(57)【要約】  本発明は、固有のボウタイ状バーコードを核酸のオリガミナノ構造体（図１）に組み込むための方法を提供する。特に、本明細書で提供されるのは、大量生産の次世代シーケンス等を使用して、個々の細胞から核酸の対合と分析を容易にする方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のバーコード化されたポリヌクレオチドを、核酸のオリガミナノ構造体に組み込む方法であって：
（ａ）バーコード核酸の第一鎖の合成又は乳化剤性液滴の増殖を行い、二本鎖のバーコード核酸を生成し、前記バーコード核酸は、目的の遺伝子配列の保存領域に相補的な領域と、核酸のオリガミナノ構造体に相補的な配列により１側面に配置される中央５’−５’ホスホスジエステルリンカーからなる一本鎖５’−５’ボウタイ状のリンカー核酸の１側面に相補的な少なくとも１つのプライミング部位からなり；
（ｂ）前記二本鎖のバーコード核酸と前記５’−５’ボウタイ状のリンカー核酸を、標的核酸を伸長するための試薬からなる油乳化剤の液滴内で混合し；
（ｃ）前記５’−５’ボウタイ状のリンカー核酸上の相補的配列に前記二本鎖のバーコード核酸をアニーリングし、ｓｓＤＮＡのバーコード化された５’−５’ボウタイ状のポリヌクレオチドの伸長を生じるのに十分な前記二本鎖のバーコード核酸と前記５’−５’ボウタイ状のリンカー核酸からなる前記油乳化剤の液滴を熱サイクルにかけ、伸長液滴を生成して；
（ｄ）伸長物を前記伸長液滴から抽出し；
（ｅ）ｓｓＤＮＡのバーコード化された５’−５’ボウタイ状のポリヌクレオチドを前記抽出された伸長物から精製し；
（ｆ）前記精製されたｓｓＤＮＡのバーコード化された５’−５’ボウタイ状のポリヌクレオチドを核酸のオリガミナノ構造体に組み込むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
組み込みは、前記精製されたｓｓＤＮＡのバーコード化された５’−５’ボウタイ状のポリヌクレオチドを、核酸のオリガミナノ構造体にアニーリングすることからなることを特徴とする、請求項１記載の方法。  
【請求項３】
前記核酸のオリガミナノ構造体は、ＤＮＡナノ構造体であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
標的核酸配列を単細胞レベルで検出するための方法であって、
（ａ）請求項１記載の方法にしたがって得られる核酸のオリガミナノ構造体を単細胞から分離される核酸に接触させ、前記ナノ構造体は、標的核酸配列に相補的なバーコード配列を有するｓｓＤＮＡのバーコード化されたポリヌクレオチドからなり；接触は、単細胞中に存在する場合、前記バーコード配列を前記標的核酸配列に結合させるのに適切な条件で起こり、
（ｂ）前記バーコード配列に結合された標的核酸配列を回収し；
（ｃ）前記ｓｓＤＮＡのバーコード化されたポリヌクレオチドを逆転写用の遺伝子特異的プライマーとして使用して、前記回収された標的核酸配列を逆転写して、それによって、標的核酸は、細胞内に存在する場合、単細胞選別工程がなくても検出されることを特徴とする、方法。
【請求項５】
前記核酸のオリガミナノ構造体は、ＤＮＡナノ構造体であることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｂ細胞受容体の配列を単細胞レベルで検出する方法であって、
（ａ）抗原特異的なＢ細胞に免疫グロブリンのＨ鎖（ＩｇＨ）とＬ鎖（ＩｇＬ）のＢＣＲのｍＲＮＡをトランスフェクトし；
（ｂ）１つ以上のｍＲＮＡ捕捉配列からなるＤＮＡオリガミナノ構造体を接触させ、免疫グロブリンのＨ鎖（ＩｇＨ）とＬ鎖（ＩｇＬ）両方のＢＣＲのｍＲＮＡを、トランスフェクトされた抗原特異的なＢ細胞内に捕捉及び保護し；
（ｃ）前記接触されたＤＮＡオリガミナノ構造体を分離し、前記１つ以上のｍＲＮＡの捕捉配列に結合されたＩｇＨとＩｇＬのｍＲＮＡを回収し；
（ｄ）１つ以上のｍＲＮＡ捕捉プローブを逆転写用の遺伝子特異的プライマーとして使用し、前記回収されたＩｇＨとＩｇＬのｍＲＮＡを逆転写して、それによって、標的ＢＣＲ配列は、単細胞選別工程がなくても検出されることを特徴とする、方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡオリガミナノ構造体は、一体型ビオチン標識からなり、前記接触されたナノ構造体の分離は、アビジンカラムによる精製からなることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年８月１９日出願の米国特許第６２／３７７，１２３号の優先権及び利点を主張し、この特許公開文書の開示が、本明細書に引用されることで組み込まれる。
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所が授与したＲ２１  ＣＡ１９６４６０及びＲ２１  ＡＩ１２５８７に基づき、アメリカ合衆国政府の支援により達成された。本発明において、合衆国政府は一定の権利を保有する。
【背景技術】
【０００３】
同義遺伝子配列に対し単細胞分析を要する生物学的問題が数多く存在し、その中には、リンパ球上のクローン性分配型の二量体免疫受容体とポリクローナル腫瘍におけるドライバー／付随的な突然変異の累積の分析等がある。細胞集団が大量に溶解する結果、遺伝子配列が混合し、どの遺伝子配列の対が特定の任意の細胞由来か判断することが不可能となり、大きな細胞集団内にある稀な配列の分析に支障が生じている。現在の単細胞選別技術は、このような問題のいくつかに対処するよう使用可能であるものの、そのような手法は高価で、専用機器を必要とし、大きなサンプルを包括的に分析するために必要な大量生産能力がない。したがって、個々の細胞の遺伝子分析用に改善された方法のための技術的ニーズが存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Arstila, T.P., et al., ヒトαβＴ細胞受容体Ｔの多様性の直接評価. Science, 1999. 286(5441): p. 958-61.
【非特許文献２】Bartok, I., et al ., Ｔ細胞受容体ＣＤＲ３ループがαβ対合に影響する. Mol Immunol, 2010. 47(7-8): p. 1613-8.
【非特許文献３】Corthay, A., K.S. Nandakumar, and R. Holmdahl, ２つの異なるＴ細胞受容体α鎖を持つ末梢Ｔ細胞の割合と自己免疫の潜在的な役割の評価. J Autoimmun, 2001 , 16(4): p. 423-9.
【非特許文献４】Rani, L., et al., 免疫グロブリンのＨ鎖可変領域遺伝子レパートリーと慢性リンパ性白血病に罹患するインド人患者のＢ細胞受容体の定型. Leuk Lymphoma, 2016: p. 1-12.
【非特許文献５】Li, X., ９つのガンタイプにおける臨床病期にわたるドライバー遺伝子の突然変異の動的変化. Cancer Med, 2016.
【非特許文献６】ＮＳＣＬＣで検出される新たなドライバー突然変異. Cancer Discov, 2016.
【非特許文献７】Anoosha, P., et al., ガンにおける上皮成長因子の受容体でのドライバーとパッセンジャー模倣の区別. Mutat Res, 2015. 780: p. 24-34.
【非特許文献８】Bozic, I, et al., 腫瘍進行中のドライバーとパッセンジャー突然変異の蓄積. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(43): p. 18545-50.
【非特許文献９】Busse, C.E., et al., 全長免疫グロブリンのＨ鎖とＬ鎖の遺伝子の単細胞に基づく高生産シーケンス. Eur J Immunol, 2014. 44(2): p. 597-603.
【非特許文献１０】Dash, P., et al., マウスでの単細胞レベルでの対合分析ＴＣＲαとＴＣＲβ鎖の分析. J Clin Invest, 2011. 121(1): p. 288-95.
【非特許文献１１】DeKosky, B. J., et al., 対合されたヒト免疫グロブリンのＨ鎖とＬ鎖のレパートリーの高生産シーケンス. Nat Biotechnol, 2013. 31(2): p. 166-9.
【非特許文献１２】Chen, A.K., et al., 単一の生体細胞中のＲＮＡの高感度検出のためのレシオメトリック二分子ビーコン. Nucleic Acids Res, 2010. 38(14): p. el48.
【非特許文献１３】Tyagi, S. and F.R. Kramer, 分子ビーコン: ハイブリタイゼーション後に蛍光発光するプローブ. Nat Biotechnol, 1996. 14(3): p. 303-8.
【非特許文献１４】Mhlanga, M.M., et al, 生体細胞の細胞質内でｍＲＮＡを画像化するためのｔＲＮＡ連結の分子ビーコン. Nucleic Acids Res, 2005. 33(6): p. 1902-12.
【非特許文献１５】Dittmer, W.U., A. Reuter, and F.C. Simmel, トロンビンを周期的に結合・放出することが可能なＤＮＡに基づく機械. Angew Chem Int Ed Engl, 2004. 43(27): p. 3550-3.
【非特許文献１６】Benenson, Y , et al., 遺伝子発現の論理制御のための自律分子コンピュータ. Nature, 2004. 429(6990): p. 423-9.
【非特許文献１７】Ko, S., et al., 細胞輸送のための組み合わせ手段としてのＤＮＡナノチューブ. Biomacromolecules, 2008. 9(11): p. 3039-43.
【非特許文献１８】Chen, Y.J., et al., 試験管から細胞までのＤＮＡナノテクノロジー. Nat Nanotechnol, 2015. 10(9): p. 748-60.
【非特許文献１９】Zhang, X., et al., 単一の工学ＲＮＡ転写物を画像化し、生体細胞中の遺伝子発現を測定するツールとしてのレシオメトリック二分子ビーコンの定量評価. Nucleic Acids Res, 2013. 41(15): p. el 52.
【非特許文献２０】Kelso, G.F., et al., アデノシン受容体拮抗剤とホスホジエステラーゼ阻害薬のネズミのハイブリドーマ細胞培養液内のモノクルーナル抗体生産への影響. Bioorg Med Chem Lett, 2016. 26(2): p. 540-4.
【非特許文献２１】Frame, K.K. and W.S. Hu, ハイブリドーマ細胞の連続培養における抗体生産性の損失. Biotechnol Bioeng, 1990. 35(5): p. 469-76.
【非特許文献２２】Franek, F. and J. Dolnikova, and monoclonal antibody production in 鉄分の多い、タンパク質のなし培地内のハイブリドーマ成長とモノクローナル抗体の生産: 栄養分濃度の影響. Cytotechnology, 1991. 7(1): p. 33-8,
【非特許文献２３】Han, D., et al., ３次元空間での複雑な湾曲を持つＤＮＡオリガミ. Science, 201 1. 332(6027): p. 342-6,
【非特許文献２４】Ke, Y., et al., ＤＮＡ四面体分子容器の足場付のＤＮＡオリガミ. Nano Lett, 2009. 9(6): p. 2445-7.
【非特許文献２５】Han, D., et al., ４つのアーム接合に基づくＤＮＡ格子ナノ構造体. Science, 2013. 339(6126): p. 1412-5.
【非特許文献２６】Rinker, S., et al., 距離依存の多価のリガンド−タンパク質結合のための自己組織化ＤＮＡナノ構造体. Nat Nanotechnol, 2008. 3(7): p. 418-22.
【非特許文献２７】Sharma, .., et al.. 金ナノ粒子の融合によるＤＮＡ小管の自己組織化の制御. Science, 2009. 323(5910): p. 112-6.
【非特許文献２８】Ke, Y,, et al.. 標識のないＲＮＡハイブリダイゼーション分析のための自己組織化の水溶性核酸プローブタイル. Science, 2008. 319(5860): p. 180-3.
【非特許文献２９】Blattman, J.N., et al., ウィルス感染への一次、記憶、再生応答の間Ｔ細胞レパートリーの進化viral infection. J Immunol, 2000. 165( 1): p. 6081-90.
【非特許文献３０】Blattman, J.N., et al,, 生体抗ウィルスＴ細胞応答を高めるためのＩＬ−２の治療的使用. Nat Med, 2003. 9(5): p. 540-7.
【非特許文献３１】Schietinger, A., et al., 救われた耐性のあるＣＤ８  Ｔ細胞は、耐性状態を回復するために予めプログラムされている. Science, 2012. 335(6069): p. 723-7.
【非特許文献３２】Rothemund, P.W., ナノスケールの形状とパターンを作成するためのＤＮＡの折り畳み. Nature, 2006. 440(7082): p. 297-302,
【非特許文献３３】Mei, Q., et al., 細胞溶解物におけるＤＮＡオリガミナノ配列の安定性. Nano Lett, 201 1. 11(4): p. 1477-82.
【非特許文献３４】Seller. P., et al., 免疫グロブリン−トランスジェニックマウスにおける早期誘発性リンパ球性脈絡髄膜炎のウィルス中和抗体による促進されたウィルスクリアランス. J Virol. 1998. 72(3): p. 2253-8.
【非特許文献３５】Miconnet, I, Probing the Ｔ−細胞受容体レパートリーを詳細な解析でのプローブ法. Curr Opin HIV AIDS, 2012, 7(1): p. 64-70.
【非特許文献３６】Venturi, V., et al., Ｔ細胞受容体レパートリーのサブセット間の類似性を評価するための方法. J Immunol Methods, 2008. 329(1-2): p. 67-80.
【非特許文献３７】Brandle, D., et al., Ｔ細胞の発育、単一Ｔ細胞受容体α鎖を発現するマウスのレパートリー. Eur J Immunol, 1995. 25(9): p. 2650-5.
【非特許文献３８】Burns, R.P., Jr., et al., Ｔ細胞受容体β鎖トランスジェニックマウスにおける斜めのＴｃｒａ−Ｖ遺伝子の利用の分子分析. Immunogenetics, 1998. 47(2): p. 107-14.
【非特許文献３９】Cabaniols, LP., et al., ほとんどのα／βＴ細胞受容体の多様性は、ターミナルデオキシヌクレオチジル転移酵素による. J Exp Med, 2001. 194(9): p. 1385-90.
【非特許文献４０】Ewing, C, et al., ランダムに選択されるＴ細胞受容体β鎖のためのトランスジェニックなマウスにおけるウィルス特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞の応答. J Virol, 1994. 68(5): p. 3065-70.
【非特許文献４１】Turner, S.J., S.C. Cose, and F.R. Carbone, ＴＣＲα鎖の利用は、抗原選択的なＴＣＲβ鎖レパートリーの多様性を決定できる. J Immunol, 1996. 157(1 1): p. 4979-85. ‘
【非特許文献４２】Hayakawa, K., et al., 高親近性の記憶Ｂ細胞の分離: 抗原結合細胞のプローブとしてのフィコエリトリン. Proc Natl Acad Sci U S A, 1987. 84(5): p. 1379-83.
【非特許文献４３】Venturi, V., et al., Ｔ細胞受容体レパートリーのサンプルの多様性を比較するための方法. J Immunol Methods, 2007. 321(1-2): p. 182-95.
【非特許文献４４】Hurlbert, S.H., 種の多様性の非概念: 批評及び代替パラメータ. Ecology, 1971. 52(4): p. 577.
【非特許文献４５】Preston, F.W., 種の共通性と希少性. Ecology, 1948. 29(3): p. 254-283.
【非特許文献４６】Futschik, A. and C. Schlotterer, プールされるＤＮＡサンプルの並列の大量シーケンスから次世代の分子マーカー. Genetics, 2010. 186(1 ): p. 207-18.
【非特許文献４７】Johnson, P.L. and M. Slatkin, メタゲノミクスにおける集団遺伝パラメータの推測: 未整理データの整理. Genome Res, 2006. 16(10): p. 1320-7.
【非特許文献４８】Casrouge, A., et al., 初実験マウスの脾細胞のαβＴＣＲレパートリーの大きさ評価. J Immunol, 2000. 164(11): p. 5782-7.
【非特許文献４９】Lynch, M., 広範囲ゲノムシーケンスプロジェクトからのヌクレオチド多様性, 不均衡係数及び突然変異率の評価. Mol Biol Evol, 2008. 25(11): p. 2409-19.
【非特許文献５０】Robins, H.S., et al., αβＴ細胞におけるＴ細胞受容体β鎖多様性の包括的評価. Blood, 2009. 1 14(19): p. 4099-107.
【発明の概要】
【０００５】
第一の側面において、本明細書では、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のバーコード化されたポリヌクレオチドを核酸のオリガミナノ構造体に組み込むための方法が提供される。該方法は、（ａ）バーコード核酸の第一鎖の合成を行い、二本鎖のバーコード核酸を生成し、前記バーコード核酸は、相補的なバーコード核酸と、後続の油乳化剤増幅工程の前又は後に行う場合がある核酸のオリガミナノ構造体に相補的な配列により、１側面に配置される中央５’−５’ホスホスジエステルリンカーからなる一本鎖５’−５’ボウタイ状のリンカー核酸の１側面に相補的な少なくとも１つのプライミング部位からなり；（ｂ）前記二本鎖のバーコード核酸（又は前記一本鎖のバーコード及び相補的なプライマー対）と前記５’−５’ボウタイ状のリンカー核酸を、標的核酸を増幅するための試薬からなる油乳化剤の液滴内で混合し；（ｃ）前記５’−５’ボウタイ状のリンカー核酸上の相補的配列に前記二本鎖のバーコード核酸から各鎖をアニーリングし、ｓｓＤＮＡのバーコード化された５’−５’ボウタイ状のポリヌクレオチドの伸長を生じさせるのに十分な前記二本鎖（又は一本鎖）のバーコード核酸プライマーと前記５’−５’ボウタイ状のリンカー核酸からなる前記油乳化剤の液滴を熱サイクルにかけ、５−５’ホスホスジエステル連鎖反応ボウタイ状鎖の片側側面上にバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉配列を含む生成物を生成し；（ｄ）伸長物を前記熱サイクルされた液滴から抽出し；（ｅ）ｓｓＤＮＡのバーコード化された５’−５’ボウタイ状のポリヌクレオチドを前記抽出された伸長物から精製し；（ｆ）前記精製されたｓｓＤＮＡのバーコード化された５’−５’ボウタイ状のポリヌクレオチドを核酸のオリガミナノ構造体に組み込むことからなる又は本質的にのみからなる方法である。組み込みは、前記精製されたｓｓＤＮＡのバーコード化された５’−５’ボウタイ状のポリヌクレオチドを、核酸のオリガミナノ構造体にアニーリングすることからなる場合がある。前記核酸のオリガミナノ構造体は、ＤＮＡナノ構造体でありうる。
【０００６】
別の側面において、本明細書では、標的核酸配列を単細胞レベルで検出するための方法が提供される。該方法は、（ａ）請求項１記載の方法にしたがって得られる核酸のオリガミナノ構造体を単細胞から分離される核酸に接触させ、前記ナノ構造体は、標的核酸配列に相補的なバーコード化された配列を有するｓｓＤＮＡのバーコード化されたポリヌクレオチドからなり；接触は、単細胞中に存在する場合、前記バーコード化された配列を前記標的核酸配列に結合させるのに適切な条件で起こり；（ｂ）前記バーコード化された配列に結合された標的核酸配列を回収し；（ｃ）前記ｓｓＤＮＡのバーコード化されたポリヌクレオチドを逆転写用の遺伝子特異的プライマーとして使用して、前記回収された標的核酸配列を逆転写して、それによって、標的核酸は、細胞内に存在する場合、単細胞選別工程がなくても検出されることからなる又は本質的にのみからなりうる。前記核酸のオリガミナノ構造体は、ＤＮＡナノ構造であり得る。
【０００７】
さらなる側面において、本明細書では、Ｂ細胞受容体の配列を単細胞レベルで検出するための方法が提供される。該方法は、（ａ）固有のＨ鎖（ＩｇＨ）とＬ鎖（ＩｇＬ）のＢＣＲのｍＲＮＡを発現する抗原特異的なＢ細胞にトランスフェクトし；（ｂ）複数のバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉配列からなるＤＮＡオリガミナノ構造体を接触させ、免疫グロブリンのＨ鎖（ＩｇＨ）とＬ鎖（ＩｇＬ）両方のＢＣＲのｍＲＮＡを、トランスフェクトされた抗原特異的なＢ細胞内に捕捉及び保護し；（ｃ）前記接触されたＤＮＡオリガミナノ構造体を分離し、前記バーコード化されたｍＲＮＡの捕捉配列に結合されたＩｇＨとＩｇＬのｍＲＮＡを回収し；（ｄ）前記バーコード化されたｍＲＮＡ捕捉プローブを逆転写用の遺伝子特異的プライマーとして使用し、前記回収されたＩｇＨとＩｇＬのｍＲＮＡを逆転写して、それによって、標的ＢＣＲ配列は、単細胞選別工程がなくても検出されることからなる又は本質的にのみからなりうる。前記ＤＮＡオリガミナノ構造体は、一体型ビオチン標識からなりうり、前記接触されたナノ構造体の分離は、アビジンカラムによる精製からなる。
【０００８】
本発明の前述及び他の利点は、以下に記載する。以下の記載において、本明細書の部分を形成する添付図面を参照し、本発明の好ましい実施形態を例証する。そのような実施形態は、必ずしも本発明の全範囲を表すことはないが、それゆえに請求項を参照して、本明細書において本発明の範囲を解釈するものとする。
【０００９】
本発明はよりよく理解され、上述した記載事項以外の特長、側面及び利点は、以下の詳細な記述を考慮すると明らかとなるであろう。そのような詳細な記載事項については、以下の図面を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、単細胞選別なしに、単細胞由来のＢＣＲ／抗体のｍＲＮＡから、連鎖される配列情報を得るために、ＤＮＡオリガミナノ構造体を使用する代表的な方法の概略図である。抗原反応Ｂ細胞は、蛍光標識抗原を使用してフローサイトメトリーによる細胞選別により得られ、ＩｇＨとＩｇＬ（すなわち、κ又はλ）両方の一定領域のｍＲＮＡに相補的な伸長された配列を含むＤＮＡオリガミナノ構造体で、電気穿孔法によりトランスフェクトされる。ＤＮＡオリガミ分子は、その後溶解される個々の細胞内の細胞内ＩｇＨとＩｇＬのｍＲＮＡを結合及び保護し、その後、結合されたｍＲＮＡを持つオリガミは、再分離され精製される。ｍＲＮＡ捕捉プローブを逆転写プライマーとして使用して、ＩｇＨとＩｇＬの遺伝子配列は、オリガミ捕捉プローブ上で伸長される。その後ｃＤＮＡは、標準ＩｇＨ／ＩｇＬのＶ遺伝子マルチプレックスＰＣＲによりさらに増幅され、イルミナ対合末端のシーケンスに適切な増殖生成物の貯留部を得る。各増幅産物は、その補体と対になることが可能な１２−ｍｅｒバーコードを含み、単細胞選別のニーズがなくても、個々の細胞からＩｇＨとＩｇＬ両方のｍＲＮＡのための配列情報を提供する。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、ＤＮＡオリガミの設計と合成の様子を示す。（Ａ）は、５’−５’ボウタイ状ｍＲＮＡ捕捉プローブの構成である。様々な領域により、ＤＮＡオリガミナノ構造体への組み込み、下流ＰＣＲ増殖、バーコード対合、及びＩｇＨ／ＩｇＬｍＲＮＡ捕捉が可能である。（Ｂ）は、オリガミナノ構造体の表面から伸長し、その一方でＢＣＲのＩｇＨとＩｇＬのｍＲＮＡでアニーリングする、５’−５’ボウタイ状ｍＲＮＡ捕捉プローブの概略図である（注：５’−５’ボウタイ状捕捉プローブの長さは、構造を見易くするため実寸よりも大きく表示した。）（Ｃ）は、予想される「ウェハ」形状（プローブはあまりにも曲がりやすいので、ＡＦＭでは可視化できない）を示す、ＡＦＭにより視覚化される、適切に折りたたまれたＤＮＡオリガミ分子の確証を示す。各オリガミ分子は、大きさが約６０×９０ｎＭである。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、相補的バーコード配列を含む５’−５’ボウタイ状ｍＲＮＡ捕捉プローブの構造を示し、（Ａ）では、１．０−ｍｅｒバーコード鎖の以下の第一鎖の合成、１：１：１バーコード：５’−５’鎖：油水乳化剤の液滴反応が樹立される。（Ｂ）では、バーコード鎖を鋳型として使用して、５’−５’鎖の重複伸長により、相補的バーコードの５’−５’鎖の片側末端への組み込みが可能になる。（Ｃ）以下の変性ＰＡＧＥ精製、アダプター鎖は、モジュール式Ｔ４ ＤＮＡライゲーション反応を起こすよう使用され、遺伝子特異的な相補的ｍＲＮＡ捕捉配列を５’−５’鎖の片側末端に付着する。最終の変性ＰＡＧＥ精製及び定量化の後、バーコード化された５’−５’ｍＲＮＡ捕捉プローブは、個々のＤＮＡオリガミナノ構造体に組み込まれ得る。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、ＤＮＡオリガミナノ構造体を、標的ｍＲＮＡに結合する様子を示し、（Ａ）では、標的ｍＲＮＡは、ＤＮＡオリガミ構造に特異的に結合し：標的ｍＲＮＡの特異的な結合によるＤＮＡオリガミの移動は、リポーターフルオレセイン分子を使用して可視化された。レーン１〜３：試験管内で転写される標的ｍＲＮＡで培養された、標的特異的に伸長されたステープル配列のないＤＮＡオリガミ（１）、ＤＮＡオリガミのみ（２）、又はナンセンス（スクランブル）ｍＲＮＡで培養されたＤＮＡオリガミ（３）。レーン４：試験管内で転写される標的ｍＲＮＡのみ（可視不可）、レーン５：ＭＷ標識（可視不可）、レーン６と７：ＤＮＡオリガミのみで培養された、伸長された標的特異的なステープル配列を持つＤＮＡオリガミ（６）又は試験管で転写される標的ｍＲＮＡで培養されたＤＮＡオリガミ（７）。特異的なＦＲＥＴ信号は、ＤＮＡオリガミ構造を識別する。（Ｂ）では、選択されたＡＦＭ画像は、標的特異的な伸長されるステープルでオリガミに結合されるが、非標的ステープル（オリガミ分子の１側面上のみで可視のｍＲＮＡ）には結合されない、試験管内で転写される標的ｍＲＮＡの特異性を示す。（Ｃ）では、選択されたＡＦＭ画像は、αとβ両方のステープル（オリガミ分子の両側面に結合されるｍＲＮＡ）を含む個々のオリガミにより捕捉される、２つの試験管内で転写される標的ｍＲＮＡの結合を示す。
【図５】図５Ａと５Ｂは、ＤＮＡオリガミナノ構造体での主要なリンパ球のトランスフェクションを示す。（Ａ）では、マウスのリンパ球は、疑似トランスフェクトされ（左図）又はＦＩＴＣ標識ＤＮＡオリガミナノ構造体でトランスフェクトされた（中図）。トランスフェクトされた細胞は、フローサイトメトリーによるＦＩＴＣ標識の検出に基づいて、可視化された。オリガミ構造が細胞により組み込まれ、細胞表面に結合されないことを確認するため、細胞はトランスフェクション後にデオキシリボヌクレアーゼで処理した。類似のＦＩＴＣ信号が、デオキシリボヌクレアーゼ処理（右図）後のＤＮＡオリガミから検出された。（Ｂ）では、デオキシリボヌクレアーゼ消化が、ゲル電気泳動法で確認された通り、培養後に細胞表面上でＤＮＡオリガミを破壊する。
【図６】図６は、代表的な次世代シーケンス（ＮＧＳ）分析プロトコルを示すフローチャートである。個々の実行からの配列は、ＢＷＡ−ＭＥＭソフトウェアを使用して、ＦＥＡＳＴＱファイル上で分析され、配置される。分析ファイルは、遺伝地図の作成、リードカウント、接合検出のために作成され、配列の品質管理及び増殖バイアスのためにさらに処理される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明が様々な変更及び代替例の形態をとりやすい一方、その代表的な実施形態は、図面に例示され、本明細書で詳細に記載される。しかし、代表的な実施形態の記載は、本発明を開示される特定の形式に限定する意図を有さず、それに反して、本発明の意図は、添付請求項で定義されるように、本発明の意図及び範囲に含まれる変更、均等物及び代替例をすべて網羅することを理解されたい。
【００１２】
本明細書で引用される、特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない、すべての公開公報は、本特許出願にあたかも完全に記載されるよう引用により、本明細書に組み込まれる。
【００１３】
本発明者は以前、トランスフェクトされた細胞からｍＲＮＡ配列を捕捉及び保護する能力を有する新規のＤＮＡオリガミナノ構造体を開発した。ＤＮＡオリガミに一体型蛍光標識を施すと、トランスフェクトされた細胞の識別が容易になり、結合されたｍＲＮＡでのナノ構造体の再分離が、一体型ビオチン標識とアビジンカラムによる精製を使用して達成される。本明細書に記載の該方法は、単細胞選別又は専用機器（図１）へのニーズなしに、個々の細胞から目的の同義遺伝子を対合するための堅固な方法論を発明者が発見したことに、少なくとも部分的に基づいている。本開示は、「ボウタイ状バーコード」技術をＤＮＡオリガミナノ構造体及び他の核酸に基づくナノ構造体に組み込む新規方法を提供し、百万単位の細胞からｍＲＮＡの同時捕捉と対合を可能にする。微細穿孔（細胞電気穿孔法には、体積単位としてマイクロリットルを使用する）技術のさらなる改良により、トランスフェクション効率と改良された細胞生存率が向上した。最終的に、油水乳化剤の液滴に基づくシステムを持つボウタイ状バーコード捕捉方法と重複伸長ＰＣＲを組み合わせることで、シーケンス中に、個々の遺伝子配列を互いに元に連結するためのバーコードとして使用可能な対合された、ランダム配列を百万単位で作成することができる。固有の整合バーコード化された配列分析により、ｍＲＮＡを連結させることで、本発明者は、大きな細胞集団を分析するのに役立ち、ほとんどいかなる異種細胞集団から対合された遺伝子の配列の多様性を検査するために容易に適応可能な費用対効果が高い方法を開発した。
【００１４】
他のトランスフェクト可能な核酸ハイブリタイゼーションのプラットフォームに関して、複数のｍＲＮＡ種の連結を必要とする分析をうまく行う分子アプローチは他に存在しない。一本鎖オリゴのトランスフェクションを試みた一方、一本鎖オリゴは、下流分析を除いて、ＲＩＳＣ複合体を活性化し、分解される。いかなる特定の機構又は理論に拘束されることなく、オリガミ分子の準スーパーコイルの性質は、トランスフェクトされたオリガミ分子を、結合されたｍＲＮＡで再捕捉及び分離する能力から明らかなように、ＲＩＳＣ複合体による分解を阻害すると考えられる。さらに、標準的な単細胞乳化剤に基づくシステムに関連し、それらは複数のｍＲＮＡ種の連結を必要とする分析に適切ではなかった。乳化剤に基づくシステムにより単細胞選別より多い細胞数の入力が可能である一方、先行技術の単細胞乳化剤に基づくシステムのみが、７対の配列を捕捉し（＞０．０００００１％）、１０００／１００００００未満の濃度で、それらの対照の存在を検出できなかった。ほとんどのクローンが一人当たり単一クローンとして存在すると考えられているが、このレベルの感度は希少細胞の発見には受け入れ可能ではないであろう。
【００１５】
したがって、第一の側面において、本明細書では、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のバーコード化されたポリヌクレオチドを核酸のオリガミナノ構造体に組み込む方法が提供される。該方法は、以下の工程からなる又は本質的にのみからなる：（ａ）バーコード核酸の第一鎖の合成（後続の油乳化剤工程の前又はその間のいずれか）を行い、相補的な二本鎖のバーコード核酸を作成し、前記バーコード核酸は、前記バーコード核酸に相補的な配列と、核酸のオリガミナノ構造体に相補的な配列により１側面に配置される中央５’−５’ホスホスジエステルリンカーからなる一本鎖ボウタイ状リンカーＤＮＡ鎖の１部分に相補的な少なくとも１つのプライミング部位からなり；（ｂ）前記二本鎖のバーコード核酸（又は一本鎖のバーコード核酸と相補的プライミングセット）と前記５’−５’ボウタイ状のリンカー核酸を、標的核酸を伸長するための試薬からなる油乳化剤の液滴に混合し、（ｃ）前記５’−５’ボウタイ状のリンカー核酸上の相補的配列に前記二本鎖のバーコード核酸から各鎖をアニーリングし、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のバーコード化された５’−５’ボウタイ状のポリヌクレオチドを生じるに十分な前記二本鎖のバーコード核酸（又は一本鎖のバーコード核酸と相補的プライマー）と前記５’−５’ボウタイ状のリンカー核酸からなる前記油乳化剤の液滴を熱サイクルにかけ、伸長物の液滴を生成して；（ｄ）伸長物を前記液滴から抽出し：（ｅ）ｓｓＤＮＡのバーコード化された５’−５’ボウタイ状のポリヌクレオチドを前記抽出された伸長物から精製し；（ｆ）前記精製されたｓｓＤＮＡのバーコード化された５’−５’ボウタイ状のポリヌクレオチドを核酸のオリガミナノ構造体に組み込む。
【００１６】
本明細書で使用される通り、用語「バーコード」は、同一の細胞からの核酸を区別、対合及び固有に識別するために使用可能なヌクレオチドの固有配列を指す。いくつかの場合において、バーコードは、例えば異なる細胞や他の発生源から生じるような、十、百さらには千単位の核酸を区別するために使用され得る。本明細書で使用される通り、用語「ボウタイ状バーコード」は、固有の５’−５’非標準ホスホスジエステルＤＮＡの「ボウタイ状」構造を介して共に連結される一連の相補的なバーコード配列を指し、相補的なバーコード核酸配列により片側で配置される中央ホスホスジエステルリンカーを意味する。
【００１７】
本明細書で使用される通り、用語「核酸ナノ構造体」は、便宜上使用するものであって、本発明は、核酸ナノ構造体を一般的に意図することを理解されたい。本発明の該ナノ構造体は、線状（例：ナノロッド）又は非線状（例：星形、三角形等）であり得る。ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡオリガミ等の様々な技術を使用して、所定の一次元、二次元又は三次元ナノ構造体に折りたたまれる場合がある。
【００１８】
用語「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、及び「核酸」は、交換可能に使用され、リン酸基及び交換可能な有機塩基に連結される糖（例：リボース又はデオキシリボース）からなる分子を意味し、置換ピリミジン類（例：シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））又は置換プリン（例：アデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ））のいずれかである。したがって、上の用語は、ＤＮＡとＲＮＡのオリゴヌクレオチド両方を包含する。同用語は、ポリヌクレオシド（すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸塩を除外したもの）及び他のいかなる有機塩基を含む高分子も含むものとする。オリゴヌクレオチドは、既存の核酸源（例：ゲノム又はｃＤＮＡ）から得られるが、好ましくは合成物（例：核酸合成により生成される）である。
【００１９】
バーコード化された５’−５’ボウタイ状のリンカー捕捉プローブの構築：バーコード化されたポリヌクレオチドは、中央５’−５’「ボウタイ状」連鎖を含んで構築される、長ｓｓＤＮＡ鎖であり、両末端が５’→３’方向に移動できる。該ボウタイ状連鎖は、予め合成されたＤＮＡ配列（例：民間販売業者から発注）からなり得る。好ましくは、バーコード化されたポリヌクレオチドの片側末端はさらに、Ｍ１３ｍｐ１８ファージＤＮＡオリガミバックボーンに相補的な特定の配列からなり得る。この配列は可変で、いかなる標的ナノ構造体へのバーコード組み込みに適合される。図２Ａを参照すると、片側末端はさらに、下流増殖のための保存ＰＣＲプライマー領域、該鎖の対立末端上のバーコードに相補的な固有のバーコード、第２保存プライミング部位、目的の遺伝子の保存領域に相補的なｍＲＮＡ捕捉部位からなり得る。捕捉配列の重要な設計上の特性は、ｍＲＮＡが５’−５’ボウタイ状鎖の片側末端上に含まれる固有の一連の相補的ヌクレオチドバーコードにより互いに対合される。
【００２０】
長いバーコード化されたボウタイ状のポリヌクレオチドは、その後、バーコードボウタイ状の自己組織中に、ＤＮＡオリガミマスターミックス（又は他の所望のナノ構造体）とＭ１３ｍｐ１８相補的配列をオリガミナノ構造体により組み込み可能である。図２Ｂを参照すると、ボウタイ状のｍＲＮＡ捕捉配列の領域は、オリガミナノ構造体の表面から伸長する。いくつかの場合において、ｓｓＤＮＡのバーコード化された５’−５’ボウタイ状のポリヌクレオチドを核酸ナノ構造体に組み込むことは、アニーリングすることからなり得る。
【００２１】
本明細書に記載の通り、油乳化剤の液滴は、固有の一連の相補的バーコードを百万単位の（又はそれ以上の）ボウタイ状鎖に組み込むために使用可能である。中央５’−５’非伝統的ホスホスジエステル連鎖からなる塩基のボウタイ状鎖は、民間販売業者（例：Integrated DNA Technologies, Inc.社）から調達される、２つの異なる保存プライミング部位同様、核酸のオリガミナノ構造体の配列に相補的な配列を含むことが可能である。いくつかの場合において、５’−５’ボウタイ状鎖は、例えば以下の配列を有する。
【００２２】
３ ‘−ＣＧＡＧＴＣＣＣＴＴＴＡＴＣＧＧＧＡＡＣ−５’−５’−ＧＡＡＣＧＴＧＧＣＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。
【００２３】
いくつかの場合において、バーコード鎖は、以下の配列を有する：５’ＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＣＧＧＡＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＴＴＧＧＧＧＴＡＧＣＣＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＴＣＴＣＴＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ここで「Ｎ」は、ＤＮＡ（アデニン、シトシン、グアニン、又はチミン）に見られる４つの窒素塩基のいずれかでありうる。
【００２４】
その他の場合において、バーコード標識鎖は、５’−５’ボウタイ状鎖の１側面に相補的な１つのプライミング部位；ランダム１０−ｍｅｒヌクレオチドバーコード（４１０=１０４８５７６個の固有のバーコード、もし＞１０６個の配列が解析されれば、１１−ｍｅｒ又は１２−ｍｅｒのバーコードを使用する場合がある）；バーコード鎖の両末端に側面配置する特定のｍＲＮＡ（相補的）捕捉配列で、５’−５’ボウタイ状鎖の他の１側面に相補的な第２プライミング部位からなる。短いバーコード鎖は、第一鎖の合成反応内で使用される場合があり、相補的バーコードでｄｓＤＮＡ生成物を作成し、又は油乳化剤の伸長工程中に標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で下流に使用され、ｄｓＤＮＡのバーコード鎖を直接に乳化剤液滴中に合成する。図３Ａを参照すると、＞１０１０個の同一のｓｓＤＮＡ５’−５’ボウタイ状鎖と固有のｄｓＤＮＡのバーコード鎖（又は相補的プライマーを持つｓｓＤＮＡのバーコード鎖）はその後、１：１：１の分子対分子対液滴の比率で、油水乳化剤の液滴の重複伸長の伸長システムに組み込まれる。標準ＰＣＲサイクルは、ｄｓＤＮＡのバーコード鎖を変性（又はｓｓＤＮＡのバーコード鎖に続き変性を増幅）するように使用可能であり、５’−５’ボウタイ状の片側末端でｄｓＤＮＡのバーコード鎖からｓｓＤＮＡ鎖両方をアニーリングし、ｓｓＤＮＡのバーコード鎖を鋳型として使用して、ボウタイ状を伸長する。
【００２５】
変性後、重複伸長が各液滴中で行われるのは、ｄｓＤＮＡのバーコードから各鎖が、５’−５’ボウタイ状リンカー上の相補的プライミング部位でアニーリングし、重複伸長のためにプライマー及び鋳型として作用し、ボウタイ状鎖の３’末端（図３Ｂ）上のｍＲＮＡに特異的な捕捉配列と同様、５’−５’ボウタイ状鎖の片側末端上の相補的１０−ｍｅｒバーコードを組み込む時である。このシステムは幾何級数的なＰＣＲ増殖でない一方、複数の解離／アニーリング／伸長サイクルが、各５’−５’リンカーの両末端が伸長されることを確証するために使用される。ＰＣＲ生成物はその後、標準エーテル／酢酸エチル抽出プロトコルを使用して油水乳化剤システムから抽出され、ｓｓＤＮＡのバーコード化された５’−５’ボウタイ状鎖が、標準変性ＰＡＧＥ精製により残存する核酸から精製される。この時点での生成物は、（５’−５’中央ボウタイ状連鎖から両３’末端に向かって伸長する順で）以下を含む：オリガミ相補的配列（１側面のみであり得る）、保存ＰＣＲプライミング部位、５’−５’連鎖の対立アーム上のバーコードに相補的なランダム１０−ｍｅｒバーコード、第２保存プライミング部位、及び遺伝子特異的ｍＲＮＡ捕捉配列（図３Ｂ）。最終的な変性ＰＡＧＥ精製の後、最終的な生成物は、以下に必要な領域を含む：１）ＤＮＡオリガミ構造への組み込み、２）下流ＰＣＲ増殖のための保存プライミング部位、３）両捕捉ｍＲＮＡを対合させるために利用される相補的バーコード、及び４）遺伝子特異的な逆転写プライマー（図３Ｃ）としても使用可能な目的の遺伝子の保存領域に相補的なｍＲＮＡ捕捉配列。
【００２６】
これら固有のボウタイ状バーコードはその後、鎖の「オリガミアニーリング配列」部分の独自性を単純に変更することで、個々のオリガミ分子又は目的のいかなる核酸構造に組み込み可能である。該方法により、各ボウタイ状鎖に取り付けられる、固有にバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉配列により、極端なレベルのｍＲＮＡ対合の特異性が可能である。
【００２７】
回収されたｍＲＮＡは、遺伝子特異的ＲＴプライマーとして捕捉鎖上に保存配列を使用して、ｃＤＮＡに逆転写（ＲＴ）され、したがって、ボウタイ状バーコードの３’末端から遺伝子特異的ｃＤＮＡを伸長する。ボウタイ状バーコード上の保存遺伝子特異的配列がＲＴ反応をプライミングするために必要であるため、いかなる非結合のｍＲＮＡは増幅されず、したがって選択度を改良し、誤った対合を回避する。
【００２８】
逆転写とバーコード連結されるｍＲＮＡ増幅産物の生成（図１）：ｍＲＮＡ結合オリガミが一度、細胞溶解物から精製されると、逆転写（ＲＴ）が行われる。ボウタイ状バーコードのｍＲＮＡ相補的領域をＲＴプライマーとして使用して、いかなる商業的に入手可能なＲＴマスターミックスを単純に加えて、製造業者の助言によって培養することで伸長が達成可能である。ｍＲＮＡはその後、商業的なＲＮａｓｅＨカクテルを加えて除去可能で、バーコード化されたｃＤＮＡは、バーコードボウタイ状の３’末端から伸長される生成物として得られる。我々は以前、試験管内で転写される標的ｍＲＮＡ結合オリガミを使用してこの手法を実証し、ＰＣＲにより遺伝子特異的なｃＤＮＡを分離する能力を確認した。最終的に、ボウタイ状バーコードの片側末端上の保存プライミング配列両方のための単一プライマーを使用する、マルチプレックスＰＣＲと、出願する技術次第では、１）ＴＣＲα／ＴＣＲβ  Ｖ−遺伝子又はＩｇＨ／ＩｇＬ Ｖ群のための確立したマルチプレックスプライマーセットが実行可能で、免疫受容体の対応するＣＤＲ３領域で増幅産物の貯留部を生成し又は２）公知のガンドライバー／交代ドライバー遺伝子中の目的の突然変異のちょうど外部の保存領域のための単一プライマーは、バーコード対合ＰＣＲ生成物を生じる。プライマーセットにイルミナ特異的なアダプター配列を含むことで、ＣＤＲ３配列を持つバーコード化された増幅産物、ガン突然変異配列、又は異種細胞集団から目的のいかなる対合された遺伝子配列は、標準イルミナ対合末端シーケンスでの使用に即座に適して、取得が可能である。
【００２９】
別の側面において、本明細書では、例えば細胞集団の概略を記載又はその他目的で、大量の単細胞から特定のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列の十から百単位又はそれ以上のパネルの並列捕捉、バーコード化及び定量化のための方法が提供される。好ましい実施形態において、標的核酸配列を単細胞レベルで検出する方法は、以下の工程からなる又は本質的にのみからなる：（ａ）請求項１記載の方法にしたがって得られる核酸のオリガミナノ構造体を単細胞から分離される核酸に接触させ、前記ナノ構造体は、標的核酸配列に相補的なバーコード配列を有するｓｓＤＮＡのバーコード化されたポリヌクレオチドからなり；接触は、単細胞中に存在する場合、前記バーコード配列を前記標的核酸配列に結合するのに適する条件で起こり；（ｂ）前記バーコード配列に結合される標的核酸配列を回収し；（ｃ）前記ｓｓＤＮＡのバーコード化されたポリヌクレオチドを逆転写用の遺伝子特異的プライマーとして使用して、前記回収された標的核酸配列を逆転写して、それによって、標的核酸は、細胞内に存在する場合、単細胞選別工程なしで検出される。
【００３０】
さらなる側面において、本明細書では、Ｂ細胞受容体の配列を単細胞レベルで検出する方法が提供される。該方法は、 以下の工程からなる又は本質的にのみからなる：（ａ）抗原特異的なＢ細胞にトランスフェクトし；（ｂ）１つ以上の組のｍＲＮＡ捕捉配列からなるＤＮＡオリガミナノ構造体を接触させ、免疫グロブリンのＨ鎖（ＩｇＨ）とＬ鎖（ＩｇＬ）両方のＢＣＲのｍＲＮＡを、トランスフェクトされた抗原特異的なＢ細胞に捕捉及び保護し（ｃ）前記接触されたＤＮＡオリガミナノ構造体を分離し、前記１つ以上のｍＲＮＡ捕捉配列に結合されたＩｇＨとＩｇＬのｍＲＮＡを回収し；（ｄ）１つ以上の組のｍＲＮＡ捕捉プローブを逆転写用の遺伝子特異的プライマーとして使用し、前記回収されたＩｇＨとＩｇＬのｍＲＮＡを逆転写し、それによって、標的ＢＣＲ配列は、単細胞選別工程がなくても検出される。
【００３１】
いくつかの場合において、ＤＮＡオリガミナノ構造体は、一体型ビオチン標識からなり、前記接触されたナノ構造体の分離する工程は、アビジンカラムによる精製からなる。
【００３２】
核酸又は核酸分子は、本明細書で使用される通り、いかなる目的の核酸を含む場合がある。いくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、ロックト核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、それらの混合物、それらの混成物、又は内部炭素バックボーンスペーサーを持つ核酸を含むがこれらに限定されない。いくつかの側面において、核酸は、条件がプライマー伸長生成物の合成に適する時、核酸の相補的鎖に沿って、合成の開始点として作用可能な「プライマー」である。核酸は、一本鎖、二本鎖、及び三本鎖でもあり得る。いくつかの側面において、核酸は、例えば、ヌクレオチドユニットの塩基に相補的な組み込みにより、相補的核酸の合成のための鋳型として作用する。例えば、いくつかの側面において、核酸は、自然発生ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡを含む）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）からなり、及び／又は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びいかなる方法により作成される組換え分子を含むが、これらに限定されない合成分子からなる。いくつかの側面において、核酸は、化学合成、逆転写、ＤＮＡ複製又はこれら作成方法の組み合わせから作成される。
【００３３】
核酸は、Maniatisらによる著書、分子クローニング：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、N．Y．、pp．２８０−２８１（１９８２）等を含む、いかなる適切な方法を使用して取得可能である。いくつかの側面において、核酸は、米国特許出願第２００２／０１９０６６３記載の通りに得られる。生体資料から典型的に得られる核酸は分解され、分析用に適切な断片を作成する。
【００３４】
本発明の核酸及び／又は他の部分は、分離される場合がある。本明細書で使用される通り、「分離される」は、該当物が、自然発生源由来又は合成的に作られるのか、全部又は部分的かに関わらず、通常関連する要素の少なくともいくつかから分かれていることを意味する。本発明の核酸及び／又は他の部分は、精製される場合がある。本明細書で使用される通り、「精製される」は、他の化合物又は実在物の大多数から分かれることを意味する。化合物又は部分は、部分的に精製又は相当量精製される場合がある。精製は、重量比測定で表示され、質量分析法、高速液体クロマトグラフィー等であるがこれらに限定されない様々な分析方法を使用して、決定される場合がある。
【００３５】
他に特段の定義がなければ、本明細書で使用されるすべての技術的及び化学的用語は、本発明に関する当業者により一般的に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書で定義及び使用されているように、すべての定義は、辞書の定義、引用に組み込まれる文書中の定義、及び／又は定義のある用語の通常の意味を統制するものと理解すべきであろう。
【００３６】
本明細書及び請求項で使用される、不定冠詞「ａ」と「ａｎ」は、他に特段の明確な指摘がない限り、「少なくとも１つ」の意味で理解されたい。
【００３７】
本明細書及び請求項で使用される用語「及び／又は」は、結合された要素の「片側１つ又は両方」、すなわちいくつかの場合で結合して存在し、他の場合では分離して存在する要素を意味することを理解されたい。「及び／又は」で列挙される複数の要素は、同じ形式、すなわち結合された要素の「１つ以上」と解釈されたい。他の要素は、「及び／又は」項により特定して識別される要素以外で、特定して識別されるそれらの要素に関連又は関連しないに関わらず、任意に存在する場合がある。このように、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」の言及は、「からなる」等の制約のない文言に関連して使用される場合、１つの実施形態において、Ａのみを指す場合がある（Ｂ以外の要素は任意に含む）；別の実施形態では、Ｂのみを指す場合がある（Ａ以外の要素は任意に含む）；さらに別の実施形態では、ＡとＢ両方を指す場合がある（他の要素は任意に含む）；その他の場合もある。
【００３８】
本明細書及び請求項で使用される通り、「又は」は、上述で定義されている「及び／又は」と同一の意味を有すると理解すべきであろう。例えば、リスト中の要素を分けるとき、「又は」や「及び／又は」は、すなわち、少なくとも１つを含むが、同様に多くの要素や要素のリストのうち１つを超えて含み、任意に、さらに列挙されていない要素を含むものと解釈されるものとする。「〜のただ１つ」又は「〜のちょうど１つ」、又は、請求項で使用される場合の「〜のみからなる」等のその他明らかに指摘のある用語のみ、多くの要素又は要素のリストのうちちょうど１つの要素を含むことを指す。一般的に、本明細書で使用される通り、文言「又は」は、「片方の１つ」、「〜の１つ」、「〜のただ１つ」、又は「〜のちょうど１つ」等の排他性の言葉に先行される場合、排他的選択肢（すなわち、「１つ又は他の１つであるが、両方ではない」）を指示するのみと解釈されるものとする。「本質的にのみからなる」は、請求項で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
【００３９】
本明細書で使用される通り、数字に関連して、文言「ほぼ」又は「約」は、一般的に、その他特に記載のない数字（〜を超える又は未満の）一方の方向に、又は（そのような数字が可能な値の１００％を超える場合を除く、）状況から明らかでなければ、５％の範囲内に含まれる数字を含むと解釈される。範囲が言及されると、終点は、他に記載がなければ又は他に状況から明らかでなければ、該範囲に含められる。
【００４０】
本発明は、１つ以上の好ましい実施形態に関して記載されており、多くの均等物、代替例、変形、及び変更は、明らかに記載される事項を除き、可能であり、本発明の範囲内にあることを理解されたい。本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮すると、より十分に理解されるであろう。
【実施例１】
【００４１】
逆転写及びバーコード連結されるｍＲＮＡ増幅産物の生成
ｍＲＮＡ−結合オリガミが一度、細胞溶解物から精製されると、逆転写（ＲＴ）が行われる。ボウタイ状バーコードのｍＲＮＡ相補的領域をＲＴプライマーとして使用して、いかなる商業的に入手可能なＲＴマスターミックスを加えて、製造業者の助言に従って培養することで伸長が達成される。ｍＲＮＡは、商業的なＲＮａｓｅＨカクテルを加えて除去され、バーコード化されたｃＤＮＡは、バーコードボウタイ状の３’末端から伸長される生成物として得られる。我々は以前、試験管内で転写される標的ｍＲＮＡ結合のオリガミを使用してこの手法を実証して、ＰＣＲにより遺伝子特異的なｃＤＮＡを分離する能力を確認した。最終的に、ボウタイ状バーコードの片側末端上の保存プライミング配列の各々のための単一プライマーを使用して、マルチプレックスＰＣＲを行う。出願する技術次第では、１）ＴＣＲα／ＴＣＲβ遺伝子又はＢＣＲ  ＩｇＨ／ＩｇＬ Ｖ群のための確立したマルチプレックスプライマーセットは、免疫受容体の対応するＣＤＲ３領域で増幅産物の貯留部を生成し、又は２）公知のガンドライバー／交代ドライバー遺伝子中の目的の突然変異のちょうど外部の保存領域のための単一プライマーは、バーコード対合ＰＣＲ生成物を得るために使用され、又は（３）多様な生物種又は細胞集団内の異種遺伝子に隣接する保存領域のための単一プライマー。プライマーセットにイルミナ特異的なアダプター配列を含むことで、ＣＤＲ３配列を持つバーコード化された増幅産物は、標準イルミナ対合末端シーケンスで使用するのに即座に適して、取得可能である。
【実施例２】
【００４２】
免疫受容体のｍＲＮＡに結合するＤＮＡオリガミ
我々は以前、多様性と異種細胞集団の点で同様の問題を提起する、以下のヘテロ二量体のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の分析方法を開発した。図４Ａ〜４Ｃは、公知のトランスジェニックＴＣＲ（Ｐ１４トランスジェニックＴ細胞）の分析に関連して、予備データを提供する。オリガミナノ構造体は、個々のオリガミ分子あたり、複数のｍＲＮＡ捕捉プローブを備えるよう設計された。我々はそれ以来、我々のナノ構造体設計を修正し、オリガミ分子あたり、単一５’−５’バーコード化されたｍＲＮＡ捕捉鎖を組み込む。ｍＲＮＡを結合する動力学は類似であると仮定される一方、最適化試験を行って、ｍＲＮＡ結合効率を評価する。以前、ＴＣＲαとＴＣＲβ両方に特異的なプローブを含むオリガミがＴＣＲβのｍＲＮＡのみで培養された時、ｍＲＮＡは、オリガミ分子の１側面で捕捉されたのみであった（おそらく、ＴＣＲβ特異的なプローブにより）（図４Ｂ）。ＴＣＲαとＴＣＲβ両方に特異的なプローブを含むオリガミが、ＴＣＲαとＴＣＲβ両方のｍＲＮＡで培養された時、ＴＣＲのｍＲＮＡの両タイプを示すオリガミ捕捉ｍＲＮＡの両側面は、個々のオリガミ分子の片側上の対応するプローブに結合され（図４Ｃ）、正確なｍＲＮＡ結合の能力と特異性を確認した。繰り返すが、ＴＣＲのｍＲＮＡ結合を分析する我々の過去の実験のため、我々は、ＴＣＲα又はＴＣＲβのいずれかの配列に相補的な、オリガミ分子の片側上に個々のプローブ鎖を利用した。ｍＲＮＡの捕捉がわずかに異なる配向で起きるものの、オリガミ−ｍＲＮＡ捕捉に有意な変化は予想されない。
【実施例３】
【００４３】
ＤＮＡオリガミナノ構造体のトランスフェクション
過去の研究は、微小管輸送を経てリソソームに至るカベオリン依存の経路経由で、ＤＮＡナノ構造体の受容体を介するエンドサイトーシス、その結果としてナノ構造体の分解を利用した。この戦略の明確な問題点は、ｍＲＮＡ捕捉及び後続の再分離のため、我々のナノ構造体は、エンドサイトーシス経路をバイパスして、その代わりに、直接細胞質まで細胞膜を横断しなければならない。電気穿孔法は、細胞質への進入、それゆえにエンドソーム分解の有害作用の回避のための最も簡便な方法である。しかし一般的に、細胞の高死亡率がこの方法に関連する。微細穿孔技術（電気穿孔法には、体積単位としてマイクロリットルを使用する）の最近の進歩により、高細胞生存率（＞８６％）と同様に、高トランスフェクション効率（＞９３％）が示された。我々のＢ細胞トランスフェクション実験のために、我々は、以前作成されたハイブリドーマ〔３４〕として、同一のＫＬ２５配列のＢＣＲを発現するＫＬ２５ ＩｇＬ／ＩｇＨトランスジェニックマウスを使用する。４〜６週齢のＫＬ２５ ＩｇＬ／ＩｇＨのトランスジェニックマウスからの脾細胞は、機械的な分解と０．８３％ＮＨ４Ｃｌ内での赤血球溶解により作成される。ＩｇＭ＋Ｂ細胞は、磁気細胞選別により精製され、選別された集団の＞９５％純度は、フローサイトメトリーにより確認される。細胞は、遠心分離法（１２００ｒｐｍ、５分、４℃）でペレット状にされ、ＯＰＴＩ−ＭＥＭTM 培地（Gibco）で洗浄され、１×１０７細胞数／ｍＬでＯＰＴＩ−ＭＥＭTM培地で再懸濁される。電気穿孔法のために、ネオン注射器によるトランスフェクションシステム（Thermo Scientific）は、以下の設定で１００μＬの注射器の先端で使用される：２０００Ｖ、１０ｍｓ、１パルス。サンプルは、１００μＬの細胞懸濁液と、２５μＬ（２０ｎＭ）のＤＮＡオリガミ懸濁液（１Ｘ ＴＡＥ−Ｍｇ２+内）又は２５μＬの１Ｘ ＴＡＥ−Ｍｇ２+ 緩衝剤の疑似トランスフェクション対照いずれかのみからなる。電気穿孔法の直後、細胞は、１０％ウシ胎仔血清で新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地に移され、９６のウェルプレートの個々のウェルで３７℃、１２〜２４時間で培養した。トランスフェクション効率を評価するため、細胞は、ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで可視化される；各ナノ構造体に組み込まれる、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ；４８８ｎｍ励起、５１８ｎｍ放出）タグにより、首尾よくトランスフェクトされた細胞が、フローサイトメトリーでの識別が可能になる。
【００４４】
我々は以前、マウスの主要なＴリンパ球（図５Ａ）のためのこのトランスフェクションプロトコルを開発し、類似の状況が、Ｂ細胞トランスフェクションのための初期の開始点を提供するだろうと予想する。我々の以前の実験において、我々は、トランスフェクトされた細胞を濃縮したデオキシリボヌクレアーゼ（Ｔｕｒｂｏデオキシリボヌクレアーゼ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理することで、偽陽性の表示を与える可能のある細胞表面に非特異的に結合するのではなく、ＤＮＡオリガミナノ構造体が、トランスフェクトされたリンパ球に進入することを実証し、その後、ＦＡＣＳ分析（図５Ａ）により成功するトランスフェクションのために細胞を分析した。我々はまた、濃縮したデオキシリボヌクレアーゼ処理により、ＤＮＡナノ構造体（図５Ｂ）の破壊が成功したことを確認した。このように、ＤＮＡオリガミは、主要なリンパ球のための申し分のないトランスフェクション効率を有する。Ｔｕｒｂｏデオキシリボヌクレアーゼは、専用の工学的なデオキシリボヌクレアーゼＩであり、我々がオリガミナノ構造体の分解においてかなり有効ではないと判断した、野生型のデオキシリボヌクレアーゼＩよりもＤＮＡに対する著しく高い親近性を有することに注意すべきであろう。さらに、我々のグループは以前、ＤＮＡオリガミは、細胞溶解物において１２時間安定性が高いことを示し〔３３〕、これらの構造が細胞質ヌクレアーゼ分解を起こしにくいことを確認した。
【実施例４】
【００４５】
配列データの管理、処理及び分析（予想作業）
このプロジェクトが成功するかどうかは、有効なデータ処理パイプラインと大量のデータの管理、処理及び共有に責任のある経験豊かな情報科学チーム次第である。したがって、対合された全ゲノムと、次世代データ処理及び分析パイプライン等のトランスクリプトーム次世代シーケンスデータを分析するための有効なパイプラインは、有効なソフトウェアツールを利用し、標準プラットフォーム独立フォーマット（図６）を作成するものとして、使用されている。パイプライン内の各工程で、統計ファイルが作成され、すべての処理が完了し、ファイルが損傷していないことを確認する。統計ファイルは、「並べられた塩基」、「不一致率」、及び「ｍｄ５ｓｕｍｓ」を含む。パイプラインの初期において、全体的なライブラリ範囲、ライブラリの一貫性、塩基の品質、及び汚染チェックの評価を含む、いくつかの追加的チェックを求める。このパイプラインは、以下を中心に構築される（１）標準化されたファイルフォーマット、（２）複数の品質管理チェック、（３）自動化処理、（４）配列データ、シーケンスアラインメント、変異通話の公表予定、及び（５）集権的主要データ処理。
【００４６】
いかなる所定の塩基でバイアスを定量化するための一連の品質管理工程で読取が行われ、固有のＣＤＲ３構造の精密なスプリットリードアラインメントのためにＢＷＡ−ＭＥＭを使用して、アラインメントのための独立ＦＡＳＴＱファイルに読取値が分析される。各配列には、１２のヌクレオチドがＶＫ又はＶＨ遺伝子断片の１つにマッチングし、Ｖ断片の３’末端で第２保存システインからＣＡＳＳのコンセンサスアミノ酸配列に対応し、同様に、６のヌクレオチドは、保存フェニルアラニンに対応するＪ断片にマッチングする。これらコドンの間のヌクレオチドの総数で長さが決定され、その結果、ＣＤＲ３領域のリーディングフレームが決定される。処理された配列データは、ＡＳＵの安全な関係のあるデータベース管理システムに預けられ、安全なＭｏｎｇｏＤＢの実例がアドホッククエリを可能にするのと同様に、ＪａｓｐｅｒソフトサーバーによるＷｅｂＡｐｐフロントエンドを可能にする。ＩｇＨとＩｇＬの配列の対合は個々の細胞を形成し、基礎的な「ｉｆ−ｔｈｅｎ」アルゴリズムにより行われ、各読取値の１０−ｍｅｒ バーコード配列ストレッチで相補的塩基対合を検索する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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