(57)【要約】  マルチアームで、水溶性ポリマーで修飾された標的薬物コンジュゲートであって、構造式（ＩＩＩ）で示す構造を有する薬物コンジュゲートに関する。2019519508.tif 000314                  （ＩＩＩ）  （式中、Ｒは有機中心であり、ＰＯＬＹはポリマーであり、Ｌは多価リンカーであり、Ｔは標的分子であり、Ｄはカンプトテシン系薬物であり、ｑは３〜８の任意の整数である。）  前記薬物コンジュゲートは、カンプトテシン系薬物の悪い水溶性、高い毒性、及び低いバイオアベイラビリティを改善することができる。
2019519508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式（ＩＩＩ）を有する、多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
【化１】
2019519508.tif 000237
（ＩＩＩ）
（式中、Ｒは有機中心であり、ＰＯＬＹはポリマーであり、Ｌは多価リンカーであり、Ｔは標的分子であり、Ｄは活性剤であり、ｑは３〜８の任意の整数である。
ただし、Ｄは下記式で示されるカンプトテシン系薬物である。
【化２】
2019519508.tif 000238
（式中、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アシル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アジド基、アミド基、ヒドラジン、アミン基、置換アミン基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基から選択され、Ｒ6は、Ｈ又はＯＲ8であり、Ｒ8は、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、又はヒドロキシアルキル基であり、Ｒ７は、ヒドロキシ基である。））
【請求項２】
Ｄは、イリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、又はルビテカンである、請求項１に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
ＰＯＬＹは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリル酸アミン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリサッカライド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリアクリル酸、ポリ酢酸ビニル、ポリフォスファジン、ポリオキサゾリン、又はポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）である、請求項１又は２に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
ＰＯＬＹは、
【化３】
2019519508.tif 000239
であり、式中、ｎは５〜５００であり、好ましくは５〜２００であり、最も好ましくは１１３である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
多価リンカーＬは、下記式で示されるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
【化４】
2019519508.tif 000240
（式中、記号「＊」は、多価リンカーＬと標的分子Ｔとの結合点を示し、「＃」は、多価リンカーＬと活性剤Ｄとの結合点を示し、「％」は、多価リンカーＬとＰＯＬＹとの結合点を示す。ｍ、ｍ’はそれぞれ１〜２０の任意の整数であり、ｌ、ｋはそれぞれ１〜１０の任意の整数である。）
【請求項６】
多価リンカーＬは、下記式で示されるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
【化５】
2019519508.tif 000241
【請求項７】
Ｔは、「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」配列を含むＲＧＤペプチド、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、ＧＥ１１、又は葉酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
Ｔは、ｉＲＧＤ又はｃＲＧＤである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
前記多分岐薬物コンジュゲートは、構造式（ＩＶ）、（Ｖ）、又は（ＶＩ）で示される構造を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
【化６】
2019519508.tif 000242
（ＩＶ）
【化７】
2019519508.tif 000243
（Ｖ）
【化８】
2019519508.tif 000244
（ＶＩ）
（式中、ｎは５〜５００であり、好ましくは５〜２００であり、最も好ましくは１１３である。）
【請求項１０】
下記の構造を有する多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩。
化合物１：
【化９】
2019519508.tif 000245
化合物２：
【化１０】
2019519508.tif 000246
化合物３：
【化１１】
2019519508.tif 000247
化合物４：
【化１２】
2019519508.tif 000248
化合物５：
【化１３】
2019519508.tif 000249
化合物６：
【化１４】
2019519508.tif 000250
化合物７：
【化１５】
2019519508.tif 000251
化合物８：
【化１６】
2019519508.tif 000252
化合物９：
【化１７】
2019519508.tif 000253
化合物１０：
【化１８】
2019519508.tif 000254
化合物１１：
【化１９】
2019519508.tif 000255
化合物１２：
【化２０】
2019519508.tif 000256
化合物１３：
【化２１】
2019519508.tif 000257
化合物１４：
【化２２】
2019519508.tif 000258
化合物１５：
【化２３】
2019519508.tif 000259
化合物１６：
【化２４】
2019519508.tif 000260
化合物１７：
【化２５】
2019519508.tif 000261
化合物１８：
【化２６】
2019519508.tif 000262
化合物１９：
【化２７】
2019519508.tif 000263
化合物２０：
【化２８】
2019519508.tif 000264
化合物２１：
【化２９】
2019519508.tif 000265
化合物２２：
【化３０】
2019519508.tif 000266
化合物２３：
【化３１】
2019519508.tif 000267
（式中、Ｒは、
【化３２】
2019519508.tif 000268
である。）
化合物２４：
【化３３】
2019519508.tif 000269
（式中、Ｒは、
【化３４】
2019519508.tif 000270
である。）
化合物２５：
【化３５】
2019519508.tif 000271
（式中、Ｒは、
【化３６】
2019519508.tif 000272
である。）
化合物２６：
【化３７】
2019519508.tif 000273
（式中、Ｒは、
【化３８】
2019519508.tif 000274
である。）
化合物２７：
【化３９】
2019519508.tif 000275
（式中、Ｒは、
【化４０】
2019519508.tif 000276
である。）
化合物２８：
【化４１】
2019519508.tif 000277
（式中、Ｒは、
【化４２】
2019519508.tif 000278
である。）
化合物２９：
【化４３】
2019519508.tif 000279
（式中、Ｒは、
【化４４】
2019519508.tif 000280
である。）
化合物３０：
【化４５】
2019519508.tif 000281
（式中、Ｒは、
【化４６】
2019519508.tif 000282
である。）
化合物３１：
【化４７】
2019519508.tif 000283
（式中、Ｒは、
【化４８】
2019519508.tif 000284
である。）
化合物３２：
【化４９】
2019519508.tif 000285
（式中、Ｒは、
【化５０】
2019519508.tif 000286
である。）
化合物３３：
【化５１】
2019519508.tif 000287
（式中、Ｒは、
【化５２】
2019519508.tif 000288
である。）
化合物３４：
【化５３】
2019519508.tif 000289
（式中、Ｒは、
【化５４】
2019519508.tif 000290
である。）
化合物３５：
【化５５】
2019519508.tif 000291
（式中、Ｒは、
【化５６】
2019519508.tif 000292
である。）
化合物３６：
【化５７】
2019519508.tif 000293
（式中、Ｒは、
【化５８】
2019519508.tif 000294
である。）
化合物３７：
【化５９】
2019519508.tif 000295
（式中、Ｒは、
【化６０】
2019519508.tif 000296
である。）
化合物３８：
【化６１】
2019519508.tif 000297
（式中、Ｒは、
【化６２】
2019519508.tif 000298
である。）
化合物３９：
【化６３】
2019519508.tif 000299
（式中、Ｒは、
【化６４】
2019519508.tif 000300
である。）
化合物４０：
【化６５】
2019519508.tif 000301
（式中、Ｒは、
【化６６】
2019519508.tif 000302
である。）
化合物４１：
【化６７】
2019519508.tif 000303
（式中、Ｒは、
【化６８】
2019519508.tif 000304
である。）
化合物４２：
【化６９】
2019519508.tif 000305
（式中、Ｒは、
【化７０】
2019519508.tif 000306
である。）
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬物組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の、結腸癌、肺がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、グリオーマ、及び、乳房、卵巣、結腸、腎臓、胆管、肺及び脳の悪性肉腫、がん及びリンパ腫を治療するための薬物の製造のための使用。
【請求項１３】
下記式で示される多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の製造方法であって、
【化７１】
2019519508.tif 000307
（式中、Ｒは有機中心であり、ＰＯＬＹはポリマーであり、Ｌは多価リンカーであり、Ｔは標的分子であり、Ｄは活性剤であり、ｑは３〜８の任意の整数であり、Ｄは下記式で示されるカンプトテシン系薬物である。
【化７２】
2019519508.tif 000308
（式中、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アシル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アジド基、アミド基、ヒドラジン、アミン基、置換アミン基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基から選択され、Ｒ6は、Ｈ又はＯＲ8であり、Ｒ8は、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、又はヒドロキシアルキル基であり、Ｒ７は、ヒドロキシ基である。））
（１）活性剤Ｄと多価リンカーＬとを連結し、Ｄ−Ｌ部分を得るスデップ、
（２）Ｄ−Ｌ部分とマルチアームポリマーである
【化７３】
2019519508.tif 000309
とを連結し、
【化７４】
2019519508.tif 000310
を得るスデップ、及び
（３）上記スデップで得られた
【化７５】
2019519508.tif 000311
と標的分子Ｔとを連結するスデップを含む、多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の製造方法。
【請求項１４】
Ｄは、イリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、又はルビテカンであり、
マルチアームポリマーである
【化７６】
2019519508.tif 000312
は、３ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ、４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ、又は８ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭであり、
Ｌは、
【化７７】
2019519508.tif 000313
であり（式中、記号「＊」は、多価リンカーＬと標的分子Ｔとの結合点を示し、「＃」は、多価リンカーＬと活性剤Ｄとの結合点を示し、「％」は、多価リンカーＬとＰＯＬＹとの結合点を示す。）、
Ｔは、ｉＲＧＤ、ｃＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、ＧＥ１１、又は葉酸である、請求項１３に記載の多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全体的に、マルチアームである水溶性ポリマー及び対応する薬物コンジュゲートに関する。より詳細には、本発明はマルチアームＰＥＧで修飾された標的抗がんコンジュゲートに関し、さらに詳細には、本発明は、マルチアームＰＥＧを介して、標的分子と抗がん薬物とを連結してなるコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生理活性物質の安定性及び送達を改善するための様々な方法が提案されている。医薬品用試薬の製造及び送達に関連する課題として、該医薬品用試薬の悪い水溶性、毒性、低いバイオアベイラビリティ、不安定さ、及び薬剤の迅速な生体内分解性が挙げられる。医薬品用試薬の送達を改善するために多くの方法が設計されているが、欠点のない単一の方法はない。例えば、通常使用される薬物送達方法は、リポソーム、ポリマーマトリックス、又は単分子ミセル内での薬物カプセル化、ポリエチレングリコールのような水溶性ポリマーへの共有結合、遺伝子標的化剤の使用、塩類の構造等のうちの少なくとも１つ又は複数の課題を解決することを目的とする。
【０００３】
ＷＯ２００５０２８５３９、ＷＯ２０１００１９２３３、ＷＯ２０１１０６３１５６、ＷＯ２０１１０６３１５８には、第ＩＩＩ相臨床試験段階の薬物であるｎｋｔｒ１０２が開示され、該薬物は主に転移性乳がんに用いられ、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに研究開発されたものである。該薬物は、薬物の担持を高めるための水溶性多分岐ポリマー薬物前駆体であり、その構造は下記のとおりである。
【０００４】
【化１】
2019519508.tif 000003
【０００５】
該化合物は、水溶性を高め、薬物担持量を増加させるように、マルチアームＰＥＧを介してイリノテカンと連結してなるものであり、抗がん作用が変わらない前提で副作用を低減する。しかし、該薬物は、例えば、標的指向性が悪く、特定のがん細胞に作用できず、がん細胞を殺すと同時に正常細胞の性能にも影響を与えることで、不良反応の発生率は依然として高いという欠点がある。
【０００６】
インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）は、細胞接着受容体分子であり、有核細胞表面全体に広く発現され、中でも、インテグリンαγβ3は、神経膠腫、メラノーマ、卵巣がん等の様々な腫瘍細胞及び腫瘍関連内皮細胞の表面に多く発現され、腫瘍の血管新生、腫瘍転移及び腫瘍の放射線治療耐性に緊密に関連しているため、インテグリンαγβ3は、腫瘍の標的化のための特異的な標的として用いられることが多い。研究により、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、ＲＧＤ）のトリペプチド配列は、αγサブユニットを含むインテグリンファミリーを特異的に認識でき、高い親和性を有することが示されている。
【０００７】
従来の腫瘍を治療するための薬物は、腫瘍組織に対する選択性に乏しく、毒性副作用が大きい等の欠点を有するものが多い。良好な薬物送達システムをどのように設計するかは、近年、広く研究されている。『腫瘍増殖が腫瘍血管に依存する理論』の提唱に伴い、腫瘍新生血管標的受容体薬物は、腫瘍治療効果を向上させるための新規且つ有望な方法になっている。インテグリンαγβ3は腫瘍標的治療の理想的な標的であり、そのリガンドＲＧＤペプチドは、エフェクター分子付けるものとして、インテグリンと特異的に結合することにより、腫瘍増殖及び血管新生を阻害することができる。
【０００８】
ＲＧＤペプチドとインテグリンのαγβ3との特異的な結合により、治療エフェクター分子を腫瘍部位に標的に導入でき、腫瘍治療中の正常組織細胞への損害を効果的に低減することができる。
【０００９】
線状ＲＧＤペプチドは生体内に広く存在するが、該ペプチドは体内循環中の半減期が短く、αγβ3受容体への親和力が低く、プロテアーゼに分解されやすい。一方、環状ＲＧＤペプチドは、安定性が高く、受容体との親和力が高く、且つ腫瘍浸透ペプチド特性を示すため、抗がん薬物の標的浸透への促進及び薬物の正常細胞への毒副作用の低減において顕著に優位性を示す。
【００１０】
ｉＲＧＤは、特許文献ＷＯ２００９１２６３４９に開示されており、その具体的な構造は以下のようである。
【００１１】
【化２】
2019519508.tif 000004
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、標的指向性を有する新たな多分岐薬物コンジュゲートに関するものであり、該コンジュゲートは、３つ以上の分岐を有すし、下記式で示される。
【００１３】
【化３】
2019519508.tif 000005
（Ｉ）
【００１４】
式中、Ｒは有機中心であり、ＰＯＬＹはポリマーであり、ＰＯＬＹはＸと共にポリマー分岐を構成する。
【００１５】
該多分岐薬物コンジュゲートの各分岐は、ほかの分岐とは相互に独立している。つまり、各分岐は異なるＰＯＬＹ、Ｘから構成されてもよい。典型的に、一般の構造は、
【００１６】
【化４】
2019519508.tif 000006
【００１７】
【化５】
2019519508.tif 000007
【００１８】
等に対応するものであり、残りはこれに基づき類推できる。各分岐は、有機中心である「Ｒ」から伸びるものである。なお、通常、該コンジュゲートの各分岐はすべて同じである。
【００１９】
以下、構造式（Ｉ）中の各変数について説明する。
【００２０】
有機中心である「Ｒ」
【００２１】
構造式（Ｉ）において、「Ｒ」は１〜１００個の原子を含む有機中心基である。好ましくは、Ｒは３〜５０個の原子を含み、より好ましくはＲは約３〜３０個の原子を含む。Ｒは、使用される特別な中心分子によって、炭素原子からなる中心基であってもよく、例えばＯ、Ｓ、Ｎ、Ｐ等のヘテロ原子を１個又は複数個選択的に含んでもよい。Ｒは直鎖、分岐又は環状のいずれであってもよく、少なくとも３つの独立したポリマー支鎖に分岐する。構造式（Ｉ）において、「ｑ」は、「Ｒ」から枝分かれしたポリマー支鎖の数に対応する。
【００２２】
有機中心「Ｒ」は、１つの分子から由来するものであり、該分子は、複数のポリマー結合部位を提供し、その数が、ポリマー支鎖の数にほぼ等しい。より好ましくは、多分岐ポリマー構造の主体中心分子式は、少なくともポリマー分岐として好適な、ヒドロキシ基、チオ基、又はアミノ基を有するポリヒドロキシ化合物、ポリスルフィド化合物、又はポリアミン化合物の残基を３つ以上有する。１つの「ポリヒドロキシ化合物」は、複数（２つ以上）の利用可能なヒドロキシ基を含有する分子である。１つの「ポリスルフィド化合物」は、複数（２つ以上）の利用可能なチオ基を含有する分子である。１つの「ポリアミン化合物」は、複数（２つ以上）の利用可能なアミン基を含有する分子である。ポリマー分岐数により、ポリヒドロキシ化合物、ポリアミン化合物又はポリスルフィド化合物の母体（ＰＯＬＹ共有結合の連結前）は、典型的にヒドロキシ基、チオ基又はアミン基を３〜２５個有し、より好ましくはヒドロキシ基、チオ基又はアミン基を３〜１０個有し、最も好ましくはＰＯＬＹ共有結合との連結に好適なヒドロキシ基、チオ基又はアミン基を３〜約８個（例えば３、４、５、６、７又は８）有する。
【００２３】
ポリヒドロキシ化合物又はポリアミン化合物中心の母体は、ポリマーと作用する前に、典型的には、構造式Ｒ−（ＯＨ）ｐ又はＲ−（ＮＨ2）ｐを１つ有する。構造式（Ｉ）中、ｐ値はｑ値に対応するものである。その理由は、母体有機分子中の各機能性基、典型的には−ＯＨ及び−ＮＨ2は、位置が影響されやすく、又は反応が発生しやすい場合、ポリマー分岐のＰＯＬＹ共有結合に連結するからである。構造式（Ｉ）中、ＰＯＬＹに連結した後、Ｒ母体のポリヒドロキシ化合物のヒドロキシ基はすべて１つのポリマー分岐に変化し、前記Ｒは連結後の残基である。例えば、有機中心分子がペンタエリスリトールから誘導された場合、ポリヒドロキシ化合物の母体は、構造式Ｃ（ＣＨ2ＯＨ）4を有し、有機中心基Ｒは下記で示される。
【００２４】
【化６】
2019519508.tif 000008
【００２５】
ポリマーの中心として好ましい例示的なポリヒドロキシ化合物は、例えば、エチレングリコール、アルカンジオール、ヒドロカルビルグリコール、アルキレンヒドロカルビルグリコール、ヒドロカルビルシクロアルキルグリコール、１，５−ナフチレングリコール、４，８−ビス（ヒドロキシメチル）トリシクロデカン、シクロアルキレングリコール、ジヒドロキシアルカン、トリヒドロキシアルカン、テトラヒドロキシアルカン等の１〜１０個の炭素原子及び１〜１０個のヒドロキシ基を有する脂肪族ポリヒドロキシ化合物が挙げられる。脂環式ポリヒドロキシ化合物は、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、キシリトール、ロイコシド、トレイトール、アラビトール、エリスリトール、ヘキサヘキサノール、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、ソルボース、マンノース、ピラノース、アルトロース、タロース、タガトース、ピラノシド、スクロース、ラクトース、マルトース等の直鎖状又は閉環式の糖類及び糖アルコールが挙げられる。また、カテコール、ヒドロカルビルカテコール、ピロガロール、フロログルシンフェノール、１，２，４−ベンゼントリオール、レゾルシン、ヒドロカルビルレゾルシン、ジヒドロカルビルレゾルシン、オルシノール一水和物、オリーブフェノール、ヒドロキノン、ヒドロカルビルヒドロキノン、フェニルヒドロキノン等の芳香族ポリヒドロキシ化合物を使用することがもできる。ほかに使用できるポリヒドロキシル化合物中心は、クラウンエーテル、シクロデキストリン、デキストリン、又はほかの炭水化物を含み得る。
【００２６】
構造式（Ｉ）中、ｑは、対応する「Ｒ」に連結しているポリマー分岐の個数を示し、具体的に３〜２０であってもよい。典型的に、「ｑ」の具体的な数字が３、４、５、６、７、８である。具体的に、「Ｒ」を中心として３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つのポリマー支鎖に分岐する。
【００２７】
一部の実施の形態において、「Ｒ」は３つのポリマー分岐を有し、「Ｒ」は好ましくは、
【００２８】
【化７】
2019519508.tif 000009
【００２９】
である。
【００３０】
一部の実施の形態において、「Ｒ」は４つのポリマー分岐を有し、「Ｒ」は好ましくは、
【００３１】
【化８】
2019519508.tif 000010
【００３２】
である。
【００３３】
一部の実施の形態において、「Ｒ」は６つのポリマー分岐を有し、「Ｒ」は好ましくは、
【００３４】
【化９】
2019519508.tif 000011
【００３５】
である。
【００３６】
一部の実施の形態において、「Ｒ」は８つのポリマー分岐を有し、「Ｒ」は好ましくは、
【００３７】
【化１０】
2019519508.tif 000012
【００３８】
である。
【００３９】
ポリマー、「ＰＯＬＹ」
【００４０】
構造式（Ｉ）中、「ＰＯＬＹ」はポリマーであり、Ｘと一緒になってポリマー分岐を構成する。各ポリマー分岐におけるＰＯＬＹは独立して選択されるものであり、好ましくは各ポリマーは同じポリマーであり、より好ましくは各構造式（Ｉ）中のポリマー分岐は同じである。好ましいポリマーは水溶性であり、任意の水溶性ポリマーを本発明のコンジュゲートの形成に使用できる。本発明でいうポリマーは、任意の幾何学的形態又は形状であってもよい。代表的なポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリル酸アミン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリサッカライド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリアクリル酸、ポリ酢酸ビニル、ポリフォスファジン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）等を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
典型的な化合物としては、「ＰＯＬＹ」はポリエチレングリコールであり、直鎖、分岐、フォーク型等の任意の幾何学的形態又は形状であってもよい。より好ましくは、「ＰＯＬＹ」は線状ポリエチレングリコールである。典型的な構造は、
【００４２】
【化１１】
2019519508.tif 000013
【００４３】
であり、「
2019519508.tif 000014
」は、原子の結合点を示し、アスタリスク付きの酸素原子は、有機中心「Ｒ」と結合する原子である。ただし、ｎの数値範囲は約５〜５００であり、最も好ましくは５０〜２００であり、好ましくは１１３とする。平均分子量は約１ｋ〜６０ｋＤａである。
【００４４】
この分野の技術者は、高分子分野では、ｎが前記ポリマーの重合度、つまり、ポリマーの高分子鎖に含まれる繰り返し単位数の平均値を表し、前記ポリマーの分子量により決められ、例えば、ｎが１１３であるとき、平均値が１１３を意味すると理解されるべきである。
【００４５】
前記ポリエチレングリコール構造は通常、さらに一部の末端部分残基を含有し、ＰＯＬＹの末端基に類似するように、Ｈ、ＮＨ2、ＯＨ、ＣＯ2Ｈ、Ｃ1-6アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基）、Ｃ1-6アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基）、アシル基、又はアリール基を末端とすることができる。例えば、ＰＯＬＹは、
【００４６】
【化１２】
2019519508.tif 000015
【００４７】
であってもよい。
【００４８】
通常の市販マルチアームポリエチレングリコールは、このような末端部分を有し、ＰＯＬＹとＸとがポリマー分岐に連結した際に、例えばヒドロキシ基等の末端部分基が反応し、上記末端部分残基の形で現れる。
【００４９】
前記ポリマーは高分岐のポリマーであってもよい。典型的な構造は、デンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）である。このようなポリマーとは、すべての結合が中央収束点又はコアから径方向に延び、分枝が規則的であり、且つそれぞれが分枝点となる繰り返し単位を有する球状のサイズ単分散ポリマーである。デンドリマーは、他の種類のポリマーには見られない独自の特性を与える、コアカプセル化等の特定の樹状特性を示す。
【００５０】
ＰＯＬＹは、樹状（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）のポリエチレングリコール結合アームであってもよく、典型的な構造は以下のとおりである。
【００５１】
【化１３】
2019519508.tif 000016
【００５２】
「
2019519508.tif 000017
」は、同じように樹状に拡散していることを示す。
【００５３】
ポリマー分岐の組成部分、Ｘ
【００５４】
構造式（Ｉ）中、「Ｘ」は「ＰＯＬＹ」と一緒になってポリマー分岐を構成する。Ｘとしては、以下の４つの形態が挙げられる。
【００５５】
１）Ｘは、その末端に、比較的非反応性の基、又は未反応の基を１つ有するものである。この場合、「Ｘ」は何の活性剤も含まず、反応し難い基である。通常はアルコキシ基（−ＯＱ）であり、ただし、Ｑが通常炭素数１〜２０の、最も好ましくはＣ1-6の低級アルキル基又はフェニル基のような有機基である。「Ｘ」は、飽和又は不飽和であってもよく、アリール基、ヘテロアリール基、環状化合物、複素環式化合物及びこれらのいずれかの置換形を含む。
【００５６】
２）Ｘは、（Ｌ）−（Ｔ）ｎ’で表される。Ｌは多価リンカーを表し、Ｔは標的分子を表し、ｎ’は１以上の整数を表す。リンカーＬは、互いに共有結合した複数のリンカーを含んでいてもよい。例えば、多価リンカーＬは、１つ以上のスペーサーリンカーＬｓ及び／又は難分解性リンカーＬｎを含有し、互いに接続させることができる。難分解性リンカーＬｎはＴに接続される。これら異なるリンカーを選択し、任意の順番で並べ、多価リンカーＬを構築することができる。例えば、多価リンカーＬは、以下の１つ以上の２価リンカーから構築されることができる。
【００５７】
【化１４】
2019519508.tif 000018
【００５８】
式中、ａ及びｂは整数、例えば０〜５の整数である。いくつかのＬｓを、直鎖、分岐、末端分岐等に連結することができる。Ｌｓは存在しなくてもよく、ＬｎによりＰＯＬＹとＴを直接的に連結してもよい。
【００５９】
多価リンカーによりＰＯＬＹとＴを様々な構造配置で連結することができ、下記例示的な一般式を含むが、これらに限定されないと理解されるべきである。
【００６０】
【化１５】
2019519508.tif 000019
【００６１】
【化１６】
2019519508.tif 000020
【００６２】
【化１７】
2019519508.tif 000021
【００６３】
【化１８】
2019519508.tif 000022
【００６４】
【化１９】
2019519508.tif 000023
【００６５】
【化２０】
2019519508.tif 000024
【００６６】
【化２１】
2019519508.tif 000025
【００６７】
【化２２】
2019519508.tif 000026
【００６８】
【化２３】
2019519508.tif 000027
【００６９】
式中、Ｌｓ1、Ｌｓ2、Ｌｓ3、Ｌｓ4はそれぞれスペーサーリンカーであり、同一でも異なっていてもよい。Ｌｎ1、Ｌｎ2、Ｌｎ3、Ｌｎ4はそれぞれ難分解性リンカーであり、同一でも異なっていてもよい。Ｔ1、Ｔ2、Ｔ3はそれぞれ標的分子であり、同一でも異なっていてもよく、より好ましくはＴ1、Ｔ2、Ｔ3は同じ標的分子である。
【００７０】
３）Ｘは（Ｌ）−（Ｄ）ｎ’で表される。Ｌは多価リンカーを表し、Ｄは活性剤を表し、ｎ’は１以上の整数を表す。多価リンカーＬは、互いに共有結合した複数のリンカーを含んでいてもよい。例えば、多価リンカーＬは、１つ以上のスペーサーリンカーＬｓ、及び／又は分離可能なリンカーＬｒを含有し、互いに連結することができる。分離可能なリンカーＬｒはＤに連結される。これら異なるリンカーを選択し、任意の順番で並べ、多価リンカーＬを構築することができる。例えば、多価リンカーＬは、以下の１つ以上の２価リンカーから構築されることができる。
【００７１】
【化２４】
2019519508.tif 000028
【００７２】
式中、ａ及びｂは整数、例えば０〜５の整数である。複数のＬｓを、直鎖、分岐、末端分岐等に連結することができる。Ｌｓは存在しなくてもよく、ＬｒによりＰＯＬＹとＤを直接的に連結してもよい。
【００７３】
多価リンカーによりＰＯＬＹとＤを様々な構造配置で連結することができ、下記例示的な一般式で示す構造を含むが、これらに限定されないと理解されるべきである。
【００７４】
【化２５】
2019519508.tif 000029
【００７５】
【化２６】
2019519508.tif 000030
【００７６】
【化２７】
2019519508.tif 000031
【００７７】
【化２８】
2019519508.tif 000032
【００７８】
【化２９】
2019519508.tif 000033
【００７９】
【化３０】
2019519508.tif 000034
【００８０】
【化３１】
2019519508.tif 000035
【００８１】
【化３２】
2019519508.tif 000036
【００８２】
【化３３】
2019519508.tif 000037
【００８３】
式中、Ｌｓ1、Ｌｓ2、Ｌｓ3、Ｌｓ4はそれぞれスペーサーリンカーであり、同一でも異なっていてもよい。Ｌｒ1、Ｌｒ2、Ｌｒ3、Ｌｒ4はそれぞれ分離可能なリンカーであり、同一でも異なっていてもよい。Ｄ1、Ｄ2、Ｄ3はそれぞれ活性剤であり、同一でも異なっていてもよく、より好ましくはＤ1、Ｄ2、Ｄ3は同じ活性剤である。
【００８４】
４）Ｘは多価リンカーＬ、標的分子Ｔ、活性剤Ｄからなる。この形態は本発明の最も好ましい形態である。
【００８５】
この形態では、Ｘは（Ｔ）ｎ’−（Ｌ）−（Ｄ）ｎ’で表される。Ｌは多価リンカーを表し、Ｄは活性剤を表し、ｎ’は１以上の整数を表す。多価リンカーＬは、互いに共有結合した複数のリンカーを含んでいてもよい。例えば、多価リンカーＬは、１つ以上のスペーサーリンカーＬｓ、難分解性リンカーＬｎ、分離可能なリンカーＬｒを含有し、互いに連結することができる。難分解性リンカーＬｎはＴに連結され、分離可能なリンカーＬｒはＤに連結される。これら異なるリンカーを選択し、任意の順番で並べることができる。複数のＬｓを、直鎖、分岐、末端分岐等に連結することができる。Ｌｓは存在しなくてもよく、ＰＯＬＹはＬｎ又はＬｒによりＴ及びＤと直接的に連結してもよい。
【００８６】
多価リンカーによりＰＯＬＹ、Ｔ及びＤを様々な構造配置で連結することができ、下記例示的な一般式を含むが、これらに限定されないと理解されるべきである。
【００８７】
【化３４】
2019519508.tif 000038
【００８８】
【化３５】
2019519508.tif 000039
【００８９】
【化３６】
2019519508.tif 000040
【００９０】
【化３７】
2019519508.tif 000041
【００９１】
【化３８】
2019519508.tif 000042
【００９２】
【化３９】
2019519508.tif 000043
【００９３】
【化４０】
2019519508.tif 000044
【００９４】
【化４１】
2019519508.tif 000045
【００９５】
【化４２】
2019519508.tif 000046
【００９６】
式中、Ｌｓ1、Ｌｓ2はそれぞれスペーサーリンカーであり、同一でも異なっていてもよい。Ｌｒ1、Ｌｒ2はそれぞれ分離可能なリンカーであり、同一でも異なっていてもよい。Ｄ1、Ｄ2はそれぞれ活性剤であり、同一でも異なっていてもよく、より好ましくはＤ1、Ｄ2は同じ活性剤である。Ｔ1、Ｔ2はそれぞれ標的分子であり、同一でも異なっていてもよく、より好ましくはＴ1、Ｔ2は同じ標的分子である。Ｘは、標的分子Ｔを１〜３０個含むことができ、より好ましくは標的分子Ｔを１〜５個含む。また、活性剤Ｄを１〜３０個含むことができ、より好ましくは活性剤Ｄを１〜５個含む。ＴとＤの個数比は１〜５：５〜１、例えば１：１、１：２、１：３、２：１、３：１等であってもよく、より好ましくはＴとＤの個数比は１：１である。
【００９７】
以上の多価リンカーによりＰＯＬＹ、Ｔ及びＤを連結する形態の中、最も好ましい形態は、
【００９８】
【化４３】
2019519508.tif 000047
【００９９】
である。
【０１００】
この形態では、ＴとＤの個数比は１：１である。
【０１０１】
つまり、本発明の最も好ましい薬物コンジュゲートは下記式で表される。
【０１０２】
【化４４】
2019519508.tif 000048
【０１０３】
以下、最も好ましい形態である式（ＩＩＩ）を例として、本発明の薬物コンジュゲートを詳しく説明する。
【０１０４】
式（ＩＩＩ）中、Ｌｓ、Ｌｎ、Ｌｒが互いに連結して多価リンカーＬを形成し、例えば多価３−チオ又は３−ジチオアリールアルコキシカルボニル、３−チオ又は３−ジチオアリールアルキルアミノカルボニル、多価３−チオ又は３−ジチオアルコキシカルボニル又は多価３−チオ又は３−ジチオアルキルアミノカルボニル等になる。ＬとＤは切断可能な結合を形成し、ＬとＴは加水分解に対して比較的安定な化学結合を形成する。
【０１０５】
以下は典型的な多価リンカーＬである。
【０１０６】
【化４５】
2019519508.tif 000049
【０１０７】
【化４６】
2019519508.tif 000050
【０１０８】
【化４７】
2019519508.tif 000051
【０１０９】
【化４８】
2019519508.tif 000052
【０１１０】
【化４９】
2019519508.tif 000053
【０１１１】
式中、記号「＊」は、多価リンカーＬと標的分子Ｔとの結合点を示し、「＃」は、多価リンカーＬと活性剤Ｄとの結合点を示し、「％」は、多価リンカーＬとＰＯＬＹとの結合点を示す。ｍ、ｍ’はそれぞれ１〜２０の任意の整数であり、ｌ、ｋはそれぞれ１〜１０の任意の整数である。
【０１１２】
なお、上記典型的な多価リンカーにおける「難分解性リンカー」の中、加水分解しにくいＳ−Ｃ結合は、標的分子Ｔと難分解性リンカー共有結合が反応してなるものであり、典型的な化合物では、原子Ｓは標的分子Ｔに由来する。
【０１１３】
以上の例示は、「難分解性リンカー」の典型的な例に過ぎず、本発明の化合物における難分解性リンカーの選択はこれらに限定されない。
【０１１４】
以上の例示は、「Ｌ」の典型的な例に過ぎず、本発明の化合物における「Ｌ」の選択はこれらに限定されない。一部の好ましい実施の形態では、「Ｌ」は、
【０１１５】
【化５０】
2019519508.tif 000054
【０１１６】
である。
【０１１７】
本発明でいうスペーサーリンカーＬｓとは、分離可能なリンカーＬｒと難分解性リンカーＬｎとを互いに連結するための一連の原子であり、且つＰＯＬＹとの連結に用いられる。
【０１１８】
１つの実施の形態では、多価リンカーＬは、少なくとも１つの、アミノ酸からなるペプチドスペーサーリンカーを含有する。前記アミノ酸は、独立して天然アミノ酸及び非天然α−アミノ酸から選択される。もう１つの実施の形態では、前記多価リンカーＬは、１〜４０個のアミノ酸を含んでなるペプチドスペーサーリンカーを含有する。前記アミノ酸は天然アミノ酸であることが好ましい。さらに、前記多価リンカーＬは、１〜２０個のアミノ酸を含んでなるペプチドスペーサーリンカーを含有し、さらに、前記Ｌは、好ましくは１０〜１５個のアミノ酸を含んでなるペプチドスペーサーリンカーを含有する。さらに、Ｌは、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、オルニチン、システイン、リジン、アスパラギン、アルギニン、スレオニン、グルタミン酸、セリン、シトルリン、バリン及びグルタミンからなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸を含有する。
【０１１９】
さらに、前記Ｌは、好ましくは１個又は複数個の、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、オルニチン、システイン、シトルリン、バリン及びリジン並びにそれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸からなる、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチド及びドデカペプチドのスペーサーリンカーを含有する。
【０１２０】
本明細書で記載する「分離可能なリンカー」は、切断可能なリンカーとも呼ばれており、少なくとも１つの生理学的条件下で切断可能な結合（例えば、ｐＨ不安定、酸不安定、酸化しやすい又は酵素不安定な結合）を含有するリンカーを指す。結合の切断をもたらすこのような生理学的条件は、例えば生理的ｐＨで発生する標準化学加水分解反応、又は細胞小器官、例えば細胞質ｐＨよりも低いｐＨを有するエンドソームに区画化されたことに起因し、生体内のタンパク加水分解酵素、エステラーゼ、コリンエステラーゼ、ホスホモノエステラーゼ、ヌクレアーゼ、スルファターゼ等による加水分解を含む。
【０１２１】
本明細書で記載する切断可能な結合は、単独で分離可能なリンカーに存在するものではなく、分離可能なリンカーと活性剤Ｄとが共有結合した後の結合部分であり、切断可能な結合は、分離可能なリンカーと活性剤Ｄとの隣接する原子を連結し、結合の切断後に、分離可能なリンカーは２個又は複数個の断片に切断され、切断可能な結合の切断後、活性剤Ｄが放出され、母体から分離し、生理活性を発揮すると理解されるべきである。
【０１２２】
本明細書で記載する活性剤Ｄは、分離可能なリンカーと共有結合して１個の切断可能な結合を形成することに適する活性剤を含む部分であると理解されるべきである。このため、切断可能な結合が切断した場合、活性剤Ｄは改良されておらず、つまり、共有結合に形成されていない形態で放出される。Ｄの選択、及びコンジュゲートで分離可能なリンカーと切断可能な結合を形成することについて、以下に詳述する。
【０１２３】
切断可能な結合は、生理的条件下で水と反応する（つまり、加水分解される）ことができる比較的に弱い１つの結合である。１つの結合が水中で加水分解する傾向は、２つの中心原子の連結種類のみに決められるのではなく、これらの中心原子に連結した置換基にも関係している。典型的な加水分解に不安定な連結基は、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエステル、イミン、オルトエステル、ペプチド、オリゴヌクレオチド等を含む。
【０１２４】
本明細書で記載する活性剤「Ｄ」は、非変性母体活性剤の一部又は薬物と、本発明の多価リンカーとが共有結合して生成する共有結合鎖（或いはその活性化又は化学変性の形態）の前の未変性母体活性剤の残基である。活性剤部分と多価リンカーとの間の連結基が加水分解又は酵素分解された時、活性剤自体は放出される。
【０１２５】
本発明の目的によれば、技術用語「残基」は、化合物の一部であり、もう１つの化合物と置換反応した後の残留物であると理解されるべきである。
【０１２６】
本明細書で記載する活性剤、活性剤「Ｄ」は、カンプトテシン系抗がん剤であり、カンプトテシン系薬物は、臨床で用いられるトポイソメラーゼＩ阻害剤であり、高活性でありながら、水溶性が悪く、正常な生体組織への毒性副作用が大きい等の欠点を有するため、カンプトテシン系抗がん剤の臨床応用が大いに制限されている。
【０１２７】
Ｄは下記式で示されるカンプトテシン系薬物である。
【０１２８】
【化５１】
2019519508.tif 000055
【０１２９】
式中、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アシル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アジド基、アミド基、ヒドラジン、アミン基、置換アミン基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基等からなる群より選択され、Ｒ6は、Ｈ又はＯＲ8であり、Ｒ8は、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、又はヒドロキシアルキル基であり、Ｒ7は、分離可能なリンカーの共有結合に連結する位置であり、好ましくはヒドロキシ基である。
【０１３０】
本明細書に適するカンプトテシン系抗がん剤に対する唯一な制限は、化学反応できる（つまり、多価リンカーと共有結合する）少なくとも１つの官能基を有すること、例えばアミノ基、ヒドロキシ基、又はメルカプタンが構造式（Ｉ）の化合物に連結し、且つ本明細書に記載の構造式（Ｉ）の化合物にカップリングする際に、生物学的活性の有意な損失を有しないことである。
【０１３１】
また、活性剤「Ｄ」はカンプトテシン系抗がん剤であり、好ましくはイリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカンである。
【０１３２】
そのうち、イリノテカンの構造は以下のとおりである。
【０１３３】
【化５２】
2019519508.tif 000056
【０１３４】
ＳＮ−３８の構造は以下のとおりである。
【０１３５】
【化５３】
2019519508.tif 000057
【０１３６】
１０−ヒドロキシカンプトテシンの構造は以下のとおりである。
【０１３７】
【化５４】
2019519508.tif 000058
【０１３８】
ルビテカンの構造は以下のとおりである。
【０１３９】
【化５５】
2019519508.tif 000059
【０１４０】
ヒドロキシ基は、分離可能なリンカーと切断可能なエステル結合を形成することができる。
【０１４１】
本明細書で記載する「難分解性リンカー」とは、少なくとも１つの生理学的条件下で、加水分解に対して比較的安定な化学結合、特に共有結合を有し、つまり、生理学的条件下で長期間に亘っても顕著な加水分解が一切発生しないものを指す。加水分解に安定的な連結基の実例は、炭素−炭素結合（例えば脂肪鎖中）、炭素−硫黄結合、ジスルフィド結合、エステル結合、アミド結合、ポリウレタン及びその類似物等を含むが、これらに限定されない。通常、加水分解に安定的な結合は、生理学的条件下での加水分解速度が約１〜２％未満である。
【０１４２】
本発明では、「Ｔ」は標的分子であり、医薬用途を有しても有しなくてもよい。該標的分子の作用は、該コンジュゲートの目標組織における濃度をさらに高め、生理活性又は医薬用途を向上させるように、標的指向性を向上させることである。「Ｔ」は単機能標的分子であってもよく、多機能標的分子であってもよい。また、「Ｔ」は、さらに２個以上の標的分子からなる標的部分であってもよい。一部の具体的な実施の形態において、「Ｔ」は、「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」配列を含むＲＧＤペプチドであってもよい。ＲＧＤペプチドは、インテグリンとその受容体タンパク質とが相互作用する認識部位である。好ましいＲＧＤペプチドとして、ｉＲＧＤ及びｃＲＧＤ等が挙げられる。
【０１４３】
ｉＲＧＤの構造は以下のとおりである。
【０１４４】
【化５６】
2019519508.tif 000060
【０１４５】
ｃＲＧＤは一連の化合物であり、典型的な化合物は下記を含む。
【０１４６】
【化５７】
2019519508.tif 000061
【０１４７】
ほかの好ましい標的分子として、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、ＧＥ１１、又は葉酸が挙げられる。
【０１４８】
ｔＬｙｐ−１の構造は以下のとおりである。
【０１４９】
【化５８】
2019519508.tif 000062
【０１５０】
Ｌｙｐ−１の構造は以下のとおりである。
【０１５１】
【化５９】
2019519508.tif 000063
【０１５２】
ＲＰＡＲＰＡＲのポリペプチド配列は、アルギニン−プロリン−アラニン−アルギニン−プロリン−アラニン−アルギニンである。なお、多価リンカーＬと連結する必要があるため、製造時に、システインを用いてＲＰＡＲＰＡＲをＬと連結する必要がある。したがって、具体的な化合物では、ＣＲＰＡＲＰＡＲとして現れる。
【０１５３】
Ａｎｇｉｏｐｅｐ２のポリペプチド配列は、ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹであり、その構造は以下のとおりである。
【０１５４】
【化６０】
2019519508.tif 000064
【０１５５】
ＧＥ１１のポリペプチド配列は、ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩであり、その構造は以下のとおりである。
【０１５６】
【化６１】
2019519508.tif 000065
【０１５７】
葉酸の構造は以下のとおりである。
【０１５８】
【化６２】
2019519508.tif 000066
【０１５９】
本発明の好ましい実施の形態では、「ＰＯＬＹ」は、線状ポリエチレングリコール結合アームであり、つまり、本発明のコンジュゲートは、下記いくつかの種類の化合物を含む。
【０１６０】
３アーム：
【０１６１】
【化６３】
2019519508.tif 000067
【０１６２】
【化６４】
2019519508.tif 000068
【０１６３】
４アーム：
【０１６４】
【化６５】
2019519508.tif 000069
【０１６５】
【化６６】
2019519508.tif 000070
【０１６６】
８アーム：
【０１６７】
【化６７】
2019519508.tif 000071
【０１６８】
【化６８】
2019519508.tif 000072
【０１６９】
なお、上記好ましい実施の形態において、線状ポリエチレングリコールは、
【０１７０】
【化６９】
2019519508.tif 000073
【０１７１】
である。
【０１７２】
しかし、本発明は該線状ポリエチレングリコールに制限されることがなく、その代わりに、例えば、下記式で示すほかの線状ポリエチレングリコール等を使用することもできる。
【０１７３】
【化７０】
2019519508.tif 000074
【０１７４】
本発明の好ましい実施の形態において、Ｒは、炭素数５の
【０１７５】
【化７１】
2019519508.tif 000075
【０１７６】
であり、つまり、本発明のコンジュゲートは下記のとおりである。
【０１７７】
【化７２】
2019519508.tif 000076
（ＩＶ）
【０１７８】
式（ＩＶ）において、ｎは５〜５００であり、好ましくは５〜５００であり、最も好ましくは１１３である。より好ましい実施の形態において、本発明のコンジュゲートの標的部分「Ｔ」は、ｉＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、ｃＲＧＤ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、ＧＥ１１、又は葉酸からなる群より選択される１種であり、活性剤「Ｄ」は、イリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカンからなる群より選択される１種である。
【０１７９】
本発明のコンジュゲートのいかなる形状も本発明に含まれており、これらの形状はその中の活性剤、標的分子及び様々な多価リンカーの結合形態により決められる。一側面において、本発明のコンジュゲートの全体的な３次元形状は線形である。別の一側面において、本明細書に記載のコンジュゲートは、３次元形状が「Ｘ」状又は十字状であることが好ましい。
【０１８０】
本発明のもう１つの好ましい実施の形態において、Ｒは、炭素数４の
【０１８１】
【化７３】
2019519508.tif 000077
【０１８２】
であり、つまり、本発明のコンジュゲートは下記のとおりである。
【０１８３】
【化７４】
2019519508.tif 000078
（Ｖ）
【０１８４】
式（Ｖ）において、ｎは５〜５００であり、好ましくは５〜５００であり、最も好ましくは１１３である。より好ましい実施の形態において、本発明のコンジュゲートの標的部分「Ｔ」は、ｉＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、ｃＲＧＤ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、ＧＥ１１、又は葉酸からなる群より選択される１種であり、活性剤「Ｄ」は、イリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカンからなる群より選択される１種である。
【０１８５】
本発明の第３の好ましい実施の形態において、本発明のコンジュゲートは下記のとおりである。
【０１８６】
【化７５】
2019519508.tif 000079
（ＶＩ）
【０１８７】
式（Ｖ）において、ｎは５〜５００であり、好ましくは５〜５００であり、最も好ましくは１１３である。この分野の技術者は、高分子分野では、ｎが前記ポリマーの重合度、つまり、ポリマーの高分子鎖に含まれる繰り返し単位数の平均値を表し、前記ポリマーの分子量により決められ、例えば、ｎが１１３であるとき、平均値が１１３を意味すると理解されるべきである。
【０１８８】
より好ましい実施の形態において、本発明のコンジュゲートの標的部分「Ｔ」は、ｉＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、ｃＲＧＤ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、ＧＥ１１、又は葉酸からなる群より選択される１種であり、活性剤「Ｄ」は、イリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカンからなる群より選択される１種である。
【０１８９】
式（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）に基づき、一部の実施の形態において、本発明の化合物は以下のとおりである。
【０１９０】
化合物１：Ｄはイリノテカンであり、ＴはｉＲＧＤである。
【０１９１】
【化７６】
2019519508.tif 000080
【０１９２】
化合物２：Ｄはイリノテカンであり、ＴはｔＬｙｐ−１である。
【０１９３】
【化７７】
2019519508.tif 000081
【０１９４】
化合物３：Ｄはイリノテカンであり、ＴはＬｙｐ−１である。
【０１９５】
【化７８】
2019519508.tif 000082
【０１９６】
化合物４：Ｄはイリノテカンであり、ＴはＲＰＡＲＰＡＲである。
【０１９７】
【化７９】
2019519508.tif 000083
【０１９８】
化合物５：Ｄはイリノテカンであり、ＴはｃＲＧＤである。
【０１９９】
【化８０】
2019519508.tif 000084
【０２００】
化合物６：ＤはＳＮ−３８であり、ＴはｉＲＧＤである。
【０２０１】
【化８１】
2019519508.tif 000085
【０２０２】
化合物７：ＤはＳＮ−３８であり、ＴはｔＬｙｐ−１である。
【０２０３】
【化８２】
2019519508.tif 000086
【０２０４】
化合物８：ＤはＳＮ−３８であり、ＴはＬｙｐ−１である。
【０２０５】
【化８３】
2019519508.tif 000087
【０２０６】
化合物９：ＤはＳＮ−３８であり、ＴはＲＰＡＲＰＡＲである。
【０２０７】
【化８４】
2019519508.tif 000088
【０２０８】
化合物１０：ＤはＳＮ−３８であり、ＴはｃＲＧＤである。
【０２０９】
【化８５】
2019519508.tif 000089
【０２１０】
化合物１１：Ｄは１０−ヒドロキシカンプトテシンであり、ＴはｉＲＧＤである。
【０２１１】
【化８６】
2019519508.tif 000090
【０２１２】
化合物１２：Ｄは１０−ヒドロキシカンプトテシンであり、ＴはｔＬｙｐ−１である。
【０２１３】
【化８７】
2019519508.tif 000091
【０２１４】
化合物１３：Ｄは１０−ヒドロキシカンプトテシンであり、ＴはＬｙｐ−１である。
【０２１５】
【化８８】
2019519508.tif 000092
【０２１６】
化合物１４：Ｄは１０−ヒドロキシカンプトテシンであり、ＴはＲＰＡＲＰＡＲである。
【０２１７】
【化８９】
2019519508.tif 000093
【０２１８】
化合物１５：Ｄは１０−ヒドロキシカンプトテシンであり、ＴはｃＲＧＤである。
【０２１９】
【化９０】
2019519508.tif 000094
【０２２０】
化合物１６：Ｄはルビテカンであり、ＴはｉＲＧＤである。
【０２２１】
【化９１】
2019519508.tif 000095
【０２２２】
化合物１７：Ｄはルビテカンであり、ＴはｔＬｙｐ−１である。
【０２２３】
【化９２】
2019519508.tif 000096
【０２２４】
化合物１８：Ｄはルビテカンであり、ＴはＬｙｐ−１である。
【０２２５】
【化９３】
2019519508.tif 000097
【０２２６】
化合物１９：Ｄはルビテカンであり、ＴはＲＰＡＲＰＡＲである。
【０２２７】
【化９４】
2019519508.tif 000098
【０２２８】
化合物２０：Ｄはルビテカンであり、ＴはｃＲＧＤである。
【０２２９】
【化９５】
2019519508.tif 000099
【０２３０】
化合物２１：
【０２３１】
【化９６】
2019519508.tif 000100
【０２３２】
化合物２２：
【０２３３】
【化９７】
2019519508.tif 000101
【０２３４】
化合物２３：
【０２３５】
【化９８】
2019519508.tif 000102
【０２３６】
式中、Ｒは、
【０２３７】
【化９９】
2019519508.tif 000103
【０２３８】
である。
【０２３９】
化合物２４：
【０２４０】
【化１００】
2019519508.tif 000104
【０２４１】
式中、Ｒは、
【０２４２】
【化１０１】
2019519508.tif 000105
【０２４３】
である。
【０２４４】
化合物２５：
【０２４５】
【化１０２】
2019519508.tif 000106
【０２４６】
式中、Ｒは、
【０２４７】
【化１０３】
2019519508.tif 000107
【０２４８】
である。
【０２４９】
化合物２６：
【０２５０】
【化１０４】
2019519508.tif 000108
【０２５１】
式中、Ｒは、
【０２５２】
【化１０５】
2019519508.tif 000109
【０２５３】
である。
【０２５４】
化合物２７：
【０２５５】
【化１０６】
2019519508.tif 000110
【０２５６】
式中、Ｒは、
【０２５７】
【化１０７】
2019519508.tif 000111
【０２５８】
である。
【０２５９】
化合物２８：
【０２６０】
【化１０８】
2019519508.tif 000112
【０２６１】
式中、Ｒは、
【０２６２】
【化１０９】
2019519508.tif 000113
【０２６３】
である。
【０２６４】
化合物２９：
【０２６５】
【化１１０】
2019519508.tif 000114
【０２６６】
式中、Ｒは、
【０２６７】
【化１１１】
2019519508.tif 000115
【０２６８】
である。
【０２６９】
化合物３０：
【０２７０】
【化１１２】
2019519508.tif 000116
【０２７１】
式中、Ｒは、
【０２７２】
【化１１３】
2019519508.tif 000117
【０２７３】
である。
【０２７４】
化合物３１：
【０２７５】
【化１１４】
2019519508.tif 000118
【０２７６】
式中、Ｒは、
【０２７７】
【化１１５】
2019519508.tif 000119
【０２７８】
である。
【０２７９】
化合物３２：
【０２８０】
【化１１６】
2019519508.tif 000120
【０２８１】
式中、Ｒは、
【０２８２】
【化１１７】
2019519508.tif 000121
【０２８３】
である。
【０２８４】
化合物３３：
【０２８５】
【化１１８】
2019519508.tif 000122
【０２８６】
式中、Ｒは、
【０２８７】
【化１１９】
2019519508.tif 000123
【０２８８】
である。
【０２８９】
化合物３４：
【０２９０】
【化１２０】
2019519508.tif 000124
【０２９１】
式中、Ｒは、
【０２９２】
【化１２１】
2019519508.tif 000125
【０２９３】
である。
【０２９４】
化合物３５：
【０２９５】
【化１２２】
2019519508.tif 000126
【０２９６】
式中、Ｒは、
【０２９７】
【化１２３】
2019519508.tif 000127
【０２９８】
である。
【０２９９】
化合物３６：
【０３００】
【化１２４】
2019519508.tif 000128
【０３０１】
式中、Ｒは、
【０３０２】
【化１２５】
2019519508.tif 000129
【０３０３】
である。
【０３０４】
化合物３７：
【０３０５】
【化１２６】
2019519508.tif 000130
【０３０６】
式中、Ｒは、
【０３０７】
【化１２７】
2019519508.tif 000131
【０３０８】
である。
【０３０９】
化合物３８：
【０３１０】
【化１２８】
2019519508.tif 000132
【０３１１】
式中、Ｒは、
【０３１２】
【化１２９】
2019519508.tif 000133
【０３１３】
である。
【０３１４】
化合物３９：
【０３１５】
【化１３０】
2019519508.tif 000134
【０３１６】
式中、Ｒは、
【０３１７】
【化１３１】
2019519508.tif 000135
【０３１８】
である。
【０３１９】
化合物４０：
【０３２０】
【化１３２】
2019519508.tif 000136
【０３２１】
式中、Ｒは、
【０３２２】
【化１３３】
2019519508.tif 000137
【０３２３】
である。
【０３２４】
化合物４１：
【０３２５】
【化１３４】
2019519508.tif 000138
【０３２６】
式中、Ｒは、
【０３２７】
【化１３５】
2019519508.tif 000139
【０３２８】
である。
【０３２９】
化合物４２：
【０３３０】
【化１３６】
2019519508.tif 000140
【０３３１】
式中、Ｒは、
【０３３２】
【化１３７】
2019519508.tif 000141
【０３３３】
である。
【０３３４】
化合物１を例として、本発明についてさらに説明する。
【０３３５】
化合物１では、Ｒは、炭素数５の
【０３３６】
【化１３８】
2019519508.tif 000142
【０３３７】
であり、ＰＯＬＹは、
【０３３８】
【化１３９】
2019519508.tif 000143
【０３３９】
であり、ＰＯＬＹとＲとが一緒になって下記活性剤の担体を構成している。
【０３４０】
【化１４０】
2019519508.tif 000144
【０３４１】
多価リンカーＬがＴ、Ｄと連結した後、以下のようになる。
【０３４２】
【化１４１】
2019519508.tif 000145
【０３４３】
「
2019519508.tif 000146
」におけるエステル結合は、本発明の上記分離可能なリンカーと活性剤Ｄとが共有結合して形成した切断可能な結合である。本発明のコンジュゲートが標的細胞に到達した後、切断可能な結合が生理学的条件下で加水分解又は酵素分解され、その後、コンジュゲートから活性剤イリノテカンが放出され、イリノテカンが標的細胞中で抗がん作用を発揮する。
【０３４４】
「
2019519508.tif 000147
」における炭素硫黄結合は、本発明の上記難分解性リンカーと標的分子Ｔとが形成し、生理学的条件下で加水分解に対して比較的安定な化学結合であり、そのうち、原子ＳはｉＲＧＤに由来するものである。標的分子の標的指向性により、本発明のコンジュゲートは特定の標的細胞に到達できながら、標的分子と母体とが分離し難い。
【０３４５】
「
2019519508.tif 000148
」はＰＯＬＹとの連結を意味する。
【０３４６】
別の一側面において、本発明は前記コンジュゲートの製造方法を提供する。このような方法では、ヒドロキシ基含有活性剤Ｄはまず、アミノ酸又はアミノ酸から形成されたペプチドと反応し、分離可能なリンカーを形成する。活性剤Ｄのヒドロキシ基とアミノ酸のカルボキシル基は、切断可能な結合−エステル結合を形成する。難分解性リンカーは、スペーサーリンカーと一緒になって多価リンカーの残りの部分を形成する。該残りの部分は、反応可能なカルボキシル基を含有し、分離可能なリンカーのアミノ基と反応し、Ｄ−Ｌ部分を形成する。
【０３４７】
ＰＯＬＹ及び有機中心Ｒから構成される活性剤担体の製造：ＰＯＬＹ及び有機中心Ｒは実質上、マルチアームポリマー、つまり
【０３４８】
【化１４２】
2019519508.tif 000149
【０３４９】
を形成している。本発明の好ましい実施例では、該マルチアームポリマーはマルチアームポリエチレングリコールであり、市販の原材料から得ることができ、例えば北京鍵凱科技有限会社から様々な種類の４アーム、８アームポリエチレングリコール誘導体を購入することができる。市販のこれらマルチアームＰＥＧは、上記Ｄ−Ｌ部分と直接的に反応することができる。
【０３５０】
例えば、式（ＩＶ）のコンジュゲートを製造する際に、使用可能な４アームポリエチレングリコールは下記のとおりである。
【０３５１】
【化１４３】
2019519508.tif 000150
【０３５２】
この好ましい４アームポリエチレングリコールは、４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭと呼ばれており、その分子量が約２０ｋＤａである。
【０３５３】
式（Ｖ）のコンジュゲートを製造する際に、使用可能な３アームポリエチレングリコールは下記のとおりである。
【０３５４】
【化１４４】
2019519508.tif 000151
【０３５５】
この好ましい３アームポリエチレングリコールは、３ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭと呼ばれている。
【０３５６】
式（ＶＩ）のコンジュゲートを製造する際に、使用可能な８アームポリエチレングリコールは下記のとおりである。
【０３５７】
【化１４５】
2019519508.tif 000152
【０３５８】
この好ましい８アームポリエチレングリコールは、８ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭと呼ばれており、ｎは１１３である。
例えば、多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の製造方法は、下記ステップを含む。
【０３５９】
【化１４６】
2019519508.tif 000153
【０３６０】
式中、Ｒは有機中心であり、ＰＯＬＹはポリマーであり、Ｌは多価リンカーであり、Ｔは標的分子であり、Ｄは活性剤であり、ｑは３〜８の任意の整数であり、Ｄは下記式で示されるカンプトテシン系薬物である。
【０３６１】
【化１４７】
2019519508.tif 000154
【０３６２】
式中、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アシル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アジド基、アミド基、ヒドラジン、アミン基、置換アミン基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基から選択され、Ｒ6は、Ｈ又はＯＲ8であり、Ｒ8は、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基又はヒドロキシアルキルであり、Ｒ7は、ヒドロキシ基である。
【０３６３】
（１）活性剤Ｄと多価リンカーＬとを連結し、Ｄ−Ｌ部分を得る。
【０３６４】
（２）Ｄ−Ｌ部分とマルチアームポリマーである
【０３６５】
【化１４８】
2019519508.tif 000155
【０３６６】
とを連結し、
【０３６７】
【化１４９】
2019519508.tif 000156
【０３６８】
を得る。
【０３６９】
（３）上記で得られた
【０３７０】
【化１５０】
2019519508.tif 000157
【０３７１】
と標的分子Ｔとを連結する。
【０３７２】
上記の製造方法によれば、好ましくは、Ｄはイリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、又はルビテカンである。
【０３７３】
マルチアームポリマーである
【０３７４】
【化１５１】
2019519508.tif 000158
【０３７５】
は、３ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ、４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ、又は８ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭであり、
【０３７６】
Ｌは、
【０３７７】
【化１５２】
2019519508.tif 000159
【０３７８】
であり（記号「＊」は、多価リンカーＬと標的分子Ｔとの結合点を示し、「＃」は、多価リンカーＬと活性剤Ｄとの結合点を示し、「％」は、多価リンカーＬとＰＯＬＹとの結合点を示す。）、
【０３７９】
Ｔは、ｉＲＧＤ、ｃＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、ＧＥ１１、又は葉酸である。
【０３８０】
必要に応じて、本発明のマルチアームポリエチレングリコールの製造は、合成により行うこともできる。例えば、任意の一定の数の適切なポリオールコア材料はすべて化学品サプライヤーから購入することができる。ポリオール上の末端ヒドロキシ基はまず、それらのアニオン型に変換される。例えば、強塩基で重合反応を励起することに適する塩基を提供し、次いで、単一分子（例えば、エチレンオキシド）が中心上で直接的に重合する。鎖の形成は、各分岐がすべて所定の長さになるまで継続し、その後、例えば焼入れの方法により反応を終了させる。
【０３８１】
あるいは、本発明のマルチアームポリエチレングリコールは、下記の方法により合成して製造されることもできる。まず、１つの必要なポリオールコア材料を用意し、次に、ポリオールを適切な条件下で適切な長さを有するヘテロ二官能性ＰＥＧとメシル化反応させる。そのうち、非メシル化ＰＥＧは、ポリオールと反応させないように、選択的に保護される。
【０３８２】
本発明で提供する、活性剤担体として好適なマルチアームポリエチレングリコールは特に、１つの末端官能基、例えば、Ｎ−スクシンイミドカーボネート（ＵＳ５２８１６９８、ＵＳ５４６８４７８を参照）、スクシンイミドプロピオネート及びスクシンイミドブチレート（ＵＳ５６７２６６２を参照）、コハク酸スクシンイミド、スクシンイミドエステル（ＵＳ５６５０２３４を参照）等を含有する。
【０３８３】
上記のとおり、本発明のコンジュゲート担体（Ｒ及びＰＯＬＹからなる）は、少なくとも１個の標的分子及び１個の活性剤と連結する。より典型的及び好ましい化合物では、高担持能力を確保するために、本発明のコンジュゲート担体は少なくとも、３個の標的分子及び３個の活性剤と連結し、好ましくは少なくとも４個の標的分子及び４個の活性剤と連結する。
【０３８４】
本発明のコンジュゲートは典型的な薬物前駆体であり、加水分解作用又は酵素分解作用により、活性剤Ｄが放出され、母体から分離し、生理活性を発揮する。
【０３８５】
本発明のコンジュゲートは高担持能力を示すため、総投与量を低減して、例えばがん等の特殊な疾患を治療することができる。つまり、本発明のコンジュゲート活性剤担体は、複数種の活性剤分子と共有結合により連結することができ、一定量のコンジュゲートあたりに、より多くの量の治療剤形（つまり、活性剤部分）を投与することが許容される。本発明のコンジュゲートは、水溶性ポリマーの修飾により、実質的に親水性となり、特に活性剤が水難溶性薬物である場合、コンジュゲートのバイオアベイラビリティを向上できる。
【０３８６】
カップリングされていない薬物に比べ、本発明のコンジュゲートはより強い作用を示し、ヒト又はほかの動物の体内組織に豊富に存在する。
【０３８７】
本発明におけるコンジュゲート薬物前駆体は、特に活性剤が１つの抗がん化合物である場合、様々な独特な性質を有する。このような薬物前駆体は、腫瘍の増殖をより高効率で抑制することができる。使用するこのような小分子は、抗がん特性を有すると知られている小分子である。しかし、上記のとおり多分岐ポリマーとの結合により、その治療効果及び薬物代謝動態学は該小分子（例えば抗がん化合物自体）に比べ、大いに改良された。対象とされうる固形腫瘍の種類としては、結腸癌、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、グリオーマ及乳房、卵巣、結腸、腎臓、胆管、肺及び脳の悪性肉腫、がん及びリンパ腫が挙げられる。
【０３８８】
上記のように、本発明は、１つのマルチアームポリマーで修飾された標的抗がんコンジュゲートに関するものであり、そのうち、水溶性ポリマーによる修飾は、該コンジュゲートの水溶性を高めることで薬物担持量を高めることができ、標的分子は標的指向性を高め、該コンジュゲートの目標組織における濃度をさらに高め、Ｌは、任意の連結リンカーであり、その作用が標的分子と抗がん薬物とを連結してから、さらに標的分子、抗がん薬物及びポリマーアームを連結し、コンジュゲートを１つのものとする。
【０３８９】
本発明の化合物１〜４２の薬学的に許容される塩は、好ましくは塩酸塩であり、薬化学分野の一般の手段により塩を形成することができ、また、トリフルオロ酢酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩等であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【０３９０】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、本発明は様々な異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載された実施例に限定されるべきではない。これらの実施例を記載する目的は、開示内容をより完全且つ全面的にするためである。使用した試薬及び原料について、製造方法を開示したもの以外はすべて市販から入手したものである。
【０３９１】
特に断りのない限り、本明細書におけるすべての技術用語は、請求の範囲に係る主題が属する分野の技術者に通常理解されている意味とは同じである。
【０３９２】
特に断りのない限り、本明細書における用語は、下記意味である。
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ：
【化１５３】
2019519508.tif 000160
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＢＭＥ：ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル
ＥＡ：酢酸エチル
ＤＭＥ：エチレングリコールジメチルエーテル
ＨＯＳＵ：Ｎ−スクシンイミドカーボネート
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ：
【化１５４】
2019519508.tif 000161
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＥＰＣ：シアノホスホン酸ジエチル
Ｐｂｆ：
【化１５５】
2019519508.tif 000162
ＨＯＢＴ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＭＴＢＥ：ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル
ＥＤＴ：１，２−エタンジチオール
ＰＢＳ：リン酸緩衝液
ＥＤＣ・ＨＣｌ：１−エチル（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
【０３９３】
実施例１  化合物１の作製
ｉＲＧＤの作製
【化１５６】
2019519508.tif 000163
【０３９４】
１０．０ｇのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ  ＭＢＨＡ  Ａｍｉｄｅ  Ｒｅｓｉｎを用意し、Ｆｍｏｃを除去した。カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨといった保護されたアミノ酸を順に樹脂に連結し、ＤＭＦ洗浄後、トリフルオロ酢酸タリウム（２．０ｅｑ）を加えて１８時間撹拌し、その後、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを縮合させ、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを除去し、無水酢酸ピリジンを加えて２０ｍｉｎ反応させ、ＤＭＦで洗浄し、ＤＣＭで洗浄し、メタノール洗浄後に乾燥させ、開裂剤として８２．５％ＴＦＡ／５％フェノール／５％水／２．５％ＥＤＴ／５％チオアニソールを加え、氷冷したＭＴＢＥが沈殿し、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣによる精製、凍結乾燥を経て、白色のフロックのｉＲＧＤを１．５６ｇ得た。
【０３９５】
Ｌ部分の作製
【化１５７】
2019519508.tif 000164
【０３９６】
１．ＢＰ１０３ａ０１の作製
窒素雰囲気下で、１０００ｍＬの三ツ口フラスコに、２００ｍＬのピリジン、１２０ｇの１（１．０ｅｑ）を加え、撹拌して０℃まで降温させ、１５１．８ｇのＴｓＣｌ（１．０ｅｑ）を数回に分けて添加し、１ｈ撹拌し、次いで室温まで徐々に昇温し、３〜４ｈ撹拌し続けた。反応終了後に、反応液を氷冷した希塩酸溶液に投入し、ＥＡを加えて抽出し、ＥＡ層を希塩酸で１回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付してＢＰ１０３ａ０１精製物を５５ｇ得た。
【０３９７】
２．ＢＰ１０３ａ０２の作製
１０００ｍＬの三ツ口フラスコに、５５ｇのＢＰ１０３ａ０１（１．０ｅｑ）及び１６０ｍＬのＤＭＳＯを加え、均一に撹拌し、次いで、ＮａＮ3２３．５２ｇ（２．０ｅｑ）を加え、５０℃に加熱して３時間反応させ、室温まで降温させ、反応液を水に投入し、ＥＡで抽出し、有機層を合併し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色の液体であるＢＰ１０３ａ０２を２９．２ｇ得た。
【０３９８】
３．ＢＰ１０３ａ０３の作製
１Ｌの水素化反応器に、２９ｇの化合物３、３６０ｍＬのメタノール、５．０ｇのパラジウム炭素を加え、撹拌し、窒素置換し、水素ガスを導入して３〜４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、反応液をろ過し、ろ液を濃縮してＢＰ１０３ａ０３の油状物を２３．５ｇ得た。
【０３９９】
４．ＢＰ１０３ａ０４の作製
１Ｌの三ツ口フラスコに、２３．５ｇの化合物ＢＰ１０３ａ０３（１．０ｅｑ）、６８．６ｇの（Ｂｏｃ）２Ｏ（２．０ｅｑ）、５００ｍｌのメタノール：トリエチルアミン（９：１）の混合溶液を加え、撹拌して還流するまでに昇温し、１ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、メタノールトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解し、ジクロロメタンで３回抽出し、有機層を合併し、１回水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、乾燥させ、固体のＢＰ１０３ａ０４を３４．８ｇ得た。
【０４００】
５．ＢＰ１０３ａ０５の作製
１０００ｍＬの三ツ口フラスコに、３４．８ｇの化合物ＢＰ１０３ａ０４（１．０ｅｑ）、それぞれ１５０ｍｌのトルエン及びＴＨＦ、５８．２ｇのブロモ酢酸（３ｅｑ）を加え、撹拌し、４５〜５０℃に加熱し、さらに３３．５ｇの水酸化ナトリウム（６ｅｑ）を加え、一晩反応し、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、反応液を留去し、水及びＥＡを加えて抽出し、水相をｐＨ３に調整し、ジクロロメタンで水相を抽出し、ジクロロメタン層を合併し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮して油状物化合物であるＢＰ１０３ａ０５を１８ｇ得た。
【０４０１】
６．ＢＰ１０３ａの作製
２５０ｍＬの三ツ口フラスコに、１８ｇの化合物ＢＰ１０３ａ０５、１００ｍｌのＥＡを加え、撹拌して溶解した後に、０℃まで降温させ、１５０ｍｌのＥＡ／ＨＣｌ（３．５Ｍ）を加え、０℃で保温し、ＴＬＣでモニタリングし、反応が終了し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して白色の固体のＢＰ１０３ａを１０．４ｇ得た。
【０４０２】
【化１５８】
2019519508.tif 000165
【０４０３】
２の作製
１００ｍＬのフラスコに、３．０ｇのＢＰ１０３ａ（１．０ｅｑ）、４．０ｇの化合物１（１．０ｅｑ）、４０ｍｌのＤＣＭ、４．０ｍｌのＤＩＥＡ（２．０ｅｑ）を加え、室温で撹拌し、ＴＬＣでモニタリングし、反応が終了後、有機溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィーに付して６．４ｇの類似油状物２を５．２ｇ得た。
【０４０４】
３の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、９．００ｇの化合物２（１．０ｅｑ）、３．９６ｇのＨＯＳＵ（１．５３ｅｑ）、９０ｍｌのＤＣＭ、６．６０ｇのＥＤＣ．ＨＣｌ（１．５３ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、ｐＨ＝６．０の５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素カリウム水溶液で２回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して５．９ｇの無色の油状物である化合物３を得た。
【０４０５】
４の作製
２００ｍＬのフラスコに、２．９３ｇの化合物Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１．０ｅｑ）、６０ｍｌの水、２．００ｇのＮａＨＣＯ3（２．０ｅｑ）を加え、撹拌し、５．９ｇの化合物３（１．０ｅｑ）を滴下して６０ｍｌのＤＭＥ（エチレングリコールジメチルエーテル）の溶液に溶解し、６０ｍｌのＴＨＦを追加し、撹拌して一晩置いた。ＴＬＣでモニタリングし、反応が終了後、有機溶媒を留去し、酢酸でＰＨ＝４に調整し、ＥＡで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、４．５０ｇの無色の油状物化合物４を得た。
【０４０６】
５の作製
１００ｍＬのフラスコに、３．８１ｇの化合物４（１．０ｅｑ）、４０ｍｌのＤＣＭ、１．０７ｇのＨＯＳＵ、１．７８ｇのＥＤＣ．ＨＣｌを加え、撹拌し、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応が終了後、ＤＣＭで希釈し、その後、５０ｍＭのリン酸二水素カリウム水溶液で２回洗浄し、純水で１回洗浄し、飽和食塩水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、４．１ｇの無色の油状物化合物５を得た。
【０４０７】
コンジュゲートの作製
【化１５９】
2019519508.tif 000166
【０４０８】
７の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、３．５０ｇの化合物６（１．０ｅｑ）、５２．５ｍｌのＤＭＦを加え、６０℃に加熱して溶解し、５〜１０ｍｉｎ後にＤＭＦを減圧留去し、３００ｍｌのｎ−ヘプタンを加えて減圧蒸留し、３回繰り返し、遠心脱水後、１０５ｍｌのＤＣＭ、１．０８ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、６３ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、１．５９ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮して１２０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１５０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥して４．０２ｇの淡黄色の固体である化合物７を得た。
【０４０９】
８の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．０２ｇの化合物７、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体８を４．００ｇ得た。
【０４１０】
９の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、２．９５ｇの化合物８、８０ｍｌのＤＣＭ、２．５７ｇ（１．０５ｅｑ）の化合物４、２．１６ｍｌのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、０．９６ｍｌのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体９を１．４８ｇ得た。
【０４１１】
【化１６０】
2019519508.tif 000167
【０４１２】
１０の作製
５０ｍＬの丸底フラスコに、２６０ｍｇの化合物９、１０ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体１０を２１０ｍｇ得た。
【０４１３】
１１の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５１ｍｇの化合物１０（４．０ｅｑ）、２ｍｌのＤＣＭ、１１ｕｌのＴＥＡ（８．０ｅｑ）、２０１ｍｇの４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体１１を２４０ｍｇ得た。
【０４１４】
【化１６１】
2019519508.tif 000168
【０４１５】
１２の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５０ｍｇの化合物１１（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１０．６ｍｇのｉＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体１２を５０ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４１６】
実施例２  化合物２の作製
【化１６２】
2019519508.tif 000169
【０４１７】
１０．０ｇの２Ｃｌ−Ｔｒｔ  Ｒｅｓｉｎを用意し、カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨといった保護されたアミノ酸を順に樹脂に連結し、開裂剤として８２．５％ＴＦＡ／５％フェノール／５％水／２．５％ＥＤＴ／５％チオアニソールを加え、氷冷したＭＴＢＥが沈殿し、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣによる精製、凍結乾燥を経て、白色のフロックを５．５ｇ得た。
【０４１８】
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４１９】
コンジュゲートの作製
【化１６３】
2019519508.tif 000170
【０４２０】
１４の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物１１（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１３９ｍｇのｔＬｙＰ−１を加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体１４を１．０ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０３（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３２（ｓ，２Ｈ）、５．４８４（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４２１】
実施例３  化合物３の作製
Ｌｙｐ−１の作製
【化１６４】
2019519508.tif 000171
【０４２２】
１０．０ｇのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ  ＭＢＨＡ  Ａｍｉｄｅ  Ｒｅｓｉｎを用意し、Ｆｍｏｃを除去した。カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨといった保護されたアミノ酸を順に樹脂に連結し、ＤＭＦ洗浄後に、トリフルオロ酢酸タリウム（２．０ｅｑ）を加えて１８時間撹拌した後にＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを縮合させ、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを除去した後に乾燥させ、開裂剤として８２．５％ＴＦＡ／５％フェノール／５％水／２．５％ＥＤＴ／５％チオアニソールを加え、氷冷したＭＴＢＥが沈殿し、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣによる精製、凍結乾燥を経て、白色のフロックであるＬｙＰ−１を７６５ｍｇ得た。
【０４２３】
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４２４】
コンジュゲートの作製
【化１６５】
2019519508.tif 000172
【０４２５】
１３の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物１１（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８２ｍｇのＬｙＰ−１を加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体１３を１．０５ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８１（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４２６】
実施例４  化合物４の作製
ＣＰＡＲＰＡＲの作製
【０４２７】
１０．０ｇの２Ｃｌ−ＴｒｔＲｅｓｉｎを用意し、カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨといった保護されたアミノ酸を順に樹脂に連結し、開裂剤として８２．５％ＴＦＡ／５％フェノール／５％水／２．５％ＥＤＴ／５％チオアニソールを加え、氷冷したＭＴＢＥが沈殿し、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣによる精製、凍結乾燥を経て、白色のフロックであるＣＲＰＡＲＰＡＲを６．１ｇ得た。
【０４２８】
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４２９】
コンジュゲートの作製
【化１６６】
2019519508.tif 000173
【０４３０】
１５の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物１１（１．０ｅｑ）、２０ｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１５４ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体１５を１．０９ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０５（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３５（ｓ，２Ｈ）、５．４８６（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４３１】
実施例５  化合物５の作製
ｃＲＧＤの作製
【化１６７】
2019519508.tif 000174
本発明で使用したｃＲＧＤは、外部から購入したものである。
【０４３２】
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４３３】
【化１６８】
2019519508.tif 000175
【０４３４】
１６の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物１１（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に９６．４ｇのｃＲＧＤを加えて４ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと６ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体１６を１．０６ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２６（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４３５】
実施例６  化合物６の作製
ｉＲＧＤの作製は実施例１と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４３６】
コンジュゲートの作製
【化１６９】
2019519508.tif 000176
【０４３７】
２１の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．００ｇの化合物２０（１．０ｅｑ）、１００ｍｌのＤＣＭ、３．８９ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、３．５０ｇのＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（１．０ｅｑ）を滴下して２０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、３．６２ｇの淡黄色の固体である化合物２１を得た。
【０４３８】
２２の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、４．８０ｇの化合物２１（１．０ｅｑ）、１４５ｍｌのＤＣＭ、１．６４ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、９５ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、２．４１ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮した時点で１３０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１６０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥して４．６５ｇの淡黄色の固体である化合物２２を得た。
【０４３９】
２３の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．６５ｇの化合物２２、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体２３を２．４８ｇ得た。
【０４４０】
２４の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、２．３ｇの化合物２３、４５ｍｌのＤＣＭ、３．１９６ｇ（１．０５ｅｑ）化合物５、１．７５ｍｌのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体２４を２．２０ｇ得た。
【０４４１】
２５の作製
２００ｍＬの丸底フラスコに、２．０ｇの化合物２４、６０ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体２５を１．７５ｇ得た。
【０４４２】
２６の作製
５００ｍＬの丸底フラスコに、１．５１ｇの化合物２５（４．０ｅｑ）、１４０ｍｌのＤＣＭ、３９０ｕｌのＴＥＡ（８．０ｅｑ）、７．０ｇの４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体２６を７．９ｇ得た。
【０４４３】
【化１７０】
2019519508.tif 000177
【０４４４】
２６１の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物２６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８８ｍｇのｉＲＧＤを加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２６１を９８０ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０５（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３３（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４４５】
実施例７  化合物７の作製
ｔＬｙｐ−１の作製は実施例２と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４４６】
コンジュゲートの作製
【化１７１】
2019519508.tif 000178
【０４４７】
２６３の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物２６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１４４ｍｇのｔＬｙＰ−１を加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２６３を１．０１ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０４（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３５（ｓ，２Ｈ）、５．４８８（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４４８】
実施例８  化合物８の作製
Ｌｙｐ−１の作製は実施例３と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４４９】
コンジュゲートの作製
【化１７２】
2019519508.tif 000179
【０４５０】
２６２の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物２６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８８ｍｇのＬｙＰ−１を加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２６２を１．０４ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８１（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４５１】
実施例９  化合物９の作製
ＣＲＰＡＲＰＡＲの作製は実施例４と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４５２】
コンジュゲートの作製
【化１７３】
2019519508.tif 000180
【０４５３】
２６４の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物２６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１５９ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２６４を１．０４ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１０（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４５４】
実施例１０  化合物１０の作製
ｃＲＧＤの作製は実施例５と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４５５】
コンジュゲートの作製
【化１７４】
2019519508.tif 000181
【０４５６】
２６５の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物２６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に９９．５ｍｇのｃＲＧＤを加えて４ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと６ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２６５を１．０３ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１５（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３７（ｓ，２Ｈ）、５．４８４（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４５７】
実施例１１  化合物１１の作製
ｉＲＧＤの作製は実施例１と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４５８】
コンジュゲートの作製
【化１７５】
2019519508.tif 000182
【０４５９】
３１の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、６．００ｇの化合物３０（１．０ｅｑ）、１２０ｍｌのＤＣＭ、５．００ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、４．５３ｇのＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（１．０ｅｑ）を滴下して２０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、４．３２ｇの淡黄色の固体である化合物３１を得た。
【０４６０】
３２の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．０ｇの化合物３１（１．０ｅｑ）、１５０ｍｌのＤＣＭ、１．７３ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、１０１ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、２．５５ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮した時点で１３０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１６０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥して４．５２ｇの淡黄色の固体である化合物３２を得た。
【０４６１】
３３の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．４０ｇの化合物２２、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体２３を２．３２ｇ得た。
【０４６２】
【化１７６】
2019519508.tif 000183
【０４６３】
３４の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、２．３ｇの化合物３３、４５ｍｌのＤＣＭ、２．７７ｇの（１．０５ｅｑ）化合物５、１．１ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体３４を２．０２ｇ得た。
【０４６４】
３５の作製
２００ｍＬの丸底フラスコに、２．０ｇの化合物３４、６０ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体３５を１．６９ｇ得た。
【０４６５】
３６の作製
５００ｍＬの丸底フラスコに、１．５０ｇの化合物２５（４．０ｅｑ）、１４０ｍｌのＤＣＭ、３９０ｕｌのＴＥＡ（８．０ｅｑ）、７．０ｇの４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体３６を７．６４ｇ得た。
【０４６６】
【化１７７】
2019519508.tif 000184
【０４６７】
３６１の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物３６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８９ｍｇのｉＲＧＤを加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３６１を１．０８ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０９（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３３（ｓ，２Ｈ）、５．４８１（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４６８】
実施例１２  化合物１２の作製
ｔＬｙｐ−１の作製は実施例２と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４６９】
コンジュゲートの作製
【化１７８】
2019519508.tif 000185
【０４７０】
３６３の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物３６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１４４ｍｇのｔＬｙＰ−１を加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３６３を０．９９ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１５（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３４０（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４７１】
実施例１３  化合物１３の作製
Ｌｙｐ−１の作製は実施例３と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４７２】
コンジュゲートの作製
【化１７９】
2019519508.tif 000186
【０４７３】
３６２の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物３６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８９ｍｇのＬｙＰ−１を加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３６２を１．０６ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０８（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３５（ｓ，２Ｈ）、５．４８４（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４７４】
実施例１４  化合物１４の作製
ＣＲＰＡＲＰＡＲの作製は実施例４と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４７５】
コンジュゲートの作製
【化１８０】
2019519508.tif 000187
【０４７６】
３６４の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物３６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１６０ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３６４を１．０１ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１０（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３６（ｓ，２Ｈ）、５．４８５（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４７７】
実施例１５  化合物１５の作製
ｃＲＧＤの作製は実施例５と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４７８】
コンジュゲートの作製
【化１８１】
2019519508.tif 000188
【０４７９】
３６５の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物３６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１００ｍｇのｃＲＧＤを加えて４ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと６ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３６５を１．０５ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１４（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３４０（ｓ，２Ｈ）、５．４８９（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４８０】
実施例１６  化合物１６の作製
ｉＲＧＤの作製は実施例１と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４８１】
コンジュゲートの作製
【化１８２】
2019519508.tif 000189
【０４８２】
４１の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．０ｇの化合物４０（１．０ｅｑ）、１５０ｍｌのＤＣＭ、２．６７ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、１５５ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、３．９３ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１５ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮した時点で１３０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１６０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥して６．８５ｇの淡黄色の固体である化合物４１を得た。
【０４８３】
４２の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．００ｇの化合物４１、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体４２を３．５４ｇ得た。
【０４８４】
【化１８３】
2019519508.tif 000190
【０４８５】
４３の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、３．００ｇの化合物４２、４５ｍｌのＤＣＭ、３．４６ｇ（１．０５ｅｑ）化合物５、１．３８ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体４３を２．６８ｇ得た。
【０４８６】
４４の作製
２００ｍＬの丸底フラスコに、２．０ｇの化合物４３、６０ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体４４を１．６１ｇ得た。
【０４８７】
４５の作製
５００ｍＬの丸底フラスコに、１．５０ｇの化合物４４（４．０ｅｑ）、１４０ｍｌのＤＣＭ、３９１ｕｌのＴＥＡ（８．０ｅｑ）、７．０ｇの４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体４５を７．６１ｇ得た。
【０４８８】
【化１８４】
2019519508.tif 000191
【０４８９】
４５１の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物４５（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８８ｍｇのｉＲＧＤを１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体４５１を１．０９ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０９（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３５（ｓ，２Ｈ）、５．４８２（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４９０】
実施例１７  化合物１７の作製
ｔＬｙｐ−１の作製は実施例２と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４９１】
コンジュゲートの作製
【化１８５】
2019519508.tif 000192
【０４９２】
４５３の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物４５（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１４４ｍｇのｔＬｙＰ−１を１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体４５３を１．０２ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３６（ｓ，２Ｈ）、５．４８５（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４９３】
実施例１８  化合物１８の作製
Ｌｙｐ−１の作製は実施例３と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４９４】
コンジュゲートの作製
【化１８６】
2019519508.tif 000193
【０４９５】
４５２の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物４５（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８８ｍｇのＬｙＰ−１を１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体４５２を１．０６ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１７（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３４０（ｓ，２Ｈ）、５．４９１（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４９６】
実施例１９  化合物１９の作製
ＣＲＰＡＲＰＡＲの作製は実施例４と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４９７】
コンジュゲートの作製
【化１８７】
2019519508.tif 000194
【０４９８】
４５４の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物４５（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１５９ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体４５４を１．０７ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３２（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４９９】
実施例２０  化合物２０の作製
ｃＲＧＤの作製は実施例５と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０５００】
コンジュゲートの作製
【化１８８】
2019519508.tif 000195
【０５０１】
４５５の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物４５（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に９９．５ｍｇのｃＲＧＤを加えて４ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと６ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体４５５を１．０３ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０９（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３１（ｓ，２Ｈ）、５．４７８（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５０２】
実施例２１  化合物２１の作製
ｉＲＧＤの作製は実施例１と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０５０３】
【化１８９】
2019519508.tif 000196
【０５０４】
５０の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５２ｍｇの化合物１０（３．０ｅｑ）、２ｍｌのＤＣＭ、１１ｕｌのＴＥＡ（６．０ｅｑ）、２７３ｍｇの３ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体５０を３１０ｍｇ得た。
【０５０５】
【化１９０】
2019519508.tif 000197
【０５０６】
５１の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５０ｍｇの化合物５０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に７．２ｍｇのｉＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体５１を４９ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５０７】
実施例２２  化合物２２の作製
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０５０８】
【化１９１】
2019519508.tif 000198
【０５０９】
５２の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５５ｍｇの化合物５０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に、４．２ｍｇのｃＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと１．５ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体５２を５０ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３３（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５１０】
実施例２３  化合物２３の作製
ｉＲＧＤの作製は実施例１と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０５１１】
コンジュゲートの作製
【化１９２】
2019519508.tif 000199
【０５１２】
６０の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、４７６ｍｇの化合物１０（８．０ｅｑ）、１５ｍｌのＤＣＭ、１０５ｕｌのＴＥＡ（１６．０ｅｑ）、１．０ｇの８ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体６０を１．３７ｇ得た。
【０５１３】
【化１９３】
2019519508.tif 000200
【０５１４】
６１の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５０ｍｇの化合物６０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１４．５ｍｇのｉＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体６１を５４ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５１５】
実施例２４  化合物２４の作製
Ｌｙｐ−１の作製は実施例３と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０５１６】
コンジュゲートの作製
【化１９４】
2019519508.tif 000201
【０５１７】
６２の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、６０ｍｇの化合物６０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１７．４ｍｇのＬｙＰ−１を加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体６２を６８ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２９（ｓ，２Ｈ）、５．４８１（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５１８】
実施例２５  化合物２５の作製
【化１９５】
2019519508.tif 000202
【０５１９】
６３の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、４５ｍｇの化合物６０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１０．０ｍｇのｔＬｙＰ−１を加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体６３を４５ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３０（ｓ，２Ｈ）、５．４８２（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５２０】
実施例２６  化合物２６の作製
【化１９６】
2019519508.tif 000203
【０５２１】
６４の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５５ｍｇの化合物６０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１３．５ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体６４を６２ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３１（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５２２】
実施例２７  化合物２７の作製
【化１９７】
2019519508.tif 000204
【０５２３】
６５の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５０ｍｇの化合物６０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に７．７ｍｇのｃＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと１．５ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体６５を５０ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８１（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５２４】
実施例２８  化合物２８の作製
ｉＲＧＤの作製は実施例１と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０５２５】
コンジュゲートの作製
【化１９８】
2019519508.tif 000205
【化１９９】
2019519508.tif 000206
【０５２６】
２１の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．００ｇの化合物２０（１．０ｅｑ）、１００ｍｌのＤＣＭ、３．８７ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、３．４９ｇのＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（１．０ｅｑ）を滴下して２０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、３．５２ｇの淡黄色の固体である化合物２１を得た。
【０５２７】
２２の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、４．５０ｇの化合物２１（１．０ｅｑ）、１３５ｍｌのＤＣＭ、１．５ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、８７ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、２．２１ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮した時点で１２０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１５０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥して４．９５ｇの淡黄色の固体である化合物２２を得た。
【０５２８】
２３の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．９５ｇの化合物２２、５５ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１３．７ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体２３を２．５ｇ得た。
【０５２９】
２４の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、２．３ｇの化合物２３、４５ｍｌのＤＣＭ、３．９ｇ（１．０５ｅｑ）化合物５、２．１４ｍｌのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体２４を２．４５ｇ得た。
【０５３０】
２５の作製
２００ｍＬの丸底フラスコに、２．２ｇの化合物２４、６５ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体２５を１．７ｇ得た。
【０５３１】
７０の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．２１ｇの化合物２５（８．０ｅｑ）、６０ｍｌのＤＣＭ、３１４ｕｌのＴＥＡ（１６．０ｅｑ）、３．０ｇの４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体７０を３．９ｇ得た。
【０５３２】
【化２００】
2019519508.tif 000207
【０５３３】
７１の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５０ｍｇの化合物７０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１５．３ｍｇのｉＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体７１を５５ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３５（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５３４】
実施例２９  化合物２９の作製
【化２０１】
2019519508.tif 000208
【０５３５】
７２の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、６０ｍｇの化合物７０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８．３ｍｇのＬｙＰ−１を加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体７２を６８ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３３（ｓ，２Ｈ）、５．４８６（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５３６】
実施例３０  化合物３０の作製
【化２０２】
2019519508.tif 000209
【０５３７】
７３の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５５ｍｇの化合物７０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１２．８ｍｇのｔＬｙＰ−１を加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体７３を５５ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３５（ｓ，２Ｈ）、５．４８８（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５３８】
実施例３１  化合物３１の作製
【化２０３】
2019519508.tif 000210
【０５３９】
７４の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５５ｍｇの化合物７０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１４．２ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体７４を６０ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３２（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５４０】
実施例３２  化合物３２の作製
【化２０４】
2019519508.tif 000211
【０５４１】
７５の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、６０ｍｇの化合物７０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に９．７ｍｇのｃＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと１．５ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体７５を６２ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９００（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３３（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５４２】
実施例３３  化合物３３の作製
【化２０５】
2019519508.tif 000212
【０５４３】
３１の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、６．００ｇの化合物３０（１．０ｅｑ）、１２０ｍｌのＤＣＭ、５．００ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、４．５３ｇのＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（１．０ｅｑ）を滴下して２０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、４．３２ｇの淡黄色の固体である化合物３１を得た。
【０５４４】
３２の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．０ｇの化合物３１（１．０ｅｑ）、１５０ｍｌのＤＣＭ、１．７３ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、１０１ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、２．５５ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮した時点で１３０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１６０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥して４．５２ｇの淡黄色の固体である化合物３２を得た。
【０５４５】
３３の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．４０ｇの化合物２２、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体２３を２．３２ｇ得た。
【０５４６】
【化２０６】
2019519508.tif 000213
【０５４７】
３４の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、２．３ｇの化合物３３、４５ｍｌのＤＣＭ、２．７７ｇの（１．０５ｅｑ）化合物５、１．１ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体３４を２．０２ｇ得た。
【０５４８】
３５の作製
２００ｍＬの丸底フラスコに、２．０ｇの化合物３４、６０ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体３５を１．６９ｇ得た。
【０５４９】
８０の作製
５００ｍＬの丸底フラスコに、２．７５ｇの化合物３５（８．０ｅｑ）、１４０ｍｌのＤＣＭ、７３０ｕｌのＴＥＡ（１６．０ｅｑ）、７．０ｇの８ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体８０を８．６４ｇ得た。
【０５５０】
【化２０７】
2019519508.tif 000214
【０５５１】
８１の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物８０（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に３０７ｍｇのｉＲＧＤを加えて１５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体８１を１．１８ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０３（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３４（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５５２】
実施例３４  化合物３４の作製
【化２０８】
2019519508.tif 000215
【０５５３】
実施例３５  化合物３５の作製
【化２０９】
2019519508.tif 000216
【０５５４】
８３の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物８０（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に２３５ｍｇのｔＬｙＰ−１を加えて１５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体８３を１．０５ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０４（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３４（ｓ，２Ｈ）、５．４８９（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５５５】
実施例３６  化合物３６の作製
【化２１０】
2019519508.tif 000217
【０５５６】
実施例３７  化合物３７の作製
【化２１１】
2019519508.tif 000218
【０５５７】
８５の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物８０（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１６３ｍｇのｃＲＧＤを加えて６ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと１０ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体８５を１．００ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０３（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３４（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５５８】
実施例３８  化合物３８の作製
【化２１２】
2019519508.tif 000219
【０５５９】
４１の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．０ｇの化合物４０（１．０ｅｑ）、１５０ｍｌのＤＣＭ、２．６７ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、１５５ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、３．９３ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１５ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮した時点で１３０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１６０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、６．８５ｇの乾燥して淡黄色の固体である化合物４１を得た。
【０５６０】
４２の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．００ｇの化合物４１、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体４２を３．５４ｇ得た。
【０５６１】
【化２１３】
2019519508.tif 000220
【０５６２】
４３の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、３．００ｇの化合物４２、４５ｍｌのＤＣＭ、３．４６ｇ（１．０５ｅｑ）化合物５、１．３８ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体４３を２．６８ｇ得た。
【０５６３】
４４の作製
２００ｍＬの丸底フラスコに、２．０ｇの化合物４３、６０ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体４４を１．６１ｇ得た。
【０５６４】
９０の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、１．６１ｇの化合物４４（８．０ｅｑ）、８０ｍｌのＤＣＭ、４１８ｕｌのＴＥＡ（１６．０ｅｑ）、４．０ｇの８ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体９０を５．１５ｇ得た。
【０５６５】
【化２１４】
2019519508.tif 000221
【０５６６】
９１の作製
５０ｍＬの丸底フラスコに、０．５ｇの化合物９０（１．０ｅｑ）、１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１５２ｍｇのｉＲＧＤを５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体９１を０．５３ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３３（ｓ，２Ｈ）、５．４８８（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５６７】
実施例３９  化合物３９の作製
【化２１５】
2019519508.tif 000222
【０５６８】
９２の作製
０．５ｇの化合物９０（１．０ｅｑ）、１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを５０ｍＬの丸底フラスコに加え、溶解して透明になった後に１５３ｍｇのＬｙＰ−１を５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体９２を０．５７ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９００（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３２（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５６９】
実施例４０  化合物４０の作製
【化２１６】
2019519508.tif 000223
【０５７０】
実施例４１  化合物４１の作製
【化２１７】
2019519508.tif 000224
【０５７１】
９４の作製
５０ｍＬの丸底フラスコに、０．５ｇの化合物９０（１．０ｅｑ）、１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１２９ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体９４を０．５５ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３１（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５７２】
実施例４２  化合物４２の作製
【化２１８】
2019519508.tif 000225
【０５７３】
９５の作製
５０ｍＬの丸底フラスコに、０．５ｇの化合物９０（１．０ｅｑ）、１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に８０．８ｍｇのｃＲＧＤを加えて４ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと６ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体９５を０．５０ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０３（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３０（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５７４】
化合物２３〜４２の作製では、Ｒは、
【０５７５】
【化２１９】
2019519508.tif 000226
である。
【０５７６】
実施例４３  ヒト結腸癌ＨＴ−２９のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用。
【０５７７】
１．  実験目的
化合物１〜４２の、ヒト結腸癌ＨＴ−２９のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用を測定する。
【０５７８】
２．  実験材料
２．１  試料
イリノテカン（原薬）、ｎｋｔｒ−１０２（原薬）は購入品であり、化合物１〜４２はすべてブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
【０５７９】
２．２  試薬
ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン二重特異性抗体、注射用水、乳酸、ソルビトール。
【０５８０】
２．３  実験動物
雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（匹数：３００匹；週齢：５〜７週）をＢｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入し、温度２０〜２５℃、相対湿度４０％〜７０％、１２時間明、１２時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取するＳＰＦ動物飼育室で飼育した。飼育して約１週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。
【０５８１】
２．４  可移植性腫瘍株
中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク（ＣＡＳ、本実験室では液体窒素中に凍結保存）から入手したヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９。
【０５８２】
３  実験方法
３．１  ＨＴ−２９細胞培養
５％ＣＯ2、３７℃の培養条件下で、ＨＴ−２９細胞を、１０％ウシ胎児血清含有ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液中で通常の細胞培養を行い、０．２５％トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に２〜３回行い、継代比率を１：３〜１：８とした。
【０５８３】
３．２  動物モデルの構築
対数増殖期のＨＴ−２９細胞を採取し、細胞数計測後に無血清ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地に再懸濁し、細胞濃度を６×１０7細胞／ｍＬに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を１ｍＬのシリンジで採取し、ヌードマウスの右前腋窩皮下に注射し、各動物に１００μＬ（６×１０6細胞／匹）接種し、ＨＴ−２９のヌードマウス移植腫瘍モデルを構築した。接種後に定期的に動物の状態及び腫瘍の増殖状態を観察し、電子ノギスを用いて腫瘍径を測定し、データを直接的にＥｘｃｅｌ表に入力し、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が１００〜３００ｍｍ3になった後に、健康状態が良好で、腫瘍体積が近い動物を２２５匹選択し、乱塊法により４５組に分けた（ｎ＝５）。実験開始後に腫瘍径を週に２回測定し、腫瘍体積を計算し、且つ動物体重を秤量して記録した。
腫瘍体積（ＴＶ）の計算公式は下記のとおりである。
ＴＶ（ｍｍ3）＝ｌ×ｗ2／２
式中、ｌは腫瘍長径（ｍｍ）を表し、ｗは腫瘍短径（ｍｍ）を表す。
【０５８４】
３．３  溶媒の調製
０．５ｇのソルビトールを秤量して５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管に５０ｍＬの注射用水を加え、固形物が完全に溶解するまで旋回振動し、濃度１％のソルビトール水溶液（ｗ／ｖ）を調製し、４℃の冷蔵庫に保存しておいた。
【０５８５】
３．４  投与製剤の調製
３．４．１  イリノテカン投与製剤の調製
１２．０ｍｇのイリノテカンを秤量し、０．１５ｍｌの１％乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに２．８５ｍｌの１％ソルビトール水溶液をそれぞれ加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の１％乳酸、１％ソルビトール水溶液の比率を約５：９５（ｖ／ｖ）とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５８６】
３．４．２  ｎｋｔｒ−１０２投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、８８．５５ｍｇのｎｋｔｒ−１０２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５８７】
３．４．３  化合物１〜５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．８５ｍｇの化合物１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．８０ｍｇの化合物２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．８８ｍｇの化合物３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１１．２４ｍｇの化合物４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．７８ｍｇの化合物５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５８８】
３．４．４  化合物６〜１０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物６を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物７を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物８を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物９を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１０を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５８９】
３．４．５  化合物１１〜１５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１２．９８ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０８．９４ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．０１ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．３７ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０４．９１ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５９０】
３．４．６  化合物１６〜２０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５９１】
３．４．７  化合物２１〜４２投与製剤の調製
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５９２】
３．５  動物の群分け及び投与
動物の群分け及び投与態様は表１のとおりである。
【０５９３】
活性剤がイリノテカンである群（群１〜８）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１群は溶媒対照群であり、尾静脈注射によりブランク溶媒を４日に１回、合計で３回（Ｑ４Ｄ×３）投与した。第２〜８群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料であるイリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、化合物１〜５を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（イリノテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０５９４】
活性剤がＳＮ−３８である群（群９〜１３）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第９〜１３群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物６〜１０を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（ＳＮ−３８含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０５９５】
活性剤が１０−ヒドロキシカンプトテシンである群（群１４〜１８）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１４〜１８群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物１１〜１５を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（１０−ヒドロキシカンプトテシン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０５９６】
活性剤がルビテカンである群（群１９〜２３）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１９〜２３群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物１６〜２０を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（ルビテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０５９７】
群２４〜４５の投与態様は上記と同様である。
【０５９８】
【表１】
2019519508.tif 000227
【０５９９】
３．６  実験終了
実験の最終日に、体重を秤量し、腫瘍径を測定した後に動物を安楽死させた（ＣＯ2）。腫瘍組織を取り出し、秤量して撮影し（撮影時に以下の組み合わせでそれぞれ撮影）、腫瘍重量抑制率を計算した。動物に対して肉眼解剖を行い、内臓器官に異常があるかを肉眼で観察した。
【０６００】
４  データ記録、計算公式
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の計算公式は下記のとおりである。
ＲＴＶ＝ＴＶt／ＴＶinitial
式中、ＴＶinitialは群分けして投与した時に測定した腫瘍体積であり、ＴＶtは投与期間中各測定時の腫瘍体積である。
相対腫瘍増殖率（％Ｔ／Ｃ）の計算公式下記のとおりである。
％Ｔ／Ｃ＝１００％´（ＲＴＶT／ＲＴＶC）
式中、ＲＴＶTは治療群のＲＴＶを示し、ＲＴＶCは溶媒対照群のＲＴＶを示す。
腫瘍増殖抑制率ＴＧＩ（％）の計算公式は下記のとおりである。
ＴＧＩ＝１００％×［１−（ＴＶt(T)−ＴＶinitial(T)）／（ＴＶt(C)−ＴＶinitial(C)）］
式中、ＴＶt(T)は治療群の各測定時の腫瘍体積を示し、ＴＶinitial(T)は群分けして投与した時の治療群の腫瘍体積を示し、ＴＶt(C)は溶媒対照群の各測定時の腫瘍体積を示し、ＴＶinitial(C)は群分けして投与した時の溶媒対照群の腫瘍体積を示す。
動物の体重低減率の計算公式は下記のとおりである。
動物の体重低減率＝１００％×（ＢＷinitial−ＢＷt）／ＢＷinitial
式中、ＢＷtは投与期間中各測定時の動物体重を示し、ＢＷinitialは群分けして投与した時の動物体重を示す。
腫瘍重量抑制率ＩＲ（％）の計算公式は下記のとおりである。
ＩＲ（％）＝１００％×（ＷC−ＷT）／ＷC
式中、ＷCは対照群の腫瘍重量を示し、ＷTは治療群の腫瘍重量を示す。
【０６０１】
５  統計分析方法
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥ）として表し、２群の比較はｔ検定で行った。
【０６０２】
６  実験観察
実験中、実験者及び獣医師は実験動物の徴候及び健康状態を観察し続けなければならない。疼痛、うつ病、活動低下等動物のいかなる異常症状を実験ノートに記録する必要がある。実験動物の異常状況がＩＡＣＵＣ関連動物福祉法規の規定に一致しない場合、獣医師は実験停止の要否を判断し、且つ実験責任者に通知することができる。
【０６０３】
７  結果
ヒトがん異種移植腫瘍モデルについて、実験評価指標として相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）を推奨する。増殖率が低いほど、腫瘍抑制効果が良いことは表２に示されている。
【０６０４】
【表２】
2019519508.tif 000228
【０６０５】
実験結果によれば、本発明の化合物は、ヒト結腸癌ＨＴ−２９のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かる。
【０６０６】
実施例４４  ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヌードマウス異種移植モデルにおける抑制作用
１．実験目的
本研究は、ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヌードマウス移植腫瘍モデルを用いて、化合物１〜４２の生体内における抗腫瘍活性を評価する。
【０６０７】
２．実験動物
２．１  動物種類
マウス。
【０６０８】
２．２  品種
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス。
【０６０９】
２．３  性別
雌性。
【０６１０】
２．４  数
３２０匹接種し、実験で２２５匹を使用した。
【０６１１】
２．５  年齢
６〜８週。
【０６１２】
２．６  体重
２０〜２２ｇ±２０％  体重平均値。
【０６１３】
２．７  動物リソース（サプライヤー）
上海西普−必凱実験動物有限公司（ＢＫ）、許可証番号ＳＣＸＫ（滬）２００８−００１６。
【０６１４】
２．８  実験動物管理
すべての実験動物をＳＰＦレベルの実験室で飼育した。実験者は日常のケア及び実験研究を担当した。
【０６１５】
２．８．１  動物身分の識別方法
各ケージに実験番号、実験群別、実験者名前、マウス品種及び性別等の情報が記載されている身分カードが付いており、マウスはイヤリングがによりマーキングした。
【０６１６】
２．８．２  ランダムな群分け
腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ3になった後に、各群にマウス５匹、各群内の腫瘍体積及びマウス体重が均一であるように、乱塊法により群分けした。各群の腫瘍体積の平均値の、すべての実験動物の腫瘍体積の平均値との差が±１０％以下であった。
【０６１７】
２．８．３  操作管理規則
すべての実験動物の操作及び管理は、動物使用及び管理ガイドラインに厳しく従う。
【０６１８】
２．８．４  飼育条件
居住条件：ＩＶＣシステム、各ケージに５匹
温度：２０℃〜２６℃
湿度：４０％±７０％
光照射：１２時間の昼夜交替
【０６１９】
２．８．５  飼料
北京科澳協力飼料有限公司から購入した照射ラット・マウス飼料。自由に摂食させた。
【０６２０】
２．８．６  飲水
都市水道水。ろ過して高圧滅菌して飲水させた。
【０６２１】
２．８．７  敷料
上海茂生誘導体科技有限公司から購入したコーンコブ。高圧滅菌して使用した。週に２回敷料を交換した。
【０６２２】
２．８．８  適応期間
実験前にマウスに少なくとも１週間の環境適応期間を与えた。
【０６２３】
３．実験材料
３．１  実験対象医薬品
イリノテカン（原薬）、ｎｋｔｒ−１０２（原薬）は購入品であり、化合物１〜４２はすべてブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
【０６２４】
３．２  ほかの化学試薬及び材料
３．２．１  生理食塩水
上海華源長富薬業（集団）有限公司から購入した生理食塩水。
【０６２５】
３．２．２  無菌シリンジ
上海康徳莱企業発展集団股フン有限公司（上海、中国）から購入した１ｍｌの無菌シリンジ。
【０６２６】
３．２．３  細胞株
上海中国科学院細胞生物研究所から購入したヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）で培養し、５％ＣＯ2を含む３７℃のインキュベーターで培養した。
【０６２７】
３．２．４  マトリゲル（ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ）
米国ＢＤ社から購入したマトリゲルＭａｔｒｉｇｅｌ。
【０６２８】
３．３  設備
ＥＳＣＯから購入した生物学的安全キャビネット（型番：ＡＣ２−６Ｅ１）、
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｆｏｒｍａから購入したＣＯ2水密性インキュベーター（型番：３１１１）、
Ｏｌｙｍｐｕｓから購入した倒立顕微鏡（型番：ＣＫＸ４１ＳＦ）、
上海医療器械工業（集団）有限公司から購入した電気吸引装置（型番：ＹＸ９３０Ｄ）、
ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯから購入した天びん（ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯ  ＡＢ１３５−Ｓ）、
北京雷勃爾遠心機有限公司から購入した低速遠心機（型番：ＬＤ５−２Ａ）、
桂林広陸数字測控股フン有限公司から購入した電子デジタルノギス（型番：ＳＦ２０００）。
【０６２９】
４．実験設計
ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヌードマウス皮下移植腫瘍モデルを構築し、各匹に対して１×１０6個の細胞を接種した。
今回の実験は以下（表）の投与量及び投与態様を設計した（表３）。
【０６３０】
【表３】
2019519508.tif 000229
【０６３１】
５．化合物の調製
調製方法はブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
単回投与に必要な容量：
２０ｇ（ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）ｘ１０（ａｎｉｍａｌｓ）ｘ１０ｍＬ／ｋｇ／１０００ｘ１．５＝３ｍＬ
【０６３２】
５．１  イリノテカン投与製剤の調製
１２．０ｍｇのイリノテカンを秤量し、０．１５ｍｌの１％乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに２．８５ｍｌの１％ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の１％乳酸、１％ソルビトール水溶液の比率を約５：９５（ｖ／ｖ）とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３３】
５．２  ｎｋｔｒ−１０２投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、８８．５５ｍｇのｎｋｔｒ−１０２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３４】
５．３  化合物１〜５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．８５ｍｇの化合物１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．８０ｍｇの化合物２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．８８ｍｇの化合物３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１１．２４ｍｇの化合物４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．７８ｍｇの化合物５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３５】
５．４  化合物６〜１０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物６を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物７を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物８を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物９を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１０を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３６】
５．４  化合物１１〜１５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１２．９８ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０８．９４ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．０１ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．３７ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０４．９１ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３７】
５．５  化合物１６〜２０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３８】
５．６  化合物２１〜４２投与製剤の調製
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３９】
６．実験方法
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を５％ＣＯ2を含む３７℃のインキュベーターで培養した。
細胞接種法による腫瘍ヌードマウス皮下移植モデルの構築：対数増殖期の腫瘍細胞を採取し、細胞数計測後に１×ＰＢＳに再懸濁し、細胞濃度をに１×１０7／ｍｌ調整し。１ｍＬのシリンジ（針Ｎｏ．４）でヌードマウス右背部皮下に腫瘍細胞を、１×１０6／０．１ｍｌ／マウスで接種した。
腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ3になった時点で、各群の腫瘍の差が平均値の１０％未満となるように、各群にマウス５匹で乱塊法により動物をランダムに群分けした。群分けの日をＤａｙ  ０とし、群分けの日に投与した。
実験期間を３週間とし、実験期間中、動物体重及び腫瘍サイズを週に２回測定した。毎日に臨床症状を観察して記録した。実験の最終日に、動物を殺し、体重を秤量し、腫瘍を取り出し、秤量して撮影して記録した。
すべての動物実験操作は、動物使用及び管理規則に厳しく従う。腫瘍関連パラメータの計算は、中国ＣＦＤＡによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』を参照する。
腫瘍体積（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、ＴＶ）の計算公式はＴＶ＝ａ×ｂ2／２である。式中、ａ、ｂはそれぞれ測定された腫瘍の長さ及び幅を示す。相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ）の計算公式はＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ0である。式中、Ｖ0は群分けして投与した時の腫瘍体積を示し、Ｖｔは測定時の腫瘍体積を示す。抗腫瘍活性の評価指標として相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）及び腫瘍抑制率（％）を用い、計算公式はそれぞれＴ／Ｃ（％）＝（ＴRTV／ＣRTV）×１００％である。ＴRTVは治療群のＲＴＶを示し、ＣRTVは陰性対照群のＲＴＶを示す。腫瘍抑制率（％）＝（陰性対照群の平均腫瘍重量−投与群の平均腫瘍重量）／陰性対照群の平均腫瘍重量×１００％。
腫瘍担持動物の体重変化（％）の計算は下記のとおりである。（測定時の体重−群分け時の体重）／群分け時の体重×１００。
【０６４０】
７．データ分析
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥ）として表し、２群の比較はｔ検定で行った。
【０６４１】
８．結果及び報告書
中国ＣＦＤＡによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』（２００６年１１月）に基づき、Ｔ／Ｃ（％）≦４０％、且つ統計学分析によりｐ＜０．０５のものが有効であることは、表４に示されている。
【０６４２】
【表４】
2019519508.tif 000230
【０６４３】
実験結果によれば、本発明の化合物は、ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヌードマウス移植腫瘍に対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かる。
【０６４４】
実施例４５  ヒト膵臓がんＭＩＡ  Ｐａｃａ−２のヌードマウス異種移植モデルにおける抑制作用
１．実験目的
本研究は、ヒト膵臓がんＭＩＡ  Ｐａｃａ−２のヌードマウス移植腫瘍モデルを用い、化合物１〜４２の生体内における抗腫瘍活性を評価する。
【０６４５】
２．実験動物
２．１  動物種類
マウス。
【０６４６】
２．２  品種
ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕヌードマウス。
【０６４７】
２．３  性別
雌性。
【０６４８】
２．４  数
３００。
【０６４９】
２．５  年齢
６〜８週。
【０６５０】
２．６  体重
２０−２２ｇ±２０％  体重平均値。
【０６５１】
２．７  動物リソース（サプライヤー）
上海西普‐必凱実験動物有限公司（ＢＫ）、許可証番号ＳＣＸＫ（滬）２００８−００１６。
【０６５２】
２．８  実験動物管理
すべての実験動物をＳＰＦレベルの実験室で飼育した。
【０６５３】
２．８．１  動物身分の識別方法
各ケージに実験番号、実験群別、実験者名前、マウス品種及び性別等の情報が記載されている身分カードが付いており、マウスはイヤリングがによりマーキングした。
【０６５４】
２．８．２  ランダムな群分け
腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ3になった後に、各群にマウス５匹、各群内の腫瘍体積及びマウス体重が均一であるように、乱塊法により群分けした。各群の腫瘍体積の平均値の、すべての実験動物の腫瘍体積の平均値との差が±１０％以下であった。
【０６５５】
２．８．３  操作管理規則
すべての実験動物の操作及び管理は、実験動物使用及び管理ガイドラインに厳しく従う。
【０６５６】
２．８．４  飼育条件
居住条件：ＩＶＣシステム、各ケージに５匹
温度：２５℃±１℃
湿度：６５％±１０％
光照射：１２時間の昼夜交替
【０６５７】
２．８．５  飼料
北京科澳協力飼料有限公司から購入した照射ラット・マウス飼料。自由に摂食させた。
【０６５８】
２．８．６  飲水
都市水道水。ろ過して高圧滅菌して飲水させた。
【０６５９】
２．８．７  敷料
上海茂生誘導体科技有限公司から購入したコーンコブ。高圧滅菌して使用した。週に２回敷料を交換した。
【０６６０】
２．８．８  適応期間
実験前にマウスに少なくとも１週間の環境適応期間を与えた。
【０６６１】
３．実験材料
３．１  実験対象医薬品
イリノテカン（原薬）、ｎｋｔｒ−１０２（原薬）は購入品であり、化合物１〜４２はすべてブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
【０６６２】
３．２  ほかの化学試薬及び材料
３．２．１  生理食塩水
上海華源長富薬業（集団）有限公司から購入した生理食塩水（上海、中国）。
【０６６３】
３．２．２  無菌シリンジ
上海康徳莱企業発展集団股フン有限公司（上海、中国）から購入した１ｍｌの無菌シリンジ。
【０６６４】
３．２．３  細胞株
ヒト膵臓がんＭＩＡ  Ｐａｃａ−２は上海中国科学院細胞生物研究所から購入した。
ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２を、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）及び２．５％ＨＳを含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）で培養し、５％ＣＯ2を含む３７℃のインキュベーターで培養した。
【０６６５】
３．２．４  マトリゲル（ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ）
米国ＢＤ社から購入したマトリゲルＭａｔｒｉｇｅｌ。
【０６６６】
３．３  設備
ＥＳＣＯから購入した生物学的安全キャビネット（型番：ＡＣ２−６Ｅ１）、
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｆｏｒｍａから購入したＣＯ2水密性インキュベーター（型番：３１１１）、
Ｏｌｙｍｐｕｓから購入した倒立顕微鏡（型番：ＣＫＸ４１ＳＦ）、
上海医療器械工業（集団）有限公司から購入した電気吸引装置（型番：ＹＸ９３０Ｄ）、
ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯから購入した天びん（ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯ  ＡＢ１３５−Ｓ）、
北京雷勃爾遠心機有限公司から購入した低速遠心機（型番：ＬＤ５−２Ａ）、
桂林広陸数字測控股フン有限公司から購入した電子デジタルノギス（型番：ＳＦ２０００）。
【０６６７】
４．実験設計
ヒト膵臓がんＭＩＡ  Ｐａｃａ−２のヌードマウス皮下移植腫瘍モデルを構築し、各匹に対して３×１０6個細胞を接種した。
今回の実験は以下（表６）の投与量及び投与態様を設計した。
【０６６８】
【表５】
2019519508.tif 000231
【０６６９】
５．化合物の調製
調製方法はブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
単回投与に必要な容量：
２０ｇ（ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）ｘ１０（ａｎｉｍａｌｓ）ｘ１０ｍＬ／ｋｇ／１０００ｘ１．５＝３ｍＬ
【０６７０】
５．１  イリノテカン投与製剤の調製
１２．０ｍｇのイリノテカンを秤量し、０．１５ｍｌの１％乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに２．８５ｍｌの１％ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の１％乳酸、１％ソルビトール水溶液の比率を約５：９５（ｖ／ｖ）とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７１】
５．２  ｎｋｔｒ−１０２投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、８８．５５ｍｇのｎｋｔｒ−１０２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７２】
５．３  化合物１〜５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．８５ｍｇの化合物１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．８０ｍｇの化合物２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．８８ｍｇの化合物３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１１．２４ｍｇの化合物４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．７８ｍｇの化合物５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７３】
５．４  化合物６〜１０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物６を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物７を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物８を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物９を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１０を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７４】
５．５  化合物１１〜１５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１２．９８ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０８．９４ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．０１ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．３７ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０４．９１ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７５】
５．６  化合物１６〜２０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７６】
５．７  化合物２１〜４２投与製剤の調製
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７７】
６．実験方法
ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２細胞を、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）及び２．５％ＨＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を５％ＣＯ2を含む３７℃のインキュベーターで培養した。
細胞接種法による腫瘍ヌードマウス皮下移植モデルの構築：対数増殖期の腫瘍細胞を採取し、細胞数計測後に１×ＰＢＳに再懸濁し、細胞濃度を３×１０7／ｍｌに調整した。１ｍＬのシリンジ（針Ｎｏ．４）でヌードマウス右背部皮下に腫瘍細胞を、３×１０6／０．１ｍｌ／マウスで接種した。
腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ3になった時点で、各群の腫瘍の差が平均値の１０％未満となるように、各群にマウス５匹で乱塊法により動物をランダムに群分けした。群分けの日をＤａｙ１とし、群分けの日に投与した。
実験期間を３週間とし、実験期間中、動物体重及び腫瘍サイズを週に２回測定した。毎日に臨床症状を観察して記録した。実験の最終日に、動物を殺し、体重を秤量し、腫瘍を取り出し、秤量して撮影して記録した。
すべての動物実験操作は、動物使用及び管理規則に厳しく従う。腫瘍関連パラメータの計算は、中国ＳＦＤＡによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』を参照する。
腫瘍体積（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、ＴＶ）の計算公式はＴＶ＝ａ×ｂ2／２である。式中、ａ、ｂはそれぞれ測定された腫瘍の長さ及び幅を示す。相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ）の計算公式はＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ0である。式中、Ｖ0は群分けして投与した時の腫瘍体積を示し、Ｖｔは測定時の腫瘍体積を示す。抗腫瘍活性の評価指標として相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）及び腫瘍抑制率（％）を用い、計算公式はそれぞれＴ／Ｃ（％）＝（ＴRTV／ＣRTV）×１００％である。ＴRTVは治療群のＲＴＶを示し、ＣRTVは陰性対照群のＲＴＶを示す。腫瘍抑制率（％）＝（陰性対照群の平均腫瘍重量−投与群の平均腫瘍重量）／陰性対照群の平均腫瘍重量×１００％。
腫瘍担持動物の体重変化（％）の計算は下記のとおりである。（測定時の体重−群分け時の体重）／群分け時の体重×１００。
中国ＳＦＤＡによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』（２００６年１１月）に基づき、Ｔ／Ｃ（％）≦４０％、且つ統計学分析によりＰ＜０．０５のものが有効である。
【０６７８】
７．データ分析
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥ）として表し、群同士の比較はｔ−検定で行い、Ｐ＜０．０５の場合に有意差ありと認められる。
【０６７９】
８．結果及び報告書
中国ＣＦＤＡによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』（２００６年１１月）に基づき、Ｔ／Ｃ（％）≦４０％、且つ統計学分析によりＰ＜０．０５のものが有効であることは、表６に示されている。
【０６８０】
【表６】
2019519508.tif 000232
【０６８１】
実験結果によれば、本発明の化合物は、ヒト膵臓がんＭＩＡ  Ｐａｃａ−２のヌードマウス移植腫瘍に対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かる。
【０６８２】
実施例４６  ヒト胃がんＮＣＩ−Ｎ８７細胞株のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用
１．実験目的
供試薬物である化合物１〜４２の、ヒト胃がんＮＣＩ−Ｎ８７細胞株のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用を評価する。
【０６８３】
２．実験材料
２．１  試料
イリノテカン（原薬）、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカン、ｎｋｔｒ−１０２は購入品であり、化合物１〜４２はすべてブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
【０６８４】
２．２  試薬
ＲＰＭＩ−１６４０培養液、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン、生理食塩水。
【０６８５】
２．３  実験動物
雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（匹数：１５０匹；週齢：６〜８週）をＢｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入し、温度２０〜２５℃、相対湿度４０％〜７０％、１２時間明、１２時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取する蘇州聖蘇新薬開発有限公司のＳＰＦ動物飼育室で飼育した。飼育して約１週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。
【０６８６】
２．４  可移植性腫瘍株
中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク（ＣＡＳ、本実験室では液体窒素中に凍結保存）から入手したヒト胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７。
【０６８７】
３  実験方法
３．１  ＮＣＩ−Ｎ８７細胞培養
５％ＣＯ2、３７℃の培養条件下で、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培養液中で通常の細胞培養を行い、０．２５％トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に１〜２回行い、継代比率を１：２〜１：６とした。
【０６８８】
３．２  動物モデルの構築
対数増殖期のＮＣＩ−Ｎ８７細胞を採取し、細胞数計測後に無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を５×１０7細胞／ｍＬに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を１ｍＬのシリンジで採取し、ヌードマウスの右前腋窩皮下に注射し、各動物に１００μＬ（５×１０6細胞／匹）接種し、ＮＣＩ−Ｎ８７のヌードマウス移植腫瘍モデルを構築した。接種後に定期的に動物の状態及び腫瘍の増殖状態を観察し、電子ノギスを用いて腫瘍径を測定し、データを直接的にＥｘｃｅｌ表に入力し、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が１００〜３００ｍｍ3になった後に、健康状態が良好で、腫瘍体積が近い動物を２２５匹選択し、乱塊法により４５組に分けた（ｎ＝５）。実験開始後に腫瘍径を週に２回測定し、腫瘍体積を計算し、且つ動物体重を秤量して記録した。
腫瘍体積（ＴＶ）の計算公式は下記のとおりである。
ＴＶ（ｍｍ3）＝ｌ×ｗ2／２
式中、ｌは腫瘍長径（ｍｍ）を表し、ｗは腫瘍短径（ｍｍ）を表す。
【０６８９】
３．３  溶媒の調製
０．５ｇのソルビトールを秤量して５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管に５０ｍＬの注射用水を加え、固形物が完全に溶解するまで旋回振動し、濃度１％のソルビトール水溶液（ｗ／ｖ）を調製し、４℃の冷蔵庫に保存しておいた。
【０６９０】
３．４  投与製剤の調製
３．４．１  イリノテカン投与製剤の調製
１２．０ｍｇのイリノテカンを秤量し、０．１５ｍｌの１％乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに２．８５ｍｌの１％ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の１％乳酸、１％ソルビトール水溶液の比率を約５：９５（ｖ／ｖ）とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９１】
３．４．２  ｎｋｔｒ−１０２投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、８８．５５ｍｇのｎｋｔｒ−１０２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９２】
３．４．３  化合物１〜５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．８５ｍｇの化合物１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．８０ｍｇの化合物２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．８８ｍｇの化合物３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１１．２４ｍｇの化合物４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．７８ｍｇの化合物５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９３】
３．４．４  化合物６〜１０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物６を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物７を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物８を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物９を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１０を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９４】
３．４．５  化合物１１〜１５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１２．９８ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０８．９４ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．０１ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．３７ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０４．９１ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９５】
３．４．６  化合物１６〜２０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９６】
３．４．７  化合物２１〜４２投与製剤の調製
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９７】
３．５  動物の群分け及び投与
動物の群分け及び投与態様は表７のとおりである。
【０６９８】
活性剤がイリノテカンである群（群１〜８）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１群は溶媒対照群であり、尾静脈注射によりブランク溶媒を４日に１回、合計で３回（Ｑ４Ｄ×３）投与した。第２〜８群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料であるイリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、化合物１〜５を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（イリノテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した、。
【０６９９】
活性剤がＳＮ−３８である群（群９〜１３）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第９〜１３群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物６〜１０を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（ＳＮ−３８含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７００】
活性剤が１０−ヒドロキシカンプトテシンである群（群１４〜１８）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１４〜１８群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物１１〜１５を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（１０−ヒドロキシカンプトテシン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７０１】
活性剤がルビテカンである群（群１９〜２３）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１９〜２３群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物１６〜２０を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（ルビテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７０２】
群２４〜４５の投与態様は上記と同様である。
【０７０３】
【表７】
2019519508.tif 000233
【０７０４】
３．６  実験終了
実験終了後、体重を秤量し、腫瘍径を測定した後に動物を安楽死させた（ＣＯ2）。腫瘍組織を取り出して秤量し、腫瘍重量抑制率を計算した。腫瘍組織秤量後に、今後の分析のために、−７０℃未満の冷蔵庫に移して保存した。
【０７０５】
４．データ記録、計算公式
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の計算公式は下記のとおりである。
ＲＴＶ＝ＴＶt／ＴＶinitial
式中、ＴＶinitiaLは群分けして投与した時に測定した腫瘍体積であり、ＴＶtは投与期間中各測定時の腫瘍体積である。
相対腫瘍増殖率（％Ｔ／Ｃ）の計算公式下記のとおりである。
％Ｔ／Ｃ＝１００％´（ＲＴＶT／ＲＴＶC）
式中、ＲＴＶTは治療群のＲＴＶを示し、ＲＴＶCは溶媒対照群のＲＴＶを示す。
腫瘍増殖抑制率ＴＧＩ（％）の計算公式は下記のとおりである。
ＴＧＩ＝１００％×［１−（ＴＶt(T)−ＴＶinitial(T)）／（ＴＶt(C)−ＴＶinitial(C)）］
式中、ＴＶt(T)は治療群の各測定時の腫瘍体積を示し、ＴＶinitial(T)は群分けして投与した時の治療群の腫瘍体積を示し、ＴＶt(C)は溶媒対照群の各測定時の腫瘍体積を示し、ＴＶinitial(C)は群分けして投与した時の溶媒対照群の腫瘍体積を示す。
動物の体重低減率の計算公式は下記のとおりである。
動物の体重低減率＝１００％×（ＢＷinitial−ＢＷt）／ＢＷinitial
式中、ＢＷtは投与期間中各測定時の動物体重を示し、ＢＷinitialは群分けして投与した時の動物体重を示す。
腫瘍重量抑制率ＩＲ（％）の計算公式は下記のとおりである。
ＩＲ（％）＝１００％×（ＷC−ＷT）／ＷC
式中、ＷCは対照群の腫瘍重量を示し、ＷTは治療群の腫瘍重量を示す。
【０７０６】
５．統計分析方法
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥ）として表し、２群の比較はｔ−検定で行った。
【０７０７】
６．実験観察
実験中、実験者及び獣医師は実験動物の徴候及び健康状態を観察し続けなければならない。疼痛、うつ病、活動低下等動物のいかなる異常症状を実験ノートに記録する必要がある。実験動物の異常状況がＩＡＣＵＣ関連動物福祉法規の規定に一致しない場合、獣医師は実験停止の要否を判断し、且つ実験責任者に通知することができる。
【０７０８】
７．結果
ヒトがん異種移植腫瘍モデルについて、実験評価指標として相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）を推奨する。増殖率が低いほど、腫瘍抑制効果が良いことは表８に示されている。
【０７０９】
【表８】
2019519508.tif 000234
【０７１０】
実験結果によれば、本発明の化合物は、ヒト胃がんＮＣＩ−Ｎ８７細胞株のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の増殖に対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かる。
【０７１１】
実施例４７  同所性Ｕ８７ＭＧヌードマウス脳グリオーマモデル生存率への影響
１．実験目的
供試薬物である化合物１〜４２の、同所性Ｕ８７ＭＧヌードマウス脳グリオーマモデル生存率への影響を評価する。
【０７１２】
２．実験材料
２．１  試料
イリノテカン（原薬）、ｎｋｔｒ−１０２（原薬）は購入品であり、化合物１〜４２はすべてブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
【０７１３】
２．２  試薬
ＲＰＭＩ−１６４０培養液、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン、生理食塩水。
【０７１４】
２．３  実験動物
雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（匹数：３００匹；週齢：６〜８週）をＢｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入し、温度２０〜２５℃、相対湿度４０％〜７０％、１２時間明、１２時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取するＳＰＦ動物飼育室で飼育した。飼育して約１週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。
【０７１５】
２．４  可移植性腫瘍株
中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク（ＣＡＳ、本実験室では液体窒素中に凍結保存）から入手したグリオーマ細胞Ｕ８７ＭＧ。
【０７１６】
３．実験方法
ＮＣＩ−Ｎ８７細胞培養
５％ＣＯ2、３７℃の培養条件下で、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞をＲＰＭＩ−１６４０培養液中で通常の細胞培養を行い、０．２５％トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に１〜２回行い、継代比率を１：２〜１：６とした。
【０７１７】
３．１  動物モデルの構築
対数増殖期のＮＣＩ−Ｎ８７細胞を採取し、細胞数計測後に無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を１×１０8細胞／ｍＬに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を１ｍＬのシリンジで採取し、動物脳定位固定装置の補助により、マイクロインジェクション法でヒトグリオーマ細胞Ｕ８７ＭＧ細胞１μＬ（１×１０5細胞／匹）を生体外で培養し、同所性Ｕ８７ＭＧ脳グリオーマモデルを構築し、接種後に定期的に動物の状態観察した。接種後１２日目に、動物を２２５匹選択し、乱塊法により４５組に分けた（ｎ＝５）。
【０７１８】
３．２  投与製剤の調製
３．２．１  イリノテカン投与製剤の調製
１２．０ｍｇのイリノテカンを秤量し、０．１５ｍｌの１％乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに２．８５ｍｌの１％ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の１％乳酸、１％ソルビトール水溶液の比率を約５：９５（ｖ／ｖ）とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７１９】
３．２．２  ｎｋｔｒ−１０２投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、８８．５５ｍｇのｎｋｔｒ−１０２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７２０】
３．２．３  化合物１〜５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．８５ｍｇの化合物１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．８０ｍｇの化合物２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．８８ｍｇの化合物３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１１．２４ｍｇの化合物４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．７８ｍｇの化合物５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７２１】
３．２．４  化合物６〜１０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物６を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物７を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物８を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物９を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１０を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７２２】
３．２．５  化合物１１〜１５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１２．９８ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０８．９４ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．０１ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．３７ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０４．９１ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７２３】
３．２．６  化合物１６〜２０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７２４】
３．２．７  化合物２１〜４２投与製剤の調製
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７２５】
３．３  動物の群分け及び投与
動物の群分け及び投与態様は表９のとおりである。
【０７２６】
活性剤がイリノテカンである群（群１〜８）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１群は溶媒対照群であり、尾静脈注射によりブランク溶媒を４日に１回、合計で３回（Ｑ４Ｄ×３）投与した。第２〜８群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料であるイリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、化合物１〜５を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（イリノテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７２７】
活性剤がＳＮ−３８である群（群９〜１３）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第９〜１３群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物６〜１０を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（ＳＮ−３８含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７２８】
活性剤が１０−ヒドロキシカンプトテシンである群（群１４〜１８）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１４〜１８群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物１１〜１５を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（１０−ヒドロキシカンプトテシン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７２９】
活性剤がルビテカンである群（群１９〜２３）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１９〜２３群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物１６〜２０を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（ルビテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７３０】
群２４〜４５の投与態様は上記と同様である。
【０７３１】
【表９】
2019519508.tif 000235
【０７３２】
４．データ記録、計算公式
動物の生存時間を記録した。
【０７３３】
５．統計分析方法
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。２群の比較はｔ検定で行った。
【０７３４】
６．結果
表１０に示している。
【０７３５】
【表１０】
2019519508.tif 000236
【０７３６】
実験結果によれば、本発明の化合物は、グリオーマに対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かる。
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月14日(2018.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全体的に、マルチアームである水溶性ポリマー及び対応する薬物コンジュゲートに関する。より詳細には、本発明はマルチアームＰＥＧで修飾された標的抗がんコンジュゲートに関し、さらに詳細には、本発明は、マルチアームＰＥＧを介して、標的分子と抗がん薬物とを連結してなるコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生理活性物質の安定性及び送達を改善するための様々な方法が提案されている。医薬品用試薬の製造及び送達に関連する課題として、該医薬品用試薬の悪い水溶性、毒性、低いバイオアベイラビリティ、不安定さ、及び薬剤の迅速な生体内分解性が挙げられる。医薬品用試薬の送達を改善するために多くの方法が設計されているが、欠点のない単一の方法はない。例えば、通常使用される薬物送達方法は、リポソーム、ポリマーマトリックス、又は単分子ミセル内での薬物カプセル化、ポリエチレングリコールのような水溶性ポリマーへの共有結合、遺伝子標的化剤の使用、塩類の構造等のうちの少なくとも１つ又は複数の課題を解決することを目的とする。
【０００３】
ＷＯ２００５０２８５３９、ＷＯ２０１００１９２３３、ＷＯ２０１１０６３１５６、ＷＯ２０１１０６３１５８には、第ＩＩＩ相臨床試験段階の薬物であるｎｋｔｒ１０２が開示され、該薬物は主に転移性乳がんに用いられ、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに研究開発されたものである。該薬物は、薬物の担持を高めるための水溶性多分岐ポリマー薬物前駆体であり、その構造は下記のとおりである。
【０００４】
【化１】
2019519508.tif 000315
【０００５】
該化合物は、水溶性を高め、薬物担持量を増加させるように、マルチアームＰＥＧを介してイリノテカンと連結してなるものであり、抗がん作用が変わらない前提で副作用を低減する。しかし、該薬物は、例えば、標的指向性が悪く、特定のがん細胞に作用できず、がん細胞を殺すと同時に正常細胞の性能にも影響を与えることで、不良反応の発生率は依然として高いという欠点がある。
【０００６】
インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）は、細胞接着受容体分子であり、有核細胞表面全体に広く発現され、中でも、インテグリンαγβ3は、神経膠腫、メラノーマ、卵巣がん等の様々な腫瘍細胞及び腫瘍関連内皮細胞の表面に多く発現され、腫瘍の血管新生、腫瘍転移及び腫瘍の放射線治療耐性に緊密に関連しているため、インテグリンαγβ3は、腫瘍の標的化のための特異的な標的として用いられることが多い。研究により、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、ＲＧＤ）のトリペプチド配列は、αγサブユニットを含むインテグリンファミリーを特異的に認識でき、高い親和性を有することが示されている。
【０００７】
従来の腫瘍を治療するための薬物は、腫瘍組織に対する選択性に乏しく、毒性副作用が大きい等の欠点を有するものが多い。良好な薬物送達システムをどのように設計するかは、近年、広く研究されている。『腫瘍増殖が腫瘍血管に依存する理論』の提唱に伴い、腫瘍新生血管標的受容体薬物は、腫瘍治療効果を向上させるための新規且つ有望な方法になっている。インテグリンαγβ3は腫瘍標的治療の理想的な標的であり、そのリガンドＲＧＤペプチドは、エフェクター分子付けるものとして、インテグリンと特異的に結合することにより、腫瘍増殖及び血管新生を阻害することができる。
【０００８】
ＲＧＤペプチドとインテグリンのαγβ3との特異的な結合により、治療エフェクター分子を腫瘍部位に標的に導入でき、腫瘍治療中の正常組織細胞への損害を効果的に低減することができる。
【０００９】
線状ＲＧＤペプチドは生体内に広く存在するが、該ペプチドは体内循環中の半減期が短く、αγβ3受容体への親和力が低く、プロテアーゼに分解されやすい。一方、環状ＲＧＤペプチドは、安定性が高く、受容体との親和力が高く、且つ腫瘍浸透ペプチド特性を示すため、抗がん薬物の標的浸透への促進及び薬物の正常細胞への毒副作用の低減において顕著に優位性を示す。
【００１０】
ｉＲＧＤは、特許文献ＷＯ２００９１２６３４９に開示されており、その具体的な構造は以下のようである。
【００１１】
【化２】
2019519508.tif 000316
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、標的指向性を有する新たな多分岐薬物コンジュゲートに関するものであり、該コンジュゲートは、３つ以上の分岐を有すし、下記式で示される。
【００１３】
【化３】
2019519508.tif 000317
（Ｉ）
【００１４】
式中、Ｒは有機中心であり、ＰＯＬＹはポリマーであり、ＰＯＬＹはＸと共にポリマー分岐を構成する。
【００１５】
該多分岐薬物コンジュゲートの各分岐は、ほかの分岐とは相互に独立している。つまり、各分岐は異なるＰＯＬＹ、Ｘから構成されてもよい。典型的に、一般の構造は、
【００１６】
【化４】
2019519508.tif 000318
【００１７】
【化５】
2019519508.tif 000319
【００１８】
等に対応するものであり、残りはこれに基づき類推できる。各分岐は、有機中心である「Ｒ」から伸びるものである。なお、通常、該コンジュゲートの各分岐はすべて同じである。
【００１９】
以下、構造式（Ｉ）中の各変数について説明する。
【００２０】
有機中心である「Ｒ」
【００２１】
構造式（Ｉ）において、「Ｒ」は１〜１００個の原子を含む有機中心基である。好ましくは、Ｒは３〜５０個の原子を含み、より好ましくはＲは約３〜３０個の原子を含む。Ｒは、使用される特別な中心分子によって、炭素原子からなる中心基であってもよく、例えばＯ、Ｓ、Ｎ、Ｐ等のヘテロ原子を１個又は複数個選択的に含んでもよい。Ｒは直鎖、分岐又は環状のいずれであってもよく、少なくとも３つの独立したポリマー支鎖に分岐する。構造式（Ｉ）において、「ｑ」は、「Ｒ」から枝分かれしたポリマー支鎖の数に対応する。
【００２２】
有機中心「Ｒ」は、１つの分子から由来するものであり、該分子は、複数のポリマー結合部位を提供し、その数が、ポリマー支鎖の数にほぼ等しい。より好ましくは、多分岐ポリマー構造の主体中心分子式は、少なくともポリマー分岐として好適な、ヒドロキシ基、チオ基、又はアミノ基を有するポリヒドロキシ化合物、ポリスルフィド化合物、又はポリアミン化合物の残基を３つ以上有する。１つの「ポリヒドロキシ化合物」は、複数（２つ以上）の利用可能なヒドロキシ基を含有する分子である。１つの「ポリスルフィド化合物」は、複数（２つ以上）の利用可能なチオ基を含有する分子である。１つの「ポリアミン化合物」は、複数（２つ以上）の利用可能なアミン基を含有する分子である。ポリマー分岐数により、ポリヒドロキシ化合物、ポリアミン化合物又はポリスルフィド化合物の母体（ＰＯＬＹ共有結合の連結前）は、典型的にヒドロキシ基、チオ基又はアミン基を３〜２５個有し、より好ましくはヒドロキシ基、チオ基又はアミン基を３〜１０個有し、最も好ましくはＰＯＬＹ共有結合との連結に好適なヒドロキシ基、チオ基又はアミン基を３〜約８個（例えば３、４、５、６、７又は８）有する。
【００２３】
ポリヒドロキシ化合物又はポリアミン化合物中心の母体は、ポリマーと作用する前に、典型的には、構造式Ｒ−（ＯＨ）ｐ又はＲ−（ＮＨ2）ｐを１つ有する。構造式（Ｉ）中、ｐ値はｑ値に対応するものである。その理由は、母体有機分子中の各機能性基、典型的には−ＯＨ及び−ＮＨ2は、位置が影響されやすく、又は反応が発生しやすい場合、ポリマー分岐のＰＯＬＹ共有結合に連結するからである。構造式（Ｉ）中、ＰＯＬＹに連結した後、Ｒ母体のポリヒドロキシ化合物のヒドロキシ基はすべて１つのポリマー分岐に変化し、前記Ｒは連結後の残基である。例えば、有機中心分子がペンタエリスリトールから誘導された場合、ポリヒドロキシ化合物の母体は、構造式Ｃ（ＣＨ2ＯＨ）4を有し、有機中心基Ｒは下記で示される。
【００２４】
【化６】
2019519508.tif 000320
【００２５】
ポリマーの中心として好ましい例示的なポリヒドロキシ化合物は、例えば、エチレングリコール、アルカンジオール、ヒドロカルビルグリコール、アルキレンヒドロカルビルグリコール、ヒドロカルビルシクロアルキルグリコール、１，５−ナフチレングリコール、４，８−ビス（ヒドロキシメチル）トリシクロデカン、シクロアルキレングリコール、ジヒドロキシアルカン、トリヒドロキシアルカン、テトラヒドロキシアルカン等の１〜１０個の炭素原子及び１〜１０個のヒドロキシ基を有する脂肪族ポリヒドロキシ化合物が挙げられる。脂環式ポリヒドロキシ化合物は、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、キシリトール、ロイコシド、トレイトール、アラビトール、エリスリトール、ヘキサヘキサノール、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、ソルボース、マンノース、ピラノース、アルトロース、タロース、タガトース、ピラノシド、スクロース、ラクトース、マルトース等の直鎖状又は閉環式の糖類及び糖アルコールが挙げられる。また、カテコール、ヒドロカルビルカテコール、ピロガロール、フロログルシンフェノール、１，２，４−ベンゼントリオール、レゾルシン、ヒドロカルビルレゾルシン、ジヒドロカルビルレゾルシン、オルシノール一水和物、オリーブフェノール、ヒドロキノン、ヒドロカルビルヒドロキノン、フェニルヒドロキノン等の芳香族ポリヒドロキシ化合物を使用することがもできる。ほかに使用できるポリヒドロキシル化合物中心は、クラウンエーテル、シクロデキストリン、デキストリン、又はほかの炭水化物を含み得る。
【００２６】
構造式（Ｉ）中、ｑは、対応する「Ｒ」に連結しているポリマー分岐の個数を示し、具体的に３〜２０であってもよい。典型的に、「ｑ」の具体的な数字が３、４、５、６、７、８である。具体的に、「Ｒ」を中心として３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つのポリマー支鎖に分岐する。
【００２７】
一部の実施の形態において、「Ｒ」は３つのポリマー分岐を有し、「Ｒ」は好ましくは、
【００２８】
【化７】
2019519508.tif 000321
【００２９】
である。
【００３０】
一部の実施の形態において、「Ｒ」は４つのポリマー分岐を有し、「Ｒ」は好ましくは、
【００３１】
【化８】
2019519508.tif 000322
【００３２】
である。
【００３３】
一部の実施の形態において、「Ｒ」は６つのポリマー分岐を有し、「Ｒ」は好ましくは、
【００３４】
【化９】
2019519508.tif 000323
【００３５】
である。
【００３６】
一部の実施の形態において、「Ｒ」は８つのポリマー分岐を有し、「Ｒ」は好ましくは、
【００３７】
【化１０】
2019519508.tif 000324
【００３８】
である。
【００３９】
ポリマー、「ＰＯＬＹ」
【００４０】
構造式（Ｉ）中、「ＰＯＬＹ」はポリマーであり、Ｘと一緒になってポリマー分岐を構成する。各ポリマー分岐におけるＰＯＬＹは独立して選択されるものであり、好ましくは各ポリマーは同じポリマーであり、より好ましくは各構造式（Ｉ）中のポリマー分岐は同じである。好ましいポリマーは水溶性であり、任意の水溶性ポリマーを本発明のコンジュゲートの形成に使用できる。本発明でいうポリマーは、任意の幾何学的形態又は形状であってもよい。代表的なポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリル酸アミン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリサッカライド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリアクリル酸、ポリ酢酸ビニル、ポリフォスファジン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）等を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
典型的な化合物としては、「ＰＯＬＹ」はポリエチレングリコールであり、直鎖、分岐、フォーク型等の任意の幾何学的形態又は形状であってもよい。より好ましくは、「ＰＯＬＹ」は線状ポリエチレングリコールである。典型的な構造は、
【００４２】
【化１１】
2019519508.tif 000325
【００４３】
であり、「
2019519508.tif 000326
」は、原子の結合点を示し、アスタリスク付きの酸素原子は、有機中心「Ｒ」と結合する原子である。ただし、ｎの数値範囲は約５〜５００であり、最も好ましくは５０〜２００であり、好ましくは１１３とする。平均分子量は約１ｋ〜６０ｋＤａである。
【００４４】
この分野の技術者は、高分子分野では、ｎが前記ポリマーの重合度、つまり、ポリマーの高分子鎖に含まれる繰り返し単位数の平均値を表し、前記ポリマーの分子量により決められ、例えば、ｎが１１３であるとき、平均値が１１３を意味すると理解されるべきである。
【００４５】
前記ポリエチレングリコール構造は通常、さらに一部の末端部分残基を含有し、ＰＯＬＹの末端基に類似するように、Ｈ、ＮＨ2、ＯＨ、ＣＯ2Ｈ、Ｃ1-6アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基）、Ｃ1-6アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基）、アシル基、又はアリール基を末端とすることができる。例えば、ＰＯＬＹは、
【００４６】
【化１２】
2019519508.tif 000327
【００４７】
であってもよい。
【００４８】
通常の市販マルチアームポリエチレングリコールは、このような末端部分を有し、ＰＯＬＹとＸとがポリマー分岐に連結した際に、例えばヒドロキシ基等の末端部分基が反応し、上記末端部分残基の形で現れる。
【００４９】
前記ポリマーは高分岐のポリマーであってもよい。典型的な構造は、デンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）である。このようなポリマーとは、すべての結合が中央収束点又はコアから径方向に延び、分枝が規則的であり、且つそれぞれが分枝点となる繰り返し単位を有する球状のサイズ単分散ポリマーである。デンドリマーは、他の種類のポリマーには見られない独自の特性を与える、コアカプセル化等の特定の樹状特性を示す。
【００５０】
ＰＯＬＹは、樹状（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）のポリエチレングリコール結合アームであってもよく、典型的な構造は以下のとおりである。
【００５１】
【化１３】
2019519508.tif 000328
【００５２】
「
2019519508.tif 000329
」は、同じように樹状に拡散していることを示す。
【００５３】
ポリマー分岐の組成部分、Ｘ
【００５４】
構造式（Ｉ）中、「Ｘ」は「ＰＯＬＹ」と一緒になってポリマー分岐を構成する。Ｘとしては、以下の４つの形態が挙げられる。
【００５５】
１）Ｘは、その末端に、比較的非反応性の基、又は未反応の基を１つ有するものである。この場合、「Ｘ」は何の活性剤も含まず、反応し難い基である。通常はアルコキシ基（−ＯＱ）であり、ただし、Ｑが通常炭素数１〜２０の、最も好ましくはＣ1-6の低級アルキル基又はフェニル基のような有機基である。「Ｘ」は、飽和又は不飽和であってもよく、アリール基、ヘテロアリール基、環状化合物、複素環式化合物及びこれらのいずれかの置換形を含む。
【００５６】
２）Ｘは、（Ｌ）−（Ｔ）ｎ’で表される。Ｌは多価リンカーを表し、Ｔは標的分子を表し、ｎ’は１以上の整数を表す。リンカーＬは、互いに共有結合した複数のリンカーを含んでいてもよい。例えば、多価リンカーＬは、１つ以上のスペーサーリンカーＬｓ及び／又は難分解性リンカーＬｎを含有し、互いに接続させることができる。難分解性リンカーＬｎはＴに接続される。これら異なるリンカーを選択し、任意の順番で並べ、多価リンカーＬを構築することができる。例えば、多価リンカーＬは、以下の１つ以上の２価リンカーから構築されることができる。
【００５７】
【化１４】
2019519508.tif 000330
【００５８】
式中、ａ及びｂは整数、例えば０〜５の整数である。いくつかのＬｓを、直鎖、分岐、末端分岐等に連結することができる。Ｌｓは存在しなくてもよく、ＬｎによりＰＯＬＹとＴを直接的に連結してもよい。
【００５９】
多価リンカーによりＰＯＬＹとＴを様々な構造配置で連結することができ、下記例示的な一般式を含むが、これらに限定されないと理解されるべきである。
【００６０】
【化１５】
2019519508.tif 000331
【００６１】
【化１６】
2019519508.tif 000332
【００６２】
【化１７】
2019519508.tif 000333
【００６３】
【化１８】
2019519508.tif 000334
【００６４】
【化１９】
2019519508.tif 000335
【００６５】
【化２０】
2019519508.tif 000336
【００６６】
【化２１】
2019519508.tif 000337
【００６７】
【化２２】
2019519508.tif 000338
【００６８】
【化２３】
2019519508.tif 000339
【００６９】
式中、Ｌｓ1、Ｌｓ2、Ｌｓ3、Ｌｓ4はそれぞれスペーサーリンカーであり、同一でも異なっていてもよい。Ｌｎ1、Ｌｎ2、Ｌｎ3、Ｌｎ4はそれぞれ難分解性リンカーであり、同一でも異なっていてもよい。Ｔ1、Ｔ2、Ｔ3はそれぞれ標的分子であり、同一でも異なっていてもよく、より好ましくはＴ1、Ｔ2、Ｔ3は同じ標的分子である。
【００７０】
３）Ｘは（Ｌ）−（Ｄ）ｎ’で表される。Ｌは多価リンカーを表し、Ｄは活性剤を表し、ｎ’は１以上の整数を表す。多価リンカーＬは、互いに共有結合した複数のリンカーを含んでいてもよい。例えば、多価リンカーＬは、１つ以上のスペーサーリンカーＬｓ、及び／又は分離可能なリンカーＬｒを含有し、互いに連結することができる。分離可能なリンカーＬｒはＤに連結される。これら異なるリンカーを選択し、任意の順番で並べ、多価リンカーＬを構築することができる。例えば、多価リンカーＬは、以下の１つ以上の２価リンカーから構築されることができる。
【００７１】
【化２４】
2019519508.tif 000340
【００７２】
式中、ａ及びｂは整数、例えば０〜５の整数である。複数のＬｓを、直鎖、分岐、末端分岐等に連結することができる。Ｌｓは存在しなくてもよく、ＬｒによりＰＯＬＹとＤを直接的に連結してもよい。
【００７３】
多価リンカーによりＰＯＬＹとＤを様々な構造配置で連結することができ、下記例示的な一般式で示す構造を含むが、これらに限定されないと理解されるべきである。
【００７４】
【化２５】
2019519508.tif 000341
【００７５】
【化２６】
2019519508.tif 000342
【００７６】
【化２７】
2019519508.tif 000343
【００７７】
【化２８】
2019519508.tif 000344
【００７８】
【化２９】
2019519508.tif 000345
【００７９】
【化３０】
2019519508.tif 000346
【００８０】
【化３１】
2019519508.tif 000347
【００８１】
【化３２】
2019519508.tif 000348
【００８２】
【化３３】
2019519508.tif 000349
【００８３】
式中、Ｌｓ1、Ｌｓ2、Ｌｓ3、Ｌｓ4はそれぞれスペーサーリンカーであり、同一でも異なっていてもよい。Ｌｒ1、Ｌｒ2、Ｌｒ3、Ｌｒ4はそれぞれ分離可能なリンカーであり、同一でも異なっていてもよい。Ｄ1、Ｄ2、Ｄ3はそれぞれ活性剤であり、同一でも異なっていてもよく、より好ましくはＤ1、Ｄ2、Ｄ3は同じ活性剤である。
【００８４】
４）Ｘは多価リンカーＬ、標的分子Ｔ、活性剤Ｄからなる。この形態は本発明の最も好ましい形態である。
【００８５】
この形態では、Ｘは（Ｔ）ｎ’−（Ｌ）−（Ｄ）ｎ’で表される。Ｌは多価リンカーを表し、Ｄは活性剤を表し、ｎ’は１以上の整数を表す。多価リンカーＬは、互いに共有結合した複数のリンカーを含んでいてもよい。例えば、多価リンカーＬは、１つ以上のスペーサーリンカーＬｓ、難分解性リンカーＬｎ、分離可能なリンカーＬｒを含有し、互いに連結することができる。難分解性リンカーＬｎはＴに連結され、分離可能なリンカーＬｒはＤに連結される。これら異なるリンカーを選択し、任意の順番で並べることができる。複数のＬｓを、直鎖、分岐、末端分岐等に連結することができる。Ｌｓは存在しなくてもよく、ＰＯＬＹはＬｎ又はＬｒによりＴ及びＤと直接的に連結してもよい。
【００８６】
多価リンカーによりＰＯＬＹ、Ｔ及びＤを様々な構造配置で連結することができ、下記例示的な一般式を含むが、これらに限定されないと理解されるべきである。
【００８７】
【化３４】
2019519508.tif 000350
【００８８】
【化３５】
2019519508.tif 000351
【００８９】
【化３６】
2019519508.tif 000352
【００９０】
【化３７】
2019519508.tif 000353
【００９１】
【化３８】
2019519508.tif 000354
【００９２】
【化３９】
2019519508.tif 000355
【００９３】
【化４０】
2019519508.tif 000356
【００９４】
【化４１】
2019519508.tif 000357
【００９５】
【化４２】
2019519508.tif 000358
【００９６】
式中、Ｌｓ1、Ｌｓ2はそれぞれスペーサーリンカーであり、同一でも異なっていてもよい。Ｌｒ1、Ｌｒ2はそれぞれ分離可能なリンカーであり、同一でも異なっていてもよい。Ｄ1、Ｄ2はそれぞれ活性剤であり、同一でも異なっていてもよく、より好ましくはＤ1、Ｄ2は同じ活性剤である。Ｔ1、Ｔ2はそれぞれ標的分子であり、同一でも異なっていてもよく、より好ましくはＴ1、Ｔ2は同じ標的分子である。Ｘは、標的分子Ｔを１〜３０個含むことができ、より好ましくは標的分子Ｔを１〜５個含む。また、活性剤Ｄを１〜３０個含むことができ、より好ましくは活性剤Ｄを１〜５個含む。ＴとＤの個数比は１〜５：５〜１、例えば１：１、１：２、１：３、２：１、３：１等であってもよく、より好ましくはＴとＤの個数比は１：１である。
【００９７】
以上の多価リンカーによりＰＯＬＹ、Ｔ及びＤを連結する形態の中、最も好ましい形態は、
【００９８】
【化４３】
2019519508.tif 000359
【００９９】
である。
【０１００】
この形態では、ＴとＤの個数比は１：１である。
【０１０１】
つまり、本発明の最も好ましい薬物コンジュゲートは下記式で表される。
【０１０２】
【化４４】
2019519508.tif 000360
【０１０３】
以下、最も好ましい形態である式（ＩＩＩ）を例として、本発明の薬物コンジュゲートを詳しく説明する。
【０１０４】
式（ＩＩＩ）中、Ｌｓ、Ｌｎ、Ｌｒが互いに連結して多価リンカーＬを形成し、例えば多価３−チオ又は３−ジチオアリールアルコキシカルボニル、３−チオ又は３−ジチオアリールアルキルアミノカルボニル、多価３−チオ又は３−ジチオアルコキシカルボニル又は多価３−チオ又は３−ジチオアルキルアミノカルボニル等になる。ＬとＤは切断可能な結合を形成し、ＬとＴは加水分解に対して比較的安定な化学結合を形成する。
【０１０５】
以下は典型的な多価リンカーＬである。
【０１０６】
【化４５】
2019519508.tif 000361
【０１０７】
【化４６】
2019519508.tif 000362
【０１０８】
【化４７】
2019519508.tif 000363
【０１０９】
【化４８】
2019519508.tif 000364
【０１１０】
【化４９】
2019519508.tif 000365
【０１１１】
式中、記号「＊」は、多価リンカーＬと標的分子Ｔとの結合点を示し、「＃」は、多価リンカーＬと活性剤Ｄとの結合点を示し、「％」は、多価リンカーＬとＰＯＬＹとの結合点を示す。ｍ、ｍ’はそれぞれ１〜２０の任意の整数であり、ｌ、ｋはそれぞれ１〜１０の任意の整数である。
【０１１２】
なお、上記典型的な多価リンカーにおける「難分解性リンカー」の中、加水分解しにくいＳ−Ｃ結合は、標的分子Ｔと難分解性リンカー共有結合が反応してなるものであり、典型的な化合物では、原子Ｓは標的分子Ｔに由来する。
【０１１３】
以上の例示は、「難分解性リンカー」の典型的な例に過ぎず、本発明の化合物における難分解性リンカーの選択はこれらに限定されない。
【０１１４】
以上の例示は、「Ｌ」の典型的な例に過ぎず、本発明の化合物における「Ｌ」の選択はこれらに限定されない。一部の好ましい実施の形態では、「Ｌ」は、
【０１１５】
【化５０】
2019519508.tif 000366
【０１１６】
である。
【０１１７】
本発明でいうスペーサーリンカーＬｓとは、分離可能なリンカーＬｒと難分解性リンカーＬｎとを互いに連結するための一連の原子であり、且つＰＯＬＹとの連結に用いられる。
【０１１８】
１つの実施の形態では、多価リンカーＬは、少なくとも１つの、アミノ酸からなるペプチドスペーサーリンカーを含有する。前記アミノ酸は、独立して天然アミノ酸及び非天然α−アミノ酸から選択される。もう１つの実施の形態では、前記多価リンカーＬは、１〜４０個のアミノ酸を含んでなるペプチドスペーサーリンカーを含有する。前記アミノ酸は天然アミノ酸であることが好ましい。さらに、前記多価リンカーＬは、１〜２０個のアミノ酸を含んでなるペプチドスペーサーリンカーを含有し、さらに、前記Ｌは、好ましくは１０〜１５個のアミノ酸を含んでなるペプチドスペーサーリンカーを含有する。さらに、Ｌは、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、オルニチン、システイン、リジン、アスパラギン、アルギニン、スレオニン、グルタミン酸、セリン、シトルリン、バリン及びグルタミンからなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸を含有する。
【０１１９】
さらに、前記Ｌは、好ましくは１個又は複数個の、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、オルニチン、システイン、シトルリン、バリン及びリジン並びにそれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸からなる、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチド及びドデカペプチドのスペーサーリンカーを含有する。
【０１２０】
本明細書で記載する「分離可能なリンカー」は、切断可能なリンカーとも呼ばれており、少なくとも１つの生理学的条件下で切断可能な結合（例えば、ｐＨ不安定、酸不安定、酸化しやすい又は酵素不安定な結合）を含有するリンカーを指す。結合の切断をもたらすこのような生理学的条件は、例えば生理的ｐＨで発生する標準化学加水分解反応、又は細胞小器官、例えば細胞質ｐＨよりも低いｐＨを有するエンドソームに区画化されたことに起因し、生体内のタンパク加水分解酵素、エステラーゼ、コリンエステラーゼ、ホスホモノエステラーゼ、ヌクレアーゼ、スルファターゼ等による加水分解を含む。
【０１２１】
本明細書で記載する切断可能な結合は、単独で分離可能なリンカーに存在するものではなく、分離可能なリンカーと活性剤Ｄとが共有結合した後の結合部分であり、切断可能な結合は、分離可能なリンカーと活性剤Ｄとの隣接する原子を連結し、結合の切断後に、分離可能なリンカーは２個又は複数個の断片に切断され、切断可能な結合の切断後、活性剤Ｄが放出され、母体から分離し、生理活性を発揮すると理解されるべきである。
【０１２２】
本明細書で記載する活性剤Ｄは、分離可能なリンカーと共有結合して１個の切断可能な結合を形成することに適する活性剤を含む部分であると理解されるべきである。このため、切断可能な結合が切断した場合、活性剤Ｄは改良されておらず、つまり、共有結合に形成されていない形態で放出される。Ｄの選択、及びコンジュゲートで分離可能なリンカーと切断可能な結合を形成することについて、以下に詳述する。
【０１２３】
切断可能な結合は、生理的条件下で水と反応する（つまり、加水分解される）ことができる比較的に弱い１つの結合である。１つの結合が水中で加水分解する傾向は、２つの中心原子の連結種類のみに決められるのではなく、これらの中心原子に連結した置換基にも関係している。典型的な加水分解に不安定な連結基は、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエステル、イミン、オルトエステル、ペプチド、オリゴヌクレオチド等を含む。
【０１２４】
本明細書で記載する活性剤「Ｄ」は、非変性母体活性剤の一部又は薬物と、本発明の多価リンカーとが共有結合して生成する共有結合鎖（或いはその活性化又は化学変性の形態）の前の未変性母体活性剤の残基である。活性剤部分と多価リンカーとの間の連結基が加水分解又は酵素分解された時、活性剤自体は放出される。
【０１２５】
本発明の目的によれば、技術用語「残基」は、化合物の一部であり、もう１つの化合物と置換反応した後の残留物であると理解されるべきである。
【０１２６】
本明細書で記載する活性剤、活性剤「Ｄ」は、カンプトテシン系抗がん剤であり、カンプトテシン系薬物は、臨床で用いられるトポイソメラーゼＩ阻害剤であり、高活性でありながら、水溶性が悪く、正常な生体組織への毒性副作用が大きい等の欠点を有するため、カンプトテシン系抗がん剤の臨床応用が大いに制限されている。
【０１２７】
Ｄは下記式で示されるカンプトテシン系薬物である。
【０１２８】
【化５１】
2019519508.tif 000367
【０１２９】
式中、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アシル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アジド基、アミド基、ヒドラジン、アミン基、置換アミン基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基等からなる群より選択され、Ｒ6は、Ｈ又はＯＲ8であり、Ｒ8は、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、又はヒドロキシアルキル基であり、Ｒ7は、分離可能なリンカーの共有結合に連結する位置であり、好ましくはヒドロキシ基である。
【０１３０】
本明細書に適するカンプトテシン系抗がん剤に対する唯一な制限は、化学反応できる（つまり、多価リンカーと共有結合する）少なくとも１つの官能基を有すること、例えばアミノ基、ヒドロキシ基、又はメルカプタンが構造式（Ｉ）の化合物に連結し、且つ本明細書に記載の構造式（Ｉ）の化合物にカップリングする際に、生物学的活性の有意な損失を有しないことである。
【０１３１】
また、活性剤「Ｄ」はカンプトテシン系抗がん剤であり、好ましくはイリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカンである。
【０１３２】
そのうち、イリノテカンの構造は以下のとおりである。
【０１３３】
【化５２】
2019519508.tif 000368
【０１３４】
ＳＮ−３８の構造は以下のとおりである。
【０１３５】
【化５３】
2019519508.tif 000369
【０１３６】
１０−ヒドロキシカンプトテシンの構造は以下のとおりである。
【０１３７】
【化５４】
2019519508.tif 000370
【０１３８】
ルビテカンの構造は以下のとおりである。
【０１３９】
【化５５】
2019519508.tif 000371
【０１４０】
ヒドロキシ基は、分離可能なリンカーと切断可能なエステル結合を形成することができる。
【０１４１】
本明細書で記載する「難分解性リンカー」とは、少なくとも１つの生理学的条件下で、加水分解に対して比較的安定な化学結合、特に共有結合を有し、つまり、生理学的条件下で長期間に亘っても顕著な加水分解が一切発生しないものを指す。加水分解に安定的な連結基の実例は、炭素−炭素結合（例えば脂肪鎖中）、炭素−硫黄結合、ジスルフィド結合、エステル結合、アミド結合、ポリウレタン及びその類似物等を含むが、これらに限定されない。通常、加水分解に安定的な結合は、生理学的条件下での加水分解速度が約１〜２％未満である。
【０１４２】
本発明では、「Ｔ」は標的分子であり、医薬用途を有しても有しなくてもよい。該標的分子の作用は、該コンジュゲートの目標組織における濃度をさらに高め、生理活性又は医薬用途を向上させるように、標的指向性を向上させることである。「Ｔ」は単機能標的分子であってもよく、多機能標的分子であってもよい。また、「Ｔ」は、さらに２個以上の標的分子からなる標的部分であってもよい。一部の具体的な実施の形態において、「Ｔ」は、「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」配列を含むＲＧＤペプチドであってもよい。ＲＧＤペプチドは、インテグリンとその受容体タンパク質とが相互作用する認識部位である。好ましいＲＧＤペプチドとして、ｉＲＧＤ及びｃＲＧＤ等が挙げられる。
【０１４３】
ｉＲＧＤの構造は以下のとおりである。
【０１４４】
【化５６】
2019519508.tif 000372
【０１４５】
ｃＲＧＤは一連の化合物であり、典型的な化合物は下記を含む。
【０１４６】
【化５７】
2019519508.tif 000373
【０１４７】
ほかの好ましい標的分子として、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、ＧＥ１１、又は葉酸が挙げられる。
【０１４８】
ｔＬｙｐ−１の構造は以下のとおりである。
【０１４９】
【化５８】
2019519508.tif 000374
【０１５０】
Ｌｙｐ−１の構造は以下のとおりである。
【０１５１】
【化５９】
2019519508.tif 000375
【０１５２】
ＲＰＡＲＰＡＲのポリペプチド配列は、アルギニン−プロリン−アラニン−アルギニン−プロリン−アラニン−アルギニンである。なお、多価リンカーＬと連結する必要があるため、製造時に、システインを用いてＲＰＡＲＰＡＲをＬと連結する必要がある。したがって、具体的な化合物では、ＣＲＰＡＲＰＡＲとして現れる。
【０１５３】
Ａｎｇｉｏｐｅｐ２のポリペプチド配列は、ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹであり、その構造は以下のとおりである。
【０１５４】
【化６０】
2019519508.tif 000376
【０１５５】
ＧＥ１１のポリペプチド配列は、ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩであり、その構造は以下のとおりである。
【０１５６】
【化６１】
2019519508.tif 000377
【０１５７】
葉酸の構造は以下のとおりである。
【０１５８】
【化６２】
2019519508.tif 000378
【０１５９】
本発明の好ましい実施の形態では、「ＰＯＬＹ」は、線状ポリエチレングリコール結合アームであり、つまり、本発明のコンジュゲートは、下記いくつかの種類の化合物を含む。
【０１６０】
３アーム：
【０１６１】
【化６３】
2019519508.tif 000379
【０１６２】
【化６４】
2019519508.tif 000380
【０１６３】
４アーム：
【０１６４】
【化６５】
2019519508.tif 000381
【０１６５】
【化６６】
2019519508.tif 000382
【０１６６】
８アーム：
【０１６７】
【化６７】
2019519508.tif 000383
【０１６８】
【化６８】
2019519508.tif 000384
【０１６９】
なお、上記好ましい実施の形態において、線状ポリエチレングリコールは、
【０１７０】
【化６９】
2019519508.tif 000385
【０１７１】
である。
【０１７２】
しかし、本発明は該線状ポリエチレングリコールに制限されることがなく、その代わりに、例えば、下記式で示すほかの線状ポリエチレングリコール等を使用することもできる。
【０１７３】
【化７０】
2019519508.tif 000386
【０１７４】
本発明の好ましい実施の形態において、Ｒは、炭素数５の
【０１７５】
【化７１】
2019519508.tif 000387
【０１７６】
であり、つまり、本発明のコンジュゲートは下記のとおりである。
【０１７７】
【化７２】
2019519508.tif 000388
（ＩＶ）
【０１７８】
式（ＩＶ）において、ｎは５〜５００であり、好ましくは５〜５００であり、最も好ましくは１１３である。より好ましい実施の形態において、本発明のコンジュゲートの標的部分「Ｔ」は、ｉＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、ｃＲＧＤ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、ＧＥ１１、又は葉酸からなる群より選択される１種であり、活性剤「Ｄ」は、イリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカンからなる群より選択される１種である。
【０１７９】
本発明のコンジュゲートのいかなる形状も本発明に含まれており、これらの形状はその中の活性剤、標的分子及び様々な多価リンカーの結合形態により決められる。一側面において、本発明のコンジュゲートの全体的な３次元形状は線形である。別の一側面において、本明細書に記載のコンジュゲートは、３次元形状が「Ｘ」状又は十字状であることが好ましい。
【０１８０】
本発明のもう１つの好ましい実施の形態において、Ｒは、炭素数４の
【０１８１】
【化７３】
2019519508.tif 000389
【０１８２】
であり、つまり、本発明のコンジュゲートは下記のとおりである。
【０１８３】
【化７４】
2019519508.tif 000390
（Ｖ）
【０１８４】
式（Ｖ）において、ｎは５〜５００であり、好ましくは５〜５００であり、最も好ましくは１１３である。より好ましい実施の形態において、本発明のコンジュゲートの標的部分「Ｔ」は、ｉＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、ｃＲＧＤ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、ＧＥ１１、又は葉酸からなる群より選択される１種であり、活性剤「Ｄ」は、イリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカンからなる群より選択される１種である。
【０１８５】
本発明の第３の好ましい実施の形態において、本発明のコンジュゲートは下記のとおりである。
【０１８６】
【化７５】
2019519508.tif 000391
（ＶＩ）
【０１８７】
式（ＶＩ）において、ｎは５〜５００であり、好ましくは５〜５００であり、最も好ましくは１１３である。この分野の技術者は、高分子分野では、ｎが前記ポリマーの重合度、つまり、ポリマーの高分子鎖に含まれる繰り返し単位数の平均値を表し、前記ポリマーの分子量により決められ、例えば、ｎが１１３であるとき、平均値が１１３を意味すると理解されるべきである。
【０１８８】
より好ましい実施の形態において、本発明のコンジュゲートの標的部分「Ｔ」は、ｉＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、ｃＲＧＤ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、ＧＥ１１、又は葉酸からなる群より選択される１種であり、活性剤「Ｄ」は、イリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカンからなる群より選択される１種である。
【０１８９】
式（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）に基づき、一部の実施の形態において、本発明の化合物は以下のとおりである。
【０１９０】
化合物１：Ｄはイリノテカンであり、ＴはｉＲＧＤである。
【０１９１】
【化７６】
2019519508.tif 000392
【０１９２】
化合物２：Ｄはイリノテカンであり、ＴはｔＬｙｐ−１である。
【０１９３】
【化７７】
2019519508.tif 000393
【０１９４】
化合物３：Ｄはイリノテカンであり、ＴはＬｙｐ−１である。
【０１９５】
【化７８】
2019519508.tif 000394
【０１９６】
化合物４：Ｄはイリノテカンであり、ＴはＲＰＡＲＰＡＲである。
【０１９７】
【化７９】
2019519508.tif 000395
【０１９８】
化合物５：Ｄはイリノテカンであり、ＴはｃＲＧＤである。
【０１９９】
【化８０】
2019519508.tif 000396
【０２００】
化合物６：ＤはＳＮ−３８であり、ＴはｉＲＧＤである。
【０２０１】
【化８１】
2019519508.tif 000397
【０２０２】
化合物７：ＤはＳＮ−３８であり、ＴはｔＬｙｐ−１である。
【０２０３】
【化８２】
2019519508.tif 000398
【０２０４】
化合物８：ＤはＳＮ−３８であり、ＴはＬｙｐ−１である。
【０２０５】
【化８３】
2019519508.tif 000399
【０２０６】
化合物９：ＤはＳＮ−３８であり、ＴはＲＰＡＲＰＡＲである。
【０２０７】
【化８４】
2019519508.tif 000400
【０２０８】
化合物１０：ＤはＳＮ−３８であり、ＴはｃＲＧＤである。
【０２０９】
【化８５】
2019519508.tif 000401
【０２１０】
化合物１１：Ｄは１０−ヒドロキシカンプトテシンであり、ＴはｉＲＧＤである。
【０２１１】
【化８６】
2019519508.tif 000402
【０２１２】
化合物１２：Ｄは１０−ヒドロキシカンプトテシンであり、ＴはｔＬｙｐ−１である。
【０２１３】
【化８７】
2019519508.tif 000403
【０２１４】
化合物１３：Ｄは１０−ヒドロキシカンプトテシンであり、ＴはＬｙｐ−１である。
【０２１５】
【化８８】
2019519508.tif 000404
【０２１６】
化合物１４：Ｄは１０−ヒドロキシカンプトテシンであり、ＴはＲＰＡＲＰＡＲである。
【０２１７】
【化８９】
2019519508.tif 000405
【０２１８】
化合物１５：Ｄは１０−ヒドロキシカンプトテシンであり、ＴはｃＲＧＤである。
【０２１９】
【化９０】
2019519508.tif 000406
【０２２０】
化合物１６：Ｄはルビテカンであり、ＴはｉＲＧＤである。
【０２２１】
【化９１】
2019519508.tif 000407
【０２２２】
化合物１７：Ｄはルビテカンであり、ＴはｔＬｙｐ−１である。
【０２２３】
【化９２】
2019519508.tif 000408
【０２２４】
化合物１８：Ｄはルビテカンであり、ＴはＬｙｐ−１である。
【０２２５】
【化９３】
2019519508.tif 000409
【０２２６】
化合物１９：Ｄはルビテカンであり、ＴはＲＰＡＲＰＡＲである。
【０２２７】
【化９４】
2019519508.tif 000410
【０２２８】
化合物２０：Ｄはルビテカンであり、ＴはｃＲＧＤである。
【０２２９】
【化９５】
2019519508.tif 000411
【０２３０】
化合物２１：
【０２３１】
【化９６】
2019519508.tif 000412
【０２３２】
化合物２２：
【０２３３】
【化９７】
2019519508.tif 000413
【０２３４】
化合物２３：
【０２３５】
【化９８】
2019519508.tif 000414
【０２３６】
式中、Ｒは、
【０２３７】
【化９９】
2019519508.tif 000415
【０２３８】
である。
【０２３９】
化合物２４：
【０２４０】
【化１００】
2019519508.tif 000416
【０２４１】
式中、Ｒは、
【０２４２】
【化１０１】
2019519508.tif 000417
【０２４３】
である。
【０２４４】
化合物２５：
【０２４５】
【化１０２】
2019519508.tif 000418
【０２４６】
式中、Ｒは、
【０２４７】
【化１０３】
2019519508.tif 000419
【０２４８】
である。
【０２４９】
化合物２６：
【０２５０】
【化１０４】
2019519508.tif 000420
【０２５１】
式中、Ｒは、
【０２５２】
【化１０５】
2019519508.tif 000421
【０２５３】
である。
【０２５４】
化合物２７：
【０２５５】
【化１０６】
2019519508.tif 000422
【０２５６】
式中、Ｒは、
【０２５７】
【化１０７】
2019519508.tif 000423
【０２５８】
である。
【０２５９】
化合物２８：
【０２６０】
【化１０８】
2019519508.tif 000424
【０２６１】
式中、Ｒは、
【０２６２】
【化１０９】
2019519508.tif 000425
【０２６３】
である。
【０２６４】
化合物２９：
【０２６５】
【化１１０】
2019519508.tif 000426
【０２６６】
式中、Ｒは、
【０２６７】
【化１１１】
2019519508.tif 000427
【０２６８】
である。
【０２６９】
化合物３０：
【０２７０】
【化１１２】
2019519508.tif 000428
【０２７１】
式中、Ｒは、
【０２７２】
【化１１３】
2019519508.tif 000429
【０２７３】
である。
【０２７４】
化合物３１：
【０２７５】
【化１１４】
2019519508.tif 000430
【０２７６】
式中、Ｒは、
【０２７７】
【化１１５】
2019519508.tif 000431
【０２７８】
である。
【０２７９】
化合物３２：
【０２８０】
【化１１６】
2019519508.tif 000432
【０２８１】
式中、Ｒは、
【０２８２】
【化１１７】
2019519508.tif 000433
【０２８３】
である。
【０２８４】
化合物３３：
【０２８５】
【化１１８】
2019519508.tif 000434
【０２８６】
式中、Ｒは、
【０２８７】
【化１１９】
2019519508.tif 000435
【０２８８】
である。
【０２８９】
化合物３４：
【０２９０】
【化１２０】
2019519508.tif 000436
【０２９１】
式中、Ｒは、
【０２９２】
【化１２１】
2019519508.tif 000437
【０２９３】
である。
【０２９４】
化合物３５：
【０２９５】
【化１２２】
2019519508.tif 000438
【０２９６】
式中、Ｒは、
【０２９７】
【化１２３】
2019519508.tif 000439
【０２９８】
である。
【０２９９】
化合物３６：
【０３００】
【化１２４】
2019519508.tif 000440
【０３０１】
式中、Ｒは、
【０３０２】
【化１２５】
2019519508.tif 000441
【０３０３】
である。
【０３０４】
化合物３７：
【０３０５】
【化１２６】
2019519508.tif 000442
【０３０６】
式中、Ｒは、
【０３０７】
【化１２７】
2019519508.tif 000443
【０３０８】
である。
【０３０９】
化合物３８：
【０３１０】
【化１２８】
2019519508.tif 000444
【０３１１】
式中、Ｒは、
【０３１２】
【化１２９】
2019519508.tif 000445
【０３１３】
である。
【０３１４】
化合物３９：
【０３１５】
【化１３０】
2019519508.tif 000446
【０３１６】
式中、Ｒは、
【０３１７】
【化１３１】
2019519508.tif 000447
【０３１８】
である。
【０３１９】
化合物４０：
【０３２０】
【化１３２】
2019519508.tif 000448
【０３２１】
式中、Ｒは、
【０３２２】
【化１３３】
2019519508.tif 000449
【０３２３】
である。
【０３２４】
化合物４１：
【０３２５】
【化１３４】
2019519508.tif 000450
【０３２６】
式中、Ｒは、
【０３２７】
【化１３５】
2019519508.tif 000451
【０３２８】
である。
【０３２９】
化合物４２：
【０３３０】
【化１３６】
2019519508.tif 000452
【０３３１】
式中、Ｒは、
【０３３２】
【化１３７】
2019519508.tif 000453
【０３３３】
である。
【０３３４】
化合物１を例として、本発明についてさらに説明する。
【０３３５】
化合物１では、Ｒは、炭素数５の
【０３３６】
【化１３８】
2019519508.tif 000454
【０３３７】
であり、ＰＯＬＹは、
【０３３８】
【化１３９】
2019519508.tif 000455
【０３３９】
であり、ＰＯＬＹとＲとが一緒になって下記活性剤の担体を構成している。
【０３４０】
【化１４０】
2019519508.tif 000456
【０３４１】
多価リンカーＬがＴ、Ｄと連結した後、以下のようになる。
【０３４２】
【化１４１】
2019519508.tif 000457
【０３４３】
「
2019519508.tif 000458
」におけるエステル結合は、本発明の上記分離可能なリンカーと活性剤Ｄとが共有結合して形成した切断可能な結合である。本発明のコンジュゲートが標的細胞に到達した後、切断可能な結合が生理学的条件下で加水分解又は酵素分解され、その後、コンジュゲートから活性剤イリノテカンが放出され、イリノテカンが標的細胞中で抗がん作用を発揮する。
【０３４４】
「
2019519508.tif 000459
」における炭素硫黄結合は、本発明の上記難分解性リンカーと標的分子Ｔとが形成し、生理学的条件下で加水分解に対して比較的安定な化学結合であり、そのうち、原子ＳはｉＲＧＤに由来するものである。標的分子の標的指向性により、本発明のコンジュゲートは特定の標的細胞に到達できながら、標的分子と母体とが分離し難い。
【０３４５】
「
2019519508.tif 000460
」はＰＯＬＹとの連結を意味する。
【０３４６】
別の一側面において、本発明は前記コンジュゲートの製造方法を提供する。このような方法では、ヒドロキシ基含有活性剤Ｄはまず、アミノ酸又はアミノ酸から形成されたペプチドと反応し、分離可能なリンカーを形成する。活性剤Ｄのヒドロキシ基とアミノ酸のカルボキシル基は、切断可能な結合−エステル結合を形成する。難分解性リンカーは、スペーサーリンカーと一緒になって多価リンカーの残りの部分を形成する。該残りの部分は、反応可能なカルボキシル基を含有し、分離可能なリンカーのアミノ基と反応し、Ｄ−Ｌ部分を形成する。
【０３４７】
ＰＯＬＹ及び有機中心Ｒから構成される活性剤担体の製造：ＰＯＬＹ及び有機中心Ｒは実質上、マルチアームポリマー、つまり
【０３４８】
【化１４２】
2019519508.tif 000461
【０３４９】
を形成している。本発明の好ましい実施例では、該マルチアームポリマーはマルチアームポリエチレングリコールであり、市販の原材料から得ることができ、例えば北京鍵凱科技有限会社から様々な種類の４アーム、８アームポリエチレングリコール誘導体を購入することができる。市販のこれらマルチアームＰＥＧは、上記Ｄ−Ｌ部分と直接的に反応することができる。
【０３５０】
例えば、式（ＩＶ）のコンジュゲートを製造する際に、使用可能な４アームポリエチレングリコールは下記のとおりである。
【０３５１】
【化１４３】
2019519508.tif 000462
【０３５２】
この好ましい４アームポリエチレングリコールは、４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭと呼ばれており、その分子量が約２０ｋＤａである。
【０３５３】
式（Ｖ）のコンジュゲートを製造する際に、使用可能な３アームポリエチレングリコールは下記のとおりである。
【０３５４】
【化１４４】
2019519508.tif 000463
【０３５５】
この好ましい３アームポリエチレングリコールは、３ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭと呼ばれている。
【０３５６】
式（ＶＩ）のコンジュゲートを製造する際に、使用可能な８アームポリエチレングリコールは下記のとおりである。
【０３５７】
【化１４５】
2019519508.tif 000464
【０３５８】
この好ましい８アームポリエチレングリコールは、８ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭと呼ばれており、ｎは１１３である。
例えば、多分岐薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の製造方法は、下記ステップを含む。
【０３５９】
【化１４６】
2019519508.tif 000465
【０３６０】
式中、Ｒは有機中心であり、ＰＯＬＹはポリマーであり、Ｌは多価リンカーであり、Ｔは標的分子であり、Ｄは活性剤であり、ｑは３〜８の任意の整数であり、Ｄは下記式で示されるカンプトテシン系薬物である。
【０３６１】
【化１４７】
2019519508.tif 000466
【０３６２】
式中、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アシル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、アジド基、アミド基、ヒドラジン、アミン基、置換アミン基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基から選択され、Ｒ6は、Ｈ又はＯＲ8であり、Ｒ8は、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基又はヒドロキシアルキルであり、Ｒ7は、ヒドロキシ基である。
【０３６３】
（１）活性剤Ｄと多価リンカーＬとを連結し、Ｄ−Ｌ部分を得る。
【０３６４】
（２）Ｄ−Ｌ部分とマルチアームポリマーである
【０３６５】
【化１４８】
2019519508.tif 000467
【０３６６】
とを連結し、
【０３６７】
【化１４９】
2019519508.tif 000468
【０３６８】
を得る。
【０３６９】
（３）上記で得られた
【０３７０】
【化１５０】
2019519508.tif 000469
【０３７１】
と標的分子Ｔとを連結する。
【０３７２】
上記の製造方法によれば、好ましくは、Ｄはイリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、又はルビテカンである。
【０３７３】
マルチアームポリマーである
【０３７４】
【化１５１】
2019519508.tif 000470
【０３７５】
は、３ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ、４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ、又は８ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭであり、
【０３７６】
Ｌは、
【０３７７】
【化１５２】
2019519508.tif 000471
【０３７８】
であり（記号「＊」は、多価リンカーＬと標的分子Ｔとの結合点を示し、「＃」は、多価リンカーＬと活性剤Ｄとの結合点を示し、「％」は、多価リンカーＬとＰＯＬＹとの結合点を示す。）、
【０３７９】
Ｔは、ｉＲＧＤ、ｃＲＧＤ、ｔＬｙｐ−１、Ｌｙｐ−１、ＲＰＡＲＰＡＲ、Ａｎｇｉｏｐｅｐ２、ＧＥ１１、又は葉酸である。
【０３８０】
必要に応じて、本発明のマルチアームポリエチレングリコールの製造は、合成により行うこともできる。例えば、任意の一定の数の適切なポリオールコア材料はすべて化学品サプライヤーから購入することができる。ポリオール上の末端ヒドロキシ基はまず、それらのアニオン型に変換される。例えば、強塩基で重合反応を励起することに適する塩基を提供し、次いで、単一分子（例えば、エチレンオキシド）が中心上で直接的に重合する。鎖の形成は、各分岐がすべて所定の長さになるまで継続し、その後、例えば焼入れの方法により反応を終了させる。
【０３８１】
あるいは、本発明のマルチアームポリエチレングリコールは、下記の方法により合成して製造されることもできる。まず、１つの必要なポリオールコア材料を用意し、次に、ポリオールを適切な条件下で適切な長さを有するヘテロ二官能性ＰＥＧとメシル化反応させる。そのうち、非メシル化ＰＥＧは、ポリオールと反応させないように、選択的に保護される。
【０３８２】
本発明で提供する、活性剤担体として好適なマルチアームポリエチレングリコールは特に、１つの末端官能基、例えば、Ｎ−スクシンイミドカーボネート（ＵＳ５２８１６９８、ＵＳ５４６８４７８を参照）、スクシンイミドプロピオネート及びスクシンイミドブチレート（ＵＳ５６７２６６２を参照）、コハク酸スクシンイミド、スクシンイミドエステル（ＵＳ５６５０２３４を参照）等を含有する。
【０３８３】
上記のとおり、本発明のコンジュゲート担体（Ｒ及びＰＯＬＹからなる）は、少なくとも１個の標的分子及び１個の活性剤と連結する。より典型的及び好ましい化合物では、高担持能力を確保するために、本発明のコンジュゲート担体は少なくとも、３個の標的分子及び３個の活性剤と連結し、好ましくは少なくとも４個の標的分子及び４個の活性剤と連結する。
【０３８４】
本発明のコンジュゲートは典型的な薬物前駆体であり、加水分解作用又は酵素分解作用により、活性剤Ｄが放出され、母体から分離し、生理活性を発揮する。
【０３８５】
本発明のコンジュゲートは高担持能力を示すため、総投与量を低減して、例えばがん等の特殊な疾患を治療することができる。つまり、本発明のコンジュゲート活性剤担体は、複数種の活性剤分子と共有結合により連結することができ、一定量のコンジュゲートあたりに、より多くの量の治療剤形（つまり、活性剤部分）を投与することが許容される。本発明のコンジュゲートは、水溶性ポリマーの修飾により、実質的に親水性となり、特に活性剤が水難溶性薬物である場合、コンジュゲートのバイオアベイラビリティを向上できる。
【０３８６】
カップリングされていない薬物に比べ、本発明のコンジュゲートはより強い作用を示し、ヒト又はほかの動物の体内組織に豊富に存在する。
【０３８７】
本発明におけるコンジュゲート薬物前駆体は、特に活性剤が１つの抗がん化合物である場合、様々な独特な性質を有する。このような薬物前駆体は、腫瘍の増殖をより高効率で抑制することができる。使用するこのような小分子は、抗がん特性を有すると知られている小分子である。しかし、上記のとおり多分岐ポリマーとの結合により、その治療効果及び薬物代謝動態学は該小分子（例えば抗がん化合物自体）に比べ、大いに改良された。対象とされうる固形腫瘍の種類としては、結腸癌、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、グリオーマ及乳房、卵巣、結腸、腎臓、胆管、肺及び脳の悪性肉腫、がん及びリンパ腫が挙げられる。
【０３８８】
上記のように、本発明は、１つのマルチアームポリマーで修飾された標的抗がんコンジュゲートに関するものであり、そのうち、水溶性ポリマーによる修飾は、該コンジュゲートの水溶性を高めることで薬物担持量を高めることができ、標的分子は標的指向性を高め、該コンジュゲートの目標組織における濃度をさらに高め、Ｌは、任意の連結リンカーであり、その作用が標的分子と抗がん薬物とを連結してから、さらに標的分子、抗がん薬物及びポリマーアームを連結し、コンジュゲートを１つのものとする。
【０３８９】
本発明の化合物１〜４２の薬学的に許容される塩は、好ましくは塩酸塩であり、薬化学分野の一般の手段により塩を形成することができ、また、トリフルオロ酢酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩等であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【０３９０】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、本発明は様々な異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載された実施例に限定されるべきではない。これらの実施例を記載する目的は、開示内容をより完全且つ全面的にするためである。使用した試薬及び原料について、製造方法を開示したもの以外はすべて市販から入手したものである。
【０３９１】
特に断りのない限り、本明細書におけるすべての技術用語は、請求の範囲に係る主題が属する分野の技術者に通常理解されている意味とは同じである。
【０３９２】
特に断りのない限り、本明細書における用語は、下記意味である。
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ：
【化１５３】
2019519508.tif 000472
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＢＭＥ：ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル
ＥＡ：酢酸エチル
ＤＭＥ：エチレングリコールジメチルエーテル
ＨＯＳＵ：Ｎ−スクシンイミドカーボネート
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ：
【化１５４】
2019519508.tif 000473
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＥＰＣ：シアノホスホン酸ジエチル
Ｐｂｆ：
【化１５５】
2019519508.tif 000474
ＨＯＢＴ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＭＴＢＥ：ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル
ＥＤＴ：１，２−エタンジチオール
ＰＢＳ：リン酸緩衝液
ＥＤＣ・ＨＣｌ：１−エチル（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
【０３９３】
実施例１
ｉＲＧＤの作製
【化１５６】
2019519508.tif 000475
【０３９４】
１０．０ｇのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ  ＭＢＨＡ  Ａｍｉｄｅ  Ｒｅｓｉｎを用意し、Ｆｍｏｃを除去した。カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨといった保護されたアミノ酸を順に樹脂に連結し、ＤＭＦ洗浄後、トリフルオロ酢酸タリウム（２．０ｅｑ）を加えて１８時間撹拌し、その後、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを縮合させ、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを除去し、無水酢酸ピリジンを加えて２０ｍｉｎ反応させ、ＤＭＦで洗浄し、ＤＣＭで洗浄し、メタノール洗浄後に乾燥させ、開裂剤として８２．５％ＴＦＡ／５％フェノール／５％水／２．５％ＥＤＴ／５％チオアニソールを加え、氷冷したＭＴＢＥが沈殿し、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣによる精製、凍結乾燥を経て、白色のフロックのｉＲＧＤを１．５６ｇ得た。
【０３９５】
Ｌ部分の作製
【化１５７】
2019519508.tif 000476
【０３９６】
１．ＢＰ１０３ａ０１の作製
窒素雰囲気下で、１０００ｍＬの三ツ口フラスコに、２００ｍＬのピリジン、１２０ｇの１（１．０ｅｑ）を加え、撹拌して０℃まで降温させ、１５１．８ｇのＴｓＣｌ（１．０ｅｑ）を数回に分けて添加し、１ｈ撹拌し、次いで室温まで徐々に昇温し、３〜４ｈ撹拌し続けた。反応終了後に、反応液を氷冷した希塩酸溶液に投入し、ＥＡを加えて抽出し、ＥＡ層を希塩酸で１回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付してＢＰ１０３ａ０１精製物を５５ｇ得た。
【０３９７】
２．ＢＰ１０３ａ０２の作製
１０００ｍＬの三ツ口フラスコに、５５ｇのＢＰ１０３ａ０１（１．０ｅｑ）及び１６０ｍＬのＤＭＳＯを加え、均一に撹拌し、次いで、ＮａＮ3２３．５２ｇ（２．０ｅｑ）を加え、５０℃に加熱して３時間反応させ、室温まで降温させ、反応液を水に投入し、ＥＡで抽出し、有機層を合併し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して無色の液体であるＢＰ１０３ａ０２を２９．２ｇ得た。
【０３９８】
３．ＢＰ１０３ａ０３の作製
１Ｌの水素化反応器に、２９ｇの化合物３、３６０ｍＬのメタノール、５．０ｇのパラジウム炭素を加え、撹拌し、窒素置換し、水素ガスを導入して３〜４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、反応液をろ過し、ろ液を濃縮してＢＰ１０３ａ０３の油状物を２３．５ｇ得た。
【０３９９】
４．ＢＰ１０３ａ０４の作製
１Ｌの三ツ口フラスコに、２３．５ｇの化合物ＢＰ１０３ａ０３（１．０ｅｑ）、６８．６ｇの（Ｂｏｃ）２Ｏ（２．０ｅｑ）、５００ｍｌのメタノール：トリエチルアミン（９：１）の混合溶液を加え、撹拌して還流するまでに昇温し、１ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、メタノールトリエチルアミンを留去し、水を加えて溶解し、ジクロロメタンで３回抽出し、有機層を合併し、１回水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、乾燥させ、固体のＢＰ１０３ａ０４を３４．８ｇ得た。
【０４００】
５．ＢＰ１０３ａ０５の作製
１０００ｍＬの三ツ口フラスコに、３４．８ｇの化合物ＢＰ１０３ａ０４（１．０ｅｑ）、それぞれ１５０ｍｌのトルエン及びＴＨＦ、５８．２ｇのブロモ酢酸（３ｅｑ）を加え、撹拌し、４５〜５０℃に加熱し、さらに３３．５ｇの水酸化ナトリウム（６ｅｑ）を加え、一晩反応し、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、反応液を留去し、水及びＥＡを加えて抽出し、水相をｐＨ３に調整し、ジクロロメタンで水相を抽出し、ジクロロメタン層を合併し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮して油状物化合物であるＢＰ１０３ａ０５を１８ｇ得た。
【０４０１】
６．ＢＰ１０３ａの作製
２５０ｍＬの三ツ口フラスコに、１８ｇの化合物ＢＰ１０３ａ０５、１００ｍｌのＥＡを加え、撹拌して溶解した後に、０℃まで降温させ、１５０ｍｌのＥＡ／ＨＣｌ（３．５Ｍ）を加え、０℃で保温し、ＴＬＣでモニタリングし、反応が終了し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して白色の固体のＢＰ１０３ａを１０．４ｇ得た。
【０４０２】
【化１５８】
2019519508.tif 000477
【０４０３】
Ｍ２の作製
１００ｍＬのフラスコに、３．０ｇのＢＰ１０３ａ（１．０ｅｑ）、４．０ｇの化合物Ｍ１（１．０ｅｑ）、４０ｍｌのＤＣＭ、４．０ｍｌのＤＩＥＡ（２．０ｅｑ）を加え、室温で撹拌し、ＴＬＣでモニタリングし、反応が終了後、有機溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィーに付して類似油状物Ｍ２を５．２ｇ得た。
【０４０４】
Ｍ３の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、９．００ｇの化合物Ｍ２（１．０ｅｑ）、３．９６ｇのＨＯＳＵ（１．５３ｅｑ）、９０ｍｌのＤＣＭ、６．６０ｇのＥＤＣ．ＨＣｌ（１．５３ｅｑ）を加え、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、ｐＨ＝６．０の５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素カリウム水溶液で２回洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して５．９ｇの無色の油状物である化合物Ｍ３を得た。
【０４０５】
Ｍ４の作製
２００ｍＬのフラスコに、２．９３ｇの化合物Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１．０ｅｑ）、６０ｍｌの水、２．００ｇのＮａＨＣＯ3（２．０ｅｑ）を加え、撹拌し、５．９ｇの化合物Ｍ３（１．０ｅｑ）を滴下して６０ｍｌのＤＭＥ（エチレングリコールジメチルエーテル）の溶液に溶解し、６０ｍｌのＴＨＦを追加し、撹拌して一晩置いた。ＴＬＣでモニタリングし、反応が終了後、有機溶媒を留去し、酢酸でＰＨ＝４に調整し、ＥＡで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、４．５０ｇの無色の油状物化合物Ｍ４を得た。
【０４０６】
Ｍ５の作製
１００ｍＬのフラスコに、３．８１ｇの化合物Ｍ４（１．０ｅｑ）、４０ｍｌのＤＣＭ、１．０７ｇのＨＯＳＵ、１．７８ｇのＥＤＣ．ＨＣｌを加え、撹拌し、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応が終了後、ＤＣＭで希釈し、その後、５０ｍＭのリン酸二水素カリウム水溶液で２回洗浄し、純水で１回洗浄し、飽和食塩水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、４．１ｇの無色の油状物化合物Ｍ５を得た。
【０４０７】
コンジュゲートの作製
【化１５９】
2019519508.tif 000478
【０４０８】
Ｍ７の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、３．５０ｇの化合物Ｍ６（１．０ｅｑ）、５２．５ｍｌのＤＭＦを加え、６０℃に加熱して溶解し、５〜１０ｍｉｎ後にＤＭＦを減圧留去し、３００ｍｌのｎ−ヘプタンを加えて減圧蒸留し、３回繰り返し、遠心脱水後、１０５ｍｌのＤＣＭ、１．０８ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、６３ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、１．５９ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮して１２０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１５０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥して４．０２ｇの淡黄色の固体である化合物Ｍ７を得た。
【０４０９】
Ｍ８の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．０２ｇの化合物Ｍ７、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体Ｍ８を４．００ｇ得た。
【０４１０】
Ｍ９の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、２．９５ｇの化合物Ｍ８、８０ｍｌのＤＣＭ、２．５７ｇ（１．０５ｅｑ）の化合物４、２．１６ｍｌのＤＩＥＡ（３．０ｅｑ）、０．９６ｍｌのＤＥＰＣ（１．５ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体Ｍ９を１．４８ｇ得た。
【０４１１】
【化１６０】
2019519508.tif 000479
【０４１２】
Ｍ１０の作製
５０ｍＬの丸底フラスコに、２６０ｍｇの化合物Ｍ９、１０ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体Ｍ１０を２１０ｍｇ得た。
【０４１３】
Ｍ１１の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５１ｍｇの化合物Ｍ１０（４．０ｅｑ）、２ｍｌのＤＣＭ、１１ｕｌのＴＥＡ（８．０ｅｑ）、２０１ｍｇの４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体Ｍ１１を２４０ｍｇ得た。
【０４１４】
【化１６１】
2019519508.tif 000480
【０４１５】
化合物１とＨ１の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５０ｍｇの化合物Ｍ１１（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１０．６ｍｇのｉＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ１（化合物１の塩酸塩）を５０ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４１６】
実施例２
【化１６２】
2019519508.tif 000481
【０４１７】
１０．０ｇの２Ｃｌ−Ｔｒｔ  Ｒｅｓｉｎを用意し、カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨといった保護されたアミノ酸を順に樹脂に連結し、開裂剤として８２．５％ＴＦＡ／５％フェノール／５％水／２．５％ＥＤＴ／５％チオアニソールを加え、氷冷したＭＴＢＥが沈殿し、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣによる精製、凍結乾燥を経て、白色のフロックを５．５ｇ得た。
【０４１８】
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４１９】
コンジュゲートの作製
【化１６３】
2019519508.tif 000482
【０４２０】
化合物２とＨ２の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物１１（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１３９ｍｇのｔＬｙＰ−１を加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ２（化合物２の塩酸塩）を１．０ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０３（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３２（ｓ，２Ｈ）、５．４８４（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４２１】
実施例３
Ｌｙｐ−１の作製
【化１６４】
2019519508.tif 000483
【０４２２】
１０．０ｇのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ  ＭＢＨＡ  Ａｍｉｄｅ  Ｒｅｓｉｎを用意し、Ｆｍｏｃを除去した。カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨといった保護されたアミノ酸を順に樹脂に連結し、ＤＭＦ洗浄後に、トリフルオロ酢酸タリウム（２．０ｅｑ）を加えて１８時間撹拌した後にＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを縮合させ、ＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃを除去した後に乾燥させ、開裂剤として８２．５％ＴＦＡ／５％フェノール／５％水／２．５％ＥＤＴ／５％チオアニソールを加え、氷冷したＭＴＢＥが沈殿し、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣによる精製、凍結乾燥を経て、白色のフロックであるＬｙＰ−１を７６５ｍｇ得た。
【０４２３】
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４２４】
コンジュゲートの作製
【化１６５】
2019519508.tif 000484
【０４２５】
化合物３とＨ３の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ１１（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８２ｍｇのＬｙＰ−１を加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ３（化合物３の塩酸塩）を１．０５ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８１（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４２６】
実施例４
ＣＰＡＲＰＡＲの作製
【０４２７】
１０．０ｇの２Ｃｌ−ＴｒｔＲｅｓｉｎを用意し、カップリング剤としてＨＯＢＴ／ＤＩＣを用い、ＤＭＦを反応溶媒とし、ニンヒドリン法により反応をモニタリングし、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨといった保護されたアミノ酸を順に樹脂に連結し、開裂剤として８２．５％ＴＦＡ／５％フェノール／５％水／２．５％ＥＤＴ／５％チオアニソールを加え、氷冷したＭＴＢＥが沈殿し、洗浄し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣによる精製、凍結乾燥を経て、白色のフロックであるＣＲＰＡＲＰＡＲを６．１ｇ得た。
【０４２８】
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４２９】
コンジュゲートの作製
【化１６６】
2019519508.tif 000485
【０４３０】
化合物４とＨ４の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ１１（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１５４ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ４（化合物４の塩酸塩）を１．０９ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０５（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３５（ｓ，２Ｈ）、５．４８６（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４３１】
実施例５
ｃＲＧＤの作製
【化１６７】
2019519508.tif 000486
本発明で使用したｃＲＧＤは、外部から購入したものである。
【０４３２】
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４３３】
【化１６８】
2019519508.tif 000487
【０４３４】
化合物５とＨ５の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ１１（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に９６．４ｇのｃＲＧＤを加えて４ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと６ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ５（化合物５の塩酸塩）を１．０６ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２６（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４３５】
実施例６
ｉＲＧＤの作製は実施例１と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４３６】
コンジュゲートの作製
【化１６９】
2019519508.tif 000488
【０４３７】
Ｍ２１の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．００ｇの化合物Ｍ２０（１．０ｅｑ）、１００ｍｌのＤＣＭ、３．８９ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、３．５０ｇのＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（１．０ｅｑ）を滴下して２０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、３．６２ｇの淡黄色の固体である化合物Ｍ２１を得た。
【０４３８】
Ｍ２２の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、４．８０ｇの化合物Ｍ２１（１．０ｅｑ）、１４５ｍｌのＤＣＭ、１．６４ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、９５ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、２．４１ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮した時点で１３０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１６０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥して４．６５ｇの淡黄色の固体である化合物Ｍ２２を得た。
【０４３９】
Ｍ２３の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．６５ｇの化合物Ｍ２２、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体Ｍ２３を２．４８ｇ得た。
【０４４０】
Ｍ２４の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、２．３ｇの化合物Ｍ２３、４５ｍｌのＤＣＭ、３．１９６ｇ（１．０５ｅｑ）化合物Ｍ５、１．７５ｍｌのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体Ｍ２４を２．２０ｇ得た。
【０４４１】
Ｍ２５の作製
２００ｍＬの丸底フラスコに、２．０ｇの化合物Ｍ２４、６０ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体Ｍ２５を１．７５ｇ得た。
【０４４２】
Ｍ２６の作製
５００ｍＬの丸底フラスコに、１．５１ｇの化合物Ｍ２５（４．０ｅｑ）、１４０ｍｌのＤＣＭ、３９０ｕｌのＴＥＡ（８．０ｅｑ）、７．０ｇの４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体Ｍ２６を７．９ｇ得た。
【０４４３】
【化１７０】
2019519508.tif 000489
【０４４４】
化合物６とＨ６の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ２６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８８ｍｇのｉＲＧＤを加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ６（化合物６の塩酸塩）を９８０ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０５（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３３（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４４５】
実施例７
ｔＬｙｐ−１の作製は実施例２と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４４６】
コンジュゲートの作製
【化１７１】
2019519508.tif 000490
【０４４７】
化合物７とＨ７の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ２６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１４４ｍｇのｔＬｙＰ−１を加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ７（化合物７の塩酸塩）を１．０１ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０４（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３５（ｓ，２Ｈ）、５．４８８（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４４８】
実施例８
Ｌｙｐ−１の作製は実施例３と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４４９】
コンジュゲートの作製
【化１７２】
2019519508.tif 000491
【０４５０】
化合物８とＨ８の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ２６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８８ｍｇのＬｙＰ−１を加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ８（化合物８の塩酸塩）を１．０４ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８１（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４５１】
実施例９
ＣＲＰＡＲＰＡＲの作製は実施例４と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４５２】
コンジュゲートの作製
【化１７３】
2019519508.tif 000492
【０４５３】
化合物９とＨ９の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ２６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１５９ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ９（化合物９の塩酸塩）を１．０４ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１０（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４５４】
実施例１０
ｃＲＧＤの作製は実施例５と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４５５】
コンジュゲートの作製
【化１７４】
2019519508.tif 000493
【０４５６】
化合物１０とＨ１０の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ２６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に９９．５ｍｇのｃＲＧＤを加えて４ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと６ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ１０（化合物１０の塩酸塩）を１．０３ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１５（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３７（ｓ，２Ｈ）、５．４８４（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４５７】
実施例１１
ｉＲＧＤの作製は実施例１と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４５８】
コンジュゲートの作製
【化１７５】
2019519508.tif 000494
【０４５９】
Ｍ３１の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、６．００ｇの化合物Ｍ３０（１．０ｅｑ）、１２０ｍｌのＤＣＭ、５．００ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、４．５３ｇのＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（１．０ｅｑ）を滴下して２０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、４．３２ｇの淡黄色の固体である化合物Ｍ３１を得た。
【０４６０】
Ｍ３２の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．０ｇの化合物Ｍ３１（１．０ｅｑ）、１５０ｍｌのＤＣＭ、１．７３ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、１０１ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、２．５５ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮した時点で１３０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１６０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥して４．５２ｇの淡黄色の固体である化合物Ｍ３２を得た。
【０４６１】
Ｍ３３の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．４０ｇの化合物Ｍ３２、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体Ｍ３３を２．３２ｇ得た。
【０４６２】
【化１７６】
2019519508.tif 000495
【０４６３】
Ｍ３４の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、２．３ｇの化合物Ｍ３３、４５ｍｌのＤＣＭ、２．７７ｇの（１．０５ｅｑ）化合物５、１．１ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体Ｍ３４を２．０２ｇ得た。
【０４６４】
Ｍ３５の作製
２００ｍＬの丸底フラスコに、２．０ｇの化合物Ｍ３４、６０ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体Ｍ３５を１．６９ｇ得た。
【０４６５】
Ｍ３６の作製
５００ｍＬの丸底フラスコに、１．５０ｇの化合物Ｍ３５（４．０ｅｑ）、１４０ｍｌのＤＣＭ、３９０ｕｌのＴＥＡ（８．０ｅｑ）、７．０ｇの４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体Ｍ３６を７．６４ｇ得た。
【０４６６】
【化１７７】
2019519508.tif 000496
【０４６７】
化合物１１とＨ１１の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ３６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８９ｍｇのｉＲＧＤを加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ１１（化合物１１の塩酸塩）を１．０８ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０９（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３３（ｓ，２Ｈ）、５．４８１（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４６８】
実施例１２
ｔＬｙｐ−１の作製は実施例２と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４６９】
コンジュゲートの作製
【化１７８】
2019519508.tif 000497
【０４７０】
化合物１２とＨ１２の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ３６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１４４ｍｇのｔＬｙＰ−１を加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ１２（化合物１２の塩酸塩）を０．９９ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１５（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３４０（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４７１】
実施例１３
Ｌｙｐ−１の作製は実施例３と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４７２】
コンジュゲートの作製
【化１７９】
2019519508.tif 000498
【０４７３】
化合物１３とＨ１３の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ３６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８９ｍｇのＬｙＰ−１を加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ１３（化合物１３の塩酸塩）を１．０６ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０８（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３５（ｓ，２Ｈ）、５．４８４（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４７４】
実施例１４
ＣＲＰＡＲＰＡＲの作製は実施例４と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４７５】
コンジュゲートの作製
【化１８０】
2019519508.tif 000499
【０４７６】
化合物１４とＨ１４の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ３６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１６０ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを加えて１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ１４（化合物１４の塩酸塩）を１．０１ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１０（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３６（ｓ，２Ｈ）、５．４８５（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４７７】
実施例１５
ｃＲＧＤの作製は実施例５と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４７８】
コンジュゲートの作製
【化１８１】
2019519508.tif 000500
【０４７９】
化合物１５とＨ１５の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ３６（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１００ｍｇのｃＲＧＤを加えて４ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと６ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ１５（化合物１５の塩酸塩）を１．０５ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１４（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３４０（ｓ，２Ｈ）、５．４８９（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４８０】
実施例１６
ｉＲＧＤの作製は実施例１と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４８１】
コンジュゲートの作製
【化１８２】
2019519508.tif 000501
【０４８２】
Ｍ４１の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．０ｇの化合物Ｍ４０（１．０ｅｑ）、１５０ｍｌのＤＣＭ、２．６７ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、１５５ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、３．９３ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１５ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮した時点で１３０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１６０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥して６．８５ｇの淡黄色の固体である化合物Ｍ４１を得た。
【０４８３】
Ｍ４２の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．００ｇの化合物Ｍ４１、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体Ｍ４２を３．５４ｇ得た。
【０４８４】
【化１８３】
2019519508.tif 000502
【０４８５】
Ｍ４３の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、３．００ｇの化合物Ｍ４２、４５ｍｌのＤＣＭ、３．４６ｇ（１．０５ｅｑ）化合物Ｍ５、１．３８ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体Ｍ４３を２．６８ｇ得た。
【０４８６】
Ｍ４４の作製
２００ｍＬの丸底フラスコに、２．０ｇの化合物Ｍ４３、６０ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体Ｍ４４を１．６１ｇ得た。
【０４８７】
Ｍ４５の作製
５００ｍＬの丸底フラスコに、１．５０ｇの化合物Ｍ４４（４．０ｅｑ）、１４０ｍｌのＤＣＭ、３９１ｕｌのＴＥＡ（８．０ｅｑ）、７．０ｇの４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体Ｍ４５を７．６１ｇ得た。
【０４８８】
【化１８４】
2019519508.tif 000503
【０４８９】
化合物１６とＨ１６の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ４５（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８８ｍｇのｉＲＧＤを１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ１６（化合物１６の塩酸塩）を１．０９ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０９（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３５（ｓ，２Ｈ）、５．４８２（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４９０】
実施例１７
ｔＬｙｐ−１の作製は実施例２と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４９１】
コンジュゲートの作製
【化１８５】
2019519508.tif 000504
【０４９２】
化合物１７とＨ１７の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ４５（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１４４ｍｇのｔＬｙＰ−１を１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ１７（化合物１７の塩酸塩）を１．０２ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３６（ｓ，２Ｈ）、５．４８５（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４９３】
実施例１８
Ｌｙｐ−１の作製は実施例３と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４９４】
コンジュゲートの作製
【化１８６】
2019519508.tif 000505
【０４９５】
化合物１８とＨ１８の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ４５（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８８ｍｇのＬｙＰ−１を１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ１８（化合物１８の塩酸塩）を１．０６ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１７（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３４０（ｓ，２Ｈ）、５．４９１（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４９６】
実施例１９
ＣＲＰＡＲＰＡＲの作製は実施例４と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０４９７】
コンジュゲートの作製
【化１８７】
2019519508.tif 000506
【０４９８】
化合物１９とＨ１９の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ４５（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１５９ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ１９（化合物１９の塩酸塩）を１．０７ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９１１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３２（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０４９９】
実施例２０
ｃＲＧＤの作製は実施例５と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０５００】
コンジュゲートの作製
【化１８８】
2019519508.tif 000507
【０５０１】
化合物２０とＨ２０の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物Ｍ４５（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に９９．５ｍｇのｃＲＧＤを加えて４ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと６ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体Ｈ２０（化合物２０の塩酸塩）を１．０３ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０９（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３１（ｓ，２Ｈ）、５．４７８（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５０２】
実施例２１
ｉＲＧＤの作製は実施例１と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０５０３】
【化１８９】
2019519508.tif 000508
【０５０４】
５０の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５２ｍｇの化合物Ｍ１０（３．０ｅｑ）、２ｍｌのＤＣＭ、１１ｕｌのＴＥＡ（６．０ｅｑ）、２７３ｍｇの３ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体５０を３１０ｍｇ得た。
【０５０５】
【化１９０】
2019519508.tif 000509
【０５０６】
化合物２１の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５０ｍｇの化合物５０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に７．２ｍｇのｉＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２１を４９ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５０７】
実施例２２
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０５０８】
【化１９１】
2019519508.tif 000510
【０５０９】
化合物２２の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５５ｍｇの化合物５０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に、４．２ｍｇのｃＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと１．５ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２２を５０ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３３（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５１０】
実施例２３
ｉＲＧＤの作製は実施例１と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０５１１】
コンジュゲートの作製
【化１９２】
2019519508.tif 000511
【０５１２】
６０の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、４７６ｍｇの化合物Ｍ１０（８．０ｅｑ）、１５ｍｌのＤＣＭ、１０５ｕｌのＴＥＡ（１６．０ｅｑ）、１．０ｇの８ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体６０を１．３７ｇ得た。
【０５１３】
【化１９３】
2019519508.tif 000512
【０５１４】
化合物２３の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５０ｍｇの化合物６０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１４．５ｍｇのｉＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２３を５４ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５１５】
実施例２４
Ｌｙｐ−１の作製は実施例３と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０５１６】
コンジュゲートの作製
【化１９４】
2019519508.tif 000513
【０５１７】
化合物２４の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、６０ｍｇの化合物６０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１７．４ｍｇのＬｙＰ−１を加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２４を６８ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２９（ｓ，２Ｈ）、５．４８１（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５１８】
実施例２５
【化１９５】
2019519508.tif 000514
【０５１９】
化合物２５の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、４５ｍｇの化合物６０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１０．０ｍｇのｔＬｙＰ−１を加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２５を４５ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３０（ｓ，２Ｈ）、５．４８２（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５２０】
実施例２６
【化１９６】
2019519508.tif 000515
【０５２１】
化合物２６の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５５ｍｇの化合物６０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１３．５ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２６を６２ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３１（ｓ，２Ｈ）、５．４８０（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５２２】
実施例２７
【化１９７】
2019519508.tif 000516
【０５２３】
化合物２７の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５０ｍｇの化合物６０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に７．７ｍｇのｃＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと１．５ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２７を５０ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３２８（ｓ，２Ｈ）、５．４８１（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５２４】
実施例２８
ｉＲＧＤの作製は実施例１と同じである。
Ｌ部分の作製は実施例１と同じである。
【０５２５】
コンジュゲートの作製
【化１９８】
2019519508.tif 000517
【化１９９】
2019519508.tif 000518
【０５２６】
Ｍ２１の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．００ｇの化合物Ｍ２０（１．０ｅｑ）、１００ｍｌのＤＣＭ、３．８７ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、３．４９ｇのＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（１．０ｅｑ）を滴下して２０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、３．５２ｇの淡黄色の固体である化合物Ｍ２１を得た。
【０５２７】
Ｍ２２の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、４．５０ｇの化合物Ｍ２１（１．０ｅｑ）、１３５ｍｌのＤＣＭ、１．５ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、８７ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、２．２１ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮した時点で１２０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１５０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥して４．９５ｇの淡黄色の固体である化合物Ｍ２２を得た。
【０５２８】
Ｍ２３の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．９５ｇの化合物Ｍ２２、５５ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１３．７ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体Ｍ２３を２．５ｇ得た。
【０５２９】
Ｍ２４の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、２．３ｇの化合物Ｍ２３、４５ｍｌのＤＣＭ、３．９ｇ（１．０５ｅｑ）化合物５、２．１４ｍｌのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体Ｍ２４を２．４５ｇ得た。
【０５３０】
Ｍ２５の作製
２００ｍＬの丸底フラスコに、２．２ｇの化合物Ｍ２４、６５ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体Ｍ２５を１．７ｇ得た。
【０５３１】
７０の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．２１ｇの化合物Ｍ２５（８．０ｅｑ）、６０ｍｌのＤＣＭ、３１４ｕｌのＴＥＡ（１６．０ｅｑ）、３．０ｇの４ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体７０を３．９ｇ得た。
【０５３２】
【化２００】
2019519508.tif 000519
【０５３３】
化合物２８の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５０ｍｇの化合物７０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１５．３ｍｇのｉＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２８を５５ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３５（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５３４】
実施例２９
【化２０１】
2019519508.tif 000520
【０５３５】
化合物２９の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、６０ｍｇの化合物７０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１８．３ｍｇのＬｙＰ−１を加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体２９を６８ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３３（ｓ，２Ｈ）、５．４８６（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５３６】
実施例３０
【化２０２】
2019519508.tif 000521
【０５３７】
化合物３０の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５５ｍｇの化合物７０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１２．８ｍｇのｔＬｙＰ−１を加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３０を５５ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３５（ｓ，２Ｈ）、５．４８８（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５３８】
実施例３１
【化２０３】
2019519508.tif 000522
【０５３９】
化合物３１の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、５５ｍｇの化合物７０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１４．２ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３１を６０ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３２（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５４０】
実施例３２
【化２０４】
2019519508.tif 000523
【０５４１】
化合物３２の作製
１０ｍＬの丸底フラスコに、６０ｍｇの化合物７０（１．０ｅｑ）、１．５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に９．７ｍｇのｃＲＧＤを加えて１ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと１．５ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３２を６２ｍｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９００（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３３（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５４２】
実施例３３
【化２０５】
2019519508.tif 000524
【０５４３】
Ｍ３１の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、６．００ｇの化合物Ｍ３０（１．０ｅｑ）、１２０ｍｌのＤＣＭ、５．００ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、４．５３ｇのＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（１．０ｅｑ）を滴下して２０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、水で洗浄し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後にカラムクロマトグラフィーに付して、４．３２ｇの淡黄色の固体である化合物Ｍ３１を得た。
【０５４４】
Ｍ３２の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．０ｇの化合物Ｍ３１（１．０ｅｑ）、１５０ｍｌのＤＣＭ、１．７３ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、１０１ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、２．５５ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１０ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮した時点で１３０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１６０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、乾燥して４．５２ｇの淡黄色の固体である化合物Ｍ３２を得た。
【０５４５】
Ｍ３３の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．４０ｇの化合物Ｍ３２、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体Ｍ３３を２．３２ｇ得た。
【０５４６】
【化２０６】
2019519508.tif 000525
【０５４７】
Ｍ３４の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、２．３ｇの化合物Ｍ３３、４５ｍｌのＤＣＭ、２．７７ｇの（１．０５ｅｑ）化合物Ｍ５、１．１ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体Ｍ３４を２．０２ｇ得た。
【０５４８】
Ｍ３５の作製
２００ｍＬの丸底フラスコに、２．０ｇの化合物Ｍ３４、６０ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体Ｍ３５を１．６９ｇ得た。
【０５４９】
８０の作製
５００ｍＬの丸底フラスコに、２．７５ｇの化合物Ｍ３５（８．０ｅｑ）、１４０ｍｌのＤＣＭ、７３０ｕｌのＴＥＡ（１６．０ｅｑ）、７．０ｇの８ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体８０を８．６４ｇ得た。
【０５５０】
【化２０７】
2019519508.tif 000526
【０５５１】
化合物３３の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物８０（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に３０７ｍｇのｉＲＧＤを加えて１５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３３を１．１８ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０３（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３４（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５５２】
実施例３４  化合物３４の作製
【化２０８】
2019519508.tif 000527
【０５５３】
実施例３５
【化２０９】
2019519508.tif 000528
【０５５４】
化合物３５の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物８０（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に２３５ｍｇのｔＬｙＰ−１を加えて１５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３５を１．０５ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０４（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３４（ｓ，２Ｈ）、５．４８９（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５５５】
実施例３６  化合物３６の作製
【化２１０】
2019519508.tif 000529
【０５５６】
実施例３７
【化２１１】
2019519508.tif 000530
【０５５７】
化合物３７の作製
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．０ｇの化合物８０（１．０ｅｑ）、２０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１６３ｍｇのｃＲＧＤを加えて６ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと１０ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３７を１．００ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０３（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３４（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５５８】
実施例３８
【化２１２】
2019519508.tif 000531
【０５５９】
Ｍ４１の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．０ｇの化合物Ｍ４０（１．０ｅｑ）、１５０ｍｌのＤＣＭ、２．６７ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２ｅｑ）、１５５ｍｇのＤＭＡＰ（０．１ｅｑ）を加え、３．９３ｇのＤＣＣ（１．５ｅｑ）を滴下して１５ｍｌのＤＣＭの溶液に溶解し、２０℃で４時間反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ろ過し、残りが２５％体積になるまで濃縮した時点で１３０ｍｌのＩＰＡを加え、７５％の溶媒を留去し、１６０ｍｌのｎ−ヘプタンを加え、室温で１時間撹拌し、ろ過し、ｎ−ヘプタンで２回洗浄し、６．８５ｇを乾燥して淡黄色の固体である化合物Ｍ４１を得た。
【０５６０】
Ｍ４２の作製
１００ｍＬの三ツ口フラスコに、４．００ｇの化合物Ｍ４１、５０ｍｌのＤＣＭを加え、攪拌溶解後に１１．６ｍｌのＴＦＡを滴下し、室温で２ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、１５０ｍｌのアセトニトリルを加え、１２０ｍｌの溶媒を減圧蒸留した後に３２０ｍｌのＴＢＭＥ溶液に投入し、３０ｍｉｎ撹拌し、ろ過し、ケーキをＴＢＭＥで洗浄して淡黄色の固体Ｍ４２を３．５４ｇ得た。
【０５６１】
【化２１３】
2019519508.tif 000532
【０５６２】
Ｍ４３の作製
２００ｍＬの三ツ口フラスコに、３．００ｇの化合物Ｍ４２、４５ｍｌのＤＣＭ、３．４６ｇ（１．０５ｅｑ）化合物５、１．３８ｇのＴＥＡ（３．０ｅｑ）を加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＤＣＭで希釈し、次いで、２回水洗し、飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させ、濃縮し、ＨＰＬＣ精製後に凍結乾燥して淡黄色の固体Ｍ４３を２．６８ｇ得た。
【０５６３】
Ｍ４４の作製
２００ｍＬの丸底フラスコに、２．０ｇの化合物Ｍ４３、６０ｍｌの２０％ＴＦＡ／ＤＣＭを加え、室温で４ｈ反応させ、ＴＬＣでモニタリングし、反応終了後、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して淡黄色の固体Ｍ４４を１．６１ｇ得た。
【０５６４】
９０の作製
２５０ｍＬの丸底フラスコに、１．６１ｇの化合物Ｍ４４（８．０ｅｑ）、８０ｍｌのＤＣＭ、４１８ｕｌのＴＥＡ（１６．０ｅｑ）、４．０ｇの８ａｒｍＰＥＧ２０Ｋ−ＳＣＭ（１．０ｅｑ）を加え、室温で一晩反応した後、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥してオフホワイトの固体９０を５．１５ｇ得た。
【０５６５】
【化２１４】
2019519508.tif 000533
【０５６６】
化合物３８の作製
５０ｍＬの丸底フラスコに、０．５ｇの化合物９０（１．０ｅｑ）、１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１５２ｍｇのｉＲＧＤを５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３８を０．５３ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０２（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３３（ｓ，２Ｈ）、５．４８８（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５６７】
実施例３９
【化２１５】
2019519508.tif 000534
【０５６８】
化合物３９の作製
０．５ｇの化合物９０（１．０ｅｑ）、１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを５０ｍＬの丸底フラスコに加え、溶解して透明になった後に１５３ｍｇのＬｙＰ−１を５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体３９を０．５７ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９００（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３２（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５６９】
実施例４０  化合物４０の作製
【化２１６】
2019519508.tif 000535
【０５７０】
実施例４１
【化２１７】
2019519508.tif 000536
【０５７１】
化合物４１の作製
５０ｍＬの丸底フラスコに、０．５ｇの化合物９０（１．０ｅｑ）、１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に１２９ｍｇのＣＲＰＡＲＰＡＲを５ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳの溶液に加え、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体４１を０．５５ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０１（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３１（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５７２】
実施例４２
【化２１８】
2019519508.tif 000537
【０５７３】
化合物４２の作製
５０ｍＬの丸底フラスコに、０．５ｇの化合物９０（１．０ｅｑ）、１０ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳを加え、溶解して透明になった後に８０．８ｍｇのｃＲＧＤを加えて４ｍｌのｐＨ＝７、０．０１ＭのＰＢＳと６ｍｌのメタノールの混合溶液に溶解し、室温で４時間反応させた後に透析し、濃縮し、メタノールで粗生成物を溶解し、ＨＣｌ／ＥＡ溶液を加え、濃縮し、ＴＢＭＥに投入し、遠心し、乾燥して黄色の固体４２を０．５０ｇ得た。
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋Ｄ2Ｏ）：δ０．９０３（ｔ，ＣＨ2ＣＨ3）、３．５（ｂｒｍＰＥＧ）、５．３３０（ｓ，２Ｈ）、５．４８７（ｓ，２Ｈ）、７．０−８．５（ｍＮＨ）
【０５７４】
化合物２３〜４２の作製では、Ｒは、
【０５７５】
【化２１９】
2019519508.tif 000538
である。
【０５７６】
実施例４３  ヒト結腸癌ＨＴ−２９のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用。
【０５７７】
１．  実験目的
化合物１〜４２の、ヒト結腸癌ＨＴ−２９のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用を測定する。
【０５７８】
２．  実験材料
２．１  試料
イリノテカン（原薬）、ｎｋｔｒ−１０２（原薬）は購入品であり、化合物１〜４２はすべてブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
【０５７９】
２．２  試薬
ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン二重特異性抗体、注射用水、乳酸、ソルビトール。
【０５８０】
２．３  実験動物
雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（匹数：３００匹；週齢：５〜７週）をＢｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入し、温度２０〜２５℃、相対湿度４０％〜７０％、１２時間明、１２時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取するＳＰＦ動物飼育室で飼育した。飼育して約１週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。
【０５８１】
２．４  可移植性腫瘍株
中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク（ＣＡＳ、本実験室では液体窒素中に凍結保存）から入手したヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９。
【０５８２】
３  実験方法
３．１  ＨＴ−２９細胞培養
５％ＣＯ2、３７℃の培養条件下で、ＨＴ−２９細胞を、１０％ウシ胎児血清含有ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液中で通常の細胞培養を行い、０．２５％トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に２〜３回行い、継代比率を１：３〜１：８とした。
【０５８３】
３．２  動物モデルの構築
対数増殖期のＨＴ−２９細胞を採取し、細胞数計測後に無血清ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地に再懸濁し、細胞濃度を６×１０7細胞／ｍＬに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を１ｍＬのシリンジで採取し、ヌードマウスの右前腋窩皮下に注射し、各動物に１００μＬ（６×１０6細胞／匹）接種し、ＨＴ−２９のヌードマウス移植腫瘍モデルを構築した。接種後に定期的に動物の状態及び腫瘍の増殖状態を観察し、電子ノギスを用いて腫瘍径を測定し、データを直接的にＥｘｃｅｌ表に入力し、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が１００〜３００ｍｍ3になった後に、健康状態が良好で、腫瘍体積が近い動物を２２５匹選択し、乱塊法により４５組に分けた（ｎ＝５）。実験開始後に腫瘍径を週に２回測定し、腫瘍体積を計算し、且つ動物体重を秤量して記録した。
腫瘍体積（ＴＶ）の計算公式は下記のとおりである。
ＴＶ（ｍｍ3）＝ｌ×ｗ2／２
式中、ｌは腫瘍長径（ｍｍ）を表し、ｗは腫瘍短径（ｍｍ）を表す。
【０５８４】
３．３  溶媒の調製
０．５ｇのソルビトールを秤量して５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管に５０ｍＬの注射用水を加え、固形物が完全に溶解するまで旋回振動し、濃度１％のソルビトール水溶液（ｗ／ｖ）を調製し、４℃の冷蔵庫に保存しておいた。
【０５８５】
３．４  投与製剤の調製
３．４．１  イリノテカン投与製剤の調製
１２．０ｍｇのイリノテカンを秤量し、０．１５ｍｌの１％乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに２．８５ｍｌの１％ソルビトール水溶液をそれぞれ加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の１％乳酸、１％ソルビトール水溶液の比率を約５：９５（ｖ／ｖ）とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５８６】
３．４．２  ｎｋｔｒ−１０２投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、８８．５５ｍｇのｎｋｔｒ−１０２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５８７】
３．４．３  化合物１〜５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．８５ｍｇの化合物１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．８０ｍｇの化合物２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．８８ｍｇの化合物３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１１．２４ｍｇの化合物４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．７８ｍｇの化合物５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５８８】
３．４．４  化合物６〜１０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物６を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物７を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物８を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物９を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１０を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５８９】
３．４．５  化合物１１〜１５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１２．９８ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０８．９４ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．０１ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．３７ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０４．９１ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５９０】
３．４．６  化合物１６〜２０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５９１】
３．４．７  化合物２１〜４２投与製剤の調製
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０５９２】
３．５  動物の群分け及び投与
動物の群分け及び投与態様は表１のとおりである。
【０５９３】
活性剤がイリノテカンである群（群１〜８）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１群は溶媒対照群であり、尾静脈注射によりブランク溶媒を４日に１回、合計で３回（Ｑ４Ｄ×３）投与した。第２〜８群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料であるイリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、化合物１〜５を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（イリノテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０５９４】
活性剤がＳＮ−３８である群（群９〜１３）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第９〜１３群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物６〜１０を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（ＳＮ−３８含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０５９５】
活性剤が１０−ヒドロキシカンプトテシンである群（群１４〜１８）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１４〜１８群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物１１〜１５を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（１０−ヒドロキシカンプトテシン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０５９６】
活性剤がルビテカンである群（群１９〜２３）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１９〜２３群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物１６〜２０を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（ルビテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０５９７】
群２４〜４５の投与態様は上記と同様である。
【０５９８】
【表１】
2019519508.tif 000539
【０５９９】
３．６  実験終了
実験の最終日に、体重を秤量し、腫瘍径を測定した後に動物を安楽死させた（ＣＯ2）。腫瘍組織を取り出し、秤量して撮影し（撮影時に以下の組み合わせでそれぞれ撮影）、腫瘍重量抑制率を計算した。動物に対して肉眼解剖を行い、内臓器官に異常があるかを肉眼で観察した。
【０６００】
４  データ記録、計算公式
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の計算公式は下記のとおりである。
ＲＴＶ＝ＴＶt／ＴＶinitial
式中、ＴＶinitialは群分けして投与した時に測定した腫瘍体積であり、ＴＶtは投与期間中各測定時の腫瘍体積である。
相対腫瘍増殖率（％Ｔ／Ｃ）の計算公式下記のとおりである。
％Ｔ／Ｃ＝１００％´（ＲＴＶT／ＲＴＶC）
式中、ＲＴＶTは治療群のＲＴＶを示し、ＲＴＶCは溶媒対照群のＲＴＶを示す。
腫瘍増殖抑制率ＴＧＩ（％）の計算公式は下記のとおりである。
ＴＧＩ＝１００％×［１−（ＴＶt(T)−ＴＶinitial(T)）／（ＴＶt(C)−ＴＶinitial(C)）］
式中、ＴＶt(T)は治療群の各測定時の腫瘍体積を示し、ＴＶinitial(T)は群分けして投与した時の治療群の腫瘍体積を示し、ＴＶt(C)は溶媒対照群の各測定時の腫瘍体積を示し、ＴＶinitial(C)は群分けして投与した時の溶媒対照群の腫瘍体積を示す。
動物の体重低減率の計算公式は下記のとおりである。
動物の体重低減率＝１００％×（ＢＷinitial−ＢＷt）／ＢＷinitial
式中、ＢＷtは投与期間中各測定時の動物体重を示し、ＢＷinitialは群分けして投与した時の動物体重を示す。
腫瘍重量抑制率ＩＲ（％）の計算公式は下記のとおりである。
ＩＲ（％）＝１００％×（ＷC−ＷT）／ＷC
式中、ＷCは対照群の腫瘍重量を示し、ＷTは治療群の腫瘍重量を示す。
【０６０１】
５  統計分析方法
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥ）として表し、２群の比較はｔ検定で行った。
【０６０２】
６  実験観察
実験中、実験者及び獣医師は実験動物の徴候及び健康状態を観察し続けなければならない。疼痛、うつ病、活動低下等動物のいかなる異常症状を実験ノートに記録する必要がある。実験動物の異常状況がＩＡＣＵＣ関連動物福祉法規の規定に一致しない場合、獣医師は実験停止の要否を判断し、且つ実験責任者に通知することができる。
【０６０３】
７  結果
ヒトがん異種移植腫瘍モデルについて、実験評価指標として相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）を推奨する。増殖率が低いほど、腫瘍抑制効果が良いことは表２に示されている。
【０６０４】
【表２】
2019519508.tif 000540
【０６０５】
実験結果によれば、本発明の化合物は、ヒト結腸癌ＨＴ−２９のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かる。
【０６０６】
実施例４４  ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヌードマウス異種移植モデルにおける抑制作用
１．実験目的
本研究は、ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヌードマウス移植腫瘍モデルを用いて、化合物１〜４２の生体内における抗腫瘍活性を評価する。
【０６０７】
２．実験動物
２．１  動物種類
マウス。
【０６０８】
２．２  品種
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス。
【０６０９】
２．３  性別
雌性。
【０６１０】
２．４  数
３２０匹接種し、実験で２２５匹を使用した。
【０６１１】
２．５  年齢
６〜８週。
【０６１２】
２．６  体重
２０〜２２ｇ±２０％  体重平均値。
【０６１３】
２．７  動物リソース（サプライヤー）
上海西普−必凱実験動物有限公司（ＢＫ）、許可証番号ＳＣＸＫ（滬）２００８−００１６。
【０６１４】
２．８  実験動物管理
すべての実験動物をＳＰＦレベルの実験室で飼育した。実験者は日常のケア及び実験研究を担当した。
【０６１５】
２．８．１  動物身分の識別方法
各ケージに実験番号、実験群別、実験者名前、マウス品種及び性別等の情報が記載されている身分カードが付いており、マウスはイヤリングがによりマーキングした。
【０６１６】
２．８．２  ランダムな群分け
腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ3になった後に、各群にマウス５匹、各群内の腫瘍体積及びマウス体重が均一であるように、乱塊法により群分けした。各群の腫瘍体積の平均値の、すべての実験動物の腫瘍体積の平均値との差が±１０％以下であった。
【０６１７】
２．８．３  操作管理規則
すべての実験動物の操作及び管理は、動物使用及び管理ガイドラインに厳しく従う。
【０６１８】
２．８．４  飼育条件
居住条件：ＩＶＣシステム、各ケージに５匹
温度：２０℃〜２６℃
湿度：４０％〜７０％
光照射：１２時間の昼夜交替
【０６１９】
２．８．５  飼料
北京科澳協力飼料有限公司から購入した照射ラット・マウス飼料。自由に摂食させた。
【０６２０】
２．８．６  飲水
都市水道水。ろ過して高圧滅菌して飲水させた。
【０６２１】
２．８．７  敷料
上海茂生誘導体科技有限公司から購入したコーンコブ。高圧滅菌して使用した。週に２回敷料を交換した。
【０６２２】
２．８．８  適応期間
実験前にマウスに少なくとも１週間の環境適応期間を与えた。
【０６２３】
３．実験材料
３．１  実験対象医薬品
イリノテカン（原薬）、ｎｋｔｒ−１０２（原薬）は購入品であり、化合物１〜４２はすべてブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
【０６２４】
３．２  ほかの化学試薬及び材料
３．２．１  生理食塩水
上海華源長富薬業（集団）有限公司から購入した生理食塩水。
【０６２５】
３．２．２  無菌シリンジ
上海康徳莱企業発展集団股フン有限公司（上海、中国）から購入した１ｍｌの無菌シリンジ。
【０６２６】
３．２．３  細胞株
上海中国科学院細胞生物研究所から購入したヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）で培養し、５％ＣＯ2を含む３７℃のインキュベーターで培養した。
【０６２７】
３．２．４  マトリゲル（ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ）
米国ＢＤ社から購入したマトリゲルＭａｔｒｉｇｅｌ。
【０６２８】
３．３  設備
ＥＳＣＯから購入した生物学的安全キャビネット（型番：ＡＣ２−６Ｅ１）、
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｆｏｒｍａから購入したＣＯ2水密性インキュベーター（型番：３１１１）、
Ｏｌｙｍｐｕｓから購入した倒立顕微鏡（型番：ＣＫＸ４１ＳＦ）、
上海医療器械工業（集団）有限公司から購入した電気吸引装置（型番：ＹＸ９３０Ｄ）、
ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯから購入した天びん（ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯ  ＡＢ１３５−Ｓ）、
北京雷勃爾遠心機有限公司から購入した低速遠心機（型番：ＬＤ５−２Ａ）、
桂林広陸数字測控股フン有限公司から購入した電子デジタルノギス（型番：ＳＦ２０００）。
【０６２９】
４．実験設計
ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヌードマウス皮下移植腫瘍モデルを構築し、各匹に対して１×１０6個の細胞を接種した。
今回の実験は以下（表）の投与量及び投与態様を設計した（表３）。
【０６３０】
【表３】
2019519508.tif 000541
【０６３１】
５．化合物の調製
調製方法はブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
単回投与に必要な容量：
２０ｇ（ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）ｘ１０（ａｎｉｍａｌｓ）ｘ１０ｍＬ／ｋｇ／１０００ｘ１．５＝３ｍＬ
【０６３２】
５．１  イリノテカン投与製剤の調製
１２．０ｍｇのイリノテカンを秤量し、０．１５ｍｌの１％乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに２．８５ｍｌの１％ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の１％乳酸、１％ソルビトール水溶液の比率を約５：９５（ｖ／ｖ）とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３３】
５．２  ｎｋｔｒ−１０２投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、８８．５５ｍｇのｎｋｔｒ−１０２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３４】
５．３  化合物１〜５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．８５ｍｇの化合物１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．８０ｍｇの化合物２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．８８ｍｇの化合物３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１１．２４ｍｇの化合物４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．７８ｍｇの化合物５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３５】
５．４  化合物６〜１０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物６を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物７を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物８を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物９を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１０を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３６】
５．４  化合物１１〜１５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１２．９８ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０８．９４ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．０１ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．３７ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０４．９１ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３７】
５．５  化合物１６〜２０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３８】
５．６  化合物２１〜４２投与製剤の調製
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６３９】
６．実験方法
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を５％ＣＯ2を含む３７℃のインキュベーターで培養した。
細胞接種法による腫瘍ヌードマウス皮下移植モデルの構築：対数増殖期の腫瘍細胞を採取し、細胞数計測後に１×ＰＢＳに再懸濁し、細胞濃度をに１×１０7／ｍｌ調整し。１ｍＬのシリンジ（針Ｎｏ．４）でヌードマウス右背部皮下に腫瘍細胞を、１×１０6／０．１ｍｌ／マウスで接種した。
腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ3になった時点で、各群の腫瘍の差が平均値の１０％未満となるように、各群にマウス５匹で乱塊法により動物をランダムに群分けした。群分けの日をＤａｙ  ０とし、群分けの日に投与した。
実験期間を３週間とし、実験期間中、動物体重及び腫瘍サイズを週に２回測定した。毎日に臨床症状を観察して記録した。実験の最終日に、動物を殺し、体重を秤量し、腫瘍を取り出し、秤量して撮影して記録した。
すべての動物実験操作は、動物使用及び管理規則に厳しく従う。腫瘍関連パラメータの計算は、中国ＣＦＤＡによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』を参照する。
腫瘍体積（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、ＴＶ）の計算公式はＴＶ＝ａ×ｂ2／２である。式中、ａ、ｂはそれぞれ測定された腫瘍の長さ及び幅を示す。相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ）の計算公式はＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ0である。式中、Ｖ0は群分けして投与した時の腫瘍体積を示し、Ｖｔは測定時の腫瘍体積を示す。抗腫瘍活性の評価指標として相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）及び腫瘍抑制率（％）を用い、計算公式はそれぞれＴ／Ｃ（％）＝（ＴRTV／ＣRTV）×１００％である。ＴRTVは治療群のＲＴＶを示し、ＣRTVは陰性対照群のＲＴＶを示す。腫瘍抑制率（％）＝（陰性対照群の平均腫瘍重量−投与群の平均腫瘍重量）／陰性対照群の平均腫瘍重量×１００％。
腫瘍担持動物の体重変化（％）の計算は下記のとおりである。（測定時の体重−群分け時の体重）／群分け時の体重×１００。
【０６４０】
７．データ分析
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥ）として表し、２群の比較はｔ検定で行った。
【０６４１】
８．結果及び報告書
中国ＣＦＤＡによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』（２００６年１１月）に基づき、Ｔ／Ｃ（％）≦４０％、且つ統計学分析によりｐ＜０．０５のものが有効であることは、表４に示されている。
【０６４２】
【表４】
2019519508.tif 000542
【０６４３】
実験結果によれば、本発明の化合物は、ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヌードマウス移植腫瘍に対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かる。
【０６４４】
実施例４５  ヒト膵臓がんＭＩＡ  Ｐａｃａ−２のヌードマウス異種移植モデルにおける抑制作用
１．実験目的
本研究は、ヒト膵臓がんＭＩＡ  Ｐａｃａ−２のヌードマウス移植腫瘍モデルを用い、化合物１〜４２の生体内における抗腫瘍活性を評価する。
【０６４５】
２．実験動物
２．１  動物種類
マウス。
【０６４６】
２．２  品種
ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕヌードマウス。
【０６４７】
２．３  性別
雌性。
【０６４８】
２．４  数
３００。
【０６４９】
２．５  年齢
６〜８週。
【０６５０】
２．６  体重
２０−２２ｇ±２０％  体重平均値。
【０６５１】
２．７  動物リソース（サプライヤー）
上海西普‐必凱実験動物有限公司（ＢＫ）、許可証番号ＳＣＸＫ（滬）２００８−００１６。
【０６５２】
２．８  実験動物管理
すべての実験動物をＳＰＦレベルの実験室で飼育した。
【０６５３】
２．８．１  動物身分の識別方法
各ケージに実験番号、実験群別、実験者名前、マウス品種及び性別等の情報が記載されている身分カードが付いており、マウスはイヤリングがによりマーキングした。
【０６５４】
２．８．２  ランダムな群分け
腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ3になった後に、各群にマウス５匹、各群内の腫瘍体積及びマウス体重が均一であるように、乱塊法により群分けした。各群の腫瘍体積の平均値の、すべての実験動物の腫瘍体積の平均値との差が±１０％以下であった。
【０６５５】
２．８．３  操作管理規則
すべての実験動物の操作及び管理は、実験動物使用及び管理ガイドラインに厳しく従う。
【０６５６】
２．８．４  飼育条件
居住条件：ＩＶＣシステム、各ケージに５匹
温度：２５℃±１℃
湿度：６５％±１０％
光照射：１２時間の昼夜交替
【０６５７】
２．８．５  飼料
北京科澳協力飼料有限公司から購入した照射ラット・マウス飼料。自由に摂食させた。
【０６５８】
２．８．６  飲水
都市水道水。ろ過して高圧滅菌して飲水させた。
【０６５９】
２．８．７  敷料
上海茂生誘導体科技有限公司から購入したコーンコブ。高圧滅菌して使用した。週に２回敷料を交換した。
【０６６０】
２．８．８  適応期間
実験前にマウスに少なくとも１週間の環境適応期間を与えた。
【０６６１】
３．実験材料
３．１  実験対象医薬品
イリノテカン（原薬）、ｎｋｔｒ−１０２（原薬）は購入品であり、化合物１〜４２はすべてブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
【０６６２】
３．２  ほかの化学試薬及び材料
３．２．１  生理食塩水
上海華源長富薬業（集団）有限公司から購入した生理食塩水（上海、中国）。
【０６６３】
３．２．２  無菌シリンジ
上海康徳莱企業発展集団股フン有限公司（上海、中国）から購入した１ｍｌの無菌シリンジ。
【０６６４】
３．２．３  細胞株
ヒト膵臓がんＭＩＡ  Ｐａｃａ−２は上海中国科学院細胞生物研究所から購入した。
ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２を、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）及び２．５％ＨＳを含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）で培養し、５％ＣＯ2を含む３７℃のインキュベーターで培養した。
【０６６５】
３．２．４  マトリゲル（ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ）
米国ＢＤ社から購入したマトリゲルＭａｔｒｉｇｅｌ。
【０６６６】
３．３  設備
ＥＳＣＯから購入した生物学的安全キャビネット（型番：ＡＣ２−６Ｅ１）、
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｆｏｒｍａから購入したＣＯ2水密性インキュベーター（型番：３１１１）、
Ｏｌｙｍｐｕｓから購入した倒立顕微鏡（型番：ＣＫＸ４１ＳＦ）、
上海医療器械工業（集団）有限公司から購入した電気吸引装置（型番：ＹＸ９３０Ｄ）、
ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯから購入した天びん（ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯ  ＡＢ１３５−Ｓ）、
北京雷勃爾遠心機有限公司から購入した低速遠心機（型番：ＬＤ５−２Ａ）、
桂林広陸数字測控股フン有限公司から購入した電子デジタルノギス（型番：ＳＦ２０００）。
【０６６７】
４．実験設計
ヒト膵臓がんＭＩＡ  Ｐａｃａ−２のヌードマウス皮下移植腫瘍モデルを構築し、各匹に対して３×１０6個細胞を接種した。
今回の実験は以下（表５）の投与量及び投与態様を設計した。
【０６６８】
【表５】
2019519508.tif 000543
【０６６９】
５．化合物の調製
調製方法はブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
単回投与に必要な容量：
２０ｇ（ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）ｘ１０（ａｎｉｍａｌｓ）ｘ１０ｍＬ／ｋｇ／１０００ｘ１．５＝３ｍＬ
【０６７０】
５．１  イリノテカン投与製剤の調製
１２．０ｍｇのイリノテカンを秤量し、０．１５ｍｌの１％乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに２．８５ｍｌの１％ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の１％乳酸、１％ソルビトール水溶液の比率を約５：９５（ｖ／ｖ）とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７１】
５．２  ｎｋｔｒ−１０２投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、８８．５５ｍｇのｎｋｔｒ−１０２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７２】
５．３  化合物１〜５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．８５ｍｇの化合物１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．８０ｍｇの化合物２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．８８ｍｇの化合物３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１１．２４ｍｇの化合物４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．７８ｍｇの化合物５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７３】
５．４  化合物６〜１０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物６を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物７を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物８を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物９を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１０を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７４】
５．５  化合物１１〜１５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１２．９８ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０８．９４ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．０１ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．３７ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０４．９１ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７５】
５．６  化合物１６〜２０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７６】
５．７  化合物２１〜４２投与製剤の調製
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６７７】
６．実験方法
ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２細胞を、１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）及び２．５％ＨＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を５％ＣＯ2を含む３７℃のインキュベーターで培養した。
細胞接種法による腫瘍ヌードマウス皮下移植モデルの構築：対数増殖期の腫瘍細胞を採取し、細胞数計測後に１×ＰＢＳに再懸濁し、細胞濃度を３×１０7／ｍｌに調整した。１ｍＬのシリンジ（針Ｎｏ．４）でヌードマウス右背部皮下に腫瘍細胞を、３×１０6／０．１ｍｌ／マウスで接種した。
腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ3になった時点で、各群の腫瘍の差が平均値の１０％未満となるように、各群にマウス５匹で乱塊法により動物をランダムに群分けした。群分けの日をＤａｙ０とし、群分けの日に投与した。
実験期間を３週間とし、実験期間中、動物体重及び腫瘍サイズを週に２回測定した。毎日に臨床症状を観察して記録した。実験の最終日に、動物を殺し、体重を秤量し、腫瘍を取り出し、秤量して撮影して記録した。
すべての動物実験操作は、動物使用及び管理規則に厳しく従う。腫瘍関連パラメータの計算は、中国ＳＦＤＡによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』を参照する。
腫瘍体積（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、ＴＶ）の計算公式はＴＶ＝ａ×ｂ2／２である。式中、ａ、ｂはそれぞれ測定された腫瘍の長さ及び幅を示す。相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ）の計算公式はＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ0である。式中、Ｖ0は群分けして投与した時の腫瘍体積を示し、Ｖｔは測定時の腫瘍体積を示す。抗腫瘍活性の評価指標として相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）及び腫瘍抑制率（％）を用い、計算公式はそれぞれＴ／Ｃ（％）＝（ＴRTV／ＣRTV）×１００％である。ＴRTVは治療群のＲＴＶを示し、ＣRTVは陰性対照群のＲＴＶを示す。腫瘍抑制率（％）＝（陰性対照群の平均腫瘍重量−投与群の平均腫瘍重量）／陰性対照群の平均腫瘍重量×１００％。
腫瘍担持動物の体重変化（％）の計算は下記のとおりである。（測定時の体重−群分け時の体重）／群分け時の体重×１００。
中国ＳＦＤＡによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』（２００６年１１月）に基づき、Ｔ／Ｃ（％）≦４０％、且つ統計学分析によりＰ＜０．０５のものが有効である。
【０６７８】
７．データ分析
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥ）として表し、群同士の比較はｔ−検定で行い、Ｐ＜０．０５の場合に有意差ありと認められる。
【０６７９】
８．結果及び報告書
中国ＣＦＤＡによる『細胞傷害性抗腫瘍薬物の非臨床研究技術のためのガイドライン』（２００６年１１月）に基づき、Ｔ／Ｃ（％）≦４０％、且つ統計学分析によりＰ＜０．０５のものが有効であることは、表６に示されている。
【０６８０】
【表６】
2019519508.tif 000544
【０６８１】
実験結果によれば、本発明の化合物は、ヒト膵臓がんＭＩＡ  Ｐａｃａ−２のヌードマウス移植腫瘍に対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かる。
【０６８２】
実施例４６  ヒト胃がんＮＣＩ−Ｎ８７細胞株のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用
１．実験目的
供試薬物である化合物１〜４２の、ヒト胃がんＮＣＩ−Ｎ８７細胞株のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の生体内増殖に対する抑制作用を評価する。
【０６８３】
２．実験材料
２．１  試料
イリノテカン（原薬）、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ルビテカン、ｎｋｔｒ−１０２は購入品であり、化合物１〜４２はすべてブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
【０６８４】
２．２  試薬
ＲＰＭＩ−１６４０培養液、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン、生理食塩水。
【０６８５】
２．３  実験動物
雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（匹数：１５０匹；週齢：６〜８週）をＢｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入し、温度２０〜２５℃、相対湿度４０％〜７０％、１２時間明、１２時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取する蘇州聖蘇新薬開発有限公司のＳＰＦ動物飼育室で飼育した。飼育して約１週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。
【０６８６】
２．４  可移植性腫瘍株
中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク（ＣＡＳ、本実験室では液体窒素中に凍結保存）から入手したヒト胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７。
【０６８７】
３  実験方法
３．１  ＮＣＩ−Ｎ８７細胞培養
５％ＣＯ2、３７℃の培養条件下で、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培養液中で通常の細胞培養を行い、０．２５％トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に１〜２回行い、継代比率を１：２〜１：６とした。
【０６８８】
３．２  動物モデルの構築
対数増殖期のＮＣＩ−Ｎ８７細胞を採取し、細胞数計測後に無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を５×１０7細胞／ｍＬに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を１ｍＬのシリンジで採取し、ヌードマウスの右前腋窩皮下に注射し、各動物に１００μＬ（５×１０6細胞／匹）接種し、ＮＣＩ−Ｎ８７のヌードマウス移植腫瘍モデルを構築した。接種後に定期的に動物の状態及び腫瘍の増殖状態を観察し、電子ノギスを用いて腫瘍径を測定し、データを直接的にＥｘｃｅｌ表に入力し、腫瘍体積を計算した。腫瘍体積が１００〜３００ｍｍ3になった後に、健康状態が良好で、腫瘍体積が近い動物を２２５匹選択し、乱塊法により４５組に分けた（ｎ＝５）。実験開始後に腫瘍径を週に２回測定し、腫瘍体積を計算し、且つ動物体重を秤量して記録した。
腫瘍体積（ＴＶ）の計算公式は下記のとおりである。
ＴＶ（ｍｍ3）＝ｌ×ｗ2／２
式中、ｌは腫瘍長径（ｍｍ）を表し、ｗは腫瘍短径（ｍｍ）を表す。
【０６８９】
３．３  溶媒の調製
０．５ｇのソルビトールを秤量して５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管に５０ｍＬの注射用水を加え、固形物が完全に溶解するまで旋回振動し、濃度１％のソルビトール水溶液（ｗ／ｖ）を調製し、４℃の冷蔵庫に保存しておいた。
【０６９０】
３．４  投与製剤の調製
３．４．１  イリノテカン投与製剤の調製
１２．０ｍｇのイリノテカンを秤量し、０．１５ｍｌの１％乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに２．８５ｍｌの１％ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の１％乳酸、１％ソルビトール水溶液の比率を約５：９５（ｖ／ｖ）とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９１】
３．４．２  ｎｋｔｒ−１０２投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、８８．５５ｍｇのｎｋｔｒ−１０２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９２】
３．４．３  化合物１〜５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．８５ｍｇの化合物１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．８０ｍｇの化合物２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．８８ｍｇの化合物３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１１．２４ｍｇの化合物４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．７８ｍｇの化合物５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９３】
３．４．４  化合物６〜１０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物６を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物７を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物８を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物９を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１０を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９４】
３．４．５  化合物１１〜１５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１２．９８ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０８．９４ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．０１ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．３７ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０４．９１ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９５】
３．４．６  化合物１６〜２０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９６】
３．４．７  化合物２１〜４２投与製剤の調製
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０６９７】
３．５  動物の群分け及び投与
動物の群分け及び投与態様は表７のとおりである。
【０６９８】
活性剤がイリノテカンである群（群１〜８）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１群は溶媒対照群であり、尾静脈注射によりブランク溶媒を４日に１回、合計で３回（Ｑ４Ｄ×３）投与した。第２〜８群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料であるイリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、化合物１〜５を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（イリノテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０６９９】
活性剤がＳＮ−３８である群（群９〜１３）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第９〜１３群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物６〜１０を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（ＳＮ−３８含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７００】
活性剤が１０−ヒドロキシカンプトテシンである群（群１４〜１８）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１４〜１８群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物１１〜１５を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（１０−ヒドロキシカンプトテシン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７０１】
活性剤がルビテカンである群（群１９〜２３）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１９〜２３群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物１６〜２０を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（ルビテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７０２】
群２４〜４５の投与態様は上記と同様である。
【０７０３】
【表７】
2019519508.tif 000545
【０７０４】
３．６  実験終了
実験終了後、体重を秤量し、腫瘍径を測定した後に動物を安楽死させた（ＣＯ2）。腫瘍組織を取り出して秤量し、腫瘍重量抑制率を計算した。腫瘍組織秤量後に、今後の分析のために、−７０℃未満の冷蔵庫に移して保存した。
【０７０５】
４．データ記録、計算公式
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の計算公式は下記のとおりである。
ＲＴＶ＝ＴＶt／ＴＶinitial
式中、ＴＶinitiaLは群分けして投与した時に測定した腫瘍体積であり、ＴＶtは投与期間中各測定時の腫瘍体積である。
相対腫瘍増殖率（％Ｔ／Ｃ）の計算公式下記のとおりである。
％Ｔ／Ｃ＝１００％×（ＲＴＶT／ＲＴＶC）
式中、ＲＴＶTは治療群のＲＴＶを示し、ＲＴＶCは溶媒対照群のＲＴＶを示す。
腫瘍増殖抑制率ＴＧＩ（％）の計算公式は下記のとおりである。
ＴＧＩ＝１００％×［１−（ＴＶt(T)−ＴＶinitial(T)）／（ＴＶt(C)−ＴＶinitial(C)）］
式中、ＴＶt(T)は治療群の各測定時の腫瘍体積を示し、ＴＶinitial(T)は群分けして投与した時の治療群の腫瘍体積を示し、ＴＶt(C)は溶媒対照群の各測定時の腫瘍体積を示し、ＴＶinitial(C)は群分けして投与した時の溶媒対照群の腫瘍体積を示す。
動物の体重低減率の計算公式は下記のとおりである。
動物の体重低減率＝１００％×（ＢＷinitial−ＢＷt）／ＢＷinitial
式中、ＢＷtは投与期間中各測定時の動物体重を示し、ＢＷinitialは群分けして投与した時の動物体重を示す。
腫瘍重量抑制率ＩＲ（％）の計算公式は下記のとおりである。
ＩＲ（％）＝１００％×（ＷC−ＷT）／ＷC
式中、ＷCは対照群の腫瘍重量を示し、ＷTは治療群の腫瘍重量を示す。
【０７０６】
５．統計分析方法
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。データは特に断りのない限り、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥ）として表し、２群の比較はｔ−検定で行った。
【０７０７】
６．実験観察
実験中、実験者及び獣医師は実験動物の徴候及び健康状態を観察し続けなければならない。疼痛、うつ病、活動低下等動物のいかなる異常症状を実験ノートに記録する必要がある。実験動物の異常状況がＩＡＣＵＣ関連動物福祉法規の規定に一致しない場合、獣医師は実験停止の要否を判断し、且つ実験責任者に通知することができる。
【０７０８】
７．結果
ヒトがん異種移植腫瘍モデルについて、実験評価指標として相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）を推奨する。増殖率が低いほど、腫瘍抑制効果が良いことは表８に示されている。
【０７０９】
【表８】
2019519508.tif 000546
【０７１０】
実験結果によれば、本発明の化合物は、ヒト胃がんＮＣＩ−Ｎ８７細胞株のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍の増殖に対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かる。
【０７１１】
実施例４７  同所性Ｕ８７ＭＧヌードマウス脳グリオーマモデル生存率への影響
１．実験目的
供試薬物である化合物１〜４２の、同所性Ｕ８７ＭＧヌードマウス脳グリオーマモデル生存率への影響を評価する。
【０７１２】
２．実験材料
２．１  試料
イリノテカン（原薬）、ｎｋｔｒ−１０２（原薬）は購入品であり、化合物１〜４２はすべてブライトジーン  バイオ−メディカル  テクノロジー  カンパニー  リミテッドにより提供されるものである。
【０７１３】
２．２  試薬
ＲＰＭＩ−１６４０培養液、トリプシン、ペニシリン−ストレプトマイシン、生理食塩水。
【０７１４】
２．３  実験動物
雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（匹数：３００匹；週齢：６〜８週）をＢｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入し、温度２０〜２５℃、相対湿度４０％〜７０％、１２時間明、１２時間暗の照明条件、動物が自由に水・餌を摂取するＳＰＦ動物飼育室で飼育した。飼育して約１週間後、獣医師による検査で身体状況が良好と判断されたマウスを今回の実験用マウスとした。群分け前にマーカーにより動物の尻尾の付け根に標識し、群分け後に各動物をイヤーカットの方法により標識した。
【０７１５】
２．４  可移植性腫瘍株
中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンク（ＣＡＳ、本実験室では液体窒素中に凍結保存）から入手したグリオーマ細胞Ｕ８７ＭＧ。
【０７１６】
３．実験方法
Ｕ８７ＭＧ細胞培養
５％ＣＯ2、３７℃の培養条件下で、Ｕ８７ＭＧ細胞をＲＰＭＩ−１６４０培養液中で通常の細胞培養を行い、０．２５％トリプシン消化法により継代した。細胞の増殖状況に応じて、継代を週に１〜２回行い、継代比率を１：２〜１：６とした。
【０７１７】
３．１  動物モデルの構築
対数増殖期のＵ８７ＭＧ細胞を採取し、細胞数計測後に無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を１×１０8細胞／ｍＬに調整し、ピペットで細胞をほぐし、均一に分散させた後に５０ｍＬの遠心管に入れ、遠心管をアイスボックスに入れた。細胞懸濁液を１ｍＬのシリンジで採取し、動物脳定位固定装置の補助により、マイクロインジェクション法でヒトグリオーマ細胞Ｕ８７ＭＧ細胞１μＬ（１×１０5細胞／匹）を生体外で培養し、同所性Ｕ８７ＭＧ脳グリオーマモデルを構築し、接種後に定期的に動物の状態を観察した。接種後１２日目に、動物を２２５匹選択し、乱塊法により４５組に分けた（ｎ＝５）。
【０７１８】
３．２  投与製剤の調製
３．２．１  イリノテカン投与製剤の調製
１２．０ｍｇのイリノテカンを秤量し、０．１５ｍｌの１％乳酸を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、さらに２．８５ｍｌの１％ソルビトール水溶液を加え、旋回振動して均一に混合し、溶液中の１％乳酸、１％ソルビトール水溶液の比率を約５：９５（ｖ／ｖ）とした。溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７１９】
３．２．２  ｎｋｔｒ−１０２投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、８８．５５ｍｇのｎｋｔｒ−１０２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７２０】
３．２．３  化合物１〜５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．８５ｍｇの化合物１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．８０ｍｇの化合物２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．８８ｍｇの化合物３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１１．２４ｍｇの化合物４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．７８ｍｇの化合物５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のイリノテカンの遊離型の濃度を約４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７２１】
３．２．４  化合物６〜１０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物６を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物７を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物８を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物９を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１０を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のＳＮ−３８の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７２２】
３．２．５  化合物１１〜１５投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１２．９８ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０８．９４ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．０１ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．３７ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０４．９１ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７２３】
３．２．６  化合物１６〜２０投与製剤の調製
毎回の投与に先立って、１１３．０９ｍｇの化合物１１を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０９．０５ｍｇの化合物１２を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１３．１２ｍｇの化合物１３を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１１０．４８ｍｇの化合物１４を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
毎回の投与に先立って、１０５．０２ｍｇの化合物１５を正確に秤量し、２．３ｍｌの生理食塩水を加え、薬物が完全に溶解するまで旋回振動し、溶液中のルビテカンの遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７２４】
３．２．７  化合物２１〜４２投与製剤の調製
調製方法は上記と同一であり、溶液中の活性剤の遊離型の濃度を４．０ｍｇ・ｍＬ-1とした。
【０７２５】
３．３  動物の群分け及び投与
動物の群分け及び投与態様は表９のとおりである。
【０７２６】
活性剤がイリノテカンである群（群１〜８）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１群は溶媒対照群であり、尾静脈注射によりブランク溶媒を４日に１回、合計で３回（Ｑ４Ｄ×３）投与した。第２〜８群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料であるイリノテカン、ｎｋｔｒ−１０２、化合物１〜５を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（イリノテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７２７】
活性剤がＳＮ−３８である群（群９〜１３）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第９〜１３群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物６〜１０を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（ＳＮ−３８含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７２８】
活性剤が１０−ヒドロキシカンプトテシンである群（群１４〜１８）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１４〜１８群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物１１〜１５を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（１０−ヒドロキシカンプトテシン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７２９】
活性剤がルビテカンである群（群１９〜２３）。群分けの日に初回の投与を開始し、２１日後に実験を終了させ、投与容量をすべて１０ｍＬ・ｋｇ-1とした。第１９〜２３群はそれぞれ尾静脈注射により供試試料である化合物１６〜２０を、すべて４０ｍｇ・ｋｇ-1（ルビテカン含有量基準で）の投与量で、Ｑ４Ｄ×３で投与した。
【０７３０】
群２４〜４５の投与態様は上記と同様である。
【０７３１】
【表９】
2019519508.tif 000547
【０７３２】
４．データ記録、計算公式
動物の生存時間を記録した。
【０７３３】
５．統計分析方法
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７ソフトウェアを使用して実験データを計算し、及び関連統計処理を行った。２群の比較はｔ検定で行った。
【０７３４】
６．結果
表１０に示している。
【０７３５】
【表１０】
2019519508.tif 000548
【０７３６】
実験結果によれば、本発明の化合物は、グリオーマに対して良好な抑制作用を有し、且つイリノテカン及びｎｋｔｒ−１０２よりも優れていることが分かる。
【国際調査報告】
2019519508.tif 000549
2019519508.tif 000550
2019519508.tif 000551
2019519508.tif 000552
2019519508.tif 000553
2019519508.tif 000554