(57)【要約】本発明は、還元多糖および高酸化多糖、例えば、治療用または診断用薬剤を封入するのに有用なアルギネート、または脂質ベースのナノ粒子、例えば、これらの対象への送達前に治療用または診断用薬剤を封入しているリポソームまたはビロソーム、ならびにこれらを作製および使用するための方法を対象とする。本発明の還元多糖および／または高酸化多糖を使用して生成された本発明のヒドロゲルは生分解性であり、当技術分野ですでに公知のヒドロゲルよりも毒性および反応性が低い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元多糖を含む組成物であって、前記還元多糖が、２％未満の残留アルデヒドを含む、組成物。
【請求項２】
還元多糖を含む組成物であって、前記還元多糖が、３％未満の残留アルデヒドを含み、
前記還元多糖が、
多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させることにより、モルベースで０．１％またはそれよりも多い酸化を含む酸化多糖を生成すること、
続いて、前記酸化多糖を水溶性のアルデヒド特異的な還元剤と反応させて、前記還元多糖を生成すること
によって生成される、組成物。
【請求項３】
前記還元多糖が、
多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させることにより、モルベースで０．１％またはそれよりも多い酸化を含む酸化多糖を含有するジオールを生成すること、
続いて、前記酸化多糖を水溶性のアルデヒド特異的な還元剤と反応させて、前記還元多糖を生成すること
によって生成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
還元多糖を含む組成物であって、
前記還元多糖が、
多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させることにより、酸化多糖を含有するジオールを生成すること、
続いて、前記酸化多糖を水溶性のアルデヒド特異的な還元剤と反応させて、前記還元多糖を生成すること
によって生成される、組成物。
【請求項５】
前記還元多糖が、１５％未満の残留アルデヒドを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記多糖が、アルギネート、アガロース、プルラン、スクレログルカン、キトサン、エルシナン、キサンタンガム、デキストラン、マンノース、ゲラン、レバン、セルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｅおよびβ−ｄ−グルカンからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記多糖がアルギネートである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記還元多糖が、以下の構造：
【化１７】
2019502652.tif 000020
を有するアルゴキシノールを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記アルデヒド特異的な水溶性の還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）；シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）；触媒の存在下の水素ガス（Ｈ２）；アンモニアボラン（Ｈ３ＮＢＨ３）；およびボラン錯体からなる群から選択される、請求項２から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アルデヒド特異的な水溶性の還元剤がアンモニアボランである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ジオール特異的な酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項２から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記還元多糖に付着している架橋剤をさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記架橋剤がクリック試薬である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記クリック試薬が、アジド、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそのバリアントからなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
還元多糖と、前記還元多糖に付着している架橋剤とを含む、組成物。
【請求項１６】
前記還元多糖が、還元アルギネートポリマーである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記還元多糖が、以下の構造：
【化１８】
2019502652.tif 000021
を有するアルゴキシノールを含む、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記還元多糖が、
多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化多糖を生成するステップと、
前記酸化多糖を水溶性のアルデヒド特異的な還元剤と反応させて、前記還元多糖を生成するステップと
を含む方法によって生成される、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ジオール特異的な酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記水溶性のアルデヒド特異的な還元剤がアンモニアボランである、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
高酸化多糖と、前記高酸化多糖に付着している架橋剤とを含む、組成物。
【請求項２２】
前記高酸化多糖がアルギネートポリマーである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記高酸化多糖が、以下の構造：
【化１９】
2019502652.tif 000022
を有するアルゴキサラートを含む、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記高酸化多糖が、
多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化多糖を生成するステップと、
前記酸化多糖を、アルデヒドをカルボン酸に変換する第２の酸化剤と反応させて、前記高酸化多糖を生成するステップと
を含む方法によって生成される、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ジオール特異的な酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記第２の酸化剤が亜塩素酸ナトリウムである、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記架橋剤がクリック試薬である、請求項１５から２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記クリック試薬が、アジド、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそのバリアントからなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の組成物を含むヒドロゲル。
【請求項３０】
治療剤をさらに含む、請求項２９に記載のヒドロゲル。
【請求項３１】
前記治療剤が、細胞、小分子および生物製剤からなる群から選択される、請求項３０に記載のヒドロゲル。
【請求項３２】
前記生物製剤が、ペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびＰＮＡ分子からなる群から選択される、請求項３１に記載のヒドロゲル。
【請求項３３】
前記生物製剤がペプチドである、請求項３２に記載のヒドロゲル。
【請求項３４】
前記ペプチドが血管新生因子である、請求項３３に記載のヒドロゲル。
【請求項３５】
前記血管新生因子が、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦ、ＮＲＰ−１、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦ−β、エンドグリン、ＴＧＦ−β受容体、ＭＣＰ−１、インテグリン、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、エフリン、プラスミノゲン活性因子、プラスミノゲン活性因子阻害剤−１、ｅＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＡＣ１３３、ＩＤ１、ＩＤ３、およびＨＧＦからなる群から選択される、請求項３４に記載のヒドロゲル。
【請求項３６】
前記血管新生因子がＶＥＧＦである、請求項３５に記載のヒドロゲル。
【請求項３７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３１に記載のヒドロゲル。
【請求項３８】
前記哺乳動物細胞がヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）である、請求項３７に記載のヒドロゲル。
【請求項３９】
１０ｎｍまたはそれ未満のメッシュサイズを含む、互いに架橋された複数の還元多糖および／または高酸化多糖を含むヒドロゲル。
【請求項４０】
前記高酸化多糖が高酸化アルギネートポリマーである、請求項３９に記載のヒドロゲル。
【請求項４１】
前記高酸化アルギネートポリマーが、
アルギネートをジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化アルギネートを生成するステップと、
前記アルデヒド含有酸化アルギネートを、アルデヒドをカルボン酸に変換する第２の酸化剤と反応させることにより、前記高酸化アルギネートポリマーを生成するステップと
を含む方法によって生成される、請求項４０に記載のヒドロゲル。
【請求項４２】
前記ジオール特異的な酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項４１に記載のヒドロゲル。
【請求項４３】
前記第２の酸化剤が亜塩素酸ナトリウムである、請求項４１に記載のヒドロゲル。
【請求項４４】
前記高酸化アルギネートポリマーが、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％酸化されている、請求項４０に記載のヒドロゲル。
【請求項４５】
前記還元多糖が還元アルギネートポリマーである、請求項３９に記載のヒドロゲル。
【請求項４６】
前記還元アルギネートポリマーが、
アルギネートをジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化アルギネートを生成するステップと、
前記アルデヒド含有酸化アルギネートを水溶性のアルデヒド特異的な還元剤と反応させることにより、前記還元アルギネートポリマーを生成するステップと
を含む方法によって生成される、請求項４５に記載のヒドロゲル。
【請求項４７】
前記ジオール特異的な酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項４６に記載のヒドロゲル。
【請求項４８】
前記水溶性のアルデヒド特異的な還元剤がアンモニアボランである、請求項４６に記載のヒドロゲル。
【請求項４９】
約１０ｎｍ〜約１ｎｍ、約１０ｎｍ〜約４ｎｍ、約７ｎｍ〜約３ｎｍ、約５ｎｍ〜約１ｎｍ、約４ｎｍ〜約２ｎｍ、または約３ｎｍ〜約０．５ｎｍの平均メッシュサイズを含む、請求項３９から４８のいずれか一項に記載のヒドロゲル。
【請求項５０】
治療用または診断用薬剤をさらに含む、請求項４９に記載のヒドロゲル。
【請求項５１】
前記治療用または診断用薬剤が、細胞、小分子および生物製剤からなる群から選択される、請求項５０に記載のヒドロゲル。
【請求項５２】
前記生物製剤が、ペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびＰＮＡ分子からなる群から選択される、請求項５１に記載のヒドロゲル。
【請求項５３】
前記生物製剤がペプチドである、請求項５２に記載のヒドロゲル。
【請求項５４】
前記ペプチドが、５００ｋＤａまたはそれ未満の分子量を有する、請求項５３に記載のヒドロゲル。
【請求項５５】
前記ペプチドが血管新生因子である、請求項５３に記載のヒドロゲル。
【請求項５６】
前記血管新生因子が、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＮＲＰ−１、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦ、ＴＧＦ−β、エンドグリン、ＴＧＦ−β受容体、ＭＣＰ−１、インテグリン、インテグリンリガンド、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、エフリン、プラスミノゲン活性因子、プラスミノゲン活性因子阻害剤−１、ｅＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＡＣ１３３、ＩＤ１、ＩＤ３、およびＨＧＦからなる群から選択される、請求項５５に記載のヒドロゲル。
【請求項５７】
前記血管新生因子がＶＥＧＦである、請求項５６に記載のヒドロゲル。
【請求項５８】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項５１に記載のヒドロゲル。
【請求項５９】
前記哺乳動物細胞がヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）である、請求項５８に記載のヒドロゲル。
【請求項６０】
前記多糖が、前記多糖に付着している架橋剤を含む、請求項３９に記載のヒドロゲル。
【請求項６１】
前記架橋剤がクリック試薬である、請求項６０に記載のヒドロゲル。
【請求項６２】
前記クリック試薬が、アジド、ジベンゾシクロオクチン、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項６１に記載のヒドロゲル。
【請求項６３】
請求項２９から６２のいずれか一項に記載のヒドロゲルを含む、埋め込み型または注射用デバイス。
【請求項６４】
還元多糖を生成する方法であって、
多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化多糖を生成するステップと、
前記アルデヒド含有酸化多糖をアルデヒド特異的な水溶性の還元剤と反応させることにより、前記還元多糖を生成するステップと
を含む、方法。
【請求項６５】
前記アルデヒド特異的な水溶性の還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）；シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）；触媒の存在下の水素ガス（Ｈ２）；アンモニアボラン（Ｈ３ＮＢＨ３）；またはボラン錯体からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記アルデヒド特異的な水溶性の還元剤がアンモニアボランである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ジオール特異的な酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記還元多糖を架橋剤と反応させることをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記架橋試薬がクリック試薬である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記クリック試薬が、アジド、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそのバリアントからなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記多糖がアルギネートポリマーである、請求項６４から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記アルギネートポリマーが、５００ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記還元多糖が、以下の構造：
【化２０】
2019502652.tif 000023
を有するアルゴキシノールを含む、請求項６４から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
架橋剤に共有結合により付着している高酸化多糖を生成する方法であって、
多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化多糖を生成するステップと、
前記アルデヒド含有酸化多糖を、アルデヒドをカルボン酸に変換する第２の酸化剤と反応させることにより、前記高酸化多糖を生成するステップと、
前記高酸化多糖を架橋剤と反応させるステップと
を含む、方法。
【請求項７５】
前記第２の酸化剤が、亜塩素酸ナトリウム、臭素、希硝酸（ＮＨＯ３）、酸化銀、銅（ＩＩ）複合体、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記第２の酸化剤が亜塩素酸ナトリウムである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記架橋剤がクリック試薬である、請求項７４から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記クリック試薬が、アジド、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記多糖がアルギネートポリマーである、請求項７４から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記高酸化多糖が、以下の構造：
【化２１】
2019502652.tif 000024
を有するアルゴキサラートを含む、請求項７４から７９に記載の方法。
【請求項８１】
治療用または診断用薬剤を封入している脂質ベースのナノ粒子と、
前記脂質ベースのナノ粒子を封入している、請求項２９から６２のいずれか一項に記載のヒドロゲルと
を含む、ドラッグデリバリー組成物。
【請求項８２】
前記脂質ベースのナノ粒子がリポソームである、請求項８１に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項８３】
前記脂質ベースのナノ粒子がビロソームである、請求項８２に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項８４】
前記脂質ベースのナノ粒子が、少なくとも１日間、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、少なくとも３５日間、少なくとも４０日間、少なくとも４５日間、少なくとも５０日間、少なくとも５５日間、少なくとも６０日間、少なくとも６５日間、少なくとも７０日間、少なくとも７５日間または少なくとも８０日間、前記ヒドロゲルに封入されたままである、請求項８１から８３のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項８５】
前記治療用または診断用薬剤が、細胞、小分子および生物製剤からなる群から選択される、請求項８１から８４のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項８６】
前記生物製剤が、ペプチド、抗体またはその断片、ワクチン、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびＰＮＡ分子からなる群から選択される、請求項８５に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項８７】
前記治療用または診断用薬剤が、ＳＴＩＮＧアジュバント、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９試薬および破壊されたがん細胞に由来するアジュバント負荷細胞内ベシクルからなる群から選択される、請求項８１から８５のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項８８】
前記治療用または診断用薬剤がワクチンである、請求項８１から８６のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項８９】
治療用または診断用薬剤を封入している脂質ベースのナノ粒子と、
前記脂質ベースのナノ粒子を封入しているクリックコンジュゲートしたポリマーヒドロゲルと、
を含むドラッグデリバリー組成物であって、
前記クリックコンジュゲートしたポリマーヒドロゲルが生分解性ポリマーを含み、
前記生分解性ポリマーが、宿主内因性酵素による分解を受けにくい、組成物。
【請求項９０】
前記脂質ベースのナノ粒子がリポソームである、請求項８９に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項９１】
前記脂質ベースのナノ粒子がビロソームである、請求項８９に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項９２】
インタクトな脂質ベースのナノ粒子の、前記宿主内の所望の位置への持続送達を可能にする、請求項８９から９１のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項９３】
前記生分解性ポリマーが多糖である、請求項８９から９２のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項９４】
前記多糖が、アルギネート、アガロース、プルラン、スクレログルカン、キトサン、エルシナン、キサンタンガム、デキストラン、マンノース、ゲラン、レバン、セルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｅおよびβ−ｄ−グルカンからなる群から選択される、請求項９３に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項９５】
前記多糖がアルギネートである、請求項９４に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項９６】
前記クリックコンジュゲートされたポリマーヒドロゲルが、アジド、ジベンゾシクロオクチン、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそのバリアントからなる群から選択される少なくとも１種のクリック試薬の使用により生成される、請求項８９から９５のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項９７】
前記アルギネートがクリック試薬にコンジュゲートしており、前記アルギネートが約０．０１％〜約９９％のクリック置換度を含む、請求項９５または９６に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項９８】
前記クリックコンジュゲートしたポリマーヒドロゲルが、約０．１％〜約９９％酸化されたアルギネートを含む、請求項９７に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項９９】
前記クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルが、約１％〜約９９％ｗ／ｖの濃度で存在するアルギネートから調製されている、請求項８９に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１００】
前記脂質ベースのナノ粒子が、少なくとも１日間、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、少なくとも３５日間、少なくとも４０日間、少なくとも４５日間、少なくとも５０日間、少なくとも５５日間、少なくとも６０日間、少なくとも６５日間、少なくとも７０日間、少なくとも７５日間または少なくとも８０日間、前記クリックコンジュゲートしたポリマーヒドロゲルに封入されたままである、請求項８９から９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０１】
治療用または診断用薬剤を封入している脂質ベースのナノ粒子と、
前記脂質ベースのナノ粒子を封入しているアルギネートヒドロゲルと
を含むドラッグデリバリー組成物であって、前記ヒドロゲルが、モルベースで５０％またはそれ未満の酸化を含むアルギネートを含む、組成物。
【請求項１０２】
前記脂質ベースのナノ粒子がリポソームである、請求項１０１に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１０３】
前記脂質ベースのナノ粒子がビロソームである、請求項１０１に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１０４】
インタクトな脂質ベースのナノ粒子の、宿主内の所望の位置への持続送達を可能にする、請求項１０１から１０３のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１０５】
前記アルギネートがクリック試薬にコンジュゲートしており、前記アルギネートが約０．０１％〜約９０％のクリック置換度を含む、請求項１０１から１０４のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１０６】
前記アルギネートヒドロゲルが、アジド、ジベンゾシクロオクチン、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそれらのバリアントからなる群から選択される少なくとも１種のクリック試薬の使用により生成される、請求項１０５に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１０７】
前記アルギネートヒドロゲルが、約０．１％〜約９９％酸化されているアルギネートを含む、請求項１０１に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１０８】
前記アルギネートヒドロゲルが、約１％〜約８０％ｗ／ｖの濃度で存在するアルギネートから調製されている、請求項１０１に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１０９】
前記脂質ベースのナノ粒子が、少なくとも１日間、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、少なくとも３５日間、少なくとも４０日間、少なくとも４５日間、少なくとも５０日間、少なくとも５５日間、少なくとも６０日間、少なくとも６５日間、少なくとも７０日間、少なくとも７５日間または少なくとも８０日間、前記ヒドロゲルに封入されたままである、請求項１０１から１０８のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１１０】
前記治療用または診断用薬剤が、細胞、小分子および生物製剤からなる群から選択される、請求項１０１から１０９のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１１１】
前記生物製剤が、ペプチド、抗体またはその断片、ワクチン、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびＰＮＡ分子からなる群から選択される、請求項１１０に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１１２】
前記ＲＮＡ分子が、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｉｓＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される、請求項１１１に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１１３】
前記治療用または診断用薬剤が、ＳＴＩＮＧアジュバント、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９試薬および破壊されたがん細胞に由来するアジュバント負荷細胞内ベシクルからなる群から選択される、請求項１０１から１０９のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１１４】
前記リポソームがカチオン性リポソームである、請求項８２、９０または１０２のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１１５】
前記所望の位置が細胞のサイトゾルである、請求項９２または１０４に記載のドラッグデリバリー組成物。
【請求項１１６】
それを必要とする対象を処置するための方法であって、前記対象に、有効量の、請求項３０から６３のいずれか一項に記載のヒドロゲル、請求項６４に記載の埋め込み型もしくは注射用デバイス、または請求項８２から１１５のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物を投与し、これによって、前記対象を処置することを含む、方法。
【請求項１１７】
前記対象が、虚血、眼に関連した障害または耳に関連した障害からなる群から選択される疾患または状態を患っている、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
それを必要とする対象において慢性虚血を処置するか、または移植した組織の生着を向上させる方法であって、前記対象に、有効量の、請求項２９から６２のいずれか一項に記載のヒドロゲル、請求項６３に記載の埋め込み型もしくは注射用デバイス、または請求項８１から１１５のいずれか一項に記載のドラッグデリバリー組成物を投与し、これによって、前記対象において前記慢性虚血を処置するか、または前記移植した組織の生着を向上させることを含む、方法。
【請求項１１９】
前記ヒドロゲル、または前記埋め込み型もしくは注射用デバイス、または前記ドラッグデリバリー組成物が、局在的に投与される、請求項１１６から１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ヒドロゲル、または前記埋め込み型もしくは注射用デバイス、または前記ドラッグデリバリー組成物が、虚血部位または移植前および／または移植後に生着させる組織に局在的に注射される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ペプチドが溶解性形態で送達される場合、前記ヒドロゲル、または前記埋め込み型もしくは注射用デバイス、または前記ドラッグデリバリー組成物が、前記ペプチドに対する推奨量の少なくとも１０分の１のより少ない用量でペプチドを含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ペプチドがＶＥＧＦおよびＩＧＦである、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記対象がヒトである、請求項１１６から１２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１０月２６日に出願された米国仮出願番号第６２／２４６，４６２号および２０１６年６月１６日に出願された米国仮出願番号第６２／３５１，１６２号に基づく優先権を主張している。前述の仮出願の各々の全体の内容は、参考として本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒドロゲルは、架橋ポリマー鎖のネットワークを含むポリマーゲルである。ヒドロゲルのネットワーク構造により、ヒドロゲルは有意な量の水を吸収することができる。ヒドロゲルは、極めて伸縮自在であり、弾性があるものもあれば、粘弾性のものもある。ヒドロゲルは、例えば、小分子、細胞および生物製剤などの治療剤のｉｎ  ｖｉｖｏ送達用のビヒクルとして治療用途に使用されてきた。
【０００３】
ヒドロゲルは、一般的に、アルギネートなどの多糖から生成される。多糖は、化学的に操作することによって、これらの特性および生成されるヒドロゲルの特性を調整することができる。例えば、多糖を、多糖中のアルコールをアルデヒドに変換する酸化剤と反応させることによって、これを酸化することにより、生成されるヒドロゲルの生分解性を顕著に増加させる。しかし、多糖の酸化はまた望ましくない副作用も伴う。例えば、酸化により生成されるアルデヒドは、タンパク質または他の分子上に存在するアミノ基と反応して、酸化多糖から生成されるヒドロゲルにより封入され得る治療剤（カーゴ）に対してｉｎ  ｖｉｖｏで毒性および／または損傷を引き起こす可能性がある。酸化多糖中に存在するアルデヒドはまた、多糖の近傍に存在し得る様々な化学部分、例えば、クリック試薬などと反応して、これらの分解を生じる可能性がある。したがって、無毒性、非反応性および生分解性であるヒドロゲルを調製するために使用することができる生分解性多糖に対する必要性が当技術分野において存在する。また、小さな分子量の治療剤を封入するのに十分に小さな細孔サイズを有するヒドロゲルを調製するために使用することができる多糖に対する必要性も当技術分野において存在する。リポソームを封入および保持し、リポソームをｉｎ  ｖｉｖｏで所望の位置に送達することが可能なヒドロゲルを調製するために使用することができる多糖に対する必要性も当技術分野において存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明は、ある特定の還元多糖、およびある特定の高酸化多糖を含む組成物を提供する。これらの還元多糖および高酸化多糖は、治療用または診断用薬剤を封入するために、または対象への送達のための、治療用または診断用薬剤を封入するために使用される脂質ベースのナノ粒子、例えば、リポソームまたはビロソームを封入するために使用することができるヒドロゲルを生成するのに特に十分に適合していることが驚くべきことに発見された。還元多糖および／または高酸化多糖を使用して生成された本発明のヒドロゲルは生分解性であり、当技術分野ですでに公知のヒドロゲルよりも毒性および反応性が低い。
【０００５】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、還元多糖を含む組成物であって、前記還元多糖が、２％未満の残留アルデヒドを含む、組成物を提供する。
【０００６】
一部の実施形態では、本発明は、還元多糖を含む組成物であって、前記還元多糖が、３％未満の残留アルデヒドを含み、前記還元多糖が、多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させることにより、モルベースで０．１％またはそれよりも多い酸化を含む酸化多糖を生成すること、続いて、前記酸化多糖を水溶性のアルデヒド特異的な還元剤と反応させて、前記還元多糖を生成することによって生成される、組成物も提供する。
【０００７】
一部の態様では、前記還元多糖は、多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させることにより、モルベースで０．１％またはそれよりも多い酸化を含む酸化多糖を含有するジオールを生成すること、続いて、前記酸化多糖を水溶性のアルデヒド特異的な還元剤と反応させて、前記還元多糖を生成することによって生成される。
【０００８】
一部の態様では、還元多糖を含む組成物であって、前記還元多糖が、多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させることにより、酸化多糖を含有するジオールを生成すること、続いて、前記酸化多糖を水溶性のアルデヒド特異的な還元剤と反応させて、前記還元多糖を生成することによって生成される、組成物もまた提供される。一部の態様では、前記還元多糖は、１５％未満の残留アルデヒド例えば、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、前記多糖は、アルギネート、アガロース、プルラン、スクレログルカン、キトサン、エルシナン、キサンタンガム、デキストラン、マンノース、ゲラン、レバン、セルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｅおよびβ−ｄ−グルカンからなる群から選択される。一実施形態では、前記多糖はアルギネートである。一実施形態では、前記還元多糖は、以下の構造：
【化１】
2019502652.tif 000002
を有するアルゴキシノールを含む。
【００１０】
一部の態様では、前記アルデヒド特異的な水溶性の還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）；シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）；触媒の存在下の水素ガス（Ｈ２）；アンモニアボラン（Ｈ３ＮＢＨ３）；およびボラン錯体からなる群から選択される。特定の実施形態では、前記アルデヒド特異的な水溶性の還元剤はアンモニアボランである。別の特定の実施形態では、前記ジオール特異的な酸化剤は過ヨウ素酸ナトリウムである。
【００１１】
一部の実施形態では、組成物は、前記還元多糖に付着している架橋剤をさらに含む。一部の態様では、前記架橋剤はクリック試薬であり、例えば、前記クリック試薬は、アジド、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそのバリアントからなる群から選択される。
【００１２】
一部の実施形態では、本発明は、還元多糖と、前記還元多糖に付着している架橋剤とを含む、組成物をまた提供する。一部の態様では、前記多糖は、アルギネートポリマーである。一部の実施形態では、前記還元多糖は、以下の構造：
【化２】
2019502652.tif 000003
を有するアルゴキシノールを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、前記還元多糖は、多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化多糖を生成するステップと、前記酸化多糖を水溶性のアルデヒド特異的な還元剤と反応させて、前記還元多糖を生成するステップとを含む方法によって生成される。
【００１４】
一部の実施形態では、前記ジオール特異的な酸化剤は過ヨウ素酸ナトリウムである。一部の実施形態では、前記水溶性のアルデヒド特異的な還元剤はアンモニアボランである。
【００１５】
一部の態様では、高酸化多糖と、前記高酸化多糖に付着している架橋剤とを含む、組成物が提供される。一部の実施形態では、前記多糖はアルギネートポリマーである。一部の態様では、前記高酸化多糖は、以下の構造：
【化３】
2019502652.tif 000004
を有するアルゴキサラートを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、前記高酸化多糖は、多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化多糖を生成するステップと、前記酸化多糖を、アルデヒドをカルボン酸に変換する第２の酸化剤と反応させて、前記高酸化多糖を生成するステップとを含む方法によって生成される。
【００１７】
一態様では、前記ジオール特異的な酸化剤は過ヨウ素酸ナトリウムである。別の態様では、前記第２の酸化剤は亜塩素酸ナトリウムである。
【００１８】
一部の実施形態では、前記架橋剤はクリック試薬、例えば、アジド、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそのバリアントからなる群から選択されるクリック試薬である。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明は、本発明の組成物を含むヒドロゲルも提供する。
【００２０】
一部の態様では、ヒドロゲルは、治療剤をさらに含んでもよく、例えば、細胞、小分子および生物製剤からなる群から選択される。一部の実施形態では、前記生物製剤は、ペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびＰＮＡ分子からなる群から選択される。一実施形態では、前記生物製剤は、ペプチド、例えば、血管新生因子であり、例えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦ、ＮＲＰ−１、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦ−β、エンドグリン、ＴＧＦ−β受容体、ＭＣＰ−１、インテグリン、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、エフリン、プラスミノゲン活性因子、プラスミノゲン活性因子阻害剤−１、ｅＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＡＣ１３３、ＩＤ１、ＩＤ３、およびＨＧＦからなる群から選択される。特定の態様では、前記血管新生因子はＶＥＧＦである。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明のヒドロゲルは、細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）をさらに含む。
【００２２】
一部の態様では、本発明は、約１０ｎｍまたはそれ未満、例えば、約１０ｎｍ、約９ｎｍ、約８ｎｍ、約７ｎｍ、約６ｎｍ、約５ｎｍ、約４ｎｍ、約３ｎｍ、約２ｎｍまたは約１ｎｍまたはそれ未満のメッシュサイズを含む、互いに架橋された複数の還元多糖および／または高酸化多糖を含むヒドロゲルを提供する。
【００２３】
一部の実施形態では、前記高酸化多糖は高酸化アルギネートポリマーである。一部の実施形態では、前記高酸化アルギネートポリマーは、アルギネートをジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化アルギネートを生成するステップと、前記アルデヒド含有酸化アルギネートを、アルデヒドをカルボン酸に変換する第２の酸化剤と反応させることにより、前記高酸化アルギネートポリマーを生成するステップとを含む方法によって生成される。
【００２４】
一実施形態では、前記ジオール特異的な酸化剤は過ヨウ素酸ナトリウムである。別の実施形態では、前記第２の酸化剤は亜塩素酸ナトリウムである。
【００２５】
一部の実施形態では、前記高酸化アルギネートポリマーは、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％酸化されている。
【００２６】
一部の実施形態では、前記還元多糖は還元アルギネートポリマーである。一部の実施形態では、前記還元アルギネートポリマーは、アルギネートをジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化アルギネートを生成するステップと、前記アルデヒド含有酸化アルギネートを水溶性のアルデヒド特異的な還元剤と反応させることにより、前記還元アルギネートポリマーを生成するステップとを含む方法によって生成される。
【００２７】
一実施形態では、前記ジオール特異的な酸化剤は過ヨウ素酸ナトリウムである。別の実施形態では、前記水溶性のアルデヒド特異的な還元剤はアンモニアボランである。
【００２８】
一部の態様では、本発明のヒドロゲルは、約１０ｎｍ〜約１ｎｍ、約１０ｎｍ〜約４ｎｍ、約７ｎｍ〜約３ｎｍ、約５ｎｍ〜約１ｎｍ、約４ｎｍ〜約２ｎｍ、または約３ｎｍ〜約０．５ｎｍの平均メッシュサイズを含む。
【００２９】
一部の態様では、本発明のヒドロゲルは、治療用または診断用薬剤、例えば、細胞、小分子および生物製剤をさらに含む。一部の態様では、前記生物製剤は、ペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびＰＮＡ分子からなる群から選択される。
【００３０】
一部の実施形態では、前記生物製剤はペプチドである。一部の実施形態では、前記ペプチドは、５００ｋＤａまたはそれ未満、例えば、約４５０ｋＤａまたはそれ未満、約３００ｋＤａまたはそれ未満、約１５０ｋＤａまたはそれ未満、約１００ｋＤａまたはそれ未満、約５０ｋＤａまたはそれ未満、約２５ｋＤａまたはそれ未満、または約１０ｋＤａまたはそれ未満の分子量を有する。
【００３１】
一部の態様では、前記ペプチドは、血管新生因子、例えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＮＲＰ−１、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦ、ＴＧＦ−β、エンドグリン、ＴＧＦ−β受容体、ＭＣＰ−１、インテグリン、インテグリンリガンド、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、エフリン、プラスミノゲン活性因子、プラスミノゲン活性因子阻害剤−１、ｅＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＡＣ１３３、ＩＤ１、ＩＤ３、およびＨＧＦである。特定の実施形態では、前記血管新生因子はＶＥＧＦである。
【００３２】
一部の実施形態では、前記細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）である。
【００３３】
一部の実施形態では、前記多糖は、前記多糖に付着している架橋剤を含む。一部の態様では、前記架橋剤は、クリック試薬、例えば、アジド、ジベンゾシクロオクチン、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそれらのバリアントである。
【００３４】
一部の態様では、本発明は、本発明のヒドロゲルを含む、埋め込み型または注射用デバイスも提供する。
【００３５】
一部の態様では、本発明は、還元多糖を生成する方法であって、多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化多糖を生成するステップと、前記アルデヒド含有酸化多糖をアルデヒド特異的な水溶性の還元剤と反応させることにより、前記還元多糖を生成するステップとを含む、方法も提供する。
【００３６】
一部の実施形態では、アルデヒド特異的な水溶性の還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）；シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）；例えば、ニッケル（Ｎｉ）、白金（Ｐｌ）またはパラジウム（Ｐｄ）触媒などの触媒の存在下での水素ガス（Ｈ２）；アンモニアボラン（Ｈ３ＮＢＨ３）；またはボラン錯体、例えば、ビス−カーボネートボラン錯体（［（ＢＨ３）２ＣＯ２］２−・２Ｎａ＋）、ボランジメチルアミン錯体［（ＣＨ３）２ＮＨ・ＢＨ３］；ボランｔｅｒｔ−ブチルアミン錯体［（ＣＨ３）３ＣＮＨ２・ＢＨ３］；もしくはボラン−ピリミジン錯体などである。特定の実施形態では、前記アルデヒド特異的な水溶性の還元剤はアンモニアボランである。別の特定の実施形態では、前記ジオール特異的な酸化剤は過ヨウ素酸ナトリウムである。
【００３７】
一部の実施形態では、方法は、前記多糖を架橋剤と反応させることをさらに含む。一部の態様では、前記架橋試薬は、クリック試薬、例えば、アジド、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそのバリアントである。特定の実施形態では、前記多糖はアルギネートポリマーである。ある実施形態では、前記アルギネートポリマーは、５００ｋＤａ未満の分子量を有する。ある実施形態では、前記還元多糖は、以下の構造：
【化４】
2019502652.tif 000005
を有するアルゴキシノールを含む。
【００３８】
一部の態様では、本発明は、架橋剤に共有結合により付着している高酸化多糖を生成する方法であって、多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化多糖を生成するステップと、前記アルデヒド含有酸化多糖を、アルデヒドをカルボン酸に変換する第２の酸化剤と反応させることにより、前記多糖を生成するステップと、前記高酸化多糖を架橋剤と反応させるステップとを含む、方法も提供する。
【００３９】
一部の態様では、前記第２の酸化剤は、亜塩素酸ナトリウム、臭素、希硝酸（ＮＨＯ３）、酸化銀、銅（ＩＩ）複合体、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）からなる群から選択される。特定の実施形態では、前記第２の酸化剤は亜塩素酸ナトリウムである。
【００４０】
一部の実施形態では、前記架橋剤は、クリック試薬、例えば、アジド、ジベンゾシクロオクチン、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそれらのバリアントである。
【００４１】
一部の態様では、前記多糖はアルギネートポリマーである。一態様では、前記アルギネートポリマーは、５００ｋＤａ未満の分子量を有する。
【００４２】
一実施形態では、前記高酸化ポリマーは、以下の構造：
【化５】
2019502652.tif 000006
を有するアルゴキサラートを含む。
【００４３】
本発明は、治療用または診断用薬剤を封入している脂質ベースのナノ粒子と、前記脂質ベースのナノ粒子を封入している、本発明のヒドロゲルとを含む、ドラッグデリバリー組成物も提供する。ある実施形態では、前記脂質ベースのナノ粒子は、リポソームまたはビロソームである。
【００４４】
一部の実施形態では、前記脂質ベースのナノ粒子は、少なくとも１日間、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、少なくとも３５日間、少なくとも４０日間、少なくとも４５日間、少なくとも５０日間、少なくとも５５日間、少なくとも６０日間、少なくとも６５日間、少なくとも７０日間、少なくとも７５日間または少なくとも８０日間、前記ヒドロゲルに封入されたままである。
【００４５】
一部の態様では、前記治療用または診断用薬剤は、細胞、小分子および生物製剤からなる群から選択される。一部の態様では、前記生物製剤は、ペプチド、抗体またはその断片、ワクチン、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびＰＮＡ分子からなる群から選択される。一部の態様では、前記治療用または診断用薬剤は、ＳＴＩＮＧアジュバント、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９試薬および破壊されたがん細胞に由来するアジュバント負荷細胞内ベシクルからなる群から選択される。一部の態様では、前記治療用または診断用薬剤はワクチンである。
【００４６】
一部の態様では、本発明は、治療用または診断用薬剤を封入している脂質ベースのナノ粒子と、前記脂質ベースのナノ粒子を封入しているクリックコンジュゲートしたポリマーヒドロゲルと、を含むドラッグデリバリー組成物であって、前記クリックコンジュゲートしたポリマーヒドロゲルが生分解性ポリマーを含み、前記ポリマーが、宿主内因性酵素による分解を受けにくい、組成物も提供する。ある実施形態では、前記脂質ベースのナノ粒子は、リポソームまたはビロソームである。
【００４７】
一部の実施形態では、前記ドラッグデリバリー組成物は、インタクトな脂質ベースのナノ粒子の、前記宿主内の所望の位置への持続送達を可能にする。
【００４８】
一部の実施形態では、前記多糖は、アルギネート、アガロース、プルラン、スクレログルカン、キトサン、エルシナン、キサンタンガム、デキストラン、マンノース、ゲラン、レバン、セルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｅおよびβ−ｄ−グルカンからなる群から選択される。特定の実施形態では、前記多糖はアルギネートである。
【００４９】
一部の態様では、前記クリックコンジュゲートされたポリマーヒドロゲルは、アジド、ジベンゾシクロオクチン、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそのバリアントからなる群から選択される少なくとも１種のクリック試薬の使用により生成される。
【００５０】
一部の実施形態では、前記アルギネートは、約０．０１％〜約９９％、例えば、約０．０１％〜約０．０５％、約０．０２％〜約０．１％、約０．０５％〜約０．５％、約０．１％〜約１％、約０．５％〜約１５％、約５％〜約１０％、約２％〜約２０％、約１５％〜約４０％、約３０％〜約５０％、約４０％〜約７０％、約５０％〜約８０％または約６０％〜約９９％のクリック置換度を含む。一部の態様では、前記クリックコンジュゲートしたポリマーヒドロゲルは、約０．１％〜約９９％酸化された、例えば、約０．１％〜約０．５％、約０．２％〜約１％、約０．５％〜約１０％、約５％〜約２０％、約１５％〜約４０％、約２５％〜約５０％、約４０％〜約７０％、約５０％〜約８０％または約７５％〜約９９％酸化されたアルギネートを含む。
【００５１】
一部の態様では、前記クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルは、約１％〜約９９％ｗ／ｖ、例えば、約１％〜約９９％ｗ／ｖ、例えば、約１％〜約５％、約２％〜約１０％、約５％〜約２０％、約１０％〜約３０％、約２０％〜約５０％、約４０％〜約７０％、約６０％〜約８０％または約７５％〜約９９％ｗ／ｖの濃度で存在するアルギネートから調製されている。一部の実施形態では、前記脂質ベースのナノ粒子は、少なくとも１日間、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、少なくとも３５日間、少なくとも４０日間、少なくとも４５日間、少なくとも５０日間、少なくとも５５日間、少なくとも６０日間、少なくとも６５日間、少なくとも７０日間、少なくとも７５日間または少なくとも８０日間、前記クリックコンジュゲートしたポリマーヒドロゲルに封入されたままである。
【００５２】
一部の態様では、本発明は、治療用または診断用薬剤を封入している脂質ベースのナノ粒子と、前記脂質ベースのナノ粒子を封入しているアルギネートヒドロゲルとを含むドラッグデリバリー組成物であって、前記ヒドロゲルが、モルベースで約５０％またはそれ未満、例えば、約４５％またはそれ未満、約４０％またはそれ未満、約３５％またはそれ未満、約３０％またはそれ未満、約２５％またはそれ未満、約２０％またはそれ未満、約１５％またはそれ未満、約１０％またはそれ未満、約５％またはそれ未満、約１％またはそれ未満、約０．５％またはそれ未満、または約０．１％またはそれ未満の酸化を含むアルギネートを含む、組成物も提供する。ある実施形態では、前記脂質ベースのナノ粒子は、リポソームまたはビロソームである。一態様では、組成物は、インタクトな脂質ベースのナノ粒子の、宿主内の所望の位置への持続送達を可能にする。
【００５３】
一部の態様では、前記クリックコンジュゲートしたポリマーヒドロゲルは、アジド、ジベンゾシクロオクチン、トランスシクロオクテン、テトラジンおよびノルボルネンおよびそれらのバリアントからなる群から選択される少なくとも１種のクリック試薬の使用により生成される。一部の態様では、前記アルギネートはクリック試薬にコンジュゲートしており、前記アルギネートは約０．０１％〜約９９％のクリック置換度を含む。
【００５４】
一部の態様では、前記アルギネートヒドロゲルは、約０．１％〜約９９％酸化されているアルギネートを含む。
【００５５】
一部の態様では、前記アルギネートヒドロゲルは、約１％〜約８０％ｗ／ｖの濃度で存在するアルギネートから調製されている。一部の実施形態では、前記脂質ベースのナノ粒子は、少なくとも１日間、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、少なくとも３５日間、少なくとも４０日間、少なくとも４５日間、少なくとも５０日間、少なくとも５５日間、少なくとも６０日間、少なくとも６５日間、少なくとも７０日間、少なくとも７５日間または少なくとも８０日間、前記ヒドロゲルに封入されたままである。
【００５６】
一部の態様では、前記治療用または診断用薬剤は、細胞、小分子および生物製剤からなる群から選択される。一部の実施形態では、前記生物製剤は、ペプチド、抗体またはその断片、ワクチン、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびＰＮＡ分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｉｓＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される。
【００５７】
一部の態様では、前記治療用または診断用薬剤は、ＳＴＩＮＧアジュバント、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９試薬および破壊されたがん細胞に由来するアジュバント負荷細胞内ベシクルからなる群から選択される。
【００５８】
一部の実施形態では、前記リポソームはカチオン性リポソームである。一部の態様では、前記所望の位置は細胞のサイトゾルである。
【００５９】
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象を処置するための方法であって、前記対象に、本発明の、有効量のヒドロゲル、埋め込み型もしくは注射用デバイス、またはドラッグデリバリー組成物を投与し、これによって、前記対象を処置することを含む、方法も提供する。
【００６０】
一部の態様では、前記対象は、虚血、眼に関連した障害または耳に関連した障害からなる群から選択される疾患または状態を患っている。
【００６１】
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において慢性虚血を処置するか、または移植した組織の生着を向上させる方法であって、前記対象に、本発明の、有効量のヒドロゲル、埋め込み型もしくは注射用デバイス、またはドラッグデリバリー組成物を投与し、これによって、前記対象において前記慢性虚血を処置するか、または前記移植した組織の生着を向上させることを含む、方法も提供する。
【００６２】
一部の態様では、前記ヒドロゲル、または前記埋め込み型もしくは注射用デバイス、または前記ドラッグデリバリー組成物は、局在的に、例えば、虚血部位または移植前および／または移植後に生着させる組織に、投与される。
【００６３】
一部の態様では、前記ペプチドが溶解性形態で送達される場合、前記ヒドロゲル、または前記埋め込み型もしくは注射用デバイス、または前記ドラッグデリバリー組成物は、前記ペプチドに対する推奨量の少なくとも約１０分の１のより少ない、例えば、約１５分の１のより少ない、約２０分の１のより少ない、約５０分の１のより少ない用量でペプチドを含む、請求項１２０に記載の方法。
【００６４】
特定の態様では、前記ペプチドはＶＥＧＦおよびＩＧＦである。ある実施形態では、前記対象はヒトである。
【００６５】
本発明は、以下の詳細な説明および図によりさらに例示される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】図１ａは、未酸化アルギネートへのクリック試薬のコンジュゲーションを示す概略図である。
【００６７】
【図１Ｂ】図１ｂは、さらなる共有結合クリックの架橋に悪影響をもたらす不安定な（加水分解可能な）イミン結合の形成を例示している、酸化アルギネートへのクリック試薬のコンジュゲーションを示す概略図である。
【００６８】
【図１Ｃ】図１ｃは、クリックコンジュゲーションに利用可能である、生成された追加のカルボン酸基を例示している、高酸化アルギネートへのクリック試薬のコンジュゲーションを示す概略図である。
【００６９】
【図２Ａ】図２ａは、酸化アルギネートへの曝露の関数として、ＥＬＩＳＡにより決定されたＶＥＧＦ生体活性の損失を示す棒グラフである。
【００７０】
【図２Ｂ】図２ｂは、酸化アルギネート中のアルデヒドの存在により、クリックコンジュゲートにおける明らかな変化を例示している、インキュベーション後にＴｚおよびＮｂにコンジュゲートした酸化アルギネートを含有するバイアルの写真である。
【００７１】
【図３Ａ】図３ａは、反応性アルデヒドを含有する酸化アルギネートを生成するアルギネートの酸化、および反応性アルデヒドを排除するための酸化アルギネートのその後の選択的還元または酸化を示す化学的スキームである。
【００７２】
【図３Ｂ】図３ｂは、アンモニアボランまたは水素化ホウ素ナトリウムでさらに還元した、または亜塩素酸ナトリウムでさらに酸化した、酸化アルギネート中に残留する酸化の％を示す棒グラフである。
【００７３】
【図４Ａ】図４ａは、酸化または還元アルギネートへの曝露の関数として、ＶＥＧＦ生体活性の損失を例示している、ＥＢＭ中での５日間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡで測定したＶＥＧＦ生体活性における％変化を示す棒グラフである。
【００７４】
【図４Ｂ】図４ｂは、酸化アルギネートに曝露された関数として、ＶＥＧＦ生体活性の損失を例示している、１％ＢＳＡ溶液中での５日間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡで測定したＶＥＧＦ生体活性における％変化を示す棒グラフである。
【００７５】
【図５Ａ】図５ａは、酸化アルギネート中のアルデヒドの存在ならびにアルゴキシノールおよびアルゴキサラートを含有するコンジュゲートにおける変化の欠如による、クリックコンジュゲートにおける明らかな変化を例示している、ＴｚおよびＮｂにコンジュゲートした、０日目でのＨｉｇｈＯｘアルギネート（上側パネル）およびＴｚおよびＮｂにコンジュゲートした、０日目でのＨｉｇｈＯｘ  Ｓｃアルギネート（下側パネル）を含有するバイアルの２つの写真のパネルである。
【００７６】
【図５Ｂ】図５ｂは、追加のカルボン酸部分を介した、アルゴキサラート含有アルギネートのクリックコンジュゲーションに対する追加的可能性を例示している、ＮＭＲにより測定されたＨｉｇｈＯｘおよびＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート中に存在するＴｚの相対量を示す棒グラフである。
【００７７】
【図６Ａ】図６ａは、２８日目における、２０〜５０％酸化を有するＴｚコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘアルギネート物質のＵＶ−Ｖｉｓスペクトル（上側パネル）、および１４日目における、２０％および３０％コンジュゲーションを含有する、亜塩素酸ナトリウムで処理した、ＴｚコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘアルギネート物質のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルである。図６ａは、クリック部分と、酸化アルギネート物質中に存在するアルギネートアルデヒドとの反応により引き起こされた、Ｔｚ  ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルにおける変化を例示している。
【００７８】
【図６Ｂ】図６ｂは、アンモニアボランで処理したＴｚコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘアルギネート物質および亜塩素酸ナトリウムで処理したＨｉｇｈＯｘアルギネート物質を含有するバイアルの２つの写真のパネルである。図６ｂは、クリック部分と、酸化アルギネート物質中に存在するアルギネートアルデヒドとの反応により引き起こされた、Ｔｚ溶液の色の変化を例示している。
【００７９】
【図６Ｃ】図６ｃは、２８日目における、２０〜５０％酸化を有するＮｂコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘアルギネート物質のＵＶ−Ｖｉｓスペクトル（上側パネル）、および１４日目における、２０％〜５０％コンジュゲーションを含有する、亜塩素酸ナトリウムで処理した、ＮｂコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘアルギネート物質のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルである。図６ｃは、クリック部分と、酸化アルギネート物質中に存在するアルギネートアルデヒドとの反応により引き起こされた、Ｎｂ  ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルにおける変化を例示している。
【００８０】
【図６Ｄ】図６ｄは、２８日目における、２０〜５０％酸化を有する、ＮｂコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘアルギネート物質（上側パネル）および１４日目における、２０％〜５０％コンジュゲーションを含有する、亜塩素酸ナトリウムで処理したＮｂコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘアルギネート物質（下側パネル）を含有するバイアルの２つの写真のパネルである。図６ｄは、クリック部分と、酸化アルギネート物質中に存在するアルギネート（ａｉｎａｔｅ）アルデヒドとの反応により引き起こされた、Ｎｂ溶液の色の変化を例示している。
【００８１】
【図６Ｅ】図６ｅは、Ｎｂピークの幅の広がり、ならびにアルデヒドピークの存在を示す、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化したＮｂコンジュゲートしたアルギネート物質のＮＭＲスペクトルである。
【００８２】
【図６Ｆ】図６ｆは、Ｎｂピークの幅の広がり、およびアルデヒドピークの存在を示す、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化したＴｚコンジュゲートしたアルギネート物質のＮＭＲスペクトルである。
【００８３】
【図６Ｇ】図６ｇは、Ｎｂピークの幅が広くなることがなく、アルデヒドピークが存在しないことを示す、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、次いで亜塩素酸ナトリウムでさらに酸化したＮｂコンジュゲートしたアルギネート物質のＮＭＲスペクトルである。
【００８４】
【図６Ｈ】図６ｈは、Ｎｂピークの幅が広くなることがなく、アルデヒドピークが存在しないことを示す、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、次いで亜塩素酸ナトリウムでさらに酸化したＴｚコンジュゲートしたアルギネート物質のＮＭＲスペクトルである。
【００８５】
【図６Ｉ】図６ｉは、亜塩素酸ナトリウムで処理後の、カルボン酸ピークの生成を実証している、アルギネート物質の代表的なＦＴＩＲスペクトルである。
【００８６】
【図６Ｊ】図６ｊは、アルゴキシノールおよびアルゴキサラートを含有するクリックコンジュゲートしたアルギネートに対して色の変化がないことを示している、１５日目における、ＴｚコンジュゲートおよびＮｂコンジュゲートしたアルギネート物質に対するＵＶ−Ｖｉｓスペクトルである。
【００８７】
【図６Ｋ−１】図６ｋは、アルデヒドに伴うピーク（約≧５．１ｐｐｍ）が存在しないことを示している、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、亜塩素酸ナトリウムでさらに酸化したアルギネート物質に対するＮＭＲスペクトルである。
【図６Ｋ−２】図６ｋは、アルデヒドに伴うピーク（約≧５．１ｐｐｍ）が存在しないことを示している、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、亜塩素酸ナトリウムでさらに酸化したアルギネート物質に対するＮＭＲスペクトルである。
【００８８】
【図７Ａ】図７ａは、時間の関数としてアルギネートポリマー骨格の加水分解を示している、２０％酸化（左のパネル）および５０％酸化（右のパネル）を有する、ＴｚコンジュゲートおよびＮｂコンジュゲートしたＭＶＧアルギネート（約２５０ｋＤａで開始するＭＷ）の分解を示す２つのグラフのパネルである。
【００８９】
【図７Ｂ】図７ｂは、時間の関数としてアルギネートポリマー骨格の加水分解を示している、未処理のアルギネート（上側の左のパネル）、アンモニアボランで還元処理したアルギネート（上側の右のパネル）、水素化ホウ素ナトリウムで還元処理したアルギネート（下側の左のパネル）、およびアンモニアボランで還元処理したアルギネート（下側の右のパネル）に対する、３７℃での、０％〜５０％酸化を含有するＶＬＶＧ（３０ｋＤａで開始するＭＷ）アルギネートの分解を示す４つのグラフのパネルである。
【００９０】
【図７Ｃ】図７ｃは、２０％酸化を有するＭＶＧおよびＶＬＶＧ物質の５０％ｗ／ｖ溶液および比較用の５０％ｗ／ｖで未酸化ＶＬＶＧを含有する、バイアルの写真である。親アルギネートとは異なり、アルゴキシノールおよびアルゴキサラート含有アルギネート物質は、増加した溶解度を示している。
【００９１】
【図８】図８は、Ｔｚコンジュゲートしたアルギネート物質対コンジュゲーション同等物の５１５ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓ吸収を示すグラフである。
【００９２】
【図９】図９は、インキュベーションの２日後の、０〜５０％酸化を含有する酸化アルギネートの存在下での、相対的細胞生存度を示す棒グラフである。
【００９３】
【図１０】図１０は、分子量２５０ｋＤａを有する未酸化アルギネート（ＭＶＧ、左のバー）；分子量３０ｋＤａを有する未酸化アルギネート（ＶＬＶＧ、中央のバー）に対する；ならびに２０％に酸化し、次いで、亜塩素酸ナトリウムを使用してさらに酸化し、クリックとコンジュゲートしたＶＬＶＧ物質（ＴｚまたはＮｂ、右のバー）に対する溶解度（％ｗ／ｖ）の上限を示す棒グラフである。図１０は、未酸化のアルギネートとは対照的に、酸化したＶＬＶＧ物質が少なくとも５０％ｗ／ｖまで溶解することを例示している。
【００９４】
【図１１Ａ】図１１ａは、ＴｚおよびＮｂを使用して、ＭＶＧおよびＶＬＶＧ物質に対して達成したコンジュゲーションの可能性を示す棒グラフである。
【００９５】
【図１１Ｂ】図１１ｂは、モル当量のＴｚの関数としての、ＶＬＶＧ物質の５１５ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を示すグラフである。
【００９６】
【図１２Ａ】図１２ａは、異なる置換度および一定のアルギネート濃度（％ｗ／ｖ）でのＶＬＶＧ物質に対する貯蔵弾性率（Ｇ’）対時間における増加を示すグラフである。
【００９７】
【図１２Ｂ】図１２ｂは、一定のアルギネート濃度（％ｗ／ｖ）での異なる置換度における、ＶＬＶＧ物質に対する貯蔵弾性率（Ｇ’）の最大値（図１３ａから）を示す棒グラフである。
【００９８】
【図１２Ｃ】図１２ｃは、図１３ｂに示されている最大貯蔵弾性率（Ｇ’）から誘導される、一定のアルギネート濃度（％ｗ／ｖ）での異なる置換度でのＶＬＶＧ物質に対するメッシュサイズの値を示す棒グラフである。
【００９９】
【図１２Ｄ】図１２ｄは、１０％酸化に酸化し、アンモニアボランで還元し、次いで２５０モル当量のＮｂおよびＴｚを、還元アルギネート濃度、５％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖまたは１５％ｗ／ｖで使用して、ＮｂまたはＴｚとコンジュゲートしたＭＶＧ物質に対する、貯蔵弾性率（Ｇ’）対時間における増加を示すグラフである。
【０１００】
【図１２Ｅ】図１２ｅは、２０％酸化に酸化し、アンモニアボランで還元し、次いで２５０モル当量のＮｂおよびＴｚを、還元アルギネート濃度、５％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ、１５％ｗ／ｖまたは２０％ｗ／ｖで使用して、ＮｂまたはＴｚとコンジュゲートしたＭＶＧ物質に対する、貯蔵弾性率（Ｇ’）対時間における増加を示すグラフである。
【０１０１】
【図１２Ｆ】図１２ｆは、２０％酸化に酸化し、アンモニアボランで還元し、次いで１０００モル当量のＮｂおよびＴｚを、還元アルギネート濃度、５％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ、１５％ｗ／ｖまたは２０％ｗ／ｖで使用して、ＮｂまたはＴｚとコンジュゲートしたＬＦ２０／４０物質に対する、貯蔵弾性率（Ｇ’）対時間における増加を示すグラフである。
【０１０２】
【図１３Ａ】図１３ａは、異なるクリックコンジュゲーション度および一定のアルギネート濃度（％ｗ／ｖ）で、クリックコンジュゲートしたＶＬＶＧ物質を使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたインスリンの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０１０３】
【図１３Ｂ】図１３ｂは、ヒドロゲル形成（２５００当量の５％ＶＬＶＧ）および線形フィット中、２５００モル当量のＮｂまたはＴｚおよび５％濃度のＡｌｇ−ＮおよびＡｌｇ−Ｔに対応する、図１４ａにおける非水平領域曲線を示すグラフである。
【０１０４】
【図１３Ｃ】図１３ｃは、異なるクリックコンジュゲーション度および一定のアルギネート濃度（％ｗ／ｖ）で、クリックコンジュゲートしたＶＬＶＧ物質を使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたＢＳＡの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０１０５】
【図１３Ｄ】図１３ｄは、ヒドロゲル形成（２５００当量の５％ＶＬＶＧ）および線形フィット中、２５００モル当量のＮｂまたはＴｚおよび５％濃度のＡｌｇ−ＮおよびＡｌｇ−Ｔに対応する、図１４ｃにおける非水平領域曲線を示すグラフである。
【０１０６】
【図１３Ｅ】図１３ｅは、異なるクリックコンジュゲーション度および一定のアルギネート濃度（％ｗ／ｖ）で、クリックコンジュゲートしたＶＬＶＧ物質を使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたＩｇＧの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０１０７】
【図１３Ｆ】図１３ｆは、ヒドロゲル形成（２５００当量の５％ＶＬＶＧ）および線形フィット中、２５００モル当量のＮｂまたはＴｚおよび５％濃度のＡｌｇ−ＮおよびＡｌｇ−Ｔに対応する、図１４ｅにおける非水平領域曲線を示すグラフである。
【０１０８】
【図１３Ｇ】図１３ｇは、最初の１〜３日間にわたり完全ではないとしても、有意なバースト放出を示している、Ｃａ２＋で媒介された架橋により生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたインスリン、ＢＳＡおよびＩｇＧの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０１０９】
【図１４Ａ】図１４ａは、５％または１０％に酸化させ、次いで、ＡＢで還元処理した、５％ｗ／ｖの濃度でクリックコンジュゲートしたＬＦ２０／４０アルギネートを使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたインスリンの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０１１０】
【図１４Ｂ】図１４ｂは、５％または１０％に酸化させ、次いで、ＳＣで酸化処理した、５％ｗ／ｖの濃度でクリックコンジュゲートしたＬＦ２０／４０アルギネートを使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたインスリンの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０１１１】
【図１４Ｃ】図１４ｃは、５％または１０％に酸化させ、次いで、ＡＢで還元処理した、５％ｗ／ｖの濃度でクリックコンジュゲートしたＬＦ２０／４０アルギネートを使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートＩｇＧの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０１１２】
【図１４Ｄ】図１４ｄは、５％または１０％に酸化させ、次いで、ＳＣで酸化処理した、５％ｗ／ｖの濃度でクリックコンジュゲートしたＬＦ２０／４０アルギネートを使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたＩｇＧの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０１１３】
【図１５Ａ】図１５ａは、クリック部分の改変を示す、有意な色の変化を示している、２．３％グルタルアルデヒドの存在下、０分後、４０分後、２１．５時間後および６７．５時間後に採取された、Ｎｂ（左バイアル）およびＴｚ（右のバイアル）へコンジュゲートした、４％ＭＶＧ物質を含有するガラスバイアルの一連の写真である。
【０１１４】
【図１５Ｂ】図１５ｂは、クリック部分の改変を示す有意な色の変化を示している、０分後、４０分後、２０時間後および６９時間後に採取した、対照としての水（左バイアル）またはＤＢＣＯ（中央バイアル）もしくはアジド（右のバイアル）へコンジュゲートした、２％ＭＶＧ物質を含有するガラスバイアルの一連の写真である。
【０１１５】
【図１６Ａ】図１６ａはＰＢＳ＋＋（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋イオンを含有するＰＢＳ緩衝液）中での、５０日間にわたるＣａ２＋架橋アルギネートからの、および非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートからの中性リポソーム（ＤＯＰＣ：コレステロール）の累積放出（％負荷）を示すグラフである。
【０１１６】
【図１６Ｂ】図１６ｂは、ＰＢＳ＋＋（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋イオンを含有するＰＢＳ緩衝液）中のＣａ２＋架橋アルギネートヒドロゲル、非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルおよびクリックゼラチンヒドロゲルからの中性リポソーム（ＤＯＰＣ：コレステロール）の累積放出（％負荷）を示すグラフである。
【０１１７】
【図１６Ｃ】図１６ｃは、２８日間の期間にわたる、Ｃａ２＋架橋アルギネートからの、および５％ｗ／ｖのアルギネート濃度で調製した非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルからの中性リポソーム（ＤＯＰＣ：コレステロール）の累積放出（％負荷）を示すグラフである。リポソーム放出プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＰＢＳ−−（Ｃａ２＋またはＭｇ２＋イオンを含有しないＰＢＳ緩衝液）中で測定したものであり、リポソームはカルシウム架橋したゲルから拡散することができる一方で、クリック架橋したゲルは、封入されたリポソームを保持することができる（拡散は限定される）ことを実証している。
【０１１８】
【図１６Ｄ】図１６ｄは、８日間の期間にわたる、非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルおよびクリックコンジュゲートしたゼラチンヒドロゲルからの中性リポソーム（ＤＯＰＣ：コレステロール）の累積放出（％負荷）を示すグラフである。ゲルは、回収率および質量平衡を示すために、８日目にアルギネートリアーゼまたはコラゲナーゼでそれぞれ消化した。
【０１１９】
【図１７Ａ】図１７ａは、図１７ｄに示されているゲルの中に封入されたリポソームストック物質の動的光散乱（ＤＬＳ）トレースである。
【０１２０】
【図１７Ｂ】図１７ｂは、ストック溶液中に存在するリポソームの平均直径からの最小差異を示している、図１７ｄに示されているような、アルギネートリアーゼにより８日後消化された非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルから放出された、リポソームのＤＬＳトレースである。
【０１２１】
【図１７Ｃ】図１７ｃは、ストック溶液中存在するリポソームの平均直径からの最小差異を示している、ＰＢＳ−−緩衝液中５％ｗ／ｖのアルギネート濃度で調製した非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルから２８日後放出された、リポソームのＤＬＳトレースである。
【０１２２】
【図１７Ｄ】図１７ｄは、８日後コラゲナーゼで消化されたクリックコンジュゲートしたゼラチンヒドロゲルから放出された、リポソームのＤＬＳトレースである。
【０１２３】
【図１７Ｅ】図１７ｅは、放出されたリポソームが、リポソーム標準より多分散系であり、より大きな直径を有することを示している、ＰＢＳ−−緩衝液中で調製したカルシウム架橋アルギネートから３日後放出された、リポソームのＤＬＳトレースである。
【０１２４】
【図１７Ｆ】図１７ｆは、放出されたリポソームが、リポソーム標準より多分散系であり、より大きな直径を有することを示している、ＰＢＳ−−緩衝液中５％ｗ／ｖのアルギネート濃度で調製したカルシウム架橋ヒドロゲルから２８日後放出された、リポソームのＤＬＳトレースである。
【０１２５】
【図１８】図１８は、０％、５％および１０％の全酸化まで酸化させ、クリックコンジュゲーション前にＡＢで還元処理したクリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルからの、ＰＢＳ中での７５日にわたるリポソームの累積放出（％負荷）を示すグラフである。
【０１２６】
【図１９Ａ】図１９ａは、リポソームおよび上清を封入するアルギネートヒドロゲルを含有する、０日目のチューブの写真である。アルギネートヒドロゲルを調製するために、アルギネートを２０％まで酸化させ、次いで続いてアンモニアボランで還元した。ゲルは、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５；左側の２つのバイアル）またはナトリウムボラン（ｐＨ９；右側の２つのバイアル）のいずれかの中で、３７℃でインキュベートした。
【０１２７】
【図１９Ｂ】図１９ｂは、リポソームおよび上清を封入するアルギネートヒドロゲルを含有する、１日目のチューブの写真である。アルギネートヒドロゲルを調製するために、アルギネートを２０％まで酸化させ、次いで続いてアンモニアボランで還元した。ゲルは、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５；左側の２つのバイアル）またはナトリウムボラン（ｐＨ９；右側の２つのバイアル）のいずれかの中で、３７℃でインキュベートした。
【０１２８】
【図１９Ｃ】図１９ｃは、リポソームおよび上清を封入するアルギネートヒドロゲルを含有する、７日目のチューブの写真である。アルギネートヒドロゲルを調製するために、アルギネートを２０％まで酸化させ、次いで続いてアンモニアボランで還元した。ゲルは、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５；左側の２つのバイアル）またはナトリウムボラン（ｐＨ９；右側の２つのバイアル）のいずれかの中で、３７℃でインキュベートした。写真は、ｐＨ９の試料は７日後に分解したのに対して、ｐＨ５の試料は依然としていくらかインタクトであったことを示している。
【０１２９】
【図１９Ｄ】図１９ｄは、リポソームおよび上清を封入するアルギネートヒドロゲルの、１４日目のチューブの写真である。アルギネートヒドロゲルを調製するために、アルギネートを２０％まで酸化させ、次いで続いてアンモニアボランで還元した。ゲルは、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５；左側の２つのバイアル）またはナトリウムボラン（ｐＨ９；右側の２つのバイアル）のいずれかの中で、３７℃でインキュベートした。画像は、試料が、ｐＨ５およびｐＨ９の両方において１４日後に分解したことを示している。
【０１３０】
【図１９Ｅ】図１９ｅは、アルギネートを２０％まで酸化させ、続いてこれをアンモニアボランで還元することによって生成されたアルギネートヒドロゲルからの、中性リポソーム（ＤＯＰＣ：コレステロール）の分解ベースの放出を示すグラフである。試料は、腫瘍周囲の微細環境を模倣するためにＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５中で放出された。
【０１３１】
【図２０Ａ】図２０ａは、押出し前のＤＯＴＡＰ：Ｈｙｄｒｏ  Ｓｏｙ  ＰＣリポソームのＤＬＳトレースである。
【０１３２】
【図２０Ｂ】図２０ｂは、押出し後のＤＯＴＡＰ：Ｈｙｄｒｏ  Ｓｏｙ  ＰＣリポソームのＤＬＳトレースである。
【０１３３】
【図２０Ｃ】図２０ｃは、Ｃａ２＋架橋アルギネートからの、および非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルからの１７日間にわたるカチオン性リポソーム（図２０ａ）の累積放出（％負荷）を示すグラフである。図２１ｂは、リポソームはカルシウム架橋したゲルから拡散することができる一方で、クリック架橋したゲルは、封入されたリポソームを保持する（拡散が限定される）ことができることを示している。
【０１３４】
【図２１Ａ】図２１ａは、様々なアルギネート組成物を使用して調製したクリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルからのＩＧＦ−１の放出を示すグラフである。
【０１３５】
【図２１Ｂ】図２１ｂは、様々なアルギネート組成物を使用して調製したクリックアルギネートヒドロゲルからのＶＥＧＦ１６５の放出を示すグラフである。
【０１３６】
【図２２】図２２は、異なるアルギネート濃度（％ｗ／ｖ）、酸化度、亜塩素酸ナトリウムまたはアンモニアボランのいずれかでの処理における、様々なアルギネート溶液の相対粘度を示す棒グラフである。粘度は、アルゴキシノールまたはアルゴキサラートのいずれかを含有するアルギネートへのクリックコンジュゲーションにより実質的に減少し、水の粘度と同等である（２５℃で０．８９０ｃＰａ）のに対して、酸化なしでの、ＭＶＧへのクリックコンジュゲーションは粘度における実質的な差異をもたらさないことをデータは示している。
【発明を実施するための形態】
【０１３７】
発明の詳細な説明
Ｉ．本発明の還元、高酸化多糖
本発明は、還元多糖を含む組成物であって、前記還元多糖が、２％未満の残留アルデヒドを含む、組成物を目的とする。本発明は、還元多糖を含む組成物であって、前記還元多糖が、３％未満の残留アルデヒドを含み、前記還元多糖が、多糖をジオール特異的な酸化剤と反応させることにより、モルベースで１５％またはそれよりも多い酸化を含む酸化多糖を生成すること、続いて、前記酸化多糖を水溶性のアルデヒド特異的な還元剤と反応させて、前記還元多糖を生成することによって生成される、組成物も目的とする。
【０１３８】
本発明の組成物中に含まれる還元多糖を使用して、ヒドロゲルを調製することができる。これらの多糖は、２ステップ処理により生成される。第１のステップは、多糖、例えば、アルギネートをジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化多糖、例えば、アルデヒド含有酸化アルギネートを生成することを含む。第２のステップは、アルデヒド含有酸化多糖をさらに還元処理して、還元多糖を生成することを含む。還元処理は、酸化多糖中に存在するアルデヒド部分を還元して、アルコール部分を生成することを含む。したがって、本明細書で使用されている「還元多糖」という用語は、アルコール部分を含む多糖を含む。一部の実施形態では、還元多糖は、ジオール特異的な酸化剤を使用して多糖を酸化して、アルデヒドを含有する多糖を生成し、次いで、例えば、水溶性のアルデヒド特異的な還元剤を使用して酸化多糖を還元処理して、還元多糖を生成することによって生成される。ある特定の例では、還元多糖は、以下の構造：
【化６】
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を有する開環アルコールを有するモノマーサブユニットを含む。
【０１３９】
本明細書で使用されている「多糖」という用語は、グリコシド連結により一緒に結合している単糖単位の鎖で構成された任意のポリマー性炭水化物分子を指す。例えば、アルギネートは、２つの異なるモノマーサブユニット、β−Ｄ−マンヌロネート（Ｍ）およびそのＣ−５エピマーα−Ｌ−グルロネート（Ｇ）（（１−４）連結している）を含む多糖である。
【０１４０】
多糖鎖は直鎖または分枝であってよい。「多糖」という用語はまた、オリゴ糖を包含することを意図する。多糖は、単に１種類だけのモノマー単位を含有するホモ多糖（例えば、グルコース）、または異なる種類のモノマー単位を含有するヘテロ多糖（例えば、グルコースおよびフルクトース）であることができる。一実施形態では、「多糖」という用語は、ジオール、すなわち、隣接する炭素上に存在する２つのヒドロキシル基を含有するポリマー性炭水化物分子を指す。ジオール含有多糖の非限定的な例として、アルギネート、アガロース、プルラン、スクレログルカン、キトサン、エルシナン、キサンタンガム、デキストラン、マンノース、ゲラン、レバン、セルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｅおよびβ−ｄ−グルカンが挙げられる。
【０１４１】
具体的な一実施形態では、ジオール含有多糖はアルギネートポリマーである。アルギネートポリマーは、２つの異なるモノマー単位、（１−４）−連結したβ−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ単位）およびαＬ−グルロン酸（Ｇ単位）モノマーで構成され、これらのモノマー単位は、異なる割合で、ポリマー鎖に沿って連続的に分布することができる。アルギネートポリマーは、二価カチオン（例えば、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２、Ｂａ＋２）に対して強い親和性を有し、これらの分子に曝露された場合、安定したヒドロゲルを形成する高分子電解質系である。Ｍａｒｔｉｎｓｅｎ  Ａ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ＆  Ｂｉｏｅｎｇ．、３３巻（１９８９年）７９〜８９頁を参照されたい。例えば、カルシウム架橋したアルギネートヒドロゲルは、歯の用途、外傷用包帯、軟骨細胞移植および他の細胞型に対するマトリックスとして有用である。理論に制約されることを望むことなく、Ｇ単位は、カルシウム架橋を使用して優先的に架橋されるのに対して、クリック反応ベースの架橋は、Ｇ単位またはＭ単位に関してより無差別である（すなわち、Ｇ単位とＭ単位の両方がクリック化学反応により架橋され得る）と考えられている。
【０１４２】
「アルギネートポリマー」という用語と交換可能なように使用される「アルギネート」という用語は、未修飾アルギネート、酸化アルギネート（例えば、１つまたは複数のアルゴキサラートモノマー単位を含む）および／または還元アルギネート（例えば、１つまたは複数のアルゴキシノールモノマー単位を含む）を含む。一部の実施形態では、酸化アルギネートは、１つもしくは複数のアルデヒド基を含むアルギネート、または１つもしくは複数のカルボキシル基を含むアルギネートを含む。他の実施形態では、酸化アルギネートは、例えば、１つもしくは複数のアルゴキサラート単位を含む、高酸化アルギネートを含む。酸化アルギネートはまた、比較的少数のアルデヒド基（例えば、１５％未満、例えば、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％またはそれ未満のアルデヒド基またはモルベースでの酸化）を含み得る。「アルギネート」または「アルギネートポリマー」という用語はまた、アルギネート、例えば、以下に記載されているような少なくとも１つのクリック試薬とコンジュゲートした、未修飾アルギネート、酸化アルギネートまたは還元アルギネート、を含み得る。
【０１４３】
本発明の文脈において有用なアルギネートポリマーは、約２０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、例えば、約２０ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約１３０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約２３０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約３００ｋＤａ〜約４５０ｋＤａまたは約３２０ｋＤａ〜約５００ｋＤａの平均分子量を有し得る。１つの例では、本発明において有用なアルギネートポリマーは、約３２ｋＤａの平均分子量を有し得る。別の例では、本発明において有用なアルギネートポリマーは、約２６５ｋＤａの平均分子量を有し得る。一部の実施形態では、アルギネートポリマーは、約１０００ｋＤａ未満、例えば、約９００Ｋｄａ未満、約８００ｋＤａ未満、約７００ｋＤａ未満、約６００ｋＤａ未満、約５００ｋＤａ未満、約４００ｋＤａ未満、約３００ｋＤａ未満、約２００ｋＤａ未満、約１００ｋＤａ未満、約５０ｋＤａ未満、約４０ｋＤａ未満、約３０ｋＤａ未満または約２５ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、アルギネートポリマーは、約１０００ｋＤａ、例えば、約９００Ｋｄａ、約８００ｋＤａ、約７００ｋＤａ、約６００ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約３０ｋＤａまたは約２５ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、アルギネートポリマーの分子量は、約２０ｋＤａである。
【化７】
2019502652.tif 000008
「ＧＧＧＧＲＧＤＳＰ」は、配列番号１２として開示された。
【０１４４】
多糖、例えば、ジオール含有多糖、例えば、アルギネートなどは、第１のステップで、ジオール特異的な酸化剤と反応させることができる。「ジオール特異的な酸化剤」という用語は、ジオール部分、例えば、多糖中に存在するジオール部分に特異的に反応し、また多糖中に存在し得る他の官能基、例えば、アルコールを酸化しない酸化剤を指す。ジオール特異的な酸化剤の非限定的例として、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、過ヨウ素酸（ＨＩＯ４）、四酢酸鉛（ＰＢ（ＯＡｃ）４）、パラ過ヨウ素酸ナトリウム（Ｎａ３Ｈ２ＩＯ６）および過ヨウ素酸カリウム（ＫＩＯ４）が挙げられる。具体的な実施形態では、ジオール特異的な酸化剤は過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）である。
【０１４５】
ジオール特異的な酸化剤は、ジオールと反応して、炭素−炭素結合を開裂し、２つのアルデヒド部分を生成する。ある特定の実施形態では、この反応は、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％酸化されている酸化多糖を生成する。列挙された値の中間の範囲もまた本発明の一部であることが意図されている。例えば、ある特定の実施形態では、この反応は、約１％〜約５％、約３％〜約１０％、約５％〜約２０％、約１０％〜約１５％、約１２％〜約２５％、約１５％〜約３０％、約２０％〜約２５％、約２５％〜約４５％、約３０％〜約５０％、約４５％〜約６０％、約５０％〜約７０％、約５５％〜約７５％、約６０％〜約８０％、約６５％〜約８０％、約７０％〜約９０％または約８５％〜約１００％酸化されている酸化多糖を生成する。
【０１４６】
本明細書全体にわたり使用されている「酸化多糖」という用語、例えば、「酸化アルギネート」は、酸化された、例えば、ジオール特異的な酸化剤などの酸化剤と反応させた多糖を指す。酸化多糖、例えば、アルギネートは、多糖の酸化に起因するアルデヒド部分を含む。酸化多糖は、約０．１％〜約１００％酸化されていてもよく、例えば、約０．１％〜約５％、約１％〜約１０％、約５％〜約２０％、約１５％〜約４０％、約２５％〜約６０％、約４０％〜約７０％、約５５％〜約９０％または約７５％〜約１００％酸化されていてもよい。一部の実施形態では、酸化多糖は、約１５％未満酸化されていてもよく、例えば、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満、約０．２％未満または約０．１％未満酸化されていてもよい。
【０１４７】
「％酸化」または「％酸化された」、「酸化レベル」または「％酸化レベル」という用語は、「モルベースの％酸化」という用語と交換可能なように使用され、酸化の結果環開される、ジオール含有多糖、例えば、アルギネートにおけるモノマーサブユニットのモル分率の％を指す。場合によっては、多糖は、過ヨウ素酸ナトリウムなどのジオール特異的な酸化剤との反応を受けたジオール含有多糖である。多糖の％酸化を測定するのに有用となり得る方法は、当業者には公知であり、例えば、ｑＮＭＲを挙げることができる。
【０１４８】
例えば、「％酸化」という用語は、例えば、ジオール特異的な酸化剤により酸化され、アルデヒド部分を含む開環したモノマーサブユニットを含有する多糖を参照して使用することができる。例えば、アルギネート中のこのようなモノマーサブユニットの１つの例を以下に示す：
【化８】
2019502652.tif 000009
「％酸化」という用語はまた、例えば、ジオール特異的な酸化剤により酸化され、続いて、例えば、水溶性のアルデヒド特異的な還元剤で還元され、アルコール部分を含む開環したモノマーサブユニットを含有する多糖を参照して使用することができる。このようなモノマーサブユニットの１つの例、例えばアルゴキシノールを以下に示す：
【化９】
2019502652.tif 000010
【０１４９】
「％酸化」という用語はまた、例えば、ジオール特異的な酸化剤により酸化され，続いて、例えば、第２の酸化剤によりさらに酸化され、カルボン酸部分を含む開環したモノマーサブユニットを含有する多糖を参照して使用することができる。このようなモノマーサブユニットの１つの例、例えば、アルゴキサラートを以下に示す：
【化１０】
2019502652.tif 000011
【０１５０】
本明細書で使用される「％アルデヒド」という用語は、多糖、例えば、アルギネートなどのジオール含有多糖の開環したモノマーサブユニット中に存在するアルデヒドの％モル分率を指す。
【０１５１】
「％残留酸化」、「残留酸化レベル」、「％残留酸化レベル」、「モルベースの％残留酸化」または「％残留アルデヒド」という用語は、残留アルデヒド、すなわち、ジオール特異的な酸化剤と反応し、次いで、例えば、アルデヒド特異的な水溶性の還元剤で還元されて、以下に記載されている還元多糖を生成した後、多糖中に残留するアルデヒド部分の％モル分率を指す。一部の実施形態では、還元多糖、例えば、還元アルギネートは、約０．０１％〜約３％の残留アルデヒド、例えば、約０．０１％〜約１％、約０．０５〜約１．５％または約１％〜約３％の残留アルデヒドを含むことができる。例えば、還元多糖は、約２％の残留アルデヒドまたは約３％の残留アルデヒドを含むことができる。この用語はまた、残留アルデヒド、すなわち、ジオール特異的な酸化剤と反応し、次いで、例えば、第２の酸化剤でさらに酸化されて、以下に記載されている高酸化多糖を生成した後、多糖中に残留するアルデヒド部分の％モル分率を指す。一部の実施形態では、高酸化多糖、例えば、高酸化アルギネートは、約０．０１％〜約３％の残留アルデヒド、例えば、約０．０１％〜約１％、約０．０５〜約１．５％または約１％〜約３％の残留アルデヒドを含むことができる。例えば、高酸化多糖は、約２％の残留アルデヒドまたは約３％の残留アルデヒドを含むことができる。
【０１５２】
多糖のモノマー単位間の例示的な反応は、アルギネートと、過ヨウ素酸ナトリウム、すなわちジオール特異的な酸化剤との間の反応であり、スキーム１に例示されている：
【化１１】
2019502652.tif 000012
【０１５３】
本発明の方法の第２のステップにおいて、アルデヒド含有酸化多糖のさらなる還元処理は、アルデヒド含有酸化多糖と、アルデヒド特異的な水溶性の還元剤との反応を含む。「アルデヒド特異的な水溶性の還元剤」という用語は、アルデヒド、例えば、ジオール特異的な酸化剤による酸化の結果として多糖中に存在するアルデヒドを特異的に酸化し、これらをアルコールに変換する還元剤を指す。ある特定の実施形態では、アルデヒド特異的な水溶性試薬は無毒性であり、および／またはグリーン試薬である。アルデヒド特異的な水溶性の還元剤の非限定的な例として、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）；シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）；例えば、ニッケル（Ｎｉ）、白金（Ｐｌ）またはパラジウム（Ｐｄ）触媒などの触媒の存在下での水素ガス（Ｈ２）；アンモニアボラン（Ｈ３ＮＢＨ３）；またはボラン錯体、例えば、ビス−カーボネートボラン錯体（［（ＢＨ３）２ＣＯ２］２−・２Ｎａ＋）、ボランジメチルアミン錯体［（ＣＨ３）２ＮＨ・ＢＨ３］；ボランｔｅｒｔ−ブチルアミン錯体［（ＣＨ３）３ＣＮＨ２・ＢＨ３］；もしくはボラン−ピリミジン錯体が挙げられる。具体例では、アルデヒド特異的な水溶性の還元剤はアンモニアボランである。一実施形態では、アルデヒド特異的な水溶性の還元剤は水素化ホウ素ナトリウムではない。
【０１５４】
スキーム１に例示された反応の生成物である、酸化グルクロン酸の、水溶性のアルデヒド特異的な還元剤であるアンモニアボランとの例示的な反応がスキーム２に例示されている。
【化１２】
2019502652.tif 000013
【０１５５】
本発明との関連で、「残留アルデヒド」という用語は、酸化多糖、例えば、酸化アルギネートの、アルデヒド特異的な水溶性の還元剤、例えば、アンモニアボランによる還元が完了した後、還元多糖中に残留するアルデヒドを指す。多糖中に存在するアルデヒドの量、例えば、水溶性の、アルデヒド特異的な還元剤による還元後、多糖中に存在する残留アルデヒドの量は、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。例えば、多糖中に存在する残留アルデヒドの量は、定量的ＮＭＲにより測定することができ、定量的ＮＭＲでは、アルギネート（１．５％ｗ／ｖ）のアルデヒドピーク（＞５．１ｐｐｍ）の積分が内部標準ジメチルマロン酸（２．５ｍｇ／ｍＬ）と比較され、残留アルデヒドの％として表現され得る。
【０１５６】
水溶性のアルデヒド特異的な還元剤、例えば、アンモニアボランが特に、酸化多糖、例えば、アルギネートポリマー中に存在するアルデヒドを還元し、これらをアルコールに変換するのに有効であることが本発明の発明者により驚くことに発見された。したがって、水溶性のアルデヒド特異的な還元剤、例えば、アンモニアボランとの反応を介して酸化多糖をさらなる還元処理の対象とすることによって得られた還元多糖は、驚くほど低レベルの残留アルデヒドを含有する。一部の実施形態では、還元多糖は、２％未満の残留アルデヒド、例えば、１．５％未満、１％未満または０．５％未満の残留アルデヒドを含有する。他の実施形態では、還元多糖は、３％未満の残留アルデヒド、例えば、３％未満、２．５％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、または０．５％未満の残留アルデヒドを含有する。
【０１５７】
ヒドロゲルを調製するために使用される多糖、例えば、アルギネート中に低レベルのアルデヒドを有することが望ましい。なぜなら、アルデヒドは、タンパク質、および多糖の近くに存在する他の分子の損傷を引き起こし、これによって、ヒドロゲルの毒性を増加させる可能性があるからである。さらに、水溶性のアルデヒド特異的な還元剤の使用は特に有利である。なぜなら、これらの試薬は毒性副産物を生成せず、多糖物質のさらなる処理を必要としないからである。水溶性のアルデヒド特異的な還元剤、例えば、アンモニアボランはまた無毒性であり、および／または「グリーン試薬」であると考えられる。
【０１５８】
本発明はまた、高酸化多糖、例えば、高酸化アルギネートポリマーを利用する。これらの高度に荷電した酸化多糖は、酸化多糖よりも水に溶解性があり、これらの操作を簡単にする。高酸化多糖は２ステップで調製することができる。第１のステップは、多糖、例えば、アルギネートポリマーをジオール特異的な酸化剤と反応させて、アルデヒド含有酸化多糖、例えば、上に記載されているようなアルデヒド含有酸化アルギネートポリマーを生成することを含む。第２のステップは、アルデヒド含有酸化多糖のさらなる酸化処理により、高酸化多糖を生成することを含む。酸化多糖のさらなる酸化処理は、酸化多糖中に存在するアルデヒド部分を、カルボン酸部分に変換することを含む。したがって、本明細書で使用されている「高酸化多糖」という用語は、モノマーサブユニット１つ当たり少なくとも１つの、例えば、２つの追加のカルボン酸部分を含む多糖を含む。例えば、高酸化多糖は、開環したカルボン酸を含有するアルギネート、または以下の構造を有するアルゴキサラートであるモノマーサブユニットを含むことができる：
【化１３】
2019502652.tif 000014
【０１５９】
アルデヒド含有酸化多糖、例えば、アルギネートポリマーのさらなる酸化処理は、アルデヒド含有酸化多糖と、第２の酸化剤との反応を含む。本明細書に使用されている「第２の酸化剤」という用語は、アルデヒド部分をカルボン酸部分に特異的に変換し、これによって、高酸化多糖を生成する任意の酸化剤を指す。第２の酸化剤の非限定的例として、亜塩素酸ナトリウム；臭素；希硝酸（ＮＨＯ３）；酸化銀、例えば、トレンス試薬（［Ａｇ（ＮＨ３）２］＋またはＡｇＮＯ３）；銅（ＩＩ）錯体、例えば、フェーリング試薬（酒石酸銅（ＩＩ）溶液）、またはベネジクト液（クエン酸銅（ＩＩ）溶液）；過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）；および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が挙げられる。具体的な実施形態では、第２の酸化剤は亜塩素酸ナトリウムである。
【０１６０】
多糖の酸化モノマー単位の例示的な反応は、酸化アルギネート、すなわちスキーム１に例示された反応の生成物と、亜塩素酸ナトリウム、すなわち第２の酸化剤との反応であり、スキーム３に例示されている。
【化１４】
2019502652.tif 000015
【０１６１】
還元多糖、例えば、酸化多糖と、水溶性のアルデヒド特異的な還元剤（例えば、アンモニアボラン）との反応によって生成した還元多糖、例えば、アルゴキシノールを含む多糖など、ならびに高酸化多糖、例えば、酸化多糖と、第２の酸化剤との反応から生成した多糖、例えば、アルゴキサラートを含む多糖などの両方が、ヒドロゲルを調製するのに特に有用であることが驚くことに発見された。還元多糖および高酸化多糖から調製したヒドロゲル、例えば、還元アルギネートおよび高酸化アルギネートポリマーは、生分解性であり、ドラッグデリバリービヒクルとして有用である。
【０１６２】
一部の実施形態では、還元多糖および／または高酸化多糖、例えば、還元アルギネートおよび／または高酸化アルギネート、例えば、アルゴキシノールおよび／またはアルゴキサラートを含むアルギネートなどの溶解度は、未修飾のアルギネートの溶解度より高い。還元多糖および／または高酸化多糖などの多糖の溶解度は、％ｗ／ｖとして、またはｍｇ／ｍＬで表現することができ、ここでは、１％ｗ／ｖは１０ｍｇ／ｍＬの多糖と等しい。例えば、還元多糖および／または高酸化多糖の溶解度は、約１０〜２０％ｗ／ｖ、１５〜３０％ｗ／ｖ、２０〜４０％ｗ／ｖ、３０〜５０％ｗ／ｖ／、４０〜６５％ｗ／ｖ、５０〜７５％ｗ／ｖまたは６０〜９０％ｗ／ｖであり得る。例えば、本発明の還元多糖および／または高酸化多糖の溶解度は、約１０％ｗ／ｖ、約１５％ｗ／ｖ、約２０％、約２５％ｗ／ｖ、約３０％ｗ／ｖ、約３５％ｗ／ｖ、約４０％ｗ／ｖ、約４５％ｗ／ｖ、約５０％ｗ／ｖ、約５５％ｗ／ｖ、約６０％ｗ／ｖ、約６５％ｗ／ｖ、約７０％ｗ／ｖ、約７５％ｗ／ｖ、約８０％ｗ／ｖまたは約９０％ｗ／ｖであり得る。
【０１６３】
一部の実施形態では、本発明の多糖は生分解性である。例えば、酸化アルギネート、還元アルギネートおよび高酸化アルギネートは生分解性である。アルギネート、例えば、酸化アルギネート、還元アルギネートおよび高酸化アルギネートは、宿主の内因性酵素、例えば、ヒトに存在し得る内因性酵素による分解を起こしにくい。アルギネート、例えば、酸化アルギネート、還元アルギネートおよび高酸化アルギネートは、酸性またはアルカリ性条件に曝露された場合、化学的に分解され、例えば、加水分解され得る。酸性条件は６．５またはそれ未満のｐＨを含み、アルカリ性条件は８またはそれよりも高いｐＨを含む。
ＩＩ．クリック試薬にコンジュゲートした本発明の多糖
【０１６４】
本発明の還元多糖および高酸化多糖、例えば、アルギネートは、クリック試薬にコンジュゲートすることができる。「クリック化学反応試薬」という用語と交換可能なように本明細書で使用されている「クリック試薬」という用語は、穏やかな条件下、水溶液中でその対応するクリック試薬と急速におよび選択的に反応する（「クリック」）ことができる試薬である。穏やかな条件とは、低い反応物質濃度とともに、中性のｐＨ、水溶液および周辺温度を含む。例示的なクリックペア試薬は当業者には周知であり、これらに限定されないが、アジドおよびジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、テトラジンおよびトランスシクロオクテン、ならびにテトラジンおよびノルボルネンが挙げられ、構造が以下に例示されている。
【化１５】
2019502652.tif 000016
【０１６５】
一部の実施形態では、クリック試薬はテトラジン（Ｔｚ）である。本明細書で使用される「テトラジン」および「テトラジン部分」という用語は、ポリマーへ連結するための適切なスペーサーで置換されている（例えば、メチルアミンまたはペンチルアミンなどのアルキルアミン）、および任意選択で、任意の利用可能な位置で１つまたは複数の置換基でさらに置換されている１，２，４，５−テトラジンを含む分子を含む。本開示の組成物および方法に対して適切な例示的なテトラジン部分は、これらに限定されないが、以下に示す構造を含む（それぞれの全内容が本明細書によって参照により本明細書に組み込まれている、例えば、Ｋａｒｖｅｒら、（２０１１年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２２巻：２２６３〜２２７０頁、およびＷＯ２０１４／０６５８６０を参照されたい）：
【化１６】
2019502652.tif 000017
【０１６６】
テトラジンに対する対応試薬の１つはノルボルネン（Ｎｂ）である。本明細書で使用される「ノルボルネン」および「ノルボルネン部分」という用語は、これらに限定されないが、多糖に連結するための適切なスペーサーをさらに含み（例えば、メチルアミンまたはペンチルアミンなどのアルキルアミン）、および任意選択で任意の利用可能な位置で１つまたは複数の置換基でさらに置換されているノルボルナジエンおよびノルボルネン基を含む。このような部分は、例えば、ノルボルネン−５−メチルアミンおよびノルボルナジエンメチルアミンを含む。
【０１６７】
クリック試薬は通常、カルボキシル部分を介して多糖、例えば、アルギネートにコンジュゲートしている。図１ａに例示された１つの具体例では、クリック試薬は、アルギネート中のグルクロン酸に存在するカルボキシレート部分を介してアルギネートポリマーにコンジュゲートしていてもよい。したがって、１つのクリック分子は、未処理のアルギネート中のグルクロネートごとにコンジュゲートしていてもよい。過ヨウ素酸ナトリウムによるアルギネートの酸化後、グルクロネート１つ当たり２つのアルデヒドが生成される。各アルデヒド部分は、イミン結合を介してクリック試薬にコンジュゲートし得る（図１ｂ）。クリック試薬の酸化アルギネートへのこのコンジュゲーションは、コンジュゲーション後、カーゴへの毒性および損傷、ならびにクリック試薬の分解をもたらし得るアルギネートに残留する残留アルデヒドにより、最適とはならない（実施例１および３も参照されたい）。さらに、アルデヒドと、クリック試薬との間のイミン結合は簡単に加水分解可能であり、アルギネートからのクリック試薬の損失をもたらす。図１ｃにおいて示されている通り、酸化アルギネート中に存在するアルデヒドのさらなる酸化は、これらのアルデヒドをカルボン酸に変換し、これによって、クリックコンジュゲーションのために２つの追加の部位を提供する。
【０１６８】
ある特定の高酸化多糖、例えば、高酸化アルギネートポリマーは、これらがクリックコンジュゲーションに対して利用可能な追加の部位を含有するため、クリック試薬コンジュゲーションに対して酸化多糖よりも良い基質であることが驚くことに発見された。還元多糖、例えば、還元アルギネートは、これらがクリック試薬と反応して、これらの分解を引き起こす可能性のあるアルデヒドをより低量で含有するため、クリック試薬コンジュゲーションに対して酸化多糖より適切であることもまた発見された。
【０１６９】
一部の実施形態では、本発明の多糖、例えば、アルギネートへコンジュゲートしたクリック試薬はまた、その対応するクリック試薬と反応することができ、ひいては、これがある部分に付着し、これによって、この部分を多糖にコンジュゲートする。クリック試薬を使用して、任意の部分を本発明の多糖にコンジュゲートすることができる。このような部分の非限定的例として、有機小分子、小さな無機分子；サッカリン；単糖；二糖；三糖；オリゴ糖；多糖；ペプチド；タンパク質、ペプチド類似体、ペプチド誘導体；ペプチド模倣体；抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）；抗体の抗原結合性断片；核酸、例えば、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、マイクロＲＮＡ、プリマイクロＲＮＡ、ｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ（例えば、凝縮プラスミドＤＮＡ）、修飾ＲＮＡ、および核酸類似体または誘導体が挙げられる。一部の実施形態では、この部分は治療剤である。
【０１７０】
他の実施形態では、本発明の多糖、例えば、アルギネートにコンジュゲートしたクリック試薬は、以下に詳細に記載されているように架橋剤として機能することができる。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、本発明の多糖、例えば、アルギネートは、異なるクリックペアに属する２つまたはそれよりも多いクリック試薬にコンジュゲートし得る。例えば、本発明の多糖が、２つの異なるクリックペアに属する２つのクリック試薬にコンジュゲートしている一実施形態では、多糖にコンジュゲートしている第１のクリック試薬はアジド−ジベンゾシクロオクチン（アジド−ＤＢＣＯ）クリックペア由来のアジドであってよく、多糖にコンジュゲートしている第２のクリック試薬は、テトラジン−ノルボルネンクリックペア由来のテトラジンであってよい。このような多糖では、異なる機能に対して２つのクリック試薬を使用することができる。例えば、第１のクリック試薬は、ヒドロゲルを形成する多糖の架橋を促進するために機能することができ、第２の架橋試薬は、上に記載されているように、ある部分を多糖にコンジュゲートするために機能することができる。具体的な実施形態では、本発明の多糖が２つまたはそれよりも多いクリック試薬にコンジュゲートした場合、多糖にコンジュゲートしたクリック試薬は、架橋反応しない、すなわち、互いに反応せず、単にこれらのクリックペアと反応する。
ＩＩＩ．架橋剤にコンジュゲートした本発明の多糖
【０１７２】
本発明の還元多糖および高酸化多糖は、架橋剤にコンジュゲートしてもよい。架橋剤は、イオンにより、共有結合によりまたは物理的に酸化多糖に付着し得る。一実施形態では、架橋剤は、本発明の還元多糖、例えば、還元アルギネートポリマーに、共有結合または非共有結合により付着している。別の実施形態では、架橋剤は、本発明の高酸化多糖、例えば、高酸化アルギネートポリマーに、共有結合または非共有結合により付着している。
【０１７３】
本明細書で使用されている「架橋剤」という用語は、特定の位置、例えば、対象の細胞もしくは組織内側の位置への多糖の架橋を実行および促進することができるか、または多糖、例えば、アルギネートポリマーの架橋を促進することができる任意の薬剤である。ある特定の実施形態では、架橋剤は、例えば、共有結合を介して多糖に付着している。ある特定の実施形態では、架橋剤は、１つのポリマー鎖に単にカップリングし、ペンダント基として機能する。
【０１７４】
一部の実施形態では、架橋剤はクリック試薬である。本発明の多糖の架橋のために使用することができる例示的なペアのクリック試薬として、これらに限定されないが、上記に例示されているような構造を有する、アジドとジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、テトラジンとトランスシクロオクテン、およびテトラジンとノルボルネンが挙げられる。
【０１７５】
クリック試薬で修飾された本発明の還元多糖および／または高酸化多糖、例えば、クリック試薬にコンジュゲートしたアルギネートは、共有結合により架橋することによって、クリック架橋されたヒドロゲル、例えば、クリックアルギネートヒドロゲルを形成することができる。クリック化学反応を介したヒドロゲルの形成は、全内容が本明細書によって参照により本明細書に組み込まれている、Ｄｅｓａｉ  ら、（２０１５年）、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、５０巻：３０〜３７頁に記載されている。架橋反応は、高度に特異的であり、生体直交型であり、急速であり（例えば、Ｄｅｖａｒａｊら、（２００８年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１９巻（１２号）：２２９７〜２２９９頁；Ｋａｒｖｅｒら、（２０１１年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２２巻（１１号）：２２６３〜２２７０頁；およびＡｌｇｅら、（２０１３年）、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌ．、１４巻（４号）：９４９〜９５３頁を参照されたい）、高い封入後生存率で細胞の組込みを可能にすることが他者により以前に示されている。
【０１７６】
例えば、本発明のクリックコンジュゲート多糖、例えば、アルゴキシノールおよび／またはアルゴキサラートを含む、クリックコンジュゲートしたアルギネートからヒドロゲルを生成するために、クリックペアの１つのメンバー、例えば、Ｎｂにコンジュゲートした多糖は、クリックペアの第２のメンバー、例えば、Ｔｚにコンジュゲートした多糖と混合し、穏やかな条件下でインキュベートすることによって、ヒドロゲルを生成することができる。このようなヒドロゲルの特性、例えば、ヒドロゲルの剛性、ゲル化までの時間、またはヒドロゲルの平均細孔サイズは、多糖のクリックコンジュゲーション度；多糖酸化度、すなわち、多糖中に存在する％残留アルデヒド；およびヒドロゲル形成中のクリックコンジュゲート多糖の濃度、例えば、ヒドロゲル形成直前に溶液中に存在するアルギネート物質の％ｗ／ｖ／を含む異なるいくつかのパラメーターにより調整することができる。
【０１７７】
「置換度」または「ＤＳ」という用語と交換可能なように使用することができる「クリックコンジュゲーション度」という用語は、多糖の１モノマー単位当たりのクリック試薬の平均数、例えば、アルギネート中の１モノマー単位当たりのクリック試薬の平均数を指す。クリック置換度は、クリックコンジュゲーション反応物中のアルギネートモノマーのモルに対する、クリック試薬のモル当量の数を変えることによって変化させることができる。例えば、クリックコンジュゲーション反応物は、約１〜約５０００のクリック試薬のモル当量、例えば、約１、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１２００、約１５００、約１８００、約２０００、約２２００、約２５００、約２８００、約３０００、約３２００、約３５００、約４０００、約４２００、約４５００または約５０００のクリック試薬のモル当量を含み得る。列挙された値の中間の範囲もまた本発明の一部であることが意図されている。例えば、クリックコンジュゲーション反応物は、約１〜約５０、約１０〜約１００、約１５０〜約２５０、約２００〜約５００、約４００〜約８００、約７００〜約１０００、約１２００〜約１６００、約１５００〜約２０００、約１８００〜約３５００または約３２００〜約５０００のクリック試薬のモル当量を含み得る。
【０１７８】
一部の実施形態では、クリック試薬にコンジュゲートした本発明の多糖は、約０．０１％〜約１００％、例えば、約０．０１％〜約０．５％、約０．１％〜約５％、約１％〜約１０％、約５％〜約１５％、約１０％〜約２０％、約１５％〜約２５％、約２０％〜約３５％、約３０％〜約４０％、約３５％〜約５０％、約４０％〜約６０％、約５０％〜約７５％、約７０％〜約９０％または約８５％〜約１００％であるクリック置換度を含む。例えば、クリック試薬にコンジュゲートした本発明の多糖は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約１００％であり得る。
【０１７９】
一部の実施形態では、ヒドロゲル形成中のクリックコンジュゲート多糖の濃度、例えば、ヒドロゲルの形成直前に溶液中に存在するアルギネート物質の濃度は、約０．０１％〜約５０％ｗ／ｖ、例えば、約０．０１％〜約１０％ｗ／ｖ、約０．１％〜約５％ｗ／ｖ、約１％〜約１５％ｗ／ｖ、約１０％〜約３０％ｗ／ｖ、約１２％〜約３５％ｗ／ｖ、約１５％〜約２５％ｗ／ｖ、約２０％〜約４５％ｗ／ｖまたは約３５％〜約５０％ｗ／ｖであってよい。例えば、ヒドロゲルの形成の直前の溶液中に存在するアルギネート物質の濃度は、約０．０１％、約０．０５％、約１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％または約５０％であり得る。
【０１８０】
ヒドロゲルの剛性は、クリック置換度に依存することができ、弾性率（または貯蔵弾性率）Ｇ’を測定することにより決定することができる。例えば、本発明のヒドロゲルのＧ’は、１Ｈｚにおける１％歪みで測定した場合、約０〜約４００００Ｐａ、例えば、約０〜約１００Ｐａ、約５０〜約３００Ｐａ、約１００〜約４５０Ｐａ、約１３０〜約６００Ｐａ、約３００〜約４５０Ｐａ、約５００〜約９００Ｐａ、約６００〜約１５００Ｐａ、約１２００〜約２０００Ｐａまたは約１９００〜約４００００Ｐａで変動し得る。例えば、１Ｈｚにおける１％歪みで測定した場合の本発明のヒドロゲルのＧ’は、約１００Ｐａ、約２００Ｐａ、約５００Ｐａ、約１０００Ｐａ、約１５００Ｐａ、約２０００Ｐａ、約２２００Ｐａ、約２５００Ｐａまたは約３０００Ｐａであり得る。
【０１８１】
一部の実施形態では、架橋剤はペプチド、例えば、細胞接着剤ペプチドである。したがって、本発明の還元多糖および／または高酸化多糖、例えば、還元アルギネートポリマーおよび／または高酸化アルギネートポリマーは、細胞接着剤ペプチド、例えば、細胞外細胞マトリックス（ＥＣＭ）構成成分により修飾され得る。細胞接着剤ペプチドは、例えば、アミノ酸配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）を含むことができる。例として、アミノ酸配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−システイン（ＲＧＤＣ）（配列番号１）およびアルギニン−グリシン−アスパラギン酸−セリン（ＲＧＤＳ）（配列番号２）が挙げられる。他の例では、細胞接着剤ペプチドは、リシン−グルタミン−アラニン−グリシン−アスパラギン酸−バリン（ＫＱＡＧＤＶ）（配列番号３）またはバリン−アラニン−プロリン−グリシン（ＶＡＰＧ）（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の例では、細胞接着剤ペプチドはＣＧＧＧＧＲＧＤＳＰ（配列番号５）である。他の細胞接着剤ペプチドは、所望の用途に基づき使用することができ、当業者には明らかである。
【０１８２】
場合によっては、細胞接着剤ペプチドは、チオール−エン反応を介して、例えば、チオール−エン光化学反応を介して還元多糖および／または高酸化多糖に共有結合で連結している。例えば、細胞接着剤ペプチドは、ヒドロゲルを形成するための多糖の架橋の前後に、多糖（例えば、アルギネートポリマー）へ共有結合により連結することができる。細胞接着剤ペプチドを多糖に共有結合で連結させるためのチオール−エン反応のこのような使用は、以前に開示された方法、例えば、ペプチドをポリマーにカップリングさせるためのカルボキシル活性化剤（例えば、ＥＤＣ）を使用する方法などよりも有意に速く、効率的である。
ＩＶ．本発明のヒドロゲル
【０１８３】
本明細書に記載の還元多糖および／または高酸化多糖は、治療用の用途のためのヒドロゲルを調製するために使用することができる。還元多糖および／または高酸化多糖、例えば、還元アルギネートおよび／または高酸化アルギネートから調製したヒドロゲルは、酸化多糖、例えば、酸化アルギネートから調製したヒドロゲルと比較して、生分解性であり、無毒性である。一部の実施形態では、本発明の還元多糖および／または高酸化多糖を使用して調製したヒドロゲルが細胞を封入する場合、酸化多糖から調製したヒドロゲルと比較して、より少ない細胞毒性が観察されている。治療剤、例えば、タンパク質を封入するために使用される本発明の還元多糖および／または高酸化多糖からヒドロゲルが生成される他の実施形態では、酸化多糖から調製したヒドロゲルと比較してより少ないタンパク質損傷が観察されている。本発明の還元多糖および／または高酸化多糖から生成されるヒドロゲルが、脂質ベースのナノ粒子、例えば、リポソームまたはビロソームを封入するために使用される実施形態では、脂質ベースのナノ粒子は宿主内の所望の位置にインタクトで送達される。
【０１８４】
本発明のヒドロゲルは、本発明のヒドロゲルにより封入される治療用または診断用薬剤を含む剤形を調製するために使用することができる。本発明のヒドロゲルはまた、治療用または診断用薬剤を含み得る埋め込み型デバイスを調製するために使用することができる。本発明のヒドロゲルは、治療用または診断用薬剤を封入している脂質ベースのナノ粒子、例えば、リポソームまたはビロソームと、前記脂質ベースのナノ粒子を封入している、本発明のヒドロゲルとを含む、ドラッグデリバリー組成物を調製するためにも使用することができる。
【０１８５】
本発明の還元多糖および／または高酸化多糖は、細孔の平均直径として測定された平均メッシュサイズが比較的幅広い範囲にわたり変動するヒドロゲルを調製するのに有用であることが現在発見された。例えば、本発明の還元多糖および／または高酸化多糖を使用して調製されたヒドロゲルは、約０．５ｎｍ〜約５００ｎｍ、例えば、約０．５ｎｍ〜約１ｎｍ、約０．５ｎｍ〜約５ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約２００ｎｍ〜約３５０ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約４００ｎｍまたは約３５０ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する細孔を有する。一部の実施形態では、本発明のヒドロゲルは、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍまたは約５００ｎｍの平均直径を有する細孔を有し得る。列挙された値の中間の範囲もまた本発明の一部であることが意図されている。
【０１８６】
１つの例では、本発明のヒドロゲルは、驚くほど小さな平均細孔サイズ、例えば、約１０ｎｍまたはそれ未満の平均直径を有する。一部の実施形態では、本発明のヒドロゲルの細孔の直径は、約１０．００ｎｍまたはそれ未満、約９．５ｎｍまたはそれ未満、約９．０ｎｍまたはそれ未満、約８．５ｎｍまたはそれ未満、約８．０ｎｍまたはそれ未満、約７．５ｎｍまたはそれ未満、約７．０ｎｍまたはそれ未満、約６．５ｎｍまたはそれ未満、約６．０ｎｍまたはそれ未満、約５．５ｎｍまたはそれ未満、約５．０ｎｍまたはそれ未満、約４．５ｎｍまたはそれ未満、約４．０ｎｍまたはそれ未満、約３．５ｎｍまたはそれ未満、約３．０ｎｍまたはそれ未満、約２．５ｎｍまたはそれ未満、約２．０ｎｍまたはそれ未満、約１．５ｎｍまたはそれ未満または約１ｎｍまたはそれ未満である。例えば、本発明のヒドロゲルは、約１０ｎｍ〜約１ｎｍ、約１０ｎｍ〜約４ｎｍ、約７ｎｍ〜約３ｎｍ、約５ｎｍ〜約１ｎｍ、約４ｎｍ〜約２ｎｍまたは約３ｎｍ〜約０．５ｎｍの平均直径を有する細孔を含み得る。列挙された値の中間の範囲もまた本発明の一部であることが意図されている。
【０１８７】
したがって、本発明のヒドロゲルは、治療用もしくは診断用薬剤を封入するため、または小さな分子量の脂質ベースのナノ粒子、例えば、治療用もしくは診断用薬剤を含むリポソームもしくはビロソームを封入するために使用することができる。例えば、本発明のヒドロゲルを使用して、治療用もしくは診断用薬剤、あるいは治療用もしくは診断用薬剤、例えば、１０００ｋＤａまたはそれ未満、例えば、９５０ｋＤａまたはそれ未満、９００ｋＤａまたはそれ未満、８５０ｋＤａまたはそれ未満、８００ｋＤａまたはそれ未満、７５０ｋＤａまたはそれ未満、７００ｋＤａまたはそれ未満、６５０ｋＤａまたはそれ未満、６００ｋＤａまたはそれ未満、５５０ｋＤａまたはそれ未満、５００ｋＤａまたはそれ未満、４５０ｋＤａまたはそれ未満、４００ｋＤａまたはそれ未満、３５０ｋＤａまたはそれ未満、３００ｋＤａまたはそれ未満、２５０ｋＤａまたはそれ未満、２００ｋＤａまたはそれ未満、１５０ｋＤａまたはそれ未満、１００ｋＤａまたはそれ未満、９０ｋＤａまたはそれ未満、８０ｋＤａまたはそれ未満、７０ｋＤａまたはそれ未満、６０ｋＤａまたはそれ未満、５０ｋＤａまたはそれ未満、４０ｋＤａまたはそれ未満、３０ｋＤａまたはそれ未満、２０ｋＤａまたはそれ未満、１０ｋＤａまたはそれ未満、８ｋＤａまたはそれ未満、６ｋＤａまたはそれ未満、４ｋＤａまたはそれ未満、２ｋＤａまたはそれ未満、１ｋＤａまたはそれ未満、０．８ｋＤａまたはそれ未満、０．６ｋＤａまたはそれ未満、０．４ｋＤａまたはそれ未満、０．２ｋＤａまたはそれ未満または０．１ｋＤａまたはそれ未満の分子量を有するポリペプチドを封入する脂質ベースのナノ粒子、例えば、リポソームもしくはビロソームを封入することができる。
【０１８８】
一部の実施形態では、本発明のヒドロゲルにより、または本発明のヒドロゲルにより封入された脂質ベースのナノ粒子、例えば、リポソームもしくはビロソームにより封入され得る治療用もしくは診断用薬剤は、ヒドロゲルの細孔が治療剤のサイズと比較して十分に小さいことから、ヒドロゲルの細孔を介して拡散しない。したがって、ヒドロゲルからの治療剤の放出は、対象内でのヒドロゲルの生分解により徐々に生じる。これは、対象、例えば、ヒトにおいて、治療用もしくは診断用薬剤、または治療用もしくは診断用薬剤を封入している脂質ベースのナノ粒子、例えば、リポソームもしくはビロソームの持続放出を提供する。
【０１８９】
本明細書で使用される場合、本発明のヒドロゲルにより封入された「治療用または診断用薬剤」という用語は、それを必要とする対象において、障害を処置、予防または診断するために使用することができる任意の薬剤を含む。治療用または診断用薬剤は、細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）など、小分子または生物製剤などであってよい。生物製剤は、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、抗体またはワクチンであってよい。例示的な治療用薬剤として、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １３ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅｄｓ．  Ｔ．Ｒ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎら、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｎ．Ｙ．，  ＮＹ；  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ５０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９７，  Ｏｒａｄｅｌｌ  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．；  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，  １９９０；  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，  ＵＳＰ  ＸＩＩ  ＮＦ  ＸＶＩＩ，  １９９０；  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｏｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（これらの全ての全内容が参考として本明細書に援用される）に見出されるものが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９０】
一部の実施形態では、本発明のヒドロゲルにより、または本発明のヒドロゲルで封入される脂質ベースのナノ粒子、例えば、リポソームもしくはビロソームにより封入される治療用もしくは診断用薬剤は、有機小分子、小さな無機分子；サッカリン；単糖；二糖；三糖；オリゴ糖；多糖；ペプチド；タンパク質；ペプチド類似体；ペプチド誘導体；ペプチド模倣体；抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）；抗体の抗原結合性断片；核酸、例えば、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、マイクロＲＮＡ、プリマイクロＲＮＡ、ｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ（例えば、凝縮プラスミドＤＮＡ）、修飾ＲＮＡ、核酸類似体または誘導体；生物学的物質、例えば、細菌、植物、真菌、または動物細胞などから作製される抽出物；動物組織；天然に存在する組成物または合成組成物；およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される化合物を含むことができる。核酸は、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドを含み得る。ペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数の非天然アミノ酸を含み得る。
【０１９１】
本明細書で使用される「小分子」という用語は、「天然産物のような」化合物を指すことができ、しかし、「小分子」という用語は「天然産物のような」化合物に限定されない。むしろ、小分子は通常、これがいくつかの炭素−炭素結合を含有し、５０００ダルトン未満（５ｋＤ）、好ましくは３ｋＤ未満、さらにより好ましくは２ｋＤ未満、および最も好ましくは１ｋＤ未満の分子量を有することにより特徴付けられる。場合によっては、小分子が７００ダルトンと等しいまたはそれ未満の分子質量を有することが好ましい。
【０１９２】
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、その最も広範な意味で使用することによって、ペプチドの所望の機能活性を依然として保持しながら、アミノ酸、アミノ酸同等物もしくは他の非アミノ基を含有する化合物を指す。ペプチド同等物は、１つまたは複数のアミノ酸を関連有機酸（例えば、ＰＡＢＡなど）、アミノ酸などと置き換えること、または側鎖もしくは官能基の置換もしくは修飾によって従来のペプチドと異なり得る。ペプチドは直鎖のまたは環式であることができる。ペプチドは、Ｄ−アミノ酸、ベータ−アミノ酸、化学的に修飾されたアミノ酸、天然に存在する非タンパク新生アミノ酸、稀なアミノ酸、およびアミノ酸の特徴であることが当技術分野で公知の特性を有する化学合成化合物の１つまたは複数を含むように修飾することができる。
【０１９３】
本明細書で使用されている「核酸」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、その類似体または誘導体を含めた、共有結合により一緒に連結した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。例示的なオリゴヌクレオチドとして、これらに限定されないが、一本鎖および二本鎖のｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡ妨害試薬（ＲＮＡｉ薬剤またはｉＲＮＡ薬剤）、ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピン型ＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。核酸は、一本鎖または二重鎖であることができる。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドであることができ、核酸は、デオキシリボ−とリボヌクレオチドの任意の組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンの任意の組合せを含有する。ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｉｓＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなる群から選択され得る。
【０１９４】
核酸はまた、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドを含み得る。例えば、核酸は、当技術分野で公知の１つまたは複数の核酸修飾を含むことができる。例えば、核酸は、１つまたは複数の骨格修飾、例えば、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４９巻（１０号）：１９２５頁（１９９３年）およびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、３５巻：３８００頁（１９７０年））、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホラミダイト（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）連結（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）、またはペプチド核酸連結（全内容が本明細書中に参照により組み込まれている、Ｅｇｈｏｌｍ，  Ｊ．  Ａｍ．、Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１１４巻：１８９５頁（１９９２年）；Ｍｅｉｅｒら、Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、３１巻：１００８頁（１９９２年）；およびＮｉｅｌｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５巻：５６６頁（１９９３年）を参照されたい）を含むことができる。核酸はまた、ヌクレオチドの核酸塩基および／または糖部分に対する修飾を含むことができる。糖部分での例示的な糖修飾は、ハロゲンを有する２’−ＯＨ（例えば、フルオロ）、Ｏ−メチル（ｍｅｈｔｙｌ）、Ｏ−メトキシエチル、ＮＨ２、ＳＨおよびＳ−メチルの置換を含む。
【０１９５】
一部の実施形態では、「治療用または診断用薬剤」という用語は、生物学的物質、例えば、細胞外マトリクス物質、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｏｎ）およびラミニンなど；サイトカイン；増殖因子；分化因子、核酸；タンパク質；ペプチド；抗体もしくはその断片もしくはその抗原結合部分、または細胞を含む。
【０１９６】
本発明のヒドロゲルに組み込むことができる適切な増殖因子およびサイトカインとして、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、間質細胞由来の因子−１、スチール因子、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｅｉｔｉｎｓ）（Ａｎｇ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ｂＦＧＦ、ＨＮＦ、ＮＧＦ、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｅ）増殖因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、およびＩＬ−１３、コロニー−刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、フィット３−リガンド、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）が挙げられるが、これらに限定されない。他の例は、Ｄｉｊｋｅら、「Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ」，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ７：７９３−７９８  （１９８９）；  Ｍｕｌｄｅｒ  ＧＤ，  Ｈａｂｅｒｅｒ  ＰＡ，  Ｊｅｔｅｒ  ＫＦ，  ｅｄｓ．  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ’  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ．  ４ｔｈ  ｅｄ．  Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ，  ＰＡ：  Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；  １９９８：８５；  Ｚｉｅｇｌｅｒ  Ｔ．Ｒ．，  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｇ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｈｅｒｎｄｏｎ，  Ｄ．Ｎ．，  １９９７，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ：  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｂｏｓｔｏｎ，  １９９５，  Ｓｅｒｏｎｏ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ＵＳＡ），  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇに記載される。
【０１９７】
本発明のヒドロゲルに組み込むことができる、または本発明のヒドロゲルにより封入される脂質ベースのナノ粒子、例えば、リポソームもしくはビロソームに組み込むことができる治療用または診断用薬剤の例として、これらに限定されないが、麻薬鎮痛薬；金の塩；コルチコステロイド；ホルモン；抗マラリア薬；インドール誘導体；関節炎処置に対する医薬品；テトラサイクリン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびオーレオマイシンを含めた抗生剤；家畜および大型ウシに適用される、抗寄生虫様薬物およびイヌジステンパー薬、例えば、フェノチアジン；硫黄に基づく薬物、例えば、スルフイソキサゾール（ｓｕｌｆｉｏｘａｚｏｌｅ）；抗腫瘍薬；中毒を管理する医薬品、例えば、アルコール依存症を制御する薬剤およびタバコ中毒を制御する薬剤；薬物中毒のアンタゴニスト、例えば、メサドンなど；重量制御薬；甲状腺を制御する薬物；鎮痛剤；受精または避妊ホルモンを制御する薬物；アンフェタミン；抗高血圧薬；抗炎症剤；鎮咳剤；鎮静剤；神経筋の弛緩薬；抗てんかん薬；抗うつ剤；抗不整脈薬；血管拡張性薬；抗高血圧利尿剤；抗糖尿病剤；抗凝血剤；抗結核剤；抗精神病剤；ホルモンおよびペプチドが挙げられる。上記リストは全部ではなく、組成物中に含まれていてもよい治療剤の幅広い多様性を表すのみであることが理解されている。一部の実施形態では、治療剤はミトキサントロン、ペプチド、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体の抗原結合性断片、タンパク質（例えばＶＥＧＦ）またはプラスミドＤＮＡである。
【０１９８】
当業者であれば、本発明のヒドロゲル、または本発明のヒドロゲルにより封入される脂質ベースのナノ粒子、例えば、リポソームもしくはビロソームに組み込むことができる多くの他の治療用または診断用薬剤を認識している。例として、放射線増感剤、ステロイド、キサンチン、ベータ−２−アゴニスト気管支拡張剤、抗炎症剤、鎮痛剤、カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシン−変換酵素阻害剤、β受容体遮断剤、中枢活性のあるアルファ−アゴニスト，アルファ−１−アンタゴニスト、抗コリン剤／鎮痙剤、バゾプレシン類似体、抗不整脈剤、抗パーキンソン剤、抗狭心症剤／血圧降下剤、抗凝血剤、抗血小板剤、鎮静剤、抗不安剤、ペプチド剤、バイオポリマー剤、抗腫瘍剤、下剤、下痢止剤、抗菌剤、抗真菌剤、ワクチン、タンパク質、または核酸が挙げられる。さらなる態様では、薬学的活性のある薬剤は、クマリン、アルブミン、ステロイド、例えば、ベタメタゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、ヒドロコルチゾンなど、および薬学的に許容されるヒドロコルチゾン誘導体；キサンチン、例えば、テオフィリンおよびドキソフィリンなど；ベータ−２−アゴニスト気管支拡張剤、例えば、サルブタモール、フェノテロール（ｆｅｎｔｅｒｏｌ）、クレンブテロール、バンブテロール、サルメテロール、フェノテロール；抗喘息抗炎症剤、抗関節炎抗炎症剤、および非ステロイド性抗炎症剤を含む抗炎症剤、例として、これらに限定されないが、スルフィド、メサラミン、ブデソニド、サラゾピリン、ジクロフェナク、薬学的に許容されるジクロフェナク塩、ニメスリド、ナプロキセン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ケトプロフェンおよびピロキシカムが挙げられる；鎮痛剤、例えば、サリチル酸塩など；カルシウムチャネル遮断剤、例えば、ニフェジピン、アムロジピン、およびニカルジピンなど；アンジオテンシン変換酵素阻害剤、例えば、カプトプリル、ベナゼプリル塩酸塩、ホシノプリルナトリウム、トランドラプリル、ラミプリル、リシノプリル、エナラプリル、キナプリル塩酸塩、およびモエキシプリル塩酸塩など；β受容体遮断剤（すなわち、ベータアドレナリン作動性遮断剤）例えば、ソタロール塩酸塩、チモロールマレイン酸塩、エスモロール塩酸塩、カルテオロール、プロパノロール塩酸塩、ベタキソロール塩酸塩、ペンブトロール硫酸塩、メトプロロール酒石酸塩、メトプロロールコハク酸塩、アセブトロール塩酸塩、アテノロール、ピンドロール、およびビソプロロールフマル酸塩など；中枢活性のあるアルファ−２−アゴニスト、例えば、クロニジンなど；アルファ−１−アンタゴニスト、例えば、ドキサゾシンおよびプラゾシンなど；抗コリン剤／鎮痙剤、例えば、ジサイクロミン塩酸塩、スコポラミン臭化水素酸塩、グリコピロレート、臭化クリジニウム、フラボキセート、およびオキシブチニンなど；バゾプレシン類似体、例えば、バゾプレシンおよびデスモプレシンなど；抗不整脈剤、例えば、キニジン、リドカイン、トカイニド塩酸塩、メキシレチン塩酸塩、ジゴキシン，ベラパミル塩酸塩、プロパフェノン塩酸塩、フレカイニド酢酸塩、プロカインアミド塩酸塩、モリシジン塩酸塩��およびジソピラミドリン酸塩；抗パーキンソン剤、例えば、ドーパミン、Ｌ−ドパ／カルビドパ、セレギリン、ジヒドロエルゴクリプチン、ペルゴリド、リスリド、アポモルフィン、およびブロモクリプチン；抗狭心症剤および血圧降下剤、例えば、一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、プロプラノロール、アテノロールおよびベラパミルなど；抗凝血剤および抗血小板剤、例えば、Ｃｏｕｍａｄｉｎ、ワルファリン、アセチルサリチル酸、およびチクロピジンなど；鎮静剤、例えば、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚａｐｉｎｅ）およびバルビツレートなど；抗不安剤、例えば、ロラゼパム、ブロマゼパム、およびジアゼパムなど；ペプチド剤およびバイオポリマー剤、例えば、カルシトニン、ロイプロリドおよび他のＬＨＲＨアゴニスト、ヒルジン、シクロスポリン、インスリン、ソマトスタチン、プロチレリン、インターフェロン、デスモプレシン、ソマトトロピン、チモペンチン、ピドチモド、エリスロポエチン、インターロイキン、メラトニン、顆粒球／マクロファージ−ＣＳＦ、およびヘパリン；抗悪性腫瘍剤、例えば、エトポシド、エトポシドリン酸塩、シクロホスファミド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シスプラチン、ヒドロキシウレア、ロイコボリンカルシウム、タモキシフェン、フルタミド、アスパラギナーゼ、アルトレタミン、ミトタン、およびプロカルバジン塩酸塩；下剤、例えば、センナ濃縮物、カサンスラノール、ビサコジル、およびピコスルフェートナトリウム；下痢止剤、例えば、ジフェノキシン塩酸塩、ロペラミド塩酸塩、フラゾリドン、ジフェノキシレート塩酸塩（ｈｄｙｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、および微生物など；ワクチン、例えば、細菌性およびウイルス性ワクチンなど；抗菌剤、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、およびマクロライドなど；抗真菌剤、例えば、イミダゾール誘導体およびトリアゾール誘導体など；ならびに核酸、例えば、生物学的タンパク質をコードするＤＮＡ配列、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどであってよい。
【０１９９】
抗がん剤として、アルキル化剤、白金薬剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍抗生剤、抗有糸分裂剤、アロマターゼ阻害剤、チミジル酸シンターゼ阻害剤、ＤＮＡアンタゴニスト、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ポンプで送り込む阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、リボヌクレオシド還元酵素阻害剤、ＴＮＦアルファアゴニスト／アンタゴニスト、エンドセリンＡ受容体アンタゴニスト、レチノイン酸受容体アゴニスト、免疫調整剤、ホルモン剤および抗ホルモン剤、光力学的薬剤、およびチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。
【０２００】
抗生剤として、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、アミカシン、ネオマイシン）、バシトラシン、コルバペネム（例えば、イミペネム／シスラスタチン）、セファロスポリン、コリスチン、メテナミン、モノバクタム（例えば、アズトレオナム）、ペニシリン（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナトシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、メズロシリン、アズロシリン）、ポリミキシンＢ、キノロン、およびバンコマイシン；ならびに静菌剤、例えば、クロラムフェニコール、クリンダニアン、マクロライド（例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン）、リンコミアン、ニトロフラントイン、スルホンアミド、テトラサイクリン（例えば、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、デメクロサイクリン（ｄｅｍｅｃｌｏｃｙｌｉｎｅ））、およびトリメトプリムが挙げられる。メトロニダゾール、フルオロキノロン、およびリタンピンもまた挙げられる。
【０２０１】
酵素阻害剤は、酵素反応を阻害する物質である。酵素阻害剤の例として、エドロホニウムクロリド、Ｎ−メチルフィゾスチグミン、ネオスチグミンブロミド、フィゾスチグミン硫酸塩、タクリン、タクリン、１−ヒドロキシマレエート、ヨードツベルシジン、ｐ−ブロモテトラミソール、１０−（アルファ−ジエチルアミノプロピオニル）−フェノチアジン塩酸塩、カルミダゾリウムクロリド、ヘミコリニウム−３，３，５−ジニトロカテコール、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤Ｉ、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤ＩＩ、３−フェニルプロパルギルアミン、Ｎ−モノメチル−Ｌアルギニンアセテート、カルビドパ、３−ヒドロキシベンジルヒドラジン、ヒドララジン、クロルギリン、デプレニル、ヒドロキシルアミン、イプロニアジドリン酸塩、６−ＭｅＯ−テトラヒドロ−９Ｈ−ピリド−インドール、ニアラミド、パルギリン、キナクリン、セミカルバジド、トラニルシプロミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル−２，２−ジフェニルバレレート塩酸塩、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｎｅ）、パパベリン、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎｄ）、２−シクロオクチル−２−ヒドロキシエチルアミン塩酸塩、２，３−ジクロロ−ａ−メチルベンジルアミン（ＤＣＭＢ）、８，９−ジクロロ−２，３，４、５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンズアゼピン塩酸塩、ｐ−アミノグルテチミド、ｐ−アミノグルテチミド酒石酸塩、３−ヨードチロシン、アルファ−メチルチロシン、アセタゾラミド、ジクロルフェナミド、６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾールスルホンアミド、およびアロプリノールが挙げられる。
【０２０２】
抗ヒスタミン剤として、中でもピリラミン、クロルフェニラミン、およびテトラヒドロゾリン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｚｏｌｉｎｅ）が挙げられる。
【０２０３】
抗炎症剤として、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、アスピリン、フェニルブタゾン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イブプロフェン、ピロキシカム、およびフェナム酸）、アセトアミノフェン、フェナセチン、金塩、クロロキン、Ｄ−ペニシラミン、メトトレキセートコルヒチン、アロプリノール、プロベネシド、およびスルフィンピラゾンが挙げられる。
【０２０４】
筋弛緩剤として、メフェネシン、メトカルバモール（ｍｅｔｈｏｃａｒｂｏｍａｌ）、シクロベンザプリン塩酸塩、トリヘキシフェニジル（ｔｒｉｈｅｘｙｌｐｈｅｎｉｄｙｌ）塩酸塩、レボドパ／カルビドパ、およびビペリデンが挙げられる。
【０２０５】
抗痙攣剤として、アトロピン、スコポラミン、オキシフェノニウム、およびパパベリンが挙げられる。
【０２０６】
鎮痛剤として、アスピリン、フェニルブタゾン、インドメタシン（ｉｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）、スリンダク、トルメチク、イブプロフェン、ピロキシカム、フェナメート、アセトアミノフェン、フェナセチン、モルヒネ硫酸塩、コデイン硫酸塩、メペリジン、ナロルフィン、オピオイド（例えば、コデイン硫酸塩、フェンタニルクエン酸塩、ヒドロコドン酒石酸水素塩、ロペラミド、モルヒネ硫酸塩、ノスカピン、ノルコデイン、ノルモルヒネ、テバイン、ノルビナルトルフィミン、ブプレノルフィン、クロルナルトレキサミン（ｃｈｌｏｍａｌｔｒｅｘａｍｉｎｅ）、フナルトレキサミン（ｆｕｎａｌｔｒｅｘａｍｉｏｎｅ）、ナルブフィン、ナロルフィン、ナロキソン、ナロキソナジン、ナルトレキソン、およびナルトリンドール）、プロカイン、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎ）、テトラカインおよびジブカインが挙げられる。
【０２０７】
眼用薬剤として、フルオレセインナトリウム、ローズベンガル、メタコリン、アドレナリン、コカイン、アトロピン、アルファ−キモトリプシン、ヒアルロニダーゼ、ベタキサロール、ピロカルピン、チモロール、チモロール塩、およびこれらの組合せが挙げられる。
【０２０８】
プロスタグランジンは、当技術分野では認識されており、様々な生物学的作用を有する天然に存在する、化学的に関連した、１つのクラスの長鎖ヒドロキシ脂肪酸である。
【０２０９】
抗うつ剤は、うつ病を予防または和らげることが可能な物質である。抗うつ剤の例として、イミプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、デシプラミン、アモキサピン、ドキセピン、マプロチリン、トラニルシプロミン、フェネルジン、およびイソカルボキサジドが挙げられる。
【０２１０】
栄養因子は、その継続的存在が細胞の生存率または寿命を改善する因子である。栄養因子として、制限なしで、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＰ）、好中球活性化タンパク質、単球化学誘引物質タンパク質、マクロファージ炎症性タンパク質、血小板因子、血小板塩基性タンパク質、および黒色腫成長刺激活性；上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（アルファ）、線維芽細胞増殖因子、血小板由来の内皮細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、神経膠由来の増殖神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子、神経増殖因子、骨成長／軟骨誘発因子（アルファおよびベータ）、骨形態形成タンパク質、インターロイキン（例えば、インターロイキン阻害剤またはインターロイキン受容体、インターロイキン１からインターロイキン１０を含む）、インターフェロン（例えば、インターフェロンアルファ、ベータおよびガンマ）、造血因子、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含む；腫瘍壊死因子、およびトランスフォーミング増殖因子（ベータ）（ベータ−１、ベータ−２、ベータ−３、インヒビン、およびアクチビンを含む）が挙げられる。
【０２１１】
ホルモンとして、エストロゲン（例えば、エストラジオール、エストロン、エストリオール、ジエチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｂｅｓｔｒｏｌ）、キネストロール、クロロトリアニセン、エチニルエストラジオール、メストラノール）、抗エストロゲン（例えば、クロミフェン、タモキシフェン）、プロゲスチン（例えば、メドロキシプロゲステロン、ノルエチンドロン、ヒドロキシプロゲステロン、ノルゲストレル）、抗黄体ホルモン（ミフェプリストーン）、アンドロゲン（例えば、シピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン、ダナゾール、テストラクトン）、抗アンドロゲン（例えば、酢酸シプロテロン、フルタミド）、甲状腺ホルモン（例えば、トリヨードチロニン（ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｎｅ）、チロキシン、プロピルチオウラシル、メチマゾール、およびヨージキソド（ｉｏｄｉｘｏｄｅ））、および下垂体ホルモン（例えば、コルチコトロピン、ソマトトロピン（ｓｕｍｕｔｏｔｒｏｐｉｎ）、オキシトシン、およびバゾプレシン）が挙げられる。ホルモンは、ホルモン補充療法および／または避妊目的で一般的に利用される。プレドニゾンなどのステロイドホルモンは、免疫抑制剤および抗炎症剤としても使用される。
【０２１２】
治療用または診断用薬剤は、骨原性タンパク質であることができる。したがって、一部の実施形態では、治療用または診断用薬剤は、タンパク質のトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーとして公知のタンパク質のファミリーから選択され、これには、アクチビン、インヒビンおよび骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれる。最も好ましくは、活性剤は、骨原性活性、および他の成長および分化タイプの活性を有することが開示されたＢＭＰとして一般的に公知の、サブクラスのタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む。これらのＢＭＰには、ＢＭＰタンパク質が含まれ、例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７は、米国特許第５，１０８，９２２号；同第５，０１３，６４９号；同第５，１１６，７３８号；同第５，１０６，７４８号；同第５，１８７，０７６号；および同第５，１４１，９０５号に開示され；ＢＭＰ−８は、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１８０９８に開示され；ＢＭＰ−９は、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２に開示され，ＢＭＰ−１０は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／２６８９３に開示され；ＢＭＰ−１１はＰＣＴ出願ＷＯ９４／２６８９２に開示され、またはＢＭＰ−１２またはＢＭＰ−１３は、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１６０３５に開示され；ＢＭＰ−１４；ＢＭＰ−１５は、米国特許第５，６３５，３７２号に開示され；またはＢＭＰ−１６は、米国特許第５，９６５，４０３号に開示される。使用することができる他のＴＧＦ−βタンパク質として、Ｖｇｒ−２（Ｊｏｎｅｓら、Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ６１１９６１（１９９２））ならびにＰＣＴ出願ＷＯ９４／１５９６５；ＷＯ９４／１５９４９；ＷＯ９５／０１８０１；ＷＯ９５／０１８０２；ＷＯ９４／２１６８１；ＷＯ９４／１５９６６；ＷＯ９５／１０５３９；ＷＯ９６／０１８４５；ＷＯ９６／０２５５９などに記載されるものを含む任意の成長および分化因子（ＧＤＦ）が挙げられる。ＢＩＰ（ＷＯ９４／０１５５７に開示）；ＨＰ００２６９（ＪＰ公開第７−２５０６８８号に開示）；およびＢＭＰ−１４（ＭＰ５２、ＣＤＭＰ１およびＧＤＦ５としても公知）（ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１６０９９に開示）も本発明において有用であり得る。上記の出願の全ての開示が参考として本明細書に援用される。使用することができるＢＭＰのサブセットとして、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７およびＢＭＰ１８が挙げられる。当技術分野で公知の他の骨原性薬剤、中でも、例えば、テリパラチド（ＦＯＲＴＥＯ（商標））、ＣＨＲＹＳＡＬＩＮ（登録商標）、プロスタグランジンＥ２、またはＬＩＭタンパク質なども使用することができる。
【０２１３】
治療用または診断用薬剤、例えば、タンパク質またはペプチドは、タンパク質組成物から、組み換え技術により生成、または精製することができる。活性剤は、例えば、ＢＭＰなどのＴＧＦ−β、または他のダイマータンパク質である場合、ホモダイマーであることもできるし、または他のＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６のそれぞれ１つのモノマーで構成されるヘテロダイマー）またはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバー、例えば、アクチビン、インヒビンおよびＴＧＦ−β１（例えば、ＢＭＰおよびＴＧＦ−βスーパーファミリー関連メンバーのそれぞれ１つのモノマーで構成されるヘテロダイマー）などと共にヘテロダイマーになることもできる。このようなヘテロダイマータンパク質の例は、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０９２２９に記載されている。
【０２１４】
治療用または診断用薬剤は、追加の薬剤、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｆｒａｚｚｌｅｄ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、ＣｅｒｂｅｒｕｓおよびＦｏｌｌｉｓｔａｔｉｎタンパク質などをさらに指すことができる。これらのタンパク質ファミリーは、Ｓａｓａｉら、（１９９４年）、Ｃｅｌｌ、７９１７７９〜７９０頁（Ｃｈｏｒｄｉｎ）；ＰＣＴ特許公開ＷＯ９４／０５８００（Ｎｏｇｇｉｎ）；およびＦｕｋｕｉら、Ｄｅｖｅｌ．  Ｂｉｏｌ．、１５９巻：１〜３１頁（１９９３年）（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）に一般的に記載されている。Ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質は、ＷＯ９６／１６６６８；ＷＯ９６／１７９２４；およびＷＯ９５／１８８５６に記載されている。Ｆｒａｚｚｌｅｄタンパク質ファミリーは、最近発見されたタンパク質ファミリーであって、Ｆｒｉｚｚｌｅｄとして公知の受容体タンパク質ファミリー細胞外結合ドメインに対して高い相同性を有する。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ遺伝子およびタンパク質ファミリーは、Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７１巻：４４６８４４７６頁（１９９６年）に記載されている。活性剤はまた、他の溶解性受容体、例えば、ＰＣＴ特許公開ＷＯ９５／０７９８２で開示された切断された溶解性受容体などを含むことができる。ＷＯ９５／０７９８２の教示から、切断された溶解性受容体が、多くの他の受容体タンパク質のために調製することができることは当業者であれば認識している。上記刊行物は、本明細書で参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１５】
本発明のヒドロゲルは細胞を含んでもよい。本発明のヒドロゲルにより封入されるのに適している細胞として、これらに限定されないが、幹細胞（胚幹細胞、間葉幹細胞、骨髄由来の幹細胞および造血幹細胞）、軟骨細胞（ｃｈｒｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）前駆細胞、膵臓前駆細胞、筋原細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト，神経細胞、グリア細胞、アストロサイト、前脂肪細胞、含脂肪細胞、血管内皮細胞、毛髪卵胞幹細胞、内皮前駆細胞、間葉細胞、神経幹細胞および平滑筋前駆細胞が挙げられる。
【０２１６】
一部の実施形態では、細胞は遺伝子修飾された細胞である。細胞は、所望の化合物、例えば、生理活性剤、増殖因子、分化因子、サイトカインなどを発現および分泌するよう遺伝子修飾することができる。目的の化合物を発現および分泌するために細胞を遺伝的に修飾する方法は当技術分野で公知であり、当業者により簡単に適応可能である。
【０２１７】
幹細胞に再プログラム化された分化した細胞もまた使用することができる。例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４の形質導入により、ヒト皮膚細胞は胚幹細胞に再プログラム化される（Ｊｕｎｙｉｎｇ  Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、３１８巻：１９１７〜１９２０頁  およびＴａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ、２００７年、１３１巻：１〜１２頁）。
【０２１８】
組成物への組込みに対して有用な細胞は、任意の供給源、例えば、哺乳動物に由来し得る。例えば、細胞はヒト、ラットまたはマウス由来のものであってよい。ヒト細胞として、これらに限定されないが、ヒト心筋細胞−成人（ＨＣＭａ）、ヒト皮膚線維芽細胞−胎児（ＨＤＦ−ｆ）、ヒト表皮性ケラチノサイト（ＨＥＫ）、ヒト間葉幹細胞−骨髄、ヒト臍帯間葉幹細胞、人毛卵胞の内毛根鞘細胞、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、およびヒト臍静脈平滑筋細胞（ＨＵＶＳＭＣ）、ヒト内皮前駆細胞、ヒト筋原細胞、ヒト毛細血管内皮細胞、およびヒト神経幹細胞が挙げられる。
【０２１９】
例示的ラットおよびマウス細胞として、これらに限定されないが、ＲＮ−ｈ（ラットニューロン−海馬の）、ＲＮ−ｃ（ラットニューロン−皮質）、ＲＡ（ラットアストロサイト）、ラット後根神経節細胞、ラット神経前駆細胞、マウス胚幹細胞（ｍＥＳＣ）、マウス神経の前駆細胞、マウス膵臓前駆細胞、マウス間葉細胞およびマウス内胚葉細胞が挙げられる。
【０２２０】
一部の実施形態では、組織培養物細胞株を本明細書に記載のヒドロゲルに使用することができる。細胞株の例として、これらに限定されないが、Ｃ１６６細胞（１２日目のマウス胎仔の卵黄嚢細胞）、Ｃ６グリア細胞腫細胞株、ＨＬ１（心筋細胞株）、ＡＭＬ１２（非トランスフォーミング肝細胞）、ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん細胞株）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が挙げられる。
【０２２１】
当業者であれば、このような細胞を配置、単離および増大することができる。加えて、細胞培養物の基本原理、ならびに再生医療のための細胞を配置、単離および増大、ならびに調製するための方法は、両方ともその内容がその全体において本明細書中に参照により組み込まれている「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」編集者：Ｇｏｒｄａｎａ  Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ、Ｒ．  Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、２００６年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ａｎｄ  Ｈｅａｔｈ  Ｃ．  Ａ．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００年、１８巻：１７〜１９頁に記載されている。
【０２２２】
一実施形態では、生物製剤は、ペプチド、例えば、２５０ｋＤａまたはそれ未満の分子量を有するペプチドであってもよい。さらなる実施形態では、ペプチドは、血管新生因子、例えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦ、ＮＲＰ−１、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦ−β、エンドグリン、ＴＧＦ−β受容体、ＭＣＰ−１、インテグリン、インテグリンリガンド（例えば、ＲＧＤペプチド）、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、エフリン、プラスミノゲン活性因子、プラスミノゲン活性因子阻害剤−１、ｅＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＡＣ１３３、ＩＤ１またはＩＤ３である。具体的な実施形態では、本発明のヒドロゲルにより封入されたペプチドはＶＥＧＦである。
【０２２３】
生物製剤、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の薬剤（例えば、抗原性薬剤）などは、精製および／または単離される。具体的には、本明細書で使用される「単離した」または「精製された」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、組換え型技術で生成した場合、他の細胞物質もしくは培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。精製された化合物は、目的の化合物の少なくとも６０重量％（乾燥重量）である。本明細書の調製物はまた、目的の化合物の少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも約９０重量％、および最も好ましくは少なくとも約９９重量％であることができる。例えば、精製された化合物は、目的の化合物の少なくとも約９０重量％、約９１重量％、約９２重量％、約９３重量％、約９４重量％、約９５重量％、約９８重量％、約９９重量％または約１００重量％（ｗ／ｗ）である。純度は、任意の適当な標準的方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析により測定される。精製されたまたは単離したポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））は、その天然の状態でそれに隣接する遺伝子または配列を含まない。精製されたとはまた、ヒト対象への投与に対して安全である滅菌度、例えば、感染性または毒性の薬剤を含まないことを定義している。
【０２２４】
同様に、「実質的に純粋」とは、ヌクレオチド、ポリペプチド、または他の化合物が、それが自然に伴う構成成分から分離されていることを意味する。通常、ヌクレオチドおよびポリペプチドは、それらの少なくとも約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、約９０重量％、約９５重量％、約９９重量％、またはさらに１００重量％さえもが、これらに自然に伴うタンパク質および天然の有機分子を含まない場合、実質的に純粋である。例として、合成化合物、組換え型化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸）または精製した化合物、例えば、クロマトグラフィー法を含む標準的手順で精製された化合物などが挙げられる。
【０２２５】
「単離した核酸」とは、その構造が、任意の天然に存在する核酸の構造と同一ではない、または３個超の別々の遺伝子に及ぶ、天然に存在するゲノム核酸の任意の断片の構造と同一ではない核酸である。この用語は、例えば、以下を網羅する：（ａ）天然に存在するゲノムのＤＮＡ分子の一部ではあるが、それが自然に生じている生物のゲノムにおいて、分子のその部分をフランキングしている核酸配列の両方によりフランキングされないＤＮＡ；（ｂ）ベクターに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに、生成される分子が任意の天然に存在するベクターもしくはゲノムＤＮＡと同一にならないような方式で組み込まれた核酸；（ｃ）別々の分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で生成された断片、または制限断片；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードしている遺伝子の部分である組換え型ヌクレオチド配列。本発明の開示に従い単離した核酸分子は、合成的に生成された分子、ならびに化学的に変更させた、および／または修飾された骨格を有する任意の核酸をさらに含む。
【０２２６】
本発明のヒドロゲルに、もしくは本発明のヒドロゲルに封入されたリポソームに封入することができる治療用または診断用薬剤は、ＳＴＩＮＧアジュバント、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９試薬および破壊されたがん細胞に由来するアジュバント負荷細胞内ベシクルであってよい。
【０２２７】
一実施形態では、治療用または診断用薬剤はまたワクチンであってもよい。
【０２２８】
ヒドロゲルのポリマー（例えば、アルギネートポリマー）は、約１〜９０％架橋されていてもよく、例えば、少なくとも約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％または約７０％架橋されていてもよい。列挙された値の中間の範囲もまた本発明の一部であることが意図されている。例えば、ヒドロゲルのポリマーは、約１％〜約１０％、約７％〜約１５％、約１２％〜約２０％、約１５％〜約３０％、約２０％〜約４０％、約３０％〜約５０％、約４５％〜約６５％または約５０％〜約９０％架橋されていてもよい。
【０２２９】
「架橋密度」という用語と交換可能なように使用される「％架橋した」という用語は、互いに反応したアルギネートモノマー１モル当たりの、コンジュゲートしたクリック部分のモル数を指す。
【０２３０】
ポリマー（例えば、アルギネート）は、酸化されている（例えば、高酸化）、還元されている、またはこれらの混合物であることができる。例えば、本発明のヒドロゲルは、多糖ポリマーの混合物、例えば、アルゴキシノールおよびアルゴキサラートを含むアルギネートポリマーを含み得る。場合によっては、酸化ポリマーまたは部分的酸化ポリマーは生分解性である。例えば、酸化アルギネートまたは部分的酸化アルギネートを含むヒドロゲルは生分解性である。
【０２３１】
治療用もしくは診断用薬剤、または治療用もしくは診断用薬剤を封入している脂質ベースのナノ粒子、例えば、リポソームまたはビロソームは、本発明のヒドロゲルから持続放出方式で、例えば、一定速度で、所与の時間数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間；または日数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８日間；または週数、例えば、１、２、３、４、５、６、７または８週間；または月数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２カ月間放出される。治療用もしくは診断用薬剤または脂質ベースのナノ粒子、例えば、治療用もしくは診断用薬剤を封入しているリポソームもしくはビロソームが本発明のヒドロゲルから一定速度で放出される場合、所与の期間にヒドロゲルから放出される治療用もしくは診断用薬剤の量または脂質ベースのナノ粒子の量はほぼ同じ、例えば、所与の期間の直前または直後の期間の間、ヒドロゲルから放出される治療用もしくは診断用薬剤または脂質ベースのナノ粒子の量の約０％〜約２０％の範囲内である。
【０２３２】
治療用もしくは診断用薬剤または治療用もしくは診断用薬剤を封入している脂質ベースのナノ粒子の放出速度は、ヒドロゲルの調製中に１つまたは複数のパラメーターを変化させることにより調整することができる。このようなパラメーターとして、これらに限定されないが、クリック置換度；％多糖酸化；架橋反応（ゲル化）中のクリックコンジュゲートした多糖の濃度；または取り囲んでいる環境のｐＨが挙げられる。
【０２３３】
クリック置換度は、酸化多糖および還元多糖、または高酸化多糖、例えば、アルゴキシノールもしくはアルゴキサラートとのクリックコンジュゲーション反応において、クリック試薬のモル当量の数を変えることによって調整することができる。例えば、クリックコンジュゲーション反応におけるクリック試薬のモル当量の数を増加させることによって、本発明の多糖にコンジュゲートするクリック分子の数を増加させることができる。別の例では、クリックコンジュゲーション反応において、クリック試薬のモル当量の数を低減させることによって、本発明の多糖にコンジュゲートするクリック分子の数を低減させることができる。一実施形態では、クリックコンジュゲーション反応物は、約１〜約２０００モル当量のクリック試薬、例えば、約１、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０または約１０００モル当量のクリック試薬を含み得る。列挙された値の中間の範囲もまた本発明の一部であることが意図されている。例えば、クリックコンジュゲーション反応物は、約１〜約５、約２〜約１０、約５〜約１０、約１０〜約５０、約４０〜約１５０、約１００〜約４００、約３００〜約５００、約４００〜約１０００、約５００〜約１５００または約１５００〜約２０００モル当量のクリック試薬を含み得る。
【０２３４】
一実施形態では、多糖、例えば、酸化多糖および還元多糖、または高酸化多糖（例えば、アルゴキシノールもしくはアルゴキサラートを含む）は約０．０１％〜約９０％、例えば、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％または約９０％であるクリック置換度を含み得る。列挙された値の中間の範囲もまた本発明の一部であることが意図されている。例えば、多糖は、約０．０１％〜約０．０５％、約０．０１％〜約１％、約０．１％〜約５％、約５％〜約１５％、約１０％〜約２０％、約１５％〜約２５％、約２０％〜約３５％、約３０％〜約４０％または約３５％〜約５０％クリック置換されていてもよい。
【０２３５】
また、多糖の％酸化を調整することによって、本発明の多糖にコンジュゲートするクリック分子の数を調整することもできる。例えば、アンモニアボランとのその還元前に、または、例えば、亜塩素酸ナトリウムとのそのさらなる酸化前に、多糖の％酸化をより高くすることにより、追加のアルデヒド部分を作り出すことができ、還元の際にこれらをアルコール部分に変換、またはさらなる酸化の際にカルボン酸部分に変換することで、これがクリック試薬コンジュゲーションに対する部位として機能し得る。
【０２３６】
本発明の多糖のクリック置換度を調整することによって、ゲル化までの時間、またはクリックコンジュゲートした多糖の架橋結合、およびヒドロゲルの生成にかかる時間を調整することが可能となり得る。例えば、より高いクリック置換度はより短いゲル化時間をもたらすことができる。
【０２３７】
クリック置換度を調整することによって、生成したヒドロゲルにおける架橋密度および細孔の平均直径、すなわち、生成したヒドロゲルのメッシュサイズを調整することも可能にする。例えば、より高いクリック置換度は、ヒドロゲルのより小さな平均細孔直径、またはメッシュサイズをもたらすことができ、これによって、治療用もしくは診断用薬剤または脂質ベースのナノ粒子、例えば、治療用もしくは診断用薬剤を含むリポソームもしくはビロソームの放出速度の低減をもたらすことができる。より高いクリック置換度はまた、ヒドロゲル中に治療用または診断用薬剤を含む脂質ベースのナノ粒子のより長期間の保持をもたらすことができる。
【０２３８】
また別の例では、架橋反応中の本発明の多糖の濃度を変化させてもよい。例えば、クリックコンジュゲーション反応における多糖、例えば、クリックコンジュゲート多糖のより高い濃度は、生成したヒドロゲルのより小さなメッシュサイズをもたらすことができ、ひいては、これによって、治療用もしくは診断用薬剤または治療用もしくは診断用薬剤を含む脂質ベースのナノ粒子、例えば、リポソームもしくはビロソームの、本発明のヒドロゲルからの放出速度を低減させることができる。より高いクリック置換度はまた、ヒドロゲル中に治療用もしくは診断用薬剤を含む脂質ベースのナノ粒子のより長期間の保持をもたらすことができる。一部の実施形態では、ヒドロゲル形成の間のクリックコンジュゲート多糖の濃度、例えば、ヒドロゲルの形成の直前の溶液に存在するアルギネート物質の濃度は、約０．０１％〜約５０％ｗ／ｖ、例えば、約０．０１％〜約１０％ｗ／ｖ、約０．１％〜約５％ｗ／ｖ、約１％〜約１５％ｗ／ｖ、約１０％〜約３０％ｗ／ｖ、約１２％〜約３５％ｗ／ｖ、約１５％〜約２５％ｗ／ｖ、約２０％〜約４５％ｗ／ｖまたは約３５％〜約５０％ｗ／ｖであり得る。
【０２３９】
本発明のヒドロゲル、例えば、アルギネートを含むヒドロゲル、例えば、アルゴキシノールおよび／またはアルゴキサラートを含むヒドロゲルなどは、宿主または対象、例えば、ヒト体内に存在する内因性酵素により分解されない。本発明のヒドロゲルは、酸性またはアルカリ性条件に曝露された場合、化学的に分解される、例えば、加水分解され得る。酸性条件は６．５またはそれ未満のｐＨを含み、アルカリ性条件は８またはそれよりも高いｐＨを含む。理論に制約されることを望むことなく、本発明のヒドロゲルの化学分解速度はｐＨ依存性であると考えられている。例えば、ｐＨ２での本発明のヒドロゲルの化学分解速度は、ｐＨ６での化学分解速度よりも高く、ｐＨ８での本発明のヒドロゲルの化学分解速度はｐＨ１２での化学分解速度よりも高い。
【０２４０】
本発明のヒドロゲルが、酸性またはアルカリ性条件に曝露された場合、ヒドロゲル中に含まれるカーゴ、例えば、治療用もしくは診断用薬剤、または脂質ベースのナノ粒子、例えば、治療用もしくは診断用薬剤を封入しているリポソームもしくはビロソームは、中性のｐＨ、例えば、ｐＨ７．４でのその放出速度と比較して、より速い速度でヒドロゲルから放出される。例えば、腫瘍内環境は６．５またはそれ未満の酸性ｐＨによって特徴付けられ得るので、本発明のヒドロゲルからのカーゴ放出速度を腫瘍内環境において増加させ、これによって、抗がん剤の持続したおよび標的送達を可能にすることができる。
Ｖ．本発明のヒドロゲルに封入された脂質ベースのナノ粒子
【０２４１】
本発明はまた、治療用もしくは診断用薬剤を封入している脂質ベースのナノ粒子およびリポソームを封入している本発明のヒドロゲルを含むドラッグデリバリー組成物を提供する。本明細書で使用される「脂質ベースのナノ粒子」という用語は、脂質を含み、対象への治療用または診断用薬剤の送達のために使用することができる任意のナノ粒子を指す。一実施形態では、脂質ベースのナノ粒子はリポソームである。別の実施形態では、脂質ベースのナノ粒子はビロソームである。
【０２４２】
リポソームは、全身性酵素的分解からのこのような薬剤の保護を提供し、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を模倣するために使用することができるので、リポソーム中で治療用または診断用薬剤を送達することが望ましいこともある。しかし、リポソームドラッグデリバリーに伴う難題が存在する。例えば、リポソーム組成物は、負荷効率、リポソームにより封入された治療用または診断用薬剤の効力およびリポソームにより封入された治療用または診断用薬剤の全身毒性に対して大きな作用を有し得る。したがって、全身毒性を減少させ、標的組織への薬物カーゴの局在化を提供し得る、持続した、局在的リポソームドラッグデリバリーに対する必要性が存在する。しかし、現在利用可能なリポソーム送達組成物は、リポソームカーゴの放出が数時間または数日間以内に生じ、リポソームカーゴを保持することができない。当技術分野で現在利用可能な組成物はまた、例えば、インタクトなリポソームが、サイトゾル送達のために、カーゴを、細胞膜を横断させる必要がある場合など、リポソームを標的位置にインタクトで送達することが不可能である。
【０２４３】
驚くことに、本発明の還元多糖および／または高酸化多糖、例えば、アルゴキシノールおよび／またはアルゴキサラートを含む、例えば、本明細書に記載の方法を使用して作製された多糖は、リポソームを封入するために使用することができるヒドロゲルを調製するのに特に有用であることが発見された。具体的には、驚くことに、本発明のヒドロゲル、例えば、クリック試薬にコンジュゲートしたアルゴキシノールおよび／またはアルゴキサラートを含むアルギネートから調製したヒドロゲルは長い期間にわたりインタクトなリポソームを保持することができ、インタクトなリポソームを対象内の所望の位置、例えば、細胞のサイトゾルに送達することができることが発見された。
【０２４４】
本明細書で使用される場合、「インタクトなリポソーム」という用語は、それがヒドロゲルにより封入されている間、または宿主または対象、例えば，ヒトの所望の位置に送達される処理の間、そのサイズ、例えば、平均直径を保持するリポソームを含む。インタクトなリポソームとは、治療用インプットに類似しており、他のリポソームと癒合して、より大きなサイズ、例えば、より大きな平均直径の多分散系リポソームを生成することも、または、より小さなリポソームもしくはミセルへと断片化することもないリポソームである。
【０２４５】
リポソームは、宿主、例えば、対象、例えば、ヒトなどの体内で、リポソームを封入しているヒドロゲルが分解された後、所望の位置、例えば、細胞のサイトゾルに、インタクトな形態で送達され得る。１つの例では、ヒドロゲルは、アルギネート、例えば、アルゴキシノールまたはアルゴキサラートを含み、これは、宿主の内因性酵素による分解を受けにくい。アルギネート、例えば、アルゴキシノールまたはアルゴキサラートは宿主の内因性酵素による分解を受けにくいので、アルギネートを含むヒドロゲルはリポソームを長時間の間保持することが可能である。例えば、本発明のリポソームは、少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日または少なくとも８０日にわたってヒドロゲルに封入されたままである。
【０２４６】
宿主または対象の体内の所望の位置への送達中にインタクトなままであるリポソームとは、送達中に平均サイズ、例えば、平均直径を保持するリポソームである。例えば、本発明のヒドロゲルによって封入されたインタクトなリポソームの平均直径は、封入前の同じリポソームの平均直径の約５０％、例えば、約４９％、約４８％、約４７％、約４６％、約４５％、約４４％、約４３％、約４２％、約４１％、約４０％、約３９％、約３８％、約３７％、約３６％、約３５％、約３４％、約３３％、約３２％、約３１％、約３０％、約２９％、約２８％、約２７％、約２６％、約２５％、約２４％、約２３％、約２２％、約２１％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％または約１％以内であるか、または標準の平均直径の約２５％、例えば、約２４％、約２３％、約２２％、約２１％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％または約１％以内である。標準は、ヒドロゲルを用いた封入に使用したリポソームと同じ方式で調製したリポソームであってよい。リポソームのサイズは、当業者に公知の任意の方法、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定することができる。
【０２４７】
本発明との関連で有用なリポソームは、治療用または診断用薬剤を送達するために使用することができる、当技術分野で公知の任意のリポソームであってよい。例えば、リポソームは、中性リポソーム、例えば、荷電していない脂質を含むリポソーム（Ｎｉｏｓｏｍｅ）であってよい。このような脂質の例として、これらに限定されないが、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）およびコレステロール（ＣＨＯＬ）が挙げられる。リポソームはまた、荷電したリポソーム、例えば、正荷電または負荷電脂質を含むカチオン性またはアニオン性リポソームなどであってもよい。正荷電脂質の非限定的例として、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル−硫酸塩（ＤＯＴＡＰ）および水素化大豆ホスファチジルコリン（ｓｏｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｌｃｈｏｌｉｎｅ）（Ｈｙｄｒｏ  Ｓｏｙ  ＰＣ）が挙げられる。負荷電脂質の非限定的例として、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）が挙げられる。一部の実施形態では、本発明との関連で有用なリポソームは、治療用リポソームまたは診断用リポソーム、例えば、上に記載されているような治療用または診断用薬剤を含むリポソームである。
【０２４８】
ビロソームは、ビロソームの標的細胞との縮合を可能にするための、ウイルス由来のタンパク質を組み込んだ単層リン脂質膜（単層または二層のいずれか）ベシクルからなる薬物またはワクチン送達機構である。ビロソームは、複製できないが、純粋な溶融活性のあるベシクルである。本発明との関連で有用なビロソームは、任意のウイルス由来のタンパク質を送達するために使用することができる、当技術分野で公知の任意のビロソームであってよい。一部の実施形態では、ビロソームは、インフルエンザウイルス由来のタンパク質、例えば、赤血球凝集素またはノイラミニダーゼを含み得る。一部の実施形態では、ビロソームは、治療用または診断用ビロソーム、例えば、上に記載されているような治療用または診断用薬剤を含むビロソームである。一部の実施形態では、ビロソームはワクチンを含む。
ＶＩ．本発明の医薬組成物
【０２４９】
対象への投与のため、本発明のヒドロゲルは、薬学的に許容される（例えば、滅菌の）組成物で提供できる。したがって、本明細書に記載の別の態様は、ヒドロゲルと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。これらの薬学的に許容される組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体（添加物）および／または希釈剤と一緒に製剤化されたヒドロゲルを含む。以下に詳細に記載されているように、本発明の開示の医薬組成物は、以下に対して適応させたものを含めて、固形のまたは液体形態での投与に対して特異的に製剤化することができる：（１）経口投与、例えば、飲薬（水性または非水性溶液または懸濁剤）、ロゼンジ剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、錠剤（例えば、口腔内頬側、舌下、および／または体内吸収を標的とするもの）、ボーラス、散剤、粒剤、舌への適用のためのペースト剤；（２）非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内（例えば、ボーラスまたは点滴）もしくは硬膜外注射、例えば、無菌溶液もしくは懸濁液、または持続放出製剤として；（３）局所的適用、例えば、クリーム剤、軟膏剤、または制御放出性パッチまたは皮膚に適用するスプレーとして；（４）膣内または直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム剤または発泡剤として；（５）舌下；（６）眼；（７）経皮的；（８）経粘膜；または（９）経鼻的。さらに、化合物は、患者にインプラントする、またはドラッグデリバリーシステムを使用して注射することができる。例えば、すべての内容が本明細書中に参照により組み込まれている、Ｕｒｑｕｈａｒｔら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ２４巻：  １９９〜２３６頁（１９８４年）；  Ｌｅｗｉｓ編、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８１年）；米国特許第３，７７３，９１９号；および米国特許第３５  ３，２７０，９６０号を参照されたい。
【０２５０】
本明細書で使用されている「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を生じることなく、妥当なベネフィットリスク比に見合うように、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適切である、化合物、物質、組成物、および／または剤形を指す。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与のため、組成物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＦＤＡの生物学的基準）により要求されているような、滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を満たすべきであることが理解されている。
【０２５１】
本明細書で使用されている「薬学的に許容される担体」という用語は、対象化合物を、身体の１つの器官、または部分から、身体の別の器官、または部分に運ぶまたは輸送することに関与している、薬学的に許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固形の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、カルシウムまたはステアリン酸亜鉛、またはステル酸）、または溶媒封入物質などを意味する。各担体は、製剤の他の成分と相容性があり、患者に対して有害ではないという意味で「許容される」ことが必要である。薬学的に許容される担体として機能することができる物質の一部の例として、以下が挙げられる：（１）糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなど；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；（３）セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロースなど；（４）粉末状トラガント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなど；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックスなど；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコールなど；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンを含まない水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；（２２）充填剤、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸など；（２３）血清構成成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなど；（２２）Ｃ２〜Ｃ１２アルコール、例えば、エタノールなど；および（２３）医薬製剤に利用される他の無毒性の相容性物質。湿潤剤、着色剤、剥離剤、コーティング剤、崩壊剤、結合剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、プロテアーゼ阻害剤、可塑剤、乳化剤、安定化剤、粘度増加する薬剤、フィルム形成剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤および抗酸化剤もまた製剤中に存在することができる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などの用語は本明細書で交換可能なように使用される。
【０２５２】
治療剤を含む本発明のヒドロゲルは、対象内のｉｎ  ｖｉｖｏの位置に送達することができる。例示的なｉｎ  ｖｉｖｏの位置として、これらに限定されないが、創傷、外傷または疾患の部位が挙げられる。ヒドロゲルは、ｉｎ  ｖｉｖｏの位置に送達できる、例えば、組成物を対象にインプラントすることができる。インプラントされているヒドロゲル、すなわち、埋め込み型デバイスは、１つまたは複数の添加物をさらに含むことができる。添加物は、分解性（生分解性）ポリマー、マンニトール、デンプン糖、イノシット、ソルビトール、グルコース、ラクトース、サッカロース、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、アミノ酸、塩化マグネシウム、クエン酸、酢酸、ヒドロキシル−ブタン二酸、リン酸、グルクロン酸、グルコン酸、ポリ−ソルビトール、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛、アルミニウムステアリン酸塩、ステアリン酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、デンプンまたはこれらの混合物であってよい。
【０２５３】
埋め込み型デバイスは、これらに限定されないが、回転楕円体、立方体、多面体、プリズム、円柱、桿体細胞、ディスク、または他の幾何学的形状を含めた、実質的にあらゆる規則的なまたは不規則な形状を有することができる。したがって、一部の実施形態では、インプラントは、直径約０．５〜約１０ｍｍおよび長さ約０．５〜約１０ｃｍの円柱状形態のものである。好ましくは、その直径は約１〜約５ｍｍであり、長さは約１〜約５ｃｍである。
【０２５４】
一部の実施形態では、埋め込み型デバイスは球状形態のものである。埋め込み型デバイスが球状形態である場合、その直径は、直径約０．５〜約５０ｍｍの範囲であることができる。一部の実施形態では、球状インプラントの直径は約５〜約３０ｍｍである。好ましくは、直径は約１０〜約２５ｍｍである。
【０２５５】
一部の実施形態では、本発明のヒドロゲルは、ドラッグデリバリーデバイスまたは薬物デポー剤を調製するために使用することができる。ドラッグデリバリーデバイスはまた生分解性および再充填可能であってもよい。再充填可能な生分解性ドラッグデリバリーデバイスは、例えば、それぞれの全内容が本明細書によって参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２４５４０および米国出願第１４／８７８，５７８号に記載されている。再充填可能な生分解性ドラッグデリバリーデバイスは、再充填薬物にコンジュゲートした標的と相互作用可能な標的認識部分を含む。
【０２５６】
一部の実施形態では、再充填可能な生分解性ドラッグデリバリーデバイスを調製するために使用される本発明のヒドロゲルは、上に記載されているような２つの異なるクリックペアに属する少なくとも２つのクリック試薬にコンジュゲートした多糖を含み得る。例えば、多糖は、再充填薬物にコンジュゲートしたそのクリックペアと反応することにより、ドラッグデリバリーデバイスに対する標的認識部分として機能する第１のクリック試薬を含み得る。多糖はまた、上に記載されているような架橋剤として機能する、またはある部分、例えば、治療剤を多糖にコンジュゲートするために機能する第２のクリック試薬を含み得る。一実施形態では、第１のクリック試薬および第２のクリック試薬は交差反応しない、すなわち、互いに反応せずに、これらのクリックペアのみと反応する。
【０２５７】
他の実施形態では、本発明のヒドロゲルは、上に記載されているような再充填可能な生分解性ドラッグデリバリーデバイスのための再充填薬物を調製するために使用することができる。再充填薬物を調製するために使用されるヒドロゲルは、上に記載されているような少なくとも２つのクリック試薬にコンジュゲートした多糖を含むことができ、ここでは、少なくとも１つのクリック試薬は、ドラッグデリバリーデバイスにコンジュゲートしたそのクリックペアと反応することによって、標的として機能することができる。
ＶＩＩ．本発明のヒドロゲルを使用した処置方法
【０２５８】
本発明はまた、それを必要とする対象を処置する方法に関する。本方法は、本発明のヒドロゲル、剤形、医薬組成物または埋め込み型ドラッグデリバリーデバイスの有効量を対象に投与することを含む。
【０２５９】
本明細書で使用されている「投与する」という用語は、所望の作用が生じるように、所望の部位における組成物の少なくとも部分的局在化をもたらす方法または経路により、組成物を対象内に配置することを指す。本明細書に記載の化合物または組成物は、当技術分野で公知の任意の適当な経路で投与することができ、これらの経路は、これらに限定されないが、経口経路、または静脈内、筋肉内、皮下、経皮的、気道（エアゾール剤）、肺、経鼻、直腸、および局所的（口腔内頬側および舌下を含む）投与を含む非経口経路を含む。
【０２６０】
例示的投与モードとして、これらに限定されないが、注射、点滴、滴下、吸入、または摂取が挙げられる。「注射」は、制限なしで、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、側脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内注射および点滴を含む。好ましい実施形態では、組成物は静脈点滴または注射により投与される。
【０２６１】
投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によるものでもよい。経粘膜的なまたは経皮的投与に対して、バリアに浸透するのに適当な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、一般的に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜的投与のための、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜的投与は、点鼻薬または坐剤の使用を介して達成できる。経皮的投与に対して、化合物は、当技術分野で一般的に公知の軟膏剤、軟膏、ゲル剤、またはクリーム剤へと製剤化される。
【０２６２】
一部の実施形態では、投与は、組成物、例えば、本明細書に記載のヒドロゲルを対象にインプラントすることを含む。
【０２６３】
本明細書で使用されている「治療有効量」という用語は、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィットリスク比で、対象内の少なくとも細胞の亜集団においていくらかの所望の治療効果を生じるのに有効な化合物、物質、または本明細書に記載の化合物を含む組成物の量を意味する。したがって、「治療有効量」とは、疾患を処置するために対象に投与された場合、疾患に対するこのような処置を実行するのに十分な量を意味する。
【０２６４】
有効量の判定は十分に当業者の能力の範囲内である。一般的に、実際の有効量は、特定の化合物、使用技術または適用技術、所望の作用、作用および副作用の期間、対象の病歴、年齢、状態、性別、ならびに対象における医学的状態の重症度およびタイプ、ならびに他の薬学的活性のある薬剤の投与により変わり得る。したがって、本明細書に記載の化合物の有効用量は、対象において少なくともいくらかの所望の治療効果を生じるのに十分な量である。
【０２６５】
細胞培養物アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒトにおける使用のための、ある範囲の投与量を策定することにおいて使用することができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、わずかな毒性を有するまたは毒性を有さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に位置する。投与量は、利用する剤形および利用する使用または投与経路に応じて、この範囲内で異なってもよい。
【０２６６】
有効用量は、最初に細胞培養物アッセイから予測することができる。用量は、細胞培養物で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する治療薬の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するために、動物モデルで策定できる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。任意の特定の投与量の作用は、適切なバイオアッセイでモニターすることができる。
【０２６７】
一般的に、「処置」または「処置する」という用語は、患者への治療剤の適用または投与、または患者から単離した組織または細胞株への治療剤の適用または投与と定義され、前記患者は、疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を有し、その目的は、疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を治癒する、修復する、軽減する、和らげる、変更させる、救済する、緩和する、改善するまたは影響を与えることである。したがって、処置することは、抑制する、阻害する、予防する、処置すること、またはこれらの組合せを含むことができる。処置するとは、中でも、進行を持続する時間を増加させる、寛解を早める、寛解を誘発する、寛解を増強させる、回復を速める、代替の治療薬の効力を増加させる、もしくは代替の治療薬に対する耐性を低減させる、またはこれらの組合せを指す。「抑制する」または「阻害する」とは、中でも、症状の発症を遅らせる、疾患の再発を予防する、再発症状の発現の数または頻度を低減させる、症候性症状の発現の間の潜伏時間を増加させる、症状の重症度を減少させる、急性症状の発現の重症度を減少させる、症状の数を減少させる、疾患関連の症状の発症率を減少させる、症状の潜伏時間を減少させる、症状を緩和する、２次的症状を減少させる、２次感染を減少させる、患者の生存を長引かせること、またはこれらの組合せを指す。一実施形態では、症状は１次であり別の実施形態では、症状は２次である。「１次」とは、障害、例えば、糖尿病の直接的結果である症状を指す一方で、２次とは、第１次的原因から誘導されたまたはその結果として起こる症状を指す。症状は、疾患または病理学的な状態の任意の所見であってよい。
【０２６８】
したがって、本明細書で使用される「処置」または「処置する」という用語は、本明細書に記載の化合物の任意の投与を含み、以下を含む：（ｉ）疾患になり得るが、これをまだ経験していない、または疾患の病理もしくは症候を示していない対象が疾患に罹るのを予防すること；（ｉｉ）疾患の病理もしくは症候を経験もしくは示している対象において疾患を阻害する（すなわち、病理および／または症候のさらなる発達を止める）；または（ｉｉｉ）疾患の病理もしくは症候を経験もしくは示している対象において疾患を緩和する（すなわち、病理および／または症候を逆転する）。
【０２６９】
疾患または障害の「処置」、「予防」または「緩和」とは、このような疾患または障害の発症を遅延または予防すること、このような疾患または障害に伴う状態の進行、悪化もしくは劣化、重症度の進行を逆転する、軽減する、緩和する、阻害する、遅らせる、または停止することを意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％軽減する。
【０２７０】
処置の効力は、障害を診断するための任意の公知の方法に関連して決定される。障害の１つまたは複数の症状の軽減は、化合物が臨床的利益を付与することを示している。上記に記載されている治療方法のいずれかは、例えば、哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくは、ヒトを含めた、任意の適切な対象に適用することができる。
【０２７１】
本明細書で使用されている「対象」という用語は、本発明のヒドロゲルまたは埋め込み型ドラッグデリバリーデバイスを投与されることにより利益を受けることができる任意の対象を含む。「対象」という用語は、動物、例えば、脊椎動物、両生類、魚、哺乳動物、ヒト以外の動物を含み、これには、ヒトおよび霊長類、例えば、チンパンジー、サルなどが含まれる。本発明の一実施形態では、対象はヒトである。
【０２７２】
「対象」という用語はまた、農業用として生産用家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ロバ、ラクダ、バッファロー、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウおよびハチ；および飼い慣らしたペット、例えば、イヌ、ネコ、かごの鳥および水槽魚、およびまたいわゆる試験動物、例えば、ハムスター、モルモット、ラットおよびマウスを含む。
【０２７３】
一実施形態では、本発明は、耳に関連する障害を処置するための方法を提供する。本方法は、それを必要とする対象に、耳に関連する障害、例えば、耳炎などを処置するためのヒドロゲル、または剤形を投与することを含む。このような剤形は、それを必要とする対象の外耳道に投与される。剤形は、様々な治療剤、例えば、少なくとも１種の抗生剤を含み得る。治療剤を耳に送達するためのドラッグデリバリーデバイスは、例えば、全内容が本明細書によって参照により本明細書に組み込まれている、ＵＳ２０１４／０１０７４２３に記載されている。
【０２７４】
別の実施形態では、本発明はまた、眼に関連した障害を処置するためのヒドロゲル、または剤形を提供する。本方法は、それを必要とする対象の眼に、本発明のヒドロゲル、または剤形を投与することを含む。本発明のヒドロゲル、または剤形は少なくとも１種の治療剤を含み得る。眼用剤形に使用することができる治療剤の非限定的例として、例えば、薬学的に有効濃度の、抗生剤、コルチコイド、局所麻酔薬、鼻詰まり薬、非ステロイド性抗フロギスティック、ウイルス増殖抑制剤、殺菌剤、コルチゾン、抗アレルギー性活性物質、プロスタグランジン類似体、活性物質クラスの抗ヒスタミン剤およびコルチコステロイドからの活性物質、抗アレルギー性活性物質、パントテン酸誘導体、非ステロイド性抗炎症薬、血管収縮剤および／または抗緑内障活性物質が挙げられる。眼への投与に対して適切な剤形は、例えば、その全内容が本明細書によって参照により本明細書に組み込まれているＵＳ２０１５０１３９９７３に記載されている。
【０２７５】
本発明はまた、それを必要とする対象において慢性虚血を処置するための方法を提供する。本方法は、本発明のヒドロゲル、剤形、または埋め込み型デバイスの有効量を対象に投与することを含む。一実施形態では、本発明のヒドロゲル、剤形、または埋め込み型デバイスはＶＥＧＦを含む。
【０２７６】
虚血部位にＶＥＧＦを局在的に送達することは、対象の身体において、ＶＥＧＦの半減期を増加させ、サイドトリートメントに関連する副作用を減少させることができることが以前に見出された。したがって、一実施形態では、ヒドロゲル、剤形または埋め込み型デバイスは、虚血部位に局在的に投与される。一部の実施形態では、ヒドロゲル、剤形または埋め込み型デバイスは、移植前および／または移植後に、生着される組織に投与される。
【０２７７】
本発明はまた、それを必要とする対象において、組織を再生するための方法を提供する。本方法は、細胞をさらに含む本発明のヒドロゲル、剤形、または埋め込み型デバイスの有効量を対象に投与することを含む。例えば、細胞は哺乳動物細胞であってよく、組織は哺乳動物組織であってよい。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、再生される組織と同じタイプのものである。他の実施形態では、哺乳動物細胞は幹細胞である。本明細書に提供されている方法の実施形態は、哺乳動物の組織を、細胞をさらに含む本発明のヒドロゲル、剤形、または埋め込み型デバイスと接触させることを含む。
【０２７８】
別の例では、対象において組織を再生するための方法は、本明細書に記載のヒドロゲル、剤形、または埋め込み型デバイスを提供することを含み、このヒドロゲルは、ヒドロゲル内に固定化された細胞を含む（すなわち、細胞はヒドロゲルから脱出することなく長時間の間ヒドロゲル内に残留する）。本方法は、組織をヒドロゲルと接触させることを含み、細胞はヒドロゲル内で固定化される。一部の実施形態では、細胞は子孫細胞である。一部の実施形態では、ヒドロゲルは安定したままであり、宿主細胞の浸潤を許さない。
【０２７９】
一実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、例えば、膵島移植に対して免疫保護バリアとして有用である。場合によっては、膵島移植は、糖尿病、例えば、Ｉ型糖尿病に対する処置である。移植される細胞、例えば、膵島などは、免疫反応により破壊される可能性があり、本発明のヒドロゲルは、ヒドロゲルのインプランテーション／注射前に、島細胞などの細胞を封入することが可能である。こうして、ヒドロゲルは、対象において免疫保護バリアとして、機能し、移植される細胞および組織の免疫拒絶を最小限に抑える。
【０２８０】
本発明は、以下の実施例によりさらに例示され、これらの実施例は、限定的であると解釈されるべきではない。本出願全体にわたり引用されたすべての参考文献の全内容は、本明細書によって明示的に参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２８１】
（実施例１）
アルギネート中に存在するアルデヒドは、カーゴタンパク質およびクリック試薬と反応することができる。
高分子量および低分子量のアルギネートを過ヨウ素酸ナトリウムとの反応により酸化させた。この目的を達成するために、約２６５ｋＤａのＭＷを有するアルギネート（ＭＶＧまたはＰｒｏｔａｎｏｌ  ＬＦ  ２０／４０、ＦＭＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｉ−１ＧまたはＩ−８、Ｋｉｍｉｃａ  Ｃｏｒｐ．）および約３２ｋＤａのＭＷを有するアルギネート（ＶＬＶＧ、ＦＭＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１％ｗ／ｖの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。アルギネートモノマーのモルに対するパーセントモル比に基づいた量で、過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶液に加えた。次いで、溶液を暗所で、室温で終夜反応させた。塩化ナトリウムを、０．３Ｍの濃度まで溶液に加え、酸化した生成物をタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）で精製するか、またはｄｉＨ２Ｏ中１５０ｍＭから０ｍＭのＮａＣｌに低減する塩勾配に対する大規模な水分変化と共に、１２〜１４ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析管（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）を終夜使用して透析した。
【０２８２】
０％〜５０％アルデヒドを含有する酸化アルギネートをＶＥＧＦと共にインキュベートした。溶解性のある、変性していない、ＶＥＧＦ（２％ｗ／ｖアルギネート、４ｍｃｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ）におけるパーセント変化を、インキュベーションの５日後、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃ＤＶＥ００）で測定した。図２ａに示されているように、アルデヒドの％増加は、ＶＥＧＦにおける％変化と直接的に相関し、５０％アルデヒドを含有するアルギネートは、ＶＥＧＦにおける５０％変化をもたらす。データは、酸化アルギネートと共にインキュベートしたアルデヒドがＶＥＧＦと反応できることを実証している。
【０２８３】
２０％〜５０％アルデヒドを含有する酸化アルギネートはまた、クリック試薬テトラジン（Ｔｚ）およびノルボルネン（Ｎｂ）ともコンジュゲートした。酸化アルギネートは室温で再懸濁後、有意な色の変化を示したが、これは分解に対するアルデヒド濃度の依存性を示している。図２ｂに示されているのは、再懸濁後、ＴｚおよびＮｂにコンジュゲートした酸化アルギネートを含有するバイアルの写真である。左から右に以下を示す：
−２０％アルデヒドを有するＴｚにコンジュゲートしたアルギネート；
−２０％アルデヒドを有するＮｂにコンジュゲートしたアルギネート；
−３０％アルデヒドを有するＴｚにコンジュゲートしたアルギネート；
−３０％アルデヒドを有するＮｂにコンジュゲートしたアルギネート；
−４０％アルデヒドを有するＴｚにコンジュゲートしたアルギネート；
−４０％アルデヒドを有するＮｂにコンジュゲートしたアルギネート；
−５０％アルデヒドを有するＴｚにコンジュゲートしたアルギネート；
−５０％アルデヒドを有するＮｂにコンジュゲートしたアルギネート。
【０２８４】
データは、アルデヒドがまたクリック試薬と反応して、アルデヒド濃度に依存する方式で、着色された生成物およびイミンを形成することができることを実証している。これらの色のシフトは、クリック部分に対して望ましくない変更を表す。イミンは、加水分解して、酸性条件でアルデヒドに戻すことができる。
（実施例２）
アルギネートアルデヒドの還元
【０２８５】
この実験の目的は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、アンモニアボラン（ＢＨ３ＮＨ３）および亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ２）と反応した酸化アルギネート中の残留アルデヒド含有量を決定することであった。図３ａに例示されているように、水素化ホウ素ナトリウムとアンモニアボランの両方はアルギネート中に存在するアルデヒドと反応して、アルコールを形成し、亜塩素酸ナトリウムはアルデヒドと反応して、カルボン酸を形成する。
【０２８６】
アルギネートを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化させて、これが５〜５０％残留アルデヒドを含有するようにした。次いで、酸化アルギネートを水素化ホウ素ナトリウム、アンモニアボランおよび亜塩素酸ナトリウムと反応させ、各反応後、ｑＮＭＲを使用して残留アルデヒドの％を定量化した。
【０２８７】
実施例１に記載されているような手順を使用して、アルギネートの過ヨウ素酸ナトリウム酸化を行った。
【０２８８】
酸化アルギネートを水素化ホウ素ナトリウムで還元するため、アルギネート溶液を水素化ホウ素ナトリウム（ＳＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、ＳＢとアルギネート酸化モノマーとのモル比＞１．５：１で処理した。反応を室温で終夜進行させた。塩化ナトリウムを溶液に加えて、濃度０．３Ｍに到達し、ＳＢで処理した生成物を、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）で精製するか、またはｄｉＨ２Ｏ中１５０ｍＭから０ｍＭのＮａＣｌに低減する塩勾配に対する大規模な水分変化と共に、１２〜１４ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析管（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）を終夜使用して透析した。次いで、還元アルギネートを含有する溶液を凍結し、凍結乾燥させた。
【０２８９】
酸化アルギネートをアンモニアボランで還元するため、アルギネート溶液をアンモニアボラン（ＡＢ）錯体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、ＡＢとアルギネートアルデヒドとのモル比＞１．５：１で処理した。反応を室温で終夜進行させた。塩化ナトリウムを溶液に加えて、濃度０．３Ｍに到達し、ＡＢで処理した生成物を、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）で精製するか、またはｄｉＨ２Ｏ中１５０ｍＭから０ｍＭのＮａＣｌに低減する塩勾配に対する大規模な水分変化と共に、１２〜１４ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析管（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）を終夜使用して透析した。次いで、還元アルギネートを含有する溶液を凍結し、凍結乾燥させた。
【０２９０】
酸化アルギネートをさらに酸化するため、アルギネート溶液を亜塩素酸ナトリウム（ＳＣ）で、ＳＣとアルギネートアルデヒドとのモル比＞１．５：１で処理した。亜塩素酸ナトリウムの添加前、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶液に、ＤＭＳＯと亜塩素酸ナトリウムとのモル比５：１で加え、溶液が均質になるまで混合した。反応を室温で終夜進行させた。次いで、塩化ナトリウムを、濃度０．３Ｍに到達するまで溶液に加え、ＳＣ処理した生成物をタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）で精製するか、またはｄｉＨ２Ｏ中１５０ｍＭから０ｍＭのＮａＣｌに低減する塩勾配に対する大規模な水分変化と共に、１２〜１４ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析管（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）を終夜使用して透析した。次いで、高酸化アルギネートを含有する溶液を凍結し、凍結乾燥させた。
【０２９１】
図３ｂは、アンモニアボランまたは水素化ホウ素ナトリウムでさらに還元した、または亜塩素酸ナトリウムでさらに酸化した、酸化アルギネート中に残留する酸化の％を示す棒グラフである。データは、アンモニアボランがアルデヒドを還元するその能力において水素化ホウ素ナトリウムよりも優り、最も低レベルの残留アルデヒドを含有するアルギネートを生成することを示している。この作用はより高いレベルの酸化を有するアルギネートに対して特に顕著である。データはまた、アルデヒドの亜塩素酸ナトリウム酸化は、「最初のＤＭＳＯ反応条件」（１：１  水：ＤＭＳＯ）で完了に到達しないことを示している。図６ｋに示されている通り、残留アルデヒドは、反応条件を３３：１  水：ＤＭＳＯに変化させることによって排除することができる。
（実施例３）
酸化アルギネートの還元処理は、カーゴタンパク質に対するアルデヒドの作用を減少させる。
【０２９２】
この実験のゴールは、酸化アルギネート中に存在するアルデヒドの、ＶＥＧＦの生物学的活性に対する作用を評価することであった。この目的を達成するために、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応によりアルギネートを酸化させることによって、０％〜５０％アルデヒドを含有する酸化アルギネートを生成した。次いで、酸化アルギネートを水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、アンモニアボラン（ＢＨ３ＮＨ３）および亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ２）と反応させた。アルギネート濃度２０ｍｇ／ｍＬおよびＶＥＧＦ濃度４μｇ／ｍＬで１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、３７℃で異なるアルギネートをＶＥＧＦと共にインキュベートした。溶解性のある、変性していないＶＥＧＦ（２％ｗ／ｖアルギネート、４ｍｃｇ／ｍＬのＶＥＧＦ）におけるパーセント変化を、インキュベーションの５日後、ＥＢＭ細胞培養物培地内でまたは１％ＢＳＡを含有する溶液中で、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃ＤＶＥ００）で測定した。
【０２９３】
データは図４ａおよび４ｂに示されている。図４ａは、ＥＢＭ中でのインキュベーションの５日後測定したＶＥＧＦにおける％変化を示している。データは、さらに処理されていない酸化アルギネートに対して、ＶＥＧＦにおける％変化がアルギネート中に含有されているアルデヒドのパーセントに直接的に相関していることを示している（「０」、「１」、「５」、「１０」、「１５」、「２５」および「５０」と示した左から７つまでの棒を参照されたい）。ＶＥＧＦの％変化は、２５％および５０％のアルデヒドを含有するアルギネートに対して１００％に到達している。データはまた、ＶＥＧＦの％変化が、アンモニアボランと反応させた酸化アルギネートに対して有意に減少していることを示し（「ＡＢ５」、「ＡＢ１０」、「ＡＢ１５」、「ＡＢ２５」および「ＡＢ５０」と示した棒を参照されたい）、最も高い％変化であるＶＥＧＦ中約６０％は、１５％のアルデヒドを含有するアルギネートに対して観察される。水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元はＶＥＧＦを保護することにおいてあまり有効ではなく、ＶＥＧＦ中のより高い％変化が試験した各アルギネート物質に対して観察される（「ＳＢ５」、「ＳＢ１０」、「ＳＢ１５」、「ＳＢ２５」および「ＳＢ５０」と示した棒を参照されたい）。亜塩素酸ナトリウムを用いた酸化は、試験したすべての試料に対して測定された有意な％変化をもたらし（「ＳＣ５」、「ＳＣ１０」、「ＳＣ１５」、「ＳＣ２５」および「ＳＣ５０」と示した棒を参照されたい）、これは、その時間点における反応の非効率性により維持される残留アルデヒドによるものである（最初のＤＭＳＯ反応条件）。
【０２９４】
図４ｂは、１％ＢＳＡ溶液中でのインキュベーションの５日後に測定されたＶＥＧＦの％変化を示している。データは、ＶＥＧＦの％変化が、さらに処理していない酸化アルギネート物質に対して、３０％超に到達し得ることを示している（「０％Ｏｘ」、「１％Ｏｘ」、「５％Ｏｘ」、「１０％Ｏｘ」、「１５％Ｏｘ」、「２５％Ｏｘ」および「５０％Ｏｘ」と示した左から７つまでの棒を参照されたい）。アンモニアボランを用いた還元処理（「ＡＢ５」、「ＡＢ１０」、「ＡＢ１５」、「ＡＢ２５」および「ＡＢ５０」と示した棒を参照されたい）または水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元処理（「ＳＣ５」、「ＳＣ１０」、「ＳＣ１５」、「ＳＣ２５」および「ＳＣ５０」と示した棒を参照されたい）は、ＶＥＧＦの％変化を減少させ、水素化ホウ素ナトリウムはアンモニアボランよりも有効であった。亜塩素酸ナトリウムを用いた酸化処理（最初のＤＭＳＯ反応条件）は、対照と比較して、ＶＥＧＦの％変化の増加をもたらした（「ＳＣ５」、「ＳＣ１０」、「ＳＣ１５」、「ＳＣ２５」および「ＳＣ５０」と示した棒を参照されたい）。
【０２９５】
図４ａおよび４ｂに示されているデータは、タンパク質カーゴを保護する能力において様々に処理したアルギネートに差異があることを示している。
（実施例４）
クリック試薬置換度は、亜塩素酸ナトリウムとの反応後、酸化アルギネートに対して増加する。
【０２９６】
この実験の目的は、クリック試薬とのクリック試薬コンジュゲーション度が、酸化アルギネートと亜塩素酸ナトリウムとの反応後に増加し得るかどうか決定することであった。図１ａに示されている通り、クリック試薬は通常、アルギネート中のグルクロン酸に存在するカルボキシレート部分を介してアルギネートにコンジュゲートすることができ、１つのアルギネートモノマー当たり１つのクリック分子をもたらす。以下の過ヨウ素酸ナトリウムを用いたアルギネート酸化後、１つのアルギネートモノマー当たり２つのアルデヒド試薬が生成され、これらもまたイミン結合を介してクリック試薬にコンジュゲートし得る（図１ｂ）。クリック試薬の酸化アルギネートへのこのコンジュゲーションは、カーゴに毒性および損傷をもたらし得る、ならびにクリック試薬の分解をもたらし得る、コンジュゲーション後にアルギネート中に残留する残留アルデヒドにより、最適とはならない（実施例１および３を参照されたい）。さらに、アルデヒドとクリック試薬との間のイミン結合は簡単に加水分解可能であり、アルギネートからのクリック試薬の損失をもたらす。しかし、図１ｃに示されている通り、酸化アルギネート中に存在するアルデヒドのさらなる酸化は、これらのアルデヒドをカルボン酸に変換し、クリックコンジュゲーションに対して２つの追加部位を提供する。
【０２９７】
酸化アルギネートのさらなる酸化がクリックコンジュゲーションを増加させることができるかどうか決定するために、過ヨウ素酸ナトリウムのみと反応させたアルギネート、または過ヨウ素酸ナトリウムで酸化させ（ＨｉｇｈＯｘアルギネート）、亜塩素酸ナトリウムでさらに酸化させた（アルゴキサラート含有アルギネート）アルギネートをクリック試薬テトラジン（Ｔｚ）およびノルボルネン（Ｎｂ）とコンジュゲートし、コンジュゲートしたテトラジンおよびノルボルネンの相対量を比較した。この目的を達成するために、実施例１および２に記載されている手順を使用して、過ヨウ素酸ナトリウムおよびＳＣを使用してアルギネートを酸化した。次いで、これらの生成物を、１−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−イルメタンアミン（ノルボルネンメタンアミン；ＴＣＩ）または３−（ｐ−ベンジルアミノ）−１，２，４，５−テトラジンのいずれかで修飾した。最初に、ＳＣ処理したアルギネートを０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５を、０．５％ｗ／ｖの濃度で含有する撹拌した緩衝液に溶解した。次に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をアルギネートに存在する５×モル過剰のカルボン酸基に加えた。次いで、ノルボルネン（Ｎｂ）またはテトラジン（Ｔｚ）のいずれかを、ＮｂまたはＴｚとアルギネートモノマーとの定義されたモル比で加えることによって、Ａｌｇ−ＮまたはＡｌｇ−Ｔをそれぞれ得た。カップリング反応物を室温で一晩撹拌し、生成物をタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）で精製するか、またはｄｉＨ２Ｏ中１５０ｍＭから０ｍＭのＮａＣｌに低減する塩勾配に対する大規模な水分変化と共に、１２〜１４ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析管（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）を終夜使用して透析した。次いで、精製されたＡｌｇ−ＮおよびＡｌｇ−Ｔポリマーを活性炭で処理し、無菌化濾過し（０．２２ｍｍ）、冷凍乾燥させた。これにより、アルギネートの利用可能なカルボン酸基が様々な置換度を有する、精製されたＡｌｇ−ＮまたはＡｌｇ−Ｔポリマーが生じた。
【０２９８】
図５ａは、ＴｚおよびＮｂにコンジュゲートした、０日目でのＨｉｇｈＯｘアルギネート（上側パネル）およびＴｚおよびＮｂにコンジュゲートした、０日目でのＨｉｇｈＯｘ  Ｓｃアルギネート（下側パネル）を含有するバイアルの写真を示す。Ｔｚ−およびＮｚ−コンジュゲート物質はそれぞれ、名目上ピンク色／赤色であり、わずかに不透明である。図５ｂは、ＮＭＲにより測定されたＨｉｇｈＯｘおよびＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート中に存在するＴｚの相対量を示す。データは、２０〜５０％酸化を含有するアルギネートに対して、ＨｉｇｈＯｘアルギネートと比較して、ＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネートにコンジュゲートした、１．４〜２．３倍多くのＴｚ分子が存在することを示しており、これは、アルゴキサラート含有アルギネートは、より多くのコンジュゲーション可能性を有することを示している。
（実施例５）
クリックコンジュゲート酸化アルギネートの特徴付け。
【０２９９】
この実験の目的は、クリックコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート物質の特性を特徴付け、これをクリックコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘアルギネート物質の特性と比較することであった。両方のアルギネート物質の安定性をＵＶ−Ｖｉｓスペクトルの分析により調査した。Ｔｚコンジュゲート物質に対するデータは、図６ａおよび６ｂに示されている。図６ａは、２８日目における、２０〜５０％酸化を有するＴｚコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘ  ＳＣ物質のＵＶ−Ｖｉｓスペクトル（上側パネル）、および１４日目における、２０％および３０％コンジュゲーションの、ＴｚコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘアルギネート物質のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す。図６ｂはまたこれらのＴｚコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘおよびＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート物質を含有するバイアルの写真を示している。データは、テトラジンコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘアルギネート物質が、２８日目に５１５ｎｍにおいて特徴Ｔｚピークを失い、その一方でこのピークは２０％および３０％酸化を含有するＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート物質において１４日目にさらに存在することを示している。これらのデータは、亜塩素酸ナトリウム処理したテトラジンコンジュゲートした物質が溶液中でより大きな安定性を表していることを示唆している。
【０３００】
Ｎｂコンジュゲート物質に対するデータは、図６ｃおよび６ｄに示されている。図６ｃは、２８日目において、２０〜５０％酸化を有する、ＮｂコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘアルギネート物質のＵＶ−Ｖｉｓスペクトル（上側パネル）および１４日目において、２０％〜５０％コンジュゲーションを有するＮｂコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘ  ＳＣ物質のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示している。図６ｄはまた、これらのＮｂコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘおよびＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート物質を含有するバイアルの写真を示す。データは、４７５ｎｍにおける水平域が、２８日目にＨｉｇｈＯｘアルギネート物質において生成されている一方で、このピークは１４日目にＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート物質に存在しないことを示している。ＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート物質はまた３００ｎｍにおける減少した吸収によって特徴付けられる。これらのデータは、亜塩素酸ナトリウム処理したノルボルネンコンジュゲートした物質が溶液中でより大きな安定性を表していることを示唆している。
【０３０１】
ＴｚコンジュゲートしたおよびＮｂコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘ（２０％および５０％アルデヒド）アンモニアボラン（ＡＢ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＳＢ）、および亜塩素酸ナトリウム（ＳＣ）アルギネート物質に対する１５日目のＵＶ−Ｖｉｓスペクトル（室温で貯蔵された４％ｗ／ｖ溶液）が図６ｊに示されている。スペクトルは、１５日後、ＴｚコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘ物質に対する５１５ｎｍでのピークが保持され、ＮｂコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘ物質に対して３００ｎｍでの吸収は存在しないことを示している。このデータは、アルギネートアルデヒドの還元またはさらなる酸化から、溶液中のクリックコンジュゲート部分より高い安定性が得られることを示している。
【０３０２】
ＴｚコンジュゲートしたおよびＮｂコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘおよびＨｉｇｈＯｘ  ＳＣ物質はまた、定量的ＮＭＲで調査することによって、これらのアルデヒド含有量を決定した。アルデヒド含有量の定量化は、＞約５．１ｐｐｍにおいて過ヨウ素酸ナトリウムで生成されたプロトンピークを、ジメチルマロン酸（ＤＭＭＡ；６Ｈ＠１．３ｐｍｍ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の内部標準と比較することによって、Ｖａｒｉａｎ  ４００ＭＨｚ上で実施した。試料は、重水素オキシド（Ｄ２Ｏ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において、１５ｍｇ／ｍＬアルギネートおよび２．５ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＭＡで調製した。
【０３０３】
結果は、図６ｅ、６ｆ、６ｇおよび６ｈに示されている。具体的には、図６ｅおよび６ｆは、ＮｂおよびＴｚにそれぞれコンジュゲートした、５０％酸化を有するＨｉｇｈＯｘアルギネート物質のＮＭＲスペクトルを示す。図６ｇおよび６ｈは、ＮｂおよびＴｚにそれぞれコンジュゲートした、５０％アルデヒドを有するＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート物質のＮＭＲスペクトルを示す。データは、ＨｉｇｈＯｘアルデヒドアルギネート物質においてピークの幅の有意な広がりを示し、この物質より動的であることを示している。ＨｉｇｈＯｘアルギネート物質に対するＮＭＲスペクトルはまた、残留アルデヒドの存在を示すピークを含有する。対照的に、ＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート物質に対するＮＭＲスペクトルはシャープなピークを示し、ＨｉｇｈＯｘ  ＳＣ物質におけるより大きな定義付けをし、残留アルデヒドがほぼ不在であることを示している。ＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート物質における残留アルデヒドの不在はまたＦＴＩＲ分析によっても確認されており、ＦＴＩＲスペクトルは図６ｉに示されている。全体的には、データは、クリックコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート物質は、活動性がより低く、より化学的に安定し、ほんの微量の残留アルデヒドを含有するにすぎないことを示す。
【０３０４】
亜塩素酸ナトリウムとの酸化アルギネートの反応条件を評価した。図３ｂに示されているデータを作成するために使用した最初の反応条件は、溶媒として水：ＤＭＳＯの１：１混合物を使用し、ＤＭＳＯは、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）副産物に対するスカベンジャーとして使用した。混合物中のＤＭＳＯ含有量を３３：１  水：ＤＭＳＯに変化させることによって、反応をさらに完了まで駆動させた。最適条件で生成されたＨｉｇｈＯｘ  ＳＣアルギネート物質に対するＮＭＲスペクトルが図６ｋに示されており、これは、これらの条件下で、亜塩素酸ナトリウムを用いてアルデヒドをさらに処理した後、２０％および５０％酸化を有する物質中に有意な残留アルデヒドが全く存在しないことを実証している。
（実施例６）
クリックコンジュゲートした酸化アルギネートのゲル化。
【０３０５】
ヒドロゲルを形成する能力について、２０〜５０％酸化を有するクリックコンジュゲートしたＨｉｇｈＯｘおよびＨｉｇｈＯｘ  ＳＣ物質を調査した。補完的酸化度の調製物（例えば２０％アルデヒド−ＴＺおよび２０％アルデヒド−Ｎｂ）を１０％（ｗ／ｖ）で作製し、混合し、２０分間ゲル化させた。図８ａおよび８ｂは、過ヨウ素酸酸化し、還元し（ＡＢ、ＳＢ）、さらに酸化した（ＳＣ）物質が、時間の関数として溶液中で分解し（例えば透析滞留時間）、ヒドロゲル形成を制限することを実証している。したがって、ゲル化を増強するために、この処理を修正して、透析をタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）と置き換えることによって、溶液滞留時間を最小限に抑えている。
【０３０６】
図８ｃは、ＨｉｇｈＯｘおよびＨｉｇｈＯｘ  ＳＣ物質の溶解度は、％酸化の関数として増加し、ＨｉｇｈＯｘ  ＳＣ物質に対して最も高いことを実証している。
（実施例７）
酸化および還元されたアルギネートのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分解および溶解度。
【０３０７】
この実験の目的は、さらなる還元処理（すなわち、水素化ホウ素ナトリウムまたはアンモニアボランとの反応）または酸化処理（すなわち、亜塩素酸ナトリウムでの還元）後のクリックコンジュゲーション有りおよび無しでの酸化アルギネートの分解および溶解度について調査することであった。
【０３０８】
クリックコンジュゲートしたアルギネート物質（ＭＶＧアルギネート、２８０ｋＤａ）は、アルギネートを過ヨウ素酸ナトリウムに反応させ、これに続いて、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で沈殿させることによって調製した。次いで、沈殿した物質を、水素化ホウ素ナトリウムまたはアンモニアボランのいずれかと反応させることによってこれを還元するか、または亜塩素酸ナトリウムと反応させることによってさらに酸化させ、さらに１日間透析した。次いで、これを、ＴｚまたはＮｂとコンジュゲートし、再度１日間透析した。
【０３０９】
クリックとコンジュゲートしていない対照アルギネート物質（ＶＬＶＧアルギネート、３０ｋＤａ）を、アルギネートを過ヨウ素酸ナトリウムと反応させて、これに続いて３日間透析することによって調製した。次いで、透析した物質を、水素化ホウ素ナトリウムまたはアンモニアボランのいずれかと反応させることによって還元するか、またはこれを亜塩素酸ナトリウムと反応させることによってさらに酸化し、さらに３日間透析した。
【０３１０】
次いで、ＭＶＧおよびＶＬＶＧアルギネート物質を３７℃で２９日間までインキュベートし、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で分析して、アルギネート物質の平均分子量を決定した。この目的を達成するために、ＰＢＳ中アルギネート物質濃度２ｍｇ／ｍＬで試料を調製した。次いで、Ｇ４０００ＰＷｘｌおよびＧ５０００ＰＷｘｌカラムを直列に備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０ＨＰＬＣを使用して試料を分析した。１００μＬの注射を使用して、０．５ｍＬ／分の流速で、０．１Ｍナトリウム硝酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）移動相、カラムを用いて、３５℃の検出温度で分析を行った。三重検出を使用して、試料を較正したＰＥＯ標準物質（３４ｋＤａ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と比較した。
【０３１１】
結果は図７ａおよび７ｂに示されている。具体的には、図７ａは、２０％酸化（左パネル）および５０％酸化（右のパネル）を有する、ＴｚコンジュゲートしたおよびＮｂコンジュゲートしたＭＶＧアルギネートの分解を示している。データは、還元処理したＭＶＧアルギネート（ＡＢ、ＳＢ）およびさらに酸化した（ＳＣ）物質はすべて分解性を表していることを示している。
【０３１２】
図７ｂは、未処理のアルギネート（上側の左のパネル）、アンモニアボランで還元処理したアルギネート（上側の右のパネル）、水素化ホウ素ナトリウムで還元処理したアルギネート（下側の左のパネル）、および亜塩素酸ナトリウムで処理したアルギネート（下側の右のパネル）に対する、３７℃での、０％〜５０％酸化を含有するＶＬＶＧアルギネートの分解を示す。データは、還元およびさらに酸化した物質が、過ヨウ素酸酸化物質対照と同様の分解プロファイルを表していることを示している。
【０３１３】
図７ｃは、アンモニアボランまたは亜塩素酸ナトリウムのいずれかで２０％酸化処理したＭＶＧ（２８０ｋＤａ）物質の５０％ｗ／ｖ溶液を含有するバイアルの写真である。５０％（ｗ／ｖ）の未酸化ＶＬＶＧ（３０ｋＤａ）が対照として提供されている。未酸化ＭＶＧは約５％ｗ／ｖまでしか溶解しないが、未酸化ＶＬＶＧは約１０％ｗ／ｖに溶解する。驚くことに、この写真は、アンモニアボランおよび亜塩素酸ナトリウム処理した両方の物質（ＶＬＶＧと同様の分子量を有する、図８ａを参照されたい）が５０％ｗ／ｖで容易に溶解することを示している。データは、亜塩素酸ナトリウムでさらに酸化したＴｚコンジュゲートしたおよびＮｂコンジュゲートしたＭＶＧ物質が最も溶解性があることを示している。
（実施例８）
テトラジンおよびノルボルネンに対するクリックコンジュゲーションの上限。
【０３１４】
この実験の目的は、実施例７に記載の通り調製したＶＬＶＧ物質に対するクリックコンジュゲーションの上限を決定することであった。同様に実施例７に記載の通り調製したＭＶＧ物質は、コンジュゲーション反応において２５０モル当量のクリック物質を使用して、１モノマー単位当たりのクリック部分の数として定義された、およそ５％の置換度（ＤＳ）を得ており、Ｔｚに対する上限は約７．５％であり、Ｎｂに対する上限は２０％であった。この実験では、未酸化ＶＬＶＧ物質を、異なる当量のＴｚまたはＮｂと反応させ、％ＤＳをｑＮＭＲで測定した。データは以下の表に示されている。ノルボルネンＮＭＲピークは、より高いモル当量において有意に拡大しており、したがってノルボルネンに対する値は、過剰報告されたと想定される（ＯＲ）。
【０３１５】
【表１】
2019502652.tif 000018
【０３１６】
テトラジンコンジュゲーションはまた、図８に示されている通り、ＵＶ−Ｖｉｓ分光分析を使用して測定された。データは、テトラジンに対する置換度が６００〜１２００テトラジン同等物との反応に対して直線的であることを示している。これらのデータは、より低い分子量のアルギネートを使用することにより、さらに大きな置換度を得ることができ、上限にはまだ到達していないことを示している。この実験を還元およびさらに酸化された物質まで拡大することによって、これらのコンジュゲーションの可能性の上限、したがって架橋密度を決定する。
（実施例９）
酸化アルギネート中に存在するアルデヒドの細胞生存度に対する作用。
【０３１７】
この実験のゴールは、酸化アルギネート中に存在するアルデヒドの存在下で相対的細胞生存度を決定することであった。この目的を達成するために、アルギネートを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化することによって、０〜５０％酸化を有するアルギネート物質を含有するアルデヒドを生成した。続いて、１０ｍｇのこの物質を、１０％ウマ血清を有するＤＭＥＭ中で、５×１０５マウス白血病細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１９、ｎ＝１）と直接２日間インキュベートした。ＭＵＳＥ  細胞カウントおよび生存率アッセイキットを使用して、生存細胞数を定量化した。０％酸化に対して正規化したデータは、以下の表において、また図９においてグラフで示されている。
【表２】
2019502652.tif 000019
データは、１５％酸化までは、細胞生存度がアルデヒドによる影響を受けず、２５％および５０％酸化において、急速に低下し始めることを示している。
（実施例１０）
酸化アルギネートの溶解度
【０３１８】
この実験の目的は、クリックコンジュゲーションを有する酸化アルギネートの溶解度を、非酸化アルギネートの溶解度と比較することであった。図１０は、分子量２５０ｋＤａを有する未酸化アルギネート（ＭＶＧ）；分子量３０ｋＤａを有する未酸化アルギネート（ＶＬＶＧ）に対する；ならびに２０％に酸化し、次いで、亜塩素酸ナトリウムを使用してさらに酸化し、クリック（ＴｚまたはＮｂ）とコンジュゲートして約３０ｋＤａの分子量を有する最終生成物を生成する、３０ｋＤａの分子量（ＶＬＶＧ）を有するアルギネート（ＭＶＧ）に対する溶解度（％ｗ／ｖ）を示す棒グラフである。この実験に使用したＶＬＶＧ物質は、図７ｃのバイアル５に示されている。この実験に使用したクリックコンジュゲートした、およびナトリウム処理したアルギネート物質が図７ｃのバイアル３および４において示されている。
【０３１９】
図１０に提示されたデータは、未酸化ＭＶＧは約５％ｗ／ｖのみに溶解し、未酸化ＶＬＶＧは約１０％ｗ／ｖに溶解し、クリックコンジュゲートした、亜塩素酸ナトリウム処理したアルギネートは約５０％溶解することを示している。データは、アルゴキサラート含有アルギネート、および、程度はわずかにより低いが、アルゴキシノール（ａｌｇｏｘａｌｏｌ）を含有するアルギネートは、未酸化のアルギネートと比較して有意に増加した溶解度によって特徴付けられることを実証している。
（実施例１１）
架橋の可能性に対するアルギネートの溶解度の影響
【０３２０】
この実験の目的は、２５０ｋＤａ（ＭＶＧ）および３０ｋＤａ（ＶＬＶＧ）の分子量を有する未酸化アルギネートに対してＴｚコンジュゲーションの上限を決定することであった。ＭＶＧ物質は、そのより高い分子量によりＶＬＶＧ物質より、さらに粘性であり、溶解性が低い。この実験は、実施例８に記載されている実験的手順を使用して行った。
【０３２１】
図１１ａは、ＭＶＧおよびＶＬＶＧ物質に対して達成されたＴｚコンジュゲーションの上限を示す棒グラフである。図１１ａのデータは、溶解性の低いＭＶＧ物質は最大約５００モル当量のＴｚにコンジュゲートすることができる一方で、より溶解性のあるＶＬＶＧ物質は最大約２５００モル当量のＴｚにコンジュゲートすることができることを実証している。したがって、ＶＬＶＧ物質がより高い溶解度を有することから（より低い分子量により）より高いクリック置換度が可能となる。このコンジュゲーションの可能性は、アルゴキシノールおよび／またはアルゴキサラート含有アルギネートの使用を介して、そのさらにより低い粘度により、さらに拡大することができる。
【０３２２】
図１１ｂは、ＶＬＶＧ物質の置換度をモル当量のＴｚの関数として示すグラフである。試験した物質は、５００、１０００、１５００、２０００および２５００モル当量のＴｚと反応させたＶＬＶＧであった。これは、ＶＬＶＧ物質に対するＴｚコンジュゲーションの上限は、約２５００当量のＴｚにおいて達成されたことを実証している。
（実施例１２）
クリックコンジュゲートしたアルギネート物質のゲル化速度に対するアルギネート濃度およびクリック置換度の影響
【０３２３】
この実験の目的は、レオロジー測定を使用して、クリックコンジュゲートしたアルギネート物質のゲル化速度を、アルギネート濃度、酸化度およびクリック置換度の関数として研究することであった。この実験は、５００、１５００および２５００モル当量のＮｂまたはＴｚを含有するコンジュゲーション反応を使用して、ＮｂおよびＴｚとコンジュゲートした非酸化ＶＬＶＧ物質を利用した。この実験はまた、過ヨウ素酸ナトリウムを使用して１０％または２０％酸化に酸化し、アンモニアボランで還元処理し、次いで、コンジュゲーション反応において２５０モル当量のＮｂおよびＴｚを使用してＮｂおよびＴｚとコンジュゲートしたＭＶＧ物質を利用した。またこの実験で使用したのは、過ヨウ素酸ナトリウムを使用して２０％酸化に酸化し、アンモニアボランで還元処理し、次いでコンジュゲーション反応において１０００モル当量のＮｂおよびＴｚを使用してＮｂまたはＴｚにコンジュゲートしたＬＦ  ２０／４０アルギネート物質であった。
【０３２４】
クリックコンジュゲートしたアルギネート物質のゲル化は、レオロジー測定を使用して、弾性率Ｇ’の値を測定することによって決定した。この目的を達成するために、所望の最終濃度（ＰＢＳ中５％、１０％、１５％または２０％ｗ／ｖ）のＡｌｇ−ＮおよびＡｌｇ−Ｔ溶液を１：１比率で混合し、ピペットで直接取って、２０ｍｍの平坦な上側プレートの形状および４００ミクロン形状のギャップを備えたＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＲＧ２レオメーターの下側プレート上に置いた。Ｐｅｌｔｉｅｒクーラーを使用して、温度依存性実験に対して温度を制御し、水リザーバーカバーをゲルの上に配置して、試験中にヒドロゲルが乾燥するのを防いだ。ヒドロゲル試料を１Ｈｚにおいて１％歪みの対象下におき、貯蔵および損失弾性率（Ｇ’およびＧ”）を１時間モニターした。
【０３２５】
図１２ａは、試験した異なるＶＬＶＧ物質に対する弾性率Ｇ’対時間における増加を示すグラフである。このデータは異なる物質がゲル化するのにどれだけかかるかを有効に実証し、水平域はゲル様状態が達成されたことを示している。データは、クリック置換度の増加は、より急速なゲル化もたらすことを示している。
【０３２６】
図１２ｂは、試験した異なるＶＬＶＧ物質に対する弾性率Ｇ’の値を示す棒グラフである。左側の黒色で示され、「２％  １：３  ＭＶＧ：ＶＬＶＧ」と示した棒グラフは、対照物質に対応し、これは、カルシウム架橋した、ＭＶＧ：ＶＬＶＧの１：３混合物の２％ｗ／ｖ溶液である。
【０３２７】
図１２ｃは、試験した異なるＶＬＶＧ物質に対するメッシュサイズの値を示す棒グラフである。左側の黒色で示され、「２％  １：３  ＭＶＧ：ＶＬＶＧ」と示した棒グラフは、対照物質に対応し、これは、カルシウム架橋した、ＭＶＧ：ＶＬＶＧの１：３混合物の２％ｗ／ｖ溶液である。
【０３２８】
図１２ｂおよび１２ｃに示されているデータは、クリック置換度の増加は、弾性率Ｇ’の増加に現れているような物質の異なるレオロジー特性および細孔サイズの減少をもたらすことを示している。
【０３２９】
図１２ｄは、１０％酸化に酸化し、アンモニアボランで還元し、次いで２５０モル当量のＮｂおよびＴｚを使用して、ＮｂまたはＴｚとコンジュゲートしたＭＶＧ物質に対する、弾性率（Ｇ’）対時間における増加を示すグラフである。ヒドロゲルは、クリックコンジュゲートした還元アルギネート濃度、５％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖまたは１５％ｗ／ｖで生成した。図１２ｅは、２０％酸化に酸化し、アンモニアボランで還元し、次いで２５０モル当量のＮｂおよびＴｚを使用して、ＮｂまたはＴｚとコンジュゲートしたＭＶＧ物質に対する、弾性率（Ｇ’）対時間における増加を示すグラフである。ヒドロゲルは、クリックコンジュゲートした還元アルギネート濃度、５％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ、１５％ｗ／ｖまたは２０％ｗ／ｖで生成した。図１２ｆは、２０％酸化に酸化し、アンモニアボランで還元し、次いで１０００モル当量のＮｂおよびＴｚを使用して、ＮｂまたはＴｚとコンジュゲートしたＬＦ２０／４０物質に対する、弾性率（Ｇ’）対時間における増加を示すグラフである。ヒドロゲルは、クリックコンジュゲートした還元アルギネート濃度、５％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ、１５％ｗ／ｖまたは２０％ｗ／ｖで生成した。
【０３３０】
図１２ｄ、図１２ｅおよび図１２ｆのデータは、還元アルギネートの濃度の増加は、クリックコンジュゲートしたアルギネートのゲル化の時間を減少させることを示している。結果は、アルギネート酸化度、クリック試薬の相対量およびクリックコンジュゲーション反応におけるアルギネート濃度を変えることによって、クリックコンジュゲートしたアルギネートのゲル化処理を調整することが可能なことを実証している。
（実施例１３）
タンパク質放出速度に対するクリック置換度の影響
【０３３１】
この実験の目的は、クリックアルギネートヒドロゲルに封入された様々なタンパク質の放出速度に対するクリック置換度の影響を調査することであった。この実験は、実施例１１に記載されているように生成された、ＮｂまたはＴｚとコンジュゲートした、非酸化ＶＬＶＧおよびＭＶＧ物質を利用した。具体的には、２５０、５００、１０００、１５００、２０００および２５００モル当量のＮｂまたはＴｚにおいて、非酸化ＶＬＶＧ物質をＮｂまたはＴｚとコンジュゲートして、ＮｂおよびＴｚコンジュゲートしたアルギネート（Ａｌｇ−ＮおよびＡｌｇ−Ｔ）を生成した。２５０モル当量のＮｂまたはＴｚで、非酸化ＭＶＧ物質をＮｂまたはＴｚとコンジュゲートした。この実験はまた異なる分子量を有するタンパク質、例えば、インスリン（約３．５ｋＤａのＭＷ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、約６７ｋＤａのＭＷ）およびＩｇＧ（約１５０ｋＤａのＭＷ）を利用した。
【０３３２】
クリックコンジュゲートしたアルギネート中にフルオレセイン標識したインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびヒト免疫グロブリン（Ｉｍｕｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）Ｇ（ＩｇＧ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を封入することによって、タンパク質放出曲線を評価した。様々な置換度の冷凍乾燥Ａｌｇ−ＮおよびＡｌｇ−Ｔポリマーを、ＰＢＳ中の所望の最終濃度（４％および５％ｗ／ｖ）まで最初に別々に溶解することによって試料を調製した。目的のタンパク質を加え、タンパク質：アルギネート比１：１０（Ａｌｇ−Ｎ＋Ａｌｇ−Ｔ、ｖ／ｖ）でＡｌｇ−Ｎ溶液と混合した。次いで、この溶液をＡｌｇ−Ｔ溶液と十分に混合し、混合物を少なくとも３０分間ゲル化させた。１ｍＬのＰＢＳを各ゲル化に加え、３７℃でインキュベートすることによって、試料を作り出した。上清を各時間点で置き換えながら、試料を様々な時間点で収集した。４９２ｎｍで励起および５１８ｎｍで発光する蛍光を用いて、プレートリーダーを使用して、上清中のタンパク質含有量を検量線に対して定量化した。
【０３３３】
図１３ａは、異なるクリックコンジュゲーション度で、クリックコンジュゲートしたＶＬＶＧ物質を使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたインスリンの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。図１３ｂは、ヒドロゲル形成（２５００当量の５％ＶＬＶＧ）および線形フィット中、２５００モル当量のＮｂまたはＴｚおよび５％濃度のＡｌｇ−ＮおよびＡｌｇ−Ｔに対応する、図１３ａにおける非水平領域曲線を示すグラフである。図１３ｃは、異なるクリックコンジュゲーション度で、クリックコンジュゲートしたＶＬＶＧ物質を使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたＢＳＡの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。図１３ｄは、ヒドロゲル形成（２５００当量の５％ＶＬＶＧ）および線形フィット中、２５００モル当量のＮｂまたはＴｚおよび５％濃度のＡｌｇ−ＮおよびＡｌｇ−Ｔに対応する、図１３ｃにおける非水平領域曲線を示すグラフである。図１３ｅは、異なるクリックコンジュゲーション度で、クリックコンジュゲートしたＶＬＶＧ物質を使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたＩｇＧの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。図１３ｆは、ヒドロゲル形成（２５００当量の５％ＶＬＶＧ）および線形フィット中、２５００モル当量のＮｂまたはＴｚおよび５％濃度のＡｌｇ−ＮおよびＡｌｇ−Ｔに対応する、図１３ｅにおける非水平領域曲線を示すグラフである。図１３ｇは、Ｃａ２＋で媒介された架橋により生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたインスリン、ＢＳＡおよびＩｇＧの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０３３４】
図１３ａ〜１３ｇに示されているデータは、アルギネートヒドロゲルからのタンパク質放出プロファイルが、アルギネートのクリック置換度により影響され得ることを実証している。具体的には、データは、より高いクリック置換度はヒドロゲルからのタンパク質の「初期バースト」を減少させることを示している。より高いクリック置換度を有するアルギネートを使用することによって、より小さな「メッシュサイズ」を有するヒドロゲルの生成が可能となり、ひいては、これが、より長いタンパク質放出時間の達成を可能にする。例えば、図１３ｂ、１３ｄおよび１３ｆにより証明されるように、最も高いクリック置換度（２５００当量）を有するアルギネートは、数日にわたり直線的なタンパク質放出速度をもたらすヒドロゲルを生成する。対照的に、他の物質から生成されたヒドロゲルは、数日ではなく数時間にわたり、非線形の「バースト」タンパク質放出をもたらす。他の物質の例は、例えば、ＫＳ  Ａｎｓｅｔｈら、Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  Ａ，２００９，９０：７２０−７２９；ＰＰ  Ｋｕｎｄｕら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２０１４，１１２：６２７−６３７；Ｔ．Ｂａｌら、Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  Ｐａｒｔ  Ａ，２０１４．１０２Ａ：４８７−４９５；Ｃ．Ｅ．Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００５，２６：１２５−１３５；Ｙ．Ｍ．Ｌｅｅら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６．１４：８７−９３；Ｃ．Ｐ．Ｃｏｖａｓら、Ｍａｔ．  Ｓｃｉ．  Ａｐｐ．２０１１．２：５０９−５２０；Ｗ．Ｆ．Ｍｉｅｌｅｒら、Ｔｒａｎｓ．  Ａｍ．  Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ．  Ｓｏｃ．，２００８．１０６：２０６−２１４；Ｗ．Ｍ．Ｔｉａｎら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００５．１０２：１３−２２．に記載される。
（実施例１４）
タンパク質放出速度に対するアルギネート酸化度およびアルギネート濃度の影響
【０３３５】
この実験の目的は、クリックアルギネートヒドロゲル中に封入された様々なタンパク質の放出速度に対する、ゲル化処理中のアルギネート酸化度およびアルギネート濃度の影響を調査することであった。この実験は、実施例１に記載されている通り、過ヨウ素酸ナトリウムで５％または１０％酸化に最初に酸化されたＬＦ２０／４０アルギネート物質を利用した。続いて、実施例２に記載されている手順を使用して、酸化ＬＦ２０／４０アルギネートをアンモニアボラン（ＡＢ）で還元処理するか、または亜塩素酸ナトリウム（ＳＣ）でさらに酸化した。次いで、２０００モル当量のＮｂまたはＴｚ、および実施例４に記載されている手順を使用して、この物質をＮｂまたはＴｚとコンジュゲートした。続いて、この物質を使用して、ヒドロゲルを生成し、インスリンまたはＩｇＧを５％または１０％ｗ／ｖアルギネート濃度で封入した。実施例１３に記載されている通り、タンパク質放出プロファイルをモニターした。
【０３３６】
図１４ａは、５％または１０％に酸化させ、次いで、ＡＢで還元処理した、５％ｗ／ｖの濃度でクリックコンジュゲートしたＬＦ２０／４０アルギネートを使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたインスリンの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０３３７】
図１４ｂは、５％または１０％に酸化させ、次いで、ＳＣで酸化処理した、５％ｗ／ｖの濃度でクリックコンジュゲートしたＬＦ２０／４０アルギネートを使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたインスリンの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０３３８】
図１４ｃは、５％または１０％に酸化させ、次いで、ＡＢで還元処理した、５％ｗ／ｖの濃度でクリックコンジュゲートしたＬＦ２０／４０アルギネートを使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートＩｇＧの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０３３９】
図１４ｄは、５％または１０％に酸化させ、次いで、ＳＣで酸化処理した、５％ｗ／ｖの濃度でクリックコンジュゲートしたＬＦ２０／４０アルギネートを使用して生成されたヒドロゲルからのフルオレセインコンジュゲートしたＩｇＧの累積放出（単位：マイクログラム）を示すグラフである。
【０３４０】
図１４ａ〜１４ｄのデータは、タンパク質放出プロファイルの調整は、ゲル化処理中、ＡｂおよびＳＣで処理した物質に対するアルギネート酸化度およびアルギネート物質の濃度を変えることによって達成することができることを示している。
（実施例１５）
酸化アルギネート中に存在するアルデヒドのクリック部分に対する作用。
【０３４１】
この実験のゴールは、アルデヒドの存在下でアルギネートへコンジュゲートしたクリック部分の安定性を決定することであった。この目的を達成するために、２５０当量のクリック物質を使用したコンジュゲーション反応において非酸化ＭＶＧ物質をＮｂまたはＴｚにコンジュゲートし、続いて２．３％のグルタルアルデヒドに曝露した。バイアルを色の変化について６９時間まで観察した。図１５ａは、２．３％グルタルアルデヒドの存在下、０分後、４０分後、２１．５時間後および６７．５時間後に採取された、Ｎｂ（左バイアル）およびＴｚ（右のバイアル）へコンジュゲートした、４％ＭＶＧ物質を含有するガラスバイアルの一連の写真である。図１５ｂは、０分後、４０分後、２０時間後および６９時間後に採取した、対照としての水（左バイアル）またはＤＢＣＯ（中央バイアル）もしくはアジド（右のバイアル）へコンジュゲートした、２％ＭＶＧ物質を含有するガラスバイアルの一連の写真である。図１５ａのデータは、アルデヒドへの曝露の４０分後、ＮｂおよびＴｚの分解が観察されたことを示している。ＤＢＣＯおよびアジドの分解は、より長い時間がかかるが、図１５ｂのデータにより証明されるように２０時間後に観察された。アルデヒドはアルギネートの酸化により生成されるので、この実験は、アルギネートにコンジュゲートしたクリック部分は、アルギネートの酸化により分解することが予想されることを実証している。したがって、クリック部分の安定性を維持するために、アルデヒドは、例えば、アンモニアボランによる還元を使用して還元により排除するか、または、例えば、亜塩素酸ナトリウムによるさらなる酸化を使用して酸化により排除しなければならない。
（実施例１６）
アルギネートヒドロゲルによるリポソームの封入および保持
【０３４２】
この実験の目的は、クリックコンジュゲートしたアルギネートから生成されたヒドロゲルの、リポソームを封入する能力およびｉｎ  ｖｉｖｏでインタクトなリポソームの持続的および局在的送達を提供する能力を調査することであった。この実験は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）およびコレステロール（ＣＨＯＬ）から、ＤＯＰＣ／ＣＨＯＬの比５５：４５および全脂質濃度５０ｍＭで調製した市販のリポソームを利用した。リポソームはまた、蛍光色素１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（Ｄｉｌ）を０．５ｍＭ（０．４７ｍｇ／ｍＬ）の濃度で含有し、１３３ｎｍの平均直径を有した。ＣａＳＯ４および２％または５％ｗ／ｖのアルギネート濃度でのリポソームの存在下、非酸化ＭＶＧ物質から架橋により調製したヒドロゲル中にリポソームを封入した。リポソームはまた、２５０モル当量のＮｂまたはＴｚを使用してＮｂまたはＴｚにコンジュゲートした非酸化ＭＶＧ物質から調製したヒドロゲル中に封入し、５％ｗ／ｖのアルギネート濃度でのリポソームの存在下でゲル化した。最後に、リポソームはまた、例えば、Ｋｏｓｈｙら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１６年、５巻、５号、５４１〜５４７頁に記載の通り調製した、クリックコンジュゲートしたゼラチンから調製したヒドロゲル中に封入した。上清中のＤｉｌ蛍光の増加を測定することによって、ヒドロゲルからのリポソームの放出をｉｎ  ｖｉｔｒｏでモニターした。５５０ｎｍで励起、５８０ｎｍで発光する蛍光を用いて、プレートリーダーを使用して、検量線に対して上清タンパク質含有量を定量化した。
【０３４３】
図１６ａは５０日間にわたるＣａ２＋架橋アルギネートからの、および非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートからのリポソームの累積放出（％負荷）を示すグラフである。図１６ｂは、Ｃａ２＋架橋アルギネートヒドロゲル、非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルおよびクリックゼラチンヒドロゲルからのリポソームの累積放出（％負荷）を示すグラフである。これらの結果は、クリックゼラチンヒドロゲルからのリポソームの定量的な放出が３０日後に観察されたことを示している。対照的に、アルギネートヒドロゲルは、リポソームを保持することにおいてより有効であった。具体的には、非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルはリポソーム負荷量の少なくとも約９５％を５０日後に保持していた一方で、Ｃａ２＋架橋したアルギネートヒドロゲルは、４０日後にリポソーム負荷量の約８５％を保持していた。このデータは、試験したヒドロゲルの中で、非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルが、４０日またはそれよりも長い期間にわたりリポソームを保持することにおいて最も有効であることを実証している。
【０３４４】
図１６ｃは、２８日間の期間にわたる、Ｃａ２＋架橋アルギネートからの、および５％ｗ／ｖのアルギネート濃度で調製した非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルからのリポソームの累積放出（％負荷）を示すグラフである。リポソーム放出プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＰＢＳ−−（Ｃａ２＋またはＭｇ２＋イオンを含有しないＰＢＳ緩衝液）中で測定した。
【０３４５】
図１６ｃのデータは、２８日後、リポソーム負荷量の約６０％がＣａ２＋架橋したアルギネートヒドロゲルから放出されたことを示している。リポソームの存在下でのアルギネートのカルシウム架橋は、封入されたリポソームに対して有意な異質性および剪断応力をもたらし、リポソームを放出させることになる。対照的に、非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルはそのリポソーム負荷量を少なくとも２０日間保持することが可能である。
【０３４６】
図１６ｄは、８日間の期間にわたる、非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルおよびクリックコンジュゲートしたゼラチンヒドロゲルからのリポソームの累積放出（％負荷）を示すグラフである。アルギネートを消化することが可能なアルギネートリアーゼの添加は、非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルからのリポソームの急速放出をもたらす。ゼラチンを消化することが可能なコラゲナーゼの添加は、クリックコンジュゲートしたゼラチンヒドロゲルからのリポソームの急速放出をもたらす。クリックコンジュゲートしたゼラチンヒドロゲルは、コラゲナーゼがｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば、ヒト体内の至る所に存在するため、ｉｎ  ｖｉｖｏで分解することが予想されている。対照的に、アルギネートリアーゼはｉｎ  ｖｉｖｏの至る所に存在しない、したがって、アルギネートヒドロゲルは、非酸化された場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでインタクトなままであると予想されている。酸化では、アルギネート分解はｐＨ依存性である。
（実施例１７）
封入後のリポソームのインタクト性
【０３４７】
この実験の目的は、リポソームがインタクトなままである能力、例えば、封入後これらの直径を維持し、異なるヒドロゲルにより回収される能力を評定することであった。この実験で試験したヒドロゲルは、実施例１６に記載されているような、カルシウム架橋したアルギネートヒドロゲル、非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルおよびクリックコンジュゲートしたゼラチンヒドロゲルを含む。リポソームのサイズは動的光散乱（ＤＬＳ）で測定した。
【０３４８】
図１７ａは、ストック標準の動的光散乱（ＤＬＳ）トレースである。
【０３４９】
図１７ｂは、アルギネートリアーゼにより８日後消化された非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルから放出された、リポソームのＤＬＳトレースである。
【０３５０】
図１７ｃは、ＰＢＳ−−緩衝液中５％ｗ／ｖのアルギネート濃度で調製した非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルから２８日後放出された、リポソームのＤＬＳトレースである。
【０３５１】
図１７ｄは、８日後コラゲナーゼで消化されたクリックコンジュゲートしたゼラチンヒドロゲルから放出された、リポソームのＤＬＳトレースである。
【０３５２】
図１７ｅは、ＰＢＳ−−緩衝液中で調製したカルシウム架橋アルギネートから３日後放出された、リポソームのＤＬＳトレースである。
【０３５３】
図１７ｆは、ＰＢＳ−−緩衝液中５％ｗ／ｖのアルギネート濃度で調製したカルシウム架橋ヒドロゲルから２８日後放出された、リポソームのＤＬＳトレースである。
【０３５４】
図１７ａ〜１７ｆのデータは、クリックコンジュゲートしたアルギネートまたはゼラチンヒドロゲルから放出されたリポソームは、リポソーム標準と同様のサイズであることを実証し、これは、２８日後、これらがインタクトなままであることを示している。対照的に、カルシウム架橋したアルギネートヒドロゲルから放出されたリポソームは、リポソーム標準と比較して、実質的により大きな範囲のサイズを有する。これは、カルシウム架橋処理中、リポソームが剪断力により引き裂かれ、続いて溶液中でコンフルエンスに達し、より大きなサイズのリポソーム粒子をもたらしていることを示唆する。カルシウム架橋はまた弱いカルシウム分布により有意な異質性を導入する。
（実施例１８）
リポソームを保持するアルギネートヒドロゲルの能力に対する、アルギネート酸化度の影響
【０３５５】
この実験の目的は、封入されたリポソームを保持するこれらの能力に対する、アルギネートヒドロゲルのアルギネート酸化度の影響を評定することであった。この実験は、クリックコンジュゲーション反応において２５０当量のＮｂまたはＴｚを使用して、ＮｂまたはＴｚに架橋したＭＶＧアルギネート物質から調製したアルギネートヒドロゲルを利用した。クリックコンジュゲーション前に、アルギネートを、全酸化０％、５％または１０％に酸化させ、次いで、実施例１および２に記載されている手順を使用して、ＡＢで還元処理した。実施例１６に記載されているリポソームをヒドロゲルに封入し、上清中のＤｉｌ蛍光の増加を７５日の期間にわたり測定することによって、これらの放出をｉｎ  ｖｉｔｒｏでモニターした。
【０３５６】
図１８は、０％、５％および１０％の全酸化まで酸化させ、クリックコンジュゲーション前にＡＢで還元処理したクリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルからの、７５日にわたるリポソームの累積放出（％負荷）を示すグラフである。図１８の結果は、クリックコンジュゲーション前の、アルギネートの５％または１０％への酸化およびその後のアルギネートの還元は、検出可能なリポソームの放出はあるが、７５日の期間にわたるリポソームの保持を可能にする一方で、非酸化アルギネートは、７５日にわたり約３％のリポソームを放出していることを実証している。したがって、アルギネートの酸化は、アルギネートヒドロゲルによるリポソームの保持を改善する。
（実施例１９）
アルギネートヒドロゲルの安定性に対する、ｐＨの影響
【０３５７】
この実験の目的は、ｐＨの関数としてのアルギネートヒドロゲルからのリポソームカーゴの放出を調査することであった。アルギネート生分解は酸またはアルカリにより媒介されるため、アルギネートヒドロゲルからのリポソームカーゴの放出をｐＨ５（０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液中）およびｐＨ９（０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液中）において、１４日間にわたりモニターした。第１にＭＶＧアルギネートを２０％酸化に酸化し、続いてアンモニアボランを使用してこの物質を還元することによって、試料を調製した。７日後、ｐＨ９の試料は大半が分解し、１４日後、ｐＨ５試料もまた分解したことが判明した。
【０３５８】
図１９ａは、０日目における、アンモニアボランで還元された２０％酸化ＭＶＧを含む封入されたリポソームを有するヒドロゲル、ヒドロゲルおよび上清を含有するチューブの写真である。図１９ｂは、１日目における、アンモニアボランで還元された２０％酸化ＭＶＧを使用して調製された封入されたリポソームを有するヒドロゲル、および上清を含有するチューブの写真である。図１９ｃは、７日目における、アンモニアボランで還元された２０％酸化ＭＶＧを使用して調製された封入されたリポソームを有するヒドロゲル、および上清を含有するチューブの写真である。図１９ｄは、１４日目における、アンモニアボランで還元された２０％酸化ＭＶＧを使用して調製された封入されたリポソームを有するヒドロゲル、および上清を含有するチューブの写真である。図１９ｅは、アルギネートを２０％まで酸化させ、続いてこれをアンモニアボランで還元することによって生成されたアルギネートヒドロゲルからの、中性リポソーム（ＤＯＰＣ：コレステロール）の分解ベースの放出を示すグラフである。試料は、腫瘍周囲の微細環境を模倣するためにＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５中で放出された。
【０３５９】
図１９ａ〜１９ｄの結果は、アルギネートは分解され、リポソームは酸性ｐＨ（ｐＨ５）または塩基性ｐＨ（ｐＨ９）において上清に拡散されているが、中性ｐＨ（７）では拡散されないことを実証している。したがって、クリックアルギネートヒドロゲルからのリポソーム放出はｐＨ感受性であり、リポソームカーゴの分解媒介性放出を可能にする。
（実施例２０）
アルギネートヒドロゲルによるカチオン性リポソームの封入および保持
【０３６０】
以前の実験（例えば、実施例１６に記載されている実験）は中性であるＤＯＰＣ／ＣＨＯＬリポソームを利用した。この実験の目的は、荷電したリポソーム、例えば、カチオン性リポソームを封入および保持するアルギネートヒドロゲルの能力を調査することであった。この実験は、１３３ｎｍの平均直径を有するＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル−硫酸塩（ＤＯＴＡＰ）および水素化ダイズホスファチジルコリン（Ｈｙｄｒｏ  Ｓｏｙ  ＰＣ）を含有するカチオン性リポソームを利用した。リポソームはまた、蛍光色素１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（Ｄｉｌ）を含有した。これらのリポソームは、カルシウム架橋したアルギネート物質内に、およびコンジュゲーション反応において２５０モル当量のクリック試薬を利用した非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネート内に封入した。ヒドロゲルからのカチオン性リポソームの放出を実施例１６に記載されている通りモニターした。
【０３６１】
図２０ａはＤＯＴＡＰ：押出し前のＨｙｄｒｏ  Ｓｏｙ  ＰＣリポソームのＤＬＳトレースであり、図２０ｂは、押出し後の同じリポソームのＤＬＳトレースである。図２０ａおよび２０ｂは、押出しを使用して、均一サイズのカチオン性リポソームを調製することが可能であることを実証している。
【０３６２】
図２０ｃは、Ｃａ２＋架橋アルギネートからの、および非酸化クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルからの１７日間にわたるカチオン性リポソームの累積放出（％負荷）を示すグラフである。図２０ｃの結果は、クリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルは、１７日の期間にわたりカチオン性リポソームを封入し、有効に保持することができることを実証している。対照的に、カチオン性のリポソームのカルシウム架橋したアルギネートヒドロゲルからの放出はわずか２日後には明らかとなる。
（実施例２１）
アルゴキシノールおよびアルゴキサラート複合クリックヒドロゲルからのタンパク質放出プロファイル
【０３６３】
この実験のゴールは、クリックコンジュゲートした、異なる酸化および還元アルギネート物質を使用して調製したヒドロゲルからの異なるタンパク質放出プロファイルを評価することであった。アルギネートヒドロゲルを調製するために使用した組成物は以下を含んだ：ａ）５０％酸化し、続いて亜塩素酸ナトリウムで酸化し、２０００当量で、Ｔｚとコンジュゲートした等分の１０％ｗ／ｖでのＭＶＧ、および１０％酸化し、続いてアンモニアボランで還元し、２０００当量でＮｂとコンジュゲートした１０％ｗ／ｖのＭＶＧ；ｂ）５０％酸化し、続いてアンモニアボランで還元し、２５０当量でＴｚとコンジュゲートした、等分の１０％ｗ／ｖでのＭＶＧ、ならびに１０％酸化し、続いてアンモニアボランで還元し、２５０当量でＮｂとコンジュゲートした１０％ｗ／ｖでのＭＶＧ；ｃ）１０％酸化し、続いてアンモニアボランで還元し、２０００当量でＮｂとコンジュゲートした、７部の１０％ｗ／ｖでのＭＶＧ、および５０％酸化し、続いてアンモニアボランで還元し、２０００当量でＴｚとコンジュゲートした、３部の１０％ｗ／ｖでのＭＶＧ；ならびにｄ）３部のＭＶＧおよび硫酸カルシウムで架橋した１部のＭＶＧ。
【０３６４】
ヒトＩＧＦおよびヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を様々なクリックヒドロゲルに封入することにより、タンパク質放出曲線を評価した。試料は、最初に、様々な置換度の冷凍乾燥Ａｌｇ−ＮおよびＡｌｇ−Ｔポリマーに、ＰＢＳ中の所望の最終濃度（ｗ／ｖ）で別々に溶解することにより調製した。タンパク質を加え、２μｇ／ゲル（１００μＬ）の最終濃度に到達するまでＡｌｇ−Ｎ溶液と混合した。タンパク質−Ａｌｇ−Ｎ溶液をＡｌｇ−Ｔ溶液と十分に混合し、少なくとも３０分間ゲル化させた。１％ＢＳＡを有する１ｍＬのＰＢＳを各ゲルに加え、３７℃でインキュベートすることによって、試料を作り出した。各時間点で上清を置き換えながら、試料を様々な時間点で収集した。ヒトＶＥＧＦおよびＩＧＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、同等の試料マトリックス（それぞれ１％ＢＳＡ含有ＰＢＳおよび５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）の検量線を使用して、ＶＥＧＦおよびＩＧＦを有する上清タンパク質含有量を定量化した。
【０３６５】
図２１ａは、様々なアルギネート組成物を使用して調製したクリックコンジュゲートしたアルギネートヒドロゲルからのＩＧＦ−１の放出を示すグラフである。図２１ｂは、様々なアルギネート組成物を使用して調製したクリックアルギネートヒドロゲルからのＶＥＧＦ１６５の放出を示すグラフである。
【０３６６】
図２１ａおよび２１ｂのデータは、異なるアルギネート組成物を使用して調製した、クリックゲルを使用して、ＩＧＦ−１およびＶＥＧＦ１６５のバースト放出を調整する能力を示している。対照的に、カルシウム架橋したアルギネートヒドロゲルは、拡散を調整することができない。この実施例は、アルゴキシノールとアルゴキサラート含有アルギネート、アルギネート置換度、アルギネート濃度、およびＮｂとＴｚの比の様々な組合せを介してタンパク質放出を調整することが可能であることを実証している。
（実施例２２）
アルギネート溶液の粘度
【０３６７】
この実験のゴールは、アルギネート酸化および／または還元の関数としてクリックコンジュゲートしたアルギネート溶液の粘度を調査することであった。この目的を達成するために、最初に、ｄｄＨ２Ｏ中の所望の最終濃度（ｗ／ｖ）まで冷凍乾燥Ａｌｇ−ＮおよびＡｌｇ−Ｔポリマーを別々に溶解することによって、クリックアルギネート溶液を相対粘度について評価した。溶液を直接ピペットで取って、２０ｍｍ平坦な上側プレート形状および４００ミクロン形状のギャップを備えた、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＲＧ２レオメーターの下側プレート上に置いた。Ｐｅｌｔｉｅｒクーラーを使用して、温度（２０℃）を制御した。アルギネート試料を、０．１および１Ｈｚの間の歪みの対象下においた。
【０３６８】
図２２は、異なるアルギネート濃度（％ｗ／ｖ）、酸化度、亜塩素酸ナトリウムまたはアンモニアボランのいずれかでの処理における、様々なアルギネート溶液の相対粘度を示す棒グラフである。粘度は、アルゴキシノールまたはアルゴキサラートのいずれかを含有するアルギネートへのクリックコンジュゲーションにより実質的に減少し、水の粘度と同等である（２５℃で０．８９０ｃＰａ）のに対して、酸化なしでの、ＭＶＧへのクリックコンジュゲーションは粘度における実質的な差異をもたらさないことをデータは実証している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ−１】
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【図６Ｋ−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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