(57)【要約】本発明は、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）の、膀胱癌、特に非神経内分泌性膀胱癌、そして、好ましくは尿路上皮癌のためのマーカー（特に、予後診断のマーカー）としての使用に関する。  特に、ＣｇＡは、膀胱癌（特に、非神経内分泌性膀胱癌、好ましくは、尿路上皮癌）の、予後診断、リスク評価、リスク層別化（ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、モニタリングおよび／または治療制御のための、インビトロアッセイにおけるマーカーとして使用することができる。  本発明はさらに、被験体における膀胱癌（特に、非神経内分泌性膀胱癌、好ましくは尿路上皮癌）の、予後診断、リスク評価、リスク層別化（ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、モニタリングおよび／または治療制御のための方法に関し、前記被験体の体液のサンプルにおける、ＣｇＡおよび場合によりＭＭＰ７のレベル決定するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱癌の予後診断マーカー（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ）としての、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）の使用。
【請求項２】
被験体の体液のサンプルにおける、ＣｇＡのレベルを決定するステップを含む、被験体の膀胱癌の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）、リスク評価、リスク層別化（ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、モニタリングおよび／または治療のコントロールのための方法。
【請求項３】
前記膀胱癌が、非神経内分泌性（ｎｏｎ−ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ）膀胱癌である、請求項１に記載の使用または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
膀胱癌が、膀胱の尿路上皮癌、膀胱の扁平上皮癌、および膀胱の腺癌、好ましくは膀胱癌が、膀胱尿路上皮癌（ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌａｄｄｅｒ．）、からなる群から選択される、請求項１に記載の使用または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
被験体由来のサンプル中のＣｇＡのレベルが、膀胱癌の重篤度および／または被験体に対する転帰（ｏｕｔｃｏｍｅ）の指標である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
対照レベルまたは所定の閾値と比較して、被験体由来のサンプル中のＣｇＡの増加のレベルが、被験体の不良転帰（ｐｏｏｒ  ｏｕｔｃｏｍｅ）の指標となる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被験体由来のサンプル中のＣｇＡのレベルが、被験体の全生存、または被験体の疾患特異的な生存または被験体の癌が進行しない生存（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）の指標である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
予後不良が、外科的治療および／または薬物治療および／または放射線療法後の、平均余命の減少によるリスクの増加、進行のリスクの増加、癌関連死のリスクの増加および／または再発のリスクの増加である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＣｇＡレベルの既定の閾値が、１００ｎｇ／ｍＬ〜４３１ｎｇ／ｍＬの範囲、好ましくは１０３ｎｇ／ｍＬ〜１９１ｎｇ／ｍＬの範囲、より好ましくは１３０ｎｇ／ｍＬ〜１６０ｎｇ／ｍＬ、そして最も好ましくは、閾値が１４７ｎｇ／ｍＬである、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体の前記サンプルにおいて、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ７）のレベルが、追加で決定され、そして、被験体由来のサンプル中のＭＭＰ７のレベルが、膀胱癌の重篤度および／または被験体の転帰の指標である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（１）既定のＣｇＡの閾値以上の、前記サンプルにおけるＣｇＡのレベルが、外科的処置および／または薬物治療および／または放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）後の癌関連死の高いリスクの指標であり、そして、
（２）既定のＣｇＡの閾値以上の、前記サンプルにおけるＣｇＡのレベルおよび既定のＭＭＰ７の閾値以上の、前記被験体の前記サンプルまたは他のサンプルにおけるＭＭＰ７のレベルが、外科的処置および／または薬物治療、および／または放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）後の、癌関連死およびより短い寿命の非常に高いリスクの指標である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＣｇＡおよび場合によりＭＭＰ７のレベルが、フォローアップ期間中の定期的な時間間隔で決定され、そして、制御レベルは、前記外科的処置および／または薬物治療、および／または放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）の前、および／または、フォローアップ期間の最初のステップ時に決定された、それぞれのレベルである、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
膀胱癌が、非筋肉浸潤性膀胱癌（ＮＭＢＣ）または筋肉浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
サンプルが、全血、血清、血漿および尿から選択される体液に由来する、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＣｇＡのレベルが、イムノアッセイを使用して決定される、請求項２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床診断の分野にある。特に、本発明は、マーカーとしての、クロモグラニン  Ａ（ＣｇＡ）に基づく、膀胱癌の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）、リスク評価、リスク層別化（ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、モニタリングおよび／または治療のコントロールに関する。
【発明の背景】
【０００２】
膀胱癌（泌尿器膀胱癌）は、尿路（ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ）の最も一般的な悪性疾患である。
新たに診断された症例および再発率（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｒａｔｅ）が高いことを考慮すると、膀胱癌は世界で最も一般的な（ｐｒｅｖａｌｅｎｔ）癌の１つである（Ｃｈａｍｉｅら、２０１１年、Ｇｏｏｄｉｓｏｎ、Ｒｏｓｓｅｒ  ａｎｄ  Ｕｒｑｕｉｄｉ  ２０１３年）。
西洋諸国はより影響を受けており、そして、男性は女性に比べて発症リスクが３−４倍高い（Ｂｕｒｇｅｒら、２０１３年ａ）。
癌になる細胞に基づいて、異なるタイプの膀胱癌を区別することができる。
最も一般的なタイプの膀胱癌は、転移性細胞癌（９０％）、続いて扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）（２〜５％）である。
膀胱癌の１％未満は、神経内分泌性（ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ）細胞（Ｂｅｒｔａｃｃｉｎｉら、２００８年；Ｐｏｍｐａｓ−Ｖｅｇａｎｚｏｎｅｓ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−ＰｅｒａｍａｔｏおよびＳａｎｃｈｅｚ−Ｃａｒｂａｙｏ、２０１４年）から生じる。
診断時に、約７０−７５％の患者が、非筋浸潤性膀胱癌（ＮＭＩＢＣ）としても知られる、表在性膀胱癌（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）（段階Ｔａ−Ｔ１）を有する。
患者の２５〜３０％が、筋肉浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ、段階Ｔ２〜Ｔ４）および／または転移性膀胱癌（Ｃｌａｒｋら、２０１３年、ＭｏｓｓａｎｅｎおよびＧｏｒｅ、２０１４年）を有する。
膀胱癌の再発率および／または進行は、治療後５〜７年以内に疾患の再発、進行または新たな発生が見られるＮＭＩＢＣ患者は５０〜７０％と、劇的に高く（Ｃｌａｒｋら、２０１３年）および１０％〜３０％のこれらの再発が侵襲的である（Ｃｈａｍｉｅら、２０１１年；Ｇｏｏｄｉｓｏｎら、２０１３年；Ｗｉｔｊｅｓら、２０１４年）。
ＭＩＢＣ症例の約半分（４３％）は、診断時に非侵襲性腫瘍を有し、臓器保存治療（筋肉浸潤性および転移性膀胱癌に関するＥＡＵガイドライン２０１４年）にも拘らず、進行した。
【０００３】
現在、膀胱癌の診断およびサーベイランスの基礎は、膀胱鏡検査中の膀胱尿路上皮（ｂｌａｄｄｅｒ  ｕｒｏｔｈｅｌｉｕｍ）からの生検の組織病理学的検査（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）／膀胱腫瘍（ＴＵＲＢＴ）の経尿道的切除（Ｔｒａｎｓ−Ｕｒｅｔｈｒａｌ  Ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｔｕｍｏｒ）である。
白色光膀胱鏡検査は、臨床医の手の中にある有用な診断ツールであるが、主な制限を受ける。
確かにそれは、しばしば、不十分な治療につながる可能性のある、腫瘍の過小評価（ｕｎｄｅｒｓｔａｇｅｓ）を齎す（Ｃａｕｂｅｒｇ  Ｅｖｅｌｙｎｅ、  ｄｅ  ｌａ  Ｒｏｓｅｔｔｅ  およびｄｅ  Ｒｅｉｊｋｅ、２０１１年）。
それは、適度に感度が良く、高価で、そして、侵襲的である。
膀胱壁穿孔（ｏｂｔｕｒａｔｏｒ  ｒｅｆｌｅｘ  ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ）、出血、ＴＵＲ症候群、尿管閉塞（ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、穿孔（腹腔外または腹腔内）および感染症のような非常に稀な合併症が、この処置中に起こり得る。
排出された尿細胞診（Ｖｏｉｄｅｄ  Ｕｒｉｎｅ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ）（ＶＵＣ）はまた、分化度の高い腫瘍（低悪性度）において、特異性は高いが感度は低い、筋層非浸潤性膀胱癌（ＮＭＩＢＣ）の診断およびサーベイランスに広く使用されている方法である。
その精度は、早期腫瘍（ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ  ｔｕｍｏｒ）においては、わずか２０〜４０％の範囲である（ＡＵＡ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、２００７−２０１４、Ｇｏｏｄｉｓｏｎら、２０１３年）。
これは、高悪性度の腫瘍、特に、ｉｎ  ｓｉｔｕの癌腫（Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）については、より良い精度を示した。この機能により、経尿道的（ｔｒａｎｓｕｒｅｔｈｒａｌ）切除（ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ）の補完的ツールになる（下記参照）。
膀胱鏡検査およびＶＵＣは、数、タイプ、悪性度および推定段階を含む、腫瘍の特徴の最初の診断および最初の評価を可能にする。
最初の腫瘍の評価には、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用することもできる。しかし、４０％までの症例では、その病気を過小評価し、そして、非侵襲性から侵襲性を区別する精度が良好であると報告されていても、腫瘍段階Ｔａ〜Ｔ３ａ（精度は、５５〜９２％の範囲）の間で、わずかに（ｍａｒｇｉｎａｌｌｙ）差別化できるにすぎない（Ｍａｕｒｅｒら、２０１３年）。
転移性の状態、そして、特にリンパ節（ｎｏｄａｌ）の状態の評価は、膀胱癌の予後評価の重要なポイントである。
リンパ節転移は、筋層非浸潤性膀胱癌では５〜１０％の低いレートから、表在筋肉浸潤腫瘍では１５〜２０％に、深部筋浸潤腫瘍では２５〜３０％に、そして、膀胱外（ｅｘｔｒａｖｅｓｉｃａｌ）腫瘍では＞４０％まで増加する（Ｓｈａｒｉａｔら、２０１２年）。
遠隔または局所の転移性膀胱癌の診断は、主として、Ｘ線撮影、超音波検査、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む、様々な画像化技術に基づいている。
超音波検査は、最も簡単で、最も非侵襲的で、そして、費用対効果が高いが、オペレーターのスキルに依存する。
ＣＴやＭＲＩもまた、非侵襲性であり、そして、これらの技術の感度は近年向上しているが、その性能は不十分である。
最初の診断が、転移性の状態にかかわらず、膀胱癌に陽性である場合、膀胱腫瘍の経尿道切除術（Ｔｒａｎｓ−Ｕｒｅｔｈｒａｌ  Ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｔｕｍｏｒ）（ＴＵＲＢＴ）は実行される。
この治療法は、腫瘍全体の内視鏡的切除を特徴とする初期治療段階である。
それは、診断を確定し、そして、腫瘍段階、特に膀胱壁浸潤の深さ、のより正確な評価を許容する。
しかし、ＴＵＲＢＴは、特に、Ｔ１腫瘍について、過小評価（ｕｎｄｅｒｓｔａｇｉｎｇ）の重大なリスクを伴う（Ｂａｂｊｕｋ、２００９年）。
さらに、不完全切除術を施行した場合、初年度に再発性腫瘍の増殖が認められる（Ｋａｍａｔら、２０１３年、Ｂａｂｊｕｋ、２００９年）。
この理由から、繰り返すＴＵＲＢＴまたは最大ＴＵＲＢＴが、ガイドラインによって、強く推奨されている（Ｂｒａｕｓｉら、２０１１年）。
【０００４】
ＮＭＩＢＣの患者は、多くの場合、安全に、追加の治療手段（たとえば、免疫療法、化学療法）の有無にかかわらず、「完璧」なＴＵＲＢＴｓで管理することができるが、両側骨盤リンパ節郭清（ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｐｅｌｖｉｃ  ｌｙｍｐｈ−ｎｏｄｅ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）（ＰＬＮＤ）を用いた、根治的膀胱切除術（ＲＣＥ）が、ＭＩＢＣの患者のケアの標準となっている（Ｃｌａｒｋら、２０１３年；Ｗｉｔｊｅｓら、２０１４年）。
いくつかのネオアジュバント化学療法は、生存期間についての利点を示しており（Ｓｈａｒｍａ、ＫｓｈｅｅｒｓａｇａｒおよびＳｈａｒｍａ、２００９年）、そして、選択された患者に推奨されている。
ＲＣＥはまた、高い悪性度および／または難治性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）ＮＭＩＢＣ、および上皮内癌（Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ）（ＣＩＳ）に推奨されている。
たくさんの根治的（ｒａｄｉｃａｌ）手術を受けた患者は、尿路変更（ｕｒｉｎａｒｙ  ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ）または新生膀胱再建（ｎｅｏ−ｂｌａｄｄｅｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を受ける。
国立癌包括的ネットワーク（ＮＣＣＮ）のガイドラインは、病理学的に推定されるリスクが最も高い、リンパ節転移陰性の患者が、放射線増感療法または化学療法を用いた、補助的な追加放射線療法を受けることを推奨している。
しかし、これらの追加の治療法は、毒性および合併症（ｃｏｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）を改善する可能性がある（Ｃｌａｒｋら、２０１３年）。
膀胱癌（ＢＣａ）全体における（すべての段階および悪性度）、ＲＣＥ単独に続いて、５年間の全体、再発なし、および、癌特異的生存率は、それぞれ、３７％および６％の遠隔および局所再発率を有する、それぞれ、わずか５７％、４８％および６７％であった（Ｙａｆｉら、２０１１年）。
ＭＩＢＣの事例において、標準的な骨盤リンパ節郭清（ＰＬＮＤ）の患者の生存に及ぼす利点は、大部分が実証されており、そして、ＰＬＮＤは、今日、合意して（ｃｏｎｓｅｎｓｕａｌｌｙ）、ガイドラインで推奨されているＲＣの不可欠な部分である。
しかし、外科的単独療法戦略におけるその利点は、中程度であり、そして、リンパ節切除（ｌｙｍｐｈａｄｅｎｅｃｔｏｍｙ）（ＬＮＤ）は、しばしば、治療的というよりも、より診断的／予後診断的（結節の状態を提供するかもしれない）であると考えられている（ＳｋｉｎｎｅｒおよびＳａｇａｌｏｗｓｋｙ、２０１４年）。
実際、局所ＬＮＤは、現在のイメージング技術の感度の限界のために、ステージング（ｓｔａｇｉｎｇ）に必要なステップである。
手術技術、造影、周術期管理（ｐｅｒｉｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）および療法における進歩にもかかわらず、約５０％の患者が転移を起こし、そして、膀胱癌で死亡する（Ｓｔｅｉｎ  ＪＰ、Ｓｋｉｎｎｅｒ  ＤＧ、２００６年）。
次いで、ネオアジュバント術前補助療法／補助（ａｄｊｕｖａｎｔ）化学療法または放射線療法、およびＰＬＮＤまたは拡張（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ＬＮＤは、高リスクの患者の生存を改善すると考えられている（ＳｋｉｎｎｅｒおよびＳａｇａｌｏｗｓｋｙ、２０１４年）。
しかしながら、毒性の増加、併存疾患のリスクおよびコストのために、これらの重い介入の利益は、生活の質の変化および、出血、神経損傷、リンパ瘤（ｌｙｍｐｈｏｃｅｌｅ）または肢血栓（ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ）を含む潜在的な合併症と完全にバランスをとらなければならない（Ｓｃａｒｐａｔｏら、２０１５年）、そして、最もリスクが高い事例に専念しなければならない。
高度な悪性腫瘍のこの種の課題の一つは、どの患者についてどの治療？という質問に答えることである。
【０００５】
ＬＮＤの有無に拘わらず、ＲＣＥに続いて、螺旋（Ｈｅｌｉｃａｌ）ＣＴは、肺、リンパ節、および肝転移を識別するために、選択すべき画像診断法（ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｏｄａｌｉｔｙ）を表し（ＩＣＵＤ−ＥＡＵ膀胱癌、２０１２年版）、そして、ＥＡＵガイドラインは、最初の年の間、３〜４月毎、３年目まで６月毎の、腹部、上部尿路（ＵＵＴ）、骨盤スキャンおよび胸部Ｘ線撮影またはＣＴ（Ｓｈａｒｍａら、２００９年）、そして、この期間後は、臨床的に指摘されているように、毎年撮像することにより、モニタリングすることを推奨する。
皮膚尿路転換（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ）（ＵＤ）を伴うＲＣＥについては、６〜１２ヶ月毎の尿路洗浄細胞診（ｕｒｅｔｈｒａｌ  ｗａｓｈ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ）がまた推奨されている（Ｓｈａｒｍａら、２００９年）。
根治的膀胱切除術のフォローアップのための頻度と方法は、ガイドライン間で厳密に合意されているわけではないが、わずかに異なるだけである。
【０００６】
遠隔再発（Ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）は、最も重要な危険因子として、より高い段階とリンパ節の状態を伴い、２４ヶ月以内に通常発生する。
骨盤内再発は、手術後６〜１８ヶ月で、典型的に起こり（患者の５〜１５％）、初期段階およびリンパ節の状態に再び依存する。
二次性尿道腫瘍はまれであり、膀胱切除後１〜３年で発生し、そして、生存率が低い。
上部尿路再発は、ほとんど見られず、そして、通常は、遅く（膀胱摘除術後２８〜４９ヶ月）現れる（Ｗｉｔｊｅｓら、２０１４年）。
最後に、ＲＣＥに続いて、１０年以上経過した後に、遅く再発する可能性があり、患者体もまた非常に長期のサーベイランスが必要である。
【０００７】
ＮＭＩＢＣおよびＭＩＢＣの両方における予後の異質性のために、膀胱癌のためのガイドラインは、より良い予後予測の重要性およびアンメットニーズを強調する（ＥＡＵガイドライン）。
ＮＭＩＢＣについては、治療および／またはフォローアップについての判断を改善するために、リスク表が入手可能である（Ｖｅｄｄｅｒら、２０１４年）。
ＥＡＵおよびＡＵＡガイドラインで推奨されている、癌研究および治療のための欧州機関（ＥＯＲＴＣ）スコアリングシステムは、しかしながら、毎日のルーチンにはめったに使用されていない。
これらのモデルはしっかりと信頼できるものではなかった、ことが、最近の多くの出版物において示されている。たとえば、Ｖｅｄｄｅｒらは、スコアリングシステムは、合理的に、進行を予測できるが、再発は予測できないと発表した（Ｖｅｄｄｅｒら、２０１４年）。
ＥＯＲＴＣの表による、再発および進行リスクの過大評価もまた、ＮＭＩＢＣ、また、ＢＣＧで治療したサブグループにおいても実証されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｍｅｚら、２０１１年）。
最後に、Ｘｙｌｉｎａｓらは、ＥＯＲＴＣのスコアリングシステムは、再発および進行の両方について、不十分な（ｐｏｏｒ）識別を示し、そして、現在の予測ツールを改善するための必要性を強調した（Ｘｙｌｉｎａｓら、２０１３年）。
今日まで、ＭＩＢＣの予後を具体的に評価して、治療選択を導くための、表またはスコアリングシステムはない。
局所リンパ節における転移の存在は、ＭＩＢＣの患者における、腫瘍再発および疾患−特異的生存（ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）（ＤＳＳ）の最も強力な予測因子である（ＳｋｉｎｎｅｒおよびＳａｇａｌｏｗｓｋｙ、２０１４年）。
しかし、表面腫瘍のおよそ半分は、イメージングツールで検出されない微小転移を有することがあり、一方、根治的外科手術の患者のわずか２５％のみが、手術時にリンパ節（ＬＮ）転移を有する（Ｓｖａｔｅｋら、２０１０年）（筋肉浸潤性および転移性膀胱癌に関するＥＡＵガイドライン、２０１４年）。
ＣＩＳの根治的膀胱摘除術後の疾患特異的生存率（ＤＳＳ）が、８５％〜９０％の範囲であっても、早期根治的膀胱摘除術は、約５０％の患者で過度の治療と見なすことができる（Ｂｕｒｇｅｒら、２０１３年ｂ）。
【０００８】
膀胱癌は、大規模な（ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ）治療アルゴリズム（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（連続的な化学的または生物学的治療、放射線療法および外科的介入）および広範な長期の監視（ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）が必要な異種新生物である。
類似の組織学を有する腫瘍は、異なる臨床的挙動を有し得、そして、これらの微妙な差（ｎｕａｎｃｅｓ）は適切な管理に必須である。
その複雑さは、直接的および間接的な経済的負担を齎し、患者単位で、生涯医療経費の観点で、それを最も高価な悪性腫瘍とする（Ｂｒａｕｓｉ、２０１３年；Ｃｈａｍｉｅら、２０１１年；Ｇｏｏｄｉｓｏｎら、２０１３年；ＭｏｓｓａｎｅｎおよびＧｏｒｅ、２０１４年）。
２０１０年には、ＢＣａのための医療費は、主要なコスト要素（５８％を占める）である直接入院治療を含め、米国においては、約４ビリオンＵＳＡドル（Ｍｏｓｓａｎｅｎおよびゴア、２０１４年）、そして、２０１２年、欧州連合（ＥＵ）では、３ビリオンユーロであった。
ＥＵにおける、世界的な経済的負担は、５ビリオンユーロであった（Ｌｅａｌら、２０１５年）。
米国では、ＢＣａの寿命までの個々の管理のための推定コストは、＄９６０００から＄２８００００の範囲である（Ｈａｎｓｅｌら、２０１３年）。
ＭＩＢＣ診断に関連する医療費は、およそ１５万ＵＳドルであるが、初期段階の病気の長期にわたる（ｐｒｏｔｒａｃｔｅｄ）臨床経過、ＭＩＢＣに対する、相対的有病率およびその手順指向の監視（ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）のために、ＮＭＩＢＣの経済的負担は、一般的に、さらに上昇していると考えられている（Ｓｖａｔｅｋら、２０１４年）。
腫瘍段階を下に見ること（ｕｎｄｅｒｓｔａｉｎｇ）は、現在の診断および予後判定ツールの主な制限である。
さらに、今日まで、ＭＩＢＣへのＮＭＩＢＣの進行を予測する信頼できるツールはなく、ＭＩＢＣの結果を予測するものもない。
【０００９】
膀胱癌患者の予後診断またはリスク層別化（ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のためのバイオマーカーの使用は、医師が適切な治療を開始し、そして、患者の監視（ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）に伴う費用を削減するのに役立つだろう。
いくつかの市販の尿マーカーは、膀胱癌の診断および／またはフォローアップに関して、ＦＤＡの承認を受けているが、臨床診療に浸透（ｐｅｎｅｔｒａｔｅ）していない。
対照的に、現在のところ、血液または尿中の予後診断マーカーは、国の保健機関によって承認されておらず、また、いかなるガイドラインによって推奨されていない。
これは、ＢＣＡのグローバルなリスクベースの管理戦略と一貫していない。
【００１０】
最近の大規模なメタアナリシス（Ｓｃｈｍｉｔｚ−Ｄｒａｇｅｒら、２０１５年）では、市販されている最も一般的に使用されているマーカー（ＢＴＡ  Ｓｔａｔ（登録商標）、Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃｈｅｃｋ（登録商標）を含む、ＮＭＰ２２、および、ＦＩＳＨ  Ｕｒｏｖｙｓｉｏｎ（商標））の性能をＶＵＣと比較した。
これらの分子マーカーが、予後診断の適用が実証されていないにも拘らず、特に、高リスクの腫瘍（ｐＴ１Ｇ３、ＣＩＳ）に対して、尿細胞診よりもはるかに優れた感受性を有することを確認した。しかしながら、また、そのようなマーカーのより低い特異性および再現性が大きな制限であることも確認された。
さらに、これらのマーカーは予後診断の価値を有していなかった。
【００１１】
クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）は、一般的に、神経内分泌性（ＮＥ）細胞中で発現される糖タンパク質である。ＣｇＡは、ほとんどのペプチド産生内分泌性細胞（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ）の分泌顆粒（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｇｒａｎｕｌｅｓ）の構成成分である（ＣｈｕａｎｇおよびＬｉａｏ、２００３年）。
それは、エキソサイトーシスによって生理学的に放出され、血液中で検出することができる。
腫瘍が、神経内分泌性組織において発症する場合、それは、ＣｇＡを循環させる主な源となる。
膀胱内でのＣｇＡ分泌は、予後不良であることが知られている、神経内分泌腺分化型腫瘍（ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ）のまれな症例と関連している（Ａｌｉｊｏ  Ｓｅｒｒａｎｏら、２００７年；Ｂｅｒｔａｃｃｉｎｉら、２００８年）。
神経内分泌性組織マーカー、たとえばＣｇＡは、神経内分泌性癌（ＮＥＣ）および移行上皮癌（ＴＣＣ）の間の区別のために頻繁に使用され、そして、ＮＥＣの診断を確認するため、そして、特に小細胞膀胱癌（ＳＣＢＣ）（Ｂｅｒｔａｃｃｉｎｉら、２００８年；Ｃｅｒｕｌｌｉら、２０１２年；Ｉｃｚｋｏｗｓｋｉら、１９９９年）や傍神経節腫（Ｂａｇｃｈｉら、２０１５年；Ｆｅｎｇら、２０１３年）のために使用される。
しかし、ＣｇＡは、神経内分泌性膀胱癌（ＮＥＢＣ）の組織において発現されることが実証されているが、今日まで、何らの研究も、神経内分泌、および、尿路上皮ＢＣＡにおける、組織および血清ＣｇＡのレベルの予後の効果を評価していない。
さらに、小細胞および移行細胞の両方の存在は、いずれの転帰をも予測させなかった（ＣｈｕａｎｇおよびＬｉａｏ、２００３年）。
Ｃｈｕａｎｇらは、ＣｇＡが、１０のＳＣＢＣ組織サンプルのうちの４つで発現されることを示したが、患者の予後との関連は認められなかった。
しかし、少ない事例数と異種のコホート（ｃｏｈｏｒｔ）のために、本研究の信頼性は限られた（ＣｈｕａｎｇおよびＬｉａｏ、２００３年）。
ＣｇＡは、大細胞および小細胞神経内分泌性膀胱癌における生存との関係を何ら示されなかった。１つの研究では、生存のための唯一の予後因子は、ＴＮＭ分類であった（Ａｌｉｊｏ−Ｓｅｒｒａｎｏ、２００７年）。筆者は、ＣｇＡが、予後診断の目的のために有用であると考えなかった。
さらに、Ｓｏｕｋｕｐらは、最近、尿のＣｇＡは、一次ＮＭＩＢＣの存在にも、癌の再発にも関連していないことを見出した（Ｓｏｕｋｕｐら、２０１５年）。それにもかかわらず、Ｂｅｒｔａｃｃｉｎｉらは、小細胞尿路上皮癌（ＳＣＵＣ）についての、膀胱前立腺切除術（ｃｙｓｔｏｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ）後１ヶ月、ＣｇＡの血清レベルが、術前のレベルと比較して、１０倍減少することを見出したが、術前の予後診断値も、フォローアップ値も評価しなかった（Ｂｅｒｔａｃｃｉｎｉｅｔａｌ、２００８年）。
【００１２】
マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ７）は、血清および尿中における、リンパ節の転移についての独立したマーカーとして（Ｇｕｎｅｓら、２０１３年；Ｊａｇｅｒら、２０１３年；Ｓｚａｒｖａｓら、２０１０年；Ｓｚａｒｖａｓら、２０１１年ｂ）、そしてまた、ＢＣａの術前の独立した予後診断マーカーとして（Ｓｖａｔｅｋら、２０１０年；Ｓｚａｒｖａｓら、２０１０年；Ｓｚａｒｖａｓら、２０１１年ａ）記載されてきた。
高いＭＭＰ−７のレベルはまた、特定の転移性膀胱癌における生存率の低い、独立した危険因子としても記載されてきた（Ｅｌ  Ｄｅｍｅｒｙら、２０１４年）。ＷＯ２００７／１４４１４４Ａ１も参照。
【００１３】
本発明は、クロモグラニン  Ａ（ＣｇＡ）が、非神経内分泌性膀胱癌において、高い予後診断値を有するという驚くべき知見に基づいている。
このようにして、膀胱癌のための先行技術の診断ツールの上記の欠点を克服するのを助けることができる。
【００１４】
発明の概要
本発明は、膀胱癌、特に非神経内分泌性膀胱癌、そして、好ましくは、尿路上皮癌のマーカーの（特に、予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ）マーカーとしての）、クロモグラニン  Ａ（ＣｇＡ）の使用にも関する。
特に、ＣｇＡは、膀胱癌、特に非神経内分泌性膀胱癌、そして、好ましくは尿路上皮癌の、予後診断、リスク評価、リスク層別化（ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、モニタリングおよび／または治療制御のためのインビトロアッセイにおけるマーカーとして使用することができる。
【００１５】
本発明は、さらに、被験体において、膀胱癌、特に、非神経内分泌性膀胱癌、そして好ましくは、尿路上皮癌の、予後診断、リスク評価、リスク層別化（ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、モニタリングおよび／または治療制御、のための方法にも関し、前記被験体の体液のサンプルにおける、ＣｇＡおよび場合によりＭＭＰ７のレベルを決定するステップを含む。
さらに、本発明は、被験者の、膀胱癌、特に非神経内分泌性膀胱癌、そして、好ましくは尿路上皮癌の予後診断、リスク評価、リスク層別化（ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、モニタリングおよび／または治療制御のために、ＣｇＡに特異的な１つまたは複数の抗体を含む診断キットの使用に関する。
本発明はまた、前記被験体からのサンプルにおける、ＣｇＡレベルが決定される、被験体における、膀胱癌、特に非神経内分泌性膀胱癌、そして、好ましくは、尿路上皮癌を治療する方法、に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、対照および事例におけるＣｇＡの血清濃度を示す。
【図２−１】図２は、手術で治療した（ＴＵＲＢＴまたはＲＣＥ）の患者における、ＣｇＡおよびＭＭＰ−７レベルならびにそれらの組み合わせの予後診断値（対数ランク検定（ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔｓ）を用いたＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線）を示す。ＤＳＳは、疾患特異的生存を示す。
【図２−２】図２は、手術で治療した（ＴＵＲＢＴまたはＲＣＥ）の患者における、ＣｇＡおよびＭＭＰ−７レベルならびにそれらの組み合わせの予後診断値（対数ランク検定（ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔｓ）を用いたＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線）を示す。ＤＳＳは、疾患特異的生存を示す。
【図３−１】図３は、ＲＣＥ治療患者のサブグループにおける、ＣｇＡおよびＭＭＰ７レベルならびにそれらの組み合わせの予後診断値（対数ランク検定（ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔｓ）を用いたＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線）を示す。
【図３−２】図３は、ＲＣＥ治療患者のサブグループにおける、ＣｇＡおよびＭＭＰ７レベルならびにそれらの組み合わせの予後診断値（対数ランク検定（ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔｓ）を用いたＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線）を示す。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、膀胱癌（特に、非神経内分泌性膀胱癌、そして、好ましくは尿路上皮癌）のマーカーとして、特に、膀胱癌、特に、非神経内分泌性膀胱癌、好ましくは尿路上皮癌の予後診断マーカーとしての、クロモグラニン  Ａ（ＣｇＡ）の使用に関する。
したがって、ＣｇＡは、膀胱癌、特に非神経内分泌性膀胱癌、好ましくは尿路上皮癌のための予後診断、リスク評価、リスク層別化（ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、モニタリングおよび／または治療制御のためのインビトロアッセイにおいて、マーカーとして使用することができる。
言い換えれば、ＣｇＡは、膀胱癌患者、特に非神経内分泌性膀胱癌患者、好ましくは尿路上皮癌患者における、疾患重症度の評価のための良好なバイオマーカーであることが判明した。
したがって、ＣｇＡは、膀胱癌、特に非神経内分泌性膀胱癌、そして、好ましくは尿路上皮癌を有する患者の管理（「患者管理」）にも使用することができる。
【００１８】
本発明は、膀胱癌を有する被験体（特に、非神経内分泌性膀胱癌を有する被験体、好ましくは、尿路上皮癌を有する被験体）の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）のための方法に関し、前記被験体の体液のサンプル中のＣｇＡ（および場合によりＭＭＰ７）のレベルを測定する工程を含む。
本発明は、特に、被験体における、膀胱癌（特に、非神経内分泌性膀胱癌、好ましくは、尿路上皮癌）の、予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）、リスク評価、リスク層別化（ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、モニタリングおよび／または治療制御のための方法に関し、前記被験体の体液のサンプルにおけるＣｇＡのレベルを決定するステップを含む。
場合により、ＭＭＰ７のレベルは、前記被験体の同一または別のサンプルにおいて、追加で決定される。
被験体からのサンプル中のＣｇＡのレベル（および場合によっては、必要に応じてＭＭＰ７）は、１つの側面では、膀胱癌（特に、非神経内分泌性膀胱癌、好ましくは、尿路上皮癌）の重症度および攻撃性の指標であり、および／または、被験体についての結果である。
対照レベルまたは既定の閾値と比較した、被験体由来のサンプルにおけるＣｇＡ（および場合によっては、必要に応じてＭＭＰ７）の増加レベルは、被験体について不良な転帰の指標である。
たとえば、被験体由来のサンプル中のＣｇＡのレベルは、被験体の全体の生存または被験体の疾患−特異的生存または被験体の無増悪生存（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）の指標である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、最初に、ＣｇＡのレベルが被験体のサンプルにおいて決定され、そして、続いて、もし、ＣｇＡレベルが、同じ被験体の別のサンプル中で既定の閾値を超えている場合には、継続して、更なる試験が行われる。たとえば、その後、ＭＭＰ７のレベルが、ＣｇＡのレベルに基づいて、初期の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）をリファインまたは確認するために決定される。
他の、より好ましい実施形態では、最初に、ＭＭＰ７のレベルが、被験体のサンプル中で決定され、そして、続いて、もし、ＭＭＰ７レベルが、同じ被験体の別のサンプル中で、既定の閾値を上回る場合には、更なる試験が行われる。たとえば、続いて、ＣｇＡのレベルが、ＭＭＰ７レベルに基づいて、初期の予後診断をリファインまたは確認するために決定される。
したがって、ＭＭＰ７およびＣｇＡのレベルは、これらの２つのマーカーのうちの１つのみに基づく、初期の予後診断をリファインするために、一緒に使用することができる。
【００２０】
本発明の文脈における、用語「膀胱癌」（「泌尿器膀胱癌（ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）」とも呼ばれる）は、好ましくは、非神経内分泌起源の膀胱癌に関する。
したがって、好ましくは、「膀胱癌」は神経内分泌性腫瘍（ＮＥＴ）ではない。
用語「神経内分泌」は、神経または内分泌の影響、そして、特に、神経系と内分泌系との間の相互作用に関係する。
特に、用語「神経内分泌」は、神経刺激に応答して、ホルモンを血液中に放出する細胞に関する。
「神経内分泌性癌（Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃａｎｃｅｒｓ）」は、その結果、内分泌性（ホルモンの）および神経系の細胞から生じる悪性の新生物である。
神経内分泌性膀胱癌には、たとえば、小細胞癌（ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＳＣＣ）、カルチノイド腫瘍（ｃａｒｃｉｎｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）および大細胞神経内分泌性癌（ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＬＣＮＥＣ）を含む。したがって、本明細書における「膀胱癌」とは、好ましくは、内分泌（ホルモン）および神経系の細胞から生じたものではない膀胱癌をいう。したがって、本明細書において好適には、膀胱癌は小細胞癌ではなく、カルチノイド腫瘍はなく、そして、大細胞神経内分泌性癌（ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）ではない。
本発明の文脈における膀胱癌は、好ましくは、移行上皮癌（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＴＣＣ）（すなわち、また、尿路上皮細胞癌（ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＵＣＣ）としても知られている、膀胱の（ＵＣ）尿路上皮癌）、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および腺癌からなる群から選択され、本発明の文脈において、より好ましくは移行上皮癌（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）である。
用語「尿路上皮」は、特に、尿路上皮癌を指し、泌尿器系のＴＣＣを意味する。
したがって、本発明の文脈において、尿路上皮（ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ）癌は、膀胱の尿路上皮癌を意味する。
移行細胞癌（＝尿路上皮癌）は、表在性膀胱癌（すなわち、非筋浸潤性膀胱癌（ＮＭＩＢＣ））または筋肉浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）であり得る。ＮＭＩＢＣは、たとえば、乳頭癌または平坦状癌（たとえば、ｉｎ  ｓｉｔｕの癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）（ＣＩＳ））でありうる。
一般的には、膀胱の尿路上皮癌は、たとえば、また、微小乳頭様（ｍｉｃｒｏｐａｐｉｌｌａｒｙ）、ネストされた（ｎｅｓｔｅｄ）、形質細胞様（ｐｌａｓｍｏｃｙｔｏｉｄ）、肉腫様（ｓａｒｃｏｍａｔｏｉｄ）または他の変異体に分類することができ、または、混合した組織（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｅｓ）を有することができる。尿路上皮癌の微小乳頭状またはネストされた（ｎｅｓｔｅｄ）変異体は、特に、攻撃的である。
これらの膀胱癌は、たとえば、ＵＩＣＣ／ＡＪＣＣ（国際がん対策／米国がん合同委員会のための連合（Ｕｎｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ／  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ））のＴＮＭテーブルに従って分類され、そして、ＷＨＯ  １９７３−２００４分類に従って、等級分けすることができる。
【００２１】
本発明の文脈において、被験体は、ＣｇＡレベルの前記測定に先立ち、非神経内分泌性膀胱癌に罹患しているおよび／または、非神経内分泌性膀胱癌と診断されている。
好ましくは、本明細書では、被験体は、神経内分泌性膀胱癌を有していない（すなわち、罹患していない）。したがって、好ましくは、被験体は、神経内分泌性膀胱癌と診断されていない。
【００２２】
本明細書における「被験体」という用語は、生きているヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。被験体は好ましくは患者である。
本明細書で使用される「患者」という用語は、病気、特に、非神経内分泌性膀胱癌により、医療行為を受けているか、または医療行為を受けなければならない、生きているヒトまたは非ヒト動物（最も好ましくはヒト）を指す。これには、病気の徴候を調査されている、定義の病気のない人が含まれる。したがって、本明細書に記載の方法およびアッセイは、ヒトおよび獣医学の両方の疾患に適用可能である。
【００２３】
本発明の文脈における「レベル」という用語は、被験体、たとえば膀胱癌患者のサンプルから得られたマーカー（たとえば、ＣｇＡおよび／またはＭＭＰ７など）の濃度（好ましくは、たとえば「ｎｇ／ｍＬ」として、重量／容量；ｗ／ｖで表される；）に関係する。
【００２４】
本発明の文脈における「診断」は、被験体における疾患または臨床状態の認識および（早期の）検出に関し、そして、また鑑別診断（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）を含み得る。また、疾患の重症度または臨床的または病理組織学的症状の評価は、特定の実施形態においては、「診断」という用語に包含され得る。
「予後診断（Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」は、特定の疾患または臨床状態、ここでは、非神経内分泌性膀胱癌に罹患している被験体の転帰（ｏｕｔｃｏｍｅ）または特定のリスクの予測に関する。これには、回復の機会の推定または前記被験体の不利な転帰の機会の推定が含まれ得る。
【００２５】
「モニタリング」または「療法モニタリング」は、たとえば、疾患（たとえば、非神経内分泌性膀胱癌）の進行、または、疾患または障害の進行に対する特定の治療の影響を分析するために、既に診断された疾患、障害、合併症またはリスクを追跡することに関する。
本発明において、「リスク層別化（ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」という用語は、それらのさらなる予後診断に従って、異なるリスク群に、被験体をグルーピングすることに関する。リスク層別化はまた、予防的および／または治療的手段を適用するための階層化にも関係する。
【００２６】
本発明の文脈における用語「患者管理（ｐａｔｉｅｎｔ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）」は、以下を示す。
・病院や集中治療室への入室のための意思決定、
・専門病院または専門病院ユニットへの患者の移転の決定、
・集中治療室または病院からの早期退院のための評価、
・リソースの割り当て（たとえば、医師および／または看護スタッフ、診断、治療、手術）。
【００２７】
「疾患重症度の評価」という用語は、腫瘍の組織病理学、疾患の転移性状態および進行、有害事象（死亡を含む）の可能性、高入院費用の可能性および長期入院の可能性を含む、患者の疾病の状態の評価に関する。
【００２８】
本発明の文脈における「転帰（ｏｕｔｃｏｍｅ）」という用語は、たとえば、規定された時間後、たとえば３日後、５日後、１０日後、１４日後、２０日後、３週後、４週後、３０日後、４５日後、６０日後、９０日後、３ヶ月後、６ヶ月後、１年後、２年後、または５年後、の患者の健康状態、のような疾患の重篤度の程度、に関する。
転帰は、集団（たとえば、研究または治療群）における割合（パーセンテージ）として、または個々の割合（すなわち、特定の被験体または患者についての確率）として表すことができる。
したがって、「全般的な転帰（ｏｕｔｃｏｍｅ）」は、「全生存率」として表すことができ、これは、本事例の非神経内分泌性膀胱癌のような疾患として、診断または治療開始から、ある期間の間、依然として生存している群（たとえば、研究または治療群）における人々のパーセンテージである。
全生存率は、５年生存率として記載されることが多く、それは、診断後または治療開始５年後に生存している研究または治療群の人々の割合である。
したがって、「全体的な転帰（ｏｕｔｃｏｍｅ）」または「全体的な生存（ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）」は、特定の被験体または患者についての、ある期間に亘って生存する確率であり、すなわち、それは、前記被験体または患者の平均余命（ｌｉｆｅ−ｅｘｐｅｃｔａｎｃｙ）に関連する。
「疾患−特異的生存」は、規定された期間内に特定の疾患で死亡していない、集団（たとえば、研究または治療群）における人々の割合である、「疾患−特異的生存率」として表すことができる。
期間は、通常、診断時または治療開始時に始まり、そして、死亡時に終了する。研究中の疾患以外の原因で死亡した患者（本明細書では、非神経内分泌性膀胱癌）は、この測定ではカウントされない。したがって、「疾患−特異的」生存または転帰は、個々の被験体または患者において、規定された期間内に、非神経内分泌性膀胱癌で死なない確率を意味する。
「無進行生存」は、非神経内分泌性膀胱癌のような疾患の治療中および治療後の期間であり、被験体または患者がその疾患に罹患しているが、悪化していない期間である。
「進行」は、たとえば、特に、治癒的（ｃｕｒａｔｉｖｅ）または緩和的（ｐａｌｌｉａｔｉｖｅ）治療後の、腫瘍の（一次のまたは遠隔部位での）任意の新たな出現（「再発」）またはサイズの増加、組織学的段階、悪性度または症状である。進行は、たとえば、放射線学的または生化学的に検出することができる。たとえば、ＮＭＩＢＣの場合、進行は、段階ＴａからＴ１からＴ２からＴ３からＴ４への進行；または段階Ｇ１／２からＧ３へ、または段階ＬＮ０からＬＮ＋へ、または段階Ｍ０からＭ＋への進行を指す。非転移性ＭＩＢＣの場合、進行は、手術後の再発、段階ＬＮ０からＬＮ＋への進行、または段階Ｍ０からＭ＋への進行を指し得る。疾病特異的死亡も、進行とみなすことができる。転移性ＭＩＢＣにおいて、進行は、たとえば、ＲＥＣＩＳＴ基準に従って、放射線学的に検出することができる。
【００２９】
いくつかの局面において、不良な転帰は、たとえば、外科的治療および／または薬物治療および／または放射線療法後の、平均余命の減少についての増大するリスク、進行の増大するリスク、癌関連死の増大するリスクおよび／または再発の増大するリスクである。
本発明の方法および使用は、疾患の異なる状況および異なる段階、たとえば、介入前または介入後（ｐｒｅ−ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｏｒ  ｐｏｓｔ−ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ）に、適用することができる。
「介入前に（ｐｒｅ−ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌｌｙ）」、「介入前の（ｐｒｅ−ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ）」および「介入の前（ｂｅｆｏｒｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書では、非神経内分泌性膀胱癌の治療の介入が開始される前の時間に関する。
「介入」とは、健康成果を修飾するために使用される、任意の医療介入を意味する。この定義には、薬物投与、外科的処置、デバイスの適用、行動療法、ケアのプロセスの変更（ｐｒｏｃｅｓｓ−ｏｆ−ｃａｒｅ  ｃｈａｎｇｅｓ）などが含まれる。
好ましくは、サンプルは、患者の病院への入院時または非神経内分泌性膀胱癌の診断が確定する前に採取される。
たとえば、一の態様では、被験体は、非神経内分泌性膀胱癌と診断されたが、（これまで）前記非神経内分泌性膀胱癌の外科的治療を受けていない。そのような場合、本発明の方法は、転帰の予測のために、または適切な処置（たとえば、外科的選択肢）の選択のために使用され得る。
「介入後に（ｐｏｓｔ−ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌｌｙ）」、「介入後の（ｐｏｓｔ−ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ）」および「介入の後（ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、介入または治療が開始された後の時間に関する。
たとえば、１つの局面において、被験体は、前記非神経内分泌性膀胱癌の（たとえば、前記非神経内分泌性膀胱癌の根治的膀胱切除術のような）外科的処置を既に受けていた。このような場合、本発明の方法は、転帰の予測のため、および／または、適切なフォローアップ治療の選択のため、および／または、被験体のモニタリング（たとえば、疾患の進行）のために使用され得る。
したがって、ＣｇＡ（および場合によっては、ＭＭＰ７を含む任意の他の追加マーカー）のレベルを、手術後のコントロール（ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）のために、使用することができる。
本発明の文脈における「手術後のコントロール（ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」という用語は、前記被験体の外科的処置後の被験体のモニタリングを指す。
【００３０】
本発明の文脈における「予測」は、一例として（ｉｎ  ｏｎｅ  ｉｎｓｔａｎｃｅ）、他の症状またはマーカーが明らかになったり、または、有意に変化したりする前の、合併症、進行または症状を予知することに関する。
本発明の文脈において、「予測値（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）」などの用語は、測定のある決定された結果の統計的有意性を指す。したがって、本発明の文脈における予測値（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）または予測力（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｐｏｗｅｒ）の増加は、あるサンプル中のあるマーカーのレベルの測定から決定された、ある値に基づいて、正しい診断、予後診断、層別化などの確率が、増加することを意味する。
【００３１】
本明細書の上記に概説したように、前記被験体のサンプル中のＣｇＡのレベル（ならびに、ＭＭＰ７などの任意の他の追加のマーカーのレベル）は、コントロールレベルまたは既定の閾値と比較することができる。これらのコントロールレベルまたは既定の閾値は、絶対値または相対値であってもよい。
特定の用途に応じて、コントロールレベルは、同じ被験体由来の以前のサンプル中のＣｇＡのレベルであってもよく、たとえば、コントロールレベルは、外科的処置（たとえば、ＲＣＥ）の前に同じ被験体から採取されたサンプル中のＣｇＡのレベルであってもよい、そして、決定されたレベルは、外科的処置（たとえば、ＲＣＥ）の後に採取されたサンプルからであってもよい。追加的に決定され得る他のマーカー、たとえばＭＭＰ７についても同様に適用される。
ＣｇＡレベルについての既定の閾値は、たとえば、１００ｎｇ／ｍＬ〜４３１ｎｇ／ｍＬの範囲で、好ましくは１０３ｎｇ／ｍＬ〜１９１ｎｇ／ｍＬの範囲で、より好ましくは１３０ｎｇ／ｍＬ〜１６０ｎｇ／ｍＬ、そして最も好ましくは１４７ｎｇ／ｍＬで選択される。
特定の適用のための閾値の選択は、たとえば、アッセイの所望の特異性および／または選択性に基づくことができる。下記参照。
【００３２】
本明細書で、上記概説したように、ＣｇＡのレベルに加えて、他のマーカー、特にバイオマーカーのレベルは、同じ被験体から、好ましくは同じサンプル中で決定され得る。
ＣｇＡと一緒になって、特別の価値があることが判明したそのようなマーカーの１つは、マトリックス  メタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ７）である。
したがって、本発明の文脈において、好ましくは、前記被験体の前記サンプルまたは前記被験体由来の別のサンプル中で、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ７）のレベルが、追加で決定され、そして、被験体由来のサンプル中のＭＭＰ７のレベルは、非神経内分泌性膀胱癌の重篤度および／または被験体の転帰のための指標である。
対照レベルまたは既定の閾値と比較して、被験者からのサンプル中におけるＭＭＰ７のレベルの増加は、外科的治療および／または薬物治療および／または放射線療法の後の、被験体の不良転帰、特に減少した平均余命のリスクの増加、進行の増加リスク、癌関連死の増加リスク、および／または再発の増大リスクの指標となる。
被験体由来の同じサンプル、または別のサンプルにおいて、ＭＭＰ７のレベルは、１つの側面において、被験体の全体的な生存または被験体の疾患特異的生存または被験体の無増悪生存（ｓｕｂｊｅｃｔ’ｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）の指標であり得る。
ＭＭＰ７レベルのための既定の閾値は、たとえば、４．４〜２１ｎｇ／ｍＬの範囲で、好ましくは５．４〜１０．１ｎｇ／ｍＬの範囲で、より好ましくは６〜９ｎｇ／ｍＬの範囲で選択され得る。
もっとも好ましくは、ＭＭＰ７のレベルに対する既定の閾値は、７．７５ｎｇ／ｍＬである。
特定の適用のための閾値の選択は、たとえば、アッセイの所望の特異性および／または選択性に基づくことができる。下記参照。
【００３３】
本発明の方法の特定の実施形態では、
（１）既定のＣｇＡの閾値以上の、前記サンプルにおけるＣｇＡのレベルは、外科的処置（たとえば、ＴＵＲＢＴ、部分的膀胱摘除術（ｐａｒｔｉａｌ  ｃｙｓｔｅｃｔｏｍｙ）（ＰＣＥ）、ＲＣＥ、ＲＣＥと組み合わせた地域または拡張ＬＮＤ（転移巣切除術（ｍｅｔａｓｔａｓｅｃｔｏｍｙ））、または薬物治療（化学療法、標的療法、免疫療法）、または放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）後の癌関連死の高いリスクの指標である。そして、
（２）既定のＣｇＡの閾値以上の、前記サンプルにおけるＣｇＡのレベルおよび既定のＭＭＰ７の閾値以上の、前記サンプルにおけるＭＭＰ７のレベルが、外科的処置（たとえば、ＴＵＲＢＴ、部分的膀胱摘除術（ｐａｒｔｉａｌ  ｃｙｓｔｅｃｔｏｍｙ）（ＰＣＥ）、ＲＣＥ、ＲＣＥと組み合わせ地域または拡張ＬＮＤ（転移巣切除術（ｍｅｔａｓｔａｓｅｃｔｏｍｙ））、または薬物治療（化学療法、標的療法、免疫療法）、または放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）後の癌関連死の高いリスクおよびより短い寿命の指標である。
【００３４】
本発明の方法を使用して、臨床医は、患者の決定されたリスクに基づいて、最も適切な治療を選択することができる。
概説したように、本発明は、治療効率、および膀胱癌、特に非神経内分泌性膀胱癌、そして、好ましくは、尿路上皮癌の再発を監視するための、外科手術後の（ｐｏｓｔ−ｓｕｒｇｉｃａｌ）、非侵襲的、取扱いが、安価かつ容易なツールを提供する。
たとえば、ＣｇＡおよび場合によりＭＭＰ７のレベルは、フォローアップ中の定期的な時間間隔で決定されてもよく、そして、制御レベルは、前記外科的処置の前および／または、フォローアップの最初のステップ時に決定された、それぞれのレベルであって良い。
【００３５】
１つの特定の態様において、ＣｇＡの術前レベル（好ましくは血清レベル）は、手術後（例えば、ＲＣＥ）の患者における全体的−および疾患−特異的生存マーカーとして使用される。
本発明の特定の態様では、ＲＣＥで治療された患者における、疾患−特異的生存率が低いため、追加のマーカーとしてＭＭＰ７を使用する。
ＭＭＰ７はまた、筋肉浸潤性腫瘍および／または転移のためのさらなるマーカーとして使用され得る。
【００３６】
検討したように、ＣｇＡのレベルの決定に加えて、被験体の、他のマーカー、特にバイオマーカー（ＭＭＰ７を含む）および他の臨床パラメーターを、追加で、決定することができる。
そのような被験体の臨床パラメータは、たとえば、
腫瘍の組織学的サブタイプ、
転移状態（リンパ節および遠隔）、
リンパ節腫脹（ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）、
喫煙またはタバコの使用、
年齢、
性別、
家族歴、
民族性（ｅｔｈｎｉｃｉｔｙ）、
体重、
ボディマス指数（ＢＭＩ）、
膀胱鏡検査レポート（ｃｙｓｔｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｐｏｒｔ）、
尿細胞診（ＶＵＣ）、
超音波検査、
ＣＴスキャン、
ＭＲＩおよびＴＵＲＢＴ、および
血圧
からなる群から選択され得る。
特定の実施形態では、さらに、少なくとも１つの臨床パラメータは、年齢、性別、収縮期血圧（ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、拡張期血圧（ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、降圧治療、尿路疾患および治療歴、脳卒中の病歴、喘鳴（ｗｈｅｅｚｉｎｇ）、ＢＭＩ、心拍数、体温、糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）の存在および現在の喫煙習慣を含む群から選択され、決定される。
【００３７】
さらに、下からなる群から選択させたマーカーのレベルは、被験体の前記サンプルまたは別のサンプルにおいて測定することができる。
補体因子Ｈ関連タンパク質および補体因子Ｈ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  Ｈ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  Ｈ）、
核マトリックスタンパク質ＢＬＣＡ−４（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＣＡ−４）、
サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）（ＢＩＲＣ５、ＥＰＲ−１）、
サイトケラチン８（ＣＫ８）、
サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、
サイトケラチン２０（ＣＫ２０）、
ＣＥＡタンパク質および膀胱腫瘍細胞関連ムチン、
改変染色体３、７、１７および９ｐ２１、
ＣＥＡタンパク質（ＣＥＡ）、
ＣＹＦＲＡ２１−１（ＣＫ１９）、
炭酸脱水酵素、
神経感覚タンパク質（ＮＳＥ）、
ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、
核有糸分裂装置タンパク質２２（ＮＭＰ２２）、
アルカリホスファターゼ、
マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）、
マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）、
マトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ−３）、
マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）、
マトリックスメタロプロテイナーゼ１０（ＭＭＰ−１０）
マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ−１３）、
マトリックスメタロプロテイナーゼ２６（ＭＭＰ−２６）、
メタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）、
メタロプロテイナーゼ２の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−２）、
メタロプロテイナーゼ３の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−３）、
メタロプロテイナーゼ４の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−４）、
α−１抗トリプシン、
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、
胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）、
血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ−１）、
可溶性血管内皮増殖因子受容体１（ｓＶＥＧＦＲ−１、ｓｆＬＴ−１）、
血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）、
可溶性血管内皮増殖因子受容体３（ｓＶＥＧＦＲ−３）、
血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、
血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦＣ）、
インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）、
インスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）、
インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）、
インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ−４）、
インスリン様成長因子結合タンパク質５（ＩＧＦＢＰ−５）、
インスリン様成長因子結合タンパク質６（ＩＧＦＢＰ−６）、
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、
インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、
インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、
インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、
内皮増殖因子（ＥＧＦ）、
内皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、
プロヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ）、
インスリン様増殖因子２  ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、
インスリン様増殖因子２  ｍＲＮＡ結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）、
アンギオスタチン、
エンドスタチン、
プラスミノゲン（ＰＬＧ）、
アクアポリン１（ＡＱＰ−１）、
ペリリピン２（ＰＬＩＮ−２）、
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、
アンドロゲン受容体（ＡＲ）、
エストロゲン受容体（ＥＲ）、
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、
遊離前立腺特異抗原（遊離ＰＳＡ）
総前立腺特異抗原（全ＰＳＡ）、
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、
Ｅ−カドヘリン、
エラスチン、
フィブロネクチン、
コラーゲン、および
ビトロネクチン
は、被験体の前記サンプルまたは別のサンプル中で決定され得る。
これらの中で、好ましい追加マーカーは、以下から選択される。
補体因子Ｈ関連タンパク質および補体因子Ｈ、
核マトリックスタンパク質ＢＬＣＡ−４、
サイトケラチン８（ＣＫ８）、
サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、
ＣＥＡタンパク質および膀胱腫瘍細胞関連ムチン、
変化染色体３、７、１７および９ｐ２１、
ＣＥＡタンパク質（ＣＥＡ）、
核有糸分裂装置タンパク質２２（ＮＭＰ２２）、
アルカリホスファターゼ、
メタロプロテイナーゼ１（ＴＩＭＰ−１）の組織阻害剤、および
メタロプロテイナーゼ２（ＴＩＭＰ−２）の組織阻害剤。
【００３８】
「バイオマーカー」（生物学的マーカー）という用語は、健康―および生理学的−に関連する評価（病気のリスク、精神病疾患、環境暴露およびその効果、疾患診断、代謝プロセス、物質乱用、妊娠、細胞株発達、疫学的研究などの）についての指標として機能する、測定可能および定量可能な、生物学的パラメータ（たとえば、特定の酵素濃度、特定のホルモン濃度、集団における特定の遺伝子表現型分布、生物学的物質の存在）に関する。
さらに、バイオマーカーは、客観的に測定され、そして、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、または治療的介入に対する薬理学的応答の指標として評価される特性として定義される。
バイオマーカーは、バイオサンプル上で測定することができる（たとえば、全血、血清、血漿、尿）。
人（血圧、ＥＣＧ、またはホルター（Ｈｏｌｔｅｒ）から得られた記録であってもよい、または、画像検査（心エコー図またはＣＴスキャン）であってもよい（Ｖａｓａｎら、２００６年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１１３：２３３５〜３６２頁）。
バイオマーカーは、
環境因子への曝露のレベルまたはタイプ、
遺伝的感受性、
曝露に対する遺伝的応答、
非臨床（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ）または臨床的疾患のバイオマーカー、または
治療に対する応答の指標、
を含む、様々な健康または疾患特性の指標となることができる。
したがって、バイオマーカーを考える単純な方法は、疾患形質（リスク因子またはリスクバイオマーカー）、疾患状態（前臨床または臨床）、または疾患率（進行）の指標としてである。
したがって、バイオマーカーは、
先行バイオマーカー（ａｎｔｅｃｅｄｅｎｔ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ）（病気を発症するリスクを特定する）、
スクリーニングバイオマーカー（非臨床の病気のスクリーニング）、
診断バイオマーカー（顕性疾患（ｏｖｅｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）の認識）、
ステージングバイオマーカー（病気の重症度を分類する）、または
予後診断バイオマーカー（再発および治療への応答、および治療の有効性のモニタリングを含む、病気の将来経過予測）
として、分類することができる。
バイオマーカーもまた、代理エンドポイントとしても役立ち得る。
代理エンドポイントは、真の結果の測定の代わりに、治療法の安全性と有効性を評価する臨床試験での結果として使用することができる。
根底にある原則は、代理エンドポイントにおける変更が、関心のある結果の変化と密接に関連していることである。
代理エンドポイントには、評価のための大きな臨床試験を必要とする、罹患率や死亡率などのエンドポイントよりも短い時間枠で、かつ費用が少なくて収集できるという利点がある。
代理エンドポイントの追加価値は、関心のある曝露／介入により近く、より遠隔の臨床事象よりも因果関係的（ｃａｕｓａｌｌｙ）により関連しやすいという事実を含む。
代理エンドポイントの重要な欠点は、関心のある臨床結果が多数の要因（代理エンドポイントに加えて）によって影響される場合、残渣交絡（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｃｏｎｆｏｕｎｄｉｎｇ）は、代理エンドポイントの妥当性を低下させる可能性があることである。
関心のある結果への暴露や介入（ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｒ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）の影響の少なくとも５０％を説明できるならば、代理エンドポイントの妥当性はより大きいと示唆されている。
たとえば、バイオマーカーは、タンパク質、ペプチドまたは核酸分子であり得る。
国立衛生研究所（ＮＩＨ）は、バイオマーカーを、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、または治療的介入に対する薬理学的応答の指標として、客観的に測定および評価される生物学的マーカーとして定義する（Ｄａｎｅｓｈら、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００１年．１６９：４１６−４６８頁）。
マーカー（特にバイオマーカー）のいくつかは、「癌マーカー」であり、すなわち、癌の診断および／または予後診断に関連するマーカーであり、ここでは、非神経内分泌性膀胱癌である。
【００３９】
本発明の方法は、前記被験体の体液のサンプルを提供する最初の工程含むことができる。
本発明の文脈において使用される用語「サンプル」は、被験体などの、興味のある被験体の、診断、予後診断、または評価のために得られた体液のサンプルを指す。
好ましい試験サンプルには、（全）血液、血清、血漿および尿が含まれる。
いくつかの試験サンプルは、たとえば、全血の血清または血漿成分への分離などの分画または精製手順に従って、より容易に分析される。
したがって、本発明の好ましい実施形態では、サンプルは、（全）血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプルおよび尿サンプル、または前述のサンプルのいずれかの抽出物を含む群から選択される。
好ましくは、サンプルは全血サンプル、最も好ましくは血清サンプルまたは血漿サンプルである。
本明細書で使用される場合、「全血サンプル（ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｓａｍｐｌｅ）」は、未処理または本質的に未処理の血液サンプルを特定する。
適切な場合には、液体サンプルを得るために、本発明で使用する前にサンプルをホモジナイズするか、または溶媒で抽出する必要があり得る。
液体サンプルは、溶液または懸濁液であってもよい。
液体サンプルは、本発明での使用に先立って、１つ以上の前処理を受けてもよい。
そのような前処理には、希釈、濾過、遠心分離、濃縮、沈降（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、沈殿または透析が含まれるが、これらに限定されない。
前処理はまた、酸、塩基、緩衝剤、塩、溶媒、反応性染料、界面活性剤、乳化剤またはキレート化剤のような、溶液への化学物質または生化学物質の添加を含み得る。
本発明の文脈における「血漿」は、遠心分離後に得られた抗凝血剤を含有する血液の、事実上細胞を含まない上清である。
例示的な抗凝固剤は、ＥＤＴＡまたはクエン酸などのカルシウムイオン結合化合物およびヘパリネート（ｈｅｐａｒｉｎａｔｅｓ）またはヒルジンなどのトロンビン阻害剤を含む。無細胞血漿は、２０００〜３０００ｇで、少なくとも１５分間、抗凝固処理された血液（たとえば、クエン酸、ＥＤＴＡまたはヘパリン添加血液）の遠心分離によって得ることができる。
したがって、本発明の文脈で、使用される血漿サンプルは、１５００ｇを超えて、３０分間、好ましくは少なくとも２０００ｇで少なくとも３０分間、より好ましくは少なくとも３０００ｇで少なくとも２０分間、最も好ましくは少なくとも３０００ｇで少なくとも３０分間、遠心分離に供されることが好ましい
本発明の文脈における「血清」は、適切な凝固が完了した後の、希釈されていない血液の細胞外部分である。凝固は、通常、３０分後に完了する。
凝固したサンプルを、１５００ｇの最低速度で少なくとも１０分間遠心分離することによって血清を得ることができる。
したがって、本発明の文脈で使用される血清サンプルは、少なくとも１５００ｇで少なくとも１０分間、好ましくは少なくとも１５分間、より好ましくは少なくとも２０分間遠心分離に供されることが好ましい。
最も好ましくは、血清サンプルを、少なくとも３０００ｇで、少なくとも２０分間遠心分離にかけた。
【００４０】
適切なアッセイを用いて、ＣｇＡのレベルを決定することができる。
「アッセイ」または「診断アッセイ」は、診断の分野で適用される任意のタイプのものであり得る。
そのようなアッセイは、検出される検体（ａｎａｌｙｔｅ）の、ある親和性を有する１つ以上の捕捉プローブへの結合に基づくことができる。
捕捉分子と標的分子または目的分子との間の相互作用に関して、親和定数は好ましくは１０8Ｍ-1より大きい。
【００４１】
好ましい検出方法は、たとえば、
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、
化学発光−および蛍光−イムノアッセイ、
酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、
ルミネックス−ベーストビーズアレイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ−ｂａｓｅｄ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙｓ）、
タンパク質マイクロアレイアッセイ、
免疫クロマトグラフィーストリップ試験のような、迅速試験、または、ポイント・オブ・ケア（ＰｏＣ）フォーマット（ｒａｐｉｄ  ｔｅｓｔ  ｏｒ  ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ  （ＰｏＣ）  ｆｏｒｍａｔｓ）および、たとえば、ＢＲＡＨＭＳ  ＫＲＹＰＴＯＲシステムのような自動のイムノアッセイシステム、のような様々なフォーマットでのイムノアッセイを含む。特に、好ましいのは、ＰｏＣテストフォーマットであり、たとえば、Ｓｔ．Ｊｏｈｎ＆Ｐｒｉｃｅ、Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｅｖ、２０１４年８月；３５（３）：１５５−１６７頁を参照されたい。
さらに、質量分析アプローチを用いて、ＣｇＡ、ＭＭＰ７および／またはさらなるバイオマーカーを検出および定量することができ、たとえば、定量的選択反応モニタリング（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）（ｑＳＲＭ）を用いることができる。
質量分析測定のために、化学的誘導体化は、通常、標的タンパク質を分析および定量する前に実施される。
【００４２】
イミノアッセイは、均質または不均一アッセイで、競合的および非競合的アッセイをすることができる。
特に好ましい実施形態では、アッセイは、非競合免疫アッセイであり、検出および／または定量される分子が、第一の抗体および第二の抗体に結合しているサンドイッチアッセイの形態である。
第一の抗体は、たとえば、ビーズ、ウェル又は他の容器の表面、チップまたはストリップのような、固相に結合することができる。そして、第二の抗体は標識されている抗体であり、たとえば、染料で、ラジオアイソトープで、または、反応性または触媒的に活性な部分で標識されている。
検体（ａｎａｌｙｔｅ）に結合された、標識された抗体の量は、適切な方法で測定する。
「サンドイッチアッセイ」に含まれる一般的な組成および手順は、十分に確立されており、そして、当業者には周知である（Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、編者Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ＬＴＤ、Ｏｘｆｏｒｄ；３版（２００５年５月）、ＩＳＢＮ−１３：９７８−００８０４４５２６７；Ｈｕｌｔｓｃｈｉｇ  Ｃら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、２００６年２月；１０（１）：４−１０頁、本明細書中に参照して組込まれる）。
【００４３】
特に好ましい態様において、アッセイは、２つの捕捉分子、好ましくは、共に、液状反応混合物中に分散物として存在する抗体であり、
第一の標識成分が第一の捕捉分子に結合し、前記第一の標識成分は、蛍光−または化学発光−消光または増幅に基づく、標識系の一部であり、そして、前記標識システムの第二の標識成分が第二の捕捉分子に結合されて、両方の捕捉分子が検体に結合すると、測定可能なシグナルが生成され、これにより、サンプルを含む溶液において、形成されたサンドイッチ複合体が検出されるのを許容する。
さらにより好ましくは、前記標識システムは、蛍光染料または化学発光染料、特に、シアニンタイプの染料との組み合わせで、希土類クリプテートまたは希土類キレートを含む。
【００４４】
本発明の方法の文脈において、ＣｇＡおよび／またはＭＭＰ７のレベルは、好ましくは、イムノアッセイを用いて測定される。
ＣｇＡの検出のための適切なイムノアッセイおよび抗体は、たとえば、ＷＯ２０１５／１５８７０１Ａ１およびＰｏｐｏｖｉｃｉら（２０１４年、Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４７：８７−９１）（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
たとえば、Ｂ・Ｒ・Ａ・Ｈ・Ｍ・Ｓ  クロモグラニン  Ａ  ＫＲＹＰＴＯＲアッセイ（Ｂ・Ｒ・Ａ・Ｈ・Ｍ・Ｓ  ＧｍｂＨ  Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ、ドイツ）を用いることができる。
クロモグラニン  Ａの検出のためのさらなる商業的アッセイは、入手可能であり、そして、使用することができる：Ｃｉｓ−Ｂｉｏ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、Ｃｏｄｏｌｅｔ、フランス）は、アミノ酸１４５〜１９７および２１９〜２３４に対応するエピトープに対する２つのモノクローナル抗体を使用する。
ＤＡＫＯ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｄａｋｏ社、デンマーク  Ａ／Ｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）は、２３ｋＤａのＣ末端フラグメントに対するウサギ  ポリクローナル抗体を使用し、Ｅｕｒｏ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社のＮＥＯＬＩＳＡ（商標）サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ（Ｅｕｒｏ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  ＡＢ、Ｍａｌｍo、スウェーデン）は、アミノ酸２３６〜２５１および２６４〜２７９に対応するエピトープに対する、２つのモノクローナル抗体を使用する（ＷＯ２０１１／１３５０３５Ａ１およびＷＯ９９／５８９８０Ａ１も参照のこと）。
ＭＭＰ７の検出のための適切なイムノアッセイは、たとえば、ＷＯ２００７／１４４１４４Ａ１号パンフレット（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＭＭＰ７のための市販のアッセイは、次のとおりである。
Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＭＭＰ−７  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔまたは
Ｈｕｍａｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｓｓａｙまたは
Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｓｓａｙまたは
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−７  Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ａｓｓａｙまたは
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−７  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ａｓｓａｙまたは
Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＭＭＰ−７  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡまたは
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ  Ｐｒｅｍｉｘｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、または
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ  ５５４１３、米国）、
Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＭＭＰ−７  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  （Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  、  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、  ＣＡ  ９２１２１、米国）、
ＭＭＰ７（Ｈｕｍａｎ）  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  （Ａｂｎｏｖａ、  Ｔａｉｐｅｉ  １１４、台湾）、
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ７／Ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）（ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ９８１２１、米国）、
ＭＭＰ７  Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）、
ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）４９０  ＭＭＰ−７  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＊Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ＊（ＡＮＡＳＰＥＣ、  Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ  ９４５５５、米国）、
Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ  ａｎｄ  ＴＩＭＰ  Ａｓｓａｙｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）、
ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ７  （ＭＭＰ７）（Ｗｕｈａｎ  ＵＳＣＮ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．、Ｗｕｈａｎ  Ｃｉｔｙ、中国）。
【００４５】
ＷＯ２０１５／１５８７０１Ａ１に記載されているＣｇＡの検出のためのイムノアッセイは、本発明の文脈において好ましい。
それらは、ＣｇＡ（サンドイッチイムノアッセイ）に対する２つの抗体の使用に基づいている。
ＷＯ２０１５／１５８７０１Ａ１号パンフレットに記載されているような免疫測定法の（第一および／または第二の）抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体は、たとえば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または遺伝子操作されたモノクローナル抗体であってもよい。
前記第一の抗体は、ＣｇＡの配列（配列番号１）のエピトープに特異的であり、好ましくは配列番号１のアミノ酸１２４〜１４４に亘る配列である。第一の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
前記第二抗体は、ＣｇＡ（配列番号１）の配列中のエピトープに特異的であり、好ましくは配列番号１のアミノ酸２８０〜３０１に亘る配列である。第二の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
特定のイムノアッセイにおいて、第一の抗体は、アミノ酸残基１２４〜１４４に亘るＣｇＡ（配列番号１）の配列中のエピトープに特異的であり、そして、第二の抗体は、アミノ酸残基２８０〜３０１に亘るＣｇＡ（配列番号１）の配列中のエピトープに特異的である。
第一および第二の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。最初の抗体または抗原結合フラグメント、またはその誘導体は、たとえば、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３１として寄託されたハイブリドーマ細胞株５３７／Ｈ２によって産生することができる。ハイブリドーマ細胞株５３７／Ｈ２によって産生された抗体は、ＣｇＡ配列（配列番号１）のアミノ酸残基１２４〜１４４に特異的に結合する。
第二の抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体は、たとえば、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３２として寄託されたハイブリドーマ細胞株５４１／Ｅ２によって製造することができる。
ハイブリドーマ細胞株５４１／Ｅ２によって産生された抗体は、ＣｇＡ配列（配列番号１）のアミノ酸残基２８０〜３０１に特異的に結合する。
イムノアッセイの特定の実施形態では、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３１として寄託されたハイブリドーマ細胞株５３７／Ｈ２によって第一の抗体が産生され、そして、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３２として寄託されたハイブリドーマ細胞株５４１／Ｅ２によって第二の抗体が産生される。
【００４６】
ＣｇＡなどのバイオマーカーは、より短いペプチドまたはタンパク質に断片化されてもよい。したがって、場合によっては、ＣｇＡまたは、ＭＭＰ７のような他のペプチドバイオマーカーのフラグメントもまた、検出され得、そして、サンプル中のそれらのレベルが決定され得る。
「フラグメント」という用語は、より大きなタンパク質またはペプチドから誘導可能な、より小さいタンパク質またはペプチドを意味し、したがって、より大きなタンパク質またはペプチドの部分配列を含む。
前記フラグメントは、１つまたはそれ以上のそのペプチド結合の鹸化により、より大きなタンパク質またはペプチドから誘導され得る。
前記ペプチドフラグメントは、好ましくは、少なくとも約１５〜約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５〜約４５アミノ酸の長さを有する。
【００４７】
マーカー（ＣｇＡ、ＭＭＰ７および、場合によりその他）の測定されたレベルは、たとえば、特定の数学的アルゴリズムを用いて、特定の診断および／または予後診断と相関させることができる。
本発明の文脈において、「アルゴリズム」または「数学的アルゴリズム」は、前記の測定された値を階層化するために、ある測定値を基準母集団の値と比較するために使用される、数学的または統計的、方法またはモデルの使用を指す。
これは、たとえば、所定のサンプルの全体における特定のエンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）のレベルの中央値であってもよく、これは、前記エンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）の測定レベルが、所定のサンプル数における前記エンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）のレベルの数学的中央値と比較されることを意味する。
中央値を決定するために使用されるサンプルの数は、特に限定されないが、中央値の統計的有意性を確実にするために十分であるべきである。
中央値を決定するために使用されるサンプルの数は、臨床サンプルからのさらなる測定値の結果が、中央値の統計的有意性を増加させるために追加されるので、時間の経過とともに増加してもよい。
好ましくは、サンプル数は、中央値の統計的有意性が保証されるように選択される。
したがって、前記中央値は基準値として使用され、これにより、前記エンティティの測定レベルは、中央値の上または下の相対レベル（ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｅｖｅｌ  ａｂｏｖｅ  ｏｒ  ｂｅｌｏｗ  ｔｈｅ  ｍｅｄｉａｎ）および前記中央値から測定された値の偏差の程度に応じて、ある種の生理学的状態、たとえば、患者の有害転帰の傾向と、統計的に相関させることができる。
中央値（ｍｅｄｉａｎ）の代わりに、クァンタイル（たとえば、クォータイルまたはパーセンタイル）の決定のような、他の統計的方法または数学的モデル、好ましくは、Ｃｏｘ回帰を上記の記載と同様に使用することができ、上記の基準値を得、および／または、その他に、サンプルが得られた所与の被験体の生理学的状態に関する測定値の有意性を決定する。
前記数学的または統計学的方法またはモデルは、当業者に周知であり、そして、医薬用途の文脈におけるその使用は十分に確立されている。
【００４８】
診断および予後診断マーカーの使用に関連して、本明細書で使用する「相関する（ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ）」または「相関する（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ）」という用語は、患者におけるマーカーの存在またはレベルを、所与の症状に罹患している、または、そのリスクにあることが知られているヒトにおける、その存在または量と比較することを示す。
患者のサンプル中のマーカーレベルは、特定の診断に関連することが知られているレベルと比較することができる。
サンプルのマーカーレベルは、診断と相関していると言われている。すなわち、当業者は、マーカーレベルを使用して、患者が特定のタイプの疾患に罹患しているかどうかを判定し、それに応じて応答することができる。
あるいは、サンプルのマーカーレベルを、良好な転帰（たとえば、疾患の不在など）と関連することが知られているマーカーレベルと比較することができる。
好ましい実施形態では、マーカーレベルのパネルは、全体的な確率または特定の結果に相関する。
【００４９】
他の実施形態において、陽性尤度比、陰性尤度比、オッズ比、またはハザード比は、リスクを予測し、または疾患を診断する試験の能力の尺度として使用される。
陽性尤度比の場合、１の値は、「罹患した」および「対照」の両方のグループの被験者間で、陽性の結果が同等に高い可能性があることを示す。
１より大きい値は、罹患群において、陽性結果がより起こりやすいことを示す；
１未満の値は、対照群において、陽性結果がより高い可能性があることを示す。
陰性尤度比の場合、１の値は、「罹患した」群および「対照」群の両方における被験者の間で負の結果が同等に高い可能性があることを示す；
１より大きい値は、試験群において、否定的な結果が得られる可能性が高いことを示す。
１未満の値は、対照群において、陰性結果がより高い可能性があることを示す。
特定の好ましい実施形態では、マーカーおよび／またはマーカーパネルは、好ましくは、
少なくとも約１．５以上または約０．６７以下、
より好ましくは、少なくとも約２以上または約０．５以下、
まだより好ましくは、少なくとも約５以上または約０．２以下、
さらにより好ましくは、少なくとも約１０以上または約０．１以下、および
最も好ましくは、少なくとも約２０以上または約０．０５以下の正または負の尤度比を示すように選択される。
この文脈における用語「約」は、所与の測定値の＋／−５％を意味する。
【００５０】
オッズ比の場合、１の値は、「罹患」群および「対照」群の両方において、被験体の間で陽性結果が同等に高い可能性があることを示す；１より大きい値は、罹患群において陽性結果がより起こりやすいことを示す；そして、１未満の値は、対照群において陽性結果がより高い可能性があることを示す。
特定の好ましい実施形態では、マーカーおよび／またはマーカーパネルは、好ましくは、少なくとも約２またはそれ以上または約０．５以下、より好ましくは少なくとも約３またはそれ以上または約０．３３以下、さらにより好ましくは少なくとも約４以上または約０．２５以下、さらにより好ましくは少なくとも約５個またはそれ以上または約０．２以下、および最も好ましくは少なくとも約１０以上または約０．１以下のオッズ比を示すように、好適には選択される。
【００５１】
この文脈における用語「約」は、所与の測定値の＋／−５％を意味する。
ハザード比の場合、１の数値は、「罹患」および「コントロール」群の両方において、エンドポイント（たとえば、死）の相対リスクが等しいことを示す。
１より大きい値は、罹患群においてリスクがより大きいことを示し、そして、１未満の値は、リスクが対照群でより大きいことを示す。
特定の好ましい実施形態では、マーカーおよび／またはマーカーパネルは、好ましくは、少なくとも約１．１以上または約０．９１以下、より好ましくは、少なくとも約１．２５以上または約０．８以下、さらにより好ましくは、少なくとも約１．５またはそれ以上または約０．６７以下、さらにより好ましくは、少なくとも約２またはそれ以上または約０．５以下、そして最も好ましくは、少なくとも約２．５以上または約０．４以下のハザード比を示すように選択される。この文脈における「約」という用語は、所定の測定値の＋／−５％を指す。
【００５２】
診断および／または予後診断試験の感度および特異性は、単なる、試験の分析的「品質」以上に依拠し、それらはまた、異常な結果を構成するものの定義にも依存する。
実際には、レシーバ動作特性曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅｓ）（ＲＯＣ曲線）は、変数対、通常、「正常」（すなわち明らかに健康な）および「疾患」集団（すなわち、膀胱癌に罹患している患者、特に、非神経内分泌性膀胱癌、そして、好ましくは尿路上皮癌）におけるその相対する頻度、の値をプロットすることによって計算される。
任意の特定のマーカーについては、疾患の有無にかかわらず、被験体のマーカーレベルの分布が重複する可能性が高い。
このような条件下では、試験は、正常と病気とを１００％の精度で完全に区別することはできず、そして、重複の領域は、試験が病気と正常を区別できない部分を示す。
閾値を上回ると（またはそれを下回る。マーカーが疾患によってどのように変化するかに応じて）、試験は異常であると考えられ、そして、それより低いと、正常とみなされる、閾値が選択される。
ＲＯＣ曲線の下の領域は、得られた測定が、状態の正しい識別を可能にする確率の尺度である。
テスト結果が必ずしも正確な数値を示さない場合でも、ＲＯＣ曲線を使用できる。結果をランク付けできる限り、ＲＯＣ曲線を作成することができる。たとえば、「病気」のサンプルの検査の結果は、程度に応じてランク付けすることができる（たとえば、１＝低、２＝正常、３＝高）。このランク付けは、「正常」の集団の結果および作成されたＲＯＣ曲線と相関させることができる。これらの方法は、当技術分野において周知である（たとえば、Ｈａｎｌｅｙら、１９８２年、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ、１４３：２９−３６頁参照）。
好ましくは、ＲＯＣ曲線は、約０．５より大きい、より好ましくは約０．７より大きい、さらにより好ましくは約０．８より大きい、さらにより好ましくは約０．８５より大きい、最も好ましくは約０．９より大きいＡＵＣを齎す。この文脈における用語「約」は、所与の測定値の＋／−５％を意味する。
【００５３】
ＲＯＣ曲線の水平軸は、（１−特異性）を表し、偽陽性の割合とともに増加する。
曲線の縦軸は感度を表し、真陽性の割合とともに増加する。
したがって、選択された特定のカットオフに対して、（１−特異性）の値が決定され得、そして、対応する感度が得られ得る。
ＲＯＣ曲線の下の領域は、測定されたマーカーレベルが疾患または状態の正確な同定を可能にする確率の尺度である。したがって、ＲＯＣ曲線の下の領域を使用して、試験の有効性を判定することができる。
【００５４】
特定の実施形態では、マーカーおよび／またはマーカーパネル（ｍａｒｋｅｒ  ｐａｎｅｌｓ）は、少なくとも、約７０％の特異性、より好ましくは少なくとも約８０％の特異性、さらにより好ましくは少なくとも約８５％の特異性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の特異性、そして、最も好ましくは少なくとも約９５％の特異性とを組み合わせた、少なくとも約７０％の感度、より好ましくは少なくとも約８０％の感度、さらにより好ましくは少なくとも約８５％の感度、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の感度、そして最も好ましくは少なくとも約９５％の感度、を発揮するように選択される。
特に好ましい実施形態では、感度および特異性の両方が、少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％である。
「約」という用語は、この文脈では、所与の測定値の＋／−５％を指す。
【００５５】
ＣｇＡレベル、さらなるマーカー（たとえば、ＭＭＰ７）および／またはパラメータ、投薬および疾患の各特定の組み合わせのために、異なる群（カテゴリー）への「被験体の層別化（ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ”）」のための適切な閾値レベルを決定しなければならない。これは、たとえば、それらのＣｇＡレベルに応じて、患者の参照集団を特定のクォンタイル（たとえば、クォータイル（ｑｕａｒｔｉｌｅｓ）、クィンタイル（ｑｕｉｎｔｉｌｅｓ）または、適切なパーセンタイルによってさえ）にグルーピングすることによって行うことができる。クォンタイルまたは特定のパーセンタイルの上下のグループのそれぞれについて、
有害な結果、すなわち「好ましくない効果」、のリスクを比較して、たとえば、ある投薬を受けた患者と受けなかった患者との間の生存率に関して、ハザード比（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏｓ）を計算することができる。
このようなシナリオでは、ハザード比（ＨＲ）が１を超えると、治療を受けた患者の有害転帰のリスクが、そうでない患者よりも高いことが示される。
１未満のＨＲは、患者群における特定の治療の有益な効果を示す。
約１（たとえば、＋／−０．１）のＨＲは、上昇したリスクがなく、しかしまた、特定の患者群に対する投薬による利益もないことも示す。
患者の特定のクォンタイル間のＨＲについて、互いと、および、患者の全集団のＨＲとを比較することにより、危険性が高い患者のそれらのクォンタイルと、投薬の利益を受ける患者のそれらのクォンタイルを識別することが可能であり、そして、それによって、本発明による被験体を階層化することができる。
【００５６】
本発明の文脈における用語「治療的処置への層別化（ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療的な層別化（ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、前記患者の適切な治療的処置の評価を指す。
下位分類は、たとえば、疾患の軽度及び重篤に従って定義するような、診断された疾患、障害、合併症又はリスクの異なるサブクラスに従って、さらに診断を規定することに関する。本発明の文脈における「治療モニタリング」という用語は、前記患者の治療的処置の制御および／または調整を指す。
【００５７】
また、本発明は、非神経内分泌性膀胱癌を治療するための方法に関し、ここで、ＣｇＡのレベル（および場合により、ＭＭＰ７のレベルのような、さらなるマーカーおよび／または臨床的パラメータ）は、最も適切な治療を決定するために決められる。
たとえば、測定されたＣｇＡレベルが増加したのに応じて、相対的に不良な予後診断を得た患者は、より積極的な治療、たとえば、下記から利益を得ることができる。
ＴＵＲＢＴまたは膀胱温存型トリモダリティー療法の代わりに、部分膀胱切除、
ＴＵＲＢＴまたは膀胱温存型トリモダリティー療法または部分膀胱切除の代わりに、ＲＣＥ、
ＲＣＥの代わりに、ＰＬＮＤと組み合わせたＲＣＥ、
ＰＬＮＤの代わりに、拡大またはスーパー拡大ＰＬＮＤ（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｏｒ  ｓｕｐｅｒ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ＬＮＤ）、
単独の外科手術の代わりに、補助化学療法や放射線療法、
転移部切除術（ｍｅｔａｓｔａｓｅｃｔｏｍｙ）。
この高リスクの患者はまた、新規の薬をテストする臨床研究のために選択することもできる。
【００５８】
さらに、本発明は、膀胱癌、特に、非神経内分泌性膀胱癌、そして、好ましくは尿路上皮癌の予後診断、リスク評価、リスク層別化、モニタリングおよび／または治療制御のために、ＣｇＡに特異的な抗体および場合によりＭＭＰ７に特異的な抗体を含むキットの使用に関する。
キットはまた、このような使用のためのバッファや指示書などの追加のコンポーネントを含むこともできる。
ＣｇＡの検出のための好ましいキットは、ＷＯ２０１５／１５８７０１Ａ１に記載され、そして、以下を含む：
（１）ＣｇＡまたはそのフラグメントに特異的である、第一の抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその誘導体；そして、
（２）ＣｇＡまたはそのフラグメントに特異的である、第二の抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその誘導体。
キットの第一抗体および第二抗体は、好ましくは、同じＣｇＡフラグメントまたはフラグメント（複数）に特異的である。例えば、
（ｉ）第一の抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体は、配列番号１の配列内に含まれるエピトープに特異的であり；および／または
（ｉｉ）第二の抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体は、配列番号１の配列内に含まれるエピトープに特異的である。
好ましくは、キットの第一抗体は、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３１として寄託されたハイブリドーマ細胞株５３７／Ｈ２によって産生される、モノクローナル抗ＣｇＡ抗体であり、および／または、第二抗体は、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３２として寄託されたハイブリドーマ細胞株５４１／Ｅ２によって産生されたモノクローナル抗ＣｇＡ抗体である。
キットは、ＭＭＰ７の検出のための１つまたはそれ以上の抗体を含み得る。
たとえば、キット（追加的に）は、
（i）ＭＭＰ７、またはそのフラグメントに特異的である、第一の抗体または抗原結合フラグメントまたは
その誘導体；そして
（ii）ＭＭＰ７、またはそのフラグメントに特異的である、第二の抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体、
を含む。
キットの第一および第二の抗体は、好ましくは、同じＭＭＰ７フラグメントまたはフラグメント（複数）に特異的である。たとえば、
（i）第一の抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体は、配列番号２の配列内に含まれるエピトープに特異的であり；および／または
（ii）第二の抗体または抗原結合フラグメントまたはその誘導体は、配列番号２の配列内に含まれるエピトープに特異的である。
【００５９】
本発明は、好ましい態様において、以下に関係する。
１．膀胱癌の予後診断マーカー（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ）としての、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）の使用。
２．膀胱癌が、非神経内分泌性（ｎｏｎ−ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ）膀胱癌である、態様１に記載の使用。
３．膀胱癌が、
膀胱の尿路上皮癌、
膀胱の扁平上皮癌、および
膀胱の腺癌、からなる群から選択され、
好ましくは膀胱癌が、
膀胱尿路上皮癌である、態様１に記載の使用。
４．膀胱癌が、非筋肉浸潤性膀胱癌（ＮＭＢＣ）または筋肉浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）である、態様３に記載の使用。
５．ＣｇＡが、膀胱癌の、予後診断、リスク評価、リスク層別化（ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、モニタリングおよび／または治療制御のための、インビトロアッセイにおけるマーカーとして使用される、態様１〜４の使用。
６．被験体の体液のサンプルにおける、ＣｇＡのレベルを決定するステップを含む、被験体の膀胱癌の予後診断（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）、リスク評価、リスク層別化（ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、モニタリングおよび／または治療のコントロールのための方法。
７．膀胱癌が非神経内分泌性膀胱癌である、態様６に記載の方法。
８．膀胱癌が、
膀胱の尿路上皮癌、
膀胱の扁平上皮癌、および膀胱の腺癌からなる群から選択され、
好ましくは、膀胱癌が膀胱の尿路上皮癌である、請求項５または６に記載の方法。
９．膀胱癌が、非筋浸潤性膀胱癌（ＮＭＢＣ）または筋肉浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）である、態様８に記載の方法。
１０．被験体からのサンプル中のＣｇＡのレベルが、膀胱癌の重症度および／または被験体のための転帰の指標である、態様６〜９の方法
１１．対照レベルまたは所定の閾値と比較して、被験体由来のサンプル中のＣｇＡの増加のレベルが、被験体の不良の転帰の指標となる、態様１０の方法。
１２．被験体由来のサンプル中のＣｇＡのレベルが、被験体の全体的生存、または被験体の疾患−特異的な生存または被験体の癌が進行しない生存（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）の指標となる、態様１０に記載の方法。
１３．不良な転帰が、外科的治療および／または薬物治療よび／または放射線療法後の、平均余命の短縮に対するリスクの増加、進行のリスクの増加、癌関連死のリスクの増加および／または再発のリスクの増加である、態様１２に記載の方法。
１４．被験体が、膀胱癌と診断され、そして、被験体は、前記膀胱癌の外科的治療を受けていない、態様６〜１３のいずれか１項に記載の方法。
１５．被験体が、前記膀胱癌の外科的治療を受けた、態様６〜１３のいずれかに記載の方法。
１６．被験体が、前記膀胱癌の根治的膀胱切除術を受けた、態様１５に記載の方法。
１７．ＣｇＡレベルの既定の閾値が、
１００ｎｇ／ｍＬ〜４３１ｎｇ／ｍＬの範囲で、
好ましくは、１０３ｎｇ／ｍＬ〜１９１ｎｇ／ｍＬの範囲で、
より好ましくは、１３０ｎｇ／ｍＬ〜１６０ｎｇ／ｍＬ、そして
最も好ましくは、閾値が１４７ｎｇ／ｍＬである、態様１１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．前記被験体の前記サンプルにおいて、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ７）のレベルが、追加で決定され、そして、被験体由来のサンプル中のＭＭＰ７のレベルが、膀胱癌の重篤度および／または被験体の転帰のための指標である、態様６〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．対照レベルまたは既定の閾値と比較した、被験体由来のサンプル中のＭＭＰ７のレベルの増加が、外科的治療および／または薬物治療および／または放射線療法の後に、被験体の不良な転帰、特に、平均余命の減少のリスクの増加、進行のリスクの増加、癌関連死のリスクの増加、および／または再発のリスクの増大の指標である、態様１８に記載の方法。
２０．被験体からのサンプル中での、ＭＭＰ７のレベルが、被験体の全体的な生存または被験体の疾患−特異的生存または被験体の無増悪生存期間の指標である、態様１８に記載の方法。
２１．ＭＭＰ７レベルについての所定の閾値が、
４．４〜２１ｎｇ／ｍＬの範囲、
好ましくは、５．４〜１０．１ｎｇ／ｍＬの範囲、
最も好ましくは、ＭＭＰ７レベルについての所定の閾値が、７．７５ｎｇ／ｍＬである、態様１９の方法。
２２．（１）既定のＣｇＡの閾値以上の、前記サンプルにおけるＣｇＡのレベルが、外科的処置および／または薬物治療および／または放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）後の癌関連死の高いリスクの指標であり、そして、
（２）既定のＣｇＡの閾値以上の、前記サンプルにおけるＣｇＡのレベルおよび既定のＭＭＰ７の閾値以上の、前記被験体の前記サンプルまたは他のサンプルにおけるＭＭＰ７のレベルが、外科的処置および／または薬物治療、および／または放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）後の癌関連死の非常に高いリスクおよび、より短い余命の指標である、態様１１〜２１にいずれかに記載の方法。
２３．ＣｇＡおよび場合によりＭＭＰ７のレベルが、フォローアップ期間中の定期的な時間間隔で決定され、そして、対照レベルが、前記外科的処置の前および／または、フォローアップ期間の最初のステップ時に決定された、それぞれのレベルである、態様１１〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．腫瘍の組織学的サブタイプ、転移状態（リンパ節および遠隔）、リンパ節腫脹、喫煙またはタバコの使用、年齢、性別、家族歴、民族性（ｅｔｈｎｉｃｉｔｙ）、体重、ボディマス指数（ＢＭＩ）、膀胱鏡検査レポート（ｃｙｓｔｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｐｏｒｔ）、尿細胞診（ＶＵＣ）、超音波検査、ＣＴスキャン、ＭＲＩおよびＴＵＲＢＴ、および血圧からなる群から追加で以下から選択される、被験体の臨床パラメータが追加で決定される、態様６〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．追加で、補体因子Ｈ関連タンパク質及び補体因子Ｈ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  Ｈ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  Ｈ）、核マトリックスタンパク質ＢＬＣＡ−４、サイトケラチン８（ＣＫ８）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、ＣＥＡタンパク質および膀胱腫瘍細胞関連ムチン、染色体３、７、１７および９ｐ２１の変異体、ＣＥＡタンパク質（ＣＥＡ）、核有糸分裂装置タンパク質２２（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２２）（ＮＭＰ２２）、アルカリホスファターゼ、メタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）およびメタロプロテイナーゼ２（ＴＩＭＰ−２）の組織阻害剤から成る群から選択されるマーカーのレベルが被験体の前記サンプル中で決定されるか、または、被験者の別のサンプルが決定される、態様６〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．サンプルが、全血、血清、血漿および尿から選択される体液に由来する、態様６〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．ＣｇＡおよび／またはＭＭＰ７のレベルが、イムノアッセイを用いて決定される、態様６〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．イムノアッセイが、
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、
化学発光−および蛍光−イムノアッセイ、
酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、
酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、
ルミネックスベーストビーズアレイアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ−ｂａｓｅｄ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ  ａｓｓａｙ）、
タンパク質マイクロアレイアッセイ、および
イムノクロマト法ストリップ試験
からなる群から選択される、態様２７に記載の方法。
２９．イムノアッセイが、ＣｇＡに特異的な第一及び第二の抗体を用いる、サンドイッチイムノアッセイである、態様２８の方法。
３０．抗体の１つが標識され、そして、他の抗体が、固相に結合されるか、または固相に選択的に結合することができることを特徴とする、態様２９の方法。
３１．第一および第二の抗体が、液体反応混合物に分散されて存在し、そして、蛍光または化学発光の消光又は増幅に基づいて、ラベリングシステムの一部である、最初の標識成分が、第一の抗体に結合し、そして、前記ラベリングシステムの第二標識成分が、第二の抗体に結合し、そうして、両方の抗体がＣｇＡに結合した後、測定溶液中で生じた、サンドイッチ複合体の検出を許容する、測定可能なシグナルが生じる、態様３０に記載のイムノアッセイ法。
３２．態様３１に記載のイムノアッセイ法であって、標識システムが、蛍光染料または化学発光染料、特にシアニンタイプと組み合わせて、希土類クリプテートまたはキレートを含むことを特徴とする、態様３１のイムノアッセイ方法。
３３．膀胱癌の予後診断マーカーとして、被験体の体液のサンプル中のクロモグラニン  Ａ（ＣｇＡ）のレベルを使用する方法。
【００６０】
引用文献
本明細書において、引用された総ての文献は、参照によって、それ全体として組み込まれる。
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【００６１】
配列
配列１（配列番号：１）：
シグナルペプチドのない、ヒトクロモグラニン  Ａ（ＣｇＡ）ｔｈｏｕｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  （ＵｎｉＰｒｏｔ受入れ番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．）Ｐ１０６４５）：
1          11         21         31         41
LPVNSPMNKG DTEVMKCIVE VISDTLSKPS PMPVSQECFE TLRGDERILS
51         61         71         81         91
ILRHQNLLKE LQDLALQGAK ERAHQQKKHS GFEDELSEVL ENQSSQAELK
101        111        121        131        141
EAVEEPSSKD VMEKREDSKE AEKSGEATDG ARPQALPEPM QESKAEGNNQ
151        161        171        181        191
APGEEEEEEE EATNTHPPAS LPSQKYPGPQ AEGDSEGLSQ GLVDREKGLS
201        211        221        231        241
AEPGWQAKRE EEEEEEEEAE AGEEAVPEEE GPTVVLNPHP SLGYKEIRKG
251        261        271        281        291
ESRSEALAVD GAGKPGAEEA QDPEGKGEQE HSQQKEEEEE MAVVPQGLFR
301        311        321        331        341
GGKSGELEQE EERLSKEWED SKRWSKMDQL AKELTAEKRL EGQEEEEDNR
351        361        371        381        391
DSSMKLSFRA RAYGFRGPGP QLRRGWRPSS REDSLEAGLP LQVRGYPEEK
401        411        421        431
KEEEGSANRR PEDQELESLS AIEAELEKVA HQLQALRRG
配列２（配列番号：２）：
ヒトマトリックス  メタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ７）（ＵｎｉＰｒｏｔ受入れ番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．）Ｐ０９２３７）：
1          11         21         31         41
MRLTVLCAVC LLPGSLALPL PQEAGGMSEL QWEQAQDYLK RFYLYDSETK
51         61         71         81         91
NANSLEAKLK EMQKFFGLPI TGMLNSRVIE IMQKPRCGVP DVAEYSLFPN
101        111        121        131        141
SPKWTSKVVT YRIVSYTRDL PHITVDRLVS KALNMWGKEI PLHFRKVVWG
151        161        171        181        191
TADIMIGFAR GAHGDSYPFD GPGNTLAHAF APGTGLGGDA HFDEDERWTD
201        211        221        231        241
GSSLGINFLY AATHELGHSL GMGHSSDPNA VMYPTYGNGD PQNFKLSQDD
251        261
IKGIQKLYGK RSNSRKK
【００６２】
実施例
実施例１：膀胱癌患者におけるクロモグラニン  ＡおよびＭＭＰ７の検出
研究デザイン
膀胱経尿道切除（ＴＵＲＢ）または根治的膀胱切除術（ＲＣＥ）の泌尿器膀胱癌（ＢＣａ）の外科的処置を受けた１８８人の患者において、血清サンプルを採取した。
患者は、２００８年８月から２０１１年１１月の間、Ｄｕｉｓｂｕｒｇ−Ｅｓｓｅｎ大学病院の泌尿器科に登録された。
研究登録の基準は、膀胱移行細胞癌の組織病理学的診断、他の腫瘍の既往歴なし、手術前の化学療法なし、十分な血清サンプルの入手可能性とフォローアップの可能性（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｆｏｌｌｏｗ  ｕｐ）であった。
神経内分泌性膀胱癌は、母集団では診断されなかった。組織学的悪性度およびＴ段階（Ｔ−ｓｔａｇｅ）は、ＷＨＯ１９７３年および２００４年および２００９年のＴＮＭ分類に従って、それぞれ分類された。癌の既往のない健康な個体９７人の血清サンプルをコントロールとして使用した。
【００６３】
この研究は、ヘルシンキ宣言の倫理基準に準じて行い、そして、病院の倫理委員会によって承認された。サンプルを、１５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、直ちに等分し（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）、分析まで−８０℃に保った。
患者の臨床的特徴を表１に示す。
【００６４】
この研究のエンドポイントは、全体的および癌特異的生存であった。死亡原因は死亡診断書から得た。
すべての患者のフォローアップ調査の中央値は２４ヶ月であり、そして、生存者のフォローアップ調査の中央値は３１ヶ月であった。
フォローアップ期間中に、１８８人の患者のうちの５６人が死亡し、そのうち３９人がＢＣａ関連であった。
【００６５】
クロモグラニン  Ａの検出
クロモグラニン  Ａのレベルは、完全に自動化された、Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ  ＫＲＹＰＴＯＲ（登録商標）機器（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ  ＧｍｂＨ社、Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ／Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）で、ＣｇＡ  ＩＩ  ＃８３９．０５０（特許出願ＷＯ２０１５／１５８７０１Ａ１）のリファレンスの元、市販されている、高度に均質なサンドイッチのフルオロイムノアッセイ（ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏ−ａｓｓａｙ）を用いて、測定した。
【００６６】
システムは、ドナー（ユーロピウムクリプテート（ｅｕｒｏｐｉｕｍ  ｃｒｙｐｔａｔｅ））とアクセプター（ＸＬ６６５）との間の非放射線エネルギーの移動に基づいた、感度の高い、Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ（ＴＲＡＣＥ（登録商標））技術を使用する。
このアッセイは、２つのマウスモノクローナル抗体を使用する。
ＬＫ２Ｈ１０抗体のエピトープは、アミノ酸配列２８０〜３０１の間に局在し、そして、モノクローナル抗体ＰＨＥ５のエピトープは、アミノ酸１２４〜１４４の間に局在している。
アッセイ間の変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）（ＣＶ）は≦１２％であり、そして、クリプター（Ｋｒｙｐｔｏｒ）アッセイのアッセイ内ＣＶは≦７％である。
機能的アッセイの感度は、１３．７ｎｇ／ｍＬであり、そして、定量限界は、１３．７１ｎｇ／ｍＬである。
【００６７】
ＭＭＰ７の検出
ＭＭＰ−７のレベルは、完全に自動化された、Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ  ＫＲＹＰＴＯＲ（登録商標）機器（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ  ＧｍｂＨ社、Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ／Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）で、高度に均質なサンドイッチのプロトタイプのフルオロイムノアッセイ（ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏ−ａｓｓａｙ）（まだ市販されていない）を用いて、測定された。
【００６８】
システムは、ドナー（ユーロピウムクリプテート）とアクセプター（ＸＬ６６５）との間の、非放射線エネルギー伝達に基づく、感度の高い、Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ（ＴＲＡＣＥ（登録商標））技術を使用する。
アッセイは、それぞれ、ドナーとして、ユーロピウム  クリプテート−ＥｕＣ−（Ｃｉｓ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、  Ｂａｇｎｏｌｓ／Ｃeｚｅ、フランス）とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  -  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、  Ｅｕｇｅｎｅ、米国）でラベルされた、ヤギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗ヒトＭＭＰ７抗体を使用した。
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体のエピトープは記載されていない。
新生仔ウシ血清（Ｔｒｉｎａ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅｓ  ＡＧ、  Ｎaｎｉｋｏｎ、  スイス）中で希釈した、組換えＭＭＰ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）をキャリブレーターとして用いた。
アッセイ間の変動係数（ＣＶ）は≦１１％であり、そして、クリプタ（Ｋｒｙｐｔｏｒ）アッセイのアッセイ内ＣＶは≦９％である。
機能的アッセイ感度は１．９５ｎｇ／ｍｌである。
【００６９】
測定
各患者のサンプル５０μＬを、５０μＬの各結合抗体溶液とともに、３７℃で、２９分間、インキュベートすることにより、単一測定（Ｓｉｎｇｌｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）を自動的に行った。
再現性（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）および再現性（ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ）を評価するために、ＣｇＡおよびＭＭＰ７アッセイのそれぞれにおいて、２および３の品質管理（ＱＣ）サンプルを２回測定した。
【００７０】
統計分析
（Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ  検定によって制御された）血清濃度データの正規分布の欠如は、独立グループの比較のために、ノンパラメトリック両側ウィルコクソンの順位和検定（ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ  ｔｅｓｔ）（マンホイットニー検定）の使用を示した。
単変量および多変量解析のために、患者は、それらのＣｇＡとＭＭＰ７レベルに関する、低いおよび高い濃度のグループに細分化された。
カットオフは、予後診断値を最大にするように決定され、ＣｇＡについては、１４７ｎｇ／ｍＬ（８０パーセンタイル）、そして、ＭＭＰ７については、７．７５ｎｇ／ｍＬ（６６パーセンタイル）に相当する。
単変量疾患特異的生存分析（Ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ対数ランク検定と単変量コックス分析の両方を用いて行われた。
多変量分析については、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデル（ｈａｚａｒｄｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）を用いた。
すべての分析において、少なくとも０．０５のｐ値が有意であると考えられた。全ての統計分析は、ＳＰＳＳソフトウェアパッケージ、バージョン２１．０（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、米国）を用いて行った。
【００７１】
実施例２：手術で治療した集団におけるＣｇＡの術前予後診断値（実施例１の研究）
腫瘍サンプルと対照サンプルとの間のＣｇＡ血清レベルの比較
ＣｇＡの濃度は、対照と比較して、腫瘍患者の血清サンプルにおいて、有意に上昇した（それぞれ、中央値３．９ｎｇ／ｍＬ対２９．４ｎｇ／ｍＬ、Ｐ＜０．０００１、図１）。
【００７２】
ＣｇＡの濃度と臨床病理学のパラメータ
腫瘍患者において、ＣｇＡの濃度は、高齢患者および男性において有意により高かった（それぞれ、ｐ＝０．０２６およびｐ＝０．００９、表２）。ＣｇＡ濃度は、段階および悪性度に相関したが、転移にはしなかった（表２）。
【００７３】
手術で治療した集団におけるＣｇＡレベルの予後診断値
単変量分析：単変量解析の結果は、表３および図２に記載した。
疾患特異的生存率（ＨＲ＝０．４４７、ＣＩ  ０．２４７〜０．９１８、ｐ＝０．０２７）に影響を与える性別とは対照的に、患者の年齢は、全体的生存率または、疾患特異的生存率に影響を与えなかった。
腫瘍段階、悪性度および転移は、全体的−および疾患−特異的生存率の重要な予測因子である（Ｐ≦０．００１、表３）。
ＣｇＡ血清レベルはまた、全般的−および疾患−特異的生存の強力な予測因子でもある。
高いＣｇＡ血清濃度は、手術により処置された患者における、不良な（ｐｏｏｒ）全体的−および疾患−特異的な生存率と有意に関連していた（それぞれ、ＨＲ＝２．５５３、９５％ＣＩ、１．４０６−４．５６６、ｐ＝０．００２およびＨＲ＝２．２９５、９５％ＣＩ、１．１０６〜４．７６４、ｐ＝０．０２６であった、表３、およびｐ＝０．０２１、図２）。
さらに、ＣｇＡはまた、連続変数とみなされた場合の全生存率の重要な予測因子でもあった（ＨＲ＝１．００１、９５％  ＣＩ、１．０００−１．００２、ｐ＝０．０２４）。
【００７４】
多変量解析：
多変量解析の結果は、表４に示した。
多変量解析は、高いＣｇＡの血清濃度は、全体および疾患−特異的生存率の段階、悪性度および転移から−独立した（ｓｔａｇｅ−、  ｇｒａｄｅ−  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）予測因子であることを実証した（それぞれ、ＨＲ＝３．４２４、９５  ％ＣＩ、１．８５６−６．３１９、ｐ＜０．００１およびＨＲ＝３．６２９；９５％  ＣＩ、１．６９２−７．７８４；Ｐ＝０．００１、表４）。
処理後の２０ヶ月の生存率は、高い術前のＣｇＡレベルを有する患者の７０％と比較して、低い術前のＣｇＡ濃度（図２）の患者の８７％であった。
術前ＣｇＡ濃度が高い患者は、膀胱癌に関連する死亡および全体的な死亡のリスクが高く、そして、段落番号［００５４］に記載されているように、より積極的または実験的な治療の恩恵を被る可能性がある。
【００７５】
手術で治療した集団における、ＣｇＡおよびＭＭＰ７の術前予後診断値
腫瘍とコントロールサンプルの間の、ＭＭＰ７血清レベルの比較
ＭＭＰ７血清濃度を、同じ集団で測定した。ＭＭＰ７濃度は、対照と比較した腫瘍患者の血清サンプルにおいて有意に上昇した（中央値は、それぞれ、２．９ｎｇ／ｍＬ対４．４ｎｇ／ｍＬであった。Ｐ＜０．００１）。
【００７６】
ＭＭＰ７濃度および臨床病理学的パラメータ
腫瘍患者において、ＭＭＰ７濃度は、高齢の患者では有意により高いが（ｐ＜０．００１、表５）、男性においては、高くなかった。ＭＭＰ７濃度は、筋肉浸潤性腫瘍および転移の存在と関連していた（それぞれ、ｐ＝０．００８、ｐ＝０．０５、表５）が、悪性度には関係なかった。
【００７７】
手術で治療された集団における、ＭＭＰ７レベルの予後診断値
単変量分析：
単変量分析の結果を表３及び図２に示した。
ＭＭＰ７血清レベルは、全般−および疾患−特異的生存の重要な予測因子である。高いＭＭＰ７血清濃度は、外科的治療がされた患者における、不良な、全体的−および疾患−特異的生存率と有意に関係していた（それぞれ、ＨＲ＝３．７６４、９５％  ＣＩ、１．９８３−７．１４８、ｐ＜０．００１およびＨＲ＝３．９０５、９５％  ＣＩ、２．２９１−６．６５５、およびｐ＜０．００１、表３；およびｐ＜０．００１、図２）。
【００７８】
多変量解析：
多変量解析は、高いＭＭＰ７血清濃度は、段階−、悪性度―および転移から独立した（ｓｔａｇｅ−、  ｇｒａｄｅ−  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）、全体的−および疾患−特異的生存率の予測因子であることを実証した（それぞれ、ＨＲ＝２．７５０、９５％  ＣＩ  １．５５７〜４．８５５、ｐ＜０．００１およびＨＲ＝２．３２４；９５％  ＣＩ、１．１８７〜４．５４８；ｐ＝０．０１４、表６）。
２０月の生存率は、高い術前の濃度を有する患者の５９％と比較して、低い術前ＭＭＰ７を有する患者の８９％であった（図２）。
【００７９】
手術で治療した集団における、ＣｇＡおよびＭＭＰ７の組合せレベルの予後診断値
多変量解析は、高いＭＭＰ７および高いＣｇＡ血清濃度は、段階−、悪性度−および転移から独立した（ｓｔａｇｅ−、  ｇｒａｄｅ−  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）、全体的−および疾患−特異的生存率の予測因子であることを実証した（表９）。
高いＭＭＰ７の濃度と組み合わせた高いＣｇＡの血清濃度は、手術によって治療された患者において、不良な疾患−特異的生存率と関連していた（ｐ＜０．００１、図２）。
治療後２０月の生存率は、１つの上昇した血清マーカーを有する患者における７１％および、ＣｇＡおよびＭＭＰ７の両方が上昇した血清マーカーを有する患者における５０％と比較して、低い術前のＣｇＡおよびＭＭＰ７を有する患者では９０％以上であった（図２）。
高い術前のＣｇＡおよびＭＭＰ７濃度を有する患者は、関連する膀胱癌および、全体的な死亡のリスクが高く、そして、段落番号［００５４］で説明したように、より積極的なまたは実験的治療から利益を得ることができる。
【００８０】
実施例３：
ＲＣＥ処置集団における、ＣｇＡ／ＭＭＰ７の術前予後診断値（実施例１の研究）
根治的膀胱切除術により治療された患者のリスクの層別化は特に重要である。したがって、我々はまた、この群のみに焦点を当てた、ＣｇＡレベルの予後診断の重要性をも分析した。
【００８１】
ＲＣＥで治療した患者における、ＣｇＡレベルの予後診断値
高いＣｇＡ血清濃度は、全体的および疾患−特異的生存率の強力で、独立した予測因子であった（それぞれ、ＨＲ＝２．４０５、９５  ＣＩ  １．０００〜５．７８４、Ｐ＝０．０５０およびＨＲ＝４．００３、９５％  ＣＩ  １．４９１〜１０．７４８、Ｐ＝０．００６、表７）。
高いＣｇＡ濃度は、根治的膀胱摘除術（ｒａｄｉｃａｌ  ｃｙｓｔｅｃｔｏｍｙ）を施行した患者における、患者の不良な疾患−特異的生存率と有意に関連していた（ｐ＝０．００８、図３）。
根治的膀胱切除術（ｒａｄｉｃａｌ  ｃｙｓｔｅｃｔｏｍｙ）の後の２０月生存率は、高い術前濃度を示した患者の３３％と比較して、ＣｇＡの低い術前濃度を示した患者では７６％であった。
高い術前のＣｇＡ濃度を有する患者は、膀胱癌に関連し、そして、全体的な死亡率の高いリスクにさらされており、そして、段落番号［００５４］に記載されているように、より積極的なまたは実験的な治療から利益を得ることができる
【００８２】
ＲＣＥで治療した患者におけるＭＭＰ７レベルの予後診断値
高いＭＭＰ７血清濃度は、全体的および疾患−特異的生存率の、強力で、独立した予測因子であった（それぞれ、ＨＲ＝２．４５６、９５％ＣＩ  １．２９４−４．６６２、  ｐ＝０．００６およびＨＲ＝２．１９５、９５％  ＣＩ  １．０５７−４．５６０、ｐ＝０．０３５、表８）。根治的膀胱摘除術を受けた患者において、高いＭＭＰ７濃度は、不良な疾患特異的生存率に有意に関連していた（ｐ＝０．０２８、図３）。
【００８３】
根治的膀胱切除術後２０月生存率は、高Ｉ術前ＭＭＰ７濃度を有していた患者では５４％に比較して、低い術前ＭＭＰ７レベルを示した患者では７８％であった（図３）。
【００８４】
ＲＣＥで治療した患者における、ＣｇＡおよびＭＭＰ７の組み合わせたレベルの予後診断値
多変量解析は、
高いＭＭＰ７および高いＣｇＡ血清濃度は、段階−、悪性度−および転移から独立した（ｓｔａｇｅ−、  ｇｒａｄｅ−  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）、全体的−および疾患−特異的生存率の予測因子であることを実証した（表１０）。
高いＭＭＰ７の濃度と組み合わせた高いＣｇＡの血清濃度は、根治的膀胱切除術によって治療された患者において、不良な疾患−特異的生存率と有意に関連していた（ｐ＝０．００１、図３）。
根治的膀胱切除術後２０月の生存率は、１つの上昇した血清マーカーを有する患者における４７％および、ＣｇＡおよびＭＭＰ７のレベルの両方が上昇した血清マーカーを有する患者における２０％と比較して、低い術前のＣｇＡおよびＭＭＰ７のレベルを有する患者では７９上であった。
高い術前のＣｇＡおよびＭＭＰ７濃度を有する患者は、関連する膀胱癌および、全体的な死亡のリスクが高く、そして、段落番号［００５６］で説明したように、より積極的なまたは実験的治療から利益を得ることができる。
【００８５】
表
【００８６】
【表１】
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【００８７】
【表２】
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【００８８】
【表３】
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【００８９】
【表４】
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【００９０】
【表５】
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【００９１】
【表６】
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【００９２】
【表７】
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【００９３】
【表８】
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【００９４】
【表９】
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【００９５】
【表１０】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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