(57)【要約】  本発明は、タンパク質有効成分及び安定化賦形剤を含む治療用製剤、タンパク質有効成分を含む治療用製剤における安定性を、安定性改善量の安定化賦形剤を治療用製剤に加えることによって改善する方法、ならびに、注入関連有害作用を患者において軽減する方法であって、その必要性のある患者に、タンパク質有効成分及び安定化賦形剤を含む治療用製剤を投与することを含む方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質有効成分及び安定化賦形剤を含む治療用製剤。
【請求項２】
約１μｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間のタンパク質有効成分を含有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
約１ｍｇ／ｍＬ未満のタンパク質有効成分を含有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
少なくとも約１ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分を含有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
少なくとも約５ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分を含有する、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
少なくとも１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分を含有する、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分を含有する、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
少なくとも約３００ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分を含有する、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
前記タンパク質有効成分が、抗体、抗体−薬物コンジュゲート、酵素、サイトカイン、神経毒、融合タンパク質、免疫原性タンパク質、ＰＥＧ化タンパク質及び抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項１０】
少なくとも約１ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍの前記安定化賦形剤を含有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項１１】
少なくとも約１ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍの前記安定化賦形剤を含有する、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１２】
少なくとも約１０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの前記安定化賦形剤を含有する、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
前記安定化賦形剤はポリプロピレンブロックコポリマーを除外する、請求項１に記載の製剤。
【請求項１４】
前記安定化賦形剤が、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール付加物、及びプロピレンオキシドユニットを含むランダムコポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項１５】
前記安定化賦形剤がポリプロピレングリコールホモポリマーである、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
前記ポリプロピレングリコールホモポリマーは数平均分子量が約３００ダルトン〜５０００ダルトンの間である、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
前記ポリプロピレングリコールホモポリマーは数平均分子量が約４２５ダルトンである、請求項１６に記載の製剤。
【請求項１８】
前記ポリプロピレングリコールホモポリマーは数平均分子量が約１０００ダルトンである、請求項１６に記載の製剤。
【請求項１９】
前記ポリプロピレングリコールホモポリマーは数平均分子量が約２０００ダルトンである、請求項１６に記載の製剤。
【請求項２０】
前記ポリプロピレングリコールホモポリマーが、少なくとも２つのヒドロキシル基を有する線状ポリマーである、請求項１５に記載の製剤。
【請求項２１】
前記線状ポリマーは２つ又は３つのヒドロキシル基を含有する、請求項２０に記載の製剤。
【請求項２２】
前記ポリプロピレングリコールが分岐型ポリマーである、請求項１４に記載の製剤。
【請求項２３】
前記分岐型ポリマーが、プロピレングリコールユニットを分岐型アルコール若しくは多官能アルコール又は分岐型アミン若しくは多官能アミンに付加することによって形成される、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２４】
前記分岐型アルコール又は多官能アルコールが、糖、グリセロール、ペンタエリトリトール又はトリエタノールアミンからなる群から選択される、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
前記安定化賦形剤がポリプロピレングリコール付加物である、請求項１４に記載の製剤。
【請求項２６】
前記ポリプロピレングリコール付加物が、プロピレンオキシドとアルコールとの間での反応生成物、又はプロピレンオキシドとアミンとの間での反応生成物である、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
前記安定化賦形剤が、疎水性修飾されたセルロースポリマーである、請求項１に記載の製剤。
【請求項２８】
前記疎水性修飾されたセルロースポリマーが、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される、請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
前記疎水性修飾されたセルロースポリマーがナトリウムカルボキシメチルセルロースではない、請求項２８に記載の製剤。
【請求項３０】
前記安定化賦形剤がポリビニルアルコールである、請求項１に記載の製剤。
【請求項３１】
前記ポリビニルアルコールは分子量が約５００ダルトン〜５００，０００ダルトンの間である、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３２】
前記ポリビニルアルコールは加水分解率が約５０％〜１００％の間である、請求項３１に記載の製剤。
【請求項３３】
前記安定化賦形剤がポリオキサゾリンである、請求項１に記載の製剤。
【請求項３４】
前記ポリオキサゾリンが、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）及びポリ（２−プロピル−２−オキサゾリン）からなる群から選択される、請求項３３に記載の製剤。
【請求項３５】
前記ポリオキサゾリンがポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）である、請求項３４に記載の製剤。
【請求項３６】
前記ポリオキサゾリンは重量平均分子量が約１０００ダルトン〜約５００，０００ダルトンの間である、請求項３３に記載の製剤。
【請求項３７】
前記ポリオキサゾリンは重量平均分子量が約５０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの間である、請求項３６に記載の製剤。
【請求項３８】
前記安定化賦形剤がポリビニルピロリドンである、請求項１に記載の製剤。
【請求項３９】
前記ポリビニルピロリドンは分子量が約１０００ダルトン〜約１，５００，０００ダルトンの間である、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４０】
前記ポリビニルピロリドンは分子量が約５０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの間である、請求項３９に記載の製剤。
【請求項４１】
前記ポリビニルピロリドンは分子量が約１０，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトンの間である、請求項４０に記載の製剤。
【請求項４２】
第２の安定化賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４３】
従来の界面活性剤を除外する、請求項１に記載の製剤。
【請求項４４】
約１ｐｐｍ〜５０００ｐｐｍの間の従来の界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４５】
約１ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの間の従来の界面活性剤を含む、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４６】
約１０ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍの間の従来の界面活性剤を含む、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４７】
約１００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍの間の従来の界面活性剤を含む、請求項４６に記載の製剤。
【請求項４８】
約１００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍの間の従来の界面活性剤を含む、請求項４７に記載の製剤。
【請求項４９】
防腐剤、糖、多糖、アルギニン、プロリン、ヒアルロニダーゼ、安定剤及び緩衝剤からなる群から選択されるさらなる薬剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項５０】
タンパク質有効成分を含む治療用製剤における安定性を、安定性改善量の安定化賦形剤を前記治療用製剤に加えることによって改善する方法。
【請求項５１】
前記安定化賦形剤が、前記安定化賦形剤を欠く対照製剤と比較した場合、前記治療用製剤の劣化を少なくとも１０％軽減する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記安定化賦形剤が、前記安定化賦形剤を欠く対照製剤と比較した場合、前記治療用製剤の劣化を少なくとも３０％軽減する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記安定化賦形剤が、前記安定化賦形剤を欠く対照製剤と比較した場合、前記治療用製剤の劣化を少なくとも５０％軽減する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記安定化賦形剤が、前記安定化賦形剤を欠く対照製剤と比較した場合、前記治療用製剤の劣化を少なくとも７０％軽減する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
注入関連有害作用を患者において軽減する方法であって、その必要性のある患者に、タンパク質有効成分及び安定化賦形剤を含む治療用製剤を投与することを含み、前記治療用製剤を前記患者に注入することにより、前記安定化賦形剤を欠く対照製剤が前記患者に注入される場合よりも少ない注入関連有害作用がもたらされる、上記方法。
【請求項５６】
前記注入関連有害作用が、有害な注入反応、有害な免疫原性応答、及び前記治療用製剤における治療用タンパク質の半減期の低下からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は米国仮特許出願第６２／３６１，７９３号（２０１６年７月１３日出願）の利益を主張する。本出願の全内容が参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、治療用タンパク質を安定化するための製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
治療用タンパク質（例えば、抗体）の水性製剤は、いくつかの異なる機構を介しての劣化、また、いくつかのタイプのストレス条件の結果としての劣化を受けやすい。一般には、治療用タンパク質製剤の劣化が、タンパク質構造がその完全に折り畳まれた立体配座からわずかに変化し（部分的なアンフォールディング）、これにより、溶液中の隣接タンパク質分子と相互作用する疎水性残基を露出させ、不可逆的な会合を形成するときに起こる。ある種のストレス条件（例えば、撹拌、凍結／解凍及び温度上昇など）は、タンパク質のより大きなアンフォールディングを誘発し、これにより、促進されたタンパク質の凝集及びタンパク質製剤の劣化を引き起こす可能性がある。タンパク質製剤の劣化が、タンパク質変性、可視粒子の形成、凝集物の形成、肉眼では見えない粒子の形成、製剤の乳白光、生物学的活性の喪失、モノマー割合の低下、製造時及び精製時における収率の喪失などによって明らかにされ得る。タンパク質製剤が、例えば、撹拌又は凍結／融解などの条件において、液体／空気又は液体／固体の境界にさらされると、タンパク質の一部分が、水素結合及び疎水性効果による折り畳まれた構造を安定化するためには境界における水が不足するためにほどける可能性がある。タンパク質の劣化を引き起こす他の機構には、酸化、加水分解、タンパク質分解、光分解及び微生物分解が含まれる。治療用タンパク質をその流通時及び貯蔵時に遭遇するストレス条件に対してより抵抗性にするための改善された安定性を治療用タンパク質製剤に与えることが望ましいであろう。例えば、治療用タンパク質の製剤は、凍結／融解サイクル、撹拌、長期貯蔵、ポンプ移送、ろ過又は非冷蔵貯蔵のようなストレス条件に遭遇する可能性があり、そこでは安定性に対する改善が好都合であると思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来のタンパク質製剤では、少量の非イオン性界面活性剤（典型的にはポリソルベート８０又はポリソルベート２０）が、境界表面を求めてタンパク質と競合して、タンパク質がそのような表面にさらされることにより起こるタンパク質の劣化を減らすために添加される。しかしながら、ポリソルベートはそれ自体が、加水分解又は酸化のどちらかを介して分解する可能性があり、生じた分解生成物により、タンパク質の凝集の促進及び／又は溶解性の低下、ならびにタンパク質製剤の不安定化が引き起こされる。ポリソルベートはまた、ミセルを形成する傾向があるため、タンパク質治療剤の製造プロセスの期間中の問題をもたらしている。ミセルの形成は、ポリソルベートの一部が、例えば、限外ろ過／透析ろ過ユニット操作などのときにおいてフィルターを通過することを妨げ、これにより、意図されたよりも有意に高い原薬中のポリソルベート濃度を生じさせる可能性がある。これらの理由から、従来の界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０及びポリソルベート２０など）を最小限に抑える、又は実質的に含まないタンパク質製剤を有することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書中には、タンパク質有効成分及び安定化賦形剤を含む治療用製剤が様々な実施形態で開示される。様々な実施形態において、製剤は、約１ｍｇ／ｍＬ未満のタンパク質有効成分、又は約１μｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間のタンパク質有効成分、又は少なくとも約１ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分、又は少なくとも約５ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分、又は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分、又は少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分、又は少なくとも約３００ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分を含有する。様々な実施形態において、タンパク質有効成分は、抗体、抗体−薬物コンジュゲート、酵素、サイトカイン、神経毒、融合タンパク質、免疫原性タンパク質、ＰＥＧ化タンパク質及び抗体フラグメントからなる群から選択される。様々な実施形態において、製剤は、少なくとも約１ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍの安定化賦形剤、又は少なくとも約１ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍの安定化賦形剤、又は少なくとも約１０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの安定化賦形剤を含有する。様々な実施形態において、安定化賦形剤はポリプロピレンブロックコポリマーを除外する。
【０００６】
ある特定の実施形態において、安定化賦形剤は、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール付加物、及びプロピレンオキシドユニットを含むランダムコポリマーからなる群から選択される。安定化賦形剤はポリプロピレングリコールホモポリマーが可能であり、約３００ダルトン〜５０００ダルトンの間の数平均分子量、又は約４２５ダルトン、約１０００ダルトン若しくは約２０００ダルトンの数平均分子量を有し得る。様々な実施形態において、前記ポリプロピレングリコールホモポリマーは、少なくとも２つのヒドロキシル基を有する線状ポリマーである（しかし、前記線状ポリマーは２つ又は３つのヒドロキシル基を含有することができる）。様々な実施形態において、前記ポリプロピレングリコールは分岐型ポリマーであり、前記分岐型ポリマーは、プロピレングリコールユニットを分岐型アルコール若しくは多官能アルコール又は分岐型アミン若しくは多官能アミンに付加することによって形成することができる。分岐型アルコール又は多官能アルコールは、糖、グリセリン、ペンタエリトリトール又はトリエタノールアミンが可能である。様々な実施形態において、安定化賦形剤はポリプロピレングリコール付加物である。ポリプロピレングリコール付加物は、プロピレンオキシドとアルコールとの間での反応生成物、又はプロピレンオキシドとアミンとの間での反応生成物が可能である。ある特定の実施形態において、安定化賦形剤は、疎水性修飾されたセルロースポリマーである。疎水性修飾されたセルロースポリマーは、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択することができる。様々な実施形態において、疎水性修飾されたセルロースポリマーはナトリウムカルボキシメチルセルロースではない。ある特定の実施形態において、安定化賦形剤はポリビニルアルコールであり、前記ポリビニルアルコールは約５００ダルトン〜約５００，０００ダルトンの間での分子量を有することができ、及び／又は約５０％〜約１００％の間での加水分解率を有することができる。ある特定の実施形態において、安定化賦形剤はポリオキサゾリンであり、前記ポリオキサゾリンは、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）及びポリ（２−プロピル−２−オキサゾリン）からなる群から選択することができる。様々な実施形態において、ポリオキサゾリンはポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）である。様々な実施形態において、ポリオキサゾリンは、約１０００ダルトン〜約５００，０００ダルトンの間での重量平均分子量、又は約５０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの間での重量平均分子量を有する。ある特定の実施形態において、安定化賦形剤はポリビニルピロリドンであり、前記ポリビニルピロリドンは、約１０００ダルトン〜約１，５００，０００ダルトンの間での分子量、又は約５０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの間での分子量、又は約１０，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトンの間での分子量を有することができる。
【０００７】
様々な実施形態において、本明細書中に開示される製剤はさらに、第２の安定化賦形剤を含むことができる。様々な実施形態において、製剤は、従来の界面活性剤を除外し得る。他の実施形態において、製剤はさらに、約１ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍの間の従来の界面活性剤を含み、又は約１ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの間の従来の界面活性剤を含み、又は約１０ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍの間の従来の界面活性剤を含み、又は約１００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍの間の従来の界面活性剤を含み、又は約１００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの間の従来の界面活性剤を含む。他の実施形態において、製剤はさらに、防腐剤、糖、多糖、アルギニン、プロリン、ヒアルロニダーゼ、安定剤及び緩衝剤からなる群から選択されるさらなる薬剤を含む。
【０００８】
本明細書中にはまた、タンパク質有効成分を含む治療用製剤における安定性を、安定性改善量の安定化賦形剤を治療用製剤に加えることによって改善する方法が様々な実施形態で開示される。様々な実施形態において、安定化賦形剤は、安定化賦形剤を欠く対照製剤と比較した場合、治療用製剤の劣化を少なくとも１０％軽減し、又は安定化用賦形剤は、安定化賦形剤を欠く対照製剤と比較した場合、治療用製剤の劣化を少なくとも３０％軽減し、又は安定化用賦形剤は、安定化賦形剤を欠く対照製剤と比較した場合、治療用製剤の劣化を少なくとも５０％軽減し、又は安定化用賦形剤は、安定化賦形剤を欠く対照製剤と比較した場合、治療用製剤の劣化を少なくとも７０％軽減する。本明細書にはまた、注入関連有害作用を患者において軽減する方法であって、その必要性のある患者に、タンパク質有効成分及び安定化賦形剤を含む治療用製剤を投与することを含み、前記治療用製剤を前記患者に注入することにより、前記安定化賦形剤を欠く対照製剤が前記患者に注入される場合よりも少ない注入関連有害作用がもたらされる方法が様々な実施形態で開示される。様々な実施形態において、注入関連有害作用は、有害な注入（点滴）反応、有害な免疫原性応答、及び治療用製剤における治療用タンパク質の半減期における低下からなる群から選択される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．定義
本開示の目的のために、用語「タンパク質」は、分子量が典型的には約１キロダルトン〜３０００キロダルトン（ｋＤａ）の間であるアミノ酸の配列体（すなわち、ポリペプチド）を示す。分子量が約１ｋＤａ以上であるポリペプチドは、本発明の目的のためのタンパク質であるとみなされる。いくつかの実施形態において、タンパク質の分子量は約５０ｋＤａ〜２００ｋＤａの間である。他の実施形態において、タンパク質の分子量は約２０ｋＤａ〜１０００ｋＤａの間であり、又は約２０ｋＤａ〜２０００ｋＤａの間である。当業者であれば理解されるように、十分な鎖長のポリペプチドは三次構造又は四次構造を有することができ、一方、より短いポリペプチドは三次構造又は四次構造を有することができない。広範囲の様々なバイオポリマーが用語「タンパク質」の範囲内に含まれる。例えば、用語「タンパク質」により、抗体、アプタマー、融合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、ＰＥＧ化タンパク質、合成ポリペプチド、タンパク質フラグメント、リポタンパク質、酵素、免疫原性タンパク質（例えば、ワクチンで使用されるようなもの）、構造ペプチド及びペプチド薬物などを含めた、治療用タンパク質又は非治療用タンパク質が示され得る。
【００１０】
治療効果を有するそのようなタンパク質は「治療用タンパク質」と称されることがあり、治療用タンパク質を治療有効量で含有する製剤は「治療用製剤」と称されることがある。治療用製剤に含有される治療用タンパク質はまた、その「タンパク質有効成分」と称されることがある。典型的には、治療用製剤は、治療有効量のタンパク質有効成分と、賦形剤とを、他の随意的な成分の有無にかかわらず含む。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、用語「治療的」には、既存障害の処置と、障害の防止との両方が含まれる。「処置」には、障害の症状の発症を予防すること、又は遅らせること、ならびに／あるいは障害の症状を緩和すること、又は改善することを含めて、障害を治療するために、治癒させるために、緩和するために、改善するために、修復するために、又は他の場合には有益な影響を障害に反して与えるために意図される手段がどのようなものであれ含まれる。用語「処置」には、予防ワクチン若しくは治療ワクチン又は他の防止的介入が含まれる。
【００１２】
処置を必要としているそのような患者には、特定の障害を既に有する人々、及び障害の防止が望ましい人々の両方が含まれる。障害は、急性疾患又は慢性疾患を含めて、哺乳動物の恒常的安寧を変化させるどのような状態でもあり、あるいは哺乳動物を急性疾患又は慢性疾患に罹患させやすくする病理学的状態である。障害の限定されない例には、ガン、代謝性障害（例えば、糖尿病）、アレルギー性障害（例えば、喘息）、皮膚科学的障害、心血管障害、呼吸器障害、血液学的障害、筋骨格障害、炎症性障害又はリウマチ学的障害、自己免疫障害、胃腸障害、泌尿器系障害、性障害及び生殖障害、神経学的障害、ならびに感染性疾患などが含まれる。
【００１３】
用語「哺乳動物」は処置目的の場合には、ヒト、家畜化動物、ペット動物、農場動物、スポーツ用動物及び作業用動物などを含めて、哺乳動物として分類される動物をどのようなものであれ示すことができる。したがって、「処置」には、獣医学的処置及びヒト処置の両方が含まれ得る。便宜上、そのような「処置」を受ける哺乳動物は「患者」と呼ぶことができる。ある特定の実施形態において、患者は、子宮内の胎児動物を含めて、どのような年齢であっても可能である。
【００１４】
様々な実施形態において、処置には、治療有効量の治療用製剤をその必要性のある哺乳動物に与えることが伴う。「治療有効量」は最低でも、その必要性のある哺乳動物に投与されて、既存障害の処置又は予想された障害の防止を達成するための治療用タンパク質の最小濃度である（この場合、そのような処置又はそのような防止のどちらもが「治療的介入」である）。有効成分として治療用製剤に含まれ得る様々な治療用タンパク質の治療有効量がこの技術分野ではよく知られている場合がある。あるいは、発見される、又は本明細書中下記では治療的介入に適用される、治療用タンパク質については、治療有効量を、日常的にすぎない実験を使用して、当業者によって行われる標準的な技術により決定することができる。
【００１５】
限定されない例として、治療用タンパク質には、下記のものを挙げることができる：哺乳動物のタンパク質、例えば、ホルモン及びプロホルモン（例えば、インスリン及びプロインスリン、合成インスリン、インスリンアナログ、グルカゴン、カルシトニン、甲状腺ホルモン（Ｔ３若しくはＴ４又は甲状腺刺激ホルモン）、副甲状腺ホルモン、ガストリン、コレシストキニン、レプチン、卵胞刺激ホルモン、オキシトシン、バソプレシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、黄体形成ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子及びソマトスタチンなど）；凝固因子及び抗凝固因子（例えば、組織因子、フォン・ウィルブランド因子、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、プロテインＣ、プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子）、トロンビン）；サイトカイン、ケモカイン及び炎症性媒介因子（例えば、腫瘍壊死因子阻害剤）；インターフェロン；コロニー刺激因子；インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０）；増殖因子（例えば、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、神経親和性増殖因子及びインスリン様増殖因子など）；アルブミン；コラーゲン及びエラスチン；造血因子（例えば、エリスロポイエチン及びトロンボポエチンなど）；骨誘導因子（例えば、骨形態形成タンパク質）；受容体（例えば、インテグリン及びカドヘリンなど）；表面膜タンパク質；輸送タンパク質；調節タンパク質；抗原性タンパク質（例えば、ワクチンでの場合のように、抗原として作用するウイルス成分）など。治療用タンパク質はまた、ワクチンとして使用される免疫原性タンパク質又は他のタンパク質（ポリペプチドを含む）が可能であり、この場合、ワクチンは、疾患に対する獲得免疫を誘導する天然調製物又は合成調製物である。ワクチンとして使用される治療用製剤には、トキソイドワクチン、タンパクに基づくワクチン若しくはタンパク質サブユニットに基づくワクチン、又はコンジュゲートワクチンが含まれる。例示的な、限定されない例として、ワクチンは、ＨＰＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びインフルエンザウイルスでの場合のように、ウイルスの表面タンパク質又はそのサブユニットを含有することができる。
【００１６】
ワクチンとして使用される治療用タンパク質は天然の供給源に由来する場合があり、例えば、微生物（例えば、真菌（例えば、アスペルギルス属、カンジダ属の種）、細菌（例えば、大腸菌属菌、スタフィロコッカス属菌、ストレプトコッカス属菌）など）、原虫（例えば、胞子虫（例えば、マラリア原虫）、根足虫（例えば、エントアメーバ属）及び鞭毛虫（トリパノソーマ属、リーシュマニア属、トリコモナス属、ジアルジア属など）など）、及びウイルス（例えば、（＋）ＲＮＡウイルス、（−）ＲＮＡウイルス、ｄｓＤＮＡウイルス、ＲＮＡからＤＮＡへのウイルス、及びＤＮＡからＲＮＡへのウイルスなど）に由来するポリペプチド又はポリペプチドフラグメントである場合がある。ワクチンが得られるウイルスの例には、限定されないが、ポックスウイルス（例えば、ワクシニア）、ピコルナウイルス（例えば、ポリオ）、トガウイルス（例えば、風疹）、フラビウイルス（例えば、ＨＣＶ）、コロナウイルス、ラブドウイルス（例えば、ＶＳＶ）、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｍｓｅｓ）（例えば、ＲＳＶ）、オルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｍｓｅｓ）（例えば、インフルエンザ）、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ）及びＢ型肝炎ウイルスが含まれる。
【００１７】
用語「治療用タンパク質」には、限定されないが、薬物として使用することができる完全体のタンパク質、例えば、融合タンパク質（例えば、エタネルセプト、デニロイキンジフチトクス、アレファセプト、アバタセプト、リノラセプト（ｒｉｎｏｌａｃｅｐｔ）、ロミプロスチム、コリフォリトロピン−アルファ、ベラタセプト、アフリベルセプト、ｚｉｖ−アフリベルセプト、エフトレノナコグ−アルファ、アルビグルチド、エフラロクトコグ−アルファ、デュラグルチドなど）が含まれる。
【００１８】
用語「治療用タンパク質」にはまた、抗体が含まれる。用語「抗体」は、限定されない例として、モノクローナル抗体（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、単鎖分子、二重特異性抗体及び多重特異性抗体、ジアボディー、抗体−薬物コンジュゲート、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、ならびに抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｃ及びＦ（ａｂ’）２を含む）を含むようにその最も広い意味で使用される。
【００１９】
抗体はまた、「免疫グロブリン」と呼ぶことができる。抗体は、生物学的に重要な物質である特異的なタンパク質「抗原」又は非タンパク質「抗原」に向けられていると理解される。治療有効量の抗体を患者に投与することにより、抗原との複合体形成をもたらすことができ、それにより、その生物学的特性を変化させ、その結果、患者は治療効果を感じるようになる。
【００２０】
様々な実施形態において、タンパク質はＰＥＧ化することができ、このことは、タンパク質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ユニット及び／又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ユニットを含むことを意味する。ＰＥＧ化タンパク質、すなわち、ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートには、その有益な特性（例えば、改善された溶解性、改善された薬物動態学、改善された薬力学、低下した免疫原性、低下した腎クリアランス、及び改善された安定性など）に起因する治療適用における有用性が見出されている。ＰＥＧ化タンパク質の限定されない例が、ＰＥＧ化インターフェロン（ＰＥＧ−ＩＦＮ）、ＰＥＧ化抗ＶＥＧＦ、ＰＥＧタンパク質コンジュゲート薬物、アダゲン（Ａｄａｇｅｎ）、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグロチカーゼ、ペグビソマント、ＰＥＧ化エポエチン−β及びセルトリズマブペゴールである。
【００２１】
ＰＥＧ化タンパク質は、様々な方法によって、例えば、１つ又は複数の反応性官能基を有するＰＥＧ試薬とのタンパク質の反応などによって合成することができる。ＰＥＧ試薬における反応性官能基は、タンパク質との結合を標的化されたタンパク質部位（例えば、リシン、ヒスチジン、システイン及びＮ末端など）において形成することができる。典型的なＰＥＧ化試薬は、タンパク質表面の標的化されたアミノ酸残基との特異的な反応性を有する反応性官能基（例えば、アルデヒド基、マレイミド基又はスクシンイミド基など）を有する。ＰＥＧ化試薬は、約１個〜約１０００個のＰＥＧ反復ユニット及び／又はＰＰＧ反復ユニットのＰＥＧ鎖長を有することができる。他のＰＥＧ化方法には、タンパク質が最初にグリコシル化され、その後、グリコシル化残基が第２の工程でＰＥＧ化されるグリコ−ＰＥＧ化が含まれる。ある種のＰＥＧ化プロセスが、シアリルトランスフェラーゼ及びトランスグルタミナーゼのような酵素によって助けられる。
【００２２】
ＰＥＧ化タンパク質は、生来的な非ＰＥＧ化タンパク質を上回る治療的利点を提供することができるが、このような物質は、その精製、溶解、ろ過、濃縮及び投与を困難にする物理的特性又は化学的特性を有することがある。タンパク質のＰＥＧ化は、生来型タンパク質と比較して、より大きい溶液粘度をもたらすことがあり、このため、一般には、ＰＥＧ化タンパク質の溶液はより低い濃度で配合されることが要求される。
【００２３】
非治療目的（すなわち、処置を伴わない目的）のために、例えば、家庭用途、栄養補給用途、商業用途及び工業用途などのために使用されるそのようなタンパク質は、「非治療用タンパク質」と称される場合がある。非治療用タンパク質を含有する製剤は「非治療用製剤」と称される場合がある。非治療用タンパク質は植物起源若しくは動物起源に由来することができ、又は細胞培養物から製造することができる。非治療用タンパク質はまた、酵素又は構造タンパク質が可能である。非治療用タンパク質は、家庭用途、栄養補給用途、商業用途及び工業用途において使用することができ、例えば、触媒、ヒト及び動物への栄養補給、加工助剤、洗浄剤及び廃棄物処理などにおいて使用することができる。
【００２４】
非治療用バイオポリマーの１つの重要なカテゴリーには、酵素が含まれる。酵素は、例えば、触媒、ヒト及び動物の栄養補給成分、加工助剤、洗浄剤及び廃棄物処理剤として、多くの非治療用途を有する。酵素触媒が、様々な化学反応を促進させるために使用される。非治療的使用のための酵素触媒の例には、カタラーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼが含まれる。ヒト及び動物での酵素の栄養学的使用には、栄養補助食品、栄養となるタンパク質源、微量栄養素のキレート化又は制御された送達、消化補助剤及びサプリメントが含まれ、これらは、アミラーゼ、プロテアーゼ、トリプシン及びラクターゼなどに由来することができる。酵素の加工助剤が、パン製造、ビール醸造、発酵、果汁加工及びワイン醸造のような業務において食品製造物及び飲料製造物の製造を改善するために使用される。これらの食品加工助剤及び飲料加工助剤の例には、アミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、グルカナーゼ、リパーゼ及びラクターゼが含まれる。酵素はまた、バイオ燃料の製造において使用することができる。例えば、バイオ燃料用のエタノールは、バイオマス原料（例えば、セルロース系材料及びリグノセルロース系材料など）の酵素分解によって促進され得る。そのような原料物質をセルラーゼ及びリグニナーゼで処理することにより、バイオマスが、燃料に発酵され得る基質に変換される。他の商業用途において、酵素が、洗濯用途、食器洗い用途、表面清浄用途及び機器清浄用途のための洗剤、洗浄剤及び汚れ落とし助剤として使用される。この目的のための典型的な酵素には、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ及びリパーゼが含まれる。加えて、非治療用酵素が、様々な商用プロセス及び工業用プロセスにおいて、例えば、セルラーゼによる繊維柔軟化、皮革加工、廃棄物処理、汚染沈殿物の処理、水処理、パルプ漂白、ならびにパルプの柔軟化及び剥離などにおいて使用される。これらの目的のための典型的な酵素が、アミラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ及びリグニナーゼである。
【００２５】
非治療用バイオポリマーの他の例には、線維タンパク質又は構造タンパク質（例えば、ケラチン、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、フィブロイン、アクチン、チューブリンなど）、あるいはそれらの加水分解形態、分解形態又は誘導体化形態が含まれる。これらの物質は、食品成分（例えば、ゼラチン、アイスクリーム、ヨーグルト及び菓子など）の調製及び配合において使用される。これらはまた、増粘剤、レオロジー調整剤、口当たり改善剤として、また、栄養補給タンパク質の供給源として食品に加えられる。化粧品及びパーソナルケア産業において、コラーゲン、エラスチン、ケラチン及び加水分解ケラチンが、スキンケア製剤及びヘアケア製剤における成分として広範囲に使用されている。非治療用バイオポリマーのさらに他の例が、乳清タンパク質、例えば、ベータ−ラクトグロブリン、アルファ−ラクトアルブミン及び血清アルブミンなどである。これらの乳清タンパク質は乳製品生産過程からの副産物として大量に製造され、様々な非治療用途のために使用されてきている。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「従来の界面活性剤」は、２つの液体の間での表面張力を低下させることができる、又は液体と固体との間での界面張力を低下させることができる有機の表面活性剤を示す。従来の界面活性剤は典型的には両親媒性であり、親水性「頭部」と、１つ又は２つの疎水性「尾部」とを含むことができる。頭部基の荷電特性により、従来の界面活性剤の類別化が可能であり、例えば、正荷電の頭部を有する界面活性剤はカチオン性と称され、負帯電の頭部を有する界面活性剤はアニオン性と称され、荷電基をその頭部に有しない界面活性剤は非イオン性と称され、２つの逆荷電基を有する頭部を有する界面活性剤は両性イオン性と称される。従来の界面活性剤の尾部は、分岐型炭化水素鎖、直鎖型炭化水素鎖又は芳香族炭化水素鎖を含むことができ、あるいはフルオロカーボン鎖（フルオロ界面活性剤の場合）又はシロキサン鎖（シロキサン系界面活性剤の場合）を含むことができる。従来の界面活性剤の親水性を、エトキシル化された配列（例えば、ポリエチレンオキシド）を含むことによって増大させることができ、一方、従来の界面活性剤の親油性を、ポリプロピレンオキシド配列を含むことによって増大させることができる。
【００２７】
様々な実施形態において、従来の界面活性剤は、ポリソルベート、すなわち、脂肪酸のエトキシル化ソルビタンエステルに由来する乳化剤が可能である。例えば、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート）及びポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアート）が、タンパク質製剤のための従来の界面活性剤として一般に使用される。他の実施形態において、従来の界面活性剤は、エトキシル化脂肪アルコール、エチレンオキシド（ＥＯ）とプロピレンオキシド（ＰＯ）とのジブロックコポリマー、又はＥＯとＰＯとのトリブロックコポリマーが可能である。
【００２８】
２．概論
本開示は、安定化賦形剤を伴う治療用タンパク質の水性製剤に関する。本明細書中で使用される場合、用語「安定化賦形剤」は、ストレス条件に対する応答での治療用タンパク質の劣化を軽減する賦形剤を示す。ストレス条件として、タンパク質構造を、例えば、タンパク質のより大きなアンフォールディングを引き起こすことによって変化させ、これにより、タンパク質製剤の促進された凝集及び劣化をもたらす条件をどのようなものであれ挙げることができる。ストレス条件には、限定されないが、撹拌、ろ過、凍結／解凍条件、凍結乾燥、５℃を超える貯蔵温度への曝露、又は液体／空気境界若しくは液体／固体界面への曝露が含まれ得る。ストレス条件に関与する他の機構には、酸化、加水分解、タンパク質分解、脱アミド化、ジスルフィドスクランブリング、光分解及び微生物分解が含まれる。
【００２９】
溶液中のタンパク質は、絡み合いを形成する傾向があり、このため、絡み合った鎖の並進運動性が制限され得ること、また、タンパク質の治療効力又は非治療効力が妨げられ得ることが、ポリマー科学及びポリマー工学の当業者には広く知られている。様々な実施形態において、本明細書中に開示されるような安定化賦形剤化合物は、タンパク質のクラスター化を溶液中における賦形剤化合物と治療用タンパク質との間での特異的相互作用のために抑制することができる。
【００３０】
様々な実施形態において、本明細書中に開示される取り組みでは、従来的なタンパク質溶液と比較したとき、改善された安定性を有する液体製剤をもたらすことができる。安定な製剤の１つが、含有されるタンパク質が、冷蔵条件、室温条件又は高温貯蔵条件であるかにかかわらず、貯蔵条件のもとで貯蔵されたとき、その物理的安定性及び化学的安定性、ならびにその治療効力又は非治療効力を実質的に保持するものである。好都合には、安定な製剤はまた、溶解されているタンパク質の凝集又は沈殿化に対する保護をもたらすことができる。例えば、冷蔵条件は、冷蔵庫又は冷凍庫での貯蔵を必然的に伴い得る。いくつかの例において、冷蔵条件は、１０℃以下の温度における従来の冷蔵庫貯蔵又は冷凍庫貯蔵を必然的に伴い得る。さらなる例において、冷蔵条件は、約２℃〜約１０℃の温度における貯蔵を必然的に伴う。他の例において、冷蔵条件は、約４℃の温度における貯蔵を必然的に伴う。さらなる例において、冷蔵条件は、凍結温度（例えば、約０℃以下など）における貯蔵を必然的に伴う。別の例において、冷蔵条件は、約−３０℃〜約０℃の温度における貯蔵を必然的に伴う。室温貯蔵条件は、周囲温度（例えば、約１０℃〜約３０℃の周囲温度）における貯蔵を必然的に伴い得る。高温安定性、例えば、約３０℃〜約５０℃の温度における高温安定性が、典型的な周囲（１０℃〜３０℃）条件における長期貯蔵を予測するための促進老化研究の一部として使用され得る。
【００３１】
様々な実施形態において、好都合な安定化賦形剤は、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコール付加物、又はプロピレンオキシドユニットを含むランダムコポリマーを含むことができる。他の実施形態において、安定化賦形剤は、疎水性修飾されたセルロースを含むことができ、この場合、疎水性修飾されたセルロースは、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースが可能であり、ナトリウムカルボキシメチルセルロースではない。他の実施形態において、安定化賦形剤はポリビニルアルコールである。他の実施形態において、安定化賦形剤はポリオキサゾリンであり、例えば、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）などである。他の実施形態において、安定化賦形剤はポリビニルピロリドンである。
【００３２】
例えば、様々な実施形態において、安定化賦形剤は、数平均分子量（Ｍｎ）が３００ダルトン〜５０００ダルトン（Ｄａ）の間であるポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ホモポリマー（例えば、ＰＰＧ４２５、ＰＰＧ１０００及びＰＰＧ２０００など）を含むことができる。様々な実施形態において、安定化賦形剤は、５０％までのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）反復ユニットを有するＰＰＧ／ＰＥＧコポリマーを含むことができる。ＰＰＧ賦形剤は、２つ又は３つの末端ヒドロキシル基を有する線状ポリマーが可能である。様々な実施形態において、安定化賦形剤はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）付加物を含むことができ、例えば、プロピレングリコールと、アルコール基又はアミン基との間での反応生成物などを含むことができる。様々な実施形態において、ＰＰＧ賦形剤は、プロピレングリコールユニットを、グリセロール、トリエタノールアミン、糖又はペンタエリトリトールのような分岐型又は多官能性のアルコール又はアミンに付加することによって形成される分岐型ポリマーの形態であることが可能である。
【００３３】
様々な実施形態において、安定化賦形剤は、疎水性修飾されたセルロース（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースなど）を含むことができる。低分子量のヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）及び低分子量のメチルセルロース（ＭＣ）が、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ）からＭＥＴＨＯＣＥＬ（登録商標）の商標で市販されている。Ｍｅｔｈｏｃｅｌ製品ラインについての命名規則は、製品名称における数字が２％水溶液の粘度であり、「ＬＶ」が低粘度を表し、最初の文字が置換のタイプ（ＨＰＭＣ又はＭＣ）及び程度を表すようになっている。低分子量のＨＰＭＣ製品（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ３ＬＶ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ１５ＬＶ、及びＭｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ３ＬＶなど）及び低分子量のＭＣ製品（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ａ１５ＬＶ）を安定化賦形剤として使用することができる。
【００３４】
様々な実施形態において、安定化賦形剤は、５０００Ｄａ〜５００，０００Ｄａの間での分子量と、５０％〜１００％の間での加水分解度とを有するポリ酢酸ビニルから調製されるポリビニルアルコールを含むことができる。様々な実施形態において、前記ポリビニルアルコールは加水分解度が８０％〜約９９％であり、又は約８３％〜約９５％である。様々な実施形態において、前記ポリビニルアルコールは分子量が約１０，０００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの間である。様々な実施形態において、前記ポリビニルアルコールは、２０℃〜２５℃における４％水溶液の粘度が約３ｃＰ〜約５０ｃＰの範囲にある。様々な実施形態において、前記ポリビニルアルコールは米国薬局方（ＵＳＰ）規格品である。
【００３５】
様々な実施形態において、安定化賦形剤はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含むことができる。ＰＶＰ賦形剤は、約１０００Ｄａ〜約１５０万Ｄａの分子量を有することができる。様々な実施形態において、ＰＶＰ安定化賦形剤は、約５０００Ｄａ〜約２００，０００Ｄａの分子量を有することができる。様々な実施形態において、ＰＶＰ安定化賦形剤は、約１０，０００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの分子量を有することができる。
【００３６】
様々な実施形態において、安定化賦形剤はポリオキサゾリンを含むことができ、例えば、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）又はポリ（２−プロピル−２−オキサゾリン）などを含むことができる。様々な実施形態において、ポリオキサゾリン安定化賦形剤は、１，０００Ｄａ〜５００，０００Ｄａ、又は５，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａの数平均分子量を有することができる。
【００３７】
安定化賦形剤は単独で加えることができ、又は従来の界面活性剤との組合せで、例えば、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０及びポリソルベート２０など）などとの組合せで加えることができる。安定化賦形剤が従来の界面活性剤賦形剤と組み合わされるとき、より少ない量の従来の賦形剤が必要とされる場合がある（例えば、０〜１００ｐｐｍの従来の界面活性剤、又は１００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍの従来の界面活性剤）。他の実施形態において、治療用タンパク質製剤は、上記安定化賦形剤と、１０ｐｐｍ〜５０００ｐｐｍの量の従来の界面活性剤とを含有する。様々な実施形態において、安定化賦形剤が、１０ｐｐｍから５０００ｐｐｍにまで及ぶ量で製剤に加えられる。様々な実施形態において、安定化賦形剤が、１００ｐｐｍから１０００ｐｐｍにまで及ぶ量で製剤に加えられる。治療用製剤における従来の界面活性剤の量を減らすことにより、ある種の利点（例えば、改善された製剤安定性、改善された賦形剤安定性、及び低下した泡立ち傾向など）がもたらされ得る。様々な実施形態において、本発明の安定化賦形剤を含有する治療用タンパク質の溶液は、この安定化賦形剤を含まない同じ治療用タンパク質の溶液と比較して、より低い泡立ち傾向を有することができる。
【００３８】
好都合には、安定化賦形剤は、ミセルを水溶液において形成せず、かつ、限外ろ過膜を通過し得るように選択することができる。好都合には、安定化賦形剤は、製剤の泡立ち傾向を増大させないように選択することができる。好都合には、安定化賦形剤は、従来の両親媒性界面活性剤構造を含まないように選択することができる。様々な実施形態において、安定化賦形剤は、親水性頭部及び疎水性尾部を有するとして構造化されないように選択することができる。他の実施形態において、安定化賦形剤は、ブロックコポリマーを含まないように選択することができ、例えば、ブロックコポリマー配置（例えば、ＰＯ／ＥＯ／ＰＯ、ＥＯ／ＰＯ、又はＥＯ／ＰＯ／ＥＯの（プロピレンオキシド−ｃｏ−エチレンオキシド）コポリマー構成など）が除外されるように選択することができる。様々な実施形態において、エチレンオキシド（ＥＯ）基、残留エチレンオキシドモノマー及び／又はジオキサン副産物を含まない安定化賦形剤を選択することができる。様々な実施形態において、安定化賦形剤は、エステル連結を含有しないように選択される。様々な実施形態において、安定化賦形剤は、内毒素又は重金属の存在を最小限に抑えるように精製される。様々な実施形態において、安定化賦形剤はＵＳＰ規格物である。本明細書中に開示されるような安定化賦形剤化合物は天然物又は合成物が可能であり、ある特定の実施形態においては、米国食品医薬品局が一般に安全と認める物質（ＧＲＡＳ）、又は登録医薬品において十分に確立され、一般に使用されている物質（例えば、通常の場合には薬局方に含まれるような物質）、又は登録簿若しくはデータベース（例えば、ＦＤＡの不活性成分データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｃｄｅｒ／ｉｉｇ／）など）に含まれる物質である場合がある。
【００３９】
３．治療用製剤
１つの態様において、本明細書中に開示される製剤及び方法は、治療有効量での治療用タンパク質と、安定化賦形剤化合物とを含む安定な液体製剤を提供する。様々な実施形態において、製剤は、許容できる濃度の有効成分と、許容できる安定性とを提供しながら、安定性を改善することができる。様々な実施形態において、製剤は、対照製剤と比較したとき、安定性における改善をもたらす。なお、本開示の目的のために、対照製剤は、乾燥重量基準で、賦形剤化合物を欠くことを除いてあらゆる点で治療用製剤と同一である、タンパク質有効成分を含有する製剤である。様々な実施形態において、タンパク質含有製剤の改善された安定性が、ストレス条件後の対照製剤と比較した場合、可溶性凝集物のより低い割合、フラグメントのより低い割合、微粒子の数における減少、肉眼では見えない粒子の数における減少、流体力学的粒子サイズにおける低下、又はゲル形成の抑制によって示される。様々な実施形態において、ストレス条件には、凍結／解凍サイクル、凍結温度（０℃未満）における１ヶ月超の貯蔵条件への曝露、冷蔵温度（０℃〜１５℃の間）における１ヶ月超の貯蔵条件への曝露、周囲温度（１５℃〜３０℃の間）における１ヶ月超の貯蔵条件への曝露、高温（３０℃〜１００℃の間）における１週間超の貯蔵条件への曝露、撹拌ストレスへの曝露、空気／水界面への曝露、プラスチック表面、ガラス表面又は金属表面との接触、ろ過、カラムクロマトグラフィー分離、ウイルス不活化、ｐＨ２〜ｐＨ５の間でのｐＨ条件への曝露、ｐＨ８〜ｐＨ１２の間でのｐＨ条件への曝露、タンパク質分解酵素への曝露、リパーゼ酵素への曝露、あるいは微生物学的汚染への曝露が含まれ得る。
【００４０】
液体タンパク質製剤の安定性が、タンパク質自体（例えば、酵素、抗体、受容体、融合タンパク質など）の性質、そのサイズ、三次元構造、化学組成及び分子量、製剤中のその濃度、タンパク質以外の製剤の成分、製剤のｐＨ範囲、製剤のための貯蔵条件、ならびに製剤を患者に投与する方法を含めて様々な要因によって影響され得ることが理解される。本明細書中に記載される賦形剤化合物との使用のために最も好適である治療用タンパク質は好ましくは本質的に純粋であり、すなわち、混入タンパク質を含まない。様々な実施形態において、「本質的に純粋な」治療用タンパク質は、少なくとも９０重量％の治療用タンパク質を含むタンパク質組成物、又は好ましくは、少なくとも９５重量％の治療用タンパク質を含むタンパク質組成物、又はより好ましくは、少なくとも９９重量％の治療用タンパク質を含むタンパク質組成物である（これらはすべてが、組成物における治療用タンパク質及び混入タンパク質の総重量に基づく）。明確化のために、賦形剤として加えられるタンパク質は、この定義に含まれることは意図されない。本明細書中に記載される治療用製剤は、タンパク質有効成分の所望される治療効力が達成され得るような形態である、かつ、製剤が投与されることになる哺乳動物に対して毒性である成分を含有しない医薬品規格の製剤（すなわち、哺乳動物を処置する際の使用のために意図される製剤）として使用するために意図される。
【００４１】
様々な実施形態において、治療用製剤は、少なくとも１μｇ／ｍＬのタンパク質有効成分を含有する。様々な実施形態において、治療用製剤は約１μｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間のタンパク質有効成分を含有する。様々な実施形態において、治療用製剤は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分を含有する。様々な実施形態において、治療用製剤は、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分を含有する。他の実施形態において、治療用製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分を含有する。他の実施形態において、治療用製剤は、少なくとも２００ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分を含有する。さらに他の実施形態において、治療用製剤溶液は、少なくとも３００ｍｇ／ｍＬのタンパク質有効成分を含有する。一般には、本明細書中に開示される賦形剤化合物は約１ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍの間での量で治療用製剤に加えられる。様々な実施形態において、賦形剤化合物は約１ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍの量で加えることができる。様々な実施形態において、賦形剤化合物は約１０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの量で加えることができる。
【００４２】
様々な実施形態において、本明細書中に開示される賦形剤化合物は安定性改善量で治療用製剤に加えられる。様々な実施形態において、安定性改善量は、対照製剤と比較したとき、製剤の劣化を少なくとも１０％軽減する賦形剤化合物の量である。なお、本開示の目的のために、対照製剤は、乾燥重量基準で、賦形剤化合物を欠くことを除いてあらゆる点で治療用製剤と同一である、タンパク質有効成分を含有する製剤である。様々な実施形態において、安定性改善量は、対照製剤と比較したとき、製剤の劣化を少なくとも３０％軽減する賦形剤化合物の量である。様々な実施形態において、安定性改善量は、対照製剤と比較したとき、製剤の劣化を少なくとも５０％軽減する賦形剤化合物の量である。様々な実施形態において、安定性改善量は、対照製剤と比較したとき、製剤の劣化を少なくとも７０％軽減する賦形剤化合物の量である。様々な実施形態において、安定性改善量は、対照製剤と比較したとき、製剤の劣化を少なくとも９０％軽減する賦形剤化合物の量である。
【００４３】
本開示による治療用製剤は、ある種の好都合な特性を有する。様々な実施形態において、治療用製剤は、剪断劣化、相分離、混濁、沈殿形成及び変性に対して抵抗性である。様々な実施形態において、治療用製剤は、加工、精製、貯蔵、シリンジによる注入、服用、ろ過及び遠心分離が、対照製剤と比較して、より効果的に行われる。様々な実施形態において、治療用製剤は、より少ない注入関連有害作用（例えば、有害な注入反応、有害な免疫原性応答、及び治療用製剤における治療用タンパク質の半減期における低下など）をもたらすことができる。様々な実施形態において、治療用製剤が患者に投与されるとき、患者は、安定化賦形剤を欠く同様な製剤により受けるであろうよりも少ない注入反応を受け得る。様々な実施形態において、治療用製剤が患者に投与されるとき、患者は、安定化賦形剤を欠く同様な製剤により受けるであろうよりも少ない、又は激しくない免疫原性応答を受け得る。様々な実施形態において、治療用製剤が患者に投与されるとき、患者は、安定化賦形剤を含まない同様な製剤と比較した場合、治療用タンパク質の体内半減期における低下をより少なく受け得る。
【００４４】
様々な実施形態において、安定化賦形剤は、治療用タンパク質を酸化的損傷に対して安定化する抗酸化特性を有する。様々な実施形態において、治療用製剤は、治療用タンパク質についての効能の感知できるほどの喪失を伴うことなく、周囲温度で貯蔵され、又は冷蔵庫条件で長期間にわたって貯蔵される。様々な実施形態において、治療用製剤は、必要とされるまでの貯蔵のために完全に乾燥される。その後、治療用製剤は、適切な溶媒（例えば、水）により再構成される。好都合には、本明細書中に記載されるように調製される製剤は、数ヶ月から数年までの長期間にわたって安定であり得る。ことのほか長期間の貯蔵が所望されるときには、製剤は、タンパク質変性の恐れを伴うことなく、冷凍庫での保存（及び、その後での再活性化）を行うことができる。様々な実施形態において、製剤を、冷蔵を必要としない長期貯蔵のために調製することができる。様々な実施形態において、安定化賦形剤は、限られた水溶性を有するタンパク質治療薬（例えば、抗体−薬物コンジュゲートなど）の溶解性又は安定性を改善するために使用することができる。
【００４５】
様々な実施形態において、安定化賦形剤は、前述のように、タンパク質製剤において用いられる従来の界面活性剤の一部又はすべてに代わる代用物を提供する。前述のように、安定化賦形剤はタンパク質製剤に単独で加えることができ、あるいは、製剤における従来の界面活性剤を完全に置き換えるために、又は使用される従来の界面活性剤の量を減らすためにそのどちらであれ、１つ又は複数の他の賦形剤との組合せでタンパク質製剤に加えることができる。様々な実施形態において、安定化賦形剤はエトキシル化化合物ではなく、残留量の１，４−ジオキサンを含有しない。
【００４６】
治療用製剤を調製するための様々な方法が当業者にはよく知られているかもしれない。本発明の治療用製剤は、例えば、安定化賦形剤化合物を、治療用タンパク質が溶液に加えられる前に、又は加えられた後で製剤に加えることによって調製することができる。治療用製剤は、例えば、治療用タンパク質と、賦形剤とを第１の（より低い）濃度で一緒にすることによって製造し、その後、第２の（より高い）濃度の治療用タンパク質を製造するためにろ過又は遠心分離によって処理することができる。治療用製剤は、カオトロープ剤、コスモトロープ剤、ヒドロトロープ剤及び塩とともに１つ又は複数の賦形剤化合物を用いて作製することができる。治療用製剤は、様々な技術（例えば、カプセル封入、分散、リポソーム及び小胞形成など）を使用して、１つ又は複数の賦形剤化合物を用いて製造することができる。本明細書中に開示される安定化賦形剤化合物を含む治療用製剤を調製するための方法では、賦形剤化合物の組合せを含むことができる。他の添加剤が治療用製剤にその製造時に導入される場合があり、これらには、防腐剤、従来の界面活性剤、糖、スクロース、トレハロース、多糖、アルギニン、プロリン、ヒアルロニダーゼ、安定剤及び緩衝剤などが含まれる。本明細書中で使用される場合、医薬的に許容される安定化賦形剤化合物は、非毒性、かつ、動物及び／又はヒトへの投与のために好適であるものである。
【００４７】
４．タンパク質／賦形剤製剤：性質及びプロセス
様々な実施形態において、上記の安定化賦形剤化合物のいくつかが、様々な加工方法（例えば、ろ過、シリンジ注入、移動、ポンプ移送、混合、熱交換による加熱又は冷却、ガス移動、遠心分離、クロマトグラフィー、膜分離、遠心濃縮、タンジェンシャルフローろ過、ラジアルフローろ過、アキシアルフローろ過、凍結乾燥及びゲル電気泳動など）を使用するタンパク質関連プロセス（例えば、タンパク質含有溶液の製造、加工、無菌充填、精製及び分析など）を改善するために使用される。これらのプロセス及び加工方法は、製造工程、加工工程、精製工程及び分析工程の期間中における溶液中のタンパク質の改善された安定性に起因する改善された効率を有し得る。様々な実施形態において、安定化賦形剤を濃縮工程の前にタンパク質含有溶液に加えることができ、安定化賦形剤により、濃縮工程の効率、処理量又は収率を改善することができる。様々な実施形態において、安定化賦形剤は、ろ過に基づく濃縮工程の期間中にタンパク質相と一緒に濃縮されない。様々な実施形態において、安定化賦形剤は、タンパク質含有溶液に加えられたとき、ミセルを形成しない。加えて、設備関連のプロセス（例えば、タンパク質加工設備の清掃、滅菌及び保守など）を、低下した汚損、低下した変性、より低い粘度、及びタンパク質の改善された溶解性のために、上記賦形剤の使用によって容易にすることができる。
【実施例】
【００４８】
・本明細書中で使用される場合、ｗｔ％の用語は、重量基準での百分率を示す。
例１：ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）製剤の撹拌ストレス
本例では、撹拌ストレスを受けたＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）製剤における下記の安定化賦形剤の効果が比較される：ポリプロピレングリコール、Ｍｎ：約４２５ｇ／ｍｏｌ（ＰＰＧ４２５）；ポリプロピレングリコール、Ｍｎ：約１０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＰＧ１０００）；ポリプロピレングリコール、Ｍｎ：約２０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＰＧ２０００）；ポリエチレングリコール、Ｍｎ：１０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＥＧ１０００）。すべての安定化賦形剤試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。
【００４９】
ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）製剤を下記のように調製した。Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．によって米国で頒布される商用のセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））製剤を入手した。ＦＤＡ薬物ラベルによれば、この商用製剤は、２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブ、８．４８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、１．８８ｍｇ／ｍＬの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、及び０．４１ｍｇ／ｍＬの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含有した。
【００５０】
次に、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）サンプルを、約２００ｐｐｍの安定化賦形剤の存在下、ｐＨ７で、１５ｍＭのリン酸ナトリウム及び４．８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムにおいて下記の方法で再配合した。緩衝剤溶液を、およそ０．１ｇの一塩基性リン酸ナトリウム二水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、０．２４ｇの塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び約０．１ｇの所望の安定化賦形剤を脱イオン水に溶解することによって調製し、さらなる脱イオン水により約５０ｇの最終質量に希釈した。それぞれの緩衝液の溶液ｐＨを、５Ｍ水酸化ナトリウム又は１Ｍ水酸化ナトリウムのどちらかを滴加することにより約７に調節した。緩衝液を０．２ミクロンの滅菌ポリエーテルスルホン・シリンジフィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）でろ過し、０．４ｍＬのそれぞれの緩衝液を、賦形剤を含有しない約３．４ｍＬの同じ緩衝液とともに５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに加えた。このようにして、約２００ｐｐｍの最終賦形剤濃度をそれぞれのサンプルにおいて達成した。３０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮器チューブ（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を脱イオン水ですすぎ、１３ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘサンプルで満たし、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機において約２５分間、約３２００×ｇ及び２５℃で遠心分離して、約１ｍＬの最終保持液量又は約３０ｍｇ／ｍＬのセツキシマブの濃度にした。その後、ろ液を取り出し、約０．２６ｍＬをそれぞれの緩衝液含有の５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに加え、０．２ミクロンの滅菌シリンジフィルターでろ過した。
【００５１】
約２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブの濃度及び約４ｍＬの最終容量を有する、５ｍＬのポリプロピレンチューブにおける得られたセツキシマブ製剤を、撹拌ストレスを加えるために２７５ｒｐｍで、Ｄａｉｇｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）Ｌａｂｇｅｎｉｕｓ回旋式振とう機に置いた。約１６時間及び約４０時間の周囲温度での連続振とうの後、サンプルを取り出し、１０ｍｍの光路長のキュベットを用いた、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ分光光度計における光学的吸収（吸光度）によって、また、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）から得られるＺｅｔａＰｌｕｓを用いた動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した。
【００５２】
３５０ｎｍ及び５５０ｎｍにおける吸光度を濁度の測定値として利用した（より大きい吸光度は、より多くの不溶性微粒子が形成されているために、ストレス後のセツキシマブの劣化がより大きいことを示している）。吸光度の値が分光光度計測定からの吸光度単位（ＡＵ）で報告される。結果が、０時間、１６時間及び４０時間の撹拌の後で測定された吸光度値を示す下記の表１に示される。
【００５３】
動的光散乱（ＤＬＳ）測定は有効径をナノメートルの単位で与え、緩衝液の粘度及び屈折率におけるわずかな差について補正されなかった。代わりに、ＤＬＳ測定を、タンパク質凝集をモニターするための、濁度よりも高感度の方法として使用した。ＤＬＳ結果が表２にまとめられる。
【表１】
2019527729.tif 000002
【表２】
2019527729.tif 000003
【００５４】
安定化賦形剤を含有する４つの製剤はすべてが、（賦形剤を含まない同じ緩衝液を使用する）対照製剤よりも実質的に良好な成績をもたらした。有意差が、賦形剤を含有するこれら４つの製剤についての吸光度測定値において認められなかった。しかしながら、有効粒子直径のＤＬＳ測定値は、ＰＥＧ１０００を含有するサンプルにおける凝集物形成を示しており、一方、ＰＰＧを含有するサンプルは、本例で試験された範囲の範囲内での分子量にかかわらず、凝集の徴候を何ら示さなかった。したがって、これらの様々なＰＰＧ賦形剤は、撹拌及び／又は空気／液体界面への曝露に起因するタンパク質溶液の劣化を防止することにおいて、ＰＥＧ１０００よりも効果的であると結論づけることができる。
【００５５】
例２：ストレスを受けたセツキシマブ製剤のＦｌｏｗＣＡＭ粒子分析
例１に従って調製される、２００ｐｐｍの賦形剤を含むｐＨ７でのリン酸塩緩衝液において約２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブを含有するサンプルを、ＦｌｏｗＣａｍ  ＶＳ１（Ｆｌｕｉｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＥ）を用いた動的フローイメージングによって不溶性粒子について分析した。ＦｌｏｗＣａｍは、２０Ｘの対物レンズと、５０ミクロンの深さのフローセルとを備え、０．０３ｍＬ／分の流速で操作された。測定を、１回あたり０．２ｍＬのサンプル容量を使用して三連で行った。粒子を計数し、ＦｌｏｗＣａｍ装置とともに提供されるＶｉｓｕａｌＳｐｒｅａｄｓｈｅｅｔ粒子分析ソフトウェアを使用して等価球直径によって４つのカテゴリーにグループ分けし、それぞれの粒子クラスを３回のサンプル分析について平均化した。この実験の結果が下記の表３に示される。ＦｌｏｗＣａｍによる粒子分析ではさらに、ＰＰＧ賦形剤により達成される安定化がＰＥＧ１０００の場合よりも大きいことが明らかにされた。ＰＰＧサンプルの中では、ＰＰＧ１０００及びＰＰＧ２０００が、類似する成績をもたらし、ＰＰＧ４２５を賦形剤として用いたサンプルよりもわずかに少ない粒子カウント数をもたらした。
【表３】
2019527729.tif 000004
【００５６】
例３：低分子量の疎水性修飾セルロースの評価
低分子量のヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）及び低分子量のメチルセルロース（ＭＣ）は、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ）からＭＥＴＨＯＣＥＬ（登録商標）の商標で市販されている疎水性修飾されたセルロースポリマーである。ＭＥＴＨＯＣＥＬ（登録商標）製品ラインについての命名規則は、製品名称における数字が２％水溶液の粘度であり、「ＬＶ」が低粘度を表し、最初の文字が置換のタイプ（ＨＰＭＣ又はＭＣ）及び程度を表すようになっている。３つの低分子量ＨＰＭＣ製品（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ３ＬＶ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ１５ＬＶ、及びＭｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ３ＬＶ）と、１つの低分子量ＭＣ製品（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ａ１５ＬＶ）とを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得られるポリソルベート８０（ＰＳ８０）及びポリプロピレングリコール２０００（ＰＰＧ２０００）とともに本例において安定化賦形剤として使用した。
【００５７】
ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）製剤を下記のように調製した。Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．によって米国で頒布される商用のセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））製剤を入手した。ＦＤＡ薬物ラベルによれば、この商用製剤は、２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブ、８．４８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、１．８８ｍｇ／ｍＬの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、及び０．４１ｍｇ／ｍＬの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含有した。
【００５８】
次に、Ｅｒｂｉｔｕｘサンプルを、約２００ｐｐｍの安定化賦形剤の存在下、ｐＨ７で、１５ｍＭのリン酸ナトリウム及び４．８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムにおいて下記の方法で再配合した。緩衝剤溶液を、およそ０．１ｇの一塩基性リン酸ナトリウム二水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、０．２４ｇの塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び約０．１ｇの所望の安定化賦形剤を脱イオン水に溶解することによって調製し、さらなる脱イオン水により約５０ｇの最終質量に希釈した。それぞれの緩衝液の溶液ｐＨを、５Ｍ水酸化ナトリウム又は１Ｍ水酸化ナトリウムのどちらかを滴加することにより約７に調節した。緩衝液を０．２ミクロンの滅菌ポリエーテルスルホン・シリンジフィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）でろ過し、０．４ｍＬのそれぞれの緩衝液を、賦形剤を含有しない約３．４ｍＬの同じ緩衝液とともに５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに加えた。このようにして、約２００ｐｐｍの最終賦形剤濃度をそれぞれのサンプルにおいて達成した。３０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮器チューブ（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を脱イオン水ですすぎ、１３ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘサンプルで満たし、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機において約２７分間、約３２００×ｇ及び２５℃で遠心分離して、約０．６ｍＬの最終保持液量又は約４０ｍｇ／ｍＬのセツキシマブの濃度にした。その後、ろ液を取り出し、約０．２ｍＬをそれぞれの緩衝液含有の５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに加え、０．２ミクロンの滅菌シリンジフィルターでろ過した。
【００５９】
約２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブの濃度及び約４ｍＬの最終容量を有する、５ｍＬのポリプロピレンチューブにおける得られたセツキシマブ製剤を、２７５ｒｐｍで、Ｄａｉｇｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）Ｌａｂｇｅｎｉｕｓ回旋式振とう機に置いた。約１６時間及び約４０時間の周囲温度での連続振とうの後、サンプルを取り出し、１０ｍｍの光路長のキュベットを用いた、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ分光光度計における吸光度によって、また、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）から得られるＺｅｔａＰｌｕｓを用いた動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した。
【００６０】
３５０ｎｍ及び５５０ｎｍにおける吸光度を濁度の測定値として利用した（より大きい吸光度は、より多くの不溶性微粒子が形成されているために、ストレス後のセツキシマブの劣化がより大きいことを示している）。吸光度の結果が分光光度計測定からの吸光度単位（ＡＵ）で報告され、下記の表４にまとめられる。
【００６１】
動的光散乱測定は有効径をナノメートルの単位で与え、緩衝液の粘度及び屈折率におけるわずかな差について補正されなかった。代わりに、ＤＬＳ測定を、タンパク質凝集をモニターするための、濁度よりも高感度の方法として使用した。動的光散乱の結果が下記の表５にまとめられる。
【表４】
2019527729.tif 000005
【表５】
2019527729.tif 000006
【００６２】
激しい剪断にさらされた後におけるサンプルの吸光度測定及びＤＬＳ測定は、低分子量のＨＰＭＣ及びＭＣは劣化からのセツキシマブの保護をＰＳ８０及びＰＰＧ２０００と同じ程度にもたらすことができたことを示している。
【００６３】
例４：ストレスを受けたセツキシマブ製剤のＦｌｏｗＣＡＭ分析
例３に従って調製される、２００ｐｐｍの賦形剤を含むｐＨ７でのリン酸塩緩衝液において約２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブを含有するサンプルを、ＦｌｏｗＣａｍ  ＶＳ１（Ｆｌｕｉｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＥ）を使用した動的フローイメージングによって不溶性粒子について分析した。ＦｌｏｗＣａｍは、２０Ｘの対物レンズと、５０ミクロンの深さのフローセルとを備え、０．０３ｍＬ／分の流速で操作された。測定を、１回あたり１．０ｍＬのサンプル容量を使用して二連で行った。粒子を計数し、ＦｌｏｗＣａｍ装置とともに提供されるＶｉｓｕａｌＳｐｒｅａｄｓｈｅｅｔ粒子分析ソフトウェアを使用して等価球直径によって４つのカテゴリーにグループ分けした。それぞれの粒子クラスについての報告値は２回のサンプル分析からの平均である。結果が下記の表６に示される。
【表６】
2019527729.tif 000007
【００６４】
例５：安定化賦形剤としてのＰＰＧ及びＰＥＧの試験
本例では、安定化賦形剤としての下記の添加剤の効果が比較される：プロピレングリコール（ＰＧ）；ジプロピレングリコール（ＤＰＧ）；トリプロピレングリコール（ＴＰＧ）；ポリプロピレングリコール、Ｍｎ：約４２５ｇ／ｍｏｌ（ＰＰＧ４２５）；ポリプロピレングリコール、Ｍｎ：約７２５ｇ／ｍｏｌ（ＰＰＧ７２５）；ポリエチレングリコール、Ｍｎ：約４００ｇ／ｍｏｌ（ＰＥＧ４００）；及びポリソルベート８０（ＰＳ８０）。
【００６５】
ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）製剤を下記のように調製した。Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．によって米国で頒布される商用のセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））製剤を入手した。ＦＤＡ薬物ラベルによれば、この商用製剤は、２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブ、８．４８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、１．８８ｍｇ／ｍＬの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、及び０．４１ｍｇ／ｍＬの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含有した。
【００６６】
次に、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）サンプルを、約２００ｐｐｍの安定化賦形剤の存在下、ｐＨ７で、１５ｍＭのリン酸ナトリウム及び４．８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムにおいて下記の方法で再配合した。緩衝剤溶液を、およそ０．１ｇの一塩基性リン酸ナトリウム二水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、０．２４ｇの塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び約０．０１ｇの所望の安定化賦形剤を脱イオン水に溶解することによって調製し、さらなる脱イオン水により約５０ｇの最終質量に希釈した。それぞれの緩衝液の溶液ｐＨを、５Ｍ水酸化ナトリウム又は１Ｍ水酸化ナトリウムのどちらかを滴加することにより約７に調節した。緩衝液を０．２ミクロンの滅菌ポリエーテルスルホン・シリンジフィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）でろ過し、３．８ｍＬのそれぞれの緩衝液を５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに加えた。３０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮器チューブ（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を脱イオン水ですすぎ、１４ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘサンプルで満たし、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機において約２５分間、約３２００×ｇ及び２５℃で遠心分離して、約１ｍＬの最終保持液量又は約３０ｍｇ／ｍＬのセツキシマブの濃度にした。その後、ろ液を取り出し、約０．２７ｍＬをそれぞれの緩衝液含有の５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに加え、０．２ミクロンの滅菌シリンジフィルターでろ過した。
【００６７】
約２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブの濃度及び約４ｍＬの最終容量を有する、５ｍＬのポリプロピレンチューブにおける得られたセツキシマブ製剤を、２７５ｒｐｍで、Ｄａｉｇｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）Ｌａｂｇｅｎｉｕｓ回旋式振とう機に置いた。１６時間及び３９時間の周囲温度での連続振とうの後、サンプルを、１０ｍｍの光路長のキュベットを用いた、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ分光光度計における吸光度によって、また、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）から得られるＺｅｔａＰｌｕｓを用いた動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した。
【００６８】
３５０ｎｍ及び５５０ｎｍにおける吸光度を濁度の測定値として利用した（より大きい吸光度は、より多くの不溶性微粒子が形成されているために、製剤の劣化がより大きいことを示している）。吸光度の値が分光光度計測定からの吸光度単位（ＡＵ）で報告される。これらの結果が表７に示される。
【００６９】
光散乱測定は有効径をナノメートルの単位で与えた。代わりに、ＤＬＳ測定を、タンパク質の凝集をモニターするための、濁度よりも高感度の方法として使用した。ＤＬＳの結果が表８にまとめられる。
【表７】
2019527729.tif 000008
【表８】
2019527729.tif 000009
【００７０】
吸光度及びＤＬＳ粒子サイズからの結果から、ポリプロピレングリコールは、激しい撹拌及び空気／液体界面への強曝露の後におけるセツキシマブの凝集を防止することにおいて、類似分子量のポリエチレングリコールよりも効果的であったことが明らかにされる。ポリプロピレングリコールでもまた、プロピレングリコール又はその二量体若しくは三量体よりも良好な成績が明らかにされた。ポリプロピレングリコール及びポリソルベート８０は、類似する吸光度結果及びＤＬＳ結果を有した。
【００７１】
例６：安定化賦形剤の試験
本例では、安定化賦形剤としての下記の添加剤の効果が比較される：ヒドロキシプロピルメチルセルロース、Ｍｎ：約１０，０００（ＨＰＭＣ）；ＰＰＧ４２５；アセスルファムＫ；サッカリン；ロイシン；及びプロピオン酸ナトリウム（プロピオン酸Ｎａ）。
【００７２】
ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）製剤を下記のように調製した。Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．によって米国で頒布される商用のセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））製剤を入手した。ＦＤＡ薬物ラベルによれば、この商用製剤は、２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブ、８．４８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、１．８８ｍｇ／ｍＬの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、及び０．４１ｍｇ／ｍＬの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含有した。
【００７３】
次に、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）サンプルを、様々な安定化賦形剤の存在下、ｐＨ７で、１５ｍＭのリン酸ナトリウムにおいて下記の方法で再配合した。賦形剤を含有する緩衝剤溶液を、およそ０．１ｇの一塩基性リン酸ナトリウム二水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び所望の賦形剤を脱イオン水に溶解し、溶液のｐＨを１Ｍ水酸化ナトリウム又は１Ｍ塩酸のどちらかの滴下により７に調節することによって調製した。溶液を、さらなる脱イオン水によりメスフラスコにおいて５０ｍＬの最終容量に希釈した。緩衝液を０．２ミクロンの滅菌ポリエーテルスルホン・シリンジフィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）でろ過し、３．８ｍＬのそれぞれの緩衝液を５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに加えた。３０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮器チューブ（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を脱イオン水ですすぎ、１４ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘサンプルで満たし、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機において約２５分間、約３２００×ｇ及び２５℃で遠心分離して、約１ｍＬの最終保持液量又は約３０ｍｇ／ｍＬのセツキシマブの濃度にした。その後、ろ液を取り出し、約０．２８ｍＬをそれぞれの緩衝液含有の５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに加え、０．２ミクロンの滅菌シリンジフィルターでろ過した。
【００７４】
約２ｍｇ／ｍＬの濃度及び約４ｍＬの最終容量を有する、５ｍＬのポリプロピレンチューブにおける得られたセツキシマブ製剤を、２７５ｒｐｍで、Ｄａｉｇｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）Ｌａｂｇｅｎｉｕｓ回旋式振とう機に置いた。１６時間及び３６時間の周囲温度での連続振とうの後、サンプルを、１０ｍｍの光路長のキュベットを用いた、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ分光光度計における光学的吸収（吸光度）によって、また、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）から得られるＺｅｔａＰｌｕｓを用いた動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した。
【００７５】
３５０ｎｍ及び５５０ｎｍにおける吸光度を濁度の測定値として利用した（より大きい吸光度は、より多くの不溶性微粒子が形成されているために、ストレス後の製剤の劣化がより大きいことを示している）。吸光度の値が分光光度計測定からの吸光度単位（ＡＵ）で報告される。場合により、サンプルを合計で１２８時間振とうし、吸光度測定値を得た。結果が下記の表９に示される。
【００７６】
動的光散乱（ＤＬＳ）測定は有効径をナノメートルの単位で与え、緩衝液の粘度及び屈折率におけるわずかな差について補正されなかった。代わりに、ＤＬＳ測定を、タンパク質凝集をモニターするための、濁度よりも高感度の方法として使用した。結果が下記の表１０にまとめられる。
【表９】
2019527729.tif 000010
【表１０】
2019527729.tif 000011
【００７７】
オートサンプラーを伴う、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズのＨＰＬＣを用いて、上記製剤のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を、振とうストレスにさらされた後のセツキシマブモノマーの喪失をモニターするために行った。サンプルを、１５マイクロリットルの注入量及び０．３５ｍＬ／分の流速により、ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００（４．６ｍｍ×３０ｃｍ）カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処理した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズのダイオードアレイ検出器を使用して、溶出液の吸光度を４ｎｍのバンド幅により２８０ｎｍで測定した。カラム温度を２５℃に設定し、移動相が０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）であった。ストレス前及びストレス後でのモノマーピークの面積における変化を、モノマーの喪失を定量化するために使用した。振とうストレス後でのモノマーピーク面積が、ストレス曝露前でのモノマーピーク面積の百分率として報告された。これらの結果が下記の表１１に示される。
【表１１】
2019527729.tif 000012
【００７８】
吸光度、ＤＬＳ粒子サイズ及びサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）からの結果から、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリプロピレングリコールは、激しい撹拌及び空気／液体界面への強曝露の後におけるセツキシマブの凝集を防止することが明らかにされる。どちらの賦形剤の存在下でも、吸光度データによって示されるように、可視粒子の形成が防止された。初期モノマーサイズが保たれたことが、ＤＬＳ粒子サイズ測定のデータによって示され、このことは、可溶性凝集物の形成が抑制されたことを示している。ＳＥ−ＨＰＬＣはこれらの測定を裏づけており、このことから、サンプル中のモノマーが本質的に失われていないことが明らかにされる。
【００７９】
ソルビン酸カリウムを伴う製剤もまた、振とう後の濁度を抑制することにおいて市販のＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）製剤を上回る有意な改善を示した。
【００８０】
例７：異なる量のＰＰＧ４２５を含むＥＲＢＩＴＵＸ製剤の振とう機ストレス
ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）製剤を下記のように調製した。Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．によって米国で頒布される商用のセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））製剤を入手した。ＦＤＡ薬物ラベルによれば、この商用製剤は、２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブ、８．４８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、１．８８ｍｇ／ｍＬの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、及び０．４１ｍｇ／ｍＬの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含有した。
【００８１】
次に、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）サンプルを、平均分子量が約４２５ｇ／ｍｏｌであるポリプロピレングリコール（ＰＰＧ４２５）の様々な量の存在下、ｐＨ７で、１５ｍＭのリン酸ナトリウム及び４．８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムにおいて下記の方法で再配合した。ＰＰＧ４２５を含有する緩衝剤溶液を、およそ０．１ｇの一塩基性リン酸ナトリウム二水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び所望の賦形剤を脱イオン水に溶解し、溶液のｐＨを１Ｍ水酸化ナトリウムの滴下により７に調節することによって調製した。溶液を、さらなる脱イオン水によりメスフラスコにおいて５０ｍＬの最終容量に希釈した。場合により、ＰＰＧ４２５を含有しない緩衝液を、より低いＰＰＧ４２５濃度を同じリン酸塩濃度及び塩化ナトリウム濃度とともに約７のｐＨで有する緩衝液を得るような方法で、ＰＰＧ４２５を含有する緩衝液に加えた。緩衝液を０．２ミクロンの滅菌ポリエーテルスルホン・シリンジフィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）でろ過し、３．８ｍＬのそれぞれの緩衝液を５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに加えた。３０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮器チューブ（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を脱イオン水ですすぎ、１４ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘサンプルで満たし、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機において約２５分間、約３２００×ｇ及び２５℃で遠心分離して、約１ｍＬの最終保持液量又は約３０ｍｇ／ｍＬのセツキシマブの濃度にした。その後、ろ液を取り出し、約０．２８ｍＬをそれぞれの緩衝液含有の５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに加え、０．２ミクロンの滅菌シリンジフィルターでろ過した。
【００８２】
約２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブの濃度及び約４ｍＬの最終容量を有する、５ｍＬのポリプロピレンチューブにおける得られたセツキシマブ製剤を、２７５ｒｐｍで、Ｄａｉｇｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）Ｌａｂｇｅｎｉｕｓ回旋式振とう機に置いた。２３時間及び５４時間の周囲温度での連続振とうの後、サンプルを、１０ｍｍの光路長のキュベットを用いた、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ分光光度計における吸光度によって、また、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）から得られるＺｅｔａＰｌｕｓを用いた動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した。
【００８３】
３５０ｎｍ及び５５０ｎｍにおける吸光度を濁度の測定値として利用した（より大きい吸光度は、より多くの不溶性微粒子の形態でのストレス後の製剤の劣化がより大きいことを示している）。吸光度の値が分光光度計測定からの吸光度単位（ＡＵ）で報告される。これらの結果が下記の表１２に示される。
【００８４】
動的光散乱（ＤＬＳ）測定は有効径をナノメートルの単位で与え、緩衝液の粘度及び屈折率におけるわずかな差について補正されなかった。代わりに、ＤＬＳ測定を、タンパク質凝集をモニターするための、濁度よりも高感度の方法として使用した。結果が下記の表１３にまとめられる。
【表１２】
2019527729.tif 000013
【表１３】
2019527729.tif 000014
【００８５】
オートサンプラーを伴う、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズのＨＰＬＣを用いて、上記製剤のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を、振とうストレスにさらされた後のセツキシマブモノマーの喪失をモニターするために行った。サンプルを、１５マイクロリットルの注入量及び０．３５ｍＬ／分の流速により、ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００（４．６ｍｍ×３０ｃｍ）カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処理した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズのダイオードアレイ検出器を使用して、溶出液の吸光度を４ｎｍのバンド幅により２８０ｎｍで測定した。カラム温度を２５℃に設定し、移動相が０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）であった。ストレス前及びストレス後でのモノマーピークの面積における変化を、モノマーの喪失を定量化するために使用した。振とうストレス後でのモノマーピーク面積が、ストレス曝露前でのモノマーピーク面積の百分率として報告された。結果が下記の表１４に示される。
【表１４】
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【００８６】
吸光度、ＤＬＳ粒子サイズ及びサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）からの結果から、０．５ｍｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬまでのポリプロピレングリコールが、激しい撹拌及び空気／液体界面への強曝露の後におけるセツキシマブの凝集を防止することにおいて有した効果が明らかにされる。それどころか低い賦形剤濃度の存在下でさえ、吸光度データによって示されるように、可視粒子の形成が防止された。ＤＬＳ粒子サイズ測定のデータによって示される、初期モノマーサイズが保たれたことは、可溶性凝集物の形成が抑制されたことを示している。ＳＥ−ＨＰＬＣは、サンプル中のモノマーが本質的に失われていないことを明らかにするこれらの測定を裏づけている。
【００８７】
例８：１０ｍｇ／ｍＬのセツキシマブを含有する製剤の撹拌ストレス
本例では、撹拌されたセツキシマブ製剤において粒子形成を軽減することにおける下記の添加剤の効果が比較される。
【００８８】
材料：
・カルボキシメチルヒドロキシプロピルグアー、ＣＭＨＰＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）
・Ｍａｌｔｒｉｎ  Ｍ１００（Ｇｒａｉｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｕｓｃａｔｉｎｅ、ＩＡ）
・ポリビニルピロリドン、１０ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
・ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、５ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
・ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、５０ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
・ポリプロピレングリコール１０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
・プルロニックＦ６８（ＢＡＳＦ、Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）
・ポリソルベート８０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
【００８９】
Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．によって米国で頒布される商用のセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））製剤を入手した。ＦＤＡ薬物ラベルによれば、この商用製剤は、２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブ、８．４８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、１．８８ｍｇ／ｍＬの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、及び０．４１ｍｇ／ｍＬの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含有した。Ｅｒｂｉｔｕｘサンプルを、約１００ｐｐｍ又は約２００ｐｐｍの安定化賦形剤の存在下、ｐＨ７で、１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び１４０ｍＭの塩化ナトリウムにおいて下記の方法で再配合した。ストック用緩衝剤溶液を、１．４ｇの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び約８．２ｇの塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を脱イオン水に溶解することによって調製し、さらなる脱イオン水により１Ｌの最終容量に希釈した。溶液のｐＨを１０Ｍ水酸化ナトリウムの滴下により約７に調節した。安定化賦形剤を、０．０２ｇ又は０．０４ｇの賦形剤を５０ｍＬのストック用緩衝液（ｐＨ７）に加えることによって、得られた緩衝液に溶解した。賦形剤溶液を０．２ミクロンの滅菌ポリエーテルスルホン・シリンジフィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）でろ過し、０．２５ｍＬのそれぞれの賦形剤溶液を、賦形剤を含有しないストック用緩衝液とともに２ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに加えて、０．７１ｍＬの容量を達成し、その後、高濃度のセツキシマブ溶液を加えた。
【００９０】
３０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮器チューブ（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を脱イオン水ですすぎ、１０ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘサンプルで満たし、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機において約３２００×ｇ及び２３℃で遠心分離して、約０．５ｍＬの最終保持液量にした。その後、ろ液を取り出し、約０．２９ｍＬをそれぞれの滅菌ポリプロピレンチューブに加え、０．２ミクロンの滅菌シリンジフィルターでろ過した。
【００９１】
約１０ｍｇ／ｍＬのセツキシマブの濃度及び約１ｍＬの最終容量を有する、２ｍＬのポリプロピレンチューブにおける得られたセツキシマブ製剤を、２７５ｒｐｍで、Ｄａｉｇｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）Ｌａｂｇｅｎｉｕｓ回旋式振とう機に置いた。サンプルを、ＦｌｏｗＣａｍ  ＶＳ１（Ｆｌｕｉｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＥ）を用いた動的フローイメージングによって、４０時間の連続振とうの後で分析した。
【００９２】
ＦｌｏｗＣａｍは、２０Ｘの対物レンズと、５０ミクロンの深さのフローセルとを備え、０．０３ｍＬ／分の流速で操作された。測定を、１回あたり０．５ｍＬのサンプル容量を使用して行った。粒子を計数し、粒子は、装置と一緒に含まれるＶｉｓｕａｌＳｐｒｅａｄｓｈｅｅｔ粒子分析ソフトウェアを使用して等価球直径に従った４つのカテゴリーで報告された。
【表１５】
2019527729.tif 000016
【００９３】
例９：セツキシマブ製剤における、撹拌ストレスに対する安定剤としてのポリビニルアルコール。
本例では、撹拌されたセツキシマブ製剤において粒子形成を軽減することにおける下記の添加剤の効果が比較される。
【００９４】
材料：
・ポリビニルアルコール、８０％加水分解、９〜１０ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
・ポリビニルアルコール、８７〜８９％加水分解、１４６〜１８６ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
・ポリプロピレングリコール１０００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
【００９５】
Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．によって米国で頒布される商用のセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））製剤を入手した。ＦＤＡ薬物ラベルによれば、この商用製剤は、２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブ、８．４８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、１．８８ｍｇ／ｍＬの二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、及び０．４１ｍｇ／ｍＬの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含有した。Ｅｒｂｉｔｕｘサンプルを、約５０ｐｐｍ又は約１００ｐｐｍの安定化賦形剤の存在下、ｐＨ７で、１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び約１４０ｍＭの塩化ナトリウムにおいて下記の方法で再配合した。緩衝剤溶液を、０．３５５ｇの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び約２ｇの塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を脱イオン水に溶解することによって調製し、さらなる脱イオン水により２５０ｍＬの最終容量に希釈した。溶液のｐＨをどちらかの１０Ｍ水酸化ナトリウムの滴下により約７に調節した。安定化賦形剤を、０．０２ｇの賦形剤を５０ｍＬのリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ｐＨ７）に加えることによって、得られた緩衝液に溶解した。賦形剤溶液を０．２ミクロンの滅菌ポリエーテルスルホン・シリンジフィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）でろ過し、１．０ｍＬ又は０．５ｍＬのどちらかのそれぞれの賦形剤溶液を、賦形剤を含有しないストック用緩衝液とともに５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに加えて、約３．８ｍＬの容量を達成し、その後、高濃度のセツキシマブ溶液を加えた。
【００９６】
３０ｋＤａの公称分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮器チューブ（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を脱イオン水ですすぎ、８．５ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘサンプルで満たし、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機において約３２００×ｇ及び２３℃で遠心分離して、約０．５ｍＬの最終保持液量にした。その後、ろ液を取り出し、約０．２１ｍＬをそれぞれの滅菌ポリプロピレンチューブに加え、０．２ミクロンの滅菌シリンジフィルターでろ過した。
【００９７】
約２ｍｇ／ｍＬのセツキシマブの濃度及び約４ｍＬの最終容量を有する、５ｍＬのポリプロピレンチューブにおける得られたセツキシマブ製剤を、２７５ｒｐｍで、Ｄａｉｇｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）Ｌａｂｇｅｎｉｕｓ回旋式振とう機に置いた。約４０時間の連続振とうの後、サンプルを取り出し、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）から得られるＺｅｔａＰｌｕｓを用いた動的光散乱によって、また、ＦｌｏｗＣａｍ  ＶＳ１（Ｆｌｕｉｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＥ）を用いた動的フローイメージングによって分析した。
【表１６】
2019527729.tif 000017
【００９８】
ＦｌｏｗＣａｍは、２０Ｘの対物レンズと、５０ミクロンの深さのフローセルとを備え、０．０３ｍＬ／分の流速で操作された。測定を、１回あたり０．５ｍＬのサンプル容量を使用して行った。粒子を計数し、粒子は、装置と一緒に含まれるＶｉｓｕａｌＳｐｒｅａｄｓｈｅｅｔ粒子分析ソフトウェアを使用して等価球直径に従った４つのカテゴリーで報告された。
【表１７】
2019527729.tif 000018
【００９９】
すべての場合において、添加剤の存在は、ＦｌｏｗＣａｍデータによって明らかにされるように、添加剤を伴わないサンプルと比較して、撹拌ストレスの間に生じる粒子の数を有意に減少させた。
【０１００】
例１０：セツキシマブ製剤の安定性に対するセルロース修飾の影響
２つの修飾セルロース材料、すなわち、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）及びナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を、これらはセツキシマブ溶液を粒子形成に対して安定化することができるかについて調べた。賦形剤をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、さらに修飾することなく使用した。セツキシマブを、Ｃｌｉｎｉｇｅｎ  Ｇｒｏｕｐ（Ｙａｒｄｌｅｙ、ＰＡ）からＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）の商品名（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で購入した。ＨＰＣは重量平均分子量が８０，０００であり、数平均分子量が１０，０００であった。ＣＭＣは重量平均分子量が９０，０００であった。数平均がＣＭＣについては報告されなかった。セツキシマブの濃度がすべての実験において２ｍｇ／ｍＬであった。ＨＰＣ及びＣＭＣの濃度が表１８に列挙される。安定化賦形剤を含まない対照サンプルもまた調製した。すべての溶液をリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ｐＨ７）において調製した。４ｍＬのそれぞれのサンプルを５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに入れた。サンプルには、ストレスを、回旋式振とう機での振とうを２７５ｒｐｍで４０時間行うことによって与えた。微粒子の形成を、３５０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量化し、粒子サイズを、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して測定した。Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＺｅｔａＰｌｕｓ装置を使用して、ＤＬＳ実験を行った。キュムラント展開を、粒子サイズを推定するためにＤＬＳ強度自己相関関数に合わせた。ＤＬＳ測定を振とう前及び振とう後の両方で行った。
【０１０１】
ＨＰＣを含有する溶液は、濁りが対照よりも少なく（表１８）、見かけ粒子サイズが実験期間中に変化しておらず、これらのことは、ＨＰＣが、粒子形成に対してセツキシマブを安定化することにおいて効果的であることを示している。しかしながら、ＣＭＣを含有する溶液は、濁度及び最終粒子サイズが対照の場合と類似しており、このことは、ＣＭＣが、粒子形成に対してセツキシマブを安定化することにおいて効果的でないことを示している。ここでの結果は、修飾のタイプが、セルロース系材料がタンパク質溶液において微粒子形成からの保護をもたらし得るかにおいて重要であることを例示している。
【表１８】
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【０１０２】
例１１：セツキシマブ製剤を粒子形成に対して安定化する賦形剤。
本例では、２ｍｇ／ｍＬでのセツキシマブが、いくつかの異なる安定化賦形剤の存在下でストレスを受ける。賦形剤は、重量平均分子量が４０，０００であるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、重量平均分子量が１３，０００〜２３，０００であり、８７％〜８９％の加水分解残基を有するポリビニルアルコール（ＰＶＯＨ）、粘度平均分子量が９０，０００である２−ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、及び、数平均分子量が５０００であり、多分散性が１．２以下であるポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＯＸ５０００）、ならびにアスパルテームである。賦形剤をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、さらに修飾することなく使用した。セツキシマブを、Ｃｌｉｎｉｇｅｎ  Ｇｒｏｕｐ（Ｙａｒｄｌｅｙ、ＰＡ）からＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）の商品名（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で購入した。それぞれの賦形剤の濃度が表１９に列挙される。安定化賦形剤を伴わない対照サンプルもまた調製した。すべての実験をｐＨ７でのリン酸塩緩衝化生理的食塩水において行った。４ｍＬのそれぞれのサンプルを５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに入れ、その後、チューブを２７５ｒｐｍに設定される回旋式振とう機に置いた。サンプルを４０時間振とうし、その後、サンプルを、濁度を推定するために４０５ｎｍでの吸光度測定によって微粒子形成について分析した。粒子の総数を、ＦｌｏｗＣａｍイメージング装置を使用して計数した。濁度測定を、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーを用いて行い、マイクロプレートにおける液体高さの光路長について補正した。ＦｌｏｗＣａｍは、２０Ｘの対物レンズと、５０μｍの深さのフローセルとを備え、０．０３ｍＬ／分の流速で操作された。測定を、１回あたり０．５ｍＬのサンプル容量を使用して行った。対照サンプルは最後にＦｌｏｗＣａｍに流され、フローセルを部分的に詰まらせた。このため、粒子数の正確な計数が妨げられた。これにより、表１９に列挙される数字は、粒子の総数に対する下界となっている。表１９に示される使用レベルにおいて、添加剤のすべてが、４０５ｎｍでの吸光度における低下及び１ｍＬあたりの粒子の総数における減少によって示されるように、セツキシマブを微粒子形成に対して安定化している。
【表１９】
2019527729.tif 000020
【０１０３】
例１２：安定化賦形剤の泡立ち傾向
Ｍｎが１０００であるポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ１０００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｎが５０００であり、ＰＤＩが１．２以下であるポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＯＸ５０００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ３ＬＶ（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ）、ポリソルベート８０（ＰＳ８０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、及びプルロニックＦ６８（Ｆ６８、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の、１０００ｐｐｍ（ｗ／ｖ）の濃度の溶液を、超高純度の脱イオン水（２５℃で１８．２ＭΩ・ｃｍ）を使用して調製した。３ｍＬのそれぞれの溶液を５ｍＬのポリプロピレンチューブに入れ、Ｍｉｎｉ  Ｖｏｒｔｅｘミキサー（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）で、＃８のミキサー設定で１５秒間ボルテックスした。泡の高さをボルテックス処理後に測定した。泡の高さが表２０に列挙される。泡が消散する時間もまた記録され、表２０に列挙される。ＰＯＸ５０００サンプル及びＦ６８サンプルについての泡は実験中を通して消散しなかった。停止点が表２０に列挙される。
【表２０】
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【０１０４】
例１３：限外ろ過後における安定化賦形剤の回収
Ｍｎが１０００であるポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ１０００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｎが５０００であり、ＰＤＩが１．２以下であるポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＯＸ５０００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ３ＬＶ（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ）、ポリソルベート８０（ＰＳ８０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、及びプルロニックＦ６８（Ｆ６８、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の、１０００ｐｐｍ（ｗ／ｖ）の濃度の溶液を、超高純度の脱イオン水（２５℃で１８．２ＭΩ・ｃｍ）を使用して調製した。
【０１０５】
使用したフィルター器具は、分子量カットオフが３０，０００であるＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心分離器具（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）である。Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機を使用して、供給物容量を２５℃において４，０００ｒｐｍで１０分間、メンブランでろ過した。屈折率検出器（ＲＩＤ）が付属する、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムを使用して、供給物容量、保持液容量及びろ液容量における物質の濃度を測定した。
【０１０６】
標準曲線を最初にそれぞれの溶液について作成した。１０００ｐｐｍ、７００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、４００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ及び１００ｐｐｍの濃度を調製し、ピーク面積を求めるためにＨＰＬＣ−ＲＩＤで分析した。その後、ピーク面積を濃度に対してプロットした。線形応答が１００ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍの範囲ですべての溶液について認められた。
【０１０７】
フィルター器具を、４ｍＬのＤＩ水を加え、４，０００ｒｐｍ及び２５℃で１０分間にわたって遠心分離することによって事前にすすいだ。次いで、ろ過されたすすぎ水を捨て、その後、４ｍＬの１０００ｐｐｍ賦形剤溶液を加えた。その後、サンプルを、上記のような条件を使用して遠心分離した。フィルター器具からのろ液を、遠心分離後、（空重量が測定された）清浄な３０ｍＬチューブに移した。このプロセスを、合計で２０ｍＬのろ液物のためにさらに４回繰り返した。ろ液の総量を質量により求めた。それぞれの条件を三連で行った。
【０１０８】
１００μＬ量のストック液、保持液及びろ液を取り出し、２０μＬの注入液を、ピーク面積を屈折率検出（ＲＩＤ）によって求めるために調製した。標準曲線式を使用して、濃度を、ピーク面積を入力することによって求めた。ろ液及び保持液に回収された賦形剤の量を、総ろ液容量及び総保持液容量に測定濃度を乗じることによって求めた。ろ液に回収された賦形剤の質量を、ろ過器具に加えられた初期質量と比較して、回収率を求めた。
【０１０９】
本例で調べられた賦形剤の回収率が表２１に示される。ＰＰＧ１０００、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ３ＬＶ、ＰＯＸ５０００及びプルロニックＦ６８の回収率は、ＰＳ８０の回収率よりも高い。
【表２１】
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【０１１０】
例１４：アバタセプトを安定化する賦形剤
アバタセプトを、Ｃｌｉｎｉｇｅｎ  Ｇｒｏｕｐ（Ｙａｒｄｌｅｙ、ＰＡ）からＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）の商品名で購入した。Ｏｒｅｎｃｉａを、添付文書の説明書に従って、抵抗率が１８．２ＭΩ・ｃｍである超高純度の脱イオン水（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）において２５ｍｇ／ｍＬのアバタセプトに再構成した。２５ｍＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む１４ｍＭのリン酸一ナトリウム緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（ｐＨ７．５）を調製した。Ｍｎが１０００であるポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ１０００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｎが５０００であり、ＰＤＩが１．２以下であるポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＯＸ５０００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、及び、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ３ＬＶ（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ）の、重量比で２０００ｐｐｍの濃度の溶液を、前述の緩衝液を使用して調製した。サンプルを、再構成されたＯｒｅｎｃｉａを賦形剤ストック溶液及び緩衝液と混合して、２．５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度、およそ１８００ｐｐｍ及び２００ｐｐｍの最終賦形剤濃度にすることによって調製した。１ｍＬのそれぞれのサンプルを２ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブに入れた。チューブを２５℃で１８時間、Ｍｕｌｔｉ−Ｔｈｅｒｍ  Ｓｈａｋｅｒ（Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｏｅｂｌｉｎｇ、ＮＪ）で振とうした。賦形剤を含まないストレス非負荷の対照サンプルもまた含まれた（サンプル１、表２２）。サンプルを動的光散乱（ＤＬＳ）によって見かけ粒子サイズについてアッセイし、ＦｌｏｗＣａｍイメージングによって総粒子数についてアッセイした。４０μＬのそれぞれのサンプルを３８４ウエルマイクロプレート（Ａｕｒｏｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ、Ｗｈｉｔｅｆｉｓｈ、ＭＴ）に入れた。気泡を、プレートを４００×ｇで１分間にわたって遠心分離することによってマイクロプレートから除いた。その後、プレートをＤＬＳ（ＤｙｎａＰｒｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＩＩ、Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）によって見かけ粒子サイズについてアッセイした。装置制御及びデータフィッティングを、ＤＹＮＡＭＩＣＳソフトウェアパッケージ（Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して行った。入射波長が８３０ｎｍであり、散乱角が１５８°であった。強度自己相関関数を、５回の５秒間の曝露を使用して作成し、粒子の拡散率を推定するためにキュムラント展開に当てはめた。見かけの流体力学的半径（Ｒｈ）をストークス・アインシュタインの関係によって拡散率から計算した。肉眼では見えない（サイズが２ミクロン超の）粒子の形成を、ＦｌｏｗＣａｍ  ＶＳ１分析装置（Ｆｌｕｉｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＥ）を使用して定量化した。ＦｌｏｗＣａｍは、２０Ｘの対物レンズと、５０ミクロンの深さのフローセルとを備え、０．０３ｍＬ���分の流速で操作された。０．５ｍＬのそれぞれのサンプルを粒子数についてアッセイした。
【０１１１】
本例における賦形剤のすべてが、対照（サンプル２、表２２）と比較した場合、粒子数及び流体力学的サイズにおける低下によって示されるように、アバタセプト製剤を振とうストレスに対して安定化する。
【表２２】
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【０１１２】
例１５：濃縮を伴わないＰＰＧ１０００の限外ろ過
ポリ（プロピレングリコール）１０００（ＰＰＧ１０００）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入して、超高純度の脱イオン化（ＤＩ）水（１８．２ＭΩ・ｃｍ）において１０００ｐｐｍ（０．１％）の濃度で調製した。ポリソルベート８０（ＰＳ８０）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入して、超高純度の脱イオン化（ＤＩ）水（１８．２ＭΩ・ｃｍ）において１０００ｐｐｍ（０．１％）の濃度で調製した。ＰＰＧ１０００溶液及びＰＳ８０溶液を下記の方法で限外ろ過によって処理した。分子量カットオフが３０，０００であるＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心分離フィルター器具（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、５ｍＬのＤＩ水で事前にすすいだ。Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機を、ＤＩ水をスピンダウンするために使用して、フィルターメンブランを２４℃において４，０００ｒｐｍで１０分間洗浄した。合計で３回の洗浄を１５ｍＬのＤＩ水の総洗浄容量のために終え、その後、サンプルをフィルター器具に入れた。フィルター器具をすすいだ後、５ｍＬの０．１％でのＰＰＧ１０００又はＰＳ８０を加え、フィルター器具を２４℃における５分間の４０００ｒｐｍでの遠心分離に供した。１００μＬ量の保持液及びろ液を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムに接続される屈折率検出器（ＲＩＤ）を使用する分析のためにろ過器具から取り出した。
【０１１３】
出発溶液、保持液及びろ液におけるＰＰＧ１０００及びＰＳ８０の相対的濃度を、ＨＰＬＣ／ＲＩＤシステムを用いて測定した。ＰＰＧ１０００について表２３に列挙される保持液及びろ液のピーク面積はほぼ同一であり、このことは、ＰＰＧ１０００が限外ろ過時に保持液に濃縮されないことを示している。同じ限外ろ過条件において、ＰＳ８０は、表２３に記録されるピーク面積によって示されるように、最初のストック液濃度と比較して保持液において９０倍濃縮され、ろ液においては最初のストック液濃度の２０分の１以下に低下している。
【表２３】
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【０１１４】
均等物
本発明の具体的な実施形態が本明細書中に開示されているが、上記明細書は例示的であり、限定的ではない。本発明はその好ましい実施態様を参照して特に示され、記載されているが、形式及び細部における様々な変化が、添付された請求項によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく形式及び細部においてなされ得ることが、当業者によって理解されるであろう。本発明の多くの変形が、本明細書を検討すると、当業者には明らかになるであろう。別途示される場合を除き、本明細書及び請求項において使用されるような、反応条件及び成分の量などを表すすべての数字は、すべての場合において用語「約」によって修飾されるとして理解されなければならない。したがって、そうでないことが示される場合を除き、本明細書中で示される数値パラメーターは、本発明によって得られようと求められる所望の性質に依存して変わり得る近似値である。
【国際調査報告】
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