(57)【要約】  扱いにくいタイプの試料を捕集し、取り扱う装置および方法が提供される。本開示の一態様では、スワブを使用して生物学的物質または環境物質を含む試料を捕集するステップと、捕集された試料を有するスワブを試料緩衝液に入れるステップと、試料をフィルタに通すステップとを有する、試料捕集方法が提供される。種々の例示的な実施形態では、試料緩衝液は、プロテアーゼまたは界面活性剤を含んでもよく、試料は、フロックドスワブを使用して捕集され、試料緩衝液に移動されてもよい。
2019502098.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スワブを使用して、生物学的物質または環境物質を含む試料を捕集するステップと、
捕集された前記試料を有する前記スワブを、試料緩衝液に入れるステップと、
前記試料をフィルタに通すステップと
を含む、試料捕集方法。
【請求項２】
プロテアーゼを有する前記試料緩衝液の中の前記試料と接触するステップをさらに含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項３】
前記スワブが、フロックドスワブである、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項４】
前記捕集するステップが、ピペッティングせずに、前記試料を試料容器から捕集するステップを含み、前記スワブが、４倍のボリューム範囲内の量の前記試料を吸収および放出するように構成される、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項５】
前記スワブが、２倍のボリューム範囲内で、前記生物学的物質または前記環境物質から前記試料を吸収および放出するように構成される、請求項４に記載の試料捕集方法。
【請求項６】
前記物質が、３ｃＰ以上の粘度を有する物質である、請求項４に記載の試料捕集方法。
【請求項７】
前記粘性の物質が、痰である、請求項６に記載の試料捕集方法。
【請求項８】
前記試料緩衝液が、前記試料緩衝液の体積で少なくとも１０％の量の界面活性剤を含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項９】
前記試料緩衝液が、前記試料緩衝液の体積で少なくとも１２％の量の界面活性剤を含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１０】
前記試料緩衝液が、前記試料緩衝液の体積で１２％〜１８％の範囲の量の界面活性剤を含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１１】
前記試料緩衝液が、試料緩衝液の体積で１５％のトリトン−Ｘを含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１２】
前記フィルタに通すステップが、プロテアーゼが存在する中で、フィルタを通して前記試料を引き込むステップを含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１３】
前記試料緩衝液が、アルコールを含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１４】
前記試料緩衝液が、アルコールを含まない、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１５】
前記試料が、試料マトリクスおよび病原体を含み、前記スワブが、前記病原体を前記試料緩衝液中に優先的に放出しながら、前記試料マトリクスを優先的に保持する、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１６】
５分を超える前処理ステップが存在しない、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１７】
２分を超える前処理ステップが存在しない、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１８】
前記試料が、痰であり、前記痰が、前記入れるステップの前に、加熱処理またはＤＴＴ処理を施されない、請求項１６に記載の試料捕集方法。
【請求項１９】
前記試料緩衝液が、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択された界面活性剤を含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項２０】
前記生物学的試料または前記環境試料が、扱いにくい試料タイプである、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項２１】
生物学的物質または環境物質を含む試料を捕集するステップと、
前記試料を試料緩衝液に入れるステップであって、前記試料緩衝液が、前記試料緩衝液の体積で少なくとも１０％の量の界面活性剤を含む、ステップと
を含む、試料捕集方法。
【請求項２２】
フィルタを通して前記試料を引き込むステップをさらに含む、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項２３】
プロテアーゼを有する前記試料緩衝液の中の前記試料と接触するステップをさらに含む、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項２４】
前記試料が、血液または血液製剤である、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項２５】
前記試料緩衝液が、アルコールを含まない、請求項２４に記載の試料捕集方法。
【請求項２６】
前記試料が、試料マトリクスおよび少なくとも１つの病原体を含み、フィルタに通すステップが、前記試料マトリクスを前記病原体から分離する、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項２７】
前記フィルタに通すステップが、５分を超える前処理ステップなしで前記試料マトリクスを前記病原体から分離する、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項２８】
前記試料が、痰であり、前記痰が、前記入れるステップの前に加熱処理されない、請求項２７に記載の試料捕集方法。
【請求項２９】
前記緩衝液が、約２〜約６のｐＨを有する、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項３０】
前記捕集するステップが、優先的には試料マトリクス上の微生物を捕集および放出する材料で、前記試料を含む試料マトリクスと接触するステップを含む、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項３１】
試料マトリクス上の微生物を優先的に捕集および放出する材料で試料と接触することにより、生物学的物質または環境物質を含む前記試料を捕集するステップと、
捕集された前記試料を有する前記材料を試料緩衝液に入れるステップと
を含む、試料捕集方法。
【請求項３２】
前記材料が、親水性材料である、請求項３１に記載の試料捕集方法。
【請求項３３】
固定的な量の前記材料が、再現性をもって４倍の範囲内の量の前記試料を吸収および放出する、請求項３２に記載の試料捕集方法。
【請求項３４】
前記材料が、スワブとして提供される、請求項３３に記載の試料捕集方法。
【請求項３５】
前記材料が、吸着性であり、スワブ、ブラシ、スポンジ、フィルタ、用具、ループおよび紙からなる群から選択される、請求項３３に記載の試料捕集方法。
【請求項３６】
前記試料をフィルタに通すステップをさらに含む、請求項３１に記載の試料捕集方法。
【請求項３７】
捕集された前記試料からの核酸を増幅条件に従わせるステップをさらに含む、請求項３１に記載の試料捕集方法。
【請求項３８】
一方の端部の上面と、対向する端部の下面と、内部バイアルボリュームを画定する、それらの間の外壁部とを有し、前記上面が、開口を有するバイアル本体、
前記下面から延在し、第１の端部と、第２の端部と、カニューレの容量を画定する、それらの間の外面とを有し、前記第１の端部が、前記内部バイアルボリュームと流体連通するカニューレ、
前記バイアル本体と前記カニューレの間に設けられるフィルタ、ならびに
前記カニューレ付きバイアルの中に提供される添加剤
を備える、カニューレ付きバイアル。
【請求項３９】
前記添加剤が、乾燥した形態で提供される、請求項３８に記載のカニューレ付きバイアル。
【請求項４０】
前記添加剤が、核酸を安定化する際に使用される、または試料溶解を開始するのに使用される材料の成分である、請求項３８に記載のカニューレ付きバイアル。
【請求項４１】
前記添加剤が、プロテアーゼである、請求項３８に記載のカニューレ付きバイアル。
【請求項４２】
試料を受けるように構成された開口と、
流体を保持するように構成された本体と、
前記流体が出ることを可能にするように構成された開口と、
前記本体と前記出口の間に設けられるフィルタと、
前記試料を処理するために提供される添加剤と
を備える、試料コンテナ。
【請求項４３】
前記添加剤が、乾燥されて前記試料コンテナ内に提供される、請求項４２に記載の試料コンテナ。
【請求項４４】
前記添加剤が、プロテアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ抑制薬、リボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ抑制薬、還元剤およびリゾチームからなる群から選択される、請求項４３に記載の試料コンテナ。
【請求項４５】
直接血液試料からの核酸を増幅する方法であって、
（ａ）前記直接血液試料を試料緩衝液に加えるステップと
（ｂ）前記試料緩衝液をビーズ破砕するステップと
（ｃ）前記試料緩衝液から前記核酸を抽出するステップと
（ｄ）前記核酸を増幅するステップと
を含む、方法。
【請求項４６】
ステップ（ｂ）〜（ｄ）が、閉じた試料容器の中で実施される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ａ）〜（ｄ）が、遠心沈殿、エタノール沈殿、およびＤＮＡ消化なしで実施される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸が、宿主のＲＮＡである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記直接血液試料が、ＲＮＡ安定化溶液中に捕集される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記直接血液試料が、ＲＮＡ以外の安定化溶液中に捕集される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記直接血液試料が、ステップ（ａ）の前に分離され、血液分画物が使用される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に、前記試料をフィルタに通すステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記核酸が、高コピー数で提供される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記核酸が、微生物由来のものである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記抽出するステップに続いて、前記核酸を洗浄するステップをさらに含み、前記洗浄するステップが、３回以下の洗浄を含む、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１５年１１月２日出願の米国仮特許出願第６２／２４９，５９２号の利益を主張し、その内容全体は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
１．技術分野
本開示の実施形態は、一般に、試料から核酸を抽出する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景技術
米国、カナダおよび西欧では、感染症がヒトの死亡数の約７％を占め、発展途上地域ではヒトの死亡数の４０％超を占める。感染症は、種々の臨床症状を引き起こす。一般的な顕性の症状には、熱、肺炎、髄膜炎、下痢、および血液の混じる下痢がある。身体的症状は、病原学的因子としていくつかの病原体を示唆し、他のものを除外するが、可能性のある種々の原因因子は残り、明確な診断にはしばしば種々の検定の実施が必要とされる。病原体を診断する従来の微生物学的技法は、数日または数週間かかる場合があり、しばしば適切な治療過程を遅らせる。
【０００４】
近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、感染因子を迅速に診断する最適な方法になっている。ＰＣＲは、感染症を診断する迅速、高感度かつ特異的なツールである場合がある。診断の主な手段としてＰＣＲを使用することに対する課題は、原因である可能性がある微生物またはウイルスの多様性であり、また病理学的標本には存在する微生物レベルまたはウイルスレベルが低いものもあることである。その大半が陰性であると予想される、原因である可能性がある微生物またはウイルスごとに、ＰＣＲ検定の大型のパネルを動かすことは、しばしば非現実的である。病原体の核酸濃度が低く、適切な反応鋳型を集めるために大量の試料を必要とするとき、問題は深刻化する。考えられるすべての病原学的因子について検定するのに十分な試料がない場合もある。解決策は、試料が単一の反応で複数のターゲットについて同時に検定される、「マルチプレックスＰＣＲ」を実施することである。マルチプレックスＰＣＲは、いくつかのシステムでは利用価値があると証明されているが、高レベルのマルチプレックス反応の頑健性、および複数の生成物を明確に分析する難しさに関する欠点がある。これらの問題を解決するために、検定は、続いて複数の２次ＰＣＲに分割されてもよい。１次生成物中で入れ子式に２次反応を起こすことにより、頑健性が増す。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ）などの閉じたシステムによって操作が減り、これによって夾雑リスクが低減する。
【０００５】
試料調製はしばしば、胞子やパラフィン保存試料などのより厄介な材料から核酸を放出するための激しい抽出および溶解条件と、特により簡単に溶解し、より長い染色体を有する夾雑物中において、核酸の分解を最小限にできる、より丁寧な溶解条件との間のバランスである。より厄介な材料からの核酸の抽出を、試料中に存在する可能性のある他の核酸を分解せずに行うことができるのが望ましいはずである。
【０００６】
さらに、いくつかの試料タイプは、取扱いが困難な場合がある。固体、半固体、または粘性の試料を生物学的処理システムに投入することは困難な場合がある。痰などの試料タイプはピペッティングおよび測定が困難であり、試料を処理する前に一定時間、例示的には熱またはジチオトレイトールで前処理して粘度を下げ、試料マトリクスの分解を助けることがしばしば必要とされる。痰に加えて、他の扱いにくい生物学的試料には、粘液、ＢＡＬ、および他の呼吸器タイプの試料、便、組織、組織ホモジネート、基本組織、パラフィン処理ホルマリン包埋組織、骨、骨ホモジネート、痂皮、膿、関節液、リンパ節吸引液、および胃洗浄液が含まれるが、これらに限定はされない。環境試料、例示的には土、地表（ｓｕｒｆａｃｅ）、土埃（ｐｏｗｄｅｒ）または食物は、しばしば固体または半固体であり、環境試料も課題を提示する場合がある。さらに、試料の前処理中の長い処理は、交差夾雑をまねく可能性があり、時間を要する場合があり、またしばしば試料を希釈して、感受性の低下をもたらす。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、次の検査の前の試料調製、たとえば生物学的分析に向けた、試料から取った核酸の精製に関する、種々の問題点に対処する。
【０００８】
本開示の一態様では、スワブを使用して生物学的物質または環境物質を含む試料を捕集するステップと、捕集された試料を有するスワブを試料緩衝液に入れるステップと、試料をフィルタに通すステップとを含む試料捕集方法が提供される。種々の例示的な実施形態では、試料緩衝液は、プロテアーゼまたは界面活性剤を含んでもよく、試料は、フロックドスワブを使用して捕集されて、試料緩衝液に移動されてもよい。
【０００９】
別の態様では、生物学的物質または環境物質を含む試料を捕集するステップと、試料を試料緩衝液に入れるステップとを含む試料捕集方法であって、試料緩衝液が、体積で試料緩衝液の少なくとも１０％の量の界面活性剤を含む、試料捕集方法が提供される。例示的な実施形態は、フィルタを通して試料を引き込むことを含んでもよい。
【００１０】
さらに別の態様では、試料マトリクス上の微生物を優先的に捕集および放出する材料で試料と接触することにより、生物学的物質または環境物質を含む試料を捕集するステップと、捕集された試料を有する材料を試料緩衝液に入れるステップとを含む、試料捕集方法が提供される。例示的には、材料は、親水性材料または吸着性材料である。一実施形態では、固定的な量の材料は、再現性をもって、４倍以内の範囲の量の試料を吸収および放出する。
【００１１】
本開示の別の態様では、一方の端部の上面と、対向する端部の下面と、内部バイアルボリュームを画定する、それらの間の外壁部とを有し、上面が、開口を有するバイアル本体、下面から延在し、第１の端部と、第２の端部と、カニューレの容量を画定する、それらの間の外面とを有するカニューレであって、第１の端部が、内部バイアルボリュームと流体連通するカニューレ、バイアル本体とカニューレの間に設けられるフィルタ、およびカニューレ付きバイアルの中に提供される添加剤を備える、カニューレ付きバイアルが提供される。
【００１２】
本開示のさらに別の態様では、試料を受けるように構成された開口と、流体を保持するように構成された本体と、流体が出て行くことを可能にするように構成された開口と、本体と出口の間に設けられたフィルタと、試料を処理するために提供される添加剤とを備える、試料コンテナが提供される。例示的には、添加剤は、乾燥されて試料コンテナ内に提供されてもよい。例示的な添加剤には、プロテアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ抑制薬、リボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ抑制薬およびリゾチームが含まれる。
【００１３】
本開示のさらに別の態様では、上述の試料コンテナを取得するステップであって、試料コンテナが流体を保持する、取得するステップと、開口を通して試料を流体に投入するステップと、フィルタを通して流体を引き込み、出口から出すステップとを含む、添加剤をシステムに投入する方法が提供される。
【００１４】
さらに別の態様では、直接血液試料（ｄｉｒｅｃｔ  ｂｌｏｏｄ  ｓａｍｐｌｅ）から取った核酸を増幅する方法であって、直接血液試料を試料緩衝液に加えるステップと、試料緩衝液をビーズ破砕するステップと、試料緩衝液から核酸を抽出するステップと、核酸を増幅するステップとを含む方法が提供される。このような方法は、例示的には閉じた試料容器内で実施されてもよい。別の例示的な方法では、ステップは、遠心沈殿、エタノール沈殿、およびＤＮＡ消化のうちの１つまたは複数なしで実施される。
【００１５】
本発明の実施形態の追加的な特徴および利点は、後に続く説明において明らかになるか、またはこのような実施形態を実施することによって知られてもよい。このような実施形態の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲で具体的に示される器具および組合せによって、実現および獲得できる。上記およびその他の特徴は、以下の説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるか、またはこれ以降説明される実施形態を実施することによって知られてもよい。
【００１６】
本発明の上記およびその他の利点および特徴を得ることができる方式を説明するために、上で簡単に説明された本発明に関するより具体的な説明が、添付の図面に示される、本発明の特定の実施形態を参照することによって提供されることになる。これらの図面は本発明の典型的な実施形態だけを示しており、したがってその範囲を限定すると考えられるべきではないことを理解すれば、本発明は、添付図面を使用することにより、追加的な特異性および詳細を伴って記載され、説明されることになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態による可撓性パウチを示す図である。
【図２】図１のパウチと共に使用される、本発明の実施形態の例による器具の、図１のパウチを含む分解斜視図である。
【図３】破線で示される図１のパウチを備え、図２のブラッダー構成要素を含む、本発明の実施形態の例による図２の器具の部分断面図である。
【図４】図２の器具の例示的な一実施形態で使用されるモータを示す図である。
【図５】図１のパウチを含む、本発明の実施形態の例による、図１のパウチを装填するための装填ステーションを示す図である。
【図６】図１のパウチに試料を装填するための試料バイアルを示す図である。
【図７】図１のパウチに水和流体を供給するための、本発明の実施形態の例による水和バイアルを示す図である。
【図８】図５と同等であるが、別の装填ステーション構成と、装填ステーションと共に使用されるバイアルとを示す、本発明の実施形態の例による装填ステーションを示す図である。
【図９】本発明の実施形態の例による、図８の試料バイアルの一部、および図８の装填ステーションの試料バイアル受け器への試料バイアルの合せ方を示す図である。
【図１０】本発明の実施形態の例による、図８の水和バイアルの一部、および図８の装填ステーションの水和バイアル受け器への水和バイアルの合せ方を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
実施形態の例が、添付図面を参照して以下に述べられる。本開示の趣旨および教示を逸脱しない限り、多くの異なる形態および実施形態が考えられ、したがって本開示は、本明細書に述べられる実施形態の例に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態例は、本開示が十分かつ完全であり、本開示の範囲を当業者に伝えることになるように提供されるものである。図面において、レイヤおよび領域のサイズおよび相対的なサイズは、見えやすいように誇張されている場合がある。説明の全体を通して、同様の参照番号は同様の要素を指す。
【００１９】
別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての用語は（専門用語および科学用語を含めて）、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味をもつ。一般的に使用される辞書に定義されている用語などの用語は、本出願および関連する技術の文脈における意味と整合性のある意味をもつと解釈されるべきであり、本明細書において明確にそう定義されない限り、理想的な、または過度に形式的な意味で解釈されるべきではないこともさらに理解されよう。本明細書において、本発明の説明で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであり、本発明を限定することは意図されていない。本開示を実施する際、本明細書に述べられているものと同様または同等の複数の方法および材料が使用されてもよいが、本明細書では、いくつかの例示的な材料および方法だけが説明される。
【００２０】
本明細書に述べられるすべての公報、特許出願、特許または他の参考文献は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。用語の矛盾が発生する場合は、本明細書が支配的である。
【００２１】
本開示の種々の態様は、装置、システム、方法などを含めて、１つまたは複数の例示的な実装形態に基づいて説明される場合がある。本明細書において使用される「例示的な」および「説明のための」という用語は、「例、実例、または例証として機能する」ということを意味し、必ずしも本明細書で開示される他の実装形態より好ましい、または有利であると解釈されるべきではない。さらに、本開示または本発明の「実装形態」または「実施形態」への言及は、本開示または本発明の１つまたは複数の実施形態についての特定の言及も含み、その逆も同様であり、以下の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を限定することなく、説明のための例を提供することを意図されている。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容から明らかにそうでないことが示されていなければ、複数の対象物を含むことに留意されたい。したがって、たとえば「タイル（ａ  ｔｉｌｅ）」という言及は、１枚、２枚、またはそれ以上のタイルを含む。同様に、複数の対象物についての言及は、内容および／または文脈から明らかにそうでないことが示されていなければ、単一の対象物および／または複数の対象物を含むと解釈されるべきである。したがって、「タイル（ｔｉｌｅｓ）」という言及は、複数のそのようなタイルを必ずしも要求するものではない。むしろ、本明細書では、活用形に左右されない、すなわち１つまたは複数のタイルが企図されることが理解されよう。
【００２３】
本出願の全体において、「できる」および「してもよい」という単語は、義務的な意味（すなわち、しなければならない、という意味）ではなく、許容的な意味（すなわち、する可能性がある、という意味）で使用される。さらに、「含んでいる」、「有している」、「内包している」、「含有している」、「特徴付けられる」という用語、これらの変形（たとえば「含む」、「有する」、「内包する」、「含有する」など）、および特許請求の範囲を含め、本明細書において使用される同様の用語は、包括的、かつ／またはオープンエンドであるとものとし、「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語およびその変形（たとえば「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」）と同じ意味をもつものであるとし、例示的には、列挙されていない追加的な要素または方法のステップを除外するものではない。
【００２４】
本明細書において使用される「上部」、「下部」、「左」、「右」、「上」、「下」、「上方の」、「下方の」、「中の」、「外の」、「内部の」、「外部の」、「内側の」、「外側の」、「近位の」、「遠位の」、「順方向の」、「逆方向の」などの、方向性の、かつ／または任意の用語は、相対的な方向および／または向きを示すのに単独で使用されてもよく、本明細書、本発明、および／または特許請求の範囲を含めて、本開示の範囲を別途限定するように意図されるものではない。
【００２５】
ある要素が、別の要素に「結合されている」、「連結されている」、「応答する」、または別の要素の「上に存在する」と称されるとき、その要素は、他方の要素に直接結合され、直接連結され、直接応答し、もしくは他方の要素の上に直接存在する場合があり、または介在する要素が存在する場合もあることが理解されよう。対照的に、ある要素が別の要素に「直接結合されている」、「直接連結されている」、「直接応答する」、または別の要素の「上に直接存在する」と称されるとき、介在する要素は存在しない。
【００２６】
本発明概念の実施形態の例は、本明細書において、実施形態の例の理想的な実施形態（および間の構造）の概略図である断面図を参照して説明される。したがって、たとえば製造技法および／または製造公差の結果として生じる、図の形状からの変化が予想されるべきである。したがって、本発明概念の実施形態の例は、本明細書に示される領域の特定の形状に限定されると解釈されるべきではなく、たとえば製造で生じる形状のずれを含むべきである。したがって、図に示されている領域は、性質上概略的なものであり、これらの領域の形状は、装置の、ある領域の実際の形状を示すことを意図されておらず、実施形態の例の範囲を限定することを意図されていない。
【００２７】
本明細書において、「第１の」、「第２の」などの用語が種々の要素を示すのに使用される場合があるが、これらの要素は、これらの用語によって限定されるべきではないことが理解されよう。これらの用語は、ある要素を別の要素と区別するためだけに使用される。したがって、「第１の」要素は、本実施形態の教示から逸脱しない限り、「第２の」要素と称されてもよい。
【００２８】
本明細書で述べられている種々の実装形態は、本開示の範囲から逸脱しない限り、述べられている、または開示されている任意の他の実装形態と組み合わせて利用されてもよいことも理解されよう。したがって、本開示の範囲から逸脱しない限り、本開示のいくつかの実装形態による製品、部材、要素、装置、道具、システム、方法、プロセス、組成物および／またはキットは、本明細書において開示される（システム、方法、および／または道具などを含む）他の実装形態で説明される特性、特徴、構成要素、部材、要素、および／またはステップなどを含み、組み込み、または別の方法にて備えてもよい。したがって、一実装形態に関連する特有の特徴についての言及は、前記実装形態の範囲内だけの適用に制限されるものと解釈されるべきではない。
【００２９】
本明細書で使用される見出しは、単に構造上の目的だけのものであり、説明または特許請求の範囲に記載の範囲を限定するように使用されることを意図されていない。図に共通してみられる同様の要素は、理解しやすいように、可能であれば同様の参照符号を使用して指定されている。さらに、可能であれば、要素の同じような番号付けが、種々の図で用いられている。さらに、特定の要素の代替的な構成物のそれぞれは、要素番号に付される別の文字を含んでもよい。
【００３０】
「約」という用語は、本明細書では、ほぼ、近辺、おおよそ、または大体を意味するのに使用される。「約」という用語が数値範囲と共に使用されるとき、「約」という用語は、記載の数値が示す上下の境界を拡大することによって、その範囲を変更する。概して、「約」という用語は、本明細書では、示された値の上下の数値を、５％の変動分変更するのに使用される。このような範囲が示されるとき、別の実施形態は、その一方の特定の値から、かつ／またはその他方の特定の値までを含む。同様に、値が、先行する語「約」を使うことによって近似値として示されるとき、特定の値は、別の実施形態を形成することが理解されよう。それぞれの範囲の終点は、他方の終点との関係においてと、他方の終点とは無関係にとの、両方において重要であることも、さらに理解されよう。
【００３１】
本明細書において使用される「または」という単語は、特定のリストの任意の一要素を意味し、そのリストの要素の任意の組合せも含む。
【００３２】
「試料」とは、動物；動物から取った組織または器官；細胞（対象中の細胞、対象から直接取られた細胞、または培養物中に保持される、もしくは培養された細胞株から取った細胞）；細胞溶解物（もしくは溶解物の分画物）または細胞抽出物；細胞、細胞物質またはウイルス物質（たとえばポリペプチドや核酸）から得た１つまたは複数の分子を含む溶液；あるいは本明細書で述べられるように検定される、非自然発生の核酸を含む溶液を意味する。試料は、宿主もしくは病原体の細胞、細胞成分または核酸を含んでも含まなくてもよい、（たとえば血液、尿、便、唾液、涙、胆汁、または脳脊髄液であるが、これらに限定されない）任意の体液または排泄物でもよい。
【００３３】
本明細書において使用される「核酸」という語句は、ＤＮＡまたはＲＮＡであれＤＮＡ−ＲＮＡ混成物であれ、１本鎖であれ２本鎖であれ、ワトソン・クリック型塩基対による相補的な核酸に対するハイブリダイゼーションが可能なセンス鎖であれアンチセンス鎖であれ、自然発生または合成のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。本発明の核酸は、ヌクレオチド類似体（たとえばＢｒｄＵ）および非リン酸ジエステルのヌクレオチド間結合（たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）やチオジエステル結合）も含んでもよい。具体的には、核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡまたはこれらの任意の組合せを含んでよいが、これらに限定はされない。
【００３４】
「プローブ」、「プライマー」または「オリゴヌクレオチド」とは、相補的な配列（「ターゲット」）を含有する第２の核酸分子と塩基対合できる、規定された配列の１本鎖核酸分子を意味する。その結果得られる混成物の安定性は、長さ、ＧＣ含量、および発生する塩基対の程度（ｅｘｔｅｎｔ）に依存する。塩基対の程度は、プローブとターゲット分子の間の相補性の度合い、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの度合いなどのパラメータに影響される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの度合いは、温度、塩濃度、およびホルムアミドなどの有機分子の濃度などのパラメータに影響され、また当業者に知られている方法で決められる。プローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドは、当業者によく知られている方法で、放射能、蛍光、または非放射能で検出可能に標識付けされてもよい。ｄｓＤＮＡ結合色素を使用して、ｄｓＤＮＡを検出することができる。「プライマー」は、具体的にはポリメラーゼによって伸長されるように構成されるが、一方「プローブ」または「オリゴヌクレオチド」は、そのように構成されてもされなくてもよいことが理解されよう。
【００３５】
「ｄｓＤＮＡ結合色素」とは、２本鎖ＤＮＡと結合したときに、通常はより強く蛍光を発することで、１本鎖ＤＮＡと結合したとき、または溶液中で遊離しているときとは異なるように蛍光を発する色素を意味する。ｄｓＤＮＡ結合色素について言及されるとき、本明細書では任意の適した色素が使用されてもよいことが理解され、いくつかの非限定的な例示的な色素は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第７，３８７，８８７号に記載されている。他の信号生成物質、例示的には当技術分野で知られている酵素、抗体などを使用して、核酸の増幅および融解を検出してもよい。
【００３６】
「特異的にハイブリダイズする」とは、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、高ストリンジェンシー条件下で実質的に相補的な核酸（たとえば、試料核酸）を認識し、これと物理的に相互作用（すなわち塩基対合）し、他の核酸とは実質的に塩基対合しないことを意味する。
【００３７】
「高ストリンジェンシー条件」とは、通常はおおよそ融解温度（Ｔｍ）マイナス５℃（すなわちプローブのＴｍから５°低い）で発生するものを意味する。機能的に、高ストリンジェンシー条件は、少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を特定するのに使用される。
【００３８】
ＰＣＲは本明細書の例で使用される増幅方法であるが、プライマーを使用する任意の増幅方法が適している場合があることが理解されよう。このような適した手順には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ストランド置換増幅（ＳＤＡ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；カスケードローリングサークル増幅（ＣＲＣＡ）、ループ介在等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ）；等温キメラプライマー核酸増幅（ＩＣＡＮ）；ターゲットベースのヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）；転写介在増幅（ＴＭＡ）などが含まれる。したがって、ＰＣＲという用語が使用されるとき、この用語は他の代替の増幅方法を含むと理解されたい。個別のサイクルがない増幅方法に関しては、サイクルまたはＣｐで測定が行われる場合は反応時間が使用されてもよく、本明細書で説明される実施形態に追加的なＰＣＲサイクルが加えられる場合は、追加的な反応時間が加算されてもよい。プロトコルは、それに応じて調整される必要がある場合があることが理解されよう。
【００３９】
本明細書の種々の例は、ヒトのターゲットおよびヒトの病原体を参照するが、これらの例は単に例示的なものである。本明細書で述べられている方法、キット、および装置を使用して、ヒトの試料、獣医学的試料、工業試料、および環境試料を含む多種多様な試料からの多種多様な核酸配列を検出および配列決定することができる。
【００４０】
本明細書で開示されている種々の実施形態は、自己完結型核酸分析パウチを使用して、種々の生物学的物質、例示的には抗原および核酸配列の存在について、例示的には単一の閉じたシステムの中で試料を検定する。このようなシステムは、パウチおよびパウチと共に使用される器具を含めて、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第８，３９４，６０８号および米国特許第８，８９５，２９５号、ならびに米国特許出願第２０１４−０２８３９４５号においてより詳細に開示されている。しかし、このようなパウチは単に例示的なものであり、本明細書で述べられる核酸の調製および増幅反応は、当技術分野で知られている種々の核酸精製および増幅システムを使用して、９６ウェルプレート、他の構成のプレート、アレイ、カルーセルなどを含む、当技術分野で知られている種々の開いた、または閉じたシステム試料容器のうちの任意のもので実施されてもよいことが理解されよう。「試料ウェル」、「増幅ウェル」、「増幅コンテナ」などの用語が本明細書で使用されるが、これらの用語は、これらの増幅システムで使用されるウェル、管および種々の他の反応コンテナを含むことを意図されている。一実施形態では、パウチは、複数の病原体について検定するために使用される。パウチは、例示的には閉じたシステム内に、試料ウェルとして使用される１つまたは複数のブリスターを含んでもよい。例示的には、任意選択のリアルタイム検出または融解曲線分析などの増幅後分析で完了する、核酸調製、１次大容量マルチプレックスＰＣＲ、１次増幅産物の希釈、および２次ＰＣＲを含む種々のステップは、任意選択的に使い捨てのパウチの中で実施されてもよい。さらに、種々のステップは本発明のパウチの中で実施され得るが、いくつかの用途については１つまたは複数のステップが省略されてもよく、それに応じてパウチの構成が変更されてもよいことが理解されよう。
【００４１】
図１は、種々の実施形態で使用できる、または種々の実施形態に対して再構成できる、例示的なパウチ５１０を示す。パウチ５１０は、米国特許第８，８９５，２９５号の図１５と同様のものであり、同様の要素には同じ番号が付されている。フィットメント５９０には入口チャネル５１５ａ〜５１５ｌが提供され、これらの入口チャネルは試薬タンクまたは廃棄物タンクとしても機能する。例示的には、試薬はフィットメント５９０内で凍結乾燥され、使用前に再水和されてもよい。ブリスターそれぞれのチャネル５１４、５３８、５４３、５５２、５５３、５６２および５６５を有するブリスター５２２、５４４、５４６、５４８、５６４および５６６は、米国特許第８，８９５，２９５号の図１５の同じ番号のブリスターと同様のものである。図１の、第２段階反応区域５８０は、米国特許出願第８，８９５，２９５号の第２段階反応区域と同様のものであるが、高密度アレイ５８１の第２段階ウェル５８２は、いくらか異なるパターンで構成される。図１の高密度アレイ５８１の、より円形のパターンが角部のウェルをなくし、第２段階ウェル５８２の充填がより均一になる可能性がある。示されているように、高密度アレイ５８１には、１０２個の第２段階ウェル５８２が提供される。パウチ５１０は、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）器具（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ）の中での使用に適している。しかし、パウチの実施形態は単に例示的なものであることが理解されよう。
【００４２】
他のコンテナが使用されてもよいが、例示的には、パウチ５１０は、可撓性プラスチックフィルム、またはポリエステル、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、もしくは押出し、プラズマ蒸着およびラミネーションを含む当技術分野で知られている任意のプロセスで作ることができるこれらの混合物などの他の可撓性材料でできた２つの層で形成される。アルミニウムラミネーションを有する金属箔またはプラスチックも使用されてもよい。互いに封止してブリスターおよびチャネルを形成できる他のバリア材料が当技術分野で知られている。プラスチックフィルムが使用される場合、層は、例示的にはヒートシールによって互いに接合されてもよい。例示的には、材料の核酸結合能力は低い。
【００４３】
蛍光観察を用いる実施形態については、作動波長での吸光度および自家蛍光が十分に低いプラスチックフィルムが好ましい。このような材料は、様々なプラスチック、様々な可塑剤および合成比率、ならびに様々な厚みのフィルムを検査することによって特定することができる。アルミニウムまたは他の箔のラミネーションを有するプラスチックについては、パウチの、蛍光検出装置で読み取られることになる部分は、箔を付けないままでもよい。たとえば、パウチ５１０の第２段階反応区域５８０の第２段階のウェル５８２で蛍光が観察される場合、ウェル５８２の片方または両方の層は、箔を付けないままにされることになる。ＰＣＲの例では、厚み約０．００４８インチ（０．１２１９ｍｍ）のポリエステル（Ｍｙｌａｒ、Ｄｕｐｏｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  ＤＥ）と、厚み０．００１〜０．００３インチ（０．０２５〜０．０７６ｍｍ）のポリプロピレンフィルムから構成されるフィルムラミネートがうまく機能する。例示的には、パウチ５１０は、入射光の約８０％〜９０％を透過させることができる透明な材料で作られる。
【００４４】
例示的な実施形態では、材料は、ブリスターおよびチャネルに圧力、例示的には空気圧をかけることによって、ブリスター間で動かされる。したがって、圧力を用いる実施形態では、パウチ材料は、例示的には、圧力が所望の効果を発揮できるのに十分に可撓性である。「可撓性」という用語は、本明細書ではパウチ材料の物理的特性を説明することに使用される。本明細書では、「可撓性」という用語は、本明細書で使用される圧力レベルで、ひび割れ、破損、亀裂などを伴うことなく容易に変形可能なことであると定義される。たとえば、Ｓａｒａｎ（商標）ラップやＺｉｐｌｏｃ（登録商標）バッグなどの薄いプラスチックシート、およびアルミニウム箔などの薄い金属箔は可撓性である。しかし、空気圧を用いる実施形態であっても、可撓性である必要があるのはブリスターおよびチャネルのいくつかの領域だけである。さらに、ブリスターおよびチャネルが容易に変形可能である限り、可撓性である必要があるのは、ブリスターおよびチャネルの片面だけである。パウチ５１０の他の領域は、剛性の材料で作られても、剛性の材料で補強されてもよい。
【００４５】
例示的には、パウチ５１０にはプラスチックフィルムが使用される。金属のシート（例示的にはアルミニウム、または他の適した材料）が圧延または別の方法で切断されて、表面が一段高くなったパターンを有するダイを作り出すことができる。例示的には１９５℃の作動温度に調節された空気圧プレス（例示的にはＡ−５３０２−ＰＤＳ、Ｊａｎｅｓｖｉｌｌｅ  Ｔｏｏｌ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｔｏｎ  ＷＩ）に嵌合させると、空気圧プレスが印刷機のように機能し、ダイがフィルムに接触するところだけ、プラスチックフィルムの封止面を溶かす。パウチ５１０が形成されるとき、（例示的にはフィルム上に付けられ、乾燥される）ＰＣＲプライマー、抗原結合基質、磁気ビーズおよびケイ酸ジルコニウムビーズなどの種々の成分が、種々のブリスターの中に封入されてもよい。封止する前に、試料処理用の試薬が、集合的または別々に、フィルム上に付けられてもよい。一実施形態では、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）は、ポリメラーゼおよびプライマーとは別々にフィルムに付けられ、反応物が水性試料によって水和されるまで、実質的にポリメラーゼの活性を排除する。水和前に水性試料が加熱されている場合、これによって真のホットスタートＰＣＲ用の条件が作り出され、高価なホットスタート用化学成分の必要性が低減または排除される。
【００４６】
パウチ５１０は、米国特許第８，８９５，２９５号に記載されているものと同様の方式で使用されてもよい。例示的な一実施形態では、検査される試料（１００μｌ）および溶解緩衝液（２００μｌ）から構成される３００μｌの混合物が、入口チャネル５１５ａの近くにある、フィットメント５９０の注入ポート（図示せず）に注入され、試料混合物は、入口チャネル５１５ａに引き込まれる。水も、入口チャネル５１５ｌと互いに隣り合う、フィットメント５９０の第２の注入ポート（図示せず）に注入されてフィットメント５９０に設けられたチャネル（図示せず）を介して分配され、それによって１１個までの異なる試薬を水和する。これらの試薬のそれぞれは、乾燥形態で事前に入口チャネル５１５ｂ〜５１５ｌ通路に提供されている。これらの試薬には、例示的には凍結乾燥されたＰＣＲ試薬、ＤＮＡ抽出試薬、洗浄溶液、免疫検定試薬、または他の化学成分が含まれてもよい。例示的には、試薬は、核酸抽出、第１段階のマルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックス反応物の希釈および第２段階のＰＣＲ試薬の調製、ならびに反応制御のためのものである。図１に示されている実施形態では、注入される必要があるのは、一方の注入ポートへの試料溶液と他方の注入ポートへの水だけである。注入後、２つの注入ポートは封止されてもよい。パウチ５１０およびフィットメント５９０の種々の構成に関するさらなる情報については、既に引用することにより本明細書の一部をなすものである米国特許第８，８９５，２９５号を参照のこと。
【００４７】
注入後、試料は、チャネル５１４を通って注入チャネル５１５ａから溶解ブリスター５２２に動かされる。溶解ブリスター５２２にはセラミックビーズなどのビーズまたは粒子５３４が提供され、溶解ブリスター５２２は、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）器具内に提供される回転ブレードまたはパドルを押し付けることによってボルテックスするために構成される。ケイ酸ジルコニウム（ＺＳ）ビーズ５３４などの溶解粒子が存在する状態で試料を振る、またはボルテックスすることによるビーズ粉砕は、溶解物を形成する効果的な方法である。本明細書において使用される「溶解する」、「溶解している」および「溶解物」などの用語は、細胞の断裂に限定されるものではなく、このような用語は、ウイルスなどの細胞をもたない粒子の破壊を含むことが理解されよう。
【００４８】
図４はビーズ破砕モータ８１９を示し、ビーズ破砕モータ８１９は、図２に示される器具８００の、支持部材８０２の第１の面８１１に取り付けることができるブレード８２１を備える。ブレードは、スロット８０４を通って延在して、パウチ５１０と接触できる。しかし、モータ８１９は、器具８００の他の構造体に取り付けられる場合もあることが理解されよう。例示的な一実施形態では、モータ８１９は、支持部材８０２に取り付けられる、マブチＲＣ−２８０ＳＡ−２８６５ＤＣモータ（千葉、日本）である。例示的な一実施形態では、モータは、５，０００〜２５，０００ｒｐｍ、より例示的には１０，０００〜２０，０００ｒｐｍ、さらに例示的には約１５，０００〜１８，０００ｒｐｍで回転される。このマブチモータについては、７．２Ｖで溶解に十分なｒｐｍが与えられることが分かっている。しかし、ブレード８２１がパウチ５１０に衝突しているとき、実際の速度はいくらか遅い場合があることが理解されよう。使用されるモータおよびパドルに応じて、他の電圧および速度が溶解に用いられてもよい。任意選択的に、制御された少量の空気が、溶解ブリスター５２２と互いに隣り合うブラッダー８２２に提供されてもよい。いくつかの実施形態では、少量のいくらかの空気で互いに隣り合うブラッダーを部分的に充填することが、溶解処理中の溶解ブリスターの位置決めおよび支持の助けになることが分かっている。別法として、他の構造、例示的には剛性もしくはコンプライアンス性のガスケット、または溶解ブリスター５２２の周りの他の保持構造を使用して、溶解中にパウチ５１０を拘束することができる。モータ８１９は単に例示的なものであり、試料を粉砕し、振り、またはボルテックスするために他の装置が使用されてもよいことも理解されよう。
【００４９】
細胞が十分に溶解されると、試料はチャネル５３８、ブリスター５４４およびチャネル５４３を通ってブリスター５４６に動かされ、ここで試料はシリカ被覆磁気ビーズ５３３などの核酸結合物質と混合される。混合物は、適当な長さの時間、例示的には約１０秒〜１０分間インキュベートされ得る。ブリスター５４６と互いに隣り合う器具の中に配置される格納式の磁石が、溶液から磁気ビーズ５３３を捉えて、ブリスター５４６の内表面にペレットを形成する。次いで液体は、ブリスター５４６から出されてブリスター５４４を通ってブリスター５２２に戻り、ブリスター５２２は、ここで廃棄物受け器として使用される。１つまたは複数の注入チャネル５１５ｃ〜５１５ｅからの１つまたは複数の洗浄緩衝液が、ブリスター５４４およびチャネル５４３を介してブリスター５４６に供給される。任意選択的に、磁石は格納され、磁気ビーズ５３３は、チャネル５４３を通ってブリスター５４４と５４６でビーズを往復運動させることによって洗浄される。磁気ビーズ５３３が洗浄されると、磁気ビーズ５３３は、磁石を活性化することによってブリスター５４６内で再び捉えられ、洗浄溶液は、次いでブリスター５２２に動かされる。本明細書に開示されるいくつかの実施形態については１回の洗浄で十分な場合があり、任意の回数の洗浄が本開示の範囲内であるが、この処理は、例示的には３回以上の洗浄を含めて、核酸結合磁気ビーズ５３３から溶解緩衝液および試料残屑を洗い落とすのに必要なだけ繰り返されてもよい。
【００５０】
洗浄後、注入チャネル５１５ｆに溜められている溶出緩衝液がブリスター５４８に動かされ、磁石は格納される。溶液は、チャネル５５２を通ってブリスター５４６と５４８の間を循環し、ブリスター５４６内の磁気ビーズ５３３のペレットを分解し、捉えられた核酸をビーズから分離して溶液中に出させることを可能にする。磁石が再び活性化され、ブリスター５４６内の磁気ビーズ５３３を捉え、溶出された核酸溶液は、ブリスター５４８に動かされる。
【００５１】
注入チャネル５１５ｇからの第１段階のＰＣＲマスターミックスが、ブリスター５４８内の核酸試料と混合される。任意選択的に、混合物は、チャネル５５３を介して５４８と５６４の間で混合物を移動させることによって混合される。複数回の混合サイクル後、溶液はブリスター５６４に容れられ、ここで第１段階のＰＣＲプライマー（ターゲットごとに少なくとも１組のプライマー）のペレットが供給され、第１段階のマルチプレックスＰＣＲが実施される。ＲＮＡのターゲットが存在する場合、第１段階のマルチプレックスＰＣＲの前、または第１段階のマルチプレックスＰＣＲと同時に、ＲＴステップが実施されてもよい。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）器具内での第１段階のマルチプレックスＰＣＲの温度サイクルは、特定用途の要求に応じて他の増幅レベルが望ましい場合があるが、例示的には１５〜２０サイクル実施される。第１段階のＰＣＲマスターミックスは、当技術分野で知られている種々のマスターミックスのうちの任意のものでよい。説明のための一例では、第１段階のＰＣＲマスターミックスは、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許出願公開第２０１５／０１１８７１５号に開示されている、サイクル当たり２０秒以下のＰＣＲプロトコルで使用される化学物質のうちの任意のものでもよい。
【００５２】
第１段階のＰＣＲが所望の回数のサイクル続けられた後、試料は、例示的には試料の大半をブリスター５４８に戻らせ、ごく少量のみをブリスター５６４に残し、注入チャネル５１５ｉから第２段階のＰＣＲマスターミックスを加えることによって希釈されてもよい。別法として、５１５ｉからの希釈緩衝液は、ブリスター５６６に動かされ、次いで流体をブリスター５６４と５６６の間で往復運動させることによって、ブリスター５６４内の増幅された試料と混合されてもよい。必要に応じて、希釈は注入チャネル５１５ｊおよび５１５ｋからの希釈緩衝液を使用して複数回繰り返されても、注入チャネル５１５ｋは連続して行われる分析またはＰＣＲ後の他の分析のために取っておかれてもよく、次いで希釈され増幅された試料のうちのいくらか、またはすべてに、注入チャネル５１５ｈからの第２段階のＰＣＲマスターミックスが加えられる。希釈のレベルは、希釈ステップの回数を変えることによって、または希釈緩衝液もしくは（特にＰＣＲではない増幅方法に関しては他の成分が適している場合があるが、例示的にはポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび適した緩衝液である）増幅用成分を含む第２段階のＰＣＲマスターミックスと混合する前に廃棄される試料のパーセンテージを変えることによって、調整できることが理解されよう。必要に応じて、この試料と第２段階のＰＣＲマスターミックスの混合物は、第２段階の増幅に向けて第２段階ウェル５８２に移動される前に、ブリスター５６４で予熱されてもよい。このような予熱により、第２段階のＰＣＲ混合物に入れるホットスタート成分（抗体、化学薬品、またはその他のもの）の必要性をなくすことができる。
【００５３】
例示的な第２段階のＰＣＲマスターミックスは、プライマー対を欠いていて不完全であり、１０２個の第２段階ウェル５８２のそれぞれは、特定のＰＣＲプライマー対を予め装填されている。必要に応じて、第２段階のＰＣＲマスターミックスは、他の反応成分を欠いていてもよく、これらの成分も同様に、第２段階ウェル５８２に予め装填されていてもよい。それぞれのプライマー対は、第１段階のＰＣＲプライマー対と同様または同一でもよく、第１段階のプライマー対の中で入れ子にされてもよい。試料をブリスター５６４から第２段階ウェル５８２に動かすことにより、ＰＣＲ反応混合物が完成する。高密度アレイ５８１が充填されると、個々の第２段階反応物は、当技術分野で知られている様々な手段で、それぞれの第２段階のブリスター内に封止される。交差夾雑なしで高密度アレイ５８１を充填および封止する例示的な手法は、既に引用することにより本明細書の一部をなすものである米国特許第８，８９５，２９５号に述べられている。熱サイクルのための他の手段が当技術分野で知られているが、例示的には、高密度アレイ５８１のウェル５８２内の種々の反応物は、例示的には１つまたは複数のペルティエ素子を用いて同時に熱サイクルにかけられる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、第２段階のＰＣＲマスターミックスは、ｄｓＤＮＡ結合色素ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ）を含んで、増幅を示す信号を生成する。しかし、この色素は単に例示的なものであり、他のｄｓＤＮＡ結合色素および当技術分野で知られているような、蛍光、放射能、化学発光、酵素などで標識付けられるプローブを含む他の信号が使用されてもよいことが理解されよう。別法として、アレイ５８１のウェル５８２は信号を伴わずに提供され、結果は後に続く処理を通して報告されてもよい。
【００５５】
パウチ５１０内で材料を動かすのに空気圧が使用されるとき、一実施形態では「ブラッダー」が用いられてもよい。図２〜３にその一部が示されているブラッダー組立体８１０は、膨張可能な複数のブラッダー８２２、８４４、８４６、８４８、８６４および８６６を収容するブラッダープレート８２４を含み、ブラッダーのそれぞれは、例示的には圧縮ガス源によって個々に膨張可能でもよい。ブラッダー組立体８１０は、圧縮ガスにさらされ、複数回使用される場合があるので、ブラッダー組立体８１０は、パウチより丈夫な、または厚みのある材料から作られてもよい。別法として、ブラッダー８２２、８４４、８４６、８４８、８６４および８６６は、ガスケット、封止材、弁およびピストンで互いに留められる一連のプレートから形成されてもよい。他の構成は、本発明の範囲内である。
【００５６】
２次ＰＣＲ反応の成功は、マルチプレックス第１段階反応によって生成される鋳型に左右される。通常、ＰＣＲは、高純度のＤＮＡを使用して実施される。フェノール抽出または商業用のＤＮＡ抽出キットなどの方法により、高純度のＤＮＡが実現される。より純度の低い調製を補うために、パウチ５１０を通って処理された試料の調整が必要になる場合がある。ＰＣＲは、生物学的試料の、障害となる可能性がある成分によって抑制される場合がある。例示的には、ホットスタートＰＣＲ、より高濃度のｔａｑポリメラーゼ酵素、ＭｇＣｌ２濃度の調整、プライマー濃度の調整、および（ＤＭＳＯ、ＴＭＳＯまたはグリセロールなどの）アジュバントの添加が、任意選択で、より低い核酸純度を補うのに使用されてもよい。純度の問題点は、第１段階の増幅においてより懸念されると考えられるが、同様の調整は、第２段階の増幅でも同様に実施されてもよいことが理解されよう。
【００５７】
パウチ５１０が器具８００の中に配置されるとき、ブラッダー組立体８１０はパウチ５１０の片面に対して押し付けられ、その結果、特定のブラッダーが膨張している場合、圧力により、液体がパウチ５１０の対応するブリスターから排出されることになる。パウチ５１０のブリスターの多くに対応するブラッダーに加えて、ブラッダー組立体８１０は、ブラッダーや空気圧駆動ピストンなどの、パウチ５１０の種々のチャネルに対応する追加的な空気圧作動装置を有してもよい。図２〜３は、パウチ５１０のチャネル５３８、５４３、５５３および５６５に対応する、例示的な複数のピストンまたは硬質の封止材８３８、８４３、８５２、８５３および８６５、ならびにフィットメント５９０への逆流を最小限にする封止材８７１、８７２、８７３、８７４を示している。作動されると、硬質の封止材８３８、８４３、８５２、８５３および８６５はピンチ弁を形成して、対応するチャネルを締め付けて閉じる。パウチ５１０の特定のブリスターの中に液体を閉じ込めるために、硬質の封止材はブリスター同士をつなぐチャネルを覆うように作動し、その結果、作動装置はピンチ弁として機能して、チャネルを締め付けて閉じる。例示的には、異なるブリスター内の２つの液体容積を混合するために、連結チャネルを封止するピンチ弁作動装置が作動され、ブリスターを覆う空気圧ブラッダーが交互に加圧され、ブリスター同士を連結するチャネルを通って液体を往復させて、その中の液体を混合する。ピンチ弁作動装置は、種々の形状およびサイズのものでもよく、１度に２つ以上のチャネルを締め付けるように構成されてもよい。本明細書では空気圧作動装置について論じられているが、リニアステップモータ、モータ駆動カム、空気圧、液圧または電磁気力によって駆動される剛性のパドル、ローラ、ロッカーアーム、場合によってはコックトスプリング（ｃｏｃｋｅｄ  ｓｐｒｉｎｇ）などの種々の電気機械式作動装置を含む、パウチに圧力をかける他の方式が企図されることが理解されよう。さらに、チャネルの軸に対して垂直な圧力をかけるだけでなく、可逆的または非可逆的にチャネルを閉じる種々の方法が存在する。これらの方法には、チャネルを横切るようにバッグをよじること、ヒートシール、作動装置の作動（ｒｏｌｌｉｎｇ）、およびチャネル内に封入されるバタフライ弁やボール弁などの種々の物理的弁が含まれる。追加的に、小さいペルティエ素子または他の温度調節器がチャネルと隣り合って配置され、流体を凍結させるのに十分な温度に設定されて、封止部を効果的に形成することができる。また、図１の設計は、ブリスターおよびチャネルのそれぞれを覆って配置される作動装置要素を特徴とする自動式器具用になされているが、作動装置は静止したままで、パウチ５１０が１次元または２次元で移行してもよく、その結果、試料の破壊、核酸捕捉、第１段階および第２段階のＰＣＲ、ならびに免疫検定や免疫ＰＣＲなどのパウチ５１０の他の用途を含む、処理ステーションのうちのいくつかのために、少ない数の作動装置が使用され得ることも企図される。チャネルおよびブリスター上で作動するローラは、パウチ５１０がステーション間で平行移動される構成において、特に有用性が発揮で���る。したがって、ここで開示される実施形態では空気圧作動装置が使用されるが、「空気圧作動装置」という用語が本明細書で使用されるとき、パウチおよび器具の構成に応じて、他の作動装置および圧力を加える他の方式が使用されてもよいことが理解されよう。
【００５８】
他の従来技術の器具は、封止される可撓性コンテナ内でのＰＣＲを教示する。たとえば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第６，６４５，７５８号および米国特許第６，７８０，６１７号、ならびに米国特許出願第２０１４／００３８２７２号を参照のこと。しかし、特に検査される試料が生物学的有害物質を含む可能性がある場合、封止されたＰＣＲ容器内に細胞の溶解を組み込むことにより、使いやすさおよび安全性を向上させることができる。本明細書で例示される実施形態では、細胞溶解および他のあらゆるステップからの廃棄物は、封止されたパウチの中に残る。しかし、パウチの内容物は、次の検査のために取り除かれてもよいことが理解されよう。
【００５９】
図２は、パウチ５１０と共に使用され得る例示的な器具８００を示す。器具８００は、ケーシングの壁部を形成しても、ケーシングの中に取り付けられてもよい支持部材８０２を含む。器具８００は、任意選択的に支持部材８０２に対して相対的に運動可能な第２の支持部材（図示せず）も含んで、パウチ５１０の挿入および引抜きを可能にすることができる。例示的には、パウチ５１０が器具８００に挿入されると、蓋部がパウチ５１０を覆ってもよい。別の実施形態では、両方の支持部材は固定され、パウチ５１０は他の機械的手段または空気圧によって定位置に保持されてもよい。
【００６０】
説明のための例では、加熱器８８６および８８８が支持部材８０２に取り付けられる。しかし、この構成は単に例示的なものであり、他の構成が考えられることが理解されよう。ブラッダー組立体８０８を形成する、ブラッダー８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、８６６を有するブラッダープレート８１０、硬質の封止材８３８、８４３、８５２、８５３、封止材８７１、８７２、８７３、８７４は、例示的にはパウチ５１０に向かって動かされ得る、運動可能な支持構造体に取り付けられてもよく、その結果、空気圧作動装置が、パウチ５１０と接触して配置される。パウチ５１０が器具８００に装填され、運動可能支持部材が支持部材８０２に向かって動かされるとき、パウチ５１０の種々のブリスターは、ブラッダー組立体８１０の種々のブラッダーおよび組立体８０８の種々の封止材と互いに隣り合う位置にあり、その結果、空気圧作動装置の作動により、液体をパウチ５１０の１つもしくは複数のブリスターから排出させること、またはパウチ５１０の１つもしくは複数のチャネルと共にピンチ弁を形成することができる。パウチ５１０のブリスターおよびチャネルと組立体８０８のブラッダーおよび封止材との関係は、図３により詳細に示されている。
【００６１】
それぞれの空気圧作動装置は、弁８９９を介して圧縮空気源８９５に連結される。いくつかのホース８７８だけが図２に示されているが、それぞれの空気圧継手はホース８７８を介して圧縮ガス源８９５に連結されることが理解されよう。圧縮ガス源８９５はコンプレッサでもよく、また別法として、圧縮ガス源８９５は、炭酸ガスシリンダなどの圧縮ガスシリンダでもよい。可搬性が所望される場合、圧縮ガスシリンダは特に有用である。他の圧縮ガス源が、本発明の範囲内である。
【００６２】
他の構成が考えられることが理解されるであろうが、組立体８０８は、例示的には運動可能支持部材に取り付けられる。
【００６３】
器具８１０の他のいくつかの構成要素も圧縮ガス源８９５に連結される。支持部材８０２の第２の面８１４に取り付けられる磁石８５０は、磁石８５０を動かす他の方法が当技術分野で知られているが、例示的にはホース８７８を介した圧縮ガス源８９５からのガスを使用して、展開および格納される。磁石８５０は、支持部材８０２の凹部８５１に位置する。凹部８５１は支持部材８０２を通る通路になることができ、その結果、磁石８５０がパウチ５１０のブリスター５４６に接触できることが理解されよう。しかし、支持部材８０２の材料に応じて、磁石８５０が展開されるときは、磁石８５０がブリスター５４６に十分な磁界を形成するのに十分に接近し、磁石８５０が格納されるときは、磁石８５０がブリスター５４６内に存在するいかなる磁気ビーズ５３３にも著しく影響しない限り、凹部８５１は、支持部材８０２を完全に貫通して延在する必要はないことが理解されよう。磁石８５０の格納について言及されるとき、電磁石が使用されてもよく、電磁石は、電磁石を通る電気の流れを制御することによって活性化および不活性化できることが理解されよう。したがって、本明細書が磁石の抜去または格納について述べているとき、これらの用語は、磁界を取り去る他の様式を組み込むのに十分に広範であることが理解されよう。空気圧連結部は、空気圧ホースまたは空気圧空気マニホールドでもよく、したがって必要とされるホースまたは弁の数が低減されることが理解されよう。
【００６４】
空気圧ピストンアレイ８６９の種々の空気圧ピストン８６８も、ホース８７８を介して圧縮ガス源８９５に連結される。空気圧ピストン８６８を圧縮ガス源８９５に連結する２本だけのホース８７８が示されているが、空気圧ピストン８６８のそれぞれが、圧縮ガス源８９５に連結されることが理解されよう。１２個の空気圧ピストン８６８が示されている。
【００６５】
１対の加熱／冷却装置、例示的にはペルティエ加熱器が、支持体８０２の第２の面８１４に取り付けられる。第１段階の加熱器８８６が配置されて、第１段階のＰＣＲのためにブリスター５６４の内容物を加熱および冷却する。第２段階の加熱器８８８が配置されて、第２段階のＰＣＲのためにパウチ５１０の第２段階のブリスター５８２の内容物を加熱および冷却する。しかし、これらの加熱器は、他の目的の加熱にも使用することができ、特定の用途に対して適当な他の加熱器が含まれてもよいことが理解されよう。
【００６６】
蛍光検出が所望されるとき、光学アレイ８９０が提供されてもよい。図２に示されているように、光学アレイ８９０は、光源８９８、例示的にはフィルタに通されたＬＥＤ光源、フィルタに通された白色光またはレーザ照明、およびカメラ８９６を含む。カメラ８９６は、例示的にはそれぞれがパウチ５１０の第２段階ウェル５８２に対応する、複数の光検出器を有する。別法として、カメラ８９６は第２段階のウェル５８２のすべてを含む画像を撮影し、画像が第２段階ウェル５８２のそれぞれに対応する別々のフィールドに分割されてもよい。構成に応じて、光学アレイ８９０は静止していてもよく、１つまたは複数のモータに取り付けられる動くものに配置されて、個々の第２段階ウェル５８２それぞれからの信号を取得するように動かされてもよい。他の構成が考えられることが理解されよう。
【００６７】
示されているように、コンピュータ８９４は、圧縮空気源８９５の弁８９９を制御し、したがって器具８００の空気圧全体を制御する。コンピュータ８９４は、加熱器８８６および８８８、ならびに光学アレイ８９０も制御する。他の物理的接続、または無線接続が本発明の範囲内であるが、これらの構成要素のそれぞれは、例示的にはケーブル８９１を介して電気的に接続される。コンピュータ８９４は、器具８００の中に収容されてもよく、器具８００の外部に存在してもよいことが理解されよう。さらに、コンピュータ８９４は、構成要素のいくつかまたはすべてを制御する組込み式の回路板を含んでもよく、デスクトップＰＣやラップトップＰＣなどの外付けのコンピュータも含んで、光学アレイからのデータを受信および表示することができる。インタフェース、例示的には温度、サイクル時間などの情報および変数を入力するためのキーを含めたキーボードインタフェースが提供されてもよい。例示的には、表示部８９２も提供される。表示部８９２は、たとえばＬＥＤ、ＬＣＤ、または他のそのような表示部でもよい。
【実施例】
【００６８】
［実施例１］
高密度ＰＣＲ
一例では、一般的な呼吸器ウイルスについての標準的な商業用の免疫蛍光検定は、７つのウイルス、すなわちアデノウイルス、ＰＩＶ１、ＰＩＶ２、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢを検出できることが知られている。より完全なパネルは、例示的にはコロナウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ライノウイルス、および非ＨＲＶのエンテロウイルスを含む、他のウイルスについての検定を含むことになる。アデノウイルスやＨＲＶなどの可変性が高いウイルスに関しては、ウイルスのリネージから分岐したものすべてをターゲットにするために、複数のプライマー（例示的にはそれぞれ４つのアウタープライマーとインナープライマーの組）を使用することが望ましい。コロナウイルスなどの他のウイルスに関しては、季節によって変化しない４つの特異なリネージ（２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１）があるが、これらのリネージは、別々のプライマー組が必要になるほど十分に分岐している。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ  ｏｆ  Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ）は、アデノウイルス、コロナウイルスＨＫＵ１、コロナウイルスＮＬ６３、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＯＣ４３、ヒトメタニューモウイルス、ヒトライノウイルス／エンテロウイルス、インフルエンザＡ、インフルエンザＡ／Ｈ１、インフルエンザＡ／Ｈ３、インフルエンザＡ／Ｈ１−２００９、インフルエンザＢ、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、パラインフルエンザウイルス４、および呼吸器合胞体ウイルスを含む。これらのウイルスに加えて、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌは、３つの細菌、すなわち百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、および肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を含む。高密度アレイ５８１は、このようなパネルを単一のパウチ５１０内に収めることができる。それぞれが少なくとも２０の病原体を検定する他のパネルが、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）で使用できる。
【００６９】
［実施例２］
パウチの装填
図５は、装填ステーション６００を示す。示されているように、図１のパウチ５１０は装填ステーション６００のスロット６１０に装填され、その結果、パウチ５１０のフィットメント５９０だけが見えている。示されているように、装填ステーション６００には、試料バイアル６５０を保持するための試料バイアル受け器６０２と水和バイアル６７０を保持するための水和バイアル受け器６０４とが提供される。しかし、受け器およびバイアルは、ワークフローを補助するためのもので、単に例示的なものであることが理解されよう。他の構成、ならびに他のパウチおよび他の装置との使用が、本開示の範囲内である。
【００７０】
試料は、ピペットまたは他の方式で試料バイアル６５０に装填される。以下でより詳細に述べられるように、ワークフローに応じて、試料バイアル６５０は、生物学的試料を受けるための緩衝液または他の流体６５２を既に容れていてもよく、操作者が適当な緩衝液内の生物学的試料を試料バイアル６５０に加えてもよい。任意選択的に、緩衝液は別のアンプルに提供され、適当な量の緩衝液が配分されてもよい。同様に、水和バイアル６７０は、水、緩衝液、または他の流体６７２が予め装填されていてもよく、操作者がこのような流体を水和バイアル６７０に装填してもよい。
【００７１】
例示的なフィットメント５９０は、例示的にはフィットメント５９０の第２の表面５９５の近くに形成される注入ポート５４１を含む。示されているように、注入ポート５４１は試料注入開口５６３内に位置し、試料注入開口５６３は、フィットメント５９０の第１の表面５９４を通して、カニューレ付きシリンジなどのカニューレ付き移動容器を受けるように構成される。この例示的な構成では、注入ポート５４１は不注意で穴が開かないよう保護されており、カニューレ付き移動容器が試料注入開口５６３に配置されるまで開かない。同様に、例示的なフィットメント５９０は、例示的にはフィットメント５９０の第２の表面５９５の近くに形成されて水和流体注入開口５８３内に位置する第２の注入ポート５８８を含み、水和流体注入開口５８３は、試料注入開口５６３と同様に構成される。この例示的な実施形態で構成されているように、注入ポート５４１は、検査される試料を受けるためのものであり、試料はチャンバ５９２ａに、または直接溶解ブリスター５２２（図１）に動かされることになり、第２の注入ポート５８８は、（図７に示される）水や緩衝液などの水和流体６７２を受けるように構成され、水和流体６７２は、後に続く、入口チャネル５１５ｂ〜５１５ｌを通る移動に向けて、チャンバ５９２ｂ〜５９２ｌに移動されることになる。注入ポート５４１および５８８、ならびに開口５６３および５８３の構成は例示的なものであり、他の構成が本開示の範囲内であることが理解されよう。
【００７２】
図６に最もよく示されているように、例示的な試料バイアル６５０は、多くのカニューレ付きシリンジと同様の構成で、上面６６２、バイアル本体６５４およびカニューレ６５５から構成される。この例示的な実施形態では、試料バイアル６５０には、多くのカニューレ付きシリンジで使用されるプランジャではなく、上面６６２を通って延在して本体６５４を封止するキャップ６５８が提供される。例示的には、操作者は、上面６６２の開口６５７を通して、固体または半固体材料を注ぐ、ピペッティングする、スワブ挿入する、すくい上げる、またはその他の方法で流体および／または他の材料をバイアル本体６５４に移動することになる。
【００７３】
検査される試料のタイプに応じて、試料バイアル６５０には、例示的にはバイアル本体６５４の六角形の下面６６６またはその近くに配置されるフィルタ６４６が提供されてもよい。示されているように、フィルタ６４６は、Ｏリング６４４によって定位置に保持される。しかし、フィルタ６４６は、接着剤、溶接、所定位置への圧入、または当技術分野で知られている他の手段によって定位置に保持されてもよいことが理解されよう。カニューレ６５５が試料注入開口５６３に挿入され、試料がパウチ５１０に引き込まれるとき、試料材料はフィルタ６４６を通ってカニューレ６５５に入るので、試料材料はフィルタに通される。フィルタ材料の選定は試料のタイプおよび粒子のサイズに依存するが、種々の生物学的試料に対して適したフィルタには、Ｐａｌｌ  １００μｍ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｕｌｔｉｐｌｅａｔ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｍｅｌｔ  Ｂｌｏｗｎ  ＭｅｄｉａおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ８０μｍ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｎｅｔ  Ｆｉｌｔｅｒが含まれる。大半のシリンジフィルタは、特定のサイズの微生物を遮断し、それによってこれらの微生物を濾過液から取り除くように設計される。このような既存のフィルタとは異なり、これらの例示的なフィルタは、直径が約６０μｍ以下のターゲット微生物（たとえば、細菌、ウイルス、原生動物および真菌の微生物）はフィルタを通らせるが、便、土、土埃などの中に見られる、より大きい粒子は遮断する能力に基づいて選択された。また、例示的なフィルタ材料は不活性であり（すなわち微生物または核酸を結合しない）、比較的詰まりにくい。例示的なこれらのフィルタは、ターゲット微生物として（約６０μｍまでの）原生動物を含む試料向けに選択されたことが理解されよう。より小さいターゲットについてのみ検査できるパウチ構成もあるので、細菌および真菌向けの、孔のサイズが１〜１０μｍのフィルタや、ウイルスの粒子のみを検出する必要がある場合、孔のサイズが１μｍ未満のフィルタなどの、より小さい孔径のフィルタが所望される場合がある。当然、より大きい孔径のフィルタが、より小さいターゲットをフィルタに通すのに引き続き使用されてもよい。このようなフィルタは、流体システムを詰まらせる可能性のある土、便および土埃などの、大量の粒子状物質を有する試料タイプに対して、特に有用な場合がある。さらに、孔径はフィルタに通される材料に基づいて選択され、孔の他のサイズが本発明の範囲内であることが理解されよう。
【００７４】
試料調製に有用な１つまたは複数の成分が、乾燥されてバイアル本体６５４に提供されてもよいことが理解されよう。このような添加剤には、緩衝液剤、安定剤、プロテアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ抑制薬、リボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ抑制薬、リゾチーム、還元剤などが含まれてもよい。別法として、このような成分は、試料緩衝液に含まれてもよく、試料が、次の処理のためにバイアル６５０から出された後に、下流で加えられてもよい。このような添加剤の選定は、試料のタイプおよび所望される次の処理に左右されることが理解されよう。粘度の低減に役立ち、または溶解性を補助して、試料がフィルタ６４６を通過することを可能にする添加剤が特に有用である。
【００７５】
示されているように、下部キャップ６６４には六角形部分６６６が提供され、六角形部分６６６は六角形に形作られた試料バイアル受け器６０２に嵌合するように構成される。例示的な実施形態では六角形部分６６６および試料バイアル受け器は六角形であるが、他の形状が使用されてもよく、六角形のまたは他の対合するまたは噛み合う形状部が提供されて、下部キャップ６６４を取り外す際に操作者を補助できることが理解されよう。別法として、操作者は、両手を使ってねじってバイアル本体６５４から下部キャップ６６４を外すなど、他の手段によって下部キャップ６６４を取り外してもよい。下部キャップ６５４は、バイアル本体６５４に、圧入、ねじ込み、またはその他の方法で付けられてもよい。
【００７６】
例示的な実施形態では、下部キャップ６６４には台座６４８が提供され、カニューレ６５５の下端部６５９が台座６４８に延在する。例示的には、カニューレ６５５の下端部６５９は台座６４８にぴったりと嵌合し、その結果、台座６４８が、カニューレ６５５の開いている下端部６５９の周りに気密封止部を提供する。任意選択的に、下部キャップ６６４とバイアル本体６５４の間にベント６４９が提供される。
【００７７】
ここで図７を参照すると、水和バイアル６７０は、試料バイアル６５０と同様に構成されてもよい。しかし、図７に示されているように、水和バイアル６７０に水和流体６７２を予め装填し、水和バイアル６７０内の水和流体６７２を予め封止することが望ましい場合がある。図７に示されているように、例示的な水和バイアル６７０は、試料バイアル６５０と同様の構成で、上面６８２、バイアル本体６７４およびカニューレ６７５から構成される。しかし、例示的な水和バイアル６７０のキャップ６７８の舌部６８０は、上面６８２の開口６７７に既に圧入されており、またキャップ６７８は上面６８２を封止することができ、それによって水和バイアル６７０が開くことを防止する。この構成は単に例示的なものであり、水和バイアル６７０内の水和流体６７２を封止する他の方式が本明細書において想定されることが理解されよう。例示的には、バイアル本体６７４およびカニューレ６７５は、流体で完全に一杯、または実質的に完全に一杯にして提供されてもよく、その結果、水和バイアル６７０を取り扱う、または回転することでカニューレ６７５に空気が入るのを防止することになる。別法として、いくらかの空気６８５または他のガスが、バイアル本体６７４の中に存在してもよく、操作者が水和本体を直立姿勢に保って、空気がカニューレ６７５に入るのを防止してもよい。さらに別の代替実施形態では、空気６８５は圧力がかかった状態で提供されてもよく、下部キャップ６８４を取り外すことによって、水和流体がカニューレ６７５に通されることになる。示されているように、必要に応じて提供されてもよいが、水和バイアル６７０にはフィルタが提供されていない。
【００７８】
下部キャップ６８４は、カニューレ６７５内の水和流体６７２の夾雑を防止するだけでなく、カニューレ６７５から滴る可能性のあるいかなる流体をも保持するために提供されてもよい。ワイパー６８３が下部キャップ６８４に提供されて、カニューレ６７５の下部から余分な流体を拭うことができる。ワイパー６８３の円錐形状も、後に続く操作および廃棄の間、下部キャップ６８４にしずくを保持することに役立ち得る。試料バイアル６５０に関して上で述べたように、他の形状が考えられるが、例示的な実施形態では、下部キャップ６８４には、六角形に形作られた水和バイアル受け器６０４と対合する六角形部分６８６が提供される。水和バイアル６７０の六角形部分６８６および六角形に形作られた水和バイアル受け器６０４は、試料バイアル６５０の六角形部分６６６および六角形に形作られた試料バイアル受け器６０２とは異なる寸法および／または異なる形状でもよく、その結果、試料バイアル６５０だけが試料バイアル受け器６０２に容易に嵌合し、水和バイアル６７０だけが水和バイアル受け器６０４に容易に嵌合することになり、操作者が試料バイアル６５０と水和バイアル６７０を取り違える可能性を低減し、その結果、適切な流体がポート５４１および５８８を通って注入される。さらに、試料バイアル６５０および注入開口５６３は、部分的または全体的に、マッチングする特定の色、例示的には赤で提供され、水和バイアル６７０および注入開口５８３は、部分的または全体的に、マッチングする特定の別の色、例示的には青で提供されてもよく、操作者が適切な流体をポート５４１および５８８に提供する際に視覚的補助を与える。誤った液体を誤った注入開口に挿入するリスクをさらに抑えるために、カニューレ６５５の直径はカニューレ６７５の直径とは異なってもよく、試料注入開口５６３および水和流体注入開口５８３の直径も同様に異なってもよい。他の構成が、本開示の範囲内である。
【００７９】
図５に戻ると、例示的には、パウチ５１０に装填するために、操作者は、試料バイアル６５０を装填ステーション６００の試料バイアル受け器６０２に、水和バイアル６７０を装填ステーション６００の水和バイアル受け器６０４に配置することになる。パウチ５１０もスロット６１０に配置されることになる。試料は、スワブ６３０を挿入すること、流体試料をピペッティングすること、患者からの血液をバイアル本体に直接落とすこと、および便などの固体または半固体試料をバイアル本体に入れることを含む、試料タイプに適した任意の方式で試料緩衝液６５２に入れられることになり、任意選択的にボルテックス、または当技術分野において標準的な他の方式で混合される。試料のタイプおよび所望のターゲット核酸に応じて、試料緩衝液は、例示的には生物学的または環境試料を処理するための、プロテアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ抑制薬、リボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ抑制薬、リゾチームなどの１つまたは複数の添加剤または安定剤を含んでもよい。追加的に、または別法として、これらの添加剤はパウチ５１０に提供されてもよい。好ましくはボルテックスまたは混合の前に、操作者は、キャップ６５８の舌部６６０を開口６５７に入れることによって、試料バイアル６５０を閉じることになる。舌部６６０を挿入することにより、バイアル本体６５４の中に含まれる空気が加圧される。例示的には、舌部６６０は、カニューレ６５５以上の容積をもつ。例示的には、下部キャップ６６４が取り外されるとき、台座６４８とカニューレ６５５の下端部６５９との間の気密封止部が壊れ、実質的にすべての空気がカニューレ６５５から出される。舌部６６０の容積がカニューレ６５５の容積より大きい場合、これは最大量の空気がカニューレ６５５から出されることを確実にするのに役立つことになる。カニューレ６５５内に入れられ、場合によっては通過する流体量のうち、溢れたものがあれば、下部キャップ６６４で捉えられ、ワイパー６６３によってカニューレ６５５の下部から取り除かれてもよい。完全に、または実質的に完全にカニューレ６５５を充填することにより、パウチに装填する際の、パウチ５１０内の泡の量が最小限にされる。１つまたは複数のベント６４９が、下部キャップ６６４を水和バイアル６５０から分離することを補助してもよい。
【００８０】
下部キャップ６６４には六角形に形作られた試料バイアル受け器６０２に嵌合するように構成された六角形部分６６６が提供されるので、下部キャップが受け器６０２に係合しているとき、操作者は、下部キャップ６５４をねじって容易に外すことができ、それによってカニューレ６５５が露出する。カニューレ６５５は、次いで試料注入開口５６３に挿入され、開いている注入ポート５４１に押し込まれる。パウチ５９０内部の真空（または常圧もしくはパウチ外側の圧力と比べて減圧されたパウチ内部の圧力）により、例示的には、試料をパウチ５１０に引き込むのに用いられ得るバイアル本体からの圧力の有無に関わらず、試料は、後に続く溶解チャンバ５２２への移動に向けて、（存在すれば）フィルタに通され、例示的にはフィットメント５９０のチャンバ５９２ａに入れられる。カニューレ６５５が流体６５２で概ね充填されているのを確実にすることにより、試料バイアル６５０からパウチ５１０に移動する空気または他のガスの量が最小限にされ、それによって泡のサイズおよび量が抑えられる。さらに、プランジャを有する従来技術のシリンジが使用され、パウチ５９０内側の真空によって流体が引き込まれるとき、プランジャはシリンジ下方に引き下げられ、それによってシリンジ内側の圧力が平衡になる。図５〜６の実施形態では、バイアル本体のそれぞれの上部の開口が封止されるので、パウチ５９０の内側からの真空がバイアルから流体を引き込むとき、バイアルも負圧状態におかれることになり、試料からガスを抜き、いくらかの残りの気泡をパウチ５９０から抜き取ることができる。カニューレ６５５は、次いで試料注入開口５６３から引き抜かれ、試料バイアル６５０および下部キャップ６６４は、プロトコルに従って処理される。バイアル本体６５４は負圧下にあるので、カニューレ６５５が引き抜かれるとき、注入ポート５４１の近くで捕集されている可能性がある気泡がパウチ５１０から引き出される場合があり、パウチ内の気泡をさらに減少させる。
【００８１】
同様に、操作者は下部キャップ６８４をねじって水和バイアル６７０から外し、それによってカニューレ６７５を露出させる。水和バイアル６７０の内容物が、圧力がかかった状態で提供される場合、カニューレ６７５が台座６９２から離されるとき、水和流体のうちの少量が、下部キャップ６８４に漏出する可能性がある。１つまたは複数のベント６９３は、下部キャップ６８４を水和バイアル６７０から分離するのを補助することができる。カニューレ６７５は、次いで水和注入開口５８３に挿入され、開いている注入ポート５８８に押し込まれる。フィットメント５９０内側からの真空を使用して、水和流体を、後に続くパウチ５１０の種々のブリスターへの移動に向けて、パウチ５１０に、例示的にはチャンバ５９２ｂ〜５９２ｌに引き込むことができる。カニューレ６７５は水和注入開口５８３から取り外され、パウチ５１０は装填ステーション６００から取り外されて器具８００に配置され、運転が開始する。バイアルを取り外すことは、単に例示的なものであることが理解されよう。器具およびバイアルの構成が許せば、バイアルは注入ポートに恒久的に挿入されていてもよく、それによってパウチの閉じたシステムの一部になり、試料からの夾雑が最小化される。このような実施形態では、シールバー（ｓｅａｌ  ｂａｒ）は必要でない場合がある。
【００８２】
上で述べられた試料バイアル６５０の例示的な実施形態では、舌部６６０は、カニューレ６５５の容積以上の容積を有する。パウチ５１０が１ｍｌの充填容積を有する例示的な一実施形態では、バイアル本体６５４には、１．５ｍｌの試料流体６５２、および試料流体の上に１ｍｌの量の空気６４５が提供されてもよい。したがって、空気はバイアル本体６５４の容積の４０％である。しかし、１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、およびその中間の数を含む、他のパーセンテージの空気が使用されてもよいことが理解されよう。舌部６６０が開口６５７を通って挿入されるとき、試料流体の上の空気は、例示的には約５０％圧縮されるが、４０〜６０％、３０〜７０％、２０〜８０％および１０〜９０％の範囲の圧縮すべてが考えられる。空気および試料流体の量の選択は、試料のサイズ、カニューレの直径、流体の反応を起こす前にバイアルを取り除くことが所望されるかどうか、および他の複数の要因に依存することが理解されよう。たとえば、すくい上げられた、またはスワブで取られた試料は、流体システムの充填容積に関わらず、著しく多い量の試料流体を必要とする場合がある。
【００８３】
例示的なバイアル本体６５４および６７４は円筒形である。しかし、これらの例示的なバイアルはプランジャなしで提供されているので、バイアル本体は円形の断面を有する必要はなく、任意の本体形状が本発明の範囲内であることが理解されよう。
【００８４】
図８〜１０は、装填ステーション６００およびバイアル６５０、６７０の代替実施形態を示し、同様の番号は同様の部分を示す。図８に示されているように、装填ステーション７００は、試料バイアル受け器７０２および水和バイアル受け器７０４、ならびに図１で示されているものと同様のパウチ５１０を受けるためのスロット７１０を有する、装填ステーション６００と同様のものでもよい。しかし、少なくとも１つの実施形態によれば、受け器の形状および位置は、装填ステーション６００と装填ステーション７００で著しく異なる。たとえば、少なくとも１つの実施形態では、装填ステーション６００の受け器６０２、６０４と比較して、受け器７０２および７０４のほうが、パウチ５１０に近い。距離がこのように短くなる場合、パウチ５１０への装填時に液垂れが起きる可能性が下がる。さらに、図９〜１０において最もよく理解されるように、試料バイアル７５０の下部キャップ７６４には、４つの比較的短いひれ部７６７が提供され、これらは試料バイアル受け器７０２の、対応する４つのスロット７０３に嵌合し、水和バイアル７７０の下部キャップ７８４には、２つの比較的長いひれ部７８７が提供され、これらは水和バイアル受け器７０４の、対応する２つのスロット７０５に嵌合する。これらのひれ部は、それぞれバイアル６５０の六角形部分６６６およびバイアル６７０の六角形部分６８６に取って代わる。下部キャップ７６４のひれ部７６７の数のほうが多いことにより、試料バイアル７５０が水和バイアル受け器７０４に配置されることが防止され、下部キャップ７８４のひれ部７８７のほうが長いことにより、水和バイアル７７０が試料バイアル受け器７０２に配置されることが防止される。しかし、異なるサイズおよび数のひれ部を使用することは単に例示的なものであり、別の嵌込みシステムが本開示の範囲内であることが理解されよう。装填ステーション６００に関して上で述べられたように、装填ステーション７００の受け器７０２、７０４は、下部キャップ７６４、７８４をねじって各バイアル本体７５４、７７４から外すのを補助し、装填プロセスを助けるために使用されてもよい。
【００８５】
試料バイアル６５０、７５０および水和バイアル６７０、７７０は、パウチ５１０を装填する説明のための例で使用されるが、これらの装填バイアルは、本明細書で開示されるパウチのうちの任意のものの装填に適していることが理解されよう。これらの装填バイアルは、他の流体装置またはマイクロ流体装置、特に真空または吸引を使用して液体を流体装置に引き込むように構成された流体装置の装填にも適している。
【００８６】
［実施例３］
試料調製
この例示的な実施形態では、下気道感染症（ＬＲＴＩ）からの試料が使用される。しかし、この方法は、処理が困難な生物学的および環境的な試料タイプを含むがこれらに限定されない、他の試料タイプに適している場合があり、また選択的に捕集材料に結合され、次いで捕集材料から放出される、任意の試料タイプに対して特に有用であることが理解されよう。ＬＲＴＩは一般的な疾患であるが、バイアスのかかった診断技法および抑制的な標本特性のために、病原学的因子の識別が困難な場合がある。病原体の識別に関する現在の「至適基準」は細菌培養であり、培養は、培養可能な病原体しか識別できず、一方で培養不能な病原体は検出されないままであるので、細菌培養は非常に主観的で、感受性に欠け、不完全なスクリーニング方法である。ＬＲＴＩ標本には、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、ミニＢＡＬ（ｍｉｎｉ−ＢＡＬ）、気管支洗浄液、痰、および気管内吸引液（ＥＴＡ）などの複数の標本タイプが含まれ、これらすべては、ユニークかつしばしば難しい特性を有する。痰およびＥＴＡ標本は、取扱いが困難な場合があり、処理するのに時間がかかる場合があり、分子検出方法に対して非常に抑制的である可能性がある。さらに、ＬＲＴＩ病原体には、しばしば種々の試料処理方法を必要とするグラム陽性菌およびグラム陰性菌、ウイルス、ならびに真菌微生物が含まれる。
【００８７】
痰は、可変粘度および粒子を有する、半固体試料マトリクスである。ＢＡＬは、きれいな食塩水と同様の粘度を有することも、痰と同様の粘度を有することもでき、これら両方が、処理上の課題を提示する場合がある。難点には、ピペットできない標本、可変粘度に起因する不正確なピペッティング量、空気ポケット、引戻し（ｐｕｌｌ−ｂａｃｋ）、残遺物、およびパウチ注入または試料の取扱い中の泡立ちが含まれる。粘度が高い場合、病原体を試料マトリクスから分離することが困難な場合がある。さらに、このような試料内で確認されるリボヌクレアーゼの活動が、ＲＮＡの検出に影響を及ぼす可能性がある。このような試料タイプの場合、物理的溶解と化学的溶解の組合せが効果的な場合がある。
【００８８】
痰試料は、患者に、適した捕集容器に喀痰させること、または患者が標本を生成するように誘発することを含む、任意の適した手段を使用して取得できる。大半の病原体検出方法は、痰または他の粘性の試料と共に使用することが困難な場合がある容積移動システムを使用する。通常は、試料は、後に続くピペッティングのために試料を液化するように前処理される。例示的な一実施形態では、スワブを使用して試料を移動し、前処理ステップの必要性を減らす、またはなくす。ピペット、他のスワブ、および他の移動装置を使用して試料を移動してもよいが、フロックドスワブの使用により、標本の取扱いに関する問題点を極力減らしながら標本を検査システムに投入する、単純かつ簡単な方法が実現される。適したスワブの１つは、ＦＬＯＱＳｗａｂｓ（商標）（Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｕｒｒｉｅｔａ、ＣＡ）である。この例示的なフロックドスワブは親水性であり、病原体を捕集するのによく適している。例示的には３ｃＰ以上の粘度を有するような粘性の試料、または固体もしくは半固体の試料に対して、フロックドスワブは、固体材料上の微生物を優先的に捕集することができる。フロックドスワブは、試料マトリクス材料上の微生物を優先的に放出することもできる。優先的に試料マトリクス上の微生物を捕集および放出する他の材料を使用して試料を移動させてもよく、スワブの型式は単に例示的なものであることが理解されよう。
【００８９】
例示的な一実施形態では、スワブ６３０は、患者から捕集された試料に入れられても、環境試料に入れられてもよい。スワブ６３０は、次いで試料バイアル６５０内の試料緩衝液６５２に直接入れられてもよい。試料緩衝液６５２は、試料タイプに応じた任意の緩衝液でもよい。図６に示されているように、必要に応じて、スワブ６３０の先端は折り取られてもよく、キャップ６５８を使用してバイアル本体６５４を閉じてもよい。スワブ先端６３０がバイアル本体６５４の中に存在することは、バイアル６５０の使用に著しい影響を及ぼさないはずである。バイアル６５０は、例示的には３回反転させることによって振られて、または例示的には１０秒間、より激しく振られて、存在している任意の病原体をスワブ６３０から放出することができる。別法として、スワブ６３０は、試料緩衝液６５２の中でかき回されてもよく、スワブ６３０は、次いでバイアル６５０から取り出されてもよい。理論に拘束されるものではないが、フロックドスワブは、優先的に試料マトリクス上の細胞、微生物、およびウイルスを捕集することができ、次いで、さらに少なくとも微生物およびウイルスを放出するとき、粘性の痰材料などの試料マトリクスの一部を保持することができると考えられている。しかし、他のスワブまたは移動装置が種々の実施形態で使用されてもよいことが理解されよう。例示的には、試料マトリクス上の所望の試料を選択的に捕集および放出する任意の移動材料を使用して、試料を集めることができる。このような材料には、スワブ、ブラシ、スポンジ、フィルタ、用具（ｕｔｅｎｓｉｌ）、ループ、紙、または選択的に所望の試料を結合および放出し、分析のために試料を移動する間、試料と接触して配置することができる他の吸着性材料が含まれる。
【００９０】
このように、このようなフロックドスワブが、ＬＲＴＩ試料などの粘性の試料内の病原体の捕集および放出の両方に適しており、フロックドスワブは、かなり均一な捕集量を実現することが分かっている。ＦＬＯＱＳｗａｂｓ（商標）の単一のスワブは、痰などのより高い粘度の試料タイプを含め、かなり再現性のある方式で約１５０〜３００μｌの試料を捕集する。小さい試料ボリューム範囲、例示的には２倍〜４倍の量の範囲で再現性をもって粘性の試料を捕集する他の材料が、本発明の範囲内である。試料ボリューム範囲は、試料捕集材料が再現性をもって捕集するボリュームの範囲であり、その結果、他の２倍の範囲および４倍の範囲を含む他の範囲が本発明の範囲内であるが、例示的な２倍の範囲は１５０〜３００μｌであり、例示的な４倍の範囲は１５０〜６００μｌであることが理解されよう。説明のための例には、５０〜１５０μｌの試料および３００〜１０００μｌの試料、場合によっては５〜１０ｍｌの試料を捕集するサイズのスワブが含まれるが、これらの範囲は例示的なものであり、他のサイズの範囲が考えられることが理解されるであろう。このようなスワブを使用して患者から標本を捕集することができるが、例示的な一実施形態では、スワブは、再現可能な方式で標本を捕集し、次の処理に向けて、試料を適した捕集容器から別の容器に移動するのに使用される。しかし、当技術分野で知られている他の適した捕集および移動材料が、本明細書に開示されている種々の実施形態で使用されてもよいことが理解されよう。
【００９１】
扱いにくい試料を一定時間前処理することが、当技術分野で知られている。たとえば、痰はジチオトレイトール（ＤＴＴ）で処理されてもよく、かつ／または１５分以上、場合によっては３０分以上加熱されてもよい。例示的にはこのような前処理なしで、痰のような標本を部分的または完全に液化できる試料緩衝液６５２が使用されてもよい。当技術分野で知られている緩衝液は、しばしば体積で１０％以下の量の界面活性剤を使用する。本発明による例示的な試料緩衝液６５２は、１０％以上の界面活性剤、例示的には１２％、１５％、１８％、２０％またはこれを超える界面活性剤を含んでもよい。適した界面活性剤には、非イオン性、イオン性および双性イオンの界面活性剤が含まれる。例示的な一実施形態では、１５％のトリトン−Ｘなどの、非イオン性界面活性剤が使用されてもよい。他の非限定的な界面活性剤には、ツイン−２０、ＳＤＳ、およびＮＰ−４０が含まれる。このより高濃度の界面活性剤により、核酸抽出前の、試料の加熱やＤＴＴ混合物前処理などの前処理の必要性を小さくする、またはなくすことができることが分かっている。したがって、試料はわずか５分以下、２分以下、１分以下、またはホールド時間なしでさえも処理され得る。しかし、いくつかの試料タイプでは前処理が望ましい場合があることが理解されよう。試料緩衝液６５２は、グアニジン塩酸塩などのグアニジニウム化合物も含んでもよい。説明のための一例では、緩衝液は、例示的にはｐＨが約２〜約６の酸性である。いくつかの試料調製方法では、例示的には試料タイプが血液または血液成分であるとき、イソプロパノールなどのアルコールが試料緩衝液６５２で使用される。しかし、他の試料緩衝液はアルコールを含まなくてもよい。１０％以上の濃度、例示的には１５％で界面活性剤を用いる種々の例示的な実施形態では、アルコールは、試料緩衝液６５２から省かれてもよいことが分かっている。
【００９２】
上で述べられたように、試料バイアル６５０にはフィルタ６４６が提供されてもよい。カニューレ６５５が試料注入開口６５３に挿入され、試料がパウチ５１０に引き込まれるとき、試料材料は、フィルタ６４６を通ってカニューレ６５５に引き込まれるので、試料材料はフィルタに通される。このようなフィルタ６４６は、痰などの粘性の試料で詰まる可能性がある。いくつかの実施形態では、試料バイアル６５０にはプロテイナーゼＫなどのプロテアーゼが提供されてもよく、または、プロテアーゼは、他の方法で試料バイアル６５０に提供されても、試料緩衝液６５２と共に加えられてもよい。プロテアーゼが乾燥した形態で提供される場合、試料緩衝液６５２の投入によってプロテアーゼが再水和され、試料を試料緩衝液６５２に投入することにより、試料がパウチ５１０に移動されて溶解ブリスター５２２に到達する前であっても、プロテアーゼが試料中のタンパク質を分解し始めることが可能になる。プロテアーゼの作用が、試料の粘度を下げるのを助けることができ、それによって試料の、フィルタ６４６を通過する能力を向上させ、または他の下流の処理ステップを改善する。したがって、試料バイアル６５０に存在するプロテアーゼを用いて、より多くの病原体が試料から放出され得る。しかし、プロテアーゼを使用するいくつかの実施形態では、プロテアーゼを直接試料緩衝液に加える、または例示的にはプロテアーゼを入口チャネル５１５ｂ内で乾燥させることにより、プロセスのさらに後のほうでプロテアーゼを加えることが望ましい場合もあり、他の実施形態では、プロテアーゼは省かれてもよい。
【００９３】
フロックドスワブを使用した病原体の優先的な移動、より高濃度の界面活性剤、プロテアーゼが存在する状態でのフィルタ６４６を通したフィルタリング、またはこれらの組合せにより、加熱またはＤＴＴによる前処理の必要性がなくなり、このような粘性の試料を十分に分解できることが理解されよう。ここで、このような試料は、ＰＣＲまたは他の検査がその後に続く、次の溶解ステップに向けての準備を整えることができる。
【００９４】
上記の例示的な説明は、痰および他のＬＲＴＩ試料タイプに焦点を当てているが、上記の方法および装置は、多種多様な試料タイプと共に、特に、限定はされないが扱いにくい試料タイプと共に使用できることが理解されよう。痰、ＢＡＬおよび他のＬＲＴＩ試料タイプに加えて、他の扱いにくい生物学的試料には、粘液、便、組織、組織ホモジネート、基本組織、パラフィン処理ホルマリン包埋組織、骨、骨ホモジネート、痂皮、膿、関節液、リンパ節吸引液、および胃洗浄液が含まれるが、これらに限定はされない。環境試料、例示的には土、地表、土埃または食物も、課題を提示する場合がある。フロックドスワブ、または優先的に病原体を捕集および放出する他の移動手段を使用した移動は、正確なピペット取りまたは測定が困難な試料からでさえも、比較的安定的な病原体の捕集を可能にする。部分的または完全に試料マトリクスを液化する試料緩衝液が使用されてもよい。例示的には試料の調製を補助する、より高濃度の界面活性剤または添加剤が存在する中で、フィルタを通して試料を引き込むことにより、試料マトリクスの分解が助けられて、次の処理に適した形式で試料が提供される。
【００９５】
［実施例４］
直接血液試料
この実施形態では、宿主ＲＮＡの分析のために、直接血液試料が使用される。本明細書において使用される「直接血液」とは、培養されていない血液試料を意味する。例示的な直接血液試料には、宿主生物、例示的にはヒトから直接取られた全血、全血分画物（たとえば血漿または血清）、抗凝固物質溶液（たとえばＥＤＴＡ、クエン酸）中に捕集された全血、またはＲＮＡ安定化溶液中に捕集された全血が含まれる。感染症、急性疾患、および／または慢性疾患に対する宿主の反応が、リボソームＲＮＡ、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡを含むがこれらに限定されない、いくつかのＲＮＡ分子の生成に変化を起こすことが理解されよう。ＲＮＡ生成におけるこのような変化を使用して、宿主の疾病の原因を示すことができる。直接血液試料中のＲＮＡは、一般に、遠心沈殿、洗浄、最適化された緩衝液の添加、しばしば追加的な洗浄を伴うタンパク質および核酸の消化、ならびに溶出から構成される、自動または手動の抽出方法で精製される。従来技術の多くの方法では、これはすべてエンドポイント分子診断ツールとは別の機器を使用して完遂され、しばしば９０分以上かかる。結果として得られる精製された試料は、次いで、手動でｃＤＮＡマイクロアレイまたはｑＰＣＲ器具などのエンドポイント分子診断システムに加えられる。宿主ＲＮＡ試料を精製するプロセスは、しばしばかなりの時間がかかり、外部の機器および試料の操作を必要とし、これらすべてが、試料の完全性および品質に影響を及ぼす可能性がある。代替の手法は、（例示的には上に定められた形態のうちの任意の形態の）直接血液試料を、試料緩衝液６５２に直接加えることである。例示的な試料緩衝液は、ＲＮＡを分解し得るリボヌクレアーゼのようなタンパク質を減らしながら核酸の結合および回収を補助する、カオトロピック薬剤を含む。他の比が考えられることが理解されるであろうが、例示的には、直接血液試料と試料緩衝液の比は、１対８から１対１までの範囲、より具体的には１対５から１対１．６７までの範囲である。この試料は、次いで上述のように、パウチ５１０に直接装填されてもよい。宿主ＲＮＡは、例示的にはバイアル６５０内で最低限だけ混合されて、またはいかなる追加的な使用者の操作もなしに、上述のように閉じたシステムの中で抽出および精製される。このような試料調製は、遠心沈殿、エタノール沈殿、およびＤＮＡ消化を含むステップのうち、任意の、またはすべてのステップなしで完了することができる。したがって、わずか２分以下で試料を処理することができ、エンドポイント分子診断ツールの他のいかなる外部機器も必要としない。
【００９６】
本出願の一実施例は、インフルエンザ感染に反応した、宿主ＲＮＡの変化の検出である。製造者の指示に従ってＲＮＡ安定化溶液中に捕集された１００マイクロリットル（１００μＬ）の全血試料が、試料緩衝液６５２、例示的にはＦｉｌｍＡｒｒａｙ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ）と共に提供される試料緩衝液に加えられた。例示的には、３００〜９００μｌの、または試料の量の２〜５倍の試料緩衝液が使用されてもよい。この混合物は、次いで使い捨てのパウチ５１０に注入された。試料抽出、精製、逆転写反応、および２段階のポリメラーゼ連鎖反応が、健康対照者と比較して著しく亢進された、ウイルス感染に反応した宿主ＲＮＡの測定につながった。試料精製およびｑＰＣＲ分析のプロセス全体で要したのは７０分未満であった。
【００９７】
本出願の別の実施例は、抗凝固物質溶液（ＥＤＴＡ）中に捕集された全血からの宿主ＲＮＡの検出である。１００マイクロリットル（１００μＬ）のこの全血試料が、８００μＬの同じ試料緩衝液に加えられた。この混合物は、次いでパウチ５１０に注入された。試料抽出、精製、逆転写反応、および２段階のポリメラーゼ連鎖反応が、宿主ＲＮＡの測定につながった。試料精製およびｑＰＣＲ分析のプロセス全体で要したのは７０分未満であった。
【００９８】
これらの実施例は、核酸、例示的には種々のＲＮＡ分子、細菌、ウイルス、または他の微生物を含むがこれらに限定されない高コピー数の核酸は、溶解、例示的には化学的溶解および／または機械的溶解のみを用いて直接血液試料から抽出されてもよく、例示的にはシリカ基質への結合、および例示的には５回以下、または３回以下であるが少なくとも１回の洗浄によるシリカ基質からの溶出によって核酸を精製することが、本発明の範囲内であることを示す。これらの核酸は、遠心沈殿または酵素消化なしで、かつ多数繰り返される洗浄ステップなしで抽出および調製されてもよい。やはり示されているように、抽出されたこれらの核酸は、後に続く増幅用の鋳型として適している。
【００９９】
本発明は、その趣旨または本質的な特性から逸脱しない限り、他の特定の形態で具体化されてもよい。記載された実施形態は、あらゆる点において単に例示的なものであり、限定的なものではないと考えられるべきである。したがって、本発明の範囲は、上記の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。本発明を分かりやすく説明する目的で、いくつかの実施形態および細目が、本明細書および添付の発明の開示に含まれているが、添付の特許請求の範囲において定められる本発明の範囲から逸脱しない限り、本明細書で開示される方法および道具に種々の変更が加えられてもよいことは、当業者には明らかであろう。特許請求の範囲の均等物の意味および範囲に含まれるあらゆる変更が、特許請求の範囲に記載の範囲に含まれるべきである。
【図１】
2019502098.tif 000003
【図２】
2019502098.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019502098.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月30日(2017.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（今回補正）
スワブを使用して、生物学的物質または環境物質を含む試料を捕集するステップと、
捕集された前記試料を有する前記スワブを、試料緩衝液に入れるステップと、
前記試料をフィルタに通すステップとを含み、
２分を超える前処理ステップが存在しない、
試料捕集方法。
【請求項２】
プロテアーゼを有する前記試料緩衝液の中の前記試料と接触するステップをさらに含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項３】
前記スワブが、フロックドスワブである、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項４】
前記捕集するステップが、ピペッティングせずに、前記試料を試料容器から捕集するステップを含み、前記スワブが、４倍のボリューム範囲内の量の前記試料を吸収および放出するように構成される、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項５】
前記スワブが、２倍のボリューム範囲内で、前記生物学的物質または前記環境物質から前記試料を吸収および放出するように構成される、請求項４に記載の試料捕集方法。
【請求項６】
前記物質が、３ｃＰ以上の粘度を有する物質である、請求項４に記載の試料捕集方法。
【請求項７】
前記粘性の物質が、痰である、請求項６に記載の試料捕集方法。
【請求項８】
前記試料緩衝液が、前記試料緩衝液の体積で少なくとも１０％の量の界面活性剤を含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項９】
前記試料緩衝液が、前記試料緩衝液の体積で少なくとも１２％の量の界面活性剤を含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１０】
前記試料緩衝液が、前記試料緩衝液の体積で１２％〜１８％の範囲の量の界面活性剤を含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１１】
前記試料緩衝液が、試料緩衝液の体積で１５％のトリトン−Ｘを含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１２】
前記フィルタに通すステップが、プロテアーゼが存在する中で、フィルタを通して前記試料を引き込むステップを含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１３】
前記試料緩衝液が、アルコールを含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１４】
前記試料緩衝液が、アルコールを含まない、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１５】
前記試料が、試料マトリクスおよび病原体を含み、前記スワブが、前記病原体を前記試料緩衝液中に優先的に放出しながら、前記試料マトリクスを優先的に保持する、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１６】
（今回補正）
５分を超える前処理ステップのためのホールド時間が存在しない、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１７】
（取消）
２分を超える前処理ステップが存在しない、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１８】
（今回補正）
前記試料が、痰であり、前記痰が、前記入れるステップの前に、加熱処理またはＤＴＴ処理を施されない、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項１９】
前記試料緩衝液が、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択された界面活性剤を含む、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項２０】
前記生物学的試料または前記環境試料が、扱いにくい試料タイプである、請求項１に記載の試料捕集方法。
【請求項２１】
生物学的物質または環境物質を含む試料を捕集するステップと、
前記試料を試料緩衝液に入れるステップであって、前記試料緩衝液が、前記試料緩衝液の体積で少なくとも１０％の量の界面活性剤を含む、ステップと
を含む、試料捕集方法。
【請求項２２】
フィルタを通して前記試料を引き込むステップをさらに含む、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項２３】
プロテアーゼを有する前記試料緩衝液の中の前記試料と接触するステップをさらに含む、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項２４】
前記試料が、血液または血液製剤である、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項２５】
前記試料緩衝液が、アルコールを含まない、請求項２４に記載の試料捕集方法。
【請求項２６】
前記試料が、試料マトリクスおよび少なくとも１つの病原体を含み、フィルタに通すステップが、前記試料マトリクスを前記病原体から分離する、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項２７】
前記フィルタに通すステップが、５分を超える前処理ステップなしで前記試料マトリクスを前記病原体から分離する、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項２８】
前記試料が、痰であり、前記痰が、前記入れるステップの前に加熱処理されない、請求項２７に記載の試料捕集方法。
【請求項２９】
前記緩衝液が、約２〜約６のｐＨを有する、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項３０】
前記捕集するステップが、優先的には試料マトリクス上の微生物を捕集および放出する材料で、前記試料を含む試料マトリクスと接触するステップを含む、請求項２１に記載の試料捕集方法。
【請求項３１】
（今回補正）
試料マトリクス上の微生物を優先的に捕集および放出する材料で試料と接触することにより、生物学的物質または環境物質を含む前記試料を捕集するステップと、
捕集された前記試料を有する前記材料を試料緩衝液に入れるステップと、
前記試料を処理するステップであって、前記試料を処理する前に、２分を超える前処理ステップが存在しない、ステップと
を含む、試料捕集方法。
【請求項３２】
前記材料が、親水性材料である、請求項３１に記載の試料捕集方法。
【請求項３３】
固定的な量の前記材料が、再現性をもって４倍の範囲内の量の前記試料を吸収および放出する、請求項３２に記載の試料捕集方法。
【請求項３４】
前記材料が、スワブとして提供される、請求項３３に記載の試料捕集方法。
【請求項３５】
前記材料が、吸着性であり、スワブ、ブラシ、スポンジ、フィルタ、用具、ループおよび紙からなる群から選択される、請求項３３に記載の試料捕集方法。
【請求項３６】
前記試料をフィルタに通すステップをさらに含む、請求項３１に記載の試料捕集方法。
【請求項３７】
捕集された前記試料からの核酸を増幅条件に従わせるステップをさらに含む、請求項３１に記載の試料捕集方法。
【請求項３８】
一方の端部の上面と、対向する端部の下面と、内部バイアルボリュームを画定する、それらの間の外壁部とを有し、前記上面が、開口を有するバイアル本体、
前記下面から延在し、第１の端部と、第２の端部と、カニューレの容量を画定する、それらの間の外面とを有し、前記第１の端部が、前記内部バイアルボリュームと流体連通するカニューレ、
前記バイアル本体と前記カニューレの間に設けられるフィルタ、ならびに
前記カニューレ付きバイアルの中に提供される添加剤
を備える、カニューレ付きバイアル。
【請求項３９】
前記添加剤が、乾燥した形態で提供される、請求項３８に記載のカニューレ付きバイアル。
【請求項４０】
前記添加剤が、核酸を安定化する際に使用される、または試料溶解を開始するのに使用される材料の成分である、請求項３８に記載のカニューレ付きバイアル。
【請求項４１】
前記添加剤が、プロテアーゼである、請求項３８に記載のカニューレ付きバイアル。
【請求項４２】
試料を受けるように構成された開口と、
流体を保持するように構成された本体と、
前記流体が出ることを可能にするように構成された開口と、
前記本体と前記出口の間に設けられるフィルタと、
前記試料を処理するために提供される添加剤と
を備える、試料コンテナ。
【請求項４３】
前記添加剤が、乾燥されて前記試料コンテナ内に提供される、請求項４２に記載の試料コンテナ。
【請求項４４】
前記添加剤が、プロテアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ抑制薬、リボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ抑制薬、還元剤およびリゾチームからなる群から選択される、請求項４３に記載の試料コンテナ。
【請求項４５】
直接血液試料からの核酸を増幅する方法であって、
（ａ）前記直接血液試料を試料緩衝液に加えるステップと
（ｂ）前記試料緩衝液をビーズ破砕するステップと
（ｃ）前記試料緩衝液から前記核酸を抽出するステップと
（ｄ）前記核酸を増幅するステップと
を含む、方法。
【請求項４６】
ステップ（ｂ）〜（ｄ）が、閉じた試料容器の中で実施される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ａ）〜（ｄ）が、遠心沈殿、エタノール沈殿、およびＤＮＡ消化なしで実施される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸が、宿主のＲＮＡである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記直接血液試料が、ＲＮＡ安定化溶液中に捕集される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記直接血液試料が、ＲＮＡ以外の安定化溶液中に捕集される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記直接血液試料が、ステップ（ａ）の前に分離され、血液分画物が使用される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に、前記試料をフィルタに通すステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記核酸が、高コピー数で提供される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記核酸が、微生物由来のものである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記抽出するステップに続いて、前記核酸を洗浄するステップをさらに含み、前記洗浄するステップが、３回以下の洗浄を含む、請求項４５に記載の方法。
【国際調査報告】
2019502098.tif 000013
2019502098.tif 000014
2019502098.tif 000015