(57)【要約】  本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用を研究し、生細胞における多様な生物学的活性を検出するための、新規のリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイおよび装置に関し、ここで、前記アッセイは、単一の試料および同時に１つまたはいくつかのウェルからの複数のシグナルを同時に捕捉することができる。リアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイは、薬物スクリーニングのため、タンパク質相互作用、潜在的な薬物候補に応答しての生細胞中の任意のチャネルまたは受容体サブユニットの立体構造の変化により、前記チャネルまたは受容体の活性化または阻害を示すために、特に有用である。
2019537030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞中で、および任意に１つまたは複数の反応ウェル中で、同時に１つ以上のタンパク質−タンパク質相互作用を検出および／またはモニタリングするための、リアルタイム多重化多色生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）技術に基づくアッセイであって、
ここで、前記生細胞は、生物発光性ドナー分子を担持する１つ以上の分子プローブ、および少なくとも２つの蛍光性アクセプター分子を担持する１つ以上の分子プローブを含む、組み換え細胞であって、
ここで、ドナー−アクセプター対からの前記生物発光ドナーおよびその対応する蛍光性アクセプター分子は、生物発光性ドナー分子の放射スペクトルが蛍光性アクセプター分子の吸光スペクトルとオーバーラップし、それにより、（ｉ）平行して、生物発光性ドナー分子を担持する１つより多くの分子プローブからカウンターパートの蛍光性アクセプター分子を担持する１つより多くの分子プローブへのエネルギーの転移を発生させること、または（ｉｉ）生物発光性ドナー分子を担持する１つの分子プローブからカウンターパートの蛍光性アクセプター分子を担持する１つより多くの分子プローブへのエネルギーの転移を発生させること、または（ｉｉｉ）生物発光性ドナー分子を担持する１つの分子プローブから蛍光性アクセプター分子を担持する少なくとも１つの分子プローブへのエネルギーの転移を発生させ、それにより、結果として生じる前記活性化された蛍光性アクセプター分子の放射スペクトルが、その後のアクセプター分子の吸光スペクトルにオーバーラップし、それにより、その後の蛍光性アクセプター分子のカスケードにおけるエネルギーの転移を可能にするように選択され、
ここで、前記の各ドナー−アクセプター対のエネルギーシグナルは、スペクトル分解を可能にするために十分に区別し得るものであり、
前記アッセイは、以下のステップ：
（１）組み換え生細胞を、活性化または阻害シグナルと接触させること、
（２）単一の試料から同時に、および、いくつかのウェルにわたり同時に、各ドナー−アクセプター対からの複数のエネルギーシグナルを捕捉すること、
（３）スペクトル分解により、前記複数のエネルギーシグナルを処理すること
を含み、
およびここで、前記アッセイは、選択的なフィルターベースのアプローチに依存しない、
前記アッセイ。
【請求項２】
複数のエネルギーシグナルが、赤外スペクトルに近いかまたは赤外スペクトル中の可視スペクトルにわたり捕捉される、請求項１に記載のリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイ。
【請求項３】
前記スペクトルが、４００〜８００ｎｍである、請求項１または２に記載のリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイ。
【請求項４】
１回の読み取りおよび１回のアウトプットにおけるＢＲＥＴシグナルの測定を可能にする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイ。
【請求項５】
フルスペクトル多色アウトプットに基づく、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイ。
【請求項６】
前記生物発光タンパク質が、受容体または電位依存性イオンチャネルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイ。
【請求項７】
前記１つ以上の生物発光性ドナー分子および蛍光性アクセプター分子が、前記分子プローブ中の目的のタンパク質に融合し、それにより、前記タンパク質−タンパク質相互作用のモニタリングおよび／または検出を可能にする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイ。
【請求項８】
前記目的のタンパク質が、膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質である、請求項７に記載のリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイ。
【請求項９】
前記生物発光分子が、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、腔腸動物ルシフェラーゼ、北米ツチボタルルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、レイルロードワームルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、エクオリン、ヒカリキノコバエルシフェラーゼのうちから選択されるルシフェラーゼ、またはいずれか１つの生物学的に活性なバリアントもしくはフラグメント、またはβ−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、もしくはβ−グルコシダーゼのうちから選択される非ルシフェラーゼ生物発光タンパク質のうちから選択されるタンパク質である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイ。
【請求項１０】
前記蛍光分子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、緑色蛍光タンパク質のバリアント（ＧＦＰ１０）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、高感度ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、GFPS65T、エメラルド、トパーズ、GFPuv、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、mRFPl、ポシロポリン、ウミシイタケＧＦＰ、Monster GFP、paGFP、Kaedeタンパク質もしくはフィコビリンタンパク質のうちから選択されるタンパク質、またはこれらのいずれか１つの生物学的に活性なバリアントもしくはフラグメントであるか、あるいは、アクセプター分子が、Alexa、fluor色素、Bodipy色素、Cy色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光ミクロスフェア、発光ナノ結晶、Marina blue、Cascade blue、Cascade yellow、Pacific blue、Oregon green、テトラメチルローダミン、ローダミン、Texas red、希土類元素キレート、mAmetrine、LSSmOrange、Aquamarineまたはそれらの任意の組み合わせまたは誘導体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイを行うために好適な装置であって、リアルタイムＢＲＥＴ機器および前記生細胞を含むための複数の反応ウェルを含み、ここで、前記ＢＲＥＴ機器は、好適なイメージングシステムを備えた分光光度計、１つより多くの光ファイバーを含み、前記好適なイメージングシステムを備えた分光光度計および光ファイバーは、得られたスペクトルシグナルの分解の収集および解釈のため、および／またはエネルギードナーの、およびエネルギーアクセプター分子のスペクトルの形態および面積を、定量的な様式において返送するための、情報インターフェースを備えたコンピューターに連結されている、前記装置。
【請求項１２】
好適なイメージングシステムを備えた分光光度計が、回折格子、ハイパースペクトルイメージング、および／またはＣＣＤカメラのうちの１つ以上から選択される特徴を含む、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
薬物スクリーニングまたは薬理学的スクリーニングのため、タンパク質標的の新たな阻害剤または活性化因子の同定、同時にいくつかの薬理学的標的に対する化学化合物／物理的刺激の効果の識別、いくつかの同時の分子イベントに対する化学化合物／物理的刺激の動力学的効果の研究のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法またはアッセイであって、請求項１において定義されるような前記生細胞を、化学的化合物または物理的刺激と接触させること、生物発光性ドナー分子の基質を提供すること、得られた複数のエネルギーシグナルのスペクトル分解に進むことを含む、前記方法またはアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウェルまたは試料ごとの複数のタンパク質−タンパク質相互作用を研究するための、および同時に１つまたはいくつかのウェルにわたって、かつリアルタイムで、生細胞中の多様な生物学的活性を決定するための、新規の多重化多色ＢＲＥＴアッセイおよび装置に関する。本発明によるリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイは、薬物スクリーニング、タンパク質相互作用のモニタリング、細胞内生物学的イベントのモニタリングのため、潜在的な薬物候補に応答しての生細胞中の任意のチャネルまたは受容体サブユニットの立体構造の変化をモニタリングして、前記チャネルまたは受容体の活性化または阻害を示すために、特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
発光は、エネルギーが、ある分子に特異的に引き込まれて、励起状態をもたらす現象である。より低いエネルギー状態への回帰は、光子の放出を伴う。発光は、蛍光、燐光、化学発光および生物発光を含む。生物発光は、生物が他の生物に可視可能な光を放射するプロセスである。発光が生物発光である場合、励起状態の生成は、酵素により触媒される反応に由来する。発光は、生物学的相互作用の分析において用いることができる。
【０００３】
細胞の生命は、その分子アクター(actor)の動力学により支配される。複数の外部刺激が、シグナル伝達分子の狭いレパートリーを共有することができる一方で、空間および時間に関するタンパク質複合体のリモデリングの微調整は、細胞応答の特異性を決定することができる。したがって、タンパク質−タンパク質相互作用およびタンパク質と他の分子との間の相互作用は、ほぼ全ての生物学的プロセスにおいて重要な制御的役割を果たす。かかる相互作用は、直接的または間接的に、シグナル伝達、代謝、細胞の運動性、アポトーシス、細胞周期制御、核の形態学、細胞ＤＮＡ含有量、微小管細胞骨格の安定性、およびヒストンのリン酸化などの多様な細胞内イベントと相関し得る。例えば、多様なチャネルまたは受容体を通して媒介される、細胞質ゾルおよび細胞表面のタンパク質−タンパク質相互作用は、正常な細胞機能および生物学的応答において、主要な役割を果たす。特に、多くの細胞質ゾルおよび細胞表面のタンパク質−タンパク質相互作用は、疾患経路に関与する。加えて、細胞の転写機構における因子の間の多くのタンパク質−タンパク質相互作用はまた、価値ある薬物標的である。タンパク質−タンパク質相互作用はまた、例えば、酵素サブユニットの組み立てに；抗原−抗体反応に；リボソーム、フィラメント、およびウイルスの超分子構造を形成することに；輸送に；ならびに細胞上の受容体と増殖因子およびホルモンとの相互作用に関与する。がん遺伝子の産物は、タンパク質−タンパク質相互作用を通して腫瘍性形質転換を生じ得る。したがって、これらの相互作用を同定して特徴づけるために、多くの技術が開発されてきた。
【０００４】
これらのツールは、in vitro結合アッセイからライブラリーに基づく方法まで多岐にわたり、遺伝子外の抑制因子または活性化因子の探索などの遺伝子学的方法を含む。タンパク質−タンパク質相互作用を評価するために一般に用いられる一技術は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づく。このプロセスにおいて、１つのフルオロフォア（「ドナー」）は、その励起状態のエネルギーを別のフルオロフォア（「アクセプター」）に転移させ、それは通常、異なる色の蛍光を放出する。ＦＲＥＴは、しかし、いくつかの限定要因を有する。任意の蛍光技術と同様に、フルオロフォアの光退色および細胞／組織の自家蛍光は、ＦＲＥＴの有用性を著しく制限し得、自家蛍光性が高い組織においては、ＦＲＥＴは、本質的に使用不可能である。また、組織が励起光により容易に損傷を受ける場合、当該技術は、健康な細胞についての値を得ることができない可能性がある。最後に、試験されるべき細胞／組織が光応答性である場合、測定が行われ次第、光応答が惹起され得るので、ＦＲＥＴは非実用的であり得る。これらの欠点を克服するために、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）が開発され、複数の用途のために用いられている。ＢＲＥＴは、オワンクラゲ(Aequorea)、オベリアクラゲ(Obelia)、Phialidium属クラゲおよびウミシイタケ(Renilla)を含む多様な腔腸生物において起こる、天然の現象である。それは、ルシフェラーゼにより媒介される、セレンテラジン（ドナー）の、エネルギーアクセプターとして作用する蛍光タンパク質（ＦＰ）への酸化に起因する、非放射性エネルギーの転移に基づき、これは、エネルギーの一部を光子として再放射する。ＢＲＥＴは、ドナーおよびアクセプタータンパク質が近傍（典型的には＜１００Å）にある場合であって、ドナーの放射スペクトルがアクセプターの励起スペクトルと十分にオーバーラップする場合に起こる。
【０００５】
過去１０年間にわたり、共鳴エネルギー転移アプローチは、生細胞中のタンパク質の成長し続けているリストの活性のリアルタイム探査のための新たな機会を提供してきた。これらの技術は、エネルギードナーと適合性の蛍光エネルギーアクセプターとの間の非放射性エネルギーの転移に基づく。これは、構成的な分子間および分子内相互作用と、制御された分子間および分子内相互作用との両方をモニタリングするために好適なシステムである。ＢＲＥＴは、分子薬理学において、特にＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に関して特に有用な、ポピュラーかつ広く適用可能な方法となった。
【０００６】
一般的な実施において、個々の細胞のプロセスは、共通の「受託(fiduciary)」イベントが存在する異なる試料からの多数の測定において、連続的に試験される。次いで、個々のプロセスについての情報を組み合わせて、シグナル伝達網のより広い描写を構築する。かかるアプローチは、演算式多重化(computational multiplexing)と称され、例えばリガンド適用のタイミング、膜電位の変化、または膜の形状の変化に関して測定される、シグナル伝達イベントの空間時間的関係を再構築することにおいて適用されてきた。有用な内因性受託イベントは、全てのプロセスについては存在せず、システムに課せられた外因性のイベントは、しばしば、研究したいと望まれる正常な動力学を撹乱する。さらに、外見上確率論的なイベントの相互依存は、興味深い特徴であり、その性質により、連続的なイベントの演算式多重化によっては研究することができない。
【０００７】
したがって、単一の測定により複数の分子イベントを同時に研究することが可能であることは、生物学および医学における重要な一歩前進を表す。数学的プロセスと組み合わされたスペクトルイメージングは、蛍光技術を用いる細胞内分子イベントの多重化イメージングについての至適基準となりつつある。また、マルチスペクトル蛍光イメージングを顕微鏡法およびフローサイトメトリーと組み合わせるシステムは、現在では商業的に利用可能である。しかし、現在まで、ＢＲＥＴ技術は、フィルターベースのアプローチに限定されており、それがそのさらなる開発を妨げていた。特に、ドナー／アクセプター対により放出されるＢＲＥＴシグナルは、２つの専用の光学フィルターを備えた２つのリーダー：エネルギードナーに対応するフィルターを備えた第１のリーダー、およびエネルギーアクセプターに対応するフィルターを備えた第２のリーダーを必要とした。実験は、単一のフルオロフォアを用いることを越えて、単一のイメージング実験における複数のフルオロフォアの組み込みに移動してきた。伝統的には、これは、注意深く選択されたオーバーラップしないスペクトル放射を有する色素のセット、ならびに異なるスペクトル放射を明らかにするために変更するかまたは繰り返すことができる光ファイバーを用いて行われてきた。同じ細胞中でのスペクトル分解されたＢＲＥＴアッセイの同時多重化は、先に報告されている。しかし、これはフィルターベースのアプローチであった。
【０００８】
フィルターベースの技術は、検出器に達するシグナルが、ＢＲＥＴからのものであるのか、ＢＲＥＴチャネル中へのドナー放射を通したブリード(bleed)からのものであるのかを区別することができない。この目的のために、かかる専用の装置および専用のフィルターの使用により、どのようにして２つのＢＲＥＴシグナルを同じウェル測定器中で同時に達成することができるかを示す研究が報告された（Breton B. et al. Biophysical Journal Volume 99 December 2010 4037-4046）。しかし、ドナー基とアクセプター基とのエネルギーの間に存在するスペクトルの回復を考慮して、これらの著者は、彼らの証明を実現するために、用いられるべきフィルターの選択について深刻に妥協しなければならなかったはずである。さらに、彼らの開発は、第１の測定はエネルギードナーについて、第２は第１のアクセプターについて、および第３は第２のアクセプターについて、測定を３回行うことを必要とする。
【０００９】
最近、Hamamatsuは、ＣＣＤカメラの補助によりプレートの全てのウェルの同時読み取りを可能にするシステムFDSS/μCELLを開発したが、これは１つのみのＢＲＥＴプローブを用い、フィルターの使用を必要とする。したがって、それは、複数のウェルからのいくつかのＢＲＥＴプローブの同時測定を達成することができない。
【００１０】
本発明において記載される新規のアッセイおよびデバイスは、ＢＲＥＴスペクトルシグナルを、その全体において、１つもしくはいくつかのウェルまたは１つ以上の試料にわたり、同時の様式において獲得すること、ならびに、ドナーおよびアクセプターエネルギーシグナルにおいて獲得されたシグナルのスペクトル分解を可能にする。これは、市場に既に存在するシステムに関して利点を表す。なぜならば、フィルターの代わりにスペクトル分解を用いることにより、ウェルあたりのプローブの数にかかわらず、１つのリーダーにおけるＢＲＥＴシグナルの測定が可能となるからである。
【００１１】
さらに、使用可能な生物発光エネルギーのドナーおよびアクセプターの異なるスペクトル放射のオーバーラップにより、ＢＲＥＴスペクトルの測定および分析は、得られたシグナルの異なる要素の数学的分離を可能にする。実験的に、これは、より正確な測定、特に全てのドナーおよびアクセプター放射全体の同時測定をもたらす。
【００１２】
この技術は、例えば、電位依存性イオンチャネル、より具体的には一過性受容体電圧（ＴＲＰ）イオンチャネルを含む、生細胞中の複数のチャネルおよび受容体にわたり適用性を有する。本発明により、本発明者らは、タンパク質−タンパク質相互作用イメージングの分野において、時間的および空間的分解、検出および分析の速度、シグナル安定性の期間、シグナルの感受性およびダイナミックレンジに関して、前例のない成績を達成した。この新規の開発は、タンパク質−タンパク質相互作用の空間時間的動力学および特定のシグナル伝達経路の活性化パターンの両方の一般的理解を改善するであろう。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、少なくとも１つの単一のウェル、もしくは１つ以上の試料において、または多重化分析において、生細胞中の１つ以上のタンパク質−タンパク質相互作用を検出および／またはモニタリングするための、リアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイを提供し、ここで、前記アッセイは、単一の試料および同時に１つまたはいくつかのウェルからの複数のシグナルを同時に捕捉することができ、ここで、複数のシグナルが、本発明によるドナー−アクセプター対により、平行しておよび／または中継されて放射される。
【００１４】
本発明はまた、生細胞中のチャネルおよび／または受容体の活性および／または活性化もしくは阻害を決定および／またはモニタリングするための、リアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイを提供し、ここで、前記アッセイは、単一の試料から、および同時にいくつかのウェルにわたり、複数のシグナルを同時に捕捉することができ、ここで、複数のシグナルが、本発明によるドナー−アクセプター対により、平行しておよび／または中継されて放射される。
【００１５】
本発明はさらに、生細胞においていくつかの連結または独立した分子イベントを同時に検出するための、リアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイを提供し、ここで、前記アッセイは、単一の試料から、および同時に１つより多くのウェルにわたり、複数のシグナルを同時に捕捉することができ、ここで、複数のシグナルが、本発明によるドナー−アクセプター対により、平行しておよび／または中継されて放射される。
【００１６】
本発明は、新規のリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイにおける使用のための、新規のプローブの構築のための、新規のデバイスまたは装置、新規の核酸を提供する。
本発明は、最後に、タンパク質標的の新たな阻害剤または活性化因子の同定、同時にいくつかの薬理学的標的に対する化学化合物／物理的刺激の効果の識別、いくつかの、および同時の分子イベントに対する化学化合物／物理的刺激の動力学的効果の研究のための、薬物スクリーニングまたは薬理学的スクリーニングの方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＹＦＰ−ＣａＭおよびＬｕｃ−ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ１−ＬｕｃまたはＴＲＰＶ４−Ｌｕｃを共発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する、ドロフェニン(Drofenine)（Ａ）、ＣＡＰＳ（Ｂ）、およびGSK1016790A（Ｃ）の効果の用量応答曲線。結果を、正味のＢＲＥＴと基線のＢＲＥＴとの間の差として表した。それぞれＬｕｃ−ＴＲＰＶ３／ＹＦＰ−ＣａＭ、ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭまたはＴＲＰＶ４−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＹＦＰ−ＣａＭ発現の飽和条件下において、０．２２１±０．００４、０．２０２±０．００３および０．２７５±０．００８の基線のＢＲＥＴを測定した。ＴＲＰＶ１について言及したとおり、これらの結果は、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４が、非活性化条件下においてＣａＭと相互作用したことを潜在的に示した。結果は、２つ組において行った３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表した。
【００１８】
【図２】多色ＢＲＥＴを用いるＴＲＰＶ活性の測定の多重化。（Ａ）Aquamarine−Ｌｕｃ、mAmetrine−Ｌｕｃ、またはLSSmOrange−Ｌｕｃを遺伝子導入された３つのＨＥＫ２９３Ｔの部分集団を含む共培養において測定された、３色ＢＲＥＴスペクトルおよびその分解の例。灰色の点は、実験データを表す。黒色、明灰色、中間の灰色、および灰色の実線は、それぞれ、Ｌｕｃ、Aquamarine、mAmetrine、およびLSSmOrangeのスペクトルの構成成分を表す。（Ｂ〜Ｄ）ＬｕｃおよびAquamarine（円）（０．０２７±０．００２の基線のＢＲＥＴ）、ＬｕｃおよびmAmetrine（菱形）（０．０１５±０．００１の基線のＢＲＥＴ）、ならびにＬｕｃおよびLSSmOrange（正方形）（０．０１７±０．００１の基線のＢＲＥＴ）により生成された多色ＢＲＥＴシグナルは、リアルタイムにおいて、Ｌｕｃ−ＴＲＰＶ３／Aquamarine−ＣａＭ、ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／mAmetrine−ＣａＭ、またはＴＲＰＶ４−Ｌｕｃ／LSSmOrange−ＣａＭコンストラクトを発現する細胞の混合集団を含む１つの試料において測定された。１ｍＭのドロフェニン（Ａ）、２０μＭのＣＡＰＳ（Ｂ）、または１００ｎＭのＧＳＫ１０１（Ｃ）を、パープルセレンテラジンのバッファー中への注射により開始された実験の開始の７５秒後に注射した。結果は、３回の独立した実験の平均を表す。
【００１９】
【図３】Ｌｕｃ（パープルセレンテラジンの基質の存在下において、黒線：左から２番目の線）、ならびにAquamarineの吸収（点線）および放射スペクトル（実線）（グラフの左から４番目の点線およびグラフの右側から３番目の実線）、mAmetrine（グラフの左側の１番目の点線およびグラフの右側から２番目の実線）、ならびにLss-mOrange（グラフの左側から３番目の点線およびグラフの右側から最後の線）の放射スペクトルの適合性。
【００２０】
【図４】２５〜５０℃の範囲の温度において、Ｌｕｃ（セレンテラジンＨの存在下において）（Ａ）およびＹＦＰ（Ｂ）の放射スペクトルを示す。
【００２１】
【図５】ＹＦＰ−Ｌｕｃ（Ａ）、Aquamarine−Ｌｕｃ（Ｂ）、mAmetrine−Ｌｕｃ（Ｃ）、またはLSSmOrange−Ｌｕｃ（Ｄ）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から測定された、生物発光スペクトルのシグナル分解を示す。実験データに基づいて（灰色の点）、LabVIEWインターフェースを用いて、ＢＲＥＴシグナルの形状を計算し、Ｌｕｃの放射スペクトル（実線）を、アクセプター（破線）：ＹＦＰ（Ａ）、Aquamarine（Ｂ）、mAmetrine（Ｃ）、ならびにLSSmOrange（Ｄ）のものから分離した。次いで、アクセプタースペクトル下の面積を、ドナースペクトル下の面積により除算することにより、ＢＲＥＴ比を計算し、それにより、ドナーまたは他のアクセプターのものによる任意のコンタミネーションからのその独立性を保証した。各ＦＰ−Ｌｕｃについての正味のＢＲＥＴは、以下のとおりである：ＹＦＰ−Ｌｕｃについては０．８２、ＣＦＰ−Ｌｕｃについては１．０９、mAmetrine−Ｌｕｃについては０．４３、およびLSSmOrange−Ｌｕｃについては０．２４。ＡにおいてはセレンテラジンＨを基質として用い、一方、Ｂ〜Ｄにおいてはパープルセレンテラジンを基質として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
別段に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書において用いられる場合、用語「リアルタイム」とは、当該操作のセットのアウトプットまたは結果が、特定のタイミングの束縛に基づいてもたらされるように、操作のセットを行うことを指す。操作は、ときに、本明細書において、リアルタイムで行われるものとして言及される一方で、操作のアウトプットは、何らかの検出可能な遅延または待ち時間によりもたらされ得ることが企図される。例えば、操作は、操作のアウトプットが、操作のインプットが得られる速度と同じまたは実質的に同じ速度でもたらされる場合、リアルタイムで行われ得る。別の例として、操作は、操作のアウトプットが、応答時間の特定の上限内、例えば１秒以内、０．１秒以内、０．０１秒以内、または０．００１秒以内においてもたらされる場合、リアルタイムで行われ得る。さらなる例として、操作は、操作のアウトプットが、それが起こっているうちに、プロセスに影響を及ぼすかまたはこれを制御することができるような時宜を得てもたらされる場合、リアルタイムで行われ得る。
【００２３】
本明細書において用いられる場合、用語「多重」とは、いくつかの反応容器または反応ウェル中での２つ以上の生成物または活性の同時検出を提供する、ＢＲＥＴアッセイを指す。各々の生成物または活性は、１つ以上の区別し得るＢＲＥＴプローブを用いて刺激(prime)される。
【００２４】
本明細書において用いられる場合、用語「多色」とは、生物学的試料中に存在する標的分析物に関して放射光を生成する１つ以上のプローブにタグ付けされた複数の発光色素を励起する、ＢＲＥＴアッセイの形式を指す。対応する放射は、フィルタリングを必要としない多色検出器またはリーダーにより検出される。試料または複数の試料中の分析物から放射される光は、イメージ検出器に到達する前に、異なる放射スペクトルを有する単一の試料または２つ以上の試料構成要素からの１つ以上の分析物からの相対的放射速度を決定するために、スペクトルにより区別し得る構成成分に分離することができる。
【００２５】
本明細書において用いられる場合、用語「タンパク質−タンパク質相互作用」またはＰＰＩとは、２つ以上のタンパク質の、任意の種類の相互作用、会合または結合を指す。ＰＰＩは、二成分（２つのタンパク質結合パートナー；二量体）であっても三成分（３つまたはそれより多くのタンパク質結合パートナー、例えば三量体）であってもよい。ＰＰＩ中のタンパク質（すなわち結合パートナー）は、同じタンパク質（ホモ二量体もしくはホモ三量体など）であっても異なるタンパク質（ヘテロ二量体もしくはヘテロ三量体など）であってもよい。三成分相互作用中のタンパク質は、ＰＰＩ中の１つ以上のタンパク質に結合してもよい。この定義は、タンパク質またはタンパク質構成成分を含む、全てのチャネルおよび／または受容体／抗原／抗体／細胞などに及ぶ。
【００２６】
本明細書において用いられる場合、用語「生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）」とは、生物発光酵素、ルシフェラーゼ、およびフルオロフォアからのエネルギー転移に依存するアッセイを指す。ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）とは異なり、ＢＲＥＴは、酵素反応により開始され、したがって光励起を必要とせず、バックグラウンド比に対して優れたシグナル、およびより高い感受性をもたらす。
【００２７】
「フィルターベースのＢＲＥＴアッセイ」とは、イメージ計器が、ドナーおよびアクセプターの放射最大値に対応する波長における光アウトプットの別々の独立した測定のためのフィルターのセットを備えているアッセイを指す。光の吸収は、励起された分子の形成をもたらし、これが次いで、分解、反応または再放射により、それらのエネルギーを放散する。これらのプロセスが行われる効率は、量子効率と称される。
【００２８】
本明細書において用いられる場合、用語「生物発光性ドナー分子」とは、好適な基質に対する作用、または外部ソースによるその自らの励起の後で、発光を生じることができる、任意の分子を指す。
本明細書において用いられる場合、用語「アクセプター分子」は、生物発光性ドナー分子の活性の結果として放射されたエネルギーを受容して、それを光エネルギーとして再放射することができる、任意の化合物を指す。
【００２９】
本明細書において用いられる場合、「電位依存性イオンチャネル」とは、緊密に関係するイオンチャネルのファミリーのグループを指す。電位開口型イオンチャネルは、機能により、構造（二次および三次の両方）により、ならびに配列相同性（一次構造）により、容易に同定することができる。電位開口型イオンチャネルの特徴は、６個の推定の膜貫通ヘリックスＳｌ〜６および「ＰＶＰ」モチーフ（これはインバリアントではなく、例えばｒＫｖ２．１はＰＩＰ配列を有する）である。より大きなスーパーファミリー中には、カリウム開口型（Ｋｖ）、ナトリウム開口型（Ｎａｖ）、ならびにカルシウム開口型（Ｃａｖ）を含む多様なファミリーがある。電位開口型カリウムチャネルは、命名法Ｋｖを用いるスーパーファミリーに該当する。１つのファミリーは、もともとDrosophilaからの４つの関連する電位開口型カリウムチャネルについて命名された４つのサブファミリー：Shaker（Ｋｉ）；Shab（Ｋｖ２）；Shaw（Ｋｖ３）；およびShal（Ｋｖ４）を含む。ShakerおよびShalは、迅速な電流の活性化および不活化を有するものとして特徴づけられ、一方、ShabおよびShawは、遅効性の不活化および非不活化を有するものとして特徴づけられる遅効性の整流チャネルである。各サブファミリーにおける相同体は、ヒト、げっ歯類および他の哺乳動物において同定されている。電位依存性イオンチャネルは、薬物の発見のための折り紙付きの標的であり、多くのイオンチャネル修飾薬が、現在、疼痛、癲癇、高血圧および他の疾患状態の処置のために、臨床的に使用されている。それらは、液体の分泌、電解質バランス、ならびに生体エネルギー学および膜の興奮性を含む必須の生理学的機能のための分子的基礎を含む。イオンチャネルは、生理学的に必須であり、薬理学的に受入可能であり、多様な遺伝子によりコードされ、通常は多量体タンパク質集合体として作動し、その結果、高度の機能的および解剖学的特異性をもたらすので、良好な薬物標的となる。分子クローニング、異種性発現およびパッチクランプ法による電気生理学的特徴づけを通して、イオンチャネルの生物学の複雑性もまた、小分子薬物が特異的な所望される機能的効果を達成するための複数の機会を提供することが明らかである。例えば、小分子は、電位依存性透過性、頻度依存性、活性化および不活化などの、イオンチャネルの多様な生物物理学的特性に影響を及ぼし得る。単純な遮断薬または開口薬とは対照的に、調節性化合物の発見は、異常なレベルのイオンチャネル活性を示す細胞または組織に対して特異的に作用する薬物の発見を可能にし得る。電位依存性イオンチャネルは、ゲーティング状態として言及される多数の異なる立体構造状態において存在することが知られている。電位開口型イオンチャネルについては、チャネルは、３つのゲーティング状態：閉鎖中（イオン透過なし）、開口中（イオンフラックスが生じる）および不活化（イオン透過なし；チャネルを脱分極により開口することができない）のうちの１つにおいて存在するものとして観察することができるが、いくつかのチャネルは、不活化状態を示さないことに注意すべきである。ゲーティング状態の間の移行は、電位依存性であり、任意の所与の時点において、これらのゲーティン��状態の間には平衡状態が存在し、各状態において存在するチャネルの割合は、細胞膜電位に依存する。多くの電位依存性イオンチャネル修飾薬は、特定のゲーティング状態に対して優先的に結合することが示されている。例えば、電位開口型ナトリウムチャネル遮断薬であるラモトリギンは、開口状態および不活化状態の脳のナトリウムチャネルタンパク質に結合すると考えられる。特定のゲーティング状態に対する優先的結合は、イオンチャネル修飾薬についてのチャネルのアフィニティーの増大を通して、または単純に、薬物のチャネル上のその結合部位へのアクセスの改善を通して起こり得る。
【００３０】
本明細書において用いられる場合、用語「ＴＲＰチャネル」とは、一過性受容体電圧ファミリーのタンパク質のイオンチャネルタンパク質を指す。
本明細書において用いられる場合、用語「ＴＲＰタンパク質」とは、ユビキタスに発現される、機能的に多様な、カチオン透過性チャネルのスーパーファミリーを形成するタンパク質であって、いくつかのカチオンに対する選択性が異なるものの群を指す。全てのＴＲＰは、６個の膜貫通ドメインを含む複合的タンパク質である。ＮおよびＣ末端ドメインは、細胞内にあり、ＴＲＰの機能、制御、およびチャネルの集合に関与することが知られている。ＴＲＰチャネルは、化学物質の伝達、温度および機械的刺激を含む、いくつかの物理化学的手段により活性化することができる。ＴＲＰチャネルは、従って、それらの開口の確率を変化させることにより応答する、ポリモーダルなシグナル統合装置として機能する。それらは、ヒトにおいて、感覚生理、心血管、消化管、および泌尿器の機能、ならびに免疫および発達を含む、多様な生理学的プロセスに緊密に関与する。結果として、ＴＲＰチャネルの機能不全は、多くの疾患に関連付けられており、高度に有望な薬物標的としてのそれらの出現をもたらした（６）。ＴＲＰチャネルの間で、６つが熱(thermo)−ＴＲＰとして認識され、一次体性感覚神経において発現され、特異的な温度において活性化される。ＴＲＰＶ１〜４は、中程度（ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４）から有害な熱（ＴＲＰＶ１およびＴＲＰＶ２）までの範囲の温度上昇を伝達するが、一方、ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＡ１は、それぞれ中程度および極端な低温により活性化される。
【００３１】
本開示の態様は、別段に示されない限り、分析化学、合成有機化学、生化学、分子生物学などの技術を使用し、これらは、当該分野における技術の範囲内である。かかる技術は、文献において、特に国際公開WO2016131832において、完全に説明される。
【００３２】
本発明により開発されたアッセイは、生物発光性ドナー分子を担持する１つより多くの分子プローブから、蛍光性アクセプター分子を担持する１つより多くの分子プローブカウンターパートへ、平行してエネルギーの転移を発生させることによる、または、生物発光性ドナー分子を担持する１つの分子プローブから、カウンターパートの蛍光性アクセプター分子を担持する１つより多くの分子プローブへエネルギーの転移を発生させることによる、または、生物発光性ドナー分子を担持する１つの分子プローブから、蛍光性アクセプター分子を担持する少なくとも１つの分子プローブへ、エネルギーの転移を発生させることによる、多重連続エネルギー転移ステップに関与することにより、累積的に多重化能力を示した。これらの構造および結果として生じる連続的転移を生み出すために、ドナーおよびアクセプターは、本発明によるエネルギードナー−アクセプターシステムの連続的活性化がエネルギーを連続するメンバーに平行してまたは中継されて転移して多色スペクトルをもたらすように、平行してまたは中継として作用する様式において、並置される。放射は、広範なスペクトル範囲にわたり測定され、ドナー／アクセプターの寄与は、スペクトル分解を通して分離される。放射チャネルの特異性を最大化するためにシグナルをフィルタリングするのではなく、光子の集合を最大化するためにスペクトルのオーバーラップを用い、ブリードは、線形分離法(linear unmixing)を通して否定した。生じた平行または連続的活性化プロセスからのスペクトルプロフィールの分光光度分析により、転移ステップの各々の効率の概算が可能となる。光またはエネルギーの吸収は、励起された分子の形成をもたらし、これが次いで、それらのエネルギーを、分解、反応または再放射により放散する。
【００３３】
本発明によるアッセイおよび方法において、生体認識に応答して、異なる放射色を有するドナー−アクセプター対の集団の発光の調節を通して、複数の光学シグナルが生成される。主に使用することができるドナー−アクセプター対相互作用は、生物発光共鳴エネルギー転移および蛍光共鳴エネルギー転移を含むが、また、電荷移動クエンチング、および近位金ナノ粒子(proximal gold nanoparticles)を介するクエンチングに対しても適用可能であり得る。複数の標的分析物間の同時検出のためのアッセイが開発されており、ここで、スペクトル分解は、重要なツールである。本発明によるドナー−アクセプター活性化パターンのユニークな光学特性は、多重化検出におけるいくつかの潜在的な利点および高度の多用途性、例えば、検出チャネルの間を区別するために波長識別のみを必要とする、アンサンブルレベルにおけるワンポット多重化を提供する。これらの方法は、全体的な多重化能力に関してアレイベースの技術に匹敵させるためではなく、多重化バイオ分析のための新たな方式を可能にするために開発されている。特に、ドナー−アクセプター相互作用の連続的活性化に基づくバイオプローブは、生細胞中での多重化バイオセンシングのためのさらなる機会を提供すると期待される。
【００３４】
本発明は、単一の試料から、および同時に複数のウェルにわたる複数の生物学的イベントの同時検出のための、多色読み取りを用いる多重化ＢＲＥＴアッセイを実施する、新規の前提に基づく。かかるアッセイは、伝統的なフィルターベースのアプローチに基づくものではなく、本発明者らは、ＢＲＥＴシグナルの全放射スペクトルの分解に関するアッセイを設計した。異なるフィルターのセットにより複数のシグナルを読み取るために複数のプローブを用いる場合、励起スペクトルと放射スペクトルとの間の不可避のトレードオフに直面する。なぜならば、それらはオーバーラップすることができないからである：所与のフィルターのセットを用立てるために、励起スペクトルの大部分を犠牲にする（照明光子を遮断することにより測定速度を犠牲にする）か、または減少した部分の放射スペクトルを得る（放射光子を遮断することによりシグナル対ノイズ比を犠牲にする）。単一の実験において２つまたは３つまたはそれより多くのＢＲＥＴプローブを使用することを試みることは、さらにより高度に限定された励起および放射フィルターの戦略の使用を必要とする。ほとんどの場合において、２つ以上のプローブを用いるアッセイは、連続的測定の必要性に起因する速度の限定、より小さなフィルター通過帯サイズの結果としての感受性の低下、およびスペクトルのオーバーラップを最小化するために必要とされるより複雑な標識戦略を含む、いくつかの望ましくない結果をもたらす。結果を連続的に集めることは、同時検出よりも多くの時間を必要とし、結果は、獲得の間の急速な標本の運動により損なわれ得る。さらに、生細胞中でのＢＲＥＴシグナルレベルは、ときに、標的の量が少ない標本または内因性のレベルを発現するものについては特に、低い場合がある。最後に、蛍光タンパク質のカラーパレットは、なお幾分限定され、広範な放射プロフィールが、放射をきれいに分離することを困難にするか、さもなければ特化したフィルターセットを必要とする。したがって、高速獲得がしばしば実験の成功におけるミッションクリティカル要因である生細胞のイメージングにおいては、これらの帰結は、研究の結果に対して深刻な影響を有し得る。これらの限定要因を克服して、このフィルターレスアッセイスキームの潜在的な用途を探索するために、本発明者らは、ドナーおよびアクセプターのエネルギーシグナルにおいて獲得されるシグナルのスペクトル分解を用いるＢＲＥＴアッセイの主題を構築する。このことは、単一のリーダーを用いて試験を行うことを可能にする。好ましい態様において、本発明は、単一の試料から、およびいくつかの反応ウェルにわたり同時に、複数のシグナルを同時に捕捉することが可能である、リアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイを提供し、ここで、前記アッセイは、単一のリーダーにおけるＢＲＥＴシグナルの測定を可能にする。
【００３５】
本発明により、リアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイは、生細胞におけるチャネルおよび／または受容体などの任意のタンパク質の活性および／または活性化もしくは阻害を決定および／またはモニタリングするために用いることができ、ここで、前記アッセイは、単一の試料から、およびいくつかの反応ウェルにわたり同時に、複数のシグナルを同時に捕捉することができる。かかるアッセイは、生細胞における複数の生物学的活性を測定するため、より具体的には、生細胞におけるいくつかの関連したまたは独立した分子イベントを同時に検出するために、用いることができる。
【００３６】
分子内および分子間プローブに基づく蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）技術は、先には、生細胞または膜における多様なチャネルの活性化の間の立体構造変化を探索するために用いられてきた。あるいは、ＦＲＥＴはまた、いくつかのイオンチャネルと、カルモジュリンなどのパートナーとの相互作用を研究することに適用されてきた。これらのアッセイは、単一の細胞の顕微鏡イメージングをパッチクランプ条件と組み合わせることにより、チャネル活性化の制御を提供しつつ、ＦＲＥＴシグナルを記録するという利点を提供する。しかし、パッチクランプ技術の主要な限定要因は、その低スループットである。典型的には、一人の高度な訓練を受けた操作者が、１日あたり１０個未満の化合物しか、パッチクランプ技術を用いて試験することができない。さらに、当該技術は、容易に自動化を受け入れることができず、詳細な分析を必要とする複雑な結果を生じる。生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）においては、ＦＲＥＴのドナーフルオロフォアは、ルシフェラーゼで置き換えられ、アクセプターは、任意の好適なフルオロフォアであってよい。
【００３７】
ルシフェラーゼの使用は、基質の添加が生物発光放射を開始させ、したがって共鳴エネルギー転移を開始させるので、照明の必要を回避する。ドナーの励起のための外部光源の必要性を取り除くことは、ＢＲＥＴに、ＦＲＥＴと比較して、いくつかの利点を与える：それは、細胞に対する光損傷、フルオロフォアの光退色、バックグラウンド自家蛍光、またはアクセプターの直接励起を引き起こさない。これらの利点のおかげで、ＢＲＥＴ技術は、薬物スクリーニングのために、特にＧＰＣＲの研究分野において、広く実践されてきた。本発明は、スペクトル分解に基づく場合に多重化多色ＢＲＥＴ分析が可能であることを、初めて認識する。
【００３８】
本発明は、したがって、生細胞において、および任意に複数の反応ウェルにおいて、同時に１つ以上のタンパク質−タンパク質相互作用を検出および／またはモニタリングするための、リアルタイム多重化多色生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）技術に基づくアッセイを提供し、ここで、前記生細胞は、生物発光性ドナー分子を担持する１つ以上の分子プローブ、および少なくとも２つの蛍光性アクセプター分子を担持する１つ以上の分子プローブを含む、組み換え細胞であって、ここで、ドナー−アクセプター対からの前記生物発光ドナーおよびその対応する蛍光性アクセプター分子は、生物発光性ドナー分子の放射スペクトルが蛍光性アクセプター分子の吸光スペクトルとオーバーラップし、それにより、（ｉ）生物発光性ドナー分子を担持する１つより多くの分子プローブから蛍光性アクセプター分子を担持する１つより多くの分子プローブカウンターパートへ、平行してエネルギーの転移を発生させること、または（ｉｉ）生物発光性ドナー分子を担持する１つの分子プローブからカウンターパートの蛍光性アクセプター分子を担持する１つより多くの分子プローブへのエネルギーの転移を発生させること、または（ｉｉｉ）生物発光性ドナー分子を担持する１つの分子プローブから蛍光性アクセプター分子を担持する少なくとも１つの分子プローブへのエネルギーの転移を発生させ、それにより、結果として生じる前記活性化された蛍光性アクセプター分子の放射スペクトルが、その後のアクセプター分子の吸光スペクトルにオーバーラップし、それにより、その後の蛍光性アクセプター分子のカスケードにおけるエネルギーの転移を可能にするように選択され、ここで、前記の各ドナー−アクセプター対のエネルギーシグナルは、スペクトル分解を可能にするために十分に区別し得るものであり、前記アッセイは、以下のステップを含む：
（１）組み換え生細胞を、活性化または阻害シグナルと接触させること；
（２）単一の試料またはウェルから、および任意に同時にいくつかの試料またはウェルにわたり、各ドナー−アクセプター対からの複数のエネルギーシグナルを同時に捕捉すること、ならびに
（３）スペクトル分解により、前記複数のエネルギーシグナルを処理すること。
【００３９】
好ましくは、赤外スペクトルに近い、最も好ましくは実質的に全ての４００〜８００ｎｍの光の波長を含む可視スペクトルにわたり、複数の放射または複数のエネルギーシグナルを捕捉する。
【００４０】
特に、本発明によるアッセイは、フィルターベースのアッセイ方式を用いない。むしろ、アッセイは、ＢＲＥＴシグナルの全放射スペクトルの分解に依存的である。適用可能な原理は、スペクトル情報（分光光度計からの）のイメージへの転換（イメージングシステムを介する）であり、これは、タンパク質−タンパク質相互作用をマッピングする数学的またはグラフィカルな手段を提供するであろう。実際には、本発明によるアッセイは、１つ以上のＢＲＥＴドナーおよび複数のＦＲＥＴアクセプター、ならびにそれらの対応するペアリングおよび相互作用であって、アッセイ中で多様なスペクトルにより解読される励起状態をもたらすものによる、フルスペクトル多色アウトプットに基づく。
【００４１】
好ましくは、本発明によるリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイは、１回の読み取りにおいて１回のアウトプットとして、ＢＲＥＴシグナルの測定を可能にする。単一のリーダーを通したＢＲＥＴによる標準的なアッセイを多重化する能力は、ユーザーが、単一のウェルから、および複数のウェルにおける複数の試料にわたり、これまでより多くの情報を抽出することを可能にする。
【００４２】
生物発光性ドナー分子は、当該分野において周知であり、本発明者らは、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、腔腸動物ルシフェラーゼ、北米ツチボタルルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、レイルロードワームルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、エクオリン、ヒカリキノコバエルシフェラーゼのうちから選択されるルシフェラーゼ、またはいずれか１つの生物学的に活性なバリアントもしくはフラグメント、またはβ−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、もしくはβ−グルコシダーゼのうちから選択される非ルシフェラーゼ生物発光タンパク質の中から選択される生物発光性ドナー分子を引用することができる。
【００４３】
蛍光性アクセプター分子もまた、当該分野において周知であり、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、緑色蛍光タンパク質のバリアント（ＧＦＰ１０）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＧＦＰ(enhanced GFP)（ＥＧＦＰ）、高感度ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、GFPS65T、エメラルド、トパーズ、GFPuv、不安定化ＥＧＦＰ(destabilised EGFP)（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、mRFPl、ポシロポリン(pocilloporin)、ウミシイタケＧＦＰ、Monster GFP、paGFP、Kaedeタンパク質もしくはフィコビリンタンパク質、またはこれらのいずれか１つの生物学的に活性なバリアントもしくはフラグメントの中から選択することができるか、またはここで、アクセプター分子は、Alexa、fluor色素、Bodipy色素、Cy色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光ミクロスフェア、発光ナノ結晶、Marina blue、Cascade blue、Cascade yellow、Pacific blue、Oregon green、テトラメチルローダミン、ローダミン、Texas red（商標）、希土類元素キレート、mAmetrine、LSSmOrange、Aquamarine、またはそれらの任意の組み合わせもしくは誘導体の中から選択することができる。
【００４４】
本発明によるリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイは、目的のタンパク質のためのアッセイを提供し、ここで、前記アッセイは、タンパク質または当該タンパク質のフラグメントをコードする核酸を含むプローブを含み、ここで、１つ以上の生物発光性ドナー分子および蛍光性アクセプター分子が、前記分子プローブ中の目的のタンパク質に融合し、それにより、前記タンパク質−タンパク質相互作用のモニタリングおよび／または検出を可能にする。特に好ましい態様において、目的のタンパク質は、膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質などである。本明細書において言及されるようなタンパク質は、全体がタンパク質からなる構成成分であっても、またはそれは、タンパク質を含む構成成分であってもよい。
【００４５】
本発明はまた、リアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイを行うためのデバイスまたは装置に関する。適用可能な原理は、スペクトル情報の変換（分光光度法からの）イメージへの（イメージングシステムを介しての）変換であり、これは、タンパク質−タンパク質相互作用をマッピングする数学的またはグラフィカルな手段を提供するであろう。
【００４６】
本発明による分光計は、帯域通過、波長分散、収差および光のスループットに対して著しい影響を有する複数の変数により、作動することができる。本発明は、その範囲内に、波長検出器としての線形アレイまたは電荷結合デバイス（ＣＣＤ）と組み合わせることができる分光計を含む。多様な波長分散素子（ＷＤＥ）を備えたさらなる分光計は、本発明の範囲内である。ある態様において、波長分散素子（ＷＤＥ）は、プリズムまたは回折格子である。最も好ましい態様において、波長分散素子は、回折格子である。検出器素子の一次元線形アレイ、または電荷結合デバイス（ＣＣＤ）などのマトリックスアレイのいずれかを備えたさらなる分光光度計は、一連の波長を同時に獲得することができる。ＣＣＤが、好ましく選択される。さらなる回折格子は、古典的ルーリング(classically ruled)（ＣＲ）、ホログラフィー表面起伏(holographic surface relief)（ＨＳＲＧ）、ならびに体積ホログラフ（ＶＨＧ）から選択することができる。古典的な回折格子は、ガラスブランク上のアルミニウムまたは金のコーティング中に溝を機械的に「ルーリングする(ruling)」（実際に研磨する）ことにより作製する。ホログラフィックな格子は、２つの伸長されたレーザービームの交差点として記録されて、フォトレジスト中に一連の周期的外辺を形成し、これは、処理の後で正弦溝を形成する。これらの格子に対する重要な利点は、それらがいかなるさらなる集束光学またはコリメート光学をも必要としないことである。実質的に全ての回折格子は、光を「順序」中に回折し、「第１」の順序が、スペクトルデータを提示するために用いられる。全ての波長が同時に回折され；したがって、存在し得る全ての順序が存在するであろう。したがって、６００ｎｍが第１の順序に回折される場合、３００ｎｍが第２の、２００ｎｍが第３の順序において提示され、以下に続く。任意のおよび全ての種類のハイパースペクトルまたはマルチスペクトルイメージングシステムが、本発明の範囲内である。
【００４７】
好ましくは、リアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイを行うためのデバイスまたは装置は、スペクトル放射を捕捉するためのリアルタイムＢＲＥＴ機器、ＢＲＥＴプローブおよび試料を含む組成物または反応混合物、ならびにスペクトルデータの読み込み可能なアウトプットへの変換のためのイメージング装置を含む。好ましい態様において、イメージング装置は、カラーイメージング検出のために適応され、これは、呈色光を検出することができる任意の構成成分、その部分、または構成成分のシステムを指し得、これは、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、裏面入射型(back-side-thinned)冷却ＣＣＤ、表面入射(front-side illuminated)ＣＣＤ、ＣＣＤアレイ、光ダイオード、光ダイオードアレイ、光電子増倍管（ＰＭＴ）、ＰＭＴアレイ、相補型金属酸化物半導体(complimentary metal-oxide semiconductor)（ＣＭＯＳ）センサー、ＣＭＯＳアレイ、電荷注入デバイス（ＣＩＤ）、ＣＩＤアレイなどを含む。イメージング検出器は、情報を、データのストレージ、相関、および／または操作のためのデータ集積装置、例えばコンピューター、または他のシグナル処理システムへと中継するように適応させることができる。
【００４８】
最も好ましくは、本発明は、リアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイを行うための装置を提供し、該装置は、リアルタイムＢＲＥＴ機器および前記生細胞を含むための複数の反応ウェル、好適なイメージングシステムを備えた分光光度計、１つ以上の光ファイバーを含み、前記好適なイメージングシステムを備えた分光光度計および光ファイバーは、得られたスペクトルシグナルの分解の収集および解釈のため、ならびに／または、エネルギードナーのおよびエネルギーアクセプターのスペクトルの形態および面積を定量的な様式において返送するために、情報インターフェースを備えたコンピューターに連結されている。イメージングシステムは、複数の構成成分または複数の構成成分の組み合わせ、または回折格子、ハイパースペクトルイメージング、および／もしくはＣＣＤカメラのうちの１つ以上から選択される特徴を含んでもよい。
【００４９】
典型的には、光ファイバーは、試料により生成される生物発光シグナルの捕捉を可能にする。前記光ファイバーは、捕捉された光またはシグナルを、回折格子およびＣＣＤカメラを含む分光光度計へと運ぶ。したがって、回折された光スペクトルは、ＣＣＤカメラにおいて記録され、次いで数学的スペクトル分解を介して処理され、これが、ドナーおよびアクセプター分子のスペクトルを抽出することを可能にする。
【００５０】
本発明によるリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイを行うために好適な装置は、１つより多くの光ファイバーにより適応させて、それにより、１つより多くのウェルにおける、好ましくは各ウェルにおける生物発光シグナルを捕捉することを可能にすることができる。装置は、したがって、十分な範囲の数の光ファイバーを含んでよく、これは例えば２〜１５３６本の光ファイバーであってよく、または、範囲は、２、１０、１２、２４、４８、９６、３８４または１５３６本から開始してこれから終わってもよい。
【００５１】
本発明によるＢＲＥＴ装置または装置は、反応混合物を含むための複数の反応ウェル、回折格子、ＣＣＤカメラ、１つ以上の光ファイバーを備えた分光計を含むＢＲＥＴ機器を含み、この全ては、得られたスペクトルシグナルの分解、ならびにエネルギードナーのおよびエネルギーアクセプターのスペクトルの形態および面積を定量的な様式において返送することを可能にする情報インターフェースを備えたコンピューターに連結されている。
【００５２】
検出システムは、これらに限定されないが、小型モジュールおよび当該モジュールにおいて配置されたイメージングデバイスを含む。イメージングデバイスは、これらに限定されないが、ＣＣＤカメラおよび冷却ＣＣＤカメラを含んでもよい。電荷結合デバイス（ＣＣＤ）検出器は、コンピューターシリコンチップを作製することにおいて用いられるものと類似の技術を用いて、集積回路を作製するための、薄いシートにスライスされたケイ素の結晶からなる。ＣＣＤ技術の詳細な概説については、Spibeyら（2001, Electrophoresis 22：829-836）を参照されたい。ケイ素ベースの検出器の特性の一つは、それらの光に対する高感度であり、これは、これらが可視光から近赤外光の範囲における光を検出することを可能にする。ＣＣＤカメラは、光の光子を、ＣＣＤのピクセルをちょうど２〜３ｅＶのエネルギーで照射する４００〜１０００ｎｍの波長において、電子へと変換することにより、作動する。ＣＣＤは、１つのもののアウトプットが次のもののインプットとして役立つように連結された半導体を含む。この方法において、入ってくる光子の強度に対応する電荷のパターンは、ＣＣＤの、ＣＣＤの縁におけるアウトプット記録器およびデジタル化のための増幅器への読み出しである。より古い強化されたＣＣＤカメラは、より新しい世代の冷却ＣＣＤカメラよりも、はるかに低い感受性を有した。このことは、ＣＣＤチップのケイ素格子中の熱エネルギーからの熱雑音（「暗電流」と称される）が、一定の電子の放出をもたらすからである。チップを冷却した場合、熱雑音は劇的に減少する；暗電流は、温度が２０℃低下するごとに１０分の１に減少する。ＢＲＥＴシステムにおいて、ＣＣＤカメラは、通常、光が入らない標本チャンバー中にマウントされ、低温冷却ユニットに取り付けられる（カメラの冷却のために）。コンピューターシステムに連結されたカメラコントローラーが、データの獲得および分析のために用いられる。スペクトル放射は、全可視スペクトルを記録するための液体窒素により冷却されたＣＣＤカメラを備えたSpectra Pro 2300iなどの分光計または任意の等価物に連結された光ファイバーにより集められる。回折格子は、伝導された光を、空間的に分離された波長構成成分に分散させ、これらは、イメージセンサー（ＣＣＤ）により受容される。LabViewプログラム言語（National Instruments, Austin, Tx, USA）または任意の他の等価物を用いて、生物発光スペクトルの獲得を実行して、ＢＲＥＴシグナルのその多様な構成成分へのリアルタイムスペクトル分解を行うために、インターフェースを開発することができる。
【００５３】
一態様によれば、本発明によるリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイは、受容体または電位依存性イオンチャネルであるタンパク質のためのアッセイを提供する。さらに提供されるのは、かかる受容体または電位依存性イオンチャネルまたはその多様なフラグメントをコードする核酸を含むプローブであり、ここで、１つ以上の生物発光性ドナー分子および蛍光性アクセプター分子は、前記分子プローブ中の核酸に融合し、それにより前記受容体または電位依存性イオンチャネルのモニタリングおよび／または検出を可能にする。
【００５４】
この態様によれば、リアルタイムＢＲＥＴのための新規のアッセイおよび装置は、生細胞における、１つまたは複数のＴＲＰＶイオンチャネル、より具体的にはＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３、およびＴＲＰＶ４イオンチャネルの活性化の測定のために用いることができる。通常の選択的なフィルターベースのアプローチの代わりに、ＢＲＥＴシグナルの全放射スペクトルの分解は、三色ＢＲＥＴ試験を行うための信頼し得る方法を初めて提供した。この新規のアプローチを、単一のアッセイにおいて同時にリアルタイムで、複数のＴＲＰＶイオンチャネル、より具体的にはＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３、およびＴＲＰＶ４の選択的な活性化を観察するために用いた。ＴＲＰを含むイオンチャネルに対するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の実施は、より困難であることが証明されたので、これは顕著な進歩である。ＴＲＰおよび他のイオンチャネルの活性を評価するための至適基準は、パッチクランプ電気生理学である。自動化された電気生理学および平面パッチクランプ技術を含む、イオンチャネル標的の直接スクリーニングのためのスループットを増大する改善が、急速に出現しているが、これらのアプローチは、なお費用が掛かり、専門家による扱いを必要とする。ＨＴＳについて、間接的読み出し技術が、初期スクリーニングステップとしてしばしば用いられ、これは後でパッチクランプにより確認される。これらの技術は、通常、膜電位または細胞質内カルシウム濃度の変化をモニタリングするために、蛍光アッセイに依存する。しかし、イオンチャネル機能の間接的アッセイは、シグナル伝達経路における複数のステップにより分離された、チャネルから遠いエンドポイントをモニタリングするので、しばしば偽陽性のヒットを生じる。受容体活性化に近いイベントを測定することにより、偽陽性の可能性を軽減することができる。したがって、生細胞におけるチャネルの活性化をリアルタイムでモニタリングするためのＢＲＥＴプローブの出現は、非常に価値がある。定常状態のＴＲＰＶ１サブユニットのオリゴマー化は、ＦＲＥＴまたはBiMolecular蛍光補完とＢＲＥＴとの組み合わせのいずれかを用いて先に研究されているが、一方で、これらの著者のいずれも、ＴＲＰＶ１の活性化の後で測定されたシグナルのいかなるバリエーションをも示すことができなかった。いくつかの研究は、分子内および分子間ＦＲＥＴベースのプローブを用いてイオンチャネル活性化を測定することに成功したが、１つの研究グループのみが、イオンチャネル活性をモニタリングするためのＢＲＥＴに基づくバイオセンサーの使用を首尾よく報告し、これは、ＦｌＡｓＨ（フルオレセインヒ素ヘアピン結合剤(fluorescein arsenical hairpin binder)）との組み合わせにおけるＫｉｒ３内向き整流性カリウムチャネルに焦点を合わせる。ＦｌＡｓＨ／ＢＲＥＴアプローチを他のチャネルに適応させることは、チャネル活性化によるＢＲＥＴシグナルにおける最適なバリエーションを生じるためにＦｌＡｓＨ配列をチャネル構造中に挿入する方法を決定するために、詳細な研究を必要するであろう。さらに、ＢＲＥＴシグナルにおける代替物はしばしば弱く、基線のＢＲＥＴシグナルの５〜１０％を越えない。先鋭な対照において、本発明によるＴＲ��Ｖ−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭを用いる実験は、活性化により、著しくより大きな、対応する基線の正味のＢＲＥＴの６５〜１１５％の範囲の、増大を検出した。これらのプローブは、チャネル活性についての直接的な情報を提供する単純な細胞ベースのアッセイを開発するための、広範な可能性を提供する。本発明は、初めて、電圧調節型イオンチャネルの非フィルターベースのＢＲＥＴ分析を認識し、ここで、前記分析は、生細胞における電圧調節型イオンチャネルの活性化または阻害を検出するためのリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイに基づき、ここで、前記アッセイは、１つ以上の電圧調節型イオンチャネルに対して特異的な２つ以上のＢＲＥＴプローブを使用し、およびここで、前記アッセイは、単一の試料から、およびいくつかのウェルにわたり同時に、複数のシグナルを同時に捕捉することができる。本発明はまた、正確かつ信頼し得る情報の作成を提供する、計器および方法を含む。本発明の１つの目的は、イオンチャネルを標的として、より優れた効率を有する、スクリーニングシステムを提供することである。本発明は、標的イオンチャネルに対して作用する化合物のための多重化スクリーニングのための、改善されたアッセイおよび材料を提供する。特別に好ましい態様において、本発明は、一度に、１つ以上の電位依存性イオンチャネルについて、１つまたは複数のウェルまたは試料を読み取ることができる、非フィルターベースのリアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイを提供し、ここで、前記電位依存性イオンチャネルは、一過性受容体電圧（ＴＲＰ）チャネルである。
【００５５】
本発明によるフルスペクトルＢＲＥＴ多重化アッセイは、また、いくつかの分子イベントを同時にモニタリングするため、またはそれらの関与の動力学を評価するために、重要なものであり得る。例えば、Ｇタンパク質共役受容体ファミリー中の単一の受容体は、様々なシグナル伝達経路に関与すること、および、この膜タンパク質に結合する多様な薬物は、それらの各々に対して異なる影響を及ぼし得ることが知られており、このことは、有効性の概念の再評価をもたらす。言い換えれば、所与のシグナル伝達経路のためのアゴニストであるリガンドは、同じ受容体を介する異なる経路のためのアンタゴニストまたはインバースアゴニストとしてすら作用し得る。イオンチャネル経路におけるタンパク質−タンパク質相互作用の大きなネットワークは、潜在的な薬物標的の豊富なソースを提供し、これは、新規の本発明によるアッセイを使用することにより、首尾よく引き出す(tap)ことができる。
【００５６】
一般にＴＲＰチャネル、および特に例えば、ＴＲＰＶ１チャネルは、カベオリン、β−アレスチン−２、ＡＫＡＰ７９／１５０およびＰＫＣβ２などの複数のパートナー、ならびに他のＴＲＰチャネルと相互作用することが示されている。ＴＲＰＶ１とこれらのパートナーの各々との間の相互作用を試験するために新規のＢＲＥＴプローブを構築することは、ＴＲＰＶ１とそれらの相互作用との間の複雑な動的相互作用を分解することに、大きく寄与し、したがって、タンパク質−チャネル界面を標的とする新たな化合物の探求において巨大分子複合体をスクリーニングするための、新たな有効な方法を提供する。この文脈において、単一の多色アッセイプロトコルを介して複数のシグナル伝達経路をモニタリングすることは、高い価値がある開発を表した。
【００５７】
本発明はまた、目的のタンパク質中で起こる任意の相互作用、立体構造変化などを決定するために、プロービングするための有用なツールを提供する。結果として、目的のタンパク質の異なるＢＲＥＴ−バイオセンサーを多重化することにより、本発明は、各々のタンパク質に特異的な薬理学的フィンガープリントをセットアップする可能性を提供し、それにより、関与する多様なシグナル伝達経路に対する異なるリガンドの区別し得るシグナル伝達様式を区別することを可能にする。本発明における使用のための特異的プローブは、以下の例において記載されるように構築することができる。
【００５８】
かかるプローブは、１つ以上の生物発光性ドナー分子および少なくとも２つの蛍光性アクセプター分子を含む電位依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードする、新規の核酸を含んでもよい。この態様により、新規のＢＲＥＴプローブは、１つの生物発光性ドナー分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、および／または少なくとも２つの蛍光性アクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、電位依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列からなってもよい。
【００５９】
電位依存性イオンチャネルサブユニットは、電位依存性カチオンチャネルであっても電位依存性アニオンチャネルであってもよい。２〜２４個の膜貫通ドメインを含み得るこれらの電位依存性イオンチャネルの複雑な構造を考慮すると、ＢＲＥＴドナーおよびアクセプターのタグを有するかかる融合サブユニットが構造的および機能的統合性を保つであろうことは驚くべきことであった。本発明の好ましい態様において、電位依存性イオンチャネルサブユニットは、電位依存性アニオンチャネルのサブユニットを含み得る。電位依存性イオンチャネルサブユニットは、電位依存性カチオンチャネルのサブユニットを含み得る。これらのチャネルは、細胞において発現する場合、Ｎ末端およびＣ末端が細胞質内にある限り、任意のソースのものであってよい。
【００６０】
リアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイにおける使用のための前記プローブは、少なくとも１つの生物発光性ドナー分子に結合し少なくとも１つの蛍光性アクセプター分子に結合した電位依存性カチオンチャネルサブユニットを含む、任意のタンパク質またはチャネルまたは受容体、またはより具体的には電位依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含み、前記電位依存性カチオンチャネルサブユニットは、一過性受容体電圧（ＴＲＰ）チャネルのサブユニットであり、およびここで、前記生物発光性ドナー分子およびアクセプター分子は、生物発光性ドナー分子の放射スペクトルが、アクセプター分子の吸光スペクトルとオーバーラップして、生物発光性ドナー分子により送達される光エネルギーが、アクセプター分子を励起することができる波長におけるものとなるように、選択される。ある好ましい態様において、前記サブユニットは、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３またはＴＲＰＶ４チャネルに属する。最も好ましい態様において、プローブは、Ｌｕｃ−ＴＲＰＶ３／ＹＦＰ−ＣａＭ、ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ、ＴＲＰＶ４−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭおよび／またはそれらの等価物から選択される、Ｌｕｃ−ＴＲＰＶ／ＹＦＰ−ＣａＭである。
【００６１】
例として、前記プローブは、以下の立体配置を有していてもよい：（ｉ）前記生物発光性ドナー分子は、チャネルサブユニットのＣ末端に結合していてもよく、前記アクセプター分子は、前記チャネルサブユニットのＮ末端に結合していてもよい、（ｉｉ）前記生物発光性ドナー分子は、チャネルサブユニットのＮ末端に結合していてもよく、アクセプター分子は、前記チャネルサブユニットのＣ末端に結合していてもよい、（ｉｉｉ）前記生物発光性ドナー分子は、チャネルサブユニットのＣ末端に結合していてもよく、アクセプター分子は、第１または第２の細胞内ループの一部に結合していてもよい、（ｉｖ）前記生物発光性ドナー分子は、チャネルサブユニットのＮ末端に結合していてもよく、前記アクセプター分子は、第１または第２の細胞内ループの一部に結合していてもよい、（ｖ）前記アクセプター分子は、チャネルサブユニットのＣ末端に結合していてもよく、生物発光性ドナー分子は、第１および／または第２の細胞内ループの一部に結合していてもよい、（ｖｉ）前記アクセプター分子は、チャネルサブユニットのＮ末端に結合していてもよく、生物発光性ドナー分子は、第１および／または第２の細胞内ループの一部を形成し、（ｖｉｉ）前記生物発光性ドナー分子は、第１の細胞内ループの部分を形成してもよく、前記アクセプター分子は、第２の細胞内ループの部分を形成してもよい、または（ｖｉｉｉ）前記生物発光性ドナー分子は、第２の細胞内ループの部分を形成してもよく、前記アクセプター分子は、第１の細胞内ループの部分を形成してもよい。
【００６２】
本発明はさらに、少なくとも１つの生物発光性ドナー分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、および／または少なくとも２つの蛍光性アクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、チャネルまたは受容体、より具体的には、電位依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供することにより、チャネルまたは受容体、より具体的には、電位依存性イオンチャネルの標的ドメインに結合することができる化合物または候補を同定する方法に関する。
【００６３】
本発明はまた、上記のような電位依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードする核酸を含む、発現ベクターに関する。本発明はまた、上記のようなプローブを運搬する核酸またはポリヌクレオチドまたはベクターで遺伝子操作された、細胞に関する。細胞は、細胞培養または宿主の一部におけるものであってよい。前記細胞または前記宿主は、前記ポリヌクレオチドまたはベクター（単数または複数）を、その／それらの存在により、前記核酸またはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（すなわち、融合サブユニット）の発現を媒介する細胞または宿主中に導入することにより、産生させることができる。細胞または宿主は、任意の原核生物または真核生物の細胞であってよい。宿主は、任意の原核生物または真核生物の細胞であってよい。本発明はまた、電位依存性イオンチャネルサブユニットの発現のための発現ベクターを含む、組み換え宿主細胞に向けられ、前記ベクターは、上記のような電位依存性イオンチャネルサブユニットまたはその機能的に同等の活性フラグメントをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む。
【００６４】
本発明による組み換え細胞は、したがって、発現ベクターを含み、ここで、前記チャネル融合サブユニットが発現され、他のホモマーまたはヘテロマーのチャネルサブユニットとin vitroおよびin vivoで共集合して、機能的チャネルを形成することができる。本発明は、上記のような前記チャネル融合サブユニットの生成のためのプロセスを具体化し、該プロセスは、前記本発明による組み換え細胞を培養すること、および前記チャネル融合サブユニットを発現させることを含む。本発明はまた、電位依存性チャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、かかる発現ベクターを含む組み換え細胞、電位依存性イオンチャネルサブユニットの生成のためのプロセス、ならびに電位依存性融合サブユニット自体に関する。
【００６５】
ＢＲＥＴのためのアッセイ
非フィルターベースのアッセイは、本発明によるアッセイのために最も好ましい形式であるが、これを含む新規の核酸およびプローブはまた、フィルターベースのアッセイにおいても用いることができる。したがって、好ましい態様において、生物発光タンパク質とアクセプター分子との間に起こるエネルギー転移は、特定の波長を選択する光学フィルター（一方はアクセプター分子放射のため、他方は生物発光タンパク質放射のため）を用いて測定された放射から計算された比として表される（式１を参照）。
式１：        Ｅａ／Ｅｄ＝ＢＲＥＴ比  （１）
ここで、Ｅａは、アクセプター分子放射強度（放射光は、アクセプターの放射のために適応させた特定のフィルターを用いて選択される）として定義され、Ｅｄは、生物発光タンパク質放射強度（放射光は、生物発光タンパク質の放射のために適応させた特定のフィルターを用いて選択される）として定義される。
【００６６】
当業者は、光学フィルターは、ＢＲＥＴのために好適な波長識別を可能にする任意の型のフィルターであってよいことを、容易に理解するはずである。例えば、本発明により用いられる光学フィルターは、干渉フィルター、ロングパスフィルター、ショートパスフィルターなどであってよい。フィルターを通して通過する波長の強度（通常、カウント毎秒（ＣＰＳ）または相対輝度単位（ＲＬＵ）において）は、光電子増倍管（ＰＭＴ）またはＣＣＤカメラのいずれかを用いて定量することができる。定量されたシグナルを、ＢＲＥＴ比を計算して、エネルギー転移効率を表すために、連続して用いることができる。ＢＲＥＴ比は、アクセプター放射の強度が増大するにつれて、増大する。
【００６７】
一般に、ドナー放射強度に対するアクセプター放射強度の比を決定し（式１を参照）、これは、エネルギー転移効率を反映する任意の単位において表される数である。比は、エネルギー転移効率の増大につれて増大する。
【００６８】
エネルギー転移効率はまた、アクセプター放射強度に対するドナー放射強度の反比を用いて表すことができる（式２を参照）。この場合、比は、エネルギー転移効率が増大するにつれて減少する。この計算を行う前に、放射強度を、バックグラウンド光および基質の自家発光の存在について補正する。この補正は、一般に、適切な波長において測定された放射強度を、基質を含むが、本発明の生物発光タンパク質、アクセプター分子またはポリペプチドを含まない対照試料から減算することにより、行うことができる。
式２：        Ｅｄ／Ｅａ＝ＢＲＥＴ比  （２）
ここで、ＥａおよびＥｄは、上記のとおりである。
【００６９】
生物発光タンパク質およびアクセプター分子放射の光強度もまた、分光蛍光光度計、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラまたはダイオードアレイ検出器などのモノクロメーターベースの機器を用いて、定量することができる。分光蛍光光度計を用いて、基質の添加により生物発光タンパク質およびアクセプター分子放射の両方のピークが検出されるように、放射スキャンを行う。ピーク下の面積は、相対光強度を表し、上で概略されるように比を計算するために用いる。同じ試料からの生物発光タンパク質およびアクセプター分子についての光を測定することができる任意の機器を、本発明のＢＲＥＴシステムをモニタリングするために用いることができる。
【００７０】
代替的な態様においては、アクセプター分子放射のみが、ＢＲＥＴの有効な検出および／または定量のために好適である。この場合、エネルギー転移効率は、アクセプター放射強度のみを用いて表される。エネルギー転移を測定するために、いかなる比の計算をも行うことなくアクセプター放射強度を用いることができることは、当業者には容易に明らかとなるであろう。このことは、理想的には、アクセプター分子は、それが生物発光タンパク質から転移した光を吸収する場合にのみ光を放射するであろう、という事実に起因する。この場合においては、１つの光フィルターのみが必要である。
【００７１】
関連する態様において、生物発光タンパク質放射のみが、ＢＲＥＴの有効な検出および／または定量のために好適である。この場合、エネルギー転移効率は、生物発光タンパク質放射強度のみを用いて計算される。エネルギー転移を測定するために、いかなる比の計算をも行うことなくドナー放射強度を用いることができることは、当業者には容易に明らかとなるであろう。このことは、アクセプター分子は生物発光タンパク質から転移した光を吸収するので、対応する生物発光タンパク質からの検出可能な放射の減少が存在するという事実に起因する。この場合においては、１つの光学フィルターのみが必要である。
【００７２】
代替的な態様において、エネルギー転移効率は、測定のために１つの光学フィルターのみを必要とする比率計測測定を用いて表される。この場合において、ドナーまたはアクセプターについての光強度は、適切な光学フィルターを用いて決定され、試料の別の測定は、いかなるフィルターをも使用することなく行われる（オープン(open)スペクトルの強度）。この後者の測定において、合計の光アウトプット（全ての波長について）が定量される。次いで、式３または４のいずれかを用いて比の計算を行う。式３について、アクセプターのための光学フィルターのみが必要とされる。式４について、ドナーのための光学フィルターのみが必要とされる。
式３：        Ｅａ／Ｅｏ−Ｅａ＝ＢＲＥＴ比または＝Ｅｏ−Ｅａ／Ｅａ  （３）
式４：        Ｅｏ−Ｅｄ／Ｅｄ＝ＢＲＥＴ比または＝Ｅｄ／Ｅｏ−Ｅｄ  （４）
ここで、ＥａおよびＥｄは、上で定義されるとおりであり、Ｅｏは、組み合わされた全波長（オープンスペクトル）についての放射強度として定義される。
【００７３】
式１〜４からさらなる式を誘導することができることは、当業者には容易に明らかとなるはずである。例えば、１つのかかる誘導物は、生物発光タンパク質および／またはアクセプター分子についての放射波長において存在するバックグラウンド光について補正することを含む。
【００７４】
ＢＲＥＴアッセイを行うことにおいて、光放射は、各ウェルからBRET Countを用いて検出することができる。BRET Count機器は、改変されたTopCountであり、ここで、TopCountは、Packard Instrument（Meriden, CT）により販売されるマイクロタイタープレートシンチレーションおよび発光カウンターである。バックグラウンドノイズを除去するために２本の光電子増倍管（ＰＭＴ）を同時に用いる古典的なカウンターとは異なり、TopCountは、標準的な不透明なマイクロタイタープレートにおける計数を可能にするために、ノイズ減少のために単ＰＭＴ技術および時間分解パルス計数を使用する。不透明なマイクロタイタープレートの使用は、光漏話を無視し得るレベルまで減少させることができる。TopCountは、１、２、６および１２個の検出器（ＰＭＴ）を含む多様な形式となり、これらは、それぞれ１、２、６または１２個の試料の同時読み取りを可能にする。BRET Countの他にも、他の市販の機器により、ＢＲＥＴを行うことができる：Victor 2（Wallac, Finland（Perkin Elmer Life Sciences））およびFusion（Packard Instrument, Meriden）。ＢＲＥＴは、少なくともアクセプター分子放射および好ましくは２つの波長（アクセプター分子および生物発光タンパク質について）またはそれより多くを検出することができるリーダーを用いて行うことができる。
【００７５】
本発明の一態様において、ＢＲＥＴは、マイクロ流体装置を用いて検出される。マイクロ流体装置は、便利なことに、一般に約５０μＬ以下の試料のアリコートのみを、マイクロ流体装置の試料リザーバに移すことを必要とする。これは、手動で、またはシリンジ、キャピラリーなどを介した気圧注射により行われる。
【００７６】
マイクロ流体を用いる自動発光バイオチップ装置は、全ての必要なＢＲＥＴ反応ステップを行うために用いることができる。マイクロ流体バイオチッププラットフォームにおいてＢＲＥＴ反応を自動化することは、これにより複数の手動の取り扱いステップが回避され、実験の実施におけるヒトの時間および労力を削減されるので、望ましい。マイクロ流体装置は、パターン化されたマイクロチャネルならびに複数の試料、試薬および基質を貯蔵するための貯蔵手段を有する区画を備えた、自給型のディスポーザブルなバイオチップを含んでもよい。試料または試薬のうちの少なくとも１つ、および次いで発光性基質を、区画からマイクロチャネルを通して反応部位へと連続的に移動させるステップは、自動化することができる。発光性基質は、次いでドナー分子と反応して発光をもたらし、これは、光学検出器により検出されるであろう。発光を検出するためのマイクロ流体装置の一例は、米国特許出願番号US6,949,377において記載される。
【００７７】
さらなる側面において、本発明は、目的のタンパク質のアゴニストまたは阻害剤化合物をスクリーニングするためのキットを提供し、当該キットは、本発明の核酸もしくはポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の組み換え細胞もしくは宿主細胞、または本発明の無細胞の組成物もしくは組成物、および／または本発明のバイオセンサーを含む。
【００７８】
本発明は、最後に、標的の新たな阻害剤／活性化因子の同定のための薬物スクリーニング、薬理学的スクリーニング、分子薬理学の研究、同時にいくつかの薬理学的標的に対する化学化合物／物理的刺激の効果の識別、いくつかの同時の分子イベントに対する化学化合物／物理的刺激の動力学的効果の研究などを行うための方法を提供し、ここで、前記方法は、生細胞における多様な生物学的活性を検出および／またはモニタリングするための、リアルタイム多重化多色ＢＲＥＴアッセイを含み、ここで、前記アッセイは、単一の試料から、およびいくつかのウェルにわたり同時に、複数のシグナルを同時に捕捉することができる。
本発明は、任意の目的のタンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る、広範な化合物を検出するために用いることができる。
【００７９】
試験化合物がリガンドとして機能するか否かを評価するこの方法によれば、方法は、以下を含む：（ｉ）少なくとも１つの生物発光性ドナー分子をコードするヌクレオチド配列に結合し、および／または少なくとも１つのアクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む細胞を提供すること；（ｉｉ）前記細胞を、試験化合物に接触させること；ならびに（ｉｉｉ）結果として生じる反応または相互作用およびアウトプットを決定すること。本発明はまた、少なくとも１つの生物発光性ドナー分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、および／または少なくとも１つのアクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、電位依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む、バイオセンサーを提供する。なおさらに、本発明は、少なくとも１つの生物発光性ドナー分子をコードするヌクレオチド配列に結合し、および／または少なくとも１つのアクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、生物発光共鳴エネルギー転移システムを提供する。
【００８０】
本発明によるスクリーニングの方法は、薬物の発見および／または開発のために用いられる。また本発明の範囲内において企図されるのは、医薬組成物を製造する方法であって、該方法は、（ｉ）本発明による方法を行うこと；（ｉｉ）目的のタンパク質と相互作用する試験化合物を同定すること；および（ｉｉｉ）前記試験化合物を、薬学的に受入可能なキャリアと組み合わせることを含む。
【００８１】
その効果のために、本発明はまた、生物学的構成成分を、物理化学的な検出器の構成成分と組み合わせる、分析物の検出のためのバイオセンサーまたは装置を提供する。それは、典型的には、３つの部分からなり、第１に、目的のタンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド分子である。第２に、変換または検出素子であり、これは、化合物と試験物質との相互作用から生じるシグナルを、より容易に測定および定量することができる別のシグナルに変換する物理化学的方法（例えば、光学的、電気化学的）において作用する（すなわち、トランスデューサー）。第３に、その後に相互作用の結果をユーザーフレンドリーな方法において提示する、関連する電気またはシグナルのプロセッサーである。
【００８２】
例
例１：ＴＲＰチャネルに対する多重化ＢＲＥＴアッセイ
例１．１：多重化ＢＲＥＴアッセイを用いる研究の概要
生細胞における機能的ＴＲＰ（一過性受容体電圧）チャネルの活性化をリアルタイムでモニタリングするために、多重化生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）アッセイを開発した。ＴＲＰＶ１の分子内再配置およびカルモジュリンとのその相互作用の両方を、化学的アゴニスト、ｐＨおよび温度による活性化の下で、探索した。カルモジュリンとの相互作用に基づくＢＲＥＴアッセイを、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４にも首尾よく拡大した。単一の試料において３つのうちの各ＴＲＰＶチャネルの特異的活性化を分析することができるフルスペクトル三色ＢＲＥＴアッセイを開発した。ＢＲＥＴ測定におけるこの主要な改善により、生細胞における独立した生物学的経路の同時モニタリングを可能にした。
【００８３】
ＴＲＰタンパク質は、ユビキタスに発現し、機能的な多様な、いくつかのカチオンに対して異なる選択性を有する、カチオン透過性チャネルのスーパーファミリーを形成する。全てのＴＲＰは、６個の膜貫通ドメインを含む複合的なタンパク質である。ＮおよびＣ末端ドメインは、細胞内にあり、ＴＲＰの機能、調節およびチャネルの組み立てに関与していることが知られている。ＴＲＰチャネルは、化学物質の伝達、温度および機械的刺激を含むいくつかの物理化学的手段により活性化することができる。ＴＲＰチャネルは、したがって、それらの開確率を変化させることにより応答する、ポリモーダルなシグナル統合装置として機能する。それらは、ヒトにおける、感覚生理学、心血管、消化管および泌尿器科的機能、ならびに免疫および発達を含む、多様な生理学的プロセスに緊密に関与する。結果として、ＴＲＰチャネルの機能不全は、多くの疾患に関与すると考えられており、これは、高度に有望な薬物標的としてのそれらの出現をもたらしている。ＴＲＰチャネルの中で、６つは、熱ＴＲＰとして認識され、一次体性感覚ニューロンにおいて発現し、特定の温度において活性化される。ＴＲＰＶ１〜４は、中程度（ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４）から有害な熱（ＴＲＰＶ１およびＴＲＰＶ２）までの範囲の温度上昇を伝達するが、一方、ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＡ１は、それぞれ中程度および極端な低温により活性化される。
【００８４】
本研究において、本発明者らは、生細胞においてＴＲＰＶ１チャネルのポリモーダルな活性化をリアルタイムでモニタリングするための、分子内および分子間ＢＲＥＴに基づくバイオセンサーを開発した。本発明者らはまた、分子間アプローチを、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４の両方の化学的活性化をモニタリングするために拡大した。最後に、スペクトル分解を用いて、本発明者らは、単一のアッセイにおいて、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３、およびＴＲＰＶ４イオンチャネルの活性化の同時モニタリングを実証した。
【００８５】
例１．２：プラスミドプローブの調製
ＢＲＥＴコンストラクトを作製するために、スーパーイエロー蛍光タンパク質２およびウミシイタケルシフェラーゼＩＩを用いて、アッセイの輝度を改善した。それらは、文書の残りにおいては、省略してＹＦＰおよびＬｕｃとして言及される。ＬｕｃおよびＹＦＰのｃＤＮＡを、第１に、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位におけるスリーピースライゲーションを用いて（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）一緒にクローニングし、２つの発現ベクター、ＹＦＰがＬｕｃのＮ末端においてインフュージョン(in-fusion)でクローニングされたpcDNA3.1 YFP-Luc、およびＬｕｃがＹＦＰのＮ末端においてインフュージョンでクローニングされたpcDNA3.1 Luc-YFPを得た。ＹＦＰおよびＬｕｃの両方を、pcDNA3-YFP-EPAC-LucベクターからＰＣＲにより増幅した。Ｌｕｃを、ＹＦＰのＮ末端においてHindIII-EcoRIフラグメントとして（用いられたプライマー：「Luc_HindIII_ATG_Ｎ末端センス」および「Luc_no Stop_EcoRI_Ｎ末端アンチセンス」）、または、ＹＦＰのＣＯＯＨ末端において、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして（用いられたプライマー：「Luc_EcoRI_ATG_Ｃ末端センス」および「Luc_XhoI_Stop_Ｃ末端アンチセンス」）クローニングした。平行して、ＹＦＰは、ＬｕｃのＮ末端においてＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして（用いられたプライマー：「YFP_HindIII_ATG_Ｎ末端センス」および「YFP_no Stop_EcoRI_Ｎ末端アンチセンス」）、または、ＬｕｃのＣＯＯＨ末端においてＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして（用いられたプライマー：「YFP_EcoRI_ATG_Ｃ末端センス」および「YFP_XhoI_Stop_Ｃ末端アンチセンス」）クローニングした。ＬｕｃおよびＹＦＰの配列を連結する配列は、リンカーとしてVPVNSGGGGS（配列番号１８）をコードし、ＡｇｅＩ制限酵素切断部位を含んだ。
【００８６】
YFP-hTRPV1-Luc発現ベクターは、ヒトＴＲＰＶ１のｃＤＮＡをpDONR201-hTRPV1ベクター（Harvard Medical School PlasmID Repository、クローンHsCD00081472）から、ベクターpcDNA3.1 YFP-LucのＥｃｏＲＩ部位におけるＥｃｏＲＩのＰＣＲフラグメントとしてサブクローニングすることにより得た（用いられたプライマー：「hTRPV1_EcoRI_Fus_センス」および「hTRPV1_EcoRI_Fus_アンチセンス」）。hTRPV1-Luc発現ベクターは、ｈＴＲＰＶ１のｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして、pcDNA3.1 YFP-LucベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位におけるＹＦＰの位置においてサブクローニングすることにより得た（用いられたプライマー：「hTRPV1_HindIII_ATG_センス」および「hTRPV1_EcoRI_Fus_アンチセンス」）。Luc-hTRPV3発現ベクターは、ｈＴＲＰＶ３のｃＤＮＡ（Harvard Medical School PlasmID Repository、クローンHsCD00341603）を、ＡｇｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして、pcDNA3.1 Luc-YFPベクターのＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ部位におけるＹＦＰの位置においてサブクローニングすることにより得た（用いられたプライマー：「hTRPV3_AgeI_ATG_センス」および「hTRPV3_Stop_XhoI_アンチセンス」）。hTRPV4-Luc発現ベクターは、ｈＴＲＰＶ４のｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩ−ＡｇｅＩフラグメントとして、pcDNA3.1 YFP-LucベクターのＢａｍＨＩ−ＡｇｅＩ部位におけるＹＦＰの位置においてサブクローニングすることにより得た（用いられたプライマー：「hTRPV4_BamHI_ATG_センス」および「hTRPV4_AgeI_Fus_アンチセンス」）。各々の場合において、目的のｃＤＮＡとＬｕｃまたはＹＦＰのいずれかの配列を連結する配列は、リンカーとしてVPVNSGGGGS（配列番号１８）をコードした。
【００８７】
mAmetrineのｃＤＮＡ（プラスミド#54660）およびLSSmOrangeのｃＤＮＡ（プラスミド#37130）は、AddGeneプラスミドリポジトリから得た。Aquamarine、mAmetrineおよびLSSmOrangeのｃＤＮＡは、全て、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして、pcDNA3.1 YFP-LucベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位におけるＹＦＰの位置においてサブクローニングし（用いられたプライマー：「YFP_HindIII_ATG_Ｎ末端センス」および「YFP_no Stop_EcoRI_Ｎ末端アンチセンス」）、pcDNA3.1 FP-Luc発現ベクターを得た（「FP」は、Aquamarine、mAmetrineおよびLSSmOrangeの間の任意の蛍光タンパク質である）。YFP-CaM発現ベクターは、ＣａＭのｃＤＮＡを、ＹＦＰのＣ末端におけるＬｕｃの位置においてＹＦＰ−Ｌｕｃ中にＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてサブクローニングすることにより得た（用いられたプライマー：「hCaM_EcorRI-ATG-センス」および「hCaM_Stop_Xho_アンチセンス」）。同様の戦略を用いて、pcDNA3.1 YFP-Lucの代わりにpcDNA3.1 FP-Luc発現ベクターを用いるFP-CaM発現ベクターを得た。
【００８８】
例１．３：プライマー選択
各ｃＤＮＡコンストラクトの配列は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。
例１．３．１：ＹＦＰおよびＬｕｃプライマーのヌクレオチド配列
Luc_HindIII_ATG_Ｎ末端センス、
TGTCTAAGCTTGGATCCGCCACCATGACCAGCAAGGTGTACGACCCCGAGC（配列番号１）
Luc_no Stop_EcoRI_Ｎ末端アンチセンス、
CACCAGAATTCACCGGTACCTGCTCGTTCTTCAGCACTCTCTCC（配列番号２）
Luc_EcoRI_ATG_Ｃ末端センス、
GTGTACCGGTGAATTCTGGTGGAGGCGGATCTATGACCAGCAAGGTGTACGACCCCGAGC（配列番号３）
Luc_XhoI_Stop_Ｃ末端アンチセンス、
ATCTAGTCTAGACTCGAGCGGTTACTGCTCGTTCTTCAGCACTCTCTCC（配列番号４）
YFP_HindIII_ATG_Ｎ末端センス、
TGTCTAAGCTTGGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACC（配列番号５）
YFP_no Stop_EcoRI_Ｎ末端アンチセンス、
CACCAGAATTCACCGGTACCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG（配列番号６）
YFP_EcoRI_ATG_Ｃ末端センス、
TGTGTACCGGTGAATTCTGGTGGAGGCGGATCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC（配列番号７）
YFP_XhoI_Stop_Ｃ末端アンチセンス、
ATCTAGTCTAGACTCGAGCGGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG（配列番号８）
【００８９】
例１．３．２：ｈＴＲＰＶ１プライマー配列
hTRPV1_EcoRI_Fus_センス、
TGTGTACCGGTGAATTCTGGTGGAGGCGGATCTATGAAGAAATGGAGCAGCACAGACT（配列番号９）
hTRPV1_EcoRI_Fus_アンチセンス、
CACCAGAATTCACCGGTACCTTCTCCCCGGAAGCGGCAGGACTC（配列番号１０）
hTRPV1_HindIII_ATG_センス、
TGTCTAAGCTTGGTACCGCCACCATGAAGAAATGGAGCAGCACAGACT（配列番号１１）
【００９０】
例１．３．３：ｈＴＲＰＶ３プライマー配列
hTRPV3_AgeI_ATG_センス、
TGTCTAAGCTTGGTACCGCCACCATGAAAGCCCACCCCAAGGAGATGG（配列番号１２）
hTRPV3_Stop_XhoI_アンチセンス、
ATCTAGTCTAGACTCGAGCGGCTACACCGAGGTTTCCGGGAATTCCTCG（配列番号１３）
【００９１】
例１．３．４：ｈＴＲＰＶ４プライマー配列
hTRPV4_BamHI_ATG_センス、
TGTCTGGATCCAAGCTTGCCACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCCCCG（配列番号１４）
hTRPV4_AgeI_Fus_アンチセンス、
CACCAGAATTCACCGGTACGAGCGGGGCGTCATCAGTCCTCCACTTGCG（配列番号１５）
【００９２】
例１．３．５：カルモジュリンプライマー配列
hCaM_EcoRI_ATG_センス：
TGTGTACCGGTGAATTCTGGTGGAGGCGGATCTATGGCTGACCAGCTGACTGAGGAGC（配列番号１６）
hCaM_Stop_Xho_アンチセンス：
ATCTAGTCTAGACTCGAGCGGTTACTTTGCAGTCATCATCTGTACAAAC（配列番号１７）
【００９３】
例１．４：試薬
カプサイシンおよびカプサゼピンは、全てTocris（Bristol, UK）からのものである。ドロフェニンおよびGSK1016790Aは、Sigma（Lyon, France）からのものである。AMG517は、Medchemexpress LLC（Princeton, NJ, USA）からのものである。セレンテラジンＨおよびパープルセレンテラジン（Nanolight Technology, Pinetop, AZ, USA）は、５μＭの最終濃度まで添加した。
【００９４】
例１．５：細胞培養および遺伝子導入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎仔血清、１００単位ｍＬ−１のペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地−高グルコース（ＤＭＥＭ）（D6429、Sigma）中で維持した。遺伝子導入の２４時間前に、５００，０００細胞の密度で６ウェルのディッシュにおいて細胞を播種した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、直鎖状、Mr 25,000；カタログ番号23966 Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA）を４：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比で用いて、一過性の遺伝子導入を行った。通常、０．１〜０．２５μｇのドナーコンストラクトおよび１．７５〜１．９μｇのアクセプターコンストラクトを、ＢＲＥＴ測定のために遺伝子導入した。遺伝子導入されたＤＮＡの量は、ｐｃＤＮＡ３．１空ベクターと合わせて合計２μｇにした。一晩のインキュベーションの後で、遺伝子導入された細胞を剥離させ、ＤＭＥＭ、フェノールレッドなし（Ref 21063-029、ThermoFisher scientific, Waltham, MA, USA）中で再懸濁し、１０５細胞／ウェルの密度で、Tristar2ルミノメーター（Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany）での読み取りのためにＤ−ポリリジン（Sigma）で前処理された９６ウェルの透明な底面を有する白色プレート（Greiner Bio one, Courtaboeuf, France）において、または、SpectraPro 2300i分光計（Acton Optics, Acton, MA, USA）での読み取りのためにポリ−Ｌ−リジンで処理された直径１２ｍｍのガラスカバースリップ（Knittel Glass, Braunschweig, Germany）上に、再播種した。細胞を、培養中に２４時間にわたり静置し、その後、ＢＲＥＴアッセイのために処理した。
【００９５】
例１．６：フィルターベースのＢＲＥＴアッセイ
プローブの薬理学的特徴づけのために、アゴニストおよびセレンテラジンＨを細胞に直接加え、各々の測定されたウェル中の全ての細胞集団から放射されたシグナルの連続統合のために、多重検出器TriStar2 LB942マイクロプレートリーダー（Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany）を用いてＢＲＥＴアッセイを行い、Ｌｕｃ（エネルギードナー）およびＹＦＰ（エネルギーアクセプター）光放射についてそれぞれ４８０±２０ｎｍおよび５４０±４０ｎｍの帯域通過ウィンドウにおいて検出した。ＹＦＰアクセプターの放射強度（Ｉ）の、Ｌｕｃドナーの放射強度に対する比を、式１：
【数１】
2019537030.tif 000003
に従って計算することにより、ＢＲＥＴシグナルを決定した。
【００９６】
ＲｌｕｃおよびＥＹＦＰのオーバーラップする放射スペクトルに起因して、ＹＦＰフィルターにおいて検出された光の一部は、Ｒｌｕｃ放射に由来し、これがバックグラウンドＢＲＥＴシグナルをもたらす。式１を用いて、Ｒｌｕｃ融合コンストラクトのみにより遺伝子導入された細胞から、同様にバックグラウンドＢＲＥＴシグナルを測定する。式２：
【数２】
2019537030.tif 000004
に従って、Ｌｕｃ−融合コンストラクトのみが発現された場合に検出されるバックグラウンドシグナルを減算することにより、正味のＢＲＥＴを計算する。
ＴＲＰＶチャネルに基づくプローブの機能性を評価するために、本文において記載されるように、アゴニストおよびアンタゴニストを、３分間にわたり所与の温度およびｐＨにおいて添加し、その後、セレンテラジンＨを添加し、ＢＲＥＴを読み取った。別段に示されない限り、全ての実験は、３７℃およびｐＨ７．５において行った。
【００９７】
例１．７：スペクトルＢＲＥＴアッセイ
全可視スペクトルを読み取るために液体窒素冷却式ＣＣＤカメラを装備したSpectra Pro 2300i分光計に連結させた光ファイバーを用いて、全ＢＲＥＴスペクトルを獲得した（Acton Optics, Acton, MA, USA）。ガラスカバースリップ上に播種され、Teflon（登録商標）製の、等張溶液（１４５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのグルコース）を含む、白色の不透明な測定チャンバー中に配置された、遺伝子導入された細胞から、生物発光シグナルを記録した。細胞バッファーの温度は、Eppendorf（登録商標）ThermoStat Plusを用いて制御し、光ファイバー温度測定Luxtron 812システム（Lumasense technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いてリアルタイムで測定した。
【００９８】
LabViewプログラム言語（National Instruments, Austin, Tx, USA）を用いて、生物発光スペクトルの獲得を実行し、ＢＲＥＴシグナルのその多様な構成成分へのリアルタイムスペクトル分解を行うための、インターフェースを開発した。Ｌｕｃ、ＹＦＰ、mAmetrine、Aquamarine、およびLss-mOrangeの実験的放射スペクトルを、Cary Eclipse蛍光光度計（Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA）を用いて、初めに実験的に得た（図３）。各々のスペクトルを、次いで、式３に基づくガウス曲線の合計としてフィットさせた：
【数３】
2019537030.tif 000005
ここでΨｎは、ａｉとａ１との間の比であり、ａｉはピーク高であり、ｍｉはピークの波長であり、σｉは最大半量における幅である。
【００９９】
最適化されたパラメーターは、LevenbergおよびMarquardtにより開発された非線形最小２乗フィット法に基づく標準的な反復アルゴリズムを用いて誘導した。それを次いでそのまま、アクセプタースペクトル下の面積をドナースペクトル下の面積により除算することにより、各々のプローブについての実際のＢＲＥＴ比を計算した。この分析方法は、ドナー放射によるアクセプターシグナルのコンタミネーションを回避しつつＢＲＥＴシグナルを測定するために、標準的なフィルターベースの方法に対する主要な利点を表した。ＹＦＰ−Ｌｕｃ、Aquamarine−Ｌｕｃ、mAmetrine−Ｌｕｃ、またはLss-mOrangeのいずれかの融合タンパク質を発現する細胞集団からの生物発光シグナルを測定して得られたＢＲＥＴスペクトルの分解の結果を、図４において示した。別段に示されない限り、全ての実験は、３７℃で行った。
【０１００】
SpectraPro 2300iと共にスペクトル分解アプローチが用いられた温度上昇下における実験について、ＹＦＰおよびＬｕｃ放射スペクトルの面積を、２５℃〜５０℃の間で観察されたわずかな変化について補正した（図５）。本発明者らは、２５℃〜５０℃の間からなる温度範囲内において、ＹＦＰ放射が１℃あたり０．４６％直線的に減少した一方で、スペクトルの形状は改変されなかったことを計算した。ＹＦＰ放射スペクトル面積は、したがって、２５℃〜５０℃の間で温度により誘導されるバリエーションについて、式４に従って補正した：
【数４】
2019537030.tif 000006
ここでＴは２５℃〜５０℃の間からなる任意の温度であり、ＡＴは温度Ｔにおいて測定されたＹＦＰスペクトルの面積であり、ＡＴｃｏｒｒは温度Ｔにおける補正されたＹＦＰの面積である。
【０１０１】
本発明者らは、Ｌｕｃ放射スペクトルの形状が、その赤色の部分においてわずかに改変され、これが、２５℃〜５０℃の間からなる温度範囲内において、１度あたり０．１７％のその面積の直線的増大を誘導したことを計算することができた（図５）。Ｌｕｃ放射スペクトル面積は、したがって、２５℃〜５０℃の間で温度により誘導されるバリエーションについて、式５に従って補正した：
【数５】
2019537030.tif 000007
ここでＴは２５℃〜５０℃の間からなる任意の温度であり、ＢＴは温度Ｔにおいて測定されたＬｕｃスペクトルの面積であり、ＢＴｃｏｒｒは温度Ｔにおける補正されたＬｕｃの面積である。
【０１０２】
例１．８：カルシウムアッセイ
ＨＥＫ細胞に、０．６７μＭのFuraPE3-AM（Teflabs, Austin, USA）を、３０分間にわたり３７℃で、ハンク平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）中でロードした。ＰＢＳで洗浄した後、フレッシュなＨＢＳＳを細胞に添加し、３７℃でFlexstation II（Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA）を用いてカルシウム測定を行った。Fura2-AMを、３４０および３８０ｎｍにおいて交互に励起し、５１０ｎｍにおいて放射を読み取った。３４０／３８０ｎｍの比を用いて、細胞質ゾルカルシウム濃度のバリエーションを概算した。
【０１０３】
例１．９：データ分析
ＢＲＥＴおよびカルシウムアッセイにおいて得られたデータを、Prism 6.01ソフトウェア（GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA, USA）を用いて分析した。
【０１０４】
例２：ＴＲＰＶ１ ＢＲＥＴバイオセンサーの検証
以下：（ｉ）ＦＲＥＴ分析により、ＴＲＰに構造的に関連するＫｖ２．１チャネルの細胞内領域内での移動が、ゲーティング機構の一部であったことが明らかとなった、および（ｉｉ）ＴＲＰＶ１がカルモジュリン（ＣａＭ）結合配列を含むという知見から、本発明者らは、生細胞におけるＴＲＰチャネルの活性化をモニタリングするためにＢＲＥＴを用いることができるという仮説を立てた。ＴＲＰファミリー中で最も研究されているチャネルであるＴＲＰＶ１を、したがって、活性化の後のチャネルの立体構造変化およびＣａＭのドッキングを探索するための、本発明者らの主なモデルとして用いた。この目的のために、本発明者らは、ＴＲＰＶ１タンパク質のＣ末端部分に融合したエネルギードナーであるウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、およびＴＲＰＶ１−ＬｕｃまたはＣａＭのいずれかのＮ末端部分に融合したエネルギーアクセプターである黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）に依存する、２種類の近接性に基づくＢＲＥＴアッセイを開発した。第１の場合において、ＴＲＰＶ１タンパク質は、Ｌｕｃ基とＹＦＰ基との間に挟まれ、その結果として分子内ＢＲＥＴプローブを生じ、これは以下においてＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃと称される。一方、第２の場合においては、ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃに対するＹＦＰ−ＣａＭのドッキング（ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ）を測定した。
【０１０５】
ＴＲＰチャネルの活性化を、遺伝子導入されたＨＥＫ２９３Ｔヒト胎性腎細胞において評価した。本発明者らは、第１に、遺伝子導入の後で、本発明者らのＴＲＰＶ１融合タンパク質が、Ｎおよび／またはＣ末端のＹＦＰまたはＬｕｃ基の付加にもかかわらず、機能的であり続けるか否かを評価した。この目的のために、本発明者らは、ネイティブなＴＲＰＶ１またはＢＲＥＴコンストラクト、ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−ＬｕｃまたはＴＲＰＶ１−Ｌｕｃのいずれかを偽(mock)遺伝子導入された、または遺伝子導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、カルシウムの流入を測定した。プロトタイプのＴＲＰＶ１アゴニストであるカプサイシン（ＣＡＰＳ）への暴露の後で、ＴＲＰＶ１、ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ、またはＴＲＰＶ１−Ｌｕｃを発現する細胞において、細胞質ゾルカルシウム濃度の急速な、持続的な増大が、観察されたが、偽遺伝子導入された細胞においてはそうではなかった。このことは、先のデータと一致して、ＹＦＰおよび／またはＬｕｃ基のいずれかの付加は、ＴＲＰＶ１チャネル開口を妨げなかったことを示す。ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−ＬｕｃまたはＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、次いで、ＢＲＥＴ分析のために処理した。いずれの場合においても、カプサイシンへの暴露の後で一次動力学により増大した、基線のＢＲＥＴシグナルを測定した。
【０１０６】
分子内ＴＲＰＶ１ ＢＲＥＴプローブから測定された基線のＢＲＥＴシグナルの増大は、チャネル開口の間のチャネルのＴＲＰＶ１四量体組織の内側でのＬｕｃとＹＦＰとの間のエネルギー転移の異なる様式における変化を完璧に反映し得る。しかし、ＴＲＰＶ１とカルモジュリンとの間の基線のＢＲＥＴの増大は、より理解しづらい。なぜならば、それは、予め組み立てられたＴＲＰＶ１−ＣａＭ複合体の立体構造変化から、および／またはこれら２つのパートナーの間の会合−解離平衡の変容から、もたらされ得るからである。興味深いことに、ＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いる細胞質内カルシウムプールのキレート化、または４つ全てのカルシウム結合部位が変異したＹＦＰタグされたＣａＭ変異体（ＹＦＰ−ＣａＭ１２３４）のアクセプターとしての使用は、いずれも、基線のＢＲＥＴシグナルを深刻に減少させ、ＣＡＰＳにより誘導されるＢＲＥＴ増大を消失させた。これらの結果は、ＴＲＰＶ１、およびカルシウムに結合したＣａＭのプールは、静止状態において予め会合し得ること、ならびに、本発明者らのＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ分子間ＢＲＥＴアッセイにおいて、カルシウムに結合したＣａＭにより、ＣＡＰＳにより誘導されるＢＲＥＴの増大が必ず観察されることを示した。ＴＲＰＶ１とＣａＭとの間の相互作用をさらに特徴づけるために、本発明者らは、ＣＡＰＳの存在下または不在下において、ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ ＢＲＥＴ対の全ＢＲＥＴ滴定曲線作成を行った。ＣＡＰＳの不在下において、ＢＲＥＴシグナルは、ＹＦＰ−ＣａＭ／ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃの比の双曲線の関数として増大し、これは、特定のタンパク質−タンパク質相互作用の指標である。測定されたシグナルの選択性は、ＴＲＰＶ１−ＬｕｃとＹＦＰ−ＣａＭとの共発現が、同じ範囲にわたり直線的に進行するより弱いエネルギーアクセプター／ドナーのシグナルをもたらしたという事実により、さらに支持された。バイスタンダーＢＲＥＴを生じるであろうランダムな分子の衝突は、ＹＦＰ／ＲＬｕｃの広範囲にわたってほぼ直線的に増大することが示されていることから、この最後の結果は、ＴＲＰＶ１が、カルシウムフリーのＣａＭとの相互作用には関与し得ないことを、明確に示した。ＣＡＰＳの添加は、観察される最大ＢＲＥＴシグナルを劇的に増大し、曲線の形状にわずかだが顕著な影響を及ぼし、それにより、最大ＢＲＥＴシグナルの５０％（ＢＲＥＴ５０）に到達するために必要とされるＹＦＰ−ＣａＭの濃度が減少した（値を示す）。ＢＲＥＴ５０はＢＲＥＴパートナーが互いに相互作用する傾向（すなわち、それらの相対的アフィニティー）を表すので、本発明者らのデータは、ＣＡＰＳ処理は、ＴＲＰＶ１／ＣａＭ複合体の数を増大させなかったことを示した。最大ＢＲＥＴシグナルの増大は、予め形成されたＴＲＰＶ１／ＣａＭ複合体内での立体構造変化が、エネルギードナーとアクセプターとの間の距離に影響を及ぼしたことを示している。最後に、イオノマイシンは、ＴＲＰＶ１／ＣａＭ基線のＢＲＥＴシグナルに対して影響を有さず、このことは、ＴＲＰＶ１が、より後の段階において、より多くのカルシウムに結合したＣａＭに関与するためには、初めに活性化されることを必要とし���ことを示唆している。
【０１０７】
本発明者らは、次に、最大半量応答により、アゴニストにより誘導されたＢＲＥＴシグナルの増大が用量依存的であったことを確認し（表１）、これは、文献において報告されている、内因性の、または過剰発現されたＴＲＰＶ１を発現する細胞に対するパッチクランプまたはカルシウムフラックス測定を用いるものと一致する。２つの周知の競合的ＴＲＰＶ１アンタゴニストであるカプサゼピン（ＣＰＺ）およびＡＭＧ５１７はいずれも、分子内および分子間の両方のＢＲＥＴ試験におけるＣＡＰＳの効力のより高い値へのシフトにより説明されるように（表１）、ＣＡＰＳにより誘導されるＢＲＥＴの増大を阻害したことから、効果の競合的性質により、リガンドにより促進されるＢＲＥＴの変化の薬理学的選択性をさらに示した。まとめると、これらのデータは、両方のプローブの立体配置におけるアゴニストにより促進されるＢＲＥＴの変化が、生細胞におけるＴＲＰＶ１チャネルの活性化に相当することを、強力に示唆した。
【０１０８】
表１：増加するＣＡＰＳの用量により活性化されたＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−ＬｕｃまたはＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭのいずれかを発現するＨＥＫ２９３Ｔにおいて、阻害剤を用いて、またはこれを用いずに（ビヒクル、１μＭのＣＰＺまたは１μＭのＡＭＧ５１７）行われたＢＲＥＴアッセイから導かれる、ＣＡＰＳの効力。GraphPad-Prismソフトウェアを用いる非線形回帰により、ＢＲＥＴアッセイを分析した。Ｌｏｇ ＥＣ５０（Ｍ）として表された効力は、シグモイド用量応答曲線のフィットから誘導した。値は、２つ組において行われた４回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。アスタリスクは、阻害剤条件と対照条件（ＣＡＰＳのみ）との間の差の統計学的有意を示し、****、ｐ＜０．０００１；***、ｐ＜０．００１；**、ｐ＜０．０１である。「ｎｓ」は、ｐ＜０．０５を示す。
【表１】
2019537030.tif 000008
【０１０９】
例３：ＢＲＥＴによりモニタリングされるＴＲＰＶ１の熱活性化
別の一連の実験は、本発明者らのＢＲＥＴプローブに対する温度の効果を評価した。細胞培養を２５℃から５０℃に加熱しつつ、ＢＲＥＴシグナルをリアルタイムで測定した。ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭコンストラクトを発現する細胞において、初期の基線のＢＲＥＴシグナルは、２５〜３７℃の間で安定であり続けた。それは、次いで、３７〜４５℃の間で増大し、その後プラトーに達した。カルシウムフリーのバッファー中で同じアッセイを繰り返した場合、または細胞をＣＰＺと共にプレインキュベートした場合、ＢＲＥＴシグナルの著しい増大は存在せず、このことは、観察された増大は、温度依存的チャネル活性化およびチャネルを通してのカルシウムの流入に完全に関係していることを示している。ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃを発現する細胞において、ＢＲＥＴシグナルは、３７℃まで安定であり続け、次いで、５０℃までに劇的に減少した。加熱の前のＣＰＺとのプレインキュベーションは、ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃプローブの温度依存的挙動を完全に改変した：基線のＢＲＥＴは、３７℃まで安定であったが、シグナルは、３７から４７℃までに劇的に増大し、その後、５０℃までに急速に減少した。ＣＰＺがこの温度範囲にわたってチャネルの開口を遮断すると考えると、これらの結果は、ＴＲＰＶ１が、チャネルが閉鎖状態であり続けているにもかかわらず、何らかの複雑な温度依存的立体構造変化を起こしたことを示唆した。
【０１１０】
多様なＴＲＰＶ１の活性化様式は、独立してチャネルゲーティングと組み合わされることが提案されていることから、本発明者らは、加熱が、ＴＲＰＶ１をＣＡＰＳに対して増感するか否かを調査した。両方のプローブを用いて、２５℃から４２℃への温度上昇は、両方において、ＣＡＰＳの効力の左向きのシフト、および最大効力の増大をもたらした。この観察は、パッチクランプ技術を用いた先の研究と一致し、ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−ＬｕｃおよびＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭの温度応答はいずれも、ネイティブなＴＲＰＶ１チャネルの温度応答を模倣したことを示した。分子内および分子間プローブはいずれも、したがって、ＴＲＰＶ１チャネルの活性をモニタリングするために、同等に良好に適していた。ＴＲＰチャネルは、静止条件または活性化条件下において、タンパク質−タンパク質相互作用の巨大ネットワークに関与していることが知られているので、分子間に基づくアプローチは、ＣａＭと相互作用するチャネルまたは他のシグナル伝達経路についての研究のために、より有望であり、一方、分子内プローブは、構造−機能研究のためにより適切であった。
【０１１１】
例４：ＣａＭ相互作用ＢＲＥＴ試験をＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４のモニタリングへ拡大する
本研究の最後の目的は、３つまでのＴＲＰチャネルの同時活性化をモニタリングすることであった。結果として、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４もまたＣａＭと相互作用することを知ることから（２２）、本発明者らは、ＣａＭ ＢＲＥＴプローブアプローチを用いて、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４のそれらの特異的アゴニストによる活性化をモニタリングした。図１において示されるとおり、遺伝子導入された細胞に特異的なＴＲＰＶ３アゴニストであるドロフェニンでチャレンジした場合に、ＹＦＰ−ＣａＭとＬｕｃ−ＴＲＰＶ３との間のＢＲＥＴシグナルの用量依存的増大が観察され、２０６μＭのＥＣ５０を得、これは文献と一致した。本発明者らは、同じ細胞に、ＴＲＰＶ１特異的アゴニストであるＣＡＰＳまたはＴＲＰＶ４特異的アゴニストであるGSK1016790Aのいずれかでチャレンジした場合には、用量依存的ＢＲＥＴ増大を見出さなかった。同様に、遺伝子導入された細胞にGSK1016790Aでチャレンジした場合に、ＴＲＰＶ４−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭの基線のＢＲＥＴシグナルの用量依存的増大が観察され、１．９３ｎＭのＥＣ５０を得、これもまた、文献と一致した。ＴＲＰＶ３について示されるとおり、ＴＲＰＶ４−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭを発現する細胞のＣＡＰＳまたはドロフェニンのいずれかによる交差活性化は、基線のＢＲＥＴシグナルのいかなる増大ももたらさなかった。本発明者らはまた、ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭの相互作用は、ＣＡＰＳに対して感受性であったが、ドロフェニンまたはGSK1016790Aに対しては感受性ではなかったことを示した（図１）。これらの結果は、ＣａＭと相互作用するＴＲＰチャネルの化学的活性化をモニタリングするための、ＣａＭ結合ＢＲＥＴ試験の有効性およびフレキシビリティーを実証した。
【０１１２】
例５：スペクトル分解を用いる３つのＴＲＰＶチャネルの多重化ＢＲＥＴモニタリング
本発明者らは、次いで、いくつかのＴＲＰチャネルの活性を同時にモニタリングするための単一の試験を設計した。標準的なフィルターベースのＢＲＥＴアプローチは、２つより多くの色による多色ＢＲＥＴアッセイを行うための技術的障壁となっていた。本発明者らは、したがって、本発明者らが１つのアクセプターのために既に実践していたＢＲＥＴシグナルのフルスペクトル分析を、３つのアクセプターのために開発した。この目的のために、本発明者らは、アクセプターのより良好な分離のために青色シフトルシフェラーゼを用い、これは、ＢＲＥＴ２の立体配置により得ることができるような。しかし、ＢＲＥＴ２システムに関連する利点は、低い量子収量およびセレンテラジン−４００ａドナー基質の迅速な減衰動態学により部分的に相殺されたことから、本発明者らは、最近開発された、より大きな発光を１３回まで生じ、４２５ｎｍにおける最大放射を有する、メトキシｅ−セレンテラジン、別名「パープルセレンテラジン」を用いた。さらに、このＲＬｕｃ変異体は、ＷＴ Ｒｌｕｃにより生成されるものよりも５０倍より明るい発光シグナルを生じるので、Ｌｕｃ２をドナーとして用いた。
【０１１３】
Aquamarine、mAmetrine、およびLSSmOrangeは、全て、４００〜４３０ｎｍの範囲において励起可能であり、それらの放射スペクトルの良好な分離をもたらすために十分に異なるストークスシフトを有する、蛍光タンパク質である。本発明者らは、パープルセレンテラジン基質の存在下におけるＬｕｃ酵素の生物発光放射スペクトルが、Aquamarine、mAmetrine、およびLSSmOrangeの励起スペクトルに一致したことを、実験により検証した（図３）。ＹＦＰについて先に行われたとおり、本発明者らは、Aquamarine、mAmetrine、およびLSSmOrangeのスペクトルの形状をモデル化し、それらを、本発明者らのスペクトルＢＲＥＴ分析において実行した（材料および方法を参照）。Aquamarine-Luc、mAmetrine−Ｌｕｃ、またはLSSmOrange−Ｌｕｃ融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞集団を、次いで、１つのディッシュ中で混合して、多成分ＢＲＥＴスペクトルを得た。本発明者らのアルゴリズムは、理論上の機能を、得られた実験データにフィットさせ、これは、全ての構成成分の機能を本質的に含んだ（図２Ａ）。それは、次いで、それぞれのスペクトルの面積をドナースペクトルの面積により除算することにより、各々のプローブについてのＢＲＥＴ比を計算するために、そのまま用いた。本発明者らは、次いで、Ｌｕｃ−ＴＲＰＶ３／Aquamarine−ＣａＭ、ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／mAmetrine−ＣａＭおよびＴＲＰＶ４−Ｌｕｃ／LSSmOrange-CaMを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一緒に混合し、アゴニスト活性化の間の複合的な多色ＢＲＥＴシグナルのスペクトル分解を、リアルタイムで行った。図２Ｂにおいて示されるとおり、この三色スペクトルＢＲＥＴ分析は、単一のウェルにおける各々のＴＲＰＶチャネルの選択的な活性化を明らかにした。各々の場合において、アゴニスト刺激は、そのコグネートなＴＲＰＶ ＢＲＥＴプローブシグナルの特異的な増大を誘導した。ドロフェニン注射は、ＴＲＰＶ３に関連するＢＲＥＴ構成成分のみの増大を誘導したが（図１Ｂ）、一方、ＣＡＰＳまたはGSK1016790Aによる活性化は、それぞれ、ＴＲＰＶ１またはＴＲＰＶ４のＢＲＥＴシグナルにおいてのみ、時間依存的な増大を誘導した（図２ＣおよびＤ）。
【０１１４】
例６：結果
本発明者らは、ここで、生細胞におけるＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３、およびＴＲＰＶ４イオンチャネル活性化のリアルタイムＢＲＥＴ測定ための、プローブの特徴づけを報告した。通常の選択的なフィルターベースのアプローチに代わって、ＢＲＥＴシグナルの全放射スペクトルの分解は、初めて、三色ＢＲＥＴ試験を行うための信頼し得る方法を提供した。この新規のアプローチを用いて、選択的なＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３、およびＴＲＰＶ４の活性化を、単一のアッセイにおいて、同時にリアルタイムで観察した。
【０１１５】
分子内および分子間プローブに基づく蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）技術は、先に、活性化の間の生細胞または膜における多様なチャネルにおける立体構造変化を探索するために用いられてきた。あるいは、ＦＲＥＴはまた、いくつかのイオンチャネルとカルモジュリンなどのパートナーとの相互作用を研究することに適用されてきた。これらのアッセイは、電位固定条件と組み合わせることができ、それによりチャネル活性化の正確な制御を提供しつつ、ＦＲＥＴシグナルを記録することができる、単一の細胞の顕微鏡イメージングの利点を提供した。ドナー励起のための外部光源についての必要性を取り除くことは、ＢＲＥＴに、ＦＲＥＴに対していくつかの利点を提供する：それは、細胞に対する光損傷、フルオロフォアの光退色、バックグラウンド自己蛍光、またはアクセプターの直接励起を引き起こさなかった。これらの利点のおかげで、ＢＲＥＴ技術は、薬物スクリーニングのために、特にＧＰＣＲ研究分野において、広く実行されてきた。ＴＲＰを含むイオンチャネルに対するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の実施は、より困難であることが証明された。ＴＲＰおよび他のイオンチャネルの活性を評価するための至適基準は、パッチクランプ電気生理学であった。イオンチャネル標的の直接スクリーニングのためのスループットを増大する改善が、迅速に出現しており、これは、自動電気生理学および平面パッチクランプ技術を含む。これらのアプローチは、なお高価であり、専門家による取り扱いを必要としている。ＨＴＳのために、間接的読み出し技術は、しばしば、初期スクリーニングステップとして用いられ、これは後で、パッチクランプにより確認された。これらの技術は、通常、膜電位または細胞質内カルシウム濃度の変化をモニタリングするために、蛍光アッセイに依存した。しかし、イオンチャネル機能の間接的アッセイは、しばしば、シグナル伝達経路において複数のステップにより分離された、チャネルから遠いエンドポイントをモニタリングすることから、偽陽性のヒットを生じた。受容体活性化に近いイベントを測定することにより、偽陽性の可能性を減少をもたらした。したがって、生細胞におけるチャネルの活性化をリアルタイムでモニタリングするためのＢＲＥＴプローブの出現は、非常に価値がある。
【０１１６】
定常状態のＴＲＰＶ１サブユニットのオリゴマー化は、ＦＲＥＴ、またはBiMolecular蛍光補完とＢＲＥＴとの組み合わせのいずれかを用いて先に研究されていた一方で、これらの著者のいずれも、ＴＲＰＶ１の活性化の後で測定されたシグナルの任意のバリエーションを示すことはできなかった。いくつかの研究は、分子内および分子間ＦＲＥＴベースのプローブを用いてイオンチャネル活性化を測定することに成功したが、１つのみの研究グループが、イオンチャネル活性をモニタリングするためのＢＲＥＴに基づくバイオセンサーの使用を首尾よく報告し、これは、ＦｌＡｓＨ（フルオレセインヒ素ヘアピン結合剤）との組み合わせにおけるＫｉｒ３内向き整流性カリウムチャネルに焦点を合わせる。ＦｌＡｓＨ／ＢＲＥＴアプローチを他のチャネルに適応させることは、チャネル活性化によるＢＲＥＴシグナルにおける最適なバリエーションを生じるためにＦｌＡｓＨ配列をチャネル構造中に挿入する方法を決定するために、詳細な研究を必要するであろう。さらに、Robertsonら（2016）により報告されたＢＲＥＴシグナルにおける代替物はしばしば弱く、基線のＢＲＥＴシグナルの５〜１０％を越えない。先鋭な対照において、ＴＲＰＶ−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭを用いる本発明者らの実験は、活性化により、著しくより大きな、対応する基線の正味のＢＲＥＴの６５〜１１５％の範囲の、増大を検出した（図２）。これらのプローブは、特に薬物スクリーニングにおいて、チャネル活性についての直接的な情報を提供する単純な細胞ベースのアッセイを開発するための、広範な可能性を提供する。
【０１１７】
本発明者らの研究は、さらに、ＣａＭとＴＲＰＶ１との間の相互作用についての新たな光を提供した。カルモジュリンは、ＴＲＰＶ１の不活化機構の構成成分として同定されているが、ＴＲＰＶ１相互作用についてのそのＣａ２＋依存性、ならびにＴＲＰＶ１におけるその結合部位として、矛盾が存在した。古典的な破壊的な生化学的技術を用いることにより、Ｃａ２＋に結合したＣａＭは、非定型ＴＲＰＶ１チャネルＣａＭ結合部位の一つに結合したが、Ｃａ２＋フリーのＣａＭはこれに結合しなかったことを示したが、一方、Rosenbaumら（2014）は、ＴＲＰＶ１に結合したＣａＭの一部は、Ｃａ２＋の存在下または不在下において、変化しなかったことを示した。本発明者らのＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ分子間ＢＲＥＴアッセイを用いて、本発明者らは、ＴＲＰＶ１およびＣａ２＋に結合したＣａＭが、静止状態の生細胞において予め会合していたことを評価することができた。本発明者らの結果はまた、ＣＡＰＳの活性化によりより多くのＴＲＰＶ１−ＣａＭ複合体が形成されたことを示す、以前の観察を確認した。ＢＲＥＴ滴定曲線は、明らかに、ＣＡＰＳ活性化の後ですら、ＴＲＰＶ１とＣａ２＋フリーのＣａＭとの間に、特異的な相互作用を測定することができなかったことを示した。最後に、本発明者らの結果は、ＴＲＰＶ１のＣＡＰＳの活性化の間に立体構造変化が起こり、これは、ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ上のＬｕｃと、ＹＦＰ−ＣａＭタンパク質上のＹＦＰとの間の方向および距離に影響を及ぼし、より高い最大ＢＲＥＴをもたらすことを示した。
【０１１８】
これらの実験において、分子内ＢＲＥＴプローブは、ＴＲＰＶ１以外のＴＲＰを調べるためには用いなかったが、ＴＲＰＶ１のゲーティングを明らかにするための有望なツールを表す。本発明者らは、ＣＡＰＳ処理は、ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃの基線のＢＲＥＴシグナルの増大を誘導した一方で、加熱は、複数の立体構造変化をもたらしたことを観察した。先の研究と一致して、このことは、ＣＡＰＳおよび熱が、区別し得る立体構造の移行を惹起し、両方が、チャネルポア開口をもたらしたことを示した。これらの結果はＴＲＰＶ１が起こしたことを示唆したこれらの結果はＴＲＰＶ１が起こしたことを示唆したこれらの結果はＴＲＰＶ１が起こしたことを示唆した。      
【０１１９】
電位感受性の機構は、初めは、熱感受性ＴＲＰチャネルのゲーティングの基礎をなすと提案された。この仮説に従って、ＴＲＰチャネルは、本質的に電位感受性であり、熱および化学的刺激は、この電位感受性を増大するように作用する。しかし、電位、温度、アゴニストおよびインバースアゴニストが、独立して、陽性または陰性に組み合わされたアロステリックなモデルは、ＴＲＰＶ１のゲーティングの多くの側面を記載することにおいて、より正確であることを証明した。本発明者らはまた、分子内および分子間ＢＲＥＴ試験の両方を用いて、熱がＣＡＰＳの効力および有効性を増大することを観察した。まとめると、本発明者らの結果は、カプサイシンおよび熱が、チャネルポアのゲーティングの間にアロステリックに組み合わされた区別し得る移行を促進したという治験と、完全に一致した。
【０１２０】
単純なＢＲＥＴアッセイは、３つのＴＲＰＶの化学的活性化を、一度に１つモニタリングすることができたという事実は、本発明者らに、単一のアッセイにおいてＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３、およびＴＲＰＶ４の活性を測定することを促した。定量的な多重化ＢＲＥＴ測定を達成することに対する最大の障害の一つは、ドナーおよびアクセプター放射スペクトルの間でのオーバーラップであった。二色ＢＲＥＴアッセイを用いてこの技術的障壁を回避するための１つのアプローチは、十分に分離された放射スペクトルを有する、Ｌｕｃと２つの蛍光アクセプターとの間のエネルギー転移の連続測定のための、微調整されたフィルターセットであった。これらの著者は、多様なフィルターセットを用いて考慮された各アクセプターの相互コンタミネーションと、Ｌｕｃとアクセプターとの間の転移効率との間で、妥協を行った。フィルターベースの戦略の限定要因を克服するために、本発明者らは、ＢＲＥＴシグナルのフルスペクトル分解を行った。フルスペクトル多重化を用いることにより、単一の試料におけるＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３、およびＴＲＰＶ４チャネルの選択的な活性化を評価しることが可能となった。このことは、特定の薬物のＴＲＰＶのサブタイプに対する特異性を、単一の実験から評価することについての展望を提供した。
【０１２１】
フルスペクトルＢＲＥＴ多重化はまた、いくつかの分子イベントを同時にモニタリングするために、または、それらの関与の動力学を評価するために、重要であり得る。Ｇタンパク質共役受容体ファミリー中の単一の受容体は、様々なシグナル伝達経路に関与し、この膜タンパク質に結合する多様な薬物は、これらの各々に異なる影響を及ぼし得ることが知られており、このことが、有効性の概念の再評価をもたらす。言い換えると、所与のシグナル伝達経路についてのアゴニストであるリガンドは、同じ受容体を介する異なる経路についてのアンタゴニストまたはインバースアゴニストとしてすら作用し得る。この概念がまた電位開口型チャネル、特にＴＲＰにも適用可能であったか否かは、まだ決定されていない。イオンチャネル経路におけるタンパク質−タンパク質相互作用の巨大ネットワークは、潜在的な薬物標的の豊富なソースを提供した。例えばＴＲＰＶ１チャネルは、カベオリン、β−アレスチン−２、ＡＫＡＰ７９／１５０およびＰＫＣβ２などの複数のパートナー、ならびに他のＴＲＰチャネルと相互作用することが示されている。ＴＲＰＶ１とこれらのパートナーの各々との間の相互作用を試験するためにＢＲＥＴプローブを構築することは、ＴＲＰＶ１とそのインタラクトームとの間の複雑な動的相互作用を分解することに大きく寄与し、それにより、タンパク質−チャネル界面を標的とする新たな化合物の検索において巨大分子複合体をスクリーニングするための、新たな有効な方法を提供するであろう。この文脈において、単一の多色アッセイプロトコルを介して複数のシグナル伝達経路をモニタリングすることは、高い価値のある開発を表した。
【０１２２】
本発明は、１つの試料から３つのＢＲＥＴシグナルを同時に集めるための、効率的な技術を記載する。試料から光子を集めるために１本の光ファイバーを用いるかわりに、複数の試料からのＢＲＥＴスペクトルをリアルタイムで集めるために多くの光ファイバーの束を用いることは、技術的に可能であった。この多くの試料中の３つのＢＲＥＴプローブの動力学の平行した同時記録は、薬物スクリーニングのための価値が高いデータを提供した。ＴＲＰＶ１／３／４についてのチャネル特異的なＢＲＥＴプローブは、マルチウェル形式における多重ＢＲＥＴプローブの読み取りをもたらし、これは、疑いようなく、イオンチャネル薬物スクリーニングおよび一般的に薬物の発見におけるブレークスルーを表す。
【図１】
2019537030.tif 000009
【図２】
2019537030.tif 000010
【図３】
2019537030.tif 000011
【図４】
2019537030.tif 000012
【図５】
2019537030.tif 000013
【配列表】
2019537030000001.app
【国際調査報告】
2019537030.tif 000014
2019537030.tif 000015
2019537030.tif 000016