(57)【要約】  本発明は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の発現を阻害することができる及び／又はその活性を遮断することができる薬剤の使用による、卵巣癌、肺癌または大腸癌の処置のための方法に関する。本発明はまた、ＬＩＦの発現を阻害することができる及び／又はその活性を遮断することができる薬剤で処置される卵巣癌、肺癌または大腸癌を患う患者のためにカスタマイズされた治療を設計する、およびＬＩＦの発現を阻害することができる及び／又はその活性を遮断することができる薬剤で処置される卵巣癌、肺癌または大腸癌を患う患者を選択する、インビトロでの方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択される癌の処置における使用のための、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の発現を阻害することができる及び／又はその活性を遮断することができる薬剤。
【請求項２】
前記癌が、高いＬＩＦレベルを有していることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択される癌を患う患者のためにカスタマイズされた治療を設計するインビトロでの方法であって、該方法が、
（ｉ）前記患者からのサンプルにおけるＬＩＦのレベルを定量化する工程、および
（ｉｉ）前記レベルを基準値と比較する工程を含み、
ここで、前記患者からの前記サンプルにおけるＬＩＦのレベルが基準値以上である場合、ＬＩＦの発現を阻害することができる及び／又はその活性を遮断することができる薬剤が、前記患者への投与に選択される、方法。
【請求項４】
ＬＩＦの発現を阻害することができる及び／又はその活性を遮断することができる薬剤で処置される卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択される癌を患う患者を選択するインビトロでの方法であって、該方法が、
（ｉ）前記患者からのサンプルにおけるＬＩＦのレベルを定量化する工程、および
（ｉｉ）前記レベルを基準値と比較する工程を含み、
ここで、前記患者からの前記サンプルにおけるＬＩＦのレベルが基準値以上である場合、前記患者は、ＬＩＦの発現を阻害することができる及び／又はその活性を遮断することができる薬剤による処置を受けるために選択される、方法。
【請求項５】
サンプルが、組織サンプルまたは生物流体である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
組織サンプルが腫瘍サンプルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生物流体が、血液、血清または血漿である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＬＩＦのレベルが、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学的検査、免疫組織蛍光、質量分析、あるいは免疫沈降またはＥＬＩＳＡに関連付けられた質量分析によって定量化される、請求項１または２に記載の薬剤あるいは請求項３乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＬＩＦのレベルが、免疫組織化学的検査または免疫組織蛍光によって定量化され、ＬＩＦスコアまたはＨスコアの値として測定される、請求項８に記載の薬剤あるいは請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
癌が、０以上のＬＩＦスコアまたは０以上のＨスコアを有していることを特徴とする、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１１】
基準値が、０以上のＬＩＦスコアまたは０以上のＨスコアである、請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１２】
ＬＩＦの発現を阻害することができる薬剤が、ＬＩＦに特異的なｓｉＲＮＡ、ＬＩＦに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＬＩＦに特異的なリボザイムから成る群からに選択される、請求項１または２に記載の薬剤あるいは請求項３乃至９および１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＬＩＦの活性を遮断することができる薬剤が、ＬＩＦに特異的な抗体、ＬＩＦに特異的なポリペプチド、ＬＩＦに特異的なオリゴヌクレオチド、およびＬＩＦに特異的なＬＩＦ受容体結合の阻害剤から成る群から選択される、請求項１または２に記載の薬剤あるいは請求項３乃至９および１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ＬＩＦに特異的な前記抗体が、ＬＩＦ中和抗体である、請求項１３に記載の薬剤あるいは請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１または２に記載の薬剤あるいは請求項３乃至９および１１乃至１４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療の分野、およびより具体的には、ＬＩＦの阻害剤の使用による癌治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、現在、主として以下の３つのタイプの治療の１つ又は組み合わせで処置される：手術；放射線；および化学療法。手術は、病変組織の塊での除去を伴う。手術は、特定の部位、例えば、乳房、結腸、および皮膚に位置する腫瘍を除去するのに時に有効であるが、背骨などの他の領域に位置する腫瘍の処置に用いることはできず、白血病などの播種性の腫瘍性疾患の処置にも用いることはできない。放射線療法は、暴露された細胞に対する死滅または損傷を引き起こすイオン化放射線への生体組織の暴露を伴う。放射線療法からの副作用は急性且つ一時的なものであり得るが、不可逆的なものもあり得る。化学療法は、細胞複製または細胞代謝の破壊を伴う。それは、乳房、肺、および睾丸の癌の処置において最も頻繁に使用される。腫瘍疾患の処置に使用される全身化学療法の有害作用は、癌の処置を受けている患者によって最も恐れられている。これらの有害作用のうち、吐き気および嘔吐が最も一般的なものである。他の有害な副作用は、血球減少、感染、悪液質、骨髄の救急治療または放射線療法を含む高用量の化学療法を受けている患者内の粘膜炎；脱毛症（抜け毛）；心因掻痒、蕁麻疹、および血管浮腫などの皮膚の合併症；神経学的合併症；肺および心臓の合併症；および生殖および内分泌の合併症。化学療法誘発性の副作用は、患者の生活の質に著しい影響を与え、患者の処置とのコンプライアンスに劇的に影響を及ぼし得る。そのため、改善された処置の方法が必要とされている。
【０００３】
ＬＩＦは、様々な生物活性に関係し、異なる細胞型に効果がある、インターロイキン６（ＩＬ−６）タイプのサイトカインである。ヒトＬＩＦは、２０２のアミノ酸のポリペプチドである。ＬＩＦが、ＴＧＦｐによって媒介されたＪＡＫ−ＳＴＡＴカスケードの活性化に関係し、それ故、細胞増殖プロセスを誘発すること、および神経膠腫における腫瘍幹細胞（癌幹細胞）の増加にも関係することが記述されてきた。この事実に基づいて、ＬＩＦ阻害剤が、高いＬＩＦ発現レベルを示す神経膠腫の処置に有用であり、その活性が、細胞を阻害する神経膠腫の増殖を阻害するＬＩＦの能力によって媒介されていることが示された。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の著者は、ＬＩＦの阻害剤が、卵巣癌、肺癌および大腸癌の進行を効率的に低減することができることを発見した。特に、本発明の著者は、抗ＬＩＦ中和抗体が、腫瘍におけるＬＩＦの発現レベルに応じた方法で同所性のモデルにおいてＮＳＣＬＣの腫瘍増殖を低減することができることを観察した。同様に、抗ＬＩＦ中和抗体は卵巣癌の同所性のモデルおよび大腸癌において腫瘍増殖を阻害することが示された。
【０００５】
したがって、第１の態様では、本発明は、卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択される癌の処置における使用のための、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の発現を阻害することができる及び／又はその活性を遮断することができる薬剤に関する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択される癌を患う患者のためにカスタマイズされた治療を設計するインビトロでの方法に関し、該方法は、
（ｉ）前記患者からのサンプルにおけるＬＩＦのレベルを定量化する工程、および
（ｉｉ）前記レベルを基準値と比較する工程を含み、
ここで、前記患者からの前記サンプルにおけるＬＩＦのレベルが基準値以上である場合、ＬＩＦの発現を阻害することができる及び／又はその活性を遮断することができる薬剤が、前記患者への投与に選択される。
【０００７】
さらに別の態様では、本発明は、ＬＩＦの発現を阻害することができる及び／又はその活性を遮断することができる薬剤で処置される卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択される癌を患う患者を選択するインビトロでの方法に関し、該方法は、
（ｉ）前記患者からのサンプルにおけるＬＩＦのレベルを定量化する工程、および
（ｉｉ）前記レベルを基準値と比較する工程を含み、
ここで、前記患者からの前記サンプルにおけるレベルＬＩＦが基準値以上である場合、前記患者は、ＬＩＦの発現を阻害することができる及び／又はその活性を遮断することができる薬剤による処置を受けるために選択される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、異なる癌細胞型におけるＬＩＦ発現を示す。
【図２】図２は、神経膠芽腫、ＮＳＣＬＣ、卵巣および膵臓の腫瘍におけるＬＩＦ発現の異質性を示す。
【図３】図３は、ＬＩＦスコアの決定を示す。
【図４】図４は、抗ＬＩＦ抗体の腫瘍増殖に対する阻害効果が、腫瘍におけるＬＩＦのレベルに左右されることを示す。
【図５】図５は、抗ＬＩＦ抗体がインビボでのＮＳＣＬＣ腫瘍退縮を促進することを示す。
【図６】図６は、ＮＳＣＬＣ腫瘍における抗ＬＩＦ抗体の治療効果がＬＩＦレベルに左右されることを示す。
【図７】図７は、ＬＩＦ経路がＮＳＣＬＣ腫瘍増殖にとって重要であることを示す。
【図８】図８は、抗ＬＩＦ抗体が、神経膠芽腫の異種移植モデル（Ｕ２５１）における腫瘍増殖を阻害することを示す。
【図９】図９は、神経膠芽腫における腫瘍増殖がＬＩＦレベルに左右されることを示す。
【図１０】図１０は、抗ＬＩＦ抗体が、卵巣の同所性の免疫適格性モデル（ＩＤ８）における腫瘍増殖を阻害することを示す。
【図１１】図１１は、卵巣の腫瘍成長がＩＤ８モデルにおけるＬＩＦレベルに左右されることを示す。
【図１２】図１２は、抗ＬＩＦ抗体が、大腸癌の免疫適格性モデル（ＣＴ２６）における腫瘍増殖を阻害することを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜定義＞
語句「活性を遮断する薬剤（ａｇｅｎｔ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」または「活性を遮断することができる薬剤（ａｇｅｎｔ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」は、本明細書で使用されるように、遺伝子によってコードされたタンパク質がその機能（活性）を実行するのを防ぐ、即ち、ＬＩＦがＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化を誘発することを防ぐことができる阻害物質または化合物に関する。ＬＩＦをコード化する遺伝子によってコードされたタンパク質がその機能を実行するのを防ぐことができる典型的な阻害剤は、例えば、タンパク質の阻害ペプチド、その機能の実行に不可欠な及びＬＩＦの活性を中和する、即ち、ＬＩＦへの結合に応じて受容体によってシグナル伝達をブロックすることができるタンパク質のエピトープに対して特異的に、またはＬＩＦ受容体に向けられた抗体などである。
【００１０】
語句「発現を阻害する薬剤（ａｇｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「発現の阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、または「発現を阻害することができる薬剤（ａｇｅｎｔ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、本明細書で使用されるように、遺伝子、特にＬＩＦをコードする遺伝子の転写及び／又は翻訳を防ぐか又はブロックすることができる、即ち、前記遺伝子の発現を防ぐか又はブロックすることができる阻害物質または化合物に関する。実例として、本発明に従った適切なＬＩＦの発現の阻害剤は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、触媒ＲＮＡまたは特異的なリボザイム、デコイ活性（ｄｅｃｏｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する、即ち、遺伝子の発現にとって重要な因子（一般にタンパク質性）に特異的に結合する能力を有するＲＮＡなどである。
【００１１】
用語「抗体」、「免疫グロブリン」などは、分析物（抗原）に特異的に結合し、それを認識する、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされたポリペプチドまたは免疫グロブリン遺伝子、またはそれらのフラグメントを指す。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミューの定常領域遺伝子の他に、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これは順に、それぞれ、免疫グロブリンクラスのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義している。典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造ユニットは、２対のポリペプチド鎖で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤ）を有している。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識の要因である約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を画定している。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれ指す。各重鎖のＣ末端は、一緒にジスルフィド結合され、抗体の定常領域を形成する。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、抗体は、異なる「クラス」に割り当てられ得る。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうちの幾つかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分割され得る。（約２５ｋＤａまたは約２１４のアミノ酸の）全長免疫グロブリン「軽鎖」は、ＮＨ２末端に約１−１０のアミノ酸の可変領域およびＣＯＯＨ末端にカッパまたはラムダの定常領域を含む。（約５０ｋＤａまたは約４４６のアミノ酸の）全長免疫グロブリン「重鎖」は、同様に、（約１１６のアミノ酸の）可変領域および（約３３０のアミノ酸の）前述の重鎖の定常領域またはクラスの１つ、例えばガンマを含む。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成は周知である。
【００１２】
用語「癌」、「腫瘍」、「腫瘍疾患」または「新生物」は、本明細書で使用されるように、未制御の細胞増殖を伴う及び悪性腫瘍悪とも呼ばれる疾患の広いグループを指す。該用語は、通常、抑制されない細胞分裂（または生存またはアポトーシス耐性の増加）、および他の隣接組織に浸潤する（浸潤）、リンパ管および血管を通って細胞が普通は位置付けられない身体の他の領域に広がる（転移）、血流に循環する、およびその後、身体のどこかの正常組織に浸潤する、前記細胞の能力を特徴とする疾患に適用される。癌は、通常、以下の特性の幾つかを共有する：増殖性のシグナル伝達を保持すること、成長抑制因子を回避すること、細胞死に抵抗すること、複製による不死化を可能にすること、血管新生を誘発すること、および浸潤および最終的に転移を活性化すること。癌は、近くの身体部分に浸潤し、リンパ系または血流を通ってより離れた身体部分にも広がり得る。癌は、腫瘍細胞が類似している細胞の型によって分類され、それ故、その型は腫瘍の起源であると推定される。癌という用語は、限定することなく、肺癌、肉腫、悪性黒色腫、胸膜中皮腫、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞腫、乳癌、大腸癌、腎臓癌、食道癌、副腎癌、耳下腺癌、頭頚部癌、子宮癌、子宮内膜癌、肝臓癌、中皮腫、多発性骨髄腫、白血病、およびリンパ腫を含む。
【００１３】
本発明の特定の実施形態では、癌は、大腸癌、肺癌および卵巣癌から成る群から選択される。「結腸癌」、「直腸癌」、または「腸癌」として知られている用語「大腸癌」は、結腸または直腸における、あるいは虫垂における抑制されない細胞増殖からの癌を指す。
該用語は、腺癌、カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）または肉腫を指すために使用される。本明細書で使用されるように、大腸癌という用語は、ステージＩ、ステージＩＩＡ、ステージＩＩＢ、ステージＩＩＣ、ステージＩＩＩＡ、ステージＩＩＩＢ、ステージＩＩＩＣ、ステージＩＶＡまたはステージＩＶＢの大腸癌を指す。さらに、本明細書で使用されるように、大腸癌は、原発性大腸腫瘍および二次大腸腫瘍、即ち、身体のどこかの原発性癌からの転移に起因する大腸腫瘍の両方を指す。
【００１４】
用語「肺癌」は、呼吸上皮の細胞から生じる癌に関し、２つの広いカテゴリーに分類され得る。肺癌という用語は、本明細書で使用されるように、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、または腺癌、扁平上皮癌、および大細胞癌を含む非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を指す。特定の実施形態では、肺癌はＮＳＣＬＣである。本明細書で使用されるように、肺癌という用語は、ステージＩＡ、ステージＩＢ、ステージＩＩＡ、ステージＩＩＢ、ステージＩＩＩＡ、ステージＩＩＩＢまたはステージＩＶの肺癌を指す。さらに、本明細書で使用されるように、肺癌は、原発性肺腫瘍および二次肺癌、即ち、身体のどこかの原発性癌からの転移に起因する肺癌の両方を指す。
【００１５】
用語「卵巣癌」は、卵巣から生じる癌性増殖に関する。本明細書で使用されるように、卵巣癌は、タイプＩの癌（子宮内膜癌、粘液性癌、および明細胞癌）およびタイプＩＩの癌（漿液性癌および癌肉腫）の両方を指すために使用される。本明細書で使用されるように、卵巣癌は、表面上皮−間質腫瘍（腺癌）、乳頭状漿液嚢胞腺癌、「境界型（Ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅ）」腺癌、腺癌、子宮内膜性腫瘍、漿液性嚢胞腺癌、乳頭状癌、粘液性嚢胞腺癌、明細胞卵巣腫瘍、粘液性腺癌、嚢胞腺癌、性索間質腫瘍、ミュラー管腫瘍、胚細胞腫、奇形腫、未分化胚細胞腫、類表皮（扁平上皮癌）またはブレンナー腫瘍を指す。本明細書で使用されるように、卵巣癌は、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩまたはステージＩＶの卵巣癌を指す。さらに、本明細書で使用されるように、卵巣癌は、原発性卵巣腫瘍および二次卵巣癌、即ち、身体のどこかの原発性癌からの転移に起因する卵巣癌の両方を指す。
【００１６】
用語「Ｈスコア」は、本明細書で使用されるように、免疫組織化学的検査を使用する染色による与えられたタンパク質の発現レベルを定義するパラメーターに関する。免疫組織化学的検査では、腫瘍細胞はそれぞれ、染色なしの０から最も強い染色の３＋までの範囲の強度レベルを与えられ、２は中程度に染色する細胞を指し、１は弱く染色する細胞を指す。その後、Ｈスコアは以下の式を使用して決定される：
Ｈスコア＝３×強く染色する細胞のパーセンテージ＋２×中程度に染色する細胞のパーセンテージ＋１×弱く染色する細胞のパーセンテージ
【００１７】
したがって、Ｈスコアの値は、細胞が染色を示さない０からサンプル中の細胞の１００％が強い染色を示す３００までの範囲であり得る。
【００１８】
「ＬＩＦ」としても知られる用語「白血病抑制因子」は、分化を阻害することによって細胞増殖に影響を与えるインターロイキン６クラスのサイトカインに関する。それは、骨髄性白血病細胞の最終分化を誘発することができ、それ故、連続した増殖を防ぐことができる。ヒトＬＩＦタンパク質配列は、受入番号Ｐ１５０１８（２０１４年５月１６日時点でのバージョン）下でＵｎｉＰｒｏｔデータベースに入れられている。ＬＩＦタンパク質をコードするヒト遺伝子は、遺伝子ＩＤ（Ｇｅｎｅ ＩＤ）：３９７６（２０１５年１０月４日時点でのバージョン）下でＮＢＣＩデータベースに入れられている。好ましい実施形態では、ＬＩＦは、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（２０１５年１１月１１日の入力）において受入番号Ｐ１５０１８−１でるポリペプチドに対応している、２０２のアミノ酸のヒトアイソフォーム１を指す。別の実施形態では、ＬＩＦは、８８のアミノ酸のヒトＬＩＦアイソフォーム２を指す。別の実施形態では、ＬＩＦは、ヒトＬＩＦアイソフォーム１と２の組み合わせを指す。
【００１９】
用語「ＬＩＦスコア」は、本明細書で使用されるように、試験サンプルにおいてＬＩＦ発現レベルを定量化するために使用されるパラメーターに関する。サンプルにおけるＬＩＦスコアは、免疫組織化学的検査を使用してサンプルを抗ＬＩＦ特異抗体で染色することによって決定される。免疫組織化学的検査では、腫瘍細胞はそれぞれ、染色なしの０から最も強い染色の３＋までの範囲の強度レベルを与えられ、２は中程度に染色する細胞を指し、１は弱く染色する細胞を指す。その後、ＬＩＦスコアは、ＬＩＦに対する強い完全な染色（３＋）を有する細胞のパーセンテージ（０％から１００％まで）として決定される。したがって、ＬＩＦスコアは、０（サンプル中の細胞が３＋染色を有していないとき）〜１００（サンプルの細胞の１００％が３＋染色を有しているとき）の範囲の値を有することができる。サンプルにおけるＬＩＦスコアは、直接ＬＩＦ発現レベルについての指標を提供するために使用され得るか、あるいはＬＩＦ発現レベルが、基準値に対して上昇されるか、低下されるか、あるいは変化を示さないかについての指標を提供するために、基準ＬＩＦスコア値と比較され得る。
【００２０】
本明細書において使用される用語「基準値」は、被験体から採集されたサンプルより得られた数値またはデータを評価するための基準として使用される、あらかじめ決められた基準に関する。基準値または基準レベルは、絶対値、相対値、上限あるいは下限を有する数値、ある範囲の数値、平均値、中央値、平均値（ｍｅａｎ  ｖａｌｕｅ）、あるいは特定の対照値またはベースライン値と比較した数値で有り得る。基準値は、例えば、試験されている被験体からのサンプルより得た、ただしより早い時点で得られた数値などの、個々のサンプル値に基づき得る。基準値は、暦年齢の一致した集団の被験体集団からなどの、多くのサンプルに基づき得るか、あるいは試験されるサンプルを含むあるいは除外するサンプルのプールに基づくことが可能である。
【００２１】
本明細書において使用される用語「サンプル」あるいは「生体サンプル」は、被験体から分離された生体物質を指す。生体サンプルは、ＲＮＡまたはタンパク質レベルを検知するのに適した生体物質を含む。特定の実施形態では、サンプルは、研究下の被験体からの、例えばＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、ｍＲＮＡなどの遺伝物質を含む。サンプルは、例えば血液、唾液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、糞便、外科的検体、腫瘍生検あるいは非腫瘍生検から得た組織検体、およびパラフィンに包埋された組織サンプルなどの、適切な組織あるいは生物流体から分離され得る。一実施形態では、サンプルは腫瘍細胞を含むサンプルである。サンプルを分離する方法は、当業者に周知である。特に、生検によりサンプルを得る方法には、グロスアポーショニングオブアマス（ｇｒｏｓｓ  ａｐｐｏｒｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍａｓｓ）、マイクロダイセクション、あるいは他の既知の技術の細胞分離法が含まれる。サンプルの保存と処理を単純化するために、サンプルは、ホルマリン固定およびパラフィン包埋され得るか、あるいは、迅速な凍結を可能にする高度に低温な培地に浸すことで、まず冷凍され、次にＯＣＴ−Ｃｏｍｐｏｕｎｄなどの冷凍固化性培地に包埋され得る。本発明の特定の実施形態では、サンプルは組織サンプルまたは生物流体である。本発明のより特定された実施形態では、生物流体は、血液、血清あるいは血漿から成る群から選択される。本発明の特定の実施形態では、サンプルは腫瘍サンプルである。
【００２２】
用語「被験体」、「個体」、「動物」または「患者」は、治療が望まれる被験体、とりわけ哺乳類の被験体を含む。哺乳類の被験体には、ヒト、家庭動物、家畜、および、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、メウシなどの動物園またはペットの動物を含む。本発明の好ましい実施形態では、被験体は哺乳動物である。本発明のより好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【００２３】
本明細書において使用される用語「処置」は、例えば癌などの、本明細書に記載の臨床状態に対する感受性を、消滅、予防、回復、および／または減少させる目的の、任意の種類の治療を含む。好ましい実施形態では、処置という用語は、予防的処置（つまり、本明細書に明示される臨床状態、障害あるいは疾患の感受性を減らすための治療）に関する。したがって、本明細書において使用される「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指し、ヒトを含む哺乳動物における病理学的疾病または障害のすべての処置を含む。この効果は、障害またはその症状を完全にまたは部分的に予防する点で予防的であり得、および／または、障害および／またはその障害に起因する副作用の部分的または完全な治癒という点で治療的で有り得る。すなわち、「処置」には、（１）被験体に障害が生じるまたは再発するのを予防すること、（２）障害の進行を妨げるなどの障害の阻害、（３）宿主がもはや障害またはその症状に苦しまないようにするために、例えば、欠けている、紛失した、あるいは欠陥のある機能を、回復または修復することによって、あるいは非効果的なプロセスを刺激することによって、障害またはその症状の後退を引き起こすなど、障害または少なくともそれに関連する症状を止める、あるいは消滅させること、あるいは、（４）障害またはそれに関連する症状を和らげ、緩和し、あるいは改善することを含み、ここで改善は、少なくともパラメーターの規模の減少を指すために、広い意味で使用される。
【００２４】
癌の処置に使用される、ＬＩＦ発現を阻害する、あるいはＬＩＦ活性を遮断する薬剤
本発明の発明者は、ＬＩＦ阻害剤が卵巣癌、肺癌および大腸癌の処置に有用であることを発見している。
【００２５】
したがって、第１の態様では、本発明は、卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択された癌の処置に使用される、ＬＩＦの発現を阻害することができる、および／またはＬＩＦの活性を遮断することができる薬剤に関する。代替的に、本発明は、癌の処置のための方法に関するものであり、前記癌は、卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択され、該方法は、ＬＩＦの発現を阻害することができる、および／またはＬＩＦの活性を遮断することができる治療上有効な量の薬剤を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む。代替的に、本発明は、癌の処置のための薬剤の製造における、ＬＩＦの発現を阻害することができる、および／またはＬＩＦの活性を遮断することができる薬剤の使用に関するものであり、前記癌は、卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択される。
【００２６】
別の態様では、本発明は、卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択された癌の再発を防ぐために使用される、ＬＩＦの発現を阻害することができる、および／またはＬＩＦの活性を遮断することができる薬剤に関する。好ましい実施形態では、腫瘍が外科的に切除された患者における再発が予防される。
【００２７】
別の態様では、本発明は、卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択された癌の転移を防ぐために使用される、ＬＩＦの発現を阻害することができる、および／またはＬＩＦの活性を遮断することができる薬剤に関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択された癌における、癌幹細胞の増殖を防ぐまたは癌幹細胞のプールを減らすために使用される、ＬＩＦの発現を阻害することができる、および／またはＬＩＦの活性を遮断することができる薬剤に関する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択された癌における、癌幹細胞の増殖を防ぐまたは癌幹細胞のプールを減らすために使用される、あるいは、卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択された癌の再発を防ぐために使用される、あるいは、卵巣癌、肺癌および大腸癌から選択された癌の転移の予防に使用される、ＬＩＦの発現を阻害することができる、および／またはＬＩＦの活性を遮断することができる薬剤に関し、該薬剤は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化およびＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害によって作用する。
【００３０】
ＬＩＦの発現を阻害することができる、および／またはＬＩＦの活性を遮断することができる薬剤は、ＬＩＦをコードする遺伝子の転写および翻訳を予防または阻害することができる、または、上記遺伝子によってコードされたタンパク質が機能（活性）化することをブロックすることができる、つまり、ＬＩＦがＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル経路の活性化を誘導することを防ぐことができる、物質あるいは化合物を含む。
【００３１】
化合物がＬＩＦの阻害剤であるかを判定するためのアッセイは、最先端技術において周知である。これらのアッセイは、ニューロスフェアおよび／または腫瘍細胞における、ＩＬ−６型のサイトカインによるＳＴＡＴ−３リン酸化の測定を制限なく含む（ＷＯ２０１０／１１５８６８）。
【００３２】
例示として、本発明における使用に適したＬＩＦ発現の阻害剤は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、触媒ＲＮＡ、あるいは特定のリボザイム、デコイ活性、つまり遺伝子の発現にとって重要な因子（一般的にタンパク質）に特異的に結合する能力を有したＲＮＡ、などを含む。同様に、ＬＩＦタンパク質がその機能を実行することを予防することができる阻害剤は、例えば、タンパク質の阻害ペプチド、その機能を実行するのに必須のタンパク質のエピトープを特異的に対象とする、あるいはＬＩＦ受容体を対象とする抗体などを含む。
【００３３】
したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明に従って使用されるＬＩＦ阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特定のリボザイム、抗体、ポリペプチド、およびＬＩＦ阻害剤から成る群から選択される。
【００３４】
特定の実施形態では、ＬＩＦ発現を阻害することができる、本発明に従って使用される薬剤は、ＬＩＦに特異的なｓｉＲＮＡ、ＬＩＦに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＬＩＦに特異的なリボザイムから成る群から選択される。特定の実施形態では、ＬＩＦ活性を遮断することができる、本発明に従って使用される薬剤は、ＬＩＦに特異的な抗体、ＬＩＦに特異的なポリペプチド、ＬＩＦに特異的なオリゴヌクレオチド、およびＬＩＦに特異的に結合するＬＩＦ受容体の阻害剤から成る群から選択される。より具体的には、ＬＩＦの活性を遮断することができる、本発明に従って使用される薬剤は、抗体、好ましくはＬＩＦ中和抗体である。
【００３５】
ｓｉＲＮＡ
小型干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を用いて標的遺伝子の発現を阻害することができる薬剤である。ｓｉＲＮＡは化学的に合成可能であり、あるいはインビトロ転写を用いて得ることができ、あるいは標的細胞のインビボで合成することができる。ｓｉＲＮＡは典型的には、長さ１５から４０のヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡから成り、および、１から６のヌクレオチドの３’および／または５’張出領域を含み得る。張出領域の長さはｓｉＲＮＡ分子の全長に無関係である。ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーの劣化あるいは転写後の無症状化によって作用する。
【００３６】
ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを形成する逆平行鎖がループまたはヘアピン型の領域によって結合されているという特徴をもつｓｈＲＮＡ（短いヘアピン型のＲＮＡ）を含む。これらのｓｉＲＮＡは、短いアンチセンス配列（１９から２５のヌクレオチド）の化合物であり、その配列の後に５から９のヌクレオチドのループが続き、さらにセンス鎖が続く。ｓｈＲＮＡは、プラスミドまたはウイルス、特にレトロウイルス、およびより具体的にはレトロウイルスによってコードされ得、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＵ６プロモーターなどのプロモーターの制御下に有り得る。本発明のｓｉＲＮＡは、ＬＩＦをコードする遺伝子のｍＲＮＡ、またはタンパク質をコードするゲノム配列と本質的に同種である。「本質的に同種」は、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉によって標的ｍＲＮＡの劣化を引き起こすことができるように、標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的である、あるいは類似する配列を有する、と理解される。前記の干渉を引き起こすのにふさわしいｓｉＲＮＡは、ＲＮＡによって形成されたＳｉＲＮＡを含み、また、以下のような異なる化学的修飾を含むＳｉＲＮＡを含む：
―ホスホロチオエート結合などの、自然に見つけられたものとはヌクレオチド間の結合が異なるｓｉＲＮＡ。
―ＲＮＡ鎖と、フルオロフォアなどの機能性の試薬との抱合体。
―ＲＮＡ鎖の末端の修飾、特に位置２’におけるヒドロキシルの異なる官能基を用いた修飾による３’末端の修飾。
―２’−Ｏ−メチルリボース  ｐ  ２’−Ｏ−フルオロリボースなどの、位置２’のＯ−アルキル化された残基などの修飾された糖を有するヌクレオチド。
―ハロゲン化された塩基（例えば、５−ブロモウラシルおよび５−ヨ−ドウラシル）、アルキル化された塩基（例えば７−メチルグアノシン）などの、修飾された塩基を有するヌクレオチド。
【００３７】
ｓｉＲＮＡ設計のための基底として採取されるヌクレオチド配列の領域は制限されないが、コード配列領域（開始コドンと終止コドンとの間）を含み得る、あるいは代替的に５’または３’の非翻訳領域、好ましくは長さ２５から５０のヌクレオチド、および開始コドンに対して位置３’の任意の位置を含むことができる。ｓｉＲＮＡを設計する一つの方法は、Ｎが、ＩＬ−６型サイトカインをコードする配列中の任意のヌクレオチドで有り得るＡＡ（Ｎ１９）ＴＴモチーフの特定、およびＧ／Ｃ含量の高いものを選択することを含む。上記モチーフが見つからない場合、Ｎが任意のヌクレオチドで有り得るＮＡ（Ｎ２１）モチーフを特定することが可能である。
【００３８】
市販で入手可能なＬＩＦのための典型的、非制限的ｓｉＲＮＡは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｃ−３７２２２）からのヒトＬＩＦ  ｓｉＲＮＡ、およびＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＡＭ１６７０８）からのヒトＬＩＦ  ｓｉＲＮＡを含む。
【００３９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明のさらなる態様は、発現を阻害するための、例えば、活性が阻害されるＬＩＦをコードする核酸の転写および／または翻訳を阻害するための単離された「アンチセンス」核酸の使用に関する。
【００４０】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、細胞中で転写された時、ＬＩＦをコードする細胞ｍＲＮＡの少なくとも１つの部分に対して相補的であるＲＮＡを産生する、発現プラスミドとして送達され得る。代替的に、アンチセンス構築物はオリゴヌクレオチドプローブであり、それはエクスビボで生成され、および細胞に導入された時に、ｍＲＮＡおよび／または標的核酸のゲノム配列とハイブリダイズすることによって発現の阻害を生じさせる。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに耐性があり、したがってインビボで安定している、修飾されたオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用される典型的な核酸分子は、ホスホルアミデート、ホスホチオナート、およびメチルホスホナートＤＮＡアナログである。アンチセンス療法において有用なオリゴマーを構築するための一般的なアプローチは当技術分野において周知である。
【００４１】
アンチセンスＤＮＡに関しては、例えば標的遺伝子の−１０から＋１０の間の、翻訳開始部位に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチド領域が好ましい。アンチセンスアプローチは、標的ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡとＲＮＡのいずれか）の設計を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡ転写産物に結合し、翻訳を予防するだろう。絶対的な相補性は必要ではないが、好ましい。二本鎖のアンチセンス核酸の場合、したがって二本鎖ＤＮＡの一本鎖が分析され得る、あるいは三本鎖ＤＮＡの構成が分析され得る。ハイブリダイズの能力は、相補性の度合およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存するだろう。一般的に、核酸ハイブリダイズが長ければ長いほど、より多くのＲＮＡ対合エラーを含むこともあり、および依然として安定した二本鎖（あるいは場合に応じて三本鎖）を形成する。当業者は、ハイブリダイズされた複合体の融点を判定する標準的な手順を使用して、対合エラーの許容可能な度合を判定することができる。ｍＲＮＡの５’末端、例えばＡＵＧ開始コドンまでの、あるいはそれを含む非翻訳５’配列ｕに対して相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害するために可能な限り効率的に機能しなければならない。しかしながら、ｍＲＮＡの非翻訳３’配列に相補的な配列はさらに、ｍＲＮＡの翻訳の阻害に有効であることが最近示された。したがって、遺伝子の、非翻訳、非コード５’または３’領域のいずれかに対して相補的であるオリゴヌクレオチドは、該ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためにアンチセンスアプローチにおいて使用され得る。ｍＲＮＡの非翻訳５’領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの補体を含んでいるべきである。ｍＲＮＡのコード化領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害剤としての効果はより小さいが、本発明に従って使用されてもよい。５’、３’、あるいはｍＲＮＡのコード化領域とハイブリダイズするように設計された場合、アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチドの長さを有するべきであり、好ましくは約１００未満、より好ましくは５０、２５、１７、あるいは１０ヌクレオチド未満の長さを有するべきである。
【００４２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖あるいは二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのキメラ混合体、修飾された誘導体、あるいは変形体で有り得る。オリゴヌクレオチドは、例えば分子の安定性やハイブリダイゼーション等を改善するために、ベース基、糖基、あるいはリン酸骨格で修飾し得る。オリゴヌクレオチドは、（例えば宿主細胞受容体の方へ向けるための）ペプチド、あるいは、細胞膜を通過する輸送をより容易にする、または血液脳関門を通過して輸送させるための薬剤、ハイブリダイゼーション触発切断剤、挿入剤などの、他の結合基を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション触発架橋剤、担体剤、ハイブリダイゼーション触発切断剤などの他の分子に結合し得る。
【００４３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（  ２−カルボキシヒドロキシエチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および、２，６−ジアミノプリン、を含むがこれらに限定されない群から選択される、少なくとも一つの修飾塩基基を含み得る。
【００４４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含むがこれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾糖基を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、中性ペプチドに類似の骨格を含みうる。そのような分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーと呼ばれる。ＰＮＡオリゴマーの利点は、ＤＮＡの中性骨格に起因する培地のイオン力とは実質的に無関係な方法で、相補的ＤＮＡに結合する能力である。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはそのアナログからなる群から選択される少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含む。
【００４５】
さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはアルファアノマー（ａｌｐｈａ−ａｎｏｍｅｒｉｃ）オリゴヌクレオチドである。アルファアノマーオリゴヌクレオチドは、補足的ＲＮＡを備えた特定の二本鎖のハイブリッドを形成し、ここで、典型的な逆平行配向とは対照的に、鎖は互いに平行である。オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはＲＮＡ−ＤＮＡキメラアナログである。
【００４６】
標的ｍＲＮＡ配列のコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる一方、非翻訳転写領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドも使用することができる。
【００４７】
場合によっては、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度に達することが困難な場合がある。したがって、好ましいアプローチでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下に置かれた組換えＤＮＡ構築物を使用する。標的細胞をトランスフェクトするためのこのような構築物を使用することにより、結果として、薬物の潜在的標的内因性転写産物と相補的な塩基対を形成し、それ故翻訳を妨げる、十分な量の一本鎖ＲＮＡの転写をもたらす。例えば、ベクターが細胞に捕捉され、アンチセンスＲＮＡの転写を指示するように、ベクターを導入することができる。そのようなベクターはエピソームのままであっても、または、染色体に組み込まれていてもよいが、所望のアンチセンスＲＮＡを生成するよう転写されることができる。そのようなベクターは、当技術分野で標準的な組換えＤＮＡテクノロジーの方法によって構築することができる。ベクターは、ウイルスプラスミド、または、哺乳動物細胞における複製および発現のために使用される当該分野で公知の他のプラスミドであり得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞に作用する、当該技術で公知のプロモーターによるものであることがある。このようなプロモーターは、誘導的または構成的であり得る。このようなプロモーターには、ＳＶ４０初期領域のプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３’長反復末端に含まれるプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン遺伝子調節配列などが含まれるが、これらに限定されない。任意のタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターを使用して、組換えＤＮＡ構築物を調製することができ、これは組織の部位に直接導入することができる。
【００４８】
あるいは、標的遺伝子の発現は、体内の標的細胞における遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成するために、遺伝子の調節領域（すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的デオキシリボヌクレオチド配列を向けることにより阻害することができる。
【００４９】
あるいは、三重らせんの形成のために選択することができる潜在的な標的配列を増加させ、「ヘアピン形状」と呼ばれる核酸分子を作製することができる。ヘアピン形状の分子は、交互の５’−３’、３’−５’形態で合成され、結果として二本鎖の一つの鎖と第一の塩基対を形成し、次に他の鎖と形成し、二本鎖の一つの鎖中のかなり大きな部分のプリンまたはピリミジンが存在する必要性をなくす。
【００５０】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンスモルホリンである。モルホリンは、天然の核酸構造の再設計の産物である合成分子である。典型的には２５塩基長で、それらは標準的な核酸塩基対合により相補的ＲＮＡ配列に結合する。
【００５１】
ＬＩＦ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、Ｋａｍｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ、２００７、３０：９７７−９８３）およびＣｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ、２００４  １  ７０：１２７０−１２７６）に記載されている。
【００５２】
ＤＮＡ酵素
本発明の別の態様は、ＬＩＦをコードする遺伝子の発現を阻害するためのＤＮＡ酵素の使用に関する。ＤＮＡ酵素は、アンチセンス技術とリボザイム技術の両方の機構的特徴のいくつかを組み込んでいる。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様に特定の標的核酸配列を認識するが、リボザイムのように触媒性であり標的核酸を特異的に切断するように設計される。
【００５３】
現在、２つのタイプのＤＮＡ酵素があり、両方がＳａｎｔｏｒｏおよびＪｏｙｃｅによって同定されている（例えば、米国特許第６，１１０，４６２号参照）。ＤＮＡ酵素１０−２３は、２つのアームを連結するループ構造を含む。２つのアームは、特定の標的核酸配列を認識することによって特異性を提供し、一方、ループ構造は生理学的条件において触媒機能を提供する。
【００５４】
リボザイム
標的ｍＲＮＡの転写産物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子はまた、活性が阻害されるＬＩＦをコードするｍＲＮＡの翻訳を妨げるために使用され得る。リボザイムは、特異的ＲＮＡ切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム分子の組成は、好ましくは、標的ｍＲＮＡに相補的な１つ以上の配列と、ｍＲＮＡまたは機能的に等価な配列を切断する原因となる公知の配列と、を含む（例えば米国特許第５，０９３，２４６号を参照、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５５】
ｍＲＮＡを部位特異的認識配列に切断するリボザイムを用いて標的ｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッドリボザイム（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ）の使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡの領域と相補的塩基対を形成する隣接領域によって指示される位置でｍＲＮＡを切断する。好ましくは、標的ｍＲＮＡは、以下の２つの塩基配列を有する：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッドリボザイムの配列は、インビボ切断の有効性を高めるために、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの安定ＲＮＡに埋め込まれ得る。特に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって媒介されるｔＲＮＡとの融合リボザイムの発現は、当技術分野において周知である。典型的には、標的ｃＤＮＡ配列中にハンマーヘッドリボザイムの潜在的な切断部位が多数存在する。リボザイムは、好ましくは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端の近くに位置し、効力を高め、非機能性ｍＲＮＡ転写産物の細胞内蓄積を最小にするように操作される。更に、例えば標的の短い形態および長い形態の、ｅ末端アミノ酸ドメインの様々な部分をコードする標的配列に位置する切断認識部位の使用は、標的のいずれかの形態への選択的な配向を可能にし、したがって、標的遺伝子産物の形態に対して選択的に作用する。
【００５６】
遺伝子に対して向けられたリボザイムは、２つの領域に相補的なハイブリダイゼーション領域、ヒトＲＡＰＢＯタンパク質のいずれかに提示される配列のｍＲＮＡなどの、各々が標的ｍＲＮＡの少なくとも５つ、好ましくはそれぞれ６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の連続長のヌクレオチド、を必ず含む。更に、リボザイムは、コード化標的ｍＲＮＡを自己触媒的に切断する非常に特異的なエンドヌクレアーゼ活性を有する。本発明は、治療薬の候補標的遺伝子などの標的遺伝子をコードするコード化ｍＲＮＡとハイブリダイズし、したがって、機能的ポリペプチド産物を合成するために翻訳されることができなくなるように、コード化ｍＲＮＡとハイブリダイズしそれを切断する、リボザイムに及ぶ。
【００５７】
本発明の組成物に使用されるリボザイムには、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ（ＩＶＳまたはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られている）において自然に見つかるようなエンドリボヌクレアーゼＲＮＡ（以下、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」という）も含まれる。リボザイムは、（例えば、安定性、誘導などを改善するために）修飾オリゴヌクレオチドによって形成することができ、インビボで標的遺伝子を発現する細胞に送達されるべきである。好ましい送達のための方法は、ｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩの強力な構成的プロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用する工程を含み、その結果、トランスフェクトされた細胞は、内因性標的メッセンジャーを破壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生する。リボザイムは触媒的であり／他のアンチセンス分子と異なっているので、効果的であるためにはより低い細胞内濃度が必要である。
【００５８】
阻害ペプチド
本明細書に使用されるように、「阻害ペプチド」という用語は、ＬＩＦに結合し、上記で説明したようにその活性を阻害する、すなわち、ＬＩＦがＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化を誘導することを妨げることができるペプチドに関する。
【００５９】
本発明における使用に適した阻害ペプチドの例は、Ｗｈｉｔｅらに記載されているようなＬＩＦのペグ化変異体である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２００７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０４：１９３５７−１９３６２）。
【００６０】
ＬＩＦ受容体結合の阻害剤
サイトカイン受容体結合の阻害剤は、ＩＬ−６型サイトカインに対する親和性を示し、したがって、サイトカインを封鎖し、その生理的受容体への結合を防止することができる化合物である。阻害ポリペプチドは、好ましくはＩＬ−６型サイトカイン受容体の可溶性形態（いわゆるデコイ受容体（ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ））である。ＬＩＦの特定の場合において、ＬＩＦ受容体またはＬＩＦ結合タンパク質（ＬＢＰ）の可溶性変異体、すなわち天然に存在するアルファＬＩＦ受容体の可溶性形態を使用することが可能であり、関節軟骨外植片におけるプロテオグリカンの代謝に及ぼすＬＩＦの影響を効果的に防止することができることが判明している（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  ２４：２３９４）。
【００６１】
阻害抗体
「阻害抗体」および「中和抗体」は、ＬＩＦ、またはＬＩＦの受容体に結合することができ、ＬＩＦがＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化を誘導することを妨げる任意の抗体を定義するために交換可能に使用される。抗体は、当業者に公知の方法のいずれかを用いて調製することができる。したがって、ポリクローナル抗体は、阻害されるタンパク質を用いた動物の免疫化によって調製される。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６：４９５）に記載された方法を使用して調整されることができる。しかし、当分野で公知の他の方法も、等しく適している。ＬＩＦ結合能力、または前記サイトカインの受容体に結合する能力を有する抗体が同定されると、このタンパク質の活性を阻害することができるものは、上記の阻害剤の同定のためのアッセイを用いて選択される（Ｍｅｔｚ、２００７、上記の通り）。
【００６２】
したがって、より具体的な実施形態では、抗体は、ＬＩＦに特異的な阻害抗体またはＬＩＦ受容体をブロックする抗体である。
【００６３】
ＬＩＦに特異的な典型的な抗体は、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１５６：９−１７、１９９２）、Ａｌｐｈｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ２８ｔｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  Ｏ，  ｎｏ．  ＳＰ．２  （１９９１）  （ＮＹ，  Ｎ．Ｅ．，  ｐ．４９）  （Ｍａｂｓ  Ｄ４．１６．９，  Ｄ２５．１．４，  ａｎｄ  Ｄ６２．３．２）に記載されている。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明に従って使用するための抗体は、全長ヒトＬＩＦを認識するが、アミノ酸１〜１６０に対応するＬＩＦフラグメントを認識しない抗体である。別の実施形態では、本発明に従って使用するための抗体は、ヒトＬＩＦのアミノ酸１６０〜２０２に対応する領域に含まれるヒトＬＩＦのエピトープを認識する抗体である。さらに別の実施形態では、本発明に従って使用するための抗体は、以下から選択される領域に含まれるエピトープを認識する抗体である：ヒトのＬＩＦの、アミノ酸１６０〜１８０に対応する領域、アミノ酸１７０〜１９０に対応する領域、アミノ酸１８０〜２００に対応する領域、アミノ酸１８２〜２０２に対応する領域。さらに別の実施形態では、本発明に従って使用するための抗体は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５４）のＶａｌｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙによって２０１０年４月１日に寄託されたハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体によるヒトＬＩＦへの結合において競合的に阻害される抗体である。さらに別の実施形態では、本発明に従って使用するための抗体は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）のＶａｌｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙによって２０１０年４月１日に寄託されたハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５４によって産生される抗体、またはその抗原結合フラグメント、そのヒト化形態、またはそのキメラ形態である。
【００６５】
本発明では、用語「抗体」は広く解釈されるべきであり、これは、本発明の文脈においてＬＩＦまたはその受容体である対象の抗原を特異的に認識することができる限り、ポリクローナル、モノクローナル、多特異的抗体およびそのフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ）などを含む。本発明の文脈において使用され得る抗体の例は、非限定的な例として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体などである。
【００６６】
ポリクローナル抗体は、もともと、抗原で免疫された動物の血清中で産生された抗体分子の異種混合物である。これらはまた、例えば、対象の抗原の単一エピトープのペプチドを用いたカラムクロマトグラフィーによる、異種混合物から得られた単一特異的ポリクローナル抗体を含む。
【００６７】
モノクローナル抗体は、抗原の単一エピトープに特異的な抗体の均質な集団である。これらのモノクローナル抗体は、既に記載された従来技術および当業者のためのルーチンによって調製することができる。
【００６８】
キメラ抗体は、異なる動物種由来の抗体のクローニングまたは組換えによって構築されたモノクローナル抗体である。本発明の典型的であるが非制限的な構成では、キメラ抗体は、キメラ抗体はモノクローナル抗体の一部であり、一般的には抗原認識および結合のための部位を含む可変フラグメント（Ｆｖ）と、ヒト抗体に対応する他の部分であり、一般的には定常領域および隣接する定常領域を含む部分と、を含む。
【００６９】
完全ヒト抗体は、ヒト免疫系を用いて、またはヒト免疫細胞のインビトロ免疫化（これは、アジュバント、および純粋または非純粋な抗原を伴うまたは伴わない遺伝的および従来の免疫化の両方を含む；または、免疫系への抗原の曝露の方法によって）、または、ヒト免疫細胞から産生された天然／合成ライブラリによって、トランスジェニック動物において産生された抗体（複数可）である。これらの抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子がクローニングされ、標的抗原（本発明では、前記抗原はＬＩＦまたはその受容体である）で免疫化されたトランスジェニック動物（例えば、マウス）から得られ、選択され得る。これらの抗体は、ファージディスプレイに提示されたヒト一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）または抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を選択し、続いてヒト抗体にクローニングおよび移植することによって、または抗体ライブラリを生成するために、両方の鎖の可変フラグメントをクローニングし、続いてそれらの組合せ／突然変異によって生成されたライブラリの、当業者に公知の他の産生およびディスプレイ方法によって、得ることができる。
【００７０】
ヒト化抗体は、それ自体の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）の交換においてヒト化抗体中のマウスモノクローナル抗体の超可変ＣＤＲのクローニングと移植によって構築されたモノクローナル抗体である。
【００７１】
加えて、本発明の文脈において、用語「抗体」は、タンパク質から、あるいは組み換え技術によって得られた、グリコシル化あるいは非グリコシル化抗体フラグメントと同様に、変更されたグリコシル化パターンを備えた変異体を含み、これは、（ｉ）結合ペプチドによって互いに結合した抗体の可変ゾーン（ｓｃＦｖ）、（ｉｉ）システインによって、または結合ペプチドおよびジスルフィド結合によって、軽鎖へ結合した重鎖（Ｆｄ）のＣＨＩ定常部を備える可変ゾーン（ｓｃＦａｂ）、（ｉｉｉ）単一重鎖などの新しい変異体、あるいは、（ｉｖ）生体流体中でより類似させ、免疫原性（ヒト化）を弱め、あるいはより安定させる目的で、抗体フラグメントに対して行われた任意の修飾からなることがあり、これは、本発明の文脈において、ＬＩＦがその機能（活性）を実行し、つまり、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化を引き起こすのを防ぐ能力を有している。
【００７２】
当業者であれば理解するであろうが、抗体は、タンパク質を得るために従来の遺伝子操作または組み換え技術、抗体産生技術、生体流体または組織からの抽出と精製の技術、あるいは当業者に広く知られているタンパク質および抗体をえるための他の従来の技術によって入手可能である。抗体の産生のための技術の例示的な非限定例は以下のとおりである：ヒト免疫グロブリン遺伝子用トランスジェニック動物を含む動物の免疫技術、ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の産生、天然のものであり得るか、合成のものであり得るか、あるいは所望の抗原に対して免疫化された有機体に由来し得る抗体ライブラリであって、かつ非常に多種多様なディスプレイ方法（ファージディスプレイ、リボソームディスプレイなど）によって選択することができる抗体ライブラリによる産生、および、その後の、様々なサイズ、組成、および構造の組み換え抗体の産生のために設計されたベクターにおいて抗体を再設計して発現させることができる遺伝子工学的技術による産生。
【００７３】
特別の実施形態では、卵巣、肺、あるいは大腸の癌の処置で使用される本発明の薬剤はＬＩＦに特異的な抗体、より好ましくはＬＩＦ中和抗体である。ＬＩＦ中和抗体は市販で入手可能であり、限定されないが、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓのヤギポリクローナル抗ヒト抗ＬＩＦ抗体（カタログ番号ＡＦ−２５０−ＳＰとＡＦ−２５０−ＮＡ）を含む。
【００７４】
ＬＩＦの活性を阻害する他の化合物
【００７５】
ＩＬ−６タイプのサイトカインの発現を阻害する能力を備えた他の化合物は、アプタマーとシュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ）を含み、これらは、その生物学的活性の修飾に起因するタンパク質に特異的に結合する一本鎖または二本鎖のＤまたはＬ核酸である。アプタマーとシュピーゲルマーは、１５〜８０のヌクレオチド、好ましくは２０〜５０のヌクレオチド長さを有する。
【００７６】
ＬＩＦの阻害的活性を有するポリペプチド
【００７７】
具体的には、本発明の文脈で役に立つことがあるＬＩＦのアンタゴニストは、以下のとおりである：同じ受容体結合部位に対して親和性の低下を示すか、受容体の鎖の一方にのみ結合することができる、受容体結合部位中で突然変異を提示するＬＩＦ変異体。上記変異体の例としては以下が挙げられる：
（ｉ）Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．により記載された変異体（Ｊ  ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  １９９６，  ２７１  ：  １１９７１−  １１９７８）、
（ｉｉ）Ｑ２９Ａ、Ｇ１２４Ｒ、およびＮ１２８Ａの群から選択される１つ以上の突然変異を有し、ＬＩＦ受容体とｇｐ１３０に対する親和性の低下を示す、ＷＯ２００５０３０８０３に記載されるＬＩＦ変異体。ＬＩＦの高効能アンタゴニストは、Ｆａｉｒｌｉｅ／  Ｗ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２００４，２７９：２１２５−２１３４）によって記載されたＭＨ３５−ＢＤ／Ｑ２９Ａ＋Ｇ１２４Ｒを含む変異体である、
（ｉｉｉ）受容体結合領域、特に、  ヒトＬＩＦの番号付けに対して位置２５−３８、１５０−１６０、あるいは１６１−１８０で１つ以上の置換基を有することを特徴とするＷ０９６０１３１９に記載される変異体。
（ｉｖ）Ｍｅｔｚ；Ｓ．ｅｔ  ａｌ．により記載されるように（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００８，２８３：５９８５−５９９５）、ＬＩＦ受容体の細胞外領域の一部とｇｐｌ３０リガンド結合ドメインを含む融合タンパク質などの、一次構造に基づいて、およびＬＩＦに結合してＬＩＦが細胞表面上のその天然の受容体と相互作用するのを防ぐ能力を有する、ＬＩＦ受容体の溶解可能な変異体。本発明は、ＬＩＦの発現を阻害することができ、および／または、癌の処置で使用されるＬＩＦの活性を遮断することができる薬剤に関し、上記癌は、卵巣癌、肺癌、および大腸癌から選択される。特定の実施形態では、上記癌（卵巣、肺、大腸癌）は、基準値に対するＬＩＦレベルを増加させることを特徴とする。
【００７８】
１つの実施形態では、ＬＩＦの発現を阻害することができ、および／または、本発明に従って使用されるＬＩＦの活性を遮断することができる薬剤は患者の治療に使用され、患者の腫瘍は基準値に対するＬＩＦレベルを増加させたことを特徴とする。
【００７９】
１つの実施形態では、ＬＩＦの発現を阻害することができ、および／または、本発明に従って使用されるＬＩＦの活性を遮断することができる薬剤は、基準値に対するＬＩＦレベルを増加させた自らの腫瘍に基づいて選択された患者の治療に使用される。
【００８０】
１つの実施形態では、ＬＩＦの発現を阻害することができ、および／または、本発明に従って使用されるＬＩＦの活性を遮断することができる薬剤は患者の治療に使用され、治療の前に、基準値に対するＬＩＦレベルを増加させた腫瘍の患者の選択が先行される。患者の選択は、以下に詳細に定義される本発明のＬＩＦ阻害剤に基づいて治療のために癌患者を選択する方法によって実行可能である。
【００８１】
当業者であれば理解するように、サンプル中のＬＩＦの発現レベルの定量化は、ｍＲＮＡレベルの決定あるいはタンパク質レベルの決定として行うことができる。ＬＩＦをコードする遺伝子の発現レベルの定量化は、上記遺伝子（ｍＲＮＡ）の転写、あるいは、代替的に、上記遺伝子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に起因するＲＮＡから行なうことができる。さらに、抽出の１工程はＲＮＡの合計を得るために必要になりえる。それは従来の技術によって行なうことができる。実際に、ＬＩＦをコードする遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ、あるいはその対応するｃＤＮＡのレベルを検知および定量化するために、本発明の文脈内でどんな従来の方法も使用することができる。非限定的な例示によって、上記遺伝子によりコードされたｍＲＮＡのレベルは、従来の方法、例えば、電気泳動および着色などの、ｍＲＮＡの増幅と上記ｍＲＮＡの増幅の生成物の定量化を含む方法を用いることによって、あるいは、代替的に、ノーザンブロットによって、および、所望のあるいはその対応するｃＤＮＡのｍＲＮＡに特異的なプローブ、ＳＩヌクレアーゼ、ＲＴ−ＬＣＲ、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイなどによるマッピング、好ましくは、プローブとプライマーの適切なセットを使用する定量的なリアルタイムＰＣＲによって、定量化可能である。同様に、ＬＩＦをコードする遺伝子によってコードされた上記ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡのレベルも、従来の技術を使用することによって定量化可能であり、この場合、本発明の方法は、対応するｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）と、その後の増幅と、上記ｃＤＮＡの増幅の生成物の定量化とによる、対応するｃＤＮＡの合成の工程を含む。発現レベルを定量化する従来の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ３”ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｅ．，  Ｖｏｌ．  １−３で見られる。したがって、特定の実施形態では、ＬＩＦをコードする遺伝子の発現レベルの定量化は、上記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、上記ｍＲＮＡのフラグメント、上記遺伝子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、上記ｃＤＮＡのフラグメント、あるいはこれらの混合物の定量化を含む。
【００８２】
別の特定の実施形態では、ＬＩＦをコードする遺伝子の発現レベルの定量化は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって行われる。
【００８３】
加えて、上記ＬＩＦをコードする遺伝子によってコードされたタンパク質、すなわち、ＬＩＦタンパク質の発現レベルも定量化することができる。当業者によって理解されるように、タンパク質の発現レベルは任意の従来の方法によって定量化することができる。非限定的な例示として、タンパク質のレベルは、上記タンパク質と（あるいは、抗原決定基を含むそのフラグメントと）結合する能力を備えた抗体を用いて定量化することができ、および、形成された複合体がその後定量化される。こうしたアッセイに使用される抗体は標識されることもあれば、標識されないこともある。使用することができるマーカーの例示的な例としては、放射性同位体、酵素、フルオロフォア、化学発光試薬、酵素基質あるいは補助因子、酵素阻害剤、粒子、染料などが挙げられる。非標識抗体（一次抗体）と標識抗体（第２の抗体）を使用する本発明で使用することができる様々な既知のアッセイがあり、こうした技術は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、ＲＩＡ（放射性免疫測定法）、競争的なＥＩＡ（競合的酵素免疫測定法）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学的免疫組織化学法、特異的な抗体を含むタンパク質のバイオチップあるいはマイクロアレイの仕様に基づく技術、あるいは、尿試験紙などのフォーマットでのコロイド沈澱反応に基づくアッセイを含む。タンパク質を検知および定量化する他の方法は、親和性クロマトグラフィー技術、リガンド結合アッセイなどを含む。別の特定の実施形態では、タンパク質のレベルの定量化は、ウェスタンブロット、免疫組織化学、あるいはＥＬＩＳＡによって行われる。
【００８４】
好ましい実施形態では、サンプル中のＬＩＦのレベルは免疫組織化学によって判定される。より好ましい実施形態では、免疫組織化学によるＬＩＦレベルの判定は、以下の工程を含む：
−室温において一晩中４％ホルマリンでサンプル固定化、
−パラフィンにサンプルを埋め込む、
−６０°Ｃ、Ｏ／Ｎでスライドをインキュベート、
−脱パラフィンと再水和：キシレン＋ＥｔＯＨ（１００％、９０％、７０％、およびＨ２０）、−抗原回収：ＤＡＫＯ溶液ｐＨ６（１１５°／３’）、
−サンプルを室温（約２０’）に冷ます、
−ペルオキシダーゼ：１０’処置（希釈１：１０）、
−ＴＢＳ−Ｔ  １ｘ（ｐＨ７．６）３ｘ５’で洗浄、
−ＴＢＳ−Ｔ  １ｘ中の３％ＢＳＡで、３０’で室温にて１時間遮断、
−ＴＢＳＴ  １ｘ（ｐＨ７．６）３ｘ５’で洗浄、
−抗ＬＩＦ抗体ＬＩＦ（ＨＰ  ＡＯ  １８８４４（Ａｔｌａｓ）１：２００（緑の希釈剤（ｄｉｌｕｙｅｎｔ）、ＤＡＫＯ）を加え、湿度の高いチャンバー内で一晩中４°で維持、
−ＴＢＳＴ  １ｘ（ｐＨ７．６）３ｘ５’で洗浄、
−室温で２０’の第２の抗体を加える（ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｄａｋｏ）
−ＴＢＳＴ  １ｘ（ｐＨ７．６）３ｘ５’で洗浄、
−成長：成長前の最大で２０’−ヘマトキシリン（２０−３０’’）で逆染色、
−脱水：ＥｔＯＨ（７０％、９０％、１００％）＋キシレン−スライドを取り付ける
【００８５】
別の好ましい実施形態では、高い発現レベルは一般にサンプル中の上記タンパク質のより高い比活性をもたらすため、ＬＩＦの発現レベルの判定は上記タンパク質の活性の決定によって実行することができる。ＬＩＦの活性を判定するためのアッセイは、化合物がＬＩＦの阻害剤であるかどうかを判断するためのアッセイの文脈で先に記載されている。
【００８６】
卵巣癌、肺癌、および大腸癌から選択される癌の処置で使用される本発明に係る薬剤の特定の実施形態では、上記癌はＬＩＦレベルを増加させることを特徴とする。
【００８７】
１つの実施形態では、ＬＩＦレベルの増加は絶対値によって定義される。好ましい実施形態において、ＬＩＦレベルの判定がタンパク質レベルで実行されるとき、ＬＩＦレベルは、ＬＩＦスコアの値として、あるいはＨ−スコアの値として測定される。
【００８８】
ＬＩＦスコアは、ＬＩＦについて強力な完全染色（３＋）を備える細胞の割合（０％から１００％まで）として定義される。例えば、５のＬＩＦスコアは、腫瘍細胞の５％が強力な完全染色を示すことを意味する。対照サンプルは、健康な個体、あるいは、癌に苦しんでいない、とりわけ、卵巣癌、肺癌、あるいは大腸癌に苦しんでいない個体からのサンプルに対応して、約０、１、２、３、４、あるいは５のＬＩＦスコアを示す。より具体的な実施形態では、高いレベルのＬＩＦを有することを特徴とする癌は、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、あるいは１００のＬＩＦスコアを有することを特徴とする。別の実施形態では、高いＬＩＦレベルは、所定のＬＩＦスコアを超えるあらゆるＬＩＦスコアとして定義される。より具体的な実施形態では、高いレベルのＬＩＦを有することを特徴とする癌は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、あるいは、９９を超えるＬＩＦスコアを有することを特徴とする。
【００８９】
用語「Ｈ−スコア」は、試験サンプル中のＬＩＦ発現レベルを定量化するために使用される特別の値スケールに関する。所定のサンプルのＨスコアに基づいて、ＬＩＦレベルが高いかそうでないかを結論付けることができる。対照サンプルは、健康な個体、あるいは、癌に苦しんでいない、とりわけ、卵巣癌、肺癌、あるいは大腸癌に苦しんでいない個体からのサンプルに、あるいは、癌患者からの健康な（非腫瘍）サンプルに対応して、０のＨスコアを示す。卵巣癌、肺癌、および大腸癌から選択される癌の処置において使用される本発明の薬剤の特定の実施形態において、癌は基準値に関してＬＩＦのレベルを上昇させることを特徴とし、ＬＩＦのレベルは免疫組織化学または免疫組織蛍光によって定量化され、上記レベルはＨスコアの値として測定される。より具体的な実施形態では、高いレベルのＬＩＦを有することを特徴とする癌は、少なくとも１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、あるいは３００のＨスコアを有することを特徴とする。
【００９０】
別の実施形態では、癌は、上記レベルが基準値よりも高いときにＬＩＦレベルを増加させるものとして定義される。この場合、ＬＩＦ発現レベルは、その基準値よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％以上高いときに、基準値よりも増大したか、または高いとみなされる。したがって、基準値に関してＬＩＦの増加したレベルは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％以上だけ、基準値とみなされるＬＩＦのレベルよりも大きいＬＩＦのレベルに関する。
【００９１】
用語は「減少したレベル」あるいは「低レベル」とは、ＬＩＦの発現レベルと関連して、基準値よりも低いサンプル中のＬＩＦの発現の任意のレベルに関する。したがって、ＬＩＦ発現レベルは、その基準値よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれよりも低いときに、基準値よりも減少したか、あるいは低いとみなされる。
【００９２】
「同様のレベル」あるいは「等しいレベル」とは、発現レベルと関連して、対照サンプルまたは基準値におけるその発現のレベルに類似するサンプル中のＬＩＦの発現の任意のレベルに関する。したがって、上記レベルは、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、あるいは０．５％未満だけ異なるとき、基準値のそのレベルに類似するとみなされる。
【００９３】
用語「基準値」又は「基準レベル」は、卵巣癌、肺癌、又は大腸癌の処置における本発明に係る使用のためにＬＩＦ発現を阻害し及び／又はＬＩＦ活性を遮断する薬剤の文脈において使用されるように、試験サンプル中のＬＩＦのレベルの判定のための基準として使用される予め定めた標準と理解される。基準値又は基準レベルは、絶対値、相対値、上限又は下限を持つ値、値の範囲、平均値、中央値、平均値（ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ）、又は特定の対照或いはベースライン値と比較した値であり得る。基準値は、例えば、試験されている被験体のサンプルから得た値など、個々のサンプル値に基づき得るが、それは初期の時点の値である。基準値は、暦年齢対応群の被験体の集団からなどの多数のサンプル、或いは、試験されるサンプルを含むか除外するサンプルのプール（ｐｏｏｌ）に基づき得る。
【００９４】
特定の実施形態において、基準値は、臨床的観点から十分に立証された患者から、及び、疾患の無い患者、特に癌に悩んでいない患者、具体的には卵巣癌、肺癌、又は大腸癌に悩んでいない患者から得たサンプルにおけるＬＩＦ発現値に相当する。基準レベルが、臨床的観点から十分に立証された患者から、及び癌に悩んでいない患者から得たサンプルにおけるＬＩＦ発現値に相当すると、ＬＩＦのレベルの増大は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、或いはそれ以上に基準値よりも大きなＬＩＦのレベルに関連する。
【００９５】
代替的に、基準値は、癌、具体的には卵巣癌、肺癌、又は大腸癌に悩み且つ抗ＬＩＦ処置に応答しないことを特徴とした患者のサンプルから得たＬＩＦ発現値に相当する。
【００９６】
基準レベルが、癌、具体的には卵巣癌、肺癌、又は大腸癌に悩み且つ抗ＬＩＦ処置に応答しないことを特徴とした患者のサンプルにおけるＬＩＦ発現値に相当すると、ＬＩＦのレベルの増大は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、或いはそれ以上に基準値よりも大きなＬＩＦのレベルに関連する。
【００９７】
代替的に、基準値は、癌、具体的には卵巣癌、肺癌、又は大腸癌に悩み、好ましくは抗ＬＩＦ処置に応答しないことを特徴とした患者から得た健康な或いは非腫瘍性の組織から得られるＬＩＦ発現値に相当する。好ましくは、健康な組織は、腫瘍が進行した組織である。
【００９８】
基準レベルが、癌、具体的には卵巣癌、肺癌、又は大腸癌に悩み、好ましくは抗ＬＩＦ処置に応答しないことを特徴とした患者から得た健康な或いは非腫瘍性の組織から得られるＬＩＦ発現値に相当すると、ＬＩＦのレベルの増大は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、或いはそれ以上に基準値よりも大きなＬＩＦのレベルに関連する。
【００９９】
特定の実施形態において、基準値は、臨床的観点から十分に立証され、及び、疾患を提示しない、特に癌に悩んでいない、具体的には卵巣癌、肺癌、又は大腸癌に悩んでいない患者の群から得たサンプルのプールから判定される平均（ａｖｅｒａｇｅ  ｏｒ  ｍｅａｎ）ＬＩＦ発現値に相当する。この場合、ＬＩＦのレベルの増大は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、或いはそれ以上に基準値よりも大きなＬＩＦのレベルに関連する。
【０１００】
代替的に、基準値は、癌、具体的には卵巣癌、肺癌、又は大腸癌に悩まず且つ抗ＬＩＦ処置に応答しないことを特徴とした患者の群から得たサンプルのプールから判定される平均ＬＩＦ発現値に相当する。この場合、ＬＩＦのレベルの増大は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、或いはそれ以上に基準値よりも大きなＬＩＦのレベルに関連する。
【０１０１】
代替的に、基準値は、癌、具体的には卵巣癌、肺癌、又は大腸癌に悩まず、好ましくは抗ＬＩＦ処置に応答しないことを特徴とした患者から得た健康な組織又は非腫瘍性組織のサンプルのプールから判定される平均ＬＩＦ発現値に相当する。
【０１０２】
この場合、ＬＩＦのレベルの増大は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、或いはそれ以上に基準値よりも大きなＬＩＦのレベルに関連する。
【０１０３】
前記サンプルにおいて、発現レベルは、例えば基準集団における平均発現レベルの判定によって判定され得る。基準値の判定において、患者の年齢、性別、身体状態などのサンプルのタイプの幾つかの特徴を考慮に入れることが必要となる。例えば、基準サンプルは、集団が統計的に有意となるように、少なくとも２、少なくとも１０、少なくとも１００から少なくとも１０００を超える個体の群の同一の量から得ることができる。
【０１０４】
基準値が得られるサンプルは通常、患者におけるＬＩＦレベルを判定するために使用される同じタイプのサンプルであることが理解される。例えば、患者におけるＬＩＦレベルの判定が腫瘍からの生検において実行される場合、基準値は同じ組織の非腫瘍性サンプルから得られる。場合によっては、非腫瘍性組織は、非腫瘍性組織を含んでいる生検のそのような部分を得ることにより、同じ腫瘍生検から得られる場合もある。
【０１０５】
上述のように、サンプルにおけるＬＩＦの発現レベルの定量化は、ｍＲＮＡレベルの判定或いはタンパク質レベルの判定として実行することができる。好ましい実施形態において、サンプルにおけるＬＩＦの発現レベルはタンパク質レベルとして判定される。より好ましい実施形態において、ＬＩＦのタンパク質レベルは、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学的検査、免疫組織蛍光、質量分析、免疫沈降又はＥＬＩＳＡに関連づけられた質量分析によって判定される。より特定の実施形態において、ＬＩＦのレベルは、免疫組織化学的検査又は免疫組織蛍光によって定量化される。
【０１０６】
本発明に係るサンプルの例示的であり限定されない例として、組織のサンプルと同様に、血液、血清、血漿、脳脊髄液、腹水、便、尿、及び唾液などの異なるタイプの体液が挙げられる。体液のサンプルは、組織のサンプルのように従来の方法により得ることができ；一例として、前記組織のサンプルは、外科的切除により得られた生検のサンプルであり得る。好ましくは、ＬＩＦの判定のために使用されるサンプルは、判定が相対的に行われる場合に基準値を判定するために使用される同じタイプのサンプルである。一例として、ＬＩＦレベルの判定が外科的切除後に得られた腫瘍のサンプルにおいて実行される場合、基準値は、ＬＩＦでの処置に応答しなかった患者から得られた腫瘍のサンプルでもある。サンプルが生物流体の場合、基準サンプルは、同じタイプの生物流体、例えば血液、血清、血漿、脳脊髄液においても判定される。
【０１０７】
本発明に係る使用のための薬剤の特定の実施形態において、癌は、卵巣癌、肺癌、及び大腸癌から選択される。より特定の実施形態において、癌は肺癌、具体的には非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【０１０８】
別の実施形態において、癌が大腸癌の場合、患者は、炎症性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎に悩んでおらず、或いはそれに悩んではいなかった。
【０１０９】
別の実施形態において、癌が大腸癌の場合、患者は悪液質に悩んでいない。本明細書で使用されるように、用語「悪液質」は、食事により元に戻すことができず且つ極端な衰弱、感染への耐性の減少、及び治療を耐えることができなくなる状態を引き起こす、身体全体にわたる貯蔵脂肪と筋肉量の両方の重大な損失により引き起こされる、体重の系統的な損失を指す。
【０１１０】
別の実施形態において、癌が大腸癌の場合、癌は化学療法抵抗性ではない。本明細書で使用されるように、用語「化学療法抵抗性」は、その細胞が抗癌治療にもかかわらず生存し且つ増大することが可能な癌を指す。化学療法抵抗性は、癌細胞にそれらの耐性を与える遺伝的特徴などの癌細胞の固有の特性により、同様に、変更された膜輸送、増強されたＤＮＡ修複、アポトーシス経路欠損、標的分子の変化、酵素不活性化などのタンパク質及び経路の機構を含む様々な機構により引き起こされ得る、薬物曝露後の獲得耐性によっても引き起こされ得る。１つの実施形態において、癌細胞は、代謝拮抗薬、好ましくはピリミジンアナログ及び最も好ましくは５−フルオロウラシルでの処置に対する耐性が無い、
【０１１１】
１つの実施形態において、癌細胞は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤での置に対する耐性が無い。好ましくは、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、エトポシド、アドリアマイシン、又はドキソルビシンである。
【０１１２】
癌患者のためにカスタマイズされた治療の設計のための本発明の方法
別の態様において、本発明は、卵巣癌、肺癌、及び大腸癌から選択される癌に悩む患者のためにカスタマイズされた治療を設計するインビトロの方法に関し、該方法は：
前記患者のサンプルにおけるＬＩＦのレベルを定量化する工程、及び
前記レベルを基準値と比較する工程
を含み、
ここで、前記患者の前記サンプルにおけるＬＩＦのレベルが基準値以上である場合、ＬＩＦの発現を阻害し及び／又はその活性を遮断することができる薬剤が、前記患者への投与のために選択される。
【０１１３】
本明細書で使用されるように、用語「カスタマイズされた治療」は、「個別化された治療」としても知られており、おそらく有効であり且つ副作用をあまり引き起こさない処置を伴う患者の一致に関連する。本発明の文脈において、患者は癌患者であり、治療は、ＬＩＦの発現を阻害し及び／又はその活性を遮断することができる薬剤に基づく治療である。
【０１１４】
故に、癌に悩む患者のためにカスタマイズされた治療を設計する本発明の方法の第１の工程において、癌は卵巣癌、肺癌、及び大腸癌から選択され、癌に悩む前記患者のサンプルにおけるＬＩＦのレベルは定量化される。ＬＩＦレベルの定量化は、本発明の治療方法の文脈において上述のように実行される。
【０１１５】
特定の実施形態において、カスタマイズされた治療が設計されることになっている患者は、肺癌患者、具体的には非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に悩む肺癌患者である。
【０１１６】
別の実施形態において、カスタマイズされた治療が設計されることになっている患者は、炎症性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎に悩んでいない、或いはそれに悩んではいなかった、大腸癌患者である。別の実施形態において、カスタマイズされた治療が設計されることになっている患者は、悪液質に悩んでいない大腸癌患者である。
【０１１７】
別の実施形態において、カスタマイズされた治療が設計されることになっている患者は、癌が大腸癌であり且つ癌が化学療法抵抗性でない、大腸癌患者である。１つの実施形態において、癌細胞は、代謝拮抗薬、好ましくはピリミジンアナログ及び最も好ましくは５−フルオロウラシルでの処置に対する耐性が無い。別の実施形態において、癌細胞は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤での処置に対する耐性が無い。好ましくは、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、エトポシド、アドリアマイシン、又はドキソルビシンである。
【０１１８】
ＬＩＦのレベルを判定するための本発明に係る適切なサンプルは、以前に同様に言及され、且つ本明細書に組み込まれている。特定の実施形態において、サンプルは組織サンプル又は生物流体である。より特定の実施形態において、組織サンプルは腫瘍サンプルである。より特定の実施形態において、生体流体は血液、血清、又は血漿である。
【０１１９】
ＬＩＦ発現レベルを定量化する方法は、以前に本発明の使用のための薬剤の文脈において記載されており、本明細書に組み込まれている。
【０１２０】
特定の実施形態において、ＬＩＦのレベルは、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学的検査、免疫組織蛍光、質量分析、免疫沈降又はＥＬＩＳＡに関連づけられた質量分析によって定量化される。より好ましくは、ＬＩＦのレベルは、免疫組織化学的検査又は免疫組織蛍光によって定量化される。
【０１２１】
癌に悩む患者のためにカスタマイズされた治療を設計する本発明の方法の第２の工程において、前記癌は卵巣癌、肺癌、及び大腸癌から選択され、患者のサンプルにおいて定量化されたＬＩＦのレベルは基準値と比較され、ここで、癌に悩む被験体のサンプルにおけるＬＩＦのレベルがゼロ以上である場合、ＬＩＦの発現を阻害し及び／又はその活性を遮断することができる薬剤が、前記患者への投与のために選択される。
【０１２２】
癌に悩む患者のためにカスタマイズされた治療を設計する本発明の方法に係る基準値は、本発明の治療方法におけるものと同じ方法で判定される。本発明に係る基準値は、以前に本発明の癌の処置における使用のための薬剤の文脈において記載されており、本明細書に組み込まれている。
【０１２３】
特定の実施形態において、ＬＩＦのレベルは、ＬＩＦスコアの値、又はＨスコアの値として測定される。より特定の実施形態において、ＬＩＦのレベルは、免疫組織化学的検査又は免疫組織蛍光によって定量化され、且つＬＩＦスコア又はＨスコアの値として測定される。
【０１２４】
ＬＩＦの発現を阻害し及び／又はその活性を遮断することができる薬剤は、本発明で上述され、本明細書に組み込まれている。特定の実施形態において、薬剤は、ＬＩＦに特異的なｓｉＲＮＡ、ＬＩＦに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＬＩＦに特異的なリボザイムから成る群から選択される。特定の代替的な実施形態において、ＬＩＦに特異的な抗体、ＬＩＦに特異的なポリペプチド、ＬＩＦに特異的なオリゴヌクレオチド、及びＬＩＦに特異的なＬＩＦ受容体結合の阻害剤から成る群から選択される。より特定の実施形態において、ＬＩＦに特異的な抗体は、ＬＩＦ中和抗体である。
【０１２５】
ＬＩＦ阻害剤に基づく処置のための癌患者の選択のための本発明の方法
更なる態様において、本発明は、ＬＩＦの発現を阻害し及び／又はその活性を遮断することができる薬剤で処置される、卵巣癌、肺癌、及び大腸癌から選択される癌に悩む患者を選択するインビトロの方法に関し、該方法は：
前記患者の腫瘍サンプルにおけるＬＩＦのレベルを定量化する工程、及び
前記レベルを基準値と比較する工程
を含み、
ここで、前記患者の前記腫瘍サンプルにおけるＬＩＦのレベルが基準値以上である場合、前記患者は、ＬＩＦの発現を阻害し及び／又はその活性を遮断することができる薬剤での処置を受けるために選択される。
【０１２６】
ＬＩＦの発現を阻害することができる及び／又はその活性を遮断することができる薬剤で処置される、卵巣癌、肺癌、および大腸癌を患う患者を選択するための本発明の方法の第１の工程は、前記患者からのサンプルにおけるＬＩＦのレベルを定量化する工程を含む。
【０１２７】
特定の実施形態では、分析される患者は、肺癌患者、より具体的には非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う肺癌患者である。別の実施形態では、患者は卵巣癌患者である。別の実施形態では、患者は大腸癌患者である。
【０１２８】
別の実施形態において、分析される患者は、炎症性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎を患っていない又はそれを患ったことがない大腸癌患者である。
【０１２９】
別の実施形態では、分析される患者は、悪液質を患っていない大腸癌患者である。
【０１３０】
別の実施形態では、分析される患者は、癌が大腸癌であり、かつ癌が化学療法抵抗性ではない大腸癌患者である。１つの実施形態では、癌細胞は、代謝拮抗薬、好ましくはピリミジンアナログ、および、最も好ましくは５−フルオロウラシルによる治療に対して耐性がない。別の実施形態では、癌細胞はトポイソメラーゼＩＩ阻害剤を用いる治療に対して耐性がない。好ましくは、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤はエトポシドあるいはアドリアマイシンあるいはドキソルビシンである。
【０１３１】
ＬＩＦのレベルを判定するための本発明にかかる適切なサンプルは、先に同様に言及され、かつ本明細書に組み込まれている。特定の実施形態では、サンプルは組織サンプルあるいは生物流体である。さらに具体的な実施形態では、組織サンプルは腫瘍サンプルである。さらに具体的な実施形態では、生物流体は、血液、血清、または、血漿、あるいはＣＳＦサンプルである。
【０１３２】
ＬＩＦ発現レベルを定量化するための方法は、本発明の使用のための薬剤の文脈において先に記載されており、かつ、本明細書に組み込まれている。
【０１３３】
特定の実施形態では、ＬＩＦのレベルは、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学的検査、免疫組織蛍光、質量分析、免疫沈降またはＥＬＩＳＡに関連付けられた質量分析によって定量化される。より好ましくは、ＬＩＦのレベルは免疫組織化学的検査または免疫組織蛍光によって定量化される。
【０１３４】
ＬＩＦの発現を阻害可能な、および／またはＬＩＦの活性を遮断可能な薬剤をもちいて処置される、卵巣癌、肺癌、および大腸癌から選択される癌に苦しむ患者を選択するための本発明の方法の第２の工程は、第１の工程で測定されたレベルと基準値とを比較する工程を含む。ＬＩＦの発現を阻害可能なおよび／またはＬＩＦの活性を遮断可能な薬剤を用いる処置のための、患者を選択する本発明の方法にかかる基準値は、本発明の処置方法と同一方法にて測定される。本発明にかかる基準値は、本発明の癌の処置で使用される薬剤の内容において予め記載され、本明細書に取り込まれる。
【０１３５】
特定の一実施形態では、ＬＩＦのレベルは、ＬＩＦスコアの値、またはＨスコアの値として測定される。より特定の実施形態では、ＬＩＦのレベルは免疫組織化学的検査または免疫組織蛍光法を用いて定量化され、ＬＩＦスコアまたはＨスコアの値として測定される。
【０１３６】
ＬＩＦの発現を阻害可能なおよび／またはＬＩＦの活性を遮断可能な薬剤は、本発明において上記されており、本明細書に取り込まれる。特定の実施形態では、薬剤は、ＬＩＦに特異的なｓｉＲＮＡ、ＬＩＦに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＬＩＦに特異的なリボザイムから成る群から選択される。特定の代替的な実施形態では、ＬＩＦに特異的な抗体、ＬＩＦに特異的なポリペプチド、ＬＩＦに特異的なオリゴヌクレオチド、およびＬＩＦに特異的なＬＩＦ受容体結合の阻害剤から成る群から選択される。より特定の実施形態では、ＬＩＦに特異的な抗体はＬＩＦ中和抗体である。
【０１３７】
本発明は、単に例示的で本発明の範囲を限定するものではないものとして解釈される次の例を用いて、以下に詳細に記載される。
【実施例】
【０１３８】
＜癌におけるＬＩＦの異種混合の横断的な発現（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｖｅｒｓａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）＞
癌におけるＬＩＦのレベルを評価するために、様々な腫瘍タイプからのサンプルをパラフィン内に埋め込み、抗ＬＩＦ抗体を用いる免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によって染色した。ＬＩＦ発現を、Ｈスコア法を使用する免疫組織化学的検査によって定量化し、グラフで表した。
【０１３９】
ＬＩＦ発現における幅広い変異性が全ての指標で見つかった。重要なことに、極めて高いレベルのＬＩＦタンパク質を発現させる腫瘍が、膠芽腫（ＧＢＭ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、および膵癌（図１および２）を含む分析される２０の癌の指標にわたって観察された。
【０１４０】
＜神経膠腫サンプルにおけるＬＩＦスコアの測定＞
対照（図３Ａ）および腫瘍（図３Ｂ）サンプルを、切除後直ちに、室温で最大４８時間にわたって、１０％緩衝ホルマリン溶液中で固定して、脱水し、真空下でパラフィンに埋め込こんだ。壊死病巣から離れた代表的な組織の領域を、ヘマトキシリン−エオジン染色部分上で特定した。免疫組織化学的検査によるＬＩＦタンパク質のレベルの測定を、以下のように実行した：
１．ｏ／Ｎ、ＲＴで、４％ホルマリン中でサンプルを固定、
２．サンプルをパラフィン内に埋め込む、
３．６０℃、Ｏ／Ｎでスライドをインキュベート、
４．脱パラフィンと再水和：キシレン＋ＥｔＯＨ（１００％−＞９０％ー＞７０％−＞Ｈ２０）
５．抗原回収：ＤＡＫＯ溶液 ｐＨ６（１１５°／３’）。サンプルを室温（ＲＴ）（約２０’）まで冷やす
６．ペルオキシダーゼ：１０’処置（希釈１：１０）
７．ＴＢＳ−Ｔ １ｘ（ｐＨ ７.６）３ｘ５’で洗浄
８．ＴＢＳ−Ｔ１ｘ中の３％ＢＳＡで、３０’−１ｈ，ＲＴで遮断
９．ＴＢＳ−Ｔ １ｘ（ｐＨ ７，６）３ｘ５’で洗浄
１０．一次抗体を多湿のチャンバーにおいて４°、Ｏ／Ｎで維持
ＬＩＦ（ＨＰＡ０１８８４４， Ａｔｌａｓ）１：２００（ｇｒｅｅｎ ｄｉｌｕｙｅｎｔ，ＤＡＫＯ）
１１．ＴＢＳ−Ｔ １ｘ（ｐＨ７.６）３ｘ５’で洗浄
１２．二次抗体をＲＴ、２０’（ｅｎｖｉｓｉｏｎ，Ｄａｋｏ）で維持
１３．ＴＢＳ−Ｔ １ｘ（ｐＨ７，６）３ｘ５’で洗浄
１４．成長：成長前に最大２０’
１５．ヘマトキシリン（２０−３０”）で逆染色
１６．脱水：ＥｔＯＨ（７０％−＞９０％−＞１００％）＋キシレン
１７．スライドを取り付ける
【０１４１】
ＬＩＦプロテインスコアの定量分析のために、染色された腫瘍細胞のパーセンテージおよび強度を、光学顕微鏡法を使用して、組織切片上で、代表的な高倍率視野（ｘ４００）で評価した。濃い十分な染色を有する細胞のパーセンテージ（０％から１００％まで）として、結果を表現した。図３を参照のこと。
【０１４２】
観察することができるように、対照サンプルのＬＩＦスコアは０であるが、神経膠腫サンプルはＬＩＦスコアを変動させ、該スコアは０（サンプル３）、１０（サンプル２）、または２５（サンプル１）に及ぶ。
【０１４３】
＜腫瘍増殖に対する抗ＬＩＦ抗体阻害の効果は、前記腫瘍におけるＬＩＦのレベルに依存する＞
ＧＢＭの患者から採取された細胞を、生物発光をインビボでモニタリングするためのホタルルシフェラーゼ遺伝子にしっかり感染させた。１００，０００の細胞を、９週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脳半球の線条体へと定位的に播種した（前頂部に対して前方に１ｍｍ、および側方に１．８ｍｍ；実質内に２．５ｍｍ）。
【０１４４】
週に二度、１５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＩＦ抗体でマウスの腹腔内を処理し、または処理せず、そして、腫瘍増殖を生物発光によりモニタリングした。生物発光イメージングのために、マウスに、１−２％のイソフルラン麻酔を吸入させた状態で、０．２ｍＬの１５ｍｇ／ｍＬ Ｄ−ルシフェリンのｉ．ｐ．注入を受けさせた。非常に高感度な冷却ＣＣＤカメラから成るＩＶＩＳ ｓｙｓｔｅｍ ２０００ ｓｅｒｉｅｓ（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して、生物発光シグナルをモニタリングした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を使用して、画像データにグリッドを据え、各箱型の領域内の合計の生物発光シグナルを統合した。関心領域（ＲＯＩ）における光子束の放出（ｐｈｏｔｏｎ ｆｌｕｘ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）（光子／秒）の合計を使用して、データを分析した。
【０１４５】
処置の一ヶ月後、マウスを安楽死させ、マウスの脳を摘出した。脳のサンプルを、切除後直ちに、最大４８時間にわたって、室温で、１０％緩衝ホルマリン溶液中で固定し、脱水し、真空下でパラフィンに埋め込こんだ。壊死病巣から離れた代表的な腫瘍の領域を、ヘマトキシリン−エオジン染色部分上で特定した。抗ＬＩＦ抗体を使用し、サンプルを染色しＬＩＦタンパク質の値を測定した。
【０１４６】
ＬＩＦプロテインスコアの定量分析のために、染色された腫瘍細胞のパーセンテージおよび強度を、光学顕微鏡法を使用して、組織切片上で、代表的な高倍率視野（ｘ４００）で評価した。濃い十分な染色を有する細胞のパーセンテージ（０％から１００％まで）として、結果を表現した。図４Ａを参照のこと。
【０１４７】
その結果は、低いＬＩＦレベルを示す腫瘍は抗ＬＩＦ治療法に応答しない（図４Ｂ）が、少なくとも１０以上のＬＩＦスコア（細胞の１０％が濃く完全に着色されている）の腫瘍は、抗ＬＩＦ抗体の処置に対して高感度であることを示す（図４Ａを参照）。
【０１４８】
＜抗ＬＩＦ抗体は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における腫瘍増殖の阻害を促進する＞
高いＬＩＦレベルのマウスの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株ＫＬＮ２０５は、インビボ生物発光モニタリングのためのホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するレンチウイルスに、安定して感染した。マウスモデルを発現させるために、免疫適格性の同系のマウスの肺へと、ＫＬＮ２０５細胞を同所的に播種した。図５を参照のこと。
【０１４９】
一旦、腫瘍が指数関数的な増殖期へと入ってから、週に二度、１５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＩＦ抗体でマウスの腹腔内を処理し、または処理せず、そして、腫瘍増殖を生物発光によりモニタリングした。生物発光イメージングのために、マウスに、１−２％のイソフルラン麻酔を吸入させた状態で、０．２ｍＬの１５ｍｇ／ｍＬ Ｄ−ルシフェリンの腹腔内注入を受けさせた。非常に高感度な冷却ＣＣＤカメラから成るＩＶＩＳ ｓｙｓｔｅｍ ２０００ ｓｅｒｉｅｓ（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して、生物発光シグナルをモニタリングした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を使用して、画像データにグリッドを据えし、各箱型の領域内の合計の生物発光シグナルを統合した。関心領域（ＲＯＩ）における光子束の放出（光子／秒）の合計を使用して、データを分析した。その結果によって、３回用量の抗ＬＩＦ抗体のみが腫瘍縮小を促進するのに十分であったことが実証される。図５Ａを参照のこと。
【０１５０】
マウスを安楽死させ、マウスの肺を摘出した。肺のサンプルを、切除後直ちに、最大４８時間にわたって、室温で、１０％緩衝ホルマリン溶液中で固定し、脱水し、真空下でパラフィンに埋め込こんだ。壊死病巣から離れた代表的な腫瘍の領域を、ヘマトキシリン−エオジン染色部分上で特定した。ホスホ−ＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ３）、Ｋｉ６７、および切断型カスパーゼ３（ＣＣ３）に特異的な抗体を使用して、サンプルを染色し、ｐＳＴＡＴ３（ＬＩＦ経路の読み出し）、Ｋｉ６７（増殖マーカー）、およびＣＣ３（アポトーシスマーカー）のレベルを測定した。代表的な画像を示す。スケールバー、２０μｍ（中パネル）。ＣＣ３＋細胞のパーセントを算出した。データは平均±ＳＥＭ（右パネル）として提示される。結果は、抗ＬＩＦ抗体を用いる処置によって、ＬＩＦ経路が阻害され（ｐＳＴＡＴ３レベル）、細胞増殖が減少し（Ｋｉ６７）、一方でアポトーシスが増加する（ＣＣ３染色）ことを示す。図５Ｂを参照のこと。
【０１５１】
インビボでの腫瘍増殖に対する効果が、ＬＩＦ経路に対する抗ＬＩＦ抗体の特定の効果によることを確認するために、細胞を、ＫＬＮ２０５細胞において、ＬＩＦに対するショートヘアピン（ｓｈＬＩＦ）、またはｓｈ対照を発現するレンチウイルスに感染させた。ｍＲＮＡレベル（リアルタイムＰＣＲ）およびタンパク質レベル（ＥＬＩＳＡ）によって分析されるように、ｓｈＬＩＦレンチウイルスに感染したＫＬＮ２０５細胞におけるＬＩＦのレベルはより低かった。図６を参照のこと。
【０１５２】
ショートヘアピンを発現するＫＬＮ２０５細胞を、同系のマウスの肺に播種し、ＣＣＤカメラを用いて腫瘍増殖をモニタリングした。ｓｈＬＩＦに感染した細胞からＫＬＮ２０５腫瘍はｓｈ対照に感染した腫瘍よりも小さく、このことが腫瘍形成活性はＬＩＦに依存することを示している。腫瘍がＩＨＣによって染色されたとき、ｓｈＬＩＦに感染した腫瘍におけるＬＩＦのレベルがより低かったことが確認された。加えて、ＫＬＮ２０５ ｓｈＬＩＦ腫瘍を有するマウスが週に二度、１５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＩＦ抗体で処置されたときには、腫瘍のさらなる低下は観察されなかった。結果により、抗ＬＩＦ抗体が明確にＬＩＦを標的としていること、および、抗ＬＩＦ抗体により観察された治療効果が抗ＬＩＦ抗体のオフターゲット効果によるものではなかったということ、が示される。播種の前に、ＬＩＦ転写産物レベルをｑＲＴ−ＰＣＲ解析によって測定し、分泌されたＬＩＦタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。データは平均±ＳＤとして提示される。ＬＩＦに対する免疫組織化学的検査も横隔膜腫瘍において実施した。これらの結果によって、ｓｈＬＩＦに感染した細胞におけるＬＩＦの発現が減少したことが確認される。代表的な画像を示す。スケールバー、２０μｍ（右パネル）。図６を参照のこと。
【０１５３】
さらなる実験を実施し、ＮＳＣＬＣモデルにおけるＬＩＦの役割、および抗ＬＩＦ抗体の治療効果を確認した。この実験２において、ＬＩＦを標的とする独立したショートヘアピンを使用した。両方のショートヘアピンは、ＬＩＦ ｍＲＮＡのレベルを効率的に減少させた。播種の前に、ＬＩＦ転写産物レベルをｑＲＴ−ＰＣＲ解析によって測定し、分泌されたＬＩＦタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。データは平均±ＳＤとして提示される。図７を参照のこと。２つの独立したｓｈＬＩＦまたはｓｈ対照のレンチウイルスに感染したＫＬＮ２０５細胞を、同系のマウスの肺に播種した。ｓｈ対照を発現する腫瘍を播種されたマウスが週に二度、１５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＩＦ抗体で処置されたとき、腫瘍増殖の明らかな減少が観察され、これによって抗ＬＩＦ抗体に対する治療効果が確認された。図７を参照のこと。
【０１５４】
加えて、両方のｓｈＬＩＦに感染した細胞を有する腫瘍はより小さな腫瘍を産生し、これによって腫瘍増殖がＬＩＦ経路に依存することが確認された。ＬＩＦに対する免疫組織化学的検査も横隔膜腫瘍において実施された。代表的な画像を示す。スケールバー、２０μｍ（右パネル）。
【０１５５】
＜抗ＬＩＦ抗体は、神経膠芽腫の腫瘍増殖阻害を促進させる＞
ホタルルシフェラーゼ遺伝子に感染したＩＨＣによって測定されるような高レベルのＬＩＦを有するＵ２５１ ＧＢＭ細胞を、９週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脳半球の線条体へと定位的に播種した（前頂部に対して前方に１ｍｍ、および側方に１．８ｍｍ；実質内に２．５ｍｍ）。これらのマウスは免疫不全であるが、活性マクロファージを持つ。
【０１５６】
細胞播種後の７日、週に二度、１５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＩＦ抗体でマウスの腹腔内を処理し、そして腫瘍増殖を生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ）によりモニタリングした。抗ＬＩＦ抗体による処置によって、腫瘍増殖が阻害された。図８を参照のこと。
【０１５７】
インビボでの腫瘍増殖に対する効果がＬＩＦ経路に依存していたことを確認するために、Ｕ２５１を、ＬＩＦに対するショートヘアピン（ｓｈＬＩＦ）、またはショートヘアピン対照を発現するレンチウイルスに感染させた。ｍＲＮＡレベル（リアルタイムＰＣＲ）およびタンパク質レベル（ＥＬＩＳＡ）によって分析されるように、ｓｈＬＩＦレンチウイルスに感染したＵ２５１の細胞におけるＬＩＦのレベルはより低かった。ＣＣＤカメラを用いて腫瘍増殖をモニタリングし、その結果によって、ｓｈＬＩＦに感染した細胞からのＵ２５１腫瘍がより小さく、それによって腫瘍形成活性がＬＩＦに依存することが示されることが実証される。加えて、ＩＨＣによって、ｓｈＬＩＦを有する腫瘍が、ＩＨＣによる、より低いレベルのＬＩＦタンパク質発現を有していたことを確認した。図９を参照のこと。
【０１５８】
＜抗ＬＩＦ抗体は、卵巣癌における腫瘍増殖の阻害を促進する＞
高いＬＩＦレベルを持つ細胞株ＩＤ８からのマウスの卵巣癌細胞を、免疫適格性の同系のマウスの腹膜へと播種した。
【０１５９】
１５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＩＦ抗体で、週に二度、マウスの腹腔内を処置し、腹水症の基準として、および腫瘍増殖の代替マーカーとして、マウスの腰部を測定した。抗ＬＩＦ抗体で処置されたマウスの腹部の周囲は減少しており、抗ＬＩＦ抗体が腫瘍増殖を阻害したことを示された。図１０Ａを参照のこと。
【０１６０】
マウスを安楽死させ、マウスの腫瘍を摘出した。腫瘍のサンプルを、切除後直ちに、最大４８時間にわたって、室温で、１０％緩衝ホルマリン溶液中で固定し、脱水し、真空下でパラフィンに埋め込こんだ。壊死病巣から離れた代表的な腫瘍の領域を、ヘマトキシリン−エオジン染色部分上で特定した。ｐ−ＳＴＡＴ３、Ｋｉ６７、および切断型カスパーゼ３（ＣＣ３）に特異的な抗体を使用してサンプルを染色し、かつｐＳＴＡＴ３（ＬＩＦ経路の読み出し）、Ｋｉ６７（増殖マーカー）、およびＣＣ３（アポトーシスマーカー）のレベルを測定し、これを全てのモデルにおいて実施した。代表的な画像を示す。スケールバー、２０μｍ（中パネル）。ＣＣ３＋細胞のパーセントを算出した。データは平均±ＳＥＭ（右パネル）として提示される。結果は、インビボでの抗ＬＩＦ抗体を用いる処置によって、ＬＩＦ経路が阻害され（ｐＳＴＡＴ３レベル）、細胞増殖が減少し（Ｋｉ６７）、一方でアポトーシスが増加する（ＣＣ３染色）ことを示す。図１０Ｂを参照のこと。
【０１６１】
インビボでの腫瘍増殖に対する効果がＬＩＦ経路に依存していたことを確認するために、ＩＤ８を、ＬＩＦに対する２つの独立したショートヘアピン（ｓｈＬＩＦ）、またはショートヘアピン対照を発現するレンチウイルスに感染させた。ｓｈＬＩＦに感染したＩＤ８の細胞におけるＬＩＦのレベルはより低かった。播種の前に、ＬＩＦ転写産物レベルをｑＲＴ−ＰＣＲ解析によって測定し、分泌されたＬＩＦタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。データは平均±ＳＤとして提示される。腹水症、および代替マーカーまたは腫瘍増殖の測定値として腹部周囲を測定した。結果によって、ｓｈＬＩＦに感染した細胞からのＩＤ８腫瘍がより小さく、それによって腫瘍形成活性がＬＩＦに依存することが示されることが実証される。ＬＩＦに対する免疫組織化学的検査も腫瘍において実施し、ショートヘアピンに感染した細胞におけるＬＩＦレベルがより低いことを確認した。代表的な画像を示す。スケールバー、２０μｍ（右パネル）。図１１を参照のこと。
【０１６２】
＜抗ＬＩＦ抗体は、大腸癌における腫瘍増殖の阻害を促進する＞
同系のマウスの右脇腹の皮下へとマウス大腸癌細胞ＣＴ２６を播種した。５日目に、腹腔内に与えられる、週に二度１５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＩＦ抗体の処置を開始した。カリパス測定によって腫瘍増殖を評価した。式Π／６×大径×（小径）２によって腫瘍体積（ｍｍ３）を算出した。結果は平均±ｓ．ｄとして提示される。抗ＬＩＦ抗体による処置により、腫瘍増殖が弱まった。
【０１６３】
マウスを安楽死させ、マウスの腫瘍を摘出し、代表的な腫瘍の写真を撮った。図１２Ａを参照のこと。マウスを安楽死させ、マウスの腫瘍を摘出した。腫瘍のサンプルを、切除後直ちに、最大４８時間にわたって、室温で、１０％緩衝ホルマリン溶液中で固定し、脱水し、真空下でパラフィンに埋め込こんだ。壊死病巣から離れた代表的な腫瘍の領域を、ヘマトキシリン−エオジン染色部分上で特定した。ｐＳＴＡＴ３、Ｋｉ６７、および切断型カスパーゼ３（ＣＣ３）に特異的な抗体を使用して、サンプルを染色し、ｐＳＴＡＴ３（ＬＩＦ経路の読み出し）、Ｋｉ６７（増殖マーカー）、およびＣＣ３（アポトーシスマーカー）のレベルを測定し、これを全てのモデルで実施した。代表的な画像を示す。スケールバー、２０μｍ（中パネル）。ＣＣ３＋細胞のパーセントを算出した。データは平均±ＳＥＭ（右パネル）として提示される。結果は、インビボでのＭＳＣ−１処置によって、ＬＩＦ経路が阻害されｐＳＴＡＴ３レベル）、増殖が減少し、一方でアポトーシスが増加する（ＣＣ３染色）ことを示す。図１２Ｂを参照のこと。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【国際調査報告】
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