(57)【要約】液体培地中、細胞が収穫濃度の細胞生産物を生産するまで細胞を培養することにより、細胞培養液から細胞生産物を収穫する方法及びシステムを開示する。細胞は、ＡＴＦ装置に接続されたバイオリアクターを含む細胞培養システムで培養される。この方法は、液体培地をバイオリアクターから排出口及びＡＴＦ装置を通じてバイオリアクターの体積が所定の体積に達するまで排出することであって、ＡＴＦカラムはＡＴＦ排出口において細胞生産物を含む液体を生成し、及び細胞生産物の濃度が収穫濃度よりも低い液体培地を通過させてバイオリアクターに返送する、ことと、細胞生産物を含む液体をＡＴＦ排出口から引き抜くことと、バイオリアクターに無菌リン酸緩衝生理食塩水又は細胞生産物を含まない液体培地を補充することと、所望量の細胞生産物が取り出されるまでステップを繰り返すことと、を含む。
2019523002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養液から細胞生産物を収穫する方法であって、
培養培地の出発体積中で、細胞を、前記細胞が前記培養培地中で収穫濃度の細胞生産物を生産するまで培養することであって、前記細胞は、交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）装置に接続されたバイオリアクターを含む細胞培養システムで培養される、ことと；
前記バイオリアクターから前記ＡＴＦ装置を通して培養培地を、前記培養培地の体積が所定の体積に達するまで排出することであって、前記ＡＴＦ装置は、ＡＴＦ排出口において細胞生産物を含む液体を提供し、及び細胞生産物の濃度が前記収穫濃度よりも低い培養培地を前記バイオリアクターに返送する、ことと；
細胞生産物を含む前記液体を前記ＡＴＦ排出口から引き抜くことと；
前記バイオリアクターに液体培地を、前記出発体積と等しい、それよりも多い、又は少ない体積まで補充することと；
前記排出ステップ、引き抜きステップ、及び補充ステップの１つ以上を、前記バイオリアクターから所望量の細胞生産物が取り出されるまで繰り返すことと
を含む、方法。
【請求項２】
前記所定の体積は前記出発体積よりも少ない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記所定の体積は前記出発体積よりも多い、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオリアクターの補充に使用される前記液体培地はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオリアクターの補充に使用される前記液体培地は細胞培養培地を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記補充は、前記バイオリアクターから前記培養培地を排出する速度と等しい速度で前記バイオリアクターに同時に補充することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記補充は、前記ＡＴＦ排出口から前記液体を引き抜く速度と等しい速度で前記バイオリアクターに同時に補充することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記排出ステップ及び前記補充ステップは順次実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞培養液から細胞生産物を収穫する方法であって、前記補充ステップ及び排出ステップは２回以上実施される、方法。
【請求項１０】
前記収穫に要する時間は、５００リットル〜２０００リットルの間の体積の場合、１８時間未満である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記収穫に要する時間は６．０時間未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオリアクター体積が所定の体積に達するまでの前記排出ステップ及び前記引き抜きステップの両方の繰り返しに要する時間は２．５時間未満である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記液体培地は、濾過流束約２〜３０リットル／メートル２／時（ＬＭＨ）で排出される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記所定の体積は、前記出発体積の５％〜３０％である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記所定の体積は、前記出発体積の１０％〜２０％である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞培養液は高密度流加培養液を含み、前記所定の体積は前記出発体積の約５０％である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞培養液は高密度流加培養液を含み、前記所定の体積は前記出発体積の約１００％である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記所定の体積は、前記培養培地中の細胞濃度に基づき決定される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＡＴＦ装置は中空繊維フィルタを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記フィルタは、孔径が約約０．１〜５．０ミクロン又は約５００〜１０００ｋＤである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記排出ステップ、前記引き抜きステップ、及び前記補充ステップは、同時に、第１流量で行われる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記排出ステップ、前記引き抜きステップ、及び前記補充ステップは、前記細胞が細胞培養プロセス完了時に収穫すべき前記細胞生産物を全て生産する前に開始される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記排出ステップ、前記引き抜きステップ、及び前記補充ステップは、前記細胞が前記液体培地中で前記収穫濃度の前記細胞生産物を生産する１〜８日前に開始される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
引き抜き及び補充体積は、約１．０容器体積／日交換（ＶＶＤ）未満である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記引き抜き及び補充体積は、約０．５ＶＶＤ未満である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
最終収穫ステップは、前記第１流量とは異なる第２流量で実施される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
最終排出ステップの結果、前記バイオリアクター内に前記出発体積の約２０％未満が残留する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞培養液は流加細胞培養液である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞培養液は高密度流加細胞培養液である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞生産物は、モノクローナル抗体、酵素、又はウイルスである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
システムであって、
導入口及び排出口を含むバイオリアクターと；
前記バイオリアクター導入口に接続された、細胞生産物を含まない液体培地の供給源と；
前記バイオリアクター排出口に接続された交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）装置と；
前記ＡＴＦ装置の排出口に接続され、前記ＡＴＦ装置から流体を除去するように構成されたポンプと；
制御装置であって、
前記バイオリアクター内の培養培地の出発体積中で、細胞を、前記細胞が前記培養培地中で収穫濃度の細胞生産物を生産するまで培養することと、前記バイオリアクターから培養培地を、前記培養培地の体積が所定の体積に達するまで前記ＡＴＦ装置を通して排出することであって、前記ＡＴＦ装置は、前記ＡＴＦ装置排出口において細胞生産物を含む液体を提供し、及び細胞生産物の濃度が前記収穫濃度よりも低い培養培地を前記バイオリアクターに返送する、ことと、前記細胞生産物を含む液体を前記ＡＴＦ装置排出口から引き抜くことと、前記バイオリアクターに液体培地を、前記出発体積と等しい、それよりも多い、又はそれよりも少ない体積まで補充することと、前記排出ステップ、引き抜きステップ、及び補充ステップの１つ以上を、前記バイオリアクターから所望量の細胞生産物が取り出されるまで繰り返すことと、を行うように配置及びプログラムされた制御装置と
を含む、システム。
【請求項３２】
前記制御装置は、前記バイオリアクターの排出及び補充を順次行うように構成されている、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記ＡＴＦ装置は中空繊維フィルタを含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３４】
前記フィルタは、孔径が約約０．１〜５．０ミクロン又は約５００〜１０００ｋＤである、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記制御装置は、前記ＡＴＦ排出口から前記液体を引き抜く速度と等しい速度で前記バイオリアクターに同時に補充を行うように配置及びプログラムされている、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３６】
前記制御装置は、前記液体培地を濾過流束約２〜３０リットル／メートル２／時（ＬＭＨ）で排出するように配置及びプログラムされている、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３７】
前記制御装置は、前記所定の体積が前記出発体積の５％〜３０％となるように配置及びプログラムされている、請求項３１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオリアクターから生産物を収穫するため、例えば、流加バイオリアクター培養液から生産物を収穫するための交互タンジェンシャルフロー濾過装置の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物、植物、又は動物細胞の培養は商品価値の高い生体物質及び化学物質の製造に用いられている。このような培養は、特に商業生産用としては、３種の操作方式：回分方式（ｂａｔｃｈ）、連続方式（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）、流加方式（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、又は高密度流加方式（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）で実施することができる。その用途には、発酵、バイオテクノロジー、並びに特殊化学品及び特殊製品を製造するための化学物質に加えて、廃棄物処理も含まれる。典型的に生産物は、タンパク質、ペプチド、核酸、ウイルス、アミノ酸、抗生物質、特殊化学品、及び他の有用な分子等の内因性及び組換え産物をはじめとした任意の所望の細胞生産物等の価値の高い生産物である。所望のタンパク質としては、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、酵素、及び他の組換え抗体、酵素、ペプチド、ウイルスを挙げることができる。収率及び生産性が僅かに向上しただけでも利益に繋がる。したがって、回分式、流加式、又は高密度流加式反応器の操作を改良する動機が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
流加バイオリアクターから現行の技術を用いて生産物を収穫する場合、通常、遠心分離及び深層濾過等の分離プロセスが用いられるが、これらは長時間を要する可能性があり、生産物の回収率が所望されるよりも低くなる可能性もある。遠心分離は一時期、細胞収穫の一部として用いられてきたが、このプロセスは高い剪断力が発生するため生存率が低下し、その結果としてタンパク質の品質が変化する可能性もある。深層濾過は遠心分離よりも有利であるが、差圧の監視の必要性、フィルタの廃棄、広い設置面積、及びスケールアップに関する問題点等の独自の限界を有する。その上、遠心分離も深層濾過も、クロマトグラフィーによる分離プロセスに適した流体を生成するための第２の清澄化ステップが必要になるという難点がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示に記載する方法及びシステムの少なくとも一部は、交互タンジェンシャルフロー（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）（ＡＴＦ）濾過が、流加培養液又は高密度流加培養液等の細胞培養液から高速収穫を行うように適合され得、それによって細胞生産物が高速且つ高収率で収穫されるという有利な結果が得られることを見出したことに基づく。この流加培養液及び他の種類の細胞培養液の収穫にＡＴＦを用いる新規な方法によって、遠心分離及び深層濾過等の一般に２つ以上の段階を必要とする収穫手順が簡素化されるため、最小限の段階を経て高速収穫手順を実施することが可能になる。ＡＴＦで収穫を行うことにより、次の段階、例えば、クロマトグラフィーカラムに適した高い清澄度の、したがって下流のシステムを汚染することのない供給ストリームが得られる。したがって本開示は、流加及び高密度流加培養液をＡＴＦを用いて収穫するための一連の方法を記載する。
【０００５】
流加バイオリアクターからタンパク質の収穫に遠心分離又は深層濾過を用いることは一般に行われている。しかし、これらの慣用技術によるタンパク質の回収率は低く、このプロセスには長時間を要する。本明細書に記載する新規な方法及びシステムによれば、ＡＴＦを流加バイオリアクターの高速収穫設備として用いると収穫時間を８又は１０時間未満に短縮することができる。この新規な方法はまた、収穫プロセス全体を通して細胞生存率を高いまま維持するので、タンパク質の品質も維持される。
【０００６】
第１の態様において、本開示は、細胞培養液から、例えば、流加又は高密度流加細胞培養液から細胞生産物を収穫する方法を含む。細胞生産物としては、任意の所望の内因性及び組換えタンパク質、核酸、ウイルス、並びに他の有用な分子が挙げられる。所望のタンパク質としては、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、酵素、及び他の組換え又は天然タンパク質を挙げることができる。この方法は、細胞を、出発体積（ｖｏｌｕｍｅ）の培養培地中で、細胞が培養培地中で収穫濃度の細胞生産物を生産するまで培養することであって、細胞は、交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）装置に接続されたバイオリアクターを含む細胞培養システム内で培養される、ことと；バイオリアクターから培養培地を、ＡＴＦ装置を通して、培養培地の体積が所定の体積に達するまで排出することであって、ＡＴＦ装置は、ＡＴＦ排出口において細胞生産物を含む液体を提供し、及び収穫濃度よりも細胞生産物の濃度が低い培養培地をバイオリアクターに返送する、ことと；細胞生産物を含む液体をＡＴＦ排出口から引き抜くことと；バイオリアクターに液体培地を、出発体積と等しいか、それよりも多いか、又はそれよりも少ない体積になるまで補充することと；バイオリアクターから所望量の細胞生産物が取り出されるまで、排出、引き抜き、及び補充ステップの１つ以上を繰り返すことと；を含む。
【０００７】
これらの方法において、所定の体積は、出発体積よりも少なくても多くても、又は出発体積とほぼ等しくてもよい。バイオリアクターの補充に使用する液体培地は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、又は細胞培養培地、又は細胞を生きたまま維持するために使用することができる他の任意の液体とすることができる。
【０００８】
幾つかの実施において、補充は、バイオリアクターから培養培地を排出する速度又はＡＴＦ排出口から液体を引き抜く速度と等しい速度でバイオリアクターに同時に補充することを含む。特定の実施形態において、排出ステップ及び補充ステップは順次実施され、並びに／又は補充ステップ及び排出ステップは２回以上実施される。
【０００９】
本新規方法において、収穫は５００リットル〜２０００リットルの間の体積に１８時間以下、例えば、２４、２０、１８、１６、１４、１２、１０時間未満若しくはそれ未満、又は、例えば、９、８、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、若しくは５．０時間未満若しくはそれ以下の時間を要し得る。例えば、幾つかの実施形態において、バイオリアクターの体積が所定の体積に達するまでの排出ステップと、引き抜きステップとの両方の繰り返しに要する時間は２．５時間未満となり得る。特定の実施形態において、培養培地は、濾過流束を約２〜３０リットル／メートル２／時（ＬＭＨ）、例えば、約２、４、５、６、７、８、９、又は１０〜３０リットル／メートル２／時（ＬＭＨ）、例えば、３〜２５、４〜２０、又は５〜１５ＬＭＨとして排出される。
【００１０】
様々な実施において、所定の体積は出発体積の約５％〜約３０％又は出発体積の約１０％〜約２０％とすることができる。これらの方法において、細胞培養液は高密度流加培養液とすることができ、所定の体積は出発体積の約５０％又は出発体積の１００％とすることができる。幾つかの実施形態において、所定の体積は、培養培地中の細胞濃度に基づき決定される。
【００１１】
幾つかの実施において、ＡＴＦ装置は、例えば、孔径が約０．１〜５．０ミクロン、例えば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、若しくは０．９ミクロン、又は１、２、３、若しくは４ミクロン、又は約５００〜１０００ｋＤ、例えば、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、若しくは９５０ｋＤの中空繊維フィルタを含むことができる。
【００１２】
これらの方法において、排出ステップ、引き抜きステップ、及び補充ステップの任意の２つ以上を第１流量で同時に行うことができる。例えば、細胞が、細胞培養プロセスの完了時に収穫される細胞生産物を全て生産する前に、排出ステップ、引き抜きステップ、及び補充ステップの任意の１つ以上を開始することができる。幾つかの実施形態においては、細胞が、液体培地中で収穫濃度の細胞生産物を生産する１〜８日前、例えば、２〜７日又は３〜６日前に、排出ステップ、引き抜きステップ、及び補充ステップを開始する。
【００１３】
幾つかの実施形態において、引き抜き体積及び補充体積は、約１．０容器体積／日交換（ｖｅｓｓｅｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅｄ  ｐｅｒ  ｄａｙ）（ＶＶＤ）未満、例えば、約０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、又は０．１ＶＶＤ未満である。
【００１４】
幾つかの実施において、最終収穫ステップは第１流量とは異なる第２流量で実施される。幾つかの実施形態において、最終排出ステップの結果、出発体積の約２０％未満、例えば、１０％未満をバイオリアクターに残留させることができる。
【００１５】
これらの方法の全てにおいて、細胞培養液は、流加細胞培養液又は高密度流加細胞培養液とすることができ、この方法は、モノクローナル抗体、酵素、及び／又はウイルス等の細胞生産物の生産に用いることができる。
【００１６】
他の態様において、本開示は、細胞培養液から細胞生産物を収穫するためのシステムを提供する。このようなシステムは、導入口及び排出口を含むバイオリアクターと；バイオリアクター導入口に接続された、細胞生産物を含まない細胞培養培地の供給源と；バイオリアクター排出口に接続された、交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）装置と；ＡＴＦ装置の排出口に接続された、ＡＴＦ装置から流体を除去するように構成されたポンプと；本明細書に記載した方法の１つ以上を、単独で、又は様々なコンビネーション及びサブコンビネーションのいずれかで実施するように配置及びプログラムされた制御装置と；を含む、バイオリアクターを含む。
【００１７】
本開示に記載する方法及びシステムは、流加培養液収穫時に加わる剪断力が小さいことに由来して、高い細胞生存率が維持されること、及び本明細書に記載する新規方法を用いて収穫された生産物中のタンパク質の品質がより高く維持されることを含む幾つかの利点をもたらす。細胞死又はストレスは酵素を分解又は変性させるタンパク質の放出に繋がることが多く、これらは生産物の品質を損ない兼ねない。本新規な方法及びシステムは、品質が向上したタンパク質の収率を向上させると共に生産性を増大させる。本新規な方法及びシステムは、細胞がほぼ無傷であり、混入物のない形態（ｕｎａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）にあり、後段の分離性能を損なわない、又は培養された細胞を液体培地から収穫及び分離する最中に望ましくない生物学的作用（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）が増大するリスクを上昇させない、細胞ブロスを回収することを可能にする。タンパク質が膜を通過する速度は分離ステップを速やかに完了させるために重要である。本新規方法及びシステムを用いた製造時間はその経済的利点の代表的なものであり、また、不安定なタンパク質を、生産物の望ましくない分解等の変性が回避されるよう速やかに取得するために必要となる可能性もある。
【００１８】
「流加培養」は、次に示す点を除いて回分操作である、生物工学的プロセスに用いられる操作技法であって、この操作を実施する間、培養中に、細胞増殖及び生産物の生産に必要な１種以上の栄養源を１つ以上の供給ストリームを介して間欠的又は連続的にバイオリアクターに供給（ｆｅｅｄ）又は補給（ｓｕｐｐｌｙ）する、操作技法を指す。操作の実施中、流出液ストリームは生成せず、したがってバイオリアクター生産物は、これらが収穫される運転終了時までバイオリアクター内に留まる。このプロセスは、細胞が生存性及び生産性を十分に有しているのであれば複数回繰り返すことができる。流加操作は、鍵となる反応速度を制御する化合物の濃度を調整するための独自の手段を提供することができ、したがって、１つ以上の供給速度を操作することによって回分操作に比し明確な利点をもたらすことができるため、流加培養は有利である。流加培養はまた、操作が単純であり、発酵を引き継ぐプロセスとして熟知されていることから大量生産にも有利である。
【００１９】
「深層濾過」という語は、粒子を濾過媒体の表面のみに保持するのではなく濾過媒体全体に保持するための多孔質濾過媒体を使用する濾過を指す。この種のフィルタは、濾過すべき流体が多量の粒子を含む場合、他の種類のフィルタよりも多量の粒子を詰まらせることなく保持することができるので、慣用されている。深層濾過は、その深さを利用して、液相中の固体混入物を捕捉する複数の多孔質層を特徴とする。
【００２０】
「透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」という語は、高純度溶液を生成することを目的として微小分子が透過可能なフィルタを使用し、成分（例えば、塩、低分子タンパク質、溶媒等の透過性分子）をその分子サイズに基づき溶液から除去又は分離することを含む希釈プロセスを指す。これは、濾過すべき溶液に液体を追加する速度と等しい速度でフィルタの透過液を除去することにより実施されることが多い（液量一定透析濾過と称される）。
【００２１】
「細胞ブロス（ｃｅｌｌ  ｂｒｏｔｈ）」という語は、培養時に細胞が懸濁している液体を指す。流加プロセスにおいて、これは、供給された培地及び栄養源並びに細胞生産物（例えば、タンパク質及び廃棄物）の両方を含有する。
【００２２】
「高密度流加」（ＣＦＢ）という語は、廃棄生産物の除去及び追加培地の反応容器への供給を行いながら、バイオリアクター内にタンパク質を保持する限外濾過膜（例えば、公称分画分子量５０ｋＤａ又は３０ｋＤａ）を備えた灌流システム（交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）／タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ））を使用することを指す。このプロセスではより高密度の細胞が得られ、生産物は従来の流加プロセスと同様に反応器内に保持される。
【００２３】
「連続供給」という語は、培地又は培地成分を収穫期間の一部に亘りバイオリアクターに連続的に添加することを指す。
別段の定めがない限り、本明細書において使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本発明の実施又は試験には本明細書に記載するものと類似又は均等な方法及び材料を使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に説明する。本明細書に述べるあらゆる刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献の全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。矛盾がある場合は、定義を含め、本明細書を優先することとする。加えて、材料、方法、及び実施例は例示のみを目的とするものであり、限定を目的とするものではない。
【００２４】
本発明の他の特徴及び利点は以下に示す詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】高速ＡＴＦ流加収穫を実施するための装置及びプロセスの略図。
【図２】図１の高速ＡＴＦ流加収穫を実施するための方法のフローチャート。
【図３】図１の方法を用いた場合の生存細胞密度（ＶＣＤ）及び生存率を培養時間に対しプロットしたグラフ。
【図４】図１の方法を用いた場合のタンパク質濃度を培養時間に対しプロットしたグラフ。
【図５】図１の方法を用いた場合の生細胞数の積算値（ＩＶＣ）に対しプロットした総タンパク質量（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に基づく細胞当たりの比生産性の図。
【図６】流加培養液の高速ＡＴＦ収穫（ｒａｐｉｄ  ＡＴＦ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｈａｒｖｅｓｔ）を実施するためのシステムの全体図。
【図７】連続的透析濾過による流加培養液の高速ＡＴＦ収穫を実施するための装置及びプロセスの略図。
【図８】図７の流加培養液の高速ＡＴＦ収穫を実施するための方法のフローチャート。
【図９】図７の方法を用いた場合の生存細胞密度及び生存率を培養時間に対しプロットしたグラフ。
【図１０】図７の方法を用いた場合のタンパク質濃度を培養時間に対しプロットしたグラフ。
【図１１】図７の方法を用いた場合の生細胞数の積算値に対しプロットした総タンパク質量に基づく細胞当たりの比生産性の図。
【図１２】連続的透析濾過を用いて高密度流加培養液の高速ＡＴＦ収穫を実施するための装置及びプロセスの実施形態の略図。
【図１３】連続的透析濾過を用いて高密度流加培養液の高速ＡＴＦ収穫を実施するための装置及びプロセスの実施形態の略図。
【図１４】連続供給に続く高速収穫を用いて流加培養液の高速ＡＴＦ収穫を実施するための装置及びプロセスの実施形態の略図。
【図１５】図１４の方法を用いた場合の培養時間に対する生存細胞密度及び生存率を従来の流加プロセスと比較してプロットしたグラフ。
【図１６】図１４の方法を用いた場合の生細胞数の積算値に対しプロットした総タンパク質量に基づく細胞当たりの比生産性の図。
【図１７】図１４の方法を用いた場合の培養時間に対するタンパク質濃度を従来の流加プロセスと比較してプロットしたグラフ。
【図１８】限外濾過膜を使用し、連続供給を行いながら高速ＡＴＦ収穫を実施するための装置及びプロセスの実施形態の略図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本開示は流加培養液の収穫（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）を実施するための交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過の使用について記載するものである。流加培養液の収穫にＡＴＦを使用することにより、高速収穫手順を単一のプロセスステップで実施し、一回分を単一の一式の設備で処理し、処理された材料として単一の生産物を得ることが可能になる。このＡＴＦを用いる方法は、ＡＴＦが他のタンジェンシャルフロー濾過方法よりも高い濾過流束で生産物を収穫することができるため、成果が得られる。
【００２７】
交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）は、濾過及び生産物からの細胞の分離を単一のステップで実施する目的で使用されているが、通常、濾過流束の限界が１．３〜５．７ＬＭＨであり、これは遅過ぎて商業的な培養液収穫の設定では利用できない。予期せぬことに、本明細書に記載するようにＡＴＦ濾過をより高い流束（例えば、１０ＬＭＨ超）で実施すると、フィルタはファウリングすることがなく、培養液からの生産物の高速回収が短い処理時間で達成された。このＡＴＦを用いた培養液の高速収穫は、更なる処理に適した清澄な供給ストリームが単一ステップで得られる経済的に有利な方法として、商業的プロセスに有益である。
【００２８】
本新規な方法はまた、従来、一般に遠心分離の後に深層濾過を行うなどの２つ以上のステップが必要であった収穫手順を簡素化する。本明細書に記載するＡＴＦ収穫により、次の段階、例えばクロマトグラフィーカラムにそのまま使用することができる、他の何等かの濾過や他の清澄化ステップを必要としない、清澄度の高い、したがって下流で例えばクロマトグラフィーカラムをファウリングさせることがない、供給ストリームが得られる。
【００２９】
流加培養では、生物工学的プロセスを利用して所望の生産物を生産する。培養中、細胞増殖及び生産物（例えば、タンパク質、核酸、ウイルス、及び他の有用な分子等の内因性及び組換え産物を含む任意の所望の細胞生産物を挙げることができる）の生産に必要な１種以上の栄養源を、培養中のバイオリアクターに供給又は補給する。この供給は、操作の実施中に、１種以上の供給ストリームを介して連続的又は間欠的のいずれかで実施される。操作の実施中に流出物ストリームは発生せず、したがって、バイオリアクター内の液体の体積及び細胞は操作中に増加する。バイオリアクター生産物は、これらが収穫される運転終了時まで、典型的には培養から５〜３０日後、例えば、７〜２５日後、又は１０〜２１日後までバイオリアクター内に留まる。流加培養液の収穫はブロス中の細胞にほとんど損傷を与えることなく最適に実施され、生産物を変性することなく、クロマトグラフィーによる生産物の更なる処理に必要な清澄化された状態にする処理を、高速且つ効率的に行う。ＡＴＦはこれらの要件を独自の形で支援することができる。
【００３０】
歴史的に、ＡＴＦは、細胞培地を細胞を含むバイオリアクターに連続補給する灌流培養（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）システムに使用されており、ＡＴＦは培養液を連続的に濾過し、精密濾過膜を使用して培養廃棄物及び生産されたタンパク質を除去していた。このプロセスにより、３０日間又はそれよりも長く続く培養期間の間、低い濾過流束で（１．３〜５．７ＬＭＨ）、タンパク質を連続的に、又は頻繁に収穫することが可能である。このプロセスは、高い細胞密度（例えば、５０〜１５０Ｅ６個／ｍＬ以上）で実施される。このようなＡＴＦで支援する灌流培養は限外濾過膜（例えば、公称孔径５０ｋＤ以下）を有するＡＴＦで実施することもでき、その間、廃棄物は除去されるが、生産物は培養ブロス中に保持される。このような培養は低い濾過流束で操作される。これは、所望の細胞生産物が細胞ブロス中に保持され、生成した廃棄物が除去されるため、細胞濃度をはるかに高くすることが可能となり、したがって所望の生産物の濃度がより高くなることから、高密度流加（ＣＦＢ）と呼ばれることもある。
【００３１】
本方法においては、ＡＴＦを用いて低流束で連続的に細胞培養するのではなく、その替わりに、ＡＴＦプロセスを流加培養における（深層濾過及び遠心分離と置き換えて）、高速収穫設備としての役割を果たすように適用する。本新規プロセスにおいては、ＡＴＦは異なる形で使用され、細胞密度が通常７〜２０Ｅ６個／ｍＬの範囲にある流加培養液又は細胞密度が５０〜２００Ｅ６個／ｍＬ（例えば、７５〜１２０Ｅ６個／ｍＬ）の範囲にあるＣＦＢ培養液の収穫当日に、高い濾過流束で使用される。従来の灌流システムとは異なり、本新規プロセスにおいて、生産物、例えばタンパク質は、高い濾過流束で収穫される。ＡＴＦシステムを流加又はＣＦＢバイオリアクターの高速収穫設備として用いることにより、この収穫プロセス全体に亘って高い細胞生存率及びより高い生産物品質が維持されるため、上に述べた問題を克服することができる。
【００３２】
本方法を流加及び高密度流加バイオリアクターに用いるために、次に示す４種の異なる高速収穫技法として具体化した：
（１）段階的に透析濾過を用いる高速ＡＴＦ収穫（従来の流加培養向け）、
（２）連続的に透析濾過を用いる高速ＡＴＦ収穫（従来の流加培養向け；段階的透析濾過よりも効率的且つ消費時間が少ない）、
（３）連続的に透析濾過を用いる高速ＡＴＦ収穫（高密度流加培養向け；より効率的且つ消費時間が少ない）、
（４）連続供給を行う高速ＡＴＦ収穫（より効率的且つ消費時間が少なく、タンパク質収率が増加）。これらの４種の異なる方法のための手順を以下により詳細に説明する。
【００３３】
段階的に透析濾過を用いる高速収穫
中空繊維多孔質膜（例えば、０．１〜５．０ミクロン等の孔径の精密濾過又は７５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ等の限外濾過膜）を備えたＡＴＦシステムは、細胞のみならず、下流のプロセスを行う前に除去することが必要な他の細かい粒子も保持するため、流加培養液の収穫に非常に適している。ＡＴＦを用いることにより、遠心分離や深層濾過とは異なり無菌状態で収穫を行うことができるため、二次汚染も低減される。
【００３４】
図１に示すように、ＡＴＦ収穫バイオリアクターシステム２００は、例えば、攪拌槽型反応器とすることができるバイオリアクター２１０を含む。バイオリアクター２１０は排出管２１２を介してＡＴＦ２２０に接続している。ＡＴＦは、交互タンジェンシャルフローを用いる中空繊維濾過を利用してバイオリアクター培養液の灌流等に使用されるシステムである。ＡＴＦ２２０は、中空繊維フィルタ２２４を通してＡＴＦを実施するためのダイアフラムポンプ２２２を制御する装置を含み（例えば、米国特許第６，５４４，４２４号明細書を参照されたい）、これらは両方共、滅菌可能な筐体２２６に収容されている。
【００３５】
培地及び添加物は、バイオリアクター２１０に、弁及び／又はポンプ２１６により制御される供給ライン２１４を介して導入される。空気供給源及び制御装置２４０（図６）が空気管２２８を介してダイアフラムポンプ２２２に接続されている。ダイアフラムポンプ２２２に空気が追加されたり抜き取られたりし、それによってダイアフラムポンプ内に含まれる２つの室の容積が増加及び減少し、筐体２２６内の圧力が変化することにより筐体２２６に含まれる流体の流れが指向され、中空繊維フィルタ２２４の膜を通して流体が引き抜かれる。通常、中空繊維の内部は排液管２１２を介してバイオリアクターに流体連通しており、一方、中空繊維フィルタ２２４の中空繊維の外側の、筐体２２６の内側の室は生産物排出管２３０に流体連通している。生産物排出管２３０は、中空繊維フィルタを通して濾過された、中空繊維フィルタ２２４及び筐体２２６の間の室内に存在する生産物の引き抜きを制御する収穫ポンプ／弁２３２を有する。図１において、生産物排出管２３０はＡＴＦ２２０の上部付近に示してあるが、生産物排出管２３０はＡＴＦ２２０の中央又は底部付近に位置することもできる。或いは、筐体２２６に２以上の生産物排出管２３０が接続されていてもよい。
【００３６】
ＡＴＦ収穫バイオリアクターシステム２００を用いて高速収穫を実施する際は、ＡＴＦを用いて生産物（例えば、タンパク質）を、１０リットル／メートル２／時（ＬＭＨ）を超えるが３０リットル／メートル２／時（ＬＭＨ）を超えない（例えば、１２〜１８ＬＭＨ、１３〜１６ＬＭＨ、又は１５ＬＭＨ）高速流束で収穫する。高速収穫は、培養容器からある体積を周期的に除去及び補充する（回分濾過）か、又は培養ブロスの液体を連続的に継ぎ足しながら濾過プロセスにより液体を収穫する（液量一定透析濾過）ことにより達成することができる。どちらの手法も以下に示す具体例で説明する。容積の約８０％を除去することしかできず依然として十分な攪拌が維持されることが、殆どのバイオリアクターの設計では現実的である。したがって、一部の反応器では８０％超を除去することが可能ではあるものの、大部分の一般的な、回分式又は周期的な濾過方法による８０％以下の除去に関し説明する。
【００３７】
６００Ｌのバイオリアクター（図１に６Ｌとして示す）内の５００Ｌの量の培地の場合、流束を１５ＬＭＨとすると、本方法においては排液時間が約２．１〜２．５時間となる（１１ｍ２のＡＴＦフィルタサイズを想定）。このタンパク質の排出は、バイオリアクター２１０内の残留体積が、例えば３０％に低下するまで継続するが、減らす体積は他の値でもよい（例えば、２０％）。このバイオリアクター体積になった時点で収穫ポンプ２３２を停止する。細胞は全てバイオリアクター２１０内の培地ブロス中に留まり、次いで流体の量が収穫を開始した時点とほぼ等しくなるように培地ブロスが充填される。幾つかの例においては、培地ブロスは次いで、収穫開始時点の流体量よりも少なく又は多くなるように充填される。流体は、無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は培養培地又は生存細胞のブロスと適合性のある他の流体とすることができる。収穫排出プロセスは、バイオリアクター２１０の体積が再び約３０％に低下するまで約１５ＬＭＨの流束で再開される。所望又は必要に応じてこのサイクルを３回及び４回繰り返す。バイオリアクター２１０内に最初に含まれていた流加培養液からタンパク質の約９６％が回収され、細胞生存率は維持される。
【００３８】
高速収穫手順のステップを図２に要約する。流加培養が完了したらステップ１５０で収穫を開始する。収穫はＡＴＦを用いて実施し、ステップ１６０において、細胞ブロスを流束１０〜３０ＬＭＨ（例えば、１５ＬＭＨ）で、バイオリアクター１１０内の体積が初期体積の１０〜５０％、より好ましくは２０〜３０％に低下するまで排出する。このバイオリアクター体積になったら収穫ポンプ２３２を停止し、オペレーターはステップ１７０において所望の収穫が達成されているか否かを判定する。これは、排出／補充サイクルの回数（例えば、２又は３回）により判定するか、又は収穫された生産物の総量若しくは総濃度を分析するなどの他の手段により判定することができる。収穫を継続する場合、ステップ１８０でバイオリアクター２１０に補充を行い、排出ステップ１６０に戻り、最終的にステップ１９０で収穫を完了する。
【００３９】
連続的に透析濾過を用いる高速収穫
他の実施形態において、連続的に透析濾過を用いる高速ＡＴＦ収穫手順を図７に示す。この液量一定透析濾過方法は、幾つかの例において、回分式方法よりも少ない体積でより高い収率が達成される。所与の用途に最適な方法を選択するために、両方の方法について収率及び時間に関する試験を実施することができる。連続的なＡＴＦ透析濾過で収穫を行うための構成要素は図１に示したものと類似している。この手順の場合、ＡＴＦ収穫が行われるバイオリアクターシステム３００は排液管３１２を介してＡＴＦ３２０に接続しているバイオリアクター３１０を含む。ＡＴＦ３２０は、中空繊維フィルタ３２４を通してＡＴＦを実施するためのダイアフラムポンプ３２２を制御する装置を含み、これらは両方共、滅菌可能な筐体３２６に収容されている。
【００４０】
培地及び添加物は、バイオリアクター３１０に、弁及び／又はポンプ３１６により制御される供給ライン３１４を介して導入される。空気供給源及び制御装置（図示せず）が空気管３２８を介してダイアフラムポンプ３２２に流体連通している。中空繊維の内側（保持液）は、バイオリアクター３１０に排液管３１２を介して接続されており、一方、中空繊維フィルタ３２４の中空繊維の外側の、筐体３２６の内側の室は生産物排出管３３０（透過液）に接続されている。生産物排出管３３０は透過液内の生産物の引き抜きを制御する回収ポンプ／弁３３２を有する。
【００４１】
このプロセスにおいて、タンパク質は同様に、ＡＴＦ３２０を用いて１０〜３０ＬＭＨ（一般に１２〜１８又は１５ＬＭＨ）の流束で収穫され、この収穫は、濾過された流体の移送量が４バイオリアクター体積になるまでの間で、バイオリアクター３１０の体積がこの高い流束を維持することができる体積に低下するまで行われる。体積低下率は０〜１００％、例えば、流加培養液は３０％、又はＣＦＢ培養液は０〜５０％とすることができる。幾つかの例においては、体積低下率は、例えば、１０〜９０％、例えば、２５〜７５％、例えば、３０〜６０％、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００％である。５００Ｌのバイオリアクター３１０の場合は、１１ｍ２フィルタを通して流束１５ＬＭＨで３０％程度まで排出する時間が約２．１時間である。
【００４２】
この低下されるバイオリアクター体積（例えば、１．８Ｌ）に到達したら、透析濾過プロセスを開始し、供給ライン３１４を介してＰＢＳ又は培養培地（又は細胞生存率を維持するのに適した他の流体）のいずれかを、生産物排出管３３０（透過液）を介した流体収穫速度と等しい流量で添加することにより、バイオリアクター体積を維持する。この透析濾過プロセスは、例えば、１５ＬＭＨの流束で、透過液中の所望の生産物の収率が９０％を超えるまで行うことができる。したがって、この方法による高速収穫は、約６〜８時間未満（例えば、６時間未満）で完了する。
【００４３】
流加培養液又はＣＦＢ培養液からの生産物の高速収穫は、透過液を回収する回分洗浄又は液量一定透析濾過のいずれかを用いて達成することができる。
連続的透析濾過を用いた高速収穫手順のステップを図８に要約する。流加培養が完了したら、ステップ２５０で収穫を開始する。ステップ２６０において、ＡＴＦを用いて収穫を実施し、細胞ブロスを流束１０〜３０ＬＭＨ（例えば、１５ＬＭＨ）で、バイオリアクター３１０の体積が初期体積の約３０％になるまで排出する。このバイオリアクター体積になった時点で、ステップ２７０において、収穫ポンプ３３２の流量を低下させ、一方、バイオリアクター２１０に流体を供給ライン２１４を介してほぼ同じ速度（例えば、１５ＬＭＨ）で添加し、透析濾過サイクルを完了させる。交換する全体積を通過させるサイクルを一巡することにより透析濾過サイクルが完了したら、（ステップ２８０において）収穫を継続するか（例えば、まだ９０％又は９６％の回収に達していない）否かを決定し、システムはステップ２７０に戻り、追加の透析濾過サイクルを実施する。所望の体積に到達したら、収穫操作をステップ２９０で完了する。
高密度流加向けの連続的な透析濾過を用いる高速収穫
他の実施形態において、高密度流加システムのための連続的な透析濾過を用いる高速ＡＴＦ収穫手順を図１２に示す。高密度流加（ＣＦＢ）向けの高速ＡＴＦ収穫プロセスは収穫当日の生存細胞密度に依存する。連続的な透析濾過を用いるＡＴＦ収穫の構成要素は図１に示したものに類似している。
【００４４】
図１２に示すように、ＡＴＦ収穫バイオリアクターシステム４００は、例えば、攪拌槽型反応器とすることができるバイオリアクター４１０を含む。バイオリアクター４１０は排出管４１２を介してＡＴＦ４２０に接続されている。ＡＴＦは、交互タンジェンシャルフローを利用した中空繊維濾過を用いてバイオリアクター培養液を灌流させる目的等に使用されるシステムである。ＡＴＦ４２０は、中空繊維フィルタ４２４を通してＡＴＦを実施するためのダイアフラムポンプ４２２を制御する装置を含み（例えば、米国特許第６，５４４，４２４号明細書参照）、これらは両方共、滅菌可能な筐体４２６に収容されている。
【００４５】
培地及び添加物は、バイオリアクター４１０に、弁及び／又はポンプ４１６により制御される供給ライン４１４を介して導入される。空気供給源及び制御装置（図示せず）が空気管４２８を介してダイアフラムポンプ４２２に流体連通している。ダイアフラムポンプ４２２には空気が追加されたり抜き取られたりし、それによってダイアフラムポンプ内に含まれる２つの室の容積が増加及び減少し、筐体４２６内の圧力が変化することにより筐体４２６に含まれる流体の流れが指向され、中空繊維フィルタ４２４の膜を通して流体が引き抜かれる。通常、中空繊維の内部は排液管４１２を介してバイオリアクターに流体連通しており、一方、中空繊維フィルタ４２４の中空繊維の外側の、筐体４２６内側の室は、生産物排出管４３０に流体連通している。生産物排出管４３０は、中空繊維フィルタを通して濾過された、中空繊維フィルタ４２４及び筐体４２６の間の室内に存在する生産物の引き抜きを制御する収穫ポンプ／弁４３２を有する。
【００４６】
図１２において、生産物排出管４３０はＡＴＦ４２０上部付近に示してあるが、生産物排出管４３０はＡＴＦ４２０の中央部又は底部付近に配置することもできる。或いは、筐体４２６に１を超える生産物排出管４３０が接続されていてもよい。
【００４７】
高密度流加バイオリアクター４１０での培養が終了した収穫日における生細胞密度（ＶＣＤ）が１００Ｅ６個／ｍＬ未満であった場合、ＡＴＦ４２０を用いて、流束を１０〜３０ＬＭＨ（一般に、１２〜１８、１３〜１６、又は１５ＬＭＨ）とし、濾過された流体の移送量が４バイオリアクター体積に達するまでの間で、バイオリアクター４１０の体積がこの高い流束を維持することができる体積に低下するまで、タンパク質を収穫する。これは細胞密度に応じて０〜５０％、例えば５０％とすることができる。
【００４８】
この低下したバイオリアクター体積に到達したら、連続的透析濾過プロセスを開始し、供給ライン４１４を介してＰＢＳ又は培養培地のいずれか（又は細胞生存率の維持に適した他の流体）を、生産物排出管（透過液）４３０を介した流体収穫速度に等しい流量で添加することにより、バイオリアクター体積を維持する。この透析濾過プロセスは、透過液中の所望の生産物の収率が９０％超に達するまで、例えば、流束１０〜３０ＬＭＨで行うことができる。したがって、この方法による高速収穫は約６〜８時間未満（例えば、６時間未満）で完了する。
【００４９】
収穫日にＶＣＤが既に１００Ｅ６個／ｍＬを超えていた場合は高細胞密度化しないことが推奨される。図１３を参照すると、この場合、連続的な透析濾過の前にバイオリアクター体積を低下させないことになる。連続的な透析濾過プロセスを開始し、バイオリアクター体積を１００％に維持するために、供給ライン４１４を介してＰＢＳ又は培養培地のいずれか（又は細胞生存率の維持に適した他の流体）を、生産物排出管４３０を介した流体収穫速度に等しい流量で添加する。この透析濾過プロセスは、流束を、例えば１０〜３０ＬＭＨとして、透過液内の所望の生産物の収率が９０％超に達するまで、例えば４バイオリアクター体積が交換されるまで実施することができる。４体積を交換した後、残留している培地は、ＰＢＳ又は新鮮培地のいずれかと交換することにより収穫することになる。
【００５０】
次に示す表１に、収穫当日の細胞密度（既知の測定法により決定することができる）に応じて提案されるバイオリアクター体積の低減量を示す。
【００５１】
【表１】
2019523002.tif 000003
これらの方法は、ＡＴＦ機器を通常の操作よりも高い流束で操作して細胞のバイオリアクターからの収穫を操作する新規な様式を提供するものである。この独自の手法により、これまで叶わなかった高速収穫を達成することができる。このプロセスの特徴は：粒子を含まない供給ストリームと、生産物収穫を行うことができる速度とを達成することが可能な単一のプロセスステップにある。これらの特徴により、生物学的製造プロセスにおいて、処理時間が短縮されると共に、複数の処理ステップを行うよりも設備費用が削減されるため、多大な経済的利益がもたらされる。
【００５２】
連続供給を用いる高速ＡＴＦ収穫
収穫時間を更に短縮するために連続供給を用いた流加及び高速収穫プロセスを発展させた。この技法は、収穫時間を半分に短縮すると共に高品質の生産物を確保するために細胞生存率を維持しながらタンパク質の生産を増加させる。収穫中にタンパク質の生産を増大させることは、現行の既存の商業的に利用可能な流加培養液の収穫技法では達成することができない。この生産性の増大は、流加培養に使用されるバイオリアクター等の基本設備や細胞培養のための管理系統を変更することなく達成されるため、特に有利である。
【００５３】
培養の最後の数日間に亘り流加バイオリアクターに連続低速供給を行うことにより、流加培養及び収穫プロセスに更なる時間を追加することなく、タンパク質生産量を押し上げる。これは、精密濾過膜（生産物を透過液中に回収）又は限外濾過膜（最終収穫段階で回収されることになる生産物を反応器内に保持）のいずれかを用いて達成することができる。更に、連続収穫プロセスは流加培養液の生存率も高め、これはタンパク質の品質に好ましい。このプロセスは遠心分離や深層濾過とは異なり、プロセス全体が滅菌状態で実施されるため、二次汚染も低減する。
【００５４】
図１４に、ＡＴＦ方法を用いた連続供給及び高速収穫を行う流加に使用するための装置の略図を示す。ＡＴＦ連続透析濾過を用いて収穫するための構成要素は図１に示したものに類似している。
【００５５】
図１４に示すように、ＡＴＦ収穫バイオリアクターシステム５００は、攪拌槽型反応器とすることができるバイオリアクター５１０を含む。バイオリアクター５１０は排液管５１２を介してＡＴＦ５２０に接続されている。ＡＴＦ５２０は、中空繊維フィルタ５２４を通してＡＴＦを実施するためのダイアフラムポンプ５２２を制御する装置を含み、これらは両方共、滅菌可能な筐体５２６に収容されている。培地及び添加物は、バイオリアクター５１０に、弁及び／又はポンプ５１６により制御される供給ライン５１４を介して導入される。空気供給源及び制御装置は空気管５２８を介してダイアフラムポンプ５２２に流体連通している。ダイアフラムポンプ５２２には空気が追加されたり抜き取られたりし、それによってダイアフラムポンプ内に含まれる２つの室の容積が増加及び減少し、筐体５２６内の圧力が変化することにより筐体５２６内に含まれる流体の流れが指向され、中空繊維フィルタ５２４の膜を通して流体が引き抜かれる。通常、中空繊維の内部は排液管５１２を介してバイオリアクターに流体連通しており、一方、中空繊維フィルタ５２４の中空繊維の外側の、筐体５２６内側の室は、生産物排出管５３０に流体連通している。生産物排出管５３０は、中空繊維フィルタを通して濾過された、中空繊維フィルタ５２４及び筐体５２６の間の室内に存在する生産物の引き抜きを制御する収穫ポンプ／弁５３２を有する。
【００５６】
連続供給は、高速収穫を実施する前に、数日間（これは変化させることができ、例えば２〜８日間）に亘って、低体積（１．０容器体積／日交換（ＶＶＤ）未満、例えば０．７ＶＶＤ未満）で行うことができる。好ましい一実施形態において、連続低速供給及び収穫（０．５ＶＶＤにおける）を培養の１１日目から１４日目まで行う。７２時間後、供給及び高速収穫としての収穫を同時に行う。タンパク質は、ＡＴＦ５２０を使用し、流束を１０〜３０ＬＭＨ（一般に、１２〜１８、１３〜１６、又は１５ＬＭＨ）として、実質的にバイオリアクターの液体部分を収穫し、バイオリアクター５１０の体積が２０％未満（好ましくは＜１０％）に低下するまで収穫を行う。プロセスの高速収穫部分は、提示したサイズのバイオリアクターの場合は完了するまでに約３時間を要する。
【００５７】
連続供給及び高速収穫プロセスは大きな利点を有する。本開示において先に記載した方法は、１４日間の培養及び更に約６時間の収穫時間が必要であり、その結果として、最終量の回収されたタンパク質が得られる。連続供給及びＡＴＦを用いた高速収穫プロセスにおいては、通常の培養を１１日間行った後、３日間連続供給／収穫（合計は同じ１４日間）を行い、その後、わずか３時間で高速収穫を行う。このプロセスにより、流加培養液の生産に使用されるものと同一のバイオリアクター設備から、実質的に同じ時間で回収されるタンパク質の量が増加する。加えて、高速収穫を行う前の低体積収穫の間に行われる連続供給により、細胞生存率は維持されるか又は向上し、生産物の品質は現行の利用可能なプロセス技術よりも高くなる。
【００５８】
高速収穫に関し記載した全ての実施形態において、最終生産物の貯留物は、後続の更なる処理又は生産物の貯蔵のために減量することを目的として、限外濾過膜を備えたＡＴＦを用いることにより更に濃縮することができる。
【００５９】
（実施例）
以下に示す実施例において本発明を更に説明するが、これらは特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を制限するものではない。
【００６０】
１）段階的な透析濾過（Ｓｔｅｐ−ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いる高速ＡＴＦ収穫−従来の流加
ＡＴＦによる段階的な透析濾過を用いる流加培養液高速収穫システムを改良するために様々な試験及び実験手順が必要であった。実施例は、高速収穫のための６Ｌの流加バイオリアクター（レプリジェン社（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）（ウォルサム  マサチューセッツ州）からのＡＴＦ２システム）を含む。ＡＴＦ２のデータを用いて１０００Ｌ流加バイオリアクターに外挿した（レプリジェン社（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）（ウォルサム  マサチューセッツ州）から市販されている５００Ｌ及び１０００Ｌバイオリアクター用灌流製品であるＡＴＦ１０使用）。
【００６１】
この方法の回収率及び総収穫時間を求めるための試験も実施した。この試験のために、ＬＯＮＧ（登録商標）Ｒ３ＩＧＦ−１に適応させたＣＨＯ  ＤＰ  １２細胞の凍結バイアルを解凍し、１００ｎｇ／ｍＬ  ＬＯＮＧ（登録商標）Ｒ３ＩＧＦ−１、２００ｎＭ  メトトレキサート、及び４ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（登録商標）を添加したＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標）培地を含む１２５ｍＬの振盪フラスコ（仕込量４０ｍＬ）で増殖させた。４〜６日後、バイオリアクターに播種するのに十分な数の細胞を生育させるため、細胞を再び１Ｌ（仕込量２００ｍＬ）の振盪フラスコで継代培養（ｐａｓｓａｇｅｄ／ｓｕｂ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ）した。密度が５〜７Ｅ６個／ｍＬに達したら、細胞をＳＳ−ＡＴＦ２を取付けた３Ｌのバイオリアクター（仕込量１．５Ｌ）に播種した。表２及び３に流加バイオリアクターの供給計画及びバイオリアクターの条件を記載する。
【００６２】
【表２】
2019523002.tif 000004
【００６３】
【表３】
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１４日目の流加培養終了後に、収穫プロセスを、ＡＴＦ速度０．９ＬＰＭ及び流束１５ＬＭＨで開始した。各サイクル終了後（図１に示す）、バイオリアクターに滅菌ＰＢＳを充填して１００％に戻し、次の収穫サイクルを同一流束で開始することにより、残存量のＩｇＧを回収した。他のサイクル（計３サイクル）も同様にして繰り返した。
【００６４】
図３に、得られた生細胞密度（ＶＣＤ）及び生存率を培養時間に対しプロットしたグラフを示す。これらは流加培養の典型的なプロファイルであり、一般に、収穫日の生存率は６０〜８５％の間で変化する。最大ＶＣＤは約１４Ｅ６個／ｍＬであり、収穫日のＶＣＤは９〜１０Ｅ６個／ｍＬであった。
【００６５】
図４は、１日目から１４日目までの流加培養液中のタンパク質濃度をプロットしたグラフである。収穫日のタンパク質の最終濃度は約６００ｍｇ／Ｌであり、これを高速収穫プロセスを開始する前の初期濃度として用いた。
【００６６】
図５は、細胞当たりの比生産性、又は経時的な細胞増殖、即ち、生存細胞の積算値（ＩＶＣ）に対する総タンパク質量をプロットしたグラフである。ＩＶＣ及び総タンパク質量のグラフが直線状であることは、細胞当たりの比生産性が流加プロセス全体を通してほぼ一定のままであったことを示唆している。
【００６７】
一般に、流加において、収穫物の清澄化は遠心分離後に深層濾過を行うことにより達成される。これは、深層濾過を単独で利用すると、現状では固形分の多い供給ストリームを取り扱うことができないので（特に細胞密度が高い場合）、遠心分離と連続して用いなければならないことが多く、２段階プロセスとなる。加えて、深層濾過はスケールアップ及び差圧の監視という意味で制限がある。
【００６８】
他方、ＡＴＦによる段階的な透析濾過を用いることにより、プロセス全体をより短い時間の単一ステップに統合することができる。０．２μｍの精密濾過膜を備えたＡＴＦは、細胞を保持すると共に他の細かい粒子も保持し、これは下流プロセスに有利であることから、培養液の収穫に十分に適している。ＡＴＦを使用することにより収穫を滅菌状態で行うことができるので、二次汚染も低減される。市販のＡＴＦｌ０システムは５００Ｌ及び１０００ＬのバイオリアクターのＡＴＦ灌流を行うことができ、複数台を使用して容易に２０００Ｌバイオリアクターへのスケールアップが可能である。本明細書に記載するデータに基づけば、段階的な透析濾過を用いた高速収穫によりタンパク質回収率は９５％を超えることができる。
【００６９】
ＡＴＦによる段階的な透析濾過を用いた収穫プロセスに要する総時間は８時間未満である。生存率が大幅に低下していないことは、収穫プロセスの最中にタンパク質の品質が変化していないことを示唆している。各収穫サイクル後の生存率及びＩｇＧ濃度の結果を下の表４に示す。各サイクル後にバイオリアクターから試料を回収して生存率及びタンパク質濃度を測定した。１回目のサイクル後には試料を回収しなかった（ＮＤ＝未測定）。
【００７０】
【表４】
2019523002.tif 000006
２台のＡＴＦ１０バイオリアクターを同時に運転することが可能である。ＡＴＦ１０はそれぞれ表面積が１１ｍ２であり、これらを同時に使用すると面積は合計２２ｍ２となる。総収穫時間はＡＴＦ１０装置の台数を２台から３台以上に増やすことによって更に短縮することができる。
【００７１】
次の表５に、ＡＴＦ２〜中型（表面積２．５ｍ２）のＡＴＦ６〜ＡＴＦ１０の表面積に基づき一覧にまとめる。
【００７２】
【表５】
2019523002.tif 000007
これらの実験において、６Ｌの流加バイオリアクターに使用したＡＴＦ２は、流束１５ＬＭＨとして、８時間未満で、生産物を９６％の回収率で上首尾にタンパク質を収穫することが示された。表面積をＡＴＦ２（０．１３ｍ２）からＡＴＦ１０（１１ｍ２）まで外挿すると、５００Ｌの流加バイオリアクターは、本明細書に記載する方法に従い、ＡＴＦ１０を用いて８時間以内に高速収穫が可能であると予想される。同様に、１０００Ｌの流加バイオリアクターは、２台のＡＴＦｌ０（フィルタ総表面積（ＳＡ）：２２ｍ２）を用いることにより８時間で収穫することができる。加えて、収穫プロセスの最中に低下する生存率が最小限に抑えられる。
【００７３】
２）連続的な透析濾過を用いた高速ＡＴＦ収穫−従来の流加
高速収穫技法を評価するために、ＡＴＦ２に接続した２Ｌ流加バイオリアクターを使用し、スケールダウンモデル（ＳＤＭ）の再循環手法を用いて、６Ｌ流加バイオリアクターを模擬した。ＡＴＦ２を取付けた６Ｌバイオリアクターのデータを用いてＡＴＦ１０を使用する５００Ｌ及び１０００Ｌ流加バイオリアクターに外挿した。
【００７４】
先に記載した方法と同様にして、この方法の回収率及び総収穫時間を求めるための試験も実施した。
図９に、得られた生細胞密度（ＶＣＤ）及び生存率を培養時間に対しプロットしたグラフを示す。これらは流加培養の典型的なプロファイルであり、一般に、収穫日の生存率は６０〜８５％の間で変化する。最大ＶＣＤは約１４Ｅ６個／ｍＬであり、収穫日のＶＣＤは９〜１０Ｅ６個／ｍＬであった。
【００７５】
図１０は、１日目から１４日目の流加培養液中のタンパク質又は力価濃度をプロットしたグラフである。収穫日のタンパク質の最終濃度は約６００ｍｇ／Ｌであり、これを高速収穫プロセス開始前の初期濃度として用いた。
【００７６】
図１１は、細胞当たりの比生産性、又は経時的な細胞増殖、即ち、生存細胞の積算値（ＩＶＣ）に対する総タンパク質量をプロットしたグラフである。ＩＶＣ及び総タンパク質量のグラフが直線状であることは、細胞当たりの比生産性が流加プロセス全体を通して一定のままであったことを示唆している。
【００７７】
一般に、流加において、収穫物の清澄化は遠心分離の後に深層濾過を行うことにより達成される。これは、深層濾過を単独で利用すると、現状では固形分の多い供給ストリームを取り扱うことができないので（特に細胞密度が高い場合）、遠心分離と連続して用いなければならないことが多く、２段階プロセスとなる。加えて、深層濾過はスケールアップ及び差圧の監視という意味で制限がある場合もある。
【００７８】
他方、ＡＴＦによる連続的な透析濾過を用いることにより、プロセス全体を、ＡＴＦによる段階的な透析濾過プロセスよりも一層短い時間の単一ステップに統合することができる。０．２μｍの精密濾過膜を備えたＡＴＦは、細胞を保持すると共に他の細かい粒子も保持し、これが除去されると下流のプロセスに有利であることから、培養液の収穫に十分に適している。ＡＴＦを使用することにより収穫が滅菌状態で行われることを示すことができるので、二次汚染も低減される。本明細書に記載するシステムは、例えば、２台以上のＡＴＦ１０灌流製品（レプリジェン社（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、ウォルサム  マサチューセッツ州）を用いて５００、１０００、１５００、又は２０００Ｌにスケールアップすることができる。本明細書に記載するデータに基づけば、段階的透析濾過を用いた高速収穫によって９５％を超えるタンパク質回収率を得ることができる。
【００７９】
ＡＴＦによる連続的な透析濾過を用いた収穫プロセスに要する総時間は６時間未満である。生存率が大幅に低下していないことは、収穫プロセスの最中にタンパク質の品質が変化していないことを示唆している。
【００８０】
各収穫サイクル後の回収率及びＩｇＧ濃度の結果を次の表６に示す。
【００８１】
【表６】
2019523002.tif 000008
連続的透析濾過を用いた高速収穫後のタンパク質の回収率を下の表７に示す。
【００８２】
【表７】
2019523002.tif 000009
ＡＴＦ２及びＡＴＦ６を用いた結果のデータをよりスケールの大きなＡＴＦ１０に外挿した。５００Ｌ流加バイオリアクターは、ＡＴＦ１０を用いると６時間未満で収穫することができ、１０００Ｌ流加バイオリアクターは２台のＡＴＦｌ０を用いると（総フィルタ表面積（ＳＡ）：２２ｍ２）６時間未満で収穫することができると求められた。表８は、ＡＴＦ２〜ＡＴＦ６〜ＡＴＦ１０の表面積に基づき表にまとめたものである。
【００８３】
【表８】
2019523002.tif 000010
ＡＴＦ２を取付けた６Ｌの流加バイオリアクターでは、流束を１５ＬＭＨとして、６時間未満で、回収率９５％でタンパク質の収穫を上首尾に行うことが示された。
【００８４】
ＡＴＦ２（０．１３ｍ２）の表面積からＡＴＦ１０（１１ｍ２）に外挿すると、５００Ｌ流加バイオリアクターが、ＡＴＦ１０を用いて６時間以内に高速収穫可能であると予想することができる。同様に、１０００Ｌ流加バイオリアクターは２台のＡＴＦｌ０を用いて６時間で収穫することが可能である。加えて、収穫プロセスの最中に生存率の大幅な低下は見られなかった。
【００８５】
３）連続的な透析濾過を用いる高速ＡＴＦ収穫−高密度流加
ＣＦＢにおいては、ＶＣＤが１００Ｅ６個／ｍＬ未満である場合のみバイオリアクターの体積を低下させることが推奨される。次に示す２つの表に、表面積をＡＴＦ２〜ＡＴＦ６〜ＡＴＦ１０へとスケールアップすることに基づき表にまとめた。最初の表である表９は、バイオリアクターの体積を連続的透析濾過プロセスを開始する前に５０％に低下させることを検討している。２番目の表である表１０は、バイオリアクターの体積を低下させず、すなわち最初から透析濾過を開始するものである。
【００８６】
【表９】
2019523002.tif 000011
【００８７】
【表１０】
2019523002.tif 000012
４）連続供給を用いた高速ＡＴＦ収穫
連続供給及び高速収穫プロセスを用いる流加を、収穫時間を更に半分に短縮し、タンパク質生産量を増加させるために発展させた。これは、高速収穫前の低体積連続供給を高流束高速収穫と併用することにより達成される。後に説明する実施例においては、現行の既存の商業的に利用可能な流加収穫技法と比較してタンパク質収率が４０％増加した。このＡＴＦを用いた連続供給及び高速収穫プロセスの実施例においては、他の実施例に記載した通常の培養を１１日間行った後、３日間連続供給／収穫（合計すると同じ１４日間）を行い、その後、わずか３時間の高速収穫を行った。他の実施形態においては、連続供給時間の長さ又は連続供給体積を変化させて細胞生存率及び総タンパク質生産量を同様に向上させることができた。これらの試験では、再循環方法を用いる２Ｌバイオリアクターで６Ｌ流加バイオリアクターを模擬し、再循環手法を用いて流束を１５ＬＭＨに維持した。
【００８８】
図１５は、連続供給及び従来の流加の両方について、生細胞密度（ＶＣＤ）及び生存率の結果を培養時間に対しプロットしたグラフを示すものである。ＶＣＤも生存率も、１１日目に連続供給及び収穫を開始した後に増加傾向を示した。図１６は、両方のプロセスに関し、細胞当たりの比生産性、又は経時的な細胞増殖、即ち、生存細胞の積算値（ＩＶＣ）に対する総タンパク質量をプロットしたグラフである。図１７は、１日目から１４日目までの流加培養液中のタンパク質をプロットしたグラフであり、従来の流加と比較して、１１日目に開始した連続供給及び収穫後の総量が増加していることを示している。
【００８９】
表１１に、流加培養液の収穫培養に用いた条件を示す。
【００９０】
【表１１】
2019523002.tif 000013
０〜３時間後の各収穫後の生存率の結果を下の表１２に示す。ＶＣＤ及び生存率測定は約２．７時間後に行った。
【００９１】
【表１２】
2019523002.tif 000014
次に示すスケールアップデータをフィルタの表面積（ＳＡ）に基づきＡＴＦ２からＡＴＦ１０に外挿した。
【００９２】
【表１３】
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連続供給及び高速収穫プロセスにより大きな利点が得られた。この実施例においては、１１日間の通常の培養に続き３日間連続供給／収穫を行った後、わずか３時間のみの高速収穫を行うことにより、回収されたタンパク質の量が従来の流加プロセスと比較して１．４倍となった。現行で利用可能な技術よりも高い細胞生存率を保持しながらより多くのタンパク質を生産させることができるプロセスは、重要且つ意義のある改良プロセスである。
【００９３】
図１８に示すように、システム６００は、連続供給を行いながら、限外濾過膜を備えたＡＴＦを使用するプロセスを実施することが可能であった。システム６００の他の構成要素は先の実施形態と同一である。生産物をバイオリアクターに保持し、全ての生産物を高速収穫段階で回収した。これにより、最終生産物貯留物の体積が更に低減される一方で、依然として生産物の収率は増大する。
【００９４】
次に示すスケールアップデータを外挿した。
【００９５】
【表１４】
2019523002.tif 000016
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に説明してきたが、ここに記載した説明は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明を例示することを目的としており、本発明の範囲を制限するものではないことが理解されよう。他の面、利点及び修正は以下に示す特許請求の範囲に包含される。
【図１】
2019523002.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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