(57)【要約】本発明は、ゲルの形成に関する。特に、本発明は、競合的リガンド交換を用いて架橋ポリマーヒドロゲルを形成する方法に関する。
2019510124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1の溶液および第2の溶液を混合することを含む、架橋ポリマーゲルを形成する方法であって、第1の溶液は、架橋剤および第1のキレート剤を含み；第2の溶液は、置換剤を含み；第1または第2の溶液の少なくとも1つは、イオノトロピー性ポリマーを含有し；ここで
(a) イオノトロピー性ポリマーは、第1のキレート剤より架橋剤に対する親和性が低く、そして
(b) 第1のキレート剤は、架橋剤より置換剤に対する親和性が高い、
方法。
【請求項２】
第2の溶液が、置換剤をキレートすることができる第2のキレート剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
イオノトロピー性ポリマーが、第2のキレート剤より置換剤に対して親和性が低い、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
第2のキレート剤が、イオノトロピー性ポリマーより架橋剤に対して親和性が低い、請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
イオノトロピー性ポリマーが、第2のキレート剤より置換剤に対して親和性が低い、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
架橋剤および置換剤が、異なる多価金属イオンである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第1および第2の溶液が、イオノトロピー性ポリマーを含有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第1および第2の溶液が、同じイオノトロピー性ポリマーまたは異なるイオノトロピー性ポリマーを含有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
架橋剤および置換剤が、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、VO2+、Cu2+、Ba2+、Sr2+、Ho3+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Pb2+、Co2+およびNi2+からなる群より選択される多価金属イオンより独立して選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
架橋剤が、Ca2+を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
置換剤が、Zn2+、Fe2+およびMn2+からなる群より選択される多価金属イオン、最も好ましくはZn2+を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第1および第2のキレート剤が、エチレンジアミン-N,N'-二コハク酸（EDDS）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミン-N,N'-二酢酸（EDDA）、プロピレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（PDTA）、1,2-シクロヘキサンジニトリロ四酢酸（CDTA）、エチレングリコール四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）、ヒドロキシフェニル-エチレンジアミン（HPED）、ニトリロ三酢酸（NTA）、2-[(2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル)アミノ]エタンスルホン酸、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-2-アミノエタンスルホン酸（TES）、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール（TRIS）、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン（トリシン）、ポルフィリン、クエン酸、リン酸、アミノ酸、ペプチドおよびシデロフォア、好ましくはエチレンジアミン-N,N'-二コハク酸（EDDS）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミン-N,N'-二酢酸（EDDA、プロピレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（PDTA）、1,2-シクロヘキサンジニトリロ四酢酸（CDTA）およびアミノ酢酸（グリシン）からなる群より独立して選択される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第1のキレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミン-N,N'-二コハク酸（EDDS）、プロピレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（PDTA）および1,2-シクロヘキサンジニトリロ四酢酸（CDTA）からなる群より選択され、好ましくはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
第2のキレート剤が、エチレンジアミン-N,N'-二コハク酸（EDDS）、アミノ酢酸（グリシン）およびエチレンジアミン-N,N'-二酢酸（EDDA）、好ましくはエチレンジアミン-N,N'-二酢酸（EDDA）またはアミノ酢酸（グリシン）からなる群より選択されるか、またはそれらの混合物である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
イオノトロピー性ポリマーが、アルギン酸、ペクチン、ポリ(ガラクツロン酸)、カラギーナン、デキストラン（および誘導体）、ゲラン、スクレログルカン、キトサン（および誘導体）、水溶性ポリホスファゼン、例えばポリ(ビス(4-カルボキシフェノキシ)ホスファゼン)、ポリアクリル酸ナトリウム、およびポリアミノ酸、好ましくはアルギン酸、ペクチンおよびポリ(ガラクツロン酸)からなる群より選択され、最も好ましくはアルギン酸である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
溶液成分が、下記組合せ：
【表１】
2019510124.tif 000007
を有し得る、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
イオノトロピー性ポリマーが、第1および第2の溶液の両方に存在する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
方法が、5℃〜40℃、好ましくは10℃〜30℃の間で実施される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
方法が、4〜9、好ましくは6〜8、好ましくは6.5〜7.5、好ましくは7.2〜7.4のpHにて実施される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
第1のキレート剤の濃度が、2mM〜200mM、好ましくは3mM〜180mM、より好ましくは4mM〜120mM、さらに好ましくは5mM〜110mM、さらにより好ましくは10mM〜110mM、最も好ましくは15mM〜100mMの範囲である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
第2のキレート剤の濃度が、2mM〜200mM、好ましくは3mM〜180mM、より好ましくは4mM〜120mM、さらに好ましくは5mM〜110mM、さらにより好ましくは10mM〜110mM、最も好ましくは15mM〜100mMの範囲である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
イオノトロピー性ポリマーが、0.1〜20wt/vol％の範囲の混合溶液中濃度である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
イオノトロピー性ゲル化以外の方法によって架橋してヒドロゲルを形成することができる、1つ以上の更なるポリマーが、ゲル化開始前に加えられる、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
1つ以上の更なるポリマーが、第1の溶液、第2の溶液、または第1および第2の溶液の両方に分散する、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
請求項1〜24に記載の方法により得ることができるかまたは得られる、架橋ポリマーゲル。
【請求項２６】
請求項1〜24のいずれかにそれぞれ定義されるゲル化イオノトロピー性ポリマー、架橋剤、第1のキレート剤、第2のキレート剤および置換剤、ならびに水を含む、架橋ポリマーゲル。
【請求項２７】
異なるイオノトロピー性ポリマーの混合物を含む、請求項26に記載の架橋ポリマーゲル。
【請求項２８】
イオノトロピー性ゲル化以外の方法によって架橋してヒドロゲルを形成することができる、1つ以上の更なるポリマーをさらに含む、請求項26または27に記載の架橋ポリマーゲル。
【請求項２９】
下記：
i) 第1の溶液であって、該第1のポリマー溶液が架橋剤および第1のキレート剤を含む第1の溶液、
ii) 第2の溶液であって、該第2の溶液が置換剤を含む第2の溶液
を含む、パーツ・キットであって；第1または第2の溶液の少なくとも1つは、イオノトロピー性ポリマーを含有し；ここで
(c) イオノトロピー性ポリマーは、第1のキレート剤より架橋剤に対する親和性が低く、そして
(d) 第1のキレート剤は、架橋剤より置換剤に対する親和性が高い、
キット。
【請求項３０】
3D印刷または大規模成型用ゲルの製造における、請求項25〜28に記載の架橋ポリマーゲルの使用。
【請求項３１】
治療における、請求項25〜28に記載の架橋ポリマーゲルの使用。
【請求項３２】
治療が、組織再生、1型糖尿病などの疾患の処置または予防、および重金属封鎖を含む、請求項31に記載の使用。
【請求項３３】
核磁気共鳴画像法における、請求項25〜28に記載の架橋ポリマーゲルの使用。
【請求項３４】
請求項25〜28に記載の架橋ポリマーゲルを含む、治療における使用のための制御放出医薬製剤。
【請求項３５】
請求項25〜28に記載の架橋ポリマーゲルを含む、経口製剤、注射剤または創傷被覆材。
【請求項３６】
請求項25〜28に記載の架橋ポリマーゲル内に封入される、細胞または細胞群。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲルの形成に関する改良に関する。特に、本発明は、競合的リガンド交換を用いて架橋ポリマーヒドロゲルを形成する改良方法に関する。本発明の別の一態様において、本発明の方法により得られる改良架橋ポリマーゲルが提供される。本発明の更なる態様において、本発明の架橋ポリマーゲルを作るためのパーツ・キットが提供される。本発明のまた更なる態様において、本発明のゲルについての様々な使用が提供される。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロゲル形成ポリマーは、天然または合成起源であり得る。ヒドロゲルは、食品、医薬品および生物医学産業などにおいて極めて広い範囲の用途で用いられる。このクラスの材料は、物理的および／または化学的架橋により水相中で安定化される三次元ポリマーネットワークから構成される。化学的に架橋したヒドロゲルは、共有結合により形成される恒久的結合（例えばポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（PEG）、ヒアルロン酸、キトサン誘導体など）を含有し、一方、物理的ネットワークは、ポリマー鎖の絡み合いに由来する一時的な可逆性結合（例えばポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、多くのポリサッカライド）、イオン結合（例えばアルギン酸、ペクチンなど）および水素結合または疎水性相互作用を有する。ヒドロゲルはまた、反応基をポリマー鎖に組み込み、化学的方法によりポリマーを架橋可能にするか、または光、熱もしくはpHまたはそれらの組合せなどの刺激に対して反応性にする、水溶性ポリマーの修飾後に形成され得る。
【０００３】
化学的架橋は、ゲル形成反応速度および架橋度の良好な制御を提供し得る。しかしながら、ポリマーの化学修飾は、化合物純度および反応性が所与の用途において材料性能を妨げ得る、例えば材料を炎症性、非生体適合性または毒性にするといった、特に生物医学、医薬品および食品用途についていくつかの欠点がある。したがって、規制上の問題が生じ得る。また、このような修飾は、最終生成物に複雑さおよび関連費用を加える。
【０００４】
生物医学的用途に対して、イオン架橋は、ポリマーの共有結合修飾を必要せず、タンパク質構造保存および細胞封入などの用途に魅力的である温和で可逆的な経路をゲル形成に提供するため、特に魅力的である。しかしながら、イオン架橋したゲル工程の反応速度は、イオノトロピー性（ionotropic）ポリマーと無機イオン間の相互作用により支配されるため、制御することが困難である。典型的に、イオン性ゲル化は、極めて急速に生じ、水中で極めて速いイオン拡散（例えば、水中のCa2+拡散係数≒1.2×10-5cm2 s-1）により制限される。これは、要求に応じてゲル化を必要とする用途（例えば、投与時に注射可能であることを必要とする治療用組成物）が、このアプローチを用いて困難であるかまたは不可能であることを意味する。
【０００５】
ゆっくりした酸依存性のゲル化機構（いわゆる内部ゲル化法）もまた、広く研究されている。これらは、キレート、典型的にはCa-エチレンジアミン四酢酸（Ca-EDTA）（K. Toft, Progress in Food and Nutrition Science 1982, 6, 89）として、または固体、典型的には炭酸カルシウム（CaCO3）（K. I. Draget, K. Ostgaard, O. Smidsrod, Applied Microbiology and Biotechnology 1989, 31, 79）としてポリマー溶液に含有されるゲル化イオンに依存する。WO2006044342およびUS20110117172のいずれも、カルシウムイオンを放出し、ポリマーの架橋を引き起こすpH変化を必要とする先行技術方法を開示する。Ca2+は、水性酸の導入によってpHを急速に低下させるか、またはD-グルクノ-δ-ラクトン（GDL）の加水分解よってpHをよりゆっくり低下させることのいずれかにより生じ得て、注射可能または成形可能な製剤を得ることができる遅いゲル形成を可能にする。しかしながら、Ca-EDTA錯体を用いるとき、pHは、Ca2+イオンを放出するためにpH5未満に低下させなければならず、これは、細胞またはタンパク質封入などの特定の用途には禁止され得る。CaCO3／GDLの量を変化させることは、ゲル化を中性条件で生じることを可能にし、低pHに関連する問題を減らし得る。しかしながら、ゲル中の気泡を生じるCO2ガスが発生する。また、カルシウムの固体源の使用は、特に、固体CaCO3がマイクロ流路を塞ぎ得るマイクロ流体液滴ゲル化において、小規模のゲル製造についての制限の原因となる。固体CaCO3源の使用はまた、製剤をろ過により滅菌できないことを意味し、固体粒子の沈降に問題があり、ゲル内のカルシウムの不均一な分布を生じ得る。GDL成分に関して、この化学物質の加水分解は極めてゆっくりであり、この方法により製造されるゲルは完全に架橋するのに数時間かかる。CaCO3の粒子径を変化させることによりゲル化反応速度を幾分制御できるが、ゲル化は常に数時間のタイムスケールである。また、GDL溶液は、水との接触で自然に加水分解するため、新しく調製しなければならない。長年の研究にもかかわらず、イオノトロピー性ゲル形成の反応速度を制御する単純で用途の広い方法は存在しない。
【０００６】
したがって、上記課題を解消するゲルの製造のための改良方法を提供することは有益である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の態様によれば、第1の溶液および第2の溶液を混合することを含む、架橋ポリマーゲルを形成する方法であって、第1の溶液は、架橋剤および第1のキレート剤を含み；第2の溶液は、置換剤を含み；第1または第2の溶液の少なくとも1つは、イオノトロピー性ポリマーを含有し；ここで、(a)イオノトロピー性ポリマーは、第1のキレート剤より架橋剤に対する親和性が低く、そして(b)第1のキレート剤は、架橋剤より置換剤に対する親和性が高い、方法が提供される。好ましくは、イオノトロピー性ポリマーは、置換剤に対して親和性が低い。
【０００８】
この方法は、ゲル形成ポリマーの水溶液への架橋剤の放出を制御するために競合的リガンド交換を用いる。競合的リガンド交換がイオン架橋したヒドロゲルの製造において用いられたのは初めてのことである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明の実施態様を詳細に以下に図面を参照して説明する：
【００１０】
【図１】図1は、第1および第2のキレート剤を用いるリガンド交換機構の概略図である。
【００１１】
【図２】図2は、レオロジーにより測定されるゲル形成の反応速度を示し、これはpHの関数としてリガンド交換を用いて架橋したアルギン酸ゲルについての経時的な機械的特性の変化を示す。所定のpHを有する2つのアルギン酸溶液の混合後、貯蔵および損失弾性率を時間の関数として記録した。混合後、貯蔵弾性率は、pHの上昇と共によりゆっくりと上昇した。ゲル形成点を、G'=G''である時点により定義する。G'は貯蔵弾性率である。G''は損失弾性率である。レオロジー特性評価を、Paar Physica MCR 300 Rheometerを用いて実施した。最小限の壁面滑りを提供する鋸歯状の平板表面を有する並行平板形状を用いた（PP50鋸歯状平板、直径＝50 mm）。1 mmの測定ギャップにて貯蔵および損失弾性率を、10％の一定ひずみ（γ）、1 rad s-1の角振動数（ω）、1 mradの振幅および25℃の温度にて時間の関数として記録した。等量（1.75 mL）の2成分ゲルを、5 mLピペットを用いてレオメーター平板上で測定した。第1の成分を直接底板上に置き、その後、その他を測定開始直前にピペットで移した。このアプローチを用いると、約30秒のラグタイムは、データ収集の開始までの第2のポリマー溶液の送達の時間により生じる。
【００１２】
【図３】図3は、競合的リガンド交換を用いて形成されるゲルのEPR特性評価を示す。図3AおよびBは、それぞれ、Mn-EDDAおよびMn-EDTAとのアルギン酸試料を表す。図3Cは、示した時点でCa-EDTAおよびMn-EDDAの混合後記録したスペクトルを示す。図3Dは、Mn2+と架橋したアルギン酸のスペクトルを示す。
【００１３】
【図４】図4は、混合前のCaEDTAおよびMnEDDAを含有する前駆アルギン酸試料および得られたバルクゲル中でインキュベートした、MC3T3-E1マウス前骨芽細胞の細胞生存率を示す。インキュベート時間は80分であった。生存染色（Live stain）：カルセイン-AM、死滅染色（Dead stain）：エチジウムホモダイマー-1。このような結果はZnを用いても見られた。
【００１４】
【図５】図5は、細胞培地に加えられる本発明の示される化学成分の60mM濃度へ2時間曝露後トルイジンブルー浸潤により決定される、MC3T3-E1マウス前骨芽細胞の細胞生存率を示す。* 細胞生存率における有意差（P＜0.05）は、陽性（未処理）対照細胞と比較して試験したすべての実験群に対して観察された。n=3、Holm-Sidak事後多重検定の一元配置分散分析を適用した。陰性対照は0.1％トリトンXで処理した細胞であった。DIL培地は、水で試験溶液と同程度（40％）に希釈した細胞培地である。
【００１５】
【図６】図6は、本発明によるマイクロ流体デバイスの例を示す（図6a）。図6bは、細胞の封入が生じるデバイスの領域の顕微鏡写真を示す。図6cおよび6dは、この方法により製造される封入哺乳類細胞を含有する最終ゲルビーズを示す。
【００１６】
【図７】図7は、アルギン酸ヒドロゲルビーズに封入されたシアノバクテリアのシネコシスティス種（Synechocystis sp.）PCC 6803の顕微鏡写真を示す。すべての画像を20倍のレンズを用いてLeica SP5共焦点顕微鏡でとる。画像は、明視野と、藻類により生成されるクロロフィルの自己蛍光を捕捉する蛍光画像を重ねた画像である。スケールバー：20μm。
【００１７】
【図８】図8は、アルギン酸ビーズに封入された藻類のクラミドモナス・レインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii）CC-4532の顕微鏡写真を示す。試料の画像を、封入0(a)、24(b)、48(c)および72(d)時間後にとった。すべての画像を20倍のレンズを用いてLeica SP5共焦点顕微鏡でとる。画像は、明視野と、藻類により生成されるクロロフィルの自己蛍光を捕捉する蛍光画像を重ねた画像である。スケールバー：20μm。
【００１８】
【図９】図9は、レオロジーにより測定されるゲル形成の反応速度を示し、これは2段階ゲル化を用いて架橋したアルギン酸-コラーゲンゲル（0.4％アルギン酸、1％コラーゲン、pH7.4）についての経時的な機械的特性の変化を示す。第1段階（0〜1800秒）中に、競合的リガンド交換を用いてアルギン酸をゲル化し、これは貯蔵（G'）および損失（G''）弾性率の増加を生じる。ゲル化点（G'とG''が交差する点）はおよそ500秒である。第1段階中、温度を4℃に維持し、その後、残りの測定のために温度を急速に上昇させ、37℃で維持する。温度の増加は、コラーゲンのゲル化を引き起こし、これは温度上昇の直後（およそ100秒）に生じる。コラーゲンのゲル化は、加熱に反応して1800〜1900秒の間に生じる初期低下の後G'およびG''の更なる増加を生じる。レオロジー特性評価を、図2で説明するように実施した。
【００１９】
【図１０】図10は、アルギン酸についてリガンド交換架橋およびコラーゲンについて熱誘発架橋の組合せにより製造したアルギン酸-コラーゲンヒドロゲル内で成長した、MC3T3 E1マウス前骨芽細胞の蛍光共焦点光顕微鏡のスタックの3Dレンダリングを示す。細胞は、培養7日後ゲル内に十分付着し、広がった。カルセイン-AMで染色した生細胞から緑色の蛍光を観察した。Leica SP5共焦点顕微鏡を用いて画像を取った。視野＝775×775μm。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
イオン性ポリマーは、イオンにより架橋してゲルを形成し得る任意のポリマーであり得る。好ましくは、金属イオンが架橋に用いられる。好ましくは、イオンは多価陽イオンである。より好ましくは、イオンは二価陽イオンである。イオノトロピー性ヒドロゲル形成バイオポリマー、高分子電解質および合成ポリマーが用いられ得る。このようなポリマーは、既に当業者に公知である。多価イオンを用いて架橋してゲルを形成し得るイオン性ポリマーの例としては、ポリサッカライド、例えばカラギーナン、デキストラン、ゲラン、スクレログルカン、キトサン、およびその誘導体；水溶性ポリホスファゼン、例えばポリ(ビス(4-カルボキシフェノキシ)ホスファゼン)；ポリアクリル酸ナトリウム；およびポリアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、用いられるポリマーは、アルギン酸、ペクチンまたはポリガラクツロン酸である。より好ましくは、用いられるポリマーは、アルギン酸である。
【００２１】
イオン性ポリマーは、好ましくは、溶媒、好ましくは水性溶媒、好ましくは水、より好ましくは蒸留水に溶解させる。置換剤、架橋剤およびキレート剤などのすべての他の反応物は、好ましくは水溶性である。
【００２２】
第1の溶液または第2の溶液のいずれかは、イオノトロピー性ポリマーを含み得る。あるいは、好ましい実施態様において、両方の溶液が、イオノトロピー性ポリマーを含む。イオノトロピー性ポリマーは、各溶液において同一であり得る。
【００２３】
あるいは、第1および第2の溶液は、異なるイオノトロピー性ポリマーを含有し得る。この場合、得られるゲルは、異なるポリマーの混合物であり得る。
【００２４】
キレート剤（chelating agent）、またはキレート剤（chelator）は、金属イオンを封鎖することができる分子である。用いられ得るイオンキレート剤の例としては、合成キレート剤、例えばEDTA、EGTA、EDDA、CDTA、PDTA、BAPTA、HPED、TES、TRIS、トリシンおよびNTA；コンプレクソン；クラウンエーテル；ヒスチジン（histadine）；ヌクレオチド；ヌクレオシド；ポルフィリン；リン酸；クエン酸；シデロフォア；アミノ酸およびペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
選択されたイオノトロピー性ポリマーとヒドロゲルを形成する任意の架橋剤が用いられ得る。本明細書で用いられる用語架橋剤およびゲル化剤は、相互交換可能に用いられる。好ましくは、架橋剤は架橋イオンである。例えば、アルギン酸がポリマーとして用いられる場合、多価陽イオン、好ましくは二価金属イオンが用いられる。
【００２６】
置換剤（displacing agent）は、交換剤（exchange agent）としても知られており、架橋剤を放出するために第1のキレート剤と結合することができる任意の分子であり得る。したがって、第1および第2の溶液を混合する際に、置換剤は架橋剤と置き換わり、その後架橋剤が遊離されて、イオノトロピー性ポリマーを架橋し、その結果ヒドロゲルが形成される。置換剤は、反応を進めるために、架橋剤よりキレート剤に対して親和性が高いことが必須である。好ましくは、置換剤はイオン、より好ましくは多価金属イオンである。多価イオンは、一価イオンよりキレート剤に対して親和性が高い傾向がある。好ましくは、置換剤は、架橋剤と少なくとも同一またはより高い原子価を有する。
【００２７】
架橋剤および置換剤は、好ましくは多価イオンであり、架橋剤イオンは、置換剤イオンと異なる。好ましい実施態様において、架橋剤および置換剤は、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、VO2+、Cu2+、Ba2+、Ho3+、Mg2+、Mn2+、Sr2+、Zn2+、Pb2+、Co2+およびNi2+からなる群より選択される多価金属イオンより独立して選択される。最も好ましくは、架橋剤は、Ca2+を含む。最も好ましくは、置換剤は、Zn2+、Fe2+およびMn2+からなる群より選択される多価金属イオン、最も好ましくはZn2+を含む。架橋剤は、同一である必要はなく、すなわち、架橋剤の混合物であり得る。同様に、置換剤は、同一である必要はない。このような混合剤は、組成物のゲル化特性の制御を可能にする。
【００２８】
好ましくは、第1のキレート剤は、エチレンジアミン-N,N'-二コハク酸（EDDS）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミン-N,N'-二酢酸（EDDA）、プロピレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（PDTA）、1,2-シクロヘキサンジニトリロ四酢酸（CDTA）、エチレングリコール四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）、ヒドロキシフェニル-エチレンジアミン（HPED）、ニトリロ三酢酸（NTA）、ポルフィリン、クエン酸、リン酸、およびシデロフォア、より好ましくはエチレンジアミン-N,N'-二コハク酸（EDDS）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミン-N,N'-二酢酸（EDDA）、プロピレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（PDTA）および1,2-シクロヘキサンジニトリロ四酢酸（CDTA）からなる群より選択される。さらにより好ましくは、第1のキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、プロピレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（PDTA）および1,2-シクロヘキサンジニトリロ四酢酸（CDTA）からなる群より選択され、最も好ましくはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）である。
【００２９】
好ましくは、イオノトロピー性ポリマーは、アルギン酸、ペクチン、ポリ(ガラクツロン酸)、カラギーナン、デキストラン（および誘導体）、ゲラン、スクレログルカン、キトサン（および誘導体）、水溶性ポリホスファゼン、例えばポリ(ビス(4-カルボキシフェノキシ)ホスファゼン)、ポリアクリル酸ナトリウム、およびポリアミノ酸、より好ましくはアルギン酸、ペクチンおよびポリ(ガラクツロン酸)からなる群より選択され、最も好ましくはアルギン酸である。
【００３０】
特定の結合親和性についての公表されたデータは、容易に入手可能であり、ゲル化反応のための試薬の組合せを選択するために用いられ得る。例えば、HaugとSmidsroed（Acta Chemica Scandinavica, 1965, 19, 341）は、Ba2+が最低濃度を必要とし、Mg2+が最高濃度を必要とする、アルギン酸のゲル化をもたらすのに必要とされる二価陽イオンの次の系列を確立した：Ba＜Pb＜Cu＜Sr＜Cd＜Ca＜Zn＜Ni＜Co＜Mn、Fe＜Mg。この系列を十分研究されているイオンキレート剤（例えばEDTAおよびその誘導体）の親和性系列と比較することにより、アルギン酸系列は極めて異なり得ることが明らかになる。例えば、Zn2+およびMn2+は、アルギン酸と弱く結合するが、EDTAと強く結合する（それぞれLog K＝16.5および13.89）。したがって、このような親和性の差異、および本質的に動的である物理的イオン相互作用によりイオンが保持されるという事実は、対象とする高分子電解質へのゲル化イオンの利用能を制御するために活用され得る。例えば、表1は、Ca2+架橋イオノトロピー性ゲルの形成のために対象とするイオンの選択に関するいくつかの一般的なキレート剤およびそれらの親和性の要約を示す。他に断らない限り、25℃における、0.1Mのバックグラウンド電解質濃度（μ）、および[ML]/[M][L]の平衡指数における、選択した陽イオンおよびリガンドのLog K値が示され、これは他に断らない限り、Smith et al. Standard Reference Data, Standard Reference Data Program, National Institute of Standards and Technology, U.S. Dept. of Commerce, Gaithersburg, MD 2004から抜き出されたものである。各セルの陰影は、この陽イオン-リガンドの組合せがアルギン酸と組み合せて存在するならば、ゲルが形成するか、すなわちこの錯体の強度がCa-アルギン酸より弱いかを示す。
【００３１】
【表１】
2019510124.tif 000003
【表２】
2019510124.tif 000004
【００３２】
pH5超のCa-EDTA錯体含有アルギン酸溶液は、ゲルを形成せず、十分低い濃度のZn2+イオンを有するアルギン酸の溶液も形成しない。十分低いは、約9mM以下を意味するが、当業者は、必要とされるイオンの正確な量は用いられる種類およびアルギン酸の濃度に依存すると理解するだろう。5より低いpHにおいて、Ca2+の親和性は、アルギン酸に対してEDTAより高く、それ故にポリマーは架橋する。2つの溶液を一緒に混合するとき、ゲルはpH5超で形成する。これは、Zn2+に対するEDTAの親和性がCa2+より極めて高いので、EDTAによりキレートされたCa2+イオンは、速やかに遊離Zn2+イオンにより追い出され、置き換えられるという事実のためである。カルシウムイオンは放出され、遊離Ca2+がアルギン酸と強力に結合するため、混合すると速やかにゲルが形成する。ここで、Zn2+は、Ca-EDTA錯体における架橋イオン（Ca2+）と交換されるため、置換剤として作用する。pHを操作することにより、いつゲル化を生じるかを制御することが可能である。pH5未満では、アルギン酸は、EDTAよりCa2+に対して親和性が高く、それ故にアルギン酸と架橋する。当業者は、この値はキレート剤および／またはイオンに応じて変化すること、および用いられるpHもまたポリマーのPka値に依存することを理解するだろう。強アルカリ性のpHでは、Znが用いられる場合、ZnOHが沈殿する傾向がある。
【００３３】
好ましい実施態様において、イオノトロピー性ポリマーはアルギン酸であり、Ca2+が架橋剤として用いられ、Zn2+、Fe2+またはMn2+が置換剤として用いられる。本発明者らは、最低濃度のおよそ9mM Zn2+、12mM Fe2+またはMn2+が置換剤として用いられ、Ca2+が架橋剤として用いられるとき、ZnCl2、FeSO4またはMnCl2を含有する1％アルギン酸溶液は効率的にゲルを形成することを見出した。この溶液をCa-EDTA含有1％アルギン酸溶液と混合するとき、Ca-EDTAの濃度が少なくとも3mMのCa2+の最終濃度を提供するのに十分高ければ、数秒以内でゲルを形成する。Ca-EDTA含有アルギン酸溶液をZn2+、Fe2+またはMn2+水溶液の添加時にゲル化したとき、またはアルギン酸をゲル化するには弱すぎる（すなわち、およそ9mM Zn2+、または12mM Fe2+またはMn2+より低い）が、臨界Ca2+濃度の3mMを超える濃度であるZn-、Fe-またはMn-アルギン酸溶液にCa-EDTA水溶液を加えたとき、この観察結果が繰り返された。この系におけるゲル形成は、2つの溶液を混合した後の交換反応の反応速度により、かつ次の反応（Zn2+／Fe2+／Mn2+＋Ca-EDTA→Zn／Fe／Mn-EDTA＋Ca2+）に従い、決定される。
【００３４】
上記アプローチを用いて形成されるヒドロゲルは、極めて迅速に形成される。したがって、特に好ましい実施態様において、第2の溶液は、置換剤をキレートすることができる第2のキレート剤をさらに含む。好ましくは、反応を依然として進行させることができるように、第2のキレート剤は、i)ポリマーより置換剤に対して親和性が高く；ii)ポリマーより架橋剤に対して親和性が低く；およびiii)架橋イオンキレート剤より置換剤に対して親和性が低い。
【００３５】
置換剤はまた、ポリマーの架橋を防止するためにキレートされ得る。しかしながら、この目的のために用いられる第2のキレート剤は、架橋を生じさせることができるポリマー自体より架橋剤に対して親和性が低くなくてはならない。ポリマーは、置換イオンキレート剤より置換剤に対して親和性が低い。反応条件は、pHおよび温度を変更することによって架橋剤の放出を制御するために変更され得る。これは、ゲル化速度に対して良好な制御を可能にするため、特に有利である。さらに、このアプローチは、中性または生理学的（pH7.4）でもあり、それ故に生物学的用途に極めて適する規定された一定のpHにおいて用いられ得る。反応は、H+の消費と共に進行するため、小さなpH増加がしばしば生じる。一定のpHを維持するために、緩衝液が用いられ得る。図1は、2つのキレート剤を用いるリガンド交換ゲル化の概略図を示す。
【００３６】
第1および第2のキレート剤は、好ましくは、エチレンジアミン-N,N'-二コハク酸（EDDS、）エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミン-N,N'-二酢酸（EDDA）、プロピレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（PDTA）、1,2-シクロヘキサンジニトリロ四酢酸（CDTA）、エチレングリコール四酢酸（EGTA）、1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）、ヒドロキシフェニル-エチレンジアミン（HPED）、ニトリロ三酢酸（NTA）、2-[(2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル)アミノ]エタンスルホン酸、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-2-アミノエタンスルホン酸（TES）、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール（TRIS）、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン（トリシン）、ポルフィリン、クエン酸、リン酸、アミノ酸、ペプチドおよびシデロフォア、より好ましくはエチレンジアミン-N,N'-二コハク酸（EDDS）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミン-N,N'-二酢酸（EDDA）、プロピレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（PDTA）、1,2-シクロヘキサンジニトリロ四酢酸（CDTA）およびアミノ酢酸（グリシン）からなる群より独立して選択される。
【００３７】
第1のキレート剤は、より好ましくは、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミン-N,N'-二コハク酸（EDDS）、プロピレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（PDTA）および1,2-シクロヘキサンジニトリロ四酢酸（CDTA）からなる群より選択され、さらにより好ましくは、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）である。
【００３８】
第2のキレート剤は、より好ましくは、エチレンジアミン-N,N'-二コハク酸（EDDS）、アミノ酢酸（グリシン）およびエチレンジアミン-N,N'-二酢酸（EDDA）、さらにより好ましくは、エチレンジアミン-N,N'-二酢酸（EDDA）またはアミノ酢酸（グリシン）からなる群より選択されるか、またはそれらの混合物である。
【００３９】
試薬の特に好ましい組合せを下記表に示す。置換剤としてZn2+の使用が特に好ましい。しかしながら、同様に挙動する他のイオン、例えばCo2+およびNi2+が用いられ得る。イオノトロピー性ポリマーは、第1および／または第2の溶液中に存在し得る。好ましくは、イオノトロピー性ポリマーは、第1および第2の溶液の両方に存在する。
【表３】
2019510124.tif 000005
EDTA：エチレンジアミン四酢酸
EDDA：エチレンジアミン-N,N'-二酢酸
PDTA：プロピレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸
CDTA：1,2-シクロヘキサンジニトリロ四酢酸
EDDS：エチレンジアミン-N,N'-二コハク酸
【００４０】
好ましくは、用いられるpH範囲は次のとおりである：
【表４】
2019510124.tif 000006
【００４１】
第2のキレート剤の導入は、いくつかの利益を有する。第2のキレート剤の使用は、キレート化していないとき、ポリマー、好ましくはアルギン酸と完全に架橋するのに必要とされる濃度を超える高濃度の交換イオンを、ゲルを形成することなく、溶液に適用されることを可能にする。これは、強固なゲルを形成する高分子電解質またはポリマーの完全なゲル化を可能にするか、または任意の程度のゲル化を達成する反応の調節を可能にする。第二に、pHのより良好な制御を可能にする。遊離交換イオン、例えばZn2+、Fe2+およびMn2+の水溶液は、酸性である傾向があり、pHの上昇時に水酸化物塩を沈殿させる可能性が高い。しかしながら、イオンが完全にキレートされるとき、これは阻害され、ポリマー溶液を所望の、例えば生理学的なpHで緩衝化することを可能にする。また、イオンとキレート剤とポリマーの間の相対親和性がpHの関数として変化するため、今度はゲル形成の反応速度を決定する交換反応の速度は、pHに強く依存する。
【００４２】
EDTA／EDDAの組合せは、pH5〜8にてアルギン酸のCa2+架橋にうまく機能し、そのため、アルギン酸と比較してCa2+に対する同様の親和性を有する任意のポリマー、例えばペクチンおよびι-カラギーナンは、うまく機能する。
【００４３】
本発明の方法は、好ましくは5℃〜40℃、より好ましくは10℃〜30℃の間で実施される。0℃未満および100℃超の極端な温度は避けるべきである。好ましくは、方法は、4〜9、好ましくは6〜8、好ましくは6.5〜7.5、好ましくは7.2〜7.4のpHにて実施される。pHは、ゲル化反応の過程において、および／またはそれを開始するために、好ましくはこれらの範囲内で変化し得る。
【００４４】
好ましくは、第1の溶液中の第1のキレート剤の濃度は、2mM〜200mM、好ましくは3mM〜180mM、より好ましくは4mM〜120mM、さらに好ましくは5mM〜110mM、さらにより好ましくは10mM〜110mM、最も好ましくは15mM〜100mMの範囲である。好ましくは、用いられる場合の第2のキレート剤の濃度は、2mM〜200mM、好ましくは3mM〜180mM、より好ましくは4mM〜120mM、さらに好ましくは5mM〜110mM、さらにより好ましくは10mM〜110mM、最も好ましくは15mM〜100mMの範囲である。
【００４５】
好ましくは、第1の溶液中の架橋剤の濃度は、2mM〜200mM、好ましくは3mM〜180mM、より好ましくは4mM〜120mM、さらに好ましくは4mM〜110mM、さらにより好ましくは7mM〜110mM、最も好ましくは12mM〜100mMの範囲である。
【００４６】
好ましくは、第1の溶液中の置換剤の濃度は、2mM〜200mM、好ましくは3mM〜180mM、より好ましくは4mM〜120mM、さらに好ましくは4mM〜110mM、さらにより好ましくは7mM〜110mM、最も好ましくは12mM〜100mMの範囲である。置換剤は、架橋剤に匹敵する濃度であるべきである。置換剤の量は、混合時に放出される架橋剤の量を決定する。
【００４７】
最低濃度にて、ヒドロゲルは完全に架橋しないが、一方、過剰の架橋イオンは強固なゲルを提供する。例えば、最終ゲル化溶液中約4mM〜120mMの濃度のCa2+が、アルギン酸ヒドロゲルを形成するために用いられ得る。1％アルギン酸溶液を用いるとき、ヒドロゲルは、約4mMにて完全に架橋せず、濃度が約30mMになるまで完全に架橋しない。架橋イオンおよび置換イオンの120mMの使用は、アルギン酸を完全にゲル化するのに十分以上であるので過剰である60mMを最終調製物中提供する。アルギン酸溶液では、完全な架橋がα-L-グルロン酸（G）残基の数に応じて生じる特定の濃度は、G含有量としても知られる。当業者は、架橋剤および置換剤の正確な濃度が用いられるポリマーおよび用いられるポリマー濃度に依存すると理解する。例えば、1％超の濃度のアルギン酸ポリマーは、架橋剤のより高い濃度にて飽和する。
【００４８】
好ましくは、イオノトロピー性ポリマーは、0.1〜20wt/vol％の範囲の混合溶液中濃度であり、アルギン酸については、好ましくは0.5〜5wt/vol％である。
【００４９】
好ましくは、本発明の方法は、ポリマー、例えばアルギン酸を溶媒、好ましくは水中に溶解させることにより実施される。次に、架橋イオン（例えばCa2+）の水溶液を調製し、当該溶液の濃度は典型的には0.5〜1Mである。Ca2+を架橋イオンとして用いるとき、通常この溶液はCaCl2である。キレート剤の水溶液を調製する（例えば、EDTA溶液を、溶解させるためにNaOHを用いてpH＞5にて調製し、好ましくは0.5M、pH8である）。場合により、所望の範囲で活性である水性緩衝液を含み得る。例えば、MOPS（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）（pH6.5〜7.9）、またはHEPES（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸）（pH6.8〜8.2）を1Mの濃度にて用いて得る。MOPSは、この緩衝液が無視できる量の対象とするイオンと結合するため、特に好ましい。
【００５０】
架橋剤およびキレート剤、ならびに用いられる場合緩衝液を一緒に混合する。Ca2+、EDTAおよび緩衝液を混合するとき、モル比は、好ましくは1：1：0〜1：1：1であるべきであり、CaおよびEDTAは、好ましくは互いに等しくあるべきである。pHを好ましくは5〜9、好ましくは6.5〜7.5に調節する。好ましくはポリマー溶液と混合する前にpHを調節する。ポリマー溶液および架橋剤／キレート剤／緩衝液を比例して混合する。好ましくは、1％のアルギン酸濃度および12〜120mMのCaEDTA濃度、より好ましくは15〜100mMのCaEDTA濃度を有する溶液を得る。
【００５１】
次に、第2（ポリマー）の溶液を製造する。当該溶液は、好ましくは、第2のキレート剤、置換イオン、および場合によりイオノトロピー性ポリマーを含む。例えば、アルギン酸-ZnEDDA溶液。好ましくは、ポリマーは、水中で約3wt/vol％の濃度に溶解したアルギン酸である。次に、置換イオンの水溶液、例えばZn2+水溶液を調製し、当該溶液の濃度は、好ましくは0.5〜1Mである。最も好ましくは、Zn(CH3CO2)2の水溶液を用いる。次に、第2のキレート剤の水溶液を用意する。好ましくは、これは、溶解させるためにNaOHを用いたpH＞5のEDDA水溶液であり、典型的には0.5MおよびpH8である。場合により、所望の範囲で活性である水性緩衝液を用い得る。好ましくは、これは、1Mの濃度のMOPS（pH6.5〜7.9）またはHEPES（pH6.8〜8.2）であり得る。
【００５２】
置換剤および第2のキレート剤、ならびに用いられる場合緩衝液を混合する。好ましくは、Zn2+、EDDAおよび緩衝液を6：5：0〜6：5：6のモル比で混合する。EDDAは、好ましくはZn2+に対してわずかに過剰であるべきであり、好ましくは6：5の比率である。pHを好ましくは5〜9、より好ましくは6.5〜7.5に調節すべきである。好ましくはポリマー溶液と混合する前にpHを調節する。ポリマー溶液および置換剤／第2のキレート剤／緩衝液を混合する。好ましくは、1％のアルギン酸濃度および12〜120mM、より好ましくは15〜100mMのCaEDTA濃度、ZnEDDA濃度を有する溶液を得る。
【００５３】
ヒドロゲルを作成するために、好ましくはほぼ等しい割合の得られたポリマー溶液を混合する。好ましくは、アルギン酸-CaEDTAおよびアルギン酸-ZnEDDAを一緒に混合する。
【００５４】
同じゲル化原理を、2つの更なるイオノトロピー性ポリマーであるペクチンおよびポリ(ガラクツロン酸)に適用する。ポリ(ガラクツロン酸)は、アルギン酸よりCa2+に対して親和性が高く、それ故にCa-EDTAのこのポリマーとの混合は、軟弱なゲルを形成する。別のキレート剤、プロピレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（PDTA）および1,2-シクロヘキサンジニトリロ四酢酸（CDTA）の両方は、Ca2+およびポリ(ガラクツロン酸)と安定な溶液を形成し、それ故に、交換イオン、例えばZn2+および交換イオンキレート、例えばZn-EDDAまたはMn-EDDSと混合する際安定なゲルを形成することが見出された。EDTAの代わりにCDTAおよびPDTAを用いることは、アルギン酸およびペクチンの有用なゲルを作成するのが可能であるpH範囲をpH4〜7に低下させる。
【００５５】
提案するゲル形成機構を確認するために、電子常磁性分光法（EPR）をまた、アルギン酸の存在下Ca-EDTAのMn-EDTAへの反応をモニターするために用いた（図3）。常磁性イオンであり、EPR測定に適するため、この実験にMn2+を選択した。Mn-EDDA中に含有されるMn2+は、Mn-EDTA錯体中より極めて柔軟であると思われる（図3Aおよび3B参照）。ほぼ等しい割合のCa-EDTA含有アルギン酸およびMn-EDDA含有アルギン酸を混合すると、EPRスペクトルは、Mn-EDDA構造に似たものからMn-EDTA構造に似たものへシフトし（図3C）、Mn-アルギン酸と同様のEPRスペクトルを得られなかった（図3D）。
【００５６】
本発明の別の一態様において、上記の制御可能な方法により得ることができるかまたは得られる架橋ポリマーゲルが提供される。好ましくは、架橋ポリマーゲルは、ゲル化イオノトロピー性ポリマー、架橋剤、第1のキレート剤、第2のキレート剤および置換剤、ならびに水を含む。
【００５７】
本発明のヒドロゲルは、先行技術のヒドロゲルに対して多くの利点を有する。例えば、本発明の方法に従って形成されるヒドロゲルは、ゲル化前後にいずれの固形成分（ゲル自体は除く）も含有しない。このように、ゲルは、ゲル化を通じて光学的に透明なままである。さらに、ゲル化反応において、水またはガスを生成しない。これは、GDL-CaCO3法の主な制限であり、水形成およびそれに続くシネレシスのため大きなゲルおよび高ポリマー含有量のゲルを形成することが困難であり、副生成物として生成されるCO2は、ゲル中に閉じ込められた気泡を生じさせる。また、ゲル化時間は、極めてゆっくり（数時間）であり、GDLの分解に依存する。さらに、ゲル化を広範囲のpHにわたり実施し得て、これは緩衝液を用いて制御可能である。
【００５８】
本発明の更なる態様において、
i) 第1の溶液であって、該第1のポリマー溶液が架橋剤および第1のキレート剤を含む第1の溶液、
ii) 第2の溶液であって、該第2の溶液が置換剤を含む第2の溶液
を含む、パーツ・キットであって；第1または第2の溶液の少なくとも1つは、イオノトロピー性ポリマーを含有し；ここで
iii) イオノトロピー性ポリマーは、第1のキレート剤より架橋剤に対する親和性が低く、そして
iv) 第1のキレート剤は、架橋剤より置換剤に対する親和性が高い、
キットが提供される。
【００５９】
本発明者らはまた、本発明の架橋ゲルが液相中であって生体適合条件下で完全に反応物を用いて達成し得ることを見出した。架橋ゲルおよびその個々の構成成分の高い細胞適合性を図4および5に示す。さらに、本発明の方法は、数秒から数分までの経時的なゲル化を制御して、これにより多くの新しい適用を可能にするように改変し得る。したがって、本発明のまた更なる態様において、手動印刷、3D印刷または大規模成型用ゲルの製造における本発明による架橋ポリマーゲルの使用が提供される。
【００６０】
このような印刷組成物は、着色するかまたはこのような印刷された組成物を機能的に改変することができる染料および／または顔料を含有し得る。このような染料または顔料は、通常の量、例えば最終ゲル化組成物の0.01〜70wt％、好ましくは0.1〜20wt％、好ましくは0.2〜5wt％で存在する。染料または顔料は、好ましくは、本発明の方法による第1の溶液および／または第2の溶液に組み込まれる。好ましい実施態様において、導電性インクは、本発明による方法および組成物に組み込まれる。
【００６１】
本発明の架橋ポリマーゲルはまた、核磁気共鳴画像法において用いられ得る。ゲル製造における常磁性金属イオン、例えばFe2+、Mn2+、VO2+およびHo3+の使用は、核磁気共鳴画像法における造影を可能にし、これはこの材料を生物医学的用途において用いるのに役立つ。好ましくは、この金属イオンは、キレート剤と結合する置換剤であり、架橋剤を遊離させて、イオノトロピー性ポリマーと結合させる。このような常磁性金属イオンは、好ましくは、適切な画像化を提供するのに十分な量、例えば最終ゲル化組成物の0.01〜25wt％、好ましくは0.1〜10wt％、好ましくは0.2〜5wt％の範囲で存在する。常磁性金属イオンは、本発明の方法において用いられる置換剤の一部のみであり得て、すなわち、置換剤は、常磁性金属イオンと非常磁性金属イオンの混合物であり得る。
【００６２】
さらに、本発明の架橋ポリマーゲルは、治療において用いられ得る。本明細書で用いられる用語治療は、組織再生、1型糖尿病などの疾患の処置または予防、および重金属封鎖を含む。更なる実施態様において、本発明の架橋ポリマーを含む、治療における使用のための制御放出医薬製剤が提供される。本発明の架橋ポリマーを含む、経口製剤、注射剤または創傷被覆材もまた提供される。本発明のゲル化方法により生成される架橋ゲルおよび組成物の副生成物以外に、このような医薬組成物は、非経腸、経口または局所送達により送達するための従来の添加剤を含有する。
【００６３】
本発明の更なる態様において、本発明の架橋ポリマーゲル内に封入される、細胞または細胞群が提供される。本発明のヒドロゲルは、特に細胞治療に有用であり得る。pHを、封入される特定の細胞に対して当業者に公知の許容される範囲に維持すべきである。例えば、哺乳類細胞（例えばヒト細胞）は、典型的に7.4の中性付近pHに存在し、哺乳類細胞の組織培養の至適pHは、pH7.2〜7.4である。細胞は、pH6.6〜7.8の範囲で十分生存し得る。好ましくは、1つ以上の生細胞をアルギン酸に封入する。
【００６４】
本発明のまた更なる態様において、ヒドロゲルは、マイクロ流体デバイスにおいて用いられ得る。様々なマイクロ流体デバイスが公知であり、その中には、2つの水性成分でのエマルジョンの製造のための並行流（co-flow）領域を有するものがある。均一なゲルを得ると同時に、早期ゲル化によりマイクロ流路が塞がるのを避けることが困難であるため、小さな流路内でのヒドロゲルのゲル化は、現在のゲル化方法では大きな課題である。さらに、既存のゲル化方法は、細胞に有害である架橋方法、例えばCaEDTAおよび酢酸に依存する。
【００６５】
本発明の一実施態様において、本発明のイオン交換ゲル化技術は、高い細胞生存率および効率的なデバイスフレンドリーなゲル化での様々な異なる細胞タイプの容易な封入のために、マイクロ流体デバイス、好ましくは並行流マイクロ流体デバイスにおいて利用され得る。本発明は、優れた細胞生存率を提供し、非ゲル化およびゲル化溶液の両方が細胞適合性である。
【００６６】
細胞封入は、好ましくは液滴マイクロ流体デバイスにより実施される - すなわち、油、好ましくは過フッ化油、より好ましくは3MTM NovecTM 7500高機能性液体（HFE7500）が、界面活性剤、好ましくはフルオロ界面活性剤、より好ましくは生体適合性フルオロ界面活性剤と混合される制御されたエマルジョン化プロセスを、界面活性剤により安定化された前駆アルギン酸エマルジョンを形成する前に並行流領域で混合された2つのアルギン酸流（2つのキレートおよび細胞を含有する）を分けるために用いる。ゲル化は、好ましくは、細胞を封入した後これらのエマルジョン内で生じる。このアプローチは、頑健であり、操作が単純であり、並行流デバイスの場合マイクロ流体デバイスにおいて1つの更なる水性流、およびアルギン酸相に加えられる安価なキレートのみを必要とする。
【００６７】
マイクロ流体デバイス、好ましくは並行流マイクロ流体デバイスは、先行技術の方法に従って作成され得て、細胞試料が導入される。ポリマー溶液、好ましくはアルギン酸の2つの流れは、デバイスに入り、液滴生成の前に好ましくは等量で組み合される。10〜100μm、好ましくは30〜70μm、より好ましくは40〜60μm、さらにより好ましくは50〜55μmの狭い粒子径分布の一様な液滴を流体デバイスにおいて製造する。用いられ得るマイクロ流体デバイスの例を図6aに示す。図6bは、細胞の封入が生じるデバイスの領域の顕微鏡写真を示す。図6cおよび6dは、この方法により製造される封入哺乳類細胞を含有する最終ゲルビーズを示す。アルギン酸のゲル化は、アルギン酸および他のイオノトロピー性ポリマーのマイクロヒドロゲルにおいて細胞フレンドリーな、pH非依存性でマイクロ流体適合性の細胞封入を達成する、本発明のリガンド交換方法に依存する。製造される細胞負荷ゲルは、好ましくは均一で単分散であり、いくつかの異なる細胞タイプについての封入および洗浄後の優れた細胞生存率および生存により示されるように、極めて生体適合性である。
【００６８】
これを実証するために、細胞がマイクロコロニーを形成し、マイクロゲル閉じ込めを回避するまで、マイクロゲル中で天然蛍光シアノバクテリアのシネコシスティス種PCC 6803およびクラミドモナス・レインハーディCC-4532藻類の成長をモニターした。純粋培地中の細胞増殖は、我々の封入細胞について観察された速度のものと一致した。ヒドロゲルの回収およびその後の洗浄後に標準的な生存／死滅染色アッセイを用いて、封入された哺乳類前骨芽細胞の高い細胞生存率（最大90％）を達成した。図7は、アルギン酸ヒドロゲルビーズに封入されたシアノバクテリアのシネコシスティス種PCC 6803の顕微鏡写真を示す。封入後、ビーズをファルコンチューブ中のBG 11培地において30℃にて連続照明下で軽く撹拌しながら貯蔵した。画像化のために、ビーズを含有する培地の液滴をカバーガラス上に置き、第2のカバーガラスをその上に置いた。試料の画像を、封入0時間、24時間、48時間、72時間、1週間および2週間後にとった。バクテリアはアルギン酸構造内で分裂する。2週間後、バクテリアコロニーは、ビースから飛び出し、漏れ出すのに十分なほど大きい。すべての画像を20倍のレンズを用いてLeica SP5共焦点顕微鏡でとる。画像は、明視野と、藻類により生成されるクロロフィルの自己蛍光を捕捉する蛍光画像を重ねた画像である。スケールバー：20μm。図8は、アルギン酸ビーズに封入された藻類のクラミドモナス・レインハーディCC-4532の顕微鏡写真を示す。封入後、ビーズをファルコンチューブ中の培地（TAP - トリスPO4およびトリスAcPO4培地）において保存し、18℃にて連続照明下で軽く撹拌しながら貯蔵した。画像化のために、ビーズを含有する培地の液滴をカバーガラス上に置き、第2のカバーガラスをその上に置いた。試料の画像を、封入0(a)、24(b)、48(c)および72(d)時間後にとった。藻類はアルギン酸構造内で分裂する。72時間後、藻類コロニーはビーズから漏れ出すのに十分なほど大きい。すべての画像を20倍のレンズを用いてLeica SP5共焦点顕微鏡でとる。画像は、明視野と、藻類により生成されるクロロフィルの自己蛍光を捕捉する蛍光画像を重ねた画像である。スケールバー：20μm。
【００６９】
本発明の一実施態様において、イオノトロピー性ゲル化以外の方法（すなわち化学的または熱的架橋）によって架橋してヒドロゲルを形成することができる1つ以上の更なるポリマーを、本発明のポリマー調製物と混合する。このような更なるポリマーは、好ましくは水溶性である。1つ以上の更なるポリマーは、ゲル化の開始前に個々の前駆溶液いずれかまたは両方に加えられ得る。好ましくは、1つ以上の更なるポリマーは、タンパク質、ポリペプチド、グリコサミノグリカン、ポリサッカライド、ポリオール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリホスファゼン、ポリアミドおよびポリアクリルアミドのリストから選択される。さらにより好ましくは、1つ以上の更なるポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリウレタン、ポリビニルピロリドン（PVP）、ヒアルロン酸、キトサン誘導体、ポリアクリル酸（PAA）、ポリビニルアルコール（PVA）、コラーゲン、ゼラチン、および種々のポリサッカライドのリストから選択される。更なるポリマーを、本発明のゲル調製物内に分散させる。本発明の競合的リガンド交換ゲル化技術によるゲル化の際、更なるポリマーを形成されるゲル内で鋳型にし、その後別の方法により架橋し得る。これは、架橋方法の制限により、この技術にこれ以外の方法では適さないゲルのプロットおよび3D印刷に特に有用性がある。
【００７０】
図9は、このような複数のポリマー調製物のレオロジー分析を示す。ここで、溶解させたI型コラーゲン溶液を、イオンおよびキレートを含有するアルギン酸と混合する。弱酸（例えば、約pH4の酢酸）に溶解させたコラーゲンは、架橋し、ヒドロゲルを形成するために37℃で中性付近のpHにて温和な加熱を必要とし、4℃の中性pH溶液にて約10〜20分以内になされ、数時間で架橋しない。両方がコラーゲンを含有するが、1つはキレート化架橋イオンを含有し、他方はキレート化置換イオンを含有する、2つのアルギン酸溶液を、レオメーターにおいて4℃にて一緒に混合した。この温度を30分間保持し、この時間により、試料の弾性率の顕著な上昇によって証拠づけられるように、本発明により開示されるゲルが形成した。30分後、温度を急速に（2分以内に）37℃に上昇させ、これにより、温度効果により誘導される最初の低下後の試料の弾性率の第2の上昇によって示されるように、その後コラーゲンが架橋した。このような調製物は、細胞接着性ポリマー、例えばコラーゲンを鋳型にするのに有用であり、このアプローチは、図10に示すように3Dで接着細胞を培養するのに用いられた。
【実施例】
【００７１】
実施例1：
CaEDTA／ZnEDDA、1％アルギン酸ヒドロゲルを以下のように調製した：
【００７２】
アルギン酸-CaEDTA溶液の調製：
i) アルギン酸を水中に3wt/vol％の濃度に溶解させて、アルギン酸ストックを製造した；
ii) 1Mの濃度を有するCaCl2水溶液を調製した；
iii) NaOHを用いてEDTA水溶液（0.5M、pH8〜9）を調製した；
iv) 1Mの濃度にてMOPS（pH7.0）を用いて水性緩衝液を調製した；
v) 次に、Ca2+、EDTAおよび緩衝液を1：1：1のモル比で混合した；
vi) pHをpH7.0に調節した；
vii) アルギン酸ストックを、1％アルギン酸濃度および60mM Ca2+／EDTA／MOPSが得られる割合でCaEDTA-緩衝液と混合した。
【００７３】
アルギン酸-ZnEDDA溶液の調製：
i) アルギン酸を水中に3wt/vol％の濃度に溶解させて、アルギン酸ストックを製造した；
ii) 1Mの濃度を有するZn(CH3CO2)2水溶液を調製した；
iii) NaOHを用いてEDDA水溶液（0.5M、pH8〜9）を調製した；
iv) 水性緩衝液を調製した。1Mの濃度にてMOPS（pH7.0）を用いた；
v) Zn2+、EDDAおよび緩衝液を5：6：5のモル比で混合した；
vi) pHを7.0に調節した；
vii) アルギン酸ストックを、1％アルギン酸濃度および60mM Zn2+／72mM EDDA／60mM MOPSが得られる割合でZnEDDA-緩衝液と混合した。
【００７４】
ヒドロゲルの調製
等しい割合のアルギン酸-CaEDTAおよびアルギン酸-ZnEDDAを一緒に混合して、ヒドロゲルを製造した。
【００７５】
実施例2：
細胞を以下のように区画化し得る。好ましくは、低粘度ヒドロフルオロエーテル（例えば、高いガス輸送を提供し、PDMSデバイスの膨張を回避する3MTM NovecTM 7500高機能性液体（HFE7500））を連続相として用いた。フルオロ界面活性剤（この場合、2％(v/v) Krytox（登録商標）-PEG600ベースのフルオロ界面活性剤）を連続相へ加えて、液滴破壊を促進し、エマルジョンを安定化し、凝集を回避した。2つの分散相を用いた：(1)84mM Ca2+／84mM EDTA／40mM MOPSを含有する0.6％(wt)アルギン酸、pH6.7および(2)84mM Zn2+／100mM EDDA／40mM MOPSを含有する0.6％(wt)アルギン酸、pH6.7。2つの水相は、液滴破壊の前にマイクロ流体の流路中の並行流領域において出会う。
【００７６】
Harvard Apparatus製のシリンジポンプ（PHD ULTRA）に取り付けられたプラスチックシリンジを用いた制御注入により、流速を連続相については200μL/時間に、両方の水相については50μL/時間に設定した。分散相に用いられるシリンジは、磁石を含み、細胞の沈降を回避するため連続的に撹拌した。細胞は、両方の水相に存在して、封入効率を上昇させ得る。
【００７７】
実施例3：
CaEDTA／ZnEDDA、0.4％アルギン酸、1％I型コラーゲンヒドロゲルを以下のように調製した：
【００７８】
アルギン酸-CaEDTA-コラーゲン溶液の調製：
i) アルギン酸を水中に3wt/vol％の濃度に溶解させて、アルギン酸ストックを製造した；
ii) 1Mの濃度を有するCaCl2水溶液を調製した；
iii) NaOHを用いてEDTA水溶液（0.5M、pH8〜9）を調製した；
iv) 1Mの濃度にてMOPS（pH7.0）を用いて水性緩衝液を調製した；
v） 次に、Ca2+、EDTAおよび緩衝液を1：1：1のモル比で混合した；
vi) pHをpH7.4に調節した；
vii) アルギン酸ストックを、0.6％アルギン酸濃度および36mM Ca2+／EDTA／MOPSが得られる割合でCaEDTA-緩衝液と混合した；
viii) アルギン酸-CaEDTA溶液を4℃に冷却した；
ix) 次に、低温（4℃）の3wt/vol％の、20mM酢酸に溶解させたI型コラーゲン（ラットの尾部から）を、1：2の体積比にて低温アルギン酸-CaEDTA溶液に加えた。
【００７９】
アルギン酸-ZnEDDA-コラーゲン溶液の調製：
i) アルギン酸を水中に3wt/vol％の濃度に溶解させて、アルギン酸ストックを製造した；
ii) 1Mの濃度を有するZn(CH3CO2)2水溶液を調製した；
iii) NaOHを用いてEDDA水溶液（0.5M、pH8〜9）を調製した；
iv) 1Mの濃度にてMOPS（pH7.0）を用いて水性緩衝液を調製した；
v） 次に、Zn2+、EDDAおよび緩衝液を1：1：1のモル比で混合した；
vi) pHをpH7.4に調節した；
vii) アルギン酸ストックを、0.6％アルギン酸濃度および36mM Zn2+／EDDA／MOPSが得られる割合でZnEDDA-緩衝液と混合した；
viii) アルギン酸-ZnEDDA溶液を4℃に冷却した；
ix) 次に、低温（4℃）の3wt/vol％の、20mM酢酸に溶解させたI型コラーゲン（ラットの尾部から）を、1：2の体積比にて低温アルギン酸-ZnEDDA溶液に加えた。
【００８０】
アルギン酸-コラーゲンヒドロゲルの調製
等しい割合のアルギン酸-CaEDTA-コラーゲンおよびアルギン酸-ZnEDDA-コラーゲンを4℃にて一緒に混合し、37℃に温めて、ヒドロゲルを製造した。
【図１】
2019510124.tif 000008
【図２】
2019510124.tif 000009
【図３】
2019510124.tif 000010
【図４】
2019510124.tif 000011
【図５】
2019510124.tif 000012
【図６】
2019510124.tif 000013
【図７】
2019510124.tif 000014
【図８】
2019510124.tif 000015
【図９】
2019510124.tif 000016
【図１０】
2019510124.tif 000017
【国際調査報告】
2019510124.tif 000018
2019510124.tif 000019
2019510124.tif 000020
2019510124.tif 000021