(57)【要約】  ヒトヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）に指向する強力な短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ７３４）は、遺伝子改変幹細胞の効率的なポジティブ選択のために、臨床的に利用可能なグアニン類似体代謝拮抗物質（６ＴＧ）への耐性を付与するように、コンディショニングおよびｉｎ  ｖｉｖｏ選択戦略によって遺伝子改変幹細胞生着の速度を改善する。ｓｈＲＮＡ７３４を含むポリヌクレオチドの使用には、細胞においてＨＰＲＴをノックダウンする方法、細胞においてグアニン類似体代謝拮抗物質への耐性を付与する方法、選択可能な遺伝子改変細胞を作製する方法、目的の遺伝子による遺伝子改変細胞を複数の細胞から選択する方法、目的の遺伝子による遺伝子改変細胞を複数の細胞から除去する方法、およびＨＩＶに感染した対象を治療する方法が挙げられる。【選択図】図１
2019509034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
短ヘアピンリボ核酸分子７３４（ｓｈＲＮＡ７３４）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ｓｈＲＮＡ７３４核酸配列が配列番号１である、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
発現制御配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ウイルスベクターである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記発現制御配列が前記ｓｈＲＮＡ７３４の上流の５’の長い末端反復（ＬＴＲ）、および前記ｓｈＲＮＡの下流の３’ＬＴＲを含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
５’ＬＴＲの下流かつ前記ｓｈＲＮＡ７３４の上流に配置された目的の遺伝子をさらに含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記目的の遺伝子の前記核酸配列がＣＣＲ５の阻害剤である、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ＣＣＲ５阻害剤が配列番号２（ＣＣＲ５ｓｈＲＮＡ）である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
以下の概略図
【化１】
2019509034.tif 000008
（図中、
Ｈ１がヒトＨ１ＲＮＡプロモーターであり、
ＵｂＣがヒトユビキチンプロモーターであり、
７ＳＫがヒト７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター（配列番号５）であり、
ＧＦＰが緑色蛍光タンパク質であり、
Ｃ４６がＨＩＶ融合阻害剤である）
に示すベクターである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項１０】
細胞においてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンする方法であって、前記細胞中の配列番号１の発現を可能にする条件下で、請求項２に記載のポリヌクレオチドと前記細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項１１】
細胞においてグアニン類似体代謝拮抗物質に対する耐性を付与する方法であって、前記細胞中の配列番号１の発現を可能にする条件下で、請求項２に記載のポリヌクレオチドと前記細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項１２】
前記グアニン類似体代謝拮抗物質が６−チオグアニン（６ＴＧ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
選択可能な遺伝子改変細胞を作製する方法であって、目的の遺伝子および配列番号１の発現を可能にする条件下で、複数の細胞を請求項５に記載のポリヌクレオチドと接触させることを含む、方法。
【請求項１４】
前記複数の細胞から未改変細胞を除去することをさらに含み、前記除去することが前記ポリヌクレオチドと接触させた前記複数の細胞をグアニン類似体代謝拮抗物質で処置することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の細胞から前記遺伝子改変細胞を除去することをさらに含み、前記除去することが前記複数の細胞をメトトレキサート（ＭＴＸ）で処置することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子改変細胞を目的の遺伝子で選択する方法であって、
（ａ）遺伝子改変細胞を含む複数の細胞を接触させることであって、前記目的の遺伝子および配列番号１の発現を可能にする条件下で、前記遺伝子改変細胞が請求項５に記載のポリヌクレオチドで改変されている、接触させること、ならびに
（ｂ）前記複数の細胞から未改変細胞を除去することであって、前記除去することが前記ポリヌクレオチドと接触させた前記複数の細胞をグアニン類似体代謝拮抗物質で処置することを含む、除去すること
を含む方法。
【請求項１７】
目的の遺伝子で遺伝子改変された細胞を除去する方法であって、
（ａ）遺伝子改変細胞を含む複数の細胞を接触させることであって、前記目的の遺伝子および配列番号１の発現を可能にする条件下で、前記遺伝子改変細胞が請求項５に記載のポリヌクレオチドで改変されている、接触させること、ならびに
（ｂ）前記複数の細胞から前記遺伝子改変細胞を除去することであって、前記除去することが前記複数の細胞をメトトレキサート（ＭＴＸ）で処置することを含む、除去すること
を含む方法。
【請求項１８】
ＨＩＶに感染している対象を治療する方法であって、
（ａ）前記目的の遺伝子および配列番号１の発現を可能にする条件下で、請求項６に記載のポリヌクレオチドで改変されている複数の造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）を接触させること、
（ｂ）遺伝子改変細胞の精製集団を形成するために、前記ポリヌクレオチドで接触させた前記複数の細胞をグアニン類似体代謝拮抗物質で処置すること、ならびに
（ｃ）前記遺伝子改変細胞の前記精製集団を前記対象に投与すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年２月１９日出願の米国特許仮出願第６２／２９７，４３２号の利益を請求し、その内容全体を参照により本出願に組み込む。
【０００２】
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＡＩ０２８６９７、ＡＩ１１７９４１の下で政府の支援によりなされた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
ＥＦＳ−ＷＥＢ経由で提出された配列表への参照
ファイルサイズ３ｋｂの「ＵＣＬＡ２３９ＷＯＵ１＿ＳＬ」と命名された配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、２０１７年２月１７日に作成され、本明細書とともにＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子提出された。配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
発明の技術分野
本発明は、短ヘアピンリボ核酸分子（ｓｈＲＮＡ）と、同リボ核酸分子を含みおよび／またはコードするポリヌクレオチドとを含み、これを用いてヒポキサンチングアニンホスホリポシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンする（例えば、その発現を停止させる）ことができる、核酸分子、ならびに同分子を用いる方法に関する。本方法は、例えば、細胞においてＨＰＲＴをノックダウンする方法、細胞においてグアニン類似体代謝拮抗物質への耐性を付与する方法、選択可能な遺伝子改変細胞を作製する方法、目的の遺伝子で遺伝子改変した細胞を複数の細胞から選択する方法、目的の遺伝子で遺伝子改変した細胞を複数の細胞から除去する方法、およびある疾患または状態を有する対象、例えば、ＨＩＶに感染した対象を治療する方法を包含する。
【背景技術】
【０００５】
ヒト幹細胞を改変するための遺伝子治療戦略は、多くのヒト疾患を治療するために、かなり有望である。しかし、主に遺伝子改変幹細胞の低い生着に起因し、これまでの臨床試験は、限定的にしか成功しなかった。この課題を解決する一戦略は、ＨＰＲＴ発現をノックダウンし、それによって、グアニン類似体代謝拮抗物質に対する耐性を付与することで遺伝子改変細胞の選択を容易にする幹細胞エンジニアリングを含む。
【０００６】
ＨＰＲＴを破壊する努力がなされてきたが、ＨＰＲＴ遺伝子を直接標的とするより効果的な材料および方法の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、短ヘアピンリボ核酸分子７３４（ｓｈＲＮＡ７３４）を含むポリヌクレオチドと、それを用いる方法とを提供することによってこれらや他の必要性を満たす。本発明は、幹細胞に基づく遺伝子治療戦略のための遺伝子改変細胞の生着を改善するために用いることができる小ＲＮＡに基づく化学選択戦略を提供する。
【０００８】
代表的な実施形態において、ｓｈＲＮＡ７３４核酸コード配列は、配列番号１である。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは発現制御配列をさらに含む。一部の実施形態において、発現制御配列は、ｓｈＲＮＡの上流に５’末端反復配列（ＬＴＲ）と、ｓｈＲＮＡ７３４の下流に３’ＬＴＲとを含む。
【０００９】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’ＬＴＲの下流かつｓｈＲＮＡ７３４の上流に配置された目的の遺伝子をさらに含む。一実施形態において、目的の遺伝子は、ＣＣＲ５の阻害剤である。ＣＣＲ５阻害剤の一例は、配列番号２（ＣＣＲ５ｓｈＲＮＡ）である。一実施形態において、ポリヌクレオチドはウイルスベクターである。ＣＣＲ５ｓｈＲＮＡを有するポリヌクレオチドの代表的な実施形態は、図１に示すベクターであり、図においてＨ１はヒトＨ１ＲＮＡプロモーターであり、ＵｂＣはヒトユビキチンプロモーターであり、７ＳＫはヒト７ＳＫ  ＲＮＡプロモーターであり、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質であり、Ｃ４６はＨＩＶ融合阻害剤である。一部の実施形態において、ＧＦＰおよび／またはＣ４６は、治療遺伝子などの目的の代替遺伝子と置き換えられる。上記のポリヌクレオチドを含む医薬組成物も提供される。
【００１０】
本発明は、さらに、細胞においてヒポキサンチングアニンホスホリポシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンする方法を提供する。一実施形態において、方法は、細胞において配列番号１の発現を可能にする条件下で、本明細書に記載のポリヌクレオチドと細胞を接触させることを含む。
【００１１】
本発明は、さらに、細胞においてグアニン類似体代謝拮抗物質に対する耐性を付与する方法を提供する。一実施形態において、方法は、細胞において配列番号１の発現を可能にする条件下で、本発明のポリヌクレオチドと細胞を接触させることを含む。一実施形態において、グアニン類似体代謝拮抗物質は、６−チオグアニン（６ＴＧ）である。
【００１２】
本発明が提供する別の方法は、選択可能な遺伝子改変細胞を作製する方法である。一実施形態において、方法は、目的の遺伝子および配列番号１の発現を可能にする条件下で、本発明のポリヌクレオチドと複数の細胞を接触させることを含む。一実施形態において、方法は複数の細胞から未改変細胞を除去することをさらに含む。除去することは、ポリヌクレオチドと接触させた複数の細胞をグアニン類似体代謝拮抗物質で処置することを含む。別の実施形態において、方法は複数の細胞から遺伝子改変細胞を除去することをさらに含む。除去することは、複数の細胞をメトトレキサート（ＭＴＸ）で処置することを含む。
【００１３】
本発明は、さらに、目的の遺伝子で遺伝子改変した細胞を複数の細胞から選択する方法を提供する。一実施形態において、方法は、遺伝子改変細胞を含む複数の細胞を接触させることを含み、該遺伝子改変細胞は、目的の遺伝子および配列番号１の発現を可能にする条件下で、本発明のポリヌクレオチドで改変されている。方法は、複数の細胞から未改変細胞を除去することをさらに含む。除去することは、ポリヌクレオチドと接触させた複数の細胞をグアニン類似体代謝拮抗物質で処置することを含む。
【００１４】
目的の遺伝子で遺伝子改変した細胞を複数の細胞から除去する方法も提供される。一実施形態において、方法は、遺伝子改変細胞を含む複数の細胞を接触させることを含み、該遺伝子改変細胞は、目的の遺伝子および配列番号１の発現を可能にする条件下で、本発明のポリヌクレオチドで改変されている。方法は、遺伝子改変細胞を複数の細胞から除去することをさらに含む。除去することは、メトトレキサート（ＭＴＸ）で複数の細胞を処置することを含む。
【００１５】
本発明は、さらに、ＨＩＶに感染した対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、方法は、目的の遺伝子および配列番号１の発現を可能にする条件下で、本発明のポリヌクレオチドで改変されている複数の造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）を接触させることを含む。方法は、遺伝子改変細胞の精製された集団を形成するために、ポリヌクレオチドと接触させた複数の細胞をグアニン類似体代謝拮抗物質で処置すること、次いで遺伝子改変細胞の精製集団を対象に投与することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡおよびＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡを含む代表的なレンチウイルスベクターの概略図を示す。
【図２】ＨＰＲＴ発現およびノックダウンに関与する代謝経路の概略図を示す。
【図３】６ＴＧによってポジティブに選択されたＨＰＲＴ欠損細胞の概略図を示す。
【図４】ＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡのレンチウイルスベクター送達によって、６ＴＧによるＨＰＲＴノックダウンの効率的な選択がもたらされることを示すグラフである。ＨＰＲＴノックダウンＭｏｌｔ４−ＣＣＲ５、ＰＢＭＣおよびＣＤ３４＋細胞の６ＴＧによる選択。ｓｈＲＮＡベクター形質導入細胞および対照ベクター形質導入細胞を６ＴＧとともに、または６ＴＧを含まずに培養した。
【図５】Ｍｏｌｔ４ＣＣＲ５細胞におけるＣＣＲ５の下方制御を示すグラフである。
【図６】ベクター形質導入細胞におけるＨＰＲＴノックダウンの解析結果を示す。示された時点での形質導入の後、全細胞溶解液をウエスタンブロットによって解析した。
【図７】安全性のためにＭＴＸによるＨＰＲＴノックダウン遺伝子改変細胞の除去の概略図を示す。
【図８】ＨＰＲＴノックダウン細胞におけるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）誘発性細胞死のＭＴＸ媒介性阻害を示す折れ線グラフである。
【図９】ＢＬＴヒト化マウスモデルを用いた、ＨＰＲＴ／ＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡベクター形質導入ＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞の生着の改善を示す概略図である。ヒト胎児肝臓由来ＣＤ３４＋細胞に二重ｓｈＲＮＡベクター（ＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡとＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡ）または対照ベクターのいずれかを別々に形質導入する。二重ｓｈＲＮＡ形質導入細胞および対照ベクター形質導入細胞を１：１の割合で混合し、ヒト胸腺を有するＮＳＧマウスに腎臓被膜内および静脈内に移植した。
【図１０】タイムラインに示すように、処置群には、手術後１週間から６ＴＧを注射した。グラフは、マウスＰＢＭＣにおいて、手術から０週目（左のグラフ）および８週目にＦＡＣＳで測定したヒトＣＤ４５＋細胞中のマーカー（ＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ）のパーセンテージを示す。
【図１１】ＢＬＴマウスからのベクター改変脾細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ選択を示すグラフである。
【図１２】変異型７ＳＫプロモーターを有する化学選択可能な抗ＨＩＶ遺伝子レンチウイルスベクターの模式図を示す。ＨＰＲＴ  ｓｈ７３４発現を減少させるために、７ＳＫ  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの遠位配列エレメント（ＤＳＥ）に変異を導入した。ベクターも、抗ＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡ  ｓｈ１００５およびＥＧＦＰを発現する。模式図に示すように、変異型プロモーターは野生型７ＳＫプロモーターの活性の１７％を示す。
【図１３】ヒト化ＢＬＴマウスにおいて７ＳＫ変異型１を有する新たに開発されたベクターによる、ベクター改変ヒト造血細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでのポジティブ選択の改善を示すグラフである。ＢＬＴマウスは、７ＳＫプロモーター内に変異型１を有するベクターを有するＣＤ３４＋ＨＳＰＣで再構成された。マウスは、一週間に１回、合計８回、６ＴＧで処置した、または処置を施さなかった。末梢血由来のヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４およびＣＤ８＋リンパ球を、９週間後の時点でＥＧＦＰ発現について解析した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書に記載のヒトヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）に指向する新規で強力な短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ７３４）は、遺伝子改変幹細胞の効率的なポジティブ選択のために、臨床的に利用可能なグアニン類似体代謝拮抗物質（６ＴＧ）への耐性を付与するように、コンディショニングおよびｉｎ  ｖｉｖｏ選択戦略によって遺伝子改変幹細胞生着の速度を改善する。６ＴＧはＨＰＲＴによって代謝され、および活性な毒性代謝物質はＤＮＡおよびＮＡに取り込まれて、細胞毒性を生じる。ｓｈＲＮＡ７３４媒介ＨＰＲＴノックダウンより、活性な毒性代謝物質の形成を阻止することができ、ｓｈＲＮＡ７３４遺伝子改変ＨＰＲＴノックダウン幹細胞の選択が可能になる。
【００１８】
例えば、抗ＨＩＶ遺伝子とｓｈＲＮＡ７３４のレンチウイルスベクター媒介共送達は、ヒト幹細胞において安定したＨＰＲＴのノックダウンをもたらすことができ、６ＴＧプレコンディショニングおよび化学選択によって移植されたこれらの遺伝子改変幹細胞は、ＨＩＶ感染の安定した制御を達成するために、ＨＩＶ保護幹細胞の生着を改善することができる。遺伝子改変細胞は、ＨＩＶ−１のＲ５とＸ４の両指向性を阻止することができた。さらに、ポジティブ選択に加えて、ｓｈＲＮＡ７３４媒介ＨＰＲＴノックダウン戦略の新規の特徴は、プリンデノボ合成経路においてジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）阻止するために、メトトキサート（ＭＸＴ）を用いることによってＨＰＲＴ欠損細胞を除去することができる。したがって、予想外の有害反応が観察される場合、遺伝子改変ＨＳＰＣを除去するための安全手順としてこれを開発することができる。
【００１９】
強力で非毒性のＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｒｏでレンチウイルスベクター形質導入ヒトＴ細胞株、ＣＤ３４＋細胞および初代末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の６ＴＧ媒介ポジティブ選択を可能にする。ｓｈ７３４を送達し、ヒトＴ細胞株、初代末梢血単核球細胞およびＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞においてＨＰＲＴを安定してノックダウンするために、レンチウイルスベクターを利用した。６ＴＧに対する耐性をもたらす効率的なＨＰＲＴノックダウンが存在した。ベクター形質導入細胞は、６ＴＧの存在下でポジティブに選択された。
【００２０】
抗ＨＩＶ−１幹細胞に基づく遺伝子治療へのｓｈＲＮＡ７３４の適用を試験するために、レンチウイルスベクターからのｓｈ７３４およびｓｈ１００５（ＣＣＲ５  ＨＩＶ共受容体に指向するｓｈＲＮＡ）の同時発現により、ＣＣＲ５およびＨＰＲＴ発現が下方制御された。二重ｓｈ１００５／ＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡベクター改変ヒトＨＳＰＣの最初のｉｎ  ｖｉｖｏでの生着実験は、ＣＣＲ５が下方制御されたヒト化ＢＬＴマウスにおいてヒトＴ細胞の再構成を示す。ＢＬＴマウスからｅｘ  ｖｉｖｏ単離された脾細胞は、６ＴＧによってポジティブに選択された。
【００２１】
さらに、本発明は、ＨＩＶ融合阻害剤Ｃ４６を発現する組み合わせ抗ＨＩＶレンチウイルスベクター、およびＣＣＲ５とＨＰＲＴのためのｓｈＲＮＡを提供する。ベクター形質導入ヒト細胞株（Ｋ５６２、ＣＣＲ５ＭＴ−４）はｉｎ  ｖｉｔｒｏでポジティブに選択された。さらに重要なことには、初代ＰＢＭＣおよび胎児肝細胞由来ＣＤ３４＋細胞も６ＴＧによってポジティブに選択されることができる。加えて、ウエスタンブロットで測定すると、ＨＰＲＴ発現は６ＴＧ選択細胞において効率的にノックダウンされた。メトトレキサート（ＭＴＸ）を用いて、形質導入細胞をネガティブに選択した。最終的に、６ＴＧが選択した抗ＨＩＶ（ＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡとＣ４６）ベクター形質導入ＣＣＲ５  ＭＴ−４細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＩＶに対して耐性であることを示した。
【００２２】
これらの結果は、この新たに特定されたＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡが効率的なポジティブ選択のためのレンチウイルスベクターにおいてｓｈＲＮＡ（ｓｈ１００５）とＣ４６に指向するＣＣＲ５と組み合わせ可能なことを示している。
【００２３】
ポジティブ選択戦略に加えて、ＭＴＸを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｓｈＲＮＡ７３４を発現するヒトＴ細胞株およびＣＤ３４＋細胞をネガティブに選択した。
【００２４】
利点
このＲＮＡに基づく技術には、既存のｉｎ  ｖｉｖｏ選択戦略に勝る利点がある。種々の薬剤耐性遺伝子を使用する以前のｉｎ  ｖｉｖｏ選択戦略を試験したが、許容できない毒性または不十分な選択効率を伴った。注目すべきことに、これらの手法は、大体において、外因性薬剤耐性遺伝子を過剰発現しているＨＳＰＣを、骨髄破壊的な放射線照射でプレコンディショニングされたレシピエントに移植することに依存してきた。
【００２５】
現在までこの手法の成功した一例では、ヒトＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼのＰ１４０Ｋ変異型（ＭＧＭＴ  Ｐ１４０Ｋ）を使用し、Ｏ６−ベンジルグアニン（Ｏ６ＢＧ）および１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア（ＢＣＮＵ）などのＤＮＡ傷害剤に対する耐性を付与する。レトロ／レンチウイルスベクターから発現されるＭＧＭＴ  Ｐ１４０Ｋは、マウス、非ヒト霊長類において形質導入ＨＳＰＣの選択を可能にし、神経膠芽腫患者において骨髄保護のための臨床試験で検証されている。しかし、高レベルのＭＧＭＴ  Ｐ１４０Ｋ発現は、それ自体で細胞毒性を引き起こすことが報告されており、より一般的に、外因性薬剤耐性導入遺伝子タンパク質産物の潜在的免疫原性が懸念される。
【００２６】
近年では、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＧＭＴ選択は、ブタオザルでのＣ４６モノ抗ＨＩＶ発現ベクター改変ＨＳＰＣ移植研究に適用された。しかし、比較的大きいＭＧＭＴ  Ｐ１４０Ｋを含むことによって、さらなる抗ＨＩＶ遺伝子の利用できるベクターパッケージング能力を低下させ、複合ベクターゲノムを作製し、ベクター力価を低下させ得る。選択も、強力なアルキル化剤（ＢＣＮＵ）を必要とする。
【００２７】
対照的に、本明細書に記載の戦略の場合、化学療法抵抗性は、内因性遺伝子の発現をノックダウンする、小さくて非免疫原性のｓｈＲＮＡによって付与される。ＨＩＶ疾患のための遺伝子治療は複数の治療遺伝子の組み合わせを必要とするので、スモールＲＮＡを用いたベクターのサイズを減少させることは大きなタンパク質分子よりも有利である。さらに、それはベクター設計および製造を容易にする。化学選択はプリン類似体代謝拮抗物質を用いる処置を必要とし、アルキル化剤よりも患者の不妊の問題が少ないことが知られている。
【００２８】
定義
本出願において使用するすべての科学的および技術的用語は、特に定めない限り、当技術分野において通常使用される意味を有する。本出願で用いる場合、以下の語または句は明記する意味を有する。
【００２９】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖もしくは二本鎖のいずれの形態での一連のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、別段の限定がない限り、天然起源のヌクレオチドに似た様式で核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの知られている類似体を包含する。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「活性フラグメント」という用語は、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする同じ機能を実行することができるオリゴヌクレオチドのかなりの部分を指す。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「ノックアウト」または「ノックダウンする」という用語は、遺伝子の発現を妨害するおよび／または不活性化することによって標的遺伝子が無効にされる遺伝学的技術指す。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「ハイブリダイズする」、「ハイブリダイズすること」および「ハイブリダイゼーション」とは、オリゴヌクレオチドが標準条件下で標的ＤＮＡ分子との非共有結合相互作用を形成することを意味する。標準ハイブリダイズ条件は、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーが標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズすることを可能にする条件である。そのような条件は、当業者に周知の技術を用いて、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーと標的ＤＮＡ分子について容易に判定される。標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、一般にオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブと相補的な配列である。ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、非共有結合相互作用を形成することに干渉しない非ハイブリダイズするヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブのヌクレオチドを非ハイブリダイズするヌクレオチドが、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの末端、またはハイブリダイズするオリゴヌクレオチド内に位置していてもよい。したがって、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、標準ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションが存在する限り、標的配列のすべてのヌクレオチドと相補的である必要はない。
【００３３】
本明細書で用いる場合「相補体」および「相補的」という用語は、２つのＤＮＡ分子が互いに塩基対を形成する能力を指すが、１つのＤＮＡ分子上のアデニンは第２のＤＮＡ分子上のチミンと塩基対を形成し、１つのＤＮＡ分子上のシトシンは第２のＤＮＡ分子上のグアニンと塩基対を形成する。１つのＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列が第２のＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列と塩基対を形成することができるとき、２つのＤＮＡ分子は互いに相補的である。例えば、２つのＤＮＡ分子５’−ＡＴＧＣと５’−ＴＡＣＧは相補的であり、ＤＮＡ分子５’−ＡＴＧＣの相補体は５’−ＴＡＣＧである。相補体および相補的という用語も、１つのＤＮＡ分子が第２のＤＮＡ分子上に存在する少なくとも１つのヌクレオチドと塩基対を形成しない少なくとも１つのヌクレオチドを含む２つのＤＮＡ分子を包含する。例えば、２つのＤＮＡ分子５’−ＡＴＴＧＣと５’−ＴＡＴＣＧの各々の第３のヌクレオチドは、塩基対を形成しないが、これらの２つのＤＮＡ分子は、本明細書で定義するように、相補的である。一般的に、上述の標準条件下でハイブリダイズする場合、２つのＤＮＡ分子は相補的である。一般的に、２つのＤＮＡ分子が、少なくとも約８０％の配列相同性、好ましくは少なくとも約９０％の配列相同性を有する。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「発現制御配列」とは、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例えば構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に作用可能に結合される。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「ベクター」とは、宿主細胞内の目的の１または複数の遺伝子または配列を送達することができる、好ましくは発現することができる構築物を意味する。
【００３６】
本明細書で用い場合、「ａ」または「ａｎ」は別段に明記しない限り、少なくとも１つということを意味する。
【００３７】
本明細書で用いる場合、状態または疾患を「予防する」または「保護する」とは、状態または疾患の発症または進行を妨げる、軽減する、または遅らせることを意味する。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「単離した」という用語は、天然起源ＤＮＡフラグメント、ＤＮＡ分子、コード配列またはオリゴヌクレオチドがその自然環境から取り出されている、または合成分子もしくはクローン化生成物である。好ましくは、ＤＮＡフラグメント、ＤＮＡ分子、コード配列またはオリゴヌクレオチドは精製される、すなわち、他のいかなるＤＮＡフラグメント、ＤＮＡ分子、コード配列またはオリゴヌクレオチドおよび関連する細胞生成物または他の不純物を本質的に含まない。
【００３９】
ポリヌクレオチドおよびそれを使用する方法
本発明は、短ヘアピンリボ核酸分子（ｓｈＲＮＡ）と、同リボ核酸分子を含むポリヌクレオチドとを提供し、これを用いてヒポキサンチングアニンホスホリポシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンする（例えば、その発現を停止させる）ことができる。一実施形態において、本発明は、ｓｈＲＮＡ７３４をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここでｓｈＲＮＡ７３４核酸配列は配列番号１である。
【００４０】
【化１】
2019509034.tif 000003
【００４１】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは発現制御配列をさらに含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えばウイルスベクターなどのベクターである。一実施形態において、発現制御配列は、ｓｈＲＮＡの上流に５’末端反復配列（ＬＴＲ）と、ｓｈＲＮＡ７３４の下流に３’ＬＴＲとを含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’ＬＴＲの下流かつｓｈＲＮＡ７３４の上流に配置された目的の遺伝子をさらに含む。一実施形態において、目的の遺伝子は、ＣＣＲ５の阻害剤である。ＣＣＲ５の阻害剤の一例は、配列番号２（ＣＣＲ５ｓｈＲＮＡ）である。
【００４２】
【化２】
2019509034.tif 000004
【００４３】
一実施形態において、ベクターは、図１に示す概略図において示される要素を含み、
式中、
Ｈ１は、ヒトＨ１  ＲＮＡプロモーター（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ｜Ｓ６８６７０｜  Ｈ１  ＲＮＡ遺伝子｛プロモーター｝ヒト、Ｇｅｎｏｍｉｃ、４９７ｎｔ）であり、
ＵｂＣは、目的の遺伝子の発現を引き起こすために用いることができるヒトユビキチンプロモーター（ポリユビキチンのためのヒトＵｂＣ遺伝子、エクソン１〜２、部分的コード領域、受入番号Ｄ６３７９１）であり、
７ＳＫは、ヒト７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター（ヒト細胞株ＨＥＫ−２９３  ７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター領域、完全配列、受入番号ＡＹ５７８６８５、配列番号３、あるいは配列番号４または５の新規変異型７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター）であり、
ＧＦＰは、緑色蛍光タンパク質（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ｜Ｌ２９３４５｜オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）メッセンジャーｍＲＮＡ、完全コード領域）であり、および
Ｃ４６は、ＨＩＶ融合阻害剤（Ｅｇｅｌｈｏｆｅｒ  Ｍ，  Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ  Ｇ，  Ｍａｒｔｉｎｉｕｓ  Ｈ，ら，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｅｎｔｒｙ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｐ４１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００４；７８（２）：５６８−５７５．）である。
【００４４】
ＣＣＲ５およびＣ４６を発現するベクターは２つの抗ＨＩＶ遺伝子を備え、ＨＰＲＴノックダウンと６ＴＧ媒介選択とを組み合わせて提供され得る。当業者は、目的の代替遺伝子、例えば治療遺伝子がベクター中でＧＦＰおよび／またはＣ４６と置換され得ることを理解する。一実施形態において、目的の遺伝子（複数可）は、長さが最高１２ｋｂである。別の実施形態において、目的の遺伝子（複数可）は、３また４までの遺伝子を直列に含む。一般的な実施形態において、切断ペプチドは、目的の遺伝子間に配列される。
【００４５】
治療遺伝子（複数可）は、ＨＩＶまたは別の疾患または状態を対象とすることができる。例えば、治療遺伝子は、遺伝性遺伝子欠損を修正し、細胞傷害性薬剤に対する正常骨髄の薬物感受性を変化させ、リンパ造血細胞に影響を及ぼす感染性微生物に対する耐性を付与し、内因性免疫系を置き換える、もしくはリセットする、または内因性骨髄の置換を介しておよび移植片対白血病効果／リンパ腫効果の誘導を介して、リンパ造血悪性腫瘍と戦うために、設計することができる。
【００４６】
より具体的には、遺伝性遺伝子欠損としては、鎌状赤血球貧血、サラセミア、遺伝性球状赤血球症、Ｇ６ＰＤ欠損などのヘモグロビン異常症を含む造血障害、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）などの免疫学的もしくは抗菌機能の障害、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）などの凝固障害につながる血小板の障害、ならびに例えば表皮水疱症（ＥＢ）の種々の形態とムコ多糖体沈着症などの組織損傷の部位に進む造血細胞の遺伝子操作によって寛解することができる他の遺伝構造または代謝異常を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００４７】
化学毒性薬物に対する骨髄の薬物感受性の改変が有利である疾患には、最大耐量が骨髄毒性によって制限される化学療法剤によって治療される悪性疾患が含まれるが、これに限定されるものではない。これらには、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、肝癌、頭頸部癌、腎細胞癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌、皮膚癌、肉腫および神経膠腫が挙げられる。
【００４８】
骨髄移植または造血幹細胞移植を用いて、内因性免疫系を置換またはリセットする疾患には、炎症性腸疾患、強皮症、およびエリテマトーデスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
感染性微生物に対する耐性を付与する疾患には、ＨＩＶ感染症とＡＩＤＳ、ＨＴＬＶ感染症およびパルボウイルスＢ１９感染症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
骨髄移植または造血幹細胞移植によって治療されるリンパ球造血の悪性疾患または前悪性疾患には、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、リンパ腫および骨髄異形成症候群が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
この技術の治療適用の別の例は、放射線傷害および化学毒素によって引き起こされる内因性リンパ球造血への後天性損傷後の骨髄移植または造血幹細胞移植の結果を改善することであろう。
【００５２】
この技術の治療的ではないが商業的に有用な適用は、その内因性リンパ球造血がほぼ完全にヒトドナー由来の細胞によって置換されているヒト化動物モデルを作製するためのその使用であろう。生成されたならば、そのような動物は、例えば、ヒト疾患への適用のために考慮される新薬の骨髄毒性を試験するために使用され得る。種々の薬物への造血の感受性が動物の種によって異なり得るので、これは有利であり、したがってヒト化動物モデルでそのような薬物を試験することが最も望ましい。
【００５３】
一実施形態において、７ＳＫは配列番号３である（ヒト細胞株ＨＥＫ−２９３  ７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター領域、完全配列。受入番号ＡＹ５７８６８５）。
【化３】
2019509034.tif 000005
【００５４】
別の実施形態において、７ＳＫは、ヒト化ＢＬＴマウスにおいてベクター改変細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで発現するＧＦＰの生着を改善する配列番号３の変異型体である（配列番号４）。
【化４】
2019509034.tif 000006
【００５５】
別の実施形態において、７ＳＫは、ヒト化ＢＬＴマウスにおいて配列番号４に示す変異の一部またはすべてを用いることによって、ベクター改変細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで発現するＧＦＰの生着を改善する配列番号３の変異型体であり、配列番号５を提供する。
【化５】
2019509034.tif 000007
【００５６】
本明細書に記載のように、本発明はポリヌクレオチドまたはその活性フラグメントを含む医薬組成物をさらに提供する。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはその活性フラグメントは、異種配列に結合される。異種配列は、例えば、検出を容易にするためにタグを加える、または送達もしくは溶解度を促進するパートナーを加えることによってポリヌクレオチドの使用を容易にするように選択することができる。組成物は、ポリヌクレオチドの生物活性の保持を容易にし、免疫系と反応しない１または複数の追加の成分を任意選択で含む。そのような薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知である。
【００５７】
方法
本発明は、細胞においてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）をノックダウンする方法をさらに提供し、該方法は細胞において配列番号１の発現を可能にする条件下で本発明のポリヌクレオチドと細胞を接触させることを含む。細胞においてグアニン類似体代謝拮抗物質に対する耐性を付与する方法も提供し、該方法は細胞において配列番号１の発現を可能にする条件下で本発明によるポリヌクレオチドと細胞を接触させることを含む。一実施形態において、グアニン類似体代謝物質は、６−チオグアニン（６ＴＧ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）またはアザチオプリン（ＡＺＡ）である。細胞代表的な例としては、造血幹細胞、Ｔ細胞、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびＣＤ３４＋細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書に記載の方法での使用に適した他の細胞を当業者なら理解するであろう。
【００５８】
本発明は、選択可能な遺伝子改変細胞を作製する方法も提供し、該細胞は目的の遺伝子を発現するように改変されている。方法は、目的の遺伝子および配列番号１の発現を可能にする条件下で、本発明のポリヌクレオチドと複数の細胞を接触させることを含む。一実施形態において、方法は複数の細胞から未改変細胞を除去することをさらに含む。除去することは、ポリヌクレオチドと接触させた複数の細胞をグアニン類似体代謝拮抗物質で処置することを含む。別の実施形態において、方法は複数の細胞から遺伝子改変細胞を除去することをさらに含む。この実施形態において、除去することは、複数の細胞をメトトレキサート（ＭＴＸ）で処置することを含む。
【００５９】
さらに、本発明は遺伝子改変された細胞を目的の遺伝子で選択する方法を提供する。方法は、（ａ）遺伝子改変細胞を含む複数の細胞を接触させることであって、目的の遺伝子および配列番号１の発現を可能にする条件下で、遺伝子改変細胞が本発明のポリヌクレオチドで改変されている、接触させること、ならびに（ｂ）複数の細胞から未改変細胞を除去することを含む。除去することは、ポリヌクレオチドで接触させた複数の細胞をグアニン類似体抗代謝物で処置することを含む。
【００６０】
さらに、目的の遺伝子で遺伝子改変した細胞を複数の細胞から除去する方法を提供する。方法は、（ａ）遺伝子改変細胞を含む複数の細胞を接触させることであって、目的の遺伝子および配列番号１の発現を可能にする条件下で、遺伝子改変細胞が本発明のポリヌクレオチドで改変されている、接触させること、ならびに（ｂ）複数の細胞から遺伝子改変細胞を除去することを含む。除去することは、複数の細胞をメトトレキサート（ＭＴＸ）で処置することを含む。ＭＴＸ媒介除去戦略は、望ましくない副作用または他の有害事象の場合、遺伝子改変細胞を除去するための安全手順を提供する。ＭＴＸ媒介性排除戦略はまた、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する遺伝子改変Ｔ細胞が、細胞を注入された患者において望ましくない副作用、例えばサイトカインストーム症候群、または移植片対宿主反応などを引き起こす場合、癌免疫遺伝子治療の副作用を緩和するためにも使用され得る。ＭＴＸ処置は、患者内の遺伝改変細胞を排除し得る。
【００６１】
さらなる実施形態において、本発明はＨＩＶに感染している対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、方法は、（ａ）目的の遺伝子および配列番号１の発現を可能にする条件下で、本発明のポリヌクレオチドで改変されている複数の造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）を接触させること、（ｂ）遺伝子改変細胞の精製集団を形成するために、ポリヌクレオチドで接触させた複数の細胞をグアニン類似体代謝拮抗物質で処置すること、ならびに（ｃ）遺伝子改変細胞の精製集団を対象に投与することを含む。プリン類似体による選択は、所望のレベルの造血毒性まで滴定されることができる。必要に応じて、対象は再投与されることができる。
【００６２】
一般的に、対象は哺乳動物である。哺乳動物対象は、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類またはヒトであり得る。一実施形態において、対象はヒトである。
【００６３】
投与および投与量
組成物は、薬学的に許容された担体とともに、任意の適した様式で投与されることが多い。本発明と関連して処置を対象に施す適切な方法が利用可能であり、および特定の組成物を投与するために複数の経路を使用することができるが、特定の経路は別の経路よりも速効性で効果的な反応をもたらし得ることが多い。
【００６４】
本発明と関連して患者に投与される用量は、患者において有益な治療反応を経時的にもたらす、または疾患の進行を阻害するのに十分であるべきである。したがって、組成物は、効果的な反応を誘発する、および／または疾患からの症状および／または合併症を緩和、軽減、治癒または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で対象に投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効用量」と定義される。
【００６５】
本明細書に開示される治療用組成物の投与経路および投与頻度、ならびに投与量は、個体によっておよび選択される薬物によって異なり、標準的な技術を用いて容易に達成することができる。一般に、医薬組成物は、注射（例えば、皮内、腫瘍内、筋肉内、静脈内または皮下）によって、（例えば、吸引によって）鼻腔内に、または経口で投与することができる。代替プロトコルは、個々の患者にとって適当であり得る。
【００６６】
当業者には理解されるように、用量はｍｇ／ｋｇ体重からｍｇ／体表面積に変換することができ、後者はヒトを含むより大きな哺乳動物対象での使用に適している。相対的成長率のための計算機は、当技術分野で周知であり、容易にオンラインで入手される。一般に、相対的成長率は、０．７５〜０．８０の指数を使用する。さらなる情報は、Ｗｅｓｔ  ＆  Ｂｒｏｗｎ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏ  ２０８，１５７５−１５９２，２００５を参照されたい。加えて、米国食品医薬品局は、「Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：  Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｄｏｓｅ  ｉｎ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」を公表しており、以下から入手可能である：Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  ＨＦＤ−２４０  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ５６００  Ｆｉｓｈｅｒｓ  Ｌａｎｅ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５７。
【００６７】
例えば、５ｍｇ／ｋｇの６ＴＧは、２０ｇのマウスに対して１５．０８ｍｇ／ｍ２の投与量に相当する。これは、６５ｋｇのヒトの場合、０．４ｍｇ／ｋｇに等しい。経口での６ＴＧ投与後の吸収率は３０％と推定され、したがって、マウスにおけるこの腹腔内投与量はヒトにおいて約１．３ｍｇ／ｋｇの経口投与後の吸収用量に相当する。小児患者および成人において、従来の単剤化学療法の６ＴＧ経口用量は、２ｍｇ／体重ｋｇ／日であり、４週間後、処置反応が認められない場合、投与量を３ｍｇ／ｋｇまで増量することができる。
【００６８】
実施例
以下の実施例は、本発明を例示し、当業者がそれを作製し、使用するのを支援するために提示する。これらの実施例は、本発明の範囲を多少なりとも限定することを意図しない。
【００６９】
実施例１：遺伝子改変ＨＩＶ保護造血幹細胞／前駆細胞のためのｉｎ  ｖｉｖｏ選択戦略
ＨＳＰＣに基づく抗ＨＩＶ遺伝子治療により、ＨＩＶ治癒への期待が大きくなっているが、これまでの臨床試験は、主に抗ＨＩＶ遺伝子改変ＨＳＰＣによる造血再構成の効率の低さにより、限定的にしか成功しなかった。この実施例では、この限定を克服するための新規の化学選択手法を述べる。
【００７０】
抗ＨＩＶ遺伝子改変ＨＳＰＣの生着を改善するために、遺伝子操作された抗ＨＩＶＨＳＰＣを下方制御したヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェファーゼ（ＨＰＲＴ）のプレコンディショニングおよび化学選択の両方のために６−チオグアニン（６ＴＧ）をもっぱら利用する、すなわち遺伝子操作抗ＨＩＶ改変ＨＳＰＣおよび前駆体の生着および長期再構成を充実させることができる、ｉｎ  ｖｉｖｏ選択戦略を検討した。遺伝子改変細胞に６ＴＧ耐性を付与するために、本発明者らは、レンチウイルスベクター形質導入ＨＰＲＴノックダウンヒトＴ細胞株、ＣＤ３４＋細胞および初代末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の６ＴＧ媒介ポジティブ選択を可能にするＨＰＲＴ短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定した。ＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡおよびＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡの同時発現ベクター改変ヒトＨＳＰＣのｉｎ  ｖｉｖｏ生着実験では、ヒト化ＢＬＴマウスにおいてＣＣＲ５が下方制御されたヒトＴ細胞の再構成を示す。ＢＬＴマウス由来のｅｘ  ｖｉｖｏ単離されたベクター改変脾細胞は、６ＴＧによってポジティブに選択された。これらの結果は、本発明者らが新たに開発したＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡが我々のポジティブ選択のためのベクター中のＣＣＲ５指向ｓｈＲＮＡと組み合わせることができることを示している。
【００７１】
ポジティブ選択に加えて、本ＨＰＲＴノックダウン戦略の新規の特徴は、プリンデノボ合成経路においてジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を阻害することによって臨床的に利用可能なメトトキセート（ＭＴＸ）によるＨＰＲＴノックダウン遺伝子改変細胞を除去するためのネガティブ選択として使用できることである。ＭＴＸは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡを発現するヒトＴ細胞株およびＣＤ３４＋細胞に対してネガティブに選択された。したがって、予想外の副作用が観察された場合、遺伝子改変ＨＳＰＣを排除する安全手順として開発することができる。
【００７２】
本明細書に記載の新規ｉｎ  ｖｉｖｏ化学選択戦略は、抗ＨＩＶ遺伝子改変細胞の生着の効率を改善し、ＨＩＶに対する治療を提供する。６−チオグアニン（６ＴＧ）のケモトキシン耐性は、６ＴＧなどのプリン類似体がその細胞毒性効果を発揮するために必要とする酵素であるヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェファーゼ（ＨＰＲＴ）を標的とする短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のレンチウイルスベクター媒介送達によって達成される。ｓｈＲＮＡは小さく（２０〜２２ｎｔ）、ベクター力価に大きく影響を及ぼすことなく、レンチウイルスベクターから同時発現させることができる。したがって、多方面の抗ＨＩＶベクターを開発するために他の抗ＨＩＶ遺伝子との組み合わせは実現可能である。
【００７３】
６ＴＧによるＨＰＲＴノックダウン細胞のポジティブ選択は、図４〜６に例示されており、ＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡのレンチウイルスベクター送達が６ＧＴによるＨＰＲＴノックダウンの効率的な選択肢をもたらすことを示している。６ＴＧによるＨＰＲＴノックダウンＭｏｌｔ４−ＣＣＲ５、ＰＢＭＣおよびＣＤ３４＋細胞の選択を図４に示す。ｓｈＲＮＡベクターおよび対照ベクターを形質導入した細胞は、６ＴＧとともに、または６ＴＧを含まずに培養した。図５は、ＣＣＲ５がＭｏｌｔ４ＣＣＲ５細胞で下方制御されていることを示す。全細胞溶解液は、示された時点での形質導入の後、ウエスタンブロットによって解析した。ベクター形質導入細胞におけるＨＰＲＴノックダウンを図６に示す。
【００７４】
ＭＴＸによるＨＰＲＴノックダウン細胞のネガティブ選択を図７に示す。図ではＨＰＲＴノックダウン細胞におけるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）誘導性細胞死のＭＴＸ媒介性阻害の模式図を示す。代謝スキームは、酵素５’−ホスホリボシル−１−ピロホスファート（ＰＲＰＰ）アミドトランスフェラーゼにより媒介されるデノボプリン合成の第１の律速段階、およびヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）とアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）により媒介されるサルベージ経路を示す。デノボ合成は多段階過程によって生じ、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）分子を合成するには、４つのアミノ酸、１つのＰＲＰＰ、２つの葉酸塩および３つのＡＴＰの寄与を必要とする。ＨＰＲＴは、補助基質としてＰＲＰＰを使用し、プリン塩基ヒポキサンチンとグアニンからそれぞれイノシン一リン酸（ＩＭＰ）とグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）のサルベージ合成を触媒する。ＨＰＲＴ欠損はその基質であるヒポキサンチンとグアニンの蓄積をもたらし、これらの基質はキサンチンオキシダーゼによって尿酸に変わる。ＡＰＲＴ活性の上昇も、プリン過剰生産の一因となり得る。
【００７５】
ＨＰＲＴ／ＣＣＲ５ノックダウン遺伝子改変細胞のＭＴＸ媒介によるネガティブ選択の結果を図８に示す。Ｍｏｌｔ４ＣＣＲ５（Ａ）、ＰＢＭＣ（Ｂ）およびＣＤ３４＋（Ｃ）細胞は、二重ｓｈＲＮＡベクターで形質導入した。形質導入細胞は、１０μＭのＭＴＸとともに、またはＭＴＸを含まずに培養した。細胞は、％ＥＧＦＰをモニターし、ＭＴＸを含有する新鮮な培養液を３日ごとに与えた。
【００７６】
ＨＰＲＴノックダウンＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ選択は図９および１０に示す。図９は、ＢＬＴ  ｈｕマウスモデルにおいて、ＨＰＲＴ／ＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡベクター形質導入ＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞の生着を示す。ヒト胎児肝臓由来のＣＤ３４＋細胞を二重ｓｈＲＮＡベクター（ＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡとＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡ）または対照ベクターのいずれかに別々に形質導入する。二重ｓｈＲＮＡ形質導入細胞および対照ベクター形質導入細胞を１：１の割合で混合し、これを、ヒト胸腺を有するＮＳＧマウスの腎臓被膜内および静脈内に移植する。
【００７７】
図１０に示すように、処置群に手術から１週間後に、タイムラインごとに６ＴＧを注射した。グラフは、手術後０週目（左グラフ）および８週目（右グラフ）にＦＡＣＳで測定したマウスＰＢＭＣにおけるヒトＣＤ４５＋細胞内のマーカー（ＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ）のパーセンテージを示す。
【００７８】
レンチウイルスベクターのＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡとＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡの送達により、効率的なＨＰＲＴとＣＣＲ５共ノックダウンがもたらされ、６ＴＧによるＥＧＦＰ＋ベクター形質導入細胞をポジティブに選択する能力が付与された。ベクター形質導入ＨＰＲＴノックダウン細胞はＭＴＸによってネガティブに選択される。ＨＰＲＴ／ＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡベクター形質導入ヒト胎児肝臓ＣＤ３４＋  ＨＳＰＣの生着は、ヒト化ＢＬＴマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ未処置群よりも６ＴＧ処置群において５倍増加した。
【００７９】
ＢＬＴマウスからのベクター改変脾細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ選択を図１１に示す。ＣＤ３４＋の形質導入効率は、１５．６％であった。単離されたマウス脾細胞は、０．３μＭの６ＴＧとともに、および６ＴＧを含まずに培養した。
【００８０】
実施例２：ＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡとともに使用するためのプロモーターの改善
この実施例は、ヒト化ＢＬＴマウスにおいてＧＦＰ発現ベクター改変細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を改善する変異型７ＳＫ  ＲＮＡプロモーターを記述する。新規プロモーターは、配列番号４に示す配列を有する。
【００８１】
ヒト化ＢＬＴマウスにおいてベクター形質導入ＣＤ３４＋  ＨＳＰＣの移植から８〜１４週間後の末梢血中の６ＴＧで選択されたベクターを有するｉｎ  ｖｉｖｏのＥＧＦＰ＋ヒトＣＤ４５＋リンパ球系細胞にわずかな低下が観察されたため、本発明者らはより安定した６ＴＧ選択可能抗ＨＩＶ−１レンチウイルスベクターを開発した。本発明者らは、ヒト化ＢＬＴマウスにおいて、２つの短ヘアピンＲＮＡ（ＣＣＲ５ｓｈ１００５とＨＰＲＴｓｈ７３４）の同時発現が移植したベクター形質導入ＣＤ３４＋ＨＳＰＣおよび前駆体細胞の細胞増殖に悪影響を及ぼし得るとの仮説を設けた。この仮説は、Ｕ６などの強力なＲＮＡポリメラーゼプロモーターＩＩＩからのｓｈＲＮＡの過剰発現がヒトＴリンパ球において細胞毒性を引き起こすことができ、弱いプロモーター（Ｈ１）を用いてｓｈＲＮＡ発現を低下させることで細胞毒性効果を最小限に抑えることができるというこれまでの経験に基づいている（Ａｎ．ＤＳ．，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００６）。効率的なＨＰＲＴ下方制御それ自体が細胞増殖に悪影響を及ぼし得る他の可能性が有り得る。
【００８２】
ベクター改変細胞の安定性を改善するために、本発明者らは、ＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡ発現のレベルを低下させることでこれらの悪影響を軽減し得るとの仮説を設けた。この仮説を検証するために、本発明者らは、遠位配列エレメント（ＤＳＥ）内に変異を有する減弱７ＳＫプロモーターからＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡ７３４を発現する３つのレンチウイルスベクターを開発した（変異型１．変異型２および変異型３）（図１２）。これまでの研究に基づいて、変異型１、変異型２および変異型３はＨｅＬａ細胞に遺伝子導入されると、ＨＰＲＴｓｈ７３４発現をそれぞれ１７％、４９％および６７％低下させると予想される（Ｂｏｙｄ  ＤＣ，ら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５  Ｎｏｖ  １０；２５３（５）：６７７−９０）。ＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡ７３４のレベルは、現在、ｓｉＲＮＡ  ＰＣＲ定量アッセイで測定されている。我々の結果および文献（Ｂｏｙｄ  ＤＣ，ら）に基づいて、変異型１を有するベクターは最低レベルでＨＰＲＴｓｈＲＮＡ  ７３４を発現すると予想される。変異型１がヒトＨＳＰＣおよびＴリンパ球においてｓｈ７３４発現を減少し得るかどうかは、不明であった。したがって、本発明者らは、さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのベクターおよび６ＴＧ媒介選択の試験を行った。ベクター形質導入ヒトＣＣＲＴ  ＭＴ４細胞株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで６ＴＧによって効率的に選択された。
【００８３】
ヒト化ＢＬＴマウスにおいて、７ＳＫ変異型１を有する新たに開発したベクターによるベクター改変ヒト造血細胞のｉｎ  ｖｉｖｏポジティブ選択の改善が観察された。ＢＬＴマウスは、７ＳＫプロモーター内に変異型１を有するベクターを有するＣＤ３４＋ＨＳＰＣによって再構成された。マウスは、一週間に１回、合計８回、６ＴＧで処置した、または処置を施さなかった。末梢血由来のヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４およびＣＤ８＋リンパ球を、９週間後の時点でＥＧＦＰ発現について解析した。
【００８４】
この実験からの結果は、以前のベクターよりも新たに開発したベクターを有する、末梢血中のベクター標識ＥＧＦＰ＋ヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３＋およびＣＤ４＋リンパ球が有意に高い（ｐ値＜０．０５）ことを示す（図１３）。
【００８５】
本出願全体を通して、種々の刊行物を参照している。本発明が関連する最先端技術をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示は、その全体を参照によって本出願に組み込まれている。
【００８６】
当業者は、前述の記載に開示された概念および特定の実施形態が、本発明の同じ目的を実行するための他の実施形態を修正または設計するための基礎として容易に利用できることを理解することになる。当業者は、そのような同等の実施形態が添付の特許請求の範囲に記載の本発明の趣旨および範囲から逸脱しないことも理解する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月21日(2018.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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