(57)【要約】  配列決定用のポリヌクレオチドを調製する配列決定アダプターおよび方法が、提供される。配列決定アダプターは、メチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含有する。標的ポリヌクレオチドへのアダプターのライゲーション中に形成される不要なアダプター二量体は、完全な制限配列を作製し、エンドヌクレアーゼに続くエキソヌクレアーゼ消化により切断され、それにより二量体が除去される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列決定用の標的ＤＮＡ二重鎖を調製する方法であって：
（ａ）複数の配列決定アダプターを提供する工程であり、
前記アダプターのそれぞれが二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含み、前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域がその末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、ここで２つのアダプターの前記二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、前記メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成される、前記工程；
（ｂ）平滑末端化した複数の標的ＤＮＡ二重鎖の第１および第２末端に前記配列決定アダプターの二重鎖領域を共有結合し、それにより前記標的ＤＮＡ二重鎖の各末端で共有結合した配列決定アダプターを含む、アダプターに連結した標的ＤＮＡ二重鎖を複数作製する工程、ならびに、
（ｃ）もしあれば、メチル依存的エンドヌクレアーゼによる消化に続く１つ以上のエキソヌクレアーゼによる消化によりアダプター二量体を除去する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記アダプターのそれぞれが一本鎖ポリヌクレオチドヘアピン領域および前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アダプターのそれぞれが第１および第２のポリヌクレオチド鎖を含む直鎖ポリヌクレオチドであり、各アダプターが前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含む第１の末端、ならびに前記第１の鎖の３’末端および前記第２の鎖の５’末端を含む第２の末端を含み、前記第１の鎖が前記３’末端またはその近傍にチオネート化ヌクレオチドを含む一本鎖３’突出領域を含み、前記第２の鎖が５’末端またはその近傍にチオネート化ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アダプターのそれぞれにある前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域が３’末端を含む第２の鎖にハイブリダイズする５’末端を含む第１の鎖を含み、前記第１の鎖が前記第２の鎖の前記３’末端にある配列ＣＣＭｅにハイブリダイズする配列ＧＧを５’末端に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アダプターのそれぞれにある前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域が３’末端を含む第２の鎖にハイブリダイズする５’末端を含む第１の鎖を含み、前記第１の鎖が前記３’末端にある配列ＧＡＭｅにハイブリダイズする配列ＴＣを５’末端に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）がリガーゼ酵素で共有結合する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的ＤＮＡが非メチル化ヌクレオチドを用いて合成されたゲノムＤＮＡの断片のコピーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
配列決定される標的ＤＮＡ二重鎖に配列決定アダプターを共有結合的に付加する工程を含む、配列決定用のポリヌクレオチドサンプルを調製する方法であって、配列決定用の前記ポリヌクレオチドサンプルが請求項１に記載の方法にしたがって調製され、約１％未満のアダプター二量体を含む、前記方法。
【請求項９】
請求項２に記載の配列決定用の標的ＤＮＡ二重鎖を調製する工程を含む、ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、各アダプターの前記一本鎖ヘアピン領域がプライマー結合配列を含み、前記方法が：
（ｄ）前記プライマー結合配列にプライマーをハイブリダイズさせる工程、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により前記プライマーを伸長する工程、および、それにより配列決定用のプライマー伸長産物を調製する工程をさらに含む、前記方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の配列決定用の標的ＤＮＡ二重鎖を調製する工程を含む、ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、前記一本鎖３’突出領域がプライマー結合配列を含み、前記方法が：
（ｄ）前記プライマー結合配列にプライマーをハイブリダイズさせる工程、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により前記プライマーを伸長する工程、および、それにより配列決定用のプライマー伸長産物を調製する工程をさらに含む、前記方法。
【請求項１１】
二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含むポリヌクレオチド配列決定用のアダプターであって、前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域がその末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、２つのアダプターの前記二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、前記メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成されることになる、前記ポリヌクレオチド配列決定用のアダプター。
【請求項１２】
標的ＤＮＡ二重鎖の各末端で共有結合された請求項１１に記載の配列決定アダプターを含むアダプターに連結されたＤＮＡ二重鎖を複数含むポリヌクレオチドサンプルを配列決定する工程を含み、前記ポリヌクレオチドサンプルが、約１％未満のアダプター二量体を含む、ポリヌクレオチドを配列決定する方法。
【請求項１３】
標的ＤＮＡ二重鎖の各末端で共有結合された請求項１１に記載の配列決定アダプターを含むアダプターに連結されたＤＮＡ二重鎖を複数含み、約１％未満のアダプター二量体を含む、配列決定用のポリヌクレオチドサンプル。
【請求項１４】
（ａ）請求項１１に記載の複数のアダプター；および
（ｂ）配列決定用の標的ＤＮＡ二重鎖を調製するための説明書、
を含む、ポリヌクレオチド配列決定のためのキット。
【請求項１５】
配列決定用の標的ＤＮＡ二重鎖を調製する方法であって：
（ａ）平滑末端化した複数の標的ＤＮＡ二重鎖の第１および第２末端に複数の配列決定アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を共有結合し、それにより前記標的ＤＮＡ二重鎖の各末端で共有結合した配列決定アダプターを含むアダプターに連結された標的ＤＮＡ二重鎖を複数作製する工程であり、
各アダプターの前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域が、その末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、２つのアダプターの前記二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、前記メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成されることになる前記工程；ならびに、
（ｂ）もしあれば、メチル依存的エンドヌクレアーゼによる消化に続く１つ以上のエキソヌクレアーゼによる消化によりアダプター二量体を除去する工程、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列決定サンプル調製混合物から不要なアダプター二量体を除去する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
主要なＤＮＡ配列決定技術は、利用可能な多くの使用のうち、サンプルＤＮＡ断片の末端に特定のＤＮＡアダプターを付加してポリメラーゼプライマー部位を創出する、サンプル捕捉部位を追加する、サンプルを「バーコード化する」、およびサンプルに較正部位を追加することに依存する。アダプター核酸は、配列決定されるＤＮＡサンプルの各末端にライゲートされる。アダプターライゲートされたＤＮＡ断片の創出は、互いにライゲートし、不要な「アダプター二量体」を形成するアダプターをしばしば含む。
【０００３】
現在のところ、アダプター二量体は、磁気ビーズを使用して大きいポリヌクレオチド断片を捕捉し、小さい断片から分離するなど、小さい断片を浄化する工程により除去される。そのような方法は、配列に基づくものではなく、したがって非特異的で、非効率的である。サンプルが環化される場合、環化されないアダプターは、エキソヌクレアーゼによる処理によって露出している末端から脱重合され得る。特に、一組の近いまたは類似のサイズのＤＮＡサンプル断片から環化したアダプター二量体を除去することは特に困難である。浄化する工程は、サイズに基づいて二量体を効率的に除去しない、または多くの時間がかかる。さらに、環状アダプターは、露出している末端がないので、エキソヌクレアーゼにより脱重合され得ない。
【０００４】
不要なアダプター二量体を除去するためのより効率的で、特異的な方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ポリヌクレオチド配列決定用のアダプター、ならびに配列決定方法に使用するための方法およびキットが提供される。本明細書に記述されるアダプターおよび方法を使用して、アダプター二量体を含まないまたはアダプター二量体を非常に低レベルしか含まない配列決定用のポリヌクレオチドサンプルを作製することができ、さもなければアダプター二量体は、ポリヌクレオチド配列決定方法の効率に干渉するまたは効率を減少させることになる。
【０００６】
一態様において、本方法は、配列決定用の標的ＤＮＡ二重鎖を調製するために提供される。本明細書に開示される方法において、アダプターは、メチル依存的エンドヌクレアーゼ認識配列の一部を含み、その配列は、アダプター二量体において共有結合的に接続された場合に、完全な認識配列を形成することになり、エンドヌクレアーゼによる消化の影響を受けることになる。アダプター二量体は、メチル依存的エンドヌクレアーゼによる消化、その後のエキソヌクレアーゼ消化によって除去される。配列決定用の標的ポリヌクレオチドに連結されたアダプターは、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ酵素による消化に感受性でなく、したがって不要なアダプター二量体だけが、サンプルから除去される。
【０００７】
一実施形態において、本方法は、（ａ）平滑末端化した複数の標的ＤＮＡ二重鎖の第１および第２末端に複数の配列決定アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を共有結合し、それにより標的ＤＮＡ二重鎖の各末端で共有結合した配列決定アダプターを含むアダプターに連結された標的ＤＮＡ二重鎖を複数作製する工程であって、各アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域が、その末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、２つのアダプターの二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成されることになる工程と；（ｂ）もしあれば、メチル依存的エンドヌクレアーゼによる消化に続く１つ以上のエキソヌクレアーゼによる消化によりアダプター二量体を除去する工程とを含む。
【０００８】
別の実施形態において、本方法は：（ａ）複数の配列決定アダプターを提供する工程であって、前記アダプターのそれぞれが、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含み、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域が、その末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、２つのアダプターの二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成されることになる工程と；（ｂ）平滑末端化した複数の標的ＤＮＡ二重鎖の第１および第２末端に前記配列決定アダプターの二重鎖領域を共有結合し、それにより標的ＤＮＡ二重鎖の各末端で共有結合した配列決定アダプターを含むアダプターに連結された標的ＤＮＡ二重鎖を複数作製する工程と、（ｃ）もしあれば、メチル依存的エンドヌクレアーゼによる消化に続く１つ以上のエキソヌクレアーゼによる消化によりアダプター二量体を除去する工程とを含む。
【０００９】
アダプターは、一本鎖ヘアピン領域を含んでもよく、または直鎖であってもよい。一実施形態において、アダプターのそれぞれは、一本鎖ポリヌクレオチドヘアピン領域および二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含む。別の実施形態において、アダプターのそれぞれは、第１および第２のポリヌクレオチド鎖を含む直鎖ポリヌクレオチドであり、各アダプターは、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域および３’突出領域を含み、第１の鎖は、３’突出領域を含み、３’末端またはその近傍にエキソヌクレアーゼ消化に抵抗性の修飾ヌクレオチド（例えば、チオネート化ヌクレオチド）を含み、ポリヌクレオチド二重鎖の部分である第２の鎖は、５’末端またはその近傍にエキソヌクレアーゼ消化に抵抗性の修飾ヌクレオチド（例えば、チオネート化ヌクレオチド）を含む。
【００１０】
一部の実施形態において、アダプターのそれぞれにある二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域は、３’末端を持つ第２の鎖にハイブリダイズする５’末端を持つ第１の鎖を含み、第１の鎖は、第２の鎖の３’末端にある配列ＣＭｅＣにハイブリダイズする配列ＧＧを５’末端に含む。メチル依存的エンドヌクレアーゼは、例えば、ＭｓｐＩまたはＭｓｐＩＩであり得、アダプター二量体は、認識配列ＣＣＭｅＧＧを含む。
【００１１】
一部の実施形態において、アダプターのそれぞれにある二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域は、３’末端を持つ第２の鎖にハイブリダイズする５’末端を持つ第１の鎖を含み、第１の鎖は、３’末端にある配列ＧＡＭｅにハイブリダイズする配列ＴＣを５’末端に含む。メチル依存的エンドヌクレアーゼは、例えば、ＤｐｎＩまたはＤｐｎＩＩであり得、アダプター二量体は、認識配列ＧＡＭｅＴＣを含む。
【００１２】
一部の実施形態において、切断されるアダプター二量体の消化に使用されるエキソヌクレアーゼには、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよび／またはＴ５エキソヌクレアーゼがある。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩが使用される。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびＴ５エキソヌクレアーゼが使用される。
【００１３】
一部の実施形態において、リガーゼ酵素を使用して、平滑末端化した標的ＤＮＡ二重鎖の第１および第２末端に配列決定アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を共有結合する。
【００１４】
様々な実施形態において、標的ＤＮＡ二重鎖は、増幅された標的ポリヌクレオチド、ゲノムＤＮＡの非増幅断片、非メチル化ヌクレオチドを用いて合成したゲノムＤＮＡの断片のコピー、および／またはＲＮＡの断片から転写されたｃＤＮＡを含むことができる。様々な実施形態において、標的ＤＮＡ二重鎖は、生体液もしくは組織サンプルおよび／または１つ以上の微生物から得ることができる。
【００１５】
別の態様において、本方法は、配列決定用のポリヌクレオチドサンプルを調製するために提供され、その方法は、本明細書に記述される方法にしたがって、配列決定される標的ＤＮＡ二重鎖に配列決定アダプターを共有結合的に付加する工程を含み、得られた配列決定用のポリヌクレオチドサンプルは、約１％未満のアダプター二量体を含む。
【００１６】
別の態様において、本方法は、配列決定用のポリヌクレオチドサンプルを調製するために提供され、その方法は、本明細書に記述される方法にしたがって、配列決定される標的ＤＮＡ二重鎖に配列決定アダプターを共有結合的に付加する工程を含み、共有結合されたアダプター上のプライマー結合配列にプライマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ酵素でプライマーを伸張させ、それにより配列決定用のプライマー伸長産物を調製する工程を含む。例えば、プライマーを伸張して、標的ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の相補的コピーを作製することができ、コピーは、ポリメラーゼにより合成されるように、配列決定される。一実施形態において、プライマー結合配列は、アダプターの一本鎖ヘアピン領域内にある。別の実施形態において、プライマー結合配列は、アダプターの３’一本鎖突出領域にある。
【００１７】
別の態様において、アダプターは、ポリヌクレオチド配列決定用に提供される。アダプターは、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含み、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域は、その末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、２つのアダプターの二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成されることになる。
【００１８】
一実施形態において、アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドヘアピン領域および二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含み、任意選択で、ヘアピン領域にプライマー結合部位を含む。
【００１９】
一実施形態において、アダプターは、第１および第２のポリヌクレオチド鎖を含む直鎖ポリヌクレオチドであり、アダプターは、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域および３’突出領域を含み、第１の鎖は、３’突出領域を含み、３’末端またはその近傍にエキソヌクレアーゼ消化に抵抗性の修飾（例えば、チオネート化）ヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチド二重鎖の部分である第２の鎖は、５’末端またはその近傍にエキソヌクレアーゼ消化に抵抗性の修飾（例えば、チオネート化）ヌクレオチドを含む。
【００２０】
一実施形態において、アダプターにある二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖は、３’末端を持つ第２の鎖にハイブリダイズする５’末端を持つ第１の鎖を含み、第１の鎖は、第２の鎖の３’末端にある配列ＣＭｅＣにハイブリダイズする配列ＧＧを５’末端に含む。
【００２１】
一実施形態において、アダプターにある二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖は、３’末端を持つ第２の鎖にハイブリダイズする５’末端を持つ第１の鎖を含み、第１の鎖は、３’末端にある配列ＧＡＭｅにハイブリダイズする配列ＴＣを５’末端に含む。
【００２２】
別の態様において、本方法が、ポリヌクレオチドを配列決定するために提供され、その方法は、標的ＤＮＡ二重鎖の各末端で共有結合された本明細書に記載の配列決定アダプターを含むアダプターに連結されたＤＮＡ二重鎖を複数含むポリヌクレオチドサンプルを配列決定する工程を含み、ポリヌクレオチドサンプルは、約１％未満のアダプター二量体を含む。
【００２３】
別の態様において、配列決定用のポリヌクレオチドサンプルが提供され、サンプルは、標的ＤＮＡ二重鎖の各末端で共有結合された本明細書に記載の配列決定アダプターを含むアダプターに連結されたＤＮＡ二重鎖を複数含み、ポリヌクレオチドサンプルは、約１％未満のアダプター二量体を含む。
【００２４】
別の態様において、キットが、ポリヌクレオチド配列決定用に提供される。一部の実施形態において、キットは：（ａ）本明細書に記載の複数の配列決定アダプター；および（ｂ）本明細書に記載の配列決定用の標的ＤＮＡ二重鎖を調製するための説明書を含む。一部の実施形態において、キットは、（ｃ）リガーゼ酵素；（ｄ）メチル依存的エンドヌクレアーゼ酵素；（ｅ）１つ以上のエキソヌクレアーゼ酵素；および／または（ｆ）１つ以上の配列決定プライマーをさらに含む。
【００２５】
したがって、本発明は、配列決定用の標的ＤＮＡ二重鎖を調製する方法を提供し、前記方法は：
（ａ）複数の配列決定アダプターを提供する工程であって、前記アダプターのそれぞれが、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含み、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域が、その末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、２つのアダプターの二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成されることになる工程と；
（ｂ）平滑末端化した複数の標的ＤＮＡ二重鎖の第１および第２末端に前記配列決定アダプターの二重鎖領域を共有結合し、それにより標的ＤＮＡ二重鎖の各末端で共有結合した配列決定アダプターを含むアダプターに連結された標的ＤＮＡ二重鎖を複数作製する工程と、
（ｃ）もしあれば、メチル依存的エンドヌクレアーゼによる消化に続く１つ以上のエキソヌクレアーゼによる消化によりアダプター二量体を除去する工程とを含む。
【００２６】
前記アダプターのそれぞれは、一本鎖ポリヌクレオチドヘアピン領域および二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含むことができる。前記アダプターのそれぞれは、第１および第２のポリヌクレオチド鎖を含む直鎖ポリヌクレオチドであり得、各アダプターは、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含む第１の末端、ならびに第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端を含む第２の末端を含み、第１の鎖は、３’末端またはその近傍にチオネート化ヌクレオチドを含む一本鎖３’突出領域を含み、第２の鎖は、５’末端またはその近傍にチオネート化ヌクレオチドを含む。前記アダプターのそれぞれにある二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域は、３’末端を含む第２の鎖にハイブリダイズする５’末端を含む第１の鎖を含むことができ、第１の鎖は、第２の鎖の３’末端にある配列ＣＣＭｅにハイブリダイズする配列ＧＧを５’末端に含む。この場合、メチル依存的エンドヌクレアーゼは、ＭｓｐＩまたはＭｓｐＩＩであり得、アダプター二量体は、認識配列ＣＣＭｅＧＧを含む。
【００２７】
前記アダプターのそれぞれにある二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域は、３’末端を含む第２の鎖にハイブリダイズする５’末端を含む第１の鎖を含むことができ、第１の鎖は、３’末端にある配列ＧＡＭｅにハイブリダイズする配列ＴＣを５’末端に含む。この場合、メチル依存的エンドヌクレアーゼは、ＤｐｎＩまたはＤｐｎＩＩであり得、アダプター二量体は、認識配列ＧＡＭｅＴＣを含む。
【００２８】
エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＴ５エキソヌクレアーゼであり得る。共有結合は、リガーゼ酵素で実行することができる。
【００２９】
標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの増幅された標的ポリヌクレオチドまたは非増幅断片を含むことができる。また、標的ＤＮＡは、非メチル化ヌクレオチドを用いて合成したゲノムＤＮＡの断片のコピーまたはＲＮＡの断片から転写されたｃＤＮＡを含むことができる。標的ＤＮＡは、生体液もしくは組織サンプルまたは１つ以上の微生物から得ることができる。
【００３０】
本発明は、配列決定される標的ＤＮＡ二重鎖に配列決定アダプターを共有結合的に付加する工程を含む、配列決定用のポリヌクレオチドサンプルを調製する方法も提供し、配列決定用のポリヌクレオチドサンプルは、上で開示された方法にしたがって調製され、約１％未満のアダプター二量体を含む。
【００３１】
本発明は、上で開示される配列決定用の標的ＤＮＡ二重鎖を調製する工程を含む、ポリヌクレオチドを配列決定する方法も提供し、各アダプターの一本鎖ヘアピン領域は、プライマー結合配列を含み、前記方法は：
（ｄ）プライマー結合配列にプライマーをハイブリダイズさせる工程と、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により前記プライマーを伸長する工程と、それにより配列決定用のプライマー伸長産物を調製する工程とをさらに含む。この場合、プライマーを伸張して、標的ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の相補的コピーを作製することができ、コピーは、ポリメラーゼにより合成されるように、配列決定される。
【００３２】
本発明は、上で開示される配列決定用の標的ＤＮＡ二重鎖を調製する工程を含む、ポリヌクレオチドを配列決定する方法も含み、一本鎖３’突出領域は、プライマー結合配列を含み、前記方法は：
（ｄ）プライマー結合配列にプライマーをハイブリダイズさせる工程と、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により前記プライマーを伸長する工程と、それにより配列決定用のプライマー伸長産物を調製する工程とをさらに含む。この場合、プライマーを伸張して、標的ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の相補的コピーを作製することができ、コピーは、ポリメラーゼにより合成されるように、配列決定される。
【００３３】
別の態様において、本発明は、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含む、ポリヌクレオチド配列決定用アダプターを提供し、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域は、その末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、２つのアダプターの二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成されることになる。アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドヘアピン領域を含むことができ、プライマー結合配列および二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含むことができる。また、アダプターは、第１および第２のポリヌクレオチド鎖を含む直鎖ポリヌクレオチドであり得、アダプターは、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含む第１の末端、ならびに第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端を含む第２の末端を含み、第１の鎖は、３’末端またはその近傍にチオネート化ヌクレオチドを含む一本鎖３’突出領域を含み、第２の鎖は、５’末端またはその近傍にチオネート化ヌクレオチドを含む。この場合、第１の鎖は、一本鎖３’突出領域にプライマー結合配列を含むことができる。
【００３４】
また、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖は、３’末端を含む第２の鎖にハイブリダイズする５’末端を含む第１の鎖を含むことができ、第１の鎖は、第２の鎖の３’末端にある配列ＣＣＭｅにハイブリダイズする配列ＧＧを５’末端に含む。また、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖は、３’末端を含む第２の鎖にハイブリダイズする５’末端を含む第１の鎖を含むことができ、第１の鎖は、３’末端にある配列ＧＡmeにハイブリダイズする配列ＴＣを５’末端に含む。
【００３５】
さらに別の態様において、本発明は、標的ＤＮＡ二重鎖の各末端で共有結合された請求項２３に記載の配列決定アダプターを含むアダプターに連結されたＤＮＡ二重鎖を複数含むポリヌクレオチドサンプルを配列決定する工程を含むポリヌクレオチドを配列決定する方法を提供し、前記ポリヌクレオチドサンプルは、約１％未満のアダプター二量体を含む。
【００３６】
本発明は、標的ＤＮＡ二重鎖の各末端で共有結合された、上で開示される配列決定アダプターを含むアダプターに連結されたＤＮＡ二重鎖を複数含み、約１％未満のアダプター二量体を含む配列決定用のポリヌクレオチドサンプルも提供する。
【００３７】
本発明は：
（ａ）請求項２３に記載の複数のアダプター；および
（ｂ）配列決定用の標的ＤＮＡ二重鎖を調製するための説明書
を含むポリヌクレオチド配列決定用のキットをさらに提供する。
そのようなキットは：
（ｃ）リガーゼ酵素；
（ｄ）メチル依存的エンドヌクレアーゼ酵素；
（ｅ）１つ以上のエキソヌクレアーゼ酵素；および
（ｆ）１つ以上の配列決定プライマー
のうち１つ以上をさらに含むことができる。
【００３８】
最終的に、本発明は、配列決定用の標的ＤＮＡ二重鎖を調製する方法を提供し、前記方法は：
（ａ）平滑末端化した複数の標的ＤＮＡ二重鎖の第１および第２末端に複数の配列決定アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を共有結合し、それにより標的ＤＮＡ二重鎖の各末端で共有結合した配列決定アダプターを含むアダプターに連結された標的ＤＮＡ二重鎖を複数作製する工程であって、各アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域が、その末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、２つのアダプターの二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成されることになる工程と；
（ｂ）もしあれば、メチル依存的エンドヌクレアーゼによる消化に続く１つ以上のエキソヌクレアーゼによる消化によりアダプター二量体を除去する工程とを含む。
【００３９】
前記アダプターのそれぞれは、一本鎖ポリヌクレオチドヘアピン領域および二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含むことができる。また、前記アダプターのそれぞれは、第１および第２のポリヌクレオチド鎖を含む直鎖ポリヌクレオチドであり得、各アダプターは、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含む第１の末端、ならびに第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端を含む第２の末端を含み、第１の鎖は、３’末端またはその近傍にチオネート化ヌクレオチドを含む一本鎖３’突出領域を含み、第２の鎖は、５’末端またはその近傍にチオネート化ヌクレオチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域および一本鎖ヘアピン領域を持つアダプターの実施形態を示す図である。
【図２】二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域および３’突出領域を持つ直鎖アダプターの実施形態を示す図である。
【図３】２つのアダプターを共にライゲートして、メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列を含むアダプター二量体を形成する実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本方法は、標的ＤＮＡの末端へのライゲーションではなくアダプターの互いのライゲーションによって形成される不要なアダプター二重鎖のレベルが有意でない配列決定用のアダプターに連結されたＤＮＡ二重鎖を調製するために提供される。本明細書に記述される方法において、アダプターは、ＤＮＡ二重鎖の末端で固有の配列を含有し、その中にメチル化ヌクレオチド塩基を含有する。アダプターが、共にライゲートされて二量体を形成すると、これらの配列は、メチル依存的制限エンドヌクレアーゼ酵素の制限部位を形成し、反応混合物からアダプター二量体を特異的に除去するための切断部位を生じる。制限酵素認識部位の残りの配列を含有しない、標的ＤＮＡの末端にライゲートされたアダプターは、切断されず、配列決定用の標的に付加されたまま残る。
【００４２】
本明細書において別段の規定がない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、ら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４年）ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｋｈａｍ、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１年）は、本発明において使用される多数の用語の一般的な辞書を当業者に与える。本明細書に記述される方法および材料と類似または同等の任意のそれらが、本発明の実行または試験に使用され得る。
【００４３】
本発明の実行は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の従来通りの技術を利用することになる。そのような技術は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、編、１９８４年；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９４年）；ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら、編、１９９４年）；およびＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年）に完全に説明されている。
【００４４】
本明細書に提供される数値範囲は、範囲を定義している数の全てを含む。
【００４５】
別段の指示がない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’方向に左から右に書かれ；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右に書かれる。
【００４６】
定義
「Ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明確な指図がない限り複数の参照を含む。
【００４７】
本明細書において用語「アダプター」とは、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖に付加される核酸のことを指す。アダプターは、互いに塩基対になる、すなわち相補的な、２つの固有のオリゴヌクレオチド分子で構成され得る。別法として、アダプターは、相補性の１つ以上の領域および１つ以上の非相補的領域を含む単一のオリゴヌクレオチドで構成され得る。
【００４８】
本明細書では用語「塩基対」または「ｂｐ」とは、二本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の相互関係（すなわち、水素結合した対）のことを指す。一部の実施形態において、塩基対は、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖においてウラシル（Ｕ）と対になったＡを含むことができる。
【００４９】
本明細書において用語「相補的」とは、１本のポリヌクレオチド鎖内または２本のポリヌクレオチド鎖間の二重鎖領域における、塩基対合によるヌクレオチドの対間の配列相補性の広い概念のことを指す。アデニンヌクレオチドが、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特異的水素結合（「塩基対合」）を形成できることは公知である。同様に、シトシンヌクレオチドが、グアニンヌクレオチドと塩基対合できることは公知である。本明細書において「本質的に相補的」とは、１本のポリヌクレオチド鎖または２本のポリヌクレオチド鎖、例えば、アダプターのポリヌクレオチド鎖間の二重鎖領域における配列相補性のことを指し、相補性は、１００％未満であるが、９０％より大きく、例えば、標的ＤＮＡ二重鎖にアダプターを共有結合する条件下で二重鎖領域の安定性を保持する。
【００５０】
用語「から得られる」は、用語「に由来する」、「から入手される」、「から入手できる」、「から単離される」、および「から創出される」を包含し、ある指定された材料が、別の指定された材料中にその起源を見出す、または別の指定された材料を参照して記述され得る特徴を有することを一般に示す。
【００５１】
本明細書において用語「二重鎖」とは、２つのポリヌクレオチド配列間に存在する相補性領域のことを指す。
【００５２】
本明細書において用語「第１の末端」および「第２の末端」とは、核酸分子を参照して使用される場合、直鎖核酸分子の末端のことを指す。
【００５３】
「遺伝子」とは、ポリペプチドの作製に関係し、コード領域に先行するおよびそれに続く領域ならびに個々のコード部分（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含むＤＮＡ部分のことを指す。
【００５４】
核酸配列を細胞に挿入する文脈において用語「導入される」は、「トランスフェクション」、「トランスフォーメーション」または「トランスダクション」を含み、真核生物または原核生物細胞に核酸配列を組み込むことを指し、核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）内に組み込まれ、自律性レプリコンに変換され、または一過性に発現され得る。
【００５５】
本明細書では用語「単離された」、「精製された」、「分離された」、および「回収された」とは、材料（例えば、タンパク質、核酸または細胞）が、天然で関連する少なくとも１つの成分から例えば、含有されるサンプルの少なくとも９０質量％、または少なくとも９５質量％、または少なくとも９８質量％の濃度で取り出されることを指す。例えば、これらの用語は、その生来の状態、例えば完全な生体系など、に見られるような通常付随している成分を実質的または本質的に含まない材料のことを指し得る。単離された核酸分子には、核酸分子を通常発現する細胞に含有されていた核酸分子が含まれるが、単離された核酸分子は、染色体外またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００５６】
本明細書において用語「ライブラリ」とは、鋳型分子（すなわち、標的ＤＮＡ二重鎖）の集まりまたは複数性のことを指し、それらは、５’末端で共通配列および３’末端で共通配列を共有する。鋳型分子の集まりまたは複数性を指す用語「ライブラリ」の使用は、ライブラリを構成する鋳型が、特定の供給源から得られる、または「ライブラリ」が、特定の組成物を有することを意味するととられるべきでない。例として、用語「ライブラリ」の使用は、ライブラリ内の個々の鋳型が、異なるヌクレオチド配列のものでなければならないまたは鋳型が、配列および／もしくは供給源に関して関連がなければならないことを意味するととられるべきでない。
【００５７】
「メチル依存的エンドヌクレアーゼ」は、二本鎖ＤＮＡを切断する制限部位に特定のメチル化塩基を必要とする制限エンドヌクレアーゼ酵素である。
【００５８】
本明細書において用語「突然変異」とは、置換、挿入、欠失（短縮を含む）を含むがこれに限定されない親配列に導入される変化のことを指す。突然変異の結果には、親配列にコードされているタンパク質に見られない新たな性質、特性、機能、表現型または特徴の創出があるが、これに限定されない。
【００５９】
本明細書において用語「ナノ細孔」とは、膜に形成される、さもなければ生成される孔、流路または通路のことを指す。膜は、脂質二重層などの有機膜、またはポリマー材料の形態をなす膜などの合成膜であり得る。ナノ細孔は、例えば相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）もしくは電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路など検出回路または検出回路と繋がれた電極に隣接もしくは近接して配置され得る。いくつかの例において、ナノ細孔は、０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍの桁の特徴的な幅または粒径を有する。いくつかのナノ細孔は、タンパク質である。ＯｍｐＧは、タンパク質ナノ細孔の例である。
【００６０】
本明細書において用語「次世代配列決定（ＮＧＳ）」とは、クローンとして増幅したおよび単一の核酸分子の超並列配列決定を可能にする配列決定方法のことを指し、単一サンプルまたは異なる複数のサンプル由来の複数、例えば、数１００万個の核酸断片が、一斉に配列決定される。ＮＧＳの非限定的な例には、合成時配列決定、ライゲーション時配列決定、リアルタイム配列決定およびナノ細孔配列決定がある。
【００６１】
本明細書において用語「ヌクレオチド」とは、糖部分（ペントース）、リン酸および窒素複素環塩基からなるＤＮＡまたはＲＮＡの単量体単位のことを指す。塩基は、グリコシド炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖部分に連結され、塩基と糖の組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドが、ペントースの３’または５’位置に結合されたリン酸基を含有する場合、それはヌクレオチドと呼ばれる。作動的に連結された重合体ヌクレオチドの一続きは、本明細書において「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」または核酸もしくはポリヌクレオチド「鎖」と一般に称され、左から右の方向が、５’終端から３’終端の従来通りの方向である式により本明細書において表され、重合体配列の「５’」および「３’」末端でそれぞれ終端５’リン酸基および終端３’ヒドロキシル基を参照する。
【００６２】
本明細書において用語「ヌクレオチド類似体」とは、ヌクレオシド三リン酸、例えば、一般的な核酸塩基：アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルおよびチミジンの（Ｓ）−グリセロールヌクレオシド三リン酸（ｇＮＴＰ）類似体のことを指す（Ｈｏｒｈｏｔａら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８：５３４５〜５３４７頁［２００６年］）。ヌクレオシド四リン酸、ヌクレオシド五リン酸およびヌクレオシド六リン酸も、包含される。「メチル化ヌクレオチド」は、メチル基（例えば、３−メチルシトシン、３−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン）の追加により修飾されたヌクレオチドである。メチル化ヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の１文字表記の後の下付き文字「Ｍｅ」で本明細書に示される（例えば、ＣＭｅ）。ヌクレオチド類似体には、エキソヌクレアーゼ消化に抵抗性のヌクレオチド、例えば、チオネート化ヌクレオチドがある。「チオネート化」ヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド（oligonucleodie）のリン酸骨格中の非架橋酸素を硫黄原子に置換するホスホロチオエート（ＰＳ）結合がある。この修飾は、ヌクレオチド間リンケージをヌクレアーゼ分解に抵抗性にする。ホスホロチオエート結合を、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端の最後の３〜５ヌクレオチドの間に導入してエキソヌクレアーゼ分解を阻害することができる。
【００６３】
用語「作動可能に連結される」とは、効果を得るために指定の要素を協調して実行できるようにするそれら要素の並置または配置のことを指す。例えば、プロモーターは、コード配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結されている。
【００６４】
本明細書において用語「ポリメラーゼ」とは、ヌクレオチドの重合を触媒する（すなわち、ポリメラーゼ活性）酵素のことを指す。用語ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を包含する。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。「ＲＮＡポリメラーゼ」は、リボヌクレオチドの重合を触媒する。「逆転写酵素」は、ＲＮＡ鋳型に相補的であるデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。
【００６５】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、鎖内で共有結合したヌクレオチド単量体で構成される重合体分子のことを指すために本明細書において互換的に使用される。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。本明細書では、用語ポリヌクレオチドとは、任意の長さおよび任意の３次元構造ならびに一本または多本鎖（例えば、一本鎖、二本鎖、三本鎖、等）のヌクレオチドの重合体形態のことを指し、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／または修飾ヌクレオチドもしくは塩基もしくはその類似体を含むデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの類似体もしくは修飾形態を含有する。遺伝暗号は縮重しているので、２つ以上のコドンを使用して特定のアミノ酸をコードすることができ、本発明は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドが、使用条件下で所望の機能性を保持する限り、ヌクレアーゼ抵抗性を増加させる修飾（例えば、デオキシ、２’−Ｏ−Ｍｅ、ホスホロチオエート、等）を含めた、任意の型の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を使用することができる。標識、例えば、放射性もしくは非放射性標識またはアンカー、例えばビオチンが、検出または捕捉目的で組み込まれてもよい。用語ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）も含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在しても天然に存在しなくてもよい。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくは両方、ならびに／またはその修飾形態および／もしくは類似体を含有し得る。連続したヌクレオチドは、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。１つ以上のホスホジエステルリンケージが、代わりの連結基により置き換えられ得る。これら代わりの連結基には、それだけには限定されないが、リン酸は、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタル」）によって置き換えられ、各ＲまたはＲ’は、それぞれ独立に、Ｈであり、または任意選択でエーテル（−Ｏ−）リンケージ、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルキル（ａｒａｌｄｙｌ）を含有する置換もしくは無置換アルキル（１〜２０Ｃ）である実施形態が含まれる。ポリヌクレオチド中の全ての結合が必要とは限らず、環状部分とは限らない。
【００６６】
本明細書では、「ポリペプチド」とは、アミノ酸から構成される組成物のことを指し、当業者によりタンパク質と認識される。アミノ酸残基の従来通りの１文字または３文字のコードが、本明細書において使用される。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーのことを指すために本明細書において互換的に使用される。ポリマーは、直鎖または分岐状であり得、修飾アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸により中断されてもよい。用語は、天然もしくは介入により修飾された；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなど他の任意の操作もしくは修飾、アミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の類似体（例えば、非天然のアミノ酸、等を含む）、および当業者に公知の他の修飾を１つ以上含有するポリペプチドもその定義に含まれる。
【００６７】
本明細書において用語「プライマー」とは、天然に存在するか合成によって作製されるかにかかわらず、オリゴヌクレオチドのことを指し、プライマーは、核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、例えば、適当な緩衝液（「緩衝液」は、ｐＨ、イオン強度、補因子、等を含む）中の異なる４つのヌクレオチド三リン酸およびポリメラーゼ酵素、例えば、熱安定酵素の存在下で、適切な温度に置かれた場合に核酸合成の開始点として作用し得る。プライマーは、増幅の最大効率のために好ましくは一本鎖であるが、別法として二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、最初に処理してその鎖が分離される。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、ポリメラーゼ、例えば、耐熱性ポリメラーゼ酵素の存在下で伸長産物の合成を準備するのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源および使用する方法を含めた多くの因子によって決まることになる。例えば、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、１５〜２５ヌクレオチドを一般に含有するが、より多いまたは少ないヌクレオチドを含有することもできる。短いプライマー分子は、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより冷たい温度を一般に必要とする。
【００６８】
「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼを結合して遺伝子の転写を開始することに関係する調節配列のことを指す。プロモーターは、誘導可能なプロモーターまたは構成的プロモーターであり得る。「誘導可能なプロモーター」は、環境または発生調節条件下で活性なプロモーターである。
【００６９】
用語「組換え」とは、コード配列を突然変異させて改変されたポリペプチドを作製する、コード配列を別の遺伝子のコード配列に融合する、遺伝子を異なるプロモーターの制御下に置く、異種生物内で遺伝子を発現させる、低下もしくは上昇レベルで遺伝子を発現させる、天然の発現プロファイルとは異なる様式で条件付きもしくは構成的に遺伝子を発現させる、等によるなど、配列または発現特質を修飾して改変された遺伝物質（すなわち、核酸、それがコードするポリペプチド、およびベクターならびにそのようなポリヌクレオチドを含む細胞）のことを指す。それに基づく組換え核酸、ポリペプチドおよび細胞は、天然に見られる関連する核酸、ポリペプチドおよび細胞と同一でないようにヒトにより一般に操作されている。
【００７０】
用語「選択マーカー」または「選択可能なマーカー」とは、導入された核酸またはベクターを含有する宿主の選択を容易にする宿主細胞において発現が可能な遺伝子のことを指す。選択可能なマーカーの例には、それだけには限らないが、抗生物質（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシンまたはクロラムフェニコール）および／または宿主細胞に対して栄養的な利点など代謝的利点を付与する遺伝子がある。
【００７１】
本明細書において用語「配列決定ライブラリ」とは、例えば超並列方法、例えば、ＮＧＳを使用する配列決定のために加工されるＤＮＡのことを指す。ＤＮＡを任意選択で増幅して、加工されたＤＮＡの複数コピーの集団を得ることができ、そのＤＮＡは、ＮＧＳによって配列決定され得る。
【００７２】
「シグナル配列」（「先行配列」、「シグナルペプチド」、「リーダー配列」または「リーダーペプチド」とも称される）は、細胞からの成熟形態のタンパク質の分泌を促進するタンパク質のＮ末端部分に結合されているアミノ酸配列のことを指す。細胞外タンパク質の成熟形態は、分泌過程の間に切断されるシグナル配列を欠いている。
【００７３】
用語「一本鎖突出」または「突出」とは、ｄｓ核酸分子の相補鎖の終端を越えて伸びている二本鎖（ｄｓ）核酸分子の鎖のことを指すために本明細書において使用される。用語「５’突出」または「５’突出配列」は、ｄｓ核酸分子の相補鎖の３’終端を超えて５’方向に伸びているｄｓ核酸分子の鎖のことを指すために本明細書において使用される。用語「３’突出」または「３’突出配列」は、ｄｓ核酸分子の相補鎖の５’終端を超えて３’方向に伸びているｄｓ核酸分子の鎖のことを指すために本明細書において使用される。
【００７４】
少なくとも２つの核酸またはポリペプチドの文脈において句「実質的に類似の」および「実質的に同一の」とは、参照（例えば、野生型）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの比較において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはさらに９９．５％配列同一性有する配列を含むことを一般に意味する。配列同一性は、標準パラメータを使用してＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮおよびＣＬＵＳＴＡＬなど公知のプログラムを使用して決定され得る。（例えば、Ａｌｔｓｈｕｌら［１９９０年］Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら［１９８９年］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：１０９１５頁；Ｋａｒｉｎら［１９９３年］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：５８７３頁；およびＨｉｇｇｉｎｓら［１９８８年］Ｇｅｎｅ  ７３：２３７頁を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国バイオテクノロジー情報センターによって一般公開されている。また、データベースは、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅｒｓｏｎら［１９８８年］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４〜２４４８頁）を使用して検索され得る。一部の実施形態において、実質的に同一のポリペプチドは、１つ以上の保存的アミノ酸置換だけにより異なる。一部の実施形態において、実質的に同一のポリペプチドは、免疫学的に交差反応性である。一部の実施形態において、実質的に同一の核酸分子は、厳しい条件下（例えば、中程度から高い厳しさの範囲）で互いにハイブリダイズする。
【００７５】
本明細書において核酸「合成」とは、ポリヌクレオチドの新たな鎖を作るまたは鋳型依存的様式で既存のポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を伸長させる任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法のことを指す。合成は、本発明によると、増幅を含むことができ、増幅は、ポリメラーゼを使用してポリヌクレオチド鋳型配列のコピー数を増加させる。ポリヌクレオチド合成（例えば、増幅）は、ポリヌクレオチドへのヌクレオチドの組み込み（例えば、プライマーからの伸長）を生じ、それによってポリヌクレオチド鋳型と相補的な新たなポリヌクレオチド分子を形成する。形成されたポリヌクレオチド分子およびその鋳型は、さらなるポリヌクレオチド分子を合成する鋳型として使用することができる。本明細書では「ＤＮＡ合成」は、それだけには限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含み、例えば、プローブのための標識ヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列決定のためのオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含み得る。
【００７６】
用語「タグ」とは、１つ以上の原子もしくは分子、または原子および分子の集まりであり得る検出可能な部分のことを指す。タグは、光学的、電気化学的、磁気的または静電的（例えば、誘導的、容量的）特徴を与えることができる。タグは、ナノ細孔を通る電流の流れを遮断することができる。
【００７７】
本明細書において用語「タグ付けされたヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリン酸（例えば、終端リン酸）、糖または窒素含有塩基部分を含むがそれに限定されないヌクレオチドの任意の位置とカップリングされたタグ（または、タグ種）を含むヌクレオチドのことを指す。タグは、１つ以上の原子もしくは分子、または原子および分子の集まりであり得る。タグは、光学的、電気化学的、磁気的または静電的（例えば、誘導的、容量的）特徴を与えることができ、その特徴は、ナノ細孔を用いて検出することができる（米国特許出願公開第２０１４／０１３６１６号）。米国特許出願公開第２０１４／０１３６１６号の図１３に示されるように、タグは、ポリリン酸に付加することもできる。
【００７８】
本明細書において用語「標的ＤＮＡ二重鎖」とは、ＤＮＡ、例えば、ゲノムもしくは無細胞ＤＮＡ、および／またはＲＮＡであるサンプルポリヌクレオチドから得られる二本鎖ＤＮＡ分子のことを指す。
【００７９】
本明細書において用語「鋳型ＤＮＡ分子」とは、相補核酸鎖が、例えば、プライマー伸長反応においてＤＮＡポリメラーゼにより合成される核酸の鎖のことを指す。
【００８０】
用語「鋳型−依存的様式」とは、プライマー分子の鋳型依存的伸長（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）を含む過程のことを指す。用語「鋳型−依存的様式」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチド合成のことを一般に指し、ポリヌクレオチドの新しく合成される鎖の配列は、相補的塩基対合の周知の原則に影響される（例えば、Ｗａｔｏｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版．Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｉｎｃ．Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．［１９８７年］を参照のこと）。
【００８１】
本明細書では、「ベクター」とは、１つ以上の細胞型に核酸を導入するように設計されたポリヌクレオチド配列のことを指す。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット、等がある。
【００８２】
関連する（および誘導体）タンパク質は、「バリアント」タンパク質を包含する。バリアントタンパク質は、別のタンパク質（すなわち、親）、および／または互いと少数のアミノ酸残基だけ異なる。バリアントは、それが得られる親タンパク質と比較して、１つ以上のアミノ酸突然変異（例えば、アミノ酸欠失、挿入または置換）を含み得る。一部の実施形態において、異なるアミノ酸残基の数は、約１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のうちいずれかである。一部の実施形態において、バリアントは、約１〜約１０アミノ酸だけ異なる。これとは別にまたは追加的に、バリアントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮおよびＣＬＵＳＴＡＬなどの配列整列化ツールを使用して決定されるように、参照タンパク質または核酸と指定された程度の配列同一性を有し得る（下を参照のこと）。例えば、バリアントタンパク質または核酸は、参照配列と少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらに９９．５％アミノ酸配列同一性を有し得る。
【００８３】
本明細書では、「野生型」、「天然の」および「天然に存在している」タンパク質は、天然に見られるものである。用語「野生型配列」とは、天然に見られるもしくは天然に存在しているアミノ酸または核酸配列のことを指す。一部の実施形態において、野生型配列は、タンパク質工学計画、例えば、バリアントタンパク質の作製、の出発点である。
【００８４】
アダプター
ポリヌクレオチド配列決定のためのアダプターが、本明細書に提供される。アダプターは、その末端にメチル依存的制限エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を有する二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖（例えば、ＤＮＡ二重鎖）領域を含有する。それぞれのポリヌクレオチド二重鎖領域（すなわち、アダプター二量体を形成している）の末端で共に共有結合する（例えば、ライゲートする）２つのアダプターは、メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な配列を形成することになり、エンドヌクレアーゼの存在下で切断を受けることになる。配列決定される標的ポリヌクレオチド二重鎖の末端に共有結合するアダプターは、標的ポリヌクレオチドの末端がエンドヌクレアーゼ認識部位の残りの配列を含有するというまれな例を除いて、エンドヌクレアーゼによる切断を受けないことになる。
【００８５】
一部の実施形態において、図１に図式的に示す通り、アダプターは、一本鎖ヘアピン領域２および二重鎖領域の末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼ配列の一部を含む二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域１を含む。任意選択で、一本鎖ヘアピン領域は、プライマー結合配列３を含む。
【００８６】
一部の実施形態において、図２に図式的に示す通り、アダプターは、第１および第２のポリヌクレオチド鎖（例えば、ＤＮＡ）ならびに第１および第２末端を含有する直鎖ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）である。第１の末端は、メチル依存的エンドヌクレアーゼ配列の一部と二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖２０を含む。第２の末端は、第１の鎖の３’末端またはその近傍にエキソヌクレアーゼ消化に抵抗性の１つ以上の修飾ヌクレオチド２２（例えば、チオネート化ヌクレオチド）を持つ一本鎖３’突出領域２１、および二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域の部分である第２の鎖の５’末端またはその近傍にエキソヌクレアーゼ消化に抵抗性の１つ以上の修飾ヌクレオチド２３（例えば、チオネート化ヌクレオチド）を含む。任意選択で、一本鎖３’突出は、１つ以上のプライマー結合配列２４を含む。一部の実施形態において、一本鎖３’突出領域２１は、長さ８〜約１００ヌクレオチドである。
【００８７】
一部の実施形態において、アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域は、５’末端に配列ＧＧおよび３’末端にＣＣＭｅを含み、２つのアダプターが共に連結された場合配列ＣＣＭｅＧＧを形成する。この配列は、メチル依存的エンドヌクレアーゼＭｓｐＩまたはＭｓｐＩＩの認識配列である。
【００８８】
一部の実施形態において、アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域は、配列ＴＣを５’末端におよびＧＡＭｅを３’末端に含み、２つのアダプターが共に連結された場合配列ＧＡＭｅＴＣを形成する。この配列は、メチル依存的エンドヌクレアーゼＤｐｎＩまたはＤｐｎＩＩの認識配列である。
【００８９】
標的ポリヌクレオチド
本明細書に記述される方法が適用され得る核酸サンプルは、組織サンプル、生体液サンプルまたは細胞サンプルなどの生体サンプル、およびその加工画分から得ることができる。生体液サンプルには、非限定的な例として、血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、耳漏、リンパ液、間質液、唾液、脳脊髄液、洗浄液（ravages）、骨髄懸濁液、膣流出液（vaginal flow）、経頸管洗浄液、脳液、腹水、乳、呼吸の分泌物、腸および尿生殖器管、羊水ならびに白血球除去サンプル（leukophoresis sample）がある。一部の実施形態において、供給源サンプルは、非侵襲的手順により容易に入手できるサンプル、例えば、血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、耳漏および唾液である。一部の実施形態において、生体サンプルは、末梢血サンプルまたは血漿および血清画分である。他の実施形態において、生体サンプルは、綿棒で採取した標本または塗布標本、生検標本または細胞培養である。別の実施形態において、サンプルは２つ以上の生体サンプルの混合物、例えば、生体液サンプル、組織サンプルおよび細胞培養サンプルのうち２つ以上を含む生体サンプルである。本明細書では、用語「血液」、「血漿」および「血清」は、その画分または加工部分を包含する。同様に、サンプルが、生検、綿棒で採取した標本、塗布標本、等から採取される場合、「サンプル」は、生検、綿棒で採取した標本、塗布標本、等から得られる加工画分または部分を包含することができる。
【００９０】
一部の実施形態において、サンプルは、異なる個体のサンプル、同じもしくは異なる個体の異なる発生段階、異なる病的個体（例えばがんである、または遺伝的障害を有すると疑われる個体）、正常な個体（例えば、目的の条件を欠いている個体）、個体において疾患の異なる段階で得られるサンプル、疾患に対して異なる処置に供された個体から得られるサンプル、異なる環境因子に供された個体のサンプル、病理学に対する素因がある個体、感染性疾患病原体（例えば、ＨＩＶ）などの病原体への曝露がある個体、ならびにドナー細胞、組織および／または器官のレシピエントである個体を含むがそれだけには限らない供給源から得ることができる。一部の実施形態において、サンプルは、同じまたは異なる対象から得られる異なる供給源サンプルの混合物を含むサンプルである。例えば、サンプルは、しばしば犯行現場で見られるような、２つ以上の個体から得られる細胞の混合物を含むことができる。一実施形態において、サンプルは、妊娠した女性、例えば妊婦から得られる母性サンプルである。この例において、サンプルを、本明細書に記述される方法を使用して分析して、潜在的胎児異常の出生前診断を得ることができる。特に明記しない限り、母性サンプルは、胎児および母性ＤＮＡ、例えば、ｃｆＤＮＡの混合物を含む。一部の実施形態において、母性サンプルは、生体液サンプル、例えば、血液サンプルである。他の実施形態において、母性サンプルは、精製したｃｆＤＮＡサンプルである。
【００９１】
サンプルは、加工されてない生体サンプル、例えば、全血サンプルであり得る。供給源サンプルは、部分的に加工された生体サンプル、例えば、分画して、実質的に無細胞の血漿画分を得た血液サンプルであり得る。供給源サンプルは、精製された核酸、例えば、本質的に無細胞の血漿サンプルから得られる精製されたｃｆＤＮＡのサンプルを含有する生体サンプルであり得る。サンプルの加工には、例えば、凍結（例えば、組織生検サンプル）固定（例えば、ホルマリン固定）および包埋（例えば、パラフィン包埋）が含まれ得る。サンプルの部分的加工には、例えば、サンプル分画（例えば、血液サンプルから血漿画分を得る）、ならびに臨床試験および／または科学研究との関連など日常的な臨床業務を通じて採集されるサンプルの分析に必要とされる他の加工工程が含まれ得る。さらなる加工工程には、例えば、サンプル核酸を単離および精製する工程が含まれ得る。精製サンプルのさらなる加工には、例えば、配列決定の調製におけるサンプル核酸の必須の修飾の工程が含まれ得る。一部の実施形態において、サンプルは加工されていないまたは部分的に加工されたサンプルである。
【００９２】
サンプルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養組織、細胞または他のポリヌクレオチド含有供給源から得ることもできる。培養サンプルは、様々な培地および条件（例えば、ｐＨ、圧力、温度）で維持された、異なる期間維持された、または異なる因子もしくは試薬（例えば、候補薬物またはモジュレータ）で処理された培養物（例えば、組織または細胞）を含むがこれに限定されない供給源から採取され得る。
【００９３】
生体サンプルは、人間、および哺乳動物を含めた他の生物、植物または対象からの細胞、微生物（例えば、細菌、真菌）またはウイルスを含むがこれに限定されない様々な対象から得ることができる。
【００９４】
本明細書に記述の通り分析され得るサンプルポリヌクレオチドには、ゲノム細胞ＤＮＡ、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡがある。いくつかのＮＧＳ配列決定プラットフォーム用配列決定ライブラリの調製は、ポリヌクレオチドが特定の範囲の断片サイズのものであることが必要であり、大きなポリヌクレオチド、例えば、細胞ゲノムＤＮＡは断片化される必要がある。したがって、ポリヌクレオチド、例えば、細胞ゲノムＤＮＡの断片化が必要な場合がある。機械的手段によるポリヌクレオチド分子の断片化は、Ｃ−Ｏ、Ｐ−ＯおよびＣ−ＣにおいてＤＮＡ骨格を切断し、配列決定用のＤＮＡを調製するために必要とされるその後の酵素反応、例えば、配列決定アダプターのライゲーション、のために修復される必要がある損傷したＣ−Ｏ、Ｐ−Ｏおよび／Ｃ−Ｃ結合を持つ平滑ならびに３’および５’突出末端の不均一な混合物が得られる。別法として、＜３００塩基の断片として存在するｃｆＤＮＡの断片化は、ｃｆＤＮＡサンプルを使用して配列決定ライブラリを生成する必要がなくてもよい。一旦出発ＤＮＡまたはｃＤＮＡが、断片化されたら、断片は、平滑化、すなわち末端修復される。
【００９５】
一部の実施形態において、配列決定される核酸を、標準的な、非メチル化ヌクレオチド塩基で伸長して、ｃＤＮＡ伸長産物を作製する。核酸標的が、メチル化ヌクレオチドを含有する場合、メチル化ヌクレオチドは両方の鎖に必要とされるので、ｃＤＮＡで作製される二重鎖は、メチル依存的エンドヌクレアーゼに対する内部認識配列を含有しないことになり、したがって作製された二本鎖核酸は、エンドヌクレアーゼにより内部的に切断されないことになる。メチル化塩基が、標的核酸の末端またはその近傍にある場合、標的二重鎖の末端と本明細書に記載のアダプターとのライゲーションにより、メチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列が作製され、アダプターは、アダプター二量体の切断の間に標的から切断され得るが、これはまれな事象になると予想される。
【００９６】
一部の実施形態において、配列決定される核酸は増幅され、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅手順により、例えば、増幅される。標準的な、非メチル化ヌクレオチド塩基によるメチル化塩基を含有する核酸サンプル（例えば、ゲノムＤＮＡ）の増幅により、メチル化塩基を含有しないＤＮＡ産物を得られることになる。そのような増幅された標的ＤＮＡは、メチル依存的エンドヌクレアーゼの制限部位を含有しないことになり、サンプルが、本明細書に記載されるアダプター二量体を除去するためにそのようなエンドヌクレアーゼで処理される場合に切断されないことになる。
【００９７】
配列決定用の標的ポリヌクレオチドを調製する
配列決定用の標的ポリヌクレオチド二重鎖を調製する方法が本明細書に提供される。標的ポリヌクレオチド二重鎖の各末端は、本明細書に記載される配列決定アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域に共有結合される。アダプターに連結された標的ポリヌクレオチド二重鎖は、各末端における配列決定アダプターにより作製される。アダプター二量体は、図３に図式的に示した通り作製され得る。図３において点線３４として図式的に示される通り、アダプター二量体は、各アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域の末端で共にライゲートされた２つのアダプター３１および３２を含む。２つのアダプターのライゲーションは、メチル依存的エンドヌクレアーゼの制限部位３３を作製する。サンプル混合物は、メチル依存的エンドヌクレアーゼで次いで処理され、上記の通り、エンドヌクレアーゼの制限配列を含むアダプター二量体は切断される。サンプル混合物は、切断されたアダプターをその５’および／または３’自由末端から脱重合する１つ以上のエキソヌクレアーゼで次いで処理され、したがって、配列決定されるポリヌクレオチドの混合物からアダプター二量体およびライゲートしていない任意の遊離アダプターが除去される。標的ポリヌクレオチド二重鎖の末端にライゲートされたアダプターは、エキソヌクレアーゼ消化の影響を受ける自由末端を持たない。上記の通り、アダプターは、エキソヌクレアーゼにより消化されないように、ヘアピンループ、または直鎖アダプターの場合、そのライゲートされていない末端に修飾ヌクレオチド、例えば、チオネート化ヌクレオチドのいずれかを有する。
【００９８】
一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される方法にしたがって配列決定用として調製され、メチル依存的エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ処理の後に、アダプターに連結された標的ポリヌクレオチド二重鎖を含有するサンプル混合物は、約１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、または０．０１％未満のアダプター二量体を含有する。一部の実施形態において、サンプル混合物は、アダプター二量体を全く含有しないまたは実質的に含有しない。
【００９９】
メチル依存的エンドヌクレアーゼ
多数のメチル依存的エンドヌクレアーゼ酵素が公知である。一実施形態において、メチル依存的エンドヌクレアーゼは、ＭｓｐＩまたはＭｓｐＩＩであり、パリンドローム制限配列ＣＣＭｅＧＧで二本鎖ＤＮＡを切断する。別の実施形態において、メチル依存的エンドヌクレアーゼは、ＤｐｎＩまたはＤｐｎＩＩであり、パリンドローム制限配列ＧＡＭｅＴＣで二本鎖ＤＮＡを切断する。少なくとも１つのメチル化ヌクレオチドを含み、本明細書に記載のアダプターの二重鎖領域の末端でヌクレオチド配列をライゲーションして酵素の完全な認識配列を得ることにより作製できる認識配列において任意のメチル依存的エンドヌクレアーゼが切断する場合、その酵素が、本明細書に記述される方法に有用であり得ることはいうまでもない。
【０１００】
配列決定の方法
本方法は、配列決定ポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチド二重鎖は、各末端で本明細書に記載のアダプターを共有結合することにより配列決定用として調製される。アダプター二量体は、本明細書に記載の通り除去され、約１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、または０．０１％未満のアダプター二量体を含有する配列決定混合物が得られる。
【０１０１】
一部の実施形態において、サンプル混合物は、アダプター二量体を全く含有しないまたは実質的に含有しない。一部の実施形態において、本方法は、標的二重鎖の各末端で連結された本明細書に記載の配列決定アダプターを含むアダプターに連結されたＤＮＡ二重鎖を複数含むポリヌクレオチドサンプルを配列決定する工程を含み、ポリヌクレオチドサンプルは、約１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、または０．０１％未満のアダプター二量体を含有する、またはアダプター二量体を含有しないもしくは実質的に含有しない。
【０１０２】
一部の実施形態において、プライマーは、アダプター上のプライマー結合配列にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼ酵素で伸長され、それにより配列決定用のプライマー伸長産物が調製される。一部の実施形態において、プライマーを伸張して、標的ポリヌクレオチド二重鎖の一方の鎖の相補的コピーを作製し、コピーは、ポリメラーゼにより合成されるように、配列決定される。
【０１０３】
多数のポリヌクレオチド配列決定方法が当業者に公知である。使用され得る配列決定方法には、次世代配列決定法（ＮＧＳ）技術があり、その技術は、１回の配列決定作業において複数のサンプルが、個々に（すなわち、シングルプレックス配列決定）またはインデックスを付けた標的ＤＮＡ分子などプールされたサンプルとして（すなわち、マルチプレックス配列決定）配列決定され、最大数億個のリードのＤＮＡ配列を生成することが可能になる。標的核酸およびインデックスを付けた標的核酸の配列は、クローンとして増幅したＤＮＡ鋳型または単一ＤＮＡ分子が、それぞれ超並列型で配列決定されるＮＧＳ方法を使用して決定され得る（例えば、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら［２００８年］Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５５：６４１〜６５８頁；Ｍｅｔｚｋｅｒ［２０１０年］Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  １１：３１〜４６頁）。ＮＧＳ技術は、第１、第２および第３世代配列決定に下位分類される場合もある（ＰａｒｅｅｋおよびＳｍｏｃｚｙｎｓｋｉ［２０１１年］Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５２：４１３〜４３５頁）。高スループット配列情報に加えて、各配列リードは、個々のクローンＤＮＡ鋳型または単一ＤＮＡ分子を表す計数可能な「配列タグ」であり得るので、ＮＧＳは、定量的情報を与える。ＮＧＳの配列決定技術には、パイロシークエンス、可逆的ダイターミネータを用いる合成時配列決定、オリゴヌクレオチドプローブライゲーションによる配列決定、イオン半導体配列決定およびナノ細孔配列決定があるがこれに限定されない。
【０１０４】
現在の技術の全てに一般に適用可能であるＮＧＳに含まれる主要な工程は、ライブラリ選択／構築、配列決定用ライブラリの調製、および超並列配列決定である。
【０１０５】
一実施形態において、本方法は、４５４配列決定に適用され得る（http://www.454.com/）（例えばＭａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍ．ら［２００５年］Ｎａｔｕｒｅ  ４３７：３７６〜３８０頁に記載の通り）。４５４の全体的な手法は、パイロシークエンスに基づく。配列決定調製は、いずれの末端にもアダプターを有するＤＮＡ（例えば、アンプリコンまたは噴霧したゲノム／メタゲノムＤＮＡ）の長さから開始する。これらは、油中水型乳剤に懸濁されている小さいビーズに固定される（理想的には、１つのビーズは、１つのＤＮＡ断片を有することになる）。エマルジョンＰＣＲ工程を次いで実行して、各ＤＮＡ断片を複数コピー作り、各１つのビーズが同じＤＮＡ断片のクローニングされたコピーを多数含有する一組のビーズを得る。ピコタイタープレートとして公知のマイクロウエルのフィールド（ｆｉｅｌｄ）で満たされた光ファイバーチップを、乳剤で次いで洗浄し、単一ビーズを各ウエルに落下させる。ウエルは、配列決定過程のための一組の酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼ）でも満たされる。この時点で、ピロリン酸放出を誘発する塩基を添加して合成時配列決定を開始することができ、その放出は、記録される閃光を発し、各塩基型（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）が追加される度に各ウエルのＤＮＡ断片の配列が推測される。
【０１０６】
別の実施形態において、本方法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定装置に適用され得る。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定法は、合成時配列決定方法であり、２つの主要な方法において４５４と異なる：（１）ビーズを含む個別のマイクロウエルを含有するチップの代わりに、オリゴヌクレオチドが付加されたフィールドを持つフローセルを使用し、（２）パイロシークエンスではなく、可逆的ダイターミネータを含む。ダイターミネーション手法は、「従来通りの」サンガー配列決定に似ている。しかしながら、ダイターミネータが可逆的であり、それらは各画像化サイクル後に除去されて、次の可逆的ダイターミネータヌクレオチドのために離れるので、その手法はサンガーと異なる。配列決定調製は、いずれの末端にも特異的アダプターを有するＤＮＡの長さから開始し、そのＤＮＡを、断片の末端にハイブリダイズする特異的オリゴヌクレオチドで満たされたフローセル上に流す。各断片を次いで複製して、同一の断片の群を作る。次いで可逆的なダイターミネータヌクレオチドを、フローセル上に流し、所与の時間付加させる；過剰なヌクレオチドを洗い流し、フローセルを撮像し、その過程を繰り返すことができ、その後のサイクルにおいてヌクレオチドを追加し続けることができるようにターミネータを破棄する。
【０１０７】
別の実施形態において、本方法は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＯＬｉＤプロセス（http://solid.appliedbiosystems.com）に適用され得る。ＳＯＬｉＤプロセスは、４５４により使用されるそれと同種のエマルジョンＰＣＲ工程から開始するが、配列決定自体は以前に記載されているシステムとまったく異なる。配列決定は、複数回の、千鳥状の、Ｄｉｂａｓｅ組み込みシステムを含む。組み込みにＤＮＡリガーゼを使用し、そのため前に記載の「合成時配列決定」手法ではなく「ライゲーション時配列決定」手法になる。Ｍａｒｄｉｓ、Ｅ．Ｒ．（２００８年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ９：３８７〜４０２頁は、このシステムを使用することに関係する複雑な配列決定および解読過程の完全な概要を提供する。
【０１０８】
別の実施形態において、本方法は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステム（http://www.iontorrent.com/）に適用され得る。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステムは、ＤＮＡ断片が付加されたビーズを含有するマイクロウエルのプレートを用いる４５４と類似の様式で開始する。しかしながら、そのシステムは、塩基組み込みが検出される様式において、他のシステム全てと異なっている。塩基が成長中のＤＮＡ鎖に追加されると、陽子が放出され、その陽子が周囲のｐＨをわずかに変化させる。ｐＨを感知する微量検出器が、それ自体が半導体チップであるプレートのウエルと関連付けられており、その検出器は、ｐHの変化が起こったときに記録する。異なる塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を、順次洗浄し終える度に、追加を記録し、各ウエルからの配列を推論することが可能になる。
【０１０９】
別の実施形態において、本方法は、ＰａｃＢｉｏ  １分子、リアルタイム配列決定手法（http://www.pacificbiosciences.com/）に適用され得る。ＰａｃＢｉｏ配列決定システムは、増幅工程を全く含まず、他の主要なＮＧＳシステムと区別される。配列決定は、多くのゼロモード導波路（ＺＭＷ）検出器を含有するチップ上で実行される。ＤＮＡポリメラーゼが、ＺＭＷ検出器に付加され、リン酸に連結されている色素標識ヌクレオチドの組み込みが、ＤＮＡ鎖が合成される度にリアルタイムで撮像される。ＰａｃＢｉｏのＲＳ  ＩＩ  Ｃ２  ＸＬは、最長のリード長（平均およそ４６００塩基）および１回当たり最大のリード数（約４７０００個）を現在提供する。リードが一般に十分に長く、ＣＣＳによるその断片は、各末端からそれぞれ独立に配列決定しなくても複数倍網羅し得るので、典型的な「ペアエンド」手法は、ＰａｃＢｉｏで使用されない。ＰａｃＢｉｏによる多重化は、独立したリードを含まず、むしろ標準的な「直列」バーコードモデルにしたがう。
【０１１０】
別の実施形態において、本方法は、ナノ細孔配列決定に適用され得る（例えば、Ｓｏｎｉ，Ｇ．Ｖ．およびＭｅｌｌｅｒ，Ａ．［２００７年］Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５３：１９９６〜２００１頁に記載の通り）。ナノ細孔配列決定ＤＮＡ分析技術は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、英国）、ＲｏｃｈｅおよびＩｌｌｕｍｉｎａを含めた多数の会社により開発された。一実施形態において、合成時配列決定法が使用され、成長中のＤＮＡ分子のコピーに組み込まれるヌクレオチドは、各ヌクレオチド型：Ａ、Ｇ、ＣおよびＴに特有のポリマータグで標識される。新たな鎖の酵素的伸長の間の標識ヌクレオチドの組み込みの間に、ポリマータグは、孔内に捕えられ、タグによるイオン電流の遮断が組み込まれている塩基を示す。鎖合成中の連続したヌクレオチド組み込みは、連続したポリマータグ捕捉（ag captures）をもたらし、新たな鎖配列を検出することが可能になる。
【０１１１】
キット
本明細書に記述される方法に使用するキットが提供される。キットは、本明細書に記載の配列決定アダプターを含む。任意選択で、例えば、配列決定用の標的ポリヌクレオチド二重鎖を調製するための使用説明書が提供される。説明書は、印刷された形態、またはＣＤ、ＤＶＤもしくはＵＳＢなどの電子媒体の形態、またはそのような説明書を入手できるウェブサイトアドレスの形態で提供され得る。任意選択で、配列決定用の標的ポリヌクレオチド二重鎖を調製するための他の成分および／または配列決定試薬が含まれ得る。例えば、キットは：リガーゼ酵素；メチル依存的エンドヌクレアーゼ酵素；１つ以上のエキソヌクレアーゼ酵素；および１つ以上の配列決定プライマーのうち１つ以上を含み得る。
【０１１２】
適切な包装が提供される。本明細書では「包装」とは、システムにおいて慣習的に使用されるおよび組成物を一定の限度内で保持できる固体マトリックスまたは材料のことを指す。そのような材料には、ガラスおよびプラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）瓶、バイアル、紙、プラスチック、ならびにプラスチック箔積層包、等がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2019523010.tif 000006