(57)【要約】  本開示は、Ｋｕに対して結合親和性を有する特定の化合物およびその使用に関する。具体的には、本開示は、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびメガヌクレアーゼを含む部位特異的なゲノムエンジニアリング技術における、本明細書に記載されるようなＫｕ阻害剤の使用に関する。本開示は、本明細書に記載されるような少なくとも１種の化合物を含む、部位特異的なゲノムエンジニアリングに有用なキットにも関する。
2019516774.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2019516774.tif 000071
（式中、
Ｘは、存在しないかまたはＣ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｃ６〜Ｃ１０アリールの各水素は、任意選択的にＲ１０で置換されており、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ６、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ６、−ＳＲ６、−Ｓ（Ｏ）Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７および−ＮＲ６Ｒ７からなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールおよび５員〜７員ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）またはＣ６〜Ｃ１０アリールの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９で置換されており、ただし、Ｒ４またはＲ５の１つは、Ｈではなく、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群から選択され、
Ｒ１０は、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ１１、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＣＯ２Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ１１、−ＳＲ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２および−ＮＲ１１Ｒ１２からなる群から選択され、
【化２】
2019516774.tif 000072
は、単結合またはπ結合のいずれかであり、および
＊は、Ｘの結合点を表す）
の化合物。
【請求項２】
式Ｉａ
【化３】
2019516774.tif 000073
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１０は、クロロである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
式Ｉｂ
【化４】
2019516774.tif 000074
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｚは、Ｏである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｚは、Ｓである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ４は、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｃ６〜Ｃ１０アリールの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ４は、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｃ６〜Ｃ１０アリールは、少なくとも１つのハロゲンまたは−ＯＲ８で置換されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ４は、フェニルであり、フェニルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ４は、少なくとも１つのハロゲンまたは−ＯＲ８で置換されたフェニルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ４は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ４は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）であり、かつＣ６〜Ｃ１０アリールの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ４は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）であり、Ｃ６〜Ｃ１０アリールは、少なくとも１つのハロゲンまたは−ＯＲ８で置換されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ４は、ベンジルであり、ベンジルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ４は、少なくとも１つのハロゲンまたは−ＯＲ８で置換されたベンジルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ４は、
【化５】
2019516774.tif 000075
（式中、＊は、アミド窒素に対するＲ４の結合点を表す）
からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ５は、Ｈである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ３は、メチルである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、５員〜７員ヘテロアリール、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｒ６または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７であり、ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈではない、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ１は、Ｈであり、かつＲ２は、５員〜７員ヘテロアリール、−ＣＮまたは−ＣＯ２Ｒ６である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ１は、−ＣＯ２Ｒ６または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７であり、かつＲ２は、Ｈである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ２は、−ＣＯ２Ｒ６であり、かつＲ６は、Ｈである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ２は、−ＣＯ２Ｒ６であり、かつＲ６は、エチルである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ１は、−ＣＯ２Ｒ６であり、かつＲ６は、Ｈである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ１は、−ＣＯ２Ｒ６であり、かつＲ６は、エチルである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ１は、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７であり、かつＲ６およびＲ７は、Ｈである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ２は、５−テトラゾールである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２９】
【化６】
2019516774.tif 000076
は、単結合である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
【化７】
2019516774.tif 000077
は、π結合である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３１】
化合物であって、
【化８】
2019516774.tif 000078
【化９】
2019516774.tif 000079
【化１０】
2019516774.tif 000080
【化１１】
2019516774.tif 000081
【化１２】
2019516774.tif 000082
【化１３】
2019516774.tif 000083
【化１４】
2019516774.tif 000084
からなる群から選択される式の化合物。
【請求項３２】
ａ．式ＩＩ
【化１５】
2019516774.tif 000085
（式中、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ６、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ６、−ＳＲ６、−Ｓ（Ｏ）Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７および−ＮＲ６Ｒ７からなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５またはフェニルであり、フェニルの各水素原子は、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ４、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＣＯ２Ｒ４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ４、−ＳＲ４、−Ｓ（Ｏ）Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、０１７３Ｓ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５および−ＮＲ４Ｒ５で置換されているか、またはフェニル上の２つの隣接する水素原子は、任意選択的に、それらが結合されている炭素原子と組み合わさって５員〜７員ヘテロシクロアルキル環を形成する基で置換されており、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールおよび５員〜７員ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）または−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）の各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９で置換されており、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９のそれぞれは、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）または−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、および
【化１６】
2019516774.tif 000086
は、単結合またはπ結合のいずれかである）
の化合物を、少なくとも１つのプログラム可能なヌクレアーゼを含む少なくとも１つの細胞と接触させること
を含む、遺伝子編集の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）が交付するＣＡ１８０７１０よる政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本開示は、Ｋｕに対して結合親和性を有する特定の化合物およびその使用に関する。具体的には、本開示は、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびメガヌクレアーゼを含む部位特異的なゲノムエンジニアリング技術における、本明細書に記載されるようなＫｕ阻害剤の使用に関する。本開示は、本明細書に記載されるような少なくとも１種の化合物を含む、部位特異的なゲノムエンジニアリングに有用なキットにも関する。
【背景技術】
【０００３】
ゲノムエンジニアリングは、臨床研究およびバイオテクノロジー研究の両方の最先端にある。ゲノム編集（本明細書では、人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集（ＧＥＥＮ）ともいう）により標的遺伝子改変を行うことができることで、産業および学界ならびに治療およびバイオテクノロジーの両方の分野の科学者にとって多様な選択肢が開かれてきた。この方法の意義は、そのプロセスを開始する人工ヌクレアーゼを「分子のはさみ」として使用して、生物のゲノムのＤＮＡ配列の標的挿入、欠失または置き換えを行うことができることにある。ゲノム編集は、遺伝子変異の標的化、染色体再構成の導入、幹細胞を用いた遺伝子機能の研究、トランスジェニック動物、内在性遺伝子の標識化、導入遺伝子付加の標的化および同種のものに応用されてきた。ゲノム編集技術の登場で可能になった用途および起こり得るゲノム変異が広範囲であるため、ゲノム編集市場は、２０１９年までに３５億ドル超に増加すると予想される。
【０００４】
ゲノムエンジニアリングは、有望であるにも関わらず、この方法にはいくつかの欠点および課題が指摘されてきた。たとえば、ゲノム編集の背景にある原理は、ゲノム配列に二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を導入するための人工ヌクレアーゼの使用である。ＤＮＡ  ＤＳＢの導入後、２つの経路、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）の１つが切断を直すのに関わっている。ＮＨＥＪは、哺乳動物細胞におけるＤＮＡ  ＤＳＢ修復の主要経路である。この極めて効率的で比較的単純な経路は、典型的には細胞周期のＳ期およびＧ２期に限定されるＨＤＲと異なり、全細胞周期を通じて活性である。加えて、ＮＨＥＪは、相同的なドナー分子も必要としない。ＮＨＥＪが主要な修復メカニズムであることから起こる１つの問題は、ＮＨＥＪが誤りがちであり、多くの場合、ＤＳＢの部位で挿入および欠失を起こすことである。ＮＨＥＪの別の問題点は、その遺伝子ターゲティング効率が低いことから、１つの改変されたクローン細胞を同定するために大規模な実験を必要とすることである。さらに、ＮＨＥＪ活性は、ゲノム全体で自然に起こるランダムなＤＳＢにドナーＤＮＡ分子の非特異的挿入を引き起こす可能性もある。これは、遺伝子ターゲティング効率のさらなる低下をもたらすことがあるため、問題となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｉｅｒｃｅ  ＡＪ  ２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
相同的なドナー配列の存在下において、ＨＤＲは、ＤＳＢ部位でドナー分子の正確な挿入をもたらす。しかしながら、ＮＨＥＪが主要なＤＮＡ修復経路であるため、ゲノム編集の効率は限定されてきた。これまでの研究から、ＮＨＥＪを阻害するとＨＤＲ活性が増加することが示されている（Ｐｉｅｒｃｅ  ＡＪ  ２００１）。そのため、ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路を阻害することができ、かつ／またはＨＤＲ  ＤＮＡ修復経路を活性化することができる新規な経路を見出すことが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定のアリール−ピラゾン化合物がＫｕに対して活性を示し、ＫｕのＤＳＢとの相互作用を阻害してＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路をシャットダウンする役割を果たし得ることが発見された。一態様では、本開示は、式Ｉ
【化１】
2019516774.tif 000003
（式中、
Ｘは、存在しないかまたはＣ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｃ６〜Ｃ１０アリールの各水素は、任意選択的に、
【化２】
2019516774.tif 000004
などのＲ１０で置換されており、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ６、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ６、−ＳＲ６、−Ｓ（Ｏ）Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７および−ＮＲ６Ｒ７からなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールおよび５員〜７員ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）またはＣ６〜Ｃ１０アリールの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されており、ただし、Ｒ４またはＲ５の１つは、Ｈではなく、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群から選択され、
Ｒ１０は、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ１１、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＣＯ２Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ１１、−ＳＲ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２および−ＮＲ１１Ｒ１２からなる群から選択され、
【化３】
2019516774.tif 000005
は、単結合またはπ結合のいずれかであり、および
＊は、Ｘの結合点を表す）
の化合物を提供する。
【０００８】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるような少なくとも１種の化合物と、ゲノム編集方法または手順におけるその化合物の一連の使用説明書とを含むキットを提供する。別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるような少なくとも１種の化合物と、ゲノム編集方法に有用な少なくとも１つの人工ヌクレアーゼとを含むキットを提供する。別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるような少なくとも１種の化合物と、ゲノム編集方法に有用な少なくとも１つの人工ヌクレアーゼと、ゲノム編集方法または手順におけるその化合物の一連の使用説明書とを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、
ａ）ＤＮＡ分子を含む真核細胞内のＤＮＡ分子のターゲット配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、真核細胞内で作動可能な第１の調節エレメントであって、ＤＮＡ分子は、少なくとも１つの遺伝子産物をコードし、かつ真核細胞は、少なくとも１つの遺伝子産物を発現する、第１の調節エレメント、および
ｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、真核細胞内で作動可能な第２の調節エレメントであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、システムの同一または異なるベクター上にある、第２の調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む非天然の人工ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムと、
式ＩＩ
【化４】
2019516774.tif 000006
（式中、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、本明細書で定義された通りである）
の少なくとも１種の化合物と
を含むキットを提供する。
【０００９】
別の態様では、本開示は、
ａ．式ＩＩ
【化５】
2019516774.tif 000007
（式中、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ６、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ６、−ＳＲ６、−Ｓ（Ｏ）Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７および−ＮＲ６Ｒ７からなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５またはフェニルであり、フェニルの各水素原子は、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ４、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＣＯ２Ｒ４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ４、−ＳＲ４、−Ｓ（Ｏ）Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５および−ＮＲ４Ｒ５で置換されているか、またはフェニル上の２つの隣接する水素原子は、任意選択的に、それらが結合されている炭素原子と組み合わさって５員〜７員ヘテロシクロアルキル環を形成する基で置換されており、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールおよび５員〜７員ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）または−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）の各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されており、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９のそれぞれは、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）または−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、および
【化６】
2019516774.tif 000008
は、単結合またはπ結合のいずれかである）
の化合物を、少なくとも１つのプログラム可能なヌクレアーゼを含む少なくとも１つの細胞と接触させること
を含む、遺伝子編集の方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、
（ａ）ターゲット配列を有しかつ遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含みかつそれを発現する真核細胞に、人工の非天然ＣＲＩＳＰＲ−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムであって、
（１）ターゲット配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、真核細胞内で作動可能な第１の調節エレメント、および
（２）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、真核細胞内で作動可能な第２の調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む人工の非天然ＣＲＩＳＰＲ−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムを導入することであって、
構成要素（１）および（２）は、システムの同一または異なるベクター上にあり、それにより、ガイドＲＮＡは、ターゲット配列を標的とし、かつＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断し、それにより、少なくとも１つの遺伝子産物の発現は、変化し、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡは、共に天然に存在しない、導入することと、
（ｂ）真核細胞を、式ＩＩ
【化７】
2019516774.tif 000009
（式中、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、本明細書で定義された通りである）
の少なくとも１種の化合物と接触させることと
を含む、少なくとも１つの遺伝子産物の発現を変化させる方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本開示は、ゲノム編集システムを含む細胞と、式ＩＩ
【化８】
2019516774.tif 000010
（式中、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、本明細書で定義された通りである）
の少なくとも１種の化合物とを提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、Ｚｎフィンガーおよびメガヌクレアーゼからなる群から選択される。
【００１２】
本開示の追加の実施形態、特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および本開示の実施を通して明らかになるであろう。本開示の化合物は、以下に列挙した項のいずれかの実施形態として記載され得る。本明細書に記載の実施形態のいずれも、それらの実施形態が互いに矛盾しない範囲まで、本明細書に記載の他の任意の実施形態と共に使用され得ることが理解されるであろう。
【００１３】
１．式Ｉ
【化９】
2019516774.tif 000011
（式中、
Ｘは、存在しないかまたはＣ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｃ６〜Ｃ１０アリールの各水素は、任意選択的に、
【化１０】
2019516774.tif 000012
などのＲ１０で置換されており、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ６、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ６、−ＳＲ６、−Ｓ（Ｏ）Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７および−ＮＲ６Ｒ７からなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールおよび５員〜７員ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）またはＣ６〜Ｃ１０アリールの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されており、ただし、Ｒ４またはＲ５の１つは、Ｈではなく、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群から選択され、
Ｒ１０は、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ１１、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＣＯ２Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ１１、−ＳＲ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２および−ＮＲ１１Ｒ１２からなる群から選択され、
【化１１】
2019516774.tif 000013
は、単結合またはπ結合のいずれかであり、および
＊は、Ｘの結合点を表す）
の化合物。
【００１４】
２．式Ｉａ
【化１２】
2019516774.tif 000014
を有する、項１の化合物。
【００１５】
３．Ｒ１０は、クロロである、項２の化合物。
【００１６】
４．式Ｉｂ
【化１３】
2019516774.tif 000015
を有する、項１の化合物。
【００１７】
４．Ｚは、Ｏである、前項のいずれか一項の化合物。
【００１８】
５．Ｚは、Ｓである、項１〜３のいずれか一項の化合物。
【００１９】
６．Ｒ４は、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｃ６〜Ｃ１０アリールの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されている、前項のいずれか一項の化合物。
【００２０】
７．Ｒ４は、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｃ６〜Ｃ１０アリールは、少なくとも１つのハロゲンまたは−ＯＲ８で置換されている、前項のいずれか一項の化合物。
【００２１】
８．Ｒ４は、フェニルであり、フェニルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されている、項１〜６のいずれか一項の化合物。
【００２２】
９．Ｒ４は、少なくとも１つのハロゲンまたは−ＯＲ８で置換されたフェニルである、項１〜６のいずれか一項の化合物。
【００２３】
１０．Ｒ４は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）である、項１〜５のいずれか一項の化合物。
【００２４】
１１．Ｒ４は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）であり、かつＣ６〜Ｃ１０アリールの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されている、項１〜５のいずれか一項の化合物。
【００２５】
１２．Ｒ４は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）であり、Ｃ６〜Ｃ１０アリールは、少なくとも１つのハロゲンまたは−ＯＲ８で置換されている、項１〜５のいずれか一項の化合物。
【００２６】
１３．Ｒ４は、ベンジルであり、ベンジルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されている、項１〜５のいずれか一項の化合物。
【００２７】
１４．Ｒ４は、少なくとも１つのハロゲンまたは−ＯＲ８で置換されたベンジルである、項１〜５のいずれか一項の化合物。
【００２８】
１５．Ｒ４は、
【化１４】
2019516774.tif 000016
（式中、＊は、アミド窒素に対するＲ４の結合点を表す）
からなる群から選択される、項１〜５のいずれか一項の化合物。
【００２９】
１６．Ｒ５は、Ｈである、前項のいずれか一項の化合物。
【００３０】
１７．Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである、前項のいずれか一項の化合物。
【００３１】
１８．Ｒ３は、メチルである、前項のいずれか一項の化合物。
【００３２】
１９．Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、５員〜７員ヘテロアリール、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｒ６または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７であり、ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈではない、前項のいずれか一項の化合物。
【００３３】
２０．Ｒ１は、Ｈであり、かつＲ２は、５員〜７員ヘテロアリール、−ＣＮまたは−ＣＯ２Ｒ６である、前項のいずれか一項の化合物。
【００３４】
２１．Ｒ１は、−ＣＯ２Ｒ６または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７であり、かつＲ２は、Ｈである、項１〜１７のいずれか一項の化合物。
【００３５】
２２．Ｒ２は、−ＣＯ２Ｒ６であり、かつＲ６は、Ｈである、項２０の化合物。
【００３６】
２３．Ｒ２は、−ＣＯ２Ｒ６であり、かつＲ６は、エチルである、項２０の化合物。
【００３７】
２４．Ｒ１は、−ＣＯ２Ｒ６であり、かつＲ６は、Ｈである、項２１の化合物。
【００３８】
２５．Ｒ１は、−ＣＯ２Ｒ６であり、かつＲ６は、エチルである、項２１の化合物。
【００３９】
２６．Ｒ１は、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７であり、かつＲ６およびＲ７は、Ｈである、項２１の化合物。
【００４０】
２７．Ｒ２は、５−テトラゾールである、項２０の化合物。
【００４１】
２８．
【化１５】
2019516774.tif 000017
は、単結合である、前項のいずれか一項の化合物。
【００４２】
２９．
【化１６】
2019516774.tif 000018
は、π結合である、項１〜２７のいずれか一項の化合物。
【００４３】
３０．化合物であって、
【化１７】
2019516774.tif 000019
【化１８】
2019516774.tif 000020
【化１９】
2019516774.tif 000021
【化２０】
2019516774.tif 000022
【化２１】
2019516774.tif 000023
【化２２】
2019516774.tif 000024
【化２３】
2019516774.tif 000025
からなる群から選択される式の化合物。
【００４４】
２７．ａ．式ＩＩ
【化２４】
2019516774.tif 000026
（式中、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ６、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ６、−ＳＲ６、−Ｓ（Ｏ）Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７および−ＮＲ６Ｒ７からなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５またはフェニルであり、フェニルの各水素原子は、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ４、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＣＯ２Ｒ４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ４、−ＳＲ４、−Ｓ（Ｏ）Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、０１７３Ｓ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５および−ＮＲ４Ｒ５で置換されているか、またはフェニル上の２つの隣接する水素原子は、任意選択的に、それらが結合されている炭素原子と組み合わさって５員〜７員ヘテロシクロアルキル環を形成する基で置換されており、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールおよび５員〜７員ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）または−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）の各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されており、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９のそれぞれは、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）または−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、および
【化２５】
2019516774.tif 000027
は、単結合またはπ結合のいずれかである）
の化合物を、少なくとも１つのプログラム可能なヌクレアーゼを含む少なくとも１つの細胞と接触させること
を含む、遺伝子編集の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＤＮＡに結合するＫｕに対するＸ−８０の作用を示す。図１Ａは、結合されたＤＮＡのパーセンテージをＸ−８０濃度の関数としてプロットしたものを示し、図１Ｂは、Ｋｕ−ＤＮＡ結合のＤＮＡゲルをＸ−８０濃度の関数として示す。
【図２】ＤＮＡに結合するＫｕに対する０５３０の作用を示す。図２Ａは、結合されたＤＮＡのパーセンテージを０５３０濃度の関数としてプロットしたものを示し、図２Ｂは、Ｋｕ−ＤＮＡ結合のＤＮＡゲルを０５３０濃度の関数として示す。
【図３】インビトロＮＨＥＪアッセイの結果を示す。阻害剤ＮＧ−０２−１３２の量を増やしながら、放射能標識した直線化ＤＮＡを全細胞抽出物とインキュベートした。
【図４】ＣＲＩＳＰＲの生物学的実施例５に使用した構成要素を示す。図４Ａは、生物学的実施例５に使用したＣＲＩＳＰＲの構成要素の概略図を示す。図４Ｂは、ドナープラスミド５．２ｋｂ（左アームホモロジー（ＬＡＨ）０．８ｋｂ；導入遺伝子インサート２．２ｋｂ；左アームホモロジー（ＬＡＨ）０．８ｋｂ）の詳細を示す。
【図５】ＣＲＩＰＳＲの生物学的実施例５の概略図および結果を示す。図５Ａは、ＰＣＲ遺伝子挿入（Ｌ１／Ｌ２：１．２ｋｂ；Ｒ１／Ｒ２：１．２ｋｂ）の概略図を示す。図５Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子挿入のゲル画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本開示をさらに記載する前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、当然のことながら変化し得ることを理解されたい。さらに、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的とし、限定的であることを意図しないことも理解されたい。
【００４７】
他に記載がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての特許、出願、公開された出願および他の刊行物は、参照によりその全体が援用される。本セクションに記載した定義が、本明細書に援用する特許、出願または他の刊行物に記載された定義に反しているかまたは他に矛盾している場合、本セクションに記載した定義が、本明細書に援用する定義に優先する。
【００４８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数形の指示対象を含む。特許請求の範囲は、任意の選択的要素を除外するように作成され得ることをさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の記載に関連して「単独で」、「のみ」および同種のもののような限定的な用語を使用すること、または「否定的な」限定を使用することの根拠となることを意図している。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「包含する」、「含有する」および「含む」という用語は、それらのオープンで非限定的な意味において使用される。
【００５０】
より簡潔な説明を行うため、本明細書に示した量的表現の一部は、「約」という用語で修飾されていない。「約」という用語が明示的に使用されるか否かに関わらず、本明細書に示されたあらゆる量は、示された実際の値を指すものとし、そのような示された値の実験および／または測定条件による均等物および近似値を含め、当該技術分野の通常の技術に基づいて合理的に推測されると思われる、そのような示された値の近似値も指すものとすることが理解されるであろう。収率がパーセンテージで示されるときには常に、そうした収率は、物質の質量を指し、その収率は、その特定の化学量論的条件下で得られ得る同じ物質の最大量を基準として示される。パーセンテージで示される濃度は、異なる記載がない限り、質量比を指す。
【００５１】
別に記載がある場合を除いて、本実施形態の方法および技術は、一般に、当該技術分野において周知の従来の方法に従い、本明細書を通じて引用および考察される様々な一般的およびより特定の参考文献に記載されているように行われる。たとえば、Ｌｏｕｄｏｎ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００２，ｐｐ．３６０−３６１，１０８４−１０８５；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１を参照されたい。
【００５２】
本明細書に記載の化合物の化学命名法は、一般に、市販されているＡＣＤ／Ｎａｍｅ  ２０１４（ＡＣＤ／Ｌａｂｓ）またはＣｈｅｍＢｉｏＤｒａｗ  Ｕｌｔｒａ  １３．０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて得られている。
【００５３】
本開示のある種の特徴は、分かりやすいように別々の実施形態に関連して記載されているが、単一の実施形態において組み合わせても提供され得ることが理解されるであろう。逆に、本開示の様々な特徴は、簡潔にするために単一の実施形態に関連して記載されているが、別々にまたは任意の好適な部分組み合わせにおいても提供され得る。変数で表される化学基に関する実施形態のすべての組み合わせは、本開示に具体的に包含され、そうした組み合わせが、安定な化合物（すなわち、単離し、キャラクタリゼーションを行い、生物活性の試験を行うことができる化合物）である化合物を包含する程度まで、あらゆる組み合わせがあたかも個々に明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。さらに、そうした変数を記載している実施形態に列挙された化学基のすべての部分組み合わせも、本開示に具体的に包含され、化学基のそうしたあらゆる部分組み合わせがあたかも個々に明示的に本明細書に開示されているかのように本明細書に開示される。
【００５４】
定義
本明細書で使用する場合、「アルキル」という用語は、任意選択的に分岐であり、１〜２０個の炭素原子を含む炭素原子鎖を含む。ある種の実施形態では、アルキルは、有利には、Ｃ１〜Ｃ１２、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ９、Ｃ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ７、Ｃ１〜Ｃ６およびＣ１〜Ｃ４を含め、長さに制限があり得ることもさらに理解されたい。例示的には、Ｃ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ７、Ｃ１〜Ｃ６およびＣ１〜Ｃ４ならびに同種のものを含む、そうした特に長さに制限があるアルキル基は、「低級アルキル」ということがある。例示的なアルキル基として、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルおよび同種のものがある。アルキルは、置換されていてもいなくてもよい。典型的な置換基群として、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、脂環式複素環、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロ、カルボニル、オキソ、（＝Ｏ）、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、ニトロおよびアミノ、または本明細書で提供される種々の実施形態に記載されているようなものがある。「アルキル」は、上記の基などの他の基と組み合わされて、官能性アルキルを形成し得ることが理解されるであろう。例として、本明細書に記載されるような「アルキル」基の「カルボキシ」基との組み合わせは、「カルボキシアルキル」基ということがある。他の非限定的な例として、ヒドロキシアルキル、アミノアルキルおよび同種のものがある。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「アルケニル」という用語は、任意選択的に分岐であり、２〜２０個の炭素原子を含み、かつ少なくとも１つの炭素−炭素二重結合（すなわちＣ＝Ｃ）も含む炭素原子鎖を含む。ある種の実施形態では、アルケニルは、有利には、Ｃ２〜Ｃ１２、Ｃ２〜Ｃ９、Ｃ２〜Ｃ８、Ｃ２〜Ｃ７、Ｃ２〜Ｃ６およびＣ２〜Ｃ４を含め、長さに制限があり得ることが理解されるであろう。例示的には、Ｃ２〜Ｃ８、Ｃ２〜Ｃ７、Ｃ２〜Ｃ６およびＣ２〜Ｃ４を含む、そうした特に長さに制限があるアルケニル基は、低級アルケニルということがある。アルケニルは、置換されていなくても、またはアルキルについて記載したようにもしくは本明細書で提供される種々の実施形態に記載されているように置換されていてもよい。例示的なアルケニル基として、限定されるものではないが、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−、２−、または３−ブテニルおよび同種のものがある。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「アルキニル」という用語は、任意選択的に分岐であり、２〜２０個の炭素原子を含み、かつ少なくとも１つの炭素−炭素三重結合（すなわちＣ≡Ｃ）も含む炭素原子鎖を含む。ある種の実施形態では、アルキニルは、有利には、Ｃ２〜Ｃ１２、Ｃ２〜Ｃ９、Ｃ２〜Ｃ８、Ｃ２〜Ｃ７、Ｃ２〜Ｃ６およびＣ２〜Ｃ４を含め、それぞれ長さに制限があり得ることが理解されるであろう。例示的には、Ｃ２〜Ｃ８、Ｃ２〜Ｃ７、Ｃ２〜Ｃ６およびＣ２〜Ｃ４を含む、そうした特に長さに制限があるアルキニル基は、低級アルキニルということがある。アルケニルは、置換されていなくても、またはアルキルについて記載したようにもしくは本明細書で提供される種々の実施形態に記載されているように置換されていてもよい。例示的なアルケニル基として、限定されるものではないが、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−、２−または３−ブチニルおよび同種のものがある。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「アリール」という用語は、完全に共役したπ電子系を有する６〜１２個の炭素原子のすべて炭素の単環式または縮合環の多環式基を指す。ある種の実施形態では、アリールは、有利には、Ｃ６〜Ｃ１０アリールなど、大きさに制限があり得ることが理解されるであろう。例示的なアリール基として、限定されるものではないが、フェニル、ナフタレニルおよびアントラセニルがある。アリール基は、置換されていなくても、またはアルキルについて記載したようにもしくは本明細書で提供される種々の実施形態に記載されているように置換されていてもよい。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「シクロアルキル」という用語は、すべて炭素の５員／６員もしくは６員／６員の縮合二環式環を含め、３〜１５員のすべて炭素の単環式環または多環式縮合環（「縮合」環系は、系内の各環が隣接する炭素原子対を互いに系内の環と共有することを意味する）基（環の１つまたは複数は、１つまたは複数の二重結合を含み得るが、シクロアルキルは、完全に共役したπ電子系を含まない）を指す。ある種の実施形態では、シクロアルキルは、有利には、Ｃ３〜Ｃ１３、Ｃ３〜Ｃ９、Ｃ３〜Ｃ６およびＣ４〜Ｃ６を含め、大きさに制限があり得ることが理解されるであろう。シクロアルキルは、置換されていなくても、またはアルキルについて記載したようにもしくは本明細書で提供される種々の実施形態に記載されているように置換されていてもよい。例示的なシクロアルキル基として、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、アダマンチル、ノルボルニル、ノルボルネニル、９Ｈ−フルオレン−９−イルおよび同種のものがある。図形表示で示したシクロアルキル基の例示的な例として、各部分が適切に結合した形態の以下の物質がある。
【化２６】
2019516774.tif 000028
【００５９】
本明細書で使用する場合、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、環内に３〜１２個の原子を有する単環基または縮合環基（少なくとも１つの環原子は、窒素、酸素または硫黄などのヘテロ原子であり、残りの環原子は、炭素原子である）を指す。ヘテロシクロアルキルは、任意選択的に、１つ、２つ、３つまたは４つのヘテロ原子を含み得る。ヘテロシクロアルキルは、窒素に対する二重結合（たとえば、Ｃ＝ＮまたはＮ＝Ｎ）を含め、１つまたは複数の二重結合も有し得るが、完全に共役したπ電子系を含まない。ある種の実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、有利には、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロシクロアルキルおよび同種のものなど、大きさに制限があり得ることが理解されるであろう。ヘテロシクロアルキルは、置換されていなくても、またはアルキルについて記載したようにもしくは本明細書で提供される種々の実施形態に記載されているように置換されていてもよい。例示的なヘテロシクロアルキル基として、限定されるものではないが、オキシラニル、チアナリル、アゼチジニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、１，４−ジオキサニル、モルホリニル、１，４−ジチアニル、ピペラジニル、オキセパニル、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、２Ｈ−ピラニル、１，２，３，４−テトラヒドロピリジニルおよび同種のものがある。図形表示で示したヘテロシクロアルキル基の例示的な例として、各部分が適切に結合した形態の以下の物質がある。
【化２７】
2019516774.tif 000029
【００６０】
本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素および硫黄から選択される１つ、２つ、３つまたは４つの環ヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素原子であり、かつ完全に共役したπ電子系も有する５〜１２個の環原子の単環基または縮合環基を指す。ある種の実施形態では、ヘテロアリールは、有利には、３員〜７員ヘテロアリール、５員〜７員ヘテロアリールおよび同種のものなど、大きさに制限があり得ることが理解されるであろう。ヘテロアリールは、置換されていなくても、またはアルキルについて記載したようにもしくは本明細書で提供される種々の実施形態に記載されているように置換されていてもよい。例示的なヘテロアリール基として、限定されるものではないが、ピロリル、フラニル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、プリニル、テトラゾリル、トリアジニル、ピラジニル、テトラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、チエニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリルおよびカルバゾロイルならびに同種のものがある。図形表示で示したヘテロアリール基の例示的な例として、各部分が適切に結合した形態の以下の物質がある。
【化２８】
2019516774.tif 000030
【００６１】
本明細書で使用する場合、「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は、−ＯＨ基を指す。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「アルコキシ」は、−Ｏ−（アルキル）または−Ｏ−（非置換シクロアルキル）基の両方を指す。代表的な例として、限定されるものではないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシおよび同種のものがある。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「アリールオキシ」は、−Ｏ−アリールまたは−Ｏ−ヘテロアリール基を指す。代表的な例として、限定されるものではないが、フェノキシ、ピリジニルオキシ、フラニルオキシ、チエニルオキシ、ピリミジニルオキシ、ピラジニルオキシおよび同種のものおよび同種のものがある。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「メルカプト」は、−ＳＨ基を指す。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「アルキルチオ」は、−Ｓ−（アルキル）または−Ｓ−（非置換シクロアルキル）基を指す。代表的な例として、限定されるものではないが、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオ、シクロプロピルチオ、シクロブチルチオ、シクロペンチルチオ、シクロヘキシルチオおよび同種のものがある。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「アリールチオ」は、−Ｓ−アリールまたは−Ｓ−ヘテロアリール基を指す。代表的な例として、限定されるものではないが、フェニルチオ、ピリジニルチオ、フラニルチオ、チエニルチオ、ピリミジニルチオおよび同種のものがある。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指す。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「シアノ」は、−ＣＮ基を指す。
【００６９】
「オキソ」という用語は、カルボニル酸素を表す。たとえば、オキソで置換されたシクロペンチルは、シクロペンタノンである。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「結合」は、共有結合を指す。
【００７１】
「置換された」という用語は、指定された基または部分が１つまたは複数の置換基を有することを意味する。「非置換の」という用語は、指定された基が置換基を有さないことを意味する。「置換された」という用語が構造系を説明するのに使用される場合、置換が、原子価により許容される系上の任意の位置で起こることを意図している。いくつかの実施形態では、「置換された」は、指定された基または部分が１つ、２つまたは３つの置換基を有することを意味する。他の実施形態では、「置換された」は、指定された基または部分が１つまたは２つの置換基を有することを意味する。なお他の実施形態では、「置換された」は、指定された基または部分が１つの置換基を有することを意味する。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「任意選択的な」または「任意選択的に」は、その後に記載される現象または状況が起こり得るが、起こる必要はなく、その記載には、その現象または状況が起こる場合と、それが起こらない場合とが含まれることを意味する。たとえば、「Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたは単環式もしくは二環式ヘテロアリールの各水素原子が、独立に、任意選択的にＣ１〜Ｃ６アルキルで置換されている場合」は、アルキルが、各アルキル基の水素原子の置き換えによりＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたは単環式もしくは二環式ヘテロアリールのいずれかに存在し得るが、存在する必要はなく、その記載には、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたは単環式もしくは二環式ヘテロアリールがアルキル基で置換されている状況と、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたは単環式もしくは二環式ヘテロアリールがアルキル基で置換されていない状況とを意味する。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「独立に」は、その後に記載される現象または状況が、他の類似の現象または状況に対して単独で解釈されるものとすることを意味する。たとえば、ある状況であって、いくつかの均等な水素基が任意選択的にその状況において記載された別の基で置換される状況において、「独立に任意選択的に」の使用は、その基の水素原子の各例が別の基で置換され得、各水素原子を置き換える基が同一であるかまたは異なり得ることを意味する。またはたとえば、そのすべてが一連の可能な候補から選択することができる複数の基が存在する場合、「独立に」の使用は、各基が他の任意の基と切り離して一連の可能な候補から選択され得、その状況で選択された基が同一であるかまたは異なり得ることを意味する。
【００７４】
本明細書に図示されるいずれの式も、その構造式の化合物およびある種の変種または形態を表すことを意図している。たとえば、本明細書に示された式は、ラセミ体、または１つもしくは複数のエナンチオマー異性体、ジアステレオマー異性体もしくは幾何異性体、あるいはそれらの混合物を含むことを意図している。加えて、本明細書に示されたいずれの式も、そうした化合物の水和物、溶媒和物もしくは多形、またはそれらの混合物を指すことも意図している。
【００７５】
代表的な実施形態
本明細書に記載の化合物のいずれも、ゲノム編集法または技術に応用することからある種の利点が得られることが理解されるであろう。たとえば、ＨＤＲ  ＤＮＡ修復経路の効率を高めるためにＮＨＥＪ経路を阻害すると、ゲノム編集法または技術の効率が高まる。Ｋｕを標的とする１つの利点は、ＮＨＥＪ  ＤＮＡ修復経路においてＫｕが果たす初期の役割にある。理論に束縛されるものではないが、Ｋｕは、切断されたＤＮＡの末端に結合することによりＮＨＥＪ経路の開始に関与していると考えられる（Ｐａｗｅｌｃｚａｋ  ＫＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｖｏｌ  １４；Ｎｏ．１２；ｐｐ．２５３１−４３（２０１１））。したがって、ＮＨＥＪ経路における最初の分子現象、ＫｕのＤＮＡ末端との相互作用の阻害、Ｋｕ阻害は、ＮＨＥＪ触媒による修復を効率的にブロックし、プロセシング酵素が、適切なドナーＤＮＡ分子とのＨＤＲによる組換えを引き起こすことを可能にすることが分かる。一方、従来の技術は、最終ステップ、ＤＮＡ鎖の連結をたとえばＤＮＡリガーゼＩＶにより阻害してきた（Ｇｒｕｎｄｙ，ＧＪ．，２０１４，Ｈａｍｍｅｌ，Ｍ．，２０１０）。そうしたＮＨＥＪ修復経路下流への干渉により、ＮＨＥＪによるＤＳＢの不完全なプロセシングが起こるだけでなく、さらに切断がＨＤＲにより修復され得なくなり、細胞死が生じることがある。Ｋｕを標的とする利点は、ＤＳＢがプロセシングを受けておらず、ＨＤＲの関与対象のままであり、したがってＨＤＲ活性の能力がある細胞数の真の増加を示すことである。さらに、ＮＨＥＪの阻害は、非特異的遺伝子編集を減少させることができ、これは、遺伝子改変産物を作製するためのまたは規制上の審査を受ける臨床用途に使用される、技術を用いる研究者などの一部の現場において重要である。加えて、非特異的遺伝子編集産物の減少により、稀な標的現象を特定するためのスクリーニングもより容易になり、なぜなら、研究者は、組換え体の大きい集団をスクリーニングして非特異的遺伝子編集現象を排除する必要がないためである。
【００７６】
ゲノム編集は、臨床医学およびバイオテクノロジー研究の多くの分野に利用されてきた。たとえば、治療的使用のためのゲノム編集は、多くの研究の対象となっており、限定されるものではないが、血友病Ｂ、ＨＩＶ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、Ｂ型肝炎（Ｈｅｐ  Ｂ）、ＳＣＩＤ、白内障、嚢胞性線維症、遺伝性チロシン血症および癌を含む多様な疾患の有望な治療法となり得る。たとえば、Ｔｕｒｉｔｚ−Ｃｏｘ，Ｄ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２，ｐｐ．１２１−１３１（２０１５）を参照されたい。さらに、ゲノム編集は、遺伝子の機能を理解するためのおよび遺伝子の操作のためのツールとしてバイオテクノロジー研究および遺伝子研究にも応用されている。ゲノム編集は、限定されるものではないが、ヒト、ゼブラフィッシュ、ウシ、ラット、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ハムスター、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、米、マウス、トウモロコシ、タバコおよび同種のものを含む多くの生物由来の細胞の遺伝子破壊、遺伝子付加および遺伝子修正のために使用されている。さらに、限定されるものではないが、ＣＣＲ５、ＴＣＲ、ｇｏｌ、ｎｔｌ、ｋｒａ、ＧＧＴＡ１、ＬＤＬＲ、ＡＣＡＮ１２、ｐ６５、ＥＭＸ１、ＰＶＡＬＢ、ＩｇＭ、Ｒａｂ３８、ＡＤＨ１、ＴＴ４、ｂｅｎ−１、ｒｅｘ−１、ｓｄｃ−１、ＤＨＦＲ、ｙｅｌｌｏｗ、ＯｓＳＷＥＥＴ１４、ＯＣＴ４、ＰＩＴＸ３、Ｆ９（凝固因子ＩＸ）、Ｒｏｓａ２６、ＡＡＶＳ１、ＶＥＧＦ−Ａ、チロシンヒドロキシラーゼ、ｆａｍ４６ｃ、ｓｍａｄ５、ＩＰＫ１、ＩＬ２ＲＧ、Ａ１ＡＴ、ＨＢＢ、ＳＮＣＡ、ＳｕＲＡ、ＳｕｒＲＢおよび同種のものを含む、広範囲の遺伝子が遺伝子編集技術により操作されている。たとえば、Ｇａｊ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖ．３１，Ｎｏ．７，ｐｐ．３９７−４０５（２０１３）を参照されたい。さらに、ゲノム編集技術は、農業研究に応用されている。たとえば、Ｐｅｔｏｌｉｎｏ，ＪＦ．，２０１５を参照されたい。
【００７７】
本明細書に記載の化合物は、当業者に知られた任意のゲノム編集法または技術に応用することができ、かつゲノム編集法または技術がどのようなものであるかは、具体的にまったく限定されないことが理解されるであろう。当該技術分野において公知の様々なゲノム編集技術は、典型的には、その技術に応用されている人工ヌクレアーゼの種類によって分類されることが理解されるであろう。本明細書に記載の化合物に関連して有用である例示的なゲノム編集技術として、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、Ｚｎフィンガーおよびメガヌクレアーゼがある。
【００７８】
ＣＲＩＳＰＲ
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼＣａｓ９は、標的配列にＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用を介してタンパク質−ＤＮＡ相互作用によりＤＮＡを標的とするプログラム可能なヌクレアーゼを含む。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするプラスミドおよびＤＮＡ配列に特異的なＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするプラスミドを含む。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡ標的に特異的なｃｒＲＮＡを選択することによりプログラム可能である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、ｃｒＲＮＡプラスミド内のｃｒＲＮＡを変えることにより再プログラム可能である。たとえば、本明細書に援用する米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第２０１５／００３１１３４号明細書；米国特許出願公開第２０１５／００４４７７２号明細書；米国特許出願公開第２０１５／００２４５００号明細書を参照されたい。
【００７９】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの調製は、ターゲットＤＮＡ配列を同定することを含む。ターゲットＤＮＡ配列が同定されると、ｃｒＲＮＡをトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と共に含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）がＰＣＲにより調製される。一例を挙げると、調製したｇＲＮＡは、次いで、他の送達メカニズムに加えて、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡとターゲット細胞にコトランスフェクトされる。ｇＲＮＡを調製するための例示的な方法には、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによるＧｅｎｅＡｒｔ（商標）法がある。ｇＲＮＡを調製するための別の例示的な方法は、Ｏｒｉｇｅｎｅにより提供されるｐＣａｓ  Ｇｕｉｄｅベクターにターゲット配列をクローニングすることによる。ｐＣａｓ  Ｇｕｉｄｅベクターは、左右相同性アームを含むドナーベクターとターゲット細胞にコトランスフェクトすることができる。次いで、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、ターゲット細胞にトランスフェクトまたは形質導入され得る。例示的なターゲット細胞株として、哺乳動物細胞株ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、Ａ５４９、Ｕ２ＯＳ、ＨＥＰ−２、ＭＤＣＫＩＩ、Ｖｅｒｏ７６、Ａ３７５、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、ＨＡＣＡＴ、ＨＣＴ１１６、ＨｅｐａＲＧ、Ｊｕｒｋａｔ、ＷＴマクロファージおよびＴＦ−１があるが、任意の好適な細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞または植物細胞も包含される。ターゲット細胞株としては、植物ラインもある。別の例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に必須のタンパク質および酵素は、ターゲット細胞に直接導入され得る。
【００８０】
ＴＡＬＥＮ
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、標的配列にＤＮＡ  ＤＳＢを導入する。ＴＡＬＥＮシステムは、タンパク質−ＤＮＡ相互作用を介してＤＮＡを標的とするプログラム可能なヌクレアーゼを含む。ＴＡＬＥＮシステムは、ＴＡＬＥモノマーを非特異的ヌクレアーゼと連結することを含む。各ＴＡＬＥモノマーは、各々が単一のＤＮＡ塩基対に特異的な一連のＴＡＬＥを含む。複数のＴＡＬＥは、特異的なＤＮＡ配列（１モノマーあたり１４〜２０ｂｐ）を認識するために連結され、標的ＤＮＡにＤＳＢを導入するためヌクレアーゼにコンジュゲートされる。ＴＡＬＥＮシステムは、ＤＮＡ標的に特異的なＴＡＬＥドメインの適切な組み合わせを選択することによりプログラム可能である。ＴＡＬＥＮシステムは、分子クローニングによってＴＡＬＥモノマー内のＴＡＬＥドメインを交換することにより再プログラム可能である。たとえば、本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１５／００７１９０６号明細書を参照されたい。
【００８１】
ＴＡＬＥＮシステムの調製は、ターゲットＤＮＡ配列を同定することを含む。ターゲットＤＮＡ配列は、ターゲットＤＮＡ配列に特異的なＴＡＬＥＮを作製するために業者に提供され得る。ＴＡＬＥＮを調製するための例示的な方法は、ターゲットＤＮＡを業者、たとえばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒに提供することによる。例示的には、業者は、必須のＴＡＬＥを、ヌクレアーゼを含むベクターにクローニングしてＴＡＬＥＮシステムを作製する。次いで、ＴＡＬＥＮは、ターゲット細胞にトランスフェクトまたは形質導入される。ターゲット細胞として、細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞および植物細胞がある。
【００８２】
Ｚｎフィンガー
Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、標的配列にＤＮＡ  ＤＳＢを導入する。ＺＦＮシステムは、タンパク質−ＤＮＡ相互作用を介してＤＮＡを標的とするプログラム可能なヌクレアーゼを含む。ＺＦＮシステムは、ｚｉｎｃフィンガーモノマーを非特異的ヌクレアーゼと連結することを含む。各ｚｉｎｃフィンガーモノマーは、各々がＤＮＡの特異的な３塩基対組み合わせを認識する複数のＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ｚｉｎｃフィンガードメインを含む。複数のＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ｚｉｎｃフィンガードメインは、特異的なＤＮＡ配列（１モノマーあたり９〜１８ｂｐ）を認識するＺｎフィンガーモノマーを形成するために連結され、標的部位近傍にＤＳＢを挿入するためヌクレアーゼにコンジュゲートされる。ＺＦＮシステムは、ＤＮＡターゲット配列に特異的なｚｉｎｃフィンガードメインの適切な組み合わせを選択することによりプログラム可能である。ＺＦＮシステムは、ターゲットＤＮＡ配列に特異的な異なるＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ｚｉｎｃフィンガードメインを連結することにより再プログラム可能である。たとえば、本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１５／００９３８０２号明細書；米国特許出願公開第２０１５／００６４７９０号明細書を参照されたい。
【００８３】
ＺＦＮシステムの調製は、ターゲットＤＮＡ配列を同定することを含む。次いで、ターゲットＤＮＡ配列は、ターゲットＤＮＡに特異的なＺＦＮを作製するため業者に提供され得る。例示的な業者には、ＣｏｍｐｏＺｒ（商標）キットを調製するＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈがある。例示的には、ターゲットＤＮＡ配列を提供すると、業者は、アルゴリズムを使用して目的の遺伝子領域を標的とするＺＦＮ候補を設計する。次いで、ＺＦＮ候補は、バリデーションが行われ得る。次いで、プラスミド内のバリデーション済みＺＦＮは、ターゲット細胞にトランスフェクトまたは形質導入され得る。ターゲット細胞として、細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞および植物細胞がある。
【００８４】
メガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼは、標的配列にＤＮＡ  ＤＳＢを導入する。メガヌクレアーゼシステムは、タンパク質−ＤＮＡ相互作用を介して＞１４ｂｐのＤＮＡを標的とするプログラム可能なヌクレアーゼを含む。メガヌクレアーゼの再標的化には、ターゲットＤＮＡを認識するドメインを変える必要がある。
【００８５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプログラム可能なヌクレアーゼをターゲット細胞にトランスフェクトし、細胞を本開示の少なくとも１種の化合物と接触させる。いくつかの実施形態では、トランスフェクション試薬を用いて、少なくとも１つのプログラム可能なヌクレアーゼをターゲット細胞にトランスフェクトする。代替的に、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプログラム可能なヌクレアーゼをターゲット細胞にエレクトロポレーションする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプログラム可能なヌクレアーゼを少なくとも１つのＡＡＶベクターに入れ、ターゲット細胞に形質導入する。いくつかの実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼは、単一のＡＡＶベクターに入れられ得、または代替的に２つ以上のＡＡＶベクターに入れられ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、Ｚｎフィンガーまたはメガヌクレアーゼなどを使用しているゲノム編集技術の種類に応じて追加のステップを含む。当業者は、代表的な技術の各々に関する上記の段落に記載されたステップおよび試薬が本教示内容と関連して使用され得ることを容易に理解するであろう。
【００８６】
さらに、本開示は、本明細書に記載の化合物に関連するゲノム編集技術を対象とするキットオブパーツを提供する。一態様では、本開示は、本明細書に記載の１つまたは複数の構成要素を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、ベクター系およびキットの使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、ベクター系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列と、ｔｒａｃｒメイト配列の上流に１つまたは複数のガイド配列を挿入するための１つまたは複数の挿入部位とに作動可能に連結された第１の調節エレメントであって、ガイド配列は、発現すると、ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を真核細胞内のターゲット配列へと誘導し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）ターゲット配列とハイブリダイズするガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列とハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成されるＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、第１の調節エレメント；および／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、キットは、システムの同一または異なるベクター上にある構成要素（ａ）および（ｂ）；ならびに（ｃ）本明細書に記載されるような少なくとも１種の化合物を含む。
【００８７】
エレメントは、個別にまたは組み合わせて提供され得、かつバイアル、ビンまたはチューブなどの任意の好適な容器で提供され得る。いくつかの実施形態では、キットは、１つまたは複数の言語、たとえば２つ以上の言語の説明書を含む。試薬は、任意の好適な容器で提供され得る。たとえば、キットは、１種または複数の反応緩衝液または保存緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイに使用可能な形態で提供され得、または使用前に１つもしくは複数の他の構成要素を加える必要がある形態（たとえば、濃縮もしくは凍結乾燥形態）で提供され得る。緩衝液は、限定されるものではないが、炭酸ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液およびこれらの組み合わせを含め、任意の緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、緩衝液は、アルカリ性である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約７〜約１０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、キットは、ガイド配列および調節エレメントを作動可能に連結するために、ベクターへの挿入のためのガイド配列に対応する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、相同組換えテンプレートポリヌクレオチドを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本開示は、式
【化２９】
2019516774.tif 000031
（式中、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ６、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ６、−ＳＲ６、−Ｓ（Ｏ）Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ６、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７および−ＮＲ６Ｒ７からなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５またはフェニルであり、フェニルの各水素原子は、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ４、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＣＯ２Ｒ４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ４、−ＳＲ４、−Ｓ（Ｏ）Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、０１７３Ｓ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５および−ＮＲ４Ｒ５で置換されているか、またはフェニル上の２つの隣接する水素原子は、任意選択的に、それらが結合されている炭素原子と組み合わさって５員〜７員ヘテロシクロアルキル環を形成する基で置換されており、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールおよび５員〜７員ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）または−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）の各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９で置換されており、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９のそれぞれは、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）、３員〜７員ヘテロシクロアルキルおよびＣ６〜Ｃ１０アリールからなる群から選択され、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）または−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）は、独立に、任意選択的にハロゲンで置換されており、および
【化３０】
2019516774.tif 000032
は、単結合またはπ結合のいずれかであり、少なくとも１つの細胞は、少なくとも１つのプログラム可能なヌクレアーゼを含む）
の化合物を提供する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、Ｙは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５またはフェニルである。いくつかの実施形態では、フェニルは、式
【化３１】
2019516774.tif 000033
（式中、Ｒ４、Ｒ５およびＲ１０は、本明細書で定義された通りであり、かつ＊は、式ＩＩの化合物に対する共有結合を表す）
のフェニルである。いくつかの実施形態では、Ｙは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５またはフェニルであり、フェニルの各水素原子は、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ４、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＣＯ２Ｒ４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ４、−ＳＲ４、−Ｓ（Ｏ）Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ４、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、０１７３Ｓ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ４Ｒ５および−ＮＲ４Ｒ５で置換されているか、またはフェニル上の２つの隣接する水素原子は、任意選択的に、それらが結合されている炭素原子と組み合わさって５員〜７員ヘテロシクロアルキル環を形成する基で置換されている。いくつかの実施形態では、Ｙは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、式Ｉａ
【化３２】
2019516774.tif 000034
（式中、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ１０のそれぞれは、本明細書で定義された通りである）
の化合物である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、式Ｉｂ
【化３３】
2019516774.tif 000035
（式中、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、本明細書で定義された通りである）
の化合物である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、式Ｉｃ
【化３４】
2019516774.tif 000036
（式中、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、本明細書で定義された通りである）
の化合物である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、Ｚは、Ｏである。いくつかの実施形態では、Ｚは、Ｓである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｃ６〜Ｃ１０アリールの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９で置換されている。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９からなる群から選択される１つの置換基で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールである。いくつかの実施形態では、その１つの置換基は、パラ位にある。いくつかの実施形態では、その１つの置換基は、メタ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９からなる群から独立に選択される２つの置換基で置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｃ６〜Ｃ１０アリールは、少なくとも１つのハロゲンまたは−ＯＲ８で置換されている。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、フェニルであり、フェニルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されている。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９からなる群から選択される１つの置換基で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態では、その１つの置換基は、パラ位にある。いくつかの実施形態では、その１つの置換基は、メタ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９からなる群から独立に選択される２つの置換基で置換されたフェニルである。
【００９５】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、少なくとも１つのハロゲンまたは−ＯＲ８で置換されたフェニルである。
【００９６】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）であり、かつＣ６〜Ｃ１０アリールの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９または−ＮＲ８Ｒ９で置換されている。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９からなる群から選択される１つの置換基で置換された−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）である。いくつかの実施形態では、その１つの置換基は、パラ位にある。いくつかの実施形態では、その１つの置換基は、メタ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９からなる群から独立に選択される２つの置換基で置換された−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）であり、Ｃ６〜Ｃ１０アリールは、少なくとも１つのハロゲンまたは−ＯＲ８で置換されている。
【００９８】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ベンジルであり、ベンジルの各水素原子は、独立に、任意選択的にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９で置換されている。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９からなる群から選択される１つの置換基で置換されたベンジルである。いくつかの実施形態では、その１つの置換基は、パラ位にある。いくつかの実施形態では、その１つの置換基は、メタ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、３員〜７員ヘテロシクロアルキル、５員〜７員ヘテロアリール、−ＯＲ８、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＳＲ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ９、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ９および−ＮＲ８Ｒ９からなる群から独立に選択される２つの置換基で置換されたベンジルである。
【００９９】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、少なくとも１つのハロゲンまたは−ＯＲ８で置換されたベンジルである。
【０１００】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、
【化３５】
2019516774.tif 000037
（式中、＊は、Ｒ４の結合点を表す）
からなる群から選択される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、５員〜７員ヘテロアリール、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｒ６または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７であり、ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈではない。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｈであり、かつＲ２は、５員〜７員ヘテロアリール、−ＣＮまたは−ＣＯ２Ｒ６である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−ＣＯ２Ｒ６または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７であり、かつＲ２は、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−ＣＯ２Ｒ６であり、かつＲ６は、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−ＣＯ２Ｒ６であり、かつＲ６は、エチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−ＣＯ２Ｒ６であり、かつＲ６は、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−ＣＯ２Ｒ６であり、かつＲ６は、エチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ６Ｒ７であり、かつＲ６およびＲ７は、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、５−テトラゾールである。いくつかの実施形態では、Ｒ１０は、クロロである。いくつかの実施形態では、
【化３６】
2019516774.tif 000038
は、単結合である。いくつかの実施形態では、
【化３７】
2019516774.tif 000039
は、π結合である。
【０１０２】
化学合成
Ｘ８０および誘導体の一般的な合成
合成に使用したすべての化学品は、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ａｃｒｏｓｓ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＫ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよびＣｏｍｂｉ−Ｂｌｏｃｋｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ＵＳＡ）から購入し、さらに精製することなく使用した。無水溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはＡｌｄｒｉｃｈから入手し、直接使用した。空気または湿気に敏感な試薬が関わる反応のすべては、窒素雰囲気下で行った。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ  ＮＭＲスペクトロメーターを使用して３００ＭＨｚおよび５００ＭＨｚで記録した。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ  ＮＭＲスペクトロメーターを使用して７５ＭＨｚおよび１２５ＭＨｚで記録した。化学シフトは、他に記載がない限り、残留溶媒ピークを標準として使用してＴＭＳに対するδｐｐｍで報告した。すべての結合定数（Ｊ）は、Ｈｅｒｔｚで示す。データは、以下の通り報告する：化学シフト、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｂｒ＝幅広、ｍ＝多重線）、プロトン数および結合定数。薄層クロマトグラフィーは、以下の技術：ＵＶ蛍光（２５４ｎｍ）、アルカリ性過マンガン酸カリウム溶液（０．５％ｗ／ｖ）またはニンヒドリン（０．２％ｗ／ｖ）およびヨウ素蒸気の１つを使用して開発されたＭｅｒｃｋシリカゲル６０  Ｆ−２５４薄層プレートを使用して行った。自動フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａクロマトグラフィーシステムで表示された溶媒系を用いてプレパックシリカカートリッジで行った。ターゲット化合物は、エタノールで結晶化させ、固体を集め、ＥｔＯＡｃ、次いで２０〜３０％ＥｔＯＡを含むヘキサンの高温溶液で洗浄して赤色からオレンジ色の固体を得た。必要に応じて、生成物は、自動フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。ターゲット化合物の化学的純度は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法に連結したＨＰＬＣ（ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ）の解析により測定して≧９５％であった。ＬＣ−ＭＳ解析結果および化合物純度データは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステムに接続したＡｇｉｌｅｎｔ  ６１３０  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ−ＭＳを用いて得、両方の装置をＡｇｉｌｅｎｔダイオードアレイ検出器に接続した。Ｃ−１８逆相カラム（Ｖｙｄａｃ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ／Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ／Ｋｉｎｅｔｅｘ２．６μＭ  ＸＢ−Ｃ１８、５０×４．６ｍｍ）を固定相として使用し、水およびメタノール／アセトニトリル（両方とも０．１〜０．２５％ＴＦＡを含む）を移動相として使用し（グラジエント：０〜１００％メタノール、流速０．８ｍＬ／分、分析時間１５分）、２５４ｎｍの固定波長のＵＶ吸光度とポジティブおよびネガティブＥＳＩ−ＭＳデータとを記録した。リテンションタイムおよび対応するＥＳＩ−ＭＳデータを分子の識別情報として使用した。ＨＲＭＳデータは、インディアナ大学化学科質量分析施設（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ａｔ  Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）（ｈｔｔｐ：／／ｍｓｆ．ｃｈｅｍ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ）で飛行時間���（ＴＯＦ）質量分析計のＷａｔｅｒｓ／Ｍａｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いて得た。
【０１０３】
実施例１：（Ｚ）−２−クロロ−５−（５−（（１−（３／４−（エトキシカルボニル）フェニル）−３−メチル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾール−４（５Ｈ）−イリデン）メチル）フラン−２−イル）安息香酸の一般的な合成スキーム。
【化３８】
2019516774.tif 000040
ステップ１：３−（３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（３ａ）の合成：
エチルアセトアセテート２（２．０１ｍＬ、１．２当量）をアルゴン雰囲気下、３−ヒドラジノ安息香酸（２ｇｍ、１当量）を氷酢酸（３０ｍＬ）に溶かした溶液に加えた。添加後、反応混合物を１２時間撹拌しながら還流状態で加熱した。反応を室温まで放冷したら、反応混合物を真空濃縮すると沈殿物が形成された。固体を濾過し、５％ＭｅＯＨを含むＤＣＭで（２回）、次いでＤＣＭで２回洗浄してオフホワイトの固体（２．０６ｇｍ、７２％の収率、さらなる精製の必要なし）を得た。ＴＬＣ：４％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４２、ＵＶで可視化。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．２２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．３６（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．７０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０および１６Ｈｚ），５．９７（ｓ，１Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６６．４８，１５８．７９，１５４．０９，１５０．１０，１４４．９０，１３６．８１，１３２．１５，１２９．９６，１２７．５７，１２４．１６，１２０．６６，１０４．６４，１０２．１９，１９．１２，１４．２５．
【０１０４】
代替ステップ１：４−（３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（３ｂ）の合成：
３ｂを上記の手順により、出発材料として４−ヒドラジノ安息香酸ヒドロクロリド（２ｇｍ）を用いて調製した。オフホワイトの固体（１．７６ｇｍ、７６％の収率、さらなる精製の必要なし）。ＴＬＣ：４％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４２、ＵＶで可視化。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．８７（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），７．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．８８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），５．３８（ｓ，１Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ）．
【０１０５】
ステップ２：エチル３−（３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（４ａ）の合成：
３−（３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸３ａ（１．９５ｇｍ）を無水エタノール（３０ｍＬ）に加えた撹拌懸濁液にアルゴン雰囲気下で触媒量の濃硫酸（１．５ｍＬ）をゆっくりと加えた。反応混合物を１２時間還流させ、次いでそれを室温まで放冷した。溶媒を真空下で除去し、得られた残渣を酢酸エチルに溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３（２×１０ｍＬ）、水およびブライン溶液で連続的に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。０〜５０％ＥｔＯＡｃを含むヘキサンを溶離液として用いて、粗残渣をＢｉｏｔａｇｅフラッシュクロマトグラフィーにより精製してエチル３−（３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート４ａを赤色の油（１．６９ｇｍ、７７％の収率）として得た。ＴＬＣ：４５％ＥｔＯＡｃを含むヘキサン、Ｒｆ＝０．４４、ＵＶで可視化。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．４１（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．９５および１５．９９Ｈｚ），４．３５−４．２８（ｑ，２Ｈ），３．３７（ｓ，２Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），１．３３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１１および１４．２５Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １７０．７０，１６６．１４，１５６．８４，１３８．１８，１３１．２２，１２８．８２，１２５．７７，１２２．６９，１１９．４６，６１．１０，４３．０２，１６．９３，１４．２９．
【０１０６】
代替ステップ２：エチル４−（３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（４ｂ）の合成：
４ｂを上記の手順により、出発材料として３ｂ（１．６０ｇｍ）を用いて調製した。白色の固体（１．４４ｇｍ、８０％の収率）。ＴＬＣ：４０％ＥｔＯＡを含むヘキサン、Ｒｆ＝０．４４、ＵＶで可視化。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．０５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９７Ｈｚ），８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９４Ｈｚ），４．４０−４．３３（ｑ，２Ｈ），３．４６（ｓ，２Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），１．３９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１１および１４．２５Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １７０．７８，１６６．１８，１５６．８９，１４１．６９，１３０．５４，１２６．４２，１１７．６１，６０．９０，４３．１７，１７．０９，１４．３６．
【０１０７】
ステップ３：２−クロロ−５−（５−ホルミルフラン−２−イル）安息香酸（７）の合成：
Ｋ２ＣＯ３（２．３７ｇｍ、３当量）を水（１０ｍＬ）に溶かした溶液を、４−クロロ−３−カルボキシフェニルボロン酸（１．３７ｇｍ、１．２当量）と５−ブロモ−２−フルアルデヒド（１ｇｍ、１当量）の混合物を含むトルエン／エタノール（６０ｍＬ）に加えた。混合物をアルゴンで５分間脱気し、次いでＰｄ（ＰＰｈ３）４（３３０ｍｇ、０．０５当量）を加えた。反応混合物を９０℃で１５時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、セライトで濾過し、水で洗浄した（２×１０ｍＬ）。溶液のｐＨを６Ｎ  ＨＣｌ溶液の添加により１〜２に調整した。沈殿した反応混合物をジクロロメタンで抽出し（３×１００ｍＬ）；合わせた有機画分をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物を、２０〜３０％ＥｔＯＡを含むヘキサンでトリチュレートし（２回）、固体を濾過して２−クロロ−５−（５−ホルミルフラン−２−イル）安息香酸７（１．２４ｇｍ、８７％の収率）をオフホワイトの固体として得た。ＴＬＣ：６０％ＥｔＯＡを含むヘキサン、Ｒｆ＝０．４０、ＵＶおよびＫＭｎＯ４溶液で可視化。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．７４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），９．６３（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２２Ｈｚ），８．０１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２８および８．４３Ｈｚ），７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３４Ｈｚ），７．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８５Ｈｚ），７．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７５Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １７８．６４，１６６．６３，１５６．４４，１５２．４７，１３２．９３，１３２．７８，１３２．１３，１２９．００，１２８．１０，１２７．２３，１１０．５６．
【０１０８】
ステップ４：（Ｚ）−２−クロロ−５−（５−（（１−（３−（エトキシカルボニル）フェニル）−３−メチル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾール−４（５Ｈ）−イリデン）メチル）フラン−２−イル）安息香酸（８ａ）の合成：
エチル３−（３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート４ａ（１ｇｍ、１当量）および２−クロロ−５−（５−ホルミルフラン−２−イル）安息香酸７（１．０１ｇｍ、１当量）を氷酢酸（５０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を撹拌しながら還流状態で３時間加熱した。溶媒を真空除去し、固体をＥｔＯＨに懸濁し、濾過し、ＥｔＯＨ、ＥｔＯＡｃおよびＤＣＭで洗浄して（それぞれ２回）赤色固体（１．４８ｇｍ、７６％の収率、さらなる精製の必要なし）を得た。ＴＬＣ：５％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４５、ＵＶで可視化。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．７５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８７Ｈｚ），８．４８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．８６および３．６９Ｈｚ），８．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２２Ｈｚ），８．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０８Ｈｚ），８．０１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２２および８．４３Ｈｚ），７．７６−７．６４（ｍ，３Ｈ），７．５６−７．５１（ｍ，２Ｈ），４．３６−４．２９（ｑ，２Ｈ），２．６４（ｓ，０．２９Ｈ，マイナー異性体），２．３２（ｓ，２．７１Ｈ，メジャー異性体），１．３３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０８および１４．１６Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６６．５９，１６５．８８，１６２．１１，１５７．６５，１５１．６４，１５０．８２，１３８．９６，１３３．１５，１３２．６７，１３１．１１，１３０．９１，１３０．０８，１２９．７７，１２８．９６，１２７．８４，１２７．２６，１２５．１７，１２２．４１，１２１．６０，１１８．４３，１１２．９１，６１．３８，１４．６５，１３．２９．
【０１０９】
代替ステップ４：（Ｚ）−２−クロロ−５−（５−（（１−（４−（エトキシカルボニル）フェニル）−３−メチル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾール−４（５Ｈ）−イリデン）メチル）フラン−２−イル）安息香酸（８ｂ）の合成：
４ｂを上記の手順により、４ｂ（１ｇｍ、１当量）および７（１．０１ｇｍ、１当量）を出発材料として用いて調製した。赤色固体（１．６９ｇｍ、８７％の収率）。ＴＬＣ：５％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４８、ＵＶで可視化。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．７２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８４Ｈｚ），８．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１９Ｈｚ），８．１５−７．９０（ｍ，５Ｈ），７．７９（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４９Ｈｚ），７．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８４Ｈｚ），４．３３−４．２６（ｑ，２Ｈ），２．６８（ｓ，０．５１Ｈ，マイナー異性体），２．３４（ｓ，２．４９Ｈ，メジャー異性体），１．３２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１１および１４．１９Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６６．６０，１６５．６９，１６２．４１，１５７．８１，１５２．２６，１５０．８３，１４２．４２，１３３．２３，１３２．７０，１３２．１８，１３０．７１，１２９．０３，１２７．８７，１２７．３５，１２５．４２，１２１．３９，１１７．３９，１１２．９７，６１．０１，１４．６７，１３．３５．
【０１１０】
実施例２：Ｘ８０［（Ｚ）−５−（５−（（１−（３−カルボキシフェニル）−３−メチル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾール−４（５Ｈ）−イリデン）メチル）フラン−２−イル）−２−クロロ安息香酸］の合成。
【化３９】
2019516774.tif 000041
化合物８ａ（１５０ｍｇ）をＴＨＦ：ＭｅＯＨ（２：１、ｖ／ｖ、１０ｍＬ）に加えた撹拌懸濁液に２Ｎ  ＮａＯＨ（１ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を室温で６時間撹拌した。溶媒を真空除去し、２０％クエン酸溶液を用いて残渣をｐＨ２〜３に酸性化した。生成物をＥｔＯＡｃで抽出した（３×１５ｍＬ）。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物をＥｔＯＡｃで結晶化させ、３０％ＥｔＯＡを含むヘキサンでトリチュレートしてＸ−８０（１２０ｍｇ、８５％の収率）をオレンジ色の固体として得た。
【０１１１】
実施例３：（Ｚ）−ベンジル２−クロロ−５−（５−（（１−（３−（エトキシカルボニル）フェニル）−３−メチル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾール−４（５Ｈ）−イリデン）メチル）フラン−２−イル）ベンゾエート（ＮＧ−０１−６２）の合成。
【化４０】
2019516774.tif 000042
８ａ（１５０ｍｇ、１当量）を乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）に加えた撹拌懸濁液にアルゴン雰囲気下でＫ２ＣＯ３（８６ｍｇ、２当量）を加えた。ベンジルブロミド（４０μＬ、１．１当量）を反応混合物に加え、撹拌を１６時間継続した。反応混合物を水に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した（３×１０ｍＬ）。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物をＥｔＯＡｃで結晶化させ、５０％ＥｔＯＡを含むヘキサンでトリチュレートしてＸ−８０（５３ｍｇ、３０％の収率）を赤色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．６４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．０および４．０Ｈｚ）；８．３０−８．２７（ｍ，２Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）；７．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５および８．５Ｈｚ）；７．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）；７．５３−７．４３（ｍ，７Ｈ），７．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ）；６．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ）；５．４５（ｓ，２Ｈ），４．４４−４．４１（ｑ，２Ｈ），２．６５（ｓ，２．１９Ｈ，メジャー異性体），２．３９（ｓ，０．８１Ｈ，マイナー異性体），１．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．０および１４．０Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １６６．３７，１６５．０６，１６５．０２，１６４．５５，１６２．１７，１５８．５４，１５７．３５，１５０．７７，１５０．３３，１５０．０４，１４７．７２，１３８．６６，１３５．３５，１３４．６８，１３１．３０，１３０．９９，１２８．７９，１２８．５４，１２７．４１，１２２．９７，１２２．４４，１１９．８０，１１９．４４，１１１．４８，１１０．７４，６７．７０，６１．０９，１４．３８，１３．０１．
【０１１２】
実施例４：８ａおよび８ｂからのアミド１０〜１９の合成
【化４１】
2019516774.tif 000043
［（Ｚ）−エチル３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（４−フルオロベンジル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート］（１０）の合成：
【化４２】
2019516774.tif 000044
化合物８ａ（３００ｍｇ、１当量）を乾燥ＤＭＦ（６ｍＬ）に溶かした溶液にＥＤＣＩ．ＨＣｌ（１８０ｍｇ、１．５当量）、ＨＯＢｔ（１２７ｍｇ  １．５当量）、ＤＩＰＥＡ（０．１６ｍＬ、１．５当量）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下において室温で３０分間撹拌した。反応混合物に４−フルオロベンジルアミン（７５μＬ、１．０５当量）およびＤＩＰＥＡ（０．１６ｍＬ、１．５当量）を加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した（３×２０ｍＬ）。合わせた有機抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３（２×１０ｍＬ）、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ＥｔＯＡを含むヘキサンの混合物でトリチュレートして（２〜３回）、１０（２７９ｍｇ、７６％の収率）を赤色固体として得た。
【化４３】
2019516774.tif 000045
【０１１３】
化合物１１〜１９を化合物１０の調製について記載した上記の合成手順により、適切な出発材料を用いて合成した。各化合物を、ＥｔＯＡを含むヘキサンの混合物でトリチュレートして（２〜３回）所望の化合物を得た。
【０１１４】
（Ｚ）−エチル３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（１１）：赤色固体（２２６ｍｇ、６２％の収率）。ＴＬＣ：３％ＭｅＯＨを含むＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．４７、ＵＶで可視化。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １０．６４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８１Ｈｚ），８．５２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．８３および３．６３Ｈｚ），８．２２−８．１４（ｍ，２Ｈ），８．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１６および８．４６Ｈｚ），７．８１−７．７０（ｍ，３Ｈ），７．６４−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｓ，１Ｈ），７．２９−７．２７（ｍ，２Ｈ），６．７４−６．７０（ｍ，１Ｈ），４．３７−４．３０（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．７５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），２．７０（ｓ，０．５８Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３３（ｓ，２．４２Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．３３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１１および１４．１９Ｈｚ，ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６５．９１，１６４．６９，１６２．２０，１６０．０１，１５７．９６，１５１．７５，１５０．８２，１４０．４０，１３９．００，１３８．２２，１３１．７８，１３１．５２，１３１．２１，１３０．６６，１２７．９６，１２５．６９，１２５．２８，１２１．６３，１１８．５８，１１２．３２，１０９．８９，１０５．８３，６１．４２，５５．５１，１４．６６，１３．３０．
【０１１５】
（Ｚ）−エチル３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（シクロプロピルメチル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（１２）：赤色固体（２４９ｍｇ、７５％の収率）。ＴＬＣ：３％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４３、ＵＶで可視化。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ８．６８−８．６４（ｍ，２Ｈ），８．５４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．８および３．５５Ｈｚ），８．２３−８．２０（ｍ，１Ｈ），８．０１−７．９２（ｍ，２Ｈ），７．７８−７．７４（ｍ，２Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．６０−７．５７（ｍ，２Ｈ），４．３８−４．３３（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．１８（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），２．７２（ｓ，０．６４Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３５（ｓ，２．３６Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．３５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１および１４．２Ｈｚ，ＣＨ３），１．０６−１．０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），０．４９−０．４５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．２８−０．２５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６５．５１，１６５．４４，１６１．７４，１５７．６５，１５１．２７，１５０．２９，１３８．５４，１３８．１４，１３１．０７，１３０．５６，１２９．６８，，１２９．３７，１２７．５４，１２７．２９，１２６．６６，１２４．９６，１２４．８０，１１２．１６，１２１．０５，１１８．１６，１１２．２８，６０．９２，４３．２４，１４．１７，１２．８１，１０．６５．
【０１１６】
（Ｚ）−エチル３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（シクロプロピルカルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（１３）：赤色固体（２２３ｍｇ、６９％の収率）。ＴＬＣ：３％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４６、ＵＶで可視化。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ８．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２６Ｈｚ），８．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），８．５２（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４１Ｈｚ），７．９７−７．８８（ｍ，２Ｈ），７．７９−７．７３（ｍ，２Ｈ），７．６７−７．５２（ｍ，３Ｈ），４．３７−４．３０（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），２−８８−２．８２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）２．６８（ｓ，０．４６Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３５（ｓ，２．５４Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．３３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０８および１４．１３Ｈｚ，ＣＨ３），０．７５−０．６９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．５８−０．５３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６７．１９，１６５．９２，１６２．２０，１５８．０９，１５１．７６，１５０．７５，１３９．０２，１３８．８３，１３８．３４，１３８．０６，１３１．０４，１３０．１７，１２９．８８，１２８．０５，１２７．７５，１２７．１６，１２５．５１，１２５．２７，１２２．５９，１２１．５０，１１８．５８，１１２．８３，６１．４２，２３．２３，１４．６７，１３．３３，６．１６．
【０１１７】
（Ｚ）−エチル３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（モルホリン−４−カルボニル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（１４）：赤色固体（２２６ｍｇ、６６％の収率）。ＴＬＣ：３％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４１、ＵＶで可視化。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ８．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８１Ｈｚ），８．５０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．７４および３．４５Ｈｚ），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．９７−７．８７（ｍ，２Ｈ），７．７７−７．６６（ｍ，３Ｈ），７．６１−７．５１（ｍ，２Ｈ），４．３７−４．２９（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．７２（ｓ，４Ｈ，２ＣＨ２），３．５７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），３．２１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．６７（ｓ，０．６５Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３２（ｓ，２．３５Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．３３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１１および１４．１６Ｈｚ，ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６５．９２，１６５．４３，１６２．２３，１５１．７８，１５０．８０，１３９．０１，１３６．８９，１３１．０４，１３０．６１，１３０．２０，１２９．２７，１２８．００，１２７．１８，１２５．３２，１２４．８２，１２２．６６，１２１．６３，１１８．６３，１１２．９８，６６．３９，６１．４３，４７．１６，１４．６７，１３．３２．
【０１１８】
（Ｚ）−エチル３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（１５）。赤色固体（２１７ｍｇ、６２％の収率）。ＴＬＣ：３％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４３、ＵＶで可視化。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ８．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８１Ｈｚ），８．５０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．８３および３．６３Ｈｚ），８．２１−８．１６（ｍ，１Ｈ），７．９７−７．９４（ｍ，２Ｈ），７．７７−７．６４（ｍ，３Ｈ），７．５８−７．５１（ｍ，２Ｈ），４．３７−４．３０（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．７１−３．６７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．２２−３．１７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），２．６６（ｓ，０．６１Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．４８−２．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），２．３６−２．３２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），２．３２（ｓ，２．３９Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），２．２２（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３），１．３３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０８および１４．１６Ｈｚ，ＣＨ３）．
【０１１９】
（Ｚ）−エチル３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（１６）：赤色固体（２４６ｍｇ、７０％の収率）。ＴＬＣ：３％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４５、ＵＶで可視化。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ８．６９（ｍ，２Ｈ），８．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．７１および３．５１Ｈｚ），８．２６−８．２０（ｍ，１Ｈ），８．０２−７．８７（ｍ，２Ｈ），７．７９（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．６９−７．５５（ｍ，３Ｈ），４．３８−４．３１（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），４．０４−３．９２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．９０−３．８４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．４５−３．３９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），２．７１（ｓ，０．５８Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，２．４２Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．８５−１．７５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．６０−１．４５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．３３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０８および１４．０１Ｈｚ，ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６６．２９，１６５．９２，１６５．３７，１６２．２１，１５８．１３，１５６．８１，１５２．４０，１５１．８１，１５０．７７，１４６．８６，１４１．３５，１３９．０３，１３８．５５，１３８．４０，１３１．４１，１３１．０２，１３０．５９，１３０．２４，１２７．９３，１２７．７８，１２７．１６，１２５．３３，１２４．６４，１２２．６５，１２１．４９，１１８．６２，１１０．４４，６６．２９，６１．４４，４６．０６，３２．６２，１４．６７，１３．３６．
【０１２０】
（Ｚ）−エチル３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（１７）：赤色固体（２６７ｍｇ、７４％の収率）。ＴＬＣ：３％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４５、ＵＶで可視化。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ８．６９−８．６３（ｍ，２Ｈ），８．５３（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０６Ｈｚ），７．９９−７．９０（ｍ，２Ｈ），７．８１−７．７４（ｍ，１Ｈ），７．７７（ｓ，１Ｈ），７．６７−７．５３（ｍ，３Ｈ），４．３８−４．２８（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．９０−３．８１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．３２−３．２２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．１９−３．１３（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），２．７２（ｓ，０．５８Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，２．４２Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．８４−１．７１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），１．６９−１．６０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．３３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０８および１３．９５Ｈｚ，ＣＨ３），１．２６−１．１５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １７８．５８，１６６．６５，１６６．２４，１６５．９２，１６２．２２，１５８．１３，１５６．８０，１５２．４０，１５１．７９，１５０．７７，１４６．８５，１４１．３５，１３９．０２，１３８．６８，１３８．５２，１３１．７２，１３１．０２，１３０．６０，１２７．９５，１２７．８８，１２７．７９，１２５．３０，１２４．６５，１２２．６５，１２１．５１，１１９．６０，１１２．８６，１１０．４２，１０８．５２，６７．２２，６１．４３，４５．２７，３６．２５，３１．２２，１４．６９，１３．４３．
【０１２１】
（Ｚ）−エチル４−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（シクロプロピルメチル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（１８）：赤色固体（３６４ｍｇ、８２％の収率）。ＴＬＣ：３％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４４、ＵＶで可視化。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ８．７４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３１および１０．５Ｈｚ），８．５９（ｓ，１Ｈ），８．０７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．７３および１７．７Ｈｚ），８．０（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝７．８３Ｈｚ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８５Ｈｚ），７．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９６Ｈｚ），４．３２−４．２５（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０９および１２．４２Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），２．６８（ｓ，０．６６Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３２（ｓ，２．３４Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．３１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１１および１４．１６Ｈｚ，ＣＨ３），１．０９−０．９８（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），０．４８−０．４２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．２８−０．２３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６６．００，１６６．０７，１６５．９２，１６２．４９，１５８．７４，１５７．９２，１５２．３９，１５０．７７，１５０．３４，１４８．９７，１４２．４７，１３８．６３，１３８．４２，１３１．６２，１３１．１２，１３０．７７，１２７．９５，１２７．７３，１２７．２０，１２５．５０，１２１．０７，１１９．６０，１１７．５１，１１２．８１，６１．０６，４３．６８，１４．７０，１３．３９，１１．１７，３．３６．
【０１２２】
（Ｚ）−エチル４−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（４−フルオロベンジル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（１９）：赤色固体（３００ｍｇ、７９％の収率）。ＴＬＣ：３％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４７、ＵＶで可視化。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ９．１７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８８および１１．７６Ｈｚ），８．６２（ｓ，１Ｈ），８．１６−７．９７（ｍ，６Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３３Ｈｚ），７．４５−７．４１（ｍ，２Ｈ），７．２２−７．１８（ｍ，２Ｈ），４．４９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．７６Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），４．３２−４．２５（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），２．６２（ｓ，０．７４Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３３（ｓ，２．２６Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．３１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０８および１４．１Ｈｚ，ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６６．２３，１６６．０７，１６５．２３，１６２．５３，１５８．６６，１５８．１９，１５４．９０，１５１．００，１５０．７４，１５０．３７，１４９．０６，１４４．８５，１４２．４６，１３８．２２，１３８．０４，１３５．５７，１３１．６１，１３１．３４，１３０．７８，１３０．３５，１２９．７３，１２７．９９，１２７．８３，１２６．５２，１２５．５３，１２４．１０，１２１．３３，１１８．２８，１１７．５２，１１５．９１，１１５．６９，１１５．４１，１１２．８９，６１．０５，４４．８４，１４．６９，１３．４７．
【０１２３】
実施例５：ターゲット化合物の一般的な合成スキーム。
【化４４】
2019516774.tif 000046
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（４−フルオロベンジル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０１−６４）の合成：
エステル１０（８０ｍｇ、１当量）をＴＨＦ：ＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ（４：２：１、７ｍＬ）に加えた撹拌懸濁液にＬｉＯＨ（３２ｍｇ、１０当量）を加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。溶媒を真空除去し、２０％クエン酸溶液を用いて残渣をｐＨ２〜３まで酸性化した。生成物をＥｔＯＡｃで抽出した（３×１５ｍＬ）。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物をＥｔＯＨで結晶化させ、固体を集め、ＥｔＯＡｃ、次いで２０〜３０％ＥｔＯＡを含むヘキサンの高温溶液で洗浄してＮＧ−０１−６４（４７ｍｇ、６２％の収率）を赤色固体として得た。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ９．１５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８および１１．７Ｈｚ），８．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０５Ｈｚ），８．５６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．７および３．８５Ｈｚ），８．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４５Ｈｚ），８．０４−７．９４（ｍ，２Ｈ），７．８２−７．６９（ｍ，２Ｈ），７．７１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．１５および１６．４５Ｈｚ），７．６２−７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４５−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．２２−７．１７（ｍ，２Ｈ），４．４９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．８５Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），２．６８（ｓ，０．７６Ｈ，ＣＨ３），２．３６（ｓ，２．２４Ｈ，ＣＨ３）．
【０１２４】
化合物ＮＧ−０１−６８、ＮＧ−０１−７０、ＮＧ−０１−７８、ＮＧ−０１−８１、ＮＧ−０１−８２、ＮＧ−０２−９１、ＮＧ−０２−９２、ＮＧ−０２−９９およびＮＧ−０２−１００を化合物ＮＧ−０１−６４の調製について記載した上記の合成手順により、適切な出発材料を用いて合成した。各化合物をＥｔＯＨで結晶化させ、固体を集め、ＥｔＯＡｃ、次いで２０〜３０％ＥｔＯＡを含むヘキサンの高温溶液で洗浄して所望の最終化合物を得た。インビトロ研究のためのすべての合成化合物は、絶対定量１Ｈ  ＮＭＲ分光法（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１４，５７（２２），９２１９−９２１９およびＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１４，５７（２２），９２２０−９２３１）により測定した場合、≧９５％純度であった。
【０１２５】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０１−６８）：赤色固体（１１１ｍｇ、６９％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．０４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），１０．６５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．１６Ｈｚ），８．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．９５および３．５Ｈｚ），８．３１−８．１９（ｍ，２Ｈ），８．０８−７．９７（ｍ，１Ｈ），７．８０−７．７０（ｍ，３Ｈ），７．６５−７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｓ，１Ｈ），７．２９−７．２８（ｍ，２Ｈ），６．７４−６．６９（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），２．７３（ｓ，０．５１Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，２．４９Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １７２．５０，１６７．５１，１６７．２８，１６５．０８，１６４．６９，１６２．２２，１６０．０１，１５７．９４，１５１．５９，１４０．４１，１３８．９３，１２３．２４，１３２．０３，１３１．９３，１３１．２２，１３０．７２，１２９．７２，１２９．４７，１２５．４８，１２４．６９，１２２．３０，１２１．７４，１１２．３２，１０９．８９，１０５．８３，５５．５２，１３．３０．
【０１２６】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（シクロプロピルメチル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０１−７０）：赤色固体（５６ｍｇ、６０％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．７１−８．６５（ｍ，２Ｈ），８．５５（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７４Ｈｚ），８．０２−７．９４（ｍ，２Ｈ），７．８３−７．６６（ｍ，３Ｈ），７．６２−７．５３（ｍ，２Ｈ），３．１９−３．１３（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），２．７３（ｓ，０．７１Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３５（ｓ，２．２９Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．０７−０．９５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），０．４８−０．４２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．２８−０．２３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６７．５０，１６６．００，１６２．２２，１５８．１１，１５１．７１，１５０．８０，１３８．９４，１３８．６３，１３１．９３，１３１．５４，１３０．０７，１２９．７３，１２８．０１，１２７．７８，１２７．１５，１２５．４９，１２２．３１，１２１．６１，１１８．９７，１１２．８１，４３．７１，１３．３２，１１．１６，３．７３．
【０１２７】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（シクロプロピルカルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０１−７８）：赤色固体（６４ｍｇ、６８％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．６６−８．６３（ｍ，２Ｈ），８．５４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．７７および３．５４Ｈｚ），８．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１６Ｈｚ），８．００−７．９４（ｍ，２Ｈ），７．８２−７．７３（ｍ，２Ｈ），７．６９−７．６４（ｍ，１Ｈ），７．６０−７．５３（ｍ，２Ｈ），２．８９−２．８０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），２．７１（ｓ，１．１０Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，１．９０Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），０．７７−０．６９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．５８−０．５３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６７．５０，１６７．１９，１６２．２１，１５８．０６，１５１．６９，１５０．７８，１３８．９４，１３８．３８，１３１．９３，１３１．５７，１３１．０６，１３０．１５，１２９．７３，１２７．９９，１２７．７８，１２７．１５，１２６．４９，１２２．２９，１２１．６２，１１８．９５，１１２．８１，２３．２２，１３．３２，６．１８．
【０１２８】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（モルホリン−４−カルボニル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０１−８１）：赤色固体（６８ｍｇ、７２％の収率）。メジャーＺ異性体データ：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．９４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４５Ｈｚ），８．５４（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０４Ｈｚ），８．０７−７．９８（ｍ，２Ｈ），７．７９−７．６８（ｍ，３Ｈ），７．６２−７．５０（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｓ，４Ｈ，２ＣＨ２），３．５６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），３．２０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），２．７２（ｓ，０．６１Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，２．３９Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１２９】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（４−メチルピペラジン−１−カルボニル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０１−８２）：赤色固体（６４ｍｇ、６９％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．６８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９５Ｈｚ），８．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．７５および３．５５Ｈｚ），８．２０−８．１６（ｍ，１Ｈ），７．９８−７．９４（ｍ，２Ｈ），７．８１−７．７３（ｍ，３Ｈ），７．６４−７．５４（ｍ，２Ｈ），３．４９−３．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．２５−３．１６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），２．６６（ｓ，０．８３Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．５０−２．４５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），２．３６−２．３１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），２．３３（ｓ，２．１７Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），２．２１（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ３）．
【０１３０】
（Ｚ）−４−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（シクロプロピルメチル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０２−９１）：赤色固体（８９ｍｇ、６３％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．８３（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．６７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．１および１０．２Ｈｚ），８．６０（ｓ，１Ｈ），８．０６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０１および１４．１９Ｈｚ），８．０（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．５５Ｈｚ），７．７６（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６４Ｈｚ），７．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），３．１７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７および１１．４Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），２．７０（ｓ，０．８１Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３３（ｓ，２．１９Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．０８−０．９４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），０．４９−０．４０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．２８−０．２２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６７．３１，１６６．０１，１６５．９１，１６２．４１，１５９．６４，１５８．２２，１５２．１８，１５０．７６，１５０．２９，１４９．０９，１４２．２１，１３８．６０，１３８．３９，１３１．８３，１３１．０５，１３０．２１，１２８．１８，１２７．７４，１２７．１６，１２６．４４，１２５．４５，１２１．３３，１１９．６２，１１７．５４２，１１２．８１，４３．７１，１３．３５，１１．１７，３．７３．
【０１３１】
（Ｚ）−４−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（４−フルオロベンジル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０２−９２）：赤色固体（６６ｍｇ、７０％の収率）。
異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．８５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），９．１７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８８および１１．７９Ｈｚ），８．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６６Ｈｚ），８．１０−７．９２（ｍ，６Ｈ），７．８３−７．７９（ｍ，１Ｈ），７．７１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６７および８．４Ｈｚ），７．６２−７．５６（ｍ，１Ｈ），７．４５−７．４０（ｍ，２Ｈ），７．２３−７．１５（ｍ，２Ｈ），４．４８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．８８Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），２．６６（ｓ，０１．６５Ｈ，ＣＨ３），２．３４（ｓ，１．３５Ｈ，ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６７．３１，１６６．２３，１６６．１１，１６５．２８，１６２．４４，１６０．１０，１５９．５６，１５８．１５，１５２．２２，１５０．８１，１５０．３３，１４９．１３，１４２．２０，１４２．００，１３８．２２，１３８．０４，１３５．５６，１３１．８３，１３１．５９，１３１．４７，１３１．１７，１３１．０３，１３０．９３，１２７．８３，１２７．７３，１２６．５２，１２５．９０，１２５．５４，１２１．４１，１１９．７１，１１７．４７，１１７．２５，１１５．６９，１１５．４２，１１２．９３，４２．３２，１３．３７．
【０１３２】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０２−９９）：赤色固体（７２ｍｇ、７６％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１１（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．６５−８．５９（ｍ，２Ｈ），８．５４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．７１および３．４２Ｈｚ），８．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１６Ｈｚ），８．０１−７．９３（ｍ，２Ｈ），７．８２−７．７３（ｍ，２Ｈ），７．７０−７．６５（ｍ，１Ｈ），７．６１−７．５３（ｍ，２Ｈ），４．０５−３．９５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．９１−３．８４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．４６−３．４１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），２．７２（ｓ，０．７７Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，２．２３Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．８６−１．７９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．５９−１．４６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６７．５０，１６５．３７，１６２．１９，１５８．０７，１５１．６８，１５０．７９，１３８．９４，１３８．５７，１３１．９２，１３１．５６，１３１．０３，１３０．１３，１２９．７１，１２８．０２，１２７．８０，１２７．１４，１２５．３４，１２２．２９，１２１．６０，１１８．９６，１１２．８１，６６．２８，４６．０５，３２．６５，１３．３２．
【０１３３】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０２−１００）：赤色固体（６６ｍｇ、７０％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．６５−８．５９（ｍ，２Ｈ），８．５４（ｓ，１Ｈ），８．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７７Ｈｚ），８．０１−７．９２（ｍ，２Ｈ），７．８２−７．７３（ｍ，２Ｈ），７．６９−７．６５（ｍ，１Ｈ），７．６０−７．５４（ｍ，２Ｈ），３．９０−３．８１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．２８−３．２２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．１９−３．１３（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），２．７０（ｓ，０．６７Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，２．３３Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．８４−１．７２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），１．６９−１．６１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．３０−１．１４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６７．００，１６５．７５，１６１．７０，１５７．５６，１５１．１８，１５０．２９，１３８．４２，１３８．１８，１３１．４１，１３０．９３，１３０．５４，１２９．６６，１２９．２２，１２７．４７，１２７．３１，１２６．６０，１２４．９８，１２１．７９，１２１．１０，１１８．４５，１１２．３２，６６．７２，４４．７８，３４．７７，３０．４０，１２．８０．
【０１３４】
実施例６：ターゲット化合物の一般的な還元方法
ＮＧ−０１−７２の合成。
【化４５】
2019516774.tif 000047
３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（シクロプロピルメチル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチル）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０１−７２）：ＮＧ−０１−７０（６０ｍｇ、１当量）を無水メタノール（５ｍＬ）に加えた懸濁液に水素化ホウ素ナトリウム（１３ｍｇ、３当量）を数回に分けて加えた。添加中にガスの発生が観察され、溶液の色が暗赤色から橙黄色に変化した。得られた溶液を室温で１．５時間撹拌した。溶媒を真空除去し、２０％クエン酸溶液を用いて残渣をｐＨ２〜３まで酸性化した。生成物をＥｔＯＡｃで抽出した（３×１５ｍＬ）。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物をＥｔＯＡｃで結晶化させ、固体を集め、冷ＥｔＯＡｃ、次いで２０〜３０％ＥｔＯＡを含むヘキサンの高温溶液で洗浄してＮＧ−０１−７２（４１ｍｇ、６８％の収率）を赤色固体として得た。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８５および１１．５８Ｈｚ），８．３０（ｓ，１Ｈ），７．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２２Ｈｚ），７．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５９Ｈｚ），７．６３−７．４７（ｍ，３Ｈ），６．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），６．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３９Ｈｚ），３．１１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．１２および１２．３３Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），２．７８−２．６２（ｑ，１Ｈ，ＣＨ），２．３４（ｂｒｓ，４Ｈ），１．０２−０．９４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），０．４４−０．３８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．２５−０．１８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）．
【０１３５】
３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（４−フルオロベンジル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチル）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０１−６５）：
ＮＧ−０１−６５をＮＧ−０１−６４から、ＮＧ−０１−７２の調製について記載した方法により調製した。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ８．９５（ｍ，１Ｈ），８．５６（ｔ，１Ｈ），８．１７（ｄ，１Ｈ），８．０２−７．９５（ｍ，２Ｈ），７．７３−７．６９（ｍ，２Ｈ），７．６５（ｔ，１Ｈ），７．５２−７．４９（ｍ，２Ｈ），７．４１−７．３８（ｍ，２Ｈ），７．１７−７．１３（ｍ，２Ｈ），４．４７（ｄ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），２．２１（ｂｒｓ，３Ｈ）．
【０１３６】
ＮＧ−０１−７２の調製について記載したのと同じ手順に従い、上述の手順を用いて適切な化合物から以下の追加のターゲット化合物を調製した。
【０１３７】
エチル３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチル）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（ＮＧ−０２−１３１）：
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝５８６．１［Ｍ  ＋Ｈ］＋
【０１３８】
３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチル）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０２−１３２）：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１２  （ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），１０．６５．９７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．６９，８．６８および８．５５（ｍ，１Ｈ），８．３２（ｓ，１Ｈ），８．２３−８．１９（ｍ，１Ｈ），８．０６−８．００（ｍ，１Ｈ），７．８４−７．７４（ｍ，３Ｈ），７．６５−７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｂｒｓ，１Ｈ），７．２９−７．２７（ｔ，２Ｈ），６．７５−６．７１（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ）．
【０１３９】
３−（４−（（５−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フラン−２−イル）メチル）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０２−１６５）：
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４４６．１［Ｍ  −Ｈ］−
【０１４０】
４−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチル）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−１８８）：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．１５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），１０．６７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２２−７．８９（ｍ，８Ｈ），７．８２−７．７６（ｍ，１Ｈ），７．４４（ｂｒｓ，１Ｈ），７．３０−７．２６（ｍ，２Ｈ），６．７４−６．７１（ｔ，１Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｂｒｓ，３Ｈ）．
【０１４１】
２−クロロ−Ｎ−（３−メトキシフェニル）−５−（５−（（３−メチル−５−オキソ−１−（４−スルファモイルフェニル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）フラン−２−イル）ベンズアミド（ＮＧ−０３−２０２）：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １０．５７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９１−７．８０（ｍ，５Ｈ），７．７３−７．６９（ｍ，１Ｈ），７．６１−７．５６（ｍ，１Ｈ），７．４３−７．３６（ｍ，２Ｈ），７．２８−７．２５（ｍ，２Ｈ），６．７３−６．６９（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ）．
【０１４２】
５−（５−（（１−（３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）フラン−２−イル）−２−クロロ−Ｎ−（３−メトキシフェニル）ベンズアミド（ＮＧ−０３−２０５）：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １０．６２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３２（ｓ，１Ｈ），８．２１−８．１７（ｍ，２Ｈ），８．０８−８．０２（ｓ，１Ｈ），７．８ｓ−７．７７（ｍ，２Ｈ），７．６９−７．６５（ｍ，３Ｈ），７．５３−７．４４（ｍ，１Ｈ），７．２９−７．２６（ｂｒｓ，２Ｈ），６．７４−６．７０（ｂｒｓ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），１．９８（ｓ，３Ｈ）．
【０１４３】
３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３，４−ジメトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチル）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−２０６）：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １０．４３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３３−８．３１（ｍ，１Ｈ），８．０５−７．９８（ｍ，１Ｈ），８．８２−７．７４（ｍ，２Ｈ），７．５９−７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４４−７．４０（ｍ，２Ｈ），７．２７−７．２１（ｍ，２Ｈ），６．９７−６．９１（ｍ，２Ｈ），３．７６（ｓ，６Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ）．
【０１４４】
３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）チオフェン−２−イル）メチル）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−２０７）：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １０．５１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３３−８．３０（ｍ，１Ｈ），８．０４−７．９８（ｍ，１Ｈ），８．７７−７．７３（ｍ，２Ｈ），７．６６−７．６４（ｍ，１Ｈ），７．５６−７．５１（ｍ，３Ｈ），７．４５−７．３９（ｍ，２Ｈ），７．２６−７．２３（ｍ，２Ｈ），６．７２−６．６９（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ）．
【０１４５】
３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（シクロプロピルメチル）カルバモイル）フェニル）チオフェン−２−イル）メチル）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−２３１）：
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝５２０．１［Ｍ  −Ｈ］−
【０１４６】
４−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）チオフェン−２−イル）メチル）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−２３８）：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．８８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），１０．５３（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０３−７．９８（ｍ，２Ｈ），７．９５−７．８９（ｔ，２Ｈ），７．７６（ｓ，１Ｈ），７．６８−７．６４（ｍ，１Ｈ），７．５４−７．５１（ｄ，１Ｈ），７．４７−７．４６（ｄｄ，１Ｈ），７．４１（ｂｒｓ，１Ｈ），７．２６−７．２１（ｍ，２Ｈ），６．９１−６．９０（ｄ，１Ｈ），６．７１−６．６７（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ）．
【０１４７】
実施例７：ＮＧ−０１−７７の合成。
【化４６】
2019516774.tif 000048
（Ｚ）−２−クロロ−Ｎ−（シクロプロピルメチル）−５−（５−（（１−（３−（（シクロプロピルメチル）カルバモイル）フェニル）−３−メチル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾール−４（５Ｈ）−イリデン）メチル）フラン−２−イル）ベンズアミド（ＮＧ−０１−７７）：
ＮＧ−０１−７７を、ＮＧ−０１−７０を出発材料として使用し、化合物１０の調製について記載した合成手順を用いて合成した。生成物をＥｔＯＨで結晶化させ、固体を集め、ＥｔＯＡｃ、次いで２０〜３０％ＥｔＯＡを含むヘキサンの高温溶液で洗浄して、ＮＧ−０１−７７を赤色固体（５１ｍｇ、７８％の収率）として得た。ＴＬＣ：４％ＭｅＯＨを含むＤＣＭ、Ｒｆ＝０．４２、ＵＶで可視化。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ８．７０−８．６５（ｍ，３Ｈ），８．３６（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８３Ｈｚ），７．９９−７．９１（ｍ，２Ｈ），７．７７（ｓ，１Ｈ），７．６８−７．６５（ｍ，２Ｈ），７．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．５４−７．４８（ｍ，１Ｈ），３．１９−３．１３（ｑ，４Ｈ，２ＮＨＣＨ２），２．７２（ｓ，０．５６Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，２．４４Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．０７−０．９５（ｍ，２Ｈ，２ＣＨ），０．４９−０．４１（ｍ，４Ｈ，２ＣＨ２），０．２７−０．２３（ｍ，４Ｈ，２ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６６．３０，１６６．０１，１６２．１４，１５９．４９，１５８．０５，１５１．５０，１５０．８０，１３８．７６，１３８．６１，１３６．０１，１３１．５１，１３１．２３，１３１．０７，１３０．０５，１２９．２３，１２７．９１，１２７．７８，１２５．４１，１２３．３４，１２１．６６，１２０．８９，１１７．６９，１１２．７６，４４．０８，４３．７１  １３．３１，１１．４９，１１．１６，３．７３（ｔ）．
【０１４８】
実施例８：ＮＧ−０２−１０４、ＮＧ−０２−１０５、ＮＧ−０２−１１２およびＮＧ−０２−１１３の一般的な合成。
【化４７】
2019516774.tif 000049
ステップ１：４−（５−ホルミルフラン−２−イル）安息香酸（２１）の合成：
Ｋ２ＣＯ３（２．３７ｇｍ、３当量）を水（１０ｍＬ）に溶かした溶液を、４−カルボキシフェニルボロン酸２０（１．１４ｇｍ、１．２当量）と５−ブロモ−２−フルアルデヒド６（１ｇｍ、１当量）との混合物を含むトルエン／エタノール（６０ｍＬ）に加えた。混合物をアルゴンで５分間脱気し、次いでＰｄ（ＰＰｈ３）４（３３０ｍｇ、０．０５当量）を加えた。反応混合物を９０℃で１５時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、溶媒を減圧下で除去した。生成物を水（３×１５ｍＬ）、ＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）、ＤＣＭで連続的に洗浄し、高真空下で一晩乾燥させて４−（５−ホルミルフラン−２−イル）安息香酸２１（１．１１ｇｍ、９０％の収率）を白色の固体として得た。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１６（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），９．６６（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），８．０５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．５および６．５Ｈｚ），８．００（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．０および７．０Ｈｚ），７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），７．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １７８．７０，１６７．１７，１５７．３６，１５２．６６，１３２．７８，１３１．７３，１３０．６１，１２５．４７，１１１．０５．
【０１４９】
ステップ２：２２ａおよび２２ｂの合成：
２２ａおよび２２ｂを、４−（５−ホルミルフラン−２−イル）安息香酸２１、４ａ（６００ｍｇ）および４ｂ（６００ｍｇ）を出発材料として使用し、化合物８ａの調製について記載した合成手順を用いて調製した。
【０１５０】
ステップ２ａ：（Ｚ）−４−（５−（（１−（３−（エトキシカルボニル）フェニル）−３−メチル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾール−４（５Ｈ）−イリデン）メチル）フラン−２−イル）安息香酸（２２ａ）
赤色固体（８４４ｍｇ、７８％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１４（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ）；８．４９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．５および３．５Ｈｚ），８．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．０３−７．９０（ｍ，４Ｈ），７．７６−７．７１（ｍ，１Ｈ），７．６５（ｓ，１Ｈ），７．５６−７．５１（ｍ，２Ｈ），４．３５−４．２９（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），２．６７（ｓ，０．６８Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３２（ｓ，２．３２Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．３４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．５および１４．５Ｈｚ，ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６６．６２，１６５．４０，１６１．６０，１５８．０５，１５１．１０，１５０．５１，１３８．４８，１３３．１５，１３１．９８，１３１．２５，１３０．０９，１２９．４５，１２９．２９，１２７．３２，１２４．９１，１２４．７０，１２１．２７，１１８．０２，１１２．９１，６０．８８，１４．１５，１２．７８．
【０１５１】
ステップ２ｂ：（Ｚ）−４−（５−（（１−（４−（エトキシカルボニル）フェニル）−３−メチル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾール−４（５Ｈ）−イリデン）メチル）フラン−２−イル）安息香酸（２２ｂ）
赤色固体（９２０ｍｇ、８５％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．０８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．５６（ｓ，１Ｈ），７．９８−７．８１（ｍ，７Ｈ），７．６２−７．３９（ｍ，３Ｈ），４．２７−４．２０（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），２．５９（ｓ，０．６８Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．２８（ｓ，２．３２Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．２８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．６３および１２．５７Ｈｚ，ＣＨ３）．
【０１５２】
実施例９：アミド２３〜２６の合成
化合物２３〜２４および２５〜２６を、それぞれ２２ａ（３００ｍｇ）および２２ｂ（３００ｍｇ）を出発材料として使用し、化合物１０の調製について記載した合成手順を用いて調製した。
【０１５３】
（Ｚ）−エチル３−（４−（（５−（４−（（シクロプロピルメチル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（２３）：
赤色固体（２４８ｍｇ、７４％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ８．７１−８．６４（ｍ，２Ｈ），８．５２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．８および３．６Ｈｚ），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２２Ｈｚ），８．０３−７．９１（ｍ，４Ｈ），７．７８−７．７０（ｍ，２Ｈ），７．５９−７．５０（ｍ，２Ｈ），４．３７−４．２８（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２１および１２．３６Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），２．７０（ｓ，０．７１Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，２．２９Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．３６−１．３０（ｍ，３Ｈ，ＣＨ３），１．０８−０．９８（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），０．４７−０．４１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．２６−０．２１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６５．９１，１６５．６４，１６５．０１，１６２．１８，１５９．００，１５１．６９，１５０．８２，１３９．０２，１３８．８４，１３５．６４，１３１．０１，１３０．９７，１３０．０９，１２９．８３，１２８．５６，１２８．０４，１２７．００，１２５．２５，１２２．５３，１２１．４３，１１８．５３，１１２．９６，６１．４０，４４．１１，１４．６６，１３．３１，１１．４６，３．８３．
【０１５４】
（Ｚ）−エチル３−（４−（（５−（４−（（４−フルオロベンジル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（２４）：
赤色固体（２９４ｍｇ、７９％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ９．２９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７および１１．７Ｈｚ），８．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７２Ｈｚ），８．５６−８．４７（ｍ，１Ｈ），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），８．０６−７．８６（ｍ，４Ｈ），７．７６−７．６１（ｍ，２Ｈ），７．５７−７．４４（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．３２（ｍ，２Ｈ），７．２０−７．１２（ｍ，２Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６７Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），４．３６−４．２７（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），２．６７（ｓ，０．４９Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３２（ｓ，２．５１Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．３５−１．２９（ｍ，３Ｈ，ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６６．５９，１６６．０５，１６２．４９，１５９．２５，１５８．４３，１５１．１５，１５０．６７，１４７．１８，１３９．３１，１３６．５５，１３５．５５，１３２．６０，１３１．５０，１３１．２８，１３０．８９，１３０．０４  １２９．９４，１２９．０１，１２８．６９，１２８．３４，１２５．７５，１２５．６１，１２２．８６，１２１．７６，１１９．９２，１１８．８５，１１５．８４，１１５．７５，１１３．３６，６１．７０（ｄ），４２．７４，１４．９９，１３．７６（ｄ）．
【０１５５】
（Ｚ）−エチル４−（４−（（５−（４−（（シクロプロピルメチル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（２５）：
赤色固体（２５１ｍｇ、７５％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ８．６９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．５８および１１．５５Ｈｚ），８．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６６Ｈｚ），８．０９−７．９０（ｍ，８Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ），７．５６−７．５０（ｍ，１Ｈ），４．３１−４．２２（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．１５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７および１２．０Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），２．６８（ｓ，０．７０Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３３（ｓ，２．３０Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．３３−１２７（ｍ，３Ｈ，ＣＨ３），１．０８−０．９９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），０．４７−０．４１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．２６−０．２１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）．
【０１５６】
（Ｚ）−エチル４−（４−（（５−（４−（（４−フルオロベンジル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（２６）：
赤色固体（２９７ｍｇ、８０％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ９．２０（ｍ，１Ｈ），８．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８４Ｈｚ），８．１１−７．９２（ｍ，８Ｈ），７．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），７．５８−７．４９（ｍ，１Ｈ），７．４０−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．１９−７．０９（ｍ，２Ｈ），４．４８−４．４２（ｑ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），４．３２−４．２１（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ２），２．６６（ｓ，０．５６Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，２．４４Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．３３−１．２５（ｍ，３Ｈ，ＣＨ３）．
【０１５７】
実施例１０：化合物ＮＧ−０２−１０４、ＮＧ−０２−１０５、ＮＧ−０２−１１２およびＮＧ−０２−１１３の調製
化合物ＮＧ−０２−１０４、ＮＧ−０２−１０５、ＮＧ−０２−１１２およびＮＧ−０２−１１３を、適切な出発材料を使用し、化合物ＮＧ−０１−６４の調製について記載した合成手順を用いて調製した。各化合物をＥｔＯＨで結晶化させ、固体を集め、ＥｔＯＡｃ、次いで２０〜３０％ＥｔＯＡを含むヘキサンの高温溶液で洗浄して所望の最終化合物を得た。
【０１５８】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−（（シクロプロピルメチル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０２−１０４）：赤色固体（９０ｍｇ、６４％の収率）。
異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１１（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．７２−８．６５（ｍ，２Ｈ），８．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．５２Ｈｚ），８．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．１５Ｈｚ），８．０５−７．９２（ｍ，４Ｈ），７．８２−７．７０（ｍ，２Ｈ），７．５９−７．５１（ｍ，２Ｈ），３．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３５および１２．２８Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），２．７３（ｓ，１．６５Ｈ，ＣＨ３），２．３４（ｓ，１．３５Ｈ，ＣＨ３），１．０９−０．９７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），０．４８−０．４０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．２７−０．２０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６７．０７，１６５．２２，１６１．７５，１５９．９３，１５８．５４，１５１．２０，１５０．４１，１３８．４９，１３８．３３，１３５．２０，１３１．４５，１３０．７７，１３０．６０，１２９．６５，１２９．２５，１２８．１４，１２７．５６，１２４．９９，１２４．８２，１２１．８２，１２１．０９，１１８．４８，１１２．５２，１１２．２９，４３．６７，１２．８７，１１．０２，３．３９．
【０１５９】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−（（４−フルオロベンジル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０２−１０５）：赤色固体（１０３ｍｇ、７３％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１２（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），９．２０−９．１６（ｍ，１Ｈ），８．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８４Ｈｚ），８．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．８３および３．６Ｈｚ，メジャー異性体），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１６Ｈｚ），８．０８−７．９８（ｍ，４Ｈ），７．８３−７．７３（ｍ，２Ｈ），７．６０−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．３５（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．９４および１７．８２Ｈｚ），４．４８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．７９Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），２．７５（ｓ，１．０６Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３５（ｓ，１．９４Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６７．０３，１６５．３４，１６２．７６，１６１．７４，１５９．５６，１５８．４３，１４９．９７，１４８．２３，１３８．４６，１３５．６８，１３４．７９，１３１．４４，１３０．７９，１２９．３２，１２９．２２，１２８．１９，１２７．５１，１２５．０４，１２４．８７，１２１．８２，１２１．１３，１１９．４６，１１８．４７，１１５．１５，１１４．８７，１１２．６０，４２．０１，１２．８４．
【０１６０】
（Ｚ）−４−（４−（（５−（４−（（シクロプロピルメチル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０２−１１２）：赤色固体（９４ｍｇ、６７％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．８２（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．７０−８．６４（ｍ，２Ｈ，），８．０９−７．７９（ｍ，８Ｈ），７．７３（ｓ，１Ｈ），７．５７−７．５３（ｍ，１Ｈ），３．１５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．０および１２．０Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），２．７２（ｓ，０．４５Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３３（ｓ，２．５５Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．０９−０．９７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），０．４６−０．４０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．２６−０．２１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６６．７６，１６５．０９，１６１．８６，１５８．５５，１５１．５９，１５０．２７，１４１．６５，１３５．２１，１３０．８５，１３０．４４，１２８．０３，１２５．８７，１２４．７３，１２０．７１，１１６．８６，１１２．４５，４３．５６，１２．７９，１０．９０，３．２７．
【０１６１】
（Ｚ）−４−（４−（（５−（４−（（４−フルオロベンジル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０２−１１３）：赤色固体（１０９ｍｇ、７７％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．８２（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），９．１８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７および１１．６４Ｈｚ），８．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４５Ｈｚ），８．１０−７．９４（ｍ，８Ｈ），７．７４（ｓ，１Ｈ），７．５９−７．５４（ｍ，１Ｈ），７．４０−７．３２（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．８５および１７．６７Ｈｚ），４．４８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．５５，ＮＨＣＨ２），２．７３（ｓ，０．６４Ｈ，マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，２．３６Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６６．６５，１６５．１４，１６１．７６，１５８．３６，１５１．５１，１５０．２１，１４１．５４，１３５．５３，１３５．４９，１３０．５６，１３０．２６，１２９．１４，１２９．０３，１２８．００，１２５．７８，１２４．７０，１２０．６８，１１６．７７，１１４．９７，１１４．６８，１１２．４４，４１．８３，１２．６９．
【０１６２】
実施例１１：（Ｚ）−３−（４−（（５−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０２−１６２）の調製
ＮＧ−０２−１６２を、４−クロロ−３−カルボキシフェニルボロン酸の代わりに３−メトキシフェニルボロン酸を使用した以外には実施例１に記載した手順に従って製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ９．９７（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３５（ｓ，１Ｈ），８．０４−８．０２（ｓ，１Ｈ），７．７７−７．７４（ｍ，１Ｈ），７．６０−７．５４（ｔ，１Ｈ），７．３７−７．２１（ｍ，５Ｈ），６．６６−６．６４（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），２．３３（ｓ，２．３７Ｈ；メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１６３】
実施例１２：追加のターゲット化合物の調製
追加ターゲット化合物を、適切な出発材料を使用し、実施例４および５に示した手順に従って調製した。
【０１６４】
（Ｚ）−４−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−１８５）：
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．９１（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），１０．５５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．６２（ｂｒｓ，１Ｈ），８．１０−７．８７（ｍ，７Ｈ），７．８１−７．７８（ｍ，１Ｈ），７．７０−７．６８（ｍ，１Ｈ），７．６０−７．５６（ｍ，１Ｈ），７．４５−７．４１（ｍ，１Ｈ），７．２８−７．２４（ｍ，２Ｈ），６．７２−６．６９（ｍ，１Ｈ）．３．７４（ｓ，３Ｈ），２．７４（ｓ，０．２２Ｈ；マイナー異性体，ＣＨ３），２．３５（ｓ，２．８４Ｈ；メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１６５】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３，４−ジメトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−１８９）：
赤色固体（６０ｍｇ、６３％の収率）。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），１０．５２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７５Ｈｚ），８．５６−８．５１（ｍ，１Ｈ），８．２８−８．１８（ｍ，２Ｈ），８．０８−８．０４（ｍ，１Ｈ），７．８０−７．７４（ｍ，３Ｈ），７．６５−７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４５（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．２７（ｍ，２Ｈ），６．９７−６．９０（ｍ，１Ｈ），３．７５および３．７４（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），２．７４（ｓ，０．４９Ｈ；マイナー異性体，ＣＨ３），２．３５（ｓ，２．４９Ｈ；メジャー異性体，ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６７．５１，１６４．２２，１６４．６９，１６２．２２，１５７．９９，１５１．７０，１５０．８４，１４９．００，１４５．７９，１３８．９３，１３８．３７，１３１．９３，１３１．５８，１３０．４６，１２９．７４，１２７．９４，１２７．３９，１２５．７３，１２５．４３，１２２．３０，１２１．７１，１１８．９６，１１２．４４，１１１．９８，１０４．９７，１０５．８３，５６．１７，５５．８４，１３．３０．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝５８４．１［Ｍ  −Ｈ］−；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３１Ｈ２３Ｎ３Ｏ７Ｃｌ［Ｍ  −Ｈ］−  ｍ／ｚ計算値＝５８４．１２２５，実測値５８４．１２３６．ＨＰＬＣ純度：９５．０７％．
【０１６６】
（Ｚ）−２−クロロ−５−（５−（（１−（３−シアノフェニル）−３−メチル−５−オキソ−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン）メチル）フラン−２−イル）−Ｎ−（３−メトキシフェニル）ベンズアミド（ＮＧ−０３−１９３）：
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １０．６５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．６２（ｂｒｓ，１Ｈ），８．３０−８．１６（ｍ，２Ｈ），７．７４（ｓ，１Ｈ），７．３１−７．２５（ｍ，２Ｈ），６．７２（ｂｒｓ，１Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），２．７７（ｓ，０．９２Ｈ；マイナー異性体，ＣＨ３），２．３２（ｓ，２．０８Ｈ；メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１６７】
（Ｚ）−２−クロロ−Ｎ−（３−メトキシフェニル）−５−（５−（（３−メチル−５−オキソ−１−（４−スルファモイルフェニル）−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン）メチル）フラン−２−イル）ベンズアミド（ＮＧ−０３−１９６）：
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １０．６６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．６４−８．６３（ｓ，１Ｈ），８．１５−８．１０（ｍ，２Ｈ），７．８７−７．７８（ｍ，４Ｈ），７．６６−７．６５（ｄ，１Ｈ），７．４３（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｓ，２Ｈ），７．２９−７．２８（ｄ，２Ｈ），６．７５−６．７１（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），２．７４（ｓ，０．４２Ｈ；マイナー異性体，ＣＨ３），２．３５（ｓ，２．６０Ｈ；メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１６８】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）チオフェン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−２０３）：
１００％Ｚ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １０．６３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５８（ｔ，１Ｈ），８．１９−８．１５（ｍ，３Ｈ），８．０７−８．０６（ｄ，１Ｈ），７．９７−７．９２（ｍ，２Ｈ），７．６６−７．６６（ｄｄ，２Ｈ），７．５８−７．５３（ｔ，１Ｈ），７．４４−７．４３（ｍ，１Ｈ），７．２９−７．２７（ｍ，２Ｈ），６．７４−６．７０（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １６８．６１，１６５．７５，１６３．６０，１６１．０４，１５４．９０，１５２．９２，１４６．０５，１４１．４５，１３９．９１，１３９．７６，１３９．２１，１３７．７４，１３３．３３，１３２．９３，１３２．３４，１３１．１９，１３０．８６，１３０．０４，１２７．７５，１２６．５５，１２３．２５，１２２．３３，１１９．７６，１１３．４６，１１０．９９，１０６．９３，５６．５６，１４．３７．
【０１６９】
（Ｚ）−２−クロロ−Ｎ−（シクロプロピルメチル）−５−（５−（（３−メチル−５−オキソ−１−（４−スルファモイルフェニル）−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン）メチル）フラン−２−イル）ベンズアミド（ＮＧ−０３−２１２）：
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ８．７１（ｔ，１Ｈ），８．６３および８．６２（ｄ，１Ｈ），８．１６−８．１０（ｍ，２Ｈ），８．０３−８．．０１（ｍ，２Ｈ），７．９０−７．８２（ｍ，３Ｈ），７．７０−７．６７（ｍ，１Ｈ），７．６３−７．５９（ｍ，１Ｈ），７．３４（ｓ，２Ｈ，ＳＯ２ＮＨ２），３．１９−３．１５（ｔ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），２．７４（ｓ，０．５２Ｈ；マイナー異性体，ＣＨ３），２．３６（ｓ，２．５９Ｈ；メジャー異性体，ＣＨ３），１．０５−０．１（ｍ，１Ｈ），０．４９−０．４３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．２８−０．２５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）．
【０１７０】
（Ｚ）−２−クロロ−Ｎ−（４−フルオロベンジル）−５−（５−（（３−メチル−５−オキソ−１−（４−スルファモイルフェニル）−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン）メチル）フラン−２−イル）ベンズアミド（ＮＧ−０３−２１３）：
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  ９．１６（ｔ，１Ｈ），８．６６および８．６５（ｄ，１Ｈ），８．１６−８．１２（ｍ，２Ｈ），８．０４−７．９９（ｍ，２Ｈ），７．７２−７．６０（ｍ，２Ｈ），７．４４−７．４１（ｍ，２Ｈ），７．３４（ｓ，２Ｈ，ＳＯ２ＮＨ２），７．２３−７．１６（ｍ，４Ｈ），４．４９−４．４７（ｄ，２Ｈ），２．６８（ｓ，０．５５Ｈ；マイナー異性体，ＣＨ３），２．３６（ｓ，２．４３Ｈ；メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１７１】
（Ｚ）−５−（５−（（１−（３−カルボキシフェニル）−３−メチル−５−オキソ−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン）メチル）チオフェン−２−イル）−２−クロロ安息香酸（ＮＧ−０３−２２４）：
１００％Ｚ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １４．１５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），１３．２９（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．３３（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０４−８．０１（ｄ，２Ｈ），７．９１−７．８９（ｍ．１Ｈ），７．８２−７．６９（ｍ，２Ｈ），７．６０−７．４２（ｍ，３Ｈ），６．７９（ｂｒｓ，１Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１７２】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（シクロプロピルメチル）カルバモイル）フェニル）チオフェン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−２２６）：
１００％Ｚ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１１（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．６３−８．５４（ｍ，１Ｈ），８．３９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０９−８．０６（ｄ，１Ｈ），７．８０−７．７２（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．３７（ｍ，５Ｈ），６．７６−６．７５（ｂｒｓ，１Ｈ），３．１６−３．０９（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），２．３１（ｓ，３Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．０４−０．９６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），０．４５−０．４０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），０．２４−０．２０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）．
【０１７３】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（４−フルオロベンジル）カルバモイル）フェニル）チオフェン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−２２７）：
１００％Ｚ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），９．１８−９．１４（ｔ，１Ｈ），８．５９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．２３−８．１９（ｍ，３Ｈ），７．９４−７．９０（ｍ，３Ｈ），７．８０−７．７５（ｄ，１Ｈ），７．６５−７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４６−７．４１（ｍ，２Ｈ），７．２２−７．１６（ｔ，２Ｈ），４．４９−４．４７（ｄ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），２．３６（ｓ，３Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１７４】
３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（４−フルオロベンジル）カルバモイル）フェニル）チオフェン−２−イル）メチル）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−２３２）：
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝５７４．１［Ｍ  −Ｈ］−
【０１７５】
（Ｚ）−５−（５−（（１−（４−カルボキシフェニル）−３−メチル−５−オキソ−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン）メチル）チオフェン−２−イル）−２−クロロ安息香酸（ＮＧ−０３−２３４）：
１００％Ｚ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １４．１１（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），１３．２３（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．２０−８．００（ｍ，３Ｈ），７．９５−７．８８（ｍ，３Ｈ），７．７４−７．７０（ｍ，１Ｈ），７．５３−７．４２（ｍ，２Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１７６】
エチル（Ｚ）−４−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）チオフェン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゾエート（ＮＧ−０３−２３５）：
１００％Ｚ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １０．６４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２１−８．１６（ｍ，２Ｈ），８．１６−８．１４（ｍ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），８．０６−８．０（ｍ，３Ｈ），７．９５−７．９０（ｍ，２Ｈ），７．７１−７．６８（ｄ，１Ｈ），７．４６−７．４３（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．２４（ｍ，２Ｈ），６．７４−６．７０（ｍ，１Ｈ），４．３４（ｑ，２Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３），１．３４−１．２８（ｔ，３Ｈ）．
【０１７７】
（Ｚ）−４−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３−メトキシフェニル）カルバモイル）フェニル）チオフェン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−２３６）：
１００％Ｚ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．８７（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），１０．６４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２１−８．１６（ｍ，２Ｈ），８．１４−７．９０（ｍ，７Ｈ），７．７４−７．６８（ｄ，１Ｈ），７．４６−７．４１（ｍ，１Ｈ），７．２９−７．２４（ｍ，２Ｈ），６．７４−６．７０（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ，メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１７８】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（３−（ベンジルカルバモイル）−４−クロロフェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−２７０）：
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１７（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），９．０７（ｔ，１Ｈ），８．３３（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０４−８．０１（ｄ，１Ｈ），７．８０−７．２５（ｍ，１２Ｈ），６．９９−６．９８（ｄ，１Ｈ），４．４５−４．４３（ｄ，２Ｈ），２．７０（ｓ，０．７０Ｈ；マイナー異性体，ＣＨ３），２．２９（ｓ，２．４３Ｈ；メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１７９】
（Ｚ）−３−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（２−クロロベンジル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−２７１）：
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １３．１４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），９．１２−９．０９（ｍ，１Ｈ），８．３２（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０３−８．００（ｄ，１Ｈ），７．９５−７．７８（ｍ，２Ｈ），７．７０−７．３０（ｍ，９Ｈ），７．０６−６．９９（ｍ，１Ｈ），４．５１−４．４９（ｄ，２Ｈ），２．７１（ｓ，０．５２Ｈ；マイナー異性体，ＣＨ３），２．３６（ｓ，２．４９Ｈ；メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１８０】
（Ｚ）−４−（４−（（５−（３−（ベンジルカルバモイル）−４−クロロフェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０３−２８０）：
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．８７（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），９．１６−９．１１（ｔ，１Ｈ），８．６２（ｂｒｓ，１Ｈ），８．１０−７．８６（ｍ，５Ｈ），７．８２−７．７６（ｍ，１Ｈ），７．７０−７．６７（ｄ，１Ｈ），７．６７−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．４６−７．２７（ｍ，５Ｈ），４．５１−４．４９（ｄ，２Ｈ），２．６６（ｓ，１．０５Ｈ；マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，１．９６Ｈ；メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１８１】
（Ｚ）−４−（４−（（５−（４−クロロ−３−（（３−メトキシベンジル）カルバモイル）フェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸（ＮＧ−０４−２８６）：
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １２．８７（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），９．１６−９．１２（ｔ，１Ｈ），８．６４および８．６３（ｄ，１Ｈ），８．１４−７．９２（ｍ，５Ｈ），７．８２−７．７８（ｍ，１Ｈ），７．７１−７．６８（ｄ，１Ｈ），７．６８−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．３５−７．２４（ｍ，１Ｈ），６．９７−６．９６（ｂｒｓ，２Ｈ），６．８８−６．８２（ｍ，１Ｈ），４．４９−４．４７（ｄ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），２．６７（ｓ，０．７７Ｈ；マイナー異性体，ＣＨ３），２．３４（ｓ，２．２６Ｈ；メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１８２】
実施例１３：ＮＧ−０３−２０１の調製
【化４８】
2019516774.tif 000050
（Ｚ）−５−（５−（（１−（３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル）−３−メチル−５−オキソ−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン）メチル）フラン−２−イル）−２−クロロ−Ｎ−（３−メトキシフェニル）ベンズアミド（ＮＧ−０３−２０１）：
ニトリル（ＮＧ−０３−１９３）（２００ｍｇ、１当量）を無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶かした溶液にアジ化ナトリウム（７２ｍｇ、３当量）、次いでＮＨ４Ｃｌ（６０ｍｇ、３当量）を加えた。反応混合物を１３０℃で２４時間加熱した。反応混合物を冷却後、５０〜６０ｍｌの冷水に注ぎ、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ約２に酸性化した。沈殿した固体を濾過により集め、水で洗浄した。粗生成物をＥｔＯＨ／ＥｔＯＡｃ混合物（１：９）で結晶化させ、固体を集め、ＥｔＯＡｃ、次いで２０〜３０％ＥｔＯＡを含むヘキサンの高温溶液で洗浄してテトラゾールＮＧ−０３−２０１（１３８ｍｇ、６４％の収率）を赤色固体として得た。
メジャーＺ異性体データ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ  １０．６６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．６４および８．６２（ｄ，１Ｈ），８．３２（ｓ，１Ｈ），８．２８−８．２１（ｍ，２Ｈ），８．０８−８．０２（ｍ，１Ｈ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．７７−７．７４（ｄ，１Ｈ），７．６５−７．６２（ｍ，３Ｈ），７．４４−７．４１（ｍ，１Ｈ），７．２９−７．２５（ｍ，２Ｈ），６．７４−６．７０（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），２．７１（ｓ，０．６４Ｈ；マイナー異性体，ＣＨ３），２．３３（ｓ，２．３６Ｈ；メジャー異性体，ＣＨ３）．
【０１８３】
生物学的実施例
実施例１：タンパク質精製および生化学的アッセイ
以前に記載されているように、組換えヒトＫｕヘテロ２量体を組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞から精製した（たとえば、Ｌｅｈｍａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，４７，４３５９−６８を参照されたい）。Ｋｕ−ＤＮＡ結合アッセイも以前に記載されているように実施した（たとえば、Ｌｅｈｍａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，４７，４３５９−６８；Ｐａｗｅｌｃｚａｋ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００５；３３，１５２−６１；およびＰａｗｅｌｃｚａｋ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００８，３６，４０２２−３１を参照されたい）。
【０１８４】
アッセイ結果
本発明者らの化合物特異性の解析では、Ｘ８０クラスの化合物は、Ｋｕタンパク質に対して強い阻害活性を有することが観察された。Ｘ８０をＫｕ−ＤＮＡ結合反応に滴下し、結果を図１Ａおよび１Ｂに示した。ＫｕのＤＮＡ結合能は、濃度依存性に低下し、ＩＣ５０（結合活性の５０％を阻害する濃度）は、約７５μＭであった。Ｋｕは、ＮＨＥＪ経路によるＤＮＡ二本鎖切断の修復に不可欠なＤＮＡ末端結合タンパク質である。ＫｕによるＤＮＡ結合のメカニズムは、末端から二本鎖ＤＮＡを取り囲むトロイド構造による。
【０１８５】
構造活性相関の決定を行うため、市販されている一連の化合物を購入した。０５３０に代表される第二世代化合物では、かなり大きい効力が得られ、ＩＣ５０は、約５μＭであった（図２Ａ、２Ｂ）。第二世代阻害剤の構造および効力を表１に示す。
【０１８６】
【表１】
2019516774.tif 000051
【０１８７】
【表２】
2019516774.tif 000052
【０１８８】
【表３】
2019516774.tif 000053
【０１８９】
【表４】
2019516774.tif 000054
【０１９０】
【表５】
2019516774.tif 000055
【０１９１】
【表６】
2019516774.tif 000056
【０１９２】
【表７】
2019516774.tif 000057
【０１９３】
実施例２：Ｋｕを標的とする新規な化学物質およびアッセイ結果
表１のデータに基づき、本発明者らは、Ｋｕ阻害を引き起こす構造活性相関をさらに探索するため、合成スキームを探求して一連の誘導体を合成した。構造および阻害データを表２に示す。これらのデータから、Ｋｕに対して多様な阻害活性を有する一連の阻害剤が明らかにされ、Ｋｕ阻害のＳＡＲの確認が可能になった。
【０１９４】
【表８】
2019516774.tif 000058
【０１９５】
【表９】
2019516774.tif 000059
【０１９６】
【表１０】
2019516774.tif 000060
【０１９７】
【表１１】
2019516774.tif 000061
【０１９８】
【表１２】
2019516774.tif 000062
【０１９９】
【表１３】
2019516774.tif 000063
【０２００】
【表１４】
2019516774.tif 000064
【０２０１】
【表１５】
2019516774.tif 000065
【０２０２】
【表１６】
2019516774.tif 000066
【０２０３】
【表１７】
2019516774.tif 000067
【０２０４】
【表１８】
2019516774.tif 000068
【０２０５】
【表１９】
2019516774.tif 000069
【０２０６】
実施例３：ＮＨＥＪ活性の阻害
Ｋｕ−ＤＮＡ結合の破壊は、ＮＨＥＪ活性の阻害につながるはずであり、この阻害を試験するため、本発明者らは、宿主細胞再活性化アッセイを採用する。このアッセイは、細胞にトランスフェクトされ、ＮＨＥＪによるプラスミドの再環状化時に発現するＧＦＰ遺伝子をコードする直線化プラスミドを利用する（Ｓｅａｒｓ，ＣＡ．，２０１２およびＷｏｏｄｓ，Ｄ．，２０１５）。環状ＲＦＰプラスミドのコトランスフェクションにより、トランスフェクション効率の違いが説明され、緑色細胞：赤色細胞の割合を検討することにより、ＮＨＥＪが促進するＧＦＰプラスミドの修復を定量することができる。このアッセイを使用して、Ｈ４６０細胞およびＨＥＫ−２９３細胞におけるＫｕ阻害剤化合物を検討し、これらの実験から得られたデータにより、化学化合物の感受性およびＫｕ阻害のＮＨＥＪ活性に対する作用を判定することができる。これは細胞アッセイであるため、本発明者らは、このアッセイを利用して一連のタイムコース実験も行い、ＮＨＥＪ活性の最大阻害を達成するため、阻害剤を細胞に送達するのに最適な時間を判定する。本発明者らがごく最近得た予備データから、化合物ＮＧ−０１−６８は、レポーターのトランスフェクションの２時間前にＨ４６０細胞とプレインキュベートすると、トランスフェクションの４８時間後に測定して、ＮＨＥＪ触媒による修復現象を２６％から１７％に低下させることができたことが立証される。第一段階の実験におけるこの３５％の低下は、ＮＨＥＪを最大限に阻害してＨＤＲによるゲノム編集を刺激する最適な処置レジメンを判定するための急速な発展の可能性の前兆となる。
【０２０７】
直線化プラスミドＤＮＡ（３ｋｂｐ）を、ＮＨＥＪコンピテント細胞（ＨＥＫ２９３）から調製した無細胞抽出物およびＡＴＰとインキュベートする。図８に示した結果は、レーン１の基質のみおよびプラスミド多量体の形成により証明される末端結合制御反応の程度を示す。抽出物とＮＧ−０２−１３２とのプレインキュベーションの結果、末端結合が阻害された。データの定量化によりＩＣ５０が約１５ｕＭであることが明らかになり、インビトロでのＫｕ  ＤＮＡ結合と整合した。これらのデータから、複雑なタンパク質混合物におけるターゲット結合が立証される。結果を図３に示す。
【０２０８】
実施例４：ＨＤＲ効率の上昇
Ｋｕ阻害を介したＮＨＥＪ活性の低下がＨＤＲ活性にどのような影響を与えるかを判定するため、公開されたＨＤＲ依存性アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，ＡＪ．，１９９９）を用いてＫｕ阻害剤の作用を検討する。このアッセイは、Ｉ−ＳｃｅＩによる切断時にＧＦＰの発現に至る組換え現象が起こるゲノム基質を利用する。ＧＦＰ発現は、フローサイトメトリーにより定量することができ、ＤＳＢの相同組換え修復の定量的指標になる。本アッセイに必要なプラスミドは、Ｖｅｒａ  Ｇｕｒｂｏｎｏｖａから入手し、アクセプター細胞株は、本アッセイ用に作製した（Ｓｅｌｕａｎｏｖ，Ａ．，２０１０）。ＮＨＥＪを検討するための上述の実験と同様に、このアッセイを使用して、Ｋｕ阻害剤がＨＤＲ活性にどのような影響を与えるかを判定する。
【０２０９】
実施例５：Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９による遺伝子エンジニアリングの促進。
Ｋｕ阻害剤のゲノムエンジニアリング効率に対する作用を検討するため、本発明者らは、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９による遺伝子挿入現象の組換え効率を定量するためのアッセイを設計した。ピューロマイシン耐性およびＧＦＰ遺伝子をコードする２．２ｋｂｐのドナーインサートを、インサートをＥＭＸ１座に誘導する８００ｂｐのホモロジーアームの間に配置した。Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＥＭＸ１遺伝子に誘導するガイドＲＮＡを購入し、ビヒクルまたは２０ｕＭの２０５のいずれかで処理したＨ４６０非小細胞肺癌細胞においてドナーコンストラクトおよびＣａｓ９発現プラスミドをコトランスフェクトした。２４時間後、細胞を５日間ピューロマイシンによる選択下に置き、単細胞クローニングのために９６ウェルプレートに蒔いた。クローンを増殖させ、ゲノムＤＮＡを単離して位置特異的ＰＣＲ解析を行い、ＥＭＸ１座での正確な遺伝子挿入を検討した。データから、細胞をＫｕ阻害剤とプレインキュベートしたとき、正確なゲノム挿入効率が６倍超上昇したことが立証される。結果を図４、図５および表３に示す。
【０２１０】
【表２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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