(57)【要約】  本開示は、インビボにおいて延長された半減期を有する、アポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）−Ｆｃ融合タンパク質に由来する、操作されたリン脂質またはリゾリン脂質（例えば、スフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ））シャペロンに関する。開示されるＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、内皮細胞および身体のすべての組織に、Ｓ１Ｐを送達する、安全で効率的かつ有効的な手段を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の結晶性断片（Ｆｃ）領域に融合しているアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項２】
ＡｐｏＭポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸２１−１８８を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＡｐｏＭポリペプチドが、配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
Ｆｃ領域がＡｐｏＭポリペプチドのアミノ末端に融合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
Ｆｃ領域がＡｐｏＭポリペプチドのカルボキシル末端に融合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
Ｆｃ領域が、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体、およびＩｇＤ抗体からなる群から選択されるＦｃ領域である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１−Ｆｃである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
リン脂質またはリゾリン脂質との複合体における請求項１に記載の融合タンパク質を含む、組成物。
【請求項９】
リン脂質が、ホスホコリンを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
リン脂質が、スフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ）を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が、融合タンパク質と、リン脂質またはリゾリン脂質とを混合すること、混合物をインキュベートして複合体を形成させること、および複合体を精製すること、により形成される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
リン脂質が、ホスホコリンを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
リン脂質が、スフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ）を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
対象の状態を処置する方法であって、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含み、ここで前記状態が、高血圧症、心臓の虚血、脳の虚血、加速性アテローム性動脈硬化症、非心臓性の再灌流障害および末梢血管疾患からなる群から選択される、前記方法。
【請求項１５】
前記高血圧症が、一次抵抗性高血圧症、二次抵抗性高血圧症、神経性高血圧症、妊娠高血圧症（妊娠高血圧腎症）、糖尿病性妊娠高血圧腎症、および慢性腎疾患の高血圧症からなる群から選択される状態を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記心臓の虚血が、心臓性の再灌流障害、心筋梗塞、急性冠症候群および狭心症からなる群から選択される疾患を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記非心臓性の再灌流障害が、肝虚血、腎虚血、腸管虚血、筋虚血からなる群から選択される虚血の結果としての障害を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
フィンゴリモドで処置される患者において、フィンゴリモドの副作用を低減させる方法であって、患者にＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質を投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年８月１５日に出願された米国仮出願第６２／３７５，０８８号に基づく優先権の利益を主張し、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号ＨＬ−８９９３４の下で政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の参照による組み込み
２０１７年８月９日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された、６ＫＢの33974_Seq_ST25.txtと命名されたＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
背景
内皮細胞機能は正常な心血管恒常性に必須である（Harrison, D. G., Basic research in Cardiology, 89 Suppl 1, 87-102 (1994); Pober, J. S. & Sessa, W. C, Nature Reviews. Immunology, 7, 803-815 (2007)）。心血管疾患および脳血管疾患の多くの環境的および内因性の危険因子は内皮機能不全を引き起こす。実際、機能不全の内皮は血管疾患の発症を引き起こすと考えられている（Girouard, H. & Iadecola, C, J. of App. Physiology, 100, 328-335 (2006)）。一方、様々な内在性因子は、内皮の健康を促進し、危険因子を打ち消す（Libby, P. et al., J. of the Am. Coll. of Cardio. 54, 2129-2138 (2009)）。そのような因子の１つは、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）である、多機能循環ナノ粒子である（Rosenson, R. S. et al., Nature Rev. Cardiology, 13, 48-60 (2016)）。
【０００５】
多数の疫学的研究は、血漿ＨＤＬレベルが、心血管疾患および脳血管疾患のリスクの減少（Hovingh, G. K. et al., Curr. Op. in Lipidology, 26, 127-132 (2015); Rader, D. J., Nature Med., 18, 1344-1346 (2012)）、ならびに虚血イベント後の転帰の改善（Makihara, N. et al., Cerebrovascular Diseases, 33, 240-247 (2012); Olsson, A. G. et al., European Heart Journal, 26, 890-896 (2005)）と相関していることを示している。しかしながら、コレステロールエステル転移タンパク質阻害剤またはナイアシン補給による総ＨＤＬコレステロールの薬理学的上昇は、心血管転帰を減少させなかった（Keene, D. et al., BMJ, 349, g4379 (2014)）。加えて、ＨＤＬ粒子は不均一であり、多数の生物活性因子を含み、そして血管機能、代謝機能および免疫機能を調節し（Rye, K. A., Journal of Lipid Research, 50 Suppl, S 195-200 (2009)）、このことは、ＨＤＬ粒子の特定のサブタイプが心血管系における独特の機能を調節することを示唆する。例えば、血漿アポリポタンパク質Ｍ含有ＨＤＬ（ＡｐｏＭ＋ＨＤＬ）が、Ｇタンパク質共役型Ｓ１Ｐ受容体に作用し、炎症応答を抑制し、血管バリア機能を維持する、生理活性脂質であるスフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の生理学的担体であることが最近実証されている（Christensen, P. M. et al., FASEB J., 30.6 (2016): 2351-2359 (2016); Christoffersen, C. et al., PNAS, 108, 9613-9618 (2011); Galvani, S. et al., Science Signaling, 8, ra79 (2015)）。Ｓ１Ｐ依存性免疫作用に関して、ＡｐｏＭ＋ＨＤＬは、二次リンパ器官からのリンパ球排出に要求されておらず、むしろ骨髄におけるリンパ球新生を抑止する（Blaho, V. A. et al., Nature, 523, 342-346 (2015)）。ＡｐｏＭを欠くマウスは、リポタンパク質代謝に変化を有し、そしてＬＤＬ受容体ヌルバックグラウンドにおいて増強されたアテローム性動脈硬化症を示す。加えて、ＡｐｏＭのアデノウイルス発現は、ＬＤＬ受容体ヌルマウスにおけるアテローム性動脈硬化症を抑制する（Wolfrum, C. et al., Nature Med., 11, 418-422 (2005); Christoffersen, C. et al., J. of Biol. Chem., 283, 1839-1847 (2008)）。血漿ＡｐｏＭは、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびコレステロールと正の相関がある一方で、急性心筋梗塞、内毒血症、糖尿病、代謝症候群およびＢＭＩと負の相関がある（Frej, C. et al., JCMM, 20.6 (2016): 1170-1181 (2016); Borup, A. et al., Current Opinion in Lipidology, 26, 48-55 (2015); Nielsen, L. B. et al., Trends in Endocrinology and Metabolism, 20, 66-71 (2009), Plomgaard, P. et al., Journal of Internal Medicine, 266, 258-267 (2009)）。まとめると、これらの観察は、ＡｐｏＭ＋ＨＤＬが内皮機能を促進すること、およびこのシグナル伝達経路が心血管疾患、炎症性疾患および代謝性疾患において損なわれていることを示唆する。
【０００６】
Ｄ−スフィンゴシンのリン酸化代謝物であるスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は、５つのＧタンパク質共役受容体（Ｓ１Ｐ１〜Ｓ１Ｐ５）に結合し、多くの生物学的作用を調節する（Garcia et al., J. Clin. Invest, 108:689-701 (2001); Ishii et al., Annu. Rev. Biochem., 73:321-354 (2004)）。特に、プロトタイプの（prototypical）Ｓ１Ｐ１受容体は発生中の血管成熟に必須であり、内皮細胞遊走、血管新生およびバリア機能を促進する（Liu et al., J. Clin. Invest, 106:951-961 (2000); Paik et al., J. Biol Chem., 276: 11830-11837 (2001); Lee et al., Cell, 99:301-312 (1999)）。したがって、Ｓ１Ｐは肺内皮のバリア特性の維持に要求される（Camerer et al., J. Clin. Invest, 119: 1871-1879 (2009)）。いくつかの細胞供給源に由来する血漿Ｓ１Ｐ（Pappu et al., Science, 316:295-298 (2007); Venkataraman et al., Circ. Res., 102:669-676 (2008)）は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）（約６５％）およびアルブミン（約３５％）と会合している（Aoki et al., J. Biochem., 138:47-55 (2005); Argraves et al., J. Lipid Res., 48:2325-2333 (2007)）。内皮に対する、ＨＤＬ誘導性血管弛緩作用ならびにバリア促進作用および生存促進（pro-survival）作用は、Ｓ１Ｐシグナル伝達に起因している（Kimura et al., J. Biol Chem., 281 :37457-37467 (2006); Nofer et al., J. Clin. Invest, 113:569-581 (2004); Argraves et al., J. Biol Chem., 283:25074-25081 (2008)）。従って、ＨＤＬの内皮保護作用の多くは内皮Ｓ１Ｐ受容体に対するＳ１Ｐの作用によるものである。
【０００７】
Ｓ１Ｐシャペロンであるアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）は、約２２ｋＤａのＨＤＬ関連アポリポタンパク質であり、主に血漿ＨＤＬ画分に存在するタンパク質のリポカリンファミリーメンバーである（XU et al., J. Biol Chem., 274:31286-31290 (1999)）。成熟ＡｐｏＭ（ヒトａｐｏＭ、配列番号９（GenBank登録番号：NP_061974.2）、およびマウスＡｐｏＭ、配列番号１０（GenBank登録番号：NP_061286.1））はシグナルペプチド（配列番号９および配列番号１０のアミノ酸１〜２１）を保持しており、これは、ＡｐｏＭをリポタンパク質のリン脂質層に付着させる脂質アンカーとして働き、それによってそれを循環に保ち、腎臓におけるＡｐｏＭの濾過を防止する（Christoffersen et al., J. Biol Chem., 283: 18765-18772 (2008)）。
【０００８】
ＡｐｏＭは、Ｓ１Ｐと会合する脂質結合ポケット、および、それがＨＤＬ粒子にアンカーすることを可能にする繋ぎ止められたシグナルペプチドを含む（Axler, O. et al., FEBS Letters 582, 826-828 (2008)）。その受容体へのＳ１Ｐ結合親和性はＡｐｏＭよりも高く、これはおそらくシャペロンからのＳ１Ｐ放出とそれに続く受容体会合および活性化を可能にする（Christoffersen, C. et al., PNAS, 108, 9613-9618 (2011); Sevvana, M. et al., Journal of Molecular Biology, 404, 363-371 (2010); Lee, M. J. et al., Science, 279, 1552-1555 (1998)）。最近の研究は、ＨＤＬ結合Ｓ１Ｐが内皮Ｓ１Ｐ１受容体に対して「偏ったアゴニスト（biased agonist）」として作用することを示しており、これは下流応答のサブセットのみが活性化されることを意味する（Galvani, S. et al., Science Signaling, 8, ra79 (2015)）。ＨＤＬ結合Ｓ１Ｐは、内皮の生存、遊走、血管新生、ＮＯ産生および炎症応答の阻害に重要である（Galvani, S. et al., Science Signaling, 8, ra79 (2015); Nofer, J. R. et al., JC1, 113, 569-581 (2004); Nofer, J. R. et al., JBC, 276, 34480-34485 (2001); Kimura, T. et al., JBC, 281, 37457-37467 (2006)）。加えて、ＨＤＬ結合Ｓ１Ｐは、ＨＤＬ受容体（ＳＲ−Ｂ１など）およびＳ１Ｐ受容体の両方を、ＮＯ合成の刺激、内皮障害および炎症の阻害などの特定の生物学的応答の誘発に従事させていると考えられる（Sato, K., World Journal of Biological Chemistry, 1, 327-337 (2010)）。
【発明の概要】
【０００９】
開示の概要
１つの側面において、本開示は、抗体の結晶性断片（Ｆｃ）領域に融合しているアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）ポリペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。
【００１０】
いくつかの態様において、ＡｐｏＭポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸２１−１８８を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭポリペプチドは、配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、Ｆｃ領域は、ＡｐｏＭポリペプチドのアミノ末端に融合している。いくつかの態様において、Ｆｃ領域は、ＡｐｏＭポリペプチドのカルボキシル末端に融合している。
【００１２】
いくつかの態様において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体、およびＩｇＤ抗体からなる群から選択されるＦｃ領域である。特定の態様において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１−Ｆｃである。
【００１３】
別の側面において、本開示は、リン脂質またはリゾリン脂質との複合体におけるＡｐｏＭ融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【００１４】
いくつかの態様において、リン脂質は、ホスホコリンを含む。いくつかの態様において、リン脂質は、スフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ）を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、組成物は、融合タンパク質と、リン脂質またはリゾリン脂質とを混合すること、混合物をインキュベートして複合体を形成させること、および複合体を精製すること、により形成される。
【００１６】
さらに別の側面において、本開示は、対象の状態を処置する方法であって、リン脂質またはリゾリン脂質との複合体におけるＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質を含む組成物を対象に投与することを含み、ここで前記状態が、高血圧症、心臓の虚血、脳の虚血、加速性アテローム性動脈硬化症、非心臓性の再灌流障害および末梢血管疾患からなる群から選択される、前記方法を提供する。
【００１７】
いくつかの態様において、前記高血圧症は、一次抵抗性高血圧症（primary resistant hypertension）、二次抵抗性高血圧症（secondary resistant hypertension）、神経性高血圧症、妊娠高血圧症（妊娠高血圧腎症）、糖尿病性妊娠高血圧腎症、および慢性腎疾患の高血圧症からなる群から選択される状態を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、前記心臓の虚血は、心臓性再灌流障害、心筋梗塞、急性冠症候群および狭心症からなる群から選択される疾患を含む。
【００１９】
いくつかの態様において、前記非心臓性の再灌流障害は、肝虚血、腎虚血、腸管虚血、筋虚血からなる群から選択される虚血の結果としての障害を含む。
【００２０】
さらなる側面において、本開示は、フィンゴリモドで処置される患者において、フィンゴリモドの副作用を減少させる方法であって、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質を患者に投与することを含む、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
図面の簡単な説明
【図１Ａ−１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｅ。ＡｐｏＭ−ＦｃおよびＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ融合タンパク質の生産、精製、およびそれらによるＳ１Ｐ結合の特徴付け。（Ａ）（左パネル）ＡｐｏＭに結合したＳ１Ｐの共結晶構造。Ｓ１Ｐの頭部基領域と接触する３つの残基であるＲ９８、Ｗ１００およびＲ１１６が標識されている。（右パネル）ＡｐｏＭ分子におけるＳ１Ｐの頭部基領域の空間充填モデル。（Ｂ）ＡｐｏＭ−ＦｃおよびＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ融合タンパク質を発現させ、記載されるようにＨＥＫ２９３またはＳｆ９細胞の条件培地から精製した。精製された材料を非還元または還元１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗ＡｐｏＭ免疫ブロットによって検出した。（Ｃ）Ｓｆ９由来の精製されたタンパク質（５μｇ）を、還元１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてクーマシーブルーで染色した。
【図１Ｄ−１Ｅ】（Ｄ）精製されたＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｆｃ）、ＡｐｏＭ−Ｆｃ、またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭを、Ｓ１Ｐ結合について、記載されるように蛍光分光蛍光分析によって分析した（Ｎ＝４、平均（＋Ｓ．Ｄ．）として表される）。データをスチューデントのｔ検定および二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＡｐｏＭ−ＦｃまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭをＦｃ単独と比較するボンフェローニの事後検定によって分析した（ＡｐｏＭ−Ｆｃ（＊＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（ｎｓ；有意ではない））。（Ｅ）精製されたＡｐｏＭ−ＦｃおよびＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（５μＭ）をＳ１Ｐと２４〜４８時間インキュベートし、またはしないで、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、そしてエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によりスフィンゴ脂質について分析した。得られたデータを平均（＋Ｓ．Ｄ．）として表す；Ｎ＝４。
【００２２】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ〜２Ｄ。ＡｐｏＭ−ＦｃはＳ１Ｐ受容体を活性化する。（Ａ）増加用量のアルブミン（Ａｌｂ）−Ｓ１Ｐ、ＡｐｏＭ−ＦｃまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭを、Ｓ１Ｐ１−ＧＦＰシグナル伝達マウスから単離したＭＥＦ細胞と２４時間インキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｂ）（Ａ）からの結果の定量分析。Ｎ＝３、平均（＋Ｓ．Ｄ．）として表される。データを二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＡｐｏＭ−ＦｃまたはＢＳＡ−Ｓ１ＰをＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭと比較するボンフェローニの事後検定によって分析した（＊＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊、Ｐ＜０．０１）。
【図２Ｃ】（Ｃ）Ｓ１Ｐ１またはＳ１Ｐ２で安定に形質導入された、またはされていないＣＨＯ細胞を、アルブミン−Ｓ１Ｐ（１００ｎＭ Ｓ１Ｐ）、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ（６〜１２μｇ／ｍｌ；６０〜１２０ｎＭ Ｓ１Ｐ）またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（１２μｇ／ｍｌ）を用いて５分間処置し、ｐ４４／４２ ＥＲＫおよびＡｋｔについて免疫ブロット分析により分析した。Ｎ＝３；代表的なブロットが示される。
【図２Ｄ】（Ｄ）ＨＵＶＥＣ（左パネル）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のＳ１Ｐ１ ＫＯ ＨＵＶＥＣ（中央および右パネル）をアルブミン（Ａｌｂ）−Ｓ１Ｐ（３３３ｎＭ Ｓ１Ｐ）、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ（２０μｇ／ｍｌ；２４０ｎＭ）またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（２０μｇ／ｍｌ）で指示された時間処置し、そしてｐ４４／４２ ＥＲＫ、ＡｋｔおよびｅＮＯＳの活性化について免疫ブロット分析によって分析した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のＳ１Ｐ１ ＫＯ ＨＵＶＥＣをビヒクル（ＤＭＳＯ）、またはＳ１Ｐ２阻害剤ＪＴＥ−０１３（１０μＭ）、またはＳ１Ｐ３阻害剤ＴＹ５２１５６（１０μＭ）、または両方を含む、または含まずに、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ（２０μｇ／ｍｌ；２４０ｎＭ Ｓ１Ｐ）で処置し、ｐ４４／４２ ＥＲＫおよびＡｋｔの活性化について免疫ブロット分析によって分析した。Ｎ＝２〜３；代表的なブロットが示される。
【００２３】
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｃ。Ｓ１Ｐ受容体エンドサイトーシスおよび内皮細胞バリア機能に対するＡｐｏＭ−Ｆｃの効果。（Ａ）記載されるようなＴＥＥＲのリアルタイム測定により、ＨＵＶＥＣをバリア機能について分析した。時間０において、Ａｌｂ−Ｓ１Ｐ（２００ｎＭ）またはＡｐｏＭ−Ｆｃ（２０μｇ／ｍｌ；２００ｎＭ）またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（２０μｇ／ｍｌ）のいずれかを添加した。すべてのデータをＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭのベースラインと比較した（Ｎ＝３；平均（＋Ｓ．Ｅ．Ｍ）として表される、ｔ検定、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；二元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）ＨＵＶＥＣまたはＳ１Ｐ１ ＫＯ ＨＵＶＥＣ（Ｓ１Ｐ１−ＣＲＩＳＰＲ）をＡｐｏＭ−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ；１００ｎＭ）で処置し、記載されるようにＴＥＥＲのリアルタイム測定によりバリア機能について分析した（ｔ検定、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）。（Ｃ）Ｓ１Ｐ１−ＧＦＰを発現するＵ２ＯＳ細胞を、指示される濃度のＦＴＹ７２０−Ｐ、ＢＳＡ−Ｓ１Ｐ、ＡｐｏＭ−ＦｃまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭで、３７℃で３０分間処置し、固定し、受容体内部移行（internalization）を記載されるように定量した。すべてのデータをＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭのベースラインと比較した（Ｎ＝２、ｎ＝８；平均（＋ｓ．ｅ．ｍ）として表される、ｔ検定 ＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０１）。
【００２４】
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ。血漿Ｓ１Ｐレベルおよび循環造血細胞に対するＡｐｏＭ−Ｆｃ投与の効果。（Ａ）ＷＴマウスを４ｍｇ／ｋｇの精製されたＡｐｏＭ−ＦｃまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（Ｎ＝４）で腹腔内注射により処置し、そして血漿ＡｐｏＭレベルを記載されるように免疫ブロット分析により決定した。（Ｂ）Ａｐｏｍ−／−マウス（Ｎ＝４、平均（＋Ｓ．Ｄ．）として表される）にＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ（４ｍｇ／ｋｇ）を投与し、投与の２４時間後に血漿スフィンゴ脂質を記載されるように定量した。（Ｃ）ＷＴマウス（Ｎ＝４、平均（＋Ｓ．Ｄ．）として表される）に、４ｍｇ／ｋｇの精製されたＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１ＰまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭを腹腔内注射によって投与し、そして投与の２４時間後に血漿スフィンゴ脂質を記載されるように定量した。ＢおよびＣについては、両側スチューデントのｔ検定によりデータを分析した（＊ｐ＝０．０５；＊＊ｐ＜０．０１＊＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図４Ｄ−４Ｇ】（Ｄ）〜（Ｇ）ＷＴマウスにＰＢＳ（Ｎ＝５）、４ｍｇ／ｋｇの精製されたＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ（Ｎ＝５）またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（Ｎ＝５）のいずれかを腹腔内注射により投与し、注射の６および２４時間後に血液を回収した。血液細胞を遠心分離によって単離し、リンパ球（Ｄ）、白血球（ＷＢＣ）（Ｅ）、赤血球（ＲＢＣ）（Ｆ）および血小板（Ｇ）を臨床グレードのサイトメトリーによって定量した。相対的な血液細胞カウントにおいて観察された変動は、二元配置ＡＮＯＶＡによって判断されるように統計的に有意ではなかった。
【００２５】
【図５Ａ−５Ｅ】図５Ａ〜図５Ｅ。ＡｐｏＭ−Ｆｃ投与は、マウスにおいて持続した血圧降下効果をもたらす。（Ａ）収縮期血圧（ＳＢＰ）を、ビヒクル（ＰＢＳ）（Ｎ＝２）または４ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＭ−Ｆｃ（Ｎ＝６）またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（Ｎ＝４）のいずれかを腹腔内注射により投与したＡｎｇＩＩ処置マウスにおいて指定された回数測定した。（Ｂ）ＡｎｇＩＩ処置マウスに、２４時間毎に（矢印）Ｓ１Ｐ１アンタゴニストＷ１４６（１０ｍｇ／ｋｇ）を注射し、続いてＳＢＰを測定した（Ｎ＝５、５）。（Ｃ）ＡｐｏＭ−ＦｃまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭをＡｎｇＩＩ処置マウス（Ｎ＝６）に２４時間投与し、そして血漿亜硝酸塩レベルを記載されるように測定した。（Ｄ）ビヒクル（ＰＢＳ）（Ｎ＝２）または４ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＭ−Ｆｃ（Ｎ＝６）またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（Ｎ＝４）のいずれかを腹腔内注射によって投与した正常血圧マウスにおいてＳＢＰを測定した。（Ｅ）ＷＴ（Ｎ＝１２）またはＡｐｏｍ−／−（Ｎ＝１１）マウスにおいて、ＳＢＰを、記載されるように測定した。すべてのデータは平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表される；野生型（ＷＴ）と比較して＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ａ〜Ｄ）。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニの事後検定または一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。
【００２６】
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ〜図６Ｈ。ＡｐｏＭ−Ｆｃ投与は、心臓および脳における虚血／再灌流障害を軽減する。心筋虚血／再灌流手術の３０分前に、ＷＴマウスにＰＢＳまたは４ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＭ−Ｆｃ（Ｎ＝９）またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（Ｎ＝９）のいずれかを静脈内注射により投与した。動物を３０分間の虚血、その後２４時間の再灌流に供した。（Ａ）危険面積（ＡＡＲ）／左心室（ＬＶ）面積および梗塞／ＡＡＲ面積の定量的測定を、盲検方式で以下のコホート、ＰＢＳ（Ｎ＝７）、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（Ｎ＝９）およびＡｐｏＭ−Ｆｃ（Ｎ＝９）で実施した。（Ｂ）心臓切片をＬｙ６ＧおよびＩＢ４抗体で染色し、そして好中球および毛細血管密度を定量した。Ｎ＝９。（Ｃ）ＬＶ拡張終期直径（ＬＶＤｄ）、ＬＶ収縮終期（ＬＶＤｓ）直径、および短縮率（ＦＳ）を、心筋Ｉ／Ｒ損傷後の指定された時点で測定した（ｎ＝６）。データは平均±ＳＥＭとして表される。ＡｐｏＭ−Ｆｃ群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６Ｄ−６Ｈ】（Ｄ）マウスを中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）による６０分間の局所脳虚血に供した。再灌流直後に、４ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＭ−Ｆｃ（Ｎ＝１０）、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（Ｎ＝１０）、またはＰＢＳ（Ｎ＝１０）のいずれかをマウスに腹腔内注射した。（Ｅ）梗塞および浮腫の比率は、画像分析によって計算され、そして非虚血性半球の比率として報告された。梗塞率は浮腫について補正された。（Ｆ）浮腫について補正されたｍｍ３での総梗塞体積。（Ｇ）神経学的欠損スコアを再灌流の２３時間後に評価した。（Ｈ）ＭＣＡＯ手術の間、中大脳動脈（ＭＣＡ）領域内の相対的脳血流（ｒＣＢＦ）をレーザースペックルにより測定した。閉塞の間（「Ｉ」として示される）および再灌流後（「Ｒ」として示される）の相対的ＣＢＦ（対側の％、ＣＬ）を示す。個々の値および平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．が示される。＊Ｐ＜０．０５（一元配置ノンパラメトリックＡＮＯＶＡとそれに続くダンの検定）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
定義
本明細書で用いられる場合、用語「約」は、所与の値からのおおよそ±１０％の変動を指す。
【００２８】
用語「急性冠症候群」（ＡＣＳ）は、心筋の一部が適切に機能できないかまたは死滅するような冠動脈内の血流の減少に起因する症候群を指す。ＡＣＳの最も一般的な症状は、しばしば左肩や顎の角度まで広がる胸痛であり、吐き気や発汗を伴う。急性冠症候群は通常、３つの問題のうちの１つによって引き起こされる：ＳＴ上昇型心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ、症例の３０％）、非ＳＴ上昇型心筋梗塞（ＮＳＴＥＭＩ、症例の２５％）、または不安定狭心症（症例の３８％）。
【００２９】
用語「狭心症」は、心筋のある領域が十分な酸素を得られないときに起こる胸痛または不快感を指す。
【００３０】
用語「アテローム性動脈硬化症」は、これらに限定されないが、冠動脈、大動脈、腎動脈、頸動脈、および四肢および中枢神経系に血液を供給する動脈を含む、身体および身体の器官の、動脈および細動脈の１つまたはいくつかの狭窄および／または閉塞をもたらす、マクロファージ、平滑筋細胞および他の種類の細胞における、コレステロールおよびコレステリルエステルならびに関連する脂質の異常な蓄積をもたらす病理学的過程を指す。この病理学的過程の関連する炎症反応および媒介物質もこの定義に含まれる。
【００３１】
本明細書中で用いられる場合、用語「慢性腎疾患」（ＣＫＤ）は、数ヶ月または数年にわたる腎機能の進行性喪失を指す。ＣＫＤは、当技術分野においてその一般的な意味を有し、腎臓、腎臓実質の破壊および機能性ネフロンまたは糸球体の喪失に影響を及ぼす多数の状態を分類するために用いられる。ＣＫＤは様々な原因から生じ得るが、最終経路は腎線維症のままであることにさらに留意すべきである。ＣＫＤの病因の例としては、これらに限定されないが、心血管疾患、高血圧症、糖尿病、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、および腎移植片拒絶反応を含む。
【００３２】
用語「結晶性断片領域（Ｆｃ領域）」は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体および補体系のいくつかのタンパク質と相互作用することができる抗体の重鎖のカルボキシ末端領域を指す。
【００３３】
用語「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」は、直接またはアミノ酸リンカーを介してのいずれかで共有結合的に連結した少なくとも２つの異種ポリペプチドを有するタンパク質を指す。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、典型的にはＣ末端からＮ末端に連結しているが、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端、またはＮ末端からＣ末端にも連結され得る。融合タンパク質のポリペプチドは任意の順序であり得、そして構成ポリペプチドのいずれかの１超、または両方を含み得る。本明細書中で用いられる場合、用語「宿主細胞」は、ポリペプチドの生産のための組み換え発現ベクターがポリペプチドの発現のためにトランスフェクトされ得る細胞または細胞株を指す。
【００３４】
用語「高血圧症」は、血管内の血圧が、それが身体を通って循環するにつれて正常よりも高い状態を指す。安静時の正常血圧は、収縮期１００〜１４０ミリメートル水銀（ｍｍＨｇ）および拡張期６０〜９０ｍｍＨｇの範囲内である。ほとんどの成人について、安静時血圧が持続的に１４０／９０ｍｍＨｇ以上である場合、高血圧症が存在する。
【００３５】
高血圧症は、「本態性」（一次性）または「二次性」として分類される。本態性（一次性）高血圧症には明白な原因はない。それは、家族歴やライフスタイルなどに起因している可能性がある。高血圧を有するほとんどの人は本態性高血圧症である。一方、二次性高血圧症はあまり一般的ではなく、クッシング症候群、高アルドステロン症、および褐色細胞腫などの副腎の障害；多嚢胞性腎疾患、腎臓腫瘍、腎不全、または腎臓に供給する主動脈の狭窄もしくは閉鎖を含む腎臓疾患；コルチコステロイド（プレドニゾンなどの抗炎症薬）、非ステロイド系抗炎症薬、減量薬（フェンテルミンなど）、プソイドエフェドリンなどの鬱血除去薬を含む風邪治療剤、避妊薬（エストロゲン成分）、および片頭痛治療剤などの薬；睡眠時無呼吸;大動脈の縮窄、大動脈が狭くなっている先天性欠損症；子癇前症、妊娠に関連する状態、甲状腺と副甲状腺の問題；などの別の状態の結果である。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、用語「虚血」は、それを供給する血管の収縮または閉鎖によって引き起こされる、身体の一部への不適切なまたは止められた血流を指す。
【００３７】
用語「脳の虚血」は、脳への血液供給の絶対的または相対的な不足を指し、その結果、脳組織、特に中枢神経細胞の損傷または機能不全を伴う。
【００３８】
用語「心臓の虚血」は、不整脈状態、例えば、心室性不整脈、心室細動、および細胞死滅をもたらし得る心臓組織への血流の減少を指す。そのような不整脈状態は、正常心臓細胞と虚血障害心臓細胞との間に作り出された非同期の興奮性状態の結果であり、それは次に心臓組織内の正常なイオン輸送チャネルの混乱を引き起す。
【００３９】
本明細書で用いられる場合、用語「心筋梗塞」（「心臓発作」としても知られる）は、心臓の一部への血液供給が欠乏したときに突然起こる急性の心血管イベントを指し、著しい持続的な虚血による心筋細胞壊死の実証によって定義される。
【００４０】
用語「末梢血管疾患」または「ＰＶＤ」は、末梢アテローム性動脈硬化症または閉塞性動脈硬化症を指し、これはアテローム硬化性プラークによる四肢への血液供給の閉塞を含み、間欠性跛行（血流が少なすぎることにより引き起こされる疼痛）を包含する。
【００４１】
用語「リン脂質」は、脂肪酸およびグリセロールまたはアミノアルコールスフィンゴシンに付着したリン酸含有化合物から誘導された化合物を指し、脂溶性および水溶性領域を有する化合物をもたらす。用語「リゾリン脂質」は、一方または両方のアシル基が加水分解によって除去されている、リン脂質の誘導体を指す。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、用語「子癇前症」は、妊娠中に起こる状態を指し、その主な症状は、尿中のタンパク質の存在および浮腫（腫脹）をしばしば伴う、様々な形態の高血圧である。時折、妊娠中毒症とも呼ばれる子癇前症は、「子癇」と呼ばれるより重篤な障害に関連しており、これは、脳卒中とともに子癇前症である。これらの状態は、妊娠の後半（２０週後）に通常発症するが、出産直後または妊娠２０週前に発症する可能性もある。
【００４３】
用語「抵抗性高血圧症」は、異なるクラスの３つの降圧剤（そのうちの１つは利尿薬である）を同時に使用したにもかかわらず、正常を上回ったままである血圧を指す。
【００４４】
本明細書中で用いられる場合、用語「組み換えタンパク質」は、宿主細胞に導入されている組み換え発現ベクター上で運ばれる遺伝子の転写および翻訳の結果として生産されるタンパク質を指す。
【００４５】
用語「再灌流障害」は、虚血の期間の後に血流が組織に戻るときに引き起こされる組織損傷を指す。
【００４６】
用語「対象」または「患者」は、疾患と診断され、そして本発明の方法で処置されるヒト種を含む動物を指す。用語「対象」または「患者」は、一方の性別が特に指定されていない限り、男性と女性の両方の性別を指すことを意図する。
【００４７】
用語「スフィンゴシン−１−リン酸」（Ｓ１Ｐ）は、リゾスフィンゴ脂質としても知られるシグナル伝達スフィンゴ脂質を指す。Ｓ１Ｐはまた、生物活性脂質媒介物質とも呼ばれる。スフィンゴ脂質は、概して、スフィンゴシンである特定の脂肪族アミノアルコールによって特徴付けられるクラスの脂質を形成する。Ｓ１Ｐは以下の化学構造：
【化１】
2019531336.tif 000002
および、化学名「（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−４−オクタデセン−１，３−ジオール１−ホスファート、Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン１−ホスファート」を有する。Ｓ１Ｐは、当技術分野において知られているプロトコール、例えば、Reimann, C. and Graeler, M. H.（Bio-protocol, (2016), 6(10): el817. DOI: 10.21769/BioProtoc. l817）に記載されるプロトコールに従って、組織試料、細胞、またはヘパラン化血液に由来する血漿から抽出および精製することができる。精製されたＳ１Ｐは、例えば、Sigma-Aldrich（Catalog #:S9666）から、VWR（Catalog #: AAJ66459-LB0)から、またはTocris Bioscience（Catalog #: 1370）から入手することもできる。
【００４８】
一般的な説明
Ａｐｏ−Ｆｃ融合タンパク質
ＨＤＬと会合しない遊離のＡｐｏＭは、極めて短い半減期（例えば、１５分未満のインビボ半減期）を有する（Faber, K. et al., Molecular Endocrinology, 20, 212-218, (2006)）。本開示に従って、本発明者らは、アポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）タンパク質の半減期が、抗体の結晶性断片（Ｆｃ）領域などの融合パートナーと融合した場合に、有意に増加することを発見した（例えば、９６時間を超えるインビボ半減期）。特定の理論に拘束されることなく、Ｆｃドメインはプロテオソームによるその分解を防止することによってＡｐｏＭの安定性を改善する。本明細書に開示されるＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、インビボで生物活性リン脂質の血漿レベルを上昇させるために機能的かつ有効的であることが示されている。開示されるＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、高度に精製された形態で組み換え的に生産され得、そして精製されたＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、精製された天然のＡｐｏＭタンパク質よりも長い期間、緩衝食塩水中で貯蔵することができる。ＡｐｏＭ融合タンパク質はまた、それを必要とする器官および組織にリン脂質を送達するために使用され得る。
【００４９】
したがって、１つの側面において、本開示は、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、二量体として提供される。いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ二量体は、Ｆｃ領域間のジスルフィド結合を介して形成される。
【００５０】
本開示にしたがって、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質中の「ＡｐｏＭ」は、Ｓ１Ｐ結合能力を保持する天然の成熟ＡｐｏＭタンパク質の部分を含む任意のＡｐｏＭポリペプチドを指す。１つの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質中のＡｐｏＭポリペプチドは、ヒトＡｐｏＭポリペプチドである。特定の態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質中のＡｐｏＭポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸２１−１８８を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質中のＡｐｏＭポリペプチドは、配列番号９における全長の成熟ＡｐｏＭタンパク質を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質中のＡｐｏＭポリペプチドは、ＡｐｏＭポリペプチドがＳ１Ｐ結合能力を保持することを条件として、天然のＡｐｏＭタンパク質または天然のＡｐｏＭタンパク質断片と比較して、１以上のアミノ酸残基の欠失、付加、修飾または置換を含有する。例えば、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質中のＡｐｏＭポリペプチドは、配列番号９と、または配列番号９のアミノ酸２１−１８８と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００５１】
いくつかの態様において、本明細書で使用されるＦｃ領域は、少なくとも、免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３を含む。いくつかの態様において、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。ヒンジは、Ｆｃ融合タンパク質の２つの部分間の柔軟なスペーサーとして働き、分子の各部分が独立して機能することを可能にし得る。いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質中のＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤから選択される免疫グロブリンのＦｃ領域である。特定の態様において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１のＦｃ領域（ＩｇＧ１−Ｆｃ）である。いくつかの態様において、Ｆｃ領域は、ＡｐｏＭのアミノ末端に融合され、他の態様においては、Ｆｃ領域は、ＡｐｏＭのカルボキシル末端に融合される。いくつかの態様において、Ｆｃ領域は、直接的に、すなわちリンカーを介すことなくＡｐｏＭタンパク質に融合される。他の態様において、Ｆｃ領域は、リンカーを介してＡｐｏＭタンパク質に融合される。前記リンカーがＡｐｏＭペプチドのＦｃ領域への化学的連結を可能にすることを条件に、任意の種類のリンカーが当業者によって使用され得る。本開示に好適なリンカーは、タンパク質ドメイン間に存在する短いペプチド配列であり得る。いくつかの態様において、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に動くことができるように、リンカーはグリシンおよびセリンのような柔軟な残基から構成される。
【００５２】
いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、好適な宿主細胞中で組み換え的に生産され得る。適切な宿主細胞は、細菌、古細菌、真菌、特に酵母、および植物、昆虫および動物の細胞、特に哺乳動物の細胞を含む。宿主細胞の特定の例は、E. coli、B. subtilis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces carlsbergensis、Schizosaccharomyces pombe、Pichia pastoris、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Neurospora、およびＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、および不死化哺乳動物骨髄およびリンパ細胞株を含む。特定の態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、Sevvana et al.（J. Mol. Biol. 393: 920-936 (2009)）により記載されるように、E. coliにおいて発現され、封入体から回収され、精製され（例えば、クロマトグラフィーにより）、リフォールディングされ得る。別の特定の態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸コンストラクトを含むバキュロウイルスの株で感染させたｓｆ９昆虫細胞において発現させることができる。
【００５３】
別の態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、例えばLife Technologyまたは他の適切な供給源を通じて市販されている、インビトロ無細胞翻訳システムを使用して生産される。原核生物および真核生物の両方の無細胞翻訳システムを使用することができる。典型的には、無細胞翻訳システムは、翻訳に要求される巨大分子成分（例えば、７０Ｓまたは８０Ｓリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、開始、伸長および終結因子）を含有する、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽およびE. coliなどの、高速度のタンパク質合成に携わる細胞から調製された抽出物を利用する。抽出物は、一般に、アミノ酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ）、エネルギー再生系（真核生物系のためのクレアチンリン酸およびクレアチンホスホキナーゼ、ならびにE.coli溶解物のためのホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼ）、および他の補因子（Ｍｇ２＋、Ｋ＋など）で補われる。網状赤血球溶解物および小麦胚芽抽出物などのいくつかの翻訳システムが鋳型としてＲＮＡを使用する一方で、他のシステムはＤＮＡ鋳型で開始し、それをＲＮＡに転写し、次いで翻訳する。すべてのこれらシステムはインビトロでのＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質の合成における使用に好適である。
【００５４】
いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、好適なタンパク質精製技術を用いて精製される。特定の態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、クロマトグラフィーを用いて精製される。いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質精製は、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーまたは拡張床（expanded bed）吸着クロマト分離法を含む。特定の態様において、クロマトグラフィー法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、アフィニティータグ精製を通じて精製され得る。特定の態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、ポリ−Ｈｉｓタグでタグ付けられ、ニッケルアフィニティー精製により精製され得る。別の態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、ＮＥタグ、Ｖ５タグもしくはＶＳＶタグから選択されるタグ、または当該技術分野において知られている任意の他のタグでタグ付けられ、次いで、タグに対する抗体を用いて精製され得る。
【００５５】
ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質の純度は、これらに限定されないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く銀染色、およびクロマトグラフィー、およびFrank J. et al., Anal Biochem. Apr; 162(l):65-73 (1987)により記載される多波長検出を含む様々な方法により評価され得る。
【００５６】
精製されたＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、ビトロまたはインビボ使用のために緩衝食塩水中に維持され得る。
【００５７】
いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、タンパク質の所望の生物学的品質をさらに改善するために、担体またはビヒクルに共有結合的に連結させるか、または付着させてもよい。特定の態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質の所望の生物学的品質は、バイオアベイラビリティーの増加、またはインビボでのタンパク質の血漿半減期の増加もしくは延長を含む。特定の態様において、担体はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはナノ粒子を含む。
【００５８】
ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質とリン脂質またはリゾリン脂質との複合体を含む組成物
本開示はさらに、リン脂質またはリゾリン脂質との複合体においてＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、複合体は、ＡｐｏＭ融合タンパク質とリン脂質との間で形成され、ここで融合タンパク質は非共有結合的相互作用を介してリン脂質に結合する（すなわち、それにより結合される）。リン脂質は天然では水に溶解せず、溶液中で膜またはミセルを形成する。いかなる特定の理論にも拘束されないが、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、リン脂質の疎水性部分に結合してそれをマスキングすることによって、溶液中のリン脂質の溶解度を増加させる。それゆえ、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、血液などの水性媒体中でのリン脂質の輸送を可能にし、それによってリン脂質の担体として作用する。
【００６０】
いくつかの態様において、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、またはそれらの組み合わせから選択することができる。
【００６１】
いくつかの態様において、組成物のリゾリン脂質は、天然に存在するリゾリン脂質、合成リゾリン脂質、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、リゾリン脂質は、極性基（例えば、ホスホコリン基）が結合しているグリセロール骨格、グリセロール骨格の２位における遊離のヒドロキシ基、およびグリセロール骨格に付着している飽和または不飽和脂肪酸残基を含む。いくつかの態様において、リゾリン脂質の脂肪酸残基は、Ｃｎ−アルキル鎖またはＣｎ−アルケニル鎖（式中、ｎ＞４である）を有する。特定の態様において、リゾリン脂質は、酸化脂肪酸残基（oxidized fatty acid residue）を含む。
【００６２】
いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質とリン脂質またはリゾリン脂質との複合体は、融合タンパク質を、メタノール、ベータ−シクロデキストランまたはＤＭＳＯに懸濁したリン脂質またはリゾリン脂質と混合することによって形成することができる。いくつかの態様において、融合タンパク質は、約１：２〜１：５０の比（μｍｏｌｅ融合タンパク質／μｍｏｌｅリン脂質またはリゾリン脂質）で脂質と混合される。いくつかの態様において、メタノール、ベータ−シクロデキストランまたはＤＭＳＯ中の比（μｍｏｌｅ融合タンパク質／μｍｏｌｅリン脂質またはリゾリン脂質）は、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０である。特定の態様において、前記比は１：８である。融合タンパク質−脂質混合物は、約４〜３７℃で２４〜４８時間インキュベートされ得る。いくつかの態様において、インキュベーション温度は、約２℃、４℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、または４０℃である。いくつかの態様において、インキュベーション時間は約２４時間、３０時間、３６時間、４２時間または４８時間である。
【００６３】
ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質／リン脂質またはリゾリン脂質複合体は、既知の技術、例えばクロマトグラフィーを使用して、遊離／未結合の脂質を除去するために、精製され得る。特定の態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質−リン脂質複合体の精製は、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーまたは拡張床吸着クロマト分離法を含む。いくつかの態様において、複合体は、ＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）装置を用いて精製され得る。特定の態様において、クロマトグラフィー法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー、タンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィー、またはゲルろ過クロマトグラフィーである。
【００６４】
精製されたＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質−リン脂質またはリゾリン脂質複合体は、Sommer, U. et al.（Journal of lipid Research, 47(4), 804-814 (2006)）およびChristoffersen, C. et al.（PNAS, 108, 9613-9618, (2011)）に記載されるような液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって液体含量について分析され得る。
【００６５】
いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質に対するＳ１Ｐ結合は、以前に記載されているような（Sevvana, M. et al., Journal of Molecular Biology, 404, 363-371 (2010)）蛍光分光光度計における固有のトリプトファン蛍光消光によって決定することができる。
【００６６】
いくつかの態様において、未結合の脂質を除去するための精製後、得られる組成物は、脂質と結合したＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質（すなわち、複合体、または「負荷された（loaded）」）、および脂質により結合されていないＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質「負荷されていない（unloaded）」）を含む。いくつかの態様において、組成物内のＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上は、リン脂質またはリゾリン脂質によって結合されている。リン脂質またはリゾリン脂質によって結合されている、組成物内のＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質の百分率は、質量分析により、例えばエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）を用いることにより決定することができる。
【００６７】
いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質-リン脂質またはリゾリン脂質複合体内で、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質とリン脂質またはリゾリン脂質との比は、約１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９または１：１である。融合タンパク質−脂質複合体中のＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質：リン脂質またはリゾリン脂質の比は、質量分析により、例えば、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）を用いることにより決定することができる。
【００６８】
医薬組成物
それに結合しているリン脂質を含む、または含まないＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質を含有する医薬組成物は、１以上の生理学的に許容し得る担体または賦形剤を用いて調製されてもよい。本明細書で用いられる場合、薬学的に許容し得る担体は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、等張剤などを含む。任意の従来の媒体、剤、希釈剤または担体がレシピエントまたはそれに含有される活性成分の治療的有効性にとって有害である場合を除いて、本発明の方法の実施におけるその使用は適切である。担体は、液体、半固体、例えばペースト、または固体担体であり得る。担体の例は、油、水、生理食塩水、アルコール、糖、ゲル、脂質、リポソーム、樹脂、多孔質マトリックス、結合剤、充填剤、コーティング剤、保存剤など、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、担体は、制御放出マトリックス、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合物含有組成物中の活性成分の緩徐な放出を可能にする材料である。
【００６９】
本発明によれば、本医薬組成物の有効成分は、例えば、混和、溶解、懸濁、乳化、カプセル化、吸収などの任意の簡便で実用的な方法で担体と組み合わせることができ、錠剤、カプセル、粉末、シロップ、注射に適した懸濁液、移植、吸入、摂取などの製剤において製造され得る。適切な場合には、本発明の医薬組成物は、周知の手順によって滅菌されるべきである。例えば、溶液は、濾過滅菌またはオートクレーブにより滅菌され得る。滅菌粉末を得るために、滅菌された溶液は、必要に応じて真空乾燥または凍結乾燥され得る。
【００７０】
処置の方法
１つの側面において、本開示は、対象における状態を処置する方法であって、該状態が、リン脂質の血漿レベルの増加から利益を得、リン脂質との（またはそれと結合した）複合体中におけるＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、前記方法を提供する。医薬組成物の投与は、内皮細胞および身体のすべての組織への、複合体における生物活性リン脂質の送達をもたらす。送達された生物活性リン脂質は次に、限定することなく、心血管疾患、炎症性疾患および代謝性疾患を含む疾患において損なわれる内皮機能を促進する。
【００７１】
いくつかの態様において、リン脂質は、スフィンゴ脂質である。特定の態様において、スフィンゴ脂質は、スフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ）である。
【００７２】
いくつかの態様において、対象は、リン脂質の血漿レベルの増加から恩恵を受ける疾患である、高血圧症、心臓の虚血、脳の虚血、加速性アテローム性動脈硬化症、非心臓性の再灌流障害および末梢血管疾患からなる群から選択される状態に罹患している。特定の態様において、高血圧症は、一次抵抗性高血圧症、二次抵抗性高血圧症、神経性高血圧症、妊娠高血圧症（妊娠高血圧腎症）、糖尿病性妊娠高血圧腎症、および慢性腎疾患の高血圧症からなる群から選択される状態を含む。いくつかの態様において、心臓の虚血は、心臓再灌流障害、心筋梗塞、急性冠症候群および狭心症からなる群から選択される疾患を含む。いくつかの態様において、非心臓性の再灌流障害は、心臓組織（心臓）以外の器官または組織に対する虚血の結果としての障害を含む。非心臓性虚血の例は、肝虚血、腎虚血、腸管虚血、および筋虚血を含む。
【００７３】
他の態様において、投与のための医薬組成物中のＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、「負荷されていない」、すなわちリン脂質によって結合されておらず、投与後にレシピエントにおいて循環しているＳ１Ｐを動員し、それと複合体を形成する。血漿Ｓ１Ｐは、いくつかの細胞供給源に由来する（Pappu et al., Science 316: 295-298 2007）。例えば、Ｓ１Ｐは、その異化の原因となる酵素を欠くヒト血小板中で比較的高濃度で貯蔵され、そして成長因子、サイトカイン、および受容体アゴニストおよび抗原のような生理学的刺激の活性化の際に血流中に放出される。
【００７４】
特定の態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、自己免疫障害のために、ＦＴＹ７２０／フィンゴリモド／Gilenya（商標）（ＩＵＰＡＣ名：２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール）またはその類似体による処置を受けている患者に与えられる。ＦＴＹ７２０／フィンゴリモド／Gilenya（商標）は、多発性硬化症について承認された治療薬であり、乾癬、慢性関節リウマチ、ブドウ膜炎およびＩ型糖尿病などの他の自己免疫適応症を処置するのに有用であり得る。フィンゴリモドの最も一般的な副作用は、鼻かぜ（head cold）、頭痛、および疲労である。しかしながら、フィンゴリモドは、潜在的に致命的な感染症、徐脈、皮膚がん、および出血性局所脳炎の症例、出血を伴う脳の炎症と関連している。本発明によれば、フィンゴリモドおよびその類似体の副作用は、投与されたＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質によって低減することができ、それは過剰な循環Ｓ１Ｐ分子を隔離すると考えられる。
【００７５】
本発明の医薬組成物である、負荷されていないＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質を含む組成物およびＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質リン脂質複合体を含む組成物の両方は、経口、鼻腔、気管、経皮、非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内）または直腸を含む、標準的な経路によって対象に投与され得る。加えて、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合物含有組成物は、注射によって、またはかなりの量の活性成分が、例えば制御放出様式でその部位に入ることができるように、予め選択された組織または器官の部位の近くへの外科的移植もしくは付着によって、直接拡散によって、身体に導入することができる。
【００７６】
投与量は、処置される病状または状態、ならびに、対象の体重および状態などの他の臨床的要因、治療に対する対象の応答、製剤の種類および投与経路に依存する。治療的に有効な、かつ有害ではない正確な投与量は、当業者によって決定され得る。一般的に言えば、医薬組成物は、単位投与量形態当たり約０.５μｇ〜約２グラムで投与され得る。単位投与量形態は、哺乳動物の処置のための単位投与量として適した物理的に別々の単位を指す：各単位は、任意の要求される医薬担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性材料を含有する。本発明の方法は、同時に、または長期間にわたって与えられる、単回投与、および複数回投与を企図する。
【００７７】
他に定義されない限り、本明細書中で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料も本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料がここに記載される。本明細書で言及されるすべての刊行物は、それらの刊行物が引用されることに関連して、方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
以下に列挙される特定の例は、例示に過ぎず、決して限定することを意味しない。
【実施例】
【００７９】
例
例1:材料および方法
ＡｐｏＭ−Ｆｃおよび三重突然変異体ＡｐｏＭ−Ｆｃ（ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ）の作成
ＡｐｏＭ−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質を、Δ１−２０ＡｐｏＭオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（Xu, N., JBC, 21 A, 31286-31290 (1999)）に対応するＰＣＲ由来のｃＤＮＡを、ｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクター（InVivogen; Cat. # pfuse-mglfc2）のＩＬ−２シグナルペプチドとＩｇＧ１−Ｆｃフレームワーク領域の間にクローニングすることによって作成した。したがって、シグナルペプチドを欠き、終止コドンを置換したヒトＡｐｏＭの５０７ｂｐのオープンリーディングフレームは、プライマー：
【化２−１】
2019531336.tif 000003
【化２−２】
2019531336.tif 000004
を用いたＰＣＲにより生成された。
【００８０】
フォワードプライマーは、新規のＮｃｏＩ制限部位（太字およびイタリック体）を挿入し、ＡｐｏＭコドン２１において開始し、切断不可能なＡｐｏＭシグナルペプチド２３を排除する。リバースプライマーは、新規のＢａｍＨＩ制限部位（太字およびイタリック体）を挿入し、Ａ＞Ｇ置換であるＴＧＡ＞ＧＧＡにより、終止コドン（ＴＧＡ、コドン１８９）をグリシンコドンで置換した。得られたＰＣＲ由来ＤＮＡを精製し、Ｎｃｏｌ−ＢａｍＨＩ（New England Biolabs; Cat#R0193S, R3136S）で二重消化することにより切断し、そしてＮｃｏｌ−ＢｇｌＩＩ（New England Biolabs; Cat# R0193S, R0144S）で消化したｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクター（InVivogen; Cat. # pfuse-mglfc2)のオープンリーディングフレームにライゲートした（Quick Ligation Kit, New England Biolabs, Cat#M2200）。ＢｇｌＩＩは、ＢａｍＨＩに対して適合可能な粘着末端であり、そしてライゲーション時に両方の部位を排除する。ライゲーションを高効率トランスフェクションコンピテントＤＨ５ａ（ThermoFisher Scientific；Cat#l 8263012）にトランスフェクトし、ゼオシン（２５μｇ／ｍｌ；ThermoFisher Scientific；Cat#R25005）Millerのブロス寒天ペトリ皿上で選択した。個別のコロニーを採取し、２ｍｌのゼオシン（２５μｇ／ｍｌ）Millerのブロス中で増殖させ、GeneJET Plasmid Miniprep Kit（ThermoScientific, Cat#K0503）を用いてＤＮＡを単離した。組み換えベクターを、４３０ｂｐのＤＮＡ断片を放出する診断用ＥｃｏＲＩ（New England Biolabs, R3101S）ＤＮＡ消化物を用いて同定し、そしてCornell DNA sequencing Core Facilityを用いて陽性クローンを配列決定した。このクローニングは、融合遺伝子ＡｐｏＭ−Ｆｃ（ｐＡｐｏＭ−Ｆｃ）をもたらした。これらの研究のための非Ｓ１Ｐ結合陰性対照を作成するために、ＡｐｏＭ１３の結晶学的分析に基づいてＡｐｏＭ−Ｆｃ三重突然変異体（ｐＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ）を作成した。製造者のプロトコールに従ってQuikChange II XL部位特異的突然変異誘発キットを使用し、そして以下のプライマー：
【化３】
2019531336.tif 000005
を使用して、コドンＲ９８Ａ、Ｗ１００Ａ、およびＲ１１６Ａにおける部位特異的突然変異誘発によって突然変異体を作成した。
【００８１】
突然変異プラスミドを上記のように細菌に形質転換し、そしてゼオシン寒天プレート上で選択した。クローンを単離し、そして上記のようにミニプレップに供し、そして上記のように配列決定した。これにより、突然変異融合遺伝子ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（ｐＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ）が得られた。
【００８２】
バキュロウイルスにおけるＡｐｏＭ−Ｆｃ、ＡｐｏＭ−ＦｃＴＭおよびＩｇＧ−Ｆｃ１タンパク質の発現
インビボ研究のための、ミリグラム量の適切に折り畳まれたグリコシル化タンパク質を生産するために、昆虫細胞上清中に可溶性タンパク質を発現する組み換えバキュロウイルスを使用する、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（ThermoFisher／Invitrogen）を採用した。ｐＡｐｏＭ−Ｆｃ、ｐＡｐｏＭ−Ｆｃ三重突然変異体または元のｐＦＵＳＥ−ＩｇＧ１Ｆｃ２（ＩｇＧ１−Ｆｃ単独）プラスミドを鋳型として使用して、ｐＦＵＳＥ−ＩｇＧ１Ｆｃ２ベクターに反応性であるプライマーを使用して、さらなるラウンドのＰＣＲを行った：
【化４】
2019531336.tif 000006
【００８３】
フォワードプライマーは、ＢａｍＨＩ（イタリック体）の制限部位を作成し、リバースプライマーは、ＮｈｅＩ（イタリック体）の制限部位を作成する。得られたＰＣＲ由来ＤＮＡカセットを精製し、ＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ（New England Biolabs, Cat#R3136S, R5131S）での二重消化によって切断し、ＢａｍＨＩ−ＸｂａI（New England Biolabs, R3136S, R5145S）で制限消化したバキュロウイルス発現ベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ１（Invitrogen）にライゲーションした。製造者のプロトコール（(Invitrogen; Bac-to-Bac Baculovirus Expression System）を用い、ＤＨ１０ＢＡＣ E. coli細菌、およびルリアブロス（ＬＢ）寒天プレート上でテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（７μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（５０ｇ／ｍｌ）を用いる三重薬物選択を用いて、組み換えウイルスＤＮＡを生成した。個別のコロニーを選択し、そして同じ三剤の組み合わせを補充したＬＢブロス中で増殖させた。組み換えプラスミドを上記のようにミニプレップによって単離し、そして陽性クローンをCornell University Sequencing Core Facilityで配列決定した。得られたバキュロウイルスプラスミドをｐＡｐｏＭ−Ｆｃ（Ｂａｃ）、ｐＡｐｏＭ−ＦｃＴＭ（Ｂａｃ）、またはｐＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｂａｃ）と命名した。
【００８４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡｐｏＭ−Ｆｃ、ＡｐｏＭ−ＦｃＴＭおよびＩｇＧ１−Ｆｃの生産
ｐＡｐｏＭ−Ｆｃ、ｐＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭまたは対照ｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ１Ｆｃ２ベクターを、Lipofectamine 2000試薬（ThermoFisher Scientific, Cat# 11668019)）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（AATC Cat. #: CRL-1573）のトランスフェクションによってタンパク質発現についてアッセイした。正常な培養物を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で３７℃に維持した。Lipofectamine 2000を使用して、７２時間、２９３Ｔ細胞の３つの別々の培養物に組み換えｐＡｐｏＭ−Ｆｃプラスミドをトランスフェクトした。最後の１８時間は、培養培地を無血清のOptiMem培地（ThermoFisher Scientific Cat# 31985-070）と置き換えた。上清を回収し、遠心分離により清澄化し、そして使用まで−８０℃で貯蔵した。
【００８５】
バキュロウイルスにおける組み換えＡｐｏＭ−Ｆｃ、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ、またはＩｇＧ１−Ｆｃの生産
組み換えバキュロウイルスＤＮＡ（１〜３μｇ）ｐＡｐｏＭ−Ｆｃ（Ｂａｃ）、ｐＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（Ｂａｃ）、またはｐＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｂａｃ）を、製造者によって提供されるリン酸カルシウム法によって昆虫細胞株Ｓｆ９の個別の培養物にトランスフェクトした。５日後、ウイルス粒子を含有する得られた培養上清を、１：５０希釈でナイーブＳｆ９細胞上に継代し、そして５日間インキュベートした。これを３回繰り返して、高力価ウイルスストック（＞１０９ＰＦＵ／ｍｌ）を作成した。ウイルスストックのさらなる増幅／維持のために、完全培養培地（Sf900-III; ThermoFisher Scientific, Cat.#12658027）中の１５０ｍｍ３組織培養プレート中の３×１０７のＳｆ９細胞を、一連のウイルス増幅工程（継代５）からの５００μｌのウイルス懸濁液で感染させ、２７℃で５日間インキュベートした。タンパク質生産のために、３×１０７個のHigh-Five（商標）（ThermoFisher Scientific, Cat#PHG0143）細胞を完全培地（Sf900-III; ThermoFisher Scientific, Cat#12658027）中の１５０ｍｍ２組織培養プレートに播種し、次いで１ｍｌのウイルスストックを感染させ、加湿インキュベーター中で２７℃で４〜５日間インキュベートした。上清を回収し、３，０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化し、そして４℃で貯蔵した。
【００８６】
組み換えＡｐｏＭ−Ｆｃの免疫ブロット分析
融合タンパク質の同一性を、抗ＡｐｏＭ特異的免疫ブロット分析を用いて確認した。ほとんどの実験について、１０〜２０μｌの組み換え細胞培養上清を５×Laemmliの試料緩衝液中で１０分間９５℃で加熱した。１００ｍＭジチオトレイトール（Sigma-Aldrich）を含む、または含まないのいずれかで別々の試料を調製した。試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（BioRad, Acrylamide, Cat# 1610156）上で分離し、電気泳動的にニトロセルロース膜（BioRad, Cat#1620115）に移した。ブロットを、ＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭトリス塩基ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）に懸濁した５％ミルク（Carnation）中で室温で１時間ブロックし、次いでウサギ抗ＡｐｏＭモノクローナル抗体（Genetex GTX62234; Clone EPR2904）と共に一晩（＞１２時間）インキュベートし、３０分にわたるＴＢＳ−Ｔの５回の交換で洗浄した。ブロットを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１：５０００（ｖ／ｖ）；Jackson Labs）に結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧを補充した１％ミルク−ＴＢＳ−Ｔ中で６０分間インキュベートし、次いで室温で３０分間緩やかに揺り動かしながらＴＢＳ−Ｔ中で５回洗浄した。ブロットをImmobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（Millipore, Cat# WBKLS0500）とインキュベートし、化学発光をＸ線フィルム（Denvillie Scientific, HyBlotCL E3018）を用いて明らかにした。
【００８７】
ＡｐｏＭ−Ｆｃ、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ、およびＩｇＧ１−Ｆｃの精製
融合タンパク質の大規模精製を、BioRad NGC FPLCクロマトグラフィーシステム上で、以下のプロトコールを使用して行った。
工程１）融合タンパク質を含有する１００〜２００ｍｌの培養上清を、滅菌ポリスチレンスクリューキャップチューブ中で、４２，０００ＲＰＭ（＞１００，０００ｇ；Sorvall Discovery 90, T-1250 Rotor）での超遠心分離により、清澄化した。
工程２）上清を回収し、Amicon Ultra-15 Centrifugal filter（Ultracel-50K）を用いて、１／１０の体積に濃縮した。
工程３）濃縮した培養上清を、Amicon Ultra-15 Centrifugal filter（Ultracel-50K）中で１０倍の体積のコンカナバリンＡレクチン結合緩衝液（ＬＢＢ）（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ｐＨ７．５、ＮａＣｌ ３００ｍＭ、ＭｎＣｌ２ １．５ｍＭ、ＣａＣｌ２ １ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ）と置き換えた。
工程４）タンパク質試料を、２０ベッド容量のＬＢＢで予め洗浄した、プレパックコンカナバリンＡ−セファロースビーズの５ｍｌのBioscale MT-5カラムに適用した。適用速度は０．２ｍ／分であり、平均圧力は３０ｐｓｉであった。
工程５）カラムフロースルーが緩衝液ベースラインＯＤ２８０、典型的には５５〜５７ｍＡＵに達するまで、カラムを０．４ｍｌ／分の流速においてＬＢＢで洗浄した。
工程６）使用前に濾過滅菌した、２００ｍＭのα−メチル−マンノシドを補充したＬＢＢ（溶出緩衝液）を用いて、タンパク質をカラムから溶出させた。システム容量を差し引いた後、典型的には、２ｍｌの溶出緩衝液をカラムに適用し（０．４ｍｌ／分）、次いで結合したタンパク質の効率的な置換を可能にするために１５〜３０分間インキュベートした。
工程７）タンパク質を０．４ｍｌ／分の速度でカラムから溶出緩衝液中に溶出させた。ＯＤ２８０が溶出緩衝液ベースライン（約１２５ｍＡＵ）に戻るまで、０．８ｍｌの画分をBioFracコレクター上で回収した。
工程８）陽性画分をプールし、Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter（Ultracel-10K）上で１０倍に濃縮し、溶出緩衝液を１０倍容量のＰＢＳ−１ｍＭ ＥＤＴＡで置き換えてマンノースを除去した。
工程９）５μｇの調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥと組み合わせた、試料のＢＣＡタンパク質分析（ThermoFisher Scientific）により、融合タンパク質のおおよその濃度を決定した。いくつかの実験について、融合タンパク質を、１：８（μｍｏｌの融合タンパク質／μｍｏｌのＳ１Ｐ）でメタノールに再懸濁したＳ１Ｐと混合し、穏やかに揺り動かしながら４℃で２４〜４８時間インキュベートした。試料中のメタノールの最終濃度は３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を超えなかった。試料をAmicon Ultra-4 Centrifugal Filter（Ultracel-10K）で濃縮した。
工程１０）１ｍｌのタンパク質濃縮物を、ＰＢＳ−１ｍＭ ＥＤＴＡで予め平衡化したSuperose 6 Increase 10/300 GLカラム上に注入し、ピーク画分が回収されるまで０．４ｍｌ／分の速度で分離した。
工程１１）タンパク質陽性画分をプールし、Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter（Ultracel-10K）で濃縮した。緩衝液を１０倍容量の滅菌ＰＢＳで置き換え、１〜３ｍｇ／ｍｌの最終濃度で維持した。
【００８８】
ＦＰＬＣタンパク質画分の分析
すべての画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。１０μｌの各画分を、１００ｍＭ ＤＴＴで補充された５×Laemmliの試料緩衝液中で９５℃で煮沸し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。ゲルをメタノール：酢酸：水（５０％：１０％：４０％）で固定し、０．３％クマシーブリリアントブルー（BioRad）を含有する固定溶液で染色し、固定溶液で脱色した。
【００８９】
蛍光消光分析に基づくＳ１ＰのＡｐｏＭ−Ｆｃ結合の測定
以前の研究は、予測されたヒトＡｐｏＭポリペプチドのトリプトファン４７（Ｗ４７）の蛍光消光に基づいて、細菌で発現された組み換えＡｐｏＭが約１μＭの相対的親和性でＳ１Ｐに結合することを実証した（Sevvana, M. et al., Journal of Molecular Biology, 404, 363-371 (2010)）。従って、０．１２５、０．２５および０．５μＭのＡｐｏＭ−Ｆｃ、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ、またはＩｇＧ１−Ｆｃを、Quantamaster 300（商標）（Horiba）で、２５０〜４００ｎｍの範囲の放射スペクトルを回収し、脂質依存性蛍光消光について分析した。ベースライン放射を確立し、そして最大放射を各タンパク質試料について決定した。消光試験のために、各タンパク質を５分間安定化させ、次いでメタノールに溶解したＳ１Ｐを６０分間かけて０．２５〜３．０μＭの最終濃度まで添加した。融合タンパク質が評価され、興味はＡｐｏＭ中での消光にのみあるので、ＩｇＧ１−Ｆｃを融合タンパク質のカルボキシ末端の非特異的消光のための対照として使用した。ＩｇＧ１−Ｆｃの放射蛍光を、すべての適切なＡｐｏＭ−ＦｃおよびＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭデータから差し引いた。データを回収し、そしてFelixGXソフトウェアを用いて分析した。
【００９０】
ＡｐｏＭ融合タンパク質の注射後の精製されたＡｐｏＭ−Ｆｃ、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭまたは血漿中のＳ１Ｐの測定。
５０μｇの精製されたＡｐｏＭ−Ｆｃ、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭを、Stony Brook University lipidomics Core Facilityを用いて液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によりスフィンゴ脂質含量について分析した。血漿試験のために、Ａｐｏｍ−／−またはＣ５７ＢＬ／６マウスをチークパンチ法により予め採血し、２４〜４８時間休ませた。マウスに１００μｇ（４ｍｇ／ｋｇ）のＡｐｏｍ−Ｆｃ−Ｓ１ＰまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭをＩＰ注射し、２４時間後に血液をＥＤＴＡ中に回収し、２０００×ｇで１０分間遠心分離して血漿を回収した。２５μｌの血漿をＬＣ／ＭＳによってスフィンゴ脂質含量および種類について分析した。
【００９１】
Ｓ１Ｐ１レポーター細胞におけるＳ１Ｐ依存性シグナル伝達のインビトロ分析
Proiaおよび同僚は、Ｓ１Ｐ１シグナル伝達を記録するためのβ−アレスチンシグナル伝達に基づいてマウス系統（Ｓ１Ｐ１ＧＦＰシグナル伝達マウスと呼ばれる）を樹立した（Kono, M. et al., JCI, 124, 2076-2086 (2014)）。本質的に、Ｓ１ＰによるＳ１Ｐ１受容体の活性化は、活性化細胞の核においてヒストン−ＧＦＰ融合タンパク質の蓄積をもたらす。マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞系を１０．５日目の胚から樹立した。標準的なプロトコールを用いて、胚を解離させ、ＭＥＦ細胞を単離し、ＳＶ４０ラージＴ抗原で形質転換した。得られた形質転換細胞を、低内在性ＧＦＰ発現について選択し、そして非常に低いレベルのＳ１Ｐを含有する１０％チャコール処理済み（charcoal-stripped）胎児ウシ血清を補充したＤＭＥＭ中で維持した。機能アッセイについては、脂肪酸非含有（ＦＡＦ）アルブミン−Ｓ１Ｐ（Ａｌｂ−Ｓ１Ｐ）の添加が、刺激後２４時間で最大のシグナルを伴う、６時間という早さで現れる核のＧＦＰ蓄積をもたらすが決定された。処置した細胞をトリプシン処置により採取し、そしてＧＦＰ発現をゲートしてＦＡＣＳ分析により直接分析した。このアッセイを使用して、０．１２〜１μＭのＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１ＰまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭを、ＦＡＣＳ分析により、Ｓ１Ｐ１活性化およびＧＦＰ発現についてアッセイした。データは、％ＧＦＰ陽性／分析された総生細胞として表現した。
【００９２】
Ｓ１Ｐ受容体１、２、および３を介したシグナル伝達に対するＡｐｏＭ−ＦｃまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭの効果の分析
レンチウイルスベクターであるｐ（ＣＨＯ−Ｓ１Ｐ１）にクローニングされたＳ１Ｐ１ ｃＤＮＡを使用した、安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるＳ１Ｐ受容体−１シグナル伝達の分析は、以前に報告されている（Christoffersen, C. et al., PNAS, 108, 9613-9618 (2011)）。別々のＣＨＯ細胞クローンを、Ｔｅｔ−Ｏｎベクターシステムを用いて、Ｓ１Ｐ受容体−２について樹立した（ＣＨＯ Ｓ１Ｐ２）。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したHamのＦ１２培地（Invitrogen）中で維持した。シグナル伝達の分析のために、播種した培養物を一晩付着させ、無血清培地中で２回洗浄し、次いで０．１％ＦＡＦ−アルブミンを補充した培地中で一晩培養した。培地を置き換え、細胞をOptiMem培地単独またはアルブミン−Ｓ１Ｐ（１００ｎＭ Ｓ１Ｐ）、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ、またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭと共に５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで簡単に洗浄した後、ＰＢＳ−ＮＰ−４０（ＰＢＳ、１％ＮＰ４０、プロテアーゼ阻害剤（Sigma）、および１ｍＭのＮａＶＯ３、１０ｍＭのＮａＦ、１０ｍＭ β−グリセロールリン酸）に溶解した。溶解物を４℃、１３，０００ｇで１０分間の遠心分離により清澄化し、上清を１００ｍＭ ＤＴＴを含有する５×Laemmliの緩衝液と混合した。試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（BioRad, Acrylamide, Cat. # 1610156）上で分離し、そしてニトロセルロース膜（BioRad, Cat.#1620115）に電気泳動的に移した。ブロットをＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭトリス塩基ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）に懸濁した５％ミルク（Carnation）中で室温で１時間ブロッキングし、次いでｐ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）（(E10)9106S、細胞シグナル伝達）に対するマウスモノクローナル抗体と共に、１：１０００で一晩（＞１２時間）インキュベートし、３０分間かけて５回交換したＴＢＳ−Ｔで洗浄した。ブロットを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１：５０００；Jackson Labs）に結合したヤギ抗マウスＩｇＧを補充した１％ミルク−ＴＢＳ−Ｔ中で６０分間インキュベートし、次いでＴＢＳ−Ｔ中で穏やかに揺り動かしながら、３０分間にわたって室温で５回洗浄した。ブロットをImmobilon Western chemiluminescentＨＲＰ基質（Millipore, Cat# WBKLS0500）とインキュベートし、化学発光をＸ線フィルム（Denvillie Scientific, HyBlotCL E3018）を用いて明らかにした。ローディング対照として、グリシンｐＨ２．５を用いて１０分間ブロットを剥がし（stripped）、そしてウサギ抗ＥＲＫ１／２（Santa Cruz Biotechnology, Cat# sc-292838）で再プローブした。ブロットを剥ぎ、そしてｐＡｋｔ（Ｓ４７３）（#9271L 細胞シグナリング）および総Ａｋｔ（#9272S、細胞シグナリング）の発現について再プローブした。ブロットをインキュベートし、洗浄し、そして上記のように発色させた。
【００９３】
ＨＵＶＥＣ（ATCC Cat. # 100-010）を、補充されたＥＧＭ緩衝液中で維持し、そしてアッセイ前に分割した。細胞を０．１％ＦＡＦ−アルブミン培地中で４時間飢餓状態にした後、アッセイした。シグナル伝達の実験のために、飢餓状態の細胞をＡｌｂ−Ｓ１Ｐ（１００〜４００ｎＭ Ｓ１Ｐ）、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ（５〜２０μｇ／ｍｌ）、またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（５〜２０μｇ／ｍｌ）と５、１５または３０分培養した。細胞を溶解し、溶解物を分離し、そして上記のようにウエスタンブロッティングのために移した。ＭａｐＫおよびＡｋｔに加えて、ブロットをｐ−ｅＮＯＳ（s1177）（#9571S 細胞シグナル伝達）の活性化および全ｅＮＯＳ発現（cat# 610296, BD Biosciences）について分析した。
【００９４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＳ１Ｐ１−ノックアウトＨＵＶＥＣの生成
以下のオリゴヌクレオチド：
【化５】
2019531336.tif 000007
を使用して、Ｓ１ＰＲ１開始コドンを標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計し、そしてｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２ベクター（Dr. Feng Zhangからの贈り物、Addgene plasmid # 529619）にクローニングした。
【００９５】
レンチウイルス粒子を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて調製し、ＨＵＶＥＣに感染させた。感染の４８時間後、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを選択のために添加し、ＨＵＶＥＣをＤＮＡ配列決定によりＳ１ＰＲ１遺伝子座の突然変異について分析し、そしてＳ１Ｐ１タンパク質発現を免疫ブロット分析により決定した。
【００９６】
Ｓ１Ｐ１内部移行の測定
ヒト骨肉腫細胞株であるＵ２０Ｓは、ＧＦＰと融合したＳ１Ｐ１受容体を安定的に発現するように作成され、高レベル発現について選択された。細胞を３８４ウェルプレートにプレーティングし、コンフルエントにした。次いで、細胞を無血清培地中で２時間飢餓状態にし、個々のウェルをいくつかの濃度のＦＴＹ７２０−Ｐ、Ａｌｂｕｍｉｎ−Ｓ１Ｐ（１０〜１００ｎＭ）、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ（１〜２０μｍ）またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（１〜２０μｇ／ｍｌ）で３０分間刺激した。次いで、細胞を４％ＰＦＡで１５分間固定し、ＰＢＳ−０．１％Ｔｒｉｔｏｎ中で１０分間透過処置した。核をＤＡＰＩで５分間染色した。細胞をＰＢＳ中に維持し、スポット検出器ソフトウェアを用いて１０×でArrayScan VTIにより３８４ウェルプレートにおいて画像化した。
【００９７】
インビトロでの内皮細胞バリア機能の測定
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を標準的な条件下で維持し、継代４〜８の間で分析した。内皮細胞バリア機能を、内皮細胞インピーダンスシステム（ＥＣＩＳ）装置（Applied BioPhysics, Troy, NY, USA）を用て、細胞被覆（cell-covered）電極の抵抗を測定することにより評価した。ＨＵＶＥＣを１×１０５細胞／ウェルの密度で０．１％フィブロネクチン被覆電極（８Ｗ１０Ｅプレート）上にプレーティングした（Kono, M. et al., JCI, 124, 2076-2086 (2014)）。コンフルエントな細胞を内皮基礎培地（EBM-2;Lonza, Basel, Switzerland）中で２〜６時間飢餓状態にし、そしてアルブミン−Ｓ１Ｐ（５０〜２００ｎＭ；Ｓ１Ｐを２％脂肪酸非含有アルブミンに溶解；Sigma-Aldrich）、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ、またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（両方とも０．２〜０．４μＭ）のいずれかで処置した。抵抗性をモニターし、そして画分抵抗性として表現し、アッセイの開始時のベースラインに対して正規化した。
【００９８】
マウスおよび細胞株
Ｃ５７Ｂｌ／６雄性マウス（６〜８週齢）をJackson Labsから購入した。Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドにおいてＡｐｏＭノックアウトマウスを、以前に報告されたように維持した（Christoffersen, C. et al., PNAS, 108, 9613-9618 (2011)）。すべての動物プロトコールは、Weill-Cornell MedicineのInstitutional Animal Care and Use Committee（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。すべての細胞株をマイコプラズマ汚染について試験した。
【００９９】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＡｐｏＭ−ＦｃまたはＡｐｏＭ−ＴＭの血漿半減期の測定
６〜８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝４）に、１００μｇ（４ｍｇ／ｋｇ）の、精製されたＡｐｏＭ−ＦｃまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭのいずれかを投与し（ｉ．ｐ．）、注射の２、４、６、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、および２１６時間後において分析した。１μｌの血漿を、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＡｐｏＭ免疫ブロット分析によって分析した。ポンソーＳ染色を実施して、レーン当たりのローディングが同等であることを確認した。対照として非注入血漿を使用するImageJ分析により、ウエスタンブロットのスキャンをタンパク質発現について定量した。最大シグナルは４〜６時間の間に観察され、これは様々な時点でその後の発現を評価するための基準点として使用された。
【０１００】
ＷＴマウスの血液細胞カウントに対するＡｐｏＭ−Ｆｃ投与の効果
Ｃ５７Ｂｌ／６ＷＴマウスに、１００μｇ（４ｍｇ／ｋｇ）のＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１ＰもしくはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭまたはＰＢＳ（それぞれＮ＝５）を腹腔内注射によって注射した。６または２４時間後のいずれかに、血液を２ｍＭ ＥＤＴＡ中に採取し、細胞画分を遠心分離によって分離した。総血液カウントはClinical Cytometry（Cytometry Core, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center）によって決定した。
【０１０１】
正常血圧マウスにおける収縮期血圧（ＳＢＰ）に対するＡｐｏＭ−ＦｃおよびＡｐｏＭ−Ｆｃ三重突然変異体の効果の分析
収縮期、拡張期および平均血圧を、空気圧テールカフ法（MRBP System, Life Science, Woodland Hills, California）を使用して、意識のある１２週齢の雄性マウスにおいて測定した。簡潔には、動物を３４℃に維持したプラスチックチャンバーに入れ、空気圧パルスセンサーを備えたカフを尾に取り付けた。１週間の訓練の後、マウスごとに複数回の測定を行い、そして値を平均した。マウスにＰＢＳ（ビヒクル対照）、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１ＰまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（４ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、そして血圧を１、２、４、８、および２４時間に、次いで７日目まで２４時間毎にモニターした。
【０１０２】
ＡｎｇＩＩの慢性的注入、ならびに、高血圧症に対するＡｐｏＭ−ＦｃおよびＡｐｏＭ−Ｆｃ三重突然変異体の効果の分析
以前に記載されたように（Cantalupo, A. et al., Nature Medicine, 21, 1028- 1037, (2015)）、浸透圧ミニポンプ（モデルALZET 2004）を用いてＡｎｇＩＩ（５００ｎｇ／ｋｇ／分）を注入した。簡潔には、ミニポンプを１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６（ＷＴ）雄性マウスに皮下移植した。ＡｎｇＩＩ注入の０日目から１４日目まで、血圧を週に２回モニターした。収縮期血圧を上記のように評価した。実験の別のセットにおいて、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＰＢＳ（ビヒクル対照）またはＰＢＳに懸濁したＡｐｏＭ−ＦｃもしくはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭのいずれか１００μｇ（４ｍｇ／ｋｇ）をＩ．Ｐ．注射により処置し、血圧を、注射後の異なる時点（１時間から２１６時間）に測定した。用量応答関係を決定するために、ＰＢＳ（ビヒクル対照）またはＰＢＳ中に懸濁した３０μｇ（１．３ｍｇ／ｋｇ）のＡｐｏＭ−ＦｃもしくはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭのいずれかを用いて同様の実験を行った。加えて、Ｓ１Ｐ受容体−１アンタゴニストＷ１４６（１０ｍｇ／ｋｇ）（８）を同様の実験に使用した。Ｗ１４６を、０時、次いで２４時間間隔で（２４〜９６時間、そして次に再度１６８時間）腹腔内注射により投与した。
【０１０３】
ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１ＰまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ後のＡｎｇＩＩ処置マウスにおける血漿亜硝酸塩の測定
以前に記載されたように改変されたグリース反応を使用して（Cantalupo, A. et al., Nature Medicine, 21, 1028-1037 (2015)）、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１ＰまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭの注入の２４時間後に、ＡｎｇＩＩ処置ＷＴマウスから血漿中の亜硝酸塩としてＮＯレベルを測定した。簡潔には、ＺｎＳＯ４（３０％ｗ／ｖ）による血漿タンパク質の沈殿後、酸洗浄された（０．２４Ｍ ＨＣｌ）カドミウム粉末（Sigma-Aldrich）で上清を化学的に還元した。遠心分離後、試料を、グリース試薬（Ｈ２Ｏ中０．１％のナフチルエチレンジアミン二塩酸塩および濃Ｈ３ＰＯ４中１％のスルファミンアミド）で亜硝酸塩含有量について測定し、５５０ｎｍの波長で読み取った。すべての試料を二重にアッセイし、そしてＮＯ濃度をＮａＮＯ２検量線に対して計算した。
【０１０４】
インビボでの心筋虚血／再灌流（ＭＩ／Ｒ）
心筋虚血再灌流（ＭＩ／Ｒ）障害のモデルは、以前に報告されたように採用された（Xu, Z., JoVE, doi: 10.3791/51329 (2014)）。本質的には、マウスを麻酔し、胸郭を肋骨の間の小さな切開によって開き、心臓を露出させた。心臓の左前下行動脈（ＬＡＤ）を同定し、スリップノット縫合結紮術により圧迫した。４５分後、スリップノットを除去し、切開口を閉じる。２４時間後、マウスを屠殺する。危険面積（ＡＡＲ）を視覚化するために、大動脈および冠動脈を介して心臓をアルシアンブルー染料で灌流し、そして梗塞の程度を心臓の１ｍｍ横断面の顕微鏡分析によって評価する。心臓を１％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）溶液で１５分間対比染色した。画像を光学顕微鏡によって視覚化し、写真撮影した。ImageJ分析の後に、梗塞面積ならびにＡＡＲ（非青色）および総左心室（ＬＶ）を評価し、そして梗塞面積（アルシアンブルー灌流なし）／縫合結紮より下の総心臓面積の百分率として表現した（Shao, D. et al., Nature Communications, 5, 3315 (2014)）。すべての実験について、手術の３０分前に、ＷＴＣ５７Ｂｌ／６マウスに、４ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１ＰまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭを含む後眼窩注射によって１００μｌのＩＶで投与した。
【０１０５】
Ｍ（Ｉ／Ｒ）の免疫蛍光染色および組織学的分析
虚血／再灌流の２４時間後、マウスを屠殺し、そして心臓を冷ＰＢＳで灌流し、４％ＰＦＡ中で２４時間固定し、次いでＯＣＴ化合物（Sakura Finetek, Torrence CA）中に包埋した。１０μｍ厚の凍結切片を切り出し、Ｌｙ６Ｇに対する一次抗体（Cat#108401, BioLegend, San Diego, CA）およびビオチン結合イソレクチンＧＳ−ＩＢ４（Cat# 121414, Invitrogen）で染色した。Ｃｙ３結合ストレプトアビジン（Invitrogen）およびフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）結合抗ラット抗体を二次試薬として使用した。画像は、Olympus Fluoview FV10iを使用して共焦点顕微鏡により視覚化した。
【０１０６】
心エコー研究
心臓の寸法および機能は、Vevo 770 Imaging System（VisualSonics）を用いた経胸壁心エコー法によって分析した。マウスを吸入イソフルラン（Ｏ２中０．２％）で軽く麻酔した。左心室Ｍモードを使用し、すべての測定値を３〜６回の連続心臓周期から得て、平均値を分析に使用した。左心室の拡張末期（ＬＶＤｄ）および収縮末期（ＬＶＤｓ）の寸法をＭモードトレースから測定し、そして短縮率（ＦＳ）を以下：［（ＬＶＤｄ“ＬＶＤｓ）／ＬＶＤｄ］のように計算した。American Society of Echocardiographyの最先端の方法（Zhang, Y. et al., J CI Insight, 1, doi: 10.1172/jci.insight.85484 (2016)）を使用して、拡張期測定は最大心腔寸法の点で行われ、収縮期測定は最小腔寸法の点で行われた。
【０１０７】
一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）およびその治療
以前に記載されているように（Kim, G. S. et al., Nature Communications, 6, 7893 (2015)）、中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）によって一過性の局所的な脳虚血をマウスに誘発した。３３匹のマウス（雄性、２４〜２８ｇ、Ｃ５７ＢＬ６）をこの試験に使用した。除外についての基準は、くも膜下出血の発症であった。この研究から除外された動物はなかった。手術、ならびにすべての行動および組織学的アセスメントは、薬物処置を知らされていない調査員によって行われた。誘発のためにＯ２中で気化させた３％イソフルランおよび維持のために１．５％イソフルランでマウスを麻酔した。温度を、手順全体を通して、サーモスタットブランケット（CMA 450 Temp Controller for mice, Harvard Apparatus, Holliston, MA）によって制御し、３６．５±０．５℃に維持した。左総頸動脈を露出させ、外頸動脈（ＥＣＡ）の後頭動脈枝を単離して凝固させた。ＥＣＡを遠位に切り裂き、そして末端の舌側（terminal lingual）および顎動脈枝と共に凝固させた。内頸動脈（ＩＣＡ）を単離し、次いでＩＣＡの頭蓋外枝を切り裂いた。切開を通してゴムシリコーン被覆モノフィラメント縫合糸（フィラメントサイズ６〜０、直径０．０９〜０．１１ｍｍ、長さ２０ｍｍ；コーティングを含む直径０．２３±０．０２ｍｍ；コーティング長５ｍｍ、Doccol Corp., Sharon, MA））をＥＣＡ内腔に導入し、次いでＩＣＡ内腔中をおおよそ９〜９．５ｍｍ穏やかに前進させてＭＣＡ血流を遮断した。再灌流のために、縫合糸をＭＣＡＯの６０分後に引き抜いた。２−Ｄレーザースペックルフローメトリー（PeriCam PSI HR, Perimed, Jarfalla, Sweden）を用いてＭＣＡ閉塞および再灌流を確認した。縫合糸を除去した直後に、ＰＢＳ、ａｐｏＭ−ＦｃまたはＡｐｏＭ−ＴＭ−Ｆｃの腹腔内注射を、動物に無作為に与えた。
【０１０８】
Mouse Ox Plus（Starr Life Sciences Corp., Oakmon, PA）を使用して、ｔＭＣＡＯの前、その間およびその後に、生理学的パラメータ（動脈Ｏ２飽和度、心拍数、脈拍拡張および呼吸数）を記録した。手術後、すべての動物を小動物加熱回復チャンバー（IMS Vetcare Chamber Recovery Unit, Harvard Apparatus, Holliston, MA）内で維持した。回復後、動物は食物と水に自由にアクセスできるようにしてそれらのケージに戻された。死亡率は、ＰＢＳ処置マウスでは１／１１、ａｐｏＭ  ＷＴでは０／１１、そしてａｐｏＭ−ＴＭ処置マウスでは１／１１であった。
【０１０９】
神経行動試験
再灌流の２３時間後、神経学的機能を評価した。神経学的欠損は、以前に記載されているように（Menzies, S. A. et al., Neurosurgery, 31, 100-106; discussion 106-107 (1992); Belayev, L. et al., Stroke, 27, 1616-1622; discussion 1623 (1996); Mokudai, T. et al., Stroke, 31, 1679-1685 (2000)）、０〜４のスコアで成績付けた：０、観察可能な欠損なし；１、前肢の屈曲；２、前肢の屈曲と横方向への押し付けに対する抵抗の減少；３、前肢の屈曲、横方向への押し付けに対する抵抗の減少、および一方向への旋回；および４、前肢の屈曲、および歩行が不可能または困難である。
【０１１０】
ＴＴＣ染色ならびに梗塞および浮腫の比率および梗塞体積の決定
再灌流の２３時間後、マウスを麻酔して頭部を切断した。脳を頭蓋から素早く取り出し、−２０℃の冷凍庫に２０分間入れた後、げっ歯動物の脳マトリックスを用いて１．５ｍｍの冠状切片に切断した。切片を３７℃で１０分間、２％塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）（Sigma Co., St. Louis, MO）で染色し、そしてスキャンした。各スライス上の梗塞面積を画像分析ソフトウェア（Image J, the National Institutes of Health, Bethesda, MD）を用いて決定し、梗塞率、浮腫率、および脳当たりの梗塞体積（ミリメートル３）を得た。以下の式：Ｉ＝Ｘ−Ｙ（式中、Ｘは対側（非虚血性）半球の面積であり、Ｙは同側性（虚血性）半球の無傷領域の面積である）を使用して梗塞面積を計算し（Swanson, R. A. et al., J. of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 10, 290-293 (1990)）、虚血性半球の浮腫形成を補正した。対側半球による正規化後に梗塞率を得た。浮腫率を、以下の式：Ｅ＝（Ｚ−Ｘ）／Ｘ（式中、Ｚは同側半球の面積である）で計算した。
【０１１１】
脳研究のための統計解析、無作為化および盲検化
報告されたすべての値は平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。Ｐ値は、GraphPad Prismソフトウェアで計算し、一元配置ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ（Kruskal Wallis）に続いてダンの検定を用いた。統計的有意性の基準はＰ＜０．０５に設定した。すべての動物実験は、処置群に対して無作為化し、盲検アセスメントを使用した（Lapchak, P. A. et al., J. of Neurology & Neurophysiology, 4 (2013)）。
【０１１２】
その他の統計分析
すべての統計分析は、Prism, version 4.03（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA）を用いて実施した。両側スチューデントのｔ検定を使用して、２つの群を比較した。適切な場合には、不等分散に対するウェルチの修正を適用した。多重比較について、分散分析（ＡＮＯＶＡ；一元配置または二元配置）を、テューキーの事後検定またはボンフェリーニの検定のいずれかで示されるように行った。Ｐ％０．０５は統計的有意性を示した。
【０１１３】
例２：Ｓ１Ｐ受容体を活性化するための組み換え可溶性ＡｐｏＭの開発
ＨＤＬと会合しない遊離のＡｐｏＭは、極めて短い半減期を有する（Faber, K. et al., Molecular Endocrinology, 20, 212-218 (2006)）。それゆえ、本発明者らは、それを免疫グロブリンの定常ドメイン（Ｆｃ）と融合させることによって血漿中のＡｐｏＭを安定化させるための戦略を開発した。ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞と昆虫Ｓｆ９細胞の両方で発現させた。ＡｐｏＭ−Ｆｃの条件培地への頑強な発現および効率的な分泌が観察された。Ｓ１Ｐ分子の頭部領域と接触する３つのアミノ酸残基に突然変異を含有する、以後ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭと称されるＳ１Ｐ結合突然変異体（Ｒ９８Ａ、Ｗ１００Ａ、およびＲ１１６Ａ）もまた調製した（図１Ａ）。精製されたタンパク質は、非還元ゲル中でオリゴマーとして移動したが、５０〜５５ｋＤの単量体に定量的に還元された（図１Ｂ）。コンカナバリンＡアフィニティークロマトグラフィーとそれに続くゲル濾過クロマトグラフィーからなる二工程精製手順は、７．８＋２μｇ／ｍｌ条件培地の収率で高度に精製されたＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質を達成した。ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ突然変異体を、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質と同様の方法で発現させ、６．４＋１．４μｇ／ｍｌの収率で精製した。ＡｐｏＭ−Ｆｃ、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭタンパク質の両方、ならびにＩｇＧ１−Ｆｃドメインを均質になるまで精製した（図１Ｃ）。
【０１１４】
ＡｐｏＭ−Ｆｃは、０．２２μＭ（９５％信頼区間：０．１６８〜０．３３６）のＥＣ５０でＳ１Ｐに結合した一方で、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭおよびＦｃは有意な結合活性を示さなかった（図１Ｄ）。さらに、Ｓｆ９から単離されたＡｐｏＭ−Ｆｃは、１．９４＋０．３１ｍｏｌ％のＳ１Ｐを含有し、おそらく細胞および／または細胞培養培地から採取された。Ｓ１Ｐ（１：８  ｍｏｌ／ｍｏｌ）とのＡｐｏＭ−Ｆｃの４℃で２４〜４８時間のインキュベーション、それ続くゲル濾過クロマトグラフィーによる精製は、５１．３＋８．１ｍｏｌ％のＳ１Ｐを含有するＡｐｏＭ−Ｆｃを生じた（図１Ｅ）。精製されたＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭは、わずか０．１２＋０．０１モル％のＳ１Ｐを含有した；さらに、上記のようにインビトロでの外因性Ｓ１Ｐとのインキュベーション後にＳ１Ｐ含量は化学量論的に増加しなかった。これは、突然変異体がリゾリン脂質に結合しないという事実と一致する。Ｓ１Ｐに富むＡｐｏＭ−Ｆｃは、以下に示されるさらなるシグナル伝達および生物学的実験に使用される。
【０１１５】
例３：Ｓ１Ｐ結合ＡｐｏＭ−Ｆｃによる内皮細胞Ｓ１Ｐ受容体の持続的活性化
ＡｐｏＭ−ＦｃがＳ１Ｐに結合することを考慮して、ＡｐｏＭ−ＦｃがＳ１Ｐ受容体を活性化するかどうかが次に決定された。ＡｐｏＭ−Ｆｃは、β−アレスチンに基づくＳ１Ｐ１レポーターを用量依存的な様式で活性化した（Kono, M. et al., JCI, 124, 2076-2086 (2014)）。しかしながら、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭが活性的ではなかった一方で、アルブミン−Ｓ１Ｐは同様の用量応答関係でレポーター活性を活性化した（図２Ａ、図２Ｂ）。Ｓ１Ｐ受容体サブタイプ１または２を発現するＣＨＯ細胞において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭではなくＡｐｏＭ−Ｆｃが、Ｇｉ経路を介するＳ１Ｐ受容体により活性化されることが知られている、細胞外受容体活性化キナーゼリン酸化（ｐｐＥＲＫ）およびｐＡＫＴのリン酸化を活性化した（図２Ｃ）。対照的に、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭの効果はごくわずかであった。ヒト内皮細胞において、ＡｐｏＭ−ＦｃはＳ１Ｐ１およびＳ１Ｐ３受容体を介してｐｐＥＲＫ、ｐＡＫＴおよびｐ−内皮型一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）を活性化した（図２Ｄ）。これらのデータは、ＡｐｏＭ−ＦｃがＳ１Ｐ１〜３受容体を活性化することができることを示唆した。
【０１１６】
内皮細胞のＳ１Ｐ１およびＳ１Ｐ３受容体の活性化は、増加した経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）によって測定することができる、接着結合の集合およびバリア機能の増強をもたらす（McVerry, B. J. et al., J. of Cellular Biochem., 92, 1075-1085 (2004)）。ＨＤＬ結合Ｓ１Ｐは、インビトロおよびインビボにおいてアルブミン−Ｓ１Ｐと比較して血管バリアの促進においてより強力である（Christensen, P. M. et al., FASEB J. (2016); Christoffersen, C. et al., PNAS, 108, 9613-9618 (2011)）。単層のＨＵＶＥＣをＡｐｏＭ−Ｆｃで処置した場合、ＴＥＥＲの持続的な増加が観察された。対照的に、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭはＴＥＥＲを増加させなかった。アルブミン結合Ｓ１ＰもＴＥＥＲを増強したが、その増加は一時的なものであった。それがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子破壊によりＳ１Ｐ１を欠くように設計されたＨＵＶＥＣにおいて大きく減弱したので、ＴＥＥＲを増加させるＡｐｏＭ−Ｆｃの能力は、Ｓ１Ｐ１シグナル伝達に依存する（図３Ａ、図３Ｂ）。加えて、ＡｐｏＭ−ＦｃがＳ１Ｐ１受容体の内部移行を誘導したとしても、内部移行の程度は、ＦＴＹ７２０−Ｐまたはアルブミン結合Ｓ１Ｐによって誘導されるものよりも低かった（図３Ｃ）。これらのデータは、ＡｐｏＭ−ＦｃがＳ１Ｐ受容体を活性化することによって内皮細胞バリア機能の持続的な増強を誘導することを示唆している。
【０１１７】
例４：ＡｐｏＭ−Ｆｃ結合Ｓ１Ｐのインビボ安定性
ＡｐｏＭ−ＦｃおよびＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭのインビボ安定性を、腹腔内注射後の血漿レベルの測定によって決定した。ＡｐｏＭ−ＦｃおよびＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭは、それぞれ９３．５時間および８６．５時間の血漿半減期を示し、これらがインビボで非常に安定であることを示唆している（図４Ａ）。１００μｇのＡｐｏＭ−Ｆｃを注射したときに、Ａｐｏｍ−／−およびＷＴマウスにおいて、その２４時間後に、血漿Ｓ１Ｐおよびジヒドロ−Ｓ１Ｐレベルは、それぞれ、７６．３＋１３．７％；５２．９＋１２．９％および２９．９＋１０．１％；３８．９＋４．１％増加した。スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、およびセラミドならびにコレステロールの血漿レベルは影響を受けなかった（図４Ｂ、図４Ｃ）。注射されたＡｐｏＭ−Ｆｃは、ＨＤＬ画分と会合しておらず、リポタンパク質非含有画分において見出された。これらのデータは、おそらくはホスファターゼ媒介分解からの保護に起因して、ＡｐｏＭ−Ｆｃがインビボで可溶性タンパク質として、結合したＳ１Ｐを安定化することを示唆している。アルブミン結合Ｓ１Ｐはインビボで急速に分解され、１５分の推定半減期を有した（（Venkataraman, K. et al., Circulation Research, 102, 669-676 (2008））。この特性は、少なくとも部分的には、ＡｐｏＭ−Ｆｃの持続的な生物学的効果を説明する。
【０１１８】
例５：造血細胞輸送に対するＡｐｏＭ−Ｆｃ結合Ｓ１Ｐのインビボ効果
ＡｐｏＭ−Ｆｃ投与および結果として生じる血漿Ｓ１Ｐの上昇は、リンパ球Ｓ１Ｐ１受容体を潜在的に活性化して、リンパ球の排出および血小板形成を調整することができる（Cyster, J. G. & Schwab, S. R., Annual Review of immunology, 30, 69-94 (2012); Zhang, L. et al., The Journal of Experimental Medicine, 209, 2165-2181 (2012)）。それゆえ、循環血液細胞を、ＡｐｏＭ−Ｆｃ投与後に定量した。図４Ｄに示すように、白血球、リンパ球、血小板および赤血球の循環レベルは、ＡｐｏＭ−ＦｃまたはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ投与によって変化せず、これは、免疫および造血性Ｓ１Ｐ受容体はＡｐｏＭ−Ｆｃ投与によって活性化されないことを示唆する。これは、二次リンパ器官である胸腺および脾臓におけるそれらの機能的拮抗作用に起因してリンパ球減少症を誘発する小分子Ｓ１Ｐ１調整剤とは著しく対照的である（Cyster, J. G. & Schwab, S. R., Annual Review of immunology, 30, 69-94 (2012)）。ＡｐｏＭ−Ｆｃは、リンパ系組織および／または造血系組織中の造血系Ｓ１Ｐ１受容体にアクセスしない可能性が高い。
【０１１９】
実施例６：ＡｐｏＭ−Ｆｃ投与後の高血圧マウスにおける持続的血圧降下
内皮機能不全は高血圧の病態生理に寄与する。実際、血漿Ｓ１Ｐレベルは、ｅＮＯＳ活性を刺激することによって血管緊張を調整する（Nofer, J. R. et al., JC1, 113, 569-581 (2004); Cantalupo, A. et al., Nature Medicine, 21, 1028-1037 (2015)) while endothelial SI Pi stimulates eNOS activity via the protein kinase Akt (Christoffersen, C. et al., PNAS, 108, 9613-9618 (2011); Igarashi, J. et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1781, 489-495 (2008)）。それゆえ、ＡｐｏＭ−Ｆｃ投与が、アンジオテンシンＩＩ浸透圧ミニポンプを移植した高血圧マウスの血圧を調節するかどうかを調査した。Ｃ５６／Ｂｌ６マウスにおいて、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ投与ではなくＡｐｏＭ−Ｆｃ投与が、処置後２時間で、血圧を約４０ｍｍＨｇ強力に降下させた（図５Ａ）。ＡｐｏＭ−Ｆｃの効果は持続し、治療有効性は単回投与後１９２時間持続した。この顕著で持続的な血圧の降下は、Ｓ１Ｐ１に対する競合的なアンタゴニストであるＷ１４６（１０ｍｇ／ｋｇ）との同時投与によって完全に廃止された（図５Ｂ）。高血圧マウスにおいて、血漿亜硝酸レベルはＡｐｏＭ−Ｆｃによって強く誘導されたが、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭによっては誘導されなかった（図５Ｃ）。正常マウスにおける安静時血圧は、ＡｐｏＭ−Ｆｃによって一過性に降下したが、その程度および期間はそれほど強力ではなく一過性であった（図５Ｄ）。実際に、Ａｐｏｍ−／−マウスは、ＷＴ対照物と比較して有意に上昇した安静時血圧を示す（図５Ｅ）。これらのデータは、ＡｐｏＭ−Ｆｃ投与が内皮Ｓ１Ｐ１／ｅＮＯＳ／ＮＯ軸を活性化して持続的な抗高血圧効果を達成することを示唆している。ＡｐｏＭ−Ｆｃとは対照的に、Ｓ１Ｐ１受容体を標的とする小分子の投与は、内皮Ｓ１Ｐ１のそれらの機能的拮抗作用に一部には起因して、げっ歯動物およびヒトにおいて軽度の血圧の上昇を誘導する（Cantalupo, A. et al., Nature Medicine, 21, 1028-1037 (2015); Camm, J. et al., American Heart Journal, 168, 632-644 (2014)）。
【０１２０】
例７：心筋梗塞後の心機能に対するＡｐｏＭ−Ｆｃ結合Ｓ１Ｐの効果
ＨＤＬおよびＳ１Ｐは、心筋梗塞のげっ歯動物およびブタモデルにおいて（Morel, S. et al., Cardiovascular Research, 109, 385-396 (2016); Sattler, K. et al., Journal of the American College of Cardiology, 66, 1470-1485 (2015); Theilmeier, G. et al., Circulation, 114, 1403-1409 (2006); Santos-Gallego, C. G. et al., Circulation, 133, 954-966 (2016))、および脳卒中のげっ歯動物モデルにおいて（Lapergue, B. et al., Stroke, 44, 699-707 (2013); Wei, Y. et al., Annals of Neurology, 69, 119-129 (2011)）、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害を抑制することが知られている。再灌流療法を受けている脳卒中患者では、ＨＤＬコレステロールレベルは３ヵ月時点での良好な転帰と関連していた（Makihara, N. et al., Cerebrovascular Diseases, 33, 240-247 (2012)）。心臓において、Ｓ１Ｐ１アゴニストの治療的投与はまた、小分子アゴニスト（ＳＥＷ２８７１）が異常な心律動を誘発したとしてもＩ／Ｒ障害（Levkau, B., Frontiers in Pharmacology, 6, 243 (2015)）を抑制する（Hofmann, U. et al., Cardiovascular Res. , 83, 285-293 (2009); Tsukada, Y. T. et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 50, 660-669 (2007)）。それゆえ、本発明者らは、ＡｐｏＭ−Ｆｃ投与は、内皮に対するその保護効果に起因して心筋Ｉ／Ｒ障害を軽減するであろうと仮定した。ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭではなくＡｐｏＭ−Ｆｃの投与は、再灌流後２４時間でＩ／Ｒ障害を減少させた（図６Ａ）。加えて、梗塞部位への好中球の蓄積はＡｐｏＭ−Ｆｃによって大きく軽減されたが、血管密度は梗塞部位において変化せず、これはＡｐｏＭ−Ｆｃが心筋Ｉ／Ｒ障害後も内皮恒常性を維持したことを示唆する（図６Ｂ）。Ｉ／Ｒ障害の１〜２週間後の心エコー分析は、ＡｐｏＭ−Ｆｃ投与による心筋機能の有意な保存を示した（図６Ｃ）。これらのデータは、ＡｐｏＭ−Ｆｃの治療的投与が血管のＳ１Ｐ受容体を活性化して心筋Ｉ／Ｒ障害を抑制することを示唆している。
【０１２１】
脳虚血におけるＡｐｏＭ−Ｆｃ処置の治療的可能性を調査するために、一過性局所脳虚血のマウスモデルである、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルを使用した。６０分の虚血後、マウスを再灌流時にＰＢＳ、ＡｐｏＭ−ＦｃまたはＡｐｏＭ−ＴＭ−Ｆｃ（Ｉ．Ｐ．注射、４ｍｇ／ｋｇ）で処置した。再灌流の２３時間後、浮腫および梗塞の比率、ならびに梗塞体積を以前に記載されたように計算した（Kim, G. S. et al., Nature Communications, 6, 7893 (2015)）。図６Ｄ〜Ｆに示されるように、ＡｐｏＭ−Ｆｃの投与は、梗塞率（ＰＢＳ処置マウス ０．３９３±０．０２６対ＡｐｏＭ−Ｆｃ処置マウス ０．２３８±０．０１９；３９％減少）および細胞障害性浮腫と血管原性浮腫の合計である、総浮腫率（ＰＢＳ処置マウス ０．１４６±０．０１３対ＡｐｏＭ−Ｆｃ処置マウス ０．０５２±０．００９、６４％減少）の両方において有意な減少をもたらした。梗塞体積（浮腫について補正）は、ＰＢＳ処置マウス（８６．８±５．８ｍｍ３）と比較してＡｐｏＭ−Ｆｃ処置マウス（５２．４±４．２ｍｍ３）において有意に低かった。対照的に、ＡｐｏＭ−ＴＭ−Ｆｃによる処置は保護効果を示す傾向があり、それは統計的有意性を達成しなかった。神経学的スコアは、ＰＢＳ処置マウスと比較してＡｐｏＭ−Ｆｃ処置マウスにおいて有意に改善されたが、ＡｐｏＭ−ＴＭ−Ｆｃで処置されたマウスでは改善されなかったことも見出された（図６Ｇ）。レーザースペックルフローメトリーにより、手術の間にモニターされたＭＣＡの脳血流領域は、閉塞の間、３つのマウス群すべてにおいて同様に減少し、そして再灌流後に同様に回復した（図６Ｈ）。これらのデータは、実験的脳卒中において、再灌流後のＡｐｏＭ−Ｆｃ処置が総脳浮腫および梗塞サイズを著しく減少させ、その結果脳卒中転帰の改善がもたらされることを示している。虚血前、間および再灌流後に測定された生理学的パラメータ（動脈酸素飽和度、心拍数、脈拍拡張および呼吸数）（Kim, G. S. et al., Nature Communications, 6, 7893 (2015)）は、ＰＢＳ、ＡｐｏＭ−ＦｃまたはＡｐｏＭ−ＴＭ−Ｆｃで処置したマウスにおいて、有意に変化しなかった。
【０１２２】
本明細書に開示された結果は、ＡｐｏＭ−Ｆｃ組み換えタンパク質がＳ１Ｐと結合し、内皮Ｓ１Ｐ受容体を活性化することを示唆している。ＡｐｏＭ−Ｆｃ組み換えタンパク質はインビボで安定であり、それゆえ、脈管構造におけるＳ１Ｐ受容体の持続的活性化を可能にする。興味深いことに、ＡｐｏＭ−Ｆｃ処置はリンパ球減少症を誘発せず、これは二次リンパ器官においてリンパ球Ｓ１Ｐ受容体にアクセスしないことを示唆している。これは、ＡｐｏＭ−Ｆｃ投与が内皮Ｓ１Ｐ受容体を選択的に標的とし、インビトロでＳ１Ｐ依存性血管病変を治療的に調整するための新規戦略を提供することを示唆している。実際、ＡｐｏＭ−Ｆｃ組み換えタンパク質の投与は、高血圧マウスにおいて血圧の持続的な降下を達成した。この効果はＳ１Ｐ１活性化に依存し、そしてＮＯ合成を含む。この経路の治療的標的化は、治療抵抗性高血圧症候群において有用であり得る。さらに、ＡｐｏＭ−Ｆｃ組み換えタンパク質がマウスモデルにおいて心筋Ｉ／Ｒ障害を抑制するという証拠が本明細書に提示されている。以前の研究は、ＨＤＬ注入またはＳ１Ｐ１アゴニストがＭＩ／Ｒ障害から心筋を保護することを示している（Morel, S. et al., Cardiovascular Research, 109, 385-396 (2016); Sattler, K. et al., Journal of the American College of Cardiology, 66, 1470-1485, (2015); Theilmeier, G. et al., Circulation, 114, 1403-1409 (2006); Santos-Gallego, C. G. et al., Circulation, 133, 954-966 (2016)）。加えて、脳卒中のマウスモデルにおいて、ＨＤＬ注入およびＳ１Ｐ１受容体活性化剤は、動物モデルおよびヒトの臨床試験においてニューロンのＩ／Ｒ障害を減少させることが示されている（Makihara, N. et al., Cerebrovascular Diseases, 33, 240-247 (2012); Keene, D. et al., BMJ, 349, g4379 (2014); Lapergue, B. et al., Stroke, 44, 699-707 (2013); Wei, Y. et al., Annals of Neurology, 69, 119-129 (2011); Kim, G. S. et al., Nature Communications, 6, 7893 (2015); Fu, Y. et al., PNAS, 111, 18315-18320 (2014); Zhu, Z. et al., Circulation, 132, 1104-1112 (2015)）。ＡｐｏＭ−Ｆｃ組み換えタンパク質により血管Ｓ１Ｐ受容体を選択的に活性化する能力は、この経路を標的とする小分子に対して大きな利点を提供する。実際、小分子Ｓ１Ｐ１阻害剤は血管系に対して選択的ではなく、短期間の作動作用は多くの器官系に影響を及ぼす慢性的機能拮抗作用へと進化する（Hla, T., Neurology, 76, S3-8 (2011)）。したがって、ＡｐｏＭ−Ｆｃ投与は、内皮機能が損なわれている疾患の新規治療法として本明細書で提案されている。
【図１Ａ−１Ｃ】
2019531336.tif 000008
【図１Ｄ−１Ｅ】
2019531336.tif 000009
【図２Ａ−２Ｂ】
2019531336.tif 000010
【図２Ｃ】
2019531336.tif 000011
【図２Ｄ】
2019531336.tif 000012
【図３Ａ−３Ｃ】
2019531336.tif 000013
【図４Ａ−４Ｃ】
2019531336.tif 000014
【図４Ｄ−４Ｇ】
2019531336.tif 000015
【図５Ａ−５Ｅ】
2019531336.tif 000016
【図６Ａ−６Ｃ】
2019531336.tif 000017
【図６Ｄ−６Ｈ】
2019531336.tif 000018
【配列表】
2019531336000001.app
【国際調査報告】
2019531336.tif 000019
2019531336.tif 000020
2019531336.tif 000021