(57)【要約】  フミン酸及び関連物質を含む増殖培地を使用して、環境試料から微生物を単離する方法が記載される。一例において、単離された微生物は、以前に培養されたことがないか、又は以前に未知であった。フミン酸を使用して単離された微生物は、その後に、フミン酸を含まない培地上で培養できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フミン酸、その塩、そのアナログ、又はピートを含む培地を使用して、培養不可能な微生物又は未知の微生物を環境試料から単離すること
を含む、基本的にそれからなる、又はそれからなる方法。
【請求項２】
前記培養不可能な微生物又は未知の微生物が、単離された後、フミン酸、その塩、そのアナログ、又はピートを含まない培地を使用して培養されることが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離工程の後に
前記培養不可能な微生物又は前記未知の微生物を、フミン酸、その塩、そのアナログ、又はピートを含まない培地を使用して培養することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記単離工程に使用される前記培地が前記フミン酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記単離工程に使用される前記培地中の前記フミン酸の濃度が、０％（重量／体積）より高く、約５％（重量／体積）未満である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記フミン酸がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５３６８０番を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記単離工程に使用される前記培地が前記フミン酸の塩を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記単離工程に使用される前記培地中の前記フミン酸の塩の濃度が、０％（重量／体積）より高く、約０．２５％（重量／体積）未満である、請求項１〜３又は７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記フミン酸の塩がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｈ１６７５２番を含む、請求項１〜３、７、又は８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記単離工程に使用される前記培地がゲル化剤を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲル化剤が寒天を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
単離が、約３０℃で周囲雰囲気中での約２〜３日のインキュベーション後に、寒天を含む前記培地上での前記培養不可能な微生物又は未知の微生物のコロニーの形成を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記環境試料が土壌又は水を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離工程に使用される前記培地が、ＩＳＰ２、イェンセン、ＬＢ、ＮＡ、Ｒ２Ａ、又はＴＳＡを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離工程の前に
環境試料から培養される微生物の効率又は多様性が、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む培地を使用することにより増加され得ることを認識しながら、微生物を単離するための培地を選択することを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養不可能な微生物又は未知の微生物が放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目の微生物を除外する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記培養不可能な微生物又は未知の微生物が、アシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）門及びウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門の微生物を除外する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）が亜門１に属し、前記ウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）が亜門４に属する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養不可能な微生物及び前記未知の微生物が原核生物である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養不可能な微生物及び前記未知の微生物が細菌又は古細菌である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む培地の上又はその中で、環境試料から細菌を培養すること；及び
その後に、前記細菌を、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地の上又はその中で培養すること
を含む、基本的にそれらからなる、又はそれらからなる方法。
【請求項２２】
前記環境試料からの、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む前記培地の上又はその中での前記培養が、事前の濃縮手順又はフミン酸、その塩、若しくはそのアナログを含まない培地の上若しくはその中での事前の培養が無い状態で起こる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌が培養不可能又は未知の細菌である、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
環境試料から細菌を単離する方法であって、
前記環境試料の一部を、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含むゲル化剤を含む培地上に、細菌コロニーが前記培地上に形成するように播種すること
を含み、基本的にそれからなり、又はそれからなり、
前記細菌コロニーが、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目及びアシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）門又はウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門を除外する方法。
【請求項２５】
前記コロニーから得た細菌が培養不可能な細菌又は未知の細菌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記コロニーから得た細菌が、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地上で培養されることが可能である、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記播種工程の後に
前記コロニーから得た細菌を、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地を使用して培養することを含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記播種工程の前に、培養不可能な細菌又は未知の細菌を単離する確率が、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む培地を使用することにより増加し得ることを認識することを含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記コロニーから得た前記細菌から、１６Ｓ  ｒＲＮＡの少なくとも部分的な配列を得ることを含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細菌コロニーから得た前記細菌が、アクチノタレア（Ａｃｔｉｎｏｔａｌｅａ）、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、アクアバクテリウム（Ａｑｕａｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カエニモナス（Ｃａｅｎｉｍｏｎａｓ）、ダーマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、レイフィソニア（Ｌｅｉｆｉｓｏｎｉａ）、リシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、マルモリコラ（Ｍａｒｍｏｒｉｃｏｌａ）、マッシリア（Ｍａｓｓｉｌｉａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ムチラギニバクター（Ｍｕｃｉｌａｇｉｎｉｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィチコッカス（Ｐｈｙｃｉｃｏｃｃｕｓ）、ラムリバクター（Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ）、リゾバクター（Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒ）、ルガモナス（Ｒｕｇａｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、テラバクター（Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ）、テトラスファエラ（Ｔｅｔｒａｓｐｈａｅｒａ）、チューメバチルス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びバリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属のメンバーである、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
環境試料から細菌を培養する方法であって、
前記環境試料又はその希釈物を、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む寒天含有培地上に、細菌コロニーが前記培地上に形成するように播種することであって、前記環境試料中の前記細菌が、事前の濃縮又は事前の成長を受けなかった状態で播種すること；及び
前記細菌コロニーの１つ以上を、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地に、前記細菌コロニーが、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない前記培地の上又はその中で成長するように移すこと
を含む、基本的にそれらからなる、又はそれらからなる方法。
【請求項３２】
前記細菌コロニーの１つから１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の少なくとも一部分を得ること；及び
少なくとも部分的に前記１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に基づいて、前記細菌コロニーの分類群を決定することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
分類群を決定できないことが、前記細菌が培養不可能であるか、又は以前に未知であったことを示す、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細菌コロニーが放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目のものでなく、アシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）門又はウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門のものでない、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記播種工程の前に、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む前記培地が、環境試料からの細菌の培養を促進し得ることを認識する、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
土壌環境試料から細菌を単離する方法であって、
フミン酸、その塩、又はそのアナログの細菌培地への添加が、前記土壌環境試料から単離された前記細菌の効率及び／又は多様性を増加させ得ることを認識すること；
前記土壌環境試料の一部分から、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む寒天含有細菌培地上で、細菌コロニーが前記細菌培地上で形成するように細菌を培養すること；及び
その後に、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地の上又はその中で、前記細菌コロニーから細菌を培養すること
を含む、基本的にそれらからなる、又はそれらからなる方法。
【請求項３７】
前記細菌コロニーの１つから１６Ｓ  ｒＲＮＡの少なくとも部分的なヌクレオチド配列を得ること；及び
少なくとも部分的に前記１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に基づいて、前記細菌コロニーの１つから得た細菌が以前に未知であったか、又は培養不可能であることを決定することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記単離された細菌が放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目のものでない、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記単離された細菌が、アシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）門又はウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門のものでない、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記フミン酸がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５３６８０番を含み、前記フミン酸の塩がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｈ１６７５２番を含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法により単離された微生物又は細菌。
【請求項４２】
微生物の成長を支持することが可能である培地を含むペトリ皿であって、前記培地が、フミン酸、その塩、又はそのアナログ、及びゲル化剤を含み、前記培地上に形成した培養不可能又は未知の微生物のコロニーを含むペトリ皿。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
いくつかの環境における微生物は「培養不可能」であると言われる。これらの微生物は、現在の技法を利用して実験室内で培養することができない。しかし、これらの環境由来の試料から得られたＤＮＡ配列から、その微生物が存在することが確認される。一例において、１グラムの土は、数百万から数十億の微生物を含むと頻繁に述べられる。しかし、これらの微生物のわずか１％しか実験室内で培養できないともしばしば述べられる。環境試料由来の微生物は種々の用途があり得るので、培養可能な環境試料由来の微生物の比率を増加させることができる方法があれば有用であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
発明者らは、フミン酸又は関連物質を微生物増殖培地に加えることにより、以前に培養不可能であると考えられていた微生物並びに以前に未知であった微生物が環境試料から培養できることを発見した。したがって、培養不可能及び未知の微生物を含む微生物を、フミン酸、その塩、そのアナログ、又はピートを含む培地を使用して環境試料から単離する方法が本明細書に開示される。一例において、単離される微生物は、細菌又は古細菌であり得る。環境試料は、土壌を含む種々の源由来であり得る。
【０００３】
発明者らは、フミン酸又は関連物質を含む培地を使用する微生物の初期培養の後、微生物を、フミン酸又は関連物質を含まない培地上で成長させることができることも発見した。
【０００４】
以下の詳細な説明と共に実施例を説明するのに役立つ、本明細書に組み込まれその一部を構成する添付図面において、フミン酸及び関連物質を使用して環境試料から微生物を単離する方法及び方法に関連する試薬の実施形態が説明される。図面に表される実施形態が、限定のためでなく説明の目的で示されることが認識されるであろう。図面に表される実施形態からの変更、改変、及び逸脱が、以下に開示される通り、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずになされ得ることが認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】土壌試料の段階希釈物を、Ｒ２Ａ培地（左）又はフミン酸を含むＲ２Ａ培地（右）に播種した後の、寒天含有培地上の細菌コロニー形成の増加した効率を示す実施例実験を説明する。図の上段の２つのプレートは、土壌試料の同じ段階希釈物で播種した。下段の２つのプレートは、土壌試料の同じ希釈物で播種したが、図の上段で示されたプレートとは異なる希釈率であった。
【図２】フミン酸を含む培地上で単離された細菌を、その後に、フミン酸を含まない培地上で成長させることができることを示す実施例実験を表す。図のパネルＡに示される２つのプレートは、元々Ｒ２Ａプレート上で単離され、次いで滅菌されたつま楊枝を使用して図に示されるＲ２Ａプレートに移された細菌コロニーを含む。図のパネルＢに示された４つのプレートは、元々０．５％フミン酸を含むＲ２Ａプレート上で単離され、次いで滅菌されたつま楊枝を使用して図に示されるＲ２Ａプレート（フミン酸を含まない）に移された細菌コロニーを含む。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
定義
下記は、本開示全体及び特許請求の範囲で使用され得る選択された用語の定義を含む。定義は、用語の範囲内に入り、実施のために利用され得る構成成分の種々の例及び／又は形態を含む。例は限定的でないものとする。用語の単数形と複数形の両方が定義内に入る。
【０００７】
本明細書では、「周囲雰囲気」は、周辺領域中の一般的な大気組成物を意味する。例えば、５％ＣＯ２、又は１０％未満のＯ２を含む大気組成物は本明細書において周囲と考えられない。１％未満のＣＯ２、又は約２１％Ｏ２の大気組成物は本明細書において周囲雰囲気状態と考えられる。
【０００８】
本明細書では、「古細菌」は、その細胞壁中にペプチドグリカンを持たず、脂肪酸を含まないその膜中に脂質を有する原核生物を意味する。
【０００９】
本明細書では、「寒天」は、一般に海藻から誘導され、培養培地に使用されて粘稠性の点で固体又は半固体である培地を提供するゼラチン状物質を意味する。一例において、培地中の約０．５〜１．５％（重量／体積）の寒天濃度が、微生物の培養プレートに使用され得る。本明細書において、寒天は一種のゲル化剤と考えられる。
【００１０】
本明細書では、「約」は、述べられた値又はパラメーターに対して±１０％を意味する。
【００１１】
本明細書では、第１の物質（例えば、フミン酸）の「アナログ」は、第１の物質に構造の面で類似しているがいくつかの相違点がある第２の物質を指す。アナログは合成のものであり得る。
【００１２】
本明細書では、「細菌」は、その細胞壁中にペプチドグリカンを有し、脂肪酸を含むその膜中に脂質を有する原核生物を意味する。
【００１３】
本明細書では、「コロニー」は、一般に固体又は半固体の培地（例えば、寒天含有培地）の表面上の、たいていは単一の細胞の分裂から発生した微生物の目に見える集団を意味する。細菌により形成されたコロニーは「細菌コロニー」と呼ばれることがある。
【００１４】
本明細書では、微生物に言及される場合の「培養すること」は、微生物を成長又は増殖させることを意味する。「から培養された」は、成長している微生物が得られた源を指す。「中で培養された」又は「上で培養された」は、微生物が培養される場所を指す。例えば、寒天含有培地上で培養された微生物は、一般に、粘稠性の点で固体又は半固体である培地上で成長しつつある。
【００１５】
本明細書では、「決定する」は、確認すること又は発見することを意味する。「決定すること」は、確認又は発見する行為を意味する。確認又は発見されたものは、「決定された」と言われることがある。
【００１６】
本明細書では、名詞として使用される場合の「希釈物」は、希釈されていない液体と比較して、低下した濃度のあるものを含む液体を指す。
【００１７】
本明細書では、「多様性」は変化に富むこと又は異なることを意味する。例えば、第１の微生物集団は、第２の微生物集団より多様性に富む、又はより多くの多様性を有すると言われることがある。一例において、これは、第１の集団が、第２の集団より、多くの異なる微生物の種又は多くの異なる微生物の属を含むことを意味し得る。
【００１８】
本明細書では、微生物の培養に言及される場合の「効率」は、ある状態（例えば、フミン酸の存在下）において別の状態（例えば、フミン酸なし）より高い、（例えば、寒天を含む培地上に）播種された微生物の数あたりの形成されたコロニーの比を意味する。
【００１９】
本明細書では、「環境試料」は、環境（例えば、生息地）のあらゆる部分から採取又は取得された試料を意味する。例の環境試料は、土壌、水、木、昆虫、蠕虫、活性汚泥など由来であり得る。
【００２０】
本明細書では、「濃縮」は、試料中のあるものの数又は比率を増加させることを意味する。
【００２１】
本明細書では、「除外する」は、妨げる又は抜かすことを意味する。
【００２２】
本明細書では、「促進する」は、何かが起こることを助けるか、又は何かを容易にすることを意味する。
【００２３】
本明細書では、「ゲル化剤」は、液体に加えられてその液体を粘稠性の点で固体又は半固体にする物質を指す。このような種々の物質が存在する。例のゲル化剤は、寒天、アガロース、アルギン酸、カラギーナン、ゼラチン、ゲランガム、グアーガム、キサンタンガムなどを含み得る。
【００２４】
本明細書では、「フミン酸」は、希アルカリに可溶性であるが、ｐＨが酸性になるにつれ不溶性になるフミン質の主要な成分（フルボ酸及びフミンはフミン質の他の主要な成分である）を指す。フミン酸「に関連する」物質は、フミン酸アナログ、合成フミン酸を含み得るが、ピートも含み得る。
【００２５】
本明細書では、「示す」は、指摘又は表示することを意味する。
【００２６】
本明細書では、「単離する」は、分離又は隔離することを意味する。「単離すること」は、分離又は隔離する行為である。一例において、単一の微生物が、多くの異なる微生物を含む土壌試料から単離され得る。
【００２７】
本明細書では、微生物の培養培地に関連する「培地」は、微生物の成長を支持する組成物を指す。例の増殖培地は、液体培地（例えば、ブロス）又は固体／半固体培地（例えば、寒天含有培地）を含み得る。
【００２８】
本明細書では、「微生物」は、哺乳類ではない細胞（例えば、細菌、真菌、酵母、古細菌）を意味する。
【００２９】
本明細書では、「得る」は、手に入れる又は取得することを意味する。
【００３０】
本明細書では、「ピート」は、一般的に、部分的に分解された野菜／植物質を指す。
【００３１】
本明細書では、「ペトリ皿」は、微生物の培養に使用される、平らな蓋のついた浅く一般的には透明な皿を意味する。
【００３２】
本明細書では、「播種すること」は、環境試料、環境試料由来の微生物、又は環境試料若しくは微生物の希釈物を、固体又は半固体の微生物培養培地（例えば、寒天含有培地）に適用することを指す。「播種された」は、固体又は半固体の微生物培養培地に適用されたものを指す。
【００３３】
本明細書では、「部分」は全体の一部を意味する。
【００３４】
本明細書では、「先の」は前を意味する。
【００３５】
本明細書では、「原核生物」は、膜に包まれた核を有さない単細胞生物を意味する。
【００３６】
本明細書では、「認識すること」は、何かについて知っていることを意味する。
【００３７】
本明細書では、「塩」は、物質のイオン性形態を指す。
【００３８】
本明細書では、「選択すること」は選ぶことを意味する。
【００３９】
本明細書では、「土壌」は、一般的に、地面の上層に存在する有機物、無機物、気体、液体、微生物などの混合物を指す。
【００４０】
本明細書では、「その後の」は、別な何かの発生の後の、時間における何かの発生を指す。
【００４１】
本明細書では、「合成の」は、天然に存在するのではなく合成された何かを指す。合成物質はアナログであり得る。
【００４２】
本明細書では、「分類群」は、関連する生物が分類される階層分類上の群を指す。例えば、具体的な属は、具体的な種と同様に、分類群である。種々の異なる属及び種がある。
【００４３】
本明細書では、「移す」は、ある場所から別の場所への移動を意味する。
【００４４】
本明細書では、微生物に言及される場合の「培養不可能な」は、現在の技術（すなわち、本開示の前の技術）を利用して培養が不可能なことを意味する。培養不可能であると考えられる微生物は、例えば、技術が進歩した場合、最終的に培養され得る。一例において、本明細書に開示される方法を利用して培養された微生物は、以前は培養されなかったかもしれない。本開示の状況において、そのような微生物は、微生物が培養されるようになるのは本明細書に開示される技術的な進歩のためなので、培養不可能と呼ばれることになる。
【００４５】
本明細書では、微生物に言及される場合の「未知」は、微生物が存在すると以前に知られていなかったことを意味する。本明細書において、フミン酸を使用して単離された微生物は、本明細書に開示される方法の開示の前には知られていなかったので、未知と呼ばれ得る。未知の微生物は、例えば、新たな属又は種を形成し得る。未知の微生物は、存在が以前に報告されていなかった。他方で、既知の微生物は、存在が知られており、既知の分類群の一部であり得る。
【００４６】
本明細書では、「使用する」は、利用すること又は使い始めることを意味する。「使用すること」は、利用又は使い始める行為を意味する。利用されたか、又は使い始められたものは「使用された」と言われることがある。
【００４７】
環境試料及び培養不可能な微生物
微生物（例えば、古細菌、細菌、真菌、酵母）は、恐らく、生物圏の全ての部分並びに多くの生命体の上又は中に存在する（すなわち微生物相）。生物圏／微生物相由来の試料が調達され、その中の微生物が培養なしに試料中に検出されることがある。しかし、本明細書に開示されるのは、これらの試料から培養される微生物の効率及び／又は多様性を増加させる方法である。
【００４８】
典型的な環境試料は、地面（例えば、土壌、永久凍土、堆積物）、水（例えば、淡水、海水、熱水噴出口）、空気、環境中の物質（例えば、腐っている木のような腐敗しつつある物質、堆肥）から、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、蠕虫）の表面（例えば、皮膚）から、動物（例えば、ヒト）の内部（例えば、消化管、腸）から、植物若しくは植物関連物質（例えば、植物の根、植物の種）から、場合によると大気圏外空間などから得ることができる。環境試料は、人造又は人工の環境（例えば、廃水、活性汚泥、病院、及び換気システム）から調達することもできる。一般に、環境試料は、自然環境から、人工環境から、自然環境の企図された複製などから調達できる。一例において、環境試料は土壌である。一例において、環境試料は水である。
【００４９】
これらの環境の一部から得た試料中の微生物の一部は「培養不可能」であり得る。培養不可能な微生物は、現在の技術を利用して、その微生物が培養できない（例えば、実験室中）のでそのように呼ばれる。しかし、ＤＮＡシークエンシングのような技法が培養不可能な微生物のゲノムを検出できるので、培養不可能な微生物は試料中に検出され得る。いくつかの環境試料中に、ＤＮＡが検出されなかった微生物もある。これらの微生物は、現在存在することが知られていないので「未知」と呼ばれることがある。未知の微生物は、培養可能なことも、培養不可能なこともある。培養不可能な微生物は、既知のことも、未知のこともある。一例において、培養不可能且つ／又は未知の微生物は原核生物（例えば、古細菌、細菌）であり得る。一例において、培養不可能且つ／又は未知の微生物は真核生物（例えば、真菌、酵母）であり得る。
【００５０】
例えば、保存されたヌクレオチド配列（例えば、１６ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド配列）が、環境試料由来の微生物から得られた場合、その保存された配列が、培養不可能且つ／又は未知の微生物を源とするかどうかを決定することは可能であり得る。種々の公開されているヌクレオチド配列データベースは、例えば、培養可能な微生物か培養不可能な微生物のいずれかを源とすると一般的に示される１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む。１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、例えば、これらのデータベースに同一配列を問い合わせるのに使用できる（例えば、ＢＬＡＳＴＮを利用）。これらの配列問い合わせから生じた配列一致（すなわち、問い合わせ配列と同一性を有するデータベース中の検索された配列）は、一般的に、培養可能な微生物か培養不可能な微生物のどちらを源とするかを特定され、問い合わせ配列が、培養可能であると知られている微生物か培養不可能であると知られている微生物のどちらを源とするのかを決定するのを助け得る。問い合わせ配列とデータベース中の配列との間の配列一致がないということは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ問い合わせ配列が以前に記載されていない微生物（すなわち、未知の微生物）を源とすることを示し得る。
【００５１】
問い合わせ配列と検索された配列との間の「配列一致」は、問い合わせ配列と検索された配列との間の同一性に基づいて決定でき、同一性は、一般的に問い合わせ配列の所与の長さ（例えば、長さの９９％）にわたって測定可能である。配列同一性一致は、例えば、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の、問い合わせ配列と検索された配列との間の同一性レベルを含み得る。配列同一性一致の欠如は、これらの述べられたレベルのいずれよりも低い同一性レベルを含み得る。一例において、１６Ｓ  ｒＲＮＡ問い合わせ配列とデータベースから検索された配列との間の少なくとも９４、９５、又は９６％の配列同一性一致は、問い合わせ配列が生じた元の微生物が、検索された配列が生じた元の微生物と同じ分類上の属（ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｇｅｎｕｓ）内に分類されるべきであることを示し得る。一例において、１６Ｓ  ｒＲＮＡ問い合わせ配列と検索された配列との間の少なくとも９４、９５、又は９６％の配列同一性一致は、検索された配列が培養不可能な微生物由来であることが示されている場合、問い合わせ配列が生じた元の微生物も、少なくともそのような微生物が本明細書に開示される方法を利用して培養されるまで、培養不可能であると分類されるべきであることを示し得る。
【００５２】
フミン酸、塩、及びアナログ
土壌の有機物は、フミン質又は非フミン質と分類され得る。フミン質は、植物、動物、微生物などの変化した又は変換された成分（例えば、分解された有機物）で構成されている。非フミン質には、植物、動物、微生物などの変化していない残物（例えば、分解されていない）がある。フミン質は、一般的に、フミン酸成分、フルボ酸成分、及びフミン成分を含むと考えられている。フミン酸成分、及びフミン酸成分の全て又は一部を含み得る物質が、環境試料由来の微生物の播種の効率を増加させること及び／又は環境試料から単離された微生物の多様性を増加させることが可能であると本明細書に開示される。
【００５３】
フミン質のこれらの３種の成分−フミン酸、フルボ酸、及びフミン−は、一部分、異なるｐＨ値でのそれらの水への溶解度に基づいて定義される。例えば、フミン酸成分は、一般的にアルカリ性のｐＨで水溶性であるが、酸性条件下で溶解性が低下する。一例において、フミン酸は、ｐＨ２で水に対して不溶性であるが、より高いｐＨ値で次第に可溶性になるフミン質の一部であると定義され得る。フルボ酸成分は、一般的に、全ｐＨ値で水に可溶性である。フミン成分は、一般的に、全ｐＨ値で不溶性である。
【００５４】
化学的には、フミン酸は、多くの場合フェノール置換基及びカルボン酸置換基を含む、弱い脂肪族有機酸と芳香族有機酸の複雑な混合物である。フミン酸（ＨＡ）は、その一様でない化学的特徴のために多分散性であると呼ばれ得る。フミン酸（ＨＡ）の分子サイズは、一例において、およそ約１０，０００〜約１００，０００の範囲であり得る。フミン酸（ＨＡ）は、無機微量鉱物元素と容易に塩を形成し得る。フミン酸とその塩の両方が使用でき、本明細書に開示される方法において活性を有し得る。
【００５５】
フミン質、及びしたがってフミン酸は、土壌（例えば、腐植土）、ピート、褐炭、石炭、湖及び小川の堆積物、海水、並びに頁岩（例えば、レオナルダイト）の成分であり得る。フミン酸は、これらの物質のいくつかから（例えば、簡便な源は、腐植土に富んだ土、ピートモス、堆肥であり得る）、種々の方法を利用して得ることも抽出することもできる。フミン酸は、フミン酸が生産されるように有機物質（例えば、植物性物質）の分解を促進するように構成された系から得ることもできる。フミン酸は、ポリフェノールのような物質の重合によっても形成され得る。これらの方法のいくつかは、例えば、米国特許第５，８５４，０３２号明細書に記載されている。フミン酸を抽出又は製造する他の方法も利用できる。フミン酸は、商業的に購入することもできる（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５３６８０番）。上述の物質−ピート、褐炭、石炭、堆積物、海水、頁岩など−も、環境試料から単離された微生物の播種効率及び／又は多様性を増加させる物質の範囲内にある。
【００５６】
フミン酸の塩は、環境試料から単離された微生物の効率及び多様性を増加させることができる物質の範囲内にある。一例において、フミン酸の塩の形成は、その中のカルボキシル基及び／又はヒドロキシル基がその水素イオンを解離し、陽性のカチオン（例えば、鉄、銅、亜鉛、カルシウム、マンガン、マグネシウムなどのような金属カチオン）と結合する能力に依存する。フミン酸の塩は、商業的に購入することもできる（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｈ１６７５２番）。
【００５７】
フミン酸アナログ及び合成フミン酸（フミン酸アナログも合成であり得る）も存在し、環境試料から単離された微生物の効率及び多様性を増加させ得る物質の範囲内にある。一例において、特定のキノンは、その１つがアントラキノン−２，６−ジスルホナート（ＡＱＤＳ）であるが、フミン酸のアナログであると考えられている。合成フミン酸は、当技術分野に公知である方法により製造できる（例えば、Ｖ．Ａ．Ｌｉｔｖｉｎ，Ｒ．Ｌ．Ｇａｌａｇａｎ．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｕｍｉｃ  Ａｃｉｄｓ．”Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８５，ｎｏ．２，２０１２）。
【００５８】
フミン酸は分別することができ、留分のいくつかは本明細書に開示される方法に首尾よく使用することができる。分別の一例において、フミン酸は、わずかに塩基性のｐＨの０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムの水溶液に加えられる。不溶性物質は混合物から除去される。残った溶液を、５，０００の分子量より大きい分子をフィルター上に残すフィルターに通す一方で、５，０００の分子量より小さい分子はフィルターを通過する。フィルター上に残った物質は、土壌試料由来の微生物の播種の効率を増加させる活性及び／又は土壌試料から単離された微生物の多様性を増加させる活性を有することが示され得る。フミン酸を分別する他の方法を利用できる。
【００５９】
フミン酸を使用する微生物の単離
本明細書に開示される方法の一例において、微生物は、フミン酸又は関連物質を含む微生物増殖培地を使用して、環境試料から単離される。一般的に、フミン酸は、あらゆる微生物培養培地に加えることができる。種々の例において、微生物培地は、細菌、真菌、酵母、及び古細菌を含む種々の異なる微生物を培養するように設計されていることがある。一例において、培養培地は、細菌の成長を支持することが知られていることがある。一例において、増殖培地は、Ｒ２Ａ、ＴＳＡ、ＬＢ、ＮＡ、ＩＳＰ２、イェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ’ｓ）などを含み得る。培地へのフミン酸の添加は、一般的に、フミン酸を含まない培地を使用する播種の効率及び／又は多様性に比較して、微生物の播種の効率（すなわち、成長する微生物の数）及び／又は環境試料から培養される微生物の多様性を増加させる。一例において、既知であるが以前に培養不可能であった微生物又は以前に未知であった微生物を、フミン酸又は関連物質を含む培地上で培養できる。
【００６０】
微生物の培養に使用される培地は、液体でも、半固体でも、固体でもよい。半固体又は固体の培地は、一例において、ゲル化剤を液体培地に加えることにより製造できる。一般的なゲル化剤は寒天である。しかし、いくつかの他のゲル化剤が存在し、使用できる。例には、アガロース、アルギン酸、カラギーナン、ゼラチン、ゲランガム、グアーガム、キサンタンガム、及び他のものがある。一般的に、半固体又は固体の培地に播種される微生物は、培地が微生物の成長の助けになる環境（例えば、周囲雰囲気中で３０℃での２〜３日のインキュベーション）に配置される場合、分裂して、ある時間の後コロニーを形成し得る。しかし、これらの条件（例えば、インキュベーションの日数、温度、雰囲気）は変わることがあり、経験的に決定できる。
【００６１】
異なる形態のフミン酸は、フミン酸を欠く培地に比較して増加した播種の効率及び環境試料から単離された微生物の増加した多様性を生み出すには、培地内の異なる濃度を要し得る。一例において、０％（重量／体積）を超える種々のフミン酸形態のいずれかの濃度が利用され得る。一例において、フミン酸形態は、０％を超え約５％未満の濃度（例えば、０．２５、０．５０、１．５０、２．００、２．５０％）で使用され得る。一例において、フミン酸形態は、０％を超え約０．２５％未満の濃度（例えば、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５％）で使用され得る。一例において、培地に使用されるフミン酸の濃度は０．１％でも、０．１％超でもない。一例において、約０〜５％又は０．０５〜２．００％のフミン酸の濃度が利用され得る。一例において、約０．２５％未満のフミン酸の塩の濃度が利用され得る。一例において、約０．５％のピートの濃度が利用され得る。
【００６２】
一例において、使用者が、環境試料から培養される微生物の効率及び／又は多様性が、培地中にフミン酸を使用することにより増加し得ることを認識し得るので、ある形態のフミン酸を含む培地が、開示される方法に使用するために選択又は選ばれる。この認識の後に、使用者はフミン酸を含む培地を使用して、例えば、培養不可能な微生物及び／又は未知の微生物を環境試料から単離し得る。
【００６３】
一例において、微生物を環境試料から単離することは、環境試料の一部を、フミン酸及び／又はその種々の形態を含む培地上又はその中で直接培養した後で起こる。「直接培養」は、この文脈において、中間の手順又は工程が、増加した播種の効率及び／又は単離された微生物の増加した多様性を得るために一般的に必要とされないことがあることを意味する。例の中間工程は、環境試料中又はそれ由来の特定の微生物を濃縮する濃縮工程（例えば、速く成長する微生物を濃縮する集積培養；優勢な微生物を濃縮する希釈培養）を含み得るか、且つ／又は環境試料由来の微生物の、フミン酸を含む培地を使用して培養される前の予備的な成長を含み得る。フミン酸を含む培地上での成長の前の環境試料の保存（例えば、冷却された環境中）、又はフミン酸を含む培地に段階希釈物の一部を適用する前の環境試料からの段階希釈物の製造のような手順が、この文脈において一般的に中間工程と考えられないことに留意されたい。したがって、一例において、環境試料の全部若しくは一部、又はその希釈物は、中間の手順又は工程の利用なしに、フミン酸又はその形態の１つを含む培地上又はその中で培養される。他の例において、中間手順が利用され得る。
【００６４】
本開示の方法に従ってフミン酸を使用して培養又は単離される微生物は、その後に、一例において、フミン酸を含まない培地上で培養できる。一例において、最初にフミン酸を含む培地を使用して単離された微生物は、微生物がフミン酸含有培地上で成長したのに類似して又は同様に成長し得る。一例において、最初にフミン酸を含む培地を使用して単離された微生物は、それらがフミン酸含有培地上で成長したよりもゆっくりと成長し得る。一例において、最初にフミン酸を含む培地を使用して単離された微生物は、フミン酸を含まない培地上で成長しないことがある（例えば、さらなる又はその後の成長にフミン酸が必要とされることがある）。一例において、最初にフミン酸を含む培地上で単離された微生物は、最初の単離に使用されたよりも少ないフミン酸を含む培地上で成長し得る。
【００６５】
一例において、開示される方法を利用して培養又は単離される微生物は、細菌のことも、古細菌のこともある。これらの細菌及び古細菌は、本明細書に開示される通り、種々の異なる属及び種のものであり得る。一例において、開示される方法を利用して培養される細菌は、以下の属のいずれかのものであり得る：アクチノタレア（Ａｃｔｉｎｏｔａｌｅａ）、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、アクアバクテリウム（Ａｑｕａｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カエニモナス（Ｃａｅｎｉｍｏｎａｓ）、ダーマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、レイフィソニア（Ｌｅｉｆｉｓｏｎｉａ）、リシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、マルモリコラ（Ｍａｒｍｏｒｉｃｏｌａ）、マッシリア（Ｍａｓｓｉｌｉａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ムチラギニバクター（Ｍｕｃｉｌａｇｉｎｉｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィチコッカス（Ｐｈｙｃｉｃｏｃｃｕｓ）、ラムリバクター（Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ）、リゾバクター（Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒ）、ルガモナス（Ｒｕｇａｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、テラバクター（Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ）、テトラスファエラ（Ｔｅｔｒａｓｐｈａｅｒａ）、チューメバチルス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びバリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）。しかし、本明細書に開示されるもの以外の多くの属及び種を、本方法を利用して培養できる。
【００６６】
一例において、本明細書に開示される方法を利用して培養される微生物は、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目のものでないことがある（例えば、この目の微生物は除外されることがある）。一例において、本明細書に開示される方法を利用して培養される微生物は、アシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）門及びウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門のものでないことがある（例えば、これらの門の一方又は両方の微生物は除外されることがある）。一例において、除外されるアシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）は亜門１にのみ属することがある。一例において、除外されるウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）は亜門４にのみ属することがある。
【００６７】
本明細書に開示される方法を利用して単離された微生物を特定する（例えば、属及び種）試みがなされることがある。一例において、特定は、本方法を使用して単離された細菌から１６Ｓ  ｒＲＮＡのヌクレオチド配列、又は部分的なヌクレオチド配列を得た後になされることがある。本明細書の別の場所に記載されている通り、これらの配列を利用して、種々のデータベースに、同一又はほぼ同一の配列（すなわち検索された配列）を問い合わせることができる。これらの方法により、特定の１６Ｓ  ｒＲＮＡが生じた元の単離された微生物を分類群に対応づけることが可能になり得る。或いは、これらの方法により、単離された微生物を、培養不可能及び／又は未知であると決定することが可能になり得る。一例において、微生物を、データベース中の配列に対するその１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の十分な同一性に基づいて分類群に対応づけることが可能でない場合、微生物は、培養不可能及び／又は未知であると決定することができる。単離された微生物を分類又は対応づけるこれらの試みは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列のみを利用することがある。いくつかの例において、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、他の遺伝子の配列、複数の遺伝子の配列、又はさらにはゲノム全体の配列と組み合わせて使用されることがある。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例は、種々の実施形態を説明する目的のものであり、限定であると解釈されないものとする。
【００６９】
実施例１．フミン酸を含む培地の調製
種々の微生物培地を、これらの試験で使用した。Ｒ２Ａ（Ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ  Ｒ２Ａ  Ａｇａｒ、ＤＦ１８２６−０７−３番）、ＴＳＡ（Ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ、ＤＦ０３６９−０７−８番）、ＬＢ（Ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ  Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  Ａｇａｒ、ＤＦ０４４５−１７−４番）、ＮＡ（Ｏｘｏｉｄ（商標）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ、ＯＸＣＭ０００３Ｂ番）、及びＩＳＰ２（Ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ  ＩＳＰ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２、ＤＦ０７７０−１７−９番）を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。Ｊｅｎｓｅｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｇａｒ（Ｍ７１０番）をＨｉＭｅｄｉａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）から購入した。
【００７０】
フミン酸（５３６８０番；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）又はフミン酸ナトリウム塩（Ｈ１６７５２番；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を、オートクレーブ処理の前に、示されたパーセンテージ（重量／体積）で培地に加えた。オートクレーブ処理の後、５３６８０番フミン酸を含む培地では、寒天プレートを注ぎながら培地を渦巻かせて、フミン酸が均一に培地全体に分布することを確実にした。
【００７１】
下記を含む、種々のピートもこれらの試験で使用した：ＤＡＫＯＴＡ（商標）Ｐｅａｔ（ＤＡＫＯＴＡ  Ｐｅａｔ  ＆  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｇｒａｎｄ  Ｆｏｒｋｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｄａｋｏｔａ，ＵＳＡ）、Ｐａｒｔａｃ  Ｐｅａｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｒｅａｔ  Ｍｅａｄｏｗｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）の詳細不明の（ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）ピート、ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅｌｍｈｕｒｓｔ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）の詳細不明のピート、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｇｒｏｖｅｌａｎｄ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ＵＳＡ）の詳細不明のピート、及び「ＣｘＣ  Ｅｎｖｉｒｏ」と名付けられた発明者らの実験室の詳細不明のピート。
【００７２】
フルボ酸をＫｅｌｐ４Ｌｅｓｓ．ｃｏｍ（Ｉｄａｈｏ  Ｆａｌｌｓ，Ｉｄａｈｏ，ＵＳＡ）から得た。
【００７３】
ピート及びフルボ酸を、上述の通りフミン酸と同様に培地に加えた。
【００７４】
実施例２．環境試料
土壌試料を、Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡの植林された区域から得た。第１の土壌試料（土壌試料Ａ）を２０１５年１０月に調達した。第２の土壌試料（土壌試料Ｂ）を２０１５年１１月に調達した。試料を、互いの約１００フィート内の区域から得た。試料は、土表面から約１５ｃｍの深さまでの土壌を含んでいた。土壌試料Ｂはバルク土壌であった。試料Ａは、バルク土壌に加え、植物根の物質も含んでいた。土壌試料を使用まで４℃で冷蔵庫中に保存した。
【００７５】
土壌試料に加え、池水試料、朽木からの木試料、及びミミズ試料もこれらの試験に使用した。これらの３種の試料を、土壌試料を得たＣｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ区域に非常に近い区域で得た。
【００７６】
実施例３．フミン酸を含む培地を使用して土壌から細菌を単離する増加した効率
土壌（０．５ｇの土壌試料Ａ）を、５０ｍｌの滅菌されたリン緩衝液（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＮＣ００７１６４７１番；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加え、激しく混合した。混合物の段階希釈物をリン緩衝液中で作成し、希釈物のアリコートをＲ２Ａプレート又は０．５％フミン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５３６８０番）を含むＲ２Ａプレート上で培養した。プレートを３０℃で２〜３日間周囲雰囲気中でインキュベートし、次いで、細菌コロニーの形成に関して調査した。
【００７７】
図１は、これらの実験の実施例結果を示す。図１において、段階希釈物のアリコートを播種した２つのＲ２Ａプレートを左に示し、同等なアリコートを播種した２つのＲ２Ａ＋フミン酸プレートを右に示す（フミン酸を含む寒天は色が濃い）。図１の上部に示される２つのプレートは、図１の下部に示される２つのプレートとは異なる希釈率で播種した。
【００７８】
結果は、Ｒ２Ａプレート上よりも多くの微生物のコロニーがＲ２Ａ＋フミン酸プレート上にあったことを示す。これは、フミン酸の添加により、これらの土壌環境試料から細菌を培養する効率が増加したことを示すものであった。全般的に、一部分にはＲ２Ａ培地は細菌の成長を支持するように設計されているので、これらの試験で形成されたコロニーの大部分は細菌のコロニーであった。
【００７９】
試料から細菌を単離する増加した効率がＲ２Ａプレートに特異的であるか、或いは他の種類の培地に観察されるより一般的な現象であるかを試験するために、０．５％フミン酸を添加した、又は添加していないいくつかの異なる種類の寒天培地を類似の播種実験で使用した。使用された異なる種類の培地は、実施例１に記載されている。既に説明した通り、リン酸緩衝液中で作成した土壌の段階希釈物を培地上で培養した。３０℃で２〜３日のプレートのインキュベーション後に、コロニーを数えた。異なる段階希釈物のアリコートを播種したプレートから得られたコロニー数を、希釈係数に基づいて調整した。これらの実験の実施例結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
2019509757.tif 000003
【００８１】
これらのデータは、試験した培地のそれぞれで、０．５％（重量／体積）のフミン酸の添加がプレート上のコロニーの数を増加させたことを示す。これらの実験において、６種の異なる培地を使用して、フミン酸なしに比べたフミン酸によるコロニーの増加は、２．１倍（ＮＡ＋ＨＡ）から６．０倍（ＬＢ＋ＨＡ）の範囲であった。これらのデータは、フミン酸によりこれらの土壌微生物を播種する効率を増加させる効果が特定の培地に特異的ではなく、多くの異なる種類の培養培地に作用する一般的な現象であることを示す。
【００８２】
別の組の実験を実施して、土壌試料から細菌を播種する効率を最適化するフミン酸の濃度を決定した。試料から段階希釈した試料を、上述の通り、ある範囲のフミン酸濃度（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５３６８０番）を含むＲ２Ａプレート上に播種し、培養した。
【００８３】
表２及び３は、これらの試験から得た実施例データを表す。
【００８４】
【表２】
2019509757.tif 000004
【００８５】
【表３】
2019509757.tif 000005
【００８６】
表２及び３のデータは、Ｒ２Ａプレート中の０．０５％から少なくとも２％のフミン酸の濃度が、フミン酸を全く含まないＲ２Ａプレートに比べてコロニーの数を増加させたことを示す。試験した最低濃度である０．０５％フミン酸が、フミン酸を全く含まないプレートの１．６倍のコロニーを生み出したので（表２）、０と０．０５％との間のフミン酸濃度も微生物播種の増加した効率をもたらすと考えられる。コロニー数増加をもたらした試験したフミン酸の最高濃度は２％であった（表３；フミン酸を全く含まないプレートの３．５倍のコロニー）。試験されたフミン酸の次に高い濃度は５％であり（表３）、フミン酸を全く含まないプレートに比べてコロニー数の減少をもたらした（フミン酸のないプレート上でのコロニー数の０．５倍）。これらのデータは、２％より高いある濃度で、フミン酸は播種の効率をもはや増加させないことを示唆している。これらのデータは、実施例の土壌試料から細菌を播種する効率が増加するフミン酸の濃度が、最低の方で０．０５と０．５％との間のある濃度及び最高の方で０．５と１．０％との間のある濃度であったことを示唆している。全体として、発明者らは、０．５％フミン酸を発明者らの試験の多くに使用した。
【００８７】
フミン酸に加えて、フミン酸のナトリウム塩（Ｈ１６７５２番；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を、土壌から細菌を単離する効率を増加させるその能力に関して試験した。フミン酸のこの塩は、非塩形態とは異なり、培地への添加後及び培地のオートクレーブ処理の間に可溶性になった。
【００８８】
非塩形態のフミン酸による試験と同様に、これらのフミン酸塩試験は、上述の通り、段階希釈した土壌を播種及び培養することにより実施した。これらの試験の実施例結果を表４、５、及び６に示す。
【００８９】
【表４】
2019509757.tif 000006
【００９０】
【表５】
2019509757.tif 000007
【００９１】
【表６】
2019509757.tif 000008
【００９２】
発明者らの所見は、Ｒ２Ａ培地中の０．５％濃度の非ナトリウム塩形態のフミン酸がコロニーの数を増加させたが、この濃度のナトリウム塩形態のフミン酸が、フミン酸なしに比べてコロニーの数を減少させたことであった（表４）。０．２５％未満の濃度では（例えば、０．０５％、０．０１％、及び０．００２％）、ナトリウム塩形態のフミン酸は、微生物コロニー形成の効率を増加させた（表６）。しかし、少なくともこれらの実施例試験において、この増加は、非塩形態のフミン酸の最適濃度による増加ほど高くなかった。
【００９３】
実施例４．土壌から細菌を単離する効率に対するピート及びフルボ酸の効果
フミン酸の他に、他の物質を、実施例の環境試料由来の微生物のコロニー形成効率を増加させるその能力に関して試験した。種々の源由来のピートを、フルボ酸と同様に試験した（ピート及びフルボ酸は実施例１に記載されている）。これらの物質を、実施例１に記載の通り、Ｒ２Ａプレートに０．５％（重量／体積）で組み込んだ。土壌試料Ａのリン緩衝液中の段階希釈物を、実施例３に記載の通り、培地上に播種して培養した。ピート及びフルボ酸で得られた実施例結果を、フミン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５３６８０番）で得られた結果と比較した。これらの試験の実施例結果を表７に示す。
【００９４】
【表７】
2019509757.tif 000009
【００９５】
データは、フルボ酸を含まない培地に比べてフルボ酸がコロニー形成を増加させるように見えなかったが、試験したピートのいくつかがコロニー形成の効率を増加させたことを示す。
【００９６】
実施例５．フミン酸を使用して土壌以外の環境試料から微生物を単離する効率
土壌以外の環境試料からの微生物の単離に対するフミン酸の効果を試験する実験を実施した。池水、腐敗木、及びミミズからの試料を、実施例２に記載の通り調達した。
【００９７】
池水試料の段階希釈物を、土壌に関して実施例３に記載の通り実施したのと同様に製造した。腐敗木試料に関しては、２ｇの木試料を１００ｍｌのリン緩衝液に加え、激しく混合し、段階希釈物を製造した。ミミズ試料に関しては、ミミズを、エタノールですすぎ、水で３回すすぎ、次いで４０％グリセロール中で−８０℃で保存した。次いで、ミミズを解凍し、乳鉢と乳棒を使用して均質になるまでつぶし、段階希釈物を製造した。
【００９８】
これらの試料全てで、段階希釈物のアリコートを、Ｒ２Ａプレート上及び０．５％フミン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５３６８０番）を含むＲ２Ａプレート上で、三連で培養した。プレートを、３０℃で３日間周囲雰囲気中でインキュベートし、コロニーを数えた。池水試料の実施例結果を表８に示す。
【００９９】
【表８】
2019509757.tif 000010
【０１００】
データは、池水試料に関して、Ｒ２Ａに比較してＲ２Ａ及びフミン酸上のコロニーに約２０％の増加があったことを示す。発明者らは、腐敗木及びミミズ試料に関してフミン酸の存在下でのコロニー数の増加を見なかった（Ｒ２Ａ上のコロニーの数は、Ｒ２Ａ＋ＨＡ上と同じであった）。
【０１０１】
実施例６．フミン酸の存在下で単離された微生物のフミン酸の継続した存在の要求なし
フミン酸を含む培地を使用して環境試料（例えば、土壌）から単離した微生物が、成長のためにフミン酸の継続した存在を要求するかどうかを決定する試験を実施した。これらの実験を実施するために、実施例３に記載の通り、Ｒ２Ａプレートか、０．５％フミン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５３６８０番）を含むＲ２Ａプレートのいずれかの上での土壌の播種の後に単離された無作為に選択された単一コロニーを、滅菌されたつま楊枝を使用して、フミン酸を含まないＲ２Ａプレートに移した。Ｒ２Ａプレートに移した微生物の成長を評点した。
【０１０２】
図２は、本試験の実施例結果を示す。図２のパネルＡは、試験の対照アームを表す。パネルＡ（白線の上）は、土壌をＲ２Ａプレート（フミン酸を含まない）上に播種した後に形成された個別のコロニーを移した２つのＲ２Ａプレート（フミン酸を含まない）を示す。コロニーを、元のＲ２Ａプレートから、パネルＡに示されるＲ２Ａプレートに、滅菌されたつま楊枝を使用して移した。元のＲ２Ａプレートの異なる個別のコロニーを、図２Ａに示される２つのＲ２Ａプレートのそれぞれの上の輪郭を描いた３２の正方形のそれぞれに移した。図２Ａ中のデータは、元のＲ２Ａプレートから移された６４のコロニーのうちおよそ５７（約８９％）が、その後に、元のコロニーが移されたＲ２Ａプレート上で成長したことを示す。
【０１０３】
図２のパネルＢは、試験の実験アームを表す。パネルＢ（白線の下）は、フミン酸を含むＲ２Ａプレート上での土壌の播種後に形成された個別のコロニーを移した４つのＲ２Ａプレート（フミン酸を含まない）を示す。コロニーを、フミン酸を含む元のＲ２Ａプレートから、パネルＢに示されるＲ２Ａプレートに、滅菌されたつま楊枝を使用して移した。フミン酸を含む元のＲ２Ａプレートからの異なる個別のコロニーを、図２Ｂに示される４つのＲ２Ａプレートのそれぞれの上の輪郭を描いた３２の正方形のそれぞれに移した。図２Ｂ中のデータは、０．５％フミン酸を含む元のＲ２Ａプレートから移された１２８のコロニーのうちおよそ１１４（やはり約８９％）が、その後に、元のコロニーが移されたＲ２Ａプレート上で成長したことを示す。
【０１０４】
これらの結果は、元々フミン酸を含む培地上で単離された微生物を、フミン酸を含まない培地上で成長させる効率が比較的高い（ほぼ９０％）ことを示す。この効率は、元々フミン酸を含まない培地上で単離された細菌を、その後にフミン酸を含まない培地上で成長させる効率とほぼ同じである。
【０１０５】
発明者らは、元々フミン酸を含む培地上で単離された細菌の一部（およそ１０％）が、フミン酸が除去されると、その後に非常にゆっくりと成長するように見えることを観察した。発明者らは、元々フミン酸を含む培地で単離された細菌コロニーが、フミン酸が除去されると成長しないように見えることも時折観察した。
【０１０６】
したがって、全般的に、発明者らは、フミン酸を微生物培地から除くことができ、元々フミン酸を含む培地上で単離された微生物はそれでも増殖することを観察する。
【０１０７】
実施例７．フミン酸を含む培地を使用して土壌から単離された細菌の増加した多様性
前記試験は、フミン酸が、環境試料由来の微生物がコロニーを形成し、試料から単離され得る効率を増加させることを表した。本明細書の実施例７及び８において、フミン酸が単離に使用されない場合の微生物の多様性に比較して、フミン酸が環境試料から単離された微生物の多様性を増加させたかどうかを決定するように設計された試験を説明する。
【０１０８】
これらの試験を実施するために、土壌試料Ｂ（実施例２に記載）を、実施例３に記載の通り、Ｒ２Ａプレートか０．５％フミン酸（重量／体積；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５３６８０番）を含むＲ２Ａプレートのいずれかの上で培養した後に、微生物のコロニーを得た。単離された各クローンの培養物を、ＧＥＮＥＷＩＺ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ）に送り、そこで１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子シークエンシングが実施された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｗｉｚ．ｃｏｍ／ｐｕｂｌｉｃ／１６Ｓ＿ｒＲＮＡ．ａｓｐｘ）。或いは、培養物を、１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンシング（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｄｉｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｄｎａ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のために、ＭＩＤＩ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗａｒｋ，Ｄｅｌａｗａｒｅ，ＵＳＡ）に送った。
【０１０９】
発明者らの分析（分析は以下に記載し、分析のデータは表９に示す）の目標は、フミン酸を含むＲ２Ａプレート上で単離された微生物由来の配列と同等な数のＲ２Ａプレート上で単離された微生物由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を分析して、単離された微生物の正体を決定することである。しかし、発明者らが微生物を１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンシングのために外部に送ったので、発明者らは、シークエンシングの質に依存して異なる数の許容できるリードを含む群でベンダーから配列データを受け取った。１６Ｓ  ｒＲＮＡからのリードが少なくとも１０００の連続したヌクレオチドを含む場合、配列を許容できると見なし、発明者らの分析に含めた。１群の配列をベンダーから受け取ると、発明者らは、群内の許容できる配列全てを発明者らの分析に含めた。したがって、発明者らの分析（表９）は、Ｒ２Ａプレートを使用して単離された微生物からの最初の４８の許容できる１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列及びフミン酸を含むＲ２Ａプレートを使用して単離された微生物からの最初の５５の許容できる１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含んでいた。
【０１１０】
発明者らの分析のために、単離された微生物からの許容できる１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列（すなわち「問い合わせ配列」）を使用して、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＮデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ）に、問い合わせ配列に最も同一である、データベース中に含まれる配列（本明細書では「検索された配列」と称する）を問い合わせた。検索された配列が、問い合わせ配列の長さの少なくとも９９％にわたって問い合わせ配列に対して少なくとも９６％の同一性を有する場合、問い合わせ配列を得た元の微生物を、最高の同一性が検索された配列が生じた元の微生物の分類上の属と対応づけた。発明者らの分析において、この規則の例外は、最高の同一性が検索された配列のデータベース記録が、検索された配列が培養不可能な微生物由来であることを示した場合、問い合わせ配列が得られた元の単離された微生物を特定の属のメンバーとしてではなく「培養不可能」と分類したことであった。
【０１１１】
さらに、発明者らの分析の一部として、問い合わせ配列が、問い合わせ配列の長さの少なくとも９９％にわたって問い合わせ配列に対して少なくとも９６％の同一性を有する検索された配列を返さなかった場合、問い合わせ配列が得られた元の微生物（すなわち、発明者らの単離された微生物の１つ）を、以前に未知であった微生物であると考えた。言い換えると、この場合、発明者らは、以前に誰も特定したことがない微生物を特定しただけでなく、フミン酸を含む培地を使用してこの微生物を首尾よく培養したと結論づけた。
【０１１２】
表９は、分析の結果を示す。これらのデータは、Ｒ２Ａプレートから単離された４８種の微生物及びフミン酸を含むＲ２Ａプレートから単離された５５種の微生物を含んでいる。
【０１１３】
【表９】
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【０１１４】
【表１０】
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【０１１５】
【表１１】
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【０１１６】
表９に示される通り、４８種の微生物をＲ２Ａプレートから単離し、分析に含めた。４８種の微生物の中に、１４種の異なる属が表された。この試験でＲ２Ａプレートから得た属の多様性の１指標は、追加の属が特定される前に単離しなければならない微生物の平均数の評価である。これは、単離された全微生物の数（すなわち４８）を、この試験で特定された属の総数（すなわち１４）で割ることにより決定できる。この試験から、３．４の微生物が、追加の属が特定される前に単離された。Ｒ２Ａプレートから単離された１４種の異なる属のうち７種は、Ｒ２Ａ＋ＨＡプレートから単離された５５種の微生物のうちに表されなかった。さらに、Ｒ２Ａプレートから単離された４８種の微生物のうち、培養不可能と分類された微生物はなく、以前未知であった微生物はなかった。
【０１１７】
やはり表９に示されている通り、５５種の微生物をＲ２Ａ＋ＨＡプレートから単離し、分析に含めた。５５種の微生物の中に、１８種の異なる属が表された。単離された全微生物の数（すなわち５５）を、この試験で特定された属の総数（すなわち１８）で割ることにより、追加の属が単離される前に３．１の微生物を単離したことが決定された。Ｒ２Ａ＋ＨＡプレートからは、Ｒ２プレート（すなわち３．４）より、属あたりにより少ない微生物（すなわち３．１）が単離されたので、フミン酸を含む培地から単離された微生物の多様性は、フミン酸を含まない培地から単離されたものより高いと評価される。さらに、Ｒ２Ａ＋ＨＡプレートから単離された１９種の異なる属のうち１１種は、Ｒ２Ａプレートから単離された４８種の微生物のうちに表されなかった。
【０１１８】
重要なことは、フミン酸を含む培地を使用して単離された５５種の微生物のうち、４種の微生物（４／５５≒７％）が、以前に培養不可能であると知られていたことである。本開示は、これら４種の生物が培養された最初の報告である。対照的に、培養不可能な生物は、この試験においてフミン酸の非存在下で単離されなかった（０／４８）。
【０１１９】
さらに、フミン酸を使用して単離された５５種の微生物のうち３種（５％超）は、以前に未知であった。本開示は、これらの微生物の存在の最初の報告である。対照的に、未知の微生物は、この試験においてフミン酸の非存在下で単離されなかった（０／４８）。
【０１２０】
データを別の見方で見ると、フミン酸を使用して単離された微生物のほぼ１３％（７／５５）は、培養されたことが以前に一度も報告されなかったか、以前に未知であった。フミン酸を使用しなかった場合に、培養不可能又は以前に未知であった生物は一つも単離されなかった（０／４８）。より多くの生物が群内で分析されるにつれ（フミン酸では５５に対してフミン酸なしでは４８）、珍しい事象（培養不可能且つ以前に未知であった生物）が検出される確率が高くなることに留意されたい。しかし、フミン酸群中の増加した数の生物（５５、対して、非フミン酸群では４８）は、この試験におけるフミン酸群（７）と非フミン酸群（０）との間の培養不可能／以前に未知の微生物の数の差を説明しない。
【０１２１】
全体として、これらの結果は、増殖培地中のフミン酸の含有が、フミン酸の非存在に比べて、単離された微生物の多様性を増加させるという結論を支持する。
【０１２２】
実施例８．培養不可能且つ未知の微生物
実施例７に記載の試験が完了した後、発明者らは、０．５％フミン酸を含むＲ２Ａプレートを使用して、追加の微生物を土壌試料Ｂから単離し続けた。７０種の追加の微生物分離株が、フミン酸を使用して得られた。１６Ｓ  ｒＲＮＡのヌクレオチド配列を、７０種の追加の微生物から得た。この実施例８では、発明者らは、１２５種の全微生物中に発見された培養不可能且つ以前に未知の微生物を報告する（実施例７に記載の５５種及び実施例８に記載の追加の７０種）。これらの試験を、既に記載の手順を利用して実施した。
【０１２３】
表１０は、これらの微生物に関する情報を含む。表の１列は、単離された微生物が培養不可能と決定されていたか、或いは以前に未知であったと決定されていたかを示す。これらの決定は、実施例７に記載の分析を利用して実施した。表１０の２列は、各微生物の数字による表示を示す。３列は、単離された微生物から得た１６  ｒＲＮＡ配列（すなわち、データベースへの問い合わせに使用された配列）に存在する連続するヌクレオチドの数を示す。４列は、単離された微生物から得られた１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に対する最高の同一性を有する検索された配列の受入れ番号である。５列は、検索された配列のデータベース記録から得られた、検索された配列が生じた元の微生物の全般的な説明を含む。
【０１２４】
【表１２】
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【０１２５】
【表１３】
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【０１２６】
表１０中のデータは、フミン酸を使用して土壌から単離された１２５種の生物のうち、８種の株（６％超）は培養されたことが一度も報告されておらず、３種の株（２％超）は以前に記載されたことが一度もない。したがって、フミン酸を使用して単離された１２５種の生物のおよそ９％が、以前に培養不可能であると考えられたか、或いは新たなものである。
【０１２７】
さらに、少なくとも２８種の既知の属の細菌が、１２５種の生物の中にあった。これらの属には下記がある：アクチノタレア（Ａｃｔｉｎｏｔａｌｅａ）、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、アクアバクテリウム（Ａｑｕａｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カエニモナス（Ｃａｅｎｉｍｏｎａｓ）、ダーマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、レイフィソニア（Ｌｅｉｆｉｓｏｎｉａ）、リシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、マルモリコラ（Ｍａｒｍｏｒｉｃｏｌａ）、マッシリア（Ｍａｓｓｉｌｉａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ムチラギニバクター（Ｍｕｃｉｌａｇｉｎｉｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィチコッカス（Ｐｈｙｃｉｃｏｃｃｕｓ）、ラムリバクター（Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ）、リゾバクター（Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒ）、ルガモナス（Ｒｕｇａｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、テラバクター（Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ）、テトラスファエラ（Ｔｅｔｒａｓｐｈａｅｒａ）、チューメバチルス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びバリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）。
【０１２８】
実施例９．フミン酸の分別及び活性
フミン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５３６８０番の７ｇ）を、１５０ｍｌの０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムと混合し、水酸化アンモニウムを使用してｐＨを９に調整した。約１０５ｍｌの混合物を分離用遠心分離機中で７，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を、５，０００分子量カットオフフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）ＵＦ  ２０  ｍｌ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ，５，０００  ＭＷＣＯ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ）により５，０００ｘｇで２０℃で３０分間遠心分離した。フロースルーを、さらに３回フィルターに通して遠心分離した。フィルター上に残った物質を、緩衝液に懸濁させ、１０％酢酸を使用してｐＨを７に調整した。物質を凍結乾燥させた。その後に、土壌試料からの微生物の播種の効率増加をもたらしたフミン酸の活性が、５，０００分子量カットオフフィルター上に残されたこの試料中に存在することを示した。発明者らは、土壌試料からの微生物の播種の効率を増加させるフミン酸中の活性の大部分が、５，０００の分子量又はそれ以上であることを結論する。
【０１２９】
例の組成物、方法などが記載により説明されており、記載が相当詳細にされているが、本願の範囲を制限又はどのようにも限定することは出願人らの意図でない。もちろん、本明細書に記載される組成物、方法などを記載する目的で、成分又は方法論の考えられる全ての組み合わせを記載するのは可能でない。追加の利点及び改変は、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、示され記載される具体的な詳細及び実例に限定されない。このように、本願は、本願の範囲内にある変更、改変、及び変形物を包含するものとする。さらに、前述の記載は本発明の範囲を限定しないものとする。
【０１３０】
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」又は「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」が詳細な説明又は特許請求の範囲で利用される限り、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が請求項中の移行部として使用される場合に解釈される通り、それに類似して包括的であるものとする。さらに、用語「又は」が詳細な説明又は特許請求の範囲中で利用される限り（例えば、Ａ又はＢ）、それは、「Ａ若しくはＢ又は両方」を意味するものとする。出願者らが「Ａ又はＢのみで両方ではない」を示すことを意図する場合、用語「Ａ又はＢのみで両方ではない」を利用することになる。そのため、本明細書での用語「又は」の使用は、包括的であり、排除的な使用ではない。Ｂｒｙａｎ  Ａ．Ｇａｒｎｅｒ，Ａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｅｇａｌ  Ｕｓａｇｅ  ６２４（２ｄ．Ｅｄ．１９９５）を参照されたい。また、用語「中の（ｉｎ）」又は「中に（ｉｎｔｏ）」が本明細書又は特許請求の範囲中で使用される限り、さらに「上で（ｏｎ）」又は「上に（ｏｎｔｏ）」を意味するものとする。さらに、用語「接続する（ｃｏｎｎｅｃｔ）」が本明細書又は特許請求の範囲中で使用される限り、「直接接続する」だけでなく、別な要素又は複数の要素を介して接続するなど「間接的に接続する」も意味するものとする。
【０１３１】
本発明の例の実施形態
１．フミン酸、その塩、そのアナログ、又はピートを含む培地を使用して、培養不可能な微生物又は未知の微生物を環境試料から単離すること
を含む、基本的にそれからなる、又はそれからなる方法。
【０１３２】
２．培養不可能な微生物又は未知の微生物が、単離された後、フミン酸、その塩、そのアナログ、又はピートを含まない培地を使用して培養されることが可能である、実施形態１に記載の方法。
【０１３３】
３．単離工程の後に
培養不可能な微生物又は未知の微生物を、フミン酸、その塩、そのアナログ、又はピートを含まない培地を使用して培養することを含む、実施形態１及び２のいずれか１つに記載の方法。
【０１３４】
４．単離工程に使用される培地がフミン酸を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【０１３５】
５．単離工程に使用される培地中のフミン酸の濃度が、０％（重量／体積）より高く、約５％（重量／体積）未満である、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【０１３６】
６．フミン酸がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５３６８０番を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０１３７】
７．単離工程に使用される培地がフミン酸の塩を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【０１３８】
８．単離工程に使用される培地中のフミン酸の塩の濃度が、０％（重量／体積）より高く、約０．２５％（重量／体積）未満である、実施形態１〜３及び７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３９】
９．フミン酸の塩がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｈ１６７５２番を含む、実施形態１〜３、７、及び８のいずれか１つに記載の方法。
【０１４０】
１０．単離工程に使用される培地がゲル化剤を含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【０１４１】
１１．ゲル化剤が寒天を含む、実施形態１０に記載の方法。
【０１４２】
１２．単離が、約３０℃で周囲雰囲気中での約２〜３日のインキュベーション後の、寒天を含む培地上での培養不可能な微生物又は未知の微生物のコロニーの形成を含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【０１４３】
１３．環境試料が土壌又は水を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０１４４】
１４．単離工程に使用される培地が、ＩＳＰ２、イェンセン、ＬＢ、ＮＡ、Ｒ２Ａ、又はＴＳＡを含む、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【０１４５】
１５．単離工程の前に
環境試料から培養される微生物の効率又は多様性が、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む培地を使用することにより増加され得ることを認識しながら、微生物を単離するための培地を選択することを含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０１４６】
１６．培養不可能な微生物又は未知の微生物が放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目の微生物を除外する、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【０１４７】
１７．培養不可能な微生物又は未知の微生物が、アシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）門及びウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門の微生物を除外する、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【０１４８】
１８．アシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）が亜門１に属し、ウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）が亜門４に属する、実施形態１７に記載の方法。
【０１４９】
１９．培養不可能な微生物及び未知の微生物が原核生物である、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５０】
２０．培養不可能な微生物及び未知の微生物が細菌又は古細菌である、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【０１５１】
２１．フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む培地の上又はその中で、環境試料から細菌を培養すること；及び
その後に、細菌を、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地の上又はその中で培養すること
を含む、基本的にそれらからなる、又はそれらからなる方法。
【０１５２】
２２．フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む培地の上又はその中での環境試料からの培養が、事前の濃縮手順又はフミン酸、その塩、若しくはそのアナログを含まない培地の上若しくはその中での事前の培養が無い状態で起こる、実施形態２１に記載の方法。
【０１５３】
２３．細菌が培養不可能又は未知の細菌である、実施形態２１及び２２のいずれか１つに記載の方法。
【０１５４】
２４．環境試料から細菌を単離する方法であって、
環境試料の一部を、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含むゲル化剤を含む培地上に、細菌コロニーが培地上に形成するように播種すること
を含み、基本的にそれからなり、又はそれからなり、
細菌コロニーが、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目及びアシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）門又はウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門を除外する方法。
【０１５５】
２５．コロニーから得た細菌が培養不可能な細菌又は未知の細菌である、実施形態２４に記載の方法。
【０１５６】
２６．コロニーから得た細菌が、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地上で培養されることが可能である、実施形態２４及び２５のいずれか１つに記載の方法。
【０１５７】
２７．播種工程の後に
コロニーから得た細菌を、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地を使用して培養することを含む、実施形態２４〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【０１５８】
２８．播種工程の前に、培養不可能な細菌又は未知の細菌を単離する確率が、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む培地を使用することにより増加し得ることを認識することを含む、実施形態２４〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【０１５９】
２９．コロニーから得た細菌から、１６Ｓ  ｒＲＮＡの少なくとも部分的な配列を得ることを含む、実施形態２４〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６０】
３０．細菌コロニーから得た細菌が、アクチノタレア（Ａｃｔｉｎｏｔａｌｅａ）、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、アクアバクテリウム（Ａｑｕａｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カエニモナス（Ｃａｅｎｉｍｏｎａｓ）、ダーマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、レイフィソニア（Ｌｅｉｆｉｓｏｎｉａ）、リシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、マルモリコラ（Ｍａｒｍｏｒｉｃｏｌａ）、マッシリア（Ｍａｓｓｉｌｉａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ムチラギニバクター（Ｍｕｃｉｌａｇｉｎｉｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィチコッカス（Ｐｈｙｃｉｃｏｃｃｕｓ）、ラムリバクター（Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ）、リゾバクター（Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒ）、ルガモナス（Ｒｕｇａｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、テラバクター（Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ）、テトラスファエラ（Ｔｅｔｒａｓｐｈａｅｒａ）、チューメバチルス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びバリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属のメンバーである、実施形態２４〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０１６１】
３１．環境試料から細菌を培養する方法であって、
環境試料又はその希釈物を、細菌コロニーが培地上に形成するように、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む寒天含有培地上に播種することであって、環境試料中の細菌が、事前の濃縮又は事前の成長を受けなかった状態で播種すること；及び
細菌コロニーの１つ以上を、細菌コロニーが、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地の上又はその中で成長するように、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地に移すこと
を含む、基本的にそれらからなる、又はそれらからなる方法。
【０１６２】
３２．細菌コロニーの１つから１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の少なくとも一部分を得ること；及び
少なくとも部分的に１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に基づいて、細菌コロニーの分類群を決定することを含む、実施形態３０に記載の方法。
【０１６３】
３３．分類群を決定できないことが、細菌が培養不可能であるか、又は以前に未知であったことを示す、実施形態３２に記載の方法。
【０１６４】
３４．細菌コロニーが放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目のものでなく、アシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）門又はウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門のものでない、実施形態３１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０１６５】
３５．播種工程の前に、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む培地が、環境試料からの細菌の培養を促進し得ることを認識する、実施形態３１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【０１６６】
３６．土壌環境試料から細菌を単離する方法であって、
フミン酸、その塩、又はそのアナログの細菌培地への添加が、土壌環境試料から単離された細菌の効率及び／又は多様性を増加させ得ることを認識すること；
土壌環境試料の一部分から、細菌コロニーが細菌培地上で形成するように、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む寒天含有細菌培地上で細菌を培養すること；及び
その後に、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地の上又はその中で、細菌コロニーから細菌を培養すること
を含む、基本的にそれらからなる、又はそれらからなる方法。
【０１６７】
３７．細菌コロニーの１つから１６Ｓ  ｒＲＮＡの少なくとも部分的なヌクレオチド配列を得ること；及び
少なくとも部分的に１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に基づいて、細菌コロニーの１つから得た細菌が以前に未知であったか、又は培養不可能であることを決定することを含む、実施形態３６に記載の方法。
【０１６８】
３８．単離された細菌が放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目のものでない、実施形態３６及び３７のいずれか１つに記載の方法。
【０１６９】
３９．単離された細菌が、アシドバクテリウム（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）門又はウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門のものでない、実施形態３６〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１７０】
４０．フミン酸がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ５３６８０番を含み、フミン酸の塩がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｈ１６７５２番を含む、実施形態３６〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【０１７１】
４１．実施形態１〜４０のいずれか１つに記載の方法により単離された微生物又は細菌。
【０１７２】
４２．微生物の成長を支持することが可能である培地を含むペトリ皿であって、培地が、フミン酸、その塩、又はそのアナログ、及びゲル化剤を含み、培地上に形成した培養不可能又は未知の微生物のコロニーを含むペトリ皿。
【図１】
2019509757.tif 000016
【図２Ａ】
2019509757.tif 000017
【図２Ｂ】
2019509757.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月10日(2018.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フミン酸、その塩、そのアナログ、又はピートを含む培地を使用して、培養不可能な微生物又は未知の微生物を環境試料から単離することを含む方法。
【請求項２】
前記単離工程の後に前記培養不可能な微生物又は前記未知の微生物を、フミン酸、その塩、そのアナログ、又はピートを含まない培地を使用して培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離工程に使用される前記培地中の前記フミン酸の濃度が、０％（重量／体積）より高く、約５％（重量／体積）未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記単離工程に使用される前記培地が前記フミン酸の塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記単離工程に使用される前記培地がゲル化剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
単離が、約３０℃で周囲雰囲気中での約２〜３日のインキュベーション後に、寒天を含む前記培地上での前記培養不可能な微生物又は未知の微生物のコロニーの形成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記環境試料が土壌又は水を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培養不可能な微生物及び前記未知の微生物が原核生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む培地の上又はその中で、環境試料から細菌を培養すること；及び
その後に、前記細菌を、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地の上又はその中で培養すること
を含む、方法。
【請求項１０】
前記環境試料からの、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む前記培地の上又はその中での前記培養が、事前の濃縮手順又はフミン酸、その塩、若しくはそのアナログを含まない培地の上若しくはその中での事前の培養が無い状態で起こる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌が培養不可能又は未知の細菌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
環境試料から細菌を培養する方法であって、
前記環境試料又はその希釈物を、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含む寒天含有培地上に、細菌コロニーが前記培地上に形成するように播種することであって、前記環境試料中の前記細菌が、事前の濃縮又は事前の成長を受けなかった状態で播種すること；及び
前記細菌コロニーの１つ以上を、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない培地に、前記細菌コロニーが、フミン酸、その塩、又はそのアナログを含まない前記培地の上又はその中で成長するように移すこと
を含む、方法。
【請求項１３】
前記細菌コロニーの１つから１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の少なくとも一部分を得ること；及び
少なくとも部分的に前記１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に基づいて、前記細菌コロニーの分類群を決定することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
分類群を決定できないことが、前記細菌が培養不可能であるか、又は以前に未知であったことを示す、請求項１３に記載の方法。
【国際調査報告】
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