(57)【要約】本発明は、１つ以上のＦｃ結合ドメインを含むＦｃ結合タンパク質であって、少なくとも１つのドメインが配列番号１〜６または２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合タンパク質に関する。本発明は、本発明のＦｃ結合タンパク質を含むアフィニティーマトリックスにさらに関する。本発明は、免疫グロブリンをアフィニティー精製するためのこれらのＦｃ結合タンパク質またはアフィニティーマトリックスの使用および本発明のＦｃ結合タンパク質を使用するアフィニティー精製の方法にさらに関する。
2019527715.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のドメインを含むＦｃ結合タンパク質であって、少なくとも１つのドメインは、配列番号１〜６または２１のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合タンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質は、相互に連結した２、３、４、５または６つのドメインを含む、請求項１に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項３】
前記ドメインの全部は、配列番号１〜６または２１のいずれか１つから選択される、請求項２に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項４】
前記ドメインは、配列番号１〜６または２１の誘導体であって、さらに各誘導体は、そのＮ末端の最初の４つのアミノ酸内の１、２もしくは３つのアミノ酸の欠失および／またはそのＣ末端の最初の２つのアミノ酸内の１もしくは２つのアミノ酸の欠失を有する以外は、配列番号１〜６または２１の１つと１００％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質はホモ多量体である、請求項２に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質はヘテロ多量体である、請求項２に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項７】
１つ以上のドメインは、相互に直接的に、または１つ以上のリンカーを用いて連結されている、請求項２〜４のいずれか一項に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項８】
前記リンカーは、ペプチドリンカーである、請求項７に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質は、少なくとも５時間にわたる０．５ＭのＮａＯＨ中でのインキュベーション後に結合能力における１５％未満の減少を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項１０】
前記Ｆｃ結合タンパク質は、固体支持体にコンジュゲート化されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｆｃ結合タンパク質は、固体支持体に前記Ｆｃ結合タンパク質を部位特異的共有結合させるための付着部位をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の前記Ｆｃ結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックス。
【請求項１３】
Ｆｃ配列を含む任意のタンパク質をアフィニティー精製するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の前記Ｆｃ結合タンパク質または請求項１２に記載のアフィニティー分離マトリックスの使用。
【請求項１４】
Ｆｃ配列を含む前記タンパク質の９５％以上が３．５以上のｐＨで溶出される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
Ｆｃ配列を含むタンパク質をアフィニティー精製するための方法であって：
（ａ）Ｆｃ配列を含むタンパク質を含有する溶液を提供する工程；
（ｂ）それに結合した請求項１〜７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスを提供する工程；
（ｃ）Ｆｃ配列を含むタンパク質への請求項１〜７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質の特異的結合を許容する条件下で、前記アフィニティー分離マトリックスを前記溶液と接触させる工程；および
（ｄ）Ｆｃ配列を含む前記タンパク質を前記アフィニティー精製マトリックスから溶出させる工程を含む方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）または（ｄ）の間に前記アフィニティーマトリックスを洗浄する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）または（ｄ）の間に前記アフィニティーマトリックスを洗浄する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
Ｆｃ配列を含む前記タンパク質は、免疫グロブリン分子またはその断片もしくは誘導体を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｆｃ配列を含む前記タンパク質の９５％以上が３．５以上のｐＨで溶出される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｆｃ配列を含むタンパク質をアフィニティー精製するための方法であって：
（ａ）Ｆｃ配列を含む前記タンパク質への前記少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質の結合を許容する条件下で、それに結合した請求項１〜７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスをＦｃ配列を含むタンパク質を含有する溶液と接触させる工程；および
（ｂ）前記アフィニティー精製マトリックス由来のＦｃ配列を含む前記結合タンパク質を溶出させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つ以上のＦｃ結合ドメインを含むＦｃ結合タンパク質であって、少なくとも１つのドメインが配列番号１〜６または２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合タンパク質に関する。本発明は、本発明のＦｃ結合タンパク質を含むアフィニティーマトリックスにさらに関する。本発明は、免疫グロブリンのアフィニティー精製するためのこれらのＦｃ結合タンパク質またはアフィニティーマトリックスの使用および本発明のＦｃ結合タンパク質を使用するアフィニティー精製の方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生物工学的および製薬学的用途は、抗体を含有する試料から汚染物質を除去することを必要とする。抗体を捕捉および精製するための確立された方法は、免疫グロブリンのための選択的リガンドとしての黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の細菌細胞表面プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーである（例えば、（非特許文献１）による概説を参照されたい）。野生型プロテインＡは、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に高度のアフィニティーおよび選択性で結合し、高温および広範囲のｐＨ値で安定である。抗体を精製するために、例えばアルカリ安定性などの改良された特性を備えるプロテインＡの変異体を入手することができ、プロテインＡリガンドを含む様々なクロマトグラフィーマトリックスは市販で入手できる。しかし、特に、野生型プロテインＡをベースとするクロマトグラフィーマトリックスは、アルカリ条件への曝露後に免疫グロブリンに対する結合能力の消失を示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】フセ（Ｈｕｓｅ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオケム・バイオフィス・メソッズ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２００２年、第５１巻、Ｐ２１７〜２３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
抗体またはＦｃ含有融合タンパク質のほとんどの大規模生産方法はアフィニティー精製するためにプロテインＡを使用する。しかし、アフィニティークロマトグラフィーにおけるプロテインＡ適用には制限があることに起因して、当分野には、免疫グロブリンのアフィニティー精製を促進するために、免疫グロブリンに特異的に結合する改良された特性を備える新規なＦｃ結合タンパク質を提供する必要がある。Ｆｃ結合タンパク質を含むクロマトグラフィーマトリックスの価値を最大限に活かすためには、アフィニティーリガンドマトリックスを複数回使用することが望ましい。クロマトグラフィーのサイクル間で、マトリックス上の残留汚染物質を浄化および除去するための完全な洗浄法が必要とされる。この方法では、アフィニティーリガンドマトリックスへ高濃度のＮａＯＨを備えるアルカリ溶液を適用することが一般的実践である。野生型プロテインＡドメインは、長期間にわたるそのような過酷なアルカリ条件に抵抗することができず、免疫グロブリンに対する結合能力を急速に消失する。したがって、免疫グロブリンに結合することができる新規なアルカリ安定性タンパク質を入手することは、この分野における継続的な必要である。
【０００５】
本発明は、免疫グロブリンをアフィニティー精製するために特に良好に適合するが先行技術の不利点を克服する、アルカリ安定性免疫グロブリン結合タンパク質を提供する。特に、本発明のアルカリ安定性Ｆｃ結合タンパク質の有意な利点は、例えば野生型プロテインＡまたは親タンパク質に比較して、高ｐＨでのそれらの改良された安定性である。
【０００６】
上記の概観は、本発明によって解決される全ての課題を必ずしも記載するものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１態様は、アフィニティー精製のために好適なＦｃ結合タンパク質を提供することである。この課題は、１つ以上のＦｃ結合ドメインを含むアルカリ安定性免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質であって、少なくとも１つのＦｃ結合ドメインが、配列番号１〜６もしくは２１のアミノ酸配列を含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなるアルカリ安定性免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質により解決される。１つの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、相互に連結した、上記に規定した２、３、４、５もしくは６つのＦｃ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ドメインを接続するリンカーは、ペプチドリンカーである。好ましい実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、固体支持体にコンジュゲート化される。
【０００８】
一部の実施形態では、タンパク質はホモ多量体であるが、一部の実施形態では、タンパク質はヘテロ多量体である。
一部の実施形態では、タンパク質のドメインの少なくとも１つは、配列番号１〜６または２１のいずれか１つの誘導体であって、そのＮ末端の最初の４つのアミノ酸（１、２、３および／または４位）内の１、２、３または４つのアミノ酸の欠失および／またはそれをベースとする配列番号１〜６または２１の１つに比較してＣ末端（５７および／または５８位）での１または２つのアミノ酸の欠失を有する以外は、配列番号１〜６または２１の１つと１００％同一である１つのアミノ酸配列を有する誘導体である。
【０００９】
一部の実施形態では、タンパク質は、少なくとも５時間にわたる０．５ＭのＮａＯＨ中でのインキュベーション後に結合能力における１５％未満の減少を有する。例えば、タンパク質は、６時間にわたる０．５ＭのＮａＯＨ中でのインキュベーション後に結合能力における１０％未満または５％未満の減少を有し得る。
【００１０】
第２態様では、本発明は、第１態様のＦｃ結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスに関する。
第３態様では、本発明は、第１態様のＦｃ結合タンパク質または免疫グロブリンをアフィニティー精製するための第２態様のアフィニティー分離マトリックスまたは免疫グロブリンのＦｃ配列を含むタンパク質の使用に関する。
【００１１】
第４態様では、本発明は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのＦｃ配列を含むタンパク質のアフィニティー精製の方法であって：（ａ）免疫グロブリンを含有する液体を提供する工程；（ｂ）前記アフィニティー分離マトリックスに結合した第１態様の固定化Ｆｃ結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスを提供する工程；（ｃ）前記液体と前記アフィニティー分離マトリックスとを接触させる工程であって、前記免疫グロブリンは前記固定化Ｆｃ結合タンパク質に結合する工程；および（ｄ）前記免疫グロブリンを前記マトリックスから溶出させ、それにより前記免疫グロブリンを含有する溶出液を入手する工程を含む方法に関する。一部の実施形態では、洗浄工程は、本明細書に開示した方法の工程（ｃ）と（ｄ）との間に導入することができる。本明細書に開示した使用および方法の一部の実施形態では、３．５以上のｐＨでＦｃ配列を含むタンパク質の９５％以上が溶出される。例えば、３．５以上のｐＨでＦｃ配列を含むタンパク質の９８％以上が溶出される。
【００１２】
また別の態様では、本発明は、Ｆｃ配列を含むタンパク質のアフィニティー精製の方法であって：（ａ）Ｆｃ配列を含む前記タンパク質への前記少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質の結合を許容する条件下で、それに結合した第１態様の少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスとＦｃ配列を含むタンパク質を含有する溶液とを接触させる工程；および（ｂ）前記アフィニティー精製マトリックス由来のＦｃ配列を含む結合タンパク質を溶出させる工程を含む方法に関する。
【００１３】
本発明のこの概要は、必ずしも本発明の全ての特徴を記述するものではない。他の実施形態は、下記の詳細な説明を精査することから明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】０．５ＭのＮａＯＨによる６時間の処理後にセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂマトリックス上に固定化した様々なＦｃ結合ドメインのアルカリ安定性の分析を示す図である。Ｆｃ結合ドメインであるｃｓ２４（配列番号１）およびｃｓ２６（配列番号２）は、親ドメインＩＢ２４（配列番号１７）と比較して、高ｐＨでの有意に改良された安定性を示している。
【図２】０．５ＭのＮａＯＨでの６時間のインキュベーション後のプレスト（Ｐｒａｅｓｔｏ）（商標）（ピュア（Ｐｕｒｅ）４５マトリックス（ｐＨ９．５））上に固定化されたＦｃ結合ドメインの活性についての分析を示す図である。Ｆｃ結合ドメインｃｓ２４（配列番号１）、ｃｓ２４ａ（配列番号３）、ｃｓ２４ｂ（配列番号５）、ｃｓ２６（配列番号２）、ｃｓ２６ａ（配列番号４）およびｃｓ２６ｂ（配列番号６）。
【図３】０．５ＭのＮａＯＨでの６時間および２４時間（パネルＡ）ならびに６時間、２４時間および３６時間（パネルＢ）にわたるインキュベーション後のｐＨ９．５でのプレスト（Ｐｒａｅｓｔｏ）（商標）ピュア（Ｐｕｒｅ）８５マトリックス（パネルＡ）およびプレスト（Ｐｒａｅｓｔｏ）（商標）ピュア（Ｐｕｒｅ）４５マトリックス（パネルＢ）上に固定化されたＦｃ結合ドメインの活性の分析を示す図である。野生型ドメインＣと比較した、Ｆｃ結合ドメインｃｓ２４（配列番号１）、ｃｓ２４ａ（配列番号３）、ｃｓ２４ｂ（配列番号５）、ｃｓ２６（配列番号２）、ｃｓ２６ａ（配列番号４）およびｃｓ２６ｂ（配列番号６）。
【図４】ｐＨ３．５および２．０でのＦｃ結合ドメインｃｓ２４（配列番号１）、ｃｓ２４ａ（配列番号３）、ｃｓ２４ｂ（配列番号５）、ｃｓ２６（配列番号２）、ｃｓ２６ａ（配列番号４）およびｃｓ２６ｂ（配列番号６）からのポリクローナルｈＩｇＧの溶出の分析を示す図である。パネルＡは、代表的な溶出試験を示している。全ＦｃドメインについてのｐＨ３．５での溶出での工程産生率は、プロテインＡのドメインＣの溶出をはるかに超えて、９８％超であった（パネルＢ）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
用語の定義
本発明について下記で詳細に記載する前に、本明細書に記載した特定の方法、プロトコールおよび試薬は変動する可能性があるので、本発明はそれらに限定されないと理解すべきである。さらに、本明細書において使用する用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されていないことも理解すべきである。他に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００１６】
好ましくは、本明細書で使用する用語は、「バイオテクノロジー用語の多言語用語集（ア・マルチリンガル・グロッサリー・オブ・バイオテクノロジカル・タームズ（Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ））：（ＩＵＰＡＣ（国際純粋応用化学連合）勧告）」、Ｈ．Ｇ．Ｗ．ロイエンベルガー（Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ）、Ｂ．ナーゲル（Ｎａｇｅｌ）およびＨ．ケルブル（Ｋｏｅｌｂｌ）ら（１９９５）著、ヘルベチカ・キミカ・アクタ（Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ）、ＣＨ−４０１０  バーゼル、スイス国）に提供された用語の定義に一致する。
【００１７】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の全体を通して、状況が他のことを要求しない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、規定の構成品、整数もしくは工程または構成品、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、任意の他の構成品、整数もしくは工程または構成品、整数もしくは工程の群を排除しないことを意味すると理解されるであろう。
【００１８】
本発明および添付の特許請求の範囲における記載において使用するように、単数形の「１つの」および「その」は、互換的に使用され、その内容が明白に他のことを指示しない限り、複数形を同様に含み、各意味の中に含まれることが意図されている。さらに、本明細書で使用する「および／または」は、列挙した品目の１つ以上の任意および全ての考えられる組合わせ、ならびに選択的に解釈される場合（「または」）は、組合わせの欠如を意味しており、それらを含む。
【００１９】
本明細書で使用する用語「約」は、明示的に列挙された量ならびにそれらからの±１０％の偏差を含む。より好ましくは、偏差５％は、用語「約」に含まれる。
本明細書の本文を通して、複数の文献（例えば、特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列登録書など）が言及されている。本明細書では、本発明が先行発明によってそのような開示が先行することを認めていないとの承認であると何も解釈すべきではない。本明細書に言及した文献の一部は、「参照により組み込まれる」と特徴付けられている。そのような組み込まれた参考文献の用語の定義または教示と本明細書に列挙された用語の定義または教示との間に万一矛盾がある場合は、本明細書の本文が優先されるものとする。
【００２０】
本明細書で言及する全ての配列は、その全内容および開示とともに、本明細書の一部である添付の配列表に開示されている。
本発明の状況では、用語「免疫グロブリン結合タンパク質」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に特異的に結合することができるタンパク質を記載するために使用される。Ｆｃ領域へのこの特異的結合に起因して、本発明の免疫グロブリン結合タンパク質は、全免疫グロブリン、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン断片、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質、および免疫グロブリンのＦｃ領域を含むコンジュゲートに結合することができる。本明細書の本発明の「免疫グロブリン結合タンパク質」は、免疫グロブリンのＦｃ領域への特異的結合を示すが、「免疫グロブリン結合タンパク質」が例えば免疫グロブリンのＦａｂ領域などの他の領域へ低下したアフィニティーで追加して結合できることは排除されない。
【００２１】
本明細書を通して、用語「免疫グロブリン結合タンパク質」は、「Ｆｃ結合タンパク質」または「Ｆｃ−結合タンパク質」と略記されることが多い。
本発明の好ましい実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、１つ以上のＦｃ結合ドメインを含む。
【００２２】
用語「解離定数」または「ＫＤ」は、特異的結合アフィニティーを規定する。本明細書で使用する用語「ＫＤ」（通常は、時には「Ｍ」と略記される「モル／Ｌ」で測定される）は、第１タンパク質と第２タンパク質との特定の相互作用の解離平衡定数を意味することが意図されている。本発明の状況では、用語「ＫＤ」は、特に免疫グロブリン結合タンパク質と免疫グロブリンとの間の結合アフィニティーを記載するために使用される。
【００２３】
本発明のタンパク質は、それが免疫グロブリンに対する少なくとも１μＭ以下、または好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下、いっそうより好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数ＫＤを有する場合に、免疫グロブリンに結合すると考えられる。例えば、配列番号１〜６および２１に開示したＦｃ結合ドメインの全部は、１μＭ以下のＫＤでＩｇＧ１に結合する。
【００２４】
本発明による用語「結合」は、好ましくは特異的結合に関する。「特異的結合」は、本発明のＦｃ結合タンパク質が、また別の非免疫グロブリン標的への結合に特に比較して、免疫グロブリン（または免疫グロブリンのＦｃ配列）により強力に結合することを意味する。
【００２５】
本明細書で理解される免疫グロブリンには、哺乳動物ＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２Ａ、マウスＩｇＧ２  ＩｇＧ１、ラットＩｇＧ２Ｃ、ヤギＩｇＧ１、ヤギＩｇＧ２、ウシＩｇＧ２、モルモットＩｇＧ、ウサギＩｇＧ；ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ；ならびにＦｃ領域を含む免疫グロブリン断片、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質、および免疫グロブリンのＦｃ領域を含むコンジュゲートを含むことができるが、必ずしもそれらに限定されない。とりわけ、天然型プロテインＡドメインおよび本発明の人工的Ｆｃ結合タンパク質はヒトＩｇＧ３に結合しない。
【００２６】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸の任意の直鎖状分子鎖を意味しており、本産物の特異的長さを意味するものではない。したがって、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」もしくは本明細書で使用する任意の他の用語は、２つ以上のアミノ酸の鎖を意味しており、「ポリペプチドの」定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれらと互換的に使用され得る。用語「ポリペプチド」は、さらに制限なくグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、タンパク質分解切断、非天然型アミノ酸による修飾を含むポリペプチドの翻訳後修飾および当分野において周知である類似の修飾の産物を意味することも意図されている。したがって、２つ以上のタンパク質ドメインを含むＦｃ結合タンパク質もまた、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」の定義の中に含まれる。
【００２７】
用語「アルカリ安定性の」もしくは「アルカリ安定性」または「苛性安定性の」もしくは「苛性安定性」（本明細書では「ｃｓ」と略記する）は、免疫グロブリンに結合する能力を有意に消失することなく本発明のＦｃ結合タンパク質がアルカリ条件に抵抗する能力を意味する。当業者であれば、例えば実施例において記載したようにＦｃ結合タンパク質を水酸化ナトリウム溶液とともにインキュベートする工程、およびその後に、例えば、クロマトグラフィーアプローチによって、当業者であれば公知のルーチン実験によって免疫グロブリンへの結合活性についての試験によってアルカリ安定性を容易に試験することができる。
【００２８】
本発明のＦｃ結合タンパク質ならびに本発明のＦｃ結合タンパク質を含むマトリックスは、「増加した」または「改良された」アルカリ安定性を示すが、これは前記Ｆｃ結合タンパク質を組み込んでいる分子およびマトリックスが親Ｆｃ結合タンパク質と比較して長期間にわたりアルカリ条件下で安定である、すなわち免疫グロブリンに結合する能力を消失しない、または親Ｆｃ結合タンパク質よりも少ない程度まで免疫グロブリンに結合する能力を消失しないことを意味する。
【００２９】
用語「結合活性」は、本発明のＦｃ結合タンパク質が免疫グロブリンに結合する能力を意味する。例えば、結合活性は、アルカリ処理の前および／または後に決定することができる。結合活性は、Ｆｃ結合タンパク質またはマトリックスに結合したＦｃ結合タンパク質について、すなわち固定化結合タンパク質に対して決定することができる。用語「人工的」は、天然型ではない対象に関しており、すなわちこの用語はヒトによって生成または改変されている対象に関する。例えば、ヒトによって（例えば、遺伝子組換え、シャッフリング法、もしくは化学反応などによって実験室で）生成されている、または故意に改変されているポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列は、人工的である。
【００３０】
本明細書で使用する用語「親Ｆｃ結合タンパク質」または「親Ｆｃ結合ドメイン」における用語「親」は、前記親タンパク質またはドメインの変異体を生成するために引き続いて改変されるＦｃ結合タンパク質に関する。そのような親タンパク質またはドメインは、本明細書においてＩＢ２４（配列番号１７）またはＩＢ２６（配列番号１８）として開示されている人工的Ｆｃ結合ドメインであってよい。
【００３１】
本明細書で使用する用語「コンジュゲート」は、例えば第２タンパク質または非タンパク質性部分などの他の物質に化学的に付加された少なくとも１つの第１タンパク質を含む、またはそれから本質的になる分子に関する。
【００３２】
用語「置換」または「アミノ酸置換」は、親ポリペプチド配列内の特定の位置でのアミノ酸とまた別のアミノ酸との交換に関する。公知の遺伝コード、ならびに組換えおよび合成ＤＮＡ技術を前提にすると、当業者であれば、アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【００３３】
用語「アミノ酸配列同一性」は、２つ以上のタンパク質のアミノ酸配列の同一性（または相違）の定量的比較を意味する。参照ポリペプチド配列に比較した「アミノ酸配列同一性率（％）」は、最高配列同一性率を達成するために、必要であれば、配列を整列させてギャップを導入した後に、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である配列内のアミノ酸残基の百分率であると定義されている。
【００３４】
配列の同一性を決定するために、クエリータンパク質の配列が参照タンパク質の配列とアラインメントさせられる。アラインメントのための方法は、当分野において周知である。
【００３５】
用語「融合した」は、構成成分がペプチド結合によって直接的またはペプチドリンカーのいずれかによって連結されていることを意味する。
用語「融合タンパク質」は、少なくとも１つの第２タンパク質へ遺伝子的に結合された少なくとも１つの第１タンパク質を含むタンパク質に関する。融合タンパク質は、本来は別個のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子の結合を通して作製される。したがって、融合タンパク質は、単一の直鎖状ポリペプチドとして表示される同一または異なるタンパク質の多量体を含み得る。
【００３６】
本明細書で使用する用語「リンカー」は、その最も広義の意味では、少なくとも２つの他の分子で共有的に結合する分子に関する。本発明の典型的な実施形態では、「リンカー」は、Ｆｃ結合ドメインを少なくとも１つまたは別のＦｃ結合ドメインと接続する部分、すなわち多量体を生成するために２つのタンパク質ドメインを相互に連結させる部分であると理解すべきである。好ましい実施形態では、「リンカー」は、ペプチドリンカーである、すなわち、２つのタンパク質ドメインを連結している部分は、１つの単一アミノ酸または２つ以上のアミノ酸を含むペプチドである。
【００３７】
用語「クロマトグラフィー」は、試料内の１つのタイプの分子（例えば、免疫グロブリン）を他の分子（例えば、汚染物質）から分離するために移動相および固定相を使用する分離テクノロジーを意味する。液体移動相は、分子の混合物を含有し、固定相（例えば、固体マトリックス）を超えて、または通してこれらを輸送する。移動相内の異なる分子と固定相との示差的相互作用に起因して、移動相内の分子を分離することができる。
【００３８】
用語「アフィニティークロマトグラフィー」は、固定相に結合したリガンドが移動相（試料）内の分子（すなわち、免疫グロブリン）と相互作用する、すなわち、リガンドが精製対象の分子に対する特異的結合アフィニティーを有する、特定モードのクロマトグラフィーを意味する。本発明の状況において理解されるように、アフィニティークロマトグラフィーは、例えば本発明のＦｃ結合タンパク質などのクロマトグラフィーリガンドを含む固定相への免疫グロブリンを含有する試料の添加を包含する。
【００３９】
用語「固体支持体」または「固体マトリックス」は、固定相のために互換的に使用される。
本明細書で互換的に使用する用語「アフィニティーマトリックス」または「アフィニティー分離マトリックス」または「アフィニティークロマトグラフィーマトリックス」は、その上にアフィニティーリガンド、例えば本発明のＦｃ結合タンパク質が付加されるマトリックス、例えば、クロマトグラフィーマトリックスを意味する。リガンド（例えば、Ｆｃ結合タンパク質）は、混合物から精製または除去すべき関心対象の分子（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）に特異的に結合することができる。
【００４０】
本明細書で使用する用語「アフィニティー精製」は、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質をマトリックスに固定化されているＦｃ結合タンパク質に結合させることによって免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質を液体から精製する方法を意味する。それにより、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質以外の混合物の全ての他の構成成分が除去される。また別の工程では、結合免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質は、精製形で溶出させることができる。
【００４１】
発明の実施形態
以下では、本発明について詳細に説明する。下記では、本発明の様々な態様についてより詳細に規定する。以下に規定する各態様は、その反対を明確に指示しない限り、任意の１つ以上の他の態様と結合することができる。特に、好ましいまたは有利であると指示されたあらゆる特徴は、また別の好ましいまたは有利であると指示された他の１つ以上の特徴と組み合わせることができる。
【００４２】
第１態様では、本発明は、１つ以上のＦｃ結合ドメインを含むＦｃ結合タンパク質であって、少なくとも１つのＦｃ結合ドメインが、配列番号１〜６もしくは２１のアミノ酸配列を含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなるＦｃ結合タンパク質に向けられる。本明細書に開示したＦｃ結合ドメインおよび前記ドメインを含むタンパク質の１つの利点は、特に親タンパク質および他の公知のＦｃ結合タンパク質と比較して、アルカリ処理後にさえ安定のままである点である。例えば、一部の実施形態では、前記ドメインを含む本明細書に開示したＦｃ結合ドメインおよびタンパク質は、アルカリ条件に曝露させた後に、プロテインＡのドメインＣよりも少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％または少なくとも約３０％超安定であり得る。これを言い換えると、本明細書に開示したＦｃ結合ドメインは、プロテインＡのドメインＣと比較した場合に、０．５ＭのＮａＯＨを用いた５時間以上のインキュベーション時間後に結合能力の減少がより少ない。したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示したＦｃタンパク質は、少なくとも５時間（例えば、６時間）にわたる０．５ＭのＮａＯＨ中でのインキュベーション後の結合能力の減少が２０％未満である。一部の実施形態では、少なくとも５時間にわたる０．５ＭのＮａＯＨ中でのインキュベーション後の本明細書に開示したＦｃタンパク質の結合能力の減少は、約１５％未満、約１０％未満または約５％未満であり得る。
【００４３】
本発明の全てのＦｃ結合タンパク質は、１μＭ未満、または好ましくは１００ｎＭ未満、またはいっそうより好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数ＫＤで免疫グロブリンに結合する。Ｆｃ結合タンパク質またはドメインの結合アフィニティーを決定するための、すなわち解離定数ＫＤを決定するための方法は、当業者には知られており、例えば、当分野において公知の下記の方法；表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）に基づくテクノロジー、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）、分析超遠心法、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡまたはＩＲＭＡ）および強化化学ルミネッセンス法（ＥＣＬ）から選択することができる。これらの方法の一部については、実施例の項において詳細に記載する。典型的には、解離定数ＫＤは、２０℃、２５℃または３０℃で決定される。他に特に特別に指示されていない限り、本明細書で言及するＫＤ値は、表面プラズモン共鳴法によって２２℃±３℃で決定される。第１態様の１つの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１に対して、０．１ｎＭ〜１００ｎＭ、好ましくは０．１ｎＭ〜１０ｎＭの範囲にある解離定数ＫＤを有する。
【００４４】
下記の実施例の項に示したように、驚くべきことに、および予想外にも、本発明のＦｃ結合タンパク質は、長時間のアルカリ処理後にさえＩｇＧに結合することが見出された。一部の実施形態では、本発明のＦｃ結合タンパク質は、対応する親タンパク質と比較して、改良されたアルカリ安定性を示す。Ｆｃ結合タンパク質のアルカリ安定性は、０．５ＭのＮａＯＨ中での６時間にわたるインキュベーション後に対応する親タンパク質のＩｇＧ結合活性の消失に対して、０．５ＭのＮａＯＨ中での６時間のインキュベーション後のＦｃ結合タンパク質のＩｇＧ結合活性の消失を比較することによって決定する。結合活性の消失は、６時間にわたる０．５ＭのＮａＯＨのインキュベーション前後に結合活性を比較することによって決定される。
【００４５】
図１の比較データによって示したように、ｃｓ２４およびｃｓ２６のＩｇＧ結合活性はＩＢ２４と比較して、少なくとも約３０％増加する。これは、親ＩＢ２４と比較して、ｃｓ２４およびｃｓ２６の予想外の有益な特性である。図２は、配列番号１〜６の全Ｆｃ結合タンパク質が０．５ＭのＮａＯＨでの６時間のインキュベーション後に少なくとも８７．６％の結合活性残留活性を有することを示している。
【００４６】
本発明の１つの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、相互に連結した２、３、４、５または６つのＦｃ結合ドメインを含み、すなわちＦｃ結合タンパク質は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体または六量体であってよい。
【００４７】
一部の実施形態では、ドメインは、配列番号１〜６および２１からなる群から選択される。他の実施形態では、ドメインは、配列番号１〜６もしくは２１の誘導体であって、さらにそのＮ末端の最初の４つのアミノ酸内の１、２、３もしくは４つのアミノ酸の欠失および／またはそれをベースとする配列番号１〜６もしくは２１の１つに比較してＣ末端での１もしくは２つのアミノ酸（５７位および／または５８位）の欠失を有する以外は、各誘導体が配列番号１〜６もしくは２１の１つと１００％同一であるアミノ酸配列を有する誘導体である（例えば、配列番号７〜１６を参照）。
【００４８】
本発明の多量体は、一般には当業者には周知である組換えＤＮＡテクノロジーによって、人工的に生成される融合タンパク質である。本発明のＦｃ結合タンパク質は、例えば単純な有機合成戦略、固相支援合成技術などの多数の従来型技術ならびに周知の技術または市販で入手できる自動合成装置のいずれかによって調製することができる。
【００４９】
第１態様の一部の実施形態では、多量体は、ホモ多量体であり、例えば、Ｆｃ結合タンパク質の全Ｆｃ結合ドメインのアミノ酸配列は同一である。
第１態様の一部の実施形態では、多量体は、ヘテロ多量体であり、例えば少なくとも１つのＦｃ結合ドメインは、Ｆｃ結合タンパク質内の他のＦｃ結合ドメインとは異なるアミノ酸配列を有する。
【００５０】
第１態様の一部の実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、相互に直接的に連結されている。他の実施形態では、１つ以上のＦｃ結合ドメインは、１つ以上のリンカーを用いて相互に連結されている。これらの典型的な実施形態において好ましいのは、ペプチドリンカーである。これは、ペプチドリンカーが第１Ｆｃ結合ドメインを第２Ｆｃ結合ドメインと接続させるアミノ酸配列であることを意味する。ペプチドリンカーは、第１Ｆｃ結合ドメインおよび第２Ｆｃ結合ドメインにこれらのドメインのＣ末端とＮ末端との間のペプチド結合によって接続させられ、それによって単一の直鎖状ポリペプチド鎖が生成される。リンカーの長さおよび組成は、少なくとも１つのアミノ酸〜約３０アミノ酸の間で変動し得る。より詳細には、ペプチドリンカーは、１〜３０アミノ酸の間の、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０アミノ酸の長さを有する。ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、苛性条件およびプロテアーゼに対して安定であるのが好ましい。リンカーは、Ｆｃ結合タンパク質内でのドメインの立体構造を不安定化してはならない。周知であるのは、例えばグリシンおよびセリンなどの小さなアミノ酸を含むリンカーである。リンカーは、グリシンリッチであってもよい（例えば、リンカー内の残基の５０％超はグリシン残基であってよい）。さらに好ましいのは、また別のアミノ酸を含むリンカーである。本発明の他の実施形態は、アラニン、プロリンおよびセリンからなるリンカーを含む。タンパク質の融合のための他のリンカーは、当分野において公知であり、使用できる。
【００５１】
本発明の一部の実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、固体支持体にコンジュゲート化される。本発明の一部の実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、Ｎ末端および／またはＣ末端で、追加のアミノ酸残基、例えばＮ末端でリーダー配列および／またはＮ末端またはＣ末端でタグを伴う、もしくは伴わないカップリング配列を含むことができる。
【００５２】
一部の実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、固体相（マトリックス）への共有結合のための付着部位をさらに含む。好ましくは、付着部位は、Ｆｃ結合タンパク質の固体相への部位特異的付着を提供するために特異的である。特異的付着部位は、天然アミノ酸、例えば固体相の反応性基または固体相と例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ヨードアセタミド、マレイミド、エポキシまたはアルケン基から選択されるタンパク質との間のリンカーとの間の特異的化学反応を可能にするシステインまたはリシンを含む。付着部位は、Ｆｃ結合タンパク質のＣ末端もしくはＮ末端で直接的であってよい、またはＮ末端もしくはＣ末端とカップリング部位との間のリンカー、好ましくはペプチドリンカーであってよい。本発明の一部の実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、末端のシステインを備える、３〜２０アミノ酸、好ましくは４〜１０アミノ酸の短鎖のＮまたはＣ末端ペプチド配列を含み得る。Ｃ末端付着部位に対するアミノ酸は、好ましくは、カップリングのためのＣ末端での単一システインとともにプロリン、アラニンおよびセリン、例えばＡＳＰＡＰＳＡＰＳＡＣ（配列番号１９）から選択されてよい。また別の実施形態では、Ｃ末端付着部位に対するアミノ酸は、好ましくは、カップリングのためのＣ末端での単一システインとともにグリシンおよびセリン、例えばＧＧＧＳＣから選択されてよい。
【００５３】
Ｃ末端システインを有する利点は、Ｆｃ結合タンパク質のカップリングが、結果としてチオエーテル架橋結合を生じさせるシステインチオールと支持体上の求電子性基との反応を通して達成できる点である。これは、増加した結合能力を提供する結合タンパク質の素晴らしい移動度を提供する。
【００５４】
第２態様では、本発明は、第１態様のＦｃ結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスに向けられる。
第２態様の好ましい実施形態では、アフィニティー分離マトリックスは、固体支持体である。アフィニティー分離マトリックスは、配列番号１〜６または２１のいずれか１つを含む少なくとも１つのＦｃ結合ドメインを含む少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質を含む。
【００５５】
本発明のＦｃ結合タンパク質を含むこのマトリックスは、分離のために、例えば免疫グロブリンおよび他のＦｃ含有タンパク質、例えばＦｃ領域を含む免疫グロブリン変異体、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質および免疫グロブリンのＦｃ領域を含むコンジュゲートのクロマトグラフィー分離のために有用である。アフィニティーマトリックスは、免疫グロブリンを分離するために有用であり、洗浄プロセス中に適用されるような高アルカリ条件後にさえＦｃ結合特性を維持しなければならない。そのようなマトリックスの洗浄は、マトリックスを長期間にわたり繰返し使用するために必須である。
【００５６】
アフィニティークロマトグラフィーのための固体支持体マトリックスは、当分野において公知であり、例えば、アガロースおよびアガロースの安定化誘導体（例えば、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、プレスト（Ｐｒａｅｓｔｏ）（商標）ピュア（Ｐｕｒｅ）；キャプティバ（ＣａｐｔｉｖＡ）（登録商標）、マブセレクト（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ）（登録商標）、プロテインＡセファロース・ファスト・フロー（ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ））、セルロースまたはセルロースの誘導体、制御された多孔ガラス（例えば、プロセップ（ＰｒｏＳｅｐ）（登録商標）ｖＡ樹脂））、モノリス（例えば、ＣＩＭ（登録商標）モノリス）、シリカ、酸化ジルコニウム（例えば、ＣＭジルコニアまたはＣＰＧ（登録商標））、酸化チタンまたは合成ポリマー（例えば、ポリスチレン、例えばポロス（Ｐｏｒｏｓ）５０Ａまたはポロス・マブキャプチャー（Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ）（登録商標）Ａ樹脂、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなど）および様々な組成物のヒドロゲルを含むがそれらに限定されない。所定の実施形態では、支持体は、ポリヒドロキシポリマー、例えば多糖を含む。支持体のために好適な多糖の例としては、寒天、アガロース、デキストラン、デンプン、セルロース、プルランなどおよびこれらの安定化変異体が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５７】
固体支持体マトリックスのためのフォーマットは、任意の好適な周知の種類のフォーマットであってよい。本発明のＦｃ結合タンパク質をカップリングするためのそのような固体支持体マトリックスは、例えば、下記の：カラム、キャピラリー、粒子、膜、フィルター、モノリス、ファイバー、パッド、ゲル、スライド、プレート、カセットまたはクロマトグラフィーにおいて一般に使用されている、当業者には公知である任意の他のフォーマットのうちの１つを含むことができる。
【００５８】
１つの実施形態では、マトリックスは、ビーズとしても公知である、例えばセファロースまたはアガロースビーズなどの実質的に球状の粒子から構成される。好適な粒径は、５〜５００μｍ、例えば１０〜１００μｍ、例えば２０〜８０μｍの径範囲内にあってよい。粒子形にあるマトリックスは、充填層として、または膨張層を含む懸濁化形で使用できる。
【００５９】
代替実施形態では、固体支持体マトリックスは、膜、例えばヒドロゲル膜である。一部の実施形態では、アフィニティー精製は、それに第１態様のＦｃ結合タンパク質が共有結合しているマトリックスとしての膜を包含する。固体支持体は、さらにカートリッジ内の膜の形態にあってもよい。
【００６０】
一部の実施形態では、アフィニティー精製は、それに第１態様のＦｃ結合タンパク質が共有結合している固体支持体マトリックスを含有するクロマトグラフィーカラムを包含する。
【００６１】
本発明のＦｃ結合タンパク質は、例えば、本発明のＦｃ結合タンパク質中に存在するアミノ基、スルフヒドロキシ基および／またはカルボキシ基を利用する従来型カップリング技術によって、好適な固体支持体マトリックスに付着させることができる。カップリングは、Ｆｃ結合タンパク質の窒素原子、酸素原子または硫黄原子によって実施され得る。好ましくは、Ｎ末端またはＣ末端ペプチドリンカー中に含まれるアミノ酸は、前記窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含む。
【００６２】
Ｆｃ結合タンパク質は、Ｆｃ結合タンパク質の利用可能性を向上させ、本発明のＦｃ結合タンパク質の支持体への化学的カップリングを促進する、本発明のマトリックス表面とＦｃ結合タンパク質との間の適切な間隔を提供するために、スペーサー要素によって直接的または間接的に支持体マトリックスへカップリングさせることができる。
【００６３】
固体支持体にタンパク質リガンドを固定化するための方法は、当分野において周知であり、当分野の当業者であれば、標準技術および装置を使用して容易に実施できる。
Ｆｃ結合タンパク質および特定の条件に依存して、カップリングは、例えば数種のリシンによるマルチポイント・カップリングまたは例えばシステインによるシングルポイント・カップリングであってよい。
【００６４】
第３態様では、本発明は、第１態様のＦｃ結合タンパク質もしくは免疫グロブリンまたはそれらの変異体をアフィニティー精製するための第２態様のアフィニティーマトリックスの使用に向けられる。すなわち本発明のＦｃ結合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーのために使用される。一部の実施形態では、本発明のＦｃ結合タンパク質は、本発明の第２態様において記載したように、固体支持体上に固定化される。
【００６５】
第４態様では、本発明は、Ｆｃ配列を含むタンパク質をアフィニティー精製するための方法であって：
（ａ）Ｆｃ配列を含むタンパク質を含有する溶液を提供する工程；
（ｂ）本発明の少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質を含むアフィニティー分離マトリックスをそれに提供する工程；
（ｃ）Ｆｃ配列を含むタンパク質への本発明の少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質の特異的結合を許容する条件下で、前記アフィニティー分離マトリックスとその溶液とを接触させる工程；および
（ｄ）前記アフィニティー精製マトリックスからＦｃ配列を含む前記タンパク質を溶出させる工程、および
（ｅ）任意選択的に、工程（ｃ）と（ｄ）との間にアフィニティーマトリックスを洗浄する工程を含む方法に向けられる。
【００６６】
本明細書に開示した使用および方法のためには、Ｆｃ配列を含むタンパク質は、本明細書に提供した用語の定義と一致するＦｃ配列を含む免疫グロブリン分子またはその断片もしくは誘導体である。
【００６７】
本明細書に開示した使用および方法のために好適なアフィニティー分離マトリックスは、上述した実施形態による、および当業者には公知であるそれらのマトリックスである。
第４態様の一部の実施形態では、工程（ｄ）におけるマトリックスからの免疫グロブリンの溶出は、ｐＨの変化および／または塩濃度の変化を通して実行される。プロテインＡ媒体からの溶出のために使用される任意の好適な溶液は、例えば、５以下のｐＨを備える溶液、または１１以上のｐＨを備える溶液によって使用され得る。
【００６８】
一部の実施形態では、アフィニティーマトリックスを効率的に洗浄するためのまた別の工程（ｆ）は、好ましくは、例えば１３〜１４のｐＨを備えるアルカリ液を使用することによって加えられる。所定の実施形態では、洗浄液は、０．１〜１．０ＭのＮａＯＨまたはＫＯＨ、好ましくは０．２５〜０．５ＭのＮａＯＨまたはＫＯＨを含む。本発明のＦｃ結合タンパク質の高アルカリ安定性のために、洗浄目的のためにそのような強アルカリ溶液を使用することができる。
【００６９】
一部の実施形態では、アフィニティーマトリックスは、工程（ａ）〜（ｅ）、任意選択的に（ａ）〜（ｆ）までの繰返しを少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回または少なくとも１００回繰り返すことができるために、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回または少なくとも１００回再使用することができる。
【００７０】
一般に、アフィニティー精製の方法を実施するために好適な条件は、当業者には周知である。一部の実施形態では、本明細書に開示したＦｃ結合ドメインを含む本明細書に開示したアフィニティー精製の使用または方法は、３．５以上（例えば、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０または約６．５）のｐＨで少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約１００％のＦｃ含有タンパク質の溶出を提供することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示したＦｃ結合ドメインの溶出プロファイルは、プロテインＡのドメインＣより優れている。
【００７１】
第５態様では、本発明は、核酸分子、好ましくは上記で開示したいずれかの実施形態のＦｃ結合タンパク質またはＦｃ結合ドメインをコードする単離核酸分子に向けられる。１つの実施形態では、本発明は、核酸分子を含むベクターに向けられる。ベクターは、タンパク質コード化情報を宿主細胞内に移すために使用できる任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。１つの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。
【００７２】
第６態様では、本発明は、上記に開示した核酸もしくはベクター、例えば、原核宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞宿主、例えば酵母のサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）または哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞を含む発現系に向けられる。
【００７３】
第７態様では、本発明は、第１態様のＦｃ結合タンパク質を生産するための方法であって：（ａ）前記Ｆｃ結合タンパク質を得るために結合タンパク質を発現させるための好適な条件下で、第６態様の宿主細胞を培養する工程；および（ｂ）任意選択的に前記Ｆｃ結合タンパク質を単離する工程を含む方法に向けられる。
【００７４】
原核または真核宿主を培養するために好適な条件は、当業者であれば周知である。
本発明のＦｃ結合分子は、例えば単純な有機合成戦略、固相支援合成技術などの多数の従来型技術ならびに周知の技術または市販で入手できる自動合成装置のいずれかによって調製することができる。他方、それらはさらに、従来型の組換え技術単独によって、または従来型合成技術と組み合わせて調製することができる。
【００７５】
本発明の１つの実施形態は、配列番号１〜６または２１のいずれか１つの配列を含む少なくとも１つのＦｃ結合ドメインを含むアルカリ安定性Ｆｃ結合タンパク質を調製するための方法であって、以下の：（ａ）上で規定したＦｃ結合タンパク質をコードする核酸を調製する工程；（ｂ）前記核酸を発現ベクターに導入する工程；（ｃ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入する工程；（ｄ）宿主細胞を培養する工程；（ｅ）その下でＦｃ結合タンパク質が発現させられる培養条件に宿主細胞を受けさせ、それにより（ｅ）上で記載したＦｃ結合タンパク質を生成する工程；任意選択的に、（ｆ）工程（ｅ）において生成されたタンパク質を単離する工程；および任意選択的に（ｇ）上で記載した固体マトリックスにタンパク質をコンジュゲート化させる工程を含む方法に向けられる。
【００７６】
本発明のまた別の実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質の生産は、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳によって実施される。
（実施例）
下記の実施例は、本発明をさらに具体的に例示するために提供する。しかし本発明は、それらに限定されるものではなく、以下の実施例は、上記の説明を根拠に単に本発明の実行可能性を示すものである。
【００７７】
実施例１．本発明の親Ｆｃ結合タンパク質の生成
親タンパク質の配列番号１７または配列番号１８を、天然型プロテインＡドメインをシャッフリングするプロセスにより初めに生成した。より詳細には、本明細書において理解されるシャッフリングプロセスは、同一ではない公知のアミノ酸配列のセットから出発する、人工アミノ酸配列を結果として生じるアセンブリプロセスである。シャッフリングプロセスは、以下の：ａ）５つの天然型プロテインＡのドメインＥ、Ｂ、Ｄ、ＡおよびＣならびにプロテインＡ変異体のドメインＺの配列を提供する工程；ｂ）前記配列のアラインメント；ｃ）組み換えられた部分配列を同定するためのコンピューター内（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）での統計的断片化、およびその後にｄ）モザイク産物、すなわち新規なアミノ酸配列を生成するための様々な断片の新規な人工配列のアセンブリを含んでいた。工程ｃ）において生成される断片は、任意の長さの断片であった。例えば、断片化された親配列が長さｎを有した場合、断片の長さは１〜ｎ−１であった。
【００７８】
モザイク産物中のアミノ酸の相対位置は、出発アミノ酸配列に比して維持された。Ｑ９位、Ｑ１０位、Ａ１２位、Ｆ１３位、Ｙ１４位、Ｌ１７位、Ｐ２０位、Ｌ２２位、Ｑ２６位、Ｒ２７位、Ｆ３０位、Ｉ３１位、Ｑ３２位、Ｓ３３位、Ｌ３４位、Ｋ３５位、Ｄ３６位、Ｄ３７位、Ｐ３８位、Ｓ３９位、Ｓ４１位、Ｌ４５位、Ｅ４７位、Ａ４８位、Ｋ５０位、Ｌ５１位、Ｑ５５位、Ａ５６位、Ｐ５７位の少なくとも９０％は、ＩＢ２４およびＩＢ２６の４位がＱであることを前提に、「シャッフルされた」親タンパク質ＩＢ２４およびＩＢ２６の人工アミノ酸配列と、天然型プロテインＡドメインまたはプロテインＡドメイン変異体との間で、同一であった。親タンパク質ＩＢ２４またはＩＢ２６の全アミノ酸配列は、天然型プロテインＡドメインまたはドメインＺのいずれかの全アミノ酸配列と同一であるのが約８５％以下である点が人工的である（例えば、ＩＢ２４またはＩＢ２６は、ドメインＢと７７％しか同一ではない）。最初の人工タンパク質を生成した後、タンパク質はさらに、結合特性をさらに改変するためにアミノ酸配列の部位特異的無作為化によって改変した。また別の改変は、個別アミノ酸残基の部位飽和突然変異誘発法によって導入した。
【００７９】
ＩＢ２４およびＩＢ２６のための遺伝子を合成し、当業者であれば公知である標準方法を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター内にクローン化した。挿入された断片の正確な配列は、ＤＮＡシーケンシングを使用して検証した。
【００８０】
２つ以上の結合ドメインを含む多量体Ｆｃ結合タンパク質を生成するために、２、３、４、５または６つのＦｃ結合ドメインを遺伝子学的に融合させた。
特異的な膜付着および精製のために、Ｃ末端Ｃｙｓ（配列番号１９）および任意選択的にストレプタグ（ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ）（配列番号２０）を備える短鎖ペプチドアミノ酸配列をＦｃ結合タンパク質のＣ末端に付加した。
【００８１】
実施例２．Ｆｃ結合タンパク質の突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発のために、Ｑ５（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（ＮＥＢ、製品番号Ｅ０５５４Ｓ）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用した。いくつかの点突然変異の組合せを、ジーンアート（ＧｅｎｅＡｒｔ）（商標）ストリングス（Ｓｔｒｉｎｇｓ）（商標）合成法（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））によって生成した。Ｓｔｒｉｎｇｓ（ストリングス）ＤＮＡ断片は精製ＰＣＲ産物に該当しており、これをｐＥＴ２８ａベクターの誘導体内にクローン化した。ライゲーション産物は、エレクトロポレーション法によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ２−ブルー（ｂｌｕｅ）細胞内に形質転換させた。単一コロニーは、正しいサイズのインサートを含有する構築物を同定するためにＰＣＲによってスクリーニングした。正確な配列を検証するために、ＤＮＡシーケンシングを使用した。
【００８２】
実施例３．Ｆｃ結合タンパク質の発現
ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞は、Ｆｃ結合タンパク質をコードする発現プラスミドを用いて形質転換させた。細胞は、選択的寒天プレート（カナマイシン）上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。前培養は、１００ｍＬの２ｘＹＴ培地中で単一コロニーから接種し、ラクトースおよび消泡剤を含まない、１５０μｇ／ｍＬのカナマイシンが補給されたバッフル付き１Ｌのエルレンマイヤーフラスコ内の従来型軌道シェーカー内において３７℃、１６０ｒｐｍで１６時間にわたり培養した。ＯＤ６００読み出しは、６〜１２の範囲内にあるはずである。本培養は、１５０μｇ／ｍＬのカナマイシンが補給された１Ｌの厚肉エルレンマイヤーフラスコ内で４００ｍＬのスーパーリッチ培地（改変Ｈ１５培地、２％のグルコース、５％の酵母抽出物、０．８９％のグリセロール、０．７６％のラクトース、２５０ｍＭのＭＯＰＳ、２０２ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）、消泡剤ＳＥ１５）中で、０．５の調整開始時ＯＤ６００を有する、先の一晩培養物から接種した。培養物を共鳴音響式ミキサー（ＲＡＭビオ（ＲＡＭｂｉｏ））に移し、３７℃、２０×ｇでインキュベートした。エアレーションは、オキシ−ポンプ（Ｏｘｙ−Ｐｕｍｐ）ストッパーによって促進した。組換えタンパク質の発現は、グルコースを代謝させ、続いてラクトースが細胞内に進入するのを許容することによって誘導した。既定の時点で、ＯＤ６００を測定し、５／ＯＤ６００に調整した試料を抜去し、ペレット化し、−２０℃で凍結させた。細胞を、約４５〜６０の最終ＯＤ６００に達するまでおよそ２４時間にわたり一晩増殖させた。バイオマスを収集するために、細胞は２０℃で１０分間にわたり１６，０００×ｇで遠心分離した。ペレットを計量し（湿性重量）、上清中でｐＨを測定した。細胞は、プロセッシングするまで−２０℃で貯蔵した。
【００８３】
実施例４．Ｆｃ結合タンパク質の発現および溶解度についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
発酵中に採取した試料を、３００μＬの抽出バッファー（０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．５×のバグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）、７．５ｍＭのＭｇＳＯ４、４０Ｕのベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）が補給されたＰＢＳ）中に再懸濁させ、１５分間にわたり７００ｒｐｍ、室温でサーモミキサー内での撹拌によって溶解させた。可溶性タンパク質を、遠心分離（１６，０００×ｇ、２分間、室温）によって不溶性タンパク質から分離した。上清（可溶性分画）を抜去し、ペレット（不溶性分画）を同等量の尿素バッファー（８Ｍの尿素、０．２ＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）中に再懸濁させた。可溶性および不溶性両方の分画から５０μＬを採取し、１２μＬの５×試料バッファーならびに５μＬの０．５ＭのＤＴＴを添加した。試料を、５分間にわたり９５℃で煮沸した。最後に、８μＬのそれらの試料を、ニューペイジ・ノベックス（ＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ）の４〜１２％のビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）ＳＤＳゲルに適用して製造業者の勧告にしたがってランし、クーマジーを用いて染色した。Ｆｃ結合タンパク質の高レベル発現が、選択された時間内の最適化条件下で見出された（データは示していない）。全ての発現したＦｃ結合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると９５％超可溶性であった。
【００８４】
実施例５．Ｆｃ結合タンパク質の精製
Ｆｃ結合タンパク質を、Ｃ末端ストレプタグ（ＳｔｒｅｐＴａｇ）ＩＩ（配列番号２０）を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の可溶性分画内で発現させた。細胞を２回の凍結／解凍サイクルによって溶解させ、精製工程を、製造業者の取扱説明書（ＩＢＡ、ゲッティンゲン、独国）にしたがってストレプタクチン（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ）（登録商標）樹脂を用いて実施した。ジスルフィド形成を回避するために、バッファーには１ｍＭのＤＴＴを補給した。
【００８５】
または、Ｆｃ結合タンパク質を、Ｃ末端ストレプタグ（ＳｔｒｅｐＴａｇ）ＩＩを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の可溶性分画内で発現させた。細胞を細胞破砕バッファー中に再懸濁させ、２サイクルについて１キロバールで一定の細胞破砕系（ユニット（Ｕｎｉｔ）Ｆ８Ｂ、ホーリー・ファーム・ビジネス・パーク（Ｈｏｌｌｙ  Ｆａｒｍ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ））によって溶解させた。精製工程を、製造業者の取扱説明書にしたがってアクタエクスプレス（ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ）システム（ＧＥヘルスケア（Ｇｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用して、ストレプタクチン（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ）樹脂（ＩＢＡ、ゲッティンゲン、独国）および追加のゲル濾過（スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５  １６／６０；ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて実施した。ストレプタクチン（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ）精製のためのジスルフィド形成バッファーを回避するために、１ｍＭのＤＴＴを補給し、ゲル濾過のためのランニングバッファーとしてクエン酸バッファー（２０ｍＭのシトラート（Ｃｉｔｒａｔ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６，０）を使用した。
【００８６】
実施例６．Ｆｃ結合タンパク質は、（表面プラズモン共鳴実験を用いて決定したように）高アフィニティーでＩｇＧに結合する
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を、ＳＰＲランニングバッファーを用いて平衡させた。表面が露出したカルボン酸基を、反応性エステル基を産生するためにＥＤＣおよびＮＨＳの混合物を通過させることによって活性化させた。７００〜１，５００ＲＵのオンリガンドをフローセル上に固定化し、オフリガンドをまた別のフローセル上に固定化した。リガンド固定化後にエタノールアミンを注入し、非共有的に結合したＦｃ結合タンパク質を除去するために、エタノールアミンおよび１０ｎＭのグリシン（ｐＨ２．０）を注入した。リガンド結合後、タンパク質分析物は表面上に蓄積し、屈折率を増大させた。屈折率におけるこの変化をリアルタイムで測定し、時間に対する反応または共鳴単位（ＲＵ）としてプロットした。分析物を、好適な流量（μＬ／分）を用いて連続希釈中のチップに適用した。各ラン後、再生バッファーを用いてチップ表面を再生し、ランニングバッファーを用いて平衡させた。コントロール試料をマトリックスに適用した。再生および再平衡化を、先に言及したように実施した。結合試験を、２５℃でのビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（登録商標）３０００（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用することによって実施し；データ評価を、製造業者によって提供されるように、ＢＩＡエバリュエーション（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）３．０ソフトウエアによって、ラングミュア１：１モデル（Ｒｌ＝０）の使用によって実施した。評価した解離定数（ＫＤ）を、オフターゲットに対して標準化した。ヒトＩｇＧ１（セツキシマブ）、ヒトＩｇＧ２（パニツモマブ）およびヒトＩｇＧ４（ナタリツマブ）に対する配列番号１および配列番号２の結合アフィニティーを、表１に示した。
【００８７】
【表１】
2019527715.tif 000003
実施例７．セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂマトリックスに結合したＦｃ結合タンパク質のアルカリ安定性
精製Ｆｃ結合タンパク質を、製造業者の取扱説明書（結合条件：ｐＨ９．０、一晩、エタノールアミンを用いる５時間にわたるブロッキング）にしたがってエポキシ活性化マトリックス（セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、ＧＥ；製品番号１７−０４８０−０１）に結合させた。セツキシマブを、ＩｇＧ１試料（５ｍｇ；１ｍｇ／ｍＬのマトリックス）として使用した。セツキシマブを、固定化Ｆｃ結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で適用した。マトリックスを、固定化ＩｇＧ結合タンパク質に結合したセツキシマブを溶出させるために１００ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．５）を用いて洗浄した。溶出したＩｇＧの濃度を、Ｆｃ結合タンパク質の結合活性を決定するために、ＢＬＩ（プロテインＡオクテット（Ｏｃｔｅｔ）センサーおよび標準物質としてのセツキシマブを用いた定量）によって測定した。カラムを、室温（２２℃±３℃）で６時間にわたり、０．５ＭのＮａＯＨとともにインキュベートした。固定化タンパク質のＩｇＧ結合活性を、６時間にわたる０．５ＭのＮａＯＨとのインキュベーションの前後に分析した。ＮａＯＨ処理前の固定化タンパク質のＩｇＧ結合活性を１００％であると規定した。
【００８８】
図１は、Ｆｃ結合タンパク質の配列番号１および配列番号２の活性が親タンパク質ＩＢ２４の活性と比較して高いことを示している（親ＩＢ２６は親ＩＢ２４に匹敵する；データは示していない）。Ｆｃ結合タンパク質の配列番号１および配列番号２は、どちらも６時間にわたる０．５ＭのＮａＯＨとのインキュベーション後に親タンパク質ＩＢ２４と比較して約少なくとも３０％高いＩｇＧ結合活性を示した。したがって、本発明のＦｃ結合タンパク質は、親タンパク質と比較して、高ｐＨで有意に改良された安定性を示す。
【００８９】
実施例８．アガロースベースのクロマトグラフィービーズプレスト（Ｐｒａｅｓｔｏ）（商標）ピュア（Ｐｕｒｅ）４５に結合したＦｃ結合タンパク質のアルカリ安定性
精製Ｆｃ結合タンパク質を、製造業者の取扱説明書にしたがって、アガロースベースのクロマトグラフィービーズ（プレスト（Ｐｒａｅｓｔｏ）（商標）ピュア（Ｐｕｒｅ）４５、ピュロライト（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）；製品番号ＰＲ０１２６２−１６６）に結合させた（結合条件：ｐＨ９．５、３時間、３５℃、エタノールアミンを用いた一晩のブロッキング）。ポリクローナルヒトＩｇＧガンマノルム（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）（登録商標）（オクタファルマ（Ｏｃａｔｐｈａｒｍ））をＩｇＧ試料（濃度、２．２ｍｇ／ｍＬ）として使用した。ポリクローナルｈＩｇＧ試料を、固定化Ｆｃ結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で適用した。マトリックスを、固定化ＩｇＧ結合タンパク質に結合したｈＩｇＧを溶出させるために１００ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ２．０）を用いて洗浄した。動的結合能力を、６分間の滞留時間、１０％破過で注入されたｈＩｇＧの質量によって決定した。カラムを、室温（２２℃±３℃）で６時間にわたり０．５ＭのＮａＯＨとともにインキュベートした。固定化タンパク質のＩｇＧ結合活性を、６時間にわたる０．５ＭのＮａＯＨとのインキュベーションの前後に分析した。ＮａＯＨ処理前の固定化タンパク質のＩｇＧ結合活性を、１００％であると規定した。
【００９０】
図２は、Ｆｃ結合タンパク質の配列番号１〜６の活性が、０．５ＭのＮａＯＨでの６時間にわたるインキュベーション後にさえ極めて高いことを示している（０．５ＭのＮａＯＨでの６時間にわたるインキュベーション後の全Ｆｃ結合タンパク質の配列番号１〜６の少なくとも８７．６％残存活性）。本発明の全Ｆｃ結合タンパク質は、高ｐＨで有意に高い安定性を示す。図３は、プレスト（Ｐｒａｅｓｔｏ）（商標）ピュア（Ｐｕｒｅ）４５マトリックスおよびプレスト（Ｐｒａｅｓｔｏ）（商標）ピュア（Ｐｕｒｅ）８５マトリックスからの結果をさらに示している。
【００９１】
実施例９．アガロースベースのクロマトグラフィービーズであるプレスト（Ｐｒａｅｓｔｏ）（商標）ピュア（Ｐｕｒｅ）４５および／またはピュア（Ｐｕｒｅ）８５に結合したＦｃ結合タンパク質からのｈＩｇＧの溶出
精製Ｆｃ結合タンパク質を、製造業者の取扱説明書にしたがって、アガロースベースのクロマトグラフィービーズ（プレスト（Ｐｒａｅｓｔｏ）（商標）ピュア（Ｐｕｒｅ）４５またはピュア（Ｐｕｒｅ）５）に結合させた。ＩｇＧ試料として、ＤＢＣ１０％まで装填した、ポリクローナルヒトＩｇＧガンマノルム（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）（登録商標）を使用した（濃度、２．２ｍｇ／ｍＬ）。ポリクローナルｈＩｇＧ試料を、固定化Ｆｃ結合タンパク質を含むマトリックスに飽和量で適用した。２工程プロセスでは、マトリックスを最初に１００ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ３．５）、次に１００ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ２．０）を用いて洗浄し、固定化Ｆｃ結合タンパク質に結合したｈＩｇＧを溶出させた。
【００９２】
図４に示したように、ｐＨ３．５で結合ポリクローナルヒトＩｇＧの９８％超が溶出したが、これは野生型プロテインＡのドメインＣからの溶出より相当に高かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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