(57)【要約】本発明は、新規マルチゲノムレトロウイルスベクター、そのようなレトロウイルスベクターを作製するための方法およびパッケージングシステムならびに使用方法を提供する。
2019509275.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. 第1対象配列を含む第1レトロウイルスベクターゲノムの2コピーを含む第1レトロウイルス粒子と；
b. 第2対象配列を含む第2レトロウイルスベクターゲノムの2コピーを含む第2レトロウイルス粒子と；
c. 第1対象配列を含む第1レトロウイルスベクターゲノムの1コピーおよび第2対象配列を含む第2レトロウイルスベクターゲノムの1コピーを含む第3レトロウイルス粒子とを含み；
第1および第2対象配列が異なり；
前記レトロウイルスベクター調製物が異種エンベロープ糖タンパク質で偽型化されている、組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項２】
第3レトロウイルス粒子が、前記調製物中の全レトロウイルス粒子の少なくとも50%を構成する、請求項１に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項３】
第3レトロウイルス粒子が、前記調製物中の全レトロウイルス粒子の少なくとも60%を構成する、請求項１に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項４】
第3レトロウイルス粒子が、前記調製物中の全レトロウイルス粒子の少なくとも75%を構成する、請求項１に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項５】
前記異種エンベロープ糖タンパク質が、VSVg、麻疹エンベロープ糖タンパク質、およびシンドビスエンベロープ糖タンパク質からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項６】
異種エンベロープ糖タンパク質が、変異型シンドビスウイルスE2糖タンパク質を含む、請求項５に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項７】
前記変異型シンドビスウイルスE2糖タンパク質が前記ベクターを樹状細胞に標的化する、請求項６に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項８】
前記レトロウイルスベクター調製物がレンチウイルスベクター調製物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項９】
第1対象配列が腫瘍関連抗原または1つ以上のネオ抗原をコードし、第2対象配列が免疫調節分子をコードする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項１０】
第1対象配列が腫瘍関連抗原をコードし、第2対象配列が異なる腫瘍関連抗原をコードする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項１１】
第1対象配列が腫瘍関連抗原をコードし、第2対象配列が1つ以上のネオ抗原をコードする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項１２】
1つ以上の前記ネオ抗原が、第1対象配列の前記腫瘍関連抗原のネオ抗原である、請求項１1に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項１３】
偽型マルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を産生するためのレトロウイルスベクターパッケージングシステムであって、
a. ウイルスエンベロープタンパク質をコードする第1核酸分子と；
b. gagおよびpolタンパク質をコードする第2核酸分子と；
c. revをコードする第3核酸分子と；
d. 第1対象配列を含む第1レトロウイルスベクターゲノムを含む第4核酸分子と；
e. 第2対象配列を含む第2レトロウイルスベクターゲノムを含む第5核酸分子と；
f. 任意に、vpxをコードする第6核酸分子と；
g. パッケージング細胞または細胞株と、
を含む、レトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項１４】
前記レトロウイルスベクター調製物がレンチウイルスベクター調製物である、請求項１３に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項１５】
第1対象配列が腫瘍関連抗原または1つ以上のネオ抗原をコードし、第2対象配列が免疫調節分子をコードする、請求項１３または１４に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項１６】
第1対象配列が腫瘍関連抗原をコードし、第2対象配列が異なる腫瘍関連抗原をコードする、請求項１３に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項１７】
第1対象配列が腫瘍関連抗原をコードし、第2対象配列が1つ以上のネオ抗原をコードする、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項１８】
前記ウイルスエンベロープタンパク質が、VSVg、麻疹エンベロープ糖タンパク質、およびアルファウイルスエンベロープ糖タンパク質からなる群より選択される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項１９】
前記ウイルスエンベロープタンパク質が、樹状細胞を標的とすることができるシンドビスウイルスE2糖タンパク質またはその変異体を含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項２０】
等量の第4核酸分子および第5核酸分子が使用される、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項２１】
パッケージングシステムで使用される第4核酸分子対第5核酸分子の相対投入比率が3:2である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項２２】
第1レンチウイルスベクターゲノムおよび第2レンチウイルスベクターがパリンドローム二量体開始部位（DIS）配列を含む、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項２３】
第1レンチウイルスベクターゲノムおよび第2レンチウイルスベクターにおけるパリンドロームDIS配列が同一である、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項２４】
第1レンチウイルスベクターゲノムが第1パリンドロームDIS配列を含み、第2レンチウイルスベクターが第2パリンドロームDIS配列を含む、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項２５】
前記レトロウイルスベクターパッケージングシステムがホモ接合性レトロウイルスベクター粒子を優先的に産生する、請求項２４に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項２６】
第1レンチウイルスベクターゲノムが第1DIS配列を含み、第2レンチウイルスベクターが第2DIS配列を含み、第1および第2DIS配列が非パリンドロームである、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項２７】
前記レトロウイルスベクターパッケージングシステムがヘテロ接合性レトロウイルスベクター粒子を優先的に産生するように、パッケージング中に第1DIS配列が第2DIS配列と対合する、請求項２６に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項２８】
前記polタンパク質が非機能性インテグラーゼを有する、請求項１３〜２６のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項２９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物であって、
e. 第3対象配列を含む第3レトロウイルスベクターゲノムの2コピーを含む第4レトロウイルス粒子と；
f. 第1対象配列を含む第1レトロウイルスベクターゲノムの1コピーおよび第3対象配列を含む第3レトロウイルスベクターゲノムの1コピーを含む第5レトロウイルス粒子と；
g. 第2対象配列を含む第2レトロウイルスベクターゲノムの1コピーと、第3対象配列を含む第3レトロウイルスベクターゲノムの1コピーを含む第6レトロウイルス粒子と、
をさらに含む、組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項３０】
第1レトロウイルスベクターゲノムが、約50%の前記ベクターゲノムを前記マルチゲノムベクター調製物中に含む、請求項１〜１２または請求項２９のいずれか一項に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項３１】
a. 特有の対象配列を含むレトロウイルスベクターゲノムをそれぞれ含む少なくとも2つの核酸分子と；
b. 偽型レトロウイルスベクター粒子を生成するのに必要な成分をコードする1つ以上の核酸分子と；
c. 任意に、vpxをコードする核酸分子と；
d. パッケージング細胞株と、
を含む、マルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項３２】
特有の対象配列を含むレトロウイルスベクターゲノムをそれぞれ含む2〜8つの核酸分子からなる、請求項３１に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項３３】
特有の対象配列を含むレトロウイルスベクターゲノムをそれぞれ含む5つの核酸分子からなる、請求項３２に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項３４】
特有の対象配列を含むレトロウイルスベクターゲノムをそれぞれ含む5つの核酸分子の相対投入比率が、表３に示す投入比率の1つから選択される、請求項３３に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項３５】
特有の対象配列を含むレトロウイルスベクターゲノムをそれぞれ含む5つの核酸分子の相対投入比率が4:1:1:1:1である、請求項３３に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項３６】
特有の対象配列が、MAGEA1、MAGEA4、NYESO1、MAGEA3、MAGEA10、ScFvanti-PD1、IL12、IL23、CD40、ScFvanti-PDL1、およびScFvanti-CTLA4をコードする配列、または野生型配列に対して少なくとも80%〜90%の同一性を有する上記のいずれかの免疫原性変異体からなる群より選択される、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項３７】
レトロウイルスベクター粒子を生成するのに必要な前記成分が、gag、pol、エンベロープ、ならびに任意にrevおよび／またはvpxタンパク質を含む、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項３８】
前記パッケージング細胞株が、レトロウイルスベクター粒子を生成するのに必要な1つ以上の前記成分を安定して発現する、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項３９】
前記レトロウイルスベクターゲノムがレンチウイルスベクターゲノムである、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステム。
【請求項４０】
（a）および（b）および任意に（c）の前記核酸でトランスフェクトされた請求項３１〜３７のいずれか一項に記載のパッケージング細胞株を培養することを含む、偽型マルチゲノムレトロウイルスベクター調製物の製造方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法によって産生された偽型マルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項４２】
請求項１〜１２、２９、３０および４１のいずれか一項に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を投与することを含む、被験体において免疫応答を誘導する方法。
【請求項４３】
請求項１〜１２、２９、３０および４１のいずれか一項に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を投与することを含む、被験体においてがんを治療する方法。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を投与することを含む、in vivoで被験体に複数の対象配列を送達および発現させる方法。
【請求項４５】
治療に使用するための、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項４６】
患者の治療方法で使用するための、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項４７】
患者のがんを治療する方法において使用するための、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【請求項４８】
患者の免疫応答を刺激する方法において使用するための、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規マルチゲノムレトロウイルスベクターならびにそのようなレトロウイルスベクターを作製するための方法およびパッケージングシステムを提供する。
【背景技術】
【０００２】
レトロウイルスベクターは、対象核酸を広範囲の細胞に送達するレトロウイルスベクターの能力が遺伝子を細胞に転移させるのによく適しているという点で、遺伝子送達の共通の手段である。レトロウイルスベクターは、遺伝子治療ならびに感染症およびがんの治療ワクチンに使用されている。しかしながら、単一のレトロウイルスベクターゲノムからの複数の導入遺伝子の発現（マルチシストロン性発現）は、例えば、転写因子に対する異なるプロモーターの競合または内部リボソーム侵入部位（IRES）の機能における変動性のために、組み換えタンパク質の発現レベルが不均一になることが多い。樹状細胞への核酸送達の場合、発現レベル、抗原プロセシングまたは抗原提示に対して、特に、特定の腫瘍抗原での干渉現象が観察されている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、複数の導入遺伝子の発現を促進する、改善されたレトロウイルスベクターおよびその作製方法を提供する。
【０００４】
本開示の1つの態様は、組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物であって、a）第1対象配列を含む第1レトロウイルスベクターゲノムの2コピーを含む第1レトロウイルス粒子と；b）第2対象配列を含む第2レトロウイルスベクターゲノムの2コピーを含む第2レトロウイルス粒子と；c）第1対象配列を含む第1レトロウイルスベクターゲノムの1コピーおよび第2対象配列を含む第2レトロウイルスベクターゲノムの1コピーを含む第3レトロウイルス粒子とを含み；第1および第2対象配列が異なり；第1および第2レトロウイルスベクターゲノムが欠損レトロウイルスゲノムであり（例えば、機能的gagまたはpolタンパク質などの必須ウイルスタンパク質をコードしておらず、標的細胞に入った後に感染性粒子を産生することができない）、レトロウイルスベクター調製物が異種エンベロープ糖タンパク質で偽型化されている、組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を提供する。本明細書の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物の特定の実施形態では、第3レトロウイルス粒子は、調製物中の全レトロウイルス粒子の少なくとも60%、70%、80%、90%または95%を構成する。本明細書に記載される組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物の別の実施形態では、異種エンベロープ糖タンパク質は、VSVg、麻疹エンベロープ糖タンパク質、およびシンドビスエンベロープ糖タンパク質からなる群より選択される。特定の実施形態では、異種エンベロープ糖タンパク質は変異型シンドビスウイルスE2糖タンパク質を含み、一実施形態では、変異型シンドビスウイルスE2糖タンパク質はDC-SIGNに結合する。一実施形態では、本明細書に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物は、レンチウイルスベクター調製物である。
【０００５】
本明細書に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物の別の実施形態では、第1対象配列は腫瘍関連抗原または1つ以上のネオ抗原をコードし、第2対象配列は免疫調節分子をコードする。別の実施形態では、第1対象配列は腫瘍関連抗原をコードし、第2対象配列は異なる腫瘍関連抗原をコードする。さらなる実施形態では、第1対象配列は腫瘍関連抗原をコードし、第2対象配列は1つ以上のネオ抗原をコードする。さらなる実施形態では、1つ以上のネオ抗原は、第1対象配列の腫瘍関連抗原に由来する。
【０００６】
別の実施形態では、本明細書に記載の組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物は、以下をさらに含む：e）第3対象配列を含む第3レトロウイルスベクターゲノムの2コピーを含む第4レトロウイルス粒子と；f）第1対象配列を含む第1レトロウイルスベクターゲノムの1コピーおよび第3対象配列を含む第3レトロウイルスベクターゲノムの1コピーを含む第5レトロウイルス粒子と；g）第2対象配列を含む第2レトロウイルスベクターゲノムの1コピーと、第3対象配列を含む第3レトロウイルスベクターゲノムの1コピーを含む第6レトロウイルス粒子。一実施形態では、本明細書のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を生成するために使用されるレトロウイルスベクターゲノムは、欠損レトロウイルスゲノムである（例えば、機能的gagまたはpolタンパク質などの必須ウイルスタンパク質をコードしておらず、標的細胞に入った後に感染性粒子を産生することができない）。
【０００７】
本開示の別の態様は、以下を含む偽型マルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を産生するためのレトロウイルスベクターパッケージングシステムを提供する：a）ウイルスエンベロープタンパク質をコードする第1核酸分子と；b）gagおよびpolタンパク質をコードする第2核酸分子と；c）revをコードする第3核酸分子と；d）第1対象配列を含む第1レトロウイルスベクターゲノムを含む第4核酸分子と；e）第2対象配列を含む第2レトロウイルスベクターゲノムを含む第5核酸分子と；f）任意に、vpxをコードする第6核酸分子と；g）パッケージング細胞または細胞株。本明細書に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステムの特定の実施形態では、レトロウイルスベクター調製物はレンチウイルスベクター調製物である。一実施形態では、本明細書のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を生成するために使用されるベクターゲノムは、欠損レトロウイルスゲノムである（例えば、機能的gagまたはpolタンパク質などの必須ウイルスタンパク質をコードしておらず、標的細胞に入った後に感染性粒子を産生することができない）。本明細書のレトロウイルスベクターパッケージングシステムの別の実施形態では、第1対象配列は腫瘍関連抗原または1つ以上のネオ抗原をコードし、第2対象配列は免疫調節分子をコードする。さらなる実施形態では、第1対象配列は腫瘍関連抗原をコードし、第2対象配列は異なる腫瘍関連抗原をコードする。一実施形態では、第1対象配列は腫瘍関連抗原をコードし、第2対象配列は1つ以上のネオ抗原をコードする。ウイルスエンベロープタンパク質が、VSVg、麻疹エンベロープ糖タンパク質、およびシンドビスエンベロープ糖タンパク質からなる群より選択される、請求項１３に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステムの別の実施形態。特定の実施形態では、ウイルスエンベロープタンパク質は、樹状細胞に感染することができるシンドビスウイルスE2糖タンパク質またはその変異体を含む。レトロウイルスベクターパッケージングシステムの別の実施形態では、等量の第4核酸分子および第5核酸分子が使用される。さらなる実施形態では、パッケージングシステムで使用される第4核酸分子対第5核酸分子の相対投入比率は60:40である。
【０００８】
本明細書に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステムの別の実施形態では、第1レンチウイルスベクターゲノムおよび第2レンチウイルスベクターは、パリンドローム二量体開始部位（DIS）配列を含む。特定の実施形態では、第1レンチウイルスベクターゲノムおよび第2レンチウイルスベクターにおけるパリンドローム二量体開始部位（DIS）配列は同一である。別の実施形態では、第1レンチウイルスベクターゲノムは第1パリンドロームDIS配列を含み、第2レンチウイルスベクターは第2パリンドローム二量体開始部位（DIS）配列を含む。したがって、特定の実施形態では、レトロウイルスベクターパッケージングシステムは、ホモ接合性レトロウイルスベクター粒子を優先的に産生する。本明細書に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステムの別の実施形態では、第1レンチウイルスベクターゲノムは第1DIS配列を含み、第2レンチウイルスベクターは第2二量体開始部位（DIS）配列を含み、レトロウイルスベクターパッケージングシステムがヘテロ接合性レトロウイルスベクター粒子を優先的に産生するように、パッケージング中に第1DIS配列が第2DIS配列と対合する。
【０００９】
本明細書に記載のレトロウイルスベクターパッケージングシステムの特定の実施形態では、polタンパク質は非機能性インテグラーゼを有する。一実施形態では、本明細書のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を生成するために使用されるベクターゲノムは、欠損レトロウイルスゲノムである（例えば、機能的gagまたはpolタンパク質などの必須ウイルスタンパク質をコードしておらず、標的細胞に入った後に感染性粒子を産生することができない）。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載のマルチゲノムベクター調製物のいずれかを生成するために使用されるベクターゲノムは、機能的gagまたはpolタンパク質をコードする配列を含まない。
【００１０】
本開示の別の態様は、以下を含むマルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステムを提供する：a）特有の対象配列を含むレトロウイルスベクターゲノムをそれぞれ含む少なくとも2つの核酸分子と；b）偽型レトロウイルスベクター粒子を生成するのに必要な成分をコードする1つ以上の核酸分子と；c）任意に、vpxをコードする核酸分子と；d）パッケージング細胞株。一実施形態では、少なくとも2つのレトロウイルスベクターゲノムは、欠損レトロウイルスゲノムである（例えば、機能的gagまたはpolタンパク質などの必須ウイルスタンパク質をコードしておらず、標的細胞に入った後に感染性粒子を産生することができない）。一実施形態では、マルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステムは、特有の対象配列を含むレトロウイルスベクターゲノムをそれぞれ含む2〜8つの核酸分子からなる。特定の実施形態では、特有の対象配列は、MAGEA1、MAGEA4、NYESO1、MAGEA3、MAGEA10、ScFvanti-PD1、IL12、IL23、CD40、ScFvanti-PDL1、およびScFvanti-CTLA4をコードする配列、または上記のいずれかの免疫原性変異体からなる群より選択される。一実施形態では、レトロウイルスベクター粒子を生成するのに必要な成分は、gag、pol、rev、およびエンベロープタンパク質を含む。さらなる実施形態では、パッケージング細胞株は、レトロウイルスベクター粒子を生成するのに必要な1つ以上の成分を安定して発現する。マルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステムの特定の一実施形態では、レトロウイルスベクターゲノムは、レンチウイルスベクターゲノムである。
【００１１】
本開示の別の態様は、以下を含む、偽型マルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を産生する方法を提供する：本明細書に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクターパッケージングシステムのパッケージング細胞株を培養することであって、ここでパッケージング細胞株は、a）特有の対象配列を含むレトロウイルスベクターゲノムをそれぞれ含む少なくとも2つの核酸分子と；b）偽型レトロウイルスベクター粒子を生成するのに必要な成分をコードする1つ以上の核酸分子と；c）任意に、vpxをコードする核酸分子とでトランスフェクトされる、および偽型マルチゲノムレトロウイルスベクター粒子を回収すること。この、本開示の一態様は、この方法によって生成される偽型マルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を提供する。
【００１２】
本開示の別の態様は、本明細書に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物、特定の実施形態では、1つ以上の腫瘍抗原および／または1つ以上の免疫調節分子を発現するそれらの調製物を投与することを含む、被験体において免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００１３】
本開示の別の態様は、1つ以上の腫瘍抗原および／または1つ以上の免疫調節分子を発現するマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を投与することを含む、被験体においてがんを治療する方法を提供する。
【００１４】
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を投与することを含む、in vivoで被験体に複数の対象配列を送達および発現させる方法を提供する。
【００１５】
本開示の別の態様は、治療に使用するための本明細書に記載の実施形態のいずれかの組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を提供する。
【００１６】
本開示の別の態様は、患者の治療方法で使用するための、本明細書に記載の実施形態のいずれかの組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を提供する。
【００１７】
本開示のさらなる態様は、患者のがんを治療する方法において使用するための、本明細書に記載の実施形態のいずれかの組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を提供する。
【００１８】
本開示の別の態様は、患者の免疫応答を刺激する方法において使用するための、本明細書に記載の実施形態のいずれかの組み換えマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を提供する。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】マルチゲノムレトロウイルスベクター調製物がどのように産生されるかを示す図である。言及したように、マルチゲノムシステムで産生されたヘテロ接合性ウイルス粒子は、再集合体と呼ぶことができる。
【図２】BALB/cマウスにおいて、単一、混合、共免疫化およびマルチゲノムウイルスベクター調製物によって誘導された、NY-ESO-1に対するCD8+ T細胞免疫応答を要約した棒グラフである。
【図３】BALB/cマウスにおいて、単一、混合、共免疫化およびマルチゲノムウイルスベクター調製物によって誘導された、MAGE-A3に対するCD8+ T細胞免疫応答を要約した棒グラフである。
【図４】BALB/cマウスにおいて、単一、混合、共免疫化およびマルチゲノムウイルスベクター調製物によって誘導された、NY-ESO-1に対するCD4+ T細胞免疫応答を要約した棒グラフである。
【図５Ａ】NYESO1を発現するベクターを送達するためのマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を尾基部に注射したBALB/c雌マウスからの抗原特異的CD8 T細胞応答のグラフを含む。
【図５Ｂ】MAGEA3を発現するベクターを送達するためのマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を尾基部に注射したBALB/c雌マウスからの抗原特異的CD8 T細胞応答のグラフを含む。
【図５Ｃ】MAGEA10を発現するベクターを送達するためのマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を尾基部に注射したBALB/c雌マウスからの抗原特異的CD8 T細胞応答のグラフを含む。
【図６】肺における腫瘍結節形成の減少およびマルチゲノムレンチウイルスベクターで処理したマウスの抗原特異的CD8+ T細胞の増加を示すグラフである。BALB/c雌に、CIN.23細胞を静脈内接種した。接種後3日目に、表示のように、マウスをレンチウイルスベクターで免疫化した（実施例４も参照）。接種後17日目に、結節計数のために肺を採取した（６Ａ）；フローサイトメトリー分析のために、脾細胞をMHC多量体で染色した（６Ｂ）。エラーバーは平均±SEMを表す。*p<0.05；**p<0.005。
【図７】図７Ａは、MAGEA1/A3/A4およびA10［M1、M3、M4、M10］を発現するベクターを送達するためのマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を尾基部に注射したBALB/cマウスからの抗原特異的CD8 T細胞応答を、単一抗原をそれぞれ発現する混合ベクターを受けたマウスまたは単一抗原を発現するベクターの注射を受けたマウスと比較して示すグラフである。７Ａ：MAGEA1プールでin vitroで刺激されたCD8+ T細胞のマルチICS染色。図７Ｂは、MAGEA1/A3/A4およびA10［M1、M3、M4、M10］を発現するベクターを送達するためのマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を尾基部に注射したBALB/cマウスからの抗原特異的CD8 T細胞応答を、単一抗原をそれぞれ発現する混合ベクターを受けたマウスまたは単一抗原を発現するベクターの注射を受けたマウスと比較して示すグラフである。７Ｂ：MAGEA3プールでin vitroで刺激されたCD8+ T細胞のマルチICS染色。図７Ｃは、MAGEA1/A3/A4およびA10［M1、M3、M4、M10］を発現するベクターを送達するためのマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を尾基部に注射したBALB/cマウスからの抗原特異的CD8 T細胞応答を、単一抗原をそれぞれ発現する混合ベクターを受けたマウスまたは単一抗原を発現するベクターの注射を受けたマウスと比較して示すグラフである。７Ｃ：MAGEA4プールでin vitroで刺激されたCD8+ T細胞のマルチICS染色。図７Ｄは、MAGEA1/A3/A4およびA10［M1、M3、M4、M10］を発現するベクターを送達するためのマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を尾基部に注射したBALB/cマウスからの抗原特異的CD8 T細胞応答を、単一抗原をそれぞれ発現する混合ベクターを受けたマウスまたは単一抗原を発現するベクターの注射を受けたマウスと比較して示すグラフである。７Ｄ：MAGEA10プールでin vitroで刺激されたCD8+ T細胞のマルチICS染色。
【図８】図８Ａは、3つの抗原（NYESO1／MAGEA3／A10［NY、M3、M10］）およびmIL12またはGFPを発現するベクターを送達するために、異なる2用量でマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を尾基部に注射したBALB/cマウスにおける抗原特異的CD8 T細胞応答を示すグラフである。８Ａ：NYESO1ペプチドプールでin vitroで刺激されたCD8+ T細胞の%IFNg+；*マン-ホイットニー検定を用いて統計的に有意である。図８Ｂは、3つの抗原（NYESO1／MAGEA3／A10［NY、M3、M10］）およびmIL12またはGFPを発現するベクターを送達するために、異なる2用量でマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を尾基部に注射したBALB/cマウスにおける抗原特異的CD8 T細胞応答を示すグラフである。８Ｂ：MAGEA3ペプチドプールでin vitroで刺激されたCD8+ T細胞の%IFNg+；%ワクチン接種率は、関連する棒線の上に示される。*マン-ホイットニー検定を用いて統計的に有意である。図８Ｃは、3つの抗原（NYESO1／MAGEA3／A10［NY、M3、M10］）およびmIL12またはGFPを発現するベクターを送達するために、異なる2用量でマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を尾基部に注射したBALB/cマウスにおける抗原特異的CD8 T細胞応答を示すグラフである。８Ｃ：MAGEA10プールでin vitroで刺激されたCD8+ T細胞の%IFNg+；%ワクチン接種率は、関連する棒線の上に示される。*マン-ホイットニー検定を用いて統計的に有意である。
【図９】野生型および修飾DIS配列で作製されたレンチウイルスベクター調製物についての遺伝子特異的ゲノム力価を示す。９Ａ：GCN/GCN=野生型DIS（GCGCGC、配列番号1）を有するNYESO1をコードする単一ベクターゲノムプラスミドで作製されたレンチウイルスベクター調製物；GGN/GGN=突然変異DIS（GGGGGG、配列番号4）を有するNYESO1をコードする単一ベクターゲノムプラスミドで作製したレンチウイルスベクター調製物。９Ｂ：GCN/GCN=野生型DIS（GCGCGC、配列番号1）を有するNYESO1をコードする単一ベクターゲノムプラスミドで作製されたレンチウイルスベクター調製物；GCN/GCM=配列番号1の野生型HIV DIS配列をそれぞれ含む2つの異なるベクターゲノムプラスミドで作製されたマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物：GCN：NYESOをコードするゲノム；GCM：MAGEA3をコードするゲノム；GGN/CCM=2つの異なるベクターゲノムで作製されたマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物：GGN：突然変異DIS配列GGGGGG、配列番号4を有するNYESO1をコードするベクターゲノム；GGM：突然変異DIS配列CCCCCC、配列番号5を有するMAGEA3をコードするベクターゲノム。
【００２１】
（配列識別子の簡単な説明）
配列番号1〜配列番号14は、本明細書に記載のレトロウイルスベクターゲノムおよびパッケージングシステムにおいて使用され得る二量体開始部位（DIS）配列である。GCGCGC（配列番号1）；GCCCGG（配列番号2）；CCGGGC（配列番号3）；GGGGGG（配列番号4）；CCCCCC（配列番号5）；GUGCAC（配列番号6）；GCGCGG（配列番号7）；CGCGCC（配列番号8）；GGGCGG（配列番号9）；CCCGCC（配列番号10）；CGCGCG（配列番号11）；CGGGCC（配列番号12）；GGCCCG（配列番号13）；CACGUG（配列番号14）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
レンチウイルスベクターは、in vivoで核酸を送達するための実績のある手段である。米国特許第8,187,872号明細書は、腫瘍関連抗原（TAA）に対する免疫応答を誘発するその能力について第2相試験で現在評価中の、組み込み不全のDC標的化改変第3世代レンチウイルスベクタープラットフォームを記載する。レンチウイルスベクター技術では、ペイロードのサイズは、多くは8〜10kbに制限されており、それは、重要であるが、複数の腫瘍抗原（TA）の標的化を妨げ、免疫調節分子をコードする配列などの他の対象配列を妨げることがある。さらに、単一のベクター構築物（例えば、エンドプロテアーゼ切断、内部リボソーム侵入部位（IRES）など）内に複数のタンパク質、例えば抗原を発現させる一般的な方法は、しばしば対象タンパク質の発現の低下および／または1つ以上のコードされた抗原に対する抗原特異的T細胞応答の誘導の有意な減少をもたらす。
【００２３】
したがって、本発明のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を、所望の遺伝子の任意の組み合わせの効率的な共発現に関する単一ゲノムベクタープラットフォームの限界を克服するように設計した。他のベクターとは異なり、多くの場合コードされた遺伝子産物の予測できない発現パターンをもたらす、ベクター骨格を改変する複数のクローニング工程を、本発明のマルチゲノムベクター調製物は必要としない。本開示は、従来のベクターシステムの限界を克服し、in vivoでの多遺伝子送達を首尾よく可能にする。本開示は、とりわけ、複数の腫瘍抗原の効果的な標的化を達成する次世代レトロウイルスベクターシステムを提供する。ベクター産生のトランスフェクション段階で制御可能な比率で抗原発現プラスミドを混合する能力は、そうでなければ達成できないマルチゲノムベクターの組み合わせを製造する柔軟性を与え、その汎用性および製造の機敏性により、がん免疫療法を強化させる腫瘍抗原と免疫モジュレーターとの共発現のための最高クラスのベクターシステムが可能になる。本発明のマルチゲノムレトロウイルスベクターシステムは、複数の抗原および／または対象エピトープ（ネオ抗原エピトープを含む）にわたる強い抗原特異的T細胞応答を生成するその能力のために、潜在的に、複数の腫瘍型にわたって抗腫瘍制御に優れた薬剤を生成する強力なプラットフォームである。本開示は、本明細書に記載の他の利点を提供する。
【００２４】
本開示は、単一産生工程において1つの（相同ベクター）または2つの（異種ベクター）導入遺伝子を発現するレトロウイルスベクター粒子の生成を記載する。これは、2つ以上の対象タンパク質を送達および発現させることができ、挿入サイズの制限、遺伝子発現の低下、機能的遺伝子産物の生合成の低下、相対発現レベルの効果的な制御の欠如などを含む、二重または多シストロン性ベクターの構築の現在の限界を克服するレトロウイルスベクター調製物を作製するための新規手法である。
【００２５】
本開示は、一態様において、ヘテロ接合性レトロウイルスベクター粒子、および製造プロセス中に制御され方向づけられた遺伝子再集合によって生成された異なる導入遺伝子をそれぞれコードする2つのRNAゲノムを含むそのようなベクター粒子を生成する方法を記載する（図１参照）。このプロセスはレンチウイルスベクター粒子の混合物を産生し、そのいくつかはヘテロ接合性であり、いくつかはホモ接合性である。本明細書でより詳細に記載されるように、ウイルスベクター調製物中のヘテロ接合性粒子対ホモ接合性粒子の比率が所望に応じて改変され得るようにプロセスを制御することができる。ヘテロ接合性粒子を含むこれらのマルチゲノムウイルスベクター調製物を使用して、標的細胞（例えば、樹状細胞、T細胞または他の標的細胞）においてin vivoまたはin vitroで、2つ以上の異なる対象核酸、例えば、ネオ抗原、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、または任意の他の対象タンパク質を含むがん抗原をコードする核酸を、単独でまたは組み合わせて送達および発現させることができる。本発明は、ベクター化されたがんワクチンの構築における現在の最先端の手法と比較して、優れた免疫原性および保護の幅を有する既製の半パーソナライズおよびパーソナライズされたがんワクチンの迅速な構築を可能にする。
【００２６】
再集合体レトロウイルスベクターからの複数の導入遺伝子の発現は、これらの問題を克服することができる。マルチシストロン性ベクターのクローニングは、導入ベクターゲノム中の対象導入遺伝子の位置の最適化を必要とするが、産生／パッケージング細胞を、異なる導入遺伝子をそれぞれ発現する複数のレトロウイルス導入ベクター（レトロウイルスゲノム）を含むプラスミドの混合物でトランスフェクトすることにより、再集合ベクターをはるかに速く生成することができる。
【００２７】
複数の導入遺伝子の発現は、ときには、細胞を形質導入する前にモノシストロン性ベクター調製物を組み合わせることによって達成される。これには、組み合わされたベクター混合物が高い感染多重度（MOI）でin vitro形質導入に使用されなければならず、その結果、ベクター調製物の非効率的な使用がもたらされる。さらに、この手法は、in vivo投与後の共形質導入の達成を予測することができないため、ワクチンまたは治療環境において非常に非効果的である。本発明は、2つの導入遺伝子の、in vivoおよび非常に低いMOIでのin vitro共発現を可能にする。
【００２８】
本発明は、既製の導入ベクターを用いたマルチプラスミドトランスフェクションにより生成されたベクター混合物に基づいて、パーソナライズされたがんワクチンを作製することを可能にする。これは、in vivoで同じ細胞内での共発現から利益を得る作用機序を有する異なる導入遺伝子から構成されるワクチンを作製することも可能にする。1つの例は、強力な適応免疫応答および免疫記憶の誘導のための、ヘルパーT細胞エピトープをコードする導入遺伝子とCTLまたはB細胞エピトープをコードする導入遺伝子との共発現である。第2の例は、抗原とIRF-3などの細胞内免疫調節因子またはCpGモチーフとの共発現である。第3の例は、操作されたリンカードメインから生じる「非自己」ネオ抗原エピトープの可能性を回避する方法での、インターロイキン12などのヘテロ二量体機能分子の個々のサブユニットの共発現である。第4の例は、非常に大きく、そのためLVに非効率的にパッケージングされた自己複製のレプリコン、転写産物の発現である。大きなレプリコンRNAを2つの別々の相補的ベクター構築物に分割することにより、レプリコン機能性を、パッケージングするのに十分小さい個々の挿入で得ることができる。
【００２９】
さらに、本発明は、本明細書の表１および表２に要約されるように、製造工程中の投入プラスミドの相対量を変化させることによって、個々のベクターゲノムの混合比を効果的に制御することを可能にする。これは、マルチシストロン性ベクターでは確実には達成できない。
【００３０】
さらに、本発明は、各レトロウイルスベクターゲノムの二量体開始シグナルを改変してホモ接合相互作用またはヘテロ接合相互作用のどちらかを促進することによって、任意の所与の調製物におけるヘテロ接合性またはホモ接合性ベクターの割合を制御することができるというさらなる利点を提供する。これに関して、2つのレトロウイルスRNAコピーは、ウイルス出芽前に、それらがgagタンパク質と相互作用する前でさえ、宿主細胞内で会合することが知られている（例えば、Moore et al., AIDS Rev. 2009 Apr-Jun; 11(2): 91-102を参照）。HIV-1では、例えば、パリンドローム配列GCGCGC（配列番号1）を露呈するSL1と呼ばれるRNA中にステムループが存在する。この配列は、他のRNAパートナー上の同一配列とワトソン-クリック様式で相互作用する。この配列を改変すると、二量体化をオンまたはオフにすることができる。この特徴を利用し、所与のゲノムを特定の所望の二量体化特性に合わせることができる。任意のレトロウイルス由来のパリンドローム二量体化配列は、本明細書での使用が意図される。別の例として、HIV-1サブタイプCはパリンドロームGUGCAC（配列番号6）を有する。
【００３１】
一例として、ゲノムAがゲノムBと二量体化する確率を低下させるために、異なるパリンドローム配列をゲノムB（ゲノムAのパリンドローム配列と対合しない配列）において使用することができ、それがそれ自身とのみ二量体化するようにする。この配列は、ホモ二量体化を可能にするが、ゲノムAとのヘテロ二量体化はできないように設計することができる。これは、特定の対象配列が、ホモ接合性ベクターに存在することから恩恵を受ける状況において、例えば免疫応答を生成する目的で、有用であり得る。
【００３２】
別の例として、パリンドローム二量体化配列は、ホモ二量体化が起こり得ないように改変され得る（例えば、配列は非パリンドロームに改変される）。その代わりに、その配列は、同種パートナーと強い塩基対合を形成するように設計される。例えば、ゲノムAについてはGCCCGG（配列番号2）、ゲノムBについてはCCGGGC（配列番号3）などの配列。この配列構成は、異種二量体対合およびヘテロ接合性ベクター粒子形成に有利である。このようにして、調製物中のヘテロ接合性ベクター粒子（再集合体）の得られる割合を制御し、50%を超える再集合体を含有させることができる。これは、例えば、免疫調節分子が特定の抗原とともに送達され、同じ宿主細胞に最良に送達される場合（例えば、IRF3、CD40、siRNAまたは他の対象配列が使用され、共送達される必要がある場合）に有用である。ヘテロ接合対合を促進することが望ましい他の例は、CART産生のためにできるだけ少ないホモ二量体でTCRアルファおよびベータ鎖を発現させることである。本明細書において意図される他の二量体化モチーフには、それぞれAおよびBのGGGGGG（配列番号4）およびCCCCCC（配列番号5）が含まれる。1つ以上のA-U塩基対合の付加を用いて、相互作用の結合強度を改変することができる。Baig et al., 2008 Retrovirl 5:65；Lu et al 2011 J Mol Biol 410:609；Moore et al., 2007 J Virol 81:4002；Moore et al., AIDS Rev. 2009 Apr-Jun; 11(2): 91-102；Tran et al., 2015 Retrovirol 12:83も参照。
【００３３】
（A.ウイルスベクターエンベロープ）
本明細書に記載のウイルスベクターは、一般に、異種ウイルス由来のエンベロープタンパク質で偽型化される。「偽型化」レンチウイルスは、レンチウイルスゲノムとは異なるウイルスによってコードされる1つ以上のエンベロープ糖タンパク質を有するレンチウイルス粒子である。エンベロープ糖タンパク質は、本明細書に記載のように修飾、突然変異または操作することができる。当業者に知られているような適切な標的化および他の特性を有する任意のエンベロープ糖タンパク質を用いて、本明細書のウイルスベクターを偽型化することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、VSVgエンベロープ糖タンパク質で偽型化される。他の実施形態では、ウイルスベクターは、異種HIV（例えばHIV-2）、またはネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウマ感染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（SIV）もしくはマエディ／ビスナウイルスなどの他の異種レトロウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質で偽型化されてもよい。さらに別の実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、麻疹ウイルスエンベロープ糖タンパク質で偽型化されている。
【００３４】
特定の実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、アルボウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質で偽型化されている。節足動物媒介ウイルス（アルボウイルス）は、ヒト、ウマ、または鳥などの宿主に、蚊などの感染した節足動物ベクターによって伝染されるウイルスである。アルボウイルスは、アルファウイルスおよびフラビウイルスを含むウイルスのサブファミリーにさらに分けられ、これらは、正極性の一本鎖RNAゲノムおよび糖タンパク質含有エンベロープを有する。例えば、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルスおよび西ナイルウイルスはフラビウイルス科に属し、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスは、アルファウイルス科のメンバーである（Wang et al. J. Virol. 66, 4992 (1992)）。シンドビスウイルスのエンベロープは2つの膜貫通糖タンパク質を含む（Mukhopadhyay et al. Nature Rev. Microbio. 3, 13 (2005)）：融合に関与すると考えられるE1、および細胞結合に関与すると考えられるE2。シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質は、オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスを含む他のレトロウイルスを偽型化することが知られている。
【００３５】
シンドビスウイルスおよび他のアルファウイルスのエンベロープは、ウイルス粒子膜の脂質二重層に組み込まれ、典型的には、2つの糖タンパク質E1およびE2の複数のコピーを含む。各糖タンパク質は膜貫通領域を有し；E2は約33残基の細胞質ドメインを有し、E1の細胞質尾部は非常に短い（約2残基）。E1およびE2の両方は、膜貫通領域またはその近傍に結合したパルミチン酸を有する。E2は、フーリンまたは他のCa2+依存性セリンプロテイナーゼによって、E2およびE3と呼ばれる小さな糖タンパク質に切断される前駆体タンパク質として最初に合成される。E2およびE1をコードする配列の間には、6Kと呼ばれるタンパク質をコードする配列が位置する。E3および6Kは、それぞれE2およびE1糖タンパク質を膜に転位させる働きをするシグナル配列である。シンドビスウイルスゲノムにおいて、シンドビスエンベロープタンパク質のコード領域は、E3、E2、6KおよびE1をコードする配列を含む。本明細書で使用される場合、アルボウイルスウイルスの「エンベロープ」は、少なくともE2を含み、E1、6KおよびE3も含み得る。シンドビスウイルス、HR株のエンベロープ糖タンパク質の例示的配列は、WO2011/011584の配列番号17として提示される。他のアルボウイルスのエンベロープ糖タンパク質の配列は、例えば、GenBankにおいて見ることができる。例えば、デング熱ウイルス糖タンパク質をコードする配列は、受託番号GQ252677（GenBankの中で）およびNCBIのウイルス変異データベース（GenBank受託番号およびウイルス変異データベースは、エンベロープ糖タンパク質配列については参照により組み込まれる）で、ならびにベネズエラウマ脳炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする配列は、受託番号NP040824で見ることができる（エンベロープ糖タンパク質の配列については参照により組み込まれる）。
【００３６】
アルファウイルス、および特にシンドビスウイルスの樹状細胞上の細胞受容体（単数または複数）は、今日まで決定的には同定されていないが、1つの受容体はDC-SIGNであるようである（Klimstra et al., J Virol 77: 12022, 2003）。用語「付着」、「結合」、「標的化」などの使用は、交換可能に使用され、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質と細胞成分との間の相互作用の機序を示すことを意味するものではない。DC-SIGN（樹状細胞特異的ICAM-3（細胞内接着分子3）-結合ノンインテグリン；CD209としても知られている）は、物質の迅速な結合およびエンドサイトーシスが可能なC型レクチン様受容体である（Geijtenbeek, T. B., et al. Annu. Rev. Immunol. 22: 33-54, 2004）。E2はDC-SIGNを介してウイルスを樹状細胞に標的化させるようである。本明細書に示されるように、DC-SIGNを発現する細胞は、シンドビスウイルスE2で偽型化されたウイルスベクター粒子により、DC-SIGNを発現しない同系細胞よりも良好に（少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも約6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍良好に）形質導入される。E2糖タンパク質がウイルス感染をどのように促進するかの機序は、DC-SIGNに作用するようであり、DC-SIGNに直接的に結合することによるか、または立体配座もしくは他の何らかの機序の変化を引き起こすことによると考えられる。実際の機序にかかわらず、E2による標的化は、DC-SIGNを発現する細胞、すなわち樹状細胞に優先的である。
【００３７】
シンドビスウイルスもヘパラン硫酸を介して細胞に結合するようである（Klimstra et al., J Virol 72: 7357, 1998；Burmes and Griffin, J Virol 72: 7349, 1998）。ヘパラン硫酸および他の細胞表面のグリコサミノグリカンはほとんどの細胞型の表面に見られるため、ヘパラン硫酸およびシンドビスエンベロープ糖タンパク質との間の相互作用を低減させることが望ましい。これは、シンドビスウイルスエンベロープのヘパラン硫酸への結合を減少させることによるか、またはシンドビスウイルスエンベロープの樹状細胞への結合を増加させること、例えば、親和性を増加させることによるか、またはその両方によって達成することができる。その結果、他の細胞型によって発現され得る他の分子、およびエンベロープがDC-SIGNに特異的であっても起こり得る他の分子との非特異的結合は減少し、改善された特異性は、所望の免疫応答を低下させ得る副作用、または他の細胞型の標的外形質導入に関連する副作用などの望ましくない副作用を回避する働きをし得る。DC-SIGNを発現する細胞の比較的特異的な形質導入の利点の代わりに、またはそれに加えて、シンドビスウイルスエンベロープE2糖タンパク質で偽型化されたウイルス粒子は、VSVGなどの糖タンパク質で偽型化されたウイルス粒子に優る他の利点を提供し得る。そのような利点の例には、補体媒介性溶解の減少および／または神経細胞標的の減少が含まれ、両方ともVSV-G偽型ウイルス粒子の投与と関連すると考えられている。
【００３８】
様々な例示において、レンチウイルスベクター粒子は、DC-SIGNを発現する細胞に特異的に結合し、ヘパラン硫酸への結合を減少させたか、または阻害した。すなわち、シンドビスウイルスエンベロープE2糖タンパク質は、他の細胞型よりもDC-SIGNを発現する樹状細胞にウイルスを優先的に向けるように修飾され得る。構造研究および他の研究での分子モデリングから得られた情報に基づいて、エンベロープタンパク質、特にE2およびE1糖タンパク質の変異体配列は、糖タンパク質がエンベロープタンパク質としての機能を維持するが、所望の結合特異性、親和性、または結合レベルを有するように設計および生成される。候補の変異体配列を各糖タンパク質について作製し、本明細書に記載の方法または当該技術分野で知られている他の方法を用いてアッセイし、最も望ましい特性を有するエンベロープ糖タンパク質を同定することができる。
【００３９】
（B.レンチウイルスベクターゲノム）
ウイルスベクター粒子は、対象配列（単数または複数）を含むゲノムを含む。ゲノムがウイルス粒子内にパッケージングされるのを可能にする配列、および標的細胞の形質導入後の対象配列（単数または複数）の発現を促進する配列などの他の配列が含まれてもよい。ゲノムは、PfeiferおよびVermaによって記載されているような、ヒト遺伝子治療適用のために同定されたものを含む、多数の適切で利用可能なレトロウイルス、例えばレンチウイルスゲノムベースのベクターのいずれかに由来し得る（Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211, 2001）。
【００４０】
（骨格）
適切なレトロウイルスベクターゲノムは、以下を含む任意のレトロウイルスに由来し得る：アルファレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス）、ベータレトロウイルス（マウス乳房腫瘍ウイルス）、ガンマレトロウイルス（ネズミ白血病ウイルス；ネコ白血病ウイルス）、デルタレトロウイルス（ウシ白血病ウイルス；ヒトTリンパ好性ウイルス（HTLV））、イプシロンレトロウイルス、スプマウイルス（サル泡沫状ウイルス）およびレンチウイルス。特に例示的なレトロウイルスベクターゲノムには、レンチウイルスベクターゲノムが含まれる。レンチウイルスベクターゲノムには、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）、HIV-2、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウマ伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（SIV）およびマエディ／ビスナウイルスに基づくものが含まれる。レンチウイルスの望ましい特徴は、それらが分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染することができることであり、標的細胞が分裂する（または標的細胞を分裂するように刺激する）必要はない。一般に、ゲノムおよびエンベロープ糖タンパク質は、得られるウイルスベクター粒子が偽型化されるように、異なるウイルスに基づくことになる。ベクターゲノムの安全機能が望ましくは組み込まれる。安全機能には、自己不活性化LTRおよび非組み込みゲノムが含まれる。
【００４１】
いくつかの例示的な実施形態では、ウイルスベクターゲノムは、HIV-1ゲノムまたはSIVゲノムなどのレンチウイルスゲノム由来の配列を含む。ウイルスゲノム構築物は、レンチウイルスの5'および3'LTRからの配列を含むことができ、特に、レンチウイルスの5'LTRからのRおよびU5配列、ならびにレンチウイルスからの不活性化または自己不活性化3'LTRを含み得る。LTR配列は、任意の種由来の任意のレンチウイルス由来のLTR配列であり得る。例えば、それらは、HIV、SIV、FIVまたはBIV由来のLTR配列であってもよい。典型的には、LTR配列はHIV LTR配列である。
【００４２】
ベクターゲノムは、不活性化または自己不活性化3'LTRを含み得る（Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998；Miyoshi et al., J Virol 72:8150, 1998）。自己不活性化ベクターは、一般に、ベクター組み込み中に5'LTRにコピーされる3'の長い末端反復（LTR）からのエンハンサーおよびプロモーター配列の欠失を有する。1つの例において、3'LTRのU3要素は、そのエンハンサー配列、TATAボックス、Sp1およびNF-カッパB部位の欠失を含む。自己不活性化3'LTRの結果として、侵入および逆転写後に生成されるプロウイルスは、不活性化5'LTRを含むことになる。その論拠は、ベクターゲノムの動員の危険性および近接細胞プロモーターに対するLTRの影響を低減することによって安全性を改善することである。自己不活性化3'LTRは、当該技術分野で知られている任意の方法によって構築され得る。
【００４３】
任意に、レンチウイルス5'LTRからのU3配列は、異種プロモーター配列などのウイルス構築物中のプロモーター配列で置換してもよい。これにより、パッケージング細胞株から回収したウイルスの力価を増加することができる。エンハンサー配列も含まれ得る。パッケージング細胞株においてウイルスRNAゲノムの発現を増加させる任意のエンハンサー／プロモーターの組合せを使用してもよい。1つの例では、CMVエンハンサー／プロモーター配列が使用される（米国特許第5385839号明細書および米国特許第5168062号明細書）。
【００４４】
レトロウイルスベクターゲノムは、一般に、gag、および／またはpolに欠損がある（Coffin, J., In: RNA Tumor Viruses, Weiss, R. et al. (ed) Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 2, pp. 36-73, 1985を参照）。したがって、本明細書での使用に適したレトロウイルスベクターゲノムは、一般に、いったんパッケージングされると、標的細胞に感染し、それらのRNAゲノムを逆転写し、特定の実施形態では、逆転写DNAを標的細胞ゲノムに組み込む（またはエピソームとして残る）ことができるが、標的細胞内で複製して感染性レトロウイルス粒子を生成することはできない欠損レトロウイルスベクターゲノムである。これらのいわゆる第3および第4世代レトロウイルスベクターは、本質的には、大半または全てのHIVタンパク質を摘出したゲノムを有する。粒子産生に必要なウイルスタンパク質は、そうしてパッケージングシステムでトランスで提供され、安全性に大きな利点がある。したがって、特定の実施形態では、ベクターゲノムは、機能的gag/polオープンリーディングフレームを含まないポリヌクレオチドを含む。したがって、特定の実施形態では、適切なベクターゲノムは、機能的gagまたはpolタンパク質をコードしない。特定の実施形態では、適切なベクターゲノムは、機能的gag、polまたはenvタンパク質をコードしない。当業者に理解されるように、特定の実施形態では、gag/polの完全なコード領域が存在しなくてもクローニングおよび／または効率的なパッケージングを容易にするために、パッケージングシグナルの近傍のいくつかのgag配列を保持することが望ましい場合がある。
【００４５】
特定の実施形態では、挿入変異誘発の危険性は、組み込み欠陥であるレンチウイルスベクターゲノムを構築することによって最小限に抑えられる。様々な手法を追求して、非組み込みベクターゲノムを産生することができる。これらの手法は、不活性インテグラーゼを有するタンパク質をコードするように、pol遺伝子のインテグラーゼ酵素成分に突然変異（単数または複数）を組み込むことを伴う。ベクターゲノム自体は、例えば、付着部位の一方または両方を突然変異もしくは欠損させることによって、または欠失もしくは修飾によって3'LTR近位ポリプリン管（PPT）を非機能的にすることによって、組み込みを防ぐように改変することができる。さらに、非遺伝的手法が利用可能である；これらには、インテグラーゼの1つ以上の機能を阻害する薬理作用のある物質が含まれる。この手法は相互に排他的ではなく、すなわち、1つより多くの手法を同時に使用することはできない。例えば、インテグラーゼおよび付着部位の両方が機能しないか、またはインテグラーゼおよびPPT部位が機能しないか、または付着部位およびPPT部位が機能しないか、またはそれらの全てが機能しなくなる可能性がある。
【００４６】
上記のように、1つの手法は、非機能性インテグラーゼを作製し使用することである。インテグラーゼは、ウイルスの二本鎖平滑末端DNAの切断、および染色体標的部位の二本鎖中の5'-リン酸にその末端を連結することに関与する。インテグラーゼは3つの機能ドメインを有する：亜鉛結合モチーフ（HHCC）を含むN末端ドメイン、触媒コアおよび保存DD35Eモチーフ（HIV-1中のD64、D116、E152）を含む中央ドメインコア、ならびにDNA結合特性を有するC末端ドメイン。インテグラーゼに導入された点突然変異は、正常な機能を妨害するのに十分である。多くのインテグラーゼ変異が構築され、特性評価されている（Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007；Apolonia, Thesis submitted to University College London, April 2009, pp, 82-97；Engelman et al. J Virol 69: 2729, 1995；Nightingale et al. Mol Therapy, 13: 1121, 2006を参照）。インテグラーゼタンパク質をコードする配列は、好ましくは逆転写酵素活性または核標的を著しく損なうことなく、欠失または突然変異されてタンパク質を不活性にすることができ、それにより標的細胞ゲノムへのプロウイルスの組み込みのみを防ぐ。許容可能な突然変異は、インテグラーゼ触媒、鎖転移、att部位への結合、宿主染色体DNAへの結合および他の機能を低下させることができる。例えば、HIVまたはSIVインテグラーゼの残基35での単一アスパラギン酸からのアスパラギン置換は、ウイルスDNAの組み込みを完全に無効にする。インテグラーゼの欠失は、一般に、C末端ドメインに限定される。残基235〜288のコード配列の欠失は、有用な非機能性インテグラーゼをもたらす（Engelman et al. J Virol 69: 2729, 1995）。さらなる例として、例えば、Asp64（残基番号がHIV-1に対して与えられ、他のレンチウイルスまたはレトロウイルス由来のインテグラーゼの対応する残基番号は当業者によって容易に判定され得る）（例えば、D64E、D64V）、Asp116（例えば、D116N）、Asn120（例えば、N120K）、Glu152、Gln148（例えば、Q148A）、Lys156、Lys159、Trp235（例えば、W235E）、Lys264（例えば、K264R）、Lys266（例えば、K266R）、Lys273（例えば、K273R）といった、突然変異を生成することができる。他の突然変異を構築し、組み込み、導入遺伝子発現、および任意の他の望ましいパラメータについて試験することができる。これらの機能についてのアッセイはよく知られている。突然変異は、部位特異的突然変異誘発および核酸配列の化学合成を含む、様々な技術のいずれかによって生成することができる。1つの突然変異が作られてもよく、またはこれらの突然変異の1つ以上がインテグラーゼに存在し得る。例えば、インテグラーゼは、2つのアミノ酸、3つのアミノ酸、4つのアミノ酸などで突然変異を有していてもよい。
【００４７】
あるいは、またはインテグラーゼ変異体（単数または複数）の使用と組み合わせて、U3およびU5における結合部位（att）を突然変異させることもできる。インテグラーゼはこれらの部位に結合し、3'末端ジヌクレオチドはベクターゲノムの両端で切断される。CAジヌクレオチドは、陥凹3'末端に位置する：CAはプロセシングに必要であり、ヌクレオチドの突然変異は宿主染色体への組み込みを阻止する。CAジヌクレオチドのAは組み込みに最も重要なヌクレオチドであり、ゲノムの両端の突然変異が最良の結果を与える（Brown et al J Virol 73:9011 (1999)）。1つの例示において、各末端のCAはTGに変更される。他の例示では、各末端のCAは一方の末端でTGに、他方の末端でGTに変更される。他の例示では、各末端のCAは欠失され；他の例示ではCAのAが各末端で欠失される。
【００４８】
組み込みは、3'LTRの近位に位置する3'ポリプリン管（PPT）（WO2009/076524）の突然変異または欠失によっても阻害することができる。PPTはプラス鎖DNA合成のプライマー結合部位として働くことができる約15ヌクレオチドのポリプリン配列である。この場合、PPTの突然変異または欠失は、逆転写プロセスを標的とする。機序にとらわれることを望むわけではないが、PPTの突然変異または欠失により、線状DNAの生成が急激に減少し、基本的に1-LTR DNA環のみが産生される。組み込みには線状二本鎖DNAベクターゲノムが必要であり、組み込みは本質的にそれなしでは排除される。上記のように、PPTを、突然変異または欠失によって非機能性にすることができる。典型的には、約15ntのPPT全体が欠失されるが、いくつかの実施形態では、14nt、13nt、12nt、11nt、10nt、9nt、8nt、7nt、6nt、5nt、4nt、3ntおよび2ntのより短い欠失が作られ得る。突然変異が起こると、典型的には、複数の突然変異が、特にPPTの5'半分において作られるが（McWilliams et al., J Virol 77:11150, 2003）、最初の4塩基の単一および二重突然変異は依然として転写を減少させる。PPTの3'末端でなされた突然変異は、一般に、より劇的な効果を有する（Powell and Levin J Virol 70:5288, 1996）。
【００４９】
ベクターゲノムを非組み込み性にするためのこれらの異なる手法は、個別にまたは組み合わせて使用することができる。1つより多くの手法を使用して、重複機序を介してフェイルセーフベクターを構築することができる。したがって、PPT突然変異もしくは欠失は、att部位突然変異もしくは欠失と、またはインテグラーゼ突然変異と組み合わせることができるか、あるいはPPT突然変異もしくは欠失は、att部位突然変異もしくは欠失およびインテグラーゼ突然変異の両方と組み合わせることができる。同様に、att部位突然変異または欠失およびインテグラーゼ突然変異は、互いにまたはPPT突然変異もしくは欠失と組み合わせることができる。
【００５０】
（2.調節要素）
本明細書で論じるように、ウイルスベクターゲノムは、標的細胞で発現するのが望ましい1つ以上の対象核酸を含む。簡潔にするために、用語「対象配列」（SOI）は、1つ以上の対象配列（抗原など、1つ以上の他の免疫賦活性分子、サイトカインまたは1つ以上のさらなる抗原の有無に関わらない）を意味するために使用される。典型的には、対象配列は5'LTR配列と3'LTR配列との間に位置する。さらに、対象配列は、好ましくは、他の遺伝要素、例えばプロモーターまたはエンハンサーを含む転写調節配列などと機能的関係にあり、特定の様式で対象配列の発現を調節する。場合によっては、有用な転写調節配列は、時間的および空間的の両方で、活性に関して高度に調節されるものである。構成要素の発現を調節するために使用され得る発現制御要素は、当該技術分野で知られており、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサーおよび他の調節要素を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
対象配列および任意の他の発現可能な配列は、典型的には、内部プロモーター／エンハンサー調節配列と機能的関係にある。「内部」プロモーター／エンハンサーは、ウイルスベクター構築物中の5'LTR配列と3'LTR配列との間に位置し、対象配列に作動可能に連結されたものである。内部プロモーター／エンハンサーは、それが機能的関係にある遺伝子の発現を増加させることが知られている任意のプロモーター、エンハンサーまたはプロモーター／エンハンサーの組み合わせであり得る。「機能的関係」および「作動可能に連結された」とは、プロモーターおよび／またはエンハンサーが適切な分子と接触したときに対象配列が発現されるように、配列がプロモーターおよび／またはエンハンサーに対して正しい位置および方向にあることを意味するが、これに限定されない。
【００５２】
内部プロモーター／エンハンサーの選択は、対象配列の所望の発現パターンおよび既知プロモーター／エンハンサーの特異的性質に基づく。したがって、内部プロモーターは構成的に活性であり得る。使用され得る構成的プロモーターの非限定的な例には、以下のプロモーターが含まれる：ユビキチン（米国特許第5510474号明細書；WO98/32869）、CMV（Thomsen et al., PNAS 81:659, 1984；米国特許第5168062号明細書）、ベータアクチン（Gunning et al. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831-4835）、ならびにpgk（例えば、Adra et al. 1987 Gene 60:65-74：Singer-Sam et al. 1984 Gene 32:409-417；およびDobson et al. 1982 Nucleic Acids Res. 10:2635-2637を参照）。
【００５３】
あるいは、プロモーターは、組織特異的プロモーターであってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、プロモーターは標的細胞特異的プロモーターである。例えば、プロモーターは、CD11c、CD103、TLR、DC-SIGN、BDCA-3、DEC-205、DCIR2、マンノース受容体、デクチン-1、Clec9A、MHCクラスIIを含む、樹状細胞によって発現される任意の産物からのものであり得る。さらに、対象配列の誘導発現を可能にするためのプロモーターを選択してもよい。誘導可能な発現のための多くの系が当該技術分野で知られており、例えばテトラサイクリン応答系、lacオペレーター-リプレッサー系が挙げられ、ならびに、様々な環境または生理学的変化に応答するプロモーター、例えば熱ショック、金属イオンではメタロチオネインプロモーターなど、インターフェロン、低酸素症、ステロイドではプロゲステロンまたはグルココルチコイド受容体プロモーターなど、放射線ではVEGFプロモーターなどが挙げられる。プロモーターの組み合わせを使用して、対象遺伝子の所望の発現を得ることもできる。当業者は、対象生物または対象標的細胞における遺伝子の所望の発現パターンに基づいてプロモーターを選択することができるであろう。
【００５４】
ウイルスゲノムは、少なくとも1つのRNAポリメラーゼIIまたはIII応答性プロモーターを含み得る。このプロモーターは対象配列に作動可能に連結することができ、終止配列に連結することもできる。さらに、1つより多くのRNAポリメラーゼIIまたはIIIプロモーターが組み込まれ得る。RNAポリメラーゼIIおよびIIIプロモーターは、当業者によく知られている。RNAポリメラーゼIIIプロモーターの適切な範囲は、例えば、Paule and White, Nucleic Acids Research., Vol. 28, pp 1283-1298 (2000)で見ることができる。RNAポリメラーゼIIまたはIIIプロモーターは、下流のRNAコード配列を転写するようにRNAポリメラーゼIIまたはIIIに指示することができる任意の合成または操作されたDNA断片も含む。さらに、RNAポリメラーゼIIもしくはIII（Pol IIもしくはIII）プロモーターまたはウイルスベクターゲノムの一部として使用されるプロモーターは、誘導性であり得る。任意の適切な誘導性Pol IIまたはIIIプロモーターを、本発明の方法とともに使用することができる。特に適切なPol IIまたはIIIプロモーターには、Ohkawa and Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11, pp 577-585 (2000)およびMeissner et al. Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682 (2001)において提供されたテトラサイクリン応答性プロモーターが含まれる。
【００５５】
対象遺伝子の発現を増加させるために、内部エンハンサーがウイルス構築物中に存在してもよい。例えば、CMVエンハンサー（Boshart et al. Cell, 41:521, 1985）が使用され得る。HIV、CMV、および哺乳動物ゲノムなどのウイルスゲノムの多くのエンハンサーが同定され、特性評価されている（GenBankを参照）。エンハンサーは、異種プロモーターと組み合わせて用いることができる。当業者は、所望の発現パターンに基づいて適切なエンハンサーを選択することができるであろう。
【００５６】
ウイルスベクターゲノムは通常、標的細胞によって認識され、対象配列、ウイルス成分、および本明細書で論じられる他の配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写が起こることを可能にする核酸配列によって形成される発現制御要素である。プロモーターは、誘導性、構成的、時間的に活性または組織特異的であり得る。誘導性プロモーターの活性は、生物的または非生物的因子の有無によって誘導される。誘導性プロモーターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現が、生物の発生の特定の段階、その製造、または特定の組織においてオンまたはオフになることができるため、遺伝子工学において有用な手段となり得る。誘導性プロモーターは、化学的に調節されるプロモーター、および物理的に調節されるプロモーターとして分類することができる。典型的な化学的に調節されるプロモーターには、限定されないが、以下が含まれる：アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼI（alcA）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体（GR）ベースのプロモーター、ヒトエストロゲン受容体（ER）ベースのプロモーター、蛾エクジソン受容体ベースのプロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーベースのプロモーター）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子ベースのプロモーター）、および病原関連のプロモーター（例えば、シロイヌナズナおよびトウモロコシ病原性関連（PR）タンパク質ベースのプロモーター）。典型的な物理的に調節されるプロモーターには、限定されないが、以下が含まれる：温度調節プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）および光調節プロモーター（例えば、ダイズSSUプロモーター）。他の例示的なプロモーターは、例えば、2009年5月18日にアクセスされたPatent Lensウェブサイトの「遺伝子発現を調節するために使用されるプロモーター」など、他の場所に記載されている。
【００５７】
当業者は、特定の状況に基づいて適切なプロモーターを選択することができるであろう。多くの異なるプロモーターが、発現されるべき遺伝子にプロモーターを作動可能に連結させるための方法と同様に、当該技術分野でよく知られている。天然のプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を用いて、パッケージング細胞および標的細胞中で発現を指示することができる。しかしながら、異種プロモーターは、それらが一般にネイティブプロモーターと比較して所望のタンパク質のより多くの転写およびより高い収率を可能にするため、好ましい。
【００５８】
プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよびサルウイルス40（SV40）などのウイルスのゲノムから得ることができる。プロモーターはまた、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、または天然の配列に通常付随するプロモーターであってもよく、ただし、そのようなプロモーターは標的細胞と相性がいいものとする。一実施形態では、プロモーターは、ウイルス発現系において天然に存在するウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、樹状細胞特異的プロモーターである。樹状細胞特異的プロモーターは、例えば、CD11cプロモーターであり得る。
【００５９】
転写は、エンハンサー配列をベクター（単数または複数）に挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは、典型的には、DNAのシス作用性要素で、通常約10〜300bpの長さであり、プロモーターに作用してその転写を増加させる。多くのエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ-フェトプロテイン、およびインスリン）ならびに真核細胞ウイルスから今では知られている。例には、複製起点の後半側のSV40エンハンサー（bp100〜270）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、抗原特異的ポリヌクレオチド配列の5'または3'の位置でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5'の部位に位置する。
【００６０】
発現ベクターは、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列も含み得る。これらの配列は、真核生物またはウイルスのDNAもしくはcDNAの5'および時には3'非翻訳領域によく見られ、当該技術分野でよく知られている。
【００６１】
ウイルスベクターゲノムは、さらなる遺伝的要素も含み得る。構築物に含まれ得る要素のタイプは、決して限定されず、特定の結果を達成するために選択され得る。例えば、標的細胞におけるウイルスゲノムの核内移行を促進するシグナルが含まれ得る。そのようなシグナルの例は、HIV-1 cPPT/CTSシグナル（DNAフラップ）である。さらに、標的細胞におけるプロウイルス組み込み部位の特性評価を容易にする要素が含まれ得る。例えば、tRNAアンバーサプレッサー配列が構築物に含まれ得る。例えば、ニワトリβ-グロビン由来のインスレーター配列もウイルスゲノム構築物に含まれ得る。この要素は、メチル化およびヘテロクロマチン化効果のために、標的細胞中に組み込まれたプロウイルスをサイレンシングする機会を減少させる。さらに、インスレーターは、内部エンハンサー、プロモーターおよび外因性遺伝子を、染色体上の組み込み部位における周囲のDNAからのポジティブまたはネガティブな位置効果から遮蔽することができる。さらに、ベクターゲノムは、対象遺伝子の発現を増強するように設計された1つ以上の遺伝子要素を含み得る。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答要素（WRE）を構築物に入れることができる（Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74:3668-3681；Deglon et al. 2000. Hum. Gene Ther. 11:179-190）。
【００６２】
ウイルスベクターゲノムは、典型的には、パッケージング細胞または産生細胞株にトランスフェクトされ得るプラスミド形態で構築される。このプラスミドは、一般に、細菌におけるプラスミドの複製に有用な配列を含む。そのようなプラスミドは、当該技術分野でよく知られている。さらに、原核生物の複製起点を含むベクターは、その発現が薬剤耐性などの検出可能なまたは選択可能なマーカーを付与する遺伝子も含み得る。典型的な細菌性薬剤耐性産物は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与えるものである。
【００６３】
本明細書に記載の1つ以上の成分を含むプラスミドは、当該技術分野でよく知られている標準的技術を用いて容易に構築される。構築されたプラスミド中の正しい配列を確認する分析では、プラスミドを大腸菌内で複製し、精製し、制限エンドヌクレアーゼ消化または通常の方法によって同定されるそのDNA配列によって分析することができる。
【００６４】
哺乳類細胞における一過性発現のために構築されたベクターも使用され得る。一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次いで、発現ベクター中の抗原特異的ポリヌクレオチドにコードされる高レベルのポリペプチドを合成するように、宿主細胞において効率的に複製することができる発現ベクターの使用を含む。上記Sambrookらの16.17〜16.22頁を参照。ポリペプチドの発現に適応させるのに適した他のベクターおよび方法は、当該技術分野でよく知られており、特定の状況に容易に適応される。
【００６５】
本明細書で提供される教示を使用して、レポータータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターでパッケージング細胞をトランスフェクションすることによって、および、適切な技術、例えば、緑色蛍光タンパク質コンジュゲートからの蛍光の測定を用いて発現を測定することによって、特定の発現系の有効性が試験され得ることを、当業者は認識するであろう。適切なレポーター遺伝子は、当該技術分野でよく知られている。
【００６６】
（二量体開始部位（DIS）配列）
レトロウイルスは、スプライシングされていないRNAゲノムの2コピーを選択的にパッケージングする。2つのレトロウイルスRNAコピーは、ウイルス出芽前に、それらがgagタンパク質と相互作用する前でさえ、宿主細胞内で会合することが知られている（例えば、Moore et al., AIDS Rev. 2009 Apr-Jun; 11(2): 91-102；Lu et al 2011 J Mol Biol 410:609を参照）。HIV-1では、例えば、ゲノムの5'末端の近く、主に5'非翻訳領域（5'UTR）内に位置する、パリンドローム配列GCGCGC（配列番号1）を露呈するSL1と呼ばれるRNA中にステムループが存在する。この配列は、他のRNAパートナー上の同じ配列とワトソン-クリック様式で相互作用する。この配列を修飾すると、二量体化をオンまたはオフにすることができる。この特徴は、所与のゲノムを特定の所望の二量体化特性に合わせるために利用することができる。任意のレトロウイルス由来のパリンドロームまたは非パリンドローム二量体開始部位（DIS）配列は、本明細書での使用が意図される。合成パリンドロームまたは非パリンドロームDIS配列も、本明細書での使用が意図される。別の例として、HIV-1サブタイプCは、パリンドロームGUGCAC（配列番号6）を有する。
【００６７】
一例として、ゲノムAがゲノムBと二量体化する確率を低下させるために、異なるパリンドローム配列をゲノムB（ゲノムAのパリンドローム配列と対になっていない配列）で使用することができ、それがそれ自身とのみ二量体化することを可能にする。この配列は、ホモ二量体化を可能にするが、ゲノムAとのヘテロ二量体化はできないように設計することができる。これは、特定の対象配列が、ホモ接合性ベクターに存在することから恩恵を受ける状況において、例えば免疫応答を生成する目的で、有用であり得る。
【００６８】
別の例として、パリンドロームDIS配列は、ホモ二量体化が減少するように修飾され得る（例えば、配列は非パリンドロームに改変される）。その代わりに、その配列は、同種のパートナーと強い塩基対合を形成するように設計される。例えば、ゲノムAについてはGCCCGG（配列番号2）、ゲノムBについてはCCGGGC（配列番号3）などの配列。この配列構成は、異種二量体対合およびヘテロ接合性ベクター粒子形成に有利である。このようにして、調製物中のヘテロ接合性ベクター粒子（再集合体）の得られる割合を改変し、50%を超える再集合体ヘテロ接合性粒子を含有させることができる。これは、例えば、免疫調節分子が特定の抗原とともに送達され、同じ宿主細胞に最良に送達される場合（例えば、IRF3、CD40、siRNAまたは他の対象配列が使用され、共送達される必要がある場合）に有用である。ヘテロ接合対合を促進することが望ましい他の例は、CART産生のためにできるだけ少ないホモ二量体でTCRアルファおよびベータ鎖を発現させることである。本明細書において企図される他の二量体化モチーフには、それぞれAおよびBのGGGGGG（配列番号4）およびCCCCCC（配列番号5）が含まれる。1つ以上のAU塩基対合の付加を用いて、相互作用の結合強度を改変することができる。本明細書中のベクターにおいて使用され得るさらなる二量体化配列の対合には、以下が含まれる：GCGCGG（配列番号7）のCGCGCC（配列番号8）との対合；GGGCGG（配列番号9）のCCCGCC（配列番号10）との対合。Lu et al 2011 J Mol Biol 410:609；Baig et al., 2008 Retrovirl 5:65；Moore et al., 2007 J Virol 81:4002；Moore et al., AIDS Rev. 2009 Apr-Jun; 11(2): 91-102；Tran et al., 2015 Retrovirol 12:83も参照。あるゲノムと別のゲノムとの所望の対合を促進するように機能するか、または二量体化配列として働く任意のRNA配列もしくは配列対は、本明細書のウイルスベクターおよびパッケージングシステムとともに使用されることが意図される。
【００６９】
（対象配列（SOI））
対象配列は決して限定されず、当業者が転写を望み、標的細胞内で発現する任意の核酸を含む。典型的には、対象配列はレトロウイルスベクターゲノムに対して異種であるが、特定の実施形態では、対象配列はレトロウイルスタンパク質をコードし得る。生成物は、タンパク質または核酸であり得る。対象配列は、siRNA、マイクロRNA、相補的領域が約20リボヌクレオチド長を超える自己相補的二本鎖RNA、またはメッセージRNAに相補的なRNAであって、メッセージRNAへの前記相補的（アンチセンス）RNAの結合が、タンパク質に翻訳されるその能力を阻害するRNAを含むタンパク質または核酸分子をコードすることができる。
【００７０】
ある場合には、対象配列は、免疫応答が望まれる抗原をコードすることができる。特に、腫瘍抗原、特にネオ抗原、ならびにHIV、RSV、HBV、HSV、HCV、HPV、百日咳、黄色ブドウ球菌、マラリア、または結核などの薬剤からの感染性疾患抗原が望ましい。多くの疾患および障害に関連する抗原は、当該技術分野においてよく知られている。抗原は、疾患または障害と関連することが以前から知られている場合があり、または当該技術分野で知られている任意の方法によって同定されている場合がある。例えば、腫瘍関連抗原もしくはネオ抗原などの、患者が罹患しているがんの種類に対する抗原を知ることができ、または当該技術分野で知られている様々な方法のいずれかによって腫瘍自体から同定することができる。
【００７１】
腫瘍関連抗原は、例えば、肉腫、腎細胞癌、前立腺がん、メラノーマ、および乳がんを含む様々ながんに関して知られている。いくつかの乳がんでは、例えば、Her-2受容体は、がん細胞の表面上で過剰発現される。例示的な腫瘍抗原には、組織分化抗原、突然変異タンパク質抗原、発がん性ウイルス抗原、がん精巣抗原および血管または間質特異的抗原が含まれる。本明細書での使用が意図される腫瘍抗原には、限定されないが、以下が含まれる：任意のがん精巣抗原、任意の1つ以上のMAGE腫瘍抗原（例えば、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA10）、BAGE、RAGE、およびNY-ESO-1、これらは、精巣の免疫特権領域および種々の腫瘍細胞において発現される未変異抗原である；メラニン細胞メラノーマ系統抗原MART-1/Melan-A、gp100、gp75、mda-7、チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質などの系統特異的腫瘍抗原、腎細胞癌腫‐5T4、SM22アルファ、炭酸脱水酵素IおよびIX（G250としても知られている）、低酸素誘導因子（例えば、HIF-1アルファおよびHIF-2アルファ）、VEGFまたは前立腺特異的膜抗原（PSMA）、前立腺特異的抗原（PSA）、前立腺酸性ホスファターゼ、および前立腺の6回膜貫通上皮抗原（STEAP）、NKX3.1、こられは、同じ組織に由来する正常および腫瘍性細胞において発現される抗原である；腫瘍細胞で突然変異した遺伝子由来の、または正常細胞と比べて異なるレベルで腫瘍中で転写された遺伝子由来のエピトープタンパク質／ペプチド、例えば、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、SSX2（HOM-MEL-40腫瘍抗原）、突然変異ras、bcr/abl再構成体、Her2/neu、EGF受容体（EGFRviii突然変異を含む）、突然変異型または野生型p53、シトクロムP450 1B1、および異常発現したイントロン配列、例えばN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV；骨髄腫およびB細胞リンパ腫において特有のイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン再構成体；オンコウイルスプロセス由来のエピトープタンパク質／ペプチド、例えばヒトパピローマウイルスタンパク質E6およびE7；腫瘍選択的発現を伴う未変異型がん胎児性タンパク質、例えばがん胎児性抗原およびアルファフェトプロテイン。また、腫瘍関連抗原として、胚性転写因子Brachyuryが考えられている（例えば、Roselli et al., Clin Cancer Res. 2012 Jul 15;18(14):3868-79；Hamilton et al., Semin Oncol. 2012 Jun;39(3):358-66；Palena et al., J Natl Cancer Inst. 2014 May 9;106(5)を参照）。多数の腫瘍関連抗原が概説されている（例えば、"Tumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes," Boon T, Cerottini J C, Vandeneynde B, Vanderbruggen P, Vanpel A, Annual Review Of Immunology 12: 337-365, 1994；"A listing of human tumor antigens recognized by T cells," Renkvist N, Castelli C, Robbins P F, Parmiani G. Cancer Immunology Immunotherapy 50: (1) 3-15 MAR 2001を参照）。
【００７２】
1つの特定の実施形態では、マルチゲノムレンチウイルスベクター調製物は、対象配列としてNYESO1およびMAGEA3を発現する。さらなる実施形態では、マルチゲノムレンチウイルスベクター調製物は、免疫調節分子の有無に関わらず、複数のMAGEタンパク質を発現する。一実施形態では、マルチゲノムレンチウイルスベクター調製物は、MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA10およびIL-12を発現する。さらなる実施形態では、マルチゲノムレンチウイルスベクター調製物は、免疫調節分子の有無に関わらず、1つ以上のネオ抗原に加えて、複数のMAGEタンパク質を発現する。これに関して、1つ以上のネオ抗原は、MAGE抗原由来であってもよく、または異なるタンパク質由来であってもよい。
【００７３】
特定の実施形態では、対象配列は1つ以上のネオ抗原をコードする。ネオ抗原は、がん細胞によって産生され、免疫系によって認識される異常な突然変異タンパク質である（例えば、Martin et al 2015 Annals Oncol. 26:2367-2374；Linnemann et al., 2015 Nature Medicine 21:81-85；Kreiter et al., Nature 520, 692-696; Blood. 2014 Jul 17; 124(3): 453-462；などを参照）。個体由来の腫瘍および正常組織由来のDNAおよびRNAを配列決定し、腫瘍特異的突然変異を同定することによって、ネオ抗原を同定することができる；HLAは個体を分類し、同定されたネオ抗原からHLA結合エピトープを予測する。その後、ネオ抗原はオープンリーディングフレームで合成され、パーソナライズされたワクチンの調製に使用される。腫瘍生検からのHLA溶出ペプチドのin silico予測および／またはMSに基づく配列決定を用いるハイスループット配列決定およびエピトープ同定、ならびに免疫アッセイの確認は、患者からのネオ抗原の同定、および同定されたネオ抗原のパーソナライズされたワクチンにおける即時使用を可能にする。したがって、マルチゲノムベクター調製物を産生するための本発明のシステムは、ネオ抗原またはネオ抗原ポリエピトープカセットをコードし、任意に他の全長腫瘍抗原および／または免疫調節分子を伴う患者特異的マルチゲノムウイルスベクター調製物を産生するのに特に適している。
【００７４】
抗原は、例えばHIV/AIDSなどの感染性疾患に関連する抗原であってもよい。抗原は、例えば、gp120であり得る（Klimstra, W. B., et al. 2003. J Virol 77:12022-12032；Bernard, K. A., et al. 2000. Virology 276:93-103；Byrnes, A. P., et al. 1998. J Virol 72: 7349-7356）。他の例示的な抗原には、限定されないが、以下が含まれる：gag、pol、env、tat、nefおよびrev（Lieberman, J. et al. 1997. AIDS Res Hum Retroviruses 13(5): 383-392；Menendez-Arias, L. et al. 1998. Viral Immunol 11(4): 167-181））。
【００７５】
ウイルス抗原の例には、限定されないが、以下が含まれる：アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド、例えば、カリシウイルスカプシド抗原、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（AE）ポリペプチド、例えば、B型肝炎コアもしくは表面抗原、またはC型肝炎ウイルスE1もしくはE2糖タンパク質、コア、または非構造タンパク質、ヘルペスウイルスポリペプチド、例えば、単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質、免疫不全ウイルスポリペプチド、例えば、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープまたはプロテアーゼ、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、インフルエンザウイルスポリペプチド、例えば、インフルエンザA型赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、または核タンパク質、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルトミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド、例えば、赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド、例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド、ポックスウイルスポリペプチド、例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド、狂犬病ウイルスポリペプチド、例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質G、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、およびロタウイルスポリペプチド。
【００７６】
細菌抗原の例には、限定されないが、以下が含まれる：アクチノマイセスポリペプチド、バチルスポリペプチド、バクテロイデスポリペプチド、ボルデテラポリペプチド、バルトネラポリペプチド、ボレリアポリペプチド、例えば、B.ブルグドルフェリOspA、ブルセラポリペプチド、カンピロバクターポリペプチド、カプノサイトファガポリペプチド、クラミジアポリペプチド、クロストリジウムポリペプチド、コリネバクテリウムポリペプチド、コクシエラポリペプチド、デルマトフィルスポリペプチド、エンテロコッカスポリペプチド、エールリヒアポリペプチド、エシェリヒアポリペプチド、フランシセラポリペプチド、フソバクテリウムポリペプチド、ヘモバルトネラポリペプチド、ヘモフィルスポリペプチド、例えば、H.インフルエンザ菌b型外膜タンパク質、ヘリコバクターポリペプチド、クレブシエラポリペプチド、L型菌ポリペプチド、レプトスピラポリペプチド、リステリアポリペプチド、マイコバクテリアポリペプチド、マイコプラズマポリペプチド、ナイセリアポリペプチド、ネオリケッチアポリペプチド、ノカルジアポリペプチド、パスツレラポリペプチド、ペプトコッカスポリペプチド、ペプトストレプトコッカスポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、プロテウスポリペプチド、シュードモナスポリペプチド、リケッチアポリペプチド、ロカリメアポリペプチド、サルモネラポリペプチド、赤痢菌ポリペプチド、ブドウ球菌ポリペプチド、連鎖球菌ポリペプチド、例えば、化膿連鎖球菌ポリペプチド、トレポネーマポリペプチド、およびエルシニアポリペプチド、例えば、ペスト菌F1およびV抗原。
【００７７】
真菌抗原の例には、限定されないが、以下が含まれる：アブシディアポリペプチド、アクレモニウムポリペプチド、アルテルナリアポリペプチド、アスペルギルスポリペプチド、バジジオボルスポリペプチド、ビポラリスポリペプチド、ブラストミセスポリペプチド、カンジダポリペプチド、コクシジオイデスポリペプチド、コニディオボルスポリペプチド、クリプトコッカスポリペプチド、カーブラリアポリペプチド、表皮菌ポリペプチド、エクソフィアラポリペプチド、ゲオトリクムポリペプチド、ヒストプラスマポリペプチド、マズレラポリペプチド、マラセジアポリペプチド、ミクロスポラムポリペプチド、モニリエラポリペプチド、モルティエレラポリペプチド、ムコールポリペプチド、ペシロマイセスポリペプチド、ペニシリウムポリペプチド、フィアレモニウムポリペプチド、フィアロフォラポリペプチド、プロトセカポリペプチド、シュードアレシェリアポリペプチド、シュードミクロドキウムポリペプチド、フハイカビポリペプチド、リノスポリジウムポリペプチド、クモノスカビポリペプチド、スコレコバシジウムポリペプチド、スポロスリクスポリペプチド、ステムフィリウムポリペプチド、トリコフィトンポリペプチド、トリコスポロンポリペプチド、およびキシロヒファポリペプチド。
【００７８】
寄生原虫抗原の例には、限定されないが、以下が含まれる：バーベシアポリペプチド、バランチジウムポリペプチド、ベスノイチアポリペプチド、クリプトスポリジウムポリペプチド、アイメリアポリペプチド、エンセファリトゾーンポリペプチド、赤痢アメーバポリペプチド、ジアルジアポリペプチド、ハモンディアポリペプチド、ヘパトゾーンポリペプチド、イソスポラポリペプチド、リーシュマニアポリペプチド、ミクロスポリジアポリペプチド、ネオスポラポリペプチド、ノゼマポリペプチド、ペンタトリコモナスポリペプチド、プラスモディウムペプチド、例えば、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲（PfCSP）、スポロゾイト表面タンパク質2（PfSSP2）、肝臓状態抗原1のカルボキシル末端（PfLSA1のC末端）、および搬出タンパク質1（PfExp-1）、ニューモシスティスポリペプチド、サルコシスチスポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、タイレリアポリペプチド、トキソプラズマポリペプチド、ならびにトリパノソーマポリペプチド。
【００７９】
寄生蠕虫抗原の例には、限定されないが、以下が含まれる：アカントケイロネマポリペプチド、アエルロストロンギルスポリペプチド、アンシロストーマポリペプチド、住血線虫ポリペプチド、回虫ポリペプチド、ブルギアポリペプチド、ブノストムムポリペプチド、毛頭虫ポリペプチド、チャベルチアポリペプチド、クーペリアリペプチド、クレノソマポリペプチド、ディクチオカウルスポリペプチド、ジオクトフィーマポリペプチド、ジペタロネーマポリペプチド、裂頭条虫ポリペプチド、ジプリジウムポリペプチド、ジロフィラリアポリペプチド、ドラクンクルスポリペプチド、エンテロビウスポリペプチド、フィラロイデスポリペプチド、ヘモンクスポリペプチド、ラゴキルアスカリスポリペプチド、ロアポリペプチド、マンソネラポリペプチド、ムエレリウスポリペプチド、ナノフィエツスポリペプチド、鉤虫ポリペプチド、ネマトジルスポリペプチド、腸結節虫ポリペプチド、オンコセルカポリペプチド、オピストルキスポリペプチド、オステルタジアポリペプチド、パラフィラリアポリペプチド、肺吸虫ポリペプチド、パラスカリスポリペプチド、フィサロプテラポリペプチド、プロトストロンギルスポリペプチド、セタリアポリペプチド、スピロセルカポリペプチド、スピロメトラポリペプチド、ステファノフィラリアポリペプチド、ストロンギロイデスポリペプチド、ストロンギルスポリペプチド、テラジアポリペプチド、トキサスカリスポリペプチド、トキソカラポリペプチド、旋毛虫ポリペプチド、毛様線虫ポリペプチド、ベンチュウポリペプチド、ウンシナリアポリペプチド、および糸状虫ポリペプチド。
【００８０】
外部寄生虫抗原の例には、限定されないが、以下が含まれる：ノミ由来のポリペプチド（防御抗原およびアレルゲンを含む）；ダニ、例えばカタダニおよび軟ダニを含む；ハエ、例えば小虫、蚊、砂ハエ、ブユ、ウシアブ、ノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、蝿蛆症を引き起こすハエ、および噛みつきブヨなど；アリ；クモ、シラミ；ダニ；ならびに半翅類の昆虫、例えばトコジラミおよびサシガメなど。
【００８１】
いったん抗原が同定され選択されると、所望の抗原をコードする配列が同定される。特定の実施形態では、配列はcDNAを含む。
【００８２】
特定の場合において、対象配列は、分子の発現を下方制御する、対象の低分子干渉RNA（siRNA）またはマイクロRNA（miRNA）をコードする遺伝子であり得る。例えば、siRNAまたはマイクロRNAをコードする遺伝子を使用して、樹状細胞の活性化または成熟を阻害するものを含む、細胞中の負の調節因子の発現を下方制御することができる。siRNAおよびマイクロRNAは、当該技術分野でよく知られている（Fire et al., Nature 391:806, 1998；see also “The RNA Interference Resource” of Applied Biosystems, Trang et al., Oncogene Suppl 2:S52, 2008；Taganov, K., et al. 2007. Immunity 26:133-137；Dahlberg, J. E. and E. Lund. 2007. Sci. STKE 387:pe25；Tiemann and Rossi, EMBO Mol Med 1: 142, 2009）。あるいは、対象配列は、相補的領域の長さが約20リボヌクレオチドより長い自己相補的二本鎖RNA、または長さが約20リボヌクレオチドより長いアンチセンスRNAをコードすることができる。当業者であれば、siRNA、miRNA、dsRNAおよびアンチセンスRNA分子は、RNAポリメラーゼIIIプロモーターから発現させることができるか、あるいは、RNAポリメラーゼIIプロモーターから転写される非コードRNAの成分であってもよいことを理解するであろう。
【００８３】
さらに、対象配列は、1つより多くの産物をコードしていてもよい。いくつかの構成では、送達される配列は、少なくとも1つのタンパク質、少なくとも1つのsiRNA、少なくとも1つのマイクロRNA、少なくとも1つのdsRNAまたは少なくとも1つのアンチセンスRNA分子またはそれらの任意の組み合わせをコードする複数の遺伝子を含むことができる。例えば、送達される配列は、免疫応答が望まれる1つ以上の抗原をコードする1つ以上の核酸を含むことができる。1つ以上の抗原は、単一の疾患もしくは障害と関連し得るか、または複数の疾患および／もしくは障害と関連し得る。特定の実施形態では、SOIは、免疫調節タンパク質をコードする配列を含む。いくつかの例では、免疫調節タンパク質をコードする配列を、免疫応答が望まれる抗原をコードする配列とともに含むことができ、その組み合わせは、免疫応答を所望の方向と大きさに誘発および調節することができる。他の例では、siRNA、マイクロRNA、dsRNAまたはアンチセンスRNA分子をコードする配列は、免疫応答が望まれる抗原をコードする遺伝子とともに構築することができ、その組み合わせは免疫応答の範囲を調節することができる。産物は、コード配列が1つのプロモーターと機能的関係にある初期融合産物として産生され得る。あるいは、産物は、別々にコードされてもよく、各コード配列はプロモーターと機能的関係にあるものであってもよい。プロモーターは同じであっても異なっていてもよい。
【００８４】
特定の構成において、ベクターは、免疫調節分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。例示的な免疫調節分子には、様々なサイトカインのいずれかが含まれる。本明細書で使用する「サイトカイン」は、ある細胞集団によって放出され、細胞間仲介物質として別の細胞に作用するタンパク質の総称を意味する。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、以下が含まれる：成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなど；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、および黄体形成ホルモン（LH）など；肝細胞成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子アルファおよびベータ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（TPO）；神経成長因子、例えばNGFベータなど；血小板成長因子；形質転換成長因子（TGF）、例えばTGFアルファおよびTGFベータなど；インスリン様成長因子IおよびII；エリスロポエチン（EPO）；骨誘導性因子；インターフェロン、例えばインターフェロンアルファ、ベータ、およびガンマなど；コロニー刺激因子（CSF）、例えばマクロファージCSF（M-CSF）など；顆粒球マクロファージCSF（GM-CSF）；および顆粒球CSF（G-CSF）；インターロイキン（IL）、例えばIL-1〜IL-36、例えばIL-1、IL-1アルファ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、TNF；ならびに他のポリペプチド因子、例えばLIFおよびキットリガンド（KL）。本明細書での使用が意図される他の免疫調節分子には、IRF3、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40リガンド（CD40L）、薬物誘導性CD40（iCD40）などが含まれる。特定の実施形態では、これらのポリヌクレオチドは、典型的には、樹状細胞におけるコード配列の発現を導く1つ以上の調節要素の制御下にある。
【００８５】
特定の実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルスベクターによってコードされる免疫調節分子は、チェックポイント阻害剤分子である。免疫チェックポイントは、自己寛容を維持し、免疫応答の持続時間および広さを調節するために重要な、免疫系の様々な阻害経路を指す。腫瘍は、特に腫瘍抗原に特異的なT細胞に対する免疫抵抗性の主要な機序として、特定の免疫チェックポイント経路を使用する。（例えば、Pardoll, 2012 Nature 12:252；Chen and Mellman 2013 Immunity 39:1を参照）。本開示は、免疫チェックポイント阻害剤をコードするベクターを提供する。免疫チェックポイント阻害剤は、統計的に有意な様式で、免疫系の阻害経路を遮断または阻害する任意の薬剤を含む。そのような阻害剤は、免疫チェックポイント受容体に結合して遮断もしくは阻害する抗体、もしくはその抗原結合断片、または免疫チェックポイント受容体リガンドに結合して遮断または阻害する抗体を含み得る。遮断または阻害の標的とすることができる例示的な免疫チェックポイント分子には、限定されないが、以下が含まれる：CTLA-4、4-1BB（CD137）、4-1BBL（CD137L）、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4（CD2ファミリーの分子に属し、全てのNK、γδ、およびメモリーCD8+（αβ）T細胞上に発現する）、CD160（BY55とも呼ばれる）ならびにCGEN-15049。免疫チェックポイント阻害剤には、CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160およびCGEN-15049の1つ以上に結合してそれらの活性を遮断もしくは阻害する抗体、もしくはそれらの抗原結合断片、または他の結合タンパク質が含まれる。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、以下が含まれる：トレメリムマブ（CTLA-4遮断抗体）、抗OX40、PD-L1モノクローナル抗体（抗B7-H1；MEDI4736）、MK-3475（PD-1遮断剤）、ニボルマブ（抗PD1抗体）、CT-011（抗PD1抗体）、BY55モノクローナル抗体、AMP224（抗PDL1抗体）、BMS-936559（抗PDL1抗体）、MPLDL3280A（抗PDL1抗体）、MSB0010718C（抗PDL1抗体）およびヤーボイ／イピリムマブ（抗CTLA-4チェックポイント阻害剤）。
【００８６】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターゲノムによって発現される対象配列は、キメラ抗原受容体（CAR）（キメラT細胞受容体とも称される）または単鎖もしくは可溶性T細胞受容体を含む組み換えT細胞受容体である。特定の実施形態では、標的T細胞の活性化および共刺激は、細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激シグナル伝達領域の有無に関わらないゼータ鎖シグナル伝達ドメイン）および標的特異的抗原結合ドメインを含む単一キメラT細胞受容体によってもたらされる。本明細書中のキメラ抗原受容体は、T細胞の表面にそれらを固定させる膜貫通（TM）ドメインも含む。TMは、CD3ゼータ鎖に由来し得るか、またはCD28またはCD4などの他の膜貫通分子に由来し得る。当業者に認識されるように、適切に機能してキメラ受容体を膜に固定させるTMドメインを使用することができる。キメラT細胞受容体は、キメラT細胞受容体を発現する本明細書に記載のレンチウイルスベクター粒子で形質導入されたTリンパ球において適切に生成される。例示的なキメラ抗原受容体は、例えば、以下に記載されている：米国特許第7,741,465号明細書；米国特許5,843,728号明細書；米国特許7,446,190号明細書；米国特許6,392,013号明細書；米国特許7,994,298号明細書；米国特許8,252,914号明細書；米国特許6,410,319号明細書；米国特許7,446,179号明細書；米国特許7,265,209号明細書；および米国公開出願20130288368号明細書、WO2002/079000およびWO2012/129514。
【００８７】
別の実施形態では、対象配列は、「結合ドメイン」または「結合領域」または「結合要素」をコードする。本開示によれば、結合ドメインは、例えば、生物学的分子（例えば、細胞表面受容体または腫瘍関連タンパク質、またはそれらの成分）を特異的に認識および結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドであり得る。結合ドメインには、対象生物学的分子に対して、任意の天然に存在する、合成、半合成、または組み換えにより産生された結合パートナーが含まれる。例えば、結合ドメインは、抗体軽鎖および重鎖可変領域であり得るか、軽鎖および重鎖可変領域領域は、単一鎖およびいずれかの配向で一緒に連結され得る（例えば、VL-VHまたはVH-VL）。特定の標的と特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための様々なアッセイが知られており、ウェスタンブロット、ELISA、フローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴分析（例えばBIACORE（商標）分析を使用する）が含まれる。
【００８８】
特定の実施形態では、結合ドメインによって結合される標的分子は、受容体（例えば、免疫チェックポイント分子）または腫瘍抗原などの細胞表面発現タンパク質であり得る。別の実施形態では、本明細書で有用な結合ドメインによって結合される標的分子は、サイトカイン、アルブミン、または他の血清タンパク質などの可溶性抗原である。例示的な結合ドメインは、免疫グロブリン抗原結合ドメイン、例えばscFv、scTCRなど、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子／受容体のリガンド、またはそれらの受容体結合ドメイン、および腫瘍結合タンパク質を含む。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、scFv、VH、VL、ドメイン抗体変異体（dAb）、ラクダ科抗体（VHH）、フィブロネクチン3ドメイン変異体、アンキリン反復変異体および他のタンパク質足場由来の他の抗原特異的結合ドメインであり得る。
【００８９】
検出可能な産物、通常はタンパク質をコードする配列を含めて、所望の産物を発現している細胞の同定を可能にすることができる。例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）などの蛍光マーカータンパク質が、対象配列（例えば、抗原をコードする）とともに構築物に組み込まれる。他の場合には、タンパク質は抗体によって検出可能であり得るか、またはタンパク質は、検出可能な産物、もしくはトランスフェクトもしくは形質導入された標的細胞の選択を可能にする産物を生じるように基質に作用する、例えばハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性を付与する、酵素であり得る。典型的な選択遺伝子は、真核細胞での使用に適した抗生物質もしくは他の毒素、例えば、当該技術分野で知られているなかでも、ネオマイシン、メトトレキセート、ブラスチシジンへの耐性を付与する、または栄養要求性欠損を補完する、または培地から得られる重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択マーカーは、任意に、別々のプラスミド上に存在し、共トランスフェクションによって導入され得る。
【００９０】
他の箇所に記載されているように、再集合体レトロウイルスベクターを産生するための本明細書の方法は、ベクター中のマルチシストロン発現単位の特定の限界を克服することを意図している。しかしながら、特定の実施形態では、パッケージング細胞における所望のウイルスの産生に必要な2つ以上の要素（例えば、対象配列（単数または複数）、エンベロープ）を含む1つ以上のマルチシストロン発現ユニットを使用することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、マルチシストロン発現ユニットをウイルスベクターゲノムに含めることができる。マルチシトニックベクターの使用は、必要とされる核酸分子の総数を減少させ、したがって、複数のベクターゲノムからの発現を調整することに伴って起こり得る困難を回避する。マルチシストロン性ベクターでは、発現される様々な要素が、1つ以上のプロモーター（および必要に応じて他の発現制御要素）に作動可能に連結される。いくつかの構成では、マルチシストロン性ベクターは、対象配列、レポーター産物をコードする配列、およびウイルス要素を含む。対象配列は、典型的には、抗原、免疫調節分子、または1つ以上の抗原と1つ以上の免疫調節分子との組み合わせをコードする。時には、マルチシストロン性ベクターは、抗原をコードする遺伝子、免疫調節分子をコードする遺伝子を含む。
【００９１】
マルチシストロン性発現ベクター中で発現される各成分は、例えば内部リボソーム侵入部位（IRES）要素またはウイルス2A要素によって分離され、同じプロモーターからの様々なタンパク質の別個の発現を可能にし得る。IRES要素および2A要素は、当該技術分野で知られている（米国特許第4,937,190号明細書；de Felipe et al. 2004. Traffic 5: 616-626）。一実施形態では、口蹄疫ウイルス（FMDV）、ウマ鼻炎Aウイルス（ERAV）、およびゾーシーアシグナ（thosea asigna）ウイルス（TaV）（Szymczak et al. 2004. Nat. Biotechnol. 22: 589-594）由来の2A様配列に連結されたフリン切断部位配列（RAKR）（Fang et al. 2005. Nat. Biotech 23: 584-590）をコードするオリゴヌクレオチドを使用して、 マルチシストロン性ベクター中の遺伝子要素を分離する。特定のマルチシストロン性ベクターの有効性は、標準的なプロトコルを用いて遺伝子のそれぞれの発現を検出することによって容易に試験することができる。
【００９２】
具体的な例示において、ウイルスベクターゲノムは以下を含む：サイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー／プロモーター配列；HIV5'LTR由来のRおよびU5配列；パッケージング配列（Ψ）；RRE、HIV-1 cPPT/CTS（DNAフラップ）シグナル；内部エンハンサー；内部プロモーター；対象遺伝子；ウッドチャック肝炎ウイルス応答要素；tRNAアンバーサプレッサー配列；そのエンハンサー配列の欠失を伴うU3要素；ニワトリβ-グロビンインスレーター；ならびに3'HIV LTRのRおよびU5配列。いくつかの例示において、ベクターゲノムは、インタクトなレンチウイルス5'LTRおよび自己不活性化3'LTRを含む。（Iwakuma et al. Virology 15:120, 1999,）。
【００９３】
ベクターゲノムの構築は、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ならびにDNA配列決定、例えばSambrookら（1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.）、およびCoffinら（Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)）および「RNAウイルス：A Practical Approach」（Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)）に記載の標準技術を含むが、これらに限定されない当該技術分野で知られている任意の適切な遺伝子工学技術を用いて達成することができる。
【００９４】
本明細書に記載の任意の対象配列は、対象配列の野生型の変異体の、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれか、またはその両方を含み得る。
【００９５】
ポリヌクレオチド配列（例えば、パッケージングシステムで使用されるDNA/cDNAプラスミド、RNAゲノム配列など）に関して、変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物学的機能が、ポリヌクレオチド配列によってコードされる参照ポリペプチドと比較して実質的に減少しないように、ポリヌクレオチド変異体は1つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含有し得る。例えば、特定のマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物は、免疫調節分子をコードする配列を含み得る。免疫調節分子をコードするポリヌクレオチド配列の変異体は、好ましくは、それによってコードされる分子の免疫調節活性が、ポリヌクレオチド配列によってコードされる参照免疫調節分子と比較して実質的に減少しないように、1つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。この点で、そのようなポリヌクレオチドは、参照ポリペプチド配列の生物活性レベルの少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の生物活性レベル（例えば、免疫調節活性）を有するポリペプチドをコードする。非限定的な例として、免疫調節タンパク質は、IL-12であり得る。IL-12活性は、当業者に知られているアッセイを用いて測定することができる。変異型IL-12ポリペプチドの活性を測定し、野生型IL-12タンパク質と比較することができる。
【００９６】
特定の実施形態では、変異体は、参照タンパク質と同一のタンパク質をコードするコドン最適化変異体ポリヌクレオチド配列であってもよい。
【００９７】
別の実施形態では、変異体は、参照配列のヘテロクリティック類似体であってもよい（例えば、米国特許第8741576号明細書を参照）。ヘテロクリティックエピトープは、天然エピトープによって誘導されるT細胞応答よりも強いT細胞応答を誘導する修飾T細胞エピトープである。ヘテロクリティック類似体は、所与の用量に対する応答の増加によって、もしくは同じ応答を達成するのにより少ない必要量によって測定されるような、特定のT細胞に対する刺激能力または効力が増加したペプチド（または全長タンパク質内のエピトープ）として定義される。
【００９８】
臨床応用におけるヘテロクリティック類似体の使用に伴う利点は、以下の通りである。第1に、ヘテロクリティック類似体は、T細胞アネルギーの状態を逆転させることによって、T細胞の非耐性化交差反応性クローンを活性化することによって、または「免疫偏向」、すなわち、Th1またはTh2などの産生されるCTLのタイプを調節することによって、耐性を打破／克服する能力がある。最近の研究は、ヘテロクリティック類似体が免疫原性であることを示しており（Zaremba, et al., Cancer Research, 57:4570 (1997)；Rivoltoni, et al., Cancer Research, 59:301 (1999)；Selby, et al., 162(2):669 (1999)）、それらは内因的にプロセシングされたエピトープを認識するCTLを誘導することができる。これは、種々の免疫系における研究によって確認されている（Zugel, et al., J. Immunol., 161:1705 (1998)；Wang, et al., J. Exp. Med., 190:983 (1999)；Men, et al., J. Immunol., 162:3566, (1999)）。例えば、Zugelらによる研究（上記Zugelら）は、成体マウスの免疫優性T細胞エピトープに対するT細胞耐性が、そのペプチドのヘテロクリティック交差反応性ペプチド類似体での免疫化によって克服できることを示した。
【００９９】
特定の実施形態では、変異体は免疫原性変異体であり、好ましくは変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの免疫原性が、参照配列によってコードされるポリペプチドと比較して実質的に減少しないように、ポリヌクレオチド変異体は1つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含む。
【０１００】
特定の実施形態では、本明細書のポリヌクレオチド、例えばポリヌクレオチド変異体は、参照ポリペプチド配列（例えば、公開配列データベースで利用可能な腫瘍抗原配列）と免疫学的に交差反応性であるポリペプチドをコードする。他の実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、参照ポリペプチド配列の免疫原性活性レベルの少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の免疫原性活性レベルを有するポリペプチドをコードする。
【０１０１】
したがって、本開示の特定の実施形態では、部位特異的突然変異誘発などの突然変異誘発手法が、本明細書に記載される対象配列の変異体および／または誘導体の調製に用いられる。この手法により、ポリペプチド配列の特異的修飾は、それらをコードする基礎となるポリヌクレオチドの突然変異誘発によって行うことができる。この技術は、例えば、1つ以上のヌクレオチド配列変化をポリヌクレオチドに導入することによって、上記の考慮事項の1つ以上を組み込むなど、配列変異体を調製および試験する直接的な手法を提供する。
【０１０２】
部位特異的突然変異誘発は、所望の変異体のDNA配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列と、十分な数の隣接ヌクレオチドとを使用して変異体を産生させ、十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を提供し、配列の両側に縦走する安定した二重鎖が形成される。選択されたポリヌクレオチド配列において突然変異をもたらし、ポリヌクレオチド自体の特性を改善、変更、減少、改変、もしくはそうでなければ変化させるか、および／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性、または一次配列を変えることができる。
【０１０３】
本発明の特定の実施形態では、本発明者らは、ポリペプチドワクチンの免疫原性などの、コードされたポリペプチドの1つ以上の特性を改変するための対象配列の突然変異誘発を意図する。部位特異的突然変異誘発の技術は、当該技術分野においてよく知られており、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の変異体を作製するために広く使用されている。例えば、部位特異的突然変異誘発は、しばしば、DNA分子の特定の部分を改変するために使用される。
【０１０４】
（C．マルチゲノムウイルスベクター調製物の産生）
一般に、本明細書中に記載されるレトロウイルスベクター粒子を産生するために使用される方法は、当該技術分野で知られている標準的な方法であるが、ヘテロ接合性（再集合体）レトロウイルス粒子を含むマルチゲノムウイルスベクター調製物を産生するために、パッケージングシステムは少なくとも2つの異なるウイルスベクターゲノムプラスミドを含むことを除く（例えば、図１参照）。ゲノム再集合体を形成するレトロウイルスの傾向のため、得られるベクター調製物は、全ての考えられるホモ接合性およびヘテロ接合性ベクター粒子の混合物を仮定上含む。
【０１０５】
本明細書の他の箇所に記載されているように、特定の実施形態では、本明細書での使用が意図される少なくとも2つの異なるウイルスベクターゲノムプラスミドは、欠損しているレトロウイルスゲノムを含む。換言すれば、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターゲノムは機能的gag/polオープンリーディングフレームを含まない。したがって、特定の実施形態では、適切なベクターゲノムは、機能的gagタンパク質または機能的gagもしくはpolタンパク質をコードしない。特定の実施形態では、適切なベクターゲノムは、機能的gag、polまたはenvタンパク質をコードしない。
【０１０６】
本発明は、産生段階中の投入プラスミドの相対量を変化させることにより、マルチゲノムウイルスベクター粒子調製物中のホモ接合性対ヘテロ接合性ベクターゲノムの最終比率を効果的に制御することを可能にする。同様に、産生段階中の投入プラスミドの相対量を変えることによって、総産出ゲノム分布を制御することができる。これらの概念は、以下の表１、表２、および表３にまとめられている。別の箇所で述べたように、2つ（またはそれ以上）の異なる対象配列の発現に対する最終的な制御は、マルチシストロン性ベクターでは、特に既製の方法では確実には達成することはできない。
【０１０７】
【表１】
2019509275.tif 000003
【０１０８】
【表２】
2019509275.tif 000004
【０１０９】
【表３】
2019509275.tif 000005
【０１１０】
したがって、本明細書に記載のウイルスベクターパッケージングシステムを使用して、2つ以上の異なるウイルスベクターゲノムを使用することができる。この点に関して、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の異なるウイルスベクターゲノムプラスミドを様々な異なる比率でパッケージングシステムに添加し、所望のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を得ることができる。特定の実施形態では、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、3〜9、3〜8、3〜7、3〜6、3〜5、3〜4、4〜9、4〜8、4〜7、4〜6、または4〜5の異なるウイルスベクターゲノムプラスミドを様々な異なる比率でパッケージングシステムに添加し、所望のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製を得ることができる。
【０１１１】
特定の実施形態では、異なるウイルスベクターゲノムは、対象配列を除いて同一である。これに関して、ウイルスベクターゲノムは、各対象配列について同一のプロモーターを有するであろう。他の実施形態では、異なるウイルスベクターゲノムの1つ以上が異なるプロモーターを有してもよい。したがって、特定の実施形態では、異なるプロモーターを異なる対象配列に使用することができる。プロモーターおよび発現制御配列は、当業者に知られており、本明細書の他の箇所でより詳細に記載される。
【０１１２】
さらに、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されているように（セクションB.レンチウイルスベクターゲノム、サブセクション3.二量体開始部位（DIS）配列を参照）、本発明は、任意の所与のマルチゲノム調製物におけるヘテロ接合性またはホモ接合性ベクター粒子の割合を制御することができるというさらなる利点を、各レトロウイルスベクターゲノムの二量体開始シグナルを改変し、ホモ接合性相互作用またはヘテロ接合性相互作用のいずれかを促進することによって提供する。さらに、本発明は、投入ベクターゲノムの特定の対合を制御することができるという利点を提供する。したがって、特定の実施形態では、2つより多くの異なるウイルスベクターゲノムプラスミドが、本明細書に記載のパッケージングシステムにおいて使用され得る。例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の異なるベクターゲノムプラスミド、特定の対合事象（したがって、特定のホモ接合性またはヘテロ接合性ウイルスベクター粒子）を促進するDIS配列を含むそれらの2つ以上を、本明細書に記載のパッケージングシステムで使用することができる。
【０１１３】
したがって、本発明は、ベクター化されたがんワクチンの構築における現在の最先端の手法と比較して、優れた免疫原性および保護の幅を有する既製の半パーソナライズおよびパーソナライズされたがんワクチンの迅速な構築を可能にする。
【０１１４】
マルチゲノムレトロウイルスベクター調製物からの複数の導入遺伝子の発現は、導入ベクターゲノム中の対象導入遺伝子の位置の最適化を必要とするマルチシストロン性ベクターのクローニングの問題に対処する。マルチゲノムウイルスベクターは、それぞれが異なる導入遺伝子を発現する複数のレトロウイルス伝達ベクター（レトロウイルスゲノム）を含むプラスミドの混合物を生成細胞／パッケージング細胞にトランスフェクトすることにより、よりはるかに迅速に生成され得る。
【０１１５】
本発明は、既製の導入ベクターを用いたマルチプラスミドトランスフェクションにより生成されたベクター混合物に基づいて、パーソナライズされたがんワクチンを作製することを可能にする。これはまた、in vivoで同じ細胞内での共発現から利益を得る作用機序を有する異なる導入遺伝子から構成されるワクチンを作製することを可能にする。
【０１１６】
本明細書中で使用される場合、本明細書中の方法を使用して生成するウイルスベクターの混合集団は、「マルチゲノム」ウイルスベクターまたはマルチゲノムウイルスベクター調製物と称され得る。これは、本明細書中のベクターを、2つのウイルスベクター調製物を単に採取したものと、それらが産生された後に混合したものから区別するのに役立つ。当業者には明らかなように、そのような混合ウイルスベクター調製物は、ヘテロ接合性ウイルス粒子を含まない。本明細書のマルチゲノムウイルスベクターは、上記のように、ホモ接合ゲノムを含む粒子とヘテロ接合ゲノムを含む粒子の混合物を含んでもよい。本発明を用いて、ウイルスベクターの様々なマルチゲノム集団を産生することができる（例えば、非限定的な例として、表１および２を参照）。マルチゲノムウイルスベクター調製物は、使用される投入ベクターゲノムに応じて、ホモ接合性およびヘテロ接合性ウイルスベクター粒子の様々な比率を含み得る（例えば、種々の二量体開始シグナル配列を使用してホモ接合性またはヘテロ接合性相互作用のいずれかを促進することによるか、または同じDIS配列を全て含む異なるウイルスベクターゲノムを使用し、パッケージングシステムで使用される投入ベクターゲノムプラスミドの量を改変することによって産出集団を制御することによって）。パッケージングシステムにおいて2つのベクターゲノムが使用される一実施形態では（ベクターゲノムAおよびB）、産出マルチゲノム調製物は、AAホモ接合ゲノム、BBホモ接合ゲノムを、それぞれが特定の比率で含む粒子を含んでもよく、さらにABヘテロ接合体粒子を特定の比率で含む。別の実施形態では、産出マルチゲノム調製物は、ホモ接合ゲノム（AAおよびBBホモ接合ゲノム）を含む少なくとも約50%の粒子を含んでもよく、約50%のABヘテロ接合性粒子を含む。特定の実施形態では、産出マルチゲノム調製物は、ホモ接合ゲノム（AAおよびBBホモ接合ゲノム）を含む少なくとも約60%の粒子を含んでもよく、約40%のABヘテロ接合性粒子を含む。特定の実施形態では、産出マルチゲノム調製物は、ホモ接合ゲノム（AAおよびBBホモ接合ゲノム）を含む少なくとも約70%の粒子を含んでもよく、約30%のABヘテロ接合性粒子を含む。特定の実施形態では、産出マルチゲノム調製物は、ホモ接合ゲノム（AAおよびBBホモ接合ゲノム）を含む少なくとも約80%の粒子を含んでもよく、約20%のABヘテロ接合性粒子を含む。
【０１１７】
特定の実施形態では、可能な限りマルチゲノムウイルスベクター調製物中に高い割合のヘテロ接合性粒子を有することが望ましい場合がある。これに関して、本発明は、少なくとも60%のヘテロ接合性ウイルスベクター粒子を含むマルチゲノムウイルスベクター調製物およびマルチゲノムウイルスベクター調製物を製造する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、約50%〜約99%のヘテロ接合性ウイルスベクター粒子を含むマルチゲノムウイルスベクター調製物を提供する。別の実施形態では、本開示は、少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、さらには100%のヘテロ接合性ウイルスベクター粒子を含むマルチゲノムウイルスベクター調製物を提供する。特定の実施形態では、本開示は、約40%〜約80%、約45%〜約75%、約50%〜約70%、または約55%〜約65%のヘテロ接合性ウイルスベクター粒子を含むマルチゲノムウイルスベクター調製物を提供する。本明細書に記載されるように、本発明は、本明細書に記載のヘテロ接合性ウイルスベクター粒子のパーセンテージを含む混合ウイルスベクター調製物を作製するための特定のウイルスベクターゲノム、方法およびパッケージングシステムを提供する。
【０１１８】
特定の実施形態では、マルチゲノムウイルスベクター調製物は、特定の調製物の全ゲノム力価と比較したある特定のゲノムのパーセンテージを測定することによって特性評価される（例えば、実施例１を参照）。これに関して、特定の実施形態では、本開示は、調製物中に約2%〜約95%の特定のゲノムを含むマルチゲノムウイルスベクター調製物を提供する。特定の実施形態では、マルチゲノムウイルスベクター調製物は、調製物中の特定のゲノムを約5%〜約70%、約10%〜約60%、約15%〜約50%含み得る。投入ベクターゲノムプラスミドの数およびそれぞれの使用比率に応じて、最終マルチゲノムレンチウイルスベクター調製物中のある特定のゲノムのパーセンテージは変化する（例えば、表２および３を参照）。
【０１１９】
マルチゲノムウイルスベクター調製物は、本明細書に記載の対象配列の任意の組み合わせを有するベクターゲノムを含み得る。非限定的な例として、異なる腫瘍抗原をそれぞれコードする3つの異なるウイルスベクターゲノムを使用してマルチゲノムウイルスベクター調製物を作製することができ、免疫調節分子をコードする1つ以上のウイルスベクターゲノムも含む。マルチゲノムウイルスベクター調製物を産生するためのウイルスベクターゲノムの組み合わせの具体例には、限定されないが、以下が含まれる：1）LV-NYESO1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-ScFvanti-CTLA4；2）LV-NYESO1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-IL12；3）2）LV-NYESO1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-IL23；4）LV-NY-ESO-1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-CD40；5）LV-MAGEA1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA4、LV-MAGEA10；6）LV-NYESO1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-ScFvanti-PD1；7）LV-NYESO1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-ScFvanti-PDL1；8）LV-NYESO1、LV-MAGEA3、LV-MAGEA10、LV-ScFvanti-PDL1、LV-ScFvanti-CTLA4。
【０１２０】
特定の実施形態では、免疫調節分子をコードする1つ以上のウイルスベクターゲノムの有無に関わらず、異なる腫瘍抗原をそれぞれコードする4つ以上の異なるウイルスベクターゲノムを使用して、マルチゲノムウイルスベクター調製物を作製することができる。マルチゲノムウイルスベクター調製物を産生するためのウイルスベクターゲノムの組み合わせの具体例には、限定されないが、免疫調節分子の有無に関わらず、複数のMAGEタンパク質が含まれる（例えば、MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA10、IL-12の有無に関わらない）。
【０１２１】
ある種の実施形態では、免疫調節分子をコードする1つ以上のウイルスベクターゲノムの有無に関わらず、異なる腫瘍抗原をそれぞれコードする複数の異なるウイルスベクターゲノム、1つ以上のネオ抗原をそれぞれコードする1つ以上のウイルスベクターゲノムを使用して、マルチゲノムウイルスベクター調製物を作製することができる。非限定的な例として、マルチゲノムウイルスベクター調製物を産生するためのウイルスベクターゲノムの組み合わせには、限定されないが、1）免疫調節分子の有無に関わらず、1つ以上のネオ抗原に加えて複数のMAGEタンパク質が含まれる（例えば、MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA10、複数のネオ抗原を含むネオ抗原カセットの1つ以上の任意の組み合わせ、IL-12の有無に関わらない）。
【０１２２】
当業者に理解されるように、マルチゲノムウイルスベクター調製物は、異なるヘテロ接合性およびホモ接合性ウイルス粒子の混合物を含有する（例えば、3つのウイルスベクターゲノムを使用した調製物中の異なる考えられる粒子を記載する表２を参照）。
【０１２３】
特定の実施形態では、混合ウイルスベクター粒子調製物は、1つ以上のヘテロ接合性ウイルスベクター粒子を含み、ここでヘテロ接合性ウイルスベクター粒子は、抗原をコードするウイルスベクターゲノムと、免疫調節分子をコードするウイルスベクターゲノムとを含む。さらなる非限定的な例として、一実施形態では、ヘテロ接合性ウイルスベクター粒子は、第1抗原をコードする第1ベクターゲノムと、第2抗原をコードする第2ベクターゲノムとを含み、ここで第2抗原は第1抗原とは異なる。特定の実施形態では、ヘテロ接合性ウイルスベクター粒子は、全長腫瘍抗原をコードする第1ベクターゲノムと、1つ以上のネオ抗原またはネオ抗原エピトープのカセットをコードする第2ベクターゲノムとを含む。さらなる実施形態では、ヘテロ接合性ウイルスベクター粒子は、抗原をコードする第1ベクターゲノムと、チェックポイント阻害剤分子をコードする第2ベクターゲノムとを含む。さらなる実施形態では、ヘテロ接合性ウイルスベクター粒子は、抗原をコードする第1ベクターゲノムと、TLRアゴニストをコードする第2ベクターゲノムとを含む。
【０１２４】
当該技術分野で既に知られている様々な方法のいずれかを使用して、そのゲノムが本明細書に記載のウイルスベクターゲノムのRNAコピーを含むレンチウイルス粒子を生成することができる。1つの方法では、ウイルスベクターゲノムから転写されたウイルスゲノムRNAをウイルス粒子にパッケージングするのに必要な全ての成分を含むパッケージング細胞株に、他の箇所で記載の2つ以上のウイルスベクターゲノムを導入する。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、1つ以上の対象配列に加えて、ウイルス成分をコードする1つ以上の遺伝子を含み得る。しかしながら、標的細胞におけるゲノムの複製を防止するために、複製に必要とされる内在性ウイルス遺伝子は、通常、除去され、パッケージング細胞株にトランスで別々に提供される。
【０１２５】
一般に、レトロウイルスベクター粒子は、粒子を生成するのに必要な成分を含む1つ以上のプラスミドベクターでトランスフェクトされた細胞株によって産生される。対象タンパク質（例えば、完全長抗原または免疫モジュレーターまたはネオ抗原エピトープカセット）をそれぞれコードする2つ以上の異なるベクターゲノムプラスミド（所定の比率で）を、産生細胞のトランスフェクションの前に、ベクター粒子を形成するタンパク質をコードする他の定常プラスミドとともに混合する。
【０１２６】
これらのベクター粒子は、典型的には複製可能ではない、すなわち、それらは1回の感染しかできない。多くの場合、複製プラスミドベクターを利用して、レトロウイルスベクター粒子を生成する様々な遺伝子構成要素を分離し、主に複製可能ウイルスを生成する可能性がある組み換え事象の機会を減少させる。しかしながら、必要に応じて、レトロウイルス成分の全てを有する単一のプラスミドベクターを使用してもよい。複数のプラスミドベクターを使用するシステムの一例として、LTR、シス作用パッケージング配列、および対象配列（単数または複数）を含むウイルスベクターゲノム（すなわち、ベクターゲノムプラスミド）を含む少なくとも2つのプラスミドで細胞株をトランスフェクトし、それらは多くの場合、異種プロモーター、ウイルス酵素および構造成分（すなわち、GagおよびPolなどの成分をコードするパッケージングプラスミド）をコードする少なくとも1つのプラスミド、ならびにエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも1つのエンベローププラスミドに作動可能に連結される。本明細書に記載され、当該技術分野で知られているように、レトロウイルス粒子生成を増強するために、さらなるプラスミド、例えばRev発現プラスミドおよび／またはVpx発現プラスミドを使用することができる。ウイルス粒子は、細胞膜を貫通して芽を出し、対象配列を含むゲノムおよび樹状細胞を標的とするエンベロープ糖タンパク質を含むコアを含む。エンベロープ糖タンパク質がシンドビスウイルスE2糖タンパク質である場合、糖タンパク質は、参照株HRと比較してヘパラン硫酸への結合が減少するように操作されている。
【０１２７】
本発明のプラスミドベクターでのパッケージング細胞のトランスフェクションは、よく知られている方法で行うことができ、用いる方法は決して限定されない。多くの非ウイルス送達系が当該技術分野で知られており、例えば、以下が含まれる：エレクトロポレーション、リポソームを含む脂質ベースの送達システム、「裸の」DNAの送達、およびポリシクロデキストリン化合物を用いる送達、例えばSchatzlein AGに記載されているもの（2001. Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy: Principles and Progresses.  Anticancer Drugs,）。陽イオン性脂質または塩処理法が典型的に使用される、例えば、Grahamらを参照（1973. Virol. 52:456; Wigler et al. (1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-76）。リン酸カルシウム沈殿法が最も頻繁に使用されている。しかしながら、核マイクロインジェクションおよび細菌プロトプラスト融合を含む、ベクターを細胞に導入するための他の方法も使用され得る。
【０１２８】
本明細書において、表１、２、３および実施例でさらに記載されるように、マルチゲノムレトロウイルスベクター調製物において所望される各ゲノムに対する投入レトロウイルスゲノムプラスミドの比率は、所望の産出量に応じて変化させることができる。
【０１２９】
パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムRNAのレトロウイルスベクター粒子へのパッケージングのためにトランスにおいて必要とされる、ウイルス調節および構造タンパク質を含む成分を提供する。パッケージング細胞株は、レトロウイルスタンパク質を発現し、機能性レトロウイルスベクター粒子を産生することができる任意の細胞株であり得る。いくつかの適切なパッケージング細胞株には、293（ATCC CCL X）、293T、HeLa（ATCC CCL 2）、D17（ATCC CCL 183）、MDCK（ATCC CCL 34）、BHK（ATCC CCL-10）およびCf2Th（ATCC CRL 1430）細胞が含まれる。パッケージング細胞株は、必要なウイルスタンパク質を安定に発現することができる。そのようなパッケージング細胞株は、例えば、米国特許第6,218,181号明細書に記載されている。あるいは、パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムとともに、1つ以上の必要なウイルスタンパク質をコードする核酸分子で一過的にトランスフェクトされてもよい。得られたウイルス粒子を回収し、標的細胞に感染させるために使用する。エンベロープ糖タンパク質（単数または複数）をコードする遺伝子（単数または複数）は、通常、pcDNA3（Invitrogen、米国カリフォルニア州）などの発現ベクターにクローニングされる。真核細胞発現ベクターは、当該技術分野でよく知られており、多くの商業的供給源から入手可能である。次いで、293T細胞などのパッケージング細胞は、対象配列をコードするウイルスベクターゲノム、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも1つのプラスミド、および標的分子の発現のためのベクターで共トランスフェクトされる。エンベロープは、パッケージング細胞の膜上に発現され、ウイルスベクターに組み込まれる。
【０１３０】
1つのシナリオでは、1つ以上のベクターを使用して、VSVgエンベロープまたはシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質、例えば本明細書に記載のようにE2などで偽型化されたレトロウイルスベクター粒子の調製のために、ポリヌクレオチド配列をパッケージング細胞株に導入する。ベクターは、VSVgまたはシンドビスウイルスエンベロープ、ベクターゲノムプラスミドを含む、ウイルスの種々の成分をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができ、それぞれ、対象配列（単数または複数）（例えば、抗原または他の対象配列）、およびパッケージング細胞によって供給されないウイルスの産生に必要な任意の成分を含む。
【０１３１】
さらに他のシナリオでは、パッケージング細胞は、対象タンパク質および1つ以上の追加のベクターをコードする少なくとも2つのウイルスベクターゲノムで共トランスフェクトされる。例えば、対象配列（単数または複数）（および、任意に1つ以上の追加の対象配列）を含むウイルスベクターゲノムに加えて、第2ベクターは、エンベロープタンパク質、例えばVSVgエンベロープまたは修飾（変異とも呼ばれる）シンドビスウイルスエンベロープをコードする遺伝子を保持する。いくつかの状況では、ウイルスベクターゲノムを含むプラスミドは、ケモカイン、サイトカイン、DC成熟因子、または免疫チェックポイント機序を調節する因子の非限定的な例を含む、付加的に選択された免疫調節分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１３２】
特定の実施形態では、パッケージングシステムは、gag-pol遺伝子が2つの別個のプラスミドにさらに分離される、いわゆる第4世代パッケージングシステムである。そのようなシステムは、当該技術分野で知られており、例えば以下に記載されている：米国特許第6365150号明細書、米国特許第6955919号明細書、米国特許第7311907号明細書および米国特許第8034620号明細書。そのようなパッケージングシステムは、例えばClontech/Takara（カリフォルニア州サンディエゴ）からも市販されている。特定の実施形態では、逆転写酵素／インテグラーゼタンパク質の組み換えウイルス粒子への輸送を確実にするために、pol遺伝子をvprに融合させてもよい。
【０１３３】
特定の実施形態では、パッケージングシステムは、WO2013/149167またはWO2011/011584に記載の通りである。
【０１３４】
いくつかのまたは任意の実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルスベクター粒子は、SAMHD1阻害剤を含む。特定の実施形態では、SAMHD1阻害剤は、Vpxタンパク質またはVprタンパク質である。特定の実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルスベクター粒子は、Vpxタンパク質またはその変異体を含む（例えば、WO2013/149167を参照）。いくつかのまたは任意の実施形態では、変異体はSAMHD1を阻害する能力を保持する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、シンドビスエンベロープタンパク質などのアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質で偽型化される。シンドビスウイルスエンベロープタンパク質は、E2タンパク質に2つ、E1タンパク質に2つのN-結合グリカンを含む。マンノシダーゼI阻害剤なしで、哺乳類細胞で産生されたウイルスの2つのN-グリカンは、高マンノース構造（1つのE2 N-結合グリカンおよび1つのE1 N-結合グリカン）を有し、残りの2つは複雑な構造を有する。2つの複雑な構造のN-グリカンはエンベロープタンパク質の表面に露出され、2つの高マンノース構造のN-グリカンはエンベロープタンパク質の3量体の中心に埋もれている。複雑なN-結合グリカンを有するシンドビスウイルス粒子は、複雑でない高マンノシル化糖タンパク質を有する粒子ほど効率的にはDC-SIGNに結合しない。
【０１３６】
特定の実施形態では、ウイルス粒子は、マンノシダーゼI阻害剤、例えばキフネンシンの存在下で、哺乳類細胞中で産生される（WO2013/149167を参照）。したがって、いくつかのまたは任意の実施形態では、ウイルスパッケージング細胞は、マンノシダーゼI阻害剤の存在下で培養される。いくつかのまたは任意の実施形態では、マンノシダーゼI阻害剤はキフネンシンである。いくつかの実施形態では、キフネンシンは、以下の濃度で培地中に存在する：約0.01μg/ml〜約1mg/ml、約0.1μg/ml〜約10μg/ml、約0.1μg/ml〜約9μg/ml、約0.1μg/ml〜約8μg/ml、約0.1μg/ml〜約7μg/ml、約0.1μg/ml〜約6μg/ml、約0.1μg/ml〜約5μg/ml、約0.1μg/ml〜約4μg/ml、約0.1μg/ml〜約3μg/ml、約0.1μg/ml〜約2μg/ml、約0.1μg/ml〜約1μg/ml、約0.25μg/ml〜約10μg/ml、約0.25μg/ml〜約9μg/ml、約0.25μg/ml〜約8μg/ml、約0.25μg/ml〜約7μg/ml、約0.25μg/ml〜約6μg/ml、約0.25μg/ml〜約5μg/ml、約0.25μg/ml〜約4μg/ml、約0.25μg/ml〜約3μg/ml、約0.25μg/ml〜約2μg/ml、または約0.25μg/ml〜約1μg/ml。
【０１３７】
偽型レトロウイルスベクター粒子がシンドビスウイルスE2糖タンパク質およびVpxタンパク質を含むいくつかのまたは任意の実施形態では、レトロウイルス粒子はマンノシダーゼI阻害剤の存在下で産生される。いくつかの実施形態では、マンノシダーゼ阻害剤はデオキシマンノジリマイシン（DMNJ）である。好ましい態様では、マンノシダーゼ阻害剤はキフネンシンである。いくつかの実施形態では、DMNJは、以下の濃度で培地中に存在する：約1.0μg/ml〜約1.0mg/ml、約1.0μg/ml〜約900μg/ml、約1.0μg/ml〜約800μg/ml、約1.0μg/ml〜約700μg/ml、約1.0μg/ml〜約600μg/ml、約1.0μg/ml〜約500μg/ml、約1.0μg/ml〜約400μg/ml、約1.0μg/ml〜約300μg/ml、約1.0μg/ml〜約200μg/ml、約1.0μg/ml〜約100μg/ml、約50μg/ml〜約500μg/ml、約50μg/ml〜約400μg/ml、約50μg/ml〜約300μg/ml、約50μg/ml〜約200μg/ml、約50μg/ml〜約100μg/ml、約100μg/ml〜約500μg/ml、約100μg/ml〜約400μg/ml、約100μg/ml〜約300μg/ml、約100μg/ml〜約200μg/ml、約200μg/ml〜約500μg/ml、または約200μg/ml〜約400μg/ml。
【０１３８】
いくつかのまたは任意の実施形態では、マンノシダーゼI阻害剤（例えば、キフネンシン）の存在下で産生される偽型レトロウイルスベクター粒子はエンベロープ糖タンパク質（例えば、シンドビスウイルスE2）を含み、ここで少なくとも60%のN-結合グリカンがマンノース5（Man5）、Man6、Man7、Man8、および／またはMan9構造を含む。いくつかの実施形態では、N結合型グリカンの少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%は、Man5、Man6、Man7、Man8、および／またはMan9+構造を含む。
【０１３９】
1つのシナリオでは、1つ以上のベクターを使用して、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質、例えば本明細書に記載のようにE2などで偽型化されたレトロウイルスベクター粒子の調製のために、ポリヌクレオチド配列をパッケージング細胞株に導入する。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は高度にマンノシル化されている。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は、Vpxタンパク質またはその変異体も含む。さらに他の実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は高度にマンノシル化されており、Vpxタンパク質またはその変異体を含む。ベクターは、シンドビスウイルスエンベロープ、対象配列（単数または複数）（典型的には抗原をコードする）、およびパッケージング細胞によって供給されないウイルスの産生に必要な任意の成分を含む、ウイルスの種々の成分をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。
【０１４０】
ウイルスエンベロープタンパク質のグリコシル化プロファイルは、当該技術分野で知られている任意の方法によって決定することができる。例えば、グリコシダーゼ（例えば、EndoHもしくはPNGaseF）で処理した、または未処置のままにしたウイルス糖タンパク質に対するゲルシフトアッセイを比較することができる。他の方法は、ウイルス糖タンパク質からグリカンを切断し、HPLCおよび質量分析法によって成分を分離および同定することを含む。
【０１４１】
ウイルスの産生は、本明細書に記載されるように測定され、1容積当たりのIUとして表される。IUは感染単位、あるいは形質導入単位（TU）である；IUおよびTUは、ウイルスベクター粒子調製物の力価の定量的尺度として交換可能に使用することができる。本明細書に記載されるように、ゲノムが容易に測定可能な産物を発現することができるウイルスが産生される。蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質が好ましい。レトロウイルスベクターは、典型的には非組み込み型である。次いでウイルスを標的細胞に投与し、GFPを発現する標的細胞の数を、フローサイトメトリーなどにより測定する。次いで力価を計算する。力価は、できるだけ高い方が好ましいが、細胞上清（任意の濃縮の前）の少なくとも1×105IU/mL、少なくとも3×105IU/mL、少なくとも1×106IU/mL、少なくとも3×106IU/mL、または少なくとも1×107IU/mLである。あるいは、力価は、VSV-Gエンベロープを有する同じ細胞で偽型化した同じレトロウイルスベクターの力価の少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%である。
【０１４２】
特定の実施形態では、ウイルスの産生はゲノム/mlとして測定される。ゲノムは、RT-PCR、PCR、qPCR、qdd（デジタル液滴）PCRおよびRNASCOPEまたはDNASCOPEなどの、当該技術分野で知られている様々な方法を用いて測定することができる。
【０１４３】
再集合体を含む本明細書に記載の特定のレトロウイルスベクター粒子調製物の構成を決定するために、様々な方法を使用することができる。例えば、ウイルスベクター調製物中に存在する各対象配列に特異的なプライマーセットに基づく遺伝子特異的qRT-PCRを使用することができる。特定の実施形態では、フローサイトメトリーと組み合わせた遺伝子特異的qRT-PCRを使用することができる。デジタル液滴PCR（例えば、Bio-Rad QX-100 RT-ddPCRシステム、Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズを参照）などの他の単一細胞方法も使用することができる；Hindson BJ et al. (2011). High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem 83(22): 8604-8610；Pinheiro LB et al. (2012). Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Anal Chem 84, 1003-1011)も参照。他の方法には、RNASCOPEおよびDNASCOPE（Advanced Cell Diagnostics社、カリフォルニア州ニューアーク）が含まれる（例えば、Deleage et al., Pathogens and Immunity 2016 Spring;1(1):68-106；Wang et al.,  J Mol Diagn. 2012;14(1):22-9；Player et al., J Histochem Cytochem. 2001;49(5):603-12を参照）。特定のウイルスベクター調製物またはウイルス粒子または形質導入細胞のホモ接合対ヘテロ接合構成を決定するためのこれらのおよび他の方法は、当業者に知られているであろう。
【０１４４】
（D.ウイルスの送達）
対象ポリヌクレオチドの送達が望まれる標的細胞にウイルスが接触することを可能にする任意の方法で、マルチゲノムウイルスベクター調製物を含む組成物は標的細胞に送達され得る。用途に応じて、異なる細胞を標的とすることができる。特定の実施形態では、腫瘍細胞が標的とされる。他の実施形態では、樹状細胞（DC）が標的とされる。さらなる実施形態では、T細胞またはB細胞が標的とされる。本発明のレトロウイルスベクターは、in vitroで（例えば、細胞のex vivo修飾用に）、またはin vivoで直接使用することができる。
【０１４５】
時には、マルチゲノムウイルスベクター調製物を含む適当量の組成物は、ヒトまたは他の動物に直接（in vivoで）、例えば体内への注射を介して導入される。好適な動物には、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリまたは他の鳥類などの任意の哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス粒子は、静脈内、筋肉内、皮膚内、皮下、結節内、腫瘍内、腹膜腔内、または粘膜などの多くの経路で注射することができる。ウイルスは、以下に開示の装置などの皮下注射装置を用いて送達することができる：米国特許第7,241,275号明細書、米国特許第7,115,108号明細書、米国特許第7,108,679号明細書、米国特許第7,083,599号明細書、米国特許第7,083,592号明細書、米国特許第7,047,070号明細書、米国特許第6,971,999号明細書、米国特許第6,808,506号明細書、米国特許第6,780,171号明細書、米国特許第6,776,776号明細書、米国特許第6,689,118号明細書、米国特許第6,670,349号明細書、米国特許第6,569,143号明細書、米国特許第6,494,865号明細書、米国特許第5,997,501号明細書、米国特許第5,848,991号明細書、米国特許第5,328,483号明細書、米国特許第5,279,552号明細書、米国特許第4,886,499号明細書。標的細胞を含む臓器への直接注入など、他の注入位置も適している。例えば、リンパ節内注射、脾臓内注射、または骨髄内注射を利用し、それぞれリンパ節、脾臓および骨髄にウイルスを送達してもよい。特定の状況および標的細胞の性質に応じて、例えば、吸入、または上皮組織、例えば眼、口もしくは皮膚の上皮組織との直接接触を含む他の手段を介して導入を行うことができる。
【０１４６】
あるいは、標的細胞を用意し、培養プレートなどのin vitroでウイルス粒子と接触させる。標的細胞は、典型的には、健康な被験体もしくは治療を必要とする被験体から得られた、または抗原に対する免疫応答を刺激することが望まれるT細胞または樹状細胞を含む細胞の集団である。被験体から細胞を得る方法は、当該技術分野でよく知られており、静脈切開、外科的切除、および生検が含まれる。ヒトDCは、CD34α+ヒト造血前駆細胞を得ること、および他の箇所で記載のようなin vitro培養法（例えば、その全体が参照により組み込まれるBanchereau et al. Cell 106, 271-274 (2001)を参照）を使用して生成することもできる。適切なT細胞集団を、同様の方法を用いてin vitroで生成することができる。
【０１４７】
マルチゲノム調製物は、培地中に懸濁され、培養プレートのウェル、チューブまたは他の容器に添加され得る。ウイルスを含む培地は、細胞のプレーティングの前に、または細胞がプレーティングされた後に添加され得る。細胞は、典型的には、生存能力を提供し、宿主細胞の形質導入が起こるように培地中のウイルスの適切な濃度を可能にするのに適当量の培地中でインキュベートされる。細胞は、好ましくは、ウイルスが細胞に感染するのを可能にするのに十分な時間、ウイルスとともにインキュベートされる。好ましくは、細胞は、少なくとも1時間、少なくとも5時間または少なくとも10時間、ウイルスとともにインキュベートされる。
【０１４８】
In vivoおよびin vitro送達の両方において、所望の標的細胞を感染させるのに十分な数を含むウイルス粒子のアリコートが使用され得る。標的細胞を培養する場合、ウイルス粒子の濃度は一般に、少なくとも1IU/μL、より好ましくは少なくとも10IU/μL、さらにより好ましくは少なくとも300IU/μL、さらにより好ましくは少なくとも1X104IU/μL、さらにより好ましくは少なくとも1×105IU/μL、さらにより好ましくは少なくとも1×106IU/μL、またはさらにより好ましくは少なくとも1×107IU/μLである。
【０１４９】
In vitroでウイルス粒子を感染させた後、標的細胞をヒトまたは他の動物に導入（または再導入）することができる。細胞は、真皮、真皮下、または末梢血流に導入することができる。動物に導入される細胞は、好ましくは、有害な免疫応答を回避するために、その動物に由来する細胞である。同様の免疫背景を有するドナー由来の細胞を使用することもできる。同様に使用することができる他の細胞には、有害な免疫応答を回避するように設計された細胞が含まれる。
【０１５０】
標的細胞は、例えば、対象配列または遺伝子（単数または複数）の統合、転写および／または発現、遺伝子組み込みのコピー数、ならびに組み込みの位置について分析され得る。そのような分析は、任意の時点で実施することができ、当該技術分野で知られている任意の方法によって実施され得る。
【０１５１】
ウイルスまたはウイルス感染細胞が投与される被験体は、当該技術分野で知られている任意の方法で、感染細胞の位置、ウイルス送達ポリヌクレオチドまたは対象遺伝子の発現、免疫応答の刺激について分析され、疾患または障害に関連する症状について観察され得る。
【０１５２】
上記で開示した細胞を感染させる方法は、細胞の個々の特異的な特性に依存しない。結果として、それらは様々な動物種に容易に拡大される。いくつかの例では、ウイルス粒子は、ヒト、またはT細胞、B細胞もしくは樹状細胞などのヒト細胞に送達され、他の場合には、マウス、ウマ、イヌ、ネコ、もしくはマウスなどの動物または鳥類に送達される。本明細書中で議論されるように、ウイルスベクターは偽型化され、それに広範な宿主範囲および標的細胞特異性を与える。当業者は、特定の動物種において対象配列の所望の発現を達成するのに適切な内部プロモーターおよび他の要素も知っているであろう。したがって、当業者は、任意の種からの細胞を感染させる方法を改変することができるであろう。
【０１５３】
標的細胞は、疾患または障害の予防または治療のための本明細書に記載の混合レトロウイルスベクター粒子調製物で感染させることができる。特定の実施形態では、標的細胞を、患者における免疫応答の活性化が有益であると考えられる疾患もしくは障害の予防または治療のための本明細書に記載の混合レトロウイルスベクター粒子調製物で感染させることができる。多くのそのような疾患がよく知られている。例えば、本発明の方法による治療または予防に適している疾患または障害には、がん、自己免疫疾患、ならびにウイルス、細菌、真菌および寄生虫感染を含む感染が含まれるが、これらに限定されない。1つの方法では、樹状細胞に対象配列を送達するために、本明細書に記載のウイルス粒子によって疾患を治療し、ここで対象配列の発現が疾患特異的抗原を産生し、抗原特異的細胞性免疫応答および体液性免疫応答の刺激をもたらす。一般に、対象配列は、免疫応答が所望されるが、樹状細胞では通常発現されない1つ以上の抗原をコードする。抗原は、樹状細胞によって発現され提示される。他の実施形態では、ウイルスベクターゲノムは、本明細書に記載の免疫調節分子をコードし得る。特定の実施形態では、ウイルスベクター粒子はヘテロ接合体であり、抗原をコードするウイルスベクターゲノムと、免疫調節分子をコードするウイルスベクターゲノムとを含み、それらの両方が標的細胞で発現される。
【０１５４】
典型的な使用では、ウイルス粒子は、樹状細胞に、免疫応答が望まれる抗原をコードする配列と、免疫調節分子をコードする配列とを送達する。送達は、細胞をin vitroでウイルスと接触させることによって達成することができ、その際感染した細胞は患者に供給される。他には、in vivoで細胞を感染させるために、ウイルスを被験体に送達することによって送達を達成することができる。特定の実施形態では、マルチゲノム調製物を含む組成物は、in vivoで樹状細胞を感染させるために被験体に送達される。次いで、樹状細胞は、患者の抗原特異的T細胞またはB細胞を刺激して、発現した抗原に対する細胞性および体液性の免疫応答を誘導する。したがって、本開示は、本明細書に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を含む医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体において免疫応答を誘導する方法を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、本明細書に記載のマルチゲノムウイルスベクター調製物を含む医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体においてがんを治療する方法を提供し、ここでSOIは、1つ以上の腫瘍関連抗原および任意に1つ以上のチェックポイント阻害剤または1つ以上のサイトカイン、またはそれらの組み合わせをコードする。別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクター調製物を含む医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体において感染症を治療する方法を提供し、ここでSOIは、感染症に関連する抗原をコードする。
【０１５５】
他の実施形態では、標的細胞をin vivoまたはin vitroのいずれかで本明細書に記載のウイルスに感染させ、免疫調節分子を発現させる。感染した細胞は、免疫調節分子を患者において発現させ、免疫応答を調節する。このようにして、疾患または障害に罹患している患者は、所望の特異性または調節された免疫応答を有する免疫細胞を、免疫調節分子で生成させることによって治療される。
【０１５６】
疾患または障害に関連する任意の抗原は、本明細書に記載のマルチゲノムウイルスベクターを用いて樹状細胞に送達することができる。疾患または障害に関連する抗原は、樹状細胞を標的とするウイルス粒子の調製のために同定される。
【０１５７】
Ex vivoで接触させる場合、標的樹状細胞は、例えば、注射によって患者に戻され、所望の抗原に対する免疫応答を生じることができる免疫細胞と相互作用する。他の実施形態では、組み換えウイルスを患者に注射し、それにより標的化樹状細胞をin situで形質導入する。次いで、樹状細胞は、治療を受ける疾患または障害に関連する特定の抗原を発現し、患者は疾患または障害に対して効果的な免疫応答を起こすことができる。
【０１５８】
特定の実施形態では、ウイルスベクター粒子はヘテロ接合体であり、異なる抗原をコードするポリヌクレオチド配列をそれぞれ含むベクターゲノムを含み、標的樹状細胞の形質導入時に、細胞に送達される多数の抗原に対する免疫応答を生じる。いくつかの実施形態では、抗原は、単一の疾患または障害に関連する。他の実施形態では、抗原は、複数の疾患または障害に関連する。
【０１５９】
本明細書に記載のいくつかのマルチゲノムベクターでは、粒子は、免疫応答を活性化および／または刺激する免疫調節分子をコードする少なくとも1つのベクターゲノムを含み、特定の実施形態ではDCの成熟を活性化および／または刺激する。別の方法では、DCは、ウイルスの送達の前、同時、または後に、DC成熟因子の送達によって活性化される。DC成熟因子は、ウイルスの投与とは別に供給され得る。
【０１６０】
本明細書に記載の方法は、患者における養子免疫療法に使用することができる。上記のように、免疫応答が所望される抗原が同定される。所望の抗原をコードするポリヌクレオチドを得て、本明細書に記載の組み換えマルチゲノムウイルスベクター調製物にパッケージングする。標的樹状細胞を患者から得て、所望の抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えウイルスで形質導入する。次いで、樹状細胞を患者に戻す。
【０１６１】
マルチゲノムウイルスベクターはin vivoで注入されてもよく、それらはDCなどの標的細胞に感染し、典型的には抗原および／または免疫調節分子をコードする対象配列を送達する。ウイルス粒子の量は少なくとも3×106IUであり、少なくとも1×107IU、少なくとも3×107IU、少なくとも1×108IU、少なくとも3×108IU、少なくとも1×109IU、または少なくとも3×109IUとなり得る。選択された間隔で、レシピエントのリンパ様器官からのDCを用いて、例えば対象抗原またはGFPまたはルシフェラーゼなどのマーカー発現を観察することによって、発現を測定することができる。核酸観察技術および逆転写酵素（RT）活性の測定も使用して、ウイルス粒子の生体内分布を分析することができる。末梢血単核細胞、リンパ節、脾臓、またはレンチウイルスベクター粒子治療レシピエントの悪性もしくは標的病原体感染組織からのT細胞を、抗原刺激に対する応答の大きさおよび持続性から測定することができる。上皮細胞およびリンパ様細胞などのDC以外の組織細胞は、in vivo遺伝子送達の特異性について分析され得る。
【０１６２】
ワクチンは、しばしばアジュバントを含む。本明細書に記載のマルチゲノムレトロウイルスベクターは、アジュバントとともに投与することもできる。アジュバントは、組み換えウイルス粒子とともに、組み換えウイルス粒子の前に、または組み換えウイルス粒子の後に投与することができる。ウイルス粒子とともに投与される場合、望ましいアジュバントは、エンベロープ糖タンパク質を含有するウイルス膜を破壊するなど、ウイルス粒子の完全性を著しくは破壊しない。
【０１６３】
本明細書のマルチゲノムウイルスベクターの典型的な使用は、抗原または複数の抗原に対する免疫応答の誘導のために、in vivoでDCを標的とするためであるが、養子免疫療法、修飾T細胞の産生（修飾TCRまたはキメラ抗原受容体を発現する）、遺伝子治療などのために、他の標的細胞および使用が本明細書で意図される。
【０１６４】
様々なアジュバントをウイルスと組み合わせて使用し、ウイルスベクターゲノムにコードされた抗原に対する免疫応答を誘発することができる。好ましいアジュバントは、応答の定性的形態に影響を及ぼす抗原の構造変化を引き起こすことなく、抗原に対する内因性応答を増大させる。好ましいアジュバントには、ミョウバン、3脱-O-アシル化モノホスホリルリピドA（MPL）が含まれる（GB2220211を参照）。QS21は、南アメリカで見られるQuillaja Saponaria Molinaの樹皮から単離されたトリテルペングリコシドまたはサポニンである（Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell and Newman, Plenum Press, NY, 1995)；米国特許第5,057,540号明細書を参照）。他のアジュバントは、水中油型エマルション（スクワレンまたはピーナッツ油など）であり、任意にモノホスホリルリピドAなどの免疫賦活剤と組み合わせてもよい（Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)を参照）。別のアジュバントはCpGである（Bioworld Today, Nov. 15, 1998）。あるいは、Aβをアジュバントにカップリングさせることができる。例えば、Aβのリポペプチド型は、B型肝炎抗原ワクチン接種について記載されているように、パルミチン酸または他の脂質をAβのN末端に直接カップリングさせることによって調製することができる（Livingston, J. Immunol. 159, 1383-1392 (1997)）。しかしながら、そのようなカップリングは、Aβへの免疫応答の性質に影響を及ぼすように、Aβの立体配座を実質的に変化させてはならない。アジュバントは、活性剤とともに治療用組成物の成分として投与することができ、または別々に、治療剤の投与前、投与と同時に、または投与後投与することができる。
【０１６５】
アジュバントの1つのクラスは、アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどである。そのようなアジュバントは、他の特異的免疫刺激剤、例えばMPLまたは3-DMP、QS21、ポリグルタミン酸またはポリリジンなどのポリマーまたはモノマーアミノ酸などの有無に関わらずに使用することができる。アジュバントの別のクラスは、水中油型エマルション製剤である。そのようなアジュバントは、例えば以下のものなどの他の特定の免疫刺激剤の有無に関わらず使用することができる：ムラミルペプチド（例えば、N-アセチルムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン（thr-MDP）、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（nor-MDP）、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン（MTP-PE）、N-アセチルグルコサミニル-N-アセチルムラミル-L-Al-D-イソグル-L-Ala-ジパルミトキシプロピルアミド（DTP-DPP）theramide（商標））、または他の細菌細胞壁成分。水中油型エマルションには、以下のものが含まれる：（a）5%スクアレン、0.5%Tween80、および0.5%Span85を含有し（任意に種々の量のMTP-PEを含有）、Model 110Yマイクロフルイダイザー（Microfluidics、マサチューセッツ州ニュートン）などのマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化される、MF59（WO90/14837）、（b）10%スクアラン、0.4%Tween80、5%プルロニックブロックポリマーL121、およびthr-MDPを含有し、サブミクロンエマルションにマイクロ流動化されるか、またはボルテックスされてより大きな粒子サイズのエマルションを生成する、SAF、ならびに（c）2%スクアレン、0.2%Tween80、およびモノホスホリル脂質A（MPL）、トレハロースジミコレート（TDM）、および細胞壁骨格（CWS）、好ましくはMPL+CWS（Detox（商標））からなる群の1つ以上の細菌細胞壁成分を含む、Ribiアジュバントシステム（Ribi Immunochem、モンタナ州ハミルトン）。他のクラスの好ましいアジュバントは、サポニンアジュバント、例えば、Stimulon（商標）（QS21、Aquila、マサチューセッツ州ウースター）またはそこから生成されたISCOM（免疫刺激複合体）およびISCOMATRIXなどの粒子が含まれる。他のアジュバントには、完全フロイントアジュバント（CFA）および不完全フロイントアジュバント（IFA）が含まれる。他のアジュバントには、サイトカイン、例えばインターロイキン（IL-1、IL-2、およびIL-12）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、腫瘍壊死因子（TNF）などが含まれる。
【０１６６】
本明細書の組成物とともに使用することができる別のアジュバントは、化学式（I）によって同定される：
【化１】
2019509275.tif 000006
(I)
式中、部位A1およびA2は、独立して、水素、ホスフェート、およびリン酸塩の群から選択される。ナトリウムおよびカリウムは、リン酸塩の代表的な対イオンである。部位R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、C3〜C23で表される、3〜23個の炭素を有するヒドロカルビルの群から選択される。より明確にするために、ある部位が、複数の要素を有する特定の群から「独立して選択される」場合、第1部位に選ばれる要素は、第2部位に選ばれる要素の選択に何ら影響または制限を及ぼさないことが理解されるべきであると説明する。R1、R3、R5およびR6が結合している炭素原子は非対称であり、したがってRまたはS立体化学のいずれかで存在することができる。一実施形態では、これらの炭素原子の全てがR立体化学にあり、別の実施形態では、それらの炭素原子の全てがS立体化学にある。
【０１６７】
「ヒドロカルビル」は、完全に水素および炭素から形成された化学的部分を指し、ここで炭素原子の配置は直鎖または分岐、非環状または環状であってよく、隣接炭素原子間の結合は完全に単結合であってもよく、すなわち飽和ヒドロカルビルを提供してもよく、または任意の2つの隣接する炭素原子の間に存在する二重結合または三重結合があってもよく、すなわち不飽和ヒドロカルビルを提供してもよく、ヒドロカルビル基中の炭素原子の数は3〜24個の炭素原子である。ヒドロカルビルはアルキルであってもよく、ここで代表的な直鎖アルキルにはメチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシルなどが含まれ、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシルなどが挙げられる；それに対して、分岐アルキルには、イソプロピル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、イソペンチルなどが含まれる。代表的な飽和環状ヒドロカルビルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれる；それに対して、不飽和環状ヒドロカルビルには、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが含まれる。不飽和ヒドロカルビルは、隣接する炭素原子間に少なくとも1つの二重または三重結合を含有する（ヒドロカルビルが非環式である場合にはそれぞれ「アルケニル」または「アルキニル」と呼ばれ、ヒドロカルビルが少なくとも部分的に環式である場合にはそれぞれシクロアルケニルおよびシクロアルキニルと呼ばれる）。代表的な直鎖および分岐アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、1-ブテニル、2-ブテニル、イソブチレニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、3-メチル-1-ブテニル、2-メチル-2-ブテニル、2,3-ジメチル-2-ブテニルなどが含まれる；一方で代表的な直鎖および分岐アルキニルには、アセチレニル、プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、1-ペンチニル、2-ペンチニル、3-メチル-1-ブチニルなどが含まれる。
【０１６８】
式（I）のアジュバントは、当該技術分野で知られている合成方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれるPCT国際公開番号WO2009/035528、ならびに、それらの刊行物の各々も参照により本明細書に組み込まれるWO2009/035528において同定された刊行物に開示されている合成方法によって得ることができる。特定のアジュバントは、商業的に入手することもできる。好ましいアジュバントはGLAであり、以下のE10と組み合わせたE1として表される式を有する。
【０１６９】
特定の実施形態では、アジュバントは、以下に示す式を有する：
【化２】
2019509275.tif 000007
【０１７０】
本発明の様々な実施形態では、アジュバントは式（I）の化学構造を有するが、部位A1、A2、R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、これらの部位に対して前に提供された選択肢のサブセットから選ばれ、これらのサブセットは、E1、E2などによって以下で識別される。
E1：A1はホスフェートまたはリン酸塩であり、A2は水素である。
E2：R1、R3、R5およびR6はC3〜C21アルキルであり；R2およびR4はC5〜C23ヒドロカルビルである。
E3：R1、R3、R5およびR6はC5〜C17アルキルであり；R2およびR4はC7〜C19ヒドロカルビルである。
E4：R1、R3、R5およびR6はC7〜C15アルキルであり；R2およびR4はC9〜C17ヒドロカルビルである。
E5：R1、R3、R5およびR6はC9〜C13アルキルであり；R2およびR4はC11〜C15ヒドロカルビルである。
E6：R1、R3、R5およびR6はC9〜C15アルキルであり；R2およびR4はC11〜C17ヒドロカルビルである。
E7：R1、R3、R5およびR6はC7〜C13アルキルであり；R2およびR4はC9〜C15ヒドロカルビルである。
E8：R1、R3、R5およびR6はC11〜C20アルキルであり；R2およびR4はC12〜C20ヒドロカルビルである。
E9：R1、R3、R5およびR6はC11アルキルであり；R2およびR4はC13ヒドロカルビルである。
E10：R1、R3、R5およびR6はウンデシルであり、R2およびR4はトリデシルである。
【０１７１】
特定の選択肢では、E2〜E10の各々が実施形態E1と組み合わされ、および／またはE2〜E9のヒドロカルビル基はアルキル基、好ましくは直鎖アルキル基である。
【０１７２】
式（I）のアジュバントは、それぞれ以下に議論されるように、任意に共アジュバントとともに、医薬組成物に製剤化され得る。これに関して、GLAアジュバントのための製剤、例えば、水性製剤（AF）および安定エマルション製剤（SE）を提供する米国特許公開第2008/0131466号が参照され、ここで、これらの製剤は、式（I）のアジュバントのいずれかに利用され得る。
【０１７３】
アジュバントは、単一組成物として本発明のマルチゲノムウイルスベクターとともに投与することができ、または本発明の組み換えウイルスの投与前、投与と同時に、または投与後に投与することができる。免疫原およびアジュバントは、パッケージングされて同じバイアルに供給され得るか、または別々のバイアルにパッケージングされて使用前に混合され得る。免疫原およびアジュバントは、典型的には、意図された治療用途を示す標識でパッケージされる。免疫原およびアジュバントが別々にパッケージングされる場合、パッケージングは、典型的には、使用前の混合のための指示書を含む。アジュバントおよび／または担体の選択は、アジュバントを含むワクチンの安定性、投与経路、投与スケジュール、ワクチン接種される種に対するアジュバントの有効性に応じ、ヒトでは、薬学的に許容されるアジュバントは、関連する規制機関によってヒト投与に承認されているか、または承認見込みのあるアジュバントである。例えば、完全フロイントアジュバントは、ヒト投与には適していない。ミョウバン、MPLおよびQS21が好ましい。任意に、ミョウバンをMPLとともに、ミョウバンをQS21とともに、MPLをQS21とともに、ならびにミョウバン、QS21およびMPLを一緒になど、2つ以上の異なるアジュバントを同時に使用することができる。また、不完全フロイントアジュバントを使用することができ（Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)）、任意にミョウバン、QS21、およびMPLのいずれかと組み合わされ、ならびにそれらの全てと組み合わされる。
【０１７４】
本明細書に記載されるようなマルチゲノムウイルスベクターを含む組成物は、1つ以上の他の治療剤の投与と同時に、投与前に、または投与後にも投与され得る。
【０１７５】
そのような併用療法には、ヘテロ接合性ウイルスベクターおよび1つ以上のさらなる活性剤を含む単一の医薬投薬製剤の投与、ならびに本発明のヘテロ接合性ウイルスベクターおよび各活性剤をそれ自体の別個の医薬投薬製剤に含む組成物の投与が挙げられる。例えば、ヘテロ接合性ウイルスベクターおよび他の活性剤を含む組成物は、錠剤またはカプセルなどの単一の経腸（例えば、経口）投薬組成物中で一緒に患者に投与することができ、または各薬剤を別個の経腸（例えば、経口）投薬製剤で投与することができる。同様に、ヘテロ接合性ウイルスベクターおよび他の活性剤を含む組成物は、生理食塩水もしくは他の生理学的に許容される溶液などの単一の非経口（例えば、皮下、皮内、結節内、腫瘍内または筋肉内などの、既知のおよび本明細書に記載の非経口経路のいずれか）投薬組成物と一緒に患者に投与することができ、または各薬剤を別個の非経口投薬製剤で投与することができる。本明細書に記載の併用療法は、同じ経路によって投与することができ、または異なる経路を用いて投与してもよい。別個の投薬製剤を使用する場合、ヘテロ接合性ウイルスベクターおよび1つ以上のさらなる活性剤を含む組成物は、本質的に同時期に、すなわち同時に、または別々に時間をずらして、すなわち連続的に、任意の順序で投与することができる；併用療法は、これらの投与計画の全てを含むと理解される。
【０１７６】
したがって、特定の実施形態では、本開示のマルチゲノムウイルスベクター調製物を含む組成物の、1つ以上の他の治療剤（例えば、他の抗がん剤、または他の緩和療法もしくは補助療法）と組み合わせての投与も企図される。特定の実施形態では、そのような治療剤は、本明細書に記載の特定のがんの標準治療剤として当該技術分野で受け入れられ得る。意図される例示的な治療剤には、サイトカイン、成長因子、ステロイド、NSAID、DMARD、抗炎症薬、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法剤、放射線治療剤、または他の活性および補助剤が含まれる。
【０１７７】
一実施形態では、マルチゲノムウイルスベクター調製物を含む組成物は、1つ以上の化学療法剤を含む、1つ以上のがん治療剤と組み合わせて投与される。がん治療剤の例には以下が含まれる：アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））など；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなど；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドバなど；エチレンイミンおよびメチラメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスフォラミドおよびトリメチロールオメラミンが含まれる；窒素マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン酸化物、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクシノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ズルビシンなど；抗代謝物、例えばメトトレキセートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）など；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなど；プリン類似体、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FUなど；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補充剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンティナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラシン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクノン；2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン；ウ���タン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（TAXOL（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology、ニュージャージー州プリンストン）およびドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer、アントニー、フランス）；クロラムブシル；ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；トラスツズマブ、ドセタキセル、白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；マイトマイシンC；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；CPT-11；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオミチン（DMFO）；レチノイン酸誘導体、例えばタルグレチン（商標）（ベキサロテン）、パンレチン（商標）（アリトレチノイン）など；ONTAK（登録商標）（デニロイキンジフチトックス）；エスペラマイシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体。また、この定義には、以下のものなど、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる：抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）など；および抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなど；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体。さらなるがん治療剤には、以下が挙げられる：ソラフェニブおよび他のタンパク質キナーゼ阻害剤、例えば、アファチニブ、アキシチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ルキソリチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、およびスニチニブ；シロリムス（ラパマイシン）、エベロリムスおよび他のmTOR阻害剤。
【０１７８】
別の実施形態では、本明細書のマルチゲノムウイルスベクター調製物を含む組成物は、別の免疫刺激剤と組み合わせて投与される。そのような免疫刺激剤には、限定されないが、以下が含まれる：N-アセチルムラミル-L-アラニン-D-イソグルタミン（MDP）、グルカン、IL-12、GM-CSF、インターフェロン-γおよび抗CD40抗体または結合して共刺激経路を活性化する他の抗体（例えば、CD28、ICOS、OX40、CD27など）。
【０１７９】
一実施形態では、本明細書のマルチゲノムウイルスベクター組成物は、1つ以上の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。免疫チェックポイントは、自己寛容を維持し、免疫応答の持続時間および広さを調節するために重要な、免疫系の様々な阻害経路を指す。腫瘍は、特に腫瘍抗原に特異的なT細胞に対する免疫抵抗性の主要な機序として、特定の免疫チェックポイント経路を使用する。（例えば、Pardoll, 2012 Nature 12:252; Chen and Mellman 2013 Immunity 39:1を参照）。本開示は、抗原なしでGLA組成物と組み合わせて投与され得る免疫チェックポイント阻害剤を提供する。そのような併用療法は協力して働き、抗がん免疫応答を増強する。特定のウイルスは、免疫チェックポイント経路を選択する機序も発達させている。したがって、特定の実施形態では、そのような併用療法を使用して、抗ウイルス免疫応答が増強され得る。
【０１８０】
免疫チェックポイント阻害剤は、統計的に有意な様式で、免疫系の阻害経路を遮断または阻害する任意の薬剤を含む。そのような阻害剤は、小分子阻害剤を含み得るか、または免疫チェックポイント受容体に結合して遮断もしくは阻害する抗体もしくはその抗原結合断片、または免疫チェックポイント受容体リガンドに結合して遮断または阻害する抗体を含み得る。遮断または阻害の標的とすることができる例示的な免疫チェックポイント分子には、限定されないが、以下が含まれる：CTLA-4、4-1BB（CD137）、4-1BBL（CD137L）、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4（CD2ファミリーの分子に属し、全てのNK、γδ、およびメモリーCD8+（αβ）T細胞上に発現する）、CD160（BY55とも呼ばれる）ならびにCGEN-15049。免疫チェックポイント阻害剤には、CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160およびCGEN-15049の1つ以上に結合してそれらの活性を遮断もしくは阻害する抗体、もしくはそれらの抗原結合断片、または他の結合タンパク質が含まれる。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、以下が含まれる：トレメリムマブ（CTLA-4遮断抗体）、抗OX40、PD-L1モノクローナル抗体（抗B7-H1；MEDI4736）、MK-3475（PD-1遮断剤）、ニボルマブ（抗PD1抗体）、CT-011（抗PD1抗体）、BY55モノクローナル抗体、AMP224（抗PDL1抗体）、BMS-936559（抗PDL1抗体）、MPLDL3280A（抗PDL1抗体）、MSB0010718C（抗PDL1抗体）およびヤーボイ／イピリムマブ（抗CTLA-4チェックポイント阻害剤）。
【０１８１】
さらなる実施形態では、本明細書のマルチゲノムウイルスベクター組成物は、他のTLR4アゴニスト、またはTLR8アゴニスト、またはTLR9アゴニストと組み合わせて投与される。そのようなアゴニストは、ペプチドグリカン、ポリI:C、CpG、3M003、フラジェリン、および真核生物リボソーム伸長および開始因子4a（LeIF）のリーシュマニアホモログから選択され得る。
【０１８２】
さらなる実施形態では、本明細書のマルチゲノムウイルスベクター組成物は、サイトカインと組み合わせて投与される。「サイトカイン」は、ある細胞集団によって放出され、細胞間仲介物質として別の細胞に作用するタンパク質の総称を意味する。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、以下が含まれる：成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなど；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、および黄体形成ホルモン（LH）など；肝細胞成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子アルファおよびベータ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（TPO）；神経成長因子、例えばNGFベータなど；血小板成長因子；形質転換成長因子（TGF）、例えばTGFアルファおよびTGFベータなど；インスリン様成長因子IおよびII；エリスロポエチン（EPO）；骨誘導性因子；インターフェロン、例えばインターフェロンアルファ、ベータ、およびガンマなど；コロニー刺激因子（CSF）、例えばマクロファージCSF（M-CSF）など；顆粒球マクロファージCSF（GM-CSF）；および顆粒球CSF（G-CSF）；インターロイキン（IL）、例えばIL-1〜IL-36、例えば、限定されないが、IL-1、IL-1アルファ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、TNF；ならびに他のポリペプチド因子、例えばLIFおよびキットリガンド（KL）。本明細書中で使用される場合、用語サイトカインには、天然供給源または組み換え細胞培養由来のタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【０１８３】
特定の実施形態では、本明細書に記載のマルチゲノムウイルスベクター調製物を含む組成物は、エンドソーム酸性化を防止し、腫瘍細胞によって誘発されるオートファジーを阻害するリソソーム剤であるクロロキンと組み合わせて投与し、加速した細胞増殖および栄養欠乏を生き残ることができる。より一般的には、本明細書に記載のヘテロ接合性ウイルスベクターを含む組成物は、オートファジー阻害剤、放射線増感剤または化学増感剤として作用する治療剤、例えばクロロキン、ミソニダゾール、メトロニダゾール、および低酸素細胞毒素、例えばチラパザミンなどと組み合わせて投与することができる。これに関して、ヘテロ接合性ウイルスベクターの、クロロキンまたは他の放射線増感剤もしくは化学増感剤、またはオートファジー阻害剤とのそのような組み合わせは、他のがん治療剤または放射線療法とのさらなる組み合わせにおいて使用することができる。
【０１８４】
別の実施形態では、本明細書に記載のマルチゲノムウイルスベクター調製物を含む組成物は、「免疫原性細胞死」と呼ばれる免疫応答の同時活性化での腫瘍細胞の死滅をもたらすことが知られている小分子薬物、例えばシクロホスファミド、ドキソルビシン、オキサリプラチンおよびミトキサントロンなどと組み合わせて投与することができる。さらに、腫瘍細胞の免疫原性を増強することが知られている以下のような薬剤との組み合わせ：パツピロン（エポチロンB）、上皮成長因子受容体（EGFR）標的モノクローナル抗体7A7.27、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ベリノスタット、およびエンチノスタットなど）、n3-多価不飽和脂肪酸ドコサヘキサエン酸、さらにプロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ）、シコニン（ムラサキの根の主要構成成分）および腫瘍溶解性ウイルス、例えばTVec（タリモジーン・ラハーパレプベック）など。他の実施形態では、本明細書に記載のヘテロ接合性ウイルスベクターを含む組成物は、局所的または全身的に投与され得るDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、デシタビン、5-アザ-2'-デオキシシチジン）などのエピジェネティックな治療と組み合わせて投与され得る。
【０１８５】
別の実施形態では、本明細書に記載のマルチゲノムウイルスベクター調製物を含む組成物は、DCによる腫瘍のADCC取り込みを増加させる1つ以上の抗体と組み合わせて投与することができる。したがって、本発明は、マルチゲノムウイルスベクター調製物を含む組成物を、腫瘍細胞もしくはその断片の抗原提示細胞による摂取と、それに続く腫瘍抗原の免疫系への提示とを誘導または増強する任意の分子と組み合わせることを意図する。これらの分子は、受容体結合（例えば、Fcまたはマンノース受容体）を誘導し、抗原提示細胞へ、抗体、抗体様分子、多特異的多価分子およびポリマーなどを輸送する薬剤を含む。そのような分子は、ヘテロ接合性ウイルスベクターを含む組成物を腫瘍内に投与するか、または異なる経路によって投与することができる。例えば、本明細書に記載のヘテロ接合性ウイルスベクターを含む組成物は、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、カンパス、パニツムマブ、オファツムマブ、ブレンツキシマブ、ペルツズマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、オビヌツズマブ、抗HER1、抗HER2、または抗HER3抗体（例えば、MEHD7945A；MM-111；MM-151；MM-121；AMG888）、抗EGFR抗体（例えば、ニモツズマブ、ABT-806）、または他の同様の抗体の腫瘍内注射と併せて、腫瘍内投与することができる。内在化を誘発することができるFc受容体および他の受容体に係合することができる任意の多価足場は、本明細書に記載の併用療法において使用され得る‐例えば、受容体に係合することができるFc断片またはポリマーに連結された標的に結合することができるペプチドおよび／またはタンパク質。
【０１８６】
特定の実施形態では、マルチゲノムウイルスベクター調製物のそのような抗体との組み合わせを、（例えば、阻害経路を遮断することによって）共刺激シグナルを促進する抗体、例えば抗CTLA-4などと、または共刺激経路を活性化する抗体、例えばCD40抗体、抗CD28抗体、抗ICOS抗体、抗OX40抗体、抗CD27抗体などとさらに組み合わせることができる。
【０１８７】
マルチゲノムウイルスベクター調製物を含む組成物は、単独で、または他の既知がん治療、例えば放射線療法、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法もしくは他のがん治療剤、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学療法などと組み合わせて投与することができる。組成物は、抗生物質と組み合わせて投与することもできる。
【０１８８】
（E.医薬組成物およびキット）
本明細書で提供されるマルチゲノムウイルスベクター調製物および1つ以上の構成要素を含有する医薬組成物およびキットも本明細書で考慮される。医薬組成物は、本明細書で提供されるマルチゲノムウイルスベクターおよび医薬担体を含み得る。キットは、本明細書で提供される医薬組成物および／または組み合わせ、ならびに1つ以上の構成要素、例えば使用説明書、化合物を被験体に投与するための装置、および被験体に化合物を投与するための装置などを含み得る。
【０１８９】
本明細書で提供されるウイルス粒子および適切な医薬担体を含有する医薬組成物が本明細書で提供される。本明細書で提供される医薬組成物は、様々な形態、例えば、固体、液体、粉末、水性、または凍結乾燥形態であり得る。適切な医薬担体の例は、当該技術分野で知られている。そのような担体および／または添加剤は、従来の方法によって製剤化することができ、適切な用量で被験体に投与することができる。脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー、およびキレート剤などの安定剤は、体内での組成物の分解を防ぐことができる。
【０１９０】
本明細書で提供されるマルチゲノムウイルスベクターを、キットとしてパッケージングすることができる。キットは、任意に、1つ以上の構成要素、例えば使用説明書、装置、および追加の試薬など、ならびに構成要素、例えば本方法の実施のためのチューブ、容器およびシリンジなどを含むことができる。例示的なキットは、本明細書で提供されるウイルスを含むことができ、任意に、使用説明書、被験体においてウイルスを検出するための装置、被験体にウイルスを投与するための装置、および被験体に化合物を投与するための装置を含むことができる。
【０１９１】
1つ以上の対象配列をコードするポリヌクレオチドを含むキットも、本明細書において考慮される。本キットは、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも1つのプラスミドおよびVSVgまたはシンドビスウイルスE2糖タンパク質変異体などのウイルスエンベロープをコードするベクターを含み得る。いくつかのキットは、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも1つのプラスミド、シンドビスウイルスE2糖タンパク質変異体をコードするベクター、ならびに2つのウイルスベクターゲノムプラスミド、抗原をコードする1つのベクターゲノムおよび免疫調節分子をコードする1つのベクターゲノムを含む。
【０１９２】
関心対象の1つ以上の配列をコードするウイルスベクター、および任意に免疫調節分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むキットも、本明細書において考慮される。いくつかのキットでは、キットは、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも1つのプラスミドおよびウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードするベクターを含む。
【０１９３】
キットには説明書も含まれている。説明書には、典型的には、ウイルス、ならびに任意に、キットに含まれる他の成分、および投与方法を記述する具体的な表現が含まれ、ウイルス投与に対する被験体の適切な状態、適切な投与量、および適切な投与方法を決定する方法が含まれる。説明書は、治療時間の期間にわたって被験体を監視するための指針も含み得る。
【０１９４】
本明細書で提供されるキットは、被験体にウイルスを投与するための装置も含み得る。医薬品またはワクチンを投与するための当該技術分野で知られている任意の様々な装置を、本明細書で提供されるキットに含めることができる。例示的な装置には、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注射器、吸入器、および点眼薬などの液体ディスペンサーが含まれるが、これらに限定されない。典型的には、キットのウイルスを投与するための装置は、キットのウイルスと相性がいい；例えば、高圧注入装置などの無針注射装置は、高圧注射によって損傷されないウイルスを有するキットに含めることができるが、典型的には、高圧注入によって損傷されるウイルスを有するキットには含まれない。
【０１９５】
本明細書で提供されるキットは、免疫調節分子または他の治療剤などの化合物を被験体に投与するための装置も含み得る。薬剤を被験体に投与するための当該技術分野で知られている任意の様々な装置を、本明細書で提供されるキットに含めることができる。例示的な装置には、皮下注射針、静脈内針、カテーテル、無針注射、限定されないが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注射器、吸入器、および点眼薬などの液体ディスペンサーが含まれる。典型的には、キットの化合物を投与するための装置は、化合物の所望の投与方法と相性がいいものとする。
【０１９６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「抗原」への言及は、複数のそのような抗原を含み、「細胞」または「該細胞」への言及は、当業者に知られている1つ以上の細胞およびその等価物（例えば、複数の細胞）などへの言及を含む。同様に、「化合物」または「組成物」への言及は複数のそのような化合物または組成物を含み、文脈上他に明確に指示されない限り、それぞれ1つ以上の化合物または組成物を指す。方法の工程が記載または特許請求され、工程が特定の順序で生じるものとして記載されている場合、第2工程の「前」（すなわち前）に発生する（または実施される）第1工程という記述は、第2工程が第1工程に「続いて」発生する（または実行される）という記述に書き換えられる場合、同じ意味を有する。数値または数値範囲を指す場合の用語「約」は、言及された数値または数値範囲が実験変動内（または統計的実験誤差内）の近似であることを意味し、したがって数値または数値範囲は、記載の数値または数値範囲の1%〜15%の間で変化し得る。用語「含む」（および「含む（単数形または複数形）」または「有する」または「含有する」などの関連用語）は、他の特定の実施形態において、例えば、本明細書に記載の任意の物質組成、組成物、方法、またはプロセスなどの実施形態を排除することを意図するものではなく、記載の特徴「からなる」または「から本質的になる」ことができる。
【０１９７】
以下の実施例は例示の目的で提供されるものであり、限定するものではない。
【実施例】
【０１９８】
（実施例１）
（マルチゲノムレンチウイルスベクターは、2つの抗原に対する強いCD8T細胞応答を誘導する）
NY-ESO-1およびMAGE-A3ベクターゲノムプラスミドの両方を用いてパッケージング細胞をトランスフェクションしたことを除いて、標準的なトランスフェクションプロトコルを使用して、NY-ESO-1/MAGE-A3再集合体（マルチゲノム）レンチウイルスベクター粒子を調製した。当該技術分野で知られている様々なトランスフェクションプロトコルを使用することができる。使用される典型的なプロトコルは、293T細胞（293LTV細胞株；CELL BIOLABS社、LTV-100）のリン酸カルシウム（CaPO4）介在一過性トランスフェクションを伴う。293T細胞を、CaPO4と一緒に沈殿させた6つのプラスミドでトランスフェクトした。以下の6つのプラスミドを使用して、マルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を産生し、以下に対応する：i）NY-ESO-1を発現するレンチウイルスベクターゲノム；ii）MAGE-A3を発現するレンチウイルスベクターゲノム；iii）HIV Revをコードするプラスミド；iv）HIV Gag/Polをコードするプラスミド；およびv）vpxをコードするプラスミド；vi）エンベロープをコードするプラスミド（この実験では、エンベロープは、例えばWO2011/011584に以前から記載されているような修飾シンドビスエンベロープ糖タンパク質であった）。典型的なトランスフェクションプロトコルでは、1mgのレンチウイルスベクターゲノムプラスミドを使用する。この場合、ベクターゲノムプラスミド（1mg）の総量は同じに保ったが、使用した2種類のレンチウイルスベクターゲノムプラスミドに分割した。したがって、0.5mgの各ベクターゲノム（MAGE-A3およびNY-ESO-1）をトランスフェクションに使用した。レンチウイルスベクターゲノムは全て、同一パリンドローム二量体開始部位（DIS）配列を含んでいた。特に、DIS配列はGCGCGC（配列番号1）である。したがって、このマルチゲノム調製では、ホモ接合性粒子対ヘテロ接合性粒子の予測される比率は、表１に記載される通り、例えば25/25/50の比率である。
【０１９９】
ベクター精製後、NY-ESO-1およびMAGE-A3に特異的なプライマーセットに基づく遺伝子特異的qRT-PCRを用いてウイルス力価を決定した。対象配列に関わらず、全てのゲノムを増幅するPCRプライマーを用いて、マルチゲノムウイルス調製物全体の全ゲノム力価を測定した。次いで、得られた調製物中に存在する特定のゲノムのパーセンテージを、全ゲノム力価（例えば、NYESO1ゲノム=5.1E10/1.2E11=42.5%）に対する比力価として計算した。力価を以下の表４に示す。示されるように、マルチゲノムレンチウイルスベクター調製物は、NY-ESO-1ならびにMAGE-A3ベクターRNAを、投入プラスミドの50/50比率が与えられた場合の予想される比率で含む。一般に、使用されているゲノムアッセイは、約2倍の変動性を有する。これに基づいて、力価は、予想された比率内であった：マルチゲノムレンチウイルス調製物中、42.5%NYESO1および42%MAGEA3。
【０２００】
【表４】
2019509275.tif 000008
【０２０１】
BALC/cマウスの免疫化を、NY-ESO-1（NY）もしくはMAGE-A3（M3）をコードするホモ接合性LV（各調製物1E10ゲノム）で、もしくはNY-ESO-1およびMAGE-A3ゲノムの両方を含むLV物質のマルチゲノムウイルスベクター調製物で（NY-ESO-1もしくはMAGE-A3ゲノムそれぞれ1E10を達成するように2E10全ゲノム；表１によれば、各ベクターゲノムの50/50開始ベクターゲノムプラスミドDNAに基づいて、25%の粒子がNYESO-1もしくはMAGE-A3についてホモ接合性となり、50%の粒子がヘテロ接合性となる）、もしくは一緒に混合させたホモ接合性NY-ESO-1およびMAGE-A3  LV物質で（それぞれ1E10ゲノム）、または共免疫化を、別個に注射したホモ接合性NY-ESO-1およびMAGE-A3  LV物質（それぞれ1E10ゲノム）で行った。免疫後14日目に、T細胞免疫応答を、ペプチド再刺激、続いて細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーを用いて評価した。図は、平均抗NYESO1 CD8 T細胞応答（図２）、抗MAGE-A3 CD8 T細胞応答（図３）および抗NYESO-1 CD4 T細胞応答（図４）を示す。
【０２０２】
（実施例２）
（マウスにおけるマルチゲノムレンチウイルスベクター免疫化のin vivo免疫原性効果）
この実施例は、3つの腫瘍関連抗原を発現するマルチゲノムレンチウイルスベクターでの免疫化が、マウスにおいて標的とする3つの腫瘍抗原の全てに対して抗原特異的T細胞応答を生じることを実証する。
【０２０３】
マルチゲノムレンチウイルスベクター粒子調製物を、3つのベクターゲノムプラスミドがこの実験で使用したことを除いて、標準的なトランスフェクションプロトコルを用いて作製した。特に、この実験では、NY-ESO-1、MAGE-A3およびMAGE-A10レンチウイルスベクターゲノムプラスミドを用いて産生細胞をトランスフェクトした。実施例１に記載のように、レンチウイルスベクタープラスミドDNAの総量を1mgに保ったが、3つのプラスミド間で等しく分割した。したがって、この場合、0.33mgの各ベクターゲノムプラスミドを、マルチゲノムLV：NY/M3/M10ウイルスベクター調製物の産生に使用した。
【０２０４】
ベクター精製後、NY-ESO-1およびMAGE-A3に特異的なプライマーセットに基づく遺伝子特異的qRT-PCRを用いて力価を測定した。結果は、マルチゲノムLV調製物が、これらの2つのベクターゲノムからのベクターRNAを、予想された比率範囲内で含むことを示した。具体的には測定されていないが、MAGE-A10ベクターゲノムの量は、測定された2つのベクターゲノムの量に基づいて予想された通りであると考えられる。
【０２０５】
この研究では、0日目に、NY-ESO-1、MAGE-A3、およびMAGE-A10遺伝子（マルチゲノムLV：NY/M3/M10）をin vivoで抗原提示細胞に送達するように製造されたレンチウイルスベクターの5E9ゲノムで、BALB/c雌マウス（1群あたり5匹）を免疫化した。14日目に、免疫化マウスから脾臓を採取し、腫瘍抗原、NY-ESO1、MAGE-A3、およびMAGE-A10に対する抗原特異的CD8 T細胞応答の発生を決定した。
【０２０６】
図５Ａ〜５Ｃに示されるように、マルチゲノムLV：NY/M3/M10で免疫化されたマウスは、3つの標的腫瘍抗原の全てに対して抗原特異的CD8 T細胞を発生させた。
【０２０７】
複数のベクター調製物のqRT-PCRによる力価測定は、最大4つの異なるTAA（NYESO1、MAGE-A3など）と2つの免疫モジュレーター（IL-12、チェックポイントインヒビターなど）とを発現するマルチゲノムウイルスベクター調製物の産生収率が、個々の抗原をコードするベクター種および生成された全ベクターゲノムの両方について、高度に再現性があることを実証した。単一のベクターゲノムからの複数の遺伝子を、融合タンパク質として発現させるか、または2Aエンドプロテアーゼ切断部位によって分離して発現させるか、または異なるIRESモチーフの制御下で発現させるベクターで免疫化したマウスと比較して、マルチゲノムウイルスベクター調製物免疫化マウスは、全ての標的化TAAに対する抗原特異的T細胞を一貫して発達させた。
【０２０８】
この実施例は、複数の腫瘍抗原の効果的な標的化を達成する次世代レンチウイルスベクターシステムを記載する。ベクター産生のトランスフェクション段階で制御可能な比率で複数のレンチウイルスベクターゲノムプラスミドを混合する能力は、他では達成できない柔軟性を与え、in vivoでの使用に非常に適したマルチゲノムベクター調製物の組み合わせを作り出し、腫瘍特異的T細胞応答および抗腫瘍治療を誘導する。特に、このレンチウイルスベクター産生システムは、ネオ抗原を含む複数の腫瘍抗原を発現する患者特異的レンチウイルスベクターを産生するために有用である。
【０２０９】
（実施例３）
（マウスにおけるマルチゲノムレンチウイルスベクターを用いた免疫化のin vivo免疫原性効果）
複数の腫瘍抗原および免疫調節因子を発現するマルチゲノムレンチウイルスベクターの投与後に生じる免疫応答を調査する。
【０２１０】
この研究では、0日目に、NY-ESO-1、MAGE-A3、およびMAGE-A10遺伝子、ならびに以下の免疫調節因子のうちの1つをin vivoで抗原提示細胞に送達するように製造されたマルチゲノムレンチウイルスベクターで、BALB/c雌マウス（1群あたり5匹）を免疫化した：mIL-12、mIRF3（5D）、抗mPDL1、または抗mCTLA4。14日目に、免疫化マウスから脾臓を採取し、腫瘍抗原、NY-ESO1、MAGE-A3、およびMAGE-A10に対する抗原特異的CD8 T細胞応答の発生を決定した。
【０２１１】
（実施例４）
（マウスにおけるマルチゲノムレンチウイルスベクターを用いた免疫化のin vivo治療効力）
以前のデータは、同じゲノムで投与した場合、T2A切断部位（NY-T2A-M3）によって分離されたマルチシストロン性ゲノム上にNYESO1およびMAGEA3をコードする配列を含むレンチウイルスベクター粒子が、両方のタンパク質を発現したという証拠にもかかわらず、NYESO1タンパク質のみをコードするレンチウイルスベクターと比較して、マウスにおいてほとんどNYESO1特異的CD8 T細胞を有意に誘導しなかったことを示した。NY-T2A-M3ベクターで免疫化したマウスは、MAGEA3に対する免疫応答を誘導することができる。さらに、NY-T2A-M3マルチシストロン性レンチウイルスベクターは、NYESO1を発現するマウス腫瘍モデル系において治療的に無効であることが示された。この実施例の実験は、NY-ESO-1およびMAGEA3をコードする配列を含むマルチゲノムウイルスベクター調製物の、マルチシストロン性NY-T2A-M3レンチウイルスベクター粒子と比較した治療効力を評価するために設計した。
【０２１２】
BALB/c雌マウスに、CIN.23細胞（NYESO1を発現するCT26腫瘍細胞株）を静脈内接種させた。接種後3日目に、対照ベクター、LV/NYESO1、LV/NYESO1とLV/MAGEA3との混合、LV/NY-T2A-M3（単一ゲノム上の2つの抗原）、またはマルチゲノムLV:NY/M3ベクターでマウスを免疫化した（実施例１も参照）。接種後17日目に、結節計数のために肺を採取した；フローサイトメトリー分析のために、脾細胞をNYESO1ペプチドMHC多量体で染色した。
【０２１３】
マルチゲノムベクターで免疫化したマウスは、全ての標的化TAAに対するT細胞を一貫して発達させた（例えば、図２および３参照）。しかしながら、以前の実験を確認すると、NY-T2A-M3マルチシストロン性ベクターは、NYESO1特異的T細胞を誘発しなかった（例えば、図６Ｂを参照）（MAGEA3 T細胞誘導はこの実験では測定されなかったが、他の実験では示されたことに留意されたい（図示せず）。この実験では、マルチゲノムベクターで免疫化したマウスは、腫瘍の増殖制御を示し（図６Ａ）、対象腫瘍抗原、この場合はNYESO1を標的とする単一ベクターで免疫化したマウスに匹敵する生存を示した。重要なことには、マルチゲノムレンチウイルスベクターは、有意により強いNYESO1特異的CD8 T細胞免疫応答を誘導し、同一ゲノム（マルチシストロン性ゲノム）由来の両方の腫瘍抗原を発現するレンチウイルスベクターと比較して、腫瘍増殖の有意な減少をもたらした（図６のLV/NY-T2A-M3と表示された棒線を、LVマルチ/[NY、M3]と表示された棒線と比較して参照）。
【０２１４】
（実施例５）
（マウスにおけるマルチゲノム（マルチMAGE）レンチウイルスベクターを用いた免疫化のin vivo免疫原性）
この実施例では、複数のMAGE腫瘍抗原を発現するマルチゲノムレンチウイルスベクターの投与後に生じる免疫応答を調査した。
【０２１５】
4つの異なるMAGE腫瘍抗原を発現するベクター粒子の混合集団を含有するマルチゲノムベクター調製物を、本質的に実施例１に記載のように調製した。この実験では、実施例１と同様に、1mgのレンチウイルスベクターゲノムプラスミドを、パッケージング細胞のトランスフェクションに使用した。したがって、ベクターゲノムプラスミド（1mg）の総量を同じに保ち、使用した4つのレンチウイルスベクターゲノムプラスミド間で分割し、そうして0.25mgの各レンチウイルスベクターゲノムプラスミド（MAGEA1/MAGEA3/MAGEA4/MAGEA10（全てコドン最適化）をこの実験に用いて、マルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を産生した。実施例１に記載のように、特異的ゲノムプライマーを使用して、マルチゲノムレンチウイルス調製物中の各特異的ゲノムの%を決定した。結果を以下の表５に示し、アッセイでの2倍の変動性に基づいて、パーセンテージは概ね予想どおりであった。
【０２１６】
【表５】
2019509275.tif 000009
【０２１７】
図７Ａ〜７Ｄに示すように、2.5E9ベクターゲノム（vg）（vg/特異的Ag）の用量の列挙されたベクター調製物で、BALB/cマウス（n=5）を免疫化した。免疫応答は、図７に示すように、in vitro再刺激およびICSによってペプチドプールを用いて評価した。
【０２１８】
結果は、マウスH2Kバックグラウンドのために、LV/MageA1（M1）がこのマウス株においては免疫原性ではなく、このマウス株MHCハプロタイプに適切なM1エピトープがないことを示す。Black6マウス株におけるさらなる実験は、マルチMAGEマルチゲノムベクターが免疫原性であり、その株において抗M1免疫応答を生成することを示した。
【０２１９】
マルチゲノムLVは、M1、M4、またはM10と交差反応性のないMageA3（M3）Ag特異的CD8 T細胞を誘導した。
【０２２０】
マルチゲノムLVは、M1およびM10との交差反応性を有するMAGEA4（M4）Ag特異的CD8 T細胞を誘導した。
【０２２１】
MAGEA10（M10）は、このマウス株において免疫原性が最小であった。
【０２２２】
したがって、この実施例は、この次世代レンチウイルスベクターシステムが、マルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を介して、複数の腫瘍抗原に対する免疫応答の効果的な発現および誘導を達成することを確認する。
【０２２３】
（実施例６）
（マウスにおける複数の抗原および免疫調節分子を発現するマルチゲノムレンチウイルスベクターを用いた免疫化のin vivo免疫原性）
この実施例は、マルチゲノムレンチウイルスベクター調製物におけるIL-12の包含により、対照タンパク質GFPの包含と比較して、マルチゲノムレンチウイルスベクター（例えば、NYESO1およびMAGE-A3）によって発現される抗原に対するCTL応答が有意に増強し、ワクチン接種率が増加したことを実証する。
【０２２４】
マルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を、本質的に実施例１に記載のように調製した。NYESO1（NY）、MAGEA3（M3）、MAGEA10（M10）、およびmIL12、または対照としてのGFPをコードするレンチウイルスゲノムを含むプラスミドを、パッケージングシステムにおける1:1:1:3比率のプラスミド投入を用いて作製した。したがって、0.5mgのプラスミドをNY、M3およびM10プラスミド間で等しく分割し、残った0.5mgプラスミドはmIL12プラスミドであった。特異的および全ウイルスゲノムは、本質的に実施例１に記載の特異的PCRを用いて決定した。抗原特異的プライマーは、このアッセイにおいてNYESO1およびMAGEA3でのみ利用可能であった。結果を以下の表６に示し、特定のゲノムのパーセンテージが、アッセイでの2倍の変動性を考慮して、予想に近いことを実証する。
【０２２５】
【表６】
2019509275.tif 000010
【０２２６】
BALB/cマウス（n=7）を、NY、M3、およびM10±GFPまたはIL-12を含むマルチゲノム調製物で免疫化した。2つの標的用量レベル（Agの1E9または2E9ベクターゲノム）を選択した：「非常に低い」および「低い」。ベクターゲノム用量（抗原をコードするゲノム）当たりのIL-12の効果を評価するために2倍の差異を選択し、ゲノムアッセイにおける近似変動性を反映させた。
【０２２７】
図８に示すように、マルチゲノムレンチウイルス調製物におけるIL-12の含有により、GFPの添加と比較して、NYESO1およびMAGE-A3に対するCTL応答が有意に高まり、ワクチン接種率が増加した（%ワクチン接種率で示された棒線を参照）。免疫増強効果は、2倍の用量増加の効果よりも大きかった。
【０２２８】
（実施例７）
（修飾二量体開始シグナル（DIS）配列を有するマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物の産生）
この実施例は、マルチゲノムレンチウイルスベクターのパッケージングプロセスで使用される投入ゲノムの二量体開始シグナル（DIS）配列の操作が、得られるウイルス調製物中のヘテロ接合性およびホモ接合性粒子の割合に影響し得るという証拠を提供する。
【０２２９】
最初の実験では、野生型DIS配列（GCGCGC、配列番号1；GCN/GCNと表示されたウイルス調製物）、またはDIS配列が非パリンドローム（および非相補性）DIS（GGGGGG、配列番号4；GGN/GGNと表示されたウイルス調製物）で置換されたゲノムのいずれかを有する単一投入ゲノム（NYESO1をコードする）で、レンチウイルスベクター調製物を作製した。パリンドロームDIS配列を非相補性DIS配列と置換すると、レンチウイルスベクターゲノム力価が有意に低下した（p=0.0022、マン-ホイットニー検定、図９Ａ）。これらの結果は、パリンドロームDIS配列が効果的な二量体化および高力価のレンチウイルスベクター産生を調節することを示した。この結果はさらに、対合するパリンドロームDIS配列を欠くゲノムが、はるかに効率は悪くても依然としてパッケージ化されており、それによりウイルスベクター力価が低下することを示した。
【０２３０】
次の実験では、2つの投入ゲノムを用い（等しい投入量で）、各ゲノム上の同一パリンドロームDIS配列または各ゲノム上の突然変異したが相補的なDIS配列のいずれかを用いて、マルチゲノムレンチウイルスベクター調製物を作製した。第1マルチゲノム調製物において、各ゲノムは野生型HIV-1パリンドロームDIS配列（配列番号1）を含有していた。第1ゲノムはNYESO（図９ＢではGCNと表示）コードし、第2ゲノムはMAGEA3（図９ではGCMと表示）をコードした。得られたマルチゲノム調製物を、GCN/GCMと記す。第2マルチゲノムウイルスベクター調製物では、NYESO1タンパク質をコードする第1ベクターゲノムプラスミドのDIS配列をGGGGGG（配列番号4；GGNと表示）に突然変異させ、MAGEA3をコードする第2ゲノムは、CCCCCC（配列番号5；CCMと表記）に突然変異したDIS配列を含有した。得られたマルチゲノムウイルス調製物をGGN/CCMと記す。
【０２３１】
レンチウイルスベクターを、実施例１に記載のようにトランスフェクションによって産生した。次に、得られたマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物に存在する特定のゲノムを、実施例１に記載の手法を用いて測定した（例えば、表４を参照）。
【０２３２】
図９Ｂは、野生型パリンドロームDIS（GCN/GCN）を用いた標準的な単一ゲノムウイルス調製物の遺伝子特異的ベクターゲノム力価を、GCN/GCMマルチゲノムレンチウイルスベクター調製物と比較して示す。以前の実験を確認し、半NYESO1および半MAGEA3投入ゲノムプラスミドを用いて作製したGCN/GCMマルチゲノム調製物では、得られたマルチゲノムウイルス調製物で検出されたNYESO1ゲノムは、NYESO1単一ゲノムウイルス調製物で検出されたものの約半分であった。パッケージングプロセスで使用されるNYESO1/MAGEA3ゲノムプラスミドの1:1投入比率から予想されるように、NYESO1ゲノムと同じ割合のMAGEA3ゲノムがGCN/GCM調製物において検出された。ウイルス遺伝学に基づいて、表１によれば、得られた調製物は、各ゲノムについて25%ホモ接合体であり、NYESO1/MAGEA3について50%ヘテロ接合体であるべきである。
【０２３３】
前回の実験（図９Ａ）は、非パリンドロームで非相補的な突然変異DIS配列で作製されたウイルス調製物中のゲノム（GGN/GGN）が、効率的には対合してパッケージングしなかったことを示した。図９Ｂ（GGN/CCM）に示されるように、突然変異DIS配列で作製されたマルチゲノムウイルス調製物では、パリンドロームDIS配列で作製されたマルチゲノムウイルス調製物とは対照的に、NYESO1およびMAGEA3特異的ゲノム力価の低下が観察された。遺伝子特異的ゲノム力価のこの低下は、おそらく、ホモ接合ゲノム（GGN/GGNおよびCCM/CCM）の対合およびパッケージングの減少によるものである。その結果、GGN/CCMマルチゲノムウイルス調製物中のヘテロ接合性粒子の得られるパーセンテージが増加すると推測することができる。
【０２３４】
この実施例は、DIS配列の操作を用いて、マルチゲノムウイルスベクター調製物中のヘテロ接合性およびホモ接合性粒子のパーセンテージを調節することができることを示す。
【０２３５】
上述の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で言及されたおよび／または出願データシートに列挙された全ての米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様を変更し、必要に応じて様々な特許、出願、および刊行物の概念を採用し、さらなる実施形態を提供することができる。
【０２３６】
上記および詳細な説明に照らして、これらのおよび他の変更を実施形態に加えることができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲に開示の特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲とともに可能な全ての実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって制限されない。
【図１】
2019509275.tif 000011
【図２】
2019509275.tif 000012
【図３】
2019509275.tif 000013
【図４】
2019509275.tif 000014
【図５Ａ】
2019509275.tif 000015
【図５Ｂ】
2019509275.tif 000016
【図５Ｃ】
2019509275.tif 000017
【図６】
2019509275.tif 000018
【図７−１】
2019509275.tif 000019
【図７−２】
2019509275.tif 000020
【図８−１】
2019509275.tif 000021
【図８−２】
2019509275.tif 000022
【図９】
2019509275.tif 000023
【配列表】
2019509275000001.app
【国際調査報告】
2019509275.tif 000024
2019509275.tif 000025
2019509275.tif 000026
2019509275.tif 000027