(57)【要約】  本発明は、養子免疫療法に有用な、選択された抗原に対し反応性の不均質なＴ細胞集団を含む組成物、及びこのようなＴ細胞組成物を作製する方法に関する。
2019519246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞を含む組成物を作製する方法であって、以下ステップ：
（ａ）Ｔ細胞を含む初期細胞集団を得ることと、
（ｂ）前記細胞集団を１つ以上の標的抗原及びサイトカインに曝露することにより、Ｔ細胞を刺激することと、 
（ｃ）前記細胞集団をサイトカインを含む培地中で培養することと、
（ｄ）前記細胞集団の抗原特異的反応性を試験することと、
（ｅ）前記得られたＴ細胞を含む組成物を採取することと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記初期細胞集団において、総Ｔ細胞（ＣＤ３＋）、ＣＤ８＋、及びＣＤ４＋  Ｔ細胞、単球、Ｂ細胞、ならびにＮＫ細胞の量を試験することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞集団の抗原特異的反応性を試験することが、フローサイトメトリーによる活性化マーカーの検出、細胞内サイトカイン染色による抗原誘導サイトカイン産生量の測定、ＥＬＩＳＡ、またはＥＬＩＳＰＯＴを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）における前記サイトカインが、個別に、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）における前記サイトカインが、個別に、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、ステップ（ｂ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 
【請求項７】
前記方法が、前記細胞集団中の前記Ｔ細胞のポリクローナル刺激をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 
【請求項８】
前記ポリクローナル刺激が、ステップ（ｃ）の後に、前記細胞集団をＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に結合する四量体抗体に曝露することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞集団が複数のサブ集団に分割され、その各々が異なる標的抗原への曝露により刺激される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数のサブ集団が、ステップ（ｃ）の前に組み合わされる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数のサブ集団が、ステップ（ｅ）の前に組み合わされる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の標的抗原が、前記１つ以上の標的抗原に由来する複数の重複ペプチドを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の標的抗原が、１つ以上のサブドミナント抗原に由来するポリペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の標的抗原が、１つ以上のネオ抗原に由来するポリペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の標的抗原が、ウイルス抗原に由来するポリペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上の標的抗原が、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトＲＳウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、黄熱病ウイルス、エボラウイルス、及びジカウイルスのうちの１つ以上からのウイルス抗原に由来するポリペプチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上の標的抗原が、前記エプスタイン・バーウイルス抗原、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１のうちの１つ以上に由来するポリペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。 
【請求項１８】
前記１つ以上の標的抗原が、サイトメガロウイルス抗原、ｐｐ６５、がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、及びサバイビンのうちの１つ以上に由来するポリペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。 
【請求項１９】
前記方法から得られた前記Ｔ細胞組成物が、主としてＣＤ８＋対ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む７０％超のＣＤ３＋  Ｔ細胞を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法から得られた前記Ｔ細胞組成物が、総ＣＤ３＋細胞の約１％超が、前記抗原（１つまたは複数）に対し反応性である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法から得られた前記Ｔ細胞組成物が、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、またはＣＸＣＲ３の表面発現上昇と、１つ以上の活性化／疲弊マーカーＬＡＧ３、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＣＤ１６０、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４の表面発現低下とを有するＴ細胞を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｔ細胞を含む組成物を作製する方法であって、以下ステップ：
（ａ）Ｔ細胞を含む初期細胞集団を得ることと、
（ｂ）Ｔ細胞活性化マーカーの発現に基づいてＴ細胞を選択することと、
（ｃ）Ｔ細胞のポリクローナル刺激と、
（ｄ）前記得られたＴ細胞を含む組成物を採取することと
を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記方法が、ステップ（ｂ）の前に、前記細胞集団を１つ以上の標的抗原及びサイトカインに曝露することにより、前記Ｔ細胞を刺激することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｂ）が前記初期細胞集団に対し実施される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｂ）が、前記細胞集団を１つ以上の標的抗原及びサイトカインに曝露することにより前記Ｔ細胞を刺激することの約７日後に実施される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１のうちの１つ以上を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記サイトカインがＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｂ）の前記Ｔ細胞活性化マーカーが、ＣＤ６９、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ２７（ＩＬ−７Ｒａ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ３６６（ＴＩＭ３）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒａ）、ＣＤ８０、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＯＳ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、及びＣＤ４５ＲＯのうちの１つ以上を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリクローナル刺激が、ステップ（ｂ）の後に、前記細胞集団をＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に結合する四量体抗体に曝露することを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つ以上の標的抗原が、前記１つ以上の標的抗原に由来する複数の重複ペプチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つ以上の標的抗原が、１つ以上のサブドミナント抗原に由来するポリペプチドを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つ以上の標的抗原が、１つ以上のネオ抗原に由来するポリペプチドを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つ以上の標的抗原が、ウイルス抗原に由来するポリペプチドを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上の標的抗原が、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトＲＳウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、黄熱病ウイルス、エボラウイルス、及びジカウイルスのうちの１つ以上からのウイルス抗原に由来するポリペプチドを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の標的抗原が、前記エプスタイン・バーウイルス抗原、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１のうちの１つ以上に由来するポリペプチドを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記１つ以上の標的抗原が、サイトメガロウイルス抗原、ｐｐ６５、がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、及びサバイビンのうちの１つ以上に由来するポリペプチドを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法から得られた前記Ｔ細胞組成物が、主としてＣＤ８＋対ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む７０％超のＣＤ３＋  Ｔ細胞を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
免疫療法の方法であって、免疫療法を必要とする患者にＴ細胞を含む組成物を投与することを含み、前記組成物が、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法により作製される、前記方法。
【請求項３９】
処置を必要とする患者に、１つ以上のＥＢＶ抗原に対し反応性のＴ細胞が豊富化されたＴ細胞組成物を投与することにより、非ホジキンリンパ腫、胃癌、または上咽頭癌を処置する方法であって、前記Ｔ細胞組成物が、請求項１〜１７及び２２〜３５のいずれか１項に記載の方法により作製される、前記方法。
【請求項４０】
処置を必要とする患者に、ｐｐ６５、がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、及びサバイビンのうちの１つ以上に対し反応性のＴ細胞が豊富化されたＴ細胞組成物を投与することにより、神経膠芽細胞腫を処置する方法であって、前記Ｔ細胞組成物が、請求項１〜１６、１８、２２〜３４、及び３６のいずれか１項に記載の方法により作製される、前記方法。
【請求項４１】
免疫療法向けのＴ細胞を含む組成物であって、前記組成物が５０万個超のＣＤ３＋細胞を含み、生細胞が７０％超のＣＤ３＋  Ｔ細胞を含み、前記Ｔ細胞が、主としてＣＤ８＋対ＣＤ４＋  Ｔ細胞であり、かつ主としてエフェクターメモリーＴ細胞である、前記組成物。
【請求項４２】
前記組成物中の前記Ｔ細胞が、最小限の疲弊マーカー、高発現レベルのリンパ球ホーミング及び輸送マーカー、ならびに高い抗原反応性を示す、請求項４１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、養子免疫療法に有用な、選択された抗原に対し反応性の不均質なＴ細胞集団を含む組成物、及びこのようなＴ細胞組成物を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの免疫系が最初に抗原に接してから何日かの期間にわたり、Ｔ細胞集団は抗原の生成を認識し、これらのＴ細胞はその抗原に対するその後の応答の性質を決定する。Ｔ細胞による抗原認識及び特異性は、細胞表面に発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の構造的特徴によって付与される。１つのＴ細胞は、特異的な主要組織適合複合体、すなわちＭＨＣと組み合わせて提示される１つの抗原に結合することができるＴＣＲを有する。そのため、Ｔ細胞の抗原特異性は、細胞が示す特異的なＴＣＲの存在及び機能によって特徴づけられる。複数のサブタイプの関与細胞が存在する一方、概して、出現するＴ細胞は、様々な細胞表面マーカー（ＣＤ４＋：ＴＨ１、ＴＨ２、Ｔｒｅｇ、Ｔ濾胞性ヘルパー、ＴＨ１７、ＴＨ２２、ＴＨ９；ＣＤ８＋：ＣＴＬなど）により特性決定され、細胞または液性免疫応答の結果は、これらの異なる細胞サブタイプの機能によるものである。加えて、集団におけるＴ細胞のある特定のサブセットは免疫抑制的であり（例えば、Ｔｒｅｇ、ＴＨ１７、アネルギー化Ｔ細胞）、これらの存在は免疫寛容を誘導し得る。
【０００３】
早くも１９９０年代には、ｅｘ  ｖｉｖｏで増大された抗原特異的Ｔ細胞の養子移入がＣＭＶ及びＥＢＶに対し免疫を付与することが示された（Ｒｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２；２５７：２３８）（Ｒｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １９９８；９２：１５４９−５５）。しかし、腫瘍進行の過程で、腫瘍に対する免疫応答が、腫瘍退縮の促進に効果のない少数の「ドミナント」抗原に集中するようになった。ｅｘ  ｖｉｖｏで増大されたＴ細胞を免疫療法に使用する過去の試みでは、腫瘍関連のドミナントな抗原反応性Ｔ細胞が誤って増大され、結果の非一貫性につながった。
【０００４】
Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌによる研究では、ほとんどの黒色腫患者が、ヒトメラニン細胞特異的抗原（ＭＡＲＴ−１／メランＡ）に対し細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を示したが、もう１つの腫瘍関連抗原ｇｐ１００に対し活性を示す患者は少数に過ぎなかった。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を養子療法に使用した場合、腫瘍退縮は、ｇｐ１００反応性Ｔ細胞との相互関連はあったが、ＭＡＲＴ−１反応性Ｔ細胞との相互関連はなかった。（Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５，１５４（８）：３９６１−８）。別の研究では、がん抗原を有する黒色腫患者の免疫処置により循環ＣＤ８＋  ＣＴＬの数が増加したが、腫瘍退縮との相互関連はなかった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：３２１）。
【０００５】
このような非一貫性は、腫瘍の微小環境が複雑であり、腫瘍の微小環境が、主に、Ｔ細胞の細胞傷害性効果を下方制御することにより腫瘍生存を促進するという事実に関係する。制御性Ｔ細胞（すなわちＴｒｅｇ）媒介の免疫寛容原性応答が発生し、これは主に、免疫優性腫瘍抗原を認識する、高存在量、高結合活性を示す腫瘍浸潤Ｔ細胞に対し向けられることが多い。加えて、抗原の損失は、腫瘍が免疫反応性を逃れる手段をもたらし得る。したがって、腫瘍から単離されたＴ細胞（例えば、ＴＩＬ）を高い抗原認識及び増大のためにｅｘ  ｖｉｖｏで選択し、患者に再注入する場合、当該細胞はほとんどの場合、ドミナントな腫瘍抗原（複数可）に向けられ、腫瘍負荷の一時的な低減をもたらすにとどまる。このような腫瘍は、処置レジメンで複数の抗原標的化Ｔ細胞集団を使用した場合であっても、以後の投与に対し抵抗性を有する可能性がある（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３，２６（５）：３８５−３９３）。また、先行研究では、養子Ｔ細胞療法の利点は、事前のリンパ枯渇処理（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）で抑制的なリンパ球機能を打ち消すことにより増強されることが指摘されている。過去の事例では、化学療法で予め宿主の条件を整えることで、後続の免疫療法に対する応答が増大した（Ｄｕｄｌｅｙ  Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２，Ｏｃｔ  ２５；２９８（５５９４）：８５０−４；Ｄｕｄｌｅｙ  Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００５，Ａｐｒ  １；２３（１０）：２３４６−５７）；（米国特許第８，０３４，３３４号）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第８，０３４，３３４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２；２５７：２３８
【非特許文献２】Ｒｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １９９８；９２：１５４９−５５
【非特許文献３】Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５，１５４（８）：３９６１−８
【非特許文献４】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：３２１
【非特許文献５】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３，２６（５）：３８５−３９３
【非特許文献６】Ｄｕｄｌｅｙ  Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２，Ｏｃｔ  ２５；２９８（５５９４）：８５０−４
【非特許文献７】Ｄｕｄｌｅｙ  Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００５，Ａｐｒ  １；２３（１０）：２３４６−５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、より良好な養子Ｔ細胞療法が依然必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において、本発明は、１つ以上の標的抗原に対し反応性のＴ細胞が豊富化された、養子細胞療法に有用な組成物を作製する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、Ｔ細胞を含む組成物を作製する方法であって、以下ステップ：
（ａ）Ｔ細胞を含む初期細胞集団を得ることと、
（ｂ）細胞集団を１つ以上の標的抗原及びサイトカインに曝露することにより、Ｔ細胞を刺激することと、
（ｃ）細胞集団をサイトカインを含む培地中で培養することと、
（ｄ）細胞集団の抗原特異的反応性を試験することと、
（ｅ）得られたＴ細胞を含む組成物を採取することと
を含む、方法を提供する。
【００１０】
一実施形態において、Ｔ細胞を含む初期細胞集団は、患者血液からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一実施形態において、初期細胞集団は凍結され、当該方法の開始前に解凍される。一実施形態において、当該方法は、初期細胞集団において、総Ｔ細胞（ＣＤ３＋）と、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞、単球、Ｂ細胞、ならびにＮＫ細胞の量とを試験することをさらに含む。
【００１１】
一実施形態において、細胞集団を抗原特異的反応性について試験することは、Ｔ細胞活性化マーカーの検出を含む。一実施形態において、Ｔ細胞活性化マーカーの検出は、フローサイトメトリー、及び細胞内サイトカイン染色による抗原誘導サイトカイン産生量の測定、ＥＬＩＳＡ、またはＥＬＩＳＰＯＴのうちの１つ以上によって遂行される。フローサイトメトリーによるＴ細胞活性化尺度のマーカーには、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１３７、ＣＤ２５、ＣＤ２７９、ＣＤ１７９、ＣＤ６２Ｌ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ６９、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ２７（ＩＬ−７Ｒａ）、ＣＤ３６６（ＴＩＭ３）、ＣＤ８０、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）のうちの１つ以上が含まれる。抗原誘導サイトカイン（ＴＮＦａ、ＩＦＮｇ、ＩＬ−２、及びＣＤ１０７ａ）は、刺激に応答してＣＴＬ中で動員され、また、フローサイトメトリーによりサイトカインと共に測定することもできる。
【００１２】
諸実施形態において、ステップ（ｂ）及び（ｃ）におけるサイトカインは、個別に、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１のうちの１つ以上を含む。別の実施形態において、ステップ（ｂ）及び（ｃ）におけるサイトカインは、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む。諸実施形態において、ステップ（ｂ）及び（ｃ）で使用するサイトカインは同じである。他の諸実施形態において、ステップ（ｂ）及び（ｃ）で使用するサイトカインは、異なるまたは重複する群のサイトカインである。
本発明の諸実施形態において、上記の方法は、ステップ（ｂ）を繰り返すことをさらに含む。諸実施形態において、上記の方法は、細胞集団中のＴ細胞のポリクローナル刺激をさらに含む。一実施形態において、ポリクローナル刺激は、ステップ（ｃ）の後に、細胞集団をＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に結合する四量体抗体に曝露することを含む。
【００１３】
本発明の諸実施形態において、細胞集団は、複数のサブ集団に分割され、その各々は、異なる標的抗原への曝露により刺激される。さらなる諸実施形態において、複数の刺激されたサブ集団は、ステップ（ｃ）の前に組み合わされる。他の実施形態において、複数の刺激されたサブ集団は、ステップ（ｅ）の前に組み合わされる。
【００１４】
本発明の諸実施形態において、１つ以上の標的抗原は、１つ以上の標的抗原に由来する複数の重複ポリペプチドを含む。本発明の諸実施形態において、重複ペプチドは１５〜５０アミノ酸長である。好ましい実施形態において、ポリペプチドは１５アミノ酸長である。
【００１５】
本発明の諸実施形態において、１つ以上の標的抗原は、１つ以上の標的ウイルス抗原に由来するポリペプチドを含む。諸実施形態において、１つ以上の標的抗原は、１つ以上の標的ウイルス抗原に由来するポリペプチドを含む。さらなる諸実施形態において、標的抗原は、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトＲＳウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、黄熱病ウイルス、エボラウイルス、及びジカウイルスのうちの１つ以上により発現するタンパク質である。諸実施形態において、１つ以上の標的抗原は、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１のうちの１つ以上に由来するポリペプチドを含む。他の諸実施形態において、１つ以上の標的抗原は、サイトメガロウイルス抗原、ｐｐ６５、がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、及びサバイビンのうちの１つ以上に由来するポリペプチドを含む。
【００１６】
本発明の諸実施形態において、１つ以上の標的抗原は、１つ以上のサブドミナント抗原または１つ以上のネオ抗原に由来するポリペプチドを含む。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞を含む組成物を作製する方法であって、以下ステップ：
（ａ）Ｔ細胞を含む初期細胞集団を得ることと、
（ｂ）Ｔ細胞活性化マーカーの発現に基づいてＴ細胞を選別することと、
（ｄ）Ｔ細胞のポリクローナル刺激と、
（ｅ）得られたＴ細胞を含む組成物を採取することと
を含む、方法を提供する。
【００１８】
本発明の諸実施形態において、当該方法は、細胞集団を１つ以上の標的抗原及びサイトカインに曝露することにより、Ｔ細胞を刺激することをさらに含む。
【００１９】
一実施形態において、Ｔ細胞を含む初期細胞集団は、患者血液からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一実施形態において、初期細胞集団は凍結され、当該方法の開始前に解凍される。一実施形態において、当該方法は、初期細胞集団において、総Ｔ細胞（ＣＤ３＋）と、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞、単球、Ｂ細胞、ならびにＮＫ細胞の量とを試験することをさらに含む。
【００２０】
諸実施形態において、ステップ（ｂ）は初期細胞集団（例えば、ＰＢＭＣ）に対し実施される。他の諸実施形態において、ステップ（ｂ）は、ステップ（ｂ）の６〜１１日後、好ましくは約７日後に実施される。
【００２１】
諸実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１のうちの１つ以上を含む。好ましい諸実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む。
【００２２】
本発明の諸実施形態において、ステップ（ｂ）のＴ細胞活性化マーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ２７（ＩＬ−７Ｒａ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ３６６（ＴＩＭ３）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒａ）、ＣＤ８０、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＯＳ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、及びＣＤ４５ＲＯのうちの１つ以上を含む。
【００２３】
本発明の諸実施形態において、ポリクローナル刺激は、細胞集団をＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に結合する四量体抗体に曝露することを含む。
【００２４】
本発明の諸実施形態において、上記の方法で使用する１つ以上の標的抗原は、標的抗原に由来する複数の重複ペプチドを含む。本発明の諸実施形態において、重複ペプチドは１５〜５０アミノ酸長である。好ましい実施形態において、ポリペプチドは１５アミノ酸長である。
【００２５】
本発明の諸実施形態において、上記の方法で使用する１つ以上の標的抗原は、１つ以上の標的ウイルス抗原に由来するポリペプチドを含む。諸実施形態において、１つ以上の標的抗原は、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトＲＳウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、黄熱病ウイルス、エボラウイルス、及びジカウイルスのうちの１つ以上からの１つ以上の標的ウイルス抗原に由来するポリペプチドを含む。諸実施形態において、１つ以上の標的抗原は、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１のうちの１つ以上に由来するポリペプチドを含む。他の諸実施形態において、１つ以上の標的抗原は、サイトメガロウイルス抗原、ｐｐ６５、がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、及びサバイビンのうちの１つ以上に由来するポリペプチドを含む。
【００２６】
本発明の諸実施形態において、１つ以上の標的抗原は、１つ以上のサブドミナント抗原または１つ以上のネオ抗原に由来するポリペプチドを含む。諸実施形態において、ネオ抗原に由来するポリペプチドは１５〜５０アミノ酸長の範囲である。好ましい長さは、１５〜２５アミノ酸を含む。
【００２７】
本発明の諸実施形態において、上記の方法は、養子Ｔ細胞療法に有用なＴ細胞組成物を提供する。本発明の諸実施形態において、上記の方法は、主としてＣＤ８＋対ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含む７０％超のＣＤ３＋  Ｔ細胞を含むＴ細胞組成物を提供する。さらなる諸実施形態において、当該方法は、例えば、抗原に対する細胞内のサイトカイン応答（主にＴＮＦα及びＩＦＮγ）及びＣＤ１０７ａ動員を測定することにより、総ＣＤ３＋細胞の約１％超が標的抗原（１つまたは複数）に対し反応性のＴ細胞組成物を提供する。諸実施形態において、当該方法は、総ＣＤ３＋細胞の約５％が標的抗原（１つまたは複数）に対し反応性のＴ細胞組成物を提供する。諸実施形態において、上記の方法から得られたＴ細胞組成物は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、またはＣＸＣＲ３の表面発現上昇と、１つ以上の活性化／疲弊マーカーＬＡＧ３、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＣＤ１６０、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４の表面発現低下とを有するＴ細胞を含む。
【００２８】
一態様において、本発明は、処置を必要とする患者に、１つ以上のＥＢＶ抗原に対し反応性のＴ細胞が豊富化されたＴ細胞組成物を投与することにより、非ホジキンリンパ腫、胃癌、または上咽頭癌を処置する方法を提供する。本発明の諸実施形態において、Ｔ細胞組成物は本発明の方法により作製され、このときＴ細胞は、細胞集団を、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１のうちの１つ以上に由来するポリペプチドに曝露することにより、刺激される。
【００２９】
一態様において、本発明は、処置を必要とする患者に、サイトメガロウイルス抗原、ｐｐ６５、がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、及びサバイビンのうちの１つ以上に対し反応性のＴ細胞が豊富化されたＴ細胞組成物を投与することにより、神経膠芽細胞腫を処置する方法を提供する。本発明の諸実施形態において、Ｔ細胞組成物は本発明の方法により作製され、このときＴ細胞は、細胞集団を、ｐｐ６５、がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、及びサバイビンのうちの１つ以上に由来するポリペプチドに曝露することにより、刺激される。
【００３０】
一態様において、本発明は、免疫療法向けのＴ細胞を含む組成物であって、当該組成物が約５００，０００個超（好ましくは約７５０，００個超、より好ましくは約１００万個超）のＣＤ３＋細胞を含み、生細胞が７０％超のＣＤ３＋  Ｔ細胞を含み、Ｔ細胞が、主としてＣＤ８＋対ＣＤ４＋  Ｔ細胞であり、かつ主としてエフェクターメモリーＴ細胞である、組成物を提供する。好ましい諸実施形態において、組成物中のＴ細胞は、最小限の疲弊マーカー、高発現レベルのリンパ球ホーミング及び輸送マーカー、ならびに高い抗原反応性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ｅｘ  ｖｉｖｏでの刺激及び増大により不均質なＴ細胞を生成するための一実施形態におけるステップ及びタイミングを提供する全般的概略図である。
【図２】ｅｘ  ｖｉｖｏでの刺激及び増大により不均質なＴ細胞を生成するための別の実施形態におけるステップ及びタイミングを示す全般的概略図である。
【図３】不均質なＴ細胞を単離しｅｘ  ｖｉｖｏで増大させる一実施形態におけるステップ及びタイミングの一例を提供する概略図である。
【図４】不均質なＴ細胞を単離しｅｘ  ｖｉｖｏで増大させる別の実施形態におけるステップ及びタイミングの一例を提供する概略図である。
【図５Ａ】０、１、２、及び３型ウイルス潜伏の間に選択的に発現するＥＢＶウイルス抗原の図である。ＥＢＶ抗原２型潜伏は、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、及びＬＭＰ２タンパク質の発現を特徴とし、いくつかのＥＢＥＲ＋癌において同定されている。
【図５Ｂ】ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ１ポリペプチド混合物（「ｐｅｐｍｉｘ」）を使用して、１６名の正常で健康なドナーのＰＢＭＣのＴ細胞反応性をスクリーニングした。
【図５Ｃ】正常なドナー４０８のＨＬＡ遺伝子型タイピングを行い、ＬＭＰ２マトリックスプールＥＬＩＳＰＯＴ解析によりＬＭＰ２反応性エピトープを同定して、認識される特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞リガンドを決定した。
【図５Ｄ】正常なドナー９１５のＨＬＡ遺伝子型タイピングを行い、マトリックスプールスクリーニングにより、複数のＣＤ８＋  ＨＬＡ／ＬＭＰ２ペプチドＴ細胞リガンドを同定した。ドナー９１５のＣＤ８  Ｔ細胞は、２つの異なるＨＬＡアレル上の３つの異なるＬＭＰ２ペプチドを認識する。
【図５Ｅ】正常なドナー１０９のＰＢＭＣを用いて実施したマトリックスプールスクリーニングが、高い、中程度、及び低いＴ細胞頻度の応答を示している。
【図６Ａ】３つのサイトカイン条件（ＫＩ：１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５／ＩＬ−２１；１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ７／１５；１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５単体）によるスモールスケール増大で、６名の正常なドナー及びＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ１に対する抗原特異的ＣＤ１０７ａ応答を評価している。
【図６Ｂ】正常なドナー１０９及び７０７のＥＢＮＡ１応答における個別の及びプールされたＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１  ｐｅｐｍｉｘ刺激。矢印は、ＬＭＰ１及びＬＭＰ２  ｐｅｐｍｉｘで刺激されたときに、ＥＢＮＡ１が他のｐｅｐｍｉｘと競合しやすいことを示している。ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１  ｐｅｐｍｉｘは、ＥＢＮＡ１反応性Ｔ細胞の損失を防止するために、３７４のペプチド全てを一緒にプールするのではなく、個々にＰＢＭＣでパルスされるべきである。
【図６Ｃ】ドナー１０９をＬＭＰ２  ｐｅｐｍｉｘ及びサイトカインを用いて培養した。１１日目に、Ｔ細胞培養物の７９．０％が五量体Ｂ４０：０１−ＩＥＤＰＰＦＮＳＬに認識された。同様に高いＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、及びＴＮＦαの抗原特異的産生により、高い抗原反応性が確認された。
【図６Ｄ−１】ＬＭＰ２  ｐｅｐｍｉｘで刺激されたＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡナイーブ細胞からＣＤ４５ＲＯエフェクターメモリー細胞へ表現型を転換する。もう１つのメモリーマーカーＣＤ６２Ｌ、ならびに活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ１３７は、７〜１１日目の間の培養で明らかに上方制御されている。
【図６Ｄ−２】図６Ｄ−１の続きである。
【図６Ｅ】ドナー４２３は、ＬＭＰ２及びＥＢＮＡ１に対し＞５％を示したが、ＬＭＰ１  ｐｅｐｍｉｘに対しては応答しなかった。
【図６Ｆ】ドナー９１５は、３つ全てのＥＢＶ潜伏型タンパク質に対し＞５％の抗原特異的Ｔ細胞反応性を示している。
【図７Ａ−１】ＮＨＬ患者試料ＨｅｍａＣａｒｅ８１５からのＰＢＭＣを、ＩＬ７／１５またはＩＬ２／７／１５（ＫＩ）のサイトカインの組合せで、１４日目におけるＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ポリクローナル刺激のありまたはなしで、研究スケールで増大させた。細胞を２８日目に採取し、生存能、ＣＤ３細胞の％（図７ａ）について評価した。
【図７Ａ−２】図７Ａ−１の続きである。
【図７Ｂ−１】ＮＨＬ患者試料ＨｅｍａＣａｒｅ８１５からのＰＢＭＣを、ＩＬ７／１５またはＩＬ２／７／１５（ＫＩ）のサイトカインの組合せで、１４日目におけるＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ポリクローナル刺激のありまたはなしで、研究スケールで増大させた。細胞を２８日目に採取し、生存能、抗原刺激に応答してのＣＤ１０７ａの％（図７ｂ）について評価した。
【図７Ｂ−２】図７Ｂ−１の続きである。
【図７Ｃ−１】ＮＨＬ患者試料ＨｅｍａＣａｒｅ８１５からのＰＢＭＣを、ＩＬ７／１５またはＩＬ２／７／１５（ＫＩ）のサイトカインの組合せで、１４日目におけるＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ポリクローナル刺激のありまたはなしで、研究スケールで増大させた。細胞を２８日目に採取し、生存能、ＣＤ１９７＋（メモリーマーカー発現）（図７ｃ）について評価した。
【図７Ｃ−２】図７Ｃ−１の続きである。
【図７Ｄ】ステージＩ濾胞性リンパ腫を有する患者からのＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１特異的Ｔ細胞の増大を示している。ＩＬ７／１５サイトカインを用いたスモール増大条件と、個別のｐｅｐｍｉｘパルス及びその後のプールとにおいて、得られた細胞集団は３つ全ての抗原に対し＞５％の応答を示した。
【図８Ａ】図８ａ［４ｂ］。フローサイトメトリーによる、正常なドナーの増大されたＴ細胞産物の特性決定。２８日目の採取材料は９８．７％のＣＤ３＋であり、６２．５％のＣＤ８及び３３．５％のＣＤ４であった。ＣＤ３＋集団の１２．５％は、様々な二次リンパ臓器へのＴ細胞のホーミングに関与するマーカーであるＣＤ１９７（ＣＣＲ７）を発現し、ＣＤ３＋集団の５３．０％は、白血球輸送を制御できるマーカーであるＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）を発現した。
【図８Ｂ−１】ＤＭＳＯ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１による刺激に対する、正常なドナーの増大されたＴ細胞産物の応答の特性決定。ＣＤ１０７ａ脱顆粒、ならびにＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びＩＬ−２の分泌の検出は、同じＬＭＰ２＞ＥＢＮＡ１＞ＬＭＰ１のランキング順に従う。
【図８Ｂ−２】図８Ｂ−１の続きである。
【図８Ｃ】２０：１、１０：１、及び５：１のエフェクター：標的比におけるドナー１０９  Ｔ細胞増大産物による、標的（ＬＭＰ２またはＥＢＮＡ１  ｐｅｐｍｉｘで装填されたＴ細胞芽細胞）に対する用量依存性選択的殺滅。
【図９Ａ】神経膠芽細胞腫及び膵臓の患者からのＰＢＭＣを、個々にＤＭＳＯ対照、ＣＭＶｐｐ６５  ｐｅｐｍｉｘ、ＮＹＥＳＯ−１  ｐｅｐｍｉｘ、及びサバイビンｐｅｐｍｉｘで、１μｇ／ｍｌにて７日間、サイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ２１）を追加した培地中で刺激した。各抗原に特異的な活性化細胞の％は、ＣＤ１３７＋ＣＤ２５＋ゲートの隣に収載されている。
【図９Ｂ】１４日目の培養物において、細胞内サイトカイン染色により、細胞腫瘍抗原に応答したＴＮＦα産生量を解析したが、バックグラウンドを３．６倍上回るに過ぎない。
【図９Ｃ】１４日目の培養物において、細胞内サイトカイン染色により、細胞腫瘍抗原に応答したＴＮＦα産生量を解析したが、バックグラウンドを７〜９倍上回るに過ぎない。
【図９Ｄ】ドナー１０９のＴ細胞において、６日目及び日におけるＣＤ１３７発現及びＬＭＰ２特異的五量体染色を評価した。五量体陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ１３７＋ＣＤ２５＋についてゲーティングされた細胞と同様である。ＣＤ１３７＋ＣＤ２５＋マーカーは抗原活性化Ｔ細胞集団を示し、このマーカーは、Ｔ細胞培養物からまたは直接患者血液からの抗原特異的Ｔ細胞の単離に使用することができる。
【図９Ｅ−１】ＣＤ１３７＋ＣＤ２５＋集団に加えて、Ｔ細胞上の追加的な活性化マーカーを、抗原特異的Ｔ細胞の単離に使用することができた。ＬＭＰ２  Ｐｅｐｍｉｘ活性化の９日目のＰＢＭＣ及び７日目におけるＰＨＡ活性化Ｔ細胞芽細胞上に発現した細胞表面マーカーの評価。細胞を、以下の表面マーカーを用いて染色した：ＣＤ６９、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ２７（ＩＬ−７Ｒａ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ３６６（ＴＩＭ３）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒａ）、ＣＤ８０、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＯＳ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４５ＲＯ。染色されていない細胞を陰性対照として使用し、ヒストグラムプロットの覆われた（ｏｖｅｒｌａｙｅｄ）ピーク高さを最大に設定した。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養から、または直接患者の血液からの両方で活性化Ｔ細胞を単離するために、ＰＤ−１、ＣＤ１３７、及びＣＤ２５に加えてまたはこれらの代わりに、ＣＤ２８、ＣＤ１５４、ＣＤ１３４、ＣＤ３６６、ＣＤ４５ＲＯを使用することができた。
【図９Ｅ−２】図９Ｅ−１の続きである。
【図９Ｆ】ドナー１０９の７日目の培養物をＴｙｔｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）上で選別し、＞９０％の純度であった。
【図９Ｇ】選別された細胞は、良好な生存能、回収率、及び形態も示した（回収された選別後のＴ細胞の形態（上パネル）及び選別後のＴ細胞の培養及び回収率（下パネル））。
【図９Ｈ】（図９ｆ及び９ｇからの）選別された細胞は、ＩＬ７／１５サイトカインを含有する培地中で増大され、標的としてのペプチド装填Ｔ細胞芽細胞に対する選択的な細胞傷害性を示した。
【図１０】同定された遺伝子における変異頻度。標準的なＭｕｔｓｉｇ解析を上記のコホートで用いて、患者のコホートからの神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）において１１種の遺伝子を同定した。各カラムは１人の患者である。２番目のカラムは、全ＧＢＭ患者における変異の頻度である。例えば、１番目の患者は、ＰＩＫ３Ｒ、ＰＴＥＮ、ｐ５３、及びＲＢにおいて変異を有する。
【図１１−１】選択された遺伝子に従った、ＧＢＭ患者における変異の分布。
【図１１−２】図１１−１の続きである。
【図１１−３】図１１−２の続きである。
【図１２】図１１における遺伝子内の選択変異ホットスポット。一部はストップコドンを含有するため、全てのホットスポットが以下に報告されているわけではない。合計１７のアミノ酸変化を伴う８つのネオ抗原ホットスポットが選択された：ＢＲＡＦ：Ｖ６００Ｅ；ＥＧＦＲ：Ａ２８９Ｉ  Ａ２８９Ｎ  Ａ２８９Ｔ  Ａ２８９Ｖ；ＩＤＨ１：Ｒ１３２Ｇ  Ｒ１３２Ｈ；ＮＦ１：Ｌ８４４Ｆ  Ｌ８４４Ｐ；ＰＤＧＦＲＡ：Ｅ２２９Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ：Ｅ５４５Ａ  Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３Ｒ１：Ｇ３７６Ｒ；ＴＰ５３：Ｒ１７５Ｈ  Ｒ２４８Ｌ  Ｒ２４８Ｗ  Ｒ２８２Ｗ。選択されたネオ抗原及び変異ホットスポットは、コホートにおける２９１名中５８名（２０％）の神経膠芽細胞腫患者を網羅しており、少なくとも１つは患者のＭＨＣに結合するが、野生型タンパク質と交差反応するＴ細胞を生成しない。
【図１３】ヒトのがんで見られる最も一般的な変異ホットスポットの概要を実施し、このような改変により標的化されるがん徴候当たりの患者のパーセンテージを言葉とグラフにより概括している。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本出願は、２０１６年６月２８日に出願された米国仮出願第６２／３５５，４５８号、第６２／３５５，５０６号、及び第６２／３５５，５５３号の優先権を主張し、各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３３】
一態様において、本発明は、免疫療法に有用なＴ細胞組成物を対象とする。本発明の諸実施形態において、Ｔ細胞組成物は、増大された抗原限定のＴ細胞の不均質な集団である。他の態様において、本発明は、患者から得られたＴ細胞を含む細胞集団からの標的抗原（複数可）に結合可能なＴ細胞を増大させることにより、１つ以上の標的抗原に対し特異性を有する組成物を創出する方法を提供する。ある特定の実施形態において、細胞集団は、標的抗原への曝露により（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで）過去に活性化されたＴ細胞を豊富化するために、増大及び採取の前に選別される（本明細書に記載の「Ｔセレクト」法）。他の実施形態において、細胞集団は、標的抗原（複数可）を認識するＴ細胞の増大を刺激するために、１つ以上の標的抗原（及びある特定のサイトカイン）に曝露される（本明細書に記載の「Ｔダイレクト」法）。本発明の諸実施形態において、標的抗原刺激に応答して活性化されたＴ細胞の細胞選別を伴う方法は、１つ以上の標的抗原に対する反応性が総Ｔ細胞集団（例えば、ＣＤ３＋細胞）の約１％を下回る場合に実施される。
【００３４】
本発明の諸実施形態は、複数の抗原に対し反応性の（すなわち、それらに限定されている）、培養で増大されたＴリンパ球の不均質な集団を対象とし、抗原の選択は、不均質なＴ細胞集団を養子移入することで疾患の低減または改善につながるように、患者の疾患状態における抗原の広まりに基づいて行われる。本発明はさらに、不均質なＴ細胞集団を生成する方法を提供する。初期のＴ細胞は、患者の末梢血、骨髄、または腫瘍の試料から得ることができ、これらは次にｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作し、すなわち、特異的な抗原に対しプライミングし、次に、最終組成物中の抗原応答性細胞傷害性Ｔ細胞の数を最大化する目標で増大させる。
【００３５】
本発明は、この不均質なＴ細胞集団を生成する方法を提供し、このＴ細胞集団は患者の末梢血、骨髄、または腫瘍の試料から開始し、次にＴ細胞数を増大するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作され、Ｔ細胞は、抗原限定になるように（再）プログラムされる。さらに、本発明は、Ｔ細胞サブ集団の選別及び選択ならびに豊富化、または不均質な細胞プール中の様々なサブ集団の除去を提供する。
【００３６】
Ｔダイレクト法
【００３７】
一態様において、本発明は、患者から得られたＴ細胞を含む細胞集団からの標的抗原（複数可）に反応するＴ細胞を増大させることにより、１つ以上の標的抗原に対し特異性を有する組成物を創出する方法を提供する。ｅｘ  ｖｉｖｏでの刺激及び増大により不均質なＴ細胞を生成するためのこの方法の諸実施形態における、ステップ及びタイミングの例を提供する全般的概略図は、図１及び２に示されている。
【００３８】
一実施形態において、本発明は、１つ以上の標的抗原に対し反応性のＴ細胞が豊富化された組成物を作製する方法であって、以下ステップ：
（ａ）Ｔ細胞を含む初期細胞集団を得ることと、
（ｂ）細胞集団を１つ以上の標的抗原及びサイトカインに曝露することにより、Ｔ細胞を刺激することと、
（ｃ）細胞集団をサイトカインを含む培地中で培養することと、
（ｄ）細胞集団の抗原特異的反応性を試験することと、
（ｅ）得られたＴ細胞を含む組成物を採取することと
を含む、方法を提供する。
【００３９】
本発明の諸実施形態において、上記の方法は、ステップ（ｂ）を繰り返すことをさらに含む。さらなる諸実施形態において、上記の方法は、細胞集団中のＴ細胞のポリクローナル刺激のステップを含む。一実施形態において、Ｔ細胞を含む初期細胞集団は、患者血液からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一実施形態において、初期細胞集団は凍結され、当該方法の開始前に解凍される。
【００４０】
この方法及び本明細書に記載の変形形態により、ナイーブＴ細胞及び／または既にｉｎ  ｖｉｖｏで標的抗原（複数可）に曝露されたＴ細胞は、患者の組織から得られ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでプライミングされ、標的抗原及び本明細書に記載のある特定のサイトカインへの曝露により増大される。
【００４１】
具体的なＴ細胞増大の方法は、処置対象の疾患に有用な特定の免疫療法の観点から所望される細胞タイプに依存することになる。細胞は、特定の表現型及び機能に細胞を誘導する薬剤の使用により、培養下で修飾される。この修飾は、培養下での０日目から約２１日目までの単離された細胞集団の生理学的特徴の改変により例示され、このとき、記載されているように、細胞集団により発現する表面マーカーは改変され、このような改変の進行は経時的に監視される。
【００４２】
Ｔセレクト法
【００４３】
一態様において、本発明は、標的抗原（複数可）への曝露により活性化されるＴ細胞を選択し、得られた細胞を増大させることにより、１つ以上の標的抗原に対し特異性を有するＴ細胞が豊富化された組成物を創出する方法を提供する。不均質なＴ細胞を単離しｅｘ  ｖｉｖｏで増大させるためのこの方法の諸実施形態における、ステップ及びタイミングの例を提供する全般的概略図は、図３及び４に示されている。別の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞を含む組成物を作製する方法であって、以下ステップ：
（ａ）Ｔ細胞を含む初期細胞集団を得ることと、
（ｂ）Ｔ細胞活性化マーカーの発現に基づいてＴ細胞を選択することと、
（ｃ）Ｔ細胞のポリクローナル刺激と、
（ｄ）得られたＴ細胞を含む組成物を採取することと
を含む、方法を提供する。
【００４４】
諸実施形態において、当該方法は、細胞集団を１つ以上の標的抗原及びサイトカインに曝露することにより、Ｔ細胞を刺激することをさらに含む。さらなる諸実施形態において、ステップ（ｃ）は、初期細胞集団（例えば、ＰＢＭＣ）に対し実施される。他の諸実施形態において、ステップ（ｃ）は、細胞を刺激することの６〜１１日後、好ましくは約７日後に実施される。一実施形態において、当該方法は、初期細胞集団において、総Ｔ細胞（ＣＤ３＋）と、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞、単球、Ｂ細胞、ならびにＮＫ細胞の量とを試験することをさらに含む。一実施形態において、Ｔ細胞を含む初期細胞集団は、患者血液からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一実施形態において、初期細胞集団は凍結され、当該方法の開始前に解凍される。
【００４５】
Ｔ細胞は、細胞選別または当技術分野で公知の他の適切な技法により、Ｔ細胞活性化マーカーの発現に基づいて選択される。本発明の諸実施形態において、選択ステップは、細胞集団の抗原反応性が約１％未満である場合に実施される。例えば、７日目に、細胞は、ＤＭＳＯ陰性対照培養に基づいてＣＤ１３７／ＣＤ２５発現でゲートにかける。例えば、ＧＢＭ及び膵臓の増大は、ＤＭＳＯ対照を上回ってこの象限内の細胞のパーセンテージを有した。このような試料は、ＴダイレクトよりもＴセレクトにとって良好な候補である。細胞集団における抗原反応性が十分に高い場合、例えば約１％、２％、または３％を超える場合、細胞集団は、本明細書に記載のＴダイレクト法を用いて刺激し増大させることができる。
【００４６】
Ｔ細胞刺激向けの標的抗原
【００４７】
本発明の方法は、Ｔ細胞を含む細胞集団を１つ以上の抗原ポリペプチド（または他の抗原）に曝露し、Ｔ細胞を本明細書に記載のサイトカインに曝露することにより、選択及び／または増大向けのＴ細胞を刺激することを伴う。ある特定の実施形態において、当該抗原は、対象が特定の疾患に応答して過少に表されるまたは表されない１つ以上の抗原である。諸実施形態において、当該抗原は、サブドミナント免疫応答に関与するＴ細胞により認識される。諸実施形態において、当該抗原はネオ抗原である。本発明の諸実施形態において、Ｔ細胞増大を刺激するために使用される抗原（１つまたは複数）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトＲＳウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、黄熱病ウイルス、エボラウイルス、及びジカウイルスからの１つ以上のウイルスタンパク質である。
【００４８】
好ましい諸実施形態において、標的抗原は、標的抗原に由来する複数のポリペプチドとして、Ｔ細胞を含む細胞集団に提示される。当該ポリペプチドは、好ましくは、ＡＰＣによる効率的な提示に好適な長さである。諸実施形態において、この複数のポリペプチドは、１５〜５０アミノ酸長の、好ましくは約１５アミノ酸長の重複ポリペプチドを含む。諸実施形態において、この複数のポリペプチドは、抗原性及び／またはドミナント／サブドミナントな状態を決定するようにスクリーニングされたポリペプチドを含む。
【００４９】
ある特定の抗原は、核酸のように非ペプチド起源である。例としては、ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）、ＣｐＧ豊富なオリゴヌクレオチド、脂質などが挙げられる。トール様受容体、すなわちＴＬＲのような細胞内認識分子の活性化は、Ｔ細胞の刺激及び増殖を駆動することが報告されている。
【００５０】
本発明のある特定の実施形態は、抗原選択レパートリー内の腫瘍転移に関する抗原を含む。転移抗原に対し生成されるＴ細胞は、腫瘍が身体の他の臓器に拡散するのを制限することができる。本発明は、転移抗原に対する免疫担当Ｔ細胞の生成に関する実施形態を含む。
【００５１】
抗原に対するサブドミナントＴ細胞の応答（複数可）
【００５２】
本発明の方法で有用な抗原は、複数のアプローチに基づいて同定される。参照により本明細書に組み込まれる米国出願第１４／１２２，０３６号は、免疫応答を再プログラムするためのサブドミナント抗原の使用について詳述している。
【００５３】
がん抗原−ウイルスタンパク質
【００５４】
ある特定のウイルスタンパク質は、特定のタイプのがんに関連し、特定のタイプのがんで発現する。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、ヒトにおいて最も一般的なウイルスの１つであり、リンパ腫（ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連する状態、例えば、毛状白板症及び中枢神経系リンパ腫）、胃癌、及び上咽頭癌に関連する。ＥＢＶは、ある特定の細胞タイプ、例えばＢ細胞に感染すると、潜伏型になる。潜伏型の場合であっても、ＥＢＶはある特定のタンパク質を発現させ、これは、本発明の方法により標的化して、１つ以上のＥＢＶタンパク質を認識する増大されたＴ細胞集団を生成することができ、そのためＥＢＶタンパク質が発現する細胞に対し免疫応答を生成する養子療法で使用することができる。一実施形態において、刺激することによりＴ細胞を増大させるために使用されるＥＢＶ抗原は、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ１、及びＢＺＬＦ−１のうちの１つ以上である。他の実施形態において、ＥＢＶ  ＩＩＩ型潜伏タンパク質は標的抗原である。一実施形態において、Ｔ細胞を刺激するために使用される抗原は、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１のうちの１つ以上に由来する複数のポリペプチドである。
【００５５】
本発明の方法により作製する、ＥＢＶ潜伏型タンパク質（例えば、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及び／またはＥＢＮＡ１）を抗原の供給源として用いたＴ細胞組成物は、これらのタンパク質を発現させる細胞または組織に対象の免疫系を標的化させることが有益な疾患の処置に有用である。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、胃癌、及び上咽頭癌のような様々ながんは、しばしば、潜伏型ＥＢＶタンパク質の発現を特徴とする。したがって、本発明の諸態様は、患者に、潜伏型ＥＢＶタンパク質（例えば、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及び／またはＥＢＮＡ１）を認識するＴ細胞を増大させるための本発明の方法により生成されるＴ細胞組成物を投与することにより、このようながんを処置することに関する。
【００５６】
同様に、ＣＭＶタンパク質は、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、結腸癌、唾液腺癌のようなある特定のがんで発現する。一実施形態において、本発明の方法は、ＣＭＶ抗原タンパク質を認識するＴ細胞が豊富化されたＴ細胞集団を生成するために使用される。一実施形態において、刺激することによりＴ細胞を増大させるために使用されるＣＭＶ抗原は、ｐｐ６５である。がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）及びサバイビンは、ｐｐ６５のように、神経膠芽細胞腫で発現する。一実施形態において、Ｔ細胞を刺激するために使用される抗原は、ｐｐ６５、がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、及びサバイビンのうちの１つ以上に由来する複数のポリペプチドである。
【００５７】
がん抗原−過剰発現抗原
【００５８】
標的抗原に対し反応性のＴ細胞が豊富化された組成物を生成するための本発明の方法においてＴ細胞を刺激し増大させるために使用され得る標的抗原には、特定のがんで過剰発現または異所発現する抗原が含まれる。このようながん関連抗原の例は、神経膠芽細胞腫におけるがん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）及びサバイビンである。
【００５９】
抗原ＰＳＭＡは健康な組織上に見られるが、前立腺腫瘍では上方制御され、転移性腫瘍では極めて上方制御されるため、本発明の方法における標的抗原として使用することができる。
【００６０】
がん抗原−ネオ抗原
【００６１】
一態様において、本発明は、新規の免疫調整療法をもたらす準備となるネオ抗原の選択、産生、及び使用に関する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の発明は、ネオ抗原組成物、及びネオ抗原限定のＴ細胞を含む組成物を生成する方法に関する。
【００６２】
本明細書において「ネオ抗原」とは、正常／ナイーブなヒトゲノム中には存在しないが、がん細胞中には変異、再構成、またはエピジェネティックな変化に起因して存在する、抗原ポリペプチドである。したがって、ネオ抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である。
【００６３】
ネオ抗原は、例えばがんの処置向けの、養子療法で有用なネオ抗原反応性Ｔ細胞集団を産生するための本発明の方法で使用することができる。サブドミナント抗原に対する寛容を誘導するドミナント抗原を避けて免疫応答の抗原特異性を再プログラムするアプローチに加えて、本発明は、免疫応答が向けられ得る代替的な抗原標的として働くネオ抗原組成物を提供する。このようなネオ抗原は、患者の免疫応答内のサブドミナント抗原を既に反映している場合もあれば、患者のＴ細胞レパートリー内に表されていない場合もある。ネオ抗原反応性Ｔ細胞の使用は、概して、自己反応性抗原及び一部の腫瘍関連抗原の場合がそうであろうように、中枢のＴ細胞寛容の影響を受けないことから、このような細胞の調製物は治療剤及びワクチンとして極めて望ましいものとなる。
【００６４】
本明細書に記載の方法において、有用なネオ抗原は、その腫瘍タイプに普遍的であり得る、または患者特異的かつ腫瘍特異的なネオ抗原であり得る、腫瘍特異的抗原であり、違いはネオ抗原反応性Ｔ細胞集団の増大及び選択にあり、ネオ抗原の選択にはない。簡潔に述べると、Ｔダイレクトは、抗原編集Ｔ細胞技術を用いて、Ｔ細胞をプライミングし増大させてがんに関連する複数のネオ抗原にする。このようなＴ細胞を患者に投与することで、複数の抗原に反応性のＴ細胞によって腫瘍を有効に標的化する、新規の免疫応答が創出される。Ｔセレクトは、ＰＢＭＣを利用して、血液から、複数のネオ抗原に対し特異的な反応性を有する腫瘍活性化Ｔ細胞を選択する。この方法は、各患者の腫瘍向けに個別化されたＴ細胞療法を提供する。Ｔセレクトにより、ネオ抗原Ｔ細胞療法が実際的なものとなり、各患者向けの個人的なネオ抗原ペプチドを予め同定し合成する必要はない。
【００６５】
ネオ抗原は、疾患状態を解析し、疾患に存在するが好ましくは健康な組織中には存在しない抗原（例えば、細胞変異の結果として）を同定することにより、第１の態様において本発明に好適なものとして判定される。患者特異的なアプローチに関しては、患者の免疫応答は、エピトープマッピングにより判定され得るように、特異的なドミナント抗原に偏っている可能性があり、これは、免疫刺激効果のネオ抗原候補を選択する場合には回避すべきであるが、免疫減弱効果の候補を選択する場合には有用であり得る。好ましいネオ抗原は、疾患状態と一意的に関連する抗原であるが、疾患状態で上方制御される腫瘍関連抗原も好適である。したがって、ＢＲＣＡ２変異、ＥＧＦＲ変異（例えば、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ）、ＡＬＫ遺伝子融合、ＲＯＳ１遺伝子融合、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ、ＴＰ５３  Ｒ２７３Ｈ、及び同様の変異は全て、優れたネオ抗原候補を提供する。
【００６６】
腫瘍抗原にのみ特異的な高親和性Ｔ細胞は、有用なネオ抗原の供給源である。腫瘍は、成長し免疫系を回避するに伴い、通常、遺伝子変異を蓄積する。ある特定のがん、例えば、肺癌、膀胱癌、乳癌、及び黒色腫は、５００以上の変異を含有し得る。様々ながんで頻繁に変異することが知られている特異的なゲノム座位が存在し、これは一般に「ホットスポット」と呼ばれ、例えば、結腸癌及び肺癌で一般に観察されるＫＲＡＳ遺伝子変異や、様々ながん遺伝子に他の「ロングテール」ホットスポット変異が存在する。変異ホットスポットの集中を伴う他の遺伝子としては、黒色腫患者の５０％に見られるＢＲＡＦ（この変異の９０％がＶ６００Ｅである）、ＣＭＬ患者の９５％に見られるＢＣＲ／Ａｂｌ転座、７０％〜９０％の神経膠腫／神経膠芽細胞腫患者に見られるＩＤＨ１、及び多くのがんに見られるｐ５３変異が挙げられる。
【００６７】
高スループット超並列シークエンシング（「次世代シークエンシング」またはＮＧＳ）の到来により、大量のゲノム情報を識別するのに有効な方法がもたらされる。野生型に対する腫瘍表面抗原内の変異は、腫瘍特異的であるため、参照抗原の有用な候補を提供する。患者からの遺伝子配列情報は、変異を評価するベースラインを提供し、また、発明者らの関連出願に記載されているＴ−ダイレクト及びＴ−セレクト様式との関連で有用である。腫瘍または病的組織のシークエンシングにより、ホットスポットにおける遺伝子変異の同定が可能になる。既知のがん遺伝子（「遺伝子パネル」）、全エクソーム、全ゲノム、及び／または全トランスクリプトームのアプローチは、がん変異を検出し、そのため腫瘍を標的化するカスタマイズされた免疫療法を開発するための有用な方法を提供する。例えば、ＮＧＳは、減算的な遺伝子解析、例えば、遺伝子的差異を判定するための原発性腫瘍及び転移性腫瘍のシークエンシング、または参照配列と比較するための患者腫瘍のシークエンシング、または非がん性組織の遺伝子的読出しとの比較のための患者の腫瘍ゲノムのシークエンシングを可能にする。曝露された抗原エピトープにおける変異は、特に良好なネオ抗原候補である。腫瘍特異的（体細胞）変異、コピー数の変化、及び転座は、次世代シークエンシング（凍結または固定した腫瘍ｖｓ正常な組織）により同定される。体細胞腫瘍特異的な変異及び転座は、共有の腫瘍特異的ネオ抗原になる。コピー数の変化は腫瘍関連のネオ抗原になる。Ｔダイレクト及びＴセレクトをこれらの診断と組み合わせることにより、発明者らは、実際的な方法で、ネオ抗原に対しカスタマイズされたＴ細胞療法を迅速に創出するシステムを創出する。また、腫瘍細胞は血液中にも溢出することから、循環ＤＮＡ中の検出も可能である。血液から得られたネオ抗原をＴダイレクト及びＴセレクトと組み合わせることで、血液試料から、ネオ抗原と、増大されたＴ細胞療法の産生向けの供給源Ｔ細胞とを同定する、完全なシステムが創出される。これは、患者からの１回の採取により遂行することができ、経時的に進化し得る、またはアーカイブした血液に由来し得る、カスタマイズされた「ワンスティック」治療薬が可能になる。
【００６８】
個人のゲノムにおいて、極めて具体的な個人的変異をシークエンシングすることで、一意的なネオ抗原を得る可能性が顕著に増加し、そのネオ抗原に対し極めて有効なＴ細胞が生成され得る。一方で、有効な療法を設計する前に個別のゲノムシークエンシングを行うコストは、経済的ではない。そのため、代替的な戦略としては（各患者に一意的ではなく腫瘍により共有された）共有の腫瘍特異的ネオ抗原が挙げられ、これは、ゲノム腫瘍進化モデルで得られた知識を用いた効果的なネオ抗原として標的化され得る。点変異は、がんサブクラスまたは共通のがん進化基幹部、すなわち、「ドライバー変異」及び「基幹抗原」（すなわち、系統発生マップ上の）に対し一意的であり、ネオ抗原限定のＴ細胞集団を生成するための優れた選択をもたらす。原発性腫瘍と転移性腫瘍との間のゲノム進化研究は、養子Ｔ細胞療法向けに免疫応答を起こすためのネオ抗原の混合物の選択に有用である。腫瘍進化の基幹部における共通の変異を標的化することにより、原発性腫瘍や任意の再発を排除することができる。
【００６９】
ネオ抗原の事前同定は、血液から得られたＴ細胞を使用する場合には必要ではない。このようなＴ細胞は、原発性腫瘍上及び転移上の抗原に対し反応性となり、腫瘍内で見られる抗原に対し反応性となるＴＩＬＳとは対照的である。神経膠芽細胞腫、結腸盲腸癌、卵巣癌、黒色腫、及び肝細胞癌は、共有された腫瘍特異的ネオ抗原の選択や血液からの反応性Ｔ細胞の成長に最も適しており（全＞１０００；＞７０％  ｃｔＤＮＡ）、その後に膀胱癌、胃食道癌、膵臓癌、頭頸部癌が続く（全＞５００；＞７０％  ｃｔＤＮＡ）。Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ（２０１４）  ６（２２４）：２２４（参照により本明細書に組み込まれる）は、血液中の腫瘍からのネオ抗原の検出性の頻度を提供している。血液は、がん及び重篤な疾患を処置するための新規の独自システムを、患者から実験室へ、そして（再び）ある患者／その患者へという直接経路で提供する。血液を得ることにより、Ｔ細胞に患者の腫瘍（血液腫瘍及び固形悪性腫瘍の両方）を探索し破壊するように教示することが可能である。
【００７０】
様々な実施形態において、ネオ抗原は、標的組織中に存在するのではなく、抗原限定免疫応答の標的対象となる組織に導入される。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍の感染により腫瘍に付加される。特に、ラッサ−ＶＳＶは、静脈注射または頭蓋内注射の後に、神経膠腫のような脳内のがん細胞を標的化する。ラッサ−ＶＳＶは、黒色腫や卵巣がんも標的化する。ラッサ−ＶＳＶは、転移がん細胞に感染し、正常な細胞には感染しない。ラッサ−ＶＳＶは、強力な免疫応答、特にＴ細胞応答を生成し、感染細胞からの複数の抗体に対する高親和性抗体を生成する。ラッサ−ＶＳＶ限定Ｔ細胞移植は、担がん（ＧＢＭ）動物の生存期間を不定に増加させ、また化学療法耐性のがんを排除し、一部のがんを完全に排除するように思われる。そのため、本発明によれば、ラッサ−ＶＳＶの調製物を腫瘍に導入し、次に、感染を標的化し取り除くことにより腫瘍負荷を低減する、ラッサ−ＶＳＶ反応性のＴ細胞調製物を提供する。
【００７１】
疾患関連物の他の抗原マーカーは科学文献や医学文献に記載されており、本明細書に記載の発明は、古典的なネオ抗原のみに、または同定された特異的なネオ抗原のみに、または明記された抗原タイプもしくは疾患状態のみに限定されるように意図されるものではない。ネオ抗原の選択は、当業者には明らかであろうように、処置対象の疾患状態に鑑みて、特異的なタイプの所望される免疫応答調整によって動機付けられる。さらに、ネオ抗原選択は、Ｔ細胞反応性を検証し最適化することができる特異的なエピトープの同定により誘導され得る。
【００７２】
ネオ抗原は、特異的な免疫応答の調整（すなわち、上方制御または寛容化）に有用である。本明細書に記載のように選択されている所与の候補ネオ抗原は、直接使用してもよく、または、アミノ酸変異誘発、環化、グリコシル化、もしくは他の化学的修飾（例えば、ハプテンの付加を含む）を含む、当技術分野で公知の一般的方法によりさらに修飾してもよい。例えば、ネオ抗原候補は、アミノ酸置き換えにより修飾して、より高い親和性でＭＨＣクラスＩ構造に結合するペプチドを産生することができる。
【００７３】
検証されたネオ抗原は、免疫療法に適した疾患状態に関連しているものとして説明され、このネオ抗原はＭＨＣクラスＩ及び／またはクラスＩＩに結合可能であり、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋サブ集団におけるＴ細胞活性化、増殖、及び／またはメモリー応答を引き起こすという点において、Ｔ細胞に対し免疫原性である。好ましくは、検証されたネオ抗原は、標的患者においてサブドミナントでもある。より好ましくは、１つ以上の検証されたネオ抗原は、不均質なＴ細胞プール中で免疫応答を誘導するために使用される。様々な他の実施形態において、３つ以上のネオ抗原が調製され検証される。Ｔ細胞の免疫化に使用される調製物中のネオ抗原の数は、１０、１５、または２０以上の個別のネオ抗原を含み得る。様々なネオ抗原の免疫原性は等しくないと考えられるため、免疫化プロトコルは、ドミナントな応答の創出を回避するように設計され得る。
【００７４】
Ｒａｓは、構造的に関係する低分子ＧＴＰアーゼタンパク質のファミリーであり、全ての細胞に発現し、細胞の成長、分化、及び生存に関与する制御遺伝子に関与する。３つのＲａｓ遺伝子の変異（ＨＲａｓ、ＫＲａｓ、及びＮＲａｓ）がヒトのがんにおいて最も一般的ながん遺伝子であり、制御されない増殖を引き起こす。Ｒａｓ変異は、全てのヒト腫瘍の２０％〜２５％、ある特定のタイプのがんでは最大９０％に見られる。
【００７５】
恒常活性型Ｒａｓは、ＧＴＰ加水分解を排除または低減する１つ以上の変異を含有することができ、その結果、タンパク質が永続的に活性となる。最も一般的なＲａｓ変異は、Ｐループ内のグリシン残基Ｇ１２、そして触媒残基Ｑ６１に見られる。残基１２におけるグリシンからバリンへの変異により、ＲａｓのＧＴＰアーゼドメインは、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質による不活性化に非感受性となり、よって恒常活性となる。残基６１におけるグルタミンはＧＴＰ加水分解の移行状態を安定化させ、Ｑ６１のリジンへの変異は加水分解を有効に排除する。他の重要な変異としては、Ｓ１７Ｎ及びＤ１１９Ｎが挙げられる。
【００７６】
本発明によれば、Ｒａｓベースのネオ抗原候補は、以下のように設計及び検証する。Ｒａｓを含めた患者のゲノムの一部をシークエンシングし、患者の腫瘍をシークエンシングし、またはコンセンサス腫瘍配列を誘導し、２つの間の差異を確認する。上述のＲａｓ変異は予測されるシークエンシング結果に典型的であり、優れたネオ抗原候補を提供する。およそ８〜１０アミノ酸長のペプチド配列が、変異部位にわたって（すなわち、１番目、２番目、３番目等から８番目までのアミノ酸位置）創出される。これらの候補ペプチドにおいて、コンピューターモデリングにより、潜在的なＭＨＣクラスＩ結合適合性を評価する。最も適合した候補を先に進める。この配列を、腫瘍配列を用いて１５〜２４アミノ酸長まで延ばす。この長いペプチドをクラスＩＩ結合適合性向けにモデリングし、任意選択で、当該ペプチドがＭＨＣクラスＩＩに結合する能力を実験に基づき検証する。ＭＨＣクラスＩ及び／またはクラスＩＩ構造に結合することができるペプチド配列は、発明者らの関連出願に記載されているＴ細胞のプライミングに使用される。具体的な諸実施形態において、ＭＨＣハプロタイプＣＷ８、Ａ３、及びＡ６８が好ましい。全体で、これらのＭＨＣアレルは患者の約４０〜５０％に示される。これらのＭＨＣタイプは、ＫＲａｓ点変異を含有する長いペプチドに特異的に結合することができ、一方正常なＲａｓ配列には結合しない。これらのＨＬＡタイプは、ＩＦＮｇ／ＴＮＦアルファＩＣＳ及びＣＤ１０７ａの刺激に対し陽性である。これらのＭＨＣアレルを用いると、ＫＲａｓへの応答は、野生型Ｒａｓ配列に対する自己反応性のリスクを冒さず、一方ＫＲａｓは、膵臓がんの９０％、結腸癌の３０〜６０％、及び肺腺癌の２０〜３０％で変異する。他の実施形態において、血液から得られたＴ細胞はＲａｓペプチドのパネルに対しスクリーニングされ、反応性の集団が増幅される。
【００７７】
免疫化された細胞集団中の細胞から選択された、ネオ抗原反応性の刺激されたＣＤ８＋及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞からのＴ細胞受容体は、このような反応性Ｔ細胞が免疫原性を大きく左右するため、ネオ抗原の検証に有用である。Ｔ細胞受容体は、例えばＰＣＲにより、シークエンシング及びクローニングすることができる。Ｂｏｒｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔｓ  ｆｏｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ，ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；９：５０；Ｇｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｉｒｅｄ  αβ  ａｎｄ  γδ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｈａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：１５０５４（２０１６）を参照。また、Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＴＣＲ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｎｏｖｅｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１４  ２；１２３０も参照。ＴＣＲは、トランスフェクションの配列を含有するベクターを含めた、複数の好適なベクターにクローニングすることができる。ある特定の実施形態において、好ましいベクターは、導入遺伝子としてクローニングＴＣＲ配列を標的Ｔ細胞に導入するための統合配列を有する。様々な実施形態において、ネオ抗原はＴ細胞応答を起こすために使用され、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋集団はネオ抗原反応性の選別及びスクリーニングが行われ、このような細胞は極めて免疫原性のサブ集団にさらにふるい分けられ、Ｔ細胞受容体配列がシークエンシング及びクローニングされる。ある特定の実施形態において、ネオ抗原限定のＴ細胞からのＴＣＲは、メモリー細胞にクローニングされる。他の実施形態において、ネオ抗原限定のＴ細胞からのＴＣＲは、Ｔｒｅｇにクローニングされる。
【００７８】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域を、Ｔ細胞受容体における細胞内シグナリング鎖に連結することにより生成される。ＣＡＲＴは、活性化に関してＭＨＣ構造との相互作用に限定されない。Ｐｕｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４，１２６４−１２７０（２００８）を参照。また、Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  １９−２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｕｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｆｅｂ  １９；６（２２４）も参照。さらなる背景については、Ｄｏｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２０１４  Ｊａｎ；２５７（１）：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２１３１を参照。また、患者において観察されたＣＡＲＴの強力な抗原特異的活性から、抗ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞の注入が一部のＢ細胞悪性腫瘍の標準療法となり得ることが示唆されると結論付けている、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ．，Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＣＤ１９  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１３  Ｍａｙ；１０（５）：２６７−７６も参照。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、ネオ抗原を対象とするＣＡＲＴ集団を提供する。このようなＣＡＲＴを生成するために、ネオ抗原に特異的な抗体は、ＣＡＲＴの標的化構成成分の創出に使用されるＩｇ重鎖及び軽鎖の供給源を提供する。このような抗体は、免疫化及び選択の方法により生じさせることができ、またはクローニングにより生成するか、もしくは配列情報から合成することができる。
【００７９】
抗原の検証
【００８０】
本発明の方法は、Ｔ細胞を含む細胞集団を抗原ポリペプチド（または他の抗原）に曝露することにより、選択及び／または増大向けのＴ細胞を刺激することを伴う。本発明の諸実施形態において、抗原は、その免疫原性を確認することにより検証される。抗原の免疫原性、すなわち、抗原が免疫応答を作動させる能力は、多数のタイプの抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、以下に限定されないが、樹状細胞（ＤＣ））によるＴ細胞への提示に大きく依存する。ＡＰＣは、典型的には、抗原が示される文脈において主要組織適合クラス（ＭＨＣ）構造（クラスＩ及びクラスＩＩ）を示す。上記の観点からの抗原の検証は、抗原が好適な断片を提供するか、すなわち、抗原がＭＨＣクラスＩ及び／またはクラスＩＩ分子と結合することができるか、そして、抗原が、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋サブ集団内でＴ細胞活性化、増殖、及び／またはメモリー応答を引き起こすという点においてＴ細胞に対し免疫原性であるかを判定することにより、遂行される。
【００８１】
ＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧ）は、抗原タンパク質のペプチド断片をＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に示し、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、標的抗原に対するＴ細胞からの直接応答を作動させる。ＭＨＣクラスＩＩ分子（ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＲ）は、ＡＰＣ、例えば、ＤＣ、単核食細胞、ある特定の内皮細胞（例えば、胸腺上皮細胞）、グループ３自然リンパ球、及びＢ細胞上に見られる。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ネオ抗原タンパク質のペプチド断片をＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に示し、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、様々な免疫応答、例えば、Ｂ細胞の活性化及び液性応答、食細胞の動員による炎症及び腫脹、ならびに長期免疫記憶を作動させる。機能的には、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、（抗原が、ウイルスペプチド抗原のように細胞質であるクラスＩ分子とは異なり）細胞外抗原を提示する。本発明の１つの目的は、抗原の使用を通じて自然免疫応答を再プログラムすることであり、したがって、本発明の技法は、例えば、典型的には細胞外の抗原に対し細胞傷害性Ｔ細胞の応答を作動させ、及び／または、典型的には細胞質の抗原に対しヘルパーＴ細胞の応答を作動させる手段を提供することができる。これを遂行するために、抗原は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの結合能力について検証され得る。
【００８２】
ＭＨＣクラスＩ分子は、α鎖及びβ２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）軽鎖を有し、ｂ２ｍ及びα３ドメインの相互作用を通じて非共有結合的に連結しているヘテロ二量体である。α３鎖は多型性でありＨＬＡ遺伝子によりコードされ、一方ｂ２ｍは遍在性である。α３ドメインは形質膜スパニングに及び、ＣＤ８＋共受容体と相互作用し、ＣＤ８＋共受容体はα１−α２ヘテロ二量体におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とＭＨＣクラスＩ分子との間の相互作用を安定化させる。α１及びα２ドメインは折り重なって、８〜１０アミノ酸長のペプチドのための溝を形成する。ＴＣＲは、溝に保持されたネオ抗原断片に対する抗原性の判定を媒介する。
【００８３】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、２つの相同なペプチド、α鎖及びβ鎖からなるヘテロ二量体である。ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原結合溝は両端がオープンであり、クラスＩ分子上の対応する溝が各端でクローズドであるのとは対照的である。したがって、ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示されるネオ抗原は、１５〜２４アミノ酸長であり得る。ＭＨＣクラスＩＩはＣＤ４に結合し、さらにＴ細胞及びＤＣ上の他の複数の細胞受容体（例えば、ＬＡＧ−３）にも結合する。
【００８４】
候補がＭＨＣクラスＩペプチド溝で結合するかの判定を補助するために使用され得るツールは多数存在する。様々なクラスＩ及び／またはクラスＩＩ抗原複合体について結合パラメーターが視覚的に説明された構造的データセットが科学文献に存在する。加えて、変異誘発技法を通じて結合ポケットの溝及び床のパラメーターが解明されており、当該分子やその抗原結合パラメーターについて非常に多くのことが分かっている。したがって、当業者が利用可能なバイオインフォマティクスベースの予測モデリングプログラムが存在し、これらを使用して候補の結合をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでモデル化しスクリーニングすることができる（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｒｖｅｒｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８９：８，ＤＯＩ：１０．１１８６／１４７１−２１７２−９−８，１６  Ｍａｒｃｈ  ２００８；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＰＬＯＳ，Ａｐｒｉｌ  ４，２００８；Ｒｕｐｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｃｈｏｒ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＨＬＡ−Ａ２．１  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  ７４，Ｉｓｓｕｅ  ５，１０  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９３，Ｐａｇｅｓ  ９２９−９３７、さらに、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＮ−ａｌｉｇｎ．Ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ−ｂａｓｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００９１０：２９６，１８  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００９，ＤＯＩ：１０．１１８６／１４７１−２１０５−１０−２９６を参照）。これらのクラスＩ及びクラスＩＩモデル及び知識を候補ネオ抗原に適用することで、提案ネオ抗原がＣＤ８＋及びまたはＣＤ４＋  Ｔ細胞の応答を誘発する能力を予測する有用な情報がもたらされることになる。これは、ネオ抗原の断片選択において助けとなり、ネオ抗原の構造的特性及び化学的特性のさらなる修飾のための基盤を提供することができる。
【００８５】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏのスクリーニングが良好になったのと同じ程度に、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子における抗原結合を評価するための現時点で好ましい方法は、例えば結合アッセイによる、実験に基づいたエピトープ結合の判定を伴う。例示的な結合アッセイにおいて、様々なハプロタイプを代表するＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子のパネルが創出され、各それぞれの分子が候補抗原ペプチドに結合する能力についてスクリーニングされる。このようなパネルは、当技術分野で記載されている手段により調製することができ、例えば、Ｊｕｓｔｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００９，５：２を参照。抗原を広範囲の一般的ハプロタイプに結合させることは、抗原が様々な患者の遺伝的背景と共に一般使用のＴ細胞療法向けに調製される場合には重要であるが、患者特異的アプローチについては、患者の特定の生理学が標的化され得る。Ｉｍｍｕｎｉｔｒａｃｋ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）は、ＭＨＣクラスＩＩ結合アッセイの供給業者であり、現在以下のアレルを示している：ＤＰ：ＤＰＡ１＊０１０３、ＤＰＡ１＊０２０２、ＤＰＢ１＊０４０１、ＤＰＢ１＊０４０２；ＤＱ：ＤＱＡ１＊０１０１、ＤＱＢ１＊０３０１、ＤＱＢ１＊０５０１；ＤＲ：ＤＲＡ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ３＊０１０１、ＤＲＢ３＊０２０２、ＤＲＢ４＊０１０１、及びＤＲＢ５＊０１０１。ＥｐｉＶａｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）は、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１、及びＤＲＢ１＊１５０１を提供している。現時点では、このより好ましい方法には、免疫原性の判定、例えば、Ｔ細胞の増殖及び応答アッセイが含まれる。抗原の免疫原性の測定に好適なＴ細胞アッセイとしては、様々な活性化サイトカインのレベルを測定するＥＬＩＳＡ、及びサイトカイン産生細胞の頻度を定量化するＥＬＩＳｐｏｔが挙げられる。フローサイトメトリーは、活性化Ｔ細胞の多数のマーカーを測定することに加えて、集団中のＴ細胞サブセットの相対的割合を特徴づけることを可能にする。活性化マーカーの発現に対する核酸ベースのアッセイ、及び細胞増殖アッセイは有用であり、広く説明されている。患者由来のＰＢＭＣは、Ｔ細胞アッセイにより、メモリー応答についてスクリーニングすることができ、これはエピトープ特異的ペプチドを用いてエピトープマッピングすることができる。したがって、抗原がサブドミナントであるか、そして抗原がこの状態を維持するかについては、患者から治療過程にわたって評価することができる。
【００８６】
Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ選択／増大向けの細胞集団
【００８７】
反応性のＴ細胞集団を創出するには、Ｔ細胞の供給源が必要である。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が現時点では好ましく、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が代替的な供給源となる。具体的な諸実施形態において、Ｔ細胞は、骨髄、リンパ節、または他の組織供給源から得ることができる。
【００８８】
患者の末梢血から得られた循環リンパ球、そして外科的外植片から得られた臓器特異的または組織特異的リンパ球は、養子免疫療法向けのｅｘ  ｖｉｖｏでの増大及び調製のための細胞集団の豊富な供給源である。患者の疾患部位に存在するＴ細胞は、疾患に関する抗原に対し反応性である。しかし、このようなＴ細胞は、疾患の自然進行の結果として、炎症または腫瘍のような疾患部位における免疫抑制的環境にも供されている。がん及び腫瘍に関する条件の場合には、腫瘍抗原（典型的にはドミナント抗原）経験のある腫瘍浸潤リンパ球、すなわちＴＩＬが単離される。腫瘍反応性Ｔ細胞は、アネルギーを示す可能性がある。
【００８９】
末梢血は循環Ｔ細胞の供給源であり、その少なくとも一部分は腫瘍抗原を経験しており、そのためプライミングまたは活性化されている。各Ｔ細胞は、Ｔ細胞が発現させるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって特徴づけられる、１つの抗原形態にのみ応答することができる。特定の抗原に対しＴＣＲ特異性を示すこれらのプライミングされた細胞は、同族抗原にさらに曝露されたときに、指数関数的成長、ある特定の表面活性化マーカーの高レベル発現によって応答し、また、抗原特異的五量体結合アッセイに対し陽性である。対象におけるドミナント及びサブドミナント抗原の同定は、抗原の存在下で細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで成長させることにより実施され、このとき、ドミナント抗原に応答したＴ細胞の成長及び活性化は、サブドミナント抗原に反応性のものにまさる可能性がある。
【００９０】
免疫療法の一部の場合において、例えば、自己免疫疾患または炎症性疾患の場合、疾患改善には免疫応答の抑制を要する。免疫制御性表現型の細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）は、疾患部位から、または循環血から、または他の関連組織から単離し選択することができ、記載の方法を用いて好適に増大させることができる。好適な細胞表面マーカーとしては、ＣＤ４＋、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ３９、ＣＤ７３、及びＣＤ２５＋を含む選択マーカーが挙げられる。単離した細胞集団を所与のマーカーによって選別して、豊富化された制御性Ｔ細胞を生成し、次にこれを増大させる。
【００９１】
代替的に、例えば、効率的な免疫応答の増強に要する条件において、高反応性のＴ細胞を移すために、標準的技法を用いてＴｒｅｇを細胞集団から選び出すことができる。
【００９２】
循環Ｔ細胞は、メモリー表現型を示すＣＤ４５ＲＯ、ナイーブな表現型を示すＣＤ４５ＲＡ、ＮＫＴ表現型を示すＣＤ５６、ＣＤ５７、ナイーブなセントラルメモリー表現型を示すＣＤ２７及びＣＤ２８、または他の表面タンパク質、例えば、ケモカイン受容体、組織ホーミング受容体、及び活性化マーカーを発現させる。転移性疾患の場合には、循環リンパ球が転移抗原反応性Ｔ細胞の供給源であり、これは、起源となる腫瘍中の腫瘍抗原にのみ反応性である腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）とは異なる。
【００９３】
抗原ナイーブＴ細胞及び抗原同族Ｔ細胞の両方がヒト末梢血中に存在し、正常な対象における細胞構成成分の約０．７〜４パーセントを構成する。本発明の最適化された細胞生物学技法を使用して、末梢血から単離された細胞の混合集団を方向付け、サブドミナント抗原及びネオ抗原の方向付けられたセットに対し反応性である、特異的なサブタイプのＴ細胞を、細胞媒介の療法向けに生成することが可能になった。
【００９４】
また、Ｔ細胞は、疾患部位、例えば、炎症、自己免疫反応、腫瘍、または感染、すなわち、ウイルス、細菌、真菌、外来、もしくは潜伏感染にも存在する。自己Ｔ細胞は、免疫反応性療法向けの細胞集団を得るための本発明の最適化された細胞培養法によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増大のために、患者の組織試料から得られる。具体的な諸実施形態において、Ｔ細胞は、別のヒト対象からの骨髄由来細胞から得ることができる。
【００９５】
疾患部位に存在するＴ細胞は、疾患に関する抗原を本質的に認識しそれに対し反応性であるが、このようなＴ細胞の大部分は、ドミナント抗原に対し応答性である。このようなＴ細胞は、今度は免疫抑制的応答の一部となる可能性があり、これが疾患進行につながり得る。このようなＴ細胞はアネルギーを示す可能性がある。
【００９６】
末梢血は循環Ｔ細胞の供給源であり、その一部は、腫瘍抗原のような疾患抗原に遭遇しているため、プライミングされている。また、循環Ｔ細胞は、メモリー表現型を示すＣＤ４５ＲＯ、ナイーブな表現型を示すＣＤ４５ＲＡ、ＮＫＴ表現型を示すＣＤ５６、ＣＤ５７、ナイーブなセントラルメモリー表現型を示すＣＤ２７及びＣＤ２８も発現させることができる。加えて、循環リンパ球は、起源となる腫瘍中の腫瘍抗原にのみ反応性である腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）とは異なる、転移抗原反応性Ｔ細胞の供給源である。具体的な諸実施形態において、Ｔ細胞は、骨髄、リンパ節、または他の組織供給源から得ることができる。
【００９７】
初期細胞集団の解析／培養セットアップ
【００９８】
細胞は、健康なドナーの血液から、またはがん、感染症、または自己免疫障害のような医学的障害を有する対象から、過去に凍結されて、または新たに単離されて得られる。末梢血単核球は、対象（ドナーまたは患者）から標準的な方法により得られる。ある特定の実施形態において、ＰＢＭＣは、解凍してから本発明の方法で後ほど使用するために、凍結される。障害を有する患者において、ＰＢＭＣは当該障害に関する抗原を経験している可能性がある。細胞は、Ｇ−Ｒｅｘ１０（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）ガス透過性デバイスに播種するか、または、当業者により実現可能とみなされる任意の好適な容器もしくはデバイス内で成長させることができる。
【００９９】
血液由来細胞を用いた例として、ＰＢＭＣを細胞培養培地に懸濁させる。本明細書に示すある特定の例では、３，０００万〜１億個のＰＢＭＣを完全培地に懸濁させる。有用な製剤は、１０％のヒトＡＢ型血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）及び１％のＧｌｕｔａＭＡＸ−１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を追加したＣｅｌｌＧｅｎｉｘ  ＣｅｌｌＧｒｏ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ  ＧｍｂＨ）を、ミリリットル当たりおよそ２００〜３００万細胞の濃度にしたものである。細胞をＣＴＬ  Ａｎｔｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｗａｓｈ培地（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）（ＣＴＬ−ＡＡ−００５）で洗浄し、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ  ＣｅｌｌＧｒｏ培地に再懸濁させる。典型的には、細胞培養手順は、標準的な温度及び湿度条件（５％のＣＯ２において３７度）を用いて実施する。
【０１００】
初期集団からの細胞の一部において、抗体を用いたフローサイトメトリー（または他の好適な方法）により、以下のマーカーを解析して、出発集団中の生存可能なＴ細胞、Ｂ細胞、単球、及びＮＫ細胞を確認する：生／死染色、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６。
【０１０１】
Ｔ細胞の刺激及び増大
【０１０２】
本明細書に記載の方法において、培養下の細胞集団は抗原に曝露され、連続培養中に１つ以上のサイトカインで処理される。一実施形態において、細胞集団中のＴ細胞の刺激（プライミングを含む）は、細胞集団を１つ以上の標的抗原に由来するペプチド混合物に曝露することにより、実施することができる。本発明の諸実施形態において、細胞は、個別の標的抗原（または標的抗原に由来するポリペプチド）で順次刺激される。他の諸実施形態において、細胞は、複数の標的抗原（または複数の標的抗原に由来するポリペプチド）で同時に刺激される。
【０１０３】
本発明の諸実施形態において、細胞集団は２つ以上のサブ集団に分割され、その各々は、異なる標的抗原に由来するペプチド混合物に曝露される。刺激は、最終採取の前にプールされた（スプリットプールプロトコル）、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＴｙｔｏのようなＧＭＰ適合性のＦＡＣＳ装置を用いて選別された、３つの別々の培養物として実施される。諸実施形態において、細胞は、各抗原に対し別々に培養下で増大させ、患者投与の前にプールすることができる。代替的に、細胞は、プールし、次に、代替の抗原調製物に順次接触させてもよい。
【０１０４】
細胞は、任意選択で、初期成長フェーズの後に分割させてもよく、これは抗原ペプチドの混合物の存在下で生じる。次のフェーズにおいて、各々が１つの抗原に応答性であるサブ集団を、別々に成長させて、専用の抗原の存在下、様々な抗原応答性細胞の等価的表現を促進する。ある特定の抗原応答性細胞が、共刺激分子または細胞成長に及ぼす影響の競合で消失し得ることは考えられる。１つの抗原の存在下で成長した細胞は、異なる成長要件及び統計値を有する。例えば、ＥＢＮＡ１抗原の場合において、個別の抗原刺激は、２１日目に、プールされたペプチド混合物よりも高い細胞収量をもたらす。分割培養からの細胞は、最終的には、多様な抗原特異的細胞の組成物向けに一緒にプールされる。分割またはプールされた細胞集団は、免疫療法の出荷基準について同じ品質管理試験を受ける。
【０１０５】
Ｔ細胞の刺激は、様々な方法を用いて遂行することができる。ポリペプチド抗原は、ＭＨＣ構造を、（上で論じられているように）細胞集団（例えば、ＰＢＭＣまたはＰＢＭＣに由来する細胞集団）中の抗原提示細胞に装填する上で有用である。精製されたＴ細胞を使用する場合、抗原が装填されたＡＰＣ集団をＴ細胞培養物に添加してもよい。本発明の諸実施形態において、ペプチド抗原は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩに最適化されている。
【０１０６】
ポリペプチドは、一般的に、食塩水、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に懸濁させ、さらに、細胞培地に添加する前に必要な濃度に希釈してもよい。抗原濃度は、プライミング技法及び抗原の毒性に応じて変動することになるが、概して、培地ｍｌ当たりポリペプチド１ナノグラム〜１０マイクログラムの範囲になる。
【０１０７】
ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞を刺激するための、１つ以上の標的抗原に由来するポリペプチドのプールの使用により、標的抗原（１つまたは複数）を認識するＴ細胞が豊富化された異種特異的なＴ細胞集団がもたらされる。このような異種特異的なＴ細胞集団は、複数の抗原に対し、高活性のエフェクター細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を作動するように生成される。
【０１０８】
サイトカイン、追加物質、及び増大する不均質なＴ細胞集団
【０１０９】
細胞培養におけるＴ細胞の刺激及び増大は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１のようなサイトカインの組合せにより支援され、その結果、異種特異的なＴ細胞の比例的増加を得、このＴ細胞を特異的な機能的サブタイプに変換する。好ましい実施形態において、ＩＬ−７及びＩＬ−１５は、本発明の方法でＴ細胞を刺激し増大させるために使用される。別の好ましい実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１は、本発明の方法でＴ細胞を刺激し増大させるために使用される。
【０１１０】
各サイトカインは、単体であっても組合せであっても、表２に記載のように、細胞集団の表現型的特徴に一定の結果をもたらす。培養物は、１つのサイトカインまたはセットのサイトカインにある特定の時間期間供することができ、次に組成物は培養手順の進行に適合するように改変される。以下の表は、培養下でのリンパ球の特異的な増大に対するサイトカインの組合せの使用を例示するものであり、これは、細胞培養物が所与濃度の１つ以上のサイトカインに一定時間曝露され得ることに基づいている。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
Ｔ細胞培養下でＩＬ−７を使用する具体的利点の１つは、ＩＬ−７が抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増大を促進することであり、マウスにおいてリンパ球の生存能及びＣＤ６２Ｌマーカー発現を保持することが示されている（Ｃｅｓｅｒｔａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４０：４７０−４７９；Ｍｏｎｔｅｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：２９２−３０２を参照）。Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．は、特異的なＣＭＶ抗原に応答したＣＤ８＋  Ｔ細胞増大は、ＩＬ−７またはＩＬ−２と比べて、ＩＬ−１５の存在下で最も高かったと報告している。ＵＳ２０１４／３５６３９８は、ＩＬ−１５がセントラルメモリー表現型を有するＣＤ８＋  Ｔ細胞を死から救出したが、ＩＬ−７は救出しなかったことを開示している。
【０１１３】
細胞集団の解析及び抗原活性化Ｔ細胞の選択
【０１１４】
細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増大及び修飾のプロセス全体において、細胞は、定期的に取り出され、細胞表面マーカーの解析による品質管理検査向けにサンプル採取され、条件付きで、免疫療法向けの不均質な細胞集団を得るための最良な細胞の組合せを達成するためにプロトコルのバリエーションに供される。
【０１１５】
本発明の諸実施形態において、細胞集団中のＴ細胞は、１つ以上の標的抗原を認識するＴ細胞を豊富化するように選択される。一態様において、本発明は、（ｉ）体内での抗原への曝露、または（ｉｉ）本明細書に記載のＴ細胞刺激法の使用により既に刺激されたＴ細胞を単離する方法を提供する。ある特定の実施形態において、細胞は閉鎖系の選別機内で選別される。細胞は、１つ以上の活性化マーカー、及び細胞生存能に基づいて選別される。抗原曝露細胞活性化プロファイルの判定に使用されるマーカーとしては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２９７（ＰＤ−１）、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌが挙げられる。
【０１１６】
一実施形態は、細胞をＰＤ−１発現についてスクリーニングすることと、ＰＤ−１陽性細胞の選択と、細胞のロバストな増大を可能にする細胞培養条件下で細胞を成長させることと、を含む。
【０１１７】
別の実施形態は、細胞において、培養下の単離された細胞上における抗原曝露マーカーとしてのＣＤ１３７の発現をスクリーニングすることと、ＣＤ１３７マーカーを有する細胞を、細胞のロバストな増大を可能にする細胞培養条件に供することと、を含む。別の実施形態において、ＣＤ−１３７及びＰＤ−１を含めた多数の発現マーカーは、ｅｘ  ｖｉｖｏでの増大向けの細胞を選択するために使用される。ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原にプライミングされた細胞をスクリーニングするための発現マーカーとしては、ＣＤ８、ＣＤ２７４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ−２７、ＣＤ２８、ＣＤ６９、ＣＤ１０７、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ４４、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒα）、ＣＤ３６６（ＴＩＭ３）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７−Ｈ５）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１２２（ＩＬ−１５Ｒα）、ＣＤ３６０（ＩＬ−２１Ｒ）、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ−１）、ＣＤ１２６（ＩＬ−６Ｒ）、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）を含む群から選択される１つ以上のメンバーが挙げられる。
【０１１８】
本発明の方法を実行するための好ましいシステムとしては、高精度と、手順中に最大限の細胞生存率を保つ細胞上の穏やかな条件とをサポートする選別デバイスが挙げられる。このデバイスは、好ましくは、自動化され、選別された細胞を直接培養容器に取込み及び払い出しを行うための無菌動作システムを維持する。
【０１１９】
集団におけるＴ細胞のある特定のサブセットは免疫抑制的であり（例えば、Ｔｒｅｇ、ＴＨ１７、アネルギー化Ｔ細胞）、これらの存在は免疫寛容を誘導する。このようなＴ細胞サブセットは、好ましいサブ集団について選別して、増強または抑制の方向に免疫応答を調整することができる。代替的に、このような細胞は、自己Ｔ細胞が患者における免疫応答を活気付けるために使用されるｅｘ  ｖｉｖｏ増大Ｔ細胞集団から選別し、排除してもよい。
【０１２０】
本発明の一実施形態は、単離された細胞集団から、抗原に予め曝露され活性化した細胞を選択することを含む。黒色腫患者からのＣＤ８＋腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）上におけるＰＤ−１（Ｔ細胞疲弊マーカーとも考えられる）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３、別称ＣＤ２２３）、Ｔ細胞免疫グロブリン、及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）の発現強化は、抗原曝露及び活性化との相互関連がある。しかし、ＴＩＬのおよそ１６％がＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３を発現するのに対し、これらのマーカーに対し陽性であるのは、黒色腫患者からのＰＢＭＣのわずか０．３％±０．１％に過ぎない（Ｇｒｏｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，１２４（５）：２２４５−２２５９を参照）。ｅｘ  ｖｉｖｏの抗原曝露後のＰＢＭＣ由来Ｔ細胞においてピークＰＤ１発現が観察されたが、培養中に減少する。もう１つの抗原曝露マーカーである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、ＴＮＦ受容体ファミリーの共刺激マーカーである。
【０１２１】
本発明の諸実施形態において、細胞は、ＣＤ２５、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１５４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７９、ＣＤ３、ＬＡＧ−３、もしくはＴＩＭ−３、または抗原にプライミングされた活性化細胞向けの任意の好適なマーカーを含めた、プライミング及び作用マーカーの発現について選別される。磁気ビーズ分離及びＦＡＣＳは、細胞分離の技法である。本発明の諸実施形態において、選別された細胞は、抗原限定の増大及びまたはポリクローナル刺激向けのｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養系に戻される。細胞の効率的な高純度選別は、採取前に（例えば、２１日目までに）、選別した日に対し、抗原指向Ｔ細胞集団の少なくとも約５０倍〜約２５０倍の増加をもたらす。
【０１２２】
本発明の諸実施形態において、五量体アッセイは、抗原特異的Ｔ細胞の増大を測定するために使用される。五量体は、特異的なペプチドで結合した特異的なＭＨＣアレルから構成される組換えタンパク質である。この組合せは、特定の特異性のＴ細胞受容体に直接結合することができる。五量体は、フローサイトメトリーで使用するためにビオチン化することも他の方法で標識することもできる。
【０１２３】
再刺激
【０１２４】
本発明の諸実施形態において、刺激ステップは、最初の刺激と同じプロトコルで繰り返される。最初及び２番目の刺激からの培養物は、集団を多様化するためにプールされる。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、細胞の単離及び刺激の後に、細胞は、完全培地をさらに追加され、再刺激される。一実施形態において、細胞は、１つ以上のサイトカインの存在下で、自己フィーダー抗原提示細胞によって再刺激される。ある特定の再刺激の方法は、抗原プールに事前に曝露し、照射されていないＰＢＭＣを利用し、培養物に直接添加し、次に選別により、または培養プレートへの細胞の接着により取り出される。当該方法の変形形態において、抗原に刺激され、ただし照射されたＰＢＭＣは、成長Ｔ細胞を再刺激するために使用される。代替的に、抗原活性化樹状細胞は、ＰＢＭＣの代わりに再刺激に使用される。
【０１２６】
再刺激の一方法は、抗原プールに事前に曝露し、照射されていないＰＢＭＣを利用し、培養物に直接添加し、次に選別により、または培養プレートへの細胞の接着により取り出される。当該方法の変形形態において、抗原に刺激され、ただし照射されたＰＢＭＣは、成長Ｔ細胞を再刺激するために使用される。代替的に、抗原活性化樹状細胞は、ＰＢＭＣの代わりに再刺激に使用される。ただし、ＤＣは、抗原が非ペプチド抗原、具体的にはヌクレオチド抗原またはＲＮＡ抗原である場合、好ましい抗原提示方法である。好ましいペプチド抗原は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩに最適化されている。ペプチドは、一般的に、食塩水、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に懸濁させ、さらに、細胞培地に添加する前に必要な濃度に希釈してもよい。抗原濃度は、プライミング技法及び抗原の毒性に応じて変動することになるが、概して、培地ｍｌ当たりペプチド１ナノグラム〜１０マイクログラムの範囲になる。
【０１２７】
この段階において、Ｔ細胞は様々な細胞表面活性化マーカーを示す。表面マーカーは、表面タンパク質に対する抗体反応により、またはＦＡＣＳを実施することにより、同定される。細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増大及び修飾のプロセス全体において、細胞は、定期的に取り出され、細胞表面マーカーの解析による品質管理検査向けにサンプル採取され、条件付きで、免疫療法向けの不均質な細胞集団を得るための最良な細胞の組合せを達成するためにプロトコルのバリエーションに供される。
【０１２８】
ポリクローナル刺激
【０１２９】
ある特定の実施形態において、所望の標的抗原（複数可）を認識するＴ細胞の増大は、Ｔ細胞を含有する細胞集団のポリクローナル刺激によって促進される。好ましい諸実施形態において、ポリクローナル刺激は、Ｔ細胞が、１つ以上の標的抗原及び本明細書に記載のある特定のサイトカインへの曝露により増大するように刺激された後に生じる。好ましくは、ポリクローナル刺激は、細胞採取の少なくとも約２週間前に実施される。
【０１３０】
このポリクローナル刺激は、Ｔ細胞数の非特異的な増大を引き起こす任意の手段により、遂行することができる。好ましい実施形態において、ポリクローナル刺激は、細胞集団をＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に結合する四量体抗体に曝露することを含む。他の非特異的なＴ細胞活性化物質をＴ細胞のポリクローナル刺激に使用してもよく、これにはＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）及びＰＭＡ／イオノマイシンが含まれるが、限定されない。
【０１３１】
Ｔ細胞の採取
【０１３２】
細胞は採取され、生存能及び好適な細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ２７９、ＣＤ１３７、ＣＤ２２３、ＴＩＭ−３、及び機能的有効性を実証する他の活性化マーカーについて解析され、またはサイトカイン放出アッセイのような機能的アッセイにより解析される。好ましくは、細胞は培養され、環境的に密封された（無菌の）閉鎖系、例えばＴｉｔｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で選別される。採取された細胞は、将来使用するために凍結保存されるか、プールされるか、または直接使用するために患者への注入向けに調製される。
【０１３３】
免疫療法向けのＴ細胞組成物
【０１３４】
一態様において、本発明は、本発明の方法によりもたらされる養子細胞療法で使用することができるＴ細胞集団を提供する。養子細胞療法（細胞養子免疫療法）は、免疫系が疾患（例えば、がんやある特定のウイルスによる感染症）と戦うのを助けるために使用される処置である。Ｔ細胞は（通常は患者から）収集され、がん細胞を認識し殺滅させる、または感染症を認識しそれと戦うことができるＴ細胞の数を増加させるために、ｅｘ  ｖｉｖｏで増大される。このような増大されたＴ細胞は患者に戻されて、免疫系が疾患と戦うのを助ける。
【０１３５】
本発明のＴ細胞組成物は、以下のうちの１つ以上を含めた、養子Ｔ細胞療法での使用において利点である特性を有する：１０億個超のＣＤ３＋細胞、７０％超のＣＤ３＋  Ｔ細胞、主としてＣＤ８＋対ＣＤ４＋  Ｔ細胞、最小限の疲弊を伴う主としてエフェクターメモリーＴ細胞、高発現レベルのリンパ球ホーミング及び輸送マーカー、ならびに高い抗原反応性（過去に公開された学術的プロトコルよりも高い）。本発明の方法により作製されるＴ細胞組成物は、腫瘍へのホーミング強化（標的細胞に対しより効率的）、及び恒久的な応答に対するより少ない疲弊をもたらす。
【０１３６】
本発明の諸実施形態において、Ｔ細胞組成物は、組成物中の総生細胞のパーセンテージとして５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超のＣＤ３＋  Ｔ細胞を含む。好ましい諸実施形態において、ＣＤ３＋  Ｔ細胞の％は７０％超である。
【０１３７】
本発明の諸実施形態において、Ｔ細胞組成物は、主として（５０％超）ＣＤ８＋対ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。
【０１３８】
本発明のさらなる諸実施形態において、Ｔ細胞組成物は、メモリー及び疲弊についての細胞表面マーカーに対するフローサイトメトリーにより測定されるところの最小限の疲弊を伴う、主としてエフェクターメモリーＴ細胞である。
【０１３９】
本発明のさらなる諸実施形態において、Ｔ細胞組成物は、フローサイトメトリーにより測定されるところの高発現レベルのリンパ球ホーミング及び輸送マーカーを有する。
【０１４０】
本発明のさらなる諸実施形態において、Ｔ細胞組成物は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定されるところの高い抗原反応性（過去に公開された学術的プロトコルよりも高い）を有する。
【０１４１】
単離されｅｘ  ｖｉｖｏで増大されるＴ細胞は、成長因子、刺激物質、例えば抗原、サイトカイン、及びケモカインの形態で培養物に適用される環境的刺激に応答して絶えず変化する、動的な細胞集団に相当する。ヒト試料から得られる集団は、不均質な細胞集団である。不均質性は、細胞表面マーカーの発現及び抗原認識から明らかである。本出願に記載のプロトコルのような増大プロトコルの完了時には、細胞集団は、細胞培養手順の教示下の単離されたプールとは異なる、構造的及び機能的な特徴を獲得することになる。このような培養条件に基づけば、得られた細胞集団は、細胞がｅｘ  ｖｉｖｏの細胞培養中に曝露された抗原に対し応答性の細胞を少なくとも５％含むことが予想される。したがって、細胞集団は、第１の抗原に対し応答する生きている活性化Ｔ細胞を少なくとも５％、及び第２の抗原、または第３の抗原などに対し応答する生きている活性化細胞を少なくとも５％含み、このとき、これらの抗原は患者におけるドミナント抗原ではない。
【０１４２】
増大されたＴ細胞集団とは、ドナーの身体から単離した後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長したＴ細胞を指す。このような細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏでかなりの変換ステップを経るように操作され、得られる細胞が、患者内で優勢な状況下では、または任意の自然成長もしくは変換プロセスではｉｎ  ｖｉｖｏで見いだされなかったであろうものにする。例えば、当該変換ステップは、組織から単離された細胞を、サブドミナント抗原及びネオ抗原を含み得る複数の抗原に供することと、細胞集団が主に、他のエフェクター細胞を伴って抗原限定のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞として発生するように、細胞培養条件を調節することと、を含む。細胞傷害性Ｔ細胞は、標的細胞の溶解にも有効である。エフェクター細胞のサブ集団は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増大される長期抗原特異的記憶を付与するＣＤ８＋メモリー細胞及び抗原限定のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞をさらに含む。単離された細胞が、ｅｘ  ｖｉｖｏで特殊化されることなく単に増大され体内に再導入される場合、腫瘍微小環境の影響により、自然の免疫優性が引き継ぐ結果となり得る。
【０１４３】
本明細書において「不均質なＴ細胞」の集団とは、１つ以上の異なる抗原に対する反応性を有する複数のＴ細胞を指す。不均質な集団は、１つの抗原の複数のエピトープに対し反応性であり得る。不均質なＴ細胞とは、均一ではないＴ細胞集団を指す。また、不均質なＴ細胞は、機能により同定可能な別々のＴ細胞サブ集団（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞及びメモリーＴ細胞）の混合物を含むことも期待される。これに対し、異種特異的なＴ細胞とは、その集団の抗原反応性を指す。不均質な集団は、異種特異的でもあり得る。
【０１４４】
ｅｘ  ｖｉｖｏで増大されたＴ細胞を用いた養子免疫療法
【０１４５】
本出願で開示されているｅｘ  ｖｉｖｏのＴ細胞増大の方法を使用すると、約３，０００万〜１億個のＰＢＭＣの培養物の播種により、典型的には、約２１日の培養後に、免疫療法向けのおよそ１，０００万〜１億個の有効なＴ細胞がもたらされ得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞の数における約１０〜１００倍またはそれ以上の増大は、当該方法を用いた２１日の培養後に達成される。
【０１４６】
ｅｘ  ｖｉｖｏで増大された細胞は、免疫療法に適合しているとみなされるために適切な出荷基準について試験される。本質的には、（ａ）養子療法に必要とされる有効な細胞数、（ｂ）細胞生存能、（ｃ）有効な抗原認識多様性のための細胞表面マーカーの発現、（ｄ）所望される表現型の有効な混合、（ｅ）標的細胞のためのサイトカイン生成及び細胞傷害性に対する細胞応答が、出荷基準に含まれる。全般的な治療プロトコルは、発明者らの関連特許出願（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１４／１２２，０３６及びＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３１０７）に開示されているように従い、ただし臨床条件により求められる変更を伴う。当該方法により生成されたＴ細胞を注入する際、当該療法は、少数または１つのドミナント抗原に対する応答性から複数の抗原に対する細胞傷害性応答へと免疫ヒエラルキーのバランスをリセットして、腫瘍の有効な治療をもたらすため、患者は免疫再プログラミングを経る。複数の抗原を標的化することにより、腫瘍領域のより広い適用範囲が促進され、より迅速で有効な療法が可能になる。
【０１４７】
注入後、当該療法の有効性を評価するため、また、必要と認められる場合は当該療法を調整するため、患者は、時々、寛容及び免疫応答をアッセイすることにより再プロファイルされる。ＰＢＭＣまたは疾患の免疫応答を反映する組織試料の単離は、頻繁な間隔で得られ、抗原応答について、特に、五量体アッセイによる任意の抗原応答性の潜在的損失について検証され得る。腫瘍の退縮は、主要な結果として監視される。当該療法の主要な評価基準は、対象の病態に依存する。
【０１４８】
疾患の処置
【０１４９】
ある特定の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞を含む細胞集団を刺激し増大させるために抗原のプールを使用して、複数の標的抗原に対する特異性を有するＴ細胞を含む免疫療法または養子免疫細胞療法向けの組成物を生成することを提供する。一実施形態において、本発明は、免疫療法向けの自己Ｔ細胞集団であって、当該療法が複数の抗原（例えば、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、サブドミナント抗原、及び／またはネオ抗原）を対象とする、自己Ｔ細胞集団を提供する。このようなＴ細胞組成物は、一次療法をもたらし、また化学療法を必要とすることなく効果的な長期腫瘍退縮をもたらす能力を有する。優先的には、このような不均質なＴ細胞集団は、複数の抗原（例えば、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、サブドミナント抗原、及び／またはネオ抗原）に対し極めて活性のエフェクター細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を作動するように開発される。
【０１５０】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物及び方法は、以下に限定されないが、がん、固形腫瘍、血液関連障害、自己免疫、炎症性、及び感染性疾患の処置を対象とする。ある特定の実施形態において、当該方法は、免疫寛容化または免疫抑制を少なくとも部分的に特徴とする任意の慢性疾患を、原因要素に対する急性応答にリダイレクトすることに適している。具体的な例としては、肝炎のような慢性感染症、または結核のような潜伏感染、及びある特定のウイルス感染症が挙げられ得る。本発明の組成物及び方法の変形形態を用いて、病原体の複数のサブドミナント抗原及びネオ抗原に対し、抑制された免疫応答を活性の応答にリダイレクトすることにより、疾患を改善することが可能である。
【０１５１】
当該組成物及び方法は、以下に限定されないが、神経膠芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、胃、上咽頭、膵臓、肺、及び他の固形腫瘍、ならびに血液癌を対象とする。神経膠芽細胞腫は、脳における極めて悪性の攻撃的な腫瘍形態であるため、特に重要である神経膠芽細胞腫は星状細胞から生じるが、混合の細胞タイプを含有する。この腫瘍内には異なる細胞タイプ及びグレードが存在するため、処置が困難である。加えて、複雑なアーキテクチャーが外科的切除を困難にしている。当該疾患の進行を遅くするために照射及び化学療法が使用されており、生存期間中央値は、攻撃的な神経膠芽細胞腫を有する成人において約１４．６ヵ月である（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｔａ．ｏｒｇ／ｂｒａｉｎ−ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｔｙｐｅｓ−ｏｆ−ｔｕｍｏｒｓ／ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．ｈｔｍｌ）。この腫瘍の異種性により、「多型性」神経膠芽細胞腫として適切に知られている。
【０１５２】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ細胞を用いた神経膠芽細胞腫の治療的試みは、腫瘍の８２％がＥＧＦＲｖＩＩＩ発現を消失したことから、当初は成功したものの、その後腫瘍が再発する結果となった（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ，７（２７５）：２７５ｒａ２２を参照）。そのため、１つの特異的抗原における神経膠芽細胞腫の標的化は、十分な利益をもたらさず、そのため本発明が特に有用である１つの例示的事例である。特にこのタイプのがんにおいて、戦略の改善の必要性は可視化されており、複数のサブドミナント抗原及びネオ抗原を標的化する免疫療法は、このタイプのがんに対する唯一の有効な療法であり得る。
【０１５３】
腫瘍に編集されたＴ細胞応答は、ドミナント抗原に対するＴ細胞固定や、腫瘍抗原に対する選択圧の増加をもたらし、腫瘍抗原はそれに応答して変異する。米国出願第１４／１２２，０３６号（参照により本明細書に組み込まれる）は、サブドミナント抗原に対するＴ細胞応答を強化することによる免疫応答の再プログラミングについて詳述しており、免疫寛容を破壊し、細胞及び体液の抗腫瘍応答を回復させるために、１つのドミナント抗原を避けて別の抗原に向けるように細胞のホメオスタシス及び免疫応答の性質を治療的に変化させる細胞を使用する。
【０１５４】
組織培養下で、ドナーまたは患者からの特定の抗原を認識するＴ細胞を刺激し成長させ、次に患者にＴ細胞を移植することにより、十分な数のＴ細胞が増大され移植される場合、移植された細胞は、内因性ドミナント抗原限定のＴ細胞を圧倒し、免疫応答を新たな抗原に向けるように変更する。メモリー細胞が確立すると、メモリー細胞はこの新たな免疫優性ヒエラルキーを反映させて、所望される治療効果が長く続くようにする。実際上、特定の抗原（複数可）（例えば、ネオ抗原）に反応性の外因的に生成されたＴ細胞の移植は、プライミングと、標的抗原に対する患者の免疫応答のリバランスとを再現し、治療的利益をもたらす。
【０１５５】
がん治療法に加えて、免疫再プログラミングの原理は、記載の方法により検証することができる他の疾患関連抗原、例えば、慢性感染病原体及び潜伏感染病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、またはプリオンに関連する病原体）に関連する抗原に適用される。代替的に、自己免疫、神経変性、アレルギー、炎症、または臓器移植拒絶、または移植片対宿主疾患に関連するある特定の抗原については、長期寛容を誘導することが望ましい。そのため、ある特定の抗原は、Ｔｈ１及びＴｈ２応答、炎症性サイトカイン、ＮＫ細胞応答、及び補体経路の寛容または下方制御を誘導するとして検証され得る。
【０１５６】
がんの他にも、有効な免疫応答をマウントするために、患者の免疫優性ヒエラルキーを複数の過少表示されたまたは表示されていない抗原を標的化するようにリダイレクトすることを含む、本明細書に記載の免疫療法の方法は、様々な他の免疫学的疾患に極めて適応可能である。当該方法は、慢性の状態及び免疫破壊的な感染症（例えば、慢性肝炎感染症）、ならびに潜伏感染（例えば、結核）、ならびに異なる種類のウイルス感染症を、有効な急性免疫表現型に変換するのに特に有用である。同様に、記載された免疫療法の方法は、歪んだ免疫応答、または過活性のアレルギー免疫反応、及び他の慢性の病気（自己免疫を含むが、限定されない）に関する状態を特徴とする疾患状態を処置するのに適している。
【０１５７】
本明細書で開示される本発明の原理における変形形態が当業者により考案され得ることは、理解及び予想されるべきものであり、このような変更は本発明の範囲内に含まれるべきであるように意図されている。以下の実施例は本発明をさらに例示するものであるが、いかなる形でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書で引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１５８】
実施例１  Ｔ細胞増大プラットフォーム
【０１５９】
実験手順
【０１６０】
抗原選択：ＰｅｐＭｉｘは、対象となる標的抗原のペプチドスキャンに由来するペプチド（本明細書では「ポリペプチド」とも呼ばれる）のプールであり（各ペプチドは１１アミノ酸の重複を伴う１５アミノ酸である）、ＨＬＡ制限を知る必要なくＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激することができる。ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ１、ＣＭＶ、ＮＹＥＳＯ−１、及びサバイビン向けのＰｅｐＭｉｘをＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ）から購入した。ｐｅｐｍｉｘの各バイアルは、およそ１５ｎｍｏｌまたは２５マイクログラムの７０％純度の各ペプチドからなるものであった。個別のＬＭＰ２ペプチド及びカスタムエピトープマッピングマトリックスプールもＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ）から購入した。
【０１６１】
ＰｅｐＭｉｘ組成物、ならびに正常なドナー及びがん患者からのＴ細胞を増大させるために使用した抗原のタンパク質配列の供給源を収載する。
・ＰｅｐＭｉｘ  ＥＢＶ（ＬＭＰ１）：潜伏型膜タンパク１（Ｌａｔｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）に由来する９４ペプチドのプール、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ：エプスタイン・バーウイルス（ＨＨＶ４）のＰ０３２３０。
・ＰｅｐＭｉｘ  ＥＢＶ（ＬＭＰ２）：潜伏型膜タンパク２に由来する１２２ペプチドのプール、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ：エプスタイン・バーウイルス（ＨＨＶ４）のＰ１３２８５。
・ＰｅｐＭｉｘ  ＥＢＶ（ＥＢＮＡ１）：エプスタイン・バー核内抗原１に由来する１５８ペプチドのプール、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ：エプスタイン・バーウイルス（ＨＨＶ４）のＰ０３２１１。
・ＰｅｐＭｉｘ  ＨＣＭＶＡ（ｐｐ６５）：６５ｋＤａのリンタンパク質に由来する１３８ペプチドのプール、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ：ヒトサイトメガロウイルス（ＨＨＶ−５）のＰ０６７２５。
【０１６２】
ＰＢＭＣの供給源：正常で健康なドナー及びがん患者からの凍結ＰＢＭＣを販売業者から購入するか、または購入した白血球単位から単離し、インハウスで処理し、次に凍結保存し、気相の液体窒素の貯蔵容器に保管した。
【０１６３】
ＰＢＭＣ単離：末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、フィコール・ハイパック勾配による遠心分離により調製した。細胞を採取し、洗浄し、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  １０凍結培地（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に再懸濁させ、バイアル当たり５，０００万個の生細胞のアリコートにした。プログラム可能なレート制御フリーザー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）またはパッシブフリーザー（Ｎａｌｇｅｎｅ，Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ）を用いてバイアルを凍結させ、次に気相の液体窒素の貯蔵容器に移し、位置を記録した。凍結解凍されたＰＢＭＣの表面免疫表現型検査をフローサイトメトリーにより実施して、出発材料における単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞の分布を決定した。
【０１６４】
ドナーＰＢＭＣのＥＢＶ反応性Ｔ細胞スクリーニング：酵素結合免疫スポット（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）（ＥＬＩＳＰＯＴ）キットを使用して、ＥＢＶ  ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１  ｐｅｐｍｉｘ、マトリックスｐｅｐｍｉｘ、ならびに個別のペプチド（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に応答してＴ細胞がインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を分泌する頻度を決定した。細胞を９６ウェル当たり４００，０００〜６００，０００個でプレーティングし、１８〜２４時間培養し、製造業者のＥＬＩＳＰＯＴキットプロトコル（ＣＴＬ，Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＯＨ）に従って処理し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータをグラフ化した。
【０１６５】
結果
【０１６６】
ＥＢＶは、このウイルスに対するヒトＴ細胞応答ならびにその溶解及び潜伏の生活環の間に発現する遺伝子及びタンパク質が特性決定されているため、Ｔ細胞増大プラットフォームのモデルとして選択した。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、９５％を超えるヒト成人集団において生涯にわたる潜伏型感染を確立するガンマヘルペスウイルスである。図５ａに示されている潜伏パターン２は、いくつかのＥＢＶ関連がんで発現する。ほぼ全ての上咽頭癌（ＩＩ型潜伏）において、ＬＭＰ１及びＬＭＰ２ならびにＥＢＮＡ１が発現する。さらに、ＥＢＶに関連するがんからのＰＢＭＣについてスクリーニングすると、非ホジキンリンパ腫の１０〜２０％、ホジキンリンパ腫の３０〜５０％、及び胃癌の１０％がＥＢＥＲ＋（ＥＢＶコードＲＮＡ）であり、これらは２型潜伏抗原のＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、及びＬＭＰ２を発現させるはずである。
【０１６７】
１６名の正常で健康なドナーからの凍結ＰＢＭＣにおいて、ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポットアッセイ）により、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）をスクリーニングした。およそ５００，０００個の刺激されていないＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌのＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１  ｐｅｐｍｉｘならびにＤＭＳＯ陰性対照及びＰＨＡ陽性対照を用いて、三重反復でプレーティングした。抗原特異的スポットの数を、ＤＭＳＯ単体のバックグラウンド数により分割して、各抗原に応答した総Ｔ細胞の相対頻度を決定した。試験を行った１６名の正常なドナーのうち、１６名中５名がＬＭＰ１に応答し、１６名中１０名がＬＭＰ２に応答し、１６名中１４名がＥＢＮＡ１に応答した。１６名の元のドナーのうち、５名からのＰＢＭＣは、３つの抗原全てに応答するＴ細胞を有し、これらを、スモールスケール培養条件のセットアップ及び最適化を行うための出発材料の供給源として選択した。図５ｂ。
【０１６８】
ＬＭＰ２ペプチドエピトープマッピング：応答を１つのペプチドに制限したＬＭＰ２マトリックスペプチド混合物に応答するドナーをスクリーニングすることにより、ＬＭＰ２  ｐｅｐｍｉｘ応答をさらに精緻化した。図５ｃ及び５ｄは、ＬＭＰ２マトリックスプールに配置された個別のペプチド、マトリックスプール（１〜２３）に対する各正常なドナーのＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答、ならびに、ドナーに対し特異的な特定のクラスＩ  ＨＬＡ分子に結合するはずである個別のＬＭＰ２ペプチド及び最小限のペプチド配列のマトリックス選択を介した同定を収載している。
【０１６９】
ＬＭＰ２サブドミナントエピトープマッピング：ドナーＨＨＵ２０１３０４２３からのＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより、刺激されていないＰＢＭＣから潜在的なＴ細胞ドミナント及びサブドミナントペプチドエピトープの存在が実証された。ドミナントＬＭＰ２ペプチド５０は、マトリックスプール６及び１６で共有されることにより同定された。ペプチド１１２（マトリックスプール２及び２２）ならびに６９（マトリックスプール３及び１８）に対するサブドミナントまたはより低い応答も同定された。このドナーは、同じＬＭＰ２分子内の３つの異なるペプチドエピトープを認識し、供血の時に１つのドミナントペプチド及び２つのサブドミナントペプチドの応答を伴うものとして同定された。図５ｅ。
【０１７０】
実施例２  Ｔ細胞培養条件
【０１７１】
実験手順
【０１７２】
サイトカイン：Ｔ細胞増大で使用するためのＧＭＰグレードサイトカインをＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入し、ストック溶液を無菌ｄＨ２０中２５ｕｇ／ｍｌにて調製し、摂氏−７０度にて保管した。サイトカインは、ヒトＩＬ−２は１００ＩＵ／ｍｌ最終濃度、ＩＬ−７及びＩＬ−１５については１０ｎｇ／ｍｌにて使用した。
【０１７３】
凍結ＰＢＭＣを、延長培養中に１ｕｇ／ｍｌのＰｅｐｍｉｘで刺激し、または２時間のバルス中に３ｕｇ／ｍｌで刺激し、次にプールした。１ｕｇ／ｍｌのＰｅｐｍｉｘ培養でのＤＭＳＯ濃度は０．４％であり、細胞傷害性は観察されなかった。３ｕｇ／ｍｌのＰｅｐｍｉｘでパルスされたＰＢＭＣはインキュベート中に１．２％のＤＭＳＯ濃度を有し、これを延長細胞培養の前に洗い流した。フローサイトメトリーを、Ｔ細胞増大の０、７、１４、２１、及びまたは２８日目からのアリコートに対し実施した。０日目の凍結ＰＢＭＣ試料の抗体に染色して、出発細胞集団を特性決定した：生／死、総Ｔ細胞に対し抗ＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ４サブセット、単球に対しＣＤ１４／ＣＤ４、ＮＫ細胞に対しＣＤ５６、ならびにＢ細胞に対しＣＤ１９。７日目に、培養物において、生／死、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、五量体（利用可能な場合）、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１９７、ＣＤ１３７、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２９７に加えて、Ｔ細胞活性化／成熟のマーカーを染色した。１４、２１、及びまたは２８日目に、細胞において、ｐｅｐｍｉｘに対する細胞内サイトカイン応答を試験する。ＩＣＳ染色カクテルは、生／死、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１０７ａ、ＴＮＦａ、ＩＦＮｇ、及びＩＬ−２から構成される。メモリーＴ細胞マーカーは、２１日目または２８日目に培養物上で評価する。メモリーＴ細胞染色カクテルは、生／死、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１９７、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１８３、ＣＤ９５、及びＣＤ６２Ｌから構成される。
【０１７４】
細胞内サイトカイン染色：ＣＤ１０７ａ及びサイトカイン（ＴＮＦａ、ＩＦＮｇ、ＩＬ−２）が、１０％のヒトＡＢ血清、１％のＧｌｕｔａｍａｘ、及び２ｕｇ／ｍｌのＰｅｐｍｉｘまたは対照としてのＤＭＳＯを含む１００ｕｌの培地中の１０〜１００万個の細胞を刺激する。１００ｕｌの培地に抗ＣＤ１０７ａ及び２ｕｌ／ｍｌのＧｏｌｇｉＳｔｏｐを添加する。細胞を摂氏３７度にて５時間インキュベートする。沈降させてペレット状細胞にし、上清を除去し、表面抗体で染色する。細胞を１００ｕｌの２％ホルムアルデヒドに再懸濁させ、摂氏４度にて終夜放置する（ホイルで覆う）。翌日、細胞をＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｅｒｍ  Ｗａｓｈ緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で２〜３回洗浄する。サイトカインに対する所望の細胞内抗体で染色し、Ｐｅｒｍ  Ｗａｓｈ緩衝液で希釈し、暗中摂氏４度にて３０分インキュベートする。Ｐｅｒｍ  Ｗａｓｈ緩衝液中で２〜３回洗浄する。細胞を１００ｕｌの２％ホルムアルデヒドに再懸濁させてから、フローサイトメーターに試料を流し、または暗中摂氏４度にて保管する。
【０１７５】
結果：
【０１７６】
ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ１  ｐｅｐｍｉｘを用いてスモールスケールで培養した６名の正常なドナー（図６ａ）及び別の２名の正常なドナー（図６ｂ）からのＰＢＭＣの評価からは、３つのサイトカインカクテル（ＫＩ：１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５／ＩＬ−２１；１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ７／１５；１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５単体）間で実質的な優位性が実証されなかった（図６ａ）。第２のサイトカイン評価研究（図６ｂ）は、３つ全てのｐｅｐｍｉｘを含む場合（合計３７４のペプチド）と個別のｐｅｐｍｉｘの場合（ＬＭＰ１  ９４ペプチド；ＬＭＰ２  １２２ペプチド；ＥＢＮＡ１  １５８ペプチド）とのＴ細胞応答における相違も評価した。図６ｂの矢印は、３つのｐｅｐｍｉｘは全て、両方のＰＢＭＣドナーに対する刺激に使用するとＥＢＮＡ１に対する応答を阻害することを示している。ＬＭＰ２に対する応答は、両方のドナーにおいてより低いが、活性の低下はＥＢＮＡ１反応性で見られたものほど厳しいものではない。ＥＢＮＡ１を刺激するエピトープ（複数可）は、ＬＭＰ１及びまたはＬＭＰ２  ｐｅｐｍｉｘにおけるペプチドと競合しやすい。この結果は、ＰＢＭＣを次にパルスするためにｐｅｐｍｉｘを個々に使用し、ペプチドを除去し、各抗原刺激のためにＰＢＭＣを合わせるＴ細胞増大プロトコルの変更を導いた。
【０１７７】
図６ｃ及び６ｄは、ＬＭＰ２  ｐｅｐｍｉｘのみで刺激されたドナー１０９のＰＢＭＣの結果を示している。１１日目に、Ｔ細胞培養物の７９．０％が五量体Ｂ４０：０１−ＩＥＤＰＰＦＮＳＬに認識され、同様の抗原特異的反応性がＣＤ１０７ａ、ＴＮＦａ、及びＩＦＮｇ発現の増加により検出された。高い抗原反応性に加えて、図６ｄは、ＬＭＰ２  ｐｅｐｍｉｘで刺激されたドナー１０９のＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ＣＤ４５ＲＡナイーブ細胞からＣＤ４５ＲＯエフェクターメモリーＴ細胞に表現型を転換することを示している。もう１つのメモリーマーカーＣＤ６２Ｌ、ならびに活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ１３７は、７〜１１日目の間の培養で明らかに上方制御されている。図６ｅ及び６ｆは、ｐｅｐｍｉｘで個々に刺激した場合のドナー４２３及び９１５における全体的な応答を示している。したがってＰＢＭＣは、採取の前に、プロセススケールで個々に刺激され、次にプールされてもよい。ただし、この方法ではバッチサイズが３倍になり、作業負荷及びコストが増加する。さらなる開発については、ＰＢＭＣを複数のｐｅｐｍｉｘで刺激するために「パルス」して次に「プール」する方法が選択された。
【０１７８】
実施例３  非ホジキンリンパ腫臨床試料のＴダイレクトスモールスケール増大。
【０１７９】
実験手順：
【０１８０】
フローサイトメトリー：標準的なフローサイトメトリー手順に従って、２００，０００個の細胞を抗体パネルで染色した。
【０１８１】
ＰＢＭＣパネル：生／死、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ５６、ＣＤ１９。
【０１８２】
細胞内サイトカイン発現：生／死、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１０７ａ、ＴＮＦａ、ＩＦＮｇ、ＩＬ−２。
【０１８３】
Ｔ細胞活性化パネル：抗原特異的五量体、生／死染色、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１９７、及びＣＤ２７９。
【０１８４】
Ｔ細胞メモリーパネル：生／死、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１９７、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１８３、ＣＤ９５、及びＣＤ６２Ｌ。
【０１８５】
スモールスケール増大プロトコル：０日目に、２つのバイアルのＮＨＬ凍結ＰＢＭＣ（ＨｅｍａＣａｒｅ、ドナーＮＨＬ  １４１０３８１５）を、ＣＴＬ抗凝集溶液を用いて、製造業者のプロトコルに従って解凍した。細胞を洗浄し、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）＋１０％のヒトＡＢ血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）＋１％のＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させ、計数ならびにＰＢＭＣ及びＴ細胞活性化パネルを用いたＦＡＣＳ解析のためにアリコートを取り出した。およそ２００万個のＰＢＭＣを、３μｇ／ｍＬのＬＭＰ１、ＬＭＰ２、またはＥＢＮＡ１  Ｐｅｐｍｉｘで、３７Ｃにて２時間パルスした。インキュベート時間の後、細胞を洗浄し、再懸濁させ、次に２ｍｌの総体積についてプールし、ＧＲＥＸ  ２４ウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）の１ウェルに移した。サイトカインを、２８日の培養のために、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７／ＩＬ−１５または１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５／２１（ＫＩサイトカイン）に添加した。７日目に、細胞を再懸濁させ、計数し、Ｔ細胞パネル（生／死、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、五量体（利用可能な場合）、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１９７、ＣＤ１３７、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２９７）を用いて活性化マーカーについて染色した。培養物を、新たな凍結ＰＢＭＣを用いて０日目の刺激プロトコルを繰り返すことにより再刺激し、次に７日目の培養物と合わせた（合計４ｍｌ）。培養物に、２〜３日ごとにサイトカインを含有する新鮮培地を供給した。
【０１８６】
１４日目に、培養物を、各培養物のアリコートを（ｉ）ＤＭＳＯ、（ｉｉ）ＬＭＰ１  Ｐｅｐｍｉｘ、（ｉｉｉ）ＬＭＰ２  Ｐｅｐｍｉｘ、または（ｉｖ）ＥＢＮＡ１  Ｐｅｐｍｉｘで再刺激することにより、細胞内サイトカイン染色により解析した。残りの１４日目の培養物（約６ｍＬ）は、２４ウェルプレートからＧＲｅｘ−１０またはＧＲｅｘ  ６ウェルプレートに移す。細胞培養物に、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含有する５ｍｌのサイトカイン培地を供給し、次に２５０μＬ（２５μｌ／ｍｌ）のＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ  ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ヒトＴ細胞活性化物質（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。１５日目と１８日目に、細胞培養物にサイトカイン培地を供給した。２１日目に、試料において、細胞内サイトカイン発現を再試験した。２８日目は培養の最終日であり、試料において、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞活性化パネル、Ｔ細胞メモリーパネル、及び細胞内サイトカイン発現を試験した。残りの試料を採取し、凍結保存した。
【０１８７】
結果：
【０１８８】
ＮＨＬ試料のＨｅｍａＣａｒｅ、ドナーＮＨＬ  １４１０３８１５を、２つの異なるサイトカインカクテル（１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７／ＩＬ−１５または１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５／２１（ＫＩサイトカイン））を用いて、ポリクローナルＴ細胞活性物質ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ  ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２のありまたはなしで、合計２８日間培養した。２８日目の採取時における細胞の状態を評価したところ、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ポリクローナル刺激と組み合わせたＩＬ７／１５サイトカインカクテルは最良のプロファイル：＞９７％のＣＤ３＋（図７ａ）で細胞を生成し、刺激に応答してＣＤ１０７ａ発現を増加させた（ＬＭＰ１：１０．７％、ＬＭＰ２：１．４２％、ＥＢＮＡ１：０．７７％、ＤＭＳＯ：０．４９％）。図７ｂ。ＩＬ−７／１５サイトカイン対ＫＩサイトカイン、そしてＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ポリクローナル刺激の添加からは、明確な成長の優位性が観察されなかった。しかし、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ポリクローナル刺激再導入の追加的な利益が２８日目のメモリー染色において見られ、潜在的メモリー細胞のパーセンテージは、ＣＤ１９７及び他のマーカーの発現により測定されたように、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２の存在下で増加した。図７ｃ。
【０１８９】
ステージ１濾胞性リンパ腫を有する患者からのもう１つのＮＨＬ試料を、同じＩＬ−７／１５及びＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ  ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ポリクローナル刺激を用いて合計２８日間培養した。図７ｄは、このプロトコルが、ＬＭＰ１（７．９１％）、ＬＭＰ２（２６．０％）、及びＥＢＮＡ１（５．０９）と首尾よく特異的Ｔ細胞を増大させることを示した（ＤＭＳＯ対照０．９１％）。サブドミナント潜伏型抗原ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、及びＥＢＮＡ１に特異的なＴ細胞は、樹状細胞を用いた刺激の必要なく、ＰＢＭＣから直接増大することができる。このプロセスの利点は、樹状細胞及びウイルスが最大限にＴ細胞を刺激する必要がないことであり、また多数のＴ細胞の製造（＞１０億個）に対し線形的にスケーラブルであるはずである。
【０１９０】
実施例４  正常なドナーのＰＢＭＣのＴダイレクトプロセススケール増大
【０１９１】
実験手順：
【０１９２】
Ｔダイレクト生産スケールプロトコル（収量＞２０億個の細胞）：ｐｅｐｍｉｘを１００μｌのＣｒｙｏＭＡＣＳ  ＧＭＰグレードＤＭＳＯ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に溶解し、完全に溶解させた（目視）。凍結保存されたＰＢＭＣをＣＴＬ抗凝集溶液を用いて解凍し、血清フリーＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した。細胞を、生産培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ  ＧＭＰ  ＤＣ培地、１０％のＡｃｃｅｓｓ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓヒトＡＢ血清、１％のＧｌｕｔａｍａｘ）中１，０００万個／ｍｌにて再懸濁させた。６００〜１，０００万個のＰＢＭＣを、生産培地中１〜５ｕｇ／ｍｌにおけるそれぞれのｐｅｐｍｉｘを用いて、３７℃にて２時間刺激した。インキュベート後、細胞を洗浄し、各ｐｅｐｍｉｘで刺激された培養物を新たな生産培地に再懸濁させ、次に１５ｍｌの総体積に合わせ、ＧＲＥＸ１０培養容器に移した。ＩＬ−７及びＩＬ−１５サイトカインを添加して、１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度にした。
【０１９３】
培養下で７日後、細胞を計数し、Ｔ細胞活性化パネル（抗原特異的五量体、生／死染色、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１９７、及びＣＤ２７９）を用いて、フローサイトメトリーにより免疫表現型を決定した。細胞において、生／死、ＣＤ３＋、及びＣＤ１３７＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞のパーセンテージをゲーティングし、抗原応答の代理マーカーとして評価した。０日目の刺激プロトコルを同じドナーのＰＢＭＣ（１５ｍｌ）を用いて繰り返し、７日目の培養物に、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７及びＩＬ−１５を追加した生産培地中３０ｍｌの最終体積について添加した。培地を、培養物の目視に基づいて２〜３日ごとに変えた。
【０１９４】
疎水性ペプチド配列は凝集して結晶を形成することが多く、細胞培養物のフィコール・ハイパック勾配における遠心分離により、または細胞濾過フィルターにより、１４日目より前に除去されるべきである。代替的に、ｐｅｐｍｉｘを希釈して生産培地中で適切な濃度にし、０．２２ミクロンの無菌フィルターに通して不溶性のペプチド結晶の大部分を除去した。
【０１９５】
１４日目に、培養物において、細胞表面活性化マーカーのＣＤ１０７ａ、ＴＮＦａ、ＩＦＮｇ、及びＩＬ−２向けの細胞内サイトカイン染色により、抗原特異的反応性を試験した。細胞を再懸濁させて１００万細胞／ｍｌ（典型的には、この段階において１億個の細胞）の濃度にし、ＧＲＥＸ１００Ｍ（１リットル容量）に移し、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２  ＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔヒトＴ細胞活性化物質（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で刺激した。１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む新たな生産培地を２〜３日ごとに添加した。２８日目に細胞を採取し、ＣＤ３細胞の％（＞７０％）及び無菌性について出荷試験を実施した。採取した材料をＣｒｙｏＳｔｏｒ  １０に再懸濁させ、５０ｍｌのバッグ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）または低温バイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で凍結させた。
【０１９６】
細胞傷害性アッセイ：ＬＤＨ細胞傷害性検出キット。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）において、ＰＨＡ培養の最後の２４時間の間にＤＭＳＯまたは特異的なｐｅｐｍｉｘでパルスされた自己Ｔ細胞芽細胞に対する特異的細胞傷害性を試験した。抗原特異的なＴ細胞エフェクター細胞における細胞媒介の細胞傷害性を、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号ＭＫ４０１）を用いて測定した。自己ＰＢＭＣをＰＨＡで刺激して、Ｔ細胞芽細胞を生成した。Ｔ細胞芽細胞を、ＤＭＳＯまたは特異的なｐｅｐｍｉｘで終夜パルスし、採取し、死細胞を除去し（ＣｌｉｏＣｅｌｌ磁気ビーズ）、血清フリー培地にウェル当たり１０，０００細胞にてプレーティングした。２１日目または２８日目の産物からのエフェクターを採取し、フローサイトメトリーにより抗原反応性の特性決定を行い（細胞内サイトカイン染色）、次に標的のアッセイの準備ができるまで凍結した。アッセイは、エフェクター細胞の数に応じて５：１〜２０：１の範囲のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でセットアップした。アッセイを６時間インキュベートし、上清を採取し、キットプロトコルを用いてＬＤＨ酵素活性の増加を測定した。
【０１９７】
結果：
【０１９８】
正常で健康なドナーのＰＢＭＣからのＴ細胞増大を、プロセススケールと考えられるスケールで実施した。図２は、当該プロセスの重要なステップの概要を説明する概略図である。多数のＥＢＶ特異的Ｔ細胞を増大させるための過去の方法と比較すると、本明細書に記載の方法は単純明快であり、なおかつ有効である。２８日目の採取における細胞数収量は、２０億個を上回る生細胞で、ＣＤ３の％は＞９５％であった。産物は主としてＣＤ８＋（６３％）であり、総ＣＤ３集団の１２．５％がＣＣＲ７を発現し、ＣＤ３細胞の過半数がケモカイン輸送受容体ＣＸＣＲ３を発現した。図８ａ。２８日後、Ｔ細胞はＣＤ１０７ａを上方制御し、３つのｐｅｐｍｉｘ抗原全てに応答してＴＮＦａ、ＩＦＮｇ、及びＩＬ２を産生した（図８ｂ）。図８ｃは、損傷細胞からのＬＤＨを測定する非放射性細胞障害アッセイを用いて、２０：１、１０：１、及び５：１のエフェクター：標的比におけるドナー１０９  Ｔ細胞増大産物による、標的（ＬＭＰ２またはＥＢＮＡ１  ｐｅｐｍｉｘで装填されたＴ細胞芽細胞）に対する用量依存性選択的殺滅を示している。
【０１９９】
実施例５  Ｔセレクトプロセス
【０２００】
実験手順：
【０２０１】
Ｔセレクトプロセスは、既知の抗原（ウイルスタンパク質、過剰発現した細胞タンパク質、変異した細胞タンパク質、ペプチド）で刺激されたＴ増大培養物からの低存在量のＴ細胞の無菌細胞選別を伴う。Ｔ細胞を刺激する方法は、細胞が７日目から１１日目の間に活性化（ＣＤ１３７及びＣＤ２５）について選別され、サイトカインを含有する培地を用いた培養に戻すことを除いて、実施例３に示される増大プロセスと同一である。抗原反応性（抗原に対する細胞内サイトカイン応答により判定）が、細胞選別及び培養の後に依然５％を下回る場合、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２  ＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔヒトＴ細胞活性化物質試薬を使用する。
【０２０２】
活性化されたＰＢＭＣを選択されたｐｅｐｍｉｘで刺激し、ＣＤ１３７＋ＣＤ２５＋ＣＤ８  Ｔ細胞のレベルを特性決定し、次にＭａｃｓＱｕａｎｔ  Ｔｙｔｏ選別機（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）上で選別し、ＩＬ７／１５含有培地を用いた培養に戻した。細胞を、実施例４に記載の手順により特異的なｐｅｐｍｉｘで装填された自己Ｔ細胞芽細胞を殺滅するためのエフェクターとして使用した。
【０２０３】
結果：
【０２０４】
Ｇｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．は、黒色腫患者の血液からの直接的ながんネオ抗原特異的Ｔ細胞の希少集団のキャプチャーを報告した（Ｇｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：２２，４３３−４３８，２０１６）。ＰＤ−１の発現は、末梢血における多様で患者特異的な抗腫瘍Ｔ細胞応答を同定した。ＰＤ−１に加えて、活性化または疲弊したＴ細胞の他のマーカーも、培養下で７日後に抗原特異的細胞の単離に使用することができた（図９ｅを参照）。７日目の増大されたＰＢＭＣにおいて、ＣＤ１３７及びＣＤ２５を発現するＴ細胞の発現を評価した（図９ｄ）。ＣＤ３＋ＣＤ１３７＋ＣＤ２５＋集団を選別に使用し、前駆体頻度が極端に低い抗原反応Ｔ細胞について豊富化することができた。さらに、活性化マーカーの細胞選別による単離は、活性化Ｔ細胞のパーセンテージが７日目に５％を下回る場合、Ｔダイレクトの改善に適用することができた。７日目に、以下の個別の抗体または抗体の組合せを含むＴ細胞活性化パネルを用いて、細胞培養物を染色することになる：ＣＤ６９、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ２７（ＩＬ−７Ｒａ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ３６６（ＴＩＭ３）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒａ）、ＣＤ８０、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２８、ＣＤ２７８（ＩＯＳ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４５ＲＯ。
【０２０５】
ドナー１０９のＴ細胞において、６日目及び８日目におけるＣＤ１３７発現及びＬＭＰ２特異的五量体染色を評価した。五量体陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージは、ＣＤ１３７＋ＣＤ２５＋についてゲーティングされた細胞と同様である。ＣＤ１３７＋ＣＤ２５＋マーカーは抗原活性化Ｔ細胞集団を示し、このマーカーは、Ｔ細胞培養物からまたは直接患者血液からの抗原特異的Ｔ細胞の単離に使用することができる。ドナー１０９の７日目の培養物をＴｙｔｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）上で選別し、当該材料は＞９０％の純度、良好な生存能、回収率、及び選別後の形態を示した（図９ｆ及び９ｇ）。選別された細胞は、ＩＬ７／１５サイトカインを含有する培地中で増大され、標的としてのペプチド装填Ｔ細胞芽細胞に対する選択的な細胞傷害性を示した（図９ｈ）。
【０２０６】
ステージＩＶ神経膠芽細胞腫及び膵臓癌のＰＢＭＣ：ＰＢＭＣを、スモールスケールで、ＫＩサイトカインカクテル（１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５／ＩＬ２１）ならびにＣＭＶｐｐ６５、ＮＹＥＳＯ−１、及びサバイビン向けの個別のｐｅｐｍｉｘを用いて培養した。抗原活性化Ｔ細胞の存在を、フローサイトメトリーを用いてＣＤ１３７＋ＣＤ２５＋ＣＤ８  Ｔ細胞の検出により評価した。ＣＭＶｐｐ６５特異的Ｔ細胞は、両方のドナーにおいて優勢であった。ＧＢＭの１４日目の培養物において、細胞内サイトカイン染色によりＴＮＦａ産生量を解析し、細胞腫瘍抗原のＮＹＥＳＯ−１及びサバイビンに対する応答はバックグラウンドを３．６倍上回るに過ぎなかった。ＮＹＥＳＯ−１及びサバイビンの集団は、膵臓がんの１４日目の培養物のバックグラウンドを７〜９倍上回った。
【０２０７】
実施例６  Ｔ細胞の選択及び増大プロトコルで使用するためのネオ抗原の同定及び選択。
【０２０８】
以下の実施例は、神経膠芽細胞腫及び他のがんに対し反応性である抗原限定のＴ細胞集団の生成に使用するための、ネオ抗原の選択について記載する。当該実施例は、神経膠芽細胞腫を標的化する免疫療法向けの腫瘍関連抗原の発現解析と、ネオ抗原特異的ペプチドを選択するためのゲノミクス及び腫瘍進化の使用とについて詳述する。本明細書では、個人的なネオ抗原（各患者に特異的）と、共有されたネオ抗原（すなわち、２名以上の患者からの腫瘍において、及び２つ以上の腫瘍タイプにおいて変異する遺伝子）との両方を例示する。そのため、ゲノミクス／腫瘍進化／バイオインフォマティクスを用いての、神経膠芽細胞腫における腫瘍関連抗原の検証は例示的なものであり、発明者らは他のがんにおいても同じアプローチを使用している。
【０２０９】
このような変異は、当該腫瘍にのみ特異的な発現タンパク質内の変異スポットにおける点変異または組換えであり、好ましくは原発及び再発（局所性及び／または転移性）内で共有された変異であり、より好ましくは当該腫瘍内の全て／ほとんどのがん細胞におけるものである。ゲノミクスアプローチにより選択されるこのようなペプチドは、個別に選び出し、（正味ＭＨＣまたはＭＨＣ結合及び／またはＴ細胞アッセイを用いて）結合についてさらに試験する必要があり得る。最も好ましくは、使用されるネオ抗原が、当該変異体に反応性であるが標的患者内の通常の（野生型）タンパク質には反応性ではないＴ細胞のみを増大させることを実証したい。
【０２１０】
本明細書におけるネオ抗原は、腫瘍のタイプ（例えば、神経膠腫または神経膠芽細胞腫）を代表する候補抗原のパネル、そしてｐａｎ−ｃａｎｃｅｒパネルさえも提供する。このようなパネルが血液からのこのような変異のシークエンシング及び同定によりアラインメントされ得る程度において、血漿中の循環ＤＮＡのシークエンシングを用いて血液中の抗原を同定し、次に同じ患者からの血液からのＰＢＭＣからＴ細胞を成長させることができる。
【０２１１】
この実施例のためのある特定のデータは、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｒｏｊｅｃｔ（Ｃｅｌｌ  ２０１３  Ｏｃｔ  １０；１５５（２）：４６２−７７で発表）（参照により本明細書に組み込まれる）に由来する。この研究は５８０名の患者からのゲノムデータを提供した。次世代シークエンシングは２９１サンプルにおいて行われた。
【０２１２】
第１のステップは、数名の患者において反復的に変異する遺伝子を抽出することである。予想以上に変異している腫瘍において役割を有する遺伝子（ドライバー遺伝子）は、ＭｕｔＳｉｇ（Ｂｒｏａｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ４９９，２１４−２１８（２０１３））、ＭｕｔＣｏｍｆｏｃａｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１３）を含めたいくつかのツールを用いて見いだすことができる。標準的なＭｕｔｓｉｇ解析を上記のコホートで用いて、１１の遺伝子を同定した（ＰＩＫ３Ｒ１  ＰＴＥＮ  ＴＰ５３  ＥＧＦＲ  ＩＤＨ１  ＢＲＡＦ  ＰＩＫ３ＣＡ  ＲＢ１  ＮＦ１  ＰＤＧＦＲＡ  ＬＺＴＲ１）。これらの遺伝子における点変異はＧＢＭ事例の７０％で生じる。図１０及び下の表を参照。
【０２１３】
【表２】
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【０２１４】
図１０は変異頻度を示している。各カラムは１人の患者である。２番目のカラムは、全ＧＢＭ患者における変異の頻度である。例えば、１番目の患者は、ＰＩＫ３Ｒ、ＰＴＥＮ、ｐ５３、及びＲＢにおいて変異を有する。これらの変異は独立しておらず、１人の患者がこれらの遺伝子にいくつかの改変を有する可能性は考えられる。このような関連性は、これらの遺伝子の一部において統計的に妥当である。発現タンパク質のみが抗原をもたらすことができたため、この変異解析は、発現タンパク質をもたらす点変異に対象を絞る。例えば、Ｐ５３、ＩＤＨ１、ならびに一緒に変異しているＡＴＲＸ及びＣＤＫ２ａの間には関連性がある。しかし、ＡＴＲＸ及びＣＤＫ２ａは変異欠失であるため、発明者らの解析には含めない。しかし、上記の対は発現した点変異であり、相互関連により、両方のネオ抗原は、同じ腫瘍内でＴダイレクトまたはＴセレクトを用いて直ちに標的化され得る。融合タンパク質も標的となり得る。標的として存在する１つの有用な融合タンパク質は、ＥＧＦＲ／ＴＡＣ−３（ＮＫＢ）である。この変異は常に同じところで起こり、神経膠芽細胞腫の３〜５％に存在する組換えホットスポットであり、早期現象ドライバー現象（ｅａｒｌｙ  ｅｖｅｎｔ−ｄｒｉｖｅｒ  ｅｖｅｎｔ）と思われる（腫瘍全体に拡散）。ＥＧＦＲ／ＣＥＰ１４のような他の融合は腫瘍の８％に高発現するが、後期現象及びサブクローナルであるため、最適な標的ではない。
【０２１５】
次に、発症患者における変異がどのように選択遺伝子に分布しているかを調べる。図１１のＢＲＡＦを参照すると、顕著で集中的なホットスポットがあることから、良好な予備ネオ抗原候補標的となる。しかし、これは神経膠腫患者のごく一部（成人神経膠腫の＜２％）にしか存在しない。しかし、存在する場合は極めて保存的な標的をもたらす。同様に、黒色腫の大部分（４０〜５０％）はＢＲＡＦ変異を示し、白血病（例えば、４０％の毛様細胞白血病）もＢＲＡＦ変異を有する。また、この変異は、結腸直腸癌（１０％のＢＲＡＦ変異）、肺及び乳頭様甲状腺癌にも存在し、ある特定の脳腫瘍もこれを有する（毛様細胞性星状細胞腫の１０〜１５％、小児びまん性浸潤性神経膠腫、未分化星状細胞腫、及び神経膠芽細胞腫の５〜１０％、ならびに神経節膠腫の３０％〜６０％）。
【０２１６】
図１１はネオ抗原候補ＥＧＦＲも示している。２８９のホットスポットが散在する変異がこれを有用な標的としている。図１１は、ネオ抗原ＩＤＨ１が発明者らのＴ細胞療法に最適な標的であることも示している。ＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｇ／Ｈは常に同じ（極めて保存的なホットスポット）であり、ファウンダー現象であるため、原発及び再発ならびに本幹−全分岐の初期で見られる。この変異は、神経膠芽細胞腫の５〜１０％及び低グレード神経膠腫の７０％で見られる。また、ＡＭＬ、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、及び急性ＰＭＬ、ならびに前悪性への移行に関連することがある一部の脊髄形成異常症（ＭＤＳ）でも見られる。低グレード神経膠腫及び神経膠芽細胞腫におけるＩＤＨ１変異は、より良好な予後との相互関連がある。図１１は、ＬＺＴＲ１も示している。これは有用なネオ抗原であり、標的化された変異はペプチドの複数の領域を代表し、重複または連続する断片はＴ細胞をプライミングするために使用される。逆に、ネオ抗原ＮＦＩについては、変異の多くが切断タンパク質に寄与するため、Ｔ細胞応答の生成に有用な抗原ではない。図１１を参照。ネオ抗原ＰＤＧＦＲＡは全体にわたり変異を有する。図１１を参照。Ｅ２２９Ｋは有用な標的であり、患者の約２％に存在する。図１１の対応するパネルに示されているように、ＰＩＫ３ＣＡは標的化に良好なネオ抗原である。Ｅ５４５  Ａ／Ｋは、神経膠腫及び神経膠芽細胞腫患者の５％に存在するホットスポットである。図１１は、ＰＩＫ３Ｒ１がＧ３７６Ｒホットスポットに基づいて良好なネオ抗原標的であることも示しており、Ｇ３７６Ｒは患者の約４％に存在する。図１１はネオ抗原ＰＴＥＮも示している。ＰＴＥＮは、その長さによる高頻度の変異を有するが、ストップコドンを創出する不活性化変異を多く示している。そのため、当該抗原が一般的であり、同様に変異している他のネオ抗原遺伝子との相互関連がある一方、他のネオ抗原ほどＴ細胞応答の創出に有用というわけではない。同様に、図１１が示すＲＢ１は古典的な腫瘍サプレッサーであるが、その変異は不活性化的（切断的）であるため、ネオ抗原ほど極めて有用というわけではない。図１１はネオ抗原ＴＰ５３を示している。ＴＰ５３は、多くの形態のがんで変異している。Ｒ２８２ＷならびにＲ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｌ／Ｗ、及び他の３つのような複数のホットスポットがこれを有用なネオ抗原にしている。
【０２１７】
次に、上記の遺伝子内で変異ホットスポットを選択する。一部はストップコドンを含有するため、全てのホットスポットが以下に報告されているわけではない。発明者らは、合計１７のアミノ酸変化を伴う８つのネオ抗原ホットスポットを選択した：ＢＲＡＦ：Ｖ６００Ｅ；ＥＧＦＲ：Ａ２８９Ｉ  Ａ２８９Ｎ  Ａ２８９Ｔ  Ａ２８９Ｖ；ＩＤＨ１：Ｒ１３２Ｇ  Ｒ１３２Ｈ；ＮＦ１：Ｌ８４４Ｆ  Ｌ８４４Ｐ；ＰＤＧＦＲＡ：Ｅ２２９Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ：Ｅ５４５Ａ  Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３Ｒ１：Ｇ３７６Ｒ；ＴＰ５３：Ｒ１７５Ｈ  Ｒ２４８Ｌ  Ｒ２４８Ｗ  Ｒ２８２Ｗ。選択されたネオ抗原及び変異ホットスポットは、コホートにおける２９１名中５８名（２０％）の神経膠芽細胞腫患者を網羅しており、少なくとも１つは患者のＭＨＣに結合するが、野生型タンパク質と交差反応するＴ細胞を生成しない。一部の患者は、２つ以上の変異を有する（例えば、１名の患者がＩＤＨ１及びＥＧＦＲの両方の変異を有する）。組換えペプチドＥＧＦＲ／ＴＡＣ−３（ＮＫＢ）もこの点変異のパネルに追加できると思われる。図１２を参照。
【０２１８】
これらの変異を網羅する２５〜３０ｍｅｒのペプチド、及び野生の正常配列を網羅する対応ペプチドセット、すなわち、２つの１７ペプチド混合物を生成し、その一方は変異を代表し、他方は付随する野生型配列を代表する。次に、これらのペプチドを使用して、神経膠芽細胞腫患者の血液中のＰＢＭＣから得られたＴ細胞を増大させる。ＩＣＳインターフェロンガンマ／ＴＮＦもしくはＣＤ１０７ａまたは殺滅アッセイは、これらのネオ抗原変異に特異的なＴ細胞が首尾よく増大されたことを示している。上で論じられているように、ＩＤＨ１以外の他の変異は生存期間との相互関連がない。
【０２１９】
好ましいネオ抗原は、選択された改変、すなわち、ファウンダー対後期現象に対する時間経過の安定性、及び発現との関連性を示す。ここで、神経膠芽細胞腫で選択されたホットスポットが、他の神経膠腫及び他の腫瘍タイプにおけるホットスポットと重複するかについて検証する。
【０２２０】
上記の変異の各々につき少なくとも１つのペプチドからなるカクテルは、低グレード神経膠腫の９６％を網羅する（大部分はＩＤＨ１による）。神経膠腫全体の（ｐａｎｇｌｉｏｍａ）データを用いたより包括的なドライバー遺伝子のリストを用いて、より広範なリストが開発され得る。
【０２２１】
他の腫瘍においては、ネオ抗原と関連する変異ホットスポットとの同じ組合せが、ＢＲＡＦにより１００％の毛様細胞白血病、ＢＲＡＦにより４０％の黒色腫、いくつかのホットスポットにより７％の肺扁平上皮癌を網羅した。
【０２２２】
発明者らの方法を用いて、全がんのネオ抗原カクテルを生成することが可能である。これらはホットスポットで生じる反復性の点変異を反映しており、腫瘍進化における早期現象／ファウンダー現象（全ての分岐、原発、再発、転移で共有される）である組換えホットスポットで生じる融合タンパク質は、クローナルではなく、むしろ腫瘍内の全てのがん細胞に存在し、高発現されるものである。
【０２２３】
異なる腫瘍にわたってヒトのがんで見られる最も一般的な変異ホットスポットを公開データベースで検索し、４１のがんタイプにおいて、１００の最も一般的に変異したホットスポットの存在を解析した（図１３を参照）。これらのホットスポットを使用して、患者間で共有され、原発、再発、及び転移または血液中の循環腫瘍ＤＮＡの間で系統発生的に保存されている、ネオ抗原の新たなパネルを創出する。この事前合成されたネオ抗原ペプチドのパネルを用いてＴダイレクト増大を実施して、ネオ抗原特異的Ｔ細胞を増大させる（４週間）。これは、ヒトのがんで見られる最も一般的な変異ホットスポットの解析である。これらの変異ホットスポットは、異なる腫瘍にわたってみられる。詳細には、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３４，１５５−１６３（２０１６）内の論文（参照により本明細書に組み込まれる）は、４１のがんタイプにわたる１１，１１９のヒトの腫瘍における変異ホットスポットを同定し、２７５の遺伝子において４７０の体細胞置換ホットスポットを同定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ−１】
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【図６Ｄ−２】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ−１】
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【図７Ａ−２】
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【図７Ｂ−１】
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【図７Ｂ−２】
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【図７Ｃ−１】
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【図７Ｃ−２】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−１】
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【図８Ｂ−２】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ−１】
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【図９Ｅ−２】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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