(57)【要約】本開示は、例えば、インビボで対象の特定の細胞型（例えば、ファスト・スパイキング・パルブアルブミン（ＦＳ−ＰＶ）免疫反応性介在ニューロン）及び／または脳領域（例えば、感覚野及び／または海馬）を同期的に活動化する周波数（例えば、約４０Ｈｚ）にて刺激を放出する刺激放出装置を用いて、対象の脳において同期ガンマ振動を誘導することによる、対象におけるアミロイドβ（Ａβ）ペプチド、Ｃ末端断片β（β−ＣＴＦ）、βセクレターゼ（ＢＡＣＥ１）、γセクレターゼ、神経炎症、及び／または認知症（例えば、アルツハイマー病もしくは加齢関連の低下）のうちの少なくとも１つのレベルまたは変化の予防、低減、及び治療のうちの少なくとも１つのためのシステム及び方法を提供する。【選択図】図１６Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における認知症の予防、軽減、及び治療のうちの少なくとも１つのための方法であって、前記対象の少なくとも１つの脳領域において、同期ガンマ振動を誘導することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記同期ガンマ振動が、周波数約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同期ガンマ振動が、周波数約４０Ｈｚを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記同期ガンマ振動が、細胞型特異的に誘導される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記同期ガンマ振動が、ファスト・スパイキング・パルブアルブミン（ＦＳ−ＰＶ）介在ニューロンの同期的活動化に対応する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記同期ガンマ振動が、脳領域特異的に誘導される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記同期ガンマ振動が、海馬領域及び感覚野領域の少なくとも一方における同期的活動化に対応する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記認知症が、アルツハイマー病、血管性認知症、前頭側頭認知症、レビー小体認知症、及び加齢関連認知低下のうちの少なくとも１つと関連する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記対象がヒトである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
対象における認知症の予防、軽減、及び治療のうちの少なくとも１つのための方法であって、前記対象の少なくとも１つの脳領域においてインビボで同期ガンマ振動を誘導するための少なくとも１つの所定の周波数を有する刺激を放出するように構成された、刺激放出装置を提供することを含む、前記方法。
【請求項１１】
前記刺激の前記少なくとも１つの所定の周波数が、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記刺激の前記少なくとも１つの所定の周波数が、約４０Ｈｚである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記刺激放出装置が、触覚装置、発光装置、及び放音装置のうちの少なくとも１つである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記発光装置が、光ファイバー装置である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象に対する前記刺激の投与期間が、約１時間である、請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記対象に対する前記刺激の投与が、ある期間にわたって繰り返される、請求項１０〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記対象に対する前記刺激の投与が、前記期間にわたって少なくとも１日１回繰り返され、前記期間が、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、及び１か月のうちの少なくとも１つである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象の少なくとも１つの脳領域におけるアミロイドβ（Ａβ）ペプチド量の維持及び低減の少なくとも一方のための方法であって、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記Ａβペプチドが、アイソフォームＡβ１−４０ペプチド及びアイソフォームＡβ１−４２ペプチドの少なくとも一方を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ａβペプチドが、可溶性Ａβペプチド及び不溶性Ａβペプチドの少なくとも一方を含む、請求項１８及び１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記同期ガンマ振動が、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域においてＡβペプチドの産生を低減する、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記同期ガンマ振動が、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域においてアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＣ末端断片（ＣＴＦ）及びＮ末端断片（ＮＴＦ）の少なくとも一方の量を低減する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記同期ガンマ振動が、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域において、βセクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）及びγセクレターゼの少なくとも一方によるＡＰＰのＣＴＦ及びＮＴＦへの切断を低減する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記同期ガンマ振動が、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域におけるエンドソームの数を低減する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記エンドソームが、初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１）及びＲＡＢ５Ａ遺伝子（Ｒａｂ５）がコードするＲａｓ関連タンパク質の少なくとも一方に対して陽性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記同期ガンマ振動が、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域におけるＡβペプチドのクリアランスを促進する、請求項１８〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記同期ガンマ振動が、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域において、ミクログリアによるＡβペプチドの取り込みを増大する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象の少なくとも１つの脳領域における、ミクログリア細胞数の増大、神経保護状態と一致する前記ミクログリア細胞の形態学的変化の誘導、及び前記ミクログリア細胞の活性の促進のうちの少なくとも１つのための方法であって、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導することを含む、前記方法。
【請求項２９】
前記同期ガンマ振動が、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域において前記ミクログリア細胞の前記活性に関与する少なくとも１つの差次的に発現される遺伝子を上方制御する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの差次的に発現される遺伝子が、Ｎｒ４ａ１、Ａｒｃ、Ｎｐａｓ４、Ｃｄ６８、Ｂ２ｍ、Ｂｓｒ２、Ｉｃａｍ１、Ｌｙｚ２、Ｉｒｆ７、Ｓｐｐ１、Ｃｓｆ１ｒ、及びＣｓｆ２ｒａのうちの少なくとも１つを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記神経保護状態と一致する前記ミクログリア細胞における前記形態学的変化が、細胞体のサイズの増加及び過程の長さの減少の少なくとも一方を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
対象の海馬においてアミロイドβ（Ａβ）ペプチドの量を低減するための方法であって、前記方法は、前記海馬において複数の光パルスでファスト・スパイキング・パルブアルブミン（ＦＳ−ＰＶ）介在ニューロンを光遺伝学的に刺激することを含み、前記ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンが、光遺伝学的アクチュエータを発現し、それにより、前記ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンにおける同期ガンマ振動をインビボで誘導し、これが、前記海馬におけるＡβペプチドの量を低減する、前記方法。
【請求項３３】
前記複数の光パルスが、パルス周波数約４０パルス／秒を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数の光パルスの各光パルスが、持続時間約１ミリ秒を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数の光パルスの各光パルスが、波長約４７３ｎｍを有する、請求項３２〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記光遺伝学的アクチュエータが、チャネルロドプシン、ハロロドプシン、及びアーキロドプシンのうちの少なくとも１つである、請求項３２〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記光遺伝学的アクチュエータが、チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
対象の視覚野における可溶性及び不溶性アミロイドβ（Ａβ）ペプチドの少なくとも一方の量を低減するための方法であって、複数の光パルスでパルス周波数約４０パルス／秒にて前記対象を刺激し、それにより、前記視覚野における同期ガンマ振動をインビボで誘導することを含み、これが、前記視覚野における可溶性Ａβペプチド及び不溶性Ａβペプチドの前記少なくとも一方の量を低減する、前記方法。
【請求項３９】
対象の視覚野におけるタウリン酸化を低減するための方法であって、複数の光パルスでパルス周波数約４０パルス／秒にて前記対象を刺激し、それにより、前記視覚野における同期ガンマ振動をインビボで誘導することを含み、これが、前記視覚野におけるタウリン酸化を低減する、前記方法。
【請求項４０】
対象の海馬及び聴覚野のうちの少なくとも一方におけるアミロイドβ（Ａβ）ペプチドの量を低減するための方法であって、複数の音波パルスでパルス周波数約４０パルス／秒にて前記対象を刺激することを含み、それにより、前記海馬及び前記聴覚野の前記少なくとも一方において同期ガンマ振動をインビボで誘導し、これが前記海馬及び前記聴覚野の前記少なくとも一方におけるＡβペプチドの量を低減する、前記方法。
【請求項４１】
対象におけるアミロイドβ（Ａβ）ペプチド、神経炎症、及び認知機能のうちの少なくとも１つにおける変化の予防、低減、及び治療のうちの少なくとも１つのためのシステムであって、
前記対象の脳領域のインビボでの同期的活動化のための刺激放出装置、
刺激パラメータ及びプロセッサの実行命令を保存するための少なくとも１つのメモリ、ならびに
前記刺激放出装置及び前記少なくとも１つのメモリに伝達可能に接続された少なくとも１つのプロセッサを含む前記システムであり、前記プロセッサの実行命令の実行時、前記少なくとも１つのプロセッサが、前記刺激放出装置を制御して前記刺激パラメータに従う前記刺激を放出し、前記パラメータが、前記周波数で前記脳領域を同期的に活動化する周波数を含み、
それにより、前記対象において前記Ａβペプチド、前記神経炎症、及び前記認知機能のうちの少なくとも１つにおける変化の予防、低減、及び治療のうちの少なくとも１つがなされる、前記システム。
【請求項４２】
前記周波数が、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚである、請求項４１に記載のシステム
【請求項４３】
前記周波数が、約４０Ｈｚである、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記インビボでの同期的活動化が、特定の細胞型で生じ、酵素によって制御される、請求項４１〜４３のいずれかに記載のシステム。
【請求項４５】
前記特定の細胞型が、ファスト・スパイキング・パルブアルブミン（ＦＳ−ＰＶ）免疫反応性介在ニューロンである、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４６】
前記酵素が、光遺伝学的活性化剤、微生物オプシン、チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）、及びベクターＡＡＶ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰのうちの少なくとも１つである、請求項４４及び４５のいずれかに記載のシステム。
【請求項４７】
対象におけるアミロイドβ（Ａβ）ペプチド、神経炎症、及び認知機能のうちの少なくとも１つにおける変化の予防、低減、及び治療のうちの少なくとも１つのためのシステムであって、
前記対象の少なくとも一方の目に対する周囲光を低減するための光閉塞装置であり、前記対象の視覚野及び海馬のうちの少なくとも一方のインビボでの同期的活動化のため、前記少なくとも一方の目に対して、光刺激を放出するための発光ユニットを含む前記光閉塞装置、ならびに
前記対象の少なくとも一方の耳に対する周囲騒音を低減するための雑音消去装置であり、前記対象の聴覚野及び海馬のうちの少なくとも一方のインビボでの同期的活動化のため、前記少なくとも一方の耳に対して、音刺激を放出するためのスピーカーユニットを含む前記雑音消去装置
のうちの少なくとも一方、
プロセッサの実行命令を保存するための少なくとも１つのメモリ、ならびに
前記光閉塞装置及び前記雑音消去装置のうちの少なくとも一方ならびに前記少なくとも１つのメモリに伝達可能に接続された少なくとも１つのプロセッサを含む前記システムであり、前記プロセッサの実行命令の実行時、前記少なくとも１つのプロセッサが：
前記発光ユニットが、前記視覚野及び前記海馬の前記少なくとも一方を同期的に活動化する周波数にて前記光刺激を放出するように前記光閉塞装置、ならびに
前記スピーカーユニットが、前記聴覚野及び前記海馬の前記少なくとも一方を同期的に活動化する前記周波数にて前記音刺激を作動させるように、前記雑音消去装置
の少なくとも一方を制御し、
それにより、前記対象において前記Ａβペプチド、前記神経炎症、及び前記認知機能のうちの少なくとも１つにおける変化の予防、低減、及び治療のうちの少なくとも１つがなされる、前記システム。
【請求項４８】
対象における認知機能を改善するための方法であって、
電気的音声信号を対応する音刺激に変換するための少なくとも１つの電気音響変換器の制御であり、前記音刺激が、クリック頻度約３５クリック／秒〜約４５クリック／秒のクリック・トレインを含む前記制御、及び
前記対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導するための前記対象に対する前記音刺激の投与であり、前記同期ガンマ振動が、前記対象における前記認知機能の改善をもたらす前記投与を含む、前記方法。
【請求項４９】
前記認知機能が、認識、識別、及び空間記憶のうちの少なくとも１つを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
対象におけるアミロイドβ（Ａβ）ペプチド、神経炎症、及び認知機能のうちの少なくとも１つにおける変化の予防、低減、及び治療のうちの少なくとも１つのための方法であって、
電気的音声信号を対応する音刺激に変換するための少なくとも１つの電気音響変換器の制御であり、前記音刺激が、クリック頻度約３５クリック／秒〜約４５クリック／秒のクリック・トレインを含む前記制御、及び
前記対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導するための前記対象に対する前記音刺激の投与であり、前記同期ガンマ振動が、前記対象における前記Ａβペプチド、前記神経炎症、及び前記認知機能のうちの少なくとも１つにおける前記変化の前記予防、前記低減、及び前記治療のうちの少なくとも１つをもたらす前記投与を含む、前記方法。
【請求項５１】
前記Ａβペプチドが、アイソフォームＡβ１−４０ペプチド及びアイソフォームＡβ１−４２ペプチドの少なくとも一方を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ａβペプチドが、可溶性Ａβペプチド及び不溶性Ａβペプチドの少なくとも一方を含む、請求項５０及び５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記同期ガンマ振動が、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域におけるミクログリア細胞の数の増大及び前記少なくとも１つの脳領域における前記ミクログリア細胞によるＡβペプチドの取り込みの向上の少なくとも一方によって、前記対象のＡβペプチド、神経炎症、及び認知機能のうちの前記少なくとも１つにおける前記変化の予防、低減、及び治療のうちの少なくとも１つをなす、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記少なくとも１つの脳領域が、前記聴覚野及び前記海馬の少なくとも一方を含む、請求項５０〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記クリック頻度が、約４０クリック／秒である、請求項５０〜５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記クリック・トレインの各クリックが、持続時間約１ミリ秒を有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記クリック・トレインの各クリックが、周波数約１０Ｈｚ〜約１００ｋＨｚを有する、請求項５０〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記クリック・トレインの各クリックが、周波数約１２Ｈｚ〜約２８ｋＨｚを有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記クリック・トレインの各クリックが、周波数約２０Ｈｚ〜約２０ｋＨｚを有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記クリック・トレインの各クリックが、周波数約２Ｈｚ〜約５ｋＨｚを有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記クリック・トレインの各クリックが、音圧レベル約０ｄＢ〜約８５ｄＢを有する、請求項５０〜６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記クリック・トレインの各クリックが、音圧レベル約３０ｄＢ〜約７０ｄＢを有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記クリック・トレインの各クリックが、音圧レベル約６０ｄＢ〜約６５ｄＢを有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記少なくとも１つの電気音響変換器が、少なくとも１つのヘッドホンを含み、前記方法が、さらに、前記対象の少なくとも一方の耳の周囲、上、及び中のうちの少なくとも１つに前記少なくとも１つのヘッドホンを使用し、前記対象の前記少なくとも一方の耳に前記音刺激を向けることを含む、請求項５０〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
さらに、受動的雑音遮断及び能動的雑音消去の少なくとも一方を用いて周囲騒音を低減することを含む、請求項５０〜６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
対象におけるアミロイドβ（Ａβ）ペプチド、神経炎症、及び認知機能のうちの少なくとも１つにおける変化の予防、低減、及び治療のうちの少なくとも１つのためのシステムであって、
電気的音声信号を対応する音刺激に変換するための少なくとも１つの電気音響変換器であり、前記音刺激が、クリック頻度約３５クリック／秒〜約４５クリック／秒のクリック・トレインを含む前記少なくとも１つの電気音響変換器、
前記電気的音声信号及びプロセッサの実行命令を保存するための少なくとも１つの記憶装置、ならびに
前記少なくとも１つの電気音響変換器及び前記少なくとも１つの記憶装置に伝達可能に接続された少なくとも１つのプロセッサを含む前記システムであり、前記プロセッサの実行命令の実行時、前記少なくとも１つのプロセッサが、前記電気音響変換器を制御し、前記対象の前記少なくとも一方の耳に前記音刺激を出力し、前記対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導し、前記同期ガンマ振動が、前記対象における前記Ａβペプチド、前記神経炎症、及び前記認知機能のうちの少なくとも１つにおける前記変化の前記予防、前記低減、及び前記治療のうちの少なくとも１つをもたらす、前記システム。
【請求項６７】
請求項６６に記載のシステムであって、
前記システムが携帯用であり、
前記少なくとも１つの電気音響変換器が、前記対象の前記少なくとも一方の耳の周囲、上、及び中のうちの少なくとも１つに着用するための少なくとも１つのヘッドホンを含み、前記対象の前記少なくとも一方の耳に前記音刺激を向け、かつ周囲騒音を低減し、
前記システムが、さらに、前記電気的音声信号を前記少なくとも１つのヘッドホンに伝達するためのヘッドホンインタフェースを含む、前記システム。
【請求項６８】
さらに、前記音刺激の出力の前、最中、及び後の少なくとも１つで、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域の機能を監視する神経画像装置を含む、請求項６６に記載のシステム。
【請求項６９】
対象における認知症の予防、軽減、及び治療のうちの少なくとも１つのための方法であって、前記対象の少なくとも１つの脳領域において、同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む、前記方法。
【請求項７０】
対象におけるストレス反応に関与する糖質コルチコイドの血中レベルの維持及び低減の少なくとも一方のための方法であって、前記対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む、前記方法。
【請求項７１】
対象における不安の予防及び低減の少なくとも一方のための方法であって、前記対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む、前記方法。
【請求項７２】
記憶の連合の維持及び強化の少なくとも一方のための方法であって、対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む、前記方法。
【請求項７３】
前記記憶の連合が、空間記憶に基づく、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
認識の柔軟性の維持及び強化の少なくとも一方のための方法であって、対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む、前記方法。
【請求項７５】
対象の少なくとも１つの脳領域における生体構造及び形態の少なくとも一方に関する変化の維持及び低減の少なくとも一方のための方法であって、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む、前記方法。
【請求項７６】
生体構造及び形態の前記少なくとも一方が、脳重量、側脳室サイズ、皮層の厚さ、ニューロン層の厚さ、及び血管径のうちの少なくとも１つを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記少なくとも１つの脳領域が、前記対象の視覚野、体性感覚皮質、及び島皮質のうちの少なくとも１つを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
対象の少なくとも１つの脳領域において、ニューロンの数、前記ニューロンのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の質、及びシナプス点密度のうちの少なくとも１つに関する変化の維持及び低減の少なくとも一方のための方法であって、前記対象の前記少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む、前記方法。
【請求項７９】
前記少なくとも１つの脳領域が、前記対象の視覚野、体性感覚皮質、島皮質、及び海馬のうちの少なくとも１つを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置であって、
前記対象における認知症の予防、軽減、及び／または治療、
前記対象における不安の予防及び／または低減、
前記対象におけるストレス反応に関与する糖質コルチコイドの血中レベルの維持及び／または低減、
前記対象の記憶の連合の維持及び／または強化、
前記対象の認識の柔軟性の維持及び／または強化、
前記対象の前記少なくとも１つの脳領域における生体構造及び形態の少なくとも一方に関する変化の維持及び／または低減、ならびに
前記対象の前記少なくとも１つの脳領域において、ニューロンの数、前記ニューロンのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の質、及びシナプス点密度のうちの少なくとも１つに関する変化の維持及び／または低減のうちの少なくとも１つのための前記装置。
【請求項８１】
対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する刺激方針に従って刺激を生成するように構成された刺激放出体を含む装置であって、前記刺激放出体が、
前記対象における認知症の予防、軽減、及び／または治療、
前記対象における不安の予防及び／または低減、
前記対象におけるストレス反応に関与する糖質コルチコイドの血中レベルの維持及び／または低減、
前記対象の記憶の連合の維持及び／または強化、
前記対象の認識の柔軟性の維持及び／または強化、
前記対象の前記少なくとも１つの脳領域における生体構造及び形態の少なくとも一方に関する変化の維持及び／または低減、ならびに
前記対象の前記少なくとも１つの脳領域において、ニューロンの数、前記ニューロンのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の質、及びシナプス点密度のうちの少なくとも１つに関する変化の維持及び／または低減のうちの少なくとも１つのためである、前記装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた認可番号ＲＦ１  ＡＧ０４７６６１の下、政府支援を受けてなされた。政府は本発明に所定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０１５年１１月２４日に出願された「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ，Ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ，ａｎｄ／ｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ」と題する米国出願第６２／２５９，１８７号の優先権の利益を主張する。当該出願の開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、概して、対象における認知症を予防、軽減、及び／または治療するためのシステムならびに方法に関する。より具体的には、本開示は、対象の少なくとも１つの脳領域において、同期ガンマ振動を誘導するためのシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶力、見当識、及び論理的思考の低下を特徴とする進行性の神経変性疾患である。これは、世界における認知症の最も一般的な形であり、６５歳以上の約８人に１人を侵し、米国では死因の第６位である。この進行性の神経変性疾患の患者数は、今後１０年で４０％増加すると推定される。
【０００５】
病理組織学的には、ＡＤは、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドを含むアミロイド斑及びタウタンパク質からなる神経原線維変化（ＮＦＴ）の蓄積を特徴とし得る。Ａβペプチドは、３６〜４３アミノ酸のタンパク質であり、その正常な生理的機能はいまだ不明である。Ａβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のβセクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）及びγセクレターゼによる一連のタンパク質分解的切断によって形成される。Ｃ末端断片β（β−ＣＴＦ）は、ＢＡＣＥ１によるＡＰＰのアミロイド形成的切断の過程で産生されるＡＰＰ誘導体であり、ひいてはＡβペプチド産生の別の指標である。正常な状態では、可溶性のＡβペプチドはニューロンによって産生及び分泌され、その後、脳脊髄液（ＣＳＦ）経路を介して脳から除去される。しかしながら、ＡＤの対象では、Ａβペプチドは、より高次の種に凝集し、可溶性のオリゴマーと不溶性の斑を濃度依存的に形成すると思われる。この凝集は、脳代謝の破壊、神経炎症、機能的結合の低下、シナプス及びニューロンの損失、及び／またはＮＦＴの形成を含めた多くの神経毒性事象を引き起こす場合がある。
【０００６】
Ａβ濃度とニューロンの活動の間の基本的関係は証明されている。第一に、ＡＰＰを過剰発現するトランスジェニック（Ｔｇ）マウスから調製した器官型海馬スライスのテトロドトキシンでの処理で、ニューロンの活動が低下し、それに続いてＡβレベルが低下した。その後、逆の効果、すなわち、ニューロンの活動の増加がピクロトキシンでの処理で観察された。Ａβペプチド濃度及び最終的な斑沈着のインビボでの動的調節もまた、ニューロンの活動を用いて証明されている。ヒトＡＤ患者では、神経系の画像化で、最も深刻な斑沈着が、「デフォルトモードネットワーク」として知られる最も一貫して活発な脳領域と一致し得ることが示される。
【０００７】
これまでのところ、ＡＤは治療法がなく、治療選択肢は、ＡＤの病理学的進行を抑制せず、主に姑息的であり、及び／または複数の厄介な副作用を有する場合もある。例えば、Ａβペプチド及び／またはその前駆体を標的とする予防及び／または治療戦略（例えば、Ａβ免疫療法ならびにβセクレターゼ及びγセクレターゼの阻害）は、臨床試験では、ＡＤの病変の低減において害があり、及び／または効果がないとされている。アミロイドベータワクチン（例えば、バピネオズマブ）を使用する臨床試験は、認知機能に関する効果の不足のために失敗している。ガンマセクレターゼ阻害剤（例えば、セマガセスタット）は、対象における認知障害の悪化のため、臨床試験に失敗している。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル及びリバスチグミン）ならびにＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト（例えば、メマンチン）等の既存薬でさえ、認知機能に関する軽度の効果しか示さない。
【発明の概要】
【０００８】
ＡＤの重要な微視的病理学的特徴としては、アミロイド斑、ＮＦＴ、及び広範囲に及ぶニューロンの欠損の存在が挙げられる。このニューロンの損傷の蓄積は、長い時間をかけて生じ、脳内の巨視的な回路の機能不全、とりわけ、記憶と集中の作業の過程でガンマパワー不足を誘導する。これらのガンマ振動（例えば、約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚ、約２０Ｈｚ〜約８０Ｈｚ、または約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚ）は、主にファスト・スパイキング・パルブアルブミン（ＦＳ−ＰＶ）介在ニューロンを生じ、これにより調節される。
【０００９】
一態様において、本開示は、当該対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導することを含む、対象における認知症を予防、軽減、及び／または治療するための装置、方法、ならびにシステムを提供する。いくつかの実施形態では、該認知症は、ＡＤ、血管性認知症、前頭側頭認知症、レビー小体認知症、及び/または加齢関連認知低下と関連する。該対象は、ヒトの場合も動物の場合もある。
【００１０】
いくつかの実施形態では、該同期ガンマ振動は、周波数約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚ、例えば、約４０Ｈｚを有する。該同期ガンマ振動は、細胞型特異的に誘導され得る。例えば、該振動は、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの同期的活動化と調和し得る。該同期ガンマ振動は、脳領域特異的に誘導され得る。例えば、該振動は、海馬領域及び感覚野領域の少なくとも一方における同期的活動化と調和し得る。
【００１１】
１つの実施形態では、対象における認知症を予防、軽減、及び／または治療するための方法は、刺激放出装置を制御して刺激を放出するステップ、ならびに該対象を該刺激に曝露するステップ、及び／または該対象に該刺激を投与するステップを含み、それにより、該対象の少なくとも１つの脳領域においてインビボで同期ガンマ振動を誘導する。該刺激は、周波数約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚ、例えば、周波数約４０Ｈｚを有し得る。該刺激放出装置は、触覚装置、発光装置、及び／または放音装置であり得る。例えば、該発光装置は、光ファイバー装置であり得る。該刺激への該対象の曝露期間及び／または該対象への該刺激の投与期間は、約１時間でよい。該刺激への該対象の曝露及び／または該対象への該刺激の投与は、ある期間にわたって繰り返してもよい。例えば、該刺激への該対象の曝露及び／または該対象への該刺激の投与は、該期間にわたって少なくとも１日１回繰り返してよい。該期間としては、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、及び／または１か月（またはより長期間、例えば、当該対象の生涯にわたり、１日１回）を挙げることができるがこれに限定されない。
【００１２】
一態様において、対象の少なくとも１つの脳領域においてＡβペプチドのレベル（例えば、量または割合）を低減するための方法は、該対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導することを含む。該Ａβペプチドとしては、Ａβペプチドの１つ以上のアイソフォーム（例えば、アイソフォームＡβ１−４０、アイソフォームＡβ１−４２、及び／またはアイソフォームＡβ１−４３）、可溶性Ａβペプチド、及び／または不溶性Ａβペプチドを挙げることができる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、該同期ガンマ振動は、例えば、該対象の該少なくとも１つの脳領域においてＡＰＰのＣ末端断片（ＣＴＦ）及び／またはＮ末端断片（ＮＴＦ）のレベル（例えば、量または割合）を低減することにより、該対象の該少なくとも１つの脳領域においてＡβペプチドの産生を低減する。該同期ガンマ振動は、該対象の該少なくとも１つの脳領域においてＢＡＣＥ１及び／またはγセクレターゼによるＡＰＰのＣＴＦ及びＮＴＦへの切断を低減し得る。該同期ガンマ振動は、該対象の該少なくとも１つの脳領域においてエンドソームのレベル（例えば、数または割合）を低減し得る。例えば、該エンドソームは、初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１）及び／またはＲＡＢ５Ａ遺伝子（Ｒａｂ５）がコードするＲａｓ関連タンパク質に対して陽性であり得る。いくつかの実施形態では、該同期ガンマ振動は、該対象の該少なくとも１つの脳領域においてＡβペプチドのクリアランスを促進する。該同期ガンマ振動は、該対象の該少なくとも１つの脳領域においてミクログリアによるＡβペプチドの取り込みを増加させ得る。
【００１４】
一態様における、対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導することを含む、対象の少なくとも１つの脳領域におけるミクログリア細胞のレベル（例えば、数または割合）、神経保護状態と一致するミクログリア細胞の形態学的変化、及び／または該ミクログリア細胞の活性を増加させる方法。該同期ガンマ振動は、少なくとも１つの差次的に発現される遺伝子、例えば、該対象の該少なくとも１つの脳領域においてミクログリアの活性に関与する、Ｎｒ４ａ１、Ａｒｃ、Ｎｐａｓ４、Ｃｄ６８、Ｂ２ｍ、Ｂｓｒ２、Ｉｃａｍ１、Ｌｙｚ２、Ｉｒｆ７、Ｓｐｐ１、Ｃｓｆ１ｒ、及び／またはＣｓｆ２ｒａを上方制御し得る。該神経保護状態と一致するミクログリア細胞の形態学的変化は、細胞体のサイズの増加及び／または過程の長さの減少を含み得る。
【００１５】
一態様において、対象の海馬においてＡβペプチドのレベル（例えば、量または割合）を低減するための方法は、該海馬において光遺伝学的にＦＳ−ＰＶ介在ニューロンを、複数の光パルスで刺激すること含み、該ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンは、光遺伝学的アクチュエータを発現し、それにより、該海馬におけるＡβペプチドのレベルを低減する興奮性ニューロン（例えば、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロン）における局所電場電位によって測定されるインビボ同期ガンマ振動に同調する。該光パルスは、パルス周波数約４０パルス／秒を有し得る。各光パルスは、持続時間約１ミリ秒を有し得る。少なくとも１つの光パルスは、波長約４７３ｎｍを有し得る。該光遺伝学的アクチュエータは、チャネルロドプシン、ハロロドプシン、及び／またはアーキロドプシンを含み得る。例えば、該光遺伝学的アクチュエータは、チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）であり得る。
【００１６】
一態様において、対象の視覚野における可溶性及び／または不溶性Ａβペプチドのレベル（例えば、量または割合）を低減するための方法は、該対象を複数の光パルスでパルス周波数約４０パルス／秒にて刺激することを含み、それにより、該視覚野において同期ガンマ振動をインビボで誘導し、これが該視覚野における可溶性及び／または不溶性Ａβペプチドのレベルを低減する。
【００１７】
一態様において、対象の視覚野におけるタウリン酸化のレベル（例えば、量または割合）を低減するための方法は、該対象を複数の光パルスでパルス周波数約４０パルス／秒にて刺激することを含み、それにより、該視覚野において同期ガンマ振動をインビボで誘導し、これが該視覚野におけるタウリン酸化を低減する。
【００１８】
一態様において、対象の海馬及び／または聴覚野におけるＡβペプチドのレベル（例えば、量または割合）を低減するための方法は、該対象を複数の音波パルスでパルス周波数約４０パルス／秒にて刺激することを含み、それにより、該海馬及び聴覚野の少なくとも一方において同期ガンマ振動をインビボで誘導し、これが該海馬及び聴覚野の少なくとも一方におけるＡβペプチドのレベルを低減する。
【００１９】
一態様において、対象におけるＡβペプチド、神経炎症、及び／または認知機能のレベル（例えば、量または割合）または変化を予防、低減、及び／または治療するためのシステムは、当該対象の脳領域のインビボでの同期的活動化のための刺激放出装置、刺激パラメータ及びプロセッサの実行命令を保存するための少なくとも１つのメモリ、ならびに該刺激放出装置及び該少なくとも１つのメモリに伝達可能に接続された少なくとも１つのプロセッサを具備する。該プロセッサの実行命令の実行時、該少なくとも１つのプロセッサは、該刺激放出装置を制御して該刺激パラメータに従う刺激を放出し、該パラメータは、当該周波数で該脳領域を同期的に活動化する周波数を含み、それにより、該対象におけるＡβペプチド、神経炎症、及び／または認知症が予防、低減、及び／または治療される。該周波数は、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚ、例えば、約４０Ｈｚでよい。該インビボでの同期的活動化は、酵素によって調節される場合があり、及び／または特定の細胞型、例えば、免疫反応性ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンで生じる場合もある。該酵素としては、光遺伝学的活性化剤、微生物オプシン、ＣｈＲ２、及び／またはベクターＡＡＶ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰを挙げることができる。
【００２０】
一態様において、対象におけるＡβペプチド、神経炎症、及び／または認知機能のレベル（例えば、量または割合）または変化を予防、低減、及び／または治療するためのシステムは、該対象の少なくとも一方の目に対する周囲光を低減するための光閉塞装置及び／または該対象の少なくとも一方の耳に対する周囲騒音を低減するための雑音消去装置を具備する。該光閉塞装置は、該対象の視覚野及び海馬のうちの少なくとも一方のインビボでの同期的活動化のため、該少なくとも一方の目に対して、光刺激を放出するための発光ユニットを具備してもよい。該雑音消去装置は、該対象の聴覚野及び海馬のうちの少なくとも一方のインビボでの同期的活動化のため、該少なくとも一方の耳に対して、音刺激を放出するためのスピーカーユニットを具備してもよい。該システムはまた、プロセッサの実行命令を保存するための少なくとも１つのメモリ、ならびに該光閉塞装置及び／または該雑音消去装置ならびに該少なくとも１つのメモリに伝達可能に接続された少なくとも１つのプロセッサを具備する。該プロセッサの実行命令の実行時、該少なくとも１つのプロセッサは、該発光ユニットが、当該周波数で視覚野及び海馬の該少なくとも一方を同期的に活動化する周波数にて該光刺激を放出するように、該光閉塞装置を制御する場合がある。代替的に、またはさらに、該少なくとも１つのプロセッサは、該スピーカーユニットが、当該周波数で聴覚野及び海馬の少なくとも一方を同期的に活動化する周波数にて該音刺激を作動させるように、該雑音消去装置を制御する場合がある。
【００２１】
一態様において、対象における認知機能を改善するための方法は、少なくとも１つの電気音響変換器を制御し、電気的音声信号を対応する音刺激に変換することを含む。いくつかの実施形態では、該音刺激としては、クリック頻度約３５クリック／秒〜約４５クリック／秒のクリック・トレインが挙げられる。該方法はさらに、該対象を該音刺激に曝露し、及び／または該対象に対して該刺激を投与し、該対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導することを含み、該同期ガンマ振動が、該対象における認知機能の改善をもたらす。該認知機能としては、認識、識別、及び／または空間記憶を挙げることができる。
【００２２】
一態様において、対象におけるＡβペプチド、神経炎症、及び／または認知機能のレベル（例えば、量または割合）または変化を予防、低減、及び／または治療するための方法は、少なくとも１つの電気音響変換器を制御し、電気的音声信号を、対応する音刺激、すなわち、クリック頻度約３５クリック／秒〜約４５クリック／秒のクリック・トレイン等の音刺激に変換すること、ならびに該対象を該音刺激に曝露し、及び／または該対象に対して該刺激を投与し、該対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導することを含み、該同期ガンマ振動が、該対象におけるＡβペプチド、神経炎症、及び／または認知症のレベルの予防、低減、及び／または治療をもたらす。
【００２３】
該Ａβペプチドとしては、Ａβペプチドの１つ以上のアイソフォーム（例えば、アイソフォームＡβ１−４０、アイソフォームＡβ１−４２、及び／またはアイソフォームＡβ１−４３）、可溶性Ａβペプチド、及び／または不溶性Ａβペプチドを挙げることができる。該同期ガンマ振動は、当該対象の少なくとも１つの脳領域におけるミクログリア細胞の数を増加させること、及び／または、該少なくとも１つの脳領域における該ミクログリア細胞によるＡβペプチドの取り込みを増加させることによって、該対象におけるＡβペプチド、神経炎症、及び／または認知症のレベルを予防、低減、及び／または治療し得る。該少なくとも１つの脳領域としては、聴覚野及び／または海馬を挙げることができる。
【００２４】
該クリック頻度は、約４０クリック／秒でよい。該クリック・トレインの各クリックは、持続時間約１ミリ秒を有し得る。該クリック・トレインの各クリックは、周波数約１０Ｈｚ〜約１００ｋＨｚ、約１２Ｈｚ〜約２８ｋＨｚ、約２０Ｈｚ〜約２０ｋＨｚ、及び／または約２ｋＨｚ〜約５ｋＨｚを有し得る。該クリック・トレインの各クリックは、音圧レベル約０ｄＢ〜約８５ｄＢ、約３０ｄＢ〜約７０ｄＢ、及び約６０ｄＢ〜約６５ｄＢを有し得る。
【００２５】
該少なくとも１つの電気音響変換器としては、少なくとも１つのヘッドホンを挙げることができ、この場合、該方法は、当該対象の少なくとも一方の耳の周囲に、耳の上に、及び／または耳の中に該少なくとも１つのヘッドホンを使用し、該対象の該少なくとも一方の耳に音刺激を向けることを含み得る。該方法としてはまた、受動的雑音遮断及び／または能動的雑音消去を用いた周囲騒音の低減を挙げることができる。
【００２６】
一態様において、対象におけるＡβペプチド、神経炎症、及び／または認知機能のレベル（例えば、量または割合）または変化を予防、低減、及び／または治療するためのシステムは、電気的音声信号を、対応する音刺激、すなわち、クリック頻度約３５クリック／秒〜約４５クリック／秒のクリック・トレイン等の音刺激に変換するための少なくとも１つの電気音響変換器、該電気的音声信号及びプロセッサの実行命令を保存するための少なくとも１つの記憶装置、ならびに該少なくとも１つの電気音響変換器及び該少なくとも１つの記憶装置に伝達可能に接続された少なくとも１つのプロセッサを具備する。該プロセッサの実行命令の実行時、該少なくとも１つのプロセッサは、該電気音響変換器を制御し、該対象の少なくとも一方の耳に音刺激を出力し、該対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導し、該同期ガンマ振動が、該対象におけるＡβペプチド、神経炎症、及び／または認知症のレベルの予防、低減、及び／または治療をもたらす。
【００２７】
該システムは、固定式でも携帯式でもよい。該少なくとも１つの電気音響変換器が、当該対象の少なくとも一方の耳の周囲に、耳の上に、及び／または耳の中に着用するための該少なくとも１つのヘッドホンを具備し、該対象の該少なくとも一方の耳に音刺激を向け、かつ周囲騒音を低減する場合、該システムは、さらに、該電気的音声信号を該少なくとも１つのヘッドホンに伝達するためのヘッドホンインタフェースを具備してもよい。代替的に、またはさらに、該システムは、該音刺激の出力の前、最中、及び／または後に、該対象の該少なくとも１つの脳領域の機能を監視する神経画像装置を具備してもよい。
【００２８】
一態様において、対象における認知症を予防、軽減、及び／または治療するための方法は、該対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む。
【００２９】
一態様において、対象におけるストレス反応に関与する糖質コルチコイドの血中レベル（例えば、量）を維持及び／または低減するための方法は、該対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む。
【００３０】
一態様において、対象における不安を予防及び／または低減するための方法は、該対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む。
【００３１】
一態様において、記憶の連合を維持及び／または強化するための方法は、当該対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む。該記憶の連合は、空間記憶に基づきうる。
【００３２】
一態様において、認識の柔軟性を維持及び／または強化するための方法は、当該対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む。
【００３３】
一態様において、対象の少なくとも１つの脳領域において、生体構造及び／または形態に関する変化を維持及び／または低減するための方法は、該対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む。該生体構造及び／または形態としては、脳重量、側脳室サイズ、皮層の厚さ、ニューロン層の厚さ、及び／または血管径を挙げることができる。該少なくとも１つの脳領域としては、該対象の視覚野、体性感覚皮質、及び／または島皮質を挙げることができる。
【００３４】
一態様において、対象の少なくとも１つの脳領域において、ニューロンの数、該ニューロンのＤＮＡの質、及び／またはシナプス点密度に関する変化を維持及び／または低減するための方法は、該対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置を提供することを含む。該少なくとも１つの脳領域としては、該対象の視覚野、体性感覚皮質、島皮質、及び／または海馬を挙げることができる。
【００３５】
一態様において、対象の少なくとも１つの脳領域において同期ガンマ振動を誘導する装置は、該対象における認知症及び／または不安を予防、軽減、及び／または治療すること、該対象の記憶の連合及び／または認識の柔軟性を維持及び／または強化すること、及び／または該対象の少なくとも１つの脳領域において生体構造、形態、細胞、及び分子に関する変化を維持及び／または低減することができる。
【００３６】
前述の概念及び以下により詳細に論じられるさらなる概念のすべての組合せ（ただし、かかる概念が互いに矛盾しないことを条件とする）は、本明細書に開示の本発明の主題の一部であるとして企図されることを理解されたい。特に、本開示の最後に現れる請求項に記載の主題のすべての組合せは、本明細書に開示の本発明の主題の一部であるとして企図される。また、参照により組み込まれる任意の開示にも同様に現れる場合がある本明細書で明示的に使用される用語は、本明細書に開示の特定の概念と最も一致する意味を与えられるべきであることも理解されたい。
【００３７】
他のシステム、過程、及び特徴は、以下の図面及び詳細な説明を検討することにより、当業者には明らかになるであろう。すべてのかかる追加のシステム、過程、及び特徴は、本説明に含まれ、本発明の範囲内であり、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図される。
【００３８】
当業者には、図面は主に説明のためのものであり、本明細書に記載の本発明の主題の範囲を限定するものではないことが理解されよう。図面は必ずしも縮尺通りではなく、いくつかの例では、本明細書に開示の本発明の主題の様々な態様は、異なる特徴の理解を容易にするために、図面に誇張されて示される場合、または拡大されて示される場合がある。図面において、同類の参照符号は、概して、例えば、同類の特徴（例えば、機能的に同類及び/または構造的に同類の要素）を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】いくつかの実施形態に従って、球状トレッドミル上の仮想直線迷路を走るマウスを示す概略図である。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、海馬ＣＡ１から記録された、シータ振動及び鋭波リップル（ＳＷＲ）を示す電気トレースである。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、いくつかの実施形態に従って、３か月齢のＴｇ  ５ＸＦＡＤ及び野生型（ＷＴ）マウスのシータ周期中の正規化されたパワースペクトルならびに正規化されたパワースペクトル密度の平均及び標準偏差を示すプロットである。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＷＴマウス及び５ＸＦＡＤマウスのＳＷＲを示すスペクトログラムである。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、いくつかの実施形態に従って、ＳＷＲ中の瞬時ガンマ周波数の分布を示すプロットである。
【図６】図６Ａは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤ及びＷＴマウスにおけるＳＷＲのピークからの時間の関数としてＺスコアのガンマパワーを示す一連のグラフである。図６Ｂは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤ及びＷＴマウスにおけるＳＷＲ中のガンマパワーの累積分布を示すプロットである。図６Ｃ及び６Ｄは、いくつかの実施形態に従って、ＷＴ及び５ＸＦＡＤマウスのＳＷＲのピークを中心にして１００ミリ秒の間のＺスコアのガンマパワーの累積分布を示すプロットである。図６Ｅは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤ及びＷＴマウスにおける大きなＳＷＲ中のガンマパワーの累積分布を示すプロットである。
【図７】いくつかの実施形態に従うＳＷＲ中、図７Ａは、ガンマ振動位相の関数としてのスパイクの割合を示すプロットであり、図７Ｂは、スパイキングの変調の深さを示すプロットである。図７Ｃ及び７Ｄは、いくつかの実施形態に従って、ガンマ振動位相の関数としてのＳＷＲ中の海馬ＣＡ１におけるスパイクの割合を示すプロットである。いくつかの実施形態に従う大きなＳＷＲ中、図７Ｅは、ガンマ振動位相の関数としてのスパイクの割合を示すプロットであり、図７Ｆは、スパイキングの変調の深さを示すプロットである。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤ及びＷＴ動物で、各動物及び合わせたすべての動物に関する非シータ周期当たりのＳＷＲ率を示すプロットである。
【図９】いくつかの実施形態に従って、対象の脳における特定の細胞型の活性化を調節するためのウイルスベクターを示す概略図である。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域に対する信号送出を示す概略図である。
【図１１】いくつかの実施形態に従って、ＣｈＲ２及びＤＡＰＩを有する対象における神経組織の免疫染色を示す免疫蛍光画像である。
【図１２】図１２Ａは、いくつかの実施形態に従って、ＰＶ＋介在ニューロンで発現されたＣｈＲ２−ＥＹＦＰを示す免疫蛍光画像である。図１２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、抗ＥＹＦＰ及び抗ＰＶ抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの試験の概略図、局所電場電位の電気トレース、及びパワースペクトル密度を含む。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１ミリ秒のレーザパルスの開始後の生の電気トレース、光遺伝学的刺激後のスパイクに対してフィルターをかけた後のトレース、及びスパイクの確率のプロットを含む。
【図１５】図１５Ａは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの刺激周期とランダム刺激周期の間の発火率の差を示すヒストグラムである。図１５Ｂは、いくつかの実施形態に従って、各動物について、４０Ｈｚの刺激、ランダム刺激、及び無刺激周期当たりのマルチユニット発火率を示す棒グラフである。
【図１６】図１６Ａは、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域における特定の細胞型の刺激の周波数特異的な増加の過程での対象の海馬から記録した電気トレースである。図１６Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域における特定の細胞型の刺激における局所電場電位パワーの周波数特異的な増加を示すパワースペクトル密度のプロットである。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、いくつかの実施形態に従って、一元配置分散分析による５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅ  ＣＡ１の相対的Ａβ１−４０及びＡβ１−４２レベルを示す棒グラフである。
【図１８】図１８Ａ及び１８Ｂは、いくつかの実施形態に従って、一元配置分散分析による５ＸＦＡＤ／αＣａｍＫＩＩ−Ｃｒｅ  ＣＡ１の相対的Ａβ１−４０及びＡβ１−４２レベルを示す棒グラフである。
【図１９】図１９Ａは、いくつかの実施形態に従って、海馬ＣＡ１領域における抗Ａβ及び抗ＥＥＡ１抗体による免疫組織化学を示す一連の画像である。図１９Ｂは、くつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰに対して正規化されたＡβの相対的免疫反応性を示す一連の棒グラフである。
【図２０】図２０Ａは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅの海馬ＣＡ１領域における抗Ａβ抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。図２０Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰに正規化されたＡβの相対的免疫反応性を示す棒グラフである。
【図２１】図２１Ａは、いくつかの実施形態に従って、ＣＡ１におけるＡＰＰ（ＣＴ６９５）、ＡＰＰ  ＮＴＦ（Ａ８９６７）、ＡＰＰ  ＣＴＦ（ＣＴ６９５）、及びβアクチン（Ａ５３１６）（負荷対照）のレベルを示す代表的なウェスタンブロットである。図２１Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ及びランダム条件に対する４０ＨｚにおけるＡＰＰ  ＣＴＦの相対的（アクチンに対して正規化）免疫反応性を示す棒グラフである。図２１Ｃは、いくつかの実施形態に従って、ＣＡ１における完全長ＡＰＰ２１０６（ＣＴ６９５）、ＡＰＰ  ＣＴＦ２１０８（ＣＴ６９５）、及びβアクチン２１１２（Ａ５３１６、負荷対照）のレベルを示す一連のウェスタンブロットである。
【図２２】図２２Ａは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ及びランダム条件に対する４０ＨｚにおけるＡＰＰ  ＮＴＦの相対的（アクチンに対して正規化）免疫反応性を示す棒グラフである。図２２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ、ランダム、及び４０Ｈｚ条件における完全長ＡＰＰの相対的（アクチンに対して正規化）免疫反応性を示す棒グラフである。
【図２３】いくつかの実施形態に従って、抗Ｒａｂ５（ＡＤＩ−ＫＡｐ−ＧＰ００６−Ｅ）による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。
【図２４】いくつかの実施形態に従うＥＹＦＰ、４０Ｈｚ、及びランダム刺激条件下、図２４Ａは、ＥＹＦＰに対して正規化されたＥＥＡ１の相対的免疫反応性を表す棒グラフであり、図２４Ｂは、５ＸＦＡＤ／ＰＶ−ＣｒｅからのＣＡ１の相対的Ｒａｂ５強度レベルを示す棒グラフである。
【図２５】図２５Ａは、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域の異なる型の刺激後のＡβペプチドアイソフォームＡβ１−４０のレベルを示す棒グラフである。図２５Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ガンマ振動での対象の海馬のＣＡ１領域における特定の細胞型の刺激後のＡβペプチドアイソフォームＡβ１−４２の減少を示す棒グラフである。図２５Ｃは、いくつかの実施形態に従って、ガンマ振動での対象の海馬のＣＡ１領域における特定の細胞型の刺激後のＣＴＦ（例えば、β−ＣＴＦ）のレベルの減少及び完全長ＡＰＰ（アクチンに対して正規化）のレベルの増加を示す一連の画像である。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域の異なる型の刺激後のエンドソームレベル（ＥＥＡ１レベルに基づく）を示す免疫蛍光画像である。
【図２７】いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域の異なる型の刺激後の図６Ａ〜６Ｂの免疫蛍光画像に対する平均強度値（ＦＡＤに対して正規化）を示す棒グラフである。
【図２８】いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの刺激の有無でのマウス海馬ＣＡ１領域の全トランスクリプトームリボ核酸シークエンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）によって決定された差次的に発現される遺伝子を示すヒートマップである。
【図２９】いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ及び４０Ｈｚ条件における上方ならびに下方制御された遺伝子のＦＰＫＭ値を示す箱ひげ図である。
【図３０】いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの刺激後の特定された上方制御された遺伝子の細胞型特異的発現パターンを示す円グラフである。
【図３１】いくつかの実施形態に従って、ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットにおける特定の遺伝子標的のＲＴ−ｑＰＣＲ検証を示す棒グラフである。
【図３２】図３２Ａ及び３２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅を見せている間に脳の上で再コード化された局所電場電位のパワースペクトル密度を示すプロットである。
【図３３】いくつかの実施形態に従って、ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットにおける特定の遺伝子標的のＲＴ−ｑＰＣＲ検証を示す棒グラフである。
【図３４】いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ、４０Ｈｚ、及びランダム刺激条件における５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅマウスの海馬ＣＡ１領域での抗Ｉｂａ１（０１９−１９７４１）及び抗Ａβ（１２Ｆ４）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。
【図３５】図３５Ａは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ及び４０Ｈｚ条件でのミクログリアの数を示す棒グラフである。図３５Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ、４０Ｈｚ、及びランダム刺激条件におけるＥＹＦＰに対して正規化されたミクログリア細胞体の直径を示す棒グラフである。図３５Ｃは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ、４０Ｈｚ、及びランダム刺激条件におけるＥＹＦＰに対して正規化されたミクログリアの一次過程の平均長さを示す棒グラフである。図３５Ｄは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ及び４０Ｈｚの刺激条件におけるＡβ陽性でもあるＩｂａ１陽性（ミクログリア）細胞体の割合を示す棒グラフである。
【図３６】いくつかの実施形態に従って、図３４の免疫蛍光画像を統合して形成された一連の３Ｄレンダリングである。
【図３７】図３７Ａは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅの海馬ＣＡ１領域におけるＨｏｅｃｈｓｔによる免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。図３７Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ及び４０Ｈｚの刺激条件における５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅの推定されるＣＡ１厚さを示す棒グラフである。
【図３８】図３８Ａは、いくつかの実施形態に従って、４０ＨｚのＦＳ−ＰＶ＋刺激または対照の刺激時の海馬ＣＡ１のゲノムワイドＲＮＡ−ｓｅｑによって決定された差次的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）を示すヒートマップである。図３８Ｂは、いくつかの実施形態に従って、図３８Ａの処理条件において上方制御されたＤＥＧ間の重なりを示す図である。
【図３９】いくつかの実施形態に従って、図３８ＡのＲＮＡ−ｓｅｑデータセットにおける特定の遺伝子標的のＲＴ−ｑＰＣＲ検証を示す棒グラフである。
【図４０】いくつかの実施形態に従って、図３８Ａの上方制御された遺伝子が関連する生物学的過程を示すプロットである。
【図４１】いくつかの実施形態に従って、図３８Ａの下方制御された遺伝子が関連する生物学的過程を示すプロットである。
【図４２】図４２Ａは、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域の異なる型の刺激後のＩｂａ１のレベルを示す一連の免疫蛍光画像である。図４２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、図４２Ａの免疫蛍光画像に対する平均強度値を示す棒グラフである。
【図４３】図４３Ａは、いくつかの実施形態に従って、光の点滅刺激に曝露されたマウスを示す概略図である。図４３Ｂは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅の前及び最中の視覚野における局所電場電位トレースならびにパワースペクトル密度のプロットを含む。図４３Ｃ〜４３Ｆは、いくつかの実施形態に従って、視覚野における局所電場電位のパワースペクトル密度を示すプロットである。
【図４４】図４４Ａは、いくつかの実施形態に従って、４サイクルの４０Ｈｚの光の点滅に関する時間の関数及びランダムな光の点滅に関する同等の期間の関数としての視覚野におけるスパイクの割合を示す一連のヒストグラムである。図４４Ｂは、いくつかの実施形態に従って、光の点滅を見せている間の脳の上で記録された局所電場電位の一連の電気トレースである。
【図４５】図４５Ａは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅及びランダムな光の点滅の間の発火率の差を示すヒストグラムである。図４５Ｂは、いくつかの実施形態に従って、視覚野におけるマルチユニット発火率を示すプロットである。
【図４６】図４６Ａは、いくつかの実施形態に従って、実験的パラダイムを示す概略図である。図４６Ｂ〜４６Ｃは、いくつかの実施形態に従って、図４６Ａの実験的パラダイム後、それぞれ、ＡβペプチドアイソフォームＡβ１−４０及びＡβ１−４２のベースラインレベルの変化をさらに示すプロットである。
【図４７】図４７Ａ及び図４７Ｂは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤの視覚野におけるそれぞれ、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２のベースラインレベルの変化を示す棒グラフである。
【図４８】図４８Ａは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での５ＸＦＡＤのバレル皮質におけるＡβ１−４０及びＡβ１−４２のベースラインレベルの変化を示す棒グラフである。図４８Ｂは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下でのＡＰＰ／ＰＳ１の視覚野におけるＡβ１−４０及びＡβ１−４２のベースラインレベルの変化を示す棒グラフである。図４８Ｃは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下でのＷＴの視覚野におけるＡβ１−４０及びＡβ１−４２のベースラインレベルの変化を示す棒グラフである。
【図４９】いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での５ＸＦＡＤの視覚野における抗Ｉｂａ１（０１９−１９７４１）及び抗Ａβ（１２Ｆ４）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。
【図５０】図５０Ａは、いくつかの実施形態に従って、Ｉｂａ１陽性細胞（ミクログリア）の数を示す棒グラフである。図５０Ｂは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での対照に対して正規化されたミクログリア細胞体の直径を示す棒グラフである。図５０Ｃは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での対照に対して正規化されたミクログリアの一次過程の平均長さを示す棒グラフである。図５０Ｄは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下でのＡβ陽性でもあるミクログリアのパーセンテージを示す棒グラフである。
【図５１】いくつかの実施形態に従って、ＣＬＡＲＩＴＹ処理された１００μｍの組織片からの暗及び４０Ｈｚの点滅条件下でのＩｂａ＋ミクログリアの一連の３Ｄレンダリング（免疫蛍光画像から）である。ＣＬＡＲＩＴＹは、例えば、組織内で構成され、組織に結合されたアクリルアミド系ヒドロゲルを用いて脳組織を透明にする方法である。
【図５２】図５２Ａは、いくつかの実施形態に従って、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いて視覚野からミクログリアを単離する方法を示す流れ図である。図５２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、図５２Ａの方法を用いて３か月齢の５ＸＦＡＤ及びＷＴ対照動物の視覚野から単離されたミクログリアにおけるＡβ１−４０のレベルを示す棒グラフである。
【図５３】図５３Ａは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での３か月齢の５ＸＦＡＤの視覚野におけるシナプトフィジンを検出するためのＳＶＰ３８抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。図５３Ｂは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件後の５ＸＦＡＤの視覚野の相対的なＳＶＰ３８の強度レベルを示す棒グラフである。
【図５４】図５４Ａは、いくつかの実施形態に従って、ガンマ振動での対象の視覚野の刺激後のＡβペプチドアイソフォームＡβ１−４２の減少を示す棒グラフである。図５４Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ガンマ振動での対象の視覚野の刺激後、及びさらに刺激後２４時間のＡβペプチドアイソフォームＡβ１−４２のレベルを示す棒グラフである。
【図５５】図５５Ａは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅の前及び最中での海馬における局所電場電位の電気トレースならびにパワースペクトル密度のプロットを含む。図５５Ｂは、いくつかの実施形態に従って、それぞれ、４サイクルの４０Ｈｚの光の点滅に関する時間の関数及びランダムな光の点滅に関する同等の期間の関数としての海馬におけるスパイクの割合の一連のヒストグラムである。
【図５６】図５６Ａは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅及びランダムな光の点滅の間の発火率の差を示すヒストグラムである。図５６Ｂは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅の間のＣＡ１におけるマルチユニット発火率を示すプロットである。
【図５７】図５７Ａは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤの視覚野における相対的なＡβ１−４０のレベルを示す棒グラフである。図５７Ｂは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤの視覚野における相対的なＡβ１−４２のレベルを示す棒グラフである。
【図５８】図５８Ａは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅後の回復を伴う５ＸＦＡＤの視覚野における相対的なＡβ１−４０のレベルを示す棒グラフである。図５８Ｂは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅後の回復を伴う５ＸＦＡＤの視覚野における相対的なＡβ１−４２のレベルを示す棒グラフである。
【図５９】図５９Ａは、いくつかの実施形態に従う試験を示す概略図である。図５９Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗または４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの視覚野における相対的なＡβ１−４２のレベルを示す棒グラフである。図５９Ｃは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗または４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの視覚野における相対的なＡβ１−４０のレベルを示す棒グラフである。
【図６０】図６０Ａは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗または４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの視覚野における抗Ａβ抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。図６０Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗または４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの視覚野におけるＡβ陽性斑の沈着数を示す棒グラフである。図６０Ｃは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗または４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの視覚野におけるＡβ陽性斑の面積を示す棒グラフである。
【図６１】図６１Ａは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗または４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の４か月齢のＰ３０１Ｓマウスにおける抗ホスホＴａｕ（Ｓ２０２）及び抗ＭＡＰ２抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。図６１Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後のＰ３０１Ｓの視覚野の相対的なホスホＴａｕ（ｐＴａｕ）（Ｓ２０２）の強度レベルを示す棒グラフである。図６１Ｃは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後のＰ３０１Ｓの視覚野の相対的なＭＡＰ２強度レベルを示す棒グラフである。
【図６２】図６２Ａは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の４か月齢のＰ３０１Ｓマウスにおける抗ｐＴａｕ６２０２（Ｓ４０４）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。図６２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後のＰ３０１Ｓの視覚野の相対的な抗ｐＴａｕ（Ｓ４００／Ｔ４０３／Ｓ４０４）の蛍光強度レベルを示す棒グラフである。
【図６３】図６３Ａは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の４か月齢のＰ３０１Ｓマウスにおける抗ｐＴａｕ６３０２（Ｓ３９６）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。図６３Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後のＰ３０１Ｓの視覚野の相対的なｐＴａｕ（Ｓ３９６）の蛍光強度レベルを示す棒グラフである。
【図６４】いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の４か月齢のＰ３０１Ｓマウスにおける抗Ｉｂａ１抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。
【図６５】図６５Ａは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後のミクログリアの数を示す棒グラフである。図６５Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の対照に対して正規化されたミクログリア細胞体の直径を示す棒グラフである。図６５Ｃは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の対照に対して正規化されたミクログリアの一次過程の平均長さを示す棒グラフである。
【図６６】いくつかの実施形態に従って、視覚のガンマ刺激の有無での対象の視覚野における可溶性及び不溶性のＡβペプチドのアイソフォームＡβ１−４０ならびにＡβ１−４２のレベルを示すプロットである。
【図６７】図６７Ａ〜６７Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の経頭蓋ガンマ刺激の有無での全脳Ａβペプチドのレベルを示すプロットである。
【図６８】図６８Ａは、いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が対象にストレスを引き起こすかどうかを調べるために実施した試験を示す流れ図である。図６８Ｂは、当該対象におけるストレス反応を示すコルチコステロンのレベルを示す棒グラフである。
【図６９】図６９Ａは、いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が対象の不安を低減するかどうかを調べるために実施した試験を示す流れ図である。図６９Ｂは、高架式十字迷路装置を示す画像である。図６９Ｃ及び６９Ｄは、高架式十字迷路期間中の当該対象の代表的な軌跡を示す画像である。
【図７０】高架式十字迷路期間中、対象が壁なし走路及び壁あり走路で探索に費やした平均時間を示す棒グラフである。
【図７１】図７１Ａは、いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が対象のストレス及び／または不安を低減するかどうかを調べるために実施した試験を示す流れ図である。図７１Ｂは、オープン・フィールド・アリーナを示す画像である。図７１Ｃ及び図７１Ｄは、オープン・フィールド試験中の対象の代表的な軌跡を示す画像である。
【図７２】図７２Ａは、オープン・フィールド試験の毎分、オープン・フィールドの中心で対象が費やした平均時間を示すプロットである。図７２Ｂは、オープン・フィールド試験中、オープン・フィールドの周辺で対象が費やした平均合計時間を示す棒グラフである。
【図７３】図７３Ａ及び７３Ｂは、いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が対象の生得新奇探索行動を変更するかどうかを調べるために実施した試験を示す概略図である。図７３Ｃは、図７３Ａの概略図に従って、対象が第二の新奇物体と比較して第一の新奇物体を探索するのに費やした平均時間を示す棒グラフである。
【図７４】図７３Ｂの概略図に従って、対象が新奇物体を探索するのに費やした毎分の平均時間を示すプロットである。
【図７５】図７５Ａは、いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が対象の学習及び記憶に影響を与えるかどうかを調べるために恐怖条件付けパラダイムを用いて実施した試験を示す流れ図である。図７５Ｂは、時間の関数としての文脈の変更を伴うトーン試験を示す刺激図である。
【図７６】図７６Ａ及び７６Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の記憶の強化を示す棒グラフである。
【図７７】図７７Ａは、いくつかの実施形態に従って、ガンマ曝露及び／または投与が対象の記憶を改善するかどうかを調べるために実施した試験を示す流れ図である。図７７Ｂは、目標象限に隠された台を備えたＭｏｒｒｉｓ水迷路を示す図である。図７７Ｃ及び７７Ｄは、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路プローブ試験中の対象の代表的な軌跡を示す画像である。
【図７８】図７８Ａは、各日のＭｏｒｒｉｓ水迷路試験において、対象が隠された台を見つけるのに費やした平均時間を示すプロットである。図７８Ｂは、各３０秒間に対象が目標象限内で除去された台を探すのに費やした平均時間を示すプロットである。図７８Ｃは、各３０秒間に対象が逆の象限内で除去された台を探すのに費やした平均時間を示すプロットである。
【図７９】図７９Ａは、第一象限に隠された台を備えたＭｏｒｒｉｓ水迷路試験を示す図である。図７９Ｂは、逆転学習のため、第二象限、すなわち、第一象限の反対側に隠された台を備えたＭｏｒｒｉｓ水迷路試験を示す図である。図７９Ｃは、各日のＭｏｒｒｉｓ水迷路逆転学習試験において、対象が隠された台を見つけるのに費やした平均時間を示すプロットである。
【図８０】図８０Ａは、いくつかの実施形態に従って、長期的なガンマ曝露及び／または投与が対象の空間学習及び記憶に影響を与えるかどうかを調べるために実施した試験を示す流れ図である。図８０Ｂは、各日のＭｏｒｒｉｓ水迷路試験において、対象が隠された台を見つけるのに費やした平均時間を示すプロットである。図８０Ｃは、３０秒の試験中に対象が目標象限内で除去された台を探すのに費やした平均時間を示す棒グラフである。
【図８１】図８１Ａは、逆転学習を含むように拡張した図８０Ａの試験を示す流れ図である。図８１Ｂは、各日のＭｏｒｒｉｓ水迷路逆転学習試験において、対象が隠された台を見つけるのに費やした平均時間を示すプロットである。
【図８２】図８２Ａは、３０秒の試験中に対象が目標象限内で除去された台を探すのに費やした平均時間を示す棒グラフである。図８２Ｂは、対象が逆の象限内で除去された台を探すのに費やした平均時間を示す棒グラフである。
【図８３】いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が対象の視覚野においてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）損傷ならびにニューロンの損失に与える影響を調べるために実施した試験のスケジュール図である。
【図８４】いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与の影響を調べるために実施した試験の対象の群を示す図である。
【図８５】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる脳重量の変化を比較する棒グラフである。
【図８６】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる側脳室の発現比を比較する棒グラフである。
【図８７】図８７Ａ〜８７Ｅは、いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群の代表的な側脳室を示す画像である。
【図８８】図８８Ａ〜８８Ｃは、いくつかの実施形態に従って、目的の脳領域を示す脳解剖図である。
【図８９】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたるＶ１皮層の平均厚さを示す棒グラフである。
【図９０】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたるＶ１−ＮｅｕＮ陽性細胞層の平均厚さを示す棒グラフである。
【図９１】図９１Ａ〜図９１Ｅは、いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群の代表的なＨｏｅｃｈｓｔ標識及び／またはＮｅｕＮ標識を有する細胞を示す画像である。
【図９２】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたるＳＳ１皮層の平均厚さを示す棒グラフである。
【図９３】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたるＳＳ１−ＮｅｕＮ陽性細胞の平均厚さを示す棒グラフである。
【図９４】図９４Ａ〜９４Ｅは、いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたるＨｏｅｃｈｓｔ標識及び／またはＮｅｕＮ標識を有する細胞を示す画像である。
【図９５】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる島皮質の皮層の平均厚さを示す棒グラフである。
【図９６】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる島皮質のＮｅｕＮ陽性細胞層の平均厚さを示す棒グラフである。
【図９７】図９７Ａ〜９７Ｅは、いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群の代表的なＨｏｅｃｈｓｔ標識及び／またはＮｅｕＮ標識を有する細胞を示す画像である。
【図９８】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる視覚野のＮｅｕＮ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。
【図９９】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる視覚野のγＨ２ＡＸ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。
【図１００】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群の代表的な視覚野の試料を示す一連の画像である。
【図１０１】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる体性感覚皮質のＮｅｕＮ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。
【図１０２】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる体性感覚皮質のγＨ２ＡＸ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。
【図１０３】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群の代表的な体性感覚皮質の試料を示す一連の画像である。
【図１０４】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる島皮質のＮｅｕＮ陽性細胞層の量を比較する棒グラフである。
【図１０５】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる島皮質のγＨ２ＡＸ陽性細胞層の量を比較する棒グラフである。
【図１０６】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群の代表的な島皮質の試料を示す一連の画像である。
【図１０７】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる海馬のＮｅｕＮ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。
【図１０８】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる海馬のγＨ２ＡＸ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。
【図１０９】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群の代表的な海馬の試料を示す一連の画像である。
【図１１０】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる視覚野の点密度を比較する棒グラフである。
【図１１１】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる体性感覚皮質の点密度を比較する棒グラフである。
【図１１２】いくつかの実施形態に従って、図８４における対象の群にわたる島皮質の点密度を比較する棒グラフである。
【図１１３】図１１３Ａ〜１１３Ｄは、いくつかの実施形態に従って、代表的な試料におけるＨｏｅｃｈｓｔ染色、ＶＧｌｕＴ１マーカー、及び／またはＧＡＤ６５マーカーを示す画像である。図１１３Ｅ及び１１３Ｆは、いくつかの実施形態に従って、点の定量化方法を示す画像である。
【図１１４】いくつかの実施形態に従って、クリック・トレイン刺激を示す刺激図である。
【図１１５】いくつかの実施形態に従う聴覚のガンマ曝露及び／または投与が対象の聴覚野においてミクログリアの活性化を誘導するかどうかを調べるために実施した試験を示す流れ図である。
【図１１６】図１１６Ａは、いくつかの実施形態に従って、対象の聴覚野における平均ミクログリア数を示す棒グラフである。図１１６Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の聴覚野におけるミクログリアの突起の長さの比を示す棒グラフである。
【図１１７】図１１７Ａ及び１１７Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の聴覚野におけるミクログリアの代表的な画像である。
【図１１８】図１１８Ａ及び１１８Ｂは、いくつかの実施形態に従って、図１１７Ａ及び１１７Ｂからのミクログリアの突起の長さの拡大画像である。
【図１１９】図１１９Ａ及び１１９Ｂは、いくつかの実施形態に従って、図１１７Ａ及び１１７Ｂからのミクログリアの細胞サイズの拡大画像である。
【図１２０】図１２０Ａは、いくつかの実施形態に従って、対象の聴覚野における画像フィールド当たりの平均ミクログリア数を示す棒グラフである。図１２０Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の聴覚野におけるミクログリアの細胞サイズの平均比を示す棒グラフである。
【図１２１】図１２１Ａ及び１２１Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の聴覚野におけるミクログリアの代表的な画像である。
【図１２２】図１２２Ａ〜１２２Ｄは、いくつかの実施形態に従って、対象の聴覚野及び海馬における可溶性ＡβアイソフォームＡβ１−４０ならびにＡβ１−４２のレベルを示す棒グラフである。
【図１２３】図１２３Ａ〜１２３Ｄは、いくつかの実施形態に従って、対象の聴覚野及び海馬における不溶性ＡβアイソフォームＡβ１−４０ならびにＡβ１−４２のレベルを示す棒グラフである。
【図１２４】図１２４Ａ〜１２４Ｄは、いくつかの実施形態に従って、対象の聴覚野におけるミクログリアの代表的な画像である。
【図１２５】図１２５Ａは、新奇物体認識試験を示す流れ図である。図１２５Ｂは、いくつかの実施形態に従って、記憶の改善を示す棒グラフである。
【図１２６】図１２６Ａは、新奇位置認識試験を示す流れ図である。図１２６Ｂは、いくつかの実施形態に従って、記憶及び／または識別の改善を示す棒グラフである。
【図１２７】図１２７Ａは、各日のＭｏｒｒｉｓ水迷路試験において、対象が隠された台を見つけるのに費やした平均時間を示すプロットである。図１２７Ｂは、プローブ試験中に対象が目標象限内で除去された台を探すのに費やした平均時間を示す棒グラフである。
【図１２８】図１２８Ａは、いくつかの実施形態に従って、視覚野における拡大した脈管構造を示す一連の代表的な免疫蛍光画像である。図１２８Ｂは、いくつかの実施形態に従って、視覚野における血管径を示し、かつガンマ曝露後の血管径の増大を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
一態様において、本開示は、対象における脳障害または認知機能障害／認知障害を予防、軽減、及び／または治療するための方法、装置、ならびにシステムを提供する。いくつかの実施形態では、該脳障害は認知症である。
【００４１】
認知機能は、ニューラルネットワーク活動における、特にガンマ周波数の振動の正確なタイミング、すなわち、集中と作業記憶に関係しているリズム（例えば、約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚ、約２０Ｈｚ〜約８０Ｈｚ、または約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚ）に大いに依存している。これらの振動はシナプス活動から生じるため、それらはニューロンの分子特性と高レベルの首尾一貫した脳活動の間の直接的なつながりを提供する。重要なことには、ガンマ振動活性は、ＡＤにおける分子神経病理によって損なわれた神経回路で中断され、当該疾患における記憶障害の主な決定要因を象徴し得る。病理と脳の振動の障害との間に因果関係があるかどうかはまだ確定していない。しかしながら、脳のリズムを操縦することは、ＡＤ等の認知症の治療に対する複数標的療法として働くことができ、かつ、これは非侵襲的治療によって達成することができる。
【００４２】
一態様において、本開示は、ガンマ振動を増強するための、または誘導するための装置、方法、及びシステムを提供する。いくつかの実施形態では、ガンマ振動の該増強または誘導は、光遺伝的方法による。他の実施形態では、ガンマ振動の該増強または誘導は、行動的方法による。本開示は、光遺伝学的、行動的、もしくは他の方法によるガンマ振動の該増強及び／または誘導が、ＡＤの病変を低減すると定めている。
【００４３】
一態様において、本開示は、認知症を有する対象におけるガンマ振動リズムの回復または誘導のための装置、システム、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、該認知症は、ＡＤ、血管性認知症、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、及び/またはレビー小体認知症である。従って、いくつかの実施形態では、本開示は、認知症を治療するための装置、システム、及び方法を提供する。
【００４４】
本明細書で使用される、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」または「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療）」という用語は、治療的な治療及びｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ（予防的）もしくはｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ（予防的）措置の両方を指す。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象には、当該疾患もしくは状態をすでに有する対象だけでなく、当該疾患もしくは状態を発症し得る対象であり、目的が該疾患もしくは状態を予防、遅延、または減少させることである該対象が含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の装置、方法、及びシステムは、当該対象が遺伝的にかかりやすい疾患もしくは状態、例えばＡＤを予防、遅延、または軽減するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の装置、方法、及びシステムは、当該対象がすでに診断されている疾患もしくは状態、例えば、ＡＤの症状を治療、軽減、低減、及び／またはその進行を遅延するために使用され得る。
【００４５】
本明細書で使用される、「対象」という用語は、哺乳類、例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ、または霊長類を意味する。好ましくは、本発明の対象はヒトである。
【００４６】
本明細書で使用される、「約」という用語は、「約」が修飾するもののプラスマイナス１０パーセントを指す。
【００４７】
認知症は、知的能力の損失及び／または記憶障害を特徴とする疾患である。認知症としては、例えば、ＡＤ、血管性認知症、レビー小体認知症、ピック病、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、エイズによる認知症、加齢関連認知機能障害、及び加齢関連記憶障害が挙げられる。認知症はまた、神経学的及び／または精神状態、例えば、脳腫瘍、脳障害、てんかん、多発性硬化症、ダウン症候群、レット症候群、進行性核上まひ、前頭葉症候群、統合失調症、及び外傷性脳損傷とも関連している場合がある。
【００４８】
ＡＤは、先進国において最も頻度の高い神経変性疾患である。ＡＤは、Ａβペプチドからなるアミロイド斑及びタウタンパク質からなるＮＦＴの蓄積を特徴とし得る。臨床的に、ＡＤは、記憶、機能、言語能力、判断、及び実行機能の損失を特徴とする進行性認知障害と関連している。ＡＤは、多くの場合、その後期に深刻な行動上の症状をもたらす。
【００４９】
血管性認知症は、脳血管性認知症とも呼ばれる場合があり、概して改善期間及び段階的悪化を伴う変動する経過を有する脳血管障害（例えば、大脳半球の梗塞）を指す。血管性認知症は、見当識障害、記憶障害、及び／または判断力の低下の１つ以上の症状を含む場合がある。血管性認知症は、別々の複数の梗塞によって引き起こされる可能性も、他の血管要因、例えば、自己免疫性血管炎、例えば、全身性エリテマトーデスに見られるもの、感染性血管炎、例えば、ライム病、再発性脳内出血、及び／または脳卒中等によって引き起こされる可能性もある。
【００５０】
前頭側頭認知症（ＦＴＤ）は、進行性の神経変性障害である。ＦＴＤの対象は、一般に顕著な行動変化及び人格変化を示し、多くの場合言語機能障害を伴う。
【００５１】
レビー小体認知症は、ＡＤのものと重複する特徴を有する認知症発現、パーキンソン病の特徴の発現、及び／または幻覚の早期発現の１つ以上の症状を特徴とする。レビー小体認知症は、一般に症状の重症度の日々の変動を特徴とする。
【００５２】
いくつかの態様において、本開示は、当該対象の脳において同期ガンマ振動を誘導することを含む、対象における認知症を予防、軽減、及び／または治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、神経疾患もしくは障害または加齢に伴う低下を抱える対象におけるガンマ振動の誘導は、該疾患もしくは障害または加齢に伴う低下の結果として、またはそれに関連して該対象において破壊されたガンマ振動リズムを回復するように作用する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ガンマ振動の誘導は、アイソフォームＡβ１−４０及びＡβ１−４２の産生を低減する。いくつかの実施形態では、ガンマ振動の誘導は、対象の脳からのＡβ（例えば、アイソフォームＡβ１−４０及びＡβ１−４２）のクリアランスを高める。いくつかの実施形態では、ガンマ振動の誘導は、対象の脳においてＡβの蓄積を防止する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法は、対象の脳におけるＡβのレベルを、治療前の該対象の脳におけるＡβのレベルと比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、またはそれ以上低減する。いくつかの実施形態では、対象の脳におけるＡβのレベルは、治療前の該対象の脳におけるＡβのレベルと比較して、少なくとも約５０％低減される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、対象の脳におけるＡβのレベルは、該対象の脳におけるＡＰＰの切断の減少によって低減される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法は、対象の脳におけるＡＰＰの切断を、治療前の該対象の脳におけるＡＰＰ切断のレベルと比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、またはそれ以上低減する。いくつかの実施形態では、対象の脳におけるＡＰＰ切断のレベルは、治療前の該対象の脳におけるＡＰＰ切断のレベルと比較して、少なくとも約５０％低減される。いくつかの実施形態では、ＡＰＰ切断のレベルは、対象の脳におけるＣ末端断片β（β−ＣＴＦ）のレベルによって測定される。いくつかの実施形態では、脳におけるＡＰＰ切断のレベルは、β及び／またはγセクレターゼの阻害によって、例えば、β及び／またはγセクレターゼ活性の阻害のレベルを増大させることによって低減される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法は、対象の脳におけるＡβ斑の凝集を低減する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、該方法は、対象における認知能力及び／または記憶を改善する。
【００５６】
別の態様において、本開示は、当該対象の脳において同期ガンマ振動を誘導することを含む、対象の脳における神経保護プロファイルまたは神経保護環境を誘導するための方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、該神経保護プロファイルは、神経保護ミクログリア細胞プロファイルと関連している。さらなる実施形態では、該神経保護プロファイルは、Ｍ−ＣＳＦ経路の活性の増加によって誘導されるか、または、これと関連している。いくつかの実施形態では、該神経保護環境は、抗炎症シグナル伝達経路と関連している。例えば、いくつかの実施形態では、該抗炎症シグナル伝達経路は、抗炎症ミクログリアシグナル伝達経路である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、該神経保護プロファイルは、炎症性グリア細胞活性の減少または不足と関連している。炎症性グリア細胞活性は、ミクログリアのＭ１表現型と関連し、酸素の反応種（ＲＯＳ）、神経分泌タンパク質クロモグラニンＡ、分泌補助因子シスタチンＣ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、一酸化窒素シンターゼ酵素、例えばｉＮＯＳ、ＮＦ−κＢ依存性炎症応答タンパク質、ならびに炎症性サイトカイン及びケモカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＩＦＮγ）の産生を含む。
【００５８】
対照的に、ミクログリアのＭ２表現型は、炎症の下方制御及び炎症誘発損傷の修復と関連している。抗炎症性サイトカイン及びケモカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−３、ＩＬ−１０、及び／またはＴＧＦβ）ならびに食作用活性の増大は、Ｍ２表現型と関連している。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法は、ミクログリアにおける神経保護Ｍ２表現型を誘発する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法は、対象の脳における食作用活性を増大する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法は、Ａβのクリアランスが増加するようにミクログリアの食作用活性を増大する。
【００５９】
ガンマ振動は、約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚを含み得る。従って、いくつかの実施形態では、本開示は、当該対象の脳において、約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚ、もしくは約２０Ｈｚ〜約８０Ｈｚ、もしくは約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚ、もしくは約３０〜約６０Ｈｚ、もしくは約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚ、または約４０Ｈｚのガンマ振動を誘導することを含む、対象における認知症を予防、軽減、または治療するための方法を提供する。好ましくは、該ガンマ振動は、約４０Ｈｚである。
【００６０】
刺激は、少なくとも１つの脳領域においてガンマ振動を直接または最終的に誘導する、対象の内部もしくは外部環境における検出可能な変化を含み得る。例えば、刺激は、電磁放射線受容器（例えば、光受容器、赤外線受容器、及び／または紫外線受容器）、機械受容器（例えば、機械的ストレス及び／または歪）、侵害受容器（例えば、痛み）、音受容器、電気受容器（例えば、電場）、磁気受容器（例えば、磁場）、水受容器、化学受容器、温度受容器、浸透圧受容器、及び／または自己受容器（すなわち、位置感覚）を刺激するように設計され得る。受容器からの反応を誘発するために必要な感覚の絶対閾値または最小量は、刺激のタイプと対象によって異なり得る。いくつかの実施形態では、刺激は、個々の感度に基づいて適応される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ガンマ振動は、脳領域特異的に誘導される。例えば、いくつかの実施形態では、ガンマ振動は、海馬、視覚野、バレル皮質、聴覚野、またはそれらの任意の組み合わせにおいて誘導される。一例として、いくつかの実施形態では、ガンマ振動は、閃光を用いて視覚野において誘導され、他の実施形態では、ガンマ振動は、特定の周波数の聴覚刺激を用いて聴覚野において誘導される。いくつかの実施形態では、ガンマ振動は、視覚、聴覚、及び／または他の刺激の組合せを用いて複数の脳領域で同時に誘導される。いくつかの実施形態では、ガンマ振動は、仮想現実システムで誘導される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、対象は、ガンマ振動を誘導するように構成された環境、例えば、無関係の刺激を受動的または能動的に遮断する（例えば、遮光もしくは雑音消去）チャンバーを介して刺激を受ける。代替的に、またはさらに、対象は、例えば、遮光または雑音消去の特徴を含むシステムを介して刺激を受けてもよい。いくつかの実施形態では、対象は、刺激放出装置、例えば、刺激を送るように設計された眼鏡類を介して視覚刺激を受ける。該装置は、他の光を遮断し得る。いくつかの実施形態では、対象は、刺激放出装置、例えば、刺激を送るように設計されたヘッドホンを介して聴覚刺激を受ける。該装置は、他の雑音を除去し得る。
【００６３】
刺激を放出するための少なくとも１つのインタフェースに加えて、いくつかの実施形態は、少なくとも１つのプロセッサ（例えば、刺激を生成させ、該刺激の放出を制御し、該刺激の放出／結果を監視し、及び／または該刺激／結果に関するフィードバックを処理する）、少なくとも１つのメモリ（例えば、プロセッサが実行可能な命令、少なくとも１つの刺激、刺激生成指針、フィードバック、及び／または結果を保存する）、少なくとも１つの通信インタフェース（例えば、当該対象、ヘルスケア提供者、介護者、臨床研究調査員、データベース、監視アプリケーション等と通信する）、及び／または検出装置（例えば、該刺激及び／または該対象を検出し、ガンマ振動が誘導されているかどうか、対象の感受性、認知機能、物理的もしくは化学的変化、ストレス、安全性等を含む、該刺激及び／または該対象に関するフィードバックを与える）を具備する場合がある。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ガンマ振動は、約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚの閃光等の視覚刺激によって誘導される。特定の実施形態では、ガンマ振動は、約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの閃光によって誘導される。さらなる実施形態では、ガンマ振動は、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの閃光によって誘導される。さらに別の実施形態では、ガンマ振動は、約４０Ｈｚの閃光によって誘導される。いくつかの実施形態では、対象は、約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚの閃光、もしくは約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚの閃光、もしくは約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚの閃光、または約４０Ｈｚの閃光を（例えば、発する遮光装置を備えたチャンバー内に配置されて、または、発する遮光装置を身に着けて）受ける。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ガンマ振動は、周波数約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚ、もしくは約２０Ｈｚ〜約８０Ｈｚ、もしくは約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚ、もしくは約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚ、または約４０Ｈｚの音波等の聴覚刺激によって誘導される。いくつかの実施形態では、対象は、約２０Ｈｚ〜約１００Ｈｚ、約２０Ｈｚ〜約８０Ｈｚ、約２０Ｈｚ〜約５０Ｈｚ、約３５Ｈｚ〜約４５Ｈｚ、または約４０Ｈｚの聴覚刺激を（例えば、発する雑音消去装置を備えたチャンバー内に配置されて、または、発する雑音消去装置を身に着けて）受ける。
【００６６】
いくつかの実施形態では、対象は、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、またはそれ以上の間、視覚及び／または聴覚刺激を（例えば、発する遮光装置を備えたチャンバー内に配置されて、または、発する遮光装置を身に着けて）受ける。いくつかの実施形態では、対象は、約６時間未満、約５時間未満、約４時間未満、約３時間未満、約２時間未満、または約１時間未満刺激を（例えば、発する遮光装置を備えたチャンバー内に配置されて、または、発する遮光装置を身に着けて）受ける。いくつかの実施形態では、対象は、１時間未満刺激を（例えば、発する遮光装置を備えたチャンバー内に配置されて、または、発する遮光装置を身に着けて）受ける。
【００６７】
いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に提供する方法を受ける。他の実施形態では、対象は、複数の別々の機会に本明細書に提供する方法で治療を受ける。対象は、定期的なスケジュールで、または症状が生じた時点もしくは悪化した時点で治療され得る。いくつかの実施形態では、長期的な治療は、可溶性のＡβペプチド及び／または不溶性のＡβペプチド（すなわち、斑）を低減するのに有効であり得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ガンマ振動は、細胞型特異的に誘導される。いくつかの実施形態では、ガンマ振動は、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンにおいて誘導される。「ファスト・スパイキング」（ＦＳ）という用語は、ニューロンのクラスを説明するために用いられる場合、スパイクの高さにおいてスパイク周波数の適応や減衰がほとんどなく長期間高率でニューロンが放電する能力を指す。従って、これらのニューロンは、大幅な調節なしに持続する高周波数（例えば、約１００Ｈｚまたは約１５０Ｈｚに等しいかそれより高い）の放電が可能である。ＦＳニューロンのこの特性は、それらの、高速の遅延整流性チャネル、すなわち、非常に迅速に活性化及び不活性化するチャネルの発現に大部分起因する。
【００６９】
一態様において、刺激は非侵襲的であり得る。本明細書で使用される、「非侵襲的」という用語は、組成物もしくは装置の注入または移植等、身体の外科的介入または処置を必要としない装置、方法、及びシステムを指す。例えば、該刺激は、視覚（例えば、点滅光）、聴覚（例えば、音の振動）、及び／または触覚（力、振動、または動きを伴う機械的刺激）であり得る。
【００７０】
別の態様において、刺激は侵襲的であるか、または少なくとも部分的に侵襲的であり得る。例えば、視覚、聴覚、及び／または触覚刺激は、組成物（例えば、感光性タンパク質）もしくは装置（例えば、集積光ファイバー及び固体光源）の注入または移植と組み合わせてもよい。
【００７１】
実験データ
ガンマ振動は、５ＸＦＡＤマウスにおいて疾患早期の海馬ＳＷＲ中に低下する。
ガンマの障害は、いくつかの神経及び精神障害における複数の脳領域で、ＡＤのヒト患者における自発的ガンマ同期の低下を含め、観察されている。興味深いことに、自発的ガンマの低下はまた、２つのＡＤのマウスモデル（ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）Ｔｇマウス及びアポリポタンパク質Ｅ４対立遺伝子（ＡＰＯＥ４）ノックインマウス）においてインビボで、ならびにインビトロスライス試験では別のマウスモデル（Ｔｇ  ＣＲＮＤ８マウス）で見出されている。しかしながら、他のＡＤのマウスモデルでガンマ振動が変化するかどうか、それが疾患の進行の早期に生じるかどうか、及びガンマの乱れが疾患の進行に影響を与えるかどうかは不明である。
【００７２】
これらの問題に対処するため、覚醒行動５ＸＦＡＤマウス、すなわち、５つの家族性ＡＤ変異を有する確立されたＡＤモデルからの神経活動を記録した。特に、５ＸＦＡＤマウスは、ＡＰＰ  ＫＭ６７０／６７１ＮＬ（スウェーデン型）、ＡＰＰ  Ｉ７１６Ｖ（フロリダ型）、ＡＰＰ  Ｖ７１７Ｉ（ロンドン型）、ＰＳＥＮ１  Ｍ１４６Ｌ（Ａ＆ｇｔ；Ｃ）、及びＰＳＥＮ１  Ｌ２８６Ｖを含む家族性ＡＤの５つの異なる対立遺伝子を発現する。従って、５ＸＦＡＤマウスを、ＡＤのアミロイド病理のモデルとして用いた。いくつかの実施形態では、該神経活動は、ほぼ３か月齢のマウスから記録し、この時、それらはＡβ値が上昇しているが、主要な斑の蓄積の開始ならびに学習及び記憶障害の発現の前である。図１は、いくつかの実施形態に従って、球状トレッドミル上の仮想直線迷路を走行するマウスを示す概略図である。摂食制限マウスは、球状トレッドミル上の仮想直線迷路を行き来することで報酬を得ることができる。
【００７３】
海馬小領域ＣＡ１から神経活動が記録され得る。図２Ａ及び２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、海馬ＣＡ１から記録された、シータ振動及び鋭波リップル（ＳＷＲ）を示す電気トレースである。いくつかの実施形態では、ＣＡ１におけるガンマ振動は、図２Ａに示すように、シータ振動（４〜１２Ｈｚ）が観察される走行中等の明らかな活動周期中、ならびに、図２Ｂに示すように、ＳＷＲが生じる静止及び探索行動中に存在し得る。
【００７４】
シータ振動中のパワースペクトル密度を調べたところ、５ＸＦＡＤマウスとＷＴの同腹仔間で低速ガンマパワー（２０Ｈｚ〜５０Ｈｚの範囲）において明らかな差は見られなかった。図３Ａ及び３Ｂは、いくつかの実施形態に従って、３か月齢のＴｇ  ５ＸＦＡＤ及びＷＴマウスのシータ周期中の正規化されたパワースペクトルならびに正規化されたパワースペクトル密度の平均ならびに標準偏差を示すプロットである。図３Ａは、３か月齢の５ＸＦＡＤ（ｎ＝６マウス）及びＷＴ（ｎ＝６マウス）マウスのシータ周期中の正規化されたパワースペクトルの平均ならびに標準偏差を示す。いくつかの実施形態では、各動物のパワースペクトル密度は、そのピーク（シータ中）に正規化される場合がある。図３Ｂは、３か月齢の５ＸＦＡＤ（ｎ＝６マウス）及びＷＴ（ｎ＝６マウス）マウスのシータ周期中の正規化されたパワースペクトル密度を示す。
【００７５】
次のステップとして、いくつかの実施形態では、ＳＷＲ中のガンマ振動、すなわち、約５０〜１００ミリ秒続く１５０〜２５０Ｈｚの高周波振動を調べた。ＳＷＲは、スパイキング活動のパターンが海馬をわたってリプレイされる集団的活動のバーストと関連している。先行研究で、低速ガンマは、ＳＷＲ中に上昇し、ＣＡ３とＣＡ１の間同期していることが示されている。結果として、これらの海馬小領域をわたるニューロンは、ニューロンがガンマに位相同期されて発火する可能性が高いため、ＳＷＲ中に共に発火する傾向にある。ＳＷＲ（約１５０Ｈｚ〜約２５０Ｈｚであるリップルバンドにおけるパワーが平均の上側４標準偏差を超えた時の周期として定義される）を特定し、これらＳＷＲ中に周波数の範囲をわたるパワーを調べるためにスペクトログラムをプロットした。スペクトログラムにおいて、ＳＷＲの特徴である高周波振動を示す１００Ｈｚより上のパワーの上昇、ならびに、ガンマパワーの同時に起こる上昇を示す約５０Ｈｚ未満のパワーの上昇が観察され得る。
【００７６】
図４Ａ及び４Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＷＴマウス及び５ＸＦＡＤマウスのＳＷＲを示すスペクトログラムである。図４Ａは、１匹のＷＴマウスの平均ＳＷＲトリガスペクトログラムが、右側のプロットにおいて拡大された周波数８０Ｈｚ未満のＳＷＲ４０４中、ガンマ帯域４０２の増加を示すことを示している。図４Ｂは、１匹の５ＸＦＡＤマウスの平均ＳＷＲトリガスペクトログラムが、ＳＷＲ中にガンマ帯域の増加を示すが、この増加は、図４Ａで示されるＷＴマウスにおけるよりも低いことを示している。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本試験は、これらの低速振動（１０〜５０Ｈｚの範囲、本明細書でさらに説明される通り）の瞬時周波数が、４０Ｈｚを中心とする単峰型分布であることを見出した。図５Ａ〜５Ｃは、いくつかの実施形態に従って、ＳＷＲ中の瞬時ガンマ周波数の分布を示すプロットである。図５Ａは、４０Ｈｚ付近の図４Ａのピークで示された同じマウスのＳＷＲ中の瞬時ガンマ周波数の分布を示す（ｎ＝３７０ＳＷＲ）。図５Ｂは、５ＸＦＡＤ及びＷＴマウスのＳＷＲ中の瞬時ガンマ周波数の分布が、各記録期間について４０Ｈｚ付近の分布を示すことを示し、図５Ｃは、平均及び動物間の平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す（６匹の５ＸＦＡＤ動物では、期間当たりガンマサイクルｎ＝８２０、８００、６７９、３８、１８７５、５７、及び６匹のＷＴ動物では、期間当たりガンマサイクル１８１、１０７５、９１９、１６２２、５１、１８６０、１９０３）。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＷＴマウスのＳＷＲ中のこれらガンマ振動を、その後５ＸＦＡＤの同腹仔におけるものと比較したところ、ＳＷＲ中のガンマにおいて障害が見出された。５ＸＦＡＤマウスにおいてＳＷＲ中にベースラインからガンマパワーは増加したが、本明細書でさらに説明する通り、ＳＷＲ中のガンマパワーは、５ＸＦＡＤでは、ＷＴマウスより有意に小さかった。
【００７９】
図６Ａは、いくつかの実施形態に従って、それぞれ、５ＸＦＡＤ及びＷＴマウスにおけるＳＷＲのピークからの時間の関数としてｚスコアのガンマパワーを示す一連のグラフである。図６Ａは、平均及びＳＥＭを示し、ＳＷＲ中のガンマパワーの増加をベースラインに対して示している。
【００８０】
図６Ｂは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤ及びＷＴマウスにおけるＳＷＲ中のガンマパワーの累積分布を示すプロットである。ＳＷＲ中のガンマパワーの累積分布は、５ＸＦＡＤにおいて、ＷＴマウスよりも有意に小さい増加を示す（順位和検定、ｐ＜１０−５、６匹の５ＸＦＡＤマウスでｎ＝２１６６ＳＷＲ及び６匹のＷＴマウスで３０８５ＳＷＲ、５ＸＦＡＤマウスのｚスコア中央値１．０２（０．３９〜１．８７、第一四分位数〜第三四分位数）及びＷＴマウスのｚスコア中央値１．１８（０．５３〜２．１５、第一四分位数〜第三四分位数））。
【００８１】
図６Ｃ及び６Ｄは、いくつかの実施形態に従って、ＷＴマウス６０６及び５ＸＦＡＤマウス６０８のＳＷＲのピークを中心にして１００ミリ秒の間のｚスコアのガンマパワーの累積分布を示すプロットならびに平均及び動物間のＳＥＭ（網掛け）である（６匹の５ＸＦＡＤ動物では、期間当たりＳＷＲ  ｎ＝５１４、３５８、４３０、２２、８０５、３７及び６匹のＷＴ動物では、期間当たりＳＷＲ８２、３１１、３７０、７７６、１８、７１０、８１８）。
【００８２】
図６Ｅは、いくつかの実施形態に従って、ＷＴマウス６１４及び５ＸＦＡＤマウス６１６における大きなＳＷＲのピークを中心にして１００ミリ秒の間のｚスコアのガンマパワーの累積分布を示すプロットである(検知閾値は平均の上側６標準偏差を上回る)。本明細書でさらに説明する通り、正規分布しなかったデータに対して順位和検定を通して行った。図６Ｅは、ＷＴマウス６１４及び５ＸＦＡＤマウス６１６において有意に小さい増加を示す（順位和検定、ｐ＜１０−５、６匹の５ＸＦＡＤマウスではｎ＝１０００ＳＷＲ及び６匹のＷＴマウスでは１４６７ＳＷＲ）。
【００８３】
いくつかの実施形態では、スパイキングは、両群においてこれらのガンマ振動によって位相変調されたが、ガンマ位相によるスパイキングの変調は、５ＸＦＡＤではＷＴ動物よりも弱かった。本試験は、変調の深さが、５ＸＦＡＤでＷＴ動物よりも有意に小さい可能性があることを示した。
【００８４】
いくつかの実施形態に従って、３か月齢の５ＸＦＡＤ（ｎ＝６マウス）及びＷＴ（ｎ＝６マウス）マウスのＳＷＲ中、図７Ａは、ガンマ振動位相の関数としてのスパイクの割合を示すプロットであり、図７Ｂは、ガンマ位相の関数としてのＳＷＲ中のスパイキングの変調の深さを示すプロットである（順位和検定、ブートストラップ法、ｐ＜１０−５、これは多重比較の調節の際に重要である。５ＸＦＡＤスパイク−ガンマ位相分布ｎ＝２５００及びＷＴ分布３０００、５ＸＦＡＤマウスの変調の深さの中央値０．３５（０．２１〜０．４４、第一四分位数〜第三四分位数）ならびにＷＴマウスの変調の深さの中央値０．３８（０．２９〜０．４７、第一四分位数〜第三四分位数））。エラーバーは、平均＋／−ＳＥＭを示す。プロット７０４は、スパイキングの変調の深さのヒストグラムを示す。
【００８５】
図７Ｃ及び７Ｄは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤ及びＷＴ動物の各動物についてのガンマ振動の位相の関数としてのＳＷＲ中の海馬ＣＡ１におけるスパイクの割合ならびに平均及び動物間のＳＥＭを示すプロットである（６匹の５ＸＦＡＤ動物では、ＳＷＲ中、期間当たりスパイクｎ＝２４７５、１０６０、３０９２、２５、６５２１、１２３及び６匹のＷＴ動物では、ＳＷＲ中、期間当たりスパイク３６０、４７４１、１５６４、２９６１、８８、３０５８、４２７０）。
【００８６】
いくつかの実施形態に従って、３か月齢の５ＸＦＡＤ（ｎ＝６マウス）及びＷＴ（ｎ＝６マウス）マウスの大きなＳＷＲ（検知閾値は平均の上側６標準偏差を上回る。本明細書でさらに説明される）中、図７Ｅは、ガンマ振動の位相の関数としてのスパイクの割合を示すプロットであり、図７Ｆは、スパイキングの変調の深さを示すプロットである（順位和検定、ブートストラップ法、１つのアスタリスクはｐ＜１０−１０を示し、５ＸＦＡＤスパイク−ガンマ位相分布ｎ＝２５００及びＷＴ分布３０００）。エラーバーは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
【００８７】
本試験はまた、非シータ周期において、５ＸＦＡＤマウスではＷＴと比較して時間当たりのＳＷＲが少ない可能性があることも見出した（順位和検定、ｐ＜１０−５、６匹の５ＸＦＡＤでは非シータ周期ｎ＝６３４及び６匹のＷＴマウスでは非シータ周期７５０、５ＸＦＡＤマウスの中央値０．０７Ｈｚ（０〜０．１７、第一四分位数〜第三四分位数）ならびにＷＴマウスの中央値０．１２Ｈｚ（０〜０．２４、第一四分位数〜第三四分位数））、上述したように、ガンマパワーが上昇する場合さらに該周期は減少する）。
【００８８】
図８Ａ及び８Ｂは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤマウス８０２及びＷＴマウス８０４の動物で、各動物（図８Ａ）及び合わせたすべての動物（図８Ｂ）に関する非シータ周期当たりのＳＷＲ率を示すプロットである（順位和検定、ｐ＜１０−１０、６匹の５ＸＦＡＤ動物では、期間当たり非シータ周期ｎ＝１１７、２１０、１５１、５５、１００、１及び６匹のＷＴ動物では、期間当たり非シータ周期８０、６８、１１５、９５、１５、１５９、２１８）。これらの結果は、主要なアミロイド斑の蓄積の発達及び認知障害の証拠の前のＡＤのマウスモデルにおいて、ガンマ振動及び海馬ＣＡ１スパイキングの変調の障害を明らかにする。
【００８９】
ガンマ周波数でのＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの光遺伝学的刺激は、海馬のＣＡ１領域においてガンマ振動を駆動した。
ＡＤの本マウスモデルにおける当該疾患の進行の初期のＳＷＲ中のガンマ障害の所見で、ガンマ振動がＡＤの分子及び細胞病態生理に影響を与え得るかどうかという疑問が生じる。それを試験するため、２．５か月齢の５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅ二重トランスジェニックマウスの海馬ＣＡ１のＦＳ−ＰＶ介在ニューロンにおいて、二重ｆｌｏｘｅｄ逆方向オープン・リーディング・フレーム（ＤＩＯ）ＣｈＲ２−ＥＹＦＰアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用い、Ｃｒｅ依存的にＣｈＲ２を発現させることによって、ガンマ振動を光遺伝学的に駆動した。試験を実施し、マウスの海馬ガンマ振動の遺伝子誘導がＡＤのマウスモデルの分子病理に影響を与えるかどうかを確認した。海馬ガンマ振動は、覚醒行動ＷＴ及び５ＸＦＡＤマウスにおいて遺伝子学的に誘導された。
【００９０】
ＥＦ１αプロモーターによって駆動される高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）に結合された二重ｆｌｏｘｅｄ、逆方向オープン・リーディング・フレーム（ＤＩＯ）ＣｈＲ２を備えたアデノ随伴ウイルス（すなわち、ＡＡＶ５ウイルス）を作製した。図９は、いくつかの実施形態に従って、対象の脳における特定の細胞型の活性化を調節するためのウイルスベクター（すなわち、ＡＡＶ５−ＤＩＯ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ）を示す概略図である。ウイルス発現は、細胞型特異的に海馬のＣＡ１領域を標的とした。Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下、２つの不和合性ｌｏｘＰバリアントのうちの１つが反転してＣｈＲ２の発現を可能にする。
【００９１】
５ＸＦＡＤマウスの海馬のＣＡ１領域は、ウイルス感染の正確な局所的標的化を可能にする定位ウイルス注入法を用い、ＡＡＶ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰまたはＥＹＦｐ単独構築物のいずれかで感染させた。１つの実施形態では、注入時、光ファイバーケーブル（白色バー）を含むフェルールを、標的とする脳領域の上側約０．３ｍｍに設置した。マウスが回復し、ＰＶ細胞でウイルスが発現する時間を与えた２週間後、ＣＡ１介在ニューロンを、光遺伝学的に操作した。
【００９２】
図１０Ａ及び１０Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域に対する信号送出を示す概略図である。図１０Ａでは、いくつかの実施形態に従って、海馬において光遺伝学によるガンマ刺激を受けながら、ボール上を走行して迷路を抜けるマウスが示されている。図１０Ａ及び１０Ｂに示す矢印１０００は、約４０Ｈｚで点滅して脳領域を活性化する青色光を示す。
【００９３】
この例では、２００ｍＷの４９３ｎｍのＤＰＳＳレーザを、各端にファイバー・チャンネル／身体的接触コネクタを備えたパッチ・コードに接続した。実験中、約１ｍＷの光刺激を約１時間送った。より具体的には、青色光（例えば、４７３ｎｍ）を、シータ（例えば、約８Ｈｚ）、ガンマ（例えば、約４０Ｈｚ）を含む各種周波数で、また、ランダムに約４０Ｈｚで、海馬のＣＡ１領域の直上に配置した光ファイバーを介して送った。いくつかの実施形態では、刺激条件を試験しなかった。いくつかの実施形態に従って、シータ条件は周波数対照の役割を果たし、ランダム条件は周期性の特異性を調整した。
【００９４】
１時間の刺激の完了後、脳組織を切断し、染色及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）分析用に−８０℃で凍結した。図１１は、いくつかの実施形態に従って、ＣｈＲ２及びＤＡＰＩを有する対象における神経組織の免疫染色を示す免疫蛍光画像である。この例では、図１１は海馬においてＤＡＰＩ（核）及びＣｈＲ２染色を示している。
【００９５】
図１２Ａは、いくつかの実施形態に従って、ＰＶ＋介在ニューロンで発現されたＣｈＲ２−ＥＹＦＰを示す免疫蛍光画像である。図１２Ａは、ＣｈＲ２−ＥＹＦＰが、３か月齢の５ＸＦＡＤ／ＰＶ−ＣｒｅマウスのＣＡ１のＰＶ＋介在ニューロンで強く発現したことを示している（スケールバー＝１００μｍ）。図１２Ｂは、ＥＹＦＰ発現をＰＶ＋細胞でのみ示す、ＡＡＶ  ＤＩＯ  ＣｈＲ２−ＥＹＦＰを発現する３か月齢の５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅ  ＣＡ１における抗ＥＹＦＰ及び抗ＰＶ抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である（スケールバー＝５０μｍ）。５ＸＦＡＤとＷＴマウスを比較するため、ＣｈＲ２を５ＸＦＡＤ陰性同腹仔のＦＳ−ＰＶ介在ニューロンで発現させた。光刺激の非特異的な影響に対する対照のため、ＥＹＦＰのみを含む、ＡＡＶ−ＤＩＯを発現する５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅ二重トランスジェニックマウスを用いた。これらのマウスでは、同一の遺伝的背景及び光送達条件で、光送達は光遺伝学的刺激をもたらさない。いくつかの実施形態では、４０ＨｚでのＦＳ−ＰＶ介在ニューロンを２つの理由で選択した。第一に、先行研究では、４０ＨｚでのＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの駆動が、最大のＬＦＰ反応を引き起こしたことが示されている。第二に、いくつかの実施形態では、ＳＷＲ中のガンマ障害が見出され、図５Ａ〜５Ｃに示すように、ＳＷＲ中の瞬時ガンマ周波数が、４０Ｈｚを中心とした分布を形成した。いくつかの実施形態では、電気生理学的記録用に、４０Ｈｚの刺激周期を、無刺激の周期または本明細書でさらに説明する４０Ｈｚを中心としたポアソン分布から選択されるランダム化間隔で送られる刺激の周期とともに交互配置した。
【００９６】
図１３Ａ及び１３Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの試験の概略図、局所電場電位の電気トレース、及びパワースペクトル密度を含む。図１３Ａを参照すると、１３０２は、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの４０Ｈｚの光遺伝学的駆動の前及び最中のＣＡ１における局所電場電位の電気トレースである。プロット１３０４は、ＣＡ１におけるＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの４０Ｈｚの刺激、ランダム刺激（４０Ｈｚを中心としたポアソン分布から選択されるランダム化間隔での刺激）、または無刺激の間のパワースペクトル密度の平均と標準偏差を示す（５ＸＦＡＤマウスｎ＝４及びＷＴマウス３）。図１３Ｂは、各マウスについて、ＣＡ１におけるＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの４０Ｈｚの刺激１３０６、ランダム刺激１３０８、または無刺激１３１０の間のパワースペクトル密度を示す（５ＸＦＡＤマウスｎ＝４、動物当たり１６９、１３０、２４０、７３の４０Ｈｚ、１４３、１２９、１５０、７２のランダム、及び２７８、３８０、５２、及び２１５の無刺激周期、ならびにＷＴマウスｎ＝３、動物当たり６５、９３、９１の４０Ｈｚ、６４、９３、９０のランダム、及び１８７、２７６、２７０の無刺激周期）。４０Ｈｚでの１ミリ秒の４７３ｎｍの光パルスの送達で、図１３Ａ及び図１３Ｂのプロット１３０６に示す通りＬＦＰで４０Ｈｚでのパワーの増加をもたらした一方、ランダム刺激は、図１３Ａ及び図１３Ｂのプロット１３０８に示す通り、４０Ｈｚでのパワーの増加をもたらさなかった。
【００９７】
さらに、いくつかの実施形態では、光パルスは、光開始から２〜３ミリ秒後、効果的にスパイクを駆動し、パルス当たりのスパイクは、ランダム及び４０Ｈｚの条件の両方で同様であった。図１４Ａ及び１４Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１ミリ秒のレーザパルスの開始後の生の電気トレース、光遺伝学的刺激後のスパイクに対してフィルターをかけた後のトレース、及びスパイクの確率のプロットを含む。図１４Ａは、例示的な生のトレース１４０２及び光遺伝学的刺激１４０６の後のスパイク（３００〜６０００Ｈｚ）１４０４に対してフィルターをかけたトレースを示す。プロット１４０８は、４０Ｈｚの刺激、ランダム刺激、または無刺激の間に、１ミリ秒のレーザパルスの開始後、パルス当たりのスパイクのヒストグラムを示す（４匹の５ＸＦＡＤ及び３匹のＷＴマウスにおいて、４０Ｈｚの刺激ｎ＝３４５７６２、ランダムパルス刺激３０１５５９、及び無刺激３２３５０の回数、５５２の４０Ｈｚの刺激、５４３のランダム刺激、及び１６８１の無刺激周期から少なくとも５００ミリ秒離す）。図１４Ｂは、レーザパルス開始の約２〜３ミリ秒後のスパイキングの増加を伴う４０Ｈｚの刺激１４１２、ランダム刺激１４１４、または無刺激１４１０に反応する１ミリ秒のレーザパルスの開始後のスパイクの確率を示す（５ＸＦＡＤ  ｎ＝４、動物当たり８７、１３０、８、７３の４０Ｈｚの刺激、８５、１２９、５、７２のランダム刺激、及び２５１、３７９、１５、２１５の無刺激周期、ならびにＷＴ  ｎ＝３、動物当たり６５、９３、９１の４０Ｈｚの刺激周期、動物当たり６４、９３、９０のランダム刺激周期、及び動物当たり１８７、２７７、２７０の無刺激周期）。エラーバーは平均＋／−ＳＥＭを示す。
【００９８】
従って、ＣＡ１における４０Ｈｚの振動は、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの光遺伝学的刺激によって効果的に駆動された。先行研究では、Ａβペプチドのレベルが、神経活動の増加の後に上昇し、神経活動の静止の後に減少することが示されている。いくつかの実施形態では、該ランダム刺激条件を用いて、刺激が引き起こすスパイキング活動の全体的な変化を調整した。いくつかの実施形態では、マルチユニット発火率を、４０Ｈｚとランダム刺激の交互配置された周期中で比較し、これらの条件において、発火率に有意な差は見られなかった。
【００９９】
図１５Ａは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの刺激周期とランダム刺激周期の間の発火率の差を示すヒストグラムである。図１５Ａは、両方のタイプの刺激が同様の量のスパイキング活動を誘発することを示す（中央値ゼロに対するウィルコクソンの符号順位検定、ｐ＞０．６、４匹の５ＸＦＡＤ及び３匹のＷＴマウスから刺激周期ｎ＝５３８、「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す）。すべてのマウスを合わせた４０Ｈｚ及びランダム刺激中の発火率の差の分布の中央値ゼロに対するウィルコクソンの符号順位検定ｐ＞０．６：中央値−１．７５×１０−５Ｈｚ（−１．２８−１．１８Ｈｚ、第一四分位数〜第三四分位数）刺激周期ｎ＝５３８。
【０１００】
図１５Ｂは、各動物について、４０Ｈｚの刺激１５１２、ランダム刺激１５１４、及び無刺激１５１０周期当たりのマルチユニット発火率を示す棒グラフである（３匹のＷＴ及び４匹の５ＸＦＡＤマウスの各動物に対する順位和検定、ｐ＞０．０９、中央値と四分位数を図に示す、マウス当たりの４０Ｈｚの刺激周期ｎ＝８７、１３０、８、６５、９３、９１、７３及びランダム刺激周期８５、１２９、５、６４、９３、９０、７２）。箱ひげ図は、中央値（箱内の白線）及び四分位数（箱の上下）を示す。すべての動物で、４０Ｈｚ及びランダム刺激間の発火率には有意な差はなく、このランダム刺激条件がスパイキング活動の対照としての役割を果たすことを示した（３匹のＷＴ及び４匹の５ＸＦＡＤマウスの各動物に対する順位和検定、ｐ＞０．０９、中央値と四分位数を図に示す、動物当たりの４０Ｈｚの刺激周期ｎ＝８７、１３０、８、６５、９３、９１、７３及びランダム刺激周期８５、１２９、５、６４、９３、９０、７２）。無刺激に対して４０Ｈｚの刺激がニューロンの活動過剰を引き起こすかどうかも調べた。ほとんどの動物で、４０Ｈｚまたはランダム刺激と無刺激の間の発火率に有意な差はない（２匹のＷＴ及び２匹の５ＸＦＡＤの各動物に対する順位和検定、ｐ＞０．２５、動物当たりの４０Ｈｚの刺激周期ｎ＝８、９３、９１、７３及びベースライン周期１５、２７７、２７０、２１５）か、または、４０Ｈｚもしくはランダム刺激中の発火率は、無刺激中よりも低く（１匹のＷＴ及び１匹の５ＸＦＡＤの各動物に対する順位和検定、ｐ＜１０−５、これは、多重比較の実施に対して補正された場合に有意であり、動物当たりの４０Ｈｚの刺激周期ｎ＝１３０、６５及びベースライン周期３７９、１８７）、４０Ｈｚの刺激はニューロンの活動過剰を引き起こさなかったことを示した。１匹の動物において、４０Ｈｚまたはランダム刺激でベースライン中より活動が有意に高かった（１匹の５ＸＦＡＤマウスに対する順位和検定、ｐ＜１０−５、動物当たりの４０Ｈｚの刺激周期ｎ＝８７及びベースライン周期２５１）。従って、７匹中６匹の動物で、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの４０Ｈｚの光遺伝学的刺激が活動過剰を引き起こす証拠はない。従って、いくつかの実施形態では、図１５Ａに示すように、このランダム条件はガンマ振動を誘導しなかったが、同様の量のマルチユニットスパイキング活動をもたらした。
【０１０１】
図１６Ａは、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域における特定の細胞型の刺激の周波数特異的な増加の過程での対象の海馬から記録した電気トレースである。より具体的には、図１６Ａは、いくつかの実施形態に従って、ＦＳ−ＰＶ＋（すなわち、ガンマ条件）の刺激の周波数特異的な増加の過程での対象の海馬から記録した。
【０１０２】
図１６Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域における特定の細胞型の刺激における局所電場電位パワーの周波数特異的な増加を示すパワースペクトル密度のプロットである。特に、図１６Ｂのパワースペクトル密度のグラフは、刺激の特異性を検証する。局所電場電位（ＬＦＰ）パワーは、ＦＳ−ＰＶ＋が４０Ｈｚの青色光パルスで活性化された場合に、ガンマ刺激条件中に４０Ｈｚ帯域１６００においてのみ高まった（１群当たりのマウスｎ＝４）。ベースラインもランダム刺激条件もこの周波数１６００での増強を示さなかった。
【０１０３】
ガンマ刺激は、海馬のＣＡ１領域におけるＡβ産生を低減した。
Ａβの蓄積は、ＡＤの病変に典型的な複数の神経毒性事象を引き起こすことがある。従って、いくつかの実施形態では、５ＸＦＡＤマウスの全般的なＡβペプチドのレベルにおけるガンマ刺激の影響を調べた。３か月齢のマウスには、この段階で海馬に斑が存在しないためにこれらを用い、斑負荷と無関係の可溶性Ａβの動態を調べられるようにした。いくつかの実施形態では、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの１時間の刺激が、Ａβ  ＥＬＩＳＡ分析で測定した、海馬のＣＡ１領域におけるＥＹＦＰ対照群と比較して、４０Ｈｚ群において、Ａβ１−４０を５３．２２％及びＡβ１−４２を４４．６２％低減したことが見出された。
【０１０４】
図１７Ａ及び１７Ｂは、いくつかの実施形態に従って、すべてのマウスをまとめた一元配置分散分析による５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅ  ＣＡ１の相対的Ａβ１−４０及びＡβ１−４２レベルを示す棒グラフである（Ａβ１−４０についてはＥＹＦＰマウスｎ＝８及び４０Ｈｚマウス７、Ａβ１−４２については１群当たりのマウスｎ＝４）。図１７Ａの棒グラフは、各刺激条件における５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅ  ＣＡ１の相対的なＡβ１−４０のレベルを表す。棒グラフのバーに重ねられた円１７０２は、各群の個々のデータ点を示す（１群当たりの５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅマウス、ＥＹＦＰ  ｎ＝８、４０Ｈｚ  ｎ＝７、８Ｈｚ  ｎ＝４、ランダムｎ＝６）。この図では、すべての棒グラフについて一元配置分散分析により、注記「ｎ．ｓ．」１７０４は有意でないことを示し、アスタリスク１７０６はｐ＜０．０５を示し、二重アスタリスク１７０８はｐ＜０．０１を示す。図１７Ｂは、各刺激条件における５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅ  ＣＡ１の相対的なＡβ１−４２のレベルを表す（１群当たりの５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅマウス、ＥＹＦＰ  ｎ＝４、４０Ｈｚ  ｎ＝４、８Ｈｚ  ｎ＝３、ランダムｎ＝３）。図１７Ａ及び１７Ｂは平均及びＳＥＭを示す。
【０１０５】
表１（下記）は、異なる条件を受ける同腹仔由来のマウスを比較した場合のスチューデントｔ検定による有意差があるｐ＜０．０５、生の濃度（ｐｇ／ｍｌ）の値を示す。表１は、各実験群について、ＥＬＩＳＡ希釈での生のＡβ１−４０及びＡβ１−４２のレベルを示す。
表１
2019502429.tif 000003
2019502429.tif 000004
2019502429.tif 000005
【０１０６】
いくつかの実施形態では、包括的な一連の対照実験を実施し、効果が周波数、細胞型、及び／または周期性に対して特異的であるかどうかを判定した。周波数特異性を判定するため、８Ｈｚにおける５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅ二重トランスジェニックマウスのＦＳ−ＰＶ介在ニューロンを駆動したところ、Ａβレベルの変化は認められなかった。次に、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンをランダムで駆動したところ、その効果は周期的刺激に特異的であった。実際、ランダム刺激後にアミロイドレベルは減少せず、それどころか、代わりにＡβ１−４０は２３０．１％増加し、Ａβ１−４２は１３３．８％増加した（例えば、図１７Ａ及び１７Ｂ参照、すべてのマウスをまとめた一元配置分散分析によるｐ＜０．０１、Ａβ１−４０に対してＥＹＦＰマウスｎ＝８及びランダムマウスｎ＝４、Ａβ１−４２に対して１群当たりのマウスｎ＝３。異なる条件を受けた同腹仔由来のマウスを比較したところ、スチューデントｔ検定による有意差があるｐ＜０．０１が認められた。
【０１０７】
最後に、５ＸＦＡＤ／αＣａｍＫＩＩ−Ｃｒｅ二重トランスジェニックマウスを用いた海馬ＣＡ１におけるＣａｍＫＩＩ＋興奮性ニューロンでの８Ｈｚ及び４０Ｈｚの刺激による効果の細胞型特異性を試験した。図１８Ａ及び１８Ｂは、いくつかの実施形態に従って、一元配置分散分析による５ＸＦＡＤ／αＣａｍＫＩＩ−Ｃｒｅ  ＣＡ１の相対的なＡβ１−４０及びＡβ１−４２レベルを示す棒グラフである。図１８Ａは、各刺激条件における５ＸＦＡＤ／αＣａｍＫＩＩ−Ｃｒｅ  ＣＡ１の相対的なＡβ１−４０レベルを表す。棒グラフのバーに重ねられた円１８０２は、各群の個々のデータ点を示す（１群当たりの５ＸＦＡＤ／αＣａｍＫＩＩ−Ｃｒｅマウス、４０Ｈｚ  ｎ＝６、８Ｈｚ  ｎ＝３、ランダムｎ＝３、一元配置分散分析により、注記「ｎ．ｓ．」１８０４は有意でないことを示し、アスタリスク１８０６はｐ＜０．００１を示す）。
【０１０８】
図１８Ｂは、各刺激条件における５ＸＦＡＤ／αＣａｍＫＩＩ−Ｃｒｅ  ＣＡ１の相対的なＡβ１−４２レベルを表す（１群当たりのαＣａｍＫＩＩ−Ｃｒｅマウスｎ＝３）。いくつかの実施形態では、８Ｈｚまたは４０ＨｚでＣａｍＫＩＩ＋興奮性ニューロンを駆動することでは、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２のレベルに有意差は生じないことが見出された（例えば、図１８Ａ及び１８Ｂ参照、右、一元配置分散分析によるｐ＞０．０５、４０Ｈｚマウスｎ＝６及び８Ｈｚマウス３（Ａβ１−４０）、１群当たりのマウスｎ＝３（Ａβ１−４２）。異なる条件を受けた同腹仔由来のマウスを比較した場合、それらはスチューデントｔ検定による有意差がないｐ＞０．０５である）。５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅマウスと同様に、ランダム刺激でのＣａｍＫＩＩ＋ニューロンの駆動もまた、Ａβ１−４０の２５７．６％の増加及びＡβ１−４２の１３３．３％の増加をもたらした（例えば、図１８Ａ及び１８Ｂ参照、右、一元配置分散分析によるｐ＜０．００１、Ａβ１−４０に対して４０Ｈｚマウスｎ＝５及びランダムマウス３、Ａβ１−４２に対して１群当たりのマウスｎ＝３。異なる条件を受けた同腹仔由来のマウスを比較した場合、Ａβ１−４０は、スチューデントｔ検定による有意差があるｐ＜０．００１であり、Ａβ１−４２は、スチューデントｔ検定によるｐ＝０．１３である）。
【０１０９】
従って、４０Ｈｚの刺激後のＡβペプチドレベルの低下は、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの駆動に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、これらＥＬＩＳＡの所見を免疫組織化学で確認するため、ＣＡ１におけるＡＰＰと交差反応しないβアミロイドのＣ末端特異抗体を用いてＡβの標識を実施した。
【０１１０】
図１９Ａは、いくつかの実施形態に従って、海馬ＣＡ１領域における抗Ａβ及び抗ＥＥＡ１抗体による免疫組織化学を示す一連の画像である。具体的には、図１９Ａは、ＥＹＦＰ、４０Ｈｚ、及びランダム刺激条件における５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅの海馬のＣＡ１領域での抗Ａβ１９０２（Ｄ５４Ｄ２）ならびに抗ＥＥＡ１  １９０４（６１０４５７）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である（スケールバー＝５０μｍ）。図１９Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰに対して正規化されたＡβの相対的免疫反応を示す一連の棒グラフである。具体的には、図１９Ｂは、ＥＹＦＰに対して正規化されたＡβの相対的免疫反応性を示す（１群当たりのマウスｎ＝４、一元配置分散分析により、１９０８はｐ＜０．０５を示し、１９２０はｐ＜０．０１を示す）。
【０１１１】
図２０Ａは、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅの海馬ＣＡ１領域における抗Ａβ抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。具体的には図２０Ａは、ＥＹＦＰ、４０Ｈｚ、及びランダム刺激条件における５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅの海馬ＣＡ１領域での抗Ａβ２００２（１２Ｆ４）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である（スケールバー＝５０μｍ）。図２０Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰに正規化されたＡβの相対的免疫反応性を示す棒グラフである。具体的には、図２０Ｂは、ＥＹＦＰに対して正規化されたＡβの相対的免疫反応性を示す（１群当たりのマウスｎ＝４、一元配置分散分析により、２００４はｐ＜０．０５を示し、２００６はｐ＜０．００１を示す）。Ａβ標識の強度は、ＥＹＦＰ群と比較した場合、３か月齢の５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅ二重トランスジェニックマウスにおけるＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの４０Ｈｚの刺激後に３９．５％減少し、ランダム刺激後は有意に１８７．０％増加した（例えば、図１９Ａ、１９Ｂ、２０Ａ、及び２０Ｂ参照、一元配置分散分析によるｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１、１群当たりのマウスｎ＝４）。
【０１１２】
脳のアミロイド濃度は、Ａβの産生及びクリアランス率に依存し得る。いくつかの実施形態では、Ａβペプチドは、ＡＰＰのβ及びγセクレターゼによる一連のタンパク質分解的切断によって産生される。ＢＡＣＥ１がＡＰＰホロタンパク質を切断する場合、ＡＰＰのＣＴＦ及びＮＴＦが産生され得る。いくつかの実施形態では、４０Ｈｚの刺激がどのようにしてＡβレベルを低減したかを明らかにするため、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの刺激後、ＡＰＰの切断中間体であるＣＴＦ及びＮＴＦのレベルを測定することによりガンマに影響されたＡＰＰ切断を調べた。４０Ｈｚの刺激後、ＣＴＦの有意な減少が、ＥＹＦＰ群と比較して４０Ｈｚの刺激後１８．６％、及びランダム群と比較して１９．７％見られた（一元配置分散分析によるｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１、１群当たりのマウスｎ＝６）。
【０１１３】
図２１Ａは、いくつかの実施形態に従って、１レーン当たり１匹のマウス、各条件の２つの生物学的反復で、ＥＹＦＰ、ランダム、及び４０Ｈｚの刺激条件における、ＣＡ１でのＡＰＰ（ＣＴ６９５）、ＡＰＰ  ＮＴＦ（Ａ８９６７）、ＡＰＰ  ＣＴＦ（ＣＴ６９５）、及びβアクチン（Ａ５３１６）（負荷対照）のレベルを示す代表的なウェスタンブロットである。図２１Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＡＰＰ  ＣＴＦの相対的免疫反応性を示す棒グラフである。具体的には、図２１Ｂは、ＥＹＦＰ及びランダム条件に対する４０ＨｚにおけるＡＰＰ  ＣＴＦの相対的（アクチンに対して正規化）免疫反応性を示す（１群当たりのマウスｎ＝６、一元配置分散分析により、１つのアスタリスク２１０２はｐ＜０．０５を示し、２つのアスタリスク２１０４はｐ＜０．０１を示す）。図２１Ｃは、いくつかの実施形態に従って、ＣＡ１における完全長ＡＰＰ２１０６（ＣＴ６９５）、ＡＰＰ  ＣＴＦ２１０８（ＣＴ６９５）、及びβアクチン２１１２（Ａ５３１６、負荷対照）のレベルを示す一連のウェスタンブロットである。具体的には、図２１Ｃは、１レーン当たり１匹のマウス、各条件の２つの生物学的反復で、ＥＹＦＰ、ランダム、及び４０Ｈｚの刺激条件における、ＣＡ１での完全長ＡＰＰ２１０６（ＣＴ６９５）、ＡＰＰ  ＣＴＦ２１０８（ＣＴ６９５）、及びβアクチン２１１２（Ａ５３１６、負荷対照）のレベルを示す。
【０１１４】
図２２Ａは、ＥＹＦＰ及びランダム条件に対する４０ＨｚにおけるＡＰＰ  ＮＴＦの相対的（アクチンに対して正規化）免疫反応性を示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝６、一元配置分散分析により、注記「ｎ．ｓ．」２２０４は有意でないことを示し、２２０２はｐ＜０．０５を示す）。図２２Ｂは、ＥＹＦＰ、ランダム、及び４０Ｈｚ条件における完全長ＡＰＰの相対的（アクチンに対して正規化）免疫反応性を示す棒グラフである（一元配置分散分析による、１群当たりのマウスｎ＝６）。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、４０Ｈｚの刺激後、ＡＰＰ  ＮＴＦレベルの有意な低下が、ＥＹＦＰ群と比較して２８．５％、及びランダム群と比較して２８．２％見られた（例えば、図２１Ａ、２２Ａ、及び２１Ｃ参照、一元配置分散分析によるｐ＜０．０５、１群当たりのマウスｎ＝６）。さらに、完全長ＡＰＰのレベルは、様々な群間で類似しているようであり、Ａβの低下は、前駆体レベルの変化によるものではないことを示した（例えば、図２１Ａ、２２Ｂ、２１Ｃ参照、ＡＰＰ実験の１群当たりのマウスｎ＝６）。いくつかの実施形態では、本マウスモデルにおいて、その切断産物と比較して相対的に多量のＡＰＰのため、完全長ＡＰＰの変化は、検出が困難であり得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ＡＰＰのプロセシングは、小胞輸送経路内で行われ、先行研究では、活動刺激後、ＡＰＰは回収エンドソームに輸送されることが示されている。さらに、ＡＤ患者由来の脳組織及びＡＤ患者由来のヒトニューロンにおいて、拡大された初期エンドソームが認められている。いくつかの実施形態では、ガンマ刺激が実験動物においてエンドソームの存在量に影響を与えるかどうかを試験するため、２つのマーカー、すなわちＥＥＡ１（初期エンドソーム抗原１）及びＲａｂ５（ＲＡＢ５Ａ遺伝子がコードするＲａｓ関連タンパク質）を用いて、４０Ｈｚ及びランダム刺激後のＣＡ１における初期エンドソームが特徴づけられている。図２３は、３か月齢の５ＸＦＡＤ／ＰＶ−ＣｒｅマウスにおいてＥＹＦＰ、４０Ｈｚ、及びランダム刺激条件で、抗Ｒａｂ５（ＡＤＩ−ＫＡｐ−ＧＰ００６−Ｅ）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である（スケールバー＝５０μｍ）。
【０１１７】
図２４Ａは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰに対して正規化されたＥＥＡ１の相対的免疫反応性を表す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝４、一元配置分散分析により、１つのアスタリスク２４０２はｐ＜０．０５を示し、２つのアスタリスク２４０２はｐ＜０．０１を示す）。図２４Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ、４０Ｈｚ、及びランダム刺激条件下での５ＸＦＡＤ／ＰＶ−ＣｒｅからのＣＡ１の相対的Ｒａｂ５強度レベルを示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝３、一元配置分散分析により、３つのアスタリスク２４０８はｐ＜０．００１を示す）。いくつかの実施形態では、ＥＥＡ１染色は、ニューロン細胞体において初期エンドソームに典型的な点状の細胞質及び膜近傍パターンを生じた（例えば、図１９Ａ参照）。いくつかの実施形態では、Ｒａｂ５標識は、大部分細胞体及び原形質膜に限局されており、エンドソーム及び膜区画内に集中した小さいまばらな点で表される（例えば、図２３参照）。全体として、ＣＡ１ニューロンの初期エンドソーム標識は、ＥＹＦＰ対照と比較して、４０Ｈｚの刺激後、ＥＥＡ１（３９．７％）及びＲａｂ５（４０．１％）染色強度の両方に有意な低下を示した（例えば、図１９Ａ、２３、２４Ａ参照、一元配置分散分析によるｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１、１群当たり３匹のマウスから切片ｎ＝２）。対照的に、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンのランダム刺激は、ＥＹＦＰ対照と比較して、ＥＥＡ１染色強度を１２２％増加させた（例えば、図１９Ａ及び２４Ａ参照、一元配置分散分析によりｐ＜０．０１、１群当たり３匹のマウスから切片ｎ＝２）。いくつかの実施形態では、ＥＥＡ１染色強度の処理依存的な変化は、ＣＡ１のＡβのそれに匹敵した（例えば、図１９Ａ〜Ｂ、２０Ａ〜Ｂ、２３、及び２４Ａ〜Ｂ参照、一元配置分散分析によりｐ＜０．０５、１群当たり３匹のマウスから切片ｎ＝２）。これらの結果は、ＣＴＦで認められた変化に加えて、４０Ｈｚの刺激がＥＥＡ１及びＲａｂ５を変化させること示唆し、一般的なエンドソームプロセシングの差を示している。
【０１１８】
図２５Ａは、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域の異なる型の刺激後のＡβペプチドアイソフォームＡβ１−４０のレベルを示す棒グラフである。この実験では、約４０ＨｚでのＦＳ−ＰＶ＋の１時間の光遺伝学的刺激５０２が、海馬ＣＡ１におけるＡβ１−４０レベルを低下させた。８Ｈｚでの興奮性錐体刺激５０６及び４０Ｈｚでの興奮性錐体刺激５０８は、Ａβ１−４０のレベルに有意な影響を及ぼさなかった。ランダムな４０Ｈｚの刺激５０４、及びとりわけランダムな興奮性錐体刺激５１０は、Ａβ１−４０のレベルを有意に増加させた（１群当たりの動物ｎ＝４〜９）。
【０１１９】
図２５Ｂは、いくつかの実施形態に従うガンマ振動での対象の海馬のＣＡ１領域における特定の細胞型の刺激後のＡβペプチドアイソフォームＡβ１−４２の減少を示す棒グラフである。この実験では、約４０ＨｚでのＦＳ−ＰＶ＋の１時間の光遺伝学的刺激５１６が、海馬ＣＡ１におけるＡβ１−４２レベルを低下させた（１群当たりの動物ｎ＝２〜４）。８Ｈｚでの刺激５２０、４０Ｈｚでの興奮性錐体刺激５２２、及び８Ｈｚでの興奮性錐体刺激５２４は、Ａβ１−４２のレベルを増加させた。ランダムな４０Ｈｚの刺激５１８、及びとりわけランダムな興奮性錐体刺激５２６は、Ａβ１−４２のレベルを有意に増加させた）。
【０１２０】
図２５Ｃは、いくつかの実施形態に従うガンマ振動での対象の海馬のＣＡ１領域における特定の細胞型の刺激後の完全長ＡＰＰ５２８、５３４（アクチン５３２に対して正規化）のレベルの増加及びＣＴＦ（例えば、β−ＣＴＦ）５３０、５３６（アクチン５３２に対して正規化）のレベルの低下を示す一連の画像である。ランダムな４０Ｈｚの対象条件と比較して、４０ＨｚでのＦＳ−ＰＶ＋刺激は、ＡＰＰのβ−ＣＴＦレベルを低下させ、完全長ＡＰＰレベルを増加させた（１群当たりの動物ｎ＝４〜６）。β−ＣＴＦはＢＡＣＥ１によるＡＰＰのアミロイド形成的切断の過程で生成するＡＰＰ誘導体であるため、β−ＣＴＦの高レベルは、Ａβ産生の増加を表す。
【０１２１】
図２６Ａ〜２６Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域の異なる型の刺激後のエンドソームレベル（ＥＥＡ１レベルに基づく）を示す免疫蛍光画像である。具体的には、免疫蛍光によって測定される、図２６Ｂの図２６Ａに対する比較で、ＦＳ−ＰＶ＋の４０Ｈｚの刺激を介したガンマ振動の誘導が、ランダムなＦＳ−ＰＶ＋の刺激９００と比較して、ＥＥＡ１レベル（エンドソームレベルのマーカー）を低減することが示される（１群当たりのマウスｎ＝３、ｐ＝０．００７）。これら細胞におけるエンドソームレベルの低下は、ＡＰＰとβセクレターゼ間の相互作用の低下を示し、これがＡＰＰの切断及びＡβ産生の低下をもたらす。従って、本試験は、エンドソームレベルの増加がＡＰＰプロセシング、ひいてはＡβ産生の増加を示すことから、ガンマ振動がＡＤマウスモデルにおいてＡＰ産生を低減することを示した。
【０１２２】
図２７は、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域の異なる型の刺激後の図２６Ａ〜２６Ｂの免疫蛍光画像に対する平均強度値（ＦＡＤに対して正規化）を示す棒グラフである。
【０１２３】
ガンマ刺激はミクログリアの形態変換を誘導した。
いくつかの実施形態では、さらに４０Ｈｚの刺激の細胞及び分子効果を不偏的に検討するため、５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅ二重トランスジェニックマウスの４０ＨｚのＦＳ−ＰＶ介在ニューロン刺激、または無刺激（ＥＹＦＰ）１時間後の海馬ＣＡ１組織のゲノムワイドＲＮＡ−ｓｅｑを実施した。ＲＮＡ−ｓｅｑ実験では、平均２６，５１８，３４５のシーケンシングリードが３匹の刺激及び３匹の無刺激マウスから得られた。データのＱＣ分析で、エクソン／イントロン比の平均値１８３、エクソン／遺伝子間比の平均値２７２、及びリボソームＲＮＡリードのパーセンテージの平均値３．６％が明らかになった。この分析は、５２３の差次的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）を特定し、このうち１３０が４０Ｈｚの刺激に応答して上方制御され、３９３が下方制御された。
【０１２４】
図２８は、４０Ｈｚの刺激の有無でのマウス海馬ＣＡ１領域の全トランスクリプトームＲＮＡ−ｓｅｑによって決定された差次的に発現される遺伝子を示すヒートマップである。正規化されたｚスコア値を、各差次的に発現される遺伝子について算出した（列）。色は、遺伝子発現の低及び高レベルを相対的に表す。表２（下記）は、４０ＨｚのＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの刺激によって上方制御された１３０の遺伝子を示す（Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ  ２．２ソフトウェア（ワシントン大学Ｔｒａｐｎｅｌｌ  Ｌａｂ、ワシントン州シアトルより入手可能、ＲＮＡ−ｓｅｑ試料における転写産物の組み立て、それらの存在量の推定、ならびに差次的発現及び調節のための試験用）を用いてｐ＜０．０５）。
表２
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【０１２５】
表３（下記）は、４０ＨｚのＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの刺激によって下方制御された３９３の遺伝子を示す（Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ  ２．２ソフトウェア（ワシントン大学Ｔｒａｐｎｅｌｌ  Ｌａｂ、ワシントン州シアトルより入手可能）によりｐ＜０．０５）。
表３
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【０１２６】
いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子は、下方制御された遺伝子より一般に高い発現値を有していた。図２９は、いくつかの実施形態に従うＥＹＦＰ及び４０Ｈｚ条件における上方ならびに下方制御された遺伝子のＦＰＫＭ値を示す箱ひげ図である。箱は、中央値（箱内の黒線）及び四分位数（箱の上下）を示し、ひげは最小値及び最大値を表し、円は外れ値を表す。上方制御された遺伝子は、ミクログリアにおいて高度に濃縮された可能性がある。具体的には、すべての上方制御された遺伝子の約３５％が、ミクログリアでそれらの最も高い発現を有していた（ニューロンで約１９％、内皮細胞で約１７％、星状細胞で約１４％、髄鞘形成乏突起膠細胞で約９％、乏突起膠細胞前駆細胞で約５％、及び新たに形成された乏突起膠細胞で約１％）。
【０１２７】
図３０は、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの刺激後の特定された上方制御された遺伝子の細胞型特異的発現パターンを示す円グラフである。遺伝子ＦＰＫＭ値は、星状細胞、内皮細胞、ミクログリア、髄鞘形成乏突起膠細胞（ＭＯ）、ニューロン、新たに形成された乏突起膠細胞（ＮＦｏ）、及び乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）を含む様々な脳細胞型からの公開されているＲＮＡ−ｓｅｑデータから算出した。従って、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析は、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの１時間の４０Ｈｚの刺激が、ミクログリアの細胞状態の変化を引き起こしたことを強く示唆しており、これは、これらの細胞がＡＤの病変において役割を果たすという累積証拠を考慮すると重要である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、４０Ｈｚの刺激がミクログリアに与える潜在的影響をさらに検討するため、異なる化学的及び遺伝的摂動下でミクログリア、末梢マクロファージ、ならびにニューロンからの一連の公開されているＲＮＡ−ｓｅｑデータセットを、遺伝子セットエンリッチメント解析を用いて、本明細書のいくつかの実施形態に記載の特徴づけからの遺伝子リストと比較した。表４（下記）は、４０Ｈｚの刺激による上方または下方制御された遺伝子と、異なる化学的及び遺伝的摂動下で公開されているニューロン、ミクログリア、及びマクロファージに特異的なＲＮＡ−ｓｅｑデータの間の相関のＧＳＥＡに基づく統計的有意性を示す。
表４
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【０１２９】
興味深いことに、４０Ｈｚの刺激後のトランスクリプトームの変化は、神経活動の増加（ＮＭＤＡ及びビククリンによる）によるものと似ており、静止活動（テトロドトキシンによる）によるものとあまり似ていなかった。これらの知見は、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの４０Ｈｚの刺激がニューロンの活動を低下させないという観察をさらに支持する。さらに、ニューロンの活動によって上方制御されることが知られている前初期遺伝子Ｎｒ４ａ１、Ａｒｃ、及びＮｐａｓ４は、ＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲＴ−ｑＰＣＲの両方によって示される１時間の４０Ｈｚの刺激後に上昇した。図３１は、いくつかの実施形態に従って、ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットにおける特定の遺伝子標的のＲＴ−ｑＰＣＲ検証を示す棒グラフである。この棒グラフは、ＥＹＦＰ３１０２、及び４０Ｈｚの刺激３１０４条件からの相対的なＲＮＡレベル（発現比）を示す（スチューデントｔ検定により、１つのアスタリスクはｐ＜０．０５を示し、２つのアスタリスクはｐ＜０．０１を示し、３つのアスタリスクはｐ＜０．００１を示す。１群当たりのマウスｎ＝３）。最大の下方制御された遺伝子は、Ｇｒｉｎ４及びＣａｍｋ２ｄであった（例えば、図３１参照、ｐ＜０．０５、１群当たりのマウスｎ＝３）。
【０１３０】
加えて、このトランスクリプトームの結果は、ミクログリアのより多くの食作用状態を示唆する。いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子は、いずれもミクログリアのＡβの取り込みを促進することが知られているマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）によって誘導されるゲノム変化と正の相関があった。図３２Ａ及び３２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅を見せている間に脳の上で再コード化された局所電場電位のパワースペクトル密度を示すプロットである。図３２Ａ及び３２Ｂは、４０Ｈｚでのパワーの増加を示さず、従って、この効果は記録機器に対する光電効果や電気的雑音によるものではない（視覚野の記録を受ける３匹の５ＸＦＡＤ動物で４つの記録期ならびに海馬の記録を受ける２匹の５ＸＦＡＤ及び３匹のＷＴマウスで５つの記録期からの４０Ｈｚの点滅周期ｎ＝４、２、１、１、１７、４２、３６、５５、５３）。記録間の平均（実線）及び標準偏差（網掛け領域）を左側（図３２Ａ）及び動物ごとのものを右側（図３２Ｂ）に示す。３未満の点滅周期の記録３２０２は、より多いデータの記録３２０４よりも雑音の多いパワースペクトル密度となったが、どれも４０Ｈｚのピークの証拠を見せなかった。いくつかの実施形態では、ＲＴ−ｑＰＣＲを実施し、既知のミクログリアの機能に関与する上方制御された遺伝子を検証した。ミクログリアの貪食に関連するＣｄ６８、Ｂ２ｍ、Ｂｓｔ２、Ｉｃａｍ１、及びＬｙｚ２等の遺伝子が、４０Ｈｚの刺激後、海馬ＣＡ１領域で上方制御されることが確認された。
【０１３１】
図３３は、いくつかの実施形態に従って、ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットにおける特定の遺伝子標的のＲＴ−ｑＰＣＲ検証を示す棒グラフである。図３３は、ＥＹＦＰ３３０２及び４０Ｈｚの刺激３３０４条件における相対的なＲＮＡレベル（発現比）を示す（スチューデントｔ検定により１つのアスタリスクはｐ＜０．０５を示し、２つのアスタリスクはｐ＜０．０１を示し、１群当たりのマウスｎ＝６）。他の注目に値する上方制御された遺伝子には、ミクログリアに富んだ転写調節因子Ｉｒｆ７、細胞接着及び遊走調節因子Ｓｐｐ１、ならびにミクログリア増殖マーカーＣｓｆ１ｒ及びＣｓｆ２ｒａが含まれる（例えば、図３３参照、スチューデントｔ検定によりｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１、１群当たりのマウスｎ＝６）。ＲＴ−ｑＰＣＲはまた、炎症性遺伝子Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂ（Ｉｌ１−β）、Ｉｔｇａｍ（ＣＤ１１−ｂ）、及び抗炎症性遺伝子Ｉｇｆ１の発現レベルが変わらないことを示した（例えば、図３３参照、スチューデントｔ検定によりｐ＞０．０５、１群当たりのマウスｎ＝６）。従って、本明細書に記載のトランスクリプトームの結果は、４０Ｈｚのニューロン刺激が、ミクログリアを、取り込みを促進する状態に誘導したことを示唆している。
【０１３２】
４０Ｈｚの刺激が食作用関連遺伝子及び遊走／細胞接着関連遺伝子の両方を上方制御したという観察を考慮し、ミクログリア活性化の形態学的特徴を調べた。いくつかの実施形態では、１時間の４０Ｈｚ、ランダム、または無刺激（ＥＹＦＰマウス）後、５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅマウス由来の海馬ＣＡ１切片のミクログリアを標識するため、ミクログリアのマーカーＩｂａ１を認識する抗体を使用した。図３４は、ＥＹＦＰ、４０Ｈｚ、及びランダム刺激条件における５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅマウスの海馬ＣＡ１領域での抗Ｉｂａ１  ３４０２（０１９−１９７４１）及び抗Ａβ  ３４０４（１２Ｆ４）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。画像は、４０倍の対物レンズで撮影した（スケールバー＝５０μｍ）。矢印は、細胞体中の＋Ｉｂａ１／＋Ａβシグナルを示す。
【０１３３】
図３５Ａは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ及び４０Ｈｚ条件でのミクログリアの数を示す棒グラフである（１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）。図３５Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ、４０Ｈｚ、及びランダム刺激条件におけるＥＹＦＰに対して正規化されたミクログリア細胞体の直径を示す棒グラフである（１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）。図３５Ｃは、ＥＹＦＰ、４０Ｈｚ、及びランダム刺激条件であるＥＹＦＰ、４０Ｈｚ、及びランダムにおけるＥＹＦＰに対して正規化されたミクログリアの一次過程または突起の平均長さを示す棒グラフである。図３５Ｄは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ及び４０Ｈｚの刺激条件におけるＡβ陽性でもあるＩｂａ１陽性（ミクログリア）細胞体の割合を示す棒グラフである（４匹のマウス群から切片ｎ＝２）。一元配置分散分析により、注記「ｎ．ｓ．」３５０２は有意でないことを示し、２つのアスタリスク３５０４はｐ＜０．０１を示し、３つのアスタリスク３５０６はｐ＜０．００１を示し、４つのアスタリスク３５０８はｐ＜０．０００１を示す。
【０１３４】
第一に、１条件当たり６匹の動物におけるＩｂａ１＋ミクログリア数を数えたところ、未刺激のＥＹＦＰ条件（ＲＯＩ当たり平均８個のミクログリア細胞）（例えば、図３４及び３５Ａ参照、一元配置分散分析によりｐ＜０．０１、１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）ならびにランダム条件（ＲＯＩ当たり平均１０個のミクログリア細胞）（例えば、図３４及び３５Ａ参照、一元配置分散分析によりｐ＜０．０５、１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）と比較して、４０Ｈｚ群で約２倍の数のミクログリア細胞が認められた（２１２．５５μｍ×２１２．５５μｍの目的の領域（ＲＯＩ）当たり１５個のミクログリア細胞）。先行研究では、食細胞ミクログリアの２つの主な特徴は、細胞体のサイズの増加及び過程の長さの減少であることが示された場合があり、従って、これらの特徴がどのように４０Ｈｚの刺激によって影響を受けたかを調べた。いくつかの実施形態では、視野内の明確に標識されたＩｂａ１＋細胞体の各々の直径を測定した。ミクログリア細胞体の直径は、４０Ｈｚの刺激後、無刺激と比較して１３５．３％増加し、ランダム条件と比較して１３８．７％増加したことが分かった（例えば、図３４及び３５Ｂ参照、一元配置分散分析によりｐ＜０．０００１、１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）。各条件におけるミクログリアの一次過程の長さを測定したところ、４０Ｈｚの刺激条件での一次ミクログリア過程の長さにおいてＥＹＦＰ対照と比較して５４．０％の減少及びランダム刺激と比較して３８．５％の減少が観察された（例えば、図３４及び３５Ｃ参照、一元配置分散分析によりｐ＜０．０００１、１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）。これらの知見は、条件間でのＩｂａ１の発現の差が本明細書に記載の遺伝子発現分析で認められなかったことから、Ｉｂａ１レベルによっては影響を受けなかった（例えば、表２及び３参照）。従って、４０Ｈｚの刺激後に観察された細胞体のサイズの増加及び過程の長さの減少は、これらミクログリアの貪食状態へのシフトと一致する形態学的変化である。Ａβ抗体（１２Ｆ４、これはＡＰＰと交差反応しない）による共免疫染色時、ミクログリア内のＡβの潜在的共局在化を、ミクログリアのＡβの取り込みを評価する方法として評価した。Ｉｂａ１＋細胞が主に位置するＣＡ１神経網において、細胞体のＡβ／Ｉｂａ１共局在化のミクログリアの数（ＩｍａｇｅＪ、Ｆｕｊｉ共局在化プラグイン）のミクログリアの総数に対する比は、４０Ｈｚの刺激後、ＥＹＦＰと比較して５４．９％増加し、ランダム条件と比較して５０．３％増加した（例えば、図３４及び３５Ｃ参照、一元配置分散分析によりｐ＜０．０１、１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）。ミクログリア過程におけるＩｂａ１／Ａβシグナルの重なりは、潜在的にランダムな非貪食共局在化を含めることを避けるために除外した。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ミクログリア内のＡβシグナルの存在のより良好な解決法を提供するため、この組織からのミクログリアの３Ｄレンダリング及びこれらのレンダリングからの映像を形成した。図３６は、いくつかの実施形態に従って、０度３６０２、Ｙ軸の周りに−２５度３６０４、及びＸ軸の周りに３０度３６０６回転した図３４の免疫蛍光画像を統合して形成された一連の３Ｄレンダリングである。画像は、４０倍の対物レンズで撮影した（スケールバー＝５０μｍ）。全体として、遺伝子発現及び形態学的分析は、４０Ｈｚの刺激が、ミクログリア細胞の刺激部位への動員を増加させ、それらの貪食活性を高めることによってミクログリア活性に影響を与え、Ａβとの結合の増加をもたらすことを示唆している。重要なことには、いくつかの実施形態では、Ｈｏｅｃｈｓｔによる核染色を用いてＣＡ１細胞層の厚さを測定することによるニューロンの損失の証拠は見られなかった。平均ＣＡ１体積は、ＥＹＦＰ及び４０Ｈｚの刺激群間で有意な差はなかった。
【０１３６】
図３７Ａは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ及び４０Ｈｚの刺激条件で、５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅの海馬ＣＡ１領域におけるＨｏｅｃｈｓｔによる免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。図３７Ｂは、いくつかの実施形態に従って、ＥＹＦＰ及び４０Ｈｚの刺激条件における５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅの推定されるＣＡ１厚さを示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝４、スチューデントｔ検定により、「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す）。
【０１３７】
次に、ＡＡＶ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰに感染し、４０ＨｚのＦＳ−ＰＶ＋刺激（処理）または対照の刺激（ＣＴＲＬ）で刺激された５ＸＦＡＤマウスにおける差次的遺伝子発現を、いくつかの実施形態に従う１時間の刺激後の海馬ＣＡ１のゲノムワイドＲＮＡ−ｓｅｑによって評価した。図３８Ａは、いくつかの実施形態に従って、処理またはＣＴＲＬ時の海馬ＣＡ１のゲノムワイドＲＮＡ−ｓｅｑによって決定された５２３の差次的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）を示すヒートマップである。図３８Ａの各列はＤＥＧを表し、図３８Ａのカラムは、３匹の個々の対照動物及び３匹の個々の処理（４０ＨｚのＦＳ＝ＰＶ＋刺激）動物のトランスクリプトーム的プロファイルを表す。
【０１３８】
図３８Ｂは、いくつかの実施形態に従って、図３８Ａの処理条件において上方制御されたＤＥＧ間の重なりを示す図である。図３８Ｂでは、ＦＳ−ＰＶ＋の４０Ｈｚの刺激を介したガンマ振動の誘導が、免疫蛍光で測定して、ランダムなＦＳ−ＰＶ＋刺激と比較してＩｂａ１レベルを低減する（１群当たりのマウスｎ＝３、ｐ＝０．００６）。図３８Ｂは、処理条件で上方制御された遺伝子が、抗炎症性ミクログリア活性化によって上方制御されたミクログリア遺伝子（すなわち、ＭＣＳＦ遺伝子）と有意に特異的に重複することを示す。遺伝子は、ミクログリア細胞で、星状細胞、内皮細胞、髄鞘形成乏突起膠細胞（ＭＯ）、ニューロン、新たに形成された乏突起膠細胞（ＮＦＯ）、及び乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）におけるよりも大きく上方制御された。表５（下記）は、上方制御された遺伝子のミクログリア／マクロファージ経路を示す。
表５
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【０１３９】
いくつかの実施形態に従って、ＲＴ−ｑＰＣＲを実施し、ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットから特定の遺伝子標的を検証した。図３９は、いくつかの実施形態に従って、図３８ＡのＲＮＡ−ｓｅｑデータセットにおける特定の遺伝子標的のＲＴ−ｑＰＣＲ検証を示す棒グラフである。具体的には、図３９は、遺伝子ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、Ｉｌ−６、Ｉｌ１−Ｂｅｔａ、ＣＤ１１−ｂ、ＣＹＢＡ、Ｈｍｏｘ１、Ｈ２−Ｋ１、Ｌｇａｌｓ３、及びＩｃａｍ１等の対照及び処理条件における特定の遺伝子標的の発現比（ＧＡＰＤＨに対して正規化）を示す。
【０１４０】
図４０は、いくつかの実施形態に従って、図３８Ａの上方制御された遺伝子が関連する生物学的過程を示すプロットである。重要なことには、図４０の上方制御された遺伝子は、免疫関連の過程と特異的に関連している。上方制御された遺伝子は、リンパ球介在、適応免疫、及び免疫グロブリン介在過程を含めた免疫関連の生物学的過程に属していた。図４１は、いくつかの実施形態に従って、図３８Ａの下方制御された遺伝子が関連する生物学的過程を示すプロットである。図４１に示すように、下方制御された遺伝子は、細胞運動、細胞間シグナル伝達、シナプス伝達、運動器官の行動、及びニューロンの突起を含めた生物学的過程に属していた。
【０１４１】
図４２Ａは、いくつかの実施形態に従って、対象の海馬のＣＡ１領域の異なる型の刺激後のＩｂａ１のレベルを示す一連の免疫蛍光画像である。図４２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、図４２Ａの免疫蛍光画像に対する平均強度値を示す棒グラフである。図４２Ａは、エンドソームレベルが、ガンマリズムの光遺伝学的増強によって低減されることを示す。ＦＳ−ＰＶ＋の４０Ｈｚの刺激を介したガンマ振動の誘導が、免疫蛍光によって測定されるように、ＥＥＡ１（エンドソームのマーカー）のレベルを低減した（１群当たりのマウスｎ＝３、ｐ＝０．０８）。この結果は、エンドソームレベルの増加はＡＰＰのプロセシング、ひいてはＡβの産生の増加を示すことから、ガンマ振動が、ＡＤのマウスモデルにおいてＡβの産生を低減することを示した。
【０１４２】
総合すれば、本試験の結果は、ＡＤのマウスモデルにおいて、ガンマリズムの回復または誘導が分子病態を回復させることを示した。光遺伝学による細胞型特異的な及び時間的に正確なガンマ振動の再導入は、凝集してＡＤの神経病理学に関与する多くの変性カスケードを開始するペプチドであるアイソフォームＡβ１−４０及びＡβ１−４２の生成を低減し、かつこれらのクリアランスを高めた。さらに、この処理は、神経変性に関連する免疫機構に対抗する抗炎症ミクログリアシグナル伝達経路を誘導した。
【０１４３】
いくつかの実施形態によれば、細胞型特異的で時間的に制御されたガンマ振動は、海馬、視覚野、バレル皮質、及び／または聴覚野において光遺伝学なしで誘導され得る。
【０１４４】
ガンマ周波数での視覚刺激は、視覚野において非侵襲的にガンマ振動を駆動した。
４０Ｈｚでの光遺伝学的刺激によってＡβレベルが強く低下したことで、脳において４０Ｈｚの振動を誘導する他の方法を探索し、この効果が光遺伝学的操作または侵襲的方法に何らかの形で特異的ではないことを確かめるに至った。光の点滅が視覚野において４０Ｈｚの振動を誘導する非侵襲的方法として使用できるかどうかを調べるため、いくつかの実施形態では、動物を暗周期と交互配置された４０Ｈｚまたはランダムな点滅、及び連続光の周期に曝露した。
【０１４５】
図４３Ａは、いくつかの実施形態に従って、光の点滅刺激に曝露されたマウスを示す概略図である。この光の点滅がＡβを変更するかどうかを判定するため、本明細書に記載のＡβを減少させた光遺伝学的刺激の期間と一致する１時間、動物を４０Ｈｚの光の点滅に曝露した。光の点滅は、動物の視界全体を覆った。分子及び細胞アッセイの対照として、３か月齢の５ＸＦＡＤマウスを３日間恒暗に維持したか、１時間恒明もしくは２０Ｈｚの点滅光、または８０Ｈｚの点滅光で処理した（例えば、図４３Ａ参照）。
【０１４６】
図４３Ｂは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅の前及び最中の視覚野における局所電場電位トレースならびにパワースペクトル密度のプロットを含む。パワースペクトル密度の平均（実線）及び標準偏差（網掛け領域）を、視覚野において４０Ｈｚの光の点滅４３０２、ランダムな光の点滅４３０４、または暗４３０６の期間中で示す（５つの記録期から５ＦＸＦＡＤマウスｎ＝４）。図４３Ｃ〜４３Ｆは、いくつかの実施形態に従って、それぞれ４０Ｈｚの光の点滅、ランダムな光の点滅、恒暗、及び恒明の過程で、各マウスに対して各記録期の視覚野における局所電場電位のパワースペクトル密度を示すプロットである（４７、５１、６１、４９、１６の４０Ｈｚの点滅、４７、５０、６４、５０、１６のランダムな点滅、２７９、３０２、３８２、２９４、９３の暗、及び４７、５０、６４、４９、１５の明周期で、４匹の５ＸＦＡＤマウスからの記録ｎ＝５）。視覚野において、４０Ｈｚでの光の点滅は、４０ＨｚでＬＦＰのパワーを増大させ（例えば、図４３Ｂ及び４３Ｃ参照）、一方、ランダム間隔の光の点滅及び暗黒は増大させない（例えば、図４３Ｂ、４３Ｄ、及び４３Ｅ参照）ことが分かった。
【０１４７】
図４４Ａは、いくつかの実施形態に従って、４サイクルの４０Ｈｚの光の点滅に関する時間の関数及びランダムな光の点滅に関する同等の期間の関数としての視覚野におけるスパイクの割合を示す一連のヒストグラムである。図４４Ａは、４サイクルの４０Ｈｚの光の点滅に関する時間の関数４４０２またはランダムな光の点滅の同等の期間の関数４４０４としての視覚野におけるスパイクの割合のヒストグラムを示す（５つの記録期から５ＸＦＡＤマウスｎ＝４、バーは平均を示し、エラーバーは動物間のＳＥＭを示す）。上側のバーは、光がオン４４０６またはオフ４４０８の場合を示す。いくつかの実施形態では、スパイキングは光がオンとオフに点滅するにつれて増加及び減少し、４０Ｈｚの刺激の最中の４０Ｈｚの周波数に同期されたスパイキング位相をもたらした（図４４Ａのヒストグラム４４０２）が、ランダム刺激の最中には明らかな周波数は現れなかった（図４４Ａのヒストグラム４４０４）。
【０１４８】
図４４Ｂは、いくつかの実施形態に従って、光の点滅の間の脳の上で記録された局所電場電位の一連の電気トレースである。いくつかの実施形態では、脳の直上の生理食塩水から記録した場合、４０Ｈｚの点滅の最中に４０Ｈｚのパワーに増加は見られず、この効果が光電効果や電気的雑音によるものではないことを示した（例えば、図３２及び４４Ｂ参照）。光遺伝学的刺激と同様、ランダムな点滅は、光の点滅による活性の全体的な変化用の対照を提供した。
【０１４９】
図４５Ａは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅及びランダムな光の点滅の間の発火率の差を示すヒストグラムである（４匹の５ＸＦＡＤマウスにおける５つの記録期から刺激周期ｎ＝２２６）。図４５Ｂは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅、ランダムな光の点滅、暗、及び明周期中の視覚野におけるマルチユニット発火率を示すプロットである。図４５Ｂは、視覚野におけるマルチユニット発火率を示す。箱ひげ図は、中央値（箱内の白線）及び四分位数（箱の上下）を示す。すべての動物において、発火率は４０Ｈｚの点滅及びランダムな点滅条件の間に有意な差はなく、このランダム刺激条件がスパイキング活動の対照としての役割を果たすことを示した（４匹の５ＸＦＡＤマウスからの５つの記録期の各々に対する順位和検定、ｐ＞０．０６、中央値と四分位数を図に示す。記録当たり４０Ｈｚの点滅周期ｎ＝４７、５１、６４、４９、１６及びランダムな点滅周期４７、５０、６４、５０、１６）。４０Ｈｚの点滅及び明条件間で発火率に有意な差はなく、４０Ｈｚの光の点滅は、概してニューロンの過剰興奮性を引き起こさなかったことを示した（４匹の５ＸＦＡＤマウスからの５つの記録期の各々に対する順位和検定、４つの記録期についてｐ＞０．２、１つの記録期についてｐ＜０．０１、これは複数の比較の実施に対して補正された場合に有意でない。中央値と四分位数を図に示す。記録当たりの４０Ｈｚ周期ｎ＝４７、５１、６４、４９、１６及び明周期４７、５０、６４、４９、１６）。１つの期において、４０Ｈｚの刺激で暗条件におけるより活動が多かった。４０Ｈｚ及びランダムな点滅周期間のマルチユニット発火率の差は、ゼロに近い傾向があった（例えば、４５Ａ参照）。また、これらの周期を動物内で比較すると、有意な差は見られなかった（例えば、図４５Ｂ参照。４匹の５ＸＦＡＤマウスからの５つの記録期の各々に関する順位和検定、ｐ＞０．０６、中央値と四分位数を図に示す。記録当たりガンマ点滅周期ｎ＝４７、５１、６４、４９、１６及びランダムな点滅周期４７、５０、６４、５０、１６）。
【０１５０】
ガンマ周波数での視覚刺激は、視覚野においてＡβレベルを低減する。
光遺伝学的方法の有効性を考慮して、翻訳的で非侵襲的なアミロイド低減処理を設計した。図４６Ａは、いくつかの実施形態に従う実験的パラダイムを示す概略図である。図４６Ａに示すように、ＡＤモデルマウスの第一のサブセットを、４０Ｈｚの閃光灯を備えた第一のチャンバー４６００に入れ、ＡＤモデルマウスの第二のサブセットを、暗くしておいた第二のチャンバー４６０２に入れた。第一のチャンバー４６００内の動物を約１時間、４０Ｈｚの閃光灯に曝露した。
【０１５１】
図４６Ｂ及び４６Ｃは、いくつかの実施形態に従って、図４６Ａの実験的パラダイム後、それぞれ、ＡβペプチドアイソフォームＡβ１−４０及びＡβ１−４２のベースラインレベルの変化をさらに示すプロットである。図４６Ｂは、５ＸＦＡＤマウスの視覚野Ｖ１における４０Ｈｚの光の曝露が有意にＡβ１−４０及びＡβ１−４２レベルを低下させたことを示す。Ａβ１−４０及びＡβ１−４２のレベルは、ｐｇ／ｍＬとして示す（１群当たりの動物ｎ＝６）。
【０１５２】
４０Ｈｚの光の点滅が４０Ｈｚの振動を一次視覚野で駆動し、４０Ｈｚの振動の光遺伝学的誘導が海馬のＡβレベルを低下させたことを考慮すると、目的は、４０Ｈｚの光の点滅が視覚野においてＡβレベルを低下させ得るかどうかを判定することとなった。これらの実験のため、いくつかの実施形態では、発症前の３か月齢の５ＸＦＡＤマウスを用いた。これらマウスを暗箱に入れ、４０Ｈｚの光の点滅、恒明オン（明）、または恒明オフ（暗）のいずれかに１時間曝露した。
【０１５３】
図４７Ａ及び４７Ｂは、いくつかの実施形態に従って、暗、明、４０Ｈｚの点滅、２０Ｈｚの点滅、８０Ｈｚの点滅、４０Ｈｚの点滅及びピクロトキシン（ＰＴＸ）、ならびにランダムな点滅条件において、それぞれ、５ＸＦＡＤの視覚野におけるＡβ１−４０及びＡβ１−４２のベースラインレベルの変化を示す棒グラフである（暗については１群当たりのマウスｎ＝１２、明、４０Ｈｚの点滅、２０Ｈｚの点滅、８０Ｈｚの点滅、及びＰＴＸについては１群当たりのマウスｎ＝６、ランダムな点滅については１群当たりのマウスｎ＝４、一元配置分散分析により、「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示し、１つのアスタリスクはｐ＜０．０５を示し、２つのアスタリスクはｐ＜０．０１を示す）。図４７及び４７Ｂは、平均及びＳＥＭを示す。棒グラフのバーに重ねられた円は、各群の個々のデータ点を示す。露光の１時間後、暗条件と比較して、視覚野におけるＡβ１−４０レベルは５７．９６％低下し、Ａβ１−４２レベルは５７．９７％低下したことが観察された（ＡβのＥＬＩＳＡにより測定。例えば、図４７Ａ及び４７Ｂ参照。一元配置分散分析によりｐ＜０．０５。１群当たりのマウスｎ＝６）。明対照と比較して、４０Ｈｚの点滅１時間後では、アミロイドレベルは６２．４７％（Ａβ１−４０）及び６８．５５％（Ａβ１−４２）減少した（ＡβのＥＬＩＳＡにより測定。例えば、図４７参照。一元配置分散分析によりｐ＜０．０５。１群当たりのマウスｎ＝６）。さらに、この効果は、２０Ｈｚ、８０Ｈｚ、またはランダムな点滅のいずれも暗及び明対照と比較して有意にＡβレベルを低減しなかったことから、４０Ｈｚの点滅に特異的であった（例えば、図４７参照。「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す。１群当たりのマウスｎ＝６）。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、局所的な特異性を試験するため、体性感覚バレル皮質（ＢＣ）におけるＡβレベルを調べたところ、有意な差は見られなかった。図４８Ａは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での５ＸＦＡＤのバレル皮質における相対的なＡβ１−４０及びＡβ１−４２のレベルを示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝３。スチューデントｔ検定により「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す）。５ＸＦＡＤマウスを少量のＧＡＢＡ−Ａアンタゴニスト（ピクロトキシン、０．１８ｍｇ／ｋｇ、これはてんかん性活動を誘導しない）で前処理したところ、４０Ｈｚの点滅のＡβレベルに対する効果は完全に無効になり、十中八九ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンからのＧＡＢＡ作動性シグナル伝達が本効果に必要であることを示した（例えば、図４７参照。「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す。１群当たりのマウスｎ＝６）。
【０１５５】
この効果が５ＸＦＡＤマウスに特異的でないことを示すため、この結果を、異なるＡＤモデルであるＡＰＰ／ＰＳ１マウス、すなわち、２つの家族性ＡＤ変異（ＡＰＰスウェーデン型及びＰＳＥＮ１デルタＥ９）を有する十分に検証されたモデルで再現した。図４８Ｂは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下でのＡＰＰ／ＰＳ１の視覚野におけるＡβ１−４０及びＡβ１−４２のベースラインレベルの変化を示す棒グラフである（暗条件については１群当たりのマウスｎ＝５及び４０Ｈｚの点滅条件については１群当たりのマウスｎ＝４。スチューデントｔ検定により「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示し、１つのアスタリスクはｐ＜０．０５を示す）。
【０１５６】
図４８Ｃは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下でのＷＴの視覚野におけるＡβ１−４０及びＡβ１−４２のベースラインレベルの変化を示す棒グラフである（暗条件については１群当たりのマウスｎ＝１１及び４０Ｈｚの点滅条件については１群当たりのマウスｎ＝９。スチューデントｔ検定により１つのアスタリスクはｐ＜０．０５を示す）。いくつかの実施形態では、４０Ｈｚの点滅処理後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、２０．８０％で有意に低下したＡβ１−４０及び３７．６８％で減少傾向のＡβ１−４２が見出されたが、後者は暗条件と有意差がなかった（例えば、図４８Ｂ参照。スチューデントｔ検定によりＡβ１−４０  ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２  ｐ＜０．０９、すなわち有意でない。暗条件については１群当たりのマウスｎ＝５、４０Ｈｚの点滅については１群当たりのマウスｎ＝４）。加えて、老齢ＷＴマウスでは、４０Ｈｚの点滅１時間後に内因性のマウスＡβ１−４０の５８．２％の低下が見られた（例えば、図４８Ｃ参照。スチューデントｔ検定によりｐ＜０．０５。暗マウスｎ＝１１及び４０Ｈｚの点滅マウスｎ＝９）。Ａβ１−４２は、これら動物の点滅及び対照群の両方で検出可能レベル未満であった。ＷＴ動物における内因性マウスＡβ１−４０の低下は、これらの結果がＴｇのＡＰＰ発現や変異型ＡＰＰに限定されない可能性があることを明らかにし、むしろ、それらは、その内因性プロモーターが駆動する発現を伴うＡＰＰから産生されるＡβにまで及ぶ可能性がある。図４８Ａ〜４８Ｃは、平均及びＳＥＭを示す。
【０１５７】
次に、いくつかの実施形態では、４０Ｈｚの点滅が視覚野においてミクログリア活性を変更するかどうかに関する調査を、４０Ｈｚの光遺伝学的なＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの刺激が海馬ＣＡ１のミクログリアを変更した方法と同じ方法で実施した。図４９は、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での５ＸＦＡＤの視覚野に抗Ｉｂａ１（０１９−１９７４１）及び抗Ａβ４９０４（１２Ｆ４）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。画像は、４０倍の対物レンズで撮影した（スケールバー＝５０μｍ）。右：１２０倍ズーム、矢印は細胞体における＋Ｉｂａ１／＋Ａβシグナルを示す。
【０１５８】
図５０Ａは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件におけるミクログリア数を示す棒グラフである（１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２。スチューデントｔ検定により「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す）。図５０Ｂは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件における対照に対して正規化されたミクログリア細胞体の直径を示す棒グラフである（１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２。スチューデントｔ検定により２つのアスタリスクはｐ＜０．０１を示す）。図５０Ｃは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件における対照に対して正規化されたミクログリアの一次過程の平均長さを示す棒グラフである（１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２。スチューデントｔ検定により４つのアスタリスクはｐ＜０．０００１を示す）。図５０Ｄは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下でのＡβ陽性でもあるＩｂａ１陽性（ミクログリア）細胞体の割合を示す棒グラフである（１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２。スチューデントｔ検定により２つのアスタリスクはｐ＜０．０１を示す）。図５０Ａ〜５０Ｄは平均及びＳＥＭを示す。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、Ｉｂａ１を用いて４０Ｈｚの点滅または暗条件の１時間後、５ＸＦＡＤマウスの視覚野切片においてミクログリアを標識した（例えば、図４９参照）。ミクログリアの数は暗及び４０Ｈｚの点滅条件間で差はなかった（例えば、図４９及び５０Ａ参照。「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す。１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）が、ミクログリア細胞体の直径は、視覚野において４０Ｈｚの点滅後、暗対照と比較して６５．８％増加した（例えば、図４９及び５０Ｂ参照。スチューデントｔ検定によりｐ＜０．０１。１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）。ミクログリアの一次過程の長さは、４０Ｈｚの点滅条件において暗対照と比較して３７．７％減少した（例えば、図４９及び５０Ｃ参照。スチューデントｔ検定によりｐ＜０．０００１。１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）。視覚野のミクログリアは貪食活性の増強を示す形態を有することから、いくつかの実施形態では、Ａβを有するミクログリアの数を調べた。本実験のため、視覚野の切片をＩｂａ１及びＡβ（１２Ｆ４）抗体で共標識した。細胞体内におけるＡβ／Ｉｂａ１の共局在化は、４０Ｈｚの点滅条件で３３．５％増加し、これは、４０Ｈｚの点滅が暗対照条件より多くのＡβを有するミクログリアをもたらすことを示した（例えば、図４９及び５０Ｄ参照。スチューデントｔ検定によりｐ＜０．０１。１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ミクログリアにおける形態学的変化のより良好な解決法を提供するため、ＣＬＡＲＩＴＹを用いて視覚野の１００μｍ切片からミクログリアの３Ｄレンダリングを形成し、これらのレンダリングから映像を形成した。図５１は、０°５１０２、Ｘ軸の周りに４５°５１０４、及びＹ軸の周りに４５°５１０６回転したＣＬＡＲＩＴＹ処理された１００μｍの組織片からの暗及び４０Ｈｚの点滅条件下でのＩｂａ＋ミクログリアの一連の３Ｄレンダリング（免疫蛍光画像から）である。画像は６３倍の対物レンズで撮影した（スケールバー＝１５μｍ）。最後に、５ＸＦＡＤマウスでミクログリアが実際にＡβを貪食することを示すため、５ＸＦＡＤ及びＷＴ動物由来のミクログリアを、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いて精製し、ＡβレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。
【０１６１】
図５２Ａは、いくつかの実施形態に従って、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いて視覚野からミクログリアを単離する方法を示す流れ図である。視覚野を切断し、その後単一細胞を懸濁し、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ４５抗体で標識した。続いて、細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により分類し、溶解した。Ａβ１−４０レベルをＥＬＩＳＡにより分析した。図５２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、図５２Ａの方法を用いて３か月齢の５ＸＦＡＤ及びＷＴ対照動物の視覚野から単離されたミクログリアにおけるＡβ１−４０のレベルを示す棒グラフである（５ＸＦＡＤについては１群当たりのマウスｎ＝８及びＷＴマウスについては１群当たりのマウスｎ＝４。スチューデントｔ検定により１つのアスタリスクはｐ＜０．０５を示す）。棒グラフのバーに重ねられた円は、各群の個々のデータ点を示す。
【０１６２】
図５３Ａは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での３か月齢の５ＸＦＡＤの視覚野におけるシナプトフィジンを検出するためのＳＶＰ３８抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。画像は、４０倍の対物レンズで撮影した（スケールバー＝５０μｍ）。右：１００倍の暗及び４０Ｈｚの点滅条件。図５３Ｂは、いくつかの実施形態に従って、暗及び４０Ｈｚの点滅条件後の５ＸＦＡＤの視覚野の相対的なＳＶＰ３８の強度レベルを示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝４。スチューデントｔ検定により「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す）。
【０１６３】
Ａβのミクログリア特異的レベルは、ＷＴ対照と比較して５ＸＦＡＤ動物で有意に高く、５ＸＦＡＤマウスでは２７．２ｐｇ／１０４ミクログリアのレベルであり、ＷＴ対照マウスでは９．７８ｐｇ／１０４ミクログリアのレベルであることが分かった（例えば、図５２Ａ及び５２Ｂ参照。スチューデントｔ検定によりｐ＜０．０５。５ＸＦＡＤについてはｎ＝８及びＷＴマウスについてはｎ＝４）。Ａβ１−４２は、これら動物において点滅及び対照群の両方について検出可能レベル未満であった。全体として、４０Ｈｚの刺激が誘導する視覚野におけるミクログリアの形質転換は、海馬ＣＡ１において生じたそれと同様に見えた。さらに、シナプトフィジンレベルは暗条件と４０Ｈｚの点滅条件間で変化せず、ミクログリアの活性化がシナプスの貪食を有意に増加させないことを示した（例えば、図５３Ａ及び５３Ｂ参照。「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す。１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）。総合すれば、本明細書に開示のデータは、感覚刺激を介して非侵襲的に誘導された４０Ｈｚの振動が、ＡＤマウスモデルにおいて効果的にＡβの存在量を低減し、ミクログリア／Ａβ相互作用を促進し得ることを示している。さらに、４０Ｈｚの刺激は、２つの異なる脳回路においてＡβを低減する可能性があり、このことが、ガンマ振動が様々な脳領域でアミロイドの存在量を低減し、ミクログリアの食作用を高める一般的機構を示唆している。
【０１６４】
さらなる実験において、暗（光なし）、２０Ｈｚの閃光、４０Ｈｚの閃光、または８０Ｈｚの閃光への曝露１時間後、Ａβ１−４２レベルを評価した。ここで、２０Ｈｚと８０Ｈｚは４０Ｈｚの高調波である。しかしながら、４０Ｈｚの閃光の点滅のみがＡβ１−４２のレベルを有意に低減した。図５４Ａは、いくつかの実施形態に従うガンマ振動での対象の視覚野の刺激後のＡβペプチドアイソフォームＡβ１−４２の減少を示す棒グラフである。
【０１６５】
別の試験を実施し、Ａβ１−４２のレベルの低下のタイミングを評価した。１時間、マウスを光なしまたは４０Ｈｚの閃光のいずれかに曝露した。Ａβ１−４２のレベルを１時間の処理後、及び再度処理終了後２４時間で測定した。図５４Ｂは、いくつかの実施形態に従うガンマ振動での対象の視覚野の刺激後、及びさらに刺激後２４時間のＡβペプチドアイソフォームＡβ１−４２のレベルを示す棒グラフである。Ａβレベルは処理後２４時間で依然として低下していたが、この低下は処理直後より小さかった。
【０１６６】
ガンマ周波数での視覚刺激は、海馬におけるＡβのレベルに影響を与えなかった。
光の点滅による視覚刺激がＡＤに関与する脳回路に影響を与えるかどうかを判定するため、いくつかの実施形態では、海馬、すなわち、ヒトにおいてＡＤの経過の初期に影響を受ける脳領域の１つに対する光の点滅の影響を調べた。図５５Ａは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅５５０２の前及び最中での海馬における局所電場電位の電気トレースならびにパワースペクトル密度のプロットを含む。ＣＡ１における暗５５０４、４０Ｈｚの光の点滅５５０６、及びランダムな光の点滅５５０８の間のパワースペクトル密度の平均（実線）及び標準偏差（網掛け領域）（５ＸＦＡＤマウスｎ＝２及びＷＴマウス３）。
【０１６７】
図５５Ｂは、いくつかの実施形態に従って、それぞれ、４サイクルの４０Ｈｚの光の点滅に関する時間の関数５５１０及びランダムな光の点滅に関する同等の期間の関数５５１２としての海馬におけるスパイクの割合の一連のヒストグラムである（５ＸＦＡＤマウスｎ＝２及びＷＴマウス３、バーは平均を示し、エラーバーは動物間のＳＥＭを示す）。上側のバーは、光がオン（白）またはオフ（黒）の場合を示す。ランダム刺激については、スパイキングは、光のオンの開始と合わせ、さらなる光の周期は、グレーが示すランダムな間隔で行った。視覚野において本明細書に開示したＣＡ１における光の点滅の効果を調べる方法と同じ方法を用いて、４０Ｈｚでの光の点滅が４０Ｈｚで記録されたＬＦＰにおけるパワーを増加させる（例えば、図５５Ａ及び図５５Ｂのグラフ５５１０参照）が、ランダムな間隔の光の点滅（ランダムな点滅）及び暗は増加させない（例えば、図５０Ｄ、図４３Ｃのグラフ４３１０参照）ことが見出された。スパイキングは、４０Ｈｚの刺激の間の４０Ｈｚの点滅周波数によっても変調されるが、しかしながら、この変調は、視覚野におけるよりも小さく見えた（例えば、図５５Ｂ、海馬、図４４Ａ、視覚野参照）。
【０１６８】
図５６Ａは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅及びランダムな光の点滅の間の発火率の差を示すヒストグラムである（２匹の５ＸＦＡＤ及び３匹のＷＴマウスにおいて５つの記録期からの刺激周期最低ｎ＝１６８）。図５６Ｂは、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅５６０４、ランダムな点滅５６０５、暗５６０２、または明５６０８周期の間のＣＡ１におけるマルチユニット発火率を示すプロットである。箱ひげ図は、中央値（箱内の白線）及び四分位数（箱の上下）を示す。すべての動物において、４０Ｈｚの点滅及びランダムな点滅条件の間の発火率に有意な差はなく、このランダム刺激条件がスパイキング活動の対照としての役割を果たすことを示した（２匹の５ＸＦＡＤ及び３匹のＷＴ動物からの５つの記録期の各々に対する順位和検定、ｐ＞０．２、中央値と四分位数を図に示す。記録当たりの４０Ｈｚの点滅周期ｎ＝２２、５４、４２、７１、５５及びランダムな点滅周期１２、３４、３２、５４、３６）。４０Ｈｚの点滅及び明条件間で発火率に有意な差はなく、４０Ｈｚの光の点滅は、概してニューロンの過剰興奮性を引き起こさなかったことを示した（２匹の５ＸＦＡＤ及び３匹のＷＴ動物からの５つの記録期の各々に対する順位和検定、ｐ＞０．３。中央値と四分位数を図に示す。記録当たりの４０Ｈｚ周期ｎ＝２２、５４、４２、７１、５５及び明周期１２、３４、３２、５４、３５）。
【０１６９】
視覚野におけるように、４０Ｈｚとランダムな点滅周期の間のマルチユニット発火率の差はゼロに近い傾向があった（例えば、図５６Ａ参照）。また、これらの周期を動物内で比較すると、有意な差は見られなかった（例えば、図５６Ｂ参照。４匹の５ＸＦＡＤマウスからの５つの記録期の各々に関する順位和検定、ｐ＞０．０６、中央値と四分位数を図に示す。記録当たりの４０Ｈｚの点滅周期ｎ＝２２、５４、４２、７１、５５及びランダムな点滅周期１２、３４、３２、５４、３６）。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、視覚野において用いた方法と同じ方法を用いて、海馬におけるＡβのレベルに対する視覚の光の点滅の影響を調べた。いくつかの実施形態に従って、図５７Ａは、５ＸＦＡＤの視覚野における相対的なＡβ１−４０のレベルを示す棒グラフであり、図５７Ｂは、５ＸＦＡＤの視覚野における相対的なＡβ１−４２のレベルを示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝４。「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す）。視覚野において観察されたこととは対照的に、ＣＡ１では、４０Ｈｚの点滅またはランダムな刺激の１時間後のＡβ１−４０及びＡβ１−４２のレベルに有意な差は見られなかった。４０Ｈｚの点滅またはランダムな点滅後のＡβレベルは暗条件と有意差がなかった。Ａβ１−４０のレベルは、４０Ｈｚ及びランダムな点滅後、暗条件のそれぞれ、１０８．４％及び９６．８２％であり、Ａβ１−４２のレベルは、４０Ｈｚ及びランダムな点滅後、暗条件のそれぞれ、１１８．８％及び９２．１５％であった（例えば、図５７Ａ及び５７Ｂ参照。「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す。１群当たりのマウスｎ＝４）。従って、４０Ｈｚの光の点滅１時間では、海馬におけるＡβのレベルを有意に低減しなかった。
【０１７１】
ガンマ周波数での長期的視覚刺激は、視覚野における斑負荷を減少させた。
４０Ｈｚの振動が光遺伝学的に、または光の点滅を介した視覚刺激によってのいずれかで駆動された場合に、前斑５ＸＦＡＤマウスにおいて影響を受けたアミロイド存在量を調べ、本明細書に開示してきた。次に、目的は、この処理がすでに斑負荷を示している動物に有効であるかどうかを判定することとなった。この目的で、いくつかの実施形態では、６か月齢の５ＸＦＡＤマウスを用いたが、これは、それらが視覚野を含む多くの脳領域において広範囲のアミロイド斑病変を発症するためである。非侵襲的ガンマ刺激後、進行したＡβ関連の病変に何が起こるかを調べるための試験を実施した。４０Ｈｚの点滅１時間に反応したＡβ減少の期間を調べるため、いくつかの実施形態では、Ａβレベルを視覚野において、４０Ｈｚの点滅または暗条件１時間の４、１２、及び２４時間後に測定した。
【０１７２】
図５８Ａ及び５８Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間の暗または４０Ｈｚの点滅処理後１、４、１２、及び２４時間での５ＸＦＡＤの視覚野における、それぞれ相対的なＡβ１−４０及びＡβ１−４２のレベルを示す棒グラフである（４及び１２時間の待機については１群当たりのマウスｎ＝４、１及び２４時間の待機についてはｎ＝６、暗処理についてはｎ＝１２。一元配置分散分析により「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示し、１つのアスタリスクはｐ＜０．０５を示し、２つのアスタリスクはｐ＜０．０１を示す）。この結果は、４時間後、暗対照と比較して、Ａβ１−４０のレベルは６３．４％低下し、Ａβ１−４２のレベルは６３．２％低下したことを示した（例えば、図５８参照。ｐ＜０．０１。１群当たりのマウスｎ＝４）。１２時間までに、Ａβ１−４０のレベルは、５０．９％減少した一方、Ａβ１−４２のレベルは、暗対照と有意差はなかった（例えば、図５８参照。「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示し、ｐ＜０．０１。１群当たりのマウスｎ＝４）。最後に、１時間の４０Ｈｚの点滅処理後２４時間で、可溶性Ａβ１−４０及びＡβ１−４２のレベルは、暗対照条件と比較して、４０Ｈｚの点滅で有意差はなかった（例えば、図５８参照。「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す。２４時間について１群当たりのマウスｎ＝６及び暗条件について１群当たりのマウスｎ＝４）。これらの結果は、４０Ｈｚの点滅処理の効果が一時的であることを示している。
【０１７３】
従って、進行した斑病変を破壊するため、いくつかの実施形態では、マウスを毎日１時間で７日間、４０Ｈｚの点滅、または対照については暗条件で処理した。図５９Ａは、いくつかの実施形態に従って、１日当たり１時間の点滅に７日間曝露された６か月齢のマウスを示す概略図である。図５９Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗または４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの視覚野における相対的なＡβ１−４２のレベルを示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝１３。２つのアスタリスクはｐ＜０．０１を示し、３つのアスタリスクはｐ＜０．００１を示す。スチューデントｔ検定）。図５９Ｃは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗条件または４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの視覚野における相対的なＡβ１−４０のレベルを示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝１３。スチューデントｔ検定により、１つのアスタリスクはｐ＜０．０１を示し、２つのアスタリスクはｐ＜０．０１を示す）。図５９Ｂ及び５９Ｃは、平均及びＳＥＭを示す。棒グラフのバーに重ねられた円は、各群の個々のデータ点を示す。
【０１７４】
７日の期間の終わりに、この視覚野をＥＬＩＳＡ及び免疫染色で分析した。いくつかの実施形態では、この組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で溶解してＰＢＳ可溶性Ａβ画分を抽出したところ、６か月齢の５ＸＦＡＤマウスにおいて、ＥＬＩＳＡで測定して、１時間の４０Ｈｚの点滅７日間で、可溶性Ａβ１−４０及びＡβ１−４２のレベルは、それぞれ、６０．５％及び５１．７％減少したことが分かった（例えば、図５９Ｂ及び５９Ｃ参照。スチューデントｔ検定によりｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１。１群当たりのマウスｎ＝１３）。組織をさらにグアニジン塩酸（ＨＣｌ）で処理して、凝集したアミロイド斑を構成する不溶性のＡβ１−４０及びＡβ１−４２画分を抽出した。不溶性のＡβ１−４０及びＡβ１−４２のレベルは、それぞれ、４３．７％及び５７．９%減少し、４０Ｈｚの点滅が、６か月齢のマウスにおいてすでに形成された不溶性のＡβ凝集物を破壊したことを示した（例えば、図５９Ｂ及び５９Ｃ参照。スチューデントｔ検定によりｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１。１群当たりのマウスｎ＝１３）。
【０１７５】
斑負荷がどのようにして特異的に影響を受けたかを判定するため、いくつかの実施形態では、免疫組織化学的な特徴づけを、Ａβ抗体を用いて実施した（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄ５４Ｄ２）。図６０Ａは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗（上）または４０Ｈｚの点滅（下）条件下での７日後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの視覚野における抗Ａβ（Ｄ５４５２）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である（スケールバー＝５０μｍ）。細胞内に見られるＡβシグナルは除外した。図６０Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗または４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの視覚野におけるＡβ陽性斑の沈着数を示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝８。スチューデントｔ検定により、３つのアスタリスクはｐ＜０．００１を示す）。図６０Ｃは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗または４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の６か月齢の５ＸＦＡＤマウスの視覚野におけるＡβ陽性斑の面積を示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝８。マン・ホイットニー検定により、２つのアスタリスクはｐ＜０．０１を示す）。図６０Ｂ及び６０Ｃは、平均及びＳＥＭを示す。
【０１７６】
斑の存在量は、直径が１０μｍ以上のＡβ＋沈着物数を数えることによって定量化した。４０Ｈｚの点滅は、斑の数を暗対照における３３．５と比較して、１１．０に低減した（例えば、図６０Ａ及び６０Ｂ参照。スチューデントｔ検定によりｐ＜０．０１。１群当たりのマウスｎ＝８）。さらに、１週間の４０Ｈｚの点滅処理後、斑のサイズ（緻密な斑領域の面積として測定）は、暗対照と比較して、約６３．７％減少した（例えば、図６０Ａ及び６０Ｃ参照。マン・ホイットニー検定によりｐ＜０．０１。１群当たりのマウスｎ＝８）。総合すれば、これらの実験は、アミロイド斑の病変に強い影響を与える完全に非侵襲的な治療を特定した。
【０１７７】
４０Ｈｚの点滅が別の重要なＡＤ関連病変を改善するかどうかを判定するため、タウリン酸化を、ＴａｕＰ３０１Ｓタウオパチーマウスモデルを用いて調べた。細胞体に局在するリン酸化タウをこの月齢で示す４か月齢のＴａｕＰ３０１Ｓ  Ｔｇマウスを４０Ｈｚの点滅または暗対照条件のいずれかで毎日１時間、７日間処理した。４０Ｈｚの点滅がタウリン酸化をどのように変化させたかを調べるため、視覚野の免疫組織化学的特徴づけを、ｐＴａｕの３つの異なるエピトープ（Ｓ２０２、Ｓ３９６、及びＳ４００／Ｔ４０３／Ｓ４０４；１１８３４Ｓ、９６３２Ｓ、１１８３７Ｓ）に対するｐＴａｕ抗体及び樹状マーカーＭＡＰ２を対照として用いて行った。
【０１７８】
図６１Ａは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗または４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の４か月齢のＰ３０１Ｓマウスにおける抗ｐＴａｕ６１０２（Ｓ２０２）及び抗ＭＡＰ２  ６１０４抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。画像は、４０倍の対物レンズで撮影した（スケールバー＝５０μｍ。差し込み図は、暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での代表的な細胞体の１００倍のレンダリングを含む）。図６１Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後のＰ３０１Ｓの視覚野の相対的なｐＴａｕ（Ｓ２０２）の強度レベルを示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝８。スチューデントｔ検定により、１つのアスタリスクはｐ＜０．０５を示す）。図６１Ｃは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後のＰ３０１Ｓの視覚野の相対的なＭＡＰ２強度レベルを示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝８。スチューデントｔ検定により、「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す）。図６１Ｂ及び６１Ｃは、平均及びＳＥＭを示す。
【０１７９】
図６２Ａは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の４か月齢のＰ３０１Ｓマウスにおける抗ｐＴａｕ６２０２（Ｓ４０４）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である（スケールバー＝５０μｍ）。図６２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後のＰ３０１Ｓの視覚野の相対的な抗ｐＴａｕ（Ｓ４００／Ｔ４０３／Ｓ４０４）の蛍光強度レベルを示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝８。スチューデントｔ検定により、２つのアスタリスクはｐ＜０．０１を示す）。図６２Ｂは平均及びＳＥＭを示す。
【０１８０】
図６３Ａは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の４か月齢のＰ３０１Ｓマウスにおける抗ｐＴａｕ６３０２（Ｓ３９６）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である（スケールバー＝５０μｍ）。図６３Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後のＰ３０１Ｓの視覚野の相対的なｐＴａｕ（Ｓ３９６）の蛍光強度レベルを示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝８。スチューデントｔ検定により、４つのアスタリスクはｐ＜０．０００１を示す）。
【０１８１】
その結果、４０Ｈｚの点滅条件では、暗対照と比較して、ｐＴａｕ（Ｓ２０２）のシグナル強度は、４１．２％及びｐＴａｕ（Ｓ４００／Ｔ４０３／Ｓ４０４）は４２．３％減少した（例えば、図６１Ａ〜Ｂ、６２Ａ〜Ｂ参照。スチューデントｔ検定により、ｐ＜０．０１。１群当たり８匹のマウスから切片ｎ＝２）一方、ＭＡＰ２レベルは変化しなかった（例えば、図６１Ａ及び６１Ｃ参照。「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す。１群当たり４匹のマウスから切片ｎ＝２）。ｐＴａｕ（Ｓ３９６）に対する抗体での染色は、同じ方向に向くことを示した。すなわち、４０Ｈｚの点滅が、ｐＴａｕ（Ｓ３９６）レベルを暗対照と比較して１４．４％低減した（例えば、図６３Ａ〜Ｂ参照。「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す。１群当たり８匹のマウスから切片ｎ＝２）。さらに、暗対照と比較して、４０Ｈｚの点滅に反応したｐＴａｕシグナルの点状の細胞体局在化は少なかった。タウリン酸化において有意な変化は見られたが、４０Ｈｚの点滅処理及び暗対照群の間で、不溶性タウのレベルに識別できる差は認められなかった。
【０１８２】
ＴａｕＰ３０１Ｓマウスモデルのミクログリアに対する４０Ｈｚの点滅の結果を評価した。図６４は、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の４か月齢のＰ３０１Ｓマウスにおける抗Ｉｂａ１（０１９−１９７４１）抗体による免疫組織化学を示す一連の免疫蛍光画像である。画像は、４０倍の対物レンズで撮影した（スケールバー＝５０μｍ。差し込み図は、ＥＹＦＰ及び４０Ｈｚの刺激条件での代表的なミクログリアの１００倍のレンダリングを含む）。
【０１８３】
図６５Ａは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後のミクログリアの数を示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝８。スチューデントｔ検定により、「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す）。図６５Ｂは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の対照に対して正規化されたミクログリア細胞体の直径を示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝８。スチューデントｔ検定により、４つのアスタリスクはｐ＜０．０００１を示す）。図６５Ｃは、いくつかの実施形態に従って、１時間／日の暗及び４０Ｈｚの点滅条件下での７日後の対照に対して正規化されたミクログリアの一次過程の平均長さを示す棒グラフである（１群当たりのマウスｎ＝８。スチューデントｔ検定により、４つのアスタリスクはｐ＜０．０００１を示す）。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ＴａｕＰ３０１Ｓマウスの視覚野切片において抗Ｉｂａ１抗体でミクログリアを１日１時間の４０Ｈｚの点滅または暗条件７日後に標識した（例えば、図６４参照）。いくつかの実施形態では、暗対照と比較して、４０Ｈｚの点滅条件では、５ＸＦＡＤモデルで観察されたものと一致して（例えば、図５０Ａ参照）、ミクログリア数に２９．５０％増加する傾向が認められた（例えば、図６４及び６５Ａ参照。「ｎ．ｓ．」は有意でないことを示す。１群当たりのマウスｎ＝３）。さらに、ミクログリア細胞体の直径は、視覚野において４０Ｈｚの点滅後、暗対照と比較して、４９．００％増加した（例えば、図６４及び６５Ｂ参照。スチューデントｔ検定により、ｐ＜０．０００１。１群当たりのマウスｎ＝３）。ミクログリアの一次過程の長さは、４０Ｈｚの点滅群で暗対照と比較して、３９．０８％低下した（例えば、図６４及び６５Ｃ参照。スチューデントｔ検定によりｐ＜０．０００１。１群当たりのマウスｎ＝３）。
【０１８５】
総合すれば、ＡＤ病変の複数のモデルからの及びＷＴ動物におけるこれらのデータは、４０Ｈｚの振動が、Ａβレベルの低下によって測定される通り、アミロイド病変を軽減し得るとともにタウリン酸化を低下させ得ることを示している。さらに、４０Ｈｚの視覚点滅は、ＡＤ病変のアミロイドーシス及びタウオパチーモデルのいずれにおいてもミクログリアの明瞭な形態変換を駆動し得る。
【０１８６】
別の実験において、老齢マウス（すなわち、６か月齢）のサブセットを視覚ガンマ刺激に７日間曝露した。残りのマウスは暗所に置いた。図６６は、マウスの視覚野における可溶性Ａβペプチド及び不溶性Ａβペプチド（すなわち、斑）の両方のレベルを示すプロットである。図６６に示すように、可溶性アイソフォームＡβ１−４０  ６６００、可溶性アイソフォームＡβ１−４２  ６６０２、不溶性アイソフォームＡβ１−４０  ６６０４、及び不溶性アイソフォームＡβ１−４２  ６６０６の各々のレベルは、視覚ガンマ刺激に曝露したマウスにおいて有意に減少した。
【０１８７】
図６７Ａ〜６７Ｂは、いくつかの実施形態に従って、対象の経頭蓋ガンマ刺激の有無でのＡβペプチドのレベルを示すプロットである。図６７Ａでは、全脳Ａβペプチドレベルは、無刺激６７００で現状維持であったが、１時間の経頭蓋ガンマ刺激６７０２後に低下した（１群当たりの動物ｎ＝１）。図６７Ｂでは、いくつかの実施形態に従って、全脳Ａβペプチドレベルは、４０Ｈｚの経頭蓋刺激後、５ｘＦＡＤマウスの海馬６７０４及び皮質６７０６で減少した。
【０１８８】
ガンマ振動は、長い間、高次の認知機能及び感覚反応と関連していると考えられてきた。いくつかの実施形態では、光遺伝学的方法を用いたＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの駆動がマウスにおいて４０ＨｚでＬＦＰを増強した。本明細書に開示のように、いくつかの実施形態では、５ＸＦＡＤマウスモデルにおいて、光遺伝学または非侵襲的な光の点滅処理を用いた４０Ｈｚの振動及び位相同期スパイキングの駆動により、少なくとも２つの異なる脳領域でＡβペプチドの顕著な減少がもたらされたことが示されている。この減少は、Ａβペプチドレベルが、４０Ｈｚの振動を高めることなく同様の量のマルチユニットスパイキング活動を生じたランダム刺激条件より、４０Ｈｚの刺激に反応して有意に低かったことから、スパイキング活動の低下によるものではなかった。錐体細胞の発火率は、これらの条件間で異なり得るが、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンまたは他の細胞型はこの変化を隠した。いくつかの実施形態では、ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンの直接の刺激の同量を与えたＦＳ−ＰＶ介在ニューロンのランダムな光遺伝学的刺激は、依然としてアミロイドを低減しなかった。それどころか、光遺伝学的確率的刺激は、アミロイドレベルを３倍超にした一方、確率的視覚点滅は有意な変化をもたらさず、このことは、ランダム刺激のいくつかの側面が神経毒性効果を有することを示す可能性がある。いくつかの実施形態では、ランダム刺激はガンマパワーの増加をもたらさなかった一方、パワーの微増の傾向が、約２０Ｈｚ〜６０Ｈｚ超までの広範囲の周波数において認められた。いくつかの実施形態では、２０Ｈｚ〜８０Ｈｚの光の点滅でアミロイドレベルの増加傾向が認められた。総合すれば、これらの結果は、４０Ｈｚ以下または以上の一部の周波数における駆動活性がアミロイドレベルを増加させる可能性があることを示唆し得る。これらの結果は、スパイキング活動のパターンがどのように分子経路及び疾患病変に影響を与えるかを理解する必要性を指摘している。
【０１８９】
総アミロイドレベルの強い低下は、ＥＥＡ１／Ｒａｂ５陽性初期エンドソームの減少に関連するアミロイド形成の減少及びミクログリアによるアミロイドのエンドサイトーシスの増加の両方によって媒介される可能性が高い。重要なことには、本明細書に開示の遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）統計分析（Ｔｈｅ  Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）で、古典的マクロファージの炎症性Ｍ１または抗炎症性Ｍ２の細胞状態は、４０Ｈｚの振動によるニューロンの刺激後の上方または下方制御された遺伝子発現プロファイルのいずれとも相関しないことが示された。実際、炎症性遺伝子Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂ、Ｉｔｇａｍ、及び抗炎症性遺伝子Ｉｇｆ１の発現レベルは、刺激後に変化しなかった。代わりに、複数のミクログリアのプロ食作用遺伝子及び細胞接着／遊走調節因子Ｓｐｐ１は、４０Ｈｚの刺激で活性化された。従って、４０Ｈｚのガンマ振動の駆動は、ニューロンとミクログリアの両方を動員することによって、総合的な神経防護反応を誘導するように見える。ＧＡＢＡ−Ａアンタゴニスト処理がＡβレベルの低下に対する４０Ｈｚの刺激の効果を完全に無効にしたという事実は、十中八九ＦＳ−ＰＶ介在ニューロンに関連するＧＡＢＡ作動性シグナル伝達がこれらの効果に不可欠であることを強く示唆している。さらに、いくつかの実施形態では、５ＸＦＡＤマウスに加えてＡＰＰ／ＰＳ１及びＷＴマウスを含めた複数のマウスモデルにおいて、４０Ｈｚの点滅刺激はＡβを低減した。複数のマウスモデルにおけるこの再現は、これらの知見が、１つの動物モデルに特異的でない可能性があり、重要なことには、ＷＴ動物におけるように、ＡＰＰがその生理学的プロモーターによって発現され、Ａβが内因性ＡＰＰから生じる状況にまで及ぶ可能性があることを示している。さらに、いくつかの実施形態では、４０Ｈｚの振動がタウオパチーのマウスモデル、ＴａｕＰ３０１ＳにおいてｐＴａｕを低減することが分かり、ガンマ刺激の防護効果が、他のマウスモデルだけでなく、他の病原性タンパク質にも一般化することを示した。要約すれば、本明細書に開示の知見は、ガンマ振動が媒介するこれまで知られていなかった細胞及び分子過程を明らかにし、脳のガンマリズム、ミクログリア機能、ならびにＡＤ関連病変間の機能的結合を確立する。いくつかの実施形態では、ガンマ振動の障害の知見は、異なるＡＤのマウスモデル（ｈＡＰＰ及びａｐｏＥ４）におけるガンマ障害の証拠に収斂し、ガンマがＡＤのヒトにおいて変更されることを報告する。Ｔｇ及びノックインモデルを含めた複数のＡＤのマウスモデルから収斂する証拠を探すことで、これらの結果が、単に導入遺伝子の過剰発現または特に１つのモデルに対する他の副作用によるものではないことが示され得る。マウス及びヒトからのこれらの結果を合わせて、Ａβ病変に寄与する複数の分子経路が収斂してＡＤにおけるガンマ振動を変更することが示される。本明細書に開示の知見は、ＡＤに対する新規な治療的介入を期待できる。
【０１９０】
ＡＤの発病の１つの理論は、ミクログリアの機能不全、具体的には、ミクログリアによる病的な分子の除去不全を疾患進行の重要な機序として指摘している。従って、４０Ｈｚの刺激が行うように、ミクログリアをエンドサイトーシス状態に復帰させる介入が、強い治療可能性を有する。本明細書にさらに記載される実験では、光遺伝学的な、または光の点滅によるガンマ振動の駆動は、ニューロンの活動過剰を引き起こさなかった。この方法は先行のＡＤ療法とは基本的に異なるため、かかるパターン化された神経活動を駆動して内因性修復を誘発することで、ＡＤに対する新規な治療方法が提供されよう。
【０１９１】
ガンマ周波数での視覚刺激は、対象の行動に好ましい影響を与えた。
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が対象に何らかのストレスを引き起こすかどうかを調べるための試験を実施した。図６８Ａは、本試験を示す流れ図である。図６８Ａの６８００に示すように、いくつかの実施形態に従って、ＷＴマウスを連続７日間、すなわち１〜７日目に、１日１時間、普通室内光（Ｎ＝８）または４０Ｈｚの光の点滅（Ｎ＝８）のいずれかに曝露した。６８０２に示す８日目、マウスから採血し、血漿を分離してコルチコステロンレベルを調べた。マウスでは、コルチコステロンは、ストレス反応に関与する主要な糖質コルチコイドである。
【０１９２】
図６８Ｂは、普通室内光（ＮＲＬ）に曝露された８匹のマウス及び４０Ｈｚの光の点滅（４０Ｈｚ）に曝露された８匹のマウスから採取した血漿におけるコルチコステロン（ＣＯＲＴ）のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスにおいてコルチコステロンの増加は認められなかった。代わりに、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスの群は、対照群と比較して、コルチコステロンのレベルが低かった。１群当たりＮ＝８の独立した測定値について、コルチコステロンレベルのＴ分布及びｐ値は：
Ｔ（１４）＝０．８２７、ｐ＝０．４２２           （１）
と計算された。
【０１９３】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が対象の不安を低減するかどうかを調べるために別の試験を実施した。図６９Ａは、本試験を示す流れ図である。図６９Ａの６９００に示すように、いくつかの実施形態に従って、ＷＴマウスを連続７日間、すなわち１〜７日目に、１日１時間、普通室内光（Ｎ＝１０）または４０Ｈｚの光の点滅（Ｎ＝１０）のいずれかに曝露した。６９０２に示す８日目、１０分間の期間の高架式十字迷路を実施した。
【０１９４】
高架式十字迷路は、実験動物の不安を測るために用いられる試験である。この行動モデルは、げっ歯類の開放的空間に対する一般的な嫌悪に基づいており、これが走触性、すなわち、閉鎖空間にとどまるかまたは囲まれた空間のへりの近くの優先傾向につながる。図６９Ｂは、高架式十字迷路装置を示す画像である。この装置は、２つの壁なし走路（垂直）及び２つの壁あり走路（水平）の十字形である。不安は、動物が壁あり走路でより長い時間を過ごすことで表現される。
【０１９５】
図６９Ｃ及び６９Ｄは、高架式十字迷路期間中の対象の代表的な軌跡を示す画像である。いくつかの実施形態に従って、図６９Ｃでは、普通室内光に曝露されたマウスは、壁あり走路にとどまる傾向があり、より大きな不安を示したが、図６９Ｄでは、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスは、壁なし走路と壁あり走路の両方を探索し、比較的小さい不安を示した。
【０１９６】
図７０は、いくつかの実施形態に従って、普通室内光（ＮＲＬ）に曝露された１０匹のマウス及び４０Ｈｚの光の点滅（４０Ｈｚ）に曝露された１０匹のマウスが壁なし走路及び壁あり走路で探索に費やした合計時間を示す棒グラフである。いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスは、壁あり走路でより少ない合計時間及び壁なし走路でより長い合計時間を費やし、対照群と比較して、より少ない不安を示した。１群当たりＮ＝１０の独立した測定値について、壁あり走路の探索に費やされた合計時間に関するＴ分布及びｐ値は：
Ｔ（１８）＝−１．６５２、ｐ＝０．１１           （２）
と計算された。
【０１９７】
１群当たりＮ＝１０の独立した測定値について、壁なし走路の探索に費やされた合計時間に関するＴ分布及びｐ値は：
Ｔ（１８）＝−２．１３６、ｐ＝０．０４７         （３）
と計算された。
【０１９８】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が対象のストレス及び／または不安を低減するかどうかを調べるために別の試験を実施した。図７１Ａは、本試験を示す流れ図である。図７１Ａの７１００に示すように、いくつかの実施形態に従って、ＷＴマウスを連続７日間、すなわち１〜７日目に、１日１時間、普通室内光（Ｎ＝８）または４０Ｈｚの光の点滅（Ｎ＝８）のいずれかに曝露した。７１０２に示す８日目、５分間のオープン・フィールド試験を実施した。
【０１９９】
オープン・フィールド試験は、実験動物で一般的な自発運動レベル及び不安をアッセイするのに用いられる実験である。行動モデルは、明るく照らされた領域を避けるが、認識された脅威刺激を探索するげっ歯類の矛盾した動きによって生じる不安に基づいている。図７１Ｂは、オープン・フィールド・アリーナを示す画像である。このオープン・フィールド・アリーナは、脱出を防ぐための壁を有し、グリッドでマークしても、ソフトウェアシステムと一体化した赤外線ビームまたはビデオカメラを用いて監視してもよい。いくつかの実施形態に従って、不安の増加は、自発運動の低下及びフィールドのヘリに対する優先傾向をもたらすが、不安の減少は、探索行動の増加につながる。
【０２００】
図７１Ｃ及び７１Ｄは、オープン・フィールド試験中の対象の代表的な軌跡を示す画像である。いくつかの実施形態に従って、図７１Ｃでは、普通室内光に曝露されたマウスは、アリーナのへりを好む傾向があり、より大きなストレス及び／または不安を示したが、図７１Ｄでは、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスは、アリーナの中心を探索し、比較的小さいストレス及び／または不安を示した。
【０２０１】
図７２Ａ及び７２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、普通室内光（ＮＲＬ）に曝露された８匹のマウス及び４０Ｈｚの光の点滅（４０Ｈｚ）に曝露された８匹のマウスが、オープン・フィールド・アリーナの中心及び周囲で探索に費やした合計時間を示すグラフである。図７２Ａは、５分ごとのアリーナの中心で費やされた平均秒数のプロットである。図７２Ｂは、分ごとに平均された、全５分間にアリーナの周囲で費やされた合計時間の棒グラフである。
【０２０２】
いくつかの実施形態に従って、対照群と比較して、平均すると、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスは、２分、４分、及び５分の間に有意にアリーナの中心でより長い時間を過ごし、ひいてはより小さいストレス及び／または不安を示したが、これはまた、高架式十字迷路の結果と一致する。反復測定分散分析（ＲＭ  ＡＮＯＶＡ）を実施した。１群当たりＮ＝８の独立した測定値について、オープン・フィールド・アリーナを探索するのに費やされた平均時間に対するＦ分布及びｐ値は：
Ｆ（１，１４）＝４．８６０、ｐ＝０．０４５              （４）
と計算された。
【０２０３】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が対象の生得新奇探索行動を変更するかどうかを調べるために別の試験を実施した。図７３Ａ及び７３Ｂは、新奇認識タスクを用いた本試験を示す概略図である。図７３Ａでは、２つの新奇物体を慣れ親しんだアリーナに設ける。図７３Ｂでは、１つの慣れ親しんだ物体と１つの新奇物体を慣れ親しんだアリーナに設ける。いくつかの実施形態に従って、野生型マウスを連続７日間、すなわち１〜７日目に、１日１時間、普通室内光（Ｎ＝８）または４０Ｈｚの光の点滅（Ｎ＝８）のいずれかに曝露した。
【０２０４】
８日目に、これらのマウスを５分間、図７３Ａのシナリオ、すなわち、慣れ親しんだアリーナ内で２つの新奇物体に曝露した。図７３Ｃは、いくつかの実施形態に従って、普通室内光（ＮＲＬ）に曝露された８匹のマウス及び４０Ｈｚの光の点滅（４０Ｈｚ）に曝露された８匹のマウスについて、新奇物体Ｂの探索に費やされた時間のパーセンテージに対して、新奇物体Ａを探索するのに費やされた時間のパーセンテージを示す棒グラフである。図７３Ｃに示すように、各群によって各物体に対して等しい優先傾向が見られた。すなわち、群間で、物体探索に差は認められなかった。
【０２０５】
次に、これらマウスを５分間、図７３Ｂのシナリオ、すなわち、慣れ親しんだアリーナ内で１つの慣れ親しんだ物体及び１つの新奇物体に曝露した。図７４は、５分ごとの新奇物体を探索するのに費やされた平均秒数を示すプロットである。いくつかの実施形態に従って、対照群と比較して、平均すると、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスは、特に１〜３分及び５分の間、有意に長い時間を新奇物体の探索に費やし、ひいては、新奇探索行動の増加を示した。フリードマンのノンパラメトリックＲＭ  ＡＮＯＶＡを実施した。１群当たりＮ＝８の独立した測定値について、新奇物体を探索するのに費やされた平均時間に対する検定統計量χ２及びｐ値は：
χ２（４，ｎ＝１６）＝１６．０８８、ｐ＝０．００３             （５）
と計算された。
【０２０６】
３分の間に新奇物体を探索するのに費やされた平均時間に対してマン・ホイットニーＵ検定を実施した。１群当たりＮ＝８の独立した測定値について、Ｕ値、Ｚ値、及びｐ値は：
Ｕ＝５８．００、Ｚ＝２．７３１、ｐ＝０．００５          （６）
と計算された。
【０２０７】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が対象の学習及び記憶に影響を与えるかどうかを調べるために別の試験を実施した。図７５Ａは、恐怖条件付けパラダイムを用いた試験を示す流れ図である。図７５Ａに７５００で示されるように、いくつかの実施形態に従って、ＷＴマウスを連続７日間、すなわち１〜７日目に、１日１時間、普通室内光または４０Ｈｚの光の点滅のいずれかに曝露した。７５０２で示される８日目、これらマウスを軽度の２トーン・ショック・ペアリングに供した。具体的には、マウスを第一のトーンと足のショックを組み合わせた新たなアリーナに入れた。これらのマウスは、文脈（すなわち、トーン）と嫌悪体験（すなわち、足のショック）を関連付けるように条件付けされた。この最初の文脈について、すくみに費やされた合計時間に対するＴ分布及びｐ値は：
Ｔ（２４）＝０．５７７、ｐ＝０．５６９           （７）
と計算された。
【０２０８】
７５０４で示される９日目、トーン試験を変更した文脈で実施した。図７５Ｂは、第一のトーンの文脈７５０６、第一のトーンの文脈後７５０８、第二のトーンの文脈７５１０、及び第二のトーンの文脈後７５１２を含む、時間の関数としてトーン試験を示す刺激図である。本試験のため、マウスを、第一のトーンが足のショックと組み合わされたアリーナに戻した。第一のトーンの文脈７５０６を適用すると、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスは、恐らく足のショックを予期して、ひいては記憶の尺度を示すすくみにより長い時間を費やした。４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスはまた、第二のトーンの文脈７５１０の間もすくみに対照群より長い時間を費やしたが、いずれのトーンの文脈後の間もすくみ時間は少なかった。
【０２０９】
図７６Ａ及び７６Ｂは、いくつかの実施形態に従って、記憶の強化を示す棒グラフである。いくつかの実施形態に従って、図７６Ａに示すように、第一のトーンの文脈７５０６及び第二のトーンの文脈７５１０の間のすくみに費やされた時間のパーセンテージは、対照群と比較して、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスでより高く、記憶の連合の強化を示した。さらに、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスは、トーン提示後により強い消去を示した。図７６Ｂに示すように、いくつかの実施形態に従って、第一のトーンの文脈７５０６後の間及び第二のトーンの文脈７５１０後の間にすくみに費やされた時間のパーセンテージは、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスと比較して、対照群でより高く、記憶の特異性の強化を示した。
【０２１０】
トーンの文脈前について、ＲＭ  ＡＮＯＶＡを群間で実施したところ、すくみに費やされた平均時間に対するＦ分布及びｐ値は：
Ｆ（１，２４）＝３．１０６、ｐ＝０．０９１              （８）
と計算された。
【０２１１】
第一のトーンの文脈について、すくみに費やされた合計時間に対するＴ分布及びｐ値は：
Ｔ（２４）＝−２．１５５、ｐ＝０．０４１         （９）
と計算された。
【０２１２】
第二のトーンの文脈について、すくみに費やされた合計時間に対するＴ分布及びｐ値は：
Ｔ（２４）＝−１．４３３、ｐ＝０．１６４         （１０）
と計算された。
【０２１３】
トーンの文脈について、ＲＭ  ＡＮＯＶＡを群間で実施したところ、すくみに費やされた平均時間に対するＦ分布及びｐ値は：
Ｆ（１，２４）＝４．５５９、ｐ＝０．０４３              （１１）
と計算された。
【０２１４】
第一のトーンの文脈後について、すくみに費やされた合計時間に対するＴ分布及びｐ値は：
Ｔ（２４）＝１．８７４、ｐ＝０．０７３           （１２）
と計算された。
【０２１５】
第二のトーンの文脈後について、すくみに費やされた合計時間に対するＴ分布及びｐ値は：
Ｔ（２４）＝２．２２３、ｐ＝０．０３６           （１３）
と計算された。
【０２１６】
トーンの文脈後について、ＲＭ  ＡＮＯＶＡを群間で実施したところ、すくみに費やされた平均時間に対するＦ分布及びｐ値は：
Ｆ（１，２４）＝６．６４６、ｐ＝０．０１７              （１４）
と計算された。
【０２１７】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が対象の記憶を改善するかどうかを調べるために別の試験を実施した。図７７Ａは、本試験を示す流れ図である。図７７Ａの７７００で示すように、いくつかの実施形態に従って、ＷＴマウスを連続７日間、すなわち１〜７日目に、１日１時間、普通室内光または４０Ｈｚの光の点滅のいずれかに曝露した。７７０２で示される８日目、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験を実施した。
【０２１８】
Ｍｏｒｒｉｓ水航行タスクまたは迷路は、実験動物で空間記憶及び学習を研究するために用いられる試験である。行動に関する手続きは、対象を目に見えないまたは見える台を備えた大きな円形のプールに入れることを含み、この台は、対象が、習慣的な方法（台に到着するのに必要な動きの想起）、走性的方法（台を見つける視覚的手がかりの使用）、または空間的方法（基準点として遠位の手がかりの使用）を用いて脱出するのを可能にする。図７７Ｂは、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路を示す図である。この迷路は、方向象限に分割された水の円形プール及び南西（ＳＷ）象限に隠された台７７０４を含む。
【０２１９】
弱い訓練については、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験を連続４日間、すなわち、８〜１１日目に、１日２回繰り返した。図７８Ａは、いくつかの実施形態に従って、普通室内光（ＮＲＬ）に曝露されたマウス及び４０Ｈｚの光の点滅（４０Ｈｚ）に曝露されたマウスが台を見つけるまでの時間を示すプロットである。
【０２２０】
１２日目、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路から、隠された台を除去してプローブ試験を実施した。図７７Ｃ及び７７Ｄは、プローブ試験中の対象の代表的な軌跡を示す画像である。いくつかの実施形態に従って、図７７Ｃでは、普通室内光に曝露されたマウスは、プール全体にわたって台を探したように見えるが、図７７Ｄでは、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスは、より系統的に、主にＳＷ象限を探したように見える。図７８Ｂは、目標象限（すなわち、ＳＷ象限）内で台を探すのに費やされた合計時間（各３０秒間当たりの秒数）を示すプロットであり、図７８Ｃは、逆の象限（すなわち、ＮＥ象限）内で台を探すのに費やされた合計時間（各３０秒間当たりの秒数）を示すプロットである。いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスは、目標象限を探すのに対照群より多くの時間を費やし、かつ逆の象限を探すのに対照群より少ない時間を費やし、空間記憶の強化を示した。
【０２２１】
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験及びプローブ試験から同じ群のマウスを用いて、逆転学習を実施した。図７９Ａは、本試験でＳＷ象限に隠された台７９００を備えたＭｏｒｒｉｓ水迷路を示す図である。図７９Ｂは、逆転学習のため、逆のＮＥ象限に隠された台７９０２を備えたＭｏｒｒｉｓ水迷路を示す図である。
【０２２２】
弱い訓練については、逆転学習を連続４日間、すなわち、１４〜１７日目、１日２回繰り返した。図７９Ｃは、いくつかの実施形態に従って、普通室内光（ＮＲＬ）に曝露されたマウス及び４０Ｈｚの光の点滅（４０Ｈｚ）に曝露されたマウスが台を見つけるまでの時間を示すプロットである。７日目以降さらなる４０Ｈｚの曝露を受けていないにもかかわらず、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスは、行動に関する柔軟性の増加を示した。
【０２２３】
いくつかの実施形態に従って、長期的なガンマ曝露及び／または投与が、対象の空間学習及び記憶に影響を与えるかどうかを調べるために別の試験を実施した。図８０Ａは、本試験を示す流れ図である。図８０Ａの８０００で示すように、いくつかの実施形態に従って、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２週間、１日１時間、普通室内光（Ｎ＝７）または４０Ｈｚの光の点滅（Ｎ＝７）のいずれかに曝露した。８００２で示される第３週の間、これらマウスを普通室内光または４０Ｈｚの光の点滅のいずれかに、毎朝１時間曝露し続け、その後毎日午後、同様にＭｏｒｒｉｓ水迷路試験に供した。
【０２２４】
図８０Ｂは、第３週の１〜４日目に、普通室内光（ＮＲＬ）に曝露されたマウス及び４０Ｈｚの光の点滅（４０Ｈｚ）に曝露されたマウスが台を見つけるまでの時間を示すプロットである。第３週の後、隠された台を取り除いてプローブ試験を実施した。図８０Ｃは、プローブ試験中に目標象限内で台を探すのに費やされた合計時間（３０秒の試験ごとの秒数）を示す棒グラフである。いくつかの実施形態に従って、１週間の処理と同様に、長期的な３週間の処理は、空間学習を強化した。
【０２２５】
図８０Ａ〜８０Ｃから同じ群のマウスを用いて逆転学習を実施した。図８１Ａは、拡張した試験を示す流れ図である。図８１Ａの８１００に示すように、いくつかの実施形態に従って、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２週間、１日１時間、普通室内光または４０Ｈｚの光の点滅のいずれかに曝露した。８１０２で示される第３週の間、これらマウスを普通室内光または４０Ｈｚの光の点滅のいずれかに、毎朝１時間曝露し続け、その後毎日午後、同様にＭｏｒｒｉｓ水迷路試験に供した。８１０４で示される第４週の間、これらマウスを普通室内光または４０Ｈｚの光の点滅のいずれかに、毎朝１時間曝露し続け、その後毎日午後、同様にＭｏｒｒｉｓ水迷路再試験に供した。図８１Ｂは、いくつかの実施形態に従って、第４週の１〜４日目に、普通室内光（ＮＲＬ）に曝露されたマウス及び４０Ｈｚの光の点滅（４０Ｈｚ）に曝露されたマウスが台を見つけるまでの時間を示すプロットである。
【０２２６】
第４週の後、隠された台を取り除いてプローブ試験を実施した。図８２Ａは，プローブ試験中に目標象限内で台を探すのに費やされた合計時間（３０秒の試験ごとの秒数）を示す棒グラフである。図８２Ｂは、プローブ試験中、逆の象限内で費やされた時間を示す棒グラフである。４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたマウスは、強い認識の柔軟性を示した。
【０２２７】
ガンマ周波数での視覚刺激は、解剖学的、形態学、細胞的、及び分子的利益を与えた。
いくつかの実施形態に従って、対象の視覚野におけるＤＮＡ損傷ならびにニューロンの欠損に対するガンマ曝露及び／または投与の影響を調べるために試験を実施した。本試験のため、ｐ２５蓄積の誘導性マウスモデル（すなわち、クレアチンキナーゼカルボキシル末端断片ｐ２５Ｔｇマウス（ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス））を用いた。ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスモデルは、前脳内の重大なニューロン損失、Ａβペプチド産生増加、タウ病理、ＤＮＡ損傷、及び重度の認知機能障害を含むＡＤの重要な病理学的特徴を示す。本モデルでは、ニューロンの損失に先立ってＡβペプチドレベルの上昇が認められ、さらに、Ａβペプチド産生の低減はＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスモデルにおいて記憶障害を軽減することから、この事象がカルボキシル末端断片ｐ２５と相乗的に作用し、神経変性及び記憶障害の発現につながることを示している。
【０２２８】
図８３は、ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスにおける変化を示すスケジュール図８３００である。２週間後８３０２、マウスはＤＮＡ損傷（例えば、バイオマーカーγＨ２ＡＸ）、Ａβペプチドの増加、及びミクログリア活性化を示す。６週間後８３０４、マウスはシナプスの損失、ニューロンの損失、タウの高リン酸化、長期増強不全、及び記憶障害を示す。
【０２２９】
異なる処理計画下でのマウスの群を比較するために試験を実施した。図８４は、ＣＫ対照マウス８４００、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス８４０２、メマンチンで処理された（毎日１０ｍｇ／ｋｇ）ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス８４０４、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露された（６週間毎日１時間）ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス８４０６、ならびにメマンチンで処理され、さらに４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス８４０８を含む群の図である。メマンチンは、ＮＭＤＡ受容体を遮断し、それによりグルタミン酸系に作用することで重度のＡＤを治療するのに使用される、ある程度の成功を収める薬剤である。
【０２３０】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与は、脳の解剖学的構造を保存及び／またはそれに関する変化を減少させることが示された。例えば、ガンマ曝露は、ＣＫｐ−２５誘導性の脳重量の減量を低減及び／または防止した。図８５は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスにおける脳重量の変化を比較する棒グラフである。脳重量の減量は、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスで顕著であった。しかしながら、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスは、より大きな脳重量を保っていた。
【０２３１】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与は、脳の形態を保存及び／またはそれに関する変化を減少させることが示された。例えば、ガンマ曝露は、対象のＣＫｐ−２５誘導性の異常な側脳室拡張を低減及び／または防止した。図８６は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスにおける側脳室拡張の比を、ベースラインとしてのＣＫ対照マウスにおける拡張と比較する棒グラフである。側脳室の拡張は、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスで顕著であった。いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスの側脳室は、他のＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスの側脳室よりはるかに拡張が小さかった。
【０２３２】
図８７Ａ〜８７Ｅは、各群における対象の代表的な側脳室を示す画像である。側脳室は未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図８７Ａ）、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図８７Ｂ）、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図８７Ｃ）において最大であった。図８７Ｄに示すように、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスの側脳室は、拡張がはるかに小さかった。図８７Ｅは、ＣＫ対照マウスにおけるベースラインの側脳室サイズの例である。
【０２３３】
図８８Ａ〜８８Ｃは、いくつかの実施形態に従って、分子の特徴づけのための目的の脳領域を示す脳解剖図である。図８８Ａは、視覚野（Ｖ１）８８００、体性感覚皮質（ＳＳ１）８８０２、海馬８８０４、及び島皮質８８０６を含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与は、視覚野の皮層及びニューロンの層を保存及び／またはそれらに関する変化を減少させることが示された。例えば、ガンマ曝露は、対象の視覚野におけるＣＫｐ−２５誘導性の皮層及びニューロン層の損失を低減及び／または防止した。
【０２３５】
皮層の損失は、Ｈｏｅｃｈｓｔ標識（すなわち、ＤＮＡを染色するために用いられる青色蛍光染料）による核染色を用いて測定した。ニューロンの層の損失は、ＮｅｕＮ、すなわち、ニューロンのバイオマーカーとして通常用いられるニューロンの核抗原を用いて測定した。図８９は、各群におけるＶ１皮層の平均厚さを示す棒グラフであり、図９０は、各群におけるＶ１−ＮｅｕＮ陽性細胞層の平均厚さを示す棒グラフである。
【０２３６】
図９１Ａ〜９１Ｅは、各群における対象の代表的なＨｏｅｃｈｓｔ標識及び／またはＮｅｕＮ標識を有する細胞を示す画像である。図９１Ａは、ＣＫ対照マウスにおけるベースラインのＶ１皮層（例えば、８３７±９μｍ）及びＶ１ニューロン層（例えば、７２５±７μｍ）の厚さの例である。
【０２３７】
Ｖ１皮層は、いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９１Ｄ、例えば、８５５±９μＭ）、メマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９１Ｅ、例えば、８２１±２２μＭ）、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９１Ｂ、例えば、７９２±１３μＭ）、ならびにメマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９１Ｃ、例えば、７８８±９μＭ）で次第に薄くなった。
【０２３８】
いくつかの実施形態に従って、４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるＶ１ニューロン層は、ＣＫ対照マウスにおけるより実際に厚かった（図９１Ｄ、例えば、７４３±９μＭ）が、その一方、メマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９１Ｅ、例えば、６９１±２０μＭ）、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９１Ｂ、例えば、６６６±１４μＭ）、ならびにメマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９１Ｃ、例えば、６６０±７μＭ）で、ＣＫ対照マウスにおけるより次第に薄くなった。
【０２３９】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与は、体性感覚皮質において皮層ならびにニューロン層を保存及び／またはそれらに関する変化を減少させることが示された。例えば、ガンマ曝露は、対象の体性感覚皮質におけるＣＫｐ−２５誘導性の皮層及びニューロン層の損失を低減及び／または防止した。
【０２４０】
図９２は、各群におけるＳＳ１皮層の平均厚さを示す棒グラフであり、図９３は、各群におけるＳＳ１−ＮｅｕＮ陽性細胞層の平均厚さを示す棒グラフである。
【０２４１】
図９４Ａ〜９４Ｅは、各群における対象の代表的なＨｏｅｃｈｓｔ標識及び／またはＮｅｕＮ標識を有する細胞を示す画像である。図９４Ａは、ＣＫ対照マウスにおけるベースラインのＳＳ１皮層（例えば、８４６±１０μＭ）及びＳＳ１ニューロン層（例えば、７０７±８μＭ）の厚さの例である。
【０２４２】
ＳＳ１皮層は、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９４Ｄ、例えば、８３４±９４μＭ）、メマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９４Ｅ、例えば、７７８±１３μＭ）、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９４Ｂ、例えば、７６２±１７μＭ）、ならびにメマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９４Ｃ、例えば、７５６±１１μＭ）で次第に薄くなった。
【０２４３】
いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるＳＳ１ニューロン層は、ＣＫ対照マウスにおける厚さとほぼ同じ厚さであった（図９４Ｄ、例えば、７０５±１５μＭ）。しかしながら、ＳＳ１ニューロン層は、メマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９４Ｅ、例えば、６５０±１１μＭ）、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９４Ｂ、例えば、６３０±１３μＭ）、ならびにメマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９４Ｃ、例えば、６２９±９μＭ）で次第に薄くなった。
【０２４４】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与は、島皮質における皮層及びニューロン層を保存及び／またはそれらに関する変化を減少させることが示された。例えば、ガンマ曝露は、対象の島皮質におけるＣＫｐ−２５誘導性の皮層及びニューロン層の損失を低減及び／または防止した。
【０２４５】
図９５は、各群における島皮質の皮層の平均厚さを示す棒グラフであり、図９６は、各群における島皮質のＮｅｕＮ陽性細胞層の平均厚さを示す棒グラフである。
【０２４６】
図９７Ａ〜９７Ｅは、各群における対象の代表的なＨｏｅｃｈｓｔ標識及び／またはＮｅｕＮ標識を有する細胞を示す画像である。図９７Ａは、ＣＫ対照マウスにおける島皮質のベースラインの皮層（例えば、１１３４±１０μＭ）及びニューロン層（例えば、１０１０±１１μＭ）の厚さの例である。
【０２４７】
皮層は、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９７Ｄ、例えば、１０７９±２０μＭ）、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９７Ｃ、例えば、９８３±１２μＭ）、メマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９７Ｅ、例えば、９６５±１６μＭ）、ならびに未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９７Ｂ、例えば、７６４±２７μＭ）の島皮質で次第に薄くなった。
【０２４８】
ニューロン層は、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９７Ｄ、例えば、９５３±１７μＭ）、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９７Ｂ、例えば、８６１±３０μＭ）、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９７Ｃ、例えば、８５０±１８μＭ）、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス（図９７Ｅ、例えば、８４８±１５μＭ）の島皮質で次第に薄くなった。
【０２４９】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与は、ニューロンの数及び／またはＤＮＡの損傷を保存及び／またはそれらに関する変化を減少させることが示された。例えば、ガンマ曝露は、対象の視覚野におけるＣＫｐ−２５誘導性のニューロンの損失及びＤＮＡ損傷を低減した。
【０２５０】
図９８は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスについて、ＣＫ対照マウスにおけるＮｅｕＮ陽性細胞のパーセンテージとしてのＮｅｕＮ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。従って、ＣＫ対照マウスのＮｅｕＮ陽性細胞のパーセンテージはＣＫ対照マウスで１００％であるが、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスで約８０％しかなく、ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスモデルにおけるニューロンの損失を裏付ける。メマンチンでの処理は、未処理群と比較してＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスにおいていくらかのニューロンの損失を防止した。いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの光の点滅への曝露は、ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスにおいてほとんどのニューロンの損失を防止した。従って、図９８は、いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの視覚の点滅処理がどのようにして視覚野のニューロンを保存することができるかを示す。しかしながら、メマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅への曝露の組合せは、等しくニューロンの損失を防ぐことができなかった。
【０２５１】
ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）は、真核細胞におけるＤＮＡ損傷の一例であり、ゲノムの不安定性を引き起こし、腫瘍形成及び恐らくは老化促進につながる。リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（γＨ２ＡＸ）をＤＳＢに対する細胞応答のバイオマーカーとして用いた。図９９は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。γＨ２ＡＸに対して陽性の細胞は、ＣＫ対照マウスではほとんど存在しなかったが、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスでは非常に多く、大量のＤＳＢ及び他のＤＮＡ損傷を示した。メマンチンでの処理は未処理群と比較して、ＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の量を低減した。いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの光の点滅への曝露は、ＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞のさらに大きな減少をもたらした。従って、図９９は、いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの視覚の点滅処理がどのようにして視覚野におけるＤＮＡ損傷を低減することができるかを示す。しかしながら、メマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅への曝露の組合せは、ＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の数を有意に増大した。
【０２５２】
図１００は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色（皮質細胞を示す）、緑色蛍光タンパク質もしくはＧＦＰ（ＣＫ−ｐ２５を示す）、γＨ２ＡＸ（ＤＳＢを示す）、またはＮｅｕＮ（ニューロンを示す）で標識した各群における対象の代表的な視覚野の試料を示す一連の画像である。
【０２５３】
ガンマ曝露はまた、対象の体性感覚皮質におけるＣＫｐ−２５誘導性のニューロン損失及びＤＮＡ損傷も低減した。図１０１は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスについて、ＣＫ対照マウスにおけるＮｅｕＮ陽性細胞のパーセンテージとしてのＮｅｕＮ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。従って、ＣＫ対照マウスのＮｅｕＮ陽性細胞のパーセンテージは、ＣＫ対照マウスで１００％であるが、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスではより８０％に近く、ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスモデルにおけるニューロンの損失を裏付ける。ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスにおいてほとんどのニューロンの損失を防いだ４０Ｈｚの光の点滅への曝露との組合せ以外は、メマンチンでの処理は、未処理群と比較してＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスにおいてニューロンの損失を防止できなかった。従って、図１０１は、いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの視覚の点滅処理がどのようにして体性感覚皮質のニューロンを保存することができるかを示す。
【０２５４】
図１０２は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。γＨ２ＡＸに対して陽性の細胞は、ＣＫ対照マウスでは存在しなかったが、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスでは非常に多く、大量のＤＳＢ及び他のＤＮＡ損傷を示した。メマンチンでの処理は未処理群と比較して、ＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の量を低減した。いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの光の点滅への曝露は、ＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞のさらに大きな減少をもたらした。従って、図１０２は、いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの視覚の点滅処理がどのようにして体性感覚皮質におけるＤＮＡ損傷を低減することができるかを示す。しかしながら、メマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅への曝露の組合せは、ＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の数を有意に増大した。
【０２５５】
図１０３は、ＮｅｕＮ（ニューロンを示す）、γＨ２ＡＸ（ＤＳＢを示す）、ＧＦＰ（ＣＫ−ｐ２５を示す）、及び／またはＨｏｅｃｈｓｔ染色（皮質細胞を示す）で標識された各群における対象の代表的な体性感覚皮質の試料を示す一連の画像である。
【０２５６】
ガンマ曝露はまた、対象の島皮質におけるＣＫｐ−２５誘導性のニューロン損失及びＤＮＡ損傷も低減した。図１０４は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスについて、ＣＫ対照マウスにおけるＮｅｕＮ陽性細胞のパーセンテージとしてのＮｅｕＮ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。従って、ＣＫ対照マウスのＮｅｕＮ陽性細胞のパーセンテージは、ＣＫ対照マウスで１００％であるが、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスではより８０％に近く、ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスモデルにおけるニューロンの損失を裏付ける。ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスにおいてニューロンの損失の防止が最小であった４０Ｈｚの光の点滅への曝露との組合せ以外は、メマンチンでの処理は、未処理群と比較してＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスにおいていくらかのニューロンの損失を防止した。従って、図１０４は、いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの視覚の点滅処理がどのようにして島皮質のニューロンを保存することができるかを示す。
【０２５７】
図１０５は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。γＨ２ＡＸに対して陽性の細胞は、ＣＫ対照マウスでは存在しなかったが、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスでは非常に多く、大量のＤＳＢ及び他のＤＮＡ損傷を示した。メマンチンでの処理は未処理群と比較して、ＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の量を低減した。いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの光の点滅への曝露は、ＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞に同様の減少をもたらした。従って、図１０５は、いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの視覚の点滅処理がどのようにして島皮質におけるＤＮＡ損傷を低減することができるかを示す。しかしながら、メマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅への曝露の組合せは、ＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の数を有意に増大した。
【０２５８】
図１０６は、ＮｅｕＮ（ニューロンを示す）、γＨ２ＡＸ（ＤＳＢを示す）、ＧＦＰ（ＣＫ−ｐ２５を示す）、またはＨｏｅｃｈｓｔ染色（皮質細胞を示す）で標識された各群における対象の代表的な島皮質の試料を示す一連の画像である。
【０２５９】
ガンマ曝露はまた、対象の海馬におけるＣＫｐ−２５誘導性のニューロン損失及びＤＮＡ損傷も低減した。図１０７は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスについて、ＣＫ対照マウスにおけるＮｅｕＮ陽性細胞のパーセンテージとしてのＮｅｕＮ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。従って、ＣＫ対照マウスのＮｅｕＮ陽性細胞のパーセンテージは、ＣＫ対照マウスで１００％であるが、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスではより８０％に近く、ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスモデルにおけるニューロンの損失を裏付ける。４０Ｈｚの光の点滅への曝露の有無にかかわらず、メマンチンでの処理は、ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスにおいてニューロンの損失の防止が最小であった未処理群と比較して、ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスにおいていくらかのニューロンの損失を防止した。従って、図１０７は、いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの視覚の点滅処理がどのようにして海馬のニューロンを保存することができるかを示す。
【０２６０】
図１０８は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の量を比較する棒グラフである。γＨ２ＡＸに対して陽性の細胞は、ＣＫ対照マウスでは存在しなかったが、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスでは非常に多く、大量のＤＳＢ及び他のＤＮＡ損傷を示した。メマンチンでの処理は未処理群と比較して、ＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の量を低減した。いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの光の点滅への曝露は、ＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞のより良好な減少をもたらした。従って、図１０８は、いくつかの実施形態に従う４０Ｈｚの視覚の点滅処理がどのようにして海馬におけるＤＮＡ損傷を低減することができるかを示す。しかしながら、メマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅への曝露の組合せは、ＣＫ−ｐ２５ＴｇマウスにおけるγＨ２ＡＸ陽性細胞の数を有意に増大した。
【０２６１】
図１０９は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色（皮質細胞を示す）、ＧＦＰ（ＣＫ−ｐ２５を示す）、γＨ２ＡＸ（ＤＳＢを示す）、またはＮｅｕＮ（ニューロンを示す）で標識した各群における対象の代表的な海馬の試料を示す一連の画像である。
【０２６２】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与は、シナプスを保存すること及び／またはシナプスの損失を低減することを示した。シナプス接続の変化は、グルタミン酸作動性シナプス（例えば、ＶＧｌｕＴ１、ＶＧｌｕＴ２、ＰＳＤ９５、及びＧｌｕＲ２）ならびにＧＡＢＡ作動性シナプス（例えば、ＧＡＤ及びＶＧＡＴ）に特異的なマーカーを用いて定量化され得る。
【０２６３】
例えば、ガンマ曝露は、対象の視覚野におけるＣＫｐ−２５誘導性のシナプス損失を低減した。図１１０は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスについて、ベースラインのＣＫ対照マウスのシナプスの点密度のパーセンテージとしてのグルタミン酸作動性シナプス（ＶＧｌｕＴ１を用いて）及びＧＡＢＡ作動性シナプス（ＧＡＤ６５を用いて）の点密度を比較する棒グラフである。
【０２６４】
ガンマ曝露はまた、対象の体性感覚皮質におけるＣＫｐ−２５誘導性のシナプスの損失を低減しただけでなく、シナプスの点密度を増大さえした。図１１１は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスについて、ベースラインのＣＫ対照マウスのシナプスの点密度のパーセンテージとしてのグルタミン酸作動性シナプス（ＶＧｌｕＴ１を用いて）及びＧＡＢＡ作動性シナプス（ＧＡＤ６５を用いて）の点密度を比較する棒グラフである。
【０２６５】
ガンマ曝露は、対象の島皮質におけるＣＫｐ−２５誘導性のシナプス損失を低減した。図１１２は、ＣＫ対照マウス、未処理ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、メマンチンで処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、いくつかの実施形態に従って４０Ｈｚの光の点滅に曝露されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウス、ならびにメマンチン及び４０Ｈｚの光の点滅の両方で処理されたＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスについて、ＣＫ対照マウスにおけるベースラインのシナプスの点密度のパーセンテージとしてのグルタミン酸作動性シナプス（ＶＧｌｕＴ１を用いて）及びＧＡＢＡ作動性シナプス（ＧＡＤ６５を用いて）の点密度を比較する棒グラフである。
【０２６６】
図１１３Ａは、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色（皮質細胞を示す）による代表的な試料を示す画像である。図１１３Ｂは、この代表的な試料におけるＶＧｌｕＴ１（グルタミン酸作動性シナプスを示す）を示す画像である。図１１３Ｃは、この代表的な試料におけるＧＡＤ６５（ＧＡＢＡ作動性シナプスを示す）を示す画像である。図１１３Ｄは、この代表的な試料におけるＨｏｅｃｈｓｔ染色、ＶＧｌｕＴ１、及びＧＡＤ６５を示す統合した画像である。図１１３Ｅ及び１１３Ｆは、ＧＡＤ６５を用いた点の定量化方法を示す。図１１３Ｅは、図１１３Ｃから変換されたＧＡＤ６５の二値画像である。図１１３Ｆに示すように、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダより入手可能）を用いて、二値画像を定量化した。
【０２６７】
いくつかの実施形態に従うガンマ曝露及び／または投与が脳血管系に影響を与えるかどうかを調べるための試験を実施した。マウスを暗箱に入れ、４０Ｈｚの発光ダイオード（ＬＥＤ）の点滅、または恒明オフ（暗）のいずれかに１時間曝露した。刺激後、マウスをサクリファイスし、かん流させた。脳切片をフルオロフォアに結合したレクチンで染色し、血管を蛍光標識した。共焦点像を用いて、脈管構造のサイズ（すなわち、血管径）の変化を測定した。４０ＨｚのＬＥＤ点滅の１時間後、血管拡張が認められた。
【０２６８】
図１２８Ａは、いくつかの実施形態に従って、視覚野における拡大した脈管構造を示す一連の代表的な免疫蛍光画像である。図１２８Ｂは、視覚野における血管径を示し、いくつかの実施形態に従うガンマ曝露後の血管径の増大を示す棒グラフである。
【０２６９】
従って、ガンマ曝露及び／または投与は、解剖学的（例えば、脳重量の減量及び脈管構造の拡大の予防及び／または低減）、形態学（例えば、異常な脳室の拡張及び皮層の厚さの損失の予防及び／または低減）、細胞的（例えば、ニューロンの損失の予防及び／または低減）、ならびに分子的（例えば、ＤＮＡ損傷及びシナプスの損失の予防及び／または低減）利益を与えることが示された。
【０２７０】
さらに、ガンマ曝露及び／または投与には、神経保護作用があることが示された。ガンマ処理の後、ＣＫ−ｐ２５Ｔｇマウスモデル、すなわち、さもなければＡβペプチドレベルの上昇、顕著なニューロンの損失、ＤＮＡ損傷、シナプスの損失、タウの高リン酸化、長期増強不全、及び重度の認知／記憶障害を示すモデルは、相対的なニューロン構造及び／または機能の保存（例えば、疾患の程度の維持／予防及び／または疾患進行の緩和／減退）を示し、いくつかの場合には、ニューロン構造及び／または機能の改善を示唆した。
【０２７１】
ガンマ周波数での聴覚刺激は、対象のミクログリアの変化を非侵襲的に誘導した。
いくつかの実施形態では、ガンマ曝露及び／または投与は、聴覚刺激を含む。聴覚刺激は音波パルスまたはクリックを含み得る。音刺激は、１秒当たり約３５回の音波パルスまたはクリック（クリック／秒）から約４５クリック／秒のクリック・トレインを含み得る。図１１４は、いくつかの実施形態に従って、クリック・トレイン刺激を示す刺激図である。図１１４の刺激は、各クリック間が２５ミリ秒でクリック頻度４０クリック／秒を有し、各クリックが持続時間１ミリ秒を有する。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、音刺激は、周波数約１０Ｈｚ〜約１００ｋＨｚ、約１２Ｈｚ〜約２８ｋＨｚ、約２０Ｈｚ〜約２０ｋＨｚ、及び／または約２ｋＨｚ〜約５ｋＨｚを有する。例えば、クリック・トレインの各音波パルスまたはクリックは、周波数約１０ｋＨｚを有し得る。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、音刺激は、音圧レベル約０ｄＢ〜約８５ｄＢ、約３０ｄＢ〜約７０ｄＢ、及び／または約６０ｄＢ〜約６５ｄＢを有する。例えば、クリック・トレインの各音波パルスまたはクリックは、音圧レベル約６５ｄＢを有し得る。
【０２７４】
聴覚ガンマ刺激は、いくつかの実施形態に従って、対象のミクログリアの細胞状態の変化を誘導することが示された。いくつかの実施形態に従って、聴覚ガンマ曝露及び／または投与が対象の聴覚野におけるミクログリアの活性化を誘導するかどうかを調べるための試験を実施した。図１１４と同様の４０Ｈｚのクリック・トレイン刺激を用いた。この刺激は、クリック頻度約４０クリック／秒を有し、各クリックはトーン約１０ｋＨｚ及び約６０〜６５ｄＢで約１ミリ秒の持続時間を有する。このクリック・トレイン刺激は、聴覚野におけるＰＶ＋介在ニューロンに同調し、それにより、聴覚野でガンマ振動を外因的に調節すると仮定された。
【０２７５】
図１１５は、本試験を示す流れ図である。図１１５では、ＷＴマウスをそれらのホームケージ１１５００に収容した。１日１時間、連続７日間（１〜７日目）、これらマウスを行動箱（すなわち、防音室）１１５０２に移動させた。行動箱１１５０２の中で、第１群のマウスを静寂に曝露し、第２群のマウスをいくつかの実施形態に従ってクリック・トレイン刺激に曝露した。行動箱１１５０２での毎時間後にマウスをそれらのホームケージ１１５００に戻した。８日目、これらマウスを組織の採取と染色１１５０４のためにサクリファイスした。
【０２７６】
この組織を、ミクログリア細胞のレベル、ミクログリア細胞の形態学的変化、及び細胞サイズで示されるミクログリア活性化について調べた。図１１６Ａは、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスと比較した、静寂（無刺激）に曝露されたマウスにおけるミクログリアの平均数を示す棒グラフである。いくつかの実施形態に従って、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスで、より多くのミクログリア細胞が認められた。図１１６Ｂは、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスと比較した、静寂（無刺激）に曝露されたマウスにおけるミクログリアの突起の長さの平均比を示す棒グラフである。ミクログリアの突起の長さの平均比は、いくつかの実施形態に従って、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスで有意に低かった。図１１６Ｃは、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスと比較した、静寂（無刺激）に曝露されたマウスにおけるミクログリアの細胞サイズの平均比を示す棒グラフである。ミクログリアの細胞サイズの平均比は、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスにおいて有意に高く、いくつかの実施形態に従うより高いミクログリアの活性化を示した。
【０２７７】
図１１７Ａは、静寂に曝露されたマウスにおけるミクログリア細胞の代表的な画像である。図１１７Ｂは、いくつかの実施形態に従って、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスにおけるミクログリア細胞の代表的な画像である。ミクログリアの突起及び細胞は、図１１７Ａといくつかの実施形態に従う１１７Ｂの間で明らかに異なる。図１１８Ａは、いくつかの実施形態に従って、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスからのミクログリア細胞の図１１７Ｂからの拡大画像である。ミクログリア細胞の１つの突起１１８００が強調表示されている。一方、図１１８Ｂは、静寂に曝露されたマウスからのミクログリア細胞の図１１７Ａからの拡大画像である。ミクログリア細胞の１つの突起１１８０２を強調表示し、いくつかの実施形態に従ってクリック・トレイン刺激に曝露されたマウスからのミクログリア細胞の比較的短い突起１１８００に対するその長さを示している。
【０２７８】
図１１９Ａは、いくつかの実施形態に従って、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスからのミクログリア細胞の図１１７Ｂからの拡大画像である。このミクログリア細胞の細胞１１９００の場所が強調表示されている。一方、図１１９Ｂは、静寂に曝露されたマウスからのミクログリア細胞の図１１７Ａからの拡大画像である。このミクログリア細胞の細胞１１９０２の場所を強調表示して、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスからのミクログリア細胞の比較的大きい細胞１１９００に対するそのサイズを示し、ひいては、いくつかの実施形態に従うより高いミクログリア活性化を示している。
【０２７９】
聴覚ガンマ刺激は、いくつかの実施形態によれば、対象においてミクログリア活性化様表現型を誘導することが示された。図１１５の試験を、いくつかの実施形態に従って、５ＸＦＡＤ  Ｔｇマウスで繰り返した。この組織を、ミクログリア細胞のレベル、ミクログリア細胞の形態学的変化（例えば、突起の長さ）、及びミクログリア活性化（例えば、細胞サイズで示される）について調べた。図１２０Ａは、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスと比較した、静寂（無刺激）に曝露されたマウスにおける画像フィールド当たりの平均ミクログリア数を示す棒グラフである。いくつかの実施形態に従ってクリック・トレイン刺激に曝露されたマウスに有意に多くのミクログリア細胞が認められた。図１２０Ｂは、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスと比較した、静寂（無刺激）に曝露されたマウスにおけるミクログリアの細胞サイズの平均比を示す棒グラフである。この細胞サイズの平均比は、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスで有意に高く、いくつかの実施形態に従って、より大きなミクログリア活性を示した。図１２０Ｃは、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスと比較した、静寂（無刺激）に曝露されたマウスにおけるミクログリアの突起の長さの平均比を示す棒グラフである。この突起の長さの平均比は、いくつかの実施形態に従ってクリック・トレイン刺激に曝露されたマウスにおいて有意に低かった。
【０２８０】
図１２１Ａは、静寂に曝露されたマウスにおけるミクログリア細胞の代表的な画像である。図１２１Ｂは、いくつかの実施形態に従ってクリック・トレイン刺激に曝露されたマウスにおけるミクログリア細胞の代表的な画像である。このミクログリアの突起及び細胞は、図１２１Ａと図１２１Ｂ間で明らかに異なり、いくつかの実施形態に従ってクリック・トレイン刺激に曝露されたマウスからのミクログリアにおいて相対的に突起の長さが短く、細胞サイズが大きい。
【０２８１】
ガンマ周波数での聴覚刺激は、対象の聴覚野及び海馬においてＡβを非侵襲的に低減する。
聴覚ガンマ刺激は、いくつかの実施形態によれば、対象のＡβのレベルを減少させることが示された。図１１５の試験を、いくつかの実施形態に従って、６か月齢の５ＸＦＡＤ  Ｔｇマウスで繰り返した。８日目、この聴覚野及び海馬を切断した。ＥＬＩＳＡを用いて、アイソフォームＡβ１−４０ペプチド及びアイソフォームＡβ１−４２ペプチドを含む可溶性及び不溶性のＡβアイソフォームのレベルを測定した。不溶性のＡβは、５ＭのグアニジンＨＣｌで３時間処理し、斑を可溶化した。
【０２８２】
聴覚ガンマ刺激は、いくつかの実施形態によれば、対象の可溶性Ａβのレベルを減少させることが示された。図１２２Ａは、いくつかの実施形態に従って、静寂（無刺激）に曝露されたマウスの聴覚野における可溶性アイソフォームＡβ１−４２ペプチドのレベルに対して、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスの聴覚野におけるはるかに小さいレベルの可溶性アイソフォームＡβ１−４２ペプチドを示す棒グラフである。
【０２８３】
図１２２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、静寂（無刺激）に曝露されたマウスの聴覚野における可溶性アイソフォームＡβ１−４０ペプチドのレベルに対して、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスの聴覚野における小さいレベルの可溶性アイソフォームＡβ１−４０ペプチドを示す棒グラフである。
【０２８４】
図１２２Ｃは、いくつかの実施形態に従って、静寂（無刺激）に曝露されたマウスの海馬における可溶性アイソフォームＡβ１−４２ペプチドのレベルに対して、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスの海馬におけるはるかに小さいレベルの可溶性アイソフォームＡβ１−４２ペプチドを示す棒グラフである。
【０２８５】
図１２２Ｄは、いくつかの実施形態に従って、静寂（無刺激）に曝露されたマウスの海馬における可溶性アイソフォームＡβ１−４０ペプチドのレベルに対して、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスの海馬における小さいレベルの可溶性アイソフォームＡβ１−４０ペプチドを示す棒グラフである。
【０２８６】
聴覚ガンマ刺激は、いくつかの実施形態によれば、対象の不溶性Ａβのレベルを減少させることが示された。図１２３Ａは、いくつかの実施形態に従って、静寂（無刺激）に曝露されたマウスの聴覚野における不溶性アイソフォームＡβ１−４２ペプチドのレベルに対して、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスの聴覚野におけるはるかに小さいレベルの不溶性アイソフォームＡβ１−４２ペプチドを示す棒グラフである。
【０２８７】
図１２３Ｂは、いくつかの実施形態に従って、静寂（無刺激）に曝露されたマウスの聴覚野における不溶性アイソフォームＡβ１−４０ペプチドのレベルに対して、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスの聴覚野における小さいレベルの不溶性アイソフォームＡβ１−４０ペプチドを示す棒グラフである。
【０２８８】
図１２３Ｃは、いくつかの実施形態に従って、静寂（無刺激）に曝露されたマウスの海馬における不溶性アイソフォームＡβ１−４２ペプチドのレベルに対して、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスの海馬におけるはるかに小さいレベルの不溶性アイソフォームＡβ１−４２ペプチドを示す棒グラフである。
【０２８９】
図１２３Ｄは、いくつかの実施形態に従って、静寂（無刺激）に曝露されたマウスの海馬における不溶性アイソフォームＡβ１−４０ペプチドのレベルに対して、クリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスの海馬における小さいレベルの不溶性アイソフォームＡβ１−４０ペプチドを示す棒グラフである。
【０２９０】
図１２４Ａは、いくつかの実施形態に従って、クリック・トレイン刺激に曝露された５ＸＦＡＤマウスにおけるミクログリア細胞の代表的な画像である。図１２４Ｂは、静寂に曝露された５ＸＦＡＤマウスにおけるミクログリア細胞の代表的な画像である。このミクログリアの突起及び細胞は、図１２４Ａと図１２４Ｂ間で明らかに異なり、いくつかの実施形態に従ってクリック・トレイン刺激に曝露された５ＸＦＡＤマウスからのミクログリアにおいて相対的に突起の長さが短く、細胞サイズが大きい。
【０２９１】
図１２４Ｃは、静寂に曝露されたＷＴマウスにおけるミクログリア細胞の代表的な画像である。図１２４Ｄは、いくつかの実施形態に従ってクリック・トレイン刺激に曝露されたＷＴマウスにおけるミクログリア細胞の代表的な画像である。このミクログリアの突起及び細胞は、図１２４Ｃと図１２４Ｄ間で明らかに異なり、いくつかの実施形態に従ってクリック・トレイン刺激に曝露されたＷＴマウスからのミクログリアにおいて相対的に突起の長さが短く、細胞サイズが大きい。
【０２９２】
従って、いくつかの実施形態によれば、ガンマ周波数での非侵襲的な聴覚刺激は、聴覚野及び海馬におけるガンマ振動ならびにＡＤ関連病変の顕著な減少を促進した。
【０２９３】
ガンマ周波数での聴覚刺激は、対象の行動に好ましい影響を与えた。
聴覚ガンマ刺激は、いくつかの実施形態によれば、対象の認識を改善することが示された。図１２５Ａは、いくつかの実施形態に従ってクリック・トレイン刺激に曝露された５ＸＦＡＤマウス及び静寂に曝露された５ＸＦＡＤマウスを用いて実施された新奇物体認識試験を示す流れ図である。この試験は、げっ歯類が慣れ親しんだ物体よりも新奇物体を探索するのにより多くの時間を費やす傾向に基づいて、対象が慣れ親しんだ物体から新奇物体を認識する能力（すなわち、認識記憶）を評価する。認識指数ＲＩを用いて対象を比較した：
2019502429.tif 000014
【０２９４】
図１２５Ａでは、５ＸＦＡＤマウスを環境１２５００に馴化させた。時間Ｔ１で、２つの新奇物体１２５０２を導入した。その後時間Ｔ２で、１時間の休息後、これらマウスを１つの慣れ親しんだ物体及び１つの新奇物体１２５０４、１２５０６に１時間曝露した。図１２５Ｂは、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスがより高いＲＩを有していた新奇物体認識試験の結果を示す棒グラフであり、いくつかの実施形態に従って、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスが、より良好な認識記憶のために慣れ親しんだ物体より新奇物体で長い時間を費やしたことを示している。
【０２９５】
聴覚ガンマ刺激は、いくつかの実施形態によれば、対象の識別を改善することが示された。図１２６Ａは、いくつかの実施形態に従ってクリック・トレイン刺激に曝露された５ＸＦＡＤマウス及び静寂に曝露された５ＸＦＡＤマウスを用いて実施された新奇位置認識試験を示す流れ図である。この試験は、げっ歯類が新奇に位置した物体を探索するのにより多くの時間を費やす傾向に基づいて、空間記憶及び／または識別を評価する。認識指数ＲＩを用いて対象を比較した：
2019502429.tif 000015
【０２９６】
図１２６Ａでは、５ＸＦＡＤマウスを環境１２６００に馴化させた。時間Ｔ１で、２つの物体を第一の位置１２６０２に導入した。その後時間Ｔ２で、１時間の休息後、これらマウスをこれら物体のうちの１つをその最初の位置で、及び他の物体を新奇の第二の位置１２６０４、１２６０６で１時間曝露した。図１２６Ｂは、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスがより高いＲＩを有していた新奇位置認識試験の結果を示す棒グラフであり、いくつかの実施形態に従って、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスが、より良好な空間記憶及び／または識別のために同じ位置にとどまった物体より移動した物体で長い時間を費やしたことを示している。
【０２９７】
聴覚ガンマ刺激は、いくつかの実施形態によれば、対象の空間記憶を改善することが示された。Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験を、いくつかの実施形態に従ってクリック・トレイン刺激に曝露された５ＸＦＡＤマウス及び静寂に曝露された５ＸＦＡＤマウスを用いて実施した。上述したように、この試験は、オープン・スイミング・アリーナの周囲の開始位置から航行し、水没した逃避台の位置を見つけるための対象が用いる遠位の手がかりに基づいて、空間及び／または参照記憶を評価する。この試験は、反復試行を経て評価し、空間及び／または参照記憶は、台が存在しない場合の台の場所に対する優先傾向によって判定した。
【０２９８】
図１２７Ａは、いくつかの実施形態に従って、各日の静寂（無刺激）に曝露されたマウス及びクリック・トレイン刺激（刺激）に曝露されたマウスが台を見つけるまでの平均時間を示すプロットである。図１２７Ｂは、台が除去されたプローブ試験の結果を示す棒グラフである。クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスは、目標象限において見当たらない台を探すのに、静寂に曝露されたマウスよりも多くの時間を費やし、ひいては、いくつかの実施形態に従って、クリック・トレイン刺激に曝露されたマウスが、より良好な空間及び／または参照記憶を有することを示した。
【０２９９】
従って、いくつかの実施形態によれば、ガンマ周波数での非侵襲的な聴覚刺激は、ミクログリアの活性化を誘導し、ＡＤ関連（例えば、Ａβ）病変を低減し、認知障害（例えば、認識、識別、及び空間記憶における）を有意に軽減した。簡単で利用しやすい投与の選択肢（自己投与を含む）のため、聴覚ガンマ刺激には、家庭用または携帯用（例えば、雑音消去ヘッドホンの使用）の用途が挙げられるがこれらに限定されない広大な商業的用途の可能性がある。自己投与の可能性に加えて、臨床医及び／または研究者が、いくつかの実施形態に従って、動物モデルからヒト患者に及ぶ対象に対して刺激パラダイムを投与してもよい。臨床医及び／または研究者は、聴覚ガンマ刺激と様々な種類の監視を組み合わせることが有用であることを見出し得る。例えば、治療期間は、対象を防音室に配置することを含んでもよいし、対象に雑音消去ヘッドホンもしくは干渉を制限する別の装置を供給することを含んでもよい。該対象は、刺激の間、例えば、機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）を用いて、有益な脳状態の変化を監視され得る。
【０３００】
実験方法
動物
すべての動物実験は、比較医学部門の実験動物委員会（ｔｈｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（マサチューセッツ工科大学、マサチューセッツ州ケンブリッジ）によって承認された。成体（３か月齢）雄二重Ｔｇ  ５ＸＦＡＤ  Ｃｒｅマウスは、５ＸＦＡＤ  ＴｇマウスをＴｇ  ＰＶまたはＣＷ２プロモーター駆動Ｃｒｅ系統とかけ合わせることによって産生した。成体（５か月齢）雄及び雌ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、Ｔｏｎｅｇａｗａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（マサチューセッツ工科大学、マサチューセッツ州ケンブリッジ）から寄贈された。成体（４か月齢）雄ＴａｕＰ３０１Ｓマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手した。老齢ＷＴマウス（８か月齢、Ｃ５７Ｂｌ／６）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バーハーバー）より入手した。マウスは、３〜５の群で、標準的な１２時間の明／１２時間の暗サイクルにて飼育し、すべての実験は、明サイクルの間に実施した。餌と水は、他に記載のない限り不断に与えた。同腹仔は、実験者によって各条件にランダムに割り当てられた。実験者には、組織の処理ならびに電気生理学的記録及び分析中、動物の遺伝子型は分からなかった。分析から除外した動物はなかった。
【０３０１】
ＡＶＶベクター
血清型５のアデノ随伴ウイルス粒子は、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ノースカロライナ大学、ノースカロライナ州チャペルヒル）から入手した。このＡＡＶ５ウイルスは、ＥＦ１αプロモーターによって駆動される高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）に融合された二重ｆｌｏｘｅｄ、逆方向オープン・リーディング・フレーム（ＤＩＯ）内のＣｈＲ２を含んでいた（例えば、図９参照）。ＡＡＶ  ＤＩＯ  ＥＹＦＰ構築物は対照として用いた。
【０３０２】
外科処置
３か月齢の５ＸＦＡＤ／ＰＶ−ＣｒｅまたはＣＷ２マウスは、ケタミン（１．１ｍｇ  ｋｇ−１）及びキシラジン（０．１６ｍｇ  ｋｇ−１）の混合物の腹腔内注射で麻酔した。２．０ｍｍ後葉から泉門点まで及び１．８ｍｍ側葉から正中まで左側に小開頭を行った。ウイルスは、硬膜の小切開を介して、Ｑｕｉｎｔｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（商標）（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．、イリノイ州ウッドデールより入手可能）に取り付けられたガラス製マイクロピペットで供給した。このガラス製マイクロピペットを脳表面の下１．２ｍｍまで下ろした。ウイルス（ＡＡＶ  ＤＩＯ  ＣｈＲ２−ＥＹＦＰまたはＡＡＶ  ＤＩＯ  ＥＹＦＰ、１ｍｌ当たり２Ｘ１０１２ウイルス分子）１μｌのボーラスを、海馬のＣＡ１領域に０．０７５μｌ分−１で注射した。ピペットは、注射後５分間その場に残し、その後脳から後退させた。片側光ファイバーインプラント（コア径３００μｍ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ニュートンより入手可能）をほぼ注射部位の脳表面の下０．９ｍｍまで下ろした。手術部位の前縁及び後縁に固定した２つの小ネジを歯科用の接着剤で固着し、このインプラントを定位置に固定した。電気生理学的記録については、成体（３か月齢）雄５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅ二重トランスジェニックマウス及び５ＸＦＡＤ陰性同腹仔（ＣＡ１記録用）、または５ＸＦＡＤ及びそのＷＴ同腹仔（視覚野記録用）マウスをイソフルランで麻酔し、定位フレームに入れた。頭皮を剃毛し、眼軟膏（例えば、Ｐｕｒａｌｕｂｅ（登録商標）Ｖｅｔ軟膏（Ｄｅｃｈｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＰＬＣ、英国ノースウィッチ））を目に塗り、Ｂｅｔａｄｉｎｅ（登録商標）消毒剤（Ｐｕｒｄｕｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌ．Ｐ．、コネチカット州スタンフォードより入手可能）及び７０％エタノールを用いて手術領域を消毒した。ＣＡ１の記録については、開頭（ｍｍ単位で、泉門点から：−２Ａ／Ｐ、１．８Ｍ／Ｌ）を行い、ウイルス１μＬをＣＡ１に供給した（上述の通り）。ＬＦＰ記録のための標的開頭部位は、頭蓋骨上にマークし（ｍｍ単位で、泉門点から：ＣＡ１については−３．２３Ａ／Ｐ、０．９８Ｍ／Ｌ及び視覚野については２．８Ａ／Ｐ、２．５Ｍ／Ｌ）、３つのセルフタッピングネジ（例えば、Ｆ０００ＣＥ０９４、Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｃｒｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｔｓ、マサチューセッツ州サウスブリッジより入手可能）をこの頭蓋骨に取り付け、カスタムステンレス鋼ヘッドプレートを歯科用セメント（例えば、Ｃ＆Ｂ  Ｍｅｔａｂｏｎｄ（登録商標）、Ｐａｒｋｅｌｌ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州エッジウッドより入手可能）を用いて取り付けた。第一の記録期間の日に、歯科用ドリルを用い、第一に頭蓋骨を厚さ約１００μｍまで薄くし、その後３０ゲージの針を用いて小開口を作ることによってＬＦＰ開頭術（例えば、３００〜４００μｍ径）を行った。この開頭は、その後、滅菌シリコーンエラストマー（例えば、Ｋｗｉｋ−Ｓｉｌ（商標）接着剤、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、フロリダ州サラソータより入手可能）で、その日の記録まで、及び記録期間の間、密封した。
【０３０３】
光遺伝学的刺激プロトコル
マウスが回復し、電気生理学用の動物用の行動訓練を受けるための、及びウイルスがニューロンで発現するための時間を与える、ウイルス注射及びインプラント設置の２〜４週間後に、海馬ＣＡ１ニューロンを光遺伝学的に操作した。２００ｍＷの４７９３ｎｍ  ＤＰＳＳレーザを、各端にファイバー・チャンネル／身体的接触コネクタを備えたパッチ・コードに接続した。実験中、１ｍＷ（ファイバーの端部から測定）の光刺激を１時間送った。分子及び生化学的分析用に、各動物は、３つの刺激プロトコル、すなわち、８Ｈｚ、４０Ｈｚ、もしくはランダム刺激（光パルスは、平均周波数４０Ｈｚで、ポアソン過程により決定されたランダムな間隔で送った）のうちの１つを受けたか、または、電気生理学的記録については、各動物は、記録中、交互配置されたすべての刺激条件を受けた。
【０３０４】
視覚刺激プロトコル
実験の１５分前、５ＸＦＡＤマウスを生理食塩水（対照）またはピクロトキシン（０．１８ｍｇ／ｋｇ）で処理した。分子及び生化学的分析用に、その後マウスを、ＬＥＤ電球によって照らされる暗室に入れ、５つの刺激条件、すなわち、暗、明、２０Ｈｚの点滅、４０Ｈｚの点滅、または８０Ｈｚの点滅（１２．５ミリ秒の光オン、１２．５ミリ秒の光オフ）１時間（例えば、図４３Ａ参照）のうちの１つに曝露した。電気生理学的記録については、各動物は、記録中、１０秒のブロックで交互配置された、暗、明、４０Ｈｚの点滅、またはランダム（光パルスは、平均間隔４０Ｈｚで、ポアソン過程により決定されたランダムな間隔で送った）刺激条件を受けた。
【０３０５】
電気生理学用の行動訓練及び仮想現実環境（ＶＲ）
ＣＡ１の記録については、Ｈａｒｖｅｙらに記載の通り、頭部を固定した動物を、エアクッションで支えられた８インチの球状トレッドミル上を仮想現実環境で走らせた。球状トレッドミルの動きは、光学式マウスで測定し、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）コンピュータ環境（ソフトウェアバージョン２０１３ｂ、ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、マサチューセッツ州ナティックより入手可能）で実行中の仮想現実ソフトウェアに送った。この仮想環境は、直線トラックと、動物が向きを変えることができる端部の２つの小さな囲いからなる。動物は、トラックの各端への交互の訪問に対して、トラックの各端で、加糖練乳（１：２に水で希釈）の報酬を得た。動物は、約１週間以上、この仮想直線トラック上を走行することを学習した。これらの動物を１週間おいて手術から回復させ、１〜２日間ハンドリングに馴らし、その後行動訓練を開始した。トレッドミルを操ること、及び試験環境に慣れることを学習するように、訓練の最初の２日間、動物は、仮想現実システムをオフにして球状トレッドミル上に置かれ、希釈されていない加糖練乳の報酬を得た。球状トレッドミル上での訓練の２日目に、動物の餌を制限し、走るための動機づけをした。動物を、その基準体重のせいぜい８５％に制限し、通常はその基準体重の８８％を超えた。３日目から訓練の終わりまで（通常５〜７日）、動物を、時間を延長しつつ（３０分〜２時間）トレッドミル上に置き、ＶＲ直線トラックを走行させた。動物は、トラックの長さを横断した後、直線トラックの端で希釈（１：２）加糖練乳の報酬を得た。記録期間の間、動物は、行動能力を維持するために再訓練期間を与えられた。視覚野の記録については、動物に球状トレッドミル上を走行させ、その間に暗、明、または光の点滅条件（以下のデータ収集に記載）に曝露した。記録に先立って、動物は、球状トレッドミル上に置かれ（仮想現実システムをオフにして）、希釈されていない加糖練乳の報酬を得ることで、トレッドミルを操ること及び試験環境に慣れることを学習した。
【０３０６】
電気生理学データ収集
記録中のＣＡ１の光遺伝学的刺激については、３００μｍコアの光ファイバーを、ＣＡ１へウイルスを供給するために用いた開頭を介して脳内に９００μｍの深さまで進めた。１ミリ秒及び１ｍＷ（ファイバーの端部から測定）の光パルスを４７３ｎｍのＤＰＳＳ（ダイオード励起固体）レーザを介して供給した（上述の通り）。光電アーチファクトを避けるため、神経活動はガラス電極で記録した。ＬＦＰ電極は、ホウケイ酸ガラス製ピペット（例えば、Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、コネチカット州ハムデンより入手可能）から、フィラメント系のマイクロピペットプラー（例えば、Ｐ−９７  Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎ（商標）マイクロピペットプラー、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、カリフォルニア州ナバトより入手可能）にて引き延ばして微細な先端にし、これを次に手で折って直径約１０〜２０μｍに戻し、その後滅菌生理食塩水で満たした。ＣＡ１の記録については、このＬＦＰ電極を、ＬＦＰ記録用開頭を介して、前頭面に対して後方に６０度の角度及び水平面に対して下側４５度で、海馬層の錐体層の明確な電気生理学的サイン（動物の走行中、約６００〜１０００μＶのシータ波、不動状態では明らかに区別できるＳＷＲ、１５０μＶを超える複数のスパイク、例えば、図２Ａ〜２Ｂ参照）が認められるまで進めた。視覚野の記録については、ＬＦＰ電極は、ＬＦＰ記録用開頭を介して垂直に６００〜９００μｍの深さまで進め、１５０μＶを超える複数のスパイクが認められた。データは、サンプリングレート２０ｋＨｚ及びバンドパスフィルター１Ｈｚ〜１ｋＨｚで収集した。動物は、長期にわたって球状トレッドミル上を走行させたか、または休息させた。光遺伝学的刺激期間については、いずれかの刺激の開始前３０分間データを記録した。その後、刺激をガンマ（４０Ｈｚ）、ランダム（光遺伝学的刺激で記載）、またはシータ（８Ｈｚ）の周波数で１０秒間の周期を１０秒間のベースライン周期（無刺激）と交互配置して供給した。２匹の動物において、各タイプの刺激またはベースラインを１０秒周期の代わりに５分周期で供給した。各３０分間の刺激の記録の後、５〜３０分間の無刺激の記録を行った。視覚の光の点滅刺激期間については、１０秒間の光オフの周期を交互配置して、動物ライト周囲のＬＥＤストリップライトをガンマ（４０Ｈｚ）、ランダム（視覚刺激プロトコルに上述）、シータ（８Ｈｚ）、または２０Ｈｚの周波数で１０秒間の周期で点滅させたか、または、１０秒間の連続オンの周期であった。光の点滅の間、脳表面の上でいくつかの記録を行い、記録中にこれらのライトが電気的または光電ノイズを生成しないことを保証した。記録期間は、約３〜５時間後に終了させた。動物は、記録時、３〜４か月齢であった。電気生理学的記録の分析
【０３０７】
スパイク検出
スパイクは、３００〜６０００Ｈｚのバンドパスシグナルを閾値化することによって検出した。閾値は、スパイクによる標準偏差測定のコンタミネーションをさけるため、フィルターにかけられたシグナルの中央値プラスフィルターにかけられたシグナルの標準偏差のロバスト推定量の５倍（中央値／０．６７５）であった（例えば、Ｒｏｓｓａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｐｉｋｅ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｌａｒｇｅ，Ｄｅｎｓｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  Ａｒｒａｙｓ，”ｂｉｏＲｘｉｖ  ｄｏｉ：ｄｘ＿ｄｏｉ＿ｏｒｇ＿１０．１１０１＿０１５１９８（Ｆｅｂ．１６，２０１５）参照）。
【０３０８】
局所電場電位（ＬＦＰ）
記録されたトレースを、２ｋＨｚに低解像度処理し、１〜３００Ｈｚ間でバンドパスフィルターにかけた。
【０３０９】
シータ及びＳＷＲ検出
動物が走行や静止をすると、海馬のネットワークを通じた活動は顕著に変化し、これらの変化はしばしば異なるネットワーク状態と呼ばれる。これらのネットワーク状態は、異なる周波数帯域におけるＬＦＰ振動の有無によって明らかに区別できる。動物が走行した際、他が示したように、ＣＡ１において大きなシータ（４〜１２Ｈｚ）振動が認められた（例えば、図２Ａ参照）。動物が静止した際、シータ振動はもはや見られず、ＳＷＲ、すなわち、約５０〜１００ミリ秒続き、集団的活動のバーストと関連する１５０〜２５０Ｈｚの高周波振動（例えば、図２Ｂ参照）が記録された。ＳＷＲは、フィルターにかけられたトレースのエンベロープ振幅が、少なくとも１５ミリ秒に対する平均の上側４標準偏差を超えた時に検出された（例えば、図４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ｂ、及び８参照）。エンベロープ振幅は、フィルターにかけられたＬＦＰのヒルベルト変換の絶対値を取って計算した。本明細書に開示の結果は、ＳＷＲ検出のため、より高閾値、すなわち、より大きなＳＷＲを検出する、平均の上側６標準偏差を用いた場合に有効であることが確認されている（例えば、図６Ｃ及び７Ｃ参照）。シータを検出するため（例えば、図３Ａ及び３Ｃ参照）、ＦＩＲ等リップルフィルターを用いて、ＬＦＰをシータ（４〜１２Ｈｚ）、デルタ（１〜４Ｈｚ）、及びベータ（１２〜３０Ｈｚ）についてバンドパスフィルターにかけた。デルタ及びベータに対するシータの比（「シータ比」）を、デルタ及びベータエンベロープ振幅の合計で除したシータエンベロープ振幅として計算した。シータ周期は、シータ比が少なくとも２秒間平均の上側１標準偏差を超え、この比が平均の上側少なくとも２標準偏差のピークに達した場合にそのように分類した。非シータ周期は、このシータ比が少なくとも２秒間１未満の場合にそのように分類した。ＳＷＲ、シータ周期、及び非シータ周期を視覚的に検査し、これらの基準がそれぞれ、ＳＷＲ、シータ周期、及び非シータ周期を正確に検出することを確認した。
【０３１０】
パワースペクトル
スペクトル解析は、マルチテーパ法を用いて実施した（例えば、Ｍｉｔｒａ  Ｌａｂ  ｉｎ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーより入手可能のＣｈｒｏｎｕｘのオープンソースソフトウェア、時間帯域幅積＝３、テーパ数＝５）。刺激なしのパワースペクトルを調べるため（例えば、図３Ａ及び３Ｃ参照）、シータ周期のみを含めた。５秒の長さを超えるシータ周期を５秒の試験に分割し、平均パワースペクトル密度をこれらの試験にわたって各動物について計算した。光遺伝学的刺激（例えば、図１３Ａ及び６Ｃ参照）及び視覚刺激（例えば、図４３Ｂ及び４３Ｃ参照）中にパワースペクトルを調べるため、データは、各刺激条件またはベースライン周期の１０秒試験に分割し、平均パワースペクトル密度をこれら試験にわたって各動物について計算した。
【０３１１】
ＳＷＲ中のガンマ
スペクトログラムは、マルチテーパ法を用いて計算した（例えば、Ｍｉｔｒａ  Ｌａｂ  ｉｎ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーより入手可能のＣｈｒｏｎｕｘのオープンソースソフトウェア）。スペクトログラムは、ＳＷＲのピークの前後４００ミリ秒の期間を含む各ＳＷＲについて計算した。その後、ｚスコアのスペクトログラムは、全記録期間にわたって計算したスペクトログラムの平均及び標準偏差を用いて各周波数帯域で計算し、標準偏差の単位でパワーの正規化された尺度を生成した（例えば、図４Ａ、４Ｂ、５Ａ、及び５Ｂ参照）。ＳＷＲ中のガンマ振動の瞬時周波数は、ＬＦＰを１０〜５０Ｈｚに対してバンドパスフィルターにかけ、ヒルベルト変換をし、その後変換されたシグナルのピークの差の逆数をとって計算した（例えば、図４Ａ、５Ａ、及び６Ｂ参照）。ＳＷＲの前、最中、及び後のガンマパワーは、ＬＦＰを低ガンマ（２０〜５０Ｈｚ）に対してフィルターにかけ、ヒルベルト変換のエンベロープ振幅を取ることで計算し、ＳＷＲピークを中心とした１００ミリ秒のビンにおける平均ガンマパワーを得た。これは、全記録期間についてのエンベロープ振幅の平均及び標準偏差によって正規化し、各ＳＷＲの周囲の各ビンについてのｚスコアのガンマパワーを得た（例えば、図６Ａ及び７Ｂ参照）。ＳＷＲ中のガンマによる位相変調は、ＬＦＰをガンマ（２０〜５０Ｈｚ）に対してバンドパスフィルターにかけ、ヒルベルト変換をし、ＳＷＲ中に生じた各スパイクに対して得られたシグナルの位相を決定することによって計算した（例えば、図７Ｅ参照）。５ＸＦＡＤ及びＷＴ動物間で位相変調の差を測定するため、復元再抽出を用いた。すなわち、各記録から１００スパイクのサブセットをランダムに選択して位相変調分布を作成し、これを各記録について５００回繰り返した（例えば、図６Ｃ及び７Ａ参照）。変調の深さは、その後、各分布に対するピークとトラフの和で除したピークとトラフの差を計算することによって、スパイク−ガンマ位相分布を測定した（例えば、図６Ｃ及び７Ａ参照）。刺激中の発火の差：刺激によって誘発されたマルチユニット発火ヒストグラムをプロットするため、パルスの各光の開始後１００ミリ秒について、スパイクを２．５ミリ秒のビンにし、各ビンにおけるスパイクの割合を計算した。平均及びＳＥＭをその後周期のすべての光にわたって計算した。条件間のマルチユニット発火率の差を計算するため、発火率を各１０秒間の刺激またはベースライン周期について計算した（周期の期間で除した合計スパイク数）。発火率の差は、関連のあるタイプの刺激の隣接する周期間で取った（光遺伝学的刺激についてはガンマ刺激周期マイナスベースラインまたはランダム周期の発火率、光の点滅刺激については、ガンマ刺激周期マイナスベースライン、連続オン、またはランダム周期の発火率）。すべての動物からの差をヒストグラムにプロットし（例えば、図１４Ａ及び４４Ａ参照）、動物当たりの差の中央値及び四分位数を箱ひげ図にプロットした（例えば、図１３Ｂ及び４４Ａ参照）。
【０３１２】
免疫組織化学
マウスは、深麻酔下で４％のパラホルムアルデヒドでかん流し、脳を４％のパラホルムアルデヒドで一夜後固定した。脳をビブラトーム（例えば、Ｌｅｉｃａ  ＶＴ１００Ｓ、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、イリノイ州バッファローグローブより入手可能）を用いて４０μｍで切片にした。切片を、室温で１時間、０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０％の正常ロバ血清を含むＰＢＳで透過処理及びブロックした。切片を一次抗体のＰＢＳ溶液中、４℃で０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０％正常ロバ血清とともに一夜インキュベートした。一次抗体は、抗ＥＥＡ１（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（商標）ＥＥＡ１（６４１０５７）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼより入手可能）、抗βアミロイド（例えば、βアミロイド（Ｄ５４Ｄ２）ＸＰ（登録商標）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州ダンバーズより入手可能）、抗Ｉｂａ１（例えば、０１９−１９７４１、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、バージニア州リッチモンドより入手可能）、抗パルブアルブミン（例えば、ａｂ３２８９５、Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジより入手可能）、抗Ｒａｂ５（ＡＤＩ−ＫＡｐ−ＧＰ００６−Ｅ、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ファーミンデールより入手可能）であった。ＥＬＩＳＡ実験を確認するため、ＥＥＡ１との同時標識を可能にすることから抗Ａβ抗体Ｄ５４Ｄ２を用い、ＡＰＰと反応せず、この標識がＡβに特異的かどうかについての判断を可能にすることから、抗Ａβ抗体１２Ｆ４を用いた。同時標識実験については、抗Ａβ抗体１２Ｆ４（８０５５０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴより入手可能）を用いた。一次抗体は、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８及びＡｌｅｘ−Ｆｌｕｏｒ  ６４７二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（９４４０３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイスより入手可能）でのニューロン核で可視化した。画像は、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ７１０、Ｚｅｉｓｓ（商標））を用い、すべての条件に対して同一の設定で取得した。画像は、ＩｍａｇｅＪ  １．４２ｑを用い、処理群が分からない実験者が定量化した。各実験条件に対して、少なくとも３匹の動物から少なくとも２つの冠状断面を定量化に用いた。海馬ＣＡ１画像化については、十分な細胞数を画像化するのに全視野が必要なＩｂａ１＋細胞分析の場合を除いて、この分析を錐体細胞層に限定した。ＩｍａｇｅＪを用いて、Ｉｂａ１＋細胞体の直径を測定し、長さ測定の過程をトレースした。さらに、Ｃｏｌｏｃ２プラグインを用いて、Ｉｂａ１及びＡβの共局在化を測定した。３−Ｄレンダリング用にＩｍａｒｉｓ  ｘ６４  ８．１．２（Ｂｉｔｐｌａｎｅ、英国ベルファストより入手可能）を用いた。「斑数」の計数に関しては、１０μｍ以上の沈着物を含めた。
【０３１３】
ＣＬＡＲＩＴＹ
固定した脳を１ＸＰＢＳ中、ビブラトーム（例えば、Ｌｅｉｃａ  ＶＴ１００Ｓ、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、イリノイ州バッファローグローブより入手可能）で１００ｕＭの冠状断面にスライスした。Ａｌｌｅｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓを参照して視覚野を含む切片を選択し、清澄用緩衝液（ｐＨ８．５〜９．０、ドデシル硫酸ナトリウム２００ｍＭ、水酸化リチウム一水和物２０ｍＭ、ホウ酸４ｍＭのｄｄＨ２Ｏ溶液）中、５５℃で振盪しながら２時間インキュベートした。清澄切片を１ＸＰＢＳＴ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１ＸＰＢＳ）で３×１０分間洗浄し、ブロッキング用溶液（２％ウシ血清アルブミン／１ＸＰＢＳＴ）に入れ、室温で一夜振盪した。次に、１ＸＰＢＳＴ中で、室温にて振盪しながら１時間の洗浄を３回実施した。切片をその後、１：１００に１ＸＰＢＳＴで希釈した抗βアミロイド（８０５５０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴより入手可能）及び抗Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、バージニア州リッチモンド、０１９−１９７４１）一次抗体とともに振盪しながら４℃で２時間インキュベートした。さらに３×１時間の洗浄を１ＸＰＢＳＴ中で実施した後、切片を、１：１００に１ＸＰＢＳで希釈した二次抗体混合物中、室温にて振盪しながら９時間インキュベートした。断片化ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ａｂ１７５６９４）及び抗マウス５６８（ａｂ１５０１０１）二次抗体（いずれもＡｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジより入手可能）を用いて一次抗体標識を可視化した。このインキュベート期間の途中で、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、９４４０３）を各試料中に最終希釈１：２５０でスパイクした。切片をその後室温で振盪しながら１ｘＰＢＳ中で一夜洗浄した。画像化用にマウントする前に、スライスを、室温で振盪しながら、１時間、ＲＩＭＳ（屈折率整合溶液：Ｈｉｓｔｏｄｅｎｚ７５ｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液２０ｍＬ、ｄｄＨ２Ｏ  ６０ｍＬ）中でインキュベートした。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ペンシルベニア州ハットフィールド）を用い、カバースリップ（例えば、ＶｉｓｔａＶｉｓｉｏｎ（商標）、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＬＬＣ、ペンシルベニア州ラドナーより入手可能）とともに組織切片を顕微鏡のスライドにマウントした。画像を、Ｚｅｎ  Ｂｌａｃｋ  ２．１ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ドイツ、イエナ）付随のＺｅｉｓｓ（商標）ＬＳＭ  ８８０顕微鏡で取得した。３−Ｄ復元に用いる断面の概観及び細胞レベルの画像をＰｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ６３ｘ／１．４  Ｏｉｌ  ＤＩＣ対物レンズを用いて撮影した。Ｉｍａｒｉｓｘ６４  ８．１．２（Ｂｉｔｐｌａｎｅ（商標）（スイス、チューリヒ））を３−Ｄレンダリング及び分析に用いた。
【０３１４】
ウェスタンブロット
海馬ＣＡ１全細胞溶解物は、３か月齢の雄５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅマウスの組織を用いて調製した。組織を手動式ホモジナイザー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス））を用いて１ｍｌのＲＩＰＡ（Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｎｐ−４０  １％、デオキシコール酸ナトリウム０．５％、ＳＤＳ０．１％）緩衝液中でホモジナイズし、氷上で１５分間インキュベートし、４℃で３０分間回転させた。１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により細胞残屑を単離し廃棄した。溶解物を、ナノドロップを用いて定量化し、２５μｇのタンパク質を１０％アクリルアミドゲルにロードした。１００Ｖで１２０分間、タンパク質をアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサムより入手可能）に移した。ＴＢＳ：Ｔｗｅｅｎで希釈したウシ血清アルブミン（５％ｗ／ｖ）を用いて膜をブロックした。膜を一次抗体中、４℃で一夜、及び二次抗体中、室温で９０分間インキュベートした。一次抗体は、抗ＡＰＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＰＡＤ  ＣＴ６９５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサムより入手可能）、抗ＡＰＰ（Ａ８９６７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイスより入手可能）、抗βアクチン（ａｂ９４８５、Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジより入手可能）であった。二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、マサチューセッツ州モールバラより入手可能）であった。シグナル強度は、ＩｍａｇｅＪ  １．４６ａを用いて定量化し、βアクチンの値に対して正規化した。タウタンパク質の溶解性は、順次タンパク質抽出を用いて調べた。界面活性剤不溶性タウ画分は、Ｔａｕ５に対する抗体（例えば、ＡＨＢ００４２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサムより入手可能）を用いてプローブした。
【０３１５】
ＥＬＩＳＡ
海馬ＣＡ１またはＶＣを雄のマウスから単離し、ＰＢＳまたは５ＭのグアニジンＨＣｌで溶解し、マウス／ヒトＡβ１−４０またはＡβ１−４２ＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサムより入手可能）を用い、製造業者の取扱説明書に従ってＡβ測定に供した。組織はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で溶解し、ＰＢＳ可溶性Ａβ画分を抽出した。この可溶性Ａβ画分は、恐らくモノマー及びオリゴマーのＡβを含んでいた。組織をさらにグアニジン塩酸（ＨＣｌ）で処理し、不溶性Ａβ画分を抽出した。
【０３１６】
ゲノムワイドＲＮＡシークエンシング
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデンより入手可能）を用いて、海馬ＣＡ１単離物から全ＲＮＡを抽出した。ＢＩＯＯ  ＮＥＸＴｆｌｅｘ（商標）キット（ＢＩＯＯ番号５１３８−０８）を製造業者の取扱説明書の通りに用いるＲＮＡ−ｓｅｑライブラリの調製用に、精製ｍＲＮＡを用いた。簡潔には、全ｍＲＮＡ１μｇを、ポリＡ精製、断片化、第一のフレックスストランド及び第二のストランド合成、ＤＮＡ末端アデニル化、ならびにアダプターライゲーションの連続ワークフローに供した。これらライブラリは、１５サイクルのＰＣＲ反応により濃縮し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、マサチューセッツ州ダンバーズより入手可能）で洗浄した。ライブラリの品質は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ−ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて評価した。バーコード化されたライブラリは、ＭＩＴ  ＢｉｏＭｉｃｒｏ  Ｃｅｎｔｅｒ（マサチューセッツ工科大学、マサチューセッツ州ケンブリッジ）にて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００プラットフォームの単一のレーンにおけるシークエンシングのため、均等に混合した。５０塩基対シングルエンドシークエンシングリードの生ｆａｓｔｑデータを、ＴｏｐＨａｔ２．０ソフトウェア（ジョンズ／ホプキンス大学、メリーランド州ボルチモアの計算生物学センターより入手可能、ＲＮＡ−ｓｅｑリードを哺乳類サイズのゲノムに対して、超高スループットショートリードアライナＢｏｗｔｉｅを用いて整列させ、その後マッピングの結果を分析してエクソン間のスプライス部位を特定するため）を用いてマウスｍｍ９参照ゲノムに対して整列させた。マッピングされたリードをＣｕｆｆｌｉｎｋｓ２．２ソフトウェア（ワシントン大学Ｔｒａｐｎｅｌｌ  Ｌａｂ、ワシントン州シアトルより入手可能）により、ＵＣＳＣｍｍ９参照遺伝子注釈で処理し、転写物の存在量を推定し、差次的発現を調べた。転写物の相対的存在量は、マッピングされた１００万断片当たりのエクソンのキロベース当たりの断片（ＦＰＫＭ）で測定した。処理及び未処理群間の遺伝子の差次的発現試験は、Ｃｕｆｆｄｉｆｆモジュール（転写物の発現、スプライシング、及びプロモーターの使用における有意な変化を見つけるため。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ２．２ソフトウェア（ワシントン大学Ｔｒａｐｎｅｌｌ  Ｌａｂ、ワシントン州シアトルより入手可能）の一部として含まれる）を用い、統計的有意性に対する調整ｐ値＜０．０５で実施した（ＧＥＯ登録：ＧＳＥ７７４７１）。
【０３１７】
ＲＮＡ−ｓｅｑデータから細胞及び分子機序を理解するため、１４の公開されているＲＮＡ−ｓｅｑデータセットを細胞型特異的分析用に処理した。さらに、６０の公開されている異なる化学的及び遺伝的摂動下でのニューロン、ミクログリア、ならびにマクロファージ特異的ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットをダウンロードし、ＧＳＥＡ統計分析用に、ＴｏｐＨａｔ  Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ２．２ソフトウェア（ワシントン大学Ｔｒａｐｎｅｌｌ  Ｌａｂ、ワシントン州シアトルより入手可能）を用いて処理した。遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）を用いて、ＲＮＡ−ｓｅｑデータからの定義された遺伝子セットが、特定の摂動試験からのランク付けされた遺伝子リストのいずれかの方向で有意に濃縮されるかどうかを判定した。公開されているＲＮＡ−ｓｅｑデータセットにおいて検出された遺伝子を発現比（症例対対照）のｌｏｇ２値によって正から負の値にランク付けした。定義された遺伝子セット（この場合、ガンマ処理での上方または下方制御された遺伝子）は、名目上のｐ値及びＦＤＲのｑ値がいずれも０．０５未満の場合、摂動に誘導されたトランスクリプトーム的変化（上方または下方制御のいずれか）と有意に相関すると考えられた。計算された正規化エンリッチメントスコア（ＮＥＳ）の符号は、遺伝子セットがランク付けされたリストの上位または下位で濃縮されるかどうかを示す。差次的に発現される遺伝子のヒートマップは、カスタムＲスクリプトを用いて生成し、各遺伝子に対するすべてのライブラリににわたるｚスコア値を、遺伝子ＦＰＫＭ値を基に計算した。細胞型特異性分析に対する箱ひげ図もまた、遺伝子ＦＰＫＭ値を基にＲプログラムによって生成した。
【０３１８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＣＡ１は、３か月齢の雄５ＸＦＡＤ／ＰＶ−Ｃｒｅマウスの海馬から単離した。液体窒素を用いて組織を急速に凍結し、−８０℃で保存し、製造業者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ（ドイツ、ヒルデン））に従ってＲＮｅａｓｙキットを用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ（３μｇ）をＤＮａｓｅ  Ｉで処理し（４Ｕ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州レークウッド））、ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ及びＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（カリフォルニア州アーバイン））を用い、製造業者の取扱説明書に従って精製し、１４μｌのＤＥＰＣ処理水で溶出した。各試料について、ランダムヘキサマー混合物及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（５０Ｕ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサムより入手可能）を含む２０μｌの反応体積中、５０℃で１時間、１μｇのＲＮＡを逆転写した。第一ストランドｃＤＮＡを１：１０に希釈し、１μｌを、プライマー（０．２μＭ）を含む２０μｌの反応物（ＳｓｏＦａｓｔ（商標）ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中でのＲＴ−ｑＰＣＲ増幅に用いた。遺伝子発現の相対的変化を２−ΔΔＣｔ法を用いて評価した。
【０３１９】
視覚野からのミクログリアの単離。Ｖ１領域を迅速に切断し、氷冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ（商標）１４１７５−０９５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手可能）に入れた。この組織を次に、製造業者のプロトコルにわずかな改変を加えて従い、神経組織解離キット（Ｐ）（１３０−０９２−６２８、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を用いて酵素的に消化した。具体的には、組織を３５分間の代わりに１５分間、３７℃で酵素的に消化し、得られた細胞懸濁液を、ＭＡＣＳ（登録商標）ＳｍａｒｔＳｔｒａｉｎｅｒ、７０μｍの代わりに４０μｍの細胞濾過器（３５２３４０、Ｆａｌｃｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒｓ，Ｓｔｅｒｉｌｅ、ニューヨーク州コーニング）を通した。得られた細胞懸濁液をその後アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートＣＤ１１ｂマウスクローンＭ１／７０．１５．１１．５（１３０−０９８−０８８、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）及びフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートＣＤ４５抗体（例えば、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）、５５３０８１）を用いて染色した。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を次に用いてＣＤ１１ｂ及びＣＤ４５陽性ミクログリア細胞を精製した。これらの細胞は直接１ＸＰＢＳに分取した（例えば、図５２Ａ参照）。
【０３２０】
統計
正規分布しなかった電気生理学的データについては、別段の記載がない限り、結果は中央値及び四分位数として示した。等しい中央値に対する両側ウィルコクソン順位和検定を実施し、分布が有意に異なるかどうかを判定したか、または、ウィルコクソン符号順位検定を実施し、これらが、データが正規分布していると仮定しない場合に分布がゼロから有意差があるかどうかを判定した。ばらつきは、統計的に比較された群間で同様であった。ボンフェローニの方法を用いて多重比較を補正した。分子及び生化学的結果を平均及びＳＥＭで示す。本開示に記載のパーセンテージは群平均である。すべての統計分析は、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を用いて実施した。正規性はＤ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ＆Ｐｅａｒｓｏｎオムニバス正規性検定を用いて判定した。ばらつきは、統計的に比較された群間で同様であった。２群からなる正規分布したデータに対する比較データは、両側独立ｔ検定によって分析した。３群以上からなる正規分布したデータに対する比較データは、一元配置分散分析に続いてテューキーの多重比較検定によって分析した。非正規分布データに関する比較データは、マン・ホイットニー検定を用いて行った。各実験についての統計検定、正確なＰ値、及びサンプルサイズ（ｎ）を図の凡例に明記する。分子及び生化学的分析を、条件当たり最低３回の生物学的反復を用いて実施した。
【０３２１】
聴覚ガンマ刺激生成
ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）プログラミング言語（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、マサチューセッツ州ナティックより入手可能）に構成される以下のスクリプトは、いくつかの実施形態に従って聴覚クリック・トレイン刺激を生成する１つの方法を示す：
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【０３２２】
結論
様々な発明に関する実施形態を本明細書に記載及び説明してきたが、当業者には、本明細書に記載の機能を実行し、及び／またはその結果及び／または１つ以上の利点を獲得するための様々な他の方法及び／または構造が容易に想起されるとともに、かかる変化及び／または修正の各々は、本明細書に記載の本発明の実施形態の範囲内であると見なされる。より一般的には、当業者には、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示的であることを意図し、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／または構成は、本発明の開示が用いられる特定の用途または複数の用途に依存するということが容易に理解されよう。当業者は、従来の実験だけを用いて、本明細書に記載の特定の発明に関する実施形態の多くの等価物を認識し、またはこれらを確認することができるであろう。従って、前述の実施形態が単なる例示として提示され、添付の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内で、発明に関する実施形態が、具体的に記載され、請求される以外の方法で実施され得ることを理解されたい。本開示の発明に関する実施形態は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法に関する。さらに、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法の２つ以上の組合せは、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法が互いに矛盾しない限り、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０３２３】
上記実施形態は、多くの方法のいずれかで実行することができる。例えば、本明細書に記載の実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組合せを用いて実行してもよい。ソフトウェアで実行する場合、該ソフトウェアのコードは、単一のコンピュータに設けられていようと複数のコンピュータに分配されていようと、任意の適切なプロセッサまたは一群のプロセッサで実行することができる。
【０３２４】
さらに、コンピュータは、複数の形態のいずれか、例えば、ラックマウント型コンピュータ、デスクトップ型コンピュータ、ラップトップ型コンピュータ、またはタブレット型コンピュータで具体化され得ることを理解されたい。加えて、コンピュータは、個人用デジタル補助装置（ＰＤＡ）、スマートフォン、または任意の他の適切な携帯用もしくは固定電子デバイスを含めた一般にはコンピュータと見なされないが適切な処理能力がある装置に埋め込まれてもよい。
【０３２５】
また、コンピュータは、１つ以上の入力及び出力装置を有し得る。これらの装置を用いて、とりわけ、ユーザインタフェースを提供することができる。ユーザインタフェースを提供するために用いることができる出力装置の例としては、出力の視覚的提示用のプリンタまたは表示画面、及び出力の可聴提示用のスピーカまたは他の音声発生装置が挙げられる。ユーザインタフェースのために用いることができる入力装置の例としては、キーボード、ポインティング・デバイス、例えば、マウス、タッチパッド、及び離散化タブレットが挙げられる。別の例として、コンピュータは、入力情報を音声認識を介して、または他の可聴形式で受信してもよい。
【０３２６】
かかるコンピュータは、ローカルエリア・ネットワークまたは広域ネットワーク、例えば、企業ネットワーク、及びインテリジェント・ネットワーク（ＩＮ）またはインターネットを含めた任意の適切な形態の１つ以上のネットワークで相互接続されてもよい。かかるネットワークは、任意の適切な技術に基づいていてもよく、任意の適切なプロトコルに従って作動してもよく、無線ネットワーク、有線ネットワーク、または光ファイバー・ネットワークを含んでもよい。
【０３２７】
本明細書で概説した様々な方法またはプロセスは、様々なオペレーティング・システムまたはプラットフォームのいずれか１つを使用する１つ以上のプロセッサで実行可能なソフトウェアとしてコード化され得る。さらに、かかるソフトウェアは、複数の適切なプログラミング言語及び／またはプログラミングもしくはスクリプト作成ツールのいずれかを用いて書かれてもよく、また、フレームワークもしくは仮想計算機上で実行される、実行可能な機械語コードまたは中間コードとしてコンパイルされ得る。
【０３２８】
また、様々な発明に関する概念は、例が提供されている１つ以上の方法として具体化されてもよい。該方法の一部として実行される行為は、任意の適切な方法で順序付けられ得る。従って、行為が説明されているものと異なる順序で実行される実施形態が構成されてもよく、これは、例示的な実施形態では連続的な行為として示されていても、いくつかの行為を同時に実行することを含んでもよい。
【０３２９】
本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、参照することによりそれらの全体が組み込まれる。
【０３３０】
本明細書で定義され使用されるすべての定義は、辞書的定義、参照により組み込まれる文書における定義、及び／または定義された用語の通常の意味を制御すると理解されたい。
【０３３１】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される不定冠詞「ａ」ならびに「ａｎ」は、それと異なるように明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されたい。
【０３３２】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される「及び／または」という表現は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」を意味すること、すなわち、ある場合には接続的に存在し、他の場合には離接的に存在する要素を意味することを理解されたい。「及び／または」とともに列挙される複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」と解釈されるべきである。「及び／または」の節によって明確に同定された要素以外に、明確に同定されたそれらの要素と関連していても関連していなくても、他の要素が任意に含まれる場合がある。従って、非限定的な例として、「含む」等のオープンエンドの用語と併せて用いられた場合、「Ａ及び／またはＢ」への言及は、１つの実施形態では、Ａのみ（Ｂ以外の要素を任意に含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（Ａ以外の要素を任意に含む）、さらに別の実施形態では、ＡとＢの両方（他の要素を任意に含む）、等を指すことができる。
【０３３３】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される「または」は、上で定義した「及び／または」と同じ意味を有すると理解されたい。例えば、リスト内の項目を分離する場合、「または」もしくは「及び／または」は、包括的、すなわち、複数の要素または要素のリストの少なくとも１つであるが、同様に複数、及び任意にリストにないさらなる項目の包含として解釈されるものとする。それとは異なるように明確に示される限定用語、例えば、「１つだけの」もしくは「厳密に１つの」または、特許請求の範囲で使用される場合、「〜からなる」は、例えば、複数の要素または要素のリストのうちの厳密に１つの要素の包含と見なす。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、排他的な用語、例えば、「いずれか」、「１つの」、「ただ１つの」、または「厳密に１つの」が先行する場合、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが両方でない」）を示すと解釈されるのみとする。特許請求の範囲で使用される場合、「本質的に〜からなる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０３３４】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される、１つ以上の要素のリストを参照した「少なくとも１つ」という表現は、要素のリスト内の任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素であるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に記載されたありとあらゆる要素の少なくとも１つを含まず、要素のリスト内の任意の要素の組合せを排除しないことを意味すると理解されたい。この定義はまた、「少なくとも１つ」という表現が言及する要素のリスト内で明確に同定された要素以外に、明確に同定された要素に関連しているか関連していないかにかかわらず、要素が任意に含まれる場合があることを許可する。従って、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」もしくは同等に「Ａ及び／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態では、少なくとも１つの、任意に複数を含めて、ＡでＢを含まず（任意にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、少なくとも１つの、任意に複数を含めて、ＢでＡを含まず（任意にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、少なくとも１つの、任意に複数を含めて、Ａ及び少なくとも１つの、任意に複数を含めて、Ｂ（任意に他の要素を含む）、等を指すことができる。
【０３３５】
特許請求の範囲において、ならびに上記明細書において、すべての移行句、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｃａｒｒｙｉｎｇ（有する）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ（含む）」、「保持する」、「ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ（〜からなる）」等は、オープンエンドである、すなわち、〜を含むがこれに限定されないということを意味すると理解されるべきである。米国特許局特許審査便覧、第２１１１．０３条に記載の通り、移行句「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（〜からなる）」及び「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（〜から本質的になる）」のみが、クローズドまたはセミクローズドの移行句であるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【国際調査報告】
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