(57)【要約】本開示は、血液または血液製剤からサイトカインを含むタンパク質を除去する方法であって、該血液または血液製剤を、グラファイト含量が高く、スリット状のメソ孔およびマクロ孔を有する炭素のフォームと接触させるステップを含み、該孔サイズ寸法が、該タンパク質のサイズと同等となるように選択され、該接触させるステップにより、数分または数時間で、該血液または血液製剤から高レベルの該タンパク質が除去される方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液または血液製剤からタンパク質またはペプチドを除去する方法であって、該血液または血液製剤をスリット状のメソ孔およびマクロ孔を有する炭素フォームと接触させるステップを含み、該孔サイズ寸法が、該タンパク質またはペプチドのサイズと同等となるように選択され、該接触させるステップにより、１２０分未満で、該血液または血液製剤から少なくとも８０％の該タンパク質または該ペプチドが除去される方法。
【請求項２】
前記炭素フォームが、熱膨張グラファイト（ＴＥＧ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炭素フォームが、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記炭素フォームが、ポリマー誘導セラミックカーバイド誘導炭素（ＰＤＣ−ＣＤＣ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質または前記ペプチドが、５から６０ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質／ペプチドが、サイトカインである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サイトカインが、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、または腫瘍壊死因子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、ＩＬ−６、ＩＬ−８、またはＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（別名ＴＮＦ−β）である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質または前記ペプチドの少なくとも８０％が、６０分未満で、前記血液または血液製剤から除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記炭素フォームが、ポリマー複合材内に分散される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＮＰが、真空アニールされたＣ−５００  ＧＮＰである、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｃ−５００  ＧＮＰが、真空アニールされ、空気により酸化され、アミノ化されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＧＮＰが、ＡＲＣ−７５０を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が、ＩＬ−６であるか、またはＩＬ−６を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、ＩＬ−８であるか、またはＩＬ−８を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が、ＴＮＦ−αであるか、またはＴＮＦ−αを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
敗血症の処置を必要とする患者の敗血症を処置する方法であって、請求項１に記載の方法を前記患者の血液に対して実施するステップを含む方法。
【請求項１８】
前記血液または血液製剤が、血液灌流カートリッジを通して処理される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１６年５月２６日に出願した米国仮特許出願第６２／３４１，６６１号および２０１６年６月２２日に出願した米国仮特許出願第６２／３５３，０７８号に対する優先権を主張する。上記で参照した出願は両方とも、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府の権利
この発明は、米国国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって与えられた契約番号第１５１８９９９号に基づく政府の支援によりなされたものである。政府は、この発明に特定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
この開示は、血液および血液製剤からサイトカインを除去することによる血液および血液製剤の精製を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
背景
高レベルの炎症促進性サイトカインは、敗血症およびエボラウイルス疾患などの重篤な状態の高い致死性に関連する。サイトカインは、人体で産生され、生理条件において細胞のシグナル伝達および伝達機能を実施するが、病理では、サイトカインのレベルが急速に上昇することは、「サイトカインストーム」としても公知である状態であり、破壊的な作用をもたらす。
【０００５】
敗血症は、感染に対する身体の調節不全の宿主応答によって引き起こされる生命を脅かす状態である。敗血症の症状（例えば、発熱、低体温、臓器機能不全）は、偶発的感染に対する誇張され歪んだ免疫応答である、「サイトカインストーム」として公知であるサイトカインカスケードに応じて急速に進行する。高濃度の炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αは、患者の敗血症の発症において役割を果たす。米国では、１９９３年から２００３年の間に、重篤な敗血症の入院数が２倍となった。敗血症は、小児および乳児にとって主要な死因であり、発生数は全世界で１９００万症例と推定された。現在の処置方法は、根底にある感染の治療ならびに輸液蘇生、広域スペクトル抗生物質、および血液透析による過剰な炎症に対する作用を媒介することに焦点を当てている。敗血症処置のための研究努力は、炎症促進性サイトカインを標的とする免疫療法、および過剰なサイトカイン濃度を吸着する体外血液灌流を必要とする。致命的なサイトカインストームを停止するのに臨床医には数時間の時間しかないため、血中サイトカインレベルを正常にまで戻す迅速な低減は非常に重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、血液からサイトカインを急速に除去することができる材料および技術に対する需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
本開示のある特定の実施形態は、血液および血液製剤からタンパク質を除去する方法を提供する。これらの実施形態の一部では、方法は、血液または血液製剤をスリット状のメソ孔およびマクロ孔を有する炭素のフォームと接触させるステップを含み、孔サイズ寸法は、タンパク質のサイズと同等となるように選択される。一部の態様では、接触させるステップにより、１２０分未満で、血液または血液製剤から少なくとも８０％のタンパク質が除去される。他の除去速度も考慮に入れる。
【０００８】
この開示で企図される炭素フォームは、熱膨張グラファイト（ＴＥＧ）、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）、およびポリマー誘導セラミックカーバイド誘導炭素（polymer  derived  ceramic  carbide-derived  carbon）（ＰＤＣ−ＣＤＣ）を含む。これらの炭素フォームは、遊離形態、フィルム、またはポリマー複合材（例えば、ＰＴＦＥ複合材）において適用されてもよい。
【０００９】
方法は、５から１００ｋＤａの範囲の数平均分子量を有するものを含む一連のタンパク質に対して実施可能である。方法は、タンパク質の分子量によって必ずしも制限されないが、但し、タンパク質は炭素フォームの孔に収まり得ることを条件とする。このように、タンパク質の分子量は、上述のものより大きいかまたは小さい端点を有する範囲で規定されてよく、および／または上述のものの部分集合を表す範囲で規定されてもよい。
【００１０】
一部の実施形態では、タンパク質は、サイトカインである。代表例では、サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、またはこれらの組合せでありうる。代替の独立した実施形態では、タンパク質は、独立して、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（別名ＴＮＦ−β）、もしくは血清アルブミン、またはこれらの組合せである。
【００１１】
本出願は、添付の図面と併せて読んだ場合に、さらに理解される。主題を例証する目的で、主題の代表的実施形態が図面に示されるが、本開示の主題は、開示された特定の方法、デバイス、およびシステムに限定されない。さらに、図面は、必ずしも実寸で描かれていない。図面においては以下の通りである：
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａについての窒素吸着等温線を示す。
【００１３】
【図１Ｂ】図１Ｂは、カーバイド誘導炭素材料である、低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａについての孔サイズ分布を示す。
【００１４】
【図１Ｃ】図１Ｃは、高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂについての窒素吸着等温線を示す。
【００１５】
【図１Ｄ】図１Ｄは、カーバイド誘導炭素材料である、高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂについての孔サイズ分布を示す。
【００１６】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａ（図２Ａ）および高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂ（図２Ｂ）の高分子量前駆体のＳＥＭ画像を示す。
【００１７】
【図３】図３は、低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂについての細胞生存率を示す。
【００１８】
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、（図４Ａ）低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび（図４Ｂ）高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂへのサイトカイン吸着を示す。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、（図４Ａ）低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび（図４Ｂ）高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂへのサイトカイン吸着を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃおよび４Ｄは、（図４Ｃ）低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび（図４Ｄ）高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂへの正規化した吸着を示す。
【図４Ｄ】図４Ｃおよび４Ｄは、（図４Ｃ）低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび（図４Ｄ）高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂへの正規化した吸着を示す。
【００１９】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｆは、（図５Ａ〜Ｃ）低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび（図５Ｄ〜Ｆ）高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂについてのサイトカイン吸着を例証する。試験のために、過剰な濃度のタンパク質が血漿に添加される場合、それは、「スパイク血漿」とみなされる。対照は、このスパイク血漿のタンパク質濃度であるが、材料とは接触しない。これは、比較的一定のままであり、血漿が材料と接触する場合に、外部因子は濃度の低下に寄与していない。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｆは、（図５Ａ〜Ｃ）低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび（図５Ｄ〜Ｆ）高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂについてのサイトカイン吸着を例証する。試験のために、過剰な濃度のタンパク質が血漿に添加される場合、それは、「スパイク血漿」とみなされる。対照は、このスパイク血漿のタンパク質濃度であるが、材料とは接触しない。これは、比較的一定のままであり、血漿が材料と接触する場合に、外部因子は濃度の低下に寄与していない。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｆは、（図５Ａ〜Ｃ）低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび（図５Ｄ〜Ｆ）高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂについてのサイトカイン吸着を例証する。試験のために、過剰な濃度のタンパク質が血漿に添加される場合、それは、「スパイク血漿」とみなされる。対照は、このスパイク血漿のタンパク質濃度であるが、材料とは接触しない。これは、比較的一定のままであり、血漿が材料と接触する場合に、外部因子は濃度の低下に寄与していない。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｆは、（図５Ａ〜Ｃ）低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび（図５Ｄ〜Ｆ）高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂについてのサイトカイン吸着を例証する。試験のために、過剰な濃度のタンパク質が血漿に添加される場合、それは、「スパイク血漿」とみなされる。対照は、このスパイク血漿のタンパク質濃度であるが、材料とは接触しない。これは、比較的一定のままであり、血漿が材料と接触する場合に、外部因子は濃度の低下に寄与していない。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｆは、（図５Ａ〜Ｃ）低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび（図５Ｄ〜Ｆ）高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂについてのサイトカイン吸着を例証する。試験のために、過剰な濃度のタンパク質が血漿に添加される場合、それは、「スパイク血漿」とみなされる。対照は、このスパイク血漿のタンパク質濃度であるが、材料とは接触しない。これは、比較的一定のままであり、血漿が材料と接触する場合に、外部因子は濃度の低下に寄与していない。
【図５Ｆ】図５Ａ〜５Ｆは、（図５Ａ〜Ｃ）低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび（図５Ｄ〜Ｆ）高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂについてのサイトカイン吸着を例証する。試験のために、過剰な濃度のタンパク質が血漿に添加される場合、それは、「スパイク血漿」とみなされる。対照は、このスパイク血漿のタンパク質濃度であるが、材料とは接触しない。これは、比較的一定のままであり、血漿が材料と接触する場合に、外部因子は濃度の低下に寄与していない。
【００２０】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｆは、６種の異なるＧＮＰ：真空アニールしたＡＲＣ−５００（図６Ａ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（図６Ｂ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（図６Ｃ）；ＡＲＣ−７５０（図６Ｄ）；ＡＲＣ−５００（図６Ｅ）；ＡＲＣ−３００（図６Ｆ）についての窒素吸着性能を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｆは、６種の異なるＧＮＰ：真空アニールしたＡＲＣ−５００（図６Ａ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（図６Ｂ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（図６Ｃ）；ＡＲＣ−７５０（図６Ｄ）；ＡＲＣ−５００（図６Ｅ）；ＡＲＣ−３００（図６Ｆ）についての窒素吸着性能を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｆは、６種の異なるＧＮＰ：真空アニールしたＡＲＣ−５００（図６Ａ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（図６Ｂ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（図６Ｃ）；ＡＲＣ−７５０（図６Ｄ）；ＡＲＣ−５００（図６Ｅ）；ＡＲＣ−３００（図６Ｆ）についての窒素吸着性能を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｆは、６種の異なるＧＮＰ：真空アニールしたＡＲＣ−５００（図６Ａ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（図６Ｂ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（図６Ｃ）；ＡＲＣ−７５０（図６Ｄ）；ＡＲＣ−５００（図６Ｅ）；ＡＲＣ−３００（図６Ｆ）についての窒素吸着性能を示す。
【図６Ｅ】図６Ａ〜６Ｆは、６種の異なるＧＮＰ：真空アニールしたＡＲＣ−５００（図６Ａ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（図６Ｂ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（図６Ｃ）；ＡＲＣ−７５０（図６Ｄ）；ＡＲＣ−５００（図６Ｅ）；ＡＲＣ−３００（図６Ｆ）についての窒素吸着性能を示す。
【図６Ｆ】図６Ａ〜６Ｆは、６種の異なるＧＮＰ：真空アニールしたＡＲＣ−５００（図６Ａ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（図６Ｂ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（図６Ｃ）；ＡＲＣ−７５０（図６Ｄ）；ＡＲＣ−５００（図６Ｅ）；ＡＲＣ−３００（図６Ｆ）についての窒素吸着性能を示す。
【００２１】
【図７】図７は、ＧＮＰの粒子サイズ分布を示す。
【００２２】
【図８Ａ】図８（Ａ〜Ｄ）は、サブミクロンサイズの粒子（図８Ｂ）でできているグラフェンナノプレートレット凝集体（図８Ａ、８Ｃ）のＳＥＭおよびＴＥＭ画像を示し、一方、単一のグラフェンナノプレートレット粒子は、ＴＥＭ画像で見られるグラフェン層のスタックからなる（図８Ｄ）。図８Ｅは、ＧＮＰの断面のＴＥＭ画像を示す。この特有の構造により、図８Ｆに表すように、サイトカイン吸着にさらされるＧＮＰの表面をより大きくすることが可能となる。図８Ｇは、左側の多孔質材料（カーバイド誘導炭素）および右側の無孔材料（グラフェンナノプレートレット）での、タンパク質吸着プロセスの概略図を示す。
【図８Ｂ】図８（Ａ〜Ｄ）は、サブミクロンサイズの粒子（図８Ｂ）でできているグラフェンナノプレートレット凝集体（図８Ａ、８Ｃ）のＳＥＭおよびＴＥＭ画像を示し、一方、単一のグラフェンナノプレートレット粒子は、ＴＥＭ画像で見られるグラフェン層のスタックからなる（図８Ｄ）。図８Ｅは、ＧＮＰの断面のＴＥＭ画像を示す。この特有の構造により、図８Ｆに表すように、サイトカイン吸着にさらされるＧＮＰの表面をより大きくすることが可能となる。図８Ｇは、左側の多孔質材料（カーバイド誘導炭素）および右側の無孔材料（グラフェンナノプレートレット）での、タンパク質吸着プロセスの概略図を示す。
【図８Ｃ】図８（Ａ〜Ｄ）は、サブミクロンサイズの粒子（図８Ｂ）でできているグラフェンナノプレートレット凝集体（図８Ａ、８Ｃ）のＳＥＭおよびＴＥＭ画像を示し、一方、単一のグラフェンナノプレートレット粒子は、ＴＥＭ画像で見られるグラフェン層のスタックからなる（図８Ｄ）。図８Ｅは、ＧＮＰの断面のＴＥＭ画像を示す。この特有の構造により、図８Ｆに表すように、サイトカイン吸着にさらされるＧＮＰの表面をより大きくすることが可能となる。図８Ｇは、左側の多孔質材料（カーバイド誘導炭素）および右側の無孔材料（グラフェンナノプレートレット）での、タンパク質吸着プロセスの概略図を示す。
【図８Ｄ】図８（Ａ〜Ｄ）は、サブミクロンサイズの粒子（図８Ｂ）でできているグラフェンナノプレートレット凝集体（図８Ａ、８Ｃ）のＳＥＭおよびＴＥＭ画像を示し、一方、単一のグラフェンナノプレートレット粒子は、ＴＥＭ画像で見られるグラフェン層のスタックからなる（図８Ｄ）。図８Ｅは、ＧＮＰの断面のＴＥＭ画像を示す。この特有の構造により、図８Ｆに表すように、サイトカイン吸着にさらされるＧＮＰの表面をより大きくすることが可能となる。図８Ｇは、左側の多孔質材料（カーバイド誘導炭素）および右側の無孔材料（グラフェンナノプレートレット）での、タンパク質吸着プロセスの概略図を示す。
【図８Ｅ】図８（Ａ〜Ｄ）は、サブミクロンサイズの粒子（図８Ｂ）でできているグラフェンナノプレートレット凝集体（図８Ａ、８Ｃ）のＳＥＭおよびＴＥＭ画像を示し、一方、単一のグラフェンナノプレートレット粒子は、ＴＥＭ画像で見られるグラフェン層のスタックからなる（図８Ｄ）。図８Ｅは、ＧＮＰの断面のＴＥＭ画像を示す。この特有の構造により、図８Ｆに表すように、サイトカイン吸着にさらされるＧＮＰの表面をより大きくすることが可能となる。図８Ｇは、左側の多孔質材料（カーバイド誘導炭素）および右側の無孔材料（グラフェンナノプレートレット）での、タンパク質吸着プロセスの概略図を示す。
【図８Ｆ】図８（Ａ〜Ｄ）は、サブミクロンサイズの粒子（図８Ｂ）でできているグラフェンナノプレートレット凝集体（図８Ａ、８Ｃ）のＳＥＭおよびＴＥＭ画像を示し、一方、単一のグラフェンナノプレートレット粒子は、ＴＥＭ画像で見られるグラフェン層のスタックからなる（図８Ｄ）。図８Ｅは、ＧＮＰの断面のＴＥＭ画像を示す。この特有の構造により、図８Ｆに表すように、サイトカイン吸着にさらされるＧＮＰの表面をより大きくすることが可能となる。図８Ｇは、左側の多孔質材料（カーバイド誘導炭素）および右側の無孔材料（グラフェンナノプレートレット）での、タンパク質吸着プロセスの概略図を示す。
【図８Ｇ】図８（Ａ〜Ｄ）は、サブミクロンサイズの粒子（図８Ｂ）でできているグラフェンナノプレートレット凝集体（図８Ａ、８Ｃ）のＳＥＭおよびＴＥＭ画像を示し、一方、単一のグラフェンナノプレートレット粒子は、ＴＥＭ画像で見られるグラフェン層のスタックからなる（図８Ｄ）。図８Ｅは、ＧＮＰの断面のＴＥＭ画像を示す。この特有の構造により、図８Ｆに表すように、サイトカイン吸着にさらされるＧＮＰの表面をより大きくすることが可能となる。図８Ｇは、左側の多孔質材料（カーバイド誘導炭素）および右側の無孔材料（グラフェンナノプレートレット）での、タンパク質吸着プロセスの概略図を示す。
【００２３】
【図９Ａ】図９（Ａ〜Ｂ）は、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）、真空アニールしたグラフェンナノプレートレット（ＶＡ−ＧＮＰ）およびグラフェンナノプレートレットポリテトラフルオロエチレン複合材フィルム（ＧＮＰ−ＰＴＦＥ）の窒素吸着等温線（図９Ａ）および孔サイズ分布（図９Ｂ）を示す。
【図９Ｂ】図９（Ａ〜Ｂ）は、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）、真空アニールしたグラフェンナノプレートレット（ＶＡ−ＧＮＰ）およびグラフェンナノプレートレットポリテトラフルオロエチレン複合材フィルム（ＧＮＰ−ＰＴＦＥ）の窒素吸着等温線（図９Ａ）および孔サイズ分布（図９Ｂ）を示す。
【００２４】
【図１０】図１０は、ＧＮＰのＳＥＭ画像を示す。
【００２５】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＡＲＣ−７５０（図１１Ａ）、ＡＲＣ−５００（図１１Ｂ）、およびＡＲＣ−３００（図１１Ｃ）の粒子サイズ安定性を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＡＲＣ−７５０（図１１Ａ）、ＡＲＣ−５００（図１１Ｂ）、およびＡＲＣ−３００（図１１Ｃ）の粒子サイズ安定性を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＡＲＣ−７５０（図１１Ａ）、ＡＲＣ−５００（図１１Ｂ）、およびＡＲＣ−３００（図１１Ｃ）の粒子サイズ安定性を示す。
【００２６】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｆは、真空アニールしたＡＲＣ−５００（図１２Ｄ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（図１２Ｅ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（図１２Ｆ）；ＡＲＣ−７５０（図１２Ａ）；ＡＲＣ−５００（図１２Ｂ）；ＡＲＣ−３００（図１２Ｃ）についてのｐＨの関数としてのゼータ電位を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｆは、真空アニールしたＡＲＣ−５００（図１２Ｄ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（図１２Ｅ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（図１２Ｆ）；ＡＲＣ−７５０（図１２Ａ）；ＡＲＣ−５００（図１２Ｂ）；ＡＲＣ−３００（図１２Ｃ）についてのｐＨの関数としてのゼータ電位を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｆは、真空アニールしたＡＲＣ−５００（図１２Ｄ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（図１２Ｅ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（図１２Ｆ）；ＡＲＣ−７５０（図１２Ａ）；ＡＲＣ−５００（図１２Ｂ）；ＡＲＣ−３００（図１２Ｃ）についてのｐＨの関数としてのゼータ電位を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｆは、真空アニールしたＡＲＣ−５００（図１２Ｄ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（図１２Ｅ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（図１２Ｆ）；ＡＲＣ−７５０（図１２Ａ）；ＡＲＣ−５００（図１２Ｂ）；ＡＲＣ−３００（図１２Ｃ）についてのｐＨの関数としてのゼータ電位を示す。
【図１２Ｅ】図１２Ａ〜１２Ｆは、真空アニールしたＡＲＣ−５００（図１２Ｄ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（図１２Ｅ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（図１２Ｆ）；ＡＲＣ−７５０（図１２Ａ）；ＡＲＣ−５００（図１２Ｂ）；ＡＲＣ−３００（図１２Ｃ）についてのｐＨの関数としてのゼータ電位を示す。
【図１２Ｆ】図１２Ａ〜１２Ｆは、真空アニールしたＡＲＣ−５００（図１２Ｄ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（図１２Ｅ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（図１２Ｆ）；ＡＲＣ−７５０（図１２Ａ）；ＡＲＣ−５００（図１２Ｂ）；ＡＲＣ−３００（図１２Ｃ）についてのｐＨの関数としてのゼータ電位を示す。
【００２７】
【図１３】図１３は、真空アニールしたＣ−５００およびＡＲＣ−５００についてのラマンスペクトルおよびＩＤ／ＩＧ比、またはＤおよびＧバンド強度の比を示す。
【００２８】
【図１４】図１４は、真空アニールしたＣ−５００  ＧＮＰのＴＧＡ分析を示す。
【００２９】
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＥＤＳからのＧＮＰの重量％の組成を示す。図１５Ｂは、ＸＰＳからのＧＮＰの原子％の組成を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａは、ＥＤＳからのＧＮＰの重量％の組成を示す。図１５Ｂは、ＸＰＳからのＧＮＰの原子％の組成を示す。
【００３０】
【図１６】図１６は、真空アミノ化した（the  vacuum  aminated）ＧＮＰ試料についての窒素結合エネルギーについてのピークフィッティングを示す。
【００３１】
【図１７Ａ】図１７Ａは、銀ナノ粒子と比較した、ＡＲＣ−５００についての細胞生存率を示す（平均の±標準誤差、ｎ＝３）。図１７Ｂは、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）および銀ナノ粒子（Ａｇ）と２４時間直接接触させた後のＨｅｐＧ２  ＭＴＳ細胞の生存率に対する効果を示す（±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【図１７Ｂ】図１７Ａは、銀ナノ粒子と比較した、ＡＲＣ−５００についての細胞生存率を示す（平均の±標準誤差、ｎ＝３）。図１７Ｂは、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）および銀ナノ粒子（Ａｇ）と２４時間直接接触させた後のＨｅｐＧ２  ＭＴＳ細胞の生存率に対する効果を示す（±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【００３２】
【図１８】図１８は、真空アニールしたＧＮＰへのＢＳＡ吸着について例証する。「陽性対照」は、タンパク質の水溶液であるが、炭素質材料を含まない。これを使用して、いずれの外部作用が吸着に影響を及びしているかどうかをモニターする（例えば、チューブの壁に貼りついているタンパク質）。
【００３３】
【図１９】図１９は、焼成したＧＮＰへのサイトカイン吸着を示す。
【００３４】
【図２０Ａ】図２０Ａ〜２０Ｃは窒素焼成（nitrogen  baked）ＧＮＰへのサイトカインの吸着を例証する。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜２０Ｃは窒素焼成（nitrogen  baked）ＧＮＰへのサイトカインの吸着を例証する。
【図２０Ｃ】図２０Ａ〜２０Ｃは窒素焼成（nitrogen  baked）ＧＮＰへのサイトカインの吸着を例証する。
【００３５】
【図２１Ａ】図２１Ａ〜２１Ｆは、異なる表面積のＧＮＰにおけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａ〜２１Ｆは、異なる表面積のＧＮＰにおけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ａ〜２１Ｆは、異なる表面積のＧＮＰにおけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２１Ｄ】図２１Ａ〜２１Ｆは、異なる表面積のＧＮＰにおけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２１Ｅ】図２１Ａ〜２１Ｆは、異なる表面積のＧＮＰにおけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２１Ｆ】図２１Ａ〜２１Ｆは、異なる表面積のＧＮＰにおけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【００３６】
【図２２Ａ】図２２Ａ〜２２Ｆは、様々な質量の吸着剤を用いた場合のＡＲＣ−５００におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａ〜２２Ｆは、様々な質量の吸着剤を用いた場合のＡＲＣ−５００におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２２Ｃ】図２２Ａ〜２２Ｆは、様々な質量の吸着剤を用いた場合のＡＲＣ−５００におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２２Ｄ】図２２Ａ〜２２Ｆは、様々な質量の吸着剤を用いた場合のＡＲＣ−５００におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２２Ｅ】図２２Ａ〜２２Ｆは、様々な質量の吸着剤を用いた場合のＡＲＣ−５００におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２２Ｆ】図２２Ａ〜２２Ｆは、様々な質量の吸着剤を用いた場合のＡＲＣ−５００におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【００３７】
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｆは、種々の表面化学を有するＣ−５００におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｆは、種々の表面化学を有するＣ−５００におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｆは、種々の表面化学を有するＣ−５００におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２３Ｄ】図２３Ａ〜２３Ｆは、種々の表面化学を有するＣ−５００におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２３Ｅ】図２３Ａ〜２３Ｆは、種々の表面化学を有するＣ−５００におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２３Ｆ】図２３Ａ〜２３Ｆは、種々の表面化学を有するＣ−５００におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【００３８】
【図２４】図２４は、グラフェンナノプレートレットと直接接触した５および６０分後に、スパイクヒト血漿試料における炎症性サイトカインＩＬ８、ＩＬ１β、ＩＬ１０、ＩＬ６およびＴＮＦ−αの除去を示す（±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【００３９】
【図２５Ａ】図２５Ａ〜２５Ｄは、ＧＮＰ複合材の窒素吸着と孔サイズ分布を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜２５Ｄは、ＧＮＰ複合材の窒素吸着と孔サイズ分布を示す。
【図２５Ｃ】図２５Ａ〜２５Ｄは、ＧＮＰ複合材の窒素吸着と孔サイズ分布を示す。
【図２５Ｄ】図２５Ａ〜２５Ｄは、ＧＮＰ複合材の窒素吸着と孔サイズ分布を示す。
【００４０】
【図２６Ａ−Ｂ】図２６Ａおよび２６Ｂは、（図２６Ａ）ＰＶＡ−ＧＮＰ（クリオゲル（Cryolgel）−ＧＮＰ）および（図２６Ｂ）ＰＴＦＥ−ＧＮＰ複合材のＳＥＭ画像を示す。
【００４１】
【図２７Ａ】図２７Ａ〜２７Ｆは、ＰＶＡ−ＧＮＰ（すなわち、クリオゲル（Cryogel）−ＧＮＰ）複合材およびその個々の成分におけるサイトカイン濃度と正規化した吸着を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ａ〜２７Ｆは、ＰＶＡ−ＧＮＰ（すなわち、クリオゲル（Cryogel）−ＧＮＰ）複合材およびその個々の成分におけるサイトカイン濃度と正規化した吸着を示す。
【図２７Ｃ】図２７Ａ〜２７Ｆは、ＰＶＡ−ＧＮＰ（すなわち、クリオゲル（Cryogel）−ＧＮＰ）複合材およびその個々の成分におけるサイトカイン濃度と正規化した吸着を示す。
【図２７Ｄ】図２７Ａ〜２７Ｆは、ＰＶＡ−ＧＮＰ（すなわち、クリオゲル（Cryogel）−ＧＮＰ）複合材およびその個々の成分におけるサイトカイン濃度と正規化した吸着を示す。
【図２７Ｅ】図２７Ａ〜２７Ｆは、ＰＶＡ−ＧＮＰ（すなわち、クリオゲル（Cryogel）−ＧＮＰ）複合材およびその個々の成分におけるサイトカイン濃度と正規化した吸着を示す。
【図２７Ｆ】図２７Ａ〜２７Ｆは、ＰＶＡ−ＧＮＰ（すなわち、クリオゲル（Cryogel）−ＧＮＰ）複合材およびその個々の成分におけるサイトカイン濃度と正規化した吸着を示す。
【００４２】
【図２８Ａ】図２８Ａ〜２８Ｆは、ＰＴＦＥ−ＧＮＰ複合材およびその個々の成分におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２８Ｂ】図２８Ａ〜２８Ｆは、ＰＴＦＥ−ＧＮＰ複合材およびその個々の成分におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２８Ｃ】図２８Ａ〜２８Ｆは、ＰＴＦＥ−ＧＮＰ複合材およびその個々の成分におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２８Ｄ】図２８Ａ〜２８Ｆは、ＰＴＦＥ−ＧＮＰ複合材およびその個々の成分におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２８Ｅ】図２８Ａ〜２８Ｆは、ＰＴＦＥ−ＧＮＰ複合材およびその個々の成分におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【図２８Ｆ】図２８Ａ〜２８Ｆは、ＰＴＦＥ−ＧＮＰ複合材およびその個々の成分におけるサイトカイン濃度および正規化した吸着を示す。
【００４３】
【図２９】図２９は、二元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定に基づく、濃度変化の統計学的有意性を示す。
【００４４】
【図３０Ａ】図３０Ａ〜３０Ｃは、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）、ポリテトラフルオロエチレン複合材フィルムを有するグラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ−ＰＴＦＥ）およびポリテトラフルオロエチレンフィルム（ＰＴＦＥ）を使用する、スパイクヒト血漿試料からの炎症性サイトカインＩＬ−８（図３０Ａ）、ＩＬ−６（図３０Ｂ）およびＴＮＦ−α（図３０Ｃ）の除去について示す。
【図３０Ｂ】図３０Ａ〜３０Ｃは、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）、ポリテトラフルオロエチレン複合材フィルムを有するグラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ−ＰＴＦＥ）およびポリテトラフルオロエチレンフィルム（ＰＴＦＥ）を使用する、スパイクヒト血漿試料からの炎症性サイトカインＩＬ−８（図３０Ａ）、ＩＬ−６（図３０Ｂ）およびＴＮＦ−α（図３０Ｃ）の除去について示す。
【図３０Ｃ】図３０Ａ〜３０Ｃは、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）、ポリテトラフルオロエチレン複合材フィルムを有するグラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ−ＰＴＦＥ）およびポリテトラフルオロエチレンフィルム（ＰＴＦＥ）を使用する、スパイクヒト血漿試料からの炎症性サイトカインＩＬ−８（図３０Ａ）、ＩＬ−６（図３０Ｂ）およびＴＮＦ−α（図３０Ｃ）の除去について示す。
【００４５】
【図３１Ａ】図３１Ａ〜３１Ｄは、ＰＤＣ−ＣＤＣ（図３１Ａ）、異なる表面積のＧＮＰ（図３１Ｂ）、表面官能化ＧＮＰ（図３１Ｃ）、およびＧＮＰ複合材（図３１Ｄ）についての正規化した吸着能を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ａ〜３１Ｄは、ＰＤＣ−ＣＤＣ（図３１Ａ）、異なる表面積のＧＮＰ（図３１Ｂ）、表面官能化ＧＮＰ（図３１Ｃ）、およびＧＮＰ複合材（図３１Ｄ）についての正規化した吸着能を示す。
【図３１Ｃ】図３１Ａ〜３１Ｄは、ＰＤＣ−ＣＤＣ（図３１Ａ）、異なる表面積のＧＮＰ（図３１Ｂ）、表面官能化ＧＮＰ（図３１Ｃ）、およびＧＮＰ複合材（図３１Ｄ）についての正規化した吸着能を示す。
【図３１Ｄ】図３１Ａ〜３１Ｄは、ＰＤＣ−ＣＤＣ（図３１Ａ）、異なる表面積のＧＮＰ（図３１Ｂ）、表面官能化ＧＮＰ（図３１Ｃ）、およびＧＮＰ複合材（図３１Ｄ）についての正規化した吸着能を示す。
【００４６】
【図３２】図３２は、敗血症の血液からのサイトカインの完全な除去のための吸着剤の質量を示す。
【００４７】
【図３３Ａ】図３３Ａ〜３３Ｃは、サイトカインＩＬ８（図３３Ａ）、ＩＬ６（図３３Ｂ）およびＴＮＦ−α（図３３Ｃ）の吸着動態の擬２次モデルを示す。
【図３３Ｂ】図３３Ａ〜３３Ｃは、サイトカインＩＬ８（図３３Ａ）、ＩＬ６（図３３Ｂ）およびＴＮＦ−α（図３３Ｃ）の吸着動態の擬２次モデルを示す。
【図３３Ｃ】図３３Ａ〜３３Ｃは、サイトカインＩＬ８（図３３Ａ）、ＩＬ６（図３３Ｂ）およびＴＮＦ−α（図３３Ｃ）の吸着動態の擬２次モデルを示す。
【００４８】
【図３４Ａ】図３４Ａ〜３４Ｃは、サイトカインＩＬ８（図３４Ａ）、ＩＬ６（図３４Ｂ）およびＴＮＦ−α（図３４Ｃ）の吸着動態の擬２次モデルを示す。
【図３４Ｂ】図３４Ａ〜３４Ｃは、サイトカインＩＬ８（図３４Ａ）、ＩＬ６（図３４Ｂ）およびＴＮＦ−α（図３４Ｃ）の吸着動態の擬２次モデルを示す。
【図３４Ｃ】図３４Ａ〜３４Ｃは、サイトカインＩＬ８（図３４Ａ）、ＩＬ６（図３４Ｂ）およびＴＮＦ−α（図３４Ｃ）の吸着動態の擬２次モデルを示す。
【００４９】
【図３５】図３５は、膨張グラファイトの試料のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、血液および血液製剤を浄化する方法であって、血液または血液製剤をスリット状のマクロ多孔性（macroporosity）を有する炭素フォームと接触させるステップを含む方法に関する。
【００５１】
炭素は、その不活性かつ調整可能な特性（例えば、多孔性、表面積）が様々な寸法のタンパク質の最適な吸着を可能とするため、血液灌流系にとって魅力的な吸着剤である。吸着は、血流中の電解質および他の小分子をそのままにしながら、サイトカインに対して選択的な材料を含有するカートリッジまたはカラムを通す血液灌流によって、標準の臨床環境において実施することができる簡便かつ潜在的に有効な技術である。活性炭（ＡＣ）、クリオゲル−ＡＣ複合材、およびポリマーを熱分解したカーボンモノリスのフォームにおける炭素に関する近年の研究により、これらの材料が、過剰発現したサイトカインおよび他の毒素を吸着するのに有用であることが示されたが、これらは作用するのに時間がかかり過ぎ、かつ高価であるため実用的ではない。
【００５２】
本発明者らは、スリット状のマクロ孔および大きな粒子サイズ（１００〜１０００μｍ）を有する熱膨張グラファイト（ＴＥＧ）、すなわち、グラファイト層間化合物（ＧＩＣ）の熱膨張によって作製された材料を含む開曲面グラファイト材料（graphitic  material）により、実用化開発のためのスピードと効率がもたらされ、これらの材料が、エボラウイルス疾患、敗血症、および「サイトカインストーム」と関連する他の重篤な状態に罹患している患者の処置に使用されうることを認識している。アコーディオン様構造のＴＥＧは、原油の質量の７０倍まで吸着する、水性油エマルジョン中の原油の吸着剤として使用される。グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）と称される新しいカテゴリーの低価格グラフェン材料が、ＴＥＧの層剥離から開発された。ＧＮＰは、加工に応じて、１〜５ナノメートルの厚さ、およびサブミクロンから約１００μｍの間の縦横寸法のグラフェン層のスタックを有する。合成方法として、超音波処理によるＴＥＧの機械的剥離、およびグラフェンオキシドの化学的還元が挙げられる。これらの無孔プレートレットは、アスペクト比に応じて、オープンにアクセス可能で大きな比表面積（約５００〜７５０ｍ２／ｇ）を有する。
【００５３】
本明細書で提示されるデータは、血液灌流適用のための吸着剤材料としてのＧＮＰの使用に起因する。さらに、メソ多孔質のスリット状の孔を有するポリマー誘導セラミックカーバイド誘導炭素（ＰＤＣ−ＣＤＣ）をその吸着効率について調査した。ＧＮＰの大きく、オープンにアクセス可能な表面は、素早い吸着に必要であるが、一方、ＰＤＣ−ＣＤＣは、炎症促進性タンパク質のサイズと同等の孔サイズを有するタンパク質の捕捉に依拠する。これらのデータは、広い範囲のグラフェン材料（graphenic  material）が、サイトカインを含むタンパク質の優れた選択的吸着剤であることを示唆する。活性炭および血液浄化に使用される他の材料に特徴的な従来の孔の代わりに、このファミリーの吸着剤は、高次構造を適応させることができるタンパク質に十分利用可能な、開放型で疎水性の表面を提供し、ここで該タンパク質の疎水性ドメインが該疎水性表面に向けられ、多価疎水性相互作用を介して該疎水性表面に固着するが、一方、血液中に存在する小分子（その大部分が親水性である）は、またグラフェンの表面に付着しない。
【００５４】
本発明は、そのすべてがこの開示の一部を形成する添付の図面および実施例と関連してなされる以下の説明を参照してより容易に理解されうる。この発明が、本明細書に記載されているかまたは示されている特定の生成物、方法、条件またはパラメーターに限定されないこと、および本明細書で使用する専門用語は、例として特定の実施形態を記載することを目的とするに過ぎず、いずれの特許請求された発明も限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。同様に、他に具体的に述べられていなければ、可能な作用機序もしくは作用方式または改良の理由についての任意の記載は例示にすぎないことを意味し、本明細書における発明は、任意のこのように示唆された作用機序もしくは作用方式または改良の理由が正しいか正しくないかに拘束されるべきではない。このテキスト全体を通して、記載内容は、組成物ならびに前記組成物を作製および使用する方法を指すことが認識される。すなわち、本開示が、組成物または組成物を作製もしくは使用する方法に関連する特色または実施形態について記載または権利主張する場合、このような記載または権利主張は、これらの特色または実施形態をこれらの文脈のそれぞれ（すなわち、組成物、作製する方法、および使用する方法）における実施形態に拡大することを意図することが理解される。
【００５５】
本開示において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は複数表示を含み、特定の数値に対する言及は、その文脈が他に明確に指示をしない限り、少なくともその特定の値を含む。したがって、例えば、「１つの材料（ａ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」に対する言及は、このような材料および当業者に公知のこれらの均等物などのうちの少なくとも１つへの言及である。
【００５６】
値が、記述語「約（ａｂｏｕｔ）」の使用によって近似値として表現される場合、特定の値は別の実施形態を形成することが理解される。一般に、用語「約」の使用は、開示された主題によって得ようとする所望の特性に応じて変化しうる近似値を示し、その機能に基づいて、使用される特定の文脈において解釈されるべきである。当業者は、これを日常の問題として解釈することができる。一部の場合では、特定の値に対して使用される有効数字の数は、「約」という語の程度を決定する１つの非限定方法であってよい。他の場合では、一連の値において使用される段階的変化（gradation）を使用して、各値に対して用語「約」を利用できる意図する範囲を決定してもよい。存在する場合、すべての範囲は末端値を含み、組合せ可能である。すなわち、範囲で指定された値への言及は、その範囲内のすべての値を含む。
【００５７】
明確化のために、別々の実施形態の文脈で本明細書において記載されている本発明のある特定の特色は、単一の実施形態において組み合わせて提供してもよいことが理解されるべきである。すなわち、明らかに矛盾しないかまたは具体的に除外されていなければ、各個別の実施形態は、任意の他の実施形態（複数可）と組合せ可能であるとみなされ、このような組合せは、別の実施形態であるとみなされる。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の種々の特色は、別々にまたは任意の下位の組合せで提供されてもよい。最後に、実施形態は、一連のステップの部分、またはより一般的な構造の部分として記載されてもよいが、前記ステップのそれぞれは、それ自体で独立した実施形態であり、他の実施形態と組合せ可能とみなしてもよい。
【００５８】
移行用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、特許専門用語（ｐａｔｅｎｔ  ｖｅｒｎａｃｕｌａｒ）で通常受け入れられている意味を内包することを意図し、すなわち、（ｉ）「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義である「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的またはオープンエンドであり、さらなる、記載されていない要素または方法のステップを除外しない、（ｉｉ）「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、請求項で特定されていないいずれの要素、ステップ、または成分を除外する、ならびに（ｉｉｉ）「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、請求項の範囲を特定された材料またはステップおよび特許請求された発明の「基礎となる新規な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないもの」に限定する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という句（またはその均等物）に関して記載される実施形態は、実施形態として、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」に関して、独立して記載されているものも提供する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」に関して提供されるこれらの実施形態として、基礎となる新規な特徴（複数可）は、吸着が記載された材料にのみ依拠するかまたは優先的に依拠するサイトカインを吸着する手段を提供する方法（または組成物もしくはそれらに由来するデバイス）の操作性である。
【００５９】
リストが存在する場合、他に述べられていなければ、そのリストの個々の要素、およびそのリストのすべての組合せは、別々の実施形態であることを理解すべきである。例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣ」として提示された実施形態のリストは、実施形態「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「ＡもしくはＢ」、「ＡもしくはＣ」、「ＢもしくはＣ」、または「Ａ、Ｂ、もしくはＣ」を含むものと解釈されるべきである。
【００６０】
この明細書全体を通して、単語は、関連する技術分野の当業者によって理解される、それらの通常の意味を与えるものである。しかし、誤解を避けるために、ある特定の用語の意味を具体的に定義するかまたは明らかにするものである。
【００６１】
再び、本開示は、グラファイト炭素の特異的フォームを使用して、血液および血液製剤からタンパク質を除去する方法を対象とする。これらの実施形態の一部では、方法（複数可）は、血液または血液製剤をスリット状のメソ孔およびマクロ孔を有する炭素のフォームと接触させるステップを含み、孔サイズ寸法は、タンパク質のサイズと同等となるように選択される。ＩＵＰＡＣ表記法によれば、ミクロ多孔質材料は、２ｎｍ未満の孔寸法を有し、マクロ多孔質材料は、５０ｎｍを超える孔寸法を有し、したがって、メソ多孔質のカテゴリーはその中間にある。炭素フォームと特定のタンパク質の性質に依存して、接触させるステップは、独立した実施形態において、数分または数時間で、最も多い場合では２時間（１２０分）未満で、血液または血液製剤から少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％のタンパク質を除去しうる。他の態様では、接触させるステップは、周囲温度または周囲温度付近（例えば、１０から３５℃）で遂行されるが、より高いかまたはより低い温度も使用されてよい。さらに他の実施形態では、接触させるステップは、患者から除去された血液または血液製剤が、患者の体の外側で処置されて患者に戻されるかまたは別々に保存した後に患者または被験体に提供する透析の手配においてなされる。このような手配により、血液または血液製剤から意図せずまたは同時に除去された天然のタンパク質を患者に投与して戻すことが可能となる。
【００６２】
本明細書で使用する場合、用語「血液および／または血液製剤」は、ヒトまたは他の哺乳動物の血液、またはそれに由来する生成物、例えば、医療専門職で通常理解されるような血小板枯渇血液および血漿を指す。
【００６３】
また、本明細書で使用する場合、用語「タンパク質のサイズと同等となるように選択される孔サイズ寸法」は、炭素フォームが、孔内、またはこれらの孔のグラファイト表面に標的タンパク質を容易に吸着／吸収する優先性を反映する。おそらく、いかなる特定の孔サイズよりも少なくとも重要であるのは、炭素フォームによって提示されるグラファイト表面のサイズである。一部の実施形態では、炭素フォームは、１００から１５０ｍ２／ｇ、１５０から２００ｍ２／ｇ、２００から２５０ｍ２／ｇ、２５０から３００ｍ２／ｇ、３００から４００ｍ２／ｇ、４００から５００ｍ２／ｇ、５００から６００ｍ２／ｇ、６００から７００ｍ２／ｇ、７００から８００ｍ２／ｇ、８００から１０００ｍ２／ｇの範囲の、またはこれらの範囲のうちの２つまたはそれより多い範囲によって規定される範囲を有するグラファイト表面積を有する。
【００６４】
一般的に、現在の開示の炭素フォームは、高いグラファイト含量を含む。一部の実施形態では、炭素フォームは、熱膨張グラファイト（ＴＥＧ）を含む。ＴＥＧは、１００〜１０００ミクロンのオーダーの粒子サイズを有する層間化合物（ＧＩＣ）の熱膨張から調製されてもよい。ＴＥＧを作製するための種々の方法の基礎となる一般的原理は、急速に加熱した際にそれら自身が体積の大きい生成物またはガスに変換されるか、またはそうでなければ、グラファイトの層間スペースに体積の大きい膨張を生じるかのいずれかの、例えば、硝酸および硫酸、アルカリ金属、ならびに塩化鉄（ＩＩＩ）などの物質または化合物のグラファイトへの挿入からなる。例えば、A.V.Yakovlevら、「Thermally  Expanded  Graphite:Synthesis,  Properties,  and  Prospects  for  Use」、Russian  J.  of  Appl.  Chem、７９巻（１１号）  ２００６年を参照のこと。膨張グラファイトは、多数の他の方法、例えば、天然の鱗状グラファイトを、クロム酸浴、次いで、濃硫酸浴に浸漬して、結晶格子面を別々にさせ、このようにしてグラファイトを膨張させることによって、作製されてもよい。膨張グラファイト粒子は、メソ孔およびマクロ孔のスリット形状によって分離される数十から数百のグラフェンシートのスタックによって形成される、みみず状の外観および特徴、いわゆる「アコーディオン」構造によって特徴付けられうる。例えば、図３５を参照のこと。膨張グラファイトの表面積は、さらなる加工（例えば、ボールミリング）のレベルに応じて、材料１グラム当たり約６０ｍ２またはそれより大きい場合がある。これらの吸着剤の表面は疎水性であり、大きな孔と組み合わせて、多くの他の吸着剤で典型的に達成されるよりもはるかに大きなこれらの吸着剤の表面は、これらの材料を分子量の大きな疎水性分子、特に大きな生体高分子、すなわち、タンパク質の吸着に理想的なものにする。
【００６５】
他の実施形態では、炭素フォームは、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）を含む。このようなＧＮＰは、加工に応じて、１〜５ナノメートルの厚さ、０．５から１００ミクロンの範囲の縦横寸法を有するグラフェン層のスタックを含む、ＴＥＧ材料の層剥離から入手可能である。これらの材料は、アスペクト比に応じて、オープンにアクセス可能な大きな比表面積（５００〜７５０ｍ２／ｇまで）を有する。具体的実施形態として、１２０〜１５０ｍ２／ｇの典型的な表面積を有するもの（グレードＭと称される）、およそ２ナノメートルの平均厚さ、１〜２ミクロンの間の直径、および３００、５００、もしくは７５０ｍ２／ｇから選択される表面積を有するもの（グレードＣと称される）、５０から８０ｍ２／ｇの典型的な表面積、５、１５もしくは２５ミクロンの平均粒径を有するもの（グレードＨと称される）、またはおよそ２〜１０ナノメートルの平均厚さ、約５ミクロンの直径、および２０〜４０ｍ２／ｇで選択される表面積を有するものが挙げられる。
【００６６】
さらに他の実施形態では、吸着剤は、ポリマー誘導セラミックカーバイド誘導炭素（ＰＤＣ−ＣＤＣ）を含む炭素フォームでありうる。例示的な場合には、ＰＤＣ−ＣＤＣは、中程度の温度（６００〜８００℃）におけるシリコン−有機ポリマーの熱分解と、それに続く塩素処理によりシリコンを除去し、孔サイズ分布が狭く、およそ３〜４ｎｍの平均孔径を有するカーバイド誘導炭素（ＣＤＣ）を得ることによって合成することができる。粒状有機ポリマーの熱分解と炭化などの他の技術を使用して、所望の多孔性および粒子サイズ分布を有するＰＤＣ−ＣＤＣを生成することもできる。
【００６７】
この開示で企図される炭素フォームは、フィルム、またはポリマー複合材（例えば、ＰＴＦＥ複合材）として、自由形状で血液または血液製剤に適用してもよい。一部の実施形態では、これらの炭素フォームを血液または血液製剤に懸濁させるかまたはスラリー化させ、次いで、除去（例えば、濾過または遠心分離によって）してもよく、または炭素フォームは、血液または血液製剤がそれを通過して流されるかまたはその周囲に流されるマトリックス（例えば、多孔質フィルム、または３次元構造物）に組み込まれてもよい。密接混合は、吸着の速度にとって好ましいが、これは、処理される血液または血液製剤由来のタンパク質を含有する最終の炭素フォームの分離し易さとバランスをとってもよい。
【００６８】
本明細書の他の箇所に記載されているように、孔サイズ寸法は、除去されるタンパク質のサイズと同等となるように選択されるのが好ましい。血液および血液製剤は、通常、ヒトまたは哺乳動物の存在に必要なある特定の分子、例えば、血漿の浸透圧を維持して、脂質およびステロイドホルモンの輸送を補助する主要な寄与体である血清アルブミン、免疫機能を補助するイオン、ホルモン、および脂質を輸送するグロブリン、血液凝固に必須であるフィブリノーゲン、ならびに酵素、および酵素前駆体などの他の調節タンパク質を含有するので、孔サイズ寸法は、５から１０ｋＤａ、１０から２０ｋＤａ、２０から３０ｋＤａ、３０から４０ｋＤａ、４０から５０ｋＤａ、５０から６０ｋＤａ、６０から７０ｋＤａ、７０から８０ｋＤａ、８０から９０ｋＤａ、９０から１００ｋＤａの範囲の、またはこれらの範囲のうちの２つまたはそれより多い範囲、例えば、５から６０ｋＤａによって規定される範囲を有する数平均分子量を有するタンパク質と相互作用するように選択されるのが好ましい。
【００６９】
好ましい実施形態では、標的タンパク質は、サイトカイン、例えば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、タンパク質は、独立して、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（別名ＴＮＦ−β）、もしくは血清アルブミン、またはこれらの組合せである。
【００７０】
実施例において示されるように、これらの開示された炭素フォームの使用によって、種々のタンパク質に対する注目すべき除去率がもたらされうる。これらの除去率は、本開示の方法によって達成可能なものの典型であると考えられる。別個の場合には、少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％のタンパク質が、６０分未満で、血液または血液製剤から除去されてもよい。他の実施形態では、少なくとも８０％のタンパク質が、４０、２０、１０、またはさらには５分未満で、除去されてもよい。さらに他の実施形態では、少なくとも９０または９５％のタンパク質が、１２０、６０、４０、２０、１０、または５分未満で除去される。前述の内容のそれぞれの並べ換えは、本開示の独立した実施形態とみなされる。
さらなる実施形態
【００７１】
以下の実施形態の列挙は、前述の記載を置き換えるかまたは取り換えるのではなく、補足することを意図するものである。
【００７２】
実施形態１。血液および血液製剤からタンパク質を除去する方法であって、血液または血液製剤をスリット状のメソ孔およびマクロ孔を有する炭素のフォームと接触させるステップを含み、孔サイズ寸法が、タンパク質のサイズと同等となるように選択される方法。この実施形態の一部の態様では、接触させるステップにより、１２０分未満で、血液または血液製剤から少なくとも８０％のタンパク質が除去される。他の態様では、接触させるステップは、周囲温度または周囲温度付近（例えば、１０から３５℃）で遂行されるが、より高いかまたはより低い温度も使用されてよい。
【００７３】
実施形態２。前記炭素フォームが、熱膨張グラファイト（ＴＥＧ）を含む、実施形態１に記載の方法。ＴＥＧの種々の態様が本明細書の他の箇所に記載されている。
【００７４】
実施形態３。前記炭素フォームが、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）を含む、実施形態１に記載の方法。
【００７５】
実施形態４。前記炭素フォームが、ポリマー誘導セラミックカーバイド誘導炭素（ＰＤＣ−ＣＤＣ）を含む、実施形態１に記載の方法。
【００７６】
実施形態５。前記タンパク質が、５から６０ｋＤａの範囲の分子量を有する、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【００７７】
実施形態６。前記タンパク質が、サイトカインである、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【００７８】
実施形態７。前記サイトカインが、独立して、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子またはこれらの組合せである、実施形態６に記載の方法。
【００７９】
実施形態８。前記タンパク質が、独立して、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（別名ＴＮＦ−β）もしくは血清アルブミン、またはこれらの組合せである、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【００８０】
実施形態９。前記タンパク質の少なくとも８０％が、６０分未満で、前記血液または血液製剤から除去される、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。この実施形態の他の態様では、少なくとも８０％のタンパク質が、４０、２０、または１０分未満で除去される。さらに他の実施形態では、少なくとも９０または９５％のタンパク質が、１２０、６０、４０、２０、１０、または５分未満で除去される。
【００８１】
実施形態１０。前記炭素フォームが、ポリマー複合材内に分散される、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。
【００８２】
実施形態１１。前記ＧＮＰが、真空アニールされたＣ−５００である、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。
【００８３】
実施形態１２。前記Ｃ−５００が、真空アニールされ、空気により酸化され、アミノ化されている、実施形態１１に記載の方法。
【００８４】
実施形態１３。前記ＧＮＰが、ＡＲＣ−７５０である、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。
【００８５】
実施形態１４。前記タンパク質が、ＩＬ−６である、実施形態１〜１３のいずれかに記載の方法。
【００８６】
実施形態１５。前記タンパク質が、ＩＬ−８であるか、またはＩＬ−８を含む、実施形態１〜１３のいずれかに記載の方法。
【００８７】
実施形態１６。前記タンパク質が、ＴＮＦ−αである、実施形態１〜１３のいずれかに記載の方法。
【００８８】
実施形態１７。敗血症の処置を必要とする患者の敗血症を処置する方法であって、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法を前記患者の血液に対して実施するステップを含む方法。
【００８９】
実施形態１８。前記血液または血液製剤が、血液灌流カートリッジを通して処理される、実施形態１７に記載の方法。
【実施例】
【００９０】
以下の実施例は、この開示内に記載されている概念の一部を例証するために提供される。各実施例は、組成物、調製および使用の方法についての具体的な個々の実施形態を提供するものと考えられるが、実施例はいずれも、本明細書に記載されているより一般的な実施形態を限定するものとみなされるべきではない。
【００９１】
以下の実施例では、使用される数値（例えば、量、温度など）に関する正確さを保証するための努力がなされているが、いくつかの実験誤差および偏差も考慮されるべきである。他に示されていない限り、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはその付近である。
【００９２】
商業的に購入されるナノプレートレットを脱官能化し、その粒子サイズ、表面積、およびサイトカイン吸着性能について特徴付けた。ＰＤＣ−ＣＤＣは、高分子量および低分子量のポリマーの塩素化から合成した。素早い吸着動態を、血漿中に存在し、接触の際にＧＮＰへと吸着される、炎症促進性サイトカインおよびより大きなアルブミン分子について観察した。
【００９３】
（実施例１．１）
材料の合成：
グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）：グラフェンナノプレートレットを実験目的で商業的に購入した（ｘＧｎＰ（商標）、ＸＧ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（著作権）、Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ、ＵＳＡ）。ＧＮＰを天然グラファイトの剥離を使用して合成し、熱膨張グラファイト（ＴＥＧ）を形成した。ＴＥＧのボールミリングにより、粒子サイズが約１μｍ（横寸法で）のＧＮＰ粉末を形成する。窒素ガスを流しながら、ＧＮＰに熱処理も行った。
【００９４】
グラフェンナノプレートレットを実験目的で商業的に購入した（ｘＧｎＰ（商標）、ＸＧ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（著作権）、Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ、ＵＳＡ）。これらのＧＮＰを、酸化および挿入、それに続く超音波処理およびボールミリングによって、熱膨張グラファイト（ＴＥＧ）を最初に作製することにより合成した。得られたＧＮＰ粉末を２ｎｍのナノプレートレット平均厚さを得るために制御し、一方、横寸法は生成物によって様々であった。３つの生成物、ｘＧｎＰ  Ｃ−７５０、Ｃ−５００、およびＣ−３００を購入した。生成物名の各数値は、材料の期待される比表面積（例えば、７５０ｍ２／ｇ、５００ｍ２／ｇ、および３００ｍ２／ｇ）に対応する。これらの材料を、本明細書では、供給業者からの「未処理（as-received）」であることを示すために名称の最初にさらに「ＡＲ」を付けて参照される（例えば、ＡＲＣ−７５０、ＡＲＣ−５００、ＡＲＣ−３００）。
【００９５】
一部の実験のために、ＧＮＰを改変した。最初に、脱官能化および官能化ＧＮＰを、様々な高温処理を使用して合成した。すべての表面化学実験では、ＡＲＣ−５００をベース材料として使用した。脱官能化のために、２ｇのＡＲＣ−５００をグラファイトのるつぼに入れて、真空炉（Ｓｏｌａｒ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＰＡ、ＵＳＡ）に載せた。炉を１０−６トル（torr）で２４時間、室温でガス放出した。ガス放出後、さらに真空下のまま、炉を、１時間当たり６００℃で、グラファイト化温度を超える１４００℃のピーク温度まで加熱した。真空アニーリングプロトコールをB.  DyatkinおよびY.  Gogots  i、「Effects  of  structural  disorder  and  surface  chemistry  on  electric  conductivity  and  capacitance  of  porous  carbon  electrodes」、Faraday  Discussions、第１７２巻、１３９〜１６２頁、２０１４年から適応させた。温度と真空を８時間保ち、次いで、室温まで冷却した。真空アニールした試料は、不純物除去により質量の約１０％の損失を経験した。
【００９６】
一部の実験では、真空アニールしたＧＮＰを空気による酸化に供し、表面を活性化し、続いて、無水アンモニアガスによるアミノ化により表面にアミン基を付加した。空気による酸化のパラメーターは、S.  Osswald、C.  Portet、Y.  Gogotsi、G.  Laudisio、J.  P.  Singer、J.  E.  Fischerら、「Porosity  control  in  nanoporous  carbide-derived  carbon  by  oxidation  in  air  and  carbon  dioxide」、Journal  of  Solid  State  Chemistry、第１８２巻、１７３３〜１７４１頁、２００９年から採用し、酸化温度は熱重量分析によって決定した。アミノ化のパラメーターは、C.  Portet、D.  Kazachkin、S.  Osswald、Y.  Gogotsi、およびE.  Borguet、「Impact  of  synthesis  conditions  on  surface  chemistry  and  structure  of  carbide-derived  carbons」、Thermochimica  Acta、第４９７巻、１３７〜１４２頁、２０１０年１月１０日；ならびにB.  Dyatkin、I.  U.  G.  Gogotsi、およびE.  Drexel  University.  College、「Influence  of  Structure  and  Surface  Chemistry  of  Porous  Carbon  Electrodes  on  Supercapacitor  Performance」、Dissertation/Thesis、２０１６年を含むいくつかの供給源から採用した。５０ｍｇの真空アニールしたＧＮＰを石英のるつぼに入れて、管状炉に載せた。８００ｃｃ／分でアルゴンガス（Ａｒ）を流しながら、温度を１分当たり１０℃で５４１℃まで上昇させ、その時点で、ガスは８００ｃｃ／分の流動空気に直ちに変換した。５４１℃における空気による酸化の４時間後、空気を止めて、８００ｃｃ／分でＡｒを出した。温度を１分当たり１０℃で６００℃まで再度上げ、次いで、ガスを８００ｃｃ／分の流速でアンモニアに変換しながらその温度を保った。６００℃におけるアンモニア処理の４時間後、ガスを２００ｃｃ／分の流速でＡｒに変換し、炉を終夜室温にまで冷却した。試料を炉から取り出した後、質量を測定すると、酸化とアミノ化による炭素原子のエッチングに起因して２０％の質量損失が見られた。
【００９７】
ＧＮＰの酸による酸化は、S.  Osswald、M.  Havel、およびY.  Gogotsi、「Monitoring  oxidation  of  multiwalled  carbon  nanotubes  by  Raman  spectroscopy」、Journal  of  Raman  Spectroscopy、第３８巻、７２８〜７３６頁、２００７年からの酸による酸化のパラメーターに基づいた。１５０ｍｇの真空アニールしたＣ−５００  ＧＮＰを、フラスコ内の１５ｍＬの発煙硝酸および１５ｍＬの３６Ｍ硫酸に添加した。フラスコを、１００ｒｐｍの混合速度で、１分当たり１℃の速度にて室温から７０℃まで加熱した。酸の蒸発を防ぐため、流水を伴う還流冷却器を使用した。酸化の４時間後、酸と試料を濾過し、次いで、５００ｍＬ以上の蒸留水を用いて再度濾過した。次いで、試料を乾燥オーブン中で約１００℃にて終夜乾燥させた。すべての酸が除去されるのを保証するために、試料を乾燥した後、さらに徹底した洗浄プロセスを実施した。酸により酸化された試料のすべてをマイクロ遠心チューブに分配し、それぞれに１．５ｍＬの蒸留水を添加した。それぞれについて１０秒のボルテックス混合と遠心分離の後、複数の試料の上清を、ｐＨストリップを使用してｐＨについて試験した。チューブを遠心分離して、水を除去し、複数のチューブのｐＨが中性となるまで、このプロセスを繰り返した。次いで、試料をさらなる蒸留水中に一緒に懸濁させ、濾過し、再度終夜乾燥させた。
【００９８】
ＧＮＰ複合材：
【００９９】
ＧＮＰ−ＰＴＦＥフィルムは、ＧＮＰを、エタノールの存在下で、１９：１の比でＰＴＦＥ（６０％ｗ／ｗ）溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳ）と混合することによって調製した。エタノールの蒸発により均質なＧＮＰ−ＰＴＦＥ濃スラリーが残り、これを圧延して粘着性の自立型のフィルムとした。使用したＧＮＰ粉末はＸＧ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＣ−５００生成物であったが、前もって不活性環境中で焼成し、合成後の不純物を除去した。これは「焼成したＣ５００  ＧＮＰ」として公知である。ＧＮＰはまた、ＰＴＦＥに添加する前に真空アニールした。ＧＮＰをグラファイトのるつぼに入れ、真空炉（Ｓｏｌａｒ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＰＡ、ＵＳＡ）中に置いた。システムを１０−６トルで２４時間ガス放出し、３００〜１８００℃の間の等温ステップで徐々に加熱し、１８００℃で８時間保った。このプロセスにより、官能基が除去され、ＧＮＰの欠点が直される。
【０１００】
クリオゲル−ＧＮＰ  ＸＧ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｘＧｎＰＴＭ、ＭＩ、ＵＳＡ）からのＡＲＣ−５００  ＧＮＰをクリオゲル−ＧＮＰ複合材の合成に使用した。クリオゲル複合材を、モノマーとしての５ｗ／ｖ％のポリ（ビニル）アルコール（ＰＶＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌ、ＵＫ）、架橋剤としての０．５ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌ、ＵＫ）、および５ｗ／ｖ％の５００ｎｍのＡＲＣ−５００を蒸留水中で混合することによって合成した。混合後、溶液をガラスシリンジにピペットで加え、−１２℃のエタノール浴中で終夜凍結させた。凍結後、クリオゲル試料をエタノール浴から取り出し、室温まで解凍させた。クリオゲル複合材はまた、本明細書において、ＰＶＡ−ＧＮＰと称される。
【０１０１】
ＰＤＣ−ＣＤＣ：ポリマー誘導カーバイド誘導炭素（ＰＤＣ−ＣＤＣ）を高分子量または低分子量のポリマー前駆体のいずれかから合成した。この前駆体を１５５０℃で処理してセラミックを形成し、塩素ガスを流しながら８３０℃で３時間処理し、次いで、水素ガスを流しながら６３０℃で２時間水素化した。高分子量ポリマー前駆体からこの手法で調製したＰＤＣ−ＣＤＣは、本明細書において、高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂと称される。低分子量ポリマー前駆体からこの手法で調製したＰＤＣ−ＣＤＣは、本明細書において、低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａと称される。
【０１０２】
（実施例１．２）
材料の特徴付け
窒素吸着：
Ｑｕａｄｒａｓｏｒｂ孔サイズ分析計（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ、ＦＬ、ＵＳＡ）を使用して、材料の多孔性および表面積を特徴付けた。これは、窒素ガスの吸着および脱着をモニタリングし、システム内の相対圧力の関数として記録された吸着体積および脱着体積を測定することによって遂行される。相対圧力は、バルブ中の圧力を周囲環境または７６０トルで割った圧力である。相対圧力が１に等しい場合、試料はガスで飽和しており、システム中の圧力変化によってガスは材料から脱着する。実験手順においてなされる１つの重要な仮定は、使用される材料のグラファイト秩序化により、吸着はスリット状の孔で起こっているというものである。急冷固体密度汎関数理論（ＱＳＤＦＴ）およびブルナウアー−エメット−テラー理論（ＢＥＴ）を含む様々なモデルを使用して、材料の比表面積を計算した。ＱＳＤＦＴを利用して、モデル吸着システムからの所与の吸着体積に孔幅を適合させて、孔サイズ分布を生じさせた。S.  Brunauer、P.  H.  Emmett、およびE.  Teller、「Adsorption  of  Gases  in  Multimolecular  Layers」、Journal  of  the  American  Chemical  Society、第６０巻、３０９〜３１９頁、１９３８年２月１日  １９３８年；C.  Lastoskie、K.  E.  Gubbins、およびN.  Quirke、「Pore  size  heterogeneity  and  the  carbon  slit  pore  :  a  density  functional  theory  model」、Langmuir、第９巻、２６９３〜２７０２頁、１９９３年１０月０１日  １９９３年を参照のこと。
【０１０３】
ブルナウアー−エメット−テラーの式（S.Brunauer、P.H.Emmett、およびE.Teller、「Adsorption  of  Gases  in  Multimolecular  Layers」、Journal  of  the  American  Chemical  Society、第６０巻、３０９〜３１９頁、１９３８年２月１日  １９３８年）を使用して比表面積を計算し、吸着されたガスの体積、平衡圧力、ある特定の体積を与えられた圧力、および単層を形成するために必要なガスの体積の関数である。この等式に基づくデータ点の線形回帰および０．０５から０．０３Ｐ／Ｐ０の間の相対圧力を用いて表面積を見出し、次いで、正規化して比表面積（ＳＳＡ）を見出した。この相対圧力範囲は、ガスの単層が形成される相対圧力に相当する。ＱＳＤＦＴは、孔サイズ分布と一緒に、別のＳＳＡ値を提供した。
【０１０４】
ＰＤＣ−ＣＤＣに対して、５０〜６０ｍｇの低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂをガラスの試料保持器に添加し、１２０℃で１００ミリトルの真空下に２４時間置き、孔から夾雑物およびガス分子を除去した。脱気後、ガラスセルを窒素ガスで５秒間再度満たして吸着剤に空気が侵入するのを防ぎ、Ｑｕａｄｒａｓｏｒｂ分析器に加えた。吸着された窒素の体積を、相対圧力が約０から開始して約１に到達するときに測定し、次いで、脱着が起こった。表面積および孔体積についての計算を、システムが７７Ｋであると仮定して実施したため、試料保持器は吸着実験の間、液体窒素デュワー内に保留した。窒素の吸着はガス状態よりも液体状態でエネルギー的により好ましいために液体窒素が使用され、使用された窒素ガスは、吸着前に液体化される［１２８］。Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅのデータ分析ソフトウェア（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ  ＱｕａｄｒａＷｉｎＴＭ  ５．１）を使用してデータを分析した。
【０１０５】
ＧＮＰに対して、同様に、窒素吸着実験を実施した。３〜１５０ｍｇを窒素吸着実験に使用し、ＳＳＡはＢＥＴおよびＱＳＤＦＴモデルの両方を使用して計算した。Ｑｕａｄｒａｓｏｒｂ孔サイズ分析計（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ、ＦＬ、ＵＳＡ）を使用して、ＧＮＰの比表面積（ＳＳＡ）を−１９６℃で窒素吸着により測定した。吸着等温線は、０．０５〜０．３Ｐ／Ｐ０の範囲の相対圧力でブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）法を使用して分析した。急冷固体密度汎関数理論（ＱＳＤＦＴ）も使用してＳＳＡを計算した。計算のためにスリット状の孔を仮定した。走査電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ｓｕｐｒａ  ５０ＶＰ  ｆｉｅｌｄ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ＳＥＭ）を使用して、高解像度の画像を生成した。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを動的光散乱による粒子サイズ測定に使用した。
【０１０６】
Ｑｕａｄｒａｓｏｒｂ孔サイズ分析計（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ、ＦＬ、ＵＳＡ）を使用して、７７．４Ｋで、２．４６  １０−３から０．９９５の間の相対圧力で、試験試料による窒素の吸着体積および脱着体積を測定した。０．０８グラムのＧＮＰをガラスセル内に載せて、分析前に１２０℃で２４時間、１００ミリトルでガス放出した。Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅデータ分析ソフトウェア（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ  ＱｕａｄｒａＷｉｎ（商標）５．１）を使用してデータを分析した。ブルナウアー、エメットおよびテラー（ＢＥＴ）法を使用して比表面積を計算し、一方、急冷固体密度汎関数理論（ＱＳＤＦＴ）を使用して孔サイズ分布を推定した。
【０１０７】
ＧＮＰ複合材に対して、窒素吸着実験を同様に実施した。８０〜９５ｍｇの試料を使用して、２４時間のガス放出後、窒素吸着等温線を作成し、ＳＳＡをＢＥＴ式とＱＳＤＦＴモデルを用いて計算した。孔サイズ分布は、スリット状の孔を仮定するＱＳＤＦＴモデルを使用して計算した。
動的光散乱
【０１０８】
Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用する動的光散乱（ＤＬＳ）を粒子サイズ測定のために使用した。
【０１０９】
ＰＤＣ−ＣＤＣに対して、低濃度の低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂを２５℃でプラスチックキュベット（ＤＴＳ００１２、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）に添加した。各１０回のスキャンで、３つの測定値を得て、平均することによりＺ−平均粒子サイズを得た。多分散指数（ＰＤＩ）値も決定した。
【０１１０】
ＧＮＰに対して、同様の手順を使用した。さらに、ＡＲＣ−７５０、ＡＲＣ−５００、およびＡＲＣ−３００の粒子安定性分析のために、時間の関数として粒子サイズを決定した。２分間隔で、０から１００分、粒子サイズを測定した。酸性（ｐＨ４）または塩基性（ｐＨ１０）の緩衝溶液の添加によって誘導したｐＨの変化をモニターするＭＰＴ−２自動滴定装置を使用して、ゼータ電位試験を行った。マグネチックスターラーバーによって試料の循環を保ちながら、６から８のｐＨ範囲を網羅するよう滴定を制御した。滴定毎に３回、ゼータ電位を測定する機械を用い、様々な量のデータ点（１２から３３回の実行の範囲）でゼータ電位を測定した。表示された各データ点は、標準誤差の平均エラーバーを有するｐＨ値毎の３回の実行の平均である。２５℃でディスポーザブルのキャピラリーセル（ＤＴＳ１０７０、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用して測定値を得た。
【０１１１】
走査電子顕微鏡法
走査電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ｓｕｐｒａ  ５０ＶＰ電界放出ＳＥＭ）を使用して、高解像度画像を生成した。ＧＮＰ粉末とＧＮＰ複合材の表面および内部の多孔質形態を走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）（Ｚｅｉｓｓ  Ｓｕｐｒａ  ５０ＶＰ電界放出ＳＥＭ、ＵＳＡ）によって特徴付けた。ＧＮＰに対して、５ｋＶの加速電圧および４．２ｍｍの作動距離を使用した。ＰＶＡ−ＧＮＰクリオゲルに対して、５ｋＶの加速電圧および７．３ｍｍの作動距離を使用した。ＰＴＦＥ−ＧＮＰフィルムに対して、５ｋＶの加速電圧および８．６ｍｍの作動距離を使用した。
【０１１２】
透過型電子顕微鏡法
２００ｋＶの加速電圧でＪＥＭ  ２１００  ＴＥＭを使用して、個々のＧＮＰナノプレートレットおよび凝集物の画像を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により捕捉した。エタノールに分散させ、試料をピペッティングによりレース状炭素グリッド上に滴下した。
【０１１３】
ラマン分光法
ＧＮＰのラマンスペクトルを６３３．２ｎｍの波長のＨｅ／Ｎｅイオンレーザーを使用するラマン顕微分光測定装置（ＩｎＶｉａ、Ｒｅｎｉｓｈａｗ  ｐｌｃ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から作成した。試料からの反射光を、１ｍｍ当たり１２００本のラインでグレーティングすることにより検出器にガイドした。得られた解像度は約２ｃｍ−１である。ラマンスペクトルを収集し、次いで、ピーク強度に対するラマンシフトとしてプロットした。X.  Xie、T.  Makaryan、M.  Zhao、K.  L.  Van  Aken、Y.  Gogotsi、およびG.  Wang、「MoS2  Nanosheets  Vertically  Aligned  on  Carbon  Paper:A  Freestanding  Electrode  for  Highly  Reversible  Sodium-Ion  Batteries」、Advanced  Energy  Materials、第６巻、ｎ／ａ−ｎ／ａ頁、２０１６年。ＧおよびＤのピークの位置および強度は、混合ガウス−ローレンツ分布を使用してフィッティングした。
【０１１４】
熱重量分析（ＴＧＡ）
熱重量分析（ＴＧＡ）を使用して、最適な空気による酸化温度を同定した。ＴＡ  Ｑ５０  ＴＧＡ分析器（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＤＥ、ＵＳＡ）を使用し、非常に少量の真空アニールしたＣ−５００  ＧＮＰ（５〜１０ｍｇ）を試料保持器に入れた。空気の流速は１０ｃｃ／分であり、試料は１分当たり１０℃の割合で加熱した。次いで、残っている質量の百分率を温度に対してプロットした。１１０℃で不純物を除去した後、試料を平衡化し、残っている質量を再度１００％に正規化した。１１０℃に到達した後に０．９％の質量を損失した温度を酸化の始まりと定義した。
【０１１５】
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）およびエネルギー分散分光法（ＥＤＳ）を、材料の表面組成を同定するための補足技術として使用した。Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅ  ５０００（ＵＬＶＡＣ−ＰＨＩ、ＭＮ、ＵＳＡ）ＸＰＳを使用した。組成についての各サーベイスキャンは、１１７．４ｅＶのパスエネルギー、０．５ｅＶのエネルギーステップ、１ステップ当たり１５０ｍｓの時間、および２回の繰り返しにより完了した。次いで、原子百分率による元素組成を各試料について計算した。官能基およびそれらの特徴的結合エネルギーを見出して同定するために、２３．５ｅＶのパスエネルギー、０．０５ｅＶのエネルギーステップ、１ステップ当たり３００ｍｓの時間、および１０回の繰り返しを使用した。アミノ化した試料の窒素ピークについての生データセットを、ガウス分布とローレンツ分布の混合であるフォークト（Ｖｏｉｇｈｔ）プロファイルに対してピークをフィッティングすることにより分析した。Hypersonic  Nonequilibrium  Flows  -  Fundamentals  and  Recent  Advances  -  Progress  in  Astronautics  and  Aeronautics、第２４７巻（American  Institute  of  Aeronautics  and  Astronautics/Aerospace  Press編）におけるE.Josyula、「8.3.2  Line  Shape  of  Emission  Lines  and  Line  Broadening」を参照のこと。各ピークは、ある特定の結合エネルギーで検出した、強度の１秒当たりのカウント（すなわちＣＰＳ）に対応する。窒素含有基間の結合の特徴的ピークを観察しフィッティングする。ＥＤＳは、ＳＥ２検出器を使用して各試料１ｍｍ２を３０秒間走査する、以前に記載したＳＥＭのセットアップを使用する。原子および重量百分率の組成を、Ｏｘｆｏｒｄ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＩＮＣＡソフトウェア（ＯｘｆｏｒｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）によって計算した。
【０１１６】
（実施例１．３）
生物学的特徴付け
サイトカイン吸着実験
新鮮凍結血漿（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡおよびＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を実験に使用した。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した血液に対して、クエン酸ナトリウム抗凝固剤を添加し（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ＳｔｅｍＣｅｌｌからの血液に対して、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤＡ）抗凝固剤を使用した（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）。組換えヒトサイトカインＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を購入し、過剰濃度のこれらのサイトカインを血漿に添加した。添加した各サイトカインの量は、敗血症状態に生理学的に関連する。ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αは、１０ｍｇ／ｍＬの濃度の１Ｘ  ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）中のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、ＵＳＡ）溶液に、１μｇ／ｍＬの濃度で別々に再構成した。３つのサイトカインすべてを１μｇ／ｍＬの濃度の４０μＬのアリコートに分けて、−８０℃で保存した。この濃度の各サイトカイン３５μＬを３５ｍＬの血漿に添加した。血漿３５ｍＬ中の各サイトカインの開始濃度は、約１，０００ｐｇ／ｍＬであった。
【０１１７】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、サイトカインの濃度を特徴付けるために使用される免疫アッセイ技術である。このアッセイは、特異的抗原、この場合には、ＩＬ−６、ＩＬ−８、またはＴＮＦ−αのいずれかに結合する、疎水性プラスチックプレートに吸着された捕捉抗体を使用する。サイトカインを捕捉した後、コンジュゲートした抗体を添加して「サンドイッチ」を完成させる。この「検出抗体」をビオチンにコンジュゲートさせ、酵素を添加した後、発色性基質を使用して、青色を発光する生成物を沈殿させる。J.R.Crowther、The  ELISA  Guidebook.  Totowa、NJ:Humana  Press、２０００年。光の光学密度または吸光度を、青色光の波長、４５０ｎｍで分光光度計を使用して測定することができる。標準曲線に基づき、サイトカインの濃度を、吸光度と濃度の間に線形関係があると述べるベールの法則に従って、吸光度の関数として計算することができる。
【０１１８】
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、血液中のサイトカインの濃度を特徴付けた。ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＯｐｔＥＩＡ（商標）ヒトＩＬ−８、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αキットを購入した。凍結乾燥したサイトカイン標準物質をテクニカルデータシートで指示された濃度で再構成し、これらの標準物質の連続希釈をプレート内で完了した。これらの標準物質は、最初に、１ｍＬの蒸留水中に再構成し、−８０℃で保存して、標準曲線のために適当な開始濃度までアッセイ希釈剤（assay  diluent）中で希釈した。血漿試料も、標準曲線内に入るような濃度にアッセイ希釈剤中で希釈した。複数回の洗浄ステップをアッセイステップ間に使用して、過剰な抗体および試薬を除去した。
【０１１９】
ＥＬＩＳＡの全プロトコールは以下の通りであった：
【０１２０】
１）コーティング緩衝液中で希釈した捕捉抗体で終夜プレートをコーティングする（１ウェル当たり１００μＬ）。
【０１２１】
２）１ウェル当たり３００μＬ以上の洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄し、１ウェル当たり２００μＬのアッセイ希釈剤を各ウェルに添加し、次いで、室温で１時間インキュベートする。
【０１２２】
３）１ウェル当たり３００μＬ以上の洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄し、１ウェル当たり１００μＬの標準物質の連続希釈物をプレートに添加し、血漿試料をそれぞれのウェルのアッセイ希釈剤に希釈し、次いで、室温で２時間インキュベートする。
【０１２３】
４）１ウェル当たり３００μＬ以上でプレートを５回洗浄し、１ウェル当たり１００μＬの「ワーキングディテクター（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）」（検出抗体＋ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼのコンジュゲート）を添加し、次いで、室温で１時間インキュベートする。
【０１２４】
５）１ウェル当たり３００μＬ以上でプレートを７回洗浄し、各洗浄間に３０秒から１分間浸漬する。次に、１ウェル当たり１００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と過酸化水素の基質溶液を添加し、次いで、暗所で室温にて３０分間インキュベートする。
【０１２５】
６）１ウェル当たり５０μＬの停止溶液（１ＭのＨ３ＰＯ４）をウェルに添加する。
【０１２６】
７）Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００  ＮａｎｏＱｕａｎｔ分光光度計（Ｔｅｃａｎ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して、４５０ｎｍの波長で吸光度を読み取る。
【０１２７】
試料を複製物として２個のウェルで繰り返し、適切なアッセイ希釈剤を有する空のウェルを使用して、分光光度計からのバックグラウンドノイズをモニターした。洗浄ステップの間、ウェルを満たした後にプレートを軽く弾き、次いで、最後の洗浄後、洗浄緩衝液を十分に除去するために複数回軽くたたいた。使用したプレートは、低蒸発フタを有するＣｏｓｔａｒ（登録商標）ポリスチレン媒体結合９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用した。
【０１２８】
ＥＬＩＳＡアッセイが完了した後、以前に論じた方法論に基づく標準曲線を描いた。これらの標準曲線はＲ２値が約０．９９の線形回帰を使用した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用する二元配置分散分析多重比較試験を利用して、吸着剤とともにインキュベートしなかった血漿に対して経時的な濃度間の統計的有意性を決定した。時間に対する濃度および正規化した吸着データ（吸着剤の単位質量当たりのサイトカインの質量の単位における）を分析するために、２つの回帰を使用した。指数関数的減衰回帰は、一般式を示す等式４．１に見られる。Ｃ０（またはｑ０）は、初期濃度であり、Ｃ∞（またはｑ∞）は無限時間の濃度であり、ｋは速度定数であり、分での時間はｔで表現される。吸着剤の質量ｑｅで正規化した吸着の平衡濃度を計算するために、HoおよびMcKayの擬二次動力学モデルを適用した。Y.  S.  HoおよびG.  McKay、「Pseudo-second  order  model  for  sorption  processes」、PROCESS  BIOCHEMISTRY、第３４巻、４５１〜４６５頁、１９９９年。等式４．２および４．３は、擬２次モデルに基づくｑｔの計算とｑｅの設定（finding）を示す。Ｖｐは血漿の体積であり、Ｃ０はサイトカインの最初の濃度であり、Ｃｔは時間ｔにおける濃度であり、ｍａは吸着剤の質量である。等式４．２に対して、直線的相関は、ｙ＝ｔ／ｑｔ、ｍ＝１／ｑｅおよびｂ＝１／（ｋ＊ｑｅ２）である場合に得られる。
【数１】
2019519290.tif 000002
【０１２９】
ＧＮＰに対して、以下の６つの試料：ＡＲＣ−７５０、ＡＲＣ−５００、ＡＲＣ−３００、真空アニールしたＣ−５００、真空アニールし、酸により酸化したＣ−５００、および真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＣ−５００を、スパイク血漿１ｍＬに対して１０ｍｇの比率で試験した。別の３つの試料は、１ｍＬのスパイク血漿に対し、２５、５０、および１００ｍｇの吸着剤を用いるサイトカイン吸着について試験した。ＧＮＰの９つのバリエーションすべては三連で試験し、３７℃で血漿と共にインキュベートし、１２５ｒｐｍで０、５、１５、３０、６０、および１２０分間振盪した。試料を各時点に１３，０００Ｇで遠心分離した。血漿上清を収集し、ＥＬＩＳＡ前の保存として、−２０℃で保存した。重要な留意点は、未処理のＧＮＰ粉末は、インキュベートした際に血漿中に十分に分散しなかったことである。粉末との均一な接触の欠如を軽減するために、すべての未処理試料を血漿中でピペッティングにより上下させ、１５秒間ボルテックス混合して、確実に分散させた。脱官能化および官能化した試料も２０秒間ボルテックス混合したが、ピペッティングにより上下させようとすると、粒子がピペットチップの内側に貼りつくため、ピペッティングはしなかった。すべての試料の血漿上清についてＥＬＩＳＡアッセイを行った。Ｒ２値が０．９９の標準曲線内に入るように、血漿試料について希釈を完了した。
【０１３０】
クエン酸ナトリウム抗凝固剤（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を含む新鮮凍結ヒト血漿を解凍し、各サイトカインについて１０００ｐｇ  ｍＬ−１の濃度で、組換えヒトサイトカイン（ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて増強した（augmented）。０．２３ｇのＧＮＰ、または１ｍＬのＧＮＰを９ｍＬのＰＢＳに添加し、真空中で終夜平衡化した。遠心分離後、１００μｌのＧＮＰを、エッペンドルフチューブ中の９００μｌのスパイク血漿に添加した。０．２０ｇのＰＤＣ−ＣＤＣ試料を、エッペンドルフチューブ中で、１ｍＬのスパイク血漿と共にインキュベートした。１５０ｒｐｍで振盪しながら、吸着剤を３７℃でインキュベートした。５、３０、６０、９０、および１２００分の時点で、試料を３５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を収集し、サイトカイン濃度についてのＥＬＩＳＡ分析（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）の前に−２０℃で保存した。吸着についての研究は、三連（ｎ＝３）で完了させ、過剰なサイトカイン濃度を有する血漿を陽性対照として使用した。
【０１３１】
一部の実験では、ＧＮＰのサイトカインマーカーの吸着プロファイルを、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）をスパイクした新鮮凍結ヒト血漿（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）と共に１０％ｗ／ｖのＧＮＰを６０分間インキュベートすることによって評価した。選択したサイトカインマーカーの濃度をＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）を使用して決定した。選択したサイトカインマーカーであるＩＬ−８、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αのＧＮＰ−ＰＴＦＥフィルムに対する吸着動態をＰＴＦＥフィルムおよびＧＮＰ粉末と比較した。選択したサイトカインマーカーの濃度を、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＥＬＩＳＡセットを使用して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。Ｐｒｉｓｍ  ６．０５（ＰｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．）を使用して、二元配置分散分析による統計分析を実施した。
【０１３２】
ＧＮＰ複合材について、２０ｍｇのいずれかの複合材を集合させ（massed）、１Ｘ  ＰＢＳ中で２４時間、事前に調整し（preconditioned）、マイクロ遠心チューブ内のスパイク血漿１ｍＬに添加した。１２５ｒｐｍで振盪させながら、血漿および吸着剤を３７℃でインキュベートした。５、３０、６０、および９０分に試料を収集して、陽性対照（吸着剤を含まないスパイク血漿）と陰性対照（過剰なサイトカインまたは吸着剤を含まない血漿）に対して比較した。これらのそれぞれの時点の後、試料を振盪機から取り出し、１３，０００Ｇで５分間遠心分離し、血漿上清を取り出し、ＥＬＩＳＡアッセイのために−２０℃で保存した。すべての試料の血漿上清について、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。Ｒ２値が０．９９の標準曲線内に入るように、血漿試料に対する希釈を同様に完了した。
【０１３３】
ＰＤＣ−ＣＤＣについて、２０ｍｇの低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａおよび高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂを５つの非粘着性マイクロ遠心チューブ（ＶＷＲ（登録商標）、ＰＡ、ＵＳＡ）にそれぞれ添加した。すべての試料を１ｍＬの１Ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で終夜、事前に調整して、空気中の環境汚染物質の吸着と任意の表面汚染物質の除去を防いだ。次いで、ＰＢＳ中の試料を１３，０００Ｇで遠心分離し、ＰＢＳ上清を除去した。ＰＤＣ−ＣＤＣ炭素を使用する研究について、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄからの血漿を使用した。１ｍＬの「スパイク」血漿を２０または１０ｍｇの吸着剤を含有した各チューブに添加し、血漿と十分に接触させるためにボルテックス混合し、次いで、３７℃にて１２５ｒｐｍで振盪した。血漿中の試料を、５分、１５分、３０分、６０分、および９０または１２０分において、振盪機から取り出した。１３，０００Ｇで５分間遠心分離した後、血漿上清を取り出し、−２０℃で保存した。サイトカイン濃度に対する任意の外部効果をモニターしようとして、各マイクロ遠心チューブを、１ｍＬのスパイク血漿（吸着剤を含まないが）で満たした追加のチューブと対にした。いかなる過剰なサイトカインも添加していない血漿の追加チューブも試験した。これらの実験はすべて、三連（ｎ＝３）で試験した。
【０１３４】
（実施例１．４）
生体適合性評価
比色細胞増殖アッセイを行って、吸着剤と細胞の相互作用を決定した。これは、代謝活性を介して細胞によって消化される化合物であるＭＴＳテトラゾリウムの変換によって決定する。変換生成物は着色溶液であり、次いで、その光学密度を分光光度計により読み取る。吸着剤による細胞生存率を、ＭＴＳ変換から生じる代謝活性によって決定した。「CellTiter  96（登録商標）  AQeuous  One  Solution  Cell  Proliferation  Assay」、Promega、Madison、WI  TB245、２０１２年を参照のこと。
【０１３５】
ヒトの肝臓上皮細胞株ＨｅｐＧ２（ＣＲＬ−１１９９７（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）、ＶＡ、ＵＳＡ）をＧＮＰ粉末の細胞毒性を評価するために選択した。ＨｅｐＧ２細胞株は、８０％コンフルエンシーで継代し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）を補充したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌ、ＵＫ）中に懸濁させることによって維持した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性評価のために、ＧＮＰ粉末（１０％ｖ／ｖ）をリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、続いて、培養培地中で２４時間事前に調整した。ＨｅｐＧ２細胞を回収し、１ウェル当たり１×１０５個の細胞の密度で、９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ２の加湿環境で、３７℃にて１８時間、プレートをインキュベートさせた後、異なる濃度の事前に調整したＧＮＰ粉末で２４時間、プレートを処理した。銀ナノ粒子を細胞毒性対照として含む一方、培養培地を非細胞毒性対照として使用した。処理後のＨｅｐＧ２細胞の生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、ＵＫ）を使用して細胞のＭＴＳ変換を比較することによって決定した。
【０１３６】
ＡＲＣ−５００  ＧＮＰ粉末を１０％体積の溶液中の水中に分散させ、細胞のインキュベーションのためにさらに１％ｖ／ｖまで希釈した。ＨｅｐＧ２細胞を回収し、１ウェル当たり１×１０４個の細胞の密度で、９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ２の加湿環境で、３７℃にて２４時間プレートをインキュベートした後、異なる濃度のＧＮＰ水溶液を、銀ナノ粒子を細胞毒性の（acytotoxic）陽性対照として、ＭＥＭを非細胞毒性の陰性対照として含むプレートに添加した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、ＵＫ）を使用して、細胞によるＭＴＳの変換を比較した。吸収度は、４９０ｎｍで吸光度を測定するＢｉｏｔｅｋ  ＥＬｘ８００分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ、ＶＴ、ＵＳＡ）を使用して測定した。細胞生存率は、適当なＭＥＭ培養培地でインキュベートした細胞である、陰性対照に対する相対的吸収度と比較することによって計算した。
【０１３７】
インキュベーションの前に、ＰＤＣ−ＣＤＣ試料を密集させ（１５０ｍｇ）、真空下で終夜、１．５ｍＬのＰＢＳ中で事前に調整した。細胞数は、トリパンブルー対ＭＥＭ中の細胞懸濁液の１：１の体積比を使用して細胞を染色し、標準の光学顕微鏡下で血球計数器のグリッドを使用して分析することによって決定した。ＨｅｐＧ２細胞を回収し、結合親和性の高い９６ウェルプレートに１ｍＬ当たり８００，０００個の細胞の密度で播種した（１００μＬ／ウェル）。５％ＣＯ２の加湿環境で、３７℃にて２４時間、プレートをインキュベートした。ＭＥＭおよび細胞懸濁液を吸引した後、１００μＬのＰＤＣ−ＣＤＣ粉末とＭＥＭの１０％ｗ／ｖ溶液をプレート中でインキュベートした。播種細胞を有するウェルに対し、さらに１００μＬのＭＥＭを添加し、栄養への十分なアクセスを確保した。対照として、ウェルを、培地中に懸濁した吸着剤と共に、または培地のみと共にインキュベートした。細胞と共にインキュベートした陽性細胞毒性対照は、０．５７％のジブチル錫マレエートを含有するＰＶＣポリマー（Ｈｙｄｒｏ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｌｔｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）であった。２４時間のインキュベーション後、培地をウェルから吸引し、ウェルをＰＢＳで洗浄および吸引し、１２０μＬ／ウェルのＭＴＳ試薬とＭＥＭを１：５の体積比でウェルに２時間添加した。１００μＬを取り出し、新たなプレートに移し、ここで、４９０ｎｍで吸光度を測定する分光光度計においてＭＴＳプロトコールを使用した。次いで、細胞のＭＴＳ変換を吸収度の関数として計算した。使用したアッセイキットは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、ＵＫ）であった。
【０１３８】
（実施例１．５）
ＢＳＡ吸着実験
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、ＵＳＡ）を１ｍｇ  ｍＬ−１の濃度で蒸留水に添加した。ＧＮＰ吸着剤を１５個のエッペンドルフチューブに秤量し（０．０２ｇ）、２００ｒｐｍで振盪しながら１ｍＬのＢＳＡ溶液と共に３７℃でインキュベートした。５、１５、３０、６０、１２０分の時点で、試料を１７，０００ｇで遠心分離し、上清を収集した。ナノプレートレットの純度を改善するために、吸着実験の前に、ＧＮＰを１４００℃で８時間真空アニールした。ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、上清中のＢＳＡ濃度を測定した。吸着についての研究は、三連（ｎ＝３）で完了させた。
【０１３９】
（実施例２）
結果および考察
ＰＤＣ−ＣＤＣ
図１Ａおよび１Ｃは、低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａ（図１Ａ）、および高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂ（図１Ｃ）における窒素吸着等温線を示す。低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａ、および高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂで見られる窒素吸着等温線は、ｉｖ型の等温線を示す。ｉｖ型の等温線は、メソ孔などの大きな孔におけるキャピラリー凝縮によるヒステリシスの特有の特徴を有する。ＰＤＣ−ＣＤＣ材料は、１．５４から８．２３ｎｍの範囲のモード孔幅を有する広いメソ多孔質の孔サイズ分布を有する。図１Ｂおよび１Ｄは、低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａ（図１Ｂ）、および高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂ（図１Ｄ）についての孔サイズ分布を示す。
【０１４０】
ＰＤＣ−ＣＤＣの両方のバリエーションについてのＳＥＭ画像は、現在の図２Ａおよび２Ｂに示されている。
【０１４１】
低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａ、および高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂについての表面積および粒子サイズの分析データを表１に示す。
【０１４２】
図３は、ＰＤＣ−ＣＤＣ材料についての細胞の細胞毒性データを示す。追加の細胞培養培地が添加された後、４０％付近の値から、細胞生存率は約５０％まで増加した。これは、粉末によって、培地由来の栄養が細胞に到達するのが妨げられた可能性を示し、粉末の高密度または栄養の吸着に由来する。ＰＤＣ−ＣＤＣ材料は、細胞毒性ＰＶＣポリマーと比較して細胞をさらに生存可能とするが、材料を細胞毒性でないと見なすために任意に定義した８０％細胞生存率が使用される場合には、ＨｅｐＧ２細胞に対して細胞毒性である。
【０１４３】
図４Ａ〜４Ｄは、低分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ａ、および高分子量のＰＤＣ−ＣＤＣ  Ｂによるサイトカインの吸着を示す。９５％信頼区間内で、対照は、すべての時点の間で統計的に異ならなかった。指数関数的減衰および擬２次方程式に関する値のブレークダウンが表３〜８に存在し、図４Ｃおよび４Ｄは、時間に対する濃度およびポリマー誘導多孔質炭素についての質量当たりの正規化した吸着の値を示す。表３〜５は、正規化した吸着の指数関数的減衰の変数を示す。エラーバーは、平均の標準誤差のプラスまたはマイナスとして示す。全体として、メソ多孔質のＰＤＣ−ＣＤＣ炭素は、吸着についての研究にわたって、サイトカイン濃度に徐々の低下が見られた。明確な傾向は、タンパク質サイズに関する吸着能について観察された。最も大きなタンパク質であるＴＮＦ−αは、最も低い正規化した吸着能、ｑｔ（吸着剤の単位質量当たりの吸着されたサイトカインの質量）を示し、一方、ＩＬ−８は、最も高いｑｔを有した。両方の材料は、ＩＬ−８の濃度を無視できるレベルまで除去することができた。ＨｏおよびＭｃＫａｙの擬２次モデルは、Ｒ２値が０．９以上の各サイトカインの正規化した吸着ｑｔにフィッティングする、ＰＤＣ−ＣＤＣ材料に対して最もよく適合した。表６〜８を参照のこと。
【０１４４】
図５Ａ〜５Ｆは、それぞれの陽性対照を含む個々のサイトカイン吸着について示す。
グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）：
【０１４５】
図６Ａ〜６Ｆは、６つの異なるＧＮＰ：真空アニールしたＡＲＣ−５００（６Ａ）；真空アニールし、酸により酸化したＡＲＣ−５００（６Ｂ）；真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＡＲＣ−５００（４Ｃ）；ＡＲＣ−７５０（６Ｄ）；ＡＲＣ−５００（６Ｅ）；ＡＲＣ−３００（６Ｆ）についての窒素吸着性能を示す。ほとんどの等温線は、ＩＩ型または無孔の等温線を示す。真空アニールしたＣ−５００、ＡＲＣ−５００、およびＡＲＣ−７５０は、最も高い窒素の吸着を有する。
【０１４６】
材料の特徴付けは、その優れた吸着効率によって、主に、ナノプレートレットに関して完了した。いくつかのＧＮＰについての粒子サイズ分布データは、図７に示される。粒子サイズおよび表面積に関する効果は、未処理のＧＮＰと窒素焼成ＧＮＰの間で観察される。平均粒子サイズのこの減少は、比表面積（ＳＳＡ）を増加させ、吸着大多数の部位が、吸着が可能となった。表１は、ＢＥＴおよびＱＳＤＦＴ計算に基づき、窒素吸着実験に由来するすべての材料の表面積データを示す。
【０１４７】
ＧＮＰの遊離凝集物（loose  agglomerate）をＳＥＭで観察することができ（図８Ａ）、より倍率の高いＳＥＭ画像によって、この凝集物がサブミクロンサイズの粒子からなることが明らかとなった（図８Ｂ）。溶媒としてエタノールを使用する超音波処理後、ＴＥＭ下でより小さなＧＮＰの凝集物が観察され（図８Ｃ）、その多層スタックグラフェン構造を明らかにした。より高い倍率のＴＥＭ画像により、トップダウン透視図（図８Ｄ）から単一のナノプレートレットを観察することができる。図８Ｅは、ＧＮＰの断面のＴＥＭ画像である。
【０１４８】
ＧＮＰ、真空アニールしたＧＮＰ、およびＧＮＰ  ＰＴＦＥフィルムの吸着等温線は、低いＰ／Ｐｏ領域で吸着された窒素体積の急速な増加を示し、図９Ａに示すように、すべてＩＩ型の無孔等温線のものである。材料のグラファイトの性質を考慮して、スリット状の孔を仮定してＱＳＤＦＴを利用し、孔サイズ分布を推定した（図９Ｂおよび表１）。ＧＮＰは、窒素吸着とブルナウアー−エメット−テラーの式によって決定した７９７．４ｍ２／ｇもの高さの比表面積を示す（表２）。メソ多孔質カテゴリーで試験した材料は、孔サイズが２ナノメートルから約２０ナノメートルの範囲であった。マクロ孔は、走査電子顕微鏡法などの方法によって確認した。表２の孔幅のモードが１ｎｍ未満であるが、メソ孔は、カーバイド誘導炭素材料（ＰＤＣ−ＣＤＣ材料）に関する図１Ｂおよび１Ｄの孔サイズ分布においてはっきりと見られる。これらのグラフは、上述の密度汎関数理論を使用して作成される。
【０１４９】
図９Ａに示されるように、ＧＮＰが真空アニールされると（ＶＡ−ＧＮＰ）、比表面積と孔体積が２．７分の１に低下する。これは、ＧＮＰと比較して、動的光散乱によって決定されるＶＡ−ＧＮＰ粒子サイズの３倍の増加と一緒に観察される。粒子サイズの増加および表面積の低下は、グラファイト化の間でのグラフェン面の再スタッキングに起因する。ＳＥＭおよびＴＥＭ画像により、窒素分子のアクセスを妨げるグラフェン層間のＧＮＰの小さい粒子サイズと緊密に積層したグラフェン構造が明らかとなった。ＧＮＰの比表面が大きいことは、主に、その外側表面積に起因する。ＶＡ−ＧＮＰがＰＴＦＥ（ＧＮＰ−ＰＴＦＥ）複合材フィルムに組み込まれると、複合材フィルムは、吸着した窒素体積とミクロ孔体積が若干低減することを示したが（図９Ｂ）、一方、等温線の形状と孔サイズ分布曲線はＶＡ−ＧＮＰと同様のままであった。ＧＮＰ−ＰＴＦＥフィルムの比表面積とミクロ孔体積は、それぞれ、２１０．４ｍ２／ｇおよび、０．３０ｃｍ３／ｇという高さのままであり、ＶＡ−ＧＮＰ単独の２９３．７ｍ２／ｇと０．３９ｃｍ３／ｇより若干低いだけであった（表２）。窒素吸着分析によって検出された比表面とミクロ孔体積のこの低減は、試料の合計重量の５％を占める無孔バインダーであるＰＴＦＥフィルムの添加によるものであり得る。この結果は、ＰＴＦＥフィルムへの組込み後も、ＧＮＰ表面積は、窒素分子によっておおいにアクセス可能のままであることを示した。
【０１５０】
ＧＮＰナノプレートレットのＳＥＭ画像を図１０に示す。
【０１５１】
粒子サイズを、使用した３つの異なる粒子サイズのＧＮＰに対して、図１１Ａ〜１１Ｃの時間の関数として測定した。すべての材料がその平均粒子サイズを相対的に維持したが、最も安定であったのは、最も小さい出発粒子サイズを有するＧＮＰ、すなわちＡＲＣ−７５０であった。これらの粒子は、経時的にわずかに凝集し、臨界凝集点の後、重力により溶液から沈んだ。
【０１５２】
ＧＮＰのすべてのバリエーションについてｐＨに関してゼータ電位を測定し、それを図１２Ａ〜１２Ｆに示す。酸で処理したＡＲＣ−５００試料は、全体的に最もよいコロイド安定性を有するようである。真空アニールしたＧＮＰの疎水性の性質は溶液からすぐに沈み、一方、酸により酸化し、アミノ化した試料は、そのほとんどが水分子と相互作用し、最も高い表面電荷を有するため、これは反直感的である。これらの試料のすべてが、血液のｐＨである７．４で、非常に大きなゼータ電位値を有することは注目に値する。したがって、これらは、水性環境において高いコロイド安定性を有し、溶液中のタンパク質と最大限に接触することが期待される。
【０１５３】
図１３は、真空アニールしたＣ−５００  ＧＮＰ材料および未処理のＣ−５００  ＧＮＰ材料についてのラマンスペクトルを示す。ＤおよびＧのバンドの間の強度の比は、材料の全体的な順序を示し、真空アニーリング後に、この比は低下する。Ｇバンドの適合した位置は、それらがＧ２ピークに近いことを示し、規則性ｓｐ２炭素を示唆する。アニーリング後に、このピークは、強度が有意に増加し、幅は狭くなる。１３２２ｃｍ−１のＤバンドの強度も増加するが、これは、粒子サイズの増加と多量の不規則である粒子端に起因する可能性がある。
【０１５４】
ＴＧＡデータは図１４に示され、グラフ上にＴＧＡの反復の両方が示されている。流動空気環境下で、５４１℃にて真空アニールした材料は、その質量の９９．１％が残っていた。これは、この環境では、表面は活性化されるがそれほど早く燃え尽きない（約６００℃の後では質量が大きく落ちることによって証明される）ため、理想的な酸化温度である。
【０１５５】
図１５Ａは、表面修飾材料のすべてについての炭素、酸素、および窒素の重量パーセンテージを示す。酸素の大きな低下は真空アニーリング後に観察され、酸による酸化により表面に多量の酸素が導入され、２％の窒素がアミノ化後の表面に導入される。周囲条件に１０日間曝露したにもかかわらず、真空アニールしたＧＮＰは依然として低い酸素含量のままである。図１５Ｂは、サーベイスキャンによる組成がＸＰＳから生じ、同様の傾向を示すことを示す。
【０１５６】
窒素結合エネルギーに対するピークフィッティングが真空アミノ化した試料について図１６で観察される。ピークフィッティングを実施した後、窒素バンドが形成され、炭素原子を置き換えて、ピリジンＮ原子としてのダングリングボンドに結合したか、またはピロールＮ原子（pyrrolic  N  atom）とのグラフェン構造において五角形を形成したことがわかる。サーベイスキャン、ＥＤＳスキャン、およびピークフィッティングにより、脱官能化および官能化が、３つすべての材料でうまく起こったことが確認される。
【０１５７】
ＭＴＳ細胞の細胞毒性データは、図１７Ａおよび１７Ｂに見られる。ＡＲＣ−５００は、ＡＲＣ−５００の０．０３％体積の濃度で、銀ナノ粒子と比較して安全な細胞生存率を維持する。０．０６％では、それは、細胞毒性として本明細書で定義した８０％の閾値を下回る約６０％の細胞生存率まで落ちる。この細胞生存率の低下は、おそらく、ＧＮＰによって細胞への栄養の遮断と、栄養の細胞代謝の阻害によるものである。
【０１５８】
図１８は、モデルタンパク質であるＢＳＡのＧＮＰへの吸着性能を示す。
【０１５９】
図１９は、サイトカインのＧＮＰへの吸着を示す。これらは、そのそれぞれの陽性対照を含む、図２０Ａ〜２０Ｃにおける吸着したサイトカインそれぞれによってさらに項目別に示される。
【０１６０】
すべてのタンパク質が９０分未満のうちに無視できるレベルまで吸着されるため、ナノプレートレットは、血漿からサイトカインを急速に除去する能力を示す。ＰＤＣ−ＣＤＣ試料は、速いキネティクスを示さなかったが、サイトカインを吸着する能力は依然として実証された。
【０１６１】
図２１Ａ〜Ｆ、図２２Ａ〜Ｆ、および図２３Ａ〜Ｆは、三連で試験したＧＮＰのバリエーションのすべてについて時間および正規化した吸着の関数としてのサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−α）濃度を示す。表３から８は、指数関数的減衰とＨｏおよびＭｃＫａｙの擬２次関数の両方に正規化した吸着データをフィッティングすることから得られた適切な値を示す。Y.S.HoおよびG.McKay、「Pseudo-second  order  model  for  sorption  processes」、PROCESS  BIOCHEMISTRY、第３４巻、４５１〜４６５頁、１９９９年を参照のこと。ＭｃＫａｙの関数は、指数関数的減衰関数に対して全体的に優れたＲ２値を有し、さらなる分析のために、平衡吸収量ｑｅをｑ∞の代わりに使用するが、これらの値はほとんどのデータセットに類似している。ｑｅは、平衡時、すなわち、吸着剤が表面の吸着物で十分に飽和した際に正規化した吸収能である。この単位は、吸着剤の単位質量当たりの吸着したサイトカインの質量である。
【０１６２】
すべてのＧＮＰ試料は、任意の試料に対して５分後の正規化した吸着にわずかな増加もないことによって証明されるように、急速にキャパシティーまで吸着する。酸により酸化されたＣ−５００材料を除いて、ＧＮＰのすべてのバリエーションは、５から１５分後に、ＩＬ−６およびＩＬ−８の無視できる濃度までの迅速な吸着を示した。二元配置分散分析多重比較試験を使用して、陽性対照（例えば、過剰なサイトカインを有するが吸着剤を有さない血漿）のすべてについて、ＡＲＣ−３００材料に対するＴＮＦ−αの研究のための対照を除いて、時点の間に統計的有意差が見られないことが観察された。研究の開始と１２０分の間で、ｐ値が０．０５以下の差は、統計的に有意であった。
【０１６３】
ＡＲＣ−７５０、ＡＲＣ−５００、およびＡＲＣ−３００についての吸収能は、３つのサイトカインすべてについて、約３３ｐｇ／ｍｇで同様である。吸着剤の質量の増加により、より速くタンパク質濃度の低下が生じた。これは、１０ｍｇと２５ｍｇの吸着剤を比較すると、質量の増加が、５分後に、さらに４００ｐｇ／ｍＬ濃度を低下させる、ＴＮＦ−αの除去において特に有意であった。
【０１６４】
ＴＮＦ−αに対するｑｅ値は、様々な表面積材料と比較した場合に低下したが、他のｑｅ値は、同様の範囲のままであったため、表面の官能化はサイトカイン吸着を改善しないようであった。吸着の動態は同じままであり、吸着は速く、約５分後に平衡に達した。
【０１６５】
ＧＮＰ粒子は、サイトカインカクテルをスパイクしたヒトの血漿からのサイトカインの迅速かつ効率的な除去を示した。スパイク血漿中のより小さいサイトカインであるＩＬ−８（８ｋＤａ）およびＩＬ−１β（１７ｋＤａ）の濃度は、直接接触して５分以内に、１５００ｐｇ／ｍｌを超えるものから２０ｐｇ／ｍｌまで低減した（図２４）。比較すると、より大きなサイトカインマーカーであるＩＬ−１０（１８．５ｋＤａ）およびＩＬ−６（２０．５ｋＤａ）のＧＮＰ除去は若干遅いようであるが、６０％および５０％の除去が接触の最初の５分以内に達成された。ＴＮＦ−αは、１７．５ｋＤａの分子量を有するが、従来の血液精製技術において除去するのが最も困難な分子の１つとなっている三量体形態で存在することが報告されている。ＧＮＰと接触して５分後に８６８ｐｇ／ｍｌから５５ｐｇ／ｍｌまで血漿のＴＮＦ−α濃度が低減することは、ＧＮＰによる迅速かつ効率的なＴＮＦ−αの除去を示した。サイトカインマーカーの除去プロファイルは、ＧＮＰを使用して、スパイク血漿から様々な分子量のサイトカインを除去することができることを示し、敗血症などの適用のための広範囲にわたるサイトカインの除去についての潜在性を実証した。速い吸着動態は、孔へと吸着することとは対照的に、完全にアクセス可能な表面積に直接接触すること、および表面への拡散障壁が最小であることに起因し得る。血液精製適用における粉末吸着剤に典型的な低い流速により、システム内の高圧力および微小塞栓を引き起こす小粒子の放出などの問題をもたらす場合がある。これらの問題を克服するために、ＧＮＰ−ＰＴＦＥ複合材フィルムをこの研究において開発した。
【０１６６】
材料の特徴付けは、その優れた吸着効率によって、ナノプレートレットに関して第一に完了した。ＧＮＰについての粒子サイズ分布データは、図７に示す。
【表１】
2019519290.tif 000003
【表２】
2019519290.tif 000004
ＧＮＰ複合材
【０１６７】
上記で論じたように、ＧＮＰ−ＰＴＦＥ混合物をエタノールと一緒に圧延して可撓性で自立型のフィルムを調製した。エタノールを除去すると、ＰＴＦＥがＧＮＰ粒子を結合して一緒にマトリックスになった。
【０１６８】
図２５Ａ〜２５Ｄは、それぞれ、ＰＶＡ−ＧＮＰクリオゲルおよびＰＴＦＥ−ＧＮＰフィルム複合材についての窒素吸着等温線と孔サイズ分布を例証する。表１は、複合材とその中に埋め込まれるナノプレートレットについての表面積、孔体積、および孔幅情報のモードを示す。無孔複合材はＰＴＦＥ−ＧＮＰについて観察され、フィルムへの組込み後に約（about〜）８０ｍ２／ｇのＳＳＡの低減を伴う。焼成し、真空アニールしたＧＮＰとＰＴＦＥ−ＧＮＰフィルムの両方に関する吸着等温線は、ＩＩ型の等温線を示し、無孔材料であることを示す。Powder  Surface  Area  and  Porosity、Dordrecht編におけるS.  LowellおよびJ.  E.  Shields、「Adsorption  isotherms」、Springer  Netherlands、１９９１年、１１〜１３頁。フィルムに多孔性が欠如しても、ナノプレートレットの表面がアクセス可能である限り、タンパク質の吸着を阻害しないはずである。窒素吸着分析は、ＰＴＦＥバインダーを使用して、真空アニールしたＧＮＰの大きな表面積を保護することができることを明らかにした（表２）。
【０１６９】
ＰＶＡ−ＧＮＰに対して、少量の吸着した窒素が存在し、メソ孔を示すヒステリシスが観察された。しかし、ミクロ孔およびメソ孔はＧＮＰにおいても、高い孔体積寄与率ｄＶ（ｄ）で見られた。このことにより、吸着実験中に、窒素のクリオゲルへの浸透性がほとんど存在せず、ＳＳＡの大きな低下に寄与するという結論に至る。大きなマクロ孔をガスで飽和させることが、窒素ガスがナノプレートレットに拡散しないというこれらの特性変化の原因となりうる。このことにより、ガスが、ポリマーネットワーク内に埋め込まれた表面積の高いＧＮＰにアクセスし、吸着することを妨げる。マクロ孔は、ＧＮＰよりももっと小さなＳＳＡを有し、この値の低下をもたらす。孔は、両方の孔サイズ分布でＧＮＰに観察され、これらの孔は、グラフェン表面における穏やかな崩壊によって生じる傾向にある。J.  Y.  Lee、K.  -H.  Lee、Y.  J.  Kim、J.  S.  Ha、S.  -S.  Lee、およびJ.  G.  Son、「Sea-Urchin-Inspired  3D  Crumpled  Graphene  Balls  Using  Simultaneous  Etching  and  Reduction  Process  for  High-Density  Capacitive  Energy  Storage」、Advanced  Functional  Materials、第２５巻、３６０６〜３６１４頁、２０１５年を参照のこと。
【０１７０】
等温線のほとんどは、ＩＩ型または無孔の等温線を示す。真空アニールしたＣ−５００、ＡＲＣ−５００、およびＡＲＣ−７５０は、最も高い窒素の吸着を有する。
【０１７１】
図２６Ａおよび２６Ｂは、それぞれ、ＰＶＡ−ＧＮＰ複合材とＰＴＦＥ−ＧＮＰフィルムのＳＥＭ画像を示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、クリオゲルの孔の平均断面を２７７ｎｍで測定し、ＰＴＦＥフィルムの平均粒径を２１１ｎｍで測定した。孔サイズは、血漿の輸送を可能にするのに十分大きいが、血液細胞は、通り抜けて移動するにはより大きな孔チャネルを必要とする。このクリオゲルは、血漿研究におけるサイトカイン吸着についての試験に適当であるが、血液灌流適用には、クリオゲルにより大きな多孔質ネットワークが必要とされる。ＰＴＦＥ−ＧＮＰフィルムは、ＧＮＰで研究した真空アニールした粒子より小さい平均径を有するＧＮＰ粒子を示す。ＰＴＦＥ＋ＧＮＰスラリーを粉砕することおよびフィルムを巻くことなどの付加的な処理工程は、凝集物を崩壊させることの原因となりうる。図２６Ｂに見られるＰＴＦＥ繊維はすべて、粒子上に保持され、凝集を妨げ、ＳＳＡの低下をもたらす可能性がある。
【０１７２】
いくつかのＧＮＰについての粒子サイズ分布データが図７に示される。粒子サイズと表面積に対する効果は、未処理のＧＮＰと窒素焼成ＧＮＰの間で観察される。平均粒子サイズのこの減少は、比表面積（ＳＳＡ）を増加させ、多数の部位で吸着を可能とする。表１は、ＢＥＴおよびＱＳＤＦＴの計算に基づいて、窒素吸着実験由来のすべての材料の表面積データを示す。
【０１７３】
図２７Ａ〜Ｆおよび図２８Ａ〜Ｆは、それぞれ、ＰＶＡ−ＧＮＰとＰＴＦＥ−ＧＮＰ複合材についての時間および正規化した吸着（吸着剤の単位質量当たりの吸着したサイトカインの質量）の関数として、サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−α）濃度を示す。表３から８は、指数関数的減衰関数とＨｏおよびＭｃＫａｙの擬２次関数の両方に対して正規化した吸着データをフィッティングすることから得られた値を示す。Y.  S.  HoおよびG.  McKay、「Pseudo-second  order  model  for  sorption  processes」、PROCESS  BIOCHEMISTRY、第３４巻、４５１〜４６５頁、１９９９年。
【０１７４】
計算したｑｅとｑ∞は、平衡時の吸着剤の単位質量当たりのサイトカインの正規化した吸着を表し、ここで、ｑｅは擬２次モデルから計算され、ｑ∞は指数関数的減衰関数から見出される。Ｒ２値がより高いことにより、ｑｅ値のみが分析に対して考慮される。
【０１７５】
全体として、ルースパウダー（loose  powder）に関する吸着の動態は、複合材の動態にはるかに勝る。迅速な吸着は、焼成し、真空アニールしたＡＲＣ−５００  ＧＮＰとＣ−５００  ＧＮＰの両方に見られた。非常に低い吸着はＧＮＰを含まないＰＴＦＥフィルムで観察され、ＧＮＰを含まないクリオゲルは、ＧＮＰ粒子を有するクリオゲルと同等の吸着能を示した。ＰＴＦＥフィルムのＧＮＰは、３つのサイトカインのすべてにおいて徐々の減少を示した。
【０１７６】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用するポストホックテューキー多重比較検定を用いる二元配置分散分析を使用することによって、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αについての陽性対照（過剰なサイトカインを有するが吸着剤を有さない血漿）は、実験の時間の尺度わたる濃度において統計的有意差を有さなかった。この多重比較検定は、材料のすべてに対して完了し、その結果を図２９に示す。この分析により、複合材は、これらの３つのサイトカインの濃度を低減し、粒子はこの吸着に寄与していることが示される。
【０１７７】
ＧＮＰを含まないＰＴＦＥフィルムに対して、ＰＴＦＥフィルムへのサイトカインの吸着に関して、区間ｐ＜０．０５での統計的有意性は存在しなかった。ＧＮＰを添加し、材料と共に１時間インキュベートした後、濃度の差は、０．０５未満から０．０００１以下までの範囲のｐ値で有意であった。ＰＶＡクリオゲルと共に５分インキュベートすると（ＧＮＰは含まない）、区間ｐ＜０．０５で初期濃度からの統計的有意性は存在しなかった。ＧＮＰをＰＶＡクリオゲルに添加することにより、５分後のＩＬ−６濃度の有意な減少が可能となり、１時間後にはさらにより有意な減少が可能となった（ｐ≦０．０１からｐ≦０．０００１）。データは、ＧＮＰを自立型の、可撓性のＰＴＦＥフィルムに添加することにより、サイトカインの吸着を生じさせたことを示す。ＩＬ−６に関する以外に、この傾向は、ＧＮＰをクリオゲルに添加しても見られなかった。
【０１７８】
ＧＮＰ−ＰＴＦＥ混合物をエタノールと一緒に圧延して可撓性で自立型のフィルムを調製した。エタノールを除去すると、ＰＴＦＥがＧＮＰ粒子を結合して一緒にマトリックスになった。サイトカインマーカーであるＩＬ−８、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの吸着により、ＰＴＦＥフィルムは単独で、インキュベーションの９０分以内の対照と比較して、スパイク血漿のサイトカイン濃度を低減しなかったことが明らかとなった。対照的に、スパイク血漿をＧＮＰ粒子と共にインキュベートした場合、そのＩＬ−８濃度は、５分以内に６３３ｐｇ／ｍｌから７ｐｇ／ｍｌへと低減した。ＩＬ−６は、５分後に４７７ｐｇ／ｍｌから２２ｐｇ／ｍｌへと低下し、３０分後には、さらに８ｐｇ／ｍｌへと落ちた（図３０Ａ〜Ｂ）。ＧＮＰ−ＰＴＦＥフィルムは、ＧＮＰと比較して、スパイク血漿からのＩＬ−８のより遅い吸着動態を示すが、９０分のインキュベーションにわたってＩＬ−８の９５％が除去された（図３０Ａ）。ＧＮＰ粒子と比較して、ＩＬ−６の有意に低い吸着効率がＧＮＰ−ＰＴＦＥフィルムで観察されたが、ＧＮＰ−ＰＴＦＥフィルムでは、９０分のインキュベーション期間にわたって、５０％を超えるＩＬ−６がスパイク血漿から除去された（図３０Ｂ）。ＧＮＰをＰＴＦＥフィルムに組み込むことにより、ＧＮＰ粒子と比較してＴＮＦ−αの除去は低減したが（図３０Ｃ）、血漿のＴＮＦ−αレベルは、ＧＮＰ−ＰＴＦＥとの９０分のインキュベーション後に有意に低減した。これは、露出した粒子の外表面積を低減するか、またはＰＴＦＥによって引き起こされる粒子間の接近性を低減する、ＧＮＰ粒子のパッキングに起因する可能性がある。全体として、ＰＴＦＥフィルムにおけるＧＮＰの組込みは、中程度の分子量のサイトカインマーカーであるＩＬ−６とＩＬ−８の吸着に利用可能なＧＮＰ表面を有意に低減せず、ＴＮＦ−αの高い吸着を実証した。
【０１７９】
【表３】
2019519290.tif 000005
【０１８０】
【表４】
2019519290.tif 000006
【０１８１】
【表５】
2019519290.tif 000007
【０１８２】
【表６】
2019519290.tif 000008
【０１８３】
【表７】
2019519290.tif 000009
【０１８４】
【表８】
2019519290.tif 000010
【０１８５】
表９  ＧＮＰおよびＧＮＰ−ＰＴＦＥ複合材によるサイトカインマーカーの吸着に関するＬａｇｅｒｇｒｅｎの１次速度論。平衡サイトカイン吸着とインキュベーション時間に対する各時点での吸着の間の差の自然対数（ｌｎ（ｑｅ〜ｑｔ））をプロットすることにより、擬１次モデルによって、擬１次吸着速度定数（Ｋｐ１）に等しい傾きと平衡吸着能の自然対数を表す切片（ｑｅ１）を有する線形回帰式が得られる。
【表９】
2019519290.tif 000011
【０１８６】
表１０  インキュベーション時間（ｔ）に対する各時点でのサイトカイン吸着で除算した時間（ｔ／ｑｔ）をプロットすることによる、ＧＮＰとＧＮＰ−ＰＴＦＥ複合材によるサイトカインマーカーの吸着についての擬２次速度論であり、擬２次モデルにより線形回帰式が得られる。平衡吸着能（ｑｅ）は、
【数２】
2019519290.tif 000012
によって計算することができ、擬２次吸着速度定数（Ｋｐ２）は、
【数３】
2019519290.tif 000013
によって計算することができる。
【表１０】
2019519290.tif 000014
【０１８７】
ＨｏおよびＭｃＫａｙの擬２次モデルにより、吸着剤の単位質量当たりのサイトカインの質量の単位で、吸着剤に関して正規化した吸着能である変数ｑｅを規定する。この変数をすべての材料にわたって比較し、最も効率的な吸着剤を同定した。それの実際の適用における迅速な吸着のための吸着剤の能力を試験するために、簡単な計算を完了した。擬２次ｑｅを使用して、５分後にＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αの濃度を血液から完全に除去するために必要な吸着剤の質量を見出した。ＸＧ  ＳｃｉｅｎｃｅｓによるＧＮＰ生成の平均コストに基づき、必要とされる材料のコストも得た。
【０１８８】
図３１Ａ〜３１Ｄは、試験した材料に関する正規化した吸着能を示す。サイトカイン当たりそれぞれ三連での平均値のみがグラフに示される。この情報から、所与のサイトカインに対する最も有効な吸着剤を決定し、その有効性を他の材料に対して比較した。ＩＬ−６に対する最も性能のよい吸着剤は、真空アニールしたＣ−５００  ＧＮＰであり、正規化した吸着能が３６ｐｇ／ｍｇであった（吸着剤１ミリグラム当たりのサイトカインのピコグラム）。ＩＬ−８に対して、真空アニールし、空気により酸化し、アミノ化したＣ−５００が最も高い能力を有し、８８ｐｇ／ｍｇが吸着された。ＴＮＦ−αは、５３ｐｇ／ｍｇの能力でＡＲＣ−７５０によって吸着された。
【０１８９】
患者の全ての血液の体積は、約６．３リットルであり（北アメリカの成人の平均体重（８０．７ｋｇ（S.  C.  Walpole、D.  Prieto-Merino、P.  Edwards、J.  Cleland、G.  Stevens、およびI.  Roberts、「The  weight  of  nations:  an  estimation  of  adult  human  biomass」、BMC  PUBLIC  HEALTH、第１２巻、４３９〜４３９頁、２０１２年）に基づく）、単位質量当たりの血液の体積は、７８ｍｌ／ｋｇであり（N/A、Protection  in  Nuclear  Medicine  and  Ultrasound  Diagnostic  Procedures  in  Childrenにおける「2.5.1  Estimated  Blood  Volumes」  :  （報告書番号７３）、National  Council  on  Radiation  Protection  and  Measurements(NCRP)編）、サイトカイン濃度は１０００ｐｇ／ｍＬであり、敗血症を有するヒトは、各サイトカインの６．３μｇが血液から除去されることを必要とする。５分後の正規化した吸着データに基づき、吸着剤の質量を吸着されるサイトカインの質量に基づいて計算することができる。図３２は、３つのサイトカインについてのこれらの計算値を示し、５分でこれらのタンパク質レベルを吸着する最小質量は、４２２グラムのＡＲＣ−５００  ＧＮＰに由来する。ＸＧ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓには、これらの製造プロセスにより、キログラム当たり４０ドルのコストでＧＮＰを生産することができると述べられているため、吸着剤についての患者当たりのコストは１７ドルとなる。この少量は、数時間、時には一度に数日間、集中治療資源を使用する血液透析および血液灌流処置からの非常に大きな改善である。血液の処置は体外であるため、極端に短い処置のための１つの大きな血液灌流カートリッジを作製することができる。
【０１９０】
当業者は、これらの教示に照らして、本発明について多数の修正と変更が可能であることを認識するため、それによって、このようなもののすべてが企図される。この文書で引用または記載された各特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照により、それぞれその全体として、すべての目的のために、本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2019519290.tif 000015
【図１Ｂ】
2019519290.tif 000016
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
2019519290.tif 000019
【図２Ｂ】
2019519290.tif 000020
【図３】
2019519290.tif 000021
【図４Ａ】
2019519290.tif 000022
【図４Ｂ】
2019519290.tif 000023
【図４Ｃ】
2019519290.tif 000024
【図４Ｄ】
2019519290.tif 000025
【図５Ａ】
2019519290.tif 000026
【図５Ｂ】
2019519290.tif 000027
【図５Ｃ】
2019519290.tif 000028
【図５Ｄ】
2019519290.tif 000029
【図５Ｅ】
2019519290.tif 000030
【図５Ｆ】
2019519290.tif 000031
【図６Ａ】
2019519290.tif 000032
【図６Ｂ】
2019519290.tif 000033
【図６Ｃ】
2019519290.tif 000034
【図６Ｄ】
2019519290.tif 000035
【図６Ｅ】
2019519290.tif 000036
【図６Ｆ】
2019519290.tif 000037
【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ−２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
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【図２８Ｆ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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2019519290.tif 000123
2019519290.tif 000124