(57)【要約】本開示は、骨障害を治療し、及び／または骨治癒を増加させるための方法及び試薬に関する。特に、本開示は、骨障害の治療及び／または骨治癒の増加に際して、ミッドカイン（以下「ＭＫ」と称する）に結合し、その機能を阻害または低下させる単離または組換えタンパク質、例えば抗体の使用に関する。【選択図】図１−２
2019510080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における骨形成の促進及び／または骨治癒の促進及び／または骨密度（ＢＭＤ）の増加方法であって、ミッドカイン（ＭＫ）タンパク質に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを含む単離または組換えタンパク質を、前記被験体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記被験体が：
（ｉ）骨折を有する被験体；
（ｉｉ）骨形成のための外科手術を受けた、または受ける予定の被験体；
（ｉｉｉ）整形外科インプラントまたはハードウェアと隣接する骨との一体化を促進するための外科手術を受けた、または受ける予定の被験体；及び
（ｉｖ）骨粗鬆症に罹患しているか、または罹患しやすい被験体
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離または組換えタンパク質の投与が、前記被験体における骨治癒を加速し、及び／または骨芽細胞活性を増強する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記単離または組換えタンパク質が、ＭＫのＮドメイン内に位置するエピトープに特異的に結合し、ＭＫの機能を阻害または低減する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記単離または組換えタンパク質が結合する前記エピトープが、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基１〜６１によって規定されるＭＫのＮドメイン内に位置する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記単離または組換えタンパク質が、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基１〜６１に位置する高静電ポテンシャルクラスターの少なくとも一部を認識する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記単離または組換えタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列によって形成される高次構造エピトープに特異的に結合し、前記エピトープが、１８Ｗ、２０Ｗ、３４Ｆ、３５Ｒ、３６Ｅ、３８Ｔ、４３Ｔ、４５Ｒ、４７Ｒ及び４９Ｒからなる群から選択される少なくとも２つの残基を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記エピトープが、以下の残基：
（ｉ）１８Ｗ、２０Ｗ、３５Ｒ及び４９Ｒ；
（ｉｉ）１８Ｗ、２０Ｗ、３６Ｅ、３８Ｔ、４３Ｔ及び４５Ｒ；または
（ｉｉｉ）１８Ｗ、２０Ｗ、３４Ｆ、３６Ｅ、４５Ｒ及び４７Ｒ
によって規定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記単離または組換えタンパク質が：
（ｉ）配列番号２に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｉ）配列番号３に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を含むＶＨ、及び配列番号３に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）それぞれ配列番号４、５及び６に記載の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびにそれぞれ配列番号７、８及び９に記載の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｖ）配列番号２に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ、及び配列番号３に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ
を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記単離または組換えタンパク質が：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｉ）配列番号１１に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号１０に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を含むＶＨ、及び配列番号１１に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１２、１３及び１４に記載の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびにそれぞれ配列番号１５、１６及び１７に記載の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｖ）配列番号１０に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ、及び配列番号１１に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ
を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記単離または組換えタンパク質が：
（ｉ）配列番号１８に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｉ）配列番号１９または２０に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号１８に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を含むＶＨ、及び配列番号１９または２０に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）それぞれ配列番号２１、２２及び２３に記載の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびにそれぞれ配列番号２４、２５及び２６に記載の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｖ）配列番号１８に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ、及び配列番号１９または２０に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ
を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記単離または組換えタンパク質が、ＭＫのＣドメイン内に位置するエピトープに特異的に結合し、ＭＫの機能を阻害または低減する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離または組換えタンパク質が結合する前記エピトープが、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６２〜１０４によって規定されるＭＫのＣドメイン内に位置する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離または組換えタンパク質が結合する前記エピトープが、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６４〜７３及びアミノ酸残基７８〜１０１内に位置する、請求項１〜３または１２または１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離または組換えタンパク質が、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６４〜６６、アミノ酸残基６４〜６７、アミノ酸残基６４〜６９、アミノ酸残基６４〜７３、アミノ酸残基８４〜９６、またはアミノ酸残基８７〜９６に位置するエピトープの少なくとも一部を認識する、請求項１〜３または１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離または組換えタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列によって形成されるエピトープに特異的に結合し、前記エピトープが、６４Ｙ  ６５Ｋ、６６Ｆ、６７Ｅ、６９Ｗ、７３Ｄ、８４Ｔ、８６Ｋ、８７Ｋ  ９０Ｙ及び９６Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの残基を含む、請求項１〜３または１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記エピトープが高次構造エピトープである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記高次構造エピトープが、逆平行βシートエピトープである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記単離または組換えタンパク質が、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６２〜１０４に位置する高静電ポテンシャルクラスターの少なくとも一部を認識する、請求項１〜３もしくは１２または請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記単離または組換えタンパク質が、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６２〜６４、６６、６８〜７０、７２、７９、８１、８５〜８９、１０２及び１０３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を認識する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記単離または組換えタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列によって形成されるエピトープに特異的に結合し、前記エピトープが、６３Ｋ、７９Ｋ、８１Ｒ  ８６Ｋ、８７Ｋ、８９Ｒ及び１０２Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの残基を含む、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記単離または組換えタンパク質が：
（ｉ）それぞれ配列番号２７、２８及び２９に記載の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び
（ｉｉ）それぞれ配列番号３０、３１及び３２に記載の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、請求項１〜３または１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離または組換えタンパク質が：
（ｉ）それぞれ配列番号３３、３４及び３５に記載の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び
（ｉｉ）それぞれ配列番号３６、３７及び３８に記載の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、請求項１〜３または１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記単離または組換えタンパク質が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＶＨ及び前記ＶＬが、単一のポリペプチド鎖内にある、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記単離または組換えタンパク質が：
（ｉ）一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体型ｓｃＦｖ（ジ−ｓｃＦｖ）；または
（ｉｉｉ）Ｆｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結した（ｉ）及び／または（ｉｉ）のうちの少なくとも１つ
である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＶＬ及びＶＨが、別々のポリペプチド鎖内にある、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記単離または組換えタンパク質が：
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ′）２；
（ｖｉ）Ｆｖ；または
（ｉｖ）Ｆｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結した（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの１つ
である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記単離または組換えタンパク質が、キメラ、脱免疫化、ヒト化またはヒト抗体である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記単離または組換えタンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＡからなる群より選択されるヒトまたは非ヒト霊長類重鎖免疫グロブリン定常領域を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記単離または組換えタンパク質を、化合物に複合体化する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物が、放射性同位体、検出可能な標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、被験体におけるタンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１６年３月１日に出願されたオーストラリア仮出願第２０１６９００７５５号の優先権を主張し、その全内容を参照として本明細書に援用する。
【０００２】
本開示は、骨障害を治療し、及び／または骨治癒を増加させるための方法及び試薬に関する。特に、本開示は、骨障害の治療及び／または骨治癒の増加に際して、ミッドカイン（以下「ＭＫ」と称する）に結合し、その機能を阻害または低下させる単離または組換えタンパク質、例えば抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ミッドカイン（以下、「ＭＫ」と称する）は、胚性癌腫（ＥＣ）細胞のレチノイン酸誘発性の分化過程で一過性に発現する遺伝子の産物として元来見出されたヘパリン結合性増殖／分化因子であり、塩基性アミノ酸及びシステインに富む分子量１３ｋＤａのポリペプチドである（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１１３１２−１３１８；Ｔｏｍｏｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６５：１０７６５−１０７７０）。
【０００４】
ＭＫは、様々な生物学的活性を有することが知られている。例えば、ＭＫ発現は、いくつかの異なるヒトがん細胞において増加することが知られており（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：３５９−３７１）、その発現は、がん細胞の生存及び遊走を促進し、血管新生を促進し、がんの進行に寄与することが見出されている。
【０００５】
ＭＫはまた、炎症プロセスにおいて中心的な役割を果たすことも知られている。例えば、ＭＫ遺伝子を欠損させたノックアウトマウスでは、腎臓における血管損傷後の新生内膜形成及び虚血性損傷時の腎炎発症が抑制されることが知られている。さらに、そのようなノックアウトマウスにおいて、リウマチ損傷モデル及び術後癒着が有意に抑制されることも知られている（ＷＯ２０００／０１０６０８；ＷＯ２００４／０７８２１０）。したがって、ＭＫは、関節炎、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎（関節リウマチ（ＲＡ）または変形性関節症（ＯＡ））、多発性硬化症、術後癒着、炎症性腸疾患、乾癬、狼瘡、喘息、及び好中球機能障害などの炎症性疾患に関与することが知られている。さらに、ＭＫは、マクロファージまたは好中球などの炎症細胞の移動（遊走）を促進することが知られている。また、破骨細胞の分化にも関与するとされている。
【０００６】
ＭＫの三次元構造はＮＭＲによって決定され、報告されている（Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：６９３６−６９４６）。ＭＫは：アミノ酸残基１〜５２からなるＮ末端断片（以下、「Ｎ断片」と称する）；アミノ酸残基６２〜１２１からなるＣ末端断片（以下、「Ｃ断片」と称する）；及びこれらの断片を連結するループ領域（アミノ酸残基５３〜６１）（以下、「ループ」と称する）からなる。
【０００７】
Ｎ及びＣ断片は、主に：３つの逆平行βシートからなる三次元構造を有する部分（以下、「ドメイン」と称する；Ｎ断片中のドメイン（アミノ酸残基１５〜５２からなる）を「Ｎドメイン」と称し、Ｃ断片中のドメイン（アミノ酸残基６２〜１０４からなる）を「Ｃドメイン」と称する）；及び特定の立体構造をとらない末端に位置する非ドメイン部分（以下、「テール」と称する；Ｎ断片中のテール（アミノ酸残基１〜１４からなる）を「Ｎテール」と称し；Ｃ断片中のテール（アミノ酸残基１０５〜１２１からなる）を「Ｃテール」と称する）からなる。
【０００８】
Ｃドメイン及びＮドメインに対する抗ＭＫ抗体は公知であり、例えば、それぞれＷＯ２００８／０５９６１６及びＷＯ２０１２／１２２５９０に開示されている。ＭＫが多数の生物学的活性を有し、一連の疾患及び病態に関与するという従前の知見に基づいて、これら及び他の抗ＭＫ抗体は、多数の疾患／病態に対して治療的に有効であり得る。
【０００９】
本開示は、骨障害及び／または骨傷害に対する非侵襲的治療選択肢に関する。最近の数十年にわたり、長骨骨折の治療が改善されたが、骨治癒の遅延または偽関節形成の有病率は、最大で１０％にとどまっている（Ｃａｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｕｒｇ．２１：５３８−５４７；Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｈｕｍｅｒａｌ  ｎｏｎｕｎｉｏｎ．Ｈａｎｄ  Ｃｌｉｎ．２３：４４９−４５６）。整形外科合併症の高い発生率は、骨接合法に基づく修復の不十分な機械的条件によって部分的にのみ説明される。大多数の症例は、患者の年齢または投薬、骨粗鬆症または糖尿病などの病的状態、及び遺伝的変異をも含む骨折治癒への他の影響に基づいている（Ｅｉｎｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，１１：４５−５４；Ｈａｙｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．，３５５（補足資料）：３１−４０）。現在、例えば、骨形成タンパク質２などの成長因子の塗布、骨移植、及び低強度パルス超音波などの非侵襲性機械的介入を含む、骨折関連合併症を治療するためのいくつかの治療選択肢が利用可能である（Ｅｉｎｈｏｒｎ  ＴＡ（２００３）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８５−Ａ（補足資料３）：８２−８８；Ｇｉａｎｎｏｕｄｉｓ  ａｎｄ  Ｄｉｎｏｐｏｕｌｏｓ（２０１０）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｔｒａｕｍａ，２４（補足資料１）：Ｓ９−１６；Ｂｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）ＣＭＡＪ，１６６：４３７−４４１）。しかしながら、これらの治療法の成功は様々であり、文献では一貫しない結果が報告されている（Ｐｏｙｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｔｒａｕｍａ，２４：５２２−５２５）。したがって、骨折治癒を改善するための、効果的で、ロバストで、特徴が明確で、非侵襲性の全身療法が依然として必要とされている。
【００１０】
概要
本開示は、骨粗鬆症のモデルとして認知されている卵巣摘出（ＯＶＸ）後のマウスを含む、若年マウス及び成熟マウスの両方において、抗ＭＫ抗体での治療が骨折治癒を促進するという本発明者らの発見に基づく。特に、本発明者らは、抗ＭＫ抗体の投与が骨折治癒を促進することを、抗ＭＫ抗体を投与しなかったマウスに比べて２８日目の骨折仮骨において、より高度に骨形成することによって示した。驚くべきことに、これは、骨折治癒の初期段階（１０日目）においても明らかであった。また、抗ＭＫ抗体の投与は、ＯＶＸマウスにおいて、骨梁骨密度（ＢＭＤ）、骨体積／骨組織体積（ＢＶ／ＴＶ）及び厚さ、及び皮質ＢＭＤを増加させることが示された。さらに、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨形成原細胞に抗ＭＫ抗体を投与すると、分化関連及びβカテニン調節性遺伝子の発現のＭＫ誘発性の低下がなくなり、ＬＲＰ−６のリン酸化が減少することを示した。まとめると、これらの知見は、ＭＫ活性または発現を阻害または低減する薬剤を用いて、骨障害／疾患及び／または傷害を治療するための基礎を提供する。
【００１１】
したがって、本開示は、被験体における骨形成の促進及び／または骨治癒の促進及び／または骨密度（ＢＭＤ）の増加方法を提供し、前記方法は、ＭＫタンパク質に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを有する単離または組換えタンパク質を被験体に投与することを含む。
【００１２】
一実施例では、被験体は：
（ｉ）骨折を有する被験体；
（ｉｉ）骨形成のための外科手術を受けた、または受ける予定の被験体；
（ｉｉｉ）整形外科インプラントまたはハードウェアと隣接する骨との一体化を促進するための外科手術を受けた、または受ける予定の被験体；及び
（ｉｖ）骨粗鬆症に罹患しているか、または罹患しやすい被験体
からなる群から選択される。
【００１３】
一実施例では、被験体への単離または組換えタンパク質の投与は、被験体における骨治癒を促進し、及び／または骨芽細胞活性を増強する。例えば、被験体への単離または組換えタンパク質の投与は、被験体における骨治癒を加速し得る。例えば、被験体への単離または組換えタンパク質の投与は、被験体における骨芽細胞活性を増強し得る。
【００１４】
一実施例によれば、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、ＭＫのＮドメイン内に位置するエピトープに特異的に結合し、ＭＫの機能を阻害または低減する。例えば、単離または組換えタンパク質が結合するエピトープは、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基１〜６１によって規定されるＭＫのＮドメイン内に位置し得る。
【００１５】
一実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基１〜６１に位置する高静電ポテンシャルクラスターの少なくとも一部を認識する。
【００１６】
一実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列によって形成される高次構造エピトープに特異的に結合し、そのエピトープは、１８Ｗ、２０Ｗ、３４Ｆ、３５Ｒ、３６Ｅ、３８Ｔ、４３Ｔ、４５Ｒ、４７Ｒ及び４９Ｒからなる群から選択される少なくとも２つの残基を含む。一実施例では、単離または組換えタンパク質は、残基１８Ｗ、２０Ｗ、３５Ｒ及び４９Ｒによって規定されるエピトープに結合する。一実施例では、単離または組換えタンパク質は、残基１８Ｗ、２０Ｗ、３６Ｅ、３８Ｔ、４３Ｔ及び４５Ｒによって規定されるエピトープに結合する。一実施例では、単離または組換えタンパク質は、残基１８Ｗ、２０Ｗ、３４Ｆ、３６Ｅ、４５Ｒ及び４７Ｒによって規定されるエピトープに結合する。
【００１７】
一実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は：
（ｉ）配列番号２に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｉ）配列番号３に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有するＶＨ、及び配列番号３に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有するＶＬ；
（ｉｖ）それぞれ配列番号４、５及び６に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびにそれぞれ配列番号７、８及び９に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｖ）配列番号２に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ、及び配列番号３に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ
を含む。
【００１８】
一実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｉ）配列番号１１に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号１０に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有するＶＨ、及び配列番号１１に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有するＶＬ；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１２、１３及び１４に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびにそれぞれ配列番号１５、１６及び１７に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｖ）配列番号１０に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ、及び配列番号１１に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ
を含む。
【００１９】
一実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は：
（ｉ）配列番号１８に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｉ）配列番号１９もしくは２０に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号１８に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有するＶＨ、及び配列番号１９もしくは２０に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有するＶＬ；
（ｉｖ）それぞれ配列番号２１、２２及び２３に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびにそれぞれ配列番号２４、２５及び２６に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｖ）配列番号１８に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ、及び配列番号１９または２０に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ
を含む。
【００２０】
別の実施例によれば、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、例えば、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６２〜１０４によって規定される、ＭＫのＣドメイン内に位置するエピトープに特異的に結合し、ＭＫの機能を阻害または低減する。
【００２１】
一実施例では、単離または組換えタンパク質が結合するエピトープは、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６４〜７３及びアミノ酸残基７８〜１０１内に位置する。
【００２２】
別の実施例では、単離または組換えタンパク質が結合するエピトープは、ＭＫのＣドメイン内に位置し、単離または組換えタンパク質は、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６４〜６６、アミノ酸残基６４〜６７、アミノ酸残基６４〜６９、アミノ酸残基６４〜７３、アミノ酸残基８４〜９６、またはアミノ酸残基８７〜９６に位置するエピトープの少なくとも一部を認識する。
【００２３】
特定の実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列によって形成されるエピトープに特異的に結合し、そのエピトープは、６４Ｙ  ６５Ｋ、６６Ｆ、６７Ｅ、６９Ｗ、７３Ｄ、８４Ｔ、８６Ｋ、８７Ｋ  ９０Ｙ及び９６Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの残基を含む。
【００２４】
本明細書の任意の実施例によれば、本開示の単離または組換えタンパク質が結合するＭＫタンパク質内のエピトープは、高次構造エピトープ、例えば逆平行βシートエピトープであってもよい。
【００２５】
一実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６２〜１０４に位置する高静電ポテンシャルクラスターの少なくとも一部を認識する。例えば、単離または組換えタンパク質は、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６２〜６４、６６、６８〜７０、７２、７９、８１、８５〜８９、１０２及び１０３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を認識する。一実施例では、単離または組換えタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列によって形成されるエピトープに特異的に結合し、そのエピトープは、６３Ｋ、７９Ｋ、８１Ｒ  ８６Ｋ、８７Ｋ、８９Ｒ及び１０２Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの残基を含む。
【００２６】
ＭＫのＣドメイン内に位置するエピトープに結合する、本開示の方法において有用な例示的な単離または組換えタンパク質は：
（ｉ）それぞれ配列番号２７、２８及び２９に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び
（ｉｉ）それぞれ配列番号３０、３１及び３２に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む。
【００２７】
ＭＫのＣドメイン内に位置するエピトープに結合する、本開示の方法において有用な別の例示的な単離または組換えタンパク質は：
（ｉ）それぞれ配列番号３３、３４及び３５に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び
（ｉｉ）それぞれ配列番号３６、３７及び３８に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む。
【００２８】
本明細書に記載の任意の実施例によれば、単離または組換えタンパク質は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００２９】
一実施例では、ＶＨ及びＶＬは、単一のポリペプチド鎖内にある。この実施例によれば、単離または組換えタンパク質は：
（ｉ）一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体型ｓｃＦｖ（ジ−ｓｃＦｖ）；または
（ｉｉｉ）Ｆｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結した（ｉ）及び／または（ｉｉ）の少なくとも１つ
であってもよい。
【００３０】
別の実施例では、ＶＬ及びＶＨは、別々のポリペプチド鎖で提供される。この実施例によれば、単離または組換えタンパク質は：
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ′）２；
（ｖｉ）Ｆｖ；または
（ｉｖ）Ｆｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結した（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの１つ
であってもよい。
【００３１】
一実施例では、単離または組換えタンパク質は、キメラ、脱免疫化、ヒト化またはヒト抗体である。
【００３２】
一実施例では、単離または組換えタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＡからなる群から選択されるヒトまたは非ヒト霊長類重鎖免疫グロブリン定常領域を含み得る。
【００３３】
一実施例では、単離または組換えタンパク質を、化合物に複合体化させてもよい。例えば、単離または組換えタンパク質は、放射性同位元素、検出可能な標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、被験体における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から選択される化合物に複合体化させてもよい。
【００３４】
本開示はまた、被験体における骨形成の促進及び／または骨治癒の促進及び／または骨密度（ＢＭＤ）の増加のための医薬の調製における、ＭＫタンパク質に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを有する単離または組換えタンパク質の使用を提供する。
【００３５】
適切な単離または組換えタンパク質は、本明細書に記載する任意の実施例に記載する通りである。
【００３６】
一実施例では、医薬は：
（ｉ）骨折を有する被験体；
（ｉｉ）骨形成のための外科手術を受けた、または受ける予定の被験体；
（ｉｉｉ）整形外科インプラントまたはハードウェアと隣接する骨との一体化を促進するための外科手術を受けた、または受ける予定の被験体；及び
（ｉｖ）骨粗鬆症に罹患しているか、または罹患しやすい被験体
からなる群から選択される被験体における骨形成の促進及び／または骨治癒の促進及び／またはＢＭＤの増加のためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１−１】抗ＭＫ抗体で処置した、及び処置していない成体マウスにおける骨折大腿骨の生体力学的及びマイクロコンピュータ断層撮影分析（関心体積１）の結果を提供する。この図は、ビヒクルを投与したマウスに比べて、抗ＭＫ抗体で処置したマウスにおいて骨折治癒が加速することを明確に示している。（Ａ）２１日目における骨折大腿骨の相対的な曲げ剛性を、無傷の大腿骨と比較して示す。（Ｂ）２８日目における骨折大腿骨の相対的な曲げ剛性を、無傷の大腿骨と比較して示す。（Ｃ）２１日目における骨折仮骨の骨体積と組織体積との比を示す。（Ｄ）２８日目における骨折仮骨の骨体積と組織体積との比を示す。（Ｅ）２１日目における骨切り開大部における骨折仮骨の組織体積を示す。（Ｆ）２８日目における骨切り開大部における骨折仮骨の組織体積を示す。＊ビヒクルとは有意差がある（ｐ＜０．０５）、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ検定より。（ｎ＝６〜８／群）。
【図１−２】抗ＭＫ抗体で処置した、及び処置していない成体マウスにおける骨折大腿骨の生体力学的及びマイクロコンピュータ断層撮影分析（関心体積１）の結果を提供する。この図は、ビヒクルを投与したマウスに比べて、抗ＭＫ抗体で処置したマウスにおいて骨折治癒が加速することを明確に示している。（Ｇ）２１日目における曲げ軸ｘにおける骨折仮骨の慣性モーメントを示す。（Ｈ）２８日目における曲げ軸ｘにおける骨折仮骨の慣性モーメントを示す。＊ビヒクルとは有意差がある（ｐ＜０．０５）、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ検定より。（ｎ＝６〜８／群）。
【図２】１０日目にサフラニンＯ染色を用いて異なる組織型の内容物について分析した骨折大腿骨の組織学的切片を示す。この図は、マウスへの抗ＭＫ抗体の投与が骨折仮骨における骨形成を増加させたことを示す。（Ａ）１０日間の治癒後の２つの内側ピンホール間の仮骨全体の組織形態計測分析。（Ｂ）２１日間の治癒後の２つの内側ピンホール間の仮骨全体の組織形態計測分析。（Ｃ）１０日目にＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏで染色した脱灰大腿骨由来切片の代表的画像。（Ｄ）２１日目にＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏで染色した脱灰大腿骨由来切片の代表的画像。スケールバー：５００μｍ。＊ビヒクルとは有意差がある（ｐ＜０．０５）、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ検定より。（ｎ＝６〜８／群）。
【図３】ＭＫに対して染色し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した、各時点及び各群での４匹のマウスに由来する骨折大腿骨の切片を示す。この図は、抗ＭＫ抗体で処置したマウスにおける血管新生領域及び新生骨形成領域においてＭＫ発現が減少したことを示す。代表的な画像を示す；Ｖｅｈ＝ビヒクル；Ｃ＝皮質；Ｖ＝血管；上部パネルの左側の画像は、骨折後４日目の骨膜領域を示しており、陽性に染色された領域がほとんど存在しない。上部パネルの右側の画像は、骨折後１０日目の軟骨性骨膜仮骨を示す。Ｍｄｋ発現は、増殖性及び肥大軟骨細胞において検出された。下部パネルの左側の画像は、骨折後１０日目の骨カルスにおける血管新生領域を示す。Ｍｄｋ発現は、ビヒクルを処置したマウスの血管周辺では検出されたが、Ｍｄｋ−Ａｂを処置したマウスでは検出されなかった。下部パネルの右側の画像は、骨折後２１日目の骨カルスにおける血管新生領域を示す。Ｍｄｋ発現は一般的に低かった。スケールバー：５０μｍ。（ｎ＝４／群）。
【図４−１】ビヒクルを投与した動物に比べて、抗ＭＫ抗体で処置した動物において、βカテニン陽性領域及び骨芽細胞表面が増加したことを示す。（Ａ）βカテニンに対して染色し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した、各時点及び各群における４匹のマウスに由来する骨折大腿骨の切片を示す。骨折後１０日目の骨切り開大部に近接する骨膜仮骨を示す代表的な画像を提供する。増殖性軟骨細胞及び骨芽細胞はβカテニンを発現したが、肥大性軟骨細胞は陰性であった。βカテニン陽性領域は、Ａｂ処置マウスにおいてより多く存在していた。スケールバー：１００μｍ。ｖｅｈ＝ビヒクル；Ｃ＝皮質；ＨＣ＝肥大性軟骨細胞；ＯＢ＝骨芽細胞；ＰＣ＝増殖性軟骨細胞。（Ｂ）抗ＭＫ抗体で処置した動物におけるβカテニン発現の割合を、ビヒクルを投与した動物（ｎ＝４／群）と比較して示す。（Ｃ）抗ＭＫ抗体で処置した動物における、２１日目における骨折大腿骨の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色切片における骨周囲長あたりの破骨細胞数を、ビヒクルを投与した動物と比較して示す。（Ｄ）２１日目における骨周囲長あたりの骨芽細胞数について、トルイジンブルー染色切片を分析した。＊ビヒクルとは有意差がある（ｐ＞０．０５）、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ検定より。（ｎ＝５〜８／群）。
【図４−２】ビヒクルを投与した動物に比べて、抗ＭＫ抗体で処置した動物において、βカテニン陽性領域及び骨芽細胞表面が増加したことを示す。（Ｅ）２１日目における骨表面あたりの骨芽細胞表面について、トルイジンブルー染色切片を分析した。（Ｆ）２８日目における骨膜仮骨中の破骨細胞数。＊ビヒクルとは有意差がある（ｐ＞０．０５）、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ検定より。（ｎ＝５〜８／群）。
【図５−１】抗ＭＫ抗体またはビヒクルで処置したＯＶＸ及び偽手術マウスについて、２３日目において骨折大腿骨上で実施した生体力学的分析、μＣＴ分析及び組織形態測定分析の結果を示す。この図は、抗ＭＫ抗体による治療が骨粗鬆症性骨折の治癒を促進することを示している。生体力学的試験：（Ａ）生体力学的試験によって測定した、無傷の大腿骨に対する骨折大腿骨の相対的な曲げ剛性を示す。μＣＴ分析によって決定したパラメータ（関心体積２）：（Ｂ）骨体積と組織体積との比を示す。（Ｃ）組織体積を示す。（Ｄ）曲げ軸ｘにおける骨折仮骨の慣性モーメントを示す（ｎ＝６〜７／群）。骨折仮骨全体の組織形態分析により決定したパラメータ：（Ｅ）骨面積と組織面積との比を示す。（Ｆ）軟骨面積と組織面積との比を示す。＊偽＋ビヒクル群またはＯＶＸ＋ビヒクル群とは有意差がある（ｐ＜０．０５）。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定。（ｎ＝５〜７／群）。
【図５−２】抗ＭＫ抗体またはビヒクルで処置したＯＶＸ及び偽手術マウスについて、２３日目において骨折大腿骨上で実施した生体力学的分析、μＣＴ分析及び組織形態測定分析の結果を示す。この図は、抗ＭＫ抗体による処置が骨粗鬆症性骨折の治癒を促進することを示している。骨折仮骨全体の組織形態分析により決定したパラメータ：（Ｇ）線維性組織面積と組織面積との比を示す。＊偽＋ビヒクル群またはＯＶＸ＋ビヒクル群とは有意差がある（ｐ＜０．０５）。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定。（ｎ＝５〜７／群）。（Ｈ）ギームザを用いて染色した２３日目の未脱灰大腿骨由来切片の代表的な画像を提供する。スケールバー：５００μｍ。
【図６】βカテニン陽性領域が、卵巣摘出（ＯＶＸ）後に減少し、抗ＭＫ抗体による処置後に増加したことを示す。（Ａ）βカテニンに対して染色し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した各群の４匹のマウスに由来する骨折大腿骨の切片を示す。骨折後１０日目の骨切り開大部に近接する骨膜仮骨の代表的な画像も示す。Ｖｅｈ：ビヒクル；Ｃ＝皮質；ＨＣ＝肥大性軟骨細胞；ＯＢ＝骨芽細胞；ＰＣ＝増殖性軟骨細胞。増殖性軟骨細胞及び骨芽細胞はβカテニンを発現したが、肥大性軟骨細胞はβカテニンについて陰性であった。スケールバー：１００μｍ。（Ｂ）抗ＭＫ抗体で処置した動物におけるβカテニン発現の割合を、ビヒクルを投与した動物（ｎ＝４／群）と比較して示す。＊偽＋ビヒクル群またはＯＶＸ＋ビヒクル群とは有意差がある（ｐ＞０．０５）、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定より。
【図７−１】抗ＭＫ抗体での処置が、短時間処置後に卵巣摘出（ＯＶＸ）マウスの無傷の大腿骨における骨量を増強することを示す。（Ａ）皮質骨密度（ＢＭＤ）を示す。（Ｂ）無傷の大腿骨の関心体積３（ＶＯＩ３）の中央骨幹における皮質骨のマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）分析によって測定した、抗ＭＫ抗体またはビヒクルで処置したＯＶＸ及び偽手術マウスの皮質厚さを示す。（Ｃ）骨梁ＢＭＤを示す。（Ｄ）骨体積と組織体積との比を示す。（Ｅ）骨梁の厚さを示す。（Ｆ）無傷の大腿骨の遠位部分（ＶＯＩ４）のμＣＴ分析によって測定した、抗ＭＫ抗体またはビヒクルで処置したＯＶＸ及び偽手術マウスの骨梁数を示す。＊偽＋ビヒクル群またはＯＶＸ＋ビヒクル群とは有意差がある（ｐ＜０．０５）、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定より。（ｎ＝６〜７／群）。
【図７−２】抗ＭＫ抗体での処置が、短時間処置後に卵巣摘出（ＯＶＸ）マウスの無傷の大腿骨における骨量を増強することを示す。（Ｇ）抗ＭＫ抗体またはビヒクルで処置したＯＶＸ及び偽手術マウスの遠位の無傷の大腿骨（ＶＯＩ４）の骨梁領域の代表的な３次元再構成を提供する。
【図８】抗ＭＫ抗体での処置が、短時間処置後に卵巣摘出（ＯＶＸ）マウスの椎体における骨量を増強することを示す。椎体（関心体積５）のマイクロコンピュータ断層撮影分析によって測定した、抗ＭＫ抗体またはビヒクルで処置したＯＶＸ及び偽手術マウスについて、以下の結果を提供する：（Ａ）第二尾椎体の２次元画像。（Ｂ）骨梁骨密度。（Ｃ）骨梁体積と組織体積との比。（Ｄ）骨梁の厚さ。（Ｆ）骨梁数。＊偽＋ビヒクル群またはＯＶＸ＋ビヒクル群とは有意差がある（ｐ＜０．０５）、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定より。（ｎ＝６〜７／群）。
【図９−１】抗ＭＫ抗体による細胞の処置が、βカテニンシグナル伝達に対するＭＫタンパク質の負の影響を減少させることを示す。（Ａ）ＭＫタンパク質及び／または抗ＭＫ抗体による刺激の６時間後の細胞増殖率を、非刺激対照（点線）（ｎ＝６）に対して正規化して示す。（Ｂ）ＭＫタンパク質及び／または抗ＭＫ抗体による６時間の刺激後の分化５日目のＢ２Ｍ発現（ハウスキーピング遺伝子）に対するＡｌｐｌ遺伝子発現を、分化前の値（点線）（ｎ＝６）に対して正規化して示す。（Ｃ）ＭＫタンパク質及び／または抗ＭＫ抗体による６時間の刺激後の分化５日目のｃＦＯＳ及びＡＬＰＬタンパク質発現を示しており、対照としてαチューブリン（ｎ＝３）を用いた。（Ｄ）３０分間の機械的刺激（Ｓ）、機械的刺激の前にＭＫタンパク質存在下で３０分間のインキュベーション（Ｓ＋Ｍｄｋ）及び抗ＭＫ抗体（Ｍｄｋ−Ａｂ）存在下でのインキュベーション後の、分化１４日目におけるｃＦｏｓの遺伝子発現を示す。Ｇａｐｄｈをハウスキーピング遺伝子として使用し、遺伝子発現値を非刺激対照（点線）（ｎ＝６〜９）に対して正規化した。（Ｅ）組換えＭＫタンパク質の存在下または非存在下で１時間インキュベートし、抗Ｍｄｋ抗体（ｎ＝６）を用いて免疫沈降したＡＴＤＣ５及びＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の結果を示す。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定。＊対照値とは有意差がある（ｐ＜０．０５）。
【図９−２】抗ＭＫ抗体による細胞の処置が、βカテニンシグナル伝達に対するＭＫタンパク質の負の影響を減少させることを示す。（Ｆ）ＭＫタンパク質及び／または抗ＭＫ抗体存在下での６時間のインキュベーション後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるリン酸化ＬＲＰ−６、ＬＲＰ−６、βカテニン及び活性βカテニンタンパク質発現を示す。ｎ＝３。（Ｇ）マウス初代卵巣骨芽細胞（ＰＯ）または初代骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いた抗Ｍｄｋ抗体による免疫沈降の結果を示す。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定。＊対照値とは有意差がある（ｐ＜０．０５）。
【図１０】初代骨芽細胞及び骨髄由来幹細胞に対する組換えＭＫタンパク質及び抗ＭＫ抗体の効果を示す。（Ａ）３０分間の機械的刺激（Ｓ）、機械的刺激の前にＭＫタンパク質存在下で３０分間のインキュベーション（Ｓ＋Ｍｄｋ）及び抗ＭＫ抗体（Ｍｄｋ−Ａｂ）存在下でのインキュベーション後の、初代骨芽細胞の分化２１日目のｃＦｏｓ遺伝子発現を示す。Ｇａｐｄｈをハウスキーピング遺伝子として使用し、遺伝子発現値を非刺激対照（点線）（ｎ＝４〜６）に対して正規化した。（Ｂ）ＭＫタンパク質及び抗ＭＫ抗体による刺激の６時間後のｍＭＳＣの増殖レベルを示す（百分率として表す）。発現値は、非刺激対照（点線）（ｎ＝６）に対して正規化した。（Ｃ）ＭＫタンパク質及び抗ＭＫ抗体による刺激の６時間後の、分化１０日目におけるｍＭＳＣのＡｌｐｌ遺伝子発現を示す。Ｂ２Ｍをハウスキーピング遺伝子として使用し、遺伝子発現値を分化前の値（点線）（ｎ＝４）に対して正規化した。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定。＊対照値とは有意差がある（ｐ＜０．０５）。
【図１１】子宮重量、無傷の骨及び骨カルス形成に対する卵巣摘出（ＯＶＸ）の影響を示す。（Ａ）初回手術から１１週間後の、偽手術及びＯＶＸマウス由来の子宮。（Ｂ）子宮の重量。（Ｃ）無傷の大腿骨の骨幹端領域の代表的な横方向のμＣＴ画像。（Ｄ）骨折後２３日目の偽手術及びＯＶＸマウスの骨折仮骨の代表的な縦方向の３ＤμＣＴ画像。
【図１２】フローサイトメトリーによって決定した骨折後１日目の骨折血腫及び骨髄における免疫細胞集団を示す。（Ａ）〜（Ｄ）偽手術（白色バー）及びＯＶＸマウス（灰色バー）の骨折血腫及び骨髄における生存Ｂリンパ球（ＣＤ１９＋）、炎症性単球（Ｌｙ６Ｇ＋，Ｆ４／８０＋，ＣＤ１１ｂ＋）、マクロファージ（Ｌｙ６Ｇ−、Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋）、好中球（Ｌｙ６Ｇ＋、Ｆ４／８０−、ＣＤ１１ｂ＋）、Ｔリンパ球（ＣＤ３＋）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ３＋，ＣＤ８＋）及びＴヘルパーリンパ球（ＣＤ３＋，ＣＤ４＋）の割合。偽手術マウスとＯＶＸマウスの比較では、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１３】免疫組織化学によって分析した、骨折後３日目の骨折仮骨中の免疫細胞の数を示す。（Ａ）骨膜仮骨の平方ｍｍあたりのＬｙ６Ｇ陽性好中球の数。（Ｂ）骨髄腔の平方ｍｍあたりのＦ４／８０陽性マクロファージの数。（Ｃ）骨膜仮骨の平方ｍｍあたりのＣＤ４５Ｒ陽性Ｂリンパ球の数。（Ｄ）骨膜仮骨の平方ｍｍあたりのＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球の数。偽手術とＯＶＸマウスの比較では＊ｐ＜０．０５、Ｍｄｋ−Ａｂ未処置マウスと処置マウスの比較では＃ｐ＜０．０５。
【図１４】骨折後３日目の骨折仮骨における免疫細胞染色を提供する。Ｍｄｋ−Ａｂを投与した場合及び投与しなかった場合の、偽手術及びＯＶＸマウス由来の骨折大腿骨におけるＬｙ６Ｇ、Ｆ４／８０、ＣＤ４５Ｒ及びＣＤ６陽性細胞の代表的画像。骨切り開大部の近位にある骨膜仮骨を示す。Ｎ＝好中球；Ｂ＝Ｂリンパ球；Ｔ＝Ｔリンパ球；Ｃ＝皮質。スケールバー＝免疫組織化学染色では１００μｍ、免疫蛍光染色では２５μｍ。
【図１５】骨折後３日目の骨折仮骨におけるサイトカイン発現を示す。Ｍｄｋ−Ａｂを投与した場合及び投与しなかった場合の、偽手術及びＯＶＸマウス由来の骨折大腿骨のＭｄｋ、ＩＬ−６、ＣＣＬ２及びＣＸＣＬ１免疫染色切片の代表的画像。骨切り開大部の近位にある骨膜仮骨を示す。Ｃ＝皮質。スケールバー＝１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
詳細な説明
配列リストの検索表
配列番号１−ヒトミッドカインタンパク質配列。
配列番号２−ＩＰ−９可変重鎖タンパク質配列。
配列番号３−ＩＰ−９可変軽鎖タンパク質配列。
配列番号４−ＩＰ−９可変重鎖ＣＤＲ１タンパク質配列。
配列番号５−ＩＰ−９可変重鎖ＣＤＲ２タンパク質配列。
配列番号６−ＩＰ−９可変重鎖ＣＤＲ３タンパク質配列。
配列番号７−ＩＰ−９可変軽鎖ＣＤＲ１タンパク質配列。
配列番号８−ＩＰ−９可変軽鎖ＣＤＲ２タンパク質配列。
配列番号９−ＩＰ−９可変軽鎖ＣＤＲ３タンパク質配列。
配列番号１０−ＩＰ−１０可変重鎖タンパク質配列。
配列番号１１−ＩＰ−１０可変軽鎖タンパク質配列。
配列番号１２−ＩＰ−１０可変重鎖ＣＤＲ１タンパク質配列。
配列番号１３−ＩＰ−１０可変重鎖ＣＤＲ２タンパク質配列。
配列番号１４−ＩＰ−１０可変重鎖ＣＤＲ３タンパク質配列。
配列番号１５−ＩＰ−１０可変軽鎖ＣＤＲ１タンパク質配列。
配列番号１６−ＩＰ−１０可変軽鎖ＣＤＲ２タンパク質配列。
配列番号１７−ＩＰ−１０可変軽鎖ＣＤＲ３タンパク質配列。
配列番号１８−ＩＰ−１３可変重鎖タンパク質配列。
配列番号１９−ＩＰ−１３可変軽鎖ｖ１タンパク質配列。
配列番号２０−ＩＰ−１３可変軽鎖ｖ２タンパク質配列。
配列番号２１−ＩＰ−１３可変重鎖ＣＤＲ１タンパク質配列。
配列番号２２−ＩＰ−１３可変重鎖ＣＤＲ２タンパク質配列。
配列番号２３−ＩＰ−１３可変重鎖ＣＤＲ３タンパク質配列。
配列番号２４−ＩＰ−１３可変軽鎖ＣＤＲ１タンパク質配列。
配列番号２５−ＩＰ−１３可変軽鎖ＣＤＲ２タンパク質配列。
配列番号２６−ＩＰ−１３可変軽鎖ＣＤＲ３タンパク質配列。
配列番号２７−ＣＳＭ−１可変重鎖ＣＤＲ１タンパク質配列。
配列番号２８−ＣＳＭ−１可変重鎖ＣＤＲ２タンパク質配列。
配列番号２９−ＣＳＭ−１可変重鎖ＣＤＲ３タンパク質配列。
配列番号３０−ＣＳＭ−１可変軽鎖ＣＤＲ１タンパク質配列。
配列番号３１−ＣＳＭ−１可変軽鎖ＣＤＲ２タンパク質配列。
配列番号３２−ＣＳＭ−１可変軽鎖ＣＤＲ３タンパク質配列。
配列番号３３−ＩＰ−１４可変重鎖ＣＤＲ１タンパク質配列。
配列番号３４−ＩＰ−１４可変重鎖ＣＤＲ２タンパク質配列。
配列番号３５−ＩＰ−１４可変重鎖ＣＤＲ３タンパク質配列。
配列番号３６−ＩＰ−１４可変軽鎖ＣＤＲ１タンパク質配列。
配列番号３７−ＩＰ−１４可変軽鎖ＣＤＲ２タンパク質配列。
配列番号３８−ＩＰ−１４可変軽鎖ＣＤＲ３タンパク質配列。
【００３９】
概説
本明細書を通して、別段の記載がない限り、または文脈上他の意味を必要としない限り、単一の工程、物質の組成物、工程の群、または物質の組成物の群への言及は、物質の組成物、工程の群、または物質の組成物の群の１つまたは複数（すなわち、１つ以上）を包含するものとする。
【００４０】
当業者であれば、本開示が、具体的に記載するもの以外の様々な変形及び改変を受け入れ可能であることを理解するであろう。本開示が、そのようなすべての変形及び改変を含むことは理解されたい。本開示はまた、本明細書中で個別にまたは集合的に言及または指示するすべての工程、特徴、組成物及び化合物、ならびに任意の及びすべての組み合わせまたは任意の２つ以上の前記工程または特徴を含む。
【００４１】
本開示は、本明細書に記載する特定の実施例によって範囲を限定されるものではなく、これらは単に例示のみを目的としたものに過ぎない。機能的に均等な製品、組成物及び方法は、明白に本開示の範囲内にある。
【００４２】
本明細書中に記載する本開示のいずれの実施例も、他に特段の断りがない限り、本開示の任意の他の実施例に準用するものとする。
【００４３】
他に特に定義されない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学における）と同じ意味を有するものとして解釈される。
【００４４】
他に特段の指示がない限り、本開示において利用する組換えタンパク質技術、細胞培養技術、及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的な手順である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ（編集者），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５  ａｎｄ  １９９６）、及びＦ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編集者），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての更新を含む），Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），ならびにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（編集者）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までのすべての更新を含む）などの文献資料に記載及び解説されている。
【００４５】
本明細書に記載の可変領域及びその一部、免疫グロブリン、抗体及びそれらの断片の記載及び定義は、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７  ａｎｄ  １９９１，Ｂｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２：３０９−３２０，Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３、及び／またはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８における考察によってさらに明確になり得る。
【００４６】
用語「及び／または」、例えば「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味するものと理解され、両方の意味またはいずれかの意味を明示的に支持するものとして捉えられる。
【００４７】
本明細書を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載する要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を含むが、任意の他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数、もしくは工程の群を除外するものではないことを意味するものとして理解される。
【００４８】
選択された定義
当業者であれば、「抗体」が、一般的に、複数の免疫グロブリン鎖、例えば、ＶＬを含むポリペプチド及びＶＨを含むポリペプチドで構成される可変領域を含むタンパク質であるとみなされることを認識するであろう。抗体はまた、一般的に定常領域を含み、そのうちのいくつかは、定常領域または定常断片または結晶化可能な断片（Ｆｃ）に配置することができる。ＶＨとＶＬは相互作用して、１つまたはいくつかの密接に関連する抗原に特異的に結合することができる抗原結合領域を含むＦｖを形成する。一般的に、哺乳類由来の軽鎖はκ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかであり、哺乳類由来の重鎖はα、δ、ε、γ、またはμである。抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。用語「抗体」は、ヒト化抗体、脱免疫化抗体、非枯渇性抗体、非活性化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体及びキメラ抗体も包含する。本明細書中で使用する場合、用語「抗体」はまた、エピトープ決定基に結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、及びＦｖなどの、完全長、インタクトまたは完全抗体分子以外のフォーマットを含むことを意図する。これらのフォーマットを、抗体「断片」と称する場合がある。これらの抗体フォーマットは、ヒトミッドカインに選択的に結合するいくつかの能力を保持しており、その例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（１）Ｆａｂ、これは抗体分子の一価結合断片を含む断片であって、全抗体を酵素パパインで消化してインタクトな軽鎖及び１つの重鎖部分を得ることにより生成することができる；
（２）Ｆａｂ′、これは全抗体をペプシンで処理し、次いで還元してインタクトな軽鎖、及び重鎖部分を得ることによって取得することができる抗体分子の断片であり；抗体分子あたり２つのＦａｂ′断片が得られる。
（３）（Ｆａｂ′）２、これは全抗体を酵素ペプシンで処理し、その後の還元を行わないことにより得ることができる抗体断片であり；Ｆ（ａｂ）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ′断片の二量体である；
（４）Ｆｖ、これは軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、二本鎖として発現させる遺伝子改変断片として定義される。
（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、これは遺伝的に融合させた一本鎖分子として、適切なポリペプチドリンカーによって連結させた軽鎖可変領域、重鎖可変領域を含む遺伝子改変分子として定義され；そのような一本鎖抗体は、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディなどの多量体の形態であってもよく、それらは多特異性であってもなくてもよい（例えば、ＷＯ１９９４／００７９２１及びＷＯ１９９８／０４４００１参照）；ならびに
（６）単一ドメイン抗体、一般的には軽鎖を欠く可変重鎖ドメイン。
【００４９】
したがって、本開示による抗体には、個別の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｃ、任意の重鎖を欠く可変軽鎖ドメイン、軽鎖を欠く可変重鎖ドメイン及びＦｖが含まれる。そのような断片は、組換えＤＮＡ技術、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離によって産生することができる。
【００５０】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」または「全抗体」は、同じ意味で用いられ、抗体の抗原結合断片とは対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を指す。具体的には、全抗体には、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有する抗体が含まれる。定常ドメインは、野生型配列の定常ドメイン（例えば、ヒト野生型配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列改変体であってもよい。いくつかの場合では、インタクトな抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する場合がある。
【００５１】
本明細書において開示する抗体は、ヒト化抗体であってもよい。本明細書中で使用する場合、用語「ヒト化抗体」とは、親抗体の抗原結合特性を保持するか、または実質的に保持するが、ヒトにおいて免疫原性がより低い非ヒト抗体、一般的にはマウス由来の抗体を指す。
【００５２】
本明細書において開示する抗体は、非枯渇性抗体であってもよい。本明細書中で使用する用語「非枯渇性抗体」とは、その標的に結合するが、標的細胞の溶解に影響を与える免疫系のエフェクター機能をリクルートしない抗体を指す。免疫系のエフェクター機能は、Ｆｃドメインと、補体カスケードの第一成分であるＣ１ｑ、及び／または受容体（ＦｃＲ）との相互作用に依存する。補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、Ｃ１ｑと相互作用する複数のＦｃドメインによって開始され、これは最終的に膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成による標的細胞の溶解をもたらし得る。さらに、顆粒球、マクロファージ、及びＮＫ細胞などの免疫系の細胞は、ＦｃＲを介して標的細胞に結合したｍＡｂと相互作用し得る。標的細胞の溶解は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または食作用によって誘発される。非枯渇性抗体には、例えば、一価（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ナノボディ及びｄＡｂ）、二価（例えば、Ｆ（ａｂ′）２及びダイアボディ）及び多価（例えば、トリアボディ及びペンタボディ）形態を含む、Ｆｃドメインを含まない抗体断片が含まれる。さらに、非枯渇性抗体には、薬物動態に影響を与えずにエフェクター機能を除去するように改変した、例えば、Ｃ１ｑ及びＦｃＲとの相互作用において主要な役割を果たすＦｃドメインのアミノ酸残基を改変することができたか、またはＣＨ２ドメイン中のＮ−結合グリコシル化部位を除去することができた抗体が含まれる。当業者であれば分かるように、非枯渇性性抗体を改変する機会は、抗体を産生するために使用する定常領域に関連する。ＩｇＧ３定常領域は、ＩｇＧ１定常領域よりも枯渇性抗体を産生する可能性が高く、ＩｇＧ１定常領域はＩｇＧ２定常領域よりも枯渇性抗体を産生する可能性が高く、その一方、ＩｇＧ４定常領域は、通常、抗体が非枯渇性であることを意味する。当業者であれば、定常領域に対する改変は、枯渇性抗体を非枯渇性抗体に変換することができ、逆もまた同様であることを理解するであろう。
【００５３】
本明細書において開示する抗体は、非活性化抗体であってもよい。本明細書中で使用する場合、「非活性化抗体」とは、細胞表面受容体に結合し、内在性リガンドの作用を無効化または遮断する抗体を指す。
【００５４】
用語「ＫａｂａｔのＥＵ付番システム」とは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａに教示されているＥＵインデックスによる免疫グロブリン重鎖の番号付けを意味するものと理解される。ＥＵインデックスは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基の番号付けに基づく。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、「可変領域」とは、抗原に特異的に結合することができ、例えばＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、本明細書中で定義する抗体の軽鎖及び／または重鎖の部分を指す。例えば、可変領域は、３つまたは４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び場合によりＦＲ４）を３つのＣＤＲとともに含む。ＶＨは重鎖可変領域を指す。ＶＬは軽鎖可変領域を指す。ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、本開示による方法の実行において、Ｋａｂａｔ（１９８７及び１９９１、前掲）または他の付番システム、例えば、Ｃｌｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７年及び／または１９８９年、前掲及び／またはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７年、前掲）の超可変ループ付番システムに従って定義することができる。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、用語「相補性決定領域」（同義語ＣＤＲ；すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）とは、抗体間でその配列が様々に異なるＦＲ間でループを形成する抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、一般的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として同定される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）の定義による「相補性決定領域」由来のアミノ酸残基及び／または「超可変ループ」Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）もしくはＩＭＧＴ付番システム（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７（１）５５−７７）を含む、任意の他の公知の付番技術またはそれらの組み合わせに由来する残基を含み得る。
【００５７】
「フレームワーク領域」（以下、ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５８】
本明細書中で使用する場合、用語「定常領域」または「結晶化可能断片」または「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ部分」（本明細書中では同じ意味で使用することができる）とは、少なくとも１つの定常ドメインを含み、一般的に（必ずしも必要ではないが）グリコシル化されており、１つ以上のＦｃ受容体及び／または補体カスケードの成分に結合することができる抗体の部分を指す。重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、またはμのいずれかから選択することができる。さらに、様々なサブクラスの重鎖（例えば、重鎖のＩｇＧサブクラス）は、異なるエフェクター機能に関与し、したがって、所望の重鎖定常領域を選択することによって、所望のエフェクター機能を有するタンパク質を産生することができる。好ましくは、本開示の抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。例示的な重鎖定常領域は、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、またはそのハイブリッド型である。軽鎖定常領域は、κ型またはλ型、好ましくはκ型であり得る。
【００５９】
「定常ドメイン」は、その配列が抗体／同種の抗体、例えばＩｇＧまたはＩｇＭまたはＩｇＥにおいて非常に類似している抗体中のドメインである。抗体の定常領域は、通常、複数の定常ドメインを含み、例えば、γ、α及びδ重鎖の定常領域は、２つの定常ドメインを含む。
【００６０】
当業者であれば理解するように、本明細書中で使用する場合、用語「残基」はアミノ酸残基を指す。したがって、用語「残基」を、用語「アミノ酸」と同じ意味で用いる場合がある。
【００６１】
抗体に関する用語「組換え」とは、細胞によって、または無細胞発現系において、その天然状態に比べて改変した量または改変した速度で産生する抗体を指す。一実施形態では、細胞は、抗体または免疫グロブリン鎖を天然には産生しない細胞である。しかしながら、細胞は、産生するポリペプチドの量の改変、好ましくは量の増加を引き起こす非内在性遺伝子を含む細胞であってもよい。本開示の組換え抗体には、それを産生するトランスジェニック（組換え）細胞、または無細胞発現系の他の成分から分離されていないポリペプチド、及びそのような細胞または無細胞系において産生後、少なくともいくつかの他の成分から精製される抗体が含まれる。
【００６２】
本明細書において開示する抗体は、ミッドカインタンパク質（例えば、ヒトミッドカインタンパク質）に特異的に結合し得る。本明細書中で使用する場合、用語「特異的に結合する」とは、別の抗原またはエピトープに比べて、より頻繁に、より迅速に、より長期間及び／またはより高い親和性で、ミッドカインまたはその特定のエピトープと反応するか、または会合するタンパク質を意味するものとして捉えられる。したがって、「特異的結合」は、必ずしも、排他的結合、すなわち別の抗原の結合が検出不可能であることを必要としない。用語「特異的に結合する」は、本明細書中では「選択的に結合する」と同じ意味で用いられる。
【００６３】
２つのエピトープに関して、「重複している」とは、２つのエピトープが十分な数のアミノ酸残基を共有し、１つのエピトープに結合する抗体が他のエピトープに結合する抗体の結合を競合的に阻害できることを意味するものとして捉えられる。例えば、２つのエピトープは、少なくとも１または２または３または４または５または６残基またはそれ以上のアミノ酸を共有する。
【００６４】
本明細書中での「モノクローナル抗体ＩＰ−９」または「ＩＰ−９」への言及は、配列番号２に示す可変重鎖配列及び配列番号３に示す可変軽鎖配列を有するモノクローナル抗体への言及である。
【００６５】
本明細書での「モノクローナル抗体ＩＰ−１０」または「ＩＰ−１０」への言及は、配列番号１０に示す可変重鎖配列及び配列番号１１に示す可変軽鎖配列を有するモノクローナル抗体への言及である。
【００６６】
本明細書中での「モノクローナル抗体ＩＰ−１３」または「ＩＰ−１３」への言及は、配列番号１８に示す可変重鎖配列及び配列番号１９または２０に示す可変軽鎖配列を有するモノクローナル抗体への言及である。
【００６７】
本明細書中での「モノクローナル抗体ＩＰ−１４」、「ＩＰ−１４」または「マウスＩＰ−１４」への言及は、それぞれ配列番号３３、３４及び３５に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む可変重鎖配列、及びそれぞれ配列番号３６、３７及び３８に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む可変軽鎖配列を有するモノクローナル抗体への言及である。ｍＡｂ  ＩＰ１４は、ＷＯ２００８／０５９６１６において指定されるＣＳＭ−４と同じ抗体である。
【００６８】
本明細書中での「モノクローナル抗体ＣＳＭ−１」または「ＣＳＭ−１」への言及は、それぞれ配列番号２７、２８及び２９に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む可変重鎖配列、それぞれ配列番号３０、３１及び３２に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む可変軽鎖配列を有するモノクローナル抗体への言及である。ＣＳＭ−１は、ＷＯ２００８／０５９６１６に記載されている。
【００６９】
本明細書中で使用する場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」及びその変形は、臨床病理の経過中に、治療する個体または細胞の自然経過を変えるように設計された臨床介入を指す。治療の望ましい効果には、疾患の進行速度の低下、疾患の状態の改善または緩和、及び寛解または予後の改善が含まれる。例えば、疾患／病態（例えば、骨粗鬆症）及び／または傷害（例えば、骨折）に関連する１つ以上の症状が軽減または除去されるか、または疾患／病態または傷害の臨床結果または予後が改善する場合、個体は効果的に「治療される」。
【００７０】
本明細書中で使用する場合、用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」もしくは「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」またはその変形は、個体における疾患の発生または再発に関する予防の提供を指す。個体は、疾患または疾患の再発を生じやすいか、またはそのリスクがある可能性があるが、まだその疾患または再発を診断されてはいない。予防という用語は、絶対的な予防を必要としないが、疾患の進行をある程度阻害することを含む。
【００７１】
「有効量」とは、所望の治療または予防結果を達成するのに必要な用量及び期間における、少なくとも有効な量を指す。有効量は、１回以上の投与で提供され得る。本開示のいくつかの実施例では、用語「有効量」とは、上記のような疾患または病態の治療を達成するために必要な量を意味する。有効量は、治療する疾患または病態、ならびに体重、年齢、人種的背景、性別、健康状態及び／または身体状態、及び治療対象の哺乳類に関連する他の要因に応じて変化し得る。一般的には、有効量は、医師による日常的な試行及び実験によって決定され得る比較的広い範囲（例えば「用量」範囲）に入る。有効量は、単回投与で、または治療期間にわたって１回または数回の反復投与で投与することができる。
【００７２】
「治療有効量」は、特定の疾患（例えば、がん）の測定可能な改善を達成するために必要とされる少なくとも最小の濃度である。本明細書中での治療有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を誘発するタンパク質の能力などの要因に応じて変化し得る。治療有効量はまた、タンパク質の毒性効果または有害作用に比べて、薬効がより大きくなるような量である。
【００７３】
「予防有効量」とは、所望の予防結果を達成するのに必要な用量及び期間における、有効量を指す。必ずしも必要ではないが、一般的に、予防投与量は、哺乳類において疾患の前または初期において使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも低い場合がある。
【００７４】
用語「５０％有効濃度」（略語「ＥＣ５０」）とは、抗体が標的とする分子の所与の効果（例えば、標的へのヒトミッドカインの結合の阻害／置換）を５０％にするのに必要とされる本開示の抗体の濃度を表す。当業者であれば、より低いＥＣ５０値がより強力な抗体に対応することは理解するであろう。
【００７５】
本開示に従って治療する「哺乳類」は、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ロバ）、コンパニオン動物（例えば、イヌ及びネコなどのペット）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）、パフォーマンス動物（例えば、競走馬、ラクダ、グレーハウンド）または捕獲野生動物であってもよい。一実施例では、哺乳類はヒトである。
【００７６】
ＭＫに選択的に結合する単離または組換えタンパク質
本明細書に記載するように、ＭＫに選択的に結合する抗体の抗原結合ドメインを含む単離または組換えタンパク質を、本開示の方法における使用のために企図する。ＭＫに選択的に結合する抗体は、当該分野で公知であり、ＷＯ２００８／０５９６１６、ＷＯ２０１２／１２２５９０及びＷＯ２０１４／０７０６４２に記載されている抗ＭＫ抗体が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる抗ＭＫ抗体は、Ｓｕｎ  Ｘ．Ｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５６（１２）：１３３９−４８及びＭｕｒａｍａｔｓｕ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９：１１７１−７７）に記載されている。しかしながら、抗ＭＫ抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質を含む、本開示の方法における使用に適した他の単離または組換えタンパク質を、当該分野で公知の方法によって産生してもよい。
【００７７】
本明細書において、抗ＭＫ抗体及びその結合断片を含む、本開示の方法における使用に適した単離または組換えタンパク質の産生方法を記載する。さらに、本明細書において、タンパク質のＭＫ結合活性を測定するための機能アッセイ及び本開示の方法における使用のためのその適合性も記載する。
【００７８】
特定の一実施例では、本開示の方法における使用を企図する単離または組換えタンパク質は、抗体の抗原結合ドメインを含むタンパク質であり、例えば、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基１〜６１によって規定される、ＭＫのＮドメイン内に位置するエピトープに特異的に結合し、それによってＭＫの機能を阻害または低減する。例えば、本開示の方法における使用を企図する単離または組換えタンパク質は、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基１〜６１に位置する高静電ポテンシャルクラスターの少なくとも一部を認識する。
【００７９】
本開示の方法における使用に適したタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列によって形成されるＭＫのＮドメイン内に位置する高次構造エピトープに特異的に結合する場合があり、エピトープは、１８Ｗ、２０Ｗ、３４Ｆ、３５Ｒ、３６Ｅ、３８Ｔ、４３Ｔ、４５Ｒ、４７Ｒ及び４９Ｒからなる群から選択される少なくとも２つの残基を含む。一実施例では、高次構造エピトープは、残基１８Ｗ、２０Ｗ、３５Ｒ及び４９Ｒによって規定される。一実施例では、高次構造エピトープは、残基１８Ｗ、２０Ｗ、３６Ｅ、３８Ｔ、４３Ｔ及び４５Ｒによって規定される。一実施例では、高次構造エピトープは、残基１８Ｗ、２０Ｗ、３４Ｆ、３６Ｅ、４５Ｒ及び４７Ｒによって規定される。
【００８０】
特定の一実施例によれば、本開示の方法における使用を企図する単離または組換えタンパク質は、ＷＯ２０１２／１２２５９０においてＩＰ−９と命名された抗体の抗原結合ドメインを含む。例えば、単離または組換えタンパク質は：
（ｉ）配列番号２に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｉ）配列番号３に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有するＶＨ、及び配列番号３に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有するＶＬ；
（ｉｖ）それぞれ配列番号４、５及び６に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびにそれぞれ配列番号７、８及び９に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｖ）配列番号２に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ、及び配列番号３に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ
を含み得る。
【００８１】
本実施例による本開示の方法において使用するうえで特に好ましいタンパク質は、配列番号２に記載の配列を有するＶＨ及び配列番号３に記載の配列を有するＶＬを含むＩＰ−９と命名された抗体である。
【００８２】
別の特定の実施例によれば、本開示の方法における使用を企図する単離または組換えタンパク質は、ＷＯ２０１２／１２２５９０においてＩＰ−１０と命名された抗体の抗原結合ドメインを含む。例えば、単離または組換えタンパク質は：
（ｉ）配列番号１０に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｉ）配列番号１１に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号１０に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有するＶＨ、及び配列番号１１に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有するＶＬ；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１２、１３及び１４に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびにそれぞれ配列番号１５、１６及び１７に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｖ）配列番号１０に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ、及び配列番号１１に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ
を含み得る。
【００８３】
本実施例による本開示の方法における使用にとって特に好ましいタンパク質は、配列番号１０に記載の配列を有するＶＨ及び配列番号１１に記載の配列を有するＶＬを含む、ＩＰ−１０と命名された抗体である。
【００８４】
別の特定の実施例によれば、本開示の方法における使用を企図する単離または組換えタンパク質は、ＷＯ２０１２／１２２５９０においてＩＰ−１３と命名された抗体の抗原結合ドメインを含む。例えば、単離または組換えタンパク質は：
（ｉ）配列番号１８に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｉ）配列番号１９または２０に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号１８に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有するＶＨ、及び配列番号１９または２０に記載の配列またはそれと９５％以上の同一性を示す配列を有するＶＬ；
（ｉｖ）それぞれ配列番号２１、２２及び２３に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびにそれぞれ配列番号２４、２５及び２６に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｖ）配列番号１８に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ、及び配列番号１９または２０に記載の配列内に含まれる３つのＣＤＲ
を含み得る。
【００８５】
本実施例による本開示の方法における使用にとって特に好ましいタンパク質は、配列番号１８に記載の配列を有するＶＨ及び配列番号１９に記載の配列を有するＶＬを含むＩＰ−１３と命名された抗体である。本実施例による本開示の方法における使用にとって特に好ましい別のタンパク質は、配列番号１８に記載の配列を有するＶＨ及び配列番号２０に記載の配列を有するＶＬを含むＩＰ−１３と命名された抗体である。
【００８６】
本開示の方法における使用を企図する他の単離または組換えタンパク質は、抗体の抗原結合ドメインを含み、例えば、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６２〜１０４によって規定されるＭＫのＣドメイン内に位置するエピトープに特異的に結合し、それによってＭＫの機能を阻害または低下させる。例えば、本開示の単離または組換えタンパク質が結合するエピトープは、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６４〜７３及びアミノ酸残基７８〜１０１内に位置し得る。例えば、本開示の単離または組換えタンパク質が結合するエピトープは、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６４〜６６、アミノ酸残基６４〜６７、アミノ酸残基６４〜６９、アミノ酸残基６４〜７３、アミノ酸残基８４〜９６、またはアミノ酸残基８７〜９６に位置し得る。
【００８７】
一実施例では、単離または組換えタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列によって形成されるエピトープに特異的に結合する場合があり、エピトープは、６４Ｙ  ６５Ｋ、６６Ｆ、６７Ｅ、６９Ｗ、７３Ｄ、８４Ｔ、８６Ｋ、８７Ｋ  ９０Ｙ及び９６Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの残基を含む。
【００８８】
本明細書に記載する任意の実施例によれば、単離または組換えタンパク質が結合するＭＫのＣドメイン内のエピトープは、高次構造エピトープ、例えば逆平行βシートエピトープであってもよい。
【００８９】
ＭＫのＣドメイン内に位置するエピトープに特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを含む、本開示の方法における使用を企図する単離または組換えタンパク質は、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６２〜１０４に位置する高静電ポテンシャルクラスターの少なくとも一部を認識し得る。例えば、単離または組換えタンパク質は、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基６２〜６４、６６、６８〜７０、７２、７９、８１、８５〜８９、１０２及び１０３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を認識し得る。一実施例では、単離または組換えタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列によって形成されるエピトープに特異的に結合する場合があり、エピトープは、６３Ｋ、７９Ｋ、８１Ｒ  ８６Ｋ、８７Ｋ、８９Ｒ及び１０２Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの残基を含む。
【００９０】
特定の一実施例によれば、本開示の方法における使用を企図する単離または組換えタンパク質は、ＷＯ２００８／０５９６１６においてＣＳＭ−１と命名された抗体の抗原結合ドメインを含む。例えば、単離または組換えタンパク質は：
（ｉ）それぞれ配列番号２７、２８及び２９に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び
（ｉｉ）それぞれ配列番号３０、３１及び３２に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含み得る。
【００９１】
特定の一実施例によれば、本開示の方法における使用を企図する単離または組換えタンパク質は、ＷＯ２００８／０５９６１６においてＣＳＭ−１と命名された抗体の抗原結合ドメインを含む（本明細書中ではＩＰ−１４とも称する）。例えば、単離または組換えタンパク質は：
（ｉ）それぞれ配列番号３３、３４及び３５に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び
（ｉｉ）それぞれ配列番号３６、３７及び３８に記載の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含み得る。
【００９２】
本明細書中の抗体開示の免疫グロブリン鎖の同一性（％）は、ＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８（３）：４４３−４５３）分析（ＧＣＧプログラム）によって決定し、そこでのギャップ生成ペナルティ＝５、及びギャップ伸長ペナルティ＝０．３である。クエリー配列は少なくとも５０アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインメントする。さらにより好ましくは、クエリー配列は少なくとも１００アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００アミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインメントする。最も好ましくは、２つの配列を、それらの全長にわたってアラインメントする。
【００９３】
規定される本開示の単離または組換えタンパク質、例えば抗体の免疫グロブリン鎖などに関して、上記のものよりも高い同一性（％）の数字が、好ましい実施形態を包含することは理解されるであろう。したがって、適用可能であれば、最小の同一性（％）の数字の観点から、単離または組換えタンパク質は、関連する指定の配列番号に対して、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、さらにより好ましくは少なくとも９９．９％同一のアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００９４】
別の実施形態では、指定の配列番号に１つの残基を追加するか、指定の配列番号から１つの残基を削除するか、指定の配列番号に対して１つの残基を追加して１つの残基を削除するか、指定の配列番号に２つの残基を追加するか、指定の配列番号から２つの残基を削除するか、指定の配列番号の１つの残基を変更して指定の配列番号の２つの残基を変更するか、指定の配列番号の１つの残基を変更して１つの残基を削除するか、もしくは指定の配列番号の１つの残基を変更して１つの残基を追加するか、またはそれらの任意の組み合わせを行う。
【００９５】
好ましい実施形態では、アラインメントにはギャップがない。より具体的には、アルゴリズムは、最適な（最も高い同一性（％）の）アラインメントを得るために、アミノ酸の連続したストレッチにギャップを生成する必要がない。
【００９６】
本開示の方法における使用を意図する単離または組換えタンパク質のアミノ酸配列突然変異体は、本開示の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、または所望のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成によって調製することができる。そのような突然変異体は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換を含む。最終ポリペプチド産物が所望の特性を保有する限りにおいて、欠失、挿入及び置換の組み合わせを作成して最終構築物に到達させることができる。
【００９７】
突然変異型（改変型）ポリペプチドは、当該分野で公知の任意の技術を用いて調製することができる。例えば、本開示のポリヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発に供してもよい。そのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発技術は、適切なベクターにポリヌクレオチドをサブクローニングし、そのベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの「突然変異誘発」株に形質転換し、形質転換した細菌を適切な数の世代にわたって増殖させることを含む。突然変異導入／改変型ＤＮＡに由来する産物を、本明細書に記載の技術を用いて容易にスクリーニングし、それらが受容体結合活性及び／または阻害活性を有するかどうかを判定することができる。
【００９８】
アミノ酸配列突然変異体を設計する際に、突然変異部位の位置及び突然変異の性質は、改変する特性（複数可）に依存する。突然変異させる部位は、例えば、（１）保存的アミノ酸選択で最初に置換し、次に、達成した結果に応じてよりラジカルな選択で置換するか、（２）標的残基を削除するか、または（３）その部位の近傍に他の残基を挿入することによって、個別に、または連続して改変することができる。
【００９９】
アミノ酸配列の欠失は、一般的には約１〜１５残基、より好ましくは約１〜１０残基、及び通常は約１〜５個の連続残基の範囲である。
【０１００】
置換突然変異体から、抗体及び／または免疫グロブリン鎖分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基を除去し、その代わりにその部位に異なる残基を挿入する。置換突然変異誘発にとって最も関心のある部位には、抗原結合にとって重要であると同定された部位が含まれる。これらの部位、特にヒト抗体及び／または免疫グロブリン鎖の少なくとも３つの他の同様に保存された部位の配列内に収まる部位を、好ましくは比較的保存的な様式で置換する。そのような保存的置換を、表１の「例示的置換」の見出しの下に示す。
表１．例示的置換
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【０１０１】
さらに、所望であれば、本開示の抗体及び／または免疫グロブリン鎖への置換または付加として、非天然アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を導入することができる。そのようなアミノ酸として、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、設計アミノ酸、例えば、α−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及びアミノ酸類似体が一般的に挙げられる。
【０１０２】
本開示の方法における使用を企図する単離または組換えタンパク質は、本明細書に記載の抗ＭＫ抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み得る。一実施例では、ＶＨ及びＶＬを単一のポリペプチド鎖で提供する。あるいは、ＶＨ及びＶＬを別々のポリペプチド鎖で提供してもよい。
【０１０３】
ＶＨ及びＶＬを単一のポリペプチド鎖で提供する実施例によれば、本開示の単離または組換えタンパク質は、以下の形態で提供され得る：
（ｉ）一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体型ｓｃＦｖ（ジ−ｓｃＦｖ）；または
（ｉｉｉ）Ｆｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結した（ｉ）及び／または（ｉｉ）のうちの少なくとも１つ。
【０１０４】
ＶＨ及びＶＬを別個のポリペプチド鎖として提供する別の実施例によれば、本開示の単離または組換えタンパク質は、以下の形態で提供され得る：
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ′）２；
（ｖｉ）Ｆｖ；または
（ｉｖ）Ｆｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結した（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの１つ。
【０１０５】
本開示の単離または組換えタンパク質が抗体である実施例によれば、抗体は、キメラ、脱免疫化、ヒト化またはヒト抗体であり得る。
【０１０６】
一実施例では、単離または組換えタンパク質はまた、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＡからなる群から選択されるヒトまたは非ヒト霊長類重鎖免疫グロブリン定常領域を含み得る。
【０１０７】
好ましい実施形態では、本明細書に記載の単離または組換えタンパク質は、本明細書に記載の免疫グロブリン軽鎖定常領域に直接結合した免疫グロブリン軽鎖可変領域である。同様に、さらに好ましい実施形態では、本明細書に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域は、本明細書に記載の免疫グロブリン重鎖定常領域に直接結合する。
【０１０８】
当業者であれば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変領域と定常領域を、標準組換えＤＮＡ技術を用いて、適切な宿主（前記免疫グロブリン鎖（複数可）を産生するための）中で発現可能なポリヌクレオチド（連結した可変領域及び定常領域をコードする）を作製することによって、またはペプチド化学を用いて、連結した可変ドメイン及び定常ドメインを合成することによって、記載されているように結合することができることを理解するであろう。
【０１０９】
単離または組換えタンパク質がヒト化抗ＭＫ抗体またはその結合断片である実施例によれば、ヒト化抗体または結合断片は、親または前駆体抗体または断片の結合特性のかなりの割合を保持する。適切なヒト化抗体は、そのような抗体を産生するために使用する親抗体または前駆体抗体によって認識されるＭＫタンパク質、例えばヒトＭＫ及び／またはマウスＭＫに特異的に結合する能力を保持する。好ましくは、本開示の方法における使用のためのヒト化抗体は、親抗体または前駆体抗体と実質的に同等かまたは向上した結合親和性及び結合活性を示す。理想的には、ミッドカインに対する抗体の親和性（ＫＤ）は、ミッドカインに対する親抗体の親和性よりも大きいであろう。
【０１１０】
結合親和性は、会合（Ｋａ）及び解離（Ｋｄ）速度によって決定することができる。平衡親和定数Ｋは、Ｋａ／Ｋｄの比である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて会合（Ｋａ）及び解離（Ｋｄ）速度を測定することができる（Ｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｍｙｓｚｋａ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：５４；Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ  Ｐ，（１９９８）Ａｎａｌｙｓｔ．１２３（７）：１５９９−１６０３）。結合速度のリアルタイム検出及びモニタリングのための計器及び方法は公知であり、市販されている（ＢｉａＣｏｒｅ  ２０００，Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，ウプサラ，スウェーデン；及びＭａｌｍｑｖｉｓｔ  Ｍ（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２７：３３５−３４０）。結合親和性のアッセイ方法は、当該技術分野で周知であり、最大半量結合アッセイ、競合アッセイ、及びスキャッチャード分析が挙げられる。
【０１１１】
当業者であれば理解するように、「結合活性」は、２つの分子、例えば、抗体と抗原の間の相互作用の全体的な強度に関する。結合活性は、相互作用の親和性と結合価の両方に依存する。さらに、「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とリガンド（例えば、抗原）との間の結合の強さに関する。リガンドＹに対する分子Ｘの親和性は、溶液中に存在するＸ分子の半数の結合部位を占有するために必要とされるＹの濃度である解離定数（Ｋｄ）によって表される。より低いＫｄは、親和性相互作用がより強いまたはより高いことを示し、その部位を占有するために必要なリガンドの濃度はより低い。
【０１１２】
本開示の方法における使用に適した抗ＭＫ抗体は、ヘテロコンジュゲート抗体であってもよい。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合で連結した２つの抗体からなる。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対する免疫系細胞の標的化（ＵＳ４，６７６，９８０）、及びＨＩＶ感染の治療に向けた提案がなされている（ＷＯ１９９１／０００３６０；ＷＯ１９９２／２００３７３；ＥＰ５８６５０５）。架橋剤を含むものを含む、合成タンパク質化学における既知の方法を用いて、抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製し得ることが企図される。
【０１１３】
本明細書に記載する障害、例えば、骨粗鬆症を治療する際の抗体の効力を高めるために、エフェクター機能に関して本開示の抗体を改変することが望ましい場合がある。例えば、システイン残基（複数可）をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にしてもよい。そのようにして生成したホモ二量体型抗体は、向上した内在化能力及び／または補体媒介性細胞傷害及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る（Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６（４）：１１９１−１１９５；Ｓｈｏｐｅｓ  Ｂ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（９）：２９１８−２９２２）。増強された活性を有するホモ二量体型抗体はまた、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製してもよい。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、それにより増強された補体溶解性及びＡＤＣＣ能力を有し得る抗体をエンジニアリングすることができる（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ＪＡＭＡ，２６１：８８４−８８８）。
【０１１４】
本開示の方法において使用するための単離または組換えタンパク質は、例えば本明細書に記載するように、人間の介入によって産生してもよい。好ましい実施形態では、本開示の単離または組換えタンパク質は、「実質的に精製」または「精製」されている。「実質的に精製された」または「精製された」とは、１つ以上の脂質、核酸、他のポリペプチド、またはその天然状態において会合している他の混入分子から分離された、単離または組換えタンパク質、例えば抗体またはその結合断片を意味する。実質的に精製されたポリペプチドは、それが天然状態で会合している他の成分を、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％含まないことが好ましい。別の実施形態では、「実質的に精製された」または「精製された」とは、それが属する分子のクラスに関して見出される組成物中の優勢な種である分子を意味する（すなわち、組成物中の分子タイプの少なくとも約５０％を構成し、一般的には、組成物中の分子種、例えば、ペプチドの少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれ以上を構成するであろう）。
【０１１５】
ＭＫに結合するタンパク質の産生
本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、当該技術分野で利用可能な方法を用いて製造することができ、その実施例を本明細書に記載する。
【０１１６】
抗体の産生
一実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、ＭＫに結合する抗体である。抗体の産生方法は、当該分野で公知であり、及び／またはＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）に記載されている。一般的に、そのような方法では、場合により、任意の適切なまたは所望の担体、アジュバント、または薬学的に許容可能な賦形剤で製剤化した、ＭＫタンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープ、またはそれら（すなわち免疫原）を発現するか、もしくは提示する細胞を、非ヒト動物、例えば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギまたはブタに投与する。免疫原は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、または他の既知の経路によって投与してもよい。
【０１１７】
免疫した動物の血液を免疫化後の様々な時点でサンプリングすることによって、ポリクローナル抗体の産生をモニタリングしてもよい。必要であれば、１回以上のさらなる免疫化を行って所望の抗体力価を達成してもよい。適切な力価が達成されるまで、追加免疫及び力価測定のプロセスを繰り返す。所望のレベルの免疫原性が得られた場合、免疫した動物から採血し、血清を単離して保存し、及び／またはその動物を用いてモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を生成する。
【０１１８】
モノクローナル抗体は、本開示の方法における使用を意図するＭＫ結合タンパク質の１つの例示的な形態である。用語「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」とは、同じ抗原（複数可）、例えば抗原内の同じエピトープに結合することができる均質な抗体集団を指す。本用語は、抗体の供給源またはその作製方法に限定されることを意図しない。
【０１１９】
Ｍａｂの産生のために、例えば、前掲のＵＳ４，１９６，２６５またはＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に例示されている手順のような、多数の公知技術のいずれかを使用してもよい。
【０１２０】
例えば、適切な動物を、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下で、免疫原を用いて免疫化する。ウサギ、マウス及びラットなどのげっ歯類は、例示的な動物である。ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するようにし、例えばマウス免疫グロブリンタンパク質を発現しないように遺伝子改変したマウス（例えば、ＷＯ２００２／０６６６３０に記載されているような）もまた、本開示の方法における使用に適した抗体を生成するために使用することができる。
【０１２１】
免疫化後、抗体産生能を有する体細胞、具体的にはＢリンパ球（Ｂ細胞）を、ＭＡｂ生成プロトコールにおいて使用するために選択する。これらの細胞は、脾臓、扁桃もしくはリンパ節の生検、または末梢血試料から採取してもよい。次いで、免疫した動物由来のＢ細胞を、通常、免疫原で免疫した動物と同じ種に由来する不死化骨髄腫細胞の細胞と融合させる。
【０１２２】
ハイブリッドを、組織培養培地中のヌクレオチドの新規合成を遮断する薬剤を含む選択培地中で培養することによって増幅させる。例示的な薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート及びアザセリンである。
【０１２３】
増幅させたハイブリドーマを、例えば、フローサイトメトリー及び／または免疫組織化学及び／またはイムノアッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドットイムノアッセイなど）によって、抗体特異性及び／または力価の機能的選択に供する。
【０１２４】
あるいは、ＡＢＬ−ＭＹＣ技術（ＮｅｏＣｌｏｎｅ、マディソン  ウィスコンシン５３７１３、ＵＳＡ）を用いて、ＭＡｂを分泌する細胞株を産生する（例えば、Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９７：８５−９５に記載されているような）。
【０１２５】
抗体はまた、例えば、ＵＳ６，３００，０６４及び／またはＵＳ５，８８５，７９３に記載されているように、ディスプレイライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによっても産生または単離することができる。
【０１２６】
キメラ抗体
一実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、ＭＫに結合するキメラ抗体である。用語「キメラ抗体」とは、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種（例えば、マウスなどのネズミ）に由来するか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種（例えば、ヒトなどの霊長類）に由来するか、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同である抗体を指す。一般的には、キメラ抗体は、主にヒトドメインを有する抗体を産生するために、げっ歯類またはウサギの可変領域及びヒト定常領域を利用する。キメラ抗体の産生方法は、例えば、ＵＳ４，８１６，５６７；及びＵＳ５，８０７，７１５に記載されている。
【０１２７】
本開示はまた、例えば、ある種の可変領域を別の種のタンパク質の領域に融合させたキメラ免疫グロブリンの使用を企図している。例えば、本開示は、ある種のＴ細胞受容体由来の可変領域と、別個の種由来のＴ細胞受容体の定常ドメインとを融合したものを含む免疫グロブリンの使用を企図する。
【０１２８】
ヒト化及びヒト抗体
一実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、ＭＫに結合するヒト化またはヒト抗体またはタンパク質であり得る。
【０１２９】
用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト種由来の抗体由来の抗原結合部位または可変領域、及びそれ以外のヒト抗体の構造及び／または配列に基づく分子の抗体構造を有するキメラ抗体のサブクラスを指すものと理解される。抗原結合部位は、ヒト抗体の可変ドメイン中の適切なＦＲに移植した非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト抗体由来の残りの領域を含む。いくつかの実施例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基を、対応する非ヒト残基によって置換する。
【０１３０】
非ヒト抗体またはその部分（例えば、可変領域）をヒト化するための方法は、当該技術分野で公知である。ヒト化は、ＵＳ５，２２５，５３９またはＵＳ５，５８５，０８９の方法に従って行うことができる。抗体をヒト化する他の方法を排除するものではない。
【０１３１】
抗体と関連して本明細書中で使用する場合、用語「ヒト抗体」とは、ヒト、例えば、ヒト生殖細胞株または体細胞において見出される配列に由来するか、または対応する可変領域（例えば、ＶＨ、ＶＬ）、及び場合により、定常領域を有する抗体を指す。「ヒト」抗体には、ヒト配列によってコードされていないアミノ酸残基、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムまたは部位特異的突然変異によって導入した突然変異（特に、抗体の少数の残基、例えば抗体の１、２、３、４または５残基、例えば抗体の１つ以上のＣＤＲを構成する１、２、３、４または５残基における保存的置換または突然変異を含む突然変異）を含ませることができる。これらの「ヒト抗体」を、実際にヒトによって産生する必要はなく、むしろ、それらを、組換え手段を用いて産生し、及び／またはヒト抗体定常領域及び／または可変領域をコードする（例えば、上記のように）核酸を含むトランスジェニック動物（例えば、マウス）から単離することができる。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（例えば、ＵＳ５，８８５，７９３に記載されているような）を含む、当該技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することができる。
【０１３２】
選択されたエピトープを認識するヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を用いて生成することもできる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導く（例えば、ＵＳ５，５６５，３３２に記載されるような）。
【０１３３】
脱免疫化抗体
別の実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、ＭＫに結合する脱免疫化抗体またはタンパク質であってもよい。脱免疫した抗体及びタンパク質は、１つ以上のエピトープ、例えばＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを除去（すなわち突然変異）させ、それによって、哺乳類がその抗体またはタンパク質に対する免疫応答を引き起こす可能性を低減する。脱免疫化した抗体及びタンパク質の産生方法は、当該分野で公知であり、例えばＷＯ２０００／０３４３１７、ＷＯ２００４／１０８１５８及びＷＯ２００４／０６４７２４に記載されている。
【０１３４】
適切な突然変異の導入方法、ならびに得られるタンパク質の発現及びアッセイ方法は、本明細書の記載に基づいて当業者には明らかであろう。
【０１３５】
重鎖抗体
別の実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、ＭＫに結合する抗体の重鎖であってもよい。重鎖抗体は、重鎖を含むが軽鎖を含まないという点で、他の多くの形態の抗体とは構造的に異なる。したがって、これらの免疫グロブリンは、「重鎖のみ抗体」とも呼ばれる。重鎖免疫グロブリンは、例えば、ラクダ科動物及び軟骨魚類に見出される（ＩｇＮＡＲとも呼ばれる）。
【０１３６】
天然に存在する重鎖抗体中に存在する可変領域は、従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変領域（「ＶＨドメイン」と呼ばれる）、及び従来の４鎖抗体中に存在する軽鎖可変領域（「ＶＬドメイン」と呼ばれる）と区別するために、通常、ラクダ科動物抗体中の「ＶＨＨドメイン」及びＩｇＮＡＲ中のＶ−ＮＡＲと呼ばれる。
【０１３７】
ラクダ科動物由来の重鎖抗体及びその可変領域ならびにそれらの産生方法及び／または単離方法及び／または使用方法の一般的な記載は、とりわけ、以下の参考文献ＷＯ１９９４／００４６７８及びＷＯ１９９７／０４９８０５に見出される。
【０１３８】
軟骨魚類由来の重鎖免疫グロブリン及びその可変領域の一般的な説明ならびにそれらの産生方法及び／または単離方法及び／または使用方法は、とりわけＷＯ２００５／１１８６２９に見出される。
【０１３９】
抗体断片
単一ドメイン抗体
いくつかの実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、ＭＫに結合する単一ドメイン抗体（用語「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」と同じ意味で使用する）であるか、またはこれを包含する。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部を含む単一ポリペプチド鎖である。特定の実施例では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，ウォルサム、マサチューセッツ；例えば、ＵＳ６，２４８，５１６参照）である。
【０１４０】
ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ
いくつかの実施例では、本開示の方法において有用なＭＫに結合する単離または組換えタンパク質は、ＷＯ１９９８／０４４００１及び／またはＷＯ１９９４／００７９２１に記載されるような、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディもしくはより高次のタンパク質複合体であるか、またはこれらを包含する。
【０１４１】
例えば、ダイアボディは、会合する２つのポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖は、構造ＶＬ−Ｘ−ＶＨまたはＶＨ−Ｘ−ＶＬを含み、式中、ＶＬは抗体軽鎖可変領域であり、ＶＨは抗体重鎖可変領域であり、Ｘは、単一のポリペプチド鎖中のＶＨとＶＬが会合する（またはＦｖを形成する）ことを可能とするには不十分な残基を含むリンカーであるか、または存在せず、１つのポリペプチド鎖のＶＨが他のポリペプチド鎖のＶＬに結合して抗原結合部位を形成する、すなわち、１つ以上の抗原に特異的に結合可能なＦｖ分子を形成する。ＶＬ及びＶＨは、各ポリペプチド鎖において同一であり得るか、またはＶＬ及びＶＨは、二重特異性ダイアボディを形成するために、各ポリペプチド鎖において異なり得る（すなわち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含む）。
【０１４２】
エフェクター活性を誘導することができるダイアボディ、トリアボディ、テトラボディなどは、ＩＬ−３Ｒαに結合することができる抗原結合ドメイン、及び免疫細胞、例えばＴ細胞上の細胞表面分子（例えば、ＣＤ３）に結合することができる抗原結合ドメインを用いて産生することができる。
【０１４３】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント
いくつかの実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質は、ＭＫに結合するｓｃＦｖフラグメントであるかまたはそれを含む。当業者であれば、ｓｃＦｖが、単一のポリペプチド鎖中のＶＨ及びＶＬ領域ならびにＶＨとＶＬとの間のポリペプチドリンカーを含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造（すなわち、互いに会合してＦｖを形成するための単一のポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬのための）を形成することができることを認識するであろう。例えば、リンカーは、ｓｃＦｖのより好ましいリンカーの１つである（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３とともに１２個を上回るアミノ酸残基を含む。
【０１４４】
本開示はまた、ジスルフィド安定化Ｆｖ（またはｄｉＦｖもしくはｄｓＦｖ）の使用を企図し、単一のシステイン残基をＶＨのＦＲ及びＶＬのＦＲに導入し、システイン残基をジスルフィド結合によって連結し、安定したＦｖを得る。
【０１４５】
あるいは、またはさらに、本開示は、二量体型ｓｃＦｖ、すなわち、例えばロイシンジッパードメイン（例えば、ＦｏｓまたはＪｕｎ由来）による、非共有結合または共有結合によって連結した２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質の使用を包含する。あるいは、例えば、ＵＳ２００６０２６３３６７に記載されているように、２つのｓｃＦｖを十分な長さのペプチドリンカーによって連結し、両方のｓｃＦｖが形成し、抗原に結合できるようにする。
【０１４６】
本開示はまた、エフェクター活性を誘導することができる二量体型ｓｃＦｖの使用を意図する。一実施例では、二量体型タンパク質は、ｄＡｂとｓｃＦｖとの組み合わせである。エフェクター機能を誘導することができる二重特異性抗体断片の例は、例えば、ＵＳ７，２３５，６４１に記載されている。
【０１４７】
ＭＫ結合タンパク質の組換え発現
いくつかの実施例では、本開示の方法において有用な単離または組換えタンパク質を、組換え技術によって産生する。
【０１４８】
組換えタンパク質の場合、それをコードする核酸を発現ベクターにクローニングすることができ、次いで発現ベクターを、宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞、例えば免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）細胞、または骨髄腫細胞に形質移入する。免疫グロブリンの発現に使用する例示的な細胞は、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞またはＨＥＫ細胞である。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は当該分野で公知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（編集者），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての更新を含む）またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。多種多様なクローニング法及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅法が、組換え核酸の構築に適している。組換え抗体を産生する方法も当該技術分野で公知である。４，８１６，５６７または５，５３０，１０１参照。
【０１４９】
単離後、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または無細胞系もしくは細胞における発現のために、発現構築物または発現ベクター中のプロモーターに核酸を作動可能に連結して挿入する。
【０１５０】
本明細書中で使用する場合、用語「プロモーター」は、その最も広い意味で解釈され、例えば、発達刺激及び／または外部刺激に応答して、または組織特異的様式で、核酸の発現を変化させるさらなる調節エレメント（例えば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー）の存在下または非存在下での正確な転写開始に必要なＴＡＴＡボックスまたは開始因子エレメントを含む、ゲノム遺伝子の転写調節配列を含む。本明細書において、用語「プロモーター」はまた、作動可能に連結した核酸の発現を付与、活性化または増強する組換え、合成もしくは融合核酸、または誘導体を記載するためにも使用する。例示的なプロモーターは、１つ以上の特異的調節エレメントのさらなるコピーを含み、前記核酸の発現をさらに増強し、及び／または空間的発現及び／または一時的発現を改変することができる。
【０１５１】
本明細書中で使用する場合、用語「作動可能に連結する」とは、核酸の発現をプロモーターによって制御するように、核酸に対してプロモーターを配置することを意味する。
【０１５２】
細胞内での発現のための多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、一般的に：シグナル配列、免疫グロブリンをコードする配列（例えば、本明細書において提供する情報に由来する配列）、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。当業者であれば、免疫グロブリンの発現のための適切な配列を認識するであろう。例示的なシグナル配列として、原核生物分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダー、もしくは酸性ホスファターゼリーダー）または哺乳類分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が挙げられる。
【０１５３】
哺乳類細胞において活性を有する例示的プロモーターとして、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α−ミオシン重鎖プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β−アクチンプロモーター；ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターまたはその活性断片を含むハイブリッド調節要素が挙げられる。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（２９３または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングした２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。
【０１５４】
酵母細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅを含む群から選択される酵母細胞における発現に適した一般的なプロモーターとして、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、またはＴＥＦ１プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
単離した核酸またはそれを含む発現構築物を発現させるために細胞に導入するための手段は、当業者に公知である。所与の細胞に用いる技法は、公知の好結果の技法に依存する。組換えＤＮＡを細胞に導入する手段として、とりわけ、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介した形質移入、例えば、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、ＵＳＡ）及び／またはセルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いることによる、リポソームを介した形質移入、ＰＥＧを介したＤＮＡの取り込み、電気穿孔法、及び、例えば、ＤＮＡコーティングしたタングステンまたは金粒子を用いることによる微粒子照射（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ  Ｉｎｃ．、ウィスコンシン、ＵＳＡ）が挙げられる。
【０１５６】
免疫グロブリンを産生するために用いる宿主細胞は、用いる細胞のタイプに応じて、様々な培地中で培養してもよい。ハムＦｌ０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭｌ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、哺乳類細胞の培養に適している。本明細書に記載する他の細胞型を培養するための培地は、当該技術分野で公知である。
【０１５７】
ＭＫ結合タンパク質の単離／精製
本開示の方法に従って使用するＭＫ結合タンパク質は、好ましくは単離し、より好ましくは実質的に精製した形態で提供される。抗体及びタンパク質の単離方法及び精製方法は、当該技術分野で公知であり、及び／または本明細書に記載する。
【０１５８】
抗体または抗体断片を培地中に分泌させる場合、そのような発現系に由来する上清を、一般的に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮する。上記の工程のいずれかにおいて、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含ませてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含ませて不都合な汚染菌の増殖を防止してもよい。
【０１５９】
細胞から調製する抗体及び抗体断片は、例えば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーもしくはプロテインＧクロマトグラフィー）またはこれらの任意の組合せを用いて精製することができる。これらの方法は当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ１９９９／０５７１３４またはＥｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）に記載されている。
【０１６０】
当業者であれば、本開示のタンパク質、例えば、抗体またはその断片などを改変し、精製または検出を容易にするためのタグ、例えばポリヒスチジンタグ、例えばヘキサヒスチジンタグ、またはインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、またはシミアンウイルス５（Ｖ５）タグ、またはＦＬＡＧタグ、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含ませることができることも認識するであろう。次いで、得られたタンパク質を、当該分野で公知の方法、例えばアフィニティー精製を用いて精製する。例えば、免疫グロブリンを含む試料を、固体または半固体の支持体上に固定化したヘキサ−ｈｉｓタグに特異的に結合するニッケル−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）と接触させ、試料を洗浄して未結合の抗体を除去し、続いて結合した抗体を溶出することにより、ヘキサ−ｈｉｓタグを含む免疫グロブリンを精製する。あるいは、またはさらに、タグに結合するリガンドまたは抗体をアフィニティー精製法に使用してもよい。
【０１６１】
複合体
本開示に従って使用する単離または組換えタンパク質は、任意の実施形態に従って本明細書に記載するように、タンパク質（例えば、抗体またはその結合断片）の複合体として提供してもよい。例えば、本開示の単離または組換えタンパク質を修飾し、当該分野で公知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含有させることができる。好ましくは、タンパク質の誘導体化に適した部分は生理学的に許容可能なポリマー、好ましくは水溶性ポリマーである。そのようなポリマーは、本開示のタンパク質の安定性を増加させ、及び／または（例えば、腎臓による）クリアランスを減少させ、及び／または免疫原性を低下させる上で有用である。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、またはプロピレングリコール（ＰＰＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６２】
一実施例では、任意の実施形態に従って本明細書に記載するように、単離または組換えタンパク質を、例えば、本明細書に記載するように、本開示の別のタンパク質、または抗体可変領域を有するタンパク質、例えば、抗体もしくはそれに由来するタンパク質を含む別のタンパク質に複合体化または連結する。他のタンパク質を除外するものではない。さらなるタンパク質は当業者には明らかであり、例えば、免疫調節物質または半減期延長タンパク質、または血清アルブミンに結合するペプチドもしくは他のタンパク質が挙げられる。
【０１６３】
例示的な血清アルブミン結合ペプチドまたはタンパク質は、ＵＳ２００６０２２８３６４またはＵＳ２００８０２６０７５７に記載されている。
【０１６４】
一実施例では、本開示に従って使用する単離または組換えタンパク質は、検出及び／または単離を容易にするための１つ以上の検出可能なマーカーを含む。例えば、化合物は、蛍光標識、例えばフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ならびにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）を含む。これらの蛍光の吸収及び発光極大は、それぞれ：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）及びＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）である。
【０１６５】
あるいは、またはさらに、任意の実施形態に従って本明細書に記載するように、単離または組換えタンパク質を、例えば、蛍光性半導体ナノクリスタルで標識する（例えば、ＵＳ６，３０６，６１０に記載されているように）。
【０１６６】
あるいは、またはさらに、単離または組換えタンパク質を、磁性または常磁性化合物、例えば、鉄、スチール、ニッケル、コバルト、希土類物質、ネオジム−鉄−ホウ素、鉄−クロム−コバルト、ニッケル−鉄、コバルト−白金、またはストロンチウムフェライトで標識する。
【０１６７】
タンパク質のＭＫ結合活性のアッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイ
本開示の方法における使用に適合させるために、単離または組換えタンパク質をＭＫに結合させ、それによってＭＫ活性を阻害または低減、及び／またはＭＫの生物学的シグナルの伝達を遮断しなければならない。したがって、１つ以上の機能的アッセイを実施して、候補タンパク質、例えば、抗体またはその断片のヒトＭＫに対する結合特異性及び親和性を測定し、それにより、本開示の方法において使用するためのそのタンパク質の適合性を判定してもよい。
【０１６８】
ＭＫタンパク質への結合、及び／またはＭＫ活性の阻害もしくは低下、及び／または骨疾患／障害の治療、及び／または骨治癒の増加に対する、本開示の組換えまたは単離タンパク質、例えば抗体の適合性を評価するために、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが利用可能である。
【０１６９】
例えば、抗体または結合タンパク質のヒトＭＫへの結合特異性及び親和性を、ＥＬＩＳＡによって評価してもよい。この方法により、候補抗体の解離定数（Ｋｄ）を測定してもよい。
【０１７０】
別の実施例では、候補タンパク質または抗体の「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」を、放射性標識ＭＫ結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定し、本開示の方法における使用に対するその適合性を判定してもよい。このアッセイは、非標識ＭＫタンパク質の滴定系列の存在下で、試験タンパク質または抗体を最小濃度の放射性ＭＫタンパク質で平衡化する。洗浄して未結合のＭＫタンパク質を除去した後、放射線量を測定し、これは試験タンパク質または抗体のＫｄを表す。
【０１７１】
別の実施例によれば、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、例えば、固定化ＩＬ−３Ｒαを用いるＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を使用して、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」を測定する。
【０１７２】
さらに別の実施例では、走化性アッセイを用いて、ＭＫタンパク質のその受容体への結合を遮断する、及び／またはＭＫのその受容体への結合に関連する機能を阻害する、本開示の単離または組換えタンパク質の能力を評価することができる。これらのアッセイは、化合物（化学誘引物質）によって誘発されるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の機能的遊走に基づく。走化性は、任意の適切な手段によって、例えば、９６ウェル走化性プレートを利用するアッセイにおいて、または走化性を評価するための他の当該技術分野で認識されている方法を用いて評価することができる。
【０１７３】
一般的に、走化性アッセイは、障壁の第一の表面から反対側の第二の表面へ向かっての化合物のレベルの増加に対する、障壁（例えば、内皮、フィルター）内へのまたはそれを通る適切な細胞の定向性の移動または遊走をモニタリングする。膜またはフィルターは簡便な障壁を提供し、それによって、フィルターの第一の表面からフィルターの反対側の第二の表面へ向かっての化合物のレベルの増加に対する、フィルター内へのまたはそれを通る適切な細胞の定向性の移動または遊走をモニタリングする。いくつかのアッセイでは、ＩＣＡＭ−１、フィブロネクチンまたはコラーゲンなどの接着を促進する物質で膜をコーティングする。そのようなアッセイは、細胞「ホーミング」のｉｎ  ｖｉｔｒｏ近似を提供する。
【０１７４】
例えば、第一のチャンバーから、微細孔膜内へのまたは微細孔膜内を通って、化学誘引物質、例えばミッドカインタンパク質、及び試験する抗体を含有する、膜によって第一のチャンバーから分割された第二のチャンバー内への、適切な容器（収容手段）内での細胞の遊走の阻害を検出または測定することができる。例えば、ニトロセルロース、ポリカーボネートを含む化合物に応答した特異的遊走をモニタリングするのに適した細孔サイズを有する適切な膜を選択する。例えば、約３〜８μｍ、好ましくは約５〜８μｍの細孔径を用いることができる。細孔サイズは、フィルター上または適切な細孔サイズの範囲内で均一であり得る。
【０１７５】
遊走及び遊走の阻害を評価するために、フィルターへの遊走距離、フィルターの第二の表面に付着したままであるフィルター通過細胞の数、及び／または第二のチャンバーに蓄積する細胞の数を、標準的な技術（例えば、顕微鏡検査及びフローサイトメトリー）を用いて測定することができる。一実施形態では、細胞を検出可能な標識（例えば、放射性同位元素、蛍光標識、抗原またはエピトープ標識）で標識し、候補抗体の存在下及び非存在下で、適切な方法を用いて（例えば、放射能の検出、蛍光、イムノアッセイによって）、膜に付着する、及び／または第二のチャンバーに存在する標識の存在を測定することによって、遊走を評価することができる。誘導または阻害される遊走の程度は、適切な対照と比較して（例えば、抗体の非存在下で測定されるバックグラウンドの遊走と比較して、第二の化合物（すなわち、標準）によって誘導される遊走の程度と比較して、抗体によって誘導される未形質移入細胞の遊走と比較して）決定することができる。
【０１７６】
一実施形態では、ＭＫタンパク質が結合するか、または、ＭＫタンパク質への遊走が可能な細胞集団を、ＭＫタンパク質（化学誘引物質）を含む別のチャンバーと液体連通する細胞培養装置のチャンバーに配置する。２つのチャンバーは、適切な膜、例えば、被験体に見出される細胞外マトリックスを模倣する膜によって分離される。１つのチャンバーから他のチャンバーへの膜を介した細胞遊走の量を、候補タンパク質または抗体の存在下または非存在下で評価する。ＭＫを介した細胞遊走を阻止するか、またはその量を対照試料（タンパク質または抗体を含まない）に比べて低減するタンパク質または抗体は、ＭＫ阻害活性を有すると考えられる。
【０１７７】
当業者には明らかであるように、スクリーニング方法は、候補タンパク質とのインキュベーション後のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの破骨細胞増殖レベル、または分化関連及びβ−カテニン調節性遺伝子の発現におけるＭＫ誘発性の低下を減少させる候補タンパク質の能力、及び、例えば、実施例３に記載するような、ＬＲＰ−６リン酸化の低下を検出することを含み得る。そのような方法は、当該技術分野で公知である。
【０１７８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ機能アッセイ
別の実施例では、本開示の方法により、骨障害／疾患及び／または傷害を治療するための、ＭＫ活性または発現を阻害または減少させる単離または組換えタンパク質の有効性及びその対応する有用性をｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて評価してもよい。
【０１７９】
例えば、候補タンパク質を、骨折に罹患している非ヒト哺乳類、例えば、実施例１に記載するように、骨切り術を処置したマウスに投与してもよい。この実施例によれば、ＭＫを阻害し、タンパク質を投与していない対照動物における骨折治癒の速度と比較した骨折治癒の速度を加速する候補タンパク質は、本明細書に記載の方法における、例えば骨折などの骨損傷の治療及び／または骨治癒の増加に適していると考えられる。
【０１８０】
別の実施例では、本開示の候補タンパク質を、骨粗鬆症の非ヒト哺乳類（例えばマウス）モデル、例えば実施例２に記載するＯＶＸマウスモデルに投与してもよい。この実施例によれば、例えば、哺乳類被験体におけるＢＭＤ、ＢＶ／ＴＶ及び／または骨の厚さを、タンパク質の投与前の症状及び／または候補タンパク質を投与していない対照哺乳類と比較して、増加させることにより、骨粗鬆症に関連する少なくとも１つの症状を軽減または緩和または改善する候補タンパク質は、疾患または病態の治療に適していると考えられる。
【０１８１】
組成物
適切には、本開示の単離または組換えタンパク質または複合体を哺乳類に投与するための組成物または方法において、当技術分野で理解されるように、単離または組換えタンパク質または複合体を、薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／または賦形剤と併用する。したがって、本開示の一実施例は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／または賦形剤と併用した、単離または組換えタンパク質またはその複合体を含む医薬組成物を提供する。あるいは、本開示の単離または組換えタンパク質または複合体を、保存のために凍結乾燥し、当技術分野で公知の凍結乾燥及び再構成技術に従って、使用前に適切な担体中に再構成することができる。
【０１８２】
別の実施例では、本開示は、哺乳類に投与する前に、単離または組換えタンパク質または複合体との併用または混合に適した薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／または賦形剤を含むキットを提供する。例えば、本開示の単離または組換えタンパク質または複合体は、哺乳類に投与する前に、薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／または賦形剤と併用または混合するために、凍結乾燥形態で提供することができる。この実施例では、キットに、例えば、本開示の方法に従って使用するための説明書をさらに含めてもよい。
【０１８３】
一般的には、「担体、希釈剤または賦形剤」とは、哺乳類、例えばヒトに対して安全に投与し得る、固体または液体の充填剤、結合剤、希釈剤、封入物質、乳化剤、湿潤剤、溶媒、懸濁剤、コーティング剤または潤滑剤を意味する。特定の投与経路に応じて、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）に記載されているように、当該分野で公知の様々な許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を使用してもよい。
【０１８４】
単なる例に過ぎないが、担体、希釈剤または賦形剤は、糖（例えば、スクロース、マルトース、トレハロース、グルコース）、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油及び合成モノまたはジグリセリドを含む油類、低級アルコール、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、ステアリン酸ナトリウムまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、等張食塩水ならびにパイロジェンフリー水を含む群から選択してもよい。例えば、担体、希釈剤または賦形剤は、非経口投与に適合しているか、または適切である。非経口投与には、消化管を介さない任意の投与経路が含まれる。非経口投与の非限定的な例として、注射、注入などが挙げられる。注射による投与の例として、静脈内、動脈内、筋肉内及び皮下注射が挙げられる。例えば、皮内、筋肉内及び皮下に送達し得るデポーまたは徐放性製剤による送達も企図される。
【０１８５】
骨関連疾患、障害及び傷害
本明細書に記載するように、本開示は、ＭＫタンパク質に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを有する単離もしくは組換えタンパク質、前記単離もしくは組換えタンパク質の複合体、またはそれを含む複合体もしくは組成物を被験体に投与することを含む、被験体における骨形成の促進及び／または骨治癒の促進及び／またはＢＭＤの増加の方法を提供する。したがって、本開示の方法は、被験体における骨形成の促進及び／または骨治癒の促進及び／またはＢＭＤの増加が望まれる骨関連疾患、障害、病態及び／または傷害の治療または予防に特に好適であり得る。
【０１８６】
治療対象の被験体は、以下から選択してもよい：
（ｉ）骨折を有する被験体；
（ｉｉ）骨形成のための外科手術を受けた、または受ける予定の被験体；
（ｉｉｉ）整形外科インプラントまたはハードウェアと隣接する骨との一体化を促進するための外科手術を受けた、または受ける予定の被験体；及び
（ｉｖ）骨粗鬆症に罹患しているか、または罹患しやすい被験体。
【０１８７】
本明細書中で使用する場合、用語「骨折」は、単純骨折、若木骨折、開放骨折、粉砕（多重分裂）骨折、嵌没骨折、複雑骨折、毛髪様骨折、圧迫骨折、疲労骨折及び／または病的骨折を含む。本開示の方法によって効果的に治療され得る骨折の例として、脊椎、脚及び腕の骨折が挙げられるが、これらに限定されない。本開示によって効果的に治療される骨折のさらなる例は、脊椎圧迫骨折である。そのような骨折は、例えば、骨粗鬆症、パジェット病または骨癌などの骨を弱める疾患または老化の結果として、椎骨が既に弱体化している場合に、椎骨の骨の１つ以上が骨折または圧潰する際に生じる。
【０１８８】
本明細書中で使用する場合、「骨形成のための外科手術」には、骨折を修復するための外科手術、脊椎骨を融合するために用いる外科手術（例えば、脊椎固定）、または、例えば、全関節置換術中におけるインプラント、骨折修復中に使用する骨ネジ、腱もしくは靭帯を固定するために使用する骨ネジ、もしくは整形外科手術部位を機械的に安定化するように設計された任意の整形外科用ハードウェアの一体化を含む外科手術が含まれる。同様に、「整形外科用インプラントまたはハードウェアと隣接する骨との一体化を促進する外科手術」には、全関節置換術中におけるインプラント、骨折修復中に使用する骨ネジ、腱もしくは靭帯を固定するために使用する骨ネジ、もしくは整形外科手術部位を機械的に安定化するように設計された任意の整形外科用ハードウェアの一体化を含む外科手術が含まれる。
【０１８９】
本明細書に記載するように、本開示の単離または組換えタンパク質の投与は、ＯＶＸマウスを含む、マウスにおけるＢＭＤ、ＢＶ／ＴＶ及び厚さを増加させることが示されている。したがって、本開示の方法は、骨粗鬆症に罹患しているか、または罹患しやすい被験体の治療に特に有用であり得る。骨粗鬆症は、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨形成不全または特発性若年性骨粗鬆症であってもよい。
【０１９０】
続発性骨粗鬆症の場合、骨粗鬆症症状は、別の病態、例えば、副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、白血病または進行がんの結果であり得るか、または骨量減少もしくは骨分解を引き起こす別の病態の治療、例えばコルチコステロイド、甲状腺ホルモン補充療法またはアロマターゼ阻害剤（乳癌の治療に使用する）の結果であり得る。したがって、本開示の方法は、罹患しやすくなっている可能性のある被験体における、骨量減少または骨分解の予防及び／または骨破壊の予防のための併用療法として使用してもよい。
【０１９１】
用量及びレジメン
本明細書に記載する骨関連疾患、障害及び／または傷害の予防または治療に関して、活性薬剤（例えば、本開示のタンパク質または複合体）の適切な用量は、治療する特定の疾患、障害及び／または傷害、疾患、障害及び／または傷害の重篤度及び経過、その活性薬剤を予防的または治療的目的のどちらで投与するのか、患者が受けた以前の治療、患者の臨床歴及び活性薬剤の応答、ならびに担当医師の裁量に依存するであろう。一般的には、治療有効量のＭＫ結合タンパク質または複合体を投与する。語句「治療有効量」とは、治療対象の被験体において治療または他の治療効果を促進、誘発、及び／または増強するのに十分な量を指す。治療有効量は、所望の効果を生じるのに十分な大きさであるべきだが、有害な副作用を引き起こすほど大きくすべきではない。特定の投与レジメン、すなわち用量、タイミング、及び反復は、特定の個体、及び医師が評価したその個体の病歴に依存するであろう。一般的には、医師は、所望の結果を達成する用量に達するまで、活性薬剤（例えば、ＭＫ結合タンパク質またはそれを含む複合体）を投与するであろう。
【０１９２】
一般的に、用量は、患者の年齢、健康状態、性別、及び疾患、障害及び／または傷害の程度によって様々に異なり、当業者によって決定され得る。合併症の場合には、個々の医師が用量を調整することができる。本明細書に記載するＭＫ結合タンパク質または複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ投与に関して、通常の用量は、１日あたり約１０ｎｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇ個体体重またはそれ以上で様々に異なり得る。例示的な用量及びその範囲を本明細書に記載する。数日間またはそれ以上にわたる反復投与については、治療する疾患、障害及び／または傷害の重篤度に応じて、所望の症状の抑制または治療が達成されるまで、治療を持続することができる。
【０１９３】
いくつかの実施例では、本明細書に記載するＭＫ結合タンパク質または複合体を、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの初期（または負荷）用量、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約２ｍｇ／ｋｇまたは約３ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇで投与する。次いで、ＭＫ結合タンパク質または複合体を、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの維持用量、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．２ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇまたは０．４ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇで投与することができる。維持用量は、７〜３０日ごと、例えば、１０〜１５日ごと、例えば、１０または１１または１２または１３または１４または１５日ごとに投与してもよい。
【０１９４】
特定のＭＫ結合タンパク質または複合体の用量は、それぞれのＭＫ結合タンパク質または複合体の１回以上の投与を受けた哺乳類において経験的に決定してもよい。本開示のＭＫ結合タンパク質または複合体の用量の有効性を評価するために、治療する疾患、病態または傷害、例えば、骨粗鬆症及び／または骨折の臨床症状を投与後にモニタリングすることができる。例えば、骨粗鬆症の治療における本開示のＭＫ結合タンパク質または複合体の用量の有効性は、当該技術分野で公知の試験、例えばμＣＴ（マイクロコンピュータ断層撮影法）またはＤｅｘａスキャン（二重エネルギーＸ線吸収測定法またはＤＥＸＡ）を用いた治療後の患者のＢＭＤに基づいて評価してもよい。別の実施例では、骨折の治療において、すなわち骨折治癒及び／または骨形成の段階を評価することによる、本開示のＭＫ結合タンパク質または複合体の用量の有効性は、Ｘ線撮影または当該技術分野で公知の他の方法によって評価してもよい。
【０１９５】
本開示の方法によるＭＫ結合タンパク質または複合体または組成物の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的であるか予防的であるか、及び当業者に公知の他の要因に応じて、連続的または断続的にすることができる。ＭＫ結合タンパク質または複合体または組成物の投与は、予め選択した期間にわたり本質的に連続的であってもよく、または一連の間隔を空けた投与であってもよい。
【０１９６】
治療する骨疾患、障害、病態及び／または傷害に応じて、経口、摂食、局所、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射）、吸入（例えば、気管支内、眼内、鼻腔内または経口吸入、点鼻）を含むが、必ずしもこれらに限定されない様々な投与経路が可能である。他の適切な投与方法として、再充填可能または生分解性のデバイス及び徐放性ポリマーデバイスも挙げることができる。
【０１９７】
併用療法
本明細書に記載する方法の一実施例では、記載する単離または組換えタンパク質または複合体または組成物を、骨形成の促進及び／または骨治癒の促進及び／またはＢＭＤの増加に有用な別の化合物と併用して、併用または追加の治療工程として、または治療用製剤の追加の成分としてのいずれかで投与する。
【０１９８】
例えば、他の化合物は、ビスホスホネート、例えば、アレンドロネート（Ｆｏｘａｍａｘ）、リセドロネート（Ａｃｔｏｎｅｌ）、イバンドロネート（Ｂｏｎｉｖａ）またはゾレドロン酸（ＲｅｃｌａｓｔまたはＡｃｌａｓｔａ）などであってもよい。あるいは、またはさらに、他の化合物は、コルチコステロイド、例えば、プレドニゾンまたはコルチゾンであってもよい。あるいは、またはさらに、他の化合物はデノスマブ（Ｐｒｏｌｉａ）であってもよい。あるいは、またはさらに、他の化合物はラネリック酸ストロンチウム（Ｐｒｏｔｏｓ）であってもよい。あるいは、またはさらに、他の化合物は、選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭＳ）、例えばラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ）であってもよい。あるいは、またはさらに、他の化合物は、ホルモン補充療法（ＨＲＴ）において使用する薬物、例えば、エストロゲンまたはプロゲステロンであってもよい。あるいは、またはさらに、他の化合物は、テリパラチド（Ｆｏｒｔｅｏ）であってもよい。あるいは、またはさらに、他の化合物は、非ステロイド系抗炎症剤または鎮痛剤であってもよい。例えば、適切な非ステロイド系抗炎症剤は、イブプロフェン、ナプロキセン、またはケトプロフェン、インドメタシン（ＩｎｄｏｃｉｎまたはＴｉｖｏｒｂｅｘ）、フェノプロフェン（Ｎａｌｆｏｎ）から選択されるＣＯＸ−１及び／またはＣＯＸ−２阻害剤であってもよい。
【０１９９】
以下の非限定的な実施例に関連して、本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例】
【０２００】
実施例１−成体の骨折治癒に対するミッドカイン抗体の効果
本実施例において、本発明者らは、成体マウスにおける骨折治癒に対する抗ミッドカイン抗体の皮下投与の効果を評価した。
【０２０１】
方法
動物
本実験に使用したすべてのマウスは、ウルム大学により提供された雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスであった。マウスを、ケージ（３７０ｃｍ２）あたり２〜４匹の動物の群で、水及び食物を自由に与えて１４時間の明期及び１０時間の暗期の概日リズムで維持した。
【０２０２】
治療
簡潔に述べると、９か月齢のマウスを、群１（ｎ＝Ｘ）及び群２（ｎ＝Ｘ）の２つの群に無作為に振り分け、各動物に対し、外部固定装置（軸剛度３．０Ｎ／ｍｍ、ＲＩＳｙｓｔｅｍ）を用いて安定化させた０．４ｍｍのギグリー線鋸（ＲＩＳｙｓｔｅｍ、ダボス、スイス）を使用して、右大腿骨の中央骨幹において標準的骨切り術を施した。手術直後に治療を開始した。群１の動物には抗ミッドカイン抗体ＩＰ−１０を処置し、これについては２５ｍｇ／ｋｇで毎週２回、３週間、皮下投与した。これに並行して、群２の動物を、ビヒクルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて処置した。手術後４、１０、２１、または２８日目に、二酸化炭素を用いて群１及び群２のそれぞれの動物を殺処分した（各時点でｎ＝６〜８／群）。手術後０、４、１０または２１日目に殺処分したマウスから血液試料を採取した。さらなる分析のために、骨折大腿骨及び無傷の大腿骨を、すべてのマウスから取り出した。
【０２０３】
血清分析
マウスミッドカインと交差反応性を有していたヒトミッドカイン酵素結合免疫吸着アッセイキット（Ｃｅｌｌｍｉｄ  Ｌｔｄ提供）を使用して、製造業者のプロトコールに従って各動物についてミッドカインタンパク質血清レベルを測定した。
【０２０４】
生体力学的試験
Ｒｏｎｔｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，２８：１４５６−１４６２に記載されるように、非破壊３点曲げ試験を用いて、２１、２３または２８日目に殺処分したマウスの無傷及び骨折大腿骨の生体力学的試験を行った。簡潔に述べると、固定具を除去した後、頭蓋側方仮骨側の上部に曲げ荷重（最大４Ｎ）を加えた。骨の曲げ剛性を、荷重−たわみ曲線の傾きを用いて計算した。骨折大腿骨の相対的曲げ剛性を、同じマウスの骨折大腿骨と無傷の大腿骨との間の比として計算した。
【０２０５】
マイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）
マウス由来の大腿骨を、８μｍ（５０ｋＶ、２００ｍＡ）のボクセル解像度で作動するμＣＴスキャン装置（Ｓｋｙｓｃａｎ１１７２、コンティフ、ベルギー）を用いて分析した。μＣＴ分析のために４つの関心体積（ＶＯＩ）を決定した：ＶＯＩ１は骨折皮質間の仮骨をカバーし、ＶＯＩ２は２つの内側ピンホールの間の骨膜仮骨をカバーした。ＶＯＩ３（無傷の皮質骨）は、無傷の大腿骨の骨幹の中央から、８０μｍ近位〜８０μｍ遠位の領域に及んだ。ＶＯＩ４（無傷の骨梁骨）の開始点は、無傷の大腿骨の骨幹端の成長板の２００μｍ近位であり、終点は開始点から２８０μｍの近位であった。ＶＯＩ５は、第二の腰椎体の骨梁部分をカバーした。各スキャン内において規定のヒドロキシアパタイト密度（２５０ｍｇ／ｃｍ３及び７５０ｍｇ／ｃｍ３）を有する２つのファントムを用いて骨密度（ＢＭＤ）を評価した。骨折仮骨のＢＭＤを閾値なしで評価し、一方、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｂｏｎｅ，４４（２）：２２５−２４４に記載される方法に従って、６４２ｍｇヒドロキシアパタイト／ｃｍ３の全体的な閾値を用いて皮質骨のＢＭＤを決定した。Ｗｅｈｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，３２（８）：１００６−１０１３及びＯ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｂｏｎｅ，５０：１３５７−６７に記載されているように、骨梁骨のＢＭＤを、３９５ｍｇヒドロキシアパタイト／ｃｍ３の全体閾値を用いて評価した。Ｂｏｕｘｓｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，２５（７）：１４６８−１４８６に記載されているように、μＣＴ分析について、米国骨代謝学会（ＡＳＢＭＲ）に記載のガイドラインに従って、Ｓｋｙｓｃａｎソフトウェア（ＮＲｅｃｏｎ、ＤａｔａＶｉｅｗｅｒ、ＣＴＡｎ）を使用して、骨パラメータの解析を行った。
【０２０６】
未脱灰大腿骨の組織形態計測
２１及び２８日目に外植した骨折大腿骨の未脱灰の組織切片を用いて、２つの内部ピンホールの間の仮骨全体の骨、軟骨及び線維組織の量を測定した。簡潔に述べると、大腿骨を４％ホルマリンで固定し、上昇エタノール系列で脱水し、メチルメタクリレートに包埋した。７μｍの断面を調製し、組織形態測定分析のためにギームザを用いて染色した。仮骨組織を光学顕微鏡（ＤＭＩ６０００Ｂ、Ｌｅｉｃａ、ヘーアブルーク、スイス）を用いて検査した。画像解析ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  ＭＭＡＦ  １．４．０  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｅｉｃａ）を用いて、骨、軟骨、及び線維組織の量を測定した。骨芽細胞及び骨芽細胞表面を同定するために、７μｍの断面を調製し、トルイジンブルーを用いて染色し、４００倍の倍率で分析した。Ｈｅｉｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，８（１２）：ｅ８４２３２に記載されているように、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色を用いて破骨細胞数を同定した。
【０２０７】
脱灰大腿骨の組織形態計測及び免疫組織化学
手術後４、１０または２１日目に殺処分したマウスの大腿骨を４％ホルマリン中に固定し、２０％エチレンジアミン四酢酸（ｐＨ  ７．２〜７．４）を用いて１０〜１２日間脱灰し、上昇エタノール系列での脱水後にパラフィンに包埋した。厚さ７μｍの縦断面を調製し、組織定量のためにサフラニンＯを用いて染色した。ミッドカイン及びβカテニンの免疫組織化学的染色を、以下の抗体を用いて行った：ポリクローナルヤギ抗マウスＭｄｋ抗体（ｓｃ−１３９８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダラス、ＵＳＡ）、ポリクローナルウサギ抗マウスβカテニン抗体（ＡＢ１９０２２、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｔｏｍｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ベルリン、ドイツ）、ビオチン結合ロバ抗ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ′）２（ｓｃ−３８５４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＵＳＡ）。種特異的非標的化免疫グロブリンをアイソタイプ対照として用いた。色素原として３−アミノ−９−エチルカルバゾール（Ｚｙｔｏｍｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ヘマトキシリン（Ｗａｌｄｅｃｋ、ミュンスター、ドイツ）を用いて切片を対比染色した。画像解析ソフトウェアＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４（Ａｄｏｂｅ、ダブリン、アイルランド）を用いて、βカテニンの陽性染色領域の定量を行った。カラーピッカーツール及び公差４０を用いて、陽性染色の色域を決定した。陽性染色されたピクセルをヒストグラムで計数し、画像の全ピクセルに対して計算して、陽性染色領域の割合を決定した。
【０２０８】
統計解析
９か月齢のマウスを用いた実験の統計解析を、ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、シカゴ、ＵＳＡ）によるノンパラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定を用いて行った。すべての結果を、中央値、第１及び第３四分位数、ならびに最大値及び最小値を有するボックスプロットとして提示する。異常値（値が、第１四分位数−１．５×四分位範囲を下回るか、または第３四分位数＋１．５×四分位範囲を上回る）を小さな円としてマークした。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意であるとみなした。
【０２０９】
結果
抗ミッドカイン抗体による治療は、成体マウスの骨折仮骨の機械的能力及び骨形成を増加させた
生体力学的試験は、抗ミッドカイン抗体による治療により、治癒の２１及び２８日後の両方において、９か月齢のマウスの骨折大腿骨の相対的曲げ剛性が対照群に比べて有意に増加することを示した（図１、Ａ及びＢ）。さらに、骨折仮骨のμＣＴ分析は、治癒の２１及び２８日後の両方において、骨体積／組織体積（ＢＶ／ＴＶ）が対照群に比べて増大したことを示した（図１、Ｃ及びＤ）。仮骨の大きさ及び幾何学的形状は、骨折治癒の中間時点、すなわち２１日目には影響を受けなかったが（図１、Ｅ及びＧ）、一方、ＴＶは、治癒の２８日後、抗ミッドカイン抗体で治療した動物において有意に低かった（図１Ｆ）。このことは、これらのマウスにおける初期の組織修復段階を示している。
【０２１０】
骨折仮骨組織組成の組織形態測定分析により、抗ミッドカイン抗体で治療した動物が、１０及び２１日後の両方において有意に増加した量の新生骨を呈することが示された（図２）。骨折治癒の後期段階では、骨折仮骨組織組成に有意差は観察されなかった（２８日目、データは示さず）。
【０２１１】
ミッドカインタンパク質発現は、骨折仮骨骨芽細胞及び軟骨細胞における抗ミッドカイン抗体処置によって示差的に影響を受けた
ミッドカインタンパク質は、骨折治癒の期間中、いくつかの細胞型で発現することが示されていることから、抗ミッドカイン抗体による処置のミッドカイン発現に対する影響も分析した（図３）。
【０２１２】
手術後４日目に、ミッドカインタンパク質が骨折仮骨の骨膜領域に発現することが示され、この発現は抗ミッドカイン抗体による処置によって減弱した。ミッドカインタンパク質の発現は、ビヒクル処置マウスにおいては、手術の１０日後にピークに達した。このタンパク質は、増殖性及び肥大性軟骨細胞においては細胞内に、新生骨形成の領域においては細胞外に位置していた。ミッドカインタンパク質の発現は、抗ミッドカイン抗体による処置によって減弱した骨膜骨折仮骨の血管周辺で明らかに大きかった。ミッドカインタンパク質は、ビヒクル処置マウス及び抗体処置マウスの両方において、軟骨細胞において細胞内で検出された。２１日目に、ミッドカインタンパク質の発現は、散在した軟骨細胞においてのみ観察され、新規骨形成領域において非常に低かった。この時点において、ビヒクル処置マウスと抗体処置マウスとの間に差はなかった。
【０２１３】
骨切り術はミッドカインタンパク質血清レベルを増加させた
骨折仮骨内の血管新生領域において、群１と群２の動物間にミッドカイン発現の有意差が認められたため、骨切り術前後のミッドカイン血清レベルを調べた。
【０２１４】
０日目の未処置マウスは、血清中に低レベルのミッドカインタンパク質しか示さなかった。対照動物では、血清ミッドカインタンパク質レベルは４日目で２倍以上（５８〜６８ｐｇ／ｍｌ）になり、１０日目（７８〜９１ｐｇ／ｍｌ）にピークを迎え、２１日目までに手術前レベルに戻った（表１）。
表１．９か月齢のマウスの骨折治癒中のミッドカイン（Ｍｄｋ）血清レベル。
2019510080.tif 000004
ｎ．ｄ  ．：検出不能；ｄ０：操作前の値（ｎ＝３〜７／群、平均±標準偏差として提示）。マン・ホイットニーＵ検定。
【０２１５】
抗ミッドカイン抗体を用いた処置は、ビヒクル処置マウスに比べて、４日目に、及び１０日目においては有意に、血清中のミッドカインタンパク質のレベルをわずかに減少させた。
【０２１６】
抗ミッドカイン抗体による治療は、βカテニン発現及び骨芽細胞活性を増加させた
ミッドカインが骨芽細胞におけるＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達に影響を及ぼすことが以前に示されている（Ｌｉｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｂｏｎｅ，４８：９４５−９５１）ことから、骨折治癒中のβカテニンシグナル伝達に対する抗ミッドカイン抗体処置の影響を評価した。増殖後の軟骨細胞及び骨芽細胞を、骨折後１０日目に、βカテニンについて免疫組織化学的に染色したが（図４Ａ）、肥大性軟骨細胞はβカテニン陰性であった。１０日目に、抗ミッドカイン抗体で処置した動物の骨折仮骨において、βカテニン陽性領域の割合が有意に増加していた（図４Ｂ）。
【０２１７】
ミッドカイン欠損マウスが、骨折仮骨における破骨細胞または骨芽細胞の数に差異を示さないことが以前に示されていることから（Ｈａｆｆｎｅｒ−Ｌｕｎｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，９（１２）：ｅ１１６２８２）、群１及び群２の動物の骨折仮骨において、破骨細胞または骨芽細胞の数を分析して、抗ミッドカイン抗体による処置の効果を判定した。２１日目に、破骨細胞の数は両群において同等であったが（図４Ｃ）、一方、骨芽細胞の数は抗体処置後わずかに増加したに過ぎなかった（ｐ＝０．１５１；図４Ｄ）。対照的に、骨芽細胞表面が抗ミッドカイン抗体による処置後に有意に増加したが（図４Ｅ）、このことは骨芽細胞活性が増強されたことを示している。２８日目に、抗体処置マウスにおいて破骨細胞の数がわずかに増加したが（ｐ＝０．０８２；図４Ｆ）、このことはより迅速な仮骨組織修復を示している。
【０２１８】
実施例２―若年及び骨粗鬆症マウスにおける骨折治癒に対するミッドカイン抗体の効果
骨粗鬆症患者は、骨治癒能力の低下及び骨折治癒の遅延を示すため、本発明者らは、若年及び骨粗鬆症マウスにおける骨折治癒に対する抗ミッドカイン抗体による治療の効果を評価した。
【０２１９】
方法
動物
本実験で使用したすべてのマウスは、ウルム大学により提供された雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスであった。マウスを、ケージ（３７０ｃｍ２）あたり２〜４匹の動物の群で、実験全体にわたって、水及びフィトエストロゲンを含まない食餌を用いて、１４時間の明期及び１０時間の暗期の概日リズムで、自由に飼育した。
【０２２０】
治療
簡潔に述べると、３か月齢のマウスを無作為に２つの群に分け、それぞれに、両側性の偽手術または卵巣摘出（ＯＶＸ）を施した。偽手術及びＯＶＸは、Ｗｅｈｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，３２（８）：１００６−１０１３に記載されるように行った。偽手術またはＯＶＸを行ってから８週間後、動物に対し、外部固定装置（軸剛度３．０Ｎ／ｍｍ、ＲＩＳｙｓｔｅｍ）を用いて安定化させた０．４ｍｍのギグリー線鋸（ＲＩＳｙｓｔｅｍ、ダボス、スイス）を使用して、右大腿骨の中央骨幹で標準的骨切り術を施した。骨切り術直後に治療を開始した。治療中に、偽手術群の動物の半数及びＯＶＸ群の動物の半数に、抗ミッドカイン抗体ＩＰ−１０を与え、これについては２５ｍｇ／ｋｇで週３回、３週間、皮下投与した。これに並行して、偽手術群及びＯＶＸ群における残りの動物を、ビヒクルのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて処置した。４つの群の各々からの動物を、骨切り後０、３、１０及び２３日目に、二酸化炭素を用いて殺処分した（各時点でｎ＝６〜７／群）。各時点で殺処分したマウスから血液試料を採取した。さらなる分析のために、骨折及び無傷の大腿骨ならびに腰椎体をすべてのマウスから取り出した。
【０２２１】
血清分析
マウスミッドカインと交差反応性を有していたヒトミッドカイン酵素結合免疫吸着アッセイキット（Ｃｅｌｌｍｉｄ  Ｌｔｄ提供）を使用して、製造業者のプロトコールに従って各動物についてミッドカインタンパク質血清レベルを測定した。
【０２２２】
生体力学的試験
Ｒｏｎｔｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，２８：１４５６−１４６２に記載されるように、非破壊３点曲げ試験を用いて、２３日目に殺処分したマウスの無傷及び骨折大腿骨の生体力学的試験を行った。簡潔に述べると、固定具を除去した後、頭蓋側方仮骨側の上部に曲げ荷重（最大４Ｎ）を加えた。骨の曲げ剛性を、荷重−たわみ曲線の傾きを用いて計算した。骨折大腿骨の相対的曲げ剛性を、同じマウスの骨折大腿骨と無傷の大腿骨との間の比として計算した。
【０２２３】
マイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）
マウス由来の大腿骨及び椎体を、８μｍ（５０ｋＶ、２００ｍＡ）のボクセル解像度で作動するμＣＴスキャン装置（Ｓｋｙｓｃａｎ１１７２、コンティフ、ベルギー）を用いて分析した。μＣＴ分析のために４つの関心体積（ＶＯＩ）を決定した：ＶＯＩ１は骨折皮質間の仮骨をカバーし、ＶＯＩ２は２つの内側ピンホールの間の骨膜仮骨をカバーした。ＶＯＩ３（無傷の皮質骨）は、無傷の大腿骨の骨幹の中央から、８０μｍ近位〜８０μｍ遠位の領域に及んだ。ＶＯＩ４（無傷の骨梁骨）の開始点は、無傷の大腿骨の骨幹端の成長板の２００μｍ近位であり、終点は開始点から２８０μｍの近位であった。ＶＯＩ５は、第二の腰椎体の骨梁部分をカバーした。各スキャン内において規定のヒドロキシアパタイト密度（２５０ｍｇ／ｃｍ３及び７５０ｍｇ／ｃｍ３）を有する２つのファントムを用いて骨密度（ＢＭＤ）を評価した。骨折仮骨のＢＭＤを閾値なしで評価し、一方、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｂｏｎｅ，４４（２）：２２５−２４４に記載される方法に従って、６４２ｍｇヒドロキシアパタイト／ｃｍ３の全体的な閾値を用いて皮質骨のＢＭＤを決定した。Ｗｅｈｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，３２（８）：１００６−１０１３及びＯ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｂｏｎｅ，５０：１３５７−６７に記載されているように、骨梁骨のＢＭＤを、３９５ｍｇヒドロキシアパタイト／ｃｍ３の全体閾値を用いて評価した。Ｂｏｕｘｓｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，２５（７）：１４６８−１４８６に記載されているように、μＣＴ分析について、米国骨代謝学会（ＡＳＢＭＲ）に記載のガイドラインに従って、Ｓｋｙｓｃａｎソフトウェア（ＮＲｅｃｏｎ、ＤａｔａＶｉｅｗｅｒ、ＣＴＡｎ）を使用して、骨パラメータの解析を行った。
【０２２４】
未脱灰大腿骨の組織形態計測
骨切り後２３日目に外植した骨折大腿骨の未脱灰の組織切片を用いて、２つの内部ピンホールの間の仮骨全体の骨、軟骨及び線維組織の量を測定した。簡潔に述べると、大腿骨を４％ホルマリンで固定し、上昇エタノール系列で脱水し、メチルメタクリレートに包埋した。７μｍの断面を調製し、組織形態測定分析のためにギームザを用いて染色した。仮骨組織を光学顕微鏡（ＤＭＩ６０００Ｂ、Ｌｅｉｃａ、ヘーアブルーク、スイス）を用いて検査した。画像解析ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  ＭＭＡＦ  １．４．０  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｅｉｃａ）を用いて、骨、軟骨、及び線維組織の量を測定した。骨芽細胞及び骨芽細胞表面を同定するために、７μｍの断面を調製し、トルイジンブルーを用いて染色し、４００倍の倍率で分析した。Ｈｅｉｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，８（１２）：ｅ８４２３２に記載されているように、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色を用いて破骨細胞数を同定した。
【０２２５】
脱灰大腿骨の組織形態計測及び免疫組織化学
骨切り術後３または１０日目に殺処分したマウスの大腿骨を４％ホルマリン中に固定し、２０％エチレンジアミン四酢酸（ｐＨ  ７．２〜７．４）を用いて１０〜１２日間脱灰し、上昇エタノール系列での脱水後にパラフィンに包埋した。厚さ７μｍの縦断面を調製し、組織定量のためにサフラニンＯを用いて染色した。ミッドカイン及びβカテニンの免疫組織化学的染色を、以下の抗体を用いて行った：ポリクローナルヤギ抗マウスミッドカイン抗体（ｓｃ−１３９８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダラス、ＵＳＡ）、ポリクローナルウサギ抗マウスβカテニン抗体（ＡＢ１９０２２、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｔｏｍｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ベルリン、ドイツ）、ビオチン結合ロバ抗ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ′）２（ｓｃ−３８５４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＵＳＡ）。種特異的非標的化免疫グロブリンをアイソタイプ対照として用いた。色素原として３−アミノ−９−エチルカルバゾール（Ｚｙｔｏｍｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ヘマトキシリン（Ｗａｌｄｅｃｋ、ミュンスター、ドイツ）を用いて切片を対比染色した。画像解析ソフトウェアＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４（Ａｄｏｂｅ、ダブリン、アイルランド）を用いて、βカテニンの陽性染色領域の定量を行った。カラーピッカーツール及び公差４０を用いて、陽性染色の色域を決定した。陽性染色されたピクセルをヒストグラムで計数し、画像の全ピクセルに対して計算して、陽性染色領域の割合を決定した。
【０２２６】
統計解析
偽手術／ＯＶＸマウスを用いた実験の統計解析を、有意性に関してクラスカルワリス検定及びＤｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を用いて行った。すべての結果を、中央値、第１及び第３四分位数、ならびに最大値及び最小値を有するボックスプロットとして提示する。異常値（値が、第１四分位数−１．５×四分位範囲を下回るか、または第３四分位数＋１．５×四分位範囲を上回る）を小さな円としてマークした。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意であるとみなした。
【０２２７】
結果
抗ミッドカイン抗体による治療は、骨粗鬆症性骨折の治癒を加速させた
生体力学的試験により、ＯＶＸがビヒクル処置マウスの相対的曲げ剛性を有意に低下させたことが確認された。抗ミッドカイン抗体による治療により、相対的曲げ剛性は、偽手術群においてはわずかに、ＯＶＸ群においては有意に増加した（図５Ａ）。骨折仮骨のμＣＴ分析は、ＯＶＸ後のＢＶ／ＴＶの低下、及び抗体処置後のＢＶ／ＴＶの増強を示した（図５Ｂ）。仮骨の大きさ及び幾何学的形状は、ＯＶＸまたはミッドカインＡｂ処置によっては影響を受けなかった（図５、Ｃ及びＤ）。骨折仮骨組織組成の組織形態計測分析は、手術後１０日目の処置群間で有意差を示さなかった（図５、Ｅ〜Ｇ）。しかしながら、２３日目に、骨折仮骨の骨量はＯＶＸ後に有意に減少し、抗ミッドカイン抗体の処置によって有意に逆転した（図５、Ｅ及びＨ）。抗ミッドカイン抗体で処置したＯＶＸマウスでは、繊維組織含量が有意に減少した（図５、Ｇ及びＨ）。
【０２２８】
抗ミッドカイン抗体による治療は、骨粗鬆症マウスにおけるＭｄｋ血清レベルを低下させた
骨折の０、３、１０及び２３日後のミッドカインタンパク質血清レベルを表２に示す。明らかなように、いずれのマウスも、０日目に検出可能な循環ミッドカインタンパク質を有していなかった。骨折は、３日後の偽手術及びＯＶＸマウスの両方においてミッドカインタンパク質血清レベルを増加させた。しかしながら、ミッドカインタンパク質血清レベルは、ＯＶＸマウスにおいてのみ２３日目まで上昇したままであった。１０日目において、抗ミッドカイン抗体による処置は、ＯＶＸ動物におけるミッドカインタンパク質血清レベルを有意に低下させた。
表２：３か月齢の偽手術及び卵巣摘出（ＯＶＸ）マウスにおける骨折治癒中のミッドカイン（Ｍｄｋ）血清レベル；ｎ．ｄ．：検出不能。ｄ０：手術前の値。（ｎ＝５〜７／群、平均±標準偏差として提示）。クラスカルワリス検定。
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【０２２９】
抗ミッドカイン抗体による治療は、ＯＶＸ誘発性のβカテニン発現の低下を無効化した
ＯＶＸは、１０日目の偽手術動物に比べて、若年マウスの骨折仮骨におけるβカテニン陽性領域を有意に減少させた（図６）。抗ミッドカイン抗体による処置は、偽手術マウスにおいてはβカテニン発現に変化を与えなかったが、一方、ＯＶＸマウスではβカテニン陽性領域の割合が有意に増加した。
【０２３０】
抗ミッドカイン抗体による治療は、骨粗鬆症マウスの無傷の大腿骨及び椎体の骨含量を増強した
抗ミッドカイン抗体による治療により、ＯＶＸマウスの仮骨中の骨含量が有意に増強されたことから、無傷の骨に対する効果についても調べた。抗体処置は、ＯＶＸ動物の無傷の大腿骨における皮質ＢＭＤを増加させたが（図７Ａ）、一方、皮質の厚さはすべての群において影響を受けなかった（図７Ｂ）。無傷の大腿骨の骨梁領域の評価により、ＯＶＸマウスにおける骨粗鬆症表現型を確認した；ビヒクル処置マウスでは、骨梁ＢＶ／ＴＶ及び数が有意に減少した。抗ミッドカイン抗体による治療は、ＯＶＸマウスにおける骨梁骨ＢＭＤ、ＢＶ／ＴＶ及び厚さを有意に増加させた（図７、Ｃ〜Ｇ）。偽手術マウスの骨パラメータは、抗体処置後わずかに増加したに過ぎなかった。
【０２３１】
大腿骨と共通して、ＯＶＸは、ビヒクル処置マウスの椎体における骨梁ＢＶ／ＴＶ及び数の減少ももたらした（図８）。抗ミッドカイン抗体による治療は、ＯＶＸ動物における椎体骨梁骨ＢＭＤ、ＢＶ／ＴＶ及び厚さを有意に増加させた（図８、Ｂ〜Ｄ）。抗体治療は、偽手術マウスでは大腿骨よりも脊椎の骨梁骨に大きな影響を与え；骨梁  ＢＭＤ及び厚さは、抗ミッドカイン抗体による治療によって有意に向上したが、一方、骨梁ＢＶ／ＴＶ及び数は、偽手術動物では変化しないままであった（図８、Ｃ及びＥ）。
【０２３２】
実施例３  −  抗ミッドカイン抗体による細胞の処置は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのβカテニンシグナル伝達に対するミッドカインの負の影響を減少させた
マウスの骨折治癒中の骨芽細胞活性が抗ミッドカイン抗体による処置後に増強されるという知見に基づいて、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、ＡＴＤＣ５細胞、Ｃ５７ＢＬ／６初代骨芽細胞及びＣ５７ＢＬ／６間葉系幹細胞におけるミッドカインタンパク質または抗ミッドカイン抗体による処置の効果を決定しようとした。
【０２３３】
方法
細胞培養条件
前造骨性ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツから入手し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ケルベ、ドイツ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）及び１％Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｍｅｒｃｋ）を含有するα−最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。培養培地に１０ｍＭのβ−グリセロリン酸及び０．２ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することによって、骨分化を誘導した。増殖及び分化実験のために、細胞を、それぞれ６または２４ウェルプレートに２０，０００細胞／ｃｍ２で播種した。繰り返し伸展刺激実験では、ＦＣＳコーティングしたシリコンディッシュに、細胞を２００，０００細胞／ディッシュでプレーティングした。
【０２３４】
ＡＴＤＣ５軟骨前駆細胞をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、Ｓｈｕｋｕｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １３３：４５７−４６８に記載されるように、５％ＦＣＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｍｅｒｃｋ）、１０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン及び３×１０−８Ｍ亜セレン酸ナトリウム（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地及びハムＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：１混合物中で培養した。細胞を１０，０００細胞／ｃｍ２で６ウェルプレートに播種した。正常培地に、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５ｎｇ／ｍｌヒトトランスフォーミング増殖因子β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を補充することにより、軟骨分化を誘導した。
【０２３５】
３〜４日齢のＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスからマウス初代骨芽細胞を採取し、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１６８：８９９−９１０に記載されている条件に従って培養した。初代骨芽細胞をＦＣＳコーティングしたシリコンディッシュに２００，０００細胞／ディッシュで播種し、１０ｍＭβ−グリセロリン酸及び０．２ｍＭアスコルビン酸−２−リン酸を培地に添加することにより、２１日間分化させ、繰り返し伸展刺激に供した。
【０２３６】
プラスチック付着によって選択し、Ｈｕｅｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１９２４−１９３４に記載されているように培養した６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの長骨をフラッシングすることにより、骨髄由来（ｍＭＳＣ）を単離した。細胞を２４ウェルプレートに７，５００細胞／ウェルで播種し、１０ｍＭβ−グリセロリン酸及び０．２ｍＭアスコルビン酸−２−リン酸を培地に添加することにより、１０日間分化させた。すべての実験は、２連または３連で３回行った。
【０２３７】
それぞれの場合において、指定の細胞培養の培地に、１００ｎｇ／ｍｌ（Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルグ、ドイツ）の組換えミッドカインタンパク質及び２μｇ／ｍｌの抗ミッドカイン抗体を添加した。
【０２３８】
すべての実験は、２連で３回実施した。
【０２３９】
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ
ＭＴＴアッセイを用いて、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞及びマウスＭＳＣの増殖を測定した。簡潔に述べると、細胞を９６ウェルプレートに３，０００細胞／ウェルで２４時間播種した後、１０μｌの１２ｍＭ  ＭＴＴ、１００ｎｇ／ｍｌミッドカインタンパク質及び／または抗ミッドカイン抗体（２μｇ／ｍｌ）を、指定のウェルに添加し、６時間インキュベートした。上清を除去し、１５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した。１０分間振とうした後、吸光度を４９０ｎｍで測定し、増殖速度を未処置細胞と比較して計算した。
【０２４０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機械的負荷
Ｋａｓｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．３３：４５−５１に記載されているように、１４または２１日目に、均質的な繰り返し伸展刺激により、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞及び初代骨芽細胞の機械的負荷を行った。２％の正弦波ひずみ及び１Ｈｚの周波数を３０分間印加した。機械的負荷の３０分前に、組換えミッドカインタンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）及び／または抗ミッドカイン抗体（２μｇ／ｍｌ）を添加した。これに並行して、負荷を行わない対照ディッシュを調製した。
【０２４１】
リアルタイム―ＲＴ−ＰＣＲ
１０μｌ／ｍｌのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）中で細胞を溶解した。可溶化液を、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラムを用いてホモジナイズし、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて全ＲＮＡを単離し（いずれもＱｉａｇｅｎ）、一方、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅキットを用いてＤＮＡを消化した（Ｑｉａｇｅｎ）。すべての工程は製造業者のプロトコールに従って実施した。１μｇの全ＲＮＡをＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全容量２０μｌで製造業者の指示書に従ってｃＤＮＡに逆転写した。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＱＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、アムステルダム、オランダ）を使用して、全容量２５μｌで製造業者のプロトコールに従って定量的ＰＣＲを行った。グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素をハウスキーピング遺伝子として使用した（Ｆ：５′−ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＧＧ−３′及びＲ：５′−ＧＧＡ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＣＴ−３）。骨形成細胞の分化を、アルカリホスファターゼの特異的プライマー（Ａｌｐｌ；Ｆ：５′−ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＴＣＣ  ＣＡＣ  ＧＴＴ  ＴＴ−３′及びＲ：５′−ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＡＧ−３′）を用いて分析した。ＬｉｎＲｅｇＰＣＲソフトウェアを使用して、Ｒａｍａｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３３９：６２−６６に記載されているように、ＰＣＲ効率補正を用いるΔΔＣＴ法を用いて、相対的遺伝子発現を計算した。
【０２４２】
ウエスタンブロット分析
１０μｇの細胞溶解物タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離し、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ、ハーキュリーズ、ＵＳＡ）に転写した。この膜を、α−チューブリン、ｃＦＯＳ、βカテニン、ホスホβカテニン（Ｓｅｒ３３／３７／Ｔｈｒ４１）（すべてＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ダルムシュタット、ドイツ）、アルカリホスファターゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＬＲＰ−１（Ａｂｃａｍ）、ＬＲＰ−６、ホスホ−ＬＲＰ−６（いずれもＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）またはＭｄｋ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対する抗体の存在下、それぞれ４℃で一晩インキュベートした。タンパク質を可視化するために、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体の存在下でインキュベートし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で展開した。Ｆｕｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ、エバーハルツェル、ドイツ）を用いてタンパク質バンドを視覚化した。
【０２４３】
免疫共沈降
細胞を６ウェルプレート中で５日間分化させ、ミッドカインタンパク質とともに氷冷ＰＢＳ中で１時間インキュベートした。架橋剤溶液（１０ｍＭ  ＤＳＰ）を室温で３０分間添加した。細胞を停止溶液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ）とともに１５分間インキュベートし、２回洗浄し、ＩＰ−溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて溶解させた。４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離することにより、細胞片を除去した。ヤギＩｇＧまたはヤギ抗ミッドカイン抗体のいずれかと結合させたプロテインＡセファロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を溶液に添加し、４℃で一晩インキュベートした。複合体を１２，０００ｇで１分間遠心分離し、溶解緩衝液で洗浄した。ＳＤＳ試料緩衝液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ＋８．５％グリセリン＋１％ＳＤＳ＋０．１％ＤＴＴ）中、９６℃で５分間、及び３７℃で３０分間インキュベートすることにより、タンパク質複合体をビーズから溶解させた。免疫共沈降したタンパク質をウェスタンブロッティングによって可視化した。
【０２４４】
結果
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の増殖に対するミッドカインタンパク質及び抗ミッドカイン抗体の効果を、ＭＴＴアッセイを用いて評価した。ミッドカインタンパク質または抗ミッドカイン抗体刺激の６時間後の群間に差異は観察されなかった（図９Ａ）。しかしながら、分化の５日目、組換えミッドカインタンパク質による刺激は、アルカリホスファターゼ（Ａｌｐｌ）及びｃＦＯＳ発現を有意に下方制御した（図９、Ｂ及びＣ）。抗ミッドカイン抗体を用いたさらなる処置は、ミッドカインにより誘導される効果を無効化した。
【０２４５】
機械的刺激に対する骨芽細胞応答に対するミッドカインタンパク質の影響を分析するために、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、繰り返し伸展刺激に供した（図９Ｄ）。組換えＭｄｋは、これらの細胞によって機械的に誘導されるｃＦｏｓ遺伝子発現を下方制御したが、一方、抗ミッドカイン抗体とのさらなるインキュベーションはこの効果を有意に減弱させた。
【０２４６】
骨折治癒の間の推定ミッドカイン受容体を調べるために、ミッドカインタンパク質で刺激したマウス軟骨形成ＡＴＤＣ５細胞及び骨細胞前駆ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いて免疫沈降を行った。興味深いことに、以前に記載された細胞内ミッドカイン相互作用タンパク質ＬＲＰ−１及びヌクレオリン（Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６：８４０５−１３；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２７：１７３１−９；Ｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６：１０６３−１０６８）は、ＡＴＣＣ５細胞においてのみミッドカインタンパク質で免疫沈降し、一方、標準的なＷｎｔシグナル伝達受容体ＬＲＰ−６（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：５９７７−８１）は、両方の細胞型においてミッドカインタンパク質で免疫沈降させた（図９Ｅ）。沈殿したＬＲＰ−６タンパク質の量は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中の外来性ミッドカインタンパク質によって増加した（図９Ｅ）。この知見に基づいて、これらの細胞に対するミッドカイン誘導性効果におけるＬＲＰ−６の役割を上記のように調べた。ミッドカインタンパク質刺激の６時間後にＬＲＰ−６リン酸化が減少することが示された（図９Ｆ）。さらに、ミッドカインタンパク質刺激後、全βカテニン及び活性βカテニンタンパク質の発現が減少し、これらの効果は抗ミッドカイン抗体によって減弱した。
【０２４７】
次に、ミッドカインタンパク質の免疫沈降を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから分離した卵巣初代骨芽細胞及びｍＭＳＣにおいて行った。ここでも、ＬＲＰ−６はミッドカインタンパク質と免疫共沈降することが示された（図９Ｇ）。この知見に基づいて、初代細胞に対するミッドカインタンパク質及び抗ミッドカイン抗体の効果を評価した。初代骨芽細胞における組換えミッドカインタンパク質処置もまた、機械的に誘導されるｃＦｏｓ遺伝子発現を下方制御するが、その一方で、抗ミッドカイン抗体とのさらなるインキュベーションがこの効果を有意に減弱させることが示された（図１０Ａ）。ｍＭＳＣと組換えミッドカインタンパク質とのインキュベーションは増殖速度を変化させなかったが（図１０）、一方、Ａｌｐｌ発現は減少し（図１０Ｃ）、これは抗ミッドカイン抗体による処置によって同様に無効化された。
【０２４８】
実施例４―エストロゲン欠損マウスにおける早期免疫応答及び骨折治癒に対する抗ミッドカイン抗体による治療の効果
エストロゲン欠乏条件下の閉経後の骨粗鬆症の女性において、骨折治癒が遅延することが知られている。エストロゲン欠乏症はまた、創傷治癒中の免疫系及び炎症反応に影響を及ぼすことも知られている。適切な骨治癒にはバランスの取れた免疫応答が必要であるため、本発明者らは、マウスにおける骨折後の早期免疫応答に対するエストロゲン枯渇の影響を判定しようとした。本発明者らは、エストロゲン欠乏が骨折後の早期免疫応答を増加させ、ミッドカイン（前炎症性サイトカイン及び骨組織修復の負の制御因子）などの炎症性メディエーターがこの効果に関与し得るとの仮説を立てた。この仮説を試験するために、本発明者らは、ＯＶＸマウス及び偽手術マウスの骨折血腫における免疫細胞及び炎症性サイトカインの存在を分析した。本発明者らはまた、ＯＶＸマウス及び偽手術マウスにおける早期免疫応答及び骨折治癒に対する抗ミッドカイン抗体による処置の効果を判定した。
【０２４９】
方法
動物
本実験で使用したすべてのマウスは、ウルム大学により提供された雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスであった。マウスを、ケージ（３７０ｃｍ２）あたり２〜４匹の動物の群で、実験全体にわたって、水及びフィトエストロゲンを含まない食餌を用いて、１４時間の明期及び１０時間の暗期の概日リズムで、自由に飼育した。
【０２５０】
治療
簡潔に述べると、３〜４月齢のマウスを無作為に２つの群に分け、実施例２に記載の方法に従って、それぞれに、両側性の偽手術または卵巣摘出（ＯＶＸ）を施した。偽手術またはＯＶＸを行ってから８週間後、動物に対し、外部固定装置（軸剛度３．０Ｎ／ｍｍ、ＲＩＳｙｓｔｅｍ）を用いて安定化させた０．４ｍｍのギグリー線鋸（ＲＩＳｙｓｔｅｍ、ダボス、スイス）を使用して、右大腿骨の中央骨幹で標準的骨切り術を施した。骨切り術直後に治療を開始し、骨折仮骨に対するミッドカインの効果を評価した。治療中に、偽手術群の動物の半数及びＯＶＸ群の動物の半数に、抗ミッドカイン抗体ＩＰ−１０を与え、これについては２５ｍｇ／ｋｇで週３回、３週間、皮下投与した。これに並行して、偽手術群及びＯＶＸ群における残りの動物を、ビヒクルのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて処置した。４つの群の各々からの動物を、骨切り後０、３、または２３日目に、二酸化炭素を用いて殺処分した（各時点でｎ＝５〜６／群）。さらなる分析のために、骨折及び無傷の大腿骨ならびに子宮をすべてのマウスから取り出した。
【０２５１】
マイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）
２３日目に殺処分したマウス由来の大腿骨を、８μｍ（５０ｋＶ、２００ｍＡ）のボクセル解像度で作動するμＣＴスキャン装置（Ｓｋｙｓｃａｎ１１７２、コンティフ、ベルギー）を用いて分析した。各スキャン内において規定のヒドロキシアパタイト密度（２５０ｍｇ／ｃｍ３及び７５０ｍｇ／ｃｍ３）を有する２つのファントムを用いて骨密度（ＢＭＤ）を評価した。Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｂｏｎｅ，４４（２）：２２５−２４４に記載されているように、６４２ｍｇヒドロキシアパタイト／ｃｍ３の全体的な閾値を用い、及びＢｏｕｘｓｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，２５（７）：１４６８−１４８６に記載されているように、μＣＴ分析のための米国骨代謝学会（ＡＳＢＭＲ）に記載のガイドラインに従って、非鉱質化及び鉱質化組織の判別を行った。ＣＴｖｏｌソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて、２つの内側ピンホール間の骨折仮骨の３次元（３Ｄ）再構成を行った。
【０２５２】
蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析
骨折血腫中の炎症細胞を分析するために、ＦＡＣＳ分析を行った。骨切り術後１日目に、骨折大腿骨及び対側骨髄を採取した。手術用はさみを使用して骨折血腫を採取した。対側骨髄を、ＰＢＳを用いて洗い流した。骨折血腫を７０μｍセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、ダーラム、ノースカロライナ）に通して単一細胞の懸濁液を得、骨折血腫及び骨髄の細胞を溶血させた。マクロファージ（Ｌｙ６Ｇ−、Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋）、好中球（Ｌｙ−６Ｇ＋、Ｆ４／８０−、ＣＤ１１ｂ＋）、炎症性単球（Ｆ４／８０＋、Ｌｙ−６Ｇ＋、ＣＤ１１ｂ＋）、Ｂリンパ球（ＣＤ１９＋）、Ｔリンパ球（ＣＤ３＋）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ３＋、ＣＤ８＋）、及びＴヘルパーリンパ球（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋）の同定には、表３に示す抗体を用いた。特異的アイソタイプが一致する免疫グロブリン抗体（表３）を、陰性対照として用いた。細胞（骨折血腫：分離した細胞の総数；骨髄：１×１０６個の細胞）を抗体とともに３０分間氷上でインキュベートした。死細胞の識別には、７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ、Ｓｉｇｍａ、シュタインハイム、ドイツ）を使用した。ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ、アシュランド、オレゴン）を用いて、細胞を分析した。
表３．フローサイトメトリーに使用した抗体
2019510080.tif 000006
【０２５３】
脱灰大腿骨の組織形態計測及び免疫組織化学
骨切り術後３または１０日目に殺処分したマウスの大腿骨を４％ホルマリン中に固定し、２０％エチレンジアミン四酢酸（ｐＨ  ７．２〜７．４）を用いて１０〜１２日間脱灰し、上昇エタノール系列での脱水後にパラフィンに包埋した。厚さ７μｍの縦断面を調製した。表４に記載の抗体を用いて、ＩＬ−６、ミッドカイン、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１、Ｌｙ６Ｇ（好中球）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂリンパ球）、ＣＤ８（細胞傷害性Ｔリンパ球）及びＦ４／８０（マクロファージ）の免疫組織化学及び免疫蛍光染色を行った。種特異的非標的化免疫グロブリンをアイソタイプ対照として用いた。色素原として３−アミノ−９−エチルカルバゾール（Ｚｙｔｏｍｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ヘマトキシリン（Ｗａｌｄｅｃｋ、ミュンスター、ドイツ）を用いて切片を対比染色した。ＦＩＴＣ−ストレプトアビジンを免疫蛍光染色に使用し、ＤＡＰＩを用いて切片を対比染色した。切片を光学顕微鏡または蛍光顕微鏡（ＤＭＩ６０００Ｂ、Ｌｅｉｃａ、ヘーアブルーク、スイス）によって調べた。仮骨組織の量及び陽性染色された細胞の数を、画像解析ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  ＭＭＡＦ  １．４．０  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｅｉｃａ）によって測定した。
表４．免疫組織化学に使用した抗体
2019510080.tif 000007
【０２５４】
統計解析
統計解析を、ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、シカゴ、イリノイ）を使用して、正規分布についてのＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定及びＡＮＯＶＡ／ＬＳＤ事後検定を用いて行った。すべての結果は、平均及び標準偏差として示す。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意であるとみなした。サンプルサイズは、各時点でｎ＝５〜６／群であった。
【０２５５】
結果
ＯＶＸ誘発性骨粗鬆症及び骨折治癒遅延
予想通り、卵巣摘出に供したマウスの子宮は重度の萎縮を示し（図１１Ａ）、体重は有意に減少した（図１１Ｂ）。無傷の大腿骨のμＣＴ分析は、骨梁区画における骨粗鬆症表現型を示した（図１１Ｃ）。２３日目の骨折仮骨の分析により、骨カルスの発達が著しく阻害され、ＯＶＸに起因する皮質架橋が不十分であることが示された（図１１Ｄ）。
【０２５６】
ＯＶＸは、骨折血腫における好中球の数を増加させた
ＦＡＣＳ分析によって判定した手術後１日目の骨折血腫における免疫細胞の存在を、図１２Ａ及びＢに示す。先天性免疫系及び適応免疫系の細胞集団は、骨折部位におけるこの時点において、偽手術マウスとＯＶＸマウスの間に有意差はなかった。しかしながら、ＯＶＸマウスは、Ｂリンパ球の数を有意に増加させ、骨髄中のＴリンパ球の数を減少させた（図１２Ｃ）。Ｔリンパ球集団内では、細胞傷害性Ｔ細胞は有意に減少し、一方、Ｔヘルパー細胞は有意に増加した（図１２Ｄ）。さらに、炎症性単球及びマクロファージの数は影響を受けなかったが、一方、好中球の数は有意に増加した。
【０２５７】
骨折の３日後、骨折仮骨中の免疫細胞を免疫組織化学によって評価した。ＯＶＸ−マウスは、骨膜仮骨において有意に多数の好中球を示した（図１３Ａ）。好中球は、線維組織を取り囲む骨折間隙ならびに初期の骨膜の骨折仮骨に主に認められた（図１４）。主に骨切り開大部の近くの骨髄に位置するマクロファージの数は、群間で有意差はなかった（図１３Ｂ）。骨膜の骨折仮骨に位置するＢリンパ球または細胞傷害性Ｔリンパ球の数に差はなかった（図１３Ｃ及びＤ）。
【０２５８】
ＯＶＸは骨折仮骨におけるミッドカイン及びＩＬ−６発現を増加させた
骨折治癒の炎症期におけるミッドカインの役割を、免疫染色による仮骨中のミッドカインの局所発現を分析することによって調べた。３日目に、ＯＶＸマウスの骨折仮骨においてミッドカインが発現していた（図１５）。このタンパク質は、血腫組織から骨切り開大部に近い軟骨カルスにかけての骨膜移行領域に位置していた。ミッドカインは偽手術動物ではあまり発現していなかった。
【０２５９】
ミッドカイン発現がＩＬ−６発現と関連していることが知られていることから、及びＩＬ−６が好中球動員のための強力な誘導物質であることから、ＩＬ−６発現も免疫染色によって評価した。偽手術マウスでは、ＩＬ−６は筋組織及び内膜細胞で発現していたが、骨膜細胞では発現が少なかったのに対し、ＯＶＸマウスでは、骨折間隙に隣接する骨膜細胞において発現の増加を示した（図１５）。
【０２６０】
ＯＶＸ後のミッドカイン発現の上方制御が骨膜仮骨の好中球数の増加に関与している可能性があるため、阻害性ミッドカイン抗体による治療効果を評価した。手術後直ちに阻害性ミッドカイン抗体で処置したマウスは、未処置マウスに比べて骨折仮骨において有意に低い好中球数を示したが（図１３Ａ）、マクロファージ、Ｂリンパ球及び細胞傷害性Ｔリンパ球の数は有意に変化しなかった（図１３Ｂ〜Ｄ）。さらに、阻害性ミッドカイン抗体で処置したＯＶＸマウスは、骨折間隙の隣の骨膜細胞においてより低いＩＬ−６発現を示した（図１５）。炎症促進性サイトカインであるＣＣＬ２及びＣＸＣＬ１のタンパク質発現は、群間で類似していた（図１５）。
【０２６１】
結論
本試験の結果から、骨折１日後のＯＶＸマウスにおいて骨髄中のＢリンパ球の数が上昇し、一方、骨髄好中球及び総Ｔリンパ球の数は低下したが、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の比は増加したことが示された。Ｂリンパ球がいくつかの炎症性サイトカインを合成することが知られていること、ならびにＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ／ＯＰＧ系の活性調節因子であることを示唆する最近の知見から、このデータは、Ｂリンパ球数の増加と閉経時の骨量減少との間に強い相関性が存在するという結論を支持する。
【０２６２】
Ｂリンパ球及びＴリンパ球ならびに好中球は、骨折治癒結果に影響を与えるため、これらの細胞の数も早期骨折血腫において評価した。外傷後１日目にＯＶＸマウスと偽手術マウスとの間に差異は観察されなかったが、骨髄における細胞集団は異なっていた。この所見は、骨折仮骨への炎症細胞の初期動員が、エストロゲン欠乏症による影響を受けなかったことを示している。しかしながら、骨折後３日目には、エストロゲン欠乏マウスの骨膜仮骨に有意により多くの好中球が存在しており、このことはエストロゲン非存在下での骨折部位における好中球の長期動員及び／または生存延長を示している。これらのデータは、エストロゲン欠乏症が骨折治癒の炎症段階に及ぼす影響に、炎症促進性サイトカインであるミッドカインが関与している可能性があることを示唆している。
【０２６３】
実施例２に記載する試験において、ミッドカイン血清レベルは、骨折後３日目から２３日目にかけてエストロゲン欠損マウスにおいて増加したことが示された。この試験では、骨折後３日目のＯＶＸマウスの骨折仮骨において、ミッドカインの局所発現が増加したことが示された。ミッドカインは、好中球及びマクロファージの両方を化学誘引することが知られているため、ミッドカイン発現の増加が、ＯＶＸマウスの骨折仮骨に好中球が長期間存在することに関与している可能性が示唆された。この結論を支持するものとして、抗ミッドカイン抗体処置後に、好中球数の有意な低下が観察された。しかしながら、好中球動員のための最も重要なタンパク質の１つであるＣＸＣＬ１の発現には有意な変化は認められなかった。
【０２６４】
以前の研究は、ミッドカイン欠損マウスが、虚血性腎障害後の尿細管間質において、より少数の好中球及びマクロファージを示したこと、及びミッドカイン欠損が、治癒の再生期において骨折部位へのマクロファージの動員を遅延させたことを明らかにした（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：３４６３−３４６９）。しかしながら、本試験では、マクロファージの数または単球走化性タンパク質１（ＣＣＬ２）の発現に有意な変化は検出されなかった。さらに、ミッドカインがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢ細胞生存を制御することが示されたが、骨折仮骨におけるＢリンパ球またはＴリンパ球の数の変化は検出されなかった。このことから、エストロゲン欠損マウスの早期骨折仮骨におけるミッドカイン発現の増加は、主に好中球の動員及び生存に影響を及ぼすと考えられる。
【０２６５】
文献では、いくつかの炎症促進性サイトカインが、エストロゲン欠損被験体における炎症性障害の重篤度を高めることに関与すると記載されている。これらのサイトカインの１つがＩＬ−６であり、炎症細胞の動員にとって決定的な因子として知られている（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９３：３６０−３６９；Ｒｏｓｅ−Ｊｏｈｎ  Ｓ：（２０１５）Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２９：７８７−７９７）。さらに、いくつかの研究が、エストロゲン欠損マウスにおける組織損傷後のＩＬ−６発現の増加を実証している（Ａｙｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，１１７：１７３−１７９；Ｓｈｉｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，７２：１２１−１２９）。今回の試験では、ＯＶＸマウスの骨膜細胞において偽手術マウスに比べてより高いＩＬ−６発現が観察されたが、抗ミッドカイン抗体で処置した場合、偽マウス及びＯＶＸマウスのいずれにおいても減少した。このことから、エストロゲンの欠乏によるＩＬ−６発現の増加は、ＯＶＸマウスの骨折仮骨における好中球の増加に寄与し得るものであり、ミッドカインの遮断はＩＬ−６の減少をもたらし、骨折部位への好中球の動員を逆転させたと結論づけた。
【０２６６】
結論として、本試験は、エストロゲン欠乏症が、骨折後の早期炎症段階に対して有意に影響を及ぼしたことを示すものである。骨折部位におけるより高いミッドカイン及びＩＬ−６の発現は、仮骨における好中球数の増加と関連していた。逆に、実施例２で観察された骨粗鬆症マウスにおける骨折治癒の加速と並行して、抗体によるミッドカインの中和は好中球及びＩＬ−６存在量を減少させた。
【０２６７】
当業者であれば、本開示の広範な通常の範囲から逸脱することなく、上述の実施形態に多くの変形及び／または改変を行い得ることは理解するであろう。したがって、本実施形態は、すべての点で例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
【０２６８】
本明細書において論述及び／または参照するすべての刊行物は、その全体を本明細書に援用する。
【０２６９】
本明細書に含まれる文書、行為、材料、装置、物品等の論述は、単に本発明の文脈を提供することを目的とするものである。これらの事項のいずれかまたはすべてが、先行技術の基礎の一部を形成するか、または本出願の各請求の優先権の日以前に存在していた、本発明に関連する分野において一般的な知識であることを認めるものとして捉えるべきではない。
参考文献
・Ｋａｄｏｍａｔｓｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１１３１２−１３１８
・Ｔｏｍｏｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６５：１０７６５−１０７７０
・Ｍｕｒａｍａｔｓｕ（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：３５９−３７１
・ＷＯ２０００／１０６０８
・ＷＯ２００４／０７８２１０
・Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：６９３６−６９４６
・ＷＯ２００８／０５９６１６
・ＷＯ２０１２／１２２５９０
・Ｃａｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｕｒｇ．２１：５３８−５４７
・Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｈｕｍｅｒａｌ  ｎｏｎｕｎｉｏｎ．Ｈａｎｄ  Ｃｌｉｎ．２３：４４９−４５６
・Ｅｉｎｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，１１：４５−５４
・Ｈａｙｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．，３５５（補足資料）：３１−４０
・Ｅｉｎｈｏｒｎ  ＴＡ（２００３）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８５−Ａ（補足資料３）：８２−８８
・Ｇｉａｎｎｏｕｄｉｓ  ａｎｄ  Ｄｉｎｏｐｏｕｌｏｓ（２０１０）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｔｒａｕｍａ，２４（補足資料１）：Ｓ９−１６
・Ｂｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）ＣＭＡＪ，１６６：４３７−４４１
・Ｐｏｙｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｔｒａｕｍａ，２４：５２２−５２５
・Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）
・Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）
・Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）
・Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５  ａｎｄ  １９９６）
・Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編集者），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての更新を含む）
・Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）
・Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（編集者）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までのすべての更新を含む）
・Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７  ａｎｄ  １９９１
・Ｂｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２：３０９−３２０
・Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７
・Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３
・Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８．
・ＷＯ１９９４／００７９２１
・ＷＯ１９９８／０４４００１
・Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７（１）５５−７７
・ＷＯ２００８／０５９６１６
・ＷＯ２０１２／１２２５９０
・ＷＯ２０１４／０７０６４２
・Ｓｕｎ  Ｘ．Ｚ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５６（１２）：１３３９−４８
・Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９：１１７１−７７
・Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８（３）：４４３−４５３
・Ｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｍｙｓｚｋａ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：５４；
・Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ  Ｐ，（１９９８）Ａｎａｌｙｓｔ．１２３（７）：１５９９−１６０３
・Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ  Ｍ（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２７：３３５−３４０
・ＵＳ４，６７６，９８０
・ＷＯ１９９１／０００３６０
・ＷＯ１９９２／２００３７３
・ＥＰ５８６５０５
・Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６（４）：１１９１−１１９５
・Ｓｈｏｐｅｓ  Ｂ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（９）：２９１８−２９２２
・Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ＪＡＭＡ，２６１：８８４−８８８
・ＵＳ４１９６２６５
・ＷＯ２００２／０６６６３０
・Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９７：８５−９５
・ＵＳ６，３００，０６４
・ＵＳ５，８８５，７９３
・ＵＳ４，８１６，５６７
・ＵＳ５，８０７，７１５
・ＵＳ５，２２５，５３９
・ＵＳ５，５８５，０８９
・ＵＳ５，５６５，３３２
・ＷＯ２０００／０３４３１７
・ＷＯ２００４／１０８１５８
・ＷＯ２００４／０６４７２４
・ＷＯ１９９４／００４６７８
・ＷＯ１９９７／０４９８０５
・ＷＯ２００５／１１８６２９
・ＷＯ１９９８／０４４００１
・ＷＯ１９９４／００７９２１
・ＵＳ２００６０２６３３６７
・ＵＳ７，２３５，６４１
・ＵＳ４，８１６，５６７
・ＵＳ５，５３０，１０１
・ＷＯ１９９９／０５７１３４
・ＵＳ２００６０２２８３６４
・ＵＳ２００８０２６０７５７
・ＵＳ  ６，３０６，６１０
・Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１
・Ｒｏｎｔｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，２８：１４５６−１４６２
・Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｂｏｎｅ，４４（２）：２２５−２４４
・Ｗｅｈｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，３２（８）：１００６−１０１３
・Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｂｏｎｅ，５０：１３５７−６７
・Ｂｏｕｘｓｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，２５（７）：１４６８−１４８６
・Ｈｅｉｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，８（１２）：ｅ８４２３２
・Ｌｉｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｂｏｎｅ，４８：９４５−９５１
・Ｈａｆｆｎｅｒ−Ｌｕｎｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，９（１２）：ｅ１１６２８２
・Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１６８：８９９−９１０
・Ｈｕｅｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１９２４−１９３４
・Ｋａｓｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．３３：４５−５１
・Ｒａｍａｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３３９：６２−６６
・Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６：８４０５−１３
・Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２７：１７３１−９
・Ｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６：１０６３−１０６８
・Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：３４６３−３４６９
・Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９３：３６０−３６９
・Ｒｏｓｅ−Ｊｏｈｎ  Ｓ：（２０１５）Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２９：７８７−７９７
・Ａｙｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，１１７：１７３−１７９
・Ｓｈｉｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，７２：１２１−１２９
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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