(57)【要約】外因性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および自己切断ペプチドコーディング配列を含む、組換えアデノウイルスゲノムが、記載される。ウイルス動態への影響を最小限にするために最適な外因性遺伝子の配置が、さらに開示される。組換えアデノウイルスの治療的適用もまた、記載される。異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および自己切断ペプチドコーディング配列を含む、組換えアデノウイルスゲノムが、本明細書において開示される。
2019509037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および自己切断ペプチドコーディング配列を、いずれも内因性アデノウイルスＯＲＦと同じリーディングフレーム内に、それと作動可能に連結した状態で含む、組換えアデノウイルスゲノムであって、前記自己切断ペプチドコーディング配列が、前記異種ＯＲＦと前記内因性ＯＲＦとの間に位置し、かつ
前記内因性ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋであり、前記異種ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋの３’にあるか、
前記内因性ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼであり、前記異種ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼの５’にあるか、
前記内因性ＯＲＦが、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）であり、前記異種ＯＲＦが、ＤＢＰの３’にあるか、
前記内因性ＯＲＦが、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）であり、前記異種ＯＲＦが、ＡＤＰの５’にあるか、
前記内因性ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋであり、前記異種ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋの３’にあるか、
前記内因性ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２であり、前記異種ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２の５’にあるか、または
前記内因性ＯＲＦが、ファイバーであり、前記異種ＯＲＦが、ファイバーの３’にあり、
前記異種ＯＲＦが、治療用タンパク質をコードする、組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項２】
前記治療用タンパク質が、免疫調節因子を含む、請求項１に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項３】
前記自己切断ペプチドが、２Ａペプチドまたはそのバリアントである、請求項１または請求項２に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項４】
前記２Ａペプチドが、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）ペプチド、またはThosea asignaウイルス（ＴａＶ）２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチド、またはそれらのバリアントを含む、請求項３に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項５】
前記自己切断ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１４〜２１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である、請求項４に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項６】
前記自己切断ペプチドが、配列番号１４〜２１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノムと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含む、組換えアデノウイルス。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えアデノウイルスと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項１０】
治療用タンパク質を被験体に送達する方法であって、前記被験体に、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム、請求項８に記載の組換えアデノウイルス、または請求項７もしくは請求項９に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１１】
腫瘍細胞の生存度および／または腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞を、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム、請求項８に記載の組換えアデノウイルス、または請求項７もしくは請求項９に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法であり、前記腫瘍細胞を接触させることが、前記組換えアデノウイルスゲノム、組換えアデノウイルス、または組成物を、腫瘍を有する被験体に投与することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
被験体における腫瘍の進行を阻害するかまたは腫瘍の体積を低減させる方法であって、前記被験体に、治療有効量の、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム、請求項８に記載の組換えアデノウイルス、または請求項７もしくは請求項９に記載の組成物を投与し、それによって、前記被験体における腫瘍の進行を阻害するか、または腫瘍の体積を低減させることを含む、方法。
【請求項１５】
被験体におけるがんを処置する方法であって、前記被験体に、治療有効量の、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム、請求項８に記載の組換えアデノウイルス、または請求項７もしくは請求項９に記載の組成物を投与し、それによって、前記被験体におけるがんを処置することを含む、方法。
【請求項１６】
前記被験体に、追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム、請求項８に記載の組換えアデノウイルス、または請求項７もしくは請求項９に記載の組成物と、
（ｉｉ）１つもしくは複数の追加の治療剤および／または１つもしくは複数の診断剤と
を含む、キット。
【請求項１８】
前記１つまたは複数の追加の治療剤が、化学療法薬、生物製剤、またはそれらの組合せを含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記１つまたは複数の診断剤が、腫瘍マーカーに特異的な１つまたは複数の抗体を含む、請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の診断剤が、腫瘍マーカーに特異的な１つまたは複数の核酸分子を含む、請求項１７または１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年２月２３日に出願された米国仮出願第６２／２９８，６５３号（その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、組換えアデノウイルス構築物における外因性オープンリーディングフレームの最適な配置、および組換えウイルスの治療的適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）は、基礎研究適用、マウス肺がんモデル、およびヒト遺伝子療法の治験において最適なベクターである。アデノウイルスは、感染を特定の細胞型上の受容体に標的化するＡｄファイバータンパク質突起（ｓｐｉｋｅ）で覆われたタンパク質キャプシドによって保護された安定な３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。アデノウイルスは、宿主ＤＮＡに組み入れられず、確立されたプロトコールを使用して高い力価で産生させることができ、ヒト遺伝子療法およびがんでの適用における安全性が証明されている。したがって、Ａｄに基づくベクターは、がんの診断および治療法において非常に有望である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および自己切断ペプチドコーディング配列を含む、組換えアデノウイルスゲノムが、本明細書において開示される。異種ＯＲＦは、例えば、治療用タンパク質をコードし得る。組換えアデノウイルスゲノムおよび開示されるゲノムによって産生される組換えアデノウイルスは、例えば、がんの処置のためなど、治療的適用において使用することができる。
【０００５】
異種ＯＲＦおよび自己切断ペプチドコーディング配列を、いずれも内因性アデノウイルスＯＲＦと同じリーディングフレーム内に、それと作動可能に連結した状態で含む、組換えアデノウイルスゲノムが、本明細書において提供される。自己切断ペプチドコーディング配列は、異種ＯＲＦと内因性ＯＲＦとの間に位置する。一部の実施形態では、内因性ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋであり、異種ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋの３’にあるか、内因性ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼであり、異種ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼの５’にあるか、内因性ＯＲＦが、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）であり、異種ＯＲＦが、ＤＢＰの３’にあるか、内因性ＯＲＦが、アデノウイルス死タンパク質（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＤＰ）であり、異種ＯＲＦが、ＡＤＰの５’にあるか、内因性ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋであり、異種ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋの３’にあるか、内因性ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２であり、異種ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２の５’にあるか、または内因性ＯＲＦが、ファイバーであり、異種ＯＲＦが、ファイバーの３’にある。一部の実施例では、異種ＯＲＦは、治療用タンパク質をコードする。
【０００６】
本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノムを含む、組換えアデノウイルスが、本明細書においてさらに提供される。本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノムまたは組換えアデノウイルスと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物もまた、提供される。
【０００７】
本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノムまたは組換えアデノウイルス（またはその組成物）を被験体に投与することによって、被験体に治療用タンパク質を送達する方法もまた、提供される。これらの方法において、組換えアデノウイルスゲノムまたは組換えアデノウイルスの異種ＯＲＦは、治療用タンパク質をコードする。
【０００８】
本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノムまたは組換えアデノウイルス（またはその組成物）を投与することによって、腫瘍細胞の生存度を阻害する方法、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法、腫瘍の進行を阻害する方法、腫瘍の体積を低減させる方法、およびがんを有する被験体を処置する方法が、さらに提供される。これらの方法において、組換えアデノウイルスゲノムまたは組換えアデノウイルスの異種ＯＲＦは、がんの処置に好適な治療用タンパク質をコードする。
【０００９】
本開示の上述およびその他の目的および特性は、以下の詳細な説明、続いて添付の図面への参照により、さらに明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、アデノウイルス構築物を試験するための例示的な作業フローの概略図である。全ウイルスゲノムプラスミドを産生し、マルチウェルプレートにおいて、好適な細胞、例えば、２９３−Ｅ４細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞が増えると、それらを、凍結／解凍に供して、ウイルス粒子を放出させ、続いて、遠心分離によって細胞残屑をペレットにする。上清（ウイルス粒子を含有する）を、複数のより大きな培養プレートに移す。ウイルス粒子を、トランスフェクトした細胞から採取し、ＣｓＣｌ精製し、感染ウイルス力価を、ＥＬＩＳＡによって測定する。次いで、目的の細胞型に、精製したウイルスを公知のＭＯＩで感染させる。感染の４８時間後または７２時間後に、アデノウイルス後期タンパク質、アデノウイルスゲノム、またはプラークを、それぞれ、ウエスタンブロット、ｑ−ＰＣＲ、またはプラークアッセイによって測定する。
【００１１】
【図２】図２は、指数関数的ウイルス増殖を示す概略図である。腫瘍内のすべての細胞の腫瘍溶解性殺滅には、指数関数的ウイルス増殖が必要である。しかしながら、ほとんどの事例において、腫瘍細胞のうち、初回に感染されるものはわずかな割合のみである。したがって、１回の複製当たりの子孫の数のわずかな違いが、たった数回の複製後でも粒子の総数に大きな違いをもたらす。１サイクル当たり３ビリオンを産生するウイルスと、１サイクル当たり５ビリオンを産生するウイルスとの間の比較を示す。グラフに示されているように、５〜６回の複製後に、これら２つのウイルスのウイルス力価は、有意に異なる。
【００１２】
【図３】図３は、蛍光に基づくウイルス動態（ＦＢＶＫ）アッセイの例示的な作業フローを示す概略図である。全ウイルスゲノムプラスミドを産生し（例えば、ＡｄｓｅｍｂｌｙまたはＡｄＳＬＩＣによって）、これを、マルチウェルプレートにおいて目的の細胞型にトランスフェクトするために使用する。あるいは、細胞に、組換えアデノウイルス粒子を感染させる。アデノウイルスゲノムは、ウイルス複製動態を実質的に変化させないウイルスゲノム内の位置に、蛍光タンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。蛍光を経時的にモニタリングして、ウイルス複製動態を計算する。腫瘍溶解性ウイルスの候補は、腫瘍細胞と正常細胞との間でウイルス動態に最も大きな差を呈するものである。
【００１３】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂは、アデノウイルスゲノムプラスミドを用いて開始した場合の動態アッセイ環境を概説する。このアッセイは、初回トランスフェクション効率の正確な把握を必要としない。トランスフェクション条件は、細胞のうちのおよそ５〜１０％が、初回にトランスフェクトされるように選択される。示されている実施例では、４８ウェルプレートを使用しており、これにより、３つの模擬感染ウェルおよびツール感度変動を補償するためのＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズを有する３つのウェルとともに、１４種類の異なるウイルス構築物を３連で試験することが可能となる。（図４Ａ）４８ウェルプレートの上半分のウェルは、６種類の異なるウイルスのゲノムプラスミドをトランスフェクトした細胞、模擬感染細胞、およびブランク（ＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズ）を、それぞれ３連で含有する。（図４Ｂ）４８ウェルプレートの下半分のウェルは、８種類の異なるウイルスのゲノムプラスミドをトランスフェクトした細胞を、３連で含有する。マルチウェルプレートは、継続的な蛍光モニタリングのために、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮプレートリーダーなど）に設置する。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂは、アデノウイルスゲノムプラスミドを用いて開始した場合の動態アッセイ環境を概説する。このアッセイは、初回トランスフェクション効率の正確な把握を必要としない。トランスフェクション条件は、細胞のうちのおよそ５〜１０％が、初回にトランスフェクトされるように選択される。示されている実施例では、４８ウェルプレートを使用しており、これにより、３つの模擬感染ウェルおよびツール感度変動を補償するためのＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズを有する３つのウェルとともに、１４種類の異なるウイルス構築物を３連で試験することが可能となる。（図４Ａ）４８ウェルプレートの上半分のウェルは、６種類の異なるウイルスのゲノムプラスミドをトランスフェクトした細胞、模擬感染細胞、およびブランク（ＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズ）を、それぞれ３連で含有する。（図４Ｂ）４８ウェルプレートの下半分のウェルは、８種類の異なるウイルスのゲノムプラスミドをトランスフェクトした細胞を、３連で含有する。マルチウェルプレートは、継続的な蛍光モニタリングのために、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮプレートリーダーなど）に設置する。
【００１４】
【図５】図５は、組換えウイルスを用いて開始した場合の動態アッセイ環境を概説する。このアッセイは、ウイルス力価の正確な把握を必要としない。組換えウイルスを連続希釈し、これを使用して、マルチウェルプレートに播種した細胞に感染させる。示されている実施例では、９６ウェルプレートを使用しており、各ウイルスを１：１００、１：３００、１：９００、１：２７００、１：８１００、１：２４，３００、１：７２，９００、および１：２１８，７００に希釈し、１１種類のウイルスを同時に試験することが可能である。４つのウェルは模擬感染であり、ツールの感度および変動を補償するために、ＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズを４つのウェルに入れる。マルチウェルプレートは、継続的な蛍光モニタリングのために、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮプレートリーダーなど）に設置する。
【００１５】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、組換えアデノウイルスのコンビナトリアルアセンブリのためのＡｄｓｅｍｂｌｙ技法およびＡｄＳＬＩＣ技法の概略図を示す。（図６Ａ）アデノウイルスゲノムを、４つのモジュール−Ｅ１、コア、Ｅ３、およびＥ４に分ける。（図６Ｂ）Ａｄｓｅｍｂｌｙは、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ反応を使用したゲノムの再アセンブリを伴う。（図６Ｃ）ＡｄＳＬＩＣは、配列およびライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）を利用して、アデノウイルスモジュールをアセンブリする。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、組換えアデノウイルスのコンビナトリアルアセンブリのためのＡｄｓｅｍｂｌｙ技法およびＡｄＳＬＩＣ技法の概略図を示す。（図６Ａ）アデノウイルスゲノムを、４つのモジュール−Ｅ１、コア、Ｅ３、およびＥ４に分ける。（図６Ｂ）Ａｄｓｅｍｂｌｙは、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ反応を使用したゲノムの再アセンブリを伴う。（図６Ｃ）ＡｄＳＬＩＣは、配列およびライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）を利用して、アデノウイルスモジュールをアセンブリする。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、組換えアデノウイルスのコンビナトリアルアセンブリのためのＡｄｓｅｍｂｌｙ技法およびＡｄＳＬＩＣ技法の概略図を示す。（図６Ａ）アデノウイルスゲノムを、４つのモジュール−Ｅ１、コア、Ｅ３、およびＥ４に分ける。（図６Ｂ）Ａｄｓｅｍｂｌｙは、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ反応を使用したゲノムの再アセンブリを伴う。（図６Ｃ）ＡｄＳＬＩＣは、配列およびライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）を利用して、アデノウイルスモジュールをアセンブリする。
【００１６】
【図７】図７は、Ｅ１領域における蛍光タンパク質をコードする組換えアデノウイルスの自然対数スロープ（ｌｎ−ｓｌｏｐｅ）を示す、棒グラフである。直接的な融合による構築物ＹＰｅｔ−Ｅ１Ａ、ならびにそれぞれＰ２Ａ部位を含有するＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ１Ａ、Ｅ１Ａ−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ、およびＥ１Ｂ−５５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ構築物の値を示す。ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ構築物は、比較のために示される。
【００１７】
【図８】図８は、蛍光に基づくウイルス動態アッセイの動態データの分析および解釈の概略図である。
【００１８】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、Ａｄ５、Ａｄ９、またはＡｄ３４に由来し、Ｅ３−１４．７ｋ（またはＡｄ９およびＡｄ３４におけるその同等物）ＯＲＦの３’に異種ＯＲＦを含有する、組換えアデノウイルスの自然対数スロープ値を示す、棒グラフである。２９３細胞（図９Ａ）、Ａ５４９細胞（図９Ｂ）、およびＵ２ＯＳ細胞（図９Ｃ）におけるＡｄ５（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８７）、Ａｄ９（Ｅ３−１５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８８）、およびＡｄ３４（Ｅ３−１４．８ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８９）の値を示す。Ａｄ５コア（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔを含む）、ならびにＡｄ９（Ａｄ５／Ａｄ９）またはＡｄ３４（Ａｄ５／Ａｄ３４）のいずれかに由来するファイバーシャフト／ノブを含む、キメラウイルスの値もまた、それぞれの図に示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｃは、Ａｄ５、Ａｄ９、またはＡｄ３４に由来し、Ｅ３−１４．７ｋ（またはＡｄ９およびＡｄ３４におけるその同等物）ＯＲＦの３’に異種ＯＲＦを含有する、組換えアデノウイルスの自然対数スロープ値を示す、棒グラフである。２９３細胞（図９Ａ）、Ａ５４９細胞（図９Ｂ）、およびＵ２ＯＳ細胞（図９Ｃ）におけるＡｄ５（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８７）、Ａｄ９（Ｅ３−１５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８８）、およびＡｄ３４（Ｅ３−１４．８ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８９）の値を示す。Ａｄ５コア（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔを含む）、ならびにＡｄ９（Ａｄ５／Ａｄ９）またはＡｄ３４（Ａｄ５／Ａｄ３４）のいずれかに由来するファイバーシャフト／ノブを含む、キメラウイルスの値もまた、それぞれの図に示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、Ａｄ５、Ａｄ９、またはＡｄ３４に由来し、Ｅ３−１４．７ｋ（またはＡｄ９およびＡｄ３４におけるその同等物）ＯＲＦの３’に異種ＯＲＦを含有する、組換えアデノウイルスの自然対数スロープ値を示す、棒グラフである。２９３細胞（図９Ａ）、Ａ５４９細胞（図９Ｂ）、およびＵ２ＯＳ細胞（図９Ｃ）におけるＡｄ５（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８７）、Ａｄ９（Ｅ３−１５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８８）、およびＡｄ３４（Ｅ３−１４．８ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＰＣＭＮ−８８９）の値を示す。Ａｄ５コア（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔを含む）、ならびにＡｄ９（Ａｄ５／Ａｄ９）またはＡｄ３４（Ａｄ５／Ａｄ３４）のいずれかに由来するファイバーシャフト／ノブを含む、キメラウイルスの値もまた、それぞれの図に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（配列表）
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基の標準的な略字およびアミノ酸の３文字コードを使用して示されている。それぞれの核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、提示された鎖に対する任意の参照により含まれると理解される。配列表は、２０１７年２月２１日に作成された７０３ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出されており、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表においては、以下の通りである。
配列番号１は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−３７９（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ１Ａ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４３２（Ｅ１Ａ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。
配列番号３は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４５６（Ｅ１Ｂ−５５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。
配列番号４は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４９９（Ｅ１Ｂ−５５ｋ−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ）のヌクレオチド配列である。
配列番号５は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−５３０（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−（ＤＮＡポリ））のヌクレオチド配列である。
配列番号６は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−８８６（ＤＢＰ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。
配列番号７は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４０３（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ）のヌクレオチド配列である。
配列番号８は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４２９（ＡＤＰ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。
配列番号９は、合成アデノウイルスゲノムＰＣＭＮ−８８７（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４５７（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２）のヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−６３３（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２）のヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４０７（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ファイバー）のヌクレオチド配列である。
配列番号１３は、合成アデノウイルスゲノムＣＭＢＴ−４４５（ファイバー−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、Ｐ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、Ｆ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号１６は、Ｅ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号１７は、Ｔ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号１８は、Ｎ末端にＧＳＧを含む修飾されたＰ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号１９は、Ｎ末端にＧＳＧを含む修飾されたＦ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号２０は、Ｎ末端にＧＳＧを含む修飾されたＥ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号２１は、Ｎ末端にＧＳＧを含む修飾されたＴ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号２２は、合成アデノウイルスゲノムＰＣＭＮ−８８８（Ａｄ９  Ｅ３−１５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、合成アデノウイルスゲノムＰＣＭＮ−８８９（Ａｄ３４  Ｅ３−１４．８ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）のヌクレオチド配列である。
【００２０】
Ｉ．略語
Ａｄ  アデノウイルス
ＡＤＰ  アデノウイルス死タンパク質
ＢＦＰ  青色蛍光タンパク質
Ｅ２Ａ  ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａ
ＥＬＩＳＡ  酵素結合免疫吸着法
ＥＲＡＶ  ウマ鼻炎Ａウイルス
Ｆ２Ａ  口蹄疫ウイルス２Ａ
ＦＡＣＳ  蛍光活性化細胞分取
ＦＭＤＶ  口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）
ＧＦＰ  緑色蛍光タンパク質
ＭＯＩ  感染多重度
ＯＤ  光学密度
ＯＲＦ  オープンリーディングフレーム
Ｐ２Ａ  ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ
ｐＩＸ  タンパク質ＩＸ
ＰＴＶ１  ブタテッショウウイルス−１
ＲＦＰ  赤色蛍光タンパク質
ＳＬＩＣ  配列およびライゲーション非依存性クローニング
Ｔ２Ａ  Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ
ＴａＶ  Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス
ＹＦＰ  黄色蛍光タンパク質
【００２１】
ＩＩ．用語および方法
別途注記されない限り、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓによって１９９４年に刊行されたＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．によって１９９４年に刊行されたＫｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．によって１９９５年に刊行されたＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
【００２２】
本開示の様々な実施形態の考察を容易にするために、特定の用語の説明を、以下に提供する。
【００２３】
２Ａペプチド：一部のＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルスによってコードされる自己切断ペプチドの一種である。２Ａペプチドは、リボソームが２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップするようにし、２Ａ配列の末端と下流のペプチドとの分離をもたらすことによって機能する（Ｋｉｍら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６巻（４号）、ｅ１８５５６、２０１１年）。「切断」は、２ＡペプチドのＣ末端に見出されるグリシン残基とプロリン残基との間に生じる。例示的な２Ａペプチドとしては、本明細書において配列番号１４〜１７として記載されている、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）、および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）によってコードされる２Ａペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、２Ａペプチドは、切断効率を改善するために、Ｎ末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙを含む（配列番号１８〜２１）。
【００２４】
アデノウイルス：線形二本鎖ＤＮＡゲノムおよび正二十面体キャプシドを有する、非エンベロープ型ウイルスである。現在、ヒトアデノウイルスには、６８種類の血清型が公知であり、７つの種（種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）に分類される。異なる血清型のアデノウイルスは、異なる種類の疾患と関連付けられており、一部の血清型は、呼吸器疾患（主として種ＢおよびＣ）、結膜炎（種ＢおよびＤ）、ならびに／または胃腸炎（種ＦおよびＧ）を引き起こす。
【００２５】
アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）：他の細胞に感染するために細胞の溶解およびアデノウイルスの放出を媒介する、アデノウイルス感染の後期に合成されるタンパク質である。ＡＤＰは、核膜、小胞体、およびゴルジ体に局在化する、１０１個のアミノ酸の内在性膜糖タンパク質である。ＡＤＰは、以前、Ｅ３−１１．６Ｋと称されていた）。
【００２６】
投与：被験体に、治療剤（例えば、組換えウイルス）などの薬剤を、任意の有効な経路によって提供することまたは与えることである。例示的な投与経路としては、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、および静脈内など）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻内、膣、および吸入の経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
キメラ：起源が異なる少なくとも２つの部分から構成されるものである。本開示の文脈において、「キメラアデノウイルス」とは、少なくとも２つの異なる血清型に由来する（例えば、Ａｄ５および第２の血清型のアデノウイルスに由来する）遺伝物質および／またはタンパク質を有するアデノウイルスである。この文脈において、「キャプシド交換型」アデノウイルスとは、キャプシドタンパク質が、１つの血清型のアデノウイルスに由来し、残りのタンパク質が、別のアデノウイルス血清型に由来する、キメラアデノウイルスを指す。同様に、「キメラファイバー」とは、少なくとも２つの異なる血清型のアデノウイルスに由来するアミノ酸配列を有するファイバータンパク質である。例えば、キメラファイバーは、Ａｄ５由来のファイバーシャフトおよび第２の血清型のアデノウイルスに由来するファイバーノブから構成され得る。別の実施例では、キメラファイバーは、Ａｄ５テール、ならびに第２の血清型のアデノウイルス（Ａｄ９またはＡｄ３４など）に由来するファイバーシャフトおよびノブから構成される。
【００２８】
接触させること：直接的な物理的会合におくことであり、固体形態および液体形態の両方を含む。
【００２９】
縮重バリアント：本開示の文脈において、「縮重バリアント」とは、遺伝子コードの結果として縮重となる配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。天然のアミノ酸が２０個あり、その大半が、１つを上回るコドンによって指定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドのアミノ酸配列が変化しない限り、そのペプチドをコードするすべての縮重ヌクレオチド配列が、含まれる。
【００３０】
欠失した：「欠失した」タンパク質（Ｅ４ｏｒｆ１またはＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質など）をコードするアデノウイルスゲノムは、タンパク質コーディング配列の完全な欠失、またはタンパク質発現の不在をもたらす部分的欠失を有するアデノウイルスを指す。
【００３１】
Ｅ２Ｆの脱制御（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）：Ｅ２Ｆ転写因子および下流の標的遺伝子の活性の増加を指し、これは、ほぼすべての種類のヒトのがんにおいて生じる。Ｅ２Ｆ経路活性および転写の脱制御は、Ｒｂ、ｐ１０７、およびｐ１３０腫瘍抑制因子の機能喪失変異および欠失など、経路の上流の任意の構成要素における様々な異なる変異の結果として生じ得る。Ｒｂは、特定された最初の腫瘍抑制因子であり、ヒト腫瘍の少なくとも３分の１で、不在であるか、または変異している。加えて、ｐ１６変異および／またはエピジェネティックサイレンシングは、腫瘍細胞においてＥ２Ｆを活性化し得る。サイクリンＤおよびＣＤＫ４の変異、遺伝子増幅、または過剰発現もまた、ヒト腫瘍においてＥ２Ｆ活性の脱制御をもたらし得る。加えて、Ｅ２Ｆは、ＥＧＦＲ、ＲＴＫ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ−３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ、ＭＹＣを含む、増殖因子受容体経路の変異によって活性化される。ｐ１６ＩＮＫ４ａ−サイクリンＤ：ｃｄｋ４／６−ＲＢ−Ｅ２Ｆ経路における変異は、概して、相互排他的様式で生じるため、一方の「ヒット」（例えば、ｐ１６）が、他方（例えば、Ｒｂ変異またはサイクリンＤ：ｃｄｋ過剰発現）を伴うことはない。しかしながら、現在の化学療法はほとんどが、Ｅ２Ｆの転写標的を阻害するが、正常な細胞に対しても毒性であり、破壊的な医原性合併症を有することの多い、増殖性の毒である。本明細書において開示されるように、代替的な治療的アプローチは、ｐ１６−サイクリンＤ：ｃｄｋ４−ＲＢ−Ｅ２Ｆ経路の脱制御を有するがん細胞病変部において選択的な溶解性複製を起こすウイルスを使用することである。
【００３２】
ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）：このアデノウイルスタンパク質は、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに二本鎖ＤＮＡに結合する。７２キロダルトンのタンパク質であるＤＢＰは、アデノウイルスＤＮＡの複製に必須である。
【００３３】
Ｅ１Ａ：アデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）遺伝子およびこの遺伝子から発現されるポリペプチドである。Ｅ１Ａタンパク質は、細胞を、細胞周期に入れることによって、ウイルスゲノム複製における役割を果たす。本明細書において使用されるとき、「Ｅ１Ａタンパク質」という用語は、Ｅ１Ａ遺伝子から発現されるタンパク質を指し、この用語には、あらゆるアデノウイルス血清型によって産生されるＥ１Ａタンパク質が含まれる。
【００３４】
Ｅ３−ＲＩＤα／ＲＩＤβおよびＥ３−１４．７ｋ：Ｅ３遺伝子によって産生される初期発現タンパク質である。Ｅ３−ＲＩＤα、Ｅ３−ＲＩＤβ、およびＥ３−１４．７ｋタンパク質は、受容体内部移行分解複合体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＲＩＤ）を成し、これが、核膜に局在化し、感染した細胞を宿主の抗ウイルス応答から保護するように、ＣＤ９５（ＦａｓＬ受容体）ならびにＴＮＦＲ１および２（ＴＮＦ／ＴＲＡＩＬ受容体）を含む様々な受容体のエンドサイトーシスおよび分解を引き起こす。Ｅ３−ＲＩＤα、Ｅ３−ＲＩＤβ、およびＥ３−１４．７ｋのコーディング配列は、この順序で、互いに隣接している。
【００３５】
Ｅ４ｏｒｆ１：Ｅ４遺伝子によって産生されるアデノウイルスタンパク質である。「Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質」という用語には、あらゆるアデノウイルス血清型に由来するＥ４遺伝子によって産生されるＥ４ｏｒｆ１タンパク質が含まれる。
【００３６】
Ｅ４ｏｒｆ６／７：アデノウイルスＥ４遺伝子によってコードされるタンパク質である。「Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質」という用語には、あらゆるアデノウイルス血清型に由来するＥ４遺伝子によって産生されるＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質が含まれる。
【００３７】
ファイバー：アデノウイルスのファイバータンパク質は、細胞表面受容体への結合を媒介する、三量体タンパク質である。ファイバータンパク質は、長いＮ末端側のシャフトおよび球状のＣ末端側のノブから構成される。
【００３８】
蛍光タンパク質：特定の波長の光に曝露したときに、ある特定の波長の光を放出するタンパク質である。蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ１、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎなど）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ａｚｕｒｉｔｅ、およびｍＴａｇＢＦＰなど）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、ｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ−Ｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、およびｍＴＦＰ１など）、黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、およびｍＢａｎａｎａ）、橙色蛍光タンパク質（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、およびｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ＡＱ１４３、ｔｄＴｏｍａｔｏ、およびＥ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ）、橙色／赤色蛍光タンパク質（ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ−Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、およびＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ）、ならびにこれらの修飾されたバージョンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
融合タンパク質：少なくとも２つの異なる（異種）タンパク質またはペプチドに由来するアミノ酸配列を含有するタンパク質である。融合タンパク質は、例えば、２つの異なる（異種）タンパク質の少なくとも一部分をコードする核酸配列から操作された核酸配列の発現によって、生成することができる。融合タンパク質を作出するためには、核酸配列は、同じリーディングフレーム内になければならず、内部終止コドンを含有してはならない。融合タンパク質、特に、短い融合タンパク質は、化学的合成によって生成することもできる。
【００４０】
異種：異種タンパク質または異種ポリペプチドとは、異なる供給源または種に由来するタンパク質またはポリペプチドを指す。
【００４１】
ヘキソン：主要なアデノウイルスキャプシドタンパク質である。
【００４２】
免疫調節因子：免疫系を変化させる（例えば、活性化する、強化する、または抑制する）作用物質である。免疫調節因子としては、サイトカイン（インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３リガンド、またはインターフェロンなど）、ケモカイン（ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０など）、Ｔ細胞活性化リガンド（抗ＣＤ３抗体または同種抗原など）、共刺激分子（Ｂ７．１／Ｂ７．２、ＯＸ４０Ｌ、４−１−ＢＢＬ、またはＣＤ４０Ｌなど）、チェックポイント遮断阻害剤（抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体など）、ならびに小分子免疫調節因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
単離された：「単離された」生物学的構成要素（核酸分子、タンパク質、ウイルス、または細胞など）は、その構成要素が天然に存在する、生物の細胞もしくは組織または生物自体における他の生物学的構成要素、例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、ならびに細胞から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製されたものが含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子およびタンパク質を包含する。
【００４４】
修飾：核酸の配列またはタンパク質配列における変化である。例えば、アミノ酸配列の修飾には、例えば、置換、挿入、および欠失、またはそれらの組合せが含まれる。挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに配列内への単一もしくは複数のアミノ酸残基の挿入が含まれる。欠失は、タンパク質配列からの、１つまたは複数のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。本明細書における一部の実施形態では、修飾（置換、挿入、または欠失など）は、タンパク質の特定の活性の低減または強化など、機能の変化をもたらす。本明細書において使用されるとき、「Δ」または「デルタ」は、欠失を指す。置換修飾は、少なくとも１つの残基が、除去され、その場所に異なる残基が挿入されているものである。アミノ酸置換は、典型的に、単一の残基のものであるが、いくつかの異なる位置で同時に生じてもよい。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組合せを、最終的な変異体の配列に到達するように組み合わせてもよい。これらの修飾は、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの修飾によって調製することができ、それによって、この修飾をコードするＤＮＡが産生される。公知の配列を有するＤＮＡの所定の部位において、挿入、欠失、および置換の変異を行うための技法は、当該技術分野において周知である。「修飾された」タンパク質、核酸、またはウイルスは、上記に概説された１つまたは複数の修飾を有するものである。
【００４５】
新形成、悪性疾患、がん、および腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂の結果として生じる、組織または細胞の異常な増殖である。新生物性増殖により、腫瘍が産生され得る。個体における腫瘍の量は、「腫瘍量」であり、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる。転移しない腫瘍は、「良性」と称される。周囲の組織に侵入する、および／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と称される。悪性腫瘍は、「がん」とも称される。
【００４６】
血液系がんは、血液または骨髄のがんである。血液系（または造血系）がんの例としては、白血病、例えば、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄単球性、単球性、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性および高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞性白血病、ならびに脊髄形成異常が挙げられる。一部の事例では、リンパ腫は、固形腫瘍とみなされる。
【００４７】
固形腫瘍は、通常は嚢胞も液体区域も含有しない、異常な組織の塊である。固形腫瘍は、良性の場合も悪性の場合もある。異なる種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類に応じて命名される（肉腫、癌腫、およびリンパ腫など）。肉腫および癌腫など、固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭状癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭状癌、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染新形成、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、ウイルムス腫瘍、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、ならびにＣＮＳ腫瘍（膠腫など（脳幹膠腫および混合性膠腫など）、膠芽腫（多形性膠芽腫としても公知である）星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、および脳転移など）が挙げられる。
【００４８】
腫瘍溶解性ウイルス：増殖性障害の細胞、例えば、がん／腫瘍細胞を、選択的に殺滅させるウイルスである。がん細胞の殺滅は、当該技術分野において確立されている任意の方法、例えば、生存細胞数を決定すること、またはがん細胞における細胞変性効果、アポトーシス、もしくはウイルスタンパク質の合成（例えば、複製に必要なウイルス遺伝子の代謝標識、イムノブロット、もしくはＲＴ−ＰＣＲによって）または腫瘍のサイズの低減を検出することによって、検出することができる。
【００４９】
作動可能に連結した：第１の核酸配列が、第２の核酸配列との機能的関係にある場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結している。例えば、プロモーターが、コーディング配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コーディング配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は、連続的であり、２つのタンパク質コーディング領域を接合する必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。
【００５０】
薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来のものである。E. W. MartinによるRemington's PharmaceuticalSciences、Mack Publishing Co.、Easton、PA、第１５版（１９７５年）は、１つまたは複数の治療用化合物、分子、または薬剤（例えば、本明細書において開示される組換えウイルス）の薬学的送達に好適な組成物および製剤について記載している。
【００５１】
一般に、担体の性質は、用いられる具体的な投与様式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどといった、薬学的および生理学的に許容される流体を含む、注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、またはカプセルの形態）については、従来の非毒性の固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性な担体に加えて、投与しようとする医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。
【００５２】
ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質：モノマーがアミノ酸残基であり、それらが、アミド結合を通じて一緒に接合された、ポリマーである。アミノ酸が、アルファアミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれも使用することができる。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換可能に使用される。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「残基」または「アミノ酸残基」という用語には、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに組み込まれているアミノ酸への参照が含まれる。
【００５３】
ポリペプチドにおける保存的置換は、タンパク質配列における１つのアミノ酸残基を、類似の生物学的特質を有する異なるアミノ酸残基の代わりに使用することである。典型的に、保存的置換は、結果として得られるポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないかまたは全く影響を及ぼさない。例えば、１つまたは複数の保存的置換（例えば、１つを上回らない、２つを上回らない、３つを上回らない、４つを上回らない、または５つを上回らない置換）を含むタンパク質またはペプチドは、野生型のタンパク質またはペプチドの構造および機能を保持する。ポリペプチドは、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲなどの標準的な手順を使用して、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、１つまたは複数の保存的置換を含有するように産生させることができる。一実施例では、そのようなバリアントは、抗体の交差反応性または抗体が免疫応答を誘導する能力を試験することによって、容易に選択することができる。保存的置換の例を、以下に示す。
【表１】
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【００５４】
保存的置換は、一般に、（ａ）置換の区域における、例えば、シートコンフォメーションもしくはヘリックスコンフォメーションとしての、ポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持する。
【００５５】
一般に、タンパク質特質に最も大きな変化をもたらすことが予測される置換は、非保存的なもの、例えば、（ａ）親水性残基、例えば、セリルもしくはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルを置換する（もしくはそれらによって置換される）変化、（ｂ）システインもしくはプロリンが、任意の他の残基を置換する（もしくはそれらによって置換される）変化、（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、もしくはヒスタジルが、電気陰性の残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルを置換する（もしくはそれらによって置換される）変化、または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さないもの、例えば、グリシンを置換する（もしくはそれらによって置換される）変化であろう。
【００５６】
疾患を予防、処置、または緩和する(ameliorate)こと：疾患を「予防すること」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置すること」とは、疾患または病態の発症が開始された後に、その徴候または症状を緩和する治療的介入を指す。「緩和すること」とは、疾患の徴候または症状の数または重症度の低減を指す。
【００５７】
プロモーター：核酸（例えば、遺伝子）の転写を導く／開始するＤＮＡの領域である。プロモーターは、転写の開始部位の近傍の必要な核酸配列を含む。典型的に、プロモーターは、転写する遺伝子の近傍に位置する。プロモーターはまた、任意選択で、転写開始部位から数千塩基対程度離れて位置し得る、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。「構成的プロモーター」は、継続的に活性であり、外部シグナルまたは分子による制御に供されないプロモーターである。対照的に、「誘導的プロモーター」の活性は、外部シグナルまたは分子（例えば、転写因子またはテトラサイクリン）によって制御される。
【００５８】
タンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）：ヘキソンタンパク質と会合するアデノウイルスキャプシドの主要ではない構成要素である。
【００５９】
精製された：「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要とするものではなく、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物は、天然に会合するタンパク質および他の混入物質から、全体または部分的に単離されているものである。ある特定の実施形態では、「実質的に精製された」という用語は、細胞、細胞培養培地、または他の粗調製物から単離されており、初期調製物の様々な構成要素、例えば、タンパク質、細胞残屑、および他の構成要素を除去するために分画に供されている、ペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物を指す。
【００６０】
組換え：組換え核酸分子、タンパク質、またはウイルスは、天然に存在しない配列を有するもの、または他の点で別個である配列の２つのセグメントの人工的な組合せによって作製された配列を有するものである。この人工的な組合せは、化学的合成によって、または単離された核酸分子のセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作技法によって、達成することができる。「組換え」という用語には、天然の核酸分子、タンパク質、またはウイルスの一部分の付加、置換、または欠失のみによって変化されている、核酸、タンパク質、およびウイルスも含まれる。
【００６１】
複製欠損：（腫瘍細胞と比較して）非腫瘍細胞において「複製欠損」を呈するアデノウイルスは、正常細胞において、腫瘍細胞と比較して低減されたウイルス複製を呈するアデノウイルスを指す。複製欠損は、例えば、腫瘍細胞と比較して、正常細胞におけるウイルス後期タンパク質発現の欠如、ウイルスＤＮＡ合成の低減、Ｅ２Ｆ標的遺伝子（例えば、サイクリンＡおよびＢ）を誘導する能力の低減、Ｓ期進入を誘起する能力の低減、ならびに／または細胞殺滅を誘導する能力の低減によって、明らかである。
【００６２】
複製欠乏ウイルス：所与の表現型を有する所定の細胞集団（例えば、Ｅ２Ｆ経路の脱制御を有する腫瘍細胞）において、細胞増殖を優先的に阻害するか、細胞溶解を引き起こすか、またはアポトーシス（集合的に、殺滅とみなされる）を誘導する、ウイルスである。そのようなウイルスは、細胞増殖の低減もしくは阻害、細胞溶解の発生、アポトーシスの誘導、またはそれ以外では所定の細胞表現型を有さない細胞（正常な非腫瘍細胞など）における複製を行うことができないか、またはその能力が限定されている。
【００６３】
自己切断ペプチド：リボソームがＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップするように誘導し、そのペプチド配列と下流のポリペプチドとの分離をもたらす、ペプチドである。ウイルスによってコードされる２Ａペプチドは、自己切断ペプチドの一種である。ウイルスによってコードされる２Ａペプチドとしては、例えば、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、およびＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）に由来する２Ａペプチドが挙げられる。
【００６４】
配列同一性：２つもしくはそれよりも多い核酸配列間または２つもしくはそれよりも多いアミノ酸配列間における同一性または類似性は、配列間の同一性または類似性として表される。配列同一性は、同一性の割合として測定することができ、割合が高いほど、配列がより同一である。配列類似性は、類似性（保存的アミノ酸置換を考慮に入れる）の割合として測定することができ、割合が高いほど、配列がより類似している。核酸配列またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を使用してアラインメントした場合に、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、オルソロガスなタンパク質またはｃＤＮＡが、より緊密に関連する種に由来する場合に（例えば、ヒト配列およびマウス配列）、関連性がより遠い種（例えば、ヒト配列およびＣ．Ｅｌｅｇａｎｓ配列）と比較して、より顕著である。
【００６５】
比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野において周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、説明されている：ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．、２巻４８２頁、１９８１年；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３頁、１９７０年；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻、２４４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、７３巻、２３７〜４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５巻、１５１〜３頁、１９８９年；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻、１０８８１〜９０頁、１９８８年；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、８巻、１５５〜６５頁、１９９２年；ならびにＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．、２４巻、３０７〜３１頁、１９９４年。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜１０頁、１９９０年は、配列アラインメント方法および相同性の計算に関する詳細な考察を提示している。
【００６６】
ＮＣＢＩのＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜１０頁、１９９０年）が、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）およびインターネットを含む、複数の供給元から、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと併せて使用するために、入手可能である。追加の情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトにおいて見出すことができる。
【００６７】
血清型：特徴的な抗原セットによって区別される緊密に関連する微生物（ウイルスなど）の群である。
【００６８】
被験体：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリーの、生きた多細胞脊椎動物の生物である。
【００６９】
合成：研究室において人工的な手段によって産生されたものであり、例えば、合成核酸またはタンパク質は、研究室において化学的に合成され得る。
【００７０】
治療剤：被験体に適正に投与された場合に、所望される治療効果または予防効果を誘導することができる任意の薬剤である。治療剤としては、化学的化合物、小分子、組換えウイルス、アンチセンス化合物、抗体（もしくはその抗原結合性断片）、ペプチド、または核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、がんを処置するための治療剤には、腫瘍の増殖、腫瘍の発達、および腫瘍の転移を予防または阻害する薬剤が含まれる。「治療用タンパク質」は、タンパク質またはペプチドである治療剤であり、抗体またはその抗原結合性断片が含まれる。本明細書における一部の実施形態では、治療用タンパク質は、免疫調節因子である。他の実施形態では、治療用タンパク質は、毒素、ＦａｓもしくはＦａｓＬ、可溶性デスファクター（death factor）、バイスタンダー破壊の媒介因子、腫瘍抗原、ネオ抗原、または同種抗原を含む。
【００７１】
治療有効量：特定の医薬品または治療剤（例えば、組換えウイルス）で処置されている被験体または細胞において、所望される効果を達成するのに十分なそれらの量である。薬剤の有効量は、処置されている被験体または細胞、ならびに治療用組成物の投与様式を含むがこれらに限定されない、複数の因子に依存し得る。
【００７２】
Ｕエクソン（Ｕｅｘｏｎ）：ｌ鎖（左方向への転写）において初期Ｅ３領域とファイバー遺伝子との間に位置するオープンリーディングフレームである（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８１巻（２３号）、１２９１８〜１２９２６頁）。
【００７３】
別途説明されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形の参照物を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、もしくはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに関して与えられる、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量値は、およそのものであり、説明のために提供されることを、さらに理解されたい。本明細書において記載されるものに類似であるかまたはそれと同等である方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が、以下に記載されている。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾が生じた場合には、用語の説明を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
【００７４】
ＩＩＩ．実施形態の概要
異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および自己切断ペプチドコーディング配列を含む、組換えアデノウイルスゲノムが、本明細書において開示される。異種ＯＲＦは、例えば、治療用タンパク質（例えば、免疫調節因子）をコードすることができる。組換えアデノウイルスゲノムおよび開示されるゲノムによって産生される組換えアデノウイルスは、例えば、がんの処置など、様々な異なる治療的適用において使用することができる。
【００７５】
異種ＯＲＦおよび自己切断ペプチドコーディング配列を、いずれも内因性アデノウイルスＯＲＦと同じリーディングフレーム内に、それと作動可能に連結した状態で含む、組換えアデノウイルスゲノムが、本明細書において提供される。自己切断ペプチドコーディング配列は、異種ＯＲＦと内因性ＯＲＦとの間に位置する。一部の実施形態では、内因性ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋであり、異種ＯＲＦが、Ｅ１Ｂ−５５ｋの３’にあるか、内因性ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼであり、異種ＯＲＦが、ＤＮＡポリメラーゼの５’にあるか、内因性ＯＲＦが、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）であり、異種ＯＲＦが、ＤＢＰの３’にあるか、内因性ＯＲＦが、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）であり、異種ＯＲＦが、ＡＤＰの５’にあるか、内因性ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋであり、異種ＯＲＦが、Ｅ３−１４．７ｋの３’にあるか、内因性ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２であり、異種ＯＲＦが、Ｅ４−ＯＲＦ２の５’にあるか、または内因性ＯＲＦが、ファイバーであり、異種ＯＲＦが、ファイバーの３’にある。
【００７６】
一部の実施形態では、異種ＯＲＦは、治療用タンパク質をコードする。
【００７７】
一部の実施形態では、自己切断ペプチドは、２Ａペプチドまたはそのバリアントである。一部の実施例では、２Ａペプチドは、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）ペプチド、またはＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチド、またはそれらのバリアントを含む。特定の実施例では、Ｐ２Ａペプチド配列は、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。一部の実施例では、２Ａペプチドバリアントは、Ｎ末端に追加のアミノ酸配列（ＧＳＧなど）を含む。
【００７８】
特定の実施例では、Ｆ２Ａペプチド配列は、配列番号１５または配列番号１９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の実施例では、Ｅ２Ａペプチド配列は、配列番号１６または配列番号２０のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の実施例では、Ｔ２Ａペプチド配列は、配列番号１７または配列番号２１のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の非限定的な実施例では、自己切断ペプチドは、配列番号１４〜２１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００７９】
一部の実施形態では、アデノウイルスは、アデノウイルス５型（Ａｄ５）である。他の実施形態では、アデノウイルスは、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ９、Ａｄ１１、Ａｄ１２、またはＡｄ３４である。さらに他の実施形態では、アデノウイルスは、キメラアデノウイルス、例えば、Ａｄ５／Ａｄ９またはＡｄ５／Ａｄ３４キメラアデノウイルスであるが、これらに限定されない。
【００８０】
本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノムを含む、組換えアデノウイルスが、本明細書においてさらに提供される。
【００８１】
本明細書において提供される組換えアデノウイルス（および組換えアデノウイルスゲノム）は、任意選択で、例えば、ウイルスを特定の細胞型に対して標的化するため、肝臓への標的化およびそこでの複製を阻害するため、腫瘍細胞における選択的な複製を可能にするため、および共通のアデノウイルス血清型に対する既存の中和抗体を避けるために、追加の修飾を含む。追加の修飾は、組換えアデノウイルスの所望される使用に応じて変動し得る。アデノウイルス修飾は、例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５１７４５号（２０１５年９月２３日に出願）、国際公開第２０１２／０２４３５０号、同第２０１３／１３８５０５号、および同第２０１４／１５３２０４号に記載されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８２】
組換えアデノウイルスゲノムまたは組換えアデノウイルスと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物もまた、本開示によって提供される。
【００８３】
治療用タンパク質を被験体に送達する方法もまた、本明細書において提供される。一部の実施形態では、本方法は、被験体に、本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノム、組換えアデノウイルス、または組成物を投与することを含む。これらの方法において、組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノムの異種ＯＲＦは、治療用タンパク質をコードする。
【００８４】
腫瘍細胞の生存度および／または腫瘍細胞の増殖を低減または阻害する方法が、さらに提供される（例えば、開示される治療法の不在時と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の低減）。一部の実施形態では、本方法は、腫瘍細胞を、本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノム、組換えアデノウイルス、または組成物と接触させることを含む。これらの方法において、異種ＯＲＦは、治療用タンパク質をコードする。一部の実施例では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。他の実施例では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法であり、腫瘍細胞を接触させることは、組換えアデノウイルスゲノム、組換えアデノウイルス、または組成物を、腫瘍を有する被験体に投与することを含む。
【００８５】
転移の数および／もしくはサイズを低減させるか、または被験体における腫瘍の体積を低減させることなどによって、腫瘍の進行を低減または阻害する方法が、本明細書においてさらに提供される（例えば、開示される治療法の不在時と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の低減）。一部の実施形態では、本方法は、被験体に、治療有効量の、本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノム、組換えアデノウイルス、または組成物を投与することを含む。これらの方法において、異種ＯＲＦは、治療用タンパク質をコードする。
【００８６】
被験体におけるがんを処置する方法が、さらに提供される。一部の実施形態では、本方法は、被験体に、治療有効量の、本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノム、組換えアデノウイルス、または組成物を投与することを含む。これらの方法において、異種ＯＲＦは、治療用タンパク質をコードする。
【００８７】
本明細書における一部の実施形態では、本方法は、被験体に、追加の治療剤を投与することをさらに含む。例えば、追加の治療剤には、抗がん剤、例えば、化学療法剤、生物製剤（抗体もしくはその断片、例えば、モノクローナル抗体など）、または核酸分子、例えば、阻害性核酸分子、または他の治療的処置、例えば、腫瘍の外科切除もしくは腫瘍の照射が含まれ得る。
【００８８】
本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノム、組換えアデノウイルス、または組成物と、１つもしくは複数の追加の治療剤および／または１つもしくは複数の診断剤とを含む、キットもまた、本明細書において提供される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の治療剤は、化学療法薬、生物製剤、またはそれらの組合せを含む。一部の実施例では、１つまたは複数の診断剤は、腫瘍マーカーに特異的な１つもしくは複数の抗体もしくは核酸分子、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでウイルスもしくは腫瘍細胞を追跡するために使用することができる画像化プローブを含む。
【００８９】
ＩＶ．外因性ＯＲＦの最適な配置
３６ｋｂのアデノウイルスゲノムは、小型であり、様々な遺伝子のコーディングにトップストランド（ｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ）とボトムストランド（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄ）の両方を使用する。アデノウイルスゲノム内の多数の位置において、トップストランドとボトムストランドとの両方が、別個の遺伝子のコーディングに同時に使用される。ゲノムのサイズは、そのキャプシドへの挿入に最適となるように進化してきた。結果として、外因性遺伝子の挿入は、キャプシドのサイズ容量によって制限されるが、これは、外因性核酸の過剰な追加により、キャプシドへのゲノムローディング（ｇｅｎｏｍｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）が不完全となり、ウイルス動態が低減されるためである。
【００９０】
アデノウイルスゲノムにおいて利用できる空間が制限されていることにより提示される課題の解決策は、外因性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、融合生成物として本来のアデノウイルスＯＲＦ内に位置づけることである。この戦略は、すでにゲノムにコードされているアデノウイルスプロモーター、５’ＵＴＲ、およびポリＡ尾部を利用する。しかしながら、本来のアデノウイルスタンパク質と外因性タンパク質との融合体の発現は、一方または両方のタンパク質機能に有害となり得、アデノウイルス複製動態の有意な減少をもたらし得る。
【００９１】
本開示は、本来の（内因性）ＯＲＦと外因性（異種）ＯＲＦとの間に配置される自己切断ペプチド配列を使用することによって、この問題に対する解決策を提供する。単一のｍＲＮＡ上の２つのＯＲＦの間に配置された場合、自己切断ペプチド配列の存在により、リボソームスキップが生じ、第１のタンパク質が第２のタンパク質とは別個に放出される。本明細書において開示される一部の実施形態では、自己切断ペプチドは、２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）である。
【００９２】
アデノウイルスゲノム内における異種ＯＲＦの最適な配置部位の特定もまた、本明細書において開示される。自己切断ペプチド配列と、異種ＯＲＦの良好な配置とを組み合わせることにより、高い発現がもたらされ、ウイルス動態に及ぼす影響が最小限となるか全くなくなる。
【００９３】
以下の実施例１に記載されるように、異種ＯＲＦを挿入したときにアデノウイルス複製動態が阻害されなかった、アデノウイルスゲノム内の複数の部位が、特定された。具体的には、異種ＯＲＦは、Ｅ１Ｂ−５５ｋ  ＯＲＦのＣ末端側、ＤＮＡポリメラーゼＯＲＦのＮ末端側、ＤＢＰ  ＯＲＦのＣ末端側、ＡＤＰ  ＯＲＦのＮ末端側、Ｅ３−１４．７ｋ  ＯＲＦのＣ末端側、またはＥ４−ＯＲＦ２のＮ末端側に挿入することができると決定された。それぞれの事例において、自己切断ペプチド配列（Ｐ２Ａ部位）を、アデノウイルスＯＲＦと異種ＯＲＦとの間に挿入した。異種ＯＲＦをファイバーのＣ末端側に挿入することにより、複製欠損アデノウイルスが産生されたことが、本明細書においてさらに開示されるが、しかしながら、この組換えウイルスは、感染細胞において極めて高いレベルの異種タンパク質を産生することが可能であったため、これにより、いくつかの治療的適用において有用であることが証明され得る。
【００９４】
したがって、本開示は、治療的適用のための、以下の組換えアデノウイルスの使用を企図する（「ＳＣ」は、Ｐ２Ａなど、自己切断ペプチドをコードする配列を指す）。
Ｅ１Ｂ−５５ｋ−ＳＣ−異種ＯＲＦ
異種ＯＲＦ−ＳＣ−（ＤＮＡポリメラーゼ）
ＤＢＰ−ＳＣ−異種ＯＲＦ
異種ＯＲＦ−ＳＣ−ＡＤＰ
Ｅ３−１４．７ｋ−ＳＣ−異種ＯＲＦ
異種ＯＲＦ−ＳＣ−Ｅ４−ＯＲＦ２
ファイバー−ＳＣ−異種ＯＲＦ
【００９５】
本明細書における一部の実施形態では、自己切断ペプチドは、ウイルスによってコードされる２Ａペプチド、または以下にさらに記載されるようなその修飾バージョンである。
【００９６】
Ｖ．自己切断ペプチド配列
自己切断ペプチドは、リボソームがＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップするように誘導し、そのペプチド配列と下流のポリペプチドとの分離をもたらす、ペプチドである。自己切断ペプチドの使用により、単一のＯＲＦから、自己切断ペプチドに隣接する複数のタンパク質の発現が可能となる。ウイルスによってコードされる２Ａペプチドは、自己切断ペプチドの一種である。
【００９７】
他の自己切断ペプチドと同様に、２Ａペプチドは、リボソームが２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップするようにし、２Ａ配列の末端と下流のペプチドとの分離をもたらすことによって機能する（Ｋｉｍら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６巻（４号）、ｅ１８５５６、２０１１年）。「切断」は、２ＡペプチドのＣ末端に見出されるグリシン残基とプロリン残基との間に生じる。例示的な２Ａペプチドとしては、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）、および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）によってコードされる２Ａペプチド、またはそれらの修飾バージョンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
本明細書における特定の実施例では、２Ａペプチドは、ＰＴＶ１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、ＦＭＤＶ  ２Ａ（Ｆ２Ａ）、ＥＲＡＶ  ２Ａ（Ｅ２Ａ）、またはＴａＶ  ２Ａ（Ｔ２Ａ）を含み、これらの配列は、配列番号１４〜１７として、以下に示され、本明細書に記載されている。
【化１】
2019509037.tif 000004
【００９９】
一部の実施例では、２Ａペプチドは、切断効率を改善するために、Ｎ末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙを含むように修飾される。修飾されたＰ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＴ２Ａの配列は、配列番号１４〜１７として、以下に示され、本明細書に記載されている。
【化２】
2019509037.tif 000005
【０１００】
一部の実施形態では、２Ａポリペプチドは、本明細書において開示される２Ａポリペプチドのバリアントである。バリアントは、野生型または本明細書において開示される修飾された２Ａポリペプチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。バリアントは、例えば、配列番号１４〜２１のうちのいずれか１つの２Ａポリペプチドから、少なくとも１つのＮ末端アミノ酸が欠失しているもの、例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸（列挙された値のうちのいずれか２つの間の範囲を含む）が欠失しているものを含み得る。バリアントは、配列番号１４〜２１のうちのいずれか１つの２Ａポリペプチドから、少なくとも１つのＣ末端アミノ酸が欠失しているもの、例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸（列挙された値のうちのいずれか２つの間の範囲を含む）が欠失しているものを含み得る。バリアントは、少なくとも１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換も含み得る。
【０１０１】
ＶＩ．医薬組成物
組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノムを含む組成物が、本明細書において提供される。本組成物は、任意選択で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの製剤化および投与に好適である。任意選択で、本組成物は、提供される薬剤のうちの１つまたは複数および薬学的に許容される担体を含む。好適な担体およびそれらの製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第２２版、Loyd V. Allenら編、Pharmaceutical Press（２０１２年）に記載されている。薬学的に許容される担体としては、生物学的にもそれ以外にも望ましくないことのない材料が挙げられる。すなわち、この材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことも、この材料が含有されている医薬組成物中の他の構成成分と有害な様式で相互作用することもなく、被験体に投与される。被験体に投与される場合、担体は、任意選択で、活性成分の分解を最小限に抑え、被験体における有害な副作用を最小限に抑えるように選択される。
【０１０２】
組換えウイルス（または組換えアデノウイルスをコードする１つもしくは複数の核酸もしくはベクター）は、公知の方法に従って、例えば、静脈内投与、例えば、ボーラスまたは長期間にわたる連続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（intracerobrospinal）、皮下、関節内、関節滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、腫瘍内、または吸入の経路によって、投与される。投与は、局所的であっても全身的であってもよい。本組成物は、局所、経口、非経口、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、体腔内（intracavity）、経皮、肝内、頭蓋内、噴霧化／吸入、または気管支鏡法を介した設置によるものを含む、複数の投与経路のうちのいずれかを介して投与することができる。したがって、本組成物は、局所的処置が所望されるか全身処置が所望されるかに応じて、また処置しようとする領域に応じて、いくつかの手段で投与される。
【０１０３】
一部の実施形態では、投与のための組成物は、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解した、本明細書において記載される組換えアデノウイルス（または組換えゲノム）を含む。様々な水性担体、例えば、緩衝食塩水などを、使用することができる。これらの溶液は、滅菌であり、通常、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって、滅菌することができる。本組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて、薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してもよい。これらの製剤における活性な薬剤の濃度は、広範に変動し得、主として、選択された具体的な投与様式および被験体の必要性に応じて、流体の体積、粘度、体重などに基づいて、選択されるであろう。
【０１０４】
医薬製剤、特に、組換えウイルスの医薬製剤は、所望される度合いの純度を有する組換えアデノウイルス（または組換えアデノウイルスをコードする１つもしくは複数の核酸）を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって、調製することができる。そのような製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液であり得る。
【０１０５】
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度で、レシピエントにとって非毒性である。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、保存剤、低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミンもしくはゼラチン、または親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；ならびにアミノ酸、単糖類、二糖類、および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン；キレート剤；ならびにイオン性および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート）；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤であり得る。組換えアデノウイルス（または組換えアデノウイルスをコードする１つもしくは複数の核酸）は、任意の適切な濃度の感染単位で、製剤化することができる。
【０１０６】
経口投与に好適な製剤は、（ａ）液体溶液、例えば、希釈剤、例えば、水、生理食塩水、またはＰＥＧ  ４００中に懸濁させた、有効量の組換えアデノウイルス、（ｂ）それぞれ所定の量の活性成分を液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして含有するカプセル、サシェ剤（sachet）、または錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁物、および（ｄ）好適なエマルジョンからなり得る。錠剤形態には、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微晶質セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、加湿剤（moistening agent）、保存剤、矯味矯臭剤、色素、崩壊剤、ならびに薬学的に適合性のある担体のうちの１つまたは複数が含まれ得る。ロゼンジ形態は、活性成分を、矯味矯臭薬、例えば、スクロース中に、ならびに活性成分に加えて当該技術分野において公知の担体を含有する、活性成分を不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアのエマルジョン、ゲルなどに含む香錠に、含み得る。
【０１０７】
組換えアデノウイルス（または組換えアデノウイルスをコードする１つもしくは複数の核酸）は、単独または他の好適な構成成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる（すなわち、それらは、「噴霧化」することができる）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴霧体に入れることができる。
【０１０８】
非経口投与、例えば、例として、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、および皮下の経路によるものに好適な製剤としては、水性および非水性の等張性滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にするための溶質を含有し得る）、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁物が挙げられる。提供される方法において、組成物は、例えば、静脈内注入によって、経口、局所、腹腔内、膀胱内、腫瘍内、または髄腔内に、投与することができる。非経口投与、腫瘍内投与、および静脈内投与が、好ましい投与方法である。化合物の製剤は、単回用量または複数回用量の密封された容器、例えば、アンプルおよびバイアルで提示され得る。
【０１０９】
注射溶液および懸濁物は、前述の種類の滅菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。アデノウイルスによって形質導入もしくは感染させた細胞、またはｅｘ  ｖｉｖｏ療法については核酸をトランスフェクトした細胞もまた、上述のように静脈内または非経口で投与することができる。
【０１１０】
一部の実施例では、医薬調製物は、単位剤形である。そのような形態では、調製物は、適切な量の活性な構成成分を含有する単位用量にさらに分割される。したがって、医薬組成物は、投与の方法に応じて、様々な単位剤形で投与され得る。例えば、経口投与に好適な単位剤形としては、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、およびロゼンジが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
ＶＩＩ．処置の方法
本明細書において開示される組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルスゲノム、および組成物は、治療的処置または予防的処置のために投与することができる。具体的には、被験体における腫瘍細胞の生存度もしくは増殖を低減もしくは阻害する方法、被験体における腫瘍の進行を低減もしくは阻害する方法、転移の数を低減させる方法、転移のサイズおよび／もしくは体積を低減させる方法、被験体における腫瘍のサイズおよび／もしくは体積を低減させる方法、ならびに／または被験体におけるがんを処置する方法が、提供される。本方法は、被験体に、治療有効量の組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノム（またはその組成物）を投与することを含む。全体を通じて記載されるように、アデノウイルスまたは医薬組成物は、静脈内、血管内、髄腔内、筋肉内、皮下、腫瘍内、腹腔内、または経口を含むがこれらに限定されない、任意の多数の方法で投与される。任意選択で、本方法は、被験体に、１つまたは複数の追加の治療剤、例えば、化学療法剤、生物製剤、および／または照射を投与することをさらに含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、肺、前立腺、結腸直腸、乳房、甲状腺、腎臓、膵臓、骨、頭頸部、もしくは肝臓のがんもしくは腫瘍であるか、または白血病の一種である。一部の事例では、がんは、転移性である。一部の実施例では、腫瘍は、乳腺、下垂体、甲状腺、もしくは前立腺の腫瘍；脳、肝臓、髄膜、骨、卵巣、子宮、もしくは子宮頸部（cervix）の腫瘍；単球性もしくは骨髄性の白血病；腺癌、腺腫、星状細胞腫、膀胱腫瘍、脳腫瘍、バーキットリンパ腫、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、軟骨肉腫、絨毛癌、線維腫、線維肉腫、膠芽腫、膠腫、ヘパトーム、組織球腫、平滑筋芽腫(leiomyoblastoma)、平滑筋肉腫、リンパ腫、脂肪肉腫細胞、乳房腫瘍、髄芽細胞腫、骨髄腫、形質細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、骨原性肉腫、膵臓腫瘍、下垂体腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、睾丸腫瘍、胸腺腫、またはウイルムス腫瘍である。腫瘍には、原発性固形腫瘍および転移性固形腫瘍の両方が含まれ、乳房、結腸、直腸、肺、口腔咽頭部、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢および胆管、小腸、尿路（腎臓、膀胱、および尿路上皮を含む）、女性生殖管（子宮頸部、子宮、および卵巣、ならびに絨毛癌および妊娠性絨毛性疾患を含む）、男性生殖管（前立腺、精嚢、精巣、および生殖細胞腫瘍を含む）、内分泌腺（甲状腺、副腎、および下垂体を含む）、および皮膚の癌腫、ならびに血管腫、黒色腫、肉腫（骨および軟組織から生じるもの、ならびにカポジ肉腫を含む）、ならびに脳、神経、眼、および髄膜の腫瘍（星状細胞腫、膠腫、膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経鞘腫、および髄膜腫を含む）が含まれる。一部の態様では、白血病などの造血系悪性疾患（すなわち、緑色腫、形質細胞腫、ならびに菌状息肉腫のプラークおよび腫瘍、ならびに皮膚Ｔ細胞性リンパ腫／白血病）により生じる固形腫瘍、ならびにリンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の両方）の処置において生じる固形腫瘍が、処置され得る。加えて、処置は、本明細書において記載される腫瘍からの転移の予防に有用であり得る。
【０１１３】
治療的適用において、組換えアデノウイルスまたはその組成物は、治療有効量または治療有効用量で、被験体に投与される。この使用に有効な量は、疾患の重症度および患者の全般的な健康状態に依存するであろう。本組成物の単回投与または複数回投与が、患者によって必要とされ、許容される、投薬量および頻度に応じて、投与され得る。「患者」または「被験体」には、ヒトおよび他の動物の両方、特に、哺乳動物が含まれる。したがって、本方法は、ヒト治療法および獣医学的適用、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ニワトリなどのいずれにも適用可能である。
【０１１４】
修飾された配列を有するアデノウイルスの有効量は、個体ごとに決定され、少なくとも部分的に、使用される具体的な組換えアデノウイルス、個体のサイズ、年齢、性別、ならびに増殖している細胞のサイズおよび他の特徴に基づく。例えば、ヒトの処置については、少なくとも１０３プラーク形成単位（ＰＦＵ）の組換えウイルスが使用され、例えば、増殖している細胞または存在する新生物の種類、サイズ、および数に応じて、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、または少なくとも１０１２ＰＦＵ、例えば、およそ１０３〜１０１２ＰＦＵの組換えウイルスが使用される。有効量は、約１．０ｐｆｕ／体重ｋｇ〜約１０１５ｐｆｕ／体重ｋｇ（例えば、約１０２ｐｆｕ／体重ｋｇ〜約１０１３ｐｆｕ／体重ｋｇ）であり得る。組換えアデノウイルスは、単回用量または複数回用量（例えば、２回、３回、４回、６回、またはそれよりも多い用量）で、投与される。複数回用量は、同時発生的または継続的に（例えば、数日間もしくは数週間の期間にわたって）投与され得る。
【０１１５】
一部の実施形態では、提供される方法は、被験体に、１つまたは複数の追加の治療剤、例えば、抗がん剤または他の治療的処置（腫瘍の外科切除など）を投与することを含む。例示的な抗がん剤としては、化学療法剤、例えば、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、挿入抗生物質（intercalatingantibiotic）、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤（anti-survivalagent）、生物学的応答修飾因子、抗ホルモン剤（例えば、抗アンドロゲン剤）、抗血管新生剤、およびＣＤＫ阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない。他の抗がん処置としては、放射線療法およびがん細胞を特異的に標的化する他の抗体が挙げられる。
【０１１６】
アルキル化剤の非限定的な例としては、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード、またはクロラムブシルなど）、アルキルスルホネート（ブスルファンなど）、ニトロソ尿素（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジンなど）が挙げられる。
【０１１７】
代謝拮抗物質の非限定的な例としては、葉酸類似体（メトトレキセートなど）、ピリミジン類似体（５−ＦＵまたはシタラビンなど）、およびプリン類似体、例えば、メルカプトプリンまたはチオグアニンが挙げられる。
【０１１８】
天然産物の非限定的な例としては、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシンなど）、エピポドフィロトキシン（エトポシドまたはテニポシドなど）、抗生物質（ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣなど）、および酵素（Ｌ−アスパラギナーゼなど）が挙げられる。
【０１１９】
その他の薬剤の非限定的な例としては、白金配位錯体（シスプラチンとしても公知であるシス−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩなど）、置換尿素（ヒドロキシ尿素など）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジンなど）、および副腎皮質抑制剤（ミトタンおよびアミノグルテチミドなど）が挙げられる。
【０１２０】
ホルモンおよびアンタゴニストの非限定的な例としては、副腎皮質ステロイド（プレドニゾンなど）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール（magestrol acetate）など）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールなど）、抗エストロゲン薬（タモキシフェンなど）、ならびにアンドロゲン（プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンなど）が挙げられる。
【０１２１】
最も一般的に使用されている化学療法薬の例としては、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン（Carboplatinum）、シスプラチン（Cisplatinum）、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（または他のタキサン類、例えば、ドセタキセル）、ベルバン（Velban）、ビンクリスチン、ＶＰ−１６が挙げられるが、いくつかのより新しい薬物としては、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ハーセプチン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ−５７１、タキソテール、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼベリン（Zevelin）、およびカルチトリオールが挙げられる。
【０１２２】
使用することができる免疫調節因子の非限定的な例としては、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．のＩｍｒｅｇより）、ＳＫ＆Ｆ  １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
【０１２３】
ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤は、ＣＤＫの機能を阻害する薬剤である。提供される方法において使用するためのＣＤＫ阻害剤の非限定的な例としては、ＡＧ−０２４３２２、ＡＴ７５１９、ＡＺＤ５４３８、フラボピリドール、インジスラム、Ｐ１４４６Ａ−０５、ＰＤ−０３３２９９１、およびＰ２７６−００が挙げられる（例えば、Lapennaら、Nature Reviews、８巻、５４７〜５６６頁、２００９年を参照されたい）。他のＣＤＫ阻害剤としては、ＬＹ２８３５２１９、パルボシクリブ、ＬＥＥ０１１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、汎ＣＤＫ阻害剤ＡＴ７５１９、セリシクリブ（seliciclib）、ＣＹＣ０６５、ブチロラクトンＩ、ヒメニアルジシン（hymenialdisine）、ＳＵ９５１６、ＣＩＮＫ４、ＰＤ０１８３８１２、またはファスカプリシン（fascaplysin）が挙げられる。
【０１２４】
一部の実施例では、ＣＤＫ阻害剤は、広範囲阻害剤（フラボピリドール、オロモウシン、ロスコビチン、ケンパウロン、ＳＮＳ−０３２、ＡＴ７５１９、ＡＧ−０２４３２２、（Ｓ）−ロスコビチン、またはＲ５４７など）である。他の実施例では、ＣＤＫ阻害剤は、特異的阻害剤（ファスカプリシン、リュビジン（ryuvidine）、プルバラノール（purvalanol）Ａ、ＮＵ２０５８、ＢＭＬ−２５９、ＳＵ  ９５１６、ＰＤ０３３２９９１、またはＰ−２７６−００など）である。
【０１２５】
一部の実施形態では、提供される方法は、被験体に、治療有効量の免疫療法を投与することをさらに含む。使用することができる免疫調節因子の非限定的な例としては、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．のＩｍｒｅｇより）、ＳＫ＆Ｆ  １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。免疫療法剤は、ＰＤ−１アンタゴニストまたはＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体、例えば、アテゾリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＮＳ−９３６５５８（ニボルマブ）、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＣＴ０１１、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、ＭＥＤＩ−０６８０、ＢＭＳ−９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＰＤＬ−３２８０Ａ、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃであり得る。免疫療法剤はまた、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、またはＢ７−Ｈ３アンタゴニスト、例えば、トレメリムマブ、ＢＭＳ−９８６０１６、およびＭＧＡ２７１であってもよい。
【０１２６】
一部の実施形態では、提供される方法は、被験体に、治療有効量の、血管の増殖を低減させるか、またはさらには阻害するように機能する、１つまたは複数の抗血管新生剤、例えば、タンパク質、酵素、多糖類、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および組換えベクター、ならびに小分子を投与することをさらに含む。好適な血管新生阻害剤の例としては、限定することなく、アンジオスタチンＫ１−３、スタウロスポリン、ゲニステイン、フマギリン、メドロキシプロゲステロン、スラミン、インターフェロン−アルファ、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血小板因子４、ソマトスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、サリドマイド、ならびにこれらの誘導体および類似体が挙げられる。例えば、一部の実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）またはＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する抗体（例えば、ＶＥＧＦＲ２抗体）である。一実施例では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦＲ２抗体またはＤＭＸＡＡ（バジメザンまたはＡＳＡ４０４としても公知であり、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている）、またはその両方を含む。抗血管新生剤は、ベバシズマブ、スニチニブ、抗血管新生チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えば、スニチニブ、キシチニブ（xitinib）、およびダサチニブであり得る。これらは、個別に使用してもよく、または任意の組合せで使用してもよい。
【０１２７】
一部の実施形態では、提供される方法は、被験体に、治療有効量の、増殖因子のリン酸化および活性化を防止する１つまたは複数のキナーゼ阻害剤、例えば、ＧＬＥＥＶＡＣ（登録商標）、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、およびＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、スニチニブ、ソラフェニブ、アニチニブ（anitinib）、およびダサチニブを投与することをさらに含む。使用することができる抗体としては、増殖因子および血管新生経路を遮断する、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）が挙げられる。これらは、個別に使用してもよく、または組み合わせて使用してもよい。
【０１２８】
一部の実施形態では、提供される方法は、被験体に、治療有効量の、１つまたは複数の治療用モノクローナル抗体、例えば、３Ｆ８、アバゴボマブ（Abagovomab）、アデカツムマブ（Adecatumumab）、アフツズマブ、アラシズマブ（Alacizumab）、アレムツズマブ、アルツモマブペンテテート（Altumomabpentetate）、アナツモマブマフェナトクス（Anatumomab mafenatox）、アポリズマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ（Bavituximab）、ベクツモマブ（Bectumomab）、ベリムマブ、ベジレソマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン（Bivatuzumab mertansine）、ブリナツモマブ（Blinatumomab）、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブメルタンシン、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス（Citatuzumab bogatox）、シクスツムマブ、クリバツズマブテトラキセタン（Clivatuzumabtetraxetan）、コナツムマブ、ダセツズマブ、デツモマブ（Detumomab）、エクロメキシマブ（Ecromeximab）、エクリズマブ、エドレコロマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ（Ertumaxomab）、エタラシズマブ、ファルレツズマブ（Farletuzumab）、フィギツムマブ（Figitumumab）、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギレンツキシマブ（Girentuximab）、グレムバツムマブベドチン（Glembatumumab vedotin）、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ（Igovomab）、イムシロマブ（Imciromab）、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ（Iratumumab）、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブメルタンシン（Lorvotuzumab mertansine）、ルカツムマブ（Lucatumumab）、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ（Metelimumab）、ミラツズマブ、ミツモマブ（Mitumomab）、モロリムマブ（Morolimumab）、ナコロマブタフェナトクス（Nacolomabtafenatox）、ナプツモマブエスタフェナトクス、ネシツムマブ、ニモツズマブ（Nimotuzumab）、ノフェツモマブメルペンタン、オファツムマブ、オララツマブ、オポルツズマブモナトクス（Oportuzumab monatox）、オレゴボマブ（Oregovomab）、パニツムマブ、ペムツモマブ（Pemtumomab）、ペルツズマブ、ピンツモマブ（Pintumomab）、プリツムマブ（Pritumumab）、ラムシルマブ、リロツムマブ（Rilotumumab）、リツキシマブ、ロバツムマブ（Robatumumab）、サツモマブペンデチド（Satumomab pendetide）、シブロツズマブ（Sibrotuzumab）、ソネプシズマブ（Sonepcizumab）、タカツズマブテトラキセタン、タプリツモマブパプトクス（Taplitumomab paptox）、テナツモマブ（Tenatumomab）、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（トレメリムマブ）、チガツズマブ（Tigatuzumab）、ＴＮＸ−６５０、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン（Tucotuzumab celmoleukin）、ベルツズマブ、ボロシキシマブ（Volociximab）、ボツムマブ（Votumumab）、またはザルツムマブを投与することをさらに含む。一部の実施例では、異種ＯＲＦは、これらの治療用抗体のうちの１つをコードする。
【０１２９】
一部の種類のがんの別の一般的な処置は、外科処置、例えば、がんまたはその一部分の外科切除である。処置の別の例は、腫瘍を根絶させるか外科切除の前にそれを退縮させるのを補助するために、放射線療法、例えば、放射性材料またはエネルギー（外部光線療法など）を、腫瘍部位に投与することである。
【０１３０】
薬剤および投薬量の選択は、処置されている所与の疾患に基づいて、当業者によって容易に決定することができる。薬剤または組成物の組合せは、並行して（例えば、１つの混合物として）、別個であるが同時に（例えば、別個の静脈ラインを介して）、または順次に（例えば、１つの薬剤がまず投与され、その後に第２の薬剤が投与される）のいずれかで投与され得る。したがって、組合せという用語は、２つまたはそれよりも多い薬剤または組成物の並行投与、同時投与、または順次投与を指して使用される。
【０１３１】
本明細書において開示される方法によると、被験体には、有効量の、本明細書において提供される薬剤のうちの１つまたは複数が投与される。有効量は、所望される生理学的応答（例えば、がん細胞の殺滅）をもたらすのに必要な任意の量として定義される。治療剤は、典型的に、１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの初回投薬量で投与される。約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲を、使用することができる。投薬量は、しかしながら、被験体の要件、処置されている状態の重症度、および用いられている化合物に応じて変動し得る。例えば、投薬量は、特定の被験体において診断されたがんの種類およびステージを考慮して、経験的に決定され得る。被験体に投与される用量は、提供される方法の文脈では、患者において経時的に有益な治療応答をもたらすのに十分であるものとする。特定の状況にとって適正な投薬量の決定は、当業者の技能の範囲内である。したがって、薬剤を投与するのに有効な量およびスケジュールは、当業者によって経験的に決定され得る。投薬量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などといった実質的な有害な副作用を引き起こすまでに多量であるべきではない。投薬量は、いずれかの禁忌が生じた場合には、個々の医師によって調整することができる。所与のクラスの医薬品の適切な投薬量についてのガイダンスは、文献において見出すことができる。
【０１３２】
腫瘍細胞を、本明細書において開示される組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルスゲノム、またはその組成物と接触させることによって、腫瘍細胞の生存度または増殖を阻害する方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。他の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法であり、腫瘍細胞を接触させることは、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルスゲノム、または組成物を、腫瘍を有する被験体に投与することを含む。
【０１３３】
被験体に、治療有効量の、本明細書において開示される組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノム（またはその組成物）を投与することによって、被験体における腫瘍の進行を阻害するか、または腫瘍の体積を低減させる方法が、さらに提供される。
【０１３４】
被験体に、治療有効量の、本明細書において開示される組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノム（またはその組成物）を投与することによって、被験体におけるがんを処置する方法もまた、提供される。
【０１３５】
ＶＩＩＩ．ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣ
アデノウイルスゲノムは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、およびＬ１−５とラベル付けされた複数の機能的な群に組織化される。Ｅ１領域は、すべての他のウイルス遺伝子の転写を調節するタンパク質をコードし、宿主細胞にＳ期を誘導する。Ｅ２領域は、ウイルスＤＮＡ複製を駆動させるタンパク質をコードする。Ｅ３領域のタンパク質は、宿主細胞の免疫応答をモジュレートし、細胞培養においては必須ではない。Ｅ４領域は、異なる機能セットの遺伝子を含有する。そしてＬ１−５領域は、ウイルス粒子の構造タンパク質をコードする。
【０１３６】
機能性のこの天然の隔離を利用し、本発明者らは、これまでに、図６Ａに示されるように、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、およびコアの４つのプラスミドに分離することによって、３６ｋｂのＡｄゲノムの迅速かつ容易な操作を可能にする、組換えアデノウイルスアセンブリの方法を開発した（ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣ、国際公開第２０１２／０２４３５１号を参照されたく、これは、参照により本明細書に組み込まれる）。それらのより合理的なサイズのため、これらのより小さなプラスミドは、標準的な技法を使用して操作することが容易である。
【０１３７】
ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣにより、適合性のあるゲノムライブラリーの部分から、４時間以内に、新規な特質を有するアデノウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコンビナトリアルアセンブリを可能とする。ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣは、新規な特質を有する合成ウイルスを、４つの機能的部分のライブラリーを使用してアセンブリすることを可能にする、一般的なゲノム設計プラットフォームを提供する（図６Ａ）。これらの部分のライブラリーは、複数部位特異的組換え部位（Ａｄｓｅｍｂｌｙ、図６Ｂ）または配列非依存性シームレスクローニング（ＡｄＳＬＩＣ、図６Ｃ）のいずれかを使用して、あらゆる可能な組合せで再アセンブリすることができる。
【０１３８】
ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣの技術は、固有の能力を有するアデノウイルスのモジュール設計および産生を可能にする。自動化された高スループットの様式でウイルスを設計、製造、および試験する能力を開発することにより、治療研究、診断研究、および調査研究のための新しいウイルスの開発が、加速し、拡大されるであろう。
【０１３９】
クローニングステップは、かつては、新しいウイルス構築物の産生の障害であったが、ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣの出現により、ウイルスゲノムを構築する能力は、それらを試験する能力を凌ぐようになった。同等に高スループットの動態アッセイは、ＡｄｓｅｍｂｌｙおよびＡｄＳＬＩＣの方法を使用して、合成の個別化されたウイルス治療および診断の最大限の可能性および高コンテンツなアセンブリを引き出すために、極めて重要である。
【０１４０】
以下の実施例は、ある特定の具体的な特性および／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載される特定の特性または実施形態に限定するとみなされるものではない。
【実施例】
【０１４１】
（実施例１：アデノウイルスゲノムにおける外因性ＯＲＦの最適な位置の特定）
この実施例では、ウイルス動態を破壊することなく、自己切断ペプチド配列とともに、外因性ＯＲＦを挿入することができる、アデノウイルスゲノム内での特異的な位置の特定について記載する。
【０１４２】
アデノウイルスベクターへの外因性遺伝子の挿入は、アデノウイルスキャプシドのサイズ容量によって制限される。外因性核酸の過剰な追加により、キャプシドへのゲノムローディングが不完全となり、ウイルス動態が低減される。アデノウイルスゲノムにおいて利用できる空間が制限されていることにより提示される課題の解決策は、外因性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、融合生成物として本来のアデノウイルスＯＲＦ内に位置づけることである。この戦略は、すでにゲノムにコードされているアデノウイルスプロモーター、５’ＵＴＲ、およびポリＡ尾部を利用する。しかしながら、本来のアデノウイルスタンパク質と外因性タンパク質との融合体の発現は、一方または両方のタンパク質機能に有害となり得、アデノウイルス複製動態の有意な減少をもたらし得る。実際に、本明細書において開示される研究は、外因性ＯＲＦのアデノウイルスＥ１Ａ、ＤＮＡポリメラーゼ、またはＡＤＰのＯＲＦへの直接的な融合が、アデノウイルス複製動態を有意に阻害することを実証している。加えて、本発明者らは、これまでに、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して外因性ＯＲＦを挿入することを試みたが、これも、野生型動態を有する組換えウイルスの産生に失敗している。
【０１４３】
この実施例では、本来のアデノウイルスＯＲＦと外因性ＯＲＦとの間に配置される自己切断ペプチド配列を使用することによる、この問題に対する解決策について記載する。単一のｍＲＮＡ上の２つのＯＲＦの間に配置された場合、自己切断ペプチド配列の存在により、リボソームスキップが生じ、第１のタンパク質が第２のタンパク質とは別個に放出される。この実施例において生成されるアデノウイルス構築物では、自己切断ペプチドＰ２Ａおよび異種ＯＲＦとして蛍光タンパク質（例えば、ＹＰｅｔ、ｍＣｈｅｒｒｙ）を使用する。
【０１４４】
以下の表は、生成した構築物の一覧を提供し、２つの異なる細胞株（２９３−Ｅ４細胞およびＡ５４９細胞）における外因性ＯＲＦの発現レベル（低い、中等度、または高い）およびウイルス複製動態のレベル（低い、中等度、または高い）を示す。
【表２】
2019509037.tif 000006
【０１４５】
両方の細胞型において「高い」複製動態（すなわち、野生型アデノウイルスに匹敵する複製動態）を呈する構築物を、治療用アデノウイルス構築物を生成するための候補と考える（太字で示す）。加えて、ファイバー−Ｐ２Ａ−異種ＯＲＦ構築物は、ウイルス複製に有意な欠損を呈したが、極めて高いレベルの異種タンパク質の発現をもたらした。したがって、これらのファイバー構築物もまた、組換え欠損アデノウイルスの文脈において、高いレベルの治療用タンパク質の産生のために治療的適用において使用することができる。
【０１４６】
直接的な融合とＰ２Ａ部位の挿入との比較
蛍光タンパク質をアデノウイルスＯＲＦに直接的に融合したいくつかの構築物を、生成した。具体的には、以下の直接的融合体を、生成した：ＹＰｅｔ−Ｅ１Ａ、ＹＰｅｔ（ＤＮＡポリメラーゼ）、およびｍＣｈｅｒｒｙ−ＡＤＰ。
【０１４７】
ＹＰｅｔ−Ｅ１Ａアデノウイルスは、ウイルス動態における有意な減損を呈した。Ｐ２Ａ部位をＹＰｅｔとＥ１Ａとの間に挿入すること（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ１Ａ）により、ウイルス動態は改善されたが、ウイルス動態が野生型レベルまで回復することはなかった。次いで、Ｅ１ＡのＣ末端へのＰ２ＡおよびＹＰｅｔの融合を試験するために、別の構築物を生成した（Ｅ１Ａ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）。この構築物は、ウイルス動態がさらに改善されたが、ここでも、動態が野生型アデノウイルスのレベルまで回復することはなかった。
【０１４８】
ＹＰｅｔ−（ＤＮＡ−ポリ）ゲノムプラスミドをトランスフェクトする試みを数回行ったが、生存能力のあるウイルスの産生は失敗した（プラークが全く形成されなかった）。しかしながら、ＹＰｅｔ−Ｐ２ＡをＤＮＡポリメラーゼのＮ末端に融合させると（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−（ＤＮＡポリ））、上記の表に示されるように、野生型動態を有するウイルスが産生された。
【０１４９】
加えて、ｍＣｈｅｒｒｙのＡＤＰへの直接的な融合（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＡＤＰ）により、有意に減損された動態を有するウイルスが産生された。しかしながら、Ｐ２Ａ部位をｍＣｈｅｒｒｙ  ＯＲＦとＡＤＰ  ＯＲＦとの間に挿入すると、野生型動態を有するウイルスが得られた（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ）。異なる蛍光タンパク質を使用しても、同じ結果が得られ、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ構築物は、野生型ウイルス動態を呈した。しかしながら、ＡＤＰのＣ末端側にＰ２Ａおよび異種ＯＲＦを配置すると、複製しないウイルスが産生された。したがって、ＡＤＰについては、異種ＯＲＦは、Ｎ末端に配置しなければならない。
【０１５０】
ファイバーへの直接的な融合、およびファイバーと異種ＯＲＦとの間へのＰ２Ａ部位の挿入のいずれによっても、有意に減損された複製動態を有するウイルスが産生された。しかしながら、ファイバー−Ｐ２Ａ−異種ＯＲＦを含む組換えアデノウイルスは、極めて高い異種タンパク質（この実施例ではＹＰｅｔまたは青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ））の発現レベルを呈した。
【０１５１】
野生型ウイルス動態を有する追加の構築物
図７は、６種類の異なる構築物の自然対数スロープの比較を示す：ＹＰｅｔ−Ｅ１Ａ、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ１Ａ、Ｅ１Ａ−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｅ１Ｂ−５５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ、およびファイバー−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ。上述のように、ＹＰｅｔのＥ１Ａへの直接的な融合により、有意に減損された動態を有するウイルスが産生され、Ｐ２Ａ部位をＮ末端（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ１Ａ）またはＣ末端（Ｅ１Ａ−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ）のいずれかに付加することにより、ウイルス動態は改善されたが、野生型レベルには至らなかった。しかしながら、Ｐ２Ａ部位および異種ＯＲＦを、Ｅ１Ｂ−５５ｋのＣ末端（Ｅ１Ｂ−５５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）またはＡＤＰのＮ末端（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ）に挿入することにより、野生型ウイルス動態を有する組換えウイルスが生成された。
【０１５２】
Ｐ２Ａ部位および異種ＯＲＦをＤＢＰのＣ末端（ＤＢＰ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）もしくはＥ３−１４．７ｋのＣ末端（Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ）に有する構築物、またはＰ２Ａ部位および異種ＯＲＦをＥ４−ＯＲＦ２のＮ末端（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２およびｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２）に有する構築物のウイルス動態の評価により、野生型複製動態を有するウイルスが得られた。
【０１５３】
これらのデータの結果は、少なくとも以下のアデノウイルスゲノム構築物を、治療用アデノウイルス構築物を開発するために使用することができることを示す。
Ｅ１Ｂ−５５ｋ−Ｐ２Ａ−異種ＯＲＦ
異種ＯＲＦ−Ｐ２Ａ−（ＤＮＡポリメラーゼ）
ＤＢＰ−ＳＣ−異種ＯＲＦ
異種ＯＲＦ−ＳＣ−ＡＤＰ
Ｅ３−１４．７ｋ−ＳＣ−異種ＯＲＦ
異種ＯＲＦ−Ｐ２Ａ−Ｅ４−ＯＲＦ２
ファイバー−Ｐ２Ａ−異種ＯＲＦ
【０１５４】
治療的適用について、異種ＯＲＦは、治療用タンパク質をコードする。
【０１５５】
他のアデノウイルス血清型
これまでに説明されているウイルス動態を測定する方法は、すべて、細胞型特異的アッセイに高度に依存し、したがって、それぞれのアデノウイルス血清型の多様な親和性に起因して、血清型特異的である。本明細書において開示されるアデノウイルス動態アッセイは、いずれか１つの細胞型に依存するものではなく、そのため、Ａｄ５以外の血清型に拡張することが可能である。すべてのアデノウイルス血清型は、Ａｄ５  Ｅ３−１４．７ｋと同等のＯＲＦを含有する。したがって、Ａｄ９（Ｅ３−１５ｋを含有する）およびＡｄ３４（Ｅ３−１４．８ｋを含有する）を使用して、Ａｄ５  Ｅ３−１４．７ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ（ＰＣＭＮ−８８７、配列番号９）と同等のウイルスを生成した：ＰＣＭＮ−８８８（Ａｄ９  Ｅ３−１５ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、配列番号２２）およびＰＣＭＮ−８８９（Ａｄ３４  Ｅ３−１４．８ｋ−Ｐ２Ａ−ＹＰｅｔ、配列番号２３）。Ａｄ５コア、ならびにＡｄ９またはＡｄ３４のいずれかに由来するファイバーシャフトおよびノブを含有するキメラウイルスもまた、生成した。次いで、４つの組換えウイルスを、２９３細胞（図９Ａ）、Ａ５４９細胞（図９Ｂ）、およびＵ２ＯＳ細胞（図９Ｃ）を使用して、ＦＢＶＫアッセイにおいて試験した。４つすべての組換えウイルスは、高いレベルのＹＰｅｔ発現を呈し、外因性ＯＲＦの挿入によって生じるウイルス動態への影響は最小限であった。
【０１５６】
（実施例２：アデノウイルスの複製動態を評価するための方法）
組換えアデノウイルスをアセンブリするためのＡｄｓｅｍｂｌｙ方法およびＡｄＳＬＩＣ方法は、短時間で、多数の組換えウイルスゲノムおよびウイルスを生成するための手段を提供する。しかしながら、臨床上および治療上の使用のために設計された組換えアデノウイルスの複製動態を評価する高速かつ高スループットな方法に対する必要性が存在する。この実施例では、組換えアデノウイルスのウイルス複製動態を試験するために使用することができる、蛍光に基づくウイルス動態アッセイについて説明する（図３）。このアッセイは、組換えアデノウイルスゲノムプラスミドまたは組換えアデノウイルス粒子のいずれかを出発材料として用いて、行うことができる。
【０１５７】
組換えアデノウイルスゲノムを用いて開始する場合、アッセイには、細胞にアデノウイルスゲノムプラスミド（実施例１において上述のものなど）をトランスフェクトし、フルオロフォアの発現を経時的にモニタリングすることが含まれる（図４Ａ〜４Ｂ）。トランスフェクション条件は、細胞のうちの約５〜１０％が、初回にトランスフェクトされるように、選択する。初回にトランスフェクトされなかった細胞は、初回のトランスフェクションによって産生されたウイルス粒子による二次感染に利用可能である。対数スロープを、二次感染、三次感染、および四次感染（など）に基づく動態の尺度として使用するため、初回にトランスフェクトされた細胞の割合を把握する必要はない。図４Ａおよび４Ｂは、組換えアデノウイルスゲノムプラスミドを用いて開始する例示的なウイルスに基づく動態アッセイを示す。この実施例では、４８ウェルプレートを使用しており、これにより、１４種類の異なるウイルス構築物を（３連で）同時に試験することが可能となる。４８ウェルプレートの上半分（図４Ａ）には、６種類の異なるウイルス、３つの模擬感染ウェル、およびツール感度変動を補償するＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズを有する３つの「ブランク」ウェルが含まれる。４８ウェルプレートの下半分（図４Ｂ）には、８種類の異なるウイルス構築物の３連のウェルが含まれる。細胞をトランスフェクトしたら、プレートを、継続的な蛍光モニタリングのために、ＴＥＣＡＮ（商標）プレートリーダーに設置する。収集したデータを使用して、各構築物の自然対数スロープを計算する（図８）。
【０１５８】
このアッセイは、細胞に組換えウイルス粒子を感染させることによって行うこともできる。このバージョンのアッセイでは、細胞に、組換えウイルス粒子を感染させ、フルオロフォア発現を、経時的にモニタリングする（図５）。ゲノムプラスミドバージョンのアッセイと同様に、開始時のウイルスストックの正確な力価を把握する必要はない。典型的には、図５に示されるように、希釈系列、例えば、１：１００から１：２１８，７００の範囲の希釈系列を、初回感染に使用する。１：１００の希釈物では、一般に、すべての細胞の感染がもたらされ、一方で、１：２１８，７００の希釈物では、一般に、非常に少ない細胞の初回感染がもたらされる。この実施例では、９６ウェルプレートを使用しており、１１種類の異なるウイルス構築物を、８つの異なる希釈物（１：１００、１：３００、１：９００、１：２７００、１：８１００、１：２４，３００、１：７２，９００、および１：２１８，７００）で同時に試験する。プレートには、模擬感染細胞の４つのウェルおよびＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（商標）ビーズの４つのウェルも含まれる。細胞を感染させたら、プレートを、継続的な蛍光モニタリングのために、ＴＥＣＡＮ（商標）プレートリーダーに設置する。収集したデータを使用して、各構築物の自然対数スロープを計算する（図８）。
【０１５９】
ＴＥＣＡＮ（商標）プレートリーダーは、インキュベーション機能も提供する（適切な温度、ならびにＣＯ２レベルおよびＯ２レベルを維持する）。データ点を、１５分ごとに取得して、自然対数スロープを計算する。これらの方法を使用することで、多数の異なるウイルス間および異なる細胞型間で、動態を高速かつ効率的に比較することが可能である。例えば、特定の組換えアデノウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスとして治療的に使用することができるかどうかを評価するためには、このアッセイを用いて、腫瘍細胞において高い複製動態を呈するが、非腫瘍細胞においては緩徐なウイルス動態を呈するウイルスを見出すことができる。さらに、組換えウイルスのウイルス動態は、このアッセイにおいて目的の腫瘍細胞型に感染またはトランスフェクトを行うことによって、評価することができる。
【０１６０】
対数スロープの計算
対数スロープを測定するために、時間に対する蛍光強度の線形プロットを、それぞれの時点で測定した蛍光強度の自然対数を取得することによって、片対数プロットに変換する。蛍光強度は、ウイルス複製時には指数関数的増殖を呈するため、この変換は、時間に対する自然対数（蛍光強度）をプロットすると直線となる。次いで、この直線を、標準的な最小二乗法を使用して当てはめる。この当てはめにより産生された結果として得られるスロープは、時間に対する蛍光の自然対数スロープであり、したがって、時間に対するウイルス増殖の自然対数スロープである。式を、以下に示す。
【数１】
2019509037.tif 000007
式中、ＦＩは、測定された蛍光強度であり、ｔは時間であり、Ｆ０は、時間＝ｔ０における初期蛍光強度であり、αは自然対数スロープである。
両側の自然対数を取得すると：
【数２】
2019509037.tif 000008
右手側は、αの自然対数スロープを有する線形方程式となる。
【０１６１】
本開示の原理を適用することができる多数の可能性のある実施形態を考慮して、例示された実施形態が、本発明の例にすぎず、本発明の範囲を限定するものとして捉えられるものではないことを認識されたい。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定められる。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および趣旨の範囲内のものすべてに関して、本発明者らの発明として権利を主張する。
【図１】
2019509037.tif 000009
【図２】
2019509037.tif 000010
【図３】
2019509037.tif 000011
【図４Ａ】
2019509037.tif 000012
【図４Ｂ】
2019509037.tif 000013
【図５】
2019509037.tif 000014
【図６Ａ】
2019509037.tif 000015
【図６Ｂ】
2019509037.tif 000016
【図６Ｃ】
2019509037.tif 000017
【図７】
2019509037.tif 000018
【図８】
2019509037.tif 000019
【図９Ａ】
2019509037.tif 000020
【図９Ｂ】
2019509037.tif 000021
【図９Ｃ】
2019509037.tif 000022
【配列表】
2019509037000001.app
【国際調査報告】
2019509037.tif 000023
2019509037.tif 000024
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