としては、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、およびグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）が挙げられ、正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）が挙げられ、負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）が挙げられる。
【０１８６】
抗体の適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、一般にセリンで置換され、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に付加し、その安定性を改善することができる（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
【０１８７】
変更されたグリコシル化
親抗体と比べて改変されたグリコシル化パターンを有する、例えば、抗体に見い出される１つまたは複数の炭水化物部分を削除し、かつ／あるいは抗体に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位を付加する、抗体変異体もまた産生することができる。
【０１８８】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が生じる。したがって、Ｎ結合型グリコシル化部位は、それがこれらのトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって、抗体に付加され得る。Ｏ−結合型グリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つをヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンに結合させることを指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る。Ｏ結合型グリコシル化部位は、元の抗体の配列に１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を挿入または置換することによって抗体に付加され得る。
【０１８９】
Ｆｃグリカンは、ＩｇＧのＦｃ受容体およびＣ１ｑへの結合に影響し、したがってＩｇＧエフェクター機能にとって重要である。改変Ｆｃグリカンおよび変更されたエフェクター機能を有する抗体変異体を、産生することができる。例えば、シアル酸、コアフコース、二分Ｎ−アセチルグルコサミン、およびマンノース残基などの改変された末端糖を有する抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体への変更された結合および変更されたＡＤＣＣ活性を有する可能性がある。さらなる例において、改変された末端ガラクトース残基を有する抗体は、Ｃ１ｑへの変更された結合および変更されたＣＤＣ活性を有する可能性がある（Ｒａｊｕ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４７１−７８，２００８）。
【０１９０】
本方法における使用のためにまた企図されるのは、ＡＤＣＣ活性の改善を呈する、フコシル化が存在しないか、あるいは減少した抗体分子である。これを達成するための様々な方法が、当該技術分野において既知である。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合によって媒介され、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７でのＮ−結合型グリコシル化の、炭水化物構造に依存することが示される。非フコシル化抗体はこの受容体に高い親和性で結合し、天然のフコシル化抗体よりも効率的にＦｃγＲＩＩＩ媒介エフェクター機能を誘導する。例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組み換え生産は、１００倍増加したＡＤＣＣ活性を有する抗体をもたらす（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４−２２（２００４））。フコシル化経路におけるこの酵素または他の酵素の活性を低下させることによって、例えば、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ処理、酵素をノックアウトするための細胞株の操作、または選択的グリコシル化阻害剤との培養を通して、同様の効果を達成できる（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１１１３−２３（１９８９））。いくつかの宿主細胞株、例えば、Ｌｅｃ１３またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、低いフコシル化レベルを有する抗体を天然に産生する。（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７７：２６７３３−４０（２００２）、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７８：３４６６−７３（２００３））。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞中で抗体を組み換え的に産生することによる、二分炭水化物の濃度の増加もまた、ＡＤＣＣ活性を増加させると決定されている（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−８０（１９９９））。２つのフコース残基のうちの１つのみしか存在しないことが、ＡＤＣＣ活性を増加させるのに十分であり得ると予測されている（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．９３：８５１−６１（２００６））。抗体のグリコシル化および方法は、Ｎｉｅｗａ  ａｎｄ  Ｓａｔｏｈ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０４：９３０−４１，２０１５に概説される。
【０１９１】
変更されたエフェクター機能を有する変異体
該方法に使用するための抗体の他の改変が企図される。一態様において、例えば、癌の治療における抗体の有効性を高めるために、エフェクター機能に関して本明細書において使用される抗体を改変することが望ましい場合がある。エフェクター機能を改変するための１つの方法は、システイン残基がＦｃ領域に導入され得、それによってこの領域内で鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることを教示する。このようにして産生されたホモ二量体抗体は、内在化能力の改善、および／または補体媒介性細胞死滅の増加、および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２））およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２））．Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３））に記載されているように、抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体抗体を、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、それによって増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９））を参照されたい。加えて、ＣＤＲ内の配列が抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させ、望まれないヘルパーＴ細胞応答を誘発し得ることが示されている。保存的置換は、抗体が結合活性を保持することを可能にし得るが、望まれないＴ細胞応答を誘発するその能力を失う。
【０１９２】
本開示の特定の実施形態において、例えば、治療効果を高めるために、無傷の抗体よりもむしろ抗体断片を使用することが望ましい場合がある。この場合、その血清半減期を増加させるために抗体断片を改変すること、例えば半減期を増加させるために、抗体断片に、多糖類ポリマーを含むＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーなどの分子を加えることが望ましい場合がある。
【０１９３】
サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループからの任意の１つもしくは複数のアミノ酸残基が、抗体断片の類似の位置に転移されている領域を構成する。さらにより好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループからの３つ以上の残基が転移される。さらにより好ましくは、エピトープは、（例えば、ＩｇＧの）Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取り出され、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、もしくはＶＨ領域、または２つ以上のそのような領域に転移される。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取り出され、抗体断片のＣＬ領域、もしくはＶＬ領域、または両方に転移される。
【０１９４】
したがって、本開示の抗体は、ジスルフィド結合に関与するシステインが改変または除去され、かつ／あるいはメチオニンがＮ末端に付加されている、かつ／あるいは１つまたは複数のＮ末端の２０個のアミノ酸が除去されている、かつ／あるいはＣ１ｑ結合部位などの補体と相互作用する領域が除去されている、かつ／あるいはＡＤＣＣ部位が除去されている、変異体を含む、Ｆｃサルベージ受容体と相互作用する能力を保持するヒトＦｃ部分、ヒトコンセンサスＦｃ部分、またはその変異体を含み得る［例えば、Ｓａｒｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：６３３−９（１９９２）を参照されたい］。
【０１９５】
Ｓｈｉｅｌｄｓらは、全てのヒトＦｃ受容体への結合に関与するＩｇＧ１残基がヒンジに近いＣＨ２ドメインに位置し、以下のように２つのカテゴリーに分類されることを報告した：１）全てのＦｃＲと直接相互作用する位置が、Ｌｅｕ２３４−Ｐｒｏ２３８、Ａｌａ３２７、およびＰｒｏ３２９（ならびに場合によりＡｓｐ２６５）を含む、２）炭水化物の性質または位置に影響する位置が、Ａｓｐ２６５およびＡｓｎ２９７を含む。Ｆｃ受容体ＩＩへの結合に影響を及ぼした追加のＩｇＧ１残基は以下の通りである：（最大の効果）Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｓｅｒ２６７、Ａｓｐ２７０、Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ２８０、Ａｒｇ２９２、Ｓｅｒ２９８、および（より少ない効果）Ｈｉｓ２６８、Ａｓｎ２７６、Ｈｉｓ２８５、Ａｓｎ２８６、Ｌｙｓ２９０、Ｇｌｎ２９５、Ａｒｇ３０１、Ｔｈｒ３０７、Ｌｅｕ３０９、Ａｓｎ３１５、Ｌｙｓ３２２、Ｌｙｓ３２６、Ｐｒｏ３３１、Ｓｅｒ３３７、Ａｌａ３３９、Ａｌａ３７８、およびＬｙｓ４１４。Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｓ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ、およびＤ２７０Ａは結合を減少させた。全てのＦｃＲのために上記で同定された残基に加えて、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡへの結合を４０％以上減少させた追加のＩｇＧ１残基は以下の通りである：Ｓｅｒ２３９、Ｓｅｒ２６７（Ｇｌｙのみ）、Ｈｉｓ２６８、Ｇｌｕ２９３、Ｇｌｎ２９５、Ｔｙｒ２９６、Ａｒｇ３０１、Ｖａｌ３０３、Ｌｙｓ３３８、およびＡｓｐ３７６。ＦｃＲＩＩＩＡへの結合を改善した変異体は、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、およびＡ３３９Ｔを含む。Ｌｙｓ４１４は、ＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＢへの結合の４０％の減少、Ａｒｇ４１６は、ＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＩＡに対して３０％の減少、Ｇｌｎ４１９は、ＦｃＲＩＩＡに対して３０％の減少およびＦｃＲＩＩＢに対して４０％の減少、Ｌｙｓ３６０は、ＦｃＲＩＩＩＡに対して２３％の改善を示した。特異的Ｆｃγ受容体（Ｒ）への結合のみを改善し、あるいは同時にある種類のＦｃγＲへの結合を改善し、かつ別の種類への結合を減少させる、ＩｇＧ１のＦｃ領域中のいくつかの位置が見出されたことを記載した、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８７−４９０，２００１）（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）も参照されたい。次いで、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合が改善された選択されたＩｇＧ１変異体を、インビトロ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイで試験し、末梢血単核細胞またはナチュラルキラー細胞のいずれかを用いた場合もＡＤＣＣの増強を示した。
【０１９６】
例えば、米国特許第６，１９４，５５１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、アミノ酸位置３２９、３３１、または３２２（Ｋａｂａｔ番号付けを使用）での（そのうちのいくつかはＣ１ｑ結合またはＣＤＣ活性の低下を提示する）、ヒトＩｇＧのＦｃ領域内での変異を含む変更されたエフェクター機能を有する変異体を記載する。別の例として、米国特許第６，７３７，０５６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、アミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、または４３９（Ｋａｂａｔ番号付けを使用）での（そのうちのいくつかは、低下したＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性に関連する受容体結合プロファイルを提示する）、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に変異を含む変更されたエフェクターまたはＦｃγ受容体結合を有する変異体を記載する。これらのうち、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、３２７または３２９での変異は、ＦｃＲＩへの結合を低下させると述べられており、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８、または４３９での変異は、ＦｃＲＩＩへの結合を低下させると述べられており、アミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５、または４３７での変異は、ＦｃＲＩＩＩへの結合を低下させると述べられている。
【０１９７】
米国特許第５，６２４，８２１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、マウス抗体のＣ１ｑ結合活性を、重鎖のアミノ酸の３１８、３２０、または３２２位の残基を変異させることによって変更することができ、２９７位の残基（Ａｓｎ）を置き換えることが溶解活性の除去をもたらすことを報告する。
【０１９８】
米国特許公開第２００４０１３２１０１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、アミノ酸位置２４０、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６６、２９９、３１３、３２５、３２８、もしくは３３２（Ｋａｂａｔ番号付けを使用）、または位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、もしくは３３２（Ｋａｂａｔ番号付けを使用）に変異を有する変異体を記載する（そのうちの位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、または３３２は、ＡＤＣＣ活性を低下させるか、またはＦｃγ受容体への結合を低下させ得る）。
【０１９９】
共有結合改変
共有結合改変を含む抗体もまた、本方法における使用のために企図される。適用可能であれば、それらは化学合成によって、または抗体の酵素的もしくは化学的開裂によって作製することができる。抗体の他の種類の共有結合改変は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と、反応させることによって分子に導入される。
【０２００】
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。
【０２０１】
他の改変としては、プロリンおよびリジンのヒスチジル、リジニルアルギニル、チロシル、グルタミニル、およびアスパラギニルヒドロキシル化が含まれる。そのような改変を行うための方法は、米国特許第８，９２６，９７６号（参照により本明細書に組み込まれる）および当該技術分野に開示されている。
【０２０２】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）はカルボジイミド（Ｒ−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に改変され、ＲおよびＲ’が、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどの異なるアルキル基である。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０２０３】
他の改変としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０２０４】
別の種類の共有結合改変は、グリコシドを抗体に化学的または酵素的に連結することに関与する。これらの手順は、それらがＮまたはＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞内の抗体の産生を必要としないという点で有利である。使用される連結モードに応じて、糖は（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０、ならびにＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，（ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１））に記載される。
【０２０５】
抗体上に存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物への抗体の曝露を必要とする。この処理は、抗体を無傷のままにしながら、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたは全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７））およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１））によって記載される。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７））によって記載されるように、種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成することができる。
【０２０６】
抗体の別の種類の共有結合改変は、種々の非タンパク質ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、またはデキストランなどの多糖類ポリマーのうちの１つに抗体を結合することを含む。そのような方法は当該技術分野において既知である。
【０２０７】
誘導体
上述のように、誘導体は、抗体物質およびポリペプチドと関連して使用される場合、ユビキチン化、治療薬または診断薬への結合、標識（例えば、放射性核種または種々の酵素による）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールを用いた誘導体化）などの共有ポリマー結合、およびオルニチンなどのアミノ酸の化学合成による挿入または置換などの技術によって化学的に改変されたポリペプチドを指す。本明細書に開示される抗体の誘導体もまた、治療薬として有用であり、本明細書の方法に使用することができる。
【０２０８】
コンジュゲート部分は、共有結合的に、あるいはイオン結合、ファンデルワールス結合、または水素結合、例えば、ストレプトアビジンによって認識される放射性ヌクレオチドもしくはビオチン化ヌクレオチドの組み込みを介してのいずれかで、抗体物質に組み込まれるか、あるいは結合され得る。
【０２０９】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を抗体物質に結合させ、インビボでより長い半減期を提供することができる。ＰＥＧ基は、任意の都合のよい分子量のものであり得、直鎖状または分岐状であり得る。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（「ｋＤ」）〜約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲になるであろう。ＰＥＧ基は、一般的に、ＰＥＧ部分上の天然または操作反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）から抗体物質（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）上の反応基までの、アシル化または還元的アルキル化を介して本開示の抗体物質に結合する。抗体物質へのＰＥＧ部分の付加は、当該技術分野において周知の技術を用いて実施することができる。例えば、国際特許公開第ＷＯ９６／１１９５３号および米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい。
【０２１０】
抗体物質とＰＥＧとの結紮は、通常水相で行われ、逆相分析ＨＰＬＣにより容易にモニターすることができる。ＰＥＧ化物質は分取ＨＰＬＣにより精製され、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、およびレーザー脱離質量分析によって特徴付けられる。
【０２１１】
抗体コンジュゲート
抗体は、その「裸の」または非コンジュゲート形態で投与することができ、あるいは他の治療薬または診断薬に直接コンジュゲートすることができ、あるいはそのような他の治療薬または診断薬を含む担体ポリマーに間接的にコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態において、抗体は、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物由来の酵素活性毒素、またはそれらの断片）などの細胞傷害剤、あるいは放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）にコンジュゲートされる。適切な化学療法剤としては、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびビンデシンが挙げられる（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）ｓｕｐｒａ）。適切な毒素としては、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−８１（２０００）、Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８（２０００）、Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１３．７８６−９１（２００２））、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−２３（１９９６））、オーリスタチン（Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：７７８−８４（２００３）、およびカリケアミシン（Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８（１９９８）、Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３））などの小分子毒素が挙げられる。抗体薬物コンジュゲートおよび方法は、Ｄｕｃｒｙ  Ｌ，ｍＡｂｓ．６（１），２０１４およびＳｈｅｎ  ＷＣ，ＡＡＰＳ．，１７：３−７（２０１５）に概説される。
【０２１２】
抗体は、放射性同位体、親和性標識（ビオチン、アビジンなど）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識または発光標識または生物発光標識（ＦＩＴＣもしくはローダミンなど）、常磁性原子などの使用を通して検出可能に標識できる。そのような標識を達成するための手順は当該技術分野において周知であり、例えば、（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）、Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）、Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））を参照されたい。
【０２１３】
抗体部分のコンジュゲーションは、米国特許第６，３０６，３９３号に記載される。一般的な技術はまた、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２−８３９（１９８８）、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１−１１０６（１９９０）、およびＳｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，０５７，３１３号に記載される。この一般的な方法は、酸化炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、複数の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素添加物、または他の治療剤を担持する担体ポリマーと反応させることを含む。この反応は、最初のシッフ塩基（イミン）結合をもたらし、第二級アミンへの還元によって安定化されて最終的なコンジュゲートを形成することができる。
【０２１４】
担体ポリマーは、例えば、アミノデキストランまたは少なくとも５０アミノ酸残基のポリペプチドであり得る。薬物または他の薬剤を担体ポリマーにコンジュゲートするための様々な技術が、当該技術分野において既知である。アミノデキストランの代わりにポリペプチド担体を使用することができるが、ポリペプチド担体は、鎖中に少なくとも５０のアミノ酸残基、好ましくは１００〜５０００のアミノ酸残基を有するべきである。少なくともいくつかのアミノ酸は、リジン残基、またはグルタメートもしくはアスパラギン酸残基であるべきである。リジン残基のペンダントアミン、ならびにグルタミンおよびアスパラギン酸のペンダントカルボキシレートは、薬物、毒素、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素付加物、または他の治療薬を結合するのに便利である。適切なポリペプチド担体の例としては、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー、およびこれらのアミノ酸の混合ポリマー、ならびに他、例えば、得られる担持担体およびコンジュゲートに望ましい溶解特性を付与するためのセリンが挙げられる。抗体をコンジュゲートすることができる薬剤の例としては、本明細書において記載される細胞傷害剤または化学療法剤のいずれかが含まれる。
【０２１５】
あるいは、コンジュゲート抗体は、抗体成分を治療薬と直接コンジュゲートさせることによって調製することができる。一般的な手順は、治療薬を酸化抗体成分に直接結合させることを除いて、コンジュゲーションの間接的な方法に類似している。例えば、抗体の炭水化物部分は、半減期を延長するためにポリエチレングリコールに結合することができる。
【０２１６】
あるいは、治療薬は、ジスルフィド結合形成を介して、あるいはＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などのヘテロ二官能性架橋剤を使用して、還元抗体成分のヒンジ領域に結合させることができる（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２４４（１９９４））。そのようなコンジュゲーションのための一般的な技術は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）、Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ１８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）、Ｐｒｉｃｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照されたい。Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの、様々な二官能性タンパク質カップリング剤が当該技術分野において既知である。
【０２１７】
抗体融合タンパク質
組み換え分子が１つまたは複数の抗体成分および毒素または化学療法剤を含む抗体毒素融合タンパク質を作製する方法もまた、当業者に既知である。例えば、抗体シュードモナス外毒素Ａ融合タンパク質は、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４（１９８９）、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８６１６（１９９１）、Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５８６７（１９９２），Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３０５４（１９９３）、Ｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６０：１３７（１９９５）、Ｆｏｍｉｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０５６０（１９９６）、Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：２８７２（１９９６）、およびＳｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６５：５３８（１９９６）に記載される。ジフテリア毒素部分を含有する抗体毒素融合タンパク質は、Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：５５３（１９９３）、Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５３０２（１９９３）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８０３７（１９９５）、およびＶａｌｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８８：２３４２（１９９６）に記載される。Ｄｅｏｎａｒａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  １：１７７（１９９５）は、ＲＮａｓｅ部分を有する抗体毒素融合タンパク質を記載しており、一方、Ｌｉｎａｒｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２４３（１９９４））は、ＤＮａｓｅ  Ｉ成分を含む抗体毒素融合タンパク質を生成した。ゲロニンをＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０９ｔｈ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｎａｈｅｉｍ，ＣＡ，Ａｐｒ．２−６，１９９５，Ｐａｒｔ  １，ＢＩＯＴ００５の抗体毒素融合タンパク質中の毒素部分として使用した。さらなる例として、Ｄｏｈｌｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８９４５（１９９４））は、ブドウ球菌エンテロトキシンＡを含む抗体毒素融合タンパク質を報告した。
【０２１８】
そのような融合タンパク質の調製に適切に用いられる毒素の例示は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素である。例えば、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４７：６４１（１９８６）、およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−−Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４４：４３（１９９４）を参照されたい。他の適切な毒素は、当業者に既知である。
【０２１９】
本開示の抗体はまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照されたい）を活性抗癌薬に変換するプロドラッグ活性化酵素に、抗体をコンジュゲートすることによってＡＤＥＰＴで使用され得る。例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。
【０２２０】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分としては、プロドラッグをより活性なその細胞傷害性形態に変換するような方法で、プロドラッグに作用することができる任意の酵素を含む。
【０２２１】
本開示に有用な酵素としては、リン酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ、サルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ、無毒の５−フルオロシトシンを抗癌剤に変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ、５−フルオロウラシル、ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、ズブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、ならびにカテプシン（カテプシンＢおよびＬなど）などのプロテアーゼ、Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ、グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なα−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなどの炭水化物切断酵素、β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ、かつアミン窒素においてフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基でそれぞれ誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、当該技術分野ではアブザイムとしても知られている酵素活性を有する抗体を使用して、本開示のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照されたい。抗体アブザイムコンジュゲートは、アブザイムの腫瘍細胞集団への送達に関して本明細書において記載されるように調製することができる。
【０２２２】
上記の酵素は、上記のヘテロ二官能性架橋試薬の使用などの、当該技術分野において周知の技術によって抗体に共有結合させることができる。あるいは、本開示の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結した、本開示の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当該技術分野において周知の組み換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照されたい）。
【０２２３】
抗体の組み換え生産
本明細書において記載される抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）単離および配列決定し得る。通常これは、抗体をコードするＤＮＡまたは好ましくはｍＲＮＡ（すなわちｃＤＮＡ）のクローニングを必要とする。クローニングおよび配列決定は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的な技術を使用して実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９４）を参照されたい）（参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２２４】
配列決定は、標準的な技術を用いて行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ａｎｄ  Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７を参照されたい（参照により本明細書に組み込まれる））。クローン化された核酸の配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの公表されている配列と比較することによって、当業者は、配列決定された領域に応じて、（ｉ）免疫グロブリンポリペプチドの生殖系列セグメントの使用（重鎖のアイソタイプを含む）、および（ｉｉ）重鎖および軽鎖可変領域の配列（Ｎ領域付加および体細胞変異のプロセスから生じる配列を含む）を容易に決定できる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの情報源は、メリーランド州ベセスダ、国立衛生研究所、国立医学図書館の国立生物光学情報センターである。
【０２２５】
単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、次いでこれを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞（例えば、２９３Ｅ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を他の方法で産生しないミエローマ細胞などの宿主細胞にトランスフェクトし、組み換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成することができる。抗体の組み換え産生は当該技術分野において周知である。
【０２２６】
代替の実施形態において、目的の免疫グロブリンのアミノ酸配列は、直接タンパク質配列決定によって決定され得る。適切なコードヌクレオチド配列は、ユニバーサルコドン表に従って設計することができる。
【０２２７】
抗体の組み換え生産のために、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離され配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は、一般的に、以下のもののうちの１つまたは複数を含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列（当該技術分野において既知であり記載されている）。
【０２２８】
本明細書中のベクター中でＤＮＡをクローニングまたは発現するための適切な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、または高等真核生物細胞である。この目的に適した原核生物としては、真正細菌、例えば、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば腸内細菌科、例えば、エシェリキア属、例えば大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属、例えばセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびシゲラ属、ならびにバチルス属、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日に公開された、ＤＤ２６６，７１０に開示されるＢ．リケニフォルミス４１頁）、シュードモナス属、例えば緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ならびにストレプトミセス属が挙げられる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）のような他の株も適している。これらの例は、限定的ではなく例示的である。
【０２２９】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌などの真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母は、低級真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、多数の他の属、種、および株が本明細書において一般に入手可能であり、有用であり、例えば、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス宿主、例えばＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウイッケルハミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルティイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィララム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびＫ．マルキシアナス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ヤロウィア（ＥＰ４０２，２２６）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｓ）（ＥＰ１８３，０７０）、カンジダ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４，２３４）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ならびにＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス宿主などの糸状菌である。
【０２３０】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（幼虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの宿主からの、多数のバキュロウイルス株および変異体ならびに対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばキンウワバ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株、ならびにそのようなウイルスが、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、本開示に従って、本明細書においてウイルスとして使用され得る。
【０２３１】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、タバコ、レムナ、および他の植物細胞の植物細胞培養物も宿主として利用することができる。
【０２３２】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系、ヒト胎児腎臓系（懸濁培養中で増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）、ベイビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ、（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１，１９８０）、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝細胞癌細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２３３】
宿主細胞を、抗体産生のために上記の発現またはクローニングベクターで形質転換またはトランスフェクトし、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地中で培養する。加えて、選択マーカーによって分離された複数コピーの転写単位を有する新規ベクターおよびトランスフェクト細胞株は、標的に結合する抗体の発現に特に有用であり好ましい。
【０２３４】
組み換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内で、ペリプラズム空間で産生されるか、あるいは微生物培養物を含む培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１工程として、宿主細胞または溶解断片のいずれかである粒状デブリが、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−４３，１９８８；ＩＣＳＵ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １０：１０５（１９９０）、およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４５７−４６１（１９９３））は、大腸菌の周辺腔に分泌される抗体を単離する手順を記載している。また、（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））も参照されたい。
【０２３５】
あるいは、抗体を、原核生物または真核生物のインビトロ翻訳を用いて無細胞系で合成することができる（Ｓｔｅｃｈ  ａｎｄ  Ｋｕｂｉｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ４：１２−３３，２０１５を参照されたい）。
【０２３６】
抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーカチオンまたはトリ交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３，１９８３）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合しているマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成され得るよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）は精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）上のクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニア沈殿などのタンパク質精製のための他の技術もまた、回収する抗体によっては利用可能である。
【０２３７】
スクリーニング方法
有効な治療法は、有意な毒性を欠く有効な薬剤の同定に依存する抗体は、当該技術分野で既知の方法によって結合親和性についてスクリーニングされ得る。例えば、ゲルシフトアッセイ、ウエスタンブロット、放射能標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる共分画、共沈、架橋、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、ＫｉｎＥｘＡなどを使用することができ、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（本明細書にその全体が参考として組み込まれる）に記載されている。
【０２３８】
抗ＰＴＨ１Ｒ化合物の中和生物学的活性を評価するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、国際特許出願第ＷＯ２００４／０７３５８７号、Ｈａｒａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｏｒａｌ  Ｄｉｓ．１３（１）：２３−３１を参照されたい。
【０２３９】
ＰＴＨ１Ｒの生物学的活性および中和を評価するための追加の方法（例えば、ＰＴＨ１Ｒ抗体による）は当該技術分野において既知である。例えば、中和は、中和アッセイによって測定することができ、ＩＣ５０値として表すことができる。ＩＣ５０値は、第２の分子の最大の生物学的応答または細胞活性の半分の阻害を引き出すのに必要な分子の濃度を決定することによって、所与の分子について計算することができる。ＩＣ５０が低いほど、所望のタンパク質活性を阻害する分子の効力が高い。
【０２４０】
併用療法
本開示のＰＴＨ１Ｒ抗体は、第２の薬剤とともに投与され得、組み合わせは、本明細書中において記載されるような疾患または障害を処置するために有用であり得る。ＰＴＨ１Ｒに対する抗体を使用する場合、１つより多いＰＴＨ１Ｒ抗体がそれぞれの標的抗原への結合に有効である場合、抗体の組み合わせが、ＰＴＨ１Ｒの阻害剤で治療される状態または障害に対して、なおさらに改善された有効性を提供するように、標的抗原の異なるエピトープに対する２つ以上の抗体を混合することが企図される。本発明の１つまたは複数の抗体を含む組成物は、標的ポリペプチドＰＴＨ１Ｒに関連する状態もしくは障害に罹患しているか、または罹患する傾向がある、あるいはＰＴＨもしくはＰＴＨｒＰの活性をＰＴＨ１Ｒによって遮断することによって改善されるであろう、人または哺乳動物に投与され得る。
【０２４１】
２つの治療剤の同時投与は、薬剤がそれらの治療効果を発揮している期間に重複がある限り、薬剤を同時にまたは同じ経路で投与する必要はない。異なる日数または週数での投与と同様に、同時または連続投与が考えられる。
【０２４２】
あるいは、第２の薬剤は、サイトカイン、成長因子、阻害剤および他の標的抗原に対する抗体などの他の治療剤であり得る。
【０２４３】
本開示の治療薬は、同じ製剤中で同時に与えられてもよいと企図される。薬剤は別々の製剤で投与され、同時に投与され、同時に３０分以内に投与される薬剤を指すことがさらに企図される。第２の薬剤を同時に投与することができることがさらに企図される。
【０２４４】
別の態様において、ＰＴＨ１Ｒに対する抗体は、他の組成物の投与前に投与される。事前投与とは、他の薬剤による治療の１週間前から他の薬剤の投与の最大３０分前の範囲内の抗体の投与を指す。薬剤は、別の組成物または薬剤の投与に続いて投与されることがさらに企図される。その後の投与は、抗体治療後３０分から抗体投与後最大１週間の投与を説明することを意味する。ＰＴＨ１Ｒ抗体の投与の前または後に、第２の薬剤をこの様式で投与することができることがさらに企図される。
【０２４５】
適切な場合には、他の補助療法を施すことができるとさらに企図される。例えば、必要に応じて、患者に外科療法、化学療法、細胞傷害剤、光線力学療法または放射線療法を施すこともできる。
【０２４６】
本明細書の治療薬が第２の薬剤と組み合わせて投与される場合、例えば、第２の薬剤がサイトカインもしくは成長因子、または化学療法剤である場合、投与は放射線療法剤または放射線療法の使用も含むことがさらに企図される。抗体組成物と組み合わせて投与される放射線療法は、治療する内科医によって決定される通りに、癌の治療を受けている患者に典型的に与えられる線量で投与される。
【０２４７】
細胞傷害剤は、細胞の機能を阻害または防止し、かつ／あるいは細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、およびＲｅ１８６）、化学療法剤、ならびに細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素などの毒素または合成毒素、あるいはそれらの断片を含むものとする。非細胞傷害性薬剤は、細胞の機能を阻害または防止しない、かつ／あるいは細胞の破壊を引き起こさない物質を指す。非細胞傷害性剤は、細胞傷害性になるように活性化され得る薬剤を含み得る。非細胞傷害剤は、ビーズ、リポソーム、マトリックスまたは粒子を含み得る（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許公開第２００３／００２８０７１号および同第２００３／００３２９９５号を参照されたい）。そのような薬剤は、本開示に従う抗体とコンジュゲート、結合、連結または会合していてもよい。
【０２４８】
一実施形態において、第２の薬剤はデノスマブ（Ｘｇｅｖａ（登録商標）、Ｐｒｏｌｉａ（登録商標））である。他の実施形態において、第２の薬剤はビスホスホネート（例えば、ゾレドロン酸）である。他の実施形態において、第２の薬剤はカルシトニンである。
【０２４９】
本開示の抗体とともに使用することが企図される化学療法剤および他の薬剤としては、表１に列挙されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５０】
（表１）
2019526244.tif 000002
2019526244.tif 000003
表１：本開示の抗体とともに使用することが企図される化学療法剤および他の薬剤
【０２５１】
障害の治療
別の実施形態において、本明細書において記載される任意の種類の抗体を方法に使用することができる。例示的な実施形態において、標的特異的抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の例示的な実施形態において、標的はヒトであり、患者はヒト患者である。あるいは、患者は、特異的抗体が交差反応する標的タンパク質を発現する哺乳動物であり得る。抗体は、獣医学的目的のためにまたはヒト疾患の動物モデルとして、抗体が交差反応する標的タンパク質（例えば、霊長類）を発現する非ヒト哺乳動物に投与することができる。
【０２５２】
一実施形態において、本開示は、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰタンパク質発現の増加に関連する高カルシウム血症を治療するための方法であって、その必要がある対象に、治療有効量のＰＴＨ１Ｒ抗体または本明細書において企図される薬学的組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０２５３】
別の実施形態において、本開示は、副甲状腺ホルモン発現の増加、副甲状腺ホルモン関連タンパク質の発現の増加、またはＰＴＨ１Ｒ発現の増加に関連する疾患、状態、または障害を治療するための方法であって、その必要がある対象に、本明細書において企図される抗体または薬学的組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【０２５４】
別の実施形態において、本開示は、癌、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ誘導性高カルシウム血症、悪性腫瘍随伴体液性高カルシウム血症（ＨＨＭ）、家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症、結核、サルコイドーシス、原発性副甲状腺機能亢進症（ＰＨＰＴ）、二次性副甲状腺機能亢進症（ＳＨＰＴ）、および悪液質からなる群から選択される疾患、状態、または障害を治療するための方法を提供する。
【０２５５】
様々な実施形態において、本明細書で企図される抗体または薬学的組成物の治療有効量を、その必要がある対象に投与することは、高カルシウム血症の１つまたは複数の症状を改善する。
【０２５６】
様々な実施形態において、治療有効量の抗体または本明細書において企図される薬学的組成物を、その必要がある対象に投与することは、ＰＴＨｒＰ誘導性ＨＨＭにおける消耗症候群、低カルシウム血症によるＨＨＭ生存の延長および／または消耗症候群を含む１つまたは複数の症状を改善する。ＰＴＨｒＰおよびＰＴＨ１Ｒは、乳癌および胃癌の進行に関係している（Ｈｏｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８８（４）：５６７−５７３、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３２（３）：３９６−４００）。さらには、乳房腫瘍細胞におけるＰＴＨｒＰおよびＰＴＨ１Ｒの過剰発現は、自己分泌様式でそれらの増殖を刺激することによって骨格転移におけるそのような細胞の増殖を促進することが示されている（Ｈｏｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８８（４）：５６７−５７３）。
【０２５７】
一実施形態において、本開示は、癌を治療するまたは癌の再発を予防するための方法であって、その必要がある対象に、本明細書において企図される治療有効量のＰＴＨ１Ｒ抗体または薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０２５８】
本開示の抗体で治療することができる例示的な状態または障害は、骨癌、肺癌、肝細胞癌、膵臓癌、腎臓癌、線維性癌、乳癌、骨髄腫、扁平上皮癌、結腸直腸癌および前立腺癌からなる群から選択される癌などの癌を含む。関連する態様において、癌は転移性である。関連する態様において、転移は、骨もしくは骨格組織、肝臓、肺、腎臓、または膵臓への転移を含む。本明細書中の方法は、対象における腫瘍サイズまたは腫瘍量を減少させ、かつ／あるいは対象における転移を減少させると企図される。様々な実施形態において、本方法は腫瘍サイズを１０％、２０％、３０％以上減少させる。様々な実施形態において、本方法は腫瘍サイズを１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少させる。
【０２５９】
一実施形態において、該治療を必要とする動物における癌の治療は、有効量のＰＴＨ１Ｒの抗体または本明細書において記載される抗体を含む組成物を動物に投与することを含む。
【０２６０】
本開示の方法によって治療可能な状態は、好ましくは哺乳動物に起こる。哺乳動物は、例えば、ヒトおよび他の霊長類、ならびにイヌおよびネコなどのペットまたはコンパニオン動物、ラット、マウス、およびウサギなどの実験動物、ならびにウマ、ブタ、ヒツジ、およびウシなどの家畜を含む。
【０２６１】
薬学的組成物の製剤
本開示の抗体をヒトまたは試験動物に投与するために、１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む組成物中に抗体を処方することが好ましい。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、以下に記載されるように、当該技術分野において周知の経路を用いて投与された場合に、アレルギーまたは他の有害反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
【０２６２】
加えて、化合物は、水または一般的な有機溶媒で溶媒和物を形成してもよい。そのような溶媒和物もまた企図される。
【０２６３】
抗体は、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、および鼻腔内投与を含む任意の適切な手段によって、かつ局所治療のために望まれる場合には病巣内投与によって投与される。非経口注入としては、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮内投与または皮下投与が挙げられる。加えて、抗体は、特に抗体の投与量を減らしながら、パルス注入によって適切に投与され得る。好ましくは、投与は、投与が短時間であるか慢性であるかに部分的に依存して、注射、最も好ましくは静脈内、筋肉内または皮下注射によって与えられる。局所投与、特に経皮投与、経粘膜投与、直腸投与、経口投与、または例えば、所望の部位の近くに配置されたカテーテルを介した局所投与を含む、他の投与方法も企図される。
【０２６４】
本明細書において記載される抗体を有効成分として含有する本開示の薬学的組成物は、投与経路に応じて薬学的に許容される担体または添加剤を含有してもよい。このような担体または添加剤の例としては、水、薬学的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、薬学的に許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加剤は、本開示の剤形に応じて、必要に応じて、上記またはそれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。
【０２６５】
薬学的組成物の製剤は、選択された投与経路（例えば、液剤、エマルジョン）に従って変わるであろう。投与される抗体を含む適切な組成物は、生理学的に許容されるビヒクルまたは担体中に投与することができる。溶液またはエマルジョンの場合、適切な担体には、例えば、水溶液またはアルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液（食塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液または不揮発性油が挙げられ得る。静脈内ビヒクルとしては、種々の添加剤、保存剤、または流体、栄養素または電解質補給剤を挙げることができる。
【０２６６】
様々な水性担体、例えば、滅菌リン酸緩衝食塩水、静菌水、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなど、かつ穏やかな化学的改変などを施した、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの安定性を高めるための他のタンパク質が挙げることができる。
【０２６７】
抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって保存用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに無毒であり、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェニル、ブチル、またはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、ならびにグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２６８】
本明細書の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な場合には１つより多い活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。そのような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２６９】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、あるいは界面重合によって、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース、またはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルまたはマイクロエマルジョンに封入され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示される。
【０２７０】
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０２７１】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合して活性化合物を含有し得る。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴムであり、分散剤または湿潤剤は、天然発生するホスファチド、例えば、レシチン、もしくはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアレート、もしくはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチルエンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと、脂肪酸から誘導された部分エステルと、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどのヘキシトルとの縮合生成物、またはエチレンオキシドと、脂肪酸から誘導された部分エステルと、ヘキシトル無水物との縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。水性懸濁液は、１つまたは複数の防腐剤、例えば、エチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエートも含有し得る。
【０２７２】
本明細書においてに記載される抗体は、保存のために凍結乾燥され得、使用前に適切な担体中で再構成され得る。この技術は、従来の免疫グロブリンに有効であることが示されている。任意の適切な凍結乾燥および再構成技術が使用され得る。凍結乾燥および再構成が様々な程度の抗体活性の喪失をもたらし得ること、かつ使用レベルを補うために調整する必要があり得ることが当業者には理解されよう。
【０２７３】
本明細書において記載されるＰＴＨ１Ｒ抗体は、１つまたは複数の追加の抗体との共製剤として調製および投与することができる。一態様において、抗体のうちの少なくとも２つが、異なる抗原を認識し、結合する。別の態様において、複数の抗体のうちの少なくとも２つは、同じ抗原の異なるエピトープを特異的に認識して結合することができる。
【０２７４】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つまたは複数の防腐剤と混合した活性化合物を提供する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、既に上で述べたものによって例示されている。
【０２７５】
これらの製剤中の抗体の濃度は、例えば、約０．５重量％未満、通常約１重量％または少なくとも約１重量％〜約１５重量％または２０重量％まで幅広く変動することができ、選択された特定の投与様式に従って、主に流体容量、粘度などに基づいて選択される。したがって、非経口注射用の典型的な薬学的組成物は、１ｍｌの無菌緩衝水、および５０ｍｇの抗体を含有するように調製することができる。静脈内注入用の典型的な組成物は、２５０ｍｌの滅菌リンゲル液、および１５０ｍｇの抗体を含有するように調製することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に既知であるか、あるいは明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）により詳細に記載されている。抗体の有効投与量は、１回の投与につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲内である。
【０２７６】
薬学的組成物は、無菌注射用水性、油性懸濁液、分散液、または無菌注射用溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末の形態であり得る。懸濁液は、上記の適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、既知の技術に従って処方することができる。無菌注射剤調製は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、植物油、リンガー溶液、および塩化ナトリウム等張液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製の用途を見出す。
【０２７７】
全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射針貫通が存在する程度に流動性でなければならない。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒径の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持され得る。これは、製造および保管条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保護されなければならない。微生物の作用の保護は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗細菌剤および抗真菌剤によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが望ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【０２７８】
投与に有用な組成物は、それらの効力を増大させるために、取り込みまたは吸収促進剤とともに処方され得る。そのような促進剤としては、例えば、サリチレート、グリココール酸／リノール酸、グリコール酸、アプロチニン、バシトラシン、ＳＤＳ、カプリン酸などが挙げられる。例えば、Ｆｉｘ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８５：１２８２−１２８５（１９９６））およびＯｌｉｙａｉ  ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌａ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：５２１−５４４（１９９３））を参照されたい。
【０２７９】
標的のその同族の受容体またはリガンドへの結合、標的媒介シグナル伝達などを含む、標的活性を阻害するための使用が企図される抗体組成物。特に、組成物は、実質的に副作用がない濃度で阻害特性を示し、したがって長期治療プロトコルに有用である。例えば、抗体組成物と別のより毒性の強い細胞傷害性薬剤との同時投与は、治療されている状態または障害の有益な阻害を達成しながら、患者における毒性の副作用を効果的に軽減することができる。
【０２８０】
加えて、本開示での使用が企図される組成物の親水性および疎水性の特性は、バランスがとれており、それによってインビトロおよび特にインビボでの使用の両方でのそれらの有用性を促進するが、そのようなバランスを欠く他の組成物は実質的に有用性が低い。具体的には、本開示での使用が企図される組成物は、体内での吸収および生物学的利用能を可能にする水性媒体中で、溶解度の適切な程度を有し、一方で、化合物が細胞膜を作用の推定上の部位へと横断することを可能にする、脂質内での溶解度の程度を有する。したがって、企図される抗体組成物は、それらが標的抗原活性の部位に送達され得る場合に最も有効である。
【０２８１】
投与と投与法
一態様において、本開示の方法は、薬学的組成物を投与するステップを含む。特定の実施形態において、薬学的組成物は無菌組成物である。
【０２８２】
本開示の方法は、注射、経口摂取、鼻腔内、局所、経皮、非経口、吸入スプレー、膣内、または直腸内投与を含むがこれらに限定されない、治療薬を哺乳動物対象に直接または間接的に導入するための任意の医学的に許容される手段を用いて実施される。本明細書において使用される非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、および嚢内注射、ならびにカテーテルまたは注入技術を含む。特定の部位への皮内、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後注射、肺内注射および／または外科的移植による投与も、同様に企図される。
【０２８３】
一実施形態において、投与は、その部位への直接注射によるか、または製剤を内部に送達することができる持続送達または持続放出機構を介して、治療を必要とする癌または罹患組織の部位で実施される。例えば、生分解性ミクロスフェア、またはカプセル、または組成物（例えば、可溶性ポリペプチド、抗体、または小分子）の持続送達が可能な他の生分解性ポリマー構成は、癌の近くまたは癌の部位に埋め込まれる本開示の製剤に含まれ得る。
【０２８４】
治療用組成物はまた、複数の部位で患者に送達され得る。複数回投与は、同時に行われてもよく、あるいはある期間にわたって投与されてもよい。ある場合には、治療用組成物の連続的な流れを提供することが有益である。追加の療法は、例えば、週に１回、２週間に１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、または３ヶ月に１回、またはより長い間隔で投与することができる。
【０２８５】
所与の投与量中の抗体組成物の量は、治療が施されている個体のサイズ、ならびに治療されている障害の特徴によって異なり得る。例示的な治療では、約１ｍｇ／日、５ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、７５ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、５００ｍｇ／日、または１０００ｍｇ／日を投与することが必要であり得る。これらの濃度は、単回剤形として、あるいは複数回投与として投与することができる。最初に動物モデルでの、次いで臨床試験での、標準的な投与量反応研究が、特定の病状と患者集団に最適な投与量を明らかにする。
【０２８６】
また本開示において企図されるように、所与の投与量中のＰＴＨ１Ｒ抗体の量は、治療が施されている個体のサイズ、ならびに治療されている障害の特徴に応じて変わり得る。抗体組成物は、疾患の進行または許容できない毒性が出るまで、１、２、または４週間毎に３０〜６０分かけて静脈内注入として週に２回、０．１〜１５ｍｇの投与量範囲で投与することができる。様々な実施形態において、抗体組成物は、１週間に２回、または１、２、もしくは４週間毎に、０．３〜３０ｍｇ／ｋｇの投与量範囲で、静脈内、皮下、または筋肉内に投与され得る。様々な実施形態において、投与量は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または３０ｍｇ／ｋｇであり得る。様々な実施形態において、抗体組成物は、０．３〜３ｍｇ／ｋｇ、１〜６ｍｇ／ｋｇ、または２〜６ｍｇ／ｋｇの投与量範囲で、週に２回、または１、２、もしくは４週間毎に静脈内投与することができる。あるいは、抗体組成物は、１週間に２回、または１、２、もしくは４週間毎に、０．５〜５ｍｇ／ｋｇの投与量範囲で、静脈内、皮下、または筋肉内に投与され得る。
【０２８７】
追加の治療薬が本開示の治療薬と組み合わせて投与される場合、投与が変更され得ることもまた明らかであろう。
【０２８８】
キット
さらなる態様として、本開示は、本開示の方法を実施するためのそれらの使用を容易にする様式で、パッケージされた１つまたは複数の化合物または組成物を含むキットを含む。一実施形態において、そのようなキットは、密封された瓶または容器などの容器に、容器に貼付された、あるいはパッケージ内に含まれる（方法の実施における化合物または組成物の使用を説明する）ラベルでパッケージされ、本明細書において記載される化合物または組成物を含む。好ましくは、化合物または組成物は、単位剤形でパッケージされる。キットは、組成物を特定の投与経路に従って投与するのに、あるいはスクリーニングアッセイを実施するのに好適な装置をさらに含み得る。好ましくは、キットは抗体組成物の使用を説明するラベルを含む。
【０２８９】
本開示のさらなる態様および詳細は、限定的ではなく例示的であることが意図されている以下の実施例から明らかとなろう。
【実施例】
【０２９０】
実施例１：ＰＴＨ１Ｒに結合する抗体の発見
Ａ．ファージパンニングおよび回収
ＰＴＨ１Ｒに結合する抗体を同定するために、ナイーブｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体ファージライブラリー（Ｓｃｈｗｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．３９１（１−２）：６０−７１）を使用した３回の細胞パンニングを実施した。κおよびλ鎖ライブラリーを一緒にパンニングした。１回目のファージパンニングでは、約５０×ライブラリー同等物を、ＦＬＡＧペプチド（シグマアドリッチ）の存在下、５％のＦＣＳ／ＰＢＳ中、室温で１時間遮断した。次いで、ＣＨＯ−Ｋ１（親細胞）に対する非特異的結合剤を、ＰＴＨ１Ｒ受容体を発現しなかった５×１０７ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して選択解除した。続いて、選択解除された細胞を、３７℃で２時間、ＦＬＡＧペプチドの存在下で、全長ヒト受容体を発現する１．５×１０８ＣＨＯ−ＰＴＨ１Ｒ細胞に結合させた。次いで受容体結合ファージを、５％ＦＣＳ−ＰＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳで洗浄した。選択の厳密性を高めるために、連続する各回のパンニングにおいて洗浄の期間を延長した。次に結合ファージを、１００ｍＭトリメチルアミン（ＴＥＡ）溶出緩衝液（Ｍｅｒｃｋ−ＴＸ１２００−５）の添加により溶出し、等容量の１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で中和した。次いで、溶出し、中和したファージを用いて、ＯＤ６００〜０．５で、ｃｙｔＦｋｐＡシャペロン変異体を発現するＴＧ１細菌細胞（Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１３Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．３９４（１−２）：１０−２１）に感染させた。感染を、１００ｒｐｍの振盪を用いて、３７℃で１時間実施した。次いで、細胞を、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、および２％グルコースを補充した２ＹＴアガロースプレート上にプレーティングし、３０℃で一晩インキュベートした。
【０２９１】
次の回のパンニングのためにファージを回収するために、５０×〜１００×アウトプットを、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（マサチューセッツ州、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で重感染させた。細胞を採取し、ＯＤ６００が約０．０５から始めて３７℃で増殖させた。ＯＤ６００ｎｍが約０．５の際に、細胞を、１００ｒｐｍでの回転で３７℃で１時間、約２０の感染多重度（ＭＯＩ）でのＭ１３Ｋ０７を用いて感染させた。感染後、細胞をペレット化し、シャペロンｃｙｔＦｋｐＡの発現を可能にするために、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、および０．２％アラビノースで補完した新しい２ＹＴ培地に移した。２５℃で細菌培養物を一晩増殖させた後、４℃で遠心分離した後にファージを回収し、次いでＰＥＧ沈殿させて、次の回のパンニングのためのインプットとして使用した。選択的濃縮を、各パンニング回に使用されたファージインプット量対得られたファージアウトプット力価によってモニターした。
【０２９２】
あるいは、２回目のパンニングから生じた回収されたファージを、ヒトＰＴＨ１Ｒを発現するように操作されたＣＨＯ細胞に結合させた。次いで、ＣＨＯ−ＰＴＨ１Ｒ細胞に結合したファージを、Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：２１９−２２６に記載のものに基づく細胞選別方法を用いて単離した。
【０２９３】
Ｂ．スクリーニング
ライブラリーパンニングアウトプットを、ＦＡＣＳによりスクリーニングした。選択されたクローンのペリプラズム細菌抽出物を含むプレートを、標準的なプロトコルを用いて調製した。次いで、それらを、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞への結合に対して、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを有するヒトＰＴＨ１Ｒを発現するＣＨＯ細胞への結合を、ＦＡＣＳによりスクリーニングした。抗ＦＬＡＧタグモノクローナル抗体を、ＰＴＨ１Ｒ発現細胞を検出するための陽性対照として使用した。
【０２９４】
次いで、ＰＴＨ１Ｒに結合する抗体断片を、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４抗体に再フォーマットした。選択されたｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）鎖を、ＰＣＲによって増幅し、抗体定常領域配列を含有するプラスミドベクターにクローニングし、標準的方法を用いて２９３Ｅ細胞に一過性にトランスフェクトして、さらなる特徴づけのためにＩｇＧ２抗体を産生した。再フォーマットされた抗体は、以下に記載されるように、ＰＴＨ１Ｒ結合について、かつ機能的アッセイにおいて試験した。
【０２９５】
実施例２：親和性成熟
初期結合および機能的特徴付け研究に基づいて、２つの抗体、ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７を、軽鎖シャフリングを用いて親和性成熟のために選択した。
【０２９６】
Ａ．ＸＰＡ．８５．０１２の親和性成熟変異体の選択
軽鎖ライブラリー構築
ＸＰＡ．８５．０１２のＶＨ領域を、２つの異なるκ鎖Ｆａｂライブラリーを含むプラスミドＤＮＡにクローニングした。得られたライブラリー、ＸＰＡ８５．０１２．０１０およびＸＰＡ８５．０１２．０５０の、得られたライブラリーのサイズは、それぞれ７．６×１０８ｃｆｕおよび２．１×１０９ｃｆｕであった。各ライブラリーを、ＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡ細胞を用いて回収した（５０×ライブラリー同等物）（Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．３９４（１−２）：１０〜２１）。
【０２９７】
ファージパンニングおよび回収
製造業者のプロトコルおよび２０倍モル過剰のビオチン試薬を用いて、ヒトＰＴＨ１Ｒ受容体の組み換えＮ末端細胞外ドメイン（ミネソタ州、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎ−ＥＣＤ  ＰＴＨ１Ｒ）をＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン（イリノイ州、ロックフォード、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でビオチン化した。非反応性ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンを、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（７Ｋ  ＭＷＣＯ）（イリノイ州、ロックフォード、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２回回転させることによって除去した。Ｎ−ＥＣＤ  ＰＴＨ１Ｒのビオチン化は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって確認された。
【０２９８】
１回目のファージパンニングのために、ＸＰＡ８５．０１２．０１０およびＸＰＡ８５．０１２．０５０（それぞれ７．６×１０１０ｃｆｕおよび２．１×１０１１ｃｆｕ）の１００×ライブラリー同等物を、１ｍＬの３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１時間氷上で遮断した。ストレプトアビジンへの結合剤を、ブロックファージをストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（カリフォルニア州、カールスバッド、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン）に添加することによって、ブロックファージから選択解除し、室温での４５分間の回転でインキュベートした。選択解除工程をもう一度繰り返した。磁石を用いてビーズをファージから単離した。選択解除工程と同時に、室温、４５分間の回転でインキュベートすることで、４０ピコモルのビオチン化Ｎ−ＥＣＤのＰＴＨ１Ｒをストレプトアビジン被覆磁気ビーズに結合させた。選択を、選択解除されたファージを磁性ストレプトアビジンビーズに結合したビオチン化Ｎ−ＥＣＤ  ＰＴＨ１Ｒに添加し、１．５時間の回転でインキュベートすることにより実施した。選択後、未結合ファージを、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回、５分間洗浄し、続いて３％ＢＳＡ／ＰＢＳで３回、５分間洗浄し、かつＰＢＳで１回迅速に洗浄することによって除去した。室温、２０分間の回転で１００ｍＭ  ＴＥＡを添加することにより、最終洗浄工程後に結合ファージをビーズから溶出させた。溶出したファージを、等容量の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加して中和し、ビーズを１ｍＬの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加して中和した。溶出およびビーズ結合した中和ファージを別々に使用して、対数増殖期のＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡ細菌細胞（ＯＤ６００約０．５）を感染させた。感染は振盪せずに３７℃で３０分間行い、続いて１００ｒｐｍで振盪しながら、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。細胞を、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、３４μｇ／ｍＬクロロアムフェニコール、および２％グルコース（２ＹＴＣＣＧ）寒天バイオアッセイプレートで補完した２ＹＴ培地上にプレーティングし、一晩３０℃でインキュベートして、一晩ローン（ｌａｗｎ）増殖させた。全てのプレートを掻き取り、細胞を組み合わせて細菌グリセロールストックを作製した。
【０２９９】
次の回のためのインプットとして使用するための準備において、前回の１００×アウトプットを、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（カリフォルニア州、カールスバッド、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた重感染によって回収した。これを、２ＹＴＣＣＧ培地に前回のパンニングのアウトプットから掻き取った細胞を接種することによって行った。ＯＤ６００ｎｍが開始培養に関して測定され、約０．０５の開始ＯＤ  ６００ｎｍを反映するように調整した。細胞を、細胞がＯＤ６００ｎｍ約０．５の対数増殖期に達するまで、振盪しながら３７℃で増殖させた。細胞を、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージに、感染多重度（ＭＯＩ）＝約２０、３７℃で３０分間振盪せずに感染させ、続いて１００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でさらに３０分間インキュベートした。３７℃で感染させた後、細胞をペレット化し、２５μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、および０．２％Ｌ−アラビノースで補完した新しい２ＹＴ培地に移した。培養物を２５℃で一晩増殖させた。遠心分離によってファージを細胞および破片から単離し、得られた上清を回収し、ＰＥＧ−６０００／ＮａＣｌを沈殿させた。選択的濃縮は、各回パンニングに使用されたインプット量および得られたファージアウトプット力価によってモニターした。
【０３００】
２回目と３回目のパンニングでは、１回目と同じ液相プロトコルを使用したが、以下の点が異なる。２回目のパンニングで使用されたファージインプット量は約１．０×１０１０ｃｆｕ、３回目では約４．０×１０８〜５×１０１０ｃｆｕであった。２回目では、１０ピコモルのビオチン化抗原を選択において用いて、３回目では、１．０および０．４ピコモルのビオチン化抗原を用いた。２回目では、洗浄条件は、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回、５分間の洗浄、続いて３％ＢＳＡ／ＰＢＳで５回、５分間の洗浄、ＰＢＳで１回、迅速な洗浄であった。３回目では、２つの洗浄条件を、キングフィッシャー装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施し、選択後にビーズから未結合ファージを洗浄した。最初の洗浄条件では、ビーズを４分間、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で８回洗浄し、続いて４分間、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで８回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳで終了するように、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒをプログラムした。磁石を使用して結合ファージを収集し、溶出およびビーズ結合したファージを用いて前述のように溶出し、ＴＧ１＋ｃｙｔＦｐＫＡ感染、細菌グリセロールストック、および単一クローンの採取のために別々にした。第２の洗浄条件では、ビーズを４分間、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄し、続いて４分間、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで５回洗浄し、一晩回転させながら４℃での１ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳ洗浄、続いて１回の迅速なＰＢＳ洗浄で終了するように、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒをプログラムした。磁石を用いて結合ファージを収集し、溶出およびビーズ結合したファージを用いて前述のように溶出し、ＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡ感染、細菌グリセロールストック、および単一クローンの採取のために別々にした。
【０３０１】
Ｂ．ＸＰＡ．８５．０１７の親和性成熟変異体の選択
軽鎖ライブラリー構築
ＸＰＡ．８５．０１７のＶＨ領域を、２つの異なるλ鎖Ｆａｂライブラリーを含むプラスミドＤＮＡにクローニングした。得られたライブラリー、ＸＰＡ．８５．０１７．０１０およびＸＰＡ．８５．０１７．０３１の、得られたライブラリーサイズは、それぞれ８．２１×１０８ｃｆｕおよび７．５１×１０８ｃｆｕであった。各ライブラリーを、ＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡを用いて回収した（５０×ライブラリー同等物）（Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．３９４（１−２）：１０−２１）。
【０３０２】
ファージパンニングおよび回収
１回目のファージパンニングでは、選択解除工程と同時に、４０ピコモルのビオチン化Ｎ−ＥＣＤのＰＴＨ１Ｒではなく１０ピコモルをストレプトアビジン被覆磁気ビーズに結合させたことを除いて、上記のように、ヒトＰＴＨ１Ｒの組み換えＮ末端細胞外ドメイン上でパンニングを実施した。
【０３０３】
２回目および３回目のパンニングでは、上記の１回目と同じ液相プロトコルを使用したが、以下の点が異なる。２回目および３回目のパンニングで使用されたファージインプット量は、約１．０×１０１０ｃｆｕであった。２回目では、１ピコモルのビオチン化抗原を選択において用いて、３回目では、０．５および０．１ピコモルのビオチン化抗原を用いた。追加のパンニング条件は、（１．５時間ではなく）３０分の選択および０．５ピコモルを用いて３回目で導入された。２回目および３回目の選択に続いて、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ装置を使用して、ビーズからの未結合ファージを洗浄した。２回目では、ビーズを５分間、ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮ＋３％ＢＳＡで５回、続いて５分間、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで５回洗浄するように、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒをプログラムした。３回目のパンニングでは、ビーズを５分間、ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮ＋３％ＢＳＡで７回洗浄し、続いて５分間、１×ＰＢＳ＋３％ＢＳＡで７回洗浄し、最後にＰＢＳで迅速に洗浄した。５００倍過剰の冷たいＮ−ＥＣＤのＰＴＨ１Ｒ抗原を用いた一晩の洗浄を、０．５および０．１ピコモルのアームに選択期間を変えながらで付加した。
【０３０４】
Ｃ．スクリーニング
ＰＴＨ１Ｒ結合剤のスクリーニングに使用するための分泌抗体断片を含有する細菌のペリプラズム抽出物を、標準的な方法で調製した。軽鎖シャッフル変異体の改善された結合速度論を評価するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて粗抗体断片のオフ速度スクリーニングを実施した。一次抗体パンニングおよび抗体発見は、全長ヒトＰＴＨ１Ｒを過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を利用した。さらなる試験は、ＸＰＡ．８５．０１２クローンおよびＸＰＡ．８５．０１７クローンの両方が、ＳＰＲベースのハイスループットスクリーニングおよび親和性特徴付けにおいて利用され得る、可溶性組み換えＮ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合することを実証した。
【０３０５】
ＳＰＲスクリーニングアッセイは、直接結合アッセイフォーマットを使用してＢＩＡＣＯＲＥ４０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。これらのアッセイでは、ＣＭ５  ＢＩＡＣＯＲＥチップを、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇキット（ニュージャージー州、ピスカタウェイ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して標準アミンカップリング化学により調製した。ヒトＰＴＨ１ＲのＮ末端ＥＣＤ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を酢酸ｐＨ４．５で４μｇ／ｍＬに希釈し、５分間注入した。これにより、およそ１５００ＲＵのＥＣＤを固定化する。ペリプラズム抽出物を、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）（カリフォルニア州、ホリスター、Ｔｅｋｎｏｖａ）で１：１希釈し、０．２μＭのＭｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、次いで３００秒間の解離で２４０秒間、３０μＬ／分で注入した。各ＰＰＥ注射後の再生は、２０秒間の１０ｍＭグリシンｐＨ３．０であった。使用した泳動緩衝液は、２．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＨＢＳ−ＥＰ＋（ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。ＢＩＡＣＯＲＥ４０００ソフトウェアの安定性早期報告点を用いて、ＰＰＥ結合レベルを評価し、解離（ｋｄ）を決定した。
【０３０６】
改善されたオフ速度を有する選択されたクローンを、実施例１に記載されているようにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４抗体として再フォーマットした。図１Ａおよび１Ｂは、１２からの子についてのファミリー（図１Ａ）の軽鎖アミノ酸、または１７からの子についてのファミリー（図１Ｂ）の軽鎖アミノ酸の多重整列（ＭＳＡ）が、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて親配列に対して実施されたことを示す。
【０３０７】
実施例３：ＳＰＲによるＩｇＧ親和性測定
様々な再フォーマットされた抗体のオン速度（ｋａ）およびオフ速度（ｋｄ）定数を測定するために、ＳＰＲアプローチを追求した。
【０３０８】
抗ヒトＩｇＧ−ＦｃのＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ４０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉Ａｂについての製造業者のプロトコルによって記載されているように標準アミンカップリングを使用して調製した。手短に説明すると、０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と、０．４Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）との１：１の新たに混合した溶液を、１０μＬ／分で１０分間注入してチップ表面を活性化した。活性化注入の後、酢酸塩ｐＨ４．５中の１５μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体を、１０μＬ／分で１０分間注入して、高密度捕捉表面を達成した。７分間の１Ｍエタノールアミン塩酸塩−ＮａＯＨ、ｐＨ８．５を注入して表面を遮断した。使用したＮＨＳ、ＥＤＣ、およびエタノールアミンは、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇキットからのものであった。
【０３０９】
速度論的分析を、２．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｔｅｋｎｏｖａ）（ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて実施した。抗体を、０．５μｇ／ｍＬに希釈し、１００〜２００ＲＵの表面密度を達成するために捕捉した。ＰＴＨ１ＲのＮ末端ＥＣＤ試料を、２００、５０、１２．５、および３．１２５ｎＭの４つの濃度で、ならびにブランク注入で注入した。注入を、３６０秒の解離時間で２４０秒間、３０μＬ／分で実施した。次いで、再生を６０秒間の１回の注入３ＭのＭｇＣｌで実施した。
【０３１０】
データをＢＩＡＣＯＲＥ４０００評価ソフトウェアを使用して分析し、ブランクフローセルデータと平均化ブラケティングブランク注入の両方を差し引くことによって二重参照した。データを、同時にオフ速度（ｋｄ）およびオン速度（ｋａ）を当てはめることによって適合し、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａとしてＫＤを計算した。測定された速度定数は表２に示され、代表的なデータは図２に含まれる。
【０３１１】
（表２）
2019526244.tif 000004
表２：ＳＰＲベースの親和性推定
【０３１２】
捕捉抗体を用いてこのアッセイで測定されたような親和性データは、ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７クローンの両方の親和性成熟変異体のヒト組み換えＥＣＤへの親和性結合の増加（より低いＫＤ）を実証した。
【０３１３】
実施例４：ＦＡＣＳ結合アッセイ
Ａ．ＣＨＯＫ１およびＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ細胞に対するＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の結合
ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７のヒトＰＴＨ１Ｒへの抗体結合特異性を評価するために、ヒトＰＴＨ１Ｒを過剰発現するＣＨＯ細胞をフロー系アッセイで使用した。ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の結合データを、それぞれ図３Ａおよび３Ｂに示す。ＣＨＯＫ１親細胞もまた、陰性細胞株として使用した。細胞を、９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ：マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に漸増濃度の抗体とともにプレーティングした。細胞および抗体を、４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ中０．５％のＢＳＡプラス０．１％のＮａＮ３）で２回洗浄した後、細胞を、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ペンシルヴァニア州、ウェストグローブ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈグローブ、ＰＡ）とともに、４℃で２０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。試料を、ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（カリフォルニア州、サンホセ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて得て、データをＦｌｏｗＪｏ（オレゴン州、アッシュランド、ＬＬＣ、ＦｌｏｗＪｏ）およびＰｒｉｓｍ（カリフォルニア州、ラホヤ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。
【０３１４】
Ｂ．ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの存在下および非存在下でのＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の結合親和性
ＰＴＨ１Ｒリガンドへの抗体の差次的結合を評価するために、飽和濃度のＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの存在下または非存在下で、漸増濃度の抗ＰＴＨ１Ｒ抗体をＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ細胞とともに６０分間インキュベートした。ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の結合データを、それぞれ図４Ａおよび４Ｂに示す。ＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ＋０．１％ＮａＮ３）で２回洗浄した後、細胞を、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ペンシルヴァニア州、ウェストグローブ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに、４℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。試料を、ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（カリフォルニア州、サンホセ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて得て、データをＦｌｏｗＪｏ（オレゴン州、アッシュランド、ＬＬＣ、ＦｌｏｗＪｏ）およびＰｒｉｓｍ（カリフォルニア州、ラホヤ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。
【０３１５】
Ｃ．ＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７の速度論（オン速度）
ＳＰＲデータは、ＸＰＡ．８５．０１２がＸＰＡ．８５．０１７より速いオン速度を有することを示した。両方の抗体のオン速度を確認するためにフロー系アッセイを開発した。まず、ＸＰＡ．８５．０１７のオン速度をフローサイトメトリーによって評価した（図５Ａ）。漸増濃度のＸＰＡ．８５．０１７を、ＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ細胞とともに、５分〜２４時間の一定時間インキュベートした。ＸＰＡ．８５．０１２に対する抗体結合を、図５Ｂに示す。要約すると、ＸＰＡ．８５．０１２は１時間以内に結合できるが、ＸＰＡ．８５．０１７は結合するのに２４時間かかる場合がある。２４時間の試料を除いて、全ての時点を同時に停止した。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ＋０．１％ＮａＮ３）で２回洗浄し、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ペンシルヴァニア州、ウェストグローブ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに、４℃で２０分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。試料を、ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（カリフォルニア州、サンホセ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて得て、データをＦｌｏｗＪｏ（オレゴン州、アッシュランド、ＬＬＣ、ＦｌｏｗＪｏ）およびＰｒｉｓｍ（カリフォルニア州、ラホヤ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。
【０３１６】
Ｄ．抗ＰＴＨ１Ｒ抗体の種交差反応性の評価
ＣＨＯＫ１過剰発現ＰＴＨ１Ｒオーソログおよび内因性細胞株を用いて、種交差反応性を評価した。ＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ細胞およびＣＨＯマウスＰＴＨ１Ｒ細胞は自家産生され、ＵＭＲ１０６およびＳａｏｓ−２をＡＴＣＣから購入した。ＵＭＲ１０６およびＳａｏｓ−２は両方、それぞれラットおよびヒトＰＴＨ１Ｒを発現する骨肉腫細胞株である。４つ全ての細胞株を用いて種交差反応性を評価した。
【０３１７】
抗ＰＴＨ１Ｒ抗体を、ＰＴＨ１Ｒオーソログを発現する細胞株への結合およびリガンド（ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ）の存在下または非存在下での差次的結合の両方についてスクリーニングした。抗体結合および差次的結合を評価するために、飽和濃度のＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの存在下または非存在下で、漸増濃度の抗ＰＴＨ１Ｒ抗体を４つ全ての細胞株とともにインキュベートした。ＰＴＨ（図６Ａ）またはＰＴＨｒＰ（図６Ｂ）の存在下および非存在下でヒトＰＴＨＲを発現するＣＨＯ細胞に対するＸＰＡ．８５．０１７およびＸＰＡ．８５．０１２抗体についての結合データを示す。ＰＴＨ（図６Ｃ）またはＰＴＨｒＰ（図６Ｄ）の存在下および非存在下でマウスＰＴＨＲを発現するＣＨＯ細胞に対するＸＰＡ．８５．０１７およびＸＰＡ．８５．０１２抗体についての結合データを示す。
【０３１８】
抗体および細胞を２４時間インキュベートして、より遅いオン速度の抗体（ＸＰＡ．８５．０１７）を平衡に到達させた。ＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ＋０．１％ＮａＮ３）で２回洗浄した後、細胞をＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ペンシルヴァニア州、ウェストグローブ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに、４℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。試料を、ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（カリフォルニア州、サンホセ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて得て、データをＦｌｏｗＪｏ（オレゴン州、アッシュランド、ＬＬＣ、ＦｌｏｗＪｏ）およびＰｒｉｓｍ（カリフォルニア州、ラホヤ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。
【０３１９】
Ｅ．ＰＴＨ１Ｒリガンドの存在下または非存在下での平衡条件での親和性成熟ＸＰＡ．８５．０１７変異体のＣＨＯＫ１、ＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ、およびＣＨＯマウスＰＴＨ１Ｒへの結合
ＰＴＨ１Ｒへの抗体結合を特徴付けるために、細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥまたはＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレットのいずれかで標識した。非標識ＣＨＯＫ１親、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥで標識されたＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ、およびＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレットで標識されたＣＨＯマウスＰＴＨ１Ｒを一緒にプールし、漸増濃度の抗体で染色した。抗体を４℃で２４時間インキュベートし、続いてＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）で２回洗浄した。次いで、細胞を、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ペンシルヴァニア州、ウェストグローブ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに、４℃で２０分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。試料を、ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（カリフォルニア州、サンホセ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて得て、データをＦｌｏｗＪｏ（オレゴン州、アッシュランド、ＬＬＣ、ＦｌｏｗＪｏ）およびＰｒｉｓｍ（カリフォルニア州、ラホヤ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。ＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ細胞およびＣＨＯマウスＰＴＨ１Ｒ細胞に結合する抗体のＥＣ５０値を、表３に示す。選択されたＸＰＡ．８５．０１７抗体変異体を、ＣＨＯヒトおよびＣＨＯマウスＰＴＨ１Ｒ細胞上の差次的結合について評価し、ＰＴＨ１Ｒリガンドのいずれかの存在下では結合の減少を示した。リガンドの非存在下ではより低いＥＣ５０値が観察された（表４）。
【０３２０】
（表３）
2019526244.tif 000005
表３：平衡状態でのＣＨＯヒトＰＴＨ１ＲおよびＣＨＯマウスＰＴＨ１Ｒ細胞に対するＸＰＡ．８５．０１７変異体のＥＣ５０値
【０３２１】
（表４）
2019526244.tif 000006
表４：選択されたＸＰＡ．８５．０１７変異体の差次的結合プロファイル。
【０３２２】
Ｆ．親和性成熟ＸＰＡ．８５．０１２変異体のＣＨＯＫ１、ＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ、ＣＨＯマウスＰＴＨ１Ｒ、ＵＭＲ１０６、およびＳａｏｓ−２細胞への結合
ＰＴＨ１Ｒへの抗体結合を特徴付けるために、細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥまたはＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレットのいずれかで標識した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥで標識された非標識ヒトＰＴＨ１Ｒ、ＣＨＯＫ１、およびＳａｏｓ−２、ならびにＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレットで標識されたＣＨＯマウスＰＴＨ１ＲおよびＵＭＲ１０６を一緒にプールし、漸増濃度の抗体で染色した。抗体を、４℃で１時間インキュベートし、続いてＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）で２回洗浄した。次いで、細胞を、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ペンシルヴァニア州、ウェストグローブ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに、４℃で２０分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。試料を、ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（カリフォルニア州、サンホセ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて得て、データをＦｌｏｗＪｏ（オレゴン州、アッシュランド、ＬＬＣ、ＦｌｏｗＪｏ）およびＰｒｉｓｍ（カリフォルニア州、ラホヤ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。全ての抗体は、ＣＨＯヒトＰＴＨ１Ｒ、ＣＨＯマウスＰＴＨ１Ｒ、およびＵＭＲ１０６上に発現されたＰＴＨ１Ｒを認識した。これらの抗体はまた、ＣＨＯＫ１親細胞およびＳａｏｓ−２細胞に非特異的に結合しない（表５）。
【０３２３】
（表５）
2019526244.tif 000007
表５：ＸＰＡ．８５．０１２変異体のＦＡＣＳ結合プロファイル。（＋）は結合を示し、（−）は結合なしを示す。
【０３２４】
Ｇ．Ｓａｏｓ−２過剰発現ヒトＰＴＨ１Ｒ細胞上でのヒトＰＴＨ１Ｒに対する抗体結合特異性
抗ＰＴＨ１Ｒ抗体の特異性を確認するために、抗体を、両方のリガンド、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの存在下または非存在下でＳａｏｓ−２過剰発現ヒトＰＴＨ１Ｒ細胞に対してスクリーニングした（図７Ａ〜７Ｄ）。
【０３２５】
Ｈ．ＣＨＯ過剰発現ヒトＰＴＨ２Ｒ細胞を用いたＰＴＨ２Ｒ交差反応性の評価
抗ＰＴＨ１Ｒ抗体（ＸＰＡ．８５．３２８、ＸＰＡ．８５．３２９、およびＸＰＡ．８５．３３０）を、ヒトＰＴＨ２Ｒを過剰発現するＣＨＯ細胞に対してスクリーニングして、受容体交差反応性を決定した（図８）。ＰＴＨ２ＲはＰＴＨ１Ｒに対して５１％の相同性を有する。ＰＴＨ１Ｒのみに対する抗ＰＴＨ１Ｒ抗体の結合特異性を確認するために、漸増濃度の抗体をＣＨＯヒトＰＴＨ２Ｒとともに、４℃で１時間インキュベートした。にかいの洗浄後、細胞を、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ペンシルヴァニア州、ウェストグローブ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに、４℃で２０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。試料を、ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（カリフォルニア州、サンホセ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて得て、データをＦｌｏｗＪｏ（オレゴン州、アッシュランド、ＬＬＣ、ＦｌｏｗＪｏ）およびＰｒｉｓｍ（カリフォルニア州、ラホヤ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。図８に示されるように、全ての抗体はＣＨＯヒトＰＴＨ２Ｒへの結合を示さず（すなわち、ＰＴＨ２Ｒへの交差反応性を示さず）、ＰＴＨ１Ｒに特異的である。抗ＫＬＨ．Ｇ２を結合への陰性対照として用いた。
【０３２６】
実施例５：機能的アッセイ
Ａ．ｃＡＭＰ蓄積アッセイ
（全部ではないにしても）ほとんどの細胞型において、ＰＴＨ１Ｒの活性化は、Ｇへの結合を介したアデニリルシクラーゼの刺激および細胞内ｃＡＭＰの蓄積をもたらし、続いてプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を刺激する。精製され、再フォーマットされたＩｇＧの機能活性は、Ｇｓ／ＰＫＡ経路の阻害を介してＰＴＨ１Ｒ媒介ｃＡＭＰ蓄積に拮抗するそれらの能力を測定することによって、日常的に試験した。
【０３２７】
ヒトＰＴＨ１ＲのＣＨＯＫ１クローン２２およびマウスＰＴＨ１ＲのＣＨＯＫ１細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミンおよび０．４ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；マサチューセッツ州、ウォルサム、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＣＨＯ細胞（ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ）のためのＥｘＣｅｌｌ３０２血清なしの培地中で増殖させた。実験当日、細胞を、遠心分離（室温で１５００ｒｐｍ、３分間）によって採取した。増殖培地を穏やかに吸引し、細胞をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水中で、カルシウムまたはマグネシウムなし（マサチューセッツ州、ウォルサム、ＤＰＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１回洗浄した。その後、細胞を室温で３分間、１５００ｒｐｍで２回遠心沈殿した。洗浄液を穏やかに吸引し、細胞をアッセイ緩衝液［０．１％のＢＳＡおよび１ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含有するＤＰＢＳ（ミズーリ州、セントルイス、ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）］中で再懸濁した。細胞をＶｉ−ＣＥＬＬ（インディアナ州、インディアナポリス、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて計数し、アッセイ緩衝液を用いて２．５×１Ｅ６生存細胞／ｍｌまたは５０，０００細胞／ウェルの密度に調整した。２０μｌ／ウェルの細胞を９６ウェル白色平底組織培養処理アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分配した。細胞を５μｌの６×ＩｇＧとともに、３７℃で３０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、５μｌの６×リガンド［（ＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨｒＰ（１−３４）のいずれか］を添加することによって、３７℃で４５分間ｃＡＭＰ蓄積を誘導した。ｃＡＭＰ蓄積を、製造業者の説明書に従ってＢｉｏｌｏｇｉｃｓキット（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）のためのＨｉｔＨｕｎｔｅｒ  ｃＡＭＰを使用して測定した。ヒトＰＴＨ（１−３４）を、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｅ（ミネソタ州、ミネアポリス）から購入し、ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州、セントルイス）から得た。両方のペプチドのストック溶液を、０．１％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ中で調製し、等分し、−８０℃で貯蔵した。リガンドおよびＩｇＧ希釈物を、０．１％ＢＳＡおよび１ｍＭのＩＢＭＸを含有するＤＰＢＳを用いて作製した。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（カリフォルニア州、サニーベイル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて化学発光シグナルを測定した。データは相対発光単位（ＲＬＵ）として表される。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６．０（カリフォルニア州、サンディエゴ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して曲線当てはめを行った。
【０３２８】
ヒトＰＴＨ１ＲのＣＨＯＫ１クローン２２細胞を、２６７ｎＭ（４０μｇ／ｍｌ）のＸＰＡ．８５．０１２（黒四角形）またはＸＰＡ．８５．０１７（黒三角形）のいずれかとともに、３７℃で３０分間プレインキュベートし、続いて漸増濃度のＰＴＨ（１−３４）（図９Ａ）またはＰＴＨｒＰ（１−３４）（図９Ｂ）のいずれかで誘導した。両方の抗体は、リガンド媒介ｃＡＭＰ蓄積（Ｇｓ／ＰＫＡ経路）を阻害した。
【０３２９】
軽鎖シャッフリングによるＸＰＡ．８５．０１７（白丸）の親和性操作に続いて、ヒト（図１０Ａおよび図１０Ｂ）またはマウスＰＴＨ１Ｒ（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）のいずれかを安定して過剰発現するＣＨＯＫ１細胞を、２６７ｎＭ（４０μｇ／ｍｌ）の変異体ＩｇＧとともに、３７℃で３０分間プレインキュベートし、その後、漸増濃度のＰＴＨ（１−３４）で、３７℃で４５分間誘導した。変異体ＩｇＧは、ヒトおよびマウスＰＴＨ１Ｒでのリガンド媒介ｃＡＭＰ蓄積（Ｇｓ／ＰＫＡ経路）のある範囲の阻害を示した。
【０３３０】
ＳａＯＳ−２およびＵＭＲ１０６細胞を、ＡＴＣＣ（バージニア州、Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手した。ＳａＯＳ−２細胞を、１５％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ（改変）培地（マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させた。ＵＭＲ１０６細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補完した、４．５ｇ／ＬのＤ−グルコースを含有するダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。ＳａＯＳ−２細胞を、５０，０００細胞／ウェルの密度で３日間、９６ウェルアッセイプレートに播種し、次いでＦＢＳを含有しないが、１％ＢＳＡを補完した培地中で一晩、血清飢餓状態にした。ＵＭＲ１０６細胞を、３５，０００細胞／ウェルの密度で１日間９６ウェルアッセイプレートに播種し、次いでＦＢＳを含有しないが、１％ＢＳＡで補完した培地中で一晩、血清飢餓状態にした。ＩｇＧによるｃＡＭＰ蓄積の拮抗作用を、ＣＨＯＫ１細胞株について以前に記載されたように測定した。
【０３３１】
軽鎖シャフリングによるＸＰＡ．８５．０１７の親和性操作により、ＸＰＡ．８５．２８７が得られた。この変異体は、ヒトＰＴＨ１Ｒ（図１１Ｂ、白四角形）対親（黒四角形）に対する活性の顕著な改善を示し、ラットＰＴＨ１Ｒに対する活性の変化はほとんどなかった（図１１Ｃ）。対照的に、ＸＰＡ．８５．０１２（黒三角形）の親和性操作は、変異体、ＸＰＡ．８５．２８８（白三角形）をもたらし、ヒトＰＴＨ１Ｒ（データは示さず）ならびにラットＰＴＨ１Ｒの両方に対する活性の顕著な改善を示した。ＸＰＡ．８５．２８８はまた、天然のヒトＰＴＨ１Ｒ（図１１Ｄ）を発現するＳａＯＳ−２細胞の、ＰＴＨｒＰ誘導性ｃＡＭＰを顕著に阻害することが見い出された。
【０３３２】
濃度応答曲線を、ヒトＰＴＨ１ＲのＣＨＯＫ１（図１２Ａ）およびマウスＰＴＨ１ＲのＣＨＯＫ１（図１２Ｂ）細胞を用いてｃＡＭＰアッセイにおいて、ＰＴＨｒＰ（１−３４）および漸増濃度のＸＰＡ．８５．２８７（ＸＰＡ．８５．０１７の親和性操作変異体）のために実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、シルト回帰分析を実施し、濃度応答曲線の非平行な右方向シフトを明らかにした。これらの結果は、変異体ＩｇＧの非競合的（アロステリック）作用機序と一致する。
【０３３３】
濃度応答曲線を、ヒトＰＴＨ１ＲのＣＨＯＫ１（図１３Ａ）およびマウスＰＴＨ１ＲのＣＨＯＫ１（図１３Ｂ）細胞を用いてｃＡＭＰアッセイにおいて、ＰＴＨｒＰ（１−３４）および漸増濃度のＸＰＡ．８５．２８８（ＸＰＡ．８５．０１２の親和性操作変異体）のために実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、シルト回帰分析を実施し、濃度応答曲線の非平行な右方向シフトを明らかにした。これらの結果は、変異体ＩｇＧの非競合的（アロステリック）作用機序と一致する。
【０３３４】
Ｂ．カルシウム動員アッセイ
いくつかの細胞型におけるＰＴＨ１Ｒの活性化は、Ｇｑカップリング、ホスホリパーゼＣβの活性化、および膜関連ホスファチジルイノシトールの加水分解によるイノシトールリン酸の形成、細胞内カルシウムの増加、およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を含むカルシウム依存性酵素の活性化をもたらす。精製され、再フォーマットされた抗ＰＴＨ１ＲのＩｇＧの機能活性は、Ｇｑ／ＰＫＣ経路の阻害を介してＰＴＨ１Ｒ媒介カルシウム動員に拮抗する、それらの能力を測定することによって試験した。
【０３３５】
ヒトＰＴＨ１Ｒ  ＣＨＯＫ１クローン２２およびマウスＰＴＨ１Ｒ  ＣＨＯＫ１細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミンおよび０．４ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（マサチューセッツ州、ウォルサム、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＣＨＯ細胞（ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ）のためのＥｘＣｅｌｌ３０２血清なしの培地中で増殖させた。細胞を、９６ウェル、黒色／透明底、組織培養処理、ポリ−Ｄ−リジン被覆アッセイプレート（ニューヨーク州、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＢｉｏＣｏａｔ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上の１００μｌ／ウェルの増殖培地に、３５，０００細胞／ウェルで播種し、３７°Ｃ［５％ＣＯ２、９５％相対湿度］で一晩インキュベートした。翌日、５ｍＭプロベネシド（ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１００μｌ／ウェルの２×カルシウム５添加色素（カリフォルニア州、サニーベイル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を製造元の指示に従って調製し、添加し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、２５μｌの添加色素／増殖培地を各ウェルから手動で除去し、続いて２５μｌの１０×試験ＩｇＧ（抗体希釈液を２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する１×ＨＢＳＳ中に調製した）を添加した。次いで、プレートをインキュベーターにさらに３０分間３７℃で戻した。その後、アッセイプレートを室温で３分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、プレートを、３７℃に予熱したＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（カリフォルニア州、サニーベイル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）に入れ、アッセイ前に５分間平衡化した。５０μｌの５×リガンド（ＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨｒＰ（１−３４）のいずれか）を添加する前に、基本蛍光を１９秒間、毎秒記録した。蛍光を１分間、毎秒記録し、次にさらに２分間、６秒毎に記録した。データは「最大−最小」として表し、曲線当てはめをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６．０（カリフォルニア州、サンディエゴ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。ヒトＰＴＨ（１−３４）をＢｉｏ−Ｔｅｃｈｎｅ（ミネソタ州、ミネアポリス）から購入し、ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州、セントルイス）から得た。両方のペプチドのストック溶液を、０．１％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ中で調製し、等分し、−８０℃で貯蔵した。
【０３３６】
ヒトＰＴＨ１ＲのＣＨＯＫ１クローン２２細胞を、２６７ｎＭ（４０μｇ／ｍｌ）のＸＰＡ．８５．０１２（黒四角形）またはＸＰＡ．８５．０１７（黒三角形）のいずれかとともに、３７℃で３０分間プレインキュベートし、続いて漸増濃度のＰＴＨ（１−３４）（図９Ｃ）またはＰＴＨｒＰ（１−３４）（図９Ｄ）のいずれかで誘導した。両抗体は、リガンド媒介カルシウム動員（Ｇｓ／ＰＫＡ経路）を阻害した。
【０３３７】
（表６）
2019526244.tif 000008
表６：軽鎖シャフリングによるＸＰＡ．８５．０１７（親）の親和性操作に由来する変異体ＩｇＧの存在下でのＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するｐＭでのＥＣ５０値。変異体ＩｇＧを、２６７ｎＭ（４０μｇ／ｍｌ）で試験し、３７℃で４５分間誘導する前に、細胞とともに３７℃で３０分間、プレインキュベートした。「ビヒクルのみ」の対照群におけるリガンドのＥＣ５０に対する、リガンドＥＣ５０の倍数シフトを計算した。実験数は括弧内に示されている。ＮＤ＝未定。
【０３３８】
（表７）
2019526244.tif 000009
実験数は括弧内に示す。
ＮＤ＝未定。
表７：軽鎖シャフリングによるＸＰＡ．８５．０１２（親）の親和性操作に由来する変異体ＩｇＧの存在下で１μＭのＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨｒＰ（１−３４）のいずれかにより媒介されるｃＡＭＰ蓄積の阻害パーセント。変異体ＩｇＧを、２６７ｎＭまたは４０μｇ／ｍｌで試験し、３７℃で４５分間のｃＡＭＰ蓄積の誘導の前に、細胞とともに、３７℃で３０分間プレインキュベートした。データは二連のウェルの平均ＲＬＵを表す。
【０３３９】
（表８）
2019526244.tif 000010
＊曲線は平坦域に達していない。
ＮＤ＝未定。
表８：軽鎖シャフリングによるＸＰＡ．８５．０１２（親）の親和性操作に由来する変異体ＩｇＧのＩＣ５０値。変異体ＩｇＧを、ある範囲の濃度（０〜６６．６７ｎＭまたは１０μｇ／ｍｌ）で試験し、ＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨｒＰ（１−３４）のいずれかによる３７℃で４５分間のｃＡＭＰ蓄積の誘導の前に、細胞とともに、３７℃で３０分間プレインキュベートした。データは、二連のウェルの平均ＲＬＵを表す。変異体は、特にヒトＰＴＨ１Ｒに対して、リガンド媒介ｃＡＭＰ蓄積のある範囲の拮抗作用を示した。
【０３４０】
Ｃ．Ｓａｏｓ−２骨芽細胞によるＭ−ＣＳＦ分泌
ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰは、骨芽細胞および骨細胞において発現されるＰＴＨ１Ｒ受容体に作用して、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）および核内因子κＢリガンドの表面発現受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）の産生を刺激する。これらの骨細胞によるＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬ発現の増加した産生は、骨吸収破骨細胞の分化および活性化を推進し、骨および骨の脱灰からのカルシウム流出濃度の増加をもたらす。これらの成長因子は両方とも、ヒト破骨細胞のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ媒介分化および活性化に必要とされる（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：９２５−３２；Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１７６６−７５）。
【０３４１】
これらの抗体が破骨細胞増殖因子のＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ刺激分泌を阻害する能力を評価するために、骨芽細胞系Ｓａｏｓ−２を用いたＭ−ＣＳＦ分泌実験を用いた。
【０３４２】
Ｓａｏｓ−２細胞（バージニア州、マナサス、ＡＴＣＣ）を、増殖培地中の９６ウェル培養プレートに５０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、４８時間集密単層を形成させた１５％ＦＢＳ（ユタ州、ローガン、Ｈｙｃｌｏｎｅ／ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む１５％ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、５％ＣＯ２および飽和湿度で３７℃で増殖させた。次いで、培地を１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ−α（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換し、さらに７２〜９６時間インキュベートした。培地をウェルから吸引し、上記と同じＭＥＭ−α系の培地中で２×抗体処理と交換した。培地中のＰＴＨ（１−３４）またはＰＴＨｒＰ（１−３６）ペプチド希釈液を添加する前に、抗体処理物を３７℃で２０〜３０分間インキュベートした。アッセイウェルへの添加後、リガンドを希釈して示された最終濃度を達成した。リガンド滴定実験では、最終抗体濃度は４０μｇ／ｍＬ（２６７ｎＭ）である。プレートをインキュベーターに戻し、３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、処理ウェルからの上清を、製造業者の指示に従ってヒトＭ−ＣＳＦ（メリーランド州、ロックヴィル、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を測定するプレート系の免疫アッセイによって分析し、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で読み取った。抗体滴定実験のために、固定濃度のリガンド（１２．５ｎＭのＰＴＨｒＰ（１−３６））を使用し、抗体の濃度を変更したことを除いて、同じプロトコルに従った。
【０３４３】
親和性成熟抗体は、Ｓａｏｓ−２細胞によるＭ−ＣＳＦ分泌のＰＴＨ刺激増加を阻害する能力を実証した。抗体ＸＰＡ．８５．２８７は、ＰＴＨ（１−３４）投与量応答曲線をおよそ７倍（１．２ｎＭ〜８．７ｎＭ）シフトさせた（図１４Ａ）。別の実験において、軽鎖変異体ＸＰＡ．８５．２８８、ＸＰＡ．８５．３４６、ＸＰＡ．８５．３３１、およびＸＰＡ．３２７は全て、ＰＴＨ（１−３４）投与量応答曲線を１０倍超シフトさせる（図１４Ｂ）。
【０３４４】
親和性成熟軽鎖変異体はまた、Ｓａｏｓ−２細胞によるＭ−ＣＳＦ分泌のＰＴＨｒＰ媒介増加を阻害した。４０μｇ／ｍＬの固定抗体濃度で、ＸＰＡ．８５．３２８、ＸＰＡ．３２９、およびＸＰＡ．８５．３３０は、ＰＴＨｒＰ（１〜３６）刺激Ｍ−ＣＳＦ分泌投与量反応を２００倍超で阻害する（図１５Ａ）。別の実験では、親クローンＸＰＡ．８５．０１２およびＸＰＡ．８５．０１７を、それらの親和性成熟変異体ＸＰＡ．８５．２８８およびＸＰＡ．８５．２８７とそれぞれ比較した。親和性成熟クローンは、ＰＴＨｒＰ誘導性Ｍ−ＣＳＦ分泌の顕著な阻害を示したが、親クローンはそうではなかった（図１５Ｃ）。この効果の抗体投与量応答もまた、１２．５ｎＭの固定ＰＴＨｒＰ（１−３６）濃度に対して評価された。ＸＰＡ．８５．３２８、ＸＰＡ．３２９、およびＸＰＡ．８５．３３０は、それぞれ６．６ｎＭ、４．０ｎＭ、および１．５ｎＭのＥＣ５０で１２．５ｎＭのＰＴＨｒＰ処理によって誘導されたＭ−ＣＳＦ産生を、完全に中和した（図１５Ｂ）。
【０３４５】
Ｄ．ＥＲＫリン酸化
ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）ＥＲＫ１／２（細胞外シグナル制御キナーゼ）は、ＰＴＨ１Ｒのリガンド刺激後にリン酸化および活性化される。この経路活性化は、Ｇタンパク質媒介アデニル酸シクラーゼ経路およびβ−アレスチン媒介経路の両方からのインプットを必要とする収束シグナル伝達事象の代表であり、腎臓カルシウム輸送に必要とされることが示されている（Ｇｅｓｔｙ−Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  ＪＢＣ  ２８１：１０８５６−６４、Ｓｎｅｄｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４１：４１８５−９３）。
【０３４６】
抗ＰＴＨ１Ｒ抗体がＭＡＰＫ経路を調節する能力を決定するために、Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ｔｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７でＰＴＨおよびＰＴＨｒＰ媒介ＥＲＫ１／２リン酸化を阻害するそれらの能力を評価する実験を行った。
【０３４７】
ＣＨＯ−ＰＴＨ１Ｒ細胞を、０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中１×１０６細胞／ｍＬで血清飢餓状態にし、振盪プラットフォーム上で３７℃および５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ）中、１ウェルあたり１００，０００細胞の密度で９６ウェルＵ底プレートに播種した。続いて、アッセイ緩衝液中で４００ｎＭ（２×、６０μｇ／ｍＬ）に希釈した、１ウェルあたり５０μＬの抗体を細胞に付加した。３７℃で１０分間インキュベートした後、２５μＬ／ウェルの希釈リガンド（４×の最終濃度）を、細胞および抗体を含有するウェルに付加し、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、１ウェルあたり１００μｌの冷たいＰＢＳを付加し、反応を停止させた。プレートを４℃で３分間遠心分離し、培地を除去した。次いで、８０μｌの氷冷ＭＳＤ溶解緩衝液を細胞に添加し、再懸濁した。プレートを、振盪プラットフォーム上で４℃で１時間インキュベートし、細胞を完全に溶解させた。全てのリン酸化ＥＲＫを、ＭＳＤ全細胞溶解物Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２キット（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃａｔ．Ｋ１１１０７Ｄ−１）を使用して、製造元の指示に従って測定し、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ６０００（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で読み込んだ。曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ６．０５（カリフォルニア州、サンディエゴ、ＧｒａｐｈＰａｄ）のシグモイド投与量反応式を用いて、非線形回帰により当てはめた。
【０３４８】
抗体ＸＰＡ．８５．０１２は、ＰＴＨ（１−３４）誘導性ＥＲＫ１／２リン酸化のＥＣ５０を、およそ９倍（３．８ｎＭ〜３４．６ｎＭ）増加させ（図１６Ａ）、ＰＴＨｒＰ（１−３４）誘導性ＥＲＫ１／２リン酸化のＥＣ５０は、およそ６倍（１０．６ｎＭ〜６２．５ｎＭのＥＣ５０）増加させた（図１６Ｂ）。抗体ＸＰＡ．８５．０１７は、ＰＴＨ（１−３４）誘導性ＥＲＫリン酸化のＥＣ５０を、１００倍超（３．８ｎＭ〜＞５００ｎＭ）増加させ（図１６Ａ）、ＰＴＨｒＰ（１−３４）のＥＣ５０は、約８０倍（１０．６ｎＭ〜８８７ｎＭのＥＣ５０）増加させた（図１６Ｂ）。
【０３４９】
実施例６：製造可能性の改善
Ａ．選択された抗体候補のＶ領域配列の評価
選択された抗体候補の軽鎖および重鎖Ｖ領域アミノ酸配列を、Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇソフトウェア（ＨＥ（商標）、米国特許第５，７６６，８８６号）を用いて「非ヒト」アミノ酸の存在について、ならびにバイオインフォマティクスソフトウェアを用いて、Ｎ結合グリカン、酸化およびアミド分解シグナルについて評価した。特定の抗体についてのこれらの分析に基づいて、アミノ酸の変化は部位特異的変異導入または遺伝子合成によって組み込まれた。
【０３５０】
Ｂ．選択された抗体候補のＣＨＯ−Ｋ１製造可能性評価
ＣＨＯ−Ｋ１細胞における一過性発現を用いて、多重抗体の製造可能性を評価した。
【０３５１】
軽鎖および重鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを、それぞれ抗体シグナル配列および軽鎖（ＬＣ）または重鎖（ＨＣ）定常領域を含む一過性発現プラスミドにクローニングし、ディープウェル９６ウェルプレート中の懸濁適合ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトした。各トランスフェクションでのＤＮＡ量を、空のプラスミドＤＮＡの添加により一定に保ちながら、発現プラスミドを１：１、２：１、４：１、および１：２のＬＣ：ＨＣプラスミド比（重量）で試験した。各抗体について二連のトランスフェクションを実施する。２つの対照抗体、ＸＢ１０およびＸＥ１７は、それぞれ高発現および低発現のための対照として含まれる。トランスフェクションに続いて、プレートを、トランスフェクションの２４時間後にＣＯ２インキュベーター内の振盪プラットフォーム上で７日間、３７℃〜３２℃に温度シフトしながらインキュベートした。上清を、プロテインＡセンサーチップを備えたＯｃｔｅｔ機器を使用して、抗体力価についてアッセイした。
【０３５２】
選択された抗体候補を、このアッセイを用いて発現について評価した。抗体のうちのいくつかで観察された結果に基づいて、シグナル配列とともにＨＣおよびＬＣのＶ領域をコードするＤＮＡ配列を、ＣＨＯ細胞における発現において最適化した（ＧｅｎｅＡｒｔ）。次いで、最適化された抗体を、製造可能性について再試験した。発現最適化を行った場合、ＤＮＡ配列は異なっていたが、軽鎖および重鎖Ｖ領域のアミノ酸配列は、Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ分析がアミノ酸変化の必要性を示さない限り同じままであった。最適化ＤＮＡ配列を有する抗体を、表９Ｂに示す。
【０３５３】
（表９Ａ）ＸＰＡ．８５．２８７、ＸＰＡ．８５．３３９、ＸＰＡ．８５．３４０、およびＸＰＡ．８５．３４１
2019526244.tif 000011
【０３５４】
（表９Ｂ）ＸＰＡ．８５．２８８、ＸＰＡ．８５．３２６、およびＸＰＡ．８５．３２７、ならびにそれらの発現最適化バージョン、ＸＰＡ．８５．３２８、ＸＰＡ．８５．３２９、およびＸＰＡ．８５．３３０
2019526244.tif 000012
【０３５５】
（表９Ｃ）ＸＰＡ．８５．３３１、ＸＰＡ．８５．３３２、ＸＰＡ．８５．３３３、およびＸＰＡ．８５．３３４
2019526244.tif 000013
表９：親和性成熟抗ＰＴＨ１Ｒ抗体のＣＨＯ−Ｋ１製造可能性評価の結果。報告された値は、１：１のＬＣ：ＨＣ比で１００に設定された「高発現」対照抗体。ＸＢ１０の発現に対するものである。最も高い発現は、太字で強調表示される。抗体のうちの３つに、発現の最適化を実施した。
【０３５６】
親和性成熟抗体ＸＰＡ．８５．２８７、ＸＰＡ．８５．３３９、ＸＰＡ．８５．３４０、およびＸＰＡ．８５．３４１では、１：２のＨＣ：ＬＣ比で最高の発現が観察された（表９Ａ）。発現は、１：１のＨＣ：ＬＣ比では１：２よりも低かったが、１：１の比で達成された濃度は、細胞株の発達に許容できる。３つの他の親和性成熟抗体、ＸＰＡ．８５．２８８、ＸＰＡ．８５．３２６、およびＸＰＡ．８５．３２７は、１：１のＨＣ：ＬＣ比で非常に低い発現を示した。特にＶ領域ＤＮＡ配列の発現最適化後に、１：１のＨＣ：ＬＣ比では、これらの抗体３つ全てにおいて、発現の顕著な改善が観察された。提示されたＸＰＡ．５８．３２８（ＸＰＡ．８５．２８８の最適化バージョン）＞１０倍増加、対ＸＰＡ．８５．２８８。提示されたＸＰＡ．８５．３２９（ＸＰＡ．８５．３２６の最適化バージョン）約３．５倍増加、対提示されたＸＰＡ．８５．３２６およびＸＰＡ．８５．３３０（ＸＰＡ．８５．３２７の最適化バージョン）約６．５倍増加、対ＸＰＡ．８５．３２７（表９Ｂ）。
【０３５７】
４つのさらなる親和性成熟抗体、ＸＰＡ．８５．３３１、ＸＰＡ．８５．３３２、ＸＰＡ．８５．３３３、およびＸＰＡ．８５．３２４もまた、ＣＨＯ製造可能性について評価した。４つ全ての抗体は、１：１のＨＣ：ＬＣ比で低い発現を示し、発現が乏しいＸＥ１７抗体以下であった（表９Ｃ）。発現は、１：２のＨＣ：ＬＣ比で２〜２．５倍高かった。ＸＰＡ．８５．３３４発現は、このアッセイにおける最小許容濃度を下回り、さらなる発現の改善なしに細胞株の発生を開始するのに適格であった。
【０３５８】
実施例７：抗ＰＴＨ１Ｒ受容体抗体のインビボ効果の測定
Ａ．甲状腺副甲状腺摘出（ＴＰＴｘ）モデル
ラットＰＴＨ１Ｒと交差反応することがわかった抗ヒトＰＴＨ１Ｒ受容体抗体を、原発性副甲状腺機能亢進症（ＰＴＨ用）および悪性腫瘍随伴体液性高カルシウム血症（ＰＴＨｒＰ用のＨＨＭ）のインビボモデルで試験した。甲状腺副甲状腺摘出（ＴＰＴｘ）モデルでは、内因性のカルシトロピックペプチドホルモン、ＰＴＨ、およびカルシトニンの効果は、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）雄性ラット（ローリー、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内の甲状腺および副甲状腺の外科的除去によって除去される。次いで、術後の低い血清カルシウム濃度が厳密に管理された設定で得られる。甲状腺ペレット（Ｌ−チロキシンＴ４、０．２５ｍｇ、６０日間の徐放、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を麻酔下で皮下に埋め込む。次いで、頸静脈に、ＰＴＨ（１−３４）の６時間連続注入のためにカニューレ挿入する（１ｍＬ／ｋｇ／時の速度での１．２５μｇ／ｋｇ／時）。このモデルは、ＰＴＨ（１−３４）静脈内注入によって誘導された血清カルシウム濃度の増加に影響を与えるＰＴＨ１Ｒ抗体の能力を評価するために使用された。
【０３５９】
抗ＰＴＨ１Ｒ受容体抗体が血清カルシウム濃度のＰＴＨ（１−３４）誘導性上昇を減少させるかどうかを決定するために、ＰＴＨ（１−３４）注入開始の１８時間前に、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）雄ラット（ｎ＝５〜６／群）を、抗体ＸＰＡ．８５．０１７（Ａｂ０１７）、ＸＰＡ．８５．２８７（Ａｂ２８７）、ＸＰＡ．８５．２８８（Ａｂ２８８）、およびＢＭ２（抗ＰＴＨ抗体）、またはアイソタイプ対照（１５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に投与した（図１７）。
【０３６０】
抗ＰＴＨ抗体は、Ａｂｇｅｎｉｘの抗体ＩＤ＃１８３（米国特許第７，３１８，９２５Ｂ２号）に基づいた。重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）Ｖ領域配列は、ＣＨＯ細胞内の産生のために最適化され、かつクローニングのための適切な制限部位を用いて合成された発現であった（ＧｅｎｅＡｒｔ）。ＤＮＡを、シグナル配列、およびＬＣまたはＨＣ定常領域を含有する一過性発現プラスミドにクローニングした。各ＨＣまたはＬＣは、ヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）プロモーターおよびマウス軽鎖３’非翻訳領域の制御下にある。発現プラスミドはまた、エプスタインバールウイルス複製起点を含み、エプスタインバールウイルス核抗原を含有する細胞株での複製を可能にする。Ｅｘｐｉ２９３発現系（カルフォルニア州、カールスバッド、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた一過性発現を用いて、インビトロおよびインビボ研究用の抗ＰＴＨ抗体を産生した。抗体精製を、Ａｒａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カリフォルニア州、モーガンヒル）で行った。
【０３６１】
血清カルシウムを、投与前（ベースライン）、注入前（Ｔ０）、注入開始から２、４、および６時間後に測定した。最初の４時間の注入にわたって、アイソタイプ群の総カルシウム濃度は増加した。Ａｂ２８７を投与されたラットでは、カルシウム濃度はアイソタイプ対照群の濃度と同程度であった。Ａｂ０１７を投与したラットのカルシウム濃度はわずかに減少した。アイソタイプ対照と比較して、ＢＭ２およびＡｂ２８８を投与されたラットは、注入を通して顕著により低い濃度のカルシウムを有した。
【０３６２】
Ｂ．ｈＰＴＨ（１−３４）注入モデル
カルシウム血症対照に対する抗ＰＴＨ１Ｒ受容体抗体の効果をさらに評価するために、ｈＰＴＨ（１−３４）を、副甲状腺機能亢進症患者のＰＴＨ過剰分泌を模倣するために、正常なＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ）に７日間連続的に皮下注射した（Ａｌｚｅｔ  ｍｉｎｉ  ｐｕｍｐ、２ＭＬ１、１０μｌ／時、１０μｇ／ｋｇ／日）。カルシウムを、ポンプ移植の２４時間後、Ａｂ２８８（２または１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５／群）、ＢＭ２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５）、またはアイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２）の単回静脈内投与によるインビボ中和を評価するためのバイオマーカーとして測定した（図１８）。
【０３６３】
血清カルシウムを、ポンプ移植前（投与前）、ポンプ移植の２４、２７（投与の３時間後）、４８、７２、９６、１２０、１４４、および１６８時間後に測定した。最初の７２時間の注入で、アイソタイプ群の総カルシウム濃度は上昇した。アイソタイプ対照と比較して、ＢＭ２およびＡｂ２８８（２および１０ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットは、投与後２４時間および注入全体を通してカルシウム濃度が顕著に低かった（２ｍｇ／ｋｇのＡｂ２８８の血清カルシウム濃度の効果は、１０ｍｇ／ｋｇのＢＭ２のものと同程度であった）。１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ２８８は、劇的な低カルシウム血症効果を生じた（図１８Ａ）。
【０３６４】
抗体、Ａｂ３２８、Ａｂ３２９、およびＡｂ３３０（２ｍｇ／ｋｇのＩＶ）を同様の研究で試験し、血清カルシウムを、ポンプ移植前（Ｐｒｅｄｏｓｅ）、ポンプ移植の２４、２７（投与の３時間後）、４８、７２、９６、および１２０時間後に測定した。全ての抗体は、投与後２４時間および注入を通してカルシウム濃度を顕著に低下させ、Ａｂ２８８およびＡｂ３２８が総血清カルシウム濃度の最も劇的な減少をもたらした（図１８Ｂ）。
【０３６５】
Ｃ．ｈＰＴＨｒＰ（１−３６）注入モデル
同様に、ＰＴＨｒＰ活性の阻害での抗ＰＴＨ１Ｒ受容体抗体の効果は、ｈＰＴＨｒＰ（１−３６）を６日間、正常なＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ）に連続的に皮下注入（Ａｌｚｅｔミニポンプ、モデル２ＭＬ１、１０μｌ／時、１００μｇ／ｋｇ／日）して、副甲状腺機能亢進症を有する患者の高カルシウム血症を模倣することによって評価した。カルシウムを、ポンプ移植の２４時間後、Ａｂ２８８（２または１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝４／群）、抗ＰＴＨｒＰ抗体ＭＣＢ１．１（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５）、またはアイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝３）の単回静脈内投与による生体内中和を評価するために、バイオマーカーとして測定した。
【０３６６】
抗ＰＴＨｒＰ抗体重鎖および軽鎖Ｖ領域配列は、Ｏｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：２６６５−２６７４，２００４に基づいた。重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）Ｖ領域配列は、ＣＨＯ細胞内の産生のために最適化され、かつシグナル配列、およびＬＣまたはＨＣ定常領域を含有する一過性発現プラスミドへのクローニングのために適切な制限部位（ＧｅｎｅＡｒｔ）で合成された発現であった。各ＨＣまたはＬＣは、ヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）プロモーターおよびマウス軽鎖３’非翻訳領域の制御下にある。発現プラスミドはまた、エプスタインバールウイルス複製起点を含み、エプスタインバールウイルス核抗原を含有する細胞株での複製を可能にする。Ｅｘｐｉ２９３発現系（カルフォルニア州、カールスバッド、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた一過性発現を用いて、インビトロおよびインビボ研究用の抗ＰＴＨｒＰ抗体を産生した。抗体精製を、Ａｒａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カリフォルニア州、モーガンヒル）で行った。
【０３６７】
血清カルシウムを、ポンプ移植の前（投与前）、ポンプ移植の２４、２６（投与の２時間後）、４８、７２、９６、１２０、および１４４時間後に測定した（図１９Ａ）。体重を、ポンプ移植前（投与前）、ポンプ移植の２６（投与の２時間後）、４８、９６、および１４４時間後に測定した（図１９Ｂ）。
【０３６８】
最初の４８時間の注入で、アイソタイプ群の総カルシウム濃度は上昇した。アイソタイプ対照と比較して、ＭＣＢ１．１およびＡｂ２８８（２および１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたラットは、投与の２４時間後でカルシウムの濃度が顕著により低かった。これらのより低いカルシウム濃度は、Ａｂ２８８（２および１０ｍｇ／ｋｇ）への注入を通して持続した。２ｍｇ／ｋｇのＡｂ２８８の血清カルシウム濃度に対する効果は、１０ｍｇ／ｋｇのＭＣＢ１．１のものよりも顕著であった。Ａｂ２８８（１０ｍｇ／ｋｇ）は劇的な低カルシウム血症作用を生じた。ＰＴＨｒＰ（１−３６）注入は、Ａｂ２８８（２および１０ｍｇ／ｋｇ）によって妨げられていた体重減少を誘発した。
【０３６９】
これは、抗ＰＴＨ１Ｒ抗体が健康上の利点を有し、深刻な体重減少をもたらす悪液質、脂肪および骨格筋組織の消耗性障害を潜在的に予防し得ることを示唆する。
【０３７０】
パイロット試験は、ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの投与量の注入が、死亡率に関連して、１４ｍｇ／ｄＬより高い血清カルシウムの濃度を生じ得ることを示した。抗ＰＴＨ１Ｒ抗体による処置は、高カルシウム血症（＞１４ｍｇ／ｄＬ）を予防することができ、したがってＨＨＭの死亡率を予防することができる（生存利点）。
【０３７１】
Ｄ．腫瘍モデル
抗ＰＴＨ１Ｒ受容体抗体が腫瘍誘導性の血清カルシウム濃度の上昇を減少させるかどうかを決定するために、血清カルシウムが３つの異なる腫瘍モデル（それぞれマウス結腸Ｃ２６、ヒト前立腺ＰＣ−３、およびヒト肺癌ＨＡＲＡ−Ｂ）において上昇していることが見出された後、６週齢のＣＤＦ１雌マウス、または無胸腺ヌード（ＮＣｒ−ｎｕ／ｎｕ）マウスに、抗体ＸＰＡ．８５．３２８（Ａｂ３２８）（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。それぞれの細胞を培養し、必要な数の細胞が得られたら、各マウスの右側腹部に５００万個（５×１０６）のＣ２６細胞、１０００万個（１×１０７）個のＰＣ−３細胞、または１０００万個（１×１０７）のＨＡＲＡ−Ｂ細胞を、０．１ｍＬの無血清培地中でＳＣ注射した。血清カルシウムを、高カルシウム血症が観察されるまで（＞１２ｍｇ／ｄＬ）（通常は腫瘍が＞１０００ｍｇであるとき）、定期的に測定した。次いで、マウスをＡｂ３２８  １０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖで処置し、ＨＡＲＡ−Ｂモデルでは、＞１ｇの腫瘍を有するマウスの別の群を、１０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖでアイソタイプ（陰性対照、抗ＫＬＨ  Ｇ２）で処置し、総カルシウム濃度を投与後２４時間で決定した。
【０３７２】
３つのパイロット研究全てにおいて、抗ＰＴＨ１Ｒ抗体Ａｂ３２８による処置は、腫瘍誘導性高カルシウム血症を＞３ｍｇ／ｄＬ減少させ、抗ＰＴＨ１Ｒ抗体が、対象の腫瘍のインビボカルシウム濃度の上昇をもたらす癌の処置にも有用であることを示唆する。
【０３７３】
マウスｃｏｌｏｎ  ２６腫瘍関連高カルシウム血症に対する抗ＰＴＨ１Ｒ  ｍＡｂ、ＸＰＡ．８５．３４９の効果
ＸＰＡ．８５．２８８の発現最適化変異体であるＸＰＡ．８５．３４９（Ａｂ３４９）を、腫瘍関連高カルシウム血症のマウスｃｏｌｏｎ  ２６モデルにおいて評価した。６週齢のＣＤＦ１雌マウス、または無胸腺ヌード（ＮＣｒ−ｎｕ／ｎｕ）マウスを試験に使用した。ｃｏｌｏｎ  ２６マウス結腸腫瘍細胞を培養し、各マウスの右脇腹に、０．１ｍＬの無血清培地中で７５０万個の細胞（７．５×１０６）Ｃ２６細胞を皮下注射した。血清カルシウムを、高カルシウム血症が観察されるまで（＞１２ｍｇ／ｄＬ）（通常は腫瘍が＞１０００ｍｇであるとき）、定期的に測定した。次いで、マウスを、２または６ｍｇ／ｋｇのＡｂ３４９で静脈内処置し、＞１０００ｍｇの腫瘍を有する別の群のマウスを６ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ（陰性対照、抗ＫＬＨ  Ｇ２）で静脈内処置した。腫瘍重量および血清試料を、処置前、処置の２４、４８、および７２時間後に採取した。総カルシウム濃度を、処置の２４、４８、７２、および１２０時間後に決定した。腫瘍重量（ｍｇ）を、楕円球のための方程式（ｌ×ｗ２）／２＝ｍｍ３を使用して計算し、式中、ｌおよびｗは、各測定で収集されたより大きいおよびより小さい寸法を指し、単位密度（１ｍｍ３＝１ｍｇ）を想定している。
【０３７４】
抗ＰＴＨ１ＲのＡｂ３４９は、投与後最大１２０時間の持続期間にわたってマウスｃｏｌｏｎ  ２６腫瘍関連高カルシウム血症を強力に減少させる（すなわち、総血清カルシウムを顕著に減少させる）ことが見出された（図２０Ａ）。この腫瘍モデルにおいて、Ａｂ３４９は、２４時間以内に高カルシウム血症を完全に元に戻すことができた。Ａｂ３４９の投与は、投与後最大１２０時間、体重（図２０Ｂ）または腫瘍重量（図２０Ｃ）に顕著な影響を及ぼさなかった。
【０３７５】
血清中のＰＴＨｒＰおよびＰＴＨの濃度を、Ａｂ３４９抗体を投与した後の異なる時点で測定した。抗体を、高カルシウム血症ｔ０の期間に、２および６ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した（ｎ＝２〜６マウス／群）。投与後２４、４８、７２、および１２０時間に後眼窩副鼻腔から血液試料を採取し、ＰＴＨｒＰ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ−ＥＩＡキット、カタログ番号：ＥＫ−０５６−０４）およびマウスＰＴＨ１−８４（ＱＵＩＤＥＬマウスＰＴＨ  １−８４  ＥＬＩＳＡキット、カタログ番号：６０−２３０５）の濃度を測定した。図２０Ｄに示されるように、血清ＰＴＨｒＰは担癌マウスで上昇しており、Ａｂ３４９での処置はＰＴＨｒＰ濃度を顕著に変化させるようには見えなかったが、Ａｂ３４９はＰＴＨｒＰ活性を阻害した。しかしながら、対照的に、２または６ｍｇ／ｋｇのＡｂ３４９での処置は、投与後最大１２０時間、ＰＴＨ濃度を顕著に増加させた（図２０Ｅ）。
【０３７６】
血清薬物濃度（ＳＤＣ）測定を、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって実施した。ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように実施し、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＦｃでコーティングし、プレートをＰＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡで、室温、１〜４時間遮断した。ＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡ中の様々な希釈度の血清試料を添加し、３７℃で１時間インキュベートした（最後の５分間で、０．２μｇ／ｍｌのビオチンＳＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ’）を添加した）。続いて、プレートをＰＢＳ／ｔｗｅｅｎですすぎ、１×ＤＥＡ緩衝液中のＰｉｅｒｃｅ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート、二ナトリウム塩（ｐＮＰＰ）とともに、室温で１時間インキュベートした。比色反応を、１ＮのＮａＯＨを添加することによって停止した。プレートを、分光光度計で４０５ｎＭで読み取った。ＳＤＣ測定は、１２０時間にわたるＡｂ３４９の正常な排泄を示した。
【０３７７】
静脈内注射後のＡｂ３４９の薬物動態プロファイルを作成するために、いくつかの薬物動態測定を実施した。ＣＤＦ１雌マウスに、２ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇでＡｂ３４９の単回投与ボーラスを投与した。Ａｂ３４９の投与後２４、４８、７２、および１２０時間後に後眼窩副鼻腔から血液試料を採取し、その濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを用いてデータを分析した。２または６ｍｇ／ｋｇのＡｂ３４９に続く薬物動態学的パラメータを（表１０）に示す。６ｍｇ／ｋｇで投与した場合、Ａｂ３４９はマウスにおいて最大４８時間の半減期を有することが示された。
【０３７８】
（表１０）Ａｂ３４９のｐＫパラメータ
2019526244.tif 000014
【０３７９】
要約すると、この非常に強力なＰＴＨ１Ｒ受容体アンタゴニスト抗体は、副甲状腺機能亢進症、悪性腫瘍随伴体液性高カルシウム血症、およびいくつかの癌に見られるＰＴＨｒＰ媒介悪液質を含む様々な症状において、価値ある治療薬となる可能性を有する。さらには、Ａｂ３４９抗体は、＜２ｍｇ／ｋｇの高カルシウム血症のモデルを、＜６ｍｇ／ｋｇの最大投与量および延長された作用期間（すなわち、半減期よりも長く持続）で処置するのに有効であった。
【０３８０】
上記の例示的な実施例に記載されるような本開示における多数の修正および変形は、当業者には想起されると予想される。したがって、特許請求の範囲に見られるそのような限定のみが、本発明に課せられるべきである。
【図１Ａ】
2019526244.tif 000015
【図１Ｂ】
2019526244.tif 000016
【図２】
2019526244.tif 000017
【図３】
2019526244.tif 000018
【図４】
2019526244.tif 000019
【図５】
2019526244.tif 000020
【図６Ａ】
2019526244.tif 000021
【図６Ｂ】
2019526244.tif 000022
【図６Ｃ】
2019526244.tif 000023
【図６Ｄ】
2019526244.tif 000024
【図７】
2019526244.tif 000025
【図８】
2019526244.tif 000026
【図９Ａ】
2019526244.tif 000027
【図９Ｂ】
2019526244.tif 000028
【図９Ｃ】
2019526244.tif 000029
【図９Ｄ】
2019526244.tif 000030
【図１０】
2019526244.tif 000031
【図１１】
2019526244.tif 000032
【図１２】
2019526244.tif 000033
【図１３】
2019526244.tif 000034
【図１４】
2019526244.tif 000035
【図１５】
2019526244.tif 000036
【図１６】
2019526244.tif 000037
【図１７】
2019526244.tif 000038
【図１８】
2019526244.tif 000039
【図１９】
2019526244.tif 000040
【図２０Ａ】
2019526244.tif 000041
【図２０Ｂ】
2019526244.tif 000042
【図２０Ｃ】
2019526244.tif 000043
【図２０Ｄ】
2019526244.tif 000044
【図２０Ｅ】
2019526244.tif 000045
【図２１−１】
2019526244.tif 000046
【図２１−２】
2019526244.tif 000047
【図２１−３】
2019526244.tif 000048
【図２１−４】
2019526244.tif 000049
【図２１−５】
2019526244.tif 000050
【図２１−６】
2019526244.tif 000051
【図２１−７】
2019526244.tif 000052
【図２１−８】
2019526244.tif 000053
【図２１−９】
2019526244.tif 000054
【図２１−１０】
2019526244.tif 000055
【図２１−１１】
2019526244.tif 000056
【図２１−１２】
2019526244.tif 000057
【図２１−１３】
2019526244.tif 000058
【図２１−１４】
2019526244.tif 000059
【図２１−１５】
2019526244.tif 000060
【図２１−１６】
2019526244.tif 000061
【配列表】
2019526244000001.app
【国際調査報告】
2019526244.tif 000062
2019526244.tif 000063
2019526244.tif 000064
2019526244.tif 000065