(57)【要約】  特定の多価不飽和長鎖ケトンおよびポリソルベートを含む、エマルジョン状、特に、水中油型エマルジョン状の医薬組成物。前記組成物は、特定の炎症性もしくは増殖性症状の治療または予防に使用し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性エマルジョン状の組成物であって、
（ｉ）  式（Ｉ）の化合物
Ｒ−Ｌ−ＣＯ−ＣＦ3    （Ｉ）
（式中、Ｒは、非置換直鎖Ｃ10〜24不飽和炭化水素基であり、前記炭化水素基は、少なくとも４個の非共役二重結合を含み、
Ｌは、Ｒ基とカルボニルＣＯとの間に２〜５個の原子の橋かけを形成する連結基であり、ここで、Ｌは、前記連結基の骨格にＳ、ＳＯ、ＳＯ2の少なくとも１つを含む）
又はその塩と、
（ｉｉ）  ポリソルベートおよび／またはポロキサマー界面活性剤と、
（ｉｉｉ）  任意に、トリグリセリドと、
（ｉｖ）  緩衝剤、キレート剤および／または脂質溶解性抗酸化剤と
を含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、
（ｉ）  式（Ｉ）の化合物
Ｒ−Ｌ−ＣＯ−ＣＦ3    （Ｉ）
（式中、Ｒは、直鎖Ｃ10〜24不飽和炭化水素基であり、前記炭化水素基は、少なくとも４個の非共役二重結合を含み、
Ｌは、Ｒ基とカルボニルＣＯとの間に２〜５個の原子の橋かけを形成する連結基であり、ここで、Ｌは、前記連結基の骨格にＳ、ＳＯ、ＳＯ2の少なくとも１つを含む）
又はその塩と、
（ｉｉ）  ポリソルベートおよび／またはポロキサマー界面活性剤と、
（ｉｉｉ）  トリグリセリドと、
（ｉｖ）  緩衝剤および／またはキレート剤と
を含む、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、
(ii)  ポリソルベート界面活性剤と、
(iv)  緩衝剤と
を含む、組成物。
【請求項４】
ポリソルベート、例えばポリソルベート８０など、を含む、請求項１〜３に記載の組成物。
【請求項５】
ＭＣＴ油を含む、先行するいずれかの請求項に記載の組成物。
【請求項６】
前記緩衝剤が、クエン酸緩衝液である、先行するいずれかの請求項に記載の組成物。
【請求項７】
前記製剤が、等張性である、先行するいずれかの請求項に記載の組成物。
【請求項８】
前記製剤のｐＨが、約６．０〜９．０である、先行するいずれかの請求項に記載の組成物。
【請求項９】
前記式（Ｉ）の化合物が、式(I')の化合物である、先行するいずれかの請求項に記載の組成物。
Ｒ−Ｙ１−ＣＨ2−ＣＯ−ＣＦ3  （Ｉ'）
（式中、Ｒは前記定義の通りであり、且つ
Ｙ１は、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ2から選択され、好ましくは、
【化７】
2019529555.tif 000026
である。）
【請求項１０】
（ｉ）１〜２０ｍｇ／ｍｌの上述の式（Ｉ）の化合物と、
（ｉｉ）１〜２０ｍｇ／ｍｌのポリソルベートおよび／またはポロキサマー界面活性剤と、
（ｉｉｉ）  １〜２０ｍｇ／ｍｌのトリグリセリドと
を含む、先行するいずれかの請求項に記載の組成物。
【請求項１１】
（ｉ）１〜１０ｍｇ／ｍｌの上述の式（Ｉ）の化合物と、
（ｉｉ）１〜１０ｍｇ／ｍｌのポリソルベートおよび／またはポロキサマー界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）と、
（ｉｉｉ）  １〜１０ｍｇ／ｍｌのトリグリセリド（例えば、ＭＣＴ油）と
を含む、先行するいずれかの請求項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記製剤が、約−２０℃の温度で少なくとも１８カ月間安定している、先行するいずれかの請求項に記載の組成物。
【請求項１３】
更に、キレート剤もしくは抗酸化剤または両方を含む、先行するいずれかの請求項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物を保持する容器と、任意に、前記組成物の使用説明書とを含む製品。
【請求項１５】
空気を置換するための不活性ガスをさらに含む、請求項１４に記載の製品。
【請求項１６】
約２ｍｇの化合物Ｂと、
約２ｍｇのポリソルベート８０と、
約２ｍｇのＭＣＴ油と、
約１０ｍｍｏｌのクエン酸緩衝液と
を含む、エマルジョン状の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１１に記載の医薬組成物を保持する容器と、任意に、前記製剤の使用説明書とを含む製品。
【請求項１８】
約１ｍｇ〜約５００ｍｇの下記式の化合物
【化８】
2019529555.tif 000027
又はその塩と、
約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇのポリソルベート８０と、
約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇのＭＣＴ油と、
緩衝剤と
を含むエマルジョン状の医薬組成物。
【請求項１９】
炎症性もしくは増殖性症状を治療または予防する方法であって、前記治療または予防を必要とする動物、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト）に、請求項１〜１３に記載の組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２０】
動物への前記製剤の非経口投与を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物への前記製剤の静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）または皮下（ｓ．ｃ．）投与を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
動物における炎症性もしくは増殖性症状の治療または予防に使用する薬剤の製造における、請求項１〜１３に記載のエマルジョンの使用。
【請求項２３】
動物における炎症性もしくは増殖性症状の治療または予防に使用する、請求項１〜１３に記載の組成物。
【請求項２４】
炎症性疾患または増殖性症状が、糖尿病性腎症または関節炎、例えば関節リウマチなど、である、請求項２３に記載の如く使用する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の多価不飽和長鎖ケトンを含む、エマルジョン状、特に、水中油型エマルジョン状の医薬組成物に関する。本発明はまた、本発明の組成物を用いて、特定の炎症性もしくは増殖性症状を治療または予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の多価不飽和長鎖ケトンは、乾癬、皮膚炎、皮膚癌、糸球体腎炎および関節リウマチを含む症状の治療に関する多くの先行技術文献に記載されている（特許文献１（欧州特許出願公開第１４６９８５９号明細書）、特許文献２（国際公開第２０１０／１３９４８２号）、特許文献３（国際公開第２０１２／０２８６８８号）、特許文献４（国際公開第２０１４／０８２９６０号）および特許文献５（国際公開第２０１５／１８１１３５号）参照）。
【０００３】
これらの参考文献に記載されている多価不飽和長鎖ケトンは、両親媒性の特徴を有するが、主に疎水性であるため、水に不溶である。水溶性の欠如により、化合物のバイオアベイラビリティが制限され、また当業者が有用な用量のこれら化合物を患者に投与する技量が制限される。特に、水溶性の欠如により、当業者が化合物を患者に非経口（例えば、静脈内、筋肉内または皮下）投与する技量が制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１４６９８５９号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１０／１３９４８２号
【特許文献３】国際公開第２０１２／０２８６８８号
【特許文献４】国際公開第２０１４／０８２９６０号
【特許文献５】国際公開第２０１５／１８１１３５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の多価不飽和ケトン化合物に関するさらなる問題は、分解されやすいことである。これら化合物のいかなる製剤も、化合物が確実に長時間安定した状態を保つ必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、これら化合物の非経口投与の問題およびそれらの安定性の問題に対する解決策を模索した。本発明者らは、これらの化合物が、エマルジョン、特に水中油型エマルジョンとして有利に製剤化できることを見出した。エマルジョンの使用により、保存期間が長くなる可能性があり、また静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）および皮下（ｓ．ｃ．）などの非経口経路による本発明の化合物の投与が可能になると考えられる。
【０００７】
よって、本発明は、一態様において、
（ｉ）  式（Ｉ）の化合物
Ｒ−Ｌ−ＣＯ−ＣＦ3    （Ｉ）
（式中、Ｒは、非置換直鎖Ｃ10〜24不飽和炭化水素基であり、前記炭化水素基は、少なくとも４個の非共役二重結合を含み、
Ｌは、Ｒ基とカルボニルＣＯとの間に２〜５個の原子の橋かけを形成する連結基であり、ここで、Ｌは、前記連結基の骨格にＳ、ＳＯ、ＳＯ2の少なくとも１つを含む）
又はその塩と、
（ｉｉ）  ポリソルベートおよび／またはポロキサマー界面活性剤と、
（ｉｉｉ）  任意に、トリグリセリドと、
（ｉｖ）  緩衝剤、キレート剤および／または脂質溶解性抗酸化剤と
を含む、水性エマルジョン状の組成物を提供する。
【０００８】
本発明は、別の態様において、
（ｉ）  式（Ｉ）の化合物
Ｒ−Ｌ−ＣＯ−ＣＦ3    （Ｉ）
（式中、Ｒは、直鎖Ｃ10〜24不飽和炭化水素基であり、前記炭化水素基は、少なくとも４個の非共役二重結合を含み、
Ｌは、Ｒ基とカルボニルＣＯとの間に２〜５個の原子の橋かけを形成する連結基であり、ここで、Ｌは、前記連結基の骨格にＳ、ＳＯ、ＳＯ2の少なくとも１つを含む）
又はその塩と、
（ｉｉ）  ポリソルベートおよび／またはポロキサマー界面活性剤と、
（ｉｉｉ）  トリグリセリドと、
（ｉｖ）  緩衝剤および／またはキレート剤と
を含む、水中油型エマルジョン状の組成物を提供する。
【０００９】
本発明は、別の態様において、
（ｉ）  式（Ｉ）の化合物
Ｒ−Ｌ−ＣＯ−ＣＦ3    （Ｉ）
（式中、Ｒは、直鎖Ｃ10〜24不飽和炭化水素基であり、前記炭化水素基は、少なくとも４個の非共役二重結合を含み、
Ｌは、Ｒ基とカルボニルＣＯとの間に２〜５個の原子の橋かけを形成する連結基であり、ここで、Ｌは、前記連結基の骨格にＳ、ＳＯ、ＳＯ2の少なくとも１つを含む）
又はその塩と、
（ｉｉ）  ポリソルベート界面活性剤と、
（ｉｉｉ）  トリグリセリドと、
（ｉｖ）  緩衝剤と
を含む、水中油型エマルジョン状の組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、別の態様において、炎症性もしくは増殖性症状を治療または予防する方法であって、前記治療または予防を必要とする動物、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト）に、上記に定義した組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明は、別の態様において、動物における炎症性もしくは増殖性症状の治療または予防に使用する薬剤の製造における上述のエマルジョンの使用を提供する。
【００１２】
本発明は、別の態様において、動物における炎症性もしくは増殖性症状の治療または予防に使用する上述の組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、別の態様において、上記に定義した組成物を担持する容器を含む製品を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［定義］
「本発明の化合物」という用語は、式（Ｉ）の活性剤またはその塩もしくは溶媒和物、特に、本明細書に定義している化合物ＡまたはＢに関する。
【００１５】
「水中油型製剤」および「水中油型エマルジョン」という用語は、互換的に用いられ、水相中における分散を表す。「分散相」は、水相（「連続相」）中に本発明の化合物を含む。
【００１６】
「ナノエマルジョン」という用語は、連続水相において、直径がナノメートル、すなわち１〜１０００ｎｍ未満の疎水性液滴である「ナノ液滴」を分散油相が含む、水中油型エマルジョンに関する。
【００１７】
本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその塩を含むエマルジョン、特に水中油型エマルジョン、および炎症性または増殖性症状などの様々な症状の治療または予防におけるそれらの使用に関する。本発明の化合物は、水中油型エマルジョンの分散相中に存在するのが好ましい。
【００１８】
［本発明の化合物］
前記エマルジョンは、式（Ｉ）の化合物を少なくとも１つ含む。
【００１９】
Ｒ−Ｌ−ＣＯ−ＣＦ3      （Ｉ）
好ましくは、本発明のエマルジョンに存在する式（Ｉ）の化合物は、１種類のみである。
【００２０】
Ｒ基は、好ましくは、５個〜９個の二重結合、好ましくは５個〜８個の二重結合（例えば、５個または６個の二重結合など５個〜７個の二重結合）を含む。これらの結合は、非共役であるべきである。二重結合が、カルボニル官能基と共役していないことも好ましい。
【００２１】
Ｒ基に存在する二重結合は、シスまたはトランス配置であってもよいが、存在する二重結合の大部分（すなわち、少なくとも５０％）がシス配置であるのが好ましい。さらに有利な実施形態においては、Ｒ基における全ての二重結合がシス配置であるか、またはトランス配置であり得るカルボニル基に最も近い二重結合を除いて全ての二重結合がシス配置である。
【００２２】
Ｒ基は、１０個〜２４個の炭素原子、好ましくは１７個〜１９個の炭素原子を有し得る。
【００２３】
Ｒ基は、非置換である。Ｒ基は、直鎖である。Ｒ基は、好ましくは、長鎖脂肪酸またはエステルなどの天然源に由来する。
【００２４】
連結基Ｌは、Ｒ基とカルボニルとの間に２〜５個の骨格原子、好ましくは２〜４個の骨格原子の橋かけ基を提供する。リンカーの骨格における原子は、炭素およびヘテロ原子であり得るが、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ2の少なくとも１つを含む。前記連結基は、好ましくは非置換である。これは、好ましくは直鎖である。
【００２５】
連結基の好ましい成分は、−ＣＨ2−、−Ｓ−、−ＳＯ−および−ＳＯ2−であり、これらは任意の（化学的に意味のある）順序で互いに組み合わせ、連結基を形成することができる。よって、２つのメチレン基および１つの−Ｓ−基を使用することにより、リンカー−ＳＣＨ2ＣＨ2−が形成される。
【００２６】
連結基Ｌは、骨格中に少なくとも１個のヘテロ原子を含む。Ｒ基に結合した連結基の最初の骨格原子が、ヘテロ原子または−Ｓ−、−ＳＯ−および−ＳＯ2−から選択されるヘテロ原子の基であるのも好ましい。
【００２７】
連結基Ｌが、骨格に少なくとも１個の−ＣＨ2−結合を含むのが非常に好ましい。理想的には、カルボニルに隣接する連結基の原子は−ＣＨ2−である。
【００２８】
ヘテロ原子−Ｓ−、−ＳＯ−または−ＳＯ2−が、カルボニルに対してα、β、γまたはδ、好ましくはカルボニルに対してβまたはγに位置するのが好ましい。
【００２９】
従って、非常に好ましい連結基は、−ＳＣＨ2−、−ＳＯＣＨ2−または−ＳＯ2ＣＨ2−である。
【００３０】
式（Ｉ）の好ましい化合物は、式（Ｉ’）のものである。
【００３１】
Ｒ−Ｙ１−ＣＨ2−ＣＯ−ＣＦ3  （Ｉ’）
（式中、Ｒは前記定義の通りであり、且つ
Ｙ１は、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ2から選択される。）
本発明において使用する非常に好ましい化合物を以下に示す。
【００３２】
【化１】
2019529555.tif 000002
【００３３】
以下の化合物、特に化合物Ｂは、本発明における使用に非常に好ましい。
【００３４】
【化２】
2019529555.tif 000003
【００３５】
可能な場合、前記化合物は、塩または溶媒和物としてエマルジョン中に存在し得る。しかしながら、そのような形態は使用しないのが好ましい。
【００３６】
式（Ｉ）の化合物は、J. Chem. Soc., Perkin Trans 1, 2000, 2271-2276またはJ. Immunol., 1998, 161, 3421に見られる公知の化学合成経路を用いて製造し得る。
【００３７】
驚くべきことに、現在では、本明細書に記載の構造を有する化合物は、ポリソルベートまたはポロキサマー界面活性剤および任意にトリグリセリド賦形剤と組み合わせると、水中油型エマルジョンなどのエマルジョン、好ましくはナノエマルジョンとして製剤化できることが確立されている。驚くべきことに、記載されている化合物のエマルジョンは、特に冷蔵庫または冷凍庫の温度で、優れた長期保存安定性を有することが分かっている。
【００３８】
理論に拘束されることを望むものではないが、記載されている化合物は、両親媒性の特徴を有するが、主に疎水性である。これらの特徴の結果として、本発明の化合物は、水性環境において、例えばミセルなどの規則ナノ構造を形成することができると考えられる。これらのミセルは、純粋な形態又は従来の溶媒中において化合物が通常取る構造ではない。本発明者らは、本発明の化合物とトリグリセリド賦形剤の両方を含む、例えば混合ミセルなどの特に安定した構造が、優れた保存安定性を有することを確立した。
【００３９】
エマルジョン中の本発明の化合物の量は、変化し得る。適切な量としては、エマルジョン１ｍｌあたり１〜５００ｍｇ、例えば１〜３００ｍｇなど、より好ましくは１〜２５０ｍｇ、特に１〜１５０ｍｇ、特に１〜１００ｍｇが挙げられる。１〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば１〜１０ｍｇ／ｍｌなどの値が特に好ましい。
【００４０】
［ポリソルベートおよび／またはポロキサマー界面活性剤］
本発明のエマルジョンは、ポリソルベートおよび／またはポロキサマー界面活性剤を含む。界面活性剤の適切な濃度は、１ｍＬのエマルジョン中、界面活性剤０．１〜１００ｍｇ、例えば０．１〜２５ｍｇなど、好ましくはエマルジョン１ｍｌあたり０．２〜２０ｍｇ、例えば０．５〜１５ｍｇなど、特に１〜１２ｍｇである。
【００４１】
ポリソルベート界面活性剤は、ソルビタンをベースとし、これは１分子当たり４個のＯＨ基を有する糖誘導体である。適切な界面活性剤は、ソルビタンのＯＨ基が反復エトキシ基でキャップされており、反復エトキシ基の１つは、それ自体が、脂肪酸エステルでキャップされているものである。
【００４２】
ポリソルベート２０、４０、６０または８０などのポリソルベートを使用することができる。特に好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０である。
【００４３】
また、界面活性剤は、ポロキサマーであってもよい。「ポロキサマー」という用語は、当技術分野の用語であり、ポリオキシプロピレンの中央ブロックおよびポリオキシエチレンの２つの外側ブロックを有するブロックポリマーを表す。特に好ましいポロキサマーは、ポロキサマー１８８である。
【００４４】
一般に、ポリエトキシル化非イオン界面活性剤が、ここでは適している。
【００４５】
２種以上のポリソルベート、２種以上のポロキサマーまたはポロキサマーとポリソルベートなどの界面活性剤の混合物を使用することが可能である。好ましくは、１種の界面活性剤を使用する。
【００４６】
好ましい実施形態では、活性化合物は、上記で定義された化合物ＡまたはＢであり、界面活性剤はポリソルベート、特にポリソルベート８０である。
【００４７】
［トリグリセリド賦形剤］
本発明の組成物は、界面活性剤の他に、１種以上のトリグリセリド、好ましくは１種のトリグリセリドを含み得る。トリグリセリド成分は、理想的には、本発明の化合物を溶解し、界面活性剤の存在下で水性環境においてミセルの形成を促進するように作用する。
【００４８】
トリグリセリドが微量成分である場合、本発明の化合物により形成されるミセルの形成を促進および／またはミセルの安定性を向上させることが分かる。賦形剤が主成分である（すなわち、化合物よりも多量の重量パーセントで存在する）場合、賦形剤は、化合物の一種の担体と見なすことができる。
【００４９】
トリグリセリドは、好ましくは中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）であり、これは、３つのＣ６〜Ｃ１２脂肪酸、特にカプロン酸（Ｃ６：０）、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）またはラウリン酸（Ｃ１２：０）でエステル化されたグリセロール骨格を有する化合物である。適切な原料としては、コーン油、ひまわり油、落花生油、オリーブ油、ヤシ油、または、最も好ましくは高純度ヤシ油であるＭＣＴ油が挙げられる。
【００５０】
賦形剤の適切な濃度は、１ｍＬのエマルジョン中、トリグリセリドが０．１〜５００ｍｇ、例えば０．１〜２５ｍｇなど、好ましくは、エマルジョン１ｍＬにつき、０．２〜２０ｍｇ、例えば０．５〜１５ｍｇなど、特に１〜１２ｍｇである。複数のトリグリセリドの混合物が賦形剤として使用される場合、これらの濃度は、それらトリグリセリドの混合物に関するものである。
【００５１】
好ましい一実施形態において、化合物は、本明細書に定義している化合物ＡまたはＢであり、トリグリセリドはＭＣＴ油である。さらにより好ましい一実施形態において、化合物は、ＡまたはＢであり、トリグリセリドはＭＣＴ油であり、且つ、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【００５２】
好ましい一実施形態においては、
（ｉ）  １〜２０ｍｇ／ｍｌの上述の式（Ｉ）の化合物と、
（ｉｉ）  １〜２０ｍｇ／ｍｌのポリソルベートおよび／またはポロキサマー界面活性剤と、任意に、
（ｉｉｉ）  １〜２０ｍｇ／ｍｌのトリグリセリドと
であり得る。
【００５３】
好ましい一実施形態においては、
（ｉ）  １〜１０ｍｇ／ｍｌの上述の式（Ｉ）の化合物と、
（ｉｉ）  １〜１０ｍｇ／ｍｌのポリソルベートおよび／またはポロキサマー界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）と、
（ｉｉｉ）  １〜１０ｍｇ／ｍｌのトリグリセリド（例えば、ＭＣＴ油）と
であり得る。
【００５４】
理想的には、エマルジョンの残量は、緩衝剤および／またはキレート剤（および水）である。
【００５５】
［他の成分］
本発明のエマルジョンは、緩衝剤、脂溶性抗酸化剤および／またはキレート剤を含む。好ましくは、本発明のエマルジョンは、緩衝剤および／またはキレート剤を含む。理想的には、エマルジョンは、緩衝剤を含む。
【００５６】
存在するいかなる緩衝剤も、エマルジョンのｐＨを７前後で維持するのが理想的である。好ましくは、緩衝剤は、エマルジョンのｐＨを６〜９、好ましくは６〜８、より好ましくはｐＨ７±０．５の範囲に維持する。任意の適切な緩衝剤を使用し得る。しかしながら、特に好ましい緩衝剤は、クエン酸緩衝液である。理想的には、エマルジョンは等張性である。緩衝剤のモル濃度は、５〜２０ｍｍｏｌ、例えば１０ｍｍｏｌなどであり得る。
【００５７】
クエン酸緩衝液などのある一定の緩衝剤もまた、微量の金属を結合することにより、本発明の化合物の酸化的分解を減少させ得る。
【００５８】
緩衝剤の代わりにまたは緩衝剤と共に、別のキレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはその塩）も存在していてもよい。
【００５９】
組成物はまた、トコフェロールまたは他のビタミンＥ類似体などの脂質溶解性抗酸化剤を含んでいてもよい。
【００６０】
本発明のエマルジョンはまた、他の活性成分（例えば、他の薬剤）を含んでいてもよいが、これは好ましくはない。
【００６１】
最も好ましい実施形態において、エマルジョンは、本発明の化合物、ポリソルベートまたはポロキサマー界面活性剤、トリグリセリド賦形剤ならびに緩衝剤および／またはキレート剤（水と共に）からなる。
【００６２】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの式ＡまたはＢの化合物と、
【００６３】
【化３】
2019529555.tif 000004
【００６４】
約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇのポリソルベート８０と、
約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇのＭＣＴ油と、
緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝液）と
を含む水性エマルジョン状の医薬組成物を提供する。
【００６５】
［ナノエマルジョン］
好ましい一実施形態において、本発明のエマルジョンは、ナノエマルジョンである。ナノエマルジョンは、分散油相および連続水相を含む。分散相の粒子は、１〜１０００ｎｍ未満、好ましくは５〜２００ｎｍの平均粒径を有する。粒径は、常法により、例えば、顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ、ＡＦＭ）、光散乱技術（光子相関分光法（ＰＣＳ））などにより、測定することができる。
【００６６】
本発明のエマルジョン、例えば、本発明のナノエマルジョンなどは、一般に、成分（化合物、界面活性剤、賦形剤および任意の添加剤）を混合し、注射用水（ＷＦＩ）を用いてその体積を所定レベルに増加させることにより形成される。界面活性剤を添加する前に、本発明の化合物をトリグリセリドと事前に接触させてもよい。典型的には、緩衝剤／キレート剤を含有する水を添加する。
【００６７】
次いで、例えば、シェーカーの使用および／または超音波処理により成分の混合物を撹拌することができる。このエマルジョンは、製造後、滅菌濾過してもよい。
【００６８】
［安定性］
本発明の組成物中に存在する化合物は、様々な副生成物に分解し得る。安定性試験において、本発明者らは、特に注目すべき副生成物が、本発明の化合物から誘導されるスルホキシドおよびチオール化合物であることを特定した。副生成物の生成は、本明細書に記載のエマルジョンである化合物の製剤により減少させることができる。
【００６９】
実施例により例示されるように、本発明の界面活性剤および賦形剤を含むエマルジョンは、優れた長期保存安定性を有する。「安定した」とは、クロマトグラフにより測定される化合物のピーク面積の減少が、５℃で１ヶ月間の保存後２０％以下、好ましくは５℃で３ヶ月間の保存後２０％以下、好ましくは、不活性雰囲気中、５℃で６ヶ月間の保存後２０％以下であることを意味する。
【００７０】
好ましくは、ピーク面積の減少は、５℃で１ヶ月間、３ヶ月間または６ヶ月間の保存後、１０％以下である。最も好ましくは、ピーク面積の減少は、不活性雰囲気中、５℃で１ヶ月間、３ヶ月間または６ヶ月間の保存後、５％以下である。
【００７１】
好ましくは、クロマトグラフにより測定される化合物のピーク面積の減少が、−２０℃で１ヶ月間の保存後、５％以下、好ましくは−２０℃で３ヶ月間の保存後、好ましくは、不活性雰囲気中、−２０℃で６ヶ月間の保存後、５％以下である。好ましくは、ピーク面積の減少は、不活性雰囲気中、−２０℃で１ヶ月間、３ヶ月間または６ヶ月間の保存後、３％以下である。最も好ましくは、ピーク面積の減少は、不活性雰囲気中、−２０℃で１ヶ月間、３ヶ月間または６ヶ月間の保存後、２％以下である。
【００７２】
［製品］
本発明の組成物は、患者への投与に適している。エマルジョンを投与するために、この組成物は、エマルジョンを保持する容器において提供してもよい。この容器は、組成物の投与に関する説明書と共にキットの一部であってもよい。投与経路が皮下、筋肉内または静脈内などの非経口である場合、容器は所定量の製剤を含む投与装置（例えば、プレフィルドシリンジ）であってもよい。
【００７３】
容器は、空気を置換することにより保存安定性を最大にするために添加された不活性ガスを含むことが好ましい。
【００７４】
適切な容器の容量は、最高１０ｍｌ、例えば１〜１０ｍｌなどであってもよい。
【００７５】
［治療］
本発明のエマルジョンは、乾癬、糸球体腎炎、ループス腎炎、糖尿病性腎症、関節リウマチ、皮膚炎および皮膚癌などの癌を含む炎症性疾患もしくは増殖性症状の治療または予防に使用するために提案されている。特に、本発明のエマルジョンは、糖尿病性腎症および関節リウマチなどの関節炎を含む炎症性疾患もしくは増殖性症状の治療または予防に使用するために提案されている。
【００７６】
治療することまたは治療とは、以下のうちの少なくとも１つを意味する。
（ｉ）．疾病を抑制すること、すなわち、疾病の発症またはその再発またはその少なくとも１つの臨床症状もしくは亜臨床症状を阻止、軽減あるいは遅延させること、または
（ｉｉ）．疾病の１つ以上の臨床症状もしくは亜臨床症状を緩和または減弱させること。
【００７７】
予防とは、（ｉ）哺乳動物において発症する疾病の臨床症状の発現を予防または遅延させることを意味する。
【００７８】
治療対象にとってのベネフィットは、統計的に有意であるか、または患者もしくは医師にとって少なくとも認知可能である。一般に、「治療」がいつ生じるか、当業者には分かる。本発明の組成物を、治療に、すなわち予防ではなく、発現している症状を治療するために使用するのが特に好ましい。本発明の組成物は、予防よりも治療に使用する場合により効果的であり得る。
【００７９】
本発明の組成物は、任意の動物対象、特に哺乳動物、より詳細には疾病のモデルとしての役割を果たすヒトまたは動物（例えば、マウス、サルなど）に使用することができる。
【００８０】
疾病を治療するためには、有効量の活性組成物を患者に投与する必要がある。「治療有効量」とは、状態、疾患または症状を治療するために動物に投与した場合、当該治療を行うのに十分である組成物の量を意味する。「治療有効量」は、組成物、疾病およびその重症度ならびに治療対象の年齢、体重、体調および反応性によって変わり、最終的には担当医の裁量に任される。
【００８１】
本発明により癌を治療するためには、本発明の組成物を一定の間隔で再投与しなければならない場合もあり得る。適切な投与計画は、医師により処方され得る。
【００８２】
当然のことながら、本発明に従って使用する医薬組成物は、理想的には、非経口投与用の形態（例えば、注射用エマルジョンとしてなど）である。
【００８３】
治療用量は、一般に、約１０〜２０００ｍｇ／日、好ましくは約３０〜１５００ｍｇ／日であろう。使用し得る他の範囲としては、例えば、５０〜５００ｍｇ／日、５０〜３００ｍｇ／日、１００〜２００ｍｇ／日などが挙げられる。
【００８４】
投与は、１日１回、１日２回またはより頻繁であってもよく、疾病または疾患の維持期間中に減らしてもよい（例えば、毎日または１日２回ではなく、２日または３日に１回など）。その用量および投与頻度は、当業者に知られている急性期の少なくとも１つ以上、好ましくは２つ以上の臨床徴候の減少または欠如により、寛解期の維持を確認できる臨床徴候により決まるであろう。
【００８５】
下記の非限定的な実施例により、以下、本発明をさらに説明する。
【００８６】
［実施例］
実験において、以下の化合物を使用する。
【００８７】
【化４】
2019529555.tif 000005
【００８８】
［実施例１］
［安定性試験］
安定性試験のために製剤を二つずつ調製した。
【００８９】
【表１】
2019529555.tif 000006
【００９０】
クエン酸緩衝液は、クエン酸一水和物１．５ｍＭ、クエン酸三ナトリウム二水和物８．５ｍＭおよび注射用水（ＷｆＩ；ｐＨ＝７）から成り、空気置換には、アルゴンを使用する。
a：２ｍｇ／ｍｌのＭＣＴ油および２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を用いて化合物Ｂをクエン酸ナトリウム１０ｍＭ（ｐＨ７）中で可溶化する。充填工程の一環として、サンプルをアルゴンで飽和させ、１０ｍｌの凍結安定性ポリマーバイアルに充填する。
【００９１】
下記表１ｂでは、テスト材料約５００ｍｇを１０ｍｌのメスフラスコに正確に検量し、ＡＣＮ／水＝９５：５でその容量まで希釈することにより、サンプルを調製した。各時点での重複サンプルを調製する。
【００９２】
【表２】
2019529555.tif 000007
【００９３】
［一般的手順］
成分：ナノエマルジョン１ｍｌにつき化合物Ｂ２ｍｇ：ＭＣＴ油２ｍｇ／ｍｌおよびＰ８０  ２ｍｇ／ｍｌおよびクエン酸緩衝液１０ｍＭ
１．化合物Ｂ  ７９１ｍｇ
２．ＭＣＴ油  ７５０ｍｇ
３．ポリソルベート８０  ７５０ｍｇ
４．クエン酸ナトリウム緩衝液  １０ｍＭ、ｐＨ７、３７５ｍｌにする量
成分１および２を、周囲温度にて容器内で混合し、アルゴンでフラッシュする。成分３を、混合しながら添加する。この混合物を、水浴中で８０〜８５℃に加熱する。頻繁に混合／撹拌しながら、成分４を６０〜８０℃でゆっくり添加する。この生成物を、濾過滅菌し、アルゴンでパージし、１０ｍｌのバイアルに充填した。バイアルを、封止する前にアルゴンでフラッシュする。バイアルを、−２０℃で凍結させた。
【００９４】
［アッセイ、純度および不純物］
使用した方法は、ＵＶ検出を用いたＲＰ−ＨＰＬＣ法である。条件は、以下にまとめている。
【００９５】
【表３】
2019529555.tif 000008
【００９６】
ＡＹ−１４について、３ヶ月のデータは、テストしたパラメータに変化がないことを示し、−２０℃で良好な安定性を示している。
【００９７】
製剤Ａ〜Ｄおよび４連のＡＹ１４の安定性を、以下の表に示す。
【００９８】
【表４】
2019529555.tif 000009
【００９９】
2019529555.tif 000010
【０１００】
2019529555.tif 000011
【０１０１】
クロマトグラムは手作業で積分され、重なりピーク／テーリングピークおよび「ゴーストピーク」により、積分にはある程度の誤差はつきものである。しかしながら、この保持域において、ゴーストピーク／重なりピークは観察されていないため、報告されているスルホキシドの量は正確であると考えられるべきである。
【０１０２】
上記のデータから分かるように、製剤Ａ／Ｂに関する化合物Ｂのピーク面積は、−２０℃での６ヶ月間の保存後であっても本質的に変化しなかった。
【０１０３】
［実施例２］
さらなる製剤を調製した。
【０１０４】
【表５】
2019529555.tif 000012
【０１０５】
３つの製剤は全てｐＨ＝７であり、空気置換にはアルゴンが使用される。これらの実施例は、次のようにまとめることができる。
ＡＹ１２−０１：化合物Ｂ  １．０ｍｇ／ｍｌ  静脈注射（「ミセル」：Ｐ８０  ５ｍｇ／ｍｌ  ＭＣＴ油  ５ｍｇ／ｍｌ  Ｎａ−ＥＤＴＡ  ５ｍＭ  ｐＨ７）
ＡＹ１２−０２：化合物Ｂ  ２．０ｍｇ／ｍｌ  皮下注射（「ミセル」：Ｐ８０  １０ｍｇ／ｍｌ  ＭＣＴ油  １０ｍｇ／ｍｌ  Ｎａ−ＥＤＴＡ  ５ｍＭ  ｐＨ７）
ＡＹ１２−０３：化合物Ｂ  ５．０ｍｇ／ｍｌ  皮下注射（「ミセル」：Ｐ８０  ２５ｍｇ／ｍｌ  ＭＣＴ油  ２５ｍｇ／ｍｌ  Ｎａ−ＥＤＴＡ  ５ｍＭ  ｐＨ７）
これらの材料は、比較例に照らしてテストされている。
ＡＹ１２−０４：化合物Ｂ  ２．０ｍｇ／ｍｌ  皮下注射（純ＭＣＴ油中）
ＡＹ１２−０５：化合物Ｂ  ５．０ｍｇ／ｍｌ  皮下注射（純ＭＣＴ油中）
ＡＹ１２−０６：化合物Ｂ  ２．５ｍｇ／ｍｌ  腹腔内注射（純ＤＭＳＯ中）
そのデータは、表５に記載されている。
【０１０６】
【表６】
2019529555.tif 000013
【０１０７】
［実施例３］
［バックグラウンド］
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）は、前臨床研究で一般的に使用される関節炎モデルである。このモデルでは、フロイント完全アジュバントに乳化したＩＩ型コラーゲン（軟骨成分）を高反応系ＤＢＡ／１マウス系統（またはラットやサルなどの他の種）に注射することによりこの疾病を引き起こさせる。コラーゲンの導入により、耐性が破壊され、関節に対する免疫媒介性の炎症性発作が誘発され、これは、関節炎指数スコアに基づいて標準的な疾病パラメータを評価することにより測定することができる（関節炎の動物モデル：予防と治療のための革新的なツール（Animal models for arthritis: innovative tools for prevention and treatment）、Ann Rheum Dis. 2011年8月;70(8):1357-62）。
【０１０８】
［被験物および製剤］
以下の化合物が使用される：
【０１０９】
【化５】
2019529555.tif 000014
【０１１０】
２ｍｇ／ｍｌの化合物Ｂ、２ｍｇ／ｍｌのＭＣＴ油（Lipoid社）、２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０（Fluka社）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）を含有するナノエマルジョンにおいて、化合物Ｂを皮下投与用に処方した。最終溶液を濾過滅菌し、アルゴン５．０ＡＧＡで飽和させた後１０ｍｌチューブに分注し、さらに使用するまで−２０℃で保存した。
【０１１１】
［動物］
７〜１０週齢のオスのＤＢＡ／１マウスを、中国の北京バイタルリバー研究所（Beijing Vital River laboratories）から入手した（試験開始時の平均体重：１８〜２５ｇ）。動物は、１２時間の明／１２時間の暗のサイクルで、温度２３±２℃、湿度４０〜７０％に設定された動物室に収容した。ＳＰＦ（血清病原体不在）マウス成長飼育飼料（Beijing KeaoXieli feed Co. LTD）を、試験中の生存期間を通して自由に与えた。水は自由に摂取できた。
【０１１２】
［コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）−実験計画］
［群］
４０匹の雄ＤＢＡ／１マウスを４群に分け、下記の計画に従って処置した。
【０１１３】
【表７】
2019529555.tif 000015
【０１１４】
［ＣＩＡの誘発］
雄ＤＢＡ／１マウス（偽群を除く）において、尾基部に等容量のウシＩＩ型コラーゲン溶液（２ｍｇ／ｍｌ）とフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）とを含む０．１ｍｌのエマジョンを用いて免疫することによりＣＩＡを誘発した。最初の注射は０日目に行い、追加免疫としての２回目の注射は２１日目に行った。処置は２回目のコラーゲン注射の１時間前に開始し、少なくとも２１日間継続した。
【０１１５】
［ＣＩＡ評価および処置］
マウスにおけるＣＩＡは、２人の盲検観察者が容量測定法により足の腫脹を測定し、評価した。関節炎の発症は、下記のように０（腫脹なし）〜４（重度の腫脹および紅斑）の範囲の臨床スコアを用いて、４本の足すべてを紅斑および腫脹の重症度について点数化することにより観察した結果、得られた最大関節炎指数（ＡＩ）スコアは１６（４本足×足１本あたりの最大スコア）であった（J Med Chem. 2014年9月25日;57(18):7523-35、Kokotos等）。
【０１１６】
【表８】
2019529555.tif 000016
【０１１７】
処置群ごとの詳細な投与データは以下の通りであった。
第１群：コラーゲンを投与していない７匹のマウスを、溶媒ＤＭＳＯ（毎日）で３週間処置した。
第２群：１１匹のマウスをコラーゲンで誘発し、溶媒ＤＭＳＯ（毎日）で３週間処置した。
第３群：１１匹のマウスをコラーゲンで誘発し、化合物Ｂ（５ｍｇ／ｋｇ、毎日）で３週間処置した。
第４群：１１匹のマウスをコラーゲンで誘発し、化合物Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、毎日）で３週間処置した。
【０１１８】
試験の終わりに、全てのマウスを、二酸化炭素吸入により適用される倫理法に従って安楽死させた。
【０１１９】
［臨床所見］
動物の体調および臨床徴候（もしあれば）を、個々の動物について、処置開始前に１回と、試験期間中毎日１回記録した。毎日、同一の時間間隔で観察を行った。体重測定も、対応する群への割り当ての日と、その後関節炎評価の各日に行った。
【０１２０】
［統計解析］
データは、平均値±標準偏差として提示した。結果の統計解析は、独立サンプルｔ検定により行った。ｐ＜０．０５の値を、有意と見なした。
【０１２１】
［結果］
［ＣＩＡマウスモデルにおける体重に対する化合物Ｂの効果］
３２日目から実験の終わりまで、偽マウスと比較して、ＣＩＡ対照マウスにおいて体重の有意な減少が観察された（ｐ＜０．００５）。ＣＩＡが進行するにつれて、このような体重の減少、すなわち削痩は、このモデルに典型的である。溶媒で処置したＣＩＡ群と比較して、３４日目および３９〜４３日目に化合物Ｂの５ｍｇ／ｋｇ群（ｐ＜０．０５〜０．００５）および２５日目および３２〜４３日目に化合物Ｂの１０ｍｇ／ｋｇ群（ｐ＜０．０５〜０．００５）の体重減少が有意に抑制された（表７）。
【０１２２】
［ＣＩＡマウスモデルにおける関節炎指数（ＡＩ）に対する化合物Ｂの効果］
ＣＩＩ免疫マウスにおいて、３２日目までにＣＩＡ発生率１００％が観察され、最大ＡＩの４．１８が、免疫後４３日目に観察された。全群のＡＩおよび発生率は、２７日目から４３日目まで経時的に増加した。
【０１２３】
４１〜４３日目に、化合物Ｂの１０ｍｇ／ｋｇ群のＡＩは、ＣＩＡ対照群と比較して、有意に減少した（ｐ＜０．０５）。化合物Ｂの５ｍｇ／ｋｇ群のＡＩ指数も、ＣＩＡ対照群と比較した場合、減少したが、その減少は統計的有意性には達しなかった（ｐ＞０．０５）（表８）。
【０１２４】
化合物Ｂで処置した動物において、明らかな他の臨床所見または副作用は見られなかった。
【０１２５】
試験結果は、とりわけ、関節炎が、ＤＢＡ／１マウスにおいて成功裏に誘発されたことを示した。皮下投与による処置。化合物Ｂは、副作用なく、関節炎症状および疾病スコアを低下させた。
【０１２６】
【表９】
2019529555.tif 000017
【０１２７】
【表１０】
2019529555.tif 000018
【０１２８】
［実施例４］
以下の化合物が使用される。
【０１２９】
【化６】
2019529555.tif 000019
【０１３０】
ＳＴＺ糖尿病性腎症モデルは、ヒトの疾病のいくつかの特徴を再現することから、前臨床糖尿病および腎臓研究において頻繁に使用されている。このモデルでは、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（菌ストレプトマイセス・グリセウスからの非常に反応性の高いニトロソ尿素基を有するグルコース部分）をラット（またはマウス）に注射し、膵臓のインスリン産生β細胞の選択的破壊を誘導する。これにより、血糖値が上昇し、４〜６週間の期間内（および最大２４週間まで）に、腎臓の血行動態の変化、糸球体基底膜の厚さの増加、ならびに腎臓における炎症および線維症の発症の促進を特徴とする進行性腎臓病を引き起こす。重要なことに、このモデルにおける疾病進行は、様々な生化学的指標（尿蛋白、アルブミン、タンパク質からクレアチニン配給量など）または組織学的指標（α−ＳＭＡ、フィブロネクチンなど）の増加レベルを分析することによりモニターでき、長期投与薬剤の作用の直接評価を可能にする（Tesch, Nephrology (Carlton).2007年6月;12(3):261−6）。
【０１３１】
［被験物および製剤］
２ｍｇ／ｍｌの化合物Ｂ、２ｍｇ／ｍｌのＭＣＴ油（Lipoid社）、２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０（Fluka社）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）を含有するナノエマルジョンにおいて、化合物Ｂを皮下投与用に処方した。最終溶液を濾過滅菌し、アルゴン５．０ＡＧＡで飽和させた後１０ｍｌチューブに分注し、さらに使用するまで−２０℃で保存した。化合物ＢおよびＭＣＴ油を含まない別個のポリソルベート８０およびクエン酸ナトリウム緩衝液をベースとする溶媒溶液も調製し、滅菌し、分注し、保存し、ＳＴＺ動物試験で使用する皮下溶媒コントロールとした。
【０１３２】
［動物］
５〜６週齢のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを、米国テキサス州ヒューストンのＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した（試験開始時の平均体重：１２５〜１３５ｇ）。動物は、１２時間の明／１２時間の暗のサイクルで、温度２３±２℃、湿度４０〜７０％に設定された動物室に収容した。Ｌａｂｄｉｅｔ  ５００１（PMI Nutrition International）を、試験中の生存期間を通して自由に与えた。水は自由に摂取できた。
【０１３３】
［実験用具とアッセイ］
以下の用具を使用した。
ケミストリー：
血糖：ＲｅｌｉＯｎ  Ｕｌｔｉｍａ血糖測定器および試験紙
尿蛋白：Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイキット：Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔc  Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素試薬およびＢＳＡのスタンダードセット。カタログ番号５００−０２０５（Bio-Rad Laboratories、Inc.米国カリフォルニア州ヘラクレス）。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔは、アルカリ性銅酒石酸溶液およびフォリン試薬とのタンパク質の反応に基づく比色アッセイである。
【０１３４】
尿中アルブミン：ラット尿中アルブミンキットのＮｅｐｈｒａｔ  ＩＩ定量（Nephrat II Quantitative Determination of Rat Urinary Albumin Kit）。カタログ番号ＮＲ００２ストリッププレート（Strip Plate）（Exocell Inc.、米国ペンシルベニア州フィラデルフィア）。Ｎｅｐｈｒａｔ  ＩＩは、ラット検体中の尿中アルブミンを定量するための直接競合ＥＬＩＳＡである。抗ラットアルブミン抗体−ＨＲＰコンジュゲートを標準物質および希釈尿サンプルと反応させる。発色基質ＴＭＢをウェルに添加することにより、発色が起こる。色彩強度は、サンプルのラットアルブミン濃度の対数に反比例する。
【０１３５】
尿中クレアチニン：Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎアッセイキット。カタログ番号１０１２（Exocell Inc.、米国ペンシルベニア州フィラデルフィア）を使用し、尿中クレアチニンを測定した。この手順は、アルカリピクリン酸法を適用しており、酸の添加前後のサンプル中の差吸光度の測定を伴い、妨害物質による色の生成を補正する。
【０１３６】
アッセイ装置：バイオ・ラッド（Bio-Rad）ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダー
免疫組織化学：
ＩｍｍＰＲＥＳＳ  ＨＲＰ抗マウスＩｇＧ、ラット吸着（ペルオキシダーゼ）ポリマー検出キット（Rat adsorbed (Peroxidase) Polymer Detection Kit）、ＭＰ−７４２２（Vector Laboratories, Inc.、カリフォルニア州バーリンゲーム（Burlingame））。
クエンチングする内因性ペルオキシダーゼ活性：０．３％Ｈ2Ｏ2
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質キット、３，３’−ジアミノベンジジンキット、ＳＫ−４１００
病理組織学的分析は、ＤＰ−７１デジタルカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１研究用顕微鏡を用いて行った。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアをコンピューター支援画像解析に使用した。
【０１３７】
［群］
５０匹のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ＳＤラットを、１０匹のラットの５つの群に分け、下記の計画に従って処置した。
【０１３８】
【表１１】
2019529555.tif 000020
【０１３９】
［糖尿病性腎症（ＤＮ）の誘発］
０．４〜０．４５ｍｌのクエン酸緩衝液中５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（Ｓ０１３０、Sigma Aldrich Corporation、米国ミズーリ州セントルイス）の尾静脈注射により、ラットにおいてＤＮを誘発した（偽群−第１群を除く）。偽対照には、ＳＴＺを含まないクエン酸緩衝液における同様の注射をした。注射は０日目に行った。処置は３日目に開始し、最高６週間続けた。
【０１４０】
［群の処置］
上記の表９は、試験の処置スケジュールをまとめている。全体として、３つの異なる用量（２、４および６ｍｇ／ｋｇ）の化合物Ｂを、糖尿病誘発後６週間、皮下（ＳＣ）投与した。溶媒対照は、第１群（ＳＴＺの投与を受けていない動物）および第２群（ＳＴＺの投与を受けた動物）に、６週間毎日投与した。以下に説明するように、定期的に尿および血液を採取し、複数の生化学的分析を可能にした。
【０１４１】
［群の評価］
この試験の過程を通して全ての群の動物に対し、以下の評価を行った。
臨床徴候：処置の開始前に１回および試験期間中１日１回、個々の動物について全ての臨床的徴候を記録した。観察は、毎日同じ時間間隔で行った。
体重：各動物の体重は、その対応する群への割り当ての日と、その後、投与量調整のため各被験物の注射前に毎回測定した。
【０１４２】
［サンプル採取と評価］
臨床化学評価
血糖：無菌の２５Ｇ針を用いて新たに突き刺した尾の先端から一滴の血液を採取することにより、０、１、２、４および６週の時点で血糖を測定した。血糖測定は、直ちに直接試験紙分析により行った。
尿蛋白：０、２、３、４、５および６週の時点で、ラットを尿採取のために代謝ケージに入れた。尿蛋白は、７〜１６ｍｌの範囲の１２時間の空隙容量で測定した。当技術分野における標準的技法に対応するように、１２時間の尿蛋白値（ｍｇで表示）は全て２４時間に外挿した。
尿中アルブミン：尿中アルブミンの測定は、０週目および６週目の時点で採取したサンプルに対して行った。尿蛋白データと同様に、アルブミン値は、当技術分野における標準的技法に対応するように２４時間に外挿した。
尿中クレアチニン：尿中クレアチニンの測定は、０週目および６週目の時点で採取したサンプルに対して行った。尿中クレアチニンのデータを用いてタンパク質とアルブミンの比率を求め、当技術分野における標準的技法に対応するように、ミリグラムクレアチニン：グラムタンパク質またはアルブミン（ｍｇ／ｇ）として表した。
【０１４３】
［最終試験］
安楽死：予定されていたテスト期間が終了した動物は、標準的な倫理指針に従って二酸化炭素で処置した。以下に詳述するように、全ての動物を病理学者の監督下で剖検に供した。屠殺した動物のスコアは、実験全体を通した実験終了までの平均群スコアの計算に含めた。
剖検：終了日、最後の投与の約５時間後に屠殺した。動物の肉眼的検査を全ての屠殺動物について実施し、全ての異常を記録した。
腎臓組織採取：血液採取直後に、左右の腎臓を摘出し、厚さ３〜４ｍｍの冠状切片に切断した。腎臓の中央切片は、後の埋め込みおよび通常の組織学的評価のためにホルマリンに入れた。いくつかの切片をアルミホイルストリップ上に置き、液体窒素中に浸漬することにより急速冷凍し、後の免疫組織化学的評価のために気密保存バイアルに入れた。全てのサンプルは、分析するまで−８０℃で凍結させた。以下の分析を行った。
【０１４４】
病理組織学的分析
糸球体α−ＳＭＡ染色（糸球体メサンギウム活性化領域に関して）：凍結腎臓切片を切断し、標準的な免疫組織化学法を用いてモノクローナル一次抗体（クローン１Ａ４、Sigma Chemical Co、ミズーリ州セントルイス）を使用し、α−ＳＭＡについてバッチ染色した。ペルオキシダーゼ結合二次抗体は、製造者の説明書（Vector Laboratories、Inc.、カリフォルニア州バーリンゲーム）に従いＩｍｍＰｒｅｓｓポリマー検出試薬を用いて検出した。第３群（ＳＴＺ＋化合物Ｂ［２ｍｇ／ｋｇ］ｓｃ）は、分析から省いた。
糸球体フィブロネクチン染色（糸球体基質の領域に関して）：凍結腎臓切片を切断し、モノクローナル一次抗体（クローンＩＳＴ−９）ＡｂＣａｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）と、Ｐｒｏｂｅｔｅｘで実施した標準免疫組織化学法を用いて、フィブロネクチン染色のためにバッチ染色した（添付の標準操作手順書参照）。第３群（ＳＴＺ＋化合物Ｂ［２ｍｇ／ｋｇ］ｓｃ）は、分析から省いた。
【０１４５】
コンピュータ支援画像解析
α−ＳＭＡおよびフィブロネクチン染色：
α−ＳＭＡ：（メサンギウム細胞活性化面積）：糸球体α−ＳＭＡ染色を画像解析により評価した。１０倍の対物倍率で２５個の無作為の糸球体のデジタル画像を撮影した。糸球体染色の総面積は、糸球体領域を捕捉するＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ画像処理ソフトの追跡ツールを使用し、コンピューター支援画像分析により測定した。画像を分割し、グレースケールに変換した後疑似着色し、背景（青）および陽性染色（赤）領域を表し、α−ＳＭＡ陽性メサンギウム細胞を表す面積パーセントを定量した。データをエクセルのスプレッドシートに保存し、平均染色面積を算出し、統計学的に分析した。
【０１４６】
フィブロネクチン：（メサンギウム細胞の基質蓄積面積）：フィブロネクチンについての糸球体染色の画像分析は、α−ＳＭＡについて上述したのと同じ方法を用いて行った。
【０１４７】
［結果 - 臨床］
血糖：試験開始時の平均血糖は、１２７ｍｇ／ｄｌ（１２０〜１３１ｍｇ／ｄｌの範囲）であった。ラット＃１１（第２群）、２１、３１および３２（第４群）ならびに４１（第５群）を除き、ＳＴＺの投与を受けた全ラットは、実験開始時に糖尿病（血糖＞２００ｍｇ／ｄｌ）になった。これらのラットのうち、＃１１のみが、残りの試験で２００ｍｇ／ｄｌを超える値まで進行した。残りのラットのほとんどは、２週間の時点で高血糖症を発症した。しかしながら、２週間の始めにグルコース測定値が上昇したにもかかわらず、一部のラット（群間で分散）では糖尿病の状態は持続しなかった。４週間および６週間で、残りの動物全てのグルコース値は、２００ｍｇ／ｄｌを超えていた。メーターの測定感度が、最高５００ｍｇ／ｄｌであるため、これらの値の中には、過小評価となっている場合もある。各群の平均血糖値を下記の要約表に示す。
【０１４８】
【表１２】
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【０１４９】
尿蛋白：試験前の尿蛋白平均値は、群間で０．７〜３．７ｍｇ／ｄｌの範囲であった。ＳＴＺ対照（第２群）は、２週間で蛋白尿中に４３．５ｍｇ／２４時間で最初のスパイクを示した。これらの値はその後低下したが、３、４、５および６週間で、それぞれ２７．２、３３．９、３０．２および３４．２ｍｇ／２４時間で上昇したままであった。溶媒対照（第１群）における蛋白尿は、試験の過程を通して１７．０〜２４．６ｍｇ／２４時間の範囲であった。下記の表１１に示されているように、化合物Ｂによる処置により、ＳＴＺ＋溶媒と比較して蛋白尿は減少した。
【０１５０】
尿蛋白対クレアチニン比は、尿蛋白排泄率のより正確な推定値を提供し、水和により影響されない。よって、尿蛋白の尿中クレアチニンに対する比は、０週目と６週目の時点で求めた。その結果は、タンパク質測定単独と同様の傾向を示したが、群間の差がより明確になった。例えば、ＳＴＺ＋溶媒は、６週間の時点でクエン酸塩対照と比較して尿蛋白／クレアチニン（ＵＰ／ＣＲ）（１７１５：２９１９）において７０％の増加を示した。全ての処置群（低用量化合物Ｂを除く）は、ＳＴＺ＋溶媒未満の比であり、減少は用量依存的パターンに従った。
【０１５１】
【表１３】
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【０１５２】
尿中アルブミン：尿中アルブミン尿は、特に糖尿病性腎症において、尿蛋白よりも糸球体透過性異常のより感度の高い測定値である。尿蛋白対クレアチニンの場合と同様に、アルブミン対クレアチニン比は、尿中アルブミン排泄率のより正確な推定値を提供し、水和による影響を受けない。よって、尿中アルブミンおよび尿中アルブミン：クレアチニン比を、０週目および６週目の時点で測定した。その結果は、尿蛋白データについて観察された同様の傾向を示し、ベースライン平均の試験前尿中アルブミン：クレアチニン比は、群間で１２８〜３８７の範囲であった。クエン酸塩対照（第１群）におけるアルブミン：クレアチニン比は、糖尿病６週目で平均４５７であった。最も高いアルブミン：クレアチニン比は、ＳＴＺ＋溶媒（第２群）において観察され、これは糖尿病６週目で１５８４まで増加した。ＳＴＺ＋化合物Ｂで処置した全群のラットのアルブミン：クレアチニン比は、ＳＴＺ＋溶媒の場合より低かった（表１２）。
【０１５３】
【表１４】
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【０１５４】
体重、化合物の毒性、および死亡率
偽溶媒（第１群）ラットは、予想通り、徐々に体重が増加した。ＳＴＺで処置した全動物は、各群の平均体重測定値に基づいて偽物と比較して成長不良であった。試験期間中の動物の健康は非常に良好に見え、化合物Ｂ処置群については毒性または死亡は観察されなかった。
【０１５５】
［結果 - 病理組織学］
糸球体α−ＳＭＡ染色（メサンギウム細胞活性化）
基底糸球体メサンギウム細胞のα−ＳＭＡ染色は、糖尿病性腎症を含むいくつかの腎臓病における活性化により増強される。偽対照（第１群）は、メサンギウムのα−ＳＭＡが最も少なく、染色の平均面積は、糸球体面積の２．１％であった。溶媒処置したＳＴＺ対照（第２群）は、最高レベルのメサンギウムのα−ＳＭＡ染色を示し、糸球体面積の４．６％に達した。化合物Ｂによる処置は、ＳＴＺ関連メサンギウム細胞活性化を鈍化し、全ての処置群におけるα−ＳＭＡ染色は、ＳＴＺ−溶媒対照に比べ少なかった（表１３）。
【０１５６】
【表１５】
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【０１５７】
糸球体フィブロネクチン染色（メサンギウム基質増加）
基質蓄積の指標として使用される糸球体フィブロネクチン染色は、α−ＳＭＡについて観察されたものと同様の傾向を示した。α−ＳＭＡと同様に、糸球体メサンギウムＦｎ染色は、糖尿病性腎症を含む腎臓病における活性化により増強される。偽対照（第１群）における基底Ｆｎ発現は、糸球体面積の平均１８．２％であった。溶媒処置ＳＴＺ対照（第２群）は、高レベルのメサンギウムＦｎ染色を示し、糸球体面積の２２．８％に達した。化合物Ｂでの処置により、溶媒対照と比較してＦｎ発現の有意な減少がもたらされた（表１４）。
【０１５８】
【表１６】
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【０１５９】
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）は、このモデルに典型的な糖尿病性腎症および糖尿病を誘発した。これは、偽対照と比較して、増加した血糖、蛋白尿、アルブミン尿、ならびに糸球体メサンギウム細胞活性化（α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の捕捉により評価）および基質タンパク質（フィブロネクチン）の蓄積を特徴とする病理組織学的変化により示される。皮下製剤で投与された化合物Ｂは、このモデルにおいて（特に高用量において）タンパク尿、アルブミン尿、尿蛋白：クレアチニン比および尿中アルブミン：クレアチニン比を減少させるのに有効であった。同様に、化合物Ｂは、免疫組織化学的評価により評価した糸球体α−ＳＭＡの糸球体発現およびＦｎ−タンパク質発現を減少させた。全体として、化合物Ｂは、６週間の処置過程の間、副作用を誘発しなかった。
【国際調査報告】
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