(57)【要約】  本出願は、一般に、Ｆｖドメインの特異的抗原結合特性を有するポリペプチド、例えば、抗体の挿入可能な可変フラグメント、およびＮＫＧ２Ｄリガンドの改変型α１−α２ドメインの生産に関する。本出願はさらに、ポリペプチド、いくつかの実施形態では、抗体または抗体のフラグメントに付着されたＮＫＧ２Ｄリガンドの改変型α１−α２ドメインに関する。本出願はさらに、２つのリンカー領域と分割された可変ドメインを含む、軽鎖および重鎖抗体可変ドメインに由来する抗原結合ペプチドに関する。
2019523016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物非変性ＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）分子由来の非天然、改変型α１−α２ドメイン分子であって、前記ＭＩＣ分子の非変性α１−α２ドメインと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、その非変性アミノ酸のうち２個以上が２０番、６８番、１２５番、１５２番、１６１番、および１６６番からなる群から選択される位置で置換されている、改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項２】
前記非変性ＭＩＣ分子が配列番号６４〜７６からなる群から選択される、請求項１に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項３】
非変性α１−α２ドメインに比べてヒトＮＫＧ２Ｄに対するその結合親和性を変更するように改変されている、請求項１に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項４】
そのＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性の変更が解離速度の変更によって達成される、請求項３に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項５】
そのＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性の変更がより遅い解離速度によって達成される、請求項３に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項６】
２０番の位置のアミノ酸がＰ、Ｔ、Ｄ、Ａ、Ｌ、もしくはＮであり；
６８番の位置のアミノ酸がＬ、Ｆ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｉ、Ｅ、Ｔ、もしくはＷであり；
１２５番の位置のアミノ酸がＬ、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｙ、Ｉ、もしくはＳであり；
１５２番の位置のアミノ酸がＥ、Ｔ、Ｖ、Ｇ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｍ、もしくはＰであり；
１６１番の位置のアミノ酸がＲ、Ｓ、Ａ、Ｋ、Ｇ、Ｌ、Ｆ、もしくはＹであり；または
１６６番の位置のアミノ酸がＦ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、またはＭである、
またはそれらのこのような位置の変化の組合せを有する、請求項１に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項７】
配列番号３１、３２、３３、３４、３９、４０および４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項６に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項８】
非変性α１−α２ドメインに比べてより大きいＮＫＧ２Ｄに対する親和性結合を示す、請求項１に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項９】
ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の活性化の増強を示して、より大きい標的細胞死滅効力を有する細胞を生じる、請求項８に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項１０】
付着された異種ペプチドをさらに含んでなる、請求項１に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項１１】
前記付着された異種ペプチドが抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、またはそのフラグメントである、請求項１０に記載の分子。
【請求項１２】
前記ペプチドがＮＫＧ２Ｄに送達される、請求項１０に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項１３】
前記異種ペプチドがドメイン分子の結合を標的細胞上の標的分子へ向け、それにより、ドメイン分子を標的細胞に送達する、請求項１０に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項１４】
抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、またはそのフラグメントに付着された非変性α１−α２ドメインに比べてより大きい標的細胞死滅効力を示す、請求項１３に記載の分子。
【請求項１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより大きい標的細胞死滅効力を示す、請求項１４に記載の分子。
【請求項１６】
請求項１に記載の改変型α１−α２ドメイン分子と担体または賦形剤とを含んでなる組成物。
【請求項１７】
治療薬または診断薬をさらに含んでなる、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記治療薬または診断薬が改変型α１−α２ドメイン分子に付着されている、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の改変型α１−α２ドメイン分子をコードする核酸分子。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸分子を含んでなる、発現カセット。
【請求項２１】
悪性腫瘍またはウイルス感染を有する疑いのある哺乳動物を処置するための医薬組成物であって、有効量の請求項１２に記載の改変型α１−α２ドメイン分子を含んでなり、標的細胞が悪性細胞またはウイルス感染細胞である、医薬組成物。
【請求項２２】
有効量の請求項１０に記載の改変型α１−α２ドメイン分子を含んでなる、悪性腫瘍またはウイルス感染を有する疑いのある哺乳動物を処置するための医薬組成物。
【請求項２３】
抗体の可変フラグメント（Ｆｖ）を含んでなる、特異的抗原結合特性を示す挿入可能なＦｖ（ｉＦｖ）ポリペプチドであって、Ｆｖの特異的抗原結合ドメインが２つの抗体可変ドメインを含んでなり、１つの可変ドメインは軽鎖（ＶＬ）に由来し、１つの可変ドメインは重鎖（ＶＨ）に由来し、それぞれ１〜３の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、それぞれＣ末端とＮ末端を有し；かつ、前記ＶＴドメインとＶＨドメインは、ＶＬドメインの両方のカノニカル末端とＶＨドメインの両方のカノニカル末端とを接続する２つのリンカー領域によって連結されている、ｉＦｖ。
【請求項２４】
レシピエント分子とのコンジュゲーションまたはレシピエント分子への挿入のための付着部位を提供するために、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかの内部にＮ末端とＣ末端の非天然対が作出されている、請求項２３に記載のｉＦｖ。
【請求項２５】
非天然Ｎ末端およびＣ末端が空間的に互いに近位に配置される、請求項２４に記載のｉＦｖ。
【請求項２６】
１以上の溶媒暴露ループを含むレシピエントポリペプチドまたはタンパク質をさらに含んでなり、前記ループの１以上にｉＦｖが挿入される、請求項２４に記載のｉＦｖ。
【請求項２７】
１以上の溶媒暴露ループを含むレシピエントポリペプチドまたはタンパク質をさらに含んでなり、ＶＬドメインまたはＶＨドメイン内の非天然Ｎ末端とＣ末端が空間的に互いに近位に配置されるように、前記ループの１以上にｉＦｖが挿入される、請求項２４に記載のｉＦｖ。
【請求項２８】
ＶＬドメインのＣ末端がＶＨドメインのＮ末端に接続され、かつ、ＶＬドメインのＮ末端がＶＨドメインのＣ末端に接続されるか；またはＶＬドメインのＮ末端がＶＨドメインのＣ末端に接続され、かつ、ＶＬドメインのＣ末端がＶＨドメインのＮ末端に接続されるかのいずれかである、請求項２３に記載のｉＦｖ。
【請求項２９】
非天然Ｎ末端とＣ末端の間の距離が約０．２〜約２．０ｎｍである、請求項２７に記載のｉＦｖ。
【請求項３０】
前記末端間の距離が約０．５ｎｍ〜約１．５ｎｍである、請求項２９に記載のｉＦｖ。
【請求項３１】
２つのリンカー領域が約１０〜２５個のアミノ酸の同一または非同一ペプチドを含んでなる、請求項２３に記載のｉＦｖ。
【請求項３２】
レシピエントポリペプチドまたはタンパク質が抗体、Ｉｇフォールド、Ｉｇドメイン、グロブリン、卵白、フィブロネクチン、フィブロネクチンドメイン、インテグリン、蛍光タンパク質、酵素、外膜タンパク質、受容体タンパク質、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体、ウイルス抗原、ウイルスキャプシド、細胞受容体のウイルスリガンド、高分子量バクテリオシン、ヒストン、ホルモン、ノッチン、環状ペプチド、ＵＬＢタンパク質、レクチン、またはレクチンのリガンドである、請求項２７に記載のｉＦｖ。
【請求項３３】
ｉＦｖが挿入または付着された非タンパク質分子をさらに含んでなる、請求項２３に記載のｉＦｖ。
【請求項３４】
非タンパク質分子が多糖、デンドリマー、ポリグリコール、ペプチドグリカン、化学療法薬、毒素、蛍光団、発色団、ファーマコフォア、抗生物質またはポリケチドである、請求項３３に記載のｉＦｖ。
【請求項３５】
非天然Ｎ末端および非天然Ｃ末端の一方または両方にコンジュゲートされた非タンパク質分子または原子をさらに含んでなる、請求項２４に記載のｉＦｖ。
【請求項３６】
レシピエント分子の１以上の溶媒暴露ループの全部または一部が削除され、ｉＦｖに置換される、請求項２７に記載のｉＦｖ。
【請求項３７】
ヒト非変性ＮＫＧ２Ｄリガンド分子由来の非天然、改変型α１−α２ドメイン分子であって、配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、その非変性アミノ酸の１以上が８０番、１５１番、１５２番、および１５３番からなる群から選択される位置で置換されている、改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項３８】
非変性リガンド分子が配列番号１５、１６、１９からなる群から選択される、請求項３７に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項３９】
その非変性α１−α２ドメインに比べてヒトＮＫＧ２Ｄに対するその結合親和性を変更するように改変されている、請求項３８に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項４０】
８０番の位置のアミノ酸がＬ、Ｗ、Ｖ、Ｆ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｐ、またはＴであり；
１５１番の位置のアミノ酸がＤ、Ｅ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、ＲまたはＴであり；
１５２番の位置のアミノ酸がＬまたはＷであり；
１５３番の位置のアミノ酸がＥ、Ｋ、Ｇ、またはＰである、
またはそれらのこのような位置の変化の組合せを有する、請求項３９に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項４１】
ヒト非変性ＮＫＧ２Ｄリガンド分子由来の非天然、改変型α１−α２ドメイン分子であって、配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、その非変性アミノ酸の１以上が１６２番および１６５番からなる群から選択される位置で置換されている、改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項４２】
前記非変性リガンド分子が配列番号１７および１８からなる群から選択される、請求項４１に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項４３】
その非変性α１−α２ドメインに比べてヒトＮＫＧ２Ｄに対するその結合親和性を変更するように改変されている、請求項４２に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項４４】
１６２番の位置のアミノ酸がＧ、Ａ、またはＹであり；および／または
１６５番の位置のアミノ酸がＳ、Ｐ、Ａ、Ｔ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、またはＧである、
請求項４３に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項４５】
免疫原に付着され、α１−α２ドメインが、前記免疫原に対するレシピエント動物の免疫応答の効力を加速化および／または増強するためにアジュバント活性を提供する、請求項８に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項４６】
その非変性α１−α２ドメインに比べてより大きいＮＫＧ２Ｄに対する親和性結合を示す、請求項４０に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項４７】
付着された異種ペプチドをさらに含んでなる、請求項４６に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項４８】
ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の活性化の増強を示して、より大きい標的細胞死滅効力を有する細胞を生じる、請求項４７に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項４９】
付着された異種ペプチドが抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、またはそのフラグメントである、請求項４７に記載の分子。
【請求項５０】
前記ペプチドがＮＫＧ２Ｄに送達される、請求項４８に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項５１】
前記異種ペプチドがドメイン分子の結合を標的細胞上の標的分子へ向け、それにより、ドメイン分子を標的細胞に送達する、請求項４８に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項５２】
ペプチドに付着されたその非変性α１−α２ドメインに比べてより大きい標的細胞死滅効力を示す、請求項４７に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項５３】
配列番号８４のアミノ酸配列を含んでなる、請求項４６に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項５４】
配列番号８５のアミノ酸配列を含んでなる、請求項４６に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項５５】
その非変性α１−α２ドメインに比べて、ＮＫＧ２Ｄに対するより大きい親和性結合を示す、請求項４４に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項５６】
付着された異種ペプチドをさらに含んでなる、請求項５５に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項５７】
ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の活性化の増強を示して、より大きい標的細胞死滅効力を有する細胞を生じる、請求項５５に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項５８】
付着された異種ペプチドが抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、またはそのフラグメントである、請求項５６に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項５９】
前記ペプチドがＮＫＧ２Ｄに送達される、請求項５６に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項６０】
前記異種ペプチドがドメイン分子の結合を標的細胞上の標的分子へ向け、それにより、ドメイン分子を標的細胞に送達する、請求項５６に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項６１】
ペプチドに付着されたその非変性α１−α２ドメインに比べてより大きい標的細胞死滅効力を示す、請求項６０に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【請求項６２】
配列番号８６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項６０に記載の改変型α１−α２ドメイン分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、一般に、Ｆｖドメインの特異的抗原結合特性を有するポリペプチド、例えば、抗体の挿入可能な可変フラグメント、およびＮＫＧ２Ｄリガンドの改変型α１−α２ドメインに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる抗体（Ａｂ）、図１は、ヒトを含む多くの哺乳動物で、細菌およびウイルスなどの外来物を識別し中和するために免疫系によって用いられる大きなＹ型のタンパク質である(Charles Janeway (2001). Immunobiology. (第5版), Chapter 3. Garland Publishing. ISBN 0-8153-3642-X. (NCBI Bookshelfによる電子フルテキスト)。抗体は、抗原と呼ばれる外来標的のユニークな部分を認識する。抗体の「Ｙ」の２本の腕の各先端は抗原結合部位、またはパラトープ（鍵穴に例えられる構造）を含み、これは抗原の１つの特定のエピトープ（同様に鍵に例えられる）に特異的であり、これによりこれらの２つの構造は正確に相互結合することができる。この結合機構を用い、抗体は、免疫系の他の部分による攻撃のために微生物または感染細胞にタグを付けることができ、または例えば微生物の、その侵入および生存のために不可欠な部分を遮断することによって、その標的を直接中和することができる。抗体の生産は、体液性、または「適応」免疫系の主要な機能である。抗体は形質細胞により分泌される。抗体は本来、細胞から分泌される可溶型とＹの「ステム」を介してＢ細胞の表面に付着される膜結合型の２つの物理的形態で生じ得る。
【０００３】
抗体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属す糖タンパク質であり、一般に、それぞれ２本の大きな重鎖と２本の小さな軽鎖を有する基本構造単位からなる。いくつかの異なるタイプの抗体重鎖、およびいくつかの異なる種類の抗体があり、これらはそれらが有する重鎖に基づいて異なるアイソタイプに分類される。哺乳動物では、５つの異なる抗体アイソタイプが知られている(Market E, Papavasiliou FN (2003年10月). "V(D)J recombination and the evolution of the adaptive immune system". PLoS Biol. 1(1): E16. doi:10.1371/journal.pbio.0000016. PMC 212695. PMID 14551913)。総ての抗体の一般構造は極めて類似しているが、Ｙ型タンパク質の各腕の先端の小領域は極めて変動性が大きく、わずかに異なる先端構造、すなわち抗原結合部位を有する何百万という抗体の存在を可能としている。この領域は超可変または可変領域として知られる。これらの天然変異体のそれぞれは異なる抗原と結合することができる。この抗体の膨大な多様性が、免疫系が等しく多様な抗原に適合し、それらを認識することを可能としている(Hozumi N, Tonegawa S (1976). "Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73 (10): 3628-3632. doi:10.1073/pnas.73.10.3628. PMC 431171. PMID 824647.)。
【０００４】
天然「Ｙ」型Ｉｇ分子は、ジスルフィド結合により接続された２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖という、４本のポリペプチド鎖からなる、図１。各重鎖は、定常領域（ＣＨ）と可変領域（ＶＨ）という２つの主要な領域を有する。定常領域は、同じアイソタイプの総ての抗体では本質的に同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。軽鎖も、より小さな定常領域（ＣＬ）と可変領域（ＶＬ）という２つの連続したドメインを有する(Woof J, Burton D (2004). "Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures." Nat Rev Immunol 4 (2): 89-99. doi: 10.1038/nril266. PMID 15040582)。
【０００５】
抗体のいくつかの部分は同じ機能を有する。例えば、Ｙの２本の腕はそれぞれ、抗原と結合し、従って、特定の外来物を認識することができる部位を含む。抗体のこの領域は、Ｆｖ（ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｖａｒｉａｂｌｅ）領域と呼ばれる。Ｆｖ領域は、抗体の重鎖（ＶＨ）由来の１つの可変ドメインと軽鎖（ＶＬ）由来の１つの可変領域から構成される(Hochman J, Inbar D, Givol D (1973). An active antibody fragment (Fv) composed of the variable portions of heavy and light chains. Biochemistry 12(6): 1130-1135. doi: 10.1021/bi00730a018. PMID 4569769)。パラトープは、Ｆｖの一方の末端に形成され、抗原に結合するための領域である。パラトープは、ＶＬおよびＶＨ上にそれぞれ３つあるβ−ストランドの可変ループからなり、抗原との結合を担っている、図２。これらの６つのループは相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる(North B, Lehmann A, Dunbrack RL (2010). "A new clustering of antibody CDR loop conformations". J Mol Biol 406 (2): 228-256. doi: 10.1016/j.jmb.2010.10.030. PMC 3065967. PMID 21035459)。
【０００６】
特異的抗原結合機能を有する有用なポリペプチドは、抗体の可変領域のＣＤＲから誘導することができる。１つは軽鎖（ＶＬ）由来であって、１つは重鎖（ＶＨ）由来であり、それぞれ３つのＣＤＲを有するこれら２つの抗体可変ドメインは、それぞれ１つの重鎖および軽鎖可変ドメインを含んでなる直鎖一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ポリペプチドを作出するように、１０〜約２５アミノ酸の単一の短いリンカーペプチドを用いて、いずれかの順序でタンデムに融合することができる、図３(Bird, R. E., Hardman, K. D., Jacobson, J. W., Johnson, S., Kaufman, B. M., Lee, S. M., Lee, T., Pope, S. H., Riordan, G. S., and Whitlow, M. (1988) Single-chain antigen-binding proteins, Science 242, 423-426; Huston, J. S., Levinson, D, Mudgett-Hunter, M, Tai, M-S, Novotny, J, Margolies, M.N., Ridge, R., Bruccoleri, RE., Haber, E., Crea, R., and Opperman, H. (1988). Protein engineering of antibody binding sites: Recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. PNAS 85: 5879-5883)。
【０００７】
リンカーは、通常、フレキシビリティーのためにはグリシン、ならびに溶解度のためにはセリン、トレオニン、または荷電アミノ酸を豊富とし、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端を接続するか、またはその逆が可能である。このタンパク質は、定常領域の除去および単一リンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。この形式は、組換えＤＮＡ技術の当業者に、親タンパク質にｓｃＦｖの抗原結合特性を付与するために親タンパク質のＮ末端またはＣ末端に線状ｓｃＦｖを遺伝的に融合することを可能とする。多価のタンデムｓｃＦｖ領域には多くの他の提案または作出された配置が存在するが、下記のように重要なこととしては、総て、少なくとも２つの空間的に離れた末端を有する、図４(Le Gall, F.; Kipriyanov, SM; Moldenhauer, G; Little, M (1999). "Di-, tri- and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD19: effect of valency on cell binding". FEBS Letters 453(1): 164-168. doi: 10.1016/S0014-5793(99)00713-9. PMID 10403395)。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、ポリペプチド、いくつかの実施形態では、抗体または抗体のフラグメントに付着されたＮＫＧ２Ｄリガンドの改変型α１−α２ドメインに関する。いくつかの側面では、本開示は、２つのリンカー領域と分割された可変ドメインを含む、軽鎖および重鎖抗体可変ドメインに由来する抗原結合ペプチドに関する。
【０００９】
本特許または出願ファイルは、カラーで作製された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を含む本特許または特許出願公開の複写は、請求および必要な料金の支払いに応じて特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】そのＹ型構造および構造成分を示す典型的な哺乳動物抗体の略図。
【図２】パラトープまたは抗原結合部位を形成する、ＶＨの３つの表示されている（相補性決定領域）ＣＤＲおよびＶＬ  ＣＤＲの表示されていない３つのループを示す天然哺乳動物抗体のＦｖ領域の構造の略図。
【図３】左にＮ末端および右にＣ末端を含む抗原結合部位を有する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の２つの可能性のある構造の略図。各ｓｃＦｖの単一リンカー領域、またはリンカーペプチドは矢印として示される。
【図４】多価一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）。二価（上）および三価（下）ｓｃＦｖ、タンデム（左）および二量化／三量化形式（右）の構造。それぞれ２以上の空間的に離れた遊離末端を有することに留意されたい。
【図５Ａ】挿入可能な可変フラグメントｉＦｖの図。図５Ａは、ｉＦｖ形式のドメイントポロジーを示すＦＧＦＲ３結合抗体に由来する可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）ドメインの構造を示す。灰色の矢印は、２つのリンカー領域（ＬＲ）を表し、そのうち１つ、また１つだけが、ＶＬとＶＨの末端を接続してｓｃＦｖを作出するために慣例的に使用される。点線で縁取られたＬＲは、ＶＬのＣ末端とＶＨのＮ末端を接続している（分子の後ろに見える）。実線で縁取られたＬＲは、ＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端を接続している。分割されたＶＬドメインのセグメントは、テキストに記載されるようにＮｔおよびＣｔと表示される。ストランド１（Ｓ１）とストランド２（Ｓ２）の間にＮ末端とＣ末端の非天然対が作出される結果として、ＶＬはＮ末端セグメント（ＶＬＮ）とＣ末端セグメント（ＶＬＣ）に分割されている。ＶＬおよびＶＨの６つのＣＤＲは、図の上にループとして表される。図５Ｂは、ｉＦｖを、スペーサー領域（ＳＲ）を伴ってまたは伴わずに、ＭＩＣＡ−α３のループ１（ＬＩ）に挿入するためのドメインレイアウトのスキームを示す。ｉＦｖは、同様に、ループ２（Ｌ２）および／またはループ３（Ｌ３）に挿入することもできる。図５Ｂは、ｉＦｖを、スペーサー領域（ＳＲ）を伴ってまたは伴わずに、ＭＩＣＡ−α３のループ１（ＬＩ）に挿入するためのドメインレイアウトのスキームを示す。ｉＦｖは、同様に、ループ２（Ｌ２）および／またはループ３（Ｌ３）に挿入することもできる。
【図５Ｂ】挿入可能な可変フラグメントｉＦｖの図。挿入可能な可変フラグメントｉＦｖの図。図５Ａは、ｉＦｖ形式のドメイントポロジーを示すＦＧＦＲ３結合抗体に由来する可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）ドメインの構造を示す。灰色の矢印は、２つのリンカー領域（ＬＲ）を表し、そのうち１つ、また１つだけが、ＶＬとＶＨの末端を接続してｓｃＦｖを作出するために慣例的に使用される。点線で縁取られたＬＲは、ＶＬのＣ末端とＶＨのＮ末端を接続している（分子の後ろに見える）。実線で縁取られたＬＲは、ＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端を接続している。分割されたＶＬドメインのセグメントは、テキストに記載されるようにＮｔおよびＣｔと表示される。ストランド１（Ｓ１）とストランド２（Ｓ２）の間にＮ末端とＣ末端の非天然対が作出される結果として、ＶＬはＮ末端セグメント（ＶＬＮ）とＣ末端セグメント（ＶＬＣ）に分割されている。ＶＬおよびＶＨの６つのＣＤＲは、図の上にループとして表される。図５Ｂは、ｉＦｖを、スペーサー領域（ＳＲ）を伴ってまたは伴わずに、ＭＩＣＡ−α３のループ１（ＬＩ）に挿入するためのドメインレイアウトのスキームを示す。ｉＦｖは、同様に、ループ２（Ｌ２）および／またはループ３（Ｌ３）に挿入することもできる。図５Ｂは、ｉＦｖを、スペーサー領域（ＳＲ）を伴ってまたは伴わずに、ＭＩＣＡ−α３のループ１（ＬＩ）に挿入するためのドメインレイアウトのスキームを示す。ｉＦｖは、同様に、ループ２（Ｌ２）および／またはループ３（Ｌ３）に挿入することもできる。
【図６】ＦＧＦＲ３コーティングウェルに結合する改変型ｓＭＩＣＡ分子の力価測定曲線。結合したｓＭＩＣＡを、二重特異性活性を確認するためのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃを用いるＥＬＩＳＡにより検出した。挿入された可変フラグメントの両方の形態（ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．１およびＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２）は、ｓｃＦｖのＣ末端融合（ＭＩＣＡ−ｓｃＦｖ）と同等にＦＧＦＲ３と結合した。
【図７Ａ】ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２の熱安定性。示された温度（摂氏度）に１時間曝した後に、ＦＧＦＲ３コーティングウェルに結合するＭＩＣＡ−ｓｃＦｖ（図７Ａ）またはＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２（図７Ｂ）のＥＬＩＳＡ力価測定曲線。ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖは８０℃に曝された後もＦＧＦＲ３と強い結合を示したが、ＭＩＣＡ−ｓｃＦｖは７０℃に曝した後に有意な活性を失っていた。
【図７Ｂ】ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２の熱安定性。示された温度（摂氏度）に１時間曝した後に、ＦＧＦＲ３コーティングウェルに結合するＭＩＣＡ−ｓｃＦｖ（図７Ａ）またはＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２（図７Ｂ）のＥＬＩＳＡ力価測定曲線。ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖは８０℃に曝された後もＦＧＦＲ３と強い結合を示したが、ＭＩＣＡ−ｓｃＦｖは７０℃に曝した後に有意な活性を失っていた。
【図８】ＮＫにより媒介される標的細胞溶解アッセイ。ＮＫＬエフェクター細胞を、カルセインを負荷したＦＧＦＲ３発現Ｐ８１５標的細胞とともにエフェクター：標的比１５：１で共インキュベートした。漸増濃度の陰性対照ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）は標的細胞溶解に効果を示さなかったが、示されたＦＧＦＲ３結合ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ変異体は、標的細胞溶解を刺激した。ＭＩＣＡ−ｓｃＦｖに比べ、両方のＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ変異体はより大きな標的細胞溶解を導いた。
【図９Ａ】ＣＤ２０特異的ｓＭＩＣＡ変異体の標的結合および細胞溶解活性。ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．３は、ＥＬＩＳＡにおいてＣＤ２０コーティングウェルに対して力価測定可能な結合を示し（図９Ａ）、また、ＣＤ２０発現Ｒａｍｏｓ細胞の、ＮＫにより媒介される細胞溶解を増強した（図９Ｂ）。図９Ｂに示される試験では、ＮＫＬエフェクター細胞を、カルセインを負荷したＣＤ２０発現Ｒａｍｏｓ細胞とともにエフェクター：標的比１５：１で、陰性対照（ｓＭＩＣＡ）またはＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．３のいずれかの濃度を漸増させつつ共インキュベートした。
【図９Ｂ】ＣＤ２０特異的ｓＭＩＣＡ変異体の標的結合および細胞溶解活性。ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．３は、ＥＬＩＳＡにおいてＣＤ２０コーティングウェルに対して力価測定可能な結合を示し（図９Ａ）、また、ＣＤ２０発現Ｒａｍｏｓ細胞の、ＮＫにより媒介される細胞溶解を増強した（図９Ｂ）。図９Ｂに示される試験では、ＮＫＬエフェクター細胞を、カルセインを負荷したＣＤ２０発現Ｒａｍｏｓ細胞とともにエフェクター：標的比１５：１で、陰性対照（ｓＭＩＣＡ）またはＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．３のいずれかの濃度を漸増させつつ共インキュベートした。
【図１０】ＦＧＦＲ３コーティングウェルに結合するＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質の力価測定曲線。結合したタンパク質を、二重特異性活性を確認するためのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃを用いるＥＬＩＳＡにより検出した。供試したＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質の総ての形態（ＯＭＣＰ、ＵＬＢＰ１、２、３、４、６）が同様にＦＧＦＲ３と結合した。
【図１１】ＮＫにより媒介される標的細胞溶解アッセイ。ＮＫＬエフェクター細胞を、カルセインを負荷したＦＧＦＲ３発現Ｐ８１５標的細胞とともにエフェクター：標的比１５：１で共インキュベートした。漸増濃度の陰性対照ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）は標的細胞溶解に効果を示さなかったが、それぞれ示されたＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質は標的細胞溶解を刺激した。
【図１２Ａ】ＮＫＧ２Ｄ親和性の増強のためのＭＩＣＡのα１−α２ドメインの構造特異的突然変異誘発。図１２Ａは、濃い灰色の５７残基にマッピングされるＮＫＧ２Ｄ結合表面を備えたＭＩＣＡ（ＰＤＢ  １ＨＹＲ）のα１−α２ドメインの構造を示す。図１２Ｂは、ＮＫＧ２Ｄ親和性突然変異のための重要部位として特定された６つの位置を示す。野生型アミノ酸残基が表示され、それらの側鎖が濃い灰色の球で示される。
【図１２Ｂ】ＮＫＧ２Ｄ親和性の増強のためのＭＩＣＡのα１−α２ドメインの構造特異的突然変異誘発。図１２Ａは、濃い灰色の５７残基にマッピングされるＮＫＧ２Ｄ結合表面を備えたＭＩＣＡ（ＰＤＢ  １ＨＹＲ）のα１−α２ドメインの構造を示す。図１２Ｂは、ＮＫＧ２Ｄ親和性突然変異のための重要部位として特定された６つの位置を示す。野生型アミノ酸残基が表示され、それらの側鎖が濃い灰色の球で示される。
【図１３Ａ】α１−α２変異体の親和性ランキングのためのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ競合ＥＬＩＳＡ。図１３Ａは、α１−α２親和性変異体（１５〜１８）、野生型（ＷＴ）、またはプレートにコーティングされたＭＩＣＡへのヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ結合を阻害するＷＥＤ可溶性ＭＩＣＡタンパク質のパネルに関する力価測定データを示す。図１３Ｂは、図１３Ａと同じタンパク質セットをマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対して力価測定したものを示す。両方のアッセイにおいて、変異体１５、１６、１７、および１８は、ＷＴタンパク質およびＷＥＤタンパク質の両方よりも有意に低いＩＣ５０値を示す。平衡ＩＣ５０値を表３に示す。
【図１３Ｂ】α１−α２変異体の親和性ランキングのためのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ競合ＥＬＩＳＡ。図１３Ａは、α１−α２親和性変異体（１５〜１８）、野生型（ＷＴ）、またはプレートにコーティングされたＭＩＣＡへのヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ結合を阻害するＷＥＤ可溶性ＭＩＣＡタンパク質のパネルに関する力価測定データを示す。図１３Ｂは、図１３Ａと同じタンパク質セットをマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対して力価測定したものを示す。両方のアッセイにおいて、変異体１５、１６、１７、および１８は、ＷＴタンパク質およびＷＥＤタンパク質の両方よりも有意に低いＩＣ５０値を示す。平衡ＩＣ５０値を表３に示す。
【図１４】Ｏｃｔｅｔ装置にてバイオレイヤー干渉法により測定される、ＮＫＧ２Ｄに結合するα１−α２変異体の会合および解離動態の分析。α１−α２変異体パネルの動態トレース。会合相および解離相は単一指数１：１結合式を用いて当てはめ、それらの当てはめから導いた会合および解離速度定数を表３に示す。
【図１５】ＦＧＦＲ３発現標的細胞を標的とするα１−α２変異体に関するＮＫ媒介標的細胞死滅アッセイ。ＮＫＬエフェクター細胞を、カルセインを負荷したＦＧＦＲ３発現Ｐ８１５標的細胞とともにエフェクター：標的比１５：１で共インキュベートした。漸増濃度の陰性対照ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）は標的細胞溶解に効果を示さなかったが、示されたα１−α２変異体は標的細胞溶解を刺激した。ＷＴおよびＷＥＤ−ＭＩＣＡに比べて、変異体１６、１７、および１８は、低濃度で有意に高い死滅を示した。
【図１６】Ｏｃｔｅｔ装置にてバイオレイヤー干渉法により測定される、ＮＫＧ２Ｄに結合するα１−α２変異体２０、２５、および４８の会合および解離動態の分析。会合相および解離相は単一指数１：１結合式を用いて当てはめ、それらの当てはめから導いた会合および解離速度定数を表５に示す。
【図１７】ＦＧＦＲ３発現Ｐ８１５標的細胞を標的とするα１−α２変異体１６、２５およびＷＥＤに関するＮＫ媒介標的細胞死滅、カルセイン系アッセイ。
【図１８】ＭＩＣＡおよびＵＬＢＰ（配列番号７７〜８３）由来のα１−α２ドメインのタンパク質配列アラインメント。灰色で強調したアミノ酸を、ＵＬＢＰ２（６０個のアミノ酸）およびＵＬＢＰ３（３６個のアミノ酸）におけるＮＮＫ突然変異誘発のために選択した。黒で強調した残基が、ＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性を調節する突然変異として選択および特定するために重要な位置であると特定された（表６および７）。
【図１９Ａ】ＮＫＧ２Ｄに結合するＵＬＢＰ変異体のファージＥＬＩＳＡ力価測定。図１９Ａは、ファージに展示されたＵＬＢＰ２変異体がＮＫＧ２Ｄに対して力価測定され、相対的結合親和性が非変性ＵＬＢＰ２（ＷＴ、黒丸）と比較して測定された実験を示す。図１９Ｂは、ファージに展示されたＵＬＢＰ３変異体がＮＫＧ２Ｄに対して力価測定され、相対的結合親和性が非変性ＵＬＢＰ３（ＷＴ、黒丸）と比較して測定された実験を示す。
【図１９Ｂ】ＮＫＧ２Ｄに結合するＵＬＢＰ変異体のファージＥＬＩＳＡ力価測定。図１９Ａは、ファージに展示されたＵＬＢＰ２変異体がＮＫＧ２Ｄに対して力価測定され、相対的結合親和性が非変性ＵＬＢＰ２（ＷＴ、黒丸）と比較して測定された実験を示す。図１９Ｂは、ファージに展示されたＵＬＢＰ３変異体がＮＫＧ２Ｄに対して力価測定され、相対的結合親和性が非変性ＵＬＢＰ３（ＷＴ、黒丸）と比較して測定された実験を示す。
【図２０Ａ】非変性（ＷＴ）、改変型変異体ＷＥＤ、２５または４８α１−α２ドメインと、ＦＧＦＲ３特異的抗体の重鎖（図２０Ａ）または軽鎖（図２０Ｂ）との融合物は、ＮＫ依存性標的細胞死滅に影響を及ぼした。変異体２５および４８と重鎖（図２０Ｃ）または軽鎖（図２０Ｄ）のいずれかとの融合物は、ＷＥＤ変異体に比べ、また、非変性（ＷＴ）融合物に比べて、死滅の範囲および死滅の効力を有意に増大させた。
【図２０Ｂ】非変性（ＷＴ）、改変型変異体ＷＥＤ、２５または４８α１−α２ドメインと、ＦＧＦＲ３特異的抗体の重鎖（図２０Ａ）または軽鎖（図２０Ｂ）との融合物は、ＮＫ依存性標的細胞死滅に影響を及ぼした。変異体２５および４８と重鎖（図２０Ｃ）または軽鎖（図２０Ｄ）のいずれかとの融合物は、ＷＥＤ変異体に比べ、また、非変性（ＷＴ）融合物に比べて、死滅の範囲および死滅の効力を有意に増大させた。
【図２０Ｃ】非変性（ＷＴ）、改変型変異体ＷＥＤ、２５または４８α１−α２ドメインと、ＦＧＦＲ３特異的抗体の重鎖（図２０Ａ）または軽鎖（図２０Ｂ）との融合物は、ＮＫ依存性標的細胞死滅に影響を及ぼした。変異体２５および４８と重鎖（図２０Ｃ）または軽鎖（図２０Ｄ）のいずれかとの融合物は、ＷＥＤ変異体に比べ、また、非変性（ＷＴ）融合物に比べて、死滅の範囲および死滅の効力を有意に増大させた。
【図２０Ｄ】非変性（ＷＴ）、改変型変異体ＷＥＤ、２５または４８α１−α２ドメインと、ＦＧＦＲ３特異的抗体の重鎖（図２０Ａ）または軽鎖（図２０Ｂ）との融合物は、ＮＫ依存性標的細胞死滅に影響を及ぼした。変異体２５および４８と重鎖（図２０Ｃ）または軽鎖（図２０Ｄ）のいずれかとの融合物は、ＷＥＤ変異体に比べ、また、非変性（ＷＴ）融合物に比べて、死滅の範囲および死滅の効力を有意に増大させた。
【図２１Ａ】変異体２５  α１−α２ドメインと、ヒトＥＧＦＲ（図２１Ａ）、ＨＥＲ２（図２１Ｂ）、またはＰＤＬ１（図２１Ｃ）を標的とする抗体の重鎖または軽鎖との融合物はそれぞれ、ＮＫＬ細胞により媒介される標的細胞死滅を増強した。それぞれの親抗体セツキシマブ（図２１Ａ）、トラスツズマブ（図２１Ｂ）、および抗ＰＤＬ１（図２１Ｃ）による低い死滅または死滅の不在を示す。
【図２１Ｂ】変異体２５  α１−α２ドメインと、ヒトＥＧＦＲ（図２１Ａ）、ＨＥＲ２（図２１Ｂ）、またはＰＤＬ１（図２１Ｃ）を標的とする抗体の重鎖または軽鎖との融合物はそれぞれ、ＮＫＬ細胞により媒介される標的細胞死滅を増強した。それぞれの親抗体セツキシマブ（図２１Ａ）、トラスツズマブ（図２１Ｂ）、および抗ＰＤＬ１（図２１Ｃ）による低い死滅または死滅の不在を示す。
【図２１Ｃ】変異体２５  α１−α２ドメインと、ヒトＥＧＦＲ（図２１Ａ）、ＨＥＲ２（図２１Ｂ）、またはＰＤＬ１（図２１Ｃ）を標的とする抗体の重鎖または軽鎖との融合物はそれぞれ、ＮＫＬ細胞により媒介される標的細胞死滅を増強した。それぞれの親抗体セツキシマブ（図２１Ａ）、トラスツズマブ（図２１Ｂ）、および抗ＰＤＬ１（図２１Ｃ）による低い死滅または死滅の不在を示す。
【図２２Ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける変異体２５  α１−α２ドメインアームＮＫ細胞のトラスツズマブに基づく融合物。親トラスツズマブ、トラスツズマブＨＣ＿２５融合物、およびトラスツズマブＬＣ＿２５融合物にＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒをコンジュゲートした。３個体のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に単回用量の１００μｇ  親、ＨＣ融合物またはＬＣ融合物を注射し、血漿ＰＫ  ＥＬＩＳＡ（図２２Ａ）および末梢ＮＫ細胞に結合した蛍光標識分子のフローサイトメトリー分析（図２２Ｂ）のために示された時点で各動物から血液を採取した。
【図２２Ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける変異体２５  α１−α２ドメインアームＮＫ細胞のトラスツズマブに基づく融合物。親トラスツズマブ、トラスツズマブＨＣ＿２５融合物、およびトラスツズマブＬＣ＿２５融合物にＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒをコンジュゲートした。３個体のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に単回用量の１００μｇ  親、ＨＣ融合物またはＬＣ融合物を注射し、血漿ＰＫ  ＥＬＩＳＡ（図２２Ａ）および末梢ＮＫ細胞に結合した蛍光標識分子のフローサイトメトリー分析（図２２Ｂ）のために示された時点で各動物から血液を採取した。
【図２３Ａ】トラスツズマブ親（図２３Ａ）、トラスツズマブに基づくＨＣ（図２３Ｂ）およびトラスツズマブ−ＬＣ（図２３Ｃ）と変異体２５との融合物を投与した、実施例７および図２１に記載されたものと同じ動物で生じた抗薬物抗体。対照（Ｃｔｒｌ）血漿は、抗体含有剤を投与しなかったマウスから得たものであった。
【図２３Ｂ】トラスツズマブ親（図２３Ａ）、トラスツズマブに基づくＨＣ（図２３Ｂ）およびトラスツズマブ−ＬＣ（図２３Ｃ）と変異体２５との融合物を投与した、実施例７および図２１に記載されたものと同じ動物で生じた抗薬物抗体。対照（Ｃｔｒｌ）血漿は、抗体含有剤を投与しなかったマウスから得たものであった。
【図２３Ｃ】トラスツズマブ親（図２３Ａ）、トラスツズマブに基づくＨＣ（図２３Ｂ）およびトラスツズマブ−ＬＣ（図２３Ｃ）と変異体２５との融合物を投与した、実施例７および図２１に記載されたものと同じ動物で生じた抗薬物抗体。対照（Ｃｔｒｌ）血漿は、抗体含有剤を投与しなかったマウスから得たものであった。
【図２４Ａ】実施例７および図２１〜２２に記載されるような変異体２５  α１−α２ドメインとトラスツズマブ−ＨＣおよび−ＬＣとの融合物を投与した動物で生成された抗体は、親抗体（図２４Ａ）およびα１−α２ドメイン（図２４Ｂ）の両方に結合した。
【図２４Ｂ】実施例７および図２１〜２２に記載されるような変異体２５  α１−α２ドメインとトラスツズマブ−ＨＣおよび−ＬＣとの融合物を投与した動物で生成された抗体は、親抗体（図２４Ａ）およびα１−α２ドメイン（図２４Ｂ）の両方に結合した。
【図２５】抗ＰＤＬ１の変異体２５との融合物の抗腫瘍活性。同系ＭＣ３８腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植し、処置の開始前に腫瘍を平均１００ｍｍ３に成長させた。処置の開始時に、各群１０個体のマウスの４コホートを、１、４、および７日目にビヒクル、抗ＣＴＬＡ４（１００ｕｇ  ｉ．ｐ．）、親抗ＰＤＬ１（３００ｕｇ  ｉ．ｖ．）、または抗ＰＤＬ１  ＨＣ＿２５融合物（３００ｕｇ  ｉ．ｖ．）で非経口的に処置した。腫瘍体積（立方ｍｍ）を、示された時点で各動物において測定した。
【図２６Ａ】ＵＬＢＰ２およびＵＬＢＰ３  α１−α２ドメイン変異体とＨＥＲ２特異的抗体の重鎖との融合物は、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性の増強を示した。改変型ＵＬＢＰ２  α１−α２ドメイン変異体Ｒ８０Ｗ（配列番号８４）およびＶ１５１Ｄ（配列番号８５）は、天然ＵＬＢＰ２（配列番号１６）融合物（ＷＴ）に比べてＮＫＧ２Ｄ結合の増強を示した（図２６Ａ）。改変型ＵＬＢＰ３変異体Ｒ１６２Ｇ（配列番号８６）は、天然ＵＬＢＰ３（配列番号１７）融合物（ＷＴ）に比べてＮＫＧ２Ｄ結合の増強を示した（図２６Ｂ）。
【図２６Ｂ】ＵＬＢＰ２およびＵＬＢＰ３  α１−α２ドメイン変異体とＨＥＲ２特異的抗体の重鎖との融合物は、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性の増強を示した。改変型ＵＬＢＰ２  α１−α２ドメイン変異体Ｒ８０Ｗ（配列番号８４）およびＶ１５１Ｄ（配列番号８５）は、天然ＵＬＢＰ２（配列番号１６）融合物（ＷＴ）に比べてＮＫＧ２Ｄ結合の増強を示した（図２６Ａ）。改変型ＵＬＢＰ３変異体Ｒ１６２Ｇ（配列番号８６）は、天然ＵＬＢＰ３（配列番号１７）融合物（ＷＴ）に比べてＮＫＧ２Ｄ結合の増強を示した（図２６Ｂ）。
【図２７Ａ】ＵＬＢＰ２およびＵＬＢＰ３  α１−α２ドメイン変異体とＨＥＲ２特異的抗体の重鎖との融合物は、ＮＫＬ細胞によるＳＫＢＲ３標的細胞の特異的溶解を示した。改変型ＵＬＢＰ２  α１−α２ドメイン変異体Ｒ８０Ｗ（配列番号８４）およびＶ１５１Ｄ（配列番号８５）は、天然ＵＬＢＰ２（配列番号１６）融合物（ＷＴ）に比べて標的細胞死滅の増強を示した（図２７Ａ）。改変型ＵＬＢＰ３変異体Ｒ１６２Ｇ（配列番号８６）は、天然ＵＬＢＰ３（配列番号１７）融合物（ＷＴ）に比べて標的細胞死滅の増強を示した（図２７Ｂ）。
【図２７Ｂ】ＵＬＢＰ２およびＵＬＢＰ３  α１−α２ドメイン変異体とＨＥＲ２特異的抗体の重鎖との融合物は、ＮＫＬ細胞によるＳＫＢＲ３標的細胞の特異的溶解を示した。改変型ＵＬＢＰ２  α１−α２ドメイン変異体Ｒ８０Ｗ（配列番号８４）およびＶ１５１Ｄ（配列番号８５）は、天然ＵＬＢＰ２（配列番号１６）融合物（ＷＴ）に比べて標的細胞死滅の増強を示した（図２７Ａ）。改変型ＵＬＢＰ３変異体Ｒ１６２Ｇ（配列番号８６）は、天然ＵＬＢＰ３（配列番号１７）融合物（ＷＴ）に比べて標的細胞死滅の増強を示した（図２７Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
いくつかの側面において、本発明は、挿入可能な可変フラグメント（ｉＦｖ）ペプチドに関する。多価ｓｃＦｖ構造を含むｓｃＦｖ分子のＣ末端およびＮ末端は空間的に離れているので、ｓｃＦｖ構造は、親またはレシピエントタンパク質のタンパク質折り畳み内に埋没したループ領域に、その折り畳みを破壊または脱安定化することなく、および／またはそれらの抗原結合特性を保持するようＣＤＲまたは超可変領域を適切に配置するために必要とされるＦｖフレームワークを破壊することなく挿入することはできない。
【００１２】
最大６つのＣＤＲを含む抗体の可変フラグメントを、新生親タンパク質分子の１以上のループ領域に、その可変フラグメントまたは親タンパク質の構造的折り畳みを破壊することなく挿入するために、本発明者らは、軽鎖および重鎖抗体可変ドメインに由来する新規クラスの抗原結合ペプチドを発明した。これらの新規な構造は、従来のｓｃＦｖ構造の単一リンカーではなく、２つのリンカー領域と分割された可変ドメインを含んだ。概念的には、可変軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）ドメインのカノニカル末端は、融合して連続的または「環状」ペプチドとした。Ｆｖの６つのＣＤＲ総てを含むその環状ペプチド構造は次に、概念的に、挿入可能なＦｖ（ｉＦｖ）を作出するために、いくつかの可能性のある新規な部位のうちの１つにおいて分割することができる。構造、安定性、または所望の機能を破壊することなく他の（親またはレシピエント）タンパク質またはポリペプチドのループに挿入可能となるように、空間的に互いに近位に、好ましくは０．５〜１．５ｎｍ以内に配置された新たなユニークなＮ末端およびＣ末端を作り出すために、軽鎖または重鎖可変ドメインのいずれかの内部の、ループの頂点またはターンの地点またはその付近に非天然分割部位を作出することができる。この新規なクラスのペプチドは挿入可能な可変フラグメント（ｉＦｖ）と呼ばれる。ｉＦｖによりレシピエント分子に運ばれる結合または標的特異性は、レシピエントに、異なる抗体もしくはｓｃＦｖに基づく別のもしくは異なるｉＦＶを挿入することによって、または既存の挿入可能なｉＦｖのＣＤＲの１以上を置換することによって変更することができる。
【００１３】
Ｆｖドメインの特異的抗原結合特性を示す１以上のｉＦｖポリペプチドの、他のタンパク質への挿入およびそれによる新規な結合特性の付与は、複数の用途を持つ。このような用途としては、限定されるものではないが、親タンパク質が特異的抗原に結合すること、抗原を標的とすること、抗原の存在を検出すること、抗原を除去すること、抗原と接触するかまたはその近傍に引き寄せること、抗原または抗原発現細胞に弾頭を送達すること、抗原を動員すること、および抗原の存在を画像化することを可能にすることが含まれる。弾頭はｉＦｖのアミノ末端およびカルボキシ末端の一方もしくは両方に直接、または親タンパク質またはペプチドを介してｉＦｖに間接的にコンジュゲートさせることができる。弾頭の例としては、限定されるものではないが、発色団、蛍光団、ファーマコフォア、原子、重いまたは放射性の同位体、造影剤、化学療法薬、または毒素が含まれる。弾頭を積んだｉＦｖは、ｉＦｖが特異的に結合する、従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて小型で安定な造影剤または診断薬として働き得る標的分子の存在を位置決定または同定するために使用することができる。加えて、例えば、悪性腫瘍または感染の治療薬としてのｉＦｖ−薬物コンジュゲートを作出するために、ｉＦｖペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の一方または両方に化学療法薬または毒性分子をコンジュゲートさせることもできる。ｉＦｖペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端の両方に、これら２つの末端を架橋または接続するように単一の弾頭をコンジュゲートしてもよく、このような架橋は、末端をエキソペプチダーゼ分解から遮断すること、またはｉＦｖを変性もしくは脱折り畳みから保護することによってｉＦｖをさらに安定化させ得る。
【００１４】
ｉＦｖペプチドの挿入のための候補となる親またはレシピエントタンパク質またはポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、抗体、ＩｇフォールドまたはＩｇドメインからなるタンパク質、グロブリン、卵白、フィブロネクチンおよびフィブロネクチンドメイン、インテグリン、蛍光タンパク質、酵素、外膜タンパク質、受容体タンパク質、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体、ウイルス抗原、ウイルスキャプシド、細胞受容体のウイルスリガンド、高分子量バクテリオシン、ヒストン、ホルモン、ノッチン、環状ペプチドまたはポリペプチド、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ファミリータンパク質、ＭＩＣタンパク質、レクチン、およびレクチンのリガンドが含まれる。また、多糖、デンドリマー、ポリグリコール、ペプチドグリカン、抗生物質、およびポリケチドなどの非タンパク質レシピエント分子にｉＦｖ構造を挿入することも可能である。
【００１５】
免疫系のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および特定の（ＣＤ８＋αβおよびγδ）Ｔ細胞は、ヒトおよび他の哺乳動物において、新生物およびウイルス感染細胞に対する第一線の自然防御として重要な役割を有する(Cerwenka, A., and L.L. Lanier. 2001. NK cells, viruses and cancer. Nat. Rev. Immunol. 1:41-49)。ＮＫ細胞および特定のＴ細胞は、それらの表面に、標的細胞の認識と病的細胞に対する自然防御の活性化を担う、顕著なホモ二量性表面免疫受容体ＮＫＧ２Ｄを呈する(Lanier, LL, 1998. NK cell receptors. Ann. Rev. Immunol. 16: 359-393; Houchins JP et al. 1991. DNA sequence analysis of NKG2, a family of related cDNA clones encoding type II integral membrane proteins on human NK cells. J. Exp. Med. 173: 1017-1020; Bauer, S et al., 1999. Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor for stress-inducible MICA. Science 285: 727-730)。ヒトＮＫＧ２Ｄ分子は、その同族リガンド、すなわち、８４％配列が同一または相同な、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ鎖関連糖タンパク質（ＭＩＣ）の多形類似体である単量体ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢに結合するＣ型レクチン様細胞外ドメインを有する(Weis et al. 1998. The C-type lectin superfamily of the immune system. Immunol. Rev. 163: 19-34; Bahram et al. 1994. A second lineage of mammalian MHC class I genes. PNAS 91:6259-6263; Bahram et al. 1996a. Nucleotide sequence of the human MHC class I MICA gene. Immunogenetics 44: 80-81; Bahram and Spies TA. 1996. Nucleotide sequence of human MHC class I MICB cDNA. Immunogenetics 43: 230-233)。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの非病的発現は、腸管上皮、ケラチノサイト、内皮細胞および単球に限定されるが、増殖、酸化および熱ショックなどの多くのタイプの細胞ストレスに応答してこれらのＭＩＣタンパク質の異常な表面発現が生じ、細胞を病的としてマークする(Groh et al. 1996. Cell stress-regulated human MHC class I gene expressed in GI epithelium. PNAS 93: 12445-12450; Groh et al. 1998. Recognition of stress-induced MHC molecules by intestinal γδT cells. Science 279: 1737-1740; Zwirner et al. 1999. Differential expression of MICA by endothelial cells, fibroblasts, keratinocytes and monocytes. Human Immunol. 60: 323-330)。ＭＩＣタンパク質の病的発現はまた、いくつかの自己免疫疾患にも関与していると思われる(Ravetch, JV and Lanier LL. 2000. Immune Inhibitory Receptors. Science 290: 84-89; Burgess, SJ. 2008. Immunol. Res. 40: 18-34)。多形性ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢなどのＮＫＧ２Ｄリガンドの差次的調節は、免疫系に、望まない攻撃から健常な細胞をなお保護しつつ、広範な緊急の合図を識別して応答するための手段を提供するために重要である(Stephens HA, (2001) MICA and MICB genes: can the enigma of their polymorphism be resolved? Trends Immunol. 22: 378-85; Spies, T. 2008. Regulation of NKG2D ligands: a purposeful but delicate affair. Nature Immunol. 9: 1013-1015)。
【００１６】
ウイルス感染は、ＭＩＣタンパク質発現の一般的な誘導因子であり、ＮＫまたはＴ細胞攻撃のためのウイルス感染細胞を識別する(Groh et al. 1998; Groh et al. 2001. Co-stimulation of CD8+ αβT-cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2: 255-260; Cerwenka, A., and L.L. Lanier. 2001)。実際に、その宿主細胞上でのこのような攻撃を避けるために、サイトメガロウイルスおよびその他のウイルスは、自然免疫系の暴威を逃れるために、それが感染した細胞の表面でのＭＩＣタンパク質の発現を防ぐ機構を進化させた(Lodoen, M.,K. Ogasawara, J.A. Hamerman, H. Arase, J.P. Houchins, E.S. Mocarski, and L.L. Lanier. 2003. NKG2D-mediated NK cell protection against cytomegalovirus is impaired by gp40 modulation of RAE-1 molecules. J. Exp. Med. 197:1245-1253; Stern-Ginossar et al., (2007) Host immune system gene targeting by viral miRNA. Science 317: 376-381; Stern-Ginossar et al., (2008) Human microRNAs regulate stress-induced immune responses mediated by the receptor NKG2D. Nature Immunology 9: 1065-73; Slavuljica, I A Busche, M Babic , M Mitrovic, I Gasparovic, D Cekinovic, E Markova Car, EP Pugel, A Cikovic, VJ Lisnic, WJ Britt, U Koszinowski, M Me
sserle, A Krmpotic and S Jonjic. 2010. Recombinant mouse cytomegalovirus expressing a ligand for the NKG2D receptor is attenuated and has improved vaccine properties. J. Clin. Invest. 120: 4532-4545)。
【００１７】
それらのストレスにもかかわらず、多くの悪性細胞、例えば、肺癌および膠芽腫脳癌のそれも、ＭＩＣタンパク質の発現を回避し、結果として、それらは自然免疫系も逃れるので特に侵襲的となり得る(Busche, A et al. 2006, NK cell mediated rejection of experimental human lung cancer by genetic over expression of MHC class I chain-related gene A. Human Gene Therapy 17: 135-146; Doubrovina, ES, MM Doubrovin, E Vider, RB Sisson, RJ O'Reilly, B Dupont, and YM Vyas, 2003. Evasion from NK Cell Immunity by MHC Class I Chain-Related Molecules Expressing Colon Adenocarcinoma (2003) J. Immunology 6891-99; Friese, M. et al. 2003. MICA/NKG2D-mediated immunogene therapy of experimental gliomas. Cancer Research 63 : 8996-9006; Fuertes, MB, MV Girart, LL Molinero, CI Domaica, LE Rossi, MM Barrio, J Mordoh, GA Rabinovich and NW Zwirner. (2008) Intracellular Retention of the NKG2D Ligand MHC Class I Chain-Related Gene A in Human Melanomas Confers Immune Privilege and Prevents NK Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Immunology, 180: 4606-4614)。
【００１８】
ＮＫＧ２Ｄに結合されたヒトＭＩＣＡの高解像度構造は解明されており、ＭＩＣＡのα３ドメインにＮＫＧ２Ｄとの直接的相互作用は無いことを実証している(Li et al. 2001. Complex structure of the activating immunoreceptor NKG2D and its MHC class I-like ligand MICA. Nature Immunol. 2: 443-451; Protein Data Bank accession code 1HYR)。ＭＩＣＡのα３ドメインは、ＭＩＣＢのそれと同様に、短いフレキシブルリンカーペプチドによりα１−α２プラットフォームドメインに接続され、それ自体は本来、プラットフォームとＭＩＣ発現細胞の表面との間の「スペーサー」として配置される。ヒトＭＩＣＡとＭＩＣＢのα３ドメインの三次元構造はほぼ同一であり（二乗平均平方根＜１Å  ９４Ｃ−αα）、機能的に互換的である(Holmes et al. 2001. Structural Studies of Allelic Diversity of the MHC Class I Homolog MICB, a Stress-Inducible Ligand for the Activating Immunoreceptor NKG2D. J Immunol. 169: 1395-1400)。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「可溶性ＭＩＣタンパク質」、「可溶性ＭＩＣＡ」および「可溶性ＭＩＣＢ」は、ＭＩＣタンパク質のα１、α２、およびα３ドメインを含むが、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインを含まないＭＩＣタンパク質を指す。
【００２０】
可溶性ＭＩＣタンパク質のα１−α２プラットフォームドメインはα３ドメインに係留され、哺乳動物の細胞間または血管内空間に拡散できる。好ましくは、本発明の非天然ＭＩＣタンパク質のα１−α２プラットフォームドメインは、ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の非変性または天然α１−α２ドメインと少なくとも８０％同一または相同であり、ＮＫＧ２Ｄと結合する。いくつかの実施形態では、α１−α２プラットフォームドメインは、ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の非変性または天然α１−α２プラットフォームドメインと８５％同一であり、ＮＫＧ２Ｄと結合する。他の実施形態では、α１−α２プラットフォームドメインは、ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の非変性または天然α１−α２プラットフォームドメインと９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、ＮＫＧ２Ｄと結合する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、異種ペプチドタグは、可溶性ＭＩＣタンパク質の精製の補助とするために、α１−α２ドメインまたは可溶性ＭＩＣタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。タグ配列は、ポリヒスチジン、ｍｙｃペプチドまたはＦＬＡＧタグなどのペプチドを含む。このようなタグは、当業者に公知の方法によってＭＩＣ分子の単離の後に除去することができる。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は互換的に使用され；「異種分子」、「異種ペプチド」、「異種配列」または「異種原子」は、天然にはまたは本来は、対象分子と物理的に一緒には見られない、それぞれ分子、ペプチド、核酸またはアミノ酸配列、または原子である。
【００２３】
用語「含んでなる」は、「含む」、「含有する」または「を特徴とする」と互換的に使用され、包括的または非限定的な(open-ended)言葉であり、付加的な列挙されてない要素または方法工程を排除しない。「からなる」という句は、特許請求の範囲に明示されていないいずれの要素、工程、または成分も排除する。「から本質的になる」という句は、クレームの範囲を明示された材料または工程および特許請求される発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。本開示は、これらの句のそれぞれの範囲に相当する本発明の組成物および方法の実施形態を企図する。よって、列挙される要素または工程を含んでなる組成物または方法は、組成物または方法がこれらの要素または工程から本質的になる、またはからなる特定の実施形態を企図する。
【００２４】
本明細書に引用される総ての参照文献は、従前に具体的に組み込まれているかいないに関わらず、それらの全内容が引用することにより本明細書の一部とされる。本明細書で使用する場合、用語「１つの(a)」、「１つの(an)」、および「任意の(any)」はそれぞれ、単数形および複数形の両方を含むものとする。
【００２５】
以上に本発明を詳細に記載してきたが、当業者には、同じことが本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、また、過度な実験を行わずに、広範囲の等価のパラメーター、濃度、および条件の中で実施できることを認識されるであろう。本発明はその特定の実施形態に関して記載されているが、さらなる改変が可能であることが理解されるであろう。本出願は、一般に本発明の原理に従いかつ本発明が属する技術の範囲内の既知または慣用の実施の範囲にあるような本開示からの逸脱を含む本発明のいずれの変形形態、使用、または適合も包含するものとし、以上に示される必須の特徴に適用することができる。
【実施例】
【００２６】
ｉＦｖおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの改変型α１−α２ドメインの例
実施例１（ｉＦｖ）。特定の例として、本発明者らは、下記の順序でコードする１１２６ｂｐおよび１１４４ｂｐのＤＮＡフラグメント（それぞれ配列番号１および２）を合成した：ヒトＭＩＣＡのα３ドメイン（親ペプチドとして）アミノ酸１８２〜アミノ酸１９４（α３ドメインのループ１の開始部）、スペーサー無しまたはＧＧＳアミノ酸スペーサー領域（ＳＲ）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）結合抗体(MAbR3;Qing, J., Du, X., Chen, Y., Chan, P., Li, H., Wu, P., Marsters, S., Stawicki, S., Tien, J., Totpal, K., Ross, S., Stinson, S., Dornan, D., French, D., Wang, Q. R., Stephan, J. P., Wu, Y., Wiesmann, C, and Ashkenazi, A. (2009) Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice, The Journal of clinical investigation 119, 1216-1229.）の構造に基づくｉＦｖペプチド、スペーサー無しまたは別のＧＧＳスペーサー領域、アミノ酸１９６で始まり、α３ドメインの残りのカルボキシ末端部分から可溶性ＭＩＣＡ分子のアミノ酸２７６までを含むα３ドメインのループ１の遠位部分。各合成二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドはこのように、ＭＩＣＡのα３ドメインのループ１に挿入されたｉＦｖの形態で６つのＣＤＲを含んだポリペプチドをコードした。
【００２７】
このｉＦｖペプチド自体（配列番号３）は、配列番号４によってコードされ、残基ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５）に相当する２つの同一の典型的なリンカー領域（ＬＲ）を含んだ(Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C, and Barbas, C. F., 3rd. (2011) Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011)。一方のＬＲは、ＶＬドメインのＣ末端とＶＨドメインのＮ末端を連結し、第２のＬＲは、ＶＨドメインのＣ末端とＶＬドメインのＮ末端を連結した。概念的には、この新規な構造は、上記で言及された、出発Ｆｖの６つのＣＤＲを含んだ連続的または「環状」ペプチドである。抗体の可変ＶＬ鎖は、β−ストランド１と２の間のループ領域内で効果的に分割され（Ｓ１およびＳ２）、それにより、それぞれ新たな非天然Ｃ末端とＮ末端の対を伴った新たなＮ末端セグメント（ＶＬＮ）と新たなＣ末端セグメント（ＶＬＣ）を作り出した、図５Ａ。この末端の対は、タンパク質などのレシピエント分子に対するｉＦｖの付着またはコンジュゲーションのための唯一の部位を作り出した。親α３ドメインに挿入されたｉＦｖの模式図を図５Ｂに示す。
【００２８】
異種ｉＦｖペプチドがα３ドメインに挿入された可溶性ＭＩＣＡタンパク質を生産するために、本発明者らは、それぞれα３−ｉＦｖ．ｌ（配列番号６）およびα３−ｉＦｖ．２（配列番号７）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１および２）を収容するためのバキュロウイルス発現ベクターを作出した。ＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅し、ＮｃｏIおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、バキュロウイルス発現ベクターＳＷ４０３にサブクローニングし、野生型α３ドメインを置換した。ＳＷ４０３は、５’ＢａｍＨＩおよび３’ＥｃｏＲＩ部位を用いて野生型ｓＭＩＣＡ（残基１〜２７６）が従前にクローニングされたｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）由来のバキュロウイルス発現ベクターである。この新たな発現ベクターをＳＦ９昆虫細胞にバキュロウイルスＤＮＡとともに共トランスフェクトし、バキュロウイルスを２回の増幅周期の間、増殖させ、製造者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、Ｔ．ｎｉ昆虫細胞でＨｉｓタグ付きＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖタンパク質を発現させるために使用した。発現は３日間、１００ｍＬ容量で行い、分泌された可溶性タンパク質を、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製するために、増殖培地を採取した。単量体ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖが＞９０％の純度に精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定した場合、推定分子量は６０．９ｋＤａであった。機能的特性評価は、結合ＥＬＩＳＡおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ標的細胞死滅アッセイを用いて行った。
【００２９】
精製されたＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖタンパク質を、ＦＧＦＲ３標的とＮＫＧ２Ｄ受容体への同時結合を確認するために、ＦＧＦＲ３結合ＥＬＩＳＡで試験した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＦＧＦＲ３を、２ｕｇ／ｍｌの濃度でＭａｘｉｓｏｒｐプレートにコーティングした。各ＭＩＣＡタンパク質の力価を測定し、１時間、ＦＧＦＲ３と結合させ、洗浄して結合していないｓＭＩＣＡタンパク質を除去した。結合したＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖタンパク質を、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃおよび抗Ｆｃ−ＨＲＰコンジュゲートを用いて検出した。図６は、ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．１およびＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２の両方のＦＧＦＲ３への結合は、可溶性ＭＩＣのＣ末端に、ＭＡｂＲ３から構築された従来のｓｃＦｖを融合させることによって作製されたＭＩＣＡ−ｓｃＦｖと同等であったことを示す。これらのＥＬＩＳＡ結果はまた、ｓｃＦｖおよびα１−α２ドメインそれぞれのＦＧＦＲ３およびＮＫＧ２Ｄ結合特異性の両方が改変型ＭＩＣＡにより保持されていたことも示し、異なるスペーサー形式を用いて挿入されたｉＦｖペプチドが機能的であったことを実証した。
【００３０】
本発明者らは、ｓＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２の熱安定性を試験し、ｓＭＩＣＡ−ｓｃＦｖと比較した。両方のタンパク質を６０〜９０℃に上昇する温度に１時間曝し、次いで１時間室温に平衡化し、その後、ＥＬＩＳＡにより結合特性に関してアッセイした。図７Ａおよび７Ｂの結果は、ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２はＦＧＦＲ３に対する特異的結合を失うことなく、８０℃の高温に曝すことができることを示した。従来のＭＩＣＡ−ｓｃＦｖは、７０℃で結合活性を失った。この結果は、本発明のｉＦｖ形式を含む可溶性ＭＩＣＡが従来のｓｃＦｖの末端融合物(Miller, B. R., Demarest, S. J., Lugovskoy, A., Huang, F., Wu, X., Snyder, W. B., Croner, L. J., Wang, N., Amatucci, A., Michaelson, J. S., and Glaser, S. M. (2010) Stability engineering of scFvs for the development of bispecific and multivalent antibodies, Protein engineering, design & selection : PEDS 23, 549-557; Weatherill, E. E., Cain, K. L., Heywood, S. P., Compson, J. E., Heads, J. T., Adams, R., and Humphreys, D. P. (2012) Towards a universal disulphide stabilised single chain Fv format: importance of interchain disulphide bond location and vL-vH orientation, Protein engineering, design & selection : PEDS 25, 321-329)よりも有意に安定であることを示した。
【００３１】
ＮＫ細胞により媒介されるＦＧＦＲ３発現標的細胞の溶解の方向を変えるＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖの能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてカルセイン放出アッセイで実証された。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫＬを、カルセインを負荷した、ＦＧＦＲ３を異所発現するＰ８１５標的細胞とともに共培養した。図８の結果は、これら２つのＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ分子は従来のＭＩＣＡ−ｓｃＦｖ融合物に比べて有意に大きいＮＫ媒介溶解を示したが、非標的化可溶性ＭＩＣＡ対照は死滅活性を有していなかったことを示した。これらの結果により、標的細胞上の本発明のｉＦｖ結合ＦＧＦＲ３は、完全な親タンパク質分子としての可溶性ＭＩＣＡに照らして、有効なＮＫ細胞媒介溶解を誘導したことが確認された。
【００３２】
ｉＦｖ形式が他の抗体可変ドメインに適用可能なことは、ＣＤ２０特異的抗体に由来するｉＦｖを含んだα３−ｉＦｖ．３（配列番号８）を同様に構築することによって証明された(Du, J., Wang, H., Zhong, C, Peng, B., Zhang, M., Li, B., Huo, S., Guo, Y., and Ding, J. (2007) Structural basis for recognition of CD20 by therapeutic antibody Rituximab, The Journal of biological chemistry 282, 15073-15080)。図９Ａおよび９Ｂは、ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．３は、上記のようなプレート系ＥＬＩＳＡにおいてＣＤ２０でコーティングしたウェルに特異的に結合できたこと、また、カルセイン放出アッセイにおいてＣＤ２０を発現するＲａｍｏｓ細胞のＮＫ媒介溶解を誘導したことを示す。
【００３３】
実施例２（ＮＫＧ２Ｄリガンドの改変型α１−α２ドメイン）。ＵＬＢＰ−１〜ＵＬＢＰ−６と呼称されるヒトタンパク質は、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ同様、ヒトＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体に結合してヒトＮＫ細胞および特定のＴ細胞を活性化する、天然に存在するストレス誘導性の細胞表面リガンドである(15; Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi.10.1034/j.1399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652)。加えて、牛痘ウイルスタンパク質ＯＭＣＰは、ＭＩＣタンパク質のα１−α２ドメインと同様にＮＫＧ２Ｄに結合する分泌型ドメインである。ＯＭＣＰは、明らかに、その感染宿主細胞上でウイルスにより誘導される天然ストレスリガンドのＮＫＧ２Ｄの認識を遮断するために、ＮＫＧ２Ｄに対して極めて高い親和性を示す(Eric Lazear, Lance W. Peterson, Chris A. Nelson, David H. Fremont. J Virol. 2013 January; 87(2): 840-850. doi: 10.1128/JVI.01948-12)。ＵＬＢＰ群およびＯＭＣＰは、カノニカルなα１−α２ドメイン構造を共有するＮＫＧ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２ＤＬ）と考えられるが、ＭＩＣＡ  α１−α２との配列相同性は２７％未満であり、それらは総て、本来、標的化ドメインを係留するためのα３ドメインを欠いている。本発明者らは、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２、ＵＬＢＰ−３、ＵＬＢＰ−４、ＵＬＢＰ−６およびＯＭＣＰのそれぞれに、標的化ｉＦｖが挿入されているＭＩＣＡの改変型α３ドメインを融合させた結果としてＦＧＦＲ３発現細胞を特異的に標的とし死滅させた異種ポリペプチドを付着させることによって、一連の非天然ＵＬＢおよびＯＭＣＰタンパク質を構築した。さらに、本発明者らは、ＭＩＣＡのα１−α２ドメインをＮＫＧ２Ｄに対するα１−α２ドメインの親和性を高めるように改変した後、改変型α１−α２ドメインにポリペプチ
ドなどの異種分子を付着させた。改変型α３−ｉＦｖドメインに付着されたＵＬＢＰおよびＯＭＣＰ  α１−α２ドメインからなるタンパク質を生産するために、本発明者らは、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２、ＵＬＢＰ−３、ＵＬＢＰ−４、ＵＬＢＰ−６、およびＯＭＣＰの種々のα１−α２ドメイン（それぞれ配列番号１５〜２０）をコードしたＤＮＡフラグメント（配列番号９〜１４）を収容するためのバキュロウイルス発現ベクターを作出した。これらのＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅し、ＢｌｐＩおよびＮｃｏＩ制限酵素を用いて消化し、個々にバキュロウイルス発現ベクターＫＬＭ４４にサブクローニングし、ＭＩＣＡ  α１−α２ドメインを置換した。ＫＬＭ４４は、ＭＩＣＡ−α３−ｉＦｖ．２が従前にクローニングされたＳＷ４０３に由来するバキュロウイルス発現ベクターであった（実施例１）。α３−ｉＦｖ．２とのＵＬＢＰ群およびＯＭＣＰ  α１−α２ドメイン融合物（それぞれＵＬＢＰ１−α３−ｉＦｖ．２、ＵＬＢＰ２−α３−ｉＦｖ．２、ＵＬＢＰ３−α３−ｉＦｖ．２、ＵＬＢＰ４−α３−ｉＦｖ．２、ＵＬＢＰ６−α３−ｉＦｖ．２、およびＯＭＣＰ−α３−ｉＦｖ．２；配列番号２１〜２６）を含有する新たなＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２構築物を、ＳＦ９昆虫細胞にバキュロウイルスＤＮＡとともに共トランスフェクトした。バキュロウイルスを２回の増幅周期の間、増殖させ、製造者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、Ｔ．ｎｉ昆虫細胞でこれらのＨｉｓタグ付きＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質を発現させるために使用した。発現は３日間、１００ｍＬ容量で行い、分泌された可溶性タンパク質を、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製するために、増殖培地を採取した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定した場合、正確な分子量の単量体タンパク質が＞９０％の純度に精製された。機能的特性評価は、結合ＥＬＩＳＡおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ標的細胞死滅アッセイを用いて行った。
【００３４】
６種類の精製されたＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質を、ＦＧＦＲ３標的とＮＫＧ２Ｄ受容体への同時結合を確認するために、ＦＧＦＲ３結合ＥＬＩＳＡで試験した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＦＧＦＲ３を２ｕｇ／ｍｌの濃度でＭａｘｉｓｏｒｐプレートにコーティングした。各ＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質の力価を測定し、１時間、ＦＧＦＲ３と結合させ、洗浄して結合していないタンパク質を除去した。結合したＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質を、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃおよび抗Ｆｃ−ＨＲＰコンジュゲートを用いて検出した。図１０は、６種類総てのＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質が、予想通り、ｉＦｖ．２ドメインとの相互作用を介してＦＧＦＲ３と強く結合したこと、およびＮＫＧ２Ｄ結合活性は付着されたＮＫＧ２ＤＬ  α１−α２ドメインによって保持されたことを示し、このことは、付着されたα３−ｉＦｖドメインは、ＭＩＣタンパク質同様にＮＫＧ２Ｄと結合するＵＬＢＰおよびＯＭＰＣタンパク質に機能的ＦＧＦＲ３結合活性を付与したことを実証した。
【００３５】
ＦＧＦＲ３発現標的細胞のＮＫ細胞媒介溶解の方向を変えるＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質の能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてカルセイン放出アッセイで実証された。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫＬを、カルセインを負荷した、ＦＧＦＲ３を異所発現するＰ８１５標的細胞とともに共培養した。図１１の結果は、ＯＭＣＰ−α３−ｉＦｖ．２は最大のＮＫ媒介溶解を誘導し、一方、他のＮＫＧ２ＤＬ−α３−ｉＦｖ．２タンパク質は総て、様々な効力の程度および溶解量で特異的な死滅活性を示したことを示した。これらの結果により、本発明のｉＦｖは、他のタンパク質に特異的結合活性を付与し、これらのタンパク質はそれらの固有の機能的特性を保持し、ｉＦｖによって標的化された細胞の、種々のレベルの細胞媒介溶解を誘導したことが確認された。
【００３６】
実施例３（ＮＫＧ２Ｄリガンドの改変型α１−α２ドメイン）。これらは、ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体に対するそれらの結合親和性を有意に増強するように改変されたＮＫＧ２ＤＬにポリペプチドを付着させる例である。ＭＩＣタンパク質のα１−α２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対するＮＫＧ２ＤＬである。この親和性は、ＮＫ細胞の生理的活性化および「標的細胞」の二次元原形質膜表面に不可逆的に係留された天然全長ＭＩＣタンパク質を発現する細胞の溶解の刺激には十分なものである(Bauer S, Groh V, Wu J, Steinle A, Phillips JH, Lanier LL, Spies T., Science. 1999 Jul 30;285(5428):727-9)。
【００３７】
しかしながら、本発明の操作された可溶性ＭＩＣタンパク質は、標的細胞の表面の特異的標的抗原と可逆的に結合するので、この操作された可溶性ＭＩＣタンパク質のＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性は、ＮＫ細胞と標的抗原発現細胞との間で形成される可溶性ＭＩＣ依存性の複合体の安定性に直接影響を及ぼすであろう。特に、ｓＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄの間の親和性がＮＫＧ２Ｄからの改変型ｓＭＩＣＡの解離速度(dissociation rate or off-rate)が実質的に遅いほど高まるならば、ＮＫ細胞に基づく死滅は、標的細胞に結合される可溶性ＭＩＣ分子の密度が低いほど大きくなると思われる。本発明の前には、可溶性ＭＩＣタンパク質の死滅活性を変更するまたはＮＫＧ２Ｄに対するＭＩＣタンパク質の親和性を高めるために結合解離速度を有意に低下させるいずれのα１−α２突然変異も同定されていなかった。コンピューター設計の試みでは、野生型ＭＩＣＡのα１−α２ドメインの３つの突然変異：Ｎ６９Ｗ、Ｋ１５２Ｅ、およびＫ１５４Ｄ（ＷＥＤ−ＭＩＣＡ）の組合せが、結合していないＭＩＣＡの安定性、およびそれによりＮＫＧ２Ｄに対する結合のその会合速度(association rate or on-rate)に影響を与えることによってＮＫＧ２Ｄ結合親和性にそこそこの影響を与え得ることが示された(Lengyel CS, Willis LJ, Mann P, Baker D, Kortemme T, Strong RK, McFarland BJ., J Biol Chem. 2007 Oct 19;282(42):30658-66. Epub 2007 Aug 8)。公開されている構造的記述(Li P, Morris DL, Willcox BE, Steinle A, Spies T, Strong RK., Nat Immunol. 2001 May;2(5):443-451)に従い、ＮＫＧ２Ｄと理論上接触しているＭＩＣＡの２２のアミノ酸位置を反復計算によりスキャンする同じグループによるその後の大規模コンピューター設計研究では、ＭＩＣＡのさらなる合理的反復コンピューター設計が、最初に設計された３つの変化と組み合わせた場合に、全部で７個の突然変異の組合せで、ＮＫＧ２Ｄに対するその親和性を弱い（Ｋｄ約２．５μΜ）から中等度の厳格性（
Ｋｄ＝５１ｎＭ）へと質的に変化させたことが実験的に示された(Henager, Samuel H., Melissa A. Hale, Nicholas J. Maurice, Erin C. Dunnington, Carter J. Swanson, Megan J. Peterson, Joseph J. Ban, David J. Culpepper, Luke D. Davies, Lisa K. Sanders, and Benjamin J. McFarland, 2102, Combining different design strategies for rational affinity maturation of the MICA-NKG2D interface. Protein Science 21 : 1396-1402)。これに対し、本発明に記載の実験的アプローチは、Lengyel et al (Lengyel CS, Willis LJ, Mann P, Baker D, Kortemme T, Strong RK, McFarland BJ., J Biol Chem. 2007 Oct 19;282(42):30658-66. Epub 2007 Aug 8)の３つのＷＥＤ変化によって安定化されたＭＩＣＡに始まり、ＭＩＣＡのα１−α２ドメインとＮＫＧ２Ｄとの間の解離速度を緩徐化したＭＩＣＡのアミノ酸修飾を実験的に選択した。
【００３８】
本発明のこの例は、解離速度結合動態に影響を及ぼし、それにより本発明の非天然標的ＭＩＣ分子のＮＫ細胞媒介死滅活性を変更する、α１−α２ドメイン内の選択されたアミノ酸位置における特定の突然変異を操作することによって、可溶性ＭＩＣタンパク質のＮＫＧ２Ｄ結合親和性を改変することに関する。
【００３９】
ＮＫＧ２Ｄに対する親和性が変更された可溶性非天然α１−α２ドメインを作出するために、α１−α２ドメイン内の５７残基を大規模突然変異誘発のために選択した（図１２Ａ）。α１−α２ドメインをコードし、かつ、５７のアミノ酸位置のそれぞれにＮＮＫ突然変異誘発コドンを含有する合成ＤＮＡライブラリーを合成し、個々に、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩマイナーコートタンパク質との融合物としてクローニングし、変異誘発されたα１−α２変異体を展示するファージ粒子を、標準的な方法に従い(Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C, and Barbas, C. F., 3rd. (2011) Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011)、ＳＳ３２０大腸菌(E.coli)細胞内で生産した。α１−α２ファージライブラリーを、標的抗原として組換えビオチン化ＮＫＧ２Ｄを用い、結合親和性の増強に関して選別し、緩慢な解離速度(dissociation- or off-rates)に関して富化された高親和性変異体を選択するために、意図的に延長された結合、延長された洗浄、およびファージクローンの溶出の反復ラウンドによってサイクルを行った。特定のアミノ酸突然変異のセットがα１−α２内の６つの位置に高い頻度で生じ、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性が増強された好ましいアミノ酸置換として選択した（図１２Ｂ、表１）。
【００４０】
表１．ＭＩＣのα１−α２ドメインの示された６つのアミノ酸位置において選択された親和性突然変異。配列番号３５の、６つの位置のそれぞれにおけるアミノ酸を表の第一列に太字で示す。同定された親和性突然変異を上から下へ高い順に列挙する。総てのアミノ酸を一文字ＩＵＰＡＣ略記で表す。
【００４１】
【表１】
2019523016.tif 000003
【００４２】
本発明者らは、発見された特定の突然変異の異なる組合せを含んだ４つの代表的変異体１５、１６、１７、１８（表２）のα１−α２ドメインをコードするＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号２７〜３０）を合成した。
【００４３】
表２．特定のα１−α２ドメイン変異体の配列。配列番号３５のアミノ酸と比較した変異体１５、１６、１７、および１８（それぞれ配列番号３１〜３４）の特定のアミノ酸置換を太字で列挙する。総てのアミノ酸を一文字ＩＵＰＡＣ略記で表す。
【００４４】
【表２】
2019523016.tif 000004
【００４５】
上記の例におけるＮＫＧ２ＤＬに対し、本発明者らは、リンカーペプチドを用いて、これらの４つの改変型α１−α２  ＮＫＧ２ＤＬのそれぞれにポリペプチドなどの異種分子を直接付着させた。異種分子が付着された改変型ＮＫＧ２ＤＬからなる４つのＨｉｓタグ付きタンパク質（配列番号３１〜３４）を昆虫細胞で発現させ、それらのＮＫＧ２Ｄ結合親和性および動態結合パラメーターの特性評価を行うために精製した。競合的結合ＥＬＩＳＡを用い、本発明者らは、これら４つの改変型α１−α２変異体の相対的ＮＫＧ２Ｄ結合親和性を決定した。ｓＭＩＣＡタンパク質である可溶性野生型（ＷＴ）ＮＫＧ２ＤＬをｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートの総てのウェルにコーティングし、ヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ試薬の結合相手を提供した。これら４つのα１−α２変異体ならびにＷＴおよびＷＥＤ−α１−α２ドメイン（配列番号３５）の溶液の力価をＥＬＩＳＡウェルで測定し、プレートにコーティングされたＷＴ  ｓＭＩＣＡに対する２ｎＭヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃの結合を競合的に阻害させた。プレート上のＷＴ  ＮＫＧ２ＤＬに結合されたヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃのレベルを、抗Ｆｃ−ＨＲＰ抗体を用いて検出した。図１３Ａは、変異体１６、１７、および１８が０．７、０．６、０．５ｎＭのＩＣ５０値を示し、変異体１５は１．７ｎＭのＩＣ５０値を示し、総てがＮＫＧ２Ｄに対して、それぞれＷＴ  ＮＫＧ２ＤＬの２７倍、３２倍、３８倍および１１倍という有意に良好な結合を有するとともに、ＷＥＤ−ＭＩＣＡよりも実質的に良好であったことを示す（表３）。
【００４６】
表３．α１−α２変異体の平衡および動態結合パラメーター。ＩＣ５０値は競合結合力価測定への４−パラメーターフィットから導き（図１２Ａおよび１２Ｂ）、動態結合パラメーターは結合動態への単一指数フィットから導いた（図１３Ａおよび１３Ｂ）。平衡結合定数（Ｋｄ）は、式Ｋｄ＝ｋＯＦＦ／ｋＯＮを用い、動態結合パラメーターから導いた。
【００４７】
【表３】
2019523016.tif 000005
【００４８】
重要なこととして、相対的なＩＣ５０の相違はマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃへのより良好な結合とも言い換えられ（図１３Ｂ）、前臨床創薬の重要な特性である、ヒトおよび非ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体間の可溶性改変型α１−α２ドメインの結合を改善する能力が実証された。
【００４９】
変更された親和性の動態基礎を理解するために、表面コーティングされたビオチン化ヒトＮＫＧ２Ｄに対するα１−α２変異体ＮＫＧ２ＤＬ結合の会合速度および解離速度の両方を、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）を用い、１００ｎＭの各改変型α１−α２タンパク質で測定した。ＩＣ５０  ＥＬＩＳＡからの結果と一致して、変異体１６、１７および１８はそれぞれ解離速度の有意な低下（ＷＴの１８分の１）を示し、これが主として親和性増強（ＷＴ  α１−α２の約３０倍）の原因である（図１４；表３）。
【００５０】
変異体１５は１６、１７、および１８と類似の遅い解離速度を示したが、その会合速度は低下し、ＷＴよりも強いが、変異体１６、１７および１８よりも弱い親和性をもたらした。変異体１５（配列番号３１）と１６（配列番号３２）の間の唯一の違いはＫ１２５ＮとＫ１２５Ｌであったので、１２５番の位置の突然変異は会合速度を明らかに変更したが、解離速度の低下はＨ１６１Ｒ突然変異によるものであった。従って、ＮＫＧ２ＤＬ突然変異の選択されたセット（表１）が有意な解離速度低下を介してＮＫＧ２Ｄに対するα１−α２の親和性を高めるために使用されたが、特定の置換もまた会合速度を変更して、本発明者らが本明細書で下記のようにＮＫ細胞媒介死滅アッセイで差次的活性を有することを示した一定範囲の漸増的親和性増強をもたらした。
【００５１】
ＦＧＦＲ発現標的細胞のＮＫ細胞媒介溶解の方向を変えるα１−α２親和性変異体の能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてカルセイン放出アッセイで実証した。ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫＬを、カルセインを負荷した、ＦＧＦＲ３を異所発現するＰ８１５標的細胞とともに共培養し、可溶性改変型ＭＩＣタンパク質を用いて力価を測定した。図１５の結果は、ＦＧＦＲ３特異的可溶性ＭＩＣ変異体の死滅活性が、それらの操作されたα１−α２親和性と相関していたことを示した。具体的には、変異体１６、１７、および１８は、０．７８ｎＭでＷＴの約１５倍の死滅を示した。ＷＥＤ−ＭＩＣＡ（配列番号３５）は、ＷＴよりもやや良好であるに過ぎなかった。よって、本発明は、ヒトＮＫＧ２Ｄに対する可溶性ＭＩＣタンパク質結合の解離速度を低下させることによりＮＫＧ２Ｄ結合親和性を増強し、その結果、予想されるように死滅効力の増強に至ったα１−α２ドメイン内のアミノ酸置換を記載する。解離速度の低下というよりも会合速度の増大によって（図１４）ＮＫＧ２Ｄに対してＷＴ  ＭＩＣＡよりもいくらか大きい親和性を示したＷＥＤ−ＭＩＣＡ（図１３Ａ）は、標的細胞死滅の実質的な改善を示さなかった（図１５）。さらに、図１３Ｂに示されるように、ＷＥＤ−ＭＩＣＡは、ＷＴ  ＭＩＣＡというよりもマウスＮＫＧ２Ｄに実質的により低い結合を示したが、変異体１５、１６、１７、および１８はそれぞれ、ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄの両方に対してより大きな親和性を示した、図１３Ａおよび１３Ｂ。
【００５２】
これらのα１−α２  ＮＫＧ２ＤＬ親和性変異体１５、１６、１７、および１８は、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する、付着されたポリペプチドの結合親和性を増強し、それにより、標的化細胞のＮＫ細胞媒介溶解を増強した、図１５。
【００５３】
実施例４（ＮＫＧ２Ｄリガンドの改変型α１−α２ドメイン）。本発明のこの実施形態は、実施例３に記載されるように（表１）、可溶性ＭＩＣ分子のα１−α２ドメイン内の選択されたアミノ酸の位置に、解離速度結合動態にも影響を及ぼし、それにより、非天然α１−α２ドメインのＮＫ細胞媒介死滅活性を変更する特定の突然変異を作出することによって誘導されたさらなるα１−α２  ＮＫＧ２ＤＬ親和性変異体に関する。変異体１５〜１８はＳ２０、Ｇ６８、Ｋ１２５、およびＨ１６１の位置に見られる特定の突然変異に焦点を当てたものであるが、Ｅ１５２、Ｈ１５８、およびＱ１６６に付加的突然変異を有する別のセットの変異体も単離された（表４）。
【００５４】
表４．特異的α１−α２ドメイン変異体の配列。配列番号３５のアミノ酸と比較した変異体２０、２５、および４８に関する特定のアミノ酸置換を、表の第一列に太字で示して列挙する。総てのアミノ酸を一文字ＩＵＰＡＣ略記で表す。
【００５５】
【表４】
2019523016.tif 000006
【００５６】
発見された特定の突然変異の異なる組合せを含んだ３つの代表的変異体２０、２５、４８（それぞれ配列番号３９〜４１）（表４）のα１−α２ドメインをコードするＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号３６〜３８）を合成した。上記の例のＮＫＧ２ＤＬに対し、ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドなどの異種分子を、リンカーペプチドを用い、これら３つの改変型α１−α２ＮＫＧ２ＤＬのそれぞれに直接付着させた。これらの構築物をＣＭＶに基づく哺乳動物細胞発現ベクターであるｐＤ２５０９のＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ＦＧＦＲ３と結合する異種分子が付着された改変型ＮＫＧ２ＤＬからなる３つのＨｉｓタグ付きタンパク質（配列番号３９〜４１）を、製造者のプロトコール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＥｘｐｉ２９３発現系を用い、ＨＥＫ２９３細胞で一過性発現させ、生化学的な、活性に基づく分析のために単離されたタンパク質を得るために、Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。
【００５７】
ＮＫＧ２Ｄ結合親和性の特性評価を行うために、表面コーティングされたビオチン化ヒトＮＫＧ２Ｄに結合する３つのα１−α２変異体ＮＫＧ２ＤＬの会合速度および解離速度の両方を、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）を用いて測定した。結合力価の測定は、１〜１００ｎＭの測定範囲を用いて各タンパク質に関して行い、動態データの当てはめを行い、会合速度、解離速度、および平衡結合定数を得た。
【００５８】
変異体２５（配列番号４０）は、変異体１６（配列番号３２）（表２）に対してＱ１６６Ｓ突然変異の付加のみを含み、主として解離速度の低下のために６２ｐＭのＮＫＧ２Ｄ結合親和性を示した（図１６および表５）。これはＱ１６６Ｓ突然変異のために平衡結合親和性に８倍の増強を表し（表３と表５の比較）、Ｑ１６６における特定の突然変異が解離速度の低下によって結合親和性に影響を及ぼしたことを実証した。
【００５９】
表５．α１−α２変異体の動態結合パラメーター。動態結合パラメーターは、結合動態への単一指数フィットから導いた（図１６）。平衡結合定数（Ｋｄ）は、式Ｋｄ＝ｋＯＦＦ／ｋＯＮを用い、動態結合パラメーターから導いた。
【００６０】
【表５】
2019523016.tif 000007
【００６１】
変異体２０（配列番号３９）は、特定の突然変異Ｇ６８Ａ、Ｅ１５２Ｑ、Ｈ１５８ＲおよびＱ１６６Ｆを含み、変異体２５と類似の結合パラメーターを維持しており（表５）、この特定の突然変異のユニークな組合せもまた解離速度の低下のためにＮＫＧ２Ｄ結合親和性を改善したことが示唆される。
【００６２】
変異体４８（配列番号４１）は、変異体１６に見られるＫ１２５ＬおよびＨ１６１Ｒ突然変異（表２）を含んでいたが、突然変異Ｅ１５２Ａ、Ｈ１５８Ｉ、およびＱ１６６Ａ（表４）の付加が解離速度の有意な増大をもたらし、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性を２５０分の１とした（図１６および表５）。Ｑ１６６Ａ突然変異は、Ｑ１６６の位置に関して選択された好適な親和性増強突然変異（表１）のものではなく、観測された解離速度の低下に寄与した可能性がある。これらのデータは、作出された突然変異で、α１−α２ドメイン内の定義された位置で選択および同定されたもののユニークな組合せは、解離速度の調節を介してＮＫＧ２Ｄの結合親和性を調整したことを明らかに実証した。
【００６３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるカルセイン放出アッセイで示されたように、ポリペプチドが付着された非天然α１−α２親和性変異体は、ＦＧＦＲ３発現標的細胞のＮＫ細胞媒介溶解の方向を変えた。ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫＬを、カルセインを負荷した、ＦＧＦＲ３を異所発現するＰ８１５標的細胞とともに共培養し、可溶性改変型ＮＫＧ２Ｄリガンドα１−α２タンパク質を用いて力価を測定した。図１７の結果は、ＦＧＦＲ３により標的化された可溶性ＭＩＣ変異体の死滅特性が、それらの操作されたα１−α２親和性と相関していたことを示した。特に、変異体２５は、０．２ｎＭで変異体１６の約３倍の死滅を示し、細胞死滅に関してはＥＣ５０に約５倍の改善を示した。加えて、このデータは、代表的な可溶性ＭＩＣ変異体において変異体２５＞１６＞ＷＥＤの順に好ましい死滅活性を明らかに示した（図１７）。
【００６４】
実施例５（ＮＫＧ２Ｄリガンドの改変型α１−α２ドメイン）。この実施形態は、ＵＬＢＰタンパク質のα１−α２ドメインを操作することによって誘導されたさらなるα１−α２  ＮＫＧ２ＤＬ親和性変異体に関する。ＵＬＢＰタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ受容体と結合することができるＮＫＧ２Ｄリガンドであるα１−α２ドメインを含む(Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi: 10.1034/j. l399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652)。ＮＫＧ２Ｄ結合のこの親和性は、ＮＫ細胞の生理的活性化および「標的細胞」の二次元原形質膜表面に天然にかつ不可逆的に係留された非変性全長ＵＬＢＰタンパク質を発現する細胞の溶解の刺激には十分なものである(Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi: 10.1034/j. l399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652)。しかしながら、本発明の特定の実施形態において、異種ポリペプチドと融合された、操作された可溶性α１−α２ドメインは、標的細胞の表面の特異的標的抗原と可逆的に結合するので、この操作されたＵＬＢＰ  α１−α２ドメインのＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性は、操作された可溶性ＭＩＣタンパク質によってすでに示されているように（実施例２〜４）、ＮＫ細胞と標的抗原発現細胞との間で形成される人工シナプスの安定性に直接影響を及ぼすであろう。ＮＫＧ２Ｄリガンドとしての操作された非天然α１−α２ドメインのレパートリーを多様化させるために、ファージディスプレーに基づく、それらのＮＫＧ２Ｄ結合親和性の操作の基質または出発点としてＵＬＢＰタンパク質を使用した。ＵＬＢＰとＭＩＣＡとの間に見られる構造的相同性にもかかわらず(Radaev, S., Rostro, B., Brooks, AG., Colonna, M., Sun, PD. (2001) Conformational plasticity revealed by the cocrystal structure of NKG2D and its class I MHC-like Ligand ULBP3. Immunity 15, 1039-49.)、配列相同性は、ＭＩＣＡに対するＵＬＢＰ  α１−α２ドメインでは＜５０％である（図１８）。よって、本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性を改善するＵＬＢＰ  α１−α２ドメイン内のコドンの位置を同定しようとした。
【００６５】
ＵＬＢＰタンパク質由来の可溶性非天然α１−α２ドメインを操作するために、ＵＬＢＰ２およびＵＬＢＰ３をファージディスプレーおよび高親和性ＮＫＧ２Ｄ結合を有する変異株の選択のために選択した。ＵＬＢＰ２のα１−α２ドメイン（配列番号１６）の６０のアミノ酸位置、およびＵＬＢＰ３のα１−α２ドメイン（配列番号１７）の３６のアミノ酸位置を大規模突然変異誘発のために選択した（図１８）。さらに、ファージパンニングに干渉することができる不対遊離システインを除去するために、ＵＬＢＰ２（配列番号１６）のＣ１０３ＳおよびＵＬＢＰ３（配列番号１７）のＣ８Ｓに保存的なシステインからセリンへの突然変異を作出した。これらのα１−α２ドメインをコードし、かつ、選択されたアミノ酸位置のそれぞれにＮＮＫ突然変異誘発コドンを含む合成ＤＮＡライブラリーを個々に合成し、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩマイナーコートタンパク質との融合物としてクローニングし、標準的な方法に従い(Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C., and Barbas, C. F., 3rd. (2011). Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011)、突変異誘発されたα１−α２  ＵＬＢＰ２またはＵＬＢＰ３変異体を展示するファージ粒子をＳＳ３２０大腸菌細胞で生産した。α１−α２ファージディスプレーライブラリーを、標的タンパク質としてヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃを用い、ＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性の増強に関して選別し、緩慢な解離速度(dissociation- or off-rates)に関して富化された高親和性変異体を選択するために、意図的に延長された結合、延長された洗浄、およびファージクローンの溶出の反復ラウンドによってサイクルを行った。ＵＬＢＰ２については、特定のアミノ酸突然変異がα１−α２内のＲ８０、Ｖ１５１、Ｖ１５２、およびＡ１５３の位置に高い頻度で見られ、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性が増強された好ましいアミノ酸置換として同定された（図１９Ａおよび表６）。
【００６６】
表６．ＵＬＢＰ２のα１−α２ドメインの示された４つのアミノ酸位置において選択された親和性突然変異。配列番号１６の前記の４つの位置のそれぞれにおけるアミノ酸を表の第１列に太字で示す。同定された親和性突然変異を上から下へ高い順に列挙する。総てのアミノ酸を一文字ＩＵＰＡＣ略記で表す。
【００６７】
【表６】
2019523016.tif 000008
【００６８】
ＵＬＢＰ３については、特定のアミノ酸突然変異がＵＬＢＰ２とは異なる位置に高い頻度で見られた（図１８）。ＵＬＢＰ３のα１−α２ドメイン内の位置Ｒ１６２およびＫ１６５は、ＮＫＧ２Ｄ結合親和性が増強された好ましいアミノ酸置換として同定された特定の突然変異を含んだ（図１９Ｂおよび表７）。ＵＬＢＰ２およびＵＬＢＰ３に由来するこれらの改変型非天然α１−α２ドメインは、単一のタンパク質または異種ペプチもしくはポリペプチドとの融合物としての多様な治療薬形式で、ＮＫＧ２Ｄ結合の増強のために使用することができる。
【００６９】
表７．ＵＬＢＰ３のα１−α２ドメインの示された２つのアミノ酸位置において選択された親和性突然変異。配列番号１７の前記２つの位置のそれぞれにおけるアミノ酸を表の第１列に太字で示す。同定された親和性突然変異を上から下へ高い順に列挙する。総てのアミノ酸を一文字ＩＵＰＡＣ略記で表す。
【００７０】
【表７】
2019523016.tif 000009
【００７１】
実施例６（抗体ペプチドと融合された改変型α１−α２ドメイン）。これらは、ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体に対するそれらの結合親和性を有意に増強するように改変されたＮＫＧ２ＤＬに抗体ポリペプチドを付着させる例である。ＭＩＣタンパク質のα１−α２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対するＮＫＧ２ＤＬである。抗体は２本の大きな重鎖と２本の小さな軽鎖から構成される極めて安定な糖タンパク質である（図１）。可変ドメインのＣＤＲ領域内で生成され得る大量の多様性は、特定の抗原標的に対して特定の抗体が生成されることを可能とする(Hozumi N, Tonegawa S (1976). "Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73 (10): 3628-3632. doi.T 0.1073/pnas.73.10.3628. PMC 431171. PMID 824647.)。抗体は創薬のための重要な治療薬プラットフォームとなっており、標的結合および中和の両方を媒介できるとともに、補体およびＦｃ受容体結合を介して免疫系を調節する(Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. (2014) IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology 5, 520.)。本発明の前には、非変性ＮＫＧ２ＤＬよりも強くＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する非天然α１−α２ドメインを用いて免疫細胞を直接活性化することができるＩｇＧ抗体形式は存在しなかった。従前の研究は、マウスＮＫＧ２ＤリガンドであるＲａｅｌβは、マウスにおいて抗腫瘍薬として使用するための抗Ｈｅｒ２抗体と融合させ得ることを実証した(Cho, HM., Rosenblatt, JD., Tolba, K., Shin, SJ., Shin, D., Calfa, C, Zhang, Y., Shin, SU. (2010) Delivery of NKG2D ligand using and anti-Her2 antibody -NKG2D ligand fusion protein results in an enhanced innate and adaptive antitumor response. Cancer Research 70, 10121-30.)。しかしながら、マウスＮＫＧ２ＤリガンドはヒトＮＫＧ２Ｄと結合せず、ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄに対して高い親和性を有する天然ヒトＮＫＧ２Ｄリガンドは無い。本発明の操作されたα１−α２ＮＫＧ２ＤリガンドとＩｇＧ抗体の重鎖または軽鎖との間の融合（図２０Ａおよび２０Ｂ）はこれらの限界を克服し、改変型α１−α２ドメインと異種タンパク質またはペプチドとの融合物の融通性を強調した。
【００７２】
抗体との変異体α１−α２ドメイン融合物を作出するために、ＭＩＣ  ＷＴ、変異体ＷＥＤ、２５、および４８のα１−α２ドメインをコードするＤＮＡ配列を合成し、ＦＧＦＲ３特異的抗体由来の重鎖（ＨＣ＿ＷＴ、ＨＣ＿ＷＥＤ、ＨＣ＿２５、ＨＣ＿４８）または軽鎖（ＬＣ＿ＷＴ、ＬＣ＿ＷＥＤ、ＬＣ＿２５、ＬＣ＿４８）配列のＣ末端融合物としてクローニングした(Qing, J., Du, X., Chen, Y., Chan, P., Li, H., Wu, P., Marsters, S., Stawicki, S., Tien, J., Totpal, K., Ross, S., Stinson, S., Dornan, D., French, D., Wang, Q. R., Stephan, J. P., Wu, Y., Wiesmann, C, and Ashkenazi, A. (2009) Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4; 14)-positive multiple myeloma in mice, The Journal of clinical investigation 119, 1216-1229.)（それぞれ配列番号４２〜４９）。得られた融合物を哺乳動物発現ベクターｐＤ２５０９にクローニングし、改変型α１−α２ドメインの重鎖または軽鎖融合物のいずれかを有する対合した完全ＩｇＧ抗体（それぞれ配列番号５０〜５７）として発現させた。一過性発現は、ＨＥＫ２９３細胞にて、Ｅｘｐｉ２９３発現系を製造者のプロトコール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って用いて行い、標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。ＦＧＦＲ３発現標的細胞のＮＫ細胞媒介溶解の方向を変える非天然α１−α２−抗体融合物の能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてカルセイン放出アッセイで実証した。ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫＬを、カルセインを負荷した、ＦＧＦＲ３を異所発現するＰ８１５標的細胞とともに共培養し、操作された抗体融合タンパク質を用いて力価を測定した。図２０Ｃおよび２０Ｄの結果は、ＦＧＦＲ３特異的非天然α１−α２抗体融合物の死滅活性がそれらの操作されたＮＫＧ２Ｄ親和性と相関したことを示した。具体的には、非天然変異体２５および４８の重鎖または軽鎖融合物（ＨＣ＿２５、ＨＣ＿４８およびＬＣ＿２５、ＬＣ＿４８）のいずれかを含んだ抗体は、ＷＴまたはＷＥＤ  α１−α２ドメインのいずれかを含む抗体融合物よりも有効にＦＧＦＲ３発現細胞を死滅させた。
【００７３】
これは、変異体２５  α１−α２ドメインをＥＧＦＲ特異的抗体セツキシマブ（米国特許第６２１７８６６号）、Ｈｅｒ２特異的抗体トラスツズマブ(Carter, P., Presta, L., Gorman, CM., Ridgway, JB., Henner, D., Wong, WL., Rowland, AM., Kotts, C, Carver, ME., Shepard, HM. (1992) Proc Natl Acad Sci 15, 4285-9)、または抗ＰＤＬ１抗体（米国特許出願第２０１４０３４１９１７号）の重鎖または軽鎖（それぞれ配列番号５８〜６３）のいずれかのＣ末端に融合させることによる、改変型α１−α２ドメインを抗体と融合させるための一般的かつ有用なアプローチであることがさらに実証された。得られた融合物を、変異体２５  α１−α２ドメインの重鎖または軽鎖融合物のいずれかを有する、対合した軽鎖および重鎖完全ＩｇＧ抗体として発現させた。一過性発現は、ＨＥＫ２９３細胞にて、Ｅｘｐｉ２９３発現系を製造者のプロトコール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って用いて行い、標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。標的発現細胞のＮＫ細胞媒介溶解の方向を変える変異体２５抗体融合物の能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてカルセイン放出アッセイで実証した。ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫＬを、カルセインを負荷した、Ａ４３１  ＥＧＦＲ発現標的細胞、ＳＫＢＲ３  Ｈｅｒ２発現標的細胞、またはＰＤＬ１発現Ｂ１６細胞と共培養し、個々の標的特異的な操作された抗体融合タンパク質を用いて力価を測定した。図２１Ａ、２１Ｂ、および２１Ｃの結果は、標的特異的変異体２５−抗体融合物の死滅活性は、総ての場合で、非融合親抗体よりも劇的に改善され、ナノモル下のＥＣ５０値で極めて有効であったことを示した。これらのデータは、改変型α１−α２変異体−抗体融合物がＩｇＧ抗体をＮＫＧ２Ｄに強く結合させ、抗原特異的細胞溶解の方向を変えるための万能プラットフォームであることを示す。
【００７４】
実施例７（α１−α２変異体２５とのトラスツズマブ融合物はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＮＫ細胞と結合し、有効な抗原提示を惹起する）。ＮＫＧ２Ｄと高い親和性で結合するα１−α２ドメイン変異体を含む融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＮＫ細胞と結合した。よって、改変型α１−α２融合物を含む抗原特異的抗体は、ＮＫＧ２Ｄと強く結合し、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＮＫ細胞の表面を、特定の抗原を発現する標的細胞を探し出すための抗体で効果的に武装した。この活性は、操作されたＣＡＲ細胞(Gill, S., and June, CH. (2015) Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunol Rev 263, 68-89.)と同等であったが、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞種の遺伝子改変を必要としなかった。
【００７５】
改変型α１−α２融合物を含む抗体がｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＮＫ細胞と結合することを実証するために、トラスツズマブおよび対応する変異体２５の重鎖および軽鎖融合物をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血清薬物動態（ＰＫ）特性およびＮＫ細胞標識の薬動力学（ＰＤ）に関して分析した。３つ総ての抗体：親トラスツズマブ；トラスツズマブＨＣ＿２５融合物；およびトラスツズマブＬＣ＿２５融合物を、製造者のプロトコール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ６４７とコンジュゲートした。３個体のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に単回用量１００μｇの各抗体を注射し、血漿ＰＫ  ＥＬＩＳＡおよび末梢ＮＫ細胞のフローサイトメトリーのために示された時点で血液を採取した。親トラスツズマブ抗体のＰＫプロフィールは、２４時間以内の典型的なアルファー相分布と、マウスにおける１週間より長い抗体の半減期に一致するベータ相排出を示した（図２２Ａ）。変異体２５との重鎖融合物および軽鎖融合物の両方について、初期アルファー相は、ＮＫＧ２Ｄシンクと一致する、親抗体よりもはるかに大きい分布体積を示し、一方、ベータ相排出もまた、マウスにおける典型的な抗体クリアランスと一致していた（図２２Ａ）。マウス血液由来の末梢ＮＫ細胞のフローサイトメトリーを用いたところ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７によるＮＫ細胞染色のレベルは、抗体融合物で標識したＮＫ細胞の百分率に明確な時間依存性の増加を示したが、親抗体はそうではなかった（図２２Ｂ）。これらの融合物による標識の増加は、これらの融合物のＰＫプロフィールで見られたシンクと一致して２４時間以内ピークに達し、注射後少なくとも３日間安定であった。合わせたＰＫおよびＰＤデータは、変異体２５α１−α２融合物を含むトラスツズマブ抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄと安定な複合体を形成したことを実証する。
【００７６】
ヒトＩｇＧトラスツズマブ抗体に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の出現を評価するために、ＰＫ／ＰＤ試験からの血漿サンプルを、ＥＬＩＳＡを用いてＡＤＡに関して評価した。図２３Ａ〜Ｃで、３種類の個々の用量の抗体をコーティングしたウェルに結合するマウスＩｇＧに関するＥＬＩＳＡは、変異体２５と融合させた抗体だけが抗体の単回投与後７日以内にＡＤＡを惹起したことを明らかにした。親トラスツズマブ抗体は、ＡＤＡシグナルを示さなかった。トラスツズマブ抗体自体が免疫応答を惹起しなかった場合に、抗体融合物がα１−α２ドメインおよび抗体（トラスツズマブ）成分の両方に対して免疫（ＡＤＡ）応答を惹起したかどうかを判定するために、抗体融合物からのＡＤＡ陽性血漿を、それぞれ親抗体および変異体２５α１−α２ドメインに対して試験したところ、両方の部分が血漿由来のＡＤＡと反応した（図２４Ａおよび２４Ｂ）。これらのデータは、高親和性変異体２５と親抗体との融合物がＮＫＧ２Ｄ依存性取り込みと、単独ではマウスにおいてそのような免疫原性がなかった親抗体に対して強力かつ迅速な免疫応答を惹起するための抗原提示とを媒介したことを実証する。従って、抗原または免疫原に付着された高親和性変異体α１−α２ドメインは、抗原の有効な提示およびエピトープスプレディング(epitope spreading)を提供し、免疫誘導のための有効なアジュバントとして効果的に働いた。
【００７７】
方向付けられた標的細胞溶解のための循環ＮＫ細胞の武装と抗原提示の増強との実証された組合せ効果は、治療利益を提供することができる改変型α１−α２ドメインとの抗体融合物の重要な活性である。
【００７８】
実施例８（α１−α２変異体２５との抗体重鎖融合物はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍活性を示した）。改変型α１−α２に融合された抗原特異的抗体が抗標的細胞活性を有する可能性を検討するために、変異体２５α１−α２との抗ＰＤＬ１抗体重鎖融合物を同系ＭＣ３８腫瘍モデルで評価した。ＭＣ３８腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植し、腫瘍を平均１００ｍｍ３に成長させた後に処置を開始した。処置の開始時、各群１０個体のマウスのコホートを１、４、および７日目にビヒクル、抗ＣＴＬＡ４（１００ｕｇ  ｉ．ｐ．）、親抗ＰＤＬ１（３００ｕｇ  ｉ．ｖ．）、または抗ＰＤＬ１  ＨＣ＿２５融合物（３００ｕｇ  ｉ．ｖ．）で処置した。図２５で、腫瘍成長曲線は、抗ＰＤＬ１  ＨＣ＿２５が処置の最初の２週間以内に最も有効な抗腫瘍活性を媒介したことを示した。腫瘍成長阻害は、処置の開始後最初の１２日にわたって、確立された抗ＣＴＬＡ４処置および親抗ＰＤＬ１抗体よりも有意に良好であった。１６日までに、抗ＰＤＬ１  ＨＣ＿２５処置は、トラスツズマブ融合物に関して見られたように（実施例７）、ＡＤＡ応答の発生と一致して有効性を失い始めた。親抗体および標準的な抗ＣＴＬＡ４処置の両方に比べて、変異体２５との抗体重鎖融合物に関して見られた有意な抗腫瘍活性は、高親和性ＮＫＧ２Ｄリガンドとして機能した改変型α１−α２ドメインとの抗体融合物の優れた治療効果を実証した。
【００７９】
実施例９（抗体ペプチドに融合されたＵＬＢＰの改変型α１−α２ドメインによる結合および細胞溶解）。以下の実施例は、ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄ受容体に対するそれらの結合親和性を有意に増強するように改変されたＮＫＧ２ＤＬに抗体ポリペプチドを付着されることに関する。ＵＬＢＰタンパク質のα１−α２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ受容体の天然リガンド、すなわち、ＮＫＧ２ＤＬである。抗体は、２本の大きな重鎖と２本の小さな軽鎖から構成される極めて安定な糖タンパク質である（図１）。当技術分野には、ＮＫＧ２Ｄ受容体に非変性ＵＬＢＰドメインよりも強く結合する非天然ＵＬＢＰ  α１−α２ドメインを用いて、免疫細胞を直接活性化することができるＩｇＧ抗体形式は存在しなかった。さらに、ＵＬＢＰ  α１−α２ドメインは、ＭＩＣＡ  α１−α２ドメインとは差次的なｉｎ  ｖｉｖｏ特性を持ち得る抗体融合物を構築するための別のＮＫＧ２ＤＬを提供する。例えば、抗体融合物内のＭＩＣＡ  α１−α２ドメインに対するｉｎ  ｖｉｖｏ抗薬物抗体応答は、ＵＬＢＰとＭＩＣＡ  α１−α２ドメインとの間の低い配列相同性のために改変型ＵＬＢＰ  α１−α２ドメインとおそらく反応しないか、またはそれに干渉しないであろう（図１８）。この実施例は、操作されたＵＬＢＰ  α１−α２  ＮＫＧ２Ｄリガンド（表６および７）とＩｇＧ分子の重鎖との間の融合物（図２０Ａ）は、天然ＵＬＢＰ  α１−α２  ＮＫＧ２Ｄリガンドよりも増強したＮＫＧ２Ｄ結合および標的細胞死滅を有していたことを示した。これはさらに、改変型α１−α２ドメインと異種タンパク質またはペプチドとの融合物の有用性を実証した。
【００８０】
抗体との操作されたα１−α２ドメイン融合物を作出するために、天然（ＷＴ）ＵＬＢＰ２、変異体Ｒ８０ＷおよびＶ１５１Ｄ（それぞれ配列番号１６、８４、および８５）、ならびに天然（ＷＴ）ＵＬＢＰ３および変異体Ｒ１６２Ｇ（それぞれ配列番号１７および８６）のα１−α２ドメインをコードするＤＮＡ配列を合成し、実施例６で使用したＨｅｒ２−特異的抗体(Carter, P., Presta, L., Gorman, CM., Ridgway, JB., Henner, D., Wong, WL., Rowland, AM., Kotts, C, Carver, ME., Shepard, HM. (1992) Proc Natl Acad Sci 15, 4285-9.)由来の重鎖配列とのＣ末端融合物をクローニングした。得られた融合物を、哺乳動物発現ベクターｐＤ２５０９にクローニングし、親抗体の軽鎖を対合した完全ＩｇＧ抗体として発現させた。一過性発現は、ＨＥＫ２９３細胞にて、Ｅｘｐｉ２９３発現系を製造者のプロトコール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行い、標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。ＵＬＢＰ２およびＵＬＢＰ３  α１−α２抗体重鎖融合物に対して行った結合ＥＬＩＳＡは、改変型ＵＬＢＰ２融合物（ＨＣ＿Ｒ８０ＷおよびＨＣ＿Ｖ１５１Ｄ）およびＵＢＬＰ３融合物（ＨＣ＿Ｒ１６２Ｇ）は、同じ重鎖に融合されたそれらの個々の天然α１−α２ドメインよりも高い親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合したことを実証した（図２６Ａおよび２６Ｂ）。
【００８１】
改変型ＵＬＢＰ抗体融合物の標的細胞死滅特性の特性評価を行うために、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫＬを、カルセインを負荷したＨｅｒ２発現ＳＫＢＲ３標的細胞と共培養し、操作された抗体融合タンパク質を用いて力価を測定した。図２７Ａおよび２７Ｂの結果は、Ｈｅｒ２特異的非天然ＵＬＢＰ２および非天然ＵＬＢＰ３  α１−α２−抗体融合物の細胞溶解（死滅）活性の増強は、それらの操作されたα１−α２ドメインの、ＮＫＧ２Ｄに対する増強された親和性を反映したことを示した。具体的には、ＵＬＢＰ２変異体融合物ＨＣ＿Ｒ８０ＷおよびＨＣ＿Ｖ１５１Ｄ、ならびにＵＬＢＰ３変異体融合物ＨＣ＿Ｒ１６２Ｇは、いずれかの非変性α１−α２ドメインを含む抗体融合物よりも効果的にＳＫＢＲ３細胞を死滅させた。これらのデータはさらに、改変型α１−α２変異体−抗体融合物はＩｇＧ分子がＮＫＧ２Ｄに強く結合することおよび抗原特異的細胞溶解を方向付けることを可能とするための万能プラットフォームであることを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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