(57)【要約】（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ本発明は、脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子を含むクロストリディウム種を提供する。さらに、そのようなクロストリディウム種を使用して、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸、またはその塩、および／または（Ｒ）−３−ブタンジオールを生産する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子を含むクロストリディウム種を培養することを含む、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および／またはその塩、および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項２】
嫌気性または微好気性の条件下で、クロストリディウム種を培養することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
生産された（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および／またはその塩、および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを精製する工程を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
遺伝子はＰｈａＢである、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸異性体は、３−ヒドロキシ酪酸の１００％を構成するか、または（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸異性体は形成された３−ヒドロキシ酪酸の９０−１００％を構成し、（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸異性体が形成された３−ヒドロキシ酪酸の０−１０％を構成する、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
形成された１，３−ブタンジオールは、１００％の（Ｒ）−１，３−ブタンジオール異性体であるか、または、形成された１，３−ブタンジオールは、９０−１００％の（Ｒ）−１，３−ブタンジオール異性体と０−１０％の（Ｓ）−１，３−ブタンジオール異性体を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
クロストリディウム種がチオエステラーゼを発現することができるノンネイティブ遺伝子をさらに含む、請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
チオエステラーゼを発現することができる遺伝子はＴｅｓＢである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
クロストリディウム種がＳ−ステレオ特異性クロトナーゼを含む、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
クロストリディウム種が、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに変換することのできる、１以上のネイティブ非基体特異性脱水素酵素／還元酵素を含む、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
クロストリディウム種が、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに変換することのできる、非基体特異性アルデヒド脱水素酵素および／またはアルコール脱水素酵素を発現することができる、１以上のノンネイティブ遺伝子を含む、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子が、クロストリディウム種の染色体へインテグレートされている、請求項１から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
クロストリディウム種の、ブタノール、アセトン、エタノール、酪酸塩、酢酸塩および／または乳酸塩の生産に関与するネイティブの遺伝子の発現が、低減またはノックアウトされている、請求項１から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
クロストリディウム種のネイティブのｐｔｂ、ｂｕｋ、ｈｂｄおよび／またはアルコール／アルデヒド脱水素酵素の発現が、低減またはノックアウトされている、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか１項記載の方法によって生産された、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸、および／またはその塩、および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオール。
【請求項１６】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子を含むクロストリディウム種。
【請求項１７】
ノンネイティブ遺伝子がＰｈａＢである、請求項１６記載のクロストリディウム種。
【請求項１８】
チオエステラーゼを発現することができるノンネイティブ遺伝子を含む、請求項１６または１７記載のクロストリディウム種。
【請求項１９】
Ｓ−ステレオ特異性クロトナーゼを含む、請求項１６から１８のいずれか１項記載のクロストリディウム種。
【請求項２０】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに変換することのできる、１以上のネイティブ非基体特異性脱水素酵素／還元酵素を含む、請求項１６から１９のいずれか１項記載のクロストリディウム種。
【請求項２１】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに変換することのできる、非基体特異性アルデヒド脱水素酵素および／またはアルコール脱水素酵素を発現することができる、１以上のノンネイティブ遺伝子を含む、請求項１６から２０のいずれか１項記載のクロストリディウム種。
【請求項２２】
クロストリディウム種はクロストリジウムアセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム−ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）またはクロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）である、請求項１６から２１のいずれか１項記載のクロストリディウム種。
【請求項２３】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子が、クロストリディウム種の染色体へインテグレートされている、請求項１６から２２のいずれか１項記載のクロストリディウム種。
【請求項２４】
クロストリディウム種の、ブタノール、アセトン、エタノール、酪酸塩、酢酸塩および／または乳酸塩の生産に関与するネイティブの遺伝子の発現が、低減またはノックアウトされている、請求項１６から２３のいずれか１項記載のクロストリディウム種。
【請求項２５】
クロストリディウム種のネイティブのｐｔｂ、ｂｕｋ、ｈｂｄおよび／またはアルコール／アルデヒド脱水素酵素の発現が、低減またはノックアウトされている、請求項２４記載のクロストリディウム種。
【請求項２６】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを発現することができるノンネイティブ遺伝子をクロストリディウム種に組込むことを含む、請求項１６から２５のいずれか１項記載のクロストリディウム種。
【請求項２７】
ノンネイティブ遺伝子がクロストリディウム種の染色体へインテグレートされている、請求項２６記載のクロストリディウム種。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子を含むクロストリディウム種に関し、また（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸、またはその塩、および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの、そのようなクロストリディウムを使用した生成方法に関する。
【０００２】
微生物発酵を利用する化学薬品のバイオ製造はグローバルなバイオ経済において重要な役割を果たし、次の十年間の間の急成長が期待される。再生可能な化学薬品に対する要望は、より安く、より純粋で、より持続可能な生成物の必要によって導かれる。特定の立体化学を備えた官能性キラル化学薬品の生産が、スペシャル化学薬品および医薬品工業で特に重要である。
【０００３】
キラル化学薬品はＲおよびＳという名の、２つの形式（鏡像異性体）で存在する。これらは構成原子は同一であるが、それらの構成する原子が異って配置されるスーパーインポーズできない鏡像である。多くの（生体内）用途では、分子の１つの鏡像異性体は不活性で、ある場合には細胞へ有毒になりえる；製薬産業および機能性食品産業においてはキラルの純度が多くの場合特に重要である。化学合成は特異的ではなく、それにより混合キラル鏡像異性体に帰着する。純粋な鏡像異性体をもたらす分離は高価で、望まれない副産物を生成する過酷な反応条件をしばしば含んでいる。
【０００４】
発酵プロセス技術は公知の微生物（酵母、かん菌または大腸菌のいずれか）に依存し、それは遺伝学的に操作し好気条件下で培養するのが比較的簡単である。しかしながら、現在まで、プロセスの非能率性のため、商業化された化学製品はほとんどない。バイオ製造するための飼育された微生物のプラットフォームのパレットを増殖することは、供給材料と化学製品のレパートリーを増加させるのに重大であると想われる。
【０００５】
クロストリディウム・バクテリアは丈夫な産業宿主である。また、成功したりしなかったりとはいえ、クロストリディウム発酵プロセスはほぼ１００年間、溶剤、アセトン、およびブタノールの商業生産に使用されている。しかしながら、代謝の生化学は複雑である。また、株発育による発酵改良が問題であると分かった。ブタノール生産における中心代謝経路内のいくつかの突然変異、つまり遺伝子エンコーディング・クロトナーゼは致死性と分かった。これらの要因は化学生産のための新しいクロストリディウム菌株の開発のための障壁を示す。
【０００６】
したがって、好ましいアプローチは、遺伝学的操作と好気条件下での培養がより簡単な、新しい宿主（たとえば大腸菌）へ、クロストリディウム（および他の操作するのが困難な微生物）から還元酵素（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ）をコードするいくつかの遺伝子を移すことだった。しかしながら、これは複数の遺伝子を含む複雑な遺伝子工学を要求する。
【０００７】
Ｔｓｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７５（１０）ｐ３１３７−３１４５は、グルコースと、好気発酵で、遺伝子操作された大腸菌（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ）中での（Ｒ）および（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートを生産する方法について記述している。Ｔｓｅｎｇらは、３つまたは５つの異種遺伝子の導入により、アセチルＣｏＡから両方の鏡像異性体を生産する方法について記述する。
【０００８】
Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｏｌ．１１５（５）ｐ４７５−４８０は、グルコースを使用する好気発酵と、エンジニアード大腸菌を使用して、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生産する方法について記述する。Ｋａｔａｏｋａらは、４つの異種遺伝子を使用して、アセチルＣｏＡから（Ｒ）−１，３ブタンジオールを生産する方法について記述する。
【０００９】
本発明は、公知技術の困難に取り組む。本発明は、遺伝子的に操作されたクロストリディウム・バクテリア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、およびクロストリディウムを使用したキラル化学薬品の生産のための発酵プロセスに関する。
【００１０】
本発明は、３−ヒドロキシ酪酸、またはその塩、および／または１，３−ブタンジオールである化学薬品を生産するクロストリディウムを遺伝子的に操作する方法を提供する；より具体的には、本発明は、遺伝子ノックアウトを要求せずに、炭素フラックス（ｃａｒｂｏｎ  ｆｌｕｘ）をリディレクト（ｒｅ−ｄｉｒｅｃｔ）する方法に関する。
【００１１】
クロストリディウム宿主は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素（Ｈｂｄ）によって触媒された反応で、Ｓ対掌体のアセトアセチルＣｏＡから細胞内代謝物質である３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを生産する。続いて、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡはクロトナーゼによって触媒され、酪酸および／またはブタノール生産に結びつくＣ４経路の第２ステップを行う。
【００１２】
本発明は、自然なＳ型ではなく、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを生産する、（Ｒ）特異性のヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素の導入と発現に関する。ネイティブのクロトナーゼ酵素（ｎａｔｉｖｅ  ｃｒｏｔｏｎａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ）は、Ｓ型に対してより大きな特異性を持っており、効果的にＲ型に触媒作用を及ぼすことができない。この細胞内の代謝物質の立体化学の変化は、他の経路を下る炭素フラックスのリ−ディレクションに帰着し、それは基体を利用することができ、酪酸とブタノールに結びつく正常なＣ４経路から離れる。続いて、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素の導入は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの生産を可能にする（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（アセトアセチルＣｏＡから）を生産する。どちらの生成物も、クロストリディウムによっては通常生産されない。新しい代謝経路は、過剰な還元力を消費し、かつＡＴＰの形でのエネルギーを提供する代替ルートを提供する。
【００１３】
本発明は、発酵プロセスおよびクロストリディウム種を提供する。異種遺伝子の導入が光学活性物質を生産する新規なクロストリディウム種を提供する。プロセスとクロストリディウムは、別個または一緒に化合物（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生産するために特に使用されることができる。
【００１４】
本発明の第１の態様は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および／またはその塩、および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの製造方法、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ）を含むクロストリディウム種を培養することを含む方法を提供する。
【００１５】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素を発現することができる異種遺伝子の導入は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの（Ｒ）体の生産に帰着する。次いで、ネイティブの還元酵素はこの（Ｒ）体を、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに変換する。
【００１６】
ネイティブの酵素、たとえばホスホトランスブチリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｂｕｔｙｒｙｌａｓｅ）（Ｐｔｂ）および酪酸キナーゼ（Ｂｕｋ）は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート−リン酸塩を介して、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に変換する。ネイティブのアルデヒドおよびアルコール脱水素酵素、または二官能性のアルデヒド／アルコール脱水素酵素（すなわちＡｄｈＥ）は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチルアルデヒドを介して、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに変換する。
これらのネイティブの還元酵素は、クロストリディウムの中に天然である３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのＳ型にもかかわらず、Ｒ型に触媒作用を及ぼす。
【００１７】
本発明の方法は、嫌気性または微好気性の環境下でクロストリディウム種を培養することを含む。
【００１８】
本発明の方法は、培地から生成された（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸、または（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート塩、および／または、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを分離するステップを含むことができる。
【００１９】
本発明の方法は以下の希望の最終生産物を生産することができる：１００％の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸異性体を含む３−ヒドロキシ酪酸、あるいは９０−１００％の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸異性体および０−１０％の（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸異性体を含む３−ヒドロキシ酪酸；および／または１００％の（Ｒ）−１，３−ブタンジオール異性体を含む１，３−ブタンジオール、または９０−１００％の（Ｒ）−１，３−ブタンジオール）異性体および０−１０％の（Ｓ）−１，３−ブタンジオール異性体を含む１，３−ブタンジオール。
【００２０】
本発明の方法は、５：１より大きな、１０：１より大きな、５０：１より大きな、１００：１より大きなモル比の、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸と（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸の、希望の最終生産物を生産することができる。１つの実施態様では、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸と（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸の比率は、約１００−５：１、１００−５０：１、１００−２０：１、５０−５：１、２０−５：１、１５−５：１、または約１５−１０：１の範囲にある。
【００２１】
本発明の方法は、５：１以上、１０：１以上、２０：１以上、または５０：１以上のモル比の、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールと（Ｓ）−１，３−ブタンジオールである１，３−ブタンジオールを生産することができる。１つの実施態様では、（Ｒ）−１，３−ブタンジオール対（Ｓ）−１，３−ブタンジオールの比率は約１００−５：１、５０−５：１、２５−５：１、１５−５：１、または約２５−１０：１である。
【００２２】
本発明は、本発明の方法により生産された（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸、および／またはその塩、および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールにも関する。
【００２３】
本発明の第２の態様は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子を含むクロストリディウム種に関する。
【００２４】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素は、遺伝子操作されたクロストリディウム中で、アセトアセチルＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する。本発明のクロストリディウム種は溶媒発生（ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）または酸発生性のクロストリディウム種であることができる。１つの実施態様では、クロストリディウム種は溶媒発生性種である。溶媒発生性種が使用される場合、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素の発現することができる単一のノンネイティブの遺伝子の導入は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生産することができるクロストリディウム株に帰着する。
【００２５】
本発明のクロストリディウム種は非限定的に以下を含む；クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム−アルブスチ（Ｃ．ａｒｂｕｓｔｉ）、クロストリジウム−オーランチブチリカム（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム−オートエタノゲマム（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｍｕｍ）、クロストリジウム−ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム−チロブチリカム（Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム−ベイジェリンキー（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウム−カルボキシデボランズ（Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム−セルロボランズ（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム−セルロリチカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム−ディオリス（Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ）、クロストリジウム−ホモプロピオニカム（Ｃ．ｈｏｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、クロストリジウム−リジュングダヒリ（Ｃ．ｌｉｊｕｎｇｄａｈｌｉ）、クロストリジウム−クルイベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、クロストリジウム−マグナム（Ｃ．ｍａｇｎｕｍ）、クロストリジウム−ノビイ（Ｃ．ｎｏｖｙｉ）、クロストリジウム−プニセウム（Ｃ．ｐｕｎｉｃｅｕｍ）、クロストリジウム−ラグスダレイ（Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ）、クロストリジウム−ロゼウム（Ｃ．ｒｏｓｅｕｍ）、クロストリジウム−パーフリンゲンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム−サッカロブチリカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム−サッカロリチカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム−サッカロブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、クロストリジウム−サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、クロストリジウム−サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム−テタノモルファン（Ｃ．ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ）、クロストリジウム−サーモブチリカム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム−サーモスクシノジーンズ（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム−サーモパルマニウム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐａｌｍａｒｉｕｍ）、クロストリジウム−チロブチリカム（Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム−フィトフェルメンテンズ（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔｅｎｓ）およびクロストリジウム−パステルリアナム（Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）。好ましくは、種はクロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）またはクロストリジウム−ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）である。
【００２６】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．３６）を発現することができる遺伝子は選択されているが、ラルストニア  ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、クプリアウィドゥス  ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、かん菌属、クレブセリア属（Ｋｌｅｂｓｅｌｌｉａｓｐ）、シュードモナス属、たとえばｐｈｂＢおよびｐｈａＢを含む生物からの遺伝子に制限されない。
遺伝子の例は表１に示される。
【００２７】
【表１−１】
2019509043.tif 000002
【００２８】
【表１−２】
2019509043.tif 000003
【００２９】
１つの実施態様では、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素遺伝子はｐｈａＢである。ｐｈａＢの導入は、クロストリディウムによる２つの生成物、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの生産に帰着することができる。ｐｈａＢ遺伝子のシーケンスはクロストリディウムのためにコドン最適化されることができる。ｐｈａＢのシーケンスは図２Ａに示されるシーケンス（配列番号：１）を含むことができる。非−ネイティブの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素をコードする核酸は、図２ＡのｐｈａＢシーケンス（配列番号：１）と、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０および９５％または９９％の配列同一性があるシーケンスを含むことができる。多くの方法が２つのシーケンス間の同一性を決定するために利用可能である。シーケンス間の同一性を決定する好ましいコンピュータ・プログラムとしてはＢＬＡＳＴ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０，１９９０）が挙げられるが、これに制限されていない。好ましくは、コンピュータ・プログラムのデフォルトのパラメーターが使用される。
【００３０】
本発明のクロストリディウム種は、さらにチオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ）を発現することができるノンネイティブの遺伝子を含んでいてもよい。チオエステラーゼは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの（Ｓ）および（Ｒ）体をそれぞれ３−ヒドロキシブチレート／３−ヒドロキシ酪酸の（Ｓ）および（Ｒ）体に変換する。
【００３１】
チオエステラーゼを発現することができる遺伝子は、ＴｅｓＢを含むが、これに制限されない。好ましくは、ＴｅｓＢは大腸菌からのものである。ＴｅｓＢ遺伝子のシーケンスはクロストリディウムのためにコドン最適化されることができる。ＴｅｓＢのシーケンスは図２Ｂに示されるシーケンス（配列番号：２）を含むことができる。
ＴｅｓＢをコードする核酸は、図２ＢのＴｅｓＢシーケンス（配列番号：２）と、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０および９５％または９９％の配列同一性があるシーケンスを含むことができる。
【００３２】
１つの実施態様では、クロストリディウム種はＳ立体特異性のクロトナーゼを含む。酪酸／ブタノール経路を利用することは望ましくないので、クロトナーゼの立体特異性を変更するか（Ｒ）−特異性クロトナーゼを導入することは有利ではない。（Ｒ）−特異性クロトナーゼは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールへの変換に利用可能な（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの量を減らすだろう。
【００３３】
クロストリディウム中のネイティブの経路の有益性は、ネイティブの酵素が、アルデヒド／アルコール脱水素酵素反応および／または３−ヒドロキシブチレート還元酵素反応に触媒作用を及ぼすことができることである。好ましくは、これらのネイティブの遺伝子はクロストリディウム中で保持される。
したがって、１つの実施態様では、クロストリディウム種は、１つ以上のネイティブの非基体特異性還元酵素（ｎａｔｉｖｅ  ｎｏｎ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子、および／または（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに変換することができる脱水素酵素を含む。ネイティブの酵素（例えばＰｔｂ、Ｂｕｋ）は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートへ変換する。（Ｒ）−１，３−ブタンジオールは、それぞれアルデヒド／アルコール脱水素酵素活性化を行う、ネイティブの酵素（たとえばＢｌｄおよび／またはＡｄｈＥ）によって、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート−ＣｏＡから生産される。
【００３４】
しかしながら、１つの実施態様では、本発明のクロストリディウム種は、さらに（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸（たとえばＰｔｂ、ＢｕｋまたはＴｅｓＢ）に転化することができる、還元性酵素をコードする１つ以上のノンネイティブの遺伝子を含んでもよい。
【００３５】
本発明のクロストリディウム種は、さらに（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに変換することができる酵素、つまりアルデヒド脱水素酵素およびアルコール脱水素酵素（アルデヒドーリダクターゼと等価）、または１ステップで（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに変換することができる酵素をコードできるノンネイティブの遺伝子または二機能性のアルデヒド／アルコール脱水素酵素を発現する遺伝子を含んでいてもよい。
【００３６】
好ましくは、クロストリディウムは、クロストリディウム種が酸発生のクロストリディウムである場合に、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに変換する還元性酵素をコードする１つ以上のノンネイティブの遺伝子を含む。１つの実施態様では、ノンネイティブの遺伝子は別のクロストリディウム種からのものであることができる。
【００３７】
これらの遺伝子はかん菌類、大腸菌、またはクロストリディウムの他の菌株を含み、これらに限定されない生物からのものであることができる。これらの酵素をエンコーディングする遺伝子の非制限的な例は以下のとおりである：
【００３８】
アルデヒド脱水素酵素：
ａｌｄ（酪酸菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）から）、ｂｌｄ（クロストリディウム  サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）から）、ｐｕｕＣ  ａｌｄＨ  ｂ１３００  ＪＷ１２９３（大腸菌から）、およびアルデヒド脱水素酵素（クロストリディウム  ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリディウム  オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム−ベエイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウム−クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、クロストリディウム  イジュンダヒー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム−パストゥリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、クロストリディウム  サッカロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリディウム  サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、クロストリディウムスポロゲネス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）から）。
【００３９】
アルコール脱水素酵素およびアルデヒドーリダクターゼ：
ｂｄｈＡおよびｂｄｈＢ（クロストリジウム−アセトブチリクムから）、ｂｄｈ１およびｂｄｈ２（クロストリジウム−クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）から）、ｂｄｈ（クロストリディウムｌ  イジュンダヒー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）から）、ａｄｈ  １（クロストリディウム  サッカロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から）、ｂｄｈ（クロストリディウム  サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）から）、およびｙｑｈＤ（大腸菌から）。
【００４０】
アルデヒドアルコール脱水素酵素：
ａｄｈＥ（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から）、ａｄｈＥおよびａｄｈＥ２（クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）から）、およびアルデヒドアルコール脱水素酵素（クロストリディウム  オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム−ベエイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウム−クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、クロストリディウムｌ  イジュンダヒー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム−パストゥリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、クロストリディウム  サッカロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリディウム  サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、クロストリディウムスポロゲネス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））から。
【００４１】
本発明のクロストリディウム種は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの生産を増加させるためにさらに遺伝子的に操作されてもよい。本発明のクロストリディウム種は、クロストリディウム種の中の、ブタノール、アセトン、エタノール、酪酸塩、酢酸塩および／または乳酸塩の生産をノックアウトするために操作されてもよい。
【００４２】
従って、本発明はさらに、ブタノール、アセトンおよびエタノール、酪酸塩、酢酸塩および／または乳酸塩の生産に関するネイティブの遺伝子の発現を減少またはノックアウトするクロストリディウム種を含む。好ましくはネイティブのｐｔｂ、ｂｕｋ、ｈｂｄおよび／またはアルコール／アルデヒド脱水素酵素の発現が、クロストリディウム種から低減されるかまたはノックアウトされる。溶媒生成性クロストリディウム種（例えばクロストリディウム  サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ））では、（Ｒ）−１，３−ブタンジオール競争経路（それらはブタノール、アセトンおよびエタノールの溶剤生産経路、および酪酸塩、酢酸塩および乳酸塩用の有機酸経路に制限されない）の収率およびタイター（ｔｉｔｒｅｓ）を増加させることが、クロストリディウム種の中で防止できるかもしれない。クロストリディウム種の中のネイティブのｈｂｄのノックアウトは、１，３−ブタンジオールに向けてブタノールおよび酪酸塩の生産から炭素フラックス流れを遠ざけるだろう。ｐｔｂまたはｂｕｋ（酪酸塩経路に含まれる遺伝子）のノックアウトは、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡから炭素フラックスをなくし、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの収率を増加させるだろう。
【００４３】
溶媒生成性クロストリディウム種では、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の生産を増加するために、ブタノール、アセトン、エタノール、１，３−ブタンジオール、酢酸塩および乳酸塩を含むがこれらに制限されない競争溶剤（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ  ｓｏｌｖｅｎｔ）、および有機酸経路をノックアウトすることができる。
アルコール／アルデヒド脱水素酵素のノックアウトは、ブタノールと（Ｒ）−１，３−ブタンジオールをなくすだろう。
【００４４】
酸発生のクロストリディウム種、たとえばクロストリディウムブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）では、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の生産を増加させるために、酢酸塩と乳酸塩を含むがこれらに制限されない競争する有機酸経路がノックアウトされることができる。ｈｂｄのノックアウトは、３−ヒドロキシブチレートの方向へ酪酸塩生産から炭素フラックスを遠ざけるだろう。
【００４５】
発現およびその変形のノックアウトは、対象の全遺伝子、発現を阻害するか防ぐかまたはそうでなければ、興味のある遺伝子を操作不可能にするそのコード部分、その非コード部分または遺伝子の任意のセグメント、またはその内部の突然変異の欠失を含む。標準の分子技術がクロストリディウム種からの選択されたネイティブの遺伝子の発現をノックアウトまたは低減するために使用された。
【００４６】
競争する経路に含まれる遺伝子のノックアウトに加え、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および／または（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの収率とタイター（ｔｉｔｒｅｓ）を増加させる他の方法は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸または（Ｒ）−１，３−ブタンジオール生産に含まれる酵素活性の最適化を含むことができる。たとえば異種および非異種遺伝子の過剰な発現、最適化された遺伝子発現および指図された酵素進化があげられる。１，３−ブタンジオール経路および（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート経路の酵素のＮＡＤＰＨ補助因子有効性の最適化は、ＮＡＤＰキナーゼの発現が（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸をおよび（Ｒ）−１，３−ブタンジオールタイターを増加するので、（Ｒ）−１，３−ブタンジオール、および（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を増加させるために使用することができる。
【００４７】
用語「ノンネイティブ遺伝子」は、その自然環境にない遺伝子をいい、同じ属の別の種へ導入された微生物の１つの種からの遺伝子を含んでいる。ノンネイティブ遺伝子は、クロストリディウムに対してコドン最適化されることができる、および／またはクロストリディウム中での遺伝子の制御可能な発現を可能にするプロモータの管理下に置かれたものであることができる。
【００４８】
酵素の発現レベルは、誘導性プロモータおよび／または異なる強さのプロモータでの制御される遺伝子発現によって最適化することができる。１つの実施態様では、ノンネイティブ遺伝子は、ネイティブのクロストリディウム・プロモーター（例えばｐｆｄｘまたはチオラーゼプロモーター）の管理下に置かれる。別の実施態様では、遺伝子は誘導性ノンネイティブ・プロモータの管理下に置かれる。他の適切なプロモータは当業者に公知であろう。
【００４９】
ノンネイティブ遺伝子は組換え微生物の生産技術で公知である標準プラスミド変換技術（つまり接合、電気穿孔）によりクロストリディウム菌株中に導入することができる。
【００５０】
遺伝子はクローンを作られ、発現ベクターから発現されることができる。これらはプラスミドを含むが、これに制限されない。ノンネイティブ遺伝子を含んでいるプラスミドは、変換または接合によってクロストリディウムへ導入される。発現ベクターは、適切なノンネイティブ酵素をコードするための核酸配列を含み、核酸の発現をコントロールするプロモータまたは他の調節配列を好ましく含むことができる。
【００５１】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素を含むノンネイティブ遺伝子は、当業者に知られている遺伝子インテグレーション技術、たとえばＷＯ／２００９／１０１４００またはＷＯ／２０１０／０８４３４９に述べられているような技術を使用して、クロストリディウムの染色体へインテグレイトされてもよい。
【００５２】
従って、本発明は、さらに（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを生産することができるクロストリディウム種を生産する方法を含む。この方法は、たとえばクロストリディウム種の染色体へ遺伝子のプラスミドトランスフォーメイション(ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ)またはインテグレーション（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ)によって、クロストリディウム種へ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子を導入することを含む。
【００５３】
本発明は、さらにクロストリディウムのトランスフォーメイション、複製または染色体のインテグレーションのための組換プラスミドを含むことができる。プラスミドは、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素をコードする核酸配列を含む。好ましくは、ヌクレイン酸シーケンスは、クプリアウィドゥス  ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）からｐｈａＢをコードする。
【００５４】
組換プラスミドは、チオエステラーゼをコードする核酸配列をさらに含むことができる。好ましくは、核酸は、大腸菌からのＴｅｓＢをコードする。
【００５５】
本発明は、さらに（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子がクロストリディウムの染色体へインテグレートされているクロストリディウム種を含む。好ましくは、本発明は、クロストリディウムの染色体へインテグレートされたｐｈａＢを含むクロストリディウムを含む。好ましくは、遺伝子はクロストリディウム  サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）の染色体へインテグレートされる。
【００５６】
クロストリディウムのゲノムへの、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素（つまりｐｈａＢ）を発現することができるノンネイティブ遺伝子のインテグレーションは、プラスミド変換が種の中への遺伝子に使用された場合と比較して、生産された（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの収率を驚くほど増加させる。したがって、クロストリディウム種において（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの収率を増加させる方法は、クロストリディウム種の染色体へ（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子を導入することを含むことができる。
【００５７】
遺伝子操作およびクロストリディウムの培養は、当業者に知られている方法および培地を使用して行うことができる。好ましくは、培養は嫌気性または微好気性の環境中で行なわれる。クロストリディウムの培養方法は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｅｄｓ  Ｈ．Ｂａｈｌ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄｕｒｒｅ，  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，２００１，ｓｅｃｔｉｏｎ  ３．４  ”Ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ”、およびＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（２００９）に述べられている。
【００５８】
遺伝子操作のための方法は、ＣｌｏｓＴｒｏｎ（ＷＯ／２００７／１４８０９１）、Ａｌｌｅｌｅ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ＷＯ／２００９／  １０１４００）、およびＷＯ／２０１０／０８４３４９およびＷＯ／２０１３／１４４６５３に記載された方法を含むが、これらに制限されない。
【００５９】
クロストリディウム種の培養にふさわしい培地は、当業者に公知であり、クロストリジウム・ブロス・メディア（ＣＢＭ）、クロストリジウム成長培地（ＣＧＭ）、酵母、トリプトン、グルコース・メディア（ＹＴＧ）、強化クロストリジウムメディア（ＲＣＭ）およびＦＣＭメディアを含むが、これらに制限されない。
【００６０】
当業者に知られている適切なバッチ／連続的／半連続的な培養システムは、微生物を育てるために使用することができる。菌株は、記述されたメディア中でのバッチ培養物中で好ましくは育てることができる。
【００６１】
適切な嫌気条件は、嫌気性キャビネット内を嫌気性ガスでフラッシュし、使用の２４時間前に嫌気性キャビネット内に成長培地を置いて培養することによって達成された。
【００６２】
培養の後、最終培養液は、水、残余の基体、塩類、副産物（例えばアルコール、有機酸）から成るが、細胞および目標生成物も含む混合物である。
【００６３】
ここに使用される用語「ヒドロキシブチレート」は、当業者に知られているようなその通常の意味を持っており、ヒドロキシ酪酸、その塩類、およびそれらの混合物を含む。生産された（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートの形は、使用される培養状態および培地に依存するだろう。（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートは、ｐＨが中性の条件の下で塩として生産されることができる。酸性の状態（＜ｐＨ  ４．４）では、分離された酸（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸が主成分である。
【００６４】
高純度化学品生成物を得るために、本発明の方法は培養から希望の最終生産物を分離することを含んでいる。これは当業者に知られていた方法によって達成される。例えば、細胞は遠心分離、ろ過または凝集を使用して分離することができる。残余の塩類および酸は電気透析、塩析またはイオン交換クロマトグラフィーを使用して除去することができる。培養液中の過剰の水は蒸発によって低減することができる。その後、蒸留が純粋な生成物（たとえばブタンジオール）を回収するために使用することができる。生成物を回収する他の方法は、真空蒸留、および酢酸エチル、トリブチル・ホスフェート、ジエチルエーテル、ｎ−ブタノール、ドデカノールおよびオレイルアルコールを含む溶剤抽出法を含んでいる。３−ヒドロキシブチレートは、酸の塩として沈殿させることができ、イオン交換クロマトグラフィーを使用して除去することができる。
【００６５】
本発明の方法を使用して生物学的に生産することができる化学薬品は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸／（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート（またそのエステル誘導体）および（Ｒ）−１，３−ブタンジオールである。これらの２つの生成物はネイティブの酸発生または溶媒生成性クロストリディウムによっては生産されない。いくつかの実施態様では、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸および／または（Ｓ）−１，３−ブタンジオールも、クロストリディウムによって生物学的に生産することができる。
【００６６】
（Ｒ）−１，３−ブタンジオールは、様々な光学活性化合物（たとえばフェロモン、香水および殺虫剤）の合成用ビルディングブロック、およびキラルアゼチジノン（ａｚｅｔｉｄｉｎｏｎｅ）誘導体の出発原料、およびペネム（ｐｅｎｅｍｓ）とカルバペネムの重要な中間体としてβ‐ラクタム抗生物質の産業用の合成に使用することができる。３−ヒドロキシブチレートおよびエステル誘導体は用途の広いキラル分子で、光学的に活性なファインケミカルズ（たとえばビタミン、抗生物質、フェロモンおよびフレーバー化合物、たとえばドルゾルアミド（Ｄｏｒｚｏｌａｍｉｄｅ）のような目薬）の合成のためのビルディングブロックとして使用される。
【００６７】
本発明は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸および（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの両方のキラル分子の経済的営業生産を許容する方法を提供し、したがって、これらの生成物のために市場をさらに開く。そのような生成物の１つは、出発原料として（Ｒ）−１，３−ブタンジオールおよび（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸の両方を要求する栄養補助食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）である。しかし、現在の化学合成方法および他の生物学的アプローチも商業化を許可するほどはコスト効率が良くない。
【００６８】
クロストリジウムは、炭水化物を様々な低減された発酵産物に天然に変換する、発酵代謝を有する嫌気性細菌である。このバクテリアは、３および４の炭素（Ｃ３／Ｃ４）化学薬品を生産するためのユニークな代謝経路および生化学を有する。
【００６９】
自然発生の「酸生成性」のクロストリディウム、たとえばクロストリディウム  ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）は酢酸および酪酸を生産するが溶剤は生産しない。一方「溶媒生成性」のクロストリディウム、たとえばクロストリディウムアセトブチリカムは最初に酸（酢酸および酪酸）を生成するが、次いで溶剤（アセトンとブタノール）を生成する、２段階または２相性発酵を示す。酸は発酵中に再同化（ｒｅ−ａｓｓｉｍｉｌａｔｅｄ）されアセトンとブタノールを生産する。これはｐＨを規制し、かつ細胞増殖に必要な補助因子を再生成する役目をする、低減された発酵産物での酸化還元反応のバランスを維持するために必要である。溶剤生産は高度に規制され、低ｐＨおよび／または有機酸の蓄積によってトリガーされ、発酵の後の部分でのみ生じる。
【００７０】
親の株の中の代謝経路は図１Ａの中で詳述される。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素（Ｈｂｄ）をコードするネイティブの遺伝子は、アセトアセチルＣｏＡを（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換し、ついでクロトナーゼ（Ｃｒｔ）によって触媒される反応で、クロトノイル−ＣｏＡ（ｃｒｏｔｏｎｏｙｌ−ＣｏＡ）に変換される。クロトノイル−ＣｏＡはブチリル−ＣｏＡに変換され、次いで酪酸塩またはブタノールのいずれかに変換される。
【００７１】
遺伝子的に操作されたクロストリディウム株の代謝経路は図１Ｂの中で詳述される。アセトアセチルＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する、異種の（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素（酵素Ａ）が導入される。（Ｒ）−特異性−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素は、ネイティブのＨｂｄ酵素と基体（アセトアセチルＣｏＡ）に対して競争する。ネイティブのクロトナーゼ（Ｃｒｔ）酵素は３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのＲ型へ活性が無いか低い活性しか持たず、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを、ネイティブの酵素を介して（Ｒ）−１，３−ブタンジオールあるいは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートのいずれかに変換されることを許容する。
酵素ＰｔｂおよびＢｕｋはＲ型には特異性で、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−リン酸塩を介して、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートに変換する。一方、アルデヒド脱水素酵素（つまりＢｌｄ）および／または２官能性のアルデヒド／アルコール脱水素酵素（つまりＡｄｈＥ）は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを（Ｒ）−１，３−ブタンジオールに、直接または（Ｒ）−３−ヒドロキシブチルアルデヒドを介して変換する。
【００７２】
（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート／（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を生産する代替ルートは、さらにチオエステラーゼ（ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ）（酵素Ｂ）、つまり大腸菌からのＴｅｓＢをコードする異種遺伝子の導入を介する。この酵素は（Ｓ）−および（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを、それぞれ（Ｓ）−および（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートに変換する。本発明は例および図を参照して以下に記述される：
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１−Ａ】図１（Ａ）は、溶媒生成性クロストリディウムの中でのネイティブの酸および溶剤生産代謝経路を示す。
【図１−Ｂ】図１（Ｂ）は、異種の（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素（Ａ）および異種のチオエステラーゼ（Ｂ）の導入の後の、溶媒生成性クロストリディウムの中での酸および溶剤生産代謝経路を示す。
【図２】図２Ａ−Ｂは、以下のもののためのコドン最適化シーケンスを示す：クプリアウィドゥス  ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）からのｐｈａＢ遺伝子（Ａ）および大腸菌からのＴｅｓＢ遺伝子（Ｂ）。
【図３】図３Ａ−Ｃは、ｐＭＴＬ８３１５１（Ａ）、ｐＭＴＬ８３２５１（Ｂ）およびｐＭＴＬ８２１５１（Ｃ）の中のｐｆｄｘ＿ｐｈａＢのためのプラスミドマップを詳述する。
【図４】図４は、（Ｒ／Ｓ）−クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ｐ８３１５１−ｐｆｄｘ＿ＰｈａＢ）の中で生産された（Ｒ／Ｓ）３−ヒドロキシブチレートおよび（Ｒ／Ｓ）−１，３−ブタンジオールの濃度を示す。
【図５】図５は、（Ｒ／Ｓ）−クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ｐ８３２５１−ｐｆｄｘ＿ＰｈａＢ）の中で生産された（Ｒ／Ｓ）３−ヒドロキシブチレートおよび（Ｒ／Ｓ）−１，３−ブタンジオールの濃度を示す。
【図６】図６は、ＣＧＭ（Ａ）およびＦＭＣ（Ｂ）の中でプラスミドトランスフォーメーション（ｐ８２１５１−ｐｆｄｘ＿ＰｈａＢ）を使用して、クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）の中で生産された（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートおよび（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの濃度を示す。
【図７】図７は、クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ｐ８３２５１−ｐｆｄｘ＿ＰｈａＢ）の中で生産された（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートの濃度を示す。
【図８】図８は、クロストリジウム−ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（ｐ８３１５１−ｐｆｄｘ＿ＰｈａＢ＿ＴｅｓＢ）およびクロストリジウム−ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（ｐ８３１５１−ｐｆｄｘ＿ＰｈａＢ）の中で生産された（Ｒ／Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートの濃度を示す。
【図９】図９Ａ−Ｂは、  遺伝子がバクテリアの染色体へインテグレートされた時の、クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）の中で生産された（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート（Ａ）および（Ｒ）−１，３−ブタンジオール（Ｂ）の濃度を示す。
【図１０】図１０Ａ−Ｂは、遺伝子がバクテリアの染色体へインテグレートされるか、プラスミドトランスフォーメーションにより導入された時の、クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）の中で生産された（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート（Ａ）および（Ｒ）−１，３−ブタンジオール（Ｂ）の濃度を示す。
【００７４】
例１  −  クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＰｈａＢ発現）
１）  遺伝子合成
遺伝子クプリアウィドゥス  ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）  ＰｈａＢはクロストリジウムのためにコドン最適化された。図２Ａは、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ  （ｒ）  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成された、コドン最適化されたシーケンスの一例を示す。
【００７５】
２）  プラスミド・アセンブリー
ＰｈａＢは制限部位ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩを使用して、プラスミドｐＭＴＬ８３１５１へクローンを作られた。Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ  Ｐｆｄｘプロモータは、プラスミドｐＭＴＬ８３１５１＿ｐｆｄｘ＿ｐｈａＢを与えるインフェクションクローニング・キットを使用して、遺伝子の上流にクローンを作られた。ＰｆｄＸ−ｐｈａＢは制限部位ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩを使用して、ｐＭＴＬ８３１５１＿ｐｆｄｘ＿ｐｈａＢから抽出された。抽出されたフラグメントは、標準クローニング方法を使用してｐＭＴＬ８３２５１へクローンを作られた（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００７６】
３）  株発育
デザインされたプラスミドは、標準トランスフォーメーションプロトコルを使用して、生体外のメチル化のために大腸菌ＴＯＰ１０  ｐＡＮ２をトランスフォーメーションするために使用された。メチル化プラスミドは、市販のキットを使用して抽出され、クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）  ＡＴＣＣ  ８２４をトランスフォーメーションするために使用された。簡潔には、クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）の一晩の培養が、２ｘＹＴＧを播種するために使用された。細胞は、０．６−０．８のＯＤ６００へ３７℃で酸素欠如状態で成長され、氷冷された嫌気性生物エレクトロポレーションバッファー（ＥＰＢ）（２７０ｍＭショ糖、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．４））で洗われた。最終ペレットは氷冷された小体積の嫌気性生物ＥＰＢ中に再懸濁され、直ちにトランスフォーメーションに使用された。プラスミドＤＮＡ（１−２μｇ）および細胞は、あらかじめ冷蔵された０．４ｃｍのギャップ・キュベットに加えられた。エレクトロポレーションは次のセッティングを備えたバイオラド  エレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）を使用して実行された：２．０ｋＶ、２５μＦおよび∞Ω。トランスフォームされた細胞は、２ｘＹＴＧの中で１−３ｈで３７℃、ｐＨ  ５．２で酸素欠如状態で回収された。その後、必要な抗生物質（１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコールまたは５０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン）を含むＣＧＭメディア上で培養され、単一のコロニーが、２４−４８時間以内に得られた。プラスミドの存在はコロニーＰＣＲおよびプラスミド特異性プライマーを使用して確認された。トランスフォームされたコロニーは、各プラスミドについて採取され、−８０℃で冷凍装置内で格納された。
【００７７】
培地は次のものを使用した：適切な培地として、ＣＢＭ、ＣＧＭおよび２ｘ  ＹＴＧメディアが挙げられるが、これらに制限されない。
例証されたメディアは次のとおりである：１Ｌにつき以下を含むＣＢＭ：１ｍｌのＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ／ｍＬ）、１０ｍｌのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ／ｍＬ）、１ｍｌのＭｎＳＯ４  ｘ  ４Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ／ｍＬ）、４ｇのカゼイン水解物、１ｍｌの４−アミノ安息香酸（１ｍｇ／ｍｌ）、１ｍｌのチアミン−ＨＣＬ（１ｍｇ／ｍｌ）、１．３３μｌのビオチン（１．５ｍｇ／ｍｌ）、１０ｍｌのＫ２ＨＰＯ４（５０ｍｇ／ｍｌ）、１０ｍｌのＫＨ２ＰＯ４（５０ｍｇ／ｍｌ）、２０ｍｌのＣａＣＯ３（２５０ｍｇ／ｍｌ）、２．５−５％のグルコース。固形培地については、寒天が１５ｇ／ｌで加えられた。また、ＣａＣＯ３が省略された。
【００７８】
１Ｌにつき以下を含むＣＧＭ：
２ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの第二燐酸カリウム、０．５ｇの第二燐酸カリウム、０．２ｇのマグネシウム硫酸塩ヘプタハイドレード、０．７５ｍｌの硫酸鉄ヘプタハイドレード（２０ｇ／ｌ）、０．５ｍｌの塩化カルシウム（２０ｇ／ｌ）、０．５ｍｌの硫酸マンガン一水化物（２０ｇ／ｌ）、０．１ｍｌのコバルト水化物（２０ｇ／ｌ）、０．１ｍｌの硫酸亜鉛（２０ｇ／ｌ）、トリプトン２ｇ、酵母抽出物１ｇ、５０ｇのグルコース、１２ｇの寒天。
【００７９】
１Ｌにつき以下を含む２ｘＹＴＧ；１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母抽出物、５ｇのＮａＣｌ、ｐＨは５．２に調節され、１２１℃でオートクレーブ滅菌することにより殺菌された。無菌のグルコースが０．５−２％の濃度でメディアを冷ますために添加された。
【００８０】
４）  クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のための発酵データ
成長方法
トランスフォームされた菌株は−８０℃の冷凍装置ストックから取り出し、適切な抗生物質（１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコールまたは５０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン）を含むＣＢＭまたはＣＧＭのプレート上に、再度ストリークした。単一のコロニーが採取され、１晩置かれた種培地（２ｘＹＴＧ、ｐＨ  ５．２）に接種するために使用された。種培地は、１６時間まで３７℃で酸素欠如状態で成長された。２．５％のグルコースを含む４０ｍｌのＣＧＭ培地は、種培地を使用して、翌日、１：１００で接種を受けた。
菌株は、３７℃で酸素欠如状態で成長された。代謝の分析のためのサンプルは４８時間の成長の後に得られ、Ｒ／Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート（Ｒ／Ｓ−ＨＢ）および（Ｒ／Ｓ）−１，３−ブタンジオール（Ｒ／Ｓ−ＢＤＯ）について分析された。
【００８１】
分析
Ｒ／Ｓ−３−ヒドロキシブチレートのための分析はＨＰＬＣ−ＭＳを使用して行なわれた。サンプルはＤＡＴＡＮ（ジアセチル酒石酸無水物）を使用して誘導体とされ、Ｒ型とＳ型との分離は、標準の非キラルＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８、２．１×１５０ｍｍ、１．８μｍ）を使用して行われた。簡潔に言えば、１０μｌの上澄みを２５０μｌのメタノールと混合した。サンプルは５０℃で乾燥され、調製された新鮮なＤＡＴＡＮ溶液（ジクロロメタン：酢酸４：１（ｖ／ｖ）中の２００ｇ／ｌのＤＡＴＡＮ）の５０μｌが加えられた。サンプルは７５℃で１２０分間インキュベートされ、次いで蒸発ステップを行った。乾燥されたサンプルは、５００μｌの水中に懸濁され、ＬＣ−ＭＳによって分析された。
【００８２】
結果
図４（ｐＭＴＬ８３１５１＿ｐｆｄｘ＿ｐｈａＢ）および図５（ｐＭＴＬ８３２５１＿ｐｆｄｘ＿ｐｈａＢ）に示されるように、ｐｈａＢの発現は（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートおよび（Ｒ）−１，３−ブタエンジオールの生産に導く。（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの２５０μＭ以上、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートの３０００μＭ以上の濃度が達成された。（Ｓ）−１，３−ブタンジオールおよび（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートの非存在または最小のレベルの存在が、トランスフォームされた菌株で検知された。
【００８３】
例２  −  クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）（プラスミド組込）
１）  遺伝子合成
遺伝子クプリアウィドゥス  ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）  ＰｈａＢはクロストリジウムのためにコドン最適化された。図２Ａは、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成された、コドン最適化されたシーケンスの一例を示す。
【００８４】
２）  プラスミド・アセンブリー
ＰｈａＢは、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ  Ｐｆｄｘプロモータと一緒に、制限部位ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩを使用してプラスミドｐＭＴＬ８２１５１内へクローンされ、プラスミドｐＭＴＬ８２１５１＿ｐｆｄｘ＿ｐｈａＢが作られた。
【００８５】
３）  株発育
プラスミドｐＭＴＬ８２１５１＿ｐｆｄｘ＿ｐｈａＢは、標準エレクトロポレーション方法によってクロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）（Ｃｓｐａ）にトランスフォームするために使用された。簡潔には、細胞は、０．６−０．８のＯＤ６００へ３７℃で酸素欠如状態で成長され、氷冷された嫌気性生物エレクトロポレーションバッファー（ＥＰＢ）（２７０ｍＭショ糖、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．４））で洗われた。最終ペレットは氷冷された小体積の嫌気性生物ＥＰＢ中に再懸濁され、直ちにトランスフォーメーションに使用された。プラスミドＤＮＡ（１−２μｇ）および細胞は、あらかじめ冷蔵された０．４ｃｍのギャップ・キュベットに加えられた。エレクトロポレーションは次のセッティングを備えたＢｉｏＲａｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを使用して実行された：２．０ｋＶ、２５μＦおよび∞Ω。トランスフォームされた細胞は、ＲＣＭの中で１−３時間で３７℃、ｐＨ  ５．２で酸素欠如状態で回収された。その後、ＲＣＭ＋５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール上で培養され、単一のコロニーが、２４−４８時間以内に得られた。
プラスミドの存在はコロニーＰＣＲおよびプラスミド特異性プライマーを使用して確認された。トランスフォームされたコロニーは、各プラスミドについて採取され、−８０℃で冷凍装置内で格納された。
【００８６】
４）  クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）のための発酵データ
成長方法
トランスフォーマントは、３７℃で種培養（成長メディア：ＣＧＭまたはＦＭＣ）の中で一晩成長された。５％のグルコースを含む４０ｍｌのＣＧＭ培地は翌日インキュベートされ、０．０５−０．１のスタートＯＤだった。菌株は、３７℃で酸素欠如状態で成長された。代謝の分析のためのサンプルは定期的に採取され、（Ｒ／Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート（Ｒ／Ｓ−ＨＢ）および（Ｒ／Ｓ）−１，３−ブタンジオール（Ｒ／Ｓ−１，３−ＢＤＯ）について分析された。
【００８７】
分析
上澄みサンプルは、ＨＰＬＣに接続されたＡｍｉｎｅｘイオン排除カラム（ＨＰＸ−８７Ｈ、３００ｍｍ  ７．８ｍｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して分析された。代謝物質は０．５ｍｌ毎分の流量で５ｍＭのＨ２ＳＯ４で溶出された。生成された３−ヒドロキシブチレートおよび１，３−ブタンジオールのキラリティー分析はＨＰＬＣ−ＭＳを使用して実行された。サンプルはＤＡＴＡＮ（ジアセチル酒石酸無水物）を使用して誘導体とされ、Ｒ型とＳ型との分離は、標準の非キラルＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＰｌｕｓのＣ１８、２．１×１５０ｍｍ、１．８μｍ）を使用して行われた。簡潔に言えば、１０μｌの上澄みを２５０μｌのメタノールと混合した。サンプルは５０℃で乾燥され、調製された新鮮なＤＡＴＡＮ溶液（ジクロロメタン：酢酸４：１（ｖ／ｖ）中の２００ｇ／ｌのＤＡＴＡＮ）の５０μｌが加えられた。サンプルは７５°Ｃで１２０分間インキュベートされ、次いで蒸発ステップを行った。乾燥されたサンプルは、５００μｌの水中に懸濁され、ＬＣ−ＭＳによって分析された。
【００８８】
結果
図６に示されるように、クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）におけるｐｈａＢの発現は（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートおよび（Ｒ）−１，３−ブタエンジオールの生産に導いた。成長メディアに依存して、約５．５−７ｍＭの３−ヒドロキシブチレートおよび５−６  ｍＭの１，３−ブタンジオールが、７２時間以内に生産された。質量分析は、生成された３−ヒドロキシブチレートおよび１，３−ブタンジオールのＲキラリティーを確認した。
【００８９】
例３  −  クロストリジウム−ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）
１）  遺伝子合成
遺伝子クプリアウィドゥス  ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）  ＰｈａＢはクロストリジウムのためにコドン最適化された。図２Ａは、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（登録商標）  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成された、コドン最適化されたシーケンスの一例を示す。
【００９０】
２）  プラスミド・アセンブリー
ＰｈａＢはＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ  Ｐｆｄｘプロモータを管理した条件で標準クローニング技術を使用してプラスミドｐＭＴＬ８３２５１へクローンを作られ、プラスミドｐＭＴＬ８３２５１＿ｐｆｄｘ＿ｐｈａを得た。
【００９１】
３）  株発育
プラスミドｐＭＴＬ８３２５１＿ｐｆｄｘ＿ｐｈａＢは大腸菌ＣＡ４３４を使用して、クロストリジウム−ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）へ接合(ｃｏｎｊｕｇａｔｅ)された。標準接合プロトコルが適用された。簡潔に言えば、プラスミドｐＭＴＬ８３２５１＿ｐｆｄｘ＿ｐｈａＢを有する大腸菌ＣＡ４３および（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）を一晩培養し、それぞれ９ｍｌのＬＢメディアおよびＲＣＭに接種するために使用された。培地は０．５−０．７のＯＤまで成長された。１ｍｌの大腸菌培養物は遠沈され、ペレットは２００μｌのクロストリジウム−ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）培養物と混合された。細胞混合物は非選択的なＲＣＭプレート上にスポットされ、一晩インキュベートされた。インキュベートされた混合物は、５００μｌの新鮮なＲＣＭへ再懸濁され、１０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含む選択培地で培養された。得られたトランス接合体(ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ)内のプラスミドの存在はプラスミド特異性プライマーを使用して、ＰＣＲによって確認された。
【００９２】
４）  クロストリジウム−ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）のための発酵データ
成長方法
１Ｌにつき以下を含むＲＣＭが使用された：酵母抽出物１３ｇ、ペプトン１０ｇ、可溶性デンプン１ｇ、塩化ナトリウム５．ｇ、酢酸ナトリウム３ｇ、塩酸システイン０．５ｇ、炭水化物２％。炭酸カルシウム１０ｇ／ｌが、ｐＨ調整のために液体培地に加えられた。
固形培地は１５ｇ／ｌの寒天を含んでいた。トランスフォーマンツ(ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ)は、３７℃で種培養（ＲＣＭ）中で一晩成長された。２％のグルコースを含む１００ｍｌのＲＣメディアは、出発ＯＤ０．０５−０．１で接種を受けた。菌株は、要求された抗生物質が存在する状態で３７℃で酸素欠如状態で成長された。代謝の分析のためのサンプルは一定間隔で得られた。
【００９３】
分析と結果
培養液上清は３−ヒドロキシブチレート分析キット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートについて分析された。図７に示されるように、ｐｈａＢ発現株は約１７ｍｇ／Ｌの３−ヒドロキシブチレートを生産した。
【００９４】
例４  −  クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）
１）  遺伝子合成
遺伝子クプリアウィドゥス  ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）  ＰｈａＢおよび大腸菌ＴｅｓＢはクロストリジウムのためにコドン最適化された。図２Ａは、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（登録商標）  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成されたコドン最適化されたｐｈａＢシーケンスの１つの例を示す。
図２Ｂは、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成されたコドン最適化されたＴｅｓＢシーケンスの１つの例を示す。
【００９５】
２）  株発育
ＰｈａＢとＴｅｓＢは、標準クローニング技術を使用して、ｐｆｄｘプロモータの管理の下でｐＭＴＬ８３１５１の中へ１つのオペロン（ｏｐｅｒｏｎ）としてクローンを作られた。生成されたプラスミドは標準トランスフォーメーションプロトコルを使用して、生体外のメチル化のために大腸菌ＴＯＰ１０  ｐＡＮ２をトランスフォームするために使用された。メチル化プラスミドは、商用キットを使用して抽出され、クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）  ＡＴＣＣ  ８２４に変換するために使用された。簡潔に言えば、クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）の一晩の培養物が、２ｘＹＴＧに接種するために使用された。細胞は、０．６−０．８のＯＤ６００へ３７℃で酸素欠如状態で成長され、氷冷された嫌気性生物エレクトロポレーションバッファー（ＥＰＢ）（２７０ｍＭショ糖、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．４）。）で洗われた。最終ペレットは氷冷された小体積の嫌気性生物ＥＰＢ中に再懸濁され、直ちにトランスフォーメーションに使用された。プラスミドＤＮＡ（１−２μｇ）および細胞は、あらかじめ冷蔵された０．４ｃｍのギャップ・キュベットに加えられた。エレクトロポレーションは次のセッティングを備えたＢｉｏＲａｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを使用して実行された：２．０ｋＶ、２５μＦおよび∞Ω。トランスフォームされた細胞は、２ｘＹＴＧの中で１−３時間で３７℃、ｐＨ  ５．２で酸素欠如状態で回収された。その後、１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含むＣＧＭメディア上で培養され、単一のコロニーが、２４−４８時間以内に得られた。プラスミドの存在はプラスミド特異性プライマーを使用してコロニーＰＣＲにより確認された。トランスフォームされたコロニーは、各プラスミドについて採取され、−８０℃で冷凍装置内で格納された。
【００９６】
３）  クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のための発酵データ
成長方法
トランスフォーマンツは、３７℃で種培養（成長培地：ＣＢＭ）の中で一晩成長された。サンプルは一定間隔で採取され、ＨＰＬＣ＿ＭＳによってキラル化学物質（Ｒ）−１，３−ブタンジオールおよび（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートの生産が分析された。
【００９７】
分析
Ｒ／Ｓ−３−ヒドロキシブチレートについての分析はＨＰＬＣ−ＭＳを使用して行なわれた。サンプルはＤＡＴＡＮ（ジアセチル酒石酸無水物）を使用して誘導体とされ、Ｒ型とＳ型との分離は、非キラルＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８、２．１×１５０ｍｍ、１．８μｍ）を使用して行われた。簡潔に言えば、１０μｌの上澄みを２５０μｌのメタノールと混合した。サンプルは５０℃で乾燥され、調製された新鮮なＤＡＴＡＮ溶液（ジクロロメタン：酢酸４：１（ｖ／ｖ）中の２００ｇ／ｌのＤＡＴＡＮ）の５０μｌが加えられた。サンプルは７５°Ｃで１２０分間インキュベートされ、次いで蒸発ステップを行った。乾燥されたサンプルは、５００μｌの水中に懸濁され、ＬＣ−ＭＳによって分析された。
【００９８】
結果
クロストリジウム−アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）の中のｐｈａＢの過剰発現は、図８に示されるように２つのキラル化学物質（Ｒ）−１，３−ブタンジオールおよび（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートの生産に結びつく。ＴｅｓＢの添加は（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートのタイターを１．５倍に増加させた。ＴｅｓＢは非キラル特異性で、Ｓ／Ｒ−３−ＨＢ−ＣｏＡを基体として使用することができ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートと（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートを１０：１の比率で生産する株が得られた。
【００９９】
例５  −  クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）（ゲノムインテグレーション）
１）  遺伝子合成
遺伝子クプリアウィドゥス  ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）  ＰｈａＢはクロストリジウムのためにコドン最適化された。図２は、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（ｒ）  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成されたコドン最適化されたシーケンスの１つの例を示す。
【０１００】
２）  株発育
ＰｈａＢは、ｐｙｒＥに基づいた、公表されたＡＣＥ方法（例えばＷＯ２００９／１０１４００に記述される）を使用して、クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）のゲノムへインテグレートされた。トランスフォーマンツは遺伝子特異性プライマーを使用して確認された。３）  クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）のための発酵
【０１０１】
成長方法
ＦＭＣとＣＧＭを含むがこれらに制限されない適切な培地を使用して、以下に提供されるように、トランスフォーマンツを一晩成長させた。
【０１０２】
例証されたメディアは次のとおりである：
１Ｌにつき以下を含むＦＭＣメディア：酵母抽出物２．５ｇ、トリプトン２．５ｇ、ＦｅＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ  ０．０２５ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．５ｇ。ｐＨはチェックされ、６．５−７にオートクレーブ滅菌する前に調節された。ＣａＣＯ３  ５ｇ−１０ｇがｐＨを規制するために添加された。
【０１０３】
１Ｌ（ｐＨ  ６．６）につき以下を含むＣＧＭメディア：酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ  １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．７５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．７５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ４＊４Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２ｇ、アスパラギン２ｇ。炭酸カルシウム５−１０ｇ／ｌがｐＨ調整のために液体培地に加えられた。
【０１０４】
代謝の分析のためのサンプルは一定間隔で採取され、（Ｒ／Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート（Ｒ／Ｓ−ＨＢ）および（Ｒ／Ｓ）−１，３−ブタンジオール（Ｒ／Ｓ−１，３−ＢＤＯ）について分析された。
【０１０５】
分析
上澄みサンプルは、ＨＰＬＣに接続されたＡｍｉｎｅｘイオン排除カラム（ＨＰＸ−８７Ｈ、３００ｍｍ  ７．８ｍｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して分析された。代謝物質は０．５ｍｌ毎分の流量で５ｍＭのＨ２ＳＯ４で溶出された。生成された３−ヒドロキシブチレートおよび１，３−ブタンジオールのキラリティー分析はＨＰＬＣ−ＭＳを使用して実行された。サンプルはＤＡＴＡＮ（ジアセチル酒石酸無水物）を使用して誘導体とされ、Ｒ型とＳ型との分離は、非キラルのＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＰｌｕｓのＣ１８、２．１×１５０ｍｍ、１．８μｍ）を使用して行われた。簡潔に言えば、１０μｌの上澄みを２５０μｌのメタノールと混合した。サンプルは５０℃で乾燥され、調製された新鮮なＤＡＴＡＮ溶液（ジクロロメタン：酢酸４：１（ｖ／ｖ）中の２００ｇ／ｌのＤＡＴＡＮ）の５０μｌが加えられた。サンプルは７５°Ｃで１２０分間インキュベートされ、次いで蒸発ステップを行った。乾燥されたサンプルは、５００μｌの水中に懸濁され、ＬＣ−ＭＳによって分析された。
【０１０６】
結果
クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）のゲノムの中へのｐｈａＢのインテグレーションは、図９Ａおよび９Ｂに示されるように、２つのキラル化学物質、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールおよび（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートの生産に結びつく。生産された量は、０．３ｇ／ｌの３−ヒドロキシブチレートおよび３．２ｇ／ｌの１，３−ブタンジオールだった。
【０１０７】
例６  −  クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）（ゲノムインテグレーション対複製プラスミド（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ｐｌａｓｍｉｄ））
１）  遺伝子合成
遺伝子クプリアウィドゥス  ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）  ＰｈａＢはクロストリジウムのためにコドン最適化された。図２は、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成された、コドン最適化されたシーケンスの１例を示す。
【０１０８】
２）  株発育
第１の株ＰｈａＢは、ｐｙｒＥに基づいた、公表されたＡＣＥ方法（例えばＷＯ２００９１０１４００に記載されている）を使用して、クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）のゲノムへインテグレーションされた。第２の株ｐｈａＢは、ｐｆｄｘプロモータの管理の下で複製ｐＭＴＬ８２１５１プラスミド上で発現された。プラスミドは嫌気性クロストリジウムに対して標準エレクトロポレーション・プロトコルを使用して、Ｃｓｐａにトランスフォームされた。各トランスフォーマンツの正確な遺伝子型は遺伝子特異性プライマーを使用して確認された。
【０１０９】
３）  クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）のための発酵
成長方法
ＦＭＣとＣＧＭを含むがこれらに制限されない適切な培地を使用して、先に記載されたように、トランスフォーマンツを一晩成長させた。代謝の分析のためのサンプルは一定間隔で採取され、（Ｒ／Ｓ）−３−ヒドロキシブチレート（Ｒ／Ｓ−ＨＢ）および（Ｒ／Ｓ）−１，３−ブタンジオール（Ｒ／Ｓ−１，３−ＢＤＯ）について分析された。
【０１１０】
分析
上澄みサンプルは、ＨＰＬＣに接続されたＡｍｉｎｅｘイオン排除カラム（ＨＰＸ−８７Ｈ、３００ｍｍ  ７．８ｍｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して分析された。代謝物質は０．５ｍｌ毎分の流量で５ｍＭのＨ２ＳＯ４で溶出された。生成された３−ヒドロキシブチレートおよび１，３−ブタンジオールのキラリティー分析はＨＰＬＣ−ＭＳを使用して実行された。サンプルはＤＡＴＡＮ（ジアセチル酒石酸無水物）を使用して誘導体とされ、Ｒ型とＳ型との分離は、非キラルＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＰｌｕｓのＣ１８、２．１×１５０ｍｍ、１．８μｍ）を使用して行われた。簡潔に言えば、１０μｌの上澄みを２５０μｌのメタノールと混合した。サンプルは５０℃で乾燥され、調製された新鮮なＤＡＴＡＮ溶液（ジクロロメタン：酢酸４：１（ｖ／ｖ）中の２００ｇ／ｌのＤＡＴＡＮ）の５０μｌが加えられた。サンプルは７５℃で１２０分間インキュベートされ、次いで蒸発ステップを行った。乾燥されたサンプルは、５００μｌの水中に懸濁され、ＬＣ−ＭＳによって分析された。
【０１１１】
結果
図１０Ａおよび１０Ｂに示されるように、クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）のゲノムへのｐｈａＢのインテグレーションおよび複製プラスミド発現は、２つのキラル化学物質、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールおよび（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートの生産に導く。プラスミド発現対ｐｈａＢのインテグレーションの比較は予期しない結果を示した。ゲノムへのｐｈａＢのインテグレーションは、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートタイターの減少に結びつく。その一方でｐｈａＢがゲノムへインテグレーションされた時、（Ｒ）−１，３−ブタンジオール生産の６倍の増加が観察された。
【０１１２】
プラスミドおよびｐｈａＢが多数のコピーで存在する時、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートについて見られるように、より大きな生成物タイターが期待されるだろう。しかしながら、これは（Ｒ）−１，３−ブタンジオール生産については観察されない。遺伝子インテグレーションはプラスミド発現と比較して、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールの増加を導き、（Ｒ）−１，３−ブタンジオールおよび（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート経路内のた酵素有効性を増加させることにより、さらなる調節機構および可能なフィードバック阻害をさらに示す。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図３−Ｃ】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図５−Ａ】
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【図５−Ｂ】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９−Ａ】
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【図９−Ｂ】
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【図１０−Ａ】
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【図１０−Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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