(57)【要約】【解決手段】マルチウェルデバイスのウェルに分注して、このようなウェルを複数のＺ面から撮像するための方法、デバイス、組立体及びシステムを提供する。本方法及び本システムのマルチＺ撮像は、所望の数の細胞を含むマルチウェルデバイスのウェルの検出を可能にし得る。マルチＺ撮像を使用して識別されたマルチウェルデバイスの細胞含有ウェルを処理するための方法、デバイス、組立体及びシステムを更に提供する。
2019527551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチウェルチップの細胞含有ウェルを処理する方法であって、
a)  ある量の細胞懸濁液を前記マルチウェルチップのウェルに分注し、
b)  前記マルチウェルチップを撮像して複数のＺ面で前記ウェルの複数の画像を得て、
c)  得た複数の画像に基づき、前記マルチウェルチップの空のウェル及び細胞含有ウェルを識別する、前記マルチウェルチップのマップを生成し、
d)  前記マルチウェルチップの識別された細胞含有ウェルのみを処理することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記マップを生成する際に、得た複数の画像を組み合わせて、拡張焦点深度を有する合成画像を生成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の画像は少なくとも３つのＺ面を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記マルチウェルチップのウェルの一部をパイロット撮像して、撮像で使用された複数のＺ面を推定することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
撮像する際に、複数のウェルを同時的に撮像することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記マルチウェルチップのマップは、前記細胞含有ウェルが単細胞を含んでいるか又はマルチピレットを含んでいるかを更に識別し、単細胞を含んでいると識別された細胞含有ウェルのみを処理することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞懸濁液の量は、30nl〜50nlであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記マルチウェルチップの前記ウェルの数は100 以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
処理する際に、識別された細胞含有ウェルに少なくとも１つの試薬を分注することを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
処理する際に、識別された細胞含有ウェルの少なくとも一部で核酸増幅反応を行うことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
a)  液体分注要素及び画像取得要素を有する分注・撮像システム組立体と、
b)  前記分注・撮像システム組立体と通信するプロセッサと、前記プロセッサによって実行されると、前記分注・撮像システム組立体に、
i)  ある量の細胞懸濁液をマルチウェルチップのウェルに分注するステップ、
ii) 前記マルチウェルチップを撮像して複数のＺ面で前記ウェルの複数の画像を得るステップ、及び
iii)  得た複数の画像に基づき、前記マルチウェルチップの空のウェル及び細胞含有ウェルを識別する、前記マルチウェルチップのマップを生成するステップ
を実行させる指示を記憶するコンピュータメモリと
を備えていることを特徴とするシステム。
【請求項１２】
前記コンピュータメモリは、得た複数の画像を組み合わせて、拡張焦点深度を有する合成画像を生成することにより、前記マップを生成するための指示を更に有することを特徴とする請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記コンピュータメモリは、前記マルチウェルチップのウェルの一部をパイロット撮像して、撮像で使用された複数のＺ面を推定するための指示を更に有することを特徴とする請求項１１又は１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記コンピュータメモリは、前記プロセッサによって実行されると、前記システムに前記マルチウェルチップの識別された細胞含有ウェルのみを更に処理させる指示を更に有することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記マルチウェルチップの識別された細胞含有ウェルのみを更に処理させる指示は、前記液体分注要素を使用して、識別された細胞含有ウェルのみに少なくとも１つの試薬を分注させる指示を含むことを特徴とする請求項１４に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００１】
遺伝学者は癌、自己免疫疾患及び神経障害のような複雑な病気を特徴付ける努力をしているが、これらの病気を進める基本的なメカニズムの発見は達成困難であった。体細胞突然変異、寿命の間に細胞に蓄積する自発的な変異体は疾患発症及び再発を進める主な要因である。細胞が新たな突然変異体を蓄積するにつれて、細胞は正常細胞と共存する多クローン性細胞集団を形成する。大量の細胞集団の配列決定は、これらの特有の珍しい細胞型の基本的な不均一性をマスクし得るため、正常な生殖細胞突然変異からこれらの細胞型を識別することを困難にする。これらの違いを明らかにしてクローン構造を視覚化する最良の方法は、集団の個々の細胞を配列決定することである。
【課題を解決するための手段】
【０００２】
マルチウェルデバイスのウェルに分注して、このようなウェルを複数のＺ面から撮像するための方法、デバイス、組立体及びシステムを提供する。本方法及びシステムのマルチＺ撮像は、所望の数の細胞を含むマルチウェルデバイスのウェルの検出を可能にし得る。マルチＺ撮像を使用して識別されたマルチウェルデバイスの細胞含有ウェルを処理するための方法、デバイス、組立体及びシステムを更に提供する。
【０００３】
ある実施形態では、a)  i)  液体分注要素、及びii) マルチウェルデバイスの上側の異なるＺ面で焦点を合わせて画像を生成することが可能な画像取得要素を有する分注・撮像組立体と、b)  前記分注・撮像組立体を移動させるように構成された移動要素とを備えたシステムを本明細書で提供する。他の実施形態では、i)  マルチウェルデバイスの上側の異なるＺ面（例えば、10... 30... 又はそれ以上）から複数の画像を取り込み、ii) ウェルに存在する細胞の全ての焦点画像を与える合成画像を生成するために必要な異なるＺ面の最小数（例えば２〜15）を決定する、ウェルを撮像するためのシステム及び方法を提供する。
【０００４】
ある実施形態では、マルチウェルチップのウェルを撮像するための方法であって、a)  i)  第１の量の水溶液を含む複数のウェルを有する第１のマルチウェルデバイスであって、複数のウェルの少なくとも１％... ５％... 20％... 30％... 40％... 50％... 又は60％が１つの細胞のみ又は２つの細胞のみを含む（例えばウェルの少なくとも35％が単細胞を含む）前記第１のマルチウェルデバイスと、ii)  異なるＺ面で焦点を合わせて画像を生成することができる画像取得システムと、iii)  任意には、第１の量の水溶液を含む複数のウェルを有する（例えば同一ウェルの幾何的形状を有する第１のマルチウェルデバイスと同一のマルチウェルデバイスである）第２のマルチウェルデバイスであって、複数のウェルの少なくとも１％... ５％... 20％... 30％... 40％... 50％... 又は60％が１つの細胞のみ又は２つの細胞のみを含んでいる前記第２のマルチウェルデバイスとを準備し、b)  第１組の撮像パラメータを有するように構成された画像取得システムを使用して、複数のウェルの第１の部分（例えば100 ウェルデバイス又は5000ウェルデバイスの８ウェル）のマルチウェルデバイスの上側の異なるＺ面から複数の画像（例えば３… 10… 100 … 1000又はそれ以上の画像）を取り込み、c)  異なるＺ面からZmax面及びZmin面を決定し、Zmax面は、少なくとも１つの焦点が合っている細胞を含むマルチウェルデバイスから最も遠い面であり、Zmin面は、少なくとも１つの焦点が合っている細胞を含むマルチウェルデバイスに最も近い面であり、d)  複数のウェルの第１の部分に存在する細胞の全ての焦点画像を与える合成画像を生成するために画像の撮像に必要な異なるＺ面の最小数（例えば２又は３又は４... 10... 15... 又はそれ以上）を決定し、最小数の異なるＺ面は少なくともZmax面及びZmin面を含み、e)  i)  画像取得システムを使用して、最小数の異なるＺ面のみを用いてマルチウェルデバイスの複数のウェルの第２の部分（例えば100 ウェルデバイスの92ウェル）を撮像する、及び／又は、ii) 第１組の撮像パラメータを有するように構成された画像取得システムを使用して第２のマルチウェルデバイスの少なくとも一部を、最小数の異なるＺ面のみを用いて撮像する、の少なくとも１つを行う方法を本明細書で提供する。一般に、マルチウェルデバイスのウェルが深くなるほど、（Zmax及びZminに加えて）より多くのＺ面が、画像を生成するために用いられる必要がある。
【０００５】
ある実施形態では、本方法で、ステップe)で最小数の異なるＺ面で撮られた画像から合成画像を生成する。他の実施形態では、本方法で、ステップe)の後、第１のマルチウェルデバイスの第２の部分のウェルの各々に存在する細胞の数を決定する、及び／又は第２のマルチウェルデバイスの一部のウェルの各々に存在する細胞の数を決定する。他の実施形態では、最小数の異なるＺ面は、Zmax面とZmin面との間に１つ、２つ、３つ又は４つのＺ面を更に含む。追加の実施形態では、最小数の異なるＺ面は、Zmax面及びZmin面のみを含む。特定の実施形態では、最小数の異なるＺ面は、Zmax面、Zmin面、及びZmax面とZmin面との間に他の１つの面（他の面を１つだけ）のみを含む。ある実施形態では、より深いウェルが、Zmax面及びZmin面に加えて少なくとも２以上の面（例えば正確には２以上の面）を必要とする。
【０００６】
ある実施形態では、撮像パラメータは第１の倍率（例えば2x、3x、4x... 15x ... 50x ... 100x... 250x... 又はそれ以上）を含む。ある実施形態では、撮像パラメータは第１の開口数を含む。他の実施形態では、画像取得システムは、光源（例えば蛍光染料を励起させるために使用されるUV光、レーザ光又は他の光）を更に備えている。特定の実施形態では、細胞は一又は複数の蛍光染色液で染色される。ある実施形態では、細胞膜に蛍光結合した抗体を使用して細胞を蛍光タグ付けする。特定の実施形態では、蛍光染色液はヘキスト染色液及びヨウ化プロピジウムから選択する。
【０００７】
ある実施形態では、画像取得システムは、水溶液を複数のウェルに追加するように構成された液体分注要素を更に備えている。他の実施形態では、液体分注要素は、分注量の水溶液を複数のウェルの各々に分注するように構成されており、水溶液は、平均してＸ細胞が分注量の水溶液に存在するような濃度で水溶液に存在する細胞を含んでいる。特定の実施形態では、Ｘは１、２、３、４、５又はそれ以上である。
【０００８】
ある実施形態では、第１のマルチウェルデバイス及び／又は第２のマルチウェルデバイスの複数のウェルは、少なくとも95... 100 ... 200 ... 500 ... 1000... 3000... 5000... 10,000 又はそれ以上のウェル（例えばナノウェル又はマイクロウェル）である。ある実施形態では、第２のマルチウェルデバイスは設けられていない。他の実施形態では、どのウェルが単細胞（例えば１つの生細胞又は１つの死細胞）のみを含み、どのウェルが生細胞若しくは死細胞を含まないか又は２以上の生細胞若しくは死細胞を含むかを示す分注マップを生成する。特定の実施形態では、水溶液の第１の量は25nl〜２μｌの間である。他の実施形態では、ウェルの各々の体積は25nl〜２μｌの間である。更なる実施形態では、ウェルの各々の体積は50nl〜500 nlの間である。
【０００９】
ある実施形態では、多目的のシステムであって、a)  複数のウェルを有するマルチウェルデバイスを定位置に固定するように構成されたマルチウェルデバイス固定要素と、b)  i)  マルチウェルデバイスのウェルに液体を分注するように構成された液体分注要素、及びii) マルチウェルデバイスの上側の異なるＺ面で焦点を合わせて画像を生成することができる画像取得要素であって、液体分注要素に取り付けられているか、又は液体分注要素に隣り合う前記画像取得要素を有する分注・撮像組立体と、c)  マルチウェルデバイスが定位置にあるとき、マルチウェルデバイスの複数のウェルの大部分又は全てが、i)  液体分注要素から液体を受けることができ、ii)  画像取得要素によって撮像されることができるように、分注・撮像組立体を前記マルチウェルデバイスに対して移動させるように構成された移動要素とを備えているシステムを本明細書で提供する。
【００１０】
ある実施形態では、液体分注要素は、分注量の液体を複数のウェルの各々に分注するように構成されており、液体は、平均してＸ細胞が分注量の液体に存在するような濃度で液体に存在する細胞を含んでいる。特定の実施形態では、Ｘは0.01、0.02、0.1 、0.5 、１、２、３、４、５又はそれ以上である。ある実施形態では、本システムはマルチウェルデバイスを更に備えている。ある実施形態では、第１のマルチウェルデバイスの複数のウェルは、少なくとも100 ウェル（例えば、100... 500... 1000... 5000又はそれ以上）である。更なる実施形態では、画像取得要素は光源を更に有している。特定の実施形態では、複数のウェルの各々の体積は25nl〜２μｌの間である。他の実施形態では、複数のウェルの各々の体積は50nl〜500 nlの間である。更なる実施形態では、移動要素は、分注・撮像組立体をＸ方向に移動させるための第１のレール、及び分注・撮像組立体をＹ方向に移動させるための第２のレールを有する。他の実施形態では、本システムは、コンピュータメモリ及びコンピュータプロセッサを有するコンピュータ部品を更に備えており、コンピュータメモリの指示は、i)  移動要素の移動、ii) 分注要素の液体分注、及びiii)  画像取得要素の画像取込みを制御する。
【００１１】
ある実施形態では、a)  i)  複数のウェルを有するマルチウェルデバイスと、ii) 複数のウェルを有するマルチウェルデバイスを定位置に固定するように構成されたマルチウェルデバイス固定要素と、iii)  A)  I)  マルチウェルデバイスのウェルに液体を分注するように構成された液体分注要素、及びII) マルチウェルデバイスの上側の異なるＺ面で焦点を合わせて画像を生成することができる画像取得要素であって、液体分注要素に取り付けられているか、又は液体分注要素に隣り合う画像取得要素を有する分注・撮像組立体と、B)  マルチウェルデバイスに対して分注・撮像組立体を移動させるように構成された移動要素とを備えた多目的のシステムとを準備し、b)  マルチウェルデバイスが定位置に配置されるようにマルチウェルデバイスをマルチウェルデバイス固定要素に置き、c)  マルチウェルデバイスの複数のウェルの大部分又は全てが、i)  複数のウェルの少なくとも１％... 5％... 20％... 30％... 50％が１つの細胞のみ又は２つの細胞のみを含むように液体分注要素から細胞含有液体を受け、ii) マルチウェルデバイスの底部の上側の複数のＺ面で画像取得要素によって撮像されることにより、異なるＺ面から複数の画像を生成するように、分注・撮像組立体を作動する方法を本明細書で提供する。
【００１２】
特定の実施形態では、本方法で、d)  異なるＺ面からZmax面及びZmin面を決定し、Zmax面は、少なくとも１つの焦点が合っている細胞を含むマルチウェルデバイスから最も遠い面であり、Zmin面は、少なくとも１つの焦点が合っている細胞を含むマルチウェルデバイスに最も近い面である。ある実施形態では、本方法で、e)  複数のウェルに存在する細胞の全ての焦点画像を与える合成画像を生成するために画像の撮像に必要な異なるＺ面の最小数（例えば２〜15）を決定し、最小数の異なるＺ面は、少なくともZmax面及びZmin面を含む。
【００１３】
ある実施形態では、マルチウェルデバイスは、少なくとも50ウェル（例えば、50... 100... 150... 400... 689... 900又はそれ以上）のウェルを有している。追加の実施形態では、マルチウェルデバイスは少なくとも1000ウェル（例えば1000... 1500... 2500... 5000... 5184... 10,000... 20,000... 又はそれ以上）を有している。他の実施形態では、マルチウェルデバイスはマルチウェルチップを有している。
【００１４】
特定の実施形態では、本方法で、ステップで分注する前及び／又は分注した後、第１及び／又は第２の検出可能な標識で細胞の少なくとも一部を標識化する。ある実施形態では、第１又は第２の検出可能な標識は循環癌細胞及び／又は癌幹細胞に特異的である。他の実施形態では、第１又は第２の検出可能な標識は、抗体又は抗体の抗原結合部分を有している。ある実施形態では、細胞懸濁液の細胞を腫物組織から精製する。他の実施形態では、分注量は、25nl〜500 nlの間であるか、又は500 nl〜１μｌの間である。更なる実施形態では、細胞の標識化を分注前に行う。更なる実施形態では、細胞の標識化を分注後に行う。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1Aは、一体型の分注・撮像組立体を使用しない例示的なワークフローを示す図である一方、図1Bは、一体型の分注・撮像組立体を使用した同様の例示的なワークフローを示す図である。図1Bのワークフローは、あるステップが遠心分離及び凍結のような本方法のある実施形態で回避され得ることを示している。
【図２】本実施形態では２つのレールとして示されている移動要素で運ばれる例示的な一体型の分注・撮像組立体を示す図である。
【図３Ａ】どのように複数の画像を異なる深度で撮って、その後結合し、焦点が合っている全ての細胞を合成画像に与えるかを示す焦点アルゴリズムの例示的な拡張深度を示す概略図である。
【図３Ｂ】細胞の一部の焦点が合っているチップ内の16ウェルの第１の画像と、焦点が合っている他の細胞を含む200 ミクロン高い（異なるＺ面の）同一の16ウェルの第２の画像とを示す図である。第３の画像は、ウェル内の焦点が合っている単細胞及びダブル細胞の全てを示す２つの第１の画像の合成である。
【図４】１つのウェルの異なるＺ面画像（面１、面２及び面３）、並びに３つの画像を結合した合成画像（最終画像）を示す図である。
【図５】マルチウェルデバイスのマルチウェルのマルチＺ面画像を示す図である。
【図６】画像処理アルゴリズムに従って重みが加えられた図５のマルチＺ面画像を示す図である。
【図７】図６の重みが加えられたマルチＺ面画像から生成された合成（つまり、平坦化）画像を示す図である。
【図８】マルチウェルチップの遠心分離有り及び遠心分離無しの両方で様々な分注量を使用した候補ウェル定量化の結果を示す図である。
【図９】図８で行われているように候補ウェル定量化から計算されたポアソン率を示す図である。
【図１０】遠心分離無しで行われたウェル識別によって生じる、混合種実験の配列決定アライメントにより決定された相対的なマルチピレット率を示す図である。
【図１１】遠心分離有りで行われたウェル識別によって生じる、混合種実験の配列決定アライメントにより決定された相対的なマルチピレット率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
マルチウェルデバイスのウェルに分注して、このようなウェルを複数のＺ面から撮像するための方法、デバイス、組立体及びシステムを提供する。本方法及びシステムのマルチＺ撮像は、所望の数の細胞を含むマルチウェルデバイスのウェルの検出を可能にし得る。マルチＺ撮像を使用して識別されたマルチウェルデバイスの細胞含有ウェルを処理するための方法、デバイス、組立体及びシステムを更に提供する。
【００１７】
ある実施形態では、a)  i)  液体分注要素、及びii) マルチウェルデバイスの上側の異なるＺ面で焦点を合わせて画像を生成することが可能な画像取得要素を有する分注・撮像組立体と、b)  前記分注・撮像組立体を移動させるように構成された移動要素とを備えたシステムを本明細書で提供する。他の実施形態では、ウェルを撮像するためのシステム及び方法であって、i)  マルチウェルデバイスの上側の異なるＺ面（例えば10... 30... 又はそれ以上）から複数の画像を取り込み、ii) ウェルに存在する細胞の全ての焦点画像を与える合成画像を生成するために必要な異なるＺ面の最小数（例えば２〜15）を決定するシステム及び方法を提供する。
【００１８】
本明細書には、ある実施形態では、例えば分注性能及び撮像性能を有する組立体を設けることにより、撮像ステップ及び分注ステップを組み合わせて、単細胞のワークフローを著しく簡略化する一体化されたシステムを提供する。分注器及び撮像システムを同一の機器に設けることにより、マルチウェルデバイス（例えば、WAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.）によって販売されているSMARTCHIP （商標）マルチウェルデバイス）のオペレータによる取り扱いの必要性を著しく低減させることができる。加えて、マルチウェルデバイスの上側の複数のＺ面画像を用いることにより、ある実施形態では一定の利点を可能にする。例えば、マルチＺ面撮像は、所望の数の細胞を含むマルチウェルデバイスの候補ウェルのより正確な検出、又は例えば遠心分離ステップの除去を含む、例えば一又は複数の処理ステップの除去を含むサンプル処理の簡略化を可能にし得る。
【００１９】
簡略化された処理の例が図１に示されている。図1Aは、一体型の分注・撮像組立体を使用しない例示的なワークフローを示す一方、図1Bは、一体型の分注・撮像組立体を使用した同様の例示的なワークフローを示す。図1Bのワークフローは、遠心分離及び凍結のようなあるステップが本明細書に記載されている方法のある実施形態で回避され得ることを示している。
【００２０】
例示的なワークフロー
以下のワークフローステップは、一体化された分注・撮像組立体（例えばマルチＺ性能を有する分注・撮像組立体）を使用するときに例示的な実施形態で用いられる。最初に、蛍光染色した細胞を384 ウェルプレートに予めロードする。この例示的な実施形態では、８つのサンプルをマルチウェルデバイス（例えば、WAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.）によって販売されている5184ウェルを有するSMARTCHIP （商標）マルチウェルデバイス）に分注することができる。図２は、マルチウェルデバイスの上側で一体化されたシステムを自動的に移動させるための移動要素と共に細胞を分注して撮像することができる例示的な一体化されたシステムを示す。図２に示されているシステムは、２つの移動要素（「レール」）及び一体化された撮像・分注システム（挿入図）を備えており、分注システムは複数の分注先端を有している。撮像要素と分注要素との一体化によって、撮像システムを使用して行われるような候補細胞含有ウェルの検出と、分注システムを使用して行われるようなウェルへの細胞の分注、及び該当する場合にはその後の処理試薬の添加との調整を可能にする。
【００２１】
本開示の実施形態の開発中に行われた作業では、K562細胞を含む複数の細胞株を使用し、WAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.）によって販売されている分注器であるマルチサンプルナノディスペンサ（MSND+ ）を使用して50nL程度の分注量を採用した。これらの実施形態に従って本マルチウェルシステムに細胞懸濁液を分注するとき、細胞溶液の濃度は、平均でウェル当たり単細胞のみが分注されるように設定されてもよい。
【００２２】
本実施形態では、分注後、一又は複数の波長の光（一又は複数の特定の蛍光染料又は細胞内に存在するか、細胞と共に存在するか若しくは細胞に付着した一又は複数の分子を含むフルオロフォアの励起波長に相当する一又は複数の波長の光を用いる場合を含む）及び複数のＺ面を用いてマルチウェルチップを撮像する。この例示的なワークフローで使用される機器は、異なるＺ面で集束させる性能を有している。例示的な実施形態では、スキャニングに利用可能な３つのフィルタセットがあり、本開示の実施形態の開発中に行われた作業で提供される例は、フィルタの内２つを使用した。このような場合、１つのフィルタは（例えば、核染色に基づき）細胞を識別するために使用し、別のフィルタは、（例えば、生細胞不透過性のDNA インターカレート染料の除外に基づき）細胞膜の健康状態を評価するために使用した。
【００２３】
次に、一体化された分注・撮像組立体によって細胞を撮像する。細胞の撮像は一般に倍率を必要とするため、被写界深度dtotを減少させる。以下の式がこの関係を数学的に示す。式は、高い開口数が被写界深度dtotを減少させることを更に示す。しかしながら、より高い開口数は、感度を高めるので一般に望ましい。
dtot＝（λｎ／NA2）＋{（ｎ／M NA）ｅ}
ここで、dtot：被写界深度、
λ0：波長
ｎ：屈折率
NA：開口数
Ｍ：対物レンズの倍率
ｅ：撮像分解能
【００２４】
異なるＺ面に位置し得る数千の個別の対象又は細胞を撮像するとき、全ての対象を正確に撮像することが重要である。これは、単細胞のみを識別する単細胞の用途で特に重要である。従って、本明細書では、マイクロウェル又は他の細胞捕捉デバイス内の細胞を識別する能力を高める方法及びシステムを提供する。この例示的な実施形態では、最初に撮像デバイスを使用して、複数の焦点又はＺ面でマルチウェルデバイス（例えば、WAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.）によって販売されているSMARTCHIP （商標）マルチウェルデバイス又は他の細胞捕捉デバイス）のウェルをスキャンする。その後、より焦点が合っている各画像のピクセルを選択することにより合成画像を生成する。このような処理は拡張焦点アルゴリズムを使用して行われ得る。合成画像を得ると、（WAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.）によって販売されている）CELLSELECT（商標）ソフトウェアのような細胞計数ソフトウェアによって、得られた画像を処理して、捕捉デバイス（例えば、WAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.）によって販売されているSMARTCHIP （商標）マルチウェルデバイス）内の全ての細胞を正確に計数することができる。この手順は、透過、反射、蛍光などの任意の撮像モードで得られた画像と共に使用することができる。
【００２５】
拡張焦点アルゴリズムがどのように機能し得るかを表す例が図３に示されている。図3Aは、異なる深度での複数の画像をどのように撮って、その後結合し、焦点が合っている全ての細胞を合成画像に与えるかを示す例示的な拡張焦点深度アルゴリズムを示す概略図である。図3Bは、細胞の一部の焦点が合っているチップ内の16ウェルの第１の画像と、焦点が合っている他の細胞を含む200 ミクロン高い（異なるＺ面の）同一の16ウェルの第２の画像とを示す図である。第３の画像は、ウェル内の焦点が合っている単細胞及びダブル細胞の全てを示す２つの第１の画像の合成である。図3Bでは、左側の画像の細胞の一部は焦点が僅かにずれており、より暗い矢印で示されている一方、他の細胞は焦点が合っており、より明るい矢印で示されている。中心にある画像は、顕微鏡対物レンズからサンプルへの距離を200 ミクロン伸ばすことにより得られた。この場合、細胞の一部の焦点は合っているが、他の細胞の焦点はずれている。第３の画像は、拡張被写界深度アルゴリズムの結果を示す。この新しい画像は前の２つの画像の合成であり、元の画像と比較すると、全ての細胞が良好な焦点を示すことが観察され得る。
【００２６】
焦点が合っているほとんどの細胞が識別されたので、CELLSELECT（商標）（WAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.））のような細胞検出アルゴリズムを使用して、１つの細胞、細胞無し、２つの細胞又は他の数の細胞を有するウェルを識別することができる。この点に関して、このようなソフトウェアによって分注マップを作成し、どのウェルが細胞、又は所望の数の細胞、例えば単細胞を有するか、一又は複数の細胞を処理するための試薬（例えば一又は複数の細胞を溶解し、一又は複数の核酸を増幅し、一又は複数の核酸を配列決定するためなどの試薬）を受けるべきであるかを示すことができる。
【００２７】
上述された例示的なワークフローの要素は、全ての実施形態で必ずしも存在する必要がない。そのため、他の実施形態は、上述した例示的なワークフローの一又は複数の要素を含んでもよく又は除外してもよく、例示的なワークフローを変更して、例えば本明細書に記載されている一又は複数の要素を含めてもよく、選択的に提供してもよい。
【００２８】
マルチＺ面撮像
本明細書に記載されている方法、デバイス、組立体及びシステムの態様がマルチＺ面撮像を利用してもよい。「マルチＺ面撮像」とは、撮像される一又は複数の対象からの複数の撮像距離で行われる１つの視野の撮像を意味する。このような複数の撮像距離はＺ距離と称されてもよく、各Ｚ距離はＺ面を定めてもよい。最も微視的な対物レンズの浅い被写界深度を考慮すると、異なるＺ面で撮られた画像は一般に、画像内に対象に関して異なる質の焦点を含む。例えば、対物レンズから異なる距離にある２つの対象の第１の画像は、２つの対象の第１の焦点を合わせて、２つの対象の第２の焦点をずらす場合がある。第２の画像を異なるＺ距離で撮ると、第１の対象は焦点から移動し、第２の対象が焦点に移動する場合がある。
【００２９】
マルチウェルデバイスと対物レンズとの距離は、あらゆる簡便な処理によって変えられてもよく、このような処理として、例えば、対物レンズをマルチウェルデバイスに徐々に近づける処理、対物レンズをマルチウェルデバイスから更に遠ざける処理、マルチウェルデバイスを対物レンズに徐々に近づける処理、マルチウェルデバイスを対物レンズから更に遠ざける処理、マルチウェルデバイス及び対物レンズの両方を移動させる処理などが含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
１つのＺ面の撮像と比較すると、マルチＺ面撮像は、撮像視野内の対象の全て、大部分又は多くの十分に焦点が合っている画像を得る確率を高め得る。このような場合は、例えば対象が理論上位置し得るＺ面の範囲が、撮像に使用される対物レンズの被写界深度より大きい場合であり得る。
【００３１】
本開示の実施形態の開発中に行われた作業は、マルチＺ合成画像手法を評価しようとしたことである。「合成画像」とは一般に、２以上の画像から構成された画像を意味する。マルチＺ合成画像は一般に、同一の視野で撮られる複数の画像から構成され、Ｚ距離の調節が複数の画像を取り込む間に行われ、例えば、Ｚ距離の調節が、マルチＺ合成画像を構築する際に用いられる、画像を取り込む間に変えられる唯一の撮像パラメータである。様々な方法が、複数のＺ面で取り込まれた複数の画像をマルチＺ合成画像に結合するために用いられてもよく、例えば以下により詳細に記載される画像処理手法の一又は複数を使用した方法を含む。
【００３２】
マルチＺ画像、又は合成画像が細胞の数の最も信頼できる測定法であると仮定すると、その画像を使用して、他の画像で得られた結果の正確性を評価することができる。特に、マルチＺ画像を、ユーザがサンプルに手動で焦点を合わせて得られる１つのＺ面画像と比較することに注目する。行われた作業は、異なるＺ面でSMARTCHIP （商標）マルチウェルデバイスの144 の関心領域（AOI ）を撮像し、合成画像を計算して、CELLSELECT（商標）（WAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.））細胞計数ソフトウェアを使用し、１つのＺ画像に基づき得られた結果の感度及び特異性を得ることである。以下の表（表１）では、肯定的な結果が単細胞を含むウェルとみなされる。ウェルが２以上の細胞を含む場合、又はウェルが細胞を含まない場合、結果は、そのウェルに関して否定的とみなされる。
【００３３】
【表１】
2019527551.tif 000003
【００３４】
この情報を用いて、ユーザは、より高いレベルの特異性及び感度を得るために細胞分注を変更することができる。文献（例えば、Microsc Res Tech. 2004 Sep;65(1-2):33-42. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Forster B, Van De Ville D, Berent J, Sage D, Unser M.；Extended depth of field using shapelet-based image analysis. Meneses J, Suarez MA, Braga J, Gharbi T. Appl Opt. 2008 Jan 10;47(2):169-78；及びModel-based 2.5-d deconvolution for extended depth of field in brightfield microscopy, Aguet F, Van De Ville D, Unser M、これら全ての全体が参照によって本明細書に組み込まれる）で入手可能なアルゴリズムを含む様々なアルゴリズムを使用してマルチＺ画像を生成することができる。使用される所望の数の細胞を含むウェルの識別に必要な最も少ない数のＺ面画像を可能にする追加の方法及びアルゴリズムが本明細書で提供される。このような方法及びアルゴリズムは多くの場合、マルチウェルサンプル処理を促進して簡素化する。
【００３５】
図４は、本明細書に開示された方法及びアルゴリズムを使用した元の画像及び合成画像の例示的な出力を示す。特に図４は、１つのウェルの異なるＺ面画像（「Ｚ面１」、「Ｚ面２」及び「Ｚ面３」）、並びに３つのＺ面画像から生成された合成画像（「最終」画像）を示す。候補ウェルを識別するために本方法及び本システムで得られる及び／又は使用されるＺ面画像の実際の数は異なってもよく、例えばウェル内の流体の量、ウェルのサイズ、マルチウェルデバイス内のウェルの数などを含む複数の要因によって決められてもよい。Ｚ面画像の有用な数は、例えば２〜10以上、例えば２〜10、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、３〜10、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、４〜10、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、５〜10、５〜９、５〜８、５〜７、６〜10、６〜９、６〜８、７〜10、７〜９、８〜10、10、９、８、７、６、５、４、３、２などを含むがこれらに限定されない。
【００３６】
マルチＺ面撮像で利用されるＺ面の数に加えて、面間のＺ距離は異なり、例えば使用されるＺ面の数、ウェル内の流体の量、ウェルのサイズ、マルチウェルデバイス内のウェルの数、撮像システムの被写界深度などを含む複数の要因によって決められてもよい。場合によっては、Ｚ面間のＺ距離は10μｍ未満〜１mm以上の範囲内であってもよく、例えば10μｍ〜１mm、10μｍ〜900 μｍ、10μｍ〜800 μｍ、10μｍ〜700 μｍ、10μｍ〜600 μｍ、10μｍ〜500 μｍ、10μｍ〜400 μｍ、10μｍ〜300 μｍ、10μｍ〜200 μｍ、10μｍ〜100 μｍ、10μｍ〜50μｍ、100μｍ〜１mm、100 μｍ〜900 μｍ、100 μｍ〜800 μｍ、100 μｍ〜700 μｍ、100 μｍ〜600 μｍ、100 μｍ〜500 μｍ、100 μｍ〜400 μｍ、100 μｍ〜300 μｍ、100 μｍ〜200 μｍなどの範囲内を含むがこれらに限定されない。
【００３７】
マルチＺ面撮像は、本明細書に記載されている方法、デバイス、組立体及びシステムの様々な態様で使用されてもよい。例えば、場合によっては、マルチＺ面撮像は、例えばマルチウェルデバイスの全てのウェルから候補ウェル（つまり、所望の数の細胞を含むウェル）を識別することを可能にすべく、マルチウェルデバイスの全てのウェルを撮像する際に使用されてもよい。マルチウェルデバイスのウェルは個々に（つまり、一度に１つずつ）撮像されてもよく、又は複数のウェルが１つの視野内で撮像されてもよい（つまり、複数のウェルが同時に若しくは同時的に撮像されてもよい）。複数のウェルを撮像するときに１つの視野に存在するウェルの数は異なり、２〜100 以上の範囲内であってもよく、例えば２〜100 、２〜90、２〜80、２〜70、２〜60、２〜50、２〜40、２〜30、２〜20、２〜10、10〜100 、10〜90、10〜80、10〜70、10〜60、10〜50、10〜40、10〜30、10〜20などの範囲内を含むがこれらに限定されない。場合によっては、マルチウェルデバイスのウェルのバッチ撮像は、マルチウェルデバイスの全てのウェルを撮像すべく使用される撮像視野の数で表現されてもよく、このような数は異なり、２〜500 以上の範囲内であってもよく、例えば２〜500 、２〜400 、２〜300 、２〜200 、２〜100 、２〜50、２〜25、２〜10、100 〜500 、100 〜400 、100 〜300 、100 〜200 、200 〜500 、200 〜400 、200 〜300 、10〜100 、10〜50などの範囲内を含むがこれらに限定されない。
【００３８】
場合によっては、マルチＺ面撮像は、マルチウェルデバイスを撮像する際に使用されるＺ面の数を決定する際に用いられてもよい。例えば、一連のマルチＺ面撮像を利用して、マルチウェルデバイスのウェルの複数のＺ面画像を収集し、所望の感度及び特異性で候補ウェルを検出するのに十分なＺ面サンプリングの程度を決定してもよい。候補ウェルを識別するために使用される実際のマルチＺ面撮像より前に行われるこのようなマルチＺ面撮像は、本明細書では「パイロット撮像」と称され得る。パイロット撮像は、マルチウェルデバイスのウェルの一部又はサンプルのみの撮像を含んでもよい。その後、パイロット撮像中にマルチウェルデバイスのウェルの一部に関して得られた複数のＺ面画像を使用して、マルチウェルプレートのウェルの全て又は残りに関して幾つのＺ面を撮像するかを決定してもよい。場合によっては、パイロット撮像中に決定されるパラメータは、複数の同様のマルチウェルデバイスの撮像全体に亘って適用されてもよい。
【００３９】
パイロット撮像は、マルチウェルデバイスの全てのウェルに関して行われるマルチＺ面撮像と比較して、Ｚサンプリングのより高いレベル又はより低いレベルで行われてもよい。例えば、場合によっては、後の撮像と比較して、パイロット撮像中により多数のＺ面を取り込んでもよい。場合によっては、後の撮像と比較して、パイロット撮像中により少数のＺ面を取り込んでもよい。場合によっては、後の撮像と比較して、パイロット撮像中に同数のＺ面を取り込んでもよい。場合によっては、パイロット撮像を用いて、後のマルチＺ面撮像で使用されるＺ面のレベルを決定及び／又は設定してもよい。例えば、パイロット撮像を用いて、後のマルチＺ面撮像で使用されるZmax及び／又はZminのＺ面の位置を決定してもよい。
【００４０】
一実施形態では、パイロット撮像中、一又は複数のウェルを複数のＺ面で撮像してもよく、画像を分析して、焦点が合っている細胞を夫々含んでいる複数のＺ面の最も低いＺ面及び最も高いＺ面を決定してもよい。その後、このような最も低いＺ面及び最も高いＺ面を、後の撮像のためにZmin及びZmaxと設定してもよい。場合によっては、許容誤差がZmin及びZmaxの設定に組み込まれてもよく、例えば、Zmin及びZmaxは、例えばプラスマイナス10μｍ以下〜100 μm以上などを含む、焦点が合っている細胞を夫々含む複数のＺ面の最も低いＺ面及び最も高いＺ面からのあるＺ距離に設定される。場合によっては、許容誤差は、焦点が合っている細胞を夫々含む複数のＺ面の最も低いＺ面及び最も高いＺ面間のＺ距離全体のある分数又は倍数に設定されてもよく、例えば、距離の±10％、距離の±20％、距離の±30％、距離の±40％、距離の±50％、距離の±100 ％、距離の±200 ％などを含む。場合によっては、許容誤差が導入されなくてもよく、Zmin及びZmaxは、パイロット撮像中に取り込まれる画像の検出された最も高い焦点が合っている細胞及び最も低い焦点が合っている細胞の対応するＺ距離に設定されてもよい。
【００４１】
マルチウェルデバイスのウェルのマルチＺ面撮像（つまり、非パイロット撮像）が、決定されたZmin面及びZmax面の一又は複数を含んでもよく、又は含まなくてもよい。場合によっては、マルチＺ面撮像はZmin面及びZmax面の両方を含んでもよく、Zmin面及びZmax面間の追加の面が含まれるか、又は含まれない。場合によっては、マルチＺ面撮像はZmin面及びZmax面の一方又は両方を除外してもよく、Zmin面及びZmax面間の追加の面のみが使用される。Zmin面及びZmax面間で使用される面の数は、Zmin面及びZmax面が使用されるか否かに関わらず異なり、１〜10以上の範囲内であってもよく、例えば１〜10、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、２〜10、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、３〜10、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、４〜10、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、５〜10、５〜９、５〜８、５〜７、６〜10、６〜９、６〜８、７〜10、７〜９、８〜10、10、９、８、７、６、５、４、３、２、１などを含むがこれらに限定されない。
【００４２】
本方法及び本システムに利用される記載された様々なＺ面は、互いに対して及び／又はＺ面の絶対位置に基づき定められてもよく、例えばマルチウェルプレートに対して（例えばマルチウェルプレートのウェルの底部に対して）、撮像に利用される対物レンズなどに対して定められてもよい。例えば、焦点が合っている細胞を含むZmin面は、マルチウェルプレートのウェルの底部にあってもよく、又はマルチウェルプレートのウェルの底部の上側Ｘμｍの位置にあってもよく、第２のＺ面はZmin面の上側Ｙμｍの位置にあると記載されてもよい。
【００４３】
画像の処理及び取得
生成されたマルチＺ面画像は、様々な画像処理ステップ及び／又は画像処理アルゴリズムを通して処理されてもよい。場合によっては、生成されたマルチＺ面画像を処理して、マルチウェルデバイスの候補ウェルを識別してもよい。場合によっては、マルチＺ面画像の画像処理は合成画像の生成を含んでもよく、合成画像から、候補ウェルの識別を行ってもよい。場合によっては、マルチウェルプレートの候補ウェルを識別する際に、合成画像を生成することなく、生成されたマルチＺ面画像を使用してもよく、例えば、合成画像を生成することなく、例えば一又は複数の画像処理ステップを通して、生成されたマルチＺ面画像から候補ウェルを直接識別してもよい。様々な画像処理ステップを、一組のマルチＺ面画像の個々の画像、一組のマルチＺ面画像から生成された合成画像、又はこれら両方に行ってもよい。
【００４４】
有用な画像処理ステップとして、例えば数学的な画像（つまりピクセル的な）変換（つまり、ピクセル的な加算、減算、除算、乗算など）、統計的な画像変換（例えば、中央値変換、標準偏差変換など）、平滑化アルゴリズム、ぼやけ変換／フィルタリング、形態学的膨張、マルチチャネル画像の分割チャネル、一又は複数の画像マスクの生成、空間充填又はホールクロージング、ノイズフィルタリング、セグメンテーションなどが含まれるが、これらに限定されなくてもよい。場合によっては、２以上の画像を特定の画像処理ステップで結合してもよく、画像又は画像の画像変換を数学的に組み合わせる、例えば合計する、平均する、減算する。例えば、場合によっては、２以上の画像又は画像の変換を組み合わせて、加重合計画像、加重画像の合計又はこれら両方などを生成してもよい。場合によっては、画像を結合する際に、フロート画像を利用してもよい。本方法及び本システムとの関連で一般に、「フロート」画像は、複数のＺ面からのピクセル値がピクセル強度飽和無しで組み合わせられ得る（例えば加算され得る、減算され得る、乗算され得る）ため、ダイナミックレンジの増加を可能にする画像を指し得る（つまり、フロート画像は、フロート画像に加えられる個々の画像のダイナミックレンジを超えるダイナミックレンジを有し得る）。フロート画像の使用への様々な手法が本方法及び本システムに見出され得る。画像処理ステップは、画像全体に亘って全体的に適用されてもよく、又は画像の一又は複数の注目領域（ROI ）に亘って選択的に適用されてもよい。場合によっては、本アルゴリズムで使用される画像処理ステップは、全体的に適用される画像処理ステップのみに限定されてもよい。
【００４５】
画像処理ステップは一般にデジタル画像の処理を含んでおり、デジタル画像は異なってもよく、バイナリ（例えば黒及び白）フォーマット、グレースケールフォーマット又はカラーフォーマットであってもよい。様々なフォーマットの画像を、必要に応じて適切な画像処理アルゴリズムによってフォーマット間で更に変換してもよい。例えば、カラー画像を個々のカラーチャネルに「分割」してカラーチャネル毎に個々のグレースケール画像を生成してもよい。例えば、赤、緑及び青（RGB ）の画像を個々の赤チャネル、緑チャネル及び青チャネルに分割して、赤チャネルのグレースケール画像、緑チャネルのグレースケール画像及び青チャネルのグレースケール画像を生成してもよい。カラー画像を各色空間の間で変換して、特定の色空間の任意の簡便で適切なカラーチャネルに分割してもよく、色空間として、例えばRGB 色空間、CMYK色空間、HSV 色空間、CIE 色空間、Lab 色空間、CIELUV色空間、YCbCr 色空間などが含まれるが、これらに限定されない。二値画像及びグレースケール画像をカラー画像のチャネルに適用してもよく、例えば、複数の二値画像又はグレースケール画像をカラー画像の複数のチャネルに適用し、カラー画像を二値画像及び／又はグレースケール画像から構築するか、又は「マージ」してもよい。
【００４６】
記載された方法に使用され得る他のデジタル画像処理の画像変換として、例えば、ポイント処理変換（例えばネガティブ変形、ログ変換、逆ログ変換、ｎ乗根変換、ｎ乗変換、ガンマ補正、コントラスト変換、ウィンドウ中心補正、ヒストグラム平坦化など）、フィルタリング（つまりネイバー）変換（例えば平均フィルタ、ガウスフィルタ、メディアンフィルタ、画像勾配フィルタ、ラプラシアンフィルタ、正規化相互相関（NCC ）フィルタなど）及び同種のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
ある実施形態では、標準偏差画像がＺ面画像毎に生成されてもよく、標準偏差画像の全てのピクセルは、一群の近傍ピクセル、例えば元の画像の５×５の近傍ピクセルの標準偏差を表す。標準偏差画像変換は、場合によっては、標準偏差変換が全てのピクセルに関して個々に計算されることを除いて、オートフォーカス変換と同様であってもよい。一般に、細胞を含む画像では、標準偏差は、焦点が合っている細胞がある領域で高く、他の領域で低い。従って、重みが標準偏差である全てのＺ面に亘ってピクセルの加重平均をとるとき、最も高い標準偏差を有する面に最も重みが加えられる。
【００４８】
ある実施形態では、変換画像の増幅を行って、例えばＺ面画像間の小さな差を拡大してもよい。例えば、ある実施形態では、標準偏差変換画像を増幅して、Ｚ面間の標準偏差の差を拡大してもよい。焦点が合っているピクセルの重みを増幅するために、全ての標準偏差の重みを増幅してもよく、例えば４乗に高めてもよい。このような増幅により、ほとんどの値が０に近いＺ重みの分布がもたらされる（つまり、Ｚ面のいずれにも対象がない）ことが可能になり、Ｚ面の一部で可視の対象があれば、値の一部が０より遥かに大きくなる。データ増幅は記載された増幅に限定されなくてもよく、それ自体異なってもよい。
【００４９】
ある実施形態では、画像処理アルゴリズムが、生成されたＺ面画像を利用してもよく、一般に焦点がずれているピクセルは、焦点が合っているピクセルより暗い。従って、場合によっては、生成された加重画像（例えば標準偏差加重画像）に元の一又は複数の画像を掛けて、明るい領域の強度を増幅し、明るい領域及び背景のコントラストを更に高めてもよい。このような増幅が標準偏差加重と組み合わせて使用される場合、結果は、桁違いのダイナミックレンジを有する加重画像であってもよい。任意のＺ面で細胞の一部ではない背景ピクセルは一般に、全ての面に関して同一であるか又は略同一である重みと、全てのＺ面に亘る背景ピクセルに関する最終平均値とを有する。低濃度細胞分注が使用される場合、分析されるピクセルの大部分は、背景ピクセルのこれらの特性を有する。
【００５０】
場合によっては、画像処理アルゴリズムは画像の平滑化処理を含んでもよい。画像の平滑化を使用して、場合によっては、例えば、第１のＺ面に重みの大部分を有する第１のピクセルが異なるＺ面に重みの大部分を有するピクセルと隣接することを防いでもよい。平滑化は、画像が細胞をほとんど含んでおらず、各細胞が１つ、又は多くとも２つのＺ面で最も焦点が合っていることが予期され、３以上のＺ面を通して真に延びる対象（つまり細胞）が基本的にないという状況で有益であり得る。平滑化は、例えば一又は複数のフロート画像の使用を含む様々な手段によって達成されてもよい。フロート画像はコンピュータメモリに記憶されてもよく、連続的に供給されるＺ面がフロート画像に追加されるか、又は他の方法でフロート画像と数学的に組み合わされてもよい。様々なフロート画像が使用されてもよく、例えば加重合計フロート画像、加重フロート画像の合計などを含む。場合によっては、アルゴリズムはメモリに記憶されている２つのフロート画像を含んでもよく、例えば加重合計画像、及び加重画像の合計を含む。フロート画像が平滑化のために使用される場合、フロート画像はアルゴリズムに供給されるＺ面毎に更新されてもよい。
【００５１】
Ｚ合成画像又は平坦化画像とも称される合成画像は様々な画像処理法を使用して生成されてもよい。場合によっては、フロート画像の生成を含む画像処理アルゴリズムが使用されてもよく、フロート画像から合成画像を生成してもよい。場合によっては、２以上のフロート画像の生成を含む画像処理アルゴリズムが使用されてもよく、フロート画像の組合せから合成画像を生成してもよい。例えば、場合によっては、生成されるフロート画像のピクセルは、Ｚ面ピクセルの加重和をそのピクセルに関する全ての重みの合計で割ったものであってもよい。従って、全ての重みの実際の合計が１つのピクセルから次のピクセルに大きく変わるか否かに関わらず、所与のピクセル座標に関する相対的なＺ重みは、合成画像に亘って明瞭に認識可能であり、細胞計数ソフトウェアによる検出に十分である。
【００５２】
例示的な画像処理アルゴリズムでは、複数のＺ面画像（図５）がアルゴリズムに与えられ、これらの画像は上述されているように重みが加えられる（図６）。フロート画像を使用して加重画像を結合し、フロート画像を平坦化して合成画像を生成する（図７）。このような合成画像を細胞計数ソフトウェアによって利用して、所望の数の細胞を有するウェルを識別してもよく、マルチウェルプレートのどのウェルを更に処理するかを示すマップを生成してもよい。
【００５３】
本明細書に記載されている方法で利用される画像はデジタル画像であり、デジタル画像のタイプ及び取得は異なってもよい。本明細書で使用されている「デジタル画像」は、固定された解像度又は固定されていない解像度を有し得る二次元画像の数値表現（例えば２進表現）を一般に指す。固定された解像度の画像は、ＸＹ方向に固定数の行及び列のピクセルを有する。場合によっては、デジタル画像は、ＸＹＺ方向に固定数のボクセルを有する三次元であってもよい。ピクセル及びボクセルは、ラスター画像又はラスターマップとしてコンピュータメモリに記憶され、小さな整数の二次元アレイ又は三次元アレイが非圧縮形式又は圧縮形式で送信又は記憶される。好適なデジタル画像ファイルフォーマットは、例えば、BMP 、BPG 、CD5 、DEEP、ECW 、Exif、FITS、FLIF、GIF 、HDR 、HEIF、ILBM、ILBM、IMG 、IMG 、JPEG 2000 、JPEG XR 、JPEG/JFIF 、Layered Image File Format、Nrrd、PAM 、PBM 、PCX 、PGF 、PGM 、PLBM、PNG 、PNM 、PPM 、SGI 、SID 、Sun Raster、TGA 、TIFF、VICAR 、WEBPなどを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
デジタル画像は、例えば、取り込まれた画像の特定のタイプ（例えばカラー又はグレースケール）及びデジタルカメラ又は他の画像取込デバイスの感度に応じて決められる様々な画像ビット深度であってもよく、例えば８ビット、10ビット、12ビット、14ビット、16ビット、18ビット、24ビット、30ビット、36ビット、48ビット、64ビットなどを含むが、これらに限定されない。場合によっては、カラー画像のチャネルが個々に存在してもよく、又は個々の８ビットグレースケール画像に分割されてもよい。場合によっては、カラー画像のチャネルが個々に存在してもよく、又は個々の16ビットグレースケール画像に分割されてもよい。場合によっては、個々に取り込まれたグレースケール画像を１つの画像の異なるカラーチャネルに割り当てることにより、１つの画像に結合された複数の個々に取り込まれたグレースケール画像からデジタルカラー画像を生成してもよい。他の場合、例えば、異なるカラーに割り当てられた複数の光検出器を有する画像取込デバイス、及び異なるカラーの光を異なる光検出器に向けるための一又は複数の光学デバイスを使用して、デジタルカラー画像の全てのカラーを同時的に取り込む。
【００５５】
デジタル画像をデジタル画像取込デバイスによって取り込む。状況に応じた本開示のシステムのデジタル画像取込デバイス（つまりデジタル撮像装置）は、カラー画像又はモノクロ（例えばグレースケール）画像を取得してもよい。あらゆる好適なカラー又はモノクロ対応の画像取込デバイスを使用して、取得されたカラー又はモノクロのデジタル画像を取り込んでもよい。好適なデジタルのカラー又はモノクロの画像取込デバイスは、スタンドアロンの画像取込ユニットであるか、又は例えば一体化された撮像・分注システムなどを含むより大型の一体化されたシステムの一部である一体化された画像取込デバイスであってもよい。好適なデジタルのカラー又はモノクロの画像取込デバイスは、特定の撮像状況、画像取込みの目的、及び全体としてのデバイス又はシステムの関連する要素に応じて大きく異なる。
【００５６】
少なくとも、記載された方法で使用するための好適なカラー又はモノクロの画像取込デバイスは、デジタルのカラー画像又はモノクロ画像を取り込むことができるデジタルのカラー又はモノクロのカメラと、デジタルのカラー画像又はモノクロ画像を記憶する、及び／又はこのような画像を取り付けられた画像処理回路若しくは画像処理回路に後で伝送するために取り付けた記憶装置に伝送する手段とを有する。好適なデジタルのカラー又はモノクロのカメラは異なり、本明細書に記載されている方法に従って処理され得る画像を取り込むために、十分高い分解能と十分なカラー又はモノクロの取込み性能とを有するあらゆるデジタルのカラー又はモノクロのカメラを一般に含む。
【００５７】
本方法又は本システムで使用される特定の特徴に応じて、好適なデジタルカメラは、約0.3 メガピクセル未満〜約14.0メガピクセル以上の範囲内の分解能を有するモノクロ又はカラーのカメラを含んでもよく、分解能の範囲として、例えば0.3 メガピクセル以上、0.9 メガピクセル以上、1.3 メガピクセル以上、1.4 メガピクセル以上、２メガピクセル以上、３メガピクセル以上、3.3 メガピクセル以上、５メガピクセル以上、７メガピクセル以上、10メガピクセル以上、12メガピクセル以上、14.0メガピクセル以上などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
好適なデジタルカメラとして、例えば特注のデジタルカメラ、消費者向けのデジタルカメラ（例えば微視的な使用のために変換された消費者向けのデジタルカメラ）、これらに限定されないが、例えばDino-Eye、Dino-Lite 、Jenoptik ProgRes、KoPa、Leica 、Motic 、Olympus 、Omano 、OptixCam、PixelLINK 、Zeiss などを含む様々な製造業者から市販されているデジタル顕微鏡カメラが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
場合によっては、本システムのデジタルカメラは、手動顕微鏡検査、自動顕微鏡検査、又は手動及び自動両方の顕微鏡検査のために構成された顕微鏡に取り付けられてもよい。顕微鏡が十分な光学的性質を有して構成されて、本明細書に記載されている方法に従って処理され得るデジタル画像の取込みを可能にすべく十分な倍率を与えるならば、あらゆる好適な顕微鏡が記載されたシステムで使用されてもよい。そのため、本システムの顕微鏡部品は、例えば個々の顕微鏡部品から組み立てられるような特注のユニット、及び市販されているユニットを有する。
【００６０】
好適な顕微鏡として、例えばBruker Optics (www(dot)brukeroptics(dot)com)、Carl Zeiss (www(dot)zeiss(dot)com)、CRAIC (www(dot)microspectra(dot)com)、Edmund Optics (www(dot)edmundoptics(dot)com)、FEI (www(dot)fei(dot)com)、Hamamatsu  (www(dot)hamamatsu(dot)com)、Hirox-USA (www(dot)hirox-usa(dot)com)、Hitachi High Technologies (www(dot)hitachi-hta(dot)com)、JEOL (www(dot)jeol(dot)com)、Keyence (www(dot)keyence(dot)com)、Kramer (www(dot)kramerscientific(dot)com)、Leica Microsystems (www(dot)leica(dot)com)、Meiji Techno America (www(dot)meijitechno(dot)com)、Motic Instruments (www(dot)motic(dot)com)、Nikon Instruments (www(dot)nikoninstruments(dot)com)、Ocean Optics (www(dot)oceanoptics(dot)com)、Olympus (www(dot)olympusamerica(dot)com)、OPTIKA Microscopes (www(dot)optikamicroscopes(dot)com )、Phenom-World (www(dot)phenom-world(dot)com )、Prior Scientific (www(dot)prior(dot)com)、Warner (www(dot)warneronline(dot)com)などを含む様々な製造業者から入手可能な顕微鏡が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
本開示で用いられる撮像サブシステムは、固定部品又は可動部品（例えば、固定撮像ステージ又は可動撮像ステージ、固定対物レンズ又は可動対物レンズなど）を有してもよい。可動部品は、プロセッサから受信する信号又は指示に従って一又は複数の部品を移動させるためのプロセッサと電気的に通信してコンピュータ制御され、一若しくは複数のアクチュエータ又はモータを有してもよい。好適な撮像システムは、固定撮像ステージ及び可動対物レンズ又は対物レンズターレット、固定対物レンズ又は対物レンズターレット及び可動撮像ステージなどを有する撮像システムを含んでもよい。固定撮像ステージ及び可動撮像サブシステムを有する一体化されたシステムの非制限例が図２に示されている。
【００６２】
本開示のシステムは一又は複数のバックラッシュ防止デバイスを備えてもよい。本システムの可動部品は撮像サブシステムに振動及び／又は誤差を導入する場合があるため、場合によっては、「不安定な」画像のために画像取込み及び／又は画像処理を複雑にする。このような振動及び誤差は、場合によっては、システムの移動駆動部品（例えば撮像システムの可動部品を駆動するギヤ）に存在するバックラッシュ又は「遊び」に起因する場合がある。そのため、本システムの一又は複数の部品は、本システムのバックラッシュを防止する及び／又は最小限度に抑えるバックラッシュ防止装置を部品内に又は部品に取り付けて有してもよい。このようなバックラッシュ防止装置の非制限例として、例えば相反するばねと連結された２つのギヤが含まれる。ギヤバックラッシュ防止装置は、本明細書に記載されているシステムの移動可能な態様の駆動部品に組み込まれてもよい。
【００６３】
本明細書に記載されている方法及びシステムは、デジタル画像及び／又はデジタル画像から抽出されたデータを含むデジタル情報を記憶してもよい。このようなデジタル情報は、これらに限定されないが、コンピュータメモリ及び／又は一又は複数のコンピュータ可読媒体に情報を記憶することを含むあらゆる簡便な方法で記憶されてもよい。例えば、処理されたデジタル画像又は処理されていないデジタル画像が、画像取込デバイスから、有線又は無線のデータ接続部を介してコンピュータメモリ又はコンピュータメモリ若しくは他のコンピュータ可読媒体にデータを書き込むように構成されたコンピュータプロセッサに送られてもよい。場合によっては、処理された一若しくは複数のデジタル画像又は処理されていない一若しくは複数のデジタル画像から抽出されたデータが、画像取込デバイスから、有線又は無線のデータ接続部を介してコンピュータメモリ又はコンピュータメモリ若しくは他のコンピュータ可読媒体にデータを書き込むように構成されたコンピュータプロセッサに送られてもよい。
【００６４】
本明細書に記載されている方法を行う際に使用されるシステムは、指示が記憶されている指定された画像処理回路、又は一若しくは複数の画像処理機能若しくは画像処理アルゴリズムを行うための取り付けられたコンピュータメモリを備えてもよい。画像処理回路は、一又は複数の追加の機能を行うように構成された追加の回路を有する操作可能な接続部であってもよく、又は前記操作可能な接続部を有してもよく、追加の機能として、例えば、画像取込デバイスからのデジタル画像の受信、メモリからのデジタル画像の検索、メモリからの基準値の検索、メモリへの処理された画像の記憶、処理された画像から得られた値のメモリへの記憶、メモリへの結果の記憶、一又は複数の細胞計数及び／又はウェル識別機能の実行などが含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
細胞計数及びウェル識別
本開示の方法、デバイス、組立体及びシステムは、一又は複数の細胞計数ステップ及び／又はウェル識別ステップを有してもよい。このようなステップは、様々な顕微鏡検査で利用可能な細胞計数ソフトウェア又は細胞計数コンピュータアプリケーション、及び／又は画像処理の市販されている自由に入手可能なソフトウェアパッケージによって行われてもよい。本明細書で使用されている「細胞計数」は一般に、マルチウェルデバイスのウェル又は複数のウェルに存在する細胞の数を識別する処理を指す。本明細書で使用されている「ウェル識別」は一般に、マルチウェルデバイスのウェルが予め定められた所望の数の細胞を含んでいるか否かを識別することを指す。ウェルが識別され得る細胞の所望の数は異なってもよく、例えば、一又は複数の細胞の存在又は欠如、１つの細胞の存在、２以上の細胞の存在（つまりマルチピレット）、特定のマルチピレットの存在（例えば２つの細胞の存在、３つの細胞の存在、４つの細胞の存在など）、細胞の欠如（つまり、「空」のウェル）などを含んでもよい。従って、ウェル識別は、場合によっては二進法であってもよく、つまり、ウェルが所望の数の細胞を含んでいるか否かであってもよい。
【００６６】
ある実施形態では、細胞計数ソフトウェアを用いて各ウェル内の細胞の数を計数してもよい。例えば、CELLSELECT（商標）ソフトウェア（WAFERGEN (WaferGen Bio-systems, Inc.)）を使用して細胞を計数し、どのウェルが０、１つ、２つ又はそれ以上の細胞を含んでいるかを決定してもよい。場合によっては複数の個々のＺ面画像から生成された合成画像に関して細胞計数を行ってもよい。ある実施形態では、ソフトウェアは、単細胞などの所望の数の細胞を含むウェルを選択するなどして、基準を満たすマルチウェルデバイスの全てのウェルを示す表（例えばフィルタファイル）を生成する。単細胞は、例えば（例えばヘキスト染色によって検出されるような）有核である、（例えばヨウ化プロピジウムによって検出されるような）非易感染性又は無傷な膜を有する、又は他の基準及び／又はこれらの組合せなどの様々な基準について、又は様々な基準に基づき評価されてもよい。例えば、細胞計数ソフトウェアを使用して行われるような細胞計数を用いて、どのウェルが所望の数の細胞を含むか、ひいてはどのウェルが更に処理されるべきかを示すマップを生成してもよい。どのウェルが更に処理されるべきかを示すマップは、例えばどのウェルが更なる処理のために一又は複数の分注試薬を受けるかを示す分注マップを含んでもよい。
【００６７】
例示的な実施形態では、特定のウェル（例えば、所望の数の細胞、例えば単細胞を含むウェル）が識別されると、機器は、フィルタファイルによって、つまり所望の数の細胞などの基準を満たすマルチウェルデバイスのウェルを示す表又はマップによって決定されたウェルに追加の分注を行ってもよい。
【００６８】
本実施形態では、試薬を384 ウェルプレートに予めロードする。組立体に一体化された撮像性能及び分注性能を用いると、マルチウェルデバイスはシステムから移動又は除去される必要がない（例えば、マルチウェルデバイスは、撮像・分注組立体に近い所定の位置（例えば撮像ステージ）にマルチウェルデバイスを固定する部品から移動又は除去される必要がない）。場合によっては、マルチＺ手法は、細胞が高精度で計数されることを保証し得る。例えば、場合によっては、オペレータがマルチウェルデバイスを一体化された機器から取り出すことを必要とする遠心分離ステップ無しでシステムが機能し得るように、精度は十分であり得る。しかしながら、一体化されたシステムの使用は、ある実施形態ではマルチウェルデバイスの遠心分離を除外しない。例えば、場合によっては、例えば遠心分離無しで行われる同様の処理と比較して細胞計数の正確性を高めるためなどの様々な理由のために、細胞計数の前に遠心分離を使用してもよい。従って、本明細書に記載されている方法では、遠心分離は任意であってもよく、又は特に除外されてもよい。多くの実施形態では、細胞を計数すると、ウェル識別及び／又は最初の流体分注が完了し、マルチウェルデバイスは、熱サイクル、サンプル抽出、エクソヌクレアーゼの追加、ライブラリの準備及び／又は最終的な配列決定などの追加の処理の準備ができている。
【００６９】
用途
ある実施形態では、本明細書で提供されている方法、システム及び組立体は、マルチウェルデバイスでの単細胞の分析に使用される。細胞不均一性は、一般に生体組織及び細胞の一般的な特徴である。遺伝学者は癌、自己免疫疾患及び神経障害を含む複雑な病気を特徴付ける努力をしている。しかしながら、これらの病気を進める基本的なメカニズムの決定は達成困難なままである。細胞が新たな突然変異体を蓄積するにつれて、正常細胞と共存する多クローン性細胞集団を形成する場合がある。その結果、大量の細胞集団の配列決定は、これらの特有の珍しい細胞型の基本的な不均一性をマスクし得るため、「干し草の山に針を見つける」ほど困難になる。集団内／細胞間の差異を明らかにするための代替の手法は、集団から選択された個々の細胞の核酸配列を評価することである。単細胞の分析を使用して、別個のDNA 発現プロファイル及びRNA 発現プロファイルを有するサブ集団を定めている。要約すると、単細胞の分析は複雑な病気の既に「隠された」メカニズムを明らかにし得ると広く信じられている。
【００７０】
単細胞の視野での中心となる要件は、評価されるサンプルが単細胞のみを含むことを明瞭に且つ明確に検出することである。FACS計測、マイクロ流体捕捉、及び制限されているか又は広く分散した細胞希釈法を含む従来の単細胞分離手法は、コストが高過ぎ、労働集約的であり、大きなサンプル入力法を必要とし、標準分子生物学的ワークフロー内のより多くの細胞の必要性に容易に合致しない。他方では、細胞のランダムな堆積は予測不能に／確率的に分布し、細胞分布の予測を行いにくくする。
【００７１】
本開示の実施形態で使用される代替の手法は、多くのこのような分注に亘る平均によって単細胞が分注されるように、細胞を反応ウェルに分注することである。この現象の統計的記述はポアソン分布として知られている。理論上、ウェル当たりの単細胞（ｎ＝正確に１つの細胞であり、０、２、３、４、５、６などの細胞ではない）の分注は、正確に１つの細胞を含むウェルの36.8％の理論的なシータ最大値によって制約される。しかしながら、ポアソン分布を利用して入力細胞濃度を非常に広範囲の占有率に変えることができる。ウェル当たりの所望の数の細胞（つまり１つの細胞／ウェル）に関して最適化する際のトレードオフが存在する。より具体的には、単細胞を含むウェルの所望の比率（ラムダが0.185 に接近する10:1の比率）を達成するために最適化することにより、細胞を全く含まないウェルの不十分な割合（＞82％）がもたらされ得る。サイズ分離手法と共にウェル当たり１つの細胞を特異的に標的にしようとする同様の手法が最近報告されている。しかしながら、その場合、場合によっては用いられる細胞捕捉デバイスの物理的な制約により、ウェルの10％のみが単細胞を含んでいた。しかしながら、その方法は複雑で、特殊な試薬を必要とする。
【００７２】
単細胞を選択するためのエマルジョン系の方法では、油中水型エマルジョンに細胞を置く。このようなシステムには、相互汚染から隔離するという利点がある。しかしながら、これらの油分離した区画の操作は難しい。更に、このようなエマルジョンは、クローン性を達成するために標準的な任意抽出のポアソン統計によって決まるボルテックスを必要とすることが多い。しかしながら、これらの手法によって、ごく僅かな占有区画と多数の占有されていない区画がもたらされる。結果として、エマルジョンがマイクロ流体システムで生成されるため、コストが増加し、エマルジョンが形成されると、ウェル内の追加の材料を制御して交換するのが難しいという著しい不利点がある。更に、エマルジョンPCR を、容易に一般化できない条件を使用して任意に行う。
【００７３】
高価で複雑な機器無しで単細胞を分離するのは難しい。更に、このようなシステムは典型的には384 を超える単細胞を捕捉することができない。組み合わされた分注及び視覚化、並びにマイクロ流体チップ（例えば、WAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.）によって販売されているマイクロ流体チップ）内の細胞を視覚化するための細胞視覚化顕微鏡検査と組み合わせられた統計的方法が本明細書で提供されている。ある実施形態では、分注量当たり平均して１つの細胞が分注されるように、ポアソン統計を使用して細胞を希釈する。
【００７４】
ある実施形態では、ウェルが１つの細胞も受けていないと識別されると、第２の（及び第３の）任意の再帰的ポアソン分布（RPD ）ステップを使用してポアソン分布の統計的限界を回避してもよく、それによって、37％〜＞50％の理論的な最大値からチップ上の単細胞の占有率が上昇する。本開示でのRPD は、(a) 細胞含有溶液をチップ内の反応容器（ウェル、チャンバなど）に分注する、(b) 個々のウェル内のチップ上の細胞を視覚化する、(c) ソフトウェアを使用した顕微鏡検査によって個々のウェル内のチップ上の（０に等しい、１に等しい、及び１より多い）細胞数を識別する、及び(d) ０の細胞数であると以前のラウンドで特異的に識別された個々のウェルへの細胞含有溶液の追加の分注サイクルを行うという反復サイクルを指す。RPD の目的は、１回の分注に関してポアソン分布の理論的限界より上に、単細胞（又は他の所望の数の細胞）を含む占有された反応容器（ウェル、チャンバなど）の数を最大化することである。本開示は、反復サイクルの数に制限を設けない。
【００７５】
ある実施形態では、本開示は、個々の細胞を分離し、マイクロ流体ウェル（例えば、WAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.）によって販売されているSMARTCHIP （商標）マルチウェルデバイスのウェル）の個々のウェルに細胞を移す方法を記載している。例えば、ある実施形態では最初に、DNA に結合すると強い青色蛍光を放射する一般に利用可能な超生体染料であるヘキスト33342 を用いて細胞を染色する。細胞を計数して、分注量当たり１つの細胞を含むように希釈し、ソース容器（例えば384 ウェルプレート）に追加し、ロボットマイクロ液体分注器（例えばWAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.）によって販売されているマルチサンプルナノディスペンサ（MSND））を使用してディープウェルチップに直接分注する。その後、０、１、２、３又は４の細胞が各ウェルに分注されているかをカテゴリー的に確認するために、自動顕微鏡検査及び画像解析によって各ウェルを視覚化する。この品質管理ステップは、チップ内のウェルの各々でウェルの内容物を迅速に且つ確実に識別するので重要且つ特有である。
【００７６】
本開示は、用いられる細胞のタイプによって限定されない。本方法では、ある量の細胞懸濁液をマルチウェルデバイスのウェルに分注してもよい。基本的に、あらゆるソースのあらゆる細胞を含むあらゆる細胞懸濁液を使用してもよい。注目する細胞は、あらゆる有機体からの細胞（例えば、バクテリア細胞、古細菌細胞、単細胞真核有機体の細胞、植物細胞、藻細胞、多細胞有機体からの細胞、無脊椎動物（例えばミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物など）からの細胞、脊椎動物（例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）からの細胞、哺乳類からの細胞、齧歯類からの細胞（例えばマウス細胞、ラット細胞など）、ヒトからの細胞、非ヒト霊長類からの細胞など）を含んでもよい。
【００７７】
あらゆるタイプの細胞が対象であってもよい（例えば、多能性前駆細胞、幹細胞、例えば胚性幹（ES）細胞、誘導多能性幹（iPS ）細胞、生殖細胞；体細胞（例えば中胚葉系統の体細胞、内胚葉系統の体細胞、外胚葉系統の体細胞、例えば、繊維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝実質細胞、膵臓細胞、上皮細胞など）、前駆細胞（例えば中胚葉系統の前駆細胞、内胚葉系統の前駆細胞、外胚葉系統の前駆細胞）、胚体外系統の細胞；あらゆるステージ、例えば１細胞ステージ、２細胞ステージ、４細胞ステージ、８細胞ステージなどの胚のインビトロ又はインビボの胚細胞（例えば、線虫胚、ハエ胚、ツメガエル胚、ゼブラフィッシュ胚、マウス胚；ラット胚、非ヒト霊長類胚など）、免疫細胞（例えば、初代又は前駆体由来の免疫細胞、例えばリンパ球（Ｔ細胞（Ｔヘルパー細胞（CD4+細胞）を含むCD3 を発現する免疫細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（CD8+細胞）、制御性Ｔ細胞（Treg）、及びガンマ−デルタＴ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞）、及び骨髄由来の細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）及び同種のもの）。更に、例えば遺伝子改変細胞のような改変細胞が対象であり、例えば遺伝子改変幹細胞、遺伝子改変免疫細胞（例えば抗体生成／スクリーニング、改変免疫受容体（例えばTCR ）生成／スクリーニング、養子免疫治療（例えば免疫細胞を発現するキメラ抗原受容体）など）及び同種のものを含むがこれらに限定されない。
【００７８】
細胞は樹立細胞株からの細胞であってもよく、又は初代細胞であってもよく、「初代細胞」、「初代細胞株」及び「初代培養物」は、被験体から得られて培養物の限られた数の継代、つまり分裂に関してインビトロでの成長を可能にする細胞及び細胞培養物を指すために本明細書で互換的に使用される。例えば、初代培養物は、危機的ステージに達する十分な回数ではなく、０回、１回、２回、４回、５回、10回又は15回継代された培養物である。典型的には、初代細胞株は、インビトロで10未満の継代で維持される。初代細胞は、多くの場合で培養されず、例えば、分離及び／又は解離の後に直接、つまり細胞培養を受けることなく、本開示の方法で利用されてもよい。
【００７９】
初代細胞は、あらゆる簡便な方法によって個体から採取されてもよい。例えば、白血球が、アフェレーシス、白血球除去療法、密度勾配分離などによって簡便に採取されてもよい一方、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織からの細胞が生検によって簡便に採取される。適切な溶液を、採取された細胞の分散、解離及び／又は懸濁のために使用してもよい。このような溶液は、低濃度（例えば５〜25mM）の許容可能なバッファと共に血清（例えばウシ胎仔血清）又は他の天然に存在する要因を補給した又は補給しない平衡塩類溶液、例えば生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（PBS ）、ハンクの平衡塩類溶液などであってもよい。簡便なバッファはHEPES 、リン酸塩バッファ、乳酸塩バッファなどを含む。細胞を直ちに使用してもよく、又は細胞を、ある期間、凍らせて保存し、解かして再使用することができる。このような場合、例えば10％のDMSO、50％の血清、40％のバッファ媒体を含む凍結媒体、又はこのような冷凍温度で細胞を保存するために本技術分野で一般に使用されて凍結された細胞を解かすためのあらゆる簡便な方法で解かされるような他のこのような溶液に細胞を凍らせてもよい。
【００８０】
場合によっては、注目する細胞は多能性前駆細胞を含んでもよい。本明細書で使用されているような「多能性前駆細胞」、「多能性前駆体」、「多能性幹細胞」、「多分化能前駆細胞」などの用語は、２以上の異なる細胞型に分化して増殖することができる細胞を指す。多能性前駆細胞の非制限例として、胚性幹細胞、胚盤胞由来幹細胞、胎児幹細胞、誘導多能性幹細胞、外胚葉由来幹細胞、内胚葉由来幹細胞、中胚葉由来幹細胞、神経冠細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞、成体幹細胞又は体細胞幹細胞、神経幹細胞、骨髄幹細胞、骨髄間質幹細胞、造血幹細胞、リンパ前駆体細胞、骨髄前駆体細胞、間葉幹細胞、上皮幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨格筋幹細胞、筋サテライト細胞、サイドポピュレーション細胞、腸幹細胞、膵幹細胞、肝幹細胞、肝実質細胞幹細胞、内皮前駆細胞、血管芽細胞、生殖腺幹細胞、生殖系列幹細胞などが含まれるが、これらに限定されない。多能性前駆細胞は、公的なソース若しくは市販のソースから得られてもよく、又は新しく得られてもよい。
【００８１】
ある実施形態では、癌細胞、循環癌細胞、幹細胞及び癌幹細胞を使用する。「癌細胞」という用語は、原発性癌細胞（つまり、例えば癌又は腫瘍の生検のような最初のソースから得られた癌細胞）、及び培養された癌細胞（つまり、例えば3T3 細胞、A549細胞、F11 細胞、HeLa細胞、HEK 293 細胞、Jurkat細胞、ベロ細胞などの、例えば不死化癌細胞株を含む癌細胞株）を含んでもよい。注目する癌細胞は、個体からの癌（例えば癌種、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、混合細胞型の癌）から分離された原発性癌細胞を含んでおり、例えば、急性リンパ性白血病(ALL) 、急性骨髄性白血病(AML) 、副腎皮質癌、AIDS関連の癌（例えば、カポジ肉腫、リンパ腫など）、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍、基底細胞癌、胆管癌（肝臓外）、膀胱癌、骨癌（例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫など）、脳幹神経膠腫、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、中枢神経系胚芽腫、中枢神経系胚細胞性腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫など）、乳癌（例えば、女性乳癌、男性乳癌、小児乳癌など）、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（例えば小児、胃腸など）、原発不明癌、心（心臓）腫瘍、中枢神経系（例えば、非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍、胚芽腫、胚細胞性腫瘍、リンパ腫など）、子宮頸癌、小児癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病(CLL) 、慢性骨髄性白血病(CML) 、慢性骨髄増殖性新生物、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腺管癌（例えば胆管、肝臓外など）、腺管上皮内癌(DCIS)、胚芽腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌（例えば、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫など）、骨の線維性組織球腫（例えば悪性、骨肉腫など）、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、胚細胞性腫瘍（例えば頭蓋外、性腺外、卵巣、精巣など）、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、組織球増殖症（例えばランゲルハンス細胞など）、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、膵島腫瘍（例えば膵内分泌腫瘍など）、カポジ肉腫、腎癌（例えば、腎細胞、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍など）、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ性白血病(ALL) 、急性骨髄性白血病(AML) 、慢性リンパ性白血病(CLL) 、慢性骨髄性白血病(CML) 、ヘアリー細胞など）、口唇・口腔癌、肝癌（原発）、非浸潤性小葉癌(LCIS)、肺癌（例えば、非小細胞、小細胞など）、リンパ腫（例えば、AIDS関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、原発中枢神経系(CNS) など）、マクログロブリン血症（例えばヴァルデンストレムなど）、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、メラノーマ、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、NUT 遺伝子を含む正中線胆道がん、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病（例えば慢性(CML) など）、骨髄性白血病（例えば急性(AML) など）、骨髄増殖性腫瘍（例えば慢性など）、鼻腔癌及び副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌（Oral Cancer）、口腔癌（Oral Cavity Cancer）（例えば口唇など）、中咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌（例えば上皮、胚細胞性腫瘍、低悪性度腫瘍など）、膵癌、膵内分泌腫瘍（膵島腫瘍）、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発中枢神経系(CNS) リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂尿管、移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（例えば、ユーイング、カポジ、骨肉腫、横紋筋肉腫、軟部組織、子宮など）、セザリー症候群、皮膚癌（例えば小児、メラノーマ、メルケル細胞癌、非メラノーマなど）、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、頸部扁平上皮癌（例えば原発不明、転移性など）、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌、尿管癌及び腎盂癌、尿道癌、子宮癌（例えば子宮内膜など）、子宮肉腫、腟癌、外陰癌、ヴァルデンストレム型マクログロブリン血症及びウィルムス腫瘍のいずれかから分離された癌細胞を含むがこれらに限定されない。
【００８２】
癌死亡の大部分は、離れた器官で腫瘍細胞を循環させることによる転移拡散及び成長によって引き起こされると考えられている。循環腫瘍細胞（CTC ）、CTC クラスタ（共に結合された２以上の個々のCTC ）及び癌幹細胞（CSC ）は、最初に局所にとどめられるか、全身に潜伏しているか、又はアジュバント療法後に枯渇する場合がある。従って、CTC 及び関連する幹細胞は、正常な非癌細胞の大きなバックグラウンド内に少数で存在することが多い。これらの細胞の低周波は、大きな「ノイズ」バックグラウンド内で必要な癌細胞信号を検出するために複雑な「干し草の山に針」分析問題を引き起こす。癌細胞特異的な細胞表面マーカの検出、及びこれらの細胞の分析は、転移拡散の生態の理解に深く関連している。本明細書で提供されている方法及びシステムは、このような重要な癌細胞の分離及び解析を可能にする。
【００８３】
単細胞、複数の細胞及び細胞クラスタは最初に、抗原／表現型の細胞表面マーカ又は細胞内マーカの存在に基づき、細胞又は組織環境又は集団から濃縮されるか又は枯渇する場合があり、マーカとして、タンパク質、脂質、これらの部分の炭水化物（つまりグリコシル化）翻訳後修飾、核酸及びこれらの修飾又はこれらの部分の様々な組合せを含むが、これらに限定されない。癌細胞を含む単細胞における細胞表面マーカの検出、及びマルチウェルデバイスの個別の個々のウェル（例えばWAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.）によって販売されているSMARTCHIP （商標）のウェル）へのこれらの細胞の移行を、本明細書に記載されている方法及びシステムを用いて行ってもよい。他の実施形態では、標識細胞をウェルに直接分注してもよく、様々な広く利用可能な蛍光フィルタを使用して標準顕微鏡検査又は自動顕微鏡検査によって抗原部分をチップ内で直接検出してもよい。
【００８４】
細胞の標識化及び／又は検出のあらゆる簡便な方法を使用してもよい。例えば、場合によっては、（細胞内マーカ及び細胞表面マーカを含む）細胞マーカを検出可能な特異的結合メンバーによって結合してもよい。検出可能な特異的結合メンバーは直接検出可能であってもよく（例えば、検出可能な部分、例えば蛍光分子に結合されてもよく）、又は間接的に検出可能であってもよい（例えば、検出可能な第２の特異的結合メンバー（例えば蛍光性二次抗体）によって結合された結合部位（例えばビオチン、ストレプトアビジン、免疫グロブリン領域、親和性タグなど）に結合されてもよい）。特異的結合メンバーは更に核酸を含んでおり、核酸として、例えばアプタマ、特定の標的（例えばタンパク質又は核酸標的）と結合するか又はハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブ（例えばRNA プローブ、DNA プローブ、LNA プローブなど）が含まれるが、これらに限定されない。核酸特異的結合メンバーは直接検出可能であってもよく（例えば、フルオロフォアに結合されてもよく）、又は（例えば第２の特異的結合メンバーの結合によって）間接的に検出可能であってもよい。
【００８５】
細胞の標識化を、（例えば特異的結合メンバーを細胞表面マーカに結合することにより）生細胞で行ってもよく、又は固定細胞で行ってもよく、本マーカが表面又は細胞又は細胞内にアクセス可能であるか否かに応じて透過処理を使用してもよく、又は使用しなくてもよい。標識化の有用な方法として、免疫組織化学法、インサイツハイブリダイゼーション及び同種のものが含まれる。場合によっては、例えば発現蛍光タンパク質、発現生物発光タンパク質及び同種のもののような検出可能な発現分子を用いて細胞を標識化してもよい。固定細胞及び／又は透過性細胞を用いる場合、架橋固定剤及び非架橋固定剤を含む、固定化及び／又は透過処理のあらゆる簡便な方法を使用してもよく、このような固定剤として、例えばホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド／アセトン、メタノール／アセトン、エタノール、メタノール、カルノワなどが含まれるが、これらに限定されない。あらゆる簡便な方法によって透過処理を促進してもよく、このような方法として、例えばプロテアーゼ消化、中性界面活性剤曝露（例えばトリトンX-100 、NP-40 、サポニンなど）を含む、例えば一又は複数の化学的方法又は酵素的方法が含まれる。場合によっては、細胞を外してもよい。
【００８６】
場合によっては、一又は複数の核酸染料、細胞質染料及び／又は生存率解析用染料で細胞を標識化してもよく、このような染料として、例えばDNA 染料、DNA インターカレート染料、生体染料、ヨウ化プロピジウム、カルセイン、ヘキスト染料などが含まれるが、これらに限定されない。生細胞及び／又は死細胞を検出するための生存率解析用染料の非制限例として、例えばヨウ化プロピジウム(PI)、７−アミノ−アクチノマイシンD（7-AAD ）、及び固定化可能な生存率解析用染料であるeFluor 455UV/450/506/520/660/780（Affymetrix eBioscience, San Diego, CA）、LIVE/DEAD Fixable Blue/Violet/Aqua/Yellow stain（Life Technologies, Grand Island, NY）、Zombie Aqua/Green/NIR/RED/UV/Violet/Yellow（BioLegend, San Diego, CA）のような商品流通業者から入手可能な染料、及び同種のものが含まれる。核酸染料の非制限例として、例えばヘキスト33342 (2'-(4-エトキシフェニル)-5-（4-メチル-1-ピペラジニル)-1H,1'H-2,5'-ビベンズイミダゾール三塩酸塩）及びヘキスト33258（4-[6-(4-メチル-1-ピペラジニル）-1',3'-ジヒドロ-1H,2'H-2,5'-ビベンズイミダゾール-2'-イリデン]-2,5-シクロヘキサジエン-1-one 三塩酸塩）及びヘキストシリーズの他のもの；SYTO 40, SYTO 11, 12, 13, 14, 15, 16, 20, 21, 22, 23, 24, 25（緑）；SYTO 17, 59（赤）, DAPI, DRAQ5（商標）（二本鎖DNA のために高親和性を有するアンスラキノン染料）、YOYO-1、ヨウ化プロピジウム、YO-PRO-3、TO-PRO-3、YOYO-3及びTOTO-3、SYTOX Green、SYTOX、メチルグリーン、アクリジンホモ二量体、7-アミノアクチノマイシンD、9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン及び同種のものが含まれる。
【００８７】
非制限例として、循環腫瘍細胞(CTC) の濃縮及び視覚化の方法が本技術分野では公知であり、本明細書に記載されている方法及びシステムで使用され得る最初の細胞懸濁液を生成する（後で視覚化する）ために使用されてもよい。例えば、Krebs 等著，Nat Rev Clin Oncol. 2014 Mar;11(3):129-44（具体的には表１に関して参照によって本明細書に組み込まれる）の表１。CTC を濃縮して視覚化するために用いられ得るマーカの例として、CD45、EpCAM 、MUC1及びHER2が含まれるが、これらに限定されない。このようなマーカの抗体を用いてこのような細胞を標識化して視覚化してもよい。フローサイトメトリー、カラム結合などのCTC を分離して濃縮するためのあらゆるタイプの適切な方法を使用してもよい。
【００８８】
場合によっては、細胞を得るサンプルは、生検又はスワブであってもよく、例えば被験体を診断する、モニタする又は評価する、例えば細胞の欠乏又は疾患、例えば癌に関して被験体を診断するために収集された生検又はスワブであってもよい。場合によっては、細胞を得るサンプルは、処置される被験体から既に収集されて保存されたサンプル、例えば預けられた組織サンプルであってもよく、このようなサンプルとして、例えば、保存された心臓組織又は心臓細胞、保存された筋骨格組織又は筋骨格細胞、保存された生殖組織又は生殖細胞、保存された皮膚組織又は皮膚細胞、保存された骨組織又は骨細胞、保存された骨髄組織又は骨髄細胞、保存された血管組織又は血管細胞、保存された臍帯血組織又は臍帯血細胞及び同種のものが含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、細胞を得るサンプルは新鮮であり、つまり予め保存又は凍結されていない。
【００８９】
細胞又は組織又は器官サンプル又は生検又はスワブの収集後、細胞を処理してもよい。例えば、固形組織及び／又は半固形組織（例えば固形腫瘍、皮膚組織、脳組織、筋組織、肝組織、脂肪組織など）の場合、組織を単細胞懸濁液に解離させてもよい。例えば酵素（例えばプロテアーゼ）解離、非酵素（例えば化学的又は物理的な）解離及び同種のものを含む細胞解離のあらゆる簡便な方法を使用してもよい。解離させた固形組織サンプル又は半固形組織サンプルの細胞を、例えば分画、濃縮、選別、染色などによって更に処理してもよく、又は更に処理しなくてよい。液体細胞サンプル（例えば血液、羊水など）の細胞を、例えば分画、濃縮、選別、染色などによって処理してもよく、又は処理しなくてよい。あらゆる簡便な技術又はデバイスを用いて、例えば密度勾配、遠心分離機、組織培養皿／フラスコ、フィルタ、注射器、血液分離管、FACSなどを含むが、これらに限定されないこのような処理ステップを促進してもよい。
【００９０】
（例えば上述されているような）解離ステップ及び／又は一若しくは複数の処理ステップを含むか否かに関わりなく、調製される細胞懸濁液を、細胞分注のための好適な容器に調製してもよく、又はこのような容器に移してもよい。細胞分注のための好適な容器は本明細書では、一又は複数の「ソース区画」又は「ソースデバイスウェル」を有してもよい「ソース容器」又は「ソースデバイス」と称されてもよい。好適なソース容器として、例えば管、フラスコ、皿、ビン、トラフ、マルチウェルデバイス（例えば６ウェルプレート、12ウェルプレート、24ウェルプレート、36ウェルプレート、48ウェルプレート、96ウェルプレート、384 ウェルプレート及び1536ウェルプレート及び同種のものを含む、例えばマルチウェルプレート）を含むが、これらに限定されない。場合によっては、本ソース容器は、分注先端が、例えばソース容器から細胞懸濁液を抽出するためにソース容器に存在する細胞懸濁液に接し得るように構成されてもよい。場合によっては、ソース容器は、例えば分注先端をバックフィリングすることにより、分注先端の充填を容易にするために、例えば管又は他の液体移送デバイスによって分注器に連結されてもよい。ソース容器の構成は異なってもよく、ソース容器及び分注先端が適合性を有するように構成されている構成を含んでもよい。
【００９１】
本開示は、用いられるマルチウェル試験デバイス（例えばプレート又はチップ）のタイプによって限定されない。一般に、このようなデバイスは、液体（例えば重力のみが液体をウェルから流出させ得ないようにウェルに捕捉される液体）を含むか、又は含むような大きさを有する複数のウェルを備えている。１つの例示的なチップは、WAFERGEN（WaferGen Bio-systems, Inc.）によって販売されている5184ウェルSMARTCHIP （商標）マルチウェルデバイスである。他の例示的なチップは、米国特許第8252581 号明細書、米国特許第7833709 号明細書及び米国特許第7547556 号明細書に提供されており、これら全ては、例えば本明細書で使用されているチップ、ウェル、熱サイクリング条件及び関連する試薬の教示のために、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。他の例示的なチップは、（Thermo Fisher Scientific Inc.によって販売されている）QUANTSTUDIO （商標）リアルタイムPCR システムで使用されているOPENARRAY （商標）プレートを含む。別の例示的なマルチウェルデバイスは、96ウェルプレート又は384 ウェルプレートである。
【００９２】
マルチウェルデバイスの外形寸法は異なってもよく、例えば、厚さが数ミクロン〜数センチメートルの範囲内であり、幅又は長さが数センチメートルから50センチメートルの範囲内であることが可能である。場合によっては、デバイス全体のサイズは、幅及び／又は長さに関して約10mm〜約200 mmの範囲内であり、厚さに関して約１mm〜約10mmの範囲内である。ある実施形態では、チップは、およそ幅40mm×長さ40mm×厚さ３mmである。
【００９３】
マルチウェルデバイスのウェル（例えばナノウェル）の総数は、本チップが使用される特定の用途に応じて異なってもよい。チップ表面のウェルの密度は特定の用途に応じて異なってもよい。ウェルの密度並びにウェルのサイズ及び体積は、所望の用途と、例えば本開示の方法が用いられる有機体の種のような要因とに応じて異なってもよい。
【００９４】
本開示は、マルチウェルデバイスのウェルの数又はマルチウェルソースデバイスのウェルの数によって限定されない。多数のウェルがデバイスに組み込まれてもよい。様々な実施形態では、デバイスのウェルの総数は、約100 〜約200,000 又は約5000〜約10,000の範囲内である。他の実施形態では、デバイスはより小さなチップを備えており、チップの各々は約5,000 ウェル〜約20,000ウェルを有する。例えば、正方形のチップは、0.1 mmの直径で125 ×125 ナノウェルを有してもよい。
【００９５】
有用なソースデバイス、つまり分注のためにソース流体（例えば細胞懸濁液）を含むように構成されたデバイスは異なり、１つの容器デバイス及びマルチウェルデバイスを備えてもよい。例えば、場合によっては、本ソースデバイスは、分注器に移すためにソース液体を含むように構成された１つのウェル、トラフ、管、ビン、フラスコ、皿、ボウルなどを備えてもよい。場合によっては、本ソースデバイスは、分注器に移すためにソース液体を含むように構成された複数のウェル又は整列した管を備えてもよい。ソースデバイスは具体的には、一又は複数の分注先端を有する分注器と並ぶように構成されてもよい。例えば、分注先端の全てを含む２以上がマルチウェルソースデバイスのウェルに同時的に夫々挿入され得るように、マルチウェルソースデバイスが、マルチ先端分注器の分注先端間の間隔に対応するような間隔で配置されるウェルを備えてもよい。従って、マルチウェルソースデバイスが分注先端の数と等しい数のウェルを有する場合、又はウェルの数と分注先端の数が等しくない場合を含めて、マルチウェルソースデバイスは、マルチ先端分注器の分注先端と適合性を有するように構成されてもよい。
【００９６】
マルチウェルデバイスのウェル（例えばナノウェル）は、あらゆる簡便なサイズ、形状又は体積で作製されてもよい。ウェルの長さは約100 μｍ〜約１mmの範囲内であってもよく、幅は約100 μｍ〜約１mmの範囲内であってもよく、深さは約100 μｍ〜約１mmの範囲内であってもよい。ウェルの長さ、幅（又は直径）及び高さは異なってもよく、50μｍ未満から５mmを超える範囲内であってもよく、例えば50μｍ〜５mm、75μｍ〜５mm、100 μｍ〜５mm、200 μｍ〜５mm、300 μｍ〜５mm、400 μｍ〜５mm、500 μｍ〜５mm、600 μｍ〜５mm、700 μｍ〜５mm、800 μｍ〜５mm、900 μｍ〜５mm、１mm 〜５mm、２mm 〜５mm、３mm 〜５mm、４mm〜５mm、50μｍ〜２mm、75μｍ〜２mm、100 μｍ〜２mm、200 μｍ〜２mm、300 μｍ〜２mm、400 μｍ〜２mm、500 μｍ〜２mm、600 μｍ〜２mm、700 μｍ〜２mm、800 μｍ〜２mm、900 μｍ〜２mm、１mm 〜２mm、50μｍ〜１mm、75μｍ〜１mm、100 μｍ〜１mm、200 μｍ〜１mm、300 μｍ〜１mm、400 μｍ〜１mm、500 μｍ〜１mm、50μｍ〜500 mm、75μｍ〜500 mm、100 μｍ〜500 mm、200 μｍ〜500 mm、300 μｍ〜500 mm、400 μｍ〜500 mmなどの範囲内を含むが、これらに限定されない。様々な実施形態では、各ナノウェルは、例えば１対４、１対３、１対２、１、２対４、２対３、２、３対４、３及び４を含む約１〜約４の範囲のアスペクト比（深さ対幅の比）を有する。ある実施形態では、各ナノウェルは約２のアスペクト比を有する。横断面は、円形、楕円形、卵形、円錐形、矩形、三角形、多面体又はあらゆる他の形状であってもよい。ウェルの任意の所与の深さにおける横断面のサイズ及び形状も異なってもよい。
【００９７】
ある実施形態では、ウェルの体積は約0.1 nl〜約１μｌである。ナノウェルの体積は１μｌ未満であってもよく、場合によっては500 nl未満であってもよい。体積は200 nl未満であってもよく、又は100 nl未満であってもよい。ある実施形態では、ナノウェルの体積は約100 nlである。ある実施形態では、ナノウェルの体積は約150 nlである。マルチウェルデバイスのウェルの体積は異なってもよく、0.1 nl未満〜100 μｌ以上の範囲内であってもよく、例えば0.1 nl〜100 μｌ、0.1 nl〜90μｌ、0.1 nl〜80μｌ、0.1 nl〜70μｌ、0.1 nl〜60μｌ、0.1 nl〜50μｌ、0.1 nl〜40μｌ、0.1 nl〜30μｌ、0.1 nl〜20μｌ、0.1 nl〜15μｌ、0.1 nl〜10μｌ、0.1 nl〜５μｌ、0.1 nl〜１μｌ、0.1 nl〜900 μｌ、0.1 nl〜800 μｌ、0.1 nl〜700 μｌ、0.1 nl〜600 μｌ、0.1 nl〜500 μｌ、0.1 nl〜450 μｌ、0.1 nl〜400 μｌ、0.1 nl〜350 μｌ、0.1 nl〜300 μｌ、0.1 nl〜250 μｌ、0.1 nl〜200 μｌ、0.1 nl〜150 μｌ、0.1 nl〜100 μｌ、0.1 nl〜50μｌなどを含むが、これらに限定されない。必要に応じて、ナノウェルは表面積対体積の比を増加させるように作製され得るため、ユニットを通した熱伝達が促進され、熱サイクルのランプ時間を減少させることができる。各ウェル（例えばナノウェル）の空洞部は様々な構成を有してもよい。例えば、ウェル内の空洞部を線形の壁又は曲線状の壁によって分割して、別個であるが、隣り合う区画が形成されてもよく、又は円形の壁によって分割して、内側及び外側の環状の区画が形成されてもよい。場合によっては、必要に応じて、内面対体積の比が高いウェルを、ウェルに含まれる反応物質がウェルの内面と相互に作用し得る可能性を低下させるための材料で覆ってもよい。試薬が内面に不必要に相互に作用するか又は付着する傾向がある場合、被覆は特に有用である。反応物質の性質に応じて、疎水性被覆体又は親水性被覆体を選択してもよい。場合によっては、本方法及び本システムに、例えば、その開示内容全体が参照によって本明細書に組み込まれるPCT 出願第PCT/US2017/034568 号に記載されているような相対的に疎水性の上面及び／又は相対的に親水性の壁を有するマルチウェルデバイスが使用されてもよい。様々な適切な被覆材料が本技術分野では入手可能である。被覆材料の内の一部が表面に共有結合で付着してもよく、他の被覆材料が表面に非共有結合相互作用によって付着してもよい。被覆材料の非制限例として、ジメチルクロロシラン、ジメチルジクロロシラン、ヘキサメチルジシラザン又はトリメチルクロロシラン、ポリマレイミドのようなシリル化試薬と、シリコン酸化物、（Thermo Fisher Scientific Inc.によって販売されている）AQUASIL （商標）及びSURFASIL（商標）のようなシリコナイジング試薬とが含まれる。更なる好適な被覆材料は、アミノ酸又はこれらに限定されないが、ポリビニルピロリドン、ポリアデニル酸及びポリマレイミドを含むポリマーのようなブロッキング剤である。ある被覆材料は、加熱、放射及び化学反応によって表面に架橋され得る。当業者は、マルチウェルデバイスのナノウェルを被覆するための他の好適な手段を知っているか、又は不要な実験をすることなく、このような手段を確認することができる。
【００９８】
例示的なマルチウェルデバイス（例えばチップ）の厚さは約0.625 mmであってもよく、ウェルの長さ及び幅は約0.25mm（250 μｍ）であってもよい。所与のウェルの下にチップの約0.1 mmを残して、ナノウェルの深さは約0.525 mm（525 μｍ）であり得る。ナノウェルの開口部は、円形、正方形、矩形又はあらゆる他の所望の幾何学形状のようなあらゆる形状を含み得る。例として、ナノウェルは、約100 μｍ〜約１mmの範囲内の直径又は幅、約150 μｍ〜約１mmの範囲内のピッチ又は長さ、及び約10μｍ〜約１mmの範囲内の深さを有し得る。各ウェルの空洞部は様々な構成を有してもよい。例えば、ナノウェル内の空洞部を線形の壁又は曲線状の壁によって分割して、別個であるが、隣り合う区画を形成してもよい。
【００９９】
マルチウェルデバイスのウェル（例えばナノウェル）は、例えば一般に知られているフォトリソグラフィ技術を使用して形成されてもよい。ナノウェルは、ウェットKOH エッチング技術、異方性ドライエッチング技術、機械穿孔、射出成形及び／又は熱成形（例えば熱エンボス加工）を使用して形成されてもよい。
【０１００】
試薬は、マルチウェルデバイスのウェルに予め分注されてもよく、又は一又は複数の細胞がウェルに加えられた後に加えられてもよく、又はこれら両方が行われてもよい。（細胞分注前、細胞分注中又は細胞分注後に関わらず）マルチウェルデバイス内の液体に含まれる試薬は、各ウェルに堆積する単細胞（又は複数の細胞）と共に行われる反応によって決まる。ある実施形態では、ウェルは核酸増幅反応を行うための試薬を含む。試薬は、（これらに限定されないが、核酸増幅、例えば（例えば配列特異的PCR 、ランダムプライムPCR 、qPCR、マルチプレックスPCR などを含む）PCR 、全ゲノム増幅(WGA) 、ライブラリ調製、逆転写、cDNA調製、テンプレートスイッチング、タグメンテーション、次世代シーケンシング(NGS) 、（例えばNGS のための）ライブラリ調製及び同種のものを含む）免疫測定、核酸調製、解析及び検出分析のための試薬とすることができる。試薬は、チップのユニット内で乾燥状態又は液体状態にすることができる。
【０１０１】
マルチウェルデバイスのウェルに追加され得る及び／又は既に存在し得る試薬の非制限例として、例えばオリゴヌクレオチド（例えばDNA 、RNA 及びヌクレオチド類似体オリゴヌクレオチドのプライマ及びプローブを含むプライマ及びプローブ、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドなどを含む）、核酸を含むバーコード、核酸を含む配列決定アダプタ、テンプレート核酸（例えばDNA テンプレート、RNA テンプレートなど）、トランスポゾン核酸、酵素（例えばポリメラーゼ（例えば逆転写酵素、RNA ポリメラーゼなど）、トランスポサーゼ、ヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼ（例えば制限エンドヌクレアーゼ）、エクソヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼなど）、リガーゼ、DNA 修復酵素（例えばウラシル-DNAグリコシラーゼ、エンドヌクレアーゼIII, IV, V, VIIIなど）、メチルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、スルフリラーゼ、リコンビナーゼ、キナーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤（例えばRNase 阻害剤）など）、dNTP（例えばdATP、dCTP、dGTP、dTTP及び／又はdUTP）、染料（例えばDNA 結合染料（例えばDAPI、ヘキスト、SYBR（登録商標）Green など）生存率解析用染料など）、塩、金属補助因子、酵素安定化成分（例えばDTT ）及び同種のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
ある実施形態では、ウェルは、プローブ、ポリメラーゼ及びdNTPの試薬の内の少なくとも１つを含む。他の実施形態では、ウェルは、プローブ、プライマ及びポリメラーゼを含む溶液を含んでいる。様々な実施形態で、各ウェルは、(1) 前記標準ゲノム内のポリヌクレオチド標的のためのプライマと、(2) プライマが前記標的と結合する場合、濃度依存信号を発する前記プライマと関連付けられているプローブとを有する。様々な実施形態で、各ウェルは、ゲノム内のポリヌクレオチド標的のためのプライマと、プライマが標的と結合する場合、濃度依存信号を発するプライマと関連付けられているプローブとを有する。別の実施形態では、チップの少なくとも１つのウェルは、フォワードPCR プライマ、リバースPCR プライマ及び少なくとも１つのFAM 標識MGB クェンチPCR プローブを含む溶液を含んでいる。ある実施形態では、プライマ対がウェルに分注され、その後、例えば凍結によって乾燥される。その後、ユーザは、サンプル、プローブ及び／又はポリメラーゼを選択的に分注する、例えばナノ分注することができる。
【０１０３】
本開示の他の実施形態では、ウェルは、上記の溶液のいずれかを乾燥形態（例えば凍結乾燥形態）で含んでもよい。本実施形態では、この乾燥形態で、ウェルに被覆されてもよく、又はウェルの底部に向けられてもよい。ユーザは、解析前に水及び捕捉された細胞の混合物をウェルの各々に追加することができる。これらの実施形態では、乾燥した反応混合物を含むチップを、ライナで密閉して、保存するか、又は別の場所に送ってもよい。
【０１０４】
各ウェルに単細胞を有するマルチウェルデバイスは、遺伝子型判定、遺伝子発現又はPCR によって行われる他のDNA 分析のために使用され得る。プレートで行われる分析は、TAQMAN、TAQMAN Gold 、SYBR gold 及びSYBR greenのようなDNA 分析に限定されず、受容体結合、酵素及び他の高処理スクリーニング分析のような他の分析も含む。
【０１０５】
ある実施形態では、（例えば溶解ステップ及び／又は他の処理ステップの後、）細胞の増幅及び／又は配列決定解析を行う。一又は複数の増幅反応を行う際、一又は複数のPCR に基づく増幅、非PCR に基づく増幅又はこれらの組合せを行ってもよい。核酸増幅技術の例示的非制限例として、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、ネステッドPCR 、線形増幅、多重置換増幅(MDA) 、リアルタイムSDA 、ローリングサークル増幅、circle-to-circle増幅転写増幅(TMA) 、リガーゼ連鎖反応(LCR) 、鎖置換増幅(SDA) 及び核酸配列に基づく増幅(NASBA) が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、ある増幅技術（例えばPCR ）ではRNA が増幅（例えばRT-PCR）前にDNA に逆転写される必要がある一方、他の増幅技術はRNA を直接増幅する（例えばTMA 及びNASBA ）と認識する。
【０１０６】
一般にPCR と称されるポリメラーゼ連鎖反応（各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第4683195 号明細書、米国特許第4683202 号明細書、米国特許第4800159 号明細書及び米国特許第4965188 号明細書）は、変性、逆ストランドへのプライマ対のアニーリング、及び標的核酸のコピー数の指数関数的な増加を可能にするプライマ伸長の複数サイクルを使用する。RT-PCRと称される変形例では、逆転写酵素(RT)を使用して、RNA から相補DNA (cDNA)を生成し、その後、cDNAをPCR によって増幅してDNA の多くのコピーを生成する。PCR の他の様々な置換に関して、例えば米国特許第4683195 号明細書、米国特許第4683202 号明細書及び米国特許第4800159 号明細書、及びMullis等著，Meth. Enzymol. 155: 335 (1987)；及びMurakawa等著，DNA 7: 287 (1988)（これら各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる）参照。
【０１０７】
一般にTMA と称される転写増幅（各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5480784 号明細書及び米国特許第5399491 号明細書）は、実質的に一定の温度、イオン強度、及び標的配列の多くのRNA コピーが追加のコピーを自己触媒的に生成するｐＨの条件下で標的核酸配列の多くのコピーを自己触媒的に合成する。例えば、米国特許第5399491 号明細書及び米国特許第5824518 号明細書（これら各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる）参照。（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）米国特許出願公開第2006/0046265号明細書に記載されている変形例では、TMA は、TMA 処理の感度及び精度を高めるために、ブロッキング部分、終止部分及び他の修飾部分の使用を任意に組み込む。
【０１０８】
一般にLCR と称されるリガーゼ連鎖反応（その全体が参照によって本明細書に組み込まれるWeiss, R., Science254: 1292 (1991)）は、標的核酸の隣り合う領域にハイブリッド形成する２組の相補DNA オリゴヌクレオチドを使用する。DNA オリゴヌクレオチドは、熱変性、ハイブリダイゼーション及び連結反応の繰返しサイクルでDNA リガーゼによって共有結合で連結されて、検出可能な二本鎖連結オリゴヌクレオチド産物を生成する。
【０１０９】
一般にSDA と称される鎖置換増幅（各々全体が参照によって本明細書に組み込まれるWalker, G.等著，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 (1992)；米国特許第5270184 号明細書及び米国特許第5455166 号明細書）は、標的配列の逆ストランドへの対のプライマ配列のアニーリング、二本鎖ヘミホスホロチオエートプライマ伸長産物を生成するための、dNTPαSの存在下でのプライマ伸長、ヘミ修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介のニッキング、及び既存のストランドを置換してプライマアニーリング、ニッキング及び鎖置換の次のラウンドのためのストランドを生成するためにニックの3'末端からのポリメラーゼ媒介のプライマ伸長のサイクルを使用して、産物の幾何的増幅をもたらす。好熱性SDA (tSDA)は、基本的に同じ方法でより高い温度の好熱性のエンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼを使用する（欧州特許出願公開第0684315 号明細書）。
【０１１０】
他の増幅方法として、例えば、一般にNASBA と称される核酸配列に基づく増幅（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5130238 号明細書）；一般にＱβレプリカーゼと称される、プローブ分子自体を増幅するためにRNA レプリカーゼを使用する増幅（その全体が参照によって本明細書に組み込まれるLizardi 等著，BioTechnol. 6: 1197 (1988)）；転写に基づく増幅法（Kwoh等著，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989)）；及び自律的な配列複製（その全体が参照によって本明細書に組み込まれるGuatelli等著，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990)）が含まれる。既知の増幅法の更なる議論のために、Persing, David H., “In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques” in Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications (Persing et al., Eds.), pp. 51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC (1993))参照。
【０１１１】
ある実施形態では、（例えば増幅核酸を検出するために）核酸配列決定法を利用する。ある実施形態では、本明細書で提供されている技術は、第二世代（別名  Next Generation or Next-Gen）配列決定技術、第三世代（別名  Next-Next-Gen）配列決定技術又は第四世代（別名  N3-Gen）配列決定技術に使用され、このような技術として、ピロシーケンス、連結反応による配列決定、一分子シーケンシング、合成による配列決定(SBS) 、半導体シーケンシング、超並列クローン、超並列一分子SBS 、超並列一分子リアルタイム、超並列一分子リアルタイムナノポア技術などが含まれるが、これらに限定されない。Morozova及びMarra は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるGenomics, 92: 255 (2008)にこのような技術の考察を提供している。当業者は、RNA が細胞でそれほど安定しておらず、実験的にヌクレアーゼ攻撃をしがちであるので、RNA は通常配列決定前にDNA に逆転写されると認識する。
【０１１２】
蛍光に基づく配列決定法（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるBirren等著，Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, N.Y.参照）を含む多くのDNA 配列決定技術が好適である。ある実施形態では、このような技術は本技術分野で理解される自動配列決定技術に使用される。ある実施形態では、本技術は分割されたアンプリコンの並行配列決定に使用される（その全体が参照によって本明細書に組み込まれるKevin McKernan等の国際公開第2006/084132 号パンフレット）。ある実施形態では、このような技術は並行オリゴヌクレオチド伸長によるDNA 配列決定に使用される（例えば、Macevicz等の米国特許第5750341 号明細書及びMacevicz等の米国特許第6306597 号明細書参照、これら両方全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。本技術が使用される配列決定技術の更なる例として、Church polony技術（Mitra 等著，2003, Analytical Biochemistry 320, 55-65；Shendure等著，2005 Science 309, 1728-1732；米国特許第6432360 号明細書、米国特許第6485944 号明細書、米国特許第6511803 号明細書；これら全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、454 ピコリットルピロシーケンス技術（Margulies 等著，2005 Nature 437, 376-380；米国特許出願公開第2005/0130173号明細書；これら全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、Solexa一塩基追加技術（Bennett 等著，2005, Pharmacogenomics, 6, 373-382；米国特許第6787308 号明細書；米国特許第6833246 号明細書；これら全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、Lynx超並列シグネチャ配列決定技術（Brenner 等著，(2000). Nat. Biotechnol. 18:630-634；米国特許第5695934 号明細書；米国特許第5714330 号明細書；これら全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、及びAdessiPCR colony技術（Adessi等著，(2000). Nucleic Acid Res. 28, E87；国際公開第00/018957号パンフレット；これら全体が参照によって本明細書に組み込まれる）が含まれる。
【０１１３】
次世代シーケンシング(NGS) 法は、より古いシーケンシング法と比較してコストをより下げる目的で超並列高処理の方針という共通の特徴を共有する（例えばVoelkerding等著，Clinical Chem., 55: 641-658, 2009；MacLean 等著，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；これら各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。NGS 法は、テンプレート増幅を典型的に使用する方法とテンプレート増幅を使用しない方法とに大まかに分割され得る。増幅を必要とする方法として、Roche によって454 技術プラットフォーム（例えば、GS 20 及びGS FLX）として商品化されているピロシーケンス、Life Technologies/Ion Torrent、Illuminaによって商品化されているSolexaプラットフォーム、GnuBio、及びApplied Biosystemsによって商品化されているthe Supported Oligonucleotide Ligation and Detection (SOLiD)プラットフォームが含まれる。一分子シーケンシングとしても知られている非増幅手法が、Helicos BioSciencesによって商品化されているHeliScope プラットフォームと、VisiGen, Oxford Nanopore Technologies Ltd.及びPacific Biosciencesによって夫々商品化されている新たなプラットフォームとによって例示されている。
【０１１４】
ピロシーケンス（例えばVoelkerding 等著，Clinical Chem., 55: 641-658, 2009；MacLean 等著，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；米国特許第6210891 号明細書；米国特許第6258568 号明細書；これらの各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる）では、テンプレートDNA が断片化されて末端修復され、アダプタに連結されて、アダプタに相補的なオリゴヌクレオチドを支持するビーズを用いて１つのテンプレート分子を取り込むことによりクローン的に原位置で増幅される。１つのテンプレート型を支持する各ビーズは、油中水型微小胞に区画化され、テンプレートは、エマルジョンPCR と称される技術を使用してクローン的に増幅される。増幅後にエマルジョンを崩壊させて、配列決定反応中、フローセルとして機能するpicotitre プレートの個々のウェルにビーズを堆積させる。４つのdNTP試薬の各々の規則正しい反復導入が、配列決定酵素及びルシフェラーゼのような発光性レポータの存在下でフローセルに生じる。適切なdNTPが配列決定プライマの3’末端に加えられる場合、その結果、ATP が生成されることにより、ウェル内に発光の突発が生じ、CCD カメラを使用して記録される。400 塩基以上のリード長が可能になり、106 の配列リードが達成されることでき、最大５億塩基対(Mb)の配列がもたらされる。
【０１１５】
Solexa/Illumina プラットフォーム（Voelkerding 等著，Clinical Chem., 55: 641-658, 2009；MacLean 等著，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；米国特許第6833246 号明細書；米国特許第7115400 号明細書；米国特許第6969488 号明細書；これらの各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる）では、配列決定データをより短いリード長の形態で生成する。この方法では、一本鎖の断片化されたDNA を末端修復して5’リン酸化平滑末端が生成され、その後、断片の3’末端への１つのＡ塩基のクレノウ媒介の追加を行う。Ａ追加は、Ｔオーバーハングアダプタオリゴヌクレオチドの追加を容易にし、その後、このようなオリゴヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチドアンカーが点在しているフローセルの表面上のテンプレートアダプタ分子を捕捉する。アンカーをPCR プライマとして使用するが、テンプレートの長さ及び他の近くのアンカーオリゴヌクレオチドへの近接のため、PCR による伸長によって、分子の「弓形」が生じて、隣り合うアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成され、フローセルの表面に架橋構造が形成される。DNA のこれらのループは変性されて切断される。その後、フォワードストランドが、可逆的な染料ターミネータを用いて配列決定される。組み込まれたヌクレオチドの配列が、組込み後の蛍光を検出することにより決定され、dNTP追加の次のサイクルの前に各蛍光体及びブロックが取り除かれる。配列リード長は36ヌクレオチド〜250 を超えるヌクレオチドの範囲内であり、出力全体が分析実行当たり10億ヌクレオチド対を超える。
【０１１６】
SOLiD 技術を使用した核酸分子の配列決定（Voelkerding 等著，Clinical Chem., 55: 641-658, 2009；MacLean 等著，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；米国特許第5912148 号明細書；米国特許第6130073 号明細書；これらの各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる）には、テンプレートの断片化、オリゴヌクレオチドアダプタへの連結反応、ビーズへの付着、及びエマルジョンPCR によるクローン増幅が更に含まれる。この後、テンプレートを支持するビーズが、ガラスのフローセルの誘導体化された表面に固定され、アダプタオリゴヌクレオチドに相補的なプライマのアニールを行う。しかしながら、3’伸長のためにこのプライマを利用するのではなく、代わりに、２つのプローブ特異的塩基、続いて６つの変性塩基及び４つの蛍光標識の内の１つを含む照合プローブへの連結反応のための5’リン酸基を与えるためにこのプライマを使用する。SOLiD システムでは、照合プローブは、各プローブの3’末端に２つの塩基の16の可能な組合せを有し、5’末端に４つの蛍光体の内の１つを有する。蛍光カラー、ひいては各プローブの同一性は、特定の色空間コード体系に対応する。プローブアニーリング、連結反応及び蛍光検出の複数のラウンド（通常７）の後、変性を行い、その後、最初のプライマに対して１つの塩基がオフセットされたプライマを使用して配列決定の第２のラウンドを行う。このように、テンプレート配列は計算的に再構築されることができ、テンプレート塩基は２回調べられて正確性が高められる。配列リード長は35ヌクレオチドを平均し、出力全体が配列決定実行当たり40億塩基を超える。
【０１１７】
ある実施形態では、本技術はナノポアシーケンシング（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるAstier等著，J. Am. Chem. Soc. 2006 Feb 8; 128(5):1705-10参照）に使用される。ナノポアシーケンシングの背後にある理論は、ナノポアが導電性流体に浸され、電位（電圧）が導電性流体に加えられるときに生じるものと関連する。これらの条件下で、ナノポアを通じたイオンの伝導による僅かな電流を観察することができ、電流の量は、ナノポアのサイズに非常に反応し易い。核酸の各塩基がナノポアを通過するので、４つの塩基毎に別個のナノポアを通じた電流の大きさが変化し、それによって、DNA 分子の配列を決定することが可能になる。
【０１１８】
ある実施形態では、本技術が、Helicos BioSciencesによるHeliScope （Voelkerding 等著，Clinical Chem., 55: 641-658, 2009；MacLean 等著，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；米国特許第7169560 号明細書；米国特許第7282337 号明細書；米国特許第7482120 号明細書；米国特許第7501245 号明細書；米国特許第6818395 号明細書；米国特許第6911345 号明細書；米国特許第7501245 号明細書；これらの各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に使用される。テンプレートDNA は断片化されて、3’末端でポリアデニル化され、最終アデノシンが蛍光標識を支持する。変性されたポリアデニル化テンプレート断片は、フローセルの表面でポリ(dT)オリゴヌクレオチドに連結される。捕捉されたテンプレート分子の最初の物理的な位置がCCD カメラによって記録され、その後、ラベルが切断されて洗い流される。配列決定は、ポリメラーゼの追加及び蛍光標識が付されたdNTP試薬の逐次加算によって行われる。組込みによって、dNTPに対応する蛍光信号が生じ、この信号がdNTP追加の各ラウンドの前にCCD カメラによって取り込まれる。配列リード長は25〜50ヌクレオチドの範囲内であり、出力全体が分析実行当たり10億ヌクレオチド対を超える。
【０１１９】
ある実施形態では、Ion Torrent 技術が使用される。Ion Torrent 技術は、DNA の重合中に放出される水素イオンの検出に基づくDNA 配列決定の方法である（例えば、あらゆる目的のために全体が参照によって組み込まれるScience 327(5970): 1190 (2010)；米国特許出願公開第2009/0026082号明細書、米国特許出願公開第2009/0127589号明細書、米国特許出願公開第2010/0301398号明細書、米国特許出願公開第2010/0197507号明細書、米国特許出願公開第2010/0188073号明細書及び米国特許出願公開第2010/0137143号明細書参照）。マイクロウェルは、配列決定されるテンプレートDNA 鎖を含む。マイクロウェルの層の下に、高感受性ISFET イオンセンサが設けられている。全ての層は、電子産業で使用されるものと同様のCMOS半導体チップ内に含まれる。dNTPが成長する相補鎖に組み込まれると、水素イオンが放出され、高感受性イオンセンサを始動させる。ホモポリマー反復がテンプレート配列にある場合、複数のdNTP分子が１つのサイクルに組み込まれる。このため、対応する数の放出される水素及び比例してより高い電子信号がもたらされる。この技術は、修飾ヌクレオチド又は光学的性質が使用されない点で他の配列決定技術とは異なる。Ion Torrent 配列決定装置の塩基毎の精度は50塩基リードに関して約99.6％であり、１つの実行当たり約100 Mb〜100 Gbが生成される。リード長は100 〜300 塩基対である。長さが５反復のホモポリマー反復の精度は約98％である。イオン半導体シーケンシングの利点は、迅速な配列決定速度及び低い初期費用及び運転コストである。
【０１２０】
本技術は、Stratos Genomics, Inc.によって開発された別の核酸配列決定手法に使用され、Xpandomersの使用を含む。この配列決定処理では典型的には、テンプレートを標的とした合成によって生成される娘鎖を与える。娘鎖は一般に、標的核酸の全て又は一部の連続的なヌクレオチド配列に対応する配列で結合された複数のサブユニットを含んでおり、個々のサブユニットは、テザー、少なくとも１つのプローブ又は核酸塩基の残基及び少なくとも１つの選択的に切断可能な結合部分を有している。一又は複数の選択的に切断可能な結合部分が切断されて、娘鎖の複数のサブユニットより長いXpandomer をもたらす。Xpandomer は典型的に、標的核酸の全て又は一部の連続的なヌクレオチド配列に対応する配列で遺伝子情報を解析するためにテザー及びレポータ要素を含んでいる。その後、Xpandomer のリポータ要素が検出される。Xpandomer に基づく手法に関連する追加の詳細内容が、例えばその全体が本明細書に組み込まれる2008年６月19日に出願された「High Throughput Nucleic Acid Sequencing by Expansion」という名称の米国特許出願公開第2009/0035777号明細書に記載されている。
【０１２１】
他の一分子シーケンシング法には、VisiGen プラットフォーム（Voelkerding 等著，Clinical Chem., 55: 641-58, 2009；米国特許第7329492 号明細書；米国特許出願第11/671956 号；米国特許出願第11/781166 号；これらの各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を使用した合成によるリアルタイム配列決定が含まれており、固定されて刺激を受けたDNA テンプレートに、蛍光修飾されたポリメラーゼ及び蛍光性受容体分子を使用した鎖伸長を行うことにより、ヌクレオチド追加で検出可能な蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が生じる。
【０１２２】
あらゆる好適なタイプの分析用試薬が、（例えばWAFERGEN (WaferGen Bio-systems, Inc.)によって販売されているようなマルチウェル分注器を使用して）マルチウェルチップのウェルに追加されてもよい。このような試薬は、細胞（例えば単細胞）がウェルに加えられる前又は後にウェルに加えられてもよい。ある実施形態では、タンパク質検出分析成分（例えば抗体に基づく分析成分）をウェルに追加する。他の実施形態では、SNP 検出分析成分をウェルに追加する。他の実施形態では、核酸配列決定分析成分をウェルに追加する。ある実施形態では、個々のmRNA分子を標識化するため、及び／又は（例えばウェルが配列決定解析前にプールされる場合）細胞／ウェルソースに関して標識化するため、及び／又は（例えば２以上のマルチウェルチップからのウェルが配列決定前にプールされる場合）特定のマルチウェルチップを標識化するためのバーコーディングを用いた核酸配列分析成分を使用する。このようなバーコーディング法及び試薬の例が、反応条件及び核酸のバーコーディング及び配列決定に関連する試薬のためを含めて、米国特許出願公開第2007/0020640号明細書、米国特許出願公開第2012/0010091号明細書、米国特許第8835358 号明細書、米国特許第8481292 号明細書、Qiu 等著，(Plant. Physiol., 133, 475-481, 2003)、Parameswaran等著，(Nucleic Acids Res. 2007 Oct; 35(19): e130)、Craig 等著，文献(Nat. Methods, 2008, October, 5(10):887-893)、Bontoux 等著，(Lab Chip, 2008, 8:443-450)、Esumi 等著，(Neuro. Res., 2008, 60:439-451)、Hug 等著，J. Theor., Biol., 2003, 221:615-624)、Sutcliffe 等著，(PNAS, 97(5):1976-1981; 2000)、Hollas及びSchuler 著，(Lecture Notes in Computer Science Volume 2812, 2003, pp 55-62)及び国際公開第2014/20127号パンフレット（これら全ての全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に見出される。
【０１２３】
ある実施形態では、国際公開第2014/201272 号パンフレット（「SCRB-seq」法）のバーコードタギング及び配列決定法を使用する。（例えばウェルの単細胞を溶解する場合）（例えば、少量に必要なため修飾される）SCRB-seq法のための必要な試薬が、マルチウェルチップのウェルに追加される。簡潔にSCRB-seq法は、各ウェルが単細胞を含む場合、（上述されているような）マルチウェルプレートの単細胞から最初のmRNAサンプルを増幅する。最初のcDNA合成は、i)  細胞／ウェル識別のためのN6又はN11 、ii) 特定の分子識別のためのN10 、iii)  mRNAを結合するためのポリT伸展、及びiv) 第２のテンプレートスイッチングプライマがハイブリッド形成する領域を生成する領域と共に第１のプライマを使用する。第２のプライマは、ポリG3’ 末端とイソ塩基を有する5’末端とを含むテンプレートスイッチングプライマである。cDNA増幅後、タグ付けされたcDNA単細胞／ウェルサンプルをプールする。その後、全長のcDNA合成が２つの異なるプライマを用いて生じ、全長のcDNAが精製される。次に、（特定のマルチウェルプレートを識別するために12のi7タグの内の１つを追加するために）i7プライマを使用し、NEXTERA 配列決定のためにP5タグを追加して（NEXTERA のための他の末端にP7タグを追加するために）P5NEXTPT5 を使用してNEXTERA 配列決定ライブラリを調製する。ライブラリはゲルで精製され、その後、NEXTERA 配列決定が生じる。非制限例として、このため、12のi7プレートタグ及び384 細胞／ウェル特異的バーコードを用いて、合計4,608 の単細胞トランスクリプトームを一度に行うことが可能になる。この方法は、単細胞のmRNA転写物の定量化を可能にし、ユーザが転写物の分子／細胞の絶対数を計数して正規化から任意の変数を取り除くことを可能にする。
【０１２４】
更なる実施形態では、核酸又は脂質又は炭水化物又はタンパク質細胞成分試薬の検出及び／又は分析のために試薬の一又は複数の追加の組合せにより更なる解析のために、チップ内の撮像されてチップマップされたウェルが動的及び／又は静的に選択される。
【０１２５】
コンピュータに関連する実施形態
上記に要約されているように、本方法で用いられる本システムの構成要素、例えば分注要素及びその部品、撮像要素及びその部品などはコンピュータ制御されてもよい（つまりロボットであってもよい）。従って、本方法及び本システムは、構成要素の一又は複数の動作を制御するためにシステムの一又は複数の電気部品と接続されているか、又は別の方法で通信するプロセッサを使用してもよい。
【０１２６】
場合によっては、画像処理回路が具体的には、画像処理機能、合成画像生成機能、マルチウェルデバイスマップ生成機能などを含む本明細書に記載されているような方法に従って機能を行うように構成又はプログラムされており、データに関連する機能を行うための少なくとも１つのデータ処理ユニットを有してもよい。
【０１２７】
本明細書で使用されている「データ処理ユニット」は、データ処理ユニットに求められている機能を行うあらゆるハードウェア及び／又はソフトウェアの組合せを意味する。例えば、本明細書では任意のデータ処理ユニットが、電子制御部、メインフレーム、サーバ又はパーソナルコンピュータ（デスクトップ若しくは携帯型）の形態で利用可能なプログラム可能なデジタルマイクロプロセッサであってもよい。データ処理ユニットがプログラム可能である場合、好適なプログラミングが遠隔地からデータ処理ユニットに通信されることができ、又は（磁気デバイス、光学デバイス又は固体デバイスに基づくか否かに関わらず、携帯型又は固定型のコンピュータ可読記憶媒体のような）コンピュータプログラム製品に既に保存されることができる。
【０１２８】
場合によっては、本明細書に記載されているようなシステムの構成要素は有線データ接続によって接続されてもよい。あらゆる好適且つ適切な有線データ接続は、例えば本明細書に記載されているような記載されたシステムの構成要素を接続する際に使用されてもよく、例えば、USB ケーブル、同軸ケーブル、シリアルケーブル、C2G 又はCat2ケーブル、Cat5/Cat5e/Cat6/Cat6a ケーブル、トークンリングケーブル(Cat4)、VGA ケーブル、HDMIケーブル、RCA ケーブル、光ファイバケーブルなどを含むが、これらに限定されない。場合によっては、例えば無線周波数接続（例えばPAN/LAN/MAN/WAN 無線ネットワーク、UHF 無線接続など）、赤外線データ伝送接続、無線光データ接続などを含むが、これらに限定されない無線データ接続を使用してもよい。
【０１２９】
上記に要約されているように、本開示のデバイス及びシステムは、コンピュータによって後でアクセス可能且つ検索可能であるように、情報を記憶することができる「メモリ」を更に備えてもよい。あらゆる所望の情報がこのようなメモリに記憶されてもよく、例えば方法の一又は複数のステップを行うための指示及び同種のものを含むが、これらに限定されない。あらゆる簡便なデータ記憶構造が、記憶された情報にアクセスするために使用される手段に基づき選択されてもよい。ある態様では、情報が、「永久メモリ」（つまりコンピュータ若しくはプロセッサへの電力供給の終了によって消去されないメモリ）又は「非永久メモリ」に記憶されてもよい。コンピュータハードドライブ、CD-ROM、フロッピーディスク、ポータブルフラッシュドライブ及びDVD は全て永久メモリの例である。ランダムアクセスメモリ(RAM) は非永久メモリの例である。永久メモリ内のファイルは編集可能であり、書換可能であってもよい。
【０１３０】
実質的にあらゆる回路が、本明細書に開示されている方法を行うためのデバイス及びシステム内の機能的な配置で構成され得る。例えば具体的に構成されたコンピュータを含むこのような回路のハードウェアアーキテクチャは、当業者に周知であり、一又は複数のプロセッサ(CPU) 、ランダムアクセスメモリ(RAM) 、読み出し専用メモリ(ROM) 、内部又は外部のデータ記憶媒体（例えばハードディスクドライブ）を含むハードウェア構成要素を備えることができる。このような回路は、図形情報を処理して表示手段に出力するための一又は複数のグラフィックボードを更に備えることができる。上記の構成要素は、例えば特定用途のコンピュータ内で、回路内のバスを介して適切に相互接続され得る。回路は、モニタ、キーボード、マウス、ネットワークなどの汎用の外部部品と通信するために好適なユーザインタフェースを更に備えることができる。ある実施形態では、回路は、本方法及び本プログラムに関する処理能力を高めるために並列処理ができるか、又は並列演算若しくは分配演算用に構成されたネットワークの一部とすることができる。ある実施形態では、記憶媒体から読み出されたプログラムコードが、回路又は回路に接続された拡張ユニットに挿入された拡張ボードに設けられたメモリに書き込まれることができ、拡張ボード又は拡張ユニットに設けられたCPU などは、記載された機能を達成するようにプログラミングの指示に従って動作の一部又は全てを実際に行うことができる。
【０１３１】
本開示はコンピュータ可読媒体を備えており、コンピュータ可読媒体として、本明細書に記載されている方法のための指示又はその一部を記憶する非一時的なコンピュータ可読媒体が含まれる。本開示の態様では、コンピューティングデバイスによって実行されると、本明細書に記載されている方法の一又は複数のステップをコンピューティングデバイスに行わせる指示を記憶するコンピュータ可読媒体が含まれる。
【０１３２】
ある実施形態では、本明細書に記載されている方法に係る指示を「プログラミング」の形態でコンピュータ可読媒体にコード化することができ、本明細書で使用されている「コンピュータ可読媒体」という用語は、指示及び／又はデータを実行及び／又は処理のためにコンピュータに与える際に関与するあらゆる記憶媒体又は伝送媒体を指す。記憶媒体の例として、このようなデバイスがコンピュータの内部にあるか外部にあるかに関わらず、フロッピーディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、CD-ROM、CD-R、磁気テープ、不揮発性メモリカード、ROM 、DVD-ROM 、ブルーレイディスク、固体ディスク及びネットワーク接続型記憶装置(NAS) が含まれる。情報を含むファイルをコンピュータ可読媒体に「記憶」することができ、「記憶する」は、コンピュータによって後でアクセス可能且つ検索可能であるように、情報を記録することを意味する。
【０１３３】
本明細書に記載されているコンピュータで実施される方法は、任意の数のコンピュータプログラミング言語の内の一又は複数で書き込まれ得るプログラミングを使用して実行され得る。このような言語として、例えば、Java (Sun Microsystems, Inc., Santa Clara, CA)、Visual Basic (Microsoft Corp., Redmond, WA)、及びC++ (AT&T Corp., Bedminster, NJ)並びに任意の他の多くのものが含まれる。
【０１３４】
以下の実施例は例示のために提供されており、制限のために提供されているわけではない。
【０１３５】
実施例
実施例１：候補ウェルを識別する際の遠心分離、Ｚ面サンプリング及び細胞分注量の影響
識別される候補ウェルの数に対する遠心分離の影響を調査した。具体的には、細胞懸濁液を１mm(150 nl)及び1.6 mm(250 nl)マルチウェルチップにポアソン分注し、候補ウェル識別（つまり、所望の数（この場合「１つ」）の細胞を含むウェルの識別）を、マルチウェルチップの遠心分離の前後に行った。遠心分離の前後の３つのＺ焦点面（Z1〜Z3）での撮像を使用して、候補ウェルの数を定量化した。表２及び表３は、１mm及び1.6 mmのチップに関してこの定量化の結果を夫々示し、Olympus 顕微鏡を使用して生成された対照候補ウェルの定量化の結果を含んでいる。
【０１３６】
【表２】
2019527551.tif 000004
【０１３７】
【表３】
2019527551.tif 000005
【０１３８】
遠心分離有り及び遠心分離無しの識別された候補ウェルの数に対するＺ面サンプリングの影響を更に調査した。候補ウェルの識別を、遠心分離前又は遠心分離後にＺ面サンプリングの様々なレベルで１mm(150 nl)チップで行った。具体的には、チップのＺ軸の１つ(Z1)の焦点面、２つ(Z1+Z2) の焦点面、３つ(Z1+Z2+Z3)の焦点面、４つ(Z1+Z2+Z3+Z4) の焦点面又は５つ(Z1+Z2+Z3+Z4+Z5)の焦点面を使用してサンプリングを行った。様々なサンプリングレベルの候補ウェルの定量化の結果を表４に示す。
【０１３９】
【表４】
2019527551.tif 000006
【０１４０】
識別された候補ウェルの数に対するＺ面サンプリングの影響を、1.6 mm(250 nl)の深いチップでより高いレベルのサンプリングを使用して更に評価した。具体的には、遠心分離の後、チップのＺ軸の１つ(Z1)の焦点面、２つ(Z1+Z2) の焦点面、３つ(Z1+Z2+Z3)の焦点面、４つ(Z1+Z2+Z3+Z4) の焦点面、５つ(Z1+Z2+Z3+Z4+Z5)の焦点面、６つ(Z1+Z2+Z3+Z4+Z5+Z6) の焦点面又は７つ(Z1+Z2+Z3+Z4+Z5+Z6+Z7)の焦点面を含む、ｚ面サンプリングの様々なレベルで候補ウェルの識別を行った。様々なサンプリングレベルの候補ウェルの定量化の結果を表５に示す。
【０１４１】
【表５】
2019527551.tif 000007
【０１４２】
上記の結果は、場合によっては、候補ウェル、つまり、上記で評価される場合には単細胞のみを含むウェルに限定された、所望の数の細胞を含むウェルの識別を高めるために遠心分離が使用され得ることを実証する。場合によっては、分注後の遠心分離によって、遠心分離無しで行われる同様の候補ウェルの識別と比較して、20〜25％多い候補ウェルが回収され得る。加えて、場合によっては、遠心分離が使用されない場合、単細胞を含む候補と識別されたウェルの一部が実際には誤認されて、実際は２つの細胞を含む場合がある。更に、この実施例で使用される分注量では、遠心分離は、細胞分注後に導入される気泡の除去に役立つことが分かった。
【０１４３】
上記の結果は、１つ又は２つのＺ軸焦点面より上のＺ面サンプリングレベルが候補ウェルの識別を改善したことを更に実証している。より多くの候補ウェルがＺ面サンプリングの最も高いレベル（例えばZ5及びZ7）で識別されたが、リターンの増加は、Ｚ面サンプリングの増加と共に減少しており、結果は、より低いＺ面サンプリング、例えば３つのＺ面のサンプリングが多くの場合に十分な感度及び特異性を与え得ることを示している。
【０１４４】
候補ウェルを識別する際の遠心分離及び細胞分注量の影響を同時的に試験するために、マルチウェルデバイスの遠心分離の前後の両方である範囲の細胞分注量（30nl、35nl及び50nl）を使用してマルチＺシステム（「Pong」）で候補ウェルの識別を行った。参考として、遠心分離後の候補ウェルの識別を50nlの細胞分注量でMSND+ システムを使用して更に行った。候補ウェルの定量化の結果が図８に示されており、各試験条件のポアソン分布の対応する割合が図９に示されている。
【０１４５】
これらの結果により、場合によっては、候補ウェルの識別を高めるために遠心分離が使用され得ることが再確認される。与えられるデータでは、例えば、候補の数が遠心分離後に５％〜９％増加した。これらの結果は、候補ウェルの数及びポアソン率が分注量の減少と共に増加することを更に実証している。この実施例では、具体的には30nlの分注量が、候補の数及びポアソン率に関して最高の性能を示した。
【０１４６】
実施例２：遠心分離はマルチピレットの発生を低下させることができる
単細胞を含むと識別された候補ウェルのマルチピレット（つまり、２以上の細胞を含むウェル）の発生に対する遠心分離の影響を、混合種配列決定実験を使用して評価した。具体的には、等しい比率（50nl当たり１つの細胞）で混合したヒトK-562 細胞及びマウス3T3 細胞をマルチウェルチップに分注し、単細胞を含む候補ウェルを、事前の遠心分離有り及び無しで識別し、候補ウェルをRT-PCRのために処理し、続いて配列決定した。配列決定リードをマウスゲノム及びヒトゲノムに整列させて、個々のウェルを、マウスのみ、ヒトのみ又は両方に整列したリードを含むと遡及的に識別した。マウス及びヒトの両方に整列したリードを含むウェルを、マルチピレットを含むと判断した。遠心分離前サンプル（図10）及び遠心分離後サンプル（図11）に関する配列決定リードアライメントデータを与える。遠心分離前の場合のマルチピレット率は5.8 ％である一方、遠心分離後のマルチピレット率はより低く、3.5 ％であった。これらのデータは、場合によっては、識別された単細胞候候補ウェルでのマルチピレットの発生を減少させるために遠心分離が使用され得ることを実証している。
【０１４７】
添付の特許請求の範囲に関わらず、本開示は下記の付記により更に定義される。
【０１４８】
付記１．マルチウェルチップの細胞含有ウェルを処理する方法であって、
a)  ある量の細胞懸濁液を前記マルチウェルチップのウェルに分注し、
b)  前記マルチウェルチップを撮像して複数のＺ面で前記ウェルの複数の画像を得て、
c)  得た複数の画像に基づき、前記マルチウェルチップの空のウェル及び細胞含有ウェルを識別する、前記マルチウェルチップのマップを生成し、
d)  前記マルチウェルチップの識別された細胞含有ウェルのみを処理することを特徴とする方法。
【０１４９】
付記２．前記マップを生成する際に、得た複数の画像を組み合わせて、拡張焦点深度を有する合成画像を生成することを特徴とする付記１に記載の方法。
【０１５０】
付記３．前記複数の画像は少なくとも３つのＺ面を有することを特徴とする付記１又は２に記載の方法。
【０１５１】
付記４．前記複数の画像は３〜７のＺ面を有することを特徴とする付記３に記載の方法。
【０１５２】
付記５．前記マルチウェルチップのウェルの一部をパイロット撮像して、撮像で使用された複数のＺ面を推定することを特徴とする付記１〜４のいずれかに記載の方法。
【０１５３】
付記６．パイロット撮像する際に、Zmax面及びZmin面を決定することを特徴とする付記５に記載の方法。
【０１５４】
付記７．前記複数のＺ面はZmax面及びZmin面を有することを特徴とする付記６に記載の方法。
【０１５５】
付記８．前記複数のＺ面は、前記Zmax面と前記Zmin面との間に１〜６のＺ面を有することを特徴とする付記６又は７に記載の方法。
【０１５６】
付記９．撮像する際に、複数のウェルを同時的に撮像することを特徴とする付記１〜８のいずれかに記載の方法。
【０１５７】
付記１０．前記マルチウェルチップのマップは、前記細胞含有ウェルが単細胞を含んでいるか又はマルチピレットを含んでいるかを更に識別することを特徴とする付記１〜９のいずれかに記載の付記。
【０１５８】
付記１１．単細胞を含んでいると識別された細胞含有ウェルのみを処理することを特徴とする付記１０に記載の方法。
【０１５９】
付記１２．前記マルチウェルチップのマップは各マルチピレットに存在する細胞の数を更に識別することを特徴とする付記１０又は１１に記載の方法。
【０１６０】
付記１３．２つの細胞を含むと識別されたマルチピレット含有ウェルを処理することを特徴とする付記１２に記載の方法。
【０１６１】
付記１４．分注後であって、撮像前に前記マルチウェルチップを遠心分離することを特徴とする付記１〜１３のいずれかに記載の方法。
【０１６２】
付記１５．分注後であって、撮像前に前記マルチウェルチップを遠心分離しないことを特徴とする付記１〜１３のいずれかに記載の方法。
【０１６３】
付記１６．細胞懸濁液の量は、30nl〜100 nlであることを特徴とする付記１〜１５のいずれかに記載の方法。
【０１６４】
付記１７．細胞懸濁液の量は、30nl〜50nlであることを特徴とする付記１６に記載の方法。
【０１６５】
付記１８．前記マルチウェルチップに存在するウェルの数は100 以上であることを特徴とする付記１〜１７のいずれかに記載の方法。
【０１６６】
付記１９．前記マルチウェルチップのウェルの最大体積は250 nl以下であることを特徴とする付記１〜１８のいずれかに記載の方法。
【０１６７】
付記２０．分注後、前記マルチウェルチップのウェルの少なくとも１％が空であることを特徴とする付記１〜１９のいずれかに記載の方法。
【０１６８】
付記２１．分注後、前記マルチウェルチップのウェルの少なくとも１％が、少なくとも１つの細胞を含んでいることを特徴とする付記１〜２０のいずれかに記載の方法。
【０１６９】
付記２２．処理する際に、識別された細胞含有ウェルに少なくとも１つの試薬を分注することを特徴とする付記１〜２１のいずれかに記載の方法。
【０１７０】
付記２３．処理する際に、識別された細胞含有ウェルの少なくとも一部で核酸増幅反応を行うことを特徴とする付記１〜２２のいずれかに記載の方法。
【０１７１】
付記２４．処理する際に、識別された細胞含有ウェルの少なくとも一部で増幅された核酸の配列決定を行うことを特徴とする付記２３に記載の方法。
【０１７２】
付記２５．画像取得要素と一体化された液体分注要素を備えた分注・撮像システム組立体によって分注及び撮像を行うことを特徴とする付記１〜２４のいずれかに記載の方法。
【０１７３】
付記２６．a)  液体分注要素及び画像取得要素を有する分注・撮像システム組立体と、
b)  前記分注・撮像システム組立体と通信するプロセッサと、前記プロセッサによって実行されると、前記分注・撮像システム組立体に、
i)  ある量の細胞懸濁液をマルチウェルチップのウェルに分注するステップ、
ii) 前記マルチウェルチップを撮像して複数のＺ面で前記ウェルの複数の画像を得るステップ、及び
iii)  得た複数の画像に基づき、前記マルチウェルチップの空のウェル及び細胞含有ウェルを識別する、前記マルチウェルチップのマップを生成するステップ
を実行させる指示を記憶するコンピュータメモリと
を備えていることを特徴とするシステム。
【０１７４】
付記２７．前記コンピュータメモリは、得た複数の画像を組み合わせて、拡張焦点深度を有する合成画像を生成することにより、前記マップを生成するための指示を更に有することを特徴とする付記２６に記載のシステム。
【０１７５】
付記２８．前記コンピュータメモリは、前記マルチウェルチップのウェルの一部をパイロット撮像して、撮像で使用された複数のＺ面を推定するための指示を更に有することを特徴とする付記２６又は２７に記載のシステム。
【０１７６】
付記２９．前記マルチウェルチップのマップは、前記細胞含有ウェルが単細胞を含んでいるか又はマルチピレットを含んでいるかを更に識別することを特徴とする付記２６〜２８のいずれかに記載のシステム。
【０１７７】
付記３０．前記マルチウェルチップのマップは各マルチピレットに存在する細胞の数を更に識別することを特徴とする付記２９に記載のシステム。
【０１７８】
付記３１．前記コンピュータメモリは、生成されたマップを前記コンピュータメモリに記憶するための指示を更に有することを特徴とする付記２６〜３０のいずれかに記載のシステム。
【０１７９】
付記３２．前記プロセッサ及び前記コンピュータメモリと通信するユーザインタフェースを更に備えていることを特徴とする付記２６〜３１のいずれかに記載のシステム。
【０１８０】
付記３３．前記コンピュータメモリは、生成されたマップをユーザインタフェースを介してユーザに与えるための指示を更に有することを特徴とする付記３２に記載のシステム。
【０１８１】
付記３４．前記ユーザインタフェースは、ユーザが前記システムに指示して、識別された細胞含有ウェル又はその一部を処理させ得ることを特徴とする付記３２又は３３に記載のシステム。
【０１８２】
付記３５．前記コンピュータメモリは、前記プロセッサによって実行されると、前記システムに前記マルチウェルチップの識別された細胞含有ウェルのみを更に処理させる指示を更に有することを特徴とする付記２６〜３４のいずれかに記載のシステム。
【０１８３】
付記３６．前記マルチウェルチップの識別された細胞含有ウェルのみを更に処理させる指示は、前記液体分注要素を使用して、識別された細胞含有ウェルのみに少なくとも１つの試薬を分注させる指示を含むことを特徴とする付記３５に記載のシステム。
【０１８４】
付記３７．マルチウェルチップのウェルを撮像する方法であって、
a)  i)  第１の量の水溶液を含む複数のウェルを有する第１のマルチウェルデバイスであって、前記複数のウェルの少なくとも１％が１つの細胞のみ又は２つの細胞を含んでいる前記第１のマルチウェルデバイスと、
ii)  異なるＺ面で焦点を合わせて画像を生成することができる画像取得システムと、
iii)  任意には、前記第１の量の水溶液を含む複数のウェルを有する第２のマルチウェルデバイスであって、前記複数のウェルの少なくとも１％が１つの細胞のみ又は２つの細胞のみを含んでいる前記第２のマルチウェルデバイスと
を準備し、
b)  第１組の撮像パラメータを有するように構成された前記画像取得システムを使用して、前記複数のウェルの第１の部分の前記マルチウェルデバイスの上側の異なるＺ面から複数の画像を取り込み、
c)  前記異なるＺ面からZmax面及びZmin面を決定し、前記Zmax面は、少なくとも１つの焦点が合っている細胞を含む前記マルチウェルデバイスから最も遠い面であり、前記Zmin面は、少なくとも１つの焦点が合っている細胞を含む前記マルチウェルデバイスに最も近い面であり、
d)  前記複数のウェルの前記第１の部分に存在する細胞の全ての焦点画像を与える合成画像を生成するために画像の撮像に必要な前記異なるＺ面の最小数を決定し、前記最小数の前記異なるＺ面は、少なくとも前記Zmax面及び前記Zmin面を含み、
e)  i)  前記画像取得システムを使用して、前記最小数の異なるＺ面のみを用いて前記マルチウェルデバイスの前記複数のウェルの第２の部分を撮像する、及び／又は、
ii)  前記第１組の撮像パラメータを有するように構成された画像取得システムを使用して前記第２のマルチウェルデバイスの少なくとも一部を、前記最小数の異なるＺ面のみを用いて撮像する
の少なくとも１つを行うことを特徴とする方法。
【０１８５】
付記３８．ステップe)で、前記最小数の異なるＺ面で撮られた画像から合成画像を生成することを特徴とする付記３７に記載の方法。
【０１８６】
付記３９．ステップe)の後、前記第１のマルチウェルデバイスの前記第２の部分の前記ウェルの各々に存在する細胞の数を決定する、及び／又は前記第２のマルチウェルデバイスの前記一部の前記ウェルの各々に存在する細胞の数を決定することを特徴とする付記３７又は３８に記載の方法。
【０１８７】
付記４０．前記最小数の異なるＺ面は、前記Zmax面と前記Zmin面との間に１つ、２つ、３つ又は４つのＺ面を更に含むことを特徴とする付記３７〜３９のいずれかに記載の方法。
【０１８８】
付記４１．前記最小数の異なるＺ面は、前記Zmax面及び前記Zmin面のみを含むことを特徴とする付記３７〜３９のいずれかに記載の方法。
【０１８９】
付記４２．前記最小数の異なるＺ面は、前記Zmax面、前記Zmin面、及び前記Zmax面と前記Zmin面との間に他の１つの面のみを含むことを特徴とする付記３７〜３９のいずれかに記載の方法。
【０１９０】
付記４３．前記撮像パラメータは第１の倍率を含むことを特徴とする付記３７〜４２のいずれかに記載の方法。
【０１９１】
付記４４．前記撮像パラメータは第１の開口数を含むことを特徴とする付記３７〜４３のいずれかに記載の方法。
【０１９２】
付記４５．前記画像取得システムは光源を更に備えていることを特徴とする付記３７〜４４のいずれかに記載の方法。
【０１９３】
付記４６．前記細胞を一又は複数の蛍光染色液で染色することを特徴とする付記３７〜４５のいずれかに記載の方法。
【０１９４】
付記４７．前記蛍光染色液を、ヘキスト染色液及びヨウ化プロピジウムから選択することを特徴とする付記４６に記載の方法。
【０１９５】
付記４８．前記画像取得システムは、前記水溶液を前記複数のウェルに追加するように構成された液体分注要素を更に備えていることを特徴とする付記３７〜４７のいずれかに記載の方法。
【０１９６】
付記４９．前記液体分注要素は、分注量の前記水溶液を前記複数のウェルの各々に分注するように構成されており、前記水溶液は、平均してＸ細胞が前記分注量の水溶液に存在するような濃度で前記水溶液に存在する細胞を含んでいることを特徴とする付記４８に記載の方法。
【０１９７】
付記５０．Ｘは0.02又は１であることを特徴とする付記４９に記載の方法。
【０１９８】
付記５１．前記第１のマルチウェルデバイス及び／又は前記第２のマルチウェルデバイスの前記複数のウェルは少なくとも100 ウェルであることを特徴とする付記３７〜５０のいずれかに記載の方法。
【０１９９】
付記５２．前記第２のマルチウェルデバイスが設けられていないことを特徴とする付記３７〜５１のいずれかに記載の方法。
【０２００】
付記５３．どのウェルが単細胞のみを含み、どのウェルが細胞を含まないか又は２以上の細胞を含むかを示す分注マップを生成することを特徴とする付記３７〜５２のいずれかに記載の方法。
【０２０１】
付記５４．水溶液の第１の量は25nl〜２μｌの間であることを特徴とする付記３７〜５３に記載の方法。
【０２０２】
付記５５．前記ウェルの各々の体積は、25nl〜２μｌの間であることを特徴とする付記３７〜５４のいずれかに記載の方法。
【０２０３】
付記５６．前記ウェルの各々の体積は、50nl〜500 nlの間であることを特徴とする付記５５に記載の方法。
【０２０４】
付記５７．多目的のシステムであって、
a)  複数のウェルを有するマルチウェルデバイスを定位置に固定するように構成されたマルチウェルデバイス固定要素と、
b)  i)  マルチウェルデバイスのウェルに液体を分注するように構成された液体分注要素、及び
ii)  前記マルチウェルデバイスの上側の異なるＺ面で焦点を合わせて画像を生成することができる画像取得要素であって、前記液体分注要素に取り付けられるか、又は前記液体分注要素に隣り合う前記画像取得要素
を有する分注・撮像システム組立体と、
c)  前記マルチウェルデバイスが前記定位置にあるとき、前記マルチウェルデバイスの前記複数のウェルの大部分又は全てが、
i)  前記液体分注要素から液体を受けることができ、
ii)  前記画像取得要素によって撮像されることができる
ように、前記分注・撮像組立体を前記マルチウェルデバイスに対して移動させるように構成された移動要素と
を備えていることを特徴とするシステム。
【０２０５】
付記５８．前記液体分注要素は、分注量の液体を前記複数のウェルの各々に分注するように構成されており、前記液体は、平均してＸ細胞が前記分注量の液体に存在するような濃度で前記液体に存在する細胞を含んでいることを特徴とする付記５７に記載の方法。
【０２０６】
付記５９．Ｘは0.02〜１の間であることを特徴とする付記５８に記載のシステム。
【０２０７】
付記６０．前記マルチウェルデバイスを更に備えており、前記第１のマルチウェルデバイスの前記複数のウェルは少なくとも100 のウェルであることを特徴とする付記５７〜５９のいずれかに記載のシステム。
【０２０８】
付記６１．前記画像取得要素は光源を更に有していることを特徴とする付記５７〜６０のいずれかに記載のシステム。
【０２０９】
付記６２．前記複数のウェルの各々の体積は、25nl〜２μｌの間であることを特徴とする付記５７〜６１のいずれかに記載のシステム。
【０２１０】
付記６３．前記複数のウェルの各々の体積は、50nl〜500 nlの間であることを特徴とする付記６２に記載のシステム。
【０２１１】
付記６４．前記移動要素は、前記分注・撮像組立体をＸ方向に移動させるための第１のレール、及び前記分注・撮像組立体をＹ方向に移動させるための第２のレールを有することを特徴とする付記５７〜６３のいずれかに記載のシステム。
【０２１２】
付記６５．コンピュータメモリ及びコンピュータプロセッサを更に備えており、前記コンピュータメモリの指示は、i)  前記移動要素の移動、ii) 前記分注要素の液体分注、及びiii)  前記画像取得要素の画像取込みを制御することを特徴とする付記５７〜６４のいずれかに記載のシステム。
【０２１３】
付記６６．前記複数のウェルは少なくとも1000のウェルであることを特徴とする付記５７〜６５のいずれかに記載のシステム。
【０２１４】
付記６７．a)  i)  複数のウェルを有するマルチウェルデバイスと、
ii) 複数のウェルを有するマルチウェルデバイスを定位置に固定するように構成されたマルチウェルデバイス固定要素と、
iii)  A)  I)  マルチウェルデバイスのウェルに液体を分注するように構成された液体分注要素、及びII) 前記マルチウェルデバイスの上側の異なるＺ面で焦点を合わせて画像を生成することができる画像取得要素であって、前記液体分注要素に取り付けられるか、又は前記液体分注要素に隣り合う前記画像取得要素を有する分注・撮像組立体と、
B)  前記マルチウェルデバイスに対して前記分注・撮像組立体を移動させるように構成された移動要素と
を有する多目的のシステムと
を準備し、
b)  前記マルチウェルデバイスが前記定位置に配置されるように前記マルチウェルデバイスを前記固定要素に置き、
c)  前記マルチウェルデバイスの前記複数のウェルの大部分又は全てが、
i)  前記複数のウェルの少なくとも１％が１つの細胞のみ又は２つの細胞を含むように前記液体分注要素から細胞含有液体を受け、
ii) 前記マルチウェルデバイスの上側の複数のＺ面で前記画像取得要素によって撮像されることにより、異なるＺ面から複数の画像を生成する
ように、前記分注・撮像組立体を作動することを特徴とする方法。
【０２１５】
付記６８．d)  前記異なるＺ面からZmax面及びZmin面を決定し、前記Zmax面は、少なくとも１つの焦点が合っている細胞を含む前記マルチウェルデバイスから最も遠い面であり、前記Zmin面は、少なくとも１つの焦点が合っている細胞を含む前記マルチウェルデバイスに最も近い面であることを特徴とする付記６７に記載の方法。
【０２１６】
付記６９．e)  前記複数のウェルに存在する細胞の全ての焦点画像を与える合成画像を生成するために画像の撮像に必要な前記異なるＺ面の最小数を決定し、前記最小数の前記異なるＺ面は、少なくとも前記Zmax面及び前記Zmin面を含むことを特徴とする付記６８に記載の方法。
【０２１７】
本出願で述べられている全ての刊行物及び特許は、参照によって本明細書に組み込まれている。本開示の記載された方法及び構成の様々な調整及び変形例は、本開示の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者にとって明らかである。本開示は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、請求されている本開示は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、適切な分野の当業者にとって明らかな本開示を実施するための記載されたモードの様々な調整は、以下の請求項の範囲内にあることが意図されている。
【０２１８】
本出願は、米国特許法第119 条(e) に従って、2016年７月21日に出願された米国仮特許出願第62／365,173 号明細書の出願日の優先権を主張しており、その開示内容が参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019527551.tif 000008
【図２】
2019527551.tif 000009
【図３Ａ】
2019527551.tif 000010
【図３Ｂ】
2019527551.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
2019527551.tif 000014
【図７】
2019527551.tif 000015
【図８】
2019527551.tif 000016
【図９】
2019527551.tif 000017
【図１０】
2019527551.tif 000018
【図１１】
2019527551.tif 000019
【国際調査報告】
2019527551.tif 000020
2019527551.tif 000021