(57)【要約】  本発明は、ミトコンドリア活性を増加させることにより持久運動能力を向上させるためのコラーゲン加水分解物の使用に関する。更に、本発明は、ミトコンドリア活性を増加させることにより脂質代謝を刺激するための、特に体重を減少させるための、コラーゲン加水分解物の使用に関する。【選択図】図１Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア活性を増加させることにより持久運動能力を向上させるためのコラーゲン加水分解物の使用。
【請求項２】
ミトコンドリア活性を増加させることにより脂質代謝を刺激するため、そして特に体重を減少させるためのコラーゲン加水分解物の使用。
【請求項３】
前記使用が非治療的使用、特に美容的使用である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記使用が、ミトコンドリア活性の減少により、そして特に持久運動能力の低下および／または体重の増加により特徴づけられる病的状態を予防および／または治療するための治療的使用である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
前記病的状態が、肥満、心血管疾患、心不整脈、心不全、低血圧、高血圧、代謝障害、糖尿病、メタボリック・シンドローム、鉄芽球性貧血、腎臓および肝臓の機能不全、神経障害、運動失調、てんかん発作、認知症、アルツハイマー病、自閉症、うつ病、慢性疲労症候群、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、脳卒中様症状、頭痛、ミオクローヌス、麻痺、神経痛、痛覚過敏、知覚過敏、嚥下障害、嘔吐、便秘、下痢、視神経線維や網膜の変性、眼振、眼瞼下垂、夜盲症、聴力喪失、難聴および内耳障害から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
コラーゲン加水分解物が腸内投与、特に経口投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
コラーゲン加水分解物が栄養補助剤の形で、特に溶液または粉末の形で投与される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記栄養補助剤が、コラーゲン加水分解物以外に、更なるタンパク質またはタンパク質加水分解物を含まない、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記栄養補助剤が、コラーゲン加水分解物以外に、更なる生理学的活性成分を含まない、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
前記コラーゲン加水分解物が１〜40 g／日、好ましくは2.5〜30 g／日、より好ましくは10〜25 g／日、特に12.5〜20 g／日の量で投与される、請求項６〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記コラーゲン加水分解物が、ビタミンＣ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＫ型のビタミン類、共益リノレイン酸、カフェインおよびその誘導体、ガラナ抽出物、緑茶抽出物、エピガロカテキン没食子酸塩、クレアチン、Ｌ−カルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニン、α−リポ酸、Ｎ−アセチルシステイン、NADH、Ｄ−リボース、アスパラギン酸マグネシウム、抗酸化剤、例えばアントシアニン、カロチノイド、フラボノイド、レスベラトロール、グルタチオン、スーパーオキシドジスムターゼおよびキサンタン、例えばマンギフェリン、ミネラル類、例えば鉄、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、セレンおよびリン、並びに追加のタンパク質、加水分解物またはペプチド、例えば大豆、小麦もしくは乳清タンパク質から選択される１つ以上の成分と組み合わされる、請求項１〜８または10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記コラーゲン加水分解物が、50〜100 mg／日の量で投与されるユビキノン-10および／またはユビキノールと、および／またはピロロキノリンキノン（PQQ）と組み合わされる、請求項１〜８、10または11のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記コラーゲン加水分解物の投与が、持久力トレーニングまたは高地トレーニングと組み合わされる、請求項１〜12のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記コラーゲン加水分解物の投与が、持久力トレーニング、高地トレーニングまたは筋肉トレーニングの非存在下で、特に通常の身体活動と組み合わせて行われる、請求項１〜12のいずれか一項記載の使用。
【請求項１５】
前記コラーゲン加水分解物が、200〜25,000 Da、好ましくは1,000〜6,000 Da、より好ましくは1,200〜4,000 Da、更により好ましくは1,500〜3,500 Da、特に2,800〜3,300 Daの平均分子量を有する、請求項１〜14のいずれか一項記載の使用。
【請求項１６】
前記コラーゲン加水分解物が、コラーゲンを含む出発材料の酵素的加水分解により生産される、請求項１〜15のいずれか一項記載の使用。
【請求項１７】
前記コラーゲンを含む出発材料が、脊椎動物の、好ましくは哺乳類の皮膚または骨、特にウシまたはブタの皮膚から選択される、請求項16に記載の使用。
【請求項１８】
前記コラーゲン加水分解物が組換え遺伝子発現により生産される、請求項１〜15のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持久運動能力を向上させるためのコラーゲン加水分解物の使用に関する。
【０００２】
更に、本発明は、脂質代謝を刺激するため、特に体重を減少させるためのコラーゲン加水分解物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
特に動物起源のコラーゲン含有出発材料の酵素的加水分解により生産されるコラーゲン加水分解物は、出発材料と生産条件によって、特定のサイズ範囲に渡る分子量分布をもつペプチド混合物から構成される。栄養補助剤としてのコラーゲン加水分解物の使用、特に骨、関節もしくは結合組織の疾患を予防および／または治療するための使用がかなり昔より知られている。これは、特に、コラーゲンペプチドによりそれらの組織型における自身の細胞外マトリックスの合成に刺激効果があることを示すことができたためである（例えばBello他、Curr. Med. Res. Opin. 2006 (22) 2221-2232参照）。
【０００４】
驚くべきことに、コラーゲン加水分解物がヒトや動物細胞のミトコンドリア活性の増加を引き起こし、すなわち、細胞当たりのミトコンドリア数の増加および／または個々のミトコンドリアのサイズの拡大を引き起こすことが示された。
【０００５】
この知見から、本発明のコラーゲン加水分解物は、筋細胞でのミトコンドリア活性を増加させることにより、標的指向形式で、ヒトや動物の持久運動能力を向上させるためおよび脂質代謝を刺激するために利用できることになる。
【０００６】
ヒトまたは動物の体の持久運動能力は、筋肉組織に必要なエネルギーを長期に渡りATP（アデノシン三リン酸）の形で供給する有酸素代謝能力と相関関係がある。有酸素容量に重要な因子は酸素吸収であり、これは次の３つの因子により決定される：肺からの酸素供給、心血管系経由での酸素輸送、および筋細胞での酸素利用。最大酸素供給量は、個体の解剖学的環境（肺胞の総表面積）により実質的に予め決められているが、酸素輸送と酸素消費はトレーニングや他の手段により強化することができ、その最終段階が典型的には決定的制限因子を表す。この理由により、持久運動能力は、酸素を消費しATPを産生する呼吸連鎖反応が起こるミトコンドリアの数（筋細胞当たりの、または全筋肉組織内の）に実質的に依存する。
【０００７】
一般に、ミトコンドリア活性の増加は、体の代謝速度が上昇すること、およびエネルギー回復のための単位時間当たりの栄養素の代謝量が増加することを意味する。しかしながら、代謝活性が高くなると必然的に体内の貯蓄物の分解が大きくなり（栄養供給が一定に保持されるならば）、すなわち、脂質代謝の刺激をもたらす。よって、脂肪組織からの長鎖カルボン酸の代謝は実質的に体全体、特に肝臓で起こるので、本発明のこの観点においては−持久運動能力を向上させることと対照的に−、関連するのは筋細胞のミトコンドリアだけではない。
【０００８】
本発明に係るコラーゲン加水分解物の使用は、特に非治療的使用、すなわち持久運動能力または体重に関して医学的に治療を必要としないヒトまたは動物へのコラーゲン加水分解物の投与を含む。むしろ、その使用は、一方では持久運動能力の一般的に望ましい強化という目的で実施される。これは、生活の質の改善に貢献し、特にスポーツをする人（アスリート）にとって意味がある。他方で、脂質代謝を刺激する結果としての体重の減少は、主に美容上の理由で、すなわち体のプロポーションを良くするために望ましいかもしれない。
【０００９】
しかしながら、更に、本発明は、ミトコンドリア活性の減少により特徴づけられる病的状態を予防および／または治療するためのコラーゲン加水分解物の治療的使用も包含する。特に、病的状態は、持久運動能力の低下および／または体重の増加により特徴づけられうる。
【００１０】
この治療的使用の状況下では、病的状態が好ましくは肥満、心血管疾患、心不整脈、心不全、低血圧、高血圧、代謝障害、糖尿病、メタボリック・シンドローム、鉄芽球性貧血、腎臓および肝臓の機能不全、神経障害、運動失調、てんかん発作、認知症、アルツハイマー病、自閉症、うつ病、慢性疲労症候群、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、脳卒中様症状、頭痛、ミオクローヌス、麻痺、神経痛、痛覚過敏、知覚過敏、嚥下障害、嘔吐、便秘、下痢、視神経線維および網膜の変性、眼振、眼瞼下垂、夜盲症、聴力喪失、難聴および内耳障害から選択される。これらの適応症では、治療効果はミトコンドリア数またはミトコンドリア活性を増加させることによって達成することができる。
【００１１】
ミトコンドリア活性の増加がグルコースレベルを低下させるため、コラーゲン加水分解物の投与は癌、いわゆる悪性腫瘍の予防および／または治療にもプラス効果（効能）を有することができる。これは、腫瘍細胞の必要とするエネルギーが主に嫌気的代謝（乳酸発酵）によって供給され、そしてその代謝が必然的にグルコースに依存するという知見に基づいている。体の細胞内のグルコース消費が高まるほど、腫瘍細胞は衰退するだろう。
【００１２】
本発明において、コラーゲン加水分解物がAMP-活性化プロテインキナーゼ（AMPK）酵素の発現の増加を引き起こすことが発見された。この調節酵素は、同様に細胞のエネルギー代謝に対しても効果があり、よってAMPKの量を増加させることが持久運動能力と脂質代謝に対してプラス効果を有する。コラーゲン加水分解物によりもたらされるミトコンドリア活性の増加とAMPK発現の増加との間には、おそらく正相関関係があるだろう。
【００１３】
本発明に係る全ての使用において、コラーゲン加水分解物は好ましくは腸内に、特に経口的に投与される。
【００１４】
本発明の好ましい態様では、コラーゲン加水分解物は栄養補給剤（サプリメント）の形で投与される。特に有利には、投与は溶液の形、例えばアンプル製剤の形、または粉末の形である。コラーゲン加水分解物は、それの易溶解性のため、濁りを引き起こすことなく、様々な飲料に添加することもできる。無味無臭のコラーゲン加水分解物の使用は、ユーザーにおける容認度を増加させうる。
【００１５】
本発明の好ましい態様によれば、栄養補助剤は、コラーゲン加水分解物以外に、更なるタンパク質またはタンパク質加水分解物を含まない。筋肉増強および筋肉維持用の既知の栄養補助剤では、特にスポーツをする人々により、エネルギー供給源として炭水化物と脂肪の大部分をタンパク質に置き換える目的で、様々なタンパク質（プロテイン）が使われている。しかしながら、本発明にかかる使用は、エネルギー供給源としてのコラーゲン加水分解物の機能に基づくのではなく、上述したミトコンドリア活性に対する特別な作用に基づいている。
【００１６】
従って、本発明の更なる態様では、栄養補助剤は、コラーゲン加水分解物以外に、更なる生理学的に活性な成分を含まない。
【００１７】
しかしながら、別の態様として、本発明は、コラーゲン加水分解物が様々な追加の成分を含有する（栄養）補助剤（サプリメント）の一成分として投与される場合も包含する。特に、コラーゲン加水分解物はチョコレートバー、プロテインバーまたはシリアルバー（いわゆる機能食品）または牛乳、乳製品（例えばヨーグルト）および代用乳（例えば豆乳、アーモンドミルクおよびココナッツミルク）のような食物や飲料に添加または処理することができる。
【００１８】
投与形態に関わらず、コラーゲン加水分解物は、典型的には、１〜40 g／日の量で、好ましくは2.5〜30 g／日、より好ましくは10〜25 g／日、特に12.5〜20 g／日の量で投与される。
【００１９】
本発明にかかる使用では、コラーゲン加水分解物は栄養補助剤の唯一の生理学的活性成分として使用されるのではなく、それは一般的な健康に対し、特に持久運動能力に対してプラス効果を有する１つ以上の追加の成分と組み合わせることができる。この種の成分は好ましくは、ビタミンＣ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＫ型のビタミン類、共益リノレイン酸、カフェインおよびその誘導体、ガラナ抽出物、緑茶抽出物、エピガロカテキン没食子酸塩、クレアチン、Ｌ−カルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−アルギニン、α−リポ酸、Ｎ−アセチルシステイン、NADH、Ｄ−リボース、アスパラギン酸マグネシウム、抗酸化剤、例えばアントシアニン、カロチノイド、フラボノイド、レスベラトロール、グルタチオン、スーパーオキシドジスムターゼおよびキサンタン、例えばマンギフェリン、ミネラル類、例えば鉄、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、セレンおよびリン、並びに追加のタンパク質、加水分解物またはペプチド、例えば大豆、小麦もしくは乳清タンパク質から選択される。
【００２０】
本発明の更なる有益な態様は、コラーゲン加水分解物をユビキノン-10および／またはユビキノール、すなわちコエンザイムＱ10の酸化型または還元型と組み合わせることに関し、ここでユビキノールはそれの良好な生物利用能のために好ましい。50〜100 mgのユビキノールの毎日の摂取で、身体能力にプラス効果が観察されたため、ユビキノールの抗酸化作用によるミトコンドリア活性の促進が想定される。このようにして、ミトコンドリア機能不全に伴う上記適応症の場合のコラーゲン加水分解物の作用が裏付けられる。代替的または付加的に、コラーゲン加水分解物を、最近重要な酸化還元補因子として発見されたピロキノリンキノン（PQQ）と組み合わせることも可能である。
【００２１】
本発明の特定の態様では、コラーゲン加水分解物の投与が持久力トレーニングまたは高地トレーニングと組み合わされる。持久力トレーニングは、代謝の有酸素容量を増加させることができる。比較的酸素欠乏環境での身体トレーニング（低酸素トレーニング）が、持久運動能力に対して顕著な効果を有することが知られており、そのためコラーゲン加水分解物の同時投与により、相乗効果が期待される。これは特にアスリートにとって興味深い。
【００２２】
他方で、本発明の範囲内では、コラーゲン加水分解物の投与が持久力トレーニング、高地トレーニングまたは筋肉トレーニングの非存在下で行われる場合も、同様に可能でありかつ実際に有用である。特に、ミトコンドリア活性等に対する本発明に係る効果が、通常の身体活動と組み合わせて既に観測されている。
【００２３】
本発明によれば、使用されるコラーゲン加水分解物の分子量は広範囲にわたり異なることができるが、変性コラーゲンやゼラチンとは異なり、コラーゲン加水分解物が室温でゲル化せず水溶性であるように十分に高い加水分解度を有するという点でその上限が与えられる。コラーゲン加水分解物の水溶性ペプチドは、200〜25,000 Da、好ましくは1,000〜6,000 Da、より好ましくは1,200〜4,000 Da、更により好ましくは1,500〜3,500 Da、特に2,800〜3,300 Daの平均分子量を有する。
【００２４】
好ましくは、コラーゲン加水分解物はコラーゲン含有出発材料の酵素的加水分解により生産される。この加水分解には、特に微生物由来または植物由来のエンドペプチダーゼおよび／またはエキソペプチダーゼが使われる。
【００２５】
コラーゲン含有出発材料は、典型的には、脊椎動物、好ましくは哺乳類の皮膚または骨、特にウシやブタの皮膚（牛骨または豚皮）から選択される。コラーゲン加水分解物は、それらの出発材料から一段階法で、またはゼラチンの中間工程を介してのいずれかで生産することができ、後者の場合はＡ型ゼラチンとＢ型ゼラチンの両方とも使用できる。
【００２６】
代わりに、本発明に従って使用されるコラーゲン加水分解物は、組換え遺伝子発現により生産してもよい。特にウシやブタ由来の天然コラーゲン配列、および遺伝子的に改変された細胞（例えば酵母、細菌または植物細胞、特にタバコ）中での該配列の発現を利用することにより、コラーゲン含有原材料の加水分解産物と実質的に同一である生成物を生産することができる。よって、比較的狭いまたは正確に規定された分子量分布を得ることが可能である。あるいは、生成物の特定の性質に対する何らかの効果を得るために、配列を突然変異により改変してもよい。
【００２７】
本発明は更に、ミトコンドリア活性を増加させることにより、持久運動能力を向上させるそして／または脂質代謝を刺激する方法、特に体重を減少させる方法に関する。該方法は好ましくは、ヒトまたは動物へのコラーゲン加水分解物の腸内投与、特に経口投与を伴う。該方法は治療方法でよく、または実際には非治療方法であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、コラーゲン加水分解物の存在下でインキュベートしたSH-SY5Y細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明をインビトロ（生体外）およびインビボ（生体内）実験結果に関して更に詳細に説明する。それは下記の実施例の文脈内に記載される。
【実施例】
【００３０】
１．コラーゲン加水分解物を使ったミトコンドリア数の増加
ヒト神経細胞(神経芽細胞腫SH-SY5Y)に関してインビトロでミトコンドリア数を増加させるためのコラーゲン加水分解物の有効性を証明することができた。
【００３１】
SH-SY5Y細胞を、0.05重量％、0.2重量％および2.5重量％の異なる濃度のコラーゲン加水分解物と共に培地中でインキュベートした。この際、酵素加水分解により生産された3,000 Daの範囲の平均分子量を有するブタ皮ゼラチンからのコラーゲン加水分解物を使用した（下記にコラーゲン加水分解物Ａと指定）。ペプチドの分子量分布はゲル浸透クロマトグラフィーにより決定し、それを下記の表１に示す。
表１：コラーゲン加水分解物Ａの分子量分布
【００３２】
【表１】
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【００３３】
ミトコンドリア数の直接評価を可能にするために、ミトコンドリアタンパク質成分TOM20を蛍光標識した。TOM20はミトコンドリアの外膜中のレセプター複合体を構成するサブユニットであり、ミトコンドリア中に細胞質前駆体タンパク質（プレペプチド）を移動させる機能を有する。ここで、プレ配列を開裂することにより、呼吸鎖の酵素またはクエン酸回路の酵素であるタンパク質が活性化される。
【００３４】
蛍光顕微鏡下で可視である蛍光標識TOM20の量は、細胞中のミトコンドリア数の尺度である。0.05重量％、0.2重量％および2.5重量％のコラーゲン加水分解物と共にインキュベートした細胞を図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す。図中、コラーゲン濃度が増加すると細胞核の周辺の領域に薄い蛍光（元は緑色）の増加が明らかに目に見える。このようなコラーゲン加水分解物は、SH-SY5Y細胞中のミトコンドリア数の増加をもたらし、よって全体的なミトコンドリア活性の増加をもたらす。
【００３５】
２．インビトロでのコラーゲン加水分解物による酵素AMPKの活性化
AMP-活性化プロテインキナーゼ（AMPK）は、脂肪組織と筋肉組織の両方のエネルギー供給に携わっている。ATPが消費されるとAMPが生成されるので、それはエネルギー欠乏の指標物質として見なすことができる。よってAMPKの発現は、蓄積した脂肪からのおよび解糖過程でのエネルギー貯蔵を活性化する働きをする。
【００３６】
AMPK発現に対するコラーゲン加水分解物の作用を調べるために、ヒト単球を0.5 mg/mLのコラーゲン加水分解物含有培地中で24時間インキュベートした。培地を除去した後、細胞層からRNAを抽出し、特異的プライマーを使ったPCRによりAMPK-RNAの量を決定した。
【００３７】
コラーゲン加水分解物を含まない対照に比べると、AMPK-RNA量が有意に増加された（600超の倍数分の増加）。この知見からも同様に、コラーゲン加水分解物による細胞のエネルギー代謝の刺激効果が証明された。
【００３８】
３．インビボでのコラーゲン加水分解物による酵素AMPKの活性化
AMPK発現に対するコラーゲン加水分解物のプラス効果を、インビボでの動物試験を使って確認することができた。
【００３９】
この目的に、10 gのヒト等価物量に相当するコラーゲン加水分解物の量を、３か月の期間に渡り、毎日マウスに与えた。マウスを犠牲にしたのち、大腿四頭筋を完全に切除し、急速凍結し、粉砕した。筋肉組織から可溶性タンパク質を抽出し、イムノアッセイ（ELISA）によりAMPKの量を測定した。
【００４０】
コラーゲン加水分解物を投与されなかった対照群に比較して、AMPKの量が1.5〜２の倍数だけ増加した。
【００４１】
４．インビトロでのNADHの生産に対するコラーゲン加水分解物の効果
低エネルギー型NAD+からのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの高エネルギー型NADH＋H+の形成は、ATPの形でのエネルギー生産と等価である。よって、それは筋肉細胞におけるミトコンドリア活性の間接的測定法である。
【００４２】
この試験では、0.5 mg/mLのコラーゲン加水分解物を含む培地中でヒト単球を６日間インキュベートした。培地を除去した後、グリセロールキナーゼとグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ酵素によってトリグリセリドを抽出し、トリグリセリドまたはグリセロールに含まれるエネルギーを、そこから放出されるNADH＋H+の形で測定した。
【００４３】
コラーゲン加水分解物を含まない対照に比較して、NADHの量が約２の倍数だけ増加した。
【００４４】
５．インビボにおけるラットのミトコンドリア密度の増加
前臨床試験において、ラットの骨格筋のミトコンドリア密度の有意な増加（すなわちミトコンドリアの数および／またはサイズの増加）を、異なるコラーゲン加水分解物の投与の結果として、証明することができた。
【００４５】
この試験は、CD（登録商標）IGS系列（Charles River Laboratories, Sulzfeld）の雄ラットにおいて実施し、そのラットは試験期間の開始時点で64日齢であり、かつ300〜400gの体重を有した。試験群と対照群はそれぞれ６匹の動物を含んだ。
【００４６】
試験の開始時点（ｔ＝０）では、細針吸引により、各ラットの大腿四頭筋の生検を採集した。４週間の期間に渡り、試験群の動物に、現体重１kgあたり200 mgの一日量の各コラーゲン加水分解物（下記参照）（75 kgの体重を有するヒトの場合の15 gの一日量に相当する）を投与した。  コラーゲン加水分解物は20 mg/mLの濃度で適当量の水道水中に溶解し、胃管経由で投与した。対照群の動物にはコラーゲン加水分解物を含まない同量の水道水を投与した。
【００４７】
上記コラーゲン加水分解物Ａの他に、追加の試験群として、2,000 Daの平均分子量を有するウシスプリットゼラチンのコラーゲン加水分解物Ｂ、および3,500 Daの平均分子量を有するウシスプリットゼラチンのコラーゲン加水分解物Ｃを使用した。それらは各場合とも酵素的加水分解により製造された。３つの加水分解物全ての分子量分布を下記の表２に示す。
表２：重量％でのコラーゲン加水分解物の分子量分布
【００４８】
【表２】
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【００４９】
試験期間の終了後（ｔ＝４週）、全てのラットを犠牲にし、再び細針吸引により大腿四頭筋の生検を採取した。４週間の間で、約30％のラットの平均重量増加が認められ、これは試験群と対照群のラット間で有意な差はなかった。
【００５０】
ミトコンドリア密度を測定するために、試験期間の前後に採取した生検を、文献に記載の通りに走査電子顕微鏡分析用に調製した（A. Glauert & P. Lewis: Biological Specimen Preparation for Transmission Electron Microscopy, Princeton Legacy Library, 2014参照）。各場合において、15.17×15.17μmのサイズ（230μm2）の筋肉生検の各表面部分をデジタル処理し、半定量的に評価した。ここで、各生検からの各10個の試料を使って、総表面積の割合としてミトコンドリアの平均表面積を求めた。明白に視覚できる、クリステを有する特徴的な内膜構造から、ミトコンドリアを局在化することが可能であった。
【００５１】
表３は、コラーゲン加水分解物Ａによる試験群の動物におけるミトコンドリア密度（総表面積230μm2あたりのミトコンドリアμm2）の増加を示す。
表３：試験群Ａでの経時増加
【００５２】
【表３】
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【００５３】
この結果は、コラーゲン加水分解物Ａの４週間投与が、平均で78.5％の、ミトコンドリア密度の非常に明白な増加をもたらすことを示した。これは統計学的に有意である（ｐ＝0.001）。
【００５４】
下表４に従った、コラーゲン加水分解物Ａ、ＢおよびＣの試験群と対照群との間での４週間後の各場合のミトコンドリア密度の比較により、同様な知見が証明された。
表４：試験群Ａ、ＢおよびＣと対照群との比較
【００５５】
【表４】
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【００５６】
試験群では、ミトコンドリア密度が、対照群よりも平均56.6％（Ａ）、59.5％（Ｂ）および90.4％（Ｃ）高く、それも同様に統計学的に有意な値である（ｐ＝0.001）。エフェクトサイズの尺度としてのコーエンのｄ値（Cohen’s d value）は、全ての試験群で2.5超であり、故に各場合において非常に顕著な効果が認められた。
【００５７】
要約すると、本試験は、コラーゲン加水分解物の投与が筋細胞のミトコンドリア密度に有意な増加をもたらし、引いてはミトコンドリア活性の対応する増加をもたらすという決定的証拠を提供する。この効果は、異なる起源（ブタとウシ）および異なる分子量分布のコラーゲン加水分解物を用いて確認することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際調査報告】
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