(57)【要約】  本発明は、自己免疫疾患を処置するか、又はその悪化若しくは発症を予防するか若しくは遅延させる方法であって、２種以上の短鎖脂肪酸、それらのエステル又は塩の組み合わせを含む食物代謝物を提供する方法に関する。本発明は、自己免疫疾患の悪化又は発症を処置するか、予防するか又は遅延させるための組成物も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における自己免疫疾患の発症を予防するか又は遅延させる方法であって、治療的有効量の２種以上の短鎖脂肪酸、それらのエステル又は塩の組み合わせを前記個体において提供し、それにより前記自己免疫疾患の前記発症を予防するか又は遅延させることを含む方法。
【請求項２】
前記個体は、自己免疫疾患の発生の危険性があると判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体は、自己免疫疾患の発生の危険性に関連した自己抗体又は炎症性マーカーを有すると判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
個体における自己免疫疾患の悪化を遅延させるか若しくは予防するか、又はそれを処置する方法であって、治療的有効量の２種以上の短鎖脂肪酸、それらのエステル又は塩の組み合わせを前記個体において提供し、それにより前記自己免疫疾患の前記悪化を処置するか若しくは遅延させるか、又はそれを処置することを含む方法。
【請求項５】
自己免疫疾患の危険性があるか又はそれを有する個体における炎症を軽減又は処置する方法であって、治療的有効量の２種以上の短鎖脂肪酸、それらのエステル又は塩の組み合わせを前記個体において提供し、それにより前記個体における炎症を軽減又は処置することを含む方法。
【請求項６】
前記個体において１種以上のプロ炎症性サイトカインの割合を低減することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記個体において１種以上の抗炎症薬サイトカインの割合を増大させることを含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
自己免疫疾患の危険性があるか又はそれを有する個体における自己免疫を予防、軽減又は処置する方法であって、治療的有効量の２種以上の短鎖脂肪酸、それらのエステル又は塩の組み合わせを前記個体において提供し、それにより前記個体における自己免疫を予防、軽減又は処置することを含む方法。
【請求項９】
前記自己免疫疾患は、１型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性肝炎、心筋炎、ループス腎炎、多発性硬化症又は原発性胆汁性肝硬変からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記自己免疫疾患は、１型糖尿病である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記短鎖脂肪酸は、酪酸、及び酢酸、及びプロピオン酸からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記短鎖脂肪酸の組み合わせは、酪酸及び酢酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記短鎖脂肪酸の組み合わせは、前記個体の大腸内に提供される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記短鎖脂肪酸の組み合わせは、前記短鎖脂肪酸を含む食物薬剤又は医薬組成物を前記個体に経口投与することにより、前記個体において提供される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記食物薬剤は、少なくとも１つの短鎖脂肪酸に共有結合された担体分子を含み、前記共有結合は、前記個体の結腸内において遊離脂肪酸を提供するために、前記個体の小腸内での分解に抵抗性であるが、前記結腸内で加水分解性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記担体は、澱粉である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記医薬組成物は、前記短鎖脂肪酸を前記個体の前記大腸内に放出するように適合される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記医薬組成物は、前記短鎖脂肪酸を前記個体の結腸内に放出するように適合される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記医薬組成物は、胃及び小腸内での分解に抵抗性である腸溶コーティングを含む経口剤形である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記短鎖脂肪酸は、前記短鎖脂肪酸を含む医薬組成物を前記個体に直腸投与することにより、前記個体において提供される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記医薬組成物は、坐薬である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記短鎖脂肪酸は、前記短鎖脂肪酸を含む医薬組成物を前記個体に注射することにより、前記個体において提供される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記医薬組成物は、皮下、静脈内又は動脈内注射に適合される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
酢酸、酪酸及びプロピオン酸から選択される２種以上の短鎖脂肪酸を個体の大腸内に送達するための食物薬剤であって、遊離脂肪酸を与えるために、個体の結腸内で加水分解性である結合によって前記短鎖脂肪酸に共有結合された担体を含む、食物薬剤。
【請求項２５】
前記担体は、澱粉、ガム、オリゴ糖又はペクチンからなる群から選択される炭水化物である、請求項２４に記載の食物薬剤。
【請求項２６】
前記担体は、澱粉であり、澱粉の各分子は、少なくとも１つの酪酸及び少なくとも１つの酢酸分子に共有結合される、請求項２５に記載の食物薬剤。
【請求項２７】
１型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性肝炎、心筋炎、ループス腎炎、原発性胆汁性肝硬変及び多発性硬化症からなる群から選択される自己免疫疾患の処置における又はその悪化を遅延させるための、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の食物薬剤の使用。
【請求項２８】
１型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性肝炎、心筋炎、ループス腎炎、原発性胆汁性肝硬変及び多発性硬化症からなる群から選択される自己免疫疾患の発症を予防するか又は遅延させるための、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の食物薬剤の使用。
【請求項２９】
個体における１型糖尿病の処置において又はその悪化を遅延させるために使用される食物であって、第１の食物薬剤及び第２の食物薬剤の組み合わせを含み、前記第１の薬剤は、酪酸部分に共有結合された担体分子を含み、前記第２の薬剤は、酢酸部分に共有結合される担体分子を含み、各薬剤において、前記部分は、遊離酪酸及び遊離酢酸を与えるために、個体の結腸内で加水分解性である結合によって前記担体に結合される、食物。
【請求項３０】
個体における１型糖尿病の発症を予防するか又は遅延させるのに使用される食物であって、第１の食物薬剤及び第２の食物薬剤の組み合わせを含み、前記第１の薬剤は、酪酸部分に共有結合された担体分子を含み、前記第２の薬剤は、酢酸部分に共有結合される担体分子を含み、各薬剤において、前記部分は、遊離酪酸及び遊離酢酸を与えるために、個体の結腸内で加水分解性である結合によって前記担体に結合される、食物。
【請求項３１】
自己免疫疾患の処置又は予防のための医薬の製造における酪酸、酢酸及びプロピオン酸の２種以上の使用。
【請求項３２】
前記自己免疫疾患は、１型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性肝炎、心筋炎、ループス腎炎、多発性硬化症及び原発性胆汁性肝硬変からなる群から選択される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
１型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性肝炎、心筋炎、ループス腎炎、多発性硬化症及び原発性胆汁性肝硬変からなる群から選択される自己免疫疾患の処置又は予防における使用のための治療的有効量の酪酸、酢酸及びプロピオン酸の２種以上。
【請求項３４】
自己免疫疾患を処置するか又はその悪化を遅延させるための医薬組成物であって、酪酸、酢酸及びプロピオン酸、それらのエステル又は塩の２種以上の組み合わせと、薬学的に許容される賦形剤とを含み、前記酪酸、酢酸及びプロピオン酸、それらのエステル又は塩の２種以上は、前記組成物中の活性成分である、医薬組成物。
【請求項３５】
自己免疫疾患の発症を予防するか又は遅延させるための医薬組成物であって、酪酸、酢酸及びプロピオン酸、それらのエステル又は塩の２種以上の組み合わせと、薬学的に許容される賦形剤とを含み、前記酪酸、酢酸及びプロピオン酸、それらのエステル又は塩の２種以上は、前記組成物中の活性成分である、医薬組成物。
【請求項３６】
経口投与のために適合される、請求項３４又は３５記載の医薬組成物。
【請求項３７】
胃及び小腸内での分解に抵抗性である腸溶コーティングを含み、それにより大腸内への前記短鎖脂肪酸の放出を提供する、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
注射用組成物である、請求項３４又は３５に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
酪酸及び酢酸、それらのエステル又は塩を含む、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全容が全体として本明細書に組み込まれるオーストラリア仮特許出願第２０１６９０３１４３号明細書による優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、自己免疫疾患の処置及び予防のための代謝化合物の組み合わせ及び送達に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書における任意の先行技術に対する参照は、その先行技術が任意の管轄における通常の一般知識の一部をなすか、又はその先行技術が当業者により関連すると理解され、見なされ、及び／若しくは他の先行技術の１つと組み合わされることを合理的に予想できることの容認又は示唆ではない。
【０００４】
自己免疫疾患は、身体内の器官及び組織に対する異常な免疫応答から生じる病理学的状態である。
【０００５】
自己免疫疾患の負荷は、有意であり、西洋人口の実質的に少数（２〜５％）がこの疾病群に罹患している。女性も特に出産可能年齢において自己免疫疾患に罹患しやすく、そのため、自己免疫疾患は、米国において６５歳までの全年齢群で女性の主な死因の１つであると判断されている。
【０００６】
自己免疫疾患には治療法が存在せず、現在の治療法は、一般に、疾病に関連する疼痛の管理（例えば、ステロイド又は非ステロイド抗炎症薬を使用した）、又は免疫抑制薬を使用して炎症性応答を軽減することを目指している。免疫抑制医薬品は、法外に高価であり得、多くの患者にとって治療法の利用を低下させている。機能細胞の破壊をもたらす自己免疫疾患（例えば、膵臓β細胞が破壊される１型糖尿病）の場合、処置選択肢が更に限定され、外来性インスリン処置が依然として主な処置手法である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
自己免疫疾患を処置及び予防するための改善された方法及び組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、個体における自己免疫疾患の発症を予防するか又は遅延させる方法であって、治療的有効量の２種以上の短鎖脂肪酸、それらのエステル又は塩の組み合わせを個体において提供し、それにより自己免疫疾患の発症を予防するか又は遅延させることを含む方法に関する。
【０００９】
本発明の任意の実施形態において、個体は、自己免疫疾患の発生の危険性があると判定され得る。例えば、個体は、自己免疫疾患の発生の危険性に関連した自己抗体又は炎症性マーカーを有し得る。
【００１０】
本発明は、個体における自己免疫疾患の悪化を遅延させるか又はそれを処置する方法であって、治療的有効量の２種以上の短鎖脂肪酸、それらのエステル又は塩の組み合わせを個体において提供し、それにより自己免疫疾患の悪化を遅延させるか又はそれを処置することを含む方法も提供する。
【００１１】
本発明は、自己免疫疾患の危険性があるか又はそれを有する個体における炎症を軽減又は処置する方法であって、治療的有効量の２種以上の短鎖脂肪酸、それらのエステル又は塩の組み合わせを個体において提供し、それにより個体における炎症を軽減又は処置することを含む方法も提供する。
【００１２】
炎症の軽減又は処置は、個体において１種以上のプロ炎症性サイトカインの割合を低減することを含み得る。更に、炎症の軽減又は処置は、個体において１種以上の抗炎症薬サイトカインの割合を増大させることを含み得る。
【００１３】
本発明は、自己免疫疾患の危険性があるか又はそれを有する個体における自己免疫を予防、軽減又は処置する方法であって、治療的有効量の２種以上の短鎖脂肪酸、それらのエステル又は塩の組み合わせを個体において提供し、それにより個体における自己免疫を予防、軽減又は処置することを含む方法を提供する。
【００１４】
自己免疫を予防、軽減又は処置することは、個体における１種以上の自己抗体の存在量又は存在を低減することを含む。自己抗体は、自己免疫疾患の危険性に関連し得る。
【００１５】
本発明の任意の実施形態において、自己免疫疾患は、１型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性肝炎、心筋炎、ループス腎炎、多発性硬化症又は原発性胆汁性肝硬変からなる群から選択される。
【００１６】
好ましくは、自己免疫疾患は、１型糖尿病である。
【００１７】
本発明の任意の実施形態において、自己抗体は、１型糖尿病の危険性に関連し、膵島自己抗体、インスリン自己抗体及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）に対する自己抗体並びに膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＰＲ）を含むが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明の任意の実施形態において、２種以上の短鎖脂肪酸、それらのエステル又は塩の組み合わせは、酪酸及び酢酸、それらのエステル又は塩の組み合わせを含む。
【００１９】
本発明は、個体におけるＩ型糖尿病を処置するか又はその悪化を遅延させる方法であって、治療的有効量の酪酸及び酢酸、それらのエステル又は塩を個体において提供し、それによりＩ型糖尿病を処置するか又はその悪化を遅延させることを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は、個体におけるＩ型糖尿病の発症を予防するか又は遅延させる方法であって、治療的有効量の酪酸及び酢酸、それらのエステル又は塩を個体において提供し、それによりＩ型糖尿病の発症を予防するか又は遅延させることを含む方法を提供する。
【００２１】
本発明は、個体におけるＩ型糖尿病を処置するか又はその悪化を遅延させる方法であって、治療的有効量の酪酸及び酢酸、それらのエステル又は塩を個体の大腸内において提供し、それによりＩ型糖尿病を処置又は予防することを含む方法も提供する。
【００２２】
本発明は、個体におけるＩ型糖尿病の発症を予防するか又は遅延させる方法であって、治療的有効量の酪酸及び酢酸、それらのエステル又は塩を個体の大腸内において提供し、それによりＩ型糖尿病の発症を予防するか又は遅延させることを含む方法も提供する。
【００２３】
本発明の任意の実施形態において、短鎖脂肪酸の組み合わせは、酪酸、及び酢酸、及びプロピオン酸からなる群から選択される。組み合わせは、酪酸及びプロピオン酸、酪酸及び酢酸、酢酸及び酪酸、又は酢酸、酪酸及びプロピオン酸であり得る。
【００２４】
本発明の任意の実施形態において、酢酸、酪酸及びプロピオン酸から選択される短鎖脂肪酸の組み合わせは、イソ酪酸酸、ｔ−ブチルカルボン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸等から選択される追加の短鎖脂肪酸を更に含むことができる。更に、追加の短鎖脂肪酸は、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、シアノ、ヒドロキシル、メトキシ、ケト等の１〜３つの置換基で置換され得る。有用な置換短鎖脂肪酸の例としては、ヒドロキシ酢酸、ケトプロピオン酸及び４，４−トリフルオロ酪酸が挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用される用語、アセテート、ブチレート、プロピオネート等は、遊離酸の塩形態又は生理学的環境に応じて遊離酸自体を指す。文脈において、これらは、遊離酸のエステルも指すことができる。
【００２６】
本発明の任意の実施形態において、短鎖脂肪酸の組み合わせは、個体の大腸内において提供される。本発明の任意の実施形態において、短鎖脂肪酸の組み合わせは、個体の結腸内において提供される。任意の実施形態において、短鎖脂肪酸の組み合わせは、個体において全身的に（即ち末梢血循環中に）提供される。
【００２７】
本発明の任意の実施形態において、短鎖脂肪酸の組み合わせは、前記短鎖脂肪酸を含む食物薬剤又は医薬組成物を個体に経口投与することにより、個体において提供される。食物薬剤は、少なくとも１つの短鎖脂肪酸に共有結合された担体分子を含み得、共有結合は、遊離脂肪酸を個体の結腸内において提供するために、個体の小腸内での分解に抵抗性であるが、結腸内で加水分解性である。好ましくは、担体は、澱粉である。
【００２８】
本発明の任意の実施形態において、短鎖脂肪酸の組み合わせの投与は、個体の血液中の短鎖脂肪酸の循環レベルの増大をもたらす。本発明の任意の実施形態において、血液中の増大された短鎖脂肪酸の循環レベルは、持続される（即ち一過性でない）。
【００２９】
本発明の任意の実施形態において、短鎖脂肪酸の組み合わせの投与は、個体において短鎖脂肪酸の循環レベルの０．５倍、１倍、２倍、３倍又は４倍以上の増大をもたらす。
【００３０】
本発明は、自己免疫疾患の処置又は予防のための医薬組成物であって、酪酸、酢酸及びプロピオン酸（それらのエステル又は塩を含む）の２種以上の組み合わせと、薬学的に許容される賦形剤とを含み、酪酸、酢酸及びプロピオン酸、それらのエステル又は塩の２種以上は、組成物中の活性成分である、医薬組成物も提供する。
【００３１】
医薬組成物は、短鎖脂肪酸を個体の大腸内に放出するように適合され得る。
【００３２】
医薬組成物は、短鎖脂肪酸を個体の結腸内に放出するように適合され得る。
【００３３】
医薬組成物は、胃及び小腸内での分解に抵抗性の腸溶コーティングを含む経口剤形の形態であり得る。腸溶コーティングは、好ましくは、短鎖脂肪酸を大腸、好ましくは結腸の管腔に放出するように設計された経口剤形上の消化抵抗性層である。
【００３４】
医薬組成物は、経口剤形、坐薬又は注射用剤形の形態であり得る。
【００３５】
本発明は、自己免疫疾患を処置するか又はその発症を予防するか若しくは遅延させるための医薬の製造における酪酸、酢酸及びプロピオン酸の２種以上の使用も含む。
【００３６】
本発明は、酢酸、酪酸及びプロピオン酸から選択される２種以上の短鎖脂肪酸を個体の大腸内に送達するための食物薬剤であって、遊離脂肪酸を与えるために、個体の結腸内で加水分解性である結合によって短鎖脂肪酸に共有結合された担体を含む、食物薬剤を提供する。
【００３７】
担体は、好ましくは、澱粉、ガム、オリゴ糖又はペクチンからなる群から選択される炭水化物である。より好ましくは、担体は、澱粉である。
【００３８】
担体が澱粉である場合、好ましくは、澱粉は、少なくとも１つの酪酸及び少なくとも１つの酢酸分子に共有結合される。
【００３９】
本発明は、自己免疫疾患の処置又は予防において使用される組み合わせ食物であって、第１の食物薬剤及び第２の食物薬剤の組み合わせを含み、第１の薬剤は、酪酸部分に共有結合された担体分子を含み、第２の薬剤は、酢酸部分に共有結合される担体分子を含み、各薬剤において、部分は、遊離酪酸及び遊離酢酸を与えるために、個体の結腸内で加水分解性である結合によって担体に結合される、組み合わせ食物を提供する。
【００４０】
本発明は、１型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性肝炎、心筋炎、ループス腎炎、原発性胆汁性肝硬変及び多発性硬化症からなる群から選択される自己免疫疾患を処置するか又はその悪化を遅延させるための上述した食物薬剤の使用も提供する。食物薬剤は、１型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性肝炎、心筋炎、ループス腎炎、原発性胆汁性肝硬変及び多発性硬化症からなる群から選択される自己免疫疾患の発症を予防するか又は遅延させるためのものでもあり得る。
【００４１】
本発明は、個体における１型糖尿病の処置において又はその悪化を遅延させるために使用される食物であって、第１の食物薬剤及び第２の食物薬剤の組み合わせを含み、第１の薬剤は、酪酸部分に共有結合された担体分子を含み、第２の薬剤は、酢酸部分に共有結合される担体分子を含み、各薬剤において、部分は、遊離酪酸及び遊離酢酸を与えるために、個体の結腸内で加水分解性である結合によって担体に結合される、食物も提供する。
【００４２】
本発明は、個体における１型糖尿病の発症を予防するか又は遅延させるのに使用される食物であって、第１の食物薬剤及び第２の食物薬剤の組み合わせを含み、第１の薬剤は、酪酸部分に共有結合された担体分子を含み、第２の薬剤は、酢酸部分に共有結合される担体分子を含み、各薬剤において、部分は、遊離酪酸及び遊離酢酸を与えるために、個体の結腸内で加水分解性である結合によって担体に結合される、食物も提供する。
【００４３】
本発明は、自己免疫疾患の処置又は予防のための医薬の製造における酪酸、酢酸及びプロピオン酸の２種以上の使用も提供する。自己免疫疾患は、１型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性肝炎、心筋炎、ループス腎炎、多発性硬化症及び原発性胆汁性肝硬変からなる群から選択される。好ましくは、自己免疫疾患は、１型糖尿病である。
【００４４】
本発明は、個体における自己免疫疾患を処置するか又はその悪化を遅延させる方法であって、自己免疫疾患は、好ましくは、１型糖尿病であり、方法は、
−  治療的有効量の結腸組成物を含む剤形を個体に投与することであって、前記組成物は、
−  短鎖脂肪酸の少なくとも２種の組み合わせからなるコアであって、短鎖脂肪酸は、酢酸、酪酸及びプロピオン酸又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくはエステルから選択される、コアと、
−  前記コアを覆う少なくとも１つの消化抵抗性層と
からなり、
−  前記消化抵抗性層は、結腸内で崩壊する、投与することと、
−  コアを結腸の管腔内で放出することと
を含む、方法も提供する。
【００４５】
本発明は、個体における自己免疫疾患の発症を予防するか又は遅延させる方法であって、自己免疫疾患は、好ましくは、１型糖尿病であり、方法は、
−  治療的有効量の結腸組成物を含む剤形を個体に投与することであって、前記組成物は、
−  短鎖脂肪酸の少なくとも２種の組み合わせからなるコアであって、短鎖脂肪酸は、酢酸、酪酸及びプロピオン酸又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくはエステルから選択される、コアと、
−  前記コアを覆う少なくとも１つの消化抵抗性層と
からなり、
−  前記消化抵抗性層は、結腸内で崩壊する、投与することと、
−  コアを結腸の管腔内で放出することと
を含む、方法も提供する。
【００４６】
本発明は、結腸組成物であって、
−  酪酸、酢酸及びプロピオン酸又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくはエステルから選択される少なくとも２種の短鎖脂肪酸の組み合わせからなるコアと、
−  前記コアを覆う少なくとも１つの消化抵抗性層であって、結腸内で崩壊する、消化抵抗性層と
からなる結腸組成物も提供する。
【００４７】
剤形は、表又はカプセルの形態であり得る。好ましくは、コアは、酪酸及び酢酸の両方又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくはエステルを含む。剤形は、１型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性肝炎、心筋炎、ループス腎炎、多発性硬化症及び原発性胆汁性肝硬変から選択される自己免疫疾患の処置における使用、又はその発症を遅延させるか若しくは予防するための使用のためである。好ましくは、自己免疫疾患は、１型糖尿病である。好ましくは、自己免疫疾患は、１型糖尿病である。
【００４８】
文脈が他に要求しない限り、本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びに「含んでいる」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含まれる」等のこの用語のバリエーションは、更なる添加物、構成成分、整数又はステップを除外することを意図するものではない。
【００４９】
本発明の更なる態様及び上記パラグラフに記載される態様の更なる実施形態は、付随する図面を参照して、例として提供される以下の記載から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＳＣＦＡ濃度は、ＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄの発生率と相関する。７週齢の特定の病原フリー（ＳＰＦ）ＮＯＤ対ＳＰＦ  ＮＯＤ．ＭｙＤ８８−／−マウスの（ａ）末梢血（大静脈）及び（ｂ）肝門脈血におけるアセテート、ブチレート及びプロピオネートの濃度。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定。データは、平均±ＳＤ、ｎ≧５を表す。示したデータは、３つの独立実験からのものである。ｃ）微生物フリー（ＧＦ）対ＳＰＦ雌ＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄ発生率。＊＊＊Ｐ＜０．００１、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定。示したデータは、２つの独立実験からのものである。（ｄ）雌（Ｆ）及び雄（Ｍ）５〜８及び１０〜１５週齢のＮＯＤマウスの末梢血（大静脈）におけるアセテート、ブチレート及びプロピオネートの濃度。データは、平均±ＳＤ、ｎ≧５を表す。示したデータは、３つの独立実験からのものである。（ｅ）５週齢から開始して、飲料水中の２００ｍＭ酢酸ナトリウム（必要に応じてｐＨを調整した）で２５週間処理した又は処理しないＳＰＦ雌ＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄ発生率。＊Ｐ＜０．００４６。（ｆ）飲料水中のアセテートで処理した又は処理しない１０週齢のＮＯＤマウスの膵島炎スコア。方法に記載したように浸潤度を点数化した。ＮＳ＝無有意。２つの実験の代表の１つを示す。
【図２】ＳＣＦＡ送達食物は、糖尿病から保護する。（ａ）ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物で５週間後のプールした１５週齢の雄及び雌ＮＯＤマウスからの糞便、盲腸内容物、肝門脈血及び末梢（大静脈）血中のアセテート、ブチレート及びプロピオネートの濃度。示したデータは、３つの独立実験からのものである。データは、平均±ＳＤを表し、各記号は、生物学的複製を表す。（ｂ）５週齢で開始して、ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ、ＨＡＭＳＢ及びＨＡＭＳＰ食物を５週間給餌した雌ＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄ発生率。＊＊＊Ｐ＝０．００２２（ＨＡＭＳＡ対ＮＰ）、＊Ｐ＝０．０４７６（ＨＡＭＳＡ対ＨＡＭＳ）、＊Ｐ＝０．０４２（ＨＡＭＳＢ対ＮＰ）及びＮＳ（ＨＭＡＳＰ対ＮＰ）Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定。（ｃ）膵島炎に関して点数化した膵島の代表的な画像。右側  −  雌ＮＯＤマウス５週齢、１５週齢及び２５週齢の糖尿病性ＮＰ給餌；１５週齢のＨＡＭＳ給餌、１５週齢のＨＡＭＳＡ給餌及び３０週齢のＨＡＭＳＡ給餌後；１５週齢のＨＡＭＳＢ給餌及び３０週齢のＨＡＭＳＢ給餌後の膵島炎スコア。方法に記載したように浸潤度を点数化した。（ｄ）ＨＡＭＳＡ／ＨＡＭＳＢ組み合わせ食物を給餌した雌ＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄ発生率。＊＊Ｐ＝０．００１８（１５％＋１５％又は７．５％＋７．５％）Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定。２つ又は３つの実験の代表の１つを示す。ＮＳ＝無有意。
【図３】アセテートは、自己免疫性Ｔ細胞の頻度を抑制する。（ａ）ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌した１５週齢の雌ＮＯＤマウスからの脾臓自己反応性ＩＧＲＰ  ４量体＋ＣＤ８＋及び（ｂ）ＢＤＣ２．５  ４量体＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度。ＴＵＭ及びｈｕ  ＣＬＩＰを４量体対照として各々使用した。ｎ＝５〜６マウス。示したデータは、３つの独立実験からのものである。（ｃ）ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌したＮＯＤ．８．３マウスにおける糖尿病発生率。＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ＨＡＭＳＡ対ＮＰ）。示したデータは、２つの独立実験からのものである。（ｄ）（ｃ）のＮＯＤ８．３マウスにおけるＩＧＲＰ  ４量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す代表的なプロット。データは、平均±ＳＤ、ｎ≧５を表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。示したデータは、２つの独立実験からのものである。
【図４】アセテート食物は、Ｂ細胞機能及び遺伝子転写に影響を与える。（ａ）ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌した１５週齢の雌ＮＯＤマウスからの脾臓及びパイエル板（ＰＰ）におけるＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞の頻度及び数を示す累積データ。ｂ）（ａ）の脾臓ＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞における１細胞当たりのＭＨＣ  Ｉ及びＣＤ８６タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析。ラットＩｇＧ２ａｋをアイソタイプ対照（黒線）として使用した。ｎ＝５〜６。３つの実験の代表の１つを示す。（ｃ）選別した脾臓ＣＤ２１高ＣＤ２３低（ＭＺＢ）及びＣＤ２１中ＣＤ２３高（ＦＯＢ）細胞上のＣＤ８６及びＩｌ１２の発現を示すリアルタイムＰＣＲ（総ＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞からゲートした）、ｎ＝３。データは、３つの実験の代表の１つ、平均±ＳＥＭを表す。（ｄ）（ａ）のＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞に関するＲＮＡ−ｓｅｑの差次的発現を示すＭＤＳプロット、ｎ＝４。（ｅ）脾臓総ＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞内のＨＡＭＳＢ対ＮＰコントラスト（ｙ軸）に対するＨＡＭＳＡ対ＮＰコントラスト（ｘ軸）間の遺伝子発現プロファイル。赤い丸は、ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ食物間で試験した差次的発現に関するＦＤＲ＜０．０５を有する発現遺伝子のｌｏｇ２倍変化を表す。（ｆ）選別脾臓ＣＤ２１高ＣＤ２３低（ＭＺＢ）及びＣＤ２１中ＣＤ２３高（ＦＯＢ）細胞上のＨＤＡＣ３の発現を示すリアルタイムＰＣＲ（総ＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞からゲートした）、Ｐ＝０．００９７（ＨＡＭＳＡ対ＨＡＭＳＢ）ｎ＝３。データは、３つの実験の１つ、平均±ＳＥＭを表す。（ｇ）ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ給餌ＮＯＤマウスからのＰＬＮにおけるＣＦＳＥ標識ＮＯＤ．８．３  ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖。ＰＬＮにおけるＣＦＳＥ−ＩＧＲＰ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す累積データ。Ｐ＝０．００８２（ＨＡＭＳＡ対ＨＡＭＳ）。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝５〜６マウスを表す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。３つの実験の代表の１つを示す。
【図５】ブチレートは、糖尿病からの保護に寄与するＴｒｅｇ生物学を向上させる。（ａ）ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌した１５週齢の雌ＮＯＤマウスからの脾臓ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度及び数を示す累積データ、ｎ≧５。３つの実験の代表の１つを示す。（ｂ）ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ給餌雌ＮＯＤマウスからの総脾臓Ｔ細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＴ１Ｄ発生率。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ＨＡＭＳ対ＮＰ、ＨＡＭＳＡ対ＨＡＭＳ、及びＨＡＭＳＢ対ＨＡＭＳ）。示したデータは、２つの独立実験からのものである。（ｃ）ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌したＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌への移植から３週間後のＰＬＮ  ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度及び数を示す代表的なプロット及び累積データ。（ｄ）ＩＬ１０産生ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＨＥＬＩＯＳ＋Ｔ細胞の頻度。データは、平均±ＳＤを表し、各記号は、個々のマウスを表す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３。示したデータは、２つの独立実験からのものである。（ｅ）ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢを給餌した雌ＮＯＤマウスからの脾臓ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞上で評価した、Ｆｏｘｐ３プロモーターにおけるヒストンのアセチル化（Ｈ３Ｋ９アセチル化及びＨ４ペンタアセチル化）、ｎ＝５。Ｐ＝０．００２７（Ｈ３Ｋ９、ＨＡＭＳ対ＨＡＭＳＢ）及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（Ｈ４、ＨＡＭＳ対ＨＡＭＳＢ）。ＩｇＧアイソタイプ対照を使用して非特異的結合を評価した。任意単位（ＡＵ）は、Ｈ３結合に対するアセチル化の富化を表す。（ｆ）ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌した雌ＮＯＤマウスのＰＬＮからのＣＤ４５ＲＢ低ＣＤ２５＋を発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３、Ｇａｔａ３、Ｇｉｔｒ及びＳｅｌｌ（ＣＤ６２Ｌ）の単一細胞発現。プールしたマウスから得た単一細胞、ｎ＝６。示したデータは、３つの独立実験からのものである。（ｇ）ＨＡＭＳ（赤色ベン図）及びＨＡＭＳＢ給餌マウス（緑色ベン図）におけるＧａｔａ３、Ｇｉｔｒ及びＳｅｌｌ（ＣＤ６２Ｌ）の共発現を示すＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ低ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３高ＰＬＮ  Ｔ細胞（Ｂから）のベン図。ベン図内の数は、Ｇａｔａ３、Ｇｉｔｒ及びＳｅｌｌ（ＣＤ６２Ｌ）を発現するＦｏｘｐ３高細胞（塗りつぶされた丸）の数を表す。ｎ＝３０細胞は、個別に選別した。
【図６】アセテートは、部分的にＧＰＲ４３を介して作用してＴ１Ｄ重症度を制限する。（ａ）ＮＰ、ＨＡＭＳ又はＨＡＭＳＡ食物を給餌した雌ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３＋／＋及びＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−リターメイトにおけるＴ１Ｄ発生率。＊＊Ｐ＝０．００２３（ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３＋／＋マウス、ＮＰ対ＨＡＭＳＡ）；＊Ｐ＝０．０３９２（ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３＋／＋マウス、ＮＰ＿対ＨＡＭＳ）及び＊Ｐ＝０．０１７９（ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウス、ＮＰ対ＨＡＭＳＡ）。示したデータは、２つの独立実験からのものである。（ｂ）ＮＰ又はＨＡＭＳＡ食物を給餌した１５週齢のＮＯＤ．Ｇｐｒ４３＋／＋及びＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウスの膵島炎スコア。方法に記載したように浸潤度を点数化した。（ｃ）脾臓及びＰＬＮのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞及び（ｄ）ＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞の絶対数を示す累積データ、ｎ≧５。示したデータは、３つの独立実験からのものである。（ｅ）ＮＰ又はＨＡＭＳＡ食物を給餌した１５週齢の雌ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３＋／＋及びＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウスからのＰＬＮ自己反応性ＩＧＲＰ  ４量体＋ＣＤ８＋及びＩＡｇ７／ＢＤＣ２．５  ４量体＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度。データは、平均±ＳＤ、ｎ≧４を表す。示したデータは、３つの独立実験からのものである。
【図７】アセテート及びブチレート食物は、ＬＰＳ、ＩＬ−２１及びＴＮＦαを含むＴ１Ｄ病態形成において重要なパラメーターを改善する。（ａ）５週齢のＮＰ給餌雌Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃマウス及び年齢一致ＮＰ給餌雌（Ｆ）及び雄（Ｍ）ＮＯＤマウスの結腸におけるＯｃｌｎ、Ｔｊｐ１、Ｍｕｃ２及びＣｄｈ１、ｍＲＮＡの倍数変化発現。各食物における対照Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃマウス、ｎ≧４生物学的複製に性差は見られなかった。（ｂ）１５週齢のＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ給餌雌ＮＯＤマウスの結腸におけるＯｃｌｎの発現における倍数変化。データは、各食物における平均±ＳＥＭ、ｎ≧７生物学的複製を表す。示したデータは、３つの独立実験からのものである。（ｃ）ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌した雌の年齢一致ＮＰ給餌Ｃ５７ＢＬ／６及び雌ＮＯＤマウスの末梢血（大静脈）におけるＬＰＳの濃度。データは、各食物における平均±ＳＤ、ｎ≧３生物学的複製を示す。示したデータは、３つの独立実験からのものである。各食物における年齢一致ＮＰ給餌ＮＯＤ．ＭｙＤ８８−／−マウス、ｎ≧４生物学的複製と比較した、１５週齢のＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ給餌雌ＮＯＤマウスからの血清中の（ｄ）ＴＮＦ−α、ＩＬ−２１、（ｅ）ＩＬ−２２及びＴＧＦ−βの濃度。データは、平均±ＳＤを表し、各記号は、個々のマウスを表す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。データは、３つの独立実験からのものである。
【図８】食物は、微生物生態及び代謝物生産を変化させ、これは、糖尿病保護に寄与する。ａ）雌ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ形成細菌叢で再コロニー形成したＧＦ  ＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄ発生率。＊Ｐ＝０．０２０４（ＨＡＭＳＡ対ＮＰ）Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定。（ｂ）異なる食物に関する糞便移植（ＦＴ）後のＳＰＦ  ＮＯＤマウス及びＧＦ  ＮＯＤマウスからの糞便における属の分布を示す棒グラフ。ｎ＝５〜６／グループ。各属は、異なる色で表され、各サンプルにおける相対的存在量に比例する。説明文は、１％を超える相対的存在量を有する属を示す。（ｃ）ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌したＮＯＤマウスにおけるＳＣＦＡアセテート、ブチレート及びプロピオネート及び細菌属間の関係を示すピアソン相関ベースのネットワーク。属を示すノードは、属が属する門により着色される一方、アセテート、ブチレート及びプロピオネートは、赤丸で表される。各属のノードの大きさは、属の相対的存在量に比例する。緑線は正に接続し、青線は、負に相関したノードである。アセテート及びブチレートの両方と正に相関したバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属は、高アセテート及びブチレート環境内で栄え、おそらく他の正に相関した（緑線）属のモジュールの成長を抑制した。（ｄ）（ａ）の３０週齢のＧＦ再コロニー形成ＮＯＤマウスのアセテート、ブチレート及びプロピオネートの血清及び盲腸濃度を示す累積データ、ｎ≧２。データは、２つの独立実験からの平均として示した。（ｅ）食物で改変された細菌叢で再コロニー形成した３０週齢のＧＦ  ＮＯＤマウスからのＰＬＮ  ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の頻度及び数。（ｆ）ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌した１５週齢の雌ＮＯＤマウスにおける糞便代謝物の濃度、ｎ≧５。（ｆ）ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌した保護された１５週齢の雌ＮＯＤマウスにおける糞便代謝物の濃度、ｎ≧２〜５。データは、平均±ＳＥＭとして示される。記号は、個々のマウスを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。データは、２つの独立実験の組み合わせを表す。
【図９】（ａ）微生物フリー（ＧＦ）ＮＯＤ．ＭｙＤ８８−／−マウス対特定の病原フリー（ＳＰＦ）ＮＯＤ．ＭｙＤ８８−／−マウスにおけるＴ１Ｄ発生率；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定。５週齢の雌ＳＰＦ及びＧＦ  ＮＯＤ及びＮＯＤ．ＭｙＤ８８−／−マウスの（ｂ）糞便におけるアセテート、ブチレート及びプロピオネートの濃度、並びに（ｃ）年齢一致雌及び雄ＮＯＤ及びＣ５７ＢＬ／６マウスの糞便におけるアセテート、ブチレート及びプロピオネートの濃度。全グラフにおいて、データは、平均±ＳＤを表し、各記号は、個々のマウスを表す。（ｄ）ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌した１５週齢の雌ＮＯＤマウスの体重。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。全データは、３つの独立実験の代表である。
【図１０】（ａ、ｂ）（図４ａ）の脾臓ＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞における１細胞当たりのＭＨＣＩ、ＣＤ８６及びＭＨＣＩＩに関する表面タンパク質発現の平均蛍光指数（ＭＦＩ）＋／−ＤＳとしての累積データ。（ｃ）１５週齢のＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ給餌雌ＮＯＤマウスからの脾臓ＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞におけるβ−アクチンに対するＣ８０／Ｂ７．１、Ｃ８０／Ｂ７．２、Ｂ２Ｍ及びＰＲＤＭ１の発現における倍数変化を示すリアルタイムＰＣＲ。（ｄ）ＮＰ給餌ＮＯＤマウス、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ給餌ＮＯＤマウスのＭＬＮから単離した総ＣＤ８＋Ｔ細胞からの移植ＣＦＳＥ−ＩＧＲＰ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す代表的なＦＡＣＳプロット及び累積データ。データは、各食物における平均±ＳＤ、ｎ≧６生物学的複製を示す。データは、少なくとも３つの独立実験の代表である。
【図１１】（ａ）ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌した１５週齢の雌ＮＯＤマウスの結腸から単離した総ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の頻度及び数を示す累積データ。（ｂ）脾臓、ＰＬＮ及びＭＮＬ  ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示すＦＡＣＳプロット。データは、平均±ＳＤを表し、各記号は、個々のマウスを表す。＊＊Ｐ＜０．０１。全データは、３つの独立実験の代表である。
【図１２】（ａ）Ｃ５７．Ｇｐｒ４３−／−マウスをＮＯＤ株（ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−）に対して１３世代戻し交配した。完全に戻し交配した後、ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウスを７０，０００ＳＮＰｓゲノムワイドにわたって遺伝子型について同定した。肝臓からのＤＮＡを精製し、Ｍｅｇａ−ＭＵＧＡアレイ（Ｇｅｎｅｓｅｅｋ、ＮＢ）を使用して遺伝子型を同定した。遺伝子型を参照（Ｃ５７ＢＬ／６）アレル及びＮＯＤゲノム配列により決定されたＮＯＤアレルと比較した（Ｙａｌｃｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ノックアウトをＦＶＢバックグラウンド上に生成し、従って、ハプロタイプは、ＮＯＤゲノム（青色）又は非ＮＯＤゲノム（赤色）に由来するとして示される。灰色は、Ｃ５７ＢＬ／６及びＮＯＤが同じ遺伝子型を有する、情報価値のない領域を示す。この図は、各マウス染色体上のハプロタイプの起源の株を示し、各染色体の物理的サイズをＸ軸上に示す。この分析により、染色体７上のほぼＧｐｒ４３座位の領域を除いて全染色体がＮＯＤ株に由来することが示された。従って、これらのマウスは、染色体７上の〜１９Ｍｂ及びおよそ８０〜１２０ＭＢに各々マッピングされるＩｄｄ７及びＩｄｄ２７座位を含む全ＮＯＤ  Ｔ１Ｄ易罹患性座位を有する。これにより、本発明者らは、非ＮＯＤ区間内に報告されたＴ１Ｄ易罹患性遺伝子が存在しないことを確認できた。（全グラフにおいて、各記号は、個々のマウスを表す。（ＮＰ、ＨＡＭＳ又はＨＡＭＳＡ食物を給餌した１５週齢の雌ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウスの（ｂ）糞便、（ｃ）盲腸内容物及び（ｄ）末梢血（大静脈）におけるアセテート、ブチレート及びプロピオネートの濃度。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５（ＨＡＭＳＡ対ＨＡＭＳ給餌ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウス）。各記号は、個々のマウスを表す。データは、平均±ＳＤとして示される。全データは、３つの独立実験の代表である。
【図１３】（ａ）ＮＰを給餌した雌ＮＯＤ．Ｇｐｒ１０９ａ−／−におけるＴ１Ｄ発生率。（ｂ）非重み付き（左パネル）及び重み付き（右パネル）Ｕｎｉｆｒａｃ距離計量に基づいたＰＣｏＡ図による、ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ食物を給餌したＮＯＤ及びＧＦ再コロニー形成ＮＯＤマウスからの糞便の微生物プロファイル分析。異なる食物の細菌群集は、重み付き（Ｐ＝６．２Ｅ−５）及び非重み付き（Ｐ＜１Ｅ−６）Ｕｎｉｆｒａｃ、１Ｅ６並べ替えの両方及びＡｄｏｎｉｓ並べ替え多変量統計に基づいて有意に異なっていた。説明文は、ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ改変細菌叢で再コロニー形成したドナーＮＯＤマウス及びＧＦ  ＮＯＤマウスからの細菌叢を同じ色で表し、ＧＦ再コロニー形成ＮＯＤマウスをより暗い色で表す。（ＦＴ）は、糞便移植を示す。（ｃ）ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を給餌したＮＯＤマウス及び異なる食物に関する糞便移植（ＦＴ）後のＧＦ  ＮＯＤマウスにおける選択された細菌集団の（属レベル）での相対的存在量。データは、平均±ＳＤを表し、各記号は、個々のマウスを表す。＊Ｐ＜０．０５。全データは、２つの独立実験の代表である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
健康的な食物の一部としての繊維消費、特に結腸管細菌叢により発酵される抵抗性澱粉の消費の増大は、慢性疾患に対する保護のためのその可能性が認識されている（Ｍａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。この発酵は、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）、主にアセテート、プロピオネート及びブチレートを生成する。ＳＣＦＡは、繊維に起因する効果の多くを媒介する可能性があり、それらの供給は、最適な腸機能に重要である。
【００５２】
大腸内の繊維の細菌発酵により生成されるＳＣＦＡは、多数の方法で腸の健康を促進し得る。例えば、これらの酸は、血流を増大させることにより内臓機能を維持するために重要であり、下痢症における改善された電解質及び流体吸収、腸病原体の増殖を制限する低い結腸ｐＨの維持及び結腸筋活動の調節に寄与すると考えられている。しかしながら、アセチル化又はブチリル化高アミローストウモロコシ澱粉（それぞれＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢとして既知）を多く含む食物は、ＧＩ管疾患を有するヒト集団で試験されたが（Ａｎｎｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｆｅｅｈｉｌｙ＆Ｋａｒａｔｚａｓ，２０１３）、腸内菌共生バランス失調の改善に関して以前記載された殆どの努力は、プロバイオティクスの使用に依存していた。
【００５３】
本発明者らは、驚くべきことに、ＳＣＦＡが消化系外でも役割を有し、特に自己免疫疾患に対する保護に重要な役割を有することを見出した。詳細には、本発明者らは、少なくとも２種の異なるＳＣＦＡの組み合わせが自己免疫疾患発生から保護し、新規な処置モダリティも提供し得ることを見出した。
【００５４】
従って、第１の態様において、本発明は、個体における自己免疫疾患を処置又は予防する方法であって、治療的有効量の２種以上の短鎖脂肪酸、それらのエステル又は塩の組み合わせを個体において提供し、それにより自己免疫疾患を処置又は予防することを含む方法に関する。
【００５５】
本発明に従って使用される短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、酪酸、酢酸及びプロピオン酸からなる群から選択される。一実施形態において、ＳＣＦＡの組み合わせは、酢酸及びプロピオン酸の組み合わせである。別の実施形態では、組み合わせは、プロピオン酸及び酪酸である。特に好ましい実施形態では、ＳＣＦＡは、酪酸及び酢酸である。また更なる実施形態では、ＳＣＦＡの３種の全てが使用される。
【００５６】
短鎖脂肪酸は、ナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウム塩として提供され得る。２種以上の短鎖脂肪酸の１つが酪酸の場合、塩は、酪酸ナトリウムであることが好ましい。２種以上の短鎖脂肪酸の１つが酢酸の場合、塩は、酢酸ナトリウムであることが好ましい。
【００５７】
いくつかの実施形態において、短鎖脂肪酸は、１〜６個の炭素の分枝状又は非分枝状アルキルアルコールを有するカルボン酸のエステルとして存在し得る。例えば、短鎖脂肪酸は、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、イソプロピルエステル、ｔ−ブチルエステル、ペンチルエステル又はヘキシルエステルとして存在し得る。
【００５８】
短鎖脂肪酸の組み合わせは、イソブチレート、ｔ−ブチルカルボキシレート、ペンタノエート、ヘキサノエート等から選択される追加の短鎖脂肪酸を更に含むことができる。更に、追加の短鎖脂肪酸は、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、シアノ、ヒドロキシル、メトキシ、ケト等の１〜３つの置換基で置換され得る。有用な置換短鎖脂肪酸の例としては、ヒドロキシアセテート、ケトプロピオネート及び４，４−トリフルオロブチレートが挙げられる。
【００５９】
２種以上の短鎖脂肪酸の１つが酪酸の場合、酪酸は、ブチレート及びグリセロールからなるエステルであるトリブチリンの形態のプロドラッグとして提供される。
【００６０】
更に、本発明者らは、酢酸及び酪酸が、異なるが相補的な経路で作用して、腸ホメオスタシス、腸細菌生態並びにＴｒｅｇの数及び機能を改善することを見出した。例えば、理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、酪酸が、アセテートに関して記載されているものと異なり且つ向上されたＴＧＦβ産生を含むＴｒｅｇ関連経路を介して作用すると考える。更に、酢酸は、抗原提示細胞、特にＢ細胞の効果を改変し、それにより自己免疫性Ｔエフェクター細胞の頻度を変更するのに特に有用であると考えられる。
【００６１】
従って、特に好ましい実施形態では、本発明は、個体における自己免疫疾患を処置又は予防する方法であって、治療的有効量の酢酸及び酪酸、それらのエステル又は塩を個体において提供し、それにより自己免疫疾患を処置又は予防することを含む方法に関する。
【００６２】
ＳＣＦＡは、当業者に既知の任意の数の手段により、処置を必要とする個体において提供され得る。例えば、一実施形態において、ＳＣＦＡは、本明細書に更に記載するように、経口、局所又は全身投与のための医薬製剤で提供される。好ましい実施形態において、本明細書に更に記載するように、医薬製剤は、ＳＣＦＡを個体の大腸、特に結腸に送達するように適合される。
【００６３】
代替的に、ＳＣＦＡは、個体の食物の一部として個体において提供され得、それにより、ＳＣＦＡは、胃腸管の所望の領域内での食物薬物の消化により、消化管の細胞との接触が提供される。好ましい実施形態において、食物薬剤は、本明細書に更に記載されるように結腸内でのＳＣＦＡの放出を提供する。
【００６４】
本発明の方法は、身体の１つ以上の領域内の増大された自己免疫性炎症性応答をもたらす任意の疾病の予防及び／又は処置に有用である。従って、本発明の方法は、機能障害性／無効性の調節性Ｔ細胞機能、拡張された自己反応性Ｔエフェクター細胞及び／又はＢ細胞機能障害に関連した疾病の処置に有用である。本発明により予防及び／又は処置され得る疾病は、１型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性肝炎、心筋炎、ループス腎炎、原発性胆汁性肝硬変及び多発性硬化症からなる群から選択される自己免疫疾患を含む自己免疫疾患である。
【００６５】
本発明の方法は、１型糖尿病予防及び処置に特定の有用性を有する。
【００６６】
本明細書で使用される「予防する」、「予防」、「予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）」又は「予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）」は、状態、疾病、疾患若しくは表現型（異常性又は症状を含む）の発生を防ぐか、又は疾病、疾患若しくは表現型の発生を妨げるか、その発生を防御するか若しくはその発生から保護することを指す。予防を必要とする個体は、自己免疫疾患を発生しやすい可能性がある。例えば、本発明による自己免疫疾患の予防は、疾病の発生の危険性があるとして同定された個体における前記疾病の発症を予防することを含む。個体は、遺伝子検査、環境因子の分析、家族歴又は他の因子により、危険性があるとして同定され得る。
【００６７】
処置を必要とする個体は、本明細書に記載される自己免疫疾患のいずれか１つと診断されるか又はその発生の危険性があるものであり得る。本明細書で使用される用語「処置」は、疾病の悪化を最小限にするか又は悪化を遅延させることを含む。例えば、本発明の方法は、疾病の初期徴候を示している個体における疾病の発症を予防するのに有用であり得る。一例として、Ｉ型糖尿病に関連して、疾病の初期徴候を有する個体は、膵島損傷の徴候を示すか、又は膵臓損傷のマーカーである膵島自己抗体を有し得るが、異常な耐糖能を依然として有していない。疾病の更なる悪化は、異常な耐糖能を含み得るが、インスリン処置を依然として必要としていない。当業者は、本発明の方法がこれらの状況のいずれかにおけるＩ型糖尿病の処置に有用であることを認識するであろう。
【００６８】
ヒト等の霊長類に加えて、多様な他の哺乳動物を本発明の方法により処置することができる。例えば、雌牛、羊、山羊、馬、犬、猫、モルモット、ラット又は他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、齧歯類又はハツカネズミ種を含むがこれらに限定されない哺乳動物を処置することができる。
【００６９】
医薬製剤
本発明は、自己免疫疾患の処置を必要とする個体にＳＣＦＡを送達することを可能にする医薬製剤を提供する。
【００７０】
本明細書に記載される医薬製剤は、遊離脂肪酸、エステル若しくは塩の形態のＳＣＦＡ又は代替的にアセチル化若しくはブチリル化澱粉等のコンジュゲートとしてのＳＣＦＡを含み得ることが当業者に理解される。
【００７１】
本明細書に記載される医薬製剤は、ＳＣＦＡの単一種又は２種以上のＳＣＦＡの組み合わせを含むことができる。例えば、本発明の方法を実行する際、自己免疫疾患の処置を必要とする人は、２種以上のＳＣＦＡの組み合わせを含む単一医薬剤形を投与され得る。例えば、剤形は、酢酸及び酪酸、それらの塩又はエステルを含むことができる。代替的に、剤形は、酢酸及びプロピオン酸、それらの塩若しくはエステル又は酪酸及びプロピオン酸及びそれらの塩を含むことができる。また更に、剤形は、酢酸、酪酸及びプロピオン酸（それらの塩又はエステルを含む）の３つの全てを含むことができる。
【００７２】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、治療的有効量の酪酸及び酢酸、それらの塩又はエステルを含む医薬製剤を、それを必要とする個体に投与することによって実行される。
【００７３】
本発明の方法は、ＳＣＦＡの単一種を含む１つ以上の医薬剤形の連続的な又は同時の投与を提供することも想定している。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、例えば、従来の固体又は液体ビヒクル又は希釈剤及び所望の投与モードに適したタイプの医薬添加物（例えば、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、香味剤等）を使用することにより、医薬製剤の技術分野で周知のもの等の技術に従って処方することができる。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性又は油性縣濁液、分散性散剤又は顆粒、エマルション、硬若しくは軟カプセル剤、又はシロップ剤若しくはエリキシル剤として経口使用に好適な形態であり得る。経口使用に意図される組成物は、医薬組成物を製造するための当該技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、甘味剤、香味剤、着色剤及び保存剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含んで、薬学的に上質であり且つ美味な製剤を提供することができる。錠剤は、錠剤の製造に好適な薬学的に許容される無毒の賦形剤との混合物中にＳＣＦＡ活性成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム等の不活性希釈剤；顆粒化及び錠剤崩壊剤、例えばトウモロコシ澱粉又はアルギン酸；結合剤、例えば澱粉、ゼラチン又はアカシア及び滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであり得る。
【００７６】
遅延放出経口剤形
本発明者らは、驚くべきことに、高投与量のアセテート及びブチレートの組み合わせを対象の下部腸管に送達することが、自己免疫疾患、特に１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の発生及び悪化に大きく影響することを見出した。本発明の方法及びその方法に使用される医薬製剤は、非常に高いレベルのＳＣＦＡが、小腸又は結腸を含む大腸内に提供されることを可能にして、腸ホメオスタシス、腸細菌生態並びにＴｒｅｇ数及び機能における改善に直接寄与する。
【００７７】
従って、一実施形態において、本発明は、自己免疫疾患の処置又は予防を、それを必要とする個体において行う方法であって、
治療的有効量の２種以上の短鎖脂肪酸、それらのエステル又は塩の組み合わせを含む医薬剤形を個体に投与することであって、短鎖脂肪酸は、酪酸及び酢酸及びプロピオン酸からなる群から選択され、医薬剤形は、短鎖脂肪酸を個体の下部胃腸管内に放出するように適合される投与すること
を含み、それにより自己免疫疾患を処置又は予防する、方法に関する。
【００７８】
当業者は、活性薬剤を胃腸管の所望の領域に送達することを促進する遅延放出経口剤形の製造方法に精通しているであろう。従って、一実施形態において、本発明は、２種以上のＳＣＦＡ及び薬学的に有効な賦形剤を含む経口剤形であって、ＳＣＦＡを大腸内に放出するように適合される、経口剤形に関する。
【００７９】
本明細書で使用される用語「遅延放出」は、ＳＣＦＡの放出が、ＳＣＦＡの送達の変更が存在しない場合に達成されるであろう位置よりも遠位の、下部ＧＩ管内の概して予測可能なある位置で達成されるように、ＳＣＦＡを含む医薬組成物を処方することによって達成されるＳＣＦＡの送達を指す。
【００８０】
本明細書で使用される用語「胃腸管」又は「ＧＩ管」は、消化管、即ち口腔から肛門に延びる長さ約３０フィートの筋結織膜管に関する。本明細書で使用される用語「上部胃腸管」は、頬側口腔、咽頭、食道及び胃を意味する。本明細書で使用される用語「下部胃腸管」は、小腸及び大腸を意味する。
【００８１】
本明細書で使用される用語「小腸」は、十二指腸、空腸及び回腸からなる下部胃腸管の部分、即ち胃底の十二指腸括約筋のすぐ遠位の及び大腸の近位の腸管のその部分を意味する。
【００８２】
本明細書で使用される用語「大腸」は、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸及び直腸を含む、小腸のすぐ遠位であり盲腸で開始する下部胃腸管の部分を意味する。
【００８３】
本発明の特定の実施形態では、小腸又はその特定のセグメント（例えば、十二指腸、空腸又は回腸）へのＳＣＦＡ（遊離酸、塩又はエステル化酸のいずれかとして）の送達を達成することが望ましい可能性がある。なお別の場合、ボーラス量のＳＣＦＡを小腸に送達することが望ましい可能性がある。
【００８４】
本発明の特定の実施形態では、大腸又はその特定のセグメント（例えば、上行結腸）へのＳＣＦＡ（遊離酸、塩又はエステル化酸のいずれかとして）の送達を達成することが望ましい可能性がある。なお別の場合、ボーラス量のＳＣＦＡを大腸に送達することが望ましい可能性がある。
【００８５】
一実施形態において、経口剤形は、胃内の分解に抵抗性であるが、胃を退出し、小腸に進入したら溶解する腸溶コーティングを含む。代替的な実施形態では、経口剤形は、胃及び小腸内の分解に抵抗性であるが、剤形が大腸内に到達したら溶解する腸溶コーティングを含む。当業者は、活性成分が胃腸管内の特定の位置で放出されるように、腸溶コーティング材料を使用して医薬剤形中に含まれる活性成分の放出を調節することに精通しているであろう。
【００８６】
当業者は、小腸又は大腸内の最終部位及び／又は送達率が、以下の任意の１つ以上を操作することにより、当業者によって十分に制御され得ることを認識するであろう。
（ａ）コーティングのタイプ、コーティングに添加される賦形剤のタイプ及びレベル、並びにコーティングの不随する所望の厚さ及び透過性（膨潤特性）；
（ｂ）コーティング自体及び／又は被覆された錠剤、粒子、ビーズ若しくは顆粒中の時間依存的条件；
（ｃ）コーティング自体及び／又は被覆された錠剤、粒子、ビーズ若しくは顆粒中のｐＨ依存的条件；
（ｄ）コーティングの溶解速度。
【００８７】
自己免疫疾患を患い、その処置を必要としているヒト又は他の哺乳動物は、本発明の特定の実施形態において、前記ヒト又は他の哺乳動物の大腸へのＳＣＦＡの送達により問題なく処置され得る。本明細書に記載される剤形は、大腸への放出を達成し、望ましくない口腔、咽頭、食道、胃及び／又は小腸内でのＳＣＦＡの放出を防止し、それにより胃腸管内の意図される部位でそれらが放出される前のＳＣＦＡの分解を防止する。
【００８８】
小腸又は結腸を含む大腸内でのＳＣＦＡの標的化放出のための様々な手段は、本発明での使用に好適である。大腸への送達のための手段の非限定的な例としては、ｐＨトリガー性送達システム及び時間依存性送達システムが挙げられる。
【００８９】
本発明の一実施形態は、腸管内の特定の所望の地点に到達するまで、胃腸液により破壊されてＳＣＦＡを放出することがない物質でＳＣＦＡを被覆（又は別様に封入）することを含む。一実施形態において、医薬組成物の遅延放出は、ＳＣＦＡの錠剤、カプセル、粒子又は顆粒を、ｐＨ依存性の、即ち一般に大腸内に存在するが、上部胃腸管（即ち口腔、頬側口腔、咽頭、食道又は胃）又は下部ＧＩ管内に存在しないｐＨで破壊されるか又は溶解する物質で被覆することによって達成される。
【００９０】
本発明の一実施形態は、部分的にメチルエステル化したメタクリル酸ポリマーから作製されたｐＨ依存性腸溶コーティング材料を使用して小腸又は大腸に送達される。経口剤形は、活性成分の顆粒又は粒子から形成されている腸溶性圧縮錠剤の形態であり得る。５．０未満のｐＨ（即ち一般に口腔、咽頭、食道、胃に見出される）で不溶性であるが、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５（即ち小腸及び大腸内に存在する）で可溶性の任意の腸溶コーティングを本発明の実践に使用することができる。例えば、大腸へのＳＣＦＡの送達の達成が所望される場合、６．５未満のｐＨで完全又は部分的に不溶性であるが、ｐＨ６．５超で可溶性の任意の腸溶コーティングが好適である。
【００９１】
当業者は、ｐＨが消化管に沿って変動することを認識し、剤形が崩壊して活性成分が胃腸管内の適切な又は所望の位置で放出されることを確実にする好適な腸溶コーティングを決定することができるであろう。
【００９２】
単独で又は他のコーティングと組み合わせて、本明細書に記載される処置方法に使用することができる、活性成分の経口剤形及び／又は顆粒、粒子若しくはビーズの被覆における使用に好適なメタクリル酸コポリマーは、陰イオン性カルボキシルポリマーである。ポリマーは、アクリルポリマーであることが特に好ましく、陰イオン性遊離カルボキシル基とエステル基との比が約１：１である部分メチル−エステル化メタクリル酸ポリマーが最も好ましい。
【００９３】
特に好適なメタクリル酸コポリマーは、Ｒｏｈｍ  Ｐｈａｒｍａ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｗｅｓｔ  Ｇｅｒｍａｎｙにより製造されているＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ（登録商標）、特にＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−３０−Ｄ（登録商標）及びＥｕｄｒａｇｉｔ  １００−５５（登録商標）である。Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−３０−Ｄ（登録商標）では、遊離カルボキシル基とエステル基との比は、およそ１：１である。更に、前記コポリマーは、５．５未満、一般に１．５〜５．５のｐＨ、即ち一般に上部胃腸管の流体中に存在するｐＨを有する胃腸液に不溶性であるが、５．５を超えるｐＨ、即ち下部胃腸管の流体中に存在するｐＨで容易に溶解可能であることが知られている。そのようなコポリマーは、小腸内への活性成分の放出を促進することが意図される腸溶コーティングに有用である。
【００９４】
代替的なコポリマーは、Ｒｏｈｍ  Ｐｈａｒｍａ  ＧｍｂＨ及びＣｏ．ＫＧ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙにより製造されているＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ（登録商標）及びＥｕｄｒａｇｉｔ  ＦＳ３０Ｄ（登録商標）である。Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ（登録商標）は、遊離カルボキシル基とエステル基との比がおよそ１：２であるという点のみＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ  ３０  Ｄ−５５（登録商標）と異なる。Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ（登録商標）も、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ  ３０  Ｄ−５５（登録商標）と同様に５．５未満のｐＨで実質的に不溶性であるが、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ  ３０  Ｄ−５５（登録商標）と異なり、小腸液中に存在するような５．５〜７．０のｐＨを有するＧＩ流体中で僅かに可溶性である。Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ（登録商標）は、ｐＨ７．０以上、即ち一般に末端回腸及び結腸に存在するｐＨで可溶性である。
【００９５】
Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ（登録商標）はまた、単独で、遅延放出機構を介して、大腸（末端回腸よりも遠位）で主に開始するＳＣＦＡ成分の送達を提供するコーティングとして使用することができる。加えて、ｐＨ７．０未満の小腸液中で僅かに可溶性のＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ（登録商標）は、ｐＨ５．５を超える小腸液中で可溶性のＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ  ３０  Ｄ−５５（登録商標）と組み合わせて使用して、活性成分を腸管の様々な区域に送達するように処方され得る遅延放出組成物を達成することができ、より多くのＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ  ３０  Ｄ−５５（登録商標）が使用されると、より近位で放出及び送達が開始し、より多くのＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ（登録商標）が使用されると、より遠位で放出及び送達が開始する。
【００９６】
コーティングは、可塑剤並びにおそらく着色剤、界面活性剤、タルク及び／又はステアリン酸マグネシウム等の他のコーティング賦形剤（それらの多くは、コーティングの分野で周知である）を含むことができ、また通常含むであろう。特に、陰イオン性カルボキシルアクリルポリマーは、通常、１０〜２５重量％の可塑剤、特にクエン酸トリエチル、クエン酸トリブチル、クエン酸アセチルトリエチル、フタル酸ジブチル、フタル酸ジエチル、ポリエチレングリコール、アセチル化モノグリセリド、プロピレングリコール及びトリアセチンを含むであろう。
【００９７】
流動床又はパンコーティング等の従来のコーティング技術がコーティングの適用に使用される。コーティングの厚さは、経口剤形が小腸内の送達の所望の部位に到達するまで本質的に無傷のままであることを確実にするのに十分である必要がある。
【００９８】
経口剤形は、ＳＣＦＡの粒子若しくは顆粒を含む被覆圧縮錠剤、又はＳＣＦＡの粒子若しくは顆粒を含む軟若しくは硬カプセル（例えば、ゼラチン、澱粉又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）（被覆又は非被覆）の形態であり得、それら自体が腸溶コーティングされる。本発明の一実施形態では、錠剤は、圧縮され、錠剤は、腸溶コーティングされる。
【００９９】
時間依存性送達システム及び細菌酵素トリガー性システム
本発明の別の実施形態では、大腸へのＳＣＦＡの送達は、時間依存性送達システムの使用により達成される。胃内容排出後の確立された通過時間を想定すると、ＳＣＦＡ放出（遊離酸又はエステル化酸のいずれかとして）は、大腸の様々なセグメントを標的化することができる。
【０１００】
本発明における使用に好適な時間依存性送達システムへのアプローチとしては、Ｐｕｌｓｉｎｃａｐ（商標）（Ｓｃｈｅｒｅｒ  ＤＤＳ，Ｓｔｒａｔｈｃｌｙｄｅ，Ｕ．Ｋ．）、Ｔｉｍｅ  Ｃｌｏｃｋ（商標）（Ｚａｍｂｏｎ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）及びＳｙｎｃｒｏＤｏｓｅ（商標）（Ｐｅｎｗｅｓｔ，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，ＮＹ）等の装置、並びに経時的に分解して錠剤内容物を放出するヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース又は任意の好適なヒドロゲル等の様々なコーティングが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明の一実施形態において、大腸へのＳＣＦＡの送達は、細菌酵素トリガー性システムの使用によって達成される。薬物放出が結腸内の細菌酵素の作用によりトリガーされる経口剤形は、当該技術分野で既知である。本発明での使用に好適な細菌トリガー性送達システムへの様々な手法としては、ジスルフィドポリマー、グリコシドプロドラッグ及びマトリクス／コーティング剤としての多糖類（Ｗａｔｔｓ＆Ｉｌｌｕｍ、１９９７）が挙げられる。使用に好適な細菌トリガー性送達システムへの更なる手法は、Ｋａｔｓｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）に開示されている。本発明の一実施形態において、結腸標的化送達システムＣＯＤＥＳ（商標）（Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ  Ｐｈａｒｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｒｍａｎ，Ｏｋｌａ．）を使用してＳＣＦＡを結腸に送達する。このシステムは、ＳＣＦＡ含む錠剤コア及び糖類を含み、錠剤コアは、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｅ（登録商標）等の酸溶性材料で被覆された後、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ（登録商標）等の腸溶コーティングで被覆されている。腸溶コーティングは、胃内での分解から剤形を保護し、続いて胃内容排出後に小腸内で溶解する。酸溶性コーティングは、剤形が小腸内を進む際に分解から保護する。剤形が大腸に到達した際、局所細菌叢は、錠剤コア中の糖類（例えば、ラクツロース）を発酵させて、短鎖脂肪酸（イソブチレート、ブチレート、イソバレレート、バレレート、イソカプロエート及びカプロエート等）とし、次いで、これらは、酸溶性コーティングを溶解してコア錠剤内容物を結腸内に放出する。
【０１０２】
従って、ＣＯＤＥＳシステムの使用により、それを必要とする個体の結腸へ増大された量の酪酸を提供するなお更なる手段が提供される。従って、また更なる実施形態において、本発明は、治療的有効量の酢酸、そのエステル又は塩を含む医薬剤形を個体に投与することを含む、個体の結腸へのＳＣＦＡの提供を想定し、剤形は、錠剤コア、糖類、酸溶性腸溶コーティングの形態の内側腸溶コーティング（Ｅｕｇｒａｄｉｔ  Ｅ等）及び外側腸溶コーティング酸抵抗性腸溶コーティング（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ等）を含む。
【０１０３】
更なる実施形態において、剤形は、錠剤コア中の治療的有効量の酪酸、そのエステル又は塩も含む。
【０１０４】
当業者は、圧力依存性システム、ＣＯＤＥＳ（商標）技術、マイクロスポンジ、ペクチン及びガラクトマンナンコーティング、微生物トリガー性浸透圧システム及びレクチンを含む、ＳＣＦＡの結腸標的化送達に使用され得る別法に精通しているであろう。
【０１０５】
経口使用のための製剤は、硬ゼラチンカプセル剤として提示され得、ここで、ＳＣＦＡは、不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合されるか、又は軟ゼラチンカプセル剤として提示され得、ここで、ＳＣＦＡは、水又は油媒体、例えばピーナッツ油、流動パラフィン又はオリーブ油と混合される。
【０１０６】
水性縣濁液は、水性縣濁液の製造に好適な賦形剤との混合物中にＳＣＦＡを含むことができる。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントガム及びアカシアガムであり、分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、例えばポリオキシエチレンステアレート、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合物、例えばポリエチレンモノオレイン酸ソルビタンであり得る。水性縣濁液は、１種以上の保存剤、例えばエチル、又はｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエート、１種以上の着色剤、１種以上の香味剤及び１種以上の甘味剤、例えばショ糖又はサッカリンも含むことができる。
【０１０７】
油性縣濁液は、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油又流動パラフィン等の鉱物油中にＳＣＦＡを懸濁させることにより処方され得る。油性縣濁液は、増粘剤、例えば蜜ろう、固形パラフィン又はアセチルアルコールを含むことができる。上記に示したもの等の甘味剤及び香味剤を添加して美味な経口製剤を提供することができる。これらは、アスコルビン酸等の抗酸化剤の添加により保存され得る。
【０１０８】
水の添加による水性縣濁液の製剤に好適な分散性粉末散剤及び顆粒は、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び１つ以上の保存剤との混合物におけるＳＣＦＡを提供する。好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤は、上記に既に言及したものにより例示される。追加の賦形剤、例えば甘味剤、香味及び着色剤も存在することができる。
【０１０９】
本発明の医薬組成物は、水中油エマルションの形態であり得る。油性相は、植物油、例えばオリーブ油若しくはラッカセイ油、又は鉱物油、例えば流動パラフィン、或いはこれらの混合物であり得る。好適な乳化剤は、天然に存在するガム、例えばアカシアガム又はトラガカントガム、天然に存在するホスファチド、例えば大豆、レシチン及び脂肪酸、並びにヘキシトール無水物から誘導されたエステル又は部分エステル、例えばモノオレイン酸ソルビタン及び前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えばポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタンであり得る。エマルションは、甘味剤及び香味剤を含み得る。
【０１１０】
シロップ剤及びエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はショ糖を用いて処方され得る。これらは、粘滑薬、保存剤並びに香味剤及び着色剤も含むことができる。
【０１１１】
直腸坐薬
本発明の方法は、直腸坐薬として提供される医薬剤形を介して大腸内にＳＣＦＡを提供することも想定している。従って、特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＳＣＦＡの直腸投与のための坐薬として処方される。これらの製剤は、ＳＣＦＡを好適な非刺激性賦形剤と混合することにより調製することができ、その賦形剤は、常温で固体であるが、直腸温度で液体であり、従って直腸内で融解して薬物を放出するであろう。そのような材料としては、ココアバター及びポリエチレングリコールが挙げられる。直腸投与は、活性薬剤の経口投与に関連した胃腸管内の腸肝初回通過効果を排除するのに使用することができる。また更なる実施形態では、直腸坐薬は、エステル化加工澱粉として提供されるＳＣＦＡを含むことができ、直腸内で加工澱粉を放出した際、澱粉は、消化及びその結果の消化代謝物としてのＳＣＦＡの放出のために常在細菌叢に利用可能となる。
【０１１２】
注射用製剤
本発明は、ＳＣＦＡの全身送達のための注射用医薬製剤の使用も含む。例えば、ＳＣＦＡは、自己免疫疾患の処置又は予防が必要な個体の血流中へ直接注射され得る。注射は、静脈内又は動脈内注射に適合され得る。代替的な実施形態では、注射用製剤は、局所投与又は血流への遅延放出のいずれかを促進するために皮下注射に適合され得る。
【０１１３】
本発明の医薬組成物は、無菌注射用水性又は油性縣濁液の形態であり得る。この縣濁液は、上記で言及した好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、当該技術分野で既知のように処方することができる。医薬組成物はまた、無毒の非経口的に容認可能な希釈剤又は溶媒中の、例えば１，３−ブタンジオールの溶液としての無菌注射用溶液又は縣濁液であり得る。使用できる容認可能なビヒクル及び溶媒は、特に水、リンゲル液及び等張の塩化ナトリウム溶液である。加えて、溶媒又は懸濁媒体として無菌固定油が都合よく使用される。これを目的として、合成モノ又はジグリセリドを含む刺激の少ない任意の固定油が使用され得る。加えて、オレイン酸等の脂肪酸が注射剤の製剤に有用である。
【０１１４】
本発明の医薬組成物は、投与単位形態で都合よく提示することができ、薬学の分野で周知の方法のいずれかにより調製することができる。全ての方法は、ＳＣＦＡを薬学的に許容される賦形剤と組み合わせるステップを含み、その賦形剤は、１つ以上の付属成分を構成する。一般に、医薬組成物は、ＳＣＦＡを均一且つ密接に液体担体若しくは微粉化固体担体又は両方と結合させた後、必要に応じて所望の製剤に成形されることにより調製される。
【０１１５】
本発明の医薬組成物はまた、リポソーム中に処方され得る。当該技術分野で既知のように、リポソームは、一般にリン脂質又は他の脂質物質から誘導される。リポソームは、水性媒体中に分散されたモノ又はマルチラメラ水和液晶によって形成されている。リポソームを形成可能な任意の無毒の生理学的に許容される及び代謝可能な脂質を使用することができる。リポソーム製剤は、安定剤、保存剤、賦形剤等を含むことができる。好ましい脂質は、天然及び合成の両方のリン脂質及びホスファチジルコリンである。リポソームの形成方法は、当該技術分野で既知である。
【０１１６】
本発明の医薬組成物は、投与のための使用説明書と共に容器、パック又はディスペンサー内に収容され得る。医薬組成物のＳＣＦＡ及び場合により追加の活性薬剤は、容器、パック又はディスペンサー内に別個の構成要素として提供されて、使用又は本明細書に記載される本発明の方法において同時に又は異なる時間に別々に又は一緒に摂取され得る。
【０１１７】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」は、担体、希釈剤又は賦形剤がそれらのレシピエントに対して有害でないことを意味する。
【０１１８】
本明細書で特に示さない限り、用語「組成物」及び「製剤」は、交換可能に使用される。
【０１１９】
用語「〜の投与及び又は「投与する」は、処置を必要とする個体に提供することを意味すると理解する必要がある。
【０１２０】
食物薬剤
アシル化高アミロース澱粉は、既知である。例えば、そのような澱粉は、米国特許第５，８４０，８６０号及びＡｎｎｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている（実施例１、３、５、６及び８を特に参照する）。詳細には、アセチル化高アミローストウモロコシ澱粉（ＨＡＭＳＡ）、ブチリル化高アミローストウモロコシ澱粉（ＨＡＭＳＢ）及びプロピオネート高アミローストウモロコシ澱粉（ＨＡＭＳＰ）は、エステル化脂肪酸を含まない高アミローストウモロコシ澱粉（ＨＡＭＳ）のように既知である。これらのアシル化澱粉の使用は、個々に既知であるが、これらの澱粉の組み合わせの使用は、今まで想定されていなかった。
【０１２１】
本発明者らは、驚くべきことに、高投与量のアセテート及びブチレートの組み合わせを、食物を介して送達することは、自己免疫疾患、特に１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の発生及び悪化に高く影響する単純な手法であることを見出した。食物及び細菌代謝物は、Ｔ１Ｄ及び他の自己免疫疾患を予防又は処置する医薬手法の非常に有望な代替物を提供する。
【０１２２】
本発明の方法は、非常に高いレベルのＳＣＦＡを下部結腸内で放出することを可能にし、これは、食物繊維の摂取のみで得られるものよりも有意に高いレベルである。詳細には、本明細書に記載されるアシル化澱粉は、個体の小腸内での分解に抵抗性であり、通常の食物に見出される澱粉よりも大量の脂肪酸を有するため、本明細書に記載される食物薬剤及び食物は、個体の大腸内への有意により高い用量の短鎖脂肪酸の提供を可能にし、短鎖脂肪酸は、利便性の高い安全な形態で個体によって投与又は摂取され得る。
【０１２３】
本発明の方法で使用される食物薬剤の調製のための例示的な方法を本明細書に更に記載する。
【０１２４】
食物代謝物は、腸内の異常又は免疫ホメオスタシスを多くのレベルで修正し、自己反応性Ｔ細胞の数を制限し、疾病を予防するように機能する。本発明の１つの重要な特徴は、大量のアセテート、天然産物の食物送達が全動物においてＢ細胞分子プロファイルの変化を達成することが示されたことである。更に、ブチレートは、アセテートに関して記載されているものと異なり、Ｔｒｅｇ関連経路を介してＴ１Ｄに対して保護することが見出された。従って、特に高アセテート及びブチレートの組み合わせ処置は、結腸内に存在する細胞のみでなく、免疫系の細胞を操作するための刺激的且つ単純な手段である。
【０１２５】
腸管細菌叢は、食物の変化に急速に応答し（Ｆａｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｚｅｌａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、特定の食物の長期の使用は、適応変異に起因して、ストレスを受けた及び競争力のない細菌の枯渇と、より高速で成長する新しい株の出現とを可能にする。要約すれば、本発明者らは、食物代謝物の使用に対するアプローチが自己免疫病態形成の崩壊のための新規且つ効果的な手段を提供することを示した。
【０１２６】
従って、本発明は、２種以上の短鎖脂肪酸を個体の大腸内に送達するための食物薬剤であって、複数の短鎖脂肪酸に共有結合された担体を含み、短鎖脂肪酸は、酢酸、酪酸及びプロピオン酸の２種以上を含み、短鎖脂肪酸は、遊離脂肪酸を与えるために、個体の結腸内で加水分解性である結合によって担体に結合される、食物薬剤を更に提供する。
【０１２７】
例えば、一実施形態において、担体の各分子は、酢酸及び酪酸部分を含む。代替的な実施形態では、担体の各分子は、酢酸及びプロピオン酸部分又はプロピオン酸及び酪酸部分を含む。更なる実施形態において、担体の各分子は、少なくとも１つの酢酸、少なくとも１つの酪酸及び少なくとも１つのプロピオン酸分子を含む。また更なる実施形態において、担体の各分子は、複数のＳＣＦＡ部分を含み、ＳＣＦＡは、酢酸、酪酸又はプロピオン酸の２種以上の組み合わせである。
【０１２８】
好ましい実施形態において、担体分子は、炭水化物であるが、他の担体を使用できることが当業者により認識されるであろう。炭水化物は、ペクチン、ガム、粘液、セルロース、ヘミセルロース、イヌリン又はオリゴ糖であり得る。炭水化物は、澱粉であることが好ましい。
【０１２９】
更なる別の好ましい実施形態では、本発明の食物薬剤は、２種の異なるＳＣＦＡでアシル化された澱粉分子を含む。例えば、澱粉は、複数の酪酸及び酢酸部分の両方でアシル化され得る。更なる実施形態において、澱粉は、複数の酪酸、酢酸及びプロピオン酸部分でアシル化される。
【０１３０】
本発明は、様々な置換度を有する様々な担体分子も想定している。例えば、担体が澱粉分子の場合、本発明は、０．０５〜１．０、好ましくは０．１〜０．８の範囲、より好ましくは０．５の置換度を想定している。置換度０．５は、澱粉分子全体の平均で２つのグルコース分子当たり１つの短鎖脂肪酸部分が存在することを意味する。当業者は、短鎖脂肪酸部分の存在が澱粉分子の長さに沿って必ずしも均一ではなく、平均の短鎖脂肪酸部分の数を表すことを認識するであろう。当業者は、２つの短鎖脂肪酸部分が澱粉の単一分子上に存在する場合、置換度０．５が、澱粉分子上に等量の各短鎖脂肪酸部分が存在すると仮定して、４分子当たりほぼ１つの１タイプの短鎖脂肪酸を示すことも認識するであろう。
【０１３１】
組み合わせ食物
本発明は、本明細書に記載される処置方法における使用のために少なくとも２つの食物薬剤を個体において提供することにも関することが認識されるであろう。例えば、食物薬剤は、それぞれ個体の大腸へ単一種の短鎖脂肪酸を送達するためのものであり得、各薬剤は、担体を含み、担体の各分子は、遊離脂肪酸を与えるために、個体の結腸内で加水分解性である結合によって短鎖脂肪酸分子に共有結合される。担体上の各脂肪酸の置換度は、０．１〜０．５、好ましくは０．１５〜０．２０である。
【０１３２】
従って、本発明は、組み合わせ食物であって、それを必要とする個体の食物中に２種以上の短鎖脂肪酸を提供するために、上述した２種以上の食物薬剤を含む組み合わせ食物にも関する。
【０１３３】
好ましくは、組み合わせ食物は、アセチル化澱粉及びブチリル化澱粉の組み合わせを含み、それらの各々は、米国特許第５，８４０，８６０号に記載されているように調製される。別の実施形態では、組み合わせ食物は、アセチル化澱粉及びプロピオニル化澱粉の組み合わせを含む。また更なる実施形態では、組み合わせ食物は、ブチリル化澱粉及びプロピオニル化澱粉の組み合わせを含む。
【０１３４】
単一種の短鎖脂肪酸を含む食物薬剤の調製方法は、既知であり、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４０，８６０号に記載され、更に実施例に記載されている。
【０１３５】
投与量
本方法は、短鎖脂肪酸の一連の投与量の提供を想定している。用量は、ＳＣＦＡの投与モード、ＳＣＦＡが提供される形態（例えば、経口剤形、注射又は食物薬剤として）及び短鎖脂肪酸の意図される作用部位に応じて変動し得ることが認識されるであろう。
【０１３６】
好ましくは、方法が個体の大腸内への短鎖脂肪酸の組み合わせの送達のための経口剤形の投与を含む場合、用量は、１日当たりおよそ０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。最も好ましい実施形態では、酢酸、酪酸又はプロピオン酸の任意の１つの１日用量は、３、４、５、６、７、８及び９ｍｇ／ｋｇを含む２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１３７】
本発明の方法が、短鎖脂肪酸の組み合わせを大腸内に送達するための食物薬剤又は組み合わせ食物の使用に関する状況では、当業者は、消費される薬剤又は食物の量が、食物の組成及び食物薬剤中に含まれる担体分子に組み込まれた各短鎖脂肪酸の割合に応じて変動することを認識するであろう。
【０１３８】
本方法が、単一担体分子に結合された２つの短鎖脂肪酸の組み合わせを含み、且つ担体が置換度０．４（即ちおよそ２．５分子毎に１短鎖脂肪酸）を有する澱粉である食物薬剤の提供に関する一実施形態において、投与量は、５０ｋｇ個体の場合、１日当たり澱粉およそ１ｇ〜澱粉４０ｇ、好ましくは１日当たり澱粉１ｇ〜１日当たり澱粉１０ｇ（即ち１日当たり０．０２ｇ〜０．２ｇ／ｋｇ）であろう。より好ましくは、用量は、１日当たり２ｇ〜８ｇ（１日当たり０．０４ｇ／ｋｇ〜０．１６ｇ／ｋｇ）であろう。より好ましくは、用量は、５０ｋｇ個体の場合、１日当たりおよそ３．７５ｇの澱粉分子（即ち０．０７５ｇ／ｋｇ／日）である。これは、澱粉分子中に各短鎖脂肪酸が等しい割合で存在すると仮定した場合、およそ２５０ｍｇ〜３００ｍｇの各短鎖脂肪酸に対応する。
【０１３９】
代替的に、本方法は、２種の短鎖脂肪酸を提供するように組み合わされたアシル化澱粉の２つの形態からなる組み合わせ食物の投与も含み得る。例えば、酢酸で修飾されており、置換度０．２（即ち平均で５グルコース分子当たり１酢酸）を有する澱粉は、１日当たり０．０４ｇ／ｋｇ〜０．１６ｇ／ｋｇ、より好ましくは１日当たり０．０５ｇ／ｋｇ〜０．１ｇ／ｋｇ、更により好ましくは０．０７５ｇ／ｋｇ／日の用量で使用され得る。
【０１４０】
投与
一実施形態において、ＳＣＦＡは、大腸の細胞をＳＣＦＡと接触させるために、個体の大腸内で放出されるように個体において提供される。これは、個体の結腸内でＳＣＦＡを放出するように処方された、経口投与のための腸溶性剤形の使用を含む多数の手段により達成することができる。代替的に、ＳＣＦＡは、直腸投与のための医薬剤形で提供され得る。
【０１４１】
本発明の医薬組成物は、任意の好適な手段により、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒若しくは散剤の形態等で経口的に；舌下に；頬側に；皮下、静脈内、筋内、腹腔内若しくは大槽内注射若しくは注入技術による等、非経口的に（例えば、無菌の注射のための水性若しくは非水性の溶液若しくは縣濁液）；吸入噴霧による等、鼻腔内に；クリーム若しくは軟膏の形態等で局部的に；又は坐薬若しくは浣腸の形態等で直腸内に；無毒の薬学的に許容されるビヒクル又は希釈剤を含む投与量単位製剤で投与することができる。これらは、例えば、即時放出又は持続放出に好適な形態において、例えば皮下インプラント、封入スフェロイド又は浸透圧ポンプ等の装置の使用により投与され得る。
【０１４２】
代替的な実施形態において、本発明の方法は、本明細書に記載される食物薬剤又は組み合わせ食物を介したＳＣＦＡの投与を含む。
【０１４３】
また更なる実施形態において、本発明は、ＳＣＦＡの第１の種が１つの投与手段により投与され、ＳＣＦＡの第２の種が代替的な手段により投与され得るように、２つ以上の投与手段によりＳＣＦＡを提供することを想定している。例えば、一実施形態において、本発明は、第１のＳＣＦＡを経口剤形の投与により提供し、第２のＳＣＦＡを静脈内注射に適合された剤形の静脈内注射により提供することを含み得る。これは、酪酸等の初回通過代謝に感受性のＳＣＦＡの投与に特に有用であり得る。しかしながら、当業者は、任意の数の組み合わせを、必要とする個体にＳＣＦＡを提供するのに使用できることを認識するであろう（即ち医薬剤形の組み合わせ、食物薬剤の組み合わせ及び医薬剤形又は食物薬剤の組み合わせ）。
【０１４４】
従って、一実施形態において、本発明は、自己免疫疾患の予防又は処置を、それを必要とする個体において行う方法であって、ＳＣＦＡの第１の種を含む第１の医薬剤形と、ＳＣＦＡの第２の種を含む第２の医薬剤形とを個体に投与することを含み、第１の医薬剤形は、非経口注射に適合され、第２の医薬剤形は、経口投与に適合される、方法を含む。
【０１４５】
好ましい実施形態において、本発明は、自己免疫疾患の予防又は処置を、それを必要とする個体において行う方法であって、酪酸、そのエステル又は塩を含む第１の医薬剤形と、酢酸、そのエステル又は塩を含む第２の医薬剤形とを個体に投与することを含み、第１の医薬剤形は、非経口注射に適合され、第２の医薬剤形は、経口投与に適合される、方法を含む。
【０１４６】
更なる代替的な実施形態において、自己免疫疾患の予防又は処置を、それを必要とする個体において行う方法であって、酢酸、そのエステル又は塩を含む第１の医薬剤形と、酪酸、そのエステル又は塩を含む第２の医薬剤形とを個体に投与することを含み、第１の医薬剤形は、非経口注射に適合され、第２の医薬剤形は、経口投与に適合される、方法を提供する。
【０１４７】
代替的に、本発明は、自己免疫疾患の予防又は処置を、それを必要とする個体において行う方法であって、酢酸、そのエステル又は塩を含む医薬剤形と、酪酸、そのエステル又は塩を含む食物薬剤とを個体に投与することを含む方法を提供する。医薬剤形は、非経口注射（静脈内又は皮下注射を含む）、経口投与に適合されるか又は直腸坐薬として適合され得る。
【０１４８】
併用療法
本発明は、本明細書に記載される医薬製剤、食物薬剤又は組み合わせ食物を他の方法と組み合わせて使用して、自己免疫疾患の処置又は予防を必要としている個体の大腸に高いレベルのＳＣＦＡを提供することを想定している。
【０１４９】
例えば、本発明の方法は、プレバイオティクス又はプロバイオティクスを含む１種以上の薬剤の、個体への予めの、同時の又は連続した提供を含み、その薬剤は、個体の腸内のマイクロバイオームの組成を変化させるために使用され得る。当業者は、そのようなプレ又はプロバイオティクスが遺伝子改変細菌又は非遺伝子改変細菌を含むことを認識するであろう。
【０１５０】
更に、本発明はまた、本明細書に記載される医薬製剤、食物薬剤又は組み合わせ食物を、自己免疫疾患を予防又は処置する他の方法と組み合わせて使用することを想定している。
【０１５１】
Ｉ型糖尿病の処置に関連して、本発明は、インスリン注射の投与と、本明細書に記載される方法のいずれかによるＳＣＦＡの投与とを含む併用療法を想定している。例えば、一実施形態において、本発明は、ＳＣＦＡの２種以上を、Ｉ型糖尿病と診断された個体の大腸内に遅延放出するように適合された経口剤形を、それを必要とする個体に投与することを想定し、ここで、個体は、インスリンの皮下注射を更に受容している。
【０１５２】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｉ型糖尿病の処置を、それを必要とする個体において行う方法であって、
治療的有効量の酢酸及び酪酸、それらの塩又はエステルを含む経口剤形であって、酢酸及び酪酸、それらの塩又はエステルは、個体の大腸内に遅延放出するように適合される、経口剤形と、
治療的有効量のインスリンと
を個体に投与することを含み、それにより個体におけるＩ型糖尿病を処置する、方法に関する。
【実施例】
【０１５３】
実施例１：動物研究
実験方法
動物及びモデル
ＮＯＤ／Ｌｔ（ＮＯＤ）、Ｃ５７ＢＬ／６及びＮＯＤ．８．３マウスは、Ｍｏｎａｓｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ由来のものであった。両方ともＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドの、Ｇｐｒ４３−／−マウス（Ｍａｓｌｏｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）及びＭｙＤ８８−／−マウス（Ｓｈｉｚｕｏ  Ａｋｉｒａから取得）をＮＯＤバックグラウンドに対して＞１０回戻し交配した。ＧＦ  ＮＯＤマウスは、Ｇｅｒｍ  Ｆｒｅｅ  Ｕｎｉｔ（Ｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｉｚａ  Ｈａｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）由来のものであった。ＮＯＤ．ＦｏｘＰ３−ＧＦＰマウス（ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔ−Ｔｇ（ＦｏｘＰ３−ＥＧＦＰ／ｃｒｅ）１ｃＪｂｓ／Ｊは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡ）から取得した。
【０１５４】
細菌叢を標準化するために、食餌を開始する前に多数のリターからのマウスを混合し、無作為にグループに割り当てた。使用した精製食物は、以前に記載されているＡＩＮ９３−Ｇ食物のバランスのとれた改変物に基づいていた（Ｂａｊｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。マウスに３、５又は１０週齢で開始して３〜５週間給餌した。糞便、血液及び盲腸内容物中のＳＣＦＡを以前に記載されているように分析した（Ｂａｊｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。以前に記載されているように糖尿病を監視した（Ｍａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１５５】
マウスに関与する全実験手順は、関連するＡｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｍｏｎａｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａにより承認されたプロトコルに従って行った。
【０１５６】
動物食物
対照（ＬＡＭＳ）並びにアセチル化（ＨＡＭＳＡ）、プロピオニル化（ＨＡＭＳＰ）及びブチリル化（ＨＡＭＳＢ）澱粉食物は、以下の成分を含んでいた。
【０１５７】
【表１】
2019527714.tif 000002
【０１５８】
フローサイトメトリー並びにリポ多糖及びサイトカイン測定
単核細胞の免疫表現性分析は、以下のｍＡｂｓを使用した：ＣＤ３ｅ（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ２５（ＰＣ６１）、ＣＤ８α（Ｌｙ２）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＩｇＭ（１１／４１）、ＣＤ４５ＲＢ（１６Ａ）、ＭＨＣ  ＩＩ（Ｉ−Ａｋ）（ＡＢｋ）（１０−３．６）、ＭＨＣ  Ｉ（Ｈ−２Ｋｄ）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）（ＧＬ１）、ＣＤ８０（Ｂ７−１）（１６−１０Ａ１）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、ＣＤ１０３（２Ｅ７）、ＦｏｘＰ３（ＦＪＫ−１６  ｓ）。アイソタイプ対照は、ＩｇＧ１、λ；ＩｇＧ；ＩｇＧ２ａ、κを含んでいた。使用した細胞内タンパク質：Ｍａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２に記載されているＩＬ−１０（ＪＥＳ５−１６Ｅ３）、ＨＥＬＩＯＳ（２２Ｆ６）及びＦｏｘＰ３を製造業者の転写因子染色プロトコルの通りに検出した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。全Ａｂｓは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ又はＢｉｏｌｅｇｅｎｄからであった）。染色サンプルをＦＡＣＳＤｉｖａソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウエアバージョン９．３．２（Ｔｏｍｙ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）を有するＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを使用して分析した。脾臓及びＰＬＮ  Ｔ細胞をＰＥ標識ＩＧＲＰ２０６−２１４（Ｈ−２Ｋ（ｄ）、ＶＹＬＫＴＮＶＦＬ）４量体、ＰＥ標識ＩＡｇ７／ＢＤＣ２．５ｍｉ（ＡＨＨＰＩＷＡＲＭＤＡ）４量体で染色した。ＰＥ標識ＴＵＭ（Ｈ−２Ｋ（ｄ）、ＫＹＱＡＶＴＴＴＬ）４量体及びＰＥ標識ＩＡｇ７／ヒトＣＬＩＰ  ８７−１０１（ＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ）４量体をＭｉｍｏｔｏｐｅｓ  ＰＴＹ  ＬＴＤ，Ａｕｓｔｒａｌｉａからのペプチドと共に全実験で負の対照として使用した（ＮＩＨ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ａｔｌａｎｔａ，ＵＳＡから提供）。
【０１５９】
ＴＮＦαを、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−２１をＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用したＥＬＩＳＡにより、並びにＩＬ−２２及びＴＧＦβをビオチン化抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）により測定した。血漿リポ多糖（ＬＰＳ）を、ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎアッセイキット（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ  Ｉｎｃ．）により製造業者のマニュアルに従って測定した。
【０１６０】
細菌ＤＮＡ配列決定及びバイオインフォマティクス
糞便からの細菌ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ便ミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出した。ＤＮＡサンプルを、細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１−Ｖ３領域を標的化して、フォワードプライマー５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧ３’；及びリバースプライマー、５’ＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴ３’を使用して増幅し、Ｒｏｃｈｅ  ４５４  ＧＳ  ＦＬＸ＋配列決定装置を使用して配列決定した。
【０１６１】
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ（ＱＩＩＭＥ）ソフトウエアへのＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓを用いてバイオインフォマティクス分析を行った。Ｐｉｎｔａｉｌアルゴリズム（Ａｓｈｅｌｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）を使用してキメラ配列を検出及び除去し、アカシア（Ｂｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）によりノイズ除去及びエラー修正した。ＯＴＵを、ＱＩＩＭＥのｕｃｌｕｓｔアルゴリズムを使用して９７％配列同一性で選択した。分類学は、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓデータベースに対してＢＬＡＳＴを使用してＱＩＩＭＥにおいて割り当てた（ＤｅＳａｎｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＥｚＴａｘｏｎデータベースを使用して、代表的ＯＴＵ配列を培養可能な株のデータベースと更に比較した（Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ネットワークをＣａｌｙｐｓｏ（ｈｔｔｐ：／／ｃｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｌｙｐｓｏ／）で可視化した。
【０１６２】
粘膜固有層Ｔｒｅｇ細胞単離、養子移植
結腸粘膜固有層リンパ球を以前に記載されたように調製した（Ａｒｐａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの養子移植のために、ＮＯＤマウスに様々な食物を５週齢で開始して１０週間給餌した。１５週目にマウスを選別し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＬＳ  ＭＡＣＳ分離カラムを有するＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  ＩｓｏｌａｔｉｏｎキットＩＩを使用して、≧９５％純度で総Ｔ細胞を脾臓、末梢リンパ節から単離し、ＮＰ食物を給餌した８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに静脈内注射し、糖尿病発生に関して監視した。Ｔｒｅｇ変換分析のために、ＣＤ３＋Ｂ２２０−Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞を、Ｉｎｆｌｕｘ選別機を使用して選別し（＞９５％純度）、ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ給餌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにｉ．ｖで移植した。ＮＯＤ．８．３  ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移植のために、ＮＯＤ．８．３マウスの脾臓、ＰＬＮ及びＭＬＮからのリンパ球を、ＭＡＣＳ  ＣＤ８α＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して精製した。５ｘ１０６ＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢを２週間にわたって予め給餌したＮＯＤレシピエントに静脈内注射した。マウスは、移植後４日間同じ食物を継続し、その時点で脾臓、ＰＬＮ及びＭＬＮリンパ球を回収し、ＣＦＳＥ希釈によりＣＤ８＋Ｔ細胞増殖に関して分析した。
【０１６３】
病理組織学
標準的な手順を用いて膵臓組織を処理及び染色した。膵島炎点数化のために、膵臓切片を３つの濃度（１００μｍ離して）で採取した。５〜１５マウスからの少なくとも１００膵島を点数化した。以下のシステムに従って膵島を類別した：グレード０  −  膵島炎の徴候なし、グレード１  −  ＜２５％浸潤、グレード２  −  ２５〜５０％浸潤、グレード３  −  ５０〜７５％浸潤及びグレード４  −  ＞７５％浸潤。
【０１６４】
腸内細菌叢の経口経管栄養
糞便及び盲腸内容物を収集し、脱酸素化ＰＢＳ中に材料１００μｇとＰＢＳ  １ｍｌの比で再懸濁した。次いで、混合物をホモジナイズし、１０００ｒｐｍで５分間沈降させ、上清を経管栄養に使用した。妊娠ＧＦ  ＮＯＤマウス及びそれらの子に、８〜１０週齢のＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ給餌ＮＯＤドナーからの２００μｌの糞便及び盲腸ミックスを経管栄養した。母親は、妊娠のＥ１８及び出産後２週間にわたりミックスの２つの経口経管栄養を受容した。子は、離乳時（２０〜２６日齢）、２４時間以内にミックスの２つの経口経管栄養を受容した。次いで、子の疾病発生率を追跡した。
【０１６５】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を（Ｔｈｏｒｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）に記載されているように行った。手短には、選別したＣＤ４＋ＣＤ２５−（＞９５％純度）Ｔ細胞を０．６％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＰＢＳで洗浄した後、ＮＰ−４０溶解緩衝液（０．５％のＮＰ−４０、ｐＨ７．４の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及びプロテアーゼ阻害剤）で溶解し、次いでＳＤＳ溶解緩衝液（１％のＳＤＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．１の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤）で溶解した。Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を使用して、ＤＮＡを４℃で２０ｓｅｃオン、３０ｓｅｃオフの３０サイクルで超音波処理した。超音波処理したクロマチン生成物を１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ中で希釈した。ＣｈＩＰをＩｇＧ対照、抗ヒストンＨ３、抗アセチル−ヒストンＨ３（Ｌｙｓ９）又は抗過アセチル化ヒストンＨ４（Ｐｅｎｔａ；Ｋ５、８、１２、１６及び２０アセチル化）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）のいずれかを用いて行った。クロマチンをタンパク質Ａ／Ｇ−セファロースで単離し、低塩緩衝液（０．１％のＳＤＳ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．１の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び２ｍＭのＥＤＴＡ）、高塩緩衝液（０．１％のＳＤＳ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、５００ｍＭのＮａＣｌ及び２ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、ＬｉＣｌ緩衝液（０．５％のＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸塩、ｐＨ８．１の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２５ＭのＬｉＣｌ）中で希釈した。ＤＮＡを溶離緩衝液（１％のＳＤＳ及び１００ｍＭのＮａＨＣＯ３）中に回収し、６５℃での高塩処理（２００ｍＭのＮａＣｌ）により脱架橋し、プロテイナーゼＫ（４０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．１の４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ）により５０℃で処理した。ＤＮＡをＦｏｘｐ３プロモーター（Ｆ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ、Ｒ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  Ｇ）に特異的なプライマーを使用したｑＰＣＲ用に単離した。アセチル化の倍数増加をＨ３に対して示す。
【０１６６】
リアルタイムＰＣＲ分析及びＴｒｅｇ細胞の単一細胞発現解析
結腸からのＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡの増幅にオリゴ（ｄＴ）１８プライマーを使用して、ＢｉｏｌｉｎｅのＴｅｔｒｏ  ｃＤＮＡ合成キットを使用してｃＤＮＡに変換した。ＢｉｏｎｅｅｒのＡｃｃｕｐｏｗｅｒ  ２ｘ  Ｇｒｅｅｎｓｔａｒ  ｑＰＣＲマスターミックスを使用して、ＢｉｏｒａｄのＣｆｘ３８４リアルタイムシステム上でｑＰＣＲを行った。全発現をハウスキーピング遺伝子β−アクチンに対して標準化した。プールしたＰＬＮ（ｎ＝１０マウス）からのＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ低ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を個々に９６ウェルｑＰＣＲプレート（Ｉｎｆｌｕｘ細胞選別機器、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内に直接選別した。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｏ  ＣＴキットを使用して、製造業者の使用説明書に従って単一細胞ＰＣＲを行った。Ｂｉｏｍａｒｋ機器（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用して、以前記載されたように（Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）単一細胞発現解析を行った。結果をＬｏｇ２Ｅｘ＝−（Ｃｑ［遺伝子］−ＬＯＤ）として表す。Ｌｏｇ２Ｅｘ値が負の場合、Ｌｏｇ２Ｅｘ＝０である。
【０１６７】
ＲＮＡ−ｓｅｑ
ＲＮｅａｓｙ  Ｑｉａｇｅｎキットを使用してＲＮＡ抽出を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  １００ベースＨＴモード配列決定化学、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  １５００レーン当たりバーコード化サンプルを使用して、断片末端読み取りフォーマット（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｅｎｄ  ｒｅａｄ  ｆｏｒｍａｔ）で、ＲＮＡｓｅｑ配列決定を用いてｃＲＮＡを全マウスゲノムアレイにハイブリダイズした。手短には、４食物ｘ４複製由来のＲＮＡサンプルを、単一末端配列決定を用いて１サンプル当たり約２０００万読み取りを配列決定した。
【０１６８】
表１（ａ）１５週齢のＨＡＭＳＡ対ＨＡＭＳ給餌雌ＮＯＤマウス、ＨＡＭＳＢ対ＨＡＭＳ給餌雌ＮＯＤマウス、及びＨＡＭＳＡ対ＨＡＭＳＢ給餌雌ＮＯＤマウスからの脾臓ＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞における差次的発現転写産物である。遺伝子発現における平均倍数変化である。ｑ＜０．０５のＦＤＲカットオフを用いてグループ間の差次的発現遺伝子を規定した。ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ発現解析のためのｍＲＮＡの増幅に使用したオリゴ（ｄＴ）１８プライマーのリストである。
【０１６９】
【表２】
2019527714.tif 000003
【０１７０】
【表３】
2019527714.tif 000004
【０１７１】
統計的分析
２つの独立グループを比較する統計的有意性を、ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＰ値を計算することにより決定した。全食物データに関して以下の比較を行った：（１）ＮＰ対ＨＡＭＳ、（２）ＨＡＭＳ対ＨＡＭＳＡ、（３）ＨＡＭＳ対ＨＡＭＳＢ、（４）ＮＰ対ＨＡＭＳＡ、（５）ＮＰ対ＨＡＭＳＢ。糖尿病発生率研究をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロットとしてグラフ化し、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定を使用して自由度２で分析した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【０１７２】
結果
腸微生物代謝物は、糖尿病に対する保護と相関する
ＳＰＦ  ＮＯＤ．ＭｙＤ８８−／−マウスにおけるＳＣＦＡアセテートの末梢血濃度は、年齢及び性別一致ＮＯＤマウスと比較して非常に上昇した（２〜３倍）（図１ａ）。これは、ＳＰＦ  ＮＯＤ．ＭｙＤ８８−／−マウスの糞便におけるアセテートの高濃度とも一致し（図９ｂ）、ＳＣＦＡ生成細菌と保護との間の正の関係が示唆される。ブチレートも末梢血中で増大していた（図１ａ）が、この代謝物は、通常の条件下でかろうじて検出可能である。ＳＰＦ  ＮＯＤマウス（５〜２０μＭ）と比較して、肝門脈血中の高濃度のブチレートがＳＰＦ  ＮＯＤ．ＭｙＤ８８−／−マウス（５０〜１００μＭ）に見出された（図１ｂ）。肝門脈血中のアセテート濃度は、末梢血中で観察された結果を支持する。
【０１７３】
細菌叢由来のＳＣＦＡが疾病発生率を変更するか否かを決定するために、ＧＦ条件下で収容した正常なＮＯＤマウスにおける疾病悪化を調べた。糖尿病浸透率は、ＳＰＦ  ＮＯＤマウスと比較してＧＦ  ＮＯＤマウスのコホートでより高く（図１ｃ）、これは、糞便中のブチレートの顕著に低い濃度と関連していた（図９Ｂ）。糞便アセテート濃度は、ＳＰＦ及びＧＦ  ＮＯＤマウス間で有意に変化しないが、遥かに高い濃度の糞便アセテート及びブチレートがＧＦと比較してＳＰＦ  ＮＯＤ．ＭｙＤ８８−／−マウスで見出された（図９ｂ）。
【０１７４】
膵島における膵島炎は、ＮＯＤマウスにおいて約５週齢で出現し、顕性糖尿病は、１５〜３０週齢で雌の６０〜８０％において生じたが、雄では２０〜３０％のみに生じた。これと一致して、若い雌ＮＯＤマウスは、年齢一致雄ＮＯＤマウスと比較してアセテート及びブチレートの両方の有意により低い末梢血中の濃度を有することが見出された（図１ｄ）。糞便ＳＣＦＡ濃度における性差は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスで見られず（図９ｃ）、ＳＣＦＡの不十分な細菌生成は、雌ＮＯＤマウスに特異的な現象であることが示唆される。
【０１７５】
アセテートの経口投与（循環中でのその濃度を増大させるために）が疾病悪化を調節できるか否かを決定するために、ＮＯＤ雌マウスの飲料水にアセテートを添加した。５週齢から開始して、アセテート処理は、糖尿病の発生を有意に遅延させた（３０週齢での発生率４０％対対照の７０％）（図１ｅ）。１０週齢までに、処置開始から５週後、アセテート処理ＮＯＤマウスは、免疫細胞浸潤を有さないより多くの膵島及び高グレード浸潤（膵島炎スコア３又は４）を有するより少ない膵島を有した（図１ｆ）。
【０１７６】
高アセテート及びブチレート産出食物によるＳＣＦＡの増大は、Ｔ１Ｄに対して保護する
ＳＣＦＡの経口投与は、ＳＣＦＡの循環濃度の急速且つ一過性の上昇を生じるが、食物繊維の細菌発酵を介した結腸からのそれらの持続性吸収と一致しない（Ｔｏｐｐｉｎｇ＆Ｃｌｉｆｔｏｎ，２００１及びＩｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。繊維由来のＳＣＦＡの組み合わせ効果に加えて、重要な問題は、Ｔ１Ｄの危険性における個々のＳＣＦＡの役割である。従って、アセチル化（ＨＡＭＳＡ）又はブチリル化（ＨＡＭＳＢ）のいずれかの特殊化高アミローストウモロコシ澱粉（ＨＡＭＳ）食物を使用した。アシル化澱粉（ＨＡＭＳ）は、小腸アミロリシスに大いに抵抗性であり、細菌がそれらの特異的に組み込まれたＳＣＦＡを放出する結腸へと通過する。次いで、ＨＡＭＳは、発酵され、通常の範囲のＳＣＦＡが生成される。これらの澱粉は、腸生物学に対する特定のＳＣＦＡ（即ちアセテート対ブチレート）の効果を評価するための強力なツールであることが証明されている（Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｂａｊｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１７７】
雌ＮＯＤマウスにＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を５週間給餌した後、糞便、盲腸内容物（ｄｉｇｅｓｔａ）、肝門血及び末梢静脈血中のアセテート又はブチレートの濃度は、対照ＨＡＭＳ給餌ＮＯＤマウスと比較して顕著に増大した（図２ａ）。これらの結果は、結腸細菌がアセテート及びブチレートの各々を生成することを標的化する高アセテート及びブチレート産出食物の有効な力、及びそれらがどのように高濃度で末梢循環に到達するかを示す。アセテートは、嫌気性発酵の最終生成物と見なされるが、フィーカリバクテリウムプラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）等のブチレート生成細菌は、アセテートの基本的ユーザーであり得る。これは、ＨＡＭＳＡ給餌マウスにおける僅かにより高いブチレート濃度の原因であり得る。同様に、ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ給餌マウスの両方におけるより高い腸プロピオネート濃度は、アセテート又はブチレートの高い送達がプロピオネートの細菌生成をフィードバックしたことを示唆する（図２ａ）。いずれかの食物上のマウスは、ＨＡＭＳ給餌又は非精製（ＮＰ）食物給餌マウスと同様の体重を有した（図９ｄ）。食物は、門脈又は末梢血におけるプロピオネート濃度を有意に変化させなかった。
【０１７８】
ＮＯＤマウスにおいて、膵島炎から臨床的糖尿病への悪化に関連した免疫−炎症性事象が５〜１５週齢で生じた（Ｍａｒｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．２００８、Ａｙｙａｖｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。インスリン等の抗原に対する自己抗体は、５週目という早期に出現し得、免疫寛容の破綻は、顕性糖尿病の徴候よりかなり前に生じることが示された。
【０１７９】
比較的遅く投与された特殊化高ＳＣＦＡ産出食物がＴ１Ｄの発生に影響を与え得るか否かを決定するために、雌ＮＯＤマウスに１０週齢で開始してＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢを５週間給餌し、次いでマウスを対照ＮＰ食物に戻し、糖尿病発生率に関して監視した。３０週齢までに、ＮＰ食物を連続的に給餌した雌ＮＯＤマウスは、予想された高頻度で糖尿病を発生した（図２ｂ）。ＨＡＭＳ食物は、ＮＰ給餌雌ＮＯＤマウスと比較して糖尿病を有意に遅延させなかった。対照的に、７１％のＨＡＭＳＡ給餌及び６２％のＨＡＭＳＢ給餌雌ＮＯＤマウスは、Ｔ１Ｄから保護された（図２ｂ）。代表的な組織診断及び膵島炎点数化により、１５週齢のＨＡＭＳ給餌ＮＯＤマウスと比較して、年齢一致ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ給餌雌ＮＯＤマウスは、より多数の浸潤を有さない膵島（グレード０）数を有し、３０週齢まで維持される差異を有する（図２ｃ）ことが示された。
【０１８０】
ＮＯＤマウスに、他の食物で行ったものと正確に同じようにＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢの組み合わせ（１５％＋１５％）を給餌した。図２ｄは、この組み合わせ食物を使用して、１００％のＮＯＤマウスが２８週間を通して糖尿病から保護されたことを示す。
【０１８１】
ＨＡＭＳＡ給餌は、自己免疫性Ｔ細胞頻度を低下させる
Ｔ１Ｄの病態形成は、自己反応性Ｔ細胞による膵島β−細胞の死滅に関与する。際だったことに、両方の食物、特にアセテート産出ＨＡＭＳＡは、膵島特異的抗原グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）を認識する脾臓糖尿病誘発性ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び糖尿病誘発性Ｔ細胞受容体ＢＤＣ２．５を保有するＣＤ４＋細胞の頻度を顕著に低下させた（図３ａ、ｂ）。ＩＧＲＰ反応性４量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、対照ＨＡＭＳ給餌ＮＯＤマウスの約１％からＨＡＭＳＡ給餌マウスの０．２％に低下し（図３ａ）、ＢＤＣ２．５反応性４量体＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、２倍低下した（図２ｂ）。
【０１８２】
ＮＯＤ  ８．３マウスは、１０週齢までに発生率約１００％で糖尿病を急速に発生した。興味深いことに、ＨＡＭＳＡ食物を給餌されたＮＯＤ．８．３マウスは、糖尿病の発生において有意な遅延を示した（図３ｃ）。ＩＧＰＲ反応性Ｔ細胞の百分率は、ＨＡＭＳＡで顕著に低下したが、ＨＡＭＳＢ給餌ＮＯＤ８．３マウスで低下しなかった（図３ｄ）。
【０１８３】
Ｂ細胞に対するアセテート効果は、ＮＯＤマウスにおいてＴ１Ｄに対して保護する
ＳＣＦＡは、自己反応性Ｔ細胞増殖を支持するＡＰＣ等の他の細胞タイプに影響を与えることにより、自己免疫性応答を損なう可能性がある。これを試験するためにＮＯＤ．８．３マウスに異なる食物を給餌した。ＮＯＤ．８．３マウスのコロニーは、ＩＧＲＰ６１を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＮＹ８．３由来のＴＣＲαβ導入遺伝子を発現するため、１０週齢までに発生率約１００％で糖尿病を急速に発生する。ＨＡＭＳＡ（ＨＡＭＳＢではない）食物を給餌されたＮＯＤ．８．３マウスは、有意に遅延された糖尿病の発生を示した（図３ｃ）。ＩＧＲＰ反応性Ｔ細胞の数は、ＨＡＭＳＡで顕著に低下したが、ＨＡＭＳＢ給餌ＮＯＤ８．３マウスで低下しなかった（図３ｄ）。ＨＡＭＳＡ給餌ＮＯＤ８．３マウスにおけるＴｒｅｇ細胞の頻度は、ＨＡＭＳＢ及びＨＡＭＳ給餌ＮＯＤ８．３マウスで観察されたものと同様であり（データは示さず）、他の機構が示唆される。抗原提示Ｂ細胞は、ＮＯＤマウスにおけるＣＤ８＋増殖に重要な役割を有する。Ｂ細胞を欠いたＮＯＤ．μＭＴ（−／−）又はＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへのＮＯＤ８．３  Ｔ細胞の移植は、糖尿病を効率的に移植することに失敗したが、移植は、以前のＢ細胞の生着により回復される（Ｍａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｚｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。以前の研究では、Ｂ細胞は、膵島抗原をＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に直接提示し、Ｔｒｅｇ細胞機能を抑制することにより、ＮＯＤマウスにおける疾病を促進することが見出された（Ｂａｊｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｌａｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＨＡＭＳＡ給餌ＮＯＤマウスは、脾臓及びパイエル板におけるＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞の頻度及び数の低下を示した（図４ａ）。際だったことに、ＨＡＭＳＡ給餌（ＨＡＭＳＢ給餌ではない）ＮＯＤマウスの脾臓及びＰＬＮからのＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞は、フローサイトメトリーによってＭＨＣ  Ｉ及びＣＤ８６、ＡＰＣに関する同時刺激分子の発現の顕著な低下を示した（図４ｂ、１０ａ）。ＣＤ４０、ＭＨＣ  ＩＩ又はＣＤ８０発現における変化は観察されなかった（図１０ｂ）。これらの知見を実証するために、異なる食物を給餌したマウスからのＢ細胞を、遺伝子マイクロアレイを使用して調べた。
【０１８４】
タンパク質レベルにおける総Ｂ細胞の変化をＣＤ８０／Ｂ７．１、ＣＤ８６／Ｂ７．２、Ｂ２Ｍ、ＰＲＤＭ１（Ｂｌｉｍｐ１）及びＭＹＤ８８に関する遺伝子発現のレベルで検証した（図１０ｃ）。β２−ミクログロブリン及びＭｙＤ８８は、ＭＨＣ  Ｉ発現並びにＢ細胞増殖及び分化を調節するためのＢｌｉｍｐ１に必須である。興味深いことに、ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢの両方は、ＩＬ１２産生成熟周辺帯（ＭＺＢ）Ｂ細胞においてＣＤ８６発現を低減し（図４ｃ）、サブセットは、免疫寛容の変造に関与していた。上記のＢ細胞における遺伝子転写産物に関する発現の変化は、アセテート又はブチレート食物が全体的な遺伝子転写に大きい効果を有し得ることを示唆した。ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢ食物を５週間給餌した１５週齢のマウスから単離した９５％純粋な選別脾臓Ｂ細胞に関してＲＮＡ配列決定を行った。多次元スケーリング分析では、ＨＡＭＳＡ給餌マウスからのＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞は、対照サンプル（ＨＡＭＳ又はＮＰ）から更に離れ（図４ｄ）、発現の増大を支持する可変性の増大を示している。実際に、ＮＰ食物と比較して、２０８遺伝子がＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ間で差次的に発現した。１４遺伝子は、抗原提示、ＢＣＲシグナル伝達、細胞代謝及び細胞傷害性Ｔ細胞の活性化等の重要なＢ細胞機能に関与している（図４ｅ及び表１ａ）。食物ＳＣＦＡの増大は、Ｈｓｐａ１ａ及びＨｓｐａ１ｂ等の熱ショックタンパク質遺伝子を下方調節し、増大した尿レベルは、Ｔ１Ｄを有する子供の進行性腎不全に関連付けられている（Ｙｉｌｍａｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。同様に、ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢの両方は、Ｉｌ１０ｒａの発現を下方調節した。感染症モデルでは、ＩＬ１０受容体の遮断により、血漿Ｂ細胞が有意に減少し、感染症を誘発する。ＳＣＦＡは、ＨＤＡＣ活性を阻害し、ヒストンアセチル化を維持する。ＨＤＡＣ３の発現の低下に関連付けられた遺伝子であるＢ細胞上のＧｎｂ３の発現の増大が見出された。ＨＤＡＣ  １及び２を欠損したマウスは、破壊されたＢ細胞の発生、生存及び活性化を示す。ＨＡＭＳＡを給餌されたマウスからの成熟Ｂ細胞サブセット（ＭＺＢ及びＦＯＢ）において、ＨＤＡＣ３転写産物の顕著に低下した発現が存在し（図４ｆ）、これは、おそらく本発明者らが観察した遺伝子発現における有意な変化と関連している。これは、ＭＨＣ  Ｉ及びＣＤ８６の発現の低下と相関し、Ｂ細胞が自己抗原をＣＤ８＋Ｔ細胞に交差提示する能力の低下を説明している。
【０１８５】
ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢが、インビボでＮＯＤマウスにおいて自己反応性Ｔ細胞増殖を支持するＡＰＣ能力に影響を与えるか否かを試験するために、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢを給餌されていた８〜１０週齢のＮＯＤマウスに精製ＣＦＳＥ標識ＮＯＤ８．３  ＣＤ８＋Ｔ細胞を移植した。従って、ＮＯＤ８．３  ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答は、主として、応答するＮＯＤ８．３  Ｔ細胞に対して直接ではなく、ＡＰＣｓ等の細胞タイプに対する食物効果に関連するはずである。移植から３〜４日後、移植膵島特異的ＮＯＤ８．３  ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を分析し、それらがＮＰ食物を給餌したＮＯＤマウスのＰＬＮ内で広範に分裂し、ＨＡＭＳ食物を給餌したＮＯＤマウスのＰＬＮ内でより低い（ただし、有意ではない）程度で分裂したことが見出された（図４ｇ）。際だったことに、ＮＯＤマウスがＨＡＭＳＡを給餌された場合、自己反応性ＮＯＤ８．３  ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＬＮ内で増殖しなかった。ＰＬＮ内でのＮＯＤ．８．３  Ｔ細胞の増殖は、ＨＡＭＳＢ給餌によって低下されなかった。ＮＯＤ．８．３  Ｔ細胞は、ＮＰを含む任意の食物グループでＭＬＮ内において増殖しなかったため、Ｔ細胞増殖は、ＰＬＮ（膵島自己抗原が排出し、ＡＰＣ−Ｔ細胞活性化が生じる）に特異的であった（図１０ｄ）。従って、食物アセテートは、Ｂ細胞の数、それらの表現型に影響を与え、それらがインビボで自己反応性Ｔ細胞を拡大させる能力に影響を与えると思われる。
【０１８６】
ブチレートは、ＮＯＤマウスにおけるリンパ組織内のＴｒｅｇ数及び機能を調節する
ＳＣＦＡは、Ｔｒｅｇ細胞を調節し、その効果が腸内で証明されたが、Ｔ１Ｄの発生に重要な他の主要な細胞に対するそれらの効果は不明であった。ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ食物を給餌された１５週齢の雌ＮＯＤマウスのＴ細胞コンパートメントを試験し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに関して報告されたものと同様に、両方の食物は、腸ホーミング活性化マーカーＣＤ１０３を発現するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を結腸内で拡大することが見出された（図１１ａ）。ＮＯＤマウスへのＨＡＭＳＢの給餌は、肝門脈内の非常に高いレベルのブチレートをもたらした。ＨＡＭＳ給餌ＮＯＤマウスと比較して、アセテート及びブチレート産出食物の両方は、脾臓Ｔｒｅｇ細胞の頻度及び数を２倍増大させた（図５ａ）。ＰＬＮ及びＭＬＮでは、Ｔｒｅｇ細胞の絶対数において頻度の中程度の増大が観察された（図１１ｂ）。
【０１８７】
異なる食物を１０週間給餌された１５週齢の雌ＮＯＤマウスからの＞９５％精製脾臓Ｔ細胞を、Ｔ及びＢ細胞を欠いた雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントの使用により、Ｔ細胞に対する食物の任意の効果が調整ドナーＴ細胞に完全に起因し得、またその効果が腸ホメオスタシス又は他のシステムに対するアセテート／ブチレートの効果から分離して試験できることが確実にされた。ＮＰ給餌ＮＯＤマウスからのＴ細胞は、全レシピエントで急速に糖尿病に移植し、移植後に発症が加速された（図５ｂ）。顕著に対照的に、ＨＡＭＳＢ給餌ＮＯＤマウスからのＴ細胞を受容したＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントの９４％は、移植後に糖尿病から２０週間以上完全に保護された（図５ｂ）。ＨＡＭＳＡ給餌ＮＯＤマウスからのＴ細胞は、Ｔエフェクター細胞の頻度に対するＨＡＭＳＡの効果にも関わらず、完全に保護することができなかった（移植から２０週後に３０％の糖尿病なしマウス）（図３ａ〜ｄ）。
【０１８８】
ＨＡＭＳＢ調整Ｔｒｅｇ細胞が、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで観察された保護を仲介したか否かを決定するために、ＮＯＤ．ＦｏｘＰ３−ＧＦＰマウスからの総Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞を養子移植した。養子移植前にレシピエントＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに異なる食物を２週間給餌し、これらのマウスは、同じ食物に留まり、疾病発生率に関して監視した。移植から３週間後、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＦｏｘｐ３、ＩＬ−１０及びＨＥＬＩＯＳの発現に関して分析した。注目すべきことに、ＨＡＭＳＢ給餌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのみが、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ−１０及びＨＥＬＩＯＳを発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞の有意な頻度及び数を示した（図５ｃ、ｄ）。
【０１８９】
末梢Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−）前駆体のＦＯＸＰ３座位におけるヒストンのアセチル化は、以前に向上されたＴｒｅｇ機能に関連付けられている（Ｔｈｏｒｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ給餌ＮＯＤマウスで、特に肝門脈内で観察された高濃度のアセテート及びブチレートを想定して（図２ａ）、高アセテート又はブチレート産出食物を、特に末梢Ｔｒｅｇ細胞におけるＦＯＸＰ３座位のヒストン修飾に対するそれらの影響に関してインビボで試験した。ＨＡＭＳＢ食物は、脾臓Ｔ細胞内のＦｏｘｐ３プロモーターにおけるＨ３Ｋ９アセチル化及びＨ４ペンタアセチル化を顕著に増大させたが、ＨＡＭＳＡを増大させなかった（図５ｅ）。末梢Ｔｒｅｇ細胞前駆体におけるヒストンアセチル化がＴｒｅｇ細胞内のＦｏｘｐ３発現の増大に関連している否かを調べるために、個別に選別されたＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ低ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｇａｔｅ）の単一細胞トランスクリプトーム分析を行った。ＨＡＭＳ給餌ＮＯＤマウスと比較して、ＨＡＭＳＢのみがＦｏｘｐ３転写産物発現の増大をもたらした（図５ｆ）。加えて、ＨＡＭＳＢ給餌ＮＯＤマウスのＴｒｅｇ細胞は、Ｇａｔａ３、Ｇｉｔｒ及びＳｅｌｌ（ＣＤ６２Ｌ）を含む遺伝子転写産物の発現の増大を有し（図５ｇ）、これは、Ｔｒｅｇ細胞活性化、機能及び遊走に重要である。
【０１９０】
代謝物感知ＧＰＣＲｓ  ＧＰＲ４３及びＧＰＲ１０９ａは、ＮＯＤ糖尿病においてマイナーな役割を有する
アセテート及びブチレートに関する主要な代謝物感知ＧＰＣＲは、ＧＰＲ４３であり、ＧＰＲ４３は、活性化マクロファージ、Ｂ細胞及びＴｒｅｇ細胞を含む多様な免疫細胞タイプにより発現されている。アセテート及びブチレートの免疫調節効果がこのＧＰＣＲにより仲介されていたか否かを決定するために、Ｃ５７．Ｇｐｒ４３−／−マウスをＮＯＤバックグラウンドに対して１３世代、戻し交配した（ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−）（図１２ａ）。ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３＋／＋対ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウス間で疾病発生率における傾向が存在した（しかし、有意差はない）。２０週目までに、７０％のＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウスは、同じ食物のＮＯＤ．Ｇｐｒ４３＋／＋リターメイトと同様に糖尿病を発生していた（図６ａ）。しかしながら、ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウスは、より高い膵島炎症（膵島炎類別１〜４）を示し、浸潤のない膵島がより少なかった（＜２０％）（図６ｂ）。これは、β細胞膵島破壊からの保護におけるＧＰＲ４３の僅かな役割を示唆する。しかしながら、ＨＡＭＳＡ食物は、ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウスで糖尿病悪化を部分的にのみ遅延させ、これらのマウスは、ＮＰ給餌ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウスと比較して少ない浸潤膵島を有した（図６ａ、ｂ）。細胞表現型分析は、ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウスが、ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３＋／＋リターメイトと比較して、脾臓及びＰＬＮ内で有意に少ない数のＴｒｅｇ細胞と、より多数のＩｇＭ＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞とを含むことを示した（図６ｃ、ｄ）。ＨＡＭＳＡは、ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３＋／＋マウスでＴｒｅｇ細胞を増大させ、自己反応性Ｔ細胞を低下させたが、ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−リターメイトでＴｒｅｇ細胞を増大させず、自己反応性Ｔ細胞を低下させなかった（図６ｃ〜ｅ）。アセチル化澱粉食物は、依然として、１５週齢の雌ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウスの糞便中で測定して、アセテートを多量に送達することが可能であった（図１２ｂ〜ｄ）。ＣＲＩＳＰＲ生成ＮＯＤ．Ｇｐｒ１０９ａ−／−マウスラインにおける疾病発生率は、８０％のＮＯＤ．Ｇｐｒ  １０９ａ−／−マウスがＷＴ  ＮＯＤマウスと同様の速度で糖尿病に進行することを示した（図１３ａ）。
【０１９１】
アセテート及びブチレートの両方は、ＮＯＤマウスにおける欠陥のある腸上皮完全性を修正する
ヒト及びマウスにおける自己免疫糖尿病は、「腸漏洩」及び密着結合タンパク質閉塞の低い発現に関連している。雌ＮＯＤマウスでは、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂａｌｂ／ｃマウスではない）におけるオクルディン及び他の密着結合マーカーの発現と比較したオクルディン及び他の密着結合マーカーの発現の低下に基づいて、腸壁は、その効果的なバリアを形成する能力が損なわれていることの証拠が存在する（図７ａ）。対照的に、糖尿病のより低い発生率を有する雄ＮＯＤマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃマウスと比較して高い密着結合マーカーの発現を有した（図７ａ）。高アセテート及びブチレート産出食物の給餌は、ＨＡＭＳ給餌ＮＯＤ対照と比較してＮＯＤマウスの結腸内でオクルディンの発現を有意に増大させた（図７ｂ）。上皮腸完全性の保存及び組織炎症を弱める際のＳＣＦＡの役割と一致して、ＨＡＭＳＡ及び特にＨＡＭＳＢ食物は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるものと同様に血清リポ多糖（ＬＰＳ）濃度の有意な低下をもたらした（図７ｃ）。
【０１９２】
循環プロ炎症性サイトカインの増大は、Ｔ１Ｄへの悪化に関連している。ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ食物の両方は、プロから抗炎症薬へのサイトカインプロファイルの切り替えを促進した（図７ｄ、ｅ）。ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生に必要な２つのサイトカイン、ＴＮＦα及びＩＬ−２１の血清濃度は、保護ＮＯＤ．ＭｙＤ８８−／−マウスで観察されたものと同様に、遅延ＨＡＭＳ給餌ＮＯＤマウス又は保護ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ給餌ＮＯＤマウスのいずれでも顕著に低下した（図７ｄ）。腸粘膜バリア完全性を維持する腸ホメオスタシス関連サイトカイン、ＩＬ−２２は、対照ＨＡＭＳ給餌ＮＯＤマウス及び糖尿病誘発性ＮＰ給餌ＮＯＤマウスと比較して、ＨＡＭＳＡ給餌において（図７ｅ）、またより低い程度でＨＡＭＳＢ給餌ＮＯＤマウスにおいて有意に上昇した。
【０１９３】
アセテート富化食物は、腸の微生物生態に有益な変化をもたらす
本研究では、ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ食物の保護効果が腸内の特定の細菌の存在量及び／又は多様性の変化に僅かでも起因し得るか否かを試験した。ＧＦ  ＮＯＤマウスに、糞便及び盲腸内容物のミックスを用いた経管栄養により、ＮＰ、ＨＡＭＳ、ＨＡＭＳＡ又はＨＡＭＳＢで給餌した１５週齢のＮＯＤマウスからの腸細菌を再コロニー形成した（図２ｂに示すように）。次いで、細菌叢再構成ＮＯＤマウスの全てを同じＮＰ食物上に配置し、糖尿病の発生に関して経時的に監視した。ＨＡＭＳ形成細菌叢で再構成されたＧＦ  ＮＯＤマウスは、ＳＰＦ  ＨＡＭＳ給餌ドナーマウスと比較して疾病発生率の差異を示さなかった（図８ａ）。しかしながら、ＨＡＭＳＡ食物により形成された細菌叢を受容したＧＦ  ＮＯＤマウスは、糖尿病に対して顕著な保護を示し、８０％のＧＦ雌ＮＯＤマウスが３０週間を超えて糖尿病なしであった（図８ａ）。ＨＡＭＳＢ形成細菌叢で再コロニー形成されたＧＦ  ＮＯＤマウスは、急速に糖尿病に進行し、ＨＡＭＳＢ食物はその効果をブチレートの直接供給により仲介し、腸管細菌叢の変化を介さないことが示唆される。糞便細菌分析は、アセテート及びブチレート産出食物（対照ＨＡＭＳ食物と比較して）の両方が、食物を給餌された１５週齢のドナーＮＯＤマウス及び年齢一致再コロニー形成ＧＦ  ＮＯＤマウスのいずれでも糞便微生物組成の有意な変化をもたらすことを示した（図８ｂ、１３ｂ）。ＨＡＭＳＡ及びＨＡＭＳＢ給餌ドナーマウスの両方がバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の存在量の増大を示したにも関わらず（図８ｃ）、ＧＦ  ＮＯＤマウスの再コロニー形成後に差異は見出されなかった（図１３ｃ）。バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）は、アセテート／ブチレート生成嫌気性細菌であり、ヒト及びマウスではより高いＴｒｅｇ細胞数の誘導に関連している。ＨＡＭＳＡ単独は、ドナー及び再コロニー形成ＧＦ  ＮＯＤマウス内でラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びパラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の存在量を有意に低下させた（図８ｃ、１３ｃ）。ＨＡＭＳＡ形成細菌叢を受容したＧＦ  ＮＯＤマウスは、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の存在量の増大を示した（図１３ｃ）。ＨＡＭＳＡ形成細菌叢で再構成したＧＦ  ＮＯＤマウスは、ＨＡＭＳ形成細菌叢で再構成されたＧＦ  ＮＯＤマウスと比較して、肝門脈血及び盲腸内容物中で有意により高い濃度のアセテートを有した（図８ｄ）。ＨＡＭＳＡ形成細菌叢で再コロニー形成されたＧＦ  ＮＯＤマウスは、ＰＬＮ中でＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増大を示し（図８ｅ）、Ｔｒｅｇ生物学におけるアセテートの役割を支持した。このように、ＨＡＭＳＡ食物媒介による保護は、細菌群集の全体にわたる変化及びアセテート生成細菌の増殖を生じた。
【０１９４】
ＳＰＦ  ＨＡＭＳＡ給餌ＮＯＤマウスは、ＨＡＭＳ給餌ＮＯＤマウスと比較してグルタメート、グルタミン、ロイシン及びイソロイシンの有意に低い糞便濃度を示した（図８ｆ）。グルタメートは、主にグルタメートデカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、既知の膵島自己抗原の作用を介して、代謝過程及びストレス応答に重要な役割を有する主要な細菌代謝物である。ＨＡＭＳＡ食物を給餌した１５週齢のＮＯＤマウス及びＨＡＭＳＡ形成細菌叢で再コロニー形成した保護ＧＦ  ＮＯＤマウスでグルタメートの低下が見出された（図８ｆ）。ロイシンファミリーのアイソフォームは、ＨＡＭＳＡ給餌ＮＯＤマウスにおいて増大した（図１３ｆ）。
【０１９５】
考察
特殊化したアセチル化又はブチリル化澱粉食物の組み合わせは、ＮＯＤマウスにおいて自己免疫性糖尿病からの顕著な保護を示した。アセテート及びブチレートの効果は、部分的にのみ重複し、異なる機構が示された。アセテートは、自己反応性Ｔ細胞の頻度を低減するのに特に有効であった一方、ブチレートは、Ｔｒｅｇ細胞の機能の増大に優れていた。本明細書に報告した代謝物手法は、疾病−腸内細菌叢組成及び腸完全性、ＩＬ−２１及びＴＮＦα等の炎症性サイトカイン、欠陥のあるＴｒｅｇ生物学、並びに自己反応性エフェクターＴ細胞の存在量に寄与するＮＯＤマウスにおける欠陥の実質的に全てを修正した。これらの知見は、免疫応答に対する食物、腸細菌及びそれらの代謝物の大きい影響を強調するものである。実際に、重要な免疫サブセット（Ｔｒｅｇｓ、Ｂ細胞及びエフェクターＴ）の頻度及びそれらの遺伝子発現プロファイルを含む多数の免疫パラメーターは、単純に食物／細菌代謝物によって操作されることが示された。
【０１９６】
ＨＡＭＳＡ送達アセテートは、自己免疫性Ｔエフェクター細胞頻度に顕著な効果を有した。これは、ＡＰＣｓ、特にＢ細胞に対するアセテート（ブチレートも同様であるが、その程度は低い）の効果により説明することができる。Ｂ細胞は、特定の膵島抗原反応性Ｔ細胞とのそれらの相互作用を介して膵島炎から臨床的糖尿病への移行に重要な役割を有する。十分な同時刺激分子を欠くＢ細胞は、免疫寛容原性であり得る。本発明者らの研究の重要な特徴は、大量のアセテート、天然産物の送達が全動物におけるＢ細胞分子プロファイルの変化を達成し得ることであった。ブチレートではなくアセテートが末梢Ｂ細胞表現型の変化に有効である理由は、ブチレートが典型的には肝臓内で代謝されるため、末梢循環に送達され得るアセテートのレベルが遥かに高いことに関連し得る。しかしながら、アセテートはまた、異なる経路、例えばＨｄａｃ３転写を下方調節するその能力を介して作用し得る。ＨＡＭＳＡ給餌ＮＯＤマウスにおけるＢ細胞上の同時刺激分子及びＭＨＣ  Ｉの下方調節は、ＩＧＲＰ＋ＣＤ８＋の低頻度と相関し（図３ａ、ｂ）、インビボで自己反応性ＮＯＤ８．３細胞の拡大を大きく減少させた（図３ｄ）。Ｔ１Ｄ患者の自己反応性Ｔ細胞数は、単純な高アセテート産出食物の送達により劇的に低下し得る。Ｔ１Ｄ患者の４量体監視により測定される自己反応性Ｔ細胞の頻度の低下は、臨床成績を何年も待つのではなく、代謝物の食物が所望の効果を有しているという遥かに迅速な指示を提供することができる。
【０１９７】
ＨＡＭＳＢ調整Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞を含む）は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスへの移植後にほぼ完全にＴ１Ｄに対して保護した。このように、ブチレートは、アセテートに関して上述されたものと異なり、Ｔｒｅｇ関連経路を介してＴ１Ｄに対して保護する。これは、主要なＴｒｅｇ細胞遺伝子の転写の増大及びＨＤＡＣｓの酵素活性を阻害するブチレート（アセテートではない）の能力に関連する可能性がある。以前の研究では、ＮＯＤマウスにおける遺伝子欠陥が、ＰＬＮ内に局在する特定のＴｒｅｇ細胞亜集団に独特に影響し、それらの抑制活性を不完全なものとすることが示された（Ｂｕｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。従って、ブチレートは、ＰＬＮ（又は末梢）Ｔｒｅｇ細胞の損なわれた抑制機能を修正した可能性がある。ＨＡＭＳＢは、Ｔｒｅｇ細胞機能に重要なＴＧＦβ産生を向上させた。加えて、アセテート及びブチレートは、血液及び組織中の炎症性サイトカイン及びＬＰＳの抑制又はＴｒｅｇ対Ｔｈ１７の分化の制御を介してＴｒｅｇ細胞に間接的に影響を与え得る。特にＩＬ−２１は、Ｔ１Ｄの発生中に重大である。ＩＬ−２１は、ＮＯＤマウス８４−８６におけるＢ細胞及び自己反応性の細胞傷害性ＣＤ８＋細胞の増殖を誘導し、Ｔｒｅｇ細胞分化及び活性を負に調節する。
【０１９８】
Ｔ１Ｄ病態形成に対する食物及び代謝物の影響は、腸に対する膵臓又はＰＬＮの近接さに関連し得る。膵臓及びＰＬＮは、腸と直接的なリンパ接続を有し、肝門脈及びおそらく腹膜腔内の高濃度のアセテート又はブチレートの影響を受け得るため、Ｔ１Ｄは、食物代謝物手法に特に適している可能性がある。免疫細胞は、高アセテート又はブチレート環境（即ち結腸）とＰＬＮ、脾臓及び他の場所との間を再循環することも考えられる。
【０１９９】
腸内細菌叢を高ＳＣＦＡ生産物の１つに形成することは、ヒト疾病を予防又は処置する戦略であり得る。ＳＣＦＡは、共生細菌、特にバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属のメンバーの主要代謝物の１つである。本明細書で使用される特殊化した食物は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種の数を拡大し、Ｔｒｅｇ細胞の数を増大させた。ＧＦ再コロニー形成ＮＯＤマウスにおいてクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の割合の高い増大が観察され、これらが結腸及び末梢のＴｒｅｇ細胞数の拡大に重要であり得ることを示している（図８ｅ）。一研究において、ビフィドバクテリウム‐アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）又はクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）クラスターＸＩＶａ又はＩＶ種（これは、アセテートからブチレートを生成する）等のいずれかのアセテートを生成する細菌種の存在量は、β−細胞自己抗体特異性の数と逆相関した（ｄｅ  Ｇｏｆｆａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。本発明者らは、ＨＡＭＳＡ食物により選択された腸内細菌叢が他の有益な代謝物経路を促進する可能性を排除するものではない。例えば、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）に結合するトリプトファン代謝物を生成する微生物は、腸ホメオスタシス及びＴｒｅｇ生物学を向上させる（Ｔｈｏｒｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｚｅｌａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。腸内菌共生バランス失調を修正する殆どの努力は、プロバイオティクスに依存してきたが、おそらく最適な手段は、本明細書に説明した食物の使用を介して有害な細菌叢組成を修正することである。腸管細菌叢は、食物の変化に急速に応答し（Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｋａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、特定の食物の長期使用は、適応変異に起因して、ストレスを受けた及び競争力のない細菌の枯渇と、より高速で成長する新しい株の出現とを可能にする（Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｙｅ，２００３、Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ  ２００３）。
【０２００】
分子レベルでは、糖尿病からの保護は、ＧＰＲ４３等の代謝物感知ＧＰＣＲｓの関与及びＨＤＡＣｓの阻害を含む可能性がある。これにより、ＧＰＣＲｓを介した即時シグナル伝達事象及び遺伝子転写の変化が可能となる。ＧＰＲ４３は、高アセテート産出ＨＡＭＳＡ食物の保護効果の少なくとも一部を促進した。ＰＬＮを含む数個の組織内のＴｒｅｇ細胞の数は、ＮＯＤ．Ｇｐｒ４３−／−マウスにおいて顕著に低下した。ＧＰＲ４３はまた、アセテート食物が自己反応性効果又はＴ細胞頻度を制限する能力に影響を与えた。ＧＰＲ４３は、後成的機構と協同的に作用することが考えられる。例えば、ＧＰＲ４３シグナル伝達は、細胞へのアセテートの進入を促進し得る。ＧＰＲ４３に関する他の主な役割は、腸上皮バリア機能の向上である。ＧＰＲ４３は、上皮細胞内のインフラマソーム経路の活性化及びプロ腸ホメオスタシスサイトカインＩＬ−１８の産生を介してこれを達成する。従って、ＧＰＲ４３は、食物仲介によるＴ１Ｄからの保護において数個のレベルで作動する可能性がある。代謝物が免疫応答に影響を与える他の主要な経路は、ＨＤＡＣ阻害である。アセテート送達は、インビボでＢ細胞におけるＨｄａｃ３転写産物発現を顕著に減少させた。これは、おそらく、選択細胞内のＨＤＡＣ３欠乏のものと類似した表現型又は以前の研究が抗炎症薬であると示した化学阻害剤若しくはブチレートによるＨＤＡＣ酵素阻害をもたらすであろう。ＤＣでは、広範なＨＤＡＣ阻害は、アセテート食物を用いたＢ細胞において本発明者らが本明細書で観察したものと類似したＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６９６の顕著な下方調節をもたらす。本発明者らの研究はまた、ＨＡＭＳＢ／ブチレートが脾臓Ｔｒｅｇ細胞内のＦｏｘｐ３座位のプロモーター領域内のヒストンＨ３アセチル化を向上させることを示した。
【０２０１】
実施例２：２種以上の脂肪酸を含むアシル化澱粉の調製（大規模）
方法：
１）ＤＭＳＯ（２４Ｌ）を浸漬ヒーターにより、金属容器内で一定の撹拌下で８０℃超に加熱した。
２）ヒーターを除去し、トウモロコシ澱粉（４４０ｇ）を、家事用ふるいを通して撹拌しているＤＭＳＯにゆっくり添加して、均一な分散を確実にした（凝集を避けるために）。混合物を一定に１時間撹拌し、その時点までに全澱粉が溶解して透明な粘性の溶液となった。
３）１−ＭＩＤ（８０ｍＬ）と、酢酸−８５ｍＬ、プロピオン−１３２ｍＬ及び酪酸１７０ｍＬから選択される１、２又は３種の無水物とを加えた。
４）４時間のインキュベーション後、過剰の無水物を３Ｌの水の添加により分解し、反応混合物を２容積のエタノールに注いだ。
５）沈殿したアシル化澱粉生成物をエタノール（８０％ｖ／ｖ）で数回洗浄して、ＤＭＳＯ及び他の反応関与体を除去し、温風室内において４０℃で乾燥した。
６）対照澱粉は、１−ＭＩＤ又は無水物を澱粉に添加しない偽手順を経た。
７）澱粉を微粉末に粉砕し、分析した。
【０２０２】
結果
上記の各アシル化澱粉生成物のＤＳは、類似していた。ステップ３で１種のみの無水物を使用した場合、アシル化澱粉は、１種のみの短鎖脂肪酸部分を含むことが理解されるであろう。２種の無水物（例えば、酢酸及び酪酸）を使用する場合、アシル化澱粉は、酢酸及び酪酸エステル部分の両方の混合物を含むであろう。３種の無水物を使用する場合、アシル化澱粉は、３種の全脂肪酸部分の混合物を含むであろう。
【０２０３】
実施例３：ＳＣＦＡ富化食物の製剤
上記の実施例２に詳細した大規模手順により、大量（約５００ｇ）のアシル化澱粉を調製した。
【０２０４】
アセチル化及びブチリル化澱粉の両方を含む組み合わせ食物を調製し、以下の成分を含んでいた。
・カゼイン（２００ｇ／ｋｇ）
・メチオニン（１．５ｇ／ｋｇ）
・ショ糖（５０ｇ／ｋｇ）
・澱粉（２５１．５ｇ／ｋｇ）
・トウモロコシ油（１００ｇ／ｋｇ）
・ミネラルミックス（３５ｇ／ｋｇ）
・ビタミンミックス（１０ｇ／ｋｇ）
・酒石酸コリン（２ｇ／ｋｇ）
・セルロース（５０ｇ／ｋｇ）
・アセチル化澱粉（１５０ｇ／ｋｇ）
・ブチリル化澱粉（１５０ｇ／ｋｇ）
【０２０５】
上記の食物におけるアシル化澱粉の百分率は、３０％（１５％：１５％アセチル化：ブチリル化澱粉）である。
【０２０６】
以下を含有する代替的な組み合わせ食物を調製し得る。
【０２０７】
【表４】
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【０２０８】
食物を低温押出してペレットとし、乾燥させ、使用前に低温で保管し得る。代替的に、食物は、本明細書に記載されるような食品に含有させるために粉末として調製され得る。
【０２０９】
アセテート及びブチレート部分の両方を含むアシル化澱粉３００ｇ（短鎖脂肪酸の１種のみでアシル化された澱粉１５０ｇではなく）を使用して、同様の食物を調製できることが認識されるであろう。
【０２１０】
実施例４：アセチル化及びブチリル化澱粉を含む食品
本明細書に記載されるアシル化澱粉は、様々な食品中のサプリメントとして、粉末形態で使用することができる。例えば、
Ａ．アセチル化及びブチリル化澱粉を含むラピッド生地（ｒａｐｉｄ  ｄｏｕｇｈ）のレシピ：
・８０部の小麦粉
・１０部のアセチル化澱粉
・１０部のブチリル化澱粉
・２部の脂肪
・２部の塩
・１部の改善料
・２．５部の酵母
【０２１１】
Ｂ．本明細書に記載されるアシル化澱粉を使用して補足できる他の食品：
上述したアシル化澱粉の粉末はまた、パスタソース、リゾット、グレイビー、スープ及びポリッジを含む一連の暖かい食品又は牛乳、シリアル、チョコレート／バニラカスタード、プリン及びジュースを含む冷たい食品に添加することができる。
【０２１２】
本明細書に開示及び定義される本発明は、文章若しくは図面に言及されるか又は文章若しくは図面から明らかな代替的な２種以上の個々の特徴の組み合わせの全てに拡張されることが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせの全ては、本発明の様々な代替的な態様を構成する。
【０２１３】
参考文献
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Ｙｉｌｍａｚ，  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈｅｒ  ｕｒｉｎｅ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０／ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  ｒａｔｉｏ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  Ｒｅｎａｌ  Ｆａｉｌｕｒｅ  ３８，４０４−４１０（２０１６）．
Ｚｅｌａｎｔｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｅｎｇａｇｅ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｂａｌａｎｃｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｖｉａ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２２．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９，３７２−３８５（２０１３）．
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Ｚｈｕ，Ｙ．＆Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｔ．Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ａ  ｆｉｂｒｏｕｓ−ｂｅｄ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  １９，３６５−３７２（２００３）．
Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ＣＤ１９  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｓ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  ＮＯＤ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５６，２６５９−２６６８（２０１３）．
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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