(57)【要約】本出願は、ＢＣＭＡを標的とする単一ドメイン抗体、及び１つ以上の抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体を含むキメラ抗原受容体（例えば、一価ＣＡＲ、及び２つのエピトープＣＡＲを含む多価ＣＡＲ）を提供する。キメラ抗原受容体を含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）がさらに提供される。がんを治療する薬学的組成物、キット、及び方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを含む多価キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
（ａ）少なくとも２つのＢＣＭＡ結合部分を含む細胞外抗原結合ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、前記多価キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記細胞外抗原結合ドメインが、第１の抗ＢＣＭＡ結合部分及び第２のＢＣＭＡ結合部分を含む、請求項１に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項３】
前記第１のＢＣＭＡ結合部分及び前記第２のＢＣＭＡ結合部分のうちの１つ以上が、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂである、請求項１または２に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項４】
前記第１のＢＣＭＡ結合部分が、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂであり、前記第２のＢＣＭＡ結合部分が、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂである、請求項２または３に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項５】
前記第１のＢＣＭＡ結合部分が、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂであり、前記第２のＢＣＭＡ結合部分が、ヒト抗体に由来する、請求項２または３に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項６】
前記第１のＢＣＭＡ結合部分が、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂであり、前記第２のＢＣＭＡ結合部分が、ＢＣＭＡのポリペプチドリガンドである、請求項２または３に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項７】
前記第１のＢＣＭＡ結合部分及び前記第２のＢＣＭＡ結合部分が、ＢＣＭＡ上の同じエピトープに特異的に結合する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項８】
前記第１のＢＣＭＡ結合部分及び前記第２のＢＣＭＡ結合部分が、ＢＣＭＡ上の異なるエピトープに特異的に結合する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項９】
前記第１のＢＣＭＡ結合部分及び／または前記第２のＢＣＭＡ結合部分が、配列番号３８８〜３９４から選択されるアミノ酸配列に由来するＢＣＭＡ上のエピトープに特異的に結合する、請求項２〜８のいずれか１項に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項１０】
前記抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが、
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（５）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（６）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣ
ＤＲ２、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１０）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１１）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１２）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１３）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１４）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１５）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１６）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１７）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１８）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１９）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２０）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２１）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２２）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２３）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２４）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２５）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２６）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２７）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２８）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２９）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３０）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３２）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３３）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７１のアミノ酸配列を含
むＣＤＲ２、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３４）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３５）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３６）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３７）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または
（３８）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、のうちの任意の１つを含む、請求項３〜９のいずれか１項に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項１１】
前記第１のＢＣＭＡ結合部分が、前記第２のＢＣＭＡ結合部分のＮ末端に位置している、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項１２】
前記第１のＢＣＭＡ結合部分が、前記第２のＢＣＭＡ結合部分のＣ末端に位置している、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項１３】
前記第１のＢＣＭＡ結合部分及び前記第２のＢＣＭＡ結合部分が、ペプチドリンカーを介して互いに融合される、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項１４】
前記ペプチドリンカーが、約５０以下のアミノ酸長である、請求項１３に記載の多価ＣＡＲ。
【請求項１５】
以下：
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（５）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（６）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１０）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１１）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１２）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１３）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１４）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１５）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１６）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１７）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１８）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（１９）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２０）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２１）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２２）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２３）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２４）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２５）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２６）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２７）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２８）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（２９）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３０）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３２）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３３）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３４）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３５）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３６）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
（３７）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または
（３８）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、のうちの任意の１つを含む、抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）。
【請求項１６】
前記抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが、配列番号１１５〜１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂと競合する、抗ＢＣＭＡ抗体。
【請求項１８】
前記抗ＢＣＭＡ抗体が、ｓｄＡｂである、請求項１７に記載の抗ＢＣＭＡ抗体。
【請求項１９】
前記抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが、ラクダ科抗体である、請求項１５、１６、及び１８のいずれか１項に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ。
【請求項２０】
前記抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが、キメラ抗体である、請求項１５、１６、及び１８のいずれか１項に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ。
【請求項２１】
前記抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが、ＶＨＨフラグメントである、請求項１５、１６及び１８〜２０のいずれか１項に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ。
【請求項２２】
ポリペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
（ａ）請求項１５、１６及び１８〜２１のいずれか１項に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２３】
前記細胞外抗原結合ドメインが、少なくとも２つの抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む、請求項２２に記載のＣＡＲ。
【請求項２４】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１から成る群から選択される分子に由来する、請求項１〜１４及び２３〜２３のいずれか１項に記載の多価ＣＡＲまたはＣＡＲ。
【請求項２５】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来する、請求項２４に記載の多価ＣＡＲまたはＣＡＲ。
【請求項２６】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１４及び２２〜２５のいずれか１項に記載の多価ＣＡＲまたはＣＡＲ。
【請求項２７】
前記一次細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζに由来する、請求項２６に記載の多価ＣＡＲまたはＣＡＲ。
【請求項２８】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１４及び２２〜２７のいずれか１項に記載の多価ＣＡＲまたはＣＡＲ。
【請求項２９】
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される共刺激分子に由来する、請求項２８に記載の多価ＣＡＲまたはＣＡＲ。
【請求項３０】
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８の細胞質ドメイン及び／またはＣＤ１３７の細胞質ドメインを含む、請求項２９に記載の多価ＣＡＲまたはＣＡＲ。
【請求項３１】
前記細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と前記膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む、請求項１〜１４及び２２〜３０のいずれか１項に記載の多価ＣＡＲまたはＣＡＲ。
【請求項３２】
前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αに由来する、請求項３１に記載の多価ＣＡＲまたはＣＡＲ。
【請求項３３】
前記ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む、請求項１〜１４及び２２〜３２のいずれか１項に記載の多価ＣＡＲまたはＣＡＲ。
【請求項３４】
前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αに由来する、請求項３３に記載の多価ＣＡＲまたはＣＡＲ。
【請求項３５】
配列番号２１６〜２５６及び２９８〜３３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項３６】
請求項１〜１４及び２２〜３５のいずれか１項に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲをコードする核酸配列を含む、単離された核酸。
【請求項３７】
請求項３６に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項３８】
請求項１〜１４及び２２〜３５のいずれか１項に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ、請求項３６に記載の単離された核酸、または請求項３７に記載のベクターを含む、操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項３９】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞である、請求項３８に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項４０】
請求項３９に記載の操作された免疫エフェクター細胞、または請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項４１】
個体におけるがんを治療する方法であって、前記個体に、有効量の請求項４０に記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
前記がんが、多発性骨髄腫である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記がんが、難治性または再発性多発性骨髄腫である、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年８月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０９４４０８号の優先権の利益を主張するものであり、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７６１４２２０００６４０ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ、記録日：２０１７年８月１０日、サイズ：５２０ＫＢ）。
【０００３】
本発明は、ＢＣＭＡを標的とする単一ドメイン抗体、キメラ抗原受容体、及び操作された免疫エフェクター細胞、ならびにその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍免疫療法及び臨床技術の発達とともに、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）免疫療法は、現在、最も有望な腫瘍免疫療法アプローチのうちの１つである。一般に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞外抗原結合ドメインは、特定された腫瘍抗原を標的とする一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み得る。ＣＡＲは、遺伝子トランスフェクション技術を使用して、Ｔ細胞の表面上に発現させることができる。標的腫瘍抗原に結合すると、ＣＡＲは、標的腫瘍抗原に特異的な主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の利用可能性によって制限されることなく、抗原依存的様態で、特異的な抗腫瘍応答を開始するように、Ｔ細胞を活性化することができる。
【０００５】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の単量体抗体可変ドメインを有することにより、従来の４鎖抗体とは異なる。例えば、ラクダ科の動物及びサメは、重鎖のみ抗体（ＨｃＡｂ）と命名されたｓｄＡｂを産生し、これは、軽鎖を天然に欠いている。ラクダ科重鎖のみ抗体の各アームにおける抗原結合フラグメントは、単一の重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）を有し、これは、軽鎖の援助なしに抗原に対する高い親和性を有することができる。ラクダ科ＶＨＨは、およそ１５ｋＤの分子量を有する最小の機能的抗原結合フラグメントとして既知である。
【０００６】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、不治の侵襲性血漿悪性腫瘍であり、これは、Ｂ細胞新形成に分類され、制御不能な方法で骨髄内に増殖し、血液細胞の正常な代謝産生を妨害し、有痛性骨病変を引き起こす（Ｇａｒｆａｌｌ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｍｅｄ．２０１４，１７，３７）。多発性骨髄腫は、高カルシウム血症、腎不全、貧血症、骨病変、細菌感染、過粘稠、及びアミロイドーシスを臨床的に呈し得る（Ｒｏｂｅｒｔ
Ｚ．Ｏｒｌｏｗｓｋｉ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２０１３，２４（３））。研究及び統計によれば、毎年ほぼ８６，０００人の患者が骨髄腫と診断される一方で、約６３，０００人の患者が毎年この疾患関連の合併症で死亡する（Ｂｅｃｋｅｒ，２０１１）。高齢化大衆のため、骨髄腫の症例数が年々増加することが予測される。多くのがんと同様に、多発性骨髄腫の原因は知られておらず、治療法も存在しない。多発性骨髄腫のいくつかの治療は、化学療法または放射線療法、幹細胞移植または骨髄移植、標的療法、または生物学的療法等の他のがんの治療と類似している（Ｇｅｏｒｇｅ，２０１４）。抗体に基づく細胞免疫療法が、血液学的悪性腫瘍、具体的には、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫を有する患
者に対する実質的な臨床的利益を実証している。多発性骨髄腫の現在の療法は、しばしば、寛解をもたらすが、ほぼ全ての患者が最終的に再発する。多発性骨髄腫の治療に有効な免疫療法薬が必要とされている。
【０００７】
本発明に開示されているＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍは、難治性または再発性多発性骨髄腫患者の治療における安全性及び有効性の両方に関して、臨床的利点が臨床試験において既に示されているＣＡＲ−Ｔを標的とする二価ＢＣＭＡである。初期臨床試験において、３５人のうちの３３人（９４％）の患者は、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を受けた際に多発性骨髄腫の臨床的寛解を有した。ほとんどの患者は、軽度の副作用のみを有した。研究は、２０１７年ＡＳＣＯ年次総会（要約ＬＢＡ３００１）及び広範なマスコミ報道を動員した記者会見（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｃｏｐｏｓｔ．ｃｏｍ／Ｎｅｗｓ／５５７１３）の両方で主要な発明者らによって提示された。
【０００８】
全体的に、客観的奏功率は、１００％であり、３３人の患者（９４％）が、ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けた２カ月以内に、骨髄腫の明らかな臨床的寛解（完全奏功、非常に良好な部分奏功、または部分奏功）を有した。この群を、４カ月を超える期間にわたって追跡後、有効性において、１９人の患者のうち１４人は、ストリンジェントな完全奏功基準に達し、１人の患者は、部分奏功に達し、４人の患者は、非常に良好な部分寛解基準を達成した。
【０００９】
ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ臨床試験から得られた優れた有効性及び安全性プロファイルは、免疫療法分野において「革命的な飛躍的進歩」として広く認識されていた、ＡＳＣＯにおいて同時に報告された、いくつかの他のＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ試験よりも著しく優れている。これら全てのＢＣＭＡ  ＣＡＲ設計は、ＢＣＭＡ抗原結合ドメインが一価ＳｃＦｖ抗体から成る従来のＣＡＲであることに注目すべきである。
【００１０】
本明細書において参照される全ての公開物、特許、特許出願、及び公開された特許出願の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【００１１】
本出願は、抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、１つ以上の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ（ＶＨＨフラグメント等）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、操作された免疫エフェクター細胞、及びがん免疫療法におけるその使用方法を提供する。
【００１２】
本出願の一態様は、配列番号１１５〜１５２のうちのいずれか１つのＣＤＲ領域を含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、以下：（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（５）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（６）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含
むＣＤＲ３、（１０）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１１）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１２）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１３）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１４）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１５）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１６）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１７）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１８）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１９）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２０）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２１）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２２）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２３）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２４）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２５）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２６）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２７）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２８）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２９）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３０）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３２）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３３）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３４）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３５）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３６）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３７）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または（３８）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２
、及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１１５〜１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ重鎖のみ抗体（ＨＣＡＢ）、または上に記載される抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つを含む抗原結合タンパク質が提供される。上に記載される抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つが、上に記載される抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つと競合する抗ＢＣＭＡ抗体（抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）に特異的に結合するＢＣＭＡエピトープも提供される。
【００１４】
上に記載される抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、キメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ＶＨＨフラグメントである。
【００１５】
本出願の一態様は、（ａ）抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメイン（上に記載される抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つ等）と、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、ポリペプチドを含むＢＣＭＡキメラ抗原受容体を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、単一特異性である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、一価である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、多価（二価または三価等）である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、多重特異性（二重特異性等）である。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、少なくとも２つの抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ（上に記載される抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つ以上等）を含む。
【００１６】
本出願の一態様は、（ａ）第１のＢＣＭＡ結合部分及び第２のＢＣＭＡ結合部分を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、ポリペプチドを含む多価キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分及び第２のＢＣＭＡ結合部分のうちの１つ以上は、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分は、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂであり、第２のＢＣＭＡ結合部分は、第２の抗ＢＣＭＡ
ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分は、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂであり、第２のＢＣＭＡ結合部分は、ヒト抗体に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分は、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂであり、第２のＢＣＭＡ結合部分は、ＢＣＭＡのポリペプチドリガンドである。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分及び第２のＢＣＭＡ結合部分は、ＢＣＭＡ上の同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分及び第２のＢＣＭＡ結合部分は、ＢＣＭＡ上の異なるエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分及び／または第２のＢＣＭＡ結合部分は、配列番号３８８〜３９４から選択されるアミノ酸配列に由来するＢＣＭＡ上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分は、配列番号３８９及び／または３９０に由来するエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２のＢＣＭＡ結合部分は、配列番号３９１及び／または３９２に由来するエピトープに特異的に結合する。
【００１７】
本出願の一態様は、（ａ）第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ（上に記載される抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つ等）及び第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ（上に記載される抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つ等）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、ポリペプチドを含む多価（二価または三価等）キメラ抗原受容体を提供する。いくつかの実施形態では、第１
の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ＢＣＭＡ上の同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ＢＣＭＡ上の異なるエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び／または第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号３８８〜３９４から選択されるアミノ酸配列に由来するＢＣＭＡ上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号３８９及び／または３９０に由来するエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号３９１及び／または３９２に由来するエピトープに特異的に結合する。
【００１８】
上に提供される多価ＣＡＲのうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）は、第２のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）のＮ末端に位置している。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）は、第２のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）のＣ末端に位置している。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）及び第２のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）は、ペプチド結合を介して互いに直接融合される。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）及び第２のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）は、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約５０個以下（約３５、２５、２０、１５、１０、または５個以下等のいずれかの個数）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号２０８〜２１５から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
上に記載されるＣＡＲ（多価ＣＡＲを含む）のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１から成る群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１９３または１９４のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
上に記載されるＣＡＲ（多価ＣＡＲを含む）のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１９７または１９８のアミノ酸配列を含む。
【００２１】
上に記載されるＣＡＲ（多価ＣＡＲを含む）のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞質ドメイン及び／またはＣＤ１３７の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１９５及び／または配列番号１９６のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
上に記載されるＣＡＲ（多価ＣＡＲを含む）のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１９２の
アミノ酸配列を含む。
【００２３】
上に記載されるＣＡＲ（多価ＣＡＲを含む）のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ−ＣＳＦ受容体α、及びＩｇＧ１重鎖から成る群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１９１のアミノ酸配列を含む。
【００２４】
本出願の一態様は、表４及び５に列記されるＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２１６〜２５６及び２９８〜３３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本出願の一態様は、配列番号１１５〜１５２、２１６〜２５６、及び２９８〜３３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００２６】
本出願の一態様は、上に記載される、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂまたはＣＡＲ（多価ＣＡＲを含む）のうちのいずれか１つをコードする核酸配列を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１５３〜１９０、２５７〜２９７、及び３３６〜３７３から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列をさらに含み、第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、またはＦ２Ａペプチド等の自己開裂ペプチドをコードする第３の核酸配列を介して、第１の核酸配列に操作可能に連結される。第３の核酸配列は、配列番号３８５である。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、ＲＮＡ分子である。
【００２７】
本出願の一態様は、上に記載される単離された核酸のうちのいずれか１つを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。
【００２８】
本出願の一態様は、上に提供されるＣＡＲ（多価ＣＡＲを含む）のうちのいずれか１つ、または上に記載される単離された核酸のうちのいずれか１つ、または上に記載されるベクターのうちのいずれか１つを含む、操作された免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚幹細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。
【００２９】
本出願の一態様は、上に記載される操作された免疫エフェクター細胞のうちのいずれか１つと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。個体におけるがんを治療する方法がさらに提供され、個体に有効量の上に記載される薬学的組成物のうちのいずれか１つを投与することを含む。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、同種異系である。いくつかの実施形態では、がんは、液体癌である。いくつかの実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、または慢性リンパ性白血病である。いくつかの実施形態では、がんは、膠芽腫等の固体がんである。いくつかの実施形態では、がんは、難治性または再発性多発性骨髄腫である。
【００３０】
本出願の一態様は、上に記載される抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つと、薬
学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、個体における疾患（がん等）を治療する方法がさらに提供され、個体に有効量の薬学的組成物を投与することを含む。
【００３１】
上に記載される、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ、ＣＡＲ（多価ＣＡＲを含む）、操作された免疫エフェクター細胞、単離された核酸、またはベクターのうちのいずれか１つを含む、使用方法、キット、及び製品も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図１Ａ）、またはＵ８７ＭＧ．Ｌｕｃ細胞（図１Ｂ）に対する様々な抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む例示的な単一特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図１Ｂ】ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図１Ａ）、またはＵ８７ＭＧ．Ｌｕｃ細胞（図１Ｂ）に対する様々な抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む例示的な単一特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図２Ａ】ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図２Ａ）、Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ細胞（図２Ｂ）、またはＫ５６２．ＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞（図２Ｃ）に対する様々な抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む例示的な単一特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図２Ｂ】ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図２Ａ）、Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ細胞（図２Ｂ）、またはＫ５６２．ＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞（図２Ｃ）に対する様々な抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む例示的な単一特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図２Ｃ】ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図２Ａ）、Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ細胞（図２Ｂ）、またはＫ５６２．ＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞（図２Ｃ）に対する様々な抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む例示的な単一特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図３】Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ細胞に対する様々な抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む例示的な単一特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロＩＦＮγ放出アッセイの結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図４Ａ〜４Ｂ）またはＵ８７ＭＧ．Ｌｕｃ細胞（図４Ｃ）に対する例示的な多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ａは、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図４Ａ〜４Ｂ）またはＵ８７ＭＧ．Ｌｕｃ細胞（図４Ｃ）に対する例示的な多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図４Ｃ】図４Ａは、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図４Ａ〜４Ｂ）またはＵ８７ＭＧ．Ｌｕｃ細胞（図４Ｃ）に対する例示的な多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図５Ａ】ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図５Ａ）、Ｋ５６２．ＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞（図５Ｂ）、Ａ５４９．Ｌｕｃ細胞（図５Ｃ）、Ｕ８７ＭＧ．Ｌｕｃ細胞（図５Ｄ）、またはＲａｊｉ．Ｌｕｃ細胞（図５Ｅ）に対する例示的な二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図５Ｂ】ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図５Ａ）、Ｋ５６２．ＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞（図５Ｂ）、Ａ５４９．Ｌｕｃ細胞（図５Ｃ）、Ｕ８７ＭＧ．Ｌｕｃ細胞（図５Ｄ）、またはＲａｊｉ．Ｌｕｃ細胞（図５Ｅ）に対する例示的な二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図５Ｃ】ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図５Ａ）、Ｋ５６２．ＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞（図５Ｂ）、Ａ５４９．Ｌｕｃ細胞（図５Ｃ）、Ｕ８７ＭＧ．Ｌｕｃ細胞（図５Ｄ）、またはＲａｊｉ．Ｌｕｃ細胞（図５Ｅ）に対する例示的な二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図５Ｄ】ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図５Ａ）、Ｋ５６２．ＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞（図５Ｂ）、Ａ５４９．Ｌｕｃ細胞（図５Ｃ）、Ｕ８７ＭＧ．Ｌｕｃ細胞（図５Ｄ）、またはＲａｊｉ．Ｌｕｃ細胞（図５Ｅ）に対する例示的な二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図５Ｅ】ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞（図５Ａ）、Ｋ５６２．ＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞（図５Ｂ）、Ａ５４９．Ｌｕｃ細胞（図５Ｃ）、Ｕ８７ＭＧ．Ｌｕｃ細胞（図５Ｄ）、またはＲａｊｉ．Ｌｕｃ細胞（図５Ｅ）に対する例示的な二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ細胞及びＫ５６２．ＣＤ３８．Ｌｕｃ細胞に対する例示的な二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図６Ａ】２つの異なるエフェクター細胞対標的細胞比でＫ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ細胞に対する例示的な二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロＩＦＮγ放出アッセイの結果を示す。
【図６Ｂ】ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ、Ａ５４９．Ｌｕｃ、Ｋ５６２．ＣＤ３８．Ｌｕｃ、及びＲａｊｉ．Ｌｕｃ細胞に対する例示的な二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロＩＦＮγ放出アッセイの結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｃは、Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ細胞及びＫ５６２．ＣＤ３８．Ｌｕｃ細胞（陰性対照）に対する３つの例示的なＶＨＨフラグメントの結合を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜図７Ｃは、Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ細胞及びＫ５６２．ＣＤ３８．Ｌｕｃ細胞（陰性対照）に対する３つの例示的なＶＨＨフラグメントの結合を示す。
【図７Ｃ】図７Ａ〜図７Ｃは、Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ細胞及びＫ５６２．ＣＤ３８．Ｌｕｃ細胞（陰性対照）に対する３つの例示的なＶＨＨフラグメントの結合を示す。
【図８Ａ】ＢＣＭＡの細胞外ドメインの結晶構造を示す。
【図８Ｂ】ＢＣＭＡエピトープペプチドを示す。
【図９Ａ】図９Ａ及び図９ＢはＶＨＨ１及びＶＨＨ２のエピトープマッピングアッセイの結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ及び図９ＢはＶＨＨ１及びＶＨＨ２のエピトープマッピングアッセイの結果を示す。
【図１０】ＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞を用いた競合結合アッセイの結果を示す。
【図１１】ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞に対してＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍを発現するドナー由来Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞に対して選択されたドナーから調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、腫瘍異種移植片マウスモデルにおけるＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性を示す。ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ処置マウス及び非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）処置マウスにおける生物発光画像化データを示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、腫瘍異種移植片マウスモデルにおけるＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性を示す。ＣＡＲ−Ｔ群及びＵｎＴ群におけるマウスの研究設計及び生物発光画像を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、腫瘍異種移植片マウスモデルにおけるＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性を示す。ＵｎＴ処置マウスからの肝臓の画像を示す。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、腫瘍異種移植片マウスモデルにおけるＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性を示す。ＵｎＴ処置マウスの肝臓中の腫瘍を検証するエクスビボルシフェラーゼアッセイを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｆは、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した２匹のサルの臨床パラメータを示す。研究でモニタリングされた臨床パラメータは、体温（図１３Ａ）、体重（図１３Ｂ）、完全血球算定（ＣＢＣ、図１３Ｃ及び１３Ｄ）、ならびに血液生化学検査及びサイトカインレベル（図１３Ｅ及び１３Ｆ）を含む。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｆは、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した２匹のサルの臨床パラメータを示す。研究でモニタリングされた臨床パラメータは、体温（図１３Ａ）、体重（図１３Ｂ）、完全血球算定（ＣＢＣ、図１３Ｃ及び１３Ｄ）、ならびに血液生化学検査及びサイトカインレベル（図１３Ｅ及び１３Ｆ）を含む。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３Ｆは、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した２匹のサルの臨床パラメータを示す。研究でモニタリングされた臨床パラメータは、体温（図１３Ａ）、体重（図１３Ｂ）、完全血球算定（ＣＢＣ、図１３Ｃ及び１３Ｄ）、ならびに血液生化学検査及びサイトカインレベル（図１３Ｅ及び１３Ｆ）を含む。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜図１３Ｆは、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した２匹のサルの臨床パラメータを示す。研究でモニタリングされた臨床パラメータは、体温（図１３Ａ）、体重（図１３Ｂ）、完全血球算定（ＣＢＣ、図１３Ｃ及び１３Ｄ）、ならびに血液生化学検査及びサイトカインレベル（図１３Ｅ及び１３Ｆ）を含む。
【図１３Ｅ】図１３Ａ〜図１３Ｆは、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した２匹のサルの臨床パラメータを示す。研究でモニタリングされた臨床パラメータは、体温（図１３Ａ）、体重（図１３Ｂ）、完全血球算定（ＣＢＣ、図１３Ｃ及び１３Ｄ）、ならびに血液生化学検査及びサイトカインレベル（図１３Ｅ及び１３Ｆ）を含む。
【図１３Ｆ】図１３Ａ〜図１３Ｆは、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置した２匹のサルの臨床パラメータを示す。研究でモニタリングされた臨床パラメータは、体温（図１３Ａ）、体重（図１３Ｂ）、完全血球算定（ＣＢＣ、図１３Ｃ及び１３Ｄ）、ならびに血液生化学検査及びサイトカインレベル（図１３Ｅ及び１３Ｆ）を含む。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜図１４Ｃは、同じ３人の多発性骨髄腫患者から調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞について、それぞれ、インビトロ細胞毒性アッセイを示す。図１４Ａは、多発性骨髄腫患者Ａから調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性の結果を示す。図１４Ｂは、多発性骨髄腫患者Ｂから調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性の結果を示す。図１４Ｃは、多発性骨髄腫患者Ｃから調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性の結果を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜図１４Ｃは、同じ３人の多発性骨髄腫患者から調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞について、それぞれ、インビトロ細胞毒性アッセイを示す。図１４Ａは、多発性骨髄腫患者Ａから調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性の結果を示す。図１４Ｂは、多発性骨髄腫患者Ｂから調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性の結果を示す。図１４Ｃは、多発性骨髄腫患者Ｃから調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性の結果を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜図１４Ｃは、同じ３人の多発性骨髄腫患者から調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞について、それぞれ、インビトロ細胞毒性アッセイを示す。図１４Ａは、多発性骨髄腫患者Ａから調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性の結果を示す。図１４Ｂは、多発性骨髄腫患者Ｂから調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性の結果を示す。図１４Ｃは、多発性骨髄腫患者Ｃから調製されたＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性の結果を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＶＨＨに基づくＣＡＲの構造と、従来のｓｃＦｖに基づくＣＡＲの構造とを比較する。左の概略構造は、ＶＨＨドメインを含む細胞外抗原結合ドメインを有する、例示的な単一特異性一価ＣＡＲを示す。右の概略構造は、ｓｃＦｖドメインを含む細胞外抗原結合ドメインを有する、例示的な単一特異性一価ＣＡＲを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、２つの抗原結合部位を有するＶＨＨに基づくＣＡＲの構造と、２つの抗原結合部位を有する従来のｓｃＦｖに基づくＣＡＲの構造とを比較する。左の概略構造は、２つのＶＨＨドメインを含む細胞外抗原結合ドメインを有する、例示的なＣＡＲである。２つのＶＨＨドメインは、同じであってもよく、または異なってもよい。右の概略構造は、２つのｓｃＦｖドメインを含む細胞外抗原結合ドメインを有する、例示的なＣＡＲを示す。２つのｓｃＦｖドメインは、同じであってもよく、または異なってもよい。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、例示的な二価及び二重特異性ＶＨＨに基づくＣＡＲの概略構造を示す。左上パネルの概略構造は、２つの同一のＶＨＨドメインを含む細胞外抗原結合ドメインを有する例示的な１つのエピトープ、二価ＣＡＲを示し、これらのそれぞれは、抗原Ａのエピトープ１に特異的に結合する。右上のパネルの概略構造は、抗原Ａのエピトープ１に特異的に結合する第１のＶＨＨドメイン及び抗原Ａのエピトープ２に特異的に結合する第２のＶＨＨドメインを含む細胞外抗原結合ドメインを有する、例示的な２つのエピトープ、二価ＣＡＲを示す。抗原Ａのエピトープ１及びエピトープ２は、それらの構造及び／または配列において異なり得る。左下のパネルの概略構造は、抗原Ａに特異的に結合する第１のＶＨＨドメイン及び抗原Ｂに特異的に結合する第２のＶＨＨドメインを含む細胞外抗原結合ドメインを有する、例示的な二重特異性ＣＡＲを示す。抗原Ａ及び抗原Ｂは、異なる抗原である。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、３つ以上のＶＨＨドメインを有する、例示的なＶＨＨに基づくＣＡＲの概略構造を示す。ＣＡＲは、互い直接、またはペプチドリンカーを介して融合される複数のＶＨＨドメインを有し得る。ＶＨＨドメインは、同じであってもよく、または異なってもよい。異なるＶＨＨドメインは、同じ抗原または異なる抗原上の異なるエピトープに特異的に結合し得る。
【図１５Ｅ】図１５Ｅは、２つの異なるＶＨＨに基づくＣＡＲを共発現する、例示的な操作された免疫エフェクター細胞を示す。左のパネルの例示的な操作された免疫エフェクター細胞は、２つの異なる単一特異性、一価ＣＡＲを共発現する。中央のパネルの例示的な操作された免疫エフェクター細胞は、単一特異性、一価ＣＡＲ、及び二重特異性または二価ＣＡＲを共発現する。右のパネルの例示的な操作された免疫エフェクター細胞は、２つの異なる二重特異性または二価ＣＡＲを共発現する。ＣＡＲは、異なる抗原を認識し得る。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本出願は、抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、及び１つ以上のＢＣＭＡ結合部分（抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）を含む細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。単一抗原に特異的に結合する、少なくとも２つの結合部分（ｓｄＡｂ等）を含む多価ＣＡＲもまた、提供される。いくつかの実施形態では、本出願は、少なくとも２つの抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む多価（二価または三価等）ＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ＢＣＭＡ上の異なるエピトープに特異的に結合する、異なる抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂである。抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ、ＣＡＲ、及び本出願に記載されるＣＡＲを発現する操作された免疫エフェクター細胞は、がん治療のための有用な薬剤である。
【００３４】
特に、本出願は、ヒト患者の間で多発性骨髄腫を治療する際に、異なるＢＣＭＡエピトープを標的とする２つの抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む二価の２つのエピトープＣＡＲ（例えば、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ）の優れた有効性を実証している。第Ｉ／ＩＩ相臨床試験の中
間分析では、再発性または難治性多発性骨髄腫を有する患者が、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ治療に対して１００％応答した。９４％の患者は、ＣＡＲ−Ｔ治療を受ける２カ月以内に骨髄腫の明らかな臨床的寛解を有した。ストリンジェントな完全奏効（ｓＣＲ）基準に達した患者は、ＣＡＲ−Ｔ治療を受けた１年超後に、最小の残留疾患がない状態を維持した。さらに、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ治療は、ほとんどの患者がＣＡＲ−Ｔ細胞に基づいた治療の一般的な副作用である、軽度及び管理可能なサイトカイン放出症候群のみを経験したため、患者によって良好な耐容性を示した。患者は、神経学的副作用を経験しなかった。相対的に、単一の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む一価ＣＡＲのパイロット臨床研究は、治療された患者間のより低い客観的応答率及び完全寛解率、ならびにより高い再発率を示した。本出願前に、臨床研究下で全てのＢＣＭＡ  ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインにおいて１つのみのＢＣＭＡ結合部分を有した。本出願の多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲの改善された臨床的有効性及び安全性は予想外である。
【００３５】
したがって、本出願の一態様は、（ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する複数の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、ポリペプチドを含む、多価ＣＡＲを提供する。
【００３６】
別の態様では、（ａ）ＢＣＭＡの第１のエピトープに特異的に結合する第１のＢＣＭＡ結合部分（第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）、及びＢＣＭＡの第２のエピトープに特異的に結合する第２のＢＣＭＡ結合部分（第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、ポリペプチドを含む、多価ＣＡＲが提供され、第１のエピトープは、第２のエピトープとは異なる。
【００３７】
本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちの任意の１つ以上を含む新規の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及びＣＡＲが、さらに提供される。
【００３８】
ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）、操作された免疫エフェクター細胞またはｓｄＡｂを使用してがんを治療する薬学的組成物、キット、製品、及び方法も本明細書に記載される。
【００３９】
Ｉ．定義
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長４鎖抗体または全長重鎖のみ抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び一本鎖分子）、ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）を含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」と同義に使用される。本明細書において企図される抗体は、重鎖のみ抗体等の単一ドメイン抗体を含む。
【００４０】
基本的な４鎖抗体ユニットは、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、５つの基本的なヘテロ四量体ユニットに加えて、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドから成り、１０個の抗原結合部位を含有しているが、一方でＩｇＡ抗体は、２〜５個の基本的な４鎖ユニットから構成されており、このユニットは、重合してＪ鎖と組み合わさった多価集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは、一般に、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つのジスルフィド共有結合によってＨ鎖に連結されているが、一方で２本のＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。Ｈ鎖及びＬ鎖はそれぞれ、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて、α及びγ鎖の各々については３つの定常ドメイン（ＣＨ）、ならびにμ及びεアイソタイプについては４つのＣＨドメイ
ンを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、続いてその反対側の端部に定常ドメインを有する。ＶＬは、ＶＨと整合しており、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整合している。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬとが一緒に対合することにより、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ（ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４、７１頁及び６章を参照されたい。任意の脊椎動物種に由来するＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に異なる種類のうちの１つに割り当てられ得る。それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てられ得る。５つのクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと表記される重鎖を有する。γ及びαクラスは、ＣＨ配列及び機能における比較的わずかな相違に基づいてさらにサブクラスに分類され、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２を発現する。
【００４１】
「重鎖のみ抗体」または「ＨＣＡｂ」という用語は、重鎖を含むが、４鎖抗体に通常見出される軽鎖を欠いている、機能的抗体を指す。ラクダ科動物（ラクダ、ラマ、またはアルパカ等）は、ＨＣＡｂを産生することが既知である。
【００４２】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という用語は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、単一の抗原結合ポリペプチドを指す。ｓｄＡｂは、単独で、対応するＣＤＲ含有ポリペプチドと対合せずに、抗原に結合することが可能である。いくつかの場合では、単一ドメイン抗体は、ラクダ科ＨＣＡｂから操作され、それらの重鎖可変ドメインは、本明細書で「ＶＨＨ」と称される。いくつかのＶＨＨはまた、ナノボディとしても既知であり得る。ラクダ科ｓｄＡｂは、最小の既知の抗原結合抗体フラグメントのうちの１つである（例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−８（１９９３）、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８−７３（１９９５）、Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ−Ｇｈａｓｓａｂｅｈ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ），８：１０１３−２６（２０１３）を参照のこと）。基本的なＶＨＨは、Ｎ末端からＣ末端まで、以下の構造：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、ここでは、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１〜４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、相補性決定領域１〜３を指す。
【００４３】
「単離された」抗体は、その産生環境（例えば、天然または組換え）の成分から特定、分離、及び／または回収されたものである。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その産生環境からの全ての他の成分との会合を含まない。組換えトランスフェクト細胞に起因するもの等のその産生環境の混入成分は、抗体の研究、診断的、または治療的使用を典型的に妨げるであろう材料であり、これらとしては、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性もしくは非タンパク質性の溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、（１）例えば、ローリー法によって決定される、抗体の９５重量％超、いくつかの実施形態では、９９重量％超になるまで、（１）スピニングカップシークエネーターを使用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルー、または好ましくはシルバー染色を使用して、非還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質性が得られるまで、精製されるであろう。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内でインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離されたポリペプチ
ドまたは抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００４４】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、「ＶＨ」及び「ＶＬ」と称され得る。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の高い部分であり（同じクラスの他の抗体と比べて）、抗原結合部位を含有する。ラクダ科種からの重鎖のみ抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、これは、「ＶＨＨ」と称される。このため、ＶＨＨは、ＶＨの特殊なタイプである。
【００４５】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定のセグメントが、抗体によって配列が大幅に異なるという事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、特定の抗体の、その特定の抗原に対する特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメイン全体に均等に分布しているわけではない。むしろ、それは、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインにおいて、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、ベータ−シート構造を接続し、いくつかの場合では、ベータ−シート構造の一部を形成するループを形成する３つのＨＶＲによって連結されたベータシート立体配置を大いに採用する４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＨＶＲは、ＦＲ領域によって極めて近接して一緒に保持され、他方の鎖からのＨＶＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与等の種々のエフェクター機能を示す。
【００４６】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用されるとき、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体を指す、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、微量で存在し得る可能性のある自然に発生する変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位を対象としている。異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象としている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンが混入されていないという点で、有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本出願に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）、Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６
７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）を参照されたい）、及びヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全てを有する動物におけるヒト抗体またはヒト様抗体の産生技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３、ＷＯ１９９６／３４０９６、ＷＯ１９９６／３３７３５、ＷＯ１９９１／１０７４１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、及び同第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）、ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい）を含む様々な技術によって作製され得る。
【００４７】
「ネイキッド抗体」という用語は、細胞毒性部分または放射標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。
【００４８】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、または「全抗体」という用語は、抗体フラグメントとは対照的に、その実質的にインタクトな形態にある抗体を指して同義に使用される。具体的には、全長４鎖抗体Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。全長重鎖のみ抗体は、重鎖（ＶＨＨ等）及びＦｃ領域を含む。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異形であり得る。いくつかの場合では、インタクトな抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有し得る。
【００４９】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部分、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域及び／または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］を参照されたい）；一本鎖抗体分子；単一ドメイン抗体（ＶＨＨ等）、ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、容易に結晶化する能力を反映して表記される残りの「Ｆｃ」フラグメントとが得られた。Ｆａｂフラグメントは、Ｌ鎖全体に加えて、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、ならびに１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。各Ｆａｂフラグメントは、抗原結合に関しては一価である、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、単一の大きいＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られ、これは、異なる抗原結合活性を有する２つのＦａｂフラグメントがジスルフィド結合したものにほぼ相当し、依然として抗原に架橋することが可能である。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含め、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の追加の残基を有することが、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生されたものであった。抗体フラグメ
ントの他の化学的カップリングも既知である。
【００５０】
Ｆｃフラグメントは、ジスルフィドによって一緒に保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域における配列によって決定され、この領域はまた、ある特定の細胞型に見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される。
【００５１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは、１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインが、非共有結合で緊密に結合した二量体から成る。これらの２つのドメインの折り畳みにより、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、抗原結合特異性を抗体に与える、６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が生じる。しかしながら、全結合部位よりも低い親和性であるが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＨＶＲを３つしか含まないＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
【００５２】
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略称される「一本鎖Ｆｖ」は、連結されて単一のポリペプチド鎖となったＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含んでおり、ｓＦｖが抗原結合に所望される構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ
ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００５３】
本明細書に記載の抗体の「機能性フラグメント」は、インタクトな抗体の一部分を含み、これには、一般に、インタクトな抗体の抗原結合領域もしくは可変領域、またはＦｃＲ結合能力を保持するかもしくは修飾されたＦｃＲ結合能力を有する抗体のＦｃ領域が含まれる。抗体フラグメントの例としては、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００５４】
「ダイアボディ」という用語は、鎖内ではなく鎖間のＶドメイン対合を達成し、それによって二価フラグメント、すなわち、２つの抗原結合部位を有するフラグメントが得られるようにＶＨ及びＶＬドメイン間に短いリンカー（約５〜１０個の残基）を用いてｓＦｖフラグメント（前の段落を参照されたい）を構築することによって調製された小さい抗体フラグメントを指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖に存在している、２つの「交差」ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第ＷＯ９３／１１１６１号、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。
【００５５】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにかかる抗体のフラグメントを特異的に含むが、これは、それらが所望の生物学的活性を呈する場合に限る（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書における目的とするキメラ抗体としては、ＰＲＩＭＡＴＴＺＦＤ（登録商標）抗体が含まれ、ここで、この抗体の抗原結合領域は、例えば、マカクザルに目的とする抗原で免疫化を行うことによ
って産生される抗体に由来する。本明細書で使用されるとき、「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。
【００５６】
非ヒト（例えば、ラクダ科）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ（以下に定義される）からの残基が、所望される特異性、親和性、及び／または能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲからの残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも供与体抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、結合親和性等の抗体の性能をさらに改良するために行われ得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、ここで、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリン配列のものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものに対応するが、ＦＲ領域には、結合親和性、異性体化、免疫原性等の抗体の性能を向上させる１つ以上の個々のＦＲ残基置換が含まれてもよい。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、典型的に、Ｈ鎖では６個以下であり、Ｌ鎖では３個以下である。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。例えば、Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）、Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）、ならびに米国特許第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号も参照されたい。
【００５７】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、及び／または本明細書に開示されるヒト抗体を作製する技術のうちの任意のものを用いて作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む当技術分野で既知の種々の技術を使用して産生され得る。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載される方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である。ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ
ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原攻撃に応答してかかる抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫化異種マウスに抗原を投与することにより調製され得る（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関しては、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照されたい）。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体についても、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）を参照されたい。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、配列が超可変性であり、及び／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、ｓｄＡｂは、３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）：ＨＶＲ１（またはＣＤＲ１）、ＨＶＲ２（またはＣＤＲ２）、及びＨＶＲ３（またはＣＤＲ３）を含む。ＨＶＲ３は、３つのＨＶＲのうちの最も高い多様性を呈し、抗体への優れた特異性を与える上で特有の役割を果たすと考えられる。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）、Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。
【００５９】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔ方式によって定義されるような超可変領域を指すために使用される。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい。
【００６０】
いくつかのＨＶＲ描写が本明細書で使用され、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置を示す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ  ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループとの間の妥協案を示し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々の残基を、以下の表１に記載する。
【表１】
2019527557.tif 000002
【００６１】
ＨＶＲは、以下の「伸長ＨＶＲ」を含み得る：ＶＬにおいて、２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７または８９〜９６
（Ｌ３）、ならびにＶＨにおいて、２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）、及び９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に従って番号付けされる。
【００６２】
ｓｄＡｂ（ＶＨＨ等）のアミノ酸残基は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０００  Ｊｕｎ．２３；２４０（１−２）：１８５−１９５の論文において、ラクダ科からのＶＨＨドメインに適用されるように、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｎｏ．９１）によって与えられる、ＶＨドメインに対する一般的な番号付けに従って番号付けされる。この番号付けによれば、ＶＨＨのＦＲ１は、１〜３０位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は、３１〜３５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２は、３６〜４９位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は、５０〜６５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３は、６６〜９４位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は、９５〜１０２位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ４は、１０３〜１１３位のアミノ酸残基を含む。この点に関して、当該技術分野で周知であるが、ＶＨドメインについて、及びＶＨＨドメインについて、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は変動し得、Ｋａｂａｔ番号付けによって示されるアミノ酸残基の総数に対応しない場合がある（つまり、Ｋａｂａｔ番号付けによる１つ以上の位置が、実際の配列において占有されない場合があるか、または実際の配列が、Ｋａｂａｔ番号付けによって許容される数よりも多いアミノ酸残基を含有する場合がある）ことに留意すべきである。
【００６３】
「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置番号付け」という表現、及びそれらの変形形態は、Ｋａｂａｔら（上記）における抗体の編成において重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用されている番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従って残基５２ａ）を、そして重鎖ＦＲ残基８２後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体に対して、抗体の配列と「標準の」Ｋａｂａｔによって番号付けされた配列との相同領域での整合によって決定され得る。
【００６４】
本明細書において別途指示がない限り、免疫グロブリン重鎖内の残基の番号付けは、上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．にあるようなＥＵ指標のものである。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵ指標」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【００６５】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６６】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」または「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌ
ｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）にあるようなサブグループである。例としては、ＶＬに関するものが含まれ、サブグループは、上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．にあるようなサブグループカッパＩ、カッパＩＩ、カッパＩＩＩ、またはカッパＩＶであり得る。さらに、ＶＨについては、サブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．にあるようなサブグループＩ、サブグループＩＩ、またはサブグループＩＩＩであり得る。あるいは、ヒトコンセンサスフレームワークは、特定の残基、例えば、ドナーフレームワーク配列を種々のヒトフレームワーク配列の集合と整合することによって、ヒトフレームワーク残基が、ドナーフレームワークに対するその相同性に基づいて選択される場合等、上記のものに由来し得る。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含んでもよく、またはそれは既存のアミノ酸配列変化を含有してもよい。いくつかの実施形態では、既存のアミノ酸変化の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下である。
【００６７】
例えば、Ｆｃ領域の指定された位置における「アミノ酸修飾」は、指定された残基の置換もしくは欠失、または指定された残基に隣接する少なくとも１個のアミノ酸残基の挿入を指す。指定された残基に「隣接する」挿入とは、その１〜２個の残基内への挿入を意味する。挿入は、指定された残基のＮ末端側またはＣ末端側であり得る。本明細書における好ましいアミノ酸修飾は、置換である。
【００６８】
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＨＶＲに１つ以上の変化を有し、これらの変化が、それらの変化（複数可）を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の向上をもたらすものである。いくつかの実施形態では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対するナノモルまたはさらにはピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該技術分野で既知の手順によって産生される。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨ及びＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＨＶＲ及び／またはフレームワーク残基のランダム変異生成は、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）、Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）、及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載されている。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、または「に対して特異的な」という用語は、標的と抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）との間の結合等の測定可能及び再生可能な相互作用を指し、それは、生体分子を含む分子の不均一な集団の存在下で標的の存在を確定させる。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）は、他の標的に結合するよりも高い親和性、結合力で、より容易に、及び／またはより長い持続時間でこの標的に結合する、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）が無関係の標的に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される際、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、標的に特異的に結合する抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）は、異なる種由来のタンパク質間で保存されるタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを必要
としない。
【００７０】
「特異性」という用語は、抗原の特定のエピトープに対する抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）の選択的認識を指す。例えば、自然抗体は、単一特異性である。「多重特異性」という用語は、本明細書で使用されるとき、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）が、２つ以上の抗原結合部位を有し、これらの少なくとも２つは、異なる抗原に結合することを示す。「二重特異性」は、本明細書で使用されるとき、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）が、２つの異なる抗原結合特異性を有することを示す。「単一特異性」ＣＡＲという用語は、本明細書で使用されるとき、各々が同じ抗原に結合する、１つ以上の結合部位を有する、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）を示す。
【００７１】
「価」という用語は、本明細書で使用されるとき、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）における指定された数の結合部位の存在を示す。例えば、自然抗体、または全長抗体は、２つの結合部位を有し、二価である。したがって、「三価」、「四価」、「五価」、及び「六価」という用語は、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂ等）における、それぞれ、２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を示す。
【００７２】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列変異形Ｆｃ領域）に帰属する生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプに応じて多様である。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞活性化が挙げられる。「低減または最小化された」抗体エフェクター機能は、野生型または未修飾抗体から少なくとも５０％（あるいは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）低減されていることを示す。抗体エフェクター機能の決定は、当業者によって容易に決定可能かつ測定可能である。好ましい実施形態では、補体結合、補体依存性細胞毒性、及び抗体依存性細胞毒性の抗体エフェクター機能が、影響される。いくつかの実施形態では、エフェクター機能は、グリコシル化を排除した定常領域における変異、例えば、「エフェクターレス変異」を通じて排除される。一態様では、エフェクターレス変異は、ＣＨ２領域におけるＮ２９７ＡまたはＤＡＮＡ変異（Ｄ２６５Ａ＋Ｎ２９７Ａ）である。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）。あるいは、低減または排除されたエフェクター機能をもたらす追加の変異としては、Ｋ３２２Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）が挙げられる。あるいは、エフェクター機能は、グリコシル化しない宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ．）、またはエフェクター機能を促進する際に非効果的であるか、もしくはあまり効果的ではない、改変されたグリコシル化パターンをもたらす宿主細胞における発現等の産生技術を通じて、低減または排除され得る（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６−３４７３（２００３）。
【００７３】
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」またはＡＤＣＣは、ある特定の細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞と特異的に結合して、続いて細胞毒を用いて標的細胞を死滅させることができるようにする細胞毒性の形態を指す。抗体は、細胞毒性細胞で「武装」し、この機序により標的細胞を死滅させるために必要である。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３
に要約されている。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載のアッセイ等のインビトロＡＤＣＣアッセイが行われ得る。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、または加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるもの等の動物モデルで評価されてもよい。
【００７４】
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義して使用され、天然配列のＦｃ領域及び変異形Ｆｃ領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで伸びると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによると残基４４７）は、例えば、抗体の産生もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって、除去されてもよい。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全Ｋ４４７残基が除去された抗体集団、除去されたＫ４４７残基がない抗体集団、及びＫ４４７残基を有する抗体と有しない抗体との混合物を有する抗体集団を含んでもよい。本明細書に記載の抗体における使用に好適な天然配列のＦｃ領域としては、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が挙げられる。
【００７５】
「結合親和性」は、一般に、分子（例えば、抗体またはＣＡＲ）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合的相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原、またはＣＡＲ及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）で表され得る。親和性は、本明細書に記載のものを含む当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定され得る。低親和性抗体は、一般に、抗原にゆっくり結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般に、抗原により早く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で既知であり、これらのいずれも、本出願の目的のために使用することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的及び例示的な実施形態が、以下に記載される。
【００７６】
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害または低減するものである。いくつかの実施形態では、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害する。
【００７７】
ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に関して、「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「相同性」は、配列同一性最大パーセントを達成するために、配列を整合させ、必要に応じてギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しない、特定のペプチドもしくはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整合は、当該技術分野の技術範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整合を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、整合を測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００７８】
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」とは、Ｔ細胞等の免疫エフェクター細胞に１つ以上の抗原特異性をグラフとするために使用され得る遺伝子操作さ
れた受容体を指す。いくつかのＣＡＲは、「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、または「キメラ免疫受容体」としても既知である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｔ細胞及び／または他の受容体の１つ以上の抗原（腫瘍抗原等）、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインに特異的な細胞外抗原結合ドメインを含む。「ＣＡＲ−Ｔ」とは、ＣＡＲを発現するＴ細胞を指す。「ＢＣＭＡ  ＣＡＲ」は、ＢＣＭＡに特異的な細胞外抗原結合ドメインを有する、ＣＡＲを指す。「２つのエピトープＣＡＲ」とは、ＢＣＭＡ上の２つの異なるエピトープに特異的な細胞外結合ドメインを有する、ＣＡＲを指す。
【００７９】
本明細書に記載のＣＡＲまたはｓｄＡｂをコードする「単離された」核酸分子は、それが産生された環境において通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から特定及び分離される核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、産生環境に関連する全ての成分との会合を含まない。本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする単離された核酸分子は、それが天然に見られる形態または設定以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞中に天然に存在する本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする核酸とは区別される。
【００８０】
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における、操作可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列には、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを用いることで知られている。
【００８１】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係性に置かれるとき、「操作可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結しているか、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に操作可能に連結しているか、あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に操作可能に連結されている。一般に、「操作可能に連結」されるとは、連結しているＤＮＡ配列が連続的であること、及び分泌リーダーの場合、連続しており、リーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続していなくてもよい。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。かかる部位が存在していない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例に従って使用される。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及び中に導入される宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが操作可能に連結している核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、「自己由来」という用語は、それが後に個体に再導入される同じ個体に由来する任意の材料を指すよう意図されている。
【００８４】
「同種」とは、同じ種の異なる個体に由来するグラフトを指す。
【００８５】
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクト」または「形質転換」または「形質導入」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換、または形質導入された細胞である。この細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という表現は、同義に使用され、全てのかかる指名は、子孫を含む。したがって、「トランスフェクタント」及び「トランスフェクト細胞」は、初代対象細胞及び移入の数にかかわらずそれに由来する培養物を含む。全ての子孫が、故意のまたは偶発的な変異により、ＤＮＡ含有量の点で厳密に同一でない場合があることも理解される。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異形子孫が含まれる。
【００８７】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は、同義に使用され、外因性核酸が中に導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞としては、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が挙げられ、これらは、初代形質転換細胞及び継代の数にかかわらずそれに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸含有量の点で完全に同一ではないが、変異を含み得る。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、「治療」または「治療する」とは、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、以下：疾患に起因する１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の弱化、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防または遅延）、疾患の蔓延（例えば、転移）の予防または遅延、疾患の再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善、疾患の寛解（部分的または全体的）の提供、疾患の治療に必要な１つ以上の他の薬剤の用量の低減、疾患の進行の遅延、生活の質の向上、及び／または生存期間の延長のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されないがんの病理学的帰結の軽減も「治療」に包含される。がんの病理学的帰結の軽減も「治療」に包含される。本出願の方法は、これらの治療態様のうちのいずれか１つ以上を企図する。
【００８９】
本明細書で使用されるとき、「個体」または「対象」とは、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯類、または霊長類を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
【００９０】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、特定の障害、状態、または疾患を治療するのに、例えば、その症状のうちの１つ以上を改善、緩和、軽減、及び／または遅延するのに十分な薬剤の量、例えば、ｓｄＡｂ、操作された免疫エフェクター細胞、またはその薬学的組成物の量を指す。がんに関して、有効量は、腫瘍の縮小を引き起こし、及び／または腫瘍の成長速度を低下させる（例えば、腫瘍成長を抑圧する）か、または他の望ましくない細胞増殖を阻止または遅延させるのに十分な量を含む。いくつかの実施形態では、有効量は、発症を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、再発を予防または遅延させるのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。有効量の薬物または組成物は、（ｉ）がん細胞の数を減少させ、（ｉｉ）腫瘍サイズを減少させ、（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞浸潤を阻止し、遅らせ、ある程度遅延させ、好ましくは停止し、（ｉｖ）腫瘍転移を阻止し（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止し）、（ｖ）腫瘍成長を阻止し、（ｖｉ）腫瘍の発生及び／または再発を予防または遅延し、及び／または（ｖｉｉ）がんに関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減し得る。
【００９１】
「補助状況」とは、個体ががんの病歴を有しており、（必ずしもではないが）一般に手術（例えば、切除手術）、放射線療法、及び化学療法を含むが、これらに限定されない療法に応答している臨床状況を指す。しかしながら、固体のがんの病歴のため、これらの個
体は、疾患を発症する危険性があると見なされる。「アジュバント状況」における治療または投与とは、その後の治療様式を指す。危険性の程度（例えば、アジュバント状況にある個体が「高リスク」または「低リスク」と見なされる場合）は、いくつかの要因、最も一般的には最初に治療されたときの疾患の程度に依存する。
【００９２】
「ネオアジュバント状況」とは、本方法が一次／原因療法前に行われる臨床状況を指す。
【００９３】
本明細書で使用されるとき、がんの発症を「遅延させる」とは、疾患の発症を保留し、妨害し、遅延させ、遅らせ、安定させ、及び／または延期することを意味する。この遅延は、治療されている病歴及び／または個体に応じて異なる期間であり得る。当業者に明らかであるように、十分なまたは著しい遅延は、事実上、個体が疾患を発症しないという点で予防を包含し得る。がんの発症を「遅延」させる方法は、その方法を使用しないときと比較して、所与の時間枠内で疾患発症の可能性を低減させ、及び／または所与の時間枠内で疾患の程度を低減させる方法である。かかる比較は、典型的には、統計的に有意な数の個体を使用する臨床研究に基づく。がん発症は、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、腹部超音波検査、凝固検査、動脈造影法、または生検を含むが、これらに限定されない標準の方法を使用して検出可能であり得る。発症は、初期に検出不可能であり得るがん進行も指し、発生、再発、及び発症を含む。
【００９４】
「薬学的製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性を有効にさせる形態であり、製剤が投与される対象に許容しがたい程度に毒性のさらなる成分を含有しない調製物を指す。かかる製剤は、滅菌である。「滅菌」製剤は、無菌であるか、または全ての生存微生物及びそれらの胞子を含まない。
【００９５】
本明細書で使用される「担体」は、用いられる投与量及び濃度でそれに曝露されている細胞または哺乳動物に非毒性の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。多くの場合、生理的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の例としては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン；単糖、二糖、及び他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【００９６】
目的とする「希釈剤」は、本明細書において、薬学的に許容され（ヒトへの投与について安全かつ非毒性である）、液体製剤の調製物、例えば凍結乾燥後に再構成される製剤に有用なものである。例示的な希釈剤としては、滅菌水、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌食塩水溶液、リンゲル液、またはデキストロース溶液が挙げられる。代替の一実施態様では、希釈剤は、塩の水溶液及び／または緩衝液を含み得る。
【００９７】
「防腐剤」は、細菌活性を低減するために本明細書における製剤に添加され得る化合物である。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。可能な防腐剤の例としては、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロライド、ベンザルコニウムクロライド（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライドの混合物）及びベンゼトニウムクロライドが挙げられる。他のタイプの防腐剤としては、芳香族アルコール、例えば、フェノール、ブチル、及びベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。本明細書において最も好ましい防腐剤は、ベンジルアルコールである。
【００９８】
「安定した」製剤とは、中のタンパク質が保管時に物理的及び化学的安定性及び完全性を本質的に保持するものである。タンパク質安定性を測定するための種々の分析技術が当該技術分野で利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に概説されている。安定性は、選択された温度で選択された期間にわたって測定され得る。迅速なスクリーニングのために、製剤が４０℃で２週間〜１ヶ月間保存され得、その時点で安定性が測定される。製剤が２〜８℃で保管される場合、一般に、製剤は、３０℃または４０℃で少なくとも１ヶ月間安定しているべきであり、及び／または２〜８℃で少なくとも２年間安定しているべきである。製剤が３０℃で保管される場合、一般に、製剤は、３０℃で少なくとも２年間安定しているべきであり、及び／または４０℃で少なくとも６ヶ月間安定しているべきである。例えば、保管中の凝集の程度は、タンパク質安定性の指標として使用され得る。したがって、「安定した」製剤は、タンパク質の約１０％未満、好ましくは約５％未満が製剤中に凝集体として存在するものであり得る。他の実施形態では、製剤の保管中の凝集体形成のいずれの増加も決定することができる。
【００９９】
「再構成された」製剤とは、タンパク質が全体に分散するように希釈剤中に凍結乾燥タンパク質または抗体製剤を溶解させることによって調製されたものである。再構成された製剤は、目的とするタンパク質で治療される患者への投与（例えば、皮下投与）に好適であり、本出願のいくつかの実施形態では、非経口または静脈内投与に好適なものであり得る。
【０１００】
「等張」製剤は、ヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有するものである。等張製剤は、一般に、約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。「低張」という用語は、ヒト血液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する製剤を説明する。同様に、「高張」という用語は、ヒト血液の浸透圧よりも高い浸透圧を有する製剤を説明するために使用される。等張性は、例えば、蒸気圧または氷結型浸透圧計を使用して測定され得る。本発明の製剤は、塩及び／または緩衝液の添加の結果として高張である。
【０１０１】
本明細書に記載の本出願の実施形態が、実施形態「から成る」及び／または「から本質的に成る」を含むことが理解される。
【０１０２】
本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変形を含む（及び説明する）。例えば、「約Ｘ」について言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【０１０３】
本明細書で使用されるとき、ある値またはパラメータ「ではない」への言及は、一般に、ある値またはパラメータ「以外」を意味及び説明する。例えば、タイプＸのがんを治療
するための方法が使用されないとは、Ｘ以外のタイプのがんを治療するための方法が使用されることを意味する。
【０１０４】
本明細書で使用される「約Ｘ−Ｙ」という用語は、「約Ｘ〜約Ｙ」と同じ意味を有する。
【０１０５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ｏｒ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含む。
【０１０６】
ＩＩ．抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体
本出願の一態様は、ヒトＢＣＭＡ等のＢＣＭＡに特異的に結合する単離された単一ドメイン抗体（本明細書で「抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ」と称される）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ＢＣＭＡ活性を調節する。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、アンタゴニスト抗体である。本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ
ｓｄＡｂのいずれか１つに由来する抗原結合フラグメント、及び本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのいずれか１つを含む抗原結合タンパク質が、さらに提供される。例示的な抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、以下の表２に列記されている。
【表２−１】
2019527557.tif 000003
【表２−２】
2019527557.tif 000004
【表２−３】
2019527557.tif 000005
【表２−４】
2019527557.tif 000006
【０１０７】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）（別名、ＣＤ２６９）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー、すなわち、ＴＮＦＲＳＦ１７である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９２（１）：１２９−１３５、２０００）。ヒトＢＣＭＡは、形質細胞及び多発性骨髄腫細胞でほぼ例外なく発現される（例えば、Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３（２）：６８９−６９４，２００４、Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７３（１９）：５９０３−５９０９、Ｆｅｌｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，９（７）：１３４８−５８，２０１５）。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖を含むリガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合することができる（例えば、Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３及びＫａｌｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ，２０４：４３−５４，２００５）。ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫に対する免疫療法薬に好適な腫瘍抗原標的であり得る。高親和性の抗体は、ＢＣＭＡとその天然リガンドＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬとの間の結合を遮断し得る。抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを、ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用する細胞免疫療法と組み合わせて使用して、例えば、腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を増強することができる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、配列番号１１５のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１６のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１７のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１８のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１９のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１２０のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１２１のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１２２のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１２３のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１２４のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１２５のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全
てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１２６のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１２７のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１２８のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１２９のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３０のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３１のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３２のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３３のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３４のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３５のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３６のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３７のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３８のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３９のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４０のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４１のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４２のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４３のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４４のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４５のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４６のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつ���の実施形態では、配列番号１４７のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４８のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４９のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１５０のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１５１のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１５２のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ラクダ科である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、受容体ヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１〜３８から選択されるアミノ酸配列を含む
ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３９〜７６から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号７７〜１１４から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ラクダ科である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、受容体ヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１〜３８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか１つの配列同一性を有するＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３９〜７６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか１つの配列同一性を有するＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号７７〜１１４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか１つの配列同一性を有するＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のうちのいずれか１つの同一性を有するＣＤＲは、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ＢＣＭＡに結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１〜３８から選択されるアミノ酸配列に対して約１、２、３、または４つのいずれか１つのアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を有するＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３９〜７６から選択されるアミノ酸配列に対して約１、２、３、または４つのいずれか１つのアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を有するＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７７〜１１４から選択されるアミノ酸配列に対して約１、２、３、または４つのいずれか１つのアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を有するＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、親和性成熟である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ラクダ科である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、受容体ヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  
ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ
ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ
ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ
）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、３つのＣＤＲを含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ラクダ科である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、受容体ヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、上に記載される実施形態のうちのいずれかを含む、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ（すなわち、特定のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３を含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）は、配列番号１１５〜１５２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか１つの配列同一性を有するＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のうちのいずれか１つの同一性を有するＶＨＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ＢＣＭＡに結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、合計１〜１０個のアミノ酸が、配列番号１１５〜１５２から選択されるアミノ酸配列に置換されており、挿入されており、及び／または欠失している。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。任意に、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、その配列の翻訳後修飾を含む配列番号１１５〜１５２から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、配列番号１１５〜１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む単離された抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１５〜１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが提供される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、機能的エピトープは、コンビナトリアルアラニンスキャニングによってマッピングされ得る。このプロセスでは、コンビナトリアルアラニンスキャニング戦略を使用して、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂとの相互作用に必要なＢＣＭＡタンパク質中のアミノ酸を特定することができる。いくつかの実施形態では、エピトープは、立体配座であり、ＢＣＭＡに結合している抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂの結晶構造を用いて、エピトープを特定することができる。いくつかの実施形態では、本出願は、配列番号３８８〜３９４から成る群から選択されるアミノ酸配列に由来するＢＣＭＡのエピトープを提供する。いくつかの実施形態では、本出願は、配列番号３８８〜３９４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＣＭＡのエピトープを提供する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本出願は、ＢＣＭＡに結合するために本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つと競合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＣＭＡ上のエピトープに結合するために本明細書に提供される抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂと競合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号１１５〜１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂと同じエピトープに結合する抗体が、提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１５〜１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂと競合してＢＣＭＡに特異的に結合する抗体が、提供される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、競合アッセイは、ＢＣＭＡに結合するために本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂと競合するモノクローナル抗体を特定するために使用され得る。競合アッセイは、２つの抗体が、同一または立体的に重なるエピトープまたは別の抗体の抗原への結合を競合的に阻害する１つの抗体を認識することによって同じエピトープに結合するかどうかを判定するために使用することができる。ある特定の実施形態では、このような競合抗体は、本明細書に記載の抗体によって結合される同じエピトープ（例えば、配列番号３８８〜３９４から成る群から選択されるアミノ酸配列に由来するＢＣＭＡエピトープ）に結合する。例示的な競合アッセイとしては、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓ
ｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に提供されるもの等の日常的なアッセイが挙げられるが、これに限定されない。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）に提供される。いくつかの実施形態では、２つの抗体は、それぞれがもう一方の結合を５０％以上遮断する場合、同じエピトープに結合すると言われている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂと競合する抗体は、ラクダ科、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、本出願は、本明細書に記載のラクダ科、キメラ、ヒト化、またはヒト抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂと競合する抗体を提供する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、上に記載される抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つを含む抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合タンパク質結合が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、ラクダ科、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、抗体フラグメント、例えば、ＶＨＨフラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４等の任意の抗体クラスまたはアイソタイプのＦｃ領域を含む全長重鎖のみ抗体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、低減または最小化されたエフェクター機能を有する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、上述の実施形態のうちのいずれかによる抗ＢＣＭＡ抗体（抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）または抗原結合タンパク質は、以下の「抗体の特徴」の第１〜７節に記載の特徴のうちのいずれかを単独でまたは組み合わせで組み込み得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、上に記載される抗ＢＣＭＡ抗体（抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）のうちのいずれか１つをコードする単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂをコードする単離された核酸が提供され、この核酸は、配列番号１５３〜１９０から成る群から選択される核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか１つの配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１５３〜１９０から成る群から選択される核酸配列を含む単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、かかる核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。いくつかの実施形態では、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体を作製する方法が提供され、この方法は、上に提供される抗ＢＣＭＡ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を抗ＢＣＭＡ抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意に、抗ＢＣＭＡ抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することとを含む。
【０１２０】
抗体の特徴
１．抗体親和性
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＢＣＭＡ抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、Ｋｄは、以下のアッセイによって説明されるように、目的とする抗体のＦａｂバージョンまたはＶＨＨフラグメント及びその抗原を用いて行われる放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。例えば、抗体に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の一連の滴定の存在下で、Ｆａｂを最低濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡させ、次いで、抗Ｆａｂ抗体をコーティングしたプレートで結合した
抗体を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、Ｋｄは、約１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを有するＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を２５℃で使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を用いて抗原を５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）になるまで希釈した後、５μＬ／分の流量で注入して、およそ１０応答単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を得る。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断する。反応速度測定のために、目的とする抗体のＦａｂまたはＶＨＨの２倍連続希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、２５℃の０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳ中におよそ２５μＬ／分の流量で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。オン速度が上述の表面プラズモン共鳴アッセイによって１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オン速度は、ストップフローを装備した分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備える８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定される漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定され得る。
【０１２３】
２．抗体フラグメント
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖフラグメント、ＶＨＨ、ならびに以下に記載の他のフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体フラグメントの概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）にも記載されている。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、また、ＷＯ９３／１６１８５、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつ増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【０１２４】
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、及びＨｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディについては、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３
）にも記載されている。
【０１２５】
抗体フラグメントは、本明細書に記載の、インタクトな抗体のタンパク質消化、ならびに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない、種々の技術によって作製され得る。
【０１２６】
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、ラマ等のラクダ科種に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、そのクラスまたはサブクラスが、親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチした」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒト化されてヒトに対する免疫原性を低減する一方で、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持する。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはそれらの部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはそれらの部分）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むことになる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１２８】
ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説され、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフトについて記載）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「表面再構成」について記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」について記載）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチについて記載）にさらに記載されている。
【０１２９】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照されたい）、ならびにＦＲライブラリのスクリーニングから得られるフレームワーク領域（例え
ば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、抗原に対するドメインの生来の親和性を低下させることなく、一方で、異種種に対するその免疫原性を減少させるように修飾、例えば、ヒト化される。例えば、ラマ抗体の抗体可変ドメイン（ＶＨＨ）のアミノ酸残基が決定され得、例えば、フレームワーク領域内のラクダ科アミノ酸のうちの１つ以上が、ポリペプチドがその典型的な特徴を失うことなく、すなわち、ヒト化が結果として生じるポリペプチドの抗原結合能力に著しく影響を及ぼさないように、ヒトコンセンサス配列に見られるようなそれらのヒト対応物に置き換えられる。ラクダ科ｓｄＡｂのヒト化は、単一ポリペプチド鎖内の限定された量のアミノ酸の導入及び変異誘発を必要とする。これは、２つの鎖（軽鎖及び重鎖）へのアミノ酸変化の導入、ならびに両方の鎖のアセンブリの保存を必要とするｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、及びＩｇＧのヒト化とは対照的である。
【０１３１】
ＶＨＨドメインを含む単一ドメイン抗体は、ヒト様配列を有するようにヒト化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＶＨＨドメインのＦＲ領域は、ヒトＶＨフレームワーク領域に対する少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のアミノ酸配列相同性のうちのいずれか１つを含む。ヒト化ＶＨＨドメインの１つの例示的なクラスは、ＶＨＨが、Ｋａｂａｔ番号付けに従って、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミンから成る群からのアミノ酸を４５位に（例えば、Ｌ４５等）、トリプトファンを１０３位に保有することを特徴とする。したがって、このクラスに属するポリペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性を示し、前記ポリペプチドは、それからの望ましくない免疫応答を予期することなく、かつさらなるヒト化に負担をかけることなくヒトに直接投与され得る。
【０１３２】
ヒト化ラクダ科ｓｄＡｂの別の例示的なクラスがＷＯ０３／０３５６９４に記載されており、典型的にはヒト起源のまたは他の種由来の従来の抗体に見られるが、二本鎖抗体由来のＶＨに存在する保存されたトリプトファン残基を１０３位の荷電アルギニン残基で置換することによりこの親水性損失を補償する疎水性ＦＲ２残基を含有する。したがって、これらの２つのクラスに属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性を示し、前記ペプチドは、それからの望ましくない免疫応答を予期することなく、さらなるヒト化に負担をかけることなくヒトに直接投与され得る。
【０１３３】
４．ヒト抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の種々の技術を使用して産生され得る。ヒト抗体は、概して、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。完全ヒトｓｄＡｂを産生することができるトランスジェニックマウスまたはラットが当該技術分野で既知である。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。
【０１３４】
ヒト抗体は、抗原投与に応答してヒト可変領域を有するインタクトなヒト抗体またはインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与する
ことによって調製することができる。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するか、もしくはその動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有する。かかるトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載）、米国特許第５，７７０，４２９号（ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載）、米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載）、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００６１９００号（ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載）も参照されたい。かかる動物によって生成されるインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに修飾され得る。
【０１３５】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株について説明されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい。）  ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体についても、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生について記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて記載）に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）については、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５：９１（２００５）にも記載されている。
【０１３６】
ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。その後、かかる可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせられ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術が以下に記載される。
【０１３７】
特定の抗原もしくは標的に対して指向されるＶＨＨ配列を得るための１つの技術は、重鎖抗体を発現することができるトランスジェニック哺乳動物を好適に免疫化することと（すなわち、免疫応答及び／または前記抗原もしくは標的に対して指向される重鎖抗体をもたらすように）、前記ＶＨＨ配列（をコードする核酸配列）を含有する前記トランスジェニック哺乳動物から好適な生体試料（血液試料、血清試料、またはＢ細胞試料等）を得ることと、その後、前記試料から開始して、本来既知の任意の好適な技術（本明細書に記載の方法またはハイブリドーマ技術のうちのいずれか等）を使用して前記抗原もしくは標的に対して指向されるＶＨＨ配列を生成することを伴う。例えば、この目的のために、ＷＯ０２／０８５９４５、ＷＯ０４／０４９７９４、及びＷＯ０６／００８５４８、ならびにＪａｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６  Ｏｃｔ．１０；１０３（４１）：１５１３０−５に記載の重鎖抗体発現マウスな
らびにさらなる方法及び技術が使用され得る。例えば、かかる重鎖抗体発現マウスは、天然源由来の（単一）可変ドメイン（例えば、ヒト（単一）可変ドメイン、ラクダ科（単一）可変ドメインまたはサメ（単一）可変ドメイン）、ならびに例えば合成または半合成（単一）可変ドメイン等の任意の好適な（単一）可変ドメインを有する重鎖抗体を発現させることができる。
【０１３８】
５．ライブラリ由来抗体
本出願の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を保有する抗体についてかかるライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で既知である。かかる方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ
Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説され、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）にさらに記載されている。ｓｄＡｂライブラリを構築するための方法が説明されており、例えば、米国特許第７３７１８４９号を参照されたい。
【０１３９】
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリ内でランダムに組換えられ、その後、これが、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントのいずれかとして抗体フラグメントをディスプレイする。免疫化源由来のライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されるように、ナイーブレパートリーが（例えば、ヒトから）クローニングされて、免疫化することなく、広範な非自己抗原及び自己抗原に対する単一源の抗体を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞からの再編成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度に可変的なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再編成を達成することによってナイーブライブラリを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０１４０】
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体フラグメントは、本明細書において
ヒト抗体またはヒト抗体フラグメントと見なされる。
【０１４１】
６．多重特異性抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有する抗体である。いくつかの実施形態では、一方の結合特異性は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＣＤ３８から成る群から選択される抗原に対してであり、他方は、任意の他の抗原に対してである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＣＤ３８から成る群から選択される抗原の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体を使用して、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、及びＣＤ３８から成る群から選択される抗原を発現させる細胞に対して細胞毒性薬を局在化させることもできる。
【０１４２】
二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、及び「ノブインホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、静電ステアリング効果を操作して抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体またはフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を使用して二重特異性抗体フラグメントを作製すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）、及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、ならびに三重特異性抗体を調製すること（例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）、ならびにタンデム単一ドメイン抗体を含むポリペプチドを作製すること（例えば、米国特許出願第２０１１００２８６９５号、及びＣｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１；２７６（１０）：７３４６−５０を参照されたい）によっても作製され得る。「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
【０１４３】
７．抗体変異形
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異形が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異形は、抗体をコードする核酸配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が含まれる。最終構築物に到達ために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行うことができるが、最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。
【０１４４】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異形
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異形が提供される。
置換型変異誘発のための目的とする部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表３の「好ましい置換」という見出しの下に示される。より実質的な変化は、表３の「例示的な置換」という見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換が目的とする抗体に導入され、生成物が所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低減、またはＡＤＣＣまたはＣＤＣの改善についてスクリーニングされ得る。
【表３】
2019527557.tif 000007
【０１４５】
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って群分けされ得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１４６】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのあるメンバーと別のクラスとの交換を伴うことになる。
【０１４７】
ある種類の置換型変異形は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる試験のために選択される結果として生じる変異形（複数可）は、親抗体と比較してある特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）の修正（例えば、改善）を有し、及び／または実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的特性を有する。例示的な置換型変異形は、例えば、本明細書に記載の技術等のファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して好都合に生成され得る親和性成熟抗体である。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基が変異され、変異形抗体がファージ上にディスプレイされ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１４８】
改変（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲ内に行われてもよい。かかる改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を経るコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８））、及び／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）に行われてもよく、結果として生じる変異形ＶＨまたはＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリの構築及びそこからの再選択による親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変異形を識別する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、特異的に識別され得る。多くの場合、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がとりわけ標的とされる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が抗体の抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲ内で行われてもよい。かかる改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＣＤＲ外であり得る。上に提供される変異形ＶＨＨ配列のいくつかの実施形態では、各ＨＶＲは、改変されていないか、または１つ、２つ、または３つ以下のアミノ酸置換を有するかのいずれかである。
【０１５０】
変異誘発の標的とされ得る抗体の残基または領域の識別のための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と称され、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されている。この方法において、標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕ等の荷電残基）の残基または基が識別され、中性または負に荷電されたアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、抗体の抗原との相互作用が影響されたかを決定する。さらなる置換が最初の置換に対する機能感受性を示すアミノ酸位置に導入され
得る。あるいは、または加えて、抗体と抗原との間の接触点を識別するための抗原−抗体複合体の結晶構造。かかる接触残基及び隣接する残基が置換の候補として標的とされ得るか、または排除され得る。変異形をスクリーニングして、それらが所望の特性を有するかを決定することができる。
【０１５１】
アミノ酸配列挿入としては、１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの範囲の長さを有するアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入型変異形には、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのため）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの抗体のＮ末端またはＣ末端の融合が含まれる。
【０１５２】
ｂ）グリコシル化変異形
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成され得る。
【０１５３】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合する炭水化物を改変してもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、一般にＮ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」中のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ある特定の改善された特性を有する抗体変異形を作製するために、本出願の抗体中のオリゴ糖の修飾が行われ得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異形が提供される。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における小規模な配列変異に起因して、２９７位から約±３アミノ酸、上流または下流、すなわち、２９４〜３００位の間に位置してもよい。かかるフコシル化変異形は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、ＵＳ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異形に関する出版物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ
ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フ
コシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８  Ａ１号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ２００４／０５６３１２  Ａ１、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、特に実施例１１）、及びアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞等のノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）が挙げられる。
【０１５５】
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を有する抗体変異形がさらに提供される。かかる抗体変異形は、低減されたフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。かかる抗体変異形の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）、及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異形も提供される。かかる抗体変異形は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。かかる抗体変異形は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１５６】
ｃ）Ｆｃ領域変異形
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異形が生成され得る。Ｆｃ領域変異形は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本出願は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を保有し、それにより抗体のインビボでの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣ等）が不要または有害である用途に望ましい候補となる抗体変異形を企図する。インビトロ及び／またはインビボ細胞毒性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（それ故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃ（ＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、Ｆｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ、及びＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照されたい）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：１４９９−１５０２（１９８５）、５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい。かかるアッセイに
有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示される動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それによりＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが行われ得る（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野で既知の方法を使用して行うこともできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照されたい）。
【０１５８】
低減したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ変異体としては、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７位のうちの２つ以上での置換を有するＦｃ変異体、例えば、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１５９】
ＦｃＲへの結合が改善または低減されたある特定の抗体変異形が記載される。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。）
【０１６０】
いくつかの実施形態では、抗体変異形は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）での置換を有するＦｃ領域を含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されるように、Ｆｃ領域でもたらされた改変の結果、改変された（すなわち、改善または低減のいずれか）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす。
【０１６２】
半減期の延長及び母体ＩｇＧの胎児への移送に関与する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合の改善を有する抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）、及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））については、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換をそこに有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異形は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０１６３】
Ｆｃ領域変異形の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
【０１６４】
ｄ）システイン操作された抗体変異形
いくつかの実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作された抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭａｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれにより抗体のアクセス可能な部位に位置付けられ、それを使用して、抗体を他の部分、例えば、薬物部分またはリンカー−薬物部分にコンジュゲートして、本明細書にさらに記載されるイムノコンジュゲートを作製することができる。いくつかの実施形態では、以下の残基のうちのいずれか１つ以上がシステインで置換され得る：重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
【０１６５】
ｅ）抗体誘導体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合したポリマーの数は異なり得、１つ以上のポリマーが結合している場合、それらは同じかまたは異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体の誘導体が規定の条件下で療法に使用されるか等を含むが、これらに限定されない、検討事項に基づいて決定され得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、通常の細胞を傷つけないが、抗体−非タンパク質性部分に近位の細胞を死滅させる温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含むが、これらに限定されない、任意の波長のものであり得る。
【０１６７】
調製方法
本明細書に記載の抗体（ｓｄＡｂ等）は、当該技術分野で既知のまたは本明細書に記載の任意の方法を使用して調製され得る。
【０１６８】
ｓｄＡｂを調製する方法が説明されている。例えば、Ｅｌｓ  Ｐａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，２０１４；９（３）：６７４を参照されたい。単
一ドメイン抗体（ＶＨＨ等）は、当該技術分野で既知の方法を使用して、例えば、ラクダ科種（ラクダまたはラマ等）を免疫化し、それからハイブリドーマを得ることによって、または当該技術分野で既知の分子生物学技術を使用してｓｄＡｂのライブラリをクローニングし、その後、選択されていないライブラリの個々のクローンをＥＬＩＳＡによりまたはファージディスプレイを使用して選択することによって得られ得る。
【０１６９】
ｓｄＡｂの組換え産生について、ｓｄＡｂをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。ｓｄＡｂをコードするＤＮＡは、従来の手法を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離及び配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核生物起源または真核生物（一般に、哺乳類）起源のいずれかのものである。
【０１７０】
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、一般に、関連抗原及びアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注入によって動物において産生される。二機能性または誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１が独立して低級アルキル基である）を使用して、関連抗原を、免疫する種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートすることが有用であり得る。用いられ得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント、及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコール酸塩）が挙げられる。免疫化プロトコルは、過度な実験なしに当業者によって選択され得る。
【０１７１】
動物は、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスの場合）を、３体積のフロイントの完全なアジュバントと組み合わせ、複数の部位で溶液を皮内注入することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫化される。１ヶ月後、動物は、複数の部位での皮下注入により完全フロイントアジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの元の量の１／５〜１／１０で追加免疫される。７〜１４日後、動物が採血され、血清が抗体力価についてアッセイされる。動物は、力価がプラトーに到達するまで追加免疫される。コンジュゲートは、タンパク質融合物として組換え細胞培養物でも作製され得る。また、ミョウバン等の凝集剤も免疫応答の増強に好適である。
【０１７２】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に同種の抗体集団から得られ、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、微量で存在し得る可能な自然に生じる変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。
【０１７３】
例えば、モノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により記載されるハイブリドーマ法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ法により作製され得る（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【０１７４】
ハイブリドーマ法において、マウス、またはハムスター等の他の適切な宿主動物が、上述のように免疫化されて、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合するであ
ろう抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球が誘発される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞で融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。
【０１７５】
免疫化剤は、典型的には、抗原タンパク質またはその融合変異形を含む。一般に、ヒト起源の細胞が所望される場合に抹消血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用されるか、または非ヒト哺乳類起源が所望される場合に脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。その後、リンパ球は、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を使用して不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６），ｐｐ．５９−１０３。
【０１７６】
不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳類細胞、特に齧歯類、ウシ、及びヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞系が用いられる。このように調製されたハイブリドーマ細胞は、播種され、融合されていない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する好適な培養培地で成長する。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらは、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する物質である。
【０１７７】
好ましい不死化骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支援し、ＨＡＴ培地等の培地に感受性を示すものである。これらの中でもとりわけ、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞（及びその誘導体、例えば、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３）等のマウス骨髄腫株が好ましい。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１７８】
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、抗原に対して指向されたモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。
【０１７９】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、所望の抗原に対して指向されたモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、モノクローナル抗体の結合親和性及び特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定され得る。かかる技術及びアッセイは、当該技術分野で既知である。例えば、結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャチャ
ード分析によって決定され得る。
【０１８０】
所望の特異性、親和性、及び／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンが限界希釈手技によってサブクローニングされ、標準の方法によって成長し得る（Ｇｏｄｉｎｇ（上記参照））。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物における腫瘍としてインビボで成長し得る。
【０１８１】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。
【０１８２】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法及び上に記載される方法等の組換えＤＮＡ法によっても作製され得る。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい源としての機能を果たす。単離されると、ＤＮＡが発現ベクター内に配置され得、その後、これが、宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を別様に産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされて、かかる組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体を合成する。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する概説論文としては、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）及びＰｌｉｉｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１−１８８（１９９２）が挙げられる。
【０１８３】
さらなる一実施形態では、抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を使用して生成された抗体ファージライブラリから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記載する。続報は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに非常に大きなファージライブラリを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換えを記載する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替案である。
【０１８４】
ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによっても修飾され得る。典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインの代わりに置換されるか、またはそれらが、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換されて、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【０１８５】
本明細書に記載のモノクローナル抗体は一価であり得、その調製は、当該技術分野で既知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び修飾された重鎖の組換え発現を伴う。重鎖は、重鎖架橋を防止するように、一般にＦｃ領域内の任意の点で切断される。あるいは、関連システイン残基は、別のアミノ酸残基で置換され得るか、または架橋を防止するように欠失される。インビトロ方法も、一価抗体の調製に好適である。そのフラグメント、具体的には、Ｆａｂフラグメントを産生するための抗体の消化は、当該技術分野で既知の日常的な技法を使用して達成され得る。
【０１８６】
キメラまたはハイブリッド抗体も、架橋剤を伴うものを含む合成タンパク質化学で既知の方法を使用してインビトロで調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的に好適な試薬としては、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデート（ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｙｒｉｍｉｄａｔｅ）が挙げられる。
【０１８７】
３．原核生物細胞における組換え産生
ａ）ベクター構築
本出願の抗体をコードするポリヌクレオチド配列は、標準の組換え技法を使用して得られ得る。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞等の抗体産生細胞から単離及び配列決定され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはＰＣＲ技術を使用して合成され得る。得られた時点で、ポリペプチドをコードする配列は、原核生物宿主内で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組換えベクターに挿入される。利用可能であり、  当該技術分野で既知である多くのベクターが本発明で使用され得る。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸の大きさ及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはこれらの両方）及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて種々の成分を含有する。ベクター成分としては、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入、及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
一般に、宿主細胞と適合性のある種由来のレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。このベクターは、通常、複製部位、及び形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を持つ。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、それ故に形質転換細胞を特定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージは、内因性タンパク質の発現のための微生物によって使用され得るプロモーターも含有し得るか、またはそれを含有するように修飾され得る。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載されている。
【０１８９】
加えて、宿主微生物と適合性のあるレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターは、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、ＧＥＭ（商標）−１１等のバクテリオファージが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２等の感受性宿主細胞を形質転換するために使用され得る組換えベクターを作製する際に利用され得る。
【０１９０】
本出願の発現ベクターは、ポリペプチド成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５′）に位置する非翻訳制御配列である。原核生物プロモーターは、典型的には、２つのクラス、誘導プロモーター及び構成プロモーターに分けられる。誘導プロモーターは、培
養条件の変化、例えば、栄養素の存在もしくは不在、または温度の変化に応答してその制御下で増加したレベルのシストロンの転写を開始するプロモーターである。
【０１９１】
様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化によりソースＤＮＡからプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列を本出願のベクターに挿入することによって、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に結合し得る。天然プロモーター配列も多くの異種プロモーターもいずれも、標的遺伝子の増幅及び／または発現を誘導するために使用され得る。いくつかの実施形態では、異種プロモーターが一般に天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して発現された標的遺伝子のより大きい転写及びより高い収率をもたらすため、異種プロモーターが利用される。
【０１９２】
原核生物宿主との使用に好適なプロモーターとしては、ＰｈｏＡプロモーター、−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃまたはｔｒｃプロモーターが挙げられる。しかしながら、細菌において機能的な他のプロモーター（他の既知の細菌またはファージプロモーター等）も好適である。それらの核酸配列が公開されており、それにより、当業者が、任意の必要な制限部位を提供するためにリンカーまたはアダプターを使用して、それらを標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンに作動可能に連結することを可能にする（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）  Ｃｅｌｌ  ２０：２６９）。
【０１９３】
一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜にわたる発現ポリペプチドの転位を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であり得る。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識もプロセシングもしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰから成る群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。本出願のいくつかの実施形態では、発現系の両方のシストロンで使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその変異形である。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本出願による抗体の産生は、宿主細胞の細胞質で生じ得、それ故に、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド成分、例えば、第２の抗原結合部分に任意に融合される第１の抗原結合部分のＶＨドメインをコードするポリペプチド及び第２の抗原結合部分に任意に融合される第１の抗原結合部分のＶＬドメインをコードするポリペプチド等が発現され、折り畳まれ、アセンブリされて、細胞質内に機能的抗体を形成する。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｘＢ−株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質条件を提供し、それにより発現タンパク質サブユニットの適切な折り畳み及びアセンブリを可能にする。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
【０１９５】
本発明は、分泌及び適切にアセンブリされた本出願の抗体の収率を最大化するために発現ポリペプチド成分の量比が調節され得る発現系を提供する。かかる調節は、ポリペプチド成分の翻訳強度を同時に調節することによって少なくとも部分的に達成される。翻訳強度を調節するための１つの技術が、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８４０，５２３号に開示されている。それは、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異形を利用する。所与のＴＩＲについて、一連のアミノ酸または核酸配列変異形がある範囲
の翻訳強度で作製され、それによりこの因子を特定の鎖の所望の発現レベルに調整するための便利な手段を提供することができる。ＴＩＲ変異形は、アミノ酸配列を改変することができるコドン変化をもたらす従来の変異誘発技法によって生成され得るが、核酸配列のサイレント変化が好ましい。ＴＩＲの改変は、例えば、シグナル配列の改変に加えて、シャイン・ダルガノ配列の数またはスペーシングの改変を含み得る。変異シグナル配列を生成するための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）コード配列の始めに「コドンバンク」を生成することである。これは、各コドンの第３のヌクレオチド位置を変化させることによって達成され得、加えて、ロイシン、セリン、及びアルギニン等のいくつかのアミノ酸は、バンクの作製を複雑にし得る複数の第１及び第２の位置を有する。この変異誘発法は、Ｙａｎｓｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４：１５１−１５８に詳細に記載されている。
【０１９６】
好ましくは、一組のベクターは、その内部の各シストロンのある範囲のＴＩＲ強度で生成される。この限定された組は、各鎖の発現レベルの比較、ならびに種々のＴＩＲ強度組み合わせ下での所望のタンパク質産物の収率を提供する。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓ
ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，８４０，５２３号に詳細に記載されるように、レポーター遺伝子の発現レベルを定量することによって決定され得る。翻訳強度比較に基づいて、所望の個々のＴＩＲが、本出願の発現ベクター構築物において組み合わせられるように選択される。
【０１９７】
ｂ）原核生物宿主細胞
本出願の抗体の発現に好適な原核生物宿主細胞としては、グラム陰性またはグラム陽性生物等のＡｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ及びＥｕｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。有用な細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓが挙げられる。いくつかの実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、本発明の宿主として使用される。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例としては、株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０−１２１９、ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及びその誘導体（遺伝子型Ｗ３１１０  ＡｆｈｕＡ（ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ＡｏｍｐＴ  Ａ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲを有する株３３Ｄ３を含む）が挙げられる（米国特許第５，６３９，６３５号）。他の株及びそれらの誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ
１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）及びＥ．ｃｏｌｉ  ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ  ３１，６０８）も好適である。これらの例は、限定するものではなく、例証するものである。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの誘導体の構築方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載されている。一般に、細菌の細胞におけるレプリコンの複製可能性を考慮して適切な細菌を選択することが必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０等の周知のプラスミドを使用してレプリコンを提供する場合、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が宿主として好適に使用され得る。
【０１９８】
典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素しか分泌すべきでなく、さらな
るプロテアーゼ阻害剤が細胞培養物に組み込まれることが望ましくあり得る。
【０１９９】
ｃ）タンパク質の産生
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切になるように修飾された従来の栄養素培地で培養される。形質転換とは、ＤＮＡが染色体外要素として、または染色体組み込み体によってのいずれかで複製可能になるように、ＤＮＡを原核生物宿主に導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換がかかる細胞に適切な標準の技術を使用して行われる。一般に、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が、実質的な細胞壁障壁を含有する細菌細胞に使用される。形質転換の別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技術は、電気穿孔法である。
【０２００】
本出願の抗体を産生するために使用される原核生物細胞は、当該技術分野で既知であり、かつ選択された宿主細胞の培養に好適な培地で成長する。好適な培地の例としては、必要な栄養補助剤を含むルリアブロス（ＬＢ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、発現ベクターを含有する原核生物細胞の成長を選択的に許容するために、発現ベクターの構築に基づいて選択された選択剤も含有する。例えば、アンピシリンは、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を成長させるための培地に添加される。
【０２０１】
炭素、窒素、及び無機リン酸塩源に加えて、任意の必要な補助剤も、単独で、または複合窒素源等の別の補助剤もしくは培地との混合物として導入される適切な濃度で含まれ得る。任意に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール、及びジチオスレイトールから成る群から選択される１つ以上の還元剤を含有し得る。
【０２０２】
原核生物宿主細胞は、好適な温度で培養される。Ｅ．ｃｏｌｉ成長の場合、例えば、好ましい温度は、約２０℃〜約３９℃の範囲、より好ましくは約２５℃〜約３７℃の範囲、さらにより好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて約５〜約９の範囲の任意のｐＨであり得る。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、ｐＨは、好ましくは約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０２０３】
誘導プロモーターが本出願の発現ベクターに使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。本出願の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換宿主細胞は、誘導のためにリン酸塩制限培地で培養される。好ましくは、リン酸塩制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７を参照されたい）。様々な他の誘導因子が、当該技術分野で既知の用いられるベクター構築物に従って使用され得る。
【０２０４】
本出願の発現抗体は、宿主細胞の周辺質に分泌され、それから回収される。タンパク質回収は、典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理、または溶解等の手段による微生物の破壊を伴う。細胞が破壊されると、細胞残屑または全細胞は、遠心分離または濾過によって除去され得る。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製される。あるいは、タンパク質は、培養培地に輸送され、その中で単離され得る。細胞が培養物から除去され得、培養上清が、産生されたタンパク質のさらなる精製のために濾過及び濃縮される。発現ポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイ等の一般に既知の方法を使用してさらに単離及び特定され得る。
【０２０５】
あるいは、タンパク質産生は、発酵プロセスによって大量に行われる。種々の大規模供
給バッチ発酵手技が、組換えタンパク質の産生に利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素及び栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分布させるために撹拌インペラーを使用する。小規模発酵とは、一般に、容積がおよそ１００リットル以下であり、及び約１リットル〜約１００リットルの範囲であり得る発酵槽での発酵を指す。
【０２０６】
発酵プロセス中、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が所望の密度、例えば、約１８０〜２２０のＯＤ５５０になるまで好適な条件下で成長した後に開始され、その段階で、細胞は、初期静止期にある。様々な誘導因子が、当該技術分野で既知の上述の用いられるベクター構築物に従って使用され得る。細胞は、誘導前により短い期間成長し得る。細胞は、通常、約１２〜５０時間誘導されるが、より長いまたはより短い誘導時間も使用され得る。
【０２０７】
本出願の抗体の産生収率及び品質を改善するために、種々の発酵条件が修正され得る。例えば、分泌ポリペプチドの適切なアセンブリ及び折り畳みを改善するために、シャペロンタンパク質、例えば、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及び／またはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペプチジルプロリルシス，トランス−イソメラーゼ）を過剰発現するさらなるベクターを使用して、宿主原核生物細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質が細菌宿主細胞において産生される異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解を容易にすることが実証されている。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１９６０１−１９６０５、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０８３，７１５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０２７，８８８号、Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５、Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３、Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
【０２０８】
発現異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性のもの）のタンパク質分解を最小限に抑えるために、タンパク質分解酵素が欠損したある特定の宿主株が本発明に使用され得る。例えば、宿主細胞株は、既知の細菌プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びそれらの組み合わせをコードする遺伝子において遺伝子変異（複数可）をもたらすように修飾され得る。いくつかのＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）（上記を参照）、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２６４，３６５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５０８，１９２号、Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載されている。
【０２０９】
タンパク質分解酵素が欠損し、１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株が、本出願の抗体をコードする発現系における宿主細胞として使用され得る。
【０２１０】
ｄ）タンパク質の精製
本明細書における産生された抗体は、さらなるアッセイ及び使用のためにさらに精製されて実質的に同種の調製物を得る。当該技術分野で既知の標準のタンパク質精製方法が用いられ得る。以下の手技：免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、ＤＥＡＥ等のシリカまたは陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えばＳｅｐ
ｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用したゲル濾過が、好適な精製手技の例示である。
【０２１１】
一態様では、固相上に固定化されたタンパク質Ａは、本出願のＦｃ領域を含む抗体の免疫親和性精製のために使用される。タンパク質Ａは、高親和性で抗体のＦｃ領域に結合するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｓ由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３。タンパク質Ａが固定化される固相は、好ましくは、ガラスまたはシリカ表面を含むカラム、より好ましくは、制御孔ガラスカラムまたはケイ酸カラムである。いくつかの適用では、カラムは、混入物質の非特異的付着を阻止するためにグリセロール等の試薬でコーティングされている。その後、固相が洗浄されて、固相に非特異的に結合している混入物質を除去する。最後に、目的とする抗体が溶出により固相から回収される。
【０２１２】
４．真核生物細胞における組換え産生
真核生物発現の場合、ベクター成分としては、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、及びエンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１３】
ａ）シグナル配列成分
真核生物宿主で使用するためのベクターは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドをコードする挿入物でもあり得る。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０２１４】
かかる前駆体領域のＤＮＡは、本出願の抗体をコードするＤＮＡに対するリーディングフレーム内でライゲーションされる。
【０２１５】
ｂ）複製起点
一般に、複製起点成分は、哺乳類発現ベクターには必要ではない（ＳＶ４０起点は、典型的には、それが初期プロモーターを含有するという理由のみで使用され得る）。
【０２１６】
ｃ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択遺伝子、別名、選択可能なマーカーを含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンへの耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか、または（ｃ）複合培地から入手不可能な必須の栄養素、例えば、ＢａｃｉｌｌｉのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
【０２１７】
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止する薬物を利用する。異種遺伝子を用いた形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を与え、したがって選択レジメンで生き残るタンパク質を産生する。かかる優性選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。
【０２１８】
哺乳類細胞に好適な選択可能なマーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の本出願の抗体をコードする核酸を取り込むための細胞成分の特定を可能にするものである。
【０２１９】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、最初に、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で全ての形質転換体を培養することによって特定される。野生型ＤＨＦＲが用いられるときに適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）である。
【０２２０】
あるいは、ポリペプチドコードＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）等の別の選択可能なマーカーで形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８等の選択可能なマーカーのための選択剤を含有する培地中での細胞成長によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
【０２２１】
ｄ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、及び所望のポリペプチド配列をコードする核酸に操作可能に連結するプロモーターを含有する。実質的に全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核生物の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡ尾部の付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列は全て、真核生物発現ベクターに挿入され得る。
【０２２２】
原核生物宿主との使用に好適な他のプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するためのプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡに操作可能に連結するシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有する。
【０２２３】
哺乳類宿主細胞中のベクターからのポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御されるが、但し、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
【０２２４】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして好都合に得られる。ウシ乳頭腫ウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主におけるＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号で開示される。この系の修飾は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載される。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞内のヒト−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関しては、Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復がプロモーターとして使用され得る。
【０２２５】
ｅ）エンハンサー要素成分
より高次の真核生物による本出願の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例としては、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化のための増強要素に関しては、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、ポリペプチドコード配列の５′位または３′位でベクターにスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターから５′部位に位置する。
【０２２６】
ｆ）転写終結成分
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有するであろう。かかる配列は、一般的には、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５′非翻訳領域、時折、３′非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、ポリペプチドコードｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結構成成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそれらで開示される発現ベクターを参照されたい。
【０２２７】
ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書におけるベクター中のＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、脊椎動物宿主細胞を含む本明細書に記載のより高次の真核生物細胞が挙げられる。培養物（組織培養物）中での脊椎動物細胞の繁殖は、日常的な手技になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚腎臓株（２９３細胞または懸濁培養物中での成長のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝臓癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２２８】
宿主細胞は、抗体産生のための上述の発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切になるように修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
【０２２９】
ｈ）宿主細胞の培養
本出願の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰ
ＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等の市販されている培地は、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、もしくは同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国特許再発行第３０，９８５号に記載される培地のいずれも、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量要素（マイクロモルの範囲の最小濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、及びグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。任意の他の必要な補充物も、当業者には既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２３０】
ｉ）タンパク質の精製
組換え技術を使用する際、抗体は、細胞内、周辺腔内で産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、微粒子残屑（宿主細胞または溶解フラグメントのいずれか）が、例えば、遠心分離または限外濾過により除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載する。簡潔には、細胞ペーストが、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分間にわたって解凍される。細胞残屑は、遠心分離によって除去され得る。抗体が培地に分泌される場合、かかる発現系の上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために前述のステップのうちのいずれかに含まれ得、抗生物質は、外来性混入物質の成長を阻止するために含まれ得る。
【０２３１】
細胞から調製されたタンパク質組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技法である。親和性リガンドとしてのタンパク質Ａの好適性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。タンパク質Ａを使用して、１つ、２つ、または４つの重鎖を含有するヒト免疫グロブリンに基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ及びヒト３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合する基質は、ほとんどの場合アガロースであるが、他の基質も利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレン−ジビニル）ベンゼン等の機械的に安定した基質は、アガロースで達成され得るものよりも速い流速及び短いプロセシング時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈降等のタンパク質精製のための他の技法も、回収される抗体に応じて利
用可能である。
【０２３２】
任意の予備精製ステップ（複数可）後、目的とする抗体及び汚染物質を含む混合物が、約２．５〜４．５のｐＨの溶出緩衝液を使用して、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われ得る。
【０２３３】
イムノコンジュゲート
いくつかの実施形態では、本出願は、化学療法剤もしくは薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）、または放射性同位体等の１つ以上の細胞毒性薬にコンジュゲートした本明細書に記載の抗体（ｓｄＡｂ等）のうちのいずれかを含むイムノコンジュゲートも提供する。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは、抗体が、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許第ＥＰ０４２５２３５  Ｂ１号を参照されたい）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）等のオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号、及び同第５，７８０，５８８号、及び同第７，４９８，２９８号を参照されたい）；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３）、ならびにＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５−２９２８（１９９８）を参照されたい）；ダウノマイシンまたはドキソルビシン等のアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７−５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８−３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７−７２１（２００５）、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２９−８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９−１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６−４３４３（２００２）、及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル等のタキサン；トリコテセン；ならびにＣＣ１０６５を含むが、これらに限定されない、１つ以上の薬物にコンジュゲートする抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含むが、これらに限定されない、酵素的に活性な毒素またはそのフラグメントにコンジュゲートした本明細書に記載の抗体を含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして放射性コンジュゲートを形成する本明細書に記載の抗体を含む。様々な放射性同位体が、
放射性コンジュゲートの産生のために利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートが検出のために使用される場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（別名、磁気共鳴画像法、ｍｒｉ）のためのスピン標識、例えば、この場合もやはりヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄を含み得る。
【０２３７】
抗体及び細胞毒性剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）等の様々な二官能性タンパク質結合剤を使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素を、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素−１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内において細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
【０２３８】
本明細書のイムヌオコンジュゲート（ｉｍｍｕｎｕｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）またはＡＤＣは、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ならびに市販される（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）ＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むが、これらに限定されない、架橋剤試薬で調製されたかかるコンジュゲートを明白に企図するが、これらに限定されない。
【０２３９】
診断及び検出のための方法及び組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体（ｓｄＡｂ等）のうちのいずれも、生体試料中のＢＣＭＡの存在の検出に有用である。「検出すること」という用語は、本明細書で使用されるとき、定量または定性検出を包含する。ある特定の実施形態では、生体試料は、血液、血清、または生体起源の他の液体試料である。いくつかの実施形態では、生体試料は、細胞または組織を含む。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、診断または検出方法に使用するための抗ＢＣＭＡ抗体（本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つ等）が提供される。さらなる態様では、生体試料中のＢＣＭＡの存在を検出する方法が提供される。ある特定の実施形態では、本方法は、生体試料中のＢＣＭＡタンパク質の存在を検出することを含む。ある特
定の実施形態では、ＢＣＭＡは、ヒトＢＣＭＡである。ある特定の実施形態では、本方法は、抗ＢＣＭＡ抗体のＢＣＭＡへの結合を許容する条件下で生体試料を本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ抗体と接触させることと、複合体が抗ＢＣＭＡ抗体とＢＣＭＡとの間に形成されたかを検出することと、を含む。かかる方法は、インビトロ方法またはインビボ方法であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、抗ＢＣＭＡ抗体での治療に適格な対象を選択するために使用され、例えば、ＢＣＭＡは、患者の選択のためのバイオマーカーである。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、標識された抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが提供される。標識としては、直接検出される標識または部分（蛍光標識、発色団標識、電子密度の高い標識、化学発光標識、及び放射性標識等）、ならびに間接的に、例えば、酵素反応または分子相互作用により検出される酵素またはリガンド等の部分が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な標識としては、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば、希土類キレートまたはフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、蛍ルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ等）とカップリングした複素環オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４２】
ＩＩＩ．キメラ抗原受容体
本出願の一態様は、１つ以上の単一ドメイン抗体（ＶＨＨ等）を含む細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。第ＩＩ節に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれか１つが、本明細書に記載のＣＡＲで使用され得る。ＣＡＲの例示的な構造を、図１５Ａ〜１５Ｄに示す。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、（ａ）抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含むＢＣＭＡを標的とするＣＡＲ（本明細書で「ＢＣＭＡ  ＣＡＲ」と称される）が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ラクダ科、キメラ、ヒト、またはヒト化である。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（ＣＤ８αヒンジドメイン等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（ＣＤ８αシグナルペプチド等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８に由来する第１の共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１３７に由来する第２の共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細
胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、単一特異性である。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、一価である。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、（ａ）抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含むＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供され、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、以下：（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（５）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（６）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１０）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１１）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１２）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１３）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１４）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１５）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１６）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１７）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１８）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１９）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２０）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２１）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２２）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２３）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２４）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列
を含むＣＤＲ２、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２５）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２６）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２７）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２８）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２９）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３０）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３２）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３３）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３４）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３５）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３６）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３７）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または（３８）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、のうちの任意の１つを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ラクダ科、キメラ、ヒト、またはヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１１５〜１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（ＣＤ８αヒンジドメイン等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（ＣＤ８αシグナルペプチド等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８に由来する第１の共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１３７に由来する第２の共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、単一特異性である。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、一価である。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、配列番号２１６〜２５６及び２９８〜３３５から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか１つの配列同一性を有するポリペプチドを含むＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２１６〜２５６及び２９８〜３３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供される。配列番号２１６〜２５６及び２９８〜３３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供される。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＢＣＭＡ  ＣＡＲのうちのいずれかをコードする単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２５７〜２９７及び３３６〜３７３から成る群から選択される核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか１つの配列同一性を有する単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２５７〜２９７及び３３６〜３７３から成る群から選択される核酸配列を含む単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、上に記載されるＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードする核酸のうちのいずれか１つを含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター等のウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。例示的な一価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを、以下の表４に示す。
【表４−１】
2019527557.tif 000008
【表４−２】
2019527557.tif 000009
【表４−３】
2019527557.tif 000010
【０２４７】
多価キメラ抗原受容体
本出願は、ＢＣＭＡ等の抗原に特異的に結合する、２つ以上（約２、３、４、５、６、またはそれ以上のうちのいずれか１つ等）の結合部分を有する多価ＣＡＲも提供する。いくつかの実施形態では、結合部分のうちの１つ以上は、抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、結合部分のうちの１つ以上は、単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、結合部分のうちの１つ以上は、ラクダ科抗体に由来する。いくつかの実施形態では、結合部分のうちの１つ以上は、４鎖抗体に由来する。いくつかの実施形態では、結合部分のうちの１つ以上は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、結合部分のうちの１つ以上は、ヒト抗体に由来する。いくつかの実施形態では、結合部分のうちの１つ以上は、ポリペプチドリガンド、または抗原に特異的に結合する他の非抗体ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、多価ＣＡＲは、単一特異性であり、多価ＣＡＲは、単一の抗原を標的とし、単一の抗原に対する２つ以上の結合部位を含む。いくつかの実施形態では、多価ＣＡＲは、多重特異性であり、すなわち、多価ＣＡＲは、２つ以上の抗原を標的とし、多価ＣＡＲは、少なくとも１つの抗原に対する２つを超える結合部位を含む。同じ抗原に特異的な結合部分は、抗原の同じエピトープ（すなわち、「１つのエピ
トープＣＡＲ」）に結合し得るか、または抗原の異なるエピトープ（すなわち、２つのエピトープＣＡＲまたは３つのエピトープＣＡＲ等の「マルチエピトープＣＡＲ」）に結合し得る。同じ抗原に特異的な結合部位は、同じまたは異なるｓｄＡｂを含み得る。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、本出願は、（ａ）抗原（腫瘍抗原等）に特異的に結合する複数（少なくとも約２、３、４、５、６つまたはそれ以上のうちの１つ）の結合部分を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価（二価、三価、またはより高い数の価数）のキメラ抗原受容体を提供する。いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、及び糖脂質Ｆ７７から成る群から選択される。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、本出願は、（ａ）抗原（腫瘍抗原等）に特異的に結合する複数（少なくとも約２、３、４、５、６つまたはそれ以上のうちの１つ）の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価（二価、三価、またはより高い数の価数）のキメラ抗原受容体を提供する。いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、及び糖脂質Ｆ７７から成る群から選択される。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、本出願は、（ａ）抗原（腫瘍抗原等）の第１のエピトープに特異的に結合する第１の結合部分と、抗原の第２のエピトープに特異的に結合する第２の結合部分とを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価（二価、三価、またはより高い数の価数）のキメラ抗原受容体を提供し、第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる。いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、及び糖脂質Ｆ７７から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の結合部分は、ｓｄＡｂであり、第２の結合部分は、ヒト抗体（例えば、ｓｃＦｖ）に由来する。いくつかの実施形態では、第１の結合部分は、ｓｄＡｂであり、第２の結合部分は、ポリペプチドリガンドである。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第２のエピトープと同じである。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第２のエピトープとは異なる。いくつかの実施形態では、多価ＣＡＲは、抗原上の２つの異なるエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、多価ＣＡＲは、抗原上の３つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、本出願は、（ａ）抗原（腫瘍抗原等）の第１のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂと、抗原の第２のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂとを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価（二価、三価、またはより高い数の価数）のキメラ抗原受容体を提供し、第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる。いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、及び糖脂質Ｆ７７から成る群から選択される。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂ（複数のｓｄＡｂ、または第１のｓｄＡｂ及び／ま
たは第２のｓｄＡｂを含む）等の結合部分は、ラクダ科、キメラ、ヒト、またはヒト化である。いくつかの実施形態では、結合部分またはｓｄＡｂは、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、各ペプチドリンカーは、約５０以下（約３５、２５、２０、１５、１０、または５以下のうちのいずれか１つ等）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、多価ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（ＣＤ８αヒンジドメイン等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、多価ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（ＣＤ８αシグナルペプチド等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、多価ＣＡＲは、単一特異性である。いくつかの実施形態では、多価ＣＡＲは、二重特異性等の多重特異性である。
【０２５３】
本明細書に記載の多価ＣＡＲは、異なる抗原結合部位による相乗的結合を介する多量体抗原の標的に、または抗原に対する結合親和性または結合力の増強に特に好適であり得る。本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれも、本明細書に記載の多価ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインで使用され得る。例示的な多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、例示的な配列、構築、及びそれらのベクターのリストを表５に示す。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、（ａ）複数（少なくとも約２、３、４、またはそれ以上のうちの１つ）のＢＣＭＡ結合部分（例えば、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むＢＣＭＡを標的とする多価ＣＡＲが提供される。抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれかを使用して、多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを構築することができる。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡの単一のエピトープに特異的に結合し、これらのＣＡＲは、本明細書で１つのエピトープの多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲと称される。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、（ａ）複数（少なくとも約２、３、４、またはそれ以上のうちの１つ）の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供され、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、（ａ）少なくとも２つ（２、３、４つ、またはそれ以上のうちの任意の１つ等）のＢＣＭＡ結合部分を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（本明細書で「マルチエピトープの多価ＣＡＲ」とも称される）が提供され、少なくとも２つのＢＣＭＡ結合部分は、ＢＣＭＡ上の少なくとも２つの異なるエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、第１のＢＣＭＡ結合部分及び第２のＢＣＭＡ結合部分を含む。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分は、
抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂであり、第２のＢＣＭＡ結合部分は、ヒト抗体（例えば、ｓｃＦｖ）に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分は、ｓｄＡｂであり、第２のＢＣＭＡ結合部分は、ＢＣＭＡポリペプチドリガンドである。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ結合部分及び／または第２のＢＣＭＡ結合部分は、配列番号３８８〜３９４から選択されるアミノ酸配列に由来するＢＣＭＡ上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分は、配列番号３８９及び／または３９０に由来するエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２のＢＣＭＡ結合部分は、配列番号３９１及び／または３９２に由来するエピトープに特異的に結合する。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、（ａ）第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供され、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ＢＣＭＡ上の異なるエピトープに特異的に結合する。抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂのうちのいずれかを使用して、多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを構築することができる。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び／または第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号３８８〜３９４から選択されるアミノ酸配列に由来するＢＣＭＡ上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号３８９及び／または３９０に由来するエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号３９１及び／または３９２に由来するエピトープに特異的に結合する。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、（ａ）第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供され、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、（ａ）第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供され、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、（ａ）第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供され、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄ
Ａｂは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、（ａ）第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供され、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、（ａ）第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供され、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、（ａ）第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供され、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）は、第２のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）のＮ末端に位置している。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）は、第２のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）のＣ末端に位置している。いくつかの実施形態では、第１のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）及び第２のＢＣＭＡ結合部分（例えば、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ）は、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約５０以下（約３５、２５、２０、１５、１０、または５以下のうちのいずれか１つ等）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態
では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（ＣＤ８αヒンジドメイン等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（ＣＤ８αシグナルペプチド等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、二価である。いくつかの実施形態では、多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、三価である。いくつかの実施形態では、多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ＢＣＭＡ上の２つの異なるエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ＢＣＭＡ上の３つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、配列番号２９８〜３３５から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか１つの配列同一性を有するポリペプチドを含む多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２９８〜３３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲが提供される。配列番号２９８〜３３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供される。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲのうちのいずれかをコードする単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３３６〜３７３から成る群から選択される核酸配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれか１つの配列同一性を有する単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３３６〜３７３から成る群から選択される核酸配列を含む単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、上に記載される多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードする核酸のうちのいずれか１つを含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター等のウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。例示的な多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを、以下の表５に示す。
【表５−１】
2019527557.tif 000011
【表５−２】
2019527557.tif 000012
【表５−３】
2019527557.tif 000013
【表５−４】
2019527557.tif 000014
【表５−５】
2019527557.tif 000015
【０２６７】
多重特異性キメラ抗原受容体
本出願は、２つ以上（約２、３、４、５、６、またはそれ以上のうちのいずれか１つ等）の異なる抗原を標的とする多重特異性キメラ抗原受容体をさらに提供する。いくつかの実施形態では、多重特異性ＣＡＲは、各抗原に対する１つの抗原結合部位を有する。いくつかの実施形態では、多重特異性ＣＡＲは、少なくとも１つの抗原に対する２つを超える結合部位を有する。各抗原結合部位は、ｓｄＡｂを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、多重特異性ＣＡＲは、抗原に各々特異的に結合する２つの異なるｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインを含む二重特異性ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、多重
特異性ＣＡＲは、抗原に各々特異的に結合する３つの異なるｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインを含む三重特異性ＣＡＲである。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、（ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及び第２の抗原（腫瘍抗原等）に特異的に結合する第２の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多重特異性（二重特異性）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供され、第１の抗原は、第２の抗原とは異なる。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、及び糖脂質Ｆ７７から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ラクダ科、キメラ、ヒト、またはヒト化である。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約５０以下（約３５、２５、２０、１５、１０、または５以下のうちのいずれか１つ等）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、多重特異性ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（ＣＤ８αヒンジドメイン等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（ＣＤ８αシグナルペプチド等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２６９】
細胞外抗原結合ドメイン
本明細書に記載のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ｓｄＡｂ等の１つ以上（１、２、３、４、５、６つ、またはそれ以上のうちのいずれか１つ等）の結合部分を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、４鎖抗体に由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、ラクダ科抗体に由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、ヒト抗体に由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部分は、非抗体結合タンパク質、例えば、ポリペプチドリガンド、または抗原に結合する操作されたタンパク質である。結合部分は、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して互いに直接融合され得る。
【０２７０】
１．単一ドメイン抗体
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上のｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメイ
ンを含む。ｓｄＡｂは、同じまたは異なる起源のものであり得、同じまたは異なるサイズのものであり得る。例示的なｓｄＡｂとしては、重鎖のみ抗体（例えば、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ）からの重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠いている結合分子、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン（ＶＨまたはＶＬ等）、ヒト化重鎖のみ抗体、ヒト重鎖セグメントを発現させるトランスジェニックマウスまたはラットによって産生されるヒトｓｄＡｂ、及び抗体に由来するもの以外の操作されたドメイン及び単一ドメインスキャフォールドが挙げられるが、これらに限定されない。本出願の第ＩＩ節に記載のｓｄＡｂを含む、当該技術分野で既知のまたは発明人によって開発された任意のｓｄＡｂを使用して、本明細書に記載のＣＡＲを構築することができる。ｓｄＡｂは、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含むが、これらに限定されない任意の種に由来し得る。本明細書で企図される単一ドメイン抗体は、ラクダ科及びサメ以外の種からの天然に存在するｓｄＡｂも含む。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、軽鎖を欠いている重鎖抗体（本明細書で「重鎖のみ抗体」とも称される）として既知の天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子に由来する。かかる単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４／０４６７８及びＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８に開示されている。明確化のために、軽鎖を天然に欠いている重鎖分子に由来する可変ドメインは、それを４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するためにＶＨＨとして本明細書で既知である。かかるＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ビクーナ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコで産生される抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種が、軽鎖を天然に欠いている重鎖分子を産生することができ、かかるＶＨＨは、本出願の範囲内である。
【０２７２】
ラクダ科からのＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子よりも約１０倍小さい。それらは、単一ポリペプチドであり、非常に安定しており、極度のｐＨ及び温度条件に耐性を示すことができる。さらに、それらは、プロテアーゼ作用に耐性を示すことができ、従来の４鎖抗体には当てはまらない。さらに、ＶＨＨのインビトロ発現は、高収率の適切に折り畳まれた機能的ＶＨＨをもたらす。加えて、ラクダ科で生成された抗体は、抗体ライブラリの使用により、またはラクダ科以外の哺乳動物の免疫化により、インビトロで生成された抗体によって認識されるエピトープ以外のエピトープを認識することができる（例えば、ＷＯ９７４９８０５を参照されたい）。したがって、１つ以上のＶＨＨドメインを含む多重特異性または多価ＣＡＲは、従来の４鎖抗体に由来する抗原結合フラグメントを含む多重特異性または多価ＣＡＲよりも効率的に標的と相互作用することができる。ＶＨＨが空洞または溝等の「異常な」エピトープに結合することで知られているため、かかるＶＨＨを含むＣＡＲの親和性は、従来の多重特異性ポリペプチドよりも治療的治療に好適であり得る。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軟骨魚に見られる免疫グロブリンの可変領域に由来する。例えば、ｓｄＡｂは、サメ血清に見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として既知の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。ＮＡＲの可変領域（「ＩｇＮＡＲ」）に由来する単一ドメイン分子を産生する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２９０１−２９０９に記載されている。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、組換え、ＣＤＲグラフト、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／またはインビトロ生成された（例えば、ファージディスプレイによって選択された）ものである。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸残基の「ラクダ化」によって改変され得る。ラクダ化は、従来の４鎖抗体由来の（天然に存在する）ＶＨドメインのアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基の、重鎖抗体のＶＨＨドメイン内の対応する位置（複数可）で生
じるアミノ酸残基のうちの１つ以上による置き換えまたは置換を指す。これは、例えば、本明細書におけるさらなる記述に基づいて当業者に明らかになる本来既知の様態において行われ得る。かかる「ラクダ化」置換は、好ましくは、ＶＨ−ＶＬ界面を形成し、及び／またはその界面に存在するアミノ酸位置に、及び／または本明細書に定義されるいわゆるラクダ科特徴残基に挿入される（例えば、ＷＯ９４／０４６７８、Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ
Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３９：２８５−２９０，１９９４、Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（６）：５３１−５３７，１９９６、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：９５７−９６９，１９９６、及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５−３８，１９９９を参照されたい）。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ヒト重鎖セグメントを発現させるトランスジェニックマウスまたはラットによって産生されるヒトｓｄＡｂである。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、親和性成熟である。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、特定の抗原または標的に対する天然に存在するＶＨＨドメインは、ラクダ科ＶＨＨ配列の（天然または免疫）ライブラリから得られ得る。かかる方法は、本来既知の１つ以上のスクリーニング技術を使用した、前記抗原または標的、または少なくとも１つの部分、フラグメント、抗原決定基、またはそのエピトープを使用するかかるライブラリのスクリーニングを伴っても伴わなくてもよい。かかるライブラリ及び技術は、例えば、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０、及びＷＯ０３／０３５６９４に記載されている。あるいは、例えば、ＷＯ００／４３５０７に記載のランダム変異誘発及び／またはＣＤＲシャッフリング等の技術により（天然または免疫）ＶＨＨライブラリから得られるＶＨＨライブラリ等の（天然または免疫）ＶＨＨライブラリに由来する改善された合成または半合成ライブラリが使用され得る。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、従来の４鎖抗体から生成される。例えば、ＥＰ
０  ３６８  ６８４、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  １９８９  Ｏｃｔ．１２；３４１（６２４２）：５４４−６）、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１（１１）：４８４−４９０、ＷＯ０６／０３０２２０、及びＷＯ０６／００３３８８を参照されたい。
【０２７８】
２．抗原
本出願のＣＡＲによって標的とされる抗原（複数可）は、細胞表面分子である。結合部分（ｓｄＡｂ等）は、特殊な病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとしての役割を果たす抗原を認識するように選択され得る。いくつかの実施形態では、抗原（第１の抗原及び／または第２の抗原等）は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、多重特異性ＣＡＲは、２つ以上の腫瘍抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する。腫瘍は、免疫応答、具体的には、Ｔ細胞媒介免疫応答に対する標的抗原としての機能を果たすことができるいくつかのタンパク質を発現する。ＣＡＲによって標的とされる抗原は、単一の疾患細胞上の抗原または各々が疾患に寄与する異なる細胞上で発現する抗原であり得る。ＣＡＲによって標的とされる抗原は、疾患に直接または間接的に関与し得る。
【０２７９】
腫瘍抗原は、免疫応答、具体的には、Ｔ細胞媒介免疫応答を誘発することができる腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の標的とされた抗原の選択は、治療される特定の種類のがんに依存するであろう。例示的な腫瘍抗原としては、例えば、神経膠
腫関連抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、スルビビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ならびにメソテリンが挙げられる。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃に対する標的抗原としての機能を果たすことができるいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子としては、組織特異的抗原、例えば、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、及びｇｐ１００、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２等の形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）等のがん胎児抗原である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３７等のＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは、腫瘍細胞に特有であり、体内の他の細胞に生じない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞に特有ではなく、代わりに、抗原に対する免疫学的寛容の状態を誘導することができない条件下で正常細胞でも発現する。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟であり、応答することができない場合に胎児発育中に正常細胞で発現する抗原であり得るか、またはそれらは、通常非常に低レベルで正常細胞上に存在するが、はるかにより高いレベルで、腫瘍細胞で発現する抗原であり得る。
【０２８２】
ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例としては、以下：分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ  １００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、及び腫瘍特異的多系列抗原、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐｌ５；過剰発現胚抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現癌遺伝子及び変異腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ；染色体転座に起因する特有の腫瘍抗原、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ及びヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７が挙げられる。他の大きいタンパク質に基づく抗原としては、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータ−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ  １５、ｐ  １６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−フェトプロテイン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−  １、ＲＣＡＳ  １、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼サイクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６
、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが挙げられる。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、抗原（第１の抗原及び／または第２の抗原等）は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、及び糖脂質Ｆ７７から成る群から選択される。
【０２８４】
３．ペプチドリンカー
本明細書に記載の多重特異性または多価ＣＡＲにおける種々の結合部分（ｓｄＡｂ等）は、ペプチドリンカーを介して互い融合され得る。いくつかの実施形態では、結合部分（ｓｄＡｂ等）は、いかなるペプチドリンカーもなしで互いに直接融合される。異なる結合部分（ｓｄＡｂ等）を連結するペプチドリンカーは、同じであってもよく、または異なってもよい。ＣＡＲの異なるドメインも、ペプチドリンカーを介して互いに融合され得る。
【０２８５】
ＣＡＲにおける各ペプチドリンカーは、ｓｄＡｂ及び／または種々のドメインの構造的及び／または機能的特徴に応じて同じまたは異なる長さ及び／または配列を有し得る。各ペプチドリンカーは、独立して選択及び最適化され得る。ＣＡＲで使用されるペプチドリンカー（複数可）の長さ、可撓度、及び／または他の特性は、１つ以上の特定の抗原またはエピトープに対する親和性、特異性、または結合力を含むが、これらに限定されない、特性に何らかの影響を及ぼし得る。例えば、より長いペプチドリンカーは、２つの隣接するドメインが互いに立体的に妨害しないことを確実にするために選択され得る。例えば、多量体抗原に対して指向されたｓｄＡｂを含む本出願の多価または多重特異性ＣＡＲにおいて、ペプチドリンカーの長さ及び可撓性は、好ましくは、多価ＣＡＲにおける各ｓｄＡｂが多量体のサブユニットの各々上の抗原決定基に結合することを可能にするようなものである。いくつかの実施形態では、短いペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に配置され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、隣接するドメインが互いに対して自由に移動することができるように、可撓性残基（グリシン及びセリン等）を含む。例えば、グリシン−セリンダブレットは、好適なペプチドリンカーであり得る。
【０２８６】
ペプチドリンカーは、任意の好適な長さのものであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、またはそれ以上のうちのいずれかのアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約１００、７５、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５以下、またはそれ以下のうちのいずれかのアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーの長さは、約１アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１アミノ酸〜約２０アミノ酸、約１アミノ酸〜約３０アミノ酸、約５アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１０アミノ酸〜約２５アミノ酸、約５アミノ酸〜約３０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸長、約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１００アミノ酸、または約１アミノ酸〜約１００アミノ酸のうちのいずれかである。
【０２８７】
ペプチドリンカーは、天然に存在する配列、または天然に存在しない配列を有し得る。例えば、重鎖のみ抗体のヒンジ領域に由来する配列は、リンカーとして使用され得る。例えば、ＷＯ１９９６／３４１０３を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、可撓性リンカーである。例示的な可撓性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、式中、ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び当該技術分野で既知の他の
可撓性リンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号２０８）、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２０９）、（ＧＧＧＳ）４（配列番号２１０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１２）、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２１３）、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号２１４）、または（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２１５）を含む。
【０２８８】
膜貫通ドメイン
本出願のＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインに直接または間接的に融合され得る膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。本明細書で使用されるとき、「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜、好ましくは、真核生物細胞膜内で熱力学的に安定している任意のタンパク質構造を指す。本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合性のある膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得られ得る。あるいは、それは、合成の天然に存在しないタンパク質セグメント、例えば、細胞膜内で熱力学的に安定している疎水性タンパク質セグメントであり得る。
【０２８９】
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの三次元構造に基づいて分類される。例えば、膜貫通ドメインは、アルファヘリックス、２つ以上のアルファヘリックスの複合体、ベータバレル、または細胞のリン脂質二重層にまたがることができる任意の他の安定した構造を形成し得る。さらに、膜貫通ドメインは、加えて、または代替的に、膜貫通ドメインが膜を通過する回数及びタンパク質の配向を含む膜貫通ドメイントポロジーに基づいて分類され得る。例えば、単回通過膜タンパク質は、細胞膜を１回横断し、複数回通過膜タンパク質は、細胞膜を少なくとも２回（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、またはそれ以上の回数）横断する。膜タンパク質は、細胞の内外に対するそれらの末端及び膜通過セグメント（複数可）のトポロジーに応じて、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型と定義され得る。Ｉ型膜タンパク質は、単一膜にまたがる領域を有し、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＣ末端が細胞質側に存在するように配向される。ＩＩ型膜タンパク質も単一膜にまたがる領域を有するが、タンパク質のＣ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＮ末端が細胞質側に存在するように配向される。ＩＩＩ型膜タンパク質は、複数膜にまたがるセグメントを有し、膜貫通セグメントの数ならびにＮ末端及びＣ末端の位置に基づいてさらに下位分類され得る。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｉ型単回通過膜タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、複数回通過膜タンパク質由来の膜貫通ドメインも、本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合性があり得る。複数回通過膜タンパク質は、複合（少なくとも２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の）アルファヘリックスまたはベータシート構造を含み得る。好ましくは、複数回通過膜タンパク質のＮ末端及びＣ末端は、脂質二重層の反対側に存在し、例えば、タンパク質のＮ末端は、脂質二重層の細胞質側に存在し、タンパク質のＣ末端は、細胞外側に存在する。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤｌ  ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ−２Ｒベータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒ  ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ  ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ  ｌａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、
ＣＤｌ  ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ  ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／またはＮＫＧ２Ｃから選択される膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１から成る群から選択される分子に由来する。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＣＤ２８の膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の膜貫通ドメインは、配列番号２０３の核酸配列によってコードされる。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＣＤ８αの膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αの膜貫通ドメインは、配列番号２０２の核酸配列によってコードされる。
【０２９４】
本明細書に記載のＣＡＲで使用するための膜貫通ドメインは、合成の天然に存在しないタンパク質セグメントの少なくとも一部も含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、合成の天然に存在しないアルファヘリックスまたはベータシートである。いくつかの実施形態では、タンパク質セグメントは、少なくともおよそ２０アミノ酸、例えば、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第７，０５２，９０６  Ｂ１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０００／０３２７７６  Ａ２号にあり、これらの関連開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９５】
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインのＣ末端側に位置する膜貫通領域及び細胞質領域を含み得る。膜貫通ドメインの細胞質領域は、３つ以上のアミノ酸を含み得、いくつかの実施形態では、脂質二重層内で膜貫通ドメインを配向させる助けとなる。いくつかの実施形態では、１つ以上のシステイン残基が、膜貫通ドメインの膜貫通領域に存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上のシステイン残基が、膜貫通ドメインの細胞質領域に存在する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸、アルギニン、セリン、及びリジンを含む。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、人工疎水性配列を含む。例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが、膜貫通ドメインのＣ末端に存在し得る。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、主に疎水性のアミノ酸残基、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはバリンを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、疎水性である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ポリ−ロイシン−アラニン配列を含む。タンパク質またはタンパク質セグメントのハイドロパシーまたは疎水性もしくは親水性特徴は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、カイト及びドゥーリトルのハイドロパシー分析によって評定され得る。
【０２９７】
細胞内シグナル伝達ドメイン
本出願のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化の原因である。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞質シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に特殊化機能を行うように指示するタンパク質の一部を指す。通常、全細胞質シグナル伝達ドメインが用いられ得るが、多くの場合、全鎖を使用する必要はない。細胞質シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される程度まで、かかる切断部分は、それがエフェクター機能シグナルを形質導入する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞質シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な細胞質シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むよう意図されている。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインから本質的に成る細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「一次細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、刺激様態で作用して免疫エフェクター機能を誘導する細胞質シグナル伝達配列を指す。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして既知のシグナル伝達モチーフを含有する。本明細書で使用される「ＩＴＡＭ」とは、一般に多くの免疫細胞で発現するシグナル伝達分子の尾部分に存在する保存されたタンパク質モチーフである。このモチーフは、６〜８個のアミノ酸によって分離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つの繰り返しを含み得、式中、各ｘは独立して、保存されたモチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６−８）ＹｘｘＬ／Ｉをもたらす任意のアミノ酸である。シグナル伝達分子内のＩＴＡＭは、細胞内のシグナル形質導入に必要であり、これは、シグナル伝達分子の活性化後にＩＴＡＭ内のチロシン残基のリン酸化によって少なくとも部分的に媒介される。ＩＴＡＭは、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキング部位としての機能も果たし得る。例示的なＩＴＡＭ含有初代細胞質シグナル伝達配列としては、ＣＤ３ζ、ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲベータ（ＦｃエプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインから成る。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、野生型ＣＤ３ζの一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｑ６５Ｋ等の１つ以上の変異を含むＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインの機能的変異体である。いくつかの実施形態では、変異体ＣＤ３ζの一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２０６または２０７の核酸配列によってコードされる。
【０３００】
共刺激シグナル伝達ドメイン
多くの免疫エフェクター細胞は、細胞増殖、分化、及び生存を促進し、細胞のエフェクター機能を活性化するために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて共刺激を必要とする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞内のシグ
ナル形質導入を媒介してエフェクター機能等の免疫応答を誘導するタンパク質の少なくとも一部を指す。本明細書に記載のキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、シグナルを形質導入し、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球によって媒介される応答を調節する共刺激タンパク質からの細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、共刺激分子の細胞質部分であり得る。「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それにより、増殖及び生存等であるが、これらに限定されない免疫細胞による共刺激応答を媒介する免疫細胞（Ｔ細胞等）上の同族結合パートナーを指す。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上（約２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のうちのいずれか等）の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達ドメインのうちの２つ以上、例えば、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のいずれか２つ以上の共刺激タンパク質等の異なる共刺激タンパク質由来の２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン等）及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及び一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン等）は、任意のペプチドリンカーを介して互いに融合される。一次細胞内シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の好適な順序で配置され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン等）との間に位置する。複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、相加的または相乗的刺激効果を提供し得る。
【０３０２】
宿主細胞（例えば、免疫細胞）内の共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、細胞が、サイトカインの産生及び分泌、食作用特性、増殖、分化、生存、及び／または細胞毒性を増加または減少するように誘導し得る。任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合性があり得る。共刺激シグナル伝達ドメインのタイプ（複数可）は、エフェクター分子が発現される免疫エフェクター細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球）、及び所望の免疫エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ効果）等の因子に基づいて選択される。ＣＡＲで使用するための共刺激シグナル伝達ドメインの例は、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ、及びＰＤＣＤ６）、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４−１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−アルファ、及びＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、Ｃ
Ｄ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、ならびに任意の他の共刺激分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉｋａｒｏｓ、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ  Ｒ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、及びＮＫＧ２Ｃを含むが、これらに限定されない、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドから成る群から選択される。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、本出願のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２０４の核酸配列によってコードされる。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、本出願のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７（すなわち、４−１ＢＢ）に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン及びＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２０５の核酸配列によってコードされる。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、本出願のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメイン。いくつかの実施形態では、配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメイン。
【０３０７】
共刺激シグナル伝達ドメインが免疫細胞の免疫応答を調節することができるように、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインのうちのいずれかの変異形も本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、野生型対応物と比較して、最大１０個のアミノ酸残基変形（例えば、１、２、３、４、５、または８個）を含む。１つ以上のアミノ酸変形を含む、かかる共刺激シグナル伝達ドメインは、変異形と称され得る。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激
シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達形質導入の増加及び免疫応答の刺激の増強をもたらし得る。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達形質導入の減少及び免疫応答の刺激の低減をもたらし得る。
【０３０８】
ヒンジ領域
本出願のＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、一般にタンパク質の２つのドメイン間に見られるアミノ酸セグメントであり、タンパク質の可撓性及びそれらのドメインの一方または両方の互いに対する移動を許容し得る。エフェクター分子の膜貫通ドメインに対する細胞外抗原結合ドメインのかかる可撓性及び移動を提供する任意のアミノ酸配列が使用され得る。
【０３０９】
ヒンジドメインは、約１０〜１００個のアミノ酸、例えば、約１５〜７５個のアミノ酸、２０〜５０個のアミノ酸、または３０〜６０個のアミノ酸のうちのいずれか１つを含有し得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５アミノ酸長のうちのいずれか１つであり得る。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含むための当該技術分野で既知の任意のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書に記載のキメラ受容体での使用に適合性がある。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、キメラ受容体に可撓性を付与する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αのヒンジドメインの一部、例えば、少なくとも１５個（例えば、２０、２５、３０、３５、または４０個）の連続アミノ酸を含有するＣＤ８αのヒンジドメインのフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αのヒンジドメインは、配列番号１９２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αのヒンジドメインは、配列番号２０１の核酸配列によってコードされる。
【０３１１】
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体等の抗体のヒンジドメインは、本明細書に記載のｐＨ依存性キメラ受容体系での使用にも適合性がある。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１及びＣＨ２を連結するヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン及び抗体の１つ以上の定常領域を含む抗体のものである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン及び抗体のＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインならびに抗体のＣＨ２及びＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域ならびにＣＨ２及びＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域及びＣＨ３定常領域を含む。
【０３１２】
天然に存在しないペプチドは、本明細書に記載のキメラ受容体のヒンジドメインとしても使用され得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジドメインは、ペプチドリンカー、例えば、（ＧｘＳ）ｎリンカーであり、式中、ｘ及びｎは独立して、３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１、１２、またはそれ以上を含む３〜１２の整数であり得る。
【０３１３】
シグナルペプチド
本出願のＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチド（別名、シグナル配列）を含み得る。一般に、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞内の所望の部位に標的するペプチド配列である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、エフェクター分子を細胞の分泌経路に標的し、エフェクター分子の脂質二重層への組み込み及び繋留を可能にする。本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適合性のある天然に存在するタンパク質のシグナル配列または合成の天然に存在しないシグナル配列を含むシグナルペプチドは、当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ−ＣＳＦ受容体α、及びＩｇＧ１重鎖から成る群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αのシグナルペプチドは、配列番号１９１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αのシグナルペプチドは、配列番号１９９または２００の核酸配列によってコードされる。
【０３１４】
ＩＶ．操作された免疫エフェクター細胞
本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれか１つを含む宿主細胞（免疫エフェクター細胞等）が本出願にさらに提供される。
【０３１５】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）ＢＣＭＡの第１のエピトープに特異的に結合する第１のＢＣＭＡ結合部分及びＢＣＭＡの第２のエピトープに特異的に結合する第２のＢＣＭＡ結合部分を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）が提供され、第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、（ａ）ＢＣＭＡの第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及びＢＣＭＡの第２のエピトープに特異的に結合する第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）が提供され、第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び／または第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ラクダ科、キメラ、ヒト、またはヒト化である。いくつかの実施形態では、第１の抗ＢＣＭＡ及び第２の抗ＢＣＭＡは、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約５０以下（約３５、２５、２０、１５、１０、または５以下のうちのいずれか１つ等）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、多価ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（ＣＤ８αヒンジドメイン等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、多価ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（ＣＤ８αシグナルペプチド等）をさらに含む。いくつか
の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚幹細胞である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、同種異系である。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、（ａ）抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含むＢＣＭＡ  ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）が提供され、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、以下：（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（５）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（６）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１０）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１１）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１２）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１３）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１４）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１５）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１６）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１７）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１８）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１９）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２０）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２１）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２２）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２３）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤ
Ｒ２、及び配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２４）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２５）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２６）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２７）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２８）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２９）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３０）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３２）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３３）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３４）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３５）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３６）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３７）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または（３８）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、のうちの任意の１つを含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、少なくとも２つの抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ラクダ科、キメラ、ヒト、またはヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１１５〜１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態では、���胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（ＣＤ８αヒンジドメイン等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（ＣＤ８αシグナルペプチド等）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８に由来する第１の共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１３７に由来する第２の共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態で
は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、配列番号２１６〜２５６、２９８〜３３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚幹細胞である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、同種異系である。
【０３１８】
２つ以上の異なるＣＡＲを含む（または発現する）操作された免疫エフェクター細胞も提供される。本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれか２つ以上が組み合わせで発現される。ＣＡＲは、異なる抗原を標的とし、それにより相乗的または相加的効果をもたらすことができる。ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン内の単一ドメイン抗体は、単一の抗原可変鎖（重鎖等）のみを有し、かかるＣＡＲ発現細胞は、２つ以上のｓｃＦｖに基づくＣＡＲを共発現する操作された免疫エフェクター細胞で見られる可変鎖誤対合問題を有しない。２つのＶＨＨに基づくＣＡＲを共発現する例示的な操作された免疫エフェクター細胞が、図１５Ｅに例証される。当業者であれば、他のｓｄＡｂに基づくＣＡＲまたは本明細書に記載の他の構造を有するＣＡＲが操作された免疫エフェクター細胞でも共発現され得ることを認識するであろう。２つ以上のＣＡＲは、同じベクターまたは異なるベクター上でコードされ得る。
【０３１９】
操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上の治療用タンパク質及び／または免疫調節剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤をさらに発現し得る。例えば、国際特許出願第  ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７３４８９号及び同第ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０８７８５５号を参照されたく、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３２０】
ベクター
本出願は、本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれか１つをクローニング及び発現するためのベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳類細胞等の真核生物細胞における複製及び組み込みに好適である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及び他のウイルス学及び分子生物学手引き書に記載されている。
【０３２１】
いくつかのウイルスベースの系が、哺乳類細胞への遺伝子導入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系に好都合なプラットフォームを提供する。異種核酸は、ベクターに挿入され、当該技術分野で既知の技術を使用してレトロウイルス粒子内にパッケージングされ得る。その後、組換えウイルスは、単離され、操作された哺乳類細胞にインビトロまたはエクスビボ送達され得る。いくつかのレトロウイルス系が当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。いくつかのアデノウイルスベクターが当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態では、自己不活性化レンチウイルスベクターが使用される。例えば、免疫調節剤（免疫チェックポイント阻害剤等）コード配列を持つ自己不活性化レンチウイルスベクター及び／またはＣＡＲを持つ自己不活性化レンチウイルスベクターが、当該技術分野で既知のプロトコルとともにパッケージングされ得る。結果として生じるレンチウイルスベクターは、当該技術分野で既知の方法を使用して哺乳類細胞（初代ヒトＴ細胞等）を形質導入するために使用され得る。レ
ンチウイルス等のレトロウイルスに由来するベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組み込み及び子孫細胞におけるその繁殖を可能にするため、長期遺伝子導入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターは、低免疫原性も有し、非増殖細胞を形質導入することができる。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、トランスポゾン、例えば、スリーピングビューティー（ＳＢ）トランスポゾン系、またはＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系である。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えば、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、及びデンドリマーを含む、ポリマーに基づく非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、陽イオン性脂質に基づく非ウイルスベクター、例えば、陽イオン性リポソーム、脂質ナノエマルション、及び固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ペプチドに基づく遺伝子非ウイルスベクター、例えば、ポリ−Ｌ−リジンである。ゲノム編集に好適な既知の非ウイルスベクターのいずれも、ＣＡＲをコードする核酸を操作された免疫エフェクター細胞に導入するために使用され得る。例えば、Ｙｉｎ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１４）  １５：５２１−５５５、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ  ＥＬ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ：ａ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．”  Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１１）  Ｒ１：Ｒ１４−２０、及びＺｈａｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．“ＰｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｔｈｅ  ｔｏｏｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．”  Ｔｒａｎｓｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０１６）  ５（１）：１２０−１２５を参照されたく、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸のうちの１つ以上は、電気穿孔法、ソノポレーション、フォトポレーション、マグネトフェクション、ヒドロポレーションを含むが、これらに限定されない、物理学的方法によって操作された免疫エフェクター細胞に導入される。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸のうちのいずれか１つを含む。核酸は、当該技術分野で既知の任意の分子クローニング法を使用して、例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ以上の選択可能なマーカーを使用して、ベクターにクローニングされ得る。いくつかの実施形態では、核酸は、プロモーターに操作可能に連結される。様々なプロモーターが哺乳類細胞での遺伝子発現について調査されており、当該技術分野で既知のプロモーターのうちのいずれかが本発明で使用され得る。プロモーターは、構成的プロモーターまたは制御プロモーター、例えば、誘導性プロモーターとして大まかに分類され得る。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、構成的プロモーターに操作可能に連結される。構成的プロモーターは、異種遺伝子（導入遺伝子とも称される）を宿主細胞で構成的に発現させる。本明細書で企図される例示的な構成的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト伸長因子−１アルファ（ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、サルウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、及びＣＭＶ初期エンハンサーとカップリングしたトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。導入遺伝子発現の駆動におけるかかる構成的プロモーターの効率は、多数の研究において広く比較されている。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅらは、初代ヒトＴ細胞でのＣＡＲ発現を駆動するためのＣＭＶ、ｈＥＦ１α、ＵｂｉＣ、及びＰＧＫの効率を比較し、ｈＥＦ１αプロモーターが、最も高いレベルの導入遺伝子発現を誘導しただけでなく、ＣＤ４及びＣＤ８  ヒトＴ細胞で最適に維持されたという結論を下
した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３−１４６４（２００９））。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、ｈＥＦ１αプロモーターに操作可能に連結される。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、誘導性プロモーターに操作可能に連結される。誘導性プロモーターは、制御プロモーターのカテゴリーに属する。誘導性プロモーターは、物理的条件、操作された免疫エフェクター細胞の微環境、または操作された免疫エフェクター細胞、誘導因子（すなわち、誘導剤）、もしくはそれらの組み合わせの生理学的状態等の１つ以上の条件によって誘導され得る。いくつかの実施形態では、誘導条件は、操作された哺乳類細胞及び／または薬学的組成物を受ける対象における内在性遺伝子発現を誘導しない。いくつかの実施形態では、誘導条件は、操作された哺乳類細胞の誘導因子、放射線照射（イオン化放射、光等）、温度（熱等）、レドックス状態、腫瘍環境、及び活性化状態から成る群から選択される。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞集団からＣＡＲを発現する細胞を選択するために選択可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子も含有する。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子はいずれも適切な制御配列と隣接して、宿主細胞での発現を可能にし得る。例えば、ベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及び核酸配列の発現の制御に有用なプロモーターを含有し得る。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＡＲをコードする核酸を２つ以上含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列及び第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む核酸を含み、第１の核酸は、自己開裂ペプチドをコードする第３の核酸配列を介して第２の核酸に操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、自己開裂ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、及びＦ２Ａから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａペプチドは、配列番号３８５のアミノ酸配列を有する。
【０３２８】
免疫エフェクター細胞
「免疫エフェクター細胞」は、免疫エフェクター機能を実行することができる免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介する免疫エフェクター細胞の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、好中球、及び好酸球が挙げられる。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８−、ＣＤ４−／ＣＤ８＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４−／ＣＤ８−、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲの発現及びＣＤ２０＋またはＣＤ１９＋腫瘍細胞等の標的細胞への結合時にＩＬ−２、ＴＦＮ、及び／またはＴＮＦを産生する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＡＲの発現及び標的細胞への結合時に抗原特異的標的細胞を溶解する。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。他の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、確立された細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞であり得る。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、造血幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ、または胚幹細胞等の幹細胞から分化される。
【０３３２】
操作された免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをＴ細胞等の免疫エフェクター細胞に導入
することによって調製される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、第ＩＩＩ節に記載の単離された核酸のうちのいずれか１つまたはベクターのうちのいずれか１つをトランスフェクトすることによって免疫エフェクター細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、タンパク質を細胞膜に挿入しながら、細胞をＣＥＬＬ  ＳＱＵＥＥＺＥ（登録商標）等のマイクロ流体系に通過させることによって免疫エフェクター細胞に導入される（例えば、米国特許出願公開第２０１４０２８７５０９号を参照されたい）。
【０３３３】
ベクターまたは単離された核酸を哺乳類細胞に導入する方法が当該技術分野で既知である。記載のベクターは、物理的、化学的、または生物学的方法によって免疫エフェクター細胞に移入される。
【０３３４】
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、微量注入法、電気穿孔法等が挙げられる。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞を産生するための方法が、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。いくつかの実施形態では、ベクターは、電気穿孔法によって細胞に導入される。
【０３３５】
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法である。
【０３３６】
ベクターを免疫エフェクター細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。インビトロで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれかをコードするＲＮＡ分子は、従来の方法（例えば、インビトロ転写）によって調製され、その後、ｍＲＮＡ電気穿孔法等の既知の方法によって免疫エフェクター細胞に導入され得る。例えば、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７：１０２７−１０３５を参照されたい。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、ベクターまたは単離された核酸の導入後にエクスビボで繁殖する。いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、培養されて、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、１２日間、または１４日間のうちのいずれかにわたって繁殖する。いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、さらに評価またはスクリーニングされて、操作された哺乳類細胞を選択する。
【０３３９】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を特定し、制御配列の機能性を評価するために使用され得る。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくは組織に存在せず、またはそれによって発現されず、発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により明らかになるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリ性ホスフ
ァターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が挙げられ得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２（２０００））。好適な発現系が周知であり、既知の技法を使用して調製されるか、または商業的に入手され得る。
【０３４０】
操作された免疫エフェクター細胞におけるＣＡＲをコードする核酸の存在を確認するための他の方法としては、例えば、サザンブロット法及びノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲ等の当業者に周知の分子生物学的アッセイ、例えば、免疫学的方法（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット法等）による特定のペプチドの存在または不在の検出等の生化学的アッセイが挙げられる。
【０３４１】
１．Ｔ細胞源
Ｔ細胞の増殖及び遺伝子修飾前に、Ｔ細胞源が個体から得られる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含むいくつかの源から得られ得る。いくつかの実施形態では、当該技術分野で入手可能な任意の数のＴ細胞株が使用され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離等の当業者に既知の任意の数の技法を使用して対象から収集される血液単位から得られ得る。いくつかの実施形態では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、及び血小板を含むリンパ球を含有する。いくつかの実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄されて血漿画分を除去し、細胞をその後の処理ステップに適切な緩衝液または培地中に置いてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得、または全てではないが多くの二価陽イオンを欠き得る。この場合もやはり、驚くべきことに、カルシウムの不在下での初期活性化ステップが、活性化の拡大をもたらす。当業者であれば容易に理解するであろうように、洗浄ステップは、当業者に既知の方法によって、例えば、製造業者の指示に従って半自動「貫流」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を使用することによって達成され得る。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋を含まないＰＢＳ、Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、または他の生理食塩水溶液（緩衝液の有無にかかわらず）等に再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分が除去され、細胞が培養培地に直接再懸濁され得る。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球細胞を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離または向流遠心分離水簸によって単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞等のＴ細胞の特定の下位集団は、陽性または陰性選択技法によってさらに単離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間にわたる、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔとのインキュベーションによって単離される。いくつかの実施形態では、時間は、約３０分間である。さらなる一実施形態では、時間は、３０分間〜３６時間以上の範囲及びそれらの間の全ての整数値である。さらなる一実施形態では、時間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。いくつかの実施形態では、時間は、１０〜２４時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、２４時間である。白血病を有する患者からのＴ細胞の単離の場合、２４時間等のより長いインキュベーション時間により、細胞収率が高まり得る。より長いインキュベーション時間を使用して、例えば、腫瘍組織または免疫が低下した個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離
する際に、他の細胞型と比較してわずかなＴ細胞しか存在しない任意の状況下でＴ細胞を単離することができる。さらに、より長いインキュベーション時間の使用により、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率が高まり得る。したがって、Ｔ細胞がＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合することができる時間を短縮もしくは延長することによって、及び／または（本明細書にさらに記載されるように）ビーズのＴ細胞に対する比率を増加もしくは減少させることによって、Ｔ細胞の下位集団は、培養開始時またはプロセス中の他の時点で賛否について優先的に選択され得る。加えて、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少させることによって、Ｔ細胞の下位集団は、培養開始時または他の所望の時点で賛否について優先的に選択され得る。当業者であれば、複数回の選択ラウンドを使用することもできることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、選択手順を実行し、活性化及び増殖プロセスで「選択されていない」細胞を使用することが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞は、さらなる選択ラウンドにも供され得る。
【０３４３】
陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、陰性選択された細胞に特有の表面マーカーに指向された抗体の組み合わせを用いて達成され得る。１つの方法は、陰性選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに指向されたモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別及び／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体のカクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、典型的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を発現する制御Ｔ細胞を富化するか、またはそれを陽性選択することが望ましい場合がある。あるいは、ある特定の実施形態では、制御Ｔ細胞は、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択方法によって枯渇される。
【０３４４】
陽性または陰性選択による所望の細胞集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズ等の粒子）の濃度を変化させることができる。ある特定の実施形態では、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズ及び細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、２０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。一実施形態では、１０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。さらなる一実施形態では、１億細胞／ｍＬ超が使用される。さらなる一実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。なお別の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万個の細胞／ｍＬの濃度が使用され得る。高濃度の使用により、細胞収率、細胞活性化、及び細胞増殖の増加がもたらされ得る。さらに、高細胞濃度の使用により、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞等の目的とする標的抗原を弱く発現し得る細胞、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（すなわち、白血病血液、腫瘍組織等）由来の細胞のより効率的な捕捉が可能になる。かかる細胞集団は、治療値を有し得、得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞の使用により、通常より弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能になる。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、より低い濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズ等の粒子）との混合物を著しく希釈することにより、粒子と細胞との間の相互作用が最小限に抑えられる。これにより、粒子に結合する多量の所望の抗原を発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。いくつかの実施形態では、使用される細胞濃度は、５×１０６／ｍＬである。いくつかの実施形態では、使用される細胞濃度は、約１×１０５／ｍＬ〜１×１０６／ｍＬ、及びそれらの間の任意の
整数値であり得る。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、細胞は、回転子上で、２〜１０℃または室温のいずれかで、様々な速度で様々な長さの時間にわたってインキュベートされ得る。
【０３４７】
刺激用のＴ細胞は、洗浄ステップ後に凍結することもできる。理論に拘束されることを望まないが、凍結ステップ及びその後の解凍ステップにより、細胞集団における顆粒球を除去し、単球をある程度除去することによってより均一な生成物が提供される。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップ後、細胞は、凍結溶液中に懸濁され得る。多くの凍結溶液及びパラメータが当該技術分野で既知であり、この状況において有用である一方で、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯ、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、及び７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地の使用を伴い、その後、細胞は、１℃／分の速度で−８０℃になるまで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相中に貯蔵される。他の制御凍結方法、ならびに−２０℃でまたは液体窒素中での直後の非制御凍結方法が使用され得る。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、凍結保存細胞が解凍され、本明細書に記載されるように洗浄され、室温で１時間静置させた後、活性化する。
【０３４９】
本明細書に記載の細胞の増殖が必要とされ得る前の時点での対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の収集も本出願で企図される。したがって、増殖される細胞の源は、必要な任意の時点で収集され、Ｔ細胞等の所望の細胞が単離され、本明細書に記載の疾患または状態等のＴ細胞療法の利益を享受するであろう任意の数の疾患または状態のためのＴ細胞療法での後の使用のために凍結される。一実施形態では、血液試料またはアフェレーシスは、一般に健常な対象から採取される。ある特定の実施形態では、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症する危険性があるが、疾患をまだ発症していない一般に健常な対象から採取され、目的とする細胞が単離され、後の使用のために凍結される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞が増殖され、凍結され、後に使用され得る。ある特定の実施形態では、試料は、本明細書に記載の特定の疾患の診断直後であるが、任意の治療の前に患者から収集される。さらなる一実施形態では、細胞は、薬剤、例えば、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び放射線照射での治療を含むが、これらに限定されない、任意の数の関連治療法前に対象由来の血液試料またはアフェレーシスから単離される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリン及びＦＫ５０６）または成長因子によって誘導されるシグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）のいずれかを阻害する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６：８０７−８１５，１９９１、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ
ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ  ７３：３１６−３２１，１９９１、Ｂｉｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５：７６３−７７３，１９９３）。さらなる一実施形態では、細胞は、患者のために単離され、骨髄もしくは幹細胞移植、フルダラビン等のいずれかの化学療法薬を使用したＴ細胞除去療法、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体、例えば、ＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨと併せて（例えば、その前に、同時に、またはその後に）後の使用のために凍結される。別の実施形態
では、細胞は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサン等のＢ細胞除去療法前に単離され、Ｂ細胞除去療法前後の治療のために後の使用のために凍結され得る。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、治療後に患者から直接得られる。この点について、ある特定のがん治療後、具体的には、免疫系を損傷する薬物での治療後、治療直後、患者が通常治療から回復する期間中、得られたＴ細胞の質が最適であるか、またはエクスビボで増殖するそれらの能力について改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用したエクスビボ操作後、これらの細胞は、移植の増強及びインビボ増殖に好ましい状態にあり得る。したがって、この回復期中のＴ細胞、樹状細胞、または造血系列の他の細胞を含む血液細胞の収集が、本発明の文脈内で企図される。さらに、ある特定の実施形態では、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの動員）及び前処置（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）レジメンを使用して、特に、療法後の定義された期間中に、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び／または増殖が好ましい状態を対象に作り出すことができる。例証的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
【０３５１】
２．Ｔ細胞の活性化及び増殖
本明細書に記載のＣＡＲでのＴ細胞の遺伝子修飾の前または後にかかわらず、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載の方法を一般に使用して活性化及び増殖され得る。
【０３５２】
一般に、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドに結合した表面との接触によって増殖され得る。具体的には、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または表面上に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと併せたタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触し得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野で一般に既知の他の方法として使用され得る（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８、Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９、Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在し得るか、または表面にカップリングし得る。表面にカップリングすると、薬剤は、同じ表面にカップリングし得る（すなわち、「シス」形成）か、または表面を分離し得る（すなわち、「トランス」形成）。あるいは、一方の薬剤が表面にカップリングし、他方の薬剤が溶液中に存在し得る。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在するか、または表面に結合
する。ある特定の実施形態では、両方の薬剤が溶液中に存在し得る。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であり得、表面、例えば、Ｆｃ受容体もしくは抗体を発現する細胞、または薬剤に結合する他の結合剤に架橋し得る。この点について、例えば、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号及び同第２００６００３４８１０号（本発明におけるＴ細胞の活性化及び増殖での使用に企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ））を参照されたい。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、薬剤でコーティングされたビーズと合わせられ、その後、ビーズとＴ細胞が分離され、次いで、Ｔ細胞が培養される。代替の一実施形態では、培養前に、薬剤でコーティングされたビーズと細胞は分離されず、一緒に培養される。さらなる一実施形態では、ビーズ及び細胞は、磁力等の力を加えることによって最初に濃縮され、細胞表面マーカーのライゲーションの増加がもたらされ、それにより細胞刺激を誘導する。
【０３５５】
一例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合する常磁性ビーズ（３×２８個のビーズ）をＴ細胞と接触させることによってライゲーションされ得る。一実施形態では、細胞（例えば、１０４〜１０９個のＴ細胞）及びビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズ１：１の比率））が、緩衝液、好ましくは、ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウム等の二価陽イオンなし）中で合わせられる。この場合もやはり、当業者であれば、任意の細胞濃度が使用され得ることを容易に理解することができる。例えば、標的細胞は、試料中では非常に稀であり、試料の０．０１％を構成し得るか、または全試料（すなわち、１００％）が目的とする標的細胞を含み得る。したがって、任意の細胞数は、本発明の文脈内である。ある特定の実施形態では、粒子及び細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させて（すなわち、細胞濃度を増加させて）、細胞と粒子との最大接触を確実にすることが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、約２０億個の細胞／ｍＬの濃度が使用される。別の実施形態では、１億個の細胞／ｍＬ超が使用される。さらなる一実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。なお別の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万個の細胞／ｍＬの濃度が使用され得る。高濃度の使用により、細胞収率、細胞活性化、及び細胞増殖の増加がもたらされ得る。さらに、高細胞濃度の使用により、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞等の目的とする標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕捉が可能になる。ある特定の実施形態では、かかる細胞集団は、治療値を有し得、取得することが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞の使用により、通常より弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能になる。
【０３５６】
いくつかの実施形態では、混合物は、数時間（約３時間）〜約１４日間またはそれらの間の任意の時間単位の整数値にわたって培養され得る。別の実施形態では、混合物は、２１日間にわたって培養され得る。本発明の一実施形態では、ビーズ及びＴ細胞は、約８日間にわたって一緒に培養される。別の実施形態では、ビーズ及びＴ細胞は、２〜３日間にわたって一緒に培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日間以上になり得るように、いくつかの刺激サイクルも所望され得る。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシまたはヒト胎児血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ−α、または当業者に既知の細胞成長のための任意の他の添加物を含む増殖及び生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞成長のための他の添加物としては、界面活性剤、プラスマネート、ならびに還元剤、例えば、Ｎ−アセチル−システ
イン及び２−メルカプトエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）または定義された組のホルモン、及び／またはＴ細胞の成長及び増殖に十分な量のサイトカイン（複数可）を補充しているかのいずれかのＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５、及びＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支援するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び大気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシス末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８）を超えるヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体の刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖により、約８〜９日目前に主にＴＨ細胞から成るＴ細胞集団が産生される一方で、約８〜９日目後、Ｔ細胞集団は、次第により多くのＴＣ細胞集団を含む。したがって、治療目的に応じて、対象にＴＨ細胞から主に成るＴ細胞集団を注入することが有利であり得る。同様に、抗原特異的ＴＣ細胞サブセットが単離された場合、このサブセットをより大きな程度に増殖することが有益であり得る。
【０３５７】
さらに、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーが、細胞増殖プロセスの過程中に著しく変化するが、主に、再現可能に変化する。したがって、かかる再現性により、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物を調整する能力が有効になる。
【０３５８】
Ｖ．薬学的組成物
抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体のうちのいずれか１つ、または本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれか１つ（ＢＣＭＡ  ＣＡＲ等）を含む操作された免疫エフェクター細胞のうちのいずれか１つと、薬学的に許容される担体と、を含む薬学的組成物が、本出願によってさらに提供される。薬学的組成物は、所望の純度を有するｓｄＡｂ、または複数の操作された免疫エフェクター細胞を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製され得る。
【０３５９】
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量及び濃度ではレシピエントに非毒性であり、緩衝液、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化物質、防腐剤、等張化剤、安定剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ及び／または非イオン性界面活性剤を含む。
【０３６０】
緩衝液は、特に安定性がｐＨ依存性である場合、治療有効性を最適化する範囲内でｐＨを制御するために使用される。緩衝液は、好ましくは、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明での使用に好適な緩衝剤は、有機酸及び無機酸の両方、ならびにそれらの塩を含む。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩。さらに、緩衝液は、ヒスチジン及びトリメチルアミン塩、例えば、トリスを含み得る。
【０３６１】
防腐剤は、微生物成長を遅延させるために添加され、典型的には、０．２ｗ／ｖ％〜１．０ｗ／ｖ％の範囲で存在する。本発明での使用に好適な防腐剤としては、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプ
ロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。
【０３６２】
時折「安定剤」としても既知の等張化剤は、組成物中の液体の等張性を調整または維持するために存在する。タンパク質及び抗体等の大きい荷電した生体分子とともに使用される場合、それらが、荷電したアミノ酸側鎖群と相互作用し、それにより分子間及び分子内相互作用の可能性を低減するため、それらは、多くの場合、「安定剤」と称される。等張化剤は、他の成分の相対量を考慮して、０．１％〜２５重量％、好ましくは、１〜５％の任意の量で存在し得る。好ましい等張化剤としては、多価糖アルコール、好ましくは、三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが挙げられる。
【０３６３】
さらなる賦形剤としては、以下：（１）増量剤、（２）溶解度向上剤、（３）安定剤、及び（４）変性または容器の壁への付着を阻止する薬剤のうちの１つ以上としての機能を果たし得る薬剤が挙げられる。かかる賦形剤としては、多価糖アルコール（上に列挙されるもの）；アミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン等；有機糖または糖アルコール、例えば、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または他の免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；単糖（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；三糖、例えば、ラフィノース；ならびに多糖、例えば、デキストリンまたはデキストランが挙げられる。
【０３６４】
非イオン性界面活性剤または洗剤（別名、「湿潤剤」）は、治療薬の可溶化を助けるために、かつ撹拌によって誘導される凝集から治療用タンパク質を保護するために存在し、それにより、活性治療用タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく製剤が剪断表面応力に曝露されることも可能になる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約０．０７ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。
【０３６５】
好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０等）、ポリオキサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）（１８４、１８８等）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０等）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０、及び６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用され得る陰イオン性洗剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、及びジオクチルスルホン酸ナトリウムを含む。陽イオン性洗剤は、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含む。
【０３６６】
薬学的組成物がインビボ投与に使用されるために、それらは、滅菌でなければならない。薬学的組成物は、滅菌濾過膜を通す濾過によって滅菌にされる。本明細書の薬学的組成
物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈用溶液袋またはバイアルに入れられる。
【０３６７】
投与経路は、好適な様態での、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、もしくは関節内経路による注射もしくは注入、局所投与、吸入、または持続放出もしくは徐放手段による長期にわたる単回もしくは複数回ボーラスまたは注入等の既知の認められている方法に従う。
【０３６８】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例としては、アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから成る注射用ミクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０３６９】
本明細書に記載の薬学的組成物は、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性化合物または薬剤、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含有し得る。あるいは、または加えて、本組成物は、細胞毒性薬、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、または成長阻害剤を含み得る。かかる分子は、意図される目的に有効な量で、組み合わせで好適に存在する。
【０３７０】
活性成分は、例えば、液滴形成技法または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）、またはマクロエマルジョンにも封入され得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに開示されている。
【０３７１】
ＶＩ．治療方法
本出願はさらに、細胞免疫療法で使用するための方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態では、細胞免疫療法は、血液学的悪性腫瘍及び固形腫瘍を含むが、これらに限定されない、がんを治療するためのものである。本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ、ＣＡＲ、及び操作された免疫エフェクター細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞等）のうちのいずれも、がんの治療方法で使用され得る。本明細書に記載のＣＡＲは、抗原損失エスケープ変異を有する腫瘍の治療、及び既存の療法への耐性の低減に有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、例えば、自己免疫疾患等の単一ドメイン抗体またはＣＡＲによって特異的に認識される抗原に関連する他の疾患を治療するために使用され得る。
【０３７２】
いくつかの実施形態では、個体（ヒト個体等）におけるがん（例えば、多発性骨髄腫、例えば、再発性または難治性多発性骨髄腫）を治療する方法であって、個体に、（１）（ａ）ＢＣＭＡの第１のエピトープに特異的に結合する第１のＢＣＭＡ結合部分及びＢＣＭＡの第２のエピトープに特異的に結合する第２のＢＣＭＡ結合部分を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）（第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる）と、（２）薬学的に許容される担体と、を
含む有効量の薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、個体（ヒト個体等）におけるがん（例えば、多発性骨髄腫、例えば、再発性または難治性多発性骨髄腫）を治療する方法であって、個体に、（１）（ａ）ＢＣＭＡの第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及びＢＣＭＡの第２のエピトープに特異的に結合する第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）（第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる）と、（２）薬学的に許容される担体と、を含む有効量の薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、同種異系である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、がんは、液体がん、例えば、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、または慢性リンパ性白血病である。いくつかの実施形態では、がんは、難治性または再発性多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、約１０５〜約１０７個の細胞／ｋｇ、例えば、約３×１０５〜約７×１０６個の細胞／ｋｇ、または約３×１０６個の細胞／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、静脈内注入によって投与される。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、約１週間にわたって３つの分割用量で投与される。
【０３７３】
いくつかの実施形態では、個体（ヒト個体等）におけるがん（例えば、多発性骨髄腫、例えば、再発性または難治性多発性骨髄腫）を治療する方法であって、個体に、（１）（ａ）抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含むＢＣＭＡ  ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）、（２）薬学的に許容される担体と、を含む有効量の薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供され、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、以下：（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（５）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（６）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１０）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１１）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１２）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１３）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１４）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１５）配列
番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１６）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１７）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１８）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１９）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２０）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２１）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２２）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２３）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２４）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２５）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２６）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２７）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２８）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２９）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３０）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３２）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３３）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３４）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３５）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３６）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３７）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または（３８）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、のうちの任意の１つを含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、少なくとも２つの抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ラクダ科、キメラ、ヒト、またはヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１１５〜１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、配列番号２１６〜２５６及び２９８〜３３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、同種異系である。いくつかの実施形態では、がんは、液体がん、
例えば、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、または慢性リンパ性白血病である。いくつかの実施形態では、がんは、難治性または再発性多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、約１０５〜約１０７個の細胞／ｋｇ、例えば、約３×１０５〜約７×１０６個の細胞／ｋｇ、または約３×１０６個の細胞／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、静脈内注入によって投与される。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、約１週間にわたって３つの分割用量で投与される。
【０３７４】
いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫（例えば、再発性または難治性多発性骨髄腫）に罹患している個体における部分的または完全臨床的寛解を得る方法であって、個体に、（１）（ａ）ＢＣＭＡの第１のエピトープに特異的に結合する第１のＢＣＭＡ結合部分（第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）、及びＢＣＭＡの第２のエピトープに特異的に結合する第２のＢＣＭＡ結合部分（第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）（第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる）と、（２）薬学的に許容される担体と、を含む有効量の薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、同種異系である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、がんは、液体がん、例えば、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、または慢性リンパ性白血病である。いくつかの実施形態では、がんは、難治性または再発性多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、約１０５〜約１０７個の細胞／ｋｇ、例えば、約３×１０５〜約７×１０６個の細胞／ｋｇ、または約３×１０６個の細胞／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、静脈内注入によって投与される。いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、約１週間にわたって３つの分割用量で投与される。
【０３７５】
いくつかの実施形態では、個体（ヒト個体等）におけるがん（例えば、多発性骨髄腫、例えば、再発性または難治性多発性骨髄腫）を治療する方法であって、個体に、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ及び薬学的に許容される担体を含む有効量の薬学的組成物を投与することを含み、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、以下：（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（５）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（６）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１０）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１１）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（
１２）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１３）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１４）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１５）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１６）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１７）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１８）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１９）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２０）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２１）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２２）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２３）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２４）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２５）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２６）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２７）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２８）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２９）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３０）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３２）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３３）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３４）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３５）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３６）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３７）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または（３８）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、のうちの任意の１つを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、ラクダ科、キメラ、ヒト、またはヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂは、配列番号１１５〜１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつか
の実施形態では、がんは、液体がん、例えば、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、または慢性リンパ性白血病である。いくつかの実施形態では、がんは、難治性または再発性多発性骨髄腫である。
【０３７６】
本明細書に記載の方法は、固形がん及び液体がんの両方を含む種々のがんの治療に好適である。これらの方法は、早期、進行期、及び転移がんを含む全ての病期のがんに適用される。本明細書に記載の方法は、補助状況または新補助状況下で、第１の療法、第２の療法、第３の療法、または当該技術分野で既知の他の種類の癌療法、例えば、化学療法、手術、放射線、遺伝子療法、免疫療法、骨髄移植、幹細胞移植、標的療法、凍結療法、超音波療法、光線力学療法、高周波アブレーション等との併用療法として使用され得る。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、Ｄｕｒｉｅ−Ｓａｌｍｏｎ病期分類システムに基づいた、ステージＩ、ステージＩＩ、もしくはステージＩＩＩ、及び／またはステージＡもしくはステージＢの多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、国際骨髄腫作業グループ（ＩＭＷＧ）によって刊行される国際病期分類システムに基づいた、ステージＩ、ステージＩＩ、またはステージＩＩＩの多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）である。いくつかの実施形態では、がんは、無症候性（くすぶり型／遅発性）骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、症候性または急性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、難治性多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、がんは、転移性多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、個体は、多発性骨髄腫に対するこれまでの治療に応答しなかった。いくつかの実施形態では、個体は、多発性骨髄腫のこれまでの治療後に進行性疾患を有する。いくつかの実施形態では、個体は、多発性骨髄腫に対する治療を少なくとも約２、３、４回、またはそれ以上のうちのいずれかの回数これまでに受けたことがある。いくつかの実施形態では、がんは、再発性多発性骨髄腫である。
【０３７８】
いくつかの実施形態では、個体は、急性多発性骨髄腫を有する。いくつかの実施形態では、個体は、少なくとも１０％のクローン骨髄形質細胞を有する。いくつかの実施形態では、個体は、生検により確定診断された骨または髄外形質細胞腫を有する。いくつかの実施形態では、個体は、基礎にある形質細胞増殖疾患に起因し得る末端器官障害の証拠を有する。いくつかの実施形態では、個体は、例えば、血清カルシウムが正常上限＞０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ（＞１ｍｇ／ｄＬ）である、または＞２．７５ｍｍｏｌ／Ｌ（＞１１ｍｇ／ｄＬ）よりも高い高カルシウム血症を有する。いくつかの実施形態では、個体は、例えば、＜４０ｍＬ／分のクレアチニンクリアランスまたは＞１７７μｍｏｌ／Ｌ（＞２ｍｇ／ｄＬ）の血清クレアチニンである、腎不全を有する。いくつかの実施形態では、個体は、例えば、正常値最下限を下回る＞２０ｇ／Ｌのヘモグロビン値、または＜１００ｇ／Ｌのヘモグロビン値である、貧血を有する。いくつかの実施形態では、個体は、１つ以上の骨病変、例えば、骨格Ｘ線撮影、ＣＴ、またはＰＥＴ／ＣＴ上の１つ以上の骨破壊性病変を有する。いくつかの実施形態では、個体は、悪性腫瘍（ＭＤＥ）の以下のバイオマーカー：（１）骨髄検査における６０％以上のクローン形質細胞、（２）１００またはそれ以上の血清病変部／非病変部の遊離軽鎖比であるが、但し、病変部軽鎖の絶対レベルが少なくとも１００ｍｇ／Ｌであるものとする、（３）サイズが少なくとも５ｍｍ以上であるＭＲＩ上の１つを超える局所性病変、のうちの１つ以上を有する。
【０３７９】
薬学的組成物の投与は、注入、摂取、輸液、植え込み、または移植を含む任意の好都合な様態で行われ得る。本組成物は、患者に、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内、または腹腔内投与され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、全身投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、静脈内注入等の注入によって個体に投与される。免疫療法のための注入技法は、当該技術分野で既知である（例
えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６（１９８８）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、個体に、皮内または皮下注射によって投与される。いくつかの実施形態では、本組成物は、静脈注射によって投与される。いくつかの実施形態では、本組成物は、腫瘍またはリンパ節に直接注射される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、腫瘍部位に、例えば、腫瘍細胞に直接、または腫瘍細胞を有する組織に局所投与される。
【０３８０】
本発明の薬学的組成物の投薬量及び所望の薬物濃度は、想定される特定の使用に応じて異なり得る。適切な投薬量または投与経路の決定は、十分に当業者の技術の範囲内である。動物実験により、ヒト療法に有効な用量を決定するのに信頼できるガイダンスが提供される。有効な用量の種間スケーリングが、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ
Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，”  Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２−４６によって設定された原理に従って行われ得る。異なる製剤が異なる治療及び異なる障害に有効であり、特定の器官または組織を治療するよう意図された投与が別の器官または組織とは異なる様態での送達を必要とし得ることは、本出願の範囲内である。
【０３８１】
薬学的組成物が本明細書に記載のｓｄＡｂのうちのいずれか１つを含むいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、投与経路に応じて、約１０ｎｇ／個体体重ｋｇ／日〜最大約１００ｍｇ／個体体重ｋｇ／日以上の投薬量で、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日で投与される。特定の投薬量及び送達方法に関するガイダンスが文献に提供されており、例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、同第５，２０６，３４４号、または同第５，２２５，２１２号を参照されたい。
【０３８２】
薬学的組成物が本明細書に記載の操作された免疫細胞のうちのいずれか１つを含むいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９個の細胞／個体体重ｋｇのうちのいずれかの投薬量で投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約１０４〜約１０５、約１０５〜約１０６、約１０６〜約１０７、約１０７〜約１０８、約１０８〜約１０９、約１０４〜約１０９、約１０４〜約１０６、約１０６〜約１０８、または約１０５〜約１０７細胞／個体体重ｋｇのうちのいずれかの投薬量で投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７個の細胞／ｋｇまたはそれ以上のうちのいずれかの用量で投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも約３×１０５〜約７×１０６個の細胞／ｋｇ、または約３×１０６個の細胞／ｋｇの用量で投与される。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単回投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、複数回（２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上の回数のうちのいずれか等）投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、または１年に１回投与される。いくつかの実施形態では、投与間の間隔は、約１週間〜２週間、２週間〜１ヶ月、２週間〜２ヶ月、１ヶ月〜２ヶ月、１ヶ月〜３ヶ月、３ヶ月〜６ヶ月、または６ヶ月〜１年のうちのいずれか１つである。特定の患者に最適な投薬量及び治療レジーム（ｒｅｇｉｍｅ）は、患者を疾患の兆候について監視し、適宜に治療を調整することによって、医学分野の技術者によって容易に決定され得る。
【０３８４】
さらに、投薬量は、１回以上の別個の投与によって、または持続注入によって投与され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の回数のうちのいずれかの１つの用量等の分割用量で投与される。いくつかの実施形態では、分割用量は、約１週間にわたって投与される。いくつかの実施形態では、分割用量は、等しく分割される。いくつかの実施形態では、分割用量は、総用量の約２０％、約３０％、及び約５０％である。いくつかの実施形態では、連続した分割用量間の間隔は、約１日、２日、３日、またはそれ以上である。数日間以上にわたる反復投与の場合、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療が継続される。しかしながら、他の投薬量レジメンも有用であり得る。この療法の進行は、従来の技法及びアッセイによって容易に監視される。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物の量は、個体における客観的臨床応答を引き起こすのに有効である。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫（例えば、再発性または難治性多発性骨髄腫）に罹患している個体における客観的臨床的反応を得る方法であって、個体に、（１）（ａ）ＢＣＭＡの第１のエピトープに特異的に結合する第１のＢＣＭＡ結合部分（第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）、及びＢＣＭＡの第２のエピトープに特異的に結合する第２のＢＣＭＡ結合部分（第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）（第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる）と、（２）薬学的に許容される担体と、を含む有効量の薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな臨床奏効（ｓＣＲ）は、個体において得られる。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物の量は、個体における疾患寛解（部分的または完全）を引き起こすのに有効である。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫（例えば、再発性または難治性多発性骨髄腫）に罹患している個体における疾患寛解（部分的または完全）を引き起こす方法であって、個体に、（１）（ａ）ＢＣＭＡの第１のエピトープに特異的に結合する第１のＢＣＭＡ結合部分（第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）、及びＢＣＭＡの第２のエピトープに特異的に結合する第２のＢＣＭＡ結合部分（第２の抗ＢＣＭＡ
ｓｄＡｂ等）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）（第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる）と、（２）薬学的に許容される担体と、を含む有効量の薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかにおいて、臨床的寛解は、個体が薬学的組成物を受けてから約６カ月、５カ月、４カ月、３カ月、２カ月、１カ月、またはそれ以下の後に得られる。
【０３８７】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物の量は、個体におけるがんの再発または疾患の進行を防ぐのに有効である。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫（例えば、再発性または難治性多発性骨髄腫）に罹患している個体における再発または疾患の進行を防ぐ方法であって、個体に、（１）（ａ）ＢＣＭＡの第１のエピトープに特異的に結合する第１のＢＣＭＡ結合部分（第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）、及びＢＣＭＡの第２のエピトープに特異的に結合する第２のＢＣＭＡ結合部分（第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）（第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる）と、（２）薬学的に許容される担体と、を含む有効量の薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、再発または疾患の進行を、少なくとも約６カ月、１年、２年、３年、４年、５年、またはそれ以上の間防ぐ。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物の量は、個体における生存（無病生存等）を延長するのに有効である。いくつかの実施形態では、生存は、少なくとも約２、３、４、５、６、１２、または２４カ月の間延長される。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫（例えば、再発性または難治性多発性骨髄腫）に罹患している個体の生存期間を延長する方法であって、個体に、（１）（ａ）ＢＣＭＡの第１のエピトープに特異的に結合する第１のＢＣＭＡ結合部分（第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）、及びＢＣＭＡの第２のエピトープに特異的に結合する第２のＢＣＭＡ結合部分（第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）（第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる）と、（２）薬学的に許容される担体と、を含む有効量の薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、個体における生活の質を改善するのに有効である。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫（例えば、再発性または難治性多発性骨髄腫）に罹患している個体の生活の質を改善する方法であって、個体に、（１）（ａ）ＢＣＭＡの第１のエピトープに特異的に結合する第１のＢＣＭＡ結合部分（第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）、及びＢＣＭＡの第２のエピトープに特異的に結合する第２のＢＣＭＡ結合部分（第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）（第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる）と、（２）薬学的に許容される担体と、を含む有効量の薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物の量は、固体腫瘍またはリンパ系腫瘍の成長を阻害するか、またはそのサイズを低減するのに有効である。いくつかの実施形態では、固体腫瘍またはリンパ系腫瘍のサイズは、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちのいずれかを含む）低減される。いくつかの実施形態では、個体における固体腫瘍またはリンパ系腫瘍の成長を阻害するか、またはそのサイズを低減する方法が、提供される。
【０３９１】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物の量は、個体における腫瘍転移を阻害するのに有効である。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちのいずれかを含む）の転移が阻害される。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫（例えば、再発性または難治性多発性骨髄腫）に罹患している個体の腫瘍転移を阻害する方法であって、個体に、（１）（ａ）ＢＣＭＡの第１のエピトープに特異的に結合する第１のＢＣＭＡ結合部分（第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）、及びＢＣＭＡの第２のエピトープに特異的に結合する第２のＢＣＭＡ結合部分（第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ等）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む多価ＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）（第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる）と、（２）薬学的に許容される担体と、を含む有効量の薬学的組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、リンパ節への転移を阻害する方法が提供される。いくつかの実施形態では、肺への転移を阻害する方法が提供される。いくつかの実施形態では、肝臓への転移を阻害する方法が提供される。転移は、当該技術分野における任意の既知の方法、例えば、血液試験、骨スキャン、Ｘ線スキャン、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、及び生検によって評価され得る。
【０３９２】
ＶＩＩ．キット及び製品
本明細書に記載の単一ドメイン抗体、キメラ抗原受容体、または操作された免疫エフェ
クター細胞のうちのいずれかを含むキット、単位投薬量、及び製品がさらに提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物のうちのいずれか１つを含むキットが提供され、好ましくは、その使用に関する指示を提供する。
【０３９３】
本出願のキットは、好適なパッケージング内に存在する。好適なパッケージングとしては、バイアル、ボトル、瓶、可撓性パッケージング（例えば、密封マイラーまたはプラスチック袋）等が挙げられるが、これらに限定されない。キットは、任意に、緩衝液及び解釈情報等の追加の成分を提供し得る。したがって、本出願は、バイアル（密封バイアル等）、ボトル、瓶、可撓性パッケージング等を含む製品も提供する。
【０３９４】
製品は、容器及び容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書を含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成され得る。一般に、容器は、本明細書に記載の疾患または障害（がん等）の治療に有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈用溶液袋またはバイアルである）。ラベルまたは添付文書は、組成物が個体における特定の状態の治療のために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、個体への組成物の投与に関する指示をさらに含む。ラベルは、再構成及び／または使用に関する指示を示し得る。薬学的組成物を保持する容器は、再構成された製剤の繰り返し投与（例えば、２〜６回の投与）を可能にする複数回使用バイアルであり得る。添付文書とは、かかる治療薬の適応症、使用、投薬量、投与、禁忌、及び／またはその使用に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業用パッケージに通例含まれる指示を指す。さらに、製品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第２の容器をさらに含み得る。製品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０３９５】
キットまたは製品は、薬局、例えば、病院薬局及び配合薬局での保管及び使用に十分な量でパッケージングされる、薬学的組成物の複数の単位用量及び使用に関する指示を含み得る。
【０３９６】
以下の実施例及び例示的な実施形態は、単に本発明の例示となるよう意図されており、それ故に、決して本発明を限定するものと見なされるべきではない。以下の実施例及び例示的な実施形態は、限定するものではなく、例証として提供されている。
【０３９７】
ＶＩＩＩ．例示的な実施形態
本発明は、以下の実施形態を提供する：
【０３９８】
実施形態１．以下：（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（５）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（６）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（
８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１０）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１１）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１２）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１３）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１４）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１５）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１６）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１７）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１８）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（１９）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２０）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２１）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２２）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２３）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２４）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２５）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２６）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２７）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２８）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（２９）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３０）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３１）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３２）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３３）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３４）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３５）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（３６）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１２のアミノ酸配
列を含むＣＤＲ３、（３７）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または（３８）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、のうちのいずれか１つを含む、抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）。
【０３９９】
実施形態２．抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが、配列番号１１５〜１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ。
【０４００】
実施形態３．実施形態１または２に記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂと競合する、抗ＢＣＭＡ抗体。
【０４０１】
実施形態４．抗ＢＣＭＡ抗体が、ｓｄＡｂである、実施形態３に記載の抗ＢＣＭＡ抗体。
【０４０２】
実施形態５．抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが、ラクダ科抗体である、実施形態１、２、及び４のいずれか１つに記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ。
【０４０３】
実施形態６．抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが、キメラ抗体である、実施形態１、２、及び４のいずれか１つに記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ。
【０４０４】
実施形態７．抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが、ヒト化である、実施形態１、２、及び４のいずれか１つに記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ。
【０４０５】
実施形態８．抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂが、ＶＨＨフラグメントである、実施形態１〜２及び４〜７のいずれか１つに記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂ。
【０４０６】
実施形態９．（ａ）実施形態１〜２及び４〜７のいずれか１つに記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【０４０７】
実施形態１０．細胞外抗原結合ドメインが、少なくとも２つの抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む、実施形態９に記載のＣＡＲ。
【０４０８】
実施形態１１．（ａ）少なくとも２つのＢＣＭＡ結合部分を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むポリペプチドを含む、多価キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【０４０９】
実施形態１２．細胞外抗原結合ドメインが、第１のＢＣＭＡ結合部分及び第２のＢＣＭＡ結合部分を含む、実施形態１１に記載の多価ＣＡＲ。
【０４１０】
実施形態１３．第１のＢＣＭＡ結合部分及び第２のＢＣＭＡ結合部分のうちの１つ以上が、ｓｄＡｂである、実施形態１２に記載の多価ＣＡＲ。
【０４１１】
実施形態１４．第１のＢＣＭＡ結合部分が、第１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂであり、第２のＢＣＭＡ結合部分が、第２の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂである、実施形態１２または１３に記載の多価ＣＡＲ。
【０４１２】
実施形態１５．第１のＢＣＭＡ結合部分が、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂであり、第２のＢＣＭＡ結合部分が、ヒト抗体に由来する、実施形態１２または１３に記載の多価ＣＡＲ。
【０４１３】
実施形態１６．第１のＢＣＭＡ結合部分が、抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂであり、第２のＢＣＭＡ結合部分が、ＢＣＭＡのポリペプチドリガンドである、実施形態１２または１３に記載の多価ＣＡＲ。
【０４１４】
実施形態１７．第１のＢＣＭＡ結合部分及び第２のＢＣＭＡ結合部分が、ＢＣＭＡ上の同じエピトープに特異的に結合する、実施形態１２〜１６のいずれか１つに記載の多価ＣＡＲ。
【０４１５】
実施形態１８．第１のＢＣＭＡ結合部分及び第２のＢＣＭＡ結合部分が、ＢＣＭＡ上の異なるエピトープに特異的に結合する、実施形態１２〜１６のいずれか１つに記載の多価ＣＡＲ。
【０４１６】
実施形態１９．第１のＢＣＭＡ結合部分及び／または第２のＢＣＭＡ結合部分が、配列番号３８８〜３９４から選択されるアミノ酸配列に由来するＢＣＭＡ上のエピトープに特異的に結合する、実施形態１２〜１８のいずれか１つに記載の多価ＣＡＲ。
【０４１７】
実施形態２０．第１のＢＣＭＡ結合部分及び第２のＢＣＭＡ結合部分のうちの１つ以上が、実施形態１の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂである、実施形態１２〜１９のいずれか１つに記載の多価ＣＡＲ。
【０４１８】
実施形態２１．第１のＢＣＭＡ結合部分が、第２のＢＣＭＡ結合部分のＮ末端に位置している、実施形態１２〜２０のいずれか１つに記載の多価ＣＡＲ。
【０４１９】
実施形態２２．第１のＢＣＭＡ結合部分が、第２のＢＣＭＡ結合部分のＣ末端に位置している、実施形態１２〜２０のいずれか１つに記載の多価ＣＡＲ。
【０４２０】
実施形態２３．第１のＢＣＭＡ結合部分及び第２のＢＣＭＡ結合部分が、ペプチドリンカーを介して互いに融合される、実施形態１２〜２２のいずれか１つに記載の多価ＣＡＲ。
【０４２１】
実施形態２４．ペプチドリンカーが、約５０以下のアミノ酸長である、実施形態２３に記載の多価ＣＡＲ。
【０４２２】
実施形態２５．ペプチドリンカーが、配列番号２０８〜２１５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２４に記載の多価ＣＡＲ。
【０４２３】
実施形態２６．膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１から成る群から選択される分子に由来する、実施形態９〜２５のいずれか１つに記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４２４】
実施形態２７．膜貫通ドメインが、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来する、実施形態２６に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４２５】
実施形態２８．膜貫通ドメインが、配列番号１９３または１９４のアミノ酸配列を含む、実施形態２７に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４２６】
実施形態２９．細胞内シグナル伝達ドメインが、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態９〜２８のいずれか１つに記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４２７】
実施形態３０．一次細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζに由来する、実施形態２９に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４２８】
実施形態３１．一次細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１９７または１９８のアミノ酸配列を含む、実施形態３０に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４２９】
実施形態３２．細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインを含む、実施形態９〜３１のいずれか１つに記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４３０】
実施形態３３．共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される共刺激分子に由来する、実施形態３２に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４３１】
実施形態３４．共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８の細胞質ドメイン及び／またはＣＤ１３７の細胞質ドメインを含む、実施形態３３に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４３２】
実施形態３５．共刺激シグナル伝達ドメインが、配列番号１９５及び／または配列番号１９６のアミノ酸配列を含む、実施形態３４に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４３３】
実施形態３６．細胞内シグナル伝達ドメインが、少なくとも２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む、実施形態３２〜３５のいずれか１つに記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４３４】
実施形態３７．細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインをさらに含む、実施形態９〜３６のいずれか１つに記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４３５】
実施形態３８．ヒンジドメインが、ＣＤ８αに由来する、実施形態３７に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４３６】
実施形態３９．ヒンジドメインが、配列番号１９２のアミノ酸配列を含む、実施形態３８に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４３７】
実施形態４０．ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチドをさらに含む、実施形態９〜３９のいずれか１つに記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４３８】
実施形態４１．シグナルペプチドが、ＣＤ８αに由来する、実施形態４０に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４３９】
実施形態４２．シグナルペプチドが、配列番号１９１のアミノ酸配列を含む、実施形態４１に記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ。
【０４４０】
実施形態４３．配列番号２１６〜２５６及び２９８〜３３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体。
【０４４１】
実施形態４４．実施形態１１〜４３のいずれか１つに記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲをコードする核酸配列を含む、単離された核酸。
【０４４２】
実施形態４５．配列番号２５７〜２９７及び３３６〜３７３から成る群から選択される核酸配列を含む、請求項４４に記載の単離された核酸。
【０４４３】
実施形態４６．第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列をさらに含み、ＣＡＲをコードする核酸配列が、自己開裂ペプチドをコードする第３の核酸配列を介して、第２の核酸配列に操作可能に連結される、実施形態４５に記載の単離された核酸。
【０４４４】
実施形態４７．自己開裂ペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、及びＦ２Ａから成る群から選択される、実施形態４６に記載の単離された核酸。
【０４４５】
実施形態４８．第３の核酸配列が、配列番号３８５である、実施形態４７に記載の単離された核酸。
【０４４６】
実施形態４９．単離された核酸が、ＲＮＡ分子である、実施形態４４〜４８のいずれか１つに記載の単離された核酸。
【０４４７】
実施形態５０．実施形態４４〜４９のいずれか１つに記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【０４４８】
実施形態５１．ベクターが、発現ベクターである、実施形態５０に記載のベクター。
【０４４９】
実施形態５２．ベクターが、ウイルスベクターである、実施形態５０または５１に記載のベクター。
【０４５０】
実施形態５３．ベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態５２に記載のベクター。
【０４５１】
実施形態５４．ベクターが、非ウイルスベクターである、実施形態５０または５１に記載のベクター。
【０４５２】
実施形態５５．実施形態９〜４３のいずれか１つに記載のＣＡＲまたは多価ＣＡＲ、実施形態４４〜４９のいずれか１つに記載の単離された核酸、または実施形態５０〜５４のいずれか１つに記載のベクターを含む、操作された免疫エフェクター細胞。
【０４５３】
実施形態５６．免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚幹細胞である、実施形態５５に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【０４５４】
実施形態５７．免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞である、実施形態５６に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【０４５５】
実施形態５８．実施形態５５〜５７のいずれか１つに記載の操作された免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【０４５６】
実施形態５９．個体におけるがんを治療する方法であって、個体に、有効量の実施形態５８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
【０４５７】
実施形態６０．がんが、多発性骨髄腫である、実施形態５９に記載の方法。
【０４５８】
実施形態６１．がんが、難治性または再発性多発性骨髄腫である、実施形態６０に記載
の方法。
【０４５９】
実施形態６２．操作された免疫エフェクター細胞が、自己由来である、実施形態５９〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【０４６０】
実施形態６３．操作された免疫エフェクター細胞が、同種異系である、実施形態５９〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【０４６１】
実施形態６４．個体が、ヒトである、実施形態５９〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０４６２】
実施形態６５．薬学的組成物が、静脈内に投与される、実施形態５９〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０４６３】
実施形態６６．薬学的組成物が、約１×１０５〜約１×１０７個の細胞／ｋｇの用量で投与される、実施形態５９〜６５のいずれか１つに記載の方法。
【０４６４】
実施形態６７．薬学的組成物が、約１週間にわたって３回の分割用量で投与される、実施形態５９〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【０４６５】
実施形態６８．個体におけるがんを治療するための実施形態５８に記載の薬学的組成物の使用。
【０４６６】
実施形態６９．個体におけるがんを治療するための薬剤の調製時に実施形態５８に記載の薬学的組成物の使用。
【０４６７】
実施形態７０．実施形態１〜８のいずれか１つに記載の抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂを含む、薬学的組成物。
【０４６８】
実施形態７１．個体における疾患を治療する方法であって、個体に、有効量の実施形態７０の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
【０４６９】
実施形態７２．疾患が、がんである、実施形態７１に記載の方法。
【実施例】
【０４７０】
以下に論じられる実施例は、単に本発明の例示となるよう意図されており、決して本発明を限定するものと見なされるべきではない。実施例は、以下の実験が行われる全ての実験または唯一の実験であることを表すようには意図されていない。使用される数（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保するよう努力されているが、いくつかの実験誤差及び偏差が計上されるべきである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。
【０４７１】
実施例１．抗ＢＣＭＡ  ｓｄＡｂの調製
ＢＣＭＡに対して高結合親和性を有するｓｄＡｂを開発するために、ラマを組換えＢＣＭＡ抗原で免疫化した。次いで、ファージディスプレイライブラリを構築して、ＶＨＨリードを特定した。はっきりと異なるクローンをランダムに選び、抗原結合において重要な役割を果たし得る領域である重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）に従って分類した。例示的なプロトコルが、以下に記載されている。ｓｄＡｂを調製するための他のプロトコルが、記載されている。例えば、Ｅｌｓ  Ｐａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌ，２０１４；９（３）：６７４を参照されたい。
【０４７２】
１．動物免疫化及び免疫応答アッセイ
１．１動物免疫化
Ｃ末端のＦｃタグを有する組換えヒトＢＣＭＡタンパク質を含む免疫原（ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＣ７−Ｈ５２５４）を、アジュバントまたはＰＢＳと混合し、ラマに注入した。動物を、サービスベンダー（Ｃｅｄａｒｌｉｎｅ）によって、典型的には、２００μｇの免疫原及びＣＦＡ（完全フロインドアジュバント）で、毎回約１週間〜２週間間隔で７回免疫化した。末梢血試料を、免疫化前段階で、５回目及び７回目の免疫化後に収集した。複数回の免疫化後、標的抗原に対するラマの免疫反応を評価して、抗原特異的ｓｄＡｂの力価を確認した。リンパ球を、約１００ｍＬの末梢血から勾配遠心分離によって単離した。細胞にＲＮＡＬＡＴＥＲ（商標）を補充し、−８０℃で保管した。血清を、抗凝固血液試料の遠心分離によって得て、−８０℃で保管した。
【０４７３】
１．２  ＩｇＧ分画
ＩｇＧサブクラス分画を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの標準操作手順に従って行った。ＩｇＧサブクラスを、タンパク質Ｇ及びタンパク質Ａ樹脂を使用して最終出血血清から分画した。１ｍＬの血清試料を１ｍＬのＨＩＴＲＡＰ（登録商標）タンパク質Ｇ  ＨＰカラムに装填し、カラムを１０ｍＬのリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で洗浄した。ＩｇＧ３（分子量１００，０００Ｄａ）画分を０．１５ＭのＮａＣｌ、０．５８％酢酸（ｐＨ３．５）で溶出し、溶出液を１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でｐＨ７．４に中和した。その後、ＩｇＧ１（分子量１７０，０００Ｄａ）画分を０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）で溶出し、溶出液を１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）でｐＨ７．４に中和した。その後、ＨＩＴＲＡＰ（登録商標）タンパク質Ｇ  ＨＰカラムの貫流液を１ｍＬのＨＩＴＲＡＰ（登録商標）タンパク質Ａ  ＨＰカラムに充填し、カラムを２０ｍＬのリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で洗浄した。ＩｇＧ２（分子量１００，０００Ｄａ）画分を０．１５ＭのＮａＣｌ、０．５８％酢酸（ｐＨ４．５）で溶出し、溶出液を１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でｐＨ７．４に中和した。精製されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３抗体の濃度をＯＤ２８０によって決定し、各々の純度を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の両方によって評定した。
【０４７４】
１．３  免疫応答アッセイ
ラマの免疫応答をＥＬＩＳＡによって評価し、血清試料及び精製されたＩｇＧを固定化免疫原への結合についてアッセイした。免疫化前、５回目の免疫化後、及び最終出血時に収集した血清を評価した。抗原（すなわち、組換えヒト抗原タンパク質）をコーティング緩衝液中に４μｇ／ｍＬで希釈した。マイクロタイタープレートを希釈抗原で、４℃で一晩コーティングした。その後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、続いて、室温で２時間遮断した。その後、プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。一連の希釈血清またはＩｇＧをプレートに添加し、室温で１．５時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲート抗ラマＩｇＧ二次抗体をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、１０分間インキュベートした後、１ＭのＨＣｌで停止した。結合を定量するために、４５０ｎｍでの吸光度を、ＭＫ３分光計を使用して各ウェルについて測定した。
【０４７５】
２．ＶＨＨファージディスプレイライブラリの構築
２．１  ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬を使用して単離されたリンパ球（１．１．１）から抽出した。全ＲＮＡの量及び質をゲル電気泳動によって評定し、ＯＤ２６０／２８０で吸光度を測定することによって定量した。
【０４７６】
２．２  ＲＴ−ＰＣＲ及びＶＨＨ増幅
全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＰＲＩＭＥＳＣＲＩＰＴ（商標）第一鎖ｃＤＮＡ合成キットを使用して、オリゴ（ｄＴ）２０プライマーでｃＤＮＡに逆転写した。６つの順方向特異的縮重プライマー及び２つの逆方向特異的縮重プライマーを、２つのＢｇｌＩ制限部位が導入されたＶＨＨフラグメントを増幅するように設計した。ＶＨＨフラグメントを、以下に記載のＧｅｎＳｃｒｉｐｔの標準操作手順に従って増幅した。
【０４７７】
重鎖免疫グロブリンの可変領域（すなわち、ＶＨＨ）を、二段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅した。第１のＰＣＲにおいて、１００ｎｇのｃＤＮＡ鋳型をプライマーＣＡＬＬ００１（配列番号３７４）及びＣＡＬＬ００２（配列番号３７５）と混合した。第１のＰＣＲ反応由来のＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。ゲル精製後、第１のＰＣＲのＤＮＡ産物を第２のＰＣＲにおける鋳型として使用した。第２のＰＣＲを、プライマーＢＡＣＫ−１（配列番号３７６）、ＢＡＣＫ−２（配列番号３７７）、及びＰＭＣＦ（配列番号３７８）で行った。ＶＨＨ  ＰＣＲフラグメントを含有する増幅された第２のＰＣＲ産物をゲル精製し、酵素消化し、その後、ファージミドプラスミドに挿入した。ＶＨＨ遺伝子フラグメントを有する組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ細胞に電気移動させて、ファージディスプレイＶＨＨ免疫ライブラリを生成した。
【０４７８】
ＰＣＲ反応の手順は、９４℃で７分間の初期変性ステップ、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間の３０サイクル、その後、７２℃で７分間の最終伸長ステップを有する。
【０４７９】
２．３  ファージライブラリの構築
ＶＨＨ  ＰＣＲ産物を、異なるプライマー対を使用して増幅によって得た。その後、ＰＣＲ産物をＢｇｌＩで消化し、ゲル精製した。ゲル精製されたフラグメントをＧｅｎＳｃｒｉｐｔの社内ファージミドベクターに挿入した。パイロットライブラリを、ライゲーション及び変換条件を最適化するように構築した。最適化されたライゲーション及び変換条件を用いて、ファージミドライブラリを開発した。形質転換細胞のほんの一部を希釈し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した２×ＹＴプレートに画線した。コロニーを計数して、ライブラリサイズを計算した。陽性クローンをランダムに選択し、配列決定して、ライブラリの質を評定した。形質転換細胞の残りを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び２％グルコースを補充したＹＴプレート上に画線した。コロニーのローンをプレートから擦り取った。ほんの一定分量の細胞をライブラリプラスミド単離に使用した。残りにグリセロールを補充し、ストックとして−８０℃で保管した。
【０４８０】
３．ファージディスプレイパニング
３．１バイオパニング
構築されたＶＨＨファージライブラリを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって開発された標準手順を使用して、それぞれ、組換えヒトＢＣＭＡタンパク質及びヒトＢＣＭＡを発現するＣＨＯ細胞（すなわち、Ｌｅｇｅｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃによって社内で調製されたＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞）に対してパニングした。ライブラリストックを対数期まで成長させ、その後、ライブラリをＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージでレスキューし、振盪機内で、２５℃で一晩増幅した。その後、ファージをＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させ、ＰＢＳ中に再懸濁し、−８０℃で保管した。固相パニングの場合、マイクロプレートウェルにＰＢＳ中の組換えヒトＢＣＭＡタンパク質を４℃で一晩コーティングした。液体相パニングの場合、ＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞をブロッキング緩衝液で、室温で１時間遮断した。コーティングまたはブロッキングステップ中、ファージ粒子をマイクロプレートウェル内でブロッキング緩衝液及びＦｃ対照タンパク質とプレインキュベートした。プレインキュベートした後、ファージ粒子を、それぞれ、ＢＣＭＡタンパク質またはＣＨＯ−ＢＣＭＡ溶液をコーティングしたウェルに添加し、１時間インキュベートした。インキュベートした後、結合していない
ファージ及び非特異的に結合したファージを、ウェルをすすぐことによって洗い流すか、またはＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞をＰＢＳＴで６回洗浄し、ＰＢＳでさらに２回洗浄した。結合したファージ粒子を１００ｍＭのトリエチルアミン（ＴＥＡ）によって溶出し、溶出液を１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）によって中和した。その後、溶出液の半分を使用して、出力滴定のために指数関数的成長するＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞（ＯＤ６００＝０．４〜０．６）を感染させた。
【０４８１】
３．２  ファージＥＬＩＳＡ
ファージＥＬＩＳＡを行って、標的抗原に特異的なクローンを特定した。個々の出力ファージクローンを、９６ウェルプレートで成長させ、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージによって一晩レスキューした。抗原タンパク質に結合するクローンを特定するために、９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに、それぞれ、コーティング緩衝液中の組換えヒトＢＣＭＡタンパク質及びＦｃ対照タンパク質を４℃で一晩コーティングし、その後、プレートをブロッキング緩衝液でブロックした。ブロックした後、一晩細胞培養由来のおよそ５０μＬ／ウェルのファージ上清をプレートに添加し、４℃で１．５時間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３モノクローナル抗体をプレートに添加し、４℃で４５分間インキュベートした。プレートを再度５回洗浄し、基質溶液をウェルに添加して発色させた。４５０ｎｍでの吸光を各ウェルについて測定した。
【０４８２】
ＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞に結合するクローンを特定するために、ＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞をブロッキング緩衝液で、室温で１時間ブロックした。ブロックした後、一晩細胞培養からのおよそ２０μＬ／ウェルのファージ上清を細胞溶液に添加し、室温で１時間インキュベートした。細胞を４回洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３モノクローナル抗体を添加し、室温で３０分間インキュベートした。細胞を５回洗浄し、その後、基質溶液を添加して発色させた。吸光を４５０ｎｍで測定した。パニング後、ＥＬＩＳＡ陽性ファージクローンをランダムに選択し、プラスミド抽出キットを使用してＤＮＡを出力ファージから調製した。プラスミドへの抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨを配列決定した。
【０４８３】
実施例２．例示的な一価ＢＣＭＡキメラ抗原受容体の調製
Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞質ドメイン、ＣＤ１３７細胞質ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質ドメインを含むＣＡＲ骨格ポリペプチドをコードする核酸配列を化学的に合成し、構成的ｈＥＦ１αプロモーターの下流に、及びそれに操作可能に連結された事前修飾レンチウイルスベクターにクローニングした。結果として生じたＣＡＲ骨格ベクターを「ＰＬＬＶ−ｈＥＦ１α−８２８１３７３」と命名した。ベクター内の多クローニング部位（ＭＣＳ）は、ＶＨＨフラグメントのＮ末端に融合されたＣＤ８αシグナルペプチドをコードする核酸配列に操作可能に連結されたＫｏｚａｋ配列（配列番号３７９）を含む核酸配列の、ＣＡＲ骨格配列の上流にかつそれに操作可能に連結されたＰＬＬＶ−ｈＥＦ１α−８２８１３７３ベクターへの挿入を可能にした。
【０４８４】
ＰＬＬＶ−ｈＥＦ１α−８２８１３７３骨格を使用して単一ＶＨＨドメインを有する単一特異性ＣＡＲを構築するために、ＶＨＨドメインをコードする核酸配列を、ＣＤ８αシグナルペプチドをコードする核酸配列の３’に操作可能に連結した。融合核酸配列を化学的に合成し、当該技術分野で既知の分子クローニング技法により、ＥｃｏＲＩ（配列番号３８０：５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’）及びＳｐｅＩ（配列番号３８１：５’−ＡＣＴＡＧＴ−３’）制限部位を介してＰＬＬＶ−ｈＥＦ１α−８２８１３７３  ＣＡＲ骨格にクローニングした。表４は、例示的な単一特異性の一価抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように構築されたベクターを列記する。
【０４８５】
単一特異性ＣＡＲ構築物を設計する際に、第２のＶＨＨをコードするヌクレオチド等の追加配列のさらなる挿入を容易にするために、ＨｐａＩ（配列番号３８２：５’−ＧＴＴＡＡＣ−３’）、ＭｌｕＩ（配列番号３８３：５’−ＡＣＧＣＧＴ−３’）、ＮｓｉＩ（配列番号３８４：５’−ＡＴＧＣＡＴ−３’）部位を含む制限部位を、ＣＤ８αシグナルペプチド核酸配列とＶＨＨ核酸配列との間に含めた。
【０４８６】
ｐＣＭＶ−ΔＲ−８．７４及びｐＭＤ２．Ｇを含むレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物（Ａｄｄｇｅｎｅ番号１２２５９）を、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）との事前最適化比率でＶＨＨフラグメントを有するベクターＰＬＬＶ−ｈＥＦ１α−８２８１３７３と事前混合し、その後、適切に混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、トランスフェクション混合物をＨＥＫ２９３細胞に滴加し、穏やかに混合した。その後、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２細胞インキュベーター内で一晩インキュベートした。４℃、５００ｇで１０分間遠心分離した後、上清を収集した。
【０４８７】
ウイルス含有上清を、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過し、その後、レンチウイルス濃縮のために超遠心分離した。超遠心分離後、上清を慎重に処分し、ウイルスペレットを予冷ＤＰＢＳで慎重にすすいだ。ウイルスを適切に一定分量に分割し、その直後に−８０℃で保管した。ウイルス力価を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって開発されたＨＴＲＦキットに基づいてｐ２４によって決定した。
【０４８８】
ＰＢＭＣの調製
白血球をアフェレーシスによって健常ドナーから収集し、細胞濃度をＲ１０培地中５×１０６個の細胞／ｍＬに調整した。その後、白血球を０．９％ＮａＣｌ溶液と１：１（ｖ／ｖ）比で混合した。３ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地を１５ｍＬの遠心分離管に添加し、６ｍＬの希釈リンパ球混合物をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地の上部に緩徐に層化した。リンパ球混合物を、制動なしで、２０℃、８００ｇで３０分間遠心分離した。その後、リンパ球バフィーコートを２００μＬのピペットで収集した。収集した画分を０．９％ＮａＣｌまたはＲ１０で少なくとも６倍希釈し、溶液の密度を低減した。その後、収集した画分を、２０℃、２５０ｇで１０分間遠心分離した。上清を完全に吸引し、１０ｍＬのＲ１０を細胞ペレットに添加して、細胞ペレットを再懸濁した。混合物を、２０℃、２５０ｇで１０分間さらに遠心分離した。上清を再度吸引した。１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を有する２ｍＬの３７℃で予温したＲ１０を細胞ペレットに添加し、細胞ペレットを緩やかに再懸濁した。細胞の数をトリパンブルー染色に従って決定し、このＰＢＭＣ試料を後の実験に準備させた。
【０４８９】
Ｔ細胞の精製
ヒトＴ細胞を、以下に記載の製造業者のプロトコルに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｐａｎ
Ｔ細胞単離キット（カタログ番号１３０−０９６−５３５）を使用してＰＢＭＣから精製した。細胞の数を最初に決定し、細胞懸濁液を３００ｇで１０分間遠心分離した。その後、上清を完全に吸引し、細胞ペレットを４０μＬ／１０７個の全細胞の緩衝液中に再懸濁した。１０μＬ／１０７個の全細胞のＰａｎ  Ｔ細胞ビオチン−抗体カクテルを添加し、完全に混合し、冷蔵庫（２〜８℃）内で約５分間インキュベートした。その後、３０μＬ／１０７個の細胞の緩衝液を添加した。２０μＬ／１０７個の細胞のＰａｎ  Ｔ細胞マイクロビーズカクテルを添加した。細胞懸濁液混合物を十分に混合し、冷蔵庫（２〜８℃）内でさらに１０分間インキュベートした。磁気分離には最小５００μＬが必要である。磁気分離のために、ＬＳカラムを好適なＭＡＣＳ分離器の磁場に置いた。カラムを３ｍＬの緩衝液ですすぐことによって調製した。その後、細胞懸濁液をカラムに塗布し、非標識細胞を含有する貫流液を収集し、これは、富化Ｔ細胞画分となった。カラムを３ｍＬの緩衝液で洗浄し、通過した非標識細胞を収集することによって、さらなるＴ細胞を収集した。これらの非標識細胞は、この場合もやはり、富化Ｔ細胞となり、これらを先のステップ
からの貫流物と合わせた。その後、プールされた富化Ｔ細胞を遠心分離し、Ｒ１０＋１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２中に再懸濁した。
【０４９０】
その後、調製されたＴ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８  ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子を１：２のビーズ：細胞比で添加した製造業者のプロトコルに従ってヒトＴ細胞活性化／増殖キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ番号１３０−０９１−４４１）で４８〜９６時間事前活性化した。
【０４９１】
インビトロ細胞毒性アッセイ
事前活性化されたＴ細胞を、１２００ｇ、３２℃で１．５時間遠心分離しながら、７μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で、レンチウイルスストックで形質導入した。その後、形質導入された細胞を細胞培養インキュベーターに移して、好適な条件下で導入遺伝子を発現させた。
【０４９２】
形質導入後３日目または７日目に、形質導入されたＴ細胞を収集し、２０：１のエフェクター（ＣＡＲ−Ｔ）：標的細胞比で腫瘍細胞と２０時間共インキュベートした。標的細胞は、ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ、ヒト細胞株Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ細胞（ＢＣＭＡを組換え発現した）、Ｋ５６２．ＣＤ１９．Ｌｕｃ細胞株（ＣＤ１９を組換え発現した）、またはヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ．Ｌｕｃ細胞であった。細胞株の全てを、社内で操作された蛍ルシフェラーゼを発現させたものであった。腫瘍細胞へのＣＡＲ−Ｔの細胞毒性をアッセイするために、ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）発光ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｅ６１１０）を製造業者のプロトコルに従って調製し、共培養細胞に添加して、ウェル内の残りのルシフェラーゼ活性を検出した。ルシフェラーゼが標的細胞でのみ発現するため、ウェル内の残りのルシフェラーゼ活性は、ウェル内の生存標的細胞の数に直接相関する。最大ルシフェラーゼ活性を、培養培地をエフェクター細胞の不在下で標的細胞に添加することによって得た。最小ルシフェラーゼ活性を、細胞毒性アッセイを開始した時点でＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１％の最終濃度で添加することによって決定した。特異的細胞毒性を以下の式によって計算した：特異的細胞毒性％＝１００％＊（１−（ＲＬＵ試料−ＲＬＵ最小）／（ＲＬＵ最大−ＲＬＵ最小））。
【０４９３】
ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）を標的とする例示的な一価ＣＡＲを、細胞毒性アッセイにおいて選択し、試験した。図１Ａに示されるように、試験した一価ＢＣＭＡ  ＣＡＲの第１の基の間で、選択されたクローンは、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞に対して異なるレベルの細胞毒性を呈し、６０％超の一価ＶＨＨに基づくＣＡＲ−Ｔが、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞に対して５０％超の細胞毒性を示した。クローン２６９Ａ３７３４６、２６９Ａ３７３４８、２６９Ａ３７３５３、及び２６９Ａ３７３５５に基づくＣＡＲ−Ｔをさらなる試験のために選択した。具体的には、クローン２６９Ａ３７３４６、２６９Ａ３７３４８、２６７Ａ３７３５３、及び２６９Ａ３７３５５に基づくＣＡＲ−Ｔは、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞に対して強力な細胞毒性を呈し、非形質導入対照Ｔ細胞（ＵｎＴ）と比較してＣＡＲ−Ｔ処置によるＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞死滅が２０％超〜３０％増加した。それにもかかわらず、かかる細胞毒性増加は、ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ．Ｌｕｃ細胞では生じなかった（図１Ｂを参照されたい）。ＵｎＴ対照と比較してこれらの一価ＶＨＨに基づくＣＡＲ−Ｔ細胞によるＵ８７ＭＧ．Ｌｕｃに対するいずれの有意な細胞毒性影響も検出されなかった。上述の観察は、これらのクローンのうちのいくつかが標的特異的であり、ＢＣＭＡ陽性細胞で強力であり得ることを示した。
【０４９４】
例示的な一価ＢＣＭＡ  ＣＡＲの第２の群を、インビトロ細胞毒性について評価した。ＧＳＳ００５（抗ＢＭＣＡ  ｓｃＦｖを含むＣＡＲ）は、陽性対照として役割を果たした。ＧＳＩ０２６（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖを含むＣＡＲ）は、陰性対照として役割
を果たした。図２Ａ〜２Ｂに示されるように、選択されたクローンは、多発性骨髄腫細胞毒性ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ、及びＢＣＭＡを過剰発現する安定な細胞株Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃに対して異なるレベルの細胞毒性を呈した。ＢＣＭＡ陰性細胞株Ｋ５６２．ＣＤ１９．Ｌｕｃ（図２Ｃ）に対していかなるクローンも強力な細胞毒性を示さなかった。これらのクローンの間で、２６９Ｂ００５Ｓ、２６９Ｂ０２８Ｓ、２６９Ｂ０３０Ｓ、２６９Ｂ０５４Ｓ、２６９Ｂ０６０Ｓ、２６９Ｂ０６９Ｓ、２６９Ｂ０９３Ｓ、２６９Ｂ０９４Ｓ、２６９Ｂ１０４Ｓ、２６９Ｂ１０９Ｓ、２６９Ｂ１１０Ｓ、及び２６９Ｂ１２９Ｓに基づくＣＡＲ−Ｔは、細胞毒性データに従って最も強力であった。
【０４９５】
ＩＦＮガンマ放出
加えて、インビトロ共培養アッセイからの上清を収集して、ＣＡＲによって誘導されるサイトカイン放出、例えば、インターフェロンガンマ（すなわち、ＩＦＮγ）放出を評価した。図３に示すように、選択された一価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＢＣＭＡを発現する標的細胞Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃで共培養する際に、高レベルのＩＦＮγを放出した。ＧＳＩ０２６等の非特異的ＣＡＲ−Ｔ、またはＴ細胞（ＵｎＴ）は、共培養物中のＩＦＮγの放出を誘導しなかった。サイトカイン放出データは、インビトロ細胞毒性データと一致する。
【０４９６】
実施例３．例示的な多価ＢＣＭＡキメラ抗原受容体の調製
多価ＶＨＨに基づくＣＡＲを、ペプチドリンカーを介して互いに融合される複数のコピーのＶＨＨ、またはＣＡＲシグナルドメイン骨格ベクターにペプチドリンカーを介して互いに融合される複数の異なるＶＨＨをコードする核酸配列をクローニングすることによって構築することができる。例示的な多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物を、表５に示す。これらの構築物を、グリシン−セリンペプチドリンカーにより２〜３つの抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨを融合し、続いて、この融合配列をＫｏｚａｋ−ＣＤ８αシグナルペプチド核酸配列と組み合わせて直接合成し、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ制限部位を介してＰＬＬＶ−ｈＥＦ１α−８１３７３  ＣＡＲ骨格にクローニングすることによって調製した。一価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物を、対照（例えば、ＧＳＩ５０１１、ＧＳＩ５０１９、及びＧＳＩ５０２０、表４）としての役割を果たすのと同じＰＬＬＶ−ｈＥＦ１α−８１３７３  ＣＡＲ骨格にもクローニングした。
【０４９７】
ＣＡＲ遺伝子を持つレンチウイルスベクターをパッケージングし、実施例２に記載のプロトコルで滴定した。実施例２に記載のプロトコルを使用して、ヒトＰＢＭＣを志願者の末梢血から調製し、ＭｉｌｔｅｎｙｉヒトＰａｎ  Ｔ細胞単離キットを使用して初代ヒトＴ細胞をさらに単離した。精製されたＴ細胞を事前活性化し、実施例２に記載のＭｉｌｔｅｎｙｉ抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズを使用して増殖させた。その後、事前活性化されたＴ細胞を、１２００ｇ、３２℃で１．５時間の遠心分離により、７μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で、レンチウイルスストックで形質導入した。その後、形質導入された細胞を細胞培養インキュベーターに移して、好適な条件下で導入遺伝子を発現させた。
【０４９８】
インビトロ細胞毒性アッセイ
形質導入後３日目に、形質導入されたＴ細胞を収集し、腫瘍細胞と共インキュベートした。腫瘍細胞へのＣＡＲ−Ｔの細胞毒性をアッセイするために、ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）発光ルシフェラーゼアッセイ試薬を共培養細胞に添加し、各ＣＡＲ−Ｔの特異的細胞毒性を実施例２に記載されるように測定した。
【０４９９】
第１の実験において、Ｔ細胞を発現する一価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（ＧＳＩ５０１１）、二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（ＧＳＩ５０１４）、及び三価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（ＧＳＩ５０１５）を、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞と２０：１のエフェクター対標的比で２０時間共培養した。３つのＣＡＲ構築物は全て、クローン２６９Ａ３７３４６の抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨド
メインを含む。図４Ａに示されるように、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞の特異的溶解の割合は、非形質導入対照Ｔ細胞（ＵｎＴ）での０．０５％±２．３３％と比較して、ＧＳＩ５０１１を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では６３．２５±２．６４％であり、ＧＳＩ５０１４を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では６１．０４±２．７５％であり、ＧＳＩ５０１５を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では５９．５７±２．６４％であった。異なる抗原結合様式を有する試験したＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ＢＣＭＡ陽性細胞に対して強力な抗腫瘍活性を有した。
【０５００】
第２の実験において、２つの異なるＢＣＭＡ結合部分２６９Ａ３７３５３及び２６９Ａ３７９１７を有する例示的な二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（ＧＳＩ５０２１−ＧＳＩ５０２６）を試験した。各二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞と２０：１のエフェクター対標的比で２０時間共培養した。一価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、ＧＳＩ５０１９及びＧＳＩ５０２０もまた、比較のために試験した。図４Ｂに示されるように、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞の特異的溶解の割合は、非形質導入対照Ｔ細胞（ＵｎＴ）での１３．４９％±１．７５％と比較して、それぞれ、ＧＳＩ５０１９を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では８８．２１±１．２９％であり、ＧＳＩ５０２０を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では９３．８４±１．１３％であり、ＧＳＩ５０２１を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では７１．４５±１．７９％であり、ＧＳＩ５０２２を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では９９．８０±０．４５％であり、ＧＳＩ５０２３を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では９７．４６±０．５０％であり、ＧＳＩ５０２４を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では８１．２９±１．２７％であり、ＧＳＩ５０２５を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では９３．５０±０．４７％であり、ＧＳＩ５０２６を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では８７．８３±０．２３％であった。また、図４Ｃに示されるように、ＢＣＭＡ陰性細胞株Ｕ８７ＭＧ．Ｌｕｃの特異的溶解の割合は、非形質導入対照Ｔ細胞（ＵｎＴ）での１２．４９％±３．７９％と比較して、ＧＳＩ５０１９を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では２．８４±７．４１％であり、ＧＳＩ５０２０を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では１５．５０±２．２４％であり、ＧＳＩ５０２１を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では６．７４±３．３７％であり、ＧＳＩ５０２２を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では８．０３±２．３６％であり、ＧＳＩ５０２３を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では９．００±１．８８％であり、ＧＳＩ５０２４を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では１７．０３±２．２７％であり、ＧＳＩ５０２５を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では１６．８１±１．９８％であり、ＧＳＩ５０２６を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では−１１．５５±５．４３％であった。データは、異なる抗原結合様式を有する二価ＣＡＲが、ＢＣＭＡ陽性細胞に対して強力な抗腫瘍活性を有したが、ＢＣＭＡ陰性細胞に対しては強力な抗腫瘍活性を有しなかったことを示唆する。
【０５０１】
第３の実験において、２つの異なるＢＣＭＡ結合部分を有する例示的な二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（すなわち、ＢＣＡＲ００１〜ＢＣＡＲ００８）を構築し、二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現する操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞を、Ｒ／Ｒ  ＭＭ患者ドナー＃１３から得られた初代Ｔ細胞から調製した。ＲＰＭＩ８２２６（ヒト多発性骨髄腫細胞株）、Ａ５４９（ヒト肺癌細胞株）、Ｕ８７−ＭＧ（ヒト膠芽腫細胞株）、及びＲａｊｉ（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）を含む、社内で開発された蛍ルシフェラーゼを発現する細胞株を、標的細胞として使用し、並んで形質導入したＴ細胞の各群（２０：１または５：１のエフェクター：標的細胞比）と３７℃／５％  ＣＯ２細胞インキュベーター内で２０時間共培養した。共培養の完了時に、残存するルシフェラーゼ活性（相対発光量、ＲＬＵ）を、各ＣＡＲ−Ｔの細胞毒性を評価するために、ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）発光ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）でアッセイした。図５Ａ〜５Ｅに示されるように、二価ＢＣＭＡ
ＣＡＲ−Ｔは、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ、Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ、及びＲａｊｉ．Ｌｕｃ細胞に対して用量依存性細胞毒性を有したが、ＢＣＭＡ陰性Ａ５４９．Ｌｕｃ及びＵ８７−ＭＧ．Ｌｕｃ細胞に対してはほとんど細胞毒性を有しなかった。図５Ｆ中のデータでは、腫瘍細胞に対する二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性は、このＣＡＲ−Ｔ細胞がＣＤ３８＋／ＢＣＭＡ−であったＫ５６２．Ｃ３８．Ｌｕｃ細胞に対して細胞
毒性を有しなかったため、ＢＣＭＡ特異的であることを示す。ＢＣＡＲ００１〜ＢＣＡＲ００８のＣＡＲ−Ｔ細胞で処理したＫ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃのみが、残存するルシフェラーゼ活性（すなわち、生存細胞）を示した（１００±３．９５％のＵｎＴと比較して、ＢＣＡＲ００１〜ＢＣＡＲ００８に対して、それぞれ、２．８８±０．４５％、１２．８４±１．６７％、２．２２±０．５６％、１．７７±０．１４％、２．５９±０．２８％、６．５８±１．１９％、２．４７±０．２０％、６．６１±１．４７％、平均±標準誤差）。これらの結果は、Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ細胞に対する二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の強力な細胞毒性を示す。ＢＣＡＲ００１〜ＢＣＡＲ００８のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＵｎＴで処理した標的細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性の有意な減少が検出されなかったため、Ｋ５６２．ＣＤ３８．Ｌｕｃ細胞に対して有意な細胞毒性を有しなかった（１００±６．５８％のＵｎＴと比較して、ＢＣＡＲ００１〜ＢＣＡＲ００８に対して、それぞれ、１１１．８２±５．１１％、１１１．７２±３．４３％、１０４．７４±０．２４％、９５．０４±２．７０％、９３．９３±７．２３％、９７．７２±１．８６％、１１１．９０±２．０１％、１０８．３３±４．０５％、平均±標準誤差）。これらのデータは、二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔの細胞毒性がＢＣＭＡ依存性であることを示唆した。
【０５０２】
ＩＦＮガンマ放出
加えて、インビトロ共培養アッセイからの上清を収集して、ＣＡＲによって誘導されるサイトカイン放出、例えば、インターフェロンガンマ（すなわち、ＩＦＮγ）放出を評価した。図６Ａ〜６Ｂに示されるように、共培養アッセイにおけるＩＦＮγ放出は、ＣＡＲ依存性及びＢＣＭＡ特異的であり、これは、インビトロ細胞毒性データと一致する（表６）。
【表６】
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【０５０３】
組み込まれたＣＡＲ遺伝子のコピー数
各形質導入されたＴ細胞群のＣＡＲ遺伝子のコピー数を半定量ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）アッセイによって決定した。簡潔には、ＣＡＲ−Ｔの各群からのゲノムＤＮＡをＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ細胞キット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製した。ゲノムＤＮＡの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐによって決定し、１０ｎｇのゲノムＤＮＡ試料を、ＣＡＲ特異的プライマー（順方向プライマー１３７Ｐ２Ｆ、配列番号３９８：５’−ＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴ−３’、及び逆方向プライマー１３７Ｐ２Ｒ、配列番号３９９：
５’−ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡ−３’）を使用してＡＢＩ番号７３００  ｑ−ＰＣＲ器具上でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲマスターミックスプラス（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて標準化ｑ−ＰＣＲアッセイのために処理した。各組み込まれたＣＡＲ遺伝子の相対コピー数を、標的配列を含有するプラスミドを使用して確立された標準曲線に基づいて計算した。
【０５０４】
表７に示されるように、ＣＡＲベクターの高いコピー数を、各ＣＡＲ−Ｔ調製物のＴ細胞のゲノムに組み込んだ。
【表７】
2019527557.tif 000017
【０５０５】
実施例４．ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍにおける２つのＶＨＨドメインのエピトープマッピング及び差次的エピトープ結合
４つの抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨドメインのエピトープをマッピングした。ＢＣＭＡの異なるエピトープに特異的に結合する２つの異なる抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨドメインを有する例示的な二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを構築した。ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲと命名されたＶＨＨ１及びＶＨＨ２を含む二価／２つのエピトープＣＡＲは、表５に列挙される１つの多価ＢＣＭＡ  ＣＡＲである。
【０５０６】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ
４つの例示的な抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ配列の各々を、ＢＣＭＡ  ＶＨＨ−ｈＩｇＧ１Ｆｃの組換え発現を促進するために、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント（ｈＩｇＧ１Ｆｃ）配列を含有するベクターにクローンした。組換えタンパク質を得、ＳＰＲアッセイについて精製した。
【０５０７】
ＢＣＭＡに対して各ＶＨＨ−ｈＩｇＧ１Ｆｃの親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００分析システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＰＲによって決定した。簡潔には、各ＶＨＨ−ｈＩｇＧ１Ｆｃタンパク質を、４μｇ／ｍＬのＶＨＨ−ｈＩｇＧ１Ｆｃを使用してＣＭ５（複数可）センサチップに共有結合させた。組換えＢＣＭＡ−Ｈｉｓタンパク質（ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＣＡ−Ｈ５２２ｙ）を、泳動緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中で連続的に希釈し、１０μＬ／分の流量で注入し、続いて、解離した。会合及び解離速度定数は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００評価ソフトウェアバージョン３．０（Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合、ローカルフィット、１：１の結合モデル）を使用して決定した。４つのＶＨＨ−ｈＩｇＧ１Ｆｃの結合親和性
を、表８に示す。
【表８】
2019527557.tif 000018
【０５０８】
標的細胞への組換えＶＨＨ−Ｈｉｓタンパク質の結合
組換え抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ−Ｈｉｓタンパク質を、Ｎ末端でヒトアルブミンシグナルペプチド配列（Ｎ’−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ−Ｃ’、配列番号３８６）、及びＣ末端で６ｘＨｉｓ−ｔａｇ（Ｎ’−ＧＳＧＨＨＨＨＨＨ−Ｃ’、配列番号３８７）に、抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ配列を融合することによって構築した。コドンは、哺乳動物宿主細胞中の最適発現のためにさらに最適化された。その後、得られたヌクレオチド配列を、プラスミド、ｐＴＴ５−ＬＡＢ００１（ＶＨＨ１に対して）、ｐＴＴ５−ＬＡＢ００２（ＶＨＨ２に対して）、及びｐＴＴ５−ＬＡＢ００３（ＶＨＨ１ｘＶＨＨ２に対して）を提供するために、５’−ＸｂａＩ及び３’−ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を介して哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５にクローンした。
【０５０９】
組換えＢＣＭＡ  ＶＨＨタンパク質を得るために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、プラスミドで一過性にトランスフェクトした。簡潔には、５×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションから１日前に、１０ｃｍの細胞培養皿に播種した。翌日、細胞を、製造業者の手引き書に従ってＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１６６８−０１９）を使用して各プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから４日後に、上清を収穫し、抗体の発現レベルを、ＨＲＰ抗Ｈｉｓ  Ｔａｇ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号６５２５０４）を使用してＥＬＳＩＡによって検出した。ＬＡＢ００１、ＬＡＢ００２、及びＬＡＢ００３の発現レベルは、それぞれ、１０９．３１ｎｇ／ｍＬ、１５２．４８ｎｇ／ｍＬ、及び３９６．６２ｎｇ／ｍＬであった。
【０５１０】
ＬＡＢ００１、ＬＡＢ００２、及びＬＡＢ００３抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ−Ｈｉｓタンパク質の結合親和性は、細胞に基づくアッセイを使用して決定した。簡潔には、連続的に希釈した抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨ−Ｈｉｓタンパク質を、１×１０５個の標的細胞（Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．ＬｕｃまたはＫ５６２．ＣＤ３８．Ｌｕｃ細胞のいずれか、これらは、ＢＣＭＡまたはＣＤ３９を、それぞれ、安定して発現する社内で開発された細胞株であった）で、４℃で２時間インキュベートした。その後、細胞を、３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、ＤＰＢＳで再懸濁した。細胞ペレットを洗浄し、遠心分離し、上清をさらに２回廃棄した。その後、細胞ペレットを、４５分間緩衝液を含有する検出抗体（ＴＨＥ（商標）Ｈｉｓタグ抗体［ＦＩＴＣ］、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔカタログ番号Ａ０１６２０）で、４℃で２時間再懸濁した。その後、細胞を、３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを洗浄し、遠心分離し、上清をさらに２回廃棄した。ＬＡＢ００１、ＬＡＢ００２、及びＬＡＢ００３の、Ｋ５６２．ＢＣＭＡ．ＬｕｃまたはＫ５６２．ＣＤ３８．Ｌｕｃ細胞のいずれかへの結合親和性は、ＡＴＴＵＮＥ（商標）Ｎｘｔフローサイトメーターを使用して決定した。データを、「Ｏｎｅ  ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｌｌ  ｓｌｏｐｅ」を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（商標）バージョン６．０によって適合した。
【０５１１】
図７Ａ〜７Ｃに示されるように、ＬＡＢ００１、ＬＡＢ００２、及びＬＡＢ００３は、用量依存性様式でＫ５６２．ＢＣＭＡ．Ｌｕｃ細胞に特異的に結合する。結合親和性は、それぞれ、０．０７９ｎＭ、０．０３５ｎＭ、及び０．００４７ｎＭである。抗体のいずれも、ＢＣＭＡ陰性細胞株Ｋ５６２．ＣＤ３８．Ｌｕｃに対して有意な結合を示さなかった。さらに、ＬＡＢ００３（ＶＨＨ１ｘＶＨＨ２）は、ＬＡＢ００１（ＶＨＨ１）またはＬＡＢ００２（ＶＨＨ２）のいずれかよりも有意に高い結合親和性（０．００４７ｎＭ）を示した。
【０５１２】
エピトープ結合
ＢＣＭＡ（ＮＰ＿００１１８３、ＵｎｉＰｒｏｔ＃Ｑ０２２２３）は、１８４のアミノ酸長の膜貫通タンパク質である。ヒトＢＣＭＡは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ、アミノ残基番号１〜５４）、膜貫通ドメイン（ＴＭ、アミノ残基番号５５〜７７）、及び細胞質ドメイン（ＣＤ、アミノ残基番号７８〜１８４）から成る。加えて、配列分析は、ＢＣＭＡがそのＮ末端で認識できるシグナルペプチドを有しないことを示唆している（Ｌａａｂｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  ＥＭＢＯ  Ｊ  １１：３８９７−３９０４、Ｌａａｂｉ
Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：１１４７−１１５４、Ｇｒａｓ  Ｍ  Ｐ（１９９５）  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：１０９３−１１０６、Ｈｏｎｇ−Ｂｉｎｇ  Ｓｈｕ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｙ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（２０００）：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０．１０７３）。
【０５１３】
オンラインのデータベースＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ０２２２３）によっても示されるため、３ジスルフィド結合（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）は、８〜２１、２４〜３７、及び２８〜４１の位置である、ＢＣＭＡのＥＣＤに位置する（表９）。Ｎ末端からＣ末端までのＢＣＭＡ  ＥＣＤの二次構造は、ベータ鎖（ａａ１２〜１５）、ターン（ａａ１６〜１９）、ベータ鎖（ａａ２０〜２３）、ヘリックス（ａａ２４〜２７）、ベータ鎖（ａａ３０〜３２）、ヘリックス（ａａ３５〜３７）、ターン（ａａ３８〜４０）、及びターン（ａａ４２〜４４）から成る。ＢＣＭＡ  ＥＣＤの構造を、図８Ａに示し、これは、ＰＤＢデータベースｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｄｂｅ／ｅｎｔｒｙ／ｐｄｂ／２ｋｎ１／からの構造から複製される。
【表９】
2019527557.tif 000019
【０５１４】
ＢＣＭＡエピトープペプチド（２６９ＥＰ００１〜２６９ＥＰ００７）を、図８Ｂ及び表１０に示されるように設計し、Ｎ末端で化学的に合成し、ビオチン化した。ＶＨＨ１−ｈＩｇＧ１ＦｃまたはＶＨＨ２−ｈＩｇＧ１Ｆｃの結合親和性は、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。簡潔には、上に記載されるペプチドは、１μＭでＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）ＥＬＩＳＡプレート上に、４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを、ＰＢＳＴ（０．５％  ＴＷＥＥＮ−２０を添加した）で２回洗浄し、続いて、室温で１時間０．５％  ＢＳＡでプレートブロッキングした。その後、プレートを、ＰＢＳＴで２回洗浄し、続いて、１０ｎＭで連続的に希釈したＶＨＨ１−ｈＩｇＧ１ＦｃまたはＶＨＨ２−ｈＩｇＧ１Ｆｃを添加し、４℃で２時間インキュベートした。その後、プレートを、冷却ＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、ヤギ抗ラマ−ＨＲＰ（１：１５００、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂ＃Ａ１６０）を各ウェルに添加し、室温で１時間さらにインキュベートした。その後、プレートを、ＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、室温で１０〜３０分間インキュベートした。その後、プレートを、４５０ｎｍで吸光度を有するＴＥＣＡＮ（登録商標）１０Ｍマイクロプレートリーダー上で読み取った。
【表１０】
2019527557.tif 000020
【０５１５】
図９Ａに示されるように、ＶＨＨ１は、２６９ＥＰ００５ペプチド、続いて、２６９ＥＰ００４ペプチドへの最も強い結合を示した。しかしながら、２６９ＥＰ００３及び２６９ＥＰ００６へのＶＨＨ１の結合は、２６９ＥＰ００５及び２６９ＥＰ００４と比較して比較的弱かった。ＶＨＨ１は、２６９ＥＰ００５ペプチド（すなわち、ＢＣＭＡ  ＥＣＤのアミノ酸２４〜３６）に位置するエピトープに結合する傾向があり、これは、ヘリックス（ａａ２４〜２７）、ベータ鎖（ａａ３０〜３２）、及びヘリックス（ａａ３５〜３７）の二次構造を含有する。
【０５１６】
図９Ｂに示されるように、ＶＨＨ２は、２６９ＥＰ００２ペプチド、続いて、２６９ＥＰ００３ペプチドへの最も強い結合を示した。しかしながら、２６９ＥＰ００１及び２６９ＥＰ００４へのＶＨＨ１の結合は、２６９ＥＰ００２及び２６９ＥＰ００３と比較して比較的弱かった。ＢＣＭＡ  ＥＣＤの第１のベータ鎖（ａａ１２〜１５）及びベータ鎖（ａａ２０〜２３）は、２６９ＥＰ００２（ａａ８〜２１）及び２６９ＥＰ００３（ａａ１１〜２３）によって覆われた配列に主に位置付けられており、ＶＨＨ２は、初めの２つのベータ鎖に位置付けられるエピトープに結合する傾向がある。
【０５１７】
競合結合アッセイ
ＶＨＨ１及びＶＨＨ２の差次的エピトープ結合は、細胞に基づく競合結合アッセイによってさらに実証された。ヒトＢＣＭＡを過剰発現する安定したＣＨＯ細胞株（「ＣＨＯ−ＢＣＭＡ」）を、アッセイで使用した。
【０５１８】
簡潔には、０．５×１０６個のＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞を、１２．５ｎｇ／ｍＬのＬＡＢ００１（Ｃ末端で６ｘＨｉｓタグを含有する）で、二重に４℃で０．５時間事前インキュベートした。その後、連続的に希釈したＶＨＨ２−ｈＩｇＧ１Ｆｃ組換え抗体をプレートの各ウェルに添加し、４℃でさらに１時間さらにインキュベートした。インキュベーション後、細胞を５００μＬのＤＰＢＳで洗浄し、３００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、抗Ｈｉｓタグ−ＦＩＴＣを含有するＤＰＢＳ（１：２００、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔカタログ番号Ａ１６０２０）で再懸濁し、その後、細胞を５００μＬのＤＰＢＳで洗浄し、３００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、ＤＰＢＳで再懸濁し、その後、ＡＴＴＵＮＥ（商標）Ｎｘｔフローサイトメーター上でＦＡＣＳ分析に供した。アッセイ対照として、連続的に希釈したＶＨＨ２−ｈＩｇＧ１Ｆｃを、上記のような並列の同一の手順に従って、ＬＡＢ００１が存在することなくＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞で直接インキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−ＦＩＴＣ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃ
ｈカタログ番号Ｆ９５１２）を、ＶＨＨ２−ｈＩｇＧ１ＦｃのＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞への結合を検出するために使用した。図１０に示されるように、ＶＨＨ２−ｈＩｇＧ１Ｆｃ単独は、用量依存性様式でＣＨＯ−ＢＣＭＡに結合する。しかしながら、ＶＨＨ２−ｈＩｇＧ１Ｆｃは、ＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞に結合するＶＨＨ１−Ｈｉｓと競合することができず、ＢＣＭＡ上のＶＨＨ１及びＶＨＨ２の異なる結合部位を示す。
【０５１９】
実施例５．腫瘍異種移植片マウスモデルにおけるＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔのインビボ有効性
ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍有効性は、多発性骨髄腫腫瘍異種移植片を有するＮＣＧマウスモデル（ＮＯＤ−Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｃｄ５２Ｉｌ２ｒｇｅｍ２６Ｃｄ２２／ＮｊｕＣｒｌ）において評価された。ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲは、異なるＢＣＭＡエピトープを標的とする２つの抗ＢＣＭＡ  ＶＨＨドメインを有する二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲである。
【０５２０】
ＮＣＧマウスモデルは、ＮＯＤ／ＮｊｕマウスにおけるＰｒｋｄｃ及びＩｌ２ｒｇ遺伝子座の逐次的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集によって作製され、但しマウスがＮＯＤ／Ｎｊｕに対してコアイソジェニックであるものとする。ＮＯＤ／Ｎｊｕマウスは、外来造血幹細胞の移植を可能にするＳｉｒｐａ（ＳＩＲＰ  α）遺伝子において変異を保因する。Ｐｒｋｄｃノックアウトは、適切なＴ細胞及びＢ細胞形成を欠くＳＣＩＤ様表現型を生成する。Ｉｌ２ｒｇ遺伝子のノックアウトは、ＳＣＩＤ様表現型をさらに悪化させるが、さらに、ＮＫ細胞産生の減少をもたらす。したがって、ＮＣＧマウスは、ＳＣＩＤ及びヌードマウスを含む一般に使用される免疫不全マウス株よりもさらに免疫不全である「三重免疫不全」マウス株である。
【０５２１】
Ｐｒｋｄｃ及びＩｌ２ｒｇは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、それほどではないが、樹状細胞の変異及び形成に影響を与える遺伝子のＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）ファミリーの一部である。Ｐｒｋｄｃは、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ酵素の触媒サブユニットをコードし、これは、Ｔ及びＢ細胞を成熟させる際に抗体多様性を広めるのに必要なプロセスであるＶ（Ｄ）Ｊの組換えに必要である。Ｉｌ２ｒｇは、ＩＬ−２及び複数のＩＬ受容体（ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１）をコードし、これらは、未成熟リンパ球（例えば、Ｔ、Ｂ、及びＮＫ細胞）及び他の白血球の成熟のためにサイトカイン媒介性シグナル伝達を誘導するために必要とされる。
【０５２２】
ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、インビトロでＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞の死滅に最も高い有効性を有するＣＡＲ−Ｔを産出するＴ細胞源をスクリーニングするために、様々なドナーからのＴ細胞を用いて調製した（図１１）。図１１の結果に基づいて、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、インビボ動物アッセイにおいて選択されたドナーのＴ細胞を用いて調製した。図１２Ａは、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のこのバッチの用量依存性のインビトロ細胞毒性を示す。腫瘍異種移植片を作製するために、ＮＣＧマウスに、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞を静脈内注入した。１４日後、腫瘍移植マウスを、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞で処理し、続いて、インビボ生物発光画像法（ＢＬＩ）を行った。
【０５２３】
図１２Ｂ〜１２Ｃに示されるように、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＮＣＧマウスにおける移植ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ腫瘍細胞を根絶し、マウスを救出するのに効果的であったが、対照（ＵｎＴ）群のほとんどのマウスは、４週間以内に死亡した。興味深いことには、剖検中、多くの転移性腫瘍は、ＵｎＴ群の全てのマウスの肝臓に観察された。この観察は、腫瘍サンプルからのエクスビボルシフェラーゼ活性を評価することによってさらに実証された（図１２Ｄ〜１２Ｅ）。対照的に、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔで処理されたマウスは、肝臓中に転移性腫瘍を有しなかった。要約すると、インビボ
研究は、ＮＣＧマウスからの多発性骨髄腫細胞（例えば、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ）の根絶におけるＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を示す。
【０５２４】
実施例６．非ヒト霊長類におけるＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ処置の安全性研究
ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ安全性は、カニクイザルモデルにおいて評価された。ＰＢＭＣは、２匹のサル（ＮＨＰ＃１２０１１７及びＮＨＰ＃１２０５４５、共に雄、約４ｋｇ）の末梢血サンプルから得られ、密度勾配遠心分離法によって調製された。カニクイザルＴ細胞は、製造業者の手引き書に従って非ヒト霊長類Ｐａｎ  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ＃１３０−０９１−９９３）を使用してＰＢＭＣから単離された。調製したサルＴ細胞は、非ヒト霊長類Ｔ細胞活性化／増殖キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ＃１３０−０９２−９１９）、ヒトＩＬ−２、及び自己血清で３日間事前活性化した。その後、事前活性化したＴ細胞を、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍレンチウイルスで形質導入し、続いて、さらに１０日間増殖した。
【０５２５】
自己ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入の３日前に、サルを、静脈内注入により２２ｍｇ／体重ｋｇの用量のシクロホスファミドで前処置した。自己注入の当日、細胞を、穏やかに旋回させることによって３７℃の水浴中で解凍させ、５分以内に動物の静脈内に直ちに注入した。サルＮＨＰ＃１２０１１７を、５×１０６個／ｋｇのＣＡＲ−Ｔ細胞で注入し、サルＮＨＰ＃１２０５４５を、４×１０７個／ｋｇのＣＡＲ−Ｔ細胞で注入した。
【０５２６】
サルは、Ｔ細胞投与後に、発熱、呼吸困難、食欲の変化、下痢、及び体重減少についてモニタリングされた。投与前及び投与後の血液サンプルを得、ＣＢＣ、血清化学、及びサイトカインレベルについて検査した。図１３Ａ〜１３Ｆに示されるように、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、サルにおいて有意な毒性を有しなかった。
【０５２７】
実施例７．難治性／再発性多発性骨髄腫に罹患しているヒト患者におけるＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔの臨床研究
単一アーム非盲検多施設第１／２相臨床研究は、難治性または再発性多発性骨髄腫（「ｒ／ｒ  ＭＭ」）と診断されたヒト患者を処置する際に、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の安全性及び有効性を決定するために行われた。臨床試験の情報は、識別子ＮＣＴ０３０９０６５９を有するｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖにおいて見出され得る。
【０５２８】
研究では、難治性／再発性多発性骨髄腫患者は、患者の自己Ｔ細胞由来のＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置された。０．５×１０６〜５×１０６個の細胞／体重ｋｇの総用量は、一週間の期間（例えば、０、２、及び６日目）にわたって３回の分割用量（それぞれ、２０％、３０％、及び５０％）で静脈内注入により各患者に投与された。研究の１〜３０日目の間、患者は、有害事象についてモニタリングされ、患者サンプルは、実験評価のために得られた。全ての患者は、ＣＡＲ−Ｔ投与後少なくとも３６カ月間経過観察される。
【０５２９】
研究の主要転帰は、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入後の１〜３０日以内に、有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）ｖ４．０によって評価されるように、処置関連有害事象の発生を測定する。二次転帰は、例えば、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与前及び投与後の患者の血清中の異常免疫グロブリンレベル、及びその骨髄の多発性骨髄腫細胞の数を決定することによってＣＡＲ−Ｔによって誘導される抗骨髄腫反応を評価する。研究の有効性目的には、病理学的完全奏功率、３年の疾患生存率、３年の無進行生存率が含まれる。
【０５３０】
１８〜７５歳の患者は、（１）患者が更新されたＩＭＷＧ基準によって定義されるよう
な、事前に確定診断された活性の多発性骨髄腫を有する場合、（２）明らかなＢＣＭＡ発現が、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によって骨髄または形質細胞腫のいずれかから悪性形質細胞において検出される場合、及び（３）患者が、ボルテゾミブを含む少なくとも３つの事前治療レジメンを受けたことがあると定義される、またはそうでなければ臨床医によって特定されるような、難治性多発性骨髄腫に罹患している場合、あるいは、患者が腫瘍学：多発性骨髄腫におけるＮＣＣＮ臨床実践ガイドライン（２０１６  Ｖ２）によって定義されるような、再発性多発性骨髄腫を有する場合、この研究の対象となる。
【０５３１】
以下の患者：（１）出産の可能性がある、または妊娠中もしくは授乳中の女性、（２）あらゆる活性及び制御されていない感染：Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、または他の致死的ウイルス及び細菌感染を有する患者、（３）５ｍｇ／日超のプレドニゾンの全身性コルチコステロイドステロイド療法を受けたことがある、または同等用量の別のコルチコステロイドが、必要とされる白血球除去輸血前もしくはコンディショニング化学療法レジメン開始前のいずれかの２週間以内に許容されない患者、（４）あらゆる制御されない併発疾患または重篤な制御されない医学的障害を有する患者、（５）ＣＮＳ転移または症候性ＣＮＳ関与（脳神経障害または腫瘤病変及び脊髄圧迫を含む）を有する患者、（６）登録から６カ月以内に、同種幹細胞移植の経歴を有する、活性の急性もしくは慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を有する、またはＧＶＨＤに対して免疫抑制剤を必要とする患者、または（７）乾癬等の活性の自己免疫皮膚疾患、もしくはリウマチ性関節炎等の他の活性の自己免疫疾患を有する患者は、この研究から除外される。
【０５３２】
２０１７年５月の中間分析では、再発性または治療抵抗性（難治性）多発性骨髄腫を有する３５人の患者が、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ治療を受けた。治療有効性の第１の兆候は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の初期注入から早ければ１０日後に見られた。全体的に、客観的奏功率は、１００％であり、３５人の患者のうち３３人（９４％）が、ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けた２カ月以内に、骨髄腫の明らかな臨床的寛解（完全奏功または非常に良好な部分奏功）を有した。
【０５３３】
分析時までに、１９人の患者を、国際骨髄腫作業グループ（ＩＭＷＧ）コンセンサス基準によって完全有効性評価のための４カ月を超える事前設定時間、追跡した。１人の患者は、有効性において、部分奏功に達し、４人の患者は、非常に良好な部分奏功基準（ＶｇＰＲ）を達成した。ストリンジェントな完全奏効（「ｓＣＲ」）基準に達した患者は、再発しなかった。１年を超えて（１２〜１４カ月）追跡した５人の患者は、ｓＣＲ状態を維持し、最小の残留疾患がなかった（すなわち、骨髄中にがん細胞が検出できなかった）。
【０５３４】
サイトカイン放出症候群（「ＣＲＳ」）は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の一般的及び潜在的に危険な副作用である。３５人の患者のうちの８５％が、一過性ＣＲＳのみ経験した。ＣＲＳ症状には、発熱、低血圧、呼吸困難、及び複数の臓器の問題が含まれる。患者の大部分において、ＣＲＳ症状は軽度であり、管理可能であった。２人の患者のみが、重篤なＣＲＳ（グレード３）を経験したが、トシリズマブ（ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の臨床試験においてＣＲＳを管理するために一般的に使用される炎症を抑える処置）を受けて回復した。ＣＡＲ  Ｔ細胞療法からの、神経学的副作用、別の一般的かつ重篤な合併症を経験した患者はいなかった。
【０５３５】
中間臨床試験データは、難治性／再発性多発性骨髄腫に罹患しているヒト患者におけるＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ治療の強力な有効性及び安全性を示す。
【０５３６】
パイロット臨床研究において、３人の患者は、一価ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現する自己Ｔ細胞、すなわち、ＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置された。ＬＣＡＲ−Ｂ２７
Ｓ  ＣＡＲ（表４に列挙される１つの一価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ）は、ＢＣＭＡ分子の単一のエピトープを認識する単一のＶＨＨフラグメントを含有する抗原結合ドメインを有する。このＶＨＨドメインは、２つのエピトープ／二価ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲの第２のＶＨＨドメインと同一である。
【０５３７】
インビトロ細胞毒性アッセイにおいて、ＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、それぞれ、３人の多発性骨髄腫患者から調製され、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ細胞はまた、対照として同じ３人の多発性骨髄腫患者からそれぞれ調製された。ＣＡＲ−Ｔ細胞は両方とも、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞で２０：１及び５：１のエフェクター対標的比（Ｅ／Ｔ比）で２０時間共培養した。図１４Ａに示されるように、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、患者ＡからのＴ細胞を使用して調製した。残存する生存細胞の割合は、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞中の残留するルシフェラーゼ活性によって評価されるように、Ｅ／Ｔ比が２０：１であるとき、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍについては３．９７±０．７５％、及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓについては３．１７±０．５７％であった。しかしながら、Ｅ／Ｔ比が５：１であったとき、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍは、ＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓと比較して、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞の死滅に高い効力を示した（ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍについては３３．３７±０．７５％の残存する生存細胞、ＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓについては６８．６０±１．６０％）。図１４Ｂに示されるように、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、患者ＢからのＴ細胞を使用して調製した。残存する生存細胞の割合は、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞中の残留するルシフェラーゼ活性によって評価されるように、Ｅ／Ｔ比が２０：１であるとき、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍについては４．４５±０．５７％、及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓについては９．３２±１．１６％であった。しかしながら、Ｅ／Ｔ比が５：１であったとき、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍは、ＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓと比較して、この場合もやはり、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞の死滅に高い効力を示した（ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍについては４０．９２±３．００％の残存する生存細胞、ＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓについては８４．０５±１．５６％）。図１４Ｃに示されるように、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、患者ＣからのＴ細胞を使用して調製した。残存する生存細胞の割合は、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞中の残留するルシフェラーゼ活性によって評価されるように、Ｅ／Ｔ比が２０：１であるとき、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍについては２．５６±０．８８％、及びＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓについては１０．１２±１．８３％であった。しかしながら、Ｅ／Ｔ比が５：１であったとき、ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍは、ＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓと比較して、この場合もやはり、ＲＰＭＩ８２２６．Ｌｕｃ細胞の死滅に高い効力を示した（ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍについては２９．９９±３．１３％の残存する生存細胞、ＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓについては１００．９３±９．２５％）。
【０５３８】
パイロット臨床研究において、３人の患者は、ＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置され、前処置、注入、及び追跡プロトコルは全て、二価ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲを用いた臨床研究のものと同一であった。ＣＡＲ−Ｔ細胞で修飾された自己ＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓの３×１０６個の細胞／体重ｋｇ（患者Ａ）、５×１０６個の細胞／体重ｋｇ（患者Ｂ）、及び７×１０６個の細胞／体重ｋｇ（患者Ｃ）の総用量は、それぞれ、一週間の期間（例えば、０、２、及び６日目）にわたって３回の分割用量（それぞれ、２０％、３０％、及び５０％）で静脈内注入により各患者に投与された。研究の１〜３０日目の間、患者は、有害事象についてモニタリングされ、患者サンプルは、実験評価のために得られた。全ての患者は、ＣＡＲ−Ｔ投与後少なくとも３６カ月間追跡した。
【０５３９】
３人の患者のうち２人は、非常に良好な部分奏功（ＶｇＰＲ）に達したが、両方の患者は、ＣＡＲ−Ｔ注入から６カ月以内に再発した。第３の患者は、いかなる臨床反応も示さなかった。ＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓを用いたパイロット研究は、その結果として、さらなる患者が登録されることなく、ＩＲＢによって終了した。
【０５４０】
このパイロット一価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ研究（ＬＣＡＲ−Ｂ２７Ｓ）及び二価ＢＣＭＡ  
ＣＡＲ研究（ＬＣＡＲ−Ｂ３８Ｍ  ＣＡＲ−Ｔ）からの客観的奏功率、完全寛解率及び再発率を、以下の表１１に示す。二価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔは、一価ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔと比較して、優れた臨床有効性を有した。
【表１１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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