(57)【要約】  本発明の1つの実施態様は、特発性肺線維症の治療に使用するための、ニンテダニブおよびその医薬的に許容される塩、ならびにピルフェニドンおよびその医薬的に許容される塩からなる群から選択される化合物であって、治療の開始が少なくとも2つの連続する時点での患者の身体試料の定量CRPM含有量によって決定され、CRPMの濃度の変化の割合が1ヶ月当たり0ng/mlよりも大きい場合に治療が開始される、前記化合物である。本発明の更なる実施態様は、進行性線維化間質性肺疾患(PF-ILD)の治療に使用するためのニンテダニブおよびその医薬的に許容される塩からなる群から選択される化合物であって、治療の開始が少なくとも2つの連続する時点での患者の身体試料の定量CRPM含有量によって決定され、CRPMの濃度の変化の割合が1ヶ月当たり0ng/mlよりも大きい場合に治療が開始される、前記化合物である。2019523225.tif 000007【選択図】なし
2019523225.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特発性肺線維症の治療に使用するための、ニンテダニブおよびその医薬的に許容される塩、ならびにピルフェニドンおよびその医薬的に許容される塩からなる群から選択される化合物であって、治療の開始が少なくとも2つの連続する時点での患者の身体試料の定量CRPM含有量によって決定され、CRPMの濃度の変化の割合が1ヶ月当たり1.7ng/mlより大きい場合に治療が開始される、前記化合物。
【請求項２】
割合が1ヶ月当たり1ng/mlよりも大きい、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
割合が1ヶ月当たり0ng/mlよりも大きい、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
ニンテダニブがそのモノエタンスルホネート塩の形態である、請求項1〜3のいずれか1項記載の化合物。
【請求項５】
進行性線維化間質性肺疾患(PF-ILD)の治療に使用するための、ニンテダニブおよびその医薬的に許容される塩からなる群から選択される化合物であって、治療の開始が少なくとも2つの連続する時点での患者の身体試料の定量CRPM含有量によって決定され、CRPMの濃度の変化の割合が1ヶ月当たり1.7ng/mlよりも大きい場合に治療が開始される、前記化合物。
【請求項６】
割合が1ヶ月当たり1ng/mlよりも大きい、請求項5記載の化合物。
【請求項７】
割合が1ヶ月当たり0ng/mlよりも大きい、請求項5記載の化合物。
【請求項８】
ニンテダニブがそのモノエタンスルホネート塩の形態である、請求項5〜7のいずれか1項記載の化合物。
【請求項９】
前記PF-ILDが特発性非特異性間質性肺炎(iNSIP)である、請求項5〜8のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１０】
前記PF-ILDが分類不能型特発性間質性肺炎(分類不能型IIP)である、請求項5〜8のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１１】
前記PF-ILDが自己免疫疾患の特徴をもった特発性肺炎(IPAF)である、請求項5〜8のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１２】
前記PF-ILDが慢性過敏性肺炎(CHP)である、請求項5〜8のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１３】
前記PF-ILDが環境/職業性線維化肺疾患である、請求項5〜8のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１４】
前記PF-ILDがSSc-ILDである、請求項5〜8のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１５】
前記PF-ILDがRA-ILDである、請求項5〜8のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１６】
前記身体試料が血清である、請求項1〜15のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１７】
前記身体試料が血漿である、請求項1〜15のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１８】
割合が、4〜12週間の時間間隔に基づいて決定される、請求項1〜17のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１９】
割合が、約12週間の時間間隔に基づいて決定される、請求項1〜17のいずれか1項記載の化合物。
【請求項２０】
割合が、12週間の時間間隔に基づいて決定される、請求項1〜17のいずれか1項記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
IPF
特発性肺線維症(IPF)は、間質性肺疾患(ILD)として知られている200を超える肺疾患の大集団に属し、肺の間質、肺の気嚢間の組織の関与を特徴とする。
特発性肺線維症(IPF)は、肺の間質の進行性線維症を特徴とする未知病因の稀な疾患であり、肺容積減少および進行性肺機能不全に至る。個々の患者における上記疾患の経過は様々であり、急速に進行する患者もあれば、急性増悪を伴う相対的安定期間を有する患者もあれば、比較的ゆっくり進行する患者もある。IPFの急性増悪は、毎年5〜10％の患者で起こる未確認の原因の呼吸器疾患の事象であり、非常に不良な結果と関連している。IPFは、中高年齢の患者で最も一般的であり、通常は40〜70歳の間に存在する。診断後のIPF患者の平均余命は2〜3年である。米国胸部学会(ATS)、欧州呼吸器学会(ERS)、日本呼吸器学会(JRS)、ラテンアメリカ胸部協会(ALAT)が共同で2015年に発行したIPFの治療に関する臨床実践ガイドラインの最新情報は、個々の患者の価値と好みを考慮して、大多数のIPF患者のためのニンテダニブまたはピルフェニドンによる治療のための条件付き推奨を示した。n-アセチルシステイン(NAC)、コルチコステロイド、シクロホスファミド、シクロスポリンおよびアザチオプリンのような従来のIPF治療は、IPFに対する承認された治療法ではなく、その有効性は疑わしいかまたは有害でさえある。一部の患者では、肺リハビリテーションや長期酸素療法のような非薬物療法が推奨されているが、IPF患者の有効性は確立されていない。肺移植は、IPF患者の生存に積極的に影響することが示されている。IPFに起因する移植患者の数は、ここ数年で着実に増加しているが、臓器の乏しい入手可能性、ならびに併存症および高齢は、肺移植への紹介から多くの患者を排除する。非臨床モデルで抗線維化活性を示した化合物であるピルフェニドンは、上記化合物による治療下での生存能力の低下減少が示された2つの局所試験に基づいて、2008年に日本で最初に認可された。国際フェーズIII CAPACITYプログラムにおいて、ピルフェニドンは、2つの確認試験のうちの1つのみにおいて、FVC肺機能主要評価項目で有効性を実証した。FDAによって要請された追加的な確認ASCEND第III相試験は、予測されたベースラインFVC％からの変化の主要評価項目を満たした。ピルフェニドンは、また、欧州連合における軽度から中等度のIPFの治療のために2011年2月から、また米国におけるIPFの治療のために2014年10月から認可されている。また、他のいくつかの国で認可されている。ニンテダニブは、前臨床モデルにおいて抗線維性および抗炎症活性を示した小分子細胞内チロシンキナーゼ阻害剤である。2回のPhase III INPULSIS試験とPhase II TOMORROW試験では、IPF患者のニンテダニブ150mgのプラセボに対する1日2回の有効性について一貫して陽性結果が示された。両方のINPULSISの試験では、ニンテダニブはFVCの年間減少率(mL/年)を約50％低下させることが示され、疾患の進行を遅らせている。これらの3つの臨床試験に基づき、ニンテダニブは、2014年10月に米国、2015年1月に欧州連合、2015年7月に日本でIPFの治療が承認された。2017年4月15日現在、ニンテダニブはIPFの治療の適応に(カナダ、スイス、ロシア、オーストラリア、チリ、エクアドル、台湾が含まれる)60か国で許可されている。ニンテダニブは世界中の他の国々でマーケティング承認のために提出されている。
【０００２】
ニンテダニブ
ニンテダニブ、化合物3-Z-[1-(4-(N-((4-メチル-ピペラジン-1-イル)-メチルカルボニル)-N-メチル-アミノ)-アニリノ)-1-フェニル-メチレン]-6-メトキシカルボニル-2-インドリノンは、特に、腫瘍学的疾患、免疫学的疾患または免疫学的成分を含む病的状態、または線維性疾患の治療のための、有益な薬理学的特性を有する革新的な化合物である。
【０００３】
この化合物の化学構造は、式Aとして下記に示される。
式A
【化１】
2019523225.tif 000003
【０００４】
この化合物の塩基形態はWO 01/27081号に記載されており、モノエタンスルホネート塩形態はWO 2004/013099号に記載されており、様々な更なる塩形態がWO 2007/141283号に示されている。免疫学的疾患または免疫学的成分を含む病的状態の治療のためのこの分子の使用は、WO 2004/017948号に記載されており、腫瘍学的疾患の治療のための使用は、WO 2004/096224号に記載されており、線維性疾患の治療のための使用は、WO 2006/067165号に記載されている。
【０００５】
この化合物のモノエタンスルホネート塩形態は、この塩が薬剤としての開発に特に適したものにする特性を示す。3-Z-[1-(4-(N-((4-メチル-ピペラジン-1-イル)-メチルカルボニル)-N-メチル-アミノ)-アニリノ)-1-フェニル-メチレン]-6-メトキシカルボニル-2-インドリノン-モノエタンスルホネートは、下記に式A1として示される。
式A1
【化２】
2019523225.tif 000004
【０００６】
前臨床試験は、この化合物が血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)、血小板由来成長因子受容体(PDGFR)および線維芽細胞成長因子受容体(FGFR)の非常に強力な、経口で生体利用可能な阻害剤であり、VEGFR、PDGFRの抗線維化能、およびニンテダニブによるFGFR阻害は、一連の前臨床試験で評価されている。ニンテダニブのキナーゼ特異性プロファイルを示すデータは、Hilberg et al.,Cancer Res.2008; 68: 4774-82に、すなわち、Src、LckおよびLynのような炎症および増殖に関連するSrcファミリーキナーゼ、ならびに他のキナーゼ、例えばFLT-3、IGF1R、InsR、EGFR、HER2、CDK1、CDK2およびCDK4に関するVEGFR、PDGFRおよびFGFRのような血管新生および線維症関連キナーゼに関して発表されている。ニンテダニブは、正常ヒト肺線維芽細胞のPDGFR-αおよびβ活性化および増殖をインビトロで阻害し、IPF患者および対照ドナーからのヒト肺線維芽細胞のPDGF-BB-、FGF-2-およびVEGF-誘導性増殖を阻害することが示された。ニンテダニブは、IPF患者からの肺線維芽細胞のPDGF-またはFGF-2-刺激による移動を減弱させ、IPF患者からの初代ヒト肺線維芽細胞の形質転換成長因子(TGF)-β-誘導性線維芽細胞から筋線維芽細胞への形質転換を阻害した(Hostettler et al., Respir.Res.2014; 15: 157; Wollin et al., J.Pharmacol.Exp.Ther.2014; 349:209-20)。ニンテダニブの多重薬理は、L.Wollin et al., Eur.Respir.J.2015; 45: 1434-1445に記載されている。IPFの2つの異なるマウスモデルにおいて、ニンテダニブは、気管支肺胞洗浄液中のリンパ球と好中球の数の有意な減少、炎症性サイトカインの減少および肺組織の組織学的分析における炎症および肉芽腫形成の減少によって示されるような抗炎症効果を発揮した。IPFマウスモデルは、また、肺コラーゲン総量の有意な減少および組織学的分析で同定された線維化の減少によって示されるように、ニンテダニブ関連の抗線維化効果を明らかにした。
【０００７】
薬量：推奨用量ニンテダニブは、150mgニンテダニブであり、1日2回約12時間間隔で投与される。投与されるニンテダニブの量は、遊離塩基で計算されるが、実際にはモノエタンスルホン酸塩として処方される。1日2回の100mg用量は、1日2回150mg用量に耐えない患者にのみ使用することが推奨されている。
用量を逃した場合、投与は推奨投与量で次の予定時刻に再開すべきである。
用量を逃した場合、患者は追加用量を服用すべきではない。300mgの推奨最大日用量は超えてはならない。
【０００８】
用量調整：適用可能な場合、ニンテダニブ(EMAのOfev(登録商標)REPAR、セクション4.4および4.8を参照)に対する副作用の管理には、症状の治療に加えて、特定の副作用が治療の継続が許容されるレベルに解決するまで、用量の減少および一時的な中断が含まれる。ニンテダニブ治療は、全用量(1日2回150mg)または減量(1日2回100mg)で再開することができる。患者が1日2回100mgを許容しない場合、ニンテダニブによる治療は中止すべきである。Ofevによる治療は、正常(ULN)の3倍を超えるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)またはアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)上昇による中断の場合、トランスアミナーゼがベースライン値に戻った後、減少した用量で再導入することができ、引き続き、全用量(1日2回150mg)に増加することができる(EPARセクション4.4および4.8を参照)。
【０００９】
肝障害：
ニンテダニブは、胆汁/糞便中への排泄(＞90％)によって主に排除される。肝障害患者では暴露が増加した(Child Pugh A, Child Pugh B; EPARセクション5.2を参照)。軽度の肝機能障害(Child Pugh A)の患者では、Ofevの推奨用量は1日2回約100mgで約12時間間隔である。軽度の肝機能障害(Child Pugh A)の患者では、副作用の管理のための治療中断または中止を考慮しなければならない。Child Pugh BおよびCに分類される肝障害の患者では、ニンテダニブの安全性と有効性は調査されていない。Ofevによる中等度(Child Pugh B)および重度(Child Pugh C)肝障害の治療は推奨されない(EPARセクション5.2を参照)。
【００１０】
ピルフェニドン：
ピルフェニドンは、CAS番号53179-13-8を有する5-メチル-1-フェニル-2(1H)-ピリジノンである。この化合物の化学構造は、下記に式Bとして示される：
式B：
【化３】
2019523225.tif 000005
【００１１】
ピルフェニドンは、267mgのピルフェニドンカプセルでEsbriet(登録商標)として市販されている。
Esbrietは、EUにおいて、軽度から中等度の特発性肺線維症(IPF)を有する成人を治療するために使用される。
成人のための治療計画：
治療を開始する際には、下記のように1日当たり9カプセルの推奨1日量に14日間の用量を滴定しなければならない。
・1日目〜7日目：1カプセル、1日3回(801mg/日)
・8日目〜14日目：2カプセル、1日3回(1602mg/日)
・15日目以降：3カプセル、1日3回(2403mg/日)
IPF患者に推奨される1日量のEsbrietは、1日3回267mgカプセル3カプセルで、合計2403mg/日の食物である。2403mg/日を超える用量は、いかなる患者にも推奨されない。
Esbriet治療の連続14日以上を逃した患者は、推奨される1日量までの最初の2週間の滴定計画を受けることにより治療を再開すべきである。連続14日未満の治療中断の場合、用量は、滴定することなく、以前の推奨された1日量で再開することができる。
【００１２】
ニンテダニブとピルフェニドンはIPFと診断された患者のケアの基準と考えることができるが、個々の患者における臨床経過の予測不可能性を考慮すると、どちらの薬剤で治療を開始するか、いつ止めるべきかは不明である。IPFの治療アルゴリズムにニンテダニブが導入されたことで、早期の病期、すなわち肺容積の障害がある患者のプロファイルをさらに特徴づけることが必要であり、これらの患者の治療をいつ開始するのかという問題に取り組む必要がある。現在、多くの医師は、特定の患者の個々の経過または治療に対する応答を予測するためのマーカーがないので、これらの患者の待機および監視戦略を適用し、治療の開始が遅れることがある。特定の患者のための治療の臨床経過と利点を疾患の経過の早期に予測するためのバイオマーカーの同定は、患者管理における最も緊急かつ関連する課題の1つである。更に、IPF自体の診断は、時間のかかる手順である可能性がある。基本的には、薬剤毒性、環境曝露(例えばアスベスト)またはコラーゲン血管疾患(例えば、強皮症、関節リウマチ)のような代替的な原因のない通常の間質性肺炎(UIP)の組織学的または画像化パターンの確認が必要である。早期にニンテダニブによる治療の恩恵を受ける患者を示す診断コンセプトが必要である。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の1つの実施態様は、特発性肺線維症の治療に使用するための、ニンテダニブおよびその医薬的に許容される塩、ならびにピルフェニドンおよびその医薬的に許容される塩からなる群から選択される化合物であって、治療の開始が少なくとも2つの連続する時点での患者の身体試料の定量CRPM含有量で決定され、CRPMの濃度の変化の割合が1.7ng/mlよりも大きい、より好ましくは1ヶ月当たり1ng/mlよりも大きい、最も好ましくは1ヶ月あたり0ng/mlよりも大きい場合に治療が開始される、前記化合物である。
本発明は、その疾患が更に進行するため、特に治療から利益を受けるIPF患者の早期同定を可能にする。
本発明の更なる実施態様は、進行性線維化間質性肺疾患(PF-ILD)の治療に使用するための、ニンテダニブおよびその医薬的に許容される塩からなる群から選択される化合物であって、治療の開始が少なくとも2つの連続する時点での患者の身体試料の定量CRPM含有量で決定され、CRPMの濃度の変化の割合が1.7ng/mlよりも大きい、より好ましくは1ヶ月当たり1ng/mlよりも大きい、最も好ましくは1ヶ月あたり0ng/mlよりも大きい場合に治療が開始される、前記化合物である。
本発明は、早期にニンテダニブによる治療の恩恵を受ける患者を示す。
本発明の更なる実施態様においては、PF-ILDは特発性非特異性間質性肺炎(iNSIP)である。
本発明の更なる実施態様においては、PF-ILDは、分類不能型特発性間質性肺炎(分類不能型IIP)である。
本発明の更なる実施態様においては、PF-ILDは自己免疫疾患の特徴をもった特発性肺炎(IPAF)である。
本発明の更なる実施態様においては、PF-ILDは、慢性過敏性肺炎(CHP)である。
本発明の更なる実施態様においては、PF-ILDは、環境/職業性線維化肺疾患である。
本発明の更なる実施態様においては、PF-ILDは、全身性強皮症を伴う間質性肺疾患(SSc-ILD)である。
本発明の更なる実施態様においては、PF-ILDは関節リウマチを伴う間質性肺炎(RA-ILD)である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】関節炎炎症スコア、確立された関節腫脹に対するニンテダニブの効果。ザイモサン注射の10週間後にニンテダニブを1日投与することにより、関節腫脹および損傷は変化しなかった：  確立された関節および肺疾患に対するニンテダニブの効果を決定するために、マウスに、ザイモサン注射の10週間後に開始するニンテダニブまたは生理食塩水を毎日強制経口投与した。16週目に生理食塩水と比較してニンテダニブによる体重または生存パーセントの著しい変化はなかった。視覚的関節炎スコアによって評価された関節腫脹は、ザイモサン注射の2〜3週間後に最初に検出され、ザイモサン注射の6〜10週間後に重症度のピークに達するまで徐々に増加した。その後、関節腫脹の重篤度は低下したが、ザイモサン注射の16週間後のマウスでは上昇したままであった。ニンテダニブの投与は、図1に示すように、10週目から開始して、生理食塩水処置動物と比較して関節腫脹の消散をわずかに増加させた。
【図２】ニンテダニブは、確立された肺疾患をもった肺における肺コンプライアンスを変化させなかった：静的肺コンプライアンスの中程度ではあるが統計的に有意な低下が、生理食塩水グループにおけるザイモサン注射SKGマウスにおいて観察されたが、圧容量曲線(A)で分析したようにニンテダニブ治療動物における静的肺コンプライアンスに有意差はなかった。ニンテダニブ治療動物と生理食塩水処置動物(D)におけるBAL細胞数(P = 0.2223、データは示さず)または肺胞マクロファージ(P = 0.2502)の総数に有意差はなかった。ニンテダニブ治療後、ヒドロキシプロリン(C)によって測定されたコラーゲンレベルの有意な減少があった。肺疾患のSKGモデルにおいて、リンパ球(E)および好中球(F)の数のわずかではあるが有意な上昇が、ニンテダニブ治療コホート(それぞれP = 0.0234およびP = 0.0318)において検出された。
【図３】関節炎炎症スコア、発症中の関節腫脹に対するニンテダニブの効果。ザイモサン注射の5週間後にニンテダニブを1日投与することにより、関節の腫脹および損傷が軽減された：  ニンテダニブによる治療は、マウスがニンテダニブを1週間投与した後に最も顕著になった生理食塩水処置マウスと比較したときに関節腫脹の逆転をもたらした。その後、ニンテダニブ治療マウスの関節炎スコアは低下し始めてその後4週間にわたり徐々に変化する。対照的に、生理食塩水を投与したマウスでは、関節炎スコアは徐々に増加した。
【図４】発症中の間質性肺炎に対するニンテダニブの効果：  確立された疾患をもったマウスとは対照的に、ニンテダニブ治療動物の圧・容量曲線において上方へのシフトが観察され、静的肺コンプライアンス(A)の増加を示した。ヒドロキシプロリンレベル(コラーゲンの尺度)は、肺疾患の発症中の生理食塩水(C)と比較して、ニンテダニブを投与したマウスのコホートにおいて有意に変化しなかった。ニンテダニブ治療動物と生理食塩水処置動物(D)における肺胞マクロファージの総数に有意差はなかった。ニンテダニブ後のBALにおいてリンパ球(E)と好中球(F)の増加傾向がみられた。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明：
CRPMの決定
CRPMは、PROFILE調査で評価されたマトリックスメタロプロテアーゼ1/8(MMP-1/8)によって分解されたC反応性タンパク質を意味する。この調査では、血清試料をベースライン、1ヶ月、3ヶ月、および6ヶ月間に前向き研究で収集し、ELISAベースのネオエピトープアッセイによって新規マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)分解ECMタンパク質のパネルについて分析した。11人のネオエピトープを55人の患者の発見コホートで試験して、より詳細な分析のための充分な厳密さのバイオマーカーを同定した。次いで、年齢が一致し、性別が一致した50人の対照を有する134人の患者の検証コホートにおいて、さらに8人を評価した。バイオマーカー濃度の変化は、反復測定モデルを使用した特発性肺線維症のその後の進行(死亡または強制生存能力の低下が試験登録後12ヶ月で10％よりも多いと定義された)と関連していた。PROFILE調査は、ClinicalTrials.gov、番号NCT01134822およびNCT01110694に登録される、JENKINS et al.,Lancet Respir Med(2015), http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00048-X, 第1-11頁を参照のこと。この調査は、CRPMについては1ヶ月当たり0ng/mlよりも大きい割合が2・16(95％CI 1・15-4・07)のHRを与えたが、1ng/mlよりも大きい割合がHR 4・08(2・14-7・8)、1・7ng/ml/月よりも大きい割合がHR 6・61(95％CI 2・74-15・94)に関連していたことを明らかにした。危険率は、安定または下降濃度を有するものと比較してネオエピトープ濃度の上昇を伴う参加者の死亡リスクを表す(JENKINS et alの第7頁、第2欄、第3段落を参照のこと)。
【００１６】
C反応性タンパク質(CRP)は、ヒトにおける原型の急性期反応物と考えられ、感染、炎症および組織損傷が含まれる様々な臨床状態に応答して産生される。急性期刺激の間、CRPの血清濃度は、24〜48時間以内に1000〜10.000倍に上昇し、数μg/mLの低い正常濃度に急速に低下する。CRPは、急性および慢性の炎症性疾患の両方の状況においてアップレギュレートされるが、ヒトにおける原型の急性期反応物であるすべての炎症性疾患におけるアップレギュレーションのために非特異的生化学マーカーであり、感染、炎症および組織損傷が含まれる様々な臨床状態に応答して産生される(VOLANAKIS, Mol Immunol 2001; 38: 189-97-DU CLOS, Ann Med 2000; 32: 274-8-HIRSCHFIELD, PEPYS, QJM 2003; 96:793-807)。
【００１７】
血清試料中のCRPMの決定は、SKJOT-ARKIL et al., Clinical and Experimental Rheumatology 2012; 30: 371-379, 特に373-375に開示された手順に従う：
CRPの『インビトロ切断』
ヒト血清からの精製されたCRP(Alpha Diagnostics)を、MMP-1、MMP-9、カテプシンK、カテプシンS(Calbiochem、VWR)、MMP-3、MMP-8(Abeam)、トロンボスポンジンモチーフ(ADAMTS)-1および-8(Abnova)を有するジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼで切断した。プロテアーゼは、製造業者の指示に従って活性化された。各切断はMMP緩衝液(100mM トリス-HCl、100mM NaCl、10mM CaCl2、2mM ZnOAc、pH8.0)、カテプシン緩衝液(50mM NaOAc、20mM L-シスチン、pH=5.5)またはアグリカナーゼ緩衝液(50mMトリス-HCl、10mM NaCl、10mM CaCl2、pH=7.5)中で200μgのCRPおよび2μgの活性化酵素を混合することによって別々に実施した。対照として200μgのCRPをMMP緩衝液のみと混合した。各アリコートを37℃で3日間インキュベートした。すべてのMMP切断は、GM6001(Sigma-Aldrich)を使用して、全てのカテプシンおよびアグリカナーゼ切断は、E64(Sigma-Aldrich)を使用して終了した。最後に、切断は、SilverXpress(登録商標)銀染色キット(Invitrogen)を使用して製造業者の指示に従って可視化により証明した。
【００１８】
MSによるペプチド同定
文献に記載されているように、ナノLC-MS-MS分析の前に、逆相(RP)マイクロカラム(Applied Biosystems)を使用して、切断産物を精製および脱塩した(THINGHOLM ＆ LARSEN: Methods Mol Biol 2009; 527:57-66,xi.28を参照)。精製したペプチドを100％ギ酸に再懸濁し、H2Oで希釈し、ナノEasy-LCシステム(Proxeon、Thermo Scientific)を使用して18cm RPキャピラリーカラムに直接装填した。100％相A(0.1％ギ酸)から35％相B(0.1％ギ酸、95％アセトニトリル)までの勾配を使用して43分間にわたって直接LTQ-Orbitrap XL質量分析計(Thermo Scientific)にペプチドを溶出した。
各MSスキャン(Orbitrap、60000、300〜1800Da範囲の分解能)には、5つの最も豊富な前駆イオンをフラグメンテーション(CID)のために選択した。生データファイルはmgfファイルに変換され、Proteome Discoverer(Thermo Scientific)を使用してMascot 2.2で検索した。
マスコット確率スコアp＜0.05を有するペプチドをさらに分析した。
【００１９】
免疫化のためのペプチドの選択
MSによって同定された配列の各遊離末端の最初の6つのアミノ酸は、問題のプロテアーゼによって生成されたネオエピトープとみなされた。すべてのプロテアーゼ生成配列を相同性および他の切断部位までの距離を分析し、次いでNPS＠：ネットワークタンパク質配列分析(COMBET, BLANCHET, GEOURJON, DELEAGE, Trends Biochem Sci 2000;25: 147-50)を使用して相同性をブラストした。
【００２０】
免疫化手順
6匹の4〜6週齢のBalb/Cマウスを、不完全アジュバントを使用して200μLの乳化抗原(免疫当たり50μg)で腹部の皮下に免疫した(KAFVFPKESD-GGC-KLHおよびGNFEGSQSLV-GGC-OVA(Chinese Peptide Company、Beijing、China))。安定な力価レベルが得られるまで免疫を続けた。最も高い力価を有するマウスを融合のために選択し、細胞融合のための脾臓の単離の3日前に、100μLの0.9％塩化ナトリウム溶液中の50μgの免疫原で静脈内に追加免疫した。融合手順は以前に記載されている(GEFTER, MARGULIES, SCHARFF, Somatic Cell Genet 1977;3:231-6)。
【００２１】
クローンの特性評価
CRP-MMPおよびCRPCATと命名されたそれぞれ潜在的配列KAFVFPおよびGNFEGSを抗体生成のために選択した。モノクローナル抗体のネイティブ反応とペプチド結合を、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート上のビオチン化ペプチド(KAFVFPKESD-K-ビオチンまたはGNFEGSQSLV-K-ビオチン)および増殖中のモノクローナルハイブリドーマからの上清を使用して予備間接ELISAにおけるヒト血清の置換によって評価した。試験したのは、遊離ペプチド(KAFVFPKESDまたはGNFEGSQSLV)、非センスペプチド、および伸長ペプチド(RKAFVFPKESDまたはGGNFEGSQSLV)に対するクローンの特異性であった。モノクローナル抗体のアイソタイピングは、Clonotyping System-HRPキット(Southern Biotech)を使用して行った。選択したクローンを、製造者の指示(GE Healthcare Life Science)に従ってプロテインGカラムを使用して精製した。
【００２２】
アッセイプロトコール
選択したモノクローナル抗体を、製造業者(Innovabio science)の指示に従ってLightning link HRPラベリングキットを使用して、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)で標識した。96ウェルストレプトアビジンプレートをアッセイ緩衝液(25mMトリス、1％BSA、0.1％Tween-20、pH7.4)に溶解した1.25ng/mLのKAFVFPKESD-K-ビオチン(CRP-MMPアッセイ)または0.40ng/mLのGNFEGSQSLVK-ビオチン(CRP-CATアッセイ)で被覆し、20℃で30分間インキュベートした。20μLの遊離ペプチドキャリブレーターまたは試料を適切なウェルに二重に加え、続いて100μLの結合モノクローナル抗体(1A7-HRPまたは3H8-HRP)を添加し、20℃で1時間インキュベートした。最後に、100μlのテトラメチルベンジニジン(TMB)(Kem-En-Tec)を添加し、プレートを暗所で20℃で15分間インキュベートした。上記のインキュベーションのすべての段階には、300rpmでの振とうが含まれている。各インキュベーション段階後、プレートを洗浄緩衝液(20mMトリス、50mM NaCl、pH7.2)中で5回洗浄した。TMB反応を、100μLの停止溶液(1％HCl)を添加することによって停止させ、650nmを基準として450nmで測定した。アミノ酸分析によって正確に定量された合成遊離ペプチドから調製されたマスターキャリブレータを較正曲線として使用し、4パラメトリック数学的フィットモデルを使用してプロットした。
【００２３】
技術的評価と特異性
品質管理(QC)血清試料の2倍希釈物から、100％試料の回収率として直線性を計算した。検出の下限は、21個のゼロ試料(すなわち、緩衝液)から決定され、平均＋3X標準偏差として計算された。アッセイ間およびアッセイ内変動は、8個のQC試料の12回の独立した試験によって決定され、各試験は2回の測定の2つの複製からなっている。
1〜10回凍結し解凍した3つの試料について、血清試料の安定性を測定した。開発したCRP-MMPとCRPCAT ELISAを、異なるMMP、カテプシンおよびアグリカナーゼによってCRPが切断される『インビトロ切断』に記載された物質を使用して評価した。物質をELISAで1：10に希釈した。
【００２４】
患者におけるCRP-MMP、CRP-CAT対全CRP
CRP-MMP、CRP-CATおよび全長ヒトCRP(Quantikine、R＆D System)を、ASと診断された患者の血清中で評価し、エアランゲン・ニュルンベルク大学の医学部3の健康な性別と年齢の一致した対照と比較した。
血清試料は、改訂ニューヨーク基準に従って、および性別および年齢が適合した非罹患対照から、強直性脊椎炎(AS)と診断された患者から回収された。BASDAIおよびmSASSSはAS患者のそれぞれに登録された。
試料をCRP-MMPアッセイおよびCRP-CATアッセイで1：4に希釈した。この研究は、エルランゲン・ニュルンベルク大学の倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言で概説された原則に準拠している。書面による同意が各人から得られた。
【００２５】
統計
AS患者と非罹患対照との間の個々のバイオマーカーの血清レベルを、両側ノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定を使用して比較した。バイオマーカー間の相関はノンパラメトリックスピアマンのテストで調べた。曲線の下の面積は、受信者動作特性曲線(ROC)を使用して測定した。バイオマーカーは、全ての被験体がバイオマーカーの正常(正常個体群の平均のSD以内)または高レベル(＞SD)に分類されるオッズ比(加重レベルから外挿した：個体群の最低値を0に設定し、最高値を1に設定した)で調べた。結果は、p＜0.05であれば統計的に有意であるとみなされた。
CRPM(MMP分解CRP-1/8)の定量化の上限および下限はそれぞれ3.2ng/mlおよび110.0ng/mlであり、イントラ/インターアッセイの変動性は≦11.1％および≦20.8％である(JENKINS et al.補足表および図の説明)。
【００２６】
PF-ILD定義
科学的作業仮説は、線維化ILDにおける肺損傷への応答が、進行性で、自立的で、元の臨床的関連またはトリガーとは無関係に、線維化の進行を含むことである。
それらの生物学的および臨床的挙動、すなわち自立的線維症および肺機能の進行性低下および早期死亡の両者の類似性に基づいて、元のILD診断とは無関係にPF-ILD患者をまとめることは正当であると考えられる。
【００２７】
非臨床開発
ニンテダニブは、肺線維症の前臨床モデル系、およびSSc-ILDおよび関節リウマチを伴うILD(RA-ILD)のより具体的なモデルにおいて調査された。
これらのモデル系における線維性肺病変の開始は異なるが、線維芽細胞の増殖、移動および病原性筋線維芽細胞への形質転換を伴う進行性線維性肺病変が最終的な共通経路である。線維芽細胞の増殖、移動および形質転換に向けられたニンテダニブのこれらの類似性および作用様式は、PF-ILD患者の治療におけるニンテダニブの使用の根拠を強く支持する。同等の用量での肺線維症、SSc-ILDおよびRA-ILDの動物モデルにおけるニンテダニブの有効性は、PF-ILD患者における同等の投薬を示唆している。包括的な非臨床開発プログラムは、適応症IPFのニンテダニブの開発中に完了した；詳細については、OFEV(登録商標)(ニンテダニブ)カプセルの新薬申請(NDA)205832を参照されたい。
【００２８】
薬力学
IPFのインビトロとインビボモデルにおけるニンテダニブの前臨床薬力学的調査中に、肺線維症における作用様式が特性評価された。ニンテダニブは、IPF患者のヒト肺線維芽細胞の増殖と移動を阻害した。データは、Huang et al.,Ann.Rheum.Dis.2016; 75: 883-90に記載されており、治療的ニンテダニブ治療によるマウスにおけるブレオマイシン誘発皮膚線維症の減弱も開示している。更に、ニンテダニブは、SSc-ILDの遺伝子モデルであるFra2+/-マウスにおいて、皮膚および肺線維症ならびに肺血管リモデリングを正常化することが示されている。ニンテダニブは、Denton et al., Nat. Clin. Pract. Rheumatol.2006;1:134-44から認識され得るように、SScの病理生物学における複数の段階で干渉する可能性を有する。
【００２９】
ニンテダニブは、また、筋線維芽細胞への肺線維芽細胞の形質転換を減弱させる。線維芽細胞の増殖、移動および形質転換は、IPFだけでなくSSc-ILDおよびRA-ILDのような肺線維症をもたらすいくつかの疾患の共通の最終経路における基本的プロセスである。肺線維症の3つの動物モデルにおいて、ニンテダニブは、予防的または治療的投薬計画で投与された場合でも、抗線維性および抗炎症活性を示した。これらの研究では、ニンテダニブは、肺切片における炎症、肉芽腫形成および線維症の組織学的スコアを低下させ、気管支肺胞洗浄液(BALF)におけるリンパ球の蓄積を減弱させ、インターロイキン(IL)-1β、ケモカインCXCL1/KC、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤(TIMP)-1および肺組織中のコラーゲン含有量を減少させ、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-β1およびプロコラーゲン1のような線維症関連マーカー遺伝子のメッセンジャーリボ核酸(mRNA)発現を阻止した。
【００３０】
SSc患者の真皮線維芽細胞を用いた実験では、ニンテダニブは移動と増殖を阻害し、細胞外マトリクスマーカーの発現を減少させ、筋線維芽細胞への形質転換を減弱させた。異なる特徴をもったSScおよびSSc-ILDの4つの動物モデルにおいて、ニンテダニブは、皮膚および肺線維症を効果的に減弱させ、皮膚および肺における細胞外マトリックス沈着を減少させ、皮膚および肺における筋線維芽細胞の蓄積を減弱させ、皮膚の肥厚を減少させた。ニンテダニブは、また、真皮の微小血管内皮細胞のアポトーシスを減少させた。更に、ニンテダニブは、血管平滑筋細胞および閉塞した肺血管の数を減少させることによって、SScの動物モデルにおける肺血管リモデリングを効果的に減弱させた。
【００３１】
RA-ILDの動物モデルにおいて、ニンテダニブは、関節炎病変および肺線維症を誘発するザイモサンで刺激されたトランスジェニックSKGマウスにおいて薬力学的効果を有することが見出された(Redente et al., Am.J.Respir.Crit.Care Med.2016; 193: A4170: Nintedanib Reduces Pulmonary Fibrosis In A Model Of Rheumatoid Arthritis Associated Interstitial Lung Disease；図1〜図4と共に実施例1を参照のこと)。このモデルでは、関節炎スコアは、ザイモサン投与後6週間まで増加した。スコアは10週目まで高値を維持し、その後徐々に低下した。しかしながら、肺コラーゲン(コラーゲン沈着のマーカーとしてヒドロキシプロリン)含有量によって決定された肺線維症は、ザイモサン投与後10週目に増加し、16週目まで更に増加した。ザイモサン投与後5週目〜11週目のニンテダニブによる早期治療は、関節炎病変を軽減し、肺機能を改善した(静的肺コンプライアンス)が、肺コラーゲン沈着に対する効果はなかった。ニンテダニブ治療の開始前の最後の測定値にスコアを正規化した場合、10〜16週後のニンテダニブ治療の後にのみ関節炎スコアが減少した。しかしながら、後期治療は、肺におけるコラーゲン沈着の減少によって示される肺線維症を減少させた。ザイモサンで処置したSKGマウスでは、ニンテダニブは肺においてわずかながらも選択的な炎症を誘発するようである。この炎症が線維症を解消するのに役立つのか、または有害なものが開いたままであるのか。
ニンテダニブは、コラーゲン誘発性関節炎(CIA)のマウスモデルにおいても試験された。ニンテダニブ治療は、フロイントアジュバントと混合したII型コラーゲンによる関節炎病変の誘導の13日後に開始した。ニンテダニブによる治療を5週間続けた。関節炎スコアは、ニンテダニブ治療の5週間の間に更に増加した。ニンテダニブは、関節炎スコアに減弱効果はなかった。
肺線維症の異なるインビボモデルにおけるニンテダニブの前臨床調査の概要を表1に示す。
【００３２】
表1  肺線維症の動物モデルにおけるニンテダニブの前臨床調査の概要
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↓有意な減少(使用された用量とは無関係)；↑有意な増加(使用された用量とは無関係)；*ニンテダニブ治療が開始される前にデータが最後のスコアリングに正規化されている場合。
BALF、気管支肺胞洗浄液；IL-1β；インターロイキン-1β；IL-6、インターロイキン-6；TIMP-1、マトリックスメタロプロテアーゼ1の組織阻害剤；KC、ケモカインCXCL1/KC；ECM、細胞外マトリックス；VSMC、血管平滑筋細胞；MVEC、微小血管内皮細胞。
【００３３】
要約すると、下記のことが示されている
・臨床的に関連する濃度のニンテダニブは、ヒト肺線維芽細胞の移動、増殖、収縮および潜在的には線維芽細胞の筋線維芽細胞への変換を阻害すること、
・ニンテダニブは、細胞外マトリックスおよび筋線維芽細胞の活性化のマーカーを減少させ、SSc患者からの真皮線維芽細胞の増殖および移動を阻止すること、
・ニンテダニブは、異なるトリガーによって誘発される肺線維症の様々な動物モデルにおいて、抗線維症、抗血管新生および抗炎症の活性を実証していること、
・診療所への通院は、IPF患者のニンテダニブの良好な有効性を示していること。
更に間質性肺疾患における前臨床試験および臨床解釈が進行中である。2015年12月に開始した間質性肺疾患も発症する全身性強皮症をもった人々におけるニンテダニブを調べるSENSCISTM(ニンテダニブの全身性強皮症における安全性と有効性)調査。
漸進的行動が存在する主な線維化ILDには、下記のものが含まれる：
・IPF、
・iNSIP、
・分類不能型IIP、
・結合組織疾患を伴うILD(CTD-ILD)[主に関節リウマチILD(RA-ILD)および全身性強皮症ILD(sSSc-ILD)]および自己免疫の特徴をもった特発性肺炎(IPAF)を含む自己免疫性ILD
・慢性過敏性肺炎(CHP)および
・環境/職業性線維化肺疾患
IPF患者に利用可能なニンテダニブおよびピルフェニドンを除いて、PF-ILDに承認された治療法はない。IPFおよびSSc-ILDとは別に、他のILDにおいて将来の対照臨床試験は行われていない。
【００３４】
PF-ILDにおけるニンテダニブの評価のための患者集団の定義
PF-ILDは、HRCTについて＞10％の範囲のびまん性線維性肺疾患の特徴をもった患者のセットで定義されており、その肺機能および呼吸器症状または胸部イメージングはILDを治療するために臨床現場で使用される未承認薬、例えばコルチコステロイド、アザチオプリン(AZA)、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)、N-アセチルシステイン(NAC)、リツキシマブ、シクロホスファミド、シクロスポリン、タクロリムスによる治療にもかかわらず悪化した。
治療の開始は、患者の身体試料のCRPM含有量を少なくとも2回測定することであり、CRPMの濃度の変化の割合は、1ヶ月当たり1.7ng/mlよりも大きく、好ましくは1ヶ月当たり1ng/mlよりも大きく、最も好ましくは1ヶ月当たり0ng/mlよりも大きい。
【実施例】
【００３５】
実施例1：関節リウマチを伴う間質性肺疾患モデルにおいてニンテダニブが肺線維症を軽減する
(Redente et al.,Am.J.Respir.Crit.Care Med.2016;193:A4170)：
はじめに：関節リウマチは女性に優先的に作用し、患者の約40.70％が肺の異常および罹患を有する。このグループから約20％が関節リウマチを伴う間質性肺疾患(RA-ILD)を発症する。雌のSKGマウスは、関節炎を起こしやすく、ヒトRA-ILDを確実に再現する：
・関節疾患(100％)と肺疾患(20％)の両方の浸透
・ヒトの細胞性非特異性間質性肺炎と同様の肺組織病理学的および白血球浸潤パターンの発生、
・罹患マウスのサブセットにおける肺線維症の発症
・シトルリン化エピトープに対する循環自己抗体の発生。
理論的根拠：遺伝的に自己免疫性関節炎を発症しやすいSKGマウスもまた、ヒトの細胞性および線維性の非特異性間質性肺炎に似た肺間質性肺炎を発症する。ニンテダニブによる関節炎のSKG動物の早期治療が間質性肺炎の発症を予防するかどうか、およびRAと間質性肺炎を伴うSKG動物の後期介入が線維性負荷の減少をもたらすかどうかを試験するために実験を行った。
【００３６】
方法：5mgのザイモサンを投与して関節炎および関連する間質性肺炎を誘発する雌SKGマウス(50匹/群)におけるニンテダニブの効果を調べた。ザイモサン後5週目または11週目に開始して、マウスに、60mg/kgのニンテダニブまたは対照として生理食塩水の毎日の胃管栄養を与えた。ニンテダニブ治療の6週間後に動物を集め、ヒドロキシプロリンレベル、静的コンプライアンスおよびマッソントリクローム染色が含まれる肺生理学的測定値を測定することによって線維性肺疾患を評価した。肺における炎症をBAL(気管支肺胞洗浄)細胞性および酵素消化した肺で測定した。関節と指の関節炎を毎週スコア化した。
結果：確立された関節炎をもったマウスへのニンテダニブの6週間の治療的送達は、ヒドロキシプロリンおよびコラーゲンに対する染色によって測定された肺コラーゲンの有意な減少を示した。5週目に開始したニンテダニブを投与されたマウスもまた、関節炎発症の有意な減少を示した。ニンテダニブによる治療は、CD4 + T細胞およびB220 + B細胞のわずかではあるが有意な増加を誘導した。ニンテダニブを5週目に開始し11週目に開始しないマウスは、肺好中球および樹状細胞を有意に増加させたが、マクロファージ数に変化はなかった。
結論：結果は、ニンテダニブの治療的送達が関節炎のSKGマウスにおける肺線維症を有意に減少させることを示している。さらに、ニンテダニブによる早期介入は、SKGマウスにおける関節炎の発症を有意に減少させた。この調査は、両方の疾患を改善する可能性のある治療法の特定を支援することによって、関節リウマチと間質性肺疾患の分野に影響を与える。提示されたモデルは、ヒトRA-ILDの発生率と特徴を再現する。
結果を図1〜図4に示す。
【００３７】
実施例2：IPFおよび制限されたFVC障害をもった患者におけるECM代謝回転のバイオマーカーに対するニンテダニブの効果
12週間の二重盲検無作為化プラセボ対照の並行群試験に続いて40週間の単群第2相試験により特発性肺線維症(IPF)および制限された努力性肺活量(FVC)をもった患者における細胞外マトリックス(ECM)代謝回転のバイオマーカーの変化に対する1日に2回の150mgの経口ニンテダニブの効果を評価して、様々な細胞外マトリックス(ECM)代謝回転バイオマーカーに対するニンテダニブの効果および疾患進行に対するこれらのECMバイオマーカーの変化の予測値を調べる。
主要な組入基準：通院1で≧40歳の男性または女性の患者(スクリーニング)；IPF診断は通院0から3年以内のATS/ERS/JRS/ALAT 2011ガイドラインに基づく；HRCTは通院0から18ヶ月以内に実施された；無作為化の前に胸部HRCTおよび外科的肺生検(後に利用可能な場合)の中央判定による診断の確認；FVC≧80％が通院1で正常と予測された(スクリーニング)。
薬量：毎日300mg(150mg 1日2回)で、有害事象(AE)を管理するために200mg(100mg 1日2回)に1日の総用量を減らす可能性がある。
主要評価項目：ベースラインから12週までの血中CRPMの変化率(傾き)。
重要な副次評価項目：絶対FVC(予測％)で定義される疾患進行をもった患者の割合は、≧10％または52週までの死亡を低下する。
副次評価項目：ベースラインから12週までの血中C1Mの変化率(傾き)。ベースラインから12週までの血中C3Mの変化率(傾き)。
更なる評価項目(選択)：12週目から52週目までの血中CRPM、C1MおよびC3Mの変化率(傾き)。
安全基準：有害事象(特にSAEおよび他の重要なAE)、身体検査、体重測定、12誘導心電図、バイタルサインおよび実験室評価。
統計的方法：連続評価項目のランダム係数回帰モデル、ログランク検定、事象までの時間評価項目のKaplan-MeierプロットおよびCox回帰、ロジスティック回帰モデルまたは二値評価項目のための他の適切な方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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