(57)【要約】本発明は、中でも筋ジストロフィー、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療するための方法及び組成物を提供する。一部の実施形態において、本発明による方法は、ＤＭＤにかかっている、またはＤＭＤにかかりやすい個体に対し、少なくとも１つのＤＭＤの症状または特徴において、強度、重症度、または頻度が低減されるように、または発症が遅れるように、有効量の組換えフォリスタチン融合タンパク質を投与することを含む。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えフォリスタチンポリペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記組換えフォリスタチンタンパク質がヘパリン結合配列（ＨＢＳ）を有し、前記ＨＢＳ内の１つ以上のアミノ酸が、置換されるアミノ酸より小さい正電荷を有するアミノ酸で置換されている、組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項２】
前記ＨＢＳ内の前記１つ以上のアミノ酸が、中性電荷を有するアミノ酸で置換されている、請求項１に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項３】
前記ＨＢＳ内の前記１つ以上のアミノ酸が、負電荷を有するアミノ酸で置換されている、請求項１に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項４】
前記１つ以上のアミノ酸が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項５】
前記１つ以上のアミノ酸が３アミノ酸を含む、請求項４に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項６】
前記組換えポリペプチドが有するヘパリン結合親和性が、天然に存在するフォリスタチンよりも減少している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項７】
前記組換えフォリスタチンタンパク質がＢＭＰ−９にもＢＭＰ−１０にも結合しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項８】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、配列番号１２〜４０または配列番号１０１〜１０６のいずれか１つに対し少なくとも８０％同一である配列を有する、請求項１に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号２、配列番号４、または配列番号５の６６位〜８８位に対応する前記アミノ酸が、配列番号４２〜６７または配列番号１１１〜１１６のいずれか１つと同一である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２、配列番号４、または配列番号５の６６位〜８８位に対応する前記アミノ酸配列が、配列番号５８〜６７または配列番号１１１〜１１３のいずれか１つと同一である、請求項９に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１１】
高グリコシル化変異体である、請求項１０に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１２】
組換えフォリスタチンポリペプチドであって、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、
Ｃ６６Ｓ、Ｃ６６Ａ、Ｇ７４Ｎ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７５Ｎ、Ｋ７６Ａ、Ｋ７６Ｄ、Ｋ７６Ｓ、Ｋ７６Ｅ、Ｃ７７Ｓ、Ｃ７７Ｔ、Ｒ７８Ｅ、Ｒ７８Ｎ、Ｎ８０Ｔ、Ｋ８１Ａ、Ｋ８１Ｄ、Ｋ８２Ａ、Ｋ８２Ｄ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８２Ｔ、Ｋ８２Ｅ、Ｋ８４Ｅ、Ｐ８５Ｔ、Ｒ８６Ｎ、Ｖ８８Ｅ、及びＶ８８Ｔ、またはその組合せからなる群から選択される前記アミノ酸バリエーションのいずれか１つを含む、組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９０％同一である、請求項９または１２に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１４】
前記アミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９５％同一である、請求項９または１２に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１５】
前記アミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９８％同一である、請求項９または１２に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１６】
前記アミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し１００％同一である、請求項９または１２に記載の組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１２、配列番号１７〜３０、及び配列番号３２〜４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、組換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のフォリスタチンポリペプチドと、ＩｇＧ  Ｆｃドメインとを含む、組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項１９】
フォリスタチンポリペプチドとヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインとを含む組換えフォリスタチン融合タンパク質であって、
前記組換えフォリスタチンポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号２、配列番号４、または配列番号５の６６位〜８８位に対応するアミノ酸が、配列番号４１、４２、４３、または５８と同一である、組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２０】
前記組換えフォリスタチンポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２１】
前記組換えフォリスタチンポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２２】
前記組換えフォリスタチンポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２３】
前記組換えフォリスタチンポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２４】
フォリスタチンポリペプチドとＩｇＧ  Ｆｃドメインとを含む組換えフォリスタチン融合タンパク質であって、
前記フォリスタチンポリペプチドが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５〜配列番号４０からなる群のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインがアミノ酸置換を含み、
前記アミノ酸置換が、ＥＵナンバリングによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、及びその組合せからなる群から選択される、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２６】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインが配列番号６のアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸配列が、ＥＵナンバリングによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、及びその組合せからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２７】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインが、配列番号７〜配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２８】
前記ＩｇＧ  ＦｃドメインがヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインである、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２９】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３０】
組換えフォリスタチン融合タンパク質であって、配列番号７３、配列番号１００、または配列番号１１７、または配列番号１１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３１】
前記タンパク質が、１〜１００ｐＭの親和性解離定数（ＫＤ）でミオスタチンに結合する、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３２】
前記タンパク質が、１〜１００ｐＭの親和性解離定数（ＫＤ）でアクチビンＡに結合する、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３３】
前記タンパク質が、０．２ｎＭ〜２５ｎＭの範囲の骨形成タンパク質−９（ＢＭＰ−９）及び／または骨形成タンパク質−１０（ＢＭＰ−１０）に結合しない、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３４】
前記タンパク質が、０．１から２５ｎＭ超の親和性解離定数（ＫＤ）でヘパリンに結合する、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３５】
前記タンパク質が、２５〜４００ｎＭの親和性解離定数（ＫＤ）で前記ＦｃＲｎ受容体に結合する、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３６】
タンパク質が、０．１〜１０ｎＭのＩＣ５０でミオスタチンを阻害する、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３７】
タンパク質が、０．１〜１０ｎＭのＩＣ５０でアクチビンＡを阻害する、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３８】
請求項１８〜３７のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項３９または４０に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項４２】
請求項３９もしくは４０に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４３】
請求項４２に記載の宿主細胞を培養することを含む、ミオスタチンに特異的に結合する組換えフォリスタチン融合タンパク質を作製する方法。
【請求項４４】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチンポリペプチドまたは請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質を生成する、ハイブリドーマ細胞。
【請求項４５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法であって、
ＤＭＤにかかっているまたはＤＭＤにかかりやすい対象に対し、少なくとも１つのＤＭＤの症状または特徴において、強度、重症度、または頻度が低減されるように、あるいは発症が遅れるように、有効量の、請求項１８〜３７のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質または請求項３８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４６】
前記対象に対し、１つ以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記１つ以上の追加の治療剤が、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその断片、エダサロネクセント（ｅｄａｓａｌｏｎｅｘｅｎｔ）、パムレブルマブ（ｐａｍｒｅｖｌｕｍａｂ）、プレドニゾン、デフラザコート、ＲＮＡ調節療法、エクソンスキッピング療法、及び遺伝子療法からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
有効量の前記組換えフォリスタチン融合タンパク質が非経口的に投与される、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記非経口投与が、静脈内、皮内、吸入、経皮（局所的）、眼内、筋肉内、皮下、経粘膜投与、またはその組合せからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記非経口投与が静脈内投与である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記非経口投与が皮下投与である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記組換えフォリスタチン融合タンパク質が、毎日、週２回、毎週、毎月、または隔月投与される、請求項４５〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記組換えフォリスタチン融合タンパク質が週２回投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記組換えフォリスタチン融合タンパク質が、表１から選択される１つ以上の骨格筋に送達される、請求項４５〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記組換えフォリスタチン融合タンパク質投与が、対照に比べての筋肉の質量増加をもたらす、請求項４５〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記筋肉が表１から選択される１つ以上の骨格筋である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記筋肉が、横隔膜、三頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、腓腹筋、長指伸筋、腹直筋、四頭筋、及びその組合せからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記筋肉が前記腓腹筋である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記筋肉の前記質量増加が、対照に比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、または５００％の増加である、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記組換えフォリスタチン融合タンパク質の前記投与が、筋肉の再生、筋肉強度の増加、柔軟性の増加、可動域の増加、スタミナの増加、易疲労感の低減、血流の増加、認知の改善、肺機能の改善、炎症の抑制、筋線維化の低減、及び／または筋壊死の低減をもたらす、請求項４５〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記少なくとも１つのＤＭＤの症状または特徴が、筋消耗、筋力低下、筋脆弱、筋壊死、筋線維化、関節拘縮、骨格変形、心筋症、嚥下障害、腸及び膀胱の機能障害、筋虚血、認知障害、行動障害、社会化障害、脊柱側弯症、ならびに呼吸機能障害からなる群から選択される、請求項４５〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
対象におけるミオスタチンを阻害する方法であって、
対象の筋肉に対し、有効量の、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質を含む組成物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年３月４日に出願された仮出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／３０３，９５４による利益を主張し、当該仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）はＸ連鎖正の劣性遺伝障害であり、男児出生において推定１：３６００で発症し、全世界で推定５０，０００人の患者が存在する。当該障害の特徴は進行性の筋消耗であり、発症した小児は１３歳になるまでに車椅子が必要となる。患者は通常３歳で症状を呈し、このような患者の生存期間中央値は２５歳から３０歳の間である。横隔膜衰弱及び心筋症に起因する呼吸不全が一般的な死因となる。
【０００３】
ＤＭＤはジストロフィン遺伝子の変異によって引き起こされる。ジストロフィン遺伝子はＸ染色体にあり、ジストロフィンタンパク質をコードする。ジストロフィンタンパク質は、ジストログリカン複合体を通じて、筋線維の収縮性機構（アクチン−ミオシン複合体）を周囲の細胞外マトリックスに接続する役目を担っている。ジストロフィン遺伝子の変異は、ジストロフィンタンパク質の変質または不在や、筋細胞膜機能の異常をもたらす。男性も女性もジストロフィン遺伝子の変異を保有し得るが、女性がＤＭＤを発症することは稀である。
【０００４】
ＤＭＤの特徴の１つは、患部組織の虚血である。虚血とは、組織または臓器への血液供給が制限されるまたは減少することであり、酸素不足や細胞代謝のための栄養要求を引き起こす。概して、虚血は血管の収縮または閉塞が原因であり、組織または臓器の損傷または機能不全がもたらされる。虚血の治療は、患部組織または臓器への血流増加に向けられる。
【０００５】
現時点では、ＤＭＤの治療法は存在しない。遺伝子療法及びコルチコステロイド投与を含めたいくつかの治療手段が検討されているが、ＤＭＤ患者向けの代替案の必要性は依然として存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明では中でも、ＤＭＤ治療のための、組換えフォリスタチン融合タンパク質の投与に基づく改善された方法及び組成物が提供される。本発明はとりわけ、フォリスタチンポリペプチドにおけるある特定のアミノ酸修飾によってフォリスタチンタンパク質の改良がもたらされるという予想外の知見を含み、改良されたフォリスタチンタンパク質は、ミオスタチン及びアクチビンＡを高い親和性で特異的に標的化し、非標的ＢＭＰやヘパリンには意味のある親和性で結合しない。ミオスタチン及びアクチビンＡのＳｍａｄ２／３経路活性化が筋原性のタンパク質発現の阻害につながり、結果的に筋芽細胞が筋肉に分化しないことが考慮されている。そのため、ミオスタチン及びアクチビンは、筋肉再生刺激のための有力な標的である。しかし、ある特定の構造類似性により、フォリスタチンを含めたミオスタチン及びアクチビンのアンタゴニストは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）にも結合し得る。ＢＭＰ、特にＢＭＰ−９及びＢＭＰ−１０は、全身における組織構造を編成する中心的な形成シグナルである。このようなＢＭＰを阻害することで、望ましくない病態がもたらされる恐れがある。また、フォリスタチンは、３つのＦＳドメインのうち１番目の塩基性ヘパリン結合配列（ＨＢＳ）を通じて細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンにも結合する。ヘパリン結合の不活性化、低減、または調節によってフォリスタチンのｉｎ  ｖｉｖｏ曝露及び／または半減期が増加し得ることが考慮されている。したがって、本発明は、半減期が長くＤＭＤの効果的治療にいっそう強力である、改善されたフォリスタチンを提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、組換えフォリスタチンポリペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、組換えフォリスタチンタンパク質がヘパリン結合ドメイン（ＨＢＳ）を有し、ＨＢＳ内の１つ以上のアミノ酸が、置換されるアミノ酸より小さい正電荷を有するアミノ酸で置換されている、組換えフォリスタチンポリペプチドを提供する。一実施形態では、ＨＢＳ内の１つ以上のアミノ酸は、中性電荷を有するアミノ酸で置換されている。一実施形態では、ＨＢＳ内の１つ以上のアミノ酸は、負電荷を有するアミノ酸で置換されている。一実施形態では、当該１つ以上は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸を含む。一実施形態では、当該１つ以上は３アミノ酸を含む。一実施形態では、当該組換えポリペプチドが有するヘパリン結合親和性は、天然に存在するフォリスタチンよりも減少している。一実施形態では、当該組換えフォリスタチンタンパク質は、ＢＭＰ−９にもＢＭＰ−１０にも結合しない。一実施形態では、当該組換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号１２〜４０または配列番号１０１〜１０６のいずれか１つに対し少なくとも８０％同一である配列を有する。
【０００８】
一態様では、本発明は、組換えフォリスタチンポリペプチドであって、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２、配列番号４、または配列番号５の６６位〜８８位に対応するアミノ酸が、配列番号４２〜６７または配列番号１１１〜１１６のいずれか１つと同一である、組換えフォリスタチンポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、配列番号２、配列番号４、または配列番号５の６６位〜８８位に対応するアミノ酸配列は、配列番号５８〜６７または配列番号１１１〜１１３のいずれか１つと同一である。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドは高グリコシル化変異体である。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９０％同一である。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９５％同一である。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９８％同一である。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し１００％同一である。
【０００９】
一態様では、本発明は、組換えフォリスタチンポリペプチドであって、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも８０％同一であるアミノ酸を含み、かつ、Ｃ６６Ｓ、Ｃ６６Ａ、Ｇ７４Ｎ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７５Ｎ、Ｋ７６Ａ、Ｋ７６Ｄ、Ｋ７６Ｓ、Ｋ７６Ｅ、Ｃ７７Ｓ、Ｃ７７Ｔ、Ｒ７８Ｅ、Ｒ７８Ｎ、Ｎ８０Ｔ、Ｋ８１Ａ、Ｋ８１Ｄ、Ｋ８２Ａ、Ｋ８２Ｄ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８２Ｔ、Ｋ８２Ｅ、Ｋ８４Ｅ、Ｐ８５Ｔ、Ｒ８６Ｎ、Ｖ８８Ｅ、及びＶ８８Ｔ、またはその組合せからなる群から選択されるアミノ酸バリエーションのいずれか１つを含む、組換えフォリスタチンポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９０％同一である。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９５％同一である。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９８％同一である。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し１００％同一である。
【００１０】
一態様では、本発明は、配列番号１２、配列番号１７〜３０、及び配列番号３２〜４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、組換えフォリスタチンポリペプチドを提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、組換えフォリスタチンポリペプチドとＩｇＧ  Ｆｃドメインとを含む、組換えフォリスタチン融合タンパク質を提供する。
【００１２】
一態様では、本発明は、組換えフォリスタチンポリペプチドとヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインとを含む組換えフォリスタチン融合タンパク質であって、組換えフォリスタチンポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも８０％同一であるアミノ酸を含み、配列番号２、配列番号４、または配列番号５の６６位〜８８位に対応するアミノ酸が、配列番号４１、４２、４３、または５８と同一である、組換えフォリスタチン融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号５に対し１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
一態様では、本発明は、フォリスタチンポリペプチドとＩｇＧ  Ｆｃドメインとを含む組換えフォリスタチン融合タンパク質であって、当該フォリスタチンポリペプチドが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５〜配列番号４０からなる群のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、組換えフォリスタチン融合タンパク質を提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、当該ＩｇＧ  Ｆｃドメインはアミノ酸置換を含み、当該アミノ酸置換は、ＥＵナンバリングによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、及びその組合せからなる群から選択される。
【００１５】
一部の実施形態では、当該ＩｇＧ  Ｆｃドメインは配列番号６のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、ＥＵナンバリングによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、及びその組合せからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、当該ＩｇＧ  Ｆｃドメインは、配列番号７〜配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、当該ＩｇＧ  ＦｃドメインはヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、当該ＩｇＧ  Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。
【００１７】
一態様では、本発明は、配列番号７３〜配列番号１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含む組換えフォリスタチン融合タンパク質を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチン融合タンパク質は、１〜１００ｐＭの親和性解離定数（ＫＤ）でミオスタチンに結合する。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチン融合タンパク質は、１〜１００ｐＭの親和性解離定数（ＫＤ）でアクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチン融合タンパク質は、０．２ｎＭ〜２５ｎＭの範囲の骨形成タンパク質−９（ＢＭＰ−９）及び／または骨形成タンパク質−１０（ＢＭＰ−１０）に結合しない。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチン融合タンパク質は、０．１〜２００ｎＭの親和性解離定数（ＫＤ）でヘパリンに結合する。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチン融合タンパク質は、２５〜４００ｎＭの親和性解離定数（ＫＤ）でＦｃ受容体に結合する。
【００１９】
一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチン融合タンパク質は、０．１〜１０ｎＭのＩＣ５０でミオスタチンを阻害する。一部の実施形態では、当該組換えフォリスタチン融合タンパク質は、０．１〜１０ｎＭのＩＣ５０でアクチビンを阻害する。
【００２０】
一態様では、本発明は、組換えフォリスタチン融合タンパク質及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
一態様では、本発明は、組換えフォリスタチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
一態様では、本発明は、組換えフォリスタチン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、発現ベクターは当該ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む。
【００２３】
一態様では、本発明は、宿主細胞を培養することにより、ミオスタチン及びアクチビンＡに特異的に結合する組換えフォリスタチン融合タンパク質を作製する方法を提供する。
【００２４】
一態様では、本発明は、組換えフォリスタチンポリペプチドまたは組換えフォリスタチン融合タンパク質を生成するハイブリドーマ細胞を提供する。
【００２５】
一態様では、本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法であって、ＤＭＤにかかっている、またはＤＭＤにかかりやすい対象に対し、少なくとも１つのＤＭＤの症状または特徴において、強度、重症度、または頻度が低減されるように、または発症が遅れるように、有効量の組換えフォリスタチン融合タンパク質または組換えフォリスタチン融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
一部の実施形態では、当該方法は、対象に対し、１つ以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、１つ以上の追加の治療剤は、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその断片、エダサロネクセント（ｅｄａｓａｌｏｎｅｘｅｎｔ）、パムレブルマブ（ｐａｍｒｅｖｌｕｍａｂ）、プレドニゾン、デフラザコート、ＲＮＡ調節療法、エクソンスキッピング療法、及び遺伝子療法からなる群から選択される。
【００２７】
一部の実施形態では、有効量の組換えフォリスタチン融合タンパク質は、非経口的に投与される。一部の実施形態では、当該非経口投与は、静脈内、皮内、吸入、経皮（局所的）、眼内、筋肉内、皮下、経粘膜投与、またはその組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、当該非経口投与は静脈内投与である。一部の実施形態では、当該非経口投与は皮下投与である。一部の実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質は、毎日、週２回、毎週、毎月、または隔月投与される。一部の実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質は週２回投与される。
【００２８】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質は、表１から選択される１つ以上の骨格筋に送達される。一部の実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質投与が、対照に比べての筋肉の質量増加をもたらす。一部の実施形態では、当該筋肉は、表１から選択される１つ以上の骨格筋である。一部の実施形態では、当該筋肉は、横隔膜、三頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、腓腹筋、長指伸筋、腹直筋、四頭筋、及びその組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、当該筋肉は腓腹筋である。一部の実施形態では、筋肉の質量増加は、対照に比べての少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、または５００％の増加である。
【００２９】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質の投与は、筋肉の再生、筋肉強度の増加、柔軟性の増加、可動域の増加、スタミナの増加、易疲労感の低減、血流の増加、認知の改善、肺機能の改善、炎症の抑制、筋線維化の低減、及び／または筋壊死の低減をもたらす。
【００３０】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＭＤの症状または特徴は、筋消耗、筋力低下、筋脆弱、筋壊死、筋線維化、関節拘縮、骨格変形、心筋症、嚥下障害、腸及び膀胱の機能障害、筋虚血、認知障害、行動障害、社会化障害、脊柱側弯症、ならびに呼吸機能障害からなる群から選択される。
【００３１】
一態様では、本発明は、対象におけるミオスタチンを阻害する方法であって、対象の筋肉に対し、有効量の組換えフォリスタチン融合タンパク質を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
図面は、単に例示を目的とするものであり、制限するためのものではない。
【００３３】
【図１Ａ】図１Ａ及び図１Ｂは、例示的な組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質またはＦＳ３１５ＷＴ−ｈＦｃ（比較タンパク質）を投与したＣＤ−１マウスの血清ＰＫプロファイルを説明する例示的結果を示している。
【図１Ｂ】同上。
【００３４】
【図２】図２は、ＰＢＳビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃ、または３ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃで処置したｍｄｘマウスにおける前肢の握力を、野生型マウスにおける前肢の握力と比較して示すグラフである。前肢の握力は投与から１１週間後に測定した。このデータは、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃで処置したｍｄｘマウスの前肢の握力に対し、ビヒクルのみで処置した動物の握力と比較して顕著な増加が見られたことを示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を以下にまず定義する。以下の用語及び他の用語のさらなる定義は、本明細書全体を通して記載される。
【００３６】
親和性：当技術分野で知られているように、「親和性」とは、特定のリガンドが自らのパートナーと結合する堅固さの尺度である。一部の実施形態では、リガンドまたはパートナーとは、組換えフォリスタチンポリペプチドである。一部の実施形態では、リガンドまたはパートナーとは、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質である。親和性は、種々の方法で測定することができる。一部の実施形態では、親和性は定量的アッセイによって測定する。一部の実施形態では、結合パートナー濃度は、生理的条件を模倣できるようにリガンド濃度を超過して固定され得る。代替的にまたは追加的に、一部の実施形態では、結合パートナー濃度及び／またはリガンド濃度は変動し得る。このような一部の実施形態では、親和性は、同等の条件（例えば、濃度）下の基準と比較され得る。
【００３７】
寛解：本明細書で使用する「寛解」という用語は、ある状態の予防、低減、もしくは軽減、または対象の状態の改善を意味する。寛解には、疾患状態の完全な回復または完全な予防が含まれるが、これが求められるわけではない。
【００３８】
動物：本明細書で使用する「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階でのヒトを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階での非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または蠕虫類が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンであり得る。
【００３９】
およそまたは約：本明細書で使用する「およそ」または「約」という用語は、関心対象となる１つ以上の値に適用される場合、記述された参照値と同等の値を意味する。特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、特記されない限り、ないしは特に文脈から明らかでない限り、記述された参照値のいずれかの方向（超または未満）における２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下に入る値の範囲を意味する（かかる数字が取り得る値の１００％を超える場合を除く）。
【００４０】
関連：本明細書において、２つの事象または実体が互いに「関連」しているというように用語が使用されるのは、一方の存在、レベル、及び／または形態が他方のものと相互関係を有する場合である。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド）が特定の疾患、障害、または状態に関連していると考えられるのは、その存在、レベル、及び／または形態が（例えば、関係する集団全体における）当該疾患、障害、または状態の発生率及び／または感受性と相互関係を有する場合である。一部の実施形態では、２つ以上の実体が直接的または間接的に相互作用して、互いに物理的に近接しているまたはその状態を保っている場合、当該２つ以上の実体は互いに物理的に「関連」している。一部の実施形態では、互いに物理的に関連している２つ以上の実体は互いに共有結合しており、一部の実施形態では、互いに物理的に関連している２つ以上の実体は互いに共有結合しているのではなく、例えば水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水相互作用、磁気、及びその組合せによって非共有結合的に関連している。
【００４１】
生物学的利用度：本明細書で使用する「生物学的利用度」という用語は、概して、投与された用量のうち対象の血流に到達する割合を意味する。
【００４２】
生物学的活性：本明細書で使用する「生物学的活性」という語句は、生体系、特に生物体において活性を有する任意の作用剤の特徴を意味する。例えば、生物体に投与された場合に、その生物体に対して生物学的作用を有する作用剤は、生物学的活性があると見なされる。ペプチドが生物学的活性である特定の実施形態では、当該ペプチドの少なくとも１つの生物活性を共有する当該ペプチドの一部分が「生物学的活性」部分と称されるのが典型的である。
【００４３】
心筋：本明細書で使用する「心筋（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ）」という用語は、心臓の壁に見いだされる不随意性横紋筋の一タイプ、特に心筋層（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）を意味する。
【００４４】
担体または希釈剤：本明細書で使用する「担体」及び「希釈剤」という用語は、医薬製剤の調製に有用な医薬的に許容される（例えば、ヒトへの投与に対して安全かつ無毒である）担体または希釈物質を意味する。希釈剤の例として、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー溶液、またはデキストロース溶液が挙げられる。
【００４５】
剤形：本明細書で使用する「剤形」及び「単位剤形」という用語は、治療対象の患者用の治療タンパク質（例えば、組換えフォリスタチンポリペプチドまたは組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質）における物理的に分離した単位を意味する。各単位は、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性物質を含有する。しかし、当該組成物の総投薬量は、主治医が妥当な医学的判断の範囲内で決定することになることを理解されたい。
【００４６】
フォリスタチンまたは組換えフォリスタチン：本明細書で使用する「フォリスタチン（ＦＳ）」または「組換えフォリスタチン」という用語は、別段の明記がない限り、実質的なフォリスタチンの生物学的活性を保持する任意の野生型または修飾されたフォリスタチンタンパク質またはポリペプチド（例えば、アミノ酸の変異、欠失、挿入を伴うフォリスタチンタンパク質、及び／または融合タンパク質）を意味する。
【００４７】
Ｆｃ領域：本明細書で使用する「Ｆｃ領域」という用語は、２つの「Ｆｃポリペプチド」の二量体を意味し、各「Ｆｃポリペプチド」は、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除いた抗体の定常領域を含む。一部の実施形態では、「Ｆｃ領域」には、１つ以上のジスルフィド結合、化学的リンカー、またはペプチドリンカーによって結合した２つのＦｃポリペプチドが含まれる。「Ｆｃポリペプチド」とは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインならびにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを意味し、また「Ｆｃポリペプチド」には、これらのドメインに対しＮ末端側にある可動性ヒンジの一部または全てが含まれ得る。ＩｇＧについては、「Ｆｃポリペプチド」は、免疫グロブリンドメインのＣガンマ２（Ｃγ２）及びＣガンマ３（Ｃγ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣγ２との間にあるヒンジ下部を含む。Ｆｃポリペプチドの境界は様々であり得るが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃポリペプチドは、そのカルボキシル末端に対し、Ｋａｂａｔ他（１９９１，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ）におけるＥＵインデックスによるところのＴ２２３またはＣ２２６またはＰ２３０で始まる残基を含むように定義されている。ＩｇＡについては、「Ｆｃポリペプチド」は、免疫グロブリンドメインのＣアルファ２（Ｃα２）及びＣアルファ３（Ｃα３）、ならびにＣアルファ１（Ｃα１）とＣα２との間にあるヒンジ下部を含む。Ｆｃ領域は、合成であっても組換えであってもよく、ＩＶＩＧのような天然の原料から生成されてもよい。
【００４８】
機能的等価物または機能的誘導体：本明細書で使用する「機能的等価物」または「機能的誘導体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体の文脈では、元来の配列の生物学的活性と実質的に同様の生物活性（機能的または構造的いずれか）を保持する分子を意味する。機能的誘導体または機能的等価物は、天然の誘導体であり得るか、または合成で調製される。例示的な機能的誘導体として、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するが、タンパク質の生物学的活性が保持されているアミノ酸配列が挙げられる。置換したアミノ酸は、望ましくは、置換されたアミノ酸と類似する化学物理的性質を有する。類似した望ましい化学物理的性質として、電荷、嵩高さ、疎水性、親水性などにおける類似性が挙げられる。
【００４９】
融合タンパク質：本明細書で使用する「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」という用語は、２種以上の元来は別々のタンパク質またはそれらの一部分を連結することによって作製されたタンパク質を意味する。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーが各タンパク質の間に存在することになる。融合タンパク質の非限定的な例の１つは、Ｆｃ融合タンパク質である。融合タンパク質の非限定的な例の１つは、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質である。
【００５０】
半減期：本明細書で使用する「半減期」という用語は、タンパク質濃度またはタンパク質活性などの量が、ある期間の開始時に測定された値の半分まで下がるのに要する時間である。
【００５１】
肥大：本明細書で使用する「肥大」という用語は、臓器または組織の構成細胞の拡大に起因する臓器または組織の体積増加を意味する。
【００５２】
改善、増加、または低減：本明細書で使用する「改善」、「増加」、もしくは「低減」という用語、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同一個体での測定値、または本明細書に記載される治療を受けていない対照被験体（または複数の対照被験体）での測定値などの基準測定値に対する相対的な値を示唆するものである。「対照被験体」とは、治療を受けている対象と同じ疾患形態を患っており、治療を受けている対象とほぼ同じ年齢の対象のことである。
【００５３】
阻害：本明細書で使用する「阻害」、「阻害する」、及び「阻害すること」という用語は、目的のタンパク質または遺伝子の活性及び／または発現を減少させるまたは低減するプロセスまたは方法を意味する。通常は、タンパク質または遺伝子を阻害することは、本明細書に記載されているまたは当技術分野で認識されている１つ以上の方法によって測定されるタンパク質または遺伝子の発現または関係する活性を、少なくとも１０％以上、例えば２０％、３０％、４０％、または５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上低減すること、あるいは発現または関係する活性の１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上より大きい減少を意味する。
【００５４】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用する「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、多細胞生物体内ではなく、例えば、試験管または反応容器中、細胞培養液中などの人工的な環境で生じる事象を意味する。
【００５５】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ：本明細書で使用する「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物体内で生じる事象を意味する。細胞型系の文脈において、当該用語は、生細胞内で生じる事象を意味するのに（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ系の対語として）使用され得る。
【００５６】
ＫＤ：本明細書で使用する「ＫＤ」という用語は、本明細書において、解離定数を意味することが意図されており、解離定数はＫｄのＫａに対する比率（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。リガンドのＫＤ値は、当技術分野で十分確立した方法を用いて測定することができる。リガンドのＫＤを測定する好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによる方法であり、好ましくはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムを用いる。
【００５７】
リンカー：本明細書で使用する「リンカー」という用語は、融合タンパク質において、天然タンパク質の特定の位置に見られるもの以外のアミノ酸配列を意味し、可撓性を持つか、または２つのタンパク質部分構造の間にα−ヘリックスなどの構造を挿入するように設計されているのが一般的である。リンカーは、スペーサーとも称される。リンカーまたはスペーサーは、一般的に、それ自体には生物学的機能を持たない。
【００５８】
医薬的に許容される：本明細書で使用する「医薬的に許容される」という用語は、妥当な医学的評価の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的な利益／リスクの比率に応じてヒト及び動物の組織に接触させて使用するのに適した物質を指す。
【００５９】
ポリペプチド：用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合を介して互いに連結したアミノ酸の連続鎖を意味する。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖について言及するのに使用されるが、当業者が理解するように、この用語は長い鎖に限定されることはなく、ペプチド結合を介して互いに連結した２つのアミノ酸を含めた極めて短い鎖についても言及することができる。当業者に知られるように、ポリペプチドはプロセシング及び／または修飾されてもよい。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は交換可能に使用される。
【００６０】
予防：本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」という用語は、疾患、障害、及び／または症状の発病に関連して使用される場合、疾患、障害、及び／または症状発症のリスクを低下させることを意味する。後述の「リスク」の定義を参照されたい。
【００６１】
タンパク質：本明細書で使用される用語「タンパク質」は、個別単位として機能する１つ以上のポリペプチドを意味する。単一のポリペプチドが個別の機能性単位であり、個別の機能性単位を形成するために他のポリペプチドと永続的または一時的に物理的会合することを必要としない場合、用語「ポリペプチド」と用語「タンパク質」は交換可能に用いることができる。個別の機能性単位が相互に物理的会合した２つ以上のポリペプチドで構成される場合、「タンパク質」という用語は、物理的に結合し、かつ個別単位として合わせて機能する複数のポリペプチドを意味する。
【００６２】
リスク：文脈から理解されるとおり、疾患、障害、及び／または症状の「危険性」は、特定の個体が疾患、障害、及び／または症状（例えば、筋ジストロフィー）を発症する可能性を包含する。一部の実施形態では、リスクは割合として表される。一部の実施形態では、リスクは０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％までである。一部の実施形態では、リスクは、参照試料または参照試料群に関連するリスクと比較したリスクとして表される。一部の実施形態では、参照試料または参照試料群は、疾患、障害、症状、及び／または事象（例えば、筋ジストロフィー）の既知のリスクを有している。一部の実施形態では、参照試料または参照試料群は、ある特定の個体と比較可能な個体由来である。一部の実施形態では、相対リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。
【００６３】
横紋筋：本明細書で使用する「横紋筋」という用語は、顕微鏡の使用または随意制御下で横紋の外観をもたらす細胞内の収縮単位、サルコメアが規則的に並んだ多核性筋組織を意味する。通常は、横紋筋は心筋、骨格筋、及び鰓弓筋であり得る。
【００６４】
平滑筋：本明細書で使用する「平滑筋」という用語は不随意に制御される非横紋筋を意味し、これには単元筋及び多元筋が含まれる。
【００６５】
対象：本明細書で使用する「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を意味する。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は患者である場合があり、これは、疾患の診断または治療のために医療機関に来院するヒトを意味する。用語「対象」は、本明細書において「個体」または「患者」と交換可能に使用される。対象は、疾患または障害に罹患している可能性があるか、またはそれにかかりやすいが、疾患または障害の症状を表していてもいなくてもよい。
【００６６】
実質的：本明細書で使用する「実質的」という用語は、関心対象の特徴または特性の全てもしくはほぼ全ての範囲または程度を示す、定性的な状態を意味する。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的な現象が、完了すること及び／もしくは完了の域に到達すること、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、「実質的」という用語は、本明細書において、多くの生物学的及び化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるのに用いられる。
【００６７】
実質的相同性：「実質的相同性」という語句は、本明細書において、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を示すのに用いられる。当業者には理解されるように、２つの配列が対応する位置に相同な残基を有する場合、それらは通例「実質的相同」であると見なされる。相同の残基は、同一残基であってもよい。あるいは、相同な残基は、非同一の残基であってもよく、構造的特徴および／または機能的特徴が適切に類似である。例えば、当業者には周知のとおり、ある特定のアミノ酸は、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として、及び／または「極性」または「非極性」の側鎖を有するとして分類されるのが典型的である。あるアミノ酸が同じタイプの別のアミノ酸から置換されたものである場合、しばしば「相同的」置換とみなされ得る。
【００６８】
当該分野で周知のとおり、アミノ酸配列または核酸配列は様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができ、そのようなアルゴリズムとして、市販のコンピュータープログラムで使用可能なアルゴリズム、例えば、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ギャップＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどが挙げられる。こうしたプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ  Ｍｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９．に記載されている。上述のプログラムは、相同な配列を特定することに加えて、相同性の度合いの表示も提供するのが一般的である。一部の実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が、関連する連続区間の残基にわたって相同である場合、実質的に相同であると見なされる。一部の実施形態では、当該連続区間は完全配列である。一部の実施形態では、当該連続区間は、少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個またはそれ以上の残基である。
【００６９】
実質的同一性：語句「実質的同一性」は、本明細書において、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を示すのに用いられる。当業者には理解されるように、２つの配列が対応する位置に同一残基を有する場合、それらは通例「実質的に同一」であると見なされる。当該分野で周知のとおり、アミノ酸配列または核酸配列は様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができ、そのようなアルゴリズムとして、市販のコンピュータープログラムで使用可能なアルゴリズム、例えば、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ギャップＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどが挙げられる。こうしたプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ  Ｍｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９．に記載されている。上述のプログラムは、同一配列を特定することに加えて、同一性の度合いの表示も提供するのが一般的である。一部の実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が、関連する連続区間の残基にわたって同一である場合、実質的に同一であると見なされる。一部の実施形態では、当該連続区間は完全配列である。一部の実施形態では、当該連続区間は、少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個またはそれ以上の残基である。
【００７０】
表面プラズモン共鳴：本明細書においては、例えば、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度変化を、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて検出することにより、特異的結合の相互作用に対するリアルタイムでの解析を可能にする光学的現象を意味する。  さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７を参照。
【００７１】
罹患：疾患、障害、及び／または症状に「罹患」している個体は、その疾患、障害、及び／または症状を持つと診断されているか、またはその疾患、障害、及び／または症状の１つ以上の徴候を示している。
【００７２】
かかりやすい：疾患、障害、及び／または症状にかかりやすい個体は、その疾患、障害、及び／または症状を持つとは診断されていない。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または症状にかかりやすい個体は、その疾患、障害、及び／または症状の徴候を呈していない場合がある。一部の実施形態では、疾患、障害、症状、または事象（例えば、ＤＭＤ）にかかりやすい個体は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けることができる：（１）疾患、障害、及び／または症状の発症と関連する遺伝子変異；（２）疾患、障害、及び／または症状の発症と関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、及び／または症状と関連するタンパク質の発現及び／または活性の増加及び／または減少；（４）疾患、障害、症状、及び／または事象の発症と関連する習慣及び／または生活様式；（５）移植を受けたか、受ける予定であるか、または移植を必要としていること。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または症状にかかりやすい個体は、その疾患、障害、及び／または症状を発症することになる。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または症状にかかりやすい個体は、その疾患、障害、及び／または症状を発症することがない。
【００７３】
標的組織：本明細書で使用する「標的組織」という用語は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のような治療の対象となる疾患の影響を受けている任意の組織を意味する。一部の実施形態では、標的組織には、疾患に関連する病態、症状、または特徴を示す組織が含まれ、以下に限定するものではないが、筋消耗、骨格変形、心筋症、及び呼吸機能障害が含まれる。
【００７４】
治療有効量：本明細書で使用される場合、治療剤の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び／もしくは症状に罹患しているか、またはかかりやすい対象に投与される場合、その疾患、障害、及び／または症状の徴候を治療する、診断する、予防する、及び／またはその開始を遅延するのに十分な量を意味する。当業者は、治療有効量が少なくとも１つの単位用量を含む投与レジメンによって投与されるのが典型的であることを理解するであろう。
【００７５】
治療：本明細書で使用する「治療する」、「治療」または「治療している」という用語は、ある特定の疾患、障害、及び／または症状の１つ以上の徴候または特徴を、部分的にまたは完全に軽減する、寛解させる、緩和する、抑制する、予防する、その開始を遅延する、その重症度を低減する、及び／またはその発症率を低減するために使用する任意の方法を意味する。疾患の症状を提示していない対象、及び／または疾患の初期の症状のみを提示している対象に対して、当該疾患に関連する病態を発症させるリスクを減らすために、治療が行われる場合もある。
【００７６】
（発明を実施するための形態）
本発明は、中でも、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及び／またはベッカー型筋ジストロフィーを含めた筋ジストロフィーを治療するための、タンパク質療法としてのフォリスタチンに基づいた方法及び組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＤＭＤを治療する方法であって、ＤＭＤにかかっている、またはＤＭＤにかかりやすい個体に対し、少なくとも１つのＤＭＤの症状または特徴において、強度、重症度、または頻度が低減されるように、または発症が遅れるように、有効量の組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を投与することを含む方法を提供する。
【００７７】
本発明の種々の態様を、以下の節で詳細に説明する。節の使用は、本発明を限定することを意味するものではない。各節は、本発明の任意の態様に対して適用することができる。本出願で使用される「または」は、別段の記載がない限り、「及び／または」を意味する。
【００７８】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）
ＤＭＤは、全身にわたる進行性の筋肉変質及び筋肉関連機能喪失を特徴とする疾患である。本発明は、筋肉を再生し、様々な筋組織におけるＤＭＤ及び他の筋ジストロフィーに関連する線維化、炎症、及び他の症状または特徴を治療するための方法及び組成物を提供することが企図されている。一部の実施形態では、提供する方法及び組成物を対象に使用することにより、対象における繊維化及び／または壊死の減少がもたらされる。
筋組織
【００７９】
動物には２つの主要なタイプの筋組織、すなわち横紋筋及び平滑筋が存在する。本明細書で使用する「横紋筋」という用語は、反復サルコメアを含有する筋組織を意味する。横紋筋は、随意的制御下に置かれ骨格に付着している傾向があるが、一部例外も存在し、例えば心筋は横紋筋のいくつかの特性を有するが、随意的制御下には置かれていない。概して、横紋筋は身体の随意運動を可能にし、横紋筋には、四頭筋、腓腹筋、二頭筋、三頭筋、僧帽筋、三角筋、その他多数を含めた主要な筋肉群が含まれる。横紋筋の長さは長い傾向があり、多くの横紋筋は独立に機能することができる。ただし、口、肛門、心臓、及び食道上部の横紋筋を含めた一部の横紋筋は、骨格に付着していない。
【００８０】
一方、平滑筋は全く異なる構造を有する。平滑筋は、別々に骨格付着部分を有する一連の長い筋肉ではなく、平滑筋細胞間の機械的結合によって連続的なシートに編成される傾向がある。平滑筋は中空臓器の壁内に位置することが多く、通常、随意的制御下には置かれていない。特定の臓器の内側を覆う平滑筋は、同じ負荷を有し、同時に収縮しなければならない。平滑筋は、少なくとも部分的には、運動及び／または位置もしくは圧力の変化により生じる中空臓器への負荷の変化に対処するよう機能する。この二重の役割は、平滑筋が横紋筋のように収縮できなければならないだけではなく、平滑筋が緊張的に収縮して、持続的な負荷に対抗して臓器の寸法を維持できなければならないことを意味する。平滑筋の例としては、血管、膀胱、消化管（例えば、直腸）の内層を覆うものがある。
【００８１】
筋肉の強度は、筋肉細胞の数及びサイズ、そして筋肉細胞の解剖学的配置に依存する。既存の筋原線維のサイズ増加（肥大）及び／または筋細胞の形成増加（過形成）によって筋線維の直径が増加すれば、筋肉の力を発生する能力が増加する。
【００８２】
また、筋肉は位置または機能によっても分類され得る。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、１つ以上の顔の筋肉、１つ以上の咀嚼用筋肉、１つ以上の舌及び頸部の筋肉、１つ以上の胸郭筋肉、１つ以上の肩帯及び腕の筋肉、１つ以上の腕及び肩の筋肉、１つ以上の腹部及び背側の前腕の筋肉、１つ以上の手の筋肉、１つ以上の脊柱起立筋、１つ以上の下肢帯及び脚の筋肉、ならびに／または１つ以上の前肢及び足の筋肉を標的とする。
【００８３】
一部の実施形態では、顔の筋肉には、以下に限定するものではないが、毛様体、瞳孔散大筋、虹彩括約筋などの眼球内筋肉；耳介、側頭頭頂筋、アブミ骨筋、鼓膜張筋などの耳の筋肉；鼻根筋、鼻筋、鼻孔開大筋、鼻中隔下制筋、眼角筋などの鼻の筋肉；口角挙筋、口角下制筋、口輪筋、頬筋、大頬骨筋及び小頬骨筋、広頬筋、上唇挙筋、下唇下制筋、笑筋、オトガイ筋、ならびに／または皺眉筋などの口の筋肉が含まれる。
【００８４】
一部の実施形態では、咀嚼の筋肉には、以下に限定するものではないが、咬筋、側頭筋、内側翼突筋、外側翼突筋が含まれる。一部の実施形態では、舌及び頸部の筋肉には、以下に限定するものではないが、オトガイ舌筋、茎突舌筋、口蓋舌筋、舌骨舌筋、顎二腹筋、茎突舌骨筋、顎舌骨筋、オトガイ舌骨筋、肩甲舌骨筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、甲状舌骨筋、胸鎖乳突筋、前斜角筋、中斜角筋、及び／または後斜角筋が含まれる。
【００８５】
一部の実施形態では、胸郭、肩帯及び腕の筋肉には、以下に限定するものではないが、鎖骨下筋、大胸筋、小胸筋、腹直筋、外腹斜筋、内腹斜筋、腹横筋、横隔膜、外肋間筋、内肋間筋、前鋸筋、僧帽筋、肩甲挙筋、大菱形筋、小菱形筋、広背筋、三角筋、肩甲下筋、棘上筋、棘下筋、大円筋、小円筋、及び／または烏口腕筋が含まれる。
【００８６】
一部の実施形態では、腕及び肩の筋肉には、以下に限定するものではないが、上腕二頭筋長頭、上腕二頭筋短頭、上腕三頭筋長頭、上腕三頭筋外側頭、上腕三頭筋内側頭、肘筋、円回内筋、回外筋、及び／または上腕筋が含まれる。
【００８７】
一部の実施形態では、腹側及び背側前腕筋には、以下に限定するものではないが、腕撓骨筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、長掌筋、尺側手根伸筋、長橈側手根伸筋、短橈側手根伸筋、指伸筋、小指伸筋が含まれる。
【００８８】
一部の実施形態では、手の筋肉には、以下に限定するものではないが、手の内筋、例えば、母指球筋、短母指外転筋、短母指屈筋、母指対立筋、小指球筋、小指外転筋、短小指屈筋、小指対立筋、掌側骨間筋、背側骨間筋、及び／または虫様筋が含まれる。
【００８９】
一部の実施形態では、脊柱起立筋には、以下に限定するものではないが、頸部、棘筋、最長筋、及び／または腸肋筋が含まれる。
【００９０】
一部の実施形態では、骨盤帯及び脚部の筋肉には、以下に限定するものではないが、大腰筋、腸骨筋、大腿方形筋、長内転筋、短内転筋、大内転筋、薄筋、縫工筋、大腿四頭筋（例えば、大腿直筋、外側広筋、内側広筋、中間広筋）、腓腹筋、長腓側（腓骨）筋、ヒラメ筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、大腿屈筋：大腿二頭筋：長頭、大腿屈筋：大腿二頭筋：短頭、大腿屈筋：半腱様筋、大腿屈筋：半膜様筋、大腿筋膜張筋、恥骨筋、及び／または前脛骨筋が含まれる。
【００９１】
一部の実施形態では、前肢及び足の筋肉には、以下に限定するものではないが、長指伸筋、長母指伸筋、短腓骨筋、足底筋、後脛骨筋、長母指屈筋、短指伸筋、短母指伸筋、母指外転筋、短母指屈筋、小指外転筋、小指屈筋、小指対立筋、短指伸筋、足の虫様筋、足底方形筋もしくは副屈筋、短指屈筋、背側骨間筋、及び／または底側骨間筋が含まれる。
【００９２】
例示的な筋肉標的を表１に概括する。
【表１−１】
2019509735.tif 000003
【表１−２】
2019509735.tif 000004
【００９３】
筋ジストロフィー
筋ジストロフィーは、筋変性をもたらし運動の衰弱及び障害につながる遺伝性障害の一群である。全ての筋ジストロフィーにおける中心的特徴は、本質的に進行性であるということである。筋ジストロフィーとしては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、及び１型及び２型筋緊張性ジストロフィー（１型筋緊張性ジストロフィーの先天的形態を含む）。筋ジストロフィーのタイプによって症状が様々であることがあり、筋肉の一部または全てに影響が及ぶ。筋ジストロフィーの例示的な症状としては、筋運動技能の発達遅延、１つ以上の筋肉群の使用困難、嚥下、発話、もしくは食事困難、流涎、瞼下垂、頻繁な転倒、成人としての筋肉もしくは筋肉群の強度損失、筋肉サイズの損失、身体の衰弱もしくは生体力学の変質に起因する歩行困難、筋肥大、仮性筋肥大、筋肉の脂肪浸潤、非収縮性組織による筋肉の置き換え（例えば、筋線維症）、筋壊死、及び／または認知もしくは行動障害／精神遅滞が挙げられる。
【００９４】
筋ジストロフィーの既知の治療法は存在しないものの、症候性療法及び疾患修飾療法を含めたいくつかの支持的治療が使用されている。筋ジストロフィーにおいては、コルチコステロイド、理学療法、矯正具、車椅子、または他のＡＤＬ及び肺機能用の支援医療デバイスが一般に使用されている。心臓ペースメーカーは、筋緊張性ジストロフィーにおける心臓不整脈による突然死を防止するために使用される。筋緊張の症状（弛緩不能）を改善する筋緊張緩和剤としては、メキシレチン（ｍｅｘｉｌｉｔｉｎｅ）ならびに場合によってはフェニトイン、プロカインアミド、及びキニーネが挙げられる。
【００９５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、筋変性がもたらされ最終的には死に至る劣性Ｘ連鎖性形態の筋ジストロフィーである。ＤＭＤは、近位筋の衰弱、異常歩行、腓腹筋群の仮性肥大、及びクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の上昇によって特徴づけられる。多くのＤＭＤ患者が、症状／徴候が通常明らかになる５歳前後に診断を受けている。発症した個体は、通常１０〜１３歳頃に歩行が停止し、２０代半ばから後半に、またはそれ以前に心肺機能不全が原因で死亡する。
【００９６】
ＤＭＤという障害は、ヒトＸ染色体にあるジストロフィン遺伝子の変異が原因であるが、このジストロフィン遺伝子によってコードされるジストロフィンタンパク質は筋組織内の重要な構造的成分であり、細胞膜のジストログリカン複合体（ＤＧＣ）の構造安定性をもたらす。ジストロフィンは、内部の細胞質アクチンフィラメントネットワーク及び細胞外マトリックスに連結し、筋線維に物理的強度をもたらしている。したがって、ジストロフィンの変質または不在は、異常な筋細胞膜断裂及び筋線維の壊死をもたらす。男女の両方が変異を保有し得るが、女性が当該疾患の重度な徴候を示すことは稀である。
【００９７】
ＤＭＤの主要な症状は筋消耗に関連する筋力低下であり、通常は随意筋が最初に発症し、特に臀部、骨盤領域、大腿、肩部、及び腓腹筋に発症する。筋力低下は、腕部、頸部、及び他の領域にも発生する。ふくらはぎは拡張することが多い。徴候及び症状は通常は６歳より前に現れ、早ければ乳児期に現れることもある。他の身体症状としては、以下に限定するものではないが、自立歩行能力の遅れ、歩行、足踏み、または走行における進行性の困難及び最終的な歩行能力の損失（通常は１５歳までに生じる）；頻繁な転倒；疲労；運動技能の困難（走行、ホップ、ジャンプ）；腰部前弯（臀部屈筋の短縮につながる）；機能性損なうアキレス腱及び大腿屈筋の拘縮（筋線維が短縮し線維症が結合組織内に生じるため）；筋線維の変形；筋組織が脂肪及び結合組織で置き換えられたことにより生じる舌及び腓腹筋の仮性肥大（拡大）；神経行動学的障害（例えば、ＡＤＨＤ）のリスク上昇；学習障害（失読症）及び特定の認知技能における非進行性薄弱（特に、短期言語記憶）；骨格変形（場合によっては脊椎側弯症を含む）が挙げられる。
【００９８】
組換えフォリスタチンタンパク質
本明細書において、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質には、実質的なフォリスタチンの生物学的活性を保持する、任意の野生型及び修飾されたフォリスタチンタンパク質（例えば、アミノ酸の変異、欠失、挿入を伴うフォリスタチンタンパク質、及び／または融合タンパク質）が含まれる。典型的には、組換えフォリスタチンタンパク質は組換え技術を用いて生成される。しかし、天然のリソースから精製したまたは化学的に合成したフォリスタチンタンパク質（野生型または修飾されたもの）も、本発明に従って使用することができる。典型的には、好適な組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン融合タンパク質は、約１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、２日、２．５日、３日、３．５日、４日、４．５日、５日、５．５日、６日、６．５日、７日、７．５日、８日、８．５日、９日、９．５日、または１０日以上のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、０．５日〜１０日、１日〜１０日、１日〜９日、１日〜８日、１日〜７日、１日〜６日、１日〜５日、１日〜４日、１日〜３日、２日〜１０日、２日〜９日、２日〜８日、２日〜７日、２日〜６日、２日〜５日、２日〜４日、２日〜３日、２．５日〜１０日、２．５日〜９日、２．５日〜８日、２．５日〜７日、２．５日〜６日、２．５日〜５日、２．５日〜４日、３日〜１０日、３日〜９日、３日〜８日、３日〜７日、３日〜６日、３日〜５日、３日〜４日、３．５日〜１０日、３．５日〜９日、３．５日〜８日、３．５日〜７日、３．５日〜６日、３．５日〜５日、３．５日〜４日、４日〜１０日、４日〜９日、４日〜８日、４日〜７日、４日〜６日、４日〜５日、４．５日〜１０日、４．５日〜９日、４．５日〜８日、４．５日〜７日、４．５日〜６日、４．５日〜５日、５日〜１０日、５日〜９日、５日〜８日、５日〜７日、５日〜６日、５．５日〜１０日、５．５日〜９日、５．５日〜８日、５．５日〜７日、５．５日〜６日、６日〜１０日、７日〜１０日、８日〜１０日、９日〜１０日のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。
【００９９】
フォリスタチン（ＦＳ）が最初に単離されたのは卵胞液からであり、下垂体細胞の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を抑制可能なタンパク因子として単離された。ＦＳがＦＳＨに対し影響を発揮するのは、少なくとも部分的にはアクチビンの結合及び中和を通じてである。
【０１００】
ＦＳには少なくとも３つのアイソフォームが存在し、それはＦＳ２８８、ＦＳ３０３、及びＦＳ３１５である（表３）。全長のＦＳ３１５タンパク質は酸性の２６残基のＣ末端尾部を含み、これはエクソン６（配列番号２、Ｃ末端尾部には１本の下線が引かれている）によってコードされる。場合によっては、ＦＳ３１５アイソフォームは、シグナル配列（配列番号１、シグナル配列は太字及びイタリックで表示）を含むことがある。ＦＳ２８８アイソフォームは、選択的スプライシングを通じてＣ末端で生成され、そしてエクソン５で終了する（配列番号５）。フォリスタチンタンパク質は、アクチビン結合に重要となる疎水性残基を含有する６３アミノ酸のＮ末端領域から構成される特徴的な構造を有し、当該タンパク質の主な部分（残基６４〜２８８、例えば配列番号２に示される）は、およそ７３〜７５アミノ酸からなる３つの１０−システインＦＳドメインを含む。これらの１０−システインドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれドメイン１、ドメイン２、及びドメイン３（すなわち、ＦＳＤ１、ＦＳＤ２、及びＦＳＤ３）と呼ばれる。ＦＳ２８８は、ヘパリン結合ドメインが存在するために組織に結合する傾向があるが、一方ＦＳ３１５は、おそらくは延長したＣ末端がヘパリン結合ドメインをマスクするため、循環形態となる傾向がある。ＦＳ３０３（配列番号４）は、ＦＳ３１５からのＣ末端ドメインのタンパク質切断によって生成されると考えられている。場合によっては、ＦＳ３０３アイソフォームは、シグナル配列（配列番号３、シグナル配列は太字及びイタリックで表示）を含むことがある。ＦＳ３０３が細胞表面に結合するレベルは、ＦＳ２８８とＦＳ３１５の間の中間レベルである。
【０１０１】
ヘパリン結合ドメインまたはヘパリン結合配列（例えば、ＨＢＳ）は、ＦＳ３１５の残基７５〜８６に対応するアミノ酸を含み、例えば配列番号２に示すＦＳＤ１内にある。ＨＢＳは二重下線で示されている。ＦＳ３０３及びＦＳ２８８タンパク質は、対応するアミノ酸にＨＢＳも含む（これも二重下線で示されている）。この領域内におけるアミノ酸の変異、欠失、または置換は、ヘパリン結合を低減または消失させる可能性があり、そのためクリアランスを低減し、治療用フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の半減期を向上させる可能性がある。
【０１０２】
一部の実施形態では、ＨＢＳ内の少なくとも１つ以上のアミノ酸を正電荷の小さいアミノ酸で置換することで、ヘパリン結合親和性が減少した組換えフォリスタチンタンパク質がもたらされる。一部の実施形態では、ＨＢＳ内の少なくとも１つ以上のアミノ酸を中性または負電荷の大きいアミノ酸で置換することで、ヘパリン結合親和性が減少した組換えフォリスタチンタンパク質がもたらされる。一部の実施形態では、元のアミノ酸よりも電荷の低減したアミノ酸で置換することで、ヘパリン結合親和性が減少した組換えフォリスタチンタンパク質がもたらされる。一部の実施形態では、ＨＢＳ内に存在するアミノ酸を、正電荷の小さい、中性電荷の、負電荷の大きい、または電荷の低減したアミノ酸で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０箇所置換することで、ヘパリン結合親和性が減少した組換えフォリスタチンタンパク質がもたらされる。一部の実施形態では、ＨＢＳ内に存在するアミノ酸を、正電荷の小さい、中性電荷の、負電荷の大きい、または電荷の低減したアミノ酸で１、２、または３箇所置換することで、ヘパリン結合親和性が減少した組換えフォリスタチンタンパク質がもたらされる。一部の実施形態では、ＨＢＳ内の２つ以上のアミノ酸を、正電荷の小さいアミノ酸、中性のアミノ酸、負電荷の大きいアミノ酸、または電荷の低減したアミノ酸で置換することで、行われたアミノ酸置換の量に応じてヘパリン結合親和性が減少する。例えば、ＨＢＳ内の３つのアミノ酸を、正電荷の小さい、中性電荷の、負電荷の大きい、または電荷の低減したアミノ酸で置換すると、ＨＢＳ内の２つのみのアミノ酸を、正電荷の小さい、中性電荷の、負電荷の大きい、または電荷の低減したアミノ酸で置換した場合よりも、組換えフォリスタチンタンパク質によるヘパリン結合が小さくなる。別の例として、ＨＢＳ内の２つのアミノ酸を、正電荷の小さい、中性電荷の、負電荷の大きい、または電荷の低減したアミノ酸で置換すると、ＨＢＳ内の１つのみのアミノ酸を、正電荷の小さい、中性電荷の、負電荷の大きい、または電荷の低減したアミノ酸で置換した場合よりも、組換えフォリスタチンタンパク質によるヘパリン結合が小さくなる。
【０１０３】
当業者であれば、ある特定のアミノ酸が他のアミノ酸に比べて正電荷が小さい、中性である、負に荷電している、または電荷が低減していることを認識することになる。アミノ酸は、アミノ酸の等電点が示す実効電荷に基づいて分離することができる。等電点とは、アミノ酸分子の平均実効電荷がゼロになるｐＨのことである。ｐＨ＞ｐＩの場合、アミノ酸は負の実効電荷を有し、ｐＨ＜ｐＩの場合、アミノ酸は正の実効電荷を有する。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質の測定ｐＩ値は、約３〜９（例えば、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、及び９）及びこの間の任意の値である。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質の測定ｐＩ値は、約４〜７（例えば、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０）及びこの間の任意の値である。例示的なアミノ酸の等電点を、以下の表２に示す。概して、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸としては、例えば、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びリジン（Ｋ）が挙げられる。負に荷電した側鎖を有するアミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）が挙げられる。極性の性質を有するアミノ酸としては、例えば、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、及びシステイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）が挙げられる。非極性のアミノ酸としては、例えば、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、及びプロリン（Ｐ）が挙げられる。
【０１０４】
一部の実施形態では、ＨＢＳ内の点変異には、ＨＢＳ内の１つ以上のリジン（Ｋ）残基の１つ以上の置換が含まれる。例えば、フォリスタチンポリペプチドのＨＢＳにおいて、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５）のリジン残基が別のアミノ酸に対して置換される。ＨＢＳは、ＦＳ３１５の残基７５〜８６に対応するアミノ酸、すなわち残基ＫＫＣＲＭＮＫＫＮＫＰＲを含む。一部の実施形態では、１つ以上の負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸（Ｅ）及び／またはアスパラギン酸（Ｄ）でリジン（Ｋ）アミノ酸を置換することで、組換えフォリスタチンポリペプチドの全体的電荷が変化する（ｐＩシフトとして知られている）。一部の実施形態では、フォリスタチン分子の全体的電荷の変化によって、ｉｎ−ｖｉｖｏのクリアランス及び半減期が改善される。一実施形態では、組換えフォリスタチンポリペプチドの全体的電荷の変化によってｉｎ  ｖｉｖｏのクリアランスが緩速化する。一部の実施形態では、１つ以上の負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸（Ｅ）及び／またはアスパラギン酸（Ｄ）で１つ以上のリジン（Ｋ）アミノ酸を置換することで、組換えフォリスタチン分子の全体的電荷が変化する。一部の実施形態では、１つ以上の負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸（Ｅ）及び／またはアスパラギン酸（Ｄ）でリジン（Ｋ）アミノ酸を置換することで、組換えフォリスタチンポリペプチドの発現中において高分子量種の量が減少する。一部の実施形態では、１つ以上の負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸（Ｅ）及び／またはアスパラギン酸（Ｄ）で１つ以上のリジン（Ｋ）アミノ酸を置換することで、組換えフォリスタチンポリペプチドの発現が増加する。
【表２】
2019509735.tif 000005
【０１０５】
ＦＳは、ミオスタチン及びアクチビンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害し、この阻害がマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで筋肥大をもたらし得ることが示されている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｍａｓｓ  ｂｙ  Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｎｓ，（２０１０），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２４（１０）：１９９８−２００８；Ｇｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｎ，（２００９），Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２９７（１）：Ｅ１５７−Ｅ１６４）。特定の理論に拘泥することは望まないが、観察されたこの作用は、少なくとも部分的には、ＦＳがミオスタチン及びアクチビンによるＳｍａｄ２／３経路の活性化を防止することに起因する可能性がある。Ｓｍａｄ２／３経路の活性化は、筋肉成長に対する負の調整をもたらすことが示されている（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｆｔｅｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，（２０１１），Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１７９（２）：９１５−９３０）。
【０１０６】
典型的な野生型のまたは天然に存在するヒトＦＳ３１５、ＦＳ３０３、及びＦＳ２８８タンパク質のアミノ酸配列を表３に示す。
【表３】
2019509735.tif 000006
【０１０７】
したがって、一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５（配列番号１または配列番号２）である。本明細書で開示する配列番号２は、ヒトフォリスタチンタンパク質の標準アミノ酸配列を示す。一部の実施形態では、フォリスタチンタンパク質は、スプライスアイソフォームまたはタンパク質分解性バリアント、例えばＦＳ３０３（配列番号３または配列番号４）であり得る。一部の実施形態では、フォリスタチンタンパク質は、ＦＳ２８８（配列番号５）のようなスプライスアイソフォームであり得る。一部の実施形態では、好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、野生型または天然に存在するタンパク質の相同体または類似体であり得る。例えば、ヒト野生型または天然に存在するフォリスタチンタンパク質の相同体または類似体は、実質的なフォリスタチンタンパク質活性（例えば、ミオスタチンまたはアクチビンの阻害）を保持しながら、野生型または天然に存在するフォリスタチンタンパク質（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５）と比較して１つ以上のアミノ酸またはドメインの置換、欠失、及び／または挿入を含有し得る。したがって、一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５フォリスタチンタンパク質（配列番号１）に対し実質的に相同である。一部の実施形態では、本発明に適した組換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５（配列番号１）フォリスタチンタンパク質に対し実質的に同一である。一部の実施形態では、本発明に適した組換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０８】
一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５フォリスタチンタンパク質（配列番号２）に対し実質的に相同である。一部の実施形態では、本発明に適した組換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５（配列番号２）フォリスタチンタンパク質に対し実質的に同一である。一部の実施形態では、本発明に適した組換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１０９】
一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３０３フォリスタチンタンパク質（配列番号３）に対し実質的に相同である。一部の実施形態では、本発明に適した組換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３０３（配列番号３）フォリスタチンタンパク質に対し実質的に同一である。一部の実施形態では、本発明に適した組換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１０】
一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３０３フォリスタチンタンパク質（配列番号４）に対し実質的に相同である。一部の実施形態では、本発明に適した組換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３０３（配列番号４）フォリスタチンタンパク質に対し実質的に同一である。一部の実施形態では、本発明に適した組換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１１】
したがって、一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ２８８フォリスタチンタンパク質（配列番号５）に対し実質的に相同である。一部の実施形態では、本発明に適した組換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ２８８（配列番号５）フォリスタチンタンパク質に対し実質的に同一である。一部の実施形態では、本発明に適した組換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１２】
ヒトフォリスタチンタンパク質の相同体または類似体は、当業者に既知のポリペプチド配列変更方法（かかる方法をまとめた参考文献において参照されるものなど）により調製することができる。当業者には理解されるように、２つの配列が対応する位置に相同な残基を有する場合、それらは通例「実質的相同」であると見なされる。相同の残基は、同一残基であってもよい。あるいは、相同な残基は、非同一の残基であってもよく、構造的特徴および／または機能的特徴が適切に類似である。例えば、当業者には周知のとおり、ある特定のアミノ酸は、典型的には「疎水性」または「親水性」アミノ酸として分類され、及び／または一つのアミノ酸の他種のアミノ酸による「極性」または「非極性」側鎖置換を有することは、多くの場合「相同性」置換と見なされ得る。一部の実施形態では、アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。一部の実施形態では、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われる箇所でタンパク質の相対的電荷またはサイズ特性が変更されないアミノ酸置換を意味する。
【０１１３】
当該分野で周知のとおり、アミノ酸配列または核酸配列は様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができ、そのようなアルゴリズムとして、市販のコンピュータープログラムで使用可能なアルゴリズム、例えば、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ギャップＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどが挙げられる。こうしたプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ  Ｍｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９．に記載されている。上述のプログラムは、相同な配列を特定することに加えて、相同性の度合いの表示も提供するのが一般的である。
【０１１４】
一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、野生型のヒトフォリスタチンタンパク質との比較で、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換を含有する。例えば、好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、表４に示すようなアミノ酸の欠失、挿入、及び／または置換を含有し得る。例示的なアミノ酸の欠失、挿入、及び／または置換は、配列番号２に対応するＦＳ３１５において例示される。一部の実施形態では、シグナル配列を含むＦＳ３１５（例えば、配列番号１）、ＦＳ３０３（例えば、配列番号３、配列番号４）、またはＦＳ２８８（例えば、配列番号５）において、対応する位置に同じ欠失、挿入、または置換が存在する可能性がある。
【表４−１】
2019509735.tif 000007
【表４−２】
2019509735.tif 000008
【表４−３】
2019509735.tif 000009
【表４−４】
2019509735.tif 000010
【０１１５】
一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓコンセンサス配列を有するＨＢＳ領域の高グリコシル化変異体を含む。Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓコンセンサスとは、グリコシル化コンセンサス配列モチーフのことであり、Ｘは、Ａｓｎ（Ｎ）とＴｈｒ（Ｔ）との間、またはＡｓｎ（Ｎ）とＳｅｒ（Ｓ）との間のプロリンを除く任意のアミノ酸であり得る。一部の実施形態では、グリコシル化コンセンサス配列マスクの追加によって、ヘパリン結合が障害または防止される。一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、表５に示すアミノ酸配列を含み、これらは野生型ヒトフォリスタチンタンパク質ＦＳ３１５、ＦＳ３０３、及びＦＳ２８８（例えば、配列番号２、配列番号４、または配列番号５）の位置６６〜８８に対応している。一部の実施形態では、高グリコシル化バリアントは改善されたＰＫパラメーターを有する。一部の実施形態では、高グリコシル化バリアントは、ｐＩ（等電点）によって示される電荷の実効的変化を有しない。
【０１１６】
一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチド内のアミノ酸の欠失、挿入、または置換は、ＨＢＳ内にある。一部の実施形態では、アミノ酸の欠失、挿入、または置換は、ＨＢＳの近くにあるか、またはＨＢＳに隣接しており、例えば、ＨＢＳのＮ末端またはＣ末端アミノ酸の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸以内である。理論に拘泥することは望まないが、ＨＢＳ内の、ＨＢＳの近くの、またはＨＢＳに隣接している変化によってヘパリン結合が低減されることが考慮されている。ヘパリン結合の低減によって、組換えタンパク質の薬物動態パラメーター、例えばｉｎ  ｖｉｖｏの血清半減期が改善されることが考慮されている。理論に拘泥することは望まないが、ＨＢＳ内の、ＨＢＳの近くの、またはＨＢＳに隣接している変化によって、免疫原性が低減され、かつ／または組換えタンパク質の発現が増加し得ることも考慮されている。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンの発現増加は、Ｋ７５Ｄ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７６Ｄ、Ｋ７６Ｅ、Ｋ８１Ｄ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８１Ｄ、またはＫ８２ＥのＨＢＳ変異のうちの１つ以上を伴って存在する。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンの発現増加は、Ｋ８２ＥのＨＢＳ変異を伴って存在する。一部の実施形態では、ＨＢＳ内の少なくとも１つのアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）を、正電荷の小さい少なくとも１つのアミノ酸残基で置換することで、組換えフォリスタチンタンパク質によるヘパリン結合が低減され得る。
【０１１７】
一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチド内のアミノ酸置換によって、ヘパリン結合領域内にコンセンサスグリコシル化部位が導入される（例えば、Ｋ８２Ｔ、Ｐ８５Ｔ、Ｒ７８Ｎ／Ｎ８０Ｔ、Ｒ８６Ｎ／Ｖ８８Ｔ、Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２Ｔ、Ｇ７４Ｎ／Ｋ７６Ｓ、Ｇ７４Ｎ／Ｋ７６Ｔ、Ｇ７４Ｎ／Ｋ７６Ｔ／Ｐ８５Ｔ、Ｃ６６Ｓ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ、Ｃ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ  Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｓ／Ｋ８２Ｔ、Ｃ６６Ｓ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｓ、Ｃ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｓ）。後続のアミノ酸グリコシル化がヘパリン結合ドメインをマスクし、それによって組換えタンパク質のヘパリンへの結合が低減されると予測される。グリカンの存在も、置換されたアミノ酸をマスクし、それによって組換えタンパク質によって付与された任意の免疫原性増加が調節されると予想される。高グリコシル化も、組換えタンパク質の溶解性及び／または半減期を改善すると予想される。例示的な高グリコシル化バリアントを表４、５、及び９に示す。
【表５−１】
2019509735.tif 000011
【表５−２】
2019509735.tif 000012
【表５−３】
2019509735.tif 000013
【０１１８】
フォリスタチン融合タンパク質
好適な組換えフォリスタチンタンパク質が融合タンパク質構成となり得ることが考慮されている。例えば、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、フォリスタチンドメインと別のドメインまたは部分との融合タンパク質、典型的には、例えば、フォリスタチンタンパク質の安定性、効力、及び／または送達を強化または増加させることによって、あるいは免疫原性またはクリアランスを低減または消去することによって、フォリスタチンの治療効果を促進し得る、別のドメインまたは部分との融合タンパク質であり得る。このようなフォリスタチン融合タンパク質に好適なドメインまたは部分としては、以下に限定するものではないが、Ｆｃドメイン、ＸＴＥＮドメイン、またはヒトアルブミン融合が挙げられる。
【０１１９】
Ｆｃドメイン
一部の実施形態では、好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ＦｃＲｎ受容体に結合するＦｃドメインまたはその一部を含有する。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、ＩｇＧなどの免疫グロブリンサブクラスに由来し得る。一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来する。一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥに由来する。特に好適なＦｃドメインとしては、ヒト抗体またはヒト化抗体に由来するものが挙げられる。一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、修飾されたヒトＦｃ部分のような修飾されたＦｃ部分である。
【０１２０】
一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、表６に示されるアミノ酸配列を含む。
【表６】
2019509735.tif 000014
【０１２１】
一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同または同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の結合が改善すると組換えタンパク質の血清半減期が延長されることが考慮されている。したがって、一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＦｃＲｎへの結合の改善をもたらす１つ以上のアミノ酸変異を含む。ＦｃＲｎへの結合の改善に影響を及ぼすＦｃドメイン内の様々な変異が当技術分野で知られており、これらを本発明の実施に適合させることができる。一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＥＵナンバリングによる、ヒトＩｇＧ１のＴｈｒ２５０、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｕ３８０、Ｍｅｔ４２８、Ｈｉｓ４３３、及び／またはＡｓｎ４３４に対応する１つ以上の位置に１つ以上の変異を含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＥＵナンバリングによる、ヒトＩｇＧ１のＬ２３４、Ｌ２３５、Ｈ４３３、及びＮ４３４に対応する１つ以上の位置に１つ以上の変異を含む。
【０１２４】
組換え融合タンパク質のＦｃ部分は、炎症促進性作用をもたらすＦｃ受容体の発現細胞の標的化をもたらし得る。Ｆｃドメインにおけるいくつかの変異は、組換えタンパク質のＦｃガンマ受容体との結合を低減することによってエフェクター機能を阻害する。一実施形態では、エフェクター機能とは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のことである。例えば、好適なＦｃドメインは、Ｌ２３４Ａ（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ）及び／またはＬ２３５Ａ（Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）（ＥＵナンバリング）の変異を含有し得る。一部の実施形態では、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異は、ＬＡＬＡ変異とも呼ばれる。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＥＵナンバリング）の変異を含有し得る。Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を含む例示的なＦｃドメイン配列は、表６の配列番号７に示されている。
【０１２５】
一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、Ｈ４３３Ｋ（Ｈｉｓ４３３Ｌｙｓ）、及び／またはＮ４３４Ｆ（Ａｓｎ４３４Ｐｈｅ）（ＥＵナンバリング）の変異を含有し得る。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ（ＥＵナンバリング）の変異を含有し得る。一部の実施形態では、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ変異は、ＮＨａｎｃｅ変異とも呼ばれる。Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ変異を組み込んでいる例示的なＦｃドメイン配列は、表６の配列番号８に示されている。
【０１２６】
一部の実施形態では、好適なＦｃドメインは、Ｌ２３４Ａ（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ）、Ｌ２３５Ａ（Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）、Ｈ４３３Ｋ（Ｈｉｓ４３３Ｌｙｓ）、及び／またはＮ４３４Ｆ（Ａｓｎ４３４Ｐｈｅ）（ＥＵナンバリング）の変異を含有し得る。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ４３３Ｋ、及びＮ４３４Ｆ（ＥＵナンバリング）の変異を含有し得る。Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ４３３Ｋ、及びＮ４３４Ｆ変異を組み込んでいる例示的なＦｃドメイン配列は、表６の配列番号９に示されている。
【０１２７】
Ｆｃドメインに含まれ得る追加的なアミノ酸置換としては、例えば、米国特許第６，２７７，３７５号、同第８，０１２，４７６号、及び同第８，１６３，８８１号に記載のものが挙げられ、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
リンカーまたはスペーサー
フォリスタチンドメインは、直接的または間接的にＦｃドメインに連結していてもよい。一部の実施形態では、好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、フォリスタチンドメイン及びＦｃドメインを連結するリンカーまたはスペーサーを含有する。アミノ酸のリンカーまたはスペーサーは、概して、柔軟であるように、またはアルファヘリックスなどの構造を２つのタンパク質部分の間に挿入するように設計されている。リンカーまたはスペーサーは、比較的短くてもよく、あるいは長くてもよい。典型的には、リンカーまたはスペーサーは、例えば、３〜１００（例えば、５〜１００、１０〜１００、２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００、５〜５５、１０〜５０、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０）のアミノ酸長を含有する。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸長と同じであるかそれ以上長い。典型的には、長いリンカーは、立体障害を減少させ得る。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン及びセリン残基の混合物を含むことになる。一部の実施形態では、当該リンカーはさらに、スレオニン、プロリン、及び／またはアラニン残基を含み得る。したがって、一部の実施形態では、当該リンカーは、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５アミノ酸を含む。様々な実施形態において、当該リンカーは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５アミノ酸を含む。一部の実施形態では、当該リンカーは、ＡＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号６８）からなるリンカーではない。
【０１２９】
非限定的な例として、本発明に好適なリンカーまたはスペーサーとしては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：
GGG（配列番号６９）
GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP  （ＧＡＧリンカー、配列番号７０）；GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP  （ＧＡＧ２リンカー、配列番号７１）；及びGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP  （ＧＡＧ３リンカー、配列番号７２）。
【０１３０】
好適なリンカーまたはスペーサーとしては、上記の例示的なリンカー、例えば、ＧＡＧリンカー（配列番号７０）、ＧＡＧ２リンカー（配列番号７１）、またはＧＡＧ３リンカー（配列番号７２）に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同または同一であるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。一部の実施形態と共に使用するのが好適なさらなるリンカーは、２０１２年３月２日に出願されたＵＳ２０１２０２３２０２１に見いだすことができ、当該出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドの同種リガンド（例えば、アクチビンＡ、ミオスタチン、ヘパリンなど）のいずれかに対する結合能に実質的に影響を及ぼさずにフォリスタチンポリペプチドとＦｃドメインを関連付けるリンカーが提供される。一部の実施形態では、リンカーは、フォリスタチンポリペプチド単体と比較してフォリスタチンポリペプチドとヘパリンとの結合が変質しないように提供される。
【０１３１】
例示的なフォリスタチン融合タンパク質
特定の実施形態では、好適な組換えフォリスタチン融合タンパク質にはフォリスタチンポリペプチド及びＦｃドメインが含まれ、フォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトＦＳ３１５タンパク質（配列番号１または配列番号２）、ＦＳ３０３タンパク質（配列番号３または配列番号４）、またはＦＳ２８８（配列番号５）に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、好適な組換えフォリスタチン融合タンパク質にはフォリスタチンポリペプチド、Ｆｃドメイン、及びフォリスタチンポリペプチドをＦｃドメインと関連付けるリンカーが含まれ、フォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトＦＳ３１５タンパク質（配列番号１）またはＦＳ３１５（配列番号２）に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。典型的には、好適な組換えフォリスタチン融合タンパク質は、アクチビンＡ及びミオスタチンに結合可能である。一部の実施形態では、好適な組換えフォリスタチン融合タンパク質は、約０．５日〜６日（例えば、約０．５日〜５．５日、約０．５日〜５日、約１日〜５日、約１．５日〜５日、約１．５日〜４．５日、約１．５日〜４．０日、約１．５日〜３．５日、約１．５日〜３日、約１．５日〜２．５日、約２日〜６日、約２日〜５．５日、約２日〜５日、約２日〜４．５日、約２日〜４日、約２日〜３．５日、約２日〜３日）の範囲のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。一部の実施形態では、好適な組換えフォリスタチン融合タンパク質は、約２日〜１０日の範囲（例えば約２．５日〜１０日、約３日〜１０日、約３．５日〜１０日、約４日〜１０日、約４．５日〜１０日、約５日〜１０日、約３日〜８日、約３．５日〜８日、約４日〜８日、約４．５日〜８日、約５日〜８日、約３日〜６日、約３．５日〜６日、約４日〜６日、約４．５日〜６日、約５日〜６日の範囲）のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。
【０１３２】
非限定的な例として、好適なフォリスタチンＦｃ融合タンパク質は、表７に示すアミノ酸配列を有し得る。
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【０１３３】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ＦＳ３１５Ｋ（８１，８２）Ａ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（８１，８２）Ａ−ＧＧＧ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ａ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３０３Ｋ（７６，８１，８２）Ａ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ａ−ＧＧＧ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３０３Ｋ（７６，８１，８２）Ａ−ＧＧＧ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ８２Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３０３Ｋ８２Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ８２Ｔ−ＧＧＧ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３０３Ｋ８２Ｔ−ＧＧＧ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ／Ｖ８８Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５ＷＴ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７５，７６）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８２）Ｄ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｒ８６Ｎ／Ｖ８８Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｓ／Ｋ８２Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５  ｄｅｌ７５−８６−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（８１，８２）Ｄ−ｈＦｃＬＡＬＡ  ＦＳ３１５Ｋ８２Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｄ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｒ７８Ｎ／Ｎ８０Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｐ８５Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡまたはＦＳ３１５Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｎ／Ｋ８２Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡと称され得る。
【０１３４】
フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質がホモダイマーまたはモノマー構成を含めた様々な構成で提供され得ることが考慮されている。例えば、好適なホモダイマー構成は、融合パートナーのＣ末端（例えば、フォリスタチンポリペプチド及びリンカー）が両方のポリペプチド鎖のＮ末端に付着しているように設計され得る。好適なモノマー構成は、融合パートナーのＣ末端（例えば、フォリスタチンポリペプチド及びリンカー）が１つのＦｃダイマーまたは１つのＦｃモノマーに融合しているように設計され得る。モノマー構成は、立体障害を減少させ得る。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、本明細書において特定される参照タンパク質配列（例えば、参照フォリスタチンタンパク質配列）に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、それらの配列を整列させ、必要であればギャップを導入して配列同一性の最大パーセントを達成した後の、参照配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義され、配列同一性の一部としての任意の保存的置換を考慮していない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術範囲内にある種々の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの公開されている入手可能なコンピューターソフトウエアを用いて実現することができる。当業者であれば、比較する配列の完全長にわたる最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを評価するための適切なパラメーターを決定することができる。好ましくは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ソフトウエアを用いてアミノ酸配列同一性を算出する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６，４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、複数の検索パラメーターを使用するが、そのほとんどがデフォルト値に設定される。調整可能なパラメーターは次の値に設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワールド閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰスコア（Ｓ）及びＨＳＰ  Ｓ２パラメーターは動的値であり、特定配列の組成に応じてプログラム自体によって確定されるが、最小値は調節可能であり、上述のとおりに設定される。
【０１３６】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ミオスタチンの結合及び／または活性を阻害する。一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ミオスタチンに結合したときに、約０．１ｐＭより大きい、約０．５ｐＭより大きい、約１ｐＭより大きい、約５ｐＭより大きい、約１０ｐＭより大きい、約５０ｐＭより大きい、約１００ｐＭより大きい、約５００ｐＭより大きい、または約１０００ｐＭより大きいＫＤを有する。組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイなどの表面プラズモン共鳴アッセイで測定され得る。
【０１３７】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンＡの結合及び／または活性を阻害する。一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンＡに結合したときに、約０．１ｐＭより大きい、約０．５ｐＭより大きい、約１ｐＭより大きい、約５ｐＭより大きい、約１０ｐＭより大きい、約５０ｐＭより大きい、約１００ｐＭより大きい、約５００ｐＭより大きい、または約１０００ｐＭより大きいＫＤを有する。組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイなどの表面プラズモン共鳴アッセイで測定され得る。
【０１３８】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、野生型のフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のヘパリンに対する結合親和性と比較してヘパリンに対する結合親和性が低減している。一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ヘパリンに結合したときに、約０．０１ｎＭより大きい、約０．０５ｎＭより大きい、約０．１ｎＭより大きい、約０．５ｎＭより大きい、約１ｎＭより大きい、約５ｎＭより大きい、約１０ｎＭより大きい、約５０ｎＭより大きい、または約１００ｎＭより大きい、約１５０ｎＭより大きい、約２００ｎＭより大きい、約２５０ｎＭより大きい、または約５００ｎＭより大きいＫＤを有する。
【０１３９】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ受容体に結合したときに、約１ｎＭより大きい、約５ｎＭより大きい、約１０ｎＭより大きい、約５０ｎＭより大きい、または約１００ｎＭより大きい、または約５００ｎＭより大きい、または約１０００ｎＭより大きいＫＤを有する。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体とは、Ｆｃγ受容体のことである。一部の実施形態では、Ｆｃγ受容体とは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、またはＦＣγＲＩＩＩＢのことである。
【０１４０】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ＢＭＰ−９に対する結合が最小限または認識できない程度である。一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ＢＭＰ−１０の結合が最小限または認識できない程度である。一部の実施形態では、この最小限または認識できない程度の結合は、１９０ｐＭ〜２５０００ｐＭの範囲で決定される。
【０１４１】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ミオスタチン刺激アッセイにおいて、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ，未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．２５ｎＭ未満、約０．１ｎＭ未満、約０．０５ｎＭ未満、または約０．０１ｎＭのＩＣ５０によって特徴づけられる。
【０１４２】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンＡ刺激アッセイにおいて、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ，未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．２５ｎＭ未満、約０．１ｎＭ未満、約０．０５ｎＭ未満、または約０．０１ｎＭのＩＣ５０によって特徴づけられる。
【０１４３】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質投与が、ｉｎ  ｖｉｖｏで対照に比べての筋肉の質量増加をもたらす。一部の実施形態では、筋肉の質量とは、例えば筋肉の重量のことである。一部の実施形態では、当該筋肉は、１つ以上の骨格筋であり、例えば表１に示される骨格筋である。一部の実施形態では、当該筋肉は、横隔膜、三頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、腓腹筋、長指伸筋、腹直筋、四頭筋、及びその組合せからなる群から選択される。
【０１４４】
組換えフォリスタチンまたは組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の生成
本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、任意の利用可能な手段によって生成することができる。例えば、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を発現するように遺伝子操作された宿主細胞系を利用して、組換え生成することができる。代替または追加として、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、内在性遺伝子によって生成することができる。代替または追加として、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、化学合成によって部分的または完全に調製することができる。
【０１４５】
タンパク質が組換え生成される場合、任意の発現系を用いることができる。いくつか例を挙げると、既知の発現系として、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、卵、バキュロウイルス、植物、酵母、または、例えばＣＨＯ細胞及び／または以下に記載の他の哺乳類の細胞などの哺乳類の細胞が挙げられる。
【０１４６】
一部の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、哺乳類細胞内で生成される。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の非限定的な例として、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ社、オランダ、ライデン）；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養での増殖用にサブクローンされたＨＥＫ２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９，１９７７）；ヒト線維肉腫細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ２１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６，１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８，１９８２）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。
【０１４７】
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト細胞またはヒト細胞から生成した組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＣＨＯ細胞またはＨＴ１０８０細胞から生成した組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【０１４８】
典型的には、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を発現するように遺伝子操作された細胞は、本明細書に記載の組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含むことができる。組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸は、調節配列、遺伝子制御配列、プロモーター、非コード配列、及び／または組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を発現するのに適正な他の配列を含むことができると理解されるべきである。典型的には、コード領域は、これらの核酸成分のうちの１つ以上と作用可能に連結している。
【０１４９】
導入遺伝子のコード領域は、特定の細胞型に対するコドン使用頻度を最適化するように１つ以上のサイレント変異を含んでいてもよい。例えば、フォリスタチン導入遺伝子のコドンは、脊椎動物細胞での発現向けに最適化されていてもよい。一部の実施形態では、フォリスタチン導入遺伝子のコドンは、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞での発現向け最適化され得る。一部の実施形態では、フォリスタチン導入遺伝子のコドンは、ヒト細胞での発現向けに最適化され得る。
【０１５０】
医薬組成物及び投与
本発明はさらに、本発明に従った治療活性を有する成分（例えば、組換えフォリスタチンタンパク質、または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質）を、１つ以上の医薬的に許容される担体または添加剤と共に含む、医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、任意選択により１つ以上の追加の治療活性を有する物質を含むことができる。
【０１５１】
本明細書で提供される医薬組成物の説明は、主として、人に対する倫理的投与に好適な医薬組成物を対象としているが、当業者であれば、このような組成物があらゆる種類の動物への投与にも広く適していることが理解されよう。ヒトへの投与に好適な医薬組成物を、様々な動物への投与に好適にするために修飾を行うことは十分理解されており、通常の技量を有する獣医薬理学者は、このような修飾を、（行う場合は）ごく普通の実験を用いて、設計及び／または実施することができる。
【０１５２】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で知られているまたは今後開発される任意の方法によって、調製することができる。概して、このような調製方法は、活性成分を、希釈剤または別の添加剤または担体及び／または１つ以上の補助的成分と関連付けるステップと、次に必要及び／または所望に応じて、生成物を所望の単回または多回用量単位に成形及び／またはパッケージングするステップとを含む。
【０１５３】
本発明による医薬組成物は、単回単位用量として、及び／または複数の単回単位用量として、大量に調製し、パッケージングし、かつ／または販売することができる。本明細書で使用する「単位用量」とは、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別的な量のことである。活性成分の量は、対象に投与されると考えられる活性成分の投薬量及び／またはこのような投薬量の好都合な画分（例えば、このような投薬量の半分または１／３）に概ね等しい。
【０１５４】
活性成分、医薬的に許容される添加剤もしくは担体、及び／または本発明による医薬組成物中の任意のさらなる成分の相対量は、独自性、サイズ、及び／または治療する対象の状態に応じて、また当該組成物を投与する経路に応じて変動することになる。例として、当該組成物は、０．１％から１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０１５５】
医薬製剤は医薬的に許容される添加剤または担体をさらに含んでもよく、本明細書で使用される場合、このような添加剤または担体には、特定の所望の剤形に適した任意及び全ての溶媒、分散媒体、希釈剤、もしくは他の液体ビヒクル、分散体もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存料、固体結合剤、滑沢剤などが含まれる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６；参照により本明細書に組み込まれる）は、医薬組成物の製剤化に使用される様々な添加剤及びその調製のための既知の技法を開示している。任意の従来的な添加剤媒体または担体が、例えば任意の所望でない生物学的影響をもたらすか、または有害な様式で任意の他の医薬組成物の構成要素と相互作用することによって、物質またはその誘導体に不適合である場合を除き、その用途は本発明の範囲内であるように考慮されている。
【０１５６】
一部の実施形態では、医薬的に許容される添加剤または担体は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の純度である。一部の実施形態では、添加剤または担体は、ヒトにおける使用及び獣医学的使用が認可されている。一部の実施形態では、添加剤または担体は、米国食品医薬品局によって認可されている。一部の実施形態では、添加剤または担体は、医薬品グレードである。一部の実施形態では、添加剤または担体は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、及び／または国際薬局方の基準を満たしている。
【０１５７】
医薬組成物の製造で使用される医薬的に許容される添加剤または担体としては、以下に限定するものではないが、不活性希釈剤、分散剤及び／または造粒剤、界面活性剤及び／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存料、緩衝剤、滑沢剤、及び／または油が挙げられる。このような添加剤または担体は、任意選択により医薬製剤に含めることができる。ココアバター及び座薬ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、及び／または着香剤などの添加剤または担体は、処方者の判断に応じて当該組成物中に存在してもよい。
【０１５８】
好適な医薬的に許容される担体としては、以下に限定するものではないが、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、食塩水、緩衝食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロース、またはデンプンなど）、糖（マンニトール、スクロース、またはその他など）、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、及びこれらの組合せが挙げられる。医薬製剤は、所望に応じて、活性化合物と有害な反応を起こさないか、またはそれらの活性を妨げない助剤（例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩類、緩衝剤、着色料、香味料、及び／または芳香剤など）と混合され得る。好ましい実施形態では、静脈内投与に適した水溶性担体が用いられる。
【０１５９】
所望に応じて、好適な医薬組成物または薬剤は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉末であり得る。組成物はまた、従来の結合剤及び担体（トリグリセリドなど）を用いて座薬としても製剤化され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。
【０１６０】
医薬組成物または薬剤は、ヒトに対する投与に適した医薬組成物として、慣行的な手順に従って製剤化され得る。例えば、一部の実施形態では、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝溶液であるのが典型的である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位の痛みを軽減するための局所麻酔薬を含んでもよい。一般的に、成分は、例えば凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、活性作用剤の量を提示するアンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密封容器に、別々に、または単位剤形の形態で混合されて供給される。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌医薬品グレードの水、食塩水、またはデキストロース／水を含有する注入瓶を用いて調剤することができる。組成物を注射によって投与する場合、注射用の無菌水か、または食塩水のアンプルを供給することができ、投与に先立って成分を混合できるようにする。
【０１６１】
本明細書に記載の組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、中性形態または塩形態で製剤化することができる。医薬的に許容される塩として、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、その他の由来の塩などの遊離アミノ基で形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、その他の由来の塩などの遊離カルボキシル基で形成される塩が挙げられる。  
【０１６２】
製剤化及び／または医薬品製造における一般考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に組み込まれる）で見いだされ得る。
【０１６３】
投与経路
本明細書に記載の組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質（または本明細書に記載の組換えフォリスタチンタンパク質を含有する組成物もしくは薬剤）は、任意の適切な経路により投与される。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質、またはそれを含有する医薬組成物は、全身に投与される。全身投与は、静脈内、皮内、吸入、経皮（局所的）、眼内、筋肉内、皮下、筋肉内、経口、及び／または経粘膜的投与であり得る。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質、またはそれを含有する医薬組成物は、皮下に投与される。本明細書で使用する「皮下組織」という用語は、皮膚直下の疎性不規則性結合組織の層として定義される。例えば、皮下投与は、組成物を、以下に限定されないが、大腿部、腹部、殿部、または肩甲部を含めた領域に注射することによって行われ得る。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質、またはそれを含有する医薬組成物は、静脈内に投与される。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質、またはそれを含有する医薬組成物は、経口的に投与される。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質、またはそれを含有する医薬組成物は、筋肉内に投与される。例えば、筋肉内投与は、組成物を、以下に限定されないが、大腿部、腹部、殿部、肩甲部の筋肉、または表１に開示される任意の筋肉を含めた領域に注射することによって行われ得る。所望の場合には、２つ以上の経路を同時に用いることができる。
【０１６４】
一部の実施形態では、投与により個体において単に局所的効果を得るだけであるが、他の実施形態では、投与により個体の複数の部位にわたる効果（例えば、全身効果）を得る。通常は、投与により、１つ以上の標的組織に対する組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の送達がもたらされる。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、以下に限定されないが、心臓、脳、脊髄、横紋筋（例えば、骨格筋）、平滑筋、腎臓、肝臓、肺、及び／または脾臓を含めた１つ以上の標的組織に送達される。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、心臓に送達される。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、横紋筋、特に骨格筋に送達される。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、三頭筋、前脛骨筋、ヒラメ筋、腓腹筋、二頭筋、僧帽筋、三角筋、四頭筋、及び／または横隔膜に送達される。
【０１６５】
剤形及び投与レジメン
一部の実施形態では、組成物の投与は、治療有効量で、かつ／または、特定の望ましい結果（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーの治療またはリスクの低減）と相関性のある投与レジメンに従って、行われる。
【０１６６】
本発明に従って投与される特定の用量または量は様々であり、例えば、所望の結果の性質及び／もしくは程度、投与経路及び／もしくはタイミングの詳細、ならびに／または１つ以上の特徴（例えば、体重、年齢、個人歴、遺伝的特徴、ライフスタイルパラメーター、心臓障害の重症度、及び／もしくは心臓障害のリスクレベルなど、またはそれらの組合せ）に依存する。こうした用量または量は、当業者によって決定され得る。一部の実施形態では、適正な用量または量は、標準的な臨床技術に従って決定される。別の方法として、または加えて、一部の実施形態では、適正な用量または量は、所望のまたは至適な投与用量範囲または量を特定するのに役立つ１つ以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを通して決定される。
【０１６７】
種々の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は治療有効量で投与される。一般に、治療有効量は、対象に対して意義のある利益を得る（例えば、基礎疾患または症状を治療する、調節する、治癒する、予防する、及び／または寛解させる）のに十分な量である。特定の一部の実施形態では、適正な投与用量または投与量を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル評価系由来の用量反応曲線から外挿することができる。
【０１６８】
一部の実施形態では、提供された組成物は医薬製剤として提供される。一部の実施形態では、医薬製剤は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーの発症率またはリスクの低減を達成することと相関性のある投与レジメンに従って投与するための単位用量であるか、またはこのような単位用量を含む。
【０１６９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を含む製剤は、単回用量として投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載の組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を含む製剤は、規則的間隔で投与される。本明細書で使用する「間隔」での投与は、治療有効量が周期的（１回限りの投与とは区別される）に投与されることを示している。間隔は、標準的な臨床技術で決定され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を含む製剤は、隔月、毎月、月２回、３週間毎、隔週、毎週、週２回、週３回、毎日、１日２回、または６時間毎に投与される。単一個体に対する投与間隔は、一定の間隔である必要はなく、個体の必要性に応じて経時的に変動する可能性がある。
【０１７０】
本明細書で使用する「隔月」という用語は２か月に１回（すなわち、２か月毎に一回）の投与を意味し、用語「毎月」は１か月に１回の投与を意味し、用語「３週間毎」は３週間に１回（すなわち３週間毎に１回）の投与を意味し、用語「隔週」は２週間に１回（すなわち、２週間毎に１回）の投与を意味し、用語「毎週」は週に１回の投与を意味し、用語「毎日」は１日に１回の投与を意味する。
【０１７１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を含む製剤は、無期限に規則的間隔で投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載の組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を含む製剤は、決められた期間の間、規則的間隔で投与される。
【０１７２】
本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、主として、本発明の医薬組成物に含まれる治療剤の総量に基づいて決定される。治療有効量は、一般的に、複数単位用量が含まれ得る投与レジメンで投与される。任意の特定の組成物に関して、治療有効量（及び／または有効投与レジメン内での適正な単位用量）は、例えば、投与経路、他の医薬作用剤との組合せに応じて変動し得る。
【０１７３】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の投与は、少なくとも１つのＤＭＤの徴候または症状における強度、重症度、または頻度を低減し、あるいはその発症を遅延させる。一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の投与は、筋消耗、骨格変形、心筋症、筋虚血、認知障害、及び呼吸機能障害からなる群から選択される、少なくとも１つのＤＭＤの徴候または症状における強度、重症度、または頻度を低減し、あるいはその発症を遅延させる。
【０１７４】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、６分歩行試験、定量的筋強度試験、時間運動パフォーマンス試験（ｔｉｍｅｄ  ｍｏｔｏｒ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｔｅｓｔ）によって測定される臨床的結果を改善する。Ｂｒｏｏｋｅ及びＶｉｇｎｏｓの四肢機能尺度、肺機能試験（努力肺活量、１秒量、最大呼気流量、最大吸気圧及び最大呼気圧）、健康関連のクオリティーオブライフ、膝及び肘の屈筋、肘の伸筋、肩の外転、握力、仰臥位から起きる時間、ノーススター（Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒｔ）歩行評価、時間１０メートル歩行／走行、Ｅｇｅｎ−Ｋｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ尺度、ガウアーズスコア、ハマースミス運動能力、ハンドヘルド筋収縮測定、可動域、角度測定、高炭酸、ベイリー（Ｎａｙｌｅｙ）乳幼児発達スケール、及び／または介護者負担尺度。
【０１７５】
併用療法
一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、筋ジストロフィーの治療に現在用いられている１つ以上の既知の治療剤（例えば、コルチコステロイド）と併用して投与される。一部の実施形態では、既知の治療剤は、その標準的もしくは承認済投与レジメン及び／またはスケジュールに従って投与される。一部の実施形態では、既知の治療剤は、その標準的もしくは承認済投与レジメン及び／またはスケジュールと比較して変更されたレジメンに従って投与される。一部の実施形態では、こうした変更されたレジメンは、１つ以上の単位用量が異なる（例えば減少または増加）という点で、及び／または投与頻度が異なるという点で（例えば、単位投与間の１つ以上の間隔を長くして低頻度にするか、または間隔を短くして高頻度にしているという点で）、標準的または承認済投与レジメンとは異なっている。
【０１７６】
一部の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質または組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、当該さらなる治療剤は、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）である。別の実施形態では、当該さらなる治療剤は、グルココルチコイド（例えば、デフラザコート）である。別の実施形態では、当該さらなる治療剤は、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態では、当該さらなる治療剤は、ＲＮＡ調節療法である。ＲＮＡ調節療法は、エクソンスキッピング療法または遺伝子療法であり得る。ＲＮＡ調節療法は、例えば、Ｄｒｉｓｐｅｒｓｅｎ、ＣＡＴ−１００４、ＦＧ３０１９、ＰＲＯ０４４、ＰＲＯ０４５、Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ（ＡＶＩ−４６５８）、ＳＲＰ−４０５３、ＳＲＰ−４０４５、ＳＲＰ−４０５０、ＳＲＰ−４０４４、ＳＲＰ−４０５２、ＳＲＰ−４０５５、またはＳＲＰ−４００８であり得る。一部の実施形態では、当該さらなる治療剤は、筋ジストロフィーの治療に現在使用されている。他の実施形態では、当該さらなる治療剤は、他の疾患または障害の治療にも使用され得る。一部の実施形態では、既知の治療剤は、その標準的もしくは承認済投与レジメン及び／またはスケジュールに従って投与される。一部の実施形態では、既知の治療剤は、その標準的もしくは承認済投与レジメン及び／またはスケジュールと比較して変更されたレジメンに従って投与される。一部の実施形態では、こうした変更されたレジメンは、１つ以上の単位用量が異なる（例えば減少または増加）という点で、及び／または投与頻度が異なるという点で（例えば、単位投与間の１つ以上の間隔を長くして低頻度にするか、または間隔を短くして高頻度にしているという点で）、標準的または承認済投与レジメンとは異なっている。
【実施例】
【０１７７】
実施例１．フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質によるミオスタチンの標的化
本実施例は、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の標的リガンド及び非標的リガンドに対する結合を例示する。理論に拘泥することは望まないが、ミオスタチン及びアクチビンＡのＳｍａｄ２／３経路活性化が筋原性のタンパク質発現の阻害につながり、結果的に筋芽細胞が筋肉に分化しないことが考慮されている。そのため、ミオスタチン及びアクチビンＡは、筋肉再生刺激のための有力な標的と考えられる。しかし、ある特定の構造的類似性により、多くのミオスタチン及びアクチビンＡアンタゴニスト（例えば、可溶性のアクチビン受容体ＩＩＢ型（ｓＡｃｔＲＩＩＢ））は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）にも結合する。ＢＭＰ、特にＢＭＰ−９及びＢＭＰ−１０は、全身における組織構造を編成する中心的な形成シグナルと考えられている。このようなＢＭＰを阻害することで、望ましくない病態がもたらされる恐れがある。また、フォリスタチンは、３つのＦＳドメインのうち１番目の塩基性ヘパリン結合配列（ＨＢＳ）を通じて細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンにも結合する。理論に拘泥することは望まないが、例えば、ＨＢＳの変異または欠失によるヘパリン結合の不活性化、低減、または調節は、フォリスタチン及び／またはフォリスタチン融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ曝露及び／または半減期を増加する可能性がある。以下で詳細に説明するように、本実施例に記載される実験データは、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質が高い親和性でミオスタチンを特異的に標的化し、非標的のＢＭＰやヘパリンに対しては意味のある親和性で結合しないことを裏付けるものである。
【０１７８】
具体的には、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ及び以下で説明される標準的な方法を用いて、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のミオスタチン、アクチビンＡ、ヘパリン、ＢＭＰ−９、及びＢＭＰ−１０に対する結合親和性（ＫＤ）及び動態を評価した。
【０１７９】
ミオスタチンに対する結合親和性及び動態を測定するため、抗ヒトＦｃ（ＧＥ、カタログ番号ＢＲ−１００８−３９）をＣＭ５チップの２つのフローセルに４２０秒間、１０μｌ／分の流量で固定した。ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ＋とした。全ての試料及び対照をランニング緩衝液を用いて１０μｇ／ｍＬに希釈した。ミオスタチン（４ｍＭのＨＣｌ中０．１ｍｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号７８８−Ｇ８−０１０／ＣＦ）を２５ｋＤａの分子量に基づいて０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、及び５ｎＭに希釈した。５０μＬ／分の流量における８秒間のキャプチャー設定、５０μＬ／分の流量における３００秒間の会合、及び５０μＬ／分の流量における１２００秒間の解離でアッセイを実施し、次に３ＭのＭｇＣｌ２を用いて６０μＬ／分の流量で３０秒間再生成した。
【０１８０】
アクチビンＡに対する結合親和性及び動態を測定するため、抗ヒトＦｃ（ＧＥ、カタログ番号ＢＲ−１００８−３９）をＣＭ５チップの２つのフローセルに４２０秒間、１０μｌ／分の流量で固定した。ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ＋とした。全ての試料及び対照をランニング緩衝液を用いて１０μｇ／ｍＬに希釈した。アクチビンＡ（４ｍＭのＨＣｌ中０．１ｍｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３３８−ＡＣ−０５０／ＣＦ）を２６ｋＤａの分子量を用いて０．１５６、０．３１２５、０．６２５、１．２５、及び２．５ｎＭに希釈した。
【０１８１】
ヘパリンの結合親和性及び動態を測定するため、アッセイ当日にビオチン化ヘパリンを１ｍｇ／ｍＬで調製し、次にＨＢＳ＋Ｎ中で１００μｇ／ｍＬに希釈した。ＨＢＳ＋Ｎ緩衝液を用いて１００μｇ／ｍＬ、５μｌ／分で５分間固定することにより、ストレプトアビジンチップフローセルを準備した。試料をＨＢＳ−ＥＰ中で０．３１ｎＭ〜２５ｎＭの濃度に希釈した。３０μＬ／分の流量で３００秒間の会合時間、及び３００秒間の解離時間を用いてアッセイを実施し、次に再生成を４ＭのＮａＣｌで３０秒間行い、その直後、第２の再生成を４ＭのＮａＣｌで３０秒間行った。
【０１８２】
ＢＭＰ−９及び／またはＢＭＰ−１０の結合親和性及び動態を測定するため、ＣＭ５チップ上でおよそ６０００〜９０００ＲＵで抗ヒトＦｃをＦＣ３及びＦＣ４に結合した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質（（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３３９−ＲＢＢ−１００）をＢＭＰ−９及びＢＭＰ−１０への結合の陽性対照として使用した。ＢＭＰ−９結合の分析のため、全ての試料を２．５μｇ／ｍＬに希釈し、ランニング緩衝液はＨＢＳ＋ＥＰとした。ＢＭＰ−１０結合の分析のため、全ての試料を５μｇ／ｍＬに希釈し、ランニング緩衝液はＨＢＳ＋ＥＰ＋０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡとした。分析条件には、１８０秒の接触時間、３００秒の解離時間、及び３０μＬ／分の流量が含まれる。ＢＭＰ−９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３２０９−ＢＰ−０１０ＣＦ）及びＢＭＰ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９２６−ＢＰ−０２５ＣＦ）を３倍の段階希釈で２５ｎＭ〜０．１９ｎＭに希釈した。例示的な結果を表８に示す。
【表８−１】
2019509735.tif 000022
【表８−２】
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【０１８３】
表８に示すように、フォリスタチン融合タンパク質は高い親和性でミオスタチンに結合するが、ＢＭＰ−９及び／またはＢＭＰ−１０には結合しない。フォリスタチン融合タンパク質のＢＭＰ−１０に対する結合を試験する研究では、試験範囲（２５０００〜１９０ｐＭ）における動態定数が決定されなかった。これは、最も弱いミオスタチン結合ＫＤよりもおよそ４３０倍高い結合親和性を説明するものである。フォリスタチン融合タンパク質のＢＭＰ−９に対する結合を試験する研究では、試験範囲（２５０００〜１９０ｐＭ）における動態定数が決定されなかった。これは、最も弱いミオスタチン結合ＫＤよりもおよそ１４００倍高い結合親和性を説明するものである。
【０１８４】
実施例２．フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃＲｎ受容体に対する結合
Ｆｃドメインにおけるいくつかの変異は、ＦｃＲｎ受容体との結合を低減し、それによってｉｎ  ｖｉｖｏの血清半減期を有することにつながる。標準的な方法を用いて、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃＲｎ受容体に対する結合親和性を評価した。例示的な結果を表９に示す。
【表９】
2019509735.tif 000024
【０１８５】
Ｆｃドメインにおけるいくつかの変異は、ＦｃガンマＩＡ受容体との結合を低減し、それによってエフェクター機能の低減を有することにつながる。標準的な方法を用いて、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃガンマＩＡ受容体に対する結合親和性を評価した。標準的な方法を用いて、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃガンマＩＡ受容体に対する結合親和性を評価した。
【０１８６】
Ｆｃガンマ受容体ＩＡの結合親和性を測定するため、フォリスタチン−Ｆｃタンパク質を酢酸ナトリウムｐＨ５．０中で２．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＣＭ５チップ上に約１５０ＲＵで固定した。Ｆｃガンマ受容体ＲＩＡをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから凍結乾燥ストックとして購入した（カタログ番号１２５７−ＦＣ−０５０）。Ｆｃガンマ受容体ＩＡの分析については、ランニング緩衝液はＨＢＳ−Ｐ＋とした。分析条件には、１８０秒の接触時間、６００秒の解離時間、及び３０μＬ／分の流量が含まれる。再生成条件は、１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ２．５、５００ｍＭのＮａＣｌをで１０秒間、３０μＬ／分において３０秒の安定性とした。Ｆｃガンマ受容体ＩＡを６２．５ｎＭ〜０．４９ｎＭに希釈した。例示的な結果を表１０に示す。
【表１０】
2019509735.tif 000025
【０１８７】
実施例３．フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質における血清半減期の延長
フォリスタチンは、短い血清半減期を有することが報告されている。例えば、典型的な市販品ＦＳ３１５タンパク質における血清半減期は約１時間である。本実施例において、図１Ａ、図１Ｂ、及び表１１に示す様々な変異を含むフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を測定した結果、比較タンパク質と比較して血清半減期が顕著に延長していた。
【０１８８】
具体的には、ＣＤ−１マウスに対し、表１１に示す用量で個別のフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を静脈内投与した。投与後、様々な時点でフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の血清レベルを収集した（図１Ａ及び図１Ｂ）。組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期は４５．７〜１９４時間の範囲であった。
【表１１】
2019509735.tif 000026
【０１８９】
実施例４．フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質によるミオスタチン及びアクチビンＡの阻害
ルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイを用いて、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のミオスタチン及びアクチビンＡに対する阻害能力を試験した。横紋筋肉腫Ａ２０４細胞に対し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子前部のＳｍａｄ３選択応答エレメントを含有するｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２−Ｌｕｃプラスミドを安定的にトランスフェクトした。１．２ｎＭのミオスタチンまたはアクチビンＡをＳｍａｄ３シグナリングの刺激に使用した。融合タンパク質をミオスタチンまたはアクチビンＡのいずれかと共に、細胞への添加前に、室温で３０分間インキュベートし、次にインキュベートから２４時間後、３７℃におけるルシフェラーゼ活性を測定した。シグナリングアッセイに使用するミオスタチンまたはアクチビンＡの濃度は１．２ｎＭとした。表１４に示すように、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、刺激アッセイにおいて０．５ｎＭ未満〜１．５ｎＭ超の範囲のＩＣ５０でミオスタチンを阻害した。表１２に示すように、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、刺激アッセイにおいて０．５ｎＭ未満〜１．５ｎＭ超の範囲のＩＣ５０でアクチビンＡを阻害した。
【表１２】
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【０１９０】
実施例５．フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質全身投与のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
本実施例は、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃ）の野生型マウス及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルに対する全身投与が、１０ｍｇ／ｋｇの用量を静脈内または皮下に投与した場合において、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋肉質量の増加傾向をもたらすことを実証するものである。
【０１９１】
具体的には、ある研究では、雄のＣ５７ＢＬ／６（野生型マウス）に対し、ビヒクル（すなわち、ＰＢＳ）またはＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡを、静脈注射により１０ｍｇ／ｋｇの用量で、または皮下注射により２０ｍｇ／ｋｇの用量で、週に２回４週間投与した。第２の研究では、雄のｍｄｘマウスに対し、ビヒクル（すなわち、ＰＢＳ）またはＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃを皮下注射により１０ｍｇ／ｋｇの用量で、あるいはマウス可溶性アクチビン受容体ＩＩＢ型キメラＦｃ融合（ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ）を皮下注射により３ｍｇ／ｋｇの用量で、週に２回１２週間投与した。最後の処置から２４時間後にマウスを屠殺し、腓腹筋及び四頭筋を採取し秤量した。表１３における例示的データは、ｍｄｘマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスの両方からの腓腹筋及び四頭筋の重量に対し、ビヒクルのみで処置した腓腹筋及び四頭筋と比較して顕著な増加が見られたことを示すものである。したがって、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質が、野生型マウス及びＤＭＤの動物モデルに全身投与した場合に筋肉質量を増加させるという明らかな徴候が見られる。ｍｄｘ研究では、投与から１１週間後に前肢の握力を測定した。図２における例示的データは、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃで処置したｍｄｘマウスの前肢の握力に対し、ビヒクルのみで処置した動物の握力と比較して顕著な増加が見られたことを示すものである。ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃ処置した動物の握力の強さは、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ陽性対照で処置した動物よりも大きく、また野生型Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎＪ動物よりも大きかった。
【表１３】
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【０１９２】
実施例６：フォリスタチンコンストラクトの特性決定
本実施例は、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃ）の野生型マウス及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルに対する全身投与が、１０ｍｇ／ｋｇの用量を静脈内または皮下に投与した場合において、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋肉質量の増加傾向をもたらすことを実証するものである。
【０１９３】
フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質についてのｐＩの変化も評価した。以下の表１４は、ＨＢＳ中でのＥ及びＤ変異による、さらに高グリコシル化バリアントによる酸性ｐＩへのシフトを示すものである。ｐＩのシフトはヘパリン結合の減少及びｉｎ  ｖｉｖｏ曝露の増加と相関している。
【０１９４】
ＮａｎｏＰｒｏ装置（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を用いてｃＩＥＦプロファイル（ｐＩ範囲）を測定した。試験した最終タンパク質濃度は０．００２５ｍｇ／ｍｌであり、ウェルに１２μＬ充填した。使用した希釈緩衝液はＤＰＢＳ及びＵｒｅａ／Ｃｈａｐｓ（１０Ｍ／０．６％）であった。使用した追加的試薬にはＧ２プレミックスが含まれた。４−９（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ０４０−９６９）、ｐＩ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｌａｄｄｅｒ  １（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ０４０−６４４）、一次抗体：ウサギ抗ＦＳ  ｐＡＢ（Ａｂｃａｍ  番号ａｂ４７９４１）の１：１００希釈、二次抗体：ウサギ抗ＩｇＧ  ＨＲＰ複合体（Ｐｒｏｍｅｇａ  番号４０１１）の１：１００希釈、及び基質：ルミノール／ペルオキシドＸＤＲ。
【表１４】
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【０１９５】
要約すると、上記実施例は、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質が、例えば全身投与により、ＤＭＤ疾患モデルにおける筋肥大の誘導に非常に有効であることを実証するものである。ｍｄｘマウスモデルにおける筋肥大は前肢の握力における機能的改善につながった。したがって、組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ＤＭＤの治療にとっての有効なタンパク質療法であり得る。
【０１９６】
等価物及び範囲
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または単なる日常的な実験方法を使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図されるものではなく、以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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