(57)【要約】  本出願は、水溶液から、陰イオン洗浄剤などの洗浄剤を除去するための、塩；式Ｉ：  Ｒ１−ＯＨ      （式Ｉ）（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；および水不混和性ハロカーボン、を含むシステム、組成物、方法およびキットを提供し、前記ハロカーボンは前記式Ｉのアルコールと混和性である。本システムは、洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など）、およびその水溶液中に存在し得る何らかの洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子を含む水溶液に使用して、洗浄剤および何らかの洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子の効率的な除去のために、水相および非水相を形成し、それらを非水相に隔離できる。したがって、本組成物、システム、方法およびキットは、理想的に使用され、水溶液から阻害物質、すなわち、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。その後、水相は、これらの下流の用途に直接使用し得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液から洗浄剤を除去するための洗浄剤除去システムであって、
ａ．塩；
ｂ．式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；および
ｃ．水不混和性のハロカーボン
を含み、前記ハロカーボンが、前記式Ｉのアルコールと混和性である、システム。
【請求項２】
前記洗浄剤が陰イオン洗浄剤である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を前記水溶液からさらに除去する、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
前記洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子がタンパク質である、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記洗浄剤および／または前記洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子が酵素阻害物質である、請求項３または４に記載のシステム。
【請求項６】
前記塩が、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
前記塩が、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、１−ブチルアミンの酸性塩、１−ペンチルアミンの酸性塩、１−ヘキシルアミンの酸性塩、１−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−ブタノール、１−ヘプタノール、１，２−ヘキサンジオール、１−ヘキサノール、２−ノナノール、１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、シクロペンタノール、１−プロパノール、１−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９】
前記塩が塩化アンモニウムである、請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
前記ハロカーボンが、１−ブロモ−３−クロロプロパン、１−ブロモ−６−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）、クロロジブロモメタン、クロロホルム、２−ヨードプロパン、ポリ（クロロトリフルオロエチレン）、またはこれらの組み合わせである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、１−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ノナノールまたは１−ウンデカノールである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記水不混和性アルコールが、１−ペンタノールまたはシクロペンタノールである、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記ハロカーボンが、ＢＤＣＭまたはポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記洗浄剤が、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）またはサルコシルである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記洗浄剤がＳＤＳである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記水溶液が生物試料である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記生物試料が、試料貯蔵、溶解または抽出組成物を含む変性生物試料である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記生物試料が、唾液、喀痰、頬側スワブ、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブまたは擦過物、口腔洗浄試料、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、精液／精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支、気管または肺洗浄液または吸引液、細胞培養液、細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、産業廃水、などを含む、請求項１６または１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記微生物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および／または原生生物を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
塩化アンモニウム、１−ペンタノールおよびブロモジクロロメタンまたはポリクロロトリフルオロエチレンを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
前記塩、前記水不混和性アルコールおよび前記水不混和性のハロカーボンが、別々の容器で提供される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２２】
前記塩、前記水不混和性アルコールおよび前記水不混和性のハロカーボンが、単一の容器で提供される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記水不混和性アルコールおよび前記水不混和性のハロカーボンが、第一の容器で単一の組成物として提供され、前記塩が、別々の第二の容器で提供される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２４】
試料収集容器を追加で含み、前記試料収集容器が必要に応じ、洗浄剤含有溶液を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記水性混合物の処理時に、水相および非水相を含む２相混合物が形成され、前記非水相が、ほぼ全ての洗浄剤および存在する何らかの洗浄剤関連タンパク質または洗浄剤結合タンパク質を含み、前記水相が下流の用途での直接使用に好適する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２６】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記酵素阻害物質が、下流の用途の阻害物質である、請求項５に記載のシステム。
【請求項２９】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３１】
還元剤をさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３２】
前記還元剤が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトヘキサノール、メルカプトウンデカノール、ジメルカプトプロパノールまたはメルカプトブタノールである、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
キレート化剤および／または緩衝液をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３４】
前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
親油性染色剤をさらに含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３６】
前記親油性染色剤が、ナイルレッド、９−アントリルジアゾメタン、Ｆｌｕｏｒｏｌ  Ｙｅｌｌｏｗ０８８、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−４−（６−フェニル−１，３，５−ヘキサトリエン−１−イル）フェニルアンモニウム  ｐ−トルエンスルホネート（ＴＭＡ−ＤＰＨ）、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルコロレート、１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン、Ｓｕｄａｎ  ＩＩＩ、Ｓｕｄａｎ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ、Ｎｉｌｅ  ＢｌｕｅクロリドまたはＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂｌｕｅ  ３７である、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記洗浄剤を含む水溶液から洗浄剤を除去する方法であって、前記水溶液を、
ａ．塩；
ｂ．式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；および
ｃ．水不混和性のハロカーボンであって、前記式Ｉのアルコールと混和性であるハロカーボン、
と混合して、２相混合物を形成するステップを含み、ほぼ全ての前記洗浄剤が非水相中に存在する、方法。
【請求項３８】
前記洗浄剤が、陰イオン洗浄剤である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を前記水溶液からさらに除去する、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子がタンパク質である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記洗浄剤および／または洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子が、酵素阻害物質である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アルコールおよび前記ハロカーボンが、前記水溶液と混合される前に、混ぜ合わされる、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記水相を前記２相混合物から分離するステップをさらに含む、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記混合物を遠心処理して前記２相の分離を容易にするステップをさらに含む、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記２相混合物の水相中の塩の濃度が、約３０ｍＭ〜約０．５Ｍである、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ハロカーボンが、前記有機相の密度を前記水相の密度より高めるのに十分な濃度で存在する、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記アルコール中のハロカーボンの濃度が、最大約８０％（ｖ／ｖ）、例えば、約５０％（ｖ／ｖ）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記塩＋前記アルコール＋前記ハロカーボンの合計体積の、前記洗浄剤を含む水溶液の体積に対する比率が、約１：９〜約２：１である、請求項３７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記塩＋前記アルコール＋前記ハロカーボンの合計体積の、前記洗浄剤を含む水溶液の体積に対する比率が、約１：５である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記洗浄剤、および何らかの洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を含む水溶液が、生物試料である、請求項３７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記生物試料が、試料貯蔵、溶解または抽出組成物を含む変性生物試料である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記生物試料が、唾液、喀痰、頬側スワブ、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブ、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、精液／精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液、細胞培養液、細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、産業廃水、などを含む、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記微生物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および／または原生生物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記塩が、アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項３７〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記塩が、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、１−ブチルアミンの酸性塩、１−ペンチルアミンの酸性塩、１−ヘキシルアミンの酸性塩、１−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−ブタノール、１−ヘプタノール、１，２−ヘキサンジオール、１−ヘキサノール、２−ノナノール、１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、シクロペンタノール、１−プロパノール、１−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせである、請求項３７〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ハロカーボンが、１−ブロモ−３−クロロプロパン、１−ブロモ−６−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）、クロロジブロモメタン、クロロホルム、２−ヨードプロパン、ポリクロロトリフルオロエチレン、またはこれらの組み合わせである、請求項３７〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記塩が塩化アンモニウムである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、１−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ノナノールまたは１−ウンデカノールである、請求項３７〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記水不混和性アルコールが、１−ペンタノールまたはシクロペンタノールである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ハロカーボンが、ＢＤＣＭまたはポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項３７〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記洗浄剤が、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）またはサルコシルである、請求項３７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記洗浄剤がＳＤＳである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記塩が塩化アンモニウムであり、前記アルコールが１−ペンタノールであり、前記ハロカーボンがブロモジクロロメタンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項６５】
前記塩が塩化アンモニウムであり、前記アルコールが１−ペンタノールであり、前記ハロカーボンがポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項６６】
前記２相混合物由来の水相の一部を、下流の用途のために直接使用するステップをさらに含む、請求項３７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記酵素阻害物質が、下流の用途の阻害物質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項７０】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
２相組成物であって、
ａ．塩；
ｂ．式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；および
ｃ．水不混和性のハロカーボンであって、式Ｉのアルコールと混和性であるハロカーボン；を、
ｄ．洗浄剤を含む水溶液；と混合して、
水相および非水相を含む２相混合物が形成され、それにより、ほぼ全ての前記洗浄剤が非水相中に存在する、２相組成物。
【請求項７３】
前記洗浄剤が陰イオン洗浄剤である、請求項７２に記載の２相組成物。
【請求項７４】
前記水溶液が、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子をさらに含み、前記２相混合物中で、前記洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子が非水相中に存在する、請求項７２または７３に記載の２相組成物。
【請求項７５】
前記洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子がタンパク質である、請求項７４に記載の２相組成物。
【請求項７６】
前記洗浄剤および／または洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子が、酵素阻害物質である、請求項７４または７５に記載の２相組成物。
【請求項７７】
前記塩が、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項７８】
前記塩が、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、１−ブチルアミンの酸性塩、１−ペンチルアミンの酸性塩、１−ヘキシルアミンの酸性塩、１−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項７７に記載の２相組成物。
【請求項７９】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−ブタノール、１−ヘプタノール、１，２−ヘキサンジオール、１−ヘキサノール、２−ノナノール、１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、シクロペンタノール、１−プロパノール、１−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせである、請求項７２〜７８のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項８０】
前記ハロカーボンが、１−ブロモ−３−クロロプロパン、１−ブロモ−６−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）、クロロジブロモメタン、クロロホルム、２−ヨードプロパン、ポリクロロトリフルオロエチレン、またはこれらの組み合わせである、請求項７２〜７９いずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項８１】
前記塩が塩化アンモニウムである、請求項７８に記載の２相組成物。
【請求項８２】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、１−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ノナノールまたは１−ウンデカノールである、請求項７２〜８１のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項８３】
前記水不混和性アルコールが、１−ペンタノールまたはシクロペンタノールである、請求項８２に記載の２相組成物。
【請求項８４】
前記ハロカーボンが、ＢＤＣＭまたはポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項７２〜８３のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項８５】
前記洗浄剤が、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）またはサルコシルである、請求項７２〜８４のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項８６】
前記洗浄剤がＳＤＳである、請求項８５に記載の２相組成物。
【請求項８７】
前記洗浄剤および／または洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を含む水溶液が、生物試料である、請求項７２〜８６のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項８８】
前記生物試料が、試料貯蔵、溶解または抽出組成物を含む変性生物試料である、請求項８７に記載の２相組成物。
【請求項８９】
前記生物試料が、唾液、喀痰、頬側スワブ、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブ、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、精液／精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液、細胞培養液、細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、産業廃水、などを含む、請求項８７または８８に記載の２相組成物。
【請求項９０】
前記微生物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および／または原生生物を含む、請求項８９に記載の２相組成物。
【請求項９１】
塩化アンモニウム、１−ペンタノールおよびブロモジクロロメタンを含む、請求項７２に記載の２相組成物。
【請求項９２】
塩化アンモニウム、１−ペンタノールおよびポリクロロトリフルオロエチレンを含む、請求項７２に記載の２相組成物。
【請求項９３】
前記水相が、下流の用途での直接使用に好適する、請求項７２〜９２のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項９４】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項９３に記載の２相組成物。
【請求項９５】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項９４に記載の２相組成物。
【請求項９６】
前記酵素阻害物質が、下流の用途の阻害物質である、請求項７６に記載の２相組成物。
【請求項９７】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項９６に記載の２相組成物。
【請求項９８】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項９７に記載の２相組成物。
【請求項９９】
還元剤をさらに含む、請求項７２〜９８のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項１００】
前記還元剤が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトヘキサノール、メルカプトウンデカノール、ジメルカプトプロパノールまたはメルカプトブタノールである、請求項９９に記載の２相組成物。
【請求項１０１】
キレート化剤および／または緩衝液をさらに含む、請求項７２〜１００のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項１０２】
前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１０１に記載の２相組成物。
【請求項１０３】
親油性染色剤をさらに含む、請求項７２〜１０２のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項１０４】
前記親油性染色剤が、ナイルレッド、９−アントリルジアゾメタン、Ｆｌｕｏｒｏｌ  Ｙｅｌｌｏｗ０８８、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−４−（６−フェニル−１，３，５−ヘキサトリエン−１−イル）フェニルアンモニウム  ｐ−トルエンスルホネート（ＴＭＡ−ＤＰＨ）、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルコロレート、１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン、Ｓｕｄａｎ  ＩＩＩ、Ｓｕｄａｎ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ、Ｎｉｌｅ  ＢｌｕｅクロリドまたはＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂｌｕｅ  ３７である、請求項１０３に記載の２相組成物。
【請求項１０５】
前記洗浄剤を含む水溶液から洗浄剤を除去するためのキットであって、
ａ．塩；
ｂ．式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；
ｃ．水不混和性のハロカーボンであって、前記式Ｉのアルコールと混和性であるハロカーボン、
ｄ．少なくとも１種の試薬容器；および場合により、
ｅ．使用説明書、
を含むキット。
【請求項１０６】
前記洗浄剤が、陰イオン洗浄剤である、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
さらに、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を前記水溶液から除去するためである、請求項１０５または１０６に記載のキット。
【請求項１０８】
前記洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子がタンパク質である、請求項１０７に記載のキット。
【請求項１０９】
前記洗浄剤および／または洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子が酵素阻害物質である、請求項１０７または１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
前記塩が、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項１０５〜１０９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１１】
前記塩が、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、１−ブチルアミンの酸性塩、１−ペンチルアミンの酸性塩、１−ヘキシルアミンの酸性塩、１−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項１１０に記載のキット。
【請求項１１２】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−ブタノール、１−ヘプタノール、１，２−ヘキサンジオール、１−ヘキサノール、２−ノナノール、１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、シクロペンタノール、１−プロパノール、１−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせである、請求項１０５〜１１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１３】
前記ハロカーボンが、１−ブロモ−３−クロロプロパン、１−ブロモ−６−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）、クロロジブロモメタン、クロロホルム、２−ヨードプロパン、ポリクロロトリフルオロエチレン、またはこれらの組み合わせである、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１４】
前記塩が塩化アンモニウムである、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１５】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、１−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ノナノールまたは１−ウンデカノールである、請求項１０５〜１１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１６】
前記水不混和性アルコールが、１−ペンタノールまたはシクロペンタノールである、請求項１１５に記載のキット。
【請求項１１７】
前記ハロカーボンが、ＢＤＣＭまたはポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項１０５〜１１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１８】
前記洗浄剤が、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）またはサルコシルである、請求項１０５〜１１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１９】
前記洗浄剤が、ＳＤＳである、請求項１１８に記載のキット。
【請求項１２０】
前記洗浄剤および／または洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子を含む水溶液が生物試料である、請求項１０５〜１１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２１】
前記生物試料が、試料貯蔵、溶解または抽出組成物を含む変性生物試料である、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２２】
前記生物試料が、唾液、喀痰、頬側スワブ、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブ、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、精液／精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液、細胞培養液、細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、産業廃水、などを含む、請求項１２０または１２１に記載のキット。
【請求項１２３】
前記微生物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および／または原生生物を含む、請求項１２２に記載のキット。
【請求項１２４】
塩化アンモニウム、１−ペンタノールおよびブロモジクロロメタンを含む、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１２５】
塩化アンモニウム、１−ペンタノールおよびポリクロロトリフルオロエチレンを含む、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１２６】
試料収集容器をさらに含む、請求項１０５〜１２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２７】
下流の用途で直接使用するための、請求項１０５〜１２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２８】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項１２７に記載のキット。
【請求項１２９】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項１２８に記載のキット。
【請求項１３０】
前記酵素阻害物質が、下流の用途の阻害物質である、請求項１０９に記載のキット。
【請求項１３１】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項１３０に記載のキット。
【請求項１３２】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項１３１に記載のキット。
【請求項１３３】
還元剤をさらに含む、請求項１０５〜１３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３４】
前記還元剤が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトヘキサノール、メルカプトウンデカノール、ジメルカプトプロパノールまたはメルカプトブタノールである、請求項１３３に記載のキット。
【請求項１３５】
キレート化剤および／または緩衝液をさらに含む、請求項１０５〜１３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３６】
前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１３５に記載のキット。
【請求項１３７】
親油性染色剤をさらに含む、請求項１０５〜１３６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３８】
前記親油性染色剤が、ナイルレッド、９−アントリルジアゾメタン、Ｆｌｕｏｒｏｌ  Ｙｅｌｌｏｗ０８８、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−４−（６−フェニル−１，３，５−ヘキサトリエン−１−イル）フェニルアンモニウム  ｐ−トルエンスルホネート（ＴＭＡ−ＤＰＨ）、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルコロレート、１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン、Ｓｕｄａｎ  ＩＩＩ、Ｓｕｄａｎ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ、Ｎｉｌｅ  ＢｌｕｅクロリドまたはＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂｌｕｅ  ３７である、請求項１３７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月３１日に出願された米国特許出願第６２／３４３，２９３号に対する優先権を主張する。本出願の全文は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本出願は、水溶液から洗浄剤を除去するための組成物、システム、方法およびキットに関する。本出願の組成物、システム、方法およびキットはまた、水溶液から洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を除去するためにも使用し得る。
【背景技術】
【０００３】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、多くの洗浄製品および個人向け衛生用製品に使用される陰イオン洗浄剤である。ＳＤＳは、タンパク質の研究のための、核酸精製手順、ならびに核酸安定化組成物において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）などの分子生物学用途にもよく使われる。
【０００４】
生物試料を用い、そこから核酸を取り出そうとする場合、その両親媒性特性により細胞膜および粒子膜を溶解する能力は、リシスバッファー中で引き出される。さらに、ＳＤＳは、タンパク質に強く結合し、抽出手順中にタンパク質−核酸相互作用を破壊するために使用される。例えば、ＳＤＳは、正に帯電したヒストンと、核酸骨格中の負に帯電した燐酸塩との間のイオン相互作用を破壊するため、核酸をタンパク質から分離するのに役立つ。多くの一般的検査室のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を精製するプロトコル、例えば、従来のＤＮＡのエタノール沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ））、塩化リチウム沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ））またはプラスミドＤＮＡを得るためのＳＤＳ−アルカリ変性法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．（１９８３）Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，２４３−５５）は、ＳＤＳを利用する。
【０００５】
タンパク質に強く結合し、それらの構造を破壊するタンパク質を変性させるＳＤＳの能力は、ヌクレアーゼを含むほとんどの酵素の不活化をもたらす。Ｂｉｒｎｂｏｉｍらにより米国特許第７，４８２，１１６号、米国特許出願公開第２０１０／０９９１４９号および同第２００９／１２３９７６号中で教示されているように、この性質は、生物試料中の核酸を安定化させ、保存するために利用される。しかし、この性質は、ＳＤＳが完全に除去されない場合に、核酸を用いたその後の用途で、酵素依存性反応を阻害する望ましくない効果を有する。
【０００６】
ＳＤＳの能力と特性は、生化学および分子生物学の技術を日常的に実施している人にはよく知られている。核酸を抽出し、精製するほとんどの手順は、溶液から核酸を取り出し、後に阻害物質と不純物を残すことにより、実施されている。例えば、水溶液に１〜２倍量のエタノールの添加は、核酸の沈殿を生じ、遠心分離ステップ後に、核酸をペレットから回収できる。あるいは、核酸を、固体マトリックス、例えば、シリカ粒子、に結合させることができ、その後、それから核酸を溶出できる。得られた精製核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、シーケンシングライブラリー調製またはシーケンシングなどの下流の用途に使用できる。
【０００７】
核酸の抽出と精製のための手順を単純化および改善するために、過去５〜６０年にわたる多くの試みがなされてきた。通常、これらの手順で使用される試薬は、精製核酸を利用する下流の用途に対し阻害性である。したがって、処理中に最初の試料に添加される試薬は、完全に除去しなければならない。例えば、低濃度のＳＤＳは、ＰＣＲ反応で使用されるＴａｑＤＮＡポリメラーゼに阻害性である。Ｗｅｙａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９０、Ｒｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２およびＳａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９９により報告されているように、最終ＰＣＲにおける体積当たりの重量が０．０１％程度の少量のＳＤＳで阻害性である。これは、下記で立証されている。試料からＳＤＳを除去するためのいくつかの製品が市場に存在する（例えば、ＳＤＳ  Ａｗａｙ（登録商標）［ＰｒｏｔｅａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ］；Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−Ｏｕｔ（登録商標）［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］；ＳＤＳ−Ｏｕｔ（登録商標）［Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．］は３つの例である）が、これらは、核酸の溶液中に存在するＳＤＳではなく、タンパク質に強く結合したＳＤＳを除去するために最適化され、配合されている。
【０００８】
現時点では、大きく分けて３種類の次に示す市販核酸精製キットが存在する：（ｉ）フェノール系抽出法（例えば、トリゾール（登録商標）［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］およびＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（登録商標）［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｉｎｃ．］）、（ｉｉ）核酸の固体マトリックス（例えば、磁気ビーズおよびカラム上のシリカ表面）へのグアニジニウムをベースにした結合、および（ｉｉｉ）ＳＤＳ系の方法。いくつかのＳＤＳ系化学反応は、グアニジニウム系の化学反応と相いれない。理由は、２つの試薬の混合により、不溶性のグアニジニウム塩としてＳＤＳの沈殿が生ずるためである。フェノール／クロロホルム抽出中のＳＤＳの存在は、ミルク状沈殿物を形成させることが観察された。しかし、ＳＤＳを事前に実質的に除去すれば、ＳＤＳ含有試料は、フェノール／クロロホルム系またはグアニジニウム系化学反応で使用可能であることが観察された。ＳＤＳ濃度を減らす簡単な方法は、試料をＳＤＳがもはや沈殿しないレベルまで希釈することであろうが、これは、後のステップで試料を濃縮する必要性が生じることになる。水性試料からの簡単で迅速なＳＤＳの除去に関しては、生化学および分子生物学技術における必要性が満たされていない。
【０００９】
したがって、陰イオン洗浄剤を含む任意の水溶液に対し使用される場合、わずかに検出可能なレベル（０．０１重量／体積％未満）まで、容易に、迅速におよび効率的に、洗浄剤を効率的に除去できる組成物および方法に対する必要性が残されている。
【００１０】
この背景情報は、出願者が考えている既知の情報を本発明に可能な限り関連づけるために提供されている。前述のいずれかの情報が本発明に対する先行技術となることを承認することを必然的に意図するものではなく、そのように解釈されるべきものでもない。
【発明の概要】
【００１１】
本出願の目的は、水溶液から洗浄剤を除去するための組成物、システム、方法およびキットを提供することである。この組成物、システム、方法およびキットはまた、水溶液から、タンパク質を含む洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子を除去するためにも使用し得る。
【００１２】
一態様では、（ａ）塩；（ｂ）式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；および（ｃ）水不混和性ハロカーボンを含む洗浄剤除去システムが提供され、ハロカーボンはアルコールと混和性である。場合により、塩は、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、システムは、水溶液中に存在する可能性がある洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を除去するためにも使用し得る。
【００１３】
別の態様では、前記洗浄剤を含む水溶液から洗浄剤を除去する方法が提供され、前記方法は、水溶液を、塩；式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性のアルコール；および水不混和性のハロカーボン（ハロカーボンは、アルコールと混和性である）と混合して２相混合物を形成するステップを含み、ほぼ全ての洗浄剤が非水相中に存在する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、方法はまた、水溶液中に存在する可能性がある洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子の除去にも使用し得る。
【００１４】
別の態様では、塩；式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性のアルコール；および水不混和性のハロカーボンを、洗浄剤を含む水溶液と混合することにより形成される２相組成物が提供され、ほぼ全ての洗浄剤が非水相中に存在する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、２相組成物の非水相は、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を含み得る。
【００１５】
別の態様では、前記洗浄剤を含む水溶液から洗浄剤を除去するためのキットが提供され、前記キットは、塩；式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性のアルコール；水不混和性のハロカーボン；少なくとも１種の試薬容器；および場合により、使用説明書（単一または複数）を含み、前記ハロカーボンは前記式Ｉのアルコールと混和性である。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、キットはまた、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を、それらが存在する可能性がある水溶液から除去するために使用し得る。
【００１６】
したがって、本組成物、システム、方法およびキットは、理想的に使用され、水溶液から阻害物質、すなわち、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。阻害物質には、例えば、その後の用途などにおける酵素阻害物質、例えば、酵素依存性反応の阻害物質が挙げられる。
【００１７】
特定の実施形態では、少なくとも一部の水相（すなわち、洗浄剤、および、存在する場合、洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子を実質的に含まない相）は、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途のために直接使用し得る。
【００１８】
本発明、ならびに他の態様およびそのさらなる特徴をより良く理解するために、図面の簡単な説明に対する参照を行うが、これは添付の図面と併せて使用されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、水溶液中の１％ＳＤＳの洗浄剤除去組成物による処理を示す；組成物１は、１−ペンタノールとブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）の１：１混合物および１５０ｍＭの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）を含む；組成物２は、１−ペンタノールとクロロホルムの１：１混合物および１５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含む；組成物３は、１−ペンタノールと２−ヨードプロパンの１：１混合物および１５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含む。
【図２】図２は、水溶液中の４％ＳＤＳの洗浄剤除去組成物による処理を示す；調査した全組成物は、１−ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物および次の塩を含む：組成物４：１７５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ；組成物５：２００ｍＭのＮＨ４Ｃｌ；組成物６：１２５ｍＭのメチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド；組成物７：１５０ｍＭのメチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド；組成物８：１５０ｍＭのトリエチルアミン塩酸塩；組成物９：１７５ｍＭのトリエチルアミン塩酸塩；組成物１０：１７５ｍＭのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムアセテート；組成物１１：２００ｍＭのテトラ−ｎ−プロピルアンモニウムクロリド。
【図３】図３は、水溶液中の１０％ＳＤＳの洗浄剤除去組成物による処理を示す；調査した全組成物は、１−ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物および種々の濃度の次のＮＨ４Ｃｌを含む：組成物１２：２７５ｍＭ；組成物１３：３００ｍＭ；および組成物１４：３２５ｍＭ。得られたデータは、１０％の出発濃度であっても、ＳＤＳを、１／５の体積の組成物を用いて１ステップで＜０．００６２５％まで減らし得ることを示す。
【図４】図４は、２％ＳＤＳを含む水溶液中に収集した唾液試料の洗浄剤除去組成物による処理を示す；使用した組成物は、１−ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物および１２５ｍＭの塩化アンモニウムからなり、結果は、この生物試料の存在下でもＳＤＳの効率的な除去を示した。
【図５】図５は、２．５％ＳＤＳを含む水溶液中に収集した血液試料の洗浄剤除去組成物による処理を示す；使用した組成物は、１−ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物および１７５ｍＭの塩化アンモニウムからなり、結果は、この複雑な生物試料の存在下でもＳＤＳの効率的な除去を示した。
【図６】図６は、既知のＳＤＳ濃度の水溶液：ＳＤＳなしのコントロール、および０．００１％ＳＤＳ、０．００５％ＳＤＳ、０．０１％ＳＤＳ、０．０５％ＳＤＳ、０．１％ＳＤＳおよび１％ＳＤＳの溶液に対して試験、比較したｑＰＣＲの結果を示す。結果は、ｑＰＣＲの部分的な阻害が０．００５％ＳＤＳの存在下で起こり、ＳＤＳが０．０１％で存在する場合に、完全な阻害が起こることを示した。
【図７】図７は、洗浄剤溶液中に収集し、本明細書に記載の洗浄剤除去組成物で処理した唾液試料由来の水層の分割量の電気泳動後に、ＳｙｂｒＧｏｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したアガロースゲルの写真である。１ｋｂ＋ＤＮＡラダーの横に並んだ試料レーンに高分子量ＤＮＡを認めることができ、洗浄剤除去組成物は、ＤＮＡの分解を起こさなかったことを示している。
【図８】図８は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した唾液試料由来の水相の分割量に対し実施したｑＰＣＲの、既知の量のＤＮＡの２つの標準的コントロールの横に並べた、結果を示す。結果は、洗浄剤除去処理後に水相中に残っているＤＮＡは、ｑＰＣＲでの使用に好適することを示す。
【図９】図９は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した血液試料由来の水相の分割量の電気泳動後に、ＳｙｂｒＧｏｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したアガロースゲルの写真である。１ｋｂ＋ＤＮＡラダーの横に並んだ試料レーンに高分子量ＤＮＡを認めることができ、洗浄剤除去組成物は、ＤＮＡの分解を起こさなかったことを示している。
【図１０】図１０は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した血液試料由来の水相の２種の異なる量の分割量に対し実施したｑＰＣＲの、既知の量のＤＮＡを含むコントロール由来の分割量の横に並べた、結果を示す。結果は、洗浄剤除去処理後に水相中に残っているＤＮＡは、ｑＰＣＲでの使用に好適したことを示す。
【図１１】図１１は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した唾液試料由来の水層の分割量の電気泳動後に、ＳｙｂｒＧｏｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したアガロースゲルの写真である。唾液試料中の細菌細胞由来の細菌１６Ｓおよび２３ＳリボソームＲＮＡバンドをゲル上に認めることができ、細菌ＲＮＡが洗浄剤除去処理により分解されなかったことを示す。
【図１２】図１２は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した唾液試料から採取した水相の１μｌの分割量から調製した逆転写酵素生成物のｑＰＣＲの結果を示す。
【図１３】図１３は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した唾液試料から採取した水相の３μｌの分割量から調製した逆転写酵素生成物のｑＰＣＲの結果を示す。
【図１４】図１４は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した血液試料由来の水層の分割量の電気泳動後に、ＳｙｂｒＧｏｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したアガロースゲルの写真である。ヒト１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡバンドを認めることができ、ヒトＲＮＡが分解されなかったことを示す。
【図１５】図１５は、洗浄剤溶液中に収集し、洗浄剤除去組成物で処理した血液試料の水層の１μｌの分割量から調製した逆転写酵素生成物のｑＰＣＲの結果を示す。
【図１６】図１６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クーマシーブルーで染色してタンパク質バンドを示したポリアクリルアミドゲルの写真である。標準的ＥＤＴＡチューブ中に収集した同じ血液試料の分割量を取り出し、本明細書に記載の種々の成分の洗浄剤除去組成物で処理した。レーン１はタンパク質分子量マーカーを含み、レーン２は空であり、レーン３は０．５μｌの洗浄剤除去前の溶解した血液試料を含み、レーン４は空である。レーン５は１μｌの洗浄剤除去前の溶解した血液試料を含み、レーン６は空であり、レーン７は溶解した血液試料をＢＤＣＭのみで処理後の７．５μｌの水相を含み、レーン８は空であり、レーン９は溶解した血液試料を３：７（体積／体積）の１−ペンタノール：ＢＤＣＭ混合物で処理後の７．５μｌの水相を含み、レーン１０は溶解した血液試料を１：１（体積／体積）の１−ペンタノール：ＢＤＣＭの混合物で処理後の７．５μｌの水相を含み、レーン１１は溶解した血液試料を７：３（体積／体積）の１−ペンタノール：ＢＤＣＭの混合物で処理後の７．５μｌの水相を含み、およびレーン１２は溶解した血液試料を１−ペンタノールのみで処理後の７．５μｌの水相を含む。
【図１７】図１７は、２％のサルコシルを含む水溶液中に収集した唾液試料の洗浄剤除去組成物による処理を示す。使用した洗浄剤除去組成物は、１−ペンタノールと（ポリ）クロロトリフルオロエチレンの１：０．８混合物および２００ｍＭの塩化アンモニウムからなり、結果は、この生物試料の存在下であっても、サルコシルが効率的に除去されたことを示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ドナーＡ由来のＳＴＡＴ−およびｐｒｅｐＩＴ・Ｌ２Ｐ処理唾液試料のバイオアナライザーゲル画像を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ドナーＢ由来のＳＴＡＴ−およびｐｒｅｐＩＴ・Ｌ２Ｐ処理唾液試料のバイオアナライザーゲル画像を示す。
【図１９Ａ】図１９は、２人のドナーの唾液試料から構築したライブラリープレップのバイオアナライザーゲルの出力図を示す。図１９Ａは、Ｏｒａｇｅｎｅ／ｐｒｅｐＩＴ・Ｌ２Ｐで精製したドナーＡの唾液試料から構築したライブラリープレップの出力図を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、Ｏｒａｇｅｎｅ／ＳＴＡＴで処理したドナーＡの唾液試料から構築したライブラリープレップの出力図を示す。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、Ｏｒａｇｅｎｅ／ｐｒｅｐＩＴ・Ｌ２Ｐで精製したドナーＢの唾液試料から構築したライブラリープレップの出力図を示す。
【図１９Ｄ】図１９Ｄは、Ｏｒａｇｅｎｅ／ＳＴＡＴで処理したドナーＢの唾液試料から構築したライブラリープレップのバイオアナライザーゲルの出力図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
特に断らなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２１】
本明細書および請求項で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な記載がない限り、複数形の指示対象を包含する。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、後に続くリストが非包括的であり、任意のその他の追加の適切な項目、例えば、必要に応じて１つまたは複数のさらなる特徴（単一または複数）、構成要素（単一または複数）および／または成分（単一または複数）を含んでも、または含まなくてもよいことを意味するものと理解される。
【００２３】
本出願は、水溶液から洗浄剤（例えば、陰イオン洗浄剤またはアニオン性界面活性剤など）を除去するためのシステム、方法、組成物およびキットを提供する。システム、方法、組成物およびキットはまた、水溶液から洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子が存在する場合、これらを除去するためにも使用し得る。本システムおよび方法は、タンパク質などの洗浄剤および洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子を有機層に隔離することにより、洗浄剤、および存在する何らかの洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子をわずかに検出可能なレベルまで効率的に除去する。水溶液を組成物と混合した結果は、洗浄剤および存在する可能性のあるどの洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子も実質的に不含の上段水相と、洗浄剤および存在する可能性のある何らかの洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子を含む下段のより密な有機相を含む２相混合物である。洗浄剤除去組成物は、以下の成分から構成される：１）塩；２）水不混和性アルコール；および３）ハロカーボン。
【００２４】
本明細書で使用される場合、洗浄剤除去組成物、洗浄剤除去システム、洗浄剤除去方法、および洗浄剤除去キットは、洗浄剤および、存在する場合、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を水溶液から除去するための、組成物、システム、方法およびキットを意味する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。
【００２５】
当該技術分野において熟練した作業者ならわかるように、洗浄剤および存在する洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子が、水溶液から「除去される」として本明細書に記載される場合、若干の低濃度の洗浄剤または洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子が水溶液中に残っているであろう。しかし、「除去された」と見なされるためには、水溶液中の洗浄剤および洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子の濃度は、水溶液の最終的な用途を基準に選択された閾値洗浄剤濃度未満に低下していることになる。一実施形態では、本システム、組成物、方法およびキットを用いて洗浄剤（および存在する場合、洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子）の「除去」後、水溶液中の洗浄剤（および存在する場合、洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子）の濃度は、実施例１に記載のステインズオールアッセイを用いて、検出可能な濃度未満である。
【００２６】
特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「洗浄剤」には、限定されないが、例えば、陰イオン洗浄剤を含む洗浄剤が含まれる。本洗浄剤除去システム、方法、組成物、およびキットを用いて水溶液から除去できる陰イオン洗浄剤の非限定的例には、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）およびサルコシルがある。
【００２７】
洗浄剤除去組成物およびシステム
上述のように、本明細書に記載の洗浄剤除去組成物およびシステムは、少なくとも３種の成分：塩；水不混和性アルコール；およびハロカーボンを含む。これらの成分は、水溶液からの洗浄剤（および存在する場合、洗浄剤関連分子／洗浄剤結合分子）の除去に使用する前に、それらが洗浄剤除去のために水溶液と混合されるまで、別々に保持でき、またはそれらを混合して、全３種の成分の混合物、もしくは３種の成分の内のいずれか２種の混合物として貯蔵できる。従って、本洗浄剤除去システムは、使用前に、塩；水不混和性アルコール；およびハロカーボン成分を貯蔵する１つまたは複数の容器をさらに含み得る。
【００２８】
したがって、本組成物およびシステムは、理想的に使用され、水溶液から阻害物質、すなわち、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。阻害物質には、すなわち、その後の用途などにおける酵素阻害物質、例えば、酵素依存性反応の阻害物質が挙げられる。
【００２９】
特定の実施形態では、少なくとも一部の水相（すなわち、洗浄剤、および、存在する場合、洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子を実質的に含まない相）は、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途のために直接使用し得る。
【００３０】
塩成分
本システム、組成物および方法に有用な塩は、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である。本システム、組成物および方法で使用可能な塩の具体例には、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、１−ブチルアミンの酸性塩、１−ペンチルアミンの酸性塩、１−ヘキシルアミンの酸性塩、１−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
アルコール成分
本システムおよび方法は、洗浄剤を含む水溶液が本洗浄剤除去組成物と混合される場合、陰イオン洗浄剤などの洗浄剤の溶解度特性の変化を利用する。２相混合物の形成を容易にするために、アルコール成分は、水に不混和性であるか、またはわずかに混和性であるのみでなければならない。水不混和性アルコールは、式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の構造を有する。
【００３２】
洗浄剤除去のために、本システム、方法および組成物に有用な水不混和性アルコールの例には、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−ブタノール、１−ヘプタノール、１，２−ヘキサンジオール、１−ヘキサノール、２−ノナノール、１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、シクロペンタノール、１−プロパノール、１−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
ハロカーボン成分
ハロカーボン成分の機能の１つは、有機相が下相で、水相が上相となるように、水溶液と本洗浄剤除去組成物との混合物を形成する２相混合物中の有機相の密度を高めることである。さらに、２相の良好な分離を確実にするために、ハロカーボンは水に不混和性であるか、またはわずかに混和性であるのみでなければならず、また、アルコール成分と混和性でなければならない。
【００３４】
洗浄剤除去のための本システム、方法および組成物に有用なハロカーボンの例には、１−ブロモ−３−クロロプロパン、１−ブロモ−６−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）、クロロジブロモメタン、クロロホルム、２−ヨードプロパン、（ポリ）クロロトリフルオロエチレン（−（ＣＦ２ＣＦＣｌ）ｎ−、式中、ｎ＝２〜１０；特に、Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｉｖｅｒ  Ｅｄｇｅ，ＮＪ；ＣＡＳ＃９００２−８３−９から入手できるハロカーボン油６．３）、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ペルフルオロノナンは、本洗浄剤除去組成物でうまく機能しなかったハロカーボンの例である。理論に束縛されるものではないが、ペルフルオロノナンはアルコール成分と混和性ではなかったという事実に起因すると考えられる。
【００３５】
任意成分
本システムおよび組成物は、例えば、除去される洗浄剤を含む水溶液の性質に応じて、または洗浄剤除去（および、存在する場合、洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子の除去）後の水溶液の最終的な用途に応じて、任意に追加の成分を含むことができる。
【００３６】
一実施形態では、洗浄剤除去システムは、さらに、ガラスビーズを含み、これは、水性試料中に存在する細胞の溶解を改善および／または加速するように、または洗浄剤を含む水溶液と、塩、アルコールおよびハロカーボン成分との混合を改善するように機能し得る。理論に制約されるものではないが、未処理の試料（例えば、唾液）が、ＳＤＳおよび本発明の組成物と同時に強く混合される場合、ビーズは試料の均一化、細胞の溶解を助け、ＳＤＳをタンパク質結合ＤＮＡと接触させると考えられている。その後、ＳＤＳは、ＤＮＡからタンパク質を剥ぎ取り、組成物はＳＤＳおよびＳＤＳ関連／ＳＤＳ結合分子を有機相に分離させる。
【００３７】
別の実施形態では、洗浄剤除去システムはさらに還元剤を含む。還元剤はまた、本洗浄剤除去組成物と混合する前に、除去される洗浄剤を含む水溶液中に存在することも、またはその水溶液に添加することもできる。このような還元剤は、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトヘキサノール、メルカプトウンデカノール、ジメルカプトプロパノールまたはメルカプトブタノールとすることができる。
【００３８】
さらに別の実施形態では、洗浄剤除去システムはさらにキレート化剤および／または緩衝液を含む。還元剤および／または緩衝液はまた、本洗浄剤除去組成物と混合する前に、除去される洗浄剤を含む水溶液中に存在することも、またはその水溶液に添加することもできる。このようなキレート化剤は、例えば、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせとすることができる。任意の好適な緩衝液を使用してよく、当業者にはよく知られている。
【００３９】
別の実施形態では、洗浄剤除去システムはさらにナイルレッドなどの親油性染色剤を含む。ナイルレッドは、細胞内脂質、細胞膜および疎水性タンパク質表面を染色する。生物試料および本組成物と混合されると、染色剤は有機下層のみに分離し、水性上相は透明で無色で残される。このような親油性染色剤は、例えば、９−アントリルジアゾメタン、Ｆｌｕｏｒｏｌ  Ｙｅｌｌｏｗ０８８、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−４−（６−フェニル−１，３，５−ヘキサトリエン−１−イル）フェニルアンモニウム  ｐ−トルエンスルホネート（ＴＭＡ−ＤＰＨ）、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルコロレート、１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン、Ｓｕｄａｎ  ＩＩＩ、Ｓｕｄａｎ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ、Ｎｉｌｅ  ＢｌｕｅクロリドおよびＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂｌｕｅ  ３７であり得る。
【００４０】
洗浄剤除去方法
本出願は、水溶液から洗浄剤を除去する方法を提供する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、陰イオン洗浄剤はＳＤＳまたはサルコシルである。方法はまた、水溶液中に存在する可能性がある洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子の除去にも使用し得る。したがって、本方法は、理想的に使用され、水溶液から阻害物質、すなわち、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。阻害物質には、例えば、その後の用途などにおける酵素阻害物質、例えば、酵素依存性反応の阻害物質が挙げられる。
【００４１】
本方法は、除去される洗浄剤を含む水溶液を、塩、水不混和性アルコール、およびハロカーボンと混合することからなるにすぎない。３種の成分は、単一ステップで、または複数ステップで、溶液と混合できる。添加の順番は重要ではなく、洗浄剤除去組成物の成分が水溶液とよく混合されることの方が重要である。この混合ステップには、混合を改善するまたは容易にするために、ボルテックスなどの機械的な撹拌を含めることができる。
【００４２】
水溶液は、除去される洗浄剤を含むどのような水溶液であってもよい。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、洗浄剤はＳＤＳまたはサルコシルである。水溶液は、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を含んでもよい。このような溶液は、例えば、唾液、喀痰、頬側スワブ試料、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブまたは擦過物、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、消化管液、精液／精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液または吸引液、細胞培養液および細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、などであってよい。
【００４３】
試料が細胞または組織を含む場合、洗浄剤除去を最大化するために、洗浄剤除去組成物との良好な混合を確実にすることは有益である。一実施形態では、混合の前またはその間に、ガラスビーズまたはその他の機械的手段を加えて、試料分散および細胞溶解を促進する。あるいは、組織試料は、ＳＤＳと洗浄剤除去組成物との混合の前または後での機械的もしくは化学的手段または酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）消化により均一化させ得る。あるいは、ＳＤＳ単独でも、固体組織片（例えば、筋肉生検材料または腫瘍生検材料）の表面を覆う十分な数の細胞を溶解して、核酸を溶液中に放出させ、その後、洗浄剤除去組成物で処理して下流の用途での使用が可能である。
【００４４】
生物試料は、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および原生生物などの微生物を含んでいても、含んでいなくてもよい。
【００４５】
水溶液と洗浄剤除去組成物との完全混合後、得られた混合物は静置するか、または短時間遠心分離して２相が形成される。洗浄剤（および何らかの洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子）は、下側有機相中に分配され、上側の水相は実質的に洗浄剤不含の状態で残される。上段の水相は、デカンテーションまたはピペット操作などの標準的な手段により下側有機相からの混入なしに、下流分析のために容易に単離できる。
【００４６】
この方法は、水溶液からの陰イオン洗浄剤などの洗浄剤の除去に有効であるのみでなく、洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子および高分子の除去にも有効である。特定の実施形態では、洗浄剤関連分子または連洗浄剤結合分子はタンパク質である。ＳＤＳなどの陰イオン洗浄剤は、膜脂質二重層を破壊し、タンパク質を変性することにより、生物試料中の細胞を溶解することが知られている。ＳＤＳはタンパク質を効率的に可溶化し、それに強く結合するので、本洗浄剤除去方法およびシステムは、洗浄剤および洗浄剤関連タンパク質／結合タンパク質の両方を容易に除去し、下側有機相中に分離できると考えられている。したがって、本出願は、生物試料などの水溶液からタンパク質を抽出する方法をさらに提供する。したがって、本明細書に記載の方法、組成物、システムおよびキットは、理想的に使用され、水溶液から阻害物質、すなわち、限定されないが、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。阻害物質には、例えば、その後の用途などにおける酵素阻害物質、例えば、酵素依存性反応の阻害物質が挙げられる。
【００４７】
少なくとも一部の水相（すなわち、洗浄剤、および、存在する場合、洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子を実質的に含まない相）は、限定されないが、その後、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途のために直接使用し得る。
【００４８】
また、洗浄剤除去用のキットも本明細書で提供される。キットは、単一の容器、または２つまたは３つの別々の容器に入れた、洗浄剤除去組成物の塩、アルコールおよびハロカーボン成分を含む。場合により、キットは、本洗浄剤除去方法を実施するための説明書および／または試料収集容器および／または洗浄剤溶液を含む試料収集容器も含む。上述のように、特定の実施形態では、キットはまた、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を、存在する可能性がある水溶液から除去するために使用し得る。
【００４９】
本明細書に記載の本発明をさらに理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、単に例示目的であることを理解されたい。したがって、これらは本発明の範囲を限定するものでない。
【実施例】
【００５０】
実施例１：低濃度のＳＤＳを検出するための高感度アッセイシステム
試料中のＳＤＳの極めて小さい（＜０．０１重量／体積％）量を定量するために、高感度アッセイシステムを開発した。このアッセイで、ＳＤＳの定量化は、ステインズオールとしても知られる、３，３′−ジエチル−９−メチル−４，５，４′，５′−ジベンゾチアカルボシアニン染料を基準にしている。これは、ＳＤＳの存在下で黄色に変わるフクシア染料である。このアッセイは、試料中の０．００３％程度の少ないＳＤＳの正確な検出および定量化を可能とする。
【００５１】
このアッセイは、“Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ−Ｖｏｌｕｍｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅｓ  ｂｙ  Ｖｉｓｉｂｌｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．”  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００１．２９５，３１−３７中でＲｕｓｃｏｎｉらにより記載されたものを改良した。
【００５２】
装置
・Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００プレートリーダー
・Ｇｒｅｎｉｅｒ９６ウエル平底透明ポリスチロールプレート
【００５３】
試薬
・ステインズオール［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｅ９３７９−１Ｇ］
・イソプロパノール［ＥＭＤ、カタログ番号ＰＸ１８３４−６］
・ＤＭＳＯ［ＢＤＨ、カタログ番号Ｂ１０３２３］
・１０％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）［ＥＭＤ、カタログ番号ＤＸ２４９０−２］
アッセイの実行前にＨ２Ｏ中の１％に希釈
【００５４】
溶液の調製
・５０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール中の１ｍｇ／ｍＬからなるステインズオールストック溶液（１．８ｍＭ）。このストック溶液は、暗所、４℃で１ヶ月間安定である。
・ステインズオール中間体溶液（９０μＭ）：
中間体溶液は、１ｍＬのステインズオールストック溶液（１．８ｍＭ）と、１ｍＬのＤＭＳＯ、および１８ｍＬのＨ２Ｏを混合することにより調製した。このステインズオール中間体溶液は、暗所、室温で貯蔵した場合、３日間安定である。
【００５５】
ＳＤＳ検量線の作成：次の標準溶液を用いて検量線を作成した：
ａ．０．０５％ＳＤＳ＝５μｌの１％ＳＤＳ＋９５μｌのＨ２Ｏ
ｂ．０．０２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ａ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｃ．０．０１２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｂ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｄ．０．０６２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｃ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｅ．０．００３１２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｄ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｆ．０．００１５６２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｅ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｇ．０．０００７８１２５％ＳＤＳ＝５０μｌ（Ｆ）＋５０μｌのＨ２Ｏ
ｈ．０％ＳＤＳ＝Ｈ２Ｏ
【００５６】
手順
１．５μｌのＳＤＳ標準溶液または試料を９６ウェルプレートのウエルに移す。
２．吸光度を読み取る直前に、１９５μｌのステインズオール中間体溶液をそれぞれの試料に加える（注意：ステインズオールは感光性である）。
３．標準的プレートリーダーを用いて、４２０ｎｍ〜４８０ｎｍから吸光度を読み取る。
４．吸光度の「曲線下面積」（ＡＵＣ）（４２０〜４８０ｎｍ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアで計算する。
【００５７】
既知のＳＤＳ濃度に対しＡＵＣをプロットすることにより、検量線（グラフの暗色バーで表される）を作成した。これにより、未知の試料中のＳＤＳの濃度は、計算されたＡＵＣおよび検量線を用いて容易に得られた。特に指示がない限り、この方法を使って、次の実施例のＳＤＳ濃度を決定した。
【００５８】
実施例２：洗浄剤除去組成物の比較
本発明の種々の洗浄剤除去組成物を用いて、既知の量のＳＤＳを含む水溶液からＳＤＳを除去した。異なる濃度のＳＤＳを含む１００マイクロリットルの分割量の水性組成物を調製した。塩および２０μｌの１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の高級アルコールとハロカーボンの混合物を下記のように加えることにより、ＳＤＳ除去を実施した。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段の（水性）相を取り出し、水相中の残留ＳＤＳを、実施例１に記載の改良ステインズオールアッセイを用いて定量した。結果を、図１〜３に示す。暗色バーは、ＳＤＳ標準溶液を表し、白色バーは、試験した洗浄剤除去組成物による結果を表す。
【００５９】
図１に示すグラフは、１％ＳＤＳ含有水溶液を種々の洗浄剤除去組成物で処理した場合の実験結果を示す。組成物１は、１−ペンタノールとブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）の１：１混合物および１５０ｍＭの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）を含む。組成物２は、１−ペンタノールとクロロホルムの１：１混合物および１５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含む。組成物３は、１−ペンタノールと２−ヨードプロパンの１：１混合物および１５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含む。いずれの場合にも、処理後の水相中で検出されたＳＤＳの量は、０．００６２５％未満であり、使用ハロカーボンが２−ヨードプロパンの場合には、洗浄剤除去後に検出されたＳＤＳの量は、０．００３１２５％未満であった。これは、１／５の体積のみの洗浄剤除去組成物を用いた単回処理で、極めて効率的な（＞９９．７％）ＳＤＳの水相からの抽出を示す。
【００６０】
図２に示すグラフは、４％ＳＤＳ含有水溶液を種々の洗浄剤除去組成物で処理した場合の実験結果を示す。この調査では、全組成物は、１−ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物および下記の塩からなる：組成物４：１７５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ；組成物５：２００ｍＭのＮＨ４Ｃｌ；組成物６：１２５ｍＭのメチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド；組成物７：１５０ｍＭのメチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド；組成物８：１５０ｍＭのトリエチルアミン塩酸塩；組成物９：１７５ｍＭのトリエチルアミン塩酸塩；組成物１０：１７５ｍＭのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムアセテート；組成物１１：２００ｍＭのテトラ−ｎ−プロピルアンモニウムクロリド。いずれの場合にも、処理後の水相中で検出されたＳＤＳの量は、０．００６２５％未満であった。この結果も、１／５の体積のみの洗浄剤除去組成物を用いた単回処理で、極めて効率的な（最大＞９９．９％）ＳＤＳの水相からの抽出を示す。
【００６１】
図３に示すグラフは、１０％ＳＤＳ含有水溶液を種々の洗浄剤除去組成物で処理した場合の実験結果を示す。この調査では、全組成物は、１−ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物および下記に示す種々濃度のＮＨ４Ｃｌからなる：組成物１２：２７５ｍＭ；組成物１３：３００ｍＭ；および組成物１４：３２５ｍＭ。いずれの場合にも、処理後の水相中で検出されたＳＤＳの量は、０．００６２５％未満であった。この結果も、極めて高い初期ＳＤＳ濃度（１０重量／体積％）であっても、１／５の体積のみの洗浄剤除去剤を用いた単回処理で、極めて効率的な（最大＞９９．９％）ＳＤＳの水性成分からの抽出を示す。
【００６２】
実施例３：唾液含有試料からのＳＤＳの除去
生物試料を含む水性組成物における本発明の有効性を示すために、新しいヒト唾液試料を１５ｍｌのコニカルチューブに収集した。１ミリリットルの唾液を、４％ＳＤＳおよび２５０ｍＭのＬｉＣｌを含む同体積のリシスバッファーで処理し、プロテイナーゼＫ（「ＰＫ」）を用いて６０℃で１５分間消化した。ＰＫは、９０℃で１５分間加熱することにより不活化し、９３．７５μｌの分割量のリシスバッファー中で処理した唾液を、６．２５μｌの２Ｍ  塩化アンモニウム溶液と混合した。
【００６３】
２０μｌの１−ペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物を１００μｌの処理した唾液試料に加えることにより、洗浄剤除去を実施した。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段の（水性）相を取り出し、ＳＤＳを、実施例１に記載の改良ステインズオールアッセイを用いて定量した。結果を、図４に示す。これらの結果は、本明細書に記載の組成物および手順を用いて、唾液含有水性試料から９９．７％を超えるＳＤＳの除去に成功したことを示す。
【００６４】
実施例４：静脈血由来試料からのＳＤＳの除去
複雑な生物試料を含む水性組成物における本発明の有効性を示すために、ヒト静脈血をＥＤＴＡチューブに収集した。１ミリリットルの血液を３倍量のＳＤＳおよび塩化アンモニウム含有リシスバッファーに７０℃で１５分間溶解した。溶解した血液試料中のＳＤＳおよび塩化アンモニウムの最終濃度は、それぞれ２．５％および１７５ｍＭであった。
【００６５】
２０μｌのペンタノールとＢＤＣＭの１：１混合物を、１００μｌの溶解した血液試料に加えることにより、洗浄剤除去を実施した。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段の（水性）相を取り出し、ＳＤＳを、実施例１に記載の改良ステインズオールアッセイを用いて定量した。結果を図５に示すが、これは、静脈血などの複雑な生物試料からでも、ＳＤＳを成功裏に除去（＞９９％）できることを示した。
【００６６】
実施例５：種々の濃度のＳＤＳによるＰＣＲの阻害
下記のマスターミックスを用いて、複数のｑＰＣＲ反応を実施した：２．５μｌの１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２．５μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液、１．５μｌの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μｌの１０ｐＭｏｌ順方向プライマー、０．５μｌの１０ｐＭｏｌ逆方向プライマー（ヒト１８Ｓ−１６５順方向５’ｇｔｇｇａｇｃｇａｔｔｔｇｔｃｔｇｇｔｔおよびヒト１８Ｓ−１６５逆方向５’ｇｇａｃａｔｃｔａａｇｇｇｃａｔｃａｃａｇ）、０．５μｌの０．５μＭ  Ｓｙｔｏ９、０．２μｌの５Ｕ／μｌ  Ｔａｑポリメラーゼ、１２．３μｌの水。
【００６７】
既知の量のコントロールＤＮＡおよび１％〜０．００１重量／体積％の範囲の種々の濃度のＳＤＳによるｑＰＣＲ反応を、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、５７．４℃のプライマーアニーリング温度および３０サイクルを用いて実施した。
【００６８】
図６に示す結果は、ｑＰＣＲは、０．０１％の低いＳＤＳ濃度で完全に阻害され、０．００５％の濃度で部分的阻害が観察された。これらの範囲は、上記で参照した発表データと一致する。
【００６９】
実施例６：ｑＰＣＲに対する以下の洗浄剤除去後の生物試料中のＤＮＡの使用
唾液由来試料
実施例３に記載のように、洗浄剤除去組成物で処理後、溶解した唾液試料の水相を得た。１２μｌの分割量の水相を１％アガロースゲル中で、１ｋｂ＋ＤＮＡラダーの横に並べて電気泳動した。その後、ゲルをＳｙｂｒＧｏｌｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で染色した。結果を図７に示すが、高分子量ＤＮＡ（＞２３ｋｂ）を認めることができ、したがって、本発明の組成物による処理は、ＤＮＡを無傷のまま水溶液中に残すことを示す。
【００７０】
上記実施例５に記載の方法に従って、洗浄剤除去後の水相の分割量を用いて、ｑＰＣＲを実施した。合計２５μｌのｑＰＣＲ反応に直接添加された４μｌの唾液由来水相のデータを図８に示す。比較のために、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５ｎｇおよび５０ｎｇの精製ＤＮＡもｑＰＣＲに供した。
【００７１】
これらの結果は、上記洗浄剤除去手順後、ＳＤＳは、効率的に、急速に唾液由来水性試料から除去し得ることをさらに実証している。図８で得られたｑＰＣＲの成功を示すデータは、唾液由来水相が極少ない量のみの残留ＰＣＲ阻害物質を含むことを示唆する。おそらく、より多い量のｑＰＣＲ混合物中のより少ない分割量の使用でも類似の結果を与えるであろう。実際に、希釈は、血液試料中に天然に存在する阻害物質を取り扱うために、よく行われる手法である。しかし、この手法は、試料から得ることができる全ＤＮＡが減少し、その実験方法により多くのエラー源を持ち込むことになろう。いつの場合でも、より多くの量の、より高い濃度の試料を用いる能力を有することが好ましい。本明細書中に記載した方法および組成物は、高希釈手法を使用する必要のない試料の使用を可能とする。
【００７２】
血液由来試料
実施例４に記載のように、この実施例用として、溶解した血液試料から洗浄剤除去後に、水相を得た。洗浄剤除去後に８μｌの分割量の水相を０．８％アガロースゲル中で、１ｋｂ＋ＤＮＡラダーの横に並べて電気泳動した。その後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。結果を図９に示すが、高分子量ＤＮＡ（＞２３ｋｂ）を認めることができ、したがって、本発明の組成物による処理は、ＤＮＡを無傷のまま水溶液中に残すことを示す。
【００７３】
上記実施例５に記載のように、洗浄剤除去後の水相の分割量を用いて、ｑＰＣＲを実施した。合計２５μｌのｑＰＣＲ反応を得るように直接添加された２μｌおよび４μｌ両方の血液由来水相のデータを図１０に示す。
【００７４】
これらの結果は、上記洗浄剤除去手順後、ＳＤＳは、効率的に血液由来水性試料から除去されたことをさらに実証している。血液は、かなりの量のＰＣＲ阻害物質を含むことがわかっているので、図１０のデータは、実施例４に記載のように、ＳＤＳ含有血液試料を洗浄剤除去組成物で処理すれば、高希釈の試料は必要なかったという点でかなり注目すべきである。以下に示すように、ＳＤＳが試料から除去されたのみではなく、何らかのＳＤＳ関連タンパク質も同様に除去されたことを理由にして、この際だった結果を説明し得るかも知れない。
【００７５】
実施例７：逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲに対する洗浄剤除去後の生物試料由来ＲＮＡの使用
唾液
２ｍＬの新しい唾液試料を１５ｍｌのコニカルチューブに収集し、等体積のリシスバッファー（４％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ）と混合した。
溶解した唾液の２００μｌの分割量をＰＫと混合し、６０℃で１５分間、インキュベートした。ＰＫを９０℃で１５分間加熱することにより不活化した。１０μｌの２Ｍの塩化アンモニウムおよび４０μｌの１−ペンタノールと（ポリ）クロロトリフルオロエチレンの１：０．８（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合物を加えた。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段（水性）相を取り出し、１％アガロースゲルで電気泳動した。ゲルをＳｙｂｒＧｏｌｄで処理して、核酸を染色した（図１１）。細菌１６Ｓおよび２３ＳリボソームＲＮＡバンドは、本明細書に記載の洗浄剤除去組成物が、無傷のＲＮＡを水相中に残すことを示すことが認められる。ヒト２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、認められなかった。理由は、それらは、非常に少ない量で唾液中に存在し、少なすぎてＳｙｂｒＧｏｌｄによる染色により検出できないためである。しかし、ヒトリボソームＲＮＡは、次のセクションで示すように、ＲＴ−ＰＣＲにより検出できる。
【００７６】
唾液試料由来の水相は、ＢＤＣＭ：１−ペンタノールの１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合物が洗浄剤除去組成物として使用されたこと以外は、上述と同様に処理された。１μｌの唾液水相を、２０μｌのＲＴ反応混合物（４μｌの５Ｘ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μｌの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μｌのＲＮＡｓｅ阻害物質（１０Ｕ／μｌ）、１μｌのランダムプライマー（１２５ｎｇ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、残りは水）に直接添加した。その後、１μｌのＲＴ生成物を、２４μｌのｑＰＣＲ反応に加え、上記実施例５に記載のように処理し、ヒト１８ＳリボソームＲＮＡ  ｃＤＮＡを検出した。ネガティブコントロールチューブ（ＲＴ酵素不含）を−ＲＴとして標識した。結果を図１２に示す。
【００７７】
別の新しい唾液試料を正確に上述のように処理した。上段水相を取り出し、３μｌを、１８μｌのＲＴ反応混合物（上述）に直接加えた。その後、２μｌのＲＴ生成物を、２３μｌのｑＰＣＲ反応に加え、上記実施例５に記載のように処理し、ヒト１８ＳリボソームＲＮＡ  ｃＤＮＡを検出した。ネガティブコントロールチューブ（逆転写酵素不含）を−ＲＴとして標識した。結果を図１１に示す。両方の場合で（図１２および１３）、結果は、１８ＳリボソームＲＮＡは、洗浄剤除去組成物で処理した溶解した唾液試料の水相中で検出し得ることを示している。予想通り、ＲＴ反応で１μｌおよびｑＰＣＲ反応で１μｌの使用（図１２）に代えて、それぞれ、ＲＴ反応で３μｌおよびｑＰＣＲ反応で２μｌの使用（図１３）は、ＰＣＲ反応でのより低いＣｔ値により明らかなように、ＲＴ反応においてより多くの１８ＳリボソームＲＮＡ  ｃＤＮＡを産生した。より大きな量の水相による、ＲＴ生成物のかなりの増加、したがって、ｑＰＣＲ生成物の増加により、阻害物質の下側有機相への隔離における洗浄剤除去組成物の顕著な有効性が実証された。−ＲＴシグナルは、ヒトゲノムＤＮＡの存在に起因し、これは、これらの調査では除去されなかった。
【００７８】
血液
ヒト静脈血を標準的ＥＤＴＡチューブに収集した。１倍量の血液を９倍量のリシスバッファー（４％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＬｉＣｌ）と混合した。溶解した血液をＰＫにより６０℃で１５分間消化した。次に、９０℃で１５分間、ＰＫを不活化した。１００μｌの分割量の溶解した血液からのＳＤＳの除去を、５μｌの２Ｍの塩化アンモニウムおよび２０μｌの１−ペンタノールと（ポリ）クロロトリフルオロエチレンの１：０．８（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合物を混合することにより実施した。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上段（水性）相を取り出し、分割量を１％アガロースゲルで泳動させた（図１４）。核酸をＳｙｂｒＧｏｌｄで染色した。ヒト１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡに対応するバンドを認めることができる。１μｌの血液水相を、２０μｌのＲＴ反応混合物（４μｌの５Ｘ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μｌの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μｌのＲＮＡｓｅ阻害物質（１０Ｕ／μｌ）、１μｌのランダムプライマー（１２５ｎｇ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．５μｌのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、残りは水）に添加した。その後、１μｌのＲＴ生成物を、２４μｌのｑＰＣＲ反応に加え、上記実施例５に記載のように処理した。逆転写酵素不含のネガティブコントロールチューブを−ＲＴとして標識した。図１５に示す結果は、ＳＤＳが、ＳＤＳに結合した可能性のある追加の阻害物質と共に、洗浄剤除去組成物により除去されると、ヒト１８ＳリボソームＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲにより検出され得ることを明確に示した。
【００７９】
実施例８：アルコールの比較
いくつかの代表的アルコールを、洗浄剤除去組成物中でのそれらの実行能力を調査した。一級アルコール、二級アルコール、環状アルコール、ジオールおよび固体および液体アルコールの両方を（室温で）試験した。アルコールを、未処理の生物試料に対して、および／または簡単な水とＳＤＳ（４重量／体積％）混合物が使用される「モデルシステム」で試験した。効率的に相分離をさせるために、アルコールは、水中でほとんど不混和性であるが、ハロカーボンとは可溶性でなければならない。結果を下記の通りまとめている：
【００８０】
【表１】
2019519228.tif 000003
【００８１】
上記で得られた観察から推定できるように、水不混和性アルコールは、式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の構造を有するいずれかのアルコールであり得る。
【００８２】
実施例９：水性試料からのタンパク質の除去
ヒト静脈血を標準的ＥＤＴＡチューブに収集した。１倍量の血液を、３倍量の４％ＳＤＳおよび３０ｍＭのＤＴＴを含むリシスバッファーと完全に混合した。洗浄剤およびタンパク質除去を以下のように実施した。ＮＨ４Ｃｌを最終濃度の１００ｍＭまで、溶解した血液試料の１００μｌの分割量に加えた。それぞれの溶解した血液の分割量に、種々の量の１−ペンタノールおよびＢＤＣＭを含む２０μｌの洗浄剤除去組成物を加えた（詳細は下記参照）。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。初期の溶解した血液試料（すなわち、洗浄剤除去前）、ならびに洗浄剤除去後の水相をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルーで染色し、タンパク質バンドを示した。結果を図１６に示す。レーン１は、タンパク質分子量マーカーを含む。レーン２は空である。レーン３は０．５μｌの洗浄剤除去前の溶解した血液試料を含む。レーン４は空である。レーン５は１μｌの洗浄剤除去前の溶解した血液試料を含む。レーン６は空である。レーン７はＢＤＣＭのみで溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。レーン８は空である。レーン９は３：７（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の１−ペンタノール：ＢＤＣＭ混合物で溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。レーン１０は１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の１−ペンタノール：ＢＤＣＭ混合物で溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。レーン１１は７：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の１−ペンタノール：ＢＤＣＭ混合物で溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。レーン１２は１−ペンタノールのみで溶解した血液試料の処理後の７．５μｌの水相を含む。
【００８３】
結果は、試料が洗浄剤除去組成物で処理されている、レーン９、１０および１１には、タンパク質がごくわずか存在するかまたは全く存在しないことを示す。この顕著に効率的なタンパク質の抽出は、極めて意外である。これは、１／５もの少ない体積の洗浄剤除去組成物（すなわち、１００μｌの溶解した血液試料に加えられた２０μｌの組成物）で、血液から大部分のタンパク質を効率的に除去できることを示している。観察されたヘモグロビンの暗赤色の除去（データは示さず）は、ＳＤＳ含有試料に対する洗浄剤除去組成物の意外に強力な除タンパク力の別の指標である。タンパク質バンドがレーン３、５、７および１２に認められ、これらのケースでは、本出願の洗浄剤除去組成物を使用しなかった（レーン３および５）か、またはいくつかの成分を除外（レーン７および１２）しており、良い結果を得るためには、これらの３種の成分が不可欠であることを示している。
【００８４】
実施例１０：生物試料からのサルコシルの除去およびｑＰＣＲでのＤＮＡの使用
生物試料を含む水性組成物中の洗浄剤除去のための、本方法および組成物の有効性を示すために、新しいヒト唾液試料を１５ｍｌのコニカルチューブに収集した。１ミリリットルの唾液を、４％サルコシルを含む同体積のリシスバッファーで処理し、プロテイナーゼＫ（「ＰＫ」）を用いて６０℃で１５分間消化した。ＰＫは、９０℃で１５分間加熱することにより不活化し、９０μｌの分割量のリシスバッファー中で処理した唾液を、１０．００μｌの２Ｍ  塩化アンモニウム溶液と混合した。
【００８５】
２０μｌの１−ペンタノールと（ポリ）クロロトリフルオロエチレンの１：０．８混合物を１００μｌの処理した唾液試料に加えることにより、洗浄剤除去を実施した。チューブを強く２分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上記実施例５に記載の方法に従って、上段（水性）相を取り出し、４μｌを、ヒト１８ｓ−１６５ｂｐ  ＰＣＲ反応に加えた。合計２５μｌのｑＰＣＲ反応に直接添加された４μｌの唾液由来水相のデータを図１７に示す。
【００８６】
実施例１１：洗浄剤除去後のライブラリープレップの構築のための生物試料中のＤＮＡの使用
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の主要素は、高品質ライブラリー調製である。ほとんどの高スループットＮＧＳライブラリー構築ワークフローは、共通の一連のステップに依存し、そのいくつかは、酵素的に−ＤＮＡフラグメンテーション、末端修復、Ａテイリング、アダプターリゲーション、およびＰＣＲ増幅−により達成される。入力ＤＮＡ品質はまた、ライブラリー構築の成功のための重要な決定因子である。洗浄剤などの酵素阻害物質は、生物試料の精製中持ち越され、最終収率の低下、ライブラリープレップの失敗、または生物情報学的に分析される場合に低く、不均一なカバー率をもたらし得る。理想的には、抽出プロトコルまたはシステムは、阻害物質不含核酸に純化するように最適化されるべきである。
【００８７】
この実施例では、ＤＮＡは生物試料から、２種の異なる方法により精製され、単離されたＤＮＡを使って、ＮＧＳ用のライブラリープレップの構築に直接使用された。シーケンシングライブラリーの品質は、試験したＤＮＡ精製法による阻害物質除去の有効性に直接相関した。一方法では、唾液を２人のドナーから等容積の、洗浄剤およびその他のシーケンシング阻害物質を含むＤＮＡ抽出および精製試薬である、Ｏｒａｇｅｎｅ（登録商標）（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ，Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）中に収集し、続けて、下流側分析の阻害物質を除去するように設計された試薬と方法である、ｐｒｅｐＩＴ（登録商標）・Ｌ２Ｐ（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ）を加え、最後にエタノール沈殿を行い精製ＤＮＡを回収した。第２の方法では、Ｏｒａｇｅｎｅ中に収集した同じ唾液の分割量を本発明の組成物と単純に混合した。特に、１００μｌの唾液／Ｏｒａｇｅｎｅを１０μｌの２Ｍ  ＮＨ４Ｃｌおよび２０μｌのペンタノール：ハロカーボン油６．３（１：０．８（ｖ／ｖ））と混合し、２０分間静置した。得られた核酸を含む上清を、ライブラリープレップ構築の準備が整っている清浄なチューブに移した（ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴ  ＤＮＡライブラリー調製ガイド）。
【００８８】
本組成物（「ＳＴＡＴ」）で処理したＯｒａｇｅｎｅ／唾液試料から、およびＯｒａｇｅｎｅ／ｐｒｅｐＩＴ・Ｌ２Ｐを用いて抽出した精製ＤＮＡから、シーケンシングライブラリーを調製した。調製したライブラリーを、Ａｇｉｌｅｎｔ高感度ＤＮＡキットを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーで分析した。バイオアナライザーゲル画像（図１８ａ〜ｂ）および出力図（図１９ａ〜ｄ）は、ＳＴＡＴを使って洗浄剤およびその他の阻害物質が除去されている唾液試料から調製したライブラリーは、精製ＤＮＡから調製したライブラリーと同じ平均フラグメントサイズおよびフラグメント長さ分布、ならびに類似の濃度を有することを示す。したがって、ＳＴＡＴ処理生物試料の上清は、ＮＧＳ用のライブラリー調製の構築に直接使用でき、かなりの時間と出費を節約できる。
【００８９】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術レベルの指標であり、個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
したがって、記載される本発明は、多くの方法で変更することができることは明らかであろう。このような変更は、本発明の趣旨および範囲からの乖離であると見なされるべきものではなく、また、当業者には明らかである全てのこのような修正は、次の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
【図１】
2019519228.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2019519228.tif 000020
【図１８Ａ】
2019519228.tif 000021
【図１８Ｂ】
2019519228.tif 000022
【図１９Ａ】
2019519228.tif 000023
【図１９Ｂ】
2019519228.tif 000024
【図１９Ｃ】
2019519228.tif 000025
【図１９Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月27日(2018.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液から洗浄剤を除去するための洗浄剤除去システムであって、
ａ．塩；
ｂ．式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；および
ｃ．水不混和性のハロカーボンを含み、前記ハロカーボンが、前記式Ｉのアルコールと混和性であり、
前記水性混合物の処理時に、水相および非水相を含む２相が形成され、前記非水相がほぼ全ての洗浄剤を含む、システム。
【請求項２】
前記洗浄剤が陰イオン洗浄剤である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を前記水溶液からさらに除去する、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
前記洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子がタンパク質である、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記洗浄剤および／または前記洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子が酵素阻害物質である、請求項３または４に記載のシステム。
【請求項６】
前記塩が、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
前記塩が、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、１−ブチルアミンの酸性塩、１−ペンチルアミンの酸性塩、１−ヘキシルアミンの酸性塩、１−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−ブタノール、１−ヘプタノール、１，２−ヘキサンジオール、１−ヘキサノール、２−ノナノール、１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９】
前記塩が塩化アンモニウムである、請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
前記ハロカーボンが、１−ブロモ−３−クロロプロパン、１−ブロモ−６−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）、クロロジブロモメタン、クロロホルム、２−ヨードプロパン、ポリ（クロロトリフルオロエチレン）、またはこれらの組み合わせである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、１−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ノナノールまたは１−ウンデカノールである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記水不混和性アルコールが、１−ペンタノールまたはシクロペンタノールである、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記ハロカーボンが、ＢＤＣＭまたはポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記洗浄剤が、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）またはサルコシルである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記洗浄剤がＳＤＳである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記水溶液が生物試料である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記生物試料が、試料貯蔵、溶解または抽出組成物を含む変性生物試料である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記生物試料が、唾液、喀痰、頬側スワブ、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブまたは擦過物、口腔洗浄試料、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、精液／精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支、気管または肺洗浄液または吸引液、細胞培養液、細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、または産業廃水を含む、請求項１６または１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記微生物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および／または原生生物を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
塩化アンモニウム、１−ペンタノールおよびブロモジクロロメタンまたはポリクロロトリフルオロエチレンを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
前記塩、前記水不混和性アルコールおよび前記水不混和性のハロカーボンが、別々の容器で提供される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２２】
前記塩、前記水不混和性アルコールおよび前記水不混和性のハロカーボンが、単一の容器で提供される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記水不混和性アルコールおよび前記水不混和性のハロカーボンが、第一の容器で単一の組成物として提供され、前記塩が、別々の第二の容器で提供される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２４】
試料収集容器を追加で含み、前記試料収集容器が必要に応じ、洗浄剤含有溶液を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記非水相が、ほぼ全ての存在する洗浄剤関連タンパク質または洗浄剤結合タンパク質を含み、前記水相が下流の用途での直接使用に好適する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２６】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記酵素阻害物質が、下流の用途の阻害物質である、請求項５に記載のシステム。
【請求項２９】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
還元剤をさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３２】
前記還元剤が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトヘキサノール、メルカプトウンデカノール、ジメルカプトプロパノールまたはメルカプトブタノールである、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
キレート化剤および／または緩衝液をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３４】
前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
親油性染色剤をさらに含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３６】
前記親油性染色剤が、ナイルレッド、９−アントリルジアゾメタン、Ｆｌｕｏｒｏｌ  Ｙｅｌｌｏｗ０８８、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−４−（６−フェニル−１，３，５−ヘキサトリエン−１−イル）フェニルアンモニウム  ｐ−トルエンスルホネート（ＴＭＡ−ＤＰＨ）、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルコロレート、１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン、Ｓｕｄａｎ  ＩＩＩ、Ｓｕｄａｎ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ、Ｎｉｌｅ  ＢｌｕｅクロリドまたはＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂｌｕｅ  ３７である、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記洗浄剤を含む水溶液から洗浄剤を除去する方法であって、前記水溶液を、
ａ．塩；
ｂ．式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；および
ｃ．水不混和性のハロカーボンであって、前記式Ｉのアルコールと混和性であるハロカーボン、
と混合して、２相混合物を形成するステップを含み、ほぼ全ての前記洗浄剤が非水相中に存在する、方法。
【請求項３８】
前記洗浄剤が、陰イオン洗浄剤である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を前記水溶液からさらに除去する、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子がタンパク質である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記洗浄剤および／または洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子が、酵素阻害物質である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アルコールおよび前記ハロカーボンが、前記水溶液と混合される前に、混ぜ合わされる、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記水相を前記２相混合物から分離するステップをさらに含む、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記混合物を遠心処理して前記２相の分離を容易にするステップをさらに含む、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記２相混合物の水相中の塩の濃度が、約３０ｍＭ〜約０．５Ｍである、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ハロカーボンが、前記有機相の密度を前記水相の密度より高めるのに十分な濃度で存在する、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記アルコール中のハロカーボンの濃度が、最大約８０％（ｖ／ｖ）、例えば、約５０％（ｖ／ｖ）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記塩＋前記アルコール＋前記ハロカーボンの合計体積の、前記洗浄剤を含む水溶液の体積に対する比率が、約１：９〜約２：１である、請求項３７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記塩＋前記アルコール＋前記ハロカーボンの合計体積の、前記洗浄剤を含む水溶液の体積に対する比率が、約１：５である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記洗浄剤を含む水溶液が、生物試料である、請求項３７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記生物試料が、試料貯蔵、溶解または抽出組成物を含む変性生物試料である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記生物試料が、唾液、喀痰、頬側スワブ、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブ、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、精液／精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液、細胞培養液、細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、または産業廃水を含む、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記微生物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および／または原生生物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記塩が、アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項３７〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記塩が、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、１−ブチルアミンの酸性塩、１−ペンチルアミンの酸性塩、１−ヘキシルアミンの酸性塩、１−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−ブタノール、１−ヘプタノール、１，２−ヘキサンジオール、１−ヘキサノール、２−ノナノール、１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせである、請求項３７〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ハロカーボンが、１−ブロモ−３−クロロプロパン、１−ブロモ−６−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）、クロロジブロモメタン、クロロホルム、２−ヨードプロパン、ポリクロロトリフルオロエチレン、またはこれらの組み合わせである、請求項３７〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記塩が塩化アンモニウムである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、１−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ノナノールまたは１−ウンデカノールである、請求項３７〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記水不混和性アルコールが、１−ペンタノールまたはシクロペンタノールである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ハロカーボンが、ＢＤＣＭまたはポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項３７〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記洗浄剤が、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）またはサルコシルである、請求項３７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記洗浄剤がＳＤＳである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記塩が塩化アンモニウムであり、前記アルコールが１−ペンタノールであり、前記ハロカーボンがブロモジクロロメタンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項６５】
前記塩が塩化アンモニウムであり、前記アルコールが１−ペンタノールであり、前記ハロカーボンがポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項６６】
前記２相混合物由来の水相の一部を、下流の用途のために直接使用するステップをさらに含む、請求項３７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記酵素阻害物質が、下流の用途の阻害物質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項７０】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
２相組成物であって、
ａ．塩；
ｂ．式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；および
ｃ．水不混和性のハロカーボンであって、式Ｉのアルコールと混和性であるハロカーボン；を、
ｄ．洗浄剤を含む水溶液；と混合して、
水相および非水相を含む２相混合物が形成され、それにより、ほぼ全ての前記洗浄剤が非水相中に存在する、２相組成物。
【請求項７３】
前記洗浄剤が陰イオン洗浄剤である、請求項７２に記載の２相組成物。
【請求項７４】
前記水溶液が、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子をさらに含み、前記２相混合物中で、前記洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子が非水相中に存在する、請求項７２または７３に記載の２相組成物。
【請求項７５】
前記洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子がタンパク質である、請求項７４に記載の２相組成物。
【請求項７６】
前記洗浄剤および／または洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子が、酵素阻害物質である、請求項７４または７５に記載の２相組成物。
【請求項７７】
前記塩が、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項７８】
前記塩が、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、１−ブチルアミンの酸性塩、１−ペンチルアミンの酸性塩、１−ヘキシルアミンの酸性塩、１−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項７７に記載の２相組成物。
【請求項７９】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−ブタノール、１−ヘプタノール、１，２−ヘキサンジオール、１−ヘキサノール、２−ノナノール、１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせである、請求項７２〜７８のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項８０】
前記ハロカーボンが、１−ブロモ−３−クロロプロパン、１−ブロモ−６−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）、クロロジブロモメタン、クロロホルム、２−ヨードプロパン、ポリクロロトリフルオロエチレン、またはこれらの組み合わせである、請求項７２〜７９いずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項８１】
前記塩が塩化アンモニウムである、請求項７８に記載の２相組成物。
【請求項８２】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、１−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ノナノールまたは１−ウンデカノールである、請求項７２〜８１のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項８３】
前記水不混和性アルコールが、１−ペンタノールまたはシクロペンタノールである、請求項８２に記載の２相組成物。
【請求項８４】
前記ハロカーボンが、ＢＤＣＭまたはポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項７２〜８３のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項８５】
前記洗浄剤が、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）またはサルコシルである、請求項７２〜８４のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項８６】
前記洗浄剤がＳＤＳである、請求項８５に記載の２相組成物。
【請求項８７】
前記洗浄剤を含む水溶液が、生物試料である、請求項７２〜８６のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項８８】
前記生物試料が、試料貯蔵、溶解または抽出組成物を含む変性生物試料である、請求項８７に記載の２相組成物。
【請求項８９】
前記生物試料が、唾液、喀痰、頬側スワブ、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブ、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、精液／精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液、細胞培養液、細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、または産業廃水を含む、請求項８７または８８に記載の２相組成物。
【請求項９０】
前記微生物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および／または原生生物を含む、請求項８９に記載の２相組成物。
【請求項９１】
塩化アンモニウム、１−ペンタノールおよびブロモジクロロメタンを含む、請求項７２に記載の２相組成物。
【請求項９２】
塩化アンモニウム、１−ペンタノールおよびポリクロロトリフルオロエチレンを含む、請求項７２に記載の２相組成物。
【請求項９３】
前記水相が、下流の用途での直接使用に好適する、請求項７２〜９２のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項９４】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項９３に記載の２相組成物。
【請求項９５】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項９４に記載の２相組成物。
【請求項９６】
前記酵素阻害物質が、下流の用途の阻害物質である、請求項７６に記載の２相組成物。
【請求項９７】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項９６に記載の２相組成物。
【請求項９８】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項９７に記載の２相組成物。
【請求項９９】
還元剤をさらに含む、請求項７２〜９８のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項１００】
前記還元剤が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトヘキサノール、メルカプトウンデカノール、ジメルカプトプロパノールまたはメルカプトブタノールである、請求項９９に記載の２相組成物。
【請求項１０１】
キレート化剤および／または緩衝液をさらに含む、請求項７２〜１００のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項１０２】
前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１０１に記載の２相組成物。
【請求項１０３】
親油性染色剤をさらに含む、請求項７２〜１０２のいずれか１項に記載の２相組成物。
【請求項１０４】
前記親油性染色剤が、ナイルレッド、９−アントリルジアゾメタン、Ｆｌｕｏｒｏｌ  Ｙｅｌｌｏｗ０８８、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−４−（６−フェニル−１，３，５−ヘキサトリエン−１−イル）フェニルアンモニウム  ｐ−トルエンスルホネート（ＴＭＡ−ＤＰＨ）、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルコロレート、１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン、Ｓｕｄａｎ  ＩＩＩ、Ｓｕｄａｎ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ、Ｎｉｌｅ  ＢｌｕｅクロリドまたはＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂｌｕｅ  ３７である、請求項１０３に記載の２相組成物。
【請求項１０５】
前記洗浄剤を含む水溶液から洗浄剤を除去するためのキットであって、
ａ．塩；
ｂ．式Ｉ：
Ｒ１−ＯＨ      Ｉ
（式中、Ｒ１は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式Ｃ４−Ｃ１２アルキルである）の水不混和性アルコール；
ｃ．水不混和性のハロカーボンであって、前記式Ｉのアルコールと混和性であるハロカーボン、
ｄ．少なくとも１種の試薬容器；および場合により、
ｅ．使用説明書、を含むキット。
【請求項１０６】
前記洗浄剤が、陰イオン洗浄剤である、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
さらに、洗浄剤関連分子および／または洗浄剤結合分子を前記水溶液から除去するためである、請求項１０５または１０６に記載のキット。
【請求項１０８】
前記洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子がタンパク質である、請求項１０７に記載のキット。
【請求項１０９】
前記洗浄剤および／または洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子が酵素阻害物質である、請求項１０７または１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
前記塩が、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項１０５〜１０９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１１】
前記塩が、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−ｎ−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−ｎ−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、１−ブチルアミンの酸性塩、１−ペンチルアミンの酸性塩、１−ヘキシルアミンの酸性塩、１−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項１１０に記載のキット。
【請求項１１２】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−ブタノール、１−ヘプタノール、１，２−ヘキサンジオール、１−ヘキサノール、２−ノナノール、１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせである、請求項１０５〜１１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１３】
前記ハロカーボンが、１−ブロモ−３−クロロプロパン、１−ブロモ−６−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン（ＢＤＣＭ）、クロロジブロモメタン、クロロホルム、２−ヨードプロパン、ポリクロロトリフルオロエチレン、またはこれらの組み合わせである、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１４】
前記塩が塩化アンモニウムである、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１５】
前記水不混和性アルコールが、１−ブタノール、１−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ノナノールまたは１−ウンデカノールである、請求項１０５〜１１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１６】
前記水不混和性アルコールが、１−ペンタノールまたはシクロペンタノールである、請求項１１５に記載のキット。
【請求項１１７】
前記ハロカーボンが、ＢＤＣＭまたはポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項１０５〜１１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１８】
前記洗浄剤が、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）またはサルコシルである、請求項１０５〜１１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１９】
前記洗浄剤が、ＳＤＳである、請求項１１８に記載のキット。
【請求項１２０】
前記洗浄剤を含む水溶液が生物試料である、請求項１０５〜１１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２１】
前記生物試料が、試料貯蔵、溶解または抽出組成物を含む変性生物試料である、請求項１２０に記載のキット。
【請求項１２２】
前記生物試料が、唾液、喀痰、頬側スワブ、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブ、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、精液／精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液、細胞培養液、細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、または産業廃水を含む、請求項１２０または１２１に記載のキット。
【請求項１２３】
前記微生物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および／または原生生物を含む、請求項１２２に記載のキット。
【請求項１２４】
塩化アンモニウム、１−ペンタノールおよびブロモジクロロメタンを含む、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１２５】
塩化アンモニウム、１−ペンタノールおよびポリクロロトリフルオロエチレンを含む、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１２６】
試料収集容器をさらに含む、請求項１０５〜１２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２７】
下流の用途で直接使用するための、請求項１０５〜１２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２８】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項１２７に記載のキット。
【請求項１２９】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項１２８に記載のキット。
【請求項１３０】
前記酵素阻害物質が、下流の用途の阻害物質である、請求項１０９に記載のキット。
【請求項１３１】
前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項１３０に記載のキット。
【請求項１３２】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項１３１に記載のキット。
【請求項１３３】
還元剤をさらに含む、請求項１０５〜１３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３４】
前記還元剤が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトヘキサノール、メルカプトウンデカノール、ジメルカプトプロパノールまたはメルカプトブタノールである、請求項１３３に記載のキット。
【請求項１３５】
キレート化剤および／または緩衝液をさらに含む、請求項１０５〜１３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３６】
前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１３５に記載のキット。
【請求項１３７】
親油性染色剤をさらに含む、請求項１０５〜１３６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３８】
前記親油性染色剤が、ナイルレッド、９−アントリルジアゾメタン、Ｆｌｕｏｒｏｌ  Ｙｅｌｌｏｗ０８８、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−４−（６−フェニル−１，３，５−ヘキサトリエン−１−イル）フェニルアンモニウム  ｐ−トルエンスルホネート（ＴＭＡ−ＤＰＨ）、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルコロレート、１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン、Ｓｕｄａｎ  ＩＩＩ、Ｓｕｄａｎ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ、Ｎｉｌｅ  ＢｌｕｅクロリドまたはＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂｌｕｅ  ３７である、請求項１３７に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
洗浄剤除去のために、本システム、方法および組成物に有用な水不混和性アルコールの例には、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−ブタノール、１−ヘプタノール、１，２−ヘキサンジオール、１−ヘキサノール、２−ノナノール、１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【国際調査報告】
2019519228.tif 000027
2019519228.tif 000028
2019519228.tif 000029
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