(57)【要約】本明細書では、患者においてＧｒｂ２核酸の翻訳開始部位とハイブリダイズする有効量のヌクレアーゼ耐性ポリヌクレオチド及び、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害薬（例えばダサチニブ）かシチジン類縁体（例えばデシタビンまたはシタラビン）かのどちらかを投与することを含む、患者のがんを処置する方法を提供する。がんは、Ｐｈ＋及び／またはＢｃｒ−Ａｂｌ陽性の慢性骨髄性白血病または急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんの処置を、それを必要とする患者に施す方法であって、
前記患者においてＧｒｂ２核酸とハイブリダイズするヌクレアーゼ耐性ポリヌクレオチドを含む有効量の第１薬物療法、及び
Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害薬を含む第２薬物療法
を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドがＧｒｂ２核酸の翻訳開始部位とハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、８〜５０塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドである、請求項１か請求項２かのどちらかに記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で示される配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドがＰ−エトキシ主鎖結合を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがリポソーム中に封入されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１薬物療法がさらに中性脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１薬物療法が全身投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１薬物療法が動脈内または静脈内への投与のために製剤化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１薬物療法が約６０ｍｇ／ｍ２〜約９０ｍｇ／ｍ２の投薬量で投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１薬物療法が週に２〜４回投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害薬がダサチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ、ポナチニブまたはバフェチニブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害薬がダサチニブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ダサチニブが約１４０ｍｇの投薬量で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ダサチニブが１日１回投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２薬物療法が全身投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２薬物療法が、経口、動脈内または静脈内投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１薬物療法が、前記第２薬物療法の投与に先立って投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１薬物療法及び前記第２薬物療法が同時発生的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１薬物療法及び前記第２薬物療法が別個の経路で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記がんが、大腸癌、神経芽腫、乳癌、膵臓癌、脳癌、肺癌、胃癌、血液癌、皮膚癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌または食道癌、子宮頸癌、頭頸部癌、非メラノーマ性皮膚癌または神経膠芽腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記がんが血液癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記血液癌が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＭＬが移行期ＣＭＬまたは芽球期ＣＭＬである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＭＬまたはＡＭＬがＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬまたはＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＡＭＬである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬまたはＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＡＭＬがＴ３１５Ｉ  Ｂｃｒ−Ａｂｌ突然変異について陽性である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＭＬまたはＡＭＬがフィラデルフィア染色体陽性ＣＭＬまたはフィラデルフィア染色体陽性ＡＭＬである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記患者が、以前にイマチニブによる処置が失敗した者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
がんまたは骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の処置を、それを必要とする患者に施す方法であって、
Ｇｒｂ２核酸とハイブリダイズするヌクレアーゼ耐性ポリヌクレオチドを含む有効量の第１薬物療法、及び
シチジン類縁体を含む第２薬物療法
を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドがＧｒｂ２核酸の翻訳開始部位とハイブリダイズする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチドが、８〜５０塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドである、請求項３０か請求項３１かのどちらかに記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で示される配列を有する、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドがＰ−エトキシ主鎖結合を含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドがリポソーム中に封入されている、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１薬物療法がさらに中性脂質を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１薬物療法が全身投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１薬物療法が動脈内または静脈内への投与のために製剤化される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１薬物療法が約６０ｍｇ／ｍ２〜約９０ｍｇ／ｍ２の投薬量で投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１薬物療法が週に２〜４回投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記シチジン類縁体がデシタビン、シタラビンまたはアザシチジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記シチジン類縁体がデシタビンである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記シチジン類縁体がシタラビンである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記シタラビンが約２０ｍｇの投薬量で投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記シタラビンが１日２回投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記シタラビンが皮下投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１薬物療法が、前記第２薬物療法の投与に先立って投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１薬物療法及び前記第２薬物療法が同時発生的に投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４９】
前記第２薬物療法が、前記第１薬物療法の投与に先立って投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１薬物療法及び前記第２薬物療法が別個の経路で投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項５１】
前記患者がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項５２】
前記がんが、大腸癌、神経芽腫、乳癌、膵臓癌、脳癌、肺癌、胃癌、血液癌、皮膚癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌または食道癌、子宮頸癌、頭頸部癌、非メラノーマ性皮膚癌または神経膠芽腫である、請求項３０に記載の方法。
【請求項５３】
前記がんが血液癌である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記血液癌が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＣＭＬが移行期ＣＭＬまたは芽球期ＣＭＬである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＣＭＬまたはＡＭＬがＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬまたはＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＡＭＬである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬまたはＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＡＭＬがＴ３１５Ｉ  Ｂｃｒ−Ａｂｌ突然変異について陽性である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＣＭＬまたはＡＭＬがフィラデルフィア染色体陽性ＣＭＬまたはフィラデルフィア染色体陽性ＡＭＬである、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１７年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４８７，２７７号及び２０１６年９月１６日に出願された第６２／３９５，６８０号に基づく優先権の利益を主張するものであり、参照によりこれらの各々の全内容を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、総じて医薬の分野に関する。より詳しくはそれは、Ｇｒｂ２を指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む併用療法によるがんの処置に関する。
【０００３】
２．関連技術の説明
米国がん協会は、２０１５年に米国内で新たに慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）と診断された患者は約６，６００名、ＣＭＬで亡くなったのは約１，１４０名であったと見積もっている。ＣＭＬと診断された時の平均年齢は６４歳あたりである。ほぼ半数の症例は６５歳以上の人で診断されている。この類の白血病に罹患するのは主に成人であり、子供にみられることは稀である。ＣＭＬは、慢性期、移行期及び芽球期に区別される。ほとんどのＣＭＬ患者は疾患の慢性期に診断される。慢性期のＣＭＬ患者は、処置されない場合には急速に疾患の移行期及び芽球期に進行し得る。
【０００４】
フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）は、ＣＭＬの患者の９０〜９５％に存在する。それは９番及び２２番染色体の転座に起因するが、これによってａｂｌ遺伝子がｂｃｒ遺伝子の３’末端に配置される。この遺伝子再構成は、全ての患者に存在し、標準的核型がフィラデルフィア染色体を示していない患者においてさえ存在する。この染色体転座はキメラ遺伝子を生むが、これは、Ｐｈ＋  ＣＭＬ細胞ではｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質として発現する。Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質は、調節解除されたチロシンキナーゼ活性を有し、その結果としてＲＡＳ及びホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル伝達経路が活性化されるが、これはＰｈ＋細胞の悪性形質転換、増殖及び生存を招く。
【０００５】
Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質を標的とするチロシンキナーゼ阻害薬として知られる薬物はＣＭＬ患者のための標準的処置である。なぜならば、Ｂｃｒ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性を抑制することによってＰｈ＋細胞の増殖及び生存が低減されるからである。第１世代のチロシンキナーゼ阻害薬であるイマチニブ（グリーベック（登録商標））は、慢性期及び移行期のＣＭＬ患者のための標準的処置である。しかしながら、芽球期のＣＭＬ患者ではイマチニブは奏効しない。さらに、ＣＭＬ慢性期または移行期の患者の一部にイマチニブ耐性が認められたことがある。第二世代チロシンキナーゼ阻害薬（例えば、ダサチニブ（Ｄａｓ））は通常、イマチニブを忍容できない、またはイマチニブに耐性であるＣＭＬ患者に対して、与えられる。しかし、ＣＭＬ患者においてＢｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質にＴ３１５Ｉ遺伝子突然変異が導入されている場合にはイマチニブまたは第２世代チロシンキナーゼ阻害薬が奏効しないであろう。移行期もしくは芽球期にある、またはチロシンキナーゼ阻害薬に対して耐性であるＣＭＬ患者のためのより効果的な療法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ある実施形態において、本明細書では、がんの処置を、それを必要とする患者に施す方法であって、患者においてＧｒｂ２核酸とハイブリダイズするヌクレアーゼ耐性ポリヌクレオチドを含む有効量の第１薬物療法、及びＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害薬を含む第２薬物療法を患者に投与することを含む、当該方法を提供する。いくつかの態様において本明細書では、がんの処置を、それを必要とする患者に施すことに使用するための、組成物を提供し、上記組成物は、患者においてＧｒｂ２核酸とハイブリダイズするヌクレアーゼ耐性ポリヌクレオチドを含む第１薬物療法、及びＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害薬を含む第２薬物療法を含む。
【０００７】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドはＧｒｂ２核酸の翻訳開始部位とハイブリダイズする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、８〜５０塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１で示される配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドはＰ−エトキシ主鎖結合を含む。
【０００８】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドはリポソーム中に封入されている。いくつかの態様では、第１薬物療法はさらに中性脂質を含む。いくつかの態様では、第１薬物療法はＢＰ１００１である。いくつかの態様では、第１薬物療法は全身投与される。いくつかの態様では、第１薬物療法は動脈内または静脈内への投与のために製剤化される。いくつかの態様では、第１薬物療法は約６０ｍｇ／ｍ２〜約９０ｍｇ／ｍ２の投薬量で投与される。いくつかの態様では、第１薬物療法は週に２〜４回投与される。
【０００９】
いくつかの態様では、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害薬はダサチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ、ポナチニブまたはバフェチニブである。ある態様では、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害薬はダサチニブである。いくつかの態様では、ダサチニブは約１４０ｍｇの投薬量で投与される。いくつかの態様では、ダサチニブは１日１回投与される。
【００１０】
いくつかの態様では、第２薬物療法は全身投与される。いくつかの態様では、第２薬物療法は、経口、動脈内または静脈内投与される。いくつかの態様では、第１薬物療法が、第２薬物療法の投与に先立って投与される。
【００１１】
いくつかの態様では、第１薬物療法及び第２薬物療法は同時発生的に投与される。いくつかの態様では、第１薬物療法及び第２薬物療法は別個の経路で投与される。
【００１２】
いくつかの態様では、患者はヒトである。いくつかの態様では、患者は、以前にイマチニブによる処置が失敗した者である。
【００１３】
いくつかの態様では、がんは、大腸癌、神経芽腫、乳癌、膵臓癌、脳癌、肺癌、胃癌、血液癌、皮膚癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌または食道癌、子宮頸癌、頭頸部癌、非メラノーマ性皮膚癌または神経膠芽腫である。いくつかの態様では、がんは血液癌である。いくつかの態様では、血液癌は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。いくつかの態様では、ＣＭＬは移行期ＣＭＬまたは芽球期ＣＭＬである。いくつかの態様では、ＣＭＬまたはＡＭＬはＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬまたはＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＡＭＬである。いくつかの態様では、Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬまたはＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＡＭＬはＴ３１５Ｉ  Ｂｃｒ−Ａｂｌ突然変異について陽性である。いくつかの態様では、ＣＭＬまたはＡＭＬはフィラデルフィア染色体陽性ＣＭＬまたはフィラデルフィア染色体陽性ＡＭＬである。
【００１４】
ある実施形態において、本明細書では、がんまたは骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の処置を、それを必要とする患者に施す方法であって、Ｇｒｂ２核酸とハイブリダイズするヌクレアーゼ耐性ポリヌクレオチドを含む有効量の第１薬物療法、及びシチジン類縁体を含む第２薬物療法を患者に投与することを含む、当該方法を提供する。いくつかの態様において本明細書では、がんまたは骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の処置を、それを必要とする患者に施すことに使用するための、組成物を提供し、上記組成物は、Ｇｒｂ２核酸とハイブリダイズするヌクレアーゼ耐性ポリヌクレオチドを含む有効量の第１薬物療法、及びシチジン類縁体を含む第２薬物療法を含む。
【００１５】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドはＧｒｂ２核酸の翻訳開始部位とハイブリダイズする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、８〜５０塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１で示される配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドはＰ−エトキシ主鎖結合を含む。
【００１６】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドはリポソーム中に封入されている。いくつかの態様では、第１薬物療法はさらに中性脂質を含む。いくつかの態様では、第１薬物療法はＢＰ１００１である。いくつかの態様では、第１薬物療法は全身投与される。いくつかの態様では、第１薬物療法は動脈内または静脈内への投与のために製剤化される。いくつかの態様では、第１薬物療法は約６０ｍｇ／ｍ２〜約９０ｍｇ／ｍ２の投薬量で投与される。いくつかの態様では、第１薬物療法は週に２〜４回投与される。
【００１７】
いくつかの態様では、シチジン類縁体はデシタビン、シタラビンまたはアザシチジンである。いくつかの態様では、シチジン類縁体はデシタビンである。いくつかの態様では、シチジン類縁体はシタラビンである。いくつかの態様では、シタラビンは約２０ｍｇの投薬量で投与される。いくつかの態様では、シタラビンは１日２回投与される。いくつかの態様では、シタラビンは皮下投与される。
【００１８】
いくつかの態様では、第１薬物療法は、第２薬物療法の投与に先立って投与される。いくつかの態様では、第１薬物療法及び第２薬物療法は同時発生的に投与される。いくつかの態様では、第２薬物療法は、第１薬物療法の投与に先立って投与される。いくつかの態様では、第１薬物療法及び第２薬物療法が別個の経路で投与される。
【００１９】
いくつかの態様では、患者はヒトである。
【００２０】
いくつかの態様では、がんは、大腸癌、神経芽腫、乳癌、膵臓癌、脳癌、肺癌、胃癌、血液癌、皮膚癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌または食道癌、子宮頸癌、頭頸部癌、非メラノーマ性皮膚癌または神経膠芽腫である。いくつかの態様では、がんは血液癌である。いくつかの態様では、血液癌は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。いくつかの態様では、ＣＭＬは移行期ＣＭＬまたは芽球期ＣＭＬである。いくつかの態様では、ＣＭＬまたはＡＭＬはＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬまたはＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＡＭＬである。いくつかの態様では、Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬまたはＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＡＭＬはＴ３１５Ｉ  Ｂｃｒ−Ａｂｌ突然変異について陽性である。いくつかの態様では、ＣＭＬまたはＡＭＬはフィラデルフィア染色体陽性ＣＭＬまたはフィラデルフィア染色体陽性ＡＭＬである。
【００２１】
ある実施形態では、ＧＲＢ２ポリヌクレオチド遺伝子産物とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの集団を含む組成物が提供される。いくつかの態様では、集団のオリゴヌクレオチドは、リン酸主鎖結合を介して繋ぎ合わせられたヌクレオシド分子からなり、各オリゴヌクレオチド中のリン酸主鎖結合のうちの少なくとも１つはＰ−エトキシ主鎖結合であり、各オリゴヌクレオチド中のリン酸主鎖結合のうちの８０％以下はＰ−エトキシ主鎖結合である。いくつかの態様では、各オリゴヌクレオチドにおけるリン酸主鎖結合のうちの少なくとも１つはホスホジエステル主鎖結合である。いくつかの態様では、集団のオリゴヌクレオチドは、配列番号１で示される配列を含む。様々な態様において、集団のオリゴヌクレオチドは、Ｇｒｂ２タンパク質の発現を阻害する。いくつかの態様では、組成物は凍結乾燥されている。
【００２２】
いくつかの態様では、リン酸主鎖結合のうちの１０〜８０％がＰ−エトキシ主鎖結合であるか、リン酸主鎖結合のうちの２０〜８０％がＰ−エトキシ主鎖結合であるか、リン酸主鎖結合のうちの３０〜８０％がＰ−エトキシ主鎖結合であるか、リン酸主鎖結合のうちの４０〜８０％がＰ−エトキシ主鎖結合であるか、リン酸主鎖結合のうちの５０〜８０％がＰ−エトキシ主鎖結合であるか、もしくはリン酸主鎖結合のうちの６０〜７０％がＰ−エトキシ主鎖結合であるか、またはそれらに含まれる任意の導出可能な範囲においてそうである。いくつかの態様では、リン酸主鎖結合のうちの２０〜９０％がホスホジエステル主鎖結合であるか、リン酸主鎖結合のうちの２０〜８０％がホスホジエステル主鎖結合であるか、リン酸主鎖結合のうちの２０〜７０％がホスホジエステル主鎖結合であるか、リン酸主鎖結合のうちの２０〜６０％がホスホジエステル主鎖結合であるか、リン酸主鎖結合のうちの２０〜５０％がホスホジエステル主鎖結合であるか、もしくはリン酸主鎖結合のうちの３０〜４０％がホスホジエステル主鎖結合であるか、またはそれらに含まれる任意の導出可能な範囲においてそうである。様々な態様において、リン酸主鎖結合のうちの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％またはそれらに含まれる任意の値がＰ−エトキシ主鎖結合である。様々な態様において、リン酸主鎖結合のうちの最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％またはそれらに含まれる任意の値がホスホジエステル主鎖結合である。特定の態様では、ホスホジエステル主鎖結合はオリゴヌクレオチドの全体にわたって分布している。このように、オリゴヌクレオチドはキメラ分子ではない。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート主鎖結合を含まない。
【００２３】
いくつかの態様では、集団のオリゴヌクレオチドの大きさは７〜３０ヌクレオチドである。特定の態様では、集団のオリゴヌクレオチドの大きさは１２〜２５ヌクレオチドである。様々な態様において、集団のオリゴヌクレオチドの大きさは少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドである。大きさは集団中のオリゴヌクレオチドの平均の大きさであり得る。
【００２４】
いくつかの態様では、集団のオリゴヌクレオチドの平均の大きさは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドであり、各オリゴヌクレオチド中のリン酸主鎖結合のうちの５、６、７、８、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個以下はそれぞれＰ−エトキシ主鎖結合である。いくつかの態様では、集団のオリゴヌクレオチドの平均の大きさは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドであり、各オリゴヌクレオチド中のリン酸主鎖結合のうちの少なくとも２、２、２、２、３、３、３、３、４、４、４、４、４、５、５、５、５、５、５、６、６、６、６または６個はそれぞれホスホジエステル主鎖結合である。
【００２５】
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの集団は、単一種類のオリゴヌクレオチドを含む。他の態様では、オリゴヌクレオチドの集団は、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドを含む。単一種類のオリゴヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列を有するが分子内の異なる位置においてＰ−エトキシ結合を有するまたは欠くものであり得る。このように、集団は、ヌクレオチドに関しては同質であり得、集団のオリゴヌクレオチドの間でホスホジエステル主鎖結合の分布に関しては異質であり得る。さらに、集団は、集団のオリゴヌクレオチドの間でＰ−エトキシ主鎖結合及びホスホジエステル主鎖結合の数に関して異種であり得る。非限定的な例を挙げると、集団のオリゴヌクレオチドの第１部分は７０％のＰ−エトキシ結合及び３０％のホスホジエステル結合を有し得るが、集団のオリゴヌクレオチドの第２部分は６０％のＰ−エトキシ結合及び４０％のホスホジエステル結合を有し得る。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの集団は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはｐｉｗｉＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含む。
【００２６】
様々な態様において、組成物はさらにリン脂質を含む。いくつかの態様では、リン脂質とオリゴヌクレオチドとが約５：１〜約１００：１のモル比で存在する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドとリン脂質とがオリゴヌクレオチド−脂質複合体、例えばリポソーム複合体などを形成する。いくつかの態様では、リポソームのうちの少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は直径が５ミクロン未満である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの集団はリポソームの集団に組み込まれる。
【００２７】
いくつかの態様では、リン脂質は生理的ｐＨにおいて帯電していない、つまり中性電荷を有する。いくつかの態様では、リン脂質は中性リン脂質である。特定の態様では、中性リン脂質はホスファチジルコリンである。特定の態様では、中性リン脂質はジオレオイルホスファチジルコリンである。いくつかの態様では、リン脂質はコレステロールを本質的に含まない。
【００２８】
ある実施形態では、本実施形態のオリゴヌクレオチドとリン脂質との構成物、及び薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物が提供される。いくつかの態様では、組成物はさらに化学療法剤を含む。
【００２９】
ある実施形態では、細胞を本実施形態のオリゴヌクレオチド構成物と接触させることを含む、細胞内のＧｒｂ２タンパク質の発現レベルを低下させる方法が提供される。いくつかの態様では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様では、細胞はがん細胞である。
【００３０】
ある実施形態では、細胞を本実施形態の医薬組成物と接触させることを含む、治療的有効量のオリゴヌクレオチドを細胞に送達する方法が提供される。いくつかの態様では、方法は、過形成、がん、自己免疫疾患または感染性疾患を処置する方法である。
【００３１】
ある実施形態では、対象に本実施形態の医薬組成物を治療的有効量投与することを含む、がん、自己免疫疾患または感染性疾患を有する対象を処置する方法が提供される。いくつかの態様では、対象はヒトである。いくつかの態様では、がんは、膀胱癌、血液癌、リンパ腫、膵臓癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、皮膚癌、精巣癌、舌癌、卵巣癌または子宮癌である。本発明の方法で処置することができる腫瘍としては、限定されないが例えば、メラノーマ、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、乳腺癌、頭頸部扁平上皮癌、乳頭状腎細胞癌、胆嚢癌、直腸癌、膵臓癌、肺癌、結腸癌、神経膠腫、星細胞腫、古典的ホジキンリンパ腫及び平滑筋腫瘍ならびに、神経膠芽腫からの細胞、骨髄幹細胞、造血細胞、骨芽細胞、上皮細胞、線維芽細胞、ならびにアポトーシスを経て腫瘍細胞に対する抵抗性または退縮を誘導する他の任意の腫瘍細胞が挙げられる。いくつかの態様では、自己免疫は、紅斑性狼瘡、脊椎関節症、シェーグレン病、クローン病、真性糖尿病、多発性硬化症または関節リウマチである。いくつかの態様では、感染性疾患は、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症または寄生虫感染症である。いくつかの態様では、組成物は、皮下、静脈内または腹腔内に投与される。いくつかの態様では、方法はさらに、対象に少なくとも第２抗がん療法を投与することを含む。いくつかの態様では、第２抗がん療法は、外科的療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法である。いくつかの態様では、組成物の投与は、患者におけるＧｒｂ２タンパク質の発現を減少させる。
【００３２】
「捕捉する」、「封入する」及び「組み込む」は、関心対象の薬剤を抱合するまたは取り囲むことによって溶液中への自由な拡散に対する妨害物を形成している、脂質またはリポソームを指し、例えば、リポソームは脂質層中、または脂質層の内部もしくは間の水性区画内に薬剤を封入しているものであり得る。特定の実施形態では、構成物が、薬学的に許容できる担体の中に含まれている。薬学的に許容できる担体は、ヒト対象または患者への投与のために製剤化されているものであり得る。
【００３３】
特定の実施形態では、脂質成分は、中性リン脂質または正味の中性電荷を含むがために、本質的に中性電荷を有する。特定の態様では、中性リン脂質は、ホスファチジルコリン、例えば、ＤＯＰＣ、卵由来ホスファチジルコリン（「ＥＰＣ」）、ジラウロイルホスファチジルコリン（「ＤＬＰＣ」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、ジステアトイルホスファチジルコリン（「ＤＳＰＣ」）、ジリノレオイルホスファチジルコリン、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＡＰＣ」）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＥＰＣ」）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＭＰＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（「ＰＭＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（「ＰＳＰＣ」）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＳＰＰＣ」）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（「ＰＯＰＣ」）、１−オレオイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＯＰＰＣ」）、またはリゾホスファチジルコリンであり得る。他の態様では、中性リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＭＰＥ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＰＯＰＥ」）またはリゾホスファチジルエタノールアミンであり得る。特定の実施形態では、リン脂質成分は、１、２、３、４、５、６、７、８またはそれより多い種類またはタイプの中性リン脂質を含み得る。他の実施形態では、リン脂質成分は、２、３、４、５、６またはそれより多い種類またはタイプの中性リン脂質を含み得る。
【００３４】
特定の実施形態では、脂質成分は、正に帯電した脂質及び負に帯電した脂質を含むがために、本質的に中性電荷を有し得る。脂質成分はさらに、中性に帯電した脂質（複数可）またはリン脂質（複数可）を含み得る。正に帯電した脂質は正に帯電したリン脂質であってもよい。負に帯電した脂質は負に帯電したリン脂質であってもよい。負に帯電したリン脂質は、ホスファチジルセリン、例えば、ジミリストイルホスファチジルセリン（「ＤＭＰＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「ＤＰＰＳ」）または脳由来ホスファチジルセリン（「ＢＰＳ」）であってもよい。負に帯電したリン脂質は、ホスファチジルグリセロール、例えば、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＬＰＧ」）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「ＤＰＰＧ」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＳＰＧ」）またはジオレオイルホスファチジルグリセロール（「ＤＯＰＧ」）であってもよい。特定の実施形態では、構成物はさらに、コレステロールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。他の実施形態では、構成物はコレステロールを本質的に含まない。特定の実施形態では、リン脂質は、天然に存在するリン脂質である。他の実施形態では、リン脂質は合成リン脂質である。
【００３５】
リポソームは、脂質材料が実質的に帯電していない限り１つ以上のリン脂質で作られることができる。構成物は、アニオン性及びカチオン性のリン脂質及びコレステロールを実質的に含まないことが重要である。適するリン脂質には、ホスファチジルコリン、及び当業者によく知られている他のものを含む。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、指定成分に関して「本質的に含まない」は、指定成分が意図的に組成物として少しも製剤化されていないこと、及び／または不純物としてもしくは痕跡量で存在しているに過ぎないことを意味して本明細書中で使用される。したがって、組成物の何らかの非意図的汚染に起因する指定成分の総量は、０．０５％を優に下回り、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいのは、標準的な分析方法で指定成分の量を検出することができない組成物である。
【００３７】
本願の明細書中で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。本願の請求項（複数可）中で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」という単語は、「含む」という単語と一緒に使用される場合、１つまたは２つ以上を意味し得る。
【００３８】
請求項における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことまたは代替物が相互に排他的であることが明示的に示されている場合を除き、「及び／または」を意味して使用される。但し、本開示は、代替物のみ及び「及び／または」を指す定義を支持する。本明細書中で使用する場合、「別の」は、少なくとも第２以降を意味し得る。
【００３９】
本願の全体を通して、「約」という用語は、値が、当該値を決定するために採用される装置もしくは方法に固有の誤差変動、または試験対象の間で存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００４０】
本発明の他の目的及び利点は以下の詳細な説明から明らかとなろう。しかしながら、詳細な説明及び具体例は本発明の好ましい実施形態を示しながらも例示としてのみ与えられているということを理解すべきである、というのも、当業者にとっては本発明の趣旨及び範囲に含まれる様々な変更及び改変が詳細な説明から明らかであろうからである。
【００４１】
以下の図面は、本明細書の一部を形成するものであり、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれている。本発明は、本明細書中で提示される具体的実施形態の詳細な説明と併せてこれらの図面を参照することによってよりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】患者の血漿中のＧｒｂ２アンチセンスオリゴの濃度である。ＢＰ１００１の血漿中レベルは二重指数関数的に低下した。実線は用量が６０ｍｇ／ｍ２であり、破線は用量が９０ｍｇ／ｍ２であった。
【図２】ＢＰ１００１＋低用量Ａｒａ−Ｃは難治性／再発性のＡＭＬ患者において骨髄芽球を減少させた。
【図３】試験デザインの図解である。
【図４】チロシンキナーゼシグナルを遅延させることにおけるＧＲＢ２の肝要な役割を示す図である。
【図５】Ｇｒｂ２タンパク質の産生の選択的阻害。ＢＶ１７３細胞（図５Ａ）及びＡＬＬ−１細胞（図５Ｂ）を４〜８μＭのＬ−Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴ及びＬ−対照オリゴと共にインキュベートした。３日間培養した後、タンパク質含有層を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に転写した。ブロットを切片として切り出し、Ｇｒｂ２（標的）またはＣｒｋ１（対照）タンパク質に特異的な抗体と共にインキュベートした。
【図６】白血病のマウスモデルにおけるＢＰ１００１の活性。図６Ａは、３２Ｄｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病異種移植片を保有するマウスの、１５ｍｇ／ｋｇ／用量のＢＰ１００１による処置を示す。図６Ｂは、３２Ｄｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病細胞を保有するマウスの、５、１０または１５ｍｇ／ｋｇ／用量のＢＰ１００１による処置を示す。
【図７−１】ＢＰ１００１及びダサチニブの投与のタイミング及び順番の影響。図７Ａは、ダサチニブの投薬に先立つＢＰ１００１による１時間の前処置を示す。図７Ｂは、ＢＰ１００１の投薬に先立つダサチニブによる１日の前処置を示す。図７Ｃは、ダサチニブの投薬に先立つＢＰ１００１による１日の前処置を示す。
【図７−２】ＢＰ１００１及びダサチニブの投与のタイミング及び順番の影響。図７Ａは、ダサチニブの投薬に先立つＢＰ１００１による１時間の前処置を示す。図７Ｂは、ＢＰ１００１の投薬に先立つダサチニブによる１日の前処置を示す。図７Ｃは、ダサチニブの投薬に先立つＢＰ１００１による１日の前処置を示す。
【図８−１】ＢＰ１００１はダサチニブ細胞死誘導を強化する。図８Ａは、ｓｕｂ−Ｇ１期の細胞の百分率を示す。図８Ｂは、Ｇ１期の細胞の百分率を示す。図８Ｃは、Ｓ期の細胞の百分率を示す。図８Ｄは、Ｇ２／Ｍ期の細胞の百分率を示す。
【図８−２】ＢＰ１００１はダサチニブ細胞死誘導を強化する。図８Ａは、ｓｕｂ−Ｇ１期の細胞の百分率を示す。図８Ｂは、Ｇ１期の細胞の百分率を示す。図８Ｃは、Ｓ期の細胞の百分率を示す。図８Ｄは、Ｇ２／Ｍ期の細胞の百分率を示す。
【図８−３】ＢＰ１００１はダサチニブ細胞死誘導を強化する。図８Ａは、ｓｕｂ−Ｇ１期の細胞の百分率を示す。図８Ｂは、Ｇ１期の細胞の百分率を示す。図８Ｃは、Ｓ期の細胞の百分率を示す。図８Ｄは、Ｇ２／Ｍ期の細胞の百分率を示す。
【図９】ＢＰ１００１前処置はダサチニブ及びニロチニブによる細胞死誘導を強化する。図９Ａは、ＢＰ１００１による前処置の後のｓｕｂ−Ｇ１期の細胞の百分率を示す。図９Ｂは、チロシンキナーゼ阻害薬による前処置の後のｓｕｂ−Ｇ１期の細胞の百分率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
例示的実施形態の説明
Ｉ．成長因子受容体結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）
ｇｒｂ２遺伝子は、ヒト染色体領域１７ｑ２２−ｑｔｅｒに対応付けられ、白血病では重複する領域であるが、これはｇｒｂ２遺伝子産物のコピー数の増加を招き得る。Ｇｒｂ２は、マウス造血細胞の形質転換、及び高レベルの発がん性チロシンキナーゼを発現するヒト白血病細胞の増殖にとって重要であるため、Ｇｒｂ２の阻害は白血病の自然の過程に著しい影響を与え得る。
【００４４】
Ｇｒｂ２は、発がん性チロシンキナーゼをそれらの下流にあって細胞の増殖及び生存の肝要な調節物質であるＥＲＫ及びＡＫＴなどのシグナル伝達分子に繋げている。Ｇｒｂ２アダプタータンパク質は、２つのＳｒｃ相同性３（ＳＨ３）ドメインを両脇に有する１つのＳｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインを含有する。Ｇｒｂ２は、そのＳＨ２ドメインを使用して、活性化されたチロシンキナーゼ、例えばＢｃｒ−Ａｂｌ、ｃ−Ｃｂｌ及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）にみられるホスホチロシン残基に結合する一方、そのＳＨ３ドメインを使用して、グアニンヌクレオチド交換因子であるＳｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ（ＳＯＳ）にみられるようなプロリンに富むモチーフに結合する。ＧＴＰアーゼタンパク質であるＲＡＳは、ＧＴＰに結合しているときに活性であり、ＧＤＰに結合しているときには不活性である。ＳＯＳなどのグアニンヌクレオチド交換因子は、ＲＡＳ上でＧＤＰのＧＴＰによる交換を増進する。成長因子刺激があるとＧｒｂ２−ＳＯＳ複合体は、細胞質膜へ動員され、そこでＳＨ２ドメインを使用して、成長因子で刺激されたチロシンキナーゼ受容体に結合する。この結合は、細胞質膜に局在するＲＡＳにＳＯＳを接近させる。かくして、それはＲＡＳ活性を刺激することができる。その後、今度はＲＡＳ活性化が、様々な細胞プロセスの調節にとって重要な多様な下流シグナル伝達経路を活性化させることになる（Ｔａｒｉ，２００１ａ）。
【００４５】
最もよく知られているＲＡＳシグナル伝達経路は、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼカスケードである。このカスケードでは、ＲＡＳはＧＴＰ依存的にＲＡＦに結合する。この結合はＲＡＦ活性化をもたらす。活性化されたＲＡＦは、（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）ＭＥＫをリン酸化するが、今度はこれが、（細胞外調節キナーゼ１，２）ＥＲＫ１，２をリン酸化して活性化させる。活性化されたＥＲＫ１，２はその後、核に移行し、転写因子（例えば、ＥＬＫ−１及びＭＹＣ）をリン酸化することによって転写を活性化させる。図４は、Ｇｒｂ２シグナル伝達経路を示す。Ｂｃｒ−Ａｂｌがん遺伝子と同様に、ｃ−Ｃｂｌ原がん遺伝子はＣＭＬ細胞において恒常的にチロシンリン酸化を受ける。Ｇｒｂ２はＣＭＬ細胞においてｃ−ＣＢＬ駆動型経路を媒介する可能性がある、というのも、Ｇｒｂ２はｃ−Ｃｂｌと安定な複合体を形成することが示されているからである。この相互作用は骨髄前駆細胞の悪性形質転換を招き得る。
【００４６】
Ｇｒｂ２を阻害することによってＧｒｂ２−ＳＯＳ複合体はもはやＲＡＳ上でＧＤＰをＧＴＰと交換することができなくなる。したがって、ＭＡＰキナーゼカスケード及びその結果としての転写の下方制御が起こる（Ｔａｒｉ  ２００１ａ）。
【００４７】
ＩＩ．Ｇｒｂ２遺伝子発現の阻害
Ｇｒｂ２の機能を阻害する多様な方策が研究されてきた。１つの方策は、欠失非機能性ＳＨ２ドメインを有する、Ｇｒｂ２の代替スプライス形態をクローニングすることを含む（Ｆａｔｈ，１９９４）。コードされるＧｒｂ３−３タンパク質はリン酸化ＥＧＦＲに結合することがない、というのも欠失した残基はＧｒｂ２がホスホチロシン残基に結合するのに不可欠であるからである。しかしながら、Ｇｒｂ３−３は機能性ＳＨ３を保持している。それゆえ、Ｇｒｂ３−３はグアニンヌクレオチド交換因子の結合においてＧｒｂ２と競合することができる。Ｆａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）による試験において、Ｇｒｂ３−３をＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３線維芽細胞にマイクロインジェクションすることは、それがアポトーシスを経ることを誘導した。これらのクローンは、グアニンヌクレオチド交換因子の結合においてＧｒｂ２と競合するように企図されている。
【００４８】
第２の方策は、成長因子受容体のＧｒｂ２  ＳＨ２ドメインとの結合を防止する低分子阻害薬を使用する（Ｇａｙ，１９９９）。この低分子Ｇｒｂ２  ＳＨ２阻害薬は、Ｔｙｒ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｘモチーフを含有するホスホペプチドリガンドと複合体化した、Ｇｒｂ２のＸ線構造に基づく分子モデルを使用して考案されている。この阻害薬は、Ｇｒｂ２  ＳＨ２ドメインに対する認識及び選択的結合ができる要素を含有する。この阻害薬の目標は、発がん性形質転換を逆転させること、及び成長因子によって誘導される細胞運動性を防止することである（Ｇａｙ，１９９９）。
【００４９】
第３の方策は、Ｇｒｂ２結合性ホスホペプチドの使用を含む（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９９７）。細胞透過性のＧｒｂ２結合性ホスホペプチドで細胞を処理すると、結果としてそれはＧｒｂ２と会合し、成長因子受容体とＧｒｂ２との結合を阻害する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９９７）。これは成長因子刺激による有糸分裂誘発を停止させ得る。
【００５０】
第４に、Ｇｒｂ２発現の阻害は、Ｇｒｂ２  ｍＲＮＡの特定領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によって実現され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと結合すると、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成される。ハイブリッド形成は、ｍＲＮＡの翻訳、したがってコードされるタンパク質の発現を、阻害する。Ｇｒｂ２タンパク質が細胞の増殖にとって必須である場合、その阻害は成長抑制につながり得る。Ｇｒｂ２発現の阻害はさらに、薬物耐性を克服し得、がん細胞における化学療法誘導アポトーシスを促進し得る。
【００５１】
ＩＩＩ．Ｇｒｂ２に対するＰ−エトキシオリゴヌクレオチドアンチセンス療法ならびにＣＭＬ及びＡＭＬに対するその阻害活性
成長因子受容体結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）は、発がん性チロシンキナーゼ、例えばＢｃｒ−Ａｂｌによって利用されてＲａｓ経路を活性化させる。Ｇｒｂ２は、線維芽細胞を形質転換させマウスに白血病様疾患を誘導するＢｃｒ−Ａｂｌによって必要とされる。ｇｒｂ２  ｍＲＮＡに特異的なリポソーム組込型アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）であるＢＰ１００１は、Ｇｒｂ２発現を遮断するために開発された。Ｇｒｂ２の連続ｃＤＮＡ配列を配列番号２に提供し、Ｇｒｂ２のタンパク質配列を配列番号３に提供する。
【００５２】
Ｇｒｂ２を阻害するこの試みにおいて採用される方策は、Ｇｒｂ２  ｍＲＮＡに対して特異的であるリポソーム組込型ヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する。ＢＰ１００１においてアンチセンスオリゴヌクレオチド薬物質は、Ｐ−エトキシ主鎖を含有するヌクレアーゼ耐性ホスホジエステル類縁体である。この構造は、硫黄部分を欠くことから、ホスホロチオエート主鎖を使用したものよりも優れているとして選択された。ホスホロチオエート主鎖の硫黄部分は出血の素因と関連付けられることがあった。
【００５３】
使用するオリゴヌクレオチド配列は、５’−ＡＴＡＴＴＴＧＧＣＧＡＴＧＧＣＴＴＣ−３’（配列番号１）であり、ヒトＧｒｂ２  ｍＲＮＡの翻訳開始部位に対して特異的であり、それによってＧｒｂ２タンパク質産生を減じる。このアンチセンスは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性白血病細胞及び、高レベルのＨＥＲ２／ｎｅｕまたはＥＧＦＲを発現する乳癌細胞において、Ｇｒｂ２発現及び細胞増殖を抑制することが示された（図５Ａ〜Ｂ）。
【００５４】
ＢＰ１００１は、Ｇｒｂ２  ｍＲＮＡを標的とするヌクレアーゼ耐性疎水性Ｐ−エトキシアンチセンスオリゴが組み込まれた中性リポソームである。前臨床試験においてＢＰ１００１は、イマチニブ感受性及びイマチニブ耐性ＣＭＬ細胞株において成長阻害を誘導しＥＲＫ１，２及びＡｋｔのリン酸化を減少させるのに有効であった。加えて、ＢＰ１００１は、Ｐｈ＋白血病細胞株ＢＶ１７３及びＡＬＬ−１におけるＧｒｂ２タンパク質産生を選択的に阻害することが示され、また、Ｂｃｒ−Ａｂｌ＋白血病細胞株（ＡＬＬ−１、ＢＶ１７３及びＫ５６２細胞）の増殖を阻害することも判明した（表１６）。
【表１６】
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【００５５】
Ｇｒｂ２タンパク質発現の阻害は、Ｐｈ＋白血病患者に由来するＢｃｒ−Ａｂｌ＋細胞株における細胞成長阻害をもたらし、Ｇｒｂ２が、Ｂｃｒ−Ａｂｌによって誘導される細胞増殖において機能的役割を果たすこと、したがってＰｈ＋白血病の腫瘍原性潜在能の維持に致命的な役割を果たすことが実証された。これらの結果は、Ｇｒｂ２タンパク質の下方制御が、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼによって調節される細胞成長の阻害につながり得ることを示している。
【００５６】
ＢＰ１００１は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性白血病異種移植片を保有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存数を増加させるのに有効であった（Ｔａｒｉ，２００７）。３２Ｄｐ２１０  Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性白血病細胞を注射されてその後にＢＰ１００１で処置されたマウスにおけるこの薬剤に対する抗腫瘍応答が試験によって示された。
【００５７】
ある試験では、３２Ｄｐ２１０  Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性白血病細胞が注射されたマウスを、腫瘍細胞の注射の１日後から始めて６週目まで週に２回、ＢＰ１００１（１５ｍｇ／ｋｇ／用量）または対照（空のＤＯＰＣリポソーム）で静脈内処置した。マウスの瀕死状態／運動性を毎日観察した。生存している全てのマウスを４０日目に安楽死させた。３２Ｄｐ２１０  Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性白血病細胞が注射されたマウスでは、ＢＰ１００１で処置された６０％が４０日目（試験終了）まで生存したのに比べ、空のリポソームを受けているマウスでは１７％であった。平均生存持続期間はこれらの処置動物では３１．６±１３．１日であったのに比べ、空のリポソームの群では２３．７±８．３であった。
【００５８】
３２Ｄｐ２１０  Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性白血病細胞を注射されたマウスにおける第２の試験では、処置群は５、１０または１５ｍｇ／ｋｇ／用量のＢＰ１００１の静脈内投与を、腫瘍細胞の注射の１日後から始めて７週目まで週に２回受けた。対照群は、ランダムな配列のオリゴヌクレオチドを含有するＤＯＰＣリポソーム（１５ｍｇ／ｋｇ／用量）を同じスケジュールで受けた。マウスの瀕死状態／運動性を毎日観察した。生存しているマウスを、対照群については４１日目、処置群については４８日目に安楽死させた。１５ｍｇ／ｋｇ／用量の投薬レベルでは、ＢＰ１００１で処置されたマウスは８０％が４８日目（試験終了）まで生存したのに比べ、１５ｍｇ／ｋｇ／用量のリポソーム型対照オリゴヌクレオチドを受けているマウスでは０％であった（図６Ｂ）。これらの群において平均生存持続期間はそれぞれ４４．２±８．５日対２０．４±７．９日であった。５または１０ｍｇ／ｋｇ／用量のＢＰ１００１で処置されたマウスの平均生存持続期間はそれぞれ２０．８±４．７日及び２２．２±８．７日であった。結果は、１５ｍｇ／ｋｇ／用量の投薬レベルでのＢＰ１００１による週に２回の処置が対照オリゴヌクレオチド処置に比べて３２Ｄｐ２１０  Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬ誘導マウスの生存数を増加させたことを示した。
【００５９】
さらに、治験第Ｉ相のＣＭＬ患者において、４回のＢＰ１００１点滴を受けた後に末梢芽球の有意な減少（８１％から５％）が認められた。患者は、Ｔ３１５Ｉ突然変異によって特徴付けられるＣＭＬ急性転化を起こしていた。これらのデータは、Ｇｒｂ２がＣＭＬ進行において肝要な役割を果たすことを示唆している。さらに、前臨床試験は、ＢＰ１００１前処置が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞におけるシタラビンの細胞障害性を強化することを指し示す。
【００６０】
ＩＶ．ＢＰ１００１の薬理学及び毒性学
Ａ．ラットでの薬物動態研究
静脈内（ｉ．ｖ．）投与後のラットでＢＰ１００１の薬物動態研究が行われた（Ｔａｒｉ，２００７）。Ｌｅｗｉｓラット（ｎ＝５、４００ｇｍ）の右大腿動脈及び左大腿静脈にカニューレを挿入し、放射標識（３２Ｐ）ＢＰ１００１を体重１ｋｇあたり１０ｍｇのオリゴヌクレオチドの用量で静脈内注射した。注射から５、１０、２０、３０、６０、９０、１２０、１８０及び２４０分後に血液（０．３ｍＬ）を右大腿動脈から採取した。各採血の後にはカテーテルをヘパリンナトリウム１：１０００（単位／ｍＬ）で洗い流した。全血試料を抽出し、以前に記載されているような液体シンチレーション（Ｔａｒｉ，１９９８、Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｐｕｅｎｔｅ，１９９９）によって３２Ｐ放射性について検査した。薬物動態パラメータを非線形回帰解析（Ｒｓｔｒｉｐ；Ｍｉｃｒｏ  Ｍａｔｈ，Ｉｎｃ．，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）によって決定した。全血の薬物濃度データは２−コンパートメントモデルで最もよく近似された。血液からのＢＰ１００１のクリアランスは２−コンパートメント数学的モデルで緊密に近似されることが分かった（相関ｒ２＞０．９８）。初期の分布相は注射後の最初の６分間にわたって起こった（ｔ１／２α＝５．１６±０．３分）。終末相の半減期（ｔ１／２β）は２２５．６±１３．２分であった。すぐに分かる分布容積（３６．４２±１．８８ｍＬ）はこの大きさのラットの総血液体積よりも高かった。濃度曲線下面積（ＡＵＣ）が５．４±０．９ｍｇ／ｍＬ×分であった一方、滞留時間は３０９．６±２１．５分であった。この試験で認められたＢＰ１００１の薬物動態分布及び高い分布容積は、以前に研究された他のリポソーム組込型Ｐ−エトキシオリゴヌクレオチドについて報告されたそれと類似していた（Ｔａｒｉ，１９９８、Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｐｕｅｎｔｅ，１９９９）。
【００６１】
Ｂ．マウスでのＢＰ１００１組織分布試験
静脈内投与後のマウスでＢＰ１００１の組織分布試験を行った。２０匹のマウス（５匹／群）を３つの試験項目群と１つの対照群とに分けた。試験項目群には尾静脈を介して放射標識（３２Ｐ）ＢＰ１００１を体重１ｋｇあたり２０ｍｇのオリゴヌクレオチドの用量で静脈内注射した。注射したマウスを臓器採取のために注射から４、２４及び４８時間後にＣＯ２吸入によって安楽死させた。対照動物は非注射動物であった。脾臓、肝臓、腎臓、心臓、胃、肺及び骨髄組織を全ての動物から採取し、各臓器から組織試料（５０〜１００ｍｇ）を計り取って加工した。シンチレーション計数器で３２Ｐ放射性の計数を行った。結果は平均μｇのＢＰ１００１／ｇ組織として表した。予想されるように、対照動物では放射性は検出されなかった。ＢＰ１００１の組織分布は、以前に研究された他のリポソーム組込型Ｐ−エトキシオリゴヌクレオチドについて報告されたそれと類似していた。ＢＰ１００１は全ての組織で蓄積し、脾臓、肝臓及び腎臓組織において最も多く蓄積していた。注射から４時間後の組織１ｇあたりの平均ＢＰ１００１組織濃度は、６４μｇ（脾臓）、５０μｇ（肝臓）、３４μｇ（腎臓）であり、他の組織では１２〜３４μｇの範囲であった。組織半減期は、脾臓、肝臓、腎臓、心臓及び胃ではおよそ２４時間であり、肺では４８時間であった。骨髄では最小量のＢＰ１００１（２つの大腿部で約０．４μｇ）が検出され、濃度は７２時間にわたって比較的一定にとどまった。
【００６２】
Ｃ．ＢＰ１００１毒性学
１．マウスでの単回用量毒性試験
ＢＰ１００１の単回用量毒性試験では１５匹の雄のＩＣＲマウス（５匹／群）を、非注射対照群（Ｉ群）と、単回注射として尾静脈を介して１５及び３０ｍｇオリゴ／ｋｇを静脈内に受ける２つの処置群（ＩＩ群及びＩＩＩ群）とに割り当てた。１５匹の雌のＩＣＲマウス（５匹／群）を、非注射対照群（ＩＶ群）と、単回注射として尾静脈を介してそれぞれ２０及び４０ｍｇオリゴ／ｋｇを静脈内に受ける２つの処置群（Ｖ群及びＶＩ群）とに割り当てた。動物を毎日観察し、血液学評価及び臨床化学評価のために注射から２及び６週間後に血液を採取した。注射から６週間後の採血の後に動物を屠殺し、臓器毒性の巨視的及び微視的評価のために組織を採取した。罹患または死亡の兆候は観察されなかった。１５〜４０ｍｇ／ｋｇのＢＰ１００１の単回静注は、調べた臓器において薬物関連の病変を生じさせなかった。３０及び４０ｍｇオリゴ／ｋｇの注射から２週間後にＷＢＣ計数の減少が認められた。ＷＢＣ計数の回復は３０ｍｇオリゴ／ｋｇでの注射から６週間後に認められた。群の平均ＷＢＣ計数は、４０ｍｇオリゴ／ｋｇを受けている動物では６週目に完全には回復しなかったが、対照に比べて統計的差異はなかった（Ｔａｒｉ，２００７）。
【００６３】
２．マウスでの多回投薬毒性試験
マウスでのＢＰ１００１の多回投薬毒性試験では、２４匹のＩＣＲマウス（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈからのマウスの非近交系統；雌５匹／群、雄３匹／群）を、非注射対照群（群Ｉ）と、連続して５日間毎日尾静脈を介して１５及び２５ｍｇオリゴ／ｋｇを静脈内に受ける２つの処置群（ＩＩ〜ＩＩＩ群）とに割り当てた。動物を毎日観察し、血液学評価及び臨床化学評価のために注射から２及び６週間後に血液を採取した。注射から６週間後の採血の後に動物を屠殺し、臓器毒性の巨視的及び微視的評価のために組織を採取した。罹患または死亡の兆候は観察されなかった。１５〜２５ｍｇ／ｋｇのＢＰ１００１の多回静注は、調べた臓器において薬物関連の病変を生じさせなかった。処置群では注射から２週間後にＷＢＣ計数の減少が認められたが、これは注射から６週間後において持続していた。差分ＷＢＣ計数は、処置動物のＷＢＣの特定集団が対照とは異なっていないことを示した（Ｔａｒｉ，２００７）。
【００６４】
３．ウサギでの多回投薬毒性試験
ダッチベルトウサギにＢＰ１００１を週に２回静脈内（低速ボーラス）投与することの潜在的毒性を行った。ＢＰ１００１を２８日間の期間にわたって投与し、その後、２週間の回復期を設けた。試験デザインを表２に示す。
【表２−１】
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【００６５】
試験の１、３、８、１０、１５、１７、２２及び２４日目に用量を投与した。試験での第１投薬日を試験１日目に定めた。用量は各日のほぼ同じ時刻に与えた。個々の用量体積は各動物の最も新しく記録された体重に基づいて算出した。試験１日目の用量レベルは予備試験体重に基づいて算出した。この試験デザインに基づけば、臨床所見、体重、骨髄細胞学、臨床病理、臓器重量または微視的知見に明らかな毒性学的変化はなかった。剖検で記録された巨視的所見が３つあった。群１の試験４日目の雄（＃８９３９）及び群２の試験４２日目の雌（＃８９６８）は、胆嚢が小さいという巨視的所見を有していた。群１の試験２９日目の雌（＃８９４４）は、全ての肺葉に伴う暗い病巣の巨視的所見を有していた。これらの用量非依存的知見は明らかにＢＰ１００１の投与とは関係がなかった。この試験デザインに基づけば、３．７５、５．００、７．５０ｍｇ／ｋｇのＢＰ１００１を週に２回静脈内（低速ボーラス）投与することの明らかな毒性は、臨床所見、体重、骨髄細胞学、臨床病理、臓器重量または微視的知見にはなかった。さらに、結果は、ＢＰ１００１をウサギに投与する場合に凝固パラメータに対する影響が観察されなかったことを示した。
【００６６】
Ｄ．エームス変異原性試験
エームス変異原性試験でＢＰ１００１を試験した。５ｍｇのＧｒｂ２オリゴヌクレオチドを含有するＢＰ１００１のバイアルに塩化ナトリウム（０．９％）を加えた。Ｓ−９酵素活性化系の存在下及び非存在下で試料を様々な濃度の５つのサルモネラ系統に対して試験した。試料は試験した系統に対して変異原性を有していなかった。
【００６７】
Ｅ．試験管内での哺乳動物染色体異常試験（ＣＨＯ細胞）
アロクロール誘導Ｓ９活性化系の存在下と非存在下との両方においてＣＨＯ細胞を使用して染色体異常アッセイでＢＰ１００１を試験した。染色体異常アッセイの用量範囲を設定するために予備毒性試験を実施した。染色体異常アッセイを用いてＢＰ１００１のクラストゲン潜在能を評価した。この試験の知見に基づけば、ＢＰ１００１は非活性化試験系及びＳ９活性化試験系のどちらにおいてもＣＨＯ細胞の構造的及び数的染色体異常の誘導について陰性であると結論付けられた。
【００６８】
Ｖ．ヒトでのＢＰ１００１の治験
ＢＰ１００１第Ｉ相試験を２パートで行った：（Ａ）ＢＰ１００１用量漸増、及び（Ｂ）同時発生的な低用量シタラビン（ＬＤＡＣ）を伴うＢＰ１００１の用量拡張。用量漸増（パートＡ）については、血液悪性腫瘍を有する３名以上の患者の連続コホートを５〜１３５ｍｇ／ｍ２の漸増用量のＢＰ１００１で最大耐量（ＭＴＤ）が同定されるまで処置する標準的な「３＋３」デザインを用いた。試験の用量拡張パート（パートＢ）については、安全性及び生物学的作用をさらに特性評価するためならびに第２相推奨用量を同定するために、ＡＭＬを有する患者の２つの連続サブセットを、固定用量のＬＤＡＣと組み合わせたＭＴＤ（または最高試験用量［ＨＴＤ］）及びＭＴＤ（またはＨＴＤ）よりも１つ低いレベルのＢＰ１００１によって処置した。試験のどちらのパートも、安全性、忍容性及び毒性、薬物動態（ＰＫ）、腫瘍応答ならびに抗白血病活性を評価するために非盲検逐次用量漸増デザインを採用した。試験では合計３９名の患者を処置した：ＡＭＬ（ｎ＝３０）、ＣＭＬ−ＢＰ（ｎ＝５）及びＭＤＳ（ｎ＝４）。３９名の患者のうち、２７名は評価可能であり、１２名は疾患進行のためにサイクル全体を完遂することができずプロトコールに従って元の所へ返された。５ｍｇ／ｍ２を受けている１名の患者だけは、増殖性ＣＭＬ−ＢＰのための高用量ヒドロキシ尿素を受けている間、グレード３の粘膜炎及び手足症候群の用量制限毒性（ＤＬＴ）を被った。試験医薬を原因因子として除外することができなかったため、この事象はＤＬＴとして報告した。患者を６名に増やしたところ、ＤＬＴに発展する患者は他にはいなかった。他の薬物関連毒性は、処置したどの患者においても認められなかった。ＭＴＤは同定されなかった。ＢＰ１００１のＨＴＤは９０ｍｇ／ｍ２である。
【００６９】
２７名の評価可能な患者の間で１サイクルの中央値を投与した（１〜５）：４名は２サイクルを受け、３名は３サイクルを受け、４名は５サイクルを受け、他の全ての者は１サイクルを受けた。単剤コホート（パートＡ）の２１名の評価可能な患者の中では、１０名が末梢または骨髄芽球の５０％以上の減少を経験し、２名には皮膚白血病の改善があり、６名には芽球の一過的減少があった。ＢＰ１００１＋ＬＤＡＣの併用療法（パートＢ）を受けている６名の評価可能な患者の中では、３名が完全寛解（ＣＲ）を達成し、２名が部分寛解（ＰＲ）を達成した。
【００７０】
Ａ．Ｇｒｂ２バイオマーカー試験
フローサイトメトリーを用いて、ＢＰ１００１単剤療法を受けている患者の循環白血病細胞中のＧｒｂ２及びｐＥｒｋタンパク質のレベルを決定し、中央蛍光強度（ＭＦＩ）として報告した。処置中のＧｒｂ２及びｐＥｒｋのＭＦＩをベースラインでのそれらと比較した。最後（処置の最後またはサイクル１の２２日目）に測定した試料では、試料１２個中１０個においてＢＰ１００１はＧｒｂ２レベルを２５％以上低下させ、試料１２個中７個においてｐＥｒｋレベルを２５％以上低下させた。低下の平均は、Ｇｒｂ２レベルについては４９％であり（範囲：２８〜９１％）、ｐＥｒｋレベルについては５２％であった（範囲：２７〜９１％）。
【００７１】
Ｂ．薬物動態試験
ＢＰ１００１（６０ｍｇ／ｍ２）＋ＬＤＡＣまたはＢＰ１００１（９０ｍｇ／ｍ２）＋ＬＤＡＣを受けている、ＡＭＬと診断された難治性／再発性の患者から採取した血漿試料に対して薬物動態（ＰＫ）分析を実施した。両方のコホートにおいて、Ｔｍａｘは投与の１時間後であった。両方の用量のＣｍａｘは８２ｎｇ／ｍＬであった。しかしながら、ＢＰ１００１の血漿半減期は６０ｍｇ／ｍ２用量の方が９０ｍｇ／ｍ２用量よりも長かった（２９．６±８．１時間対１１．８±５．４時間）。ＢＰ１００１のクリアランス速度は６０ｍｇ／ｍ２用量の方が９０ｍｇ／ｍ２用量よりも低かった（１３３±２４Ｌ／時対２０５±７０Ｌ／時）。これらの結果は、６０ｍｇ／ｍ２ＢＰ１００１用量の方が９０ｍｇ／ｍ２用量よりも好ましい可能性があることを示唆している。
【００７２】
ＶＩ．脂質及びリポソーム
本明細書において「リポソーム」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを捕捉または組み込むことができる、脂質二重層を有する脂質含有小胞、及びその他の脂質担体粒子を意味して使用される。このように、リポソームは、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される様々な単層、多層及び多重小胞脂質ビヒクルを包含する包括的用語である。さらに、リポソームは、定義されない層状構造を有してもよい。リポソームは、リン脂質二重膜と内部の水性媒体とを備えた小胞構造を有するものとして特徴付けられ得る。多層リポソームは、水性媒体によって隔てられた多重脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分は閉鎖構造を形成する前に自己再配置を受け、脂質二重層間に水と溶解した溶質とを捕捉する（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，１９９１）。しかしながら、本発明は、水溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する構成物も包含する。例えば、脂質はミセル構造をとっていてもよいし、または単に脂質分子の非一様な凝集体として存在していてもよい。
【００７３】
リポソームは、様々な薬物を疾患組織中へ送達するための担体であるナノ粒子の一形態である。リポソームの最適な大きさは、標的組織に依存する。腫瘍組織では、脈管構造は不連続であり、孔径は１００ｎｍから７８０ｎｍまで様々である（Ｓｉｗａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。それに比べて、正常な脈管内皮の孔径はほとんどの組織において２ｎｍ未満であり、後毛細管細静脈では６ｎｍである。負に帯電したリポソームは、中性または正に帯電したリポソームより迅速に循環系から除去されると考えられているが、近年の研究から、負に帯電した脂質の種類が細網内皮系（ＲＥＳ）によるリポソーム取込速度に影響を与えていることが示唆された。例えば、立体的に遮蔽されていない負に帯電した脂質を含有するリポソーム（ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸及びホスファチジルグリセロール）は中性リポソームよりも迅速に清掃される。興味深いことに、カチオン性リポソーム（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン［ＤＯＴＡＰ］）及びカチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体は、血管新生血管の内皮細胞によってエンドサイトーシスを経てアニオン性、中性、または立体的に安定化された中性のリポソームよりも貪欲に結合を受け内在化される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｋｒａｓｎｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。カチオン性リポソームは腫瘍細胞に対して理想的な送達ビヒクルではない可能性がある、というのも、腫瘍細胞との表面相互作用は静電気由来の結合部位障壁効果を作り出して送達系と腫瘍球とのさらなる会合を阻害するからである（Ｋｏｓｔａｒｅｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。他方、中性リポソームは腫瘍内への浸透がより良好であると見受けられる。特異的リポソーム製剤の毒性も関心事とされてきた。カチオン性リポソームは、活性酸素中間体の遊離を促進することによって用量依存的毒性及び肺炎症を誘発し、この作用はＤＯＴＡＰなどの一価カチオン性リポソームよりも多価カチオン性リポソームにおいて顕著である（Ｄｏｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。中性及び負のリポソームは肺毒性を呈しないと見受けられる（Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ−Ｐｕｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。カチオン性リポソームは、効率的に核酸を取り込むが、生体内での遺伝子下方制御の成功には限りがあり、これはおそらく、それらが細胞内で安定でありその結果として核酸内容物を放出し損なうからである。本明細書では、生体内での中立的特質、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド送達の好結果ゆえに、中性電荷を有する脂質、または中和された電荷を有する脂質構成物、例えば１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を使用する。
【００７４】
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドを脂質及び／またはリポソームと会合させるための方法及び組成物を提供する。オリゴヌクレオチドを、リポソームの水性内部に組み込んでもよいし、リポソームの脂質二重層内に散在させてもよいし、リポソームとオリゴヌクレオチドとの両方と会合する結合分子を介してリポソームに結合させてもよいし、リポソーム内に捕捉してもよいし、リポソームと複合体化させてもよいし、脂質を含有する溶液中に分散させてもよいし、脂質と混合してもよいし、脂質と化合させてもよいし、液体中の懸濁液として含有してもよいし、ミセルと共に含有するもしくは複合体化させてもよいし、あるいは脂質と会合させてもよい。本明細書において提供されるリポソームまたはリポソーム／オリゴヌクレオチド会合構成物は、溶液中のいかなる特定構造にも限定されない。例えば、二重層構造体中に、ミセルとして、または「崩壊した」構造体と共に、それらが存在していてもよい。また、それらは、単に溶液中に散在しておそらく大きさまたは形状の一様でない凝集体を形成していてもよい。
【００７５】
Ａ．脂質
脂質は、天然に存在するかまたは合成のものであり得る脂肪性物質である。例えば、脂質としては、細胞質中に天然に存在する脂肪滴ならびに、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有する当業者によく知られている類の化合物が挙げられる。一例は、脂質１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）である。
【００７６】
本発明の脂質構成物は、リン脂質を含み得る。特定の実施形態では、単一の種類またはタイプのリン脂質がリポソームなどの脂質構成物の製造に使用され得る。他の実施形態では、１つより多い種類またはタイプのリン脂質が使用され得る。
【００７７】
リン脂質としては、例えば、グリセロリン脂質及び特定のスフィンゴ脂質が挙げられる。リン脂質としては、限定されないが例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン（「ＤＯＰＣ」）、卵由来ホスファチジルコリン（「ＥＰＣ」）、ジラウロイルホスファチジルコリン（「ＤＬＰＣ」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、ジステアトイルホスファチジルコリン（「ＤＳＰＣ」）、ジリノレオイルホスファチジルコリン、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＡＰＣ」）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＥＰＣ」）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＭＰＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（「ＰＭＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（「ＰＳＰＣ」）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＳＰＰＣ」）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（「ＰＯＰＣ」）、１−オレオイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＯＰＰＣ」）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＬＰＧ」）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「ＤＰＰＧ」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＳＰＧ」）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（「ＤＯＰＧ」）、ジミリストイルホスファチジン酸（「ＤＭＰＡ」）、ジパルミトイルホスファチジン酸（「ＤＰＰＡ」）、ジステアロイルホスファチジン酸（「ＤＳＰＡ」）、ジオレオイルホスファチジン酸（「ＤＯＰＡ」）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＭＰＥ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＰＯＰＥ」）、ジミリストイルホスファチジルセリン（「ＤＭＰＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「ＤＰＰＳ」）、脳由来ホスファチジルセリン（「ＢＰＳ」）、ジステアロイルスフィンゴミエリン（「ＤＳＳＰ」）、脳スフィンゴミエリン（「ＢＳＰ」）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（「ＤＰＳＰ」）、リゾホスファチジルコリン、及びリゾホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。
【００７８】
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる、というのも、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンは生理的条件下（つまり、約７のｐＨ）で非荷電であるからであり、これらの化合物は、中性リポソームを生み出すのに特に有用であり得る。特定の実施形態では、非荷電のリポソームまたは脂質構成物を作るためにリン脂質ＤＯＰＣを使用する。特定の実施形態では、リン脂質でない脂質（例えばコレステロール）を使用することもできる。
【００７９】
リン脂質は、天然起源または合成起源のものであり得る。しかしながら、卵由来またはダイズ由来のホスファチジルコリン、脳由来ホスファチジン酸、脳由来または植物由来のホスファチジルイノシトール、心臓由来カルジオリピン、及び植物由来または細菌由来のホスファチジルエタノールアミンなどの天然起源のリン脂質は、特定の実施形態では主要な（つまり、ホスファチド構成物全体の５０％以上を構成する）ホスファチドとして使用されない、というのも、これは結果として得られるリポソームの不安定性及び漏出性を招きかねないからである。
【００８０】
Ｂ．中性リポソーム
「中性のリポソームまたは脂質構成物」または「非荷電のリポソームまたは脂質構成物」は、本明細書中で使用される場合、本質的に中性の正味の電荷を生む（実質的に非荷電である）１つ以上の脂質を有するリポソームまたは脂質構成物として定義される。特定の実施形態では、中性のリポソームまたは脂質構成物は、大部分において、自体が中性である脂質及び／またはリン脂質を含み得る。特定の実施形態では、中性のリポソームまたは脂質構成物を生み出すために両親媒性脂質を組み込むまたは使用することがある。例えば、電荷が互いに実質的に相殺されてそれによって本質的に中性の正味電荷がもたらされるように、正または負に帯電した脂質を組み合わせることによって、中性リポソームが生み出され得る。「本質的に中性」または「本質的に非荷電」とは、他成分の反対電荷によって相殺されない電荷を含む脂質は所与の集団（例えばリポソームの集団）中に存在するとしてもわずかであること（例えば、成分の１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満が非相殺電荷を含むこと）を意味する。本発明の特定の実施形態では、構成物の脂質成分が本質的に中性であるがリポソームの形態でない、構成物が調製され得る。
【００８１】
リポソームの大きさは合成方法によって様々である。水溶液中に懸濁したリポソームは、概して球形小胞の形状であり、同中心の１つ以上の脂質二重層分子層を有し得る。各層は、式ＸＹで表される分子の平行な並びからなり、Ｘは親水性部分であり、Ｙは疎水性部分である。水性懸濁液中で同中心層は、親水性部分が水相に接触し続ける傾向にあるように、かつ疎水性領域が自己会合する傾向にあるように並ぶ。例えば、水相がリポソーム内に存在する場合、脂質分子は、ＸＹ−ＹＸの並びを有するラメラとして知られる二重層を形成し得る。１つ以上の脂質分子の親水性及び疎水性部分が互いに会合する場合、脂質の凝集体が形成され得る。これらの凝集体の大きさ及び形状は、溶媒の性質、及び溶液中の他の化合物の存在などの種々の変数に依存するであろう。
【００８２】
本発明の範囲内のリポソームは、既知の実験室的技術、例えば、Ｂａｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９６５）（参照によりこの内容を本明細書に援用する）の方法；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（１９７９）（参照によりこの内容を本明細書に援用する）の方法；Ｄｅａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｕｓｔｅｒ（１９８３）（参照によりこの内容を援用する）の方法；及びＳｚｏｋａ  ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）によって記述されている逆相エバポレーション法などに従って調製することができる。上記方法は、それらの各々の水性材料捕捉能、及びそれらの各々の水性空間対脂質比率が異なる。
【００８３】
特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドを送達するために中性リポソームが使用され得る。中性リポソームは、単一の遺伝子の翻訳を抑制するように仕向けられた単一種のオリゴヌクレオチドを含有してもよいし、または多数の遺伝子の翻訳を抑制するように仕向けられた多種のオリゴヌクレオチドを含有してもよい。さらに、中性リポソームはオリゴヌクレオチドの他に化学療法薬を含有していてもよく、したがって、特定の実施形態では、化学療法薬及びオリゴヌクレオチドが同じまたは別個の構成物に入って細胞（例えば、ヒト対象のがん細胞）へ送達され得る。
【００８４】
乾燥させた脂質または凍結乾燥させたリポソームは好適な溶媒（例えば、ＤＰＢＳまたはＨｅｐｅｓ緩衝液）によって適切な濃度に脱水及び再構成され得る。その後、混合物はボルテックスミキサーで激しく振盪され得る。リポソームは適切な総リン脂質濃度（例えば約１０〜２００ｍＭ）で再懸濁され得る。未封入オリゴヌクレオチドは２９，０００ｇで遠心分離によって除去され得、リポソームペレットは洗浄され得る。あるいは、未封入オリゴヌクレオチドは過剰の溶媒に対する透析によって除去され得る。封入されたオリゴヌクレオチドの量は標準的方法に従って決定することができる。
【００８５】
ＶＩＩ．遺伝子発現の阻害
阻害性オリゴヌクレオチドは、細胞における遺伝子の転写または翻訳を阻害することができる。オリゴヌクレオチドは、長さが５〜５０ヌクレオチド以上であり得、特定の実施形態では長さが７〜３０ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは長さが７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは核酸及び／または核酸類縁体を含み得る。典型的には、阻害性オリゴヌクレオチドは細胞内での単一の遺伝子の翻訳を阻害することになるが、特定の実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは細胞内での２つ以上の遺伝子の翻訳を阻害し得る。
【００８６】
オリゴヌクレオチド内でオリゴヌクレオチドの成分が全体にわたって同じタイプまたは同種である必要はない（例えば、オリゴヌクレオチドがヌクレオチドと核酸または核酸類縁体とを含んでいてもよい）。本発明の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは単一の核酸または核酸類縁体のみを含み得る。阻害性オリゴヌクレオチドは、相補的核酸とハイブリダイズして二本鎖構造を形成する５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０以上の連続核酸塩基を（それらの間のあらゆる範囲を含めて）含み得る。
【００８７】
ＶＩＩＩ．核酸
本発明は、中性リポソームによってオリゴヌクレオチドを送達するための方法及び組成物を提供する。オリゴヌクレオチドは核酸からなるため、核酸に関係する方法（例えば、核酸の生成、核酸の修飾など）をオリゴヌクレオチドに関して用いてもよい。
【００８８】
「核酸」という用語は当技術分野でよく知られている。本明細書で使用される「核酸」は、総じて、核酸塩基を含むＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの誘導体もしくは類縁体の分子（すなわち鎖）を指す。これらの定義は、一本鎖または二本鎖核酸を指す。二本鎖核酸は、完全に相補的な結合によって形成され得るが、いくつかの実施形態では、二本鎖核酸は部分的または実質的に相補的な結合によって形成され得る。本明細書中で使用する場合、一本鎖核酸は接頭辞「ｓｓ」で表されることがあり、二本鎖核酸は接頭辞「ｄｓ」で表されることがある。
【００８９】
Ａ．核酸塩基
本明細書中で使用する場合、「核酸塩基」は、複素環式塩基、例えば、天然に存在する少なくとも１つの核酸（すなわちＤＮＡ及びＲＮＡ）中にみられる天然に存在する核酸塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵ）ならびに、それらの核酸塩基の天然に存在するまたは天然に存在しない誘導体（複数可）及び類縁体などを指す。核酸塩基は通常、天然に起こる核酸塩基対合（例えば、ＡとＴ、ＧとＣ、及びＡとＵの水素結合）を置き換え得るように、少なくとも１つの天然に存在する核酸塩基と１つ以上の水素結合を形成（つまり「アニールする」または「ハイブリダイズ」）することができる。核酸塩基は、本明細書中に記載されているかまたは当業者に知られている任意の化学または天然の合成方法を用いてヌクレオシドまたはヌクレオチドの中に含み込められ得る。
【００９０】
「プリン」及び／または「ピリミジン」核酸塩基（複数可）は、天然に存在するプリン及び／またはピリミジン核酸塩基ならびにそれらの誘導体（複数可）及び類縁体（複数可）を包含し、限定されないが、アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、チオールまたはアルキルチオール部分のうちの１つ以上で置換されたプリンまたはピリミジンを含む。好ましいアルキル（例えば、アルキル、カルボキシアルキルなど）部分は、約１、約２、約３、約４、約５個から約６個までの炭素原子からなる。他のプリンまたはピリミジンの非限定的な例としては、デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、キサンチン、ハイポキサンチン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、ブロモチミン（ｂｒｏｍｏｔｈｙｌｉｎｅ）、８−アミノグアニン、８−ヒドロキシグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、アザグアニン、２−アミノプリン、５−エチルシトシン、５−メチルシトシン（５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｏｓｉｎｅ）、５−ブロモウラシル、５−エチルウラシル、５−ヨードウラシル、５−クロロウラシル、５−プロピルウラシル、チオウラシル、２−メチルアデニン、メチルチオアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ）、アザアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヒドロキシアデニン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、４−（６−アミノヘキシル／シトシン）などが挙げられる。プリン及びピリミジンの誘導体または類縁体としては、限定されないが例えば（略記／修飾塩基表記）、ａｃ４ｃ／４−アセチルシチジン、Ｍａｍ５ｓ２ｕ／５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、Ｃｈｍ５ｕ／５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、Ｍａｎ  ｑ／ベータ，Ｄ−マンノシルクエオシン、Ｃｍ／２’−Ｏ−メチルシチジン、Ｍｃｍ５ｓ２ｕ／５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、Ｃｍｎｍ５ｓ２ｕ／５−カルボキシメチルアミノ−メチル−２−チオリジン、Ｍｃｍ５ｕ／５−メトキシカルボニルメチルウリジン、Ｃｍｎｍ５ｕ／５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、Ｍｏ５ｕ／５−メトキシウリジン、Ｄ／ジヒドロウリジン、Ｍｓ２ｉ６ａ、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｆｍ／２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、Ｍｓ２ｔ６ａ／Ｎ−（（９−ベータ−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｇａｌ  ｑ／ベータ，Ｄ−ガラクトシルクエオシン、Ｍｔ６ａ／Ｎ−（（９−ベータ−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチル−カルバモイル）スレオニン、Ｇｍ／２’−Ｏ−メチルグアノシン、Ｍｖ／ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、Ｉ／イノシン、ｏ５ｕ／ウリジン−５−オキシ酢酸（ｖ）、Ｉ６ａ／Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｏｓｙｗ／ウイブトキソシン、ｍ１ａ／１−メチルアデノシン、Ｐ／シュードウリジン、ｍ１ｆ／１−メチルシュードウリジン、Ｑ／クエオシン、ｍ１ｇ／１−メチルグアノシン、ｓ２ｃ／２−チオシチジン、ｍ１Ｉ／１−メチルイノシン、ｓ２ｔ／５−メチル−２−チオウリジン、ｍ２２��／２，２−ジメチルグアノシン、ｓ２ｕ／２−チオウリジン、ｍ２ａ／２−メチルアデノシン、ｓ４ｕ／４−チオウリジン、ｍ２ｇ／２−メチルグアノシン、Ｔ／５−メチルウリジン、ｍ３ｃ／３−メチルシチジン、ｔ６ａ／Ｎ−（（９−ベータ−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、ｍ５ｃ／５−メチルシチジン、Ｔｍ／２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、ｍ６ａ／Ｎ６−メチルアデノシン、Ｕｍ／２’−Ｏ−メチルウリジン、ｍ７ｇ／７−メチルグアノシン、Ｙｗ／ウイブトシン、Ｍａｍ５ｕ／５−メチルアミノメチルウリジン、またはＸ／３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン、（ａｃｐ３）ｕが挙げられる。
【００９１】
Ｂ．ヌクレオシド
本明細書中で使用する場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基リンカー部分に共有結合した核酸塩基を含んでいる個々の化学単位を指す。「核酸塩基リンカー部分」の非限定的な例は、５−炭素原子を含む糖（すなわち「５−炭素糖」）であり、限定されないが、デオキシリボース、リボース、アラビノース、または５−炭素糖の誘導体もしくは類縁体を含む。５−炭素糖の誘導体または類縁体の非限定的な例としては、２’−フルオロ−２’−デオキシリボース、または糖環において炭素が酸素原子で置き換わった炭素環糖が挙げられる。本明細書中で使用する場合、「部分」は通常、大きい化学または分子構造体の、小さい化学または分子成分を指す。
【００９２】
核酸塩基リンカー部分に対する核酸塩基の様々なタイプの共有結合（複数可）が当技術分野で知られている。非限定的な例を挙げると、プリン（すなわちＡまたはＧ）を含んでいるヌクレオシドまたは７−デアザプリン核酸塩基は典型的には５−炭素糖の１’位に対するプリンまたは７−デアザプリンの９位の共有結合を含む。別の非限定的な例では、ピリミジン核酸塩基（すなわちＣ、ＴまたはＵ）を含んでいるヌクレオシドは典型的には５−炭素糖の１’位に対するピリミジンの１位の共有結合を含む（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，１９９２）。
【００９３】
Ｃ．ヌクレオチド
本明細書中で使用する場合、「ヌクレオチド」は、「主鎖結合」をさらに含んでいるヌクレオシドを指す。主鎖結合は通常、ヌクレオチドを、ヌクレオチドを含んでいる別の分子、または別のヌクレオチドに共有結合させて核酸を形成している。天然に存在するヌクレオチドの「主鎖結合」は典型的にはリン酸部分（例えば、ホスホジエステル主鎖結合）を含んでいるが、これは５−炭素糖と共有結合している。主鎖部分の結合は典型的には５−炭素糖の３’位または５’位で起こる。しかしながら、他のタイプの結合は、とりわけ天然に存在する５−炭素糖またはリン酸部分の誘導体または類縁体をヌクレオチドが含む場合に、当技術分野で知られている。
【００９４】
Ｄ．核酸類縁体
核酸は、核酸塩基の誘導体もしくは類縁体、核酸塩基リンカー部分、及び／または天然に存在する核酸に存在し得る主鎖結合を含む、または完全にそれらからなるものであり得る。本明細書中で使用する場合、「誘導体」は、化学修飾されているかまたは改変された形態の天然に存在する分子を指す一方、「模倣体」または「類縁体」は、天然に存在する分子または部分と構造的に類似しているものであってもなくてもよいが同様の機能を有している分子を指す。核酸塩基、ヌクレオシド及びヌクレオチドの類縁体または誘導体は当技術分野でよく知られている。
【００９５】
５−炭素糖、及び／または主鎖結合の誘導体もしくは類縁体を含んでいる、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたは核酸の非限定的な例としては、ｄｓＤＮＡの発現を有する及び／または防止する三重螺旋を形成するプリン誘導体を含むオリゴヌクレオチドについて記載している米国特許第５，６８１，９４７号；特に蛍光性核酸プローブとして使用するための、ＤＮＡまたはＲＮＡにみられるヌクレオシドの蛍光性類縁体を組み込んだ核酸について記載している米国特許第５，６５２，０９９号及び第５，７６３，１６７号；強化されたヌクレアーゼ安定性をもつ、ピリミジン環に置換を有するオリゴヌクレオチド類縁体について記載している米国特許第５，６１４，６１７号；核酸検出に使用される修飾５−炭素糖（すなわち修飾２’−デオキシフラノシル部分）を有するオリゴヌクレオチド類縁体について記載している米国特許第５，６７０，６６３号、第５，８７２，２３２号及び第５，８５９，２２１号；ハイブリダイゼーションアッセイで使用することができる４’位において水素以外の置換基で置換された少なくとも１つの５−炭素糖部分を含むオリゴヌクレオチドについて記載している米国特許第５，４４６，１３７号；３’−５’主鎖結合を有するデオキシリボヌクレオチドと２’−５’主鎖結合を有するリボヌクレオチドとを有するオリゴヌクレオチドについて記載している米国特許第５，８８６，１６５号；核酸のヌクレアーゼ耐性を強化するために主鎖結合の３’位の酸素が炭素で置き換わっている改変型主鎖結合について記載している米国特許第５，７１４，６０６号；ヌクレアーゼ耐性を強化する１つ以上の５’メチレンホスホナート主鎖結合を含有するオリゴヌクレオチドについて記載している米国特許第５，６７２，６９７号；強化されたヌクレアーゼ耐性、及び薬物または検出部分を送達する能力をもたらすための、オリゴヌクレオチドの２’炭素に対する薬物または標識を含み得る置換基部分の結合について記載している米国特許第５，４６６，７８６号及び第５，７９２，８４７号；強化された細胞内取込み、ヌクレアーゼに対する耐性、及びＲＮＡを標的とするハイブリダイゼーションに向けて、隣接する５−炭素糖の４’位及び３’位を結び付ける炭素数２または３の主鎖結合を有するオリゴヌクレオチド類縁体について記載している米国特許第５，２２３，６１８号；核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用な少なくとも１つのスルファメートまたはスルファミド主鎖結合を含むオリゴヌクレオチドについて記載している米国特許第５，４７０，９６７号；ヌクレアーゼ耐性の向上、細胞内取込み、及びＲＮＡ発現の調節のために使用される、ホスホジエステル主鎖結合を置き換えている炭素数３または４の主鎖結合部分を有するオリゴヌクレオチドについて記載している米国特許第５，３７８，８２５号、第５，７７７，０９２号、第５，６２３，０７０号、第５，６１０，２８９号及び第５，６０２，２４０号；膜透過性及び安定性を強化するためにオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ位に取り付けられている疎水性担体薬剤について記載している米国特許第５，８５８，９８８号；ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションが強化され、ヌクレアーゼに対する耐性が強化された、５’末端においてアントラキノンと共役しているオリゴヌクレオチドについて記載している米国特許第５，２１４，１３６号；強化されたヌクレアーゼ耐性、結合親和性、及びＲＮアーゼＨを活性化させる能力のためにＤＮＡが２’−デオキシ−エリスロ−ペントファラノシルヌクレオチドを含むＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラについて記載している米国特許第５，７００，９２２号；ＤＮＡに繋げられてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しているＲＮＡについて記載している米国特許第５，７０８，１５４号；１つ以上の核酸塩基がポリエーテル主鎖のキラル炭素原子に繋げられているポリエーテル核酸について記載している米国特許第５，９０８，８４５号；核酸塩基部分、５−炭素糖でない核酸塩基リンカー部分（例えば、アザ窒素原子、アミド及び／またはウレイドの繋ぎ鎖）、及び／またはリン酸主鎖結合でない主鎖結合（例えば、アミノエチルグリシン、ポリアミド、ポリエチル、ポリチオアミド、ポリスルフィンアミドまたはポリスルホンアミド主鎖結合）を含む１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオシドを概して含んでいるペプチド核酸（ＰＮＡまたはペプチド系核酸類縁体またはＰＥＮＡＭ）について記載している米国特許第５，７８６，４６１号、第５，８９１，６２５号、第５，７８６，４６１号、第５，７７３，５７１号、第５，７６６，８５５号、第５，７３６，３３６号、第５，７１９，２６２号、第５，７１４，３３１号、第５，５３９，０８２号及びＷＯ９２／２０７０２；ならびに疎水性のヌクレアーゼ耐性Ｐ−エトキシ主鎖結合について記載している米国特許第５，８５５，９１１号で示されているものが挙げられる。
【００９６】
核酸類縁体のその他の改変及び用途は当技術分野において既知であり、これらの技術及びタイプの核酸類縁体を本発明と共に用いてもよいことが予期される。
【００９７】
Ｅ．核酸の調製
核酸は、当業者に知られている任意の技術、例えば、化学合成、酵素的生産または生物学的生産によって作られ得る。合成核酸（例えば合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例としては、ホスホトリエステル、亜リン酸エステルもしくはホスホロアミダイト化学及び固相技術、例えば参照により本明細書に援用されるＥＰ２６６，０３２に記載されているものを使用して試験管内での化学合成によって作られるか、または参照により各々が本明細書に援用されるＦｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）及び米国特許第５，７０５，６２９号により記載されているようなデオキシヌクレオシドＨ−リン酸中間体によって作られる、核酸が挙げられる。本発明の方法では、１つ以上の種類のオリゴヌクレオチドを使用してもよい。オリゴヌクレオチド合成の様々な機構が例えば米国特許第４，６５９，７７４号、第４，８１６，５７１号、第５，１４１，８１３号、第５，２６４，５６６号、第４，９５９，４６３号、第５，４２８，１４８号、第５，５５４，７４４号、第５，５７４，１４６号、第５，６０２，２４４号に開示されているが、参照によりこれらの各々を本明細書に援用する。
【００９８】
Ｆ．核酸の精製
核酸はポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム遠心分離勾配または当業者に知られている他の任意の手段（例えば、参照により本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）を参照のこと）で精製され得る。
【００９９】
特定の実施形態では、本発明は、単離核酸である核酸に関する。本明細書中で使用する場合、「単離核酸」という用語は、１つ以上の細胞のゲノム由来及び転写由来の全核酸のバルクを除去されたかあるいはそれを含まない、核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を指す。特定の実施形態では、「単離核酸」は、細胞成分または試験管内反応成分、例えば、脂質またはタンパク質などの巨大分子、生物学的低分子などが除去されたかあるいはそれを含まない、核酸を指す。
【０１００】
Ｇ．ハイブリダイゼーション
本明細書中で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、二本鎖もしくは三本鎖分子、または部分的な二本鎖もしくは三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると理解される。本明細書中で使用される「アニールする」という用語は「ハイブリダイズする」と同義である。
【０１０１】
本明細書中で使用する場合、「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」は、相補的配列（複数可）を含有する１つ以上の核酸鎖（複数可）同士またはそれの中でのハイブリダイゼーションを可能にするがランダムな配列のハイブリダイゼーションを不可能にする条件である。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との不一致を許容するとしてもわずかである。そのような条件は、当業者によく知られており、高選択性を必要とする用途にとって好ましい。
【０１０２】
ストリンジェントな条件は、約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌによって提供されるような、低塩分及び／または高温条件を含み得る。所望のストリンジェンシーの温度及びイオン強度の一部が、特定核酸（複数可）の長さ、標的配列（複数可）の長さ及び核酸塩基含有量、核酸（複数可）の電荷組成、ならびにハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他の溶媒（複数可）の存在または濃度によって決定されることは理解される。
【０１０３】
これらの範囲、組成及び条件が非限定的な例としてのみ言及されていること、及び特定のハイブリダイゼーション反応の所望のストリンジェンシーが１つ以上の陽性または陰性対照との比較によって実験的に決定されることがよくあることも理解される。企図される用途に応じて、様々なハイブリダイゼーション条件を採用して核酸の標的配列に対する様々な度合いの選択性を実現することが好ましい。非限定的な例では、ストリンジェントな条件下で核酸とハイブリダイズしない関連標的核酸の同定または単離は、低温及び／または高イオン強度でのハイブリダイゼーションによって成し遂げられ得る。そのような条件は「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリンジェンシーの非限定的な例としては、約２０℃〜約５０℃の温度範囲において約０．１５Ｍ〜約０．９ＭのＮａＣｌで実施されるハイブリダイゼーションが挙げられる。当然ながら、低または高ストリンジェンシー条件をさらに改変して特定用途に適合させることは当業者の技量の範囲内である。
【０１０４】
ＩＸ．リポソームＰ−エトキシアンチセンス薬製品を製造する方法
標的ｍＲＮＡの特定領域に対して相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）を使用して内因性遺伝子の発現が阻害された。アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと結合するとき、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成される。このハイブリッド形成はｍＲＮＡの翻訳、したがってコードされるタンパク質の発現を阻害する。タンパク質が細胞の生存にとって必須である場合、その発現の阻害は細胞死につながり得る。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは抗がん及び抗ウイルス療法において有用なツールとなり得る。
【０１０５】
遺伝子発現を阻害すべくアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する際の主な障壁は細胞内不安定性、低い細胞内取込み、及び乏しい細胞内送達である。天然のホスホジエステルはヌクレアーゼ加水分解に対して耐性でなく、それゆえ、何らかの阻害作用が観察されるまでに高濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドが必要となる。改変型ホスホジエステル類縁体、例えばＰ−エトキシは、このヌクレアーゼ加水分解の課題を克服するために作られたが、それらは当該課題に対する十分な解決を提供しなかった。
【０１０６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内取込みは低い。この課題を解決するために、物理的技術、例えば、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストランによる媒介、または電気穿孔を用いてオリゴヌクレオチドの細胞内取込みを増進させてきた。これらの技術は再現することが難しく、生体内で適用することができない。カチオン性脂質、例えばリポフェクションも、オリゴヌクレオチドを送達するために用いられてきた。カチオン性脂質と負に帯電したオリゴヌクレオチドとの間に静電気相互作用が形成されるが、この結果として、後に標的細胞によって取り込まれる複合体が得られる。これらのカチオン性脂質はオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ消化から保護せず細胞膜にとって有害であるため、それらは、ヌクレアーゼにより開裂可能であるホスホジエステルではなくヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートの送達においてのみ有用である。
【０１０７】
調製されたことがある別の改変型ホスホジエステル類縁体は、Ｐ−エトキシである。Ｐ−エトキシアンチセンス主鎖は、他のアンチセンス類縁体について報告されている毒性のうちのいくつかである出血及び補体活性化に対して悪影響を与えない。Ｐ−エトキシオリゴヌクレオチドの改変は、改変がこれらのオリゴヌクレオチドと標的ｍＲＮＡとの結合に干渉することにならないようにリン酸主鎖においてなされている。Ｐ−エトキシオリゴヌクレオチドは、リン酸主鎖の非架橋性酸素原子にエチル基を加えることによって作られ、かくしてこれらのオリゴヌクレオチドを非荷電化合物にする。ヌクレアーゼに対するその耐性にもかかわらず、Ｐ−エトキシオリゴヌクレオチドの細胞内取込み及び細胞内送達は乏しい、というのも、内在化によってこれらのオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡへのそれらの到達を阻んでエンドソーム／リゾソーム胞の内部に隔離されたままとなるからである。
【０１０８】
Ａ．Ｐ−エトキシアンチセンス薬製品
リポソームＰ−エトキシアンチセンス薬製品は２つのｃＧＭＰ製品からなるが、これらは両方とも、ＦＤＡ承認済みの発売告知基準でのＦＤＡによって義務付けられた分析証を有する。原材料、溶媒及び最終薬製品は本明細書中に記載されている。製造されたときの薬製品は凍結乾燥された琥珀色または白色の結晶または粉末であり、以下の材料を含む：オリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ−エトキシアンチセンス薬物質）、中性脂質（例えばＤＯＰＣ）及び界面活性剤（例えばポリソルベート２０）。患者への投与のために調合するときは生理食塩水をバイアルに加えるが、この時に、Ｐ−エトキシアンチセンスを内部に組み込んだリポソームが形成される。
【０１０９】
Ｂ．Ｐ−エトキシアンチセンス薬物質
完成品の固有の物理的特質（例えば溶解性及び疎水性であるが、これらは後に生理食塩水への薬製品の溶解性、リポソーム中へのオリゴの組込み、及びリポソーム粒径に影響を与える）は、Ｐ−エトキシアンチセンス薬物質の生産中に所定のＰ−エトキシとホスホジエステルアミダイトとの原材料混合物を使用して定義することができる。オリゴヌクレオチド製造中にＰ−エトキシ主鎖基の逸失がランダムに起こり、結果としてそれらの結合がホスホジエステル結合になるが、その逸失はオリゴヌクレオチド中でのＰ−エトキシ：ホスホジエステル主鎖結合の好ましい比をもたらさないことがある。この場合には、Ｐ−エトキシとホスホジエステルアミダイト原材料との混合物でＰ−エトキシ主鎖欠失の予想される値を補い、かくして所望の比を有するオリゴヌクレオチドが生成する。オリゴヌクレオチドの主鎖中のＰ−エトキシ分子の数を増加させることは、分子の疎水性をより大きくし（この結果、リポソーム粒子はより大きくなる；表１）、極性を小さくし、溶解性を小さくする（表２）。中性電荷の疎水性Ｐ−エトキシ薬物質を試験する方法としては、例えば、オリゴヌクレオチド長の分布を決定する質量分析、及び薬物質の溶解性を決定するアッセイ（溶解性のための実用目的では、生理食塩水で再構成した薬製品の目視検査である）が挙げられる。Ｐ−エトキシ主鎖結合の数が大きくなるにつれてオリゴヌクレオチドの溶解性は低下するため、再構成された溶液は白くなってゆき、ついには疎水性が高くなり過ぎたために微粒子が形成される。
【表１−１】
2019529420.tif 000004
【表１−２】
2019529420.tif 000005
【表２−２−１】
2019529420.tif 000006
【表２−２−２】
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【０１１０】
Ｃ．リポソームＰ−エトキシアンチセンス薬製品の製剤化、濾過及び凍結乾燥
１グラム（１ｇ）のｐＥオリゴをＤＭＳＯ中に、ＤＭＳＯ１ｍＬあたりオリゴヌクレオチド１０ｍｇの比率で溶解させる。次に、ＤＯＰＣをｔｅｒｔ−ブチルアルコールに、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール１７１９ｍＬあたりＤＯＰＣ１ｇの比率で添加する。オリゴとＤＯＰＣとを、ＤＯＰＣ２．６７ｇあたりオリゴヌクレオチド１ｇの比率で合わせて混合する。その後、０．８３５％（ｖ／ｖ）のポリソルベート２０の溶液２０ｍＬを混合物に添加し、結果として０．０３９ｍｇ／ｍＬの終濃度を得る。溶液を無菌フィルタに通し、その後、凍結乾燥のためにガラスバイアル内に分注する。
【０１１１】
界面活性剤の量を滴定することにより、リポソーム粒径に対する界面活性剤の影響を決定した（表３）。ポリソルベート２０の非存在下では、粒子のうちのたった２．８％だけが３００ｎｍ以下の直径を有していた。１ｘのポリソルベート２０の存在下では、粒子のうちの１２．５％が３００ｎｍ以下の直径を有していた。３ｘ〜１０ｘのポリソルベート２０を添加することで、およそ２０％の粒子が３００ｎｍ以下の直径を有した。このように、界面活性剤を１ｘから３ｘへと増加させることは粒径の減少をもたらす。
【表３−１】
2019529420.tif 000008
【０１１２】
Ｄ．リポソームＰ−エトキシアンチセンス薬製品の投与のための調合
凍結乾燥製剤を生理食塩水（０．９％／１０ｍＭのＮａＣｌ）で１０〜５０００μＭの終オリゴ濃度に水和させた。リポソーム−Ｐ−エトキシオリゴを手による振盪によって混合した。
【０１１３】
Ｅ．リポソームＰ−エトキシアンチセンス薬製品の試験方法
製造された薬製品の目視検査：製造後、薬製品を含有する試料バイアルを選択して目視検査をする。液体が存在しないことは必須であり、バイアルの底に琥珀色結晶があるのは許容範囲内であり、許容性は、最良の結果としての白色の凝集した粉末または外観に向かうにつれて向上する。白色の外観は、乾燥プロセスがより良好であるとともに表面積対質量の比率が高いことを示唆しているが、このことは、使用のために再構成する上で大いに役に立つ。
【０１１４】
患者の静脈内へ施す準備が整った再構成薬物の目視検査：製造されたリポソームＰ−エトキシアンチセンス薬製品を含有するバイアルに生理食塩水を加え、振盪して、薬物の結晶または粉末が完全に消失した溶液として再構成させる。主に３つの観察がなされる：１）結晶または粉末が完全に溶解していること、２）未溶解の材料の白い塊がないこと、及び３）外観が乳白色またはスキムミルクの外観であること。再構成された液体の外観が青ければ青いほど良い、というのも、このことは、青色領域の光を反射する小さめのリポソーム粒径を示唆しているからである。
【０１１５】
質量分析：質量分析（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（質量分析（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃ））は、試料中の様々な質量のプロファイルを表示するために用いられる。Ｐ−エトキシアンチセンス材料が生成したときに試料に対して質量分析を行う。結果は、「ｘ」軸を右に向かって増す質量と、「ｙ」軸を上に向かって増す相対質量存在量とを有するグリッド上に存在する材料のピークを示す。ピークのプロファイルが（最も右にあるものから出発して）、主鎖全てがＰ−エトキシ結合からなる完全長材料を表し、その左にある次のピークが完全長において１つの主鎖のＰ−エトキシが欠失したもの（したがって、エチルが取り払われて結果として通常のホスホジエステル主鎖結合になったもの）を表し、そして続く、という認識のもと、試料からのプロファイルを解析してＰ−エトキシ試料中のＰ−エトキシ主鎖の相対量を決定する。質量分析パターンは、右へ向かって、Ｐ−エトキシ試料がより多くのＰ−エトキシ主鎖を有すること、したがって疎水性がより大きく、溶解性がより小さいことを表し、同様に、左へ向かってその反対の作用があることを表す。試料の質量分析チャートの検査は、濾過された薬製品中のオリゴヌクレオチド構成物に対して製造中の濾過が何らかの悪影響を生じさせるか否かを判定するためにも用いることができる。
【０１１６】
ＵＶ試験：紫外線試験を用いて、試料中に存在するオリゴヌクレオチドの質量を決定する。オリゴヌクレオチドは２６０ナノメートルの範囲の光を吸収する。このため、完成した再構成薬製品のＵＶ試験は、薬製品のバイアル内のオリゴヌクレオチド薬物質の量を決定する際の方法として用いられるようになった。製造開発及び革新に関してＵＶ試験は、製造時の濾過中に被る問題があるか否か、またはＰ−エトキシアンチセンス薬物質の溶解性が乏しくその結果として溶液中のオリゴヌクレオチドが少なく、したがってＵＶ読み値が低くなっているか否かを判定するために用いられた。当該方法は検証がなされておそらくは最終製品発売告知試験の一部となるであろう。
【０１１７】
リポソーム粒径：最終薬製品のバイアルを再構成し、リポソーム粒径について試験する。結果は、中央点、末尾及び平均値を有する大まかな正規分布になるかまたは、大半の粒子の大まかな正規分布と、二次粒子形成効果に起因したより小さいリポソーム粒子のより小さい副次ピークとになることが多い。リポソーム粒子は大き過ぎないことが重要である、というのも、それは患者において悪影響を招く（例えば、肺の小血管において血流の問題を生じさせる）可能性があるからである。したがって、薬製品発売告知基準は、粒径試験で９０％のリポソームの大きさが５ミクロン以下であると示されることである。さらに、より小さいリポソームが好ましい、というのも、それは細胞内への取込みがより良好であろうからであり、第２に、より小さいリポソームは血管孔を透過することができ、それによってリポソームが腫瘍内部へと透過するのを可能にし、リポソームＰ−エトキシアンチセンス薬製品の処置有効性を向上させるからである。
【０１１８】
Ｘ．処置方法
本発明の特定の態様は、Ｇｒｂ２を標的とするヌクレアーゼ耐性阻害性オリゴを含有するオリゴヌクレオチド−脂質複合体（例えば、中性リポソーム中に組み込まれたオリゴヌクレオチド）でがん患者を処置する方法を提供する。詳しくは、オリゴヌクレオチドは、Ｇｒｂ２の翻訳開始部位においてヒトヌクレオチド配列と塩基対合することを可能にする配列を有し得、かくして、Ｇｒｂ２の発現を阻害し得る。いくつかの態様では、方法はさらに、最前線の治療薬、例えば、チロシンキナーゼ阻害薬（例えば、イマニチブ、ダサニチブ、ニロチニブ、ボスチニブ、ポナチニブまたはバフェチニブ）またはシチジン類縁体（例えば、デシタビン、アザシチジンまたはシタラビン）を患者に投与することを含む。
【０１１９】
「処置」及び「処置する」は、対象への治療剤の投与もしくは適用、または疾患もしくは健康関連症状の治療的利益を得る目的のための対象に対する手順もしくは様式の性能を指す。例えば、処置は、薬学的有効量のオリゴヌクレオチド−脂質複合体の投与を含み得る。
【０１２０】
「対象」及び「患者」は、ヒトか、霊長類、哺乳動物及び脊椎動物などの非ヒトかのどちらかを指す。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０１２１】
本願の全体にわたって使用される「治療的利益」または「治療的に有効」という用語は、この症状の医療処置に関して対象の健康を増進または強化するいかなるものも指す。これには、限定されないが、疾患の兆候または症候の頻度または重症度の低減が含まれる。例えば、がんの処置は例えば、腫瘍の大きさの低減、腫瘍の侵襲性の低減、がんの成長速度の低減、または転移の防止を含み得る。がんの処置はまた、がんを有する対象の生存期間を延長することも指し得る。
【０１２２】
本発明の処置方法が有用となる腫瘍には、固形腫瘍、血液腫瘍、転移性がんまたは非転移性がんにみられるような任意の悪性細胞種が含まれる。例示的な固形腫瘍としては、限定されないが、膵臓、結腸、盲腸、食道、胃腸、歯肉、肝臓、皮膚、胃、精巣、舌、子宮、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、骨、肺、膀胱、メラノーマ、前立腺及び乳房からなる群から選択される臓器の腫瘍を挙げることができる。例示的な血液腫瘍としては、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽腫、骨髄腫などが挙げられる。本明細書において提供される方法を用いて処置され得るがんのさらなる例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺腫、及び肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（消化管癌及び消化管間質癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、様々な種類の頭頸部癌、メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端黒子型メラノーマ、結節型メラノーマ、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄芽球性白血病が挙げられる。
【０１２３】
がんは、具体的には以下の組織学的種類のものであり得るが、これらに限定されない：新生物、悪性腫瘍；癌腫；未分化癌腫；巨細胞及び紡錘細胞の癌腫；小細胞癌腫；乳頭状癌腫；扁平上皮癌腫；リンパ上皮癌腫；基底細胞癌腫；石灰化上皮腫；移行上皮癌腫；乳頭状移行上皮癌腫；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌腫；肝細胞癌腫；肝細胞癌腫と胆管癌腫との併発；線維柱体腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープの腺癌；家族性大腸ポリポーシス；固形癌腫；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌腫；好酸性癌腫；好酸性腺癌；好塩基性癌腫；明細胞腺癌；顆粒細胞腺癌；顆粒細胞癌腫；濾胞状腺癌；乳頭状及び濾胞状腺癌；非被嚢性硬化性癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜癌腫；皮膚付属器癌腫；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；漿液性乳頭状嚢胞腺癌；粘液嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌腫；浸潤性乳管癌腫；髄様癌腫；小葉癌腫；炎症性癌腫；乳房パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌腫；扁平上皮化生を伴う腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜細胞腫；悪性顆粒膜細胞腫；悪性アンドロブラストーマ；セルトリ細胞癌腫；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞腫瘍；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；クロム親和性細胞腫；グロムス血管腫；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑の悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胎児性癌腫；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌腫；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管周皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽腫；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル芽細胞歯肉腫；悪性エナメル芽細胞腫；エナメル芽細胞線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠芽腫；上衣腫；星細胞腫；原形質性星細胞腫；線維性星細胞腫；星芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽腫；原始外胚葉の；小脳の肉腫；神経節芽腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン；側肉芽腫；悪性小リンパ球性リンパ腫；悪性びまん性大細胞型リンパ腫；悪性濾胞性リンパ腫；菌状息肉症；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基性白血病；好酸性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；ならびに有毛細胞白血病。
【０１２４】
特定の実施形態では、本発明は、生体内で治療的有効量のオリゴヌクレオチド−脂質複合体を疾患細胞集団に、疾患を抑制するまたは逆行させるのに十分な期間にわたって接触させることを含む、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の使用方法を想定している。ある実施形態では、生体内で接触させることは、本発明のオリゴヌクレオチド−脂質複合体を含む生理学的に忍容できる組成物を静脈内、腹腔内、皮下または腫瘍内への注射によって患者に治療的有効量投与することによって、成し遂げられる。オリゴヌクレオチド−脂質複合体は、注射によって、または時間をかけた緩徐な点滴によって、非経口投与されることができる。
【０１２５】
オリゴヌクレオチド−脂質複合体を含む治療用組成物は、例えば単位用量を注射することなどによって静脈内または皮下に簡便に投与される。治療用組成物に関して使用される「単位用量」という用語は、対象に対する単一の投薬量として適した物理的に別個になった単位を指し、各単位は、所望の治療効果をもたらすべく算出された所定量の活性材料を必要な希釈剤すなわち担体またはビヒクルと一緒に含有するものである。
【０１２６】
組成物は、投薬剤形に適合する様式で治療的有効量が投与される。投与される量は、処置される対象、活性原料を利用する対象の身体の能力、及び望まれる治療効果の度合いに依存する。投与する必要がある活性原料の正確な量は、実施者の判断に依存し、また、各個体に特有のものである。しかしながら、全身適用のための適切な投薬量の範囲は、本明細書中に開示されており、また、投与形態に依存する。初回及び追加投与に適した投薬計画も想定内であり、典型的には、初回投与を行ってその後に１時間以上の間隔で次の注射または他の投与による反復的投薬を行う。例示的な多回投与は本明細書中に記載されており、継続的にポリペプチドの血清レベル及び組織レベルを高く維持することが特に好ましい。あるいは、生体内療法のために指定される範囲内に血中濃度を維持するのに十分な連続的静脈内点滴が考えられる。
【０１２７】
本発明の方法は、疾患を処置するため、例えば、局所進行性または転移性がんを有するがん患者において腫瘍細胞成長を阻害するまたはがん細胞を殺傷するために、オリゴヌクレオチド組成物を全身または局所に投与することを要し得ることが想定される。それは、静脈内、クモ膜下腔内、皮下及び／または腹腔内に投与されることができる。それは、単独で、または抗増殖薬と組み合わせて投与されることができる。ある実施形態では、それは、外科手術またはその他の手技に先立って患者におけるがん負荷を減少させるために投与される。あるいは、それを外科手術の後に投与して、残存しているがん（例えば、外科手術で除去し損なったがん）が生存しないことを確実なものにすることができる。
【０１２８】
オリゴヌクレオチドの治療的有効量は、所望の効果を実現すべく（つまり、がん細胞の増殖を阻害すべく）算出された所定の量である。かくして、本発明のオリゴヌクレオチドの投与のための投薬量範囲は、所望の効果をもたらすのに十分に大きい投薬量範囲である。投薬量は、有害な副作用、例えば、過粘稠度症候群、肺水腫、鬱血性心不全、神経学的影響などを招くほど大きくしてはならない。一般に、投薬量は、患者における年齢、症状、性別、及び疾患の程度によって様々であろうが、当業者であれば決定することができる。投薬量は、何らかの合併症が生じた場合には個々の医師によって調節され得る。
【０１２９】
本発明の組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、リンパ管内、腹腔内、皮下、胸腔内、またはクモ膜下腔内への注射によって患者に投与されることが好ましいが、または生体外で使用されてもよい。好ましい投薬量は５〜９０ｍｇ／ｍ２である。投与は、がんが消失または退行するまで定時スケジュールで繰り返されることが好ましいが、または他の形態の療法と併せて行われてもよい。
【０１３０】
ＸＩ．医薬製剤
リポソームを含む医薬組成物は通常、滅菌された薬学的に許容できる担体または希釈剤、例えば水または生理食塩水溶液を含むであろう。
【０１３１】
オリゴヌクレオチドを含有する（例えばリポソームの形態の）中性脂質成分の臨床適用がなされる場合、意図した用途に適する医薬組成物として液体複合体を調製することが一般に有益であろう。これは典型的には、発熱原も、ヒトまたは動物にとって有害となる可能性のある他のいかなる不純物も本質的に含んでいない医薬組成物を調製することを要するであろう。さらに、複合体を安定化させ、標的細胞による取込みを可能にするために、適切な緩衝液を採用してもよい。
【０１３２】
「薬学的または薬理学的に許容できる」という表現は、ヒトなどの動物に必要に応じて投与された場合に有害反応、アレルギー反応またはその他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。オリゴヌクレオチドまたは付加的な活性原料を含んでいる少なくとも１つの非荷電液体成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ，２００５によって例示されているように、本開示に照らせば当業者には既知であろう。さらに、動物（例えばヒト）への投与のためには製剤が、ＦＤＡ生物学的基準局によって義務付けられている無菌性、発熱原性、全体的安定性及び純度の基準を満たさねばならないことは理解されよう。
【０１３３】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」は、当業者にとっては既知であろうが、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存料（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存料、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、そのような材料及びそれらの組み合わせを含む。薬学的に許容できる担体は、ヒトへの投与のために製剤化されることが好ましいが、特定の実施形態では、ヒトへの投与のためには（例えば政府規制のために）許容できないであろうが、非ヒト動物への投与のために製剤化される、薬学的に許容できる担体を使用することが望ましいことがある。従来の担体が活性原料と適合しない場合を除き、治療用及び医薬組成物でのその使用が想定される。
【０１３４】
患者または対象に投与される本発明の組成物の実際の投薬量は、物理的及び生理学的因子、例えば、体重、症状の重症度、処置されている疾患の種類、以前または同時発生の治療介入、患者及び投与経路での突発性疾患によって決定され得る。投与を担当する実施者は、いずれにせよ組成物中の活性原料（複数可）の濃度及び個々の対象に適した用量（複数可）を決定するであろう。
【０１３５】
特定の実施形態では、医薬組成物は例えば少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、単位の重量の約２％〜約７５％、または約２５％〜約６０％、例えば、それらに含まれる導出可能な任意の範囲を構成し得る。他の非限定的な例では、用量は、投与１回あたり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重以上、及びそれらに含まれる導出可能な任意の範囲を構成し得る。本明細書において列挙される数値から導出可能な範囲の非限定的な例として、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などが投与され得る。
【０１３６】
本実施形態のオリゴヌクレオチドは、投薬１回あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ以上の核酸の用量で投与され得る。各用量は１、１０、５０、１００、２００、５００、１０００μｌもしくはｍｌまたはそれ以上の体積で投与され得る。
【０１３７】
治療用組成物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤を好適に混ぜた水で調製することができる。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合物、及び油の中の分散液を調製することもできる。通常の貯蔵及び使用の条件下ではこれらの製剤は、微生物の成長を防止するための保存料を含有する。
【０１３８】
本発明の治療用組成物は、液体の溶液か懸濁液かのどちらかとしての注射用組成物の形態で投与され得るが、注射前に液体中に溶解または懸濁させるのに適した固体形態を調製してもよい。また、これらの製剤は、乳化されていてもよい。そのような目的のための典型的な組成物は、薬学的に許容できる担体を含む。例えば、組成物は、リン酸緩衝生理食塩水１ミリリットルあたり１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、または約１００ｍｇ以下のヒト血清アルブミンを含有し得る。他の薬学的に許容できる担体としては、例えば、塩、保存料、緩衝液などを含めた水溶液、無毒性賦形剤が挙げられる。
【０１３９】
非水性溶媒の例は、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及び注射用の有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、例えば、水、アルコール性／水性溶液、塩溶液、非経口用ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンガーデキストロースなどが挙げられる。静脈内用ビヒクルは、流体及び栄養補給剤を含む。保存料としては、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤及び不活性ガスが挙げられる。医薬組成物の様々な成分のｐＨ及び正確な濃度は、よく知られているパラメータによって調節される。
【０１４０】
本発明の治療用組成物は、古典的な医薬製剤を含み得る。本発明に係る治療用組成物の投与は一般的な経路を介して行われることになり、但し、その経路が標的組織へ到達可能であることを条件とする。これには、経口、経鼻、頬側、直腸内、膣内または局所への投与が含まれる。局所投与は、化学療法によって誘発される脱毛症またはその他の皮膚過剰増殖性障害を防止する上で皮膚癌の処置には特に有益であり得る。あるいは、投与は、同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内への注射であってもよい。そのような組成物は通常、生理学的に許容できる担体、緩衝液またはその他の賦形剤を含む薬学的に許容できる組成物として投与されることになろう。肺の症状の処置のためには、エアゾール送達を用いることができる。エアゾールの体積は約０．０１ｍｌ〜０．５ｍｌである。
【０１４１】
治療用組成物の有効量は、意図した目標に基づいて決定される。「単位用量」または「投薬量」という用語は、対象に使用するのに適した物理的に別個になった単位を指し、各単位は、その投与、つまり適切な経路及び処置計画に関連して上述した所望の奏効をもたらすべく算出された所定量の治療用組成物を含有するものである。処置の回数と単位用量との両方に応じて投与する量は所望の保護または効果に依存する。
【０１４２】
治療用組成物の正確な量は、実施者の判断にも依存し、また、各個体に特有のものである。用量に影響を与える因子としては、例えば、患者の物理的及び臨床的状態、投与経路、意図した処置目標（例えば、症候対治癒の低減）、ならびに特定治療物質の力価、安定性及び毒性が挙げられる。
【０１４３】
ＸＩＩ．併用処置
特定の実施形態では、本発明の方法は、阻害性オリゴヌクレオチド、または遺伝子発現の阻害薬を発現することができるオリゴヌクレオチドを第２または付加的療法と組み合わせて投与することを伴う。併用療法を含む方法及び組成物は治療的もしくは保護的効果を強化し、及び／または別の抗癌もしくは抗過剰増殖療法の治療的効果を増大させる。治療的及び予防的な方法及び組成物は、がん細胞の殺傷及び／または細胞過剰増殖の阻害などの所望の効果を得るのに有効な組み合わせの量で提供され得る。このプロセスは、遺伝子発現の阻害薬と第２療法、例えばチロシンキナーゼ阻害薬（例えば、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ポナチニブまたはバフェチニブ）またはシチジン類縁体（例えば、デシタビン、シタラビンまたはアザシチジン）との両方に細胞を接触させることを伴い得る。薬剤（すなわち、遺伝子発現の阻害薬または抗がん剤）のうちの１つ以上を含む１つ以上の組成物もしくは薬理製剤（複数可）を組織、腫瘍もしくは細胞に接触させることができ、または、２つ以上の別個の組成物もしくは製剤を組織、腫瘍及び／または細胞に接触させることができ、ここで、１つの組成物は、１）阻害性オリゴヌクレオチド；２）抗がん剤、または３）阻害性オリゴヌクレオチドと抗がん剤との両方を提供する。また、そのような併用療法を化学療法、放射線療法、外科的療法または免疫療法と併せて用いることもできる。
【０１４４】
阻害性オリゴヌクレオチドは、抗がん処置の前に、間に、後に、または様々な組み合わせで、投与され得る。投与の間隔は、同時発生から、数分にまで、数日にまで、数週間にまで及び得る。阻害性オリゴヌクレオチドを患者に抗がん剤とは別に提供する実施形態では、２つの化合物がなおも有益な併用効果を患者に及ぼすことができるように、総じて各送達間で大きな期間が経過しないことを確保することになろう。そのような場合、阻害性オリゴヌクレオチド及び抗がん療法は互いに１２〜２４または７２時間以内、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に患者に提供され得ることが想定される。ある状況では、各投与の間を数日（２、３、４、５、６または７日）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）空けて処置期間を大きく延ばすことが望ましいことがある。
【０１４５】
特定の実施形態では、処置過程は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０日以上続くことになる。ある薬剤を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９及び／または９０日目、それらを任意に組み合わせた日に与えてもよく、別の薬剤を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９及び／または９０日目またはそれらを任意に組み合わせた日に与えることが考えられる。単一の日（２４時間）のうちに患者に１回または多数回の薬剤（複数可）の投与を与えてもよい。さらに、処置過程の後には、抗がん処置を全く施さない期間があることが想定される。この期間は、患者の症状、例えば、予後、強さ、健康状態などに応じて、１、２、３、４、５、６、７日間及び／または１、２、３、４、５週間及び／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月以上続き得る。
【０１４６】
様々な組み合わせが採用され得る。例えば、以下において阻害性オリゴヌクレオチドは「Ａ」であり抗がん療法は「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ    Ｂ／Ａ／Ｂ    Ｂ／Ｂ／Ａ    Ａ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ａ／Ａ    Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ    Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ    Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ
Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ    Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ
Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ    Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ    Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ
Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ    Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ    Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ。
【０１４７】
本発明の任意の化合物または療法の患者への投与は、薬剤の毒性（あれば）を考慮して、そのような化合物の投与のための一般的なプロトコールに従うものとする。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に起因する毒性を追跡評価するステップが存在する。処置サイクルは必要に応じて繰り返すことが予想される。また、様々な標準的療法、及び外科的介入が所望の療法と組み合わせて適用され得ることも想定される。
【０１４８】
具体的態様では、標準的療法に化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的療法または遺伝子療法が含まれるであろうこと、及びそれらが本明細書中で記載されているように遺伝子発現療法の阻害薬、抗がん療法、または遺伝子発現療法の阻害薬と抗がん療法との両方と組み合わせて採用され得ることが想定される。
【０１４９】
Ａ．化学療法
広範な化学療法剤が本実施形態に従って使用され得る。「化学療法」という用語は、がんを処置する薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの処置において投与される化合物または組成物を含意して使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内でのそれらの活性様式、例えば、それらが細胞周期に影響を及ぼすか否か及びそれがどの段階で起こるかによって分類される。あるいは、薬剤は、ＤＮＡと直接架橋する、ＤＮＡ中にインターカレートする、または核酸合成に影響を与えることによって染色体及び有糸分裂の異常を誘発するその能力に基づいて、特徴付けられ得る。
【０１５０】
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボクオン、メツレデパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）及びウレデパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；エチレンイミンならびに、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含めたメチラメラミン；アセトゲニン（例えば、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類縁体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類縁体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類縁体ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド及びウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エネジイン抗生物質（例えば、カリキアマイシン、特に、カリキアマイシンガンマ１Ｉ及びカリキアマイシンオメガＩ１）などの抗生物質；ジネマイシンＡを含むジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；ならびに、ネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン及びゾルビシン；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、プテロプテリン及びトリメトレキサートなどの葉酸類縁体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン及びチオグアニンなどのプリン類縁体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、デシタビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン及びフロキシウリジンなどのピリミジン類縁体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン及びテストラクトンなどのアンドロゲン；ミトタン及びトリロスタンなどの副腎抑制剤；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸栄養補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン、エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジキオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルムチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫポリサッカリド複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えばパクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えばＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ポナチニブ及びバフェチニブなどのチロシンキナーゼ阻害薬；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害薬、トランス白金、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１５１】
Ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こす、幅広く使用されてきた他の因子としては、例えば、γ線、Ｘ線、及び／または放射線同位体の腫瘍細胞への指向的送達として一般に知られるものが挙げられる。他の形態のＤＮＡ損傷因子、例えば、マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び第４，８７０，２８７号）及びＵＶ照射も想定される。これらの因子は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、ならびに染色体の集合及び維持に対して広範な損傷を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたる５０〜２００レントゲンの１日線量から２０００〜６０００レントゲンの単回線量までの範囲である。放射線同位体の場合の線量範囲は広く様々であり、同位体の半減期、放出される放射線の強さ及び種類、ならびに新生物細胞による取込みに依存する。
【０１５２】
「接触させる」及び「曝露する」という用語は、細胞に対して適用される場合、本明細書では、治療用構築物と化学療法剤または放射線療法剤とを標的細胞に送達する、または標的細胞のすぐ隣に配置するプロセスを表現すべく使用される。細胞殺傷を成し遂げるためには、例えば、両方の薬剤が、細胞を殺傷するまたはその分裂を防止するのに有効な組み合わせた量で送達される。
【０１５３】
Ｃ．免疫療法
がん処置に関して免疫療法薬は概して、免疫エフェクター細胞ならびに、がん細胞を指向及び破壊する分子の使用に依拠する。トラスツズマブ（ハーセプチン（商標））はそのような一例である。免疫エフェクターは例えば、腫瘍細胞の表面のいくつかのマーカーに対して特異的であり得る。抗体は単独で治療のエフェクターとしての役割を果たすものであってもよいし、またはそれは他の細胞を動員して実際は細胞殺傷に影響を与えるものであってもよい。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）と結合しており単に標的指向性薬剤としての役割を果たすものであってもよい。あるいは、エフェクターは、直接的あるいは間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を保有するリンパ球であってもよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。治療様式の組み合わせ、すなわち、直接的な細胞傷害活性と、ＥｒｂＢ２の阻害または低減は、ＥｒｂＢ２過剰発現がんの処置に治療的利益をもたらすであろう。
【０１５４】
別の免疫療法を、上に述べた遺伝子サイレンシング療法と組み合わせた療法の一部として用いることもできよう。免疫療法の一態様において、腫瘍細胞は、標的指向化を受けることができる、つまり他の大半の細胞上には存在していない、いくつかのマーカーを持ち合わせていなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのうちのいずれかは本発明に関して標的指向化に適するものであり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、例えば、がん胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、及びｐ１５５が挙げられる。免疫療法の別の側面は、抗がん作用を免疫刺激作用と組み合わせることである。免疫刺激分子も、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮ、ケモカイン、例えば、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、及び成長因子、例えばＦＬＴ３リガンドを含めて存在する。タンパク質として、あるいは遺伝子送達を用いて、免疫刺激分子を腫瘍抑制物質と組み合わせることは、抗腫瘍効果を強化することが示された。さらに、これらの化合物のうちのいずれかに対する抗体を使用して本明細書中で述べる抗がん剤を標的化することができる。
【０１５５】
現在研究中である、または使用されている免疫療法の例は、免疫賦活剤、例えば、牛型結核菌、熱帯熱マラリア原虫及び有機化合物（米国特許第５，８０１，００５号及び第５，７３９，１６９号、Ｈｕｉ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８、Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β及びγ；ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ｐ５３（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ａｕｓｔｉｎ−Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８、米国特許第５，８３０，８８０号及び第５，８４６，９４５号）、ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ガングリオシドＧＭ２、抗ＨＥＲ−２、抗ｐ１８５（Ｐｉｅｔｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第５，８２４，３１１号）である。１つ以上の抗がん療法が本明細書に記載の遺伝子サイレンシング療法と共に採用され得ることが想定される。
【０１５６】
能動免疫療法では、抗原性のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または自家性もしくは同種異系の腫瘍細胞組成物、または「ワクチン」を、通常、別個の細菌性アジュバントと共に投与する（Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔｏｎ，１９９１、Ｍｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【０１５７】
養子免疫療法では、患者の循環性リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球を試験管内で単離し、ＩＬ−２などのリンフォカインによって活性化させるかまたは腫瘍壊死のための遺伝子を形質導入し、そして再投与する（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、１９８９）。
【０１５８】
Ｄ．外科手術
がんを有する人々のうちのおよそ６０％は何らかの種類の外科手術を受けることになるが、これには、防止、診断または病気判定、治癒及び緩和のための外科手術が含まれる。治癒的外科手術は、他の療法、例えば、本発明の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法及び／または代替療法と併せて用いられるがん処置である。
【０１５９】
治癒的外科手術は、がん組織の全部または一部を物理的に除去、摘出及び／または破壊する切除を含む。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除の他にも、外科手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡法で管理される外科手術（モース手術）が含まれる。さらに、本発明を表在がん、前がんまたは付随的な量の正常組織の除去と併せて用いてもよいことが想定される。
【０１６０】
がんの細胞、組織または腫瘍の一部または全部を摘出する際、身体に空洞が形成され得る。処置は、付加的な抗がん療法による、領域の灌流、直接注射または局所塗布によって完遂され得る。そのような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日ごと、または１、２、３、４及び５週間ごと、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヶ月ごとに繰り返されてもよい。これらの処置も様々な投薬量であり得る。
【０１６１】
Ｅ．他の薬剤
他の薬剤を本実施形態の特定の態様と組み合わせて用いて処置の治療的有効性を向上させ得ることが想定される。これらの付加的薬剤としては、例えば、細胞表面受容体及びギャップ結合の上方制御に影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着阻害薬、アポトーシス誘導薬に対する過剰増殖細胞の感受性を増大させる薬剤、または他の生物学的薬剤が挙げられる。ギャップ結合の数を多くすることによって細胞間シグナル伝達を増加させることは、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖作用を増加させるであろう。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤または分化剤を本実施形態の特定の態様と併せて使用して処置の抗過剰増殖有効性を向上させることができる。本実施形態の有効性を向上させるためには細胞接着を阻害することが考えられる。細胞接着阻害薬の例は焦点接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害薬及びロバスタチンである。さらに、アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を増大させる他の薬剤、例えば抗体ｃ２２５を本実施形態の特定の態様と併せて使用して処置有効性を向上させることができることが考えられる。
【実施例】
【０１６２】
ＸＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。当業者であれば、以下の実施例で開示されている技術が、本発明の実施において十分に機能する本発明者によって発見された技術を表すこと、したがってその実施のための好ましい形態を構成するとみなすことができることを認識するはずである。しかしながら、本開示に鑑みて、開示される具体的実施形態に多くの変更を加えてなおも同様の、または類似した結果を本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく得ることができることは、当業者であれば認識するはずである。
【０１６３】
実施例１−血液悪性腫瘍を有する患者におけるＢＰ１００１（リポソームＧｒｂ２アンチセンス）の第Ｉ相試験
成長因子受容体結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）は、がん細胞シグナル伝達に必須であり、がん化チロシンキナーゼによって利用されてＲａｓ及びＥＲＫを活性化させる。ＢＰ１００１は、Ｇｒｂ２発現を阻害する、リポソームに組み込まれたアンチセンスである。試験のねらいは、血液悪性腫瘍を有する患者におけるＢＰ１００１の安全性、最大耐量（ＭＴＤ）、薬物動態及び抗白血病活性を画定することであった。
【０１６４】
ＢＰ１００１薬物質及び投与。Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴの配列は、５’−ＡＴＡ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ−３’（配列番号１）であり、これは、ヒトｇｒｂ２  ｍＲＮＡのコドン２〜７を標的とする。Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴは、Ｐ−エトキシオリゴ修飾からなり、Ｎｉｔｔｏ  Ｄｅｎｋｏ  Ａｖｅｃｉａ，Ｉｎｃ．（８５６０  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｒｏａｄ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ  ４５２１５，ＵＳＡ）によって製造された。Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴを凍結乾燥プロトコールによって１，２−ジオレオイル−３−ホスファチジルコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）の中に組み込んだ。ＢＰ１００１を５ｍｇ薬粉末として作製し、４℃で貯蔵した。薬物点滴の日に０．９％の生理食塩水を２ｍＬ添加して２．５ｍｇ／ｍＬのＢＰ１００１終濃度を得た。参加者にＢＰ１００１の２〜３時間の静脈内（ＩＶ）点滴を２８日間にわたって週に２回（３または４日ごと）投与した。参加者は、処置による利益が継続している場合には６サイクルまで処置を与えられることができた。
【０１６５】
患者及び試験デザイン。試験は、難治性／再発性のフィラデルフィア染色体陽性ＣＭＬまたはＡＬＬ、ＡＭＬまたはＭＤＳと診断された成人患者におけるＢＰ１００１の安全性、薬物動態及び有効性の評価のために標準的な３＋３用量漸増試験として設計した。各用量レベルに３名の患者のコホートを登録した。ＢＰ１００１の初回用量は５ｍｇ／ｍ２であった（コホート１）。１名の患者がグレード３以上の毒性に発展した場合には、その用量レベルでさらに３名の患者を増やした。２名以上の患者がグレード３以上の毒性に発展した場合にはその用量レベルを毒性とみなした。最大耐量（ＭＴＤ）は、２名以上の患者で用量制限毒性を生じさせる用量よりも低い用量として定義した。毒性は米国国立がん研究所の有害事象共通用語規準（ＮＣＩ  ＣＴＣＡＥ、バージョン３．０）を用いて等級分けした。用量制限毒性（ＤＬＴ）が認められなかった場合には、患者を次にコホート２（１０ｍｇ／ｍ２）、コホート３（２０ｍｇ／ｍ２）、コホート４（４０ｍｇ／ｍ２）、コホート５（６０ｍｇ／ｍ２）またはコホート６（９０ｍｇ／ｍ２）に登録することにした。
【０１６６】
ＢＰ１００１単剤第Ｉ相コホート１〜６が完了した時点で、ＢＰ１００１と低用量シタラビンとの併用（第Ｉｂ相）の安全性及び有効性を試験した。ＢＰ１００１を６０ｍｇ／ｍ２（コホート７）または９０ｍｇ／ｍ２（コホート８）としてＩＶ投与した。患者にＢＰ１００１の注射を３回与え、その後、２０ｍｇの低用量シタラビン（ＬＤＡＣ）を１０連続日にわたって１日に２回皮下投与した。この試験はＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖのＮＣＴ０１１５９０２８番に登録された。
【０１６７】
末梢血及び骨髄の評価。ベースライン時（試験開始から１４日以内）、及び１、８、１５、２２日目、サイクル１の完了時、ならびに臨床的必要に応じて、末梢血評価を行った。骨髄評価は、ベースライン時（試験開始から１４日以内）、サイクル１、サイクル２の完了時、及び臨床的必要に応じて行った。処置の前にベースライン細胞遺伝学的データを得た。ベースライン骨髄での体細胞突然変異を検出するために分子分析を行った。
【０１６８】
フローサイトメトリー。サイクル１の１、８、１５及び２２日目ならびにサイクル２の１日目に投薬を行う前に、コホート３、４、５及び６の患者から末梢血を採取した。ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ細胞調製チューブを使用してヘパリンナトリウム（ＢＤ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって白血球を末梢血から単離し、固定し、−８０℃の冷凍庫内で貯蔵した。検証済みの方法（Ｆｌｏｗ  Ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｓｉｔｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ，ＵＳＡ）を用いてフローサイトメトリーを利用してＣＤ３３発現細胞におけるＧｒｂ２及びリン酸化Ｅｒｋ１，２（ｐＥｒｋ）レベルを決定した。
【０１６９】
薬物動態試料の採取及び分析。投薬前、点滴開始（ＳＯＩ）から１、２、４、６、８、２４、７２時間後にコホート７及び８の患者からＧｒｂ２アンチセンスオリゴ濃度の測定のための血液試料を採取した。投薬開始〜４時間、投薬後４〜８時間、及び投薬後８〜２４時間の時にコホート７及び８の患者からＢＰ１００１濃度の測定のための尿試料も採取した。ＰＫ血液試料を処理して血漿を得、検証済みの方法（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を用いて定量下限（ＬＬＯＱ；０．５ｎｇ／ｍＬ）で分析した。尿試料は検証済みの方法（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を用いて１．００ｎｇ／ｍＬのＬＬＯＱで分析した。
【０１７０】
Ｐｈｏｅｎｉｘ薬理動態ソフトウェア（Ｃｅｒｔａｒａ）を用いてＰＫパラメータを推定した。ＩＶ点滴投与経路との一貫性を有するノンコンパートメント手法をパラメータ評価のために用い、２．５時間の推定点滴時間を用いた。全てのパラメータは、実用的であれば常に、サイクル１の１日目の血漿中Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴ個体濃度から生成させた。サイクル１の１日目の投薬前濃度値はＬＬＯＱ未満であり、それゆえ、時間ゼロでの値をゼロとみなした。パラメータは点滴開始に対する公称試料採取時間を用いて推定した。濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）は線形内挿によって線形台形法を用いて算出した。終末消失相の勾配は、重み付けされていない濃度データに対する対数線形回帰を用いて決定した。決定係数（Ｒ２）が０．８００未満であった場合、またはＡＵＣの無限への外挿（％ＡＵＣｅｘｔｒａｐ）が総面積の２０％超を表した場合には、終末消失相の決定に依拠するパラメータを報告しなかった。
【０１７１】
血漿から推定したパラメータは、最大観察濃度が観察された時の投薬後時間、Ｔｍａｘ；投薬後に測定された最大観察濃度、Ｃｍａｘ；見掛終末消失半減期、Ｔ１／２；投薬から投与後２４時間目までのＡＵＣ、ＡＵＣ（０−２４）；投薬から最終定量可能濃度が観察された時の投与後時間までのＡＵＣ、ＡＵＣ（０−ｔ）；投薬から無限までの推定ＡＵＣ、ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）；Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴの見掛クリアランス速度、ＣＬ；Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴの見掛分布体積、Ｖｚであった。
【０１７２】
尿パラメータの推定はマイクロソフトエクセルを使用して行った。全てのパラメータは、サイクル１の１日目の尿中Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴ個体濃度から生成させた。報告したパラメータは、試料採取期間全体にわたって尿中に排泄されたＧｒｂ２アンチセンスオリゴの累積量である合計Ｕ；血漿に対する腎クリアランスであるＣＬｒ；投与された薬物の合計と比較した尿中排泄Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴの相対量である回収率であった。
【０１７３】
統計解析。ＰＫ解析ならびに表及びグラフ生成はＰｈｏｅｎｉｘ  バージョン１．４によって生成させた。適切な分類及び選別変数のための記述的解析（Ｎ、数学平均、標準偏差）は、Ｐｈｏｅｎｉｘ  バージョン１．４、及びマイクロソフトエクセル２００７を使用して生成させた。
【０１７４】
研究目的。ＢＰ１００１第Ｉ相試験の主目的は、単剤療法としての漸増用量のＢＰ１００１の毒性及び耐性を決定すること；ＢＰ１００１の最大耐量（ＭＴＤ）を決定すること；ならびに低用量シタラビン（Ａｒａ−Ｃ；第Ｉｂ相）と組み合わせたＢＰ１０１の毒性及び耐性を決定することであった。ＢＰ１００１第Ｉ相試験のもう１つの目的は、最適生理学的活性用量（ＯＢＡＤ；循環白血病細胞のＧｒｂ２発現の５０％の低減として定義される）を決定すること；ＢＰ１００１の生体内での薬物動態を決定すること；及び腫瘍応答を評価することであった。
【０１７５】
組入れ及び除外の基準。試験のどちらのパートも、安全性、忍容性及び毒性、ＰＫ、腫瘍応答ならびに抗白血病活性を評価するために非盲検逐次用量漸増デザインを採用した。組入れの基準は、少なくとも１８歳であること；難治性または再発性のＡＭＬ、Ｐｈ＋  ＣＭＬ、ＡＬＬまたはＭＤＳを有すること；試験登録前に抗がん療法が少なくとも２週間行われていないこと（ヒドロキシ尿素またはアナグレリド（２４時間）、ＴＫＩ  ９５日間、及びインターフェロン（２週間）は除く）；十分な肝及び腎機能（ＡＬＴ＜２ｘ  ＵＬＮ、血清クレアチニン＜２ｘ  ＵＬＮ、血清ビリルビン＜２ｘ  ＵＬＮ）を有すること；及びＥＣＯＧパフォーマンスが０〜２であることであった。除外の基準は、処置プログラムを成し遂げる患者の能力に干渉するであろう重篤な併発性の医学的病気を有すること；及び別の研究の製品を１４日間または先の製品の５半減期よりも長く受けていることであった。
【０１７６】
患者の特徴。合計３９名の患者が試験に登録された：１３名の患者（コホート１）、６名の患者（コホート２）、３名の患者（コホート３）、３名の患者（コホート４）、３名の患者（コホート５）、４名の患者（コホート６）、４名の患者（コホート７）及び３名の患者（コホート８）。５名の患者はＣＭＬ芽球期、３０名の患者はＡＭＬ、４名の患者はＭＤＳと診断された（表３）。患者の年齢は３２〜８９歳の範囲であり、中央値が６６であった。２７名は男性患者、１２名は女性患者であった。登録前に、患者は４つの投薬計画の中央値を受けた。彼らの全身状態の中央値は１であった。末梢血芽球計数は０〜９６％の範囲であり、中央値が１５％であった。予想どおりこれらの患者は、ｔ（９；２２）（ｎ＝７）、二倍体（ｎ＝１２）、複合型（ｎ＝１０）、混合型（ｎ＝１３）を含めた多様な細胞遺伝学的特徴を有していた。２名の患者はｔ（９；２２）陽性ＣＭＬ及び複合型の細胞遺伝学的特徴を有していた一方、１名の患者はｔ（９；２２）陽性ＡＭＬを有していた。
【０１７７】
評価可能な患者における有害事象。３９名の患者のうち２７名の患者が評価可能であった。１２名の患者は疾患進行のためにサイクル全体を完遂することができずプロトコールに従って元の所へ返された（表４）。２７名の評価可能な患者のうち２１名の患者はＢＰ１００１単剤療法を受けた一方、６名の患者はＢＰ１００１＋ＬＤＡＣ併用療法を受けた。表８に示すように、評価可能な患者は白血病において様々な分子的異常を有しており、これらにはＡＳＸＬ１（ｎ＝１）、ＢＣＲ−ＡＢＬ（ｎ＝２；１名はＴ３１５Ｉを含む）、ＣＥＢＰＡ（ｎ＝４）、ＤＮＭＴ３Ａ（ｎ＝１）、ＦＬＴ−ＩＴＤ（ｎ＝２）、ＩＤＨ１／２（ｎ＝３）、ＪＡＫ２（ｎ＝２）、ＮＯＴＣＨ１（ｎ＝１）、ＮＰＭ１（ｎ＝２）、ＮＲＡＳ（ｎ＝２）、ＴＥＴ２（ｎ＝２）、ＴＰ５３（ｎ＝２）が含まれていた。登録患者の特徴を表３に示す。
【０１７８】
５ｍｇ／ｍ２を受けている１名の患者だけは、増殖性ＣＭＬ−ＢＰのための高用量ヒドロキシ尿素を受けている間、グレード３の粘膜炎及び手足症候群の用量制限毒性（ＤＬＴ）を被った。試験医薬を原因因子として除外することができなかったため、この事象はＤＬＴとして報告した。患者を６名に増やしたところ、ＤＬＴに発展する患者は他にはいなかった。他の薬物関連毒性は、処置したどの患者においても認められなかった。ＭＴＤは同定されなかった。ＢＰ１００１のＨＴＤは９０ｍｇ／ｍ２である。
【表３−２−１】
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【表３−２−２】
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【表４】
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【０１７９】
Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴの薬物動態。Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴの血漿中濃度の定量下限（ＬＬＯＱ）は０．５０ｎｇ／ｍＬである。試験前の時点では定量可能なＧｒｂ２アンチセンスオリゴ濃度はなかった。Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴの血漿中レベルは二重指数関数的に低下した（図１）。血漿中のＧｒｂ２アンチセンスオリゴの最大濃度は点滴の１時間後に観察された（図１）。点滴後７２時間目にＧｒｂ２アンチセンスオリゴの血漿中レベルはＬＬＯＱ未満またはその少し上であった（図１）。血漿中のＧｒｂ２アンチセンスオリゴの血漿ｔ１／２は、６０ｍｇ／ｍ２用量の場合には２２．２〜３７．７時間、９０ｍｇ／ｍ２用量の場合には４．６４〜１４．２時間の範囲であった（表５）。Ｃｍａｘ、ＡＵＣ（０−２４）、ＡＵＣ（０−ｔ）及びＡＵＣ（０−ｉｎｆ）は、６０ｍｇ／ｍ２から９０ｍｇ／ｍ２へと１．５倍に増加したにもかかわらずどちらの用量レベルでも同様であった（表５）。用量が６０ｍｇ／ｍ２から９０ｍｇ／ｍ２へと増加した場合、Ｖｚはおよそ１．５分の１減少し、ＣＬはおよそ１．５倍増加した（表５）。
【表５】
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【０１８０】
投与された合計用量と比べて尿中のＧｒｂ２アンチセンスオリゴの回収量は、６０ｍｇ／ｍ２用量の場合には０．０４〜３．２３％、９０ｍｇ／ｍ２用量の場合には０．３６〜４．７７％の範囲であった。尿中のＧｒｂ２アンチセンスオリゴの平均濃度は６０ｍｇ／ｍ２コホートよりも９０ｍｇ／ｍ２コホートにおいてより高かった（表６）。
【表６】
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【０１８１】
ＢＰ１００１はＧｒｂ２及びリン酸化Ｅｒｋ１，２（ｐＥｒｋ）のレベルを低下させた。フローサイトメトリーを利用して、ＢＰ１００１単剤療法を受けている患者の循環白血病細胞におけるＧｒｂ２及びｐＥｒｋタンパク質のレベルを決定し、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として報告した。処置中のＧｒｂ２及びｐＥｒｋのＭＦＩをベースライン時のそれらと比較した（表７）。最後（処置の最後またはサイクル１の２２日目）に測定した試料では、ＢＰ１００１は、１２個中１０個の試料においてＧｒｂ２レベルを２５％以上減少させ、１２個中７個の試料においてｐＥｒｋレベルを２５％以上減少させた。減少の平均はＧｒｂ２レベルでは４９％（範囲：２８〜９１％）、ｐＥｒｋレベルでは５２％（範囲：２７〜９１％）であった。
【表７】
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【０１８２】
ＢＰ１００１の抗白血病活性。単剤療法としてのＢＰ１００１は、２１名中９名の患者において５０％超の末梢血芽球を減少させ、２１名中３名の患者において５０％超の骨髄芽球を減少させた（表８）。プロトコールに従って、患者が安定した疾患を呈する（治療の最初４週間にわたって彼らのＷＢＣの増加が５０％未満である）場合または彼らの疾患が改善した場合に彼らはＢＰ１００１処置を６ヶ月までにわたって受け得る。４名の患者は２サイクルの処置を完遂し、３名の患者は５サイクルの処置を完遂した（表８）。これらの７名の患者は様々な細胞遺伝学的特徴ならびに分子的異常、例えばＪＡＫ２及びＮＲＡＳ突然変異を有していた（表８）。
【０１８３】
ＢＰ１００１＋ＬＤＡＣ併用療法を受けていた６名の評価可能な患者のうち、３名の患者は３サイクルの処置を受け、１名の患者は５サイクルの処置を受けた（表８）。より重要なことに、３名の患者は完全寛解（骨髄芽球≦５％）に達し、２名の患者は部分寛解（骨髄芽球の５０％以上の減少）に達した（表８、図２）。
【表８】
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【０１８４】
実施例２−Ｄａｓと組み合わせたＢＰ１００１の試験管内での有効性
ＢＰ１００１の臨床的活性を移行期または芽球期のＣＭＬ患者で研究することになる。移行期及び芽球期の患者へのイマチニブの奏効は乏しいかまたは短期的である。これらの患者は他のチロシンキナーゼ阻害薬、例えば、ダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ及びポナチニブで処置されることが多い。ここでは、ＢＰ１００１がダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ及びポナチニブのＣＭＬ細胞における阻害効果を強化することができるか否かを判定した。
【０１８５】
細胞培養。ＢＶ１７３及びＫ５６２細胞は、ＣＭＬ患者に由来するＢｃｒ−Ａｂｌ陽性細胞株である。それらをＣＬＳ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ＧｍｂＨ（Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清が補給されたＲＰＭＩ培地中で培養した。
【０１８６】
化学物質。Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴの配列は、５’−ＡＴＡＴＴＴＧＧＣＧＡＴＧＧＣＴＴＣ−３’（配列番号１）である。Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴはＡｖｅｃｉａ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）、によって製造された。ＢＰ１００１は、記載されているようにＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）によって作製された。手短に述べると、Ｇｒｂ２アンチセンスオリゴをジオレオイルホスファチジルコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）と混合し、冷凍し、凍結乾燥させた。凍結乾燥物は４℃で貯蔵した。実験の日にＢＰ１００１を培地で水和させ、０〜１２０μｇ／ｍＬの終濃度で細胞に添加した。ダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ及びポナチニブなどのチロシンキナーゼ阻害薬は１０ｍＭ  ＤＭＳＯ原液としてＳｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）から購入した。
【０１８７】
細胞生存率評価。９６ウェルプレートにＢＶ１７３及びＫ５６２細胞をそれぞれ５及び１５×１０３細胞／ウェルで培地０．１ｍＬ中に播種した。細胞をＢＰ１００１及び／またはチロシンキナーゼ阻害薬と共に４日間インキュベートした。未処理及び処理済みの白血病細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）によって測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイは、代謝的活性細胞の指標であるＡＴＰの存在を定量することによって生細胞の数を決定する。
【０１８８】
細胞周期分析。ＢＰ１００１及び／またはチロシンキナーゼ阻害薬と共に４日間インキュベートした後、ＢＶ１７３細胞を採集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで１Ｘの固定／透過化用緩衝液（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ，ＵＳＡ）を使用して細胞を固定し、４℃で１時間透過化させた。透過化後、細胞を洗浄し、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共に暗所にて４℃で約３０分間インキュベートした。フローサイトメトリーデータ取得はＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して行った。フローサイトメータは２０，０００イベントを捕集するように設定された。細胞周期の種々の期（ｓｕｂ−Ｇ１、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ）の相対的百分率を報告した。
【０１８９】
ＢＰ１００１による前処理はダサチニブによる阻害を強化した。最初に、ＢＰ１００１がＣＭＬ細胞株におけるダサチニブによる阻害を強化することができるか否かを判定した。ＢＰ１００１添加のタイミングがダサチニブ活性に影響を与え得るか否かを判別するために、ＢＰ１００１とダサチニブとを様々な順序で共インキュベートを実施した：（１）（同日処理を模擬して）ダサチニブ添加の１時間前にＢＰ１００１を細胞に添加した；（２）細胞をダサチニブで処理した１日後にＢＰ１００１を細胞に添加した；（３）細胞をダサチニブで処理する１日前にＢＰ１００１を細胞に添加した。
【０１９０】
共インキュベーション順序（１）：同じ日に添加するＢＰ１００１及びダサチニブ。Ｋ５６２及びＢＶ１７３細胞をＢＰ１００１（０〜１２０μｇ／ｍＬ）と共に１時間インキュベートし、その後、１ｎＭのダサチニブで処理した。４日後に成長阻害効果を判定した。１２０μｇ／ｍＬのＢＰ１００１の非存在下及び存在下でダサチニブはＫ５６２生存率をそれぞれ２５％及び１５％低下させた（図７Ａ）。１２０μｇ／ｍＬのＢＰ１００１の非存在下及び存在下でダサチニブはＢＶ１７３生存率をそれぞれ４０％及び４９％低下させた（図７Ａ）。これらのデータは、ＣＭＬ細胞をＢＰ１００１及びダサチニブで同日処理した場合にＢＰ１００１がダサチニブによる阻害に対して最小限の影響を与えたことを示している。
【０１９１】
共インキュベーション順序（２）：ＢＰ１００１より前に添加するダサチニブ。ＣＭＬ細胞株をダサチニブで１日間処理し、続いてＢＰ１００１で処理した。細胞生存率を３日後に決定した。ダサチニブはＫ５６２生存率を１２％低下させた（図７Ｂ）。濃度１９０μｇ／ｍＬのＢＰ１００１の添加はＫ５６２生存率を５０％低下させた（図７Ｂ）。しかしながら、濃度１２０μｇ／ｍＬのＢＰ１００１をダサチニブに添加した場合、Ｋ５６２生存率は２５％低下した（図７Ｂ）。ダサチニブはＢＶ１７３生存率を６％低下させた（図７Ｂ）。１２０μｇ／ｍＬのＢＰ１００１の添加はＢＶ１７３生存率を３４％低下させた（図７Ｂ）。ダサチニブ処理の１日後に添加したＢＰ１００１はＢＶ１７３生存率をさらに低下させた。しかし、ダサチニブ処理の１日後に添加したＢＰ１００１がＫ５６２生存率をさらに低下させることができるか否かについては不明である。
【０１９２】
共インキュベーション順序（３）：ダサチニブより前に添加するＢＰ１００１。ＣＭＬ細胞株をＢＰ１００１と共に１日間インキュベートし、その後、ダサチニブで処理した。ダサチニブ単独はＫ５６２生存率を２５％低下させた（図７Ｃ）。１２０μｇ／ｍＬのＢＰ１００１をダサチニブに添加した場合、Ｋ５６２生存率は４４％低下した（図７Ｃ）。１２０μｇ／ｍＬのＢＰ１００１の非存在下及び存在下でダサチニブはＢＶ１７３生存率をそれぞれ１０％及び６８％低下させた（図７Ｃ）。これらのデータは、１日前にＢＰ１００１で処理することによってどちらのＣＭＬ細胞株でもダサチニブによる阻害が強化されたことを示している。
【０１９３】
ＢＰ１００１はダサチニブによる細胞死誘導を強化した。次に本発明者らは、ＢＰ１００１がダサチニブによる阻害を強化する機序を判定した。ＢＶ１７３細胞をＢＰ１００１と共に１日間インキュベートし、その後、ダサチニブで処理した。３日後に細胞を採集し、フローサイトメトリーのために処理した。ＢＰ１００１＋ダサチニブ併用の主な阻害機序は、ｓｕｂ−Ｇ１期の細胞の百分率の増加（図８Ａ〜Ｄ）によって示されるとおり、細胞死誘導であった。ＢＰ１００１、ダサチニブ及び併用によって処理された時のｓｕｂ−Ｇ１期の細胞の百分率はそれぞれ３．１、１０．６及び２８．０であった（図８Ａ〜Ｄ）。
【０１９４】
ＢＰ１００１による前処理はダサチニブ及びニロチニブによる細胞死誘導を強化した。フローサイトメトリーを用いてＢＰ１００１による前処理がニロチニブ、ボスチニブ及びポナチニブに対して与える影響を判定した。図３は、ＢＰ１００１による前処理がダサチニブ及びニロチニブによる阻害を強化することを示した。ｓｕｂ−Ｇ１期の細胞の百分率は、ダサチニブでは３０．７から４０．６、ニロチニブでは２６．４から３２に増加した（図９Ａ）。しかしながら、ＢＰ１００１による前処理はボスチニブまたはポナチニブによる阻害に対して影響を与えなかった（図９Ａ）。ボスチニブ、及びＢＰ１００１＋ボスチニブ併用で処理されたｓｕｂ−Ｇ１期の細胞の百分率はそれぞれ３４．３及び３６．４であり、一方ポナチニブ及びＢＰ１００１＋ポナチニブ併用では３４．０％及び３６．０％であった（図９Ａ）。これらのデータは、ＢＰ１００１による前処理がダサチニブ及びニロチニブによる阻害を選択的に強化したことを示している。
【０１９５】
興味深いことに、細胞をチロシンキナーゼ阻害薬の後にＢＰ１００１で処理した場合には細胞死の減少が認められた。ｓｕｂ−Ｇ１期の細胞の百分率は、ダサチニブでは６４．１から５１．８、ニロチニブでは６５．０から５７．１、ボスチニブでは６６．１から４８．６、ポナチニブでは７１．１から５１．７に減少した（図９Ｂ）。
【０１９６】
実施例３−移行期または芽球期のＰｈ＋  ＣＭＬを有する患者におけるダサチニブ（Ｄａｓ）と組み合わせたＢＰ１００１の安全性、薬物動態及び有効性を評価するための第Ｉｂ／ＩＩａ期治験
試験の原理的説明。第Ｉｂ期試験には、移行期または芽球期のＰｈ＋  ＣＭＬを有する参加者が登録されることになる。参加者はＢＰ１００１に加えてＤａｓを受けることになる。これは非盲検シングルアーム治験である。第Ｉｂ相試験で処置を受けるのに適格な参加者は、ＢＰ１００１（コホート１では６０ｍｇ／ｍ２、またはコホート２では９０ｍｇ／ｍ２）及び同じ用量レベルのＤａｓ（１４０ｍｇ）を受けることになる。第ＩＩａ相のための用量が同定された時点で、第ＩＩａ相での処置を受けるのに適格な全ての参加者はＢＰ１００１とＤａｓとについて同じ用量レベルを受けることになる。この試験では無作為化を行わないこととする。
【０１９７】
各処置サイクルは２８日とされる。各処置サイクルにおいて合計８回の投与のために、ＢＰ１００１をサイクルの１日目から開始して２〜４日（＋／−１日は容認可能なゆとりである）ごとにおよそ１〜３時間かけて投与することになる。サイクルの５日目またはそのあたりで、なおかつＢＰ１００１の２回目の投薬が完了してから２４時間以上後に、参加者は１４０ｍｇのＤａｓの１日１回の経口投薬を開始してその後毎日途切れることなく継続することとなる。この投薬計画に続いて繰り返されるサイクルは、進行、再発、不耐性、参加者の６サイクルの処置の完遂、または参加者／研究者による非継続の要求があるまで、４週間ごとに予定されることになる。参加者は、試験の投薬部分を完遂した場合にはその後におよそ６ヶ月間、または死亡もしくは試験閉鎖のいずれか早く到来する方まで追跡がなされることになる。
【０１９８】
試験の原理的説明：用量選択。事前のデータは、参加者においてＧｒｂ２の下方制御（及び潜在的な抗白血病利益）をＨＴＤ（９０ｍｇ／ｍ２）及びＨＴＤの１レベル下（６０ｍｇ／ｍ２）のＢＰ１００１によって得ることができること、ならびにこれらの２つの用量間で安全性／忍容性にあまり差がないことを示している。これに基づいて、６０または９０ｍｇ／ｍ２のＢＰ１００１とＤａｓとを組み合わせることの安全性及び忍容性を試験することとする。
【０１９９】
第Ｉｂ相試験では、２８日のサイクルにわたって与えられる合計８回の投薬のために、＋／−１日のゆとりを容認可能として週に２回（２〜４日ごとに）、ＢＰ１００１をおよそ１〜３時間かけて静脈内（ＩＶ）投与することになる。開始用量は６０ｍｇ／ｍ２となり、ＢＰ１００１の最初の投薬を各２８日サイクルの１日目に開始することになる。ＢＰ１００１の２回目の投薬が完了してから２４時間以上後に、参加者は１４０ｍｇのＤａｓの毎日の投薬を開始してその後毎日途切れることなく継続することとなる。Ｄａｓの投薬は、それがＢＰ１００１の２回目の投薬が完了してから２４時間以上後に開始されるのである限り、早くも５日目から開始され得る。３名の患者はＤＬＴの非存在下で各用量のＢＰ１００１を２８日間受けることになる。試験のこのパート内での用量漸増は、グレード３のＤＬＴが検出されるまで進められることになる。
【０２００】
次の患者コホートは、前のコホートの３名の患者がＤＬＴの兆候を伴わずに２８日の処置を完遂した時点で試験に登録されることになる。その後、用量漸増は９０ｍｇ／ｍ２にまで進められることになる。１名の患者がＤＬＴを被る場合にはこのコホートに追加で３名の患者を増やすことになる。３〜６名中２名以上の処置患者がＤＬＴを被るいかなるコホートも、ＭＴＤを超過しているとみなされることとなり、そのすぐ下の用量コホートがさらなる試験のために選択されることになる。全ての患者は、毒性に関して処置（２８日）の最後にＮＣＩ  ＣＴＣＡＥ規準を用いて評価されることになる。この投薬計画に続いて繰り返されるサイクルは、進行、再発、不耐性、参加者の６サイクルの処置の完遂、または参加者／研究者による非継続の要求があるまで、４週間ごとに予定されることになる。
【０２０１】
第ＩＩａ処置スケジュールは第Ｉｂ相試験と同一とする。しかしながら、全ての参加者は、同じ（第Ｉｂ相試験で同定された）用量のＢＰ１００１、及び１４０ｍｇのＤａｓを与えられることになる。
【０２０２】
試験の原理的説明：試験デザイン。移行期または芽球期のＰｈ＋  ＣＭＬ患者の処置において十分に確立された治療計画であるＤａｓと併せて、ＢＰ１００１の有効性及び安全性を評価することになる。前臨床試験に基づいてＤａｓと組み合わせたＢＰ１００１は、最前線の処置であるイマチニブが奏効しない移行期または芽球期のＣＭＬ患者に利益をもたらすことが予想される。試験デザインを図３に図式で表す。
【０２０３】
この試験はシングルアーム非盲検デザインを利用してＤａｓと組み合わせたＢＰ１００１の安全性プロファイル、薬物動態及び有効性を評価することになる。第Ｉｂ相試験は非盲検逐次用量漸増デザインを採用して安全性、忍容性及び毒性、腫瘍応答ならびに抗白血病活性を評価する。
【０２０４】
安全性及び生物学的作用を特性評価するためならびに第ＩＩａ相推奨用量を同定するために、ＣＭＬを有する患者の連続コホートを、固定用量のＤａｓと組み合わせた最大耐量（ＭＴＤ）またはＭＴＤが同定されない場合のＨＴＤ、及びＭＴＤ（またはＨＴＤ）よりも１つ低いレベルのＢＰ１００１で処置する、標準的な「３＋３」デザインが用いられることになる。
【０２０５】
３名の患者は、ＤＬＴの非存在下で各用量レベルのＢＰ１００１を２８日間受けることになる。次の患者コホートは、前のコホートの３名の患者がＤＬＴの兆候を伴わずに２８日の処置を完遂した時点で試験に登録されることになる。その後、用量漸増は９０ｍｇ／ｍ２にまで進められることになる。１名の患者がＤＬＴを被る場合にはこのコホートに追加で３名の患者を増やすことになる。３〜６名中２名以上の処置患者がＤＬＴを被るいかなるコホートも、ＭＴＤを超過しているとみなされることとなり、そのすぐ下の用量コホートがさらなる試験のために選択されることになる。全ての患者は、毒性に関して処置（２８日）の最後にＮＣＩ  ＣＴＣＡＥ規準を用いて評価されることになる。
【０２０６】
患者は処置が延長されてもよい。この投薬計画に続いて繰り返されるサイクルは、進行、再発、不耐性、参加者の６サイクルの処置の完遂、または参加者／研究者による非継続の要求があるまで、４週間ごとに予定されることになる。
【０２０７】
第ＩＩａ相試験は非盲検単回用量レベル試験である。試験で処置を受けるのに適格である全ての参加者は、どちらのＢＰ１００１についても第Ｉｂ相試験で決定されたのと同じである用量レベル（ＨＴＤまたはＨＴＤよりも１つ下のレベル）、及びＤａｓ（１４０ｍｇ）を受けることになる。この試験では無作為化を行わないこととする。
【０２０８】
第ＩＩａ相試験では、Ｄａｓと組み合わせたＢＰ１００１の有効性が、Ｄａｓ単独について証拠によって支持されている過去に得られた奏効率と比較されることになり、単独で、またはＤａｓと組み合わせて与えられるＢＰ１００１の薬物動態が評価されることになる。
【０２０９】
およそ４０名の評価可能な患者は第ＩＩａ相で以下のとおりにＢＰ１００１とＤａｓとの組み合わせを受けることになる。参加者は、スクリーニング期間中に適格性が検証された後、ＢＰ１００１の初回投薬を受けることになる。用量は、ＢＰ１００１とＤａｓとを組み合わせることの安全性及び忍容性に基づいて第Ｉｂ相で同定されることになる。ＢＰ１００１は、２８日のサイクルにわたって与えられる合計８回の投薬のために、Ｃ１Ｄ１に与えられてその後は２〜４日ごとに与えられることになる。サイクルの５日目またはそのあたりで、なおかつＢＰ１００１の２回目の投薬が完了してから２４時間以上後に、参加者は１４０ｍｇのＤａｓの１日１回の経口投薬を開始してその後毎日途切れることなく継続することとなる。
【０２１０】
少なくとも３サイクルの処置を完遂した参加者は奏効について評価されることになる。目標奏効率は３５％である。無益性のモニタリングのためにＴｈａｌｌ，Ｓｉｍｏｎ，Ｅｓｔｅｙのベイズ流アプローチが実施されることになる。５のコホートサイズで５番目の患者から始めて以下の無益性中止則が適用されることになる：ｐｒｏｂ｛ｐ（ＲＲ）＞０．３５）＜０．０３。ここで、ｐ（ＲＲ）は奏効率を表す。つまり、ＲＲが３５％を上回る可能性が３％未満であると試験中に判定されるならば、治験は無益性のために早期に中止されることになる。
【０２１１】
ベイズ流アプローチはまた、登録患者の毒性モニタリングのためにも実施されることになり、この場合、毒性は、少なくとも処置に関係している可能性があるＤＬＴであると判定される任意の非血液学的毒性として定義される。毒性は、ＴＯＸと表されるが、ベータ二項分布に基づいて算出されるベイズ流中止境界によってモニタリングされることになる。本発明者らは演繹的にｐ（ＴＯＸ）〜ベータ（０．６，１．４）と仮定する。Ｐｒ（ｐ（ＴＯＸ）＞０．３０｜データ）＞０．８８ならば、試験は毒性のために中止されることになる。つまり、試験中のいかなる時であろうと毒性率が３０％を上回る可能性が８８％を上回ると判定されるならば、新たな患者登録のための治験は中止することになる。
【０２１２】
患者は処置が延長されてもよい。この投薬計画に続いて繰り返されるサイクルは、進行、再発、不耐性、参加者の６サイクルの処置の完遂、または参加者／研究者による非継続の要求があるまで、４週間ごとに予定されることになる。
【０２１３】
試験目的。第Ｉｂ相試験の主目的は、Ｄａｓと組み合わせたＢＰ１００１の用量制限毒性（ＤＬＴ）及び最大耐量（ＭＴＤ）を決定することである。第ＩＩａ相試験の主目的は、ＢＰ１００１とＤａｓとの組み合わせの薬物動態（ＰＫ）及び有効性を評価することである。
【０２１４】
この試験のもう１つの目的は以下である：Ｄａｓと組み合わせたＢＰ１００１の安全性を評価すること；ＢＰ１００１とＤａｓとの組み合わせが（過去の記録との比較によって）Ｄａｓ単独より高い有効性（血液学的奏効、細胞遺伝学的奏効または分子的奏効）をもたらすか否かを判定すること；単独で、及びＤａｓと組み合わせて与えられる場合のＢＰ１００１の薬物動態（ＰＫ）を評価すること；全体的生存、奏効するまでの時間、及び奏効の持続時間を評価すること。
【０２１５】
この試験の診査上の目的は、処置奏効とａｂｌキナーゼドメイン突然変異との相関性を評価することになる。
【０２１６】
試験集団：組入れ基準。参加者は、試験に参加するのに適格であると見なされるためにはスクリーニング時に以下の基準を全て満たさねばならない：
１．１８歳以上の成人
２．女性は、出産潜在能を有さない者、外科的に不稔である者、閉経後である者、または適切な避妊方法を試験中及び試験薬もしくはＤａｓの最終投薬後３０日間に実施する者でなければならない
３．男性は、適切な避妊方法を試験中及び試験薬もしくはＤａｓの最終投薬後少なくとも３０日間に用いることに同意せねばならない
４．組織学的証拠によって支持されている、移行期または芽球期のＰｈ＋  ＣＭＬの診断。芽球期は、末梢血中または骨髄中の芽球が３０％以上であること、または肝臓もしくは脾臓におけるものを除く髄外性疾患の存在として定義される。移行期ＣＭＬの基準を満たすには以下のパラメータのうちの１つが必要とされる：
ａ．末梢血中または骨髄中の芽球≧１５％
ｂ．末梢血中または骨髄中の前骨髄球及び芽球≧３０％
ｃ．ＰＢまたはＢＭ好塩基球≧２０％
ｄ．療法に起因しない血小板減少症＜１００×１０３／ｍｌ
ｅ．細胞遺伝学的
５．以下によって定義される十分な肝及び腎機能：
ａ．アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）及びアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）≦基準範囲上限（ＵＬＮ）の２．５倍；かつ
ｂ．総ビリルビン≦１．５ＵＬＮ；かつ
ｃ．少なくとも５０ｍｌ／分の推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）。血中尿素窒素（ＢＵＮ）及びクレアチニンの試験をベースラインで実施するときにＣｏｃｋｃｒｏｆｔ−Ｇａｕｌｔ式を利用してｅＧＦＲを決定することになる。安全性保証のためにｅＧＦＲ血清クレアチニンとＢＵＮとの組み合わせを使用して患者の腎機能を評価することになる。
（ｉ）Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ−Ｇａｕｌｔ式：推定クレアチニンクリアランス＝［（１４０−年齢）×総体重］／（血清クレアチニン×７２）
（ｉｉ）女性の場合は０．８５を掛ける
６．証拠によって支持されている米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の全身状態が０、１または２（表９）であること
７．以前のいかなる外科手術、放射線療法または抗新生物薬処置の影響（脱毛症を除く）から回復していること
８．書面でインフォームドコンセントを提供することに意欲的でありそれができること。
【表９】
2019529420.tif 000016
【０２１７】
試験集団：除外基準。スクリーニング時に以下のいずれかの基準を満たす参加者は試験参加から排除されることになる：
１．Ｔ３１５Ｉ突然変異を有する患者は排除されないが個別に奏効が分析されることになる
２．過去２年間におけるＣＭＬ以外の別の原発性悪性腫瘍（非メラノーマ皮膚癌または子宮頸部上皮内癌は除く）
３．クモ膜下腔内療法を必要とする既知の活動性軟髄膜白血病。注：ＣＮＳ疾患の病歴を有する患者は、スクリーニング前に少なくとも２回連続して陰性の髄液評価が証拠によって支持されていることに基づいて、参加が容認され得る。
４．白血病についての骨髄基準も満たすことなく単離される髄外性白血病
５．ＢＰ１００１開始から１４日以内に、ヒドロキシ尿素もしくはアナグレリドまたはＴＫＩ（２日以内）を除く何らかの抗がん療法を受けていること
６．制御されず活動性で未処置または進行性である感染症
７．ＢＰ１００１開始から１４日以内または５半減期以内に何らかの研究薬剤を受けていること
８．妊娠している、妊娠試験陽性である、もしくはスクリーニング期間中に授乳中である、または試験の過程中もしくは試験薬の最終投薬後３０日以内に妊娠することもしくは授乳することを意図している、女性
９．以前におけるＢＰ１００１への曝露
１０．Ｄａｓに対する不耐性の過去を有する、またはＤａｓが適さない可能性がある、患者
１１．参加者の試験完遂能力に干渉するであろう重篤な併発性の医学的病気または精神病
１２．活動性／慢性Ｂ型肝炎感染症（陽性表面抗原［ＨＢｓＡｇ］に基づく）、Ｃ型肝炎感染症（陽性抗体［ＨＣＶ  Ａｂ］に基づく）、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２、陽性抗体に基づく）
１３．試験処置を忍容する参加者の能力を損なうおそれ、または試験遂行もしくは結果解釈の何らかの側面に干渉するおそれがある同時進行的症状の存在。これには、限定されないが、不安定狭心症もしくは制御されない狭心症、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）のクラスＩＩＩもしくはＩＶの鬱血性心不全、制御されず持続している高血圧、臨床的に重大な不整脈、または臨床的に重大なＥＣＧ異常（例えば、ＱＴｃＦ＞４７０ｍｓｅｃ）が含まれる。
１４．過去６ヶ月間に以下のいずれかがあった：胸膜滲出、心筋梗塞、不安定狭心症、冠動脈／末梢動脈バイパス移植、脳血管事故、または一過性脳虚血性発作
１５．制御されない発作障害（すなわち過去２ヶ月間の発作）
１６．何らかの理由で、研究者との意思疎通ができない、もしくは意欲的でない、または協力をしない、あるいはプロトコールに従わない
【０２１８】
試験処置：ＢＰ１００１の用量及び投与。ＢＰ１００１は、ＩＶ投与のための再構成のために、滅菌され保存料無添加で白色の凍結乾燥粉末として供給され、２０ｍＬバイアルに入れて供給される。各単回使用のＢＰ１００１の２０ｍｌバイアルは５ｍｇのＧｒｂ２オリゴヌクレオチドと１３．３５ｍｇのＤＯＰＣとを含有する。投薬量の算出はＧｒｂ２オリゴヌクレオチドに基づいている。注射のためにはＢＰ１００１の各バイアルを２ｍＬの生理食塩水（塩化ナトリウム０．９％）で再構成して５．０ｍｇ／２．０ｍＬ（２．５ｍｇ／ｍＬ）のＢＰ１００１濃度とせねばならない。再構成されたＢＰ１００１は再構築からおよそ６時間安定であり、それゆえ、ＩＶ点滴は再構成からおよそ６時間後までに完了されねばならない。
【０２１９】
第Ｉｂ試験では、用いられるＢＰ１００１の用量は６０ｍｇ／ｍ２（コホート１）または９０ｍｇ／ｍ２（コホート２）である。ＢＰ１００１は各２８日サイクルの１、４、８、１１、１５、１８、２２及び２５日目（＋／−１日のゆとりは容認可能）にＩＶ点滴として投与されることになる。処置サイクル１の場合、参加者は、Ｄａｓ投薬に進んで試験を継続するには（１日目及び４日目の）どちらの用量のＢＰ１００１も受けねばならない。Ｄａｓ投薬開始前に両方のＢＰ１００１を受けていない参加者は、試験の投薬部分が中断されて試験の経過観察に入り得る。
【０２２０】
ＢＰ１００１の投薬量は、ベースライン（スクリーニング時）体表面積（ＢＳＡ）に基づくことになる。しかしながら、ベースラインから１０％以上の体重変化を被る参加者の場合には用量が調節されることになる。ＢＳＡは実際の体重を使用して算出されることになり、但し１００ｋｇを上回る体重の参加者は例外とし、これらの個体については１００ｋｇに基づいて用量が算出されることになる。
【０２２１】
ＩＶ点滴は、およそ１〜３時間かけて投与することとし、また、ＩＶプッシュまたはＩＶボーラスとして与えてはならない。点滴は、専用の中枢または末梢ＩＶラインによって与えることとし、また、他の医薬と同時に与えることはできない。
【０２２２】
試験処置：ダサチニブの用量及び投与。ダサチニブ（Ｄａｓ）は、各２８日サイクルのおよそ５日目から開始して１日１回、経口投与されることとする。Ｄａｓの投薬は、それがＢＰ１００１の２回目の投薬が完了してから２４時間以上後に開始されるのである限り、各サイクルの早くも５日目から開始され得る。Ｄａｓ処置は一旦開始されると中断することなく継続されることになる。この試験で用いるＤａｓの用量は１４０ｍｇ（各用量）である。
【０２２３】
付随する薬。最初の４週間の療法の間、ヒドロキシ尿素は容認されることになる。アナグレリドも、５００Ｋより上回る血小板血症の管理のためにいつでも容認されることになる。以下の薬は処置期間中は許容されない：試験下の疾患または他の悪性腫瘍の処置のための任意の（Ｄａｓ、ヒドロキシ尿素またはアナグレリド以外の）抗がん剤。
【０２２４】
手順のスケジュール及び説明。参加者は、表１０に示すスクリーニング手順を受けることになる。
【表１０】
2019529420.tif 000017
【０２２５】
初回の経過観察訪問は、処置サイクル中断後３０日（＋／−７日）以内になされねばならない。初回の経過観察訪問は、身体測定；分類及び血小板を伴うＣＢＣ、芽球を含む％；血清化学；付随する薬の記録；有害事象の記録を含むことになる。
【０２２６】
長期の経過観察訪問は、３０日目の経過観察訪問から、療法開始後１２ヶ月目まで、または試験閉鎖までもしくは別の療法の開始まで、または死亡まで、８週（±１週）ごとになされねばならない。
【０２２７】
有効性評価項目。以下の奏効基準及び尺度を用いて寛解及び客観的奏効を評価することによって有効性を事前に評価することになる。さらなる有効性評価項目には、奏効するまでの時間、奏効の持続時間、及び全体的生存が含まれることになる。
【０２２８】
血液学的奏効（ＨＲ）基準を表１１に示す。確証のあるＨＲは、最初に基準が満たされてから少なくとも２８日後に全ての基準を満たされるときに得られる。
【表１１】
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【０２２９】
細胞遺伝学的奏効は、細胞遺伝学（または、細胞遺伝学的分析に情報価値がない、例えば中期が十分にない場合にはＦＩＳＨ）により、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）の抑制に応じて表１２に示すように分類される。大きな細胞遺伝学的奏効は、完全奏効と部分奏効とを合わせたものである。
【表１２】
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【０２３０】
分子的奏効は、表１３に示す基準に応じて分類される。
【表１３】
2019529420.tif 000020
【０２３１】
安全性報告：有害事象（ＡＥ）。試験薬を受ける各参加者はＡＥについて緊密に追跡評価されることになる。ＡＥは、薬物との関係があるとみなされるか否かにかかわらず、ヒトにおける薬物の使用に関連した任意の望ましくない医学的出来事である。有害事象には、任意の兆候、症候、病気、または試験の過程中に出現もしくは悪化するという診断が含まれる。ＡＥは、併発性の病気、創傷、または付随する患者の健康の任意の弱化であり得る。同意を得た時から処置最後の訪問までの任意の時に起こる全てのＡＥが事象の原因にかかわらず報告されることになる。ＮＣＩのＣＴＣＡＥ  ｖ４．０３をＡＥの等級分けのために用いることになる。ＣＴＣＡＥはワールドワイドウェブでｅｖｓ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｆｔｐ１／ＣＴＣＡＥ／ＣＴＣＡＥ＿４．０３＿２０１０−０６−１４＿ＱｕｉｃｋＲｅｆｅｒｅｎｃｅ＿５ｘ７．ｐｄｆに見つけることができる。
【０２３２】
有害事象は規制上の報告目的のために「重篤」と「非重篤」とに分類される。「重篤」の定義は必ずしも事象の重度に依拠しているわけでないことに留意されたい。重篤基準を満たさない全てのＡＥは非重篤であるとみなされる。
【０２３３】
試験薬との関係性にかかわらず、いかなる用量（過剰用量を含む）でのいかなるＡＥも、（１）それが死を招く場合（つまり、ＡＥが、参加者を事象の時に死の危険性に曝す致死性を招いたかもしくはそれにつながった場合。それは、より重度であった場合に仮定的に死を招く可能性があった事象をさすものではない。）；（２）それが生命を脅かすものであった場合（つまり、ＡＥがより重度であったならば仮定的に死を招く可能性があった場合ではなく、ＡＥが個体を緊急の死の危険性に曝した場合）；（３）それが入院もしくは入院の予想される滞在長さを超える延長を必要とした場合（つまり、予定の処置及び選択的な医学的／外科的手順のための入院がこの基準によって重篤有害事象（ＳＡＥ）とならない場合）；（４）それが障害を引き起こす場合（つまり、ＡＥの結果として日常生活の活動を行う参加者の能力が実質的に低下した場合）；（５）それの結果として先天異常もしくは先天性欠損（すなわち、受胎前または妊娠中に試験薬に曝された参加者の子または胎児における有害所見）が生じた場合；または（６）それが医学的に重要な症状であった場合（つまり、ＡＥが上記重篤基準をどれも満たさないが、適切な医学的判断に基づけば参加者を危険に曝す可能性またはこれらの基準に列挙される重篤な転帰のうちの１つを防止する医学的もしくは外科的介入［すなわち、アレルギー性気管支痙攣、血液疾患またはひきつけのための、入院を招かない救急処置室または自宅での集中処置］を必要とする可能性があった場合）には、ＳＡＥとして分類されることになる。
【０２３４】
全てのＡＥにおけるＢＰ１００１  ＩＰまたはＤａｓとの因果関係は以下のように評価されることになる：（１）確かに関係がある−試験投薬計画の実施に明らかに起因するＡＥ；（２）おそらく関係がある−試験投薬計画との因果関係の合理的可能性があるＡＥ；（３）関係している可能性がある−併存疾患、医薬もしくは他の考慮すべき事項による交絡があるものの、ＡＥが試験投薬計画によって引き起こされた可能性があることが非合理的でない、ＡＥ；または（４）関係がない−試験投薬計画とは明らかに因果関係がないと考えられるかもしくは別の明確な解釈が存在するＡＥ。
【０２３５】
予想外のＡＥは、ＢＰ１００１かＤａｓかのどちらかの既知転帰として性質、重症度または頻度が同定されないＡＥのことである。この定義において使用される「予想外」は、医薬製品の薬理学的特性から予期されない、そのような経験の見地からのではなく以前に観察されたことがないＡＥを指す。
【０２３６】
表１４は、処置群、試験登録時の疾患診断、及び医薬規制用語集（ＭｅｄＤＲＡ、バージョン１８．０）で規定される器官別大分類（ＳＯＣ）／基本語（ＰＴ）によって表した、試験２００３−０５７８においてＢＰ１００１の単剤療法で最も頻繁に起こるＡＥ、及び（米国国立がん研究所［ＮＣＩ］の有害事象共通用語規準［ＣＴＣＡＥ］、バージョン４．０に基づく）グレード３以上の強さのＡＥを詳細に示す。
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【０２３７】
表１５は、ＳＯＣ／ＰＴ、発生及び（ＮＣＩ  ＣＴＣＡＥに基づく）強さによって表した、試験２００３−０５７８におけるＢＰ１００１による単剤療法の処置の全ての有害事象の発生を網羅的に列挙した詳細を示す。
【表１５】
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【０２３８】
あり得る危険性及び副作用。ダサチニブ（Ｄａｓ）及びＢＰ１００１は各々、低い血球計数（赤血球、血小板及び白血球）の原因となることがある。既知のＤａｓ副作用としては、例えば、発熱、皮疹、頭痛、疲労感、下痢、吐き気、息切れ及び筋肉痛が挙げられる。動物及びヒトでの試験に基づくと、ＢＰ１００１は手足症候群、口唇ヘルペス／疱疹、及び低い白血球計数の原因となることがある。
【０２３９】
本明細書において開示され特許請求される全ての方法は、本開示に鑑みて必要以上の実験を伴うことなく成し遂げられ遂行され得る。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態の観点から記載してきたが、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく本明細書に記載の方法及び方法のステップまたはステップの順序に変化形態を適用してもよいことは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的に関係のある特定の薬剤で本明細書に記載の薬剤が置き換えられ得る一方で同じまたは同様の結果が得られるであろうことは明らかであろう。そのような同様の、当業者にとって明らかなあらゆる置換及び改変は、別記の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書中に示す手順の補足となる例示的手順などの詳細を提供する限りにおいて参照により具体的に本明細書に援用される。
Ａｓｈｉｚａｗａ  ＡＴ  ａｎｄ  Ｃｏｒｔｅｓ  Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ＢＰ−１００−１．０１．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，１２：１１０７−１１２０，２０１５。
ＡＣＳウェブサイト（２０１３年７月２４日）。Ｗｈａｔ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｋｅｙ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｂｏｕｔ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ？、２０１４年２月７日更新。２０１５年１月６日に米国がん協会から検索：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｌｅｕｋｅｍｉａ−ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄａｍｌ／ｄｅｔａｉｌｅｄｇｕｉｄｅ／ｌｅｕｋｅｍｉａ−ａｃｕｔｅ−ｍｙｅｌｏｉｄ−ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ−ｋｅｙ−ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ
Ａｐｐｅｌｂａｕｍ  ＦＲ，Ｇｕｎｄａｃｋｅｒ  Ｈ，Ｈｅａｄ  ＤＲ，Ｓｌｏｖａｋ  ＭＬ，Ｗｉｌｌｍａｎ  ＣＬ，Ｇｏｄｗｉｎ  ＪＥ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＪＥ，Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ  ＳＨ．Ａｇｅ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ，２００６；１０７（９），３４８１−３４８５。
Ｂｕｒｎｅｔｔ  ＡＫ，Ｍｉｌｌｉｇａｎ  Ｄ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  ＡＧ，Ｇｏｌｄｓｔｏｎｅ  ＡＨ，ＭｃＭｕｌｌｉｎ  ＭＦ，Ｈｉｌｌｓ  ＦＫ，Ｗｈｅａｔｌｅｙ  Ｋ．Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ  ｗｉｔｈ  ｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｎｏｔ  ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ  ｆｉｔ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ，２００７；１０９，１１１４−１１２４。
Ｃｈｅｓｏｎ  ＢＤ，Ｊａｓｐｅｒｓｅ  ＤＭ，Ｓｉｍｏｎ  Ｒ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＭＡ．Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｐｐｒａｉｓａｌ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｎｏｎ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，１９８６；４（１２），１８５７−１８６４。
Ｃｏｒｔｅｓ  ＪＥ，Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ  Ｈ，Ｓｈａｈ  ＮＰ，Ｂｉｘｂｙ  Ｄ，Ｍａｕｒｏ  ＭＪ，Ｆｌｉｎｎ  Ｉ，Ｏ’Ｈａｒｅ  Ｔ，Ｈｕ  Ｓ，Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ  ＮＩ，Ｒｉｖｅｒａ  ＶＭ，Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ，Ｔｕｒｎｅｒ  ＣＤ，Ｈａｌｕｓｋａ  ＦＧ，Ｄｒｕｋｅｒ  ＢＪ，Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  ＭＷＮ，Ｔａｌｐａｚ  Ｍ．（２０１２）Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ  ｉｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６７：２０７５−２０８８。
Ｄａｌｅｙ  Ｇ，ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ  Ｒ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｄ．（１９９０）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐ２１０ｂｃｒ／ａｂｌ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：８２４−８３０。
Ｄｅｇｏｓ  Ｌ，Ｃａｓｔａｉｇｎｅ  Ｓ，Ｔｉｌｌｙ  Ｈ，Ｓｉｇａｕｘ  Ｆ，Ｄａｎｉｅｌ  ＭＴ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ａｒａ−Ｃ：ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  １６０  ｃａｓｅｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，１９８５；１２（２  Ｓｕｐｐｌ  ３），１９６−１９９。
ｄｅ  Ｋｌｅｉｎ  Ａ，ｖａｎ  Ｋｅｓｓｅｌ  ＡＧ，Ｇｒｏｓｖｅｌｄ  Ｇ，Ｂａｒｔｒａｍ  ＣＲ，Ｈａｇｅｍｅｉｊｅｒ  Ａ，Ｂｏｏｔｓｍａ  Ｄ，Ｓｐｕｒｒ  ＮＫ，Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ  Ｎ，Ｇｒｏｆｆｅｎ  Ｊ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ＪＲ．（１９８２）Ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｓ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ．Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７６５−７６７。
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Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｐｕｅｎｔｅ  Ｙ，Ｔａｒｉ  ＡＭ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｃ，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  Ｍ，Ｇｕｅｒｒａ  ＲＴ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  Ｇ．Ｓａｆｅｔｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｐ−ｅｔｈｏｘｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  Ｂｃｌ−２．（１９９９）  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２９１：８６５−８６９。
Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ  Ｎ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ＪＲ，Ｇｒｏｆｆｅｎ  Ｊ，Ｈａｎｓｅｎ  ＰＦ，ｄｅ  Ｋｌｅｉｎ  Ａ，Ｂａｒｔｒａｍ  ＣＲ，Ｇｒｏｓｖｅｌｄ  Ｇ．（１９８３）Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃ−ａｂｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｔｏ  ａ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：２３９−２４２。
Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ  Ｎ，Ｈｅｎｓｔｅｒ  Ｇ，ｔｅｎ  Ｈｏｅｖｅ  Ｊ，Ｚｏｖｉｃｈ  Ｄ，Ｐａｔｔｅｎｇａｌｅ  Ｐ，Ｇｒｏｆｆｅｎ  Ｊ．（１９９０）Ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｉｎ  ｂｃｒ／ａｂｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：２５１−２５３。
Ｋａｄｉａ  ＴＭ，Ｂｏｒｔｈａｋｕｒ  Ｇ，Ｆｅｒｒａｊｏｌｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ  ａｎｄ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ａｒａｃ（ＬＤＡＣ）  ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ  ｉｎ  ｏｌｄｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  （ＡＭＬ）．Ｂｌｏｏｄ，２０１３；１５，５０１１。
Ｋｌｏｅｔｚｅｒ  Ｗ，Ｋｕｒｚｒｏｃｋ  Ｒ，Ｓｍｉｔｈ  Ｌ，Ｔａｌｐａｚ  Ｍ，Ｓｐｉｌｌｅｒ  Ｍ，Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ  Ｊ，ａｎｄ  Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ  Ｒ．（１９８５）Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｂｌ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  Ｋ５６２  ｈａｓ  ａｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４０：２３０−２３８。
Ｋｏｎｏｐｋａ  Ｊ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｓ，Ｗｉｔｔｅ  Ｏ．（１９８４）Ａｎ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃ−ａｂｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｋ５６２  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｕｎｍａｓｋｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  ３７：１０３５−１０４２。
Ｌｉｍ  Ｓ−Ｊ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  Ｇ，Ｈｕｎｇ  Ｍ−Ｃ，Ｌｕｐｕ  Ｒ，Ｔａｒｉ  ＡＭ．Ｇｒｂ２  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ａｋｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ＥｒｂＢ２−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０００；１９，６２７１−６２７６。
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Ｍｏｌｏｎｅｙ  ＷＣ，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ＤＳ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ａｃｕｔｅ  ｎｏｎｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｄｏｓｅ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ．Ｈａｅｍａｔｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓ，１９８１；２６，５９−６２。
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Ｎｏｗｅｌｌ  Ｐ，Ｈｕｎｇｅｒｆｏｒｄ  ＤＡ．（１９６０）Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２５：８５−１０９。
Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ  Ａ，Ｑｕｉｌｌｉａｍ  Ｌ，Ｃｒｉｐｅ  Ｌ，Ｂａｓｓｉｎｇ  Ｃ，Ｄａｉ  Ｚ，Ｌｉ  Ｎ，Ｂａｔｚｅｒ  Ａ，Ｒａｂｕｎ  Ｋ，Ｄｅｒ  Ｃ，Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  Ｊ，Ｇｉｓｈｉｚｋｙ  Ｍ．（１９９３）ＢＣＲ−ＡＢＬ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＳＨ２  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＲＢ−２  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ  ７５：１７５−１８５。
Ｐｕｉｌ  Ｌ，Ｌｉｕ  Ｊ，ＧｉｓｈＧ，Ｍｂａｍａｌｕ  Ｇ，Ｂｏｗｔｅｌｌ  Ｄ，Ｐｅｌｉｃｃｉ  Ｐ，Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ  Ｒ，Ｐａｗｓｏｎ  Ｔ．（１９９４）Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｉｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒａｓ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：７６４−７７３。
Ｒｏｗｌｅｙ  ＪＤ．（１９７３）Ｌｅｔｔｅｒ：Ａ  ｎｅｗ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｑｕｉｎａｃｒｉｎｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｉｅｍｓａ  ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ２４３：２９０−２９３。
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Ｓｋｏｒｓｋｉ  Ｔ，Ｋａｎａｋａｒａｊ  Ｐ，Ｋｕ  ＤＨ，Ｎｉｅｂｏｒｏｗｓｋａ−Ｓｋｏｒｓｋａ  Ｍ，Ｃａｎａａｎｉ  Ｅ，Ｚｏｎ  Ｇ，Ｐｅｒｕｓｓｉａ  Ｂ，Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ  Ｂ．（１９９４）Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ１２０ＧＡＰ  ＧＴＰａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｐ２１０ｂｃｒ／ａｂｌ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒａｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７９：１８５５−１８６５。
Ｓｋｏｒｓｋｉ  Ｔ，Ｋａｎａｋａｒａｊ  Ｐ，Ｋｕ  Ｄ−Ｈ，Ｎｉｅｂｏｒｏｗｓｋａ−Ｓｋｏｒｓｋａ  Ｍ，Ｒａｔａｊｃｚａｋ  Ｍ，Ｗｅｎ  Ｓ−Ｃ，Ｚｏｎ  Ｇ，Ｇｅｗｉｒｔｚ  Ａ，Ｐｅｒｕｓｓｉａ  Ｂ，Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ  Ｂ．（１９９５）Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−３  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＢＣＲ／ＡＢＬ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８６：７２６−７３６。
Ｓｔａｍ  Ｋ，Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ  Ｎ，Ｇｒｏｓｖｅｌｄ  Ｇ，ｄｅ  Ｋｌｅｉｎ  Ａ，Ｖｅｒｍａ  ＲＳ，Ｃｏｌｅｍａｎ  Ｍ，Ｄｏｓｉｋ  Ｈ，Ｇｒｏｆｆｅｎ  Ｊ．（１９８５）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｂｃｒ／ｃ−ａｂｌ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３１３：１４２９−１４３３。
Ｔａｒｉ  Ａｓｈｉｚａｗａ  Ａ，Ｃｏｒｔｅｓ  Ｊ．（２０１５）Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ＢＰ−１００−１．０１．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  １２：１１０７−１１２０。
Ｔａｒｉ  ＡＭ，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｐｕｅｎｔｅ  Ｙ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｃ，ｅｔ．ａｌ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｇｒｂ２  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｂｃｒ−ａｂｌ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．（２００７）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ３１：１２４３−１２５０。
Ｔａｒｉ  ＡＭ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  Ｇ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｒｕｇｓ，２００１；２，１４５０−１４５３。
Ｔａｒｉ  ＡＭ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  Ｇ．（２００１）ＧＲＢ２：ａ  ｐｉｖｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８：１４２−１４７。
Ｔａｒｉ  ＡＭ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｃ，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  Ｍ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  Ｇ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｐ−ｅｔｈｏｘｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．Ｊ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ，１９９８；８，２５１−２６４。
Ｔａｒｉ  ＡＭ，Ｈｕｎｇ  Ｍ−Ｃ，Ｌｉ  Ｋ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  Ｇ．Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｇｒｂ２  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ＥＧＦＲ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ＥｒｂＢ２，ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９９；１８，１３２５−１３３２。
Ｔａｒｉ  ＡＭ，Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ  Ｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  Ｇ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｒｂ２  ａｎｄ  Ｃｒｋｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１９９７；２３５，３８３−３８８。
Ｔｈａｌｌ  ＰＦ，Ｓｉｍｏｎ  ＲＭ，Ｅｓｔｅｙ  ＥＨ．（１９９５）Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｄｅｓｉｇｎｓ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ａｒｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４：３５７−３７９。
Ｔｉｌｌｙ  Ｈ，Ｃａｓｔａｉｇｎｅ  Ｓ，Ｂｏｒｄｅｓｓｏｕｌｅ  Ｄ，Ｃａｓａｓｓｕｓ  Ｐ，Ｌｅ  Ｐｒｉｓｅ  ＰＹ，Ｔｅｒｔｉａｎ  Ｇ，Ｄｅｓａｂｌｅｎｓ  Ｂ，Ｈｅｎｒｙ−Ａｍａｒ  Ｍ，Ｄｅｇｏｓ  Ｌ．Ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｌｄｅｒｌｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，１９９０；８（２），２７２−２７９。
Ｖａｒｄｉｍａｎ  ＪＷ，Ｔｈｉｅｌｅ  Ｊ，Ａｒｂｅｒ  ＤＡ，ｅｔ．ａｌ．Ｔｈｅ  ２００８  ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ａｎｄ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｃｈａｎｇｅｓ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１４：９３７−９５１。
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ，Ｄｕｎｉｃａｎ  Ｄ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ａ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｇｒｂ２−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９７；２７２，２２３４９−２２３５４。
【図１】
2019529420.tif 000025
【図２】
2019529420.tif 000026
【図３】
2019529420.tif 000027
【図４】
2019529420.tif 000028
【図５】
2019529420.tif 000029
【図６】
2019529420.tif 000030
【図７−１】
2019529420.tif 000031
【図７−２】
2019529420.tif 000032
【図８−１】
2019529420.tif 000033
【図８−２】
2019529420.tif 000034
【図８−３】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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