(57)【要約】  パテアミンA誘導体、該誘導体を含む医薬組成物、及び該誘導体を用いて慢性リンパ球性白血病を治療する方法。
2019510070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)
【化１】
2019510070.tif 000033
[式中、
XはO、NH、及びSから選択され、
YはR、OR1、SR1、及びN(R1)R2から選択され、
RはC1〜C6アルキル、C1〜C6ハロアルキル、C6〜C10アリール、及び1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキル基から選択され、
R1及びR2は水素、C1〜C6アルキル、C1〜C6ハロアルキル、C6〜C10アリール、及び1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキル基から独立に選択される]
を有する化合物、その立体異性体、ラセミ体、又は薬学的に許容される塩。
【請求項２】
式(II)
【化２】
2019510070.tif 000034
[式中、
XはO、NH、及びSから選択され、
YはR、OR1、SR1、及びN(R1)R2から選択され、
RはC1〜C6アルキル、C1〜C6ハロアルキル、C6〜C10アリール、及び1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキル基から選択され、
R1及びR2は水素、C1〜C6アルキル、C1〜C6ハロアルキル、C6〜C10アリール、及び1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキル基から独立に選択される]
を有する化合物、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
式(III)
【化３】
2019510070.tif 000035
[式中、A-が薬学的に許容される対イオンである]
を有する、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
式(IV)
【化４】
2019510070.tif 000036
[式中、A-が薬学的に許容される対イオンである]
を有する、請求項2に記載の化合物。
【請求項５】
A-が、クロリド、ブロミド、ヨージド、サルフェート、ホスフェート、ホルメート、アセテート、トリフルオロアセテート、マレエート、フマレート、スクシネート、タルタレート、オキサレート、シトレート、マレート、ベンゾエート、トルエンスルホネート、メタンスルホネート、及びベンゼンスルホネートからなる群から選択される、請求項3又は4に記載の化合物。
【請求項６】
XがOであり、YがRである、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Rがメチル、トリフルオロメチル、又はt-ブチルである、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
XがOであり、YがOR1である、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
R1がメチル又はt-ブチルである、請求項8に記載の化合物。
【請求項１０】
XがOであり、YがN(R1)R2である、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
R1が水素であり、R2が水素であるか、又はR1が水素であり、R2がメチルである、請求項10に記載の化合物。
【請求項１２】
XがOであり、YがSR1である、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
R1がメチル又はt-ブチルである、請求項12に記載の化合物。
【請求項１４】
XがSであり、YがRである、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
Rがメチルである、請求項14に記載の化合物。
【請求項１６】
XがSであり、YがOR1である、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
R1がメチル又はt-ブチルである、請求項16に記載の化合物。
【請求項１８】
XがSであり、YがN(R1)R2である、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
R1が水素であり、R2が水素であるか、又はR1が水素であり、R2がメチルである、請求項18に記載の化合物。
【請求項２０】
XがSであり、YがSR1である、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
R1がメチル又はt-ブチルである、請求項20に記載の化合物。
【請求項２２】
XがNHであり、YがRである、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
Rがメチル、トリフルオロメチル、又はt-ブチルである、請求項22に記載の化合物。
【請求項２４】
XがNHであり、YがOR1である、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
R1がメチル又はt-ブチルである、請求項24に記載の化合物。
【請求項２６】
XがNHであり、YがN(R1)R2である、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７】
R1が水素であり、R2が水素であるか、又はR1が水素であり、R2がメチルである、請求項26に記載の化合物。
【請求項２８】
XがNHであり、YがSR1である、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２９】
R1がメチル又はt-ブチルである、請求項28に記載の化合物。
【請求項３０】
1つ又は複数の炭素がOで置換されたC3〜C12アルキル基が、-CH2-O-CH3、-CH2CH2-O-CH3、及び-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH3から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３１】
1つ又は複数の炭素がNで置換されたC3〜C12アルキル基が、-CH2-NH-CH3、-CH2-N(CH3)2、-CH2CH2-NH-CH3、及び-CH2CH2-N(CH3)2から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３２】
式(V)
【化５】
2019510070.tif 000037
[式中、
ZがR及びOR1から選択され、
RがC1〜C6アルキル、C1〜C6ハロアルキル、C6〜C10アリール、及び1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキル基から選択され、
R1が水素、C1〜C6アルキル、C1〜C6ハロアルキル、C6〜C10アリール、及び1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキル基から選択される]
を有する化合物、その立体異性体、ラセミ体、又は薬学的に許容される塩。
【請求項３３】
式(VI)
【化６】
2019510070.tif 000038
[式中、
ZがR及びOR1から選択され、
RがC1〜C6アルキル、C1〜C6ハロアルキル、C6〜C10アリール、及び1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキル基から選択され、
R1が水素、C1〜C6アルキル、C1〜C6ハロアルキル、C6〜C10アリール、及び1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキル基から選択される]
を有する化合物、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３４】
式(VII)
【化７】
2019510070.tif 000039
[式中、A-が薬学的に許容される対イオンである]
を有する、請求項32に記載の化合物。
【請求項３５】
式(VIII)
【化８】
2019510070.tif 000040
[式中、A-が薬学的に許容される対イオンである]
を有する、請求項33に記載の化合物。
【請求項３６】
A-が、クロリド、ブロミド、ヨージド、サルフェート、ホスフェート、ホルメート、アセテート、トリフルオロアセテート、マレエート、フマレート、スクシネート、タルタレート、オキサレート、シトレート、マレート、ベンゾエート、トルエンスルホネート、メタンスルホネート、及びベンゼンスルホネートからなる群から選択される、請求項34又は35に記載の化合物。
【請求項３７】
ZがC1〜C6アルキルである、請求項32から36のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３８】
Zがメチルである、請求項32から36のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３９】
ZがC1〜C6ハロアルキルである、請求項32から36のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４０】
Zがトリフルオロメチルである、請求項32から36のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４１】
ZがC6〜C10アリールである、請求項32から36のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４２】
Zがフェニルである、請求項32から36のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４３】
Zが、1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキルである、請求項32から36のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４４】
Zが-CH2-O-CH3、-CH2CH2-O-CH3、及び-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH3から選択される、請求項32から36のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４５】
Zが-CH2-NH-CH3、-CH2-N(CH3)2、-CH2CH2-NH-CH3、及び-CH2CH2-N(CH3)2から選択される、請求項32から36のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４６】
式(IX)
【化９】
2019510070.tif 000041
を有する化合物、又はその立体異性体、ラセミ体、若しくは薬学的塩。
【請求項４７】
式(IX)
【化１０】
2019510070.tif 000042
を有する化合物、又はそのラセミ体若しくは薬学的塩。
【請求項４８】
式(XI)
【化１１】
2019510070.tif 000043
[式中、A-が薬学的に許容される対イオンである]
を有する化合物、又はその立体異性体、ラセミ体、若しくは薬学的塩。
【請求項４９】
式(XII)
【化１２】
2019510070.tif 000044
[式中、A-が薬学的に許容される対イオンである]
を有する化合物、又はそのラセミ体、若しくは薬学的塩。
【請求項５０】
請求項1から49のいずれか一項に記載の化合物と薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項５１】
抗体又はその機能的断片に直接又はリンカー単位を介して共有結合で連結された請求項1から49のいずれか一項に記載の化合物を含む、β-アミノパテアミン誘導体の送達のための抗体コンジュゲート。
【請求項５２】
請求項51に記載の抗体コンジュゲートと薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項５３】
慢性リンパ球性白血病(CLL)細胞の増殖を阻害する方法であって、CLL細胞を請求項1から49のいずれか一項に記載の化合物又は請求項51に記載の抗体コンジュゲートと接触させる工程を含む、方法。
【請求項５４】
慢性リンパ球性白血病(CLL)を治療する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の請求項1から49のいずれか一項に記載の化合物、請求項51に記載の抗体コンジュゲート、又は請求項50若しくは52に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる2016年3月31日出願の出願番号第62/316,299号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、β-アミノパテアミンA誘導体及びβ-アミノパテアミンA誘導体を用いて慢性リンパ球性白血病を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
悪性腫瘍の病態生理学を特異的なターゲットとする新規な作用機序を有する薬剤に基づいて、有効かつ新規な癌治療が開発されてきた。これらの疾患の大部分では、生存促進性タンパク質の過発現による正常なリンパ球の細胞死機序に顕著な欠損が見られる。B細胞悪性腫瘍代謝の重要な態様は、これらの細胞をアポトーシスによる死から遠ざける生存促進性タンパク質を補給することに向けられていることが今では認められている。これらの生存促進性タンパク質の一次タンパク質構造に固有の配列モチーフがこれらのタンパク質(たとえばMc1-1、XIAP)の急速なターンオーバーのシグナルとなるので、このことが必要である。これはB細胞悪性腫瘍の病態生理学の特徴である。重要なことに、翻訳の一時的な阻害さえも、これらの重要なタンパク質を、アポトーシスを妨害できないレベルにまで急速に減少させる。いったん開始すれば、この致命的なプロセスは不可逆的である。正常なリンパ球細胞はこの依存性を示さないので、CLL細胞は生存のための抗アポトーシスタンパク質の継続的な発現に「依存している」と思われる。
【０００４】
パテアミンA(PatA)は、最初にP388マウス白血病細胞に対する細胞毒性活性(IC50、0.27nmol/L)に基づくバイオアッセイに導かれた分画によって、カイメンMycale sp.から単離された。その後、その細胞毒性と一致して、PatAはいくつかの癌細胞株においてアポトーシスを誘導することが示された。デスメチルデスアミノパテアミンA(DMDAPatA)は、天然物の単純化された類似体であり、合成がより簡単で、30を超えるヒト癌細胞株に対する強力なインビトロ抗増殖剤である。
【０００５】
【化１】
2019510070.tif 000003
【０００６】
PatA及びDMDAPatAは、eIF4F複合体の形成を妨害する、eIF4Aの隔離によって、又はmRNAにおける開始複合体を停滞させることによって、キャップ依存性翻訳開始を阻害する。マウスにおける異種移植研究によって、DMDAPatAがヒト白血病及び黒色腫のモデルにおいて高い活性を有し、それにより腫瘍の顕著な縮小が見られ、良好なバイオアベイラビリティを示すことが分かった。PatAの20を超える誘導体の合成によってDMDAPatAの同定が行なわれ、これらは天然産生物よりも有意に安定性が高いことも見出された。多剤耐性タンパク質の過発現はこの活性に影響しなかった。重要なことに、DMDAPatAは初代CLL細胞における内在的に短寿命の抗アポトーシスタンパク質のレベルを低減させ、アポトーシスを開始する。しかし、DMDAPatAに関する予備的なデータは、ヒト血漿中ではこれがタンパク質と高度に結合しており、効果的な治療剤としての開発に必要な十分なインビボ効力を欠く可能性があることを示唆している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Romo, D.、Rzasa, R. M.、Shea, H. A.、Park, K.、Langenhan, J. M.、Sun, L.、Akhiezer, A.、Liu, J. O. (1998年)「Total Synthesis and Immunosuppressive Activity of (-)-Pateamine A and Related Compounds: Implementation of a  β-Lactam-Based Macrocyclization」、J. Am. Chem. Soc. 120、12237〜12254頁
【非特許文献２】Low, W. K.、Li, J., Zhu, M.、Kommaraju, S. S.、Shah-Mittal, J.、Hull, K.、Liu, J. O.、Romo, D. (2014年)「Second-generation derivatives of the eukaryotic translation initiation inhibitor pateamine A targeting eIF4A as potential anticancer agents」、Bioorg. Med. Chem. 22、116〜125頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
PatA及びDMDAPatAは治療剤の開発のための魅力的な候補と思われるが、治療有効性、低毒性、及び有利な薬力学特性を有する改善されたPatA誘導体へのニーズが存在する。本発明はこれらのニーズを満たすことを目的としており、更に関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の上記の態様及び付随する利点の多くは、添付した図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによって、より良く理解されるとともに、より容易に認識されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の代表的なβ-アミノパテアミンAアミド誘導体の調製に有用な合成中間体の調製の図式的説明である。
【図２】本発明の代表的なβ-アミノパテアミンAアミド誘導体の調製の図式的説明である。
【図３−１】図３Ａは、複数の初代CLLの試験におけるDMDAPatAの作用機序を説明するフロー図である。図３Ｂは、[3H]ロイシン取り込みによって測定したタンパク質合成のDMDAPatAによる阻害を示す図である(DMDAPatA濃度の関数としての対照に対する百分率とした[3H]ロイシン取り込み)。
【図３−２】図３Ｃは、DMDAPatAが短寿命の抗アポトーシスタンパク質Mc1-1を低減させ、Bc1-2のレベルには影響しないことを示す図である。図３Ｄは、DMDAPatAによるMc1-1の除去によって、カチオン色素DiOC6の結合の喪失として示されるミトコンドリア外部膜透過性上昇(MOMP)が誘導されることを示す図である。図３Ｅは、DMDAPatA濃度の関数としてのCLL生存百分率を比較する図である。
【図４】図４Ａは、DMDAPatA(良好な又は不良な予測特性を有するCLL患者からの試料)のIC50値を比較し、各群における試料間の有意差がないことを示す図である。図４Ｂは、用量低減解析を示し、DMDAPatAとABT-199のIC50、IC75及びIC90値を比較して、相乗強化作用を示す図である。
【図５】DMDAPatAの効力をその親化合物PatAと比較し、DMDAPatAがPatAより約30分の1しか効力がなかったことを示す図である。これらの実験は10%の患者血漿を添加した培地中で培養したCLL細胞で行なった。
【図６】代表的なα-アミノ(2-アミノ)パテアミンA誘導体(α-アミノバリアント)と代表的なβ-アミノ(3-アミノ)パテアミンA誘導体(β-アミノバリアント)の化学構造を比較する図である。
【図７−１】図７は、10%のFBS又は患者血漿を添加した培地中で培養したCLL細胞について、代表的なパテアミンA誘導体(OR-IV-234)の初代CLL細胞効力及び血漿タンパク質結合を対照としてのPatA及びDMDAPatAと比較する図である。誘導体濃度の関数としての生存百分率を図７Ａに示す。
【図７−２】IC50及びタンパク質結合結果を図７Ｂにまとめる。
【図８−１】図８は、代表的なパテアミンA誘導体(OR-IV-234)についての正常(健常)ドナーからのB細胞及びT細胞に対するCLL細胞効力を対照としてのPatA及びDMDAPatAと比較する図である。誘導体濃度の関数としての生存百分率を図８Ａに示す。
【図８−２】IC50値を図８Ｂにまとめる。
【図９−１】代表的なパテアミンA誘導体(OR-IV-234)についてのタンパク質合成の阻害(ロイシン取り込み解析)を示し(図９Ａ)、DMDAPatA及びPatAと比較した図である。
【図９−２】全ての誘導体はタンパク質合成の強い阻害を実証し、イムノブロット(図９Ｂ)によってMc1-1レベルの低減が確認された。ブロットの下に示すCLL細胞の生存の低減によって、アポトーシスが実証された。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明はβ-アミノパテアミンA誘導体、該誘導体を含む医薬組成物、及び該誘導体を用いる方法を提供する。
【００１２】
本発明の化合物はC5-メチル基を欠くパテアミンAの単純化された類似体である。本発明の化合物はβ-アミノ(3-アミノ)パテアミンA誘導体である。
【００１３】
本発明の化合物は翻訳阻害剤パテアミンAの誘導体であり、パテアミンAの誘導体として本発明の化合物はeIF4A依存性翻訳開始の阻害による抗癌効果及び抗増殖効果を提供することが期待される。
【００１４】
本発明の化合物は慢性リンパ球性白血病(CLL)細胞に対する強力な阻害活性を示し、ヒト血漿中における血漿タンパク質結合(PPB)を低下させる。効力と低いPPBの組合せにより、この化合物はCLLの治療のための治療薬の開発の候補となる。
【００１５】
CLL細胞における翻訳の阻害は、B細胞悪性腫瘍の治療の臨床開発のため、及び現存する標準的ケア治療に対する薬剤耐性を克服する可能性を有している。再発した難治性CLLは全体的生存率が不良であるという臨床的問題を依然として有している。本発明の化合物はその特徴的な作用モード、即ち翻訳及びタンパク質の生合成の阻害によって、抵抗性のCLLと闘うために有用であり得る。
【００１６】
β-アミノパテアミン誘導体
1つの実施形態では、本発明は式(I)
【００１７】
【化２】
2019510070.tif 000004
【００１８】
を有するパテアミンA誘導体、その立体異性体、ラセミ体、及び薬学的に許容される塩を提供し、
式中、
XはO、NH、及びSから選択され、
YはR、OR1、SR1、及びN(R1)R2から選択され、
RはC1〜C6アルキル、C1〜C6ハロアルキル、C6〜C10アリール、及び1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキル基から選択され、
R1及びR2は水素、C1〜C6アルキル、C1〜C6ハロアルキル、C6〜C10アリール、及び1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキル基から独立に選択される。
【００１９】
ある実施形態では、本発明は式(II)
【００２０】
【化３】
2019510070.tif 000005
【００２１】
を有するパテアミンA誘導体、並びにそのラセミ体及び薬学的に許容される塩を提供し、式中、X、Y、R、R1、及びR2は式(I)についての上記と同じである。
【００２２】
薬学的に許容される塩は、式(I)及び式(II)の化合物と、薬学的に許容される有機酸(たとえばカルボン酸)又は無機酸(たとえば鉱酸)とから形成され得る。代表的な酸には、塩酸、硫酸、リン酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、シュウ酸、クエン酸、リンゴ酸、安息香酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、及びベンゼンスルホン酸が含まれる。そのような塩は、式(I)又は式(II)の化合物の合成の間、又はその後に形成され得る。
【００２３】
本発明の代表的な塩は式(III)
【００２４】
【化４】
2019510070.tif 000006
【００２５】
のものを含み、式中、X及びYは式(I)及び式(II)についての上記と同じであり、A-は薬学的に許容される対イオンである。好適な対イオンには、クロリド、ブロミド、ヨージド、サルフェート、ホスフェート、ホルメート、アセテート、トリフルオロアセテート、マレエート、フマレート、スクシネート、タルタレート、オキサレート、シトレート、マレート、ベンゾエート、トルエンスルホネート、メタンスルホネート、及びベンゼンスルホネートが含まれる。
【００２６】
1つの実施形態では、本発明の代表的な塩は式(IV)
【００２７】
【化５】
2019510070.tif 000007
【００２８】
を有し、式中、X及びYは式(I)及び式(II)についての上記と同じであり、A-は薬学的に許容される対イオンである。好適な対イオンには、クロリド、ブロミド、ヨージド、サルフェート、ホスフェート、ホルメート、アセテート、トリフルオロアセテート、マレエート、フマレート、スクシネート、タルタレート、オキサレート、シトレート、マレート、ベンゾエート、トルエンスルホネート、メタンスルホネート、及びベンゼンスルホネートが含まれる。
【００２９】
式(I)、(II)、(III)、及び(IV)の化合物について、C1〜C6アルキル基には直鎖(即ちメチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、及びn-ヘキシル)、分枝(たとえばs-プロピル、s-ブチル、t-ブチル、s-ペンチル、及びs-ヘキシル)、及びシクロアルキル(即ちシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシル)基が含まれ、
C1〜C6ハロアルキル基には1つ又は複数のハロ(たとえばフルオロ又はクロロ)基で更に置換されたC1〜C6アルキル基(たとえばトリフルオロメチル又はトリクロロメチル)が含まれ、
C6〜C10アリール基には任意選択で1つ又は複数のアルキル基(たとえばメチル、エチル)で置換されたフェニル基が含まれ、
C3〜C12アルキル基は化合物の水溶性を高めるエーテル含有基及びアミン含有基を含む、1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキル基を指す。代表的なエーテル含有基には-CH2-O-CH3、-CH2CH2-O-CH3、及び-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH3が含まれる。代表的なアミン含有基には-CH2-NH-CH3、-CH2-N(CH3)2、-CH2CH2-NH-CH3、及び-CH2CH2-N(CH3)2が含まれる。
【００３０】
本発明は以下の実施形態を含む式(I)、(II)、(III)、及び(IV)の化合物を提供し、
XはOであり、YはRであり(アミド)、これらの実施形態のあるものではRはメチル、トリフルオロメチル、又はt-ブチルであり、
XはOであり、YはOR1であり(カルバメート)、これらの実施形態のあるものではR1はメチル又はt-ブチルであり、
XはOであり、YはN(R1)R2であり(ウレア)、これらの実施形態のあるものではR1は水素、R2は水素であり、又はR1は水素、R2はメチルであり、
XはOであり、YはSR1であり、これらの実施形態のあるものではR1はメチル又はt-ブチルであり、
XはSであり、YはRであり(チオアミド)、これらの実施形態のあるものではRはメチルであり、
XはSであり、YはOR1であり(チオカルバメート)、これらの実施形態のあるものではR1はメチル又はt-ブチルであり、
XはSであり、YはN(R1)R2であり(チオウレア)、これらの実施形態のあるものではR1は水素、R2は水素であり、又はR1は水素、R2はメチルであり、
XはSであり、YはSR1であり、これらの実施形態のあるものではR1はメチル又はt-ブチルであり、
XはNHであり、YはRであり、これらの実施形態のあるものではRはメチル、トリフルオロメチル、又はt-ブチルであり、
XはNHであり、YはOR1であり、これらの実施形態のあるものではR1はメチル又はt-ブチルであり、
XはNHであり、YはN(R1)R2であり、これらの実施形態のあるものではR1は水素、R2は水素であり、又はR1は水素、R2はメチルであり、及び
XはNHであり、YはSR1であり、これらの実施形態のあるものではR1はメチル又はt-ブチルである。
【００３１】
本発明の代表的なβ-アミノパテアミンAアミド誘導体の調製を実施例1に記載し、図1(合成中間体9の調製)及び図2(代表的なβ-アミノパテアミンAアミド誘導体13(OR-IV-211)、14(MZ732)、及び15(OR-IV-234)の調製)に図示する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は式(V)
【００３３】
【化６】
2019510070.tif 000008
【００３４】
を有するパテアミンA誘導体、その立体異性体、ラセミ体、及び薬学的に許容される塩を提供し、式中、ZはR及びOR1から選択され、R及びR1は式(I)〜(IV)についての上記と同じである。
【００３５】
ある実施形態では、本発明は式(VI)
【００３６】
【化７】
2019510070.tif 000009
【００３７】
を有するパテアミンA誘導体、そのラセミ体及び薬学的に許容される塩を提供し、式中、Zは式(V)についての上記と同じである。
【００３８】
本発明の代表的な塩には式(VII)
【００３９】
【化８】
2019510070.tif 000010
【００４０】
を有するものが含まれ、式中、Zは式(V)についての上記と同じであり、A-は薬学的に許容される対イオンである。好適な対イオンには、クロリド、ブロミド、ヨージド、サルフェート、ホスフェート、ホルメート、アセテート、トリフルオロアセテート、マレエート、フマレート、スクシネート、タルタレート、オキサレート、シトレート、マレート、ベンゾエート、トルエンスルホネート、メタンスルホネート、及びベンゼンスルホネートが含まれる。
【００４１】
1つの実施形態では、本発明の代表的な塩は式(VIII)
【００４２】
【化９】
2019510070.tif 000011
【００４３】
を有し、式中、Zは式(V)についての上記と同じであり、A-は式(VII)についての上記と同じである。
【００４４】
本発明は以下の実施形態を含む式(V)、(VI)、(VII)、及び(VIII)の化合物を提供し、
ZはC1〜C6アルキル(たとえばメチル)であり、
ZはC1〜C6ハロアルキル(たとえばトリフルオロメチル)であり、
ZはC6〜C10アリール(たとえばフェニル)であり、
Zは、1つ又は複数の炭素がO又はN原子で置換されたC3〜C12アルキル(たとえば-CH2-O-CH3、-CH2CH2-O-CH3、及び-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH3、又は-CH2-NH-CH3、-CH2-N(CH3)2、-CH2CH2-NH-CH3、及び-CH2CH2-N(CH3)2)である。
【００４５】
本発明の更なる実施形態では、パテアミンA遊離アミン誘導体、その立体異性体、ラセミ体、薬学的な塩が提供される。
【００４６】
1つの実施形態では、本発明は式(IX)
【００４７】
【化１０】
2019510070.tif 000012
【００４８】
を有するパテアミンA誘導体、並びにその立体異性体、ラセミ体、及び薬学的な塩を提供する。
【００４９】
別の実施形態では、本発明は式(X)
【００５０】
【化１１】
2019510070.tif 000013
【００５１】
を有するパテアミンA誘導体、そのラセミ体及び薬学的な塩を提供する。
【００５２】
本発明の代表的な遊離アミン塩には式(XI)を有するものが含まれ、
【００５３】
【化１２】
2019510070.tif 000014
【００５４】
式中、A-は薬学的に許容される対イオンである。好適な対イオンには、クロリド、ブロミド、ヨージド、サルフェート、ホスフェート、ホルメート、アセテート、トリフルオロアセテート、マレエート、フマレート、スクシネート、タルタレート、オキサレート、シトレート、マレート、ベンゾエート、トルエンスルホネート、メタンスルホネート、及びベンゼンスルホネートが含まれる。1つの実施形態では、A-はホルメートである。
【００５５】
1つの実施形態では本発明の代表的な塩は式(XII)
【００５６】
【化１３】
2019510070.tif 000015
【００５７】
を有し、式中、A-は薬学的に許容される対イオンである。好適な対イオンには、クロリド、ブロミド、ヨージド、サルフェート、ホスフェート、ホルメート、アセテート、トリフルオロアセテート、マレエート、フマレート、スクシネート、タルタレート、オキサレート、シトレート、マレート、ベンゾエート、トルエンスルホネート、メタンスルホネート、及びベンゼンスルホネートが含まれる。1つの実施形態では、A-はホルメートである。
【００５８】
本発明のβ-アミノパテアミン誘導体(即ち式(I)〜(VIII)の化合物)は、大環の3-アミノ基(即ちβ-アミノ基)を好適な反応試薬(たとえばN-アシル化又はN-スルホン化試薬)と反応させて種々のβ-アミノパテアミン誘導体を提供することによって調製することができる。
【００５９】
本発明のβ-アミノパテアミン遊離アミン誘導体(即ち式(IX)〜(XII)の化合物)は、実施例1に記載したようにして調製することができる。
【００６０】
抗体コンジュゲート
別の態様では、本発明は本発明のβ-アミノパテアミン誘導体の送達のための抗体薬剤コンジュゲートを提供する。抗体薬剤コンジュゲートは当技術分野で公知のコンジュゲーション化学反応によってβ-アミノパテアミン誘導体から容易に調製される。ある実施形態では、β-アミノパテアミン誘導体は3-アミノ基(即ちβ-アミノ基)を介して抗体にコンジュゲートされる。ある実施形態では、β-アミノパテアミン誘導体は抗体に直接コンジュゲートされる。他の実施形態では、β-アミノパテアミン誘導体はリンカー単位を介して抗体にコンジュゲートされる。
【００６１】
ある実施形態では、抗体薬剤コンジュゲートは式:Ab-(LU-D)pの抗体-リンカー-薬剤コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物であり、式中、Abは抗体単位、LUはリンカー単位、Dは薬剤単位、pは1〜約20の整数である。抗体薬剤コンジュゲートについて、Dは本発明のβ-アミノパテアミン誘導体を含む。抗体薬剤コンジュゲートのための好適なリンカー単位は当業者には公知である。
【００６２】
好適な抗体には、たとえばキメラ、ヒト化若しくはヒト抗体等のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体単位は、標的抗原に結合する抗原結合領域を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートが抗体単位に特異的な細胞表面レセプターを有する細胞に進入するまでかなりの量の薬剤単位がコンジュゲートから開裂せず、コンジュゲートが細胞に進入するときに薬剤単位が抗体単位から開裂する。いくつかの実施形態では、コンジュゲートが抗体単位に特異的な細胞表面レセプターを有する細胞に進入するまでかなりの量のリンカー-薬剤単位がコンジュゲートから開裂せず、コンジュゲートが細胞に進入するときにリンカー-薬剤単位が抗体単位から開裂する。
【００６４】
本明細書で用いる用語「抗体」は、全長の免疫グロブリン分子又は全長の免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分(即ち、対象標的の抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子又はその部分であり、そのような標的は、これだけに限らないが癌細胞を含む)を指す。抗体は免疫グロブリン分子の任意のクラス(たとえばIgG、IgE、IgM、IgD、及びIgA)、又はサブクラス(たとえばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)であってよい。抗体は任意の種に由来し得る。1つの態様では、抗体はヒト、マウス、又はウサギ起源である。別の態様では、抗体はポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、多重特異性、ヒト、ヒト化若しくはキメラ抗体、又は標的抗原に免疫特異的に結合する上記の任意のエピトープ結合断片である。
【００６５】
本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す(即ち、集団を構成する個別の抗体は、少量存在するかも知れない可能性がある天然に発生する変異を除いて同一である)。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を対象としている。
【００６６】
モノクローナル抗体は特に、所望の生物活性を示す、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である一方、鎖の残りが別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びにそのような抗体の断片を含む。たとえば、キメラ抗体はマウス抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域に由来し得る。
【００６７】
「抗体断片」は、典型的には抗原結合領域又はその可変領域を含む未変性の抗体の部分を指す。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片;直鎖状抗体;一本鎖抗体分子;scFv;IgGΔCH、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、dsFv;sc-Fv-Fc;(scFv)2;Fab発現ライブラリーによって産生された断片;抗イディオタイプ(抗-Id)抗体;並びに抗体断片から形成された多重特異的抗体が含まれる。
【００６８】
「未変性」抗体は抗原結合可変領域並びに軽鎖定常ドメイン(CO)及び重鎖定常ドメイン、CH1、CH2及びCH3を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(たとえばヒト天然配列定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列バリアントであってよい。
【００６９】
用語「二重特異性抗体」は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片で、その断片が同じポリペプチド鎖の中の可変軽ドメイン(VL)に連結された可変重ドメイン(VH)を含むものを指す。同じ鎖の上の2つのドメインの間の対形成ができないほどに短いリンカーを用いることによって、強制的に、ドメインは別の鎖の相補的なドメインと対を形成することになり、2つの抗原結合部位が生じる。
【００７０】
非ヒト(たとえばげっ歯類)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は大部分、レシピエントの超可変領域からの残基が所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類等の非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域からの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基が対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体中又はドナー抗体中に見られない残基を含んでもよい。これらの改質は抗体の性能を更に向上させるために行なわれる。ヒト化抗体は一般に、全ての又は実質的に全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、全ての又は実質的に全てのFRがヒト免疫グロブリン配列のFRである少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体は任意選択で免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むことにもなる。
【００７１】
有用なモノクローナル抗体には、これだけに限らないが、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、抗体断片、又はキメラ(たとえばヒト-マウス又は他の種)モノクローナル抗体が含まれる。ヒトモノクローナル抗体は当技術分野で公知の数多くの手法のいずれによって作成してもよい。
【００７２】
抗体は二重特異性抗体等の多重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体を作成する方法は当技術分野で公知である。全長の二重特異性抗体の従来の産生は、2つの鎖が異なった特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の共発現に基づいている。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のランダムな組合せにより、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は10個の異なった抗体分子の可能な混合物を産生する。
【００７３】
医薬組成物
別の態様では、本発明は本発明の化合物(即ち式(I)〜(XII)の化合物)と薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物を提供する。
【００７４】
本発明はまた、本発明の抗体コンジュゲート(即ち式(I)〜(XII)の化合物を送達する抗体コンジュゲート)と薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物を提供する。
【００７５】
好適なキャリアには、動物(たとえばヒト対象)への投与に適したキャリアが含まれる。注入使用に好適な医薬組成物には、無菌の水溶液(たとえば生理食塩水、デキストロース)及び分散体が含まれる。
【００７６】
本発明の化合物及び組成物は、たとえば不活性な希釈剤又はキャリアとともに、硬若しくは軟シェルゼラチンカプセルに封入して、又は錠剤に圧縮して、経口投与することができる。経口治療投与のためには、化合物及び組成物を賦形剤と組み合わせて、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェーファ等の形態で用いることができる。そのような治療に有用な組成物における活性化合物の量は、好適な用量が得られる量である。
【００７７】
本発明の化合物及び組成物は、非経口又は腹腔内投与することができる。遊離塩基又は薬学的に許容される塩としての化合物の溶液は、好適には界面活性剤等の添加物と混合して水中で調製することができる。油中で分散体を調製することもできる。
【００７８】
本発明の方法において、用語「治療有効量」は、用量及び必要な期間において、低減されたレベルのロッド遺伝子発現又はそのタンパク質産生物等の、所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。化合物の治療有効量は、疾患の状態、対象の年齢、性別、及び体重、並びに対象において所望の応答を導く化合物の能力等の要素によって変動し得る。最適の治療応答を提供するために投与計画を調節することができる。治療有効量は、投与された化合物の毒性又は有害な影響のいずれよりも治療に有益な効果が上回る量でもある。
【００７９】
用量値は緩和すべき病状の重篤度によって変動し得ることに注意すべきである。任意の特定の対象について、特定の用量計画は個別の必要性及び組成物を投与する、又は投与を監督する者の専門的判断に従って経時的に調節することができる。本明細書において説明する用量範囲は例示のみであって、臨床医によって選択され得る用量範囲を制限するものではない。組成物中の活性化合物の量は、疾患の状態、対象の年齢、性別、及び体重等の要素によって変動し得る。最適の治療応答を提供するために投与計画を調節することができる。たとえば、単一ボーラスを投与してもよく、経時的にいくつかの分割用量を投与してもよく、治療状況の緊急性に応じて用量を比例的に減少又は増加してもよい。
【００８０】
本方法において、化合物の投与は対象への全身投与であってよい。用語「対象」は哺乳類生命体を含むことを意図している。対象の例にはヒト及び非ヒト哺乳類が含まれる。本発明の特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００８１】
用語「投与する」、「接触させる」、又は「治療する」は、化合物又は化合物を含む医薬組成物を対象の系内に送達する任意の方法を含む。
【００８２】
使用方法
ある実施形態では、本発明のβ-アミノパテアミン化合物は、パテアミンAの有利な効力(たとえば慢性リンパ球性白血病(CLL)細胞に対する阻害活性)を保持し、かつパテアミンAと比較して改善された生体利用性(たとえばヒト血漿中における、より低い血漿タンパク質結合(PPB))を有している。
【００８３】
1つの態様では、本発明は慢性リンパ球性白血病(CLL)細胞の増殖を阻害する方法を提供する。本方法において、CLL細胞の増殖は、CLL細胞を本発明のβ-アミノパテアミン化合物(又は本発明の抗体コンジュゲート、又はβ-アミノパテアミン化合物若しくは抗体コンジュゲートを含む本発明の医薬組成物)と接触させることによって阻害される。ある実施形態では、本方法は対象(たとえばヒト対象)において慢性リンパ球性白血病(CLL)細胞の増殖を阻害するために有効である。
【００８４】
別の態様では、本発明は慢性リンパ球性白血病(CLL)を治療する方法を提供する。本方法では、CLLは、それを必要とする対象(たとえばヒト対象)に有効量の本発明のβ-アミノパテアミン化合物(又は本発明の抗体コンジュゲート、又はβ-アミノパテアミン化合物若しくは抗体コンジュゲートを含む本発明の医薬組成物)を投与することによって治療される。
【００８５】
CLLにおけるDMDAPatAの作用機序
DMDAPatAの作用機序を、多数の初代CLL試料において試験した(図3A)。DMDAPatAは[3H]ロイシン取り込み分析(図3B)で測定されるように、タンパク質合成を阻害することが示された。CLL細胞をDMDAPatAとともに4時間及び24時間インキュベートし、次いで[3H]ロイシンで1時間パルスラベルした。酸不溶性材料(DNA、RNA及びタンパク質)への[3H]ロイシンの取り込み量をシンチレーションカウンターで測定した。これらのデータはCLL細胞におけるタンパク質翻訳開始のDMDAPatAによる阻害を支持している。更に、DMDAPatAは短寿命の抗アポトーシスタンパク質Mc1-1を低減させた。これは図3Cで定量したように、3つの試料において一致している。Bc1-2のレベルはDMDAPatAによって影響されず、これはそのより長い半減期(図3C)と一致している。Mc1-1はBax及びBakがミトコンドリア膜に穿孔することを妨害することによってアポトーシスをブロックするので、DMDAPatAがMc1-1を除去することによってミトコンドリア外膜透過性上昇(MOMP)が誘導される。このことは、カチオン色素DiOC6の結合の喪失によって実証された(図3D)。MOMPはミトコンドリアからのシトクロームcの放出を促進してアポトソームを形成させ、これがカスパーゼ-3を活性化し、アポトーシスを誘導した。PARPはカスパーゼ-3の基質なので、図3Cにおける開裂したPARPの増加は、カスパーゼ-3の活性化を示していた。アポトーシスは、アネキシンVとヨウ化プロポジウム(PI)の二重染色及びそれに続くフローサイトメトリーによって測定した。最後に、13個のCLL試料について測定したDMDAPatAの平均IC50は2.8μMであった(図3E)。
【００８６】
CLL患者の臨床応答は一定でないので、疾患の傾向又は治療の結果を予測するために、細胞マーカー及び分子マーカーが同定されてきた。疾患の状況及び治療の選択を評価するためにRai及びBinetのステージ決定システムが広く用いられており、RaiのステージIII及びIVが高リスクで侵攻性疾患であると考えられる。β2マクログロブリン(B2M)の高い発現は、アルキル化剤及びプリンヌクレオシド類似体を含む標準的な化学療法にとっては好ましくない予後である。体細胞変異IgVH遺伝子の非存在、又はZAP-70の高い発現も、侵攻性疾患と関連している。良好な又は不良な予後特性を有するCLL患者の試料におけるDMDAPatAのIC50値を比較した。各群における試料間で有意差は見いだされなかった(図4A)。これらの結果は、DMDAPatAがこれらの変数には依存しない機序によってアポトーシスを誘導していることを示し、DMDAPatAがCLL治療における薬剤耐性を克服する可能性を有していることを示唆している。
【００８７】
Bc1-2とMc1-1の両方は、それらのアポトーシス促進性パートナーのBH3モチーフと相互作用することによってアポトーシスを規制する生存促進性タンパク質である。ABT-199等のBH3模倣体は高い親和性でBc1-2と結合し、この相互作用をブロックするが、Mc1-1には結合しない。BH3模倣体への耐性にはMc1-1の上方調節が伴う。DMDAPatAはBc1-2の発現に影響せずにMc1-1を枯渇させたので、それらの組合せはアポトーシス制御の2つの並行な手段を標的として、相乗作用的にCLL細胞を殺滅するはずである。実際、4つのCLL試料におけるメディアン効果解析によって、DMDAPatAとABT-199は強い相乗性を示す(コンビネーションインデックス1未満)ことが示された。用量低減解析によって、この組合せがそれぞれの化合物のIC50、IC75及びIC90値を大きく低減させることが示され、相乗強化作用があることが示された(図4B)。これらの結果は、DMDAPatA及び類似体と、Bc1-2活性と拮抗する阻害剤との臨床的組合せを支持するものである。
【００８８】
DMDAPatAの限界
DMDAPatAをその親化合物であるPatAと直接比較することにより、DMDAPatAがPatAの約30分の1の効力しかないことが示された(図5)。これらの実験は、10%の患者血漿を添加した培地中で培養したCLL細胞で行なった。インビボ環境を模倣しているが、この条件は細胞の生存を維持するためには有利であることも見出された。ヒト血漿の存在下で効力が低減する1つの可能な理由は安定性である。この理論を試験するため、DMDAPatAの安定性を2つの異なった濃度で、FBS及びヒト血漿中で試験した。興味あることに、血清の存在はDMDAPatAを大きく安定化し(Table 1(表1))、FBS中又はヒト血清中でDMDAPatAの半減期の間に有意差は見られず、DMDAPatAの安定性に対する血漿の影響は否定された。
【００８９】
【表１】
2019510070.tif 000016
【００９０】
血漿タンパク質の結合がインビボにおける薬剤の利用性及び効率に大きく影響することはよく知られている。PatA類似体の毒性に対する患者血漿の影響を推測するため、10%ウシ胎児血清、10%患者血漿又は50%患者血漿を添加したRPMI培地中でPatAとDMDAPatAのIC50を比較した。その結果、培地中のヒト血漿含量を増加させるとDMDAPatAの効力が著しく低下したが、PatAではそれほど影響がないことが示され、DMDAPatAが患者血漿タンパク質に高度に結合している可能性があることが示唆された(図5)。したがって、より良い効力とより低い血漿タンパク質結合性を有すると予想される新規な類似体の合成へと、合成の努力を傾けた(下記参照)。
【００９１】
PatA類似体の設計及び合成
CLLに対する細胞毒効力を改善し、同時に血漿タンパク質結合(PPB)を低減させるための戦略を図6に示す。この戦略には大環状化合物のC2又はC3位にアミノ基を導入してCLL効力を改善するステップが含まれる。それは、新規な類似体がPatAと同様の機能性を有し、それが初代CLL細胞に対してDMDAPatAよりも約30倍の効力があることが本発明者らによって示されているからである。化学スカフォールドに対するこの改変により、計算に基づく親油性(LogD)が低下する。小分子の親油性は血漿タンパク質の結合と相関することが既に文献に示されているので、新規なアミノ基及びそれに結合した他の極性官能基は新規なバリアントの親油性を低下させ、おそらくヒト血漿中のPPBを低下させる。候補薬剤の親油性を低下させることは、水溶性が増大する等、他の有益な物性にも繋がり得る。したがって、α-アミノ系列(2-アミノ、デスメチルPatA)及びβ-アミノ系列(デスメチルPatA)の両方における誘導体は、薬剤設計の視点から魅力的である。
【００９２】
β-アミノバリアントであるデスメチルPatA(DMPatA)(OR-IV-234又は15)、MZ732(14)、及びOR-IV-211(13)の合成を示す(図1及び図2)。市販のBoc-L-アスパラギン酸4-tert-ブチルエステルによって、3つの化合物全ての調製が可能であった。DMPatAの合成における最長の鎖状配列も18ステップであり、前臨床開発に必要なより多くの量の調製のためにスケールアップすることは可能である。
【００９３】
構造活性相関(SAR)表
PatA及びDMDAPatAと比較した3つのβ-アミノバリアントの構造活性相関をTable 2(表2)に示す。
【００９４】
【表２】
2019510070.tif 000017
【００９５】
最も強力なものは遊離アミン(OR-IV-234、R1=NH2)であり、FBS中及びヒト血漿中で同様の活性である。これは構造的にはPatAと最も類似した誘導体であるので、これは驚くことではない。カルバメート又はアセトアミド官能基を有するアミンの誘導体(OR-IV-211及びMZ732)は、アミンそれ自体よりも有意に活性が低い。したがって、β-アミノ系列の中で遊離アミンが最も強力な類似体である。
【００９６】
PatA類似体の生物学的スクリーニング
より大きな効力及びより少ない血漿タンパク質結合性を有するPatA類似体をスクリーニングするため、初代CLL細胞に対する類似体の毒性を、24時間のインキュベーションの後、アネキシン/PI二重染色とそれに続くフローサイトメトリーによって測定した。血漿の影響を評価するため、10%FBS又は患者血漿を添加した培地中で培養したCLL細胞の間でこれを比較した。血漿タンパク質結合は平衡透析法によって評価した(図7B)。その結果、DMDAPatAは血漿タンパク質と99.7%結合しており、血漿中での効力がより低いことと一致していることが示された。血漿中でのDMDAPatAの回収率が低いことは、非特異結合、低い水溶性又は不可逆的なタンパク質結合を示唆している可能性がある。OR-IV-234はPatA及びDMDAPatAのいずれよりもずっと低い血漿タンパク質結合(PPB)を実証し、回収率は中程度であった。
【００９７】
PatA類似体の治療濃度域を予測するため、それらの細胞毒性をCLL細胞と健常ドナーからのB細胞及びT細胞について比較した(図8A及び図8B)。データは、PatAがCLL細胞と健常B細胞及びT細胞について同様に毒性を有することを示した。PatAはもともとT細胞の活性化を阻害する生物学的プローブとして同定されており、そのT細胞への毒性と一致する。全てのPatA類似体がT細胞へのずっと低い毒性、並びに健常B細胞へのより低い殺滅性を実証したことは興味深く、治療濃度域の顕著な改善を示すものである。
【００９８】
類似体がタンパク質合成に対する阻害作用を保持していることを確認するため、類似体についてロイシン取り込み解析を行ない(図9A)、DMDAPatA及びPatAと比較した。試験した3つのCLL試料において全ての類似体はタンパク質合成の強い阻害を実証し、Mc1-1レベルの低減がイムノブロットによって確認された(図9B)。ブロットの下に示すCLL細胞の生存の低減によって、アポトーシスが実証された。
【００９９】
PatAの類似体であるDMDAPatAは、患者の予後特性に関わらず内因性の経路によって初代CLL細胞のアポトーシスを誘導し、短寿命の抗アポトーシスタンパク質Mc1-1を低減させたが、Bc1-2は低減させなかった。DMDAPatAとABT-199はアポトーシス制御の2つの並行な手段を標的として相乗的に細胞死を誘導し、これらを組み合わせてCLLの治療に効果的に使用できることを示している。予想されるように、DMDAPatAはヒト血漿中で99%を超えて結合していた。一連のPatA誘導体を合成したが、そのいくつかはCLL細胞に対してより大きな細胞毒性の効力を示し、ヒト血漿タンパク質の結合を低下させた。これらの試験により、PatA類似体によりeIF4Aを妨げることによるタンパク質翻訳の阻害は、単独で又は機序に基づく組合せにおいて、CLLに対する正当な治療戦略であることが実証された。まとめると、タンパク質翻訳の強力な阻害効果を有する3つの新たなリードPatA類似体を同定した。これらの類似体は初代CLL細胞に対する毒性を保持しており、健常なリンパ球に対する改善された選択性及び低減された血漿タンパク質結合を示した。これらの化合物は、白血病細胞が生存のためにMc1-1の持続的発現に依存しているCLL等の正しい生物学的背景を有する患者特異的疾患への適用が極めて有望である。
【０１００】
以下の実施例は説明の目的だけに提供され、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１０１】
一般的方法
全ての反応は火炎乾燥したガラス容器中、窒素雰囲気下で行なった。アセトニトリル、ジクロロメタン、メタノール、及びテトラヒドロフランは、活性化モレキュラーシーブ又はアルミナを通すことによって精製した(溶媒系)。ジメチルホルムアミド(DMF)は購入して4Åのモレキュラーシーブ上で乾燥した。全ての市販の試薬は購入したままで用いた。1H NMRスペクトルはINOVA-500で記録した。1H NMRの化学シフトはCDCl3(7.26ppm)に対するδ値(ppm)として報告し、カップリング定数(J)はヘルツ(Hz)として報告する。多重度は慣習に従う。フラッシュカラムクロマトグラフィーは固定相として60Åのシリカゲルを用い、勾配溶媒系(他に特定しない限りEtOAc/ヘキサンを溶離液とする)を用いて行なった。prep-HPLCによる精製は、Gemini HPLCカラム(C18、5ミクロン、100×21.20mm)を用いてAgilent 1260 Infinity Preparative-Scale Purification Systemで行なった。マススペクトルはCenter for Chemical Characterization and Analysis (Texas A&M University)で得た。薄層クロマトグラフィー(TLC)はガラスで裏打ちしたシリカゲル60F254を用いて行なった。
【０１０２】
(実施例1)
代表的なβ-アミノパテアミンA誘導体の調製
本実施例では、本発明の代表的なβ-アミノパテアミンA誘導体、即ち化合物13(OR-IV-211)、14(MZ732)、及び15(OR-IV-234)の調製について述べる。調製法を図式的に図1及び図2に示す。
【０１０３】
【化１４】
2019510070.tif 000018
【０１０４】
tert-ブチル(S)-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-4-ヒドロキシブタノエート(1)
アスパラギン酸誘導体(5.0g、17.28mmol)を無水THF(100mL)に溶解し、次いで溶液を-15℃に冷却した。次いでトリエチルアミン(2.41mL、17.28mmol)をゆっくりと滴下し、次いでクロロギ酸エチル(1.65mL、17.28mmol)を加えた。反応混合物を同じ温度で15分撹拌し、次いで水素化ホウ素ナトリウム(1.96g、51.84mmol)を加え、次いで-15℃で30分かけてメタノール(100mL)をゆっくりと加えた。溶液を更に30分撹拌し、次いで0.5N HClで(pH7に)中和した。減圧下で有機溶媒を除去し、次いで残渣を水(100mL)で希釈し、酢酸エチル(3×150mL)で抽出した。有機画分を合わせて硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を高真空下で乾燥し、無色オイル(4.76g)として所望の生成物1を得て、更に精製することなく次の反応に用いた。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  5.47 (bs, 1H), 5.23 (bs, 1H), 3.99-3.93 (m, 1H), 3.68 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 2.57-2.47 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.43 (s, 9H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3)  δ  171.2, 155.9, 81.1, 79.6, 64.3, 49.7, 37.5, 28.4 (3C), 28.0 (3C). HRMS (ESI+): C13H25NNaO5+ ([M+Na]+)の計算値: 298.1625.  実測値: 298.1611.
【０１０５】
【化１５】
2019510070.tif 000019
【０１０６】
tert-ブチル(S,E)-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-6-オキソヘプタ-4-エノエート(2)
塩化オキサリル(2.49mL、28.51mmol)を無水ジクロロメタン(50mL)に溶解し、次いで溶液を-60℃に冷却した。次いで無水ジメチルスルホキシド(4.05mL、57.01mmol、ジクロロメタン10mL中)の溶液を15分かけてゆっくりと滴下した。次いでアミノアルコール(4.76g、17.28mmol)を10分かけてゆっくりと加えた。得られた混合物を-60℃で15分撹拌し、次いでジイソプロピルエチルアミン(18.06mL、103.66mmol、ジクロロメタン50mL中)を15分かけて滴下した。反応混合物を-60℃で30分撹拌し、次いで水5mLを加えて反応停止した。得られたスラリーを300mLのジエチルエーテルに注ぎ、KHSO4の20%水溶液(2×100mL)で洗浄した。有機画分を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して粗アルデヒドを得た。これは更に精製することなく直ちに次の反応に用いた。
【０１０７】
粗アルデヒドを無水THF(100mL)に溶解し、次いで溶液を0℃に冷却した。次いでトリフェニルホスホラニリデンを加えて反応混合物を22℃になるまで置き、この温度で12時間撹拌した。次いで混合物を減圧下で濃縮し、ジエチルエーテル(100mL)に再懸濁し、セライトを通して濾過して副生物のトリフェニルホスフィンオキシドを除去し、次いで濾液を減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン及び酢酸エチルの勾配(9:1→1:9)によるシリカゲル上のMPLCで精製し、無色オイル(2.78g、3つのステップについて51%)として所望の生成物2を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  6.69 (dd, J = 16.0, 5.0 Hz, 1H), 6.14 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.38 (bs, 1H), 4.70-4.55 (m, 1H), 2.58 (dd, J = 15.5, 5.5 Hz, 1H), 2.51 (dd, J = 15.5, 6.0 Hz, 1H), 2.22 (s, 3H), 1.41 (s, 9H), 1.40 (s, 9H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3)  δ  198.1, 170.0, 155.0, 145.8, 130.2, 81.9, 80.0, 60.5, 48.4, 39.8, 28.4 (3C), 28.1 (3C). LRMS (APCI-): C16H26NO5- ([M-H]-)の計算値: 312.18.  実測値: 311.99.
【０１０８】
【化１６】
2019510070.tif 000020
【０１０９】
tert-ブチル(R)-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-6-オキソヘプタノエート(3)
エノン(2.5g、7.98mmol)を酢酸エチル(54mL)及びEtOH(6mL)に溶解した。次いでパラジウム触媒(0.25g、Pd/C 10%w/w)を加え、次いで混合物を22℃で15時間、水素雰囲気下(バルーン)で撹拌した。混合物を窒素でパージし、次いで短いセライトパッドを通して濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、残渣をヘキサン及び酢酸エチルの勾配(8:2→1:9)によるシリカゲル上のMPLCで精製し、無色オイル(1.36g、54%)として所望の生成物3を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  4.99 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.92-3.80 (m, 1H), 2.56-2.49 (m, 2H), 2.43-2.35 (m, 2H), 2.14 (s, 3H), 1.87-1.77 (m, 1H), 1.75-1.66 (m, 1H), 1.44 (s, 9H), 1.42 (s, 9H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3)  δ  208.3, 170.9, 155.6, 81.2, 79.3, 47.5, 41.1, 40.3, 30.2, 28.5 (3C), 28.2 (3C). LRMS (APCI+): C16H29NNaO5+ ([M+Na]+)の計算値: 338.19.  実測値: 338.31.
【０１１０】
【化１７】
2019510070.tif 000021
【０１１１】
tert-ブチル(R)-7-ブロモ-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-6-オキソヘプタノエート(4)
n-ブチルリチウム(3.24mL、8.09mmol、ヘキサン中2.5M)を-78℃でTHF(50mL)中の1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザン(1.70mL、8.09mmol)の溶液にゆっくりと加えた。溶液を-78℃で15分、次いで0℃で20分撹拌した。混合物を-78℃に冷却し、次いでクロロトリメチルシラン(1.4mL、11.03mmol)をゆっくりと加え、続いてメチルケトン3(1.16g、3.68mmol、THF20mL中)を加えた。20分後、無水トリエチルアミン(8mL)をゆっくりと加えた。混合物を5分続けて撹拌し、次いで50mLのNaHCO3飽和水溶液で反応停止し、酢酸エチル(3×50mL)で抽出した。有機画分を合わせて硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を10mLのTHFに溶解し、溶液を-78℃でTHF(60mL)中のN-ブロモスクシンイミド(0.655g、3.68mmol)及びNaHCO3(0.340g、4.05mmol)の懸濁液に撹拌しながら加えた。-78℃で1.5時間撹拌した後、30mLの飽和NaHCO3水溶液を加えることによって反応を停止し、混合物を酢酸エチル(3×50mL)で抽出した。有機画分を合わせて硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗残渣をヘキサン及び酢酸エチルの勾配(9:1→1:1)によるシリカゲル上のMPLCで精製し、淡黄色オイル(0.668g、2つのステップについて46%)として所望の生成物4を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  5.04 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.93 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 3.90 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 3.89-3.82 (m, 1H), 2.78-2.66 (m, 2H), 2.46 (dd, J = 15.5, 5.5 Hz, 1H), 2.38 (dd, J = 15.5, 6.0 Hz, 1H), 1.90-1.83 (m, 1H), 1.77-1.70 (m, 1H), 1.44 (s, 9H), 1.42 (s, 9H). LRMS (ESI+):  C16H28BrNNaO5+ ([M+Na]+)の計算値: 416.1043.  実測値: 416.1024.
【０１１２】
【化１８】
2019510070.tif 000022
【０１１３】
tert-ブチル(R)-5-(2-((R,E)-4-ブロモ-2-((トリイソプロピルシリル)オキシ)ペンタ-3-エン-1-イル)チアゾール-4-イル)-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ペンタノエート(5)
α-ブロモケトエステル4(0.636g、1.61mmol)をジクロロメタン(16mL)に溶解し、次いで溶液を0℃に冷却した。チオアミド(0.614g、1.61mmol)を加え、続けてピリジン(0.325mL、4.03mmol)を加えた。反応混合物を22℃になるまで置き、次いで22℃で18時間撹拌した。混合物を0℃に冷却し、次いで無水トリフルオロ酢酸(0.273mL、1.94mmol)を加えた。反応混合物を22℃になるまで置き、22℃で3時間撹拌し、次いで15mLのNaHCO3飽和水溶液で反応停止し、ジクロロメタン(3×50mL)で抽出した。有機画分を合わせて硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗残渣をヘキサン及び酢酸エチルの勾配(9:1→1:1)によるシリカゲル上のMPLCで精製し、淡黄色オイル(0.540g、50%)として所望の生成物5を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  6.83 (s, 1H), 5.87 (dd, J= 9.0, 1.5 Hz, 1H), 5.09 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.77 (dt, J = 9.0, 6.5 Hz, 1H), 4.00-3.92  (m, 1H), 3.23 (dd, J= 14.0, 6.0 Hz, 1H), 3.09 (dd, J = 14.0, 6.5 Hz, 1H), 2.85-2.72 (m, 2H), 2.47 (dd, J= 15.0, 5.0 Hz, 1H), 2.41 (dd, J = 15.0, 6.0 Hz, 1H), 2.08 (s, 3H), 1.92-1.82 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.04-1.00 (m, 21H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3)  δ  170.9, 165.2, 156.0, 155.4, 134.9, 121.3, 113.6, 80.8, 78.9, 70.2, 47.5, 41.9, 40.7, 34.4, 28.4 (3C), 28.1, 28.0 (3C), 23.9, 18.0 (3C), 17.8 (3C), 12.3 (3C). LRMS (APCI+): C31H56BrN2O5SSi+ ([M+H]+)の計算値: 675.2
8.  実測値: 675.22.
【０１１４】
【化１９】
2019510070.tif 000023
【０１１５】
(S,E)-4-ブロモ-1-(4-((R)-5-(tert-ブトキシ)-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-5-オキソペンチル)チアゾール-2-イル)ペンタ-3-エン-2-イル(S,E)-5-メチル-7-((トリイソプロピルシリル)オキシ)オクタ-4-エン-2-イノエート(6)
チアゾールエステル5(0.510g、0.755mmol)をTHF(10mL)に溶解し、次いで溶液を-20℃に冷却した。テトラブチルアンモニウムフルオリド(1.13mL、1.13mmol、THF中1M)及び酢酸(13μL、0.226mmol)の事前混合溶液を滴下し、次いで反応混合物を0℃で6時間撹拌した。混合物をジクロロメタン(20mL)で希釈し、15mLのNaHCO3飽和水溶液で洗浄した。有機画分を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をTHF(10mL)に溶解し、次いでエンイン酸(0.318g、0.981mmol)を加え、続いてトリフェニルホスフィン(0.495g、1.89mmol)を加えた。混合物を0℃に冷却し、次いでDIAD(0.444mL、2.26mmol)を滴下した。反応混合物を22℃になるまで置き、次いで反応混合物を22℃で8時間撹拌した。15mLのpH7緩衝溶液で反応を停止させ、ジクロロメタン(3×50mL)で抽出した。有機画分を合わせて硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗残渣をヘキサン及び酢酸エチルの勾配(9:1→1:1)によるシリカゲル上のMPLCで精製し、淡黄色オイル(0.437g、70%)として所望の生成物6を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  6.88 (s, 1H), 5.87 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.77 (dt, J = 9.5, 6.7 Hz, 1H), 5.40 (s, 1H), 5.05 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 4.14-4.09 (m, 1H), 3.98-3.92 (m, 1H), 3.38 (dd, J = 14.7, 6.9 Hz, 1H), 3.25 (dd, J = 14.7, 6.6 Hz, 1H), 2.85-2.73 (m, 2H), 2.48-2.41 (m, 2H), 2.41 (dd, J = 13.2, 6.0 Hz, 1H), 2.27 (s, 3H), 2.25 (dd, J = 13.2, 7.0 Hz, 1H), 2.01 (s, 3H), 1.91-1.86 (m, 2H), 1.43 (s, 18H), 1.15 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.05 (s, 21H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3)  δ  171.1, 164.0, 159.3, 156.1, 155.6, 153.2, 128.5, 128.1, 114.5, 105.0, 86.2, 83.5, 81.2, 79.3, 71.4, 67.2, 49.7, 47.5, 40.9, 37.7, 34.4, 28.6 (3C), 28.2 (3C), 28.1, 24.5, 23.6, 21.2, 18.28 (3C), 18.26 (3C), 12.6 (3C). LRMS (APCI+): C40H66BrN2O7SSi ([M+H]+)の計算値: 825.34.  実測値: 825.34.
【０１１６】
【化２０】
2019510070.tif 000024
【０１１７】
(R)-5-(2-((S,E)-4-ブロモ-2-(((S,E)-7-ヒドロキシ-5-メチルオクタ-4-エン-2-イノイル)オキシ)ペンタ-3-エン-1-イル)-314-チアゾール-4-イル-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ペンタン酸(7)
2.5mLのDCM中、6(108mg、0.131mmol、1.0当量)の溶液にN2下、0℃で1.0mLのTFAをゆっくりと加えた。溶液を4℃で20時間保ち、10mLのトルエンで希釈して真空で濃縮した。残渣を5mLのジオキサンと0.5mLのH2Oに溶解し、0℃に冷却し、次いでBoc2O(85μL、0.392mmol、3当量)及びEt3N(92mL、0.655mmol、5当量)を加えた。溶液を20℃で15時間撹拌し、100mLのEtOAcで希釈し、分液ロートに移し、1mLの水性HCl(1M)を加えて酸性にし、ブライン(5mL)で洗浄した。有機層をMgSO4上で乾燥し、真空で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン:アセトン=5:1→5:2)で精製し、無色オイル(41mg、51%)として所望の生成物7を得た。Rf=0.41(ヘキサン:アセトン=5:3)1H NMR (500 MHz, CDCl3, COOH及びOHが認められない)  δ  6.90 (s, 1H), 5.88 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 5.82-5.76 (m, 1H), 5.46 (s, 1H), 5.32-5.29 (m, 1H), 4.05-4.00 (m, 1H), 3.97-3.90 (m, 1H), 3.39 (dd, J = 14.7, 7.4 Hz, 1H), 3.30 (dd, J = 14.7, 5.5 Hz, 1H), 2.88-2.74 (m, 2H), 2.58 (brs, 2H), 2.31-2.25 (m, 2H), 2.30 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.97-1.90 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.22 (d, J = 6.2 Hz, 3H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3)  δ  174.8, 164.5, 158.5, 156.2, 155.9, 153.2, 128.5, 128.1, 114.5, 105.1, 85.8, 83.6, 79.7, 71.5, 65.9, 48.8, 47.4, 39.5, 37.6, 34.2, 29.9, 28.6 (3C), 24.5, 23.6, 20.7. LRMS (ESI-):  C27H37BrN2O7S ([M-H]-)の計算値: 611.1.  実測値: 611.1.
【０１１８】
【化２１】
2019510070.tif 000025
【０１１９】
tert-ブチル((12Z,3S,8E,11S,15R)-3-((E)-2-ブロモプロパ-1-エン-1-イル)-9,11-ジメチル-5,13-ジオキソ-4,12-ジオキサ-1(2,4)-チアゾールアシクロヘプタデカファン-6-イン-8-エン-15-イル)カルバメート(8)
6mLのTHF中、7(38mg、0.0169mmol、1当量)の溶液に2,4,6-トリクロロベンゾイルクロリド(48μL、0.310mmol、5当量)を加え、続いてEt3N(43μL、0.310mmol、5当量)を加えた。30分撹拌した後、溶液をトルエン150mL中のDMAP(76mg、0.619mmol、10当量)の溶液に移し、20℃で48時間撹拌し続けた。混合物をブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥して濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=5:1)で精製し、無色オイル(27mg、73%)として所望の生成物8を得た。Rf=0.55(ヘキサン:酢酸エチル=2:1)。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  6.83 (s, 1H), 6.04-6.01 (m, 1H), 5.85 (td, J = 8.8, 3.8 Hz, 1H), 5.34 (s, 1H), 5.31-5.26 (m, 1H), 4.55 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.97-3.91 (m, 1H), 3.33 (dd, J = 15.3, 3.9 Hz, 1H), 3.37 (dd, J = 15.3, 8.4 Hz, 1H), 2.85-2.79 (m, 1H), 2.75-2.69 (m, 2H), 2.39 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 2.31-2.26 (m, 3H), 2.00-1.95 (m, 2H), 1.92 (s, 3H), 1.44 (s, 9H), 1.25 (d, J = 6.5 Hz, 3H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3)  δ  170.3, 163.6, 158.3, 156.7, 155.5, 153.4, 128.9, 127.3, 144.0, 105.8, 85.1, 84.0, 79.7, 70.8, 67.1, 47.8, 46.7, 40.2, 37.8, 34.7, 29.1, 28.6 (3C), 34.6, 21.0, 20.2. HRMS (ESI+):  C27H36BrN2O6S ([M+H]+)の計算値: 595.1477.  実測値: 595.1451.
【０１２０】
【化２２】
2019510070.tif 000026
【０１２１】
tert-ブチル((12Z,3S,6Z,8E,11S,15R)-3-(E)-2-ブロモプロパ-1-エン-1-イル)-9,11-ジメチル-5,13-ジオキソ-4,12-ジオキサ-1(2,4)チアゾールアシクロヘプタデカファン-6,8-ジエン-15-イル)カルバメート(9)
丸底フラスコにエネイン8(25mg、0.042mmol)、リンドラー触媒(17.5mg、70%w/w)及びメタノール(2mL)を仕込んだ。フラスコの上に水素バルーンを取り付け、出発材料がTLCで観察されなくなるまで、混合物を20℃で4時間撹拌した。5mLのEtOAcで洗浄した木綿パッドを通して混合物を濾過した。真空で溶媒を蒸発させ、粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(CH2Cl2:Et2O=8:1)で精製して、無色オイル(18mg、72%)として生成物9を得た。Rf=0.45(ヘキサン:酢酸エチル=3:1)。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  6.98 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.70 (t, J = 11.8 Hz, 1H), 6.05 (td, J = 9.4, 4.7 Hz, 1H), 5.96 (dq, J = 9.5, 1.3 Hz, 1H), 5.34 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.14-5.08 (m, 1H), 4.67 (brs, 1H), 3.62 (brs, 1H), 3.21-3.14 (m, 2H), 2.81 (dt, J = 14.5, 6.1 Hz, 1H), 2.70 (dt, J = 14.5, 7.7 Hz, 1H), 2.48 (s, 3H), 2.41-2.30 (m, 3H), 2.15 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 1.98-1.88 (m, 2H), 1.84 (s, 3H), 1.42 (s, 9H), 1.25 (d, J = 6.3 Hz, 3H).  13C NMR (150 MHz, CDCl3)  δ  170.6, 164.9, 164.7, 156.7, 155.5, 146.4, 141.4, 129.9, 127.0, 123.9, 114.9, 113.7, 79.3, 69.0, 68.0, 48.1, 47.5, 40.1, 38.4, 36.8, 33.9, 28.6 (3C), 24.7, 21.4, 17.1. HRMS (ESI+):  C27H38BrN2O6S ([M+H]+)の計算値: 597.1634.  実測値: 597.1667.
【０１２２】
【化２３】
2019510070.tif 000027
【０１２３】
(12Z,3S,6Z,8E,11S,15R)-15-アミノ-3-((E)-2-ブロモプロパ-1-エン-1-イル)-9,11-ジメチル-4,12-ジオキサ-1(2,4)-チアゾールアシクロヘプタデカファン-6,8-ジエン-5,13-ジオン(10)
DCM(1.2mL)中のトリフルオロ酢酸(0.3mL)の溶液を0℃に冷却し、N2下、0℃でカルバメート9(8.0mg、0.013mmol)に加えた。4℃の冷蔵庫中で15時間、反応を保ち、次いで10mLのCHCl3を加え、フラスコを0℃に保ちながら溶媒を蒸発させた。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(ジクロロメタン:MeOH=20:1)で精製して、TFA塩の形態の無色オイル(9mg、99%)として生成物10を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3)    δ  7.96 (brs, 3H), 7.19 (s, 1H), 6.80 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 6.71 (t, J = 11.7 Hz, 1H), 6.12 (t, J = 11.4 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 5.36 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 5.20-5.17 (m, 1H), 3.26-3.31 (m, 1H), 3.22-3.14 (m, 2H), 3.03-2.95 (m, 2H), 2.85-2.80 (m, 1H), 2.64-2.60 (m, 1H), 2.45 (s, 3H), 2.35-2.31 (m, 1H), 2.22-2.15 (m, 1H), 2.15 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.08-2.00 (m, 1H), 1.84 (s, 3H), 1.28 (d, J = 6.4 Hz, 3H).  HRMS (ESI+): C22H30BrN2O4S ([M+H]+)の計算値: 497.1104.  実測値: 497.1099.
【０１２４】
【化２４】
2019510070.tif 000028
【０１２５】
N-((12Z,3S,6Z,8E,11S,15R)-3-((E)-2-ブロモプロパ-1-エン-1-イル)-9,11-ジメチル-5,13-ジオキソ-4,12-ジオキサ-1(2,4)-チアゾールアシクロヘプタデカファン-6,8-ジエン-15-イル)アセトアミド(11)
0.5mLのCH2Cl2中アミン10(10.0mg、0.0164mmol、1当量)の溶液に0℃でピリジン(0.25mL、過剰)及びAcCl(5.9μL、0.0828mmol、5当量)を加えた。反応フラスコを4℃の冷蔵庫中で15時間保った。混合物を25mLのEtOAcで希釈し、H2O及びブラインで洗浄した。有機相をMgSO4上で乾燥し、真空で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン:アセトン=2:1)で精製し、無色オイル(6.5mg、74%)として所望の生成物11を得た。Rf=0.41(ヘキサン:アセトン=2:1)。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  7.01 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.74 (t, J = 11.7 Hz, 1H), 6.06 (td, J = 9.3, 5.5 Hz, 1H), 5.97 (dt, J = 9.3, 1.1 Hz, 1H), 5.77 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 5.13-5.07 (m, 1H), 3.96 (sextet, J = 7.0 Hz, 1H), 3.19-3.18 (m, 2H), 2.79-2.68 (m, 2H), 2.51 (dd, J = 15.7, 7.4 Hz, 1H), 2.45 (s, 3H), 2.41 (dd, J = 15.7, 5.7 Hz, 1H), 2.36 (dd, J = 13.4, 10.8 Hz, 1H), 2.16 (d, J = 13.4 Hz, 1H),  1.93 (s, 3H), 1.89-1.83 (m, 2H), 1.85 (s, 3H), 1.25 (d, J = 6.4 Hz, 3H).  HRMS (ESI+):  C24H32BrN2O5S ([M+H]+)の計算値: 539.1210.  実測値: 539.1198.
【０１２６】
【化２５】
2019510070.tif 000029
【０１２７】
1,1,1-トリクロロ-2-メチルプロパン-2-イル((12Z,3S,6Z,8E,11S,15R)-3-((E)-2-ブロモプロパ-1-エン-1-イル)-9,11-ジメチル-5,13-ジオキソ-4,12-ジオキサ-1(2,4)チアゾールアシクロヘプタデカファン-6,8-ジエン-15-イル)カルバメート(12)
公開された手順(Romo, D.、Rzasa, R. M.、Shea, H. A.、Park, K.、Langenhan, J. M.、Sun, L.、Akhiezer, A.、Liu, J. O. (1998年)「Total Synthesis and Immunosuppressive Activity of (-)-Pateamine A and Related Compounds: Implementation of a  β-Lactam-Based Macrocyclization、J. Am. Chem. Soc. 120、12237〜12254頁)に従って、化合物10(4.3mg、0.0074mmol)から無色オイル(5.3mg、71%)として所望の生成物12を得た。Rf=0.28(ヘキサン:酢酸エチル=4:1)。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  7.00 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.72 (t, J = 11.8 Hz, 1H), 6.06 (td, J = 9.0, 5.3 Hz, 1H), 5.96 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 5.35 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 5.15-5.09 (m, 2H), 3.68-3.64 (m, 1H), 3.20-3.18 (m, 2H), 2.85-2.79 (m, 1H), 2.74-2.68 (m, 1H), 2.57 (dd, J = 16.3, 8.3 Hz, 1H), 2.46 (s, 3H), 2.41-2.34 (m, 2H), 2.15 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 1.90 (s, 6H), 1.89-1.83 (m, 2H), 1.84 (s, 3H), 1.25 (d, J = 6.3 Hz, 3H). 13C NMR (150 MHz, CDCl3)  δ  170.4, 165.7, 164.7, 160.9, 156.0, 153.8, 146.6, 141.7, 129.6, 127.4, 124.0, 114.7, 114.1, 106.8, 88.1, 68.9, 68.1, 48.0, 47.9, 40.0, 38.1, 33.5, 28.5, 24.8, 21.9 (2C). HRMS (ESI+): C27H35BrCl3N2O6S ([M+H]+)の計算値: 699.0465.  実測値: 699.0437.
【０１２８】
【化２６】
2019510070.tif 000030
【０１２９】
1,1,1-トリクロロ-2-メチルプロパン-2-イル((12Z,3S,6Z,8E,11S,15R)-3-((1E,3E,5E)-7-(ジメチルアミノ)-2-メチルヘプタ-1,3,5-トリエン-1-イル)-9,11-ジメチル-5,13-ジオキソ-4,12-ジオキサ-1(2,4)-チアゾールアシクロヘプタデカファン-6,8-ジエン-15-イル)カルバメート(13又はOR-IV-211)
12(4.5mg、0.0064mmol、1当量)と(2E,4E)-N,N,3-トリメチル-5-(トリブチルスタンニル)ペンタ-2,4-ジエン-1-アミン(5.3mg、0.0128mmol、2当量)のカップリングは公知の手順(Low, W. K.、Li, J.、Zhu, M.、Kommaraju, S. S.、Shah-Mittal, J.、Hull, K.、Liu, J. O.、Romo, D. (2014年)「Second-generation derivatives of the eukaryotic translation initiation inhibitor pateamine A targeting eIF4A as potential anticancer agents」、Bioorg. Med. Chem. 22、116〜125頁)に従った。反応混合物を15時間、20℃に保ち、精製のため直接シリカゲルクロマトグラフィー(ジクロロメタン:MeOH:トリエチルアミン=20:1:0.1)に移した。生成物をPrep-HPLC(溶媒A:8mM HCOOH及び12mM NH3・H2Oで緩衝した水、pH=9.0;溶媒B: 8mM HCOOH及び12mM NH3・H2Oで緩衝したCH3CN/H2O(9:1 v/v;定組成溶離、溶媒A/溶媒B=1:4)で更に精製した。画分を集めて濃縮し、生成物と固体ギ酸アンモニウムの混合物を得て、これにDCM(10mL)を加え、焼結したブフナーガラスロートを通して懸濁液を濾過した。沈殿物を過剰のジクロロメタン(2×5mL)で洗浄した。真空濃縮の後、ギ酸塩の形の無色オイル(2.8mg、56%)として生成物13(OR-IV-211)を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  8.52 (s, 1H), 7.02 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.71 (t, J = 11.7 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 6.29 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 6.28-6.25 (m, 1H), 5.67 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 5.59 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 11.4 H
z, 1H), 5.16-5.11 (m, 1H), 5.08 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.69-3.63 (m, 1H), 3.43 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 3.21-3.19 (m, 2H), 2.83 (dt, J = 15.0, 6.3 Hz, 1H), 2.77-2.70 (m, 1H), 2.59 (dd. J = 15.7, 8.3 Hz, 1H), 2.49 (s, 6H), 2.42-2.34 (m, 2H), 2.16 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 2.07-2.02 (m, 1H), 1.99 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 1.93-1.89 (m, 1H), 1.91 (s, 6H), 1.84 (s, 3H), 1.83 (s, 3H), 1.25 (d, J = 6.1 Hz, 3H). HRMS (ESI+): C35H49Cl3N3O6S ([M+H]+)の計算値: 744.2408.  実測値: 744.2429.
【０１３０】
【化２７】
2019510070.tif 000031
【０１３１】
N-((12Z,3S,6Z,8E,11S,15R)-3-((1E,3E,5E)-7-(ジメチルアミノ)-2,5-ジメチルヘプタ-1,3,5-トリエン-1-イル)-9,11-ジメチル-5,13-ジオキソ-4,12-ジオキサ-1(2,4)-チアゾールアシクロヘプタデカファン-6,8-ジエン-15-イル)アセトアミド(14又はMZ732)
11(3.4mg、0.0063mmol、1当量)と(2E,4E)-N,N,3-トリメチル-5-(トリブチルスタンニル)ペンタ-2,4-ジエン-1-アミン(5.2mg、0.0126mmol、2当量)とのカップリングは既知の手順に基づいた。Low, W. K.、Li, J.、Zhu, M.、Kommaraju, S. S.、Shah-Mittal, J.、Hull, K.、Liu, J. O.、Romo, D. (2014年)「Second-generation derivatives of the eukaryotic translation initiation inhibitor pateamine A targeting eIF4A as potential anticancer agents」、Bioorg. Med. Chem. 22、116〜125頁。精製手順は13(OR-IV-211)と同じであり、ギ酸塩の形の無色オイル(1.8mg、49%)として純粋な生成物14(MZ732)を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  8.23  (s, 1H), 7.03 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.74 (t, J = 11.3 Hz, 1H), 6.39 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 6.29-6.25 (m, 1H), 5.84 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.69 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.63 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 5.13-5.09 (m, 1H), 4.01-3.98 (m, 1H), 3.68 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.21-3.19 (m, 2H), 2.79-2.74 (m, 2H), 2.67 (s, 6H), 2.50-2.46 (m, 2H), 2.35-2.32 (m, 1H), 2.16 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 1.99 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 1.97-1.93 (m, 2H), 1.95 (s, 3H), 1.87 (s, 3H), 1.86 (s, 3H), 1.25 (d, J = 6.4 Hz, 3H).  HRMS (ESI+): C32H46N3O5S ([M+H]+)の計算値: 584.3158.  実測値: 584.3139.
【０１３２】
【化２８】
2019510070.tif 000032
【０１３３】
(12Z,3S,6Z,8E,11S,15R)-15-アミノ-3-((1E,3E,5E)-7-ジメチルアミノ-2,5-ジメチルヘプタ-1,3,5-トリエン-1-イル)-9,11-ジメチル-4,12-ジオキサ-1(2,4)-チアゾールアシクロヘプタデカファン-6,8-ジエン-5,13-ジオン、デスメチルパテアミンA(DMPatA)(15又はOR-IV-234)
カルバメート13(OR-IV-211)(1.2mg、1.5μmol)、Cd-Pbカップル(4.8mg)、NH4OAc水溶液(1M、50μL)、H2O(150μL)、及びTHF(150μL)の混合物をN2下、20℃で撹拌した。1時間後に追加のCd-Pbカップル(1.2mg)を加え、更に1時間、混合物の撹拌を継続した。溶媒を蒸発させ、残渣にCHCl3(5mL)を加えた。焼結したブフナーガラスロートを通して懸濁液を濾過し、溶媒を濃縮した。粗残渣を13(OR-IV-211)と同じ手順に従ってprep-HPLCで精製し、ギ酸塩の形の生成物15(OR-IV-234) (0.57mg、59%)を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3)  δ  8.41  (brs, 2H), 7.10 (s, 1H), 6.87 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 6.67 (t, J = 11.6 Hz, 1H), 6.39 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 6.34-6.29 (m, 1H), 6.32 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 5.68 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 5.57 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 5.37 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 5.19-5.12 (m, 1H), 3.86-3.25 (brs, 4H), 3.64 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 3.20 (dd, J = 14.6, 3.4 Hz, 1H), 3.15 (dd, J = 14.6, 10.7 Hz, 1H), 3.07-3.01 (m, 1H), 2.92-2.89 (m, 1H), 2.77-2.72 (m, 1H), 2.63 (s, 6H), 2.63-2.59 (m, 1H), 2.52 (dd, J = 17.5, 11.7 Hz, 1H), 2.32 (dd, J = 13.0, 11.1 Hz, 1H), 2.12 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 2.10-2.07 (m, 1H), 2.02 (s, 3H), 1.99-1.96 (m, 1H), 1.86 (s, 3H), 1.83 (s, 3H), 1.27 (d, J = 6.4 Hz, 3H). HRMS (ESI+): C30H44N3O4S ([M+H]+)の計算値: 542.3053.  実測値: 542.3044.
【０１３４】
(実施例2)
血漿タンパク質結合アッセイ
本実施例では、血漿タンパク質結合データを得るために用いた血漿タンパク質結合アッセイについて述べる。
【０１３５】
アッセイは以下のステップを含む。
1.  凍結血漿を解凍して1120gで10分遠心し、粒状物を全て除いた。血漿をデカンテーションしてpHを測定し、必要な場合には乳酸でpH7.4に調整した。
2.  全ての化合物はDMSO中、10mMの濃度で調製した。溶液を注意深くボルテックスして化合物が溶解したことを確認した。10mMのDMSO溶液を500μMのMeOH溶液に希釈した(5+95μl)。
3.  2mLの96ウェルプレート(DWP)のカラム1〜4の各ウェルに、1000μLの血漿をピペットで入れた。
4.  対応する1000μLの血漿に10μLの500μM化合物溶液をピペットで入れた(最終DMSO=0.05%)。溶液にキャップをして5分、注意深くボルテックスした。
5.  透析プレートの各レシーバーウェルに200μLのPBS緩衝液を加えた(最初に緩衝液をレシーバーに加えた)。
6.  透析プレートの底にキャップをして、透析プレートのオレンジ色のドナー側(上)の上に反転させた。
7.  透析プレートのオレンジ色のドナー側のキャップを外し、10μM薬剤/血漿試料200μLを2mLの96-DWPから透析プレートの対応するドナーウェルに移した。次いで透析プレートのオレンジ色のドナー側にキャップをした。
8.  透析プレートを37℃オーブン中のプレートローテーターの上に置き、回転速度20rpmとして22時間、37℃でインキュベートした。
9.  1mLの96-DWPに2mLの96-DWPから5μMの薬剤/血漿試料をウェルあたり50μL、3回ずつピペットで入れた。ウェルあたり50μLのPBSを加え、次いで300μLのACN/ISを加えた。プレートを4℃に保った。このプレートをリカバリープレートとして用いた。
10.  1mLの96-DWPを2個調製し、ドナープレート及びレシーバープレートとしてマークした。
11.  透析プレートを37℃のオーブンから取り出した。
12.  透析プレートのドナー側からキャップを取り外した。
13.  透析プレートのドナー側から50μLの試料をピペットで取り出し、96-DWPドナープレートに加えた。96-DWPドナープレートに50μLのPBS緩衝液を加えた。
14.  透析プレートのドナー側にキャップをして反転させた。レシーバー側のウェルからキャップを取り外した。透析プレートのレシーバー側から50μLの試料をピペットで取り出し、96-DWPレシーバープレートに加えた。
15.  50μLのブランク血漿を96-DWPレシーバープレートに加えた。
16.  アセトニトリル(ACN)中1μMのイミプラミン(IS)を96-DWPドナープレート、96-DWPレシーバープレート、及びリカバリープレートにウェルあたり300μL加えた。
17.  3つのプレートにキャップをして10分ボルテックスした。
18.  プレートを4℃、4000rpmで10分遠心した。
19.  150μLのクエンチ試料を各プレートから対応する96-DWPインジェクションプレートに移した。
20.  150μLの0.1%酢酸/水をインジェクションプレートに加えた。
21.  インジェクションプレートにキャップをして5分ボルテックスした。
22.  プレートを4℃、4000rpmで5分遠心した。
23.  レシーバープレート、ドナープレート、及びリカバリープレート中の試料をLC/MS/MSで分析した。
HPLC:Agilent 1290インフィニティバイナリーLC/HTCインジェクター。カラム:Sigma-Aldrich Supelco Ascentis fused-core C18、2.7um、2.1×20mm。溶媒A:0.1%酢酸/水、溶媒B:0.1%酢酸/アセトニトリル。カラム温度:40℃。インジェクションボリューム:2uL。時間/流量:0分/0.5mL/分|1.3分/0.5mL/分|1.31分/1.0mL/分|1.7分/1.0mL/分。
MS/MS:Agilent 6460、Positive、ESI。シースガス温度:400℃。シースガス流量:12L/分。ガス温度:300℃。ガス流量:11L/分。キャピラリ電圧:4000V。ノズル電圧:500V。ネブライザー:35psi。セル加速電圧:7V。
【０１３６】
本発明の好ましい実施形態を説明し記述したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなくこれに種々の変更を加えることができることが認識されよう。
【０１３７】
独占的権利又は独占権を主張する本発明の実施形態は以下のように定義される。
【図１】
2019510070.tif 000045
【図２】
2019510070.tif 000046
【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【国際調査報告】
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