(57)【要約】  本発明は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）を標的とするヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、又は標的結合能を保持した抗体誘導体若しくは断片に関する。本発明は、さらに、二重特異性又は多重特異性抗体、免疫リガンド−薬物コンジュゲート、キメラ抗原受容体、及びこのようなキメラ抗原受容体を含むＴ細胞に関する。
2019502363.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）を標的とするヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、標的結合能を保持した抗体誘導体若しくは断片。
【請求項２】
少なくとも３つのＣＤＲ配列：
配列番号１  ＣＤＲ１  ＨＣ
配列番号２  ＣＤＲ２  ＨＣ
配列番号３  ＣＤＲ３  ＨＣ
又は
配列番号１５  ＣＤＲ１  ＨＣ
配列番号１６  ＣＤＲ２  ＨＣ
配列番号１７  ＣＤＲ３  ＨＣ
又は
配列番号２９  ＣＤＲ１  ＨＣ
配列番号３０  ＣＤＲ２  ＨＣ
配列番号３１  ＣＤＲ３  ＨＣ
を含む、請求項１に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片。
【請求項３】
少なくとも３つのＣＤＲ配列：
配列番号４  ＣＤＲ１  ＬＣ
配列番号５  ＣＤＲ２  ＬＣ
配列番号６  ＣＤＲ３  ＬＣ
又は
配列番号１８  ＣＤＲ１  ＬＣ
配列番号１９  ＣＤＲ２  ＬＣ
配列番号２０  ＣＤＲ３  ＬＣ
又は
配列番号３２  ＣＤＲ１  ＬＣ
配列番号３３  ＣＤＲ２  ＬＣ
配列番号３４  ＣＤＲ３  ＬＣ
を含む、請求項１又は２に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片。
【請求項４】
配列番号９  ＶＲ  ＨＣ
配列番号１０  ＶＲ  ＬＣ
配列番号１１  ＶＲ  ＨＣ
配列番号１２  ＶＲ  ＬＣ
配列番号１３  ＶＲ  ＨＣ
配列番号１４  ＶＲ  ＬＣ
配列番号２３  ＶＲ  ＨＣ
配列番号２４  ＶＲ  ＬＣ
配列番号２５  ＶＲ  ＨＣ
配列番号２６  ＶＲ  ＬＣ
配列番号２７  ＶＲ  ＨＣ
配列番号２８  ＶＲ  ＬＣ
配列番号３７  ＶＲ  ＨＣ
配列番号３８  ＶＲ  ＬＣ
配列番号３９  ＶＲ  ＨＣ
配列番号４０  ＶＲ  ＬＣ
配列番号４１  ＶＲ  ＨＣ
配列番号４２  ＶＲ  ＬＣ
配列番号４３  ＶＲ  ＨＣ
配列番号４４  ＶＲ  ＬＣ
からなる群から選択される配列に対して９５％同一、好ましくは９６％又はさらには９７％同一、より好ましくは９８％又はさらには９９％同一、そして最も好ましくは１００％同一である少なくとも１つの重鎖又は軽鎖可変領域配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片。
【請求項５】
・マウス抗ＲＯＲ抗体ｍＡｂ  ２Ａ２、
・ウサギ抗ＲＯＲ抗体ｍＡｂ  Ｒ１１、及び／若しくは
・ウサギ抗ＲＯＲ抗体ｍＡｂ  Ｒ１２からヒト化され、
かつ／又は、
・ｈｕ２Ａ２ｂ−Ｑ１１（ｍｓＱ１１−３とも呼ばれる）
・ｈｕ２Ａ２−Ｄ２３（ｍｓＤ２３−１９とも呼ばれる）
・ｈｕ２Ａ２−Ｄ１６（ｍｓＤ１６−７とも呼ばれる）
・ｒｂＱ１１（ｒｂＱ１１−３２とも呼ばれる）
・ｒｂＤ４（ｒｂＤ４−３２とも呼ばれる）
・ｒｂＱ１２（ｒｂＱ１２−４０とも呼ばれる）
・ｈｕＲ１２−４
・ｈｕＲ１２−７
・ｈｕＲ１２−１１、及び／若しくは
・ｈｕＲ１２−１６、
及び／若しくは上記の抗体のいずれかと少なくとも９５％、好ましくは９６％若しくはさらに９７％同一、より好ましくは９８％若しくはさらには９９％同一、そして最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一を共有する抗体からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片。
【請求項６】
抗体が、表１又は表２に示されている特徴の少なくとも１つを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片。
【請求項７】
（ｉ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片の結合親和性と少なくとも同じほど高い又は実質的に同じほど高い、ＲＯＲ１に対する結合親和性を有し、かつ／又は
（ｉｉ）ＲＯＲ１に対する結合について、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片と競合する、ヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、標的結合能を保持した抗体誘導体若しくは断片。
【請求項８】
前記受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）がヒトＲＯＲ１である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体又は断片。
【請求項９】
二重特異性抗体又は多重特異性抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片、又は請求項９に記載の二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体をコードする単離された核酸配列又はそのセット。
【請求項１１】
請求項１０に記載の少なくとも１つの核酸配列を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片、又は請求項９に記載の二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体を発現し、及び／又は請求項１０に記載の核酸配列若しくはそのセット、又は請求項１１に記載のベクターを含む単離された細胞。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片、又は請求項９に記載の二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体を作製する方法であって、請求項１２に記載の細胞を培養するステップ、前記抗体、前記抗体ベースの結合タンパク質、前記改変抗体フォーマット、前記抗体誘導体若しくは断片を精製するステップを含む、方法。
【請求項１４】
一般式Ａ−（Ｌ）ｎ−（Ｔ）ｍを有する免疫リガンド−薬物コンジュゲートであって、式中、
・Ａが、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）を標的とする免疫リガンドであり、
・Ｌがリンカーであり、
・Ｔが毒素であり、
ｎ及びｍが１以上１０の整数である、免疫リガンド−薬物コンジュゲート。
【請求項１５】
免疫リガンドが、
・抗体、
・抗体ベースの結合タンパク質、
・標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、
・標的結合能を保持した抗体誘導体若しくは断片、及び／又は
・二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１４に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲート。
【請求項１６】
前記免疫リガンドが、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体、又は請求項９に記載の二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体である、請求項１４又は１５に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲート。
【請求項１７】
前記リンカーが、
・オリゴペプチドリンカー、
・ｐＨ、酸化還元電位の変化、及び／又は特定の細胞内酵素によって切断され得る、切断可能なスペーサーを任意選択により含むマレイミドリンカーからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲート。
【請求項１８】
前記リンカーが、ＬＰＸＳＧn、ＬＰＸＡＧn、ＬＰＸＴＧn、ＬＡＸＴＧn、ＬＡＥＴＧn、ＬＰＸＴＡn、又はＮＰＱＴＧnからなる群から選択される配列のオリゴペプチドを含み、ｎが１以上２１以下の整数であり、Ｘが任意のアミノ酸である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
前記リンカーが、免疫リガンドの少なくとも１つのサブドメインのＣ末端にコンジュゲートされている、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
コンジュゲーションの前に、
・前記免疫リガンドが、少なくとも１つのそのサブドメインのＣ末端に融合又はコンジュゲートされたソルターゼ認識タグを有し、かつ
・前記毒素が、１〜２０のグリシン残基長、好ましくは３〜５のアミノ酸長を有する短いグリシンストレッチを含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
前記毒素が、
・メイタンシノイド、
・アウリスタチン、
・アントラサイクリン、好ましくはＰＮＵ由来アントラサイクリン
・カリケアミシン、
・チューブリシン
・デュオカルマイシン
・ラジオアイソトープ
・有毒なペイロードを含むリポソーム、
・タンパク質毒素
・タキサン、及び／又は
・ピロロベンゾジアゼピンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲート。
【請求項２２】
図８又は図１２に示されているような細胞殺傷活性を有する、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲート。
【請求項２３】
（ｉ）１つ以上のソルターゼ認識タグを有する免疫リガンドと（ｉｉ）オリゴグリシンタグを有する１つ以上の毒素とのソルターゼ媒介コンジュゲーションによって形成される、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲート。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲートを製造する方法であって：
（ａ）ソルターゼ認識タグを有する、請求項１５に示されているリストによる免疫リガンドを用意するステップ、
（ｂ）オリゴグリシンタグを有する１つ以上の毒素を用意するステップ、及び
（ｃ）ソルターゼ媒介コンジュゲーションによって免疫リガンドと毒素とをコンジュゲートするステップを含む、方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの膜貫通領域及び少なくとも１つの細胞内ドメインに融合又はコンジュゲートした、請求項１〜８のいずれか１項に示されている少なくとも１つの抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、又は抗体誘導体若しくは断片、又は請求項９に記載の二重特異性若しくは多重特異性抗体を含むＲＯＲ１特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２６】
好ましくは遺伝子工学的に改変されたＴ細胞である、請求項２５に記載のキメラ抗原受容体を含む細胞。
【請求項２７】
・腫瘍性疾患に罹患している、
・腫瘍性疾患の発症リスクがある、及び／又は
・腫瘍性疾患と診断されている患者の処置のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片、請求項９に記載の二重特異性若しくは多重特異性抗体、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲート、又は請求項２５若しくは２６に記載のＣＡＲ若しくは細胞の使用。
【請求項２８】
前記腫瘍性疾患が、
・慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などのようなリンパ腫及び白血病などの血液癌、並びに
・結腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、及び膵臓癌などの固形癌からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
１つ以上の薬学的に許容される成分と共に、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体、又は抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片、請求項９に記載の二重特異性若しくは多重特異性抗体、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲート、又は請求項２５若しくは２６に記載のＣＡＲ若しくは細胞を含む医薬組成物。
【請求項３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は患者においてＲＯＲ１を発現する細胞を殺傷する又はその増殖を阻害する方法であって、薬学的に有効量又は有効用量の（ｉ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体、又は抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片、請求項９に記載の二重特異性若しくは多重特異性抗体、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の免疫リガンド−薬物コンジュゲート、請求項２５若しくは２６に記載のＣＡＲ若しくは細胞、又は（ｉｉ）請求項３０に記載の医薬組成物を前記細胞に投与するステップを含む、方法。
【請求項３１】
前記ＲＯＲ１を発現する細胞が癌細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＯＲ１がヒトＲＯＲ１である、請求項３０〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重特異性及び多重特異性抗体を含む抗ＲＯＲ１抗体、ＲＯＲ１を標的とする免疫リガンド（Ｉｍｍｕｎｏｌｉｇａｎｄ）−毒素コンジュゲート、並びに抗ＲＯＲ１  ＣＡＲ及びＣＡＲ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
序論
いくつかの腫瘍性疾患では、有効な治療アプローチが存在しない。これは、とりわけ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及び骨髄悪性腫瘍、並びに結腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、及び膵臓癌を含む固形癌に当てはまる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、これらの疾患に対応する新規な治療アプローチを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
好ましい実施形態
本明細書で開示される実施形態は、互いに関係しないであろう個々の実施形態として理解されることを意味するものではないことを理解されたい。一実施形態で議論される特徴は、本明細書に示される他の実施形態に関連しても開示されることを意味する。ある事例では、特定の特徴が、一実施形態では開示されていないが、別の実施形態で開示されている場合は、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されるものではないことを必ずしも意味しないことを理解されよう。業者であれば、他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の主旨であるが、単に明瞭にするため、及び本明細書を管理可能な量に維持するために、これが行われていないことを理解されよう。
【０００５】
本発明の第１の実施形態によると、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）を標的とするヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体ベースの結合タンパク質、又は標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、又は標的結合能を保持した抗体誘導体若しくは断片が提供される。
【０００６】
第２の実施形態では、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）を標的とするヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体ベースの結合タンパク質、又は標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、又は標的結合能を保持した抗体誘導体若しくは断片に共有結合された機能的部分を有する前記第１の実施形態の免疫リガンド−薬物コンジュゲートも提供される。このコンジュゲートは、好ましくは、限定されるものではないが、国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレットに開示されているソルターゼ−酵素媒介コンジュゲーション技術（ＳＭＡＣ−技術）によって、好ましくは部位特異的に、好ましくは小分子量の細胞毒素がコンジュゲートされている抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であることが好ましい。
【０００７】
第３の実施形態では、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）に対するヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体ベースの結合タンパク質、又は標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、又は標的結合能を保持した抗体誘導体若しくは断片を含む、受容体を担持する哺乳動物細胞も提供される。このような哺乳動物細胞は、好ましくは、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）に対する前記ヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体ベースの結合タンパク質、又は標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、又は標的結合能を保持した抗体誘導体若しくは断片を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を好ましくは担持する免疫系のＴ細胞である。従って、さらに好ましい一実施形態では、これらの哺乳動物細胞は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）に対する前記ヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体ベースの結合タンパク質、又は標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、又は標的結合能を保持した抗体誘導体若しくは断片を含むＣＡＲ  Ｔ細胞である。
【０００８】
受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）は、細胞表面分子の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーのメンバーであり、胚及び胎児発生中に高度に発現され、ＲＯＲ−１ノックアウトマウスは新生児のうちに死亡するため、胚及び胎児の発生にとって重要である（Ｎｏｍｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２１，８３２９−３５）。分娩後のヒト組織では、ＲＯＲ１の発現はほとんど認められなかった。低発現は、脂肪組織で観察され、膵臓、肺、及び中間体Ｂ細胞のサブセットではわずかに認められた。しかしながら、重要なことに、ＲＯＲ１発現の上昇が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及び骨髄性悪性腫瘍のような血液悪性腫瘍を含むいくつかの癌、並びに神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、メラノーマ、結腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、及び膵臓癌を含む固形癌で見出されている。従って、ＲＯＲ１の発現パターンは、腫瘍胎児発現パターン（ｐａｔｔｅｒ）と呼ばれ、従って、特定の癌及び腫瘍の標的として高い医学的関心がある（Ｂｏｒｃｈｅｒｄｉｎｇ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ  ５，４９６−５０２；Ｈｏｊｊａｔ−Ｆａｒｓａｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２９，２１−３１）。
【０００９】
分娩後の組織におけるＲＯＲ１発現の本質的な欠如に一致して、非ヒト霊長類がＲＯＲ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞で処置された場合は毒性が観察されず、ヒトの癌治療におけるＲＯＲ１の特異的標的化が安全であることが示唆された（Ｂｅｒｇｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．３，２０６−１６）。これまでのところ、癌治療のために、臨床承認されたＲＯＲ１特異的抗体はない。
【００１０】
ヒト疾患の治療に適用可能にするためには、ＲＯＲ−１を標的とする抗体、及びＲＯＲ−１を標的とする免疫リガンド−毒素複合体は、最小の免疫原性を示すべきであり、従って、患者の免疫系によって系から除去される可能性が最小限になり、結果として血清半減期が延長され、結果的により高い効率がもたらされる。さらに、免疫原性の低下は、免疫原性反応のような望ましくない、そして時には生命を脅かす副作用さえも回避する。
【００１１】
従って、本発明は、最小限の免疫原性及び腫瘍性状態の処置での有効性をもたらすことが期待されるヒト及びヒト化抗ＲＯＲ−１抗体を提供する。
【００１２】
特定の一実施形態では、ヒト化抗ＲＯＲ−１抗体又は抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、標的結合能を保持した抗体誘導体又は断片が提供される。
【００１３】
「ヒト化抗体」という用語は、ＣＤＲ領域の実質的に全てが非ヒト由来であり、ＦＲ領域の実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域に対応するように、ヒト及び非ヒト（例えば、ウサギ）免疫グロブリンに由来する配列を含むキメラ抗体を指す。一実施形態では、抗体は、げっ歯類又はウサギ親抗体からヒト化されている、即ち、げっ歯類又はウサギ由来のＣＤＲ領域を含む。
【００１４】
ヒト化抗体は、Ｒ１１、Ｒ１２（両方ともウサギ）（国際公開第２０１２／０７５１５８Ａ１号パンフレット）及び２Ａ２（マウス）（国際公開第２０１０／１２４１８８Ａ１号パンフレット）と命名されたマウス及びウサギ由来の機能的に特徴付けられた抗ＲＯＲ１げっ歯類抗体に基づいて開発され、これらの抗体は全て、ＲＯＲ１分子の様々な細胞外ドメイン、即ち、Ｉｇ、ＲＯＲ１のｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン及びクリングルドメインに結合する（Ｙａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６，ｅ２１０１８；Ｂａｓｋａｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ｍＡｂｓ  ４，１−１３）。
【００１５】
これらの抗体は、ヒト抗体レパートリーからの大きな次世代配列決定データに対する配列アライメント、及びヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖配列に対する最大の類似性を有するヒトフレームワークの選択に基づいて、独自のアルゴリズムによってヒト化されている。親抗体クローンに対して所望の配列相同性を有する同定されたヒトフレームワーク領域のコレクションが選択され、高親和性げっ歯類ｍＡｂ  Ｒ１１、Ｒ１２、及び２Ａ２のＣＤＲと組み合わせられている。
【００１６】
記載されている転移媒介抗体提示（Ｔｒａｎｓｐｏ−ｍＡｂ）（Ｗａｌｄｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＭＡｂｓ  ８（４）：７２６−７４０、ＷＯ２０１４０１３０２６）を用いて、最大１８３の予想ヒト化抗体のコレクションを遺伝子合成し、個々のＩｇＧ重鎖及び軽鎖のライブラリーを安定に発現させ、そして哺乳動物細胞の表面上に提示した。ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の個々の組み合わせを、ＲＯＲ１標的結合効率に基づいて選択し、最良のクローンを配列回収のために分析した。ヒト化ＩｇＧ重鎖及び軽鎖のより大きなレパートリーのスクリーニングに基づいて、高親和性ヒト化ｍＡｂを、さらなる親和性成熟なしに同定することができる。
【００１７】
提供されるヒト化抗ＲＯＲ−１抗体は、場合によっては、これらが由来する親抗体と比較して、ＲＯＲ１に対する結合親和性の予想外の有意な改善を示す。抗体のヒト化は通常、面倒にも追加の親和性成熟によって補償する必要がある、親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）の減少又は喪失をもたらすため、これは予想外である（Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０６７８−８４）。
【００１８】
好ましい一実施形態では、抗体は、少なくとも３つのＣＤＲ配列を含む：
配列番号１  ＣＤＲ１  ＨＣ
配列番号２  ＣＤＲ２  ＨＣ
配列番号３  ＣＤＲ３  ＨＣ
又は
配列番号１５  ＣＤＲ１  ＨＣ
配列番号１６  ＣＤＲ２  ＨＣ
配列番号１７  ＣＤＲ３  ＨＣ
又は
配列番号２９  ＣＤＲ１  ＨＣ
配列番号３０  ＣＤＲ２  ＨＣ
配列番号３１  ＣＤＲ３  ＨＣ
【００１９】
別の好ましい実施形態では、抗体は、少なくとも３つのＣＤＲ配列を含む：
配列番号４  ＣＤＲ１  ＬＣ
配列番号５  ＣＤＲ２  ＬＣ
配列番号６  ＣＤＲ３  ＬＣ
又は
配列番号１８  ＣＤＲ１  ＬＣ
配列番号１９  ＣＤＲ２  ＬＣ
配列番号２０  ＣＤＲ３  ＬＣ
又は
配列番号３２  ＣＤＲ１  ＬＣ
配列番号３３  ＣＤＲ２  ＬＣ
配列番号３４  ＣＤＲ３  ＬＣ
【００２０】
両方の場合において、ＣＤＲ（「相補性決定領域」）の定義は、「全ての種の全てのＩＧ及びＴＲ  Ｖ−ＲＥＧＩＯＮに対するＩＭＧＴ固有の付番：構造及び進化に対する関心」に基づいていることを理解されたい。さらに、「ＣＤＲ  ＬＣ」は軽鎖ＣＤＲを意味し、「ＣＤＲ  ＨＣ」は重鎖ＣＤＲを意味する。
【００２１】
好ましい一実施形態では、抗体は、以下からなる群から選択される配列に対して９５％同一、好ましくは９６％又はさらには９７％同一、より好ましくは９８％又はさらには９９％同一、そして最も好ましくは１００％同一である少なくとも１つの重鎖又は軽鎖可変領域配列を含む：
配列番号９  ＶＲ  ＨＣ
配列番号１０  ＶＲ  ＬＣ
配列番号１１  ＶＲ  ＨＣ
配列番号１２  ＶＲ  ＬＣ
配列番号１３  ＶＲ  ＨＣ
配列番号１４  ＶＲ  ＬＣ
配列番号２３  ＶＲ  ＨＣ
配列番号２４  ＶＲ  ＬＣ
配列番号２５  ＶＲ  ＨＣ
配列番号２６  ＶＲ  ＬＣ
配列番号２７  ＶＲ  ＨＣ
配列番号２８  ＶＲ  ＬＣ
配列番号３７  ＶＲ  ＨＣ
配列番号３８  ＶＲ  ＬＣ
配列番号３９  ＶＲ  ＨＣ
配列番号４０  ＶＲ  ＬＣ
配列番号４１  ＶＲ  ＨＣ
配列番号４２  ＶＲ  ＬＣ
配列番号４３  ＶＲ  ＨＣ
配列番号４４  ＶＲ  ＬＣ
「ＶＲ  ＨＣ」は重鎖可変配列を意味し、「ＶＲ  ＬＣ」は軽鎖可変配列を意味する。
【００２２】
好ましい実施形態では、抗体は
・マウス抗ＲＯＲ抗体ｍＡｂ  ２Ａ２、
・ウサギ抗ＲＯＲ抗体ｍＡｂ  Ｒ１１、及び／若しくは
・ウサギ抗ＲＯＲ抗体ｍＡｂ  Ｒ１２からヒト化され、
かつ／又は、
・ｈｕ２Ａ２ｂ−Ｑ１１（ｍｓＱ１１−３とも呼ばれる）
・ｈｕ２Ａ２−Ｄ２３（ｍｓＤ２３−１９とも呼ばれる）
・好ましくは、限定されるものではないが、１１ｎＭよりも高い親和性を有するｈｕ２Ａ２−Ｄ１６（ｍｓＤ１６−７とも呼ばれる）
・ｒｂＱ１１（ｒｂＱ１１−３２とも呼ばれる）
・ｒｂＤ４（ｒｂＤ４−３２とも呼ばれる）
・好ましくは、限定されるものではないが、１５ｎＭよりも高い親和性を有するｒｂＱ１２（ｒｂＱ１２−４０とも呼ばれる）
・ｈｕＲ１２−４
・ｈｕＲ１２−７
・ｈｕＲ１２−１１、及び／若しくは
・ｈｕＲ１２−１６
及び／若しくは上記の抗体のいずれかと少なくとも９５％同一、好ましくは９６％若しくはさらに９７％同一、より好ましくは９８％若しくはさらには９９％同一、そして最も好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を共有する抗体からなる群から選択される。
【００２３】
一実施形態では、抗体は、ヒトＲＯＲ１に対して１．０ｎＭより高い親和性を有する。
【００２４】
他の一実施形態では、ウサギ抗ＲＯＲ抗体ｍＡｂ  Ｒ１２からヒト化された抗体は、その親抗体、即ち、ウサギモノクローナル抗体Ｒ１２よりも高い親和性を有する。
【００２５】
好ましい一実施形態では、抗体は、表１又は表２に示される特性の少なくとも１つを有する。
【００２６】
本発明のさらに別の実施形態によると、ヒト又はヒト化抗体、又は抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、標的結合能を保持した抗体誘導体又は断片が提供され、これらは、
（ｉ）上記の抗体のいずれかに従った抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体又は断片の結合親和性と少なくとも同じほど高い又は実質的に同じほど高い、ＲＯＲ１に対する結合親和性を有し、かつ／又は
（ｉｉ）ＲＯＲ１に対する結合について、上記の抗体のいずれかに従った抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体又は断片と競合する。
【００２７】
上記に従った抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体又は断片の一実施形態では、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）はヒトＲＯＲ１である。
【００２８】
本発明の別の実施形態によると、上述の請求のいずれかの抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体又は断片は、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。
【００２９】
「二重特異性抗体」及び「多重特異性抗体」という用語は、１つの抗原又は２つの異なる抗原上の２つ又はそれ以上の別個のエピトープに結合する能力を有する抗体を指し、そのうちの１つがＲＯＲ１である。本発明の二重特異性抗体は、生物学的方法、例えば、体細胞ハイブリダイゼーション；又は遺伝学的方法、例えば、生物における所望の抗体構造をコードする非天然ＤＮＡ配列の発現；化学的方法、例えば、２つの抗体の化学的コンジュゲーション；又はこれらの組み合わせによって作製することができる（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．Ｉｎ：Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ（ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−２８（２０１１））。
【００３０】
化学的にコンジュゲートした二重特異性抗体は、２つの既存の抗体又は抗体断片の化学的カップリングから生じる。典型的なカップリングには、２つの異なる完全長抗体の架橋、二重特異性Ｆ（ａｂ’）２を形成する２つの異なるＦａｂ’断片の架橋、及び二重特異性Ｆ（ａｂ’）３を形成するＦ（ａｂ’）２断片と異なるＦａｂ’断片との架橋が含まれる。化学的コンジュゲーションでは、酸化的再会合（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）戦略を用いることができる。現在の方法には、ホモ又はヘテロ二官能性架橋試薬（Ｉｄ．）の使用が含まれる。ヘテロ二官能性架橋試薬は、例えば、抗体分子上の２つの異なる反応基に対する反応性を有する。ヘテロ二官能性架橋試薬の例には、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＡＴＡ（スクシンイミジルアセチルチオアセテート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、ＰＥＡＳ（Ｎ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリチルアミド）、ＡＴＦＢ、ＳＥ（４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、スクシンイミジルエステル）、ベンゾフェノン−４−マレイミド、ベンゾフェノン−４−イソチオシアネート、４−ベンゾイル安息香酸、スクシンイミジルエステル、ヨードアセトアミドアジド、ヨードアセトアミドアルキン、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴマレイミドＤＩＢＯアルキン、アジド（ＰＥＯ）４プロピオン酸、スクシンイミジルエステル、アルキン、スクシンイミジルエステル、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴスクシンイミジルエステルＤＩＢＯアルキン、スルホ−ＳＢＥＤ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−２−（６−［ビオチンアミド］−２−（ｐ−アジドベンズアミド）−ヘキサノアミド）エチル−１，３’−ジチオプロプリオネート）、光反応性アミノ酸（例えば、Ｌ−フォト−ロイシン及びＬ−フォト−メチオニン）、ＮＨＳ−ハロアセチル架橋剤、例えば、スルホ−ＳＩＡＢ、ＳＩＡＢ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＮＨＳ−マレイミド架橋剤、例えば、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎシリーズ架橋剤、ＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＥＭＣＳ、ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、ＭＢＳ、スルホ−ＳＭＰＢ、ＳＭＰＢ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＳＭＰＨ、ＰＥＧ１２−ＳＰＤＰ、ＰＥＧ４−ＳＰＤＰ、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＤＣＣ（Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、スルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）、ＢＭＰＨ、ＥＭＣＨ、ＫＭＵＨ、ＭＰＢＨ、ＰＤＰＨ、及びＰＭＰＩが含まれる。
【００３１】
ホモ二官能性架橋試薬は、分子、例えば、抗体上の同じ反応基に対して反応性を有する。ホモ二官能性架橋試薬の例には、ＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、ｏ−ＰＤＭ（ｏ−フェニレンジマレイミド）、ＤＭＡ（アジピン酸ジメチル）、ＤＭＰ（ピメルイミド酸ジメチル）、ＤＭＳ（スベリイミド酸ジメチル）、ＤＴＢＰ（ジチオビスプロピオンイミデート）、ＢＳ（ＰＥＧ）５、ＢＳ（ＰＥＧ）９、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、スルホ−ＥＧＳ、ＴＳＡＴ、ＤＦＤＮＢ、ＢＭ（ＰＥＧ）ｎ架橋剤、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＤＴＭＥ、及びＴＭＥＡが含まれる。［００３０］体細胞ハイブリダイゼーションは、２つの異なるハイブリドーマ（特異的抗体及び骨髄腫細胞を産生するＢ細胞の融合物）細胞株の融合であり、２つの異なる抗体重鎖（ＶＨＡ及びＶＨＢ）及び軽鎖（ＶＬＡ及びＶＬＢ）を産生することができるクアドローマを産生する（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｒ．Ｅ．Ｉｎ：Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ（ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１−２８（２０１１））。これらの重鎖及び軽鎖は、細胞内でランダムに結合し、二重特異性抗体（ＶＬＡと組み合わせられたＶＨＡ及びＶＬＢと組み合わせられたＶＨＢ）、並びにいくつかの非官能性抗体（例えば、２つのＶＬＢと組み合わせられた２つのＶＨＡ）及び単一特異性抗体（２つのＶＬＡと組み合わせられた２つのＶＨＡ）となる。次いで、二重特異性抗体は、例えば、２つの異なる親和性クロマトグラフィーカラムを用いて精製することができる。単一特異性抗体と同様に、二重特異性抗体は、抗原結合の下流にＦｃ媒介効果を誘発するＦｃ領域も含み得る。これらの効果は、例えば、ペプシン消化によりＦｃ領域を二重特異性抗体からタンパク質分解的に切断することによって低下し、結果として二重特異性Ｆ（ａｂ’）２分子（Ｉｄ．）が生じ得る。
【００３２】
二重特異性抗体は、遺伝的手段、例えば、所望の抗体構造に対応するＤＮＡ配列を含むプラスミドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現によっても作製することができる。例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｒ．Ｅ．Ｉｎ：Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ（ｅｄ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１−２８（２０１１）を参照されたい。このような二重特異性抗体は、以下でより詳細に説明される。
【００３３】
本発明の二重特異性抗体は、２価、３価、又は４価であり得る。本明細書中で使用される場合、「価（ｖａｌｅｎｔ）」、「価数（ｖａｌｅｎｃｅ）」、「価数（ｖａｌｅｎｃｉｅｓ）」、又はその他の文法上の変形は、抗体分子中の抗原結合部位の数を意味する。
【００３４】
（ａ）上記に従った抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片、又は上記に従った二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体をコードする単離された核酸配列又はそのセット、
（ｂ）少なくとも１つのこのような核酸配列を含むベクター、
（ｃ）上記に従った抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片、又は上記に従った二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体を発現する単離された細胞、
（ｄ）及び／又は上記に従った核酸配列若しくはそのセット、又は上記に従ったベクターを含み、並びに
（ｅ）上記に従った抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体又は断片を作製する方法であって、上記に従った細胞を培養するステップ、及び抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体又は断片を精製するステップを含む、方法が、さらに提供される。
【００３５】
本発明の別の態様によると、一般式Ａ−（Ｌ）ｎ−（Ｔ）ｍを有する免疫リガンド−薬物コンジュゲートが提供され、式中、
・Ａは、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）を標的とする免疫リガンドであり、
・Ｌはリンカーであり、
・Ｔは毒素であり、
そして、ｎ及びｍは、１〜１０の整数である。
【００３６】
この構築物において、（Ｌ）ｎは、１つの毒素を１つの免疫リガンドにコンジュゲートする単位鎖（ｕｎｉｔａｒｙ  ｃｈａｉｎ）を形成するいくつかのリンカー、及び／又はいくつかの毒素を１つの免疫リガンドに連結するいくつかのリンカーを意味し得る。同様に、（Ｌ）ｎは、同じ免疫リガンドの２つのサブドメインを２つの毒素分子にコンジュゲートするいくつかのリンカーを意味し得る。
【００３７】
【表１】
2019502363.tif 000003
【００３８】
結果として得られる免疫リガンド−毒素−コンジュゲートは、１〜１０の毒素／免疫リガンド比を有するであろう。好ましくは、ｎ及びｍは、１〜４の整数である。従って、結果として得られる免疫リガンド−毒素−コンジュゲートは、１〜４の毒素／免疫リガンド比を有するであろう。
【００３９】
本明細書で使用される「免疫リガンド」という用語は、所与の標的、例えば、受容体、細胞表面タンパク質、又はサイトカインなどに親和性を有する実体、薬剤、又は分子を定義することを意味する。このような免疫リガンドは、任意選択よりアゴニスト媒介応答を遮断又は弱める、又は受容体−アゴニスト相互作用を阻害することができる。しかしながら、最も重要なことに、免疫リガンドは、前記免疫リガンドによって認識される標的によって規定される特定の部位にペイロードを送達するためのシャトルとしての役割を果たし得る。従って、受容体を標的とする免疫リガンドは、多数の前記受容体によって特徴付けられる部位にそのペイロードを送達する。
【００４０】
さらに好ましい実施形態では、免疫リガンドは、以下からなる群から選択される少なくとも１つである：
・抗体、
・抗体ベースの結合タンパク質、
・標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、
・標的結合能を保持した抗体誘導体若しくは断片、及び／又は
・二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体。
【００４１】
同義語として「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも呼ばれる「抗体」は、一般に、２つの重鎖（Ｈ）鎖及び２つの軽鎖（Ｌ）の４つのポリペプチド鎖を含み、従って、多量体タンパク質又はその等価Ｉｇホモログ（例えば、重鎖又は軽鎖のいずれかに由来し得る重鎖の単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）のみを含むラクダ抗体）であり；Ｉｇ分子の必須のエピトープ結合特徴を保持している、完全長の機能的突然変異体、変異体、又はこれらの誘導体（限定されるものではないが、マウス、キメラ、ヒト化及び完全ヒト抗体）を含み、かつ二重特異性（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、多重特異性、及び二重可変ドメイン免疫グロブリンを含み；免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌ、及びＩｇＡ２）及びアロタイプであり得る。
【００４２】
本明細書で使用される「抗体ベースの結合タンパク質」は、他の非免疫グロブリン、又は非抗体由来成分に関して少なくとも１つの抗体由来ＶH、ＶL、又はＣH免疫グロブリンドメインを含む任意のタンパク質を表すことができる。このような抗体ベースのタンパク質には、限定されるものではないが、（ｉ）免疫グロブリンＣHドメインの全部又は一部を有する受容体又は受容体成分を含む結合タンパク質のＦc−融合タンパク質、（ｉｉ）ＶH及び／又はＶLドメインが代替分子足場に結合されている結合タンパク質、又は（ｉｉｉ）免疫グロブリンＶH、及び／又はＶL、及び／又はＣHドメインが天然に存在する抗体又は抗体断片に通常は見られない様式で組み合わせられ、かつ／又は構築された分子が含まれる。
【００４３】
本明細書で使用される「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）は、小分子量の活性医薬成分（ＡＰＩ）に結合された抗体、又は抗体断片、又は抗体ベースの結合タンパク質に関し、この活性医薬成分には、限定されるものではないが、毒素（例えば、限定されるものではないが、チューブリン阻害剤、アクチン結合剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ＤＮＡ挿入剤、及び修飾／損傷薬を含む）、キナーゼ阻害剤、又は細胞の生存に及び／若しくは特定の生理学的細胞経路に必須の特定の細胞経路を阻害する任意のＡＰＩが含まれる。
【００４４】
本明細書中で使用される「抗体誘導体又は断片」は、完全長ではない抗体に由来する少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子に関し、これには、限定されるものではないが、（ｉ）可変軽鎖（ＶL）、可変重鎖（ＶH）、定常軽鎖（ＣL）、及び定常重鎖１（ＣHＩ）ドメインからなる１価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む２価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶH及びＣHＩドメインからなるＦab（Ｆａ）断片の重鎖部分；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶL及びＶHドメインからなる可変断片（Ｆv）断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むドメイン抗体（ｄＡｂ）断片；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）単鎖Ｆv断片（ｓｃＦv）；（ｖｉｉｉ）２価の二重特異性抗体であるダイアボディであって、ＶH及びＶLドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、これにより、ドメインが、別の鎖の相補性ドメインと強制的に対合され、２つの抗原結合部位が形成される、ダイアボディ；（ｉｘ）相補性軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦvセグメント（ＶH−ＣH１−ＶH−ＣH１）を含む線状抗体；（Ｘ）二重可変ドメイン免疫グロブリン、（ｘＩ）単独又は任意の組み合わせである、免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖の他の非完全長部分、又はその突然変異体、変異体、若しくは誘導体が含まれる。
【００４５】
本明細書中で使用される「改変抗体フォーマット」という用語には、抗体−薬物−コンジュゲート、ポリアルキレンオキシド修飾ｓｃＦｖ、モノボディ、ダイアボディ、ラクダ抗体、ドメイン抗体、二重特異性又は三重特異性抗体、ＩｇＡ、又はＪ鎖及び分泌成分によって連結された２つのＩｇＧ構造、サメ抗体、新世界霊長類フレームワーク＋非新世界霊長類ＣＤＲ、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体、ＣＨ３ドメインに工学的に改変された２つの追加結合部位を有するＩｇＧ、Ｆｃγ受容体に対する親和性を向上させる変更Ｆｃ領域を有する抗体、及びＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含む二量体構築物などが含まれる。本明細書で使用される「抗体模倣物」という用語は、免疫グロブリンファミリーに属さないタンパク質、及び非タンパク質、例えば、アプタマー、又は合成ポリマーも指す。一部のタイプは、抗体様βシート構造を有する。抗体に対する「抗体模倣物」又は「代替足場」の潜在的な利点は、より優れた溶解性、より高い組織浸透性、熱及び酵素に対するより高い安定性、及び比較的低い生産コストである。
【００４６】
別の好ましい実施形態は、上記開示に記載のＲＯＲ１への結合能を有する少なくとも１つの抗体又は抗体断片を含む免疫リガンドである。
【００４７】
本明細書中で使用される「免疫リガンド−薬物コンジュゲート」（ＩＤＣ）は、低分子量の活性医薬成分（ＡＰＩ）に結合された、本明細書で開示されるヒト化抗ＲＯＲ１抗体又は抗体ベースの結合タンパク質の結合部分を含む分子を指し、この活性医薬成分には、限定されるものではないが、毒素（例えば、限定されるものではないが、チューブリン阻害剤、アクチン結合剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ＤＮＡ挿入剤、及び修飾／損傷薬を含む）、キナーゼ阻害剤、又は細胞の生存に及び／若しくは特定の生理学的細胞経路に必須の特定の細胞経路を阻害する任意のＡＰＩが含まれる。
【００４８】
別の好ましい実施形態は、免疫リガンドと、好ましくは低分子量の活性医薬成分（ＡＰＩ）との間の共有結合リンカーを含む、上記開示された免疫リガンド−薬物コンジュゲートである。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、前記リンカーは、以下からなる群から選択される少なくとも１つである：
・ｐＨ、酸化還元電位、及び／又は特異的な細胞内酵素の変化によって切断され得る、切断可能なスペーサーを任意選択により含むオリゴペプチドリンカー、及び／又は
・ｐＨ、酸化還元電位、及び／又は特定の細胞内酵素の変化によって切断され得る、切断可能なスペーサーを任意選択により含むマレイミドリンカー。
【００５０】
好ましい一実施形態では、リンカーは：オリゴペプチドリンカー（切断可能及び切断不可能なオリゴペプチドリンカーを含む）、ヒドラジンリンカー、チオ尿素リンカー、自壊的リンカー（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ  ｌｉｎｋｅｒ）、スクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、マレイミドリンカー、ジスルフィドリンカー、チオエーテルリンカー、及び／又はマレイミドリンカーからなる群から選択される少なくとも１つを含む、又はこの少なくとも１つからなる。
【００５１】
当業者は、さらなるリンカーが適切であり得ることを理解している。このようなリンカーは、切断不可能であってもよいし、又はｐＨ、酸化還元電位、若しくは特異的な細胞内酵素若しくは腫瘍組織関連酵素の変化によって切断されてもよい。切断可能なオリゴペプチドリンカーには、プロテアーゼ又はマトリックスメタロプロテアーゼ切断可能リンカーが含まれる。リンカーは、上記の組み合わせを含み得ることを理解されたい。例えば、リンカーは、バリン−シトルリンＰＡＢリンカーであってもよい。
【００５２】
好ましい一実施形態では、リンカーは、限定されるものではないが、ＬＰＸＳＧn、ＬＰＸＡＧn、ＬＰＸＴＧｎ、ＬＡＸＴＧn、ＬＡＥＴＧn、ＬＰＸＴＡn、又はＮＰＱＴＧnから選択されるアミノ酸配列を含むソルターゼ酵素によって認識されるオリゴペプチドを含み、ｎは１〜２１の整数であり、Ｘは任意のアミノ酸である。
【００５３】
さらに別の好ましい実施形態では、リンカーは、配列ＬＰＸＴＧｎのオリゴペプチドを含み、ｎは１〜２０の整数であり、Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸である。
【００５４】
別の好ましい実施形態において、リンカーは、免疫リガンドの少なくとも１つのサブドメインのＣ末端にコンジュゲートされる。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、コンジュゲーションの前に、
・免疫リガンドは、少なくとも１つのサブドメインのＣ末端に融合又はコンジュゲートされたソルターゼ認識タグを有し、そして
・毒素は、１〜２０のグリシン残基長、好ましくは３〜５のアミノ酸長を有する短いグリシンストレッチ（ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む。
【００５６】
好ましくは、ソルターゼ認識タグは、
・黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼＡによって認識されるＬＰＸＴＧ又はＬＰＸＡＧ；
・黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼＡ又は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の工学的に改変されたソルターゼＡ  ４Ｓ−９によって認識されるＬＰＸＳＧ；
・ＬＡＸＴＧ、及び特に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の工学的に改変されたソルターゼＡ  ２Ａ−９によって認識されるＬＡＥＴＧ；
・化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼＡによって認識されるＬＰＸＴＡ；又は
・黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼＢによって認識されるＮＰＱＴＮ。
【００５７】
以下の表は、認識タグ及びリンカーの一部である該認識タグ由来のペプチド（ｎは、１〜２１の整数であり、Ｘは任意のアミノ酸である）を示す。
【００５８】
【表２】
2019502363.tif 000004
【００５９】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＡ  ２Ａ−９及びＡ  ４Ｓ−９を含む工学的に改変されたソルターゼは、Ｄｏｒｒ  ＢＭ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２０１４；１１１，１３３４３−８．，ａｎｄ  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２０１１；１０８（２８）；１１３９９−１１４０４に記載されている。
【００６０】
背景として、ソルターゼペプチド転移の一般的概念を例示するために、例えば、ソルターゼＡは、求核剤としてオリゴ−グリシン−ストレッチを使用してペプチド転移を触媒し、これにより、オリゴ−グリシンの末端アミノ基が、ソルターゼタグの最後の２つのＣ末端残基を結合するペプチド結合に対して求核攻撃を引き起こす。これにより、そのペプチド結合が破壊され、ソルターゼタグのＣ末端の最後から２番目の残基とオリゴ−グリシンペプチドのＮ末端グリシンとの間に新たなペプチド結合が形成される、即ち、ペプチド転移が生じる。
【００６１】
ソルターゼのコンジュゲーションの前に、ソルターゼタグは、そのＣ末端において、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、又はＳｔｒｅｐタグのような他のタグをさらに有していてもよい（参照によりその内容が本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１４／１４０３１７号パンフレットの図４ａを参照）。しかしながら、ソルターゼタグの４番目と５番目のアミノ酸間のペプチド結合は、ソルターゼＡ媒介コンジュゲーションにより切断されるため、これらの追加タグはコンジュゲート産物には現れない。
【００６２】
ソルターゼタグは、例えば、遺伝的融合によって結合タンパク質のＣ末端又はそのドメイン若しくはサブユニットに融合することができ、それらと共発現される。別の好ましい実施形態では、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖がＣ末端システイン残基である場合、及びヒト免疫グロブリンＩｇＧ１重鎖がヒトＦｃγ１  ｃＤＮＡによってコードされるＣ末端リジン残基であり得る場合は、ソルターゼタグを、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖の最後の天然に存在するＣ末端アミノ酸に直接付加することができる。しかしながら、別の好ましい実施形態でも、通常は抗体重鎖の末端リジン残基が、哺乳動物細胞における翻訳後修飾によって切断されるため、ソルターゼタグが、ヒトＦｃγ１  ｃＤＮＡによってコードされる最後から２番目のＣ末端グリシン残基に直接付加される。従って、９０％を超える事例において、天然に存在するヒトＩｇＧ１は、ＩｇＧ１重鎖のＣ末端リジン残基が欠損している。
【００６３】
従って、本発明の１つの好ましい実施形態では、ソルターゼ認識モチーフタグ付きＩｇγ１重鎖の発現構築物におけるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のＣ末端リジンアミノ酸残基が除外される。別の好ましい実施形態では、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のＣ末端リジンアミノ酸残基が、ソルターゼ認識モチーフタグ付きＩｇγ１重鎖の発現構築物に含められる。
【００６４】
別の好ましい実施形態では、ソルターゼタグは、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１重鎖のＣ末端に付加されてもよく、ヒトＦｃγ１  ｃＤＮＡによってコードされるＣ末端リジン残基が、リジン以外のアミノ酸残基によって置換されてソルターゼの非生産的反応が防止され、前記Ｃ末端リジン残基のε−アミノ基が重鎖間架橋を生じさせる。
【００６５】
本発明者らは、既に述べたように、場合によっては（例えば、Ｉｇκ軽鎖のＣ末端において、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  １０，ｅ１３１１７７を参照）、さらなるアミノ酸を結合タンパク質のＣ末端とソルターゼタグとの間に付加することが有益である。これは、結合タンパク質に対するペイロードのソルターゼ酵素コンジュゲーション効率を改善することを示している。Ｉｇκ軽鎖の場合には、Ｉｇκ軽鎖の最後のＣ末端システインアミノ酸とソルターゼペンタペプチドモチーフとの間に５個のアミノ酸を付加することにより、コンジュゲーションの反応速度が改善され、これにより、Ｉｇκ軽鎖及びＩｇ重鎖のＣ末端を、類似の反応速度でコンジュゲートすることができることが観察された（Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  １０，ｅ１３１１７７を参照）。従って、別の好ましい実施形態では、任意選択により、１〜１１個のアミノ酸が、結合タンパク質又は抗体サブユニットの最後のＣ末端アミノ酸とソルターゼタグとの間に付加される。
【００６６】
さらに、免疫リガンドは、ソルターゼタグのＣ末端に、例えば、限定されるものではないが、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、及び／又はＳｔｒｅｐ  ＩＩタグなどの他のタグを含み得る。さらなる詳細については、内容が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１４１４０３１７Ａ２号パンフレットを参照されたい。
【００６７】
別の好ましい実施形態では、毒素は以下からなる群から選択される少なくとも１つである：
・メイタンシノイド、
・アウリスタチン、
・アントラサイクリン、好ましくはＰＮＵ由来アントラサイクリン
・カリケアミシン、
・チューブリシン
・デュオカルマイシン
・ラジオアイソトープ
・有毒なペイロードを含むリポソーム、
・タンパク質毒素
・タキサン、及び／又は
・ピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）。
【００６８】
好ましいメイタンシノイド毒素の例が、図１及び図２に示されている。本明細書に開示されるアントラサイクリン誘導体は、「ＰＮＵ」とも呼ばれ、ＰＮＵ−１５９６８２の誘導体であり、この誘導体は、アントラサイクリンネモルビシンの代謝産物であり、Ｑｕｉｎｔｉｅｒｅｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５によって最初に開示された。ＰＮＵ−１５９６８２は、図５に示されている。好ましいアントラサイクリン誘導体は図３（ａ）に示されている。
【００６９】
アントラサイクリン誘導体を含む免疫リガンド薬物コンジュゲートは、内容が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１６１０２６９７号パンフレット及びその優先権を主張する出願書類に開示されている。
【００７０】
好ましくは、免疫リガンド−薬物コンジュゲートは、２つ以上の異なる毒素を含む。このようにして、免疫リガンド−薬物コンジュゲート中に含まれる単一の毒素に対する耐性をなくすことによって、細胞殺傷活性を増強することができる。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、免疫リガンド−薬物コンジュゲートは、図８又は図１２に示されているような細胞殺傷活性を有する。
【００７２】
別の実施形態では、免疫リガンド−薬物コンジュゲートは、（ｉ）１つ以上のソルターゼ認識タグを有する免疫リガンドと（ｉｉ）オリゴグリシンタグを有する１つ以上の毒素とのソルターゼ媒介コンジュゲーションによって形成される。
【００７３】
本発明の別の態様によると、上記の開示のいずれかによる免疫リガンド−薬物コンジュゲートを製造する方法が提供され、この方法は、以下のステップを含む：
（ａ）ソルターゼ認識タグを有する、上記のリストによる免疫リガンドを用意するステップ、
（ｂ）オリゴグリシンタグを有する１つ以上の毒素を用意するステップ、及び
（ｃ）ソルターゼ媒介コンジュゲーションによる免疫リガンドと毒素とをコンジュゲーションするステップ。
【００７４】
ソルターゼ又はスプリットインテインによって免疫リガンドをペイロードにコンジュゲートする方法は、内容が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレットに全詳細が開示されている。
【００７５】
さらに別の実施形態によると、以下を含むＲＯＲ１特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される：
（ａ）上記に従った少なくとも１つの抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、又は抗体の誘導体若しくは断片、又は
（ｂ）上記に従った二重特異性又は多重特異性抗体を含み、
この抗体は、少なくとも１つの膜貫通領域及び少なくとも１つの細胞内ドメインに融合又はコンジュゲートしている。
【００７６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、時には人工Ｔ細胞受容体とも呼ばれ、免疫エフェクター細胞に任意の特異性を移植する、工学的に改変された受容体である。典型的には、これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植するために使用され；それらのコード配列の導入が、レトロウイルスベクターによって容易にされる。受容体は異なる起源の部分から構成されているため、キメラと呼ばれる。
【００７７】
ＣＡＲは、癌の治療法として有望な候補であり、養子細胞導入と呼ばれる技術を使用する。Ｔ細胞は、患者から採取され、ＲＯＲ１での場合のように、癌特異的抗原に特異的に結合することによって患者の特定の癌に特異的なＣＡＲを発現するように改変される。癌細胞を認識して殺傷することができるＴ細胞が、患者に再導入される。
【００７８】
プロトタイプＣＡＲの構造は、様々な機能ドメインに適合し、これによりＴ細胞の特異性及び制御された活性化の選択を可能にするように設計されたモジュールである。本発明の文脈において、ＣＡＲは、ＲＯＲ１を標的とする抗体、抗体ベースの結合タンパク質、改変抗体フォーマット、抗体誘導体又は断片に由来する抗体様結合ドメインを含む。このような実体は、例えば、限定されるものではないが、少なくとも１つの膜貫通領域及び少なくとも１つの細胞内ドメインに融合又はコンジュゲートされた、単一ポリペプチド鎖におけるモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の両方の特異性及び結合残基を兼ね備えた一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。
【００７９】
好ましくは、前記膜貫通領域は、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインを含む。好ましくは、前記ＣＡＲは、膜貫通ドメインと抗体、抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、又は抗体誘導体との間に配置されたヒンジ領域をさらに含む。好ましくは、前記細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含む。より好ましくは、前記シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζ鎖のζ鎖を含む又はこのζ鎖に由来する。好ましくは、前記細胞内ドメインは、Ｔ細胞共刺激分子の１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【００８０】
Ｔ細胞共刺激分子の好ましい細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ−２８、ＯＸ４０、及び／又はＣＤ２７８／ＩＣＯＳからなる群から選択される。これらのドメインの２つ以上の組み合わせが特に好ましい。
【００８１】
本発明の別の実施形態によると、このようなキメラ抗原受容体を含む細胞が提供される。
【００８２】
前記細胞は、好ましくは、「ＣＡＲ  Ｔ細胞」とも呼ばれる工学的に改変されたＴ細胞である。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲを備える遺伝子工学的に改変されたＴ細胞であり、その細胞外認識単位が、抗体由来の認識ドメインからなり、その細胞内領域がリンパ球刺激部分（複数可）に由来する。このようなキメラ受容体をＴ細胞が備えることによって、工学的に改変された細胞は、非ＨＬＡ制限様式で、任意の所望の標的抗原に所定の特異性で再誘導される。ＣＡＲ構築物は、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター又は転移要素を用いて、所与の患者の末梢リンパ球からＴ細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入される。得られるＣＡＲ-遺伝子工学的Ｔ細胞を注入して患者に戻した後、これらは移動して、それらの標的部位に到達し、それらの標的細胞又は標的組織と相互作用すると、これらは活性化され、これらの所定のエフェクター機能を果たす。ＣＡＲアプローチの治療標的には、癌及びＨＩＶ感染細胞、又は自己免疫エフェクター細胞が含まれる。別法では、前記細胞は、好ましくは、工学的に改変されたナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。
【００８３】
本発明の別の態様は、上記に従った請求項のいずれかに記載の抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片、上記に従った二重特異性若しくは多重特異性抗体、上記に従った免疫リガンド−薬物コンジュゲート、又は上記に従ったＣＡＲ若しくは細胞を、患者の処置、即ち、
・腫瘍性疾患に罹患している、
・腫瘍性疾患の発症リスクがある、及び／又は
・腫瘍性疾患と診断されている患者の処置のために使用することである。
【００８４】
好ましい実施形態において、腫瘍性疾患は、以下からなる群から選択される少なくとも１つである：
・慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のようなリンパ腫及び白血病などの血液癌、並びに
・結腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、及び膵臓癌などの固形癌。
【００８５】
本発明のさらなる態様によると、医薬組成物が提供され、この医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される成分と共に、上記に従った抗体、若しくは抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片、上記に従った二重特異性若しくは多重特異性抗体、上記に従った免疫リガンド−薬物コンジュゲート、又は上記に従ったＣＡＲ若しくは細胞を含む。
【００８６】
本発明のさらなる態様によると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は患者でＲＯＲ１を発現する細胞を殺傷する又はその増殖を抑制する方法が提供され、この方法は、薬学的に有効量又は有効用量の（ｉ）上記に従った抗体、又は抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持した改変抗体フォーマット、抗体誘導体若しくは断片、上記に従った二重特異性若しくは多重特異性抗体、上記に従った免疫リガンド−薬物コンジュゲート、又は上記に従ったＣＡＲ若しくは細胞、又は（ｉｉ）上記に従った医薬組成物を細胞に投与するステップを含む。
【００８７】
好ましくは、ＲＯＲ１を発現する細胞は、好ましくは、血液癌、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のようなリンパ腫及び白血病、又は固形癌、例えば、結腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、及び膵臓癌の癌細胞である。
【００８８】
さらに好ましくは、ＲＯＲ１はヒトＲＯＲ１である。
【００８９】
実験及び図面
本発明は、図面及び前述の説明において詳細に例示し、説明されたが、このような例示及び説明は、実例的又は例示的であって制限的ではないとみなされるべきであり；本発明は、開示される実施形態に限定されるものではない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」は複数形を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。
【００９０】
本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に示され；本明細書に開示される全ての核酸配列は５’→３’に示される。
【００９１】
実験結果
Ｔｒａｎｓｐｏ−ｍＡｂディスプレイスクリーニングによるヒト化抗ＲＯＲ１抗体の作製及び選択
癌細胞表面マーカーＲＯＲ１に特異的なマウス２Ａ２（Ｂａｓｋａｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ｍＡｂｓ  ４，１−１３）及び２つのウサギモノクローナル抗体（Ｒ１２及びＲ１１（Ｙａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６、ｅ２１０１８））をヒト化するために、本発明者らは、ヒトＩｇＧ抗体のヒト可変領域配列の次世代配列決定データを含む独自のデータベースに対して独自のアルゴリズムによる親抗体配列を最初に整列させることによって前記抗体の可変領域をヒト化することを決定した。独自のアルゴリズムに基づいて、最良のマッチが確認され、親ｍＡｂのＣＤＲが、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、選択されたヒトＶH及びＶLフレームワークに接ぎ合わされた。これにより、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測では、ｍＡｂ  ２Ａ２のＶHに対する６４のヒト化ＶH配列、及びｍＡｂ  ２Ａ２のＶLに対する４９のヒト化ＶL配列となる。Ｒ１１の場合は、ＶHの１０１のヒト化変異体及びＶLの８２のヒト化変異体が、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで作製されている。最後に、Ｒ１２の場合は、２５のヒト化ＶH及び２５のヒト化ＶL配列が予測された。本明細書に記載されるように、転移ＩｇＧ重鎖及び軽鎖発現ベクターのライブラリーがクローニングされている。ベクターライブラリーは、個々の細胞がヒト化ＲＯＲ１  ＩｇＧ重鎖及び軽鎖の単一の組み合わせを発現する転移によって細胞ライブラリーを作製するために、本明細書に記載されるようにＬ１ｌ宿主細胞に安定に転移されている。ＦＡＣＳによる細胞のＲＯＲ１組換え抗原への結合に基づいて（図９（ａ））、個々の結合剤を単一細胞ＦＡＣＳソーティングにより選択し、個々のクローンからの上清を高親和性結合剤についてＳＰＲによってスクリーニングした（図９（ｂ））。単一濃度測定を用いて、６０個（２Ａ２）及び３０個（Ｒ１ｌ）の細胞クローン上清のＲＯＲ１親和性を決定した。続いて、本発明者らは、本明細書に記載されているように、最も高い親和性を示した各ヒト化について、５つのクローンから配列を回収することを選択した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への一過性トランスフェクションによる個々のＨＣ／ＬＣ対の配列の回収及び評価、並びにＥＬＩＳＡによる抗原結合についての上清の分析の後に、本発明者らは、最良の結合を示した３つのｍＡｂをより大量に発現及び精製することを選択した（データは不図示）。
【００９２】
Ｒ１２クローンのヒト化のために、本発明者らは、最も有望なクローンについてＬ１１細胞クローン上清をＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることを選択した。抗原結合の強度に従ってクローンを評価するために、本発明者らは、それらの個々の抗原結合：ＩｇＧ−力価比を決定した（図１０）。続いて、本発明者らは、最も高い抗原結合：ＩｇＧ−力価比を示した、即ち、ＩｇＧ−力価に正規化された最も高い結合を示した１６個の細胞クローンから配列を回収することを選択した。各抗体発現構築物のＨＥＫ２９３Ｔ細胞への一過性トランスフェクションによる個々のＨＣ／ＬＣ対の配列の回復及び検証、並びにＥＬＩＳＡによる抗原結合：ＩｇＧ−力価比についての上清の分析の後に、本発明者らは、参照として親ｍＡｂ  Ｒ１２をコードする発現構築物で並列に一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の上清を含む、一過性トランスフェクションから得られたＨＥＫ２９３Ｔ上清を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＥＬＩＳＡで最も高い抗原結合：ＩｇＧ−力価比を示した８つのｍＡｂの親和性の測定に進んだ。この分析は、単離されたヒト化抗ＲＯＲ１  ｍＡｂの親和性が、親ｍＡｂの親和性よりも著しく優れていることを実証した（表２）。この観察を確認するために、３つのヒト化Ｒ１２  ｍＡｂをＨＥＫ２９３Ｔ細胞で大量に発現させ、精製し、そしてＳＰＲによる親和性の決定をこれらの精製ｍＡｂで繰り返した（図１３）。
【００９３】
この分析により、ヒト化ｍＡｂ  Ｒ１２の親ｍＡｂ  Ｒ１２に対する１価の親和性の５倍を超える実質的な増加が確認された。
【００９４】
従って、一番上のヒト化抗ＲＯＲ１ヒト化ｍＡｂのマルチサイクル表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、選択されたヒト化抗ＲＯＲ１  ｍＡｂの親和性が、２Ａ２及びＲ１１の場合にはそれぞれの親ｍＡｂの同じ範囲にある（図９（ｃ）及び表１）、又はＲ１２の場合にはさらに有意に高いアフィンであること（表２及び図１３（ａ）及び（ｂ））が実証された。
【００９５】
この知見は、抗体のヒト化が規則的に結合親和性の有意な低下又は完全な消失をもたらし、その後の親和性成熟によって再び獲得されなければならないため非常に意外である。
【００９６】
ヒト化の程度の分析
これらのクローン間のヒト化の程度の分析も行った。この分析を行うために、本発明者らは、ヒト化ｍＡｂの全可変領域配列に最も密接に関連したヒト生殖系列配列のフレームワーク領域に対する各鎖のフレームワーク領域のパーセント類似性を決定した（図１１）。全体として、ライブラリー及び単離されたｍＡｂの平均ヒト化度を、臨床的に承認されたヒト化抗体と十分に比較した（図１１）。
【００９７】
ヒト化ＲＯＲ１  ｍＡｂを用いたＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺傷活性の評価
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）としての単離されたヒト化抗体クローンの力価を評価するために、抗体を発現させ、そしてＳＭＡＣ技術（商標）を利用するアントラサイクリン由来毒素（図６）のコンジュゲーションを可能にするＬＰＥＴＧタグ化バージョンとして精製した。図６に示される細胞増殖抑制剤（ＰＮＵ−ＥＤＡ−Ｇｌｙ5）にコンジュゲートした２Ａ２ベースの抗ＲＯＲ１抗体は、ＲＯＲ１陽性６９７  ＡＬＬ細胞株の細胞生存率に強力に影響を与えたが、ＡＤＣの非コンジュゲート抗体との冷競合（ｃｏｌｄ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）が細胞傷害性を有意に低下させ、細胞傷害性が実際に標的媒介性であったことを示している（図８（ｂ））。ヒト化バージョンベースのＡＤＣは、非常に類似した細胞殺傷効率並びに標的特異性を示した。同様に、親及びヒト化Ｒ１２抗体ベースのＡＤＣは、ＲＯＲ１陽性ヒト６９７  ＡＬＬ癌細胞（図１２（ｂ））並びにヒトＲＯＲ１を過剰発現するマウス癌細胞（ＥＭＴ６−ＲＯＲ１）を特異的かつ強力に殺傷することができたが、ヒトＲＯＲ１を発現しない親細胞株（ＥＭＴ６）は殺傷しなかった（図１２（ｃ））。
【００９８】
ＡＤＣ及びそのｉｎ  ｖｉｖｏ効果
ＳＭＡＣ−コンジュゲートｈｕ２Ａ２ｂ−Ｑ１１ベースのＡＤＣで処置したマウスは、アイソタイプ対照ＡＤＣで処置したマウスと比較して、生存期間の延長を示した（図８（ｃ））。特に、ｈｕ２Ａ２ｂ−Ｑ１１ベースのＡＤＣで処置したマウスの中央生存期間は２８．３日であったが、アイソタイプ対照群では２３．５日であった。群間で有意な体重減少の差異は観察されなかった（データは不図示）。
【実施例】
【００９９】
以下のセクションは、本明細書に開示される抗ＲＯＲ１抗体がどのように作製されたかの実験の詳細を説明する。
【０１００】
ＥＢＮＡベースのキメラ抗体発現構築物の作製
親抗ＲＯＲ１マウスｍＡｂ  ２Ａ２（Ｂａｓｋａｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ｍＡｂｓ  ４，１−１３）、ウサギｍＡｂ  Ｒ１２、及びウサギｍＡｂ  Ｒ１１（Ｙａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６，ｅ２１０１８）を、ヒト定常領域を有するキメラ完全長ＩｇＧ１抗体として以下のように作製した。リーダー配列としてＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣを用いる全遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）によって、隣接制限部位５’ＮｏｔＩ／３’−ＮｈｅＩ（ＶH）及びＮｏｔＩ／ＢｓｉＷＩ（Ｖｋａｐｐａ）又はＮｏｔＩ／ＫａｓＩ（Ｖｌａｍｂｄａ）を含む可変領域コード配列を作製した。付加されたＣ末端タグ（ＩｇＨ鎖タグ：ＬＰＥＴＧ−Ｇ−ＷＳＨＰＱＦＥＫ；ＩｇＬ鎖タグ：ＧＧＧＧＳ−ＬＰＥＴＧ−Ｇ−ＷＳＨＰＱＦＥＫ）を有する可溶性抗体発現のためのヒトＩｇＨ−γ１及びＩｇＬ−κ（２Ａ２及びＲ１１）又はヒトＩｇＨ−λ（Ｒ１２）定常領域配列を、隣接制限部位５’ＮｈｅＩ／３’ＢｓｔＢＩ（ＩｇＨ−γ１）及び５’ＢｓｉｗＩ／３’ＢｓｔＢＩ（ＩｇＬ−κ）又は５’ＫａｓＩ／３’ＢｓｔＢＩ（ＩｇＬ−λ）を含む全遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）によって作製した。抗体可変及び定常領域断片を、それらの隣接制限部位に従って個別に二重消化し、そしてこれらを、ＮｏｔＩ／ＢｓｔＢＩ制限酵素での二重消化によって予め線状化した発現ベクターｐＣＢ１４ｂ（図１４）でのライゲーションによって構築した。ｐＣＢ１４ｂは、ＥＢＶ複製起点を有し、かつ染色体外複製を可能にするＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ−１）をコードするエピソーム哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体であり、元のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子の代わりにピューロマイシン選択マーカーを含む。図１５は、重鎖（２Ａ２及びＲ１２、それぞれ図１５（ａ）及び（ｃ））、κ軽鎖（２Ａ２、図１５（ｂ））、及びλ軽鎖（Ｒ１２、図１５（ｄ））の発現のための、得られたｐＣＢ１４ｂベースの発現構築物のプラスミドマップを示している。Ｒ１１構築物（κ軽鎖）は、２Ａ２構築物に類似しているが、Ｒ１１可変領域を有する。
【０１０１】
抗原の発現及び精製
ＳｔｒｅｐＩＩタグ付きＲＯＲ１細胞外ドメインを次のように作製した：ヒトＲＯＲ１（ＮＰ＿００５００３）の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列をシグナル配列（ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣ）にＮ末端融合させ、ｓｔｒｅｐＩＩ−タグ（ＧＷＳＨＰＱＦＥＫ）をコードする配列にＣ末端融合させた（図１６）。隣接５’ＮｏｔＩ及び３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する全ヌクレオチド配列を全遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＵＳＡ）によって作製し、Ｅｖｉｔｒｉａ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によるＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素での二重消化によって線状化された独自の哺乳動物発現ベクターｐＥｖｉ５に構築し、そしてＤＮＡ配列決定によって検証した。タンパク質の発現は、Ｅｖｉｔｒｉａ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）による懸濁適合ＣＨＯ  Ｋ１細胞で行った。トランスフェクトＣＨＯ  Ｋ１細胞のプールからの上清を遠心分離により回収し、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎカラム（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＦＰＬＣベースの親和性精製の前に滅菌濾過した（０．２μｍ）。
【０１０２】
ＩｇＧのＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン発現のためのベクターの構築
プラスミド骨格及び抗体配列を作製するためのすべてのＤＮＡ合成は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）によって行った。（Ｙｕｓａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８，１５３１−１５３６）に従った高活性ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ（ｈｙＰＢ）のアミノ酸配列を、マウス発現のためにコドン最適化し、隣接制限部位で合成し、一過性発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした（図１７）。転移抗体発現構築物（ｐＰＢ）を作製するための骨格は、配列が検証された市販のベクターから合成又は誘導された隣接制限部位を有するモジュラー部分から構築され、国際公開第２０１４０１３０２６Ａ１号パンフレットに詳細に記載されている。
【０１０３】
抗体ＯＲＦを、２方向又は３方向クローニング（ｔｗｏ−  ｏｒ  ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｃｌｏｎｉｎｇ）によって次のように転移ベクター骨格に構築した：リーダー配列ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣとともに抗体可変領域を、５’ＮｏｔＩ／３’  ＮｈｅＩ（ＩｇＨＶ）及び５’ＮｏｔＩ／３’ＢｓｉＷＩ（ＩｇｋａｐｐａＶ）又は５’ＮｏｔＩ／３’ＫａｓＩ（ＩｇｌａｍｂｄａＶ）制限部位を用いて導入し、５’ＮｈｅＩ／３’ＢｓｔＢＩ（ＩｇＨＣ−γ１）又は５’ＢｓｉＷＩ／３’ＢｓｔＢＩ（ＩｇＫＣ）又は５’ＫａｓＩ／３’ＢｓｔＢＩ（ＩｇＬＣ）制限部位を用いて定常領域断片にインフレームで結合した。
【０１０４】
ヒト化ＲＯＲ−１  ＩｇＧ重鎖及び軽鎖のための発現ライブラリーの構築
ウサギ抗ＲＯＲ１抗体Ｒ１１及びＲ１２（Ｙａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６，ｅ２１０１８）及びマウス抗ＲＯＲ１抗体２Ａ２（Ｂａｓｋａｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ｍＡｂｓ  ４，１−１３）のヒト化フレームワーク領域を、健康なドナーからの次世代配列決定（ＮＧＳ）によって得られた数百万のヒトＶH及びＶL配列と整列させ、そして独自のアルゴリズムによって、げっ歯類親ｍＡｂと比較して最も相同なヒトフレームワークを選択した。選択されたフレームワークは、げっ歯類抗ＲＯＲ１  ｍＡｂ  Ｒ１１、Ｒ１２、及び２Ａ２の親ｍＡｂのＣＤＲを用いたｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの独自のアルゴリズムによって構築した。
【０１０５】
選択されたヒト可変領域は、リーダー配列ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣと共に、Ｇｅｎ９、Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳＡ）によって合成された。
【０１０６】
２Ａ２のヒト化のために６４  ＶＨ×４９  ＶＬ変異体を合成し、Ｒ１１のヒト化のために、１０１  ＶＨ×８２  ＶＬ変異体を合成し、Ｒ１２のヒト化のために合計で２５  ＶＨ×２５  ＶＬを合成した。
【０１０７】
合成されたＶHｓ及びＶLｓのアリコートを等モル量にプールし、ＶH及びＶL配列ライブラリーの後の方向性クローニングのためのＮｏｔＩ制限酵素認識部位を含むフォワードプライマーｕｎｉｖ−ＮｏｔＩ−ＳＰ−Ｆ（ＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＧ）、及び後のＶH配列ライブラリーの方向性クローニングのためのＮｈｅＩ制限酵素認識部位を含むリバースプライマーｈｕＣＧ１−Ｂ（ＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧ）を用いたＰＣＲによって増幅した。
【０１０８】
Ｖκ配列ライブラリーの後の方向性クローニングのためのＢｓｉＷＩ制限酵素認識部位を含むリバースプライマーｈｕＣＫ−Ｂ（ＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣ）を、ＶK配列ライブラリーの増幅用として使用した。
【０１０９】
Ｖλ配列ライブラリーの後の方向性クローニングのためのＫａｓＩ制限酵素認識部位を含むリバースプライマーｈｕＣＬ−Ｂ（ＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＣＴＴＧＧ）を、Ｖλ配列ライブラリーの増幅用として使用した。
【０１１０】
ＰＣＲ増幅したライブラリー断片をカラム精製し、ＮｏｔＩ／ＮｈｅＩ（ＩｇＨＶ）又はＮｏｔＩ／ＢｓｉＷＩ（ＩｇｋａｐｐａＶ）又はＮｏｔＩ／ＫａｓＩ（ＩｇｌａｍｂｄａＶ）を用いて消化し、そして２方向（ＨＣ構築物）又は３方向クローニング（ＬＣ構築物）によって上記の転移ベクターにクローニングした。ＨＣ構築物のベクター断片を、ＮｏｔＩ／ＮｈｅＩを用いたｐＰＢ−Ｈｙｇｒｏ−ＨＣｇ１−ｇｅｎ（図１８（ａ））の消化によって調製した。ＬＣ構築物のベクター断片を、ＮｏｔＩ／ＢｓｔＢＩ制限酵素を用いたｐＰＢ−Ｐｕｒｏ−ＬＣ（図１８（ｂ））の消化によって調製した。隣接制限部位５’ＢｓｉＷＩ／３’−ＢｓｔＢＩ（Ｃｋａｐｐａ）及び５’ＫａｓＩ／３’−ＢｓｔＢＩ（Ｃｌａｍｂｄａ）を含む定常領域配列を、全遺伝子合成及びｐＵＣ７５（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）へのクローニングによって作製した。ライブラリーの構築のための定常領域断片を、ＢｓｉＷＩ／ＢｓｔＢＩ（κ定常領域断片を作製するため）又はＫａｓＩ／ＢｓｔＢＩ（λ定常領域断片を作製するため）を用いたκ又はλ定常領域を含むそれぞれのプラスミドのＤＮＡマキシプレップの消化によって作製した。ライブラリーのライゲーションをＮｅｂ５−αエレクトロコンピテント細胞（Ｎｅｂ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＳＡ）に形質転換し、１時間前培養し、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む選択的ＬＢ培地で一晩増幅し、そしてプラスミドＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍａｘｉ  Ｐｌｕｓキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｅｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離した。ライブラリーサイズを、前培養物の連続希釈を選択的寒天プレート（滴定プレート）にプレーティングすることによって決定し、得られたクローン数を計算してライブラリーの複雑性を推定した。滴定プレートからの少なくとも１２のクローンを、制限消化及びプライマーｐＰＢｓｅｑ１３（ＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧ）を用いた可変領域の配列決定によって分析した。
【０１１１】
最良のヒト化ＲＯＲ１  ｍＡｂの発現、提示、及び同定
ヒト化抗体ライブラリーの提示のために、ＲＡＧ−２欠損マウスから単離されたＡｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）形質転換プレＢ細胞株６３−１２の社内で作製されたサブクローンを表すＬ１１マウスプレＢ細胞を使用した（Ｓｈｉｎｋａｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６８（５），８５５−８６７）。これらの細胞を、３７℃、７．５％ＣＯ2のスクリューキャップボトル（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内の、２％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ  ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（Ａｍｉｍｅｄ，ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ  Ｌｔｄ．，Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及び５０μＭ  ｂ−メルカプトエタノール（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，ＵＳＡ）を添加したＳＦ−ＩＭＤＭ培地で培養した。
【０１１２】
Ａ．Ｚｉｐｐｅｌｉｕｓ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂａｓｅｌ）の親切な贈り物であるＥＭＴ６細胞、及び２９３Ｔ細胞の両方を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ  ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍｌ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ａｍｉｍｅｄ）が添加されたＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ2下で増殖させた。６９７細胞を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ  ペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍｌ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ａｍｉｍｅｄ）が添加されたＲＰＭＩ中、３７℃、７．５％ＣＯ2下で増殖させた。
【０１１３】
ヒト化抗ＲＯＲ１  ＩｇＧライブラリーを発現するＬｌｌ細胞の転移及び選択：
エレクトロポレーションの１日前に、Ｌ１１細胞を０．２Ｅ＋６細胞／ｍｌの密度で播種して、翌日に対数増殖期の細胞を得た。エレクトロポレーションの全手順を室温で行った。細胞を１２００ｒｐｍで６分間遠心分離して回収し、プレーンＲＰＭＩ培地に８Ｅ＋７細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。キュベットごとに、２５μｇの全ＤＮＡを４００μｌ  ＲＰＭＩ（図Ｓ２Ｂに示されているＨＣ／ＬＣ／トランスポザーゼ重量比を使用）で希釈し、４００μｌの細胞懸濁液を希釈ＤＮＡと合わせ、０．４ｃｍギャップ遺伝子パルサーキュベット（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）に移した。エレクトロポレーションは、３００Ｖ及び９５０μＦに設定された容量エクステンダーを備えたＢｉｏＲａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  ＩＩで行った。孔が閉じるようにするためにキュベットで５〜１０分間インキュベートした後、細胞を完全ＳＦ−ＩＭＤＭ増殖培地で１回洗浄し、再懸濁させ、総容量６４ｍｌの完全増殖培地でＴ１７５組織培養フラスコに播種した。選択のために、１μｇ／ｍｌ  ピューロマイシン及び８００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（それぞれ０２４０．４及びＣＰ１２．２；Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を同時に添加し、選択が完了するまで、培地を交換しないで選択を４〜５日間続けた、又は継代培養した。
【０１１４】
細胞ライブラリーのＦＡＣＳ染色及びＦＡＣＳ選別
細胞を１Ｅ＋７細胞／ｍｌの濃度でＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳを添加したＰＢＳ）中で氷上で染色した。洗浄ステップは、１３００ｒｐｍでの３分間の遠心分離により細胞をペレット化し、５倍量の染色反応を用いてＦＡＣＳ−緩衝液に再懸濁し、再びペレット化し、そして１倍量の染色反応を用いてＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁して行った。
【０１１５】
表面抗体の発現の分析のために、細胞を、１：２００希釈Ｉｇ−κＬＣ−ＡＰＣ標識抗体（ＭＨ１０５１５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を用いて３０分間染色した。細胞を１回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡ）でフローサイトメトリーにより分析した。
【０１１６】
ＩｇＧライブラリーを発現する細胞ライブラリーの染色のために、予め決定された限界濃度の抗原（０．２５μｇ／ｍｌ  ＲＯＲ１−ｓｔｒｅｐ）及び１：２５０希釈抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ特異的）ＰＥ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２−４９９８−８２）を添加し、細胞を氷上、暗所で３０分間インキュベートした。細胞を１回洗浄した後、１：５００希釈のＳｔｒｅｐ−ｍＡｂクラシックオイスター６４５（２−１５５５−０５０  ｉｂａ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、細胞に結合したｓｔｒｅｐタグ抗原を３０分間検出した。最終洗浄後、細胞を、細胞ストレーナキャップＦＡＣＳチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を用いて濾過した。選別を、ＦＡＣＳＡｒｉａｌｌ装置（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡ）で行った。
【０１１７】
ＥＬＩＳＡによる抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ発現Ｌｌｌクローンのスクリーニング
ＥＬＩＳＡによる抗原結合分析を、コーティング緩衝液（１００ｍＭ  重炭酸塩／炭酸塩緩衝液）に希釈した抗原でＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）を４℃で一晩コーティングすることによって行った。サンドイッチＥＬＩＳＡのために、プレートを、コーティング緩衝液に希釈した２μｇ／ｍｌ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＵＳＡ）で、４℃で一晩コーティングした。コーティング後、プレートを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むＰＢＳ−Ｔで、３７℃で１時間ブロックし、そしてＰＢＳ／Ｔでさらに５回洗浄した。Ｌ１１クローン上清を３倍に予め希釈し、２９３Ｔ細胞からの上清を５０倍に予め希釈した。０．５μｇ／ｍｌに希釈した親ｍＡｂを使用して標準曲線を作成した。サンプルの３．５倍連続希釈を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔで５回洗浄した後、ＨＲＰＯコンジュゲートＦ（ａｂ）２抗ヒトＦＣ−γ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＵＳＡ）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ／Ｔに１０，０００倍の希釈で添加し、そしてプレートを３７℃で１時間インキュベートした。最後に、プレートをＰＢＳ／Ｔで５回洗浄し、５０μｌのＳｉｇｍａｆａｓｔ  ＯＰＤペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を添加した。５０μｌの２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を加えることによって反応を停止させた。吸光度を４９０ｎｍで測定した。既知の濃度を有する標準のＯＤ５０値及び４点曲線適合モデルによって決定されたサンプルを使用してＥＣ５０を計算した。
【０１１８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性の分析
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて親和性を決定し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｔ２００  Ｖ２．０ソフトウェアを用いてデータを評価した。ｍＡｂを捕捉するために、ヤギα−ヒトＦｃ−γ特異的ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９−００５−０９８）を、ＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃ＢＲ−１００５−３０）に共有結合で固定した。
【０１１９】
Ｌ１１クローンの上清の測定のために、抗体を完全ＳＦ−ＩＭＤＭ細胞培養培地で０．３ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして１０μｌ／分の流量で１２０秒間捕捉した。ＲＯＲ１−ｓｔｒｅｐをランニング緩衝液で４０ｎＭに希釈した。会合を、３０μｌ／分の流速で１２０秒間測定し、そして解離を２００秒間続けた。曲線を、後の時点での上部プラトー形成のため、３０秒の解離を用いてフィッティングした。捕捉レベルは、２９．１ＲＵ〜５７．７ＲＵであった。
【０１２０】
選択された２Ａ２ベース及びＲ１１ベースのヒト化クローンの抗ＲＯＲ１親和性の決定及び親ｍＡｂとの比較のために、精製されたｍＡｂをランニング緩衝液で０．３μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌ／分の流量で１２０秒間捕捉した。ＲＯＲ１−ｓｔｒｅｐを、２０ｎＭ〜２．５ｎＭの範囲の２倍連続希釈を用いてランニング緩衝液で希釈した。会合を、３０μｌ／分の流速で１２０秒間測定し、そして解離を２００秒間続けた。曲線を、後の時点での上部プラトー形成のため、３０秒の解離を用いてフィッティングした。捕捉レベルは、２９．１ＲＵ〜５７．７ＲＵであった。
【０１２１】
一過性ＨＥＫ２９３Ｔ上清を用いてｈｕＲ１２クローン親和性及び親Ｒ１２を最初に決定するために、ＩｇＧ発現ベクターを２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトし、上清中のＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡによって定量した。ＳＰＲについては、上清を、ランニング緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ＋ｐＨ７．４（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０））で１μｇ／ｍｌ  ＩｇＧに希釈し、３０μｌ／分の流量で２００秒間捕捉した。ＲＯＲ１−ｓｔｒｅｐを、２０ｎＭ〜２．５ｎＭの範囲の２倍連続希釈を用いてランニング緩衝液で希釈した。会合を、３０μｌ／分の流量で１２０秒間測定し、そして解離を１０００秒間続けた。捕捉レベルは、２６．９ＲＵ〜５４．１ＲＵであった。
【０１２２】
精製されたＩｇＧを用いてｈｕＲ１２クローン親和性及び親Ｒ１２を決定するために、ｍＡｂを、ランニング緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ＋ｐＨ７．４（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０））を用いて２μｇ／ｍｌ  ＩｇＧに希釈し、３０μｌ／分の流量で２００秒間捕捉した。ＲＯＲ１−ｓｔｒｅｐを、１．２５ｎＭ〜２０ｎＭの範囲の２倍連続希釈を用いてランニング緩衝液で希釈した。会合を、３０μｌ／分の流量で１２０秒間測定し、そして解離を１０００秒間続けた。捕捉レベルは、２６．９ＲＵ〜５４．１ＲＵであった。
【０１２３】
全ての測定は２５℃で行った。全ての曲線を、ＲＩ＝０の１：１結合モデルを用いてフィッティングした。３０μｌ／分の流速で１００ｍＭのＨ3ＰＯ4を用いて９０秒間の再生を行った。
【０１２４】
強力なＲＯＲ１結合特異性を示すＬｌｌクローンからのＶＨ及びＶＬ配列の回収及び同定
製造業者の指示に従って、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を用いて２４ウェルプレートで増殖させた約２Ｅ＋６細胞からＲＮＡを抽出し、ランダムノナマー（ｒａｎｄｏｍ  ｎｏｎａｍｅｒ）を用いてＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｎｅｂ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＳＡ）で逆転写した。可変領域を、フォワードプライマーＥＦｌａＮｏｔＩ＿Ｆ（ＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＣ）及びＶＨ用のリバースプライマーＣＧ−ｒｅｖｓｅｑ−１（ＧＴＴＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧ）及びＶＬ用のＩｎｔｒｏｎ−ｒｅｖ−１（ＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＧＴＡＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＴＧＣＣ）によるＱ５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｂ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＳＡ）を用いるＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物を、製造業者の指示に従ってカラム精製（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｅｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製し、制限酵素で消化し、そしてアガロースゲル精製によって精製した。回収された可変領域を、ヒトＩｇ−γ１又はＩｇ−κ定常領域と共に、それぞれ２方向又は３方向クローニングによってｐＣＢ１４ｂにクローニングした。いくつかの細菌クローンからの可変領域を、配列決定プライマーＣＭＶｓｅｑ２（ＧＣＡＧＴＧＴＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＧＴＡＣ）を用いてＳａｎｇｅｒ配列決定（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ  ＡＧ，Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄで行われた）によって配列決定し、そしてＧｅｎｅｉｏｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）を用いてライブラリー配列に整列させた。
【０１２５】
２９３Ｔ細胞における組換えＩｇＧ抗体の発現
組換え抗体の発現は、ｐＣＢ１４ｂベースの発現構築物をＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、細胞上清を回収することによって行った。
【０１２６】
一過性抗体発現のために、細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  ｐｌｕｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を用いて６ウェルプレートにトランスフェクトした。１ウェル当たり、２．５μｇの全ＤＮＡをトランスフェクトし、翌日に新鮮な増殖培地を添加し、４日間コンディショニングした。上清を滅菌濾過し、分析まで−２０℃で保存した。
【０１２７】
大量で準安定な抗体発現のために、細胞を、２μｇ／ｍｌ  ピューロマイシン（０２４０．４、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）での選択により濃縮されたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  ｐｌｕｓを用いて１０ｃｍ皿でトランスフェクトし、ポリ−Ｌリジンでコーティングされた１４ｃｍ皿に拡大し、１６１μｇ／ｍｌ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、１０ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−グルタチオン、及び１μｇ／ｍｌ  ピューロマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。抗体を含む上清を１週間に２回回収し、滅菌濾過し、精製まで４℃で保存した。ＦＰＬＣによる精製を、Ａｋｔａ精製装置（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。上清をＡｍｓｐｈｅｒｅプロテインＡカラム（ＪＷＴ２０３ＣＥ，ＪＳＲ  Ｍｉｃｒｏ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＵＳＡ）に通し、続いてＰＢＳで洗浄し、抗体を０．１Ｍ  グリシン  ｐＨ２．５で溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０ですぐに中和した。ＰＢＳとの緩衝液交換を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心濾過器（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて行った。
【０１２８】
ヒトＲＯＲ１標的抗原を過剰発現するＥＭＴ−６細胞乳癌細胞の作製
ヒトＲＯＲ１抗原を過剰発現するマウスＥＭＴ６細胞を転移によって作製した。完全長ヒトＲＯＲ１（ＮＰ＿００５００３．２）の発現のための発現構築物を、ピューロマイシン選択マーカー（ｐＰＢ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１）を含むＰｉｇｇｙＢａｃ−転移発現ベクター（図１９）を用いて作製した。このベクターは、抗生物質選択マーカーのＩＲＥＳ駆動発現を、別個のホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）によって駆動される選択マーカー発現で置き換えることによって得た。ｐＰＢ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１発現ベクター及びＰｉｇｇｙＢａｃ発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｍＰＢ（図１７）を用いたＥＭＴ６細胞のエレクトロポレーションは、ＥＭＴ６細胞ペレットをＲＰＭＩ中、５Ｅ＋６細胞／ｍｌに再懸濁して、２０μｇの全ＤＮＡを使用した（ｐＰＢ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ−ＲＯＲ１：トランスポザーゼ＝３：２）ことを除いて、Ｌ１１細胞と同様に行った。エレクトロポレーション後、細胞を６ウェルプレートに播種し、そして３μｇ／ｍｌ  ピューロマイシンを用いて選択を６日間行った。単一細胞クローンを、次のように転移させて選択した細胞の染色によって単離した：細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／２％ＦＣＳ）で、希釈した２μｇ／ｍｌ  抗ＲＯＲ１抗体２Ａ２（マウス−ヒトＩｇＧキメラ）を用いて氷上で３０分間染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、一次抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液で１：２００に希釈されたＰＥ結合Ｆｃ特異的抗ヒトＩｇＧを用いて、氷上で３０分間検出した。最後の洗浄の後、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡ）を備えたＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ装置を用いて単一細胞を９６ウェルプレートに選別した。増殖後、上記のような染色及びフローサイトメトリー分析によって、クローンが抗原を均一に発現するかを検証した。
【０１２９】
ソルターゼ媒介抗体コンジュゲーション
ソルターゼ媒介抗体コンジュゲーションは、本質的に記載されているように実施した（Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ，１０（７），ｅ０１３１１７７，２０１５）。簡単に説明すると、ソルターゼタグ付きｍＡｂ［１０μＭ］を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０％グリセロール中、３μＭ  ソルターゼＡの存在下でオリゴ−グリシン修飾毒素［２００μＭ］と共に、ｐＨ７．５、２５℃で３．５時間インキュベートした。反応を、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通し、続いて２０カラム容量（ＣＶ）の洗浄緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｖ／ｖグリセロール）で洗浄して停止させた。結合したコンジュゲートを、５  ＣＶの溶出緩衝液（０．１Ｍ  グリシン、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．５）で溶出し、０．５  ＣＶ画分を、２５％ｖ／ｖ  １Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８を含む管に収集して酸を中和した。製造業者の指示に従って、タンパク質含有画分をプールし、そしてＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して調製した。ｍＡｂ  ２Ａ２及びＲ１１のキメラ及びヒト化バージョンに基づいたＡＤＣを、Ｃａ2+及びＭｇ2+を含まないＰＢＳ（Ａｍｉｍｅｄ−Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）中で調製した。キメラｍＡｂ  Ｒ１２に基づいたＡＤＣは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、１７５ｍＭ  スクロース、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０中で調製したが、ヒト化Ｒ１２  ｍＡｂに基づいたＡＤＣは、１５ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ６．０，１７５ｍＭ  スクロース、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０中で調製した。
【０１３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞死滅アッセイ
ＡＤＣの細胞傷害性を、本質的に記載されているように細胞死滅アッセイで調べた（Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。簡単に説明すると、細胞を、７５μＬの増殖培地中の９６ウェルプレートにプレーティングし、７．５％ＣＯ2雰囲気の加湿インキュベーター内で３７℃で増殖させた。細胞を、１，０００細胞／ウェル（ＥＭＴ６及びその誘導クローン）又は１０，０００細胞／ウェル（６９７細胞で２Ａ２及びｈｕ２Ａ２  ＡＤＣを試験するため）又は７５，０００の細胞（６９７細胞でｈｕＲ１２−４  ＡＤＣを試験するため）で９６ウェルプレートに播種した。翌日、増殖培地中の各ＡＤＣの２５μＬの３．５倍連続希釈を添加し、２０μｇ／ｍＬ〜０．０２ｎｇ／ｍＬの最終ＡＤＣ濃度にした。競合のために、ＡＤＣ連続希釈を、２００μｇ／ｍＬの濃度の非コンジュゲートｍＡｂ（「ｃｏｍｐ」）を含む増殖培地中で行った。さらに４日後、プレートをインキュベーターから取り出し、室温で平衡化させた。約３０分後、５０μＬの培地を注意深く各ウェルから取り出し、５０μＬ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ  Ｇ７５７０）と交換した。プレートを４５０ｒｐｍで５分間振盪した後、暗所で振盪しないで１０分間インキュベートし、１ウェル当たり２５０ミリ秒の積分時間で、Ｔｅｃａｎ  Ｓｐａｒｋ  １０Ｍで発光を測定した。
【０１３１】
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＢ細胞白血病細胞（６９７）の播種性異種移植モデル
ｈｕ２Ａ２ｂ−Ｑ１１ベースの抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、図６のグリシン修飾毒素にコンジュゲートしたＳＭＡＣの有効性を調べ、そしてヒト６９７白血病癌細胞に由来する腫瘍を有する雌ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの播種異種移植片モデルにおけるアイソタイプ対照−ＡＤＣ（トラスツズマブ、ＨＥＲ２を標的とする）で処置された群と比較した。試験の０日目、各々が少なくとも２０ｇの体重の９週齢のマウス１２匹に、６９７腫瘍細胞（２００μＬ  ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）中、５×１０6細胞／動物）を接種した。ＰＢＳ中で調製した試験ＡＤＣを、７日目、１４日目、及び２１日目に、各ＡＤＣ投与の２０時間前にマウスＩｇＧ（Ｐｒｉｖｉｇｅｎ  ＩＶＩＧ（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｌｏｔ，４３３５５０００３７）、３０ｍｇ／ｋｇ）の投与と共に１．０ｍｇ／ｋｇで６匹のマウスの群に投与した（ｉ．ｖ．）。１つのアイソタイプ対照ＡＤＣ（ＨＥＲ２標的化トラスツズマブ、図６のグリシン修飾毒素とコンジュゲートしたＳＭＡＣ）を、６匹のマウスの群において同じ条件及びプロトコルの下で投与した。中程度の痛み、中程度の困難、又はあらゆる程度の苦しみである臨床的徴候を示す全ての動物を、人道的に安楽死させた。さらに；実験的研究における動物に対する欧州及びデンマークの法律に従った試験用の特定の人道的エンドポイントの限界を超える臨床徴候を示した場合は、いずれの動物も人道的に安楽死させた。各動物の体重を、試験の間、１週間に３回測定した。データ解析は、ソフトウェアＰＲＩＳＭを用いて行った。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】ＳＭＡＣ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）免疫リガンドコンジュゲーションに使用されるＧｌｙ5修飾メイタンシン毒素の化学構造。  図１の上部において、メイタンシノイドは、ＳＭＡＣ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）によるコンジュゲーションを可能にするために、オリゴ−グリシンペプチド（Ｇｌｙn）に対するいわゆるＳＭＣＣリンカーを含むＤＭ１［Ｎ2’−デアセチル−Ｎ2’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン］である。このＳＭＣＣリンカーは、単に、ＳＭＡＣ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）コンジュゲート免疫リガンド毒素コンジュゲートの任意選択の成分であり、ペイロードのコンジュゲーションには重要ではない。  ＤＭ１の代わりに、メイタンシノイドペイロードＤＭ４［Ｎ２０−デアセチル−Ｎ２０−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソ−ペンチル）−メイタンシン］のＳＰＤＢリンカーのような他の任意選択のリンカー構造を任意選択により含めることができる。図２を参照されたい。  図１の下部において、メイタンシノイドは、メイタンシン自体であり、非共役型では図２（ａ）の構造を有し、ここに描写されたオリゴ−グリシンペプチド（Ｇｌｙn）誘導体の生成に使用することができ、本明細書で分析される免疫リガンドメイタンシンコンジュゲートの基礎を形成している。
【図２】本発明の文脈で使用することができる３つのメイタンシノイド。図５（ａ）：メイタンシン、図５（ｂ）：ＤＭ１［Ｎ2’−デアセチル−Ｎ2’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン］、図５（ｃ）：ＤＭ４［Ｎ２０−デアセチル−Ｎ２０−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソ−ペンチル）−メイタンシン］。
【図３ａ】本発明による免疫リガンド−毒素−コンジュゲートと共に使用することができるアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体。この誘導体は、その波線において、オリゴ−グリシン（Ｇｌｙn）ペプチドが遊離アミノ末端を有するように前記アントラサイクリン誘導体に結合したオリゴ−グリシンペプチド（Ｇｌn）を含む化学構造を含み得、式中、ｎは１〜２１の整数である。誘導体は、図５に示されている式（ｖ）を有するアントラサイクリンＰＮＵ−１５９６８２に由来する。
【図３ｂ】オリゴ−グリシンペプチド（Ｇｌｙn）が、図３（ａ）に示されているようにエチレンジアミノリンカー（ＥＤＡ）によってアントラサイクリン誘導体に結合され、このエチレンジアミノリンカーは、第１のアミド結合によってアントラサイクリン誘導体に結合され、このアントラサイクリン誘導体は、第２のアミド結合、前記エチレンジアミノリンカー、及びオリゴ−グリシンペプチドによってオリゴ−グリシンペプチドのカルボキシ末端にコンジュゲートされている。
【図４ａ】本発明による免疫リガンド−毒素−コンジュゲートと共に使用することができる別のアントラサイクリン（ＰＮＵ）誘導体。この誘導体は、その波線において、オリゴ−グリシン（Ｇｌｙn）ペプチドが遊離アミノ末端を有するように前記アントラサイクリン誘導体に結合したオリゴ−グリシンペプチド（Ｇｌｙn）を含む化学構造を含み得、式中、ｎは１〜２１の整数である。誘導体は、図５に示されている式（ｖ）を有するアントラサイクリンＰＮＵ−１５９６８２に由来する。
【図４ｂ】オリゴ−グリシンペプチド（Ｇｌｙn）が、エチレンジアミノリンカー（ＥＤＡ）によって図４（ａ）に示されているようにアントラサイクリン誘導体に結合され、このエチレンジアミノリンカーは、第１のアミド結合によってアントラサイクリン誘導体に結合され、このアントラサイクリン誘導体は、第２のアミド結合、前記エチレンジアミノリンカー、及びオリゴ−グリシンペプチドによってオリゴ−グリシンペプチドのカルボキシ末端にコンジュゲートされている。
【図５】先行技術（例えば、国際公開第２００９０９９７４１号パンフレット又はＱｕｉｎｔｉｅｒｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１，１６０８−１７）に記載されているＰＮＵ−１５９６８２の構造。
【図６】本明細書の実施例に開示されているソルターゼ酵素を用いたＣ末端のＬＰＥＴＧソルターゼタグ付きモノクローナル抗体へのＳＭＡＣ−技術コンジュゲーションに利用されるＰＮＵ−ＥＤＡ−Ｇｌｙ5の構造。
【図７】部位特異的ソルターゼ媒介抗体コンジュゲーション（ＳＭＡＣ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の概略図。モノクローナル抗体を、Ｃ末端ＬＰＸＴＧソルターゼタグを用いて作製する必要がある。有毒なペイロードは、ある数（ｎは１〜２１、好ましくはｎは３〜１０、最も好ましくはｎ＝５）のグリシン残基を一列に有するオリゴグリシンペプチドストレッチ（Ｇｌｙn−ストレッチ）を含むように作製する必要がある。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡ酵素は、ＬＰＸＴＧペンタペプチドモチーフを特異的に認識し、オリゴ−グリシンペプチドストレッチのＬＰＸＴＧのスレオニン−グリシンペプチド結合へのペプチド転移を触媒し、これにより、オリゴ−グリシンストレッチのスレオニンとＮ末端グリシンとの間に新しい安定したペプチド結合を形成する。
【図８】ヒト化２Ａ２抗体の能力を評価し、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の形態の親キメラｍＡｂの力価と比較する。ＡＤＣを形成するために、Ｃ末端がソルターゼＡ認識モチーフを含む配列でタグ付けされた重鎖及び軽鎖を有する抗体を発現させ、ソルターゼ媒介コンジュゲーションを用いてＧｌｙ５修飾アントラサイクリンＰＮＵ１５９６８２誘導体に結合し（国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレット）、次いでＲＯＲ１発現ＡＬＬ癌細胞株を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ死滅アッセイで試験した。６９７  ＡＬＬは、２Ａ２抗ＲＯＲ１抗体による染色及びフローサイトメトリーによる分析によって明らかにされたようにＲＯＲ１を発現した（図８（ａ））。細胞殺傷が行われた場合、キメラ２Ａ２−ＰＮＵ及びヒト化バージョンの両方が６９７細胞を効率的に死滅させ、この効果は、非コンジュゲート抗体と競合（「冷競合」）し得るため標的特異的であった。処置の４日後に、生細胞を、発光細胞生存アッセイを用いて定量した。各データポイントは、複製の平均を表し、エラーバーはＳＤを表す（図８（ｂ））。ヒト化２Ａ２  ＡＤＣの有効性を、ヒト６９７  ＡＬＬ細胞株を用いて確立された播種マウスモデル（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ）においてｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存曲線を示し、アイソタイプ対照で処置した群と比較している（図８（ｃ））。ヒト化２Ａ２  ＡＤＣで処置したマウスは、対照と比較して生存期間の延長を示している。
【図９Ａ】Ｔｒａｎｓｐｏ−ｍＡｂによるマウス２Ａ２及びウサギＲ１１抗ＲＯＲ１抗体のヒト化。転移ヒト化ライブラリーは、６４  ＶＨ×４９  ＶＬ（マウス）及び１０１  ＶＨ×８２  ＶＬ（ウサギ）配列からなり、４：２：１（ＨＣ：ＬＣ：トランスポサーゼ）のＤＮＡ重量比を用いて転移させた。この細胞ライブラリーは、抗生物質選択によって抗体発現について濃縮し、予め決定された限界濃度で可溶性抗原（ＲＯＲ１−ｓｔｒｅｐ）を用いて抗原結合について標識した。抗原結合を、フルオロフォア標識抗ｓｔｒｅｐタグ抗体（ＳｔｒｅｐＭＡＢ−６４５）を用いて検出した。抗体表面発現レベルを正規化するために、ライブラリーを抗ＩｇＧ−ＰＥで共染色した。次いで、抗原結合単一細胞をＦＡＣＳによって単離した。図９（ａ）は、選別直前に分析された抗原結合（ｘ軸）及び抗体表面発現（ｙ軸）について分析したヒト化細胞ライブラリーのフローサイトメトリープロットを示している。単一細胞選別の後、クローン上清を増殖させ、これにより、抗体含有馴化上清を生成させ、これをＳＰＲによってスクリーニングした。
【図９Ｂ】Ｔｒａｎｓｐｏ−ｍＡｂによるマウス２Ａ２及びウサギＲ１１抗ＲＯＲ１抗体のヒト化。転移ヒト化ライブラリーは、６４  ＶＨ×４９  ＶＬ（マウス）及び１０１  ＶＨ×８２  ＶＬ（ウサギ）配列からなり、４：２：１（ＨＣ：ＬＣ：トランスポサーゼ）のＤＮＡ重量比を用いて転移させた。この細胞ライブラリーは、抗生物質選択によって抗体発現について濃縮し、予め決定された限界濃度で可溶性抗原（ＲＯＲ１−ｓｔｒｅｐ）を用いて抗原結合について標識した。抗原結合を、フルオロフォア標識抗ｓｔｒｅｐタグ抗体（ＳｔｒｅｐＭＡＢ−６４５）を用いて検出した。抗体表面発現レベルを正規化するために、ライブラリーを抗ＩｇＧ−ＰＥで共染色した。次いで、抗原結合単一細胞をＦＡＣＳによって単離した。図９（ｂ）は、単一細胞選別クローン上清（一重（ｕｎｉｃａｔｅ））又は精製親ｍＡｂ（三重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ））を用いたＳＰＲによって決定されたｋa及びｋdを示すアイソアフィニティープロット（ｉｓｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｌｏｔ）を示している。最良のＫＤを示す５つのクローンの抗体配列をＲＴ−ＰＣＲによって回収し、ＥＬＩＳＡによってデコンボリューション／検証した。ライブラリー設計に一致しない配列は、それ以上追求しなかった。この分析の上位３つのクローンを２９３Ｔ細胞で発現させ、精製し、そして親和性をＳＰＲによって測定した。
【図９Ｃ】Ｔｒａｎｓｐｏ−ｍＡｂによるマウス２Ａ２及びウサギＲ１１抗ＲＯＲ１抗体のヒト化。転移ヒト化ライブラリーは、６４  ＶＨ×４９  ＶＬ（マウス）及び１０１  ＶＨ×８２  ＶＬ（ウサギ）配列からなり、４：２：１（ＨＣ：ＬＣ：トランスポサーゼ）のＤＮＡ重量比を用いて転移させた。この細胞ライブラリーは、抗生物質選択によって抗体発現について濃縮し、予め決定された限界濃度で可溶性抗原（ＲＯＲ１−ｓｔｒｅｐ）を用いて抗原結合について標識した。抗原結合を、フルオロフォア標識抗ｓｔｒｅｐタグ抗体（ＳｔｒｅｐＭＡＢ−６４５）を用いて検出した。抗体表面発現レベルを正規化するために、ライブラリーを抗ＩｇＧ−ＰＥで共染色した。次いで、抗原結合単一細胞をＦＡＣＳによって単離した。図９（ｃ）は、各スクリーニングのこれらの精製された上位３つのｍＡｂのアイソアフィニティープロットを示している。
【図１０】Ｔｒａｎｓｐｏ−ｍＡｂによるウサギＲ１２抗体のヒト化。転移ヒト化ライブラリーは、２５  ＶＨ×２５  ＶＬ配列からなり、０．２５：０．１２５：１（ＨＣ：ＬＣ：トランスポサーゼ）のＤＮＡ重量比を用いてＬ１１細胞に転移させた。ヒト化Ｒ１２  ｃＤＮＡライブラリーで転移された細胞を、抗生物質選択によって抗体表面発現について濃縮し、次いで抗原結合について単一細胞選別した。得られたクローンを増殖させ、そして培養上清をＥＬＩＳＡによって分析した。ＥＬＩＳＡにより抗原結合及びＩｇＧ力価について並列に分析された単一細胞クローン上清の散布図が示されている。９６ウェルプレートで増殖させたクローン上清の連続希釈物を、アビディティー効果を最小限にするためにＲＯＲ１の制限濃度でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートへの結合の評価に直接使用した。ＩｇＧレベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。ＥＣ５０値を、既知の濃度の親ｍＡｂ  Ｒ１２で得られた標準曲線を用いて計算した。ＲＯＲ１結合：ＩｇＧ−力価比が最も高い１６のクローンを抗体可変領域配列の回復のために選択した。
【図１１】ヒト生殖系列遺伝子を有する臨床的に認可されたヒト化ｍＡｂと一緒に生成されたヒト化抗体の比較。示された抗体の可変領域を、それぞれ最も近いヒト生殖系列配列についてＩｇ−Ｂｌａｓｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）で検索し、そしてフレームワーク領域１、２、及び３内の配列同一性を決定した。３つのフレームワーク全体にわたるヒト生殖系列との平均同一性は、ヒト化の程度の評価基準とみなされ、パーセントで示されている。ライブラリーについては、そのライブラリー内の全ての配列にわたる平均値が示されている。ＦＤＡの承認状況及び参照ヒト化抗体の配列を、ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／で検索した。
【図１２Ａ】ヒト化Ｒ１２抗体の力価及び抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の形態の親キメラｍＡｂの力価との比較。ＡＤＣを形成するために、Ｃ末端ソルターゼＡ認識モチーフを含む重鎖及び軽鎖を有する抗体を発現させ、ソルターゼ媒介コンジュゲーションを用いて（図６のように）Ｇｌｙ５修飾アントラサイクリンに結合させた（国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレット）。得られたＡＤＣを、内因性レベルのＲＯＲ１を発現するヒト６９７  ＡＬＬ細胞（図８（ａ））及びヒトＲＯＲ１を過剰発現するマウスＥＭＴ６細胞のクローン（ＥＭＴ６−ＲＯＲ１クローン６、ＥＭＴ６−ＲＯＲ１クローン１４）、又は親ＥＭＴ６細胞（ＥＭＴ  ＷＴ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ死滅アッセイで試験した。ＥＭＴ６細胞変異体上での抗原表面発現の有無を確認するために、細胞を、２μｇ／ｍｌ  ２Ａ２抗ＲＯＲ１抗体で染色し、続いてフローサイトメトリーで分析した（図１２（ａ））。形成されたＡＤＣの力価を評価するために、ヒトＡＬＬ癌細胞（６９７）、及びヒトＲＯＲ１を過剰発現するマウスＥＭＴ６細胞（ＥＭＴ６−ＲＯＲ１クローン６、ＥＭＴ６−ＲＯＲ１クローン１４）又は親ＥＭＴ６細胞（ＥＭＴ  ＷＴ）を、ＡＤＣに４日間曝露し、発光ベースの細胞生存率アッセイを用いて細胞生存率を定量した（それぞれ図１２（ｂ）及び（ｃ））。全ての場合において、ＲＯＲ１発現細胞の細胞生存率は、ヒト化Ｒ１２ベースのＡＤＣで処置した場合は低下し（ＲＯＲ１発現と正の相関）、対照ＡＤＣのみで処置した場合は、高用量で非特異的殺傷が起こった。
【図１２Ｂ】ヒト化Ｒ１２抗体の力価及び抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の形態の親キメラｍＡｂの力価との比較。ＡＤＣを形成するために、Ｃ末端ソルターゼＡ認識モチーフを含む重鎖及び軽鎖を有する抗体を発現させ、ソルターゼ媒介コンジュゲーションを用いて（図６のように）Ｇｌｙ５修飾アントラサイクリンに結合させた（国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレット）。得られたＡＤＣを、内因性レベルのＲＯＲ１を発現するヒト６９７  ＡＬＬ細胞（図８（ａ））及びヒトＲＯＲ１を過剰発現するマウスＥＭＴ６細胞のクローン（ＥＭＴ６−ＲＯＲ１クローン６、ＥＭＴ６−ＲＯＲ１クローン１４）、又は親ＥＭＴ６細胞（ＥＭＴ  ＷＴ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ死滅アッセイで試験した。ＥＭＴ６細胞変異体上での抗原表面発現の有無を確認するために、細胞を、２μｇ／ｍｌ  ２Ａ２抗ＲＯＲ１抗体で染色し、続いてフローサイトメトリーで分析した（図１２（ａ））。形成されたＡＤＣの力価を評価するために、ヒトＡＬＬ癌細胞（６９７）、及びヒトＲＯＲ１を過剰発現するマウスＥＭＴ６細胞（ＥＭＴ６−ＲＯＲ１クローン６、ＥＭＴ６−ＲＯＲ１クローン１４）又は親ＥＭＴ６細胞（ＥＭＴ  ＷＴ）を、ＡＤＣに４日間曝露し、発光ベースの細胞生存率アッセイを用いて細胞生存率を定量した（それぞれ図１２（ｂ）及び（ｃ））。全ての場合において、ＲＯＲ１発現細胞の細胞生存率は、ヒト化Ｒ１２ベースのＡＤＣで処置した場合は低下し（ＲＯＲ１発現と正の相関）、対照ＡＤＣのみで処置した場合は、高用量で非特異的殺傷が起こった。
【図１２Ｃ】ヒト化Ｒ１２抗体の力価及び抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の形態の親キメラｍＡｂの力価との比較。ＡＤＣを形成するために、Ｃ末端ソルターゼＡ認識モチーフを含む重鎖及び軽鎖を有する抗体を発現させ、ソルターゼ媒介コンジュゲーションを用いて（図６のように）Ｇｌｙ５修飾アントラサイクリンに結合させた（国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレット）。得られたＡＤＣを、内因性レベルのＲＯＲ１を発現するヒト６９７  ＡＬＬ細胞（図８（ａ））及びヒトＲＯＲ１を過剰発現するマウスＥＭＴ６細胞のクローン（ＥＭＴ６−ＲＯＲ１クローン６、ＥＭＴ６−ＲＯＲ１クローン１４）、又は親ＥＭＴ６細胞（ＥＭＴ  ＷＴ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ死滅アッセイで試験した。ＥＭＴ６細胞変異体上での抗原表面発現の有無を確認するために、細胞を、２μｇ／ｍｌ  ２Ａ２抗ＲＯＲ１抗体で染色し、続いてフローサイトメトリーで分析した（図１２（ａ））。形成されたＡＤＣの力価を評価するために、ヒトＡＬＬ癌細胞（６９７）、及びヒトＲＯＲ１を過剰発現するマウスＥＭＴ６細胞（ＥＭＴ６−ＲＯＲ１クローン６、ＥＭＴ６−ＲＯＲ１クローン１４）又は親ＥＭＴ６細胞（ＥＭＴ  ＷＴ）を、ＡＤＣに４日間曝露し、発光ベースの細胞生存率アッセイを用いて細胞生存率を定量した（それぞれ図１２（ｂ）及び（ｃ））。全ての場合において、ＲＯＲ１発現細胞の細胞生存率は、ヒト化Ｒ１２ベースのＡＤＣで処置した場合は低下し（ＲＯＲ１発現と正の相関）、対照ＡＤＣのみで処置した場合は、高用量で非特異的殺傷が起こった。
【図１３】精製された抗体を用いるＳＰＲによって決定されたヒト化Ｒ１２  ｍＡｂ及び親Ｒ１２  ｍＡｂの親和性の比較。示された３つのヒト化Ｒ１２  ｍＡｂを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で大量に発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして可溶性ＲＯＲ１−ｓｔｒｅｐに対する親和性の決定のためにＳＰＲ分析した。抗体を、ヤギα−ヒトＦｃ−γ特異的ＩｇＧを用いて捕捉した。ＲＯＲ１−ｓｔｒｅｐを、１．２５ｎＭ〜２０ｎＭの２倍連続希釈を用いてランニング緩衝液で希釈した。会合を１２０秒間測定し、解離を１０００秒間続けた。捕捉レベルは、２６．９ＲＵ〜５４．１ＲＵであった。この分析により、ヒト化ｍＡｂ  Ｒ１２の親和性が親ｍＡｂ  Ｒ１２の親和性に対して５倍を超える実質的な増加が確認された。
【図１４】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における一過性又は準安定性の抗体発現のためのＥＢＮＡベースの発現ベクターｐＣＢ１４ｂ。記載されたクローニングに使用されるベクターの主要成分及び制限部位が示されている。
【図１５ａ】転移発現構築物。記載されたクローニングに使用されるベクターの主要成分及び制限部位が示されている。（ａ）転移２Ａ２重鎖発現ベクター。
【図１５ｂ】転移発現構築物。記載されたクローニングに使用されるベクターの主要成分及び制限部位が示されている。（ｂ）転移２Ａ２軽鎖発現ベクター。
【図１５ｃ】転移発現構築物。記載されたクローニングに使用されるベクターの主要成分及び制限部位が示されている。（ｃ）転移Ｒ１２重鎖発現ベクター。
【図１５ｄ】転移発現構築物。記載されたクローニングに使用されるベクターの主要成分及び制限部位が示されている。（ｄ）転移Ｒ１２軽鎖発現ベクター。
【図１６】Ｓｔｒｅｐタグ付きヒトＲＯＲ１の配列。Ｎ末端にｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）が付けられたヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列が示されている。
【図１７】高活性ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ（ｈｙＰＢ）の一過性発現のための構築物。
【図１８】転移重鎖ライブラリーを作製するための骨格として使用されるベクター。記載されたクローニングに使用されるベクターの主要成分及び制限部位が示されている。（ａ）ヒト化重鎖可変領域断片の挿入に使用されるベクター。重鎖可変領域断片を、ＮｏｔＩ／ＮｈｅＩ部位を用いて導入した。（ｂ）ヒト化軽鎖可変領域断片をκ型又はλ型の定常領域断片と共に挿入するために使用したベクター。ＮｏｔＩ／ＢｓｉＷＩで消化されたκ軽鎖可変領域断片を、ＢｓｉＷＩ／ＢｓｔＢＩで消化されたκ軽鎖定常領域断片と共に、ＮｏｔＩ／ＢｓｔＢＩで線状化されたこのベクターに導入した。ＮｏｔＩ／ＫａｓＩで消化されたλ軽鎖可変領域断片を、ＫａｓＩ／ＢｓｔＢＩで消化されたλ軽鎖定常領域断片と共に、ＮｏｔＩ／ＢｓｔＢＩで線状化されたこのベクターに導入した。
【図１９】完全長ＲＯＲ１の発現のための転移ベクター。記載されたクローニングに使用されるベクターの主要成分及び制限部位が示されている。
【発明を実施するための形態】
【０１３３】
【表３】
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2019502363.tif 000007
【０１３４】
参照による組み入れ
本明細書は、ソルターゼ媒介抗体コンジュゲーション（ＳＭＡＣ）についてのいくつかの参照を含む。この技術は、国際公開第２０１４１４０３１７号パンフレットに十分に開示されており、その内容は、実現のために参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３５】
【表４】
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【０１３６】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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