(57)【要約】  本開示の実施形態は、例えば、少なくともウイルス感染および肝臓癌を含む、肝臓に関連する病態の治療のための方法および組成物を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを肝臓に局所的に送達するための免疫療法が提供され、ここで、ポリヌクレオチドは、例えば、特定の肝臓抗原を標的とするものを含む、二重特異性抗体を含む特定の遺伝子産物をコードする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの肝臓抗原標的化実体および少なくとも１つの免疫刺激実体を含む分泌可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、前記少なくとも１つの肝臓疾患抗原標的化実体と前記少なくとも１つの免疫刺激実体とを作動可能に連結するリンカー領域をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記肝臓抗原が肝細胞上の抗原を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
肝細胞が疾患肝細胞である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
肝細胞が癌細胞である、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
前記癌細胞が、原発性肝癌細胞である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記原発性肝癌細胞が、肝細胞癌細胞（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ）または肝芽腫細胞（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ）である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記癌細胞が、肝臓に転移した癌に由来する、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記肝臓抗原が、肝臓に感染する病原体上の抗原を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記病原体が、ウイルスまたは細菌である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ウイルスが、肝炎ウイルスである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、またはＥ型肝炎ウイルスである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ウイルスが、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−８、エボラウイルス、ジカウイルス、パルボウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）関連コロナウイルス、パピローマウイルス、インフルエンザウイルス、または黄熱病ウイルスである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記肝臓抗原が、ＨＢＶ小表面抗原、ＨＢＶ中間表面抗原（ＰｒｅＳ２ドメインを含む）、ＨＢＶ大表面抗原（ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２ドメインを含む）、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質、ＥＢＶ糖タンパク質、ＣＭＶ糖タンパク質、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ，  ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−β、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ  Ｂ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴｌ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＭＡＧＥ−Ａｌ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／Ｇａｌｅｃｔｉｎ  ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、またはＩＧＬＬ１である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記肝臓抗原標的化実体が、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ペプチド、ラクダ科可変ドメイン、サメＩｇＮＡＲ可変ドメイン、単一ドメイン抗体、アフィマーまたはＶＨＨ抗体を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記免疫刺激実体が、刺激を誘発する免疫細胞上の受容体に対する、一本鎖抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ペプチド、ラクダ科可変ドメイン、サメＩｇＮＡＲ可変ドメイン、単一ドメイン抗体、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）またはＶＨＨ抗体を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫刺激実体が、サイトカイン、Ｆｃ受容体結合体、免疫細胞リガンドの外部ドメイン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記サイトカインが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６およびＩＬ−１８、例えば顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびエリスロポエチンのような造血因子、ＴＮＦαのような腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシンのようなリンホカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγのようなインターフェロン、若しくは種々のケモカイン、またはそれらの組み合わせである、請求項１７に記載の組成物
【請求項１９】
前記Ｆｃ受容体結合体が、ＩｇＧ定常領域を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
ＩｇＧ定常領域が、ＩｇＧ４、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ２由来である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記Ｆｃ受容体結合体が、Ｆｃ受容体に結合するモノクローナル抗体を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記Ｆｃ受容体結合体が、Ｆｃ受容体に結合するｓｃＦｖを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記免疫刺激実体が、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖ、抗４１ＢＢ  ｓｃＦｖ、抗ＯＸ４０  ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ４  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ１  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖ、ＣＤ２８のリガンドの外部ドメインの一部または全部（ＣＤ８０および／またはＣＤ８６の外部ドメインの一部または全部）、４１ＢＢリガンドの外部ドメインの一部または全部、ＳＩＲＰα、ＬＩＧＨＴタンパク質の外部ドメインの一部または全部、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＣＤ１３４Ｌ、もしくはＣＤ１３７Ｌ、および／またはこれらの組み合わせ、を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記リンカーが、グリシン−セリン配列、Ｆｃドメイン、１つ以上の免疫グロブリンドメイン、異種抗体軽鎖定常ドメインおよび重鎖定常ドメインの対、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記Ｆｃドメインが、ドメインの特性を変更する１つ以上の変異を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記Ｆｃドメインが、ＦｃＲγ受容体結合を減少させ、前記Ｆｃドメインの補体結合を阻害する能力を減少させ、前記Ｆｃドメインの免疫複合体を形成する能力を減少させ、および／またはドメインを単量体構造にする突然変異を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記免疫グロブリンドメインが、抗原結合のためのスペーサーとして構成される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記免疫グロブリンドメインが、ヒトタンパク質ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ２７８、ＣＤ７、ＣＤ２、ＬＩＬＲ、ＫＩＲ、およびＣＤ４の細胞外領域からなる群より選択される免疫グロブリンドメインを含む、請求項２４または２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記リンカーが、１つ以上の抗体由来の１つ以上のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項３１】
前記リンカーがＦｃＲｎ結合ドメインを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下の構造を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物:
肝臓抗原標的化実体−−リンカー−−免疫刺激実体；または
免疫刺激実体−−リンカー−−肝臓抗原標的化実体。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下の構造を含む、請求項３２に記載の組成物:
肝臓抗原標的化実体−−リンカー−−サイトカイン；または
サイトカイン−−リンカー−−肝臓抗原標的化実体。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドがベクター上に含まれる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ベクターがウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
ベクターが脂質ベースのナノ粒子である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)である場合、該ｍＲＮＡが修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ベクターが、前記ポリペプチドをコードする発現カセットを含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記発現カセットが、１つ以上の調節配列を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記１つ以上の調節配列が、少なくとも１つの組織特異的調節配列を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組織特異的調節配列が、肝臓特異的調節配列である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記組織特異的調節配列が、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、ＵＳ２０１１／０１８４０４９に記載される調節エレメント、アルブミンエンハンサー／プロモーター、ａｐｏＥプロモーター、α１−アンチトリプシンプロモーター、またはＨＢＶコアプロモーターを含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４５】
前記アデノ随伴ウイルスベクターが、変異キャプシドを含むアデノ随伴ウイルスを含むか、またはヒト肝臓を形質導入する血清型である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、または非ヒト霊長類から単離されたＡＡＶ血清型である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
細胞保護剤をコードする同じまたは異なるポリヌクレオチドを含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記細胞保護剤が核酸またはポリペプチドである、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記細胞保護剤が、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、ＣＥＤ−０、Ｂｆｌ−１、アポトーシスタンパク質のＸ結合阻害剤（ＸＩＡＰ）、ｃ−ＩＡＰ１、Ｃ−ＩＡＰ２、ＮＡＩＰ、Ｌｉｖｉｎ、サバイビン、セルピンプロテイナーゼ阻害剤９、またはセルピンＢ４である、請求項４７または４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記細胞保護剤が、Ｆａｓ受容体、ＴＮＦα受容体、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、ＢａｋまたはＢａｄを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはモルホリノである、請求項４７または４８に記載の組成物。
【請求項５１】
前記細胞保護剤が、個体のｍｉＲＮＡ分子によって標的化され得る非翻訳配列を含むｍＲＮＡである、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれか１項に記載の組成物のうちの少なくとも１つの治療有効量を、病態を有するか、または病態のリスクがある個体に送達するステップを含む、病態を治療する方法。
【請求項５３】
前記病態が、癌である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記病態が、感染性疾患である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記感染性疾患が、Ｂ型肝炎感染またはＣ型肝炎感染である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記組成物が、前記個体に２回以上送達される、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記組成物の別々の送達の間の期間が、数日、数週、数か月またはその他の範囲内である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物の混合物が前記個体に提供される、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記個体が、前記病態のための追加の治療を受けているか、受けたか、または受ける予定である、請求項５２〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記病態が癌である場合、前記追加の治療は、パクリタキセル、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、エベロリムス、メルファラン、パミドロネート、アナストロゾール、エキセメスタン、ネララビン、ベリノスタット、カルムスチン、ブレオマイシン、ボスチニブ、イリノテカン、バンデタニブ、ビカルタミド、ロムスチン、クロファラビン、カボザンチニブ、ダクチノマイシン、コビメチニブ、シトキサン、シクロホスファミド、デシタビン、ダウノルビシン、シタラビン、ドセタキセル、ヒドロキシウレア、デカルバジン、ロイプロリド、エピルビシン、オキサリプラチン、アスパラギナーゼ、エストラムスチン、ビスモデギブ、アミホスチン、フルタミド、トレミフェン、パノビノスタット、フルベストラント、レトロゾール、デガレリクス、フルダラビン、プララトレキセート、フロクスウリジン、ゲムシタビン、アファチニブ、イマチニブメシレート、カルムスチン、エリブリン、アルトレタミン、トポテカン、アルトレタミン、トポテカン、ハイドレア（ヒドロキシウレア、パルボシクリブ、ポナチニブ、イダルビシン、イホスファミド、イブルチニブ、アキシチニブ、ゲフィチニブ、ロミデプシン、イクサベピロン、ルキソリチニブ、カバジタキセル、カルフィルゾミブ、レンバチニブ、クロラムブシル、サルグラモスチム、クラドリビン、トリフルリジンおよびチピラシル、ロイプロリド、オラパリブ、ミトタン、プロカルバジン、メゲストロール、トラメチニブ、メスナ、塩化ストロンチウム−89、メトトレキサート、メクロレタミン、マイトマイシン、ビノレルビン、ソラフェニブ、ニルタミド、ペントスタチン、ミトキサントロン、ソニデジブ、アリトレチノイン、カルボプラチン、シスプラチン、ポマリドマイド、メルカプトプリン、ゾレドロン酸、レナリドマイド、オクトレオチド、タモキシフェン、ダサチニブ、レゴラフェニブ、ヒストレリン、スニチニブ、オマセタキシン、チオグアニン、ダブラフェニブ、エルロチニブ、ベキサロテン、デカルバジン、パクリタキセル、ドセタキセル、テモゾロミド、チオテパ、サリドマイド、テムシロリムス、ベンダムスチン塩酸塩、トリプトレリン、三酸化ヒ素、ラパチニブ、バルルビシン、ヒストレリン、ビンブラスチン、ボルテゾミブ、エトポシド、トレチノイン、アザシチジン、ビンクリスチン、パゾパニブ、テニポシド、ロイコボリン、クリゾチニブ、カペシタビン、エンザルタミド、トラベクテジン、ストレプトゾシン、ベムラフェニブ、ゴセレリン、ボリノスタット、ゾレドロン酸、エベロリムス、イデラリシブ、セリチニブ、アビラテロン、またはこれらの組み合わせ、を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記追加の治療が、ＨＢＶを標的とする逆転写酵素阻害剤、インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロン、化学療法、放射線、手術、ホルモン療法、動脈塞栓術、免疫療法肝臓移植、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記送達が、局所的または全身的である、請求項５２〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記組成物が、静脈内注射、カテーテルを用いた門脈内または肝動脈内への直接注射、経口投与、皮下注射、筋肉内注射、または腹腔内注射によって送達される、請求項５２〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記送達が一定の注入ではない、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
以下の成分を含むポリペプチド: 
１）  ＸＴＬ１９  ｓｃＦｖ、ＸＴＬ１７  ｓｃＦｖ、ＯＳＴ５７７  ｓｃＦｖ、５α１９  ｓｃＦｖ、またはそれらの組み合わせを含む抗体または抗体断片；
２）ＩｇＧ１野生型Ｆｃ、ＩｇＧ４野生型Ｆｃ、ＩｇＧ１（ＡＡ）Ｆｃ、ＩｇＧ２（ＡＡ）Ｆｃ、ＩｇＧ１（ＡＡ）−ＣＨ２ドメインのみ、ＩｇＧ２（ＡＡ）−ＣＨ２ドメインのみ、ＩｇＧ４ｍ  Ｆｃ、ＣＤ８０外部ドメイン、ＣＤ８６外部ドメイン、またはそれらの組み合わせ；および
３）抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ、
ここで、１）、２）、または３）の成分が、Ｎ末端からＣ末端への配向において、任意の順序であり得る。
【請求項６６】
Ｎ末端からＣ末端への配向において、その順序が１）、２）および３）である、請求項６５に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
Ｎ末端からＣ末端への配向において、その順序が３）、２）および１）である、請求項６５に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
治療有効量の２つの別個のポリペプチドまたは２つの別個のポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、個体に、治療有効量の２つの別個のポリペプチドまたは２つの別個のポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、病態を有するか、または病態のリスクがある個体に送達する工程を含み、ここで、
第一のポリペプチドが、ＦｃＲｎ結合ドメインに作動可能に連結された肝臓抗原標的化実体を含み、
第二のポリペプチドが、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖに作動可能に連結された肝臓抗原標的化実体を含み、
第一のポリペプチドは抗原粒子の分泌を阻害し得るが、第二のポリペプチドは前記粒子によって阻害され得ず、代わりに、病原性細胞表面にＴ細胞を再指向し得る、
病態を治療する方法。
【請求項６９】
前記ＦｃＲｎ結合ドメインに作動可能に連結された肝臓抗原標的化実体が、肝細胞からの表面抗原粒子およびＢ型肝炎ビリオンの分泌を阻害する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記第二のポリペプチドが、肝臓抗原の存在下での増殖、細胞毒性、およびサイトカイン放出のために、Ｔ細胞を活性化する二重特異性抗体である、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記第二のポリペプチドが、肝細胞内への内在化なしに肝細胞表面上に残存し、それによってエフェクター細胞との会合を延長する、請求項６８、６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
個体の組織においてｉｎ  ｓｉｔｕで単一特異性および二重特異性抗体を生成する方法であって、
各々が非同一の単一特異性抗体ポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドを個体に提供するステップであって、前記個体の組織においてｉｎ  ｓｉｔｕでポリヌクレオチドから生成された抗体が互いに二量体化し、それによって前記個体の組織内で単一特異性抗体および二重特異性抗体の混合物を生成するステップを含む、方法。
【請求項７３】
前記抗体が、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ペプチド、ラクダ科可変ドメイン、サメＩｇＮＡＲ可変ドメイン、単一ドメイン抗体、アフィマーまたはＶＨＨ抗体を含む１つ以上の抗原結合ドメインを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗原結合ドメインが、それらのそれぞれのＦｃ領域において二量体化する、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗原結合ドメインが、別個のタンパク質ドメインと二量体化する、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記別個のタンパク質ドメインが、ロイシンジッパーモチーフ、免疫グロブリンＧ由来のヒンジおよびＣＨ２ドメイン、ヘリックス−ループ−ヘリックス二量体化ドメイン、またはジスルフィド結合を形成するタンパク質ドメインを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記組織が、肝臓である、請求項７１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
少なくとも１つのポリヌクレオチドが、疾患抗原に対する単一特異性抗体をコードし、少なくとも１つのポリヌクレオチドが免疫刺激因子に対する単一特異性抗体をコードするか、または免疫刺激因子ドメインを提供する、請求項７２〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記免疫刺激因子が、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖ、抗４１ＢＢ  ｓｃＦｖ、抗ＯＸ４０  ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ４  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ１  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖ、ＣＤ２８のリガンドに対する外部ドメインの一部または全部、４１ＢＢリガンドの外部ドメインの一部または全部、ＳＩＲＰα、ＬＩＧＨＴタンパク質の外部ドメインの一部または全部、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、Ｂ７−Ｈ４、およびＢ７−Ｈ６、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、および／またはこれらの組み合わせである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ＣＤ２８のリガンドの外部ドメインの一部または全部が、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６の外部ドメインの一部または全部としてさらに定義される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
個体の組織においてｉｎ  ｓｉｔｕで二重特異性、三重特異性および四重特異性抗体を生成する方法であって、各々が非同一の二重特異性抗体ポリペプチドをコードする二つ以上のポリヌクレオチドを前記個体に提供するステップであって、前記個体の組織においてｉｎ  ｓｉｔｕでポリヌクレオチドから生成された抗体が互いに二量体化し、それによって個体の組織内に二重特異性、三重特異性および四重特異性抗体の混合物を生成するステップを含む、方法。
【請求項８２】
前記抗体が、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ペプチド、ラクダ科可変ドメイン、サメＩｇＮＡＲ可変ドメイン、単一ドメイン抗体、アフィマーまたはＶＨＨ抗体を含む１つ以上の抗原結合ドメインを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記抗体が、それらのそれぞれのＦｃ領域において二量体化する、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記抗原結合ドメインが、別個のタンパク質ドメインと二量体化する、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記別個のタンパク質ドメインが、ロイシンジッパーモチーフ、免疫グロブリンＧ由来のヒンジおよびＣＨ２ドメイン、ヘリックス−ループ−ヘリックス二量体化ドメイン、またはジスルフィド結合を形成するタンパク質ドメインを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記組織が、肝臓である、請求項８１〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
少なくとも１つのポリヌクレオチドが疾患抗原に対する抗体をコードし、少なくとも１つのポリヌクレオチドが免疫刺激因子に対する単一特異性抗体をコードするか、または免疫刺激因子ドメインを提供する、請求項７８〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記免疫刺激因子が、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖ、抗４１ＢＢ  ｓｃＦｖ、抗ＯＸ４０  ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ４  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ１  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ４７ｓｃＦｖ、ＣＤ２８のリガンドの外部ドメインの一部または全部、４１ＢＢリガンドの外部ドメインの一部または全部、ＳＩＲＰα、ＬＩＧＨＴタンパク質の外部ドメインの一部または全部、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、Ｂ７−Ｈ４、およびＢ７−Ｈ６、ＣＤ１３４Ｌ、またはＣＤ１３７Ｌ、および／またはこれらの組み合わせである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
ＣＤ２８のリガンドの外部ドメインの一部または全部が、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６の外部ドメインの一部または全部としてさらに定義される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記分泌可能なポリペプチドが、インビボの組織において適切なレベルで発現される場合、該ポリペプチドは、抗原に対する抗原依存性免疫刺激に加えて、免疫刺激の抗原非依存性特性を誘発する、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９１】
インビボで、組織中で発現される場合、シグナル伝達および免疫細胞の活性化を含むが、インビトロでは同じ活性を欠く、抗原標的化ドメイン、を含まず、免疫刺激性単一特異性抗体を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１６年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／４０２，５０４号、および２０１７年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／５０５，９５５号に対する優先権を主張し、これらの出願の両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、少なくとも免疫学、細胞生物学、分子生物学、および医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫療法の分野は種々の感染性疾患および癌の治療において有望であり、臨床試験において最近の成功を収めている。宿主免疫細胞を人工的にインビトロまたはインビボで操作または活性化することにより、これらの疾患を潜在的に逆転させることができる。しかし、これらの治療は、重大な毒性、持続性の欠如、および投薬制限を保持し得る。これらの限界を解決し、標的外毒性および臓器外毒性を最小にしながら治療の効力を最大にする新しい方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、少なくとも特定の局面において、全身性の副作用および毒性を欠く一方で、特定の組織または器官に影響を及ぼす医学的状態のための有効な標的化免疫療法を提供することによって、当該技術分野における長年の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示の実施形態は、特定の組織における疾患の治療のための方法および／または組成物に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、免疫療法である組成物を使用する標的化治療に関する。特定の実施形態では、免疫療法が１つ以上の肝臓関連病態に有用である。
【０００６】
本開示のいくつかの実施形態は、器官または組織に特異的な抗原に実質的に同時に結合し得、そしてまた、免疫応答を間接的または直接的に刺激する標的に結合し得る、複数の実体（例えば、二部タンパク質または三部タンパク質など）を有するタンパク質の分泌可能な形態をコードするポリヌクレオチドの送達を使用する遺伝子治療に関する。特定の局面において、多成分タンパク質は肝臓疾患特異的抗原に結合し得、そして疾患細胞への免疫系のリダイレクト（例えば、肝臓に局在化される）を容易にする標的に結合し得る。特定の実施形態では、組成物は二重特異性抗体であり、異なる成分を作動可能に連結するためのリンカーも含み得る。特定の態様において、分泌可能なポリペプチドの組成物は、核酸またはタンパク質形態で、インビボでそれを必要とする個体に送達される。
【０００７】
特定の実施形態において、組成物は局所的に、および遺伝子治療の形態で提供され、その結果、一定かつ高産生が、肝臓を含む所望の組織または器官における部位で生じ得る。すなわち、いったんポリヌクレオチドが組織または器官に局所的に送達され、または全身注射および送達ベクターによる器官局在化（ｏｒｇａｎ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を介して、または器官における系注射および選択的発現（すべて例として）を介して、組織中の局所細胞が形質導入され、所望のタンパク質を産生および分泌する。癌が治療される実施形態では、これは例えば、固形腫瘍塊内および／または腫瘍微小環境内で起こり得る。
【０００８】
本開示の実施形態はインビボで特定の器官にＴ細胞活性化を直接送達し、それによって局所免疫応答を調節する方法を含む。これは、抗原特異性が標的器官を誘導する組換えタンパク質戦略、または送達のための細胞ベースのキャリアの使用とは異なる。
【０００９】
二重特異性抗体などの二重特異性ポリペプチドの特定の実施形態では２つの部分が互いに独立して機能してもしなくてもよく、それらが互いに独立して機能する場合には相乗効果を付与してもよいが、場合によってはその効果は相加的である。
【００１０】
特定の実施形態では、２つ以上の異なる非重複エピトープを覆う二重特異性抗体の混合物を利用して、所与のウイルス（グローバルＨＢＶ血清型を含む）または癌内の変異に関する血清型の大多数を包含することによって、抗体の異なる親和性を補完することができる。さらに、複数の抗体遺伝子を同時に肝臓に導入することは、異種遺伝子のＦｃ対合を介して、二重、三重、四重またはより特異的な抗体を生成し得、少なくともいくつかの場合において、複数のエピトープ（例として、複数のＨＢｓＡｇエピトープを含む）への相乗的結合を生じる。
【００１１】
二重特異性抗体の効率的な器官（肝臓など）への遺伝子送達のために２つの異なる戦略を利用することができるが、他の戦略を用いてもよい。第一の戦略は、二重特異性抗体を送達するためにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのベクターを利用し得る。特定の場合におけるＡＡＶは個体を新規の（ｄｅ  ｎｏｖｏ）感染サイクルから保護する、二重特異性抗体のより永久的な発現を提供するが、本明細書中の結果は、誘導された炎症がＡＡＶゲノムを迅速に不安定化し、少なくともいくつかの場合において、一過性の、しかし安全な治療をもたらすことを示唆する。さらに、特定の実施形態において、炎症はＡＡＶカプシドに対してワクチン接種し、療法の再投与を妨げる。
【００１２】
代替的なアプローチとして、二重特異性抗体をコードするｍＲＮＡを肝臓に直接送達することができ、そのことは、本明細書において確立された治療動態内で、十分な経時的発現（数時間で開始し、数日間持続する）を生成し、信頼できる薬物動態を有する安全な戦略をもたらす。このような場合、免疫活性化を防止し、安定性を増大させ、経時的に凝集する傾向を減少させ、および／または不純物を回避するために、１種以上の手段によってｍＲＮＡを最適化することができる。このような最適化はｍＲＮＡにおける修飾ヌクレオシド（例えば、１−メチルシュードウリジンとの）の使用を含み得、および／または細胞内安定性および翻訳効率を改善するための特定の５′ＵＴＲ、３′ＵＴＲ、および／またはポリ（Ａ）テールを含み得る（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒら、２０１７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．を参照のこと）。
【００１３】
本開示は、ＨＢＶ感染と戦うための適応免疫系を個体に与える新規な方法を提供する。特定の実施形態ではこれは抗体部分を介して体液性免疫を提供するが、感染肝細胞に対してＴ細胞を連結および活性化する能力も提供する、単一の二重特異性抗体分子によって達成される。このような組み合わせの使用は、少なくともいくつかの実施形態において、共有結合的に閉じた環状ＤＮＡ(ｃｃｃＤＮＡ)分解、感染細胞の直接殺傷、ウイルス侵入阻害、先天性免疫活性、ＨＢｓＡｇ分泌阻害、およびワクチン様免疫刺激を、単一の治療製品において利用する機構を包含する。
【００１４】
一実施形態では、少なくとも１つの組織抗原標的化実体（例えば、肝臓抗原または肺抗原など）、および、少なくとも１つの免疫刺激実体を含む分泌可能ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物がある。ポリペプチドは、少なくとも１つの肝臓抗原標的化実体および少なくとも１つの免疫刺激実体を、作動可能に連結するリンカー領域をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、肝臓抗原が肝細胞、例えば癌細胞などの疾患肝細胞上の抗原を含む。癌細胞は原発性肝癌細胞（例えば、肝細胞癌細胞または肝芽腫細胞）であり得る。特定の場合において、癌細胞は、肝臓に転移した癌に由来する。肝臓抗原に関しては、肝臓に感染する病原体上の抗原であってもよく、病原体はウイルス、細菌、または真菌であってもよい。特定の場合において、ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、またはＥ型肝炎ウイルスである。場合によっては、ウイルスは、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−８、エボラウイルス、ジカウイルス、パルボウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）関連コロナウイルス、パピローマウイルス、インフルエンザウイルス、または黄熱病ウイルスである。
【００１５】
特定の場合において、肝臓抗原は、ＨＢＶ小表面抗原、ＨＢＶ中間表面抗原（ＰｒｅＳ２ドメインを含む）、ＨＢＶ大表面抗原（ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２ドメインを含む）、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質、ＥＢＶ糖タンパク質、ＣＭＶ糖タンパク質、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−β、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ  Ｂ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴｌ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＭＡＧＥ−Ａｌ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−  ２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／Ｇａｌｅｃｔｉｎ  ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、またはＩＧＬＬ１である。肝臓抗原標的化実体は、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ペプチド、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）可変ドメイン、サメＩｇＮＡＲ可変ドメイン、単一ドメイン抗体、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）またはＶＨＨ抗体を含み得る。
【００１６】
特定の実施形態では、免疫刺激実体が、刺激を誘発する免疫細胞上の受容体に対する、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ペプチド、ラクダ科可変ドメイン、サメＩｇＮＡＲ可変ドメイン、単一ドメイン抗体、アフィマーまたはＶＨＨ抗体を含む。免疫刺激実体はまた、サイトカイン、Ｆｃ受容体結合体、免疫細胞リガンドの外部ドメイン、またはそれらの組み合わせを含み得る。具体的なサイトカインには、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、およびＩＬ−１８、例えば顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびエリスロポエチンのような造血因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシンのようなリンホカイン、インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγのようなインターフェロン、または種々のケモカインの組み合わせが含まれる。Ｆｃ受容体結合体が用いられる場合、それはＩｇＧ定常領域、例えばＩｇＧ４、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ２由来のものであってもよい。特定の場合において、Ｆｃ受容体結合体は、Ｆｃ受容体に結合するモノクローナル抗体を含む。Ｆｃレセプター結合体は、Ｆｃレセプターに結合するｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体を含み得る。
【００１７】
特定の実施形態では、免疫刺激実体が抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖ、抗４１ＢＢ  ｓｃＦｖ、抗ＯＸ４０  ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ４  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ１  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖ、ＣＤ２８のリガンドに対する外部ドメインの一部または全部（ＣＤ８０および／またはＣＤ８６の外部ドメインの一部または全部など）、４１ＢＢリガンドの外部ドメインの一部または全部、ＳＩＲＰα、ＬＩＧＨＴタンパク質の外部ドメインの一部または全部、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、Ｂ７−Ｈ４、およびＢ７−Ｈ６、またはＣＤ１３７Ｌ、および／またはそれらの組合せを含む。
【００１８】
リンカーに関して、リンカーは、グリシン−セリン配列、Ｆｃドメイン、１つ以上の免疫グロブリンドメイン、異種抗体軽鎖定常ドメインおよび重鎖定常ドメインの対、またはそれらの組み合わせを含み得る。特定の場合において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ドメインの特性を変更する１つ以上の変異を含み得る。Ｆｃドメインは、ＦｃＲγレセプター結合を減少させる、Ｆｃドメインの補体結合能力を低下させる、Ｆｃドメインの免疫複合体を形成する能力を低下させる、および／またはドメインを単量体構造にする、突然変異を含み得る。特定の実施形態では、免疫グロブリンドメインが抗原結合のためのスペーサーとして構成される。免疫グロブリンドメインは、ヒトタンパク質ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ２７８、ＣＤ７、ＣＤ２、ＬＩＬＲ、ＫＩＲ、およびＣＤ４の細胞外領域からなる群より選択される免疫グロブリンドメインを含み得る。特定の場合において、リンカーは１つ以上の抗体由来の１つ以上のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含み、これは、いくつかの実施形態において、単量体形態についての変異を含み得る。リンカーは、ＦｃＲｎ結合ドメインを含み得る。
【００１９】
特定の実施形態では、分泌可能なポリペプチドがＮ末端からＣ末端の方向に以下の構造を含む：肝臓抗原標的化実体−−リンカー−−免疫刺激実体；または免疫刺激実体−−リンカー−−肝臓抗原標的化実体。ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下の構造を含むことができる：肝臓抗原標的化実体−−リンカー−−サイトカイン；またはサイトカイン−−リンカー−−肝臓抗原標的化実体。
【００２０】
特定の局面において、ポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡを含み得、そしてそれらは、ベクターまたは送達ビヒクル（例えば、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）または非ウイルスベクターもしくは送達ビヒクル（例えば、脂質ベースのナノ粒子、ポリマーベースのナノ粒子、またはエキソソーム）中に、またはその上に含まれ得るか、または含まれ得ない。特定の場合において、ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である場合、ｍＲＮＡは、修飾されたヌクレオチドを含んでも含まなくてもよい。他の場合、ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である場合、ｍＲＮＡは非修飾ヌクレオチドを含む。ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。ベクターまたは送達ビヒクルは、ポリペプチドをコードする発現カセットを含み得る。発現カセットは、肝臓特異的調節配列を含む、少なくとも１つの組織特異的調節配列を含む配列などの、１つ以上の調節配列を含むことができる。特定の場合において、組織特異的調節配列は、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、ＵＳ２０１１／０１８４０４９に記載される調節エレメント、アルブミンエンハンサー／プロモーター、ａｐｏＥプロモーター、α１−アンチトリプシンプロモーター、またはＨＢＶコアプロモーター（例として）を含む。ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである場合、それは、変異キャプシドを含むアデノ随伴ウイルスを含んでもよく、またはヒト肝臓を形質導入する血清型であってもよい。アデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、または非ヒト霊長類から単離されたＡＡＶ血清型であり得る。場合によっては、ベクターまたは送達ビヒクルが肝臓へのベクターまたは送達ビヒクルの送達を指示する部分を含む。
【００２１】
特定の実施形態において、分泌可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、細胞保護剤をコードするが、特定の場合において、それらは別個のポリヌクレオチド上に含まれる。細胞保護剤は、核酸またはポリペプチドとして個体に送達され得る。細胞保護剤は、アポトーシス阻害剤であってもよい。特定の実施形態では、細胞保護剤がＢｃｌ２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−、ＣＥＤ−０、Ｂｆｌ−１、Ｘ連鎖アポトーシスタンパク質阻害剤（ＸＩＡＰ）、ｃ−ＩＡＰｌ、Ｃ−ＩＡＰ２、ＮＡＩＰ、Ｌｉｖｉｎ、サバイビン、セルピンプロテイナーゼ阻害剤９、またはセルピンＢ４、およびアポトーシスを阻害する他の遺伝子産物である。特定の場合において、細胞保護剤は、Ｆａｓレセプター、ＴＮＦａｌｐｈａレセプター、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、もしくはＢａｄ、およびそれ例外のアポトーシスを促進する他の遺伝子産物を標的とする、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはモルホリノである。特定の場合において、細胞保護剤は、標的組織における所望の細胞型における発現を制限する個体のｍｉＲＮＡ分子によって標的化され得る非翻訳配列を含むｍＲＮＡである。
【００２２】
一つの態様において、病態を治療する方法であって、本開示により包含される組成物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）の少なくとも１つの治療有効量を、病態を有するか、または病態のリスクを有する個体に送達する工程を包含する方法がある。特定の実施形態において、前記病態は癌または感染性疾患（例えば、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎感染症）である。組成物は個体に２回以上送達され得、そしてこのような場合、組成物の別々の送達の間の期間は互いに数日、数週間、または数か月以内である。場合によっては、組成物の混合物が個体に提供される。個体は、パクリタキセル、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、エベロリムス、メルファラン、パミドロネート、アナストロゾール、エキセメスタン、ネララビン、ベリノスタット、カルムスチン、ブレオマイシン、ボスチニブ、イリノテカン、バンデタニブ、ビカルタミド、ロムスチン、クロファラビン、カボザンチニブ、ダクチノマイシン、コビメチニブ、シトキサン、シクロホスファミド、デシタビン、ダウノルビシン、シタラビン、ドセタキセル、ヒドロキシウレア、デカルバジン、ロイプロリド、エピルビシン、オキサリプラチン、アスパラギナーゼ、エストラムスチン、ビスモデギブ、アミホスチン、フルタミド、トレミフェン、パノビノスタット、フルベストラント、レトロゾール、デガレリクス、フルダラビン、プララトレキセート、フロクスウリジン、ゲムシタビン、アファチニブ、イマチニブメシレート、カルムスチン、エリブリン、アルトレタミン、トポテカン、ハイドレア（ヒドロキシウレア、パルボシクリブ、ポナチニブ、イダルビシン、イホスファミド、イブルチニブ、アキシチニブ、ゲフィチニブ、ロミデプシン、イクサベピロン、ルキソリチニブ、カバジタキセル、カルフィルゾミブ、レンバチニブ、クロラムブシル、サルグラモスチム、クラドリビン、トリフルリジンとチピラシル、ロイプロリド、オラパリブ、ミトタン、プロカルバジン、メゲストロール、トラメチニブ、メスナ、塩化ストロンチウム89、メトトレキサート、メクロレタミン、マイトマイシン、ビノレルビン、ソラフェニブ、ニルタミド、ペントスタチン、ミトキサントロン、ソニデジブ、アリトレチノイン、カルボプラチン、シスプラチン、ポマリドマイド、メルカプトプリン、ゾレドロン酸、レナリドマイド、オクトレオチド、タモキシフェン、ダサチニブ、レゴラフェニブ、ヒストレリン、スニチニブ、オマセタキシン、チオグアニン、ダブラフェニブ、エルロチニブ、ベキサロテン、デカルバジン、パクリタキセル、ドセタキセル、テモゾロミド、チオテパ、サリドマイド、テムシロリムス、ベンダムスチン塩酸塩、トリプトレリン、三酸化ヒ素、ラパチニブ、バルルビシン、ヒストレリン、ビンブラスチン、ボルテゾミブ、エトポシド、トレチノイン、アザシチジン、ビンクリスチン、パゾパニブ、テニポシド、ロイコボリン、クリゾチニブ、カペシタビン、エンザルタミド、トラベクテジン ストレプトゾシン、ベムラフェニブ、ゴセレリン、ボリノスタット、ゾレドロン酸、エベロリムス、イデラリシブ、セリチニブ、アビラテロン、またはこれらの組み合わせ、などの追加の病態の治療を現在受けているか、受けたか、受ける予定であってもよい。１種以上のＨＢＶ抗ウイルス剤を個体に提供してもよい。組成物は、局所的にまたは全身的に送達され得る。特定の場合において、組成物は、静脈内注射、カテーテルを用いた門脈内または肝動脈内への直接注射、経口投与、皮下注射、筋肉内注射、または腹腔内注射によって送達される。送達は、一定の注入によるものであってもよく、そうでなくてもよい。
【００２３】
一実施形態では、以下の成分を含むポリペプチドがある：１）ＸＴＬ１９  ｓｃＦｖ、ＸＴＬ１７  ｓｃＦｖ、ＯＳＴ５７７  ｓｃＦｖ、５α１９  ｓｃＦｖ、またはそれらの組み合わせを含む、抗体または抗体断片；２）ＩｇＧ１野生型Ｆｃ、ＩｇＧ４野生型Ｆｃ、ＩｇＧ１（ＡＡ）Ｆｃ、ＩｇＧ２（ＡＡ）Ｆｃ、ＩｇＧ１（ＡＡ）−ＣＨ２ドメインのみ、ＩｇＧ２（ＡＡ）−ＣＨ２ドメインのみ、ＩｇＧ４ｍ  Ｆｃ、ＩｇＧ４ｍ、ＣＤ８０外部ドメイン、ＣＤ８６外部ドメイン、またはそれらの組み合わせ；および３）抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、を含む。ここで、１）、２）、または３）の成分が、Ｎ末端からＣ末端への配向において、任意の順序であり得る。特定の場合においては、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、順序は、１）、２）および３）である。他の場合においては、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、順序は、３）、２）、および１）である。
【００２４】
別の実施形態では、治療有効量の２つの別個のポリペプチドまたは２つの別個のポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、治療有効量の個体に送達する工程を包含する病態を治療する方法であって、第一のポリペプチドがＦｃＲｎ結合ドメインに作動可能に連結された肝臓抗原標的化実体を含み、第二のポリペプチドが抗ＣＤ３  ｓｃＦｖに作動可能に連結された肝臓抗原標的化実体を含み、その結果、第一のポリペプチドが抗原粒子の分泌を阻害し得る一方で、第二のポリペプチドが前記粒子によって阻害され得ず、代わりに、病原性細胞表面にＴ細胞をリダイレクトし得る、方法が存在する。特定の実施形態では、ＦｃＲｎ結合ドメインに作動可能に連結された肝臓抗原標的化実体が肝細胞からの表面抗原粒子およびＢ型肝炎ビリオンの分泌を阻害する。特定の局面において、第二のポリペプチドは、肝臓抗原の存在下で増殖、細胞傷害性、およびサイトカイン放出についてＴ細胞を活性化する二重特異性抗体である。一実施形態では、第二のポリペプチドが肝細胞内への内在化なしに肝細胞表面上に残存し、それによってエフェクター細胞との会合を延長する。
【００２５】
一実施形態では、個体の組織（例として、肝臓または肺）においてｉｎ  ｓｉｔｕで単一特異性および二重特異性抗体を生成する方法であって、ここで、各々が同一の単一特異性抗体ポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドを個体に提供する工程を包含し、ここで、個体の組織においてｉｎ  ｓｉｔｕでポリヌクレオチドから生成される抗体は互いに二量体化し、それによって、個体の組織内で単一特異性抗体および二重特異性抗体の混合物を生成する、方法が本明細書に提供される。抗体は、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ペプチド、ラクダ科の可変ドメイン、サメＩｇＮＡＲ可変ドメイン、単一ドメイン抗体、アフィマー、またはＶＨＨ抗体を含む１つ以上の抗原結合ドメインを含み得る。場合によっては、抗原結合ドメインはそれぞれのＦｃ領域で二量体化し、場合によって、抗原結合ドメインは別個のタンパク質ドメイン（例えば、免疫グロブリンＧ由来のロイシンジッパーモチーフ、ヒンジおよびＣＨ２ドメインを含むもの、ヘリックス−ループ−ヘリックス二量体化ドメイン、またはジスルフィド結合を形成するタンパク質ドメイン）と二量体化する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドは疾患抗原に対する単一特異性抗体をコードし、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、免疫刺激因子に対する単一特異性抗体をコードするか、または免疫刺激因子ドメインを提供する。免疫刺激剤は、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖ、抗４１ＢＢ  ｓｃＦｖ、抗ＯＸ４０  ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ４  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ１  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖ、ＣＤ２８に対するリガンドの外部ドメインの一部または全部、４１ＢＢリガンドの外部ドメインの一部または全部、ＳＩＲＰα、ＬＩＧＨＴタンパク質の外部ドメインの一部または全部、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、Ｂ７−Ｈ４、およびＢ７−Ｈ６、ＣＤ１３４Ｌ、および／またはそれらの組み合わせであり得る。場合によっては、ＣＤ２８のリガンドの外部ドメインの一部または全部がＣＤ８０および／またはＣＤ８６の外部ドメインの一部または全部としてさらに定義される。
【００２６】
特定の実施形態では、個体の組織（例えば、肝臓または肺）においてｉｎ  ｓｉｔｕで二重特異性、三重特異性および四重特異性抗体を生成する方法であって、各々が非同一の二重特異性抗体ポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドを個体に提供する工程を包含し、ここで、個体の組織においてｉｎ  ｓｉｔｕでポリヌクレオチドから産生される抗体は互いに二量体化し、それによって、個体の組織内で二重特異性、三重特異性および四重特異性抗体の混合物を生成する、方法が存在する。抗体は、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ペプチド、ラクダ科の可変ドメイン、サメＩｇＮＡＲ可変ドメイン、単一ドメイン抗体、アフィマー、またはＶＨＨ抗体を含む１つ以上の抗原結合ドメインを含み得る。抗体は、それぞれのＦｃ領域において二量体化し得る。抗原結合ドメインは、ロイシンジッパーモチーフ、免疫グロブリンＧ由来のヒンジおよびＣＨ２ドメイン、ヘリックス−ループ−ヘリックス二量体化ドメイン、またはジスルフィド結合を形成するタンパク質ドメインなどの別個のタンパク質ドメインと二量体化することができる。特定の実施形態では少なくとも１つのポリヌクレオチドが疾患抗原に対する抗体をコードし、少なくとも１つのポリヌクレオチドは免疫刺激因子に対する単一特異性抗体をコードするか、または免疫刺激因子ドメインを提供する。特定の場合において、免疫刺激因子は、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖ、抗４１ＢＢ  ｓｃＦｖ、抗ＯＸ４０  ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ４  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ１  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖ、ＣＤ２８のリガンドの外部ドメインの一部または全部、４１ＢＢリガンドの外部ドメインの一部または全部、ＳＩＲＰα、ＬＩＧＨＴタンパク質の外部ドメインの一部または全部、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、Ｂ７−Ｈ４、およびＢ７−Ｈ６、ＣＤ１３４Ｌ、またはＣＤ１３７Ｌおよび／またはそれらの組み合わせ、である。ＣＤ２８のリガンドの外部ドメインの一部または全部は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６の外部ドメインの一部または全部としてさらに定義され得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、インビボの組織において分泌可能なポリペプチドが適切なレベルで発現されると、このポリペプチドが、抗原に対する抗原依存性免疫刺激に加えて、抗原非依存性の免疫刺激特性を誘発する、組成物が存在する。
いくつかの実施形態ではインビボで組織中に発現される場合、シグナル伝達および免疫細胞の活性化の活性を含むが、インビトロでは同じ活性を欠く、抗原標的化ドメインを含まない免疫刺激性単一特異性抗体を含む組成物がある。
【００２８】
上記は以下の本発明の詳細な説明がよりよく理解され得るように、本発明の特徴および技術的利点をかなり広く概説した。本発明の特許請求の範囲の主題を形成する本発明の追加の特徴および利点を以下に説明する。開示される概念および特定の実施形態は本発明の同じ目的を実行するための他の構造を修正または設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者によって理解されるべきである。当業者なら、添付の特許請求で説明したような本発明の精神および範囲から、このような等価な構成が、逸脱しないことも認識すべきである。本発明の特徴であると考えられる新規な特徴はその構成および動作方法の両方に関して、更なる目的および利点とともに、添付の図面と関連して考慮されるとき、以下の説明からより良く理解されるのであろう。しかしながら、図面の各々は、例示および説明の目的のみのために提供され、本発明の限定の定義として意図されないことが明確に理解されるべきである。本出願の範囲は、明細書に記載されたプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本発明をより完全に理解するために、添付の図面とともに以下の説明を参照する。
【００３０】
【図１】本開示の二重特異性抗体の例を図示する。
【００３１】
【図２】理論に縛られることなく、本開示の特定の二重特異性抗体の作用機序の一例を示す。
【００３２】
【図３】Ｂ型肝炎感染のモデルにおける使用のための特定のプラスミドを例示する。
【００３３】
【図４】本開示に包含される１つの特定の二重特異性抗体のインビボでの有効性を実証する。
【００３４】
【図５】本開示に包含される１つの特定の二重特異性抗体についてのインビボ投与の例を示す。
【００３５】
【図６】マウスモデルにおける用量の２つの例を利用してインビボでの有効性を実証する。
【００３６】
【図７】図７Ａ〜７Ｅ：抗体産生をin vivoで検証し、免疫リードアウトのためのウイルス生物発光系を確立した。（７Ａ）ＨＢｓＡｇの「ａ」決定基に対して特異性を有する１９．７９．５ヒト抗体クローンに由来するｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質からなる１９−Ｆｃ抗体を開発した。ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１タンパク質に由来した。インビボでの発現のために抗体をｐＣＡＧＧＳベクターにクローニングした。（７Ｂ）ハイドロダイナミックインジェクションの際に、インジェクションの４日後に血清を回収し、ＨＢｓＡｇに結合し得る機能的１９−Ｆｃタンパク質について測定した（ｎ＝４）。（７Ｃ）野生型ＨＢＶ過剰長ゲノムの送達と、ＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼ発現を駆動するＨＢＶコアプロモーターの使用とを組み合わせた、ＨＢＶについてのルミネセンスモデルを開発した。（７Ｄ）ＩＶＩＳイメージングは、５μｇのプラスミドのインジェクト後に肝臓に特異的な効率的かつ特異的な発光を明らかにした。（７Ｅ）ＮＳＧマウスにおいて経時的に発光をモニターし、２．５ヶ月にわたって発現が漸減することが明らかとなった（ｎ＝４、対応のないｔ検定、＊：ｐ＜０．０５）。
【００３７】
【図８】図８Ａ〜８Ｂ：バイスペクティブ抗体フォーマットをｉｎ  ｖｉｖｏで有効性についてスクリーニングした。（８Ａ）異なるリンカードメインが挿入された異なる末端に付加された免疫対ＨＢｓＡｇ結合成分とともに、図示された種々の二重特異性抗体フォーマットをｐＣＡＧＧＳベクターにクローン化した。（８Ｂ）１５ｕｇの二重特異性抗体ベクターを５ｕｇのＨＢＶ−Ｌｕｃと同時注入し、インジェクト後４日目に発光を測定した（ｎ＝３）（対応のないｔ検定、＊：ｐ＜０．０５）。定義：ｍＣＤ３＝２ｃ１１ハムスタークローン由来のマウスＣＤ３イプシロンに対するｓｃＦｖ；ｍＢ７．１＝マウスＢ７．１タンパク質の外部ドメイン；ＣＨ２，ＣＨ３＝抗体Ｆｃドメインの成分、灰色＝ヒトＩｇＧ１、茶色＝Ｆｃ受容体結合を妨げる突然変異を有するヒトＩｇＧ４；オレンジ色＝二量体化およびＦｃ受容体結合を妨げる突然変異を有するヒトＩｇＧ１；ＸＴＬ１９＝抗体クローン１９．７９．５由来のｓｃＦｖ。
【００３８】
【図９】図９Ａ〜９Ｃ：二重特異性抗体は、急性ＨＢＶマウスモデルにおいてウイルスを減少させる。（９Ａ）５ｕｇのＨＢＶ‐Ｌｕｃによる流体力学的注射後４日目にガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）対照と比較して最も高い発光低下を示すプラスミドレベルを見出すために、投与系列を実施した（ｎ＝４、対応のないｔ検定、＊：ｐ＜０．０５）。（９Ｂ）１５ｕｇ用量を用いて、１９‐Ｆｃ‐ｍＣＤ３をｍＣＤ３結合を欠く１９‐ＦｃおよびＦｃ受容体結合を欠くＧ４ｍを含むバージョンと比較した。ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）と空のｐＣＡＧＧＧＳ（Ｅｍｐｔｙ  ｐＣＡＧＧＳ）を対照として用いた（ｎ＝４、対応のないｔ検定、＊：ｐ＜０．０５）。このアッセイにおけるバックグラウンドルミネセンスは５×１０５  ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２であった。（９Ｃ）発光の減少は、ＨＢＶ−Ｌｕｃ＋ガウシア条件の４日目のＨＢｓＡｇレベルに対して正規化した実験における、血清ＨＢｓＡｇレベルをモニタリングすることによって相関させた（ｎ＝４、対応のないｔ検定、＊：ｐ＜０．０５）；
【００３９】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄ：ＣＤ３に結合する二重特異性抗体は、標的抗原非依存性Ｔ細胞活性化を生じる。（１０Ａ）ＸＴＬ１９特異性を、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する１３９ｓｃＦｖ特異性およびヒトＥｐｈＡ２に対するｓｃＦｖに置き換え、以前の試験（１５ｕｇ抗体＋５ｕｇ  ＨＢＶ−Ｌｕｃ）と同様の群を用いた（ｎ＝４、対応のないｔ検定、＊：ｐ＜０．０５）。（１０Ｂ）１９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３は注射後４日目に１３９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３より有意に大きい発光の減少を有し、抗原標的化の役割を明らかになった。（ｎ＝４，  対応のないｔ検定）。（１０Ｃ）二重特異性抗体を、ｍＣＤ３  ｓｃＦｖ単独とともに、ＢｉＴＥフォーマットに類似してＦｃドメインを欠くように構築した（ｎ＝４、対応のないｔ検定、＊：ｐ＜０．０５）。（１０Ｄ）ＢｉＴＥフォーマットに対する治療応答の動態を１６日間にわたって追跡した。
【００４０】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄ：発現長、安全性、およびクリアランス機構を二重特異性抗体療法について評価した。（１１Ａ）二重特異性抗体療法の文脈における適応免疫の寄与を、ＮＳＧ対免疫応答性マウスにおける１９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３療法を比較することによって評価し、最初の二重特異性媒介減少の後にＮＳＧマウスにおいて減少が停止したことを示した。（１１Ｂ）最初の二重特異性抗体活性化の時間経過を、最初の４日間にわたって追跡したところ、発光の有意な減少が１日目に生じ、その後増加しなかった（対応のないｔ検定）。（１１Ｃ）二重特異性抗体発現の毒性を、Ｒｏｓａ−Ｌｕｃマウスに１９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３を含むＣｒｅプラスミドをインジェクトしたものを、ガウシアをインジェクトしたものと比べて評価した。発光の差は有意でなく、肝細胞の生存を示した（ｎ＝４、対応のないｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５）。（１１Ｄ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９療法を同じ系で１９−Ｆｃ−ｍＣＤ３と比較し、異なる作用機序ではあるが、発光は同様に有意に減少した（ｎ＝４、対応のないｔ検定、＊：ｐ＜０．０５）；
【００４１】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄ：二重特異性抗体は、ＨＢＶの新規マウスモデルにおいてＨＢＶのｃｃｃＤＮＡクリアランスおよび宿主の免疫応答を促進することができる。（１２Ａ）Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ−ＨＢＶ（ＣＬＸ）プラスミドを用いて、インビボでｃｃｃＤＮＡを生成し、Ｒｏｓａ−Ｌｕｃマウスにおいて感染肝細胞をルシフェラーゼ発現で標識した。５ｕｇのＣＬＸプラスミドを１５ｕｇの１９−または１３９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３プラスミドまたは１５ｕｇのＣＭＶ−ガウシアと同時注入し、発光レベルをモニターした。感染した肝細胞は発光の低下によって判断されるように、二重特異性治療群において除去されるように思われた。（１２Ｂ）異なる群間の４日目の発光レベルを比較して、感染細胞に対する任意の初期細胞毒性を評価した。（ｎ＝４、対応のないｔ検定、＊：ｐ＜０．０５）。（１２Ｃ）ＨＢｓＡｇ血清レベルも注射後４日目に評価し、二重特異性構築物は血清ＨＢｓＡｇの１．５ｌｏｇ以上の減少を生じた。（ｎ＝４、対応のないｔ検定、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．００１）（１２Ｄ）適応免疫を誘発する二重特異性抗体の能力を、抗ＨＢｓＡｇ抗体の血清レベルを測定して追跡した。１２日目から差異を認めた（ｎ＝４、対応のないｔ検定、＊：ｐ＜０．０５）；
【００４２】
【図１３】ＨＢＶ−Ｌｕｃプラスミドの配列情報（配列番号１および配列番号２）。生物発光を用いてＨＢＶに対する免疫応答をリアルタイムでモニターするための報告されたシステムを開発した。プラスミドｐＳＰ６５−ＨＢＶａｙｗ１．３（Ｓｔｅｆａｎ  Ｗｉｅｌａｎｄからの寄贈）を使用に適応させた。内因性ＨＢＶコアプロモーターを利用して、ＨＢＶ遺伝子発現に対するサイトカインの効果を正確に評価した。天然要素を利用するために、ＧＦＰをコアタンパク質翻訳の直後に融合タンパク質として導入し、構築を単純化した。生成されたルシフェラーゼは、２Ａペプチド切断によって分離され、外来配列を有しなかった。
【００４３】
【図１４】生物発光およびｃｃｃＤＮＡ生成を用いた感染肝細胞のための二重モニタリングシステム。Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ−ＨＢＶプラスミドはＣＭＶ−ＮＬＳ−Ｃｒｅ（イントロン）カセットおよびＬｏｘＰ−ＨＢＶ隣接ゲノムを含み、ＬｏｘＰはＨＢＶ  Ｘタンパク質のアミノ酸８３と８４の間に挿入される。プラスミドをＲｏｓａ−Ｌｕｃマウスにハイドロダイナミックインジェクションした。ここで、このマウスは、Ｒｏｓａ２６プロモーターによって駆動されるＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ホタルルシフェラーゼカセットを含む。導入に際して、ＣＭＶにより駆動されるＣｒｅリコンビナーゼ発現は、組換えｃｃｃＤＮＡ分子を切り出して形成し、そして同じ細胞におけるルシフェラーゼ発現を活性化する。従って、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを有する全ての細胞はルシフェラーゼ発現も有し、二重のモニタリングおよび読み出しを提供する；
【００４４】
【図１５】細胞が細胞死を防ぐためにアポトーシス阻害剤も発現した場合、ＨＢＶに対する免疫刺激分子を送達する治療効果が維持されるかどうかの試験。マウス（ｎ＝４＋）は全て、５ｕｇのＨＢＶ−Ｌｕｃプラスミド、５ｕｇのＣＡＧ−Ｂｃｌ２または対照プラスミド、および１５ｕｇの１９−Ｆｃ−ｍＣＤ３プラスミドを、ハイドロダイナミックインジェクションした。細胞内での抗アポトーシスタンパク質の発現は、対照に対する同等の生物発光減少によって判断されるように、二重特異性抗体の効果を阻害しない。
【００４５】
【図１６】図１６Ａ〜１６：ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃの血行動態尾静脈注射は、インビボでＨＢｓ−Ｆｃ抗体発現をもたらす。（１６Ａ）ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃの模式図。（１６Ｂ）ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃのハイドロダイナミック尾静脈インジェクションの４日後に血清を採取した。ＨＢｓ−Ｆｃの血清中濃度はＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ  Ａｂ  ＥＬＩＳＡ（ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５）により測定した。
【００４６】
【図１７】１７Ａ〜１７Ｂ：肝細胞へのＨＢｓ−Ｆｃ遺伝子送達は、インビボで抗ＨＢＶを有する。（１７Ａ）免疫応答性マウスに、５μｇのｐＨＢＶｆｆＬｕｃおよび１５μｇのｐＣＡＧ．ＨＢ−Ｆｃ、ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ、または対照プラスミドをハイドロダイナミック尾静脈インジェクションにより同時注射した。全てのマウスについての定量的生物発光イメージングデータ（放射輝度＝光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示す（平均±標準偏差、ｎ＝３、＊：ｐ＜０．０５）（１７Ｂ）ＨＢｓＡｇレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。データをｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃ／対照プラスミド群の４日目のＨＢｓＡｇレベルに対して正規化した（平均±標準偏差、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。
【００４７】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃ：ＣＤ３結合ドメインの付加は、ＨＢｓ−Ｆｃの抗ＨＢＶ活性を増強する。（１８Ａ）抗体構築物のスキーム（緑色：ｍＡｂ  １９．７９．５（１９）由来のＨＢｓＡｇ特異的ｓｃＦｖ、紫色：ｍＡｂ  １３９（１３９）由来のＥｖＩＩＩ特異的ｓｃＦｖ、灰色：ＩｇＧ１−Ｆｃ（ＣＨ２、ＣＨ３）、青色：ｍＡｂ  １４５−２Ｃ１１（１４５）由来のマウスＣＤ３特異的ｓｃＦｖ。（１８Ｂ）免疫応答性マウスに、１５μｇのｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ−ＣＤ３、ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩＦｃ−ＣＤ３、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ、ｐＣＡＧ−ＥｖＩＩＦ−Ｆｃまたは対照プラスミド、並びに５μｇのｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃをハイドロダイナミック尾静脈インジェクションにより同時注射した。全マウスの定量的生物発光イメージングデータ（放射輝度＝光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示す（平均±標準偏差、ｎ＝３）。（１８Ｃ）同一の暴露時間を用いて、注射後４日目の異なる構築物のマウスイメージを示す（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。
【００４８】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂ：Ｆｃ受容体結合は、ＨＢｓ−Ｆｃ−ＣＤ３の抗ＨＢＶ活性に寄与しない。（１９Ａ）抗体構築物のスキーム（緑色：ｍＡｂ  １９．７９．５（１９）由来のＨＢｓＡｇ特異的ｓｃＦｖ、紫色）：  ｍＡｂ  １３９（１３９）由来のＥｖＩＩＩ特異的ｓｃＦｖ、褐色：変異Ｆｃ受容体結合部位（ＣＨ２、ＣＨ３）を有するＩｇＧ４−Ｆｃ、青色：ｍＡｂ  １４５−２Ｃ１１（１４５）由来のマウスＣＤ３特異的ｓｃＦｖ。（１９Ｂ）免疫応答性マウスに、１５μｇのｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３、ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３、または対象プラスミドを、５μｇのｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃとともにハイドロダイナミック尾静脈インジェクションにより同時注射した。すべてのマウスについての定量的生物発光イメージングデータ（放射輝度＝光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示す（平均±標準偏差、ｎ＝３）。ＣＡＧ−ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３（＊ｐ＜０．０５）；ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３は、ｐ．ＣＡＧ−ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３よりも有意に高い抗ＨＢＶ活性を有していた（＊：ｐ＜０．０５）。
【００４９】
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｄ：ＨＢＶの組換えｃｃｃＤＮＡモデルにおけるＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３のインビボ発現は抗ウイルス効果を有し、内因性ＨＢｓＡｇ抗体を誘導する。Ｒｏｓａ−Ｌｕｃマウスに、５μｇのｐＣＬＸおよび１５μｇのｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３、ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３、または１５μｇの対照プラスミド（ｎ＝４）をハイドロダイナミック尾静脈インジェクションにより同時注射した。（２０Ａ）ＨＢｓＡｇ血清レベルを、注射後４日目にＥＬＩＳＡによって測定した（平均±標準偏差を示す、ｎ＝４、＊＊ｐ  ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００１）（２０Ｂ）宿主ＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ抗体の生成を、図に示された時点で、ＥＬＩＳＡによって測定した（平均±標準偏差、ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５）。（２０Ｃ）組織を注射後４日目にマウスから採取し、ＨＢＶコアタンパク質（赤色）発現を免疫蛍光（青色＝ＤＡＰＩ、スケールバー＝５０μｍ）によって評価した。（２０Ｄ，２０Ｅ）すべてのマウスについての定量的生物発光イメージングデータ（放射輝度＝光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を、注射後４日目は（２０Ｄ）に、および長期追跡におけるものは（２０Ｅ）に示す（平均±  ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５）。
【００５０】
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｃ：非侵襲的生物発光イメージングを用いてＨＢＶのクリアランスを測定することを可能にするマウスモデル。（２１Ａ）過剰長（１．３量体）ＨＢＶゲノムおよびコアタンパク質融合ＧＦＰ−２Ａ−ｆｆＬｕｃカセットをコードするプラスミドのスキーム（両方とも同一のＨＢＶコアプロモーターの転写制御下にある）。（２１Ｂ，２１Ｃ）ＮＳＧマウスに５μｇのｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃを流体力学的尾静脈注射により注射し、ｆｆＬｕｃ発現を生物発光イメージングによりモニターした。（２１Ｂ）注射後４日目のマウスの生物発光画像。（２１Ｃ）定量的生物発光イメージングデータ（放射輝度＝光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を経時的に示す（平均および標準誤差平均、ｎ＝４）。
【００５１】
【図２２】ＥｐｈＡ２−Ｆｃ−ＣＤ３のインビボ発現は抗ＨＢＶ活性を有していた。ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ−ＣＤ３の抗原非依存性活性を確認するために、本発明者らは、ＥｖＩＩＩ特異的ｓｃＦｖをｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ−ＣＤ３と、ＥｐｈＡ２特異的ｍＡｂ  ４Ｈ５  ｐＣＡＧ．ＥｐｈＡ２−Ｆｃ−ＣＤ３）由来のｓｃＦｖと置き換えた。免疫応答性マウスに、５μｇのｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃおよび１５μｇのｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ−ＣＤ３、ｐＣＡＧ．Ｅｐｈａ２−Ｆｃ−ＣＤ３、または対照プラスミドを、ハイドロダイナミック尾静脈インジェクションにより同時注射した。すべてのマウスについての定量的生物発光イメージングデータ（放射輝度＝光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を、注射後４日目（平均±標準偏差）、ｎ＝４、ｎ．ｓ＝有意でない、＊＊ｐ＜０．００５）について示す。
【００５２】
【図２３】二重特異性抗体のインビボ発現の抗ウイルス効果は、複数の実験にわたって一貫している。各構築物についての異なる実験にわたる反復の照合された生物発光データ（放射輝度＝光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）が示され、一貫した効果を実証している。対照，ｎ＝１６；  ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ、ｎ＝６；ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ−ＣＤ３、ｎ＝４；ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３、ｎ＝５；  ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ、ｎ＝６；ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ−ＣＤ３、ｎ＝１０；ｐＣＡＧ．ＨＢｓｍＦｃ−ＣＤ３、ｎ＝９。
【００５３】
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｂ：二重特異性抗体は注射後早期に、ＣＤ３結合を介して作用し、抗ウイルス活性を媒介する。（２４Ａ）マウス（ｎ＝３）に１５μｇのｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３、もしくは対照、並びに５μｇのｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃを同時注射した後、生物発光を追跡した。（２４Ｂ）同様の実験において、１５μｇのｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３、１５μｇのｐＣＡＧ．ＣＤ８０−ｍＦｃ−ＨＢｓ、もしくはは対照、並びに５μｇのｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃをマウスに注射し、注射後４日目に測定した（ｎ＝４）。すべてのマウスについての定量的生物発光イメージングデータ（放射輝度＝光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示し（平均±標準偏差）、有意差（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００１）を示す。
【００５４】
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｃ：肝細胞におけるＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３のインビボ発現は非毒性である。（２５Ａ）トランスアミナーゼレベル（ＡＳＴおよびＡＬＴ）を、５μｇのｐＨＢＶｆｆＬｕｃおよび１５μｇのｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３、対照プラスミド（ｎ＝３）、またはｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩｍＦｃ−ＣＤ３（ｎ＝４）の注射後４日目に測定した。（平均±標準偏差）。ＡＬＴまたはＡＳＴ測定のいずれにおいても、いずれの群間にも有意な（ｎ．ｓ．）差はなかった。（２５Ｂ）形質導入されたＣｒｅリコンビナーゼ発現肝細胞においてｆｆＬｕｃ発現を誘導するレポーターＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ｆｆｌｕｃカセットを含む、Ｒｏｓａ−Ｌｕｃマウスに、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３または対照プラスミドとともにｐＣＭＶ−ＮＬＳ−Ｃｒｅを同時注射することによって、ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３発現の毒性を評価した。全てのマウスについての定量的生物発光イメージングデータ（放射輝度＝光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示す（平均±標準偏差、ｎ＝３）。ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３注入群と対照プラスミド注入群との間に有意差（ｎ．ｓ．）はなかった。（２５Ｃ）５μｇのｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃおよび１５μｇのｐＣＡＧ．ＨＢ−ｍＦｃ−ＣＤ３または対照プラスミドを同時注射し、パラホルムアルデヒド中で固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した組織でマウスの肝組織を注射後４日目に採取した。マウス間で組織形態の差は観察されなかった（低倍率スケールバー＝１００μｍ、高倍率スケールバー＝５０μｍ）。
【００５５】
【図２６】肝細胞におけるＨＢｓ−Ｆｃ、ＨＢｓ−Ｆｃ−ＣＤ３、またはＥｖＩＩＩ−Ｆｃ−ＣＤ３のインビボ発現は非毒性である。５μｇのｐＨＢＶ−Ｌｕｃおよび１５μｇのｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ−ＣＤ３、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ、ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ−ＣＤ３、または対照プラスミドを同時注射したマウスのハイドロダイナミック尾静脈インジェクション後４日目に肝組織を採取した。組織をパラホルムアルデヒド中で固定し、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（低倍率スケールバー＝１００μｍ、高倍率スケールバー＝５０μｍ）。
【００５６】
【図２７】抗ウイルス活性および抗ウイルス剤の肝毒性をモニターするための組換えｃｃｃＤＮＡ  ＨＢＶマウスモデル。（Ａ）ＣＭＶＮＬＳ−Ｃｒｅ（イントロン）カセットおよびＬｏｘＰ−ＨＢＶ隣接ゲノム（ｐＬｏｘＰ−ＨＢＶ由来）を含み、ＬｏｘＰ部位がＨＢＶ  Ｘタンパク質のアミノ酸８３と８４の間に挿入されているｐＣＬＸのスキーム。Ｒｏｓａ２６プロモーターによって駆動されるＬｏｘＰ−ＳＴＯＰＬｏｘＰ−ｆｆＬｕｃカセットを含むＲｏｓａ−ＬｕｃマウスにｐＣＬＸがハイドロダイナミック尾静脈注射によってインジェクトされると、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現はｉ）（ｒ）ｃｃｃＤＮＡ分子を切り出して組換え体を形成し、そしてｉｉ）同じ細胞においてｆｆＬｕｃ発現を誘導する。従って、ＨＢＶ  ｒｃｃｃＤＮＡを含む全ての細胞はｆｆＬｕｃも発現し、非侵襲的生物発光イメージングによる抗ウイルス剤の毒性モニタリングを可能にする。（Ｂ）２０μｇのｐＣＬＸまたはｐＬｏｘＰ−ＨＢＶを、ハイドロダイナミック尾静脈インジェクションによってＮＳＧマウスに注射した。血清を注射１週間後に採取し、ＨＢｓＡｇレベルをＥＬＩＳＡ（平均±標準偏差、ｎ＝４）（Ｃ）５μｇのｐＣＬＸまたはｐＬｏｘＰ−ＨＢＶをハイドロダイナミック尾静脈インジェクションによりマウスに注射し、注射４日後に肝臓切片をＨＢＶコア（赤＝ＨＢＶコア、青＝ＤＡＰＩ、スケールバー＝２０μｍ）について染色した。
【００５７】
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｂ：ｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃの配列情報。（２８Ａ）（配列番号１）ＧＦＰ−２Ａ−ｆｆＬｕｃの下流発現を可能にするために、ＧＦＰリーディングフレーム（緑色）に融合したコアタンパク質配列（青色）。（２８Ｂ）（配列番号２）コア−ＧＦＰ融合体のＤＮＡ配列であり、コアｍＲＮＡの転写開始部位を赤色（標準的なプレゲノムｐｇＲＮＡと同じ）で示し、コアタンパク質の開始コドンを青色で示し、ＧＦＰの開始コドンを緑色で示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つ以上のことを意味し得る。特許請求の範囲において使用される場合、単語「有する」とともに使用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味することができる。本明細書で使用される「別の」は、少なくとも第二のまたはそれ以上を意味することができる。特定の実施形態において、本発明の局面は例えば、本発明の１つ以上の配列から「本質的になる」か、または「からなる」。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の１つまたは複数の要素、方法ステップ、および／または方法からなるか、または本質的にそれらからなることができる。本明細書中に記載されるいずれの方法または組成物も、本明細書中に記載される任意の他の方法または組成物に関して使用され得ることが意図される。本出願の範囲は、明細書に記載されたプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図していない。
【００５９】
特定の場合において、本開示は例えば、疾患細胞に対して免疫系をリダイレクトする二重特異性抗体を使用して、肝臓のウイルス感染および癌を標的化する戦略に関する。従来、当該技術分野において、そのような分子は、それを必要とする個体に投与される組換えタンパク質として開発されてきた。種々の腫瘍を標的とする臨床試験において、この戦略の有効性は乏しく、一定の注入を必要とするわずかな成功（例えば、ＣＤ１９＋細胞を標的とするブリナツモマブ）にとどまる。本開示において、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは罹患器官に直接送達され得、その結果、それらは、全身療法とは対照的に、高度に濃縮され、そして罹患細胞に容易に到達する。さらに、これは、このクラスの分子について以前の試験で認められた用量規制毒性を減少させる。
【００６０】
本開示は特に、肝臓組織（これは、種々の感染性疾患および癌障害（原発性および転移性の両方）の宿主である）を標的とする用途に関する。遺伝子治療の実施形態は、肝臓を標的にするために、例えば、アデノ随伴ウイルス、または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ｍＲＮＡ送達を利用し得る。これらはいずれも、それぞれヒトおよびチンパンジーにおける有効性について既に検証されている。特に、免疫適格マウスにおける未治療群と比較して、治療４日以内にウイルスゲノムの１００倍の減少をもたらし、そして未治療マウスにおいては、その時点でウイルスゲノムが影響を受けていないものと比較して８日までにウイルス除去が起こる、Ｂ型肝炎ウイルスに対する二重特異性抗体が、本明細書中に包含される。同様の効力は、Ｔ細胞活性化のみを標的とする単一特異性構築物において観察されている。現在の治療法がウイルスゲノムを標的とすることができないことを考慮すれば、これは当該技術分野における重要な進歩である。少なくともマウスにおいて効力をもたらす異なる抗体配列および二重特異性設計の例が本明細書に包含される。例えば、有効性およびＴ細胞活性化のために適切な幾何学的形状を維持することができる独特のリンカー組成物もまた、本明細書中に包含される。本開示は特定の器官の例として、肝臓における自己抗原を標的化する能力、およびこれらの細胞におけるシグナルのクリアランスを実証する。そしてそのことは、例えば、多くの自己腫瘍抗原標的への適用のために外挿され得る。
【００６１】
（Ｉ．組成物例）
本開示は、以下に例として利用される、肝臓などの特定の器官に影響を及ぼすものなどの、病態の１つ以上の症状の治療または予防に使用するための新規組成物を提供する。特定の実施形態では、組成物は、肝臓に位置する細胞上の抗原または肝臓の外側の細胞上にも肝臓に位置する細胞上にも見出される抗原を含む、肝臓疾患抗原に結合することができる１つ以上の成分を含む。特定の実施形態では、免疫系を刺激および／または活性化することができる１つまたは複数の成分を含み、これは組成物が肝臓内の疾患細胞を含む肝臓に集中するように、免疫系を刺激および／または活性化することを含む。組成物はまた、分子の２つ以上の成分を作動可能に連結する少なくとも１つのリンカーを含んでもよい。２つ以上の構成要素は互いに連携して働くことができ、または互いに別々に機能しても良い。組成物の２つ以上の成分は、類似または別個の機能を有し得、および／または各々が異なる標的に結合してもよい。それぞれの標的が結合すると、それらは、直接的または間接的に下流の作用をもたらしてもよく、このとき別個の下流アクションであっても、そうでなくてもよい。
【００６２】
（Ａ．肝臓疾患抗原標的化実体）
本開示の実施形態は、少なくとも１つの肝臓疾患抗原標的化実体を含む組成物を含む。この実体は、１、２、３、４またはそれ以上の肝臓抗原標的化実体を含むことができる。複数の肝臓疾患抗原標的化実体が組成物の１つの分子上に存在する場合、異なる実体は互いに隣接し得るか、またはそれらの間に肝臓抗原標的化実体ではない分子上の配列が存在し得る。２つの肝臓疾患抗原標的化実体の間に配列が存在する場合、肝臓抗原標的化実体は、少なくとも特定の場合において、連携して作用することを含めて、それらが適切に機能し得るように依然として配向される。異なる肝臓疾患抗原標的化実体は、標的化すべき肝臓抗原が同じ抗原であってもそうでなくてもよく、特定の実施形態では、個体に同時に投与される、１つ以上の抗原に対する肝臓疾患抗原標的化実体のカクテルを包含する。
【００６３】
特定の実施形態では、肝臓抗原標的化実体は、肝臓内の細胞の表面上の抗原を標的化する。その細胞は、正常な肝細胞または罹患した肝細胞であり得る。特定の実施形態では、肝臓抗原標的化実体は、肝臓内の細胞上の少なくとも１つの抗原に直接的または間接的に結合することができる。肝臓中の細胞が疾患細胞である場合、細胞は病原体（例えば、ウイルス、細菌、または寄生虫）に感染し得る。病原体が寄生虫である場合、標的抗原は、マラリアの原因物質である熱帯熱マラリア原虫由来であり得る。標的とされ得る肝臓に感染する他の寄生虫としては、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、サルマラリア原虫（Plasmodium knowlesi）、トキソプラズマ（Toxoplasmosis gondii）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、エキノコックス（Echinococcosis）、肝蛭（Fasciola hepatica）、肝吸虫（Clonorchis sinensis）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansonsi）、ビルハルツ住血吸虫（Schisosoma intercalatum）、ヒト回虫（Ascaris lumbricoi）、アライグマ回虫（Baylisascaris procyonis）、犬回虫（Toxocara canis）、または猫回虫（Toxocara cati）が含まれる。病原体がウイルスである場合、肝抗原標的化実体は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、またはＥ型肝炎ウイルスなどの任意のタイプの肝炎ウイルス、あるいはサイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−８、エボラウイルス、ジカウイルス、パルボウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）関連コロナウイルス、パピローマウイルス、インフルエンザウイルス、または黄熱病ウイルスなどの別のタイプのウイルス、に由来する抗原を発現する細胞を、標的化し得る。他の場合において、肝疾患抗原標的化実体は原発性癌細胞、肝臓に転移した癌に由来する癌細胞、難治性癌細胞などを含む、肝臓に存在する癌細胞（例えば、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）または肝芽腫（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ））上の抗原を標的化する。
【００６４】
肝臓抗原標的化実体は肝臓抗原に直接または間接的に結合することができる限り、任意の種類であり得る。肝臓抗原標的化実体はそれを必要とする個体に提供され得る特定のポリヌクレオチドによってコードされるものを含む、タンパク質またはペプチドであり得る（しかし、代替の実施形態において、個体に提供される組成物はペプチドまたはポリペプチドであり、ポリヌクレオチドではない）。特定の実施形態では、肝臓抗原標的化実体は、例えば、一本鎖抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、ラクダ科抗体、またはラマ抗体を含む、抗体またはその機能的断片を含む。他の例には、アフィマーが含まれる。肝臓抗原標的化実体の具体例としては、少なくともＨＢＶ小表面抗原、ＨＢＶ中間表面抗原（ＰｒｅＳ２ドメインを含む）、ＨＢＶ大表面抗原（ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２ドメインを含む）、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ  ｅ抗原、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質、ＥＢＶ糖タンパク質、ＣＭＶ糖タンパク質などを標的化するものが挙げられる。転移を含む肝臓内の癌の場合、標的となり得る抗原の具体例には、例えば、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、Ｉｌ−１  １Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−β、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ  Ｂ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴｌ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＭＡＧＥ−Ａｌ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−  ２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／Ｇａｌｅｃｔｉｎ  ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣ���Ｒ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、およびＩＧＬＬ１が含まれる。
【００６５】
特定の場合において、肝臓抗原標的化実体は、ｓｃＦｖなどの１つ以上の抗体または抗体断片を含む。特定のｓｃＦｖは、例えば、モノクローナル抗体１７．１．４１、１９．７９．５、ＯＳＴ５７７、ｓｃＦｖ  Ａ５、ＶＨＨ−Ｓ４、ＶＨＨ−Ｓ５、ＨｚＫＲ１２７、ＫＲ３５９、２Ｂ６、２Ｄ９、２Ｅ７、２Ｇ３、ＡＤＲＩ−２Ｆ３、Ｅ６Ｆ６、ＨＢ−Ｃ７Ａ、５α１９、および１Ｃ９に由来するｓｃＦｖなどの、少なくとも１つの肝炎ウイルス抗原に直接結合するｓｃＦｖを含み得る。
【００６６】
特定の場合において、肝臓抗原標的化実体は、１つ以上のペプチドまたはペプチド断片を含む。特定のペプチドは、少なくとも１つの肝炎ウイルス抗原に直接結合するものを含み得る。特定のペプチドは少なくとも１つの肝炎ウイルス抗原に直接結合するもの、例えば、ペプチドＡ５、ペプチドＥＴＧＡＫＰＨ、ペプチドＰ７、ペプチドｐＣ、ペプチドｐ２、ペプチドｐ５、ペプチドｐ１８、ペプチド４Ｂ１０、またはペプチドＳＲＬＬＹＧＷを含み得る。
【００６７】
特定の場合において、肝臓抗原標的化実体は、２つのｓｃＦｖ（例えば、タンデムｓｃＦｖ）を含む。特に、タンデムｓｃＦｖは異なる肝臓抗原標的化実体に結合するが、いくつかの場合において、肝臓抗原標的化は、例えば、抗原上の同じまたは異なる部位で、同じ抗原に結合するタンデムｓｃＦｖを含む；それらは同じ抗原上の異なるエピトープに結合しても、しなくてもよい。
【００６８】
特定の実施形態では、肝臓抗原標的化実体は、融合タンパク質上などで、Ｆｃ受容体などの１つ以上の免疫グロブリン受容体に結合する成分に作動可能に連結される。肝臓抗原標的化実体は、例えば、ＦｃＲｎ結合ドメインに連結され得る。肝臓抗原標的化実体が１つ以上のＦｃＲｎ結合ドメインに連結されている組成物は、肝細胞からの表面抗原粒子およびＨＢＶビリオン（例として）の分泌の阻害活性を提供する。Ｆｃドメインは、ＦｃＲγ受容体結合および細胞傷害性を減少させ、Ｆｃドメインの補体結合を阻害する能力を減少させ、Ｆｃドメインの免疫複合体を形成する能力を減少させ、および／またはドメインを単量体構造にする、突然変異を含み得る。
【００６９】
別の場合において、肝疾患抗原標的化実体とＣＤ３結合ドメインとの間のリンカー領域はＦｃＲｎ結合を欠き（例えば、２つの部分を連結するＦｃドメインにおける変異を介して）、肝細胞の抗体治療剤のエンドサイトーシスを妨げる。ヒトＩｇＧ  ＦｃドメインのＣＨ２−ＣＨ３界面の残基を包含する残基Ｉｌｅ２５３Ａｌａ、Ｓｅｒ２５４Ａｌａ、Ｈｉｓ４３５ＡｌａおよびＴｙｒ４３６Ａｌａにおける突然変異は、ＦｃＲｎ結合を無効にするのに役立ち、この実施形態で使用することができる。このような特徴は、種々の疾患を治療する際に適切な有効な幾何学的形状を保持することによって、細胞表面上の肝臓疾患抗原を標的化する免疫細胞の能力を最大にし、一方で、細胞内輸送とは対照的に、標的細胞の表面上の二重特異性分子のより多くを最適化する。
【００７０】
特定の実施形態において利用することができる一本鎖抗体配列は、以下の通りである:
【００７１】
ＸＴＬ１９  （ＨＢｓＡｇを標的化する）
QVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAPSGFVFR SYGMHWVRQT PGKGLEWVSL IWHDGSNRFY   ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYFCAR ERLIAAPAAF DLWGQGTLVT VSSGGGGSGG GGSGGGGSSY VLTQPPSVSV APGKTARISC GGNNIGTKNV HWYQQKPGQA PVLVVYADSD RPSGIPERFS GSNSGNTATL TISRVEVGDE ADYYCQVWDS VSYHVVFGGG TTLTVLG  （配列番号３）
【００７２】
ＸＴＬ１７  （ＨＢｓＡｇを標的化する）
QVQLVESGGG VVRPGRSLRL SCAASGFAFS DYSINWVRQA PGKGLEWVAI ISYDGRITYY RDSVKGRFTI SRDDSKNTLY LQMNSLRTED TAVYYCARQY YDFWSGSSVG RNYDGMDVWG LGTTVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSDIVMTQ SPLSLSVTPG EPASISCRSS QSLLHRSGNN YLDWYLQKPG HSPQLLIYVG SNRASGVPDR FSGSGSGTEY TLRISTVEAE DVGVYYCMQA LQTPRTFGQG TKLEIKR  （配列番号４）
【００７３】
ＯＳＴ５７７  （ＨＢｓＡｇを標的化する）
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS RYGMHWVR QAPGKGLEWV AVISYDGSNK WYADSVKGRF TISRDNSKNT LFLQMHSL RAADTGVYYC AKDQLYFGSQ SPGHYWVQGT LVTVSSGGGG SGGGGSGGGG SQSQLTQPPS VSVAPGQTAR ITCGGDNIGS KSVNWFQQKP GQAPVLVVYD DNERPSGISE RFSGSNSGNT ATLTISRVEA GDEADYYCQV WDSSSDHVVF GGGTKLTVL  （配列番号５）
【００７４】
Ｈｕ１２Ｆ６  （ヒトＣＤ３イプシロンを標的化する）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT MTCRASSDSV SYMHWYQQTP GKAPKPWIYA TSNLASGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDIATYYCQQ WSSNPPTFGQ GTKLQITRGG GGSGGGGSGG GGSQVQLVQS GGGVVQPGRS LRLSCKASGY TFTSYAMYWV RQAPGKGLEW VAIINPSSGY TKNQKFDRFT ISADKSKSTA FLQMDSLRPE DTGVYFCARD GDYDVYFSAS CFGPDYWGQG TPVTVSS  （配列番号２５）
【００７５】
ヒト化ＵＣＨＴ１  （ヒトＣＤ３イプシロンを標的化する）
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIR NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLESGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GNTLPWTFGQ GTKVEIKRTG GGGSGGGGSG GGGSEVGQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GYSFTGYTMN WVRQAPGKGL EWVALINPYK GVTTYADSVK GRFTISVDKS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYY CARSGYYGDS DWYFDVWGQG TLVTVSS  （配列番号２６）
【００７６】
ＨｕＭ２９１  （ヒトＣＤ３イプシロンを標的化する）
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFI SYTMHWVRQA PGQGLEWMGY INPRSGYTHY NQKLKDKATL TADKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARSA YYDYDGFAYW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCSA SSSVSYMNWY QQKPGKAPKR LIYDTSKLAS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQWSSNPP TFGGGTKVEI K  （配列番号２７）
【００７７】
ｇＯＫＴ３−５  （ヒトＣＤ３イプシロンを標的化する）
QVQLVQSGGG VVQPGRSLRL SCKASGYTFT RYTMHWVRQA PGKGLEWIGY INPSRGYTNY NQKVKDRFTI STDKSKSTAF LQMDSLRPED TAVYYCARYY DDHYCLDYWG QGTPVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTITCSAS SSVSYMNWYQ QTPGKAPKRW IYDTSKLASG VPSRFSGSGS GTDYTFTISS LQPEDIATYY CQQWSSNPFT FGQGTKLQIT R  （配列番号２８）
【００７８】
ｇＯＫＴ３−７  （ヒトＣＤ３イプシロンを標的化する）
QVQLVQSGGG VVQPGRSLRL SCKASGYTFT RYTMHWVRQA PGKGLEWIGY INPSRGYTNY NQKVKDRFTI SRDNSKNTAF LQMDSLRPED TGVYFCARYY DDHYCLDYWG QGTPVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTITCSAS SSVSYMNWYQ QTPGKAPKRW IYDTSKLASG VPSRFSGSGS GTDYTFTISS LQPEDIATYY CQQWSSNPFT FGQGTKLQIT R  （配列番号２９）
【００７９】
ＴＧＮ１４１２  （ヒトＣＤ２８を標的化する）
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYYIHWVRQA PGQGLEWIGC IYPGNVNTNY NEKFKDRATL TVDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYFCTRSH YGLDWNFDVW GQGTTVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCHA SQNIYVWLNW YQQKPGKAPK LLIYKASNLH TGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YYCQQGQTYP YTFGGGTKVE IK  （配列番号３０）
【００８０】
さらに組織指向性二重特異性抗体に採用し得る一本鎖可変領域は以下のとおりである：
scFv A5   (対HBsAg, リファレンスPMID: 14597165)
VHH-S4    (対HBsAg, リファレンスPMID: 19085971)
VHH-S5    (対HBsAg, リファレンスPMID: 19085971)
HzKR127   (対PreS1, リファレンスPMID: 18176536)
KR359     (対PreS1, リファレンスPMID: 10772975)
2B6       (対PreS1, リファレンスPMID: 26888694)
2D9       (対PreS1, リファレンスPMID: 26888694)
2E7       (対PreS1, リファレンスPMID: 26888694)
2G3       (対PreS1, リファレンスPMID: 26888694)
ADRI-2F3  (対HBsAg, リファレンスPMID: 25923526)
E6F6      (対HBsAg, リファレンスPMID: 26423112)
HB-C7A    (対HBsAg, リファレンスPMID: 18479762)
5a19      (対PreS1, リファレンスPMID: 11749974)
scFv 1C9  (対HBV コアタンパク質, PMID: 10385671)
【００８１】
ペプチドはまた、ＨＢｓＡｇに対する標的化リガンドとして、単独で、または他の部分と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは二価結合因子を形成し、ここで、ペプチドおよび異なるＨＢｓＡｇエピトープまたはタンパク質に対するｓｃＦｖは、標的抗原への二価の結合を生じるようにタンデムで連結される。特定の実施形態は、低分子量ＨＢｓＡｇタンパク質に結合する抗体と組み合わせてＰｒｅＳ１結合ペプチドを利用する。実施形態にかかわらず、キメラ抗原レセプターにおいて使用するためのＨＢＶエンベロープを標的とするいくつかの考えられるペプチドは、以下に列挙される配列を利用し得る:
ペプチドA5 (PreS1を標的化, リファレンスPMID: 24966187):SGSGLKKKWST (配列番号6)
ペプチドETGAKPH (HBsAgを標的化, リファレンスPMID: 16087122):CETGAKPHC (配列番号7)
ペプチドP7 (PreS1を標的化, リファレンスPMID: 21856287):KHMHWHPPALNT (配列番号8)
ペプチドpC (PreS1を標的化, リファレンスPMID: 17192308):SGSGWTNWWST (配列番号9)
ペプチドp2 (PreS1を標的化, リファレンスPMID: 17192308):NNWWYWWDTLVN (配列番号10)
ペプチドp5 (PreS1を標的化, リファレンスPMID: 17192308):GLWRFWFGDFLT (配列番号11)
ペプチドp18 (PreS1を標的化, リファレンスPMID: 17192308):WTDMFTAWWSTP (配列番号12)
ペプチド4B10 (PreS1を標的化, リファレンスPMID: 27384014):LRNIRLRNIRLRNIRLRNIR (配列番号13)
ペプチドSRLLYGW (PreS1を標的化, リファレンスPMID: 15996026):CSRLLYGWC (配列番号14)
【００８２】
癌抗原を標的とするために使用され得るｓｃＦｖの例は、以下の通りである。
scFv 4H5 (対ヒトEphA2, PMID: 17241664)
scFv 3E11 or 2G9 or 4G5 or 3D8 or 2E10 (対ヒトglypican-3, PMID: 22564378)
scFv hu1G8 (対ヒト前立腺幹細胞抗原, PMID: 19010866)
scFv HMFG2 (対ヒトMUC1, PMID: 18354214)
scFv 139 (対ヒトEGFRvIII, PMID: 22780919)
scFv P4 (対ヒトメソテリン, WO2013063419 A2)
scFv C2-45 (対ヒト癌胎児性抗原, PMID: 20683006)
scFv C4 (対ヒト葉酸受容体α, PMID: 26101914)
【００８３】
（Ｂ．免疫刺激実体）
本開示の実施形態は、１つ以上の免疫刺激実体を含む組成物を含む。組成物は、１、２、３、４、またはそれ以上の免疫刺激実体を含むことができる。複数の免疫刺激実体が組成物の分子上に存在する場合、異なる実体は、互いに隣接し得るか、または免疫刺激実体ではない分子上のそれらの間に配列が存在し得る。分子上に２つの免疫刺激実体間に配列が存在する場合、免疫刺激実体は、少なくとも特定の場合において、連携して作用することを含めて、それらが適切に機能し得るように依然として配置される。
【００８４】
特定の実施形態では、組成物中の１つ以上の免疫刺激実体は、組成物が提供される個体の免疫系を、体内の疾患肝細胞を含む体内の特定の細胞に向ける。組成物は、少なくともいくつかの実施形態において、Ｔ細胞活性化およびサイトカイン分泌を誘発する。特定の実施形態では、免疫刺激ドメインが、肝臓においてＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、単球、好塩基球、好中球、好酸球、肥満細胞、クッパー細胞、またはＢ細胞を活性化し、免疫エフェクター細胞においてシグナル伝達経路の活性化を間接的または直接的に引き起こす。本組成物は、肝臓における癌細胞または病原体感染細胞などの肝臓における疾患細胞を含む、肝臓における細胞の表面へのＴ細胞の動員を容易にし得る。いくつかの実施形態において、分泌されるタンパク質はリンカーを有するかまたは有さない１つ以上の免疫刺激ドメインを単に含み、そして肝臓疾患抗原標的化ドメインを欠く。これは、疾患細胞に向かう免疫細胞のいかなる特定の方向転換も伴わずに、器官内の免疫応答を刺激するのに役立つ。このメカニズムは周囲の細胞に刺激を与えるために、組織内でつくられた分泌タンパク質の凝集を含み得る。
【００８５】
免疫刺激実体は、ポリペプチドもしくはペプチド、またはポリペプチドもしくはペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。特定の場合において、免疫刺激ドメインは、ｓｃＦｖを含む抗体または機能的抗体断片を含む。特定の例としては、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖ、抗４１ＢＢ  ｓｃＦｖ、抗ＯＸ４０  ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ４  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１６ ｓｃＦｖ、抗ＰＤ１  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖ、ＣＤ２８に対するリガンドの一部または全部（ＣＤ８０および／またはＣＤ８６の外部ドメインの一部または全部など）、４１ＢＢリガンドの外部ドメインの一部または全部、ＳＩＲＰα、ＬＩＧＨＴタンパク質の外部ドメインの一部または全部、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、Ｂ７−Ｈ４、およびＢ７−Ｈ６、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、サイトカイン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。サイトカインの例としては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、およびＩＬ−１８、例えば顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびエリスロポエチンのような造血因子、例えばＴＮＦαのような腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばリンホトキシンのようなリンホカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγのようなインターフェロン、ならびにケモカイン、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、送達されるポリヌクレオチドが、いかなる抗原結合成分も伴わない免疫刺激タンパク質をコードする。これらの実施形態において、標的器官への局在化は、組織送達の特異性のみによって達成され得る。さらに、この実体は免疫細胞を活性化するだけであって、罹患細胞と免疫細胞との間にシナプスを形成しない。これは、免疫細胞を単独で刺激する能力を提供し、または特定の場合において、細胞表面上に疾患特異的抗原標的を発現しない疾患に対する治療を提供する。免疫細胞の活性化は、標的組織細胞からのポリペプチドの発現を介した潜在的凝集によって達成され得、一例は肝臓の特定の実施形態にあり、シグナル伝達を促進するための標的疾患抗原の非存在下での標的免疫受容体の活性化を促進する。
【００８７】
（Ｃ．リンカー）
本開示の特定の実施形態では、少なくとも１つの肝臓抗原標的化実体を、例えば同じ分子上の少なくとも１つの免疫刺激実体と連結するリンカーがある。リンカーは、特定の実施形態において、有効性およびＴ細胞活性化のための適切な幾何学的形状を維持するように構成される。
【００８８】
場合によっては、リンカーがグリシンおよび／またはセリンに富む配列を含む。特定の場合において、リンカーは、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％のグリシンおよび／またはセリンである配列を含む。特定の場合において、リンカーはまた、１つ以上のトレオニンを含む。リンカーは一連のグリシンおよび／またはセリン残基（例えば、ＧＧＳＧおよび／またはＧＧＧＳ）の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の反復を含み得る。特定の実施形態では、リンカーの長さが少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、または１５０アミノ酸である。他の場合において、リンカーは、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、または１５０アミノ酸以下である。
【００８９】
場合によっては、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来のＦｃドメインを含む、１つ以上のＦｃドメインが、リンカーにおいて使用される。特定の実施形態は、ＩｇＧ由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを、単独でまたは組み合わせて使用する。場合によっては、リンカーに使用されるＦｃドメインは修飾され、１つ以上の修飾があってもよい。特定の実施形態では、修飾が、以下のＦｃドメインの特性の１つまたは複数を変化させる：１）減少したＦｃＲ(ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６、ＣＤ２３、ＣＤ８９）γ受容体結合を有すること；２）それらを単量体構造にすること；３）補体活性化を除去すること；４）ＦｃＲｎ結合を除去すること；および／または５）増加したＦｃＲγ受容体結合を有すること。
【００９０】
特定の実施形態において、１つ以上の免疫グロブリンドメインが、リンカーに使用される。免疫グロブリンドメインは、いくつかの実施形態において、Ｉｇスーパーファミリーの任意のメンバーに由来し得る。特定の実施形態において、ＣＤ８６および／またはＣＤ８０、ＣＤ４および／またはＣＤ８由来の１つ以上のドメインが利用される。ドメインは例えば、Ｉｇ可変様（ＩｇＶ）ドメイン、Ｉｇ定常様（ＩｇＣ）ドメイン、および／または細胞内ドメインであり得る。特定の実施形態において、Ｆｃドメインが利用される場合、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４および／またはＣＤ８由来のドメイン）で置換され得る。
【００９１】
特定の局面において、ＩｇＧ  Ｆｃ領域はａ）ＦｃＲ結合を破壊するための１つ以上の変異、ｂ）ＣＨ２ドメインの欠失、および／またはｃ）例えば、異なるヒトタンパク質由来の別の免疫グロブリンドメイン（例えば、ヒトＣＤ４ドメインＤ２〜Ｄ４から選択される代替ヒトタンパク質由来の免疫グロブリン）によるＣＨ２ドメインの置換を含む。ＦｃＲ結合を破壊する突然変異はＩｇＧ  Ｆｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、ＩｇＧ２  Ｆｃドメイン、またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む）のヒンジ領域および／またはグリコシル化部位に位置し得る。
【００９２】
特定の実施形態において利用され得るリンカードメイン配列は、以下の通りである：
【００９３】
ＩｇＧ１（ＡＡ）Ｆｃ（リンカードメインまたは領域、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、変異型ＦｃＲ結合）
EPKSCDKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK (配列番号31)
【００９４】
ＩｇＧ２（ＡＡ）Ｆｃ（リンカードメインまたは領域、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、変異型ＦｃＲ結合）
ERKCCVECPP CPAPPAAAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDISV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK (配列番号32)
【００９５】
ＩｇＧ４ｍ  Ｆｃ（リンカードメインまたは領域、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、変異型ＦｃＲ結合）
【００９６】
ESKYGPPCPS CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFQST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISK KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK (配列番号33)
【００９７】
ＩｇＧ１(ＡＡ)ＣＨ２ドメインのみ（二量体化を抑制するためにヒンジドメイン中の変異システイン、ＦｃＲ結合を抑制するために変異ヒンジドメイン）
【００９８】
EPKSSDKTHTSPPSPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE (配列番号34)
【００９９】
ＩｇＧ２(ＡＡ)ＣＨ２ドメインのみ（二量体化を阻止するためにヒンジドメイン中の変異システイン、およびＦｃＲ結合を阻止するために変異ヒンジドメイン）。
【０１００】
ERKCCVECPPCPAPPAAAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPRE (配列番号35)
【０１０１】
ＩｇＧ１野生型配列
【０１０２】
EP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV  MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (配列番号36)
【０１０３】
ＩｇＧ４野生型配列
【０１０４】
ESKYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK (配列番号37)
【０１０５】
（Ｄ．組成分子およびベクター）
本開示の実施形態は、少なくとも１つの肝臓抗原標的化実体を含む少なくとも１つの分子を含む組成物を包含する。本開示の実施形態はまた、少なくとも１つの免疫刺激実体を含む少なくとも１つの分子を含む組成物を包含する。本開示の実施形態は、少なくとも１つの肝臓抗原標的化実体および少なくとも１つの免疫刺激実体の両方を含む少なくとも１つの分子を含む組成物を包含する。特定の実施形態では、分子はまた、少なくとも１つの肝臓抗原標的化実体および少なくとも１つの免疫刺激実体を連結するリンカーを含む。任意の種類の複数の実体が同一分子上に含まれる場合、それらは、複数の実体が例えば、互いに関連して、それぞれの機能を実行することができるように、機能的に連結される。
【０１０６】
場合によっては、１つ以上の肝臓抗原標的化実体および／または１つ以上の免疫刺激実体を含む分子がＤＮＡまたはＲＮＡを含むポリヌクレオチドである。２つ以上の実体がポリヌクレオチド分子上にある場合、２つ以上の実体の発現の調節は例えば、同じエレメントであるように調整され得るか、または発現の調節のために異なる調節エレメントを利用し得る。本明細書で使用される「調節エレメント」は、コード領域からのＲＮＡの転写、特に組織特異的転写を調節および／または制御することができる、非コードシス作用性転写制御エレメントなどの１つまたは複数の転写制御エレメントを指す。調節エレメントは少なくとも１つの転写因子結合部位、より詳細には組織特異的転写因子のための少なくとも１つの結合部位、最も詳細には肝臓特異的転写因子のための少なくとも１つの結合部位を含み得る。調節エレメントは、エンハンサー配列を含み得る。調節エレメントはそれらがインビボで調節する配列の上流（例えば、プロモーター領域）または下流（例えば、３′ＵＴＲ）のいずれかに位置してもよく、そして遺伝子のすぐ近くに、またはさらに遠くに位置し得る。特定の局面において、ポリヌクレオチド上の１つ以上の調節エレメントは組織特異的（例えば、肝臓特異的調節配列）である。肝臓組織特異的調節エレメントの例としては、少なくとも１）チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター；および／または２）ＵＳ２０１１／０１８４０４９に記載される調節エレメント、３）アルブミンエンハンサー／プロモーター、４）ａｐｏＥプロモーター、５）α１−アンチトリプシンプロモーター、６）ＨＢＶコアプロモーター；および７）それらの組み合わせが挙げられる。
【０１０７】
特定の実施形態では、任意の種類の２つ以上の実体を発現するポリヌクレオチドが２つ以上の実体が融合タンパク質として発現されるように構成される。
【０１０８】
特定の例において、ポリヌクレオチドは発現されたポリペプチドが細胞から分泌されることを可能にする配列（例えば、リーダー配列）をコードする。リーダー配列は、融合タンパク質上に適切に構成され、その結果、ポリヌクレオチドが存在する任意の細胞がポリペプチドを発現し得る。そしてポリペプチドが例えば、他の細胞に作用し得るように、分泌され得る。特定の実施形態では、リーダー配列が約５〜３０アミノ酸長であり、融合タンパク質のＮ末端に存在する。少なくともいくつかの場合において、リーダー配列のコア（シグナルペプチドとも呼ばれる）は、単一のαヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含む。アミノ酸形式の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＭＤＷＩＷＲＩＬＦＬＶＧＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号２２）、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号２３）、またはＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＳＲ（配列番号２４）。
【０１０９】
ある場合には、ポリヌクレオチドが少なくとも１つの肝臓抗原標的化実体および／または少なくとも１つの免疫刺激実体を含み、かつポリヌクレオチド上の５′から３′方向に、実体の各々（および任意で、より多くの実体）はそれらがそれぞれの機能を実行することができる限り、任意の順序であり得る。特定の場合、ポリヌクレオチド上の５′から３′の方向において、分子上の順序は例えば、以下の通りであり得る:
ａ)肝臓抗原標的化実体−−免疫刺激実体；
ｂ)肝臓抗原標的化実体−−リンカー−−免疫刺激実体；
ｃ)免疫賦活物質−−肝臓抗原標的化実体；または
ｄ）免疫刺激実体−−リンカー−−肝臓抗原標的化実体。
ｅ)免疫賦活実体−リンカー
ｆ)免疫賦活実体。
【０１１０】
特定の場合において、分子が二重特異性抗体をコードする場合、５′から３′の方向における分子上の順序は例えば、以下の通りであり得る:
ａ)ｓｃＦｖ(肝臓抗原標的化実体）−−ｓｃＦｖ（免疫刺激実体）；
ｂ)ｓｃＦｖ(肝臓抗原標的化実体）−−リンカー−−ｓｃＦｖ(免疫刺激実体）；
ｃ)ｓｃＦｖ(免疫刺激実体）−−ｓｃＦｖ（肝臓抗原標的化実体）；または
ｄ)ｓｃＦｖ(免疫刺激実体）−−リンカー――ｓｃＦｖ(肝臓抗原標的化実体）
【０１１１】
特定の場合において、分子がサイトカインを含む場合、５′から３′の方向における分子上の順序は例えば、以下の通りであり得る:
ａ)ｓｃＦｖ(肝臓抗原標的化実体）−−サイトカイン；
ｂ)ｓｃＦｖ(肝臓抗原標的化実体）−−リンカー−−サイトカイン；
ｃ)サイトカイン−−ｓｃＦｖ  （肝臓抗原標的化実体）；または
ｄ)サイトカイン−−リンカー−−ｓｃＦｖ(肝臓抗原標的化実体）。
【０１１２】
特定の実施形態では、１つ以上の肝臓抗原標的化実体および／または１つ以上の免疫刺激実体を含む分子は、ポリペプチドである。特定の実施形態では、ポリペプチドは分泌可能である。
【０１１３】
特定の実施形態では、本開示に含まれるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドが裸の形態で個体に提供される。しかし、他の実施形態において、本開示によって包含されるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、ベクター内および／またはベクター上に構成される。ベクターは任意の種類であってもよく、少なくともいくつかの場合において、例えば、１つ以上の有害な事象および／または環境（例えば、それぞれ、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼ）から、そのベクターが含有する、またはそれに結合しているポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを保護するように、作用する。任意のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを、インビボまたはエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で使用して、病原体感染細胞および腫瘍細胞ならびに／または腫瘍微小環境内の細胞を含む肝臓疾患細胞などの肝臓細胞を含む、標的細胞にポリヌクレオチドを送達することができる。これにはアデノウイルス（複製能のあるもの、複製不能のもの、ヘルパー依存性のもの）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１５１５０９号の全体が参照により本明細書に組み込まれる）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）、粘液腫ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、レトロウイルス、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、脂質ナノ粒子、リポソーム、および／または脂質ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。例として、ポリヌクレオチドはベクターと同じ分子の一部として生成されてもよく、ポリヌクレオチドはベクター内に包含されてもよく、および／またはポリヌクレオチドはベクターに結合されてもよい。
【０１１４】
従って、ベクターは、特定の場合において、ウイルス性であっても非ウイルス性であってもよい。非ウイルスベクターは、プラスミド、リポソーム、ナノ粒子、マイクロバブル＋超音波、デンドリマー、カチオン性磁性ナノ粒子、リポプレックス（脂質ベース）；無機分子などを含み得る。ウイルスベクターは任意の種類であり得るが、特定の実施形態ではウイルスベクターがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。特定の場合において、ウイルスベクターは、ウイルスベクターの特性を変化させる１つ以上の改変を含み得る。ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである場合、アデノ随伴ウイルスはアデノ随伴ウイルスの特性を変化させる１つ以上の修飾（例えば、キャプシド突然変異）を含み得、これは、標的組織または器官（例えば、肝臓）に優先的に形質導入するようにする。アデノ随伴ウイルスベクターは、肝臓などの特定の標的組織または器官を優先的に形質導入するので、場合により利用することができる。特定の実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターが血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、または非ヒト霊長類から単離されたＡＡＶ血清型のものである。
【０１１５】
特定の場合において、ポリヌクレオチドがＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である場合、ベクターは、脂質ベースのナノ粒子を含み得る。ある特定の場合において、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡであり、翻訳を増加させる、および／または、ｍＲＮＡが提供される個体における先天性免疫応答を阻害する、１つ以上の修飾されたヌクレオチド（すなわち、標準的なリボヌクレオチドの後ろに追加の化学基を有する（シュードウリジンおよび５−メチルシトシンが例である））を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ分子は、５′グアノシンキャップ、５′ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３′ＵＴＲ、およびポリＡテールのうちの１つ以上、または全てを含む。３′ＵＴＲの配列を操作して、宿主ｍｉＲＮＡによって標的とされる配列を付加し、それにより、罹患細胞または正常細胞のいずれかに対してあるレベルの発現制御を提供することができる。
【０１１６】
特定の実施形態では、ベクターが少なくとも１つの肝臓抗原標的化実体および少なくとも１つの免疫刺激実体を含む分子をコードする少なくとも１つの発現構築物を含む。発現構築物は少なくとも１つの肝臓抗原標的化実体および少なくとも１つの免疫刺激実体をコードするコード領域を含み得、いくつかの場合において、実体は１つ以上の調節領域によって発現構築物中で調節される。特定の場合において、それらは融合タンパク質として発現されることなどによって、少なくとも１つの調節領域を共有するが、代替的な場合において、それらは異なる調節領域を利用する。いずれの場合においても、発現カセットにおける調節領域は、肝臓特異的を含む組織特異的であり得る。
【０１１７】
本開示によって包含される非天然ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド組成物は、任意の適切な手段によって製造され得る。具体的な実施形態では、それらは当該技術分野における通常の組換え手段を用いて生成される。本開示に従って組換えＤＮＡおよびＲＮＡ分子を構築するための基本的な手順はＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｉｎ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇを含む多くの刊行物に開示される：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク。（１９８９），これは、参照により本明細書に組み込まれる。特定の場合において、組成物は、適切な条件下で保存され、そして必要に応じて個体に提供される（開業医を介することを含めて）。
【０１１８】
Ｅ．組成物の具体例
特定のｓｃＦｖおよびリンカーを有する組成物の特定の例は、以下の通りである:
【０１１９】
１９−Ｆｃ−ＣＤ３：リーダー−ｓｃＦｖ  ＸＴＬ１９−ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン−ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ  結合ヒトＣＤ３
MDWIWRILFL VGAATGAHSQ VQLVESGGGV VQPGGSLRLS CAPSGFVFRS YGMHWVRQTP GKGLEWVSLI WHDGSNRFYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AMYFCARERL IAAPAAFDLW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSSYVLT QPPSVSVAPG KTARISCGGN NIGTKNVHWY QQKPGQAPVL VVYADSDRPS GIPERFSGSN SGNTATLTIS RVEVGDEADY YCQVWDSVSY HVVFGGGTTL TVLGSGGGGS DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKSSD IKLQQSGAEL ARPGASVKMS CKTSGYTFTR YTMHWVKQRP GQGLEWIGYI NPSRGYTNYN QKFKDKATLT TDKSSSTAYM QLSSLTSEDS AVYYCARYYD DHYCLDYWGQ GTTLTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIQLTQS PAIMSASPGE KVTMTCRASS SVSYMNWYQQ KSGTSPKRWI YDTSKVASGV PYRFSGSGSG TSYSLTISSM EAEDAATYYC (配列番号15)
【０１２０】
１９−ｍＦｃ−ＣＤ３：リーダー−ｓｃＦｖ  ＸＴＬ１９−単量体型および無効化Ｆｃ受容体結合についての変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン−ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ結合ヒトＣＤ３
MDWIWRILFL VGAATGAHSQ VQLVESGGGV VQPGGSLRLS CAPSGFVFRS YGMHWVRQTP GKGLEWVSLI WHDGSNRFYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AMYFCARERL IAAPAAFDLW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSSYVLT QPPSVSVAPG KTARISCGGN NIGTKNVHWY QQKPGQAPVL VVYADSDRPS GIPERFSGSN SGNTATLTIS RVEVGDEADY YCQVWDSVSY HVVFGGGTTL TVLGSGGGGS GAPPVAGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVGVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYQSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CAVSNKQLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT KPPSRDELTK NQVSLSCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTVPVLDS DGSFRLASYL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKGSG GGGSDIKLQQ SGAELARPGA SVKMSCKTSG YTFTRYTMHW VKQRPGQGLE WIGYINPSRG YTNYNQKFKD KATLTTDKSS STAYMQLSSL TSEDSAVYYC ARYYDDHYCL DYWGQGTTLT VSSGGGGSGG GGSGGGGSDI QLTQSPAIMS ASPGEKVTMT CRASSSVSYM NWYQQKSGTS PKRWIYDTSK VASGVPYRFS GSGSGTSYSL TISSMEAEDA ATYYCQQWSS (配列番号16)
【０１２１】
１９−Ｇ４ｍ−ＣＤ３：リーダー−ｓｃＦｖ  ＸＴＬ１９−無効化Ｆｃ受容体結合ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン−ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ結合ヒトＣＤ３
MDWIWRILFL VGAATGAHSQ VQLVESGGGV VQPGGSLRLS CAPSGFVFRS YGMHWVRQ TPGKGLEWVS LIWHDGSNRF YADSVKGRFT ISRDNSKNTL YLQMNSLR AEDTAMYF CARERLIAAP AAFDLWGQGT LVTVSSGGGG SGGGGSGGGG SSYVLTQPPS VSVAPGKTAR ISCGGNNIGT KNVHWYQQKP GQAPVLVVYA DSDRPSGIPE RFSGSNSGNT ATLTISRVEV GDEADYYCQV WDSVSYHVVF GGGTTLTVLG SGGGGSESKY GPPCPSCPAP PVAGPSVFLF PPKPKDTLM ISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFQSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVM HEALHNHYT QKSLSLSPGK GSGGGGSDIK LQQSGAELAR PGASVKMSCK TSGYTFTRYT MHWVKQRPGQ GLEWIGYINP SRGYTNYNQK FKDKATLTTD KSSSTAYMQL (配列番号17)
【０１２２】
19-CD3:リーダー−scFv XTL19−短いグリシンセリンリンカー−OKT3 scFv結合ヒトCD3
MDWIWRILFL VGAATGAHSQ VQLVESGGGV VQPGGSLRLS CAPSGFVFRS YGMHWVRQTP GKGLEWVSLI WHDGSNRFYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AMYFCARERL IAAPAAFDLW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSSYVLT QPPSVSVAPG KTARISCGGN NIGTKNVHWY QQKPGQAPVL VVYADSDRPS GIPERFSGSN SGNTATLTIS RVEVGDEADY YCQVWDSVSY HVVFGGGTTL TVLGSGGGGS DIKLQQSGAE LARPGASVKM SCKTSGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY INPSRGYTNY NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY DDHYCLDYWG QGTTLTVSSG GGGSGGGGSG GGGSDIQLTQ SPAIMSASPG EKVTMTCRAS SSVSYMNWYQ QKSGTSPKRW IYDTSKVASG VPYRFSGSGS GTSYSLTISS MEAEDAATYY CQQWSSNPLT FGAGTKLELK S (配列番号18)
【０１２３】
ＣＤ３−Ｆｃ−１９：リーダー−ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ結合ヒトＣＤ３−ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン−ｓｃＦｖ  ＸＴＬ１９
MDWIWRILFL VGAATGAHSD IKLQQSGAEL ARPGASVKMS CKTSGYTFTR YTMHWVKQRP GQGLEWIGYI NPSRGYTNYN QKFKDKATLT TDKSSSTAYM QLSSLTSEDS AVYYCARYYD DHYCLDYWGQ GTTLTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIQLTQS PAIMSASPGE KVTMTCRASS SVSYMNWYQQ KSGTSPKRWI YDTSKVASGV PYRFSGSGSG TSYSLTISSM EAEDAATYYC QQWSSNPLTF GAGTKLELKS SGGGGSDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGKSSDIQVQ LVESGGGVVQ PGGSLRLSCA PSGFVFRSYG MHWVRQTPGK GLEWVSLIWH DGSNRFYADS VKGRFTISRD NSKNTLYLQM NSLRAEDTAM YFCARERLIA APAAFDLWGQ GTLVTVSSGG GGSGGGGSGG GGSSYVLTQP PSVSVAPGKT ARISCGGNNI GTKNVHWYQQ KPGQAPVLVV YADSDRPSGI PERFSGSNSG NTATLTISRV EVGDEADYYC (配列番号19)
【０１２４】
ＣＤ３−Ｂ７．１−１９：リーダー−ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ結合ヒトＣＤ３−ヒトＣＤ８０外部ドメイン−ｓｃＦｖ  ＸＴＬ１９
MDWIWRILFL VGAATGAHSD IKLQQSGAEL ARPGASVKMS CKTSGYTFTR YTMHWVKQRP GQGLEWIGYI NPSRGYTNYN QKFKDKATLT TDKSSSTAYM QLSSLTSEDS AVYYCARYYD DHYCLDYWGQ GTTLTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIQLTQS PAIMSASPGE KVTMTCRASS SVSYMNWYQQ KSGTSPKRWI YDTSKVASGV PYRFSGSGSG TSYSLTISSM EAEDAATYYC QQWSSNPLTF GAGTKLELKS SGGGGSPYLN FFQLLVLAGL SHFCSGVIHV TKEVKEVATL SCGHNVSVEE LAQTRIYWQK EKKMVLTMMS GDMNIWPEYK NRTIFDITNN LSIVILALRP SDEGTYECVV LKYEKDAFKR EHLAEVTLSV KADFPTPSIS DFEIPTSNIR RIICSTSGGF PEPHLSWLEN GEELNAINTT VSQDPETELY AVSSKLDFNM TTNHSFMCLI KYGHLRVNQT FNSSDIQVQL VESGGGVVQP GGSLRLSCAP SGFVFRSYGM HWVRQTPGKG LEWVSLIWHD GSNRFYADSV KGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAMY FCARERLIAA PAAFDLWGQG TLVTVSSGGG GSGGGGSGGG GSSYVLTQPP SVSVAPGKTA RISCGGNNIG TKNVHWYQQK PGQAPVLVVY ADSDRPSGIP ERFSGSNSGN TATLTISRVE VGDEADYYCQ VWDSVSYHVV (配列番号20)
【０１２５】
ＣＤ３−Ｂ７．１−Ｇ４ｍ−１９：リーダー−ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ結合ヒトＣＤ３−ヒトＣＤ８０外部ドメイン−無効化されたＦｃ受容体結合を有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン−ｓｃＦｖ  ＸＴＬ１９
MDWIWRILFL VGAATGAHSD IKLQQSGAEL ARPGASVKMS CKTSGYTFTR YTMHWVKQRP GQGLEWIGYI NPSRGYTNYN QKFKDKATLT TDKSSSTAYM QLSSLTSEDS AVYYCARYYD DHYCLDYWGQ GTTLTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIQLTQS PAIMSASPGE KVTMTCRASS SVSYMNWYQQ KSGTSPKRWI YDTSKVASGV PYRFSGSGSG TSYSLTISSM EAEDAATYYC QQWSSNPLTF GAGTKLELKS SGGGGSPYLN FFQLLVLAGL SHFCSGVIHV TKEVKEVATL SCGHNVSVEE LAQTRIYWQK EKKMVLTMMS GDMNIWPEYK NRTIFDITNN LSIVILALRP SDEGTYECVV LKYEKDAFKR EHLAEVTLSV KADFPTPSIS DFEIPTSNIR RIICSTSGGF PEPHLSWLEN GEELNAINTT VSQDPETELY AVSSKLDFNM TTNHSFMCLI KYGHLRVNQT FNSGGGSESK YGPPCPSCPA PPVAGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFQSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGKSSDIQ VQLVESGGGV VQPGGSLRLS CAPSGFVFRS YGMHWVRQTP GKGLEWVSLI WHDGSNRFYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AMYFCARERL IAAPAAFDLW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSSYVLT QPPSVSVAPG KTARISCGGN NIGTKNVHWY QQKPGQAPVL VVYADSDRPS GIPERFSGSN SGNTATLTIS RVEVGDEADY YCQVWDSVSY HVVFGGGTTL (配列番号21)
【０１２６】
リーダー−１９−ｍＦｃ−ｈＣＤ３＝１９．４５．９またはＸＴＬ−１９  ｓｃＦｖ−Ｆｃ変異を有するＩｇＧ１ｍ  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン−ヒト化ＯＫＴ３（ｇＯＫＴ３−７）
MDWIWRILFL VGAATGAHSQ VQLVESGGGV VQPGGSLRLS CAPSGFVFRS YGMHWVRQTP GKGLEWVSLI WHDGSNRFYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AMYFCARERL IAAPAAFDLW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSSYVLT QPPSVSVAPG KTARISCGGN NIGTKNVHWY QQKPGQAPVL VVYADSDRPS GIPERFSGSN SGNTATLTIS RVEVGDEADY YCQVWDSVSY HVVFGGGTTL TVLGEPKSCD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYQSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGKSGSG SQVQLVQSGG GVVQPGRSLR LSCKASGYTF TRYTMHWVRQ APGKGLEWIG YINPSRGYTN YNQKVKDRFT ISRDNSKNTA FLQMDSLRPE DTGVYFCARY YDDHYCLDYW GQGTPVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCSA SSSVSYMNWY QQTPGKAPKR WIYDTSKLAS GVPSRFSGSG SGTDYTFTIS SLQPEDIATY YCQQWSSNPF TFGQGTKLQI TR (配列番号38)
【０１２７】
リーダー−１９−ｍＦｃ＝１９．４５．９またはＸＴＬ−１９  ｓｃＦｖ−Ｆｃ変異を有するＩｇＧ１ｍ  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン
【０１２８】
MDWIWRILFL VGAATGAHSQ VQLVESGGGV VQPGGSLRLS CAPSGFVFRS YGMHWVRQTP GKGLEWVSLI WHDGSNRFYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AMYFCARERL IAAPAAFDLW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSSYVLT QPPSVSVAPG KTARISCGGN NIGTKNVHWY QQKPGQAPVL VVYADSDRPS GIPERFSGSN SGNTATLTIS RVEVGDEADY YCQVWDSVSY HVVFGGGTTL TVLGEPKSCD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYQSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK 496 (配列番号39)
【０１２９】
リーダー−１９−ｈＣＤ３＝１９．７９．５またはＸＴＬ−１９  ｓｃＦｖ−ヒト化ＯＫＴ３（ｇＯＫＴ３−７）
【０１３０】
MDWIWRILFL VGAATGAHSQ VQLVESGGGV VQPGGSLRLS CAPSGFVFRS YGMHWVRQTP GKGLEWVSLI WHDGSNRFYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AMYFCARERL IAAPAAFDLW GQGTLVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSSYVLT QPPSVSVAPG KTARISCGGN NIGTKNVHWY QQKPGQAPVL VVYADSDRPS GIPERFSGSN SGNTATLTIS RVEVGDEADY YCQVWDSVSY HVVFGGGTTL TVLGSGGGGS VQLVQSGGGV VQPGRSLRLS CKASGYTFTR YTMHWVRQAP GKGLEWIGYI NPSRGYTNYN QKVKDRFTIS RDNSKNTAFL QMDSLRPEDT GVYFCARYYD DHYCLDYWGQ GTPVTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCSASS SVSYMNWYQQ TPGKAPKRWI YDTSKLASGV PSRFSGSGSG TDYTFTISSL QPEDIATYYC QQWSSNPFTF GQGTKLQITR (配列番号40)
【０１３１】
リーダー−１７−ｍＦｃ−ｈＣＤ３＝１７．１．４１またはＸＴＬ−１７  ｓｃＦｖ−Ｆｃ変異を有するＩｇＧ１ｍ  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン−ヒト化ＯＫＴ３（ｇＯＫＴ３−７）
【０１３２】
MDWIWRILFL VGAATGAHSQ VQLVESGGGV VRPGRSLRLS CAASGFAFSD YSINWVRQAP GKGLEWVAII SYDGRITYYR DSVKGRFTIS RDDSKNTLYL QMNSLRTEDT AVYYCARQYY DFWSGSSVGR NYDGMDVWGL GTTVTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIVMTQS PLSLSVTPGE PASISCRSSQ SLLHRSGNNY LDWYLQKPGH SPQLLIYVGS NRASGVPDRF SGSGSGTEYT LRISTVEAED VGVYYCMQAL QTPRTFGQGT KLEIKREPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYQST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKSG SGSQVQLVQS GGGVVQPGRS LRLSCKASGY TFTRYTMHWV RQAPGKGLEW IGYINPSRGY TNYNQKVKDR FTISRDNSKN TAFLQMDSLR PEDTGVYFCA RYYDDHYCLD YWGQGTPVTV SSGGGGSGGG GSGGGGSDIQ MTQSPSSLSA SVGDRVTITC SASSSVSYMN WYQQTPGKAP KRWIYDTSKL ASGVPSRFSG SGSGTDYTFT ISSLQPEDIA TYYCQQWSSN PFTFGQGTKL QITR (配列番号41)
【０１３３】
リーダー−１７−ｍＦｃ  ＝  １７．１．４１またはＸＴＬ−１７  ｓｃＦｖ−Ｆｃ変異を有するＩｇＧ１ｍ  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン
【０１３４】
MDWIWRILFL VGAATGAHSQ VQLVESGGGV VRPGRSLRLS CAASGFAFSD YSINWVRQAP GKGLEWVAII SYDGRITYYR DSVKGRFTIS RDDSKNTLYL QMNSLRTEDT AVYYCARQYY DFWSGSSVGR NYDGMDVWGL GTTVTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIVMTQS PLSLSVTPGE PASISCRSSQ SLLHRSGNNY LDWYLQKPGH SPQLLIYVGS NRASGVPDRF SGSGSGTEYT LRISTVEAED VGVYYCMQAL QTPRTFGQGT KLEIKREPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYQST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK (配列番号42)
【０１３５】
リーダー−１７−ｈＣＤ３＝１７．１．４１またはＸＴＬ−１７  ｓｃＦｖ−ヒト化ＯＫＴ３（ｇＯＫＴ３−７）
【０１３６】
MDWIWRILFL VGAATGAHSQ VQLVESGGGV VRPGRSLRLS CAASGFAFSD YSINWVRQAP GKGLEWVAII SYDGRITYYR DSVKGRFTIS RDDSKNTLYL QMNSLRTEDT AVYYCARQYY DFWSGSSVGR NYDGMDVWGL GTTVTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIVMTQS PLSLSVTPGE PASISCRSSQ SLLHRSGNNY LDWYLQKPGH SPQLLIYVGS NRASGVPDRF SGSGSGTEYT LRISTVEAED VGVYYCMQAL QTPRTFGQGT KLEIKRSGGG GSQVQLVQSG GGVVQPGRSL RLSCKASGYT FTRYTMHWVR QAPGKGLEWI GYINPSRGYT NYNQKVKDRF TISRDNSKNT AFLQMDSLRP EDTGVYFCAR YYDDHYCLDY WGQGTPVTVS SGGGGSGGGG SGGGGSDIQM TQSPSSLSAS VGDRVTITCS ASSSVSYMNW YQQTPGKAPK RWIYDTSKLA SGVPSRFSGS GSGTDYTFTI SSLQPEDIAT YYCQQWSSNP FTFGQGTKLQ ITR (配列番号43)
【０１３７】
リーダー−ｈＣＤ３−ｍＦｃ＝リーダー−ヒト化ＯＫＴ３（ｇＯＫＴ３−７）−ｍＦｃ（Ｆｃ受容体タンパク質に対するＦｃドメインの突然変異）
【０１３８】
MDWIWRILFL VGAATGAHSQ VQLVQSGGGV VQPGRSLRLS CKASGYTFTR YTMHWVRQAP GKGLEWIGYI NPSRGYTNYN QKVKDRFTIS RDNSKNTAFL QMDSLRPEDT GVYFCARYYD DHYCLDYWGQ GTPVTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCSASS SVSYMNWYQQ TPGKAPKRWI YDTSKLASGV PSRFSGSGSG TDYTFTISSL QPEDIATYYC QQWSSNPFTF GQGTKLQITR EPKSCDKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YQSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK (配列番号44)
【０１３９】
リーダー−ｈＣＤ３＝リーダー−ヒト化ＯＫＴ３（ｇＯＫＴ３−７）
【０１４０】
MDWIWRILFL VGAATGAHSQ VQLVQSGGGV VQPGRSLRLS CKASGYTFTR YTMHWVRQAP GKGLEWIGYI NPSRGYTNYN QKVKDRFTIS RDNSKNTAFL QMDSLRPEDT GVYFCARYYD DHYCLDYWGQ GTPVTVSSGG GGSGGGGSGG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCSASS SVSYMNWYQQ TPGKAPKRWI YDTSKLASGV PSRFSGSGSG TDYTFTISSL QPEDIATYYC QQWSSNPFTF GQGTKLQITR (配列番号45)
【０１４１】
特定の実施形態では、少なくとも１つの肝臓抗原標的化実体および／または免疫刺激実体、および／またはポリペプチド自体をコードするポリヌクレオチド組成物の特定の例が本明細書に提供される。特定の組成物において、肝臓抗原標的化実体は、一本鎖抗体、一本鎖可変フラグメント、ラクダ科抗体、またはペプチドからなるか、またはこれらを含む。免疫刺激ドメインは、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖ、抗４１ＢＢ  ｓｃＦｖ、抗ＯＸ４０  ｓｃＦｖ、抗ＣＴＬＡ４  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ１ｓｃＦｖ、抗ＰＤ１  ｓｃＦｖ、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ、抗ＣＤ４７  ｓｃＦｖ、ＣＤ２８のリガンドに対する外部ドメインの一部または全部（ＣＤ８０および／またはＣＤ８６の外部ドメインの一部または全部など）、４１ＢＢリガンドの外部ドメインの一部または全部、ＬＩＧＨＴタンパク質の外部ドメインの一部または全部、ＩＣＯＳ−リガンド、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、Ｂ７−Ｈ４、およびＢ７−Ｈ６、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、またはサイトカイン（ＩＬ−１５、ＩＬ−２など）を含むことができる。
【０１４２】
このような特定の組成物のいずれか、またはその他は例えば、ベクター中に、またはベクターの一部として、またはベクターに付着して存在し得、そして特定の場合において、このベクターはアデノ随伴ウイルスであり、ここで、このウイルスは特定の器官に発現を標的化するために、組織特異的プロモーターをコードするカセットを有する。ベクターがメッセンジャーＲＮＡを含む場合、ｍＲＮＡは脂質ベースのナノ粒子で送達され得、そして本開示によって包含される任意のｍＲＮＡは翻訳を増加させ、そして先天性免疫応答を阻害するために修飾されたヌクレオチドを有し得る。
【０１４３】
特定のベクターの実施形態において、好ましくはヒト肝臓に形質導入された変異キャプシドまたは血清型を有するアデノ随伴ウイルスが存在する。一例は、血清型、好ましくはＡＡＶ８またはＡＡＶ９を有するＡＡＶである。いくつかのベクターは例えば、ＡＡＶによる送達後の肝臓への二重特異性抗体の発現を標的化するために、ＴＢＧプロモーターを利用し得る。
【０１４４】
疾患細胞上の細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗体は、本明細書に包含され、少なくともＨＢＶ小表面抗原、ＨＢＶ中間表面抗原、ＨＢＶ大表面抗原、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質、ＥＢＶ糖タンパク質、ＣＭＶ糖タンパク質、ＥｐｈＡ２、グリピカン−３、ＨＥＲ２、ＰＳＣＡ、ＴＥＭ８、ＣＤ１９、ＥＧＦＲｖＩＩＩなどを標的とするものを含む。特定の実施形態では、分子上に：ｓｃＦｖ（標的）−リンカー−ｓｃＦｖ（免疫）またはｓｃＦｖ（免疫）−リンカー−ｓｃＦｖ（標的）の配向を含む二重特異性抗体構築物がある。他の態様において、サイトカイン−リンカー−ｓｃＦｖ（標的）またはｓｃＦｖ（標的）−リンカー−サイトカインの配向を含む免疫サイトカイン構築物が存在する。
【０１４５】
代替の実施形態において、個体に提供される組成物は例えば、肝臓抗原標的化実体の非存在下、特に同じ分子上に存在しない免疫刺激タンパク質単独（すなわち、抗ＣＤ３−Ｆｃ単独、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ単独、抗ＣＤ２８−Ｆｃ単独、抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖ単独、またはＢ７−Ｆｃ単独、または抗ＰＤ１単独）を含む。通常、これらの分子は活性化しないが、本発明に記載のｉｎ  ｓｉｔｕ組織発現は予想外の凝集および活性化特性をもたらす。他の代替の実施形態において、組成物は抗原標的化ドメイン単独（またはそれをコードするポリヌクレオチド）を含むタンパク質を含み、特定の実施形態において、抗原標的化ドメインを有する組成物は、免疫刺激リガンドと組み合わせて使用され得る。
【０１４６】
代替の実施形態において、個体に提供される組成物は、疾患抗原標的化成分および／または免疫刺激成分に加えて、さらなる細胞保護ポリヌクレオチド配列を含む。細胞保護ポリヌクレオチド配列は誘導された炎症の中で標的組織が細胞傷害性死を被ることを阻害し、病原体または癌に対する治療効力を維持しながら正常細胞および組織の損失を防止するのに役立つ。細胞保護剤の例としては、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、ＣＥＤ−０、Ｂｆｌ−１、アポトーシスタンパク質のＸ結合阻害剤（ＸＩＡＰ）、ｃ−ＩＡＰ１、Ｃ−ＩＡＰ２、ＮＡＩＰ、Ｌｉｖｉｎ、サバイビン、セルピンプロテイナーゼ阻害剤９、またはセルピンＢ４をコードするｍＲＮＡが挙げられる。Ｆａｓ受容体、ＴＮＦα受容体、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、またはＢａｄ、あるいはその他アポトーシスを誘導する遺伝子のノックダウン標的化する、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはモルホリノが挙げられる。細胞保護剤は、特定の場合において、アポトーシス阻害剤であり得る。いくつかの場合において、分泌可能なポリペプチドおよび細胞保護剤は例えば、それらが別々のプロモーターによって調節される場合、またはＩＲＥＳもしくは２Ａエレメントによって分離される場合、同じ核酸分子上にコードされる。分泌可能なポリペプチドおよび細胞保護剤が別々の核酸上にある場合、それらは２つの別々の分子上で別々に送達され得るが、ナノ粒子のような同じ組成物中で一緒にパッケージングされ得る。
【０１４７】
（ＩＩ．使用方法）
本開示の実施形態は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジなどを含む哺乳動物の肝臓などの標的組織に影響を及ぼす少なくとも１つの病態を治療する方法を含む。特定の実施形態ではこの疾患が病原体によって引き起こされるが、代替的にまたは追加的に、少なくとも部分的に、本質的に環境および／または遺伝性であり得る。特定の実施形態では、この方法が肝臓を含む標的組織における癌または感染性疾患を治療するために使用される。特定の実施形態では本開示の方法がウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを介してタンパク質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡを投与する工程を包含するが、代替の実施形態ではポリペプチドが投与される。
【０１４８】
標的療法で治療され得る特定の組織における任意の疾患は、本開示の方法で治療され得る。しかし、特定の実施形態では、任意の肝疾患を含む、肝疾患が治療される。ウイルス性肝疾患は、本開示の標的療法を使用して治療され得、ならびに原発性病変および転移性病変の両方を含む、肝臓の癌が治療され得る。特定の肝疾患としてはＢ型肝炎感染、Ａ型肝炎感染、Ｃ型肝炎感染、肝芽腫、肝細胞癌、および乳房、前立腺、膵臓、結腸、直腸、食道、胃、肺、腎臓、または皮膚の転移性癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
本開示のポリヌクレオチドは標的抗原に結合し、そして免疫機能を刺激する融合タンパク質をコードし、そしてこの融合タンパク質は、個体のために、および／または個体において、任意の様式で生成され得る。場合によっては、ポリヌクレオチドがインビボで標的組織または器官にポリヌクレオチド組成物を送達すると、ポリヌクレオチドが組織または器官に取り込まれ、融合タンパク質がこれらの細胞において産生されるように、個体に局所的に送達される。細胞中での融合タンパク質の産生に続いて、細胞は、融合タンパク質が可溶性の状態で、そして病原体感染細胞または癌細胞を含む疾患細胞などの、少なくとも非形質導入細胞を含む、他の細胞上でその標的に結合することができる、融合タンパク質を分泌する。
【０１５０】
本開示によって包含される組成物の送達は、任意の種類、経路、持続時間、再発などであり得る。特定の実施形態では組成物の送達が本質的に局所的であるが、代替の実施形態では送達は全身性である。場合によっては同じ組成物がそれを必要とする個体に送達されるが、他の場合には異なる組成物がそれを必要とする個体に提供され、それはそれが同じ時刻に起こるか、または異なる時刻に起こるかにかかわらず、同じ組成物がそれを必要とする個体に送達される。特定の実施形態において、それを必要とする個体への１つ以上の組成物の送達は、全身送達の非存在下（例えば、一定の注入の非存在下）で行われる。
【０１５１】
本開示のいくつかの方法では、少なくとも１つの肝臓抗原標的化実体および／または少なくとも１つの免疫刺激実体を含む２つ以上の組成物が個体に提供され、いくつかの場合において、組成物は同一ではない。例えば、それらは異なる肝臓抗原を標的化していてもよく、それらは異なる標的を介して免疫刺激を提供していてもよく、またはその両方であってもよい。このような場合、２つ以上の異なる組成物は、同時におよび／または異なる時間に個体に提供され得る。いくつかの態様において、異なる組成物は、１〜６０分、１〜２４時間、１〜７日、１〜４週間、１〜１２ヶ月、または１年以上のオーダーを含む、送達期間の適切な期間にわたって異なる時間で提供される。特定の局面では、同一でない組成物が、特定の治療が難治性となる場合（例えば、原発性肝臓癌または転移性癌特定の治療）などの、特定のアウトカム下の個体に提供される。本開示の組成物（単数または複数）の投与は、例えば、最小残存疾患、早期癌、進行癌、転移癌および／または難治性癌を含む、（一例として）肝臓に影響を及ぼす癌の全ての段階および型に有用である。
【０１５２】
使用方法の特定の実施形態には、ウイルスＤＮＡまたは非ウイルスＲＮＡベクターを、例えば、それらの発現のためのプラットフォームとして使用する、肝臓への二重特異性抗体の送達を含む。特定の実施形態では、例えば、組換え二重特異性抗体療法の注入よりも高い安全性および有効性指数を有するものを含む、既製の免疫療法を使用することができる。
【０１５３】
実例として、罹患個体または疾患を有するかまたはリスクがあると疑われる個体は、それ故、本明細書中に記載されるように治療され得る。本明細書中に記載されるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、個体に投与され得、そして長期間保持され得る。個体は、ポリヌクレオチドの１回以上の投与を受け得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは免疫認識を阻害するためにカプセル化され、そして組織または器官（または癌の実施形態については腫瘍）の部位に配置される。
【０１５４】
種々の実施形態において、発現構築物、核酸配列、ベクター、宿主細胞、および／またはそれらを含む医薬組成物は、肝臓疾患の予防、治療、または改善のために使用される。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物が、例えば、固形腫瘍を有するウイルス感染または肝臓癌を含む、肝臓に関連する疾患を予防、改善および／または治療するのに特に有用であり得る。
【０１５５】
本明細書中で使用される場合、「治療」または「治療する」は疾患または病理学的状態の症状または病理学に対する任意の有益なまたは望ましい効果を含み、そして治療される疾患または状態の１つ以上の測定可能なマーカー（例えば、病原体感染または癌）における最小の減少さえ含み得る。治療は、疾患または状態の症状の減少または改善、および／または疾患または状態の進行の遅延のいずれかを含み得る。「治療」は、必ずしも、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。
【０１５６】
特定の実施形態では、本開示は、部分的に、単独でまたは別の治療と任意の組み合わせで、ならびに少なくともいくつかの態様において、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と一緒に投与され得るポリペプチド、核酸分子および／またはベクターを意図する。特定の実施形態において、核酸分子またはベクターは、標的細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。特定の実施形態では、特定の細胞または組織に特異的であり、前記細胞中に存続するウイルスベクターが使用され得る。適切な医薬担体および賦形剤は、当技術分野で周知である。本開示に従って調製された組成物は、上記で同定された疾患の予防または治療または遅延のために使用され得る。
【０１５７】
さらに、本開示は、肝臓疾患の治療または改善のための方法に関し、この方法はそれを必要とする被験体に、有効量のポリヌクレオチド、細胞、および／またはベクター（本明細書で企図される、および／または本明細書で企図される方法によって産生される）を投与する工程を包含する。
【０１５８】
一実施形態では、異なる抗原または免疫刺激ドメインを標的とする２つ以上のコード配列を個体に投与することを含む、機能的な二重、三重または四重特異性抗体を作製する方法であって、産生されたタンパク質がランダムに二量化して、ヘテロタイプパートナーを有する抗体の実質的な画分を生成し、それにより、二重標的特異性および／または二重免疫刺激特性を有する抗体を生成し得る、方法が存在する。より具体的には、Ｆｃドメインを有する抗体がＦｃ−Ｆｃ界面で二量体を自然に形成するであろう。同じ細胞内で２つ以上の抗体を発現させると、Ｆｃドメインのランダムな対合が起こり、同じタンパク質内で複数の抗原標的化が起こる。このようなタンパク質は、一度に標的化された２つの抗原を介して、癌または病原体細胞をより高親和性に標的化するために有用であり得る。同様に、２つの免疫分子を標的とする１つの分子は、より高い活性化および効力をもたらし得る。１つの抗体が疾患抗原を標的とし、１つの抗体が免疫刺激分子を標的とする、肝臓などの特定の組織に送達される２つのコード配列の発現はまた、別の実施形態の単一特異性抗体に加えて、肝臓においてｉｎ  ｓｉｔｕでより単純に二重特異性抗体を作製し得る。これは、免疫細胞をリダイレクトし得る二重特異性抗体を含む、複数の異なるタイプの抗体を特定の組織内で作製するための有利な方法である。いくつかの実施形態において、ＦｃドメインはよりヘテロなＦｃ対合を有するために、２つの異なるタンパク質の対合を偏らせる変異を有し得る。
【０１５９】
一実施形態では、これらの複数のエピトープ標的化抗体が肝臓組織においてインビボで生成され得る。複数の異なる配列を実質的に同時に注入し、複数の異なるエピトープを肝臓に標的化し、それらのＦｃドメインの画分を互いに結合させる。Ｂ型肝炎ウイルスの治療に適用される場合、例えば、小さい表面抗原上のコンホメーションおよび／または線状エピトープおよび／または表面抗原のＰｒｅＳ１ドメイン中のエピトープを標的化するｓｃＦｖは、２つのポリペプチド鎖および２つの特異性の単一のタンパク質に組み合わされることで、より大きな親和性を有し得る。あるいは、ＨＢＶ表面抗原を標的とする抗体およびＣＤ３を標的とする抗体を肝臓で発現させ、Ｆｃ二量体を生成し、抗ＨＢｓＡｇ抗体、抗ＣＤ３抗体、および二重特異性抗ＨＢｓＡｇ／ＣＤ３−Ｆｃ抗体の混合物を生成することができる。Ｆｃドメインにおける突然変異（例：ノブ・イン・ホール設計）は、より異種のＦｃ鎖対合を促進することができる。
【０１６０】
本開示はさらに、他の化合物、例えば、免疫細胞を介して作用する二重特異性抗体構築物、標的毒素または他の化合物との同時投与プロトコルを包含するが、特定の場合、追加の治療は免疫細胞を介して作用しない。本発明の化合物の同時投与のための臨床レジメンは、他の成分の投与と同時、前および／または後における同時投与を包含し得る。特定の併用療法には、ＨＢＶを標的とする逆転写酵素阻害薬（例：ラミブジン、アデホビル、ジピボキシル、テルビブジン、テノホビルアラフェナミド、テノホビル、およびエンテカビル）、インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロン、化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法、動脈塞栓術、または他のタイプの免疫療法が含まれる。特定の実施形態では、本開示の組成物が肝臓移植において、例えば、移植前に肝臓移植片に投与して、死体ドナーにおいて、切除された臓器に潅流して、および／または肝臓レシピエントに投与して、利用される。
【０１６１】
実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチド、本明細書に記載の１つ以上のポリペプチド、および／または本明細書に記載のベクターを含むキットに関する。本開示のキットは、単独で、または医療治療または介入を必要とする個体に投与されるさらなる薬剤と組み合わせて、本明細書に記載の医薬組成物を含むことも企図される。
【０１６２】
ポリヌクレオチドの導入は、多くの場合、インテグレーションをもたらす必要はない。多くの状況において、導入されたポリヌクレオチドの一過性の維持で十分であり得る。このようにして、遺伝子ベクターが局所部位または器官で宿主に導入され、導入後に、次いで、例えば、炎症が特定の部位で誘導された後に、オフにされるという、短期間の効果を有することができる。タンパク質発現のためのｍＲＮＡ様式の場合、分子の自然の半減期は、いくつかの実施形態において、発現をせいぜい４８〜７２時間に制限する。
【０１６３】
この系は多くの変数（例えば、リガンドに対する細胞応答、発現の効率、および必要に応じて、分泌産物のレベル、発現産物のレベル、患者の特定ニーズ（これは、時間および環境とともに変化し得る）、細胞の損失または個々の細胞の発現レベルの結果としての細胞レベルの損失の速度など）に従うことが理解されるべきである。従って、各個々の患者について、各患者はその個体についての適切な投薬量についてモニターされることが予想され、そして患者をモニターするこのような実務は当該分野において通常行われる。さらに、肝臓毒性についてのアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）測定など、組織損傷および毒性のモニタリングも想定され、これらは当技術分野で周知の通常行われる臨床測定である。
【０１６４】
（ＩＩＩ．医薬組成物）
本開示によれば、用語「医薬組成物」は、個体に投与するための組成物に関する。本開示の特定の局面において、医薬組成物は、少なくとも１つの免疫刺激実体および／または少なくとも１つの肝臓抗原標的化実体および／またはそのコードされたポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、医薬組成物が非経口、経皮、管腔内、動脈内、髄腔内または静脈内投与のための組成物、または癌への直接注射のための組成物を含む。医薬組成物は、注入または注射によって個体に投与されることが特に想定される。適切な組成物の投与は異なる方法（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、局所または皮内投与）によって達成され得、そして代替の実施形態において、肝動脈または門脈注入などの注入（カテーテルベースの注入など）によって起こる。肝動脈注入の特定の実施形態では注入は一定ではなく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回、またはそれ以上起こり得、特定の実施形態では、注入は、特定かつ適切な時間枠内に含まれる。
【０１６５】
本開示の薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。適切な医薬担体の例は当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などを含む。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化することができる。これらの医薬組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。
【０１６６】
投薬レジメンは、主治医および臨床因子によって決定される。医療分野で周知のように、任意の１人の患者に対する投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、性別、投与の時間および経路、一般的な健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多くの因子に依存する。進行は、定期的な評価によってモニターすることができる。
【０１６７】
本開示の組成物は局所的に投与され得るが、代替の実施形態において、有害な副作用を誘発しない限り、全身的に投与される。投与は一般に、非経口（例えば、静脈内）であり得；ＤＮＡはまた、標的部位に直接（例えば、内部または外部標的部位へのバイオリスティック送達によって、または動脈中の部位へのカテーテルによって）投与され得る。一実施形態では医薬組成物が皮下投与され、別の実施形態では静脈内投与される。非経口投与のための調製物は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、および、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、乳液または懸濁液が含まれ、これらには食塩水、緩衝性媒体を包含する。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲルまたは不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルとしては、体液および栄養補給剤、電解質補給剤（例えば、リンゲルデキストロースをベースとするもの）などが挙げられる。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス、およびそれらに類似したもの、が存在してもよい。さらに、本開示の医薬組成物は、好ましくはヒト由来の、血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体を含んでもよい。本開示の医薬組成物は、（本開示に記載されるように、）医薬組成物の意図する用途に応じて、構築物または核酸分子またはそれをコードするベクターに加えて、さらなる生物学的に活性な薬剤を含み得ることが想定される。
【０１６８】
投与量は肝細胞の高形質導入を達成するために、ヒトおよび霊長類において以前に確立された臨床パラメーターに密接に従い得る。ＡＡＶ遺伝子治療ベクター投与の例は、肝臓を標的とするための１〜９×１０１２ベクターゲノム／ｋｇ静脈内注入であり得る。脂質ナノ粒子による肝臓へのｍＲＮＡ送達については、大部分の肝細胞への効率的な送達のために、１回の注射当たり０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．２５０ｍｇ／ｋｇの用量のｍＲＮＡの例をナノ粒子中に静脈内に注入することができる。複数の投与サイクルが、治療効果を満たすために必要に応じて想定される。
【０１６９】
（ＩＶ．脂質形成）
本開示の特定の実施形態では、１つ以上の組成物が脂質製剤中に製剤化される。特定の実施形態において、脂質ベースのナノ粒子は、１つ以上の組成物のために使用される。特定の場合において、メッセンジャーＲＮＡである核酸のような、所望の組成物をコードする核酸を含むベクターは、脂質ベースのナノ粒子において送達され得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、本発明によれば、脂質溶液はｍＲＮＡのカプセル化のための脂質ナノ粒子を形成するのに適した脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態において、適切な脂質溶液は、エタノールベースである。例えば、適切な脂質溶液は純粋なエタノール（すなわち、１００％エタノール）に溶解した所望の脂質の混合物を含み得る。別の実施形態では、適切な脂質溶液がイソプロピルアルコールベースである。別の実施形態では、適切な脂質溶液がジメチルスルホキシドベースである。別の実施形態では、適切な脂質溶液がエタノール、イソプロピルアルコールおよびジメチルスルホキシドを含むが、これらに限定されない適切な溶媒の混合物である。
【０１７１】
適切な脂質溶液は、種々の濃度の所望の脂質の混合物を含有し得る。例えば、適切な脂質溶液は、約０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｇ／ｍｌ、７．０ｍｇ／ｍｌ、８．０ｍｇ／ｍｌ、９．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌ以上の総濃度の所望の脂質の混合物を含有し得る。いくつかの実施形態では、適切な脂質溶液が約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、０．５〜９０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜８０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜７０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜６０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜５０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜４０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜３０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜２０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜１５ｍｇ／ｍｌ、１．０〜１０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜９ｍｇ／ｍｌ、１．０〜８ｍｇ／ｍｌ、１．０〜７ｍｇ／ｍｌ、１．０〜６ｍｇ／ｍｌ、または１．０〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の総濃度の所望の脂質の混合物を含有することができる。いくつかの実施形態において、適切な脂質溶液は、約１００ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または１０ｍｇ／ｍｌまでの総濃度の所望の脂質の混合物を含有し得る。
【０１７２】
任意の所望の脂質を、ｍＲＮＡをカプセル化するのに適した任意の比率で混合することができる。いくつかの実施形態において、適切な脂質溶液はカチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／またはコレステロール脂質）および／またはＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含む。いくつかの実施形態において、適切な脂質溶液は１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／またはコレステロール脂質）、および１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含む。
【０１７３】
（Ａ．カチオン性脂質）
本明細書中で使用される場合、語句「カチオン性脂質」は選択されたｐＨ（例えば、生理学的ｐＨ）で正味の正電荷を有する多数の脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物および方法における使用に特に好適なカチオン性脂質には、国際特許公開ＷＯ２０１０／０５３５７２（特に、パラグラフ［００２２５］に記載されるＣ１２−２００）およびＷＯ２０１２／１７０９３０に記載されるものが含まれ、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７４】
いくつかの態様において、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は「Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids」と題するＷＯ ２０１５／１８４２５６Ａ２に記載されたカチオン性脂質を含み、これは、３−（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）−６−（４−（（２−ヒドロキシドデシル）（２−ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ターゲット２３）、３−（５−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン−２−イル）−６−（５−（（２−ヒドロキシドデシル）（２−ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン−２−イル）−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（ターゲット２４）として、参照により組み込まれる。
【０１７５】
ある態様において、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質には、ＷＯ２０１３／０６３４６８および米国仮出願「Lipid Formulations for Delivery of Messenger RNA」に記載されたカチオン性脂質を含み、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が式Ｉｃ１−ａの化合物を含む:
【化１】
2019529499.tif 000002
Ｉ−ｃ１−ａ、
またはその薬学的に許容される塩であって:
各Ｒ２は、独立して、水素またはＣ１  ３アルキルであり;
各ｑは、独立して、２〜６であり;
各Ｒ′は、独立して、水素またはＣ１  ３アルキルであり;
各ＲＬは、独立して、Ｃ８  １２アルキルである。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は独立して、水素、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ２は独立して、水素またはメチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ２は水素である。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、各ｑは独立して、３〜６である。いくつかの実施形態において、各ｑは独立して、３〜５である。いくつかの実施形態では、各ｑは４である。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、各Ｒ′は独立して、水素、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ′は独立して、水素またはメチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ′は独立して、水素である。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、各ＲＬは独立して、Ｃ８  １２アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは独立して、ｎ−Ｃ８  １２アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは独立して、Ｃ９  １１アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは独立して、ｎ−Ｃ９  １１アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは独立して、Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは独立して、ｎ−Ｃ１０アルキルである。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は独立して、水素またはメチルであり；各ｑは独立して、３〜５であり；各Ｒ′は独立して、水素またはメチルであり；そして各ＲＬは独立して、Ｃ８  １２アルキルである。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は水素であり；各ｑは独立して、３〜５であり；各Ｒ′は、水素であり；各ＲＬは独立して、Ｃ８  １２アルキルである。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は水素であり；各ｑは４であり；各Ｒ′は水素であり；各ＲＬは独立して、Ｃ８  １２アルキルである。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が式Ｉ  ｇの化合物を含む：
【化２】
2019529499.tif 000003
Ｉ−ｇ、
または、各ＲＬが独立して、Ｃ８  １２アルキルであり、薬学的に許容されるその塩。いくつかの実施形態では、各ＲＬが独立して、ｎ−Ｃ８  １２アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬが独立して、Ｃ９  １１アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは独立して、ｎ−Ｃ９  １１アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは独立して、Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬはｎ−Ｃ１０アルキルである。
【０１８４】
特定の実施形態では、適切なカチオン性脂質は、ｃＫＫ−Ｅ１２、または（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）である。ｃＫＫ−Ｅ１２の構造を以下に示す：
【化３】
2019529499.tif 000004
さらなる例示的なカチオン性脂質としては、式Ｉのものが含まれる：
【化４】
2019529499.tif 000005
Ｉおよび薬学的に許容されるその塩であって、
【化５】
2019529499.tif 000006
（例えば、Ｆｅｎｔｏｎ、Ｏｗｅｎ  Ｓ．ら、「Bioinspired Alkenyl Amino Alcohol Ionizable Lipid Materials for Highly Potent In vivo mRNA Delivery」、Advanced materials (2016)を参照のこと）。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、本発明に適した１つ以上のカチオン性脂質は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＴＭＡ」であり得る。(Feigner et al（Proc. Nat’l Acad. Sci. 84, 7413 (1987)）； 米国特許。Ｎｏ．４，８９７，３５５）。他の適切なカチオン性脂質としては、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミドまたは「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−l−プロパナミニウムまたは「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒら、Proc. Nat’l. Acad Sci. 86, 6982 (1989)；米国特許第５，１７１，６７８号；米国特許第５，３３４，７６１号）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＤＡＰ」、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＴＡＰ」。
【０１８６】
追加の例示的なカチオン性脂質には、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドもしくは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドもしくは「ＤＤＡＢ」、Ｎ，２−ジメチル−ジメチル−Ｎ−ジメチルプロパン−３−オキシプロパンもしくは「ＤＳＤＭＡ」、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルーＮ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノー２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５′−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３′−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９′、１，２′−オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンまたは「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ、Ｎ′−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレイルオキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチルプロピルアミンまたは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２−Ｎ、Ｎ′−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２−２−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ−−ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、および２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）（ＷＯ２０１０／０４２８７７；  Ｓｅｍｐｌｅら、Nature Biotech.28:172-176(2010)を参照のこと）、またはこれらの混合物、も含まれる（Ｈｅｙｅｓ、Ｊ．ら、J Controlled Release 107:276-287 (2005)；Morrissey、ＤＶ．ら、Nat. Biotechnol. 23(8):1003-1007 (2005)；ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１）。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質のうちの１つ以上がイミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニジニウム部分のうちの少なくとも１つを含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質が、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル  ４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソル−５−アミン））、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１，１６−ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３（ＷＯ２０１２／１７０８８９、その教示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＩＣＥ（ＷＯ２０１１／０６８８１０、その教示は参照により本明細書に組み込まれる）、ＨＧＴ５０００（米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号、その教示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）またはＨＧＴ５００１（シスまたはトランス）（仮特許出願第６１／６１７，４６８号）、ＷＯ２０１０／０５３５７２に開示されるようなアミノアルコールリピドイド、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Heyes, J.; Palmer, L.;Bremner, K.;MacLachlan, I. 「Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids」J. Contr. Rel. 2005, 107, 276-287），  ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，  Ｓ．Ｃ．ら、「Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery」Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，  Ｋ．Ｔ．ら「Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing」PNAS 2010, 107, 1864-1869）から選ばれる。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、全脂質混合物の約３０〜７０％（例えば、約３０〜６５％、約３０〜６０％、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を重量またはモルで構成する。
【０１８９】
（Ｂ．非カチオン性／ヘルパー脂質）
本明細書中で使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、任意の中性、両性イオン性またはアニオン性脂質をいう。本明細書中で使用される場合、語句「アニオン性脂質」は選択されたｐＨ（例えば、生理学的ｐＨ）で正味の負電荷を帯びた多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質にはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、
またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質は重量またはモルにより、適切な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％を構成し得る。いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質は重量またはモルにより、適切な脂質溶液中の総脂質の約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。
【０１９１】
（Ｃ．コレステロール系脂質）
いくつかの実施形態において、適切な脂質溶液は、１つ以上のコレステロールベースの脂質を含む。例えば、適切なコレステロールベースのカチオン性脂質は、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991)；Ｗｏｌｆら、BioTechniques 23, 139 (1997)；米国特許。Ｎｏ．５，７４４，３３５）またはＩＣＥ、を含む。いくつかの実施形態では、コレステロールベースの脂質が、適切な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０重量％またはモル％を構成する。いくつかの実施形態では、コレステロールベースの脂質が、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の総脂質の約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。
【０１９２】
（Ｄ．ＰＥＧ化脂質）
いくつかの実施形態において、適切な脂質溶液は、１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−ｌ−［サクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００](Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含む、ポリエチレングリコール修飾リン脂質および誘導体化セラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）のような誘導体化脂質の使用も、本発明によって意図される。意図されるＰＥＧ修飾脂質にはＣ６〜Ｃ２０長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した５ｋＤａまでの長さのポリエチレングリコール鎖が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質がＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ−２Ｋである。いくつかの実施形態において、特に有用な交換可能な脂質はより短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧ−セラミドである。
【０１９３】
ＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は重量またはモルにより、適切な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％を構成し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質が重量またはモルにより、適切な脂質溶液中の総脂質の約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。
【０１９４】
カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロールベースの脂質、およびＰＥＧ修飾脂質の例示的な組み合わせは、実施例の節に記載される。例えば、適切な脂質溶液は、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＰＰＣ、ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＰＰＣ、ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；またはＨＧＴ５００１、ＤＰＰＣ、ｃｈｏｌ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含み得る。脂質混合物を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質および／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにこのような脂質の互いの相対モル比は、選択された脂質の特性、ならびにカプセル化されるｍＲＮＡの性質および特性に基づく。さらなる考慮事項には、例えば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択された脂質のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性および毒性が含まれる。従って、モル比は、それに応じて調節することができる。
【０１９５】
（Ｖ．開示のキット）
本明細書中に記載される組成物のいずれか、またはその構成要素は、キットに含まれ得る。非限定的な例において、ポリヌクレオチド、細胞、または特定のポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび／または細胞を操作または生成するための任意の試薬は、キットに含まれ得る。このようなキットは、分子の操作のための１つ以上の試薬を有していても、または有していなくてもよい。このような試薬は、例えば、小分子、タンパク質、核酸、抗体、緩衝液、プライマー、ヌクレオチド、塩、および／またはそれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、肝臓抗原標的化実体および／または免疫刺激実体、または各成分を別々に含むポリペプチド、またはいずれかの実体を増幅するのに適したプライマーをコードするポリヌクレオチドを、キットで提供することができる。いくつかの場合において、このようなポリヌクレオチドを保有するための細胞は、キット中に提供され得、そして／または個体から細胞を得るための装置がキット中に提供され得る。キットは、特定の１つ以上の肝臓抗原および／または１つ以上の免疫刺激実体に合わせた１つ以上の試薬を有し得る。
【０１９６】
特定の局面において、キットは、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド治療、ならびにまた別の治療を含む。場合によっては、キットがポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド治療の実施形態に加えて、個体が癌を有する場合、例えば、化学療法、ホルモン療法、および／または免疫療法などの第二の癌治療も含む。キット（複数可）は、個体についての特定の癌に合わせて調整され得、そして個体についてのそれぞれの第二の癌治療を含む。
【０１９７】
キットは、本発明の適切に分注された組成物を含み得る。キットの成分は、水性媒質中または凍結乾燥形態にある状態でパッケージ化することができる。キットの容器手段は一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器または他の容器を含み、その中に構成要素を配置し、好ましくは適切に等分することができる。キット中に２つ以上の成分がある場合、キットは一般に、第二、第三、または他の追加の容器も含むことができ、その中に追加の成分を別々に配置することができる。しかし、成分のさまざまな組み合わせを１つのバイアル中に含めてもよい。また、本キットは、典型的には商業的販売のための密閉状態にある配合物および任意の他の反応剤容器を収容するための手段を含む。そのような容器は、所望のバイアルを含ませるインジェクションまたは使い捨て型プラスチック容器を含む。
【０１９８】
キットの成分が１つおよび／または複数の液体溶液で提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。この場合、容器手段がそれ自身、注射器、ピペット、および／または他の同様の器具であってもよく、そこから製剤を身体の感染領域に適用し、動物に注射し、および／またはキットの他の成分に適用し、および／または混合することさえできる。しかし、キットの成分は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合には、粉末を適した溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒が別の容器手段の中にも提供されることが想定されている。
【実施例】
【０１９９】
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。しかし、それらは、本開示の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０２００】
単一の二重特異性抗体デザインの概略図を図１に示す。この例では、マウスモデルにおける試験を容易にするために、Ｎ末端はＨＢｓＡｇを標的とするｓｃＦｖ  ＸＴＬ１９または１９を有し、リンカー領域はヒトＩｇＧ１に由来するＦｃドメインであり、Ｃ末端ドメインはマウスＣＤ３に対してｓｃＦｖを有する。次いで、組換えタンパク質は、肝臓への遺伝子治療による発現のために送達される。このような二重特異性分子がどのように機能するかについてのメカニズムの一例が図２に示されており、ここで、分子は抗原標的（ここでは細胞表面上のＨＢｓＡｇ）を、ＣＤ３結合を介してＴ細胞に連結し（他の実施形態においては他の細胞型であり得る）、ＣＤ３分子のクラスター化をもたらし、Ｔ細胞シグナル伝達および活性化をもたらす。マウスモデルにおける試験系において、本発明者らは標的（ＨＢＶ）をコードするプラスミド＋ルシフェラーゼレポーターの同時送達を使用し（一例として図３を参照のこと）、ＣＡＧプロモーター下での二重特異性抗体治療をコードするプラスミドが提供され、これはヒト患者への肝臓器への遺伝子治療および他の組織における限定された発現をシミュレートする。標的抗原は二重特異性分子とともに肝臓においてのみ発現され、ルシフェラーゼ媒介ルミネセンスは肝臓内部の免疫反応のための便利なリアルタイムリードアウトを提供する。
【０２０１】
ＨＢＶ感染の急性モデルにおいて、ＨＢＶに対する人工Ｔ細胞応答は、ウイルスに対する免疫応答が開始していない初期の時点（４日目および８日目）と比較して、ゲノムレベルの約１００倍まで除去された（図４）。抗体ターゲティング抗原単独（１９−Ｆｃ）の有効性についても改善が認められた。この初期設定は、ベースラインでウイルスに対する免疫応答を有さないヒト患者をシミュレートする。現在の治療法はウイルスゲノムを標的としておらず、ゲノム減少（ＨＢＶ共有結合で閉じた環状ＤＮＡ）はＲＴ阻害剤ではわずか（２倍）である。ノックダウンの効果に用量依存性が観察され、ＨＢＶの抑制および除去におけるＴ細胞活性化の重要性が示された。より多くの遺伝子が肝臓に送達された結果、１５μｇおよび２０μｇレベルで飽和用量が得られた（図５）。
【０２０２】
図６は、定量的データの可視化を示す。腫瘍モデルにおける同様の実験は、応答を測定するためのゴールドスタンダードである。肝臓における局所Ｔ細胞の動員に依存する免疫応答性動物モデルにおける劇的な減少は、このアプローチがヒト治療に直接適用可能であることを示す。結果は１週間での完全なウイルス除去を表すが、患者における現在の治療法はウイルスゲノムを除去せず、血清マーカーを抑制するだけである。
【実施例２】
【０２０３】
［二重特異性抗体を発現する肝臓遺伝子治療は、Ｂ型肝炎ウイルスに対する強力な抗ウイルス応答を媒介するようにＴ細胞をリダイレクトする］
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する新規な治療法が、今日の薬物では現在達成できない患者からのウイルスを治癒するために必要である。Ｔ細胞応答は急性感染においてＨＢＶを除去し、そして抗ウイルスＴ細胞の養子移入は、インビボでの有意な減少を導き得る。ＨＢＶに対してＴ細胞を利用するためのよりスケーラブルな方法を求めて、本発明者らは、ＨＢＶ治療のために肝臓においてｉｎ  ｓｉｔｕで宿主Ｔ細胞を活性化する新規方法を開発した。ＨＢｓＡｇおよびＣＤ３イプシロンに結合する二重特異性抗体の遺伝子を、ハイドロダイナミック尾静脈インジェクションによって肝臓に直接送達すると、マウスＴ細胞が、１日以内にＨＢｓＡｇおよびレポーター遺伝子発現のマルチログ減少を媒介することを見出した。ｉｎ  ｓｉｔｕで発現された二重特異性抗体は肝臓微小環境において抗原非依存性Ｔ細胞を活性化する傾向があり、潜在的なウイルス突然変異の逃避に対する耐性を与えた。元々二重特異性抗体は標的抗原の非存在下で免疫細胞を活性化しないので、これは新規な予想外の知見であった。さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕでの二重特異性抗体産生は肝細胞に対して細胞毒性を示さず、抗ウイルス効果はおおむね細胞を変性させなかった。最後に、二重特異性抗体は、それらの発現後に宿主抗ＨＢｓＡｇ抗体産生を強力に活性化し、ｉｎ  ｓｉｔｕワクチンとしてのさらなる可能性を示唆する。全体として、この戦略は、慢性ＨＢＶ感染の臨床治療に有用である。
【０２０４】
（序論）
現在、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は慢性的に３億人以上に感染している。現在、慢性的に感染しているこれらの個体についての治療法はない。現在の薬物は血清ＨＢＶ  ＤＮＡレベルを抑制することができるが、ＨＢＶのウイルスゲノムである共有結合的に閉じた環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）には効果がない。特に、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、おそらく形質細胞様樹状細胞（Ｘｕら、２００９）および先天性免疫シグナル伝達（Ｌｉｕら、２０１５）の阻害を介して、免疫応答を抑制すると考えられる重要な分子であるが、このＨＢｓＡｇの産生は抑制されない。より新しく提案された治療はｓｉＲＮＡ（Ｗｏｏｄｄｅｌｌら、２０１３）およびアンチセンス様式（Ｂｉｌｌｉｏｕｄら、２０１６）を用いてＨＢＶ  ＲＮＡを分解し、ＨＢｓＡｇ発現を効果的にノックダウンするものである。しかし、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡには未だ着手されていない。ＨＢｓＡｇ媒介抑制を緩和することによってｃｃｃＤＮＡを除去するための免疫系を再活性化すれば、ＨＢＶを治癒することができるという仮説が立てられているが(ＤｕｒａｎｔｅｌとＺｏｕｌｉｍ、２０１６）、これは、前臨床動物モデルではそれを適切に試験することができないため、ヒト試験において実現されていない。
【０２０５】
ＨＢＶに対する免疫系を活性化する、より直接的なアプローチは、治癒に対する有効な治療であることが証明され得る。ＣＤ８Ｔ細胞応答は、肝臓におけるＨＢＶの除去に重要である（Ｔｈｉｍｍｅ、et al、２００３）。さらに、除去は主に細胞を変性させず、主に分泌サイトカイン、ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−αに依存する（Ｘｉａ、et al、２０１６）。しかし、ＨＢＶ患者において、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞の頻度は低く（Ｂｏｎｉ、et al、２００７）、そしてそれらの機能性は損なわれる（Ｐａｒｋ、et al、２０１６）。Ｔ細胞の活性化に依存するワクチン戦略は存立し得ず、潜在的に機能不全の免疫系に依存したＨＢＶノックダウン戦略は効を奏さないであろう。
【０２０６】
以前に、ＨＢｓＡｇを標的とするキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を用いて、Ｔ細胞がＨＢＶ感染肝細胞を攻撃するように転向した（Ｂｏｈｎｅら、２００８）。主には分泌されるが、ＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識可能な、感染した肝細胞の表面上に検出される残留量のＨＢｓＡｇが存在する。リダイレクトされたＴ細胞は、感染した初代肝細胞由来のｃｃｃＤＮＡをインビトロで減少させ、ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルにおいては一過性ウイルス減少をもたらすことが示されている（Ｋｒｅｂｓら、２０１３）。
【０２０７】
ＣＡＲ−Ｔ細胞はＨＢＶに対する潜在的な手段を提示するが、世界中の多数のＨＢＶ患者はより容易に利用可能な既製の戦略を必要とする。係る目的のために、ＨＢＶに対する二重特異性抗体の使用が研究された。これは、体液性免疫および細胞性免疫の両方を提供することによって、ＨＢＶに対して適応免疫応答を与えるものである。特に、所与のＨＢＶ感染細胞に対して宿主Ｔ細胞を直接活性化する試みにおいて、肝細胞表面上のＨＢｓＡｇおよびＴ細胞表面上のＣＤ３イプシロン（ＣＤ３）の両方を標的とする二重特異性抗体を構築することができる。ＣＤ３を標的とする二重特異性抗体は元々３０年以上前に報告されており（Ｓｔａｅｒｚら、１９８５；  Ｓｔａｅｒｚら、１９８６）、その後、ＦＤＡはＣＤ１９抗原を標的とするブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）を認可したこと（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａら、２０１５）を含めて、これまでに多くの用途が認められる。これらの分子は細胞表面上の標的抗原に結合することによって作用し、その抗原に結合した後、Ｔ細胞表面上のＣＤ３タンパク質のクラスター化を引き起こし、ＴＣＲ複合体と同様の活性化を誘発する。この戦略の利点は、ＭＨＣ非依存的なＴ細胞活性化であることであり、全ての患者に一般的な既製戦略をもたらす機会が広がる。
【０２０８】
現在の二重特異性抗体アプローチは、複雑な製造工程、一定の注入を必要とする複雑な薬物動態学、および全身性Ｔ細胞活性化による潜在的な毒性の問題を抱えている。これらの障害の全ては、患者組織においてＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型から二重特異性抗体をｉｎ  ｓｉｔｕで発現させることによって直接対処され得るが、これらの遺伝子を組織において直接発現するこのような試みは文献において報告されておらず、むしろ、細胞ビヒクルによる分泌が着目されている（Ｃｏｍｐｔｅ  ｅｔ  ａｌ、２０１３）。ここでは、ＨＢＶに対する二重特異性抗体が存在し、肝臓組織に送達された場合、免疫応答性マウスモデルにおいてウイルスの迅速な減少を媒介する。
【０２０９】
（結果の例）
二重特異性抗体を患者に送達する目的で遺伝子治療戦略を選択したのは、以下の複数の理由による:１)血清中の可溶性ＨＢｓＡｇが、注入された治療剤の大部分を容易に中和する；２）Ｔ細胞が、可溶性表面抗原粒子によって誘導されるＣＤ３の架橋によって、全身的に活性化される危険性；３）ＨＢＶ抗体を用いた臨床試験において、抗体の迅速な代謝が前述の肝臓へのエンドサイトーシスを介して起こり、その結果、減少は数時間しか続かないこと（Ｎｅｕｍａｎｎら、２０１０）；４）二重特異性Ｔ細胞治療のための臨床試験において、おそらく単一分子を介して２つの異なる細胞を同時に会合させる必要があるロジスティックスに起因して、治療効果を測定するために抗体の連続注入がしばしば必要とされること；および５）抗ＨＢｓＡｇ抗体がＨＢＶ患者に注入された場合、免疫複合体障害の報告（ｖａｎら、２００１）。次いで、遺伝子治療戦略を通じて、ＨＢＶ免疫は、直接患者の肝臓の部位に与えられ得、そして特異的かつ安全な様式でＴ細胞を活性化し得る。
【０２１０】
患者組織において発現されるべき二重特異性抗体療法の設計に新規な焦点が置かれていることを考慮すると、様々な量のＴ細胞、プロデューサー細胞、および標的細胞を用いた人工組織培養条件の最適化は、インビボでは意味がないと考えられた。肝臓は、異なる細胞および成分の複雑な微小環境および構造を呈する。循環中のＴ細胞は肝細胞膜に到達するときでさえ、Ｄｉｓｓｅの空間を形成する内皮細胞のギャップを通って到達しなければならず（Ｇｕｉｄｏｔｔｉ、et al、２０１５）、分泌された分子がこれらの２つの標的を効果的に架橋するかどうかは不明である。これら全ての理由から、前臨床マウスモデル系における直接試験を選択した。
【０２１１】
インビボでＨＢＶ感染肝細胞への宿主Ｔ細胞の動員を可能にするために、ヒト感染に近い設定で治療様式を評価し、免疫応答性マウスモデルを使用することが望まれた。これには天然の環境の中で。ヒト患者において予想される肝細胞に対するＴ細胞のより真正な比率、ならびにこの治療においてさらなる役割を果たし得るクッパー細胞およびナチュラルキラー細胞などの他のすべての重要な細胞プレーヤーを含む。さらに、介入に対するマウスにおけるその後の適応免疫応答を追跡することができる。
【０２１２】
ＨＢＶおよび抗体遺伝子の両方をマウス肝臓に送達するために、流体力学的尾静脈注射を使用した（Ｌｉｕ、et al、１９９９）。ＨＢＶ感染の流体力学的モデルはＨＢＶプラスミドの直接送達によるＨＢＶの便利なモデルであることが以前に実証されており、通常、ほとんどの株において急性感染を生じる（Ｙａｎｇら、２００２；  Ｃｈｅｎら、２０１２）。さらに、この方法はまた、治療遺伝子を肝臓に導入するために使用され得（Ｖｉｅｃｅｌｌｉら、２０１４、Ａｌｉｎｏら、２００３）、この場合、二重特異性抗体遺伝子が同時注射される。
【０２１３】
（肝細胞による抗体産生とＨＢＶ発光モデルの検証）
最初に、ＨＢｓＡｇに対する親和性を保持しながら、マウス肝臓に抗体タンパク質をｉｎ  ｓｉｔｕで発現させて正しい発現および分泌をもたらす能力を確立することが望まれた。これらの研究のために、本発明者らは前臨床モデル（Ｅｒｅｎら、２０００）および臨床試験（Ｇａｌｕｎら、２００２）において以前に検証され、ＨＢＶビリオンを効果的に中和する、ヒト抗体、ＸＴＬ  Ｐｈａｒｍａ（本明細書中でＸＴＬ１９または１９として知られる）のｍＡｂ１９．７９．５に着目した。抗体はナノモルの親和性を有する小ＨＢｓＡｇの「ａ」決定基上の線状エピトープを標的とする（Ｅｒｅｎら、１９９８）。ヒトＩｇＧ１タンパク質のＦｃドメインに付加されたＸＴＬ１９抗体クローンの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）からなるハイブリッド抗体１９−Ｆｃの２つの異なる用量（５ｕｇ、１５ｕｇプラスミド）で、ハイドロダイナミック尾静脈インジェクションを実施した（図７Ａ）。抗体発現はＣＭＶ駆動構築物（Ｋａｙら、１９９２）とは対照的に、ネズミ肝臓における高い発現効力およびサイレンシングに対する抵抗性について以前に注目されているＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）ハイブリッドプロモーターの下で駆動された（Ｎｇｕｙｅｎら、２００８）。２つの異なる用量は注射後４日目に８および１６ｍＩＵ／ｍＬの血清抗ＨＢｓＡｇ抗体レベルを達成し、１５ｕｇ用量はヒト患者をＨＢＶ感染から防御するのに十分な抗体レベルをもたらした（ＭｃＭａｈｏｎら、２００９）（図７Ｂ）。肝臓微小環境内の有効な抗体濃度は、血清中の全濃度よりもはるかに高く、潜在的な効力を増加させる可能性がある。
【０２１４】
肝細胞において抗体を産生する能力が検証されたので、本発明者らは次に、ｃｃｃＤＮＡを標的とすることが滅菌治癒のための重要な局面であることを考慮して、ウイルスゲノム安定性に焦点を当てて、ウイルスに対する治療効力を、インビボで、リアルタイムでモニタリングするためのシステムを確立することを探求した。変動する可能性が有るが、細胞内の実際のプラスミドゲノムのレベルの情報を与えない血清マーカーに焦点を当てるのではなく、ホタルルシフェラーゼを用いる生物発光系を用いた。ＧＦＰ−２Ａ−ルシフェラーゼの融合タンパク質を駆動する第二のＨＢＶコアプロモーターを有するＨＢＶ１．３過剰長ゲノムを有するプラスミド（ＨＢＶ−Ｌｕｃ）を構築した（図７Ｃ）。この構築物の配列を図１３に示す。ルシフェラーゼ発現はＨＢＶ（Ｌｉａｎｇら、２０１３）およびマラリア（Ｒａｉら、２０１２）についての類似のシステムにおいて以前に実証されたように、免疫応答の読み出しとしてインビボでモニターされ得る。さらに、ＨＢＶ研究は、ルミネセンスが血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ  ＤＮＡレベルと直接相関することを見出した（Ｌｉａｎｇ、ｅｔ  ａｌ、２０１３）。直接レベルでは、プラスミドレベルおよび肝臓におけるＨＢＶコアプロモーター活性が発光と結び付けられる。５ｕｇのＨＢＶ−Ｌｕｃプラスミドは、流体力学的注射後にルシフェラーゼを発現し得（図７Ｄ）、適応免疫応答の非存在下でＮＯＤ  ＳＣＩＤ−／−  γ−／−  （ＮＳＧ）マウスにおいて長期間発現され得た（図７Ｅ）。このことは、ＨＢＶ治療介入の試験におけるその使用の将来性を実証する。
【０２１５】
（二重特異性抗体フォーマットの有効性についてのインビボスクリーニング）
文献（Ｗｅｉｄｌｅら、２０１２；Ｓｐｉｅｓｓら、２０１５）には異なる幾何学的形状および価数を有する複数の二重特異性抗体フォーマットがあり、本発明者らは肝細胞媒介産生の場合における最も強力なタンパク質を確認するためのスクリーニングアプローチを実施したいと考えた。目的はマウスにおいてＴ細胞を活性化することであるので、マウスＣＤ３イプシロン（ｍＣＤ３）に結合するハムスター１４５−２Ｃ１１抗体クローンをコードするｓｃＦｖを選択した（Ｌｅｏら、１９８７）（このタンパク質の会合はマウスＴ細胞を選択的に活性化することができるからである）。さらに、ｓｃＦｖはマウスＴ細胞をリダイレクトするための二重特異性抗体を構築するために、以前の研究において利用されてきた（Ｊｏｓｔ、et al、１９９６）。また、マウスＣＤ８０またはＢ７．１外部ドメインとの共刺激の追加が、代替活性化ドメインとしてＣＤ２８受容体を関与させるのに役立つか否かも試験した（Ｈａｉｌｅ、et al、２０１３）。本発明者らはまた、ｍＣＤ３、ｍＢ７．１、およびＸＴＬ１９の全てを含むフォーマットとともに、これらの活性化部分が、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）フォーマットに類似するＸＴＬ１９  ｓｃＦｖに直接結合している、１つのフォーマットを試験した。
【０２１６】
ＨＢＶ抗体は、感染を中和し、粒子のより速いクリアランスを媒介するだけでなく、肝細胞のエンドソームに入り、ＨＢｓＡｇ粒子の分泌を遮断する能力を有することが知られている（Ｓｃｈｉｌｉｎら、２０１３）。この機能は、可溶性ＨＢｓＡｇ粒子が抗体を標的細胞表面から遠ざけるという、二重特異性標的化における固有の課題を助けることができる。１つのアプローチについて、Ｔ細胞会合のための通常のＩｇＧ抗体フォーマットを操作することが、これらの課題の両方を解決し得ると考えられた。ＨＢＶに対するｓｃＦｖを、ＩｇＧ  Ｆｃを介して、ＣＤ３イプシロンに対する別のｓｃＦｖに接続することによって、ＨＢＶを効果的に中和し、ＨＢｓＡｇをブロックし、そしてＴ細胞を感染肝細胞の表面に動員することができる。
【０２１７】
これらの抗体においてＦｃレセプター結合を維持するか否かもまた考慮される。Ｆｃレセプター結合は、さらなる効力を付加し得るが、毒性もまた付加し得る。本発明者らは、以前の研究（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、２００３）において実証されるように、ＨＢｓＡｇ分泌の阻害に重要な、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合の機能を維持することを目指した。安全性においては、他のエフェクター機能は、潜在的な毒性を引き起こし得る。臨床試験において、抗ＨＢｓＡｇ抗体で治療された患者で抗体複合体毒性が認められた（ｖａｎ  Ｎｕｎｅｎら、２００１）。さらに、二重特異性カツマキソマブおよび野生型Ｆｃドメインを用いた臨床試験において、全身性Ｔ細胞活性化を引き起こすＦｃＲとの結合および架橋を介して、静脈内注射中に毒性が認められた（Ｍａｕ−Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、２０１５）。この問題を解決するために、Ｆｃ受容体結合を無効にするリンカー領域およびＣＨ２ドメインに変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃドメインを使用することが決定された（Ｈｕｄｅｃｅｋ、ｅｔ  ａｌ、２０１５）。別の二重特異性バージョンは、構造的にＦｃドメインを単量体にするためのさらなる変異を有した（Ｙｉｎｇら、２０１２）。さらに、抗体の組織部位への局所的送達、およびＣ末端でのｓｃＦｖの局在化によるＣＤ３親和性の低下により、いくらかの毒性が回避され得ると考えられた（Ｋｕｏら、２０１２）。
【０２１８】
従って、本発明者らは、Ｆｃレセプターに結合し得るＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、およびＦｃレセプター結合を排除するための変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃドメインの両方を試験した（Ｈｕｄｅｃｅｋ、et al、２０１５）。ＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかにｍＣＤ３ ｓｃＦｖを付加する試験が行われた。ここで、ＸＴＬ１９  ｓｃＦｖが他方の部位を占めていた。ｍＢ７．１を別の形式でＮ末端に付加して、Ｔ細胞に共刺激シグナルを提供した。試験した抗体の概要を図８Ａに示される。これらの種々のフォーマットを、１５ｕｇの抗体と５ｕｇのＨＢＶ−Ｌｕｃとを同時注射することによって系統的に試験した。対照として、１５ｕｇのＣＭＶ−Ｇａｕｓｓｉａを同時注射した。これもまた分泌タンパク質であるが、免疫系に対して活性化効果を有しない。陽性対照は、Ｔ細胞を部分的に活性化することが知られている不活性Ｆｃを有するｍＣＤ３抗体も含まれた（Ｓｍｉｔｈ、et al、１９９７）。対照群におけるルシフェラーゼ発現のピークである４日目に、発光レベルは減少した。注目すべきことに、全ての抗体フォーマットがＨＢＶに対する有効性を示した。そして肝臓への遺伝子治療として送達される場合に、本開示において使用され得る抗体設計および免疫刺激ドメインにおける異なる順列が有用であることを実証した。１９‐Ｆｃ‐ｍＣＤ３およびｍＣＤ３‐１９はルミネセンスの減少が最も低く、さらなる研究でそれらを追跡し続けた（図８Ｂ）。
【０２１９】
（二重特異性抗体による急性ＨＢＶ感染の治療）
本発明者らは最初に、１９−Ｆｃ−ｍＣＤ３二重特異性に焦点を当てた。その理由は、このフォーマットが少なくとも特定の局面において、さらなるＦｃ機能性を活用することができ、治療的使用においてより可能性を有するからである。ＨＢＶの流体力学的注射が数週間以内にウイルスクリアランスをもたらす、免疫応答性マウスにおける急性ＨＢＶモデルにおいて、この抗体を試験した。分解能は、抗ＨＢｓＡｇ抗体の発生および肝臓へのＨＢＶ特異的Ｔ細胞の浸潤を特徴とする（Ｙａｎｇ、ｅｔ  ａｌ、２００２）。二重特異性は、ＨＢＶレベルの早期の減少を引き起こし、対照群と比較してマウスにおいてより速いクリアランスを促進すると考えられた。ＨＢＶ単独での注射と比較する、二重特異性抗体を用いたインビボ投与試験を実施したところ、この系における治療の最高用量応答を見出した。ルシフェラーゼ発現の阻害は１５ｕｇ  ＣＡＧ−１９−Ｆｃ−ｍＣＤ３まで増加し、１５および２０ｕｇは比較的同じであった（図３Ａ）。従って、１５ｕｇのプラスミド用量を以後使用した。
【０２２０】
１９−Ｆｃ−ｍＣＤ３の効力およびその作用機序を試験した。注射後４日目に、１９−Ｆｃ−ｍＣＤ３標的化ＨＢＶで生じた１．７９ｌｏｇルミネセンスノックダウンがあった（図９Ｂ）。注目すべきことに、ｃ末端にｍＣＤ３  ｓｃＦｖを含めると、１９‐Ｆｃ抗体単独と比較して有意により多くのルミネセンス減少もたらされた（０．８２ｌｏｇ減少、ｐ＜０．０５）。さらに、１９‐Ｇ４ｍ‐ｍＣＤ３バージョンは同様の効力を有するので、Ｆｃ受容体機能は１９‐Ｆｃ‐ｍＣＤ３機能には必要でなかった。最終クリアランスは、ガウシア封入が１６日目に空のプラスミド構築物を含むよりも速いクリアランスを促進したので、外来タンパク質の存在によって部分的に駆動され得る。１９−Ｆｃおよび二重特異性構築物では、４日目にＨＢｓＡｇレベルの１．３〜１．７ｌｏｇ減少があり、ウイルス学的マーカーによるルミネセンスデータと同様の傾向が確認された（図９Ｃ）。
【０２２１】
（肝臓微小環境における二重特異性抗体による抗原非依存性Ｔ細胞活性化）
ｓｃＦｖ１９およびｍＣＤ３結合を含有する二重特異性構築物を用いて有効性を検証し、プロセスの特異性を検証した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的１３９ｓｃＦｖで置換されたＸＴＬ１９ｓｃＦｖドメインを用いて一連の平行抗体を構築した。この抗体は特定の癌において発現されるが、正常マウス組織においては発現されないエピトープを標的とする（Ｍｏｒｇａｎら、２０１２）。別の対照としてＥｐｈＡ２を標的とするｓｃＦｖを用いてバージョンを構築した（Ｉｗａｈｏｒｉ、et al、２０１５）。同じ実験を繰り返すと、１３９−Ｆｃ−ｍＣＤ３、１３−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３、ＥｐｈＡ２−Ｆｃ−ｍＣＤ３を含有するｍＣＤ３はすべてルシフェラーゼレベルを低下させることができ、Ｔ細胞活性化を示した（すべてｐ＜０．０５対ＣＭＶ−Ｇａｕｓｓｉａ対照）（図１０Ａ）。比較すると、１３９−Ｆｃは、予想通り、対照に対してルミネセンスを減少させる活性を有さなかった（ｐ＝０．８７）。同様の抗原非依存性バックグラウンド活性化はこの同じ二重特異性デザインで以前に報告されたが、標的上の活性化よりも有意に少ない（Ｋｕｏら、２０１２）。本発明者らはまた、抗体−Ｔ細胞クロスリンクを促進するうえでのＦｃ受容体の交絡作用を除去するために、Ｇ４ｍドメインリンカーと並行して２つの類似のバージョンを比較しようと考えた。４日目のルミネセンスレベルを見ると、１９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３構築物は１３９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３よりも有意にルミネセンスを減少させ、そして予想されたように、１９ｓｃＦｖが、抗原依存的に増加した二重特異性抗体クラスタリングおよびＴ細胞活性化を誘発するのに役立ち得ることを示唆する（図１０Ｂ）。
【０２２２】
Ｆｃ含有抗体は本質的に二量体であるため、２つのｍＣＤ３結合部分のみが、あるレベルのＴ細胞活性化を促進するのに役立つ可能性がある。単量体二重特異性分子が抗原非依存性Ｔ細胞活性化を減少させるか否かを検討した。一連の二重特異性抗体を、ブリナツモマブにおいて見出されるＢｉＴＥフォーマットと同様に構築した（Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ、et al、２００７）が、これは標的抗原の非存在下でＴ細胞を活性化しない。本発明者らは、マウスモデルにおいてより良好な効力を提供すると報告されていることから、ＢｉＴＥのＮ末端にｍＣＤ３結合部分を付加した（Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ、et al、２００６）。ｍＣＤ３に結合し、他の結合成分を欠くｓｃＦｖ単独構築物も設計した。予想外に、ｍＣＤ３−１３９およびｍＣＤ３単独ベクターもまた、Ｔ細胞活性化を刺激し、発光は、ｍＣＤ３−１９と同様のレベルまで低下した（ＣＡＧ−ｅｍｐｔｙに対してｐ＜０．０５）（図１０Ｃ）。このことは、下流のプロセシングにおいて解決される工業的組換えタンパク質産生の間の共通の現象である（Ｐａｕｌら、２０１４）ＣＤ３クラスター化を引き起こし得る過剰発現条件において、肝臓が抗体タンパク質の凝集体を容易に産生し得ることを示唆するが、この設定ではそうではない可能性を除くことができない。インビトロで細胞系から分泌された二重特異性抗体による抗原非依存性活性化は、この現象と同様にこの研究で以前に報告されている（Ｃｏｍｐｔｅ、et al、２０１４）。ＢｉＴＥ依存性活性化の時間変化は、以前に研究されたＦｃ含有構築物と同様であり、これは発光の減少させることにおいて、さらなる利益を示さなかった（図１０Ｄ）。
【０２２３】
（ＨＢＶの除去における二重特異性抗体の作用機序）
二重特異性抗体の作用機序をさらに考察した。これまでのところ、抗体発現はＣＡＧプロモーターで駆動され、これは導入後、特定の実施形態において、全てのＨＢＶが排除されるまで、抗体の連続的な産生を導き得る。他方、前の図は効果が４日目でのみピークがあり、プラスミド不活性化または宿主免疫応答によって最終的な排除が起こることを示唆する。明確にするために、ＮＳＧおよびＷＴマウスにおける二重特異性活性を比較する実験を行った。ＮＳＧマウスにおける二重特異性抗体は、残存する未成熟Ｔ細胞前駆体を活性化することができるはずである（Ｆａｌｋら、１９９６）。実際に４日目の時点では、ＮＳＧマウスとＷＴマウスとは同様であった（図１１Ａ）。しかし、その後、ＮＳＧマウスは発光シグナルが持続することが認められたが、ＷＴマウスは完全に消失し、抗体は実験を通して連続的に作製されなかった。宿主適応免疫が、曲線における除去の後期段階の鍵であることを示した。二重特異性抗体の作用が早期に起こるという発見により、本発明者らは、どれだけ早期に起こるかを見出そうと考えた。発光シグナルを最初の４日間毎日測定した以外は、図９と同様の実験を繰り返した。コントロールと既に治療された抗体との間の１．０３ｌｏｇの差異は注射後１日目に生じ（図１１Ｂ）、同様の差異はその後も大部分が維持された。このことは、最初の分泌された二重特異性分子が１日目にＴ細胞を活性化し、ＨＢＶの除去を助けることに加えて、最終的にプラスミドＣＡＧ−抗体発現ベクターをサイレンシングするのを助けるサイトカインを産生しているに違いないことを示唆する。
【０２２４】
肝細胞による抗体自体の発現が毒性であるかどうかをチェックすることが望まれており、毒性がなければ、これまでに観察された治療効果を生じ得る可能性がある。同じ実験を繰り返したが、ＨＢＶ−ＬｕｃベクターをＣＭＶ−ＮＬＳ−Ｃｒｅプラスミドで置き換えた。プラスミドを、ＲＯＳＡ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰルシフェラーゼ（Ｒｏｓａ−Ｌｕｃ）マウス株に同時注射し、肝臓におけるルシフェラーゼ発現を活性化した。４日目または８日目に、二重特異性抗体を注射したマウスとガウシア注射したマウスとの間で、発光レベルの有意差はなく（図１１Ｃ）、このことは、細胞死でシグナルが減少する肝細胞に対して、二重特異性抗体産生が毒性でないことを示唆する。
【０２２５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは選択されたＤＮＡ配列を特異的に標的化し、切断する能力を有し、そして多くの研究においてＨＢＶ  ＤＮＡゲノムを標的化するための治療法として提案されている（Ｄｏｎｇら、２０１５；ＳｅｅｇｅｒおよびＳｏｈｎら、２０１４；Ｋａｒｉｍｏｖａら、２０１５）。一方、最近、哺乳動物免疫系が、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを分解する内因性効果をアップレギュレートする能力を有することが報告されている（Ｌｕｃｉｆｏｒａら、２０１４）。そのメリットを評価するために、同じシステムにおいて突き合わせて作用機構が異なる２つのアプローチを比較することが望まれた。本発明者らはＣａｓ９とｇＲＮＡ−２１（高度に効力があることが以前に見出された）（Ｒａｍａｎａｎら、２０１５）をＨＢＶ−Ｌｕｃと共注入した。ＣＲＩＳＰＲおよび二重特異性抗体は４日目に類似のノックダウンを有し（図１１Ｄ）、これは炎症の誘導だけでも、デザイナーヌクレアーゼ戦略の代替となることを示唆する。
【０２２６】
（インビボでのｃｃｃＤＮＡマウスモデルの二重特異性抗体治療）
インビボでのｃｃｃＤＮＡクリアランスを誘導する二重特異性抗体療法の能力を調べた。これは、ヒト感染のより真正なモデルを代表する。この目的のために、本発明者らは、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＮＬＳ−Ｃｒｅ（内部イントロンを含む）カセットを有するフロックス化ＨＢＶゲノムを同じプラスミド上にシス（ｃｉｓ）で含むツールを利用した（図１４）。このプラスミドをＲｏｓａ−Ｌｕｃマウスに導入すると、Ｃｒｅリコンビナーゼは宿主細胞染色体におけるルシフェラーゼ発現およびエピソームｃｃｃＤＮＡ形成を活性化する（図１４）。ＨＢＶが感染細胞を死滅させると、ルシフェラーゼシグナルは治療により完全に消失することはずである。一方、二重特異性抗体がＴ細胞を活性化して非細胞変性的にマウス肝細胞からｃｃｃＤＮＡを除去する場合、ルシフェラーゼシグナルは高レベルのままであるはずであり、一方、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡはマウスから除去されるはずである。本発明者らは、１５ｕｇの１９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３、対照１３９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３、またはガウシアを、５ｕｇのＣｒｅ／ＬｏｘＰ−ＨＢＶ（ＣＬＸ）プラスミドとともに同時注入した。経時的に、２つの治療群は経時的にルミネセンスの損失を示したが、高レベルのルミネセンスが残存したことから、元の感染細胞が完全には排除されなかったことが示された（図１２Ａ）。特に、ガウシア処理群は同じ時間経過にわたってずっとゆっくりした減少を示し、ＨＢＶ抗原に対するいくらかの耐性を示唆した。最初の日は二重特異性抗体が主として機能するときであることが立証されたので、少なくともいくつかの実施形態では、最初の時点で細胞毒性を評価することが望まれた。１９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３群はガウス対照よりも７５％少ないルミネセンスを有し、これは統計的に有意であった（図１２Ｂ）。同じ時点で、１９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３群はすでにＨＢｓＡｇレベルの１．６５ｌｏｇ低下を示し、非細胞変性効果が優勢であり、１９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３によって駆動される細胞毒性が小さい役割を演じていることを示している（図１２Ｃ）。二重特異性抗体は注射後短時間しか作用しないように見えるが、適応免疫応答を調節し、ｉｎ  ｓｉｔｕワクチンとして作用する可能性を見出すことが望ましい。マウスにおける抗ＨＢｓＡｇ抗体の発生を測定したところ、１９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３群は、抗原結合を欠く１３９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３群、および、ＨＢｓＡｇに対する抗体はこの期間中にほとんど発現しないガウシア群と比較して、はるかに速くより高いレベルで高力価抗体を発現した。（図１２Ｄ）。この結果は、抗原認識とＴ細胞活性化、体液性アームおよび細胞介在アームの組み合わせが、Ｔ細胞（１３９−Ｇ４ｍ−ｍＣＤ３群）単独の活性化よりも有意な利点を有することを示唆する。
【０２２７】
治療の間、肝細胞の完全性および健康を維持することの重要性を考慮して、治療に加えて、肝細胞を破壊から保護するのに役立ち得る、さらなるタンパク質または分子を同時送達し得るかどうかを検討した。Ｂｃｌ２は、マウスにおいてＦａｓ抗体誘導劇症肝不全を予防することが以前に示された（Ｌａｃｒｏｎｉｑｕｅら、１９９６）。同時に起こる問題は、これがＨＢＶ抑制を媒介する二重特異性抗体の能力を妨害するかどうかであった。マウス（ｎ＝４＋  に５ｕｇのＨＢＶ−Ｌｕｃプラスミドを、５ｕｇのＣＡＧ−Ｂｃｌ２または対照プラスミド、および１５ｕｇの１９−Ｆｃ−ｍＣＤ３プラスミドとともにハイドロダイナミックインジェクションしたところ、細胞内の抗アポトーシスタンパク質Ｂｃ１２を発現させても、対照条件に対する同等の発光減少で判定される二重特異性抗体の有効性を阻害しなかった。肝細胞死をさらに防止するための新規の潜在的な安全性の特徴とともに、抗体作用の非細胞変性効果が確認された（図１５）。
【実施例３】
【０２２８】
［ＨＢＶ免疫療法のためのＨＢＳＡＧ／ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ  ｓｉｔｕ肝臓発現］
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は肝臓に対する親和性を有する部分的二本鎖ＤＮＡウイルスであり、世界中で慢性的に３億人以上に感染し、これらの患者のかなりの数において肝硬変および肝臓癌を引き起こす（Ｅｌ−Ｓｅｒａｇら、２０１２）。一旦感染すると、非常に少数のＨＢＶ患者は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する抗体を発現し、そしてこれを除去する。ＨＢｓＡｇは機能的治癒の臨床的バイオマーカーとなる（Ｌｉｕら、２０１０）。慢性ＨＢＶ患者に有効な治療法はない；逆転写酵素阻害剤であるエンテカビルによる５年間の治療コースでは、患者のわずか１．４％でＨＢｓＡｇセロコンバージョンもたらされる（Ｃｈａｎｇら、２０１０）。これらの抗ウイルス阻害剤は血清ＨＢＶ  ＤＮＡレベルを抑制するが、ＨＢＶのエピソーム転写鋳型である共有結合的に閉じた環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）には影響を及ぼさない。この分子は肝細胞中で一旦形成されると非常に安定であり、ｃｃｃＤＮＡは、何年も持続することが示されている（Ｗｅｒｌｅ−Ｌａｐｏｓｔｏｌｌｅら、２００４）。ペグ化インターフェロン（ＩＦＮ）−αもまた、ＨＢＶ治療のために承認されているが、少数の患者においてのみ有効性を示し、一方、十分に忍容性ではない（Ｐｅｒｒｉｌｌｏら、２００９）。
【０２２９】
急性感染中にＨＢＶを除去する患者では、ＣＤ８陽性Ｔ細胞応答が重要である（Ｔｈｉｍｍｅら、２００３）。この免疫応答は部分的には非細胞変性であり、主に分泌サイトカインであるＩＦＮ−γおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αに依存して、ｃｃｃＤＮＡ分解を媒介する（Ｘｉａら、２０１６）。しかし、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞の頻度は、慢性的に感染したＨＢＶ患者において低く（Ｂｏｎｉら、２００７）、それらの機能性は損なわれる（Ｐａｒｋら、２０１６）。宿主における抗ウイルスＴ細胞の不足を考慮すると、Ｔ細胞はＨＢｓＡｇに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて、ＨＢＶ感染肝細胞を攻撃するようにリダイレクトされている（Ｂｏｈｎｅら、２００８）。リダイレクトＴ細胞はインビトロで感染初代肝細胞からのｃｃｃＤＮＡを減少させ（Ｂｏｈｎｅら、２００８）、ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルにおいて一過性ウイルス減少を媒介することが示された（Ｋｒｅｂｓら、２０１３）。ＣＡＲ−Ｔ細胞はＨＢＶに対する潜在的な治療を表すが、Ｔ細胞産物は現在、各患者について個々に産生されなければならず、容易に利用可能な治療剤としてのそれらの潜在的な有用性を制限する。Ｔ細胞をＨＢｓＡｇ陽性肝細胞に向け直すための「既製品」を発展させるために、本発明者らは、ここではほとんどすべてのＴ細胞上で発現されるＨＢｓＡｇおよびＣＤ３を認識する二重特異性抗体の使用を検討した。
【０２３０】
Ｔ細胞を細胞表面抗原に向けるためにＣＤ３を標的とする二重特異性抗体（Ａｂ）は３０年以上前に最初に報告され（Ｓｔａｅｒｚら、１９８５；  Ｓｔａｅｒｚら、１９８６）、多くの前臨床モデルにおいて有望な抗腫瘍活性を示した。しかし、Ｂ細胞悪性腫瘍に発現する、ＣＤ３およびＣＤ１９を標的とする二重特異性抗体であるブリナツモマブのみが、これまでにＦＤＡの承認を受けている（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａら、２０１５）。現在の二重特異性Ａｂアプローチは、複雑な製造プロセス、持続注入を必要とする短い半減期、および全身性Ｔ細胞活性化に続発する副作用という課題を有する（Ｍａｕ−Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、２０１５）。これらの課題は、患者組織におけるＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型からの二重特異性抗体のｉｎ  ｓｉｔｕ発現によって克服され得るが、このような戦略に関する報告はほとんどない（Ｃｏｍｐｔｅら、２０１３；  Ｐａｎｇら、２０１７；  Ｓｔａｄｌｅｒら、２０１７）。肝臓は遺伝子治療ベクター、ナノ粒子またはリポソームの主要な画分を吸収し、その結果、遺伝子構築物が、任意の他の器官におけるよりもより容易に送達されうる。肝臓における二重特異性抗体の発現は、ＨＢＶを治療するための組換えタンパク質の受動注入と比較して、いくつかの利点を有するはずである。局所発現は、循環中で希釈される前に、肝臓における抗体濃度の増加をもたらすはずである。さらに、ＨＢＶ患者の血清中の可溶性ＨＢｓＡｇは、注入された抗体のかなりの部分を中和することによって有効性を低下させる可能性があり（Ｇａｌｕｎら、２００２）、形成されたＨＢｓＡｇ／Ａｂ免疫複合体はＨＢＶ患者において免疫複合体障害のリスクを有する（ｖａｎ  Ｎｕｎｅｎら、２００１）。
【０２３１】
これらの制限を克服するために、本発明者らは、Ｔ細胞をＨＢｓＡｇにリダイレクトするために二重特異性Ａｂをｉｎ  ｓｉｔｕで発現するアプローチを開発した。ＨＢＶのトランスフェクションベースのマウスモデルにおける結果は、主に非細胞変性様式でウイルスが急速に減少することを示す。
【０２３２】
（結果例）
ＨＢｓＡｇ特異的抗体を発現するプラスミドのハイドロダイナミック尾静脈インジェクションは、インビボでの機能的抗体の産生をもたらす。インビボで機能性ＨＢｓＡｇ特異的抗体を発現することの実現可能性を評価するために、免疫グロブリン重鎖リーダーペプチド、ＨＢｓＡｇ特異的Ａｂ１９．７９．５（Ｇａｌｕｎら、２００２；  Ｅｒｅｎら、１９９８；  Ｅｒｅｎら、２０００）に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインからなる、ＨＢｓＡｇ特異的抗体（ＨＢｓ−Ｆｃ）をコードするミニ遺伝子を、発現プラスミドｐＣＡＧ（ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ；図１６Ａ）にクローニングした。ハイドロダイナミック尾静脈（ＨＴＶ）インジェクションを用いて、プラスミドを肝臓に送達し、大容量ボーラス（１０％体液容量）にプラスミドＤＮＡを注入し（Ｌｉｕら、１９９９）、細胞膜に穴をあけることによって肝細胞に特異的に送達した（Ｚｈａｎｇら、２００４）。５または１５μｇのｐＣＡＧ．ＨＢ−Ｆｃを免疫応答性マウスにＨＴＶ注射により注射し、注射４日後にＨＢｓ−Ｆｃの血漿濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。平均ＨＢｓ−Ｆｃ濃度は、５μｇについては６．４ｍＩＵ／ｍＬ、および１５μｇプラスミド注射については１４．７ｍＩＵ／ｍＬであった（図１６Ｂ）。従って、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ＦｃのＨＴＶ注射は、インビボでのＨＢｓＡｇ特異的抗体の有意な用量依存的産生をもたらす。
【０２３３】
ＨＢｓ−Ｆｃ遺伝子送達は、インビボで抗ウイルス活性を有する。ＨＢｓ−Ｆｃのインビボ発現が抗ウイルス活性を有するかどうかを評価するために、血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ  ＤＮＡレベルと相関する非侵襲的生物発光イメージングを用いてＨＢＶのクリアランスを測定することを可能にする、マウスモデルを適合させた（Ｌｉａｎｇら、２０１３）。レポーター遺伝子の生物発光は、同時送達された抗原遺伝子に対する肝臓におけるＣＤ８  Ｔ細胞応答の高感度の読み取り値であることが以前に示されていた（Ｓｔａｂｅｎｏｗら、２０１０；  Ｒａｉら、２０１２）。簡潔には、ＨＢＶゲノムおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−２Ａ−ホタルルシフェラーゼ（ＧＦＰ−２Ａ−ｆｆＬｕｃ）発現カセットをコードするプラスミドを、両方とも同一のＨＢＶコアプロモーターの転写制御下で作製した（ｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃ；図２１Ａ）。ＮＳＧマウスへのｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃのＨＴＶ注射は、生物発光イメージングによって判断されるように、肝臓においてルシフェラーゼ発現をもたらし、ｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃの機能性を確認した（図２１Ｂ、２１Ｃ）。ＨＴＶ注射による免疫応答性マウスへのＨＢＶプラスミドＤＮＡの導入は、急性ＨＢＶ感染に類似したプロセスにおいて、２週間にわたる免疫クリアランスをもたらす（Ｙａｎｇ、ｅｔ  ａｌ、２００２）。ＨＢｓ−Ｆｃの発現がＨＢＶのクリアランスを誘導するかどうかを評価するために、ｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃを、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ、無関係な抗原に特異的な抗体をコードするｐＣＡＧプラスミド（Ｍｏｒｇａｎら、２０１２）（ＥＧＦＲｖＩＩＩ；  ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ）、または対照プラスミド、とともに注射した。注射したＤＮＡの総量を一定にしたところ、５μｇのｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃと１５μｇのｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃの同時注入は、１５μｇのｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−Ｆｃまたは対照プラスミドとの同時注入と比較して、有意に低いルシフェラーゼシグナルをもたらした（図１７Ａ）。さらに、ｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃ／ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ同時注射マウスは他の治療群と比較して、有意に低いレベルの血清ＨＢｓＡｇレベルを有し（図１７Ｂ）、これはＨＢｓ−Ｆｃがインビボで抗ウイルス活性を有することを示す。
【０２３４】
ＨＢｓ−Ｆｃに抗ＣＤ３ドメインを含むと、インビボで抗ウイルス活性を増強する。ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃがインビボで抗ＨＢＶ活性を有することを立証したので、次に、Ｔ細胞を活性化するマウスＣＤ３に特異的なｓｃＦｖを含むことが、その抗ウイルス活性をさらに増強するかどうかを決定した。ｍＡｂ  １４５−２Ｃ１１由来のマウスＣＤ３特異的ｓｃＦｖ（Ｌｅｏら、１９８７；  Ｊｏｓｔら、１９９６）をそれぞれＨＢｓ−ＦｃまたはＥｖＩＩＩ−ＦｃのＣ末端に挿入することによって、ＨＢ−Ｆｃ／ＣＤ３またはＥｖＩＩＩ−Ｆｃ／ＣＤ３二重特異性抗体をコードするｐＣＡＧ発現プラスミドを作製した（ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ−ＣＤ３；  ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ−ＣＤ３；図１８Ａ）。
【０２３５】
注入されたＤＮＡの総量を一定に保ちながら、５μｇのｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃを、１５μｇの対照プラスミドまたはそれぞれの抗体をコードするプラスミドと組み合わせて、ＨＴＶ注入によって注入した。本研究では、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ‐ＣＤ３、ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ、およびｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ−ＣＤ３を比較した。ＣＤ３特異的ｓｃＦｖを含めると、生物発光イメージングによって判断されるように、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃの抗ウイルス活性を３０倍増強した（ｐ＜０．０５）（図１８Ｂ）。注射後４日目のマウスの代表的な生物発光画像を示し、この時点で、ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−ＦｃとｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ−ＣＤ３との間に有意差があり（ｐ＜０．０５）、二重特異性抗体が非特異的Ｔ細胞活性化を誘導することを示した（図１８Ｃ）。非特異的Ｔ細胞活性化は無関係な抗原ＥｐｈＡ２およびＣＤ３に特異的な抗体をコードするｐＣＡＧプラスミドで確認された（ｐＣＡＧ．ＥｐｈＡ２−Ｆｃ−ＣＤ３；（図２２)(Ｉｗａｈｏｒｉら、２０１５）。
【０２３６】
二重特異性抗体の観察された抗ウイルス活性に対するＦｃ受容体媒介食作用または細胞死滅の寄与を評価するために、本発明者らはＨＢｓ−Ｆｃ−ＣＤ３およびＥｖＩＩＩ−Ｆｃ−ＣＤ３における野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを、Ｆｃ受容体に結合しない変異型ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ｍＦｃ）ドメインで置き換えた（Ｈｕｄｅｃｅｋら、２０１５）（ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３；  ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３）（図１９Ａ）。モデルにおけるｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３とｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３の抗ウイルス活性を比較した。両方の二重特異性抗体は生物発光イメージングによって判定されるように、抗ウイルス活性を有した（図１９Ｂ）。ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３は、４日目にＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３（図１９Ｂ）より有意に大きな（１０倍）抗ウイルス活性を有したが、非突然変異Ｆｃ（図１８Ｂ）を用いて既に示されるように、ＨＢｓ−Ｆｃ−ＣＤ３は同じ時点で、対応するＥｖＩＩＩ−Ｆｃ−ＣＤ３よりわずか５倍大きい活性を有した。この観察はさらなる反復実験で確認され（図２３）、従って、ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３およびＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３はその後の研究のための対照として選択された。
【０２３７】
二重特異性抗体は、注射後早期に、ＨＢＶモデルにおいてＣＤ３依存的に作用する。本発明者らは、急性クリアランスの経過にわたるＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３作用の動態を探った。本発明者らは、５μｇのｐＨＢＶ．ｆｆＬｕｃおよび１５μｇのｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３または対照を同時注射し、最初の４日間毎日生物発光を測定した。対照とＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３治療との間に１３倍の差異が注射後１日目に既に生じ（図２４Ａ）、その後も同様の差異が維持された。これは、注射後８時間でピークに達するという、遺伝子発現ＨＴＶ注射の公表された動態と一致し（Ｌｉｕら、１９９９）、そして１日後の進行中の二重特異性抗体産生および／または抗ウイルスＴ細胞活性化が最小であることを示唆する。
【０２３８】
Ｔ細胞刺激のために異なる部分を置換し、ＣＤ３標的化部分を置き換えることによって、Ｔ細胞シグナル伝達における必要性を調べた。この目的のために、本発明者らは、Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２８と相互作用し得るマウスＣＤ８０タンパク質の細胞外ドメインを利用した。この部分を、その天然の配向に最もよく似るように、Ｎ末端にクローニングした。注入されたｐＣＡＧ．ＣＤ８０−ｍＦｃ−ＨＢｓプラスミドは、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３プラスミドと比較して有意に高い生物発光（２８倍高い）を有し（図２４Ｂ）、Ｔ細胞のＣＤ３活性化が観察された抗ウイルス活性に重要であることが示された。
【０２３９】
ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３のインビボ発現は肝細胞毒性を生じない。非特異的Ｔ細胞活性化がＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３の抗ウイルス活性に寄与することを実証したので、ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３発現によって誘発される非特異的肝毒性を調べた。本発明者らは最初に、二重特異性抗体発現から生じ得る肝トランスアミナーゼ上昇を評価し、ＨＴＶ手順自体が一過性肝細胞損傷および血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）増加をもたらすことを知った（Ｂｏｎａｍａｓｓａら、２０１１）。４日目に測定したところ、条件間の差は観察されず、ＡＳＴにおけるレベルは、注射後のこの時点で依然として軽度に上昇した（図２５Ａ）。トランスアミナーゼを単独で調べることによって、直接的な導入遺伝子毒性に対して、ＨＴＶ手順から直接損傷に対してバルク損傷を分離することは困難であるので、本発明者らは、個々の導入遺伝子改変肝細胞における毒性をより正確に研究しようとした。この目標に向けて、トランスフェクトされた肝細胞が持続するかどうかを評価するために、生物発光イメージングに基づいて新しい肝毒性アッセイが開発された。トランスジェニックＲｏｓａ−Ｌｕｃマウスに、ｐＣＭＶ−ＮＬＳ−ＣｒｅおよびｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３または対照プラスミドをＨＴＶ注射により注射した。注射は同じ肝細胞へのプラスミドの同時送達をもたらし；Ｒｏｓａ−Ｌｕｃマウスのトランスフェクトされた細胞において発現されたＣｒｅリコンビナーゼがｆｆＬｕｃ発現を誘導し、そして得られた生物発光シグナルは、生存可能なトランスフェクトされた肝細胞の数とインビボで相関する（方法の詳細）。ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３発現は、注射後４日目または８日目の生物発光シグナルを対照マウスに対して減少させず（図２５Ｂ）、ＨＢ−ｍＦｃ−ＣＤ３は肝細胞において非毒性であることを示した。これらの知見は、注射後４日目にｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃおよび対照またはｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３を同時注射したマウス由来の肝臓切片の標準的な組織学的検査（Ｈ＆Ｅ染色）を用いて確認した（図２５Ｃ）。同様に、以前に使用した抗体構築物をトランスフェクトした場合、毒性を示す組織形態学的変化は認められなかった（図２６）。これらの組織学的染色もまた、４日目に異なる試験構築物間でリンパ球レベルの顕著な増加を示さず、追加のＴ細胞が肝臓に補充されなかったが、むしろ肝臓中の組織に存在するＴ細胞が活性化されたと思われる（図２６）。
【０２４０】
ＨＢ−ｍＦｃ−ＣＤ３のインビボ発現は、組換えｃｃｃＤＮＡ  ＨＢＶマウスモデルにおいて抗ウイルス活性を有する。最後に、本発明者らは、ＨＢＶゲノムを有するプラスミドよりもヒト細胞においてＨＢＶ転写鋳型をより厳密に模倣する、インビボでｃｃｃＤＮＡクリアランスを誘導するＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３の能力を探ろうと考えた。本発明者らは細菌ＤＮＡを欠く組換えｃｃｃＤＮＡ様（ｒｃｃｃＤＮＡ）分子を作製するためにリコンビナーゼを利用したＨＢＶマウスモデルを以前に報告した（Ｑｉら、２０１４；  Ｇｕｏら、２０１６）。この系では、同じプラスミド上でＣＭＶプロモーターによってシスに駆動されるＮＬＳ−Ｃｒｅリコンビナーゼ（内部イントロンを含む）カセットを用いて、フロックス化（ｆｌｏｘｅｄ）ＨＢＶゲノムを構築した（ｐＣＬＸ；図２７Ａ；  Ｋｒｕｓｅ  ＲＬら、原稿準備中）。Ｃｒｅ組換え酵素を用いてフロックス化され、切断されていない状態では、ウイルス転写物および／またはタンパク質はＬｏｘＰ配列によって中断されて発現を妨げるので（図２７Ｂ，２７Ｃ）、ＨＢＶ抗原の検出はない。ｐＣＬＸのＨＴＶ注射後、Ｃｒｅ発現および結果として生じるｒｃｃｃＤＮＡ形成は、注射の１週間後に高レベルのＨＢｓＡｇ産生およびＨＢＶコア発現を生じ、モデルの機能性を実証する（図２７Ｂ、２７Ｃ）。ｐＣＬＸをＲｏｓａ−Ｌｕｃマウスに導入すると、ＣｒｅリコンビナーゼもｆｆＬｕｃ発現を誘導する。従って、生物発光画像化は生存トランスフェクト細胞をモニターするための非侵襲的手段として役立ち、そして以前のＲｏｓａ−Ｌｕｃ実験におけるように、二重特異性抗体治療の肝毒性をモニターするために使用され得る。
【０２４１】
ｒｃｃｃＤＮＡモデルにおけるＨＢ−ｍＦｃ−ＣＤ３の抗ウイルス活性および安全性を決定するために、本発明者らは、ｐＣＬＸをｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３、ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３または対照プラスミドと共注射した。注射後４日目に、対照プラスミドまたはｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３をそれぞれ投与したマウスと比較して、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３を注射したマウスにおいて、４９５倍および３０倍低いＨＢｓＡｇレベルが測定された（図２０Ａ）。ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３療法は、ＨＢｓＡｇレベルを低下させただけではなく、ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３および対照よりも早くより高いレベルでＨＢｓＡｇ抗体を誘導した（図２０Ｂ）。ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３療法の抗ウイルス活性はまた、注射後４日目の動物のサブセットにおける免疫蛍光によっても確認され、ｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３群および対照群と比較して、個々の肝細胞内でのＨＢＶコア発現が少ないことを示した（図２０Ｃ）。生物発光イメージングを用いて、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３療法の安全性を決定した。注射後４日目に、対照プラスミドを受けたマウスと比較して、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３注射マウスにおいて生物発光シグナルの３．３倍減少し（図２０Ｄ）、長期追跡では、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３注射マウスの生物発光シグナルがさらなる減少を示した。注射後４、２０および２６日目に、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３およびｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３注射マウス間に有意差があった（ｐ＜０．０５、図２０Ｅ）。
【０２４２】
（特定の実施形態の重要性）
本明細書において、ＨＢＶ免疫療法のための二重特異性Ａｂを使用する新規な治療戦略が提供される。本明細書に記載されているのは、肝臓における二重特異性抗体の産生、局所Ｔ細胞活性化を導き、器官における免疫応答を調節することである。これは、さらなる標的化部分が含まれない限りにおいて、組織部位に特異的に蓄積しない組換えタンパク質戦略、または送達のための細胞ベースのキャリアの使用とは異なる（Ｉｗａｈｏｒｉら、２０１５）。この戦略では、抗ウイルス効果を媒介するために、消耗した機能不全のＨＢＶ特異的Ｔ細胞に依存することとは対照的に、ＨＢＶに対するナイーブＴ細胞の動員を利用する（Ｂｏｎｉら、２００７；  Ｐａｒｋら、２０１６）。
【０２４３】
本明細書に示すように、抗体は肝細胞で発現することができ、それらの機能を保持することができる。予想されるように、ＨＢｓ−Ｆｃ抗体は親モノクローナル抗体と同様に、特異的かつ効果的に抗ウイルス効果を媒介したが（Ｇａｌｕｍら、２００２；Ｅｒｅｎら、２０００）、ＣＤ３特異的ｓｃＦｖの添加は、さらにより強力な抗ウイルス応答をもたらした。この抗ウイルス効果は注射後１日目にピークに達し、そして本発明者らはおそらく高レベルの蓄積を妨げるマウスＴ細胞との活性化および／または関与のために、４日目に血清中の有意なレベルの二重特異性抗体を検出することができなかった。ＣＤ３特異的ｓｃＦｖの代わりにＣＤ８０外部ドメインを介して共刺激を送達しても、高レベルの抗ウイルス応答を誘発しなかった。興味深いことに、ＣＤ３を標的とする二重特異性抗体および無関係の抗原を標的とする抗体は、インビボで有意な抗ＨＢＶ活性を有し、Ｔ細胞活性化がＨＢｓＡｇ結合とは無関係に起こることが示された。Ｆｃレセプター架橋は、変異Ｆｃレセプター結合部位、ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３を有する構築物がＨＢｓ−Ｆｃ−ＣＤ３と同様の抗ＨＢＶ活性を有していたため、抗ウイルス作用の増強またはＴ細胞活性化の促進において役割を果たさなかった（Ｒｉｎｎｏｏｙら、１９８６）。ＩＦＮ−γの抗原非依存性分泌は、本研究で使用される二重特異性抗体フォーマットを用いて以前にインビトロで観察されている（Ｋｕｏら、２０１２）。さらに、細胞株から分泌される二重特異性抗体による抗原非依存性Ｔ細胞活性化も報告されている（Ｃｏｍｐｔｅら、２０１４）。特定の実施形態では、理論によって拘束されないが、二重特異性抗体による抗原非依存性Ｔ細胞活性化の機構は自己凝集を介して起こり、その結果、ＣＤ３の架橋が生じる。
【０２４４】
本開示において、以前の報告（Ｑｉら、２０１４；  Ｇｕｏら、２０１６）に類似のｃｃｃＤＮＡ様分子を生成するように組換え方法を適応させて、肝細胞生存率およびＨＢＶマーカーの二重モニタリングのために新規な手順が利用された。一方で、宿主細胞レポーター遺伝子の組換えもまた活用した。この研究は肝臓におけるＨＢＶに対する最初のＴ細胞効果が非細胞変性であるという別の報告を再現することができた（Ｘｉａら、２０１６）が、それはＨＢｓＡｇレベルが、肝細胞の生存率を反映する発光と比較して、二重特異性抗体治療群においてずっと大きな程度まで減少したからである。Ｔ細胞の活性化以外にも、ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３は、ｒｃｃｃＤＮＡモデルにおいて、新生児Ｆｃレセプターとの会合を介して肝細胞からのＨＢｓＡｇ分泌を阻害する抗体の能力によって、血清ＨＢｓＡｇレベルを低下させる可能性がある（Ｎｅｕｍａｎｎら、２０１０）。チンパンジーにおける感染細胞の最終クリアランスのパターンと同様に、二重特異性抗体で治療した群における放射輝度のその後の減少が観察された（Ｔｈｉｍｍｅら、２００３）。より高いレベルのＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ抗体産生と併せて、このことは、二重特異性抗体が、対照群に対して宿主適応免疫応答を増加させたことを示す。
【０２４５】
本研究は、肝臓において個々のサイトカイン、ＩＦＮ−γを発現することが抗ウイルス活性を有することを実証する以前の遺伝子治療研究とは異なる（Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒら、２００５；  Ｓｈｉｎら、２００５）。代用ウッドチャックモデルで試験した場合、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのアデノウイルス送達は、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）の即時減少をもたらさず、むしろ、Ｔ細胞によるアデノウイルスに対する後の適応応答はＷＨＶウイルス負荷を減少させ、個々のサイトカインのみを発現するだけでは十分ではない可能性があることを示唆した（Ｚｈｕら、２００４）。従って、ＣＤ３を介してＴ細胞を活性化し、ＩＦＮ−γだけでなく、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦなどの他の炎症性サイトカインの産生をももたらすことは、より効果的であり得る（Ｓｅｎら、２００１）。ＨＢＶに対する標的アプローチはまた、ＩＦＮ−αをＨＢＶ感染肝細胞に送達するための組換えＴＣＲ様抗体の注入（Ｊｉら、２０１２）、およびＡｐｏ−Ａ１／ＩＦＮ−α融合タンパク質による遺伝子治療（Ｂｅｒｒａｏｎｄｏら、２０１５）とは異なる。さらに、ＨＢｓＡｇおよびＣＤ３フォーマットを標的化する戦略はＨＢｓＡｇ上の２つの異なるエピトープを標的化する以前のタンパク質ベースの二重特異性抗体戦略（Ｐａｒｋら、２０００；  Ｔａｎら、２０１３）、ならびに肝細胞癌についてＨＢｘおよびＣＤ３を標的化する戦略（Ｌｉａｏら、１９９６）とは異なる。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ（Ｎａｔｈｗａｎｉら、２０１１）またはｍＲＮＡナノ粒子（Ｔｈｅｓｓら、２０１５；  ＤｅＲｏｓａら、２０１６）などの臨床的に翻訳可能な肝臓遺伝子送達系を使用することができる。最近の研究では、ｍＲＮＡ−ナノ粒子はマウスの肝臓を効果的に標的とし、全身に分泌された二重特異性抗体がクローディン６およびＣＤ３に会合し、皮下注射された腫瘍に対してＴ細胞毒性を誘発した（Ｓｔａｄｌｅｒら、２０１７）。この戦略は、特定の態様において、ｉｎ  ｓｉｔｕ肝疾患を治療するための本明細書における方法に適用可能である。別の制限は、ＨＴＶ注射が、ＨＢＶゲノムのＡＡＶ（Ｄｉｏｎら、２０１３）または低用量アデノウイルス（Ｈｕａｎｇら、２０１２）送達を有する免疫応答性マウスにおいて確立され得る慢性ＨＢＶマウスモデルではなく、ＨＢＶの急性モデルをもたらすことである。
【０２４７】
結論として、肝細胞において二重特異性抗体を発現し、ＨＢＶに対する局所的かつ主として非細胞変性免疫応答をもたらすことによって、ＨＢＶ感染を標的とする新規な治療アプローチが提供される。このアプローチは、ＨＢＶだけでなく、他のウイルス性肝疾患の治療にも有用である。
【０２４８】
（材料および方法の例）
プラスミド構築物。Ａｂ構築物の生成： 免疫グロブリン重鎖リーダーペプチド（ＭＤＷＩＷＲＩＬＦＬＶＧＡＡＴＧＡＨＳ；配列番号）、ＨＢｓ特異的ｍＡｂ  １９．７９．５（Ｅｒｅｎら、１９９８）重鎖、グリシン（Ｇ）セリン（Ｓ）リンカー［（Ｇ４Ｓ）３］、および５′ＸｈｏＩ部位および３′ＢａｍＨＩ部位に隣接する１９．７９．５軽鎖を含む、コドン最適化ミニ遺伝子が、ＩＤＴＤＮＡ（アイオワ州コーラルビレ）によって合成された。５′ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ  ３′を含むＰＣＲプライマーを用いて、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを、ＩｇＧ１  Ｆｃヒンジを含むＣＡＲをコードするプラスミドからＰＣＲ増幅した。ミニ遺伝子およびＰＣＲ産物を、三方ライゲーションしてｐＣＡＧにクローニングし、ｐＣＡＧ−ＨＢｓ−Ｆｃを作製した。ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ対照プラスミドを作製するために、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的な１３９ｓｃＦｖを、５′ＸｈｏＩおよび３′ＢａｍＨＩ部位を含むＰＣＲプライマーを用いて、ｐＳＦＧ．１３９−ＣＤ３−Ｉ−ＯｒａｎｇｅからＰＣＲクローニングした。三方ライゲーション反応を行ってｐＣＡＧ−ＥｖＩＩＩ−Ｆｃを作製した。クローニングは、配列決定（Ｌｏｎｅ  Ｓｔａｒ  Ｌａｂｓ、テキサス州ヒューストン）によって確認した。
【０２４９】
二重特異性Ａｂ構築物の生成：マウスＣＤ３に特異的な１４５−２Ｃ１１  ｓｃＦｖ（Ｌｅｏら、１９８７）を、５′ＥｃｏＲＶおよび３′ＮｏｔＩ部位を有するｐＲＶ２０１１．１４５−２Ｃ１１−１Ｄ３−Ｉ−Ｔｈｙ１．１からＰＣＲ増幅した。５′ＸｈｏＩ−リーダー−ＨＢｓまたはＥｖＩＩＩ  ｓｃＦｖ−３′ＢａｍＨＩ、５′ＢａｍＨＩ−Ｆｃ−３′ＥｃｏＲＶ、５′ＥｃｏＲＶ−１４５−２Ｃ１１  ｓｃＦｖ−３′ＮｏｔＩ、およびＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＣＡＧを用いて４方ライゲーションを行い、ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−Ｆｃ−ＣＤ３およびｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−Ｆｃ−ＣＤ３を作製した。ｐＣＡＧ．ＨＢｓ−ｍＦｃ−ＣＤ３およびｐＣＡＧ．ＥｖＩＩＩ−ｍＦｃ−ＣＤ３は、変異Ｆｃ結合部位（Ｈｕｄｅｃｅｋら、２０１５）を有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃをコードするコドン最適化ミニ遺伝子（ＩＤＴＤＮＡ、アイオワ州コーラルビレ）、並びに、５′ＢａｍＨＩおよび３′ＥｃｏＲＶ部位に隣接する５′ＢａｍＨＩ−Ｆｃ−３′ＥｃｏＲＶ部位を５′ＢａｍＨＩ−Ｆｃ−３′ＥｃｏＲＶの代わりに使用した以外は、同様の様式で作製した。ｐＣＡＧ．ＣＤ８０−ｍＦｃ−ＨＢｓは、５′‐ＸｈｏＩと３′ＢａｍＨＩ部位の間のマウスＣＤ８０（Ｂ７．１）タンパク質のリーダー配列を含む細胞外ドメインを合成することにより作製した。別々に、ＨＢｓ  ｓｃＦｖのＰＣＲ増幅は、５′ＥｃｏＲＶおよび３′ＮｏｔＩ部位を付加した。５′−ＸｈｏＩ−ＣＤ８０−３′ＢａｍＨＩ、５′ＢａｍＨＩ−ｍＦｃ−３′ＥｃｏＲＶ、および５′ＥｃｏＲＶ−ＨＢ−３′ＮｏｔＩ、ならびにＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＣＡＧ、の４方向ライゲーション反応を行い、ｐＣＡＧ．ＣＤ８０−ｍＦｃ−ＨＢｓを作製した。クローニングは、配列決定（Ｌｏｎｅ  Ｓｔａｒ  Ｌａｂｓ、テキサス州ヒューストン）によって確認した。
【０２５０】
ｐＣＡＧの生成：ｐＣＡＧベクターは、ｐＣＩＧベクター（ハイブリッドプロモーターＣＭＶエンハンサーニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、ウサギβグロビン３′ＵＴＲ、ポリアデニル化配列、ＩＲＥＳ−ＮＬＳ−ＧＦＰ、およびＳＶ４０複製起点を含む）から導入遺伝子を挿入するためのＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位を残してＩＲＥＳ−ＮＬＳ−ＧＦＰを除去することによって構築した（図２１Ａ）。
【０２５１】
ｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃの生成：ｐＳＰ６５ａｙｗ１．３（ＤｒＳｔｅｆａｎ  Ｗｉｅｌａｎｄ、バーゼル大学、スイス、によって提供される）のＳｍａＩおよびＳａｃＩ部位に、ＰＣＲクローニングによってＧＦＰ−２Ａ−ｆｆＬｕｃ発現カセットを挿入することによって（ＤｒＩｎｄｅｒ  Ｖｅｒｍａ、ソーク研究所、カリフォルニア州サンディエゴ、によって提供される）、ｐＨＢＶ−ｆｆＬｕｃを作製した。ｐＳＰ６５ａｙｗ１．３は、遺伝子型Ｄ、サブタイプａｙｗ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｖ０１４６０からの過剰長ＨＢＶゲノムをコードする。ＳｍａＩ部位は過剰長ＨＢＶゲノムの３′末端に位置し、ＧＦＰ−２Ａ−ｆｆＬｕｃサブクローニングのためのＰＣＲプライマーは、ＧＦＰ−２Ａ−ｆｆＬｕｃ翻訳がＨＢＶゲノムの３′末端のコアタンパク質翻訳とインフレームになるように設計された（より多くの配列情報については図２８を参照のこと）。クローニングは、配列決定（Ｌｏｎｅ  Ｓｔａｒ  Ｌａｂｓ、テキサス州ヒューストン）によって確認した。
【０２５２】
生物発光イメージング。ＩＶＩＳ（登録商標）システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、カリフォルニア州、アラメダ）を、生物発光イメージングのために使用した。マウスをイソフルランで麻酔し、２００μＬの７．５ｍｇ／ｍＬルシフェリン溶液（ＧｏｌｄＢｉｏ、ミズーリ州、オリベッテ）を腹腔内注射した。ルシフェリンを注射後１０分間循環させ、マウスを腹側を上にして、その後速やかに画像化した。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．２ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州、ホプキントン）を用い、肝臓上の領域を囲む関心領域（ＲＯＩ）を用いて発光シグナルを定量した。
【０２５３】
ＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡ。ＨＢｓＡｇレベルは、以前に記載されたように決定した（Ｂｉｌｌｉｏｕｄら、２０１６）。簡潔には、血清ＨＢｓＡｇレベルを、製造業者の説明書（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カリフォルニア州、フォスター市）に従って、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて評価した。血清ＨＢｓＡｇの定量は、既知の標準（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）の連続希釈を比較することによって行った。ＨＢｓＡｇレベルは利用した標準に対してｎｇ／ｍＬとして報告された。ＩＵ／ｍＬへの変換比は製造業者によって提供されていないが、多くのキットはおおよそのガイドラインとして、１または１０ｎｇ／ｍＬから１ＩＵ／ｍＬへのＨＢｓＡｇの変換を有する（Ｌｏｒｎｉｎｉら、２０１２）。
【０２５４】
ＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡ。血清ＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ  Ａｂレベルを、製造業者の説明書（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、テキサス州サンアントニオ）に従ってＥＬＩＳＡによって定量した。ＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ  ＡｂレベルはｍＩＵ／ｍＬとして報告された。ＥＬＩＳＡアッセイは、ヒトおよびマウス免疫グロブリンの両方を検出することができる。
【０２５５】
トランスアミナーゼ分析。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、ＣＯＢＡＳ  ＩＮＴＥＧＲＡ  ４００およびアナライザー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナ州インディアナポリス）を使用して、比較病理学研究所（ベイラー医科大学、テキサス州ヒューストン）によって測定した。
【０２５６】
動物実験。全ての動物実験は、ベイラー医科大学実験動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従った。免疫応答性マウスを使用する全ての実験について、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ由来のＲｏｓａ−Ｌｕｃ系統（FVB.129S6(B6)-Gt(ROSA)26Sortm1(Luc)Kael/J）を利用し、ここで、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）遺伝子の発現は、Ｌｕｃ配列とＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒプロモーターの間に配置されたｌｏｘＰ隣接ＳＴＯＰフラグメントによってブロックされる。たとえ大部分の実験が内因性ルシフェラーゼレポーターを利用しなかったとしても、全ての実験についてＲｏｓａ−Ｌｕｃマウスを使用すると、系統間変動のリスクが低下した。６〜１０週齢のＲｏｓａ−Ｌｕｃマウスを、ハイドロダイナミック尾静脈インジェクションのために選択した。等量のＤＮＡがマウスの各群に注射されるように、充填剤または対照プラスミドとして、ｐＣＭＶ−ガウシアルシフェラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ワルタム）を使用した。プラスミドＤＮＡを０．９％生理食塩水溶液に希釈し、全容量をマウス体重の１０％に等しくした。マウスを５〜１０分間加熱ランプ下に置いて外側尾静脈を拡張し、注射を４〜６秒かけて行った（Ｋｏｖａｃｓｉｃｓら、２０１４）。マウスを後眼窩で採血し、２．３Ｇで３０分間の遠心分離後に血清を集めた。血清を、ＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡおよびＨＢｓＡｇ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡの定量にさらに使用するまで−８０℃で保存した。
【０２５７】
組織学。肝臓由来の凍結組織スライドを４％  ＰＦＡで１０分間固定し、一次抗体を用いてＰＢＳ−Ｔ緩衝液（０．５％  ＢＳＡおよび０．２％トリトン−１００を含有するＰＢＳ  １×）中に、４℃で一晩ＨＢＶコアを染色した：ウサギ抗Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア州サンタクララ）。一次抗体をＰＢＳ  １×で洗浄し、スライドをＰＢＳ−Ｔ緩衝液中でＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）とインキュベートした。Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ｐｌｕｓ  ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、カリフォルニア州バーリンガム）をスライドマウンティングに使用した。他の実験では、肝臓組織を４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、パラフィン包埋肝臓の連続切片をヘマトキシリン＆エオシンで染色した。
【０２５８】
統計解析。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ラホーヤ）を用いて行った。データ測定は、平均＋／平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として提示する。平均差は、対応のないパラメトリックの片側ｔ検定を含む、適切な検定を用いて検定した。使用した有意水準は他に特定しない限り、ｐ＜  ０．０５であった。
【０２５９】
（参照）
本明細書において言及される全ての特許および刊行物は、本開示が関係する当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物は、各個々の刊行物が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されたのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
特許および特許出願
米国特許出願公開第２００２／０１５１５０９号
米国特許出願公開第２０１１／０１８４０４９号
（参考文献）
Alino, S. F., Crespo, A. & Dasi, F. Long-term therapeutic levels of human alpha-1 antitrypsin in plasma after hydrodynamic injection of nonviral DNA. Gene Therapy 10, 1672-1679 (2003).
Billioud, G. et al. In vivo reduction of hepatitis B virus antigenemia and viremia by antisense oligonucleotides. Journal of Hepatology 64, 781-789 (2016).
Bohne, F. et al. T Cells Redirected Against Hepatitis B Virus Surface Proteins Eliminate Infected Hepatocytes. Gastroenterology 134, 239-247 (2008).
Boni, C. et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology 81, 4215-4225 (2007).
Brischwein, K. et al. Strictly target cell-dependent activation of T cells by bispecific single-chain antibody constructs of the BiTE class. Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md. : 1997) 30, 798-807 (2007).
Cassidy, A., Mossman, S., Olivieri, A., De Ridder, M. & Leroux-Roels, G. Hepatitis B vaccine effectiveness in the face of global HBV genotype diversity. Expert Review of Vaccines 10, 1709-1715 (2011).
Chen, S.-H., Wu, H.-L., Kao, J.-H. & Hwang, L.-H. Persistent Hepatitis B Viral Replication in a FVB/N Mouse Model: Impact of Host and Viral Factors. PLoS ONE 7, e36984-12 (2012).
Compte, M. et al. Functional comparison of single-chain and two-chain anti-CD3-based bispecific antibodies in gene immunotherapy applications. OncoImmunology 3, e28810 (2014).
Compte, M., Nunez-Prado, N., Sanz, L. & Alvarez-Vallina, L. In vivo Secretion of Bispecific Antibodies Recruiting Lymphocytic Effector Cells. Antibodies 2, 415-425 (2013).
Dong, C. et al. Targeting hepatitis B virus cccDNA by CRISPR/Cas9 nuclease efficiently inhibits viral replication. Antiviral Research 118, 110-117 (2015).
Durantel, D. & Zoulim, F. New antiviral targets for innovative treatment concepts for hepatitis B virus and hepatitis delta virus. Journal of Hepatology 64, S117-S131 (2016).
Eren, R. et al. Human monoclonal antibodies specific to hepatitis B virus generated in a human/mouse radiation chimera: the Trimera system. Immunology 93, 154-161 (1998).
Eren, R. et al. Preclinical Evaluation of Two Human Anti-Hepatitis B Virus(HBV) Monoclonal Antibodies in the HBV-Trimera Mouse Model and in HBV Chronic Carrier Chimpanzees. Hepatology 32, 588-596 (2000).
Falk, I., Potocnik, A. J., Barthlott, T., Levelt, C. N. & Eichmann, K. Immature T cells in peripheral lymphoid organs of recombinase-activating gene-1/-2-deficient mice. Thymus dependence and responsiveness to anti-CD3 epsilon antibody. J. Immunol. 156, 1362-1368 (1996).
Galun, E. Clinical evaluation (phase I) of a combination of two human monoclonal antibodies to HBV: Safety and antiviral properties. Hepatology 35, 673-679 (2002).
Guidotti, L. G. et al. Immunosurveillance of the liver by intravascular effector CD8(+) T cells. Cell 161, 486-500 (2015).
Haile, S. T., Dalal, S. P., Clements, V., Tamada, K. & Ostrand-Rosenberg, S. Soluble CD80 restores T cell activation and overcomes tumor cell programmed death ligand 1-mediated immune suppression. J. Immunol. 191, 2829-2836 (2013).
Hosel, M. et al. Hepatitis B virus infection enhances susceptibility toward adeno-associated viral vector transduction in vitro and in vivo. Hepatology 59, 2110-2120 (2014).
Hudecek, M. et al. The nonsignaling extracellular spacer domain of chimeric antigen receptors is decisive for in vivo antitumor activity. Cancer Immunol Res 3, 125-135 (2015).
Iwahori, K. et al. Engager T cells: a new class of antigen-specific T cells that redirect bystander T cells. Mol Ther 23, 171-178 (2015).
Jost, C. R., Titus, J. A., Kurucz, I. & Segal, D. M. A single-chain bispecific Fv2 molecule produced in mammalian cells redirects lysis by activated CTL. Molecular Immunology 33, 211-219 (1996).
Karimova, M. et al. CRISPR/Cas9 nickase-mediated disruption of hepatitis B virus open reading frame S and X. Nature Publishing Group 5, 13734 (2015).
Kay, M. A. et al. Expression of human alpha 1-antitrypsin in dogs after autologous transplantation of retroviral transduced hepatocytes. Proc Natl Acad Sci USA 89, 89-93 (1992).
Krebs, K. et al. T Cells Expressing a Chimeric Antigen Receptor That Binds Hepatitis B&nbsp;Virus Envelope Proteins Control Virus Replication in Mice. Gastroenterology 1-10 (2013). doi:10.1053/j.gastro.2013.04.047
Kuo, S. R., Wong, L. & Liu, J. S. Engineering a CD123xCD3 bispecific scFv immunofusion for the treatment of leukemia and elimination of leukemia stem cells. Protein Engineering Design and Selection 25, 561-570 (2012).
Leo, O., Foo, M., Sachs, D. H., Samelson, L. E. & Bluestone, J. A. Identification of a monoclonal antibody specific for a murine T3 polypeptide. Proc Natl Acad Sci USA 84, 1374-1378 (1987).
Liang, S.-Q. et al. A Mouse Model for Studying the Clearance of Hepatitis B Virus In vivo Using a Luciferase Reporter. PLoS ONE 8, e60005-9 (2013).
Liu, F., Song, Y. & Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy 6, 1258-1266 (1999).
Liu, S. et al. Human hepatitis B virus surface and e antigens inhibit major vault protein signaling in interferon induction pathways. Journal of Hepatology 62, 1015-1023 (2015).
Lucifora, J. et al. Specific and Nonhepatotoxic Degradation of Nuclear Hepatitis B Virus cccDNA. Science 343, 1221-1228 (2014).
Mau-Sorensen, M. et al. A phase I trial of intravenous catumaxomab: a bispecific monoclonal antibody targeting EpCAM and the T cell coreceptor CD3. Cancer Chemother. Pharmacol. 75, 1065-1073 (2015).
McMahon, B. J. et al. Antibody levels and protection after hepatitis B vaccine: results of a 22-year follow-up study and response to a booster dose. J. Infect. Dis. 200, 1390-1396 (2009).
Morgan, R. A. et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Human Gene Therapy 23, 1043-1053 (2012).
Nathwani, A. C. et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. N. Engl. J. Med. 365, 2357-2365 (2011).
Neumann, A. U. et al. Novel mechanism of antibodies to hepatitis B virus in blocking viral particle release from cells. Hepatology 52, 875-885 (2010).
Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W. & Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. The Journal of surgical research 148, 60-66 (2008).
Park, J.-J. et al. Hepatitis B Virus--Specific and Global T-Cell Dysfunction in Chronic Hepatitis B. Gastroenterology 150, 684-695.e5 (2016).
Paul, A. J., Schwab, K. & Hesse, F. Direct analysis of mAb aggregates in mammalian cell culture supernatant. BMC Biotechnol. 14, 99 (2014).
Przepiorka, D. et al. FDA Approval: Blinatumomab. Clin Cancer Res 21, 4035-4039 (2015).
Rai, U. et al. A New Method to Determine Antigen-Specific CD8+ T Cell Activity in vivo by Hydrodynamic Injection. Biomolecules 2, 23-33 (2012).
Ramanan, V. et al. CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus. Nature Publishing Group 5, 10833 (2015).
Ribera, J.-M., Ferrer, A., Ribera, J. & Genesca, E. Profile of blinatumomab and its potential in the treatment of relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia. Onco Targets Ther 8, 1567-1574 (2015).
Schilling, R. et al. Endocytosis of hepatitis B immune globulin into hepatocytes inhibits the secretion of hepatitis B virus surface antigen and virions. Journal of Virology 77, 8882-8892 (2003).
Schlereth, B. et al. Potent inhibition of local and disseminated tumor growth in immunocompetent mouse models by a bispecific antibody construct specific for Murine CD3. Cancer Immunol. Immunother. 55, 785-796 (2006).
Seeger, C. & Sohn, J. A. Targeting Hepatitis B Virus With CRISPR/Cas9. Mol Ther Nucleic Acids 3, e216 (2014).
Smith, J. A., Tso, J. Y., Clark, M. R., Cole, M. S. & Bluestone, J. A. Nonmitogenic anti-CD3 monoclonal antibodies deliver a partial T cell receptor signal and induce clonal anergy. J Exp Med 185, 1413-1422 (1997).
Spiess, C., Zhai, Q. & Carter, P. J. Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Molecular Immunology 1-12 (2015). doi:10.1016/j.molimm.2015.01.003
Staerz, U. D. & Bevan, M. J. Hybrid hybridoma producing a bispecific monoclonal antibody that can focus effector T-cell activity. Proc Natl Acad Sci USA 83, 1453-1457 (1986).
Staerz, U. D., Kanagawa, O. & Bevan, M. J. Hybrid antibodies can target sites for attack by T cells. Nature 314, 628-631 (1985).
Tan, W. et al. A bispecific antibody against two different epitopes on hepatitis B surface antigen has potent hepatitis B virus neutralizing activity. MAbs 5, 946-955 (2013).
Thess, A. et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther 23, 1-9 (2015).
Thimme, R. et al. CD8(+) T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infection. Journal of Virology 77, 68-76 (2003).
van Nunen, A. B. et al. Efficacy and safety of an intravenous monoclonal anti-HBs in chronic hepatitis B patients. Liver 21, 207-212 (2001).
Viecelli, H. M. et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology 60, 1035-1043 (2014).
Weidle, U. H., Tiefenthaler, G., Weiss, E. H., Georges, G. & Brinkmann, U. The intriguing options of multispecific antibody formats for treatment of cancer. Cancer Genomics Proteomics 10, 1-18 (2013).
Wooddell, C. I. et al. Hepatocyte-targeted RNAi therapeutics for the treatment of chronic hepatitis B virus infection. Mol Ther 21, 973-985 (2013).
Xia, Y. et al. Interferon-&gamma; and Tumor Necrosis Factor-&alpha; Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology 150, 194-205 (2016).
Xu, Y. et al. HBsAg inhibits TLR9-mediated activation and IFN-alpha production in plasmacytoid dendritic cells. Molecular Immunology 46, 2640-2646 (2009).
Yang, P. L., Althage, A., Chung, J. & Chisari, F. V. Hydrodynamic injection of viral DNA: a mouse model of acute hepatitis B virus infection. Proc Natl Acad Sci USA 99, 13825-13830 (2002).
Ying, T., Chen, W., Gong, R., Feng, Y. & Dimitrov, D. S. Soluble Monomeric IgG1 Fc. J. Biol. Chem. 287, 19399-19408 (2012).
【０２６０】
本開示およびその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換、および変更を本明細書で行うことができることを理解されたい。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されたプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図していない。当業者は本開示の開示から容易に理解するように、本明細書に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行するか、または実質的に同じ結果を達成する、現在存在するか、または後に開発されるプロセス、機械、製造、物質、手段、方法、またはステップが、本開示に従って利用され得る。従って、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、またはステップをそれらの範囲内に含むことが意図される。
【図１】
2019529499.tif 000007
【図２】
2019529499.tif 000008
【図３】
2019529499.tif 000009
【図４】
2019529499.tif 000010
【図５】
2019529499.tif 000011
【図６】
2019529499.tif 000012
【図７】
2019529499.tif 000013
【図８】
2019529499.tif 000014
【図９】
2019529499.tif 000015
【図１０】
2019529499.tif 000016
【図１１】
2019529499.tif 000017
【図１２】
2019529499.tif 000018
【図１３】
2019529499.tif 000019
【図１４】
2019529499.tif 000020
【図１５】
2019529499.tif 000021
【図１６】
2019529499.tif 000022
【図１７】
2019529499.tif 000023
【図１８】
2019529499.tif 000024
【図１９】
2019529499.tif 000025
【図２０】
2019529499.tif 000026
【図２１】
2019529499.tif 000027
【図２２】
2019529499.tif 000028
【図２３】
2019529499.tif 000029
【図２４】
2019529499.tif 000030
【図２５】
2019529499.tif 000031
【図２６】
2019529499.tif 000032
【図２７】
2019529499.tif 000033
【図２８】
2019529499.tif 000034
【配列表】
2019529499000001.app
【国際調査報告】
2019529499.tif 000035
2019529499.tif 000036
2019529499.tif 000037