(57)【要約】  流体フローストリームにおける分離ガスを検出するための方法が本明細書で提供される。一例では、複数のガスにより分離されたサンプルのフローストリームがフローサイトメータを通過する際に、フローサイトメータの散乱検出器により電圧出力信号が生成される。電圧出力信号がサンプリングされ、分離ギャップ閾値よりも大きい電圧出力信号の各サンプリング電圧に関するタイムスタンプ及び電圧値が記録される。いくつかの例では、分離ギャップ閾値は、サンプルの最大電圧出力よりも少なくとも２倍大きい。これらの方法ステップを行うように構成されたソフトウェアを含むフローサイトメトリシステムも説明される。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体フローストリームにおける分離ガスを検出するための方法であって、
散乱検出器で、それぞれ分離ガスにより分離された複数のサンプルを含むフローストリームがフローサイトメータを或る時間期間にわたって通過する際の散乱光の強度を示す散乱電圧出力信号を生成することと、
前記散乱電圧出力信号をサンプリングすることと、
分離ギャップ閾値よりも大きい前記散乱電圧出力信号の各サンプリング電圧に関するタイムスタンプ及び電圧値を記録することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記散乱電圧出力信号の各サンプリング電圧を前記分離ギャップ閾値と比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離ギャップ閾値が、前記複数のサンプルの最大電圧出力よりも少なくとも２倍大きい値を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記記録することがメモリに格納することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記複数のサンプルのそれぞれは、関心ある粒子を含有していると思われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記タイムスタンプが、分離ギャップ閾値よりも大きいサンプリング電圧が発生した時間を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記サンプリングが或る周波数で起こる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記周波数が５ｋＨｚから５００ｋＨｚまでの間である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生成するステップの前に、前記粒子を含む複数のサンプルを前記フローストリームへ移動させることと、
前記フローストリームにおける前記サンプルを互いから分離するべく前記複数のサンプルのうちの隣接するサンプル間に前記分離ガスを挿入し、これにより、前記フローストリームがガスにより分離されたサンプルフローストリームを構成することと、
前記分離されたサンプル及び前記分離流体を含む前記流体により分離されたサンプルフローストリームを前記フローサイトメータへ及び前記フローサイトメータを通るように誘導することと、
流体フローストリームが前記フローサイトメータを通過する際に前記ガスにより分離されたフローストリームに焦点をあて、散乱検出器により散乱光を検出するべく、前記フローサイトメータを連続的に動作させることと、
をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記移動させるステップの前に、複数のサンプルウェルを有するプレートから複数のサンプルを得ることをさらに含み、前記複数のサンプルのうちの各サンプルが前記複数のウェルのうちのそれぞれのウェルから得られる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記分離ギャップ閾値よりも大きい前記散乱電圧出力信号の各サンプリング電圧に関する記録された電圧値及び対応するタイムスタンプを含む分離ガスタイミングデータを生成することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離ガスタイミングデータに少なくとも部分的に基づいて前記複数のサンプルウェルのそれぞれのサンプルウェルを識別することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記散乱検出器が前方散乱光検出器を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記散乱検出器が側方散乱光検出器を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
側方散乱光検出器で、それぞれ分離ガスにより分離された前記複数のサンプルを含む前記フローストリームが或る時間期間にわたって前記フローサイトメータを通過する際の側方散乱光の強度を示す側方散乱光電圧出力信号を生成することと、
蛍光検出器で、それぞれ分離ガスにより分離された前記複数のサンプルを含む前記フローストリームが或る時間期間にわたって前記フローサイトメータを通過する際に放出された蛍光の強度を示す蛍光電圧出力信号を生成することと、
前記前方散乱光電圧出力信号、側方散乱光電圧出力信号、及び蛍光電圧出力信号に少なくとも部分的に基づいてサンプルイベントデータを生成することと、
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離ガスタイミングデータ及び前記サンプルイベントデータを時間に少なくとも部分的に基づいて相関させることをさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記相関させられた分離ガスタイミングデータ及び前記サンプルイベントデータをプロットすることをさらに含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
プロセッサに請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法を行わせるべく実行可能な命令を格納している一時的でないコンピュータ可読媒体。
【請求項１９】
システムであって、
散乱検出器を備えるフローサイトメータと、
前記散乱検出器の出力と通信するプロセッサと、
前記プロセッサに請求項１〜請求項１７のいずれか一項に記載の方法を行わせるべく実行可能な命令を格納している一時的でないコンピュータ可読媒体と、
を備えるシステム。
【請求項２０】
複数のそれぞれのソースウェルからの粒子を含む複数のサンプルを流体フローストリームへ挿入するためのオートサンプラーをさらに備える、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記フローサイトメータが、導管を介して前記オートサンプラーと連通し、前記流体フローストリームが前記フローサイトメータを通過する際に、前記オートサンプラーから前記導管により送達される前記流体フローストリームに焦点をあて、前記複数のサンプルのそれぞれにおける前記粒子を選択的に分析するように構成される、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記流体フローストリームにおける前記複数のサンプルを前記チュービングの単一長さに沿って移動させるためのポンプをさらに備え、
前記オートサンプラーと前記ポンプが、前記流体フローストリームを気泡により分離された流体フローストリームとして構成するべく前記流体フローストリームにおける前記サンプルの連続したサンプル間に分離流体のアリコートを導入するべく協働する、
請求項２０〜請求項２１のいずれかに記載のシステム。
【請求項２３】
前記散乱検出器が、前方散乱光検出器を含み、フローサイトメータが、側方散乱光検出器及び蛍光検出器をさらに備える、請求項１９〜２２のいずれかに記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１６年６月７日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｉｒ  ｂｕｂｂｌｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｗａｖｅｆｏｒｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ」という名称の米国特許仮出願第６２／３４６，７３９号に基づく優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
高スループットのフローサイトメトリシステムは、マイクロプレートのウェルから吸引され、気泡ギャップにより各々分離された個別のサンプル粒子懸濁液のストリームをサンプルチュービングラインに充填するのに、ポンプシステムを用いる。マイクロプレートにおけるすべてのサンプルからのデータが取得され、単一のデータファイルに格納されるように、すべてのサンプルストリームがフローサイトメータへ連続的に送達される。データ収集中に高分解能の時間パラメータも記録される。空隙の通過によりデータストリームに粒子検出における時間的ギャップが生じ、時間パラメータと併せてプロットされるときに、個々の粒子懸濁液を区別し、別々に評価することが可能となる。この時間的分布に基づいて、データピークが識別され、マイクロプレートの個々のウェルに割り当てられる。しかしながら、多くの場合に、これらの時間的分布は、個々のサンプルウェルを正確に識別するのに十分ではなく、識別エラーが時々生じる。
【発明の概要】
【０００３】
気泡により分離されたサンプルの連続流体ストリームにおける気泡を検出するための方法及びシステムが本明細書で開示される。一例では、フローサイトメータの散乱検出器の散乱波形出力が、気泡を検出するのに用いられる。
【０００４】
本開示のいくつかの実施形態は、散乱検出器で、それぞれ分離ガスにより分離された複数のサンプルを含むフローストリームがフローサイトメータを或る時間期間にわたって通過する際に電圧出力信号を生成し、電圧出力信号をサンプリングし、分離ギャップ閾値よりも大きい電圧出力信号の各サンプリング電圧に関するタイムスタンプ及び電圧値を記録するための方法を提供する。方法は、生成するステップの前に、粒子を含む複数のサンプルをフローストリームへ移動させるステップと、前記フローストリームにおける前記サンプルを互いから分離するべく前記複数のサンプルのうちの隣接するサンプル間に分離ガスを挿入し、これにより、前記フローストリームがガスにより分離されたサンプルフローストリームを構成するステップと、分離されたサンプル及び分離流体を含む前記流体により分離されたサンプルフローストリームをフローサイトメータへ及びフローサイトメータを通るように誘導するステップと、流体フローストリームがフローサイトメータを通過する際にガスにより分離されたフローストリームに焦点をあて、散乱検出器により散乱光を検出するべく、フローサイトメータを連続的に動作させるステップと、をさらに含んでよい。さらなる実施形態では、方法は、移動させるステップの前に、複数のサンプルウェルを有するプレートから複数のサンプルを得るステップを含んでよく、複数のサンプルのうちの各サンプルが複数のウェルのうちのそれぞれのウェルから得られる。
【０００５】
本開示のいくつかの実施形態は、プロセッサに本明細書に記載の方法を行わせるべく実行可能な命令を格納している一時的でないコンピュータ可読媒体をさらに含む。
【０００６】
本開示のさらなる実施形態は、散乱検出器を備えるフローサイトメータと、散乱検出器の出力と通信するプロセッサと、プロセッサに本明細書に記載の方法を行わせるべく実行可能な命令を格納している一時的でないコンピュータ可読媒体とを備えるシステムを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】フローサイトメトリ装置の概略図である。
【図１Ｂ】図１Ａのフローサイトメトリ装置の導管の中の隣接するサンプルの断面概略図である。
【図２】前方散乱光検出器からのサンプルイベント波形出力の例示的なプロットを示す図である。
【図３】前方散乱光検出器からの気泡ギャップ波形出力の例示的なプロットを示す図である。
【図４】フローサイトメータの前方散乱光検出器から取得した分離ガスタイミング出力データと共にプロットした、フローサイトメータから取得した、サンプルプレートの第１の列Ａと、列間の振とうと、サンプルプレートの列Ｂの最初の２つのウェルとの、事前プレートプライム気泡のサンプルイベントデータの例示的なヒストグラムを示す図である。
【図５】図４の一部の拡大図である。
【図６】図４の一部の拡大図である。
【図７】フローサイトメータの前方散乱光検出器から取得した分離ガスタイミング出力データと共にプロットした、フローサイトメータから取得した全９６ウェルプレートのサンプルイベントデータの例示的なヒストグラムを示す図である。
【図８】フローサイトメータの前方散乱光検出器から取得した分離ガスタイミング出力データと共にプロットした、フローサイトメータから取得した処理済みＦＳＣ−Ａ出力のサンプルイベントデータの例示的なヒストグラムを示す図である。
【図９】フローサイトメータの側方散乱光検出器から取得した分離ガスタイミング出力データと共にプロットした、フローサイトメータから取得した処理済みＳＳＣ−Ａ出力のサンプルイベントデータの例示的なヒストグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
文脈が明らかに他を要求しない限り、明細書及び請求項の全体を通して、「備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの言葉は、排他的又は網羅的な意味ではなく包括的な意味で、つまり、「〜を含むがこれに限らない」という意味で解釈されるべきである。単数又は複数を用いる言葉は、それぞれ複数又は単数も含む。
【０００９】
本開示の実施形態／例の説明は、網羅的となること又は本開示を開示された正確な形態に限定することを意図していない。本開示の具体的な実施形態及び例が例証の目的で本明細書において説明されるが、当該技術分野の当業者が認識することになる種々の等価な修正が本開示の範囲内で可能である。
【００１０】
本発明の任意の態様のすべての実施形態は、文脈上他の意味に明白に規定される場合を除き、組み合わせて用いることができる。
【００１１】
本発明の目的上、本明細書で用いられる場合の「サンプル」という用語は、粒子分析器により検出可能な関心ある粒子又はマーカ粒子を含有し得る任意の量の液体を指す。より詳細には、サンプルは、本明細書で開示される方法及び／又は装置を用いて検出及び／又は分析されるべき関心ある粒子又はマーカ粒子を含有する流体溶液又は懸濁液を含んでよい。サンプル中の関心ある粒子は、蛍光タグなどで標識されてよい。関心ある粒子はまた、ビーズ、レセプタ、又は他の有用なタンパク質又はポリペプチドに結合される場合があり、又は細胞溶解液中で自然に見受けられる粒子、細胞溶解液からの精製粒子、組織培養からの粒子などの自由粒子として単に存在する場合がある。サンプルは、関心ある粒子との反応を生じるのに用いられる有機又は無機のいずれかの化学品を含んでよい。関心ある粒子が生体材料のとき、薬剤が、生体材料粒子に反応又は応答を生じさせるべくサンプルに添加されてよい。化学品、薬剤、又は他の添加剤は、サンプルがサンプルソースウェルにあるときにサンプルに添加及び混合されてよく、又は、化学品、薬剤、又は他の添加剤は、サンプルがオートサンプラーにより取り込まれた後の流体フローストリームにおけるサンプルに添加されてよい。
【００１２】
本明細書で用いられる場合の「生体材料」という用語は、生きている生物又は死んでいる生物のいずれかから得られる任意の有機材料を指す。「生体材料」という用語はまた、合成オリゴヌクレオチド、合成ポリペプチドなどの任意の合成の生体材料を指す。合成の生体材料は、自然発生の生体材料の合成バージョン、又は融合タンパク質などの自然発生の生体材料の一部から作製された自然発生でない生体材料、又はオリゴヌクレオチドが普通は自然には結合しないペプチドに共有結合又は非共有結合のいずれかで結合されたＤＮＡ又はＲＮＡなどの、オリゴヌクレオチドなどの、互いに結合されている２つの生体材料であり得る。
【００１３】
本明細書で用いられる場合の「オリゴヌクレオチド」という用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）及び天然又は合成、誘導体化されている又は誘導体化されていない、のいずれかの任意の配列の核酸を含む、任意のオリゴヌクレオチドを指す。
【００１４】
本明細書で用いられる場合の「ペプチド」は、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、タンパク質配列、アミノ酸配列、変性タンパク質、抗原、がん遺伝子、及びがん遺伝子の一部を含む、すべてのタイプのペプチド及びコンジュゲートしたペプチドを指す。
【００１５】
本明細書で用いられる場合の「生物」という用語は、動物、植物、細菌、ウィルスなどだけでなく、動物、植物、細菌、ウィルスなどから得られる有機材料から作製された細胞培養物、複製されたオリゴヌクレオチドなども指す。
【００１６】
本明細書で用いられる場合の「薬剤」という用語は、通常薬剤と考えられるあらゆるタイプの物質を指す。薬剤は、人の中枢神経系に作用する物質、例えば、麻薬、幻覚剤、バルビツレート、又は抗精神薬であり得る。本発明の目的上、薬剤はまた、病原感染性微生物を死滅させる又は不活性化させる物質であり得る。加えて、薬剤は、特定の細胞、身体の器官、又は機能の活性に影響する物質であり得る。薬剤は、有機又は無機化学、生体材料などであり得る。
【００１７】
本明細書で用いられる場合の「アリコート」は、フローサイトメータのプローブを介してウェルから採取されたサンプルの一部である。
【００１８】
本明細書で用いられる場合の「導管」という用語は、流体ストリームがそれを通って流れるチューブ、チャネルなどのデバイスを指す。導管は、単独で或いはチャネル又は他の異なるデバイスと組み合わせて、チュービングのいくつかの接続又は接合されたピース又はチュービングの単一のピースなどのいくつかの別個のデバイスで構成され得る。種々の実施形態では、導管は、蠕動ポンプが隣接するサンプルを互いに混合させずに少なくとも６サンプル／分の速度で分離ガス又はマーカ粒子のアリコートにより分離されたサンプルをチューブの中で移動させることを可能にする圧縮特徴を有する蠕動ポンプと共に用いられ得る任意のチューブを含んでよい。
【００１９】
本明細書で用いられる場合の「マーカ粒子」は、制御粒子、ビーズ、又はマイクロビーズを含んでよく、さらに、サンプルコンテナから分析されるべき関心ある粒子を含有していると思われるサンプルのアリコートを取り込むことができるフローサイトメータシステム（例えば、米国特許第６，８７８，５５６号及びＷ０２０１０００５６１７で説明されるシステム）により検出可能な１つ以上の粒子を指す。
【００２０】
本発明の目的上、本明細書で用いられる場合の「粒子」という用語は、分子、細胞、タンパク質、タンパク質凝集体などの生体粒子、核及びミトコンドリアなどの細胞構成要素、微生物及びウィルスを含む生物、ミクロスフェア、マイクロビーズ、及び化合物及び化学凝集体などの合成粒子などを含むがこれらに限定されない、サンプル中に存在し、フローサイトメトリ装置を用いて検出され得る、小さい物体を指す。
【００２１】
本発明の目的上、「サンプル」という用語は、関心ある粒子を含有し得る流体溶液又は懸濁液を指す。
【００２２】
本発明の目的上、本明細書で用いられる場合の「ウェル」という用語は、分析されるべきサンプル、制御粒子、又はマーカ粒子のアリコートを収容する任意の構造体を指す。
【００２３】
本発明の目的上、本明細書で用いられる場合の「プレート」、「マイクロプレート」、及び「マイクロタイタープレート」という用語は、分析されるべきサンプル、制御粒子、又はマーカ粒子のアリコートを収容する構造体を指す。
【００２４】
本発明の目的上、「約」という用語は、列挙されたパラメータの＋／−５％を意味する。
【００２５】
本発明の目的上、「検出器」という用語は、光電子増倍管（ＰＭＴ）及びシングルフォトンアバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）を含む、散乱光を検出することができる任意の検出器を指す。
【００２６】
本発明の目的上、「分離ガス」という用語は、隣接するサンプル間に又はサンプルとバッファ流体との間にガス気泡又は不混和性流体を形成するのに用いることができる空気、不活性ガス、又は流体などの任意のガスを指す。不混和性流体は、サンプルと実質的に混和せず、サンプルを汚染しない流体である。
【００２７】
本発明の目的上、「隣接するサンプル」という用語は、気泡などの分離ガスによってのみ互いから分離される流体フローストリームにおける２つのサンプルを指す。
【００２８】
本発明の目的上、「フローサイトメータ」という用語は、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８９５，７６４号、第５，８２４，２６９号、第５，３９５，５８８号、第４，６６１，９１３号で説明されるフローサイトメータを含むがこれに限らない任意のフローサイトメトリ装置を含む。フローサイトメータでは、サンプルは、公知の方法を用いて粒子ごとにソートされ得る。
【００２９】
本開示は、フローサイトメータ検出器の散乱波形出力を用いて気泡により分離されたサンプルの連続流体ストリームにおける気泡を検出するための新規なシステム及び方法を説明する。
【００３０】
図１Ａは、本発明に関連して用いるための例示的なフローサイトメトリ装置１００を示す。フローサイトメトリ装置１００は、その上に中空のプローブ１０６がマウントされる調節可能なアーム１０１を有する従来のオートサンプラー１０２を含む。アーム１０４が前後に（図１Ａでの左及び右へ）及び横方向に（図１Ａの平面の内外へ）移動する際に、フローサイトメトリ装置１００を用いて分析されるべき粒子（蛍光タグで標識され得る（図１Ａには図示せず））を含むサンプルを得るべく、プローブ１０６がウェルプレート１１０の個々のソースウェル１０８の中へ下降される。ソースウェル１０８のそれぞれからのサンプル材料の取り込みと取り込みの間に、プローブ１０６は、（空気などの）分離流体のアリコートを取り込むことができ、これにより、流体フローストリームにおける連続するサンプル間に分離気泡を形成する。
【００３１】
サンプルは、プローブ１０６により採取されると、流体フローストリームへ導入され、蠕動ポンプ１１２が、オートサンプラー１０２から蠕動ポンプ１１２を通ってフローセル１１８及びレーザインテロゲーションデバイス１２０を含むフローサイトメータ１１６へ延びる導管１１４にサンプルを強制的に通す。フローセル１１８は、流体フローストリームがフローサイトメータを通過する際に流体フローストリームに焦点をあて、複数のサンプルのそれぞれにおける粒子を分析するべく連続的に操作し得る。レーザインテロゲーションデバイス１２０は、レーザインテロゲーションポイント１２２でフローセル１１８から流れる個々のサンプルを分析する。
【００３２】
図１Ｂは、気泡により分離された流体フローストリームを形成する、導管１１４の中の分離気泡１３６及び１３８により互いから分離された一連のサンプル１３０、１３２、及び１３４を示す。図１Ｂでは、サンプル１３０はサンプル１３２に隣接し、サンプル１３２はサンプル１３４に隣接する。サンプル１３０、１３２、及び１３４がレーザインテロゲーションポイント１２２を通過するとき、サンプルにおける粒子がフローサイトメータ１１６により感知される。前方散乱光が、前方散乱光検出器１２４により検出される。フローセルにおける標識粒子から放出された蛍光が、蛍光検出器１２６により検出される。側方散乱光が、側方散乱光検出器１２８により検出される。対照的に、気泡１３６及び１３８がレーザインテロゲーションポイント１２２を通過するとき、粒子は感知されない。したがって、フローサイトメータを用いて分析した一連のサンプルに関する感知された蛍光のデータポイント対時間のグラフは、粒子を含有するサンプルがレーザインテロゲーションポイントを通過する時間とそれぞれ位置合わせされる別個のグループをなすことになる。このようなグラフは、前方散乱光検出器１２４、蛍光検出器１２６、及び／又は側方散乱光検出器１２８の両方の出力により生成することができる。
【００３３】
各サンプルが採取されたサンプルウェルを適正に識別することが、フローサイトメータ出力データの分析及び使用において重要である。いくつかの高スループットのフローサイトメトリシステム方法では、プローブシップ時間（ｐｒｏｂｅ  ｓｉｐ  ｔｉｍｅ）（プローブがウェルの中にある持続時間）、プローブアップ時間（プローブがウェルの外で休止して空気を吸い込む時間量）、マルチウェル振とう及びリンスステップ、サンプリング順序、並びにイベントピークの高さ及びそれらの間隔などのパラメータを含むサンプリングプロトコルが、マイクロタイタープレート全体に関するデータファイルを個々のウェルデータへセグメント化するのに用いられる。しかしながら、これらの要素を用いても、ウェル識別エラーが依然として生じる。
【００３４】
本発明の一実施形態では、分離気泡ギャップの検出が、個々のサンプルウェルの正確な識別に用いられる。これは、いくつかの場合には、既に用いられているパラメータに加えて又は代替的に用いられ得る。分離気泡ギャップは、複数の分離ガスにより分離されたサンプルを伴うフローストリームがフローサイトメータを或る時間期間にわたって通過する際にフローサイトメータの前方検出器１２４又は側方散乱光検出器１２８などの散乱検出器により生成された電圧出力信号を分析することにより識別される。フローストリームにおけるそれぞれ関心ある粒子を含有することが期待されるサンプルがフローサイトメータのフローセルを通って移動している間に、粒子によりトリガされる各イベントは、約４μｓから１０μｓまでの間の持続時間及び約１．４から１．６ボルトまでの間のピークツーピーク検出器電圧出力を有する極めて一貫した散乱波形パターンを生じる。前方散乱光検出器出力に接続されたオシロスコープを介して得られたサンプルイベント波形が、図２に示される。
【００３５】
フローサイトメータのフローセルを通って移動するサンプルに後続する分離気泡ギャップも、極めて一貫した散乱波形パターンを生じる。サンプルイベント波形よりも約７〜９倍大きい５０μｓから９０μｓまでの間の持続時間、及びサンプルイベント波形よりも３倍大きい約４．２から４．８ボルトまでの間のピークツーピーク検出器電圧出力の特徴を有する波形パターンが、図３に示される。気泡は、フローセルを通って行く際に、励起レーザ光の大部分を前方散乱光検出器に反射するミラーとして作用する。この散乱光の強度は、検出器に、波形で示される場合の最大電圧をもつ信号を出力させる。
【００３６】
これらの波形を用いて、フローサイトメータの一部として一体化された又はフローサイトメータと通信するプロセッサが、以下の信号パターン：バックグラウンド（測定されるイベントなし）、前述の波形に基づいて測定されたイベント、又は測定された気泡のうちの１つと照合するべく、経時的に電圧出力を分析する。これらのパターンは、次いで、データストリームにおける各ソースウェルを識別するのに用いることができる。
【００３７】
特に、流体フローストリームにおける分離ガスを検出するための方法は、（ａ）散乱検出器で、それぞれ分離ガスにより分離された複数のサンプルを含むフローストリームがフローサイトメータを或る時間期間にわたって通過する際の散乱光の強度を示す散乱電圧出力信号を生成することと、（ｂ）散乱電圧出力信号をサンプリングすることと、（ｃ）分離ギャップ閾値よりも大きい散乱電圧出力信号の各サンプリング電圧に関するタイムスタンプ及び電圧値を記録することを含む。一例では、複数のサンプルのそれぞれは、関心ある粒子を含有していると思われる。方法はまた、散乱電圧出力信号の各サンプリング電圧を分離ギャップ閾値と比較することを含んでよい。
【００３８】
動作時に、プロセッサは、散乱検出器の電圧出力信号をサンプリングし、分離ギャップ閾値よりも大きい電圧値を記録する。いくつかの例では、電圧出力信号の各サンプリング電圧が分離ギャップ閾値と比較される。分離ギャップ閾値は、いくつかの例では、複数のサンプルの最大電圧出力よりも少なくとも２倍大きい値を有し、これは、フローサイトメータ及び前方散乱光検出器の電子装置のタイプに依存することがある。以下に提示される実験データとの関連において、前方散乱光検出器により検出することができる最大電圧は５Ｖであり、３．９Ｖの分離ギャップ閾値（（８００／１０２３）＊５Ｖに対応する）が選択された。この閾値は、前方散乱光検出器からの１．６Ｖの最大期待サンプル出力の２倍以上である。さらに、電圧出力信号は、或る周波数でサンプリングされる。いくつかの例では、サンプリング周波数は、５ｋＨｚから５００ｋＨｚまでの間である。さらなる例では、約１０ＭＨｚまでのサンプリング周波数が用いられる。
【００３９】
プロセッサにより実行される分析ソフトウェアアルゴリズムは、連続するフローサイトメータデータストリームから個々のマイクロプレートウェルを線引きするべく、最初の時間相関と気泡ギャップイベントタイミングとの２つの部分で構成することができる。気泡ギャップイベントタイミングアルゴリズムは、前述したパラメータなどの他のウェル識別パラメータと併せて用いられてよい。
【００４０】
散乱データが収集される際に、閾値を超える各サンプリング電圧が発生した時点でタイムスタンプが記録される。したがって、フローサイトメトリシステム、又はこの内部に一体化された又はこれと通信するプロセッサはまた、クロックを含んでよい。このタイムスタンプは、検出したパターンをフローサイトメータからのデータストリームと相関させるのに用いられることになる。フローサイトメトリシステムはまた、閾値を上回るサンプリング電圧値及びタイムスタンプが記録されるメモリを含んでよい又はメモリと通信してよい。
【００４１】
加えて、マイクロプレートのサンプリング実行の開始時に、第１のマイクロプレートウェルがサンプリングされる前に、開始時間校正手順が行われてよい。このような例では、方法はまた、生成するステップの前に、粒子を含む複数のサンプルをフローストリームへ移動させることと、前記フローストリームにおける前記サンプルを互いから分離するべく前記複数のサンプルのうちの隣接するサンプル間に分離ガスを挿入し、これにより、前記フローストリームがガスにより分離されたサンプルフローストリームを構成することと、分離されたサンプル及び分離流体を含む前記流体により分離されたサンプルフローストリームをフローサイトメータへ及びフローサイトメータを通るように誘導することと、流体フローストリームがフローサイトメータを通過する際にガスにより分離されたフローストリームに焦点をあて、散乱検出器により散乱光を検出するべく、フローサイトメータを連続的に動作させることを含んでよい。このような例では、方法はまた、移動させるステップの前に、複数のサンプルウェルを有するプレートから複数のサンプルを得ることを含んでよく、複数のサンプルのうちの各サンプルが複数のウェルのうちのそれぞれのウェルから得られる。
【００４２】
１つの特定の例では、１秒の量の脱イオン水、及びその後の８秒の脱イオン水によってそれぞれ分離される、３つの分離気泡ギャップが導入される。フローサイトメータからサンプルイベントデータ収集が始まるときに、気泡ギャップ検出器のマイクロプロセッサがゼロのタイムスタンプで初期化される。この校正手順により、プレートのサンプリング実行の開始を同期させるべく、気泡ギャップ検出器のタイムスタンプ出力（分離ガスタイミングデータ）を、フローサイトメータのサンプルイベントデータのタイミングと相関させることができる。動作時に、取り込まれた散乱電圧信号と、散乱検出器の出力が設定電圧閾値を超えるときに適用される対応するタイムスタンプから、分離ガスタイミングデータが生成される。この分離ガスタイミングデータは、タイミングに基づいてフローサイトメータからのサンプルイベントデータと同期される。分離ガスタイミングデータは、ウェルの識別のために用いられるサンプルイベント対時間ヒストグラムと共にプロットされる。したがって、気泡検出パターンタイミング出力は、マイクロ気泡、ごみ、不十分なサンプル、サンプル調製エラー、又はキャリーオーバーが経時的イベントカウントを用いるだけでそれを行うことを難しいものにする場合に、ウェル気泡ギャップ間に線引きするのに用いられてよい。
【００４３】
一例では、散乱検出器は、図４〜図８に関連してさらに詳しく後述するように、前方散乱光検出器を含む。別の例では、散乱検出器は、図９に関連してさらに詳しく後述するように、側方散乱光検出器を含む。散乱検出器が前方散乱光検出器を含む実施形態では、方法はまた、側方散乱光検出器で、それぞれ分離ガスにより分離された複数のサンプルを含むフローストリームが或る時間期間にわたってフローサイトメータを通過する際の側方散乱光の強度を示す側方散乱光電圧出力信号を生成することと、蛍光検出器で、それぞれ分離ガスにより分離された複数のサンプルを含むフローストリームが或る時間期間にわたってフローサイトメータを通過する際に放出された蛍光の強度を示す蛍光電圧出力信号を生成することと、前方散乱光電圧出力信号、側方散乱光電圧出力信号、及び蛍光電圧出力信号に少なくとも部分的に基づいてサンプルイベントデータを生成することを含んでよい。
【００４４】
気泡とサンプルとの両方の前方散乱光フローサイトメータ波形を最初に測定し、２つのタイプの波形を区別するための方法を判別することにより、本発明の例示的な気泡検出器を実験的にテストした。結果的に得られる分離ガスタイミングデータが、サンプル検出データヒストグラムと共にプロットして図４〜図７に例示される。フローサイトメータは、前方散乱光検出器、側方散乱光検出器、及び蛍光検出器の出力に基づいてサンプル検出データを生成する。ウェル識別アルゴリズムにより識別されるウェルの数と、サンプルプレートにおけるウェルの総数が、ヒストグラムの上部に示されている。これらの図面では、時間ヒストグラム上の高い垂直ラインは、フローセルを通って行く気泡と相関し、短い垂直ラインは、サンプルにおけるイベントの数と相関する。分離気泡の検出は、ウェルプレートの第１の列Ａのサンプリングからの検出器出力、その後の列間の振とうによるサンプルにおけるあらゆる粒子を再懸濁させるためのマイクロプレートの振とう、及び列Ｂの最初の２つのウェルのサンプリングからの検出器出力も例証する、図４に示された事前プレートプライミング手順で特によく分かる。図５は、図４の一部の、具体的には、ウェルプレートの第１の列Ａのサンプリングからの検出器出力、その後のマイクロプレート振とう、及び列Ｂの最初の２つのウェルのサンプリングからの検出器出力の拡大図である。図６も、図４の一部の、具体的には、ウェルプレートの列Ａの最初の６つのウェルのサンプリングからの検出器出力の拡大図である。図７は、サンプリングされた全９６ウェルプレートからの検出器出力のヒストグラムである。フローサイトメトリデバイスを動作させるための制御ソフトウェアは、いくつかの場合には、例えば、或る数のウェルがサンプリングされた後で行われるべき一組のプローブリンス及び／又はマイクロプレート振とう手順を含んでもよいカスタムサンプリングプロトコルをユーザがプログラムすることを可能にし得る。図示された例では、９６ウェルマイクロプレートは、各列の後のマイクロプレートの振とうを伴って、列ごとにサンプリングされた。
【００４５】
図４〜図７のそれぞれにおける英字及び数字でそれぞれ標識されたゲートは、本開示の方法により識別されるウェルプレートのそれぞれのウェルに対応する。気泡ギャップを検出するのに前方散乱光出力を使用するこの新規な方法は、以前の方法と比べてウェル識別エラーを制限する。サンプリングプロトコルと併せて用いられる、本明細書で説明される前方散乱光波形分析は、サンプル自体の検出から独立している、列又はカラムプレート振とう及びプローブリンス、並びにサンプル間の気泡ギャップなどのサンプリングプロトコル特徴の正確な識別及び検証を可能にし得る。前方散乱光波形分析では、サンプル間の一連の低いイベントカウントではなく、一連の検出された気泡が、サンプルを線引きするのに用いられる。これは、例えば、サンプル調製エラー、不適正に分与されたサンプル、非常にわずかな関心ある粒子を有するサンプル（例えば、毒性アッセイ）、サンプルの不十分な再懸濁、流体サンプルチュービングの詰まりに起因するサンプルにおける一連の低いイベントカウントが存在する場合に生じることがある可能性のあるエラーをなくし得る。加えて、前方散乱光波形分析は、サンプルプローブからフローセルへの流体経路の詰まりを検出するのに用いることができるフローセル中の気泡ギャップの一貫性に対するリアルタイムフィードバックを提供することができる。
【００４６】
図８は、フローサイトメータの前方散乱光検出器から取得した分離ガスタイミング出力データと共にプロットした、フローサイトメータから取得した処理済みＦＳＣ−Ａ出力のサンプルイベントデータの例示的なヒストグラムを示す。したがって、図８に示された例では、フローサイトメータ検出器自体（外部デバイスではない）が、前方散乱光ＰＭＴからの電圧出力を各イベントに関する処理済みＦＳＣ−Ａデジタル出力値に変換する。分離ガスと液体サンプルとの境界により、ＦＳＣ−Ａ値をもつ１つ以上のイベントが検出の上限（例えば、フローサイトメータにより生成される上限値）となり、これにより、図８に示すようにトップＦＳＣ−Ａイベント値の周りのゲートを形成する。フローサイトメータはまた、記録されるイベントごとにタイムスタンプを記録する。この情報により、分離ガスタイミングデータは、タイミングに基づいてフローサイトメータからのサンプルイベントデータと同期される。分離ガスタイミングデータは、ウェルの識別のために用いられるサンプルイベント対時間ヒストグラムと共にプロットされる。したがって、気泡検出パターンタイミング出力は、マイクロ気泡、ごみ、不十分なサンプル、サンプル調製エラー、又はキャリーオーバーが経時的イベントカウントを用いるだけでそれを行うことを難しいものにする場合に、ウェル気泡ギャップ間に線引きするのに用いられてよい。
【００４７】
図９は、フローサイトメータの側方散乱光検出器から取得した分離ガスタイミング出力データと共にプロットした、フローサイトメータから取得した処理済みＳＳＣ−Ａ出力のサンプルイベントデータの例示的なヒストグラムを示す。図９に示された例では、フローサイトメータ検出器自体（外部デバイスではない）が、側方散乱光ＰＭＴからの電圧出力を各イベントに関する処理済みＳＳＣ−Ａデジタル出力値に変換する。フローサイトメータはまた、記録されるイベントごとにタイムスタンプを記録する。この情報により、分離ガスタイミングデータは、タイミングに基づいてフローサイトメータからのサンプルイベントデータと同期される。分離ガスタイミングデータは、ウェルの識別のために用いられるサンプルイベント対時間ヒストグラムと共にプロットされる。
【００４８】
種々の態様及び実施形態が本明細書で開示されているが、他の態様及び実施形態が当業者には明白であろう。本明細書で開示される種々の態様及び実施形態は、例証する目的のためであって、限定するものとなることを意図しておらず、その真の範囲は以下の請求項により示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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