(57)【要約】本発明は、細胞ゲノムＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の試料内の、変異性変化、ＳＮＰ、転座、逆位、欠失、コピー数における変化、または他の遺伝的変異の検出のために有用な組成物及び方法を含む。いくつかの実施形態において、本発明のこれらの組成物及び方法は、生体試料（たとえば、血液）から全ｃｆＤＮＡのごく一部中のコピー数多型を検出する際に特に有用である非常に高水準の分解能を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ標的領域上で試験試料から遺伝子解析を実施する方法であって、
（ａ）複数のＤＮＡライブラリ断片を含むゲノムＤＮＡライブラリを生成することであって、そこで各前記ＤＮＡライブラリ断片は前記試験試料からのゲノムＤＮＡ断片、及びアダプタを含む、前記生成すること、
（ｂ）ＤＮＡ標的領域に特異的に結着する複数のキャプチャプローブと前記ゲノムＤＮＡライブラリを接触させることにより、前記ＤＮＡ標的領域を含む前記キャプチャプローブとＤＮＡライブラリ断片との間に複合体を形成すること、ならびに
（ｃ）前記ＤＮＡ標的領域を含む前記ゲノムＤＮＡ断片の定量的遺伝子解析を実施すること、
を備え、
そこで前記アダプタは増幅領域、試料タグ領域、及びアンカー領域を含むＤＮＡポリヌクレオチドであり、
そこで前記増幅領域はＰＣＲ増幅についてプライマー認識部位として機能することが可能であるポリヌクレオチド配列を含み、
そこで前記試料タグは前記ユニークライブラリＤＮＡ断片の一致度を符号化し、前記試験試料の一致度を符号化するポリヌクレオチド配列を含み、
そこで前記アンカー領域は前記試験試料の前記一致度を符号化するポリヌクレオチド配列を含み、そこで前記アンカー領域は前記ゲノムＤＮＡ断片に付着することが可能であり、
そこで前記遺伝子解析は疾患状態を示す遺伝的変化を検出するために実施される、
前記方法。
【請求項２】
疾患状態を示す前記遺伝的変化は、一塩基多様体（ＳＮＶ）、４０ヌクレオチド長未満の挿入、４０ヌクレオチド長未満のＤＮＡ領域の欠失、及び／またはコピー数における変化から選択される、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
疾患状態を示す前記遺伝的変化は、コピー数における変化である、請求項１に記載の前記方法。
【請求項４】
前記試験試料は、組織診である、請求項１から３のいずれかに記載の前記方法。
【請求項５】
前記組織診は、腫瘍、または腫瘍であると疑われる組織から採取される、請求項４に記載の前記方法。
【請求項６】
前記ゲノムＤＮＡは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または細胞ＤＮＡである、請求項１から３のいずれかに記載の前記方法。
【請求項７】
前記ゲノムＤＮＡは、前記試験試料から単離されるｃｆＤＮＡであり、前記試験試料は、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼液、尿、唾液、便、粘液、及び汗からなる群から選択される生体試料である、請求項６に記載の前記方法。
【請求項８】
前記ゲノムＤＮＡ断片は、
（ｉ）前記試験試料から細胞ＤＮＡを単離すること、
（ｉｉ）前記細胞ＤＮＡを断片化し、前記ゲノムＤＮＡ断片を取得すること、
を備えるステップによって取得される、請求項１から５のいずれかに記載の前記方法。
【請求項９】
ステップ（ｉｉ）は、前記細胞ＤＮＡを少なくとも１個の消化酵素と接触させることによって実施される、請求項８に記載の前記方法。
【請求項１０】
ステップ（ｉｉ）は、機械的応力を前記細胞ＤＮＡへ加えることによって実施される、請求項８に記載の前記方法。
【請求項１１】
前記機械的応力は、前記細胞ＤＮＡを超音波処理することによって加えられる、請求項１０に記載の前記方法。
【請求項１２】
前記試料タグは、前記ユニークゲノムＤＮＡ断片の前記同定を容易にするユニーク分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の前記方法。
【請求項１３】
前記増幅領域は、１０から５０の間のヌクレオチド長にある、先行請求項のうちのいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１４】
前記増幅領域は、２０から３０の間のヌクレオチド長にある、先行請求項のうちのいずれか１項のいずれかに記載の前記方法。
【請求項１５】
前記増幅領域は、２５ヌクレオチド長にある、先行請求項のうちのいずれか１項のいずれかに記載の前記方法。
【請求項１６】
前記試料タグは、５から５０の間のヌクレオチド長にある、先行請求項のうちのいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１７】
前記試料タグは、５から１５の間のヌクレオチド長にある、請求項１６に記載の前記方法。
【請求項１８】
前記試料タグは、８ヌクレオチド長にある、請求項１６に記載の前記方法。
【請求項１９】
前記ＵＭＩ増倍管は、前記試料タグ領域に隣接する、または前記試料タグ領域内に含まれる、請求項１２から１８のうちのいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２０】
前記ＵＭＩ増倍管は、１から５の間のヌクレオチド長にある、請求項１９に記載の前記方法。
【請求項２１】
前記ＵＭＩ増倍管は、３ヌクレオチド長にあり、６４個の可能なヌクレオチド配列のうちの１個を含む、請求項１９に記載の前記方法。
【請求項２２】
前記アンカー領域は、１から５０の間のヌクレオチド長にある、先行請求項のうちのいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２３】
前記アンカー領域は、５から２５の間のヌクレオチド長にある、請求項２２に記載の前記方法。
【請求項２４】
前記アンカー領域は、１０ヌクレオチド長にある、請求項２２または２３に記載の前記方法。
【請求項２５】
ステップ（ａ）は、前記ゲノムＤＮＡ断片を複数のアダプタへ付着させることを備える、先行請求項のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２６】
前記ゲノムＤＮＡ断片は、前記ゲノムＤＮＡ断片を複数のアダプタと付着させる前に、末端修復される、請求項２５に記載の前記方法。
【請求項２７】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記増幅領域は、同一のヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の前記方法。
【請求項２８】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記試料タグ領域は、２から１，０００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個を含む、請求項２６または２７に記載の前記方法。
【請求項２９】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記試料タグ領域は、５０から５００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個を含む、請求項２８に記載の前記方法。
【請求項３０】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記試料タグ領域は、１００から４００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個を含む、請求項２８に記載の前記方法。
【請求項３１】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記試料タグ領域は、２００から３００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個を含む、請求項２８に記載の前記方法。
【請求項３２】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記試料タグ領域は、８ヌクレオチド長にある、請求項２８に記載の前記方法。
【請求項３３】
前記ヌクレオチド配列の各配列は、少なくとも２のハミング距離によって前記２４０個のヌクレオチド配列のいずれかの他の配列から分離する、請求項２８から３２のいずれかに記載の前記方法。
【請求項３４】
前記複数のアダプタのそれぞれは、前記試料タグ領域に隣接する、または前記試料タグ領域内に含まれるＵＭＩ増倍管を備える、請求項２６から３３のうちのいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項３５】
前記複数のアダプタのそれぞれは、前記試料タグ領域に隣接するＵＭＩ増倍管を備える、請求項２６から３４のうちのいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項３６】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記ＵＭＩ増倍管は、１から５の間のヌクレオチド長にある、請求項３４または３５に記載の前記方法。
【請求項３７】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記ＵＭＩ増倍管は、３ヌクレオチド長にある、請求項３６に記載の前記方法。
【請求項３８】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記アンカータグ領域は、４個のヌクレオチド配列のうちの１個を含み、所与の配列の各試料領域は、所与の配列の前記４個のアンカー領域のうちの１個のみに対合される、請求項２６から３７に記載の前記方法。
【請求項３９】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記増幅領域は、同一のヌクレオチド配列を含み、
前記複数のアダプタの各アダプタの前記試料タグ領域は、８ヌクレオチド長にあり、各試料タグの前記ヌクレオチド配列は、少なくとも２のハミング距離によって前記複数のアダプタの前記試料タグのいずれかの他のヌクレオチド配列から分離し、
前記複数のアダプタのそれぞれは、前記試料タグ領域に隣接する、または前記試料タグ領域内に含まれるＵＭＩ増倍管を備え、前記複数のアダプタの各アダプタの前記ＵＭＩ増倍管は、３ヌクレオチド長にあり、それぞれの前記可能なヌクレオチド配列の前記ＵＭＩ増倍管は、前記複数のアダプタの各試料タグ領域に対合され、
前記複数のアダプタの各アダプタの前記アンカータグ領域は、４個のヌクレオチド配列のうちの１個を含み、所与の配列の各試料領域は、所与の配列の前記４個のアンカー領域のうちの１個のみに対合される、
請求項２５または２６に記載の前記方法。
【請求項４０】
前記ゲノムＤＮＡ断片を複数のアダプタと付着させる前記ステップは、
（ｉ）アンカー領域の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドを各ゲノムＤＮＡ断片へ付着させることであって、そこでアンカー領域の少なくとも一部を含む前記オリゴヌクレオチドはパートナー鎖によって二本鎖にされる５’リン酸化付着鎖を含むＤＮＡ二本鎖であり、そこで前記パートナー鎖は化学修飾による付着からその３’末端で遮断され、そこで前記付着鎖は前記ゲノムＤＮＡ断片に付着する、前記付着させること、
（ｉｉ）前記複数のアダプタの各アダプタのヌクレオチド配列についてアダプタ配列の全長を符号化するＤＮＡオリゴヌクレオチドと、前記アンカー領域の少なくとも一部を含む前記オリゴヌクレオチドに付着する前記ゲノムＤＮＡ断片を接触させること、ならびに
（ｉｉｉ）ＤＮＡライゲーションに適切な条件下でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、及びＢｓｔポリメラーゼ全長と、前記ゲノムＤＮＡ断片、及び前記アダプタ配列の全長を符号化する前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドを接触させること、
を備え、
それらにより、前記複数のアダプタを前記ゲノムＤＮＡ断片に付着させる、請求項２５から３９のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４１】
前記ゲノムＤＮＡ断片は、ｃｆＤＮＡである、請求項２５から４０のいずれかに記載の前記方法。
【請求項４２】
前記ＤＮＡ標的領域は、コピー数における変化について解析される、請求項２５から４１のいずれかに記載の前記方法。
【請求項４３】
ステップ（ｃ）は、前記ＤＮＡ標的領域を含む前記キャプチャプローブとＤＮＡライブラリ断片との間に形成される前記複合体の精製を備える、先行請求項のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４４】
ステップ（ｃ）は、前記ＤＮＡ標的領域を含む前記キャプチャプローブとＤＮＡライブラリ断片との間に形成される前記複合体の精製を備え、前記ゲノムＤＮＡライブラリから前記関心領域を含む前記ＤＮＡライブラリ断片のプライマー伸長及び／または増幅を実施する、先行請求項のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４５】
ステップ（ｃ）は、前記ＤＮＡ標的領域を含む前記キャプチャプローブとＤＮＡライブラリ断片との間に形成される前記複合体の精製を備え、前記ゲノムＤＮＡライブラリから前記関心領域を含む前記ＤＮＡライブラリ断片のプライマー伸長及び増幅を実施する、先行請求項のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４６】
ステップ（ｃ）は、複数のシーケンシングリードを生成するために、前記ＤＮＡ標的領域を含む前記ＤＮＡライブラリ断片のＤＮＡシーケンシングを備える、先行請求項のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４７】
前記ゲノム解析は、ＤＮＡ関心領域におけるコピー数の変化を測定することを備え、ステップ（ｃ）は、
（ｉ）前記試験試料に由来する前記ゲノムＤＮＡライブラリ中に存在する前記関心領域のコピー数を測定すること、及び
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において測定された前記コピー数を標準試料に由来する前記ゲノムＤＮＡライブラリ中に存在する前記関心領域のコピー数と比較すること、
を備え、
前記標準試料は、前記ＤＮＡ標的領域の既知のコピー数を有する、
先行請求項のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４８】
前記関心領域における前記コピー数を測定することは、複数のシーケンシングリードを生成するために前記ＤＮＡ標的領域を含む前記ＤＮＡライブラリ断片のＤＮＡシーケンシングを備え、各シーケンシングリードは、ユニーク分子識別素子（ＵＭＩＥ）を含む、請求項４７に記載の前記方法。
【請求項４９】
前記ＵＭＩＥは、前記アダプタからのシーケンシング情報、及び前記ゲノムＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む、請求項４８に記載の前記方法。
【請求項５０】
同一ＵＭＩＥを含むシーケンシングリードは、ユニークゲノム配列（ＵＧＳ）として識別される、請求項４９に記載の前記方法。
【請求項５１】
前記ゲノムＤＮＡライブラリと接触する前記キャプチャプローブのそれぞれについて生のゲノム深度（ＲＧＤ）を測定することをさらに備える、請求項４７から５０のいずれかに記載の前記方法。
【請求項５２】
前記ＲＧＤは、試料複製物群内の各キャプチャプローブ配列と関連するＵＧＳの前記平均数を測定することを備える、請求項５１に記載の前記方法。
【請求項５３】
非常にばらつきのある数のＵＧＳと関連するキャプチャプローブは、ノイズの多いプローブとして識別され、さらなる計算から除外される、請求項５２に記載の前記方法。
【請求項５４】
試料についてＲＧＤを計算することをさらに備え、前記試料中のすべてのキャプチャプローブについてすべてのＲＧＤの数値平均を計算することを備える、請求項５２に記載の前記方法。
【請求項５５】
ノイズの多いプローブについての前記ＲＧＤ値は、試料についてＲＧＤを計算する際に含まれない、請求項５２に記載の前記方法。
【請求項５６】
前記キャプチャプローブについての前記ＲＧＤは、各キャプチャプローブについての前記ＲＧＤをプローブ特異的な正規化されたリードカウントに変換することによって実験群中のすべての試料にわたり正規化され、
前記プローブ特異的な正規化されたリードカウントは、
（ｉ）試料中の各キャプチャプローブＲＧＤに正規化定数を乗算することであって、そこで前記正規化定数はいずれかの実数を含む、前記乗算すること、及び
（ｉｉ）前記対応する試料について計算される前記ＲＧＤで（ｉ）の前記積を除算すること、または
（ｉｉｉ）１サブセットのプローブから計算される平均ＲＧＤで（ｉ）の前記積を除算すること、
を備える、請求項５１から５５のいずれかに記載の前記方法。
【請求項５７】
前記１サブセットのプローブは、１セットの対照プローブである、請求項５６に記載の前記方法。
【請求項５８】
前記プローブ特異的な、正規化されたリードカウントは、コピー数値に変換され、
前記コピー数値は、
（ｉ）．女性に由来する試料において、常染色体及び／またはＸ連鎖領域を対象とするプローブの前記プローブ特異的な、正規化されたリードカウントに２を乗算すること、
（ｉｉ）．男性に由来する試料において、Ｙ連鎖領域及び／またはＸ連鎖領域を対象とするプローブの前記プローブ特異的な、正規化されたリードカウントに１を乗算すること、
（ｉｉｉ）．実験中に、すべての試料にわたり（ｉ）及び／または（ｉｉ）の前記積を平均すること、ならびに
（ｉｖ）．（ｉｉｉ）の前記平均値で（ｉ）及び／または（ｉｉ）の前記積を除算すること、
を備える、請求項５７に記載の前記方法。
【請求項５９】
特異的な遺伝子を標的にするすべてのプローブについて前記近似したコピー数値は、平均される、請求項５８に記載の前記方法。
【請求項６０】
コピー数増加及びコピー数減少の高感度検出方法であって、
（ｉ）キャプチャプローブについてＲＧＤを測定すること、
（ｉｉ）前記キャプチャプローブについての前記ＲＧＤをプローブ特異的な、正規化されたリードカウントに変換することによって、実験群中にすべての試料にわたり前記キャプチャプローブについての前記ＲＧＤを正規化すること、
（ｉｉｉ）各プローブ特異的な、正規化されたリードカウントについて近似したコピー数値を計算すること、及び
（ｉｖ）特異的な遺伝子を標的にするすべてのプローブについて前記近似したコピー数値を平均すること、
を備える、前記方法。
【請求項６１】
染色体安定性を測定する方法であって、
（ｉ）１セットの１つ以上の染色体安定性プローブを設計し、妥当性確認することであって、前記染色体安定性プローブはヒト染色体にわたり均一に分布する、前記妥当性確認すること、
（ｉｉ）前記１つ以上の染色体安定性プローブを使用して患者試料上で標的シーケンシングを実施すること、
（ｉｉｉ）各染色体プローブについて近似したコピー数値を決定すること、
（ｉｖ）患者試料のゲノム表現型を決定することであって、そこで前記患者試料中の１つ以上の染色体プローブについて前記コピー数値における増減はゲノム不安定性を示すこと、
を備える、前記方法。
【請求項６２】
それを必要とする被験体中の癌を処置する方法であって、
前記被験体は請求項６１の前記方法に従い、不安定化されたゲノムを含むと識別され、
前記癌を処置する前記方法は薬学的に有効量のＰＡＲＰ阻害剤を投与する、
ことを備える、前記方法。
【請求項６３】
前記関心領域は、遺伝子、または前記遺伝子の一部である、先行請求項のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項６４】
前記遺伝子は、疾患と関連する、請求項６３に記載の前記方法。
【請求項６５】
前記疾患は、癌である、請求項６４に記載の前記方法。
【請求項６６】
前記遺伝子は、ＢＲＣＡ２、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＩＰ１、ＣＨＥＫ２、ＦＡＮＣＡ、ＨＤＡＣ２、及び／またはＰＡＬＢ２である、請求項６３に記載の前記方法。
【請求項６７】
複数のＤＮＡライブラリ断片を含むゲノムＤＮＡライブラリであって、
前記ＤＮＡライブラリ断片のそれぞれはアダプタ及びゲノムＤＮＡ断片を含み、
前記アダプタは増幅領域、試料タグ領域、及びアンカー領域を含むＤＮＡポリヌクレオチドであり、
前記増幅領域はＰＣＲ増幅についてプライマー認識部位として機能することが可能であるポリヌクレオチド配列を含み、
前記試料タグは前記ユニークライブラリＤＮＡ断片の一致度を符号化し、前記試験試料の一致度を符号化するポリヌクレオチド配列を含み、
前記アンカー領域は前記試験試料の前記一致度を符号化するポリヌクレオチド配列を含み、前記アンカー領域は前記ゲノムＤＮＡ断片に付着することが可能である、
前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項６８】
前記試料タグは、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含み、前記ＵＭＩは、前記ユニークゲノムＤＮＡ断片の前記同定を容易にする、請求項６７に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項６９】
前記増幅領域は、１０から５０の間のヌクレオチド長にある、請求項６７または６８に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項７０】
前記増幅領域は、２５ヌクレオチド長にある、請求項６９に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項７１】
前記試料タグは、５から５０の間のヌクレオチド長にある、先行請求項のうちのいずれか１項に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項７２】
前記試料タグは、８ヌクレオチド長にある、請求項７１に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項７３】
前記ＵＭＩ増倍管は、前記試料タグ領域に隣接する、または前記試料タグ領域内に含まれる、請求項６７から７２のうちのいずれか１項に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項７４】
前記ＵＭＩ増倍管は、１から５の間のヌクレオチド長にある、請求項７３に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項７５】
前記アンカー領域は、１から５０の間のヌクレオチド長にある、先行請求項のうちのいずれか１項に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項７６】
前記アンカー領域は、１０ヌクレオチド長にある、請求項７５に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項７７】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記増幅領域は、同一のヌクレオチド配列を含む、請求項６７から７６のいずれか１項に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項７８】
前記試料タグの各ヌクレオチド配列は、少なくとも２のハミング距離によって前記試料の前記ヌクレオチド配列のいずれかの他の配列から分離する、請求項６７から７７のいずれか１項に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項７９】
前記複数のアダプタのそれぞれは、前記試料タグ領域に隣接する、または前記試料タグ領域内に含まれるＵＭＩ増倍管を備える、請求項６７から７８のいずれか１項に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項８０】
前記複数のアダプタのそれぞれは、前記試料タグ領域に隣接するＵＭＩ増倍管を備える、請求項６７から７８のいずれか１項に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項８１】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記アンカータグ領域は、４個のヌクレオチド配列のうちの１個を含み、所与の配列の各試料領域は、所与の配列の前記４個のアンカー領域のうちの１個のみに対合される、請求項６７から７８のいずれか１項に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項８２】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記増幅領域は、同一のヌクレオチド配列を含み、
前記複数のアダプタの各アダプタの前記試料タグ領域は、８ヌクレオチド長にあり、前記複数のアダプタの各アダプタの前記試料タグ領域は、少なくとも２のハミング距離によって前記複数のアダプタの前記試料タグのいずれかの他のヌクレオチド配列から分離し、
前記複数のアダプタのそれぞれは、前記試料タグ領域に隣接する、または前記試料タグ領域内に含まれるＵＭＩ増倍管を備え、前記複数のアダプタの各アダプタの前記ＵＭＩ増倍管は、３ヌクレオチド長にあり、それぞれの前記可能なヌクレオチド配列の前記ＵＭＩ増倍管は、前記複数のアダプタの前記試料タグ領域のそれぞれに対合され、
前記複数のアダプタの各アダプタの前記アンカータグ領域は、４個のヌクレオチド配列のうちの１個を含み、
所与の配列の各試料領域は、所与の配列の前記４個のアンカー領域のうちの１個のみに対合される、
請求項６７に記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項８３】
前記ゲノムＤＮＡ断片は、ｃｆＤＮＡである、請求項６７から８２のいずれかに記載の前記ゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項８４】
請求項６７から８３のいずれか１項に従い、１個より多いゲノムライブラリを含む、複数のゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項８５】
前記複数のゲノムＤＮＡライブラリに属する１個のゲノムＤＮＡライブラリの前記試料タグ領域の前記核酸配列は、前記複数のゲノムＤＮＡライブラリに属する他のゲノムＤＮＡライブラリの前記試料タグ領域の前記核酸配列と異なる、請求項８４に記載の前記複数のゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項８６】
前記複数のゲノムＤＮＡライブラリに属する１個のゲノムＤＮＡライブラリの前記増幅領域の前記核酸配列は、前記複数のゲノムＤＮＡライブラリに属する他のゲノムＤＮＡライブラリの前記増幅領域の前記核酸配列に同一である、請求項８４または８５に記載の前記複数のゲノムＤＮＡライブラリ。
【請求項８７】
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のＤＮＡ標的領域の遺伝子解析方法であって、
（ａ）請求項６７から８６のいずれかに記載の前記ＤＮＡライブラリを生成すること、
（ｂ）ＤＮＡ標的領域に特異的に結着する複数のキャプチャプローブと前記ｃｆＤＮＡライブラリを接触させることにより、前記ＤＮＡ標的領域を含む前記キャプチャプローブとＤＮＡライブラリ断片との間に複合体を形成すること、及び
（ｃ）前記ＤＮＡ標的領域を含む前記ｃｆＤＮＡ断片の定量的遺伝子解析を実施すること、
を備え
それらにより、前記ＤＮＡ標的領域の遺伝子解析を実施する、
前記遺伝子解析方法。
【請求項８８】
被験体における遺伝性疾患を予測する、診断する、または監視する方法であって、
（ａ）前記被験体から試験試料を得ることと、
（ｂ）前記試験試料からゲノムＤＮＡを単離することと、
（ｃ）複数のＤＮＡライブラリ断片を含むＤＮＡライブラリを生成することであって、前記ＤＮＡライブラリ断片のそれぞれは前記試験試料からのゲノムＤＮＡ断片、及びアダプタを含む、前記生成することと、
（ｄ）ＤＮＡ標的領域に特異的に結着する複数のキャプチャプローブと前記ｃｆＤＮＡライブラリを接触させることにより、前記ＤＮＡ標的領域を含む前記キャプチャプローブとＤＮＡライブラリ断片との間に複合体を形成することと、
（ｅ）前記ｃｆＤＮＡクローンライブラリにおける前記遺伝性疾患に関連する１つ以上の標的遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施することであって、前記１つ以上の標的遺伝子座における１つ以上の遺伝子損傷の前記同定または検出は前記遺伝性疾患の前記進行の予後判定、診断、または監視である、前記実施することと、
を含む前記方法。
【請求項８９】
前記定量的遺伝子解析は、複数のシーケンシングリードを生成するためのＤＮＡシーケンシングを含む、請求項８７または８８に記載の前記方法。
【請求項９０】
ユニークゲノムＤＮＡ断片の一致度、及び試験試料の一致度を符号化する１セットのアダプタであって、ゲノムＤＮＡライブラリを生成する際の使用のために、
前記１セットのアダプタ中の各アダプタは増幅領域、試料タグ領域、及びアンカー領域を含むＤＮＡポリヌクレオチドであり、
前記増幅領域はＰＣＲ増幅についてプライマー認識部位として機能することが可能であるポリヌクレオチド配列を含み、
前記試料タグは前記ユニークライブラリＤＮＡ断片の前記一致度を符号化し、前記試験試料の前記一致度を符号化するポリヌクレオチド配列を含み、
前記アンカー領域は前記試験試料の前記一致度を符号化するポリヌクレオチド配列を含み、前記アンカー領域は前記ゲノムＤＮＡ断片に付着することが可能である、
前記１セットのアダプタ。
【請求項９１】
前記試料タグは、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含み、前記ＵＭＩは、前記ユニークゲノムＤＮＡ断片の前記同定を容易にする、請求項９０に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項９２】
前記増幅領域は、１０から５０の間のヌクレオチド長にある、請求項９０または９１に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項９３】
前記増幅領域は、２５ヌクレオチド長にある、請求項９０から９２のいずれか１項に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項９４】
前記試料タグは、５から５０の間のヌクレオチド長にある、先行請求項のいずれか１項に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項９５】
前記試料タグは、８ヌクレオチド長にある、請求項９４に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項９６】
前記ＵＭＩ増倍管は、前記試料タグ領域に隣接する、または前記試料タグ領域内に含まれる、請求項９０から９５のいずれか１項に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項９７】
前記ＵＭＩ増倍管は、１から５の間のヌクレオチド長にある、請求項９６に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項９８】
前記アンカー領域は、１から５０の間のヌクレオチド長にある、請求項９０から９７に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項９９】
前記アンカー領域は、１０ヌクレオチド長にある、請求項９８に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項１００】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記増幅領域は、同一のヌクレオチド配列を含む、請求項９０から９９のいずれかに記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項１０１】
前記試料タグの各ヌクレオチド配列は、少なくとも２のハミング距離によって前記１セットのアダプタの前記試料タグのいずれかの他のヌクレオチド配列から分離する、請求項１００に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項１０２】
前記複数のアダプタのそれぞれは、前記試料タグ領域に隣接する、または前記試料タグ領域内に含まれるＵＭＩ増倍管を備える、請求項９０から１０１のいずれか１項に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項１０３】
前記複数のアダプタのそれぞれは、前記試料タグ領域に隣接するＵＭＩ増倍管を備える、請求項９０から１０１のいずれか１項に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項１０４】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記アンカータグ領域は、４個のヌクレオチド配列のうちの１個を含み、所与の配列の各試料領域は、所与の配列の前記４個のアンカー領域のうちの１個のみに対合される、請求項１０３に記載の前記１セットのアダプタ。
【請求項１０５】
前記複数のアダプタの各アダプタの前記増幅領域は、同一のヌクレオチド配列を含み、
各アダプタの前記試料タグ領域は、８ヌクレオチド長にあり、前記試料タグの各ヌクレオチド配列は、少なくとも２のハミング距離によって前記１セットのアダプタの前記試料タグのいずれかの他のヌクレオチド配列から分離し、
前記複数のアダプタのそれぞれは、前記試料タグ領域に隣接する、または前記試料タグ領域内に含まれるＵＭＩ増倍管を備え、前記複数のアダプタの各アダプタの前記ＵＭＩ増倍管は、３ヌクレオチド長にあり、前記ＵＭＩ増倍管は、６４個の可能なヌクレオチド配列のうちの１個を含み、それぞれの前記６４個の可能なヌクレオチド配列の前記ＵＭＩ増倍管は、前記複数のアダプタの前記試料タグ領域のそれぞれに対合され、
前記複数のアダプタの各アダプタの前記アンカータグ領域は、４個のヌクレオチド配列のうちの１個を含み、
所与の配列の各試料領域は、所与の配列の前記４個のアンカー領域のうちの１個のみに対合される、
請求項９０から１０４のいずれか１項に記載の前記１セットのアダプタ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１６年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／３７９，５９３号、及び２０１７年４月４日に出願された米国仮特許出願第６２／４８１，５３８号に優先権を主張し、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙媒体の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＣＬＦＫ＿００５＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５である。テキストファイルは、２，２３８ＫＢであり、２０１７年８月２４日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子提出された。
【０００３】
本発明は、概して、生体試料、たとえば、直接組織診または末梢血液などの定量的遺伝子解析のための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、生体試料の、遺伝子特性及び解析と同様に、標的特異的コピー数変化の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
全部でないにしてもほとんどの場合、最も一般的なヒトの癌がヒトゲノムの疾患であることは、明らかになりつつある。個人の一生の間に体細胞変異が蓄積し、体細胞変異がひそむ細胞が腫瘍中に発生する可能性を体細胞変異のいくつかが増加させると考えられる。蓄積された変異事象の誤った組み合わせだけで、前癌性増殖は、制御されない増殖を阻止する制約を失った結果、細胞塊が癌になる。癌の原因となるのに必要かつ十分である一連の変異は、「ドライバー変異」と合わせて称されることが多い。最新の、かつ集中的な分子解析から現れた主題の１つは、癌が以前は単一の組織特異的疾患と考えられていたが、実際には特有の分子病理を各有する関連した疾患群であることである。ヒトゲノム計画は、癌のゲノムワイド解析についての基礎を築いた。
【０００５】
遺伝子コピー数における変化は、生物学的多様性の基本的なドライバーである。進化の背景に、遺伝子の重複、及び機能の多様性は、種の多様性の良く認識されたドライバーである。ヒト疾患の背景に、体細胞内の遺伝子減少及び遺伝子増幅は、癌などの患部組織の特徴である。ある一定の治療薬は、これらのゲノムの増加及び／または減少変異を有する細胞上に特異的に作用するが、これらのような変異が患部細胞または癌細胞のＤＮＡ内にのみ存在することが多く、体の他の細胞中で見出されないために、これらのコピー数多型の同定は困難である。患部組織または細胞が変異したＤＮＡの主な供給源であり、バイオプシーを介してＤＮＡを取得することは、侵襲的で、危険であり、そして不可能であることが多い。瀕死の腫瘍または癌細胞が無細胞ＤＮＡまたは循環ＤＮＡと称される、それらのＤＮＡの小片を血流中に放出する観察は、血液試料などの、低侵襲性技術によって実施されることが可能である遺伝子検査の開発を可能にした。しかしながら、試料から無細胞ＤＮＡを単離することから、ＤＮＡのわずかな量のみを取得することができ、全ＤＮＡの一部のみは、疾患と関連する変異を保因するであろう。たとえば、癌ゲノムの背景に、診断上著しい腫瘍変異は、有意に５０％未満であるマイナーアレル頻度でのみ見出されることが多い。これは、アレル頻度が一般的に約１００％、５０％または０％である、従来のＳＮＰ遺伝子型判定と対照的である。
【０００６】
したがって、特異的な標的遺伝子座における遺伝子コピー数変化を検出することが可能であるゲノム技術が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ｃｆＤＮＡにおける希少変異を検出する方法は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０２８３１６号に先行して記載されている。しかしながら、これらの技術は、非常にマイナーなアレル頻度で最も希少なコピー数減少を検出するために必要な感度を依然として欠く。本明細書に提供されるのは、標的特異的コピー数変化の検出用の組成物及び方法であり、これらの組成物及び方法は、直接組織診、末梢血液、及び特にｃｆＤＮＡを含む、いくつかの試料タイプに適用可能である。本明細書に記載されるこれらの組成物及び方法は、全ＤＮＡのわずかな一部のみに存在するコピー数における変化を検出するのに十分に高感度である。
【０００８】
本発明は、とりわけ、細胞ゲノムＤＮＡ（たとえば、組織診試料からの）またはｃｆＤＮＡ（たとえば、血液試料からの）の試料内の、変異性変化、ＳＮＰ、転座、逆位、欠失、コピー数における変化、または他の遺伝的変異の検出のために有用である組成物及び方法を含む。特に、本発明のこれらの組成物及び方法は、生体試料（たとえば、血液）から全ｃｆＤＮＡのごく一部中のコピー数多型を検出する際に特に有用である非常に高水準の分解能を提供する。
【０００９】
特定の実施形態は、ＤＮＡ標的領域上で試験試料から遺伝子解析を実施する方法に描画され、この方法は、（ａ）複数のＤＮＡライブラリ断片を含むゲノムＤＮＡライブラリを生成することであって、各ＤＮＡライブラリ断片は試験試料からのゲノムＤＮＡ断片、及びアダプタを含む、生成すること、（ｂ）ＤＮＡ標的領域に特異的に結着する複数のキャプチャプローブとゲノムＤＮＡライブラリを接触させることにより、ＤＮＡ標的領域を含むキャプチャプローブとＤＮＡライブラリ断片との間に複合体を形成すること、ならびに（ｃ）ＤＮＡ標的領域を含むゲノムＤＮＡ断片の定量的遺伝子解析を実施することを備え、そこでアダプタは増幅領域、試料タグ領域、及びアンカー領域を含むＤＮＡポリヌクレオチドであり、そこで増幅領域はＰＣＲ増幅についてプライマー認識部位として機能することが可能であるポリヌクレオチド配列を含み、そこで試料タグはユニークライブラリＤＮＡ断片の一致度を符号化し、試験試料の一致度を符号化するポリヌクレオチド配列を含み、そこでアンカー領域は試験試料の一致度を符号化するポリヌクレオチド配列を含み、アンカー領域はゲノムＤＮＡ断片に付着することが可能であり、そこで遺伝子解析は疾患状態を示す遺伝的変化を検出するために実施される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、疾患状態を示す遺伝的変化は、一塩基多様体（ＳＮＶ）、４０ヌクレオチド長未満の挿入、４０ヌクレオチド長未満のＤＮＡ領域の欠失、及び／またはコピー数における変化から選択される。特定の実施形態において、疾患状態を示す遺伝的変化は、コピー数における変化である。いくつかの実施形態において、試験試料は、組織診である。さまざまな実施形態において、組織診は、腫瘍、または腫瘍であると疑われる組織から採取される。ある一定の実施形態において、ゲノムＤＮＡは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または細胞ＤＮＡである。特定の実施形態において、ゲノムＤＮＡは、試験試料から単離されるｃｆＤＮＡであり、この試験試料は、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼液、尿、唾液、便、粘液、及び汗からなる群から選択される生体試料である。
【００１１】
ある一定の実施形態において、ゲノムＤＮＡ断片は、（ｉ）試験試料から細胞ＤＮＡを単離すること、及び（ｉｉ）この細胞ＤＮＡを断片化してゲノムＤＮＡ断片を取得すること、を備えるステップによって取得される。特定の実施形態において、ステップ（ｉｉ）は、細胞ＤＮＡを少なくとも１個の消化酵素と接触させることによって実施される。いくつかの実施形態において、ステップ（ｉｉ）は、機械的応力を細胞ＤＮＡへ加えることによって実施される。ある一定の実施形態において、この機械的応力は、細胞ＤＮＡを超音波処理することによって加えられる。
【００１２】
特定の実施形態において、この試料タグは、ユニークゲノムＤＮＡ断片の同定を容易にするユニーク分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、増幅領域は、１０から５０の間のヌクレオチド長にある。特定の実施形態において、増幅領域は、２０から３０の間のヌクレオチド長にある。ある一定の実施形態において、増幅領域は、２５ヌクレオチド長にある。
【００１４】
いくつかの実施形態において、試料タグは、５から５０の間のヌクレオチド長にある。特定の実施形態において、試料タグは、５から１５の間のヌクレオチド長にある。ある一定の実施形態において、試料タグは、８ヌクレオチド長にある。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、試料タグ領域に隣接する、または試料タグ領域内に含まれる。
【００１５】
ある一定の実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、１から５の間のヌクレオチド長にある。特定の実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、３ヌクレオチド長にあり、６４個の可能なヌクレオチド配列のうちの１個を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、アンカー領域は、１から５０の間のヌクレオチド長にある。特定の実施形態において、アンカー領域は、５から２５の間のヌクレオチド長にある。ある一定の実施形態において、アンカー領域は、１０ヌクレオチド長にある。
【００１７】
本発明の特定の実施形態は、（ａ）複数のＤＮＡライブラリ断片を含むゲノムＤＮＡライブラリを生成することのステップは、ゲノムＤＮＡ断片を複数のアダプタへ付着させることを備える。ある一定の実施形態において、ゲノムＤＮＡ断片は、ゲノムＤＮＡ断片を複数のアダプタと付着させる前に、末端修復される。特定の実施形態において、複数のアダプタの各アダプタの増幅領域は、同一のヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
ある一定の実施形態において、複数のアダプタの各アダプタの試料タグ領域は、２から１，０００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個を含む。特定の実施形態において、複数のアダプタの各アダプタの試料タグ領域は、５０から５００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個を含む。さまざまな実施形態において、複数のアダプタの各アダプタの試料タグ領域は、１００から４００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個を含む。いくつかの実施形態において、複数のアダプタの各アダプタの試料タグ領域は、２００から３００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個を含む。ある一定の実施形態において、複数のアダプタの各アダプタの試料タグ領域は、８ヌクレオチド長にある。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列の各配列は、少なくとも２のハミング距離によって２４０個のヌクレオチド配列のいずれかの他の配列から分離する。
【００１９】
特定の実施形態において、複数のアダプタのそれぞれは、試料タグ領域に隣接する、または試料タグ領域内に含まれるＵＭＩ増倍管を含む。いくつかの実施形態において、複数のアダプタのそれぞれは、試料タグ領域に隣接するＵＭＩ増倍管を含む。ある一定の実施形態において、複数のアダプタの各アダプタのＵＭＩ増倍管は、１から５の間のヌクレオチド長にある。いくつかの実施形態において、複数のアダプタの各アダプタのＵＭＩ増倍管は、３ヌクレオチド長にある。
【００２０】
特定の実施形態において、複数のアダプタの各アダプタのアンカータグ領域は、４個のヌクレオチド配列のうちの１個を含み、所与の配列の各試料領域は、所与の配列の４個のアンカー領域のうちの１個のみに対合される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、複数のアダプタの各アダプタの増幅領域は、同一のヌクレオチド配列を含み、複数のアダプタの各アダプタの試料タグ領域は、８ヌクレオチド長にあり、各試料タグのヌクレオチド配列は、少なくとも２のハミング距離によって複数のアダプタの試料タグのいずれかの他のヌクレオチド配列から分離し、複数のアダプタのそれぞれは、試料タグ領域に隣接する、または試料タグ領域内に含まれるＵＭＩ増倍管を備え、複数のアダプタの各アダプタのＵＭＩ増倍管は、３ヌクレオチド長にあり、それぞれの可能なヌクレオチド配列のＵＭＩ増倍管は、複数のアダプタの各試料タグ領域に対合され、複数のアダプタの各アダプタのアンカータグ領域は、４個のヌクレオチド配列のうちの１個を含み、所与の配列の各試料領域は、所与の配列の４個のアンカー領域のうちの１個のみに対合される。
【００２２】
本発明の特定の実施形態は、方法について描画し、この方法においてゲノムＤＮＡ断片を複数のアダプタと付着させるステップは、（ｉ）アンカー領域の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドを各ゲノムＤＮＡ断片へ付着させることであって、アンカー領域の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドはパートナー鎖によって二本鎖にされる５’リン酸化付着鎖を含むＤＮＡ二本鎖であり、パートナー鎖は化学修飾による付着からその３’末端で遮断され、付着鎖はゲノムＤＮＡ断片に付着する、付着させること、（ｉｉ）アンカー領域の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドに付着するゲノムＤＮＡ断片を、複数のアダプタの各アダプタのヌクレオチド配列についてアダプタ配列の全長を符号化するＤＮＡオリゴヌクレオチドと接触させること、ならびに（ｉｉｉ）ＤＮＡライゲーションに適切な条件下で、ゲノムＤＮＡ断片、及びアダプタ配列の全長を符号化するＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ及びＢｓｔポリメラーゼの全長と接触させることを備え、それらにより、複数のアダプタをゲノムＤＮＡ断片に付着させる。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ断片は、ｃｆＤＮＡである。ある一定の実施形態において、ＤＮＡ標的領域をコピー数における変化について解析する。
【００２３】
特定の実施形態において、ＤＮＡ標的領域を含むゲノムＤＮＡ断片の定量的遺伝子解析を実施するステップ（ｃ）は、ＤＮＡ標的領域を含むキャプチャプローブとＤＮＡライブラリ断片との間に形成される複合体の精製を有する。ある一定の実施形態において、ステップ（ｃ）は、ＤＮＡ標的領域を含むキャプチャプローブとＤＮＡライブラリ断片との間に形成される複合体の精製を有し、ゲノムＤＮＡライブラリから関心領域を含むＤＮＡライブラリ断片のプライマー伸長及び／または増幅を実施する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、ＤＮＡ標的領域を含むキャプチャプローブとＤＮＡライブラリ断片との間に形成される複合体の精製を有し、ゲノムＤＮＡライブラリから関心領域を含むＤＮＡライブラリ断片のプライマー伸長及び増幅を実施する。ある一定の実施形態において、ステップ（ｃ）は、複数のシーケンシングリードを生成するために、ＤＮＡ標的領域を含むＤＮＡライブラリ断片のＤＮＡシーケンシングを備える。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明は、方法を描画し、そこでゲノム解析は、ＤＮＡ関心領域におけるコピー数の変化を測定することを備え、またそこでステップ（ｃ）は、ＤＮＡ標的領域を含むゲノムＤＮＡ断片の定量的遺伝子解析を実施し、試験試料に由来するゲノムＤＮＡライブラリに存在する関心領域のコピー数を測定すること、そしてそれを標準試料に由来するゲノムＤＮＡライブラリに存在する関心領域のコピー数と比較することを備え、そこで標準試料は、ＤＮＡ標的領域の既知のコピー数を有する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、関心領域においてコピー数を測定することは、複数のシーケンシングリードを生成するためにＤＮＡ標的領域を含むＤＮＡライブラリ断片のＤＮＡシーケンシングを備え、そこで各シーケンシングリードは、ユニーク分子識別素子（ＵＭＩＥ）を含む。いくつかの実施形態において、ＵＭＩＥは、アダプタからのシーケンシング情報、及びゲノムＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、同一ＵＭＩＥを含むシーケンシングリードは、ユニークゲノム配列（ＵＧＳ）として識別される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、コピー数を測定する方法は、ゲノムＤＮＡライブラリと接触するキャプチャプローブのそれぞれについて生のゲノム深度（ＲＧＤ）を測定することをさらに備える。いくつかの実施形態において、ＲＧＤを測定することは、試料複製物群内の各キャプチャプローブ配列と関連するＵＧＳの平均数を測定することを備える。いくつかの実施形態において、非常にばらつきのある数のＵＧＳと関連するキャプチャプローブは、ノイズの多いプローブとして識別され、さらなる計算から除外される。いくつかの実施形態において、ＲＧＤを測定することは、試料についてＲＧＤを計算することをさらに備え、この試料中のすべてのキャプチャプローブについてすべてのＲＧＤの数値平均を計算することを備える。いくつかの実施形態において、ノイズの多いプローブについてのＲＧＤ値は、試料についてＲＧＤを計算する際に含まれない。
【００２７】
いくつかの実施形態において、キャプチャプローブ用のＲＧＤは、プローブ特異的な正規化されたリードカウントに各キャプチャプローブ用のＲＧＤを変換することによって実験群中のすべての試料にわたり正規化され、これは、（ｉ）試料中の各キャプチャプローブＲＧＤに正規化定数を乗算することであって、正規化定数はいずれかの実数を含む、乗算すること、及び（ｉｉ）対応する試料について計算されるＲＧＤで（ｉ）の積を除算すること、または（ｉｉｉ）１サブセットのプローブから計算される平均ＲＧＤで（ｉ）の積を除算することを備える。いくつかの実施形態において、１サブセットのプローブは、１セットの対照プローブである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、プローブ特異的な正規化されたリードカウントは、コピー数値に変換され、これは、（ｉ）女性に由来する試料において、常染色体及び／またはＸ連鎖領域を対象とするプローブのプローブ特異的な正規化されたリードカウントに２を乗算すること、（ｉｉ）男性に由来する試料において、Ｙ連鎖領域及び／またはＸ連鎖領域を対象とするプローブのプローブ特異的な正規化されたリードカウントに１を乗算すること、（ｉｉｉ）実験において、すべての試料にわたり（ｉ）及び／または（ｉｉ）の積を平均すること、及び（ｉｖ）（ｉｉｉ）の平均値で（ｉ）及び／または（ｉｉ）の積を除算することを備える。いくつかの実施形態において、特異的な遺伝子を標的にするすべてのプローブについて近似したコピー数値を平均する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明は、コピー数増加及びコピー数減少の高感度検出方法について描画され、この方法は、（ｉ）キャプチャプローブについてＲＧＤを測定すること、（ｉｉ）キャプチャプローブについてのＲＧＤをプローブ特異的な正規化されたリードカウントに変換することによって実験群中のすべての試料にわたりキャプチャプローブについてのＲＧＤを正規化すること、（ｉｉｉ）各プローブ特異的な正規化されたリードカウントについて近似したコピー数値を計算すること、及び（ｉｖ）特異的な遺伝子を標的にするすべてのプローブについて近似したコピー数値を平均することを備える。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明は、染色体安定性を測定する方法について描画され、この方法は、（ｉ）１セットの１個以上の染色体安定性プローブを設計し、妥当性確認することであって、これらの染色体安定性プローブはヒト染色体にわたり一様に分布する、妥当性確認すること、（ｉｉ）１つ以上の染色体安定性プローブを使用して患者試料上で標的シーケンシングを実施すること、（ｉｉｉ）各染色体プローブについて近似したコピー数値を測定すること、（ｉｖ）患者試料のゲノム表現型を決定することであって、患者試料中の１つ以上の染色体プローブについてコピー数値における増減はゲノム不安定性を示す、決定することを備える。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本発明は、それを必要とする被験体中の癌を処置する方法について描画され、この被験体は請求項６２の方法に従い、不安定化されたゲノムを含むと識別され、癌を処置する方法は薬学的に有効量のＰＡＲＰ阻害剤を投与することを備える。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明は、方法を描画し、そこでゲノム解析は、ＤＮＡ関心領域におけるコピー数の変化を測定することを備え、またそこでステップ（ｃ）は、ＤＮＡ標的領域を含むゲノムＤＮＡ断片の定量的遺伝子解析を実施し、試験試料に由来するゲノムＤＮＡライブラリに存在する関心領域のコピー数を測定すること、そしてそれを標準試料に由来するゲノムＤＮＡライブラリに存在する関心領域のコピー数と比較することを備え、そこで標準試料は、ＤＮＡ標的領域の既知のコピー数を有する。いくつかの実施形態において、関心領域は、遺伝子、または遺伝子の一部である。特定の実施形態では、遺伝子は、疾患と関連する。ある一定の実施形態では、この疾患は、がんである。さまざまな実施形態において、この遺伝子は、ＢＲＣＡ２、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＩＰ１、ＣＨＥＫ２、ＦＡＮＣＡ、ＨＤＡＣ２、及び／またはＰＡＬＢ２である。
【００３３】
特定の実施形態は、複数のＤＮＡライブラリ断片を含むゲノムＤＮＡライブラリについて描画され、そこで各ＤＮＡライブラリ断片はアダプタ及びゲノムＤＮＡ断片を含み、そこでアダプタは増幅領域、試料タグ領域、及びアンカー領域を含むＤＮＡポリヌクレオチドであり、そこで増幅領域はＰＣＲ増幅についてプライマー認識部位として機能することが可能であるポリヌクレオチド配列を含み、そこで試料タグはユニークライブラリＤＮＡ断片の一致度を符号化し、試験試料の一致度を符号化するポリヌクレオチド配列を含み、そこでアンカー領域は試験試料の一致度を符号化するポリヌクレオチド配列を含み、アンカー領域はゲノムＤＮＡ断片に付着することが可能である。いくつかの実施形態において、この試料タグは、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含み、そこでＵＭＩはユニークゲノムＤＮＡ断片の同定を容易にする。特定の実施形態において、増幅領域は、１０から５０の間のヌクレオチド長にある。特定の実施形態において、増幅領域は、２５ヌクレオチド長にある。特定の実施形態において、試料タグは、５から５０の間のヌクレオチド長にある。ある一定の実施形態において、試料タグは、８ヌクレオチド長にある。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、試料タグ領域に隣接する、または試料タグ領域内に含まれる。特定の実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、１から５の間のヌクレオチド長にある。ある一定の実施形態において、アンカー領域は、１から５０の間のヌクレオチド長にある。いくつかの実施形態において、アンカー領域は、１０ヌクレオチド長にある。特定の実施形態において、複数のアダプタの各アダプタの増幅領域は、同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、試料タグの各ヌクレオチド配列は、少なくとも２のハミング距離によって試料のヌクレオチド配列のいずれかの他の配列から分離する。ある一定の実施形態において、複数のアダプタのそれぞれは、試料タグ領域に隣接する、または試料タグ領域内に含まれるＵＭＩ増倍管を含む。特定の実施形態において、複数のアダプタのそれぞれは、試料タグ領域に隣接するＵＭＩ増倍管を含む。いくつかの実施形態において、複数のアダプタの各アダプタのアンカータグ領域は、４個のヌクレオチド配列のうちの１個を含み、所与の配列の各試料領域は、所与の配列の４個のアンカー領域のうちの１個のみに対合される。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ断片は、ｃｆＤＮＡである。
【００３４】
ある一定の実施形態において、複数のアダプタの各アダプタの増幅領域は、同一のヌクレオチド配列を含み、複数のアダプタの各アダプタの試料タグ領域は、８ヌクレオチド長にあり、複数のアダプタの各アダプタの試料タグ領域は、少なくとも２のハミング距離によって複数のアダプタの試料タグのいずれかの他のヌクレオチド配列から分離するヌクレオチド配列を含み、複数のアダプタのそれぞれは、試料タグ領域に隣接する、または試料タグ領域内に含まれるＵＭＩ増倍管を備え、複数のアダプタの各アダプタのＵＭＩ増倍管は、３ヌクレオチド長にあり、それぞれの可能なヌクレオチド配列のＵＭＩ増倍管は、複数のアダプタの各試料タグ領域に対合され、複数のアダプタの各アダプタのアンカータグ領域は、４個のヌクレオチド配列のうちの１個を含み、所与の配列の各試料領域は、所与の配列の４個のアンカー領域のうちの１個のみに対合される。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ断片は、ｃｆＤＮＡである。
【００３５】
ある一定の実施形態は、本明細書に記載される１つより多いゲノムライブラリを含む、複数のゲノムＤＮＡライブラリについて描画される。いくつかの実施形態において、複数のゲノムＤＮＡライブラリに属する１つのゲノムＤＮＡライブラリの試料タグ領域の核酸配列は、複数のゲノムＤＮＡライブラリに属する他のゲノムＤＮＡライブラリの試料タグ領域の核酸配列と異なる。特定の実施形態において、複数のゲノムＤＮＡライブラリに属する１つのゲノムＤＮＡライブラリの増幅領域の核酸配列は、複数のゲノムＤＮＡライブラリに属する他のゲノムＤＮＡライブラリの増幅領域の核酸配列に同一である。
【００３６】
ある一定の実施形態は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のＤＮＡ標的領域の遺伝子解析方法について描画され、この遺伝子解析方法は、（ａ）本明細書に記載されるようなＤＮＡライブラリを生成すること、（ｂ）ＤＮＡ標的領域に特異的に結着する複数のキャプチャプローブとｃｆＤＮＡライブラリを接触させることにより、ＤＮＡ標的領域を含むキャプチャプローブとＤＮＡライブラリ断片との間に複合体を形成すること、及び（ｃ）ＤＮＡ標的領域を含むｃｆＤＮＡ断片の定量的遺伝子解析を実施すること、を備え、それらによりＤＮＡ標的領域の遺伝子解析を実施する。
【００３７】
ある一定の実施形態は、被験体における遺伝性疾患を予測する、診断する、または監視する方法を対象とし、この方法は、（ａ）試験試料を被験体から取得すること、（ｂ）ゲノムＤＮＡを試験試料から単離すること、（ｃ）複数のＤＮＡライブラリ断片を含むＤＮＡライブラリを生成することであって、各ＤＮＡライブラリ断片は試験試料からのゲノムＤＮＡ断片、及びアダプタを含む、生成すること、（ｄ）ＤＮＡ標的領域に特異的に結着する複数のキャプチャプローブとｃｆＤＮＡライブラリを接触させることにより、ＤＮＡ標的領域を含むキャプチャプローブとＤＮＡライブラリ断片との間に複合体を形成すること、ならびに（ｅ）ｃｆＤＮＡクローンライブラリにおける遺伝性疾患に関連する１つ以上の標的遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施することであって、１つ以上の標的遺伝子座における１つ以上の遺伝子損傷の同定または検出は遺伝性疾患の進行の予後判定、診断、または監視である、実施することを備える。特定の実施形態では、定量的遺伝子解析は、複数のシーケンシングリードを生成するためのＤＮＡシーケンシングを含む。
【００３８】
特定の実施形態は、ユニークゲノムＤＮＡ断片の一致度、及び試験試料の一致度を符号化する１セットのアダプタについて描画され、ゲノムＤＮＡライブラリを生成する際の使用のために、そこで１セットのアダプタ中の各アダプタは、増幅領域、試料タグ領域、及びアンカー領域を含むＤＮＡポリヌクレオチドであり、そこで増幅領域は、ＰＣＲ増幅についてプライマー認識部位として機能することが可能であるポリヌクレオチド配列を含み、そこで試料タグは、ユニークライブラリＤＮＡ断片の一致度を符号化し、試験試料の一致度を符号化するポリヌクレオチド配列を含み、そこでアンカー領域は、試験試料の一致度を符号化するポリヌクレオチド配列を含み、アンカー領域は、ゲノムＤＮＡ断片に付着することが可能である。いくつかの実施形態において、この試料タグは、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含み、そこでＵＭＩはユニークゲノムＤＮＡ断片の同定を容易にする。さまざまな実施形態において、増幅領域は、１０から５０の間のヌクレオチド長にある。ある一定の実施形態において、増幅領域は、２５ヌクレオチド長にある。特定の実施形態において、試料タグは、５から５０の間のヌクレオチド長にある。いくつかの実施形態において、試料タグは、８ヌクレオチド長にある。特定の実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、試料タグ領域に隣接する、または試料タグ領域内に含まれる。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、１から５の間のヌクレオチド長にある。特定の実施形態において、アンカー領域は、１から５０の間のヌクレオチド長にある。いくつかの実施形態において、アンカー領域は、１０ヌクレオチド長にある。ある一定の実施形態において、複数のアダプタの各アダプタの増幅領域は、同一のヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、試料タグの各ヌクレオチド配列は、少なくとも２のハミング距離によって１セットのアダプタの試料タグのいずれかの他のヌクレオチド配列から分離する。さまざまな実施形態において、複数のアダプタのそれぞれは、試料タグ領域に隣接する、または試料タグ領域内に含まれるＵＭＩ増倍管を含む。特定の実施形態において、複数のアダプタのそれぞれは、試料タグ領域に隣接するＵＭＩ増倍管を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、複数のアダプタの各アダプタのアンカータグ領域は、４個のヌクレオチド配列のうちの１個を含み、所与の配列の各試料領域は、所与の配列の４個のアンカー領域のうちの１個のみに対合される。請求項７５の１セットのアダプタにおいて、複数のアダプタの各アダプタの増幅領域は、同一のヌクレオチド配列を含み、各アダプタの試料タグ領域は、８ヌクレオチド長にあり、試料タグの各ヌクレオチド配列は、少なくとも２のハミング距離によって１セットのアダプタの試料タグのいずれかの他のヌクレオチド配列から分離し、複数のアダプタのそれぞれは、試料タグ領域に隣接する、または試料タグ領域内に含まれるＵＭＩ増倍管を備え、複数のアダプタの各アダプタのＵＭＩ増倍管は、３ヌクレオチド長にあり、ＵＭＩ増倍管は、６４個の可能なヌクレオチド配列のうちの１個を含み、それぞれの６４個の可能なヌクレオチド配列のＵＭＩ増倍管は、複数のアダプタの試料タグ領域のそれぞれに対合され、複数のアダプタの各アダプタのアンカータグ領域は、４個のヌクレオチド配列のうちの１個を含み、所与の配列の各試料領域は、所与の配列の４個のアンカー領域のうちの１個のみに対合される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】コピー数減少（ＣＮＬ）アッセイのフレームワークを示す。各遺伝子（縦列）は、本明細書に陰影によって表される特徴的なユニークリード値を示す。各試料（横列）を同一の遺伝子パネルにわたり調べる。
【図２】ＣＮＬアッセイシグナルのドライバーを示す図解である。
【図３】無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）上で実施される例示的なＣＮＬアッセイのステップを説明する図解を示す。
【図４−１】例示的な第一生成アダプタ（図４Ａ及び図４Ｂ）、及び本発明のアダプタ（図４Ｃから図４Ｅ）の図解を示す。図４Ａは、第一生成アダプタ設計を示す。図４Ｂは、第一生成アダプタ中で２４９個の可能な配列タグの採取があり、これらの各配列タグは単一のアンカー配列に付着した５ヌクレオチド（ｎｔ）長にあったことを示す。図４Ｃは、第二生成アダプタの図を示す。図４Ｄは、４セットの８ｍｅｒタグ配列からなり、各セットが６０個のメンバーを含む、単一の試料に適用される例示的な１セットのアダプタを示す。６０個のタグの各セットは、４個のアンカー配列のうちの１個に特異的である。図４Ｅは、４７ｎｔのアダプタの例示的なＤＮＡ配列を示す。
【図４−２】同上。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、試料タグ内のＵＭＩ増倍管の位置を移動させることによりユニーク試料タグの数が増加することが可能であることを説明する図を示す。
【図６】ＣＮＬアッセイについてのゲノムライブラリを構築するプロセスを説明する図を示す。図６Ａは、１０ｎｔのアンカー配列をゲノム断片の３’末端に付着させるステップを示す。図６Ｂは、ゲノムアダプタの全長を最初のアンカー配列にアニールするステップを示す。
【図７】ＤＮＡインプットをＣＮＬライブラリ中に示す。左に示されるマーカーサイズ（ｂｐ）を有するアガロースゲル画像を示す。
【図８】図８Ａ〜図８Ｃは、ＣＮＬ解析によって決定されるように８個の試料にわたる測定された遺伝子コピーの従来の箱ひげ図を示す。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、断片化されたゲノム試料についてのＣＮＬ測定値における有意な標準からの偏差を定量化するＬｏｇ１０のＰ値プロットを示す。ＳＮＰ百分率は、ΔＡＴＭ及びΔＢＲＣＡ２試料中に存在する希少なヘテロ接合ＳＮＰのマイナーアレル頻度を最上部に示す。
【図１０】図１０Ａ及び図１０Ｂは、断片化されたゲノムＤＮＡによって添加されるｃｆＤＮＡ試料についてのＣＮＬ測定値における有意な標準からの偏差を定量化するＬｏｇ１０のＰ値プロットを示す。ＳＮＰ百分率は、ΔＡＴＭ及びΔＢＲＣＡ２試料中に存在する希少なヘテロ接合ＳＮＰのマイナーアレル頻度を最上部に示す。
【図１１】標的ハイブリッドキャプチャプラットフォームを示す。図１１Ａは、普遍的なシングルプライマーＰＣＲ増幅配列、試料多重化タグ、及びユニーク分子識別子をすべてのゲノムクローンへ提供する追加のアダプタ配列によってゲノムライブラリへのｃｆＤＮＡの変換を示す。図１１Ｂは、標的特異的キャプチャプローブ及びプライマー伸長によってハイブリダイズされる変性し増幅されたゲノムを示す。図１１Ｃは、非対称ペアエンドシーケンシングの概略図を示す。図１１Ｄは、一般的な標的キャプチャシーケンスランから３７７，７１１，０２０個のＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑリードについてマッピング統計を示す。９８．５％のリードをそれらの意図された標的へマッピングする。重複排除後、２０．４０％のリード（７７，０５３，０４８）は、ユニークゲノムクローンに由来する。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜図１２Ｈは、プール１−３からのオリゴヌクレオチドのアダプタの配列を示す。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【図１２Ｄ】同上。
【図１２Ｅ】同上。
【図１２Ｆ】同上。
【図１２Ｇ】同上。
【図１２Ｈ】同上。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｈは、プール４−６からのオリゴヌクレオチドのアダプタの配列を示す。
【図１３Ｂ】同上。
【図１３Ｃ】同上。
【図１３Ｄ】同上。
【図１３Ｅ】同上。
【図１３Ｆ】同上。
【図１３Ｇ】同上。
【図１３Ｈ】同上。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜図１４Ｉは、プール７−９からのオリゴヌクレオチドのアダプタの配列を示す。
【図１４Ｂ】同上。
【図１４Ｃ】同上。
【図１４Ｄ】同上。
【図１４Ｅ】同上。
【図１４Ｆ】同上。
【図１４Ｇ】同上。
【図１４Ｈ】同上。
【図１４Ｉ】同上。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｈは、プール１０−１２からのオリゴヌクレオチドのアダプタの配列を示す。
【図１５Ｂ】同上。
【図１５Ｃ−１】同上。
【図１５Ｃ−２】同上。
【図１５Ｄ】同上。
【図１５Ｅ】同上。
【図１５Ｆ】同上。
【図１５Ｇ】同上。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜図１６Ｈは、プール１３−１５からのオリゴヌクレオチドのアダプタの配列を示す。
【図１６Ｂ】同上。
【図１６Ｃ】同上。
【図１６Ｄ】同上。
【図１６Ｅ】同上。
【図１６Ｆ】同上。
【図１６Ｇ】同上。
【図１６Ｈ】同上。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜図１７Ｈは、プール１６−１８からのオリゴヌクレオチドのアダプタの配列を示す。
【図１７Ｂ】同上。
【図１７Ｃ】同上。
【図１７Ｄ】同上。
【図１７Ｅ】同上。
【図１７Ｆ】同上。
【図１７Ｇ】同上。
【図１７Ｈ】同上。
【図１８Ａ】図１８Ａ〜図１８Ｈは、プール１９−２１からのオリゴヌクレオチドのアダプタの配列を示す。
【図１８Ｂ】同上。
【図１８Ｃ】同上。
【図１８Ｄ】同上。
【図１８Ｅ】同上。
【図１８Ｆ】同上。
【図１８Ｇ】同上。
【図１８Ｈ】同上。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜図１９Ｈは、プール２２−２４からのオリゴヌクレオチドのアダプタの配列を示す。
【図１９Ｂ】同上。
【図１９Ｃ】同上。
【図１９Ｄ】同上。
【図１９Ｅ】同上。
【図１９Ｆ】同上。
【図１９Ｇ】同上。
【図１９Ｈ】同上。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜図２０Ｈは、プール２５−２７からのオリゴヌクレオチドのアダプタの配列を示す。
【図２０Ｂ】同上。
【図２０Ｃ】同上。
【図２０Ｄ】同上。
【図２０Ｅ】同上。
【図２０Ｆ】同上。
【図２０Ｇ】同上。
【図２０Ｈ】同上。
【図２１Ａ】図２１Ａ〜図２１Ｈは、プール２８−３０からのオリゴヌクレオチドのアダプタの配列を示す。
【図２１Ｂ】同上。
【図２１Ｃ】同上。
【図２１Ｄ】同上。
【図２１Ｅ】同上。
【図２１Ｆ】同上。
【図２１Ｇ】同上。
【図２１Ｈ】同上。
【図２２Ａ】図２２Ａ〜図２２Ｈは、プール３１−３２からのオリゴヌクレオチドのアダプタの配列を示す。
【図２２Ｂ】同上。
【図２２Ｃ】同上。
【図２２Ｄ】同上。
【図２２Ｅ】同上。
【図２２Ｆ】同上。
【図２２Ｇ】同上。
【図２２Ｈ】同上。
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｃは、ＴＰ５３遺伝子の標的シーケンシングを示す。図２３Ａは、キャプチャプローブのＢｅｄＦｉｌｅ表示を図示する。図２３Ｂは、０から８０００のスケールのユニークリード上で各塩基位置におけるカバレッジ深度を示す。図２３Ｃは、既知のＴＰ５３スプライス変異体のＵＣＳＣ遺伝子モデル表示を示す。より厚い矩形領域は、ＴＰ５３符号化タンパク質についてアミノ酸コード化領域を表す。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｃは、１６個の試料にわたり、単一のプローブ、ＴＰ５３ｒ１０＿１について生の正規化されたユニークリード密度を示す。図２４Ａは、「重複排除」によって冗長リードの除去後に１６個の独立した試料に対してプローブＴＰ５３ｒ１０＿１によって生のユニークリードキャプチャ数を示す。図２４Ｂは、１６個の試料すべてについて２５９６個のキャプチャプローブにわたりユニークリードの網羅的平均を示す。図２４Ｃは、１６個の試料  にわたる正規化されたユニークリード深度を示す（［プローブＴＰ５３ｒ１０＿１からの試料ｎユニークリード×定数÷試料ｎからの網羅的平均ユニークリード／プローブ］として計算された）。
【図２５】プローブ間の有意な平均深度変動にもかかわらず、いずれかの所与のＴＰ５３プローブ内の１６個の試料のすべてについて正規化されたユニークリードカウントの一般的な一貫性を示す。１６個の試料すべてについて正規化されたユニークリードカウントを狭い間隔の棒グラフの「柱」として示し、ＴＰ５３を標的にする４５個のプローブすべてについて結果を示す。「ノイズの多い」カウント挙動を示す２個のプローブを矢印で強調表示する。これらのようなプローブからのカウントは、後続のコピー数解析における外れ値として現れることが多い。
【図２６】２５９６個のプローブの幅広のパネルにわたり正規化されたプローブごとのユニークリードカウントの試料間の一貫性を図示する。３個の代表的な試料からの散布図を示す。各点は、異なるプローブを表す。ｘ軸は、１６個の試料にわたる１個のプローブあたりの正規化された平均ユニークリード深度である。ｙ軸は、３個の異なる個々の試料について１個のプローブあたりの正規化されユニークリード深度である。一貫したプローブごとのユニークリードカウントは、染色体コピー変動の定量的解析を支援する。
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｃは、健康な女性及び男性ドナーからのｃｆＤＮＡ、ならびに進行期前立腺癌患者からのｃｆＤＮＡのコピー数解析を図示する。図２７Ａは、健康な女性ドナーからのｃｆＤＮＡの解析を示す。ｘ軸は、２２個すべての常染色体からの領域を標的にする一連の対照プローブ、Ｘ連鎖ＡＲ遺伝子を標的にする一連のプローブ、及びＴＰ５３遺伝子のコード化領域を標的にする一連のプローブである。Ｙ軸は、各プローブについて計算された倍数性を示す。この近似は、倍数性が既知である一連の対照試料に対して観察されたユニークリードカウントを正規化することによって各プローブについて計算される（［試料＿Ｚのプローブ＿Ｙについてユニークリードカウント］×２÷［複数の対照試料についてのプローブ＿Ｙに対する平均ユニークリードカウント］）。図２７Ｂは、Ｘ連鎖ＡＲ遺伝子が健康な男性における単数体コピー数を示すことを説明する。図２７Ｃは、進行期前立腺癌患者からのｃｆＤＮＡのコピー数解析を図示し、対照プローブ、ＡＲ遺伝子の増幅、及びＴＰ５３遺伝子の減少にわたり非常に有意な異数性の根拠を示す。
【図２８】対照試料に関連する前立腺患者のｃｆＤＮＡライブラリの全ゲノム異数性解析を示す。２３９個の各対照プローブについて近似した倍数性を染色体によって選別し、示す。患者の染色体の２個のプローブは、一貫したコピー減少を示し、大部分の染色体の５個のプローブは、コピー増加を示す。全てではないが多くの患者対照プローブについて、近似した倍数性の有意な偏差がみられる。
【図２９】コピー数減少の検出の解析の妥当性確認を示す。不死化株ＮＡ０２７１８（単一アレルΔＡＴＭ）からのゲノムＤＮＡ、及びＮＡ０９５９６（単一アレルΔＢＲＣＡ２）からのゲノムＤＮＡは、１６％でＮＡ１２８７８からの「ゴールドスタンダード」ゲノムＤＮＡ中に添加され、８％の両アレル欠失のマイナーアレル頻度に相当するものをもたらした。標的シーケンシング及びＣＮＶ解析後に、プローブごとの倍数性を２個の標的遺伝子について平均した。比較のために、２個の撹乱のない対照遺伝子、ＢＲＩＰ１及びＨＤＡＣ２を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
Ａ．概要
本発明は、とりわけ、細胞ゲノムＤＮＡ（たとえば、組織診試料からの）またはｃｆＤＮＡ（たとえば、血液試料からの）の試料内の、変異性変化、ＳＮＰ、転座、逆位、欠失、コピー数における変化、または他の遺伝的変異の検出のために有用である組成物及び方法を含む。本発明のこれらの組成物及び方法は、絶妙な分解能によって生体試料（たとえば、血液）からｃｆＤＮＡ中のコピー数多型を検出する、信じられないほど困難な検出をする際に特に有用である。特に、本発明のいくつかの実施形態は、アダプタへ付着するゲノムＤＮＡ断片から作製されるゲノムＤＮＡライブラリを生成し、ＤＮＡ標的領域を複数のキャプチャプローブによってキャプチャし、このＤＮＡ標的領域を含むＤＮＡライブラリ断片を単離し、ＤＮＡ標的領域の定量的遺伝子解析を実施することによりＤＮＡ標的領域のコピー数を測定することによって、試験試料からＤＮＡ標的領域のコピー数を検出する方法について描画される。本明細書に記載されるアダプタは、試料の一致度またはゲノムＤＮＡの供給源と同様に、配列されている個々のＤＮＡ断片の同定を可能にする。
【００４３】
本発明は、直接組織診及び末梢血を含むがこれらに限定されない、いくつかの試料タイプに適用可能である標的に特異的なコピー数変化の検出のための組成物及び方法を部分的に企図する。癌ゲノミクス、特に、固形腫瘍の解析のための無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）アッセイとの関連で、腫瘍ＤＮＡ量は、ＤＮＡ全体のごくわずかな割合であることが多い。さらにコピー数減少は、ゲノムＤＮＡアッセイ、特にコピー数変化が試料、たとえば、ｃｆＤＮＡアッセイからの全ゲノムＤＮＡの一部にのみ存在することができるゲノムＤＮＡアッセイ中で検出することが困難である。たとえば、癌患者から抽出される無細胞ＤＮＡの大部分は、正常な供給源に由来し、二倍体コピー数を有する（男性被験体中のＸ連鎖遺伝子を除く）。癌患者、たとえば、血漿から抽出される２％の循環ＤＮＡが腫瘍に由来する患者などにおいて、腫瘍に由来するＤＮＡの割合は、低いマイナーアレル頻度を有することが多い。腫瘍抑制遺伝子（たとえば、乳癌中のＢＲＣＡ１）の１コピーの減少は、検出可能なゲノム断片が存在しないマイナーアレル頻度が１％であることを意味する。この状況において、操作されるコピー数減少アッセイは、１００コピー（正常）から９９コピー（ヘテロ接合性遺伝子消失）の間で識別することが可能でなければならない。したがって、特定の実施形態は、本発明の方法及び組成物がｃｆＤＮＡとの関連でもマイナーアレル頻度でコピー数における変化を検出するのに十分な分解能によってコピー数変化の検出を可能にすることを企図する。
【００４４】
この水準の識別を達成するために、本発明は、新規の試料アダプタ設計を提供する。本発明のこれらのアダプタは、（ｉ）アダプタ全体に均一な性能、（ｉｉ）多数のユニーク分子識別子（ＵＭＩ）、（ｉｉｉ）高効率の付着、及び（ｉｖ）試料多重化への適応能を含む、成功したコピー数減少のアッセイ性能について重要な特徴を有するように設計される。たとえば、本発明のアダプタは、以下を提供する。
【００４５】
アダプタ全体に均一な性能：生物情報学的解析は、試料内プローブ性能及び試料間プローブ性能に目を向けることが多い。したがって、試料にわたるアダプタプール間のいずれかの性能変動がＣＮＬ解析に必要とされるわずかな変動を検出する能力に悪影響を与えると想定される。本発明において、この性能の均一性は、固定試料タグ領域（試料及びゲノム断片の両方を識別するように機能する）が各プールについてランダムに選択されながら、各試料タグプールにすべて見受けられる複数のアンカータグと、ゲノム断片を識別するためにユニーク試料タグ配列を増加させるＵＭＩ増倍管とを含むことによって達成される。
【００４６】
多数のユニーク分子識別子（ＵＭＩ）：これらのアダプタが分子生物学的観点から機能的に当量でなければならならず、それらは、ユニークゲノム断片の同定を増強させる非常に多数のユニーク配列のタグ（≧１０，０００）を含まなければならない。これに関連して、「増強させる」ことによって、二本鎖ＤＮＡを切断したゲノム配列中の位置に対応する断片化部位の特定の対を各ゲノムクローン断片が含むことを意味する。各クローンが異なる切断部位を含む可能性が高いため、この切断部位を使用して、ユニークゲノムクローンを区別する。しかしながら、数千個の独立したクローンを含むライブラリにおいて、ユニークに由来する断片は、全く同一の切断部位を含むことが多い。同一の切断部位を共有するゲノムクローン（すなわち、断片）は、同一の試料に由来する他のクローン配列に関して、ユニークまたは冗長のいずれか一方として分類されることが可能である。非常に多様性である配列タグを導入するアダプタを付着させることにより、同一の切断部位を共有する異なるゲノムクローンは、ユニークとして識別される可能性がさらに高い。このシステムにおいて、ＵＭＩは、ＵＭＩ増倍管と試料タグ領域の組み合わせによって作製される。ＵＭＩ及び切断部位の組み合わせは、ユニーク分子識別子素子（ＵＭＩＥ）を作製し、このＵＭＩＥは、冗長リードまたはユニークリードとして配列リードの分類を容易にする。特定の実施形態は、ＵＭＩ増倍管がより長い配列、またはより短い配列を含み、全体的なＵＭＩ複雑性を増す、または低下させることが可能であることを企図する。
【００４７】
高効率の付着：アダプタは、ゲノム断片に高効率で付着しなければならない。ほとんどの腫瘍学用途において、利用可能な細胞ＤＮＡまたはｃｆＤＮＡの量は、限られるため、ゲノムライブラリクローンへのこれらのゲノム断片の変換は、非常に効率的でなければならない。これを達成するために、本発明のいくつかの態様において、本明細書に記載されるアダプタシステムは、約２５％から約５０％以上のゲノムインプット断片をゲノムライブラリクローンに変換する。
【００４８】
試料多重化への適応能：一般に、アダプタの異なるセットのプールがなければならず、そこでセットの各ユニークアダプタを異なる試料に付着させる。同時に、アダプタのセットの各メンバーは、セット中のすべての他のメンバーへ本質的に同一挙動（配列カウント観点から）を有さなければならない。これを達成するために、いくつかの実施形態において、試料タグ領域は、いずれかの他の可能な試料タグ組み合わせ間で２のハミング距離を有し、リードが誤った試料に擬似的に割り当てられる可能性を減らす。いくつかの実施形態において、各セットのアダプタをプール中で分断し、特異的なアンカー領域と対合させ、試料多重化解除におけるエラーの可能性のさらなる減少を可能にする。たとえば、２のハミング距離を有する８ｍｅｒのタグにおいて、可能な配列の全数は、１６，３８４個である。
【００４９】
特定の実施形態において、アダプタのオリゴヌクレオチドの所定のプールを提供する。これらのような所定のプールを使用して、単一の試料を表す。すなわち、Ｘ個のアダプタのオリゴヌクレオチドの各プールにおける各アダプタ配列（上記の所与の例において１６，３８４個）は、他の試料を識別するために使用されるあらゆる他のプール中の各アダプタ配列と異なる。当業者は、アダプタのオリゴヌクレオチドについて可能である別個の所定のプール数が試料タグ及び／またはＵＭＩ増倍管の長さに依存することを認識するであろう。
【００５０】
したがって、ある一定の実施形態において、これらのアダプタは、１個の配列を含む、すなわち、試料タグ及び隣接する及び／または包含されたＵＭＩ増倍管は、両方の試料を表し、または識別し、遺伝子断片をユニークに識別する。これは、配列を識別するためにランダムに生成されたタグと、多重化を可能にするインデックスを付ける別々のバーコードまたはシーケンサとを使用する、当該技術分野において用いられる現在のシステムに対して全く対照的である。
【００５１】
図３において、標的に特異的なコピー数変化を試料から取得されるＤＮＡ内で検出するために例示的な実施形態を示す。図３は、ｃｆＤＮＡからＤＮＡライブラリを生成するが、この例示的な手順は、他の供給源、たとえば、断片化された細胞ＤＮＡなどからのＤＮＡによって使用されることが可能である。図３に示されるように、ｃｆＤＮＡを捕集する（最上部のパネル）。つぎに、本発明のゲノムライブラリアダプタ（灰色の丸）をゲノムＤＮＡにコンジュゲートすることによって、ゲノムライブラリをｃｆＤＮＡから生成する。関心のゲノム領域を認識するキャプチャプローブ（黒色の丸）によってゲノムＤＮＡ断片を捕らえる。関心のゲノムＤＮＡを配列決定し、関心のゲノムＤＮＡのコピー減少解析及び／または特徴についてデータ解析を実施する。
【００５２】
反対のことが明示されない限り、本発明における特定の実施形態の実施には、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学における当業者の技能範囲内の従来的な方法が用いられることになり、これらの多くを、例示の目的で後に説明する。このような技法は、文献で十分に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）を参照する。
Ｂ．定義
【００５３】
別途定義されない限り、本明細書で使用する技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験の際に、本明細書に記載の方法及び材料に類似したまたは同等の、任意の方法及び材料を使用することは可能であるが、好ましい実施形態の組成物、方法、及び材料について説明する。本発明において、以下の用語は下記のように定義する。
【００５４】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すように使用している。例として、「（ａｎ）要素」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【００５５】
選択肢（例えば、「または（ｏｒ）」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方、またはその任意の組合せのいずれかを意味するものと理解されたい。
【００５６】
「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語は、選択肢のうちの１つまたは両方のいずれかを意味するものと理解されたい。
【００５７】
本明細書で使用する「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対し、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の分変動する量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さについて、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
【００５８】
本明細書全体において、文脈上他の意味が要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、述べられるステップ若しくは要素またはステップ若しくは要素の群を含むことを意味し、ただし任意の他のステップ若しくは要素またはステップ若しくは要素の群を除外することを意味するものではないことを理解されたい。特定の実施形態では、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は同義語として使用される。
【００５９】
「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句の後に来るものすべてを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句は、挙げられる要素が必要または必須であり、かつ他の要素は存在しない場合があることを示す。
【００６０】
「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、このフレーズの後に挙げられる任意の要素を含み、他の要素については、挙げられる要素の開示内容で指定された活性または作用を妨げず、寄与もしない要素に限定することを意味する。したがって、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」というフレーズは、挙げられる要素は必要または必須であるが、他の要素については任意選択ではなく、挙げられる要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、他の要素が存在する場合もあれば存在しない場合もあることを示す。
【００６１】
本明細書全体における「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「一実施形態（ａｎ  ｅｎｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「特定の実施形態」、「関連した実施形態」、「ある特定の実施形態（ａ  ｃｅｒｔａｉｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「追加的な実施形態」、若しくは「さらなる実施形態」、またはこれらの組合せに対する言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造、または特色が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所で出現する上記フレーズが、必ずしも全て同じ実施形態を言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特色は、１つ以上の実施形態における任意の好適な方法で組み合わせることができる。
【００６２】
本明細書で使用する「単離した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、天然の状態において通常は付随する構成要素を実質的または本質的に含まない材料を意味する。特定の実施形態では、「取得した（ｏｂｔａｉｎｅｄ）」または「導き出した（ｄｅｒｉｖｅｄ）」という用語は、「単離した」の同義語として使用される。
【００６３】
本明細書で使用する「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸を指す。様々な実施形態では、ＤＮＡという用語は、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはｃＤＮＡを指す。一実施形態では、ＤＮＡはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを指す。特定の実施形態において、ＤＮＡは「標的領域」を含む。本明細書で企図されるＤＮＡライブラリは、ゲノムＤＮＡライブラリ、及びＲＮＡから構築するｃＤＮＡライブラリ、例えば、ＲＮＡ発現ライブラリなどが含まれる。様々な実施形態では、ＤＮＡライブラリは１つ以上の追加的なＤＮＡ配列及び／またはタグを含む。
【００６４】
用語、「標的遺伝子座」及び「ＤＮＡ標的領域」は、本明細書に互換的に使用され、ＤＮＡ配列内の関心領域を指す。様々な実施形態では、標的遺伝子座に対し標的化遺伝子解析を実施する。特定の実施形態では、ＤＮＡ標的領域は、特定の遺伝子様相、遺伝子状態、遺伝性疾患、胎児検査、遺伝子モザイク、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断若しくは監視、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、または臓器移植監視に関連する遺伝子の領域である。さらに実施形態において、ＤＮＡ標的領域は、特定のヒト染色体、たとえば、特定の常染色体若しくはＸ連鎖染色体、またはその領域（たとえば、ユニーク染色体領域）などと関連するＤＮＡ配列である。
【００６５】
本明細書で使用する「循環ＤＮＡ」、「循環セルフリーＤＮＡ」、及び「セルフリーＤＮＡ」という用語は、しばしば互換的に使用され、細胞外ＤＮＡであるＤＮＡ、細胞から押し出されたＤＮＡ、またはネクローシス性細胞若しくはアポトーシス性細胞から放出されたＤＮＡを指す。この用語は、「細胞ゲノムＤＮＡ」または「細胞ＤＮＡ」と対照的に使用されることが多く、本明細書に互換的に使用され、ゲノムＤＮＡを指し、このゲノムＤＮＡは、細胞（すなわち、ヌクレアーゼ）内に含まれ、また細胞の完全性にある、またはその他の方法により細胞の完全性を破壊することによって、本明細書に記載されるこれらのような分子生物学的技術に唯一到達可能である。
【００６６】
本明細書で使用する「対象」、「個体」、または「患者」には、本明細書で企図する組成物により検出または識別され得る状態の症状を示す任意の動物が含まれる。好適な対象としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ）、飼育動物、すなわちペット（例えば、ネコまたはイヌ）が挙げられる。特定の実施形態では、対象は哺乳類である。あるいくつかの実施形態では、対象は非ヒト霊長類であり、好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００６７】
本明細書に使用されるように、用語「対合された」は、異なるポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡの２個の異なるポリヌクレオチド配列または領域に関連して使用されるときに、異なるポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡの２個の異なるポリヌクレオチド配列または領域が同一のポリヌクレオチド上に存在することを意味する。たとえば、ＤＮＡの特定の試料タグ領域がＤＮＡの特定の増幅領域に対合されると言われる場合に、試料タグ領域及び増幅タグが同一のＤＮＡポリヌクレオチド分子上に存在することを意味する。
【００６８】
Ｃ．コピー数解析方法
様々な実施形態では、ＤＮＡ標的領域のＤＮＡのコピー数解析方法を提供する。ある一定の実施形態において、コピー数解析は、ゲノムＤＮＡ断片及びアダプタを各含むＤＮＡライブラリ断片のゲノムＤＮＡライブラリを生成し、これらのＤＮＡ標的領域を含むＤＮＡライブラリ断片を単離し、ＤＮＡ標的領域の定量的遺伝子解析を行うことによって実施される。「定量的遺伝子解析」は、ＤＮＡ変異、ＳＮＰ、転座、欠失、及びコピー数多型（ＣＮＶ）を含むが、これらに限定されない、ＤＮＡ（たとえば、遺伝子、遺伝子座、関心の標的領域など）における変化を定量化することが可能である、いずれかの分子生物学的技術によって実施される解析を意味する。ある一定の実施形態では、定量的遺伝子解析をシーケンシング、たとえば、次世代シーケンシングによって実施する。
【００６９】
次世代ＤＮＡシーケンシング（ＮＧＳ）は、２つの診断用途に最適である。最初は、莫大な規模のＤＮＡ配列の決定である。本発明に関連して、この能力は、効果的な治療決定を導く、稀な、実施可能な変異体についての検索を可能にする。つぎは、遺伝子コピー数をカウントすることである。数百万個の独立した配列のアウトプットは、ゲノムワイドスケールで遺伝子コピー数の正確な測定を可能にすることができる。胎児トリソミー用の母体血試料からの非侵襲的な出生前検査の出現は、この能力に対する証明である。インプットがゲノムＤＮＡよりもむしろＲＮＡ（ｃＤＮＡ）であるが、ＲＮＡｓｅｑ、すなわち、ＮＧＳを使用する遺伝子発現プロファイリング技術は、別の例である。現在のキャプチャ方法の比較は、Ｓａｍｏｒｏｄｎｉｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．２０１５  Ｊａｎ；１７（１）：６４−７５、に記載される。
【００７０】
本発明は、ＮＧＳカウント能力を標的ハイブリッドキャプチャ方法の範囲に拡張する。本明細書に記載されるこれらの方法は、それらが以下の４つの品質を有するために、少なくとも部分的にコピー数多型の検出に効果的である。
（ａ）本発明のこれらの方法は、ユニーククローンと冗長クローンとを区別する。増幅されたゲノムＤＮＡライブラリ断片のＮＧＳシーケンシングは、複数の個々のＮＧＳリードをもたらし、これらのＮＧＳリードは、特異的なヒトゲノム配列に結合されるアダプタ符号化配列情報を各含む。これらの素子は、すべてのクローンの一致度を定義する。キャプチャされたゲノム領域をＰＣＲによって増幅するため、その後のＮＧＳ解析で同一のクローンに数回遭遇することは、珍しくはない。単一クローン化及びキャプチャプロセスに由来するリード群は、「冗長リード」と称される。２個以上の冗長リードは、ユニーク分子識別素子（ＵＭＩＥ）によって提供されるシーケンシング情報に基づき冗長リードとして識別される。ＵＭＩＥは、アダプタタグからの配列情報、及びゲノムＤＮＡ配列の開始の組み合わせを指す。同一ＵＭＩＥを含む２個以上のリードを冗長リードとして識別する。冗長リードを合わせてグループ化し、単一の代表的なコンセンサス配列を冗長リードのファミリーから組み立てる。このコンセンサス配列は、「ユニークリード」または「ユニークゲノム配列」（ＵＧＳ）と称される。各ユニークリードは、元のＤＮＡ検体から分離したクローンを表す。冗長クローンファミリーを識別し、グループ化するプロセス、及びこのファミリーを表す単一のユニークリードを生成するプロセスを、「重複排除」と定義する。これらのアダプタは、ゲノムライブラリを作製するために使用され、ユニーク試料タグ情報（１個のアダプタあたり１５，３６０個のコード）の非常に深いレパートリーをもつ。それぞれのキャプチャされたゲノムクローン（キャプチャプローブに関して＞１００の異なる位置に及ぶことが可能である）の正確なマッピング座標と併せて適用するときに、ゲノムライブラリに生成された後に、標的特異的キャプチャプローブによって取得される各ユニーククローンは、同一のキャプチャ環境を包含するすべての他のユニーククローンと区別可能である非常に高い尤度を有する。ユニーククローンを冗長クローンと区別する能力は、本明細書に記載される方法に中心となるものである。
（ｂ）ゲノムライブラリを作製するために使用されるアダプタは、アダプタ間のばらつきをコピー数カウントにおいて生じることなく試料多重化を可能にする。コピー数決定の重要な基礎は、単一のシーケンシングラン内ですべて処理された１セットの試料の同時解析である。これにより、正及び負の対照を臨床試料に加えて含むことが可能である。以前のアダプタ設計繰り返しに関する主な課題は、同一の対照試料間の遺伝子コピーカウントにおけるわずかなシフトを誘導し、実際には、血液に基づく、固形腫瘍遺伝子型判定アッセイに臨床的に有益であるには高すぎたシグナル対ノイズの不確実性閾値を設定した。本発明は、この課題を克服し、シングルコピー遺伝子減少が≦２％のマイナーアレル頻度で検出可能であるように、シグナル対ノイズ閾値を実質的下げる。この改善されたシグナル認識は、本発明の方法が腫瘍ＤＮＡアッセイを循環させる際に有意な臨床的有用性を有することを可能にする。
（ｃ）本明細書に使用される独自開発の標的ハイブリッドキャプチャ方法は、すべての標的にわたり非常に均一な「標的上」リードカバレッジを作製しなければならない。本明細書に記載されるものなどの、ユニークゲノム断片のカウントに頼り、コピー数を推定する方法は、すべての可能なユニーク断片に遭遇する観点から近飽和を達成しなければならない。オーバーサンプリング、すなわち、最終的に遭遇するユニークリード数より多いシーケンシングリードを集めることによってのみ近飽和を達成する。実用的、スケーラブル、及び経済的であるために、標的上リードの＜１０倍のオーバーサンプリング、及び好ましくは標的上リードの＜４倍のオーバーサンプリングが＞９０％のユニーク標的上リードをすべての標的遺伝子座でキャプチャするように、標的ハイブリッドキャプチャライブラリ中のユニークリードは、十分な均一性を示さなければならない。
（ｄ）標的ハイブリッドキャプチャ方法（米国特許公開第２０１４−０２７４７３１号を参照する）は、高い標的上捕捉率を有さなければならない。実用的、スケーラブル、及び経済的であるために、換言すれば、この分野における他の技術と比較して本開示の顕著な特徴であるために、この方法は、＞９０％、好ましくは＞９５％の標的上リードを達成しなければならない。標的上マッピング率が９５％を超えながら、標的上リードの４から１０倍のオーバーサンプリングについての要件、及びオーバーサンプリング全体についての要件は、同一のものである。
【００７１】
いくつかの実施形態では、試料中に存在するＤＮＡ標的領域のコピー数を定量的遺伝子解析によって決定する。いくつかの実施形態において、試料中に存在するＤＮＡ標的領域のコピー量を比較すること、またそれを既知のコピー数を有する１つ以上の試料中に存在するＤＮＡ標的領域の量と比較することによって、ＤＮＡ標的領域のコピー数を決定する。
【００７２】
特定の実施形態は、本明細書に記載される組成物及び方法がゲノムＤＮＡの試料中のコピー数における変化を検出するために特に有益であることを企図し、そこで試料中の全ゲノムＤＮＡの一部のみがコピー数における変化を有する。たとえば、有意な腫瘍変異は、試料、たとえば、無細胞ＤＮＡの試料などの中に存在する可能性があり、すなわち、アレル頻度が一般的に約１００％、５０％または０％である従来のＳＮＰ遺伝子型判定と比較して、有意に５０％未満で（たとえば、０．１％から＞２０％の範囲に）あるマイナーアレル頻度に存在する。当業者は、本発明の組成物及び方法が一塩基多様体（ＳＮＶ）、短い（たとえば、４０塩基対（ｂｐ）未満の）挿入、及び欠失（インデル）を含む変異の他のタイプと、発癌遺伝子融合を含むゲノム再編成とを検出する際にまた有用であることを認識するであろう。
【００７３】
ある一定の実施形態において、本明細書に記載される本発明の組成物及び／または方法は、１つ以上のＤＮＡ標的領域のコピー数における変化を検出する、識別する、観察する、及び／または明らかにするために有用であり、これらをすることができ、これらをすることに適しており、及び／またはこれらをすることができ、このコピー数における変化は、試料からの全ゲノムＤＮＡの、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２％未満、または約０．１％未満に存在する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、試料からの全ゲノムＤＮＡの、約０．０１％から約１００％、約０．０１％から約５０％、及び／または約０．１％から約２０％の間に存在する１つ以上のＤＮＡ標的領域のコピー数における変化を検出する、識別する、観察する、及び／または明らかにするために有用であり、これらをすることが可能であり、これらをするのに適しており、及び／またはこれらのことをすることができる。
【００７４】
特定の実施形態を図１に図示される概念的なフレームワークによって表す。図１において、各遺伝子を縦列によって表し、各患者試料を横列として表す。いずれかの所与のゲノムＤＮＡ試料内に、各個々の遺伝子について計数される断片数は、ある程度のばらつきを有し、そしてその関心のいずれかの所与のＤＮＡ領域、たとえば、遺伝子などについて、他の試料中のＤＮＡ標的領域へ正規化されたカウントに関して有意な断片カウント偏差としてコピー数における撹乱を検出する。このようなアッセイは、試料内で遺伝子ごとの断片カウントプロファイルが再現性のあることを要求し、また試料ごとのカウントプロファイルは同等性が高いことを要求する。アッセイ要件の両方は、良好なシグナル対ノイズカウント識別を要求する。
【００７５】
いくつかの実施形態は、図２に示されるように、シグナル対ノイズ比を増すことに寄与するアッセイ要素がゲノムインプット、プローブ数、及びシーケンシング深度であることを企図する。
【００７６】
特定の実施形態では、ｃｆＤＮＡの遺伝子解析方法は、ｃｆＤＮＡライブラリを生成及び増幅すること、ｃｆＤＮＡライブラリにおけるゲノム当量数を決定すること、ならびに１つ以上のゲノム標的遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施することを含む。
【００７７】
特定の実施形態は、本明細書に記載される方法及び組成物のいずれかが、ゲノムＤＮＡ、たとえば、細胞ＤＮＡまたはｃｆＤＮＡなどを使用して、遺伝子状態、遺伝子条件、遺伝性疾患、遺伝子モザイク現象、胎児診断、父子鑑定、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植監視を効率的に解析する、検出する、診断する、及び／または監視するための使用に効果的であり、そこで試料中の全ゲノムＤＮＡのすべて、または一部のみが関心特徴、たとえば、遺伝子損傷、変異、一塩基多様体（ＳＮＶ）などを含むことを企図する。いくつかの実施形態において、関心特徴は、疾患または状態と関連する遺伝子特徴である。たとえば、有意な腫瘍変異は、試料、たとえば、ｃｆＤＮＡの試料などの中に存在する可能性があり、アレル頻度が一般的に約１００％、５０％または０％である従来のＳＮＰ遺伝子型判定と比較して、有意に５０％未満で（たとえば、０．１％から＞２０％の範囲に）あるマイナーアレル頻度に存在する。
【００７８】
ある一定の実施形態において、本明細書に記載される本発明の組成物及び／または方法は、１つ以上のＤＮＡ標的領域の遺伝子損傷を検出する、識別する、観察する、及び／または明らかにするために有用であり、これらをすることが可能であり、これらをすることに適し、及び／またはこれらをすることができ、１つ以上のＤＮＡ標的領域のこの遺伝子損傷は、試料からの全ゲノムＤＮＡの、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２％未満、または約０．１％未満に存在する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、試料からの全ゲノムＤＮＡの、約０．０１％から約１００％、約０．０１％から約５０％、及び／または約０．１％から約２０％の間に存在する１つ以上のＤＮＡ標的領域の遺伝子損傷を検出する、識別する、観察する、及び／または明らかにするために有用である、これらをすることが可能である、これらをするのに適している、及び／またはこれらをすることができる。
【００７９】
１．ＤＮＡライブラリの生成
特定の実施形態において、本明細書に企図される遺伝子解析方法は、末端修復ＤＮＡを生成するために１つ以上の末端修復酵素によって処置するｃｆＤＮＡまたは断片化細胞ゲノムＤＮＡを含むＤＮＡライブラリを生成すること、及びＤＮＡライブラリを生成するために末端修復ＤＮＡの各末端に１つ以上のアダプタを付着させることを備える。
【００８０】
ゲノムＤＮＡ
特定の実施形態において、本明細書で企図される方法及び組成物は、ゲノムＤＮＡをアナライトとして使用して、コピー数における変化を効率的に解析、検出、診断、及び／または監視するように設計される。ある一定の実施形態において、コピー数解析は、試験試料、たとえば、組織診などの生体試料などから得られるゲノムＤＮＡからゲノムＤＮＡライブラリを生成することによって実施される。ある一定の実施形態において、ゲノムＤＮＡは、循環または無細胞ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡは、細胞ゲノムＤＮＡである。
【００８１】
ある一定の実施形態において、骨髄、食道、胃、十二指腸、直腸、結腸、回腸、膵臓、肺、肝臓、前立腺、脳、神経、髄膜組織、腎組織、子宮内膜組織、子宮頸部組織、乳房、リンパ節、筋肉、及び皮膚を含むが、これらに限定されない、組織試料、または組織から得られる組織診からゲノムＤＮＡを取得する。ある一定の実施形態において、組織試料は、腫瘍、または疑わしい腫瘍の組織診である。特定の実施形態において、腫瘍は、癌性である、または癌性であると疑われる。特定の実施形態において、組織試料は、癌細胞、または癌性であると疑われる細胞を含む。
【００８２】
細胞からの、または細胞から構成される生体組織からのゲノムＤＮＡを精製する方法は、当該技術分野において周知であり、当業者は、組織、及び組織を取得する条件に応じて、最適な手順または市販のキットを認識するであろう。いくつかの実施形態は、組織からの細胞ＤＮＡを精製することにより、たとえば、化学的方法及び物理的方法によって、細胞ＤＮＡを曝露するために細胞破砕または細胞溶解を必要とすることを企図し、これらの化学的方法及び物理的方法は、組織試料を配合する、粉砕する、または超音波処理すること、細胞溶解にも機能する界面活性剤またはサーファクタントを加えることによって、膜脂質を除去し、任意選択で、たとえば、プロテアーゼを加えることなどによって、タンパク質を除去すること、たとえば、ＲＮａｓｅを加えることなどによって、ＲＮＡを除去すること、ならびにたとえば、細胞溶解ステップ中に使用される界面活性剤、タンパク質、塩類及び試薬類からの、ＤＮＡ精製などである。たとえば、エタノールまたはイソプロパノールによる、沈殿によって、またフェノール−クロロホルム抽出によって、ＤＮＡ精製を実施することができる。
【００８３】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるようにゲノムＤＮＡライブラリを取得する、生成する、作製する、形成する、及び／または産生する前に、またはこれらをする間に、組織及び／または細胞から取得される細胞ＤＮＡを断片化する。当業者は、ＤＮＡ断片化についていくつかの適切な技術があることを理解し、次世代シーケンシングを有するが、これに限定されない、ＤＮＡシーケンシングについてゲノムＤＮＡライブラリを生成するために、細胞ＤＮＡを断片化するために適切な技術を認識し、識別することが可能である。ある一定の実施形態は、物理的断片化、酵素的断片化、及び化学的せん断を有するが、これらに限定されない、方法によってライブラリを生成するために、適切な、及び／または十分な長さの断片に細胞ＤＮＡを断片化することが可能であることを企図する。
【００８４】
物理的断片化は、音響学的せん断、超音波処理、及び流体力学的せん断を有するが、これらに限定されないことが可能である。いくつかの実施形態において、物理的断片化によって細胞ＤＮＡを断片化する。特定の実施形態では、音響学的せん断または超音波処理によって、細胞ＤＮＡを断片化する。特定の実施形態は、音響学的せん断及び超音波処理が細胞ＤＮＡをせん断するために使用される共通の物理的方法であることを企図する。Ｃｏｖａｒｉｓ（登録商標）機器（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）は、ＤＮＡを１００から５ｋｂ  ｂｐで破壊するための音響装置である。またＣｏｖａｒｉｓは、メイトペアライブラリについて、試料を６から２０ｋｂで処理するチューブ（ｇＴｕｂｅ）を製造する。Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（登録商標）（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ，ＮＪ）は、クロマチン、ＤＮＡをせん断し、組織を撹乱するために利用される超音波処理装置である。わずかな量のＤＮＡを１５０から１ｋｂの長さでせん断することが可能である。Ｄｉｇｉｌａｂ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）からのＨｙｄｒｏｓｈｅａｒは、ＤＮＡをせん断するために流体力を利用する。またＮｅｂｕｌｉｚｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して、圧縮空気を用いて液体を微粒化し、ＤＮＡを１００から３ｋｂ断片に数秒でせん断することが可能である。噴霧化は、低コストであるが、このプロセスは、元の試料からの細胞ＤＮＡの約３０％の減少を引き起こすことがある。ある一定の実施形態において、超音波処理によって、細胞ＤＮＡを断片化する。
【００８５】
酵素的断片化は、制限エンドヌクレアーゼ、たとえば、ＤＮａｓｅ  Ｉによる処置、または非特異的ヌクレアーゼによる処理を含むが、これらに限定されないことが可能である。いくつかの実施形態において、酵素的断片化によって細胞ＤＮＡを断片化する。特定の実施形態において、制限エンドヌクレアーゼによる処置によって、細胞ＤＮＡを断片化する。いくつかの実施形態において、非特異的ヌクレアーゼによる処置によって、細胞ＤＮＡを断片化する。ある一定の実施形態において、トランスポサーゼによる処置によって、細胞ＤＮＡを断片化する。ある一定の実施形態は、細胞ＤＮＡを小片にせん断する酵素的方法がＤＮＡｓｅ  Ｉ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−Ｔ７  Ｅｎｄｏ  Ｉ及び非特異的ヌクレアーゼの組み合わせ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ（Ｖｖｎ）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）の  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ、及びＮｅｘｔｅｒａ  ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含むことを企図する。非特異的ヌクレアーゼ及びＴ７Ｅｎｄｏの組み合わせは、相乗的に機能し、非特異的ニック及びカウンタニックを産生し、ニック部位から８ヌクレオチド以下を解離する断片を生成する。タグメンテーションは、アダプタを二本鎖ＤＮＡ上で同時に断片化し、挿入するトランスポサーゼを使用する。
【００８６】
化学的断片化は、加温及び二価の金属カチオンによる処置を有することが可能である。いくつかの実施形態において、化学的断片化によってゲノムＤＮＡを断片化する。特定の実施形態は、ゲノムＤＮＡに対向するように長いＲＮＡ断片の粉砕のために化学的せん断をより一般的に使用することを企図する。化学的断片化は、二価の金属カチオン（マグネシウムまたは亜鉛）によってＤＮＡの加温消化を通して一般的に実施される。インキュベーション時間を増加させる、または減少させることによって、ＤＮＡ断片の長さを調整することが可能である。
【００８７】
特定の実施形態において、本明細書で企図される方法及び組成物は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）をアナライトに使用して、コピー数における変化を効率的に解析、検出、診断、及び／または監視するように設計される。ｃｆＤＮＡのサイズ分布は、約１５０ｂｐから約１８０ｂｐ断片の範囲である。ｃｆＤＮＡの断片化は、エンドヌクレアーゼ及び／またはエキソヌクレアーゼ活性の結果であり得るものであり、この断片化により、正確で信頼性の高いロバストなｃｆＤＮＡ解析に対する困難な課題が提示される。ｃｆＤＮＡ解析に関するもう１つの課題は、血流における半減期が約１５分程度と短いことである。いかなる特定の理論にも拘泥されることは望まないが、本発明は、その一部として、ｃｆＤＮＡの解析が「リキッドバイオプシー」に類似するものであり、現在の生体プロセスのリアルタイムスナップショットであることを企図している。
【００８８】
さらに、ｃｆＤＮＡは、細胞内に見出されず、また生物学的流体及び便試料を含むが、これらに限定されない、複数の適切な供給源から得ることができるため、解析される組織への直接アクセスなどの、次世代シーケンシング解析を困難にする既存の制限を受けない。
【００８９】
特定の実施形態においてｃｆＤＮＡを単離するための好適な供与源となる生物学的流体の例示的な例は、以下に限定するものではないが、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼液、尿、唾液、粘液、及び汗が挙げられる。特定の実施形態では、生物学的流体は血液または血漿である。
【００９０】
ある一定の実施形態では、市販されているキット及び当業者に知られた他の方法を使用して、患者の生物学的流体から、または過去に取得し、任意選択により安定化させた生物学的試料（例えば、凍結及び／または酵素キレート剤（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、または２価カチオンに特異的な他のキレート剤を含むが、これに限定されない）による安定化）から、直接ｃｆＤＮＡを単離することができる。
【００９１】
（ａ）末端修復ｃｆＤＮＡの生成
特定の実施形態において、ゲノムＤＮＡライブラリを生成することは、単離されたｃｆＤＮＡまたは断片化細胞ＤＮＡの末端修復を備える。断片化ｃｆＤＮＡまたは細胞ＤＮＡを末端修復酵素によって処理し、平滑末端、５’−オーバーハング、または３’−オーバーハングによって、末端修復ｃｆＤＮＡを生成する。いくつかの実施形態において、末端修復酵素は、たとえば産生することが可能である。いくつかの実施形態において、末端修復ｃｆＤＮＡまたは細胞ＤＮＡは、平滑末端を含有する。いくつかの実施形態では、末端修復細胞ＤＮＡまたはｃｆＤＮＡは、平滑末端を含有するように処理される。いくつかの実施形態では、末端修復ｃｆＤＮＡまたは細胞ＤＮＡの平滑末端は、単一塩基対オーバーハングを含有するように、さらに修飾される。いくつかの実施形態では、平滑末端を含む末端修復ｃｆＤＮＡまたは細胞ＤＮＡは、アデニン（Ａ）／チミン（Ｔ）オーバーハングを含有するようにさらに処理されることが可能である。いくつかの実施形態では、平滑末端を含む末端修復ｃｆＤＮＡまたは細胞ＤＮＡは、単一塩基対オーバーハングとしてアデニン（Ａ）／チミン（Ｔ）オーバーハングを含有するように、さらに処理されることが可能である。いくつかの実施形態では、末端修復ｃｆＤＮＡまたは細胞ＤＮＡは、非鋳型化３’オーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、末端修復ｃｆＤＮＡまたは細胞ＤＮＡは、３’オーバーハングを含むように処理される。一部の実施形態では、末端修復ｃｆＤＮＡまたは細胞ＤＮＡは、３’オーバーハングを含有するように末端トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）で処理される。一部の実施形態では、ＴｄＴによりＧテールを加えてもよい。いくつかの実施形態では、末端修復ｃｆＤＮＡまたは細胞ＤＮＡは、オーバーハング末端を含有するように、任意の公知の制限酵素(例えば、Ｓａｕ３Ａ酵素など)による部分的消化を用いて処理される。
【００９２】
（ｂ）末端修復ｃｆＤＮＡへのアダプタ分子の付着
特定の実施形態において、ｃｆＤＮＡライブラリを生成することは、１つ以上のアダプタを末端修復ｃｆＤＮＡの各末端へ付着させることを備える。本発明は、部分的に、ｃｆＤＮＡライブラリ中の多数のゲノム当量を収容するように設計されるアダプタモジュールを企図する。アダプタモジュールは、ｃｆＤＮＡライブラリに存在するゲノム当量数を測定するように構成され、伸長によって、シーケンシングアッセイの感度を使用して、配列変異を識別した。
【００９３】
本明細書に使用されるように、用語「アダプタ」及び「アダプタモジュール」は、互換的に使用され、また増幅領域、試料タグ領域、及びアンカー領域の少なくとも３つの要素を含むポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、アダプタは、増幅領域、試料タグ領域、及びアンカー領域を含む。いくつかの実施形態において、このアダプタは、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）をも含む。特定の実施形態では、このアダプタは、１つ以上の増幅領域、１つ以上の試料タグ領域、１つ以上のＵＭＩ、及び／または１つ以上のアンカー領域を含む。いくつかの実施形態において、このアダプタは、５’から３’の順に、増幅領域、試料タグ領域、ＵＭＩ、及びアンカー領域を含む。特定の実施形態において、このアダプタは、５’から３’の順に、増幅領域、試料タグ領域、ＵＭＩ、及びアンカー領域を含む。ある一定の実施形態において、ＵＭＩは、試料タグ領域内に含まれ、このアダプタは、５’から３’の順に、増幅領域、組み込まれた試料タグ／ＵＭＩ領域、及びアンカー領域を含む。
【００９４】
本明細書に使用されるように、用語「増幅領域」は、ＰＣＲ増幅についてプライマー認識部位として機能することが可能であるポリヌクレオチド配列を含むアダプタ分子の元素を指す。特定の実施形態では、アダプタは、ゲノムＤＮＡライブラリのシングルプライマー増幅について１つ以上のプライマー認識配列を含有する増幅領域を含む。いくつかの実施形態では、増幅領域は、ゲノムＤＮＡライブラリのシングルプライマー増幅について、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１０個超のプライマー認識配列を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、増幅領域は、約５から５０の間のヌクレオチド長、１０から４５の間のヌクレオチド長、１５から４０の間のヌクレオチド長、または２０から３０の間のヌクレオチド長にある。いくつかの実施形態では、増幅領域は、１０個のヌクレオチド、１１個のヌクレオチド、１２個のヌクレオチド、１３個のヌクレオチド、１４個のヌクレオチド、１５個のヌクレオチド、１６個のヌクレオチド、１７個のヌクレオチド、約１８個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、２２個のヌクレオチド、２３個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２５個のヌクレオチド、２６個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、２８個のヌクレオチド、２９個のヌクレオチド、３０個のヌクレオチド、３１個のヌクレオチド、３２個のヌクレオチド、３３個のヌクレオチド、３４個のヌクレオチド、３５個のヌクレオチド、３６個のヌクレオチド、３７個のヌクレオチド、３８個のヌクレオチド、３９個のヌクレオチド、または４０個以上のヌクレオチドである。特定の実施形態において、増幅領域は、２５ヌクレオチド長にある。
【００９６】
本明細書に使用されるように、用語「試料タグ」または「試料タグ領域」は、互換的に使用され、それが由来した試料と同様に特定のＤＮＡ断片をユニークに識別するポリヌクレオチド配列を含むアダプタ素子を指す。
【００９７】
ある一定の実施形態において、試料タグ領域は、約３から５０の間のヌクレオチド長、約３から２５の間のヌクレオチド長、または約５から１５の間のヌクレオチド長にある。いくつかの実施形態では、試料タグ領域は、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、約１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長以上にある。
【００９８】
ある一定の実施形態では、アダプタは、ＵＭＩ増倍管を含み、そこでＵＭＩ増倍管は、少なくとも１ヌクレオチド長、少なくとも２ヌクレオチド長、少なくとも３ヌクレオチド長、少なくとも４ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド長、少なくとも６ヌクレオチド長、少なくとも７ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド長、少なくとも９ヌクレオチド長、または少なくとも１０ヌクレオチド長にある。
【００９９】
ある一定の実施形態において、ＵＭＩ増倍管の各ヌクレオチド位置は、アデニン、グアニン、シトシン、またはチミンのいずれかを含むことが可能である。したがって、いくつかの実施形態において、ｎ個のヌクレオチドを含むＵＭＩ増倍管は、ｎ４個の可能なヌクレオチド配列のいずれかを含むことが可能である。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、１ヌクレオチド長にあり、４個の可能な配列のうちの１個を含む。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、２ヌクレオチド長にあり、１６個の可能な配列のうちの１個を含む。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、３ヌクレオチド長にあり、６４個の可能な配列のうちの１個を含む。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、４ヌクレオチド長にあり、２５６個の可能な配列のうちの１個を含む。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、５ヌクレオチド長にあり、１，０２４個の可能な配列のうちの１個を含む。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、６ヌクレオチド長にあり、４，０９６個の可能な配列のうちの１個を含む。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、７ヌクレオチド長にあり、１６，３８４個の可能な配列のうちの１個を含む。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、８ヌクレオチド長にあり、６５，５３３６個の可能な配列のうちの１個を含む。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、９ヌクレオチド長にあり、２６２，１４４個の可能な配列のうちの１個を含む。いくつかの実施形態において、ＵＭＩ増倍管は、１０以上のヌクレオチド長にあり、１，０４８，５７６個以上の可能な配列のうちの１個を含む。
【０１００】
特定の実施形態において、アダプタは、ＵＭＩ増倍管を含み、そこでＵＭＩ増倍管は、試料タグ領域（図５Ａ）に隣接する、またはこの試料タグ領域内に含まれる。試料タグに隣接する、または試料タグ内に含まれるＵＭＩ増倍管の例示的な例を図５Ｂに示す。図５Ｂにおいて、隣接するＵＭＩ増倍管（縦列の最上部及び最下部）、または試料タグ（中間の７縦列）内に組み込まれるＵＭＩ増倍管を含む、８−ｍｅｒ試料タグ領域を示す。いくつかの実施形態において、そのアダプタは、８ヌクレオチド長にある試料タグ、及び３ヌクレオチド長にあり、６４個の可能な配列のうちの１個を含むＵＭＩ増倍管を含み、そこでＵＭＩ増倍管は、試料タグ領域に隣接する、またはこの試料タグ領域内に含まれる。いくつかの実施形態において、同一のプロセスは、アダプタ全長をゲノム断片の他の末端に付着させる。
【０１０１】
特定の実施形態では、アダプタモジュールは、１つ以上のアンカー配列を含む。本明細書に使用されるように、「アンカー領域」及び「アンカー配列」は、互換的に使用され、パートナーオリゴヌクレオチドをハイブリダイズするヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、以下の３つの特性を有する。（１）各アンカー配列は、伸長内の各部位に４個の可能なＤＮＡ塩基のそれぞれを合わせて表す２個以上のアンカー配列のファミリーの部分であり、この特徴、平衡した塩基表現は、特定の実施形態においてシーケンシングリードにおける適切な塩基呼び出しを較正するために有用である。（２）各アンカー配列は、４個の可能な塩基のうちの２個のみから構成され、そしてこれらは、いずれかの数の、また等しい数のＡ＋Ｃ、または等しい数のＧ＋Ｔであるように特異的に選択され、２個の塩基のみから形成されるアンカー配列は、アンカー配列が適切なアダプタ機能を妨げる二次構造の形成に関与する可能性を減少させる。そして（３）各アンカー配列は、等しい数のＡ＋ＣまたはＧ＋Ｔから構成され、各アンカー配列は、１セットの４個中のすべての他のアンカー配列と同一の融解温度及び二本鎖安定性を大まかに共有する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、アンカー配列は、１から５０の間のヌクレオチド長にある。いくつかの実施形態において、アンカー配列は、４から４０の間のヌクレオチド長にある。ある一定の実施形態において、アンカー領域は、５から２５の間のヌクレオチド長にある。特定の実施形態では、アンカー領域は、少なくとも４ヌクレオチド長、少なくとも６ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長、少なくとも１２ヌクレオチド長、少なくとも１４ヌクレオチド長、または少なくとも１６ヌクレオチド長にある。特定の実施形態において、アンカー領域は、１０ヌクレオチド長にある。
【０１０３】
特定の実施形態では、付着ステップは、「タグ付き」ゲノムＤＮＡライブラリを生成するためにアダプタモジュールを末端修復ｃｆＤＮＡまたは細胞ＤＮＡに付着させる／ライゲーションすることを備える。いくつかの実施形態では、単一アダプタモジュールを用いる。いくつかの実施形態では、２種、３種、４種、または５種のアダプタモジュールを用いる。いくつかの実施形態では、同一配列のアダプタモジュールを、断片化した末端修復ＤＮＡの各末端に付着させる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、複数種のアダプタを末端修復細胞または無細胞ゲノムＤＮＡ断片に付着させる。これらの複数種のアダプタのそれぞれは、ｃｆＤＮＡまたは細胞ＤＮＡライブラリの増幅について１個以上の増幅領域と、ｃｆＤＮＡまたは細胞ゲノムＤＮＡ断片の同定、及び個々の試料の同定について１個以上の試料タグ領域と、ＤＮＡシーケンシングについて１個以上の配列とを含むことができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、複数種のアダプタは、試料の末端修復細胞または無細胞ゲノムＤＮＡ断片に付着し、複数種のアダプタは、同一のヌクレオチド配列の増幅領域をすべて含む。
【０１０６】
ある一定の実施形態において、試料からのゲノムＤＮＡを、複数のアダプタと付着させ、これらの複数のアダプタは、他の試料からのゲノムＤＮＡ断片に付着するアダプタ中の試料タグ領域の他の配列とすべて異なる試料タグ配列を含む。
【０１０７】
特定の実施形態において、複数種のアダプタを試料からの末端修復細胞または無細胞ゲノムＤＮＡ断片に付着させ、これらの複数のアダプタは、２から１０，０００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個、５から５，０００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個、２５から１，０００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個、５０から５００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個、１００から４００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個、または２００から３００個の間のヌクレオチド配列のうちの１個を含有する１個以上の試料タグ領域をすべて含む。いくつかの実施形態において、各アダプタの試料タグ領域は、８ヌクレオチド長にあり、複数のアダプタの各試料タグ領域は、２４０個のヌクレオチド配列のうちの１個を含む。
【０１０８】
ある一定の実施形態において、複数種のアダプタは、試料からの末端修復細胞または無細胞ゲノムＤＮＡ断片に付着し、複数種のアダプタの試料タグ領域は、１、２、３、４または４を上回るハミング距離によって互いに異なるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ハミング距離は、２である。
【０１０９】
特定の実施形態において、試料のゲノムＤＮＡ断片に付着する複数のアダプタの試料タグ領域は、８ヌクレオチド長にあり、２のハミング距離によって互いに異なる２４０個のヌクレオチド配列のうちの１個を含む。
【０１１０】
ある一定の実施形態において、試料タグ領域は、個々のゲノムＤＮＡ断片を識別するように、また個々の試料、すなわち、ゲノムライブラリ供給源を識別するように機能する。たとえば、試料に付着する複数のアダプタの試料タグが２４０個の可能な配列のうちの１個を含むときに、各試料は、２４０個の可能なタグのうちの１個を含むと識別され、各試料は、２のハミング距離（一方のタグを他方のタグに変化させるために２塩基変化を必要とすることを意味する）によっていずれかの他の試料から分離する、２４０個のタグの１セットを受容する。これらの同一のタグを使用し、クローン多様性を列挙するので、それらは、配列タグとしても機能する、すなわち、ゲノムＤＮＡ断片を識別する。可能な配列タグの多様性をさらに増すために、ＵＭＩ増倍管を加えることができる。たとえば、３塩基の６４個の可能な組み合わせからなる３個のヌクレオチドを含むアダプタ領域にＵＭＩ増倍管を加えることが可能である。加えて、複数のアダプタは、１個を上回るアンカー配列を含むことが可能である。たとえば、複数のアダプタは、同時に使用される４個の異なるアンカー配列を含むことができる。また、エラーを少なくするために試料多重化解除中に、これらのアンカー配列を使用することができる。
【０１１１】
図４は、第一生成アダプタ（図４Ａ及び図４Ｂ）と本発明のアダプタ（図４Ｃから図４Ｅ）との間の例示的な比較を示す。図４Ａ及び図４Ｂは、４０ｎｔの長さにあり、別々のＰＣＲ増幅配列、配列タグ、及び試料タグからなる第一生成アダプタの例を示す。ここで、試料は、固定配列（配列タグ）によって識別され、この固定配列は、試料からＤＮＡライブラリを生成するために使用されるすべてのアダプタ上に存在する。個々のゲノム断片は、別々の、また別個の配列（配列タグ）によって識別される。図４Ｃから図４Ｅは、本発明からのアダプタの例示的な例を示す。示される例示的なアダプタは、４７ヌクレオチド長にあり、配列タグは、試料タグと混合する。３塩基の６４個の可能な組み合わせからなる、追加の３ｎｔの配列、ＵＭＩ増倍管がある。１０ｎｔのアンカー配列は、４個の異なる別個の配列のうちの１個である。
【０１１２】
したがって、例示的な例（図４Ｃから図４Ｅを参照する）において、単一の試料に関連して使用される１セットのアダプタは、２４０個の試料タグ配列を含み、これらの試料タグ配列は、４セットの試料タグ配列に分割され、各セットは、６０個のタグ（各ヌクレオチド、Ａ、Ｃ、Ｔ及びＧについて１個）を含むことが可能である。したがって、６０個のタグの各セットは、４個のアンカー配列のうちの１個に特異的である。合計で、１試料あたり２４０個の可能な試料タグ配置のプールが可能である。具体的に、この事態において、これらの２４０個の試料タグ配列を６０個の配列の４セットに分割し、この各セットは、特異的なアンカー領域を対象とする。したがって、試料ＩＤは、８個のヌクレオチド試料タグからの配列情報だけではなく、関連したアンカー配列情報をも含む。加えて、リード内の配列の位置を固定するので、試料タグ及びアンカー配列は、下流の考察用に封入体フィルタを通すため、シーケンシングリード内に固定位置を有さなければならない。さらに、ＵＭＩ増倍管の封入体は、配列タグ多様性を２４０から２４０×６４＝１５，３６０個の可能な配列タグまで増加させる。
【０１１３】
本明細書に企図される１個以上のアダプタの付着を当業者に知られている方法によって実施することができる。特定の実施形態において、本明細書に企図される１個以上のアダプタを、平滑末端を含む末端修復ｃｆＤＮＡに付着させる。ある一定の実施形態において、本明細書に企図される１個以上のアダプタは、用いられる付着方法に適切である相補的な末端を含む末端修復ｃｆＤＮＡに付着する。ある一定の実施形態において、本明細書企図される１個以上のアダプタは、３’オーバーハングを含む末端修復ｃｆＤＮＡに付着する。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ断片を複数のアダプタに付着させることは、末端修復ｃｆＤＮＡまたは細胞ＤＮＡ断片を、アンカー領域の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドに付着させるステップを備える。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、全アンカー領域を含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、パートナー鎖によって二本鎖にされる５’リン酸化付着鎖を含むＤＮＡ二本鎖であり、そこでパートナー鎖は、化学修飾による付着からその３’末端で遮断され、そこで付着鎖は、ゲノムＤＮＡ断片に付着する。ある一定の実施形態において、つぎにアンカー領域の少なくとも一部と付着するＤＮＡ断片を、ＤＮＡオリゴヌクレオチドによってアニールし、アダプタ配列の全長を符号化する。特定の実施形態において、１個以上のポリヌクレオチドキナーゼ、１個以上のＤＮＡリガーゼ、及び／または１個以上のＤＮＡポリメラーゼを、ゲノムＤＮＡ断片、及びＤＮＡオリゴヌクレオチドに加え、アダプタ配列の全長を符号化する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡリガーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼである。ある一定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼである。特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔポリメラーゼ全長である。
【０１１５】
図６は、複数のアダプタを修復されたＤＮＡ断片の３’末端に付着させる例示的な方法を示す。第一ステップにおいて、アンカー配列をゲノム断片の３’末端に付着させる。このステップにおいて、アンカー部分は、ＤＮＡ二本鎖であり、このＤＮＡ二本鎖において、１０ヌクレオチドの５’リン酸化「付着鎖」は、８ヌクレオチド「パートナー鎖」によって二本鎖にされ、これらのヌクレオチドパートナー鎖は、化学修飾による付着からその３’末端で遮断される。アンカー二本鎖は、リン酸化／遮断末端上の平滑末端であるので、平滑末端ゲノム断片に付着することが可能である。つぎのステップにおいて、全アダプタ配列を符号化するオリゴヌクレオチドのプールを最初のアンカー配列にアニールする。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、及びＢｓｔポリメラーゼの全長の混合作用は、上部の鎖について図示されるようにライゲーションを介してこのオリゴヌクレオチドを付着させ、最初のアンカー配列をＤＮＡ重合によって下部の鎖上に伸長させ、アダプタ配列の全長を完成させる。同一のプロセスを使用して、アダプタ全長をゲノム断片の５’末端に付着させることができる。
【０１１６】
２．ＤＮＡライブラリ増幅
特定の実施形態において、本明細書に企図される遺伝子解析方法は、ゲノムＤＮＡライブラリ、たとえば、細胞ＤＮＡライブラリまたはｃｆＤＮＡライブラリなどの増幅を有し、１個のＤＮＡクローンライブラリ、若しくは複数のＤＮＡクローンの１個のライブラリ、たとえば、１個のｃｆＤＮＡクローンライブラリ、若しくは複数のｃｆＤＮＡクローンの１個のライブラリ、または１個の細胞ＤＮＡクローンライブラリ、若しくは複数の細胞ＤＮＡクローンの１個のライブラリなどを生成する。ＤＮＡライブラリの各分子は、末端修復ＤＮＡ断片の各末端に付着するアダプタを含み、各アダプタは、１つ以上の増幅領域を含む。いくつかの実施形態において、異なるアダプタを末端修復ｃｆＤＮＡの異なる末端に付着させる。特定の実施形態において、異なるアダプタを末端修復細胞ＤＮＡの異なる末端に付着させる。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、同じアダプタをＤＮＡ断片の両方の末端に付着させる。末端修復ＤＮＡの両方の末端への同一アダプタの付着により、シングルプライマー配列によるＰＣＲ増幅が可能である。特定の実施形態において、アダプタが付着したｃｆＤＮＡライブラリの一部を、シングルプライマー配列駆動増幅による標準的なＰＣＲ手法を用いて増幅することになる。一実施形態では、単一プライマー配列は、約２５ヌクレオチドであり、任意選択により、標準的なイオン強度条件下で≧５５℃の推定Ｔｍを有する。
【０１１８】
特定の実施形態において、ピコグラム単位の初期ゲノムＤＮＡライブラリ、たとえば、細胞ＤＮＡライブラリまたはｃｆＤＮＡライブラリを、マイクログラム単位のＤＮＡクローンに増幅、つまり１０，０００倍に増幅する。増幅産物の量は、当該技術分野で公知の方法(例えば、Ｑｕｂｉｔ２．０またはＮａｎｏｄｒｏｐ装置での定量化)を用いて測定されることができる。
【０１１９】
３．ゲノム当量数の決定
様々な実施形態において、ゲノムＤＮＡの遺伝子解析方法は、ＤＮＡクローンライブラリにおけるゲノム当量数を決定することを備える。本明細書で使用する「ゲノム当量」という用語は、各ライブラリにおけるゲノムコピー数を指す。本明細書で企図する組成物及び方法が遭遇する重要な課題は、遺伝子配列における希少な遺伝子突然変異または相違を検出し解析するのに十分なアッセイ感度を達成することである。試料ごとに基づいてアッセイ感度の値を決定するために、シーケンシングライブラリ内に存在するゲノム当量数を測定することにより、各試料内に存在する異なる別々の配列の数を測定する。感度を確立するため、ゲノム当量数を試料ライブラリごとに測定しなければならない。
【０１２０】
ゲノム当量数は、ｑＰＣＲアッセイにより、またはシーケンシング実施後のバイオインフォマティクスに基づくカウントにより決定されることができる。臨床試料のプロセスフローでは、ゲノム当量のｑＰＣＲ測定は、ＤＮＡライブラリ、たとえば、ｃｆＤＮＡライブラリまたはゲノムＤＮＡライブラリなどにＱＣステップとして使用される。配列解析の前にアッセイ感度の期待値を確立させ、試料に対応するＤＮＡクローンライブラリがゲノム当量の要求深度を欠く場合は、その試料を解析から除外することが可能になる。最終的には、バイオインフォマティクスに基づくゲノム当量カウントも使用してゲノム当量を特定する。そのため、それぞれの所与のＤＮＡクローンライブラリに対するアッセイ感度及び偽陰性推定値も特定される。
【０１２１】
実験的ｑＰＣＲアッセイ及び統計的カウントアッセイは十分に相互関係を有するべきである。シーケンシングによってＤＮＡクローンライブラリにおける配列深度が明らかにならない場合は、ＤＮＡクローンライブラリの再処理及び／または追加的なシーケンシングが必要となり得る。
【０１２２】
一実施形態では、細胞ＤＮＡまたはｃｆＤＮＡクローンライブラリにおけるゲノム当量を定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを用いて決定する。特定の実施形態では、既知濃度の標準的なライブラリを使用して標準曲線を構築し、この得られた標準曲線にｑＰＣＲアッセイを適合させ、適合度からゲノム当量の値を導き出す。本発明者らは、ゲノム中の共通配列、たとえば、反復配列などへ特異的にハイブリダイズする一方のプライマーと、アダプタ中のプライマー結着部位へ結着する他方のプライマーとを含むｑＰＣＲ「反復に基づく」アッセイがアダプタの特異的なプライマー（ｃｆＤＮＡクローンの両方の末端上に存在する）だけを使用する方法と比較してゲノム当量中で８倍増加を測定したことを発見した。反復に基づくアッセイにより測定されるゲノム当量数は、より一貫したライブラリ間パフォーマンスをもたらし、またゲノム当量のｑＰＣＲ推定値とシーケンシング実行時にバイオインフォマティクス的にカウントしたタグ当量との間のアライメントをより良好なものにする。
【０１２３】
本明細書で企図する反復に基づくゲノム当量アッセイでの使用に好適な、反復の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、短散在型核内反復配列（ＳＩＮＥ）（例えば、Ａｌｕ反復）、長散在型反復配列（ＬＩＮＥ）（例えば、ＬＩＮＥ１、ＬＩＮＥ２、ＬＩＮＥ３）、マイクロサテライト反復配列（例えば、短いタンデム反復（ＳＴＲ）、単純反復配列（ＳＳＲ））、及び哺乳類散在型反復（ＭＩＲ）が挙げられる。
【０１２４】
一実施形態では、反復はＡｌｕ反復である。
【０１２５】
４．定量的遺伝子解析
様々な実施形態では、ゲノムＤＮＡ、たとえば、ゲノム細胞またはｃｆＤＮＡなどの遺伝子解析方法は、ＤＮＡライブラリクローンにおける１つ以上の標的遺伝子座の定量的遺伝子解析を含む。定量的遺伝子解析は、以下のステップの１つ以上、または全てを含む：標的遺伝子座を含むＤＮＡクローンのキャプチャ；キャプチャした標的遺伝子座の増幅；キャプチャし増幅した標的遺伝子座のシーケンシング；及び得られたシークエンスリードのバイオインフォマティクス解析。本明細書に使用されるように、用語「ＤＮＡライブラリクローン」は、ＤＮＡライブラリ断片を指し、そこでアダプタ及びゲノムＤＮＡ断片の組み合わせは、ユニークＤＮＡ配列（たとえば、その別のＤＮＡライブラリクローンと区別されることが可能であるＤＮＡ配列）をもたらす。
【０１２６】
（ａ）標的遺伝子座のキャプチャ
本発明は、その一部として、より大きなプローブの効率及び信頼性を保持するように設計され、ただしより小さなＤＮＡ断片を含むゲノムＤＮＡライブラリ、たとえば、ｃｆＤＮＡクローンライブラリなどにおける情報価値のない配列の生成を最小限にとどめる、キャプチャプローブモジュールを企図する。本明細書に使用されるような「キャプチャプローブ」または「キャプチャプローブモジュール」は、互換的に使用され、キャプチャプローブ配列及びテール配列を含むポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、キャプチャプローブモジュール配列またはその一部は、１つ以上のシーケンシングプライマーのためのプライマー結合部位として働く。
【０１２７】
特定の実施形態では、キャプチャプローブモジュールはキャプチャプローブを含む。本明細書で使用する「キャプチャプローブ」とは、特異的なＤＮＡ標的領域とハイブリダイズすることができる領域を指す。いくつかのの実施形態において、キャプチャプローブは、細胞ＤＮＡから構築されるゲノムＤＮＡライブラリによって使用される。特定の実施形態において、キャプチャプローブは、ｃｆＤＮＡから構築されるゲノムＤＮＡライブラリによって使用される。ｃｆＤＮＡの平均サイズが約１５０から約１７０ｂｐであり、また高度に断片化されるため、ある一定の実施形態は、対象となるＤＮＡ標的領域を調べるための高密度及び比較的短いキャプチャプローブの使用を含む本明細書で企図される組成物及び方法を対象とする。いくつかの実施形態において、キャプチャプローブは、すべての染色体セグメントにわたり均一な密度で分布する、ＤＮＡ標的領域にハイブリダイズすることが可能である。１セットのこれらのようなキャプチャプローブは、本明細書において「染色体安定性プローブ」と称される。染色体コピー数（たとえば、染色体倍数性）のゲノムワイド測定を提供するために、これらの染色体安定性プローブを使用して、コピー数多型をゲノムワイドスケール上で調べる。
【０１２８】
高密度キャプチャプローブの使用に関する特定の懸念の１つは、概して、キャプチャプローブが特異的な「配列規則」を用いて設計されていることである。たとえば、冗長配列の領域、または極端に塩基組成物に偏る領域は、キャプチャプローブを設計する際に一般的に排除される。しかし、発明者らは、キャプチャプローブの設計規則が柔軟性に欠けることで、プローブの性能に対する実質的影響が生じるわけではないことを発見した。対照的に、位置的な制約により厳密に選ばれたキャプチャプローブは、標的上の配列情報を提供し、標的外のマッピング不可能なリードキャプチャはごくわずかしか示さず、少数の例外を除いて均一で有用で標的上にリードをもたらす。その上、近接したプローブ間隔での高冗長性は、時として低性能となるキャプチャプローブを補って余りあるものである。
【０１２９】
特定の実施形態では、１つの標的領域を複数のキャプチャプローブが標的とし、任意の２つ以上のキャプチャプローブは、当該標的領域に対し、互いの１０ヌクレオチド以内、互いの１５ヌクレオチド以内、互いの２０ヌクレオチド以内、互いの２５ヌクレオチド以内、互いの３０ヌクレオチド以内、互いの３５ヌクレオチド以内、互いの４０ヌクレオチド以内、互いの４５ヌクレオチド以内、若しくは互いの５０ヌクレオチド以内、またはそれより多いヌクレオチド以内、さらにこれらの間にある全てのヌクレオチド長で結合するように設計される。
【０１３０】
一実施形態では、キャプチャプローブは、約２５ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約２７ヌクレオチド、約２８ヌクレオチド、約２９ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３１ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約３３ヌクレオチド、約３４ヌクレオチド、約３５ヌクレオチド、約３６ヌクレオチド、約３７ヌクレオチド、約３８ヌクレオチド、約３９ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４１ヌクレオチド、約４２ヌクレオチド、約４３ヌクレオチド、約４４ヌクレオチド、または約４５ヌクレオチドである。
【０１３１】
一実施形態では、キャプチャプローブは、約１００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、または約１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、キャプチャプローブは、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、若しくは約４００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、またはこれらの間にある任意の範囲である。
【０１３２】
特定の実施形態では、キャプチャプローブは６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、キャプチャプローブは、実質的に６０ヌクレオチドより小さいが、同じＤＮＡ標的領域を標的とする６０ヌクレオチドのキャプチャプローブと同等に、同様に、またはより良好にハイブリダイズする。あるいくつかの実施形態では、キャプチャプローブは４０ヌクレオチドである。
【０１３３】
あるいくつかの実施形態では、キャプチャプローブモジュールはテール配列を含む。本明細書で使用する「テール配列」という用語は、キャプチャプローブモジュールの５’末端におけるポリヌクレオチドを指し、これは特定の実施形態においてプライマー結合部位として働き得る。特定の実施形態では、シーケンシングプライマーは、テール領域内のプライマー結合部位に結合する。
【０１３４】
特定の実施形態では、テール配列は、約５〜約１００ヌクレオチド、約１０〜約１００ヌクレオチド、約５〜約７５ヌクレオチド、約５〜約５０ヌクレオチド、約５〜約２５ヌクレオチド、または約５〜約２０ヌクレオチドである。あるいくつかの実施形態では、第３の領域は、約１０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約４０ヌクレオチド、約２０〜約３０ヌクレオチド、若しくは約２０ヌクレオチド、または間にある任意の数のヌクレオチドである。
【０１３５】
特定の実施形態では、テール配列は、約３０ヌクレオチド、約３１ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約３３ヌクレオチド、約３４ヌクレオチド、約３５ヌクレオチド、約３６ヌクレオチド、約３７ヌクレオチド、約３８ヌクレオチド、約３９ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチドである。
【０１３６】
様々な実施形態では、キャプチャプローブモジュールは、キャプチャプローブとハイブリダイズするタグ付き及び／または増幅したゲノムＤＮＡライブラリ（たとえば、細胞またはｃｆＤＮＡライブラリ）における１つ以上のキャプチャした断片の単離及び／または精製を可能にする、特定のメンバーの結合対を含む。特定の実施形態では、キャプチャプローブモジュールは、ビオチンまたは他の好適なハプテン（例えば、ジニトロフェノール、ジゴキシゲニン）に共役する。
【０１３７】
様々な実施形態では、キャプチャプローブモジュールを、タグ付きの、任意選択により増幅したＤＮＡライブラリとハイブリダイズして、複合体を形成する。一部の実施形態では、多機能のキャプチャプローブモジュールは、ＤＮＡライブラリにおける特異的なゲノム標的領域と実質的にハイブリダイズする。
【０１３８】
ハイブリダイゼーションまたはハイブリダイズ条件には、２つのヌクレオチド配列が安定した複合体を形成する（例えば、タグ付きＤＮＡライブラリ及びキャプチャプローブモジュールが安定したタグ付きＤＮＡライブラリ−キャプチャプローブモジュール複合体を形成する）任意の反応条件が含まれ得る。これらのような反応条件は、当技術分野において周知であり、当業者であれば、これらのような条件は、例えばアニーリング温度を低くし、長さの短いキャプチャプローブを用いるというように、必要に応じて、かつ本発明の範囲内で改変することができることを理解することになる。キャプチャプローブ複合体の第２の領域が、タグ付きＤＮＡライブラリの領域に対し、１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列一致度、相同性、または相補性を示す場合、実質的なハイブリダイゼーションが起こり得る。
【０１３９】
特定の実施形態では、キャプチャプローブは約４０ヌクレオチドであり、約４４℃〜約４７℃の最適アニーリング温度を有する。
【０１４０】
あるいくつかの実施形態では、本明細書で企図する方法は、タグ付きｃｆＤＮＡライブラリ−キャプチャプローブモジュール複合体を単離することを含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ複合体を単離する方法は当業者に周知であり、当業者が適切とみなす任意の方法を本発明の方法で用いることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００７−２０１２）。特定の実施形態では、ビオチン−ストレプトアビジン単離技術を用いて複合体を単離する。
【０１４１】
特定の実施形態では、単離したタグ付きＤＮＡライブラリ断片−キャプチャプローブモジュール複合体からの１本鎖の３’末端除去を企図している。あるいくつかの実施形態では、当該方法は、１本鎖の３’末端を除去するための、単離したタグ付きＤＮＡライブラリ−多機能キャプチャプローブモジュール複合体の３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素処理を含む。
【０１４２】
あるいくつかの他の実施形態では、当該方法は、単離したタグ付きＤＮＡライブラリ断片を鋳型として利用して多機能キャプチャプローブの５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実施することを含む。
【０１４３】
ある一定の他の実施形態において、これらの方法は、５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合、及びＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協調作用を通じて、ハイブリッドキャプチャプローブ−単離したタグ付きＤＮＡ標的分子、たとえば、タグ付きｃｆＤＮＡ標的分子またはタグ付き細胞ＤＮＡ標的分子などを創出することを含む。
【０１４４】
単離したタグ付きＤＮＡライブラリ−多機能キャプチャプローブモジュール複合体の３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素処理用に様々な酵素を用いることができる。３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素活性を示し、特定の実施形態で使用することができる好適な酵素の例示的例は、限定するものではないが、Ｔ４またはエキソヌクレアーゼＩ、ＩＩＩ、Ｖを含む（Ｓｈｅｖｅｌｅｖ  ＩＶ，Ｈｕｂｓｃｈｅｒ  Ｕ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３（５）：３６４−７６（２００２）も参照）。特定の実施形態において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備える酵素は、Ｔ４ポリメラーゼである。特定の実施形態では、３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素活性を示し、プライマー鋳型伸長が可能な酵素を使用することができ、これには、例えばＴ４またはエキソヌクレアーゼＩ、ＩＩＩ、Ｖ（同上）が含まれる。
【０１４５】
一部の実施形態では、本明細書で企図する方法は、上記または本明細書の他の箇所で論じられている３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素処理をした複合体に、シーケンシング及び／またはＰＣＲを実施することを含む。特定の実施形態では、ハイブリッド核酸分子を生成するために、キャプチャプローブ分子のテール部分をコピーする。一実施形態では、生成したハイブリッド核酸分子は、キャプチャプローブモジュールへハイブリダイズ可能な標的領域と、キャプチャプローブモジュールテール配列の相補配列とを含む。
【０１４６】
特定の実施形態では、遺伝子解析は、ａ）１個以上のキャプチャプローブモジュールを複数のゲノムＤＮＡライブラリクローン中の１個以上の標的遺伝子座にハイブリダイズして、１個以上のキャプチャプローブモジュール−ＤＮＡライブラリクローン複合体を形成すること；ｂ）ａ）からの１個以上のキャプチャプローブモジュール−ＤＮＡライブラリクローン複合体を単離すること；ｃ）ステップｂ）からの１個以上の単離したキャプチャプローブモジュール−ＤＮＡライブラリクローン複合体を酵素処理すること；ｄ）ｃ）からの酵素処理した複合体にＰＣＲを実施することであって、増幅したハイブリッド核酸分子を生成するためにキャプチャプローブ分子のテール部分をコピーし、増幅したハイブリッド核酸分子がキャプチャプローブにハイブリダイズ可能な標的ゲノム遺伝子座位内の標的配列と、キャプチャプローブモジュールテール配列の相補配列とを含む、実施すること；及びｅ）ｄ）からの増幅したハイブリッド核酸分子上に定量的遺伝子解析を実施すること、を含む。
【０１４７】
特定の実施形態では、特異的な標的遺伝子座のコピー数を決定する方法が企図され、この方法は、ａ）１個以上のキャプチャプローブモジュールを複数のＤＮＡライブラリクローンにおける１個以上の標的遺伝子座にハイブリダイズして、１個以上のキャプチャプローブモジュール−ＤＮＡライブラリクローン複合体を形成すること；ｂ）ａ）から１個以上のキャプチャプローブモジュール−ＤＮＡライブラリクローン複合体を単離すること；ｃ）ステップｂ）からの１個以上の単離したキャプチャプローブモジュール−ＤＮＡライブラリクローン複合体を酵素処理すること；ｄ）ｃ）からの酵素処理した複合体上にＰＣＲを実施することであって、増幅したハイブリッド核酸分子を生成するためにキャプチャプローブ分子のテール部分をコピーし、増幅したハイブリッド核酸分子がキャプチャプローブにハイブリダイズ可能な標的遺伝子座内の標的配列と、キャプチャプローブモジュールテール配列の相補配列とを含む、実施すること；ｅ）ｄ）における増幅したハイブリッド核酸分子のＰＣＲ増幅を実施すること；及びｆ）ｅ）におけるＰＣＲ反応を定量化することであって、この定量化によって、特異的な標的領域のコピー数を決定することができる、定量化することを備える。
【０１４８】
一実施形態では、ステップｃ）の酵素処理は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて、ｂ）からの１個以上のキャプチャプローブモジュール−ＤＮＡライブラリクローン複合体上に３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素処理を実施して１本鎖の３’末端を除去すること；５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合、及びＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協調作用を通じて、１個以上のハイブリッドキャプチャプローブ−ｃｆＤＮＡライブラリクローン分子を創出すること；または、複合体内の単離したＤＮＡクローンを鋳型として用いてキャプチャプローブの５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実施すること、を含む。
【０１４９】
一実施形態では、ステップｃ）の酵素処理は、複合体内の単離したＤＮＡクローンを鋳型として用いてキャプチャプローブの５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を実施することを含む。
【０１５０】
特定の実施形態では、当業者に周知である任意の標準的なＰＣＲ反応条件を用いてＰＣＲを実施することができる。ある一定の実施形態において、ｅ）におけるＰＣＲ反応は、２個のＰＣＲプライマーを用いる。一実施形態では、ｅ）におけるＰＣＲ反応は、標的遺伝子座内の反復にハイブリダイズする第１のＰＣＲプライマーを用いる。特定の実施形態では、ｅ）におけるＰＣＲ反応は、標的遺伝子座／テール接合部におけるハイブリッド核酸分子にハイブリダイズする第２のＰＣＲプライマーを用いる。あるいくつかの実施形態では、ｅ）におけるＰＣＲ反応は、標的遺伝子座にハイブリダイズする第１のＰＣＲプライマーを用い、第２のＰＣＲプライマーは、標的遺伝子座／テール接合部における増幅したハイブリッド核酸分子にハイブリダイズする。特定の実施形態では、プライマーの少なくとも１個以上のヌクレオチドは標的遺伝子座にハイブリダイズし、プライマーの少なくとも１個以上のヌクレオチドはテール配列にハイブリダイズするように、第２のプライマーは、標的遺伝子座／テール接合部にハイブリダイズする。
【０１５１】
あるいくつかの実施形態では、ステップｅ）から取得する増幅したハイブリッド核酸分子を配列決定し、配列を水平方向にアライメントを取る。すなわち、参照配列に対してではなく、互いに対しアライメントを取る。特定の実施形態では、ａ）からｅ）のステップを１個以上のキャプチャプローブモジュールで１回以上反復する。キャプチャプローブモジュールは、同じであっても異なっていてもよく、標的遺伝子座のいずれかのｃｆＤＮＡ鎖を標的にするように設計され得る。一部の実施形態では、キャプチャプローブが異なる場合、これらのキャプチャプローブは、タグ付きｃｆＤＮＡクローンライブラリにおける標的遺伝子座内のオーバーラップまたは隣接する標的配列にハイブリダイズする。一実施形態では、高密度キャプチャプローブ計画を使用し、この計画で複数のキャプチャプローブは、標的遺伝子座にハイブリダイズし、複数のキャプチャプローブのそれぞれは、タグ付きＤＮＡクローンライブラリ中の標的遺伝子座にハイブリダイズする任意の他のキャプチャプローブから約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００ｂｐ以上（間にある全ての距離を含む）内の標的遺伝子座にハイブリダイズする。
【０１５２】
一部の実施形態において、この方法は、標的遺伝子座ごとに２個のキャプチャプローブモジュールを用いて実施されることができ、この一方が標的領域の上流にある「ワトソン」鎖（非コード鎖または鋳型鎖）にハイブリダイズし、一方が標的領域の下流にある「クリック」鎖（コード鎖または非鋳型鎖）にハイブリダイズする。
【０１５３】
特定の実施形態では、本明細書で企図する方法は、標的遺伝子座ごとに、任意の組合せでワトソン鎖またはクリック鎖にハイブリダイズする任意の数のキャプチャプローブモジュール、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上のキャプチャプローブモジュールを用いて、さらに複数回実施することができる。一部の実施形態では、取得した配列は、複数の相違のいずれかを識別するために相互にアライメントを取ることができる。
【０１５４】
あるいくつかの実施形態では、複数の標的遺伝子座を、１つ以上のキャプチャプローブモジュールを用いた１回の反応で、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、１００００、５００００、１０００００、５０００００またはそれ以上調べる。
【０１５５】
（ｂ）シーケンシング
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析は、本明細書の上記の他の箇所で論じているように複数のハイブリッド核酸分子を配列決定して、複数のユニークシーケンシングリードを取得するのに十分なシーケンシング深度を生成することを含む。用語「ユニークリード」または「ユニークゲノム配列」（ＵＧＳ）は、本明細書に互換的に使用され、個々の冗長リードを合わせて「ファミリー」にグループ化することによって識別される。これらの冗長リードは、個々のＵＭＩＥを共有する（たとえば、同一リードコード、及び同一ＤＮＡ配列の開始位置をゲノム配列内で共有する）配列リードであり、単一の付着事象に由来するため、増幅由来の互いの「同胞」である。冗長リードのファミリーを代表する単一のコンセンサスをユニークリードまたはＵＧＳとして進める。それぞれのユニークリードまたはＵＧＳは、ユニーク付着事象とみなされる。特定のキャプチャプローブに対応するユニークリードの合計は、その特定のキャプチャプローブについての「生のゲノム深度」（ＲＧＤ）と称される。各キャプチャプローブは、ファミリーにグループ化することにより全リードから計算的に抽出される１セットのユニークリードをもたらす。次に所与の試料についてのユニークリード（たとえば、試料についての生のゲノム深度）を、プローブごとに観察される全てのユニークリードの平均値として計算する。ユニークリードは、それぞれがユニークゲノムＤＮＡクローンから導き出されなければならないため、重要である。それぞれのユニークリードは、一倍体当量のゲノムＤＮＡのインプット及び解析を表す。ユニークリードの和は、解析した一倍体ゲノムの和である。そして解析したゲノムの数は、シーケンシングアッセイの感度を定義する。非限定的な例として、ユニークリードの平均カウントが１００ゲノム当量である場合、この特定のアッセイは１００のうちの１つの変異リード、すなわち１％を検出することができる感度を有する。これを下回るいかなる観察も正当ではない。
【０１５６】
明らかなコピー数の変化（たとえば、ノイズの多いプローブの例）がある場合は、試料平均値の計算に使用するデータセットから除外する。本明細書において、「ノイズの多いプローブ」は、大規模な１セットの同一の試料中のユニークリードの非常にばらつきのある数（たとえば、１２から１６個の試料複製物中のユニークリードの非常にばらつきのある数）をキャプチャするプローブを指す。いくつかの実施形態において、ノイズの多いプローブと関連するユニークリード数は、５０％以上までの試料についてのユニークリードの平均数と比較して増加する。いくつかの実施形態において、ノイズの多いプローブと関連するユニークリード数は、５０％以上までの試料についてのユニークリードの平均数と比較して減少する。いくつかの実施形態において、特定の解析において使用される、約２％から約４％のプローブをノイズの多いプローブとして識別し、計算から除外し、所与の試料についてユニークリードの平均数を決定する。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、シーケンシングリードを「標的上リード」または「標的外リード」のいずれか一方として識別する。標的上リードは、ゲノムライブラリを作製するために使用されるキャプチャプローブの近くにマッピングするゲノムＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態において、各ゲノム配列を特異的なキャプチャプローブへ物理的に結合し、ゲノムセグメント及びキャプチャプローブの両方の配列を統合情報として決定し、開始座標が対応するキャプチャプローブの３’末端の４００ｂｐ内に、またより一般的に２００ｂｐ内に、マッピングされるいずれかのゲノム配列として標的上リードを定義する。キャプチャプローブに関して、≧５００の塩基対の位置に基準ゲノムにアライメントを取るゲノム配列を含む（及び完全に異なる染色体にマッピングすることがさらに多い）ものとして標的外リードを定義する。
【０１５８】
特定の実施形態では、定量的遺伝子解析は複数の試料に由来するハイブリッド核酸分子の多重シーケンシングを含む。
【０１５９】
様々な実施形態では、定量的遺伝子解析は、それぞれが第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列を含む、１つ以上または複数のタグ付きＤＮＡライブラリのクローンを取得することであって、第１のＤＮＡ配列が標的とする遺伝子座内に配列を含み、第２のＤＮＡ配列がキャプチャプローブ配列を含む、取得すること；１つ以上のクローンに対し、対合した末端のシーケンシング反応を実施し１つ以上のシーケンシングリードを取得すること、または、１つ以上のクローンに対し、約１００、２００、３００、４００、５００またはそれ以上のヌクレオチドを上回る単一の長いシーケンシングリードを取得するシーケンシング反応を実施することであって、リードが第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列の両方を識別するのに十分である、実施すること；ならびに、１つ以上のクローンのシーケンシングリードをシーケンシングリードのプローブ配列に従って順序付けまたはクラスター化すること、を含む。
【０１６０】
（ｃ）バイオインフォマティクス解析
様々な実施形態では、定量的遺伝子解析は、シーケンシングリードのバイオインフォマティクス解析を含む。バイオインフォマティクス解析により、シーケンシングのための組成物または方法が不在の場合に実施されるいかなる純粋な精神的解析も除外される。あるいくつかの実施形態では、バイオインフォマティクス解析には、以下に限定するものではないが、配列アライメント、ゲノム当量解析、一塩基多様体（ＳＮＶ）解析、遺伝子コピー数多型（ＣＮＶ）解析、染色体コピー数の測定、及び遺伝子損傷の検出が含まれる。特定の実施形態では、バイオインフォマティクス解析は、ｃｆＤＮＡクローンライブラリにおいて解析するゲノム当量数の定量化、標的遺伝子座の遺伝子状態の検出、標的遺伝子座における遺伝子損傷の検出、及び標的遺伝子座内のコピー数変動の測定に有用である。
【０１６１】
配列アライメントは、配列リードと１つ以上のヒト参照ＤＮＡ配列との間で実施されることができる。特定の実施形態では、シーケンシングアライメントは、標的遺伝子座における遺伝子損傷の検出に使用することができ、遺伝子損傷の検出には、以下に限定するものではないが、ヌクレオチドのトランジション若しくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入若しくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合の検出が含まれる。原因または予後の指標である遺伝子損傷の検出は、特定の遺伝子の状態または疾患の診断、予後判定、処置、及び／または監視に有用であり得る。
【０１６２】
本明細書には、参照配列に対するアライメントの必要なしに実施されることができる配列アライメント解析の方法も企図されており、本明細書ではこの方法を水平配列解析と呼ぶ。このような解析は、本明細書で企図する方法または他の任意の方法によって生成した任意の配列に対し実施されることができる。特定の実施形態では、この配列解析は、本明細書で企図する方法によって取得したリードに対し、配列アライメントを実施することを含む。
【０１６３】
一実施形態では、ｃｆＤＮＡクローンライブラリにおけるゲノム当量は、シーケンシングの実施後にバイオインフォマティクスに基づくカウントを用いて決定される。各シーケンシングリードは、特定のキャプチャプローブと関連し、各キャプチャプローブに割り当てられたリードの集合体は、群にパースされる。群内において、個々のリードのセットは、ゲノム配列内で同じリードコード、及び同じＤＮＡ配列の開始位置を共有する。これらの個々のリードは、「ファミリー」にグループ化され、このファミリーを代表する単一のコンセンサスは、「ユニークリード」として進められる。ファミリーを構成した個々のリードのすべては、単一の付着事象に由来するため、これらは、互いに増幅由来の「同胞」である。それぞれのユニークリードは、ユニーク付着事象とみなされ、ユニークリードの和は、解析されるゲノム当量数に相当するとみなされる。
【０１６４】
ユニーククローンの数が、可能な配列組合せの総数に近づくにつれ、確率は、独立した事象により同じコード及び開始部位が創出されること、またこれらの独立した事象が不適切な形で１つのファミリーにグループ化されることを示す。最終結果は、解析ゲノム当量より少ない見積もりとなり、希少な変異リードは、同じ識別子を有する野生型リードと重複するという理由からシーケンシングエラーとして廃棄される場合がある。
【０１６５】
特定の実施形態では、ｃｆＤＮＡクローンライブラリの正確な解析を提供するため、解析ゲノム当量数は、可能なユニーククローン数の約１／１０、約１／１２、約１／１４、約１／１６、約１／１８、約１／２０、約１／２５またはそれ以下である。上記で概説されている手順が例示的なものに過ぎず、非限定的であることを理解されたい。
【０１６６】
一部の実施形態では、解析するゲノム当量数を増加させる必要があり得る。ゲノム当量の深度を拡大するため、少なくとも２つの解決策が企図されている。第１の解決策は、試料ごとに２つ以上のアダプタセットを使用することである。アダプタを組み合わせることにより、可能なクローンの総数を乗法的に拡大し、そのためゲノムインプットの無理のない限界を拡大することが可能である。第２の解決策は、リードコードを１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つ、またはそれ以上の塩基の分拡大することである。他の全てのリードコードから少なくとも２塩基の分異なる可能なリードコードの数は、４（ｎ−１）のスケールであり、式中、ｎはリードコード内の塩基の数である。したがって、非限定的な例において、リードコードが５ヌクレオチドであれば４（５−１）＝２５６であるから、追加的な塩基を含めることで、利用可能なレパートリーは追加塩基１つにつき４倍拡大する。
【０１６７】
一実施形態では、定量的遺伝子解析は、希少な一塩基多様体（ＳＮＶ）を識別するための、シーケンシングリードのバイオインフォマティクス解析を含む。
【０１６８】
次世代シーケンシングは、大まかに０．０２から０．０２％の固有のエラー率を有し、これは１／２００から１／５００のいずれかの塩基呼び出しが不正確であることを意味する。これより低い頻度（例えば、１０００配列当たり１の頻度）で発生する変異体及び他の突然変異を検出するため、分子アノテーション計画を発動する必要がある。非限定的な例として、標的配列キャプチャ技術を用いて５０００個のユニーク分子を解析すれば、＞５０，０００リードの十分なシーケンシング深度で、５０００ユニークリードの集合（各ユニークリードは、いずれもが同じリードコードを所持しているリードの「ファミリー」に属する）が生成されることになる。ファミリー内で発生するＳＮＶは、希少変異体としての候補である。この同じ変異体が２つ以上のファミリーで観察される場合、開始試料内に存在する希少変異体としての非常に有力な候補となる。これに対し、複数ファミリー内で散発的に生じる変異体は、シーケンシングエラーである可能性があり、１つ及び１つのみのファミリー内で生じる変異体は、希少であるかまたは生体外で生じる塩基変更（例えば、ＤＮＡ塩基の酸化またはＰＣＲにより導入されたエラー）の結果である。
【０１６９】
一実施形態では、ＳＮＶを検出する方法は、アッセイにおける所望の標的感度の１０倍以上のゲノムインプット（ゲノムまたはゲノム当量）を導入することを含む。非限定的な一例では、所望の感度が２％（１００のうち２）である場合、実験的標的は２０００ゲノムのインプットである。
【０１７０】
特定の実施形態では、シーケンシングデータのバイオインフォマティクス解析は、遺伝子の様相、状態または疾患、遺伝子モザイク、胎児検査、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断または監視、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植の監視に関連するＳＮＶの検出または識別に使用される。
【０１７１】
様々な実施形態では、コピー数決定解析の方法であって、それぞれが第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列を含む、１つ以上または複数のクローンを取得することを含み、第１のＤＮＡ配列が標的とする遺伝子座内に配列を含み、第２のＤＮＡ配列がキャプチャプローブ配列を含む、方法が提供される。関係する実施形態では、１つ以上のクローンに対し、対合した末端のシーケンシング反応を実施し、１つ以上のシーケンシングリードを取得する。別の実施形態では、１個以上のクローン上でシーケンシング反応を実施し、約１００個を上回るヌクレオチドの単一の長いシーケンシングリードを取得し、このリードは、第一ＤＮＡ配列及び第二ＤＮＡ配列の両方を識別するのに十分である。１つ以上のクローンのシーケンシングリードは、シーケンシングリードのプローブ配列に従って順序付けまたはクラスター化することができる。
【０１７２】
コピー数解析には、以下に限定するものではないが、所与のゲノムＤＮＡ試料で生じる特定の遺伝子または突然変異のコピー数を調べる解析が含まれ、またさらに、所与の遺伝子のコピー数、または所与の試料中の配列相違数の定量的決定も含まれ得る。特定の実施形態では、コピー数解析は、遺伝子の様相、状態または疾患、胎児検査、遺伝子モザイク、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断または監視、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植の監視に関連する遺伝子増幅の検出または識別に使用される。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、コピー数解析を使用して、染色体不安定性を測定する。これらのような実施形態において、染色体安定性プローブを含むキャプチャプローブセットを使用して、コピー数多型をすべての染色体セットにわたり均一な密度で決定する。コピー数解析を各染色体安定性プローブについて実施し、その後、染色体安定性プローブをそれらの染色体標的に従い順序付けする。これは、ゲノムにわたるコピー数減少または増加の視覚化を可能にし、染色体安定性の測定として機能することが可能である。
【０１７４】
特定の実施形態では、シーケンシングデータのバイオインフォマティクス解析は、標的遺伝子座における１個以上の配列または遺伝子損傷の検出または識別に使用されることができ、これらの検出または識別には、以下に限定するものではないが、ヌクレオチドのトランジション若しくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入若しくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合の検出が含まれる。原因または予後の指標である遺伝子損傷の検出は、特定の遺伝子の状態または疾患の診断、予後判定、処置、及び／または監視に有用であり得る。一実施形態では、遺伝子損傷は、遺伝子の様相、状態または疾患、胎児検査、遺伝子モザイク、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断または監視、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植の監視に関連する。
【０１７５】
Ｄ．定量的ＣＮＬアッセイの臨床応用
様々な実施形態では、本発明は、関心領域における、変異性変化、ＳＮＰ、転座、逆位、欠失、コピー数における変化、または他の遺伝的変異を検出することによって、被験体における状態または疾患を検出する、識別する、予測する、診断する、または監視する方法を企図する。
【０１７６】
Ｅ．定量的遺伝子解析の臨床応用
様々な実施形態では、本発明は、被験体における状態または疾患を検出、識別、予測、診断、または監視する方法を企図している。
【０１７７】
特定の実施形態では、被験体における遺伝子の様相、状態、または疾患を検出、識別、予測、診断、または監視する方法は、ＤＮＡクローンライブラリにおける１つ以上の標的遺伝子座の定量的遺伝子解析を実施して、１つ以上の標的遺伝子座での配列における変化を検出する、または識別することを含む。いくつかの実施形態において、この変化は、コピー数における変化である。
【０１７８】
１つの実施形態において、遺伝子状態、条件または疾患を検出する、識別する、予測する、診断する、または監視する方法は、細胞ＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを被験体の生体試料から単離する、または取得すること、細胞ＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを１個以上の末端修復酵素によって処置し、末端修復ＤＮＡを生成すること、１個以上のアダプタを末端修復ＤＮＡの各末端に付着させて、ゲノムＤＮＡライブラリを生成すること、ＤＮＡライブラリを増幅して、ＤＮＡクローンライブラリを生成すること、ＤＮＡクローンライブラリ中の遺伝子当量数を決定すること、及び１個以上の標的遺伝子座の定量的遺伝子解析をＤＮＡクローンライブラリ中で実施して、１つ以上の標的遺伝子座の、配列における変化、たとえば、ＳＮＰ、転座、逆位、欠失、またはコピー数における変化などを検出する、または識別することを備える。
【０１７９】
特定の実施形態において、遺伝性疾患、遺伝子モザイク現象、胎児検査、父子鑑定、薬物治療に対する応答の予測、医学的状態の診断または監視、マイクロバイオームプロファイリング、病原体スクリーニング、及び臓器移植の監視からなる群から選択される、遺伝子様相、または遺伝子の状態若しくは疾患を検出、識別、予測、診断、または監視する方法は、ゲノムＤＮＡを被験体の生体試料から単離する、または取得すること、ＤＮＡを１個以上の末端修復酵素によって処置して、末端修復ＤＮＡを生成すること、１個以上のアダプタを末端修復ＤＮＡの各末端に付着させて、ゲノムＤＮＡライブラリを生成すること、ゲノムＤＮＡライブラリを増幅して、ＤＮＡクローンライブラリを生成すること、ゲノム当量数をＤＮＡクローンライブラリ中で決定すること、及び１個以上の標的遺伝子座の定量的遺伝子解析をＤＮＡクローンライブラリ中で実施して、１個以上の標的遺伝子座で配列におけるヌクレオチドのトランジション若しくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入若しくは欠失、ゲノム再編成、コピー数における変化、または遺伝子融合を検出する、または識別することを備える。
【０１８０】
本明細書に企図される組成物及び方法によって検出される、識別される、予測される、診断される、または監視されることが可能である遺伝性疾患の例示的な例は、アルツハイマー病（ＡＰＯＥ１）、シャルコー・マリー・トゥース病、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、アンジェルマン症候群（ＵＢＥ３Ａ、ユビキチン−タンパク質リガーゼＥ３Ａ）、プラダー・ウィリー症候群（染色体１５中の領域）、βサラセミア（ＨＢＢ、β−グロビン）、ゴーシェ病（１型）（ＧＢＡ、グルコセレブロシダーゼ）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ、上皮クロライドチャネル）、鎌状赤血球症（ＨＢＢ、β−グロビン）、テイ・サックス病（ＨＥＸＡ、ヘキソサミニダーゼＡ）、フェニルケトン尿症（ＰＡＨ、フェニルアラニンヒドロリアーゼ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬＲ、低密度リポタンパク質受容体）、成人型嚢胞腎（ＰＫＤ１、ポリシスチン）、ハンチントン病（ＨＤＤ、ハンチンチン）、神経線維腫症Ｉ型（ＮＦ１、ＮＦ１腫瘍抑制遺伝子）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ、ミオトニン）、結節性硬化症（ＴＳＣ１、ツベリン）、軟骨形成不全（ＦＧＦＲ３、線維芽細胞増殖因子受容体）、脆弱Ｘ染色体症候群（ＦＭＲ１、ＲＮＡ結合タンパク質）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ、ジストロフィン）、血友病Ａ（Ｆ８Ｃ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子）、レッシュ・ナイハン症候群（ＨＰＲＴ１、ヒポキサンチングアニンリボシルトランスフェラーゼ１）、及び副腎白質ジストロフィー（ＡＢＣＤ１）を有するが、これらに限定されない。
【０１８１】
本明細書で企図される組成物及び方法によって検出される、識別される、予測される、診断される、または監視されることが可能である癌の例示的な例は、Ｂ細胞癌、例えば、多発性骨髄腫、黒色腫、乳癌、肺癌（非小細胞肺癌腫またはＮＳＣＬＣなど）、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｇｌａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ）、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織の癌、腺癌腫、炎症性筋線維芽細胞腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、結腸癌、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、軟部組織肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮細胞癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌腫、髄様癌腫、気管支癌腫、腎細胞癌腫、肝細胞癌、胆管癌腫、絨毛癌腫、セミノーマ、胎生期癌腫、ウィルムス腫瘍、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肝細胞癌腫、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、小細胞癌、本態性血小板血症、特発性骨髄化生、好酸球増加症候群、全身性肥満細胞症、一般的な過好酸球増加症、慢性好酸球性白血病、神経内分泌癌、カルチノイド腫瘍などを含むが、これらに限定されない。
【０１８２】
１つの実施形態において、遺伝子損傷は、Ｃｏｓｍｉｃデータベースで注釈がつけられた損傷（損傷及び配列データはオンラインで利用可能であり、ＣｏｓｍｉｃウェブサイトのＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓ  ｓｅｃｔｉｏｎからダウンロードされることが可能である）、またはＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓで注釈がつけられた損傷（損傷及び配列データはオンラインで利用可能であり、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓウェブサイトからダウンロードされることが可能である）である。
【０１８３】
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、または監視することができるがんに関連する１つ以上の遺伝子損傷を有する遺伝子の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＤＨ４Ａ１、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＡＦ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ６、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｃｌｏｒｆ１４４、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＥＢＰＡ、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＣＴＮＮＢ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＤＰＹＤ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＥＰＨＸ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＣＣ２、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＯＸＰ４、ＧＡＴＡ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２４、ＧＳＴＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＨＯＸＡ３、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＺＦ１、ＩＮＨＢＡ、ＩＲＳ２、ＩＴＰＡ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＮ１Ｂ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＬＬ、ＭＰＬ、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＨＦＲ、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＫＸ２−１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＱＯ１、ＮＲＡＳ、ＮＲＰ２、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ３、ＰＡＫ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＫＨＤ１、ＰＬＣＧ１、ＰＲＫＤＣ、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＬＣ１９Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＴＢＸ２２、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＰＭＴ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＹＭＳ、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＭＰＳ、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、及びＷＴ１が挙げられる。
【０１８４】
特定の実施形態では、遺伝子損傷は、ヌクレオチドのトランジション若しくはトランスバージョン、ヌクレオチドの挿入若しくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む。
【０１８５】
一実施形態では、遺伝子損傷は、ＡＬＫ遺伝子の３’コード領域を別の遺伝子に融合させる遺伝子融合である。
【０１８６】
一実施形態では、遺伝子損傷は、ＡＬＫ遺伝子の３’コード領域をＥＭＬ４遺伝子に融合させる遺伝子融合である。
【０１８７】
本明細書で企図される組成物及び方法によって検出される、識別される、予測される、診断される、または監視されることが可能である胎児検査に適している条件の例示的な例は、ダウン症候群（トリソミー２１）、エドワード症候群（トリソミー１８）、パトー症候群（トリソミー１３）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）、トリプルＸ症候群、ＸＹＹ症候群、トリソミー８、トリソミー１６、ターナー症候群（ＸＯ）、ロバートソン転座、ディジョージ症候群、及びウォルフ・ヒルショルン症候群を含むが、これらに限定されない。
【０１８８】
本明細書で企図される組成物及び方法によって検出される、識別される、予測される、診断される、または監視されることが可能である父子鑑定に適しているアレルの例示的な例は、Ｄ２０Ｓ１０８２、Ｄ６Ｓ４７４、Ｄ１２ＡＴＡ６３、Ｄ２２Ｓ１０４５、Ｄ１０Ｓ１２４８、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ１１Ｓ４４６３、Ｄ４Ｓ２３６４、Ｄ９Ｓ１１２２、Ｄ２Ｓ１７７６、Ｄ１０Ｓ１４２５、Ｄ３Ｓ３０５３、Ｄ５Ｓ２５００、Ｄ１Ｓ１６２７、Ｄ３Ｓ４５２９、Ｄ２Ｓ４４１、Ｄ１７Ｓ９７４、Ｄ６Ｓ１０１７、Ｄ４Ｓ２４０８、Ｄ９Ｓ２１５７、アメロゲニン、Ｄ１７Ｓ１３０１、Ｄ１ＧＡＴＡ１１３、Ｄ１８Ｓ８５３、Ｄ２０Ｓ４８２、及びＤ１４Ｓ１４３４のうちの１６個以上を含むが、これらに限定されない。
【０１８９】
本明細書で企図される組成物及び方法によって検出される、識別される、予測される、診断される、または監視されることが可能である薬物治療に対する応答を予測するのに適している遺伝子の例示的な例は、以下の遺伝子、ＡＢＣＢ１（ＡＴＰ−結着カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー１）、ＡＣＥ（酵素を変換するアンジオテンシンＩ）、ＡＤＨ１Ａ（アルコール脱水素酵素１Ａ（クラスＩ）、アルファポリペプチド）、ＡＤＨ１Ｂ（アルコール脱水素酵素１Ｂ（クラスＩ）、ベータポリペプチド）、ＡＤＨ１Ｃ（アルコール脱水素酵素１Ｃ（クラスＩ）、ガンマポリペプチド）、ＡＤＲＢ１（アドレナリン作動性、ベータ−１−、受容体）、ＡＤＲＢ２（アドレナリン作動性、ベータ−２−、受容体、表面）、ＡＨＲ（アリール炭化水素受容体）、ＡＬＤＨ１Ａ１（アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、メンバーＡ１）、ＡＬＯＸ５（アラキドン酸５−リポキシゲナーゼ）、ＢＲＣＡ１（乳癌１、早期発症型）、ＣＯＭＴ（カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）、ＣＹＰ２Ａ６（チトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＡ、ポリペプチド６）、ＣＹＰ２Ｂ６（チトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＢ、ポリペプチド６）、ＣＹＰ２Ｃ９（チトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＣ、ポリペプチド９）、ＣＹＰ２Ｃ１９（チトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＣ、ポリペプチド１９）、ＣＹＰ２Ｄ６（チトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＤ、ポリペプチド６）、ＣＹＰ２Ｊ２（チトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＪ、ポリペプチド２）、ＣＹＰ３Ａ４（チトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、ポリペプチド４）、ＣＹＰ３Ａ５（チトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、ポリペプチド５）、ＤＰＹＤ（ジヒドロピリミジン脱水素酵素）、ＤＲＤ２（ドーパミン受容体Ｄ２）、Ｆ５（凝固因子Ｖ）、ＧＳＴＰ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼパイ）、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡ還元酵素）、ＫＣＮＨ２（電位依存性カリウムチャネル、サブファミリーＨ（ｅａｇ関連の）、メンバー２）ＫＣＮＪ１１（内向き整流性カリウムチャネル、サブファミリーＪ、メンバー１１）、ＭＴＨＦＲ（５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＮＡＤＰＨ））、ＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ脱水素酵素、キノン１）、Ｐ２ＲＹ１（プリン受容体Ｐ２Ｙ、Ｇ−タンパク質共役型、１）、Ｐ２ＲＹ１２（プリン受容体Ｐ２Ｙ、Ｇ−タンパク質共役型、１２）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＳＣＮ５Ａ（ナトリウムチャネル、電位依存性、Ｖ型、アルファ（ＱＴ延長症候群３））、ＳＬＣ１９Ａ１（溶質輸送体ファミリー１９（葉酸トランスポーター）、メンバー１）、ＳＬＣＯ１Ｂ１（溶質輸送体有機アニオン輸送体ファミリー、メンバー１Ｂ１）、ＳＵＬＴ１Ａ１（スルホトランスフェラーゼファミリー、サイトゾル、１Ａ、フェノールが好ましい、メンバー１）、ＴＰＭＴ（チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンターゼ）、ＵＧＴ１Ａ１（ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１）、ＶＤＲ（ビタミンＤ（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）受容体）、ＶＫＯＲＣ１（ビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体、サブユニット１）のうちの１個以上を含むが、これらに限定されない。
【０１９０】
本明細書で企図する組成物及び方法により検出、識別、予測、診断、または監視することができる医学的状態の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、脳卒中、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、心疾患、心臓発作、アンギナ、粥状動脈硬化、及び高血圧が挙げられる。
【０１９１】
本明細書で企図する組成物及び方法によりスクリーニングすることができる病原体の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、細菌、真菌、及びウイルスが挙げられる。
【０１９２】
本明細書で企図する組成物及び方法によりスクリーニングすることができる細菌種の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ種、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられる。
【０１９３】
本明細書で企図する組成物及び方法によりスクリーニングすることができる真菌種の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ種、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｏｃｃｉｃｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、皮膚糸状菌、Ｔｉｎｅａ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ種、Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ種、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ種、Ｅｘｓｅｒｏｐｈｉｌｕｍ種、またはＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種が挙げられる。
【０１９４】
本明細書に企図される組成物及び方法によりスクリーニングされることができるウイルスの例示的な例としては、インフルエンザＡ（たとえば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１（鳥インフルエンザ）などの）、インフルエンザＢ、インフルエンザＣウイルス、肝炎Ａウイルス、肝炎Ｂウイルス、肝炎Ｃウイルス、肝炎Ｄウイルス、肝炎Ｅウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群のうちのいずれかのウイルス、腸管アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目、リッサウイルス（たとえば、狂犬病、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス１＆２、及びオーストラリアコウモリウイルス）、エフェメロウイルス、ベジクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス属（たとえば、単純ヘルペスウイルス１及び２型、水痘帯状発疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型及び８型）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型、及びＨＩＶ２型を含むヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス科（たとえば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ））、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｉａｅ）（たとえば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候性出血熱を引き起こすウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、フィロウイルス科（フィロウイルス）（エボラ出血熱及びマールブルグ出血熱を含む）、フラビウイルス科（キャサヌール森林病ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎を引き起こすウイルス含む）及びパラミクソウイルス科（ヘンドラウイルス及びニパウイルスを含む）、大痘瘡及び小痘瘡（痘瘡）、アルファウイルス属（たとえば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、西ナイルウイルス、ならびにいずれかの脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｌｔｉｓ）を引き起こすウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９５】
本明細書で企図される組成物及び方法によって検出される、識別される、予測される、診断される、または監視されることが可能である移植患者における臓器移植を監視するのに適している遺伝子の例示的な例は、以下の遺伝子、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、及びＨＬＡ−ＤＱのうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。
【０１９６】
特定の実施形態では、バイオインフォマティクス解析は、ｃｆＤＮＡクローンライブラリにおいて解析されるゲノム当量数の定量化；標的遺伝子座における遺伝子変異体の検出；標的遺伝子座における突然変異の検出；標的遺伝子座における遺伝子融合の検出、または標的遺伝子座におけるコピー数変動の測定のために使用される。
【０１９７】
Ｆ．コンパニオン診断
さまざまな実施形態において、遺伝性疾患についてのコンパニオン診断を提供し、このコンパニオン診断は、ゲノムＤＮＡを被験体の生体試料から単離する、または取得すること、ＤＮＡを１個以上の末端修復酵素によって処置して、末端修復ＤＮＡを生成すること、１個以上のアダプタを末端修復ＤＮＡの各末端へ付着させて、ＤＮＡライブラリを生成すること、ＤＮＡライブラリを増幅して、ＤＮＡクローンライブラリを生成すること、ＤＮＡクローンライブラリ中のゲノム当量数を決定すること、及びＤＮＡクローンライブラリ中の遺伝性疾患と関連する１個以上のバイオマーカーの定量的遺伝子解析を実施することを備え、そこで１個以上のバイオマーカーのうちの少なくとも１個の検出、またはこれらの検出の失敗は、被験体を遺伝性疾患について処置するかどうかを示す      。いくつかの実施形態では、このＤＮＡはｃｆＤＮＡである。特定の実施形態では、このＤＮＡは細胞ＤＮＡである。
【０１９８】
本明細書で使用する「コンパニオン診断」という用語は、特定の抗がん療法に結びついた診断検査を指す。特定の実施形態では、これらの診断方法は、生体試料に関連するバイオマーカーにおける遺伝子損傷の検出を含むことにより、患者を抗がん療法で治療すべきかそうでないかの迅速な識別が可能になる。
【０１９９】
抗がん療法としては、以下に限定するものではないが、手術、放射線照射、化学療法、抗がん剤、及び免疫調節剤が挙げられる。
【０２００】
抗がん薬の例示的な例は、アルキル化剤（たとえば、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標）））、アルキルスルホン酸塩類（たとえば、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン）、アジリジン類（たとえば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパ）、エチレンイミン類及びメチラメラミン類（たとえば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオルアミド、及びトリメチルオロメラミンレジュームを含む）、ナイトロジェンマスタード類（たとえば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）、ニトロソウレア類（たとえば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）、抗生物質類（たとえば、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシンとそのペグ化製剤類、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）、代謝拮抗剤類（たとえば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））、葉酸類似体（たとえば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）、プリン類似体（たとえば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）、ピリミジン類似体（たとえば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ）、アンドロゲン類（たとえば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）、抗副腎剤類（たとえば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）、葉酸補充薬（たとえば、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））、アセグラトン、アルドホスファミド配糖体、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクオン、エルホルミチン、エリプチニウムアセテート、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）、ラゾキサン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、２，���’，２’’−トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソイド類（たとえば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）及びドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ））、クロラムブシル、ゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、白金類似体（たとえば、シスプラチン及びカルボプラチン）、ビンブラスチン、白金、エトポシド（ＶＰ−１６）、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロネート、ＣＰＴ−１１、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、ジフルオロメチロマイシン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸誘導体（たとえば、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン））、ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）、エスペラミシン類、カペシタビン、ならびに上記いずれかの薬学的に許容される塩類、酸類、または誘導体を含むが、これらに限定されない。この定義にさらに含まれるものとして、がんに対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）、ならびに抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン）、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩類、酸類、または誘導体がある。
【０２０１】
免疫調節剤の例示的な例としては、以下に限定するものではないが、シクロスポリン、タクロリムス、トレスペリムス、ピメクロリムス、シロリムス、ベロリムス、ラフルニムス、ラキニモド及びイミキモド、ならびにこれらの類似体、誘導体、塩類、イオン類、及び複合体が挙げられる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、抗がん薬は、ポリ−ＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤を含むことができる。ＰＡＲＰ阻害剤の例示的な例は、オラパリブ（ＡＺＤ−２２８１）、ルカパリブ（ＡＧ０１４６９９またはＰＦ−０１３６７３３８）、ニラパリブ（ＭＫ−４８２７）、タラゾパリブ（ＢＭＮ−６７３）、ベリパリブ（ＡＢＴ−８８８）、ＣＥＰ  ９７２２、Ｅ７０１６、ＢＧＢ−２９０、３−アミノベンズアミドを含むが、これらに限定されない。
【０２０３】
本明細書で引用された全ての刊行物、特許出願及び発行された特許は、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許が明確に及び個々に示され、参照により援用されているかのように、参照により本明細書に援用される。特に、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０２８３１６号の全内容は、参照により具体的に援用される。
【０２０４】
上記の発明を、明快に理解するための例示及び例を通じてある程度詳細に説明してきたが、本発明の教示を踏まえた上で、添付の請求項の趣旨または範囲から逸脱することなく、本発明にあるいくつかの変更及び修正を施してもよいことは、当業者には直ちに明らかになることである。以下の実施例は、単に例として提供されるものであり、限定として提供されるものではない。当業者であれば、本質的に同様な結果をもたらすために変更または修正ができるであろう様々な重要性の低いパラメーターがあることを容易に認識することになる。
【実施例】
【０２０５】
実施例１：断片化ゲノムＤＮＡの配合物を含む試料のコピー数解析
断片化された野生型ヒトｇＤＮＡ試料中に添加されたΔＡＴＭまたはΔＢＲＣＡ２の不死化ヒト試料に由来するＤＮＡを含んだ、断片化ゲノムＤＮＡの配合物を細心に生成した。この試料タイプの利点は、組成を慎重に制御することが可能であり、試料の入手可能性が本質的に無制限であることである。
【０２０６】
野生型、ヒト女性ゲノムＤＮＡを、健康な志願者によって提供された全血試料から精製した。ＡＴＭ遺伝子（ＮＡ０９５９６、ΔＡＴＭ）を網羅するヘテロ接合性欠失を宿す不死化細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＢＲＣＡ２（ＮＡ０２７１８、ΔＢＲＣＡ２）のヘテロ接合性欠失を有する別々の試料をＣｏｒｉｅｌｌリポジトリから取得した。重要なことに、これらの試料は、ゲノムの残部にわたりほかの点では正常な倍数性を有するようにみえた。ΔＡＴＭ試料は、男性ドナーに由来したため、Ｘ連鎖ＡＲ遺伝子についてのコピー数において、ヘミ接合性でもあった。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を健康な女性または男性由来のドナー血漿試料から取得した。ライブラリ構築のために、ゲノムＤＮＡを、Ｃｏｖａｒｉｓ機器に関して２００ｂｐの設定で超音波処理し、つぎにさらに「両側」ＤＮＡビーズ精製を使用して、サイズを選択した。ライブラリインプットＤＮＡ試料を図７に示す。
【０２０７】
断片化したｃｆＤＮＡ試料の適切な組み合わせを配合して、百分率で定義し、末端修復し、そしてゲノムライブラリに変換した。約５００ｎｇの各ライブラリを８個の試料セットに混合し、２３０４個のＤＮＡプローブを含んだ前立腺プローブプールのコピー数減少（ＣＮＬ）にハイブリダイズした。試料処理後、８個の試料の各セットを、６千万リード／試料に対応する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ＮＧＳ機器上で、約４億８千万個のパスフィルタリードの深度へ配列決定した。おおよそ９５％のリードは、妥当な試料ＩＤタグを含み、ヒト基準ゲノムにアライメントを取り、そしてこれらのうちの、約９８％を意図された標的遺伝子座へマッピングした。シーケンシング深度全体を、１個のプローブにつき、１個のインプットゲノムあたりのリード数として測定し（平均ゲノム深度（２５００）によって除算し、またプローブカウント（２４００）によって除算する、標的上リード（６千万）として計算した）、１個のプローブにつき、１個のインプットゲノムあたり約１０リードであった。コピー数減少解析のグラフ表示を図１に示す。コピー数撹乱を矢印で強調表示した。（試料１、女性ＤＮＡ中の５％の男性ＤＮＡ、試料２、女性ＤＮＡ中の５％のΔＡＴＭ  ＤＮＡ（男性）、試料３、女性ＤＮＡ中の５％のΔＢＲＣＡ２  ＤＮＡ（女性）、試料４、純粋な女性ＤＮＡ）。
【０２０８】
ＣＮＬ呼び出し側は、冗長リードを識別し、これらを単一のコンセンサスリード中に縮合させ、つぎに各プローブ位置で定量化する。この情報を遺伝子ごとのコピー数平均値にさらに縮合した。最後に、各ＣＮＬ測定で検出された偏差に、統計学的有意性を割り当て、これをｌｏｇ１０Ｐ値の統計的有意性としてグラフで示す。
【０２０９】
図８は、断片化され、配合されたゲノムライブラリ中のＡＲ遺伝子（図８Ｂ）及びＡＴＭ遺伝子（図８Ｃ）についてコピー数決定の箱ひげ図を示す。ΔＡＴＭ試料が男性であるため、ＡＲ遺伝子（Ｘ連鎖、ヘミ接合性）及びＡＴＭ遺伝子の両方は、ＣＮＬ挙動を示した。予測されたように、測定されたコピー変動の大きさは、中程度であった。図９Ｂに示される統計解析は、観察されたコピー増減が統計的に有意であったことを実証する。さらに、均一なコピー特性を示すと予測された残りの遺伝子中で、ほとんど有意な増減は観察されなかった。これらの値は、さまざまなゲノム配合物について予測された頻度と良く相関していた。図１０は、異性からｃｆＤＮＡの微量なスパイクイン、または断片化ｇＤＮＡの微量な追加のいずれか一方を有する、主にｃｆＤＮＡであった試料中で、統計的に有意なコピー増減も容易に観察されたことを示す。これらの値は、さまざまなゲノム配合物について予測された頻度と良く相関していた。断片化されたｇＤＮＡ、及びｃｆＤＮＡの両方に関してみられた、これらの結果は、同等であったことにより、アッセイの完全性を実証し、この完全性が臨床試料に翻訳されることを示した。
【０２１０】
これらのデータは、遺伝子コピー数において２％のマイナーアレル頻度に下がった、わずかな変化を検出するアッセイシステムの能力を実証する。提示された実証例の焦点は、コピー数減少にあるが、技術は、染色体アーム重複及び局所的増幅を通して発生する遺伝子コピーにおける増加を含む、コピー数増加の検出に等しく良く適している。このアッセイは、ＳＮＶ、インデル及び遺伝子融合（染色体再編成）を含む、他の種類のゲノム変異体を検出する能力をさらに保持する。重要なことには、これらのデータは、血漿に由来するゲノムＤＮＡに、また組織などの他の供給源及び他の身体供給源に由来するゲノムＤＮＡに、この方法を適用することが可能であることを実証する。
【０２１１】
実施例２：健康なドナー及び癌患者からのｃｆＤＮＡのコピー数解析
以下の例は、ゲノムライブラリ構築中に、またハイブリダイゼーション処理後に、追加される分子特徴を使用して、コピー数解析を生成する方式を示す。Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、１６個の健康なドナー、及び１個の去勢抵抗性前立腺癌の患者の血漿からＤＮＡを抽出した。Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及び対応するｈｓＤＮＡ定量化キットを用いて、二本鎖ＤＮＡの収量を定量化した。ゲル電気泳動法を２％のアガロースゲル上に用いて、サイズ規格としてＰＣＲマーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）によって、サイズ解析を実施した。試料からのｃｆＤＮＡの収量によって、約４０から１００ｎｇのｃｆＤＮＡをライブラリ構築に使用した。
【０２１２】
ライブラリ構築の基本的な特徴を図１１Ａから１１Ｃに示す。最初にｃｆＤＮＡを脱リン酸化した後に、二段階プロセスで修復し、末端を平滑末端化した。短い、１０ｎｔのアンカー配列は、リン酸化ライゲーション鎖及び不活性パートナー鎖からなり、つぎにｃｆＤＮＡにライゲーションされた。４個のアンカー配列のセットを作製するために用いられた８個のオリゴヌクレオチドを表１に示す。
【表１】
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【０２１３】
アダプタ構造は、アンカー配列にアニールしたアダプタ配列全長の付加によって完成した。３２セットのアダプタ配列を、２４０個のメンバーから各構成し、図１２から図２２に示す。これらのアダプタをｃｆＤＮＡに付着させ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼの協調作用を通して伸長させ、ゲノムライブラリを生成した。シーケンシング前の品質管理ステップとして、得られたゲノムライブラリをｑＰＣＲによってカバレッジの深度について定量化した。つぎにゲノムライブラリを増幅し、特異的な遺伝子を標的にするプローブセットへハイブリダイズした（図１１Ｂ）。ハイブリダイゼーション後に、プローブのプライマー伸長を用いて、キャプチャされたゲノム配列をコピーし、情報を付着したアダプタ中で符号化した（図１１Ｃ）。標準的な次世代解析ソフトウェアを用いたシーケンシング解析後の例を図１１Ｄに示す。この解析をシーケンシングラン上で実施し、このシーケンシングランは、３２個の試料（２８個の癌患者試料、及び４個の野生型対照）を含み、それは、シーケンシングリードの全体的な分布を表示する。
【０２１４】
本明細書に記載される標的ハイブリッドキャプチャプラットフォームの中心となる機能は、それが複数の種類のゲノム情報を提供することである。キャプチャプローブの１つの必須機能は、標的領域にわたり深いカバレッジ深度で変異検出を提供することである。この機能をキャプチャプローブの配列構成、密度、及び配置によって管理し、ＴＰ５３遺伝子に関して図２３に示す（ＴＰ５３プローブ配列を以下の表２に示す）。等しい有意性の、標的ハイブリッドキャプチャプラットフォームアッセイを有意な変異が検出されなかった領域中の等しいカバレッジ深度からの読み出しを生成した。これらのデータは、有害な変異が検出されなかった場合に統計的有意性を加えるため、医師及び患者に重要である。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【０２１５】
キャプチャされたゲノム配列（図１１Ｃ）のキャプチャプローブの連鎖は、各プローブ位置におけるゲノム深度の測定をも容易にした。実験に使用されたすべてのキャプチャプローブと関連するユニークリード数を測定した（図２４）。図２４に示されるデータを、１６個の健康なドナーのｃｆＤＮＡ試料を解析したシーケンシングランから導出した。ＴＰ５３遺伝子中の１箇所のプローブ位置において各試料中で遭遇したユニークリードの深度を計算した（図２４に示された生のユニークリードカウント）。ユニークリードの広範な試料間分布に反映されたように、各試料は、ユニークライブラリ深度を有した。また実験において、２５９６個すべてのキャプチャプローブにわたるユニークリード深度の網羅的平均を計算した（図２４Ｂ）。有意には、すべてのプローブについて測定された網羅的なユニークリード深度によって図２４Ｃに表された、単一のプローブ部位で観察されたリード深度の正規化は、正規化されたユニークリードの均一な密度を明らかにした。これらのデータは、試料間から解析のために選択された特定のプローブのキャプチャ性能が均一であり、それぞれの個々のライブラリのゲノム深度に比例したことを示す。
【０２１６】
この同一の正規化機能を図２３に示される４５個のＴＰ５３−特異的プローブに適用した（図２５に示される正規化データ）。図２３は、ＴＰ５３コード領域のシーケンシング深度へのすべてのプローブの凝集寄与を示すが、図２５は、個々の各プローブによって取得された正規化深度を示す。個々の各プローブによって取得された正規化深度は、いずれかの所与のプローブについて試料間で一般的に一貫していたが、一方のプローブを他方と比較したときにいくぶんばらつきがあった。いくつかの要因は、プローブ間で観察された正規化後のキャプチャ深度における差を支配し、最も有意なのは、互いに関するプローブの配置であり、またゲノム反復領域に対するプローブの近接性であった。ほとんどのプローブは、均一なキャプチャ挙動を示すが、キャプチャ性能が一貫していなかった２個のプローブを図２５に矢印によって強調表示する。しかしながら、これらのデータは、これらのようなプローブが稀であり、容易に識別されることを示す。またこのようなものとして、それらを下流側コピー数解析から除外することが可能である。
【０２１７】
均一なキャプチャ性能は、図２５中に４５個のＴＰ５３標的プローブによって示され、本明細書に記載される標的ハイブリッドキャプチャプラットフォームの一般的な特徴である。図２６において、この実験中に、特性を明らかにされた１６個すべての正常なｃｆＤＮＡライブラリについて、２５９６個のキャプチャプローブの１つのパネル中の各プローブについて平均キャプチャ深度を計算した。つぎに散布図解析を使用して、平均値を３個の代表的な試料と個々に比較した。各点は、異なるプローブを表し、グラフ上の各点の位置は、ｘ軸上の平均値とｙ軸上の個々の試料との比較である。大多数のプローブの緊密な対角分布は、ほとんどのプローブの高い相関関係のユニークリードキャプチャ性能を反映した（３つのグラフすべてについて、Ｒ２相関関係≧０．９５）。重要なことには、プローブごとのシーケンシング深度の一貫性は、コピー数測定における標的ハイブリッドキャプチャプラットフォームの使用をサポートする。
【０２１８】
コピー数に関して、プローブデータの最も直接的な処理は、常染色体中で「２」の二倍体平均値に発生する調整されたゲノム深度値をさらに正規化することである。Ｘ連鎖性の遺伝子座について女性に発生するプローブ値についても同様である。正常な男性中のＸ連鎖領域及びＹ連鎖領域について、平均されたコピー値を「１」へ適宜に設定する。上記に詳細に考察される、この数値変換を、染色体対照プローブ（表３で、２２個すべての常染色体上で選択された遺伝子座を標的とする２３９個のプローブ）のセット、Ｘ連鎖ＡＲ遺伝子を標的とする１９９個のプローブのセット、及び４５個のＴＰ５３−特異的プローブに適用した（図２７Ａ及び２７Ｂ）。各点は、個々のプローブについての値を表す。稀な「ノイズの多い」プローブを除き、領域中の大多数の個々のプローブカウントは、約「２」であった二倍体を含む値であると予測された。健康な男性中のＡＲ遺伝子についてプローブは、予測された「１」に近い平均値に関して増減した。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【０２１９】
有意には、去勢抵抗性前立腺癌の患者の血液の血漿部分から収集されたｃｆＤＮＡに対して、健常試料を使用した正規化対照と同一の解析を適用したときに、３つの突出した特徴が現れた（図２７Ｃ）。第一に、すべての対照プローブは、ノイズの多いカウント挙動を示した。第二に、すべてのＡＲプローブにわたるカウントは、有意に「１」の正常な値から約「５」の増幅された値へ上昇した。ＡＲ遺伝子の増幅は、進行前立腺癌において一貫して観察された。第三に、ＴＰ５３プローブカウントは、より密接にクラスター化し、「２」の所期の値よりはるかに「１」に近い平均値を有した。これは、腫瘍組織に由来した循環ＤＮＡ部分におけるコピー数減少によって、ＴＰ５３の一方または両方のアレルの不活性化を反映した可能性がある。
【０２２０】
これらのデータは、本発明の方法が３つの重要な核型分析の態様を有することを示した。すなわち、本明細書に記載されるこれらの方法は、一般染色体異数性、特異的な標的遺伝子のコピー増加、及び同一の特異的な標的遺伝子におけるコピー減少を検出する。さらにこれらの結果は、３つすべてのこれらのゲノム異常が癌に発生することが多いので、本明細書に記載される方法及びプラットフォームが精密治療の使用を導くことが可能であることを示す。
【０２２１】
健常対照（茶色の点）と比較した、去勢抵抗性前立腺癌の患者試料（青色の点）についての一般染色体異数性を測定した（図２８）。この解析において、実験に使用された２３９個すべての対照プローブについてほぼ倍数性を、それらの染色体標的に従い順序付けした。いくつかの染色体（たとえば、染色体１及び染色体２２）について、患者試料と対照試料との間で同様の倍数性の「２」の値を観察した。他の事例において、これら２個の試料間の偏差を観察した。これらの実験によって提供される、ゲノム倍数性全体についての情報の程度を、使用された対照プローブの数及び密度によって制限した。しかしながら、これらのデータは、均一な密度で染色体セグメントをすべて覆うより高密度なプローブパネルを、本発明の追加のユニーク特徴と併せて使用することが可能であることを示す。これらのような解析は、より高い分解能の、染色体コピー数のゲノムワイド測定を提供するであろう。
【０２２２】
これらのデータは、精密治療についてのガイドとして本発明の可能性をさらに強調する。たとえば、相同組換え修復においてゲノム欠損を有する腫瘍は、非常に不安定化した染色体倍数性を示すことが多く、またこれらのような腫瘍を含む患者は、ＰＡＲＰ酵素複合体の阻害剤について良い候補である（Ｐｏｐｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０（１１）：Ｒ１２８参照）。腫瘍の遺伝子型を探すほとんどのシーケンシングアッセイと異なり、本明細書に記載されるこれらのアッセイは、腫瘍の表現型を駆動する原因の変異が標的解析から隠されている場合でも、シーケンシングを使用して、この腫瘍の表現型として不安定化した染色体倍数性を検出する。
【０２２３】
固形腫瘍から脱落するＤＮＡ中の遺伝子減少を検出する能力は、特に有意である。腫瘍抑制遺伝子の変異及び欠失は、がんゲノム中で頻繁な事象であり、さらに腫瘍抑制遺伝子の生殖系列喪失に関する個体は、高齢期にがんにかかることに対してユニークに脆弱である。液体バイオプシーコピー数減少（ＣＮＬ）アッセイの診断値は、その感度に正比例する。本明細書に記載される本発明についての検出の下限値を決定するために、実施例１に記載される不死化株を「ゲノム・イン・ア・ボトル」基準の細胞株、ＮＡ１２８７８中で系統的に希釈した。一方の株は、ＡＴＭのシングルコピー欠失（単一アレルの減少）を有し、他方の株は、ＢＲＣＡ２のシングルコピー欠失を有する。実験は、純粋なＮＡ１２８７８の４個の対照試料、及び１６％の各単一アレル欠失株を含有する８個のスパイクイン試料を含んだ（図２９）。報告目的のために、これは、両アレル減少の８％のマイナーアレル頻度に対応する。特異的な遺伝子を標的とするすべてのプローブについての平均値、及び２個の追加の、欠失のない対照遺伝子を図２９に示す。ＡＴＭ及びＢＲＣＡ２のコピー減少をスパイクイン試料のみに限定した。このデータの追加の計算上の処理は、２％のマイナーアレル頻度まで下げる、両アレル欠失の確信的なコピー減少呼び出しを明らかにした。この感度は、標準的な血液に基づく遺伝子型判定アッセイにおけるコピー減少呼び出しを常に有するため、本発明が特別な配慮を必要としないことを示した。
【０２２４】
これらのデータは、標的ゲノム遺伝子座のコピー数増加及びコピー数減少の両方を含む、コピー数の解析のためのプローブ特異的ゲノムキャプチャデータの使用を実証する。加えて、本明細書に記載される本発明は、単一のヌクレオチド変異体、単一のヌクレオチドからなん千もの塩基対に及ぶ挿入及び欠失、ならびに異常な変異プロセスによる染色体再編成（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０２８３１６号、及び米国特許公開第２０１４−０２７４７３１号を参照）に起因する遺伝子融合を検出するために、感度の高い能力をもつことを示している。これらの変異プロセスのすべては、新生物がんへの正常な組織の形質転換に寄与する可能性があり、精密治療が出現し続けるなら、これらの疾患ゲノム特性の正確な診断は、次第に精密医薬の不可欠な機能となるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ−１】
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【図１５Ｃ−２】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２１Ｇ】
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【図２１Ｈ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019526257.tif 000126
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