(57)【要約】  生体適合性ポリマーおよび機能性金属ナノ構造体を含む生体適合性ポリマーナノ粒子であって、生体適合性ポリマーが、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）であり、機能性金属ナノ構造体が、少なくとも１つの貴金属もしくは少なくとも１つの磁性金属酸化物、またはそれらの混合物を含む、生体適合性ポリマーナノ粒子。生体適合性ポリマーナノ粒子の平均径が、２００ｎｍ以下、好ましくは１５０ｎｍ以下である。生体適合性ポリマーナノ粒子は、画像診断解析、特に磁気共鳴撮像解析もしくは光音響解析における造影剤として使用され得、または諸形態のがんの治療に使用され得、この使用は有効成分と組み合わされた形であってもよい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性ポリマーおよび機能性金属ナノ構造体を含む生体適合性ポリマーナノ粒子であって、
前記生体適合性ポリマーが、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）であり、
前記機能性金属ナノ構造体が、少なくとも１つの貴金属もしくは少なくとも１つの磁性金属酸化物、またはそれらの混合物を含み、
前記生体適合性ポリマーナノ粒子の平均寸法が、２００ｎｍ以下、好ましくは１５０ｎｍ以下である、
生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項２】
７０質量％〜９９質量％、好ましくは８０質量％〜９５質量％のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、および１質量％〜３０質量％、好ましくは５質量％〜２０質量％の機能性金属ナノ構造体を含み、百分率が前記ナノ粒子の総質量に対して計算される、請求項１に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項３】
前記ＰＨＡの質量平均分子量（Ｍw）が、５，０００〜１，５００，０００Ｄａ、好ましくは１００，０００〜１，０００，０００Ｄａである、請求項１または２に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項４】
前記機能性金属ナノ構造体が、金（Ａｕ）をベースとする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項５】
前記機能性金属ナノ構造体が、貴金属ベースナノ構造体であり、ナノ球体、ナノロッド、ナノスター、ナノワイヤー、ナノケージまたはナノプレートレットの形態であり、平均寸法が１ｎｍ〜１００ｎｍの間、より好ましくは３〜８０ｎｍの間に含まれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項６】
前記機能性金属ナノ構造体が、金ナノロッド（ＧＮＲ）である、請求項５に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項７】
前記金ナノロッドの平均長が１０〜１００ｎｍ、平均幅が２〜２５ｎｍである、請求項６に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項８】
前記機能性金属ナノ構造体が、強磁性金属酸化物ベースナノ構造体、好ましくはマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）またはマグヘマイト（γ−Ｆｅ2Ｏ3）であり、Ｆｅとは異なる少なくとも１つの遷移金属、特にＭｎ、Ｃｏ、Ｚｎでドープされていてもよい、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項９】
前記強磁性金属酸化物をベースとする機能性金属ナノ構造体の平均寸法が、１ｎｍ〜８０ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜５０ｎｍである、請求項８に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項１０】
前記機能性金属ナノ構造体が、表面上に少なくとも１つの疎水化剤を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項１１】
前記疎水化剤が、チオールＲ−ＳＨであり、ここで、Ｒは、飽和または不飽和で、脂肪族および／または芳香族であり、４〜２８個の炭素原子を有し、エステル基、アミド基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基などの官能基で置換されていてもよい炭化水素基である、請求項１０に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項１２】
前記疎水化剤が、カルボン酸、アルコール、ポリオール、もしくは長鎖アミン（通常Ｃ8−Ｃ28）、またはそれらの誘導体から選択される、請求項１０に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項１３】
少なくとも１つの界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの界面活性剤が、１質量％〜１０質量％の間、好ましくは３質量％〜６質量％の間に含まれる量で存在し、百分率が前記ナノ粒子の総質量に対して測定される、請求項１３に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項１５】
前記機能性金属ナノ構造体が、金ナノロッドおよび磁性ナノ粒子の混合物からなる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項１６】
少なくとも１つの有効成分、好ましくは少なくとも１つの抗腫瘍剤をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子を調製する方法であって、
乳濁液を調製する工程であって、前記乳濁液が、（ａ）機能性金属ナノ構造体が分散している、少なくとも１つの有機溶媒中のＰＨＡの溶液を含む疎水性相、（ｂ）水性相、および（ｃ）少なくとも１つの界面活性剤を含む、工程、
前記乳濁液に超音波処理（ソニケーション）を施す工程、
ソニケーション後に前記少なくとも１つの有機溶媒を前記乳濁液から蒸発させ、前記金属ナノ構造体を組み込んだ生体適合性ポリマーナノ粒子の懸濁液を得る工程
を含む方法。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子を調製する方法であって、
少なくとも１つの有機溶媒中のＰＨＡの溶液を調製する工程、
少なくとも１つの界面活性剤の存在下で、水性媒体中の金属ナノ構造体の懸濁液を調製する工程、
前記ＰＨＡの溶液を前記金属ナノ構造体の懸濁液に接触させ、前記金属ナノ構造体を組み込んだ生体適合性ポリマーナノ粒子の懸濁液を得る工程
を含む方法。
【請求項１９】
画像診断解析、特に磁気共鳴または光音響による画像解析における造影剤として使用するための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【請求項２０】
有効成分と組み合わされていてもよい、諸形態のがんの治療に使用するための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマーナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性金属ナノ構造体を含有する生体適合性ポリマーナノ粒子、その調製方法、ならびに診断分野および／または治療分野における相対的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学分野において、特に腫瘍学の分野において、診断機能および治療機能を同時に発揮する非侵襲的システムの必要性が強く意識される。これらのシステムは、通常「セラノスティック剤（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）」と呼ばれる。セラノスティック剤は、疾患組織に選択的に局在化するので、疾患のより正確な診断を可能とし、有効成分の制御放出も可能とする。本態様において、例えばD. Gentili et al, Chem. Commun., 2009, 5874-5876の論文を参照すべきであるが、この論文において、金ナノロッド（ＧＮＲ）を含有するポリエチレングリコールコポリマー（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）をベースとするナノ構造体を調製するための二相間移動法が記載されている。
ＧＮＲは、２つの異なるプラズモン共鳴帯を有するために医学分野において高い関心を集めている機能性円筒状ナノ構造体であり、２つの異なるプラズモン共鳴帯の１つは、ロッドの短軸上の電子の振動に起因し、およそ５２０ｎｍとなり、一方、もう１つは長軸上の電子の振動に起因し、より高い波長のおよそ７００ｎｍとなる。ロッドのアスペクト比（長さ／幅比）が増加すると、電子の縦振動に関する波長は、近赤外（ＮＩＲ：ｎｅａｒ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｗｉｎｄｏｗ）域にまで達するさらに高い値（８００〜１２００ｎｍ）に移動し得る。このように水やヘモグロビンにより、それゆえに、人体の組織により光放射が非常に僅かしか吸収されない、いわゆる「生体の窓（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｗｉｎｄｏｗ）」に波長が重なるので、臨床的生体医学の分野におけるＧＮＲの使用の可能性は大きく広がる。
多くの光学的機械法により、ＧＮＲは細胞内で可視化でき、画像診断の分野において造影剤として作用する。特に、ＧＮＲは光音響イメージングの適用に対して理想的な特性を有するのと同時に、特定の局所表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）の周波数でレーザーにより照射される場合、熱の形態で急速に移動する吸収光の割合のため、組織が位置する場所での組織の熱アブレーション（ｔｈｅｒｍｏａｂｌａｔｉｏｎ）は、選択的な加熱（ｂｕｒｎｉｎｇ）により得ることができ、したがって治療的であることが証明される。
目的とする他の機能性金属ナノ構造体は、磁性酸化鉄ナノ粒子（マグネタイトまたはマグヘマイト）であり、必要な生体適合性の特性を満たすことから生物学的な用途に広く使用される。特に、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）は、造影手段として、したがって、がんの診断のための磁気共鳴撮像法（ＭＲＩ）におけるイメージング剤として使用される。磁性ナノ粒子を、体内に直接注射して腫瘤に到達させ、交流磁場により加熱することができる。「温熱療法」と呼ばれるこの技術は、開発段階にあり、がん細胞を選択的に破壊できることから治療分野において高い関心を集めている。これに関して、G. Baldi et al, Intl. J. Nanomedicine, 2014:9, 3037-3056の論文を参照すべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
機能性金属ナノ構造体を人体内に運搬するために、前記ナノ構造体は、患者において望ましくない全身的な影響を避けるために生体適合性が高く、同時に、有意な量のナノ構造体を、その機能的特性を変更することなく、またナノ構造体を向かわせる細胞および／または組織との相互作用が有利になるように充填することが可能である媒体に充填する必要がある。さらに、ナノテクノロジーに典型的な寸法に関連する利点を失わないため、全身循環中に、疾患により影響を受けた細胞および／または組織に到達するように効果的な放出を可能にするために、担体も好適なナノメートル内（通常２００ｎｍ未満）の寸法である必要がある。
最終的に、ポリマーナノ粒子は、それらの機能性を危うくし、したがって有効性を危うくし得る分散媒体から有意な凝集や分離の現象を起こすことなく、経時的に安定である必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
出願人は、ここで、機能性金属ナノ構造体がポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）のナノ粒子に充填でき、これは生体適合性が高く、機能性金属ナノ構造体の生体機能性（ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を変更することなく機能性金属ナノ構造体の効果的な担体として作用することを見出した。
したがって、第１の態様によると、本発明は、生体適合性ポリマーおよび機能性金属ナノ構造体を含む生体適合性ポリマーナノ粒子であって、
生体適合性ポリマーが、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）であり、
機能性金属ナノ構造体が、少なくとも１つの貴金属もしくは少なくとも１つの磁性金属酸化物、またはそれらの混合物を含み、
生体適合性ポリマーナノ粒子の平均径が、２００ｎｍ以下であり、好ましくは１５０ｎｍ以下である、生体適合性ポリマーナノ粒子に関する。
別の態様によると、本発明は、画像診断解析、特に磁気共鳴撮像解析または光音響解析における造影剤として使用するための、上で定義された生体適合性ポリマーナノ粒子に関する。
別の態様によると、本発明は、有効成分に関連し得る、諸形態のがんの治療に使用するための、上で定義された生体適合性ポリマーナノ粒子に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、健康な実験用マウスにおけるＰＨＢ＋マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）ナノ粒子の生体分布のＭＲＩ画像を示す。
【図２】図２は、様々な臓器におけるナノ粒子の吸収によるＳＩＲ百分率の平均のグラフ表示である。
【図３】図３は、健康な実験用マウスにおけるＰＨＢ＋マンガンフェライト（ＭｎＦe2Ｏ4）ナノ粒子の生体分布のＭＲＩ画像を示す。
【図４】図４は、様々な臓器におけるナノ粒子の吸収によるＳＩＲ百分率の平均を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、自然環境から単離された微生物または遺伝子組換え微生物により生成されたポリマーであり、これは炭素およびエネルギーのリザーブとして働き、好ましくない増殖条件下および過剰な炭素源の存在下で、様々な細菌により蓄積される。ＰＨＡは、９０超のグラム陽性およびグラム陰性細菌属、例えばバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ロドスピリルム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に含まれる、約３００種の様々な微生物種により合成され蓄積される。ＰＨＡは、細胞内に微粉末粒子の形態で貯蔵され、細胞当たりの大きさや数は細菌種ごとに異なる。
ＰＨＡは、通常、下記の式を有する繰返し単位を含有するポリマーである。
−Ｏ−ＣＨＲ1−（ＣＨ2）n−ＣＯ−    （Ｉ）
（式中、
Ｒ1は、−Ｈ、Ｃ1−Ｃ12アルキル、Ｃ4−Ｃ16シクロアルキル、Ｃ2−Ｃ12アルケニルから選択され、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ）、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＲ、−ＣＯＯＲ（Ｒ＝Ｃ1−Ｃ4アルキル、ベンジル）から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよく、
ｎは、０または１〜６の整数であり、好ましくは１または２である）
Ｒ1は好ましくはメチルまたはエチルであり、ｎは１または２である。
【０００７】
ＰＨＡは、ホモポリマーまたはコポリマーまたはターポリマーのいずれかであり得る。コポリマーまたはターポリマーである場合、これらは、式（Ｉ）を有する様々な繰返し単位、または、ヒドロキシアルカノエートと共重合できるコモノマー、例えばラクトンもしくはラクタム由来の少なくとも１つの繰返し単位と組み合わされた式（Ｉ）を有する少なくとも１つの繰返し単位から構成され得る。後者の場合、式（Ｉ）を有する繰返し単位は、繰返し単位の総モル数に対して少なくとも１０モル％に等しい量で存在する。
特に好ましい式（Ｉ）を有する繰返し単位は、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバリレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシウンデカ−１０−エノエート、４−ヒドロキシバリレートに由来するものである。
【０００８】
ＰＨＡは、モノマー単位を形成する炭素原子数に応じて下記の３つの群に分けることができる。ＰＨＡｓｃｌ（短鎖長）は３〜５の炭素原子を有するモノマー単位から構成され、ＰＨＡｍｃｌ（中鎖長）は６〜１５の炭素原子を有するモノマー単位から構成されるのに対して、ＰＨＡｌｃｌ（長鎖長）は１５超の炭素原子を有するモノマー単位から構成される。ＰＨＡｓｃｌは結晶度が高いのに対して、ＰＨＡｍｃｌおよびＰＨＡｌｃｌは結晶度の低いエラストマーであり、融点が低い。
特に好ましいＰＨＡは、ポリ−３−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ−３−ヒドロキシバリレート（ＰＨＶ）、ポリ−３−ヒドロキシヘキサノエート（ＰＨＨ）、ポリ−３−ヒドロキシオクタノエート（ＰＨＯ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＢＨ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシオクタノエート−ｃｏ−３−ヒドロキシウンデカ−１０−エノエート）（ＰＨＯＵ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバリレート−ｃｏ−４−ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶＶ）、またはそれらの混合物である。
【０００９】
ＰＨＡの質量平均分子量（Ｍw）は、好ましくは５，０００〜１，５００，０００Ｄａ、より好ましくは１００，０００〜１，０００，０００Ｄａの範囲である。質量平均分子量は、公知の技術により、特にＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）解析またはＤＳＣ（示差走査熱量測定）解析を用いて決定できる。
ＰＨＡの生成に関する限り、これは、好ましくは、ＰＨＡを生成し、その後、細胞集団からＰＨＡを回収できる微生物の株を用いて、有機基質（例えば、炭水化物またはグリセロールなどの他の発酵性基質）の微生物発酵により得られる。さらなる詳細は、例えば、ＷＯ９９／２３１４６、ＷＯ２０１１／０４５６２５、およびＷＯ２０１５／０１５３１５を参照すべきである。発酵を介するＰＨＡの生成に好適な基質は、特に野菜の加工、例えばテンサイ加工およびサトウキビからの果汁、糖液、果肉から得ることができる。これらの基質は通常、ショ糖および他の炭水化物に加え、有機成長因子、窒素、亜リン酸および／または細胞の成長に有用な栄養素としての他の鉱物を含有する。代替として、バイオディーゼル生成時の副産物である、安価の有機炭素源であるグリセロールがあるが、これはレブリン酸と混合して用いられ得る（例えば、米国特許第８９５６８３５号（Ｂ２）を参照のこと）。
【００１０】
機能性金属ナノ構造体に関して、これらは少なくとも１つの貴金属または少なくとも１つの磁性金属酸化物を含む。貴金属が好ましくは金（Ａｕ）であり、一方、磁性金属酸化物は、好ましくは強磁性金属酸化物、好ましくはマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）またはマグヘマイト（γ−Ｆｅ2Ｏ3）であり、Ｆｅとは異なる少なくとも１つの遷移金属、特にＭｎ、Ｃｏ、Ｚｎでドープされていてもよい。
機能性金属ナノ構造体は、様々な形態を有し得、特にナノ球体、ナノロッド、ナノスター、ナノワイヤー、ナノケージまたはナノプレートレットの形態であり得る。これら機能性ナノ構造体の平均径は、好ましくは１ｎｍ〜１００ｎｍ、より好ましくは３〜８０ｎｍの範囲である。
機能性金属ナノ構造体は、より好ましくは金ナノロッド（ＧＮＲ）および磁性ナノ粒子、またはそれらの混合物から選択される。
金ナノロッドに関して、これらは、好ましくは１０〜１００ｎｍ、より好ましくは３０〜８０ｎｍの平均長の範囲および、２〜２５ｎｍ、より好ましくは５〜１５ｎｍの平均幅を有する。
金ナノロッドは、長さと幅との間の比で定義されるアスペクト比が、好ましくは２〜２０、より好ましくは３〜１０の範囲である。
【００１１】
本発明で使用され得る機能性金属ナノ構造体は、通常、市販されている製品であるか、または公知の技術により調製され得る。市販の製品に関する限り、例えばＮａｎｏｐａｒｔｚ社およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のカタログを参照すべきである。
金ナノロッドは、例えば硬いテンプレートを使用することで、または好適な界面活性剤（シード介在成長（ｓｅｅｄ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ））によって調製され得る。前者の場合、テンプレートとして使用されるのは、無機材料（特に酸化物）、または、実質的に円筒状の孔を有するポリマー材料であり、これらでは金属の堆積によりナノロッドが成長する。後者の場合、ナノロッドは、好適な界面活性剤の存在下の水性または非水性媒体で、特に、水性環境でのヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）または非水性環境でのトリオクチルホスフィンオキシドで成長する。さらなる詳細は、例えば、B. Nikoobakht et al, Chem. Mater., 2003, 15, 1957-1962の論文、またはD. Gentili et al, Chem. Commun., 2009, 5874-5876の上述の論文を参照すべきである。
【００１２】
磁性ナノ構造体に関して、これらは通常、実質的に球状ナノ粒子の形態であり、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）またはマグヘマイト（γ−Ｆｅ2Ｏ3）から構成され、Ｆｅとは異なる少なくとも１つの遷移金属、特にＭｎ、Ｃｏ、Ｚｎ、より好ましくはＭｎ（ＭｎＦｅ2Ｏ4）でドープされていてもよい。これらの平均径は、好ましくは１ｎｍ〜８０ｎｍ、より好ましくは１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲である。
磁性ナノ構造体は、公知の技術により、例えば金属カルボニルの熱分解により調製され得る。例えば、K. Woo et al, Chem. Mater., 2004, 16, 2814-2818およびS. Sun et al, J. Am. Chem. Soc., 2004, 126(1), 273-279の論文を参照すべきである。
上で定義されたナノ粒子およびナノ構造体の寸法は、公知の技術により、特に動的光散乱（ＤＬＳ）解析、ＴＥＭ（透過電子顕微鏡）画像解析によって、または紫外可視（ＵＶ−Ｖｉｓ）分光法によっても決定できる。
機能性金属ナノ構造体は、好ましくは表面上に少なくとも１つの疎水化剤を有する。前記薬剤は、ポリマー自体への前記ナノ構造体の埋め込みが有利になるように、金属ナノ構造体とＰＨＡナノ粒子の親油性部分との間の親和性を増大する機能を有する。この機能を発揮するために最も好適な疎水化剤は、主に、金属ナノ構造体の種類に関連して選択される。疎水化剤が、金属ナノ構造体の表面との相互作用を可能とする少なくとも１つの基で官能化され、ＰＨＡとの相互作用が有利になるのに十分な長さを有する炭化水素鎖を有するからである。
【００１３】
ＧＮＲの場合、例えば、疎水化剤は好ましくはチオールＲ−ＳＨであり、ここで、Ｒは、飽和または不飽和で、脂肪族および／または芳香族であり、炭素原子４〜２８個を有し、エステル基、アミド基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基などの官能基で置換されていてもよい炭化水素基である。
磁性ナノ構造体の場合、疎水化剤は、好ましくは、カルボン酸、アルコール、ポリオール、もしくは長鎖アミン（通常Ｃ8−Ｃ28）、またはこれらの誘導体で、例えば、オレイン酸、オレイン酸アミン、カテコールの誘導体および炭水化物誘導体から選択される。
疎水化剤は、既に金属ナノ構造体が生成されている場合は金属ナノ構造体に添加でき、または、好ましくはナノ構造体の調製が行われる媒体に添加する。
本発明によるポリマーナノ粒子は、好ましくは７０質量％〜９９質量％、より好ましくは８０質量％〜９５質量％のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、および１質量％〜３０質量％、より好ましくは５質量％〜２０質量％の機能性金属ナノ構造体を含み、この百分率はナノ粒子の全質量に対して計算される。
好ましい実施形態において、本発明によるポリマーナノ粒子はまた、好ましくは少なくとも１つの界面活性剤、より好ましくは非イオン性界面活性剤を含む。界面活性剤の存在が、水性媒体、例えば生理的溶液中のポリマーナノ粒子の分散が改善し、患者に、例えば非経口的に、特に静注により投与できる安定な懸濁液を得られる。前記少なくとも１つの界面活性剤の量は、通常、１質量％〜１０質量％、より好ましくは３質量％〜６質量％の範囲であり、この百分率はナノ粒子の総質量に対して計算される。
【００１４】
界面活性剤の選択は、それが水性媒体中にナノ粒子を分散させる有効性に依存することは言うまでもなく、非経口投与に続く有害反応を回避するために、その生体適合性にも依存する。
界面活性剤は、例えば以下から選択することができる：
−  ポリエチレングリコールアルキルエーテル、
−  ポリエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、例えばポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、
−  Ｄ−アルファ−トコフェノールポリエチレングリコールスクシネート、
−  ポリビニルアルコール。
界面活性剤は、好ましくはその調製中にナノ粒子に添加され、以下によりよく図示されるように、ナノ粒子自体の中に効果的に一体化する。
【００１５】
機能性金属ナノ構造体の存在により、磁気共鳴（ＭＲＩ（磁気共鳴撮像法））による、または超音波−光音響技術を介する、画像診断の技術における本発明によるナノ粒子の使用が可能となる。さらに、本発明によるナノ粒子は、金属ナノ構造体の存在下で、局所的に加熱し、がん細胞のアブレーションを可能とする医療レーザーにより、腫瘍を除去するまたは縮小する治療目的で使用できる。
好ましい実施形態において、本発明による生体適合性ポリマーナノ粒子はまた、少なくとも１つの有効成分を含むことができ、有効成分は処置しようとする疾患により影響を受けている標的とする細胞に達するようにナノ粒子により運搬される。前記有効成分は、好ましくは抗腫瘍剤、例えばドキソルビシン、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、ｃｉｓ−プラチナ、カルムスチン、パクリタキセルなどである。
さらなる態様によると、本発明は、上で定義された生体適合性ポリマーナノ粒子を調製する方法であって、
（ａ）機能性金属ナノ構造体が分散する少なくとも１つの有機溶媒中のＰＨＡの溶液を含む疎水性相、（ｂ）水性相、および（ｃ）少なくとも１つの界面活性剤
を含む乳濁液を調製すること、
前記乳濁液に超音波処理（ソニケーション）を施すこと、
ソニケーション後に上記の少なくとも１つの有機溶媒を前記乳濁液から蒸発させ、金属ナノ構造体を組み込んだ生体適合性ポリマーナノ粒子の懸濁液を得ること
を含む方法に関する。
【００１６】
使用できる有機溶媒は、ＰＨＡを溶解するように通常採用されるもの、例えば、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、またはそれらの混合物である。
界面活性剤に関する限り、水性媒体中のナノ粒子の安定な懸濁液の形成を有利にする、上に示したものから選択され得る。
超音波処理（ソニケーション）は、例えば、チップ超音波処理器による公知の技術により実施され得る。好ましくは、ソニケーションの工程中、乳濁液は氷浴中に維持して、超音波の作用により乳濁液が局所的に過熱することを避ける。ソニケーションの工程により、金属ナノ構造体をポリマーナノ粒子の親油性部分の内部に組み込むようにシステムが乳化されることを可能にし、一方、水性媒体中のナノ粒子の分散が有利になるように、界面活性剤は、ナノ粒子の外部に位置すると考えられている。
ソニケーションの工程の最後に、乳濁液の加熱を防ぎ、したがってポリマーおよび／または金属ナノ構造体の起こり得る分解を避けるために、有機溶媒を蒸発、好ましくは真空蒸発することにより乳濁液から除去する。
別の態様によると、本発明は、上で定義された生体適合性ポリマーナノ粒子を調製するさらなる方法であって、
少なくとも１つの有機溶媒中でＰＨＡの溶液を調製すること、
少なくとも１つの界面活性剤の存在下で、水性媒体中の金属ナノ構造体の懸濁液を調製すること、
ＰＨＡの溶液を金属ナノ構造体の懸濁液に接触させ、金属ナノ構造体を組み込んだ生体適合性ポリマーナノ粒子の懸濁液を得ること
を含む方法に関する。
【００１７】
この第２の方法（溶媒堆積またはナノ沈殿法（ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）として定義され得る）は、ソニケーションの工程を含み、比較的低減した容量をバッチ式で実施する第１の方法と異なり、大きな容量でも連続して行うことができるという利点がある。またこの場合、界面活性剤は、上で示したものから選択できる。
ＰＨＡの溶液は、蠕動ポンプを通して連続して金属ナノ構造体を運搬する容器内の金属ナノ構造体の懸濁液に接触させることができる。金属ナノ構造体を組み込んだ生体適合性ポリマーナノ粒子の懸濁液は、容器から、好ましくは連続して取り出される。
上記の両方法において、こうして得られたナノ粒子の懸濁液を、好ましくはろ過を施して、ナノ粒子を、それが縣濁されている液相から分離する。次いで、ナノ粒子に精製を施して、全身投与には望ましくない可能性のある、起こり得る加工残渣を除去する。
あるいは、水相が既に使用に望ましい特性を有している場合、例えば、生理食塩水緩衝液（ｐＨ＝７）の溶液を水相として使用する場合、懸濁液は、ナノ粒子をろ過し、再懸濁する必要がなく、そのまま使用できる。
上記の通りに得られた生体適合性ポリマーナノ粒子は、水性媒体、特に生理的溶液中の懸濁液の形態で、患者に投与され得る。前記懸濁液は、特に非経口的に、例えば静注により投与され得る。
【００１８】
さらに、ナノ粒子の懸濁液は、凍結乾燥を施すことができ、単離したナノ粒子を得られるが、これは使用する場合に生理的溶液中に容易に分散させることができる。
好ましい実施形態において、機能性金属ナノ構造体は金ナノロッドおよび磁性ナノ粒子の混合物から構成される。
２つの造影剤が同時に存在することが、重要かつ相補的な特性をもたらすので腫瘍学の分野において診断および療法に対して多くの利点をもたらす。磁性ナノ粒子の存在により、ＭＲＩ（磁気共鳴撮像法）技術の使用が可能となり、通常、直接読影することで術前の可視化に極めて有用であり、外科手術の第１の指示を与えるが、限定的な空間解像度、とりわけ腫瘤の端部において欠点を有する。これに対して、ＧＮＲの存在もまた、光音響イメージング技術の使用を可能とするが、これは限定的な解像度や浸透深さの課題を克服して、腫瘍の縁のよりよい可視化を可能とする。したがって、外科医が腫瘤を正確かつ完全に切除できるために、手術の間に使用され得る。
以下の実施例は、本発明の目的を単に例示的に提供するだけであり、添付の特許請求の範囲により規定される保護の範囲を制限すると見なされるべきではない。
【実施例】
【００１９】
（例１）
金ナノロッド（ＧＮＲ）を含有するＰＨＢナノ粒子の調製。
ＰＨＢ（ポリ−３−ヒドロキシブチレート）２５ｍｇを、クロロホルム２．５ｍＬ中に溶解した。溶液を事前に珪藻土（Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標））上でろ過して、小さい非溶解性凝集物を除去した。次いで、D. Gentili et al. Chem. Commun., 2009, 5874-5876の論文に記載された通り、エチル−１１−メルカプトウンデカノエートの表面上に存在するために親油性となったＧＮＲを、上の溶液に添加した。ＧＮＲはまた、クロロホルム中に分散した（体積２．５ｍＬ、濃度１．０ｍＭ）。ＧＮＲは、以下の寸法：平均長５０ｎｍ、平均幅１２ｎｍ、アスペクト比４．１６を有した。
次いで、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０  −  ３．８ｍｇ／ｍＬ）を界面活性剤として含有する水溶液５０ｍＬを先の有機相に添加し、混合物全体を最終的にチップ超音波処理器（ｔｉｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）（６００Ｗ入力、５０％振幅、３分間、氷浴）で乳化した。得られた乳濁液を、クロロホルムが完全に除去されるまで真空下で蒸発させ、次いで精製し、特定の膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、１００，０００ＮＭＷＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）上で遠心分離することで濃縮し、水で３回洗浄した。最終的な体積を水で２ｍＬになるように調整した。
結果
ＤＬＳ（動的光散乱）解析により、平均流体力学直径が約１１５／１３０ｎｍであり、０．１５０／０．１７０に等しい良好な多分散性指数（ＰＤＩ）で、ゼータ表面電位が負である（−３９／−３１，０ｍＶ）、ナノ粒子の存在が示された。原子吸着分光解析（ＡＡＳ）により推定された金の濃度は、０．７５ｍＭであった。
【００２０】
（例２）
マグネタイト（Ｆe３Ｏ4）のナノ粒子を含有するＰＨＢナノ粒子の調製。
金ナノロッドを、オレイン酸と含めることで親油性となった等量のマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）のナノ粒子で置換して、例１と同様の手順に従った。
結果。
ＤＬＳ（動的光散乱）解析により、平均流体力学直径が約１３９ｎｍであり、０．１５０／０．２００に等しい良好な多分散性指数（ＰＤＩ）で、ゼータ表面電位が負である（−２５．２ｍＶ）、ナノ粒子の存在が示された。
原子吸着分光解析（ＡＡＳ）により推定された鉄の濃度は、３．１６ｍＭであった。
【００２１】
（例３）
金ナノロッド（ＧＮＲ）およびマグネタイトのナノ粒子を含有するＰＨＢナノ粒子の調製。
ＰＨＢ（ポリ−３−ヒドロキシブチレート）２５ｍｇを、クロロホルム２ｍＬ中に溶解した。また、例１の親油性ＧＮＲ（体積２ｍＬ、濃度１．０ｍＭ）を本溶液に添加し、例２の親油性マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）ナノ粒子（体積２ｍＬ、濃度１．０ｍＭ）と一緒にクロロホルム中に分散した。次いで、エタノール１４ｍＬを添加し、エタノール：クロロホルム７０：３０の混合有機溶液を得た。
【００２２】
次いで、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（３．８ｍｇ／ｍＬ）を含有する水溶液５０ｍＬを先の有機相に添加し、混合物全体を最終的にチップ超音波処理器（６００Ｗ入力、５０％振幅、３分間、氷浴）で乳化した。得られた乳濁液を、エタノールとクロロホルムとが完全に除去されるまで真空下で蒸発させ、次いで精製し、特定の膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、１００，０００ＮＭＷＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）上で遠心分離することで濃縮し、水で３回洗浄した。最終的な体積を水で２ｍＬに調整した。得られた溶液を、最終的にシリンジフィルターＳｔｅｒｉｖｅｘ（登録商標）−ＧＰ０．２２μｍポリエーテルスルホン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）上でろ過した。
結果
ＤＬＳ（動的光散乱）解析により、平均流体力学直径が約１３０／１５０ｎｍであり、０．１６０／０．１９０に等しい良好な多分散性指数（ＰＤＩ）で、表面電位ゼータが負である（−４０／−３０ｍＶ）、ナノ粒子の存在が示された。原子吸着分光解析（ＡＡＳ）により推定された金および鉄の濃度は、金０．８０ｍＭ、鉄２．５５ｍＭであった。
【００２３】
（例４）
健康な実験用マウスにおけるＰＨＢ＋マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）ナノ粒子の生体分布のＭＲＩ研究。
例１に記載されたものにより得られたマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）ナノ粒子を埋め込んだＰＨＢナノ粒子を、約５ｍｌ／分の注入速度、および、投与体積１０．５３ｍＬ／ｋｇに相当する体重１ｋｇ当たりＦｅ  １ｍｇの全投与量で、ボーラス静注した。ＭＲＩ取得は、時間０（注射前）、注射後１時間、４時間、７２時間および１週間に行った。
マウスは９８％Ｏ2中のイソフルランガス（２％）で麻酔した。ＭＲＩ取得中、麻酔は、ガスフローをマウスの呼吸頻度に対して調節しながら維持し、後者は３７℃の温度に維持した。
ＭＲＩ取得は１Ｔ  ＭＲスキャナー（Ｉｃｏｎ、Ｂｒｕｋｅｒ）で行った。重み付けされたＴ２画像を、以下のパラメータを用いて、特定の配列で得た：ＴＲ＝２０００ｍｓ、ＴＥ＝５０ｍｓ、ＦＡ＝１８０°、ＮＥＸ＝４、ＭＴＸ＝１９２×１９２、ＦＯＶ  ３．５ｃｍ。
【００２４】
取得したＭＲＩ画像全てを、定量解析のための特定のソフトウェアに移動した。肝臓、脾臓および腎臓の相対的信号解析強度（ＳＩ）を推定した。この手順に従って、画像の全信号を推定し、バックグラウンドノイズを差し引いた。
臓器の平均ＳＩ値［ｒＳＩ(organ)］を、以下の方程式により計算した。
ｒＳＩ(organ)＝［ＳＩ(organ)−ＳＩ(muscles)］／［ＳＩ(organ)＋ＳＩ(muscle)］
（式中、ＳＩ(organ)は、検査中の臓器の３つの信号の強度低下値（ＲＯＩ）の平均であり、ＳＩ(muscles)は傍脊柱筋のＲＯＩである）
次いで、信号の強度低下百分率（ＳＩＲ）を、ＰＨＢ＋マグネタイトのナノ粒子の生体分布を評価するために、注射前後のｒＳＩ(organ)値を比較することで計算した。
ＭＲＩ画像を図１に示し、一方、図２は様々な臓器における前記ナノ粒子の吸収によるＳＩＲ百分率の平均のグラフ表示である。
【００２５】
（例５）
健康な実験用マウスにおけるＰＨＢ＋マンガンフェライト（ＭｎＦe2Ｏ4）ナノ粒子の生体分布のＭＲＩ研究。
例１に記載された同様の手順に従って得られたマンガンフェライト（ＭｎＦｅ2Ｏ4）ナノ粒子を包み込んだＰＨＢナノ粒子を、約５ｍｌ／分の注入速度、および、投与体積１０．５３ｍＬ／ｋｇに相当する体重１ｋｇ当たりＦｅ  １ｍｇの全投与量で、ボーラス静注した。ＭＲＩ取得は、時間０（注射前）、注射後１時間、４時間、２４時間および４８時間に行った。
例４に記載された同様の手順に従って、ＭＲＩ画像を取得、および加工したものを図３に示し、一方、図４は様々な臓器における前記ナノ粒子の吸収によるＳＩＲ百分率の平均を表すグラフである。
上で示した例４および例５で得た結果から、以下が観察できる。
（１）ＳＩＲ％の定量評価により、磁性造影剤を含有するＰＨＢナノ粒子が肝臓や脾臓に高速で移動することが示される。
（２）ＰＨＢ＋Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子の注射１時間後、ＳＩＲ％値により、肝臓（２６４％）および脾臓（９７．６％）において強力に蓄積することが示される。１週間後、肝臓および脾臓における有意な永続性が観察される。
（３）ＰＨＢ＋ＭｎＦｅ2Ｏ3ナノ粒子の注射１時間後、ＳＩＲ％値により、ＰＨＢ＋Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子に対して肝臓（３７６％）においてより蓄積する一方、脾臓への蓄積は実質的に同一であることが示される。
（４）体重１ｋｇ当たりＦｅ  １ｍｇの投与量でのＰＨＢ＋Ｆｅ3Ｏ4およびＰＨＢ＋ＭｎＦｅ2Ｏ3のマウスへの注入に由来する毒性効果は観察されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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