(57)【要約】  任意選択で、細胞にガンマセクレターゼ阻害剤を接触させる、肺上皮エンジニアリングにおいてヒト気道幹細胞を使用する方法、それによって産生されるバイオ人工気道臓器、および例えば移植のためのその使用。同様に、バイオ人工マトリックスをテネイシン−Ｃおよび／またはフィブリリン２によって処置する方法。
2019519217.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ人工肺臓器を提供する方法であって、
ヒトドナーから増殖性の基底幹細胞集団を提供するステップであって、前記細胞が、好ましくは前記ドナーの気道から得たＫｒｔ５+ｐ６３+細胞である、ステップと；
任意選択でＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で、任意選択で最大５回の継代（好ましくは、細胞を６０〜１００％、好ましくは８０％コンフルエンシーで継代した）まで、前記細胞を培養において維持および増大させるステップと；
気道および実質的な血管系を含む（無細胞）肺組織マトリックスを提供するステップと；
前記肺組織マトリックスに、前記気道を通して前記幹細胞を、および前記血管系を通して内皮細胞を播種するステップと；
前記気道における機能的上皮および機能的血管系の形成にとって十分な条件で前記マトリックスを維持するステップであって、前記マトリックスの維持が、ｎｏｔｃｈ阻害剤、好ましくはガンマセクレターゼ阻害剤を含む液体培地を使用して、第１の所望の程度に臓器を成熟させて、湿潤成熟臓器を産生させるために十分な時間、前記肺組織マトリックスに湿式換気を提供することと、任意選択で湿式換気の間、臓器チャンバーにおいて実質的に一定の流体レベルを維持することとを含む、ステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記臓器チャンバーが、各々がチャンバー圧センサーによって伝達されるデータに反応して二方向排液ポンプを制御する制御モジュールによって制御されるチャンバー圧センサーと二方向排液チャンバーポンプとを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
静脈ラインにおける圧力レベルを培地リザーバーにおける圧力レベルと平衡にすることによって、肺内外圧差を防止するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記臓器チャンバーが、前記臓器チャンバーに接続された空気圧制御モジュールをさらに備え、前記空気圧制御モジュールが、
吸気相の間、前記臓器チャンバーにおいて陰圧を生成し；
平衡相の間、前記臓器チャンバー圧を維持し；および
呼気相の間、前記臓器チャンバーにおいて陽圧を生成する、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
湿式換気が、
コントローラーに接続された二方向気管ポンプを含む気管ラインを、培地リザーバーに接続するステップと；
前記二方向気管ポンプを使用して前記肺組織マトリックスを培地によって膨らませるステップと；
前記二方向気管ポンプを使用し前記肺組織マトリックスから培地を引き抜いて、前記肺組織マトリックスをしぼませるステップとを含み、
前記培地が湿式換気の間、絶えず補充される、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記湿式換気が、
各々がコントローラーに接続された第１のポンプと第２のポンプとを含む前記気管ラインを、培地リザーバーに接続するステップと；
前記第１のポンプを使用して、前記肺組織マトリックスを培地によって膨らませるステップと；
前記第２のポンプを使用し前記肺組織マトリックスから培地を引き抜いて、前記肺組織マトリックスをしぼませるステップとを含み、
前記培地が湿式換気の間、絶えず補充される、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記コントローラーが、前記気管ラインに接続された気管圧センサーによって伝達されるデータに反応して前記二方向気管ポンプを制御する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｎｏｔｃｈ阻害剤を含む液体培地を使用して湿式換気を少なくとも２、５、７、または１０日間提供し、任意選択で、その後に、ｎｏｔｃｈ阻害剤を含まない液体培地を使用して追加の湿式換気をするステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記肺組織マトリックスが、外から添加したテネイシン−ｃおよび／または外から添加したフィブリリン−２の１つまたは両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
播種の前に、前記肺組織マトリックスにテネイシン−ｃまたはフィブリリン−２の１つまたは両方を接触させるステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載の方法によって産生された機能的な肺。
【請求項１２】
前記臓器が、完全な肺またはその血管柄付きの部分である、請求項１１に記載の機能的な肺。
【請求項１３】
請求項１１に記載の肺を対象に移植するステップを含む、肺活量が損なわれたまたは低減した対象を治療する方法。
【請求項１４】
肺活量が損なわれたまたは低減した対象を治療する方法における、請求項１１に記載の機能的な肺の使用。
【請求項１５】
肺活量が損なわれたまたは低減した対象を治療する方法に使用するための請求項１１に記載の機能的な肺。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１６年５月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／３３７，０４１号明細書；２０１６年１１月２３日に出願された第６２／４２６，１４６号明細書；および２０１７年４月１０日に出願された第６２／４８３，７６０号明細書の利益を主張する。前述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
連邦政府助成研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された助成金番号ＯＤ００８７４９およびＨＬ１０８６７８の下で、米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を保有する。
【０００３】
本明細書において、任意選択で、細胞にガンマセクレターゼ阻害剤を接触させる、肺上皮エンジニアリングにおいてヒト気道幹細胞を使用する方法、それによって産生されたバイオ人工気道臓器、および例えば移植のためのその使用を提供する。
【背景技術】
【０００４】
肺移植は、肺の不全、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺がん、および先天性肺疾患を典型とする状態を経験している多くの患者の最後の希望となっている。肺移植の典型的な待ち時間は、２年以上であり、そのため、順番待ちリストに記載された人の死亡率は３０％であり得る。移植のための臓器を工学操作する技術が開発されれば、最終的に、拒絶のリスクがない末期臓器不全の解決策を提供するであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
臓器全体の灌流による脱細胞化プロセスに基づき、本発明者らは、初代ヒトドナー肺組織由来細胞を、ネイティブの肺足場材料に再配置して再生させるために利用することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に示すように、増殖性の基底上皮幹細胞集団を単離して、培養において増大させ、齧歯類およびヒト肺細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の両方の強固な再細胞化が達成された。繊毛気道上皮表現型への分化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでの齧歯類全肺再細胞化およびバイオミメティック培養の両方において証明された。遠位上皮表現型の誘導は、γ−セクレターゼを通してのＮｏｔｃｈ経路の阻害によって達成された。サーファクタントタンパク質ＢおよびＣの発現の増加は、ヒトＥＣＭスライス培養および齧歯類全肺培養におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｍＲＮＡ解析によって証明された。長期間のｅｘ  ｖｉｖｏでのバイオミメティック培養と組み合わせた単離ヒト肺葉の再細胞化により、この細胞集団の再生能がさらに確認された。再細胞化肺構築物の機能分析により、培養全体を通しての細胞生存率および代謝活性、ならびに臓器の動的コンプライアンスおよびガス交換が確認された。最終の組織分析において、生理的な組織構造および形態を伴う広範囲の上皮再形成が観察された。
【０００７】
これらの結果は、ヒト気道幹細胞の再生能および二系列分化能を証明し、これらは全肺組織のバイオエンジニアリングおよびｅｘ  ｖｉｖｏでの臓器培養において有用である。
【０００８】
加えて、新生児（生後１週未満）または成人肺ドナー（１群あたりｎ＝３のドナー）に由来する無細胞ＥＣＭ上で培養した、成人ヒト肺組織から単離した基底上皮幹細胞（ＢＥＳＣ）の挙動を評価した。細胞増殖および生存の有意な差が見出された。肺足場材料の詳細なプロテオーム解析を実施して、新生児ＥＣＭに有意に豊富に存在するタンパク質を定量し、観察された効果について可能性があるメディエータとして糖タンパク質であるフィブリリン−２（ＦＢＮ−２）およびテネイシン−Ｃ（ＴＮ−Ｃ）を同定した。ＩＶ型コラーゲンコーティングプレート上で培養したＢＥＳＣにＦＢＮ−２および／またはＴＮ−Ｃを補充すると、増殖の有意な増加および細胞の老化減少が証明された（この差はまた、無処置プレート（ＩＶ型コラーゲンコーティングなし）と比較した場合にも見出されたことに注意されたい）。上皮間葉転換の有意な増加は観察されなかった。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの創傷閉鎖もまた、ＦＢＮ−２および／またはＴＮ−Ｃにおいて増加した。上皮再形成の前にＦＢＮ−２および／またはＴＮ−Ｃによって前処置した脱細胞化肺足場材料は、より大きい上皮増殖および組織リモデリングを支持した。ＢＥＳＣ分布、マトリックスの配置、および全体的な組織形態は、処置した肺足場材料において、ｅｘ  ｖｉｖｏ肺培養の３および７日後に改善した。これらの結果は、足場材料の上皮再形成が新生児肺ＥＣＭ上で増強されること、ならびにネイティブの足場材料にＦＢＮ−２およびＴＮ−Ｃを補充することが、肺組織再生における貴重なツールであることを証明している。
【０００９】
このため、本明細書において、バイオ人工肺臓器を提供する方法を提供する。方法は、ヒトドナーから、増殖性の基底幹細胞集団を提供するステップであって、細胞が、好ましくはドナーの気道から得たＫｒｔ５+ｐ６３+細胞である、ステップと；任意選択でＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で、任意選択で最大５回の継代（例えば、細胞を６０〜１００％、例えば８０％コンフルエンシーで継代した）まで、細胞を培養において維持および増大させるステップと；気道および実質的な血管系を含む（無細胞）肺組織マトリックスを提供するステップと；肺組織マトリックスに、気道を通して幹細胞を、および血管系を通して内皮細胞を播種するステップと；気道における機能的上皮および機能的血管系の形成にとって十分な条件でマトリックスを維持するステップであって、マトリックスの維持が、ｎｏｔｃｈ阻害剤、例えばガンマセクレターゼ阻害剤を含む液体培地を使用して、第１の所望の程度に臓器を成熟させて、湿潤成熟臓器を産生させるために十分な時間、肺組織マトリックスに湿式換気を提供することと、任意選択で湿式換気の間、臓器チャンバーにおいて実質的に一定の流体レベルを維持することとを含む、ステップとを含む。
【００１０】
一部の実施形態において、臓器チャンバーは、各々がチャンバー圧センサーによって伝達されるデータに反応して二方向排液ポンプを制御する制御モジュールによって制御されるチャンバー圧センサーと二方向排液チャンバーポンプとを備える。
【００１１】
一部の実施形態において、方法は、静脈ラインにおける圧力レベルを培地リザーバーにおける圧力レベルと平衡にすることによって、肺内外圧差を防止するステップを含む。
【００１２】
一部の実施形態において、臓器チャンバーは、臓器チャンバーに接続された空気圧制御モジュールをさらに備え、空気圧制御モジュールは、吸気相の間、臓器チャンバーにおいて陰圧を生成し；平衡相の間、臓器チャンバー圧を維持し；および呼気相の間、臓器チャンバーにおいて陽圧を生成する。
【００１３】
一部の実施形態において、湿式換気は、コントローラーに接続された二方向気管ポンプを含む気管ラインを、培地リザーバーに接続するステップと；二方向気管ポンプを使用して肺組織マトリックスを培地によって膨らませるステップと；二方向気管ポンプを使用し肺組織マトリックスから培地を引き抜いて、肺組織マトリックスをしぼませるステップとを含み、培地は湿式換気の間、絶えず補充される。
【００１４】
一部の実施形態において、湿式換気は、各々がコントローラーに接続された第１のポンプと第２のポンプとを含む気管ラインを、培地リザーバーに接続するステップと；第１のポンプを使用して肺組織マトリックスを培地によって膨らませるステップと；第２のポンプを使用し肺組織マトリックスから培地を引き抜いて、肺組織マトリックスをしぼませるステップとを含み、培地は湿式換気の間、絶えず補充される。一部の実施形態において、コントローラーは、気管ラインに接続された気管の圧センサーによって伝達されるデータに反応して、二方向気管ポンプを制御する。
【００１５】
一部の実施形態において、方法は、ｎｏｔｃｈ阻害剤を含む液体培地を使用して湿式換気を少なくとも２、５、７、または１０日間提供し、任意選択で、その後に、ｎｏｔｃｈ阻害剤を含まない液体培地を使用して追加の湿式換気を提供するステップを含む。
【００１６】
一部の実施形態において、肺組織マトリックスは、テネイシン−ｃ（ＴＮ−Ｃ）、例えば、脱細胞化臓器足場材料に由来するマトリックスに天然に存在し得る任意のテネイシン−ｃに加えて、補充のテネイシン−ｃを含み；方法は、細胞播種の前に、肺組織マトリックスにテネイシン−ｃを接触させるステップ、例えばテネイシン−ｃ、例えば約０．５〜１０μｇ／ｍｌ  テネイシン−Ｃを含む溶液を肺組織マトリックス足場材料気道に送達するステップを含み得る。
【００１７】
一部の実施形態において、肺組織マトリックスは、フィブリリン−２（ＦＢＮ−２）、例えば、脱細胞化臓器足場材料に由来するマトリックスに天然に存在し得る任意のＦＢＮ−２に加えて、補充のＦＢＮ−２を含み；方法は、細胞播種の前に、肺組織マトリックスにＦＢＮ−２を接触させるステップ、例えばＦＢＮ−２、例えば約０．１〜１００μｇ／ｍｌ  ＦＢＮ−２、例えば０．５〜５０、１〜２０、５〜１５、５〜２０、１０〜２０μｇ／ｍｌ  ＦＢＮ−２を含む溶液を肺組織マトリックス足場材料気道に送達するステップを含み得る。
【００１８】
一部の実施形態において、肺組織マトリックスは、ＴＮ−ＣおよびＦＢＮ−２の両方を含む。
【００１９】
同様に、本明細書において、本明細書に記載の方法によって産生された機能的肺を提供する。一部の実施形態において、臓器は、完全な肺またはその血管柄付きの部分である。
【００２０】
同様に、本明細書において、本明細書に記載の方法によって産生された機能的肺を対象に移植するステップを含む、肺活量が損なわれたまたは低減した対象を治療する方法を提供する。
【００２１】
特に定義していなければ、本明細書において使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において使用するための方法および材料を本明細書に記載する。当技術分野で公知の他の適した方法および材料も同様に使用することができる。材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、制限されないと意図される。本明細書において言及した全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれている。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。
【００２２】
本発明の他の構成および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００２３】
本特許または出願のファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を含む本特許または特許出願刊行物のコピーは、要請に応じて、必要な料金を支払うことによって当局によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】図１Ａ〜Ｅは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの初代ヒト肺上皮幹細胞増大の特徴付けの図である。（Ａ）継代１（Ｐ１）および（Ｂ）継代４（Ｐ４）の初代ヒト上皮細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの明視野および免疫蛍光画像は、Ｋｒｔ５+ｐ６３+基底幹細胞が豊富に存在するコロニーの増殖物を説明する。スケールバー＝１００μｍ。
【図１−２】図１Ａ〜Ｅは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの初代ヒト肺上皮幹細胞増大の特徴付けの図である。（Ｃ）継代毎のＫｉ６７陽性細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの定量。継代（Ｐ１−Ｐ４）あたり、ｎ＝３の画像を定量した。一元配置ＡＮＯＶＡによって継代１（Ｐ１）と比較し、Ｄｕｎｎｅｔの事後検定を行った。エラーバーは全て、標準偏差を表す。（Ｄ）Ｐ１およびＰ４での上皮細胞マーカーのフローサイトメトリーによる定量。２×１０4個の事象を収集した。ダブレットおよび自己蛍光細胞を除外するように集団のゲートを設定した。継代あたりｎ＝３の細胞株。
【図１−３】図１Ａ〜Ｅは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの初代ヒト肺上皮幹細胞増大の特徴付けの図である。（Ｅ）細胞継代毎の遺伝子発現の定量的ＰＣＲ解析。箱ひげ図は、中央値プラス第１四分位および第３四分位を表す。ひげは、２．５〜９７．５％のデータ範囲を表す。継代あたりｎ＝３の細胞株。β−アクチン発現に対して標準化し、正常な死体肺組織対照と比較した。
【図２−１】図２Ａ〜Ｆは、気液界面培養による繊毛気道上皮への分化の図である。（Ａ）気液界面（ＡＬＩ）での２１日目の初代ヒト肺上皮幹細胞。繊毛形成の誘導が、ヘマトキシリンおよびエオジン染色によって観察される。スケールバー＝２５μｍ。（Ｂ）免疫蛍光画像は、ＡＬＩでの基底幹細胞集団（Ｋｒｔ５／ｐ６３＋）の保存、機能的繊毛形成（ＦＯＸＪ１およびアセチル化αチューブリン）、および密着結合の形成（Ｅ−カドへリン）を証明する。スケールバー＝２５μｍ。
【図２−２】図２Ａ〜Ｆは、気液界面培養による繊毛気道上皮への分化の図である。（Ｃ）持続気道陽圧（ＣＰＡＰ）モデルによる脱細胞化肺マトリックスにおける気液界面（２０ｍｍＨｇ気道圧を７日間の後に、血管灌流のみの培養を７日間）。（Ｄ）免疫蛍光画像は、ＣＰＡＰ前の肺と比較して（７日目と１４日目の比較）、基底幹細胞集団（Ｋｒｔ５）の維持、ＦＯＸＪ１発現の誘導、密着結合形成の増強（Ｅ−カドヘリン）、および増殖の減少（Ｋｉ６７）を証明する。スケールバー＝５０μｍ。
【図２−３】図２Ａ〜Ｆは、気液界面培養による繊毛気道上皮への分化の図である。（Ｅ）＋ＣＰＡＰまたは−ＣＰＡＰ（血管灌流のみ）の肺組織における１４日目でのＥ−カドヘリンタンパク質レベルのウェスタンブロット解析。
【図２−４】図２Ａ〜Ｆは、気液界面培養による繊毛気道上皮への分化の図である。（Ｆ）１４日目の肺（ＣＰＡＰをさらに７日または灌流のみ）と比較した、再細胞化して７日間血管灌流のみを行った後の再細胞化肺における遺伝子発現の定量的ＰＣＲ解析。３回の独立した再細胞化肺からのデータを示す。ｎ＝３の独立した組織試料を、肺毎に時点毎に３連測定実験で分析した。βアクチン発現に対して標準化し、正常な死体肺組織対照と比較した。エラーバーは全て、標準偏差を表す。一元配置ＡＮＯＶＡの後にＴｕｋｅｙの多重比較事後検定によって解析した。
【図３−１】図３Ａ〜Ｈは、Ｎｏｔｃｈ阻害による遠位ＩＩ型肺胞上皮細胞表現型の誘導の図である。（Ａ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤、すなわちホスホジエステラーゼ阻害剤である３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、およびＮ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−（Ｓ）−フェニルグリシン  ｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ、ＧＳＩ  ＩＸとしても知られる、ガンマセクレターゼ阻害剤）によって５日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置した初代上皮基底細胞（継代３）の免疫蛍光画像は、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）陽性細胞の増加を証明している。スケールバー＝１００μｍ。
【図３−２】図３Ａ〜Ｈは、Ｎｏｔｃｈ阻害による遠位ＩＩ型肺胞上皮細胞表現型の誘導の図である。（Ｂ）ＩＢＭＸ（１００μＭ）、ＤＡＰＴ（５０μＭ）、またはＩＢＭＸ＋ＤＡＰＴの組合せによって５日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置した細胞の遺伝子発現の定量的ＰＣＲ解析は、ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃ発現の増加を証明している。ｎ＝３の反復実験を示す。一元配置ＡＮＯＶＡの後にＤｕｎｎｅｔの事後検定によって、無処置（ＮＴ）と比較した。本実験において、ＤＡＰＴおよびＩＢＭＸは、単独では無効であったが、他の反復実験では、それらは何らかの活性を示した。三次元培養アッセイは、スフィアの形成を証明した。
【図３−３】図３Ａ〜Ｈは、Ｎｏｔｃｈ阻害による遠位ＩＩ型肺胞上皮細胞表現型の誘導の図である。（Ｃ）スフィアの免疫蛍光画像は、三次元スフィア培養においてＫｒｔ５+ｐ６３+表現型が優勢であることを証明している。スケールバー＝５０μｍ。（Ｄ）ヘマトキシリンおよびエオジンで染色したスフィアは、７日目までに内腔の発達を証明している。
【図３−４】図３Ａ〜Ｈは、Ｎｏｔｃｈ阻害による遠位ＩＩ型肺胞上皮細胞表現型の誘導の図である。（Ｅ）７日目での無処置およびＮｏｔｃｈ阻害（ＩＢＭＸ＋ＤＡＰＴ）細胞の両方におけるスフィアの明視野画像。スケールバー＝１００μｍ。（Ｆ）最初に播種した総細胞数の百分率としてスフィア数を定量すると、ＩＢＭＸ＋ＤＡＰＴ処置細胞においてスフィア形成の減少を証明している。ｎ＝３の独立した培養を３連測定実験で定量した。Ｔ−検定により分析した。
【図３−５】図３Ａ〜Ｈは、Ｎｏｔｃｈ阻害による遠位ＩＩ型肺胞上皮細胞表現型の誘導の図である。（Ｇ）Ｎｏｔｃｈ阻害（ＩＢＭＸ＋ＤＡＰＴ）を伴うまたは伴わない、７日目でのスフィア培養の遺伝子発現の定量的ＰＣＲ解析。３つの独立した培養からのデータを示し、２連測定実験で分析した。β−アクチン発現に対して標準化し、正常な死体肺組織対照と比較した。
【図３−６】図３Ａ〜Ｈは、Ｎｏｔｃｈ阻害による遠位ＩＩ型肺胞上皮細胞表現型の誘導の図である。（Ｈ）ＤＡＰＴ＋ＩＢＭＸによるｉｎ  ｖｉｔｒｏで５日間の処置後のＢＥＳＣ（継代４、ｐ４）の条件培地中のＳＰ−Ｃタンパク質もまた、ＥＬＩＳＡによって測定した。エラーバーは全て、標準偏差を表し、ｔ−検定によって分析する。
【図４−１】図４Ａ〜Ｅは、脱細胞化肺足場材料培養における初代基底気道幹細胞の遠位ＩＩ型肺胞上皮細胞表現型への誘導の図である。（Ａ）基底上皮幹細胞をヒト脱細胞化肺スライスと共に５日間培養することにより、インテグリンα２β１およびα３β１を介した肺マトリックスへの細胞の接着、マトリックス接着領域に沿った密着結合の形成（Ｅ−カドヘリン）、および持続的な増殖（Ｋｉ６７+）が証明される。スケールバー＝１００μｍ。
【図４−２】図４Ａ〜Ｅは、脱細胞化肺足場材料培養における初代基底気道幹細胞の遠位ＩＩ型肺胞上皮細胞表現型への誘導の図である。（Ｂ）Ｎｏｔｃｈ阻害（ＩＢＭＸ＋ＤＡＰＴ）を伴うまたは伴わない、５日間の細胞−マトリックス培養における遺伝子発現の定量的ＰＣＲ解析は、処置後にＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃの誘導、ならびにクララ細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）発現が失われることを証明した。２つの個別の実験からのデータを示し、２人の異なる肺ドナーに由来するマトリックスに細胞を播種し（ＨＬ３０に対してｎ＝３およびＨＬ３８に対してｎ＝３）、２連測定実験で分析した。β−アクチン発現に対して標準化し、正常な死体肺組織対照と比較した。Ｔ−検定（ＩＢＭＸ＋ＤＡＰＴとＮＴとの比較）によって解析した。エラーバーは標準偏差を表す。
【図４−３】図４Ａ〜Ｅは、脱細胞化肺足場材料培養における初代基底気道幹細胞の遠位ＩＩ型肺胞上皮細胞表現型への誘導の図である。（Ｃ）初代基底幹細胞（２０×１０6個）によって再細胞化し、ＩＢＭＸ＋ＤＡＰＴ処置を行った肺のバイオミメティック培養。
【図４−４】図４Ａ〜Ｅは、脱細胞化肺足場材料培養における初代基底気道幹細胞の遠位ＩＩ型肺胞上皮細胞表現型への誘導の図である。（Ｄ）無処置の肺（５日目）と比較して固定性灌流培養においてＩＢＭＸ＋ＤＡＰＴによって５日間処置した再細胞化肺における遺伝子発現の定量的ＰＣＲ解析。肺あたりｎ＝３の独立した組織試料を３連測定実験で分析した。β−アクチン発現に対して標準化し、正常な死体肺組織対照と比較した。Ｔ−検定（ＩＢＭＸ＋ＤＡＰＴとＮＴとの比較）により分析した。エラーバーは標準偏差を表す。
【図４−５】図４Ａ〜Ｅは、脱細胞化肺足場材料培養における初代基底気道幹細胞の遠位ＩＩ型肺胞上皮細胞表現型への誘導の図である。（Ｅ）５日目での再細胞化肺の免疫蛍光画像（無処置とＩＢＭＸ＋ＤＡＰＴ  Ｎｏｔｃｈ阻害との比較）は、Ｋｒｔ５／ｐ６３＋基底細胞集団の維持、密着結合の強度の増加（Ｅ−カドヘリン）、ＳＰ−Ｃ陽性細胞の増加、およびアクアポリン−５陽性細胞の喪失を確認する。スケールバー＝５０μｍ。
【図５−１】図５Ａ〜Ｋは、初代ヒト肺基底幹細胞による脱細胞ヒト全肺足場材料の再細胞化および培養の図である。（Ａ）固定性臓器灌流および陰圧換気を行うことができる例示的な肺バイオリアクターの概略図。（Ｂ）肺静脈、気道、および肺動脈へのアクセスポートを強調して示す、バイオリアクターにおける単一のヒト脱細胞化肺葉。肺葉に初代ＰＡＥＣ（肺動脈内皮細胞、１６０〜２４０×１０6個）およびＢＥＳＣ（基底上皮幹細胞、２２０〜２８０×１０6個、ｎ＝３）を播種し、固定性培地灌流および周期的陰圧換気下で維持した。
【図５−２】図５Ａ〜Ｋは、初代ヒト肺基底幹細胞による脱細胞ヒト全肺足場材料の再細胞化および培養の図である。（Ｃ）再細胞化肺灌流培養の８日間の肺動脈圧、再細胞化肺ｎ＝３。データは平均圧±ＳＤを表す。（Ｄ〜Ｅ）（Ｄ）肺培養培地から採取した培地中のグルコース測定の変化。培地を４８時間毎に交換し、値は、グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）の変化を表し、（Ｅ）新しい培地と比較した、臓器灌流の４８時間後の乳酸塩濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）の変化。示したデータは、各時点でｎ＝２の独立した肺培養を表す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図５−３】図５Ａ〜Ｋは、初代ヒト肺基底幹細胞による脱細胞ヒト全肺足場材料の再細胞化および培養の図である。（Ｆ）陰圧換気の間の代表的な圧の軌跡（呼吸数６回／分）。臓器チャンバー、肺動脈、ＰＥＥＰチャンバー、気道、および肺静脈において圧を同時に記録する。（Ｇ）換気の間のピーク壁内外圧差（ｍｍＨｇ）。（Ｈ）換気の間の計算された１回換気量（ｍＬ）。箱ひげ図は、中央値に加えて第１四分位および第３四分位を表す。ひげは、データの範囲を表す。外れ値（箱ひげ図の１．５×ＩＱＲより大きい点）を、プラス印（＋）で表す。（Ｉ）バイオリアクターにおける陰圧換気の間に生成された代表的な圧−容量ループ。ｔ＝０での軌跡のループを青色で表し、ｔ＝ｆｉｎａｌは、赤色で表す。
【図５−４】図５Ａ〜Ｋは、初代ヒト肺基底幹細胞による脱細胞ヒト全肺足場材料の再細胞化および培養の図である。（Ｊ）単一の下葉のエンドポイント陽圧換気チャレンジ。（Ｋ）陽圧換気チャレンジの間の灌流液のｐＨ、ｐＯ2、ｐＣＯ2、およびＨＣＯ3の代表的な測定。肺葉を再細胞化して試験の前７日間培養し、機能的チャレンジは、２１％および１００％ＦｉＯ2によって行った。
【図６−１】図６Ａ〜Ｈは、バイオミメティック培養後の肺組織再細胞化の分析の図である。（Ａ）バイオミメティック培養の７日目の細胞生存率をアッセイするためのレサズリン含有培地の灌流。青色色素の生存細胞の代謝は、ピンク色への移行によって可視化され、培養後の広範囲の細胞の保持、分布、および生存率を証明する。（Ｂ）再細胞化肺組織のＨ＆Ｅ切片の代表的なスキャン。（ｉ）スケールバー＝５ｍｍおよび（ｉｉ）スケールバー＝１００μｍ。
【図６−２】図６Ａ〜Ｈは、バイオミメティック培養後の肺組織再細胞化の分析の図である。（Ｃ）培養７日目での持続的なＥ−カドヘリン＋上皮細胞増殖（Ｋｉ６７+）の免疫蛍光画像。スケールバー＝５０μｍ。（Ｄ）再細胞化肺組織におけるＫｉ６７+染色による細胞増殖の定量。肺あたり３つの代表的な領域を分析し、領域あたり４つの画像を定量した。エラーバーは標準偏差を表す。一元配置ＡＮＯＶＡによって分析し、有意性は同定されなかった。
【図６−３】図６Ａ〜Ｈは、バイオミメティック培養後の肺組織再細胞化の分析の図である。（Ｅ）培養７日目での再細胞化肺の免疫蛍光画像は、Ｋｒｔ５+ｐ６３+基底細胞集団の維持および非接着性のｐｒｏＳＰ−Ｂ＋細胞のまれな観察を確認した。（Ｆ）再細胞化（ｉ〜ｉｉ）ラットおよび（ｉｉｉ）ヒト肺におけるＫｒｔ５＋、ｐ６３＋、およびＥ−カドヘリン＋上皮細胞によって証明された、培養後の大きい気道の細胞保持および再配置。
【図６−４】図６Ａ〜Ｈは、バイオミメティック培養後の肺組織再細胞化の分析の図である。（Ｇ）肺足場材料の毛細血管区画におけるＣＤ３１＋細胞の局在および組織化。スケールバー＝５０μｍ。（Ｈ）培養７日目または１０日目（最終日）での肺組織の遺伝子発現の定量的ＰＣＲ解析。３つの独立した再細胞化肺培養からのデータを示し、肺あたりｎ＝４の独自の組織試料を、２連測定実験で分析した。発現をβ−アクチンに対して標準化し、正常な死体肺組織対照と比較した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持した細胞の遺伝子発現レベルを参照のために示す。エラーバーは全て標準偏差を表す。一元配置ＡＮＯＶＡによって解析し、有意性は同定されなかった。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、初代内皮細胞の単離および培養の図である。（Ａ）初代肺内皮細胞を大きい血管から単離し、ＥＧＭ２培地中で５日間培養後、ＣＤ３１＋集団に関して選別した。ゲート設定戦略により、ダブレットおよび死細胞（パシフィックブルー+）が除外されたことおよびＣＤ３１＋集団が単離されたことが証明される。代表的な例を紹介する。（Ｂ）ゼラチンコーティングフラスコでの培養における選別集団の免疫蛍光染色は、内皮細胞の純度を証明する。スケールバー＝１００μｍ。
【図８−１】図８Ａ〜Ｃは、細胞表現型および老化に及ぼすＲＯＣＫ阻害剤の効果の図である。（Ａ）ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（１０μＭ）を添加したまたは添加しない継代１および継代４のｎ＝３の個々の細胞株の遺伝子発現解析。エラーバーは標準偏差を表す。各継代で、無処置および処置（＋ＲＯＣＫ）の間の有意差はｔ−検定によって見出されなかった。
【図８−２】図８Ａ〜Ｃは、細胞表現型および老化に及ぼすＲＯＣＫ阻害剤の効果の図である。（Ｂ）培養培地に添加したトリパンブルーによる、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下または非存在下での継代１および継代４の細胞の代表的な画像。（Ｃ）ｐＨ６で老化関連β−ガラクトシダーゼ活性に関して染色した、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下または非存在下での継代１および継代４の細胞の代表的な画像。スケールバー＝５０μｍ。
【図９】図９Ａ〜Ｂは、基底細胞増殖に及ぼす内皮細胞同時培養の効果の図である。（Ａ）初代肺内皮細胞と同時培養した初代上皮基底細胞（継代４）のｑＰＣＲ遺伝子発現解析。データは、培養細胞にＶＥＧＦを添加した（ＶＥＧＦ＋、４０／ｍｌ）、または添加していない、基底細胞集団（Ｅｐｉ＋）、プラス、トランスウェルインサート上の内皮細胞上での培養（Ｅｎｄｏ＋）を表す。（Ｂ）処置および無処置上皮（非検出）ならびに内皮によるＶＥＧＦ受容体の発現。発現レベルをβ−アクチンに対して標準化し、正常な肺組織と比較して表記する。ｎ＝３の反復実験を２連測定で解析した。エラーバー＝標準偏差。Ｅｐｉ＋無処置群と比較して一元配置ＡＮＯＶＡの後のＤｕｎｎｅｔ事後検定によって解析した。
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、ＢＥＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＡＰＴ（５０ｎＭ）によって５日間前処置した後にラット肺足場材料（２０×１０6個）に送達し、持続的な阻害剤処置を行うことなく遠位２型細胞様の運命を維持した図である。（Ａ）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの処置終了時（５日目）およびラット肺足場材料への送達後に阻害剤を含まずにさらに５日間ｅｘ  ｖｉｖｏで培養した場合の遺伝子発現の定量的ＰＣＲ解析。３個の独立したウェル（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または３個の独立した組織片（ｅｘ  ｖｉｖｏ）からのデータを示す。発現をβ−アクチンに対して標準化し、正常な死体肺組織対照と比較した。（Ｂ）Ｅｘ  ｖｉｖｏでの培養５日目の再細胞化肺組織におけるサーファクタントタンパク質Ｃおよびｐ６３に関する免疫蛍光染色。５０μｍのスケールバー。
【図１１】Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遠位肺胞上皮細胞運命を有する組織由来ＢＥＳＣを効率的に対象とする、ガンマセクレターゼを標的とする二重低分子（この図において、ＬＹ４１１５７５およびＧＳＩ−Ｘ）を使用するＮｏｔｃｈシグナル経路の直接阻害の図である。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ処置終了時（５日目）での遺伝子発現の定量的ＰＣＲ解析。反復実験において分析したｎ＝３の独立したウェルからのデータを示す。発現をβ−アクチンに対して標準化し、無処置細胞（ＳＡＧＭ）と比較して変化倍率を計算した。この処置によって、１型肺胞上皮細胞マーカーＡＱＰ５もまた増加したが、これはＤＡＰＴ／ＩＢＭＸ処置では見出されなかった（図３のように）。
【図１２−１】図１２Ａ〜Ｃは、単離されたヒトＥＣＭ上での上皮細胞培養の図である。（Ａ）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養のためのマトリックスコーティングの調製方法。
【図１２−２】図１２Ａ〜Ｃは、単離されたヒトＥＣＭ上での上皮細胞培養の図である。（Ｂ）新生児（Ｎ１〜Ｎ３）および成人（Ａ１〜Ａ３）マトリックスコーティング上で成長させたＢＥＳＣの定量的遺伝子発現解析。発現をβ−アクチンに対して標準化し、正常な成人肺組織と比較して表記する。
【図１２−３】図１２Ａ〜Ｃは、単離されたヒトＥＣＭ上での上皮細胞培養の図である。（Ｃ）７日目で総生細胞および死細胞蛍光を測定する細胞傷害アッセイ。
【図１３−１】図１３Ａ〜Ｂは、プロテオーム解析による新生児および成人肺組成の図である。（Ａ）各試料中で検出されたタンパク質のヒートマップ。
【図１３−２】図１３Ａ〜Ｂは、プロテオーム解析による新生児および成人肺組成の図である。（Ｂ）新生児と成人のマトリックスを比較するマトリソーム組成の要約（ｎ＝３／群）。
【図１４−１】図１４Ａ〜Ｂは、成人および新生児の肺足場材料におけるマトリックスタンパク質の定量的比較の図である。（Ａ）検出されたマトリックスタンパク質のボルケーノプロット。
【図１４−２】図１４Ａ〜Ｂは、成人および新生児の肺足場材料におけるマトリックスタンパク質の定量的比較の図である。（Ｂ）（Ａ）で強調したタンパク質の詳細。
【図１５−１】図１５Ａ〜Ｅは、ＦＢＮ−２およびＴＮ−Ｃに対するＢＥＳＣの反応のｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析の図である。（Ａ）β−アクチンに対して標準化し、正常な成人肺組織と比較して表記した遺伝子発現解析。
【図１５−２】図１５Ａ〜Ｅは、ＦＢＮ−２およびＴＮ−Ｃに対するＢＥＳＣの反応のｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析の図である。（Ｂ）免疫蛍光染色。
【図１５−３】図１５Ａ〜Ｅは、ＦＢＮ−２およびＴＮ−Ｃに対するＢＥＳＣの反応のｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析の図である。（Ｃ）Ｋｉ６７＋定量（ｎ＝３組織／群）。スケールバー＝５０μｍ。
【図１５−４】図１５Ａ〜Ｅは、ＦＢＮ−２およびＴＮ−Ｃに対するＢＥＳＣの反応のｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析の図である。（Ｄ）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遊走アッセイ、代表的な画像および１８０分間での無細胞領域の変化の定量。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ）各コーティング上でのＢＥＳＣによる接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）の発現。遺伝子発現解析を、β−アクチンに対して標準化し、正常な成人肺組織と比較して表記する。
【図１６−１】図１６Ａ〜Ｅは、前処置したマトリックス上のｅｘ  ｖｉｖｏでの肺上皮再生の図である。（Ａ）上皮再形成された肺足場材料の定量的遺伝子発現。
【図１６−２】図１６Ａ〜Ｅは、前処置したマトリックス上のｅｘ  ｖｉｖｏでの肺上皮再生の図である。（Ｂ）肺組織のヘマトキシリンおよびエオジン評価。スケールバー＝５０μｍ。
【図１６−３】図１６Ａ〜Ｅは、前処置したマトリックス上のｅｘ  ｖｉｖｏでの肺上皮再生の図である。（Ｃ）再生の３および７日目での肺組織の免疫蛍光染色。スケールバー＝５０μｍ。
【図１６−４】図１６Ａ〜Ｅは、前処置したマトリックス上のｅｘ  ｖｉｖｏでの肺上皮再生の図である。（Ｄ）肺上皮再生の３および７日目でのＫｉ６７陽性細胞の定量。（Ｅ）隔膜の厚さによる組織形態の定量。
【図１７】図１７Ａ〜Ｃは、新生児ヒト肺の脱細胞化の図である。（Ａ）ドナーの左右の肺。（Ｂ）ドナー肺のカニューレ挿入。スケールバー＝５ｃｍ。（Ｃ）０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液の灌流脱細胞化による新生児ドナー肺の脱細胞化。
【図１８】隔膜の厚さの代表的な測定。赤色の線は、測定領域（ｎ＝５／画像）を示す。スケールバー（白色）＝５０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
ネイティブ細胞外マトリックス足場材料に基づく固体臓器バイオエンジニアリングにより、末端臓器障害に対する再生医学アプローチに関する最近の強い関心はさらに高まっている（１）。主要なアプローチは、再生細胞集団を、対応する生物学的マトリックスと混合し、生きている機能的移植片を形成することを伴う。この目的に関して、ネイティブ固体臓器細胞外マトリックス（ＥＣＭ）足場材料は、生物適合性のフレームワークを再生のための基礎とする、特定の洗浄剤による灌流脱細胞化によって容易に作製することができる（２〜７）。
【００２６】
臨床的に意義がある臓器再細胞化は、細胞ソースの同定、および移植前の臓器成熟を支持するための機能的バイオミメティック臓器培養条件の確立の両方に関して重要な問題となっている（８）。
【００２７】
最適な細胞ソースとは、容易に得られ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に増大され、理想的には多系列分化能を有する細胞ソースである。人工多能性幹細胞の重要な発達段階を通しての方向性の分化は、肺特異的細胞集団を得るための有望な選択肢を与えるが（９〜１１）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養の長さおよび細胞数が限られることにより、大規模な臓器エンジニアリングに関する有用性は、現行のままでは限定される。成人肺組織は、ほとんどが静止期であるが、多数の条件的な幹細胞／前駆細胞集団が組織損傷に反応して活性化されるようになることにより、顕著な再生能を有する（１２）。転写因子ｐ６３およびサイトケラチン５（Ｋｒｔ５）の発現によって同定される気道基底細胞は、気道上皮の多能性幹細胞として機能し、生理的な細胞の代謝回転および再生の間に気道の恒常性を維持するために重要である（１３、１４）。この本質的な細胞集団は、ヒト気道上皮の細胞の３０％を構成し（１５）、気道再生に関する初期の研究により、単離された基底細胞が、露出したマウス気管に播種した場合に完全に分化した気道上皮を再現できることが証明された（１６）。損傷に反応して、基底上皮幹細胞は、急速に増殖し、繊毛細胞およびクララ細胞子孫の両方を生じることができ、組織の恒常性および損傷修復におけるその重要な機能が確認されている（１７）。肺基底細胞は、容易に肺組織から単離して（１８、１９）、培養において増大させることができ（２０）、このため組織エンジニアリング応用のための有用な標的集団となる。この初代幹細胞集団のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養はまた、特にその多系列分化能（２１、２２）を考慮すると、基礎生物学および組織再生（１３）を研究するための重要なツールも提供する。
【００２８】
本明細書において、容易に入手できる組織ソースの高増殖性基底幹細胞集団の単離を記述し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１００倍超の増大を証明した。この細胞集団は、Ｋｒｔ５+ｐ６３+発現によって同定され、肺の修復の動物モデル（２３〜２５）およびヒト疾患（２６）において試験されている。
【００２９】
Ｋｒｔ５+ｐ６３+集団において、各々が組織恒常性および修復において独自の役割を有する、基底幹細胞のさらなる個別の亜集団が存在し得る。これは、損傷後に特異的に増殖することができる（２７）正常な遠位肺内の最近報告された細胞系列陰性上皮前駆細胞（ＬＮＥＰ）を含む。これらのまれな細胞サブセットが単独で作用することができるか否か、または損傷した組織環境における他の細胞との複合的なシグナリングおよび作用を必要とするか否かは不明である。数学モデルは、基底幹細胞集団が不均一であることを支持し、多能性幹細胞と単分化能前駆細胞がほぼ同数であること（２８）を提唱する。ソース、強度、および持続を含む損傷の役割もまた、細胞の活性化および運命の重要な決定因子である。２つの例として年齢および種を考慮すると、試験される細胞集団のソースもまた、再生能および細胞運命に寄与し得る。発達の細管期での胎児肺は最近、間葉細胞および血球細胞によって取り囲まれた、上皮前駆細胞が豊富に存在する別個のニッチを保有することが示されており、これらの細胞を、損傷した肺に移植して、多数の系列に分化させることができる（２９）。
【００３０】
肺の損傷後、インタクト上皮の再確立は、肺の恒常性を回復するために極めて重要である（３０）。本発明の肺損傷モデルにおいて、脱細胞化肺足場材料は、上皮細胞遊走のための仮のマトリックスとして役立ち、露出した気道およびガス交換表面を被覆して修復するためにｉｎ  ｖｉｖｏで活性化されるプロセスを（少なくとも部分的に）再現する（３１）。上皮細胞をマトリックスに結合させて下層の間質を保護するのを助ける、基底細胞の生理的役割は、それらが豊富な細胞骨格、結合部および接着タンパク質を発現することによって補助されており、このことはネイティブ肺ＥＣＭの上皮再形成におけるその証明された有用性を裏付ける（３２）。
【００３１】
齧歯類の気道損傷モデルは、上皮修復の時系列表を確立している。上皮の損傷後、最初の１２〜２４時間に、細胞の伸展および遊走が一次修復機構として起こり、増殖は２４時間後に始まり、数週間持続する（３３）。この時系列表は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの培養における肺修復および再生の現在のモデルと一致する。修復機構における次のステップは、多列上皮の再確立であり、これは確立するのに数週間を要し得る（３４）。本発明のラット全肺足場材料上の気液界面培養モデルは、７日目でＦＯＸＪ１の初回アップレギュレーションおよび密着結合形成の増加を証明した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＬＩモデルは成熟気道生物学を再現するために３〜４週間を要することから（３５）、再構成された上皮を完全に成熟させるためには長期のバイオリアクター培養が必要であり得る。再細胞化およびｅｘ  ｖｉｖｏ培養後、本発明の再構成上皮内には、有意な肺胞上皮細胞系列は同定されなかった。動物モデルにより、遠位肺再生には５０〜９０日を要することが証明されていることから（２７、３６）、送達された幹細胞集団から単分化能肺胞上皮細胞の分化を誘導するためには、おそらくシグナリング経路の調節と組み合わせたより長い再生時間が必要である。
【００３２】
Ｎｏｔｃｈシグナリングは、肺上皮の発達および恒常性において本質的かつ複合的な役割を果たしており、Ｎｏｔｃｈリガンドは、肺において非常に高レベルで発現される（３７）。肺の発達は、多数の細胞系列の正確なパターン形成を必要とし、その多くの運命の選択は、直接の細胞−細胞伝達によって制御される。胎児の肺胞発達の間、Ｎｏｔｃｈの構成的な過剰発現は、遠位上皮の発達を阻害し、その代わりに肺胞マーカーを主に欠如する嚢胞形成を促進する（３８）。初期の肺近位−遠位細胞運命の決定においてＮｏｔｃｈシグナリングが必要であることはまた、ＤＡＰＴによるＮｏｔｃｈ阻害後でも示されており、それによってＮｋｘ２．１+遠位肺前駆細胞集団の蓄積が起こる（３８）。同様に本明細書において示されるように、γ−セクレターゼを通してのＮｏｔｃｈ経路の薬理学的阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでの肺足場材料培養においてＩＩ型肺胞上皮細胞表現型への全体的な転換を誘導することができる。これは、マウス基底幹細胞の三次元スフィア培養の報告を確認する（２７）。同様に、Ｎｏｔｃｈ阻害後にＣＣＳＰ発現の喪失も観察され、分泌系列への基底細胞の分化におけるＮｏｔｃｈ活性化の本質的な役割をさらに強調している（３９、４０）。臓器エンジニアリングに関して、これらのシグナルの正確な制御は、最適な細胞パターン形成を得るために、Ｎｏｔｃｈ経路の薬学的活性化または阻害を必要とし得る。これらの生化学シグナルを特定の近位または遠位肺区画に、用量および時間を制御しながら、特異的に送達するためには、進んだバイオエンジニアリング手順をさらに開発する必要がある。機械的な力もまた、メタロプロテアーゼ切断部位を露出するＮｏｔｃｈシグナリングの活性化および自己阻害コンフォメーションからのその後の変化の促進に寄与する（４１）。これらの機械的な面についての検討は、三次元全臓器バイオミメティック培養と従来の二次元培養とを比較した場合に細胞−細胞シグナリングに対してさらに重要であり得る。バイオミメティック臓器灌流に起因する剪断流体力は、培養の間、足場材料に沿った細胞の組織化をさらに指示し得る。上皮細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで流体流の流線型に沿って遊走することが示されており、これは局所微小環境におけるパラクライン型のケモカインフィールドによって指示され得る（４２）。
【００３３】
本発明の肺足場材料再細胞化およびｅｘ  ｖｉｖｏ再生モデルは、上皮修復を系統的にさらに調べるための独自の容易に入手できるツールを提供する。
【００３４】
脱細胞化足場材料に基づく臓器再生は、おそらく損傷および細胞修復能の試験に関する最終的なモデルである。再生臓器のｅｘ  ｖｉｖｏ培養によって提供されるバイオミメティック刺激と合わせて、孤立した環境を考慮すると、特異的細胞集団がネイティブ組織を再生する能力を直接評価することが可能である。本研究において、系統的な構築ブロックアプローチを使用することによって、初代の単離された気道幹細胞集団が、無細胞肺足場材料において広範な組織再生を達成することができること、ならびに近位および遠位上皮系列の両方に分化させることができることを証明することは、重要な前進である。
【００３５】
本発明の文書は、気道臓器生成および保存に関係する方法および材料に関する。ヒトおよび他の動物にすぐに移植できる機能的気道臓器を成長させるためのより現実的な環境を提供するために使用することができる機能的肺組織を生成するように構成された方法、装置、細胞、および組成物を記載する。肺組織は、所定のマトリックス、例えば人工または脱細胞化肺組織マトリックス上で生成される。本発明はさらに、移植のためのより多くの、改善された、および個別化した移植片を提供するために、長期間にわたってドナー臓器を保存、修復、および修飾するためにこの現実的な環境を使用することにさらに基づく。
【００３６】
本明細書において使用される、「機能的な」肺組織は、正常な健康な肺の機能のほとんどまたは全てを実行し、例えば空気からの酸素を血流に輸送することおよび血流からの二酸化炭素を空気中に放出することを可能にする。機能的な肺組織は、吸気を加湿し、肺胞の表面張力を減少させるためにサーファクタントを産生し、ならびに／または粘液を産生および輸送して、吸い込んだ微粒子物質を遠位から近位気道に除去することができる。
【００３７】
本明細書において使用される用語「脱細胞化」および「無細胞」は、標準的な組織学染色手順を使用して、組織切片における検出可能な細胞内物質、内皮細胞、上皮細胞および核の完全またはほぼ完全な非存在として使用または定義される。残留細胞デブリもまた脱細胞化臓器または組織から除去されていることが好ましいが、必ずしもその必要はない。
【００３８】
脱細胞化組織／臓器マトリックス
本発明の方法の一部の実施形態において、肺組織は脱細胞化マトリックス上で生成される。脱細胞化肺組織マトリックスを調製するための方法および材料は、以下に考察されるように、当技術分野で公知である。そのようなマトリックスを調製するために、任意の適切な材料を使用することができる。好ましい実施形態において、組織マトリックスは、脱細胞化肺組織から開発した無細胞組織足場材料であり得る。例えば、ヒト肺などの組織、例えば１つまたは１対のヒト肺またはその一部、例えばヒト、ブタ、ウシ、霊長類、またはヒツジ死体肺またはその一部を、組織または組織の一部の形態学的完全性および血管系を維持しながら、ならびに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を保存しながら、組織からネイティブの細胞を除去するために適切な方法によって脱細胞化することができる（Tapias LF, and Ott HC. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Current opinion in organ transplantation. 2014;19(2):145-52を参照されたい）。哺乳動物の肺組織を脱細胞化する方法は、例えばO’Neill JD et al., Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.  Ann Thorac Surg. 2013 Sep;96(3):1046-55; Nichols JE et al., Production and assessment of decellularized pig and human lung scaffolds, Tissue Eng Part A. 2013 Sep;19 (17-18):2045-62; Gilpin SE et al., Perfusion decellularization of human and porcine lungs: Bringing the matrix to clinical scale. Journal of Heart and Lung Transplantation.  2014; 33: 298-308; Song JJ et al., Bioartificial lung engineering. Am J Transplant. 2012 Feb;12(2):283-8;およびOtt HC et al., Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 2010 Aug;16(8):927-33に記載されている。例示的な脱細胞化方法は、組織（例えば、肺組織）を、例えば液体窒素を使用して繰り返し凍結融解サイクルに供するステップを含み得る。他の例において、組織をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはＴｒｉｔｏｎＸなどの陰イオン性またはイオン性の細胞破壊培地に供することができる。組織はまた、ヌクレアーゼ溶液（例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ）によって処置し、軽く攪拌しながら滅菌リン酸緩衝食塩水によって洗浄することができる。例示的な方法は、当技術分野で公知であり、例えばO’Neill JD et al., Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.  Ann Thorac Surg. 2013 Sep; 96(3):1046-55である。一部の例において、脱細胞化は、当技術分野で公知の方法および材料を使用して、臓器または組織の血管、導管、および／または腔を洗い流すことによって実施することができる。例えば、Maghsoudlou et al., Preservation of micro-architecture and angiogenic potential in a pulmonary acellular matrix obtained using intermittent intra-tracheal flow of detergent enzymatic treatment. Biomaterials. 2013 Sep; 34(28):6638-48に記述されるように。洗い流すステップの後、臓器または組織を、上記の細胞破壊培地、例えば１％ＳＤＳの脱イオン水溶液によってラインを介して灌流することができる。組織の中の灌流は、順行性または逆行性であり得て、灌流の効率を改善するために、方向を交互にすることができる。臓器または組織のサイズおよび重量、ならびに細胞破壊培地中の特定の陰イオン性またはイオン性洗浄剤および陰イオン性またはイオン性洗浄剤の濃度に応じて、組織を一般的に、細胞破壊培地に���って組織１グラムあたり約２〜約１２時間灌流する。洗浄を含めて、臓器を、組織１グラムあたり最大約１２〜約７２時間灌流してもよい。灌流は一般的に、流速および圧力を含む生理的条件、例えば５〜１００ｍｍＨｇの間の圧力、およびソース生物または個体の生理的心拍出量の０．１〜１０倍の間の流速となるように調節される。
【００３９】
別の例示的な方法において、脱細胞化方法は、洗浄剤、例えば（１）０．１％ＳＤＳ、（２）２％デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）、または（３）８ｍｍｏｌ／ｌの（３）３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）（ｐＨ１２）洗浄剤を、３０ｃｍ  Ｈ2Ｏの定圧で肺動脈を通して灌流するステップを含む。３つ全ての洗浄剤のプロトコールは以下を含む：
１．リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）による１０分間の初回順行性洗浄、
２．不透明で半透明なマトリックス（脱細胞化を示している）を可視化するために必要な時間プラスその最初の時間のさらに２０％（例えば、７０分＋１４分）の時間での洗浄剤の灌流、
３．１５分間の脱イオンＨ2Ｏによる洗浄、ならびに
４．抗生物質および抗真菌剤を添加したＰＢＳによるさらにｌ７２時間の洗浄。
この脱細胞化方法は、脱イオンＨ2Ｏによる洗浄後に、例えば１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘによるさらなる洗浄を含み得る。ＳＤＣプロトコールは、ＳＤＣの前に０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの灌流およびＳＤＣ後に１ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌの洗浄を含み得る。
【００４０】
同様に、ブタおよびヒト肺脱細胞化方法は、洗浄剤または他の脱細胞化剤を定圧で肺動脈を通して灌流後に、Ｈ2Ｏ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液、およびＰＢＳによって連続的に洗浄するステップを含み得る。ラット肺と同様に、脱細胞化は、肉眼で検査して、不透明で半透明なマトリックスが出現すれば完全であると思われる。開始臓器における、主に収集の間の予洗が十分かどうか、および生じた任意のクロットによる変動により、必要な灌流時間が変化し得る。一般的に、脱細胞化灌流時間は、例えば４〜７日間まで変化し得る。
【００４１】
脱細胞化組織は、本質的に、血管樹のＥＣＭ構成要素を含む組織の全てまたは大部分の領域の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成要素からなり得る（例えば、少なくとも８５重量％純粋、９０重量％純粋、９２重量％純粋、９５重量％純粋、９６重量％純粋、９７重量％純粋、９８重量％純粋、および９９重量％純粋）。ＥＣＭ構成要素は、基底層などの定義された構造として組織化されたままであり得る、フィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンファミリーメンバー（例えば、Ｉ、ＩＩＩ、およびＩＶ型コラーゲン）、グリコサミノグリカン、マトリックス、細網線維およびトロンボスポンジンのいずれかまたは全てを含み得る。好ましい実施形態において、脱細胞化肺組織マトリックスは、インタクト血管系を保持している。実質的にインタクトの血管系を保存していることにより、移植の際に、組織マトリックスを対象の血管系に接続することができる。加えて、脱細胞化組織マトリックスは、脱細胞化組織マトリックス上またはマトリックス内に残っているいかなるタイプの微生物の存在も低減または除去するために、例えば放射線照射（例えば、ＵＶ、ガンマ線）によってさらに処置することができる。
【００４２】
物理的、化学的、および酵素的手段を使用して脱細胞化組織マトリックスを得る方法は、当技術分野で公知であり、例えばLiao et al, Biomaterials 29(8):1065-74 (2008); Gilbert et al., Biomaterials 27(9):3675-83 (2006); Teebken et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 19:381-86 (2000)を参照されたい。同様に、米国特許出願公開第２００９／０１４２８３６号明細書；第２００５／０２５６５８８号明細書；第２００７／０２４４５６８号明細書；および第２００３／００８７４２８号明細書も参照されたい。
【００４３】
人工臓器マトリックス
本発明の一部の実施形態において、肺組織は人工臓器マトリックス上で生成される。人工臓器マトリックスを調製するための方法および材料は、当技術分野で公知である。そのようなマトリックスを調製するために任意の適切な材料を使用することができる。好ましい実施形態において、人工臓器マトリックスは、例えばポリグリコール酸、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（ＰＦ−１２７）、Ｇｅｌｆｏａｍスポンジ、コラーゲン−グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、フィブリノゲン−フィブロネクチン−ビトロネクチンハイドロゲル（ＦＦＶＨ）、およびエラスチンなどの多孔性材料から開発された足場材料であり得る。例えば、Ingenito et al., J Tissue Eng Regen Med. 2009 Dec 17; Hoganson et al., Pediatric Research, May 2008, 63(5):520-526; Chen et al., Tissue Eng. 2005 Sep-Oct;11(9-10):1436-48を参照されたい。一部の例において、人工臓器マトリックスは、肺胞単位と類似の多孔性構造を有し得る。Andrade et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2007 Feb;292(2):L510-8を参照されたい。一部の例において、移植された人工臓器マトリックスは、臓器特異的マーカー（例えば、クララ細胞、肺胞上皮細胞、および呼吸上皮の肺特異的マーカー）を発現することができる。一部の例において、移植された人工臓器マトリックスは、同定可能な構造（例えば、人工肺マトリックスにおける肺胞および末端気管支と類似の構造）へと組織化することができる。例えば、ＦＦＶＨを使用して作製した、移植された人工肺マトリックスは、周辺組織への栄養作用の証拠を示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞接着、細胞伸展、および細胞外マトリックス発現を促進し、ｉｎ  ｖｉｖｏで明白な生着を促進することができる。Ingenito et al., 上記を参照されたい。同様に、米国特許第７，６６２，４０９号明細書および第６，０８７，５５２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／００３４７９１号明細書；第２００９／００７５２８２号明細書；第２００９／００３５８５５号明細書；第２００８／０２９２６７７号明細書；第２００８／０１３１４７３号明細書；第２００７／００５９２９３号明細書；第２００５／０１９６４２３号明細書；第２００３／０１６６２７４号明細書；第２００３／０１２９７５１号明細書；第２００２／０１８２２６１号明細書；第２００２／０１８２２４１号明細書；および第２００２／０１７２７０５号明細書を参照されたい。
【００４４】
テネイシン−Ｃおよび／またはフィブリリン−２による処置
肺臓器エンジニアリングのための最適な足場材料は、必要な構造を提供するのみならず、新しい肺組織の組織化および機能をさらに誘導する。ＥＣＭは、組織の発達および修復を含む多くの生物学的プロセスに関与する複雑な実体である（Balestrini and Niklason, Annals of biomedical engineering. 2015;43(3):568-76）。臓器全体の再生においてＥＣＭを検討する場合、足場材料を調製するために使用するネイティブの肺組織のソースは、その後の再生に直接影響を及ぼし得る。いくつかの研究が、基礎となる肺の病態が、脱細胞化後に保持されるＥＣＭの変化を引き起こし得ること、およびそれが組織修復の間に永続しうることを示している（Burgess et al., The Journal of pathology. 2016;240(4):397-409）。このことは、肺線維症および肺気腫の両方に関して証明されている（Booth et al. American journal of respiratory and critical care medicine. 2012;186(9):866-76; Sokocevic et al. Biomaterials. 2013;34(13):3256-69）。肺の年齢もまた、脱細胞化足場材料に対する重要な差異に寄与し得る。老齢のＥＣＭ上で成長させると、ラミニンα３およびα４鎖の細胞発現が有意に低くなり得ることが示されており、これは老齢の肺ＥＣＭにおいて観察されるラミニン欠乏を再現している。これらのデータはさらに、肺足場材料に含まれる深い生物情報、および修復細胞集団と基礎となるタンパク質マトリックスとの間に存在し得るフィードバックループがあることをさらに強調する（Godin et al., PloS one. 2016;11(3):e0150966）。
【００４５】
肺の発達は、生後活動的に持続し、ＥＣＭリモデリングは、生後の肺胞形成プロセスにおける必須の構成要素である。この機構は、肺が、未成熟肺胞構造をさらに精密化して、多数のより小さいサイズの肺胞を生成するために二次肺胞形成を開始すると、ガス交換表面積を劇的に増加させるように機能する（Whitsett et al., Physiological reviews. 1995;75(4):749-57）。このプロセスの結末およびＥＣＭ組成の特定の差は、ｅｘ  ｖｉｖｏ組織再生の状況において十分に研究されていない。胎児の創傷は、成人より速い速度で修復し、瘢痕はほとんどまたは全く残らない（Yates et al., Birth defects research Part C, Embryo today: reviews. 2012;96(4):325-33）。肺の再増殖は、幼少期での肺葉切除後では可能であり、気道機能が回復し、肺容量は完全に回復する（McBride et al., The Journal of clinical investigation. 1980;66(5):962-70）。これに対し、ＥＣＭの調節異常は、加齢の重要な促進因子であり、ＥＣＭにおける加齢関連変化は、周辺細胞に直接伝達され、肺気腫および肺線維症などの慢性的な肺疾患の発症に寄与し得る（Meiners et al., The European respiratory journal. 2015;45(3):807-27）。加齢の別の結末は、多能性前駆細胞プールが進行性に低下し、老化の増大に至る、幹細胞の機能障害および消耗の現象である（Thannickal et al., American journal of respiratory and critical care medicine. 2015;191(3):261-9）。幹細胞と、ＥＣＭを含むニッチとの間のこれらの相互作用は、再生能のこの減少に寄与し得る。
【００４６】
本研究は、成人肺ドナーと比較して、活動的に肺胞形成を行っている新生児肺からのＥＣＭの差を調べ、ｅｘ  ｖｉｖｏでの肺上皮修復に及ぼすこれらの差の結末を評価した。新生児ヒト肺ＥＣＭでは、発達に関連するタンパク質であるフィブリリン−３（ＦＢＮ−３）、フィブリリン−２（ＦＢＮ−２）、およびテネイシン−Ｃ（ＴＮ−Ｃ）が増加しており、これらの２つのタンパク質を無細胞肺足場材料上でのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの両方の肺再生に補充すると、上皮増殖を増強し、老化を減少させ、細胞接着および遊走を助け、ならびに再生された組織の形態および構造を最終的に改善することが報告されている。
【００４７】
一部の実施形態において、肺組織マトリックス、例えば脱細胞化肺組織マトリックスまたは人工肺マトリックスを、細胞を播種する前に、例えば、ラット肺マトリックスに関して全量１５ｍｌ中でテネイシン−Ｃ（例えば、０．５〜１０μｇ／ｍｌ、例えば約１〜３μｇ／ｍｌ）、および／またはフィブリリン−２（例えば、全体またはＮおよびＣ断片）（例えば、０．５〜１０μｇ／ｍｌ、例えば約１〜３μｇ／ｍｌ）を含む溶液によって前処置する。これらの方法において、テネイシン−Ｃおよび／またはフィブリリン−２は外部から添加され、すなわち、マトリックスをインキュベートする溶液に（マトリックスに接触させる前または間のいずれか）添加され、これは、マトリックスに既に存在する（または溶液中に存在する任意の血清中に既に存在する）任意のテネイシン−Ｃおよび／またはフィブリリン−２に加えての添加である。一部の実施形態において、方法は、テネイシン−ｃおよび／またはフィブリリン−２を含む溶液、例えば約０．５〜１０μｇ／ｍｌテネイシン−Ｃおよび／または約０．５〜１０μｇ／ｍｌフィブリリン−２を含む溶液を、足場材料気道に送達するステップ（例えば、重力圧によって）と、テネイシン−Ｃおよび／またはフィブリリン−２の存在下でマトリックスを例えば３７℃で１時間インキュベートするステップを含む。一部の実施形態において、細胞は、テネイシン−Ｃおよび／またはフィブリリン−２を含む溶液に播種される。フィブリリン−２の代替としてまたはそれに加えて、フィブリリン−３を使用することができる。
【００４８】
ヒトテネイシン−Ｃ前駆体の例示的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおけるＮＭ＿００２１６０．３（核酸）およびＮＰ＿００２１５１．２（タンパク質）である。例示的なタンパク質配列は以下の通りである：
【００４９】
【化１】
2019519217.tif 000003
【００５０】
アミノ酸１〜２２位はシグナル配列であるように思われ、一部の実施形態において成熟テネイシン−Ｃタンパク質、例えば配列番号１のアミノ酸２３〜２２０１位を使用することができる。あるいは、アミノ酸２３〜６２５位を含む断片を使用することができる。
【００５１】
ヒトフィブリリン−２前駆体の例示的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおけるＮＭ＿００１９９９．３（核酸）およびＮＰ＿００１９９０．２（タンパク質）である。ヒトフィブリリン−２前駆体の例示的なタンパク質配列は以下の通りである：
【００５２】
【化２】
2019519217.tif 000004
【００５３】
アミノ酸１〜２８位はシグナル配列であるように思われる。一部の実施形態において、成熟フィブリリン−２タンパク質、例えば配列番号２のアミノ酸２９〜２９１２位を使用することができる。一部の実施形態において、フィブリリン−２は、例えばヒト２９３細胞において産生された、２つの個別のペプチド、例えばＮおよびＣ断片、例えばＮ末端半分であるｒＦＢＮ２−Ｎ（アミノ酸１〜１７３２位）およびＣ末端半分であるｒＦＢＮ２−Ｃ（アミノ酸１５３１〜２７７１位）として作製される。例えば、Lin et al., J. Biol. Chem. 277: 50795-50804 (2002)を参照されたい。
【００５４】
ヒトフィブリリン−３前駆体の例示的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおけるＮＭ＿００１３２１４３１．１（核酸）およびＮＰ＿００１３０８３６０．１（タンパク質）、またはＮＭ＿０３２４４７．４（核酸）およびＮＰ＿１１５８２３．３（アミノ酸）である。
【００５５】
好ましくは、使用したタンパク質の配列は、上記で提供した成熟参照配列と少なくとも８０％同一（例えば少なくとも９０％、９５％、または９９％同一）であり、本明細書に記載の活性を有する。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を、最適な比較目的で整列させる（例えば、最適なアライメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の１つまたは両方にギャップを導入することができ、非相同配列を比較目的に関して無視することができる）。好ましい実施形態において、比較目的のために整列させた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、一部の実施形態において、少なくとも９０％または１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置で同一である（本明細書において使用されるアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である
【００５６】
２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ワールドワイドウェブｇｃｇ．ｃｏｍ上で入手可能）においてＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453）のアルゴリズムを使用して、デフォルトパラメータ、例えばＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコア行列と共にギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５を使用して決定することができる。
【００５７】
任意の形態のＴＮＣまたはＦＢＮ−２、例えば組み換えによって産生された（例えば、細胞、例えば原核細胞もしくは真核細胞、好ましくは哺乳動物（より好ましくはヒト）細胞から発現および単離された、またはタンパク質を産生するトランスジェニック動物から発現および単離された、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの無細胞系において転写および翻訳された）タンパク質、または天然ソースから単離されたタンパク質を使用することができる。ヒトタンパク質が好ましいが、他の哺乳動物種、例えばウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、またはヒツジも使用することができる。
【００５８】
本開示は、一部の細胞タイプに関するＴＮＣおよび／またはＦＢＮ−２の使用を例示しているが、他も同様に使用することができる。
【００５９】
細胞の播種
本明細書に記載の方法の一部において、肺組織マトリックス、例えば脱細胞化肺組織マトリックスまたは人工肺マトリックスに、細胞、例えば分化したまたは再生細胞を播種する。
【００６０】
ナイーブまたは未分化細胞タイプなどの適切な再生細胞タイプを、肺組織マトリックスに播種するために使用することができる。幹細胞段階（例えば、誘導後）、前駆細胞段階、造血芽球段階、または分化段階（例えば、ＣＤ３１＋、ｖＷＦ＋）を含むがこれらに限定されない、多様な発達段階の細胞を播種してもよい。本明細書において使用される再生細胞は、前駆細胞（progenitor cell）、前駆細胞（precursor cell）、および臍帯細胞（例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞）を含む「成人」由来幹細胞、および胎児幹細胞を含み得るがこれらに限定されない。再生細胞はまた、分化したまたは単分化能細胞タイプを含み得る。本明細書において提供する方法および材料にとって適切な幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（例えば、未分化、分化内胚葉、前方臓側内胚葉、ＴＴＦ−１陽性肺前駆細胞）、ヒト間葉幹細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、多能性成人前駆細胞（ＭＡＰＣ）、ｉＰＳ由来間葉細胞、または胚幹細胞を含み得る。一部の例において、他の組織に由来する再生細胞も同様に使用することができる。例えば、皮膚、骨、筋肉、骨髄、滑膜、または脂肪組織に由来する再生細胞を、幹細胞を播種した組織マトリックスを開発するために使用することができる。
【００６１】
一部の例において、本明細書において提供される肺組織マトリックスに、あるいはまたはさらに（好ましくはヒト）上皮細胞および内皮細胞などの分化した細胞タイプを播種することができる。例えば、肺マトリックスに、血管系を介して（例えば、動脈ラインまたは静脈ラインを通して）内皮細胞を播種することができ、気道を介して（例えば、気管ラインを通して）Ｋｒｔ５+ｐ６３+細胞であるヒトドナーからの増殖性基底幹細胞を播種することができる。肺マトリックスはまた、１つまたは複数の細胞タイプ、例えば、１つまたは複数のタイプの上皮および間葉細胞、成人末梢血由来上皮細胞、臍帯血由来上皮細胞、ｉＰＳ由来上皮細胞、前駆段階細胞（例えば、平滑筋）、成人肺由来細胞混合物（例えば、ラット、ヒト）、市販の小さい気道上皮細胞または肺胞上皮細胞、胚幹（ＥＳ）細胞由来上皮細胞、および／またはヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種することができる。
【００６２】
任意のタイプの適切な市販の培地および／または培地キットを、細胞の播種および培養のために使用してもよい。例えば、ＳＡＧＭ培地を、小さい気道細胞（例えば、ＬｏｎｚａのＳＡＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）のために使用してもよく、ＥＧＭ−２キットを内皮細胞のために使用してもよい（例えば、ＬｏｎｚａのＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）。播種する内皮細胞タイプに合わせた培地（例えば、ＶＥＧＦなどの増殖因子を増加または減少させることによって）を、例えば、Brudno Y et al. Biomaterials 34 (2013) 9201-9209に記述されるように使用してもよい。内皮細胞の場合、細胞の播種、増大、生着、および成熟の異なる相を誘導するために、一連の異なる培地組成を使用してもよい。例えば第１の相において、細胞を播種した構築物を、内皮細胞の増大、遊走、および代謝を増加させるために「血管新生培地」によって２〜３０日間灌流してもよい。この培地は、高濃度のサイトカイン、例えば５〜１００ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦおよび５〜１００ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、ならびにプロテインキナーゼＣの活性化を通して血管新生経路を活性化するホルボルミリステートアセテート（ＰＭＡ）、例えば５〜１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡの存在および内皮細胞の発芽を刺激するＡｎｇ−１の存在によって特徴付けられる。第２の相において、細胞を播種した構築物を、内皮細胞の成熟および密着結合の形成を支持する「強化培地」によって灌流することができる。強化培地は、低レベルのサイトカインを有し、血管新生培地と同じ基本組成を有するが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＰＭＡ（０．１〜５ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＭＡ）のレベルが減少している。密着結合形成を促進し、肺浮腫を低減することが示されているヒドロコルチゾンを、血管の成熟を促進するために強化培地にさらに添加することができる。血管形成を増強するために、ＰＤＧＦおよびＡｎｇ−２などのさらなる成熟促進因子を強化培地に添加してもよい。これらの因子の濃度は、異なる血管サイズを支持するために滴定してもよい。突然のサイトカインの変化の有害な効果を回避するために、培地の変化を徐々に行うことができる。内皮細胞補助培地と同様に、上皮細胞の運命を誘導するために、連続的な培地の変化を使用することができる。最初の培地は、例えば胚体内胚葉を誘導するために、１０〜２００ｎｇ／ｍｌ  アクチビンＡおよびＰｉ３Ｋ阻害剤、例えば０．０１〜１μＭ  ＺＳＴＫ  ４７４を含んでもよく、次に前方臓側内胚葉を誘導するためにＴＧＦ−ベータ阻害剤、例えば０１〜１０μＭ  Ａ−８３０１、およびＢＭＰ４アンタゴニスト、例えば０．０５〜１μＭ  ＤＭＨ−１を含んでもよく、最後に肺前駆細胞の生成を誘導するために、１〜１００μｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、１０〜５００ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３ベータ阻害剤、例えば１０〜５００ｎＭ  ＣＨＩＲ  ９９０２１、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば１〜１００ｎＭ  ＰＩＫ−７５、および１〜１００ｎＭ  メトトレキサートを含んでもよい。
【００６３】
播種のための細胞を単離および収集するための任意の適した方法を使用することができる。例えば、人工多能性幹細胞は、一般的にＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８などの転写因子の異所発現によって多能性状態へと「リプログラムされた」体細胞から得ることができる。Takahashi et al., Cell 131:861-72 (2007); Park et al., Nature 451:141-146 (2008); Yu et al., Science 318:1917-20 (2007); Zhu et al., Cell Stem Cell. 7:651-5 2010; and Li et al., Cell Res. 21:196-204 (2011); Malik and Rao, Methods Mol Biol. 2013;997:23-33; Okano et al., Circ Res. 2013 Feb 1;112(3):523-33; Lin and Ying, Methods Mol Biol. 2013;936:295-312を参照されたい。末梢血由来単核球細胞を、患者の血液試料から単離して、人工多能性幹細胞を生成するために使用することができる。他の例において、人工多能性幹細胞は、トランスフォーミング増殖因子β（ＳＢ４３１５４２）、ＭＥＫ／ＥＲＫ（ＰＤ０３２５９０１）、およびＲｈｏ−キナーゼシグナリング（チアゾビビン）などの低分子と共に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭＹＣが高度に同時発現するように最適化された構築物によってリプログラムすることによって得ることができる。GroB et al., Curr Mol Med. 13:765-76 (2013) and Hou et al., Science  341:651:654 (2013)を参照されたい。幹細胞から内皮細胞を生成する方法は、Reed et al., Br J Clin Pharmacol. 2013 Apr;75(4):897-906によって論評されている。臍帯血幹細胞は、新鮮なまたは凍結臍帯血から単離することができる。間葉幹細胞は、例えば無処理の非精製骨髄またはｆｉｃｏｌｌ精製骨髄から単離することができる。上皮および内皮細胞は、生きているまたは死体ドナー、例えばバイオ人工肺を受けている対象から当技術分野で公知の方法に従って単離および収集することができる。例えば、上皮細胞は、皮膚組織試料（例えば、パンチ生検）から得ることができ、内皮細胞は、血管組織試料から得ることができる。
【００６４】
一部の実施形態において、タンパク質分解酵素を、血管系に留置したカテーテルを通して組織試料に灌流する。酵素処理した組織の一部を、さらに酵素的および機械的破壊に供することができる。このようにして得られた細胞の混合物を分離して、上皮細胞および内皮細胞を精製することができる。一部の例において、フローサイトメトリーに基づく方法（例えば、蛍光活性化細胞選別）を使用して、特異的細胞表面マーカーの有無に基づいて細胞を選別することができる。さらに、肺細胞（上皮、間葉、および内皮）を、肺生検から得ることができ、これは経気管支および気管支内生検を介して、または肺組織の外科的生検を介して得ることができる。非自己細胞を使用する場合、対象に移植した場合に臓器または組織が拒絶されないように、免疫タイプをマッチさせた細胞の選択を検討すべきである。
【００６５】
単離された細胞を、緩衝液（例えば、ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水）中ですすいで、細胞培養培地に浮遊させることができる。標準的な細胞培養方法を使用して、細胞集団を培養および増大させることができる。細胞が得られた後、その細胞を使用して組織マトリックスに播種する、例えば動脈もしくは静脈ライン（内皮細胞）を介して、または気道（気管）ライン（上皮細胞）を通してマトリックスに導入することができる。例えば、組織マトリックスに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも１つの細胞タイプを任意の適切な細胞密度で播種することができる。例えば、マトリックスに播種するための細胞密度は、マトリックス１グラムあたり細胞少なくとも１×１０3個であり得る。細胞密度はマトリックス１グラムあたり細胞約１×１０5個〜約１×１０10個の範囲であり得る（例えば、マトリックス１グラムあたり細胞少なくとも１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、１００，０００，０００、１，０００，０００，０００、または１０，０００，０００，０００個を使用することができる）。
【００６６】
一部の例において、本明細書において提供される脱細胞化または人工組織マトリックスに、例えば重力流または灌流播種によって上記の細胞タイプおよび細胞密度を播種することができる。例えば、フロー灌流システムを使用して、組織マトリックスにおいて保存されている血管系を介して（例えば、動脈ラインを通して）脱細胞化肺組織マトリックスに播種することができる。一部の例において、自動フロー灌流システムを、適切な条件下で使用することができる。そのような灌流播種方法は、播種効率を改善し、組成物の中全体に細胞のより均一な分布を提供することができる。定量的な生化学および画像解析技術を使用して、静的播種または灌流播種方法のいずれかに従って播種した細胞の分布にアクセスすることができる。
【００６７】
一部の例において、播種した再生細胞の分化を刺激するために、組織マトリックスに、１つまたは複数の増殖因子を含浸または灌流させることができる。例えば、組織マトリックスに、本明細書において提供される方法および材料にとって適切な増殖因子、例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴＧＦ−β増殖因子、骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−４）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、例えばＦＧＦ−１０、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、または増殖分化因子−５（ＧＤＦ−５）を含浸または灌流することができる。例えばDesai and Cardoso, Respire. Res. 3:2 (2002)を参照されたい。これらの増殖因子は、時間的な放出を制御するためにカプセルに封入することができる。足場材料の異なる部分を、増殖因子刺激の空間的制御を高めるために、異なる増殖因子によって増強することができる。本発明の方法において、細胞を播種した気道に、ｎｏｔｃｈ阻害剤、例えばガンマセクレターゼ阻害剤を灌流することができる。
【００６８】
播種した組織マトリックスを、組織マトリックス中の細胞の接着および浸透を改善するために、播種後一定期間（例えば、数時間から約１４日以上）インキュベートすることができる。播種した組織マトリックスを、再生細胞の少なくとも一部が、無細胞組織マトリックス内およびマトリックス上で複製および／または分化することができる条件で維持することができる。そのような条件は、適切な温度（３５〜３８℃）および／または圧力（例えば、大気圧）、電気的および／または機械的活性（例えば、呼吸終末陽圧が１〜２０ｃｍ  Ｈ2Ｏである陽圧または陰圧による換気、平均気道圧５〜５０ｃｍ  Ｈ2Ｏ、および最大吸気圧５〜６５ｃｍ  Ｈ2Ｏ）、適切なガス、例えばＯ2（１〜１００％  ＦｉＯ2）、および／またはＣＯ2（０〜１０％  ＦｉＣＯ2）、適切な量の湿度（１０〜１００％）、および無菌的またはほぼ無菌的条件が挙げられるがこれらに限定されない。そのような条件はまた、湿式換気、湿式から乾式換気、乾式換気を含み得る。一部の例において、栄養補助剤（例えば、栄養および／またはグルコースなどの炭素源）、外因性のホルモン、または増殖因子を、播種した組織マトリックスに添加することができる。好ましい実施形態において、ｎｏｔｃｈ阻害剤、例えばガンマセクレターゼ阻害剤を、気道を通して播種した細胞に添加する。組織学および細胞染色を実施して、播種した細胞の保持および繁殖に関してアッセイすることができる。任意の適切な方法を実施して、播種した細胞の分化に関してアッセイすることができる。一般的に、本明細書に記載の方法は、例えば本明細書に記載の気道臓器バイオリアクター装置で実施される。
【００６９】
このため、本明細書に記載の方法は、例えばヒト対象に移植するための移植可能なバイオ人工肺組織を生成するために使用することができる。本明細書に記載される移植可能な組織は好ましくは、患者の血管系に接続することができる十分にインタクトの血管系を保持している。
【００７０】
本明細書に記載のバイオ人工肺組織を、包装材料と組み合わせて製品またはキットを生成することができる。製品を産生するための構成要素および方法は周知である。バイオ人工組織に加えて、製品またはキットはさらに、例えば１つまたは複数の付着防止剤、滅菌水、薬学的担体、緩衝液、ならびに／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでおよび／もしくは移植後に機能的肺組織の開発を促進するための他の薬剤を含み得る。加えて、その中に含まれる組成物を使用する方法を説明する印刷された説明書を、そのような製品に含めることができる。製品またはキット中の構成要素を、適した多様な容器に包装することができる。
【００７１】
Ｎｏｔｃｈ／ガンマ−セクレターゼ阻害剤
本発明の方法において有用なガンマセクレターゼ阻害剤には、例えばＲＯ４９２９０９７；ＤＡＰＴ（Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル］グリシン−１，１−ジメチルエチルエステル）；Ｌ−６８５４５８（（５Ｓ）−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６−フェニル−（４Ｒ）ヒドロキシ−（２Ｒ）ベンジルヘキサノイル）−Ｌ−ｌｅｕ−Ｌ−ｐｈｅ−アミド）；ＢＭＳ−７０８１６３（アバガセスタット）；ＢＭＳ−２９９８９７（２−［（１Ｒ）−１−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］（２，５−ジフルオロフェニル）アミノ］エチル−５−フルオロベンゼンブタン酸）；ＭＫ−０７５２；ＹＯ−０１０２７；ＭＤＬ２８１７０（Ｓｉｇｍａ）；ＬＹ４１１５７５（Ｎ−２（（２Ｓ）−２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシエタノイル）−Ｎ１−（（７Ｓ）−５−メチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル）−ｌ−アラニンアミド、米国特許第６，５４１，４６６号明細書を参照されたい）；ＥＬＮ−４６７１９（ＬＹ４１１５７５の２−ヒドロキシ−吉草酸アミドアナログ（ＬＹ４１１５７５は、３，５−ジフルオロ−マンデル酸アミドである）（米国特許第６，５４１，４６６号明細書））；ＰＦ−０３０８４０１４（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−５，７−ジフルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−３−イルアミノ）−Ｎ−（１−（２−メチル−１−（ネオペンチルアミノ）プロパン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド、Samon et al., Mol Cancer Ther 2012;11:1565-1575）；および化合物Ｅ（（２Ｓ）−２−｛［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］アミノ｝−Ｎ−［（３Ｓ）−１−メチル−２−オキソ−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］プロパンアミド；国際公開第９８／２８２６８号パンフレットおよびSamon et al., Mol Cancer Ther 2012;11:1565-1575；Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手できる）を参照されたい）、またはその薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００７２】
一部の実施形態において、適したガンマセクレターゼ阻害剤には：セマガセスタット（ＬＹ４５０１３９としても知られる、（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチル−Ｎ−［（１Ｓ）−１−メチル−２−オキソ−２−［［（１Ｓ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−３−メチル−２−オキソ−１Ｈ−３−ベンゾアゼピン−１−イル］アミノ］エチル］ブタンアミド、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙから入手できる；国際公開第０２／４７６７１号パンフレットおよび米国特許第７，４６８，３６５号明細書）；ＬＹ４１１５７５（Ｎ−２（（２Ｓ）−２−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシエタノイル）−Ｎ１−（（７Ｓ）−５−メチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル）−Ｌ−アラニンアミド、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙから入手できる、Fauq et al., Bioorg Med Chem Lett 17: 6392-5, 2007）；ベガセスタット（ＧＳＩ−９５３としても知られる、米国特許第７，３００，９５１号明細書）；アリールスルホンアミド（ＡＳ、Fuwa et al., Bioorg Med Chem Lett. 16(16):4184-4189, 2006）；Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−（Ｓ）−フェニルグリシン  ｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ、Shih and Wang, Cancer Res. 67: 1879-1882, 2007）；Ｎ−［Ｎ−３，５−ジフルオロフェナセチル］−Ｌ−アラニル−Ｓ−フェニルグリシン  メチルエステル（ＤＡＰＭとしても知られる、ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＸＶＩ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手できる）；化合物Ｗ（３，５−ビス（４−ニトロフェノキシ）安息香酸、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手できる）；Ｌ−６８５，４５８（（５Ｓ）−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６−フェニル−（４Ｒ）−ヒドロキシ−（２Ｒ）−ベンジルヘキサノイル）−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニンアミド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手できる、Shearmen et al., Biochemistry 39, 8698-8704, 2000）；ＢＭＳ−２８９９４８４−クロロ−Ｎ−（２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ−（（１Ｒ）−｛４−フルオロ−２−［３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）プロピル］フェニル｝エチル）ベンゼンスルホンアミド塩酸塩、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂから入手できる）；ＢＭＳ−２９９８９７（４−［２−（（１Ｒ）−１−｛［（４−クロロフェニル）スルホニル］−２，５−ジフルオロアニリノ｝エチル）−５−フルオロフェニル］ブタン酸、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂから入手できる、Zheng et al., Xenobiotica 39(7):544-55, 2009を参照されたい）；アバガセスタット（ＢＭＳ−７０８１６３としても知られる、（Ｒ）−２−（４−クロロ−Ｎ−（２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ベンジル）フェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂから入手できる、Albright et al., J Pharmacol. Exp. Ther. 344(3):686-695, 2013）；ＭＫ−０７５２（３−（４−（（４−クロロフェニル）スルホニル）−４−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロヘキシル）プロパン酸、Ｍｅｒｃｋから入手できる）；ＭＲＫ−００３（（３’Ｒ，６Ｒ，９Ｒ）−５’−（２，２，２−トリフルオロエチル）−２−（（Ｅ）−３−（４−（トリ��ルオロメチル）ピペリジン−１−イル）プロパ−１−エン−１−イル）−５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロスピロ［６，９−メタノベンゾ［８］アヌレン−１１，３’−［１，２，５］チアジアゾリジン］１’，１’−ジオキシド、Ｍｅｒｃｋから入手できる、Mizuma et al., Mol Cancer Ther. 11(9):1999-2009, 2012）；ＭＲＫ−５６０（Ｎ−［シス−４−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−−４−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロヘキシル］−１，１，１−トリフルオロ−メタンスルホンアミド、Best et. al., J Pharmacol Exp Ther. 317(2):786-90, 2006）；ＲＯ−４９２９０９７（Ｒ４７３３としても知られる、（Ｓ）−２，２−ジメチル−Ｎ１−（６−オキソ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル）−Ｎ３−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）マロンアミド、Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．から入手できる、Tolcher et al., J Clin. Oncol. 30(19):2348-2353, 2012）；ＪＬＫ６（７−アミノ−４−クロロ−３−メトキシイソクマリンとしても知られる、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から入手できる、Petit et al., Nat. Cell. Biol. 3: 507-511, 2001）；タレンフルルビル（（Ｒ）−フルルビプロフェンとしても知られる、（２Ｒ）−２−（３−フルオロ−４−フェニルフェニル）プロパン酸）；ＡＬＸ−２６０−１２７（化合物１１としても知られる、Wolfe et al., J. Med. Chem. 41: 6, 1998に記載）；スリンダク硫化物（ＳＳｉｄｅ、Takahashi et al., J Biol Chem. 278(20): 18664-70, 2003）；１，１，１−トリフルオロ−Ｎ−（４−［５−フルオロ−２−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−｛［４（トリフルオロメチル）フェニル］スルホニル｝シクロヘキシル）メタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２７５７１９号明細書に記載）；Ｎ−［ｔｒａｎｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−［ｃｉｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−［ｃｉｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２−シアノ−５−フルオロフェニル）シクロブチル］−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−［ｃｉｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジクロロフェニル）シクロブチル］−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−（ｃｉｓ−３−（２，５−ジフルオロフェニル）−３−｛［４−（トリフルオロメチル）フェニル］スルホニル｝シクロブチル）−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−｛ｃｉｓ−３−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］シクロブチル｝−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１��２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−｛ｃｉｓ−３−（２，５−ジフルオロフェニル）−３−［（４−フルオロフェニル）スルホニル］シクロブチル｝−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−｛ｃｉｓ−３−（２，５−ジフルオロフェニル）−３−［（３，４−ジフルオロフェニル）スルホニル］シクロブチル｝−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−［ｃｉｓ−３−［（４−シアノフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；４−｛［ｃｉｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］［トリフルオロメチル）スルホニル］アミノ｝ブタン酸（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−［ｃｉｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］−１，１，１−トリフルオロ−Ｎ−［２−（テトラヒドロ−２−ピラン−２−イルオキシ）エチル］メタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；メチル｛［ｃｉｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］［（トリフルオロメチル）スルホニル］アミノ｝アセテート（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−［３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］−１，１，１−トリフルオロ−Ｎ−メチルメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−［３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］−１，１，１−トリフルオロ−Ｎ−メチルメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；メチル４−｛［ｃｉｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］［（トリフルオロ−メチル）スルホニル］アミノ｝ブタノエート（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−［ｃｉｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］−Ｎ−［（トリフルオロメチル）スルホニル］グリシン（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−［ｃｉｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−メチルシクロブチル］−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−（ｃｉｓ−３−（２，５−ジフルオロフェニル）−１−メチル−３−｛［４−（トリフルオロメチル）フェニル］スルホニル｝シクロブチル）−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−［ｃｉｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］−１，��，１−トリフルオロ−Ｎ−［（トリフルオロメチル）スルホニル］メタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；ナトリウム［ｃｉｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］［（トリフルオロメチル）スルホニル］アザニド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；カリウム［ｃｉｓ−３−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］［（トリフルオロメチル）スルホニル］アザニド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；Ｎ−［ｃｉｓ−３−［（４−トリフルオロメトキシフェニル）スルホニル］−３−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロブチル］−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；１，１，１−トリフルオロ−Ｎ−（４−［５−フルオロ−２−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−｛［４−（トリフルオロメチル）フェニル］スルホニル｝シクロヘキシル）メタンスルホンアミド（米国特許第２０１１０２６３５８０号明細書に記載）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤Ｉ（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯとしても知られる、ベンジルオキシカルボニル−ロイシル−ロイシル−ノルロイシナル、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＩＩ：
【００７３】
【化３】
2019519217.tif 000005
（ＭＯＬ）（ＣＤＸ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＩＩＩ、（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−ロイシナル、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＩＶ、（Ｎ−（２−ナフトイル）−Ｖａｌ−フェニルアラニナル、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤Ｖ（Ｚ−ＬＦ−ＣＨＯとしても知られる、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−フェニルアラニナル、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＶＩ（１−（Ｓ）−エンド−Ｎ−（１，３，３）−トリメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−イル）−４−フルオロフェニルスルホンアミド、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＶＩＩ、（化合物Ａ、ＭＯＣ−ＬＬ−ＣＨＯ、メンチルオキシカルボニル−ＬＬ−ＣＨＯとしても知られる、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤Ｘ、（｛１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロキシ−５−フェニルペンチル｝カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＸＩ、（７−アミノ−４−クロロ−３−メトキシイソクマリン、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＸＩＩ、（Ｚ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＣＨＯとしても知られる、Shih and Wang, Cancer Res. 67: 1879-1882, 2007）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＸＩＩＩ、（Ｚ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＸＩＶ、（Ｚ−Ｃｙｓ（ｔ−Ｂｕ）−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＸＶＩＩ、（ＷＰＥ−ＩＩＩ−３１Ｃとしても知られる）、
【００７４】
【化４】
2019519217.tif 000006
（ＭＯＬ）（ＣＤＸ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＸＩＸ、（ベンゾジアゼピンとしても知られる、（２Ｓ，３Ｒ）−３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（（３Ｓ）−２−オキソ−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピン−３−イル）−ブチルアミド、Churcher et al., J Med Chem. 46(12):2275-8, 2003）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＸＸ、（ジベンゾアゼピン、（Ｓ，Ｓ）−２−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）アセチルアミノ］−Ｎ−（５−メチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル）プロピオンアミド、
【００７５】
【化５】
2019519217.tif 000007
（ＭＯＬ）（ＣＤＸ）（Weihofen et al., Science 296: 2215-2218, 2002，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＸＸＩ、（（Ｓ，Ｓ）−２−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−アセチルアミノ］−Ｎ−（１−メチル−２−オキソ−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピン−３−イル）−プロピオンアミド、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；５−メチル−２−プロパン−２−イルシクロヘキシル）Ｎ−［４−メチル−１−［（４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ］−１−オキソペンタン−２−イル］カルバメート（ＨＤＨ  Ｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．から入手できる）；Ｎ−ｔｒａｎｓ−３，５−ジメトキシシンナモイル−Ｉｌｅ−ロイシナール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−バリナール；イソバレリル−Ｖ  Ｖ−Ｓｔａ−Ａ−Ｓｔａ−ＯＣＨ３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できる）；ジエチル−（５−フェニル−３Ｈ−アゼピン−２−イル）−アミン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；ジエチル−（５−イソプロピル−３Ｈ−アゼピン−２−イル）−アミン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；ジエチル−（４−フェニル−３Ｈ−アゼピン−２−イル）−アミン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；ジエチル−（６−フェニル−３Ｈ−アゼピン−２−イル）−アミン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；５−フェニル−１，３−ジヒドロ−アゼピン−２−オン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；５−イソプロピル−１，３−ジヒドロ−アゼピン−２−オン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；４−フェニル−１，３−ジヒドロ−アゼピン−２−オン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；６−フェニル−１，３−ジヒドロ−アゼピン−２−オン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；２−ブトキシ−５−フェニル−３Ｈ−アゼピン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；１−メチル−５−フェニル−１，３−ジヒドロ−アゼピン−２−オン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；５−イソプロピル−１−メチル−１，３−ジヒドロ−アゼピン−２−オン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；１−メチル−４−フェニル−１，３−ジヒドロ−アゼピン−２−オン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；１−メチル−６−フェニル−１，３−ジヒドロ−アゼピン−２−オン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；１−メチル−５−フェニル−１Ｈ−アゼピン−２，３−ジオン−３−オキシム（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；５−イソプロピル−１−メチル−１Ｈ−アゼピン−２，３−ジオン−３−オキシム（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；１−メチル−６−フェニル−１Ｈ−アゼピン−２，３−ジオン−３−オキシム（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；１−メチル−４−フェニル−１Ｈ−アゼピン−２，３−ジオン−３−オキシム（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；３−アミノ−１−メチル−５−フェニル−１，３−ジヒドロ−アゼピン−２−オン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；３−アミノ−５−イソプロピル−１−メチル−１，３−ジヒドロ−アゼピン−２−オン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；３−アミノ−１−メチル−４−フェニル−１，３−ジヒドロ−アゼピン−２−オン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；３−アミノ−１−メチル−６−フェニル−１，３−ジヒドロ−アゼピン−２−オン（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；（Ｓ）−［１−（１−メチル−２−オキソ−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イルカルバモイル）−エチル］−カルバミン酸ｔｅｒｔブチルエステル（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；［（Ｓ）−１−（５−イソプロピル−１−メチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イルカルバモイル）−エチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；［（Ｓ）−１−（１−メチル−２−オキソ−４−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イルカルバモイル）−エチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；［（Ｓ）−１−（１−メチル−２−オキソ−６−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イルカルバモイル）−エチル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（１−メチル−２−オキソ−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イル）−プロピオンアミド（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（５−イソプロピル−１−メチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イル）プロピオンアミド（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（Ｉ−メチル−２−オキソ−６−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イル）プロピオンアミド塩酸塩（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（Ｉ−メチル−２−オキソ−４−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イル）プロピオンアミド塩酸塩（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；（Ｓ）−２−フルオロ−３−メチル−酪酸（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチル−Ｎ−［（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−メチル−２−オキソ−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イルカルバモイル）−エチル］−ブチルアミド（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；（Ｓ）−２−フルオロ−３−メチル−Ｎ−［（Ｓ）−１−（１−メチル−２−オキソ−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イルカルバモイル）−エチル］−ブチルアミド（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；（Ｓ）−２−ヒドロキシ−Ｎ−［（Ｓ）−１−（５−イソプロピル−１−メチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イルカルバモイル）エチル］−３−メチル−ブチルアミド（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチル−Ｎ−［（Ｓ）−１−（１−メチル−２−オキソ−４−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イルカルバモイル）−エチル］−ブチルアミド（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチル−Ｎ−［（Ｓ）−１−（１−メチル−２−オキソ−６−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イルカルバモイル）−エチル］−ブチルアミド（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）；および（Ｓ）−２−フルオロ−３−メチル−Ｎ−［（Ｓ）−１−（１−メチル−２−オキソ−６−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−アゼピン−３−イルカルバモイル）−エチル］−ブチルアミド（米国特許第８１８８０６９号明細書に記載）、またはその薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００７６】
ガンマ−セクレターゼ阻害剤のさらなる例は、米国特許出願公開第２００４／００２９８６２号明細書、第２００４／００４９０３８号明細書、第２００４／０１８６１４７号明細書、第２００５／０２１５６０２号明細書、第２００５／０１８２１１１号明細書、第２００５／０１８２１０９号明細書、第２００５／０１４３３６９号明細書、第２００５／０１１９２９３号明細書、第２００７／０１９００４６号明細書、第２００８／００８３１６号明細書、第２０１０／０１９７６６０号および第２０１１／００２０２３２号明細書、米国特許第６，７５６，５１１号明細書、第６，８９０，９５６号明細書、第６，９８４，６２６号明細書、第７，０４９，２９６号明細書、第７，１０１，８９５号明細書、第７，１３８，４００号明細書、第７，１４４，９１０号明細書、第７，１８３，３０３号明細書、第８，１８８，０６９号明細書、ならびに国際公開第１９９８／２８２６８号パンフレット、国際公開第２００１／７０６７７号パンフレット、国際公開第２００２／０４９０３８号パンフレット、国際公開第２００４／１８６１４７号パンフレット、国際公開第２００３／０９３２５３号パンフレット、国際公開第２００３／０９３２５１号パンフレット、国際公開第２００３／０９３２５２号パンフレット、国際公開第２００３／０９３２６４号パンフレット、国際公開第２００５／０３０７３１号パンフレット、国際公開第２００５／０１４５５３号パンフレット、国際公開第２００４／０３９８００号パンフレット、国際公開第２００４／０３９３７０号パンフレット、国際公開第２００９／０２３４５３号パンフレット、欧州特許第１７２０９０９号明細書、欧州特許第２１７８８４４号明細書、欧州特許第２２４４７１３号明細書に開示されている。
【００７７】
前述の全ての全開示は、全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００７８】
バイオ人工肺を使用する方法
本文書はまた、バイオ人工肺組織を使用するため、および一部の例において、肺の機能を促進するための方法および材料を提供する。一部の実施形態において、本明細書に提供する方法は、肺活量を損なうまたは低減させる疾患（例えば、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、肺気腫、肺がん、喘息、肺高血圧症、肺の外傷、または遺伝的もしくは先天性の肺の異常、例えば気管支原性嚢胞、肺無形成および形成不全、多葉肺葉、肺胞毛細血管異形成、肺動静脈奇形（ＡＶＭ）およびシミター症候群を含む分画症、肺リンパ管拡張症、先天性小葉性肺気腫（ＣＬＥ）、および嚢胞性腺腫様奇形（ＣＡＭ）ならびに他の肺嚢胞）を有する患者における一部の肺機能を回復するために使用することができる。本明細書に提供する方法はまた、対象が特定の明記された処置、例えば、肺機能の増加、または肺活量の増加もしくは改善を必要とすると同定されている方法である。
【００７９】
バイオ人工肺組織（例えば、臓器全体またはその一部）は、本明細書に提供する方法に従って生成することができる。一部の実施形態において、方法は、本明細書に提供するバイオ人工肺組織を、それを必要とする対象（例えば、ヒト患者）に移植するステップを含む。一部の実施形態において、バイオ人工肺組織は、疾患を有するまたは損傷した組織の部位に移植される。例えば、バイオ人工肺組織は、機能していないまたは機能不良な肺の代わりに（またはそれと共に）対象の胸腔に移植することができる；肺移植を実施する方法は、当技術分野で公知であり、例えばBoasquevisque et al., Proceedings of the American Thoracic Society 6:66-78 (2009); Camargo et al., Eur J Cardiothorac Surg 2008;34:1206-1209 (2008); Yoshida et al., Ann Thorac Cardiovasc Surg. 11(1):7-11 (2005); Venuta et al., Transplantation Proceedings 37(6):2682-2683 (2005); Yang and Conte, Transplantation Proceedings 32(7):1521-1522 (2000); Gaissert and Patterson, “Surgical Techniques of Single and Bilateral Lung Transplantation,” in The Transplantation and Replacement of Thoracic Organs, 2d ed. Springer Netherlands (1996)を参照されたい。
【００８０】
方法は、対象の肺を部分的もしくは完全に切除するための外科技法の間、および／または肺切除の間に、本明細書に提供するバイオ人工肺またはその一部を移植するステップを含み得る。方法はまた、生きているドナーまたは死体からの肺またはその一部を収集するステップ、および本明細書に記載のバイオリアクターにおいて肺を保存または再生するステップを含み得る。一部の例において、本明細書に提供する方法は、対象、例えばヒトまたは動物対象における肺組織および機能を置換または補完するために使用することができる。
【００８１】
移植前または移植後の肺機能に関してアッセイするために、任意の適切な方法を実施することができる。例えば、組織治癒を評価する、機能性を評価する、および細胞の内植を評価する方法を実施することができる。一部の例において、組織部分を収集して、例えば中性緩衝ホルマリンなどの固定液によって処理することができる。そのような組織部分を脱水し、パラフィンに包埋し、組織学分析のためにミクロトームによって切片にすることができる。切片をヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）によって染色し、形態学および細胞充実度を顕微鏡によって評価するためにスライドガラスに載せることができる。例えば、播種した細胞の増殖を検出するために、組織学および細胞染色を実施することができる。アッセイは、移植した組織マトリックスの機能的評価、撮像技術（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波、または磁気共鳴画像（例えば、コントラスト増強ＭＲＩ））を含み得る。アッセイはさらに、安静時および生理的ストレス下での機能的試験（例えば、体プレスチモグラフィ、肺機能試験）を含み得る。細胞を播種したマトリックスの機能性は、当技術分野で公知の方法、例えば組織学、電子顕微鏡、および機械的試験（例えば、容積およびコンプライアンスの試験）を使用してアッセイすることができる。ガス交換を、別の機能性アッセイとして測定することができる。細胞増殖に関してアッセイするために、チミジンキナーゼ活性を、例えばチミジン取り込みを検出することによって測定することができる。一部の例において、血液中の酸素レベルに基づいて肺の機能を評価するために、血液検査を実施することができる。
【００８２】
培養の間の機能性アッセイを容易にするために、本明細書に記載のバイオリアクター装置の任意のラインは、機能性パラメータ（例えば、ｐＨ、グルコース、乳酸塩、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｃｌ、重炭酸塩、Ｏ2、ＣＯ2、飽和）の単回またはリアルタイム測定を可能にするためのサンプリング口を含み得る。代謝物をまた、比色アッセイを使用して細胞数および生存率をモニターするために使用してもよく、生化学アッセイを使用して細胞の成熟（例えば、サーファクタントタンパク質の測定等）をモニターしてもよい。例えば、サーファクタントの濃度の増加は、培養肺が、乾式換気に耐えるために十分な上皮細胞を保有することを示している。一部の例において、内皮障壁機能を血管成熟のマーカーとして使用してもよい。肺を、異なるサイズの分子（規定のサイズのデキストランおよびアルブミンなど）およびマイクロビーズ（０．２〜５μｍの漸増サイズ）によって、ならびに単離した赤血球細胞によって灌流することができる。次に、気管支肺胞洗浄液を採取して、これらのマーカーの肺胞腔への漏出を評価することができる。例えば、５００ｋＤａのデキストランを、気管支肺胞洗浄アッセイと共に使用して、血管区画内に保持されるデキストランの百分率を決定することができる。デキストランに対する障壁機能は、生きている機能的な内皮に依存するが、固定性灌流の間、デキストランは露出した血管基底膜（例えば、無細胞肺）を超えて経時的に拡散することから、保持されるデキストランの百分率が増加すれば、障壁機能の改善を示している。例えば、死体肺は、血管区画内に実質的に全てのデキストランを保持し得るが、無細胞肺は小さい割合のデキストラン（例えば、１０．０％±８．０％）を保持し得る。これらのマーカーが認容される最低量（例えば、４μｍマイクロビーズの１０％超、または０．２μｍマイクロビーズの２０％超）を超えて肺胞腔に漏出することは、肺が乾式換気に耐えるほど十分に成熟していないことを示すために使用することができる。
【００８３】
一部の例において、ＲＴ−ＰＣＲなどの分子生物学技術を使用して、代謝（例えば、サーファクタントタンパク質、ムチン−１）マーカーおよび分化マーカー（例えば、ＴＴＦ−１、ｐ６３、サーファクタントタンパク質Ｃ）の発現を定量することができる。任意の適切なＲＴ−ＰＣＲプロトコールを使用することができる。簡単に説明すると、生物試料（例えば、腱試料）をホモジナイズすること、クロロホルム抽出を実施すること、およびスピンカラム（例えば、ＲＮｅａｓｙ(登録商標）ミニスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））または他の核酸結合基質を使用して総ＲＮＡを抽出することによって収集することができる。他の例において、肺細胞タイプおよびそのような細胞タイプの異なる分化段階に関連するマーカーを、抗体および標準的なイムノアッセイを使用して検出することができる。
【００８４】
気道臓器バイオリアクター装置
例示的な気道臓器バイオリアクターおよびその使用方法は、全体が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２０１５／１３８９９９号パンフレットに記載されている。他の例示的なバイオリアクターは、Charest et al., Biomaterials. 2015 Jun;52:79-87;Gilpin et al., Ann Thorac Surg. 2014 Nov;98(5):1721-9; discussion 1729;Price et al., Tissue Eng Part A 2010;16(8):2581-91;Petersen et al., Cell Transplant 2011;20(7):1117-26;Bonvillain et al., J Vis Exp 2013;(82):e50825;Nichols et al., J Tissue Eng Regen Med. 2016 Jan 12. doi:10.1002/term.2113に記載されている。
【実施例】
【００８５】
本発明を、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限しない以下の実施例においてさらに説明する。
【００８６】
［実施例１］
肺上皮エンジニアリングにおけるヒト気道幹細胞の再生能
慣例的に、肺上皮の維持および修復において、系列は限定されるという概念が保持されている。基底上皮細胞は比較的未分化であり、転写因子Ｔｒｐ−６３（ｐ６３）ならびにサイトケラチン５および１４（Ｋｒｔ５／１４）を特徴的に発現し、修復の間の肺気道の幹細胞として機能する（３２）。このことは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの露出した気道の修復モデルにおいて証明された（４３）。基底肺上皮細胞は、損傷後に基底（自己再生）細胞、繊毛およびクララ（クララ）細胞を生成する能力を有する多能性成人組織幹細胞として分類されている（２１、４４）。遠位肺胞上皮における従来の系列階層モデルは、最終分化した１型肺胞上皮細胞の前駆細胞として、２型肺胞上皮細胞を定義している（４５、４６）。肺上皮系列の能力における新しいパラダイムの例には、気管支クララ細胞および肺胞細胞の両方について提唱されている前駆細胞集団である、気管支肺胞幹細胞（ＢＡＳＣ）が挙げられる（４７）。生後に成熟ＩＩ型肺胞上皮前駆細胞に転換することができる二能性の肺胞前駆細胞が、発達中の肺において報告されている（４８）。古典的な肺胞ＩＩ型／Ｉ型の分化の階層も同様に異議が唱えられており、新規の二方向分化能が報告されている（４９）。インフルエンザによる損傷後、Ｋｒｔ５+気道幹細胞を送達すると、遠位肺がＩ型およびＩＩ型両方の肺胞上皮系列を取り込みおよびそれらに関与することが明らかとなった（３６）。これらの研究は、従来の細胞階層および同一性の理解が前進していることを強調している。Ｎｏｔｃｈシグナリングはまた、損傷後の上皮の運命決定においても重要である（２７）。低レベルＮｏｔｃｈシグナリングは、定常状態肺上皮に存在して気道の損傷後に増加し、基底幹細胞の分泌系列への分化を促進する（３９）。上皮修復および遠位肺胞上皮細胞の分化におけるＮｏｔｃｈシグナリングの大きさおよび時期の両方に関するより微妙な点についての理解が進行中である。
【００８７】
本実験は、全臓器エンジニアリングの状況において、この容易に入手でき、増大可能な基底幹細胞集団が、損傷に応答し、上皮の完全性および機能的組織化を再度確立する能力を探索することを目的とした（１３、４４）。ネイティブ細胞外マトリックス内に保持された構造的および生物学的ニッチは、細胞生着を誘導するためおよび肺組織修復機構を調べるための有効なひな型を提供し（５０、５１）、長期間のバイオミメティック培養と組み合わせて、ヒト肺構築物の再生のための重要なプラットフォームを提供する。
【００８８】
方法
以下の材料および方法を、以下の実施例において使用した。
【００８９】
試験の承認
他の状況では移植に不適であるドナー肺を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｂａｎｋからインフォームドコンセントの後に得た。実験は、ＭＧＨ  ＩＲＢおよび動物利用プロトコール（Ａｎｉｍａｌ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって承認された。
【００９０】
【表１】
2019519217.tif 000008
【００９１】
データは、年齢（歳）、性別（男性（Ｍ）または女性（Ｆ））、体格指数（ＢＭＩ）、およびドナーの状態（心臓死後の提供（ＤＣＤ）または脳死後の提供（ＤＢＤ））を表す。年齢およびＢＭＩは、要約した平均値±標準偏差として表す。
【００９２】
細胞の単離および増大
ドナー肺末梢組織（１−インチ角）をαＭＥＭ中で洗浄した後、ハサミで約１／４インチにきざみ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ）および１．４ｍｇ／ｍｌプロナーゼ（Ｒｏｃｈｅ、１１４５９６４３００１）中、２４時間／４℃で消化した（５２）。消化した組織を非コーティング培養フラスコ上、ＳＡＧＭ中、３０分／３７℃で播種した後、非接着細胞を移し、ヒトＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ７５２１）コーティングフラスコに接着させた。上皮細胞をＳＡＧＭ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−３１１８）中で維持し、８０％コンフルエント（およそ３〜５日／継代）で継代した。γ−セクレターゼ阻害剤である（１）３−イソブチル−１−メチルキサンチン（１００μｇ／ｍｌ  ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉ５８７９）および（２）Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル］グリシン−１，１−ジメチルエチルエステル（５０μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＴ、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ２２１５）によって処置した細胞に関して、培地を毎日交換した。初代内皮細胞を、ドナー肺の大きい血管から同じ消化プロトコールを使用して単離した。内皮細胞集団をフローサイトメトリーによってＣＤ３１+純度に関して選別し、ゼラチンコーティングフラスコにおいてＥＧＭ２（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−３１６２）中で維持および増大させた後、ヒト肺再細胞化のために利用した（図７Ａ〜Ｂを参照されたい）。
【００９３】
気液界面培養
継代３回目の初代上皮細胞を、ＩＶ型コラーゲンをコーティングした０．４μＭトランスウェルインサートに播種し、ＳＡＧＭと共に５日間、液内培養で維持した。培地を、基本チャンバーのみにおいてＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ（商標）−ＡＬＩ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０５００１）に交換し、１日おきに培地を交換しながら気液界面で２１日間維持した。
【００９４】
三次元スフィアアッセイ
継代３の初代上皮細胞を、４０μｍメッシュの中に通して、細胞塊を除去した後、既に公表されたプロトコール（４６）に従って、０．４μＭトランスウェルインサートに５０：５０のマトリゲル対ＳＡＧＭ基質９０μｌあたり５０００個の密度で移した。単細胞浮遊液を光学顕微鏡（４０倍）によって確認した。培養を基礎チャンバーのみＳＡＧＭによって７日間維持した。
【００９５】
肺の脱細胞化
ラットおよびヒトドナー肺を既に記述されているように（２、６）脱細胞化した。
【００９６】
マトリックススライス培養アッセイ
ヒト肺マトリックススライスを、既に記載されているように調製した（６）。初代上皮細胞（継代３）を、５０，０００個／スライスでマトリックスに播種し、ＳＡＧＭによって５日間維持した。
【００９７】
ラット肺再細胞化および培養
初代肺上皮細胞（継代３）を、二次元培養から回収して計数し、重力によって溶液（２０ｍｌ）中の足場材料気道に再導入した。肺動脈を通しての連続的な培地灌流を、蠕動ポンプによって４ｍｌ／分で維持し、毎日交換した。
【００９８】
持続気道陽圧（ＣＰＡＰ）ラット肺培養に関して、上皮の再細胞化およびＳＡＧＭによる７日間の固定性灌流培養後、培地をＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ（商標）−ＡＬＩ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０５００１）に交換し、ＣＰＡＰを２０ｃｍ  Ｈ2Ｏで開始した。気管を二次リザーバーチャンバーに接続することによって、気道陽圧を２０ｃｍ  Ｈ2Ｏに連続的に加圧した。
【００９９】
ヒト肺再細胞化およびバイオミメティック培養
単葉を、インタクト脱細胞化ヒト肺から外科的に単離し、肺動脈、肺静脈、および気管支にカニューレを留置した。肺葉を、０．１％過酢酸の４％エタノール溶液中に６０分／２５℃で浸した後、ＰＢＳによって３回洗浄し、次に１０，０００Ｒａｄのγ線照射に２時間の間曝露することによって滅菌した。単離した肺葉をバイオリアクターに無菌的に入れて、ＳＡＧＭ灌流によって組織を一晩プライミングした。
【０１００】
全体で１６０〜２４０×１０6個の初代ドナー由来ＣＤ３１+内皮細胞を最初に、５０ｍｍＨｇの定圧でポンプによって肺動脈を介して血管系に送達した。９０分後、全体で２２０〜２８０×１０6個の上皮細胞（継代４）を溶液中（培地の全量５００ｍｌ）でポンプによって５０ｍｌ／分で主要な気道に送達した、全体でｎ＝４の独立した肺葉を、個別の実験で再細胞化した。
【０１０１】
４０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦを含むＳＡＧＭの固定性灌流を、２０〜４０ｍｌ／分で７（ｎ＝３）または１０（ｎ＝１）日間維持した。灌流圧を絶えずモニターして、生理的範囲内（平均値＝２１．３９±４．５３ｍｍＨｇ、図５Ｃを参照されたい）に維持した。６呼吸サイクル／分の呼吸回数を達成するために、チャンバーの圧力振動を介して陰圧換気を生成した。換気は培養３日目に開始し、２時間／日で維持した。肺動脈、肺静脈、およびチャンバーからの培地試料を、ｉＳＴＡＴカートリッジ（ＣＧ４＋／ＣＧ８＋、Ａｂｂｏｔｔ）によって毎日試験した。
【０１０２】
陽圧換気刺激を培養の最終日に実施した。従量式調節換気を、Ｄｒａｇｅｒ  Ｅｖｉｔａ  ４人工呼吸器を使用して、１回換気量１５０〜２００ｍＬ、ＰＥＥＰ  ５ｍｍＨｇ、および呼吸回数１２回／分で適用した。試料を、ＧＣ３＋ｉＳＴＡＴカートリッジを使用して、２１％ＦｉＯ2の１０分間の換気後に分析し、１００％ＦｉＯ2による換気の１０分後に再度分析した。
【０１０３】
培養最終日、０．０５ｍＭレサズリン溶液を、３０ｍｌ／分の一定速度で９０分間循環させた後、色素の色の代謝的変換に関して組織を肉眼で調べた。次に、組織試料を５％ホルマリンで固定し、その後の分析のためにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）中で保存した。
【０１０４】
定量的ＰＣＲ
ＲＮＡをＲＮＥａｓｙ  Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して転写した。定量的遺伝子発現を、ＴａｑｍａｎプローブおよびＯｎｅＳｔｅｐ  Ｐｌｕｓシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析した。発現を、β−アクチン発現に関して標準化し、死体肺組織対照試料と比較した。
【０１０５】
免疫染色
一次抗体（１：１００）：ｐ６３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−２５２６８）、Ｋｒｔ５（Ａｂｃａｍ、ａｂ２４６４７）、Ｅ−カドヘリン（ＢＤ、６１０１８１）、サーファクタントタンパク質−Ｂ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ３４３０）、プロサーファクタントタンパク質−Ｃ（Ａｂｃａｍ、ａｂ３７８６）、アクアポリン−５（Ａｂｃａｍ、ａｂ９２３２０）、アセチル化α−チューブリン（Ａｂｃａｍ、ａｂ２４６１０）、α２β１インテグリン（Ａｂｃａｍ、ａｂ２４６９７）、α３β１インテグリン（Ａｂｃａｍ、ａｂ２４６９６）、およびＣＤ３１（Ｄａｋｉ、Ｍ０８２３０１−２）。二次抗体（１：４００）：Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８および５９４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１０６】
結果
最初に、高増殖性の細胞集団を、ヒト死体末梢肺組織から単離した。Ｋｒｔ５+ｐ６３+基底幹細胞集団の強い増大が、連続継代培養の間、再現性よく観察された（図１Ａ〜Ｂ）。単離された細胞集団の増殖能は、３回の継代の間維持され（染色によるＫｉ６７+細胞、６３．４±８．０８％）、４回の継代では減少し始めた（図１Ｃ）。表現型の安定性を、継代１および継代４の細胞のフローサイトメトリー分析によってさらに調べ、Ｋｒｔ５+ｐ６３+基底幹細胞系列の増大を確認した（図１Ｄ）。遺伝子発現を縦断的にプロファイルしたところ（図１Ｅ）、気道幹細胞集団に富むが、同時に１型および２型肺胞上皮細胞、ならびにＣＣＳＰ+分泌細胞が失われていることをさらに確認した。間葉系の遺伝子であるビメンチンまたは平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の発現の増加は、細胞増大の間測定されず、上皮間葉転換に関連する転写因子ＺＥＢ１およびＳＮＡＩＬの発現の増加も測定されなかった。継代３での最大の細胞増殖もまた、Ｋｉ６７の遺伝子発現によって確認された。本実験において、細胞の単離および継代の間にＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（５３）を使用しても、基底細胞集団を増強せず、または増殖（Ｋｉ６７、ＰＣＮＡ）もしくは老化（老化関連サイクリン依存的キナーゼ阻害剤２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ）を変化させなかったことから（５４）（図８Ａ〜Ｃ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増大のために使用しなかった。
【０１０７】
無細胞肺足場材料上での機能的上皮の形成が成功するためには、多細胞系列を含む複合組織の再確立が必要である。したがって、単離して増大させた細胞の再生能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの気液界面（ＡＬＩ）で培養した場合の繊毛形成能を確認することによって試験した（図２Ａ）。アセチル化α−チューブリン+繊毛上層、基底Ｋｒｔ５+ｐ６３+細胞層、Ｆｏｒｋｈｅａｄボックスタンパク質−Ｊ１（ＦＯＸＪ１）の核発現、および細胞−細胞密着結合形成（Ｅ−カドヘリン）を含む多列上皮が観察され、これらは共に表現型の多様性、分化能、および生理的自己組織化能が保存されたことを示している（図２Ｂ）。臓器全体の再細胞化におけるこの能力を試験するために、上皮再形成したラット肺を、固定性培地灌流下で７日間維持した後、肺足場材料上でのＡＬＩを再現するために持続気道陽圧（ＣＰＡＰ）モデルにさらに７日間転換させたか、または全体で１４日間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養の間、血管灌流のみによって維持した（図２Ｃ）。広範囲の基底細胞（Ｋｒｔ５+）の再配置がＣＰＡＰ培養後に維持され、気道および肺胞構造の内側を覆った。ＦＯＸＪ１発現の誘導、Ｅ−カドヘリン強度の増加、および増殖の減少（Ｋｉ６７）が観察された（図２Ｄ〜Ｅ）。繊毛上皮表現型へのこの早期誘導は、遺伝子発現の定量によって確認され、培養７日目および１４日目で血管灌流のみの肺と比較して、ＣＰＡＰ肺においてＦＯＸＪ１およびＥ−カドヘリン発現が有意に増加することが判明した（図２Ｆ）。
【０１０８】
次に、細胞の可塑性を、γ−セクレターゼ活性を通してのＮｏｔｃｈシグナリングの阻害によって調べた。単剤による結果は、ドナー細胞に応じていくぶん可変であるが、継代３の細胞に対するＮｏｔｃｈ阻害剤ＩＢＭＸおよびＤＡＰＴとの組合せによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの処置は、核Ｎｋｘ２．１および細胞質ｐｒｏＳＰ−Ｃ発現の両方の発現を誘導した（図３Ａ）。このことは、ＩＩ型肺胞上皮細胞マーカーであるサーファクタントタンパク質−Ｂ（ＳＰ−Ｂ）およびＳＰ−Ｃの有意な増加（Ｎｏｔｃｈ阻害後に２２．０６±０．２９倍の増加、基底幹細胞集団（ｐ６３）を保存しながら）を証明する遺伝子発現解析によってさらに確認された（図３Ｂ）。Ｉ型肺胞上皮細胞マーカーであるアクアポリン５（ＡＱＰ５）およびＨＯＰＸ１の喪失、ならびに分泌細胞マーカー発現（ＣＣＳＰ）の喪失も同様に、Ｎｏｔｃｈシグナルの阻害後に定量された。サーファクタントタンパク質−Ｃの産生もまた、ＥＬＩＳＡによって条件培地において測定した場合に増加した（無処置の０．３３±１．１３ｐｇ／ｍｌに対し、Ｎｏｔｃｈ阻害処置後の１．１３±０．０９ｐｇ／ｍｌ）。ＧＳＩ  ＸおよびＬＹ４１１５７５による処置もまた、ＡＱＰ５発現（１型細胞のマーカーであるが、２型細胞のマーカーではなく、２型細胞は１型細胞に分化する）を増加させたが、ＩＢＭＸ＋ＤＡＰＴ処置は、ＡＱＰ５発現を支持しなかった（図３および図１１を参照されたい）。
【０１０９】
マトリックス支持体（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）において培養した単一の上皮細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで７日間の間に三次元スフィアを形成し、内腔の発達（図３Ｄ）および上皮極性（図３Ｃ）の証拠を示した。二重のＮｏｔｃｈ阻害（ＩＢＭＸ＋ＤＡＰＴ）によって処置した培養は、有意により少ないスフィアを形成した（図３Ｅ〜Ｆ）。遺伝子発現解析により、三次元培養におけるＮｏｔｃｈシグナリング経路の阻害が、ＩＩ型肺胞上皮細胞集団への転換（ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ）、Ｉ型肺胞上皮細胞の喪失（ＡＱＰ５、ＨＯＰＸ１）、クララ細胞の喪失（ＣＣＳＰ）、および基底幹細胞マーカー発現の有意な変化がない（ｐ６３）ことを促進することができることをさらに確認した（図３Ｇ）。
【０１１０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト脱細胞化肺スライスに播種した細胞は、インテグリンα２β１およびα３β１を介してマトリックスへの特異的細胞接着、マトリックス結合領域に沿った密着結合の形成（Ｅ−カドヘリン）、および持続的な全体的増殖（Ｋｉ６７+）を証明した（図４Ａ）。Ｎｏｔｃｈ阻害後の遺伝子発現を、新生児ドナー（ＨＬ３８、日齢３日）および健康な成人肺（ＨＬ３０）からの肺マトリックス上に播種した細胞において解析した。ＩＩ型肺胞上皮細胞集団の誘導が、Ｎｏｔｃｈ阻害剤によって処置した両方の培養において見出された（図４Ｂ）。齧歯類の全肺上皮再形成および培養に規模拡大すると（図４Ｃ）、ＩＩ型肺胞上皮細胞集団への転換は、培地のみを灌流した肺と比較して、Ｎｏｔｃｈ阻害剤による持続性の培地灌流の５日後に証明された（図４Ｄ〜Ｅ）。
【０１１１】
大規模な全臓器培養を可能にするために、本発明の単離した肺バイオリアクターシステムを、インタクトヒト肺足場材料の再細胞化のために適合させた（５５）（図５Ａ）。増大させた基底幹細胞集団を、ヒト肺足場材料の気道に送達し、加えて、初代ヒト肺由来内皮細胞（ＣＤ３１+）を、血管区画に送達した（図５Ｂ）。バイオリアクターは、細胞生存および代謝活性を７〜１０日間にわたって非侵襲性にモニターしながら、ｅｘ  ｖｉｖｏでの再生臓器の生理的灌流範囲（平均値＝２１．３９±４．５３ｍｍＨｇ）を維持した（図５Ｃ）。灌流液中のグルコース消費の増加および乳酸産生を４８時間毎に測定した（図５Ｄ〜Ｅ）。肺構築物の陰圧換気は、設定したチャンバーの圧力目標の間で振動させることによって呼吸６回／分によって達成され（図５Ｆ）、壁内外圧差の中央値１５．８８ｍｍＨｇ（１４．４２〜２１．７３ｍｍＨｇ、ｎ＝２４４７回の呼吸）、および一回呼吸量の中央値１３８．０８ｍｌ／呼吸（７８．０８〜１８３．３２ｍｌ、ｎ＝２４４７回の呼吸）（図５Ｇ〜Ｉ）を得た。陽圧換気を、可能性がある臓器機能のエンドポイント試験として実施し（図５Ｊ）、灌流培地への酸素化の移行を、２１％および１００％ＦｉＯ2で１０分間の換気後に測定した。その結果ｐＯ2  ７２ｍｍＨｇ（ＰａＯ2／ＦｉＯ2＝３４３ｍｍＨｇ）が測定され、これが４１２ｍｍＨｇ（ＰａＯ2／ＦｉＯ2＝４１２ｍｍＨｇ）に増加し、それぞれ、ｐＣＯ2  １７．５ｍｍＨｇおよび２４．９ｍｍＨｇに対応した（図５Ｋ）。このことは、再生されたヒト肺構築物が、再細胞化および培養後の最小の臓器機能およびガス移行を支持することができることを示唆している。
【０１１２】
組織の再細胞化および細胞生存率を、レサズリン含有灌流液の代謝後に肉眼で評価し、生存細胞によるピンク色への代謝を認めた（図６Ｂ）。被覆の程度および細胞形態学を、各肺の複数の領域での組織学染色によって調べた（図６Ｂ）。保存されたマトリックス構造に従って細胞が配置され、上気道から遠位肺領域までの再配置された足場材料全体に広い細胞分布が見出された。再導入された細胞がマトリックス内で増大し続ける能力が確認された。最大７５％の細胞が、臓器培養終了時に増殖中であった（６１．７％±１０．４）（図６Ｃ〜Ｄ）。基底幹細胞集団と内皮細胞との同時培養によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの上皮増殖が増加することが見出され（図９Ａ〜Ｂ）、このことは全肺培養における効果を裏付ける。強いＫｒｔ５+ｐ６３+基底幹細胞表現型が、再生された肺組織全体に観察され（図６Ｅｉ）、同定された非接着ｐｒｏＳＰ−Ｂ+細胞の関与は非常に軽微であった（図６Ｅｉｉ）。大きい気道への上皮細胞の接着も、ラットおよび全肺培養の両方において観察された（図６Ｆ）。不均一な内皮細胞の被覆が血管区画全体を通して観察され、これは、播種した初回細胞数に基づいて予想される分布と一致した。肺胞−毛細管界面に沿って並ぶ単層の内皮細胞および上皮細胞によって表される基本のガス交換単位を同定することができ（図６Ｇｉ）、再配置された血管導管が見出された（図６Ｇｉｉ）。培養した肺内に保持された上皮細胞集団を、遺伝子発現に関してさらに解析したところ、正常な肺と比較して、基底幹細胞集団の維持（正常な死体肺組織より２５倍超高いｐ６３発現）、および非常に低い発現レベルの他の成熟肺上皮系列（ＣＣＳＰ、ＦＯＸＪ１、Ｎｋｘ２．１、およびＳＰ−Ｂ）が確認された（図６Ｈ）。
【０１１３】
加えて、遠位２型肺胞上皮細胞の運命の誘導が、無細胞肺ラット足場材料およびｅｘ  ｖｉｖｏバイオミメティック培養の気道へのＢＥＳＣの送達後、血管灌流液を通して阻害剤ＤＡＰＴ＋ＩＢＭＸの５日間送達によって確認された（ＳＰ−Ｃ発現の１３．０８±１．１５倍の増加）。図４Ａ〜ＢおよびＥを参照されたい。ＢＥＳＣはまた、再細胞化の前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで予め分化させることができ、これによって肺足場材料の再生および阻害剤の除去後に持続的な遠位運命を維持することが示された。図１０Ａを参照されたい。再生肺組織の解析により、組織化された組織構造および形態を有する広範囲の肺胞再細胞化が確認された。図１０Ｂを参照されたい。
【０１１４】
［実施例２］
テネイシン−Ｃおよびフィブリリン−２によるネイティブヒト足場材料上の上皮再生の増強
典型的に、ネイティブマトリックス足場材料に基づく臓器エンジニアリングは、再生細胞集団を対応する生物マトリックスと組み合わせて、機能的移植片を必要に応じて形成することを伴う。肺の脱細胞化後に保持される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、再細胞化後の全臓器再生のための基本的構造および生物物理学的手がかりを提供する。生後間もない肺における活動的な肺胞形成の間の独自のＥＣＭ組成は、細胞接着、生存、および増殖の促進を助けることができる別個のシグナルを有し得る。
【０１１５】
方法
以下の材料および方法を実施例２において使用した。
【０１１６】
試験の承認。他の状況では移植には不適であるヒトドナー肺を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｂａｎｋ（表１を参照されたい）から、インフォームドコンセント後に得た。実験は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ内部倫理委員会および動物利用プロトコールの承認を受けた。ドナーの人口統計学を表１に記載する。
【０１１７】
【表２】
2019519217.tif 000009
【０１１８】
細胞の単離および増大。上皮細胞を上記のように成人ドナー肺抹消組織から単離し、ヒトＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ７５２１）コーティングフラスコにおいて、小気道増殖培地（ＳＡＧＭ、Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−３１１８）中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持し、継代３で実験に使用した。
【０１１９】
肺の脱細胞化。ラットおよびヒトドナー肺を既に記述されているように（Gilpin et al., The Journal of heart and lung transplantation: the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 2014;33(3):298-308; Guyette et al., Nature protocols. 2014;9(6):1451-68）脱細胞化した。簡単に説明すると、死体ラット肺を、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ、８週齢超、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から摘出し、０．１％ＳＤＳ溶液を、肺動脈を通して４０ｍｍＨｇで灌流した後、洗浄することによって脱細胞化した。ヒト肺脱細胞化は、０．５％ＳＤＳ溶液を、肺動脈を通して３０ｍｍＨｇから６０ｍｍＨｇの間の定圧で灌流することによって実施した。
【０１２０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏコーティングおよび培養のための肺ＥＣＭ消化。脱細胞化肺（新生児、ｎ＝３および成人、ｎ＝３）からの組織試料を凍結乾燥して、１０ｍｇ／ｍＬ（０．１Ｍ滅菌ＨＣｌ  １ｍＬあたりペプシン１ｍｇ）ペプシン緩衝液中、室温で２４時間、機械によりホモジナイズした。コーティング前にペプシン消化組織を、０．１Ｍ酢酸中で１：１００に希釈し、最終濃度を０．１ｍｇ／ｍＬにした。コーティングを組織培養プレートに加えて、３００×ｇで５分間遠心分離した。全体で１×１０6個のＢＥＳＣ（ｐ６３およびＫｒｔ５発現によって同定）を、２４ウェルプレートの各ウェルに添加し、ＳＡＧＭ中で７日間培養した。
【０１２１】
細胞傷害アッセイを、上記のようにＥＣＭをコーティングした９６ウェルプレートにおいて、全体で１×１０5個のＢＥＳＣを各ウェルに添加して実施した。５日間培養後、ＭｕｌｔｉＴｏｘ−Ｆｌｕｏｒマルチプレックス細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造元の説明書に従って実施し、生細胞の蛍光を４００Ｅｘ／５０５Ｅｍで読み取り、死細胞の蛍光を４８５Ｅｘ／５２０Ｅｍで読み取った。
【０１２２】
プロテオーム試料調製。脱細胞化新生児および成人肺組織を、既に記述されたように（Li et al., Biomaterials. 2016; 75:37-46; Li et al. Biomaterials. 2016;81:104-13）プロテオーム解析のために調製した。各組織およそ９０ｍｇを、氷中で細切し、使い捨てのペレットペッスルによって１．５ｍＬチューブにおいて１分間すりつぶした後、４％ＳＤＳ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．６）および０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）（試薬は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから得た）を含むＳＤＴ溶液３００μＬを添加した。次に、試料を９５℃で７分間加熱し、プローブ超音波装置（Ｍｉｓｏｎｉｘ  ＸＬ２０１５、Ｍｉｓｏｎｉｘ  ｍｉｃｒｏｔｉｐ  ＰＮ／４１８、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）によって氷中で２０秒間オンおよび２０秒間オフを６分間交互にすることによって超音波処理し、その後１６，１００×ｇ、２２℃で５分間遠心分離した。試料上清のアリコート（２×３０μＬ）を、３０Ｋ  ＭＷ  Ｖｉｖａｃｏｎ  ５００フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｂｏｈｅｍｉａ、ＮＹ）において、８Ｍ尿素／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）の２×２００μＬと混合した。試料を洗浄し、ヨードアセトアミドによってアルキル化し、さらに洗浄した後、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；タンパク質：酵素比５０：１（ｗ／ｗ））によって３７℃で一晩消化し、消化したペプチドを遠心分離によって収集した。次に、１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の最終濃度０．５％ＴＦＡによって消化をクエンチした。
【０１２３】
クエンチした消化物を、ＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）上で、Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）Ｃ１８カラム（５μｍ、１００Å、２５０×４．６ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を使用して高速ｐＨ分画に供した。移動相Ａは、２０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液であり、移動相Ｂは、７０％アセトニトリル（ＡＣＮ）中の２０ｍＭギ酸アンモニウム溶液であり、０〜１００％移動相Ｂの勾配を２０分間で行った。ＨＰＬＣの流速は１ｍＬ／分であり、溶出液を収集して、６分画にまとめ、その各々をＳｐｅｅｄＶａｃにおいて蒸発乾固させて、５％ＡＣＮ、２％ギ酸（ＦＡ）中で再構成した。
【０１２４】
液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるプロテオーム解析。再構成したペプチド溶液を、ＥＳＩイオントラップ／Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に接続したＷａｔｅｒｓ  ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣに注入した。ペプチドを、１．７μｍ  ＢＥＨ  Ｃ１８粒子（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）２０ｃｍを充填した内径１００μｍのカラム上で分離し、ＡＣＮの漸増勾配により、０．１％ＦＡ中、０．３μＬ／分で２．５時間溶出させた。ヒーターカートリッジを使用して、キャピラリーカラムを６０℃に維持した。完全な質量スキャン（３００〜１５００  ｍ／ｚ）を、Ｏｒｂｉｔｒａｐにおいて解像度６０，０００で実施した。１０個の最も強いピークを、４２％衝突エネルギーでの高エネルギー衝突誘起解離（ＨＣＤ）による断片化のために選択した後、解像度７，５００および単離幅２．５ｍ／ｚで分析した。ダイナミックエクスクルージョンによって、３０秒間に１回のリピート数および１２０秒の除外期間が可能となった。
【０１２５】
プロテオームデータ解析。獲得した生のファイルを、ＭａｘＱｕａｎｔバージョン１．５．２．８（Cox et al., Nat Biotech. 2008;26(12):1367-72）によって解析した。使用したＵｎｉＰｒｏｔデータベースは、２６２個の一般的な夾雑物が補足された、２０１３年１２月５日にダウンロードした２０，２７８個の、ホモサピエンス由来の審査後配列を含んだ。前駆体および断片のイオンマストレランスをそれぞれ、４．５ｐｐｍおよび２０ｐｐｍに設定した。静的システインカルバミドメチル化（＋５７．０２１５Ｄａ）および最大７個の可変メチオニンおよびプロリン酸化（＋１５．９９４９Ｄａ）を指定した。ペプチドおよびタンパク質レベルの両方で１％の偽発見率を許容した。最大２の切れ残りを許容し、タンパク質あたり少なくとも２つのユニークペプチドを必要とした。リバースデータベースからのタンパク質または夾雑物とのマッチを含むタンパク質群を廃棄した。ユニークペプチドおよびｒａｚｏｒペプチドのみを定量のために使用し、最小カウント２を必要とした。各試料内のタンパク質の相対量を、強度に基づく絶対定量（ｉＢＡＱ）によって測定し、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアパッケージに組み込まれたラベルなし定量（ＬＦＱ）アルゴリズムを、異なる試料間のタンパク質の量を比較するために使用した。Ｐｅｒｓｅｕｓソフトウェア（バージョン１．５．０．１５）を、下流のデータ処理のために使用した。少なくとも１つの試料群（新生児または成人）において少なくとも２つの有効な値を必要とすることによって、タンパク質をフィルタリングした。補正した強度をｌｏｇ２変換し、幅０．３およびダウンシフト０．９を使用することによるデータ補完を使用して欠失値を置換した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を行う２つの試料のｔ−検定を実施して、新生児および成人組織中の個々のタンパク質のＬＦＱ値を統計学的に比較した。
【０１２６】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ培養および遊走アッセイ。２４ウェルプレートを、ヒトＩＶ型コラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ７５２１）によって３７℃で２時間、プレコーティングした。次に、コラーゲン溶液を除去後、ウェルを選択するために、ＴＮ−Ｃ（１０μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  ３３５８−ＴＣ−０５０）、またはヒトＦＢＮ−２の組み換えＮ末端半分（ＦＢＮ−２−Ｎ）もしくはＣ末端半分（ＦＢＮ−２−Ｃ）（Lin et al., The Journal of biological chemistry. 2002;277(52):50795-804）（１０μｇ／ｍｌ）を添加して、３７℃で２時間インキュベートした。次に、全体で１×１０5個のＢＥＳＣを各ウェルに播種して、ＳＡＧＭ中で７日間培養した。
【０１２７】
遊走アッセイに関して、上記のようにコーティングした後、細胞を播種する前に、小さいインセット（ＩＢＩＤＩ）をウェルに添加した。全体で１×１０4個の細胞をインサート内に播種し、１２時間インキュベートした後、インサートを取り出した。細胞の遊走を追跡するために、明視野画像を３０分毎に１８０分間得た。無細胞領域の変化を定量するために、画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Schneider et al., Nature methods. 2012;9(7):671-5）によって解析した。
【０１２８】
Ｅｘ  Ｖｉｖｏラット肺再細胞化および培養。脱細胞化肺足場材料を、気管を通して送達することによって、（Ａ）ＰＢＳ対照、（Ｂ）ＴＮ−Ｃ、１０μｇ／ｍｌ、（Ｃ）ＦＢＮ−２、（ＦＢＮ−２のＮおよびＣ末端断片の各々に関して１０μｇ／ｍｌ）、または（Ｄ）ＴＮ−Ｃ＋ＦＢＮ−２（ＴＮ−ＣならびにＦＢＮ−２のＮおよびＣ末端断片の各々に関して１０μｇ／ｍｌ）によってプレコーティングした。溶液を３７℃で９０分間気管にリサイクルした。全体で２０×１０6個の初代肺上皮細胞（継代３）をＳＡＧＭ  ２０ｍｌ中で重力によって足場材料気道に送達した。肺動脈を通してのＳＡＧＭの固定性培地灌流を、４ｍｌ／分（圧力１５〜２０ｍｍＨｇ）で維持し、毎日交換した。再細胞化肺を培養で７日間維持し、時点分析のために３日目に右肺を切除した。
【０１２９】
定量的ＰＣＲ。ｍＲＮＡを単離して（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ）、ｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）に転写した。遺伝子発現を、ＴａｑｍａｎプローブおよびＯｎｅＳｔｅｐ  Ｐｌｕｓシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析した。各生物試料を、反復実験（ｑＰＣＲ反応物に関してｎ＝２の反復ウェル）で分析し、各反復実験のＣｔ値を平均し、ｎ＝１の独自の生物試料として扱った。各試料の発現を、β−アクチン（ＡＣＴＡ１）遺伝子発現に対して標準化し（△Ｃｔ）、死体末梢肺組織対照試料と比較し（△△Ｃｔ）、変化倍率を２−△△Ｃｔによって計算した（Livak and Schmittgen, Methods. 2001;25(4):402-8）。各々の報告された実験に関して、全体でｎ＝３の独自の生物試料を分析した。
【０１３０】
免疫染色。脱パラフィン化および再水和後、５μｍ組織切片を、必要であれば、細胞内抗原のために０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって透過性にした。培養中の細胞を、染色前に氷冷メタノールによって固定した。全ての試料を１％ロバ血清によって１時間ブロックした。一次抗体は全て１：１００倍希釈した：ｐ６３（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａ、ＣＭ１６３Ａ）、Ｋｒｔ５（Ａｂｃａｍ、ａｂ２４６４７）、Ｅ−カドヘリン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、６１０１８１）、Ｋｉ６７（Ａｂｃａｍ、ａｂ１６６６７）。二次抗体は全て１：４００倍希釈した：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または５９４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にコンジュゲートした、ロバ抗マウス、ウサギ、またはヤギ。核を可視化するために、試料を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色し、Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅｃｌｉｐｓｅ顕微鏡を使用して撮像した。
【０１３１】
画像分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して実施し、隔膜の厚さをｎ＝３の独自の区分で測定し、区分あたりｎ＝５の領域を測定した（図１８を参照されたい）。
【０１３２】
統計分析。全ての実験に関して、記載のｎ値は独立した生物試料を表す。データは、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して、必要に応じて一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。統計学的有意性は全て、以下に従って報告する。*＝ｐ＜０．０５、**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。
【０１３３】
結果
臨床での移植に不適であると思われる提供されたヒト肺を、最初に、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液の定圧血管灌流によって脱細胞化した（図１７Ａ〜Ｂを参照されたい）後、残留洗浄剤および細胞構成要素を除去するために十分に洗浄し、細胞外タンパク質マトリックス足場材料を生成した（Gilpin et al., The Journal of heart and lung transplantation: the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 2014;33(3):298-308; Guyette et al., Nature protocols. 2014;9(6):1451-68に既に記述されている）。全体でｎ＝３の新生児（生後１週間未満）の肺足場材料およびｎ＝３の成人肺足場材料を、その後の解析のためにこのようにして調製した（表１を参照されたい）。
【０１３４】
本発明者らは、最初に、成人肺と比較して新生児肺に由来するＥＣＭ上で培養した場合の、初代ドナー組織由来基底上皮幹細胞（ＢＥＳＣ）の反応を評価することを目的とした。この目的のために、各新生児および成人ドナーからの無細胞肺ＥＣＭを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上皮細胞培養のためのコーティングとして調製した（図１２Ａ）。各基質上でＢＥＳＣを７日間培養後、新生児ＥＣＭ上の細胞は、成人肺ＥＣＭ上で成長させた細胞と比較して有意により増殖性（Ｋｉ６７およびＰＣＮＡ発現）で、老化の程度が低い（ＣＤＫＮ２Ａ発現）ことが見出された（図１２Ｂ）。上皮表現型の有意な差は見出されず（Ｅ−カドヘリン、ｐ６３発現）、間葉マーカー平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の発現の増加は観察されなかった。細胞全体の評価により、培養７日目までに、新生児ＥＣＭコーティング上では成人肺ＥＣＭより有意により多くの生存細胞が生着したが、死細胞数の差は見出されなかった（図１２Ｃ）。
【０１３５】
次に、この効果を媒介し得るタンパク質組成の差を調べるために、本発明者らは、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）と共にプロテオーム解析によって、新生児ドナー肺からの無細胞肺足場材料を成人ドナー肺と比較して評価した。図１３Ａのヒートマップは、各生物試料からの各タンパク質の量の変化を示している。両方の群において、多数の少量のタンパク質（緑色）を、少数の大量のタンパク質（赤色）に加えて測定した。マトリソームのサブカテゴリのさらなる解析（図１３Ｂ）によって、新生児肺足場材料がより大量のコラーゲンを含むが、他のサブカテゴリ（糖タンパク質、プロテオグリカン、ＥＣＭ調節因子等）は、成人足場材料においてより大量に存在することが示された。
【０１３６】
次に、各個々のマトリックスタンパク質の測定量を、新生児足場材料と成人足場材料において比較した。統計学的ｐ−値に対してプロットしたタンパク質量の変化倍率（成人対新生児）を示す、ボルケーノプロットを作成した。新生児または成人足場材料において豊富に存在する、選択されたタンパク質を、図１４Ａに強調し、図１４Ｂに詳細に記載する。
【０１３７】
フィブリリン２および３は、成人試料と比較して新生児足場材料において豊富に存在することが見出された（フィブリリン−２＝２０２．７４倍の変化、ｐ＝２．８×１０-2）。フィブリリンは、エラスチンの沈着および弾性繊維の形成にとって必須である糖タンパク質であり、肺胞の発達および構造を支持している（Peirce et al., Ciba Foundation symposium. 1995;192(199-212; discussion -4）。具体的には、ＦＢＮ−２の発現パターンは、発達中の胎児組織にほとんど限定されている（Zhang et al., The Journal of cell biology. 1994;124(5):855-6）。加えて、ＦＢＮ−２は、発達および組織修復の両方において、ＴＮ−Ｃと相互作用することが示されている（Brinckmann et al., Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 2010;90(5):739-52）。ＴＮ−Ｃはまた、新生児肺ＥＣＭにおいても見出され、分枝形態形成プロセスを助けることが示されている（Young et al., Developmental biology. 1994;161(2):615-25）。新生児肺足場材料にこれらの２つのタンパク質が豊富に存在することにより、本発明者らは、新生児肺ＥＣＭコーティング上に見出される上皮修復反応増強の可能性があるメディエータとしてのその役割をさらに解析した。
【０１３８】
本発明者らは、これらの個々のタンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢＥＳＣ上の新生児ＥＣＭの有益な効果を再現することができるか否かを試験した。ＢＥＳＣをＩＶ型コラーゲンによって最初にコーティングしたプレート上で培養し、その後ＴＮ−Ｃおよび／またはＦＢＮ−２組み換えＮおよびＣ末端半分を補充し、これを非コーティングウェル上での培養と比較した（図１５Ａ）。ＢＥＳＣを、単離された新生児ＥＣＭコーティング上で培養した場合に観察されるように、本発明者らは、ＦＢＮ−２およびＴＮ−Ｃコーティングプレート上で成長させたＢＥＳＣによって有意により大きい増殖およびより少ない老化を見出し、最も有意な反応はＴＮ−Ｃ＋ＦＢＮ−２−Ｃ末端半分コーティングにおいて測定された。非コーティングまたはＩＶ型コラーゲンコーティングウェルと比較して、上皮表現型の差は見出されなかった。異なるタンパク質コーティングに反応した、ＴＮ−Ｃ、ＦＢＮ−２、またはビメンチン発現の有意な変化は検出されなかった（図１５Ａ）。同様に、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）発現ならびに転写因子ＳＮＡＩＬおよびＺＥＢによって評価した場合に、異なるコーティング上で上皮間葉転換（ＥＭＴ）の証拠は同定されなかった（図１５Ａ）。異なるＥＣＭコーティング上で成長させたＢＥＳＣの免疫蛍光染色は、遺伝子発現解析の知見を確認し、Ｋｉ６７発現を定量した場合、ＦＢＮ−２およびＴＮ−Ｃコーティングプレート上で有意差が見出された（図１５Ｂ〜Ｃ）。ＢＥＳＣ遊走をまた、細胞遊走アッセイを定量することによって、様々なタンパク質コーティング上で調べた。ＦＢＮ−２のＮおよびＣ末端半分の混合物を遊走アッセイに使用した。ＩＶ型コラーゲンコーティング単独と比較して、ＢＥＳＣ遊走の有意により高い割合が、３時間の間にＦＢＮ−２およびＴＮ−Ｃコーティングプレート上で同定された（ｐ＜０．００１、図１５Ｄ）。加えて、細胞遊走の追加の指標である接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）の遺伝子発現（Mitra et al., Nature reviews Molecular cell biology. 2005;6(1):56-6）を様々なコーティングにおいて測定したところ、ＴＮ−Ｃ＋ＦＢＮ−２  Ｃ末端断片コーティングプレート上で成長させたＢＥＳＣでは有意に高い発現レベルであった（図１５Ｅ）。
【０１３９】
全肺上皮組織再生の状況においてこれらの知見を最終的に評価するために、本発明者らは、上皮の再細胞化の前に、無細胞肺足場材料をＦＢＮ−２（ＮおよびＣ末端断片の混合物）およびＴＮ−Ｃで前処置する効果を評価した。プレコーティングおよびＢＥＳＣ上皮再形成後、肺をｅｘ  ｖｉｖｏバイオミメティック培養において７日間維持し、右肺を時点分析のために３日目に切除した。
【０１４０】
組織分析により、再生の３日目および７日目に、足場材料の前処置によって有意により多くの上皮増殖が再度同定された（図１６Ａ）。培養７日目での細胞老化の増加は、ＦＢＮ−２＋ＴＮ−Ｃ足場材料コーティングによって有意に低減された。Ｅ−カドヘリン発現の増加は、ＦＢＮ−２＋ＴＮ−Ｃ処置後３日目に測定されたが、それ以外の上皮の運命は足場材料コーティングによって不変であった。ＦＢＮ−２またはＴＮ−Ｃのいずれも処置によってアップレギュレートされなかった。間葉表現型またはＥＭＴ関連転写因子発現の増加は認められなかった。ヘマトキシリンおよびエオジン染色による上皮再形成肺組織の肉眼での形態分析により、無処置対照と比較して、コーティングした肺において改善された組織構造、マトリックスへの細胞の配置、およびより少ない細胞の肥大が明らかとなった（図１６Ｂ）。これらの知見は、培養７日目で最も明らかであった。
【０１４１】
上皮の運命および増殖を評価するために、免疫蛍光染色を実施した。Ｋｒｔ５＋  ＢＥＳＣのＫｉ６７発現の定量により、肺足場材料をＦＢＮ−２およびＴＮ−Ｃによってプレコーティングした場合に、増殖が有意に増加することが確認され、足場材料コーティング用に両方のタンパク質を組み合わせると、最大の細胞反応が見出された（図１６Ｃ〜Ｄ）。
【０１４２】
隔膜の厚さの測定による組織形態学の定量によってもまた、足場材料のプレコーティングによって、再生肺組織においてより多くの細胞の配置およびより少ない隔膜肥厚が得られるという知見が確認された（図１６Ｅおよび図１８）。これによって、サイズおよび構造の両方において、ネイティブの肺組織とより類似の外観を有する肺胞構造が得られた。
【０１４３】
まとめると、これらの結果は、ＦＢＮ−２およびＴＮ−Ｃタンパク質による無細胞肺マトリックスの処置が、基底上皮幹細胞の遊走、増殖を増強し、および肺組織修復を助けることができることを証明している。
【０１４４】
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【０１４５】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明するためのものであり、それを制限するためのものではないと理解される。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１−１】
2019519217.tif 000010
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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