(57)【要約】本開示は、miRNAバイオマーカーの発現レベルに基づく、食道癌に対する治療的処置および診断法に関する。本開示の局面は、患者における食道癌（EC）を治療する方法に関し、該方法は、対照サンプルにおける、mir-15b、miR-17、mir-18a、mir-21、mir-23a、mir-24-2、mir-25、mir-27a、mir-93、mir-103、mir-106b、mir-129-2、mir-139、mir-146b、mir-148a、mir-151、miR-155、mir-181a-1、mir-181a、mir-181b-1、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-192、mir-194-1、mir-194-2、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-205、mir-215、mir-223、mir-224、mir-335、mir-338、mir-375、mir-421、mir-484、mir-505、mir-769、mir-944、mir-1468、mir-3648、およびlet-7iより選択される1種または複数種のmiRNAの発現レベルと比べて、患者が、患者由来のサンプルにおける該1種または複数種のmiRNAの上昇したまたは減少したレベルの発現を有すると判定される場合、患者を食道癌であると診断する工程；ならびに診断された患者に有効量の食道治療を施す工程を含む。2019529351.tif 000014
2019529351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
患者に食道癌治療を施す工程であって、対照サンプルにおける、miR-103、miR-106b、miR-151、miR-17、miR-181a、miR-21、miR-25、およびmiR-93より選択される1種または複数種のmiRNAの発現レベルと比べて、該患者が、該患者由来のサンプルにおける該1種または複数種のmiRNAの上昇したレベルの発現を有すると判定された、工程
を含む、食道癌を有すると判定された患者を治療するための方法。
【請求項２】
患者由来のサンプルが血清サンプルを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
食道癌が食道扁平上皮細胞癌（ESCC）である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
以下の工程：
対照サンプルにおける、mir-15b、miR-17、mir-18a、mir-21、mir-23a、mir-24-2、mir-25、mir-27a、mir-93、mir-103、mir-106b、mir-129-2、mir-139、mir-146b、mir-148a、mir-151、miR-155、mir-181a-1、mir-181a、mir-181b-1、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-192、mir-194-1、mir-194-2、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-205、mir-215、mir-223、mir-224、mir-335、mir-338、mir-375、mir-421、mir-484、mir-505、mir-769、mir-944、mir-1468、mir-3648、およびlet-7iより選択される1種または複数種のmiRNAの発現レベルと比べて、患者が、該患者由来のサンプルにおける該1種または複数種のmiRNAの上昇したまたは減少したレベルの発現を有すると判定される場合、該患者を食道癌であると診断する工程；ならびに
該診断された患者に有効量の食道治療を施す工程
を含む、患者における食道癌（EC）を治療する方法。
【請求項５】
以下の工程：
患者に食道癌治療を施す工程であって、対照サンプルにおける、mir-15b、miR-17、mir-18a、mir-21、mir-23a、mir-24-2、mir-25、mir-27a、mir-93、mir-103、mir-106b、mir-129-2、mir-139、mir-146b、mir-148a、mir-151、miR-155、mir-181a-1、mir-181a、mir-181b-1、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-192、mir-194-1、mir-194-2、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-205、mir-215、mir-223、mir-224、mir-335、mir-338、mir-375、mir-421、mir-484、mir-505、mir-769、mir-944、mir-1468、mir-3648、およびlet-7iより選択される1種または複数種のmiRNAの発現レベルと比べて、該患者が、該患者由来のサンプルにおける該1種または複数種のmiRNAの上昇したまたは減少したレベルの発現を有すると判定された、工程
を含む、食道癌を有すると判定された患者を治療するための方法。
【請求項６】
以下の工程：
患者由来のサンプルにおける、mir-15b、miR-17、mir-18a、mir-21、mir-23a、mir-24-2、mir-25、mir-27a、mir-93、mir-103、mir-106b、mir-129-2、mir-139、mir-146b、mir-148a、mir-151、miR-155、mir-181a-1、mir-181a、mir-181b-1、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-192、mir-194-1、mir-194-2、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-205、mir-215、mir-223、mir-224、mir-335、mir-338、mir-375、mir-421、mir-484、mir-505、mir-769、mir-944、mir-1468、mir-3648、およびlet-7iより選択される1種または複数種のmiRNAの発現のレベルを判定する工程；ならびに
該1種または複数種のmiRNAの発現レベルに基づいて食道癌を診断する工程
を含む、患者を食道癌であると診断するための方法。
【請求項７】
前記1種または複数種の検出されたmiRNAの発現レベルが、対照サンプルと比較して有意に異なる場合、患者はECであると診断される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
患者からサンプルを獲得する工程
をさらに含む、請求項4〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記1種または複数種のmiRNAの発現のレベルが、対照と比較して上昇している、請求項4〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記1種または複数種のmiRNAの発現のレベルが、対照と比較して減少している、請求項4〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
対照が、非EC患者サンプルにおける前記1種または複数種のmiRNAのレベルである、請求項4〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
患者由来のサンプルにおける前記1種または複数種のmiRNAの発現のレベルを判定する工程
をさらに含む、請求項4〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
対照サンプルが非癌性生物学的サンプルである、請求項4〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記1種または複数種のmiRNAが、mir-21、mir-93、mir-103、mir-151、mir-25、mir-106b、mir-27a、miR-17、および/またはmir-181aのうちの1種または複数種を含む、請求項4〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記1種または複数種のmiRNAがmir-93を含む、請求項4〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記1種または複数種のmiRNAが、mir-93およびmir-21を含む、請求項4〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記1種または複数種のmiRNAが、mir-103、mir-106b、mir-151、mir-17、miR-181a、mir-21、miR-25、およびmir-93のうちの少なくとも2種を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記1種または複数種のmiRNAが、mir-181a、mir-21、およびmir-17を含む、請求項4〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記1種または複数種のmiRNAが、mir-181a、mir-17、mir-21、およびmir-27aを含む、請求項4〜14または18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記1種または複数種のmiRNAが、mir-21、mir-93、およびmir-27aを含む、請求項4〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記1種または複数種のmiRNAがmir-205を含む、請求項4〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記1種または複数種のmiRNAが、let-7i、mir-103、mir-106b、mir-17、mir-151、mir-155、mir-181a、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-18a、mir-21、mir-223、mir-23a、mir-25、mir-484、mir-505、およびmir-93を含む、請求項4〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
食道癌が食道扁平上皮細胞癌（ESCC）である、請求項4〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
前記1種または複数種のmiRNAが、mir-196a-1、mir-196b、および/またはmir-21を含む、請求項4〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
食道癌が食道腺癌（EAC）である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
患者サンプルおよび/または対照サンプルが組織サンプルである、請求項4〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
患者サンプルおよび/または対照サンプルが血清サンプルである、請求項4〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
食道癌治療が、化学療法、放射線療法、外科手術、またはその組み合わせを含む、請求項4〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
化学療法が、カルボプラチン、パクリタキセル、シスプラチン、5-フルオロウラシル、エピルビシン、ドセタキセル、カペシタビン、オキサリプラチン、およびその組み合わせを含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
患者由来の生物学的サンプルにおける前記1種または複数種のmiRNAの発現レベルを測定する工程
をさらに含む、請求項4〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
患者由来の生物学的サンプルにおける前記1種または複数種のmiRNAの発現レベルと、対照生物学的サンプルにおける前記1種または複数種のmiRNAの発現レベルとを比較する工程
をさらに含む、請求項4〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
患者が、ステージI、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IIIC、またはIVの食道癌を有するかまたは有すると判定される、請求項4〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
患者由来の生物学的サンプルが、原発性腫瘍由来のサンプルである、請求項4〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
食道癌が、カテゴリーT1、T2、T3、またはT4の食道癌を含む、請求項4〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
食道癌が、カテゴリーN0、N1、N2、またはN3の食道癌を含む、請求項4〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
食道癌が、カテゴリーM0またはM1の食道癌を含む、請求項4〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
食道癌がリンパ節転移を含む、請求項4〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
食道癌が遠隔転移を含む、請求項4〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
遠隔転移が、肺、肝臓、および/または骨転移である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
上昇したまたは減少したレベルの発現が、カットオフ値から判定される、請求項4〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
カットオフ値がROC解析によって決定される、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
患者が食道癌について以前に治療を受けている、請求項4〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
mir-15b、mir-17、mir-18a、mir-21、mir-23a、mir-24-2、mir-25、mir-27a、mir-93、mir-103、mir-106b、mir-129-2、mir-139、mir-146b、mir-148a、mir-151、miR-155、mir-181a-1、mir-181a、mir-181b-1、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-192、mir-194-1、mir-194-2、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-205、mir-215、mir-223、mir-224、mir-335、mir-338、mir-375、mir-421、mir-484、mir-505、mir-769、mir-944、mir-1468、mir-3648、およびlet-7iより選択される1種または複数種のmiRNAを検出するための作用物質を含む、キット。
【請求項４４】
前記作用物質が、生物学的サンプルからの前記miRNAの増幅のための1種または複数種の核酸プローブを含む、請求項43記載のキット。
【請求項４５】
前記作用物質が標識されている、請求項43または44記載のキット。
【請求項４６】
使用のための取扱説明書
をさらに含む、請求項43〜45のいずれか一項記載のキット。
【請求項４７】
EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットであって、該差次的に発現したmiRNAが、mir-21、mir-93、mir-106b、mir-27a、miR-17、およびmir-181aからなる、キット。
【請求項４８】
EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットであって、該差次的に発現したmiRNAが、mir-103、mir-106b、mir-151、mir-17、mir-181a、mir-21、mir-25、およびmir-93からなる、キット。
【請求項４９】
EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットであって、該差次的に発現したmiRNAが、let-7i、mir-103、mir-106b、mir-17、mir-151、mir-155、mir-181a、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-18a、mir-21、mir-223、mir-23a、mir-25、mir-484、mir-505、およびmir-93からなる、キット。
【請求項５０】
EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットであって、該差次的に発現したmiRNAがmir-205からなる、キット。
【請求項５１】
EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットであって、該差次的に発現したmiRNAがmir-196a-1からなる、キット。
【請求項５２】
EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットであって、該差次的に発現したmiRNAがmir-196bからなる、キット。
【請求項５３】
EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットであって、該差次的に発現したmiRNAがmir-21からなる、キット。
【請求項５４】
1つまたは複数の対照を検出するための1種または複数種の作用物質
をさらに含む、請求項47〜53のいずれか一項記載のキット。
【請求項５５】
生物学的サンプルから核酸を単離するための試薬
をさらに含む、請求項43〜54のいずれか一項記載のキット。
【請求項５６】
試薬が、血清サンプルから核酸を単離するためのものである、請求項55記載のキット。
【請求項５７】
以下の工程：
ヒト患者からサンプルを獲得する工程；
該サンプルとmiRNA検出剤とを接触させることによって、1種または複数種のmiRNAが該サンプルにおいて上昇したまたは低下した発現を有するかどうかを検出する工程であって、該1種または複数種のmiRNAが、mir-15b、miR-17、mir-18a、mir-21、mir-23a、mir-24-2、mir-25、mir-27a、mir-93、mir-103、mir-106b、mir-129-2、mir-139、mir-146b、mir-148a、mir-151、miR-155、mir-181a-1、mir-181a、mir-181b-1、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-192、mir-194-1、mir-194-2、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-205、mir-215、mir-223、mir-224、mir-335、mir-338、mir-375、mir-421、mir-484、mir-505、mir-769、mir-944、mir-1468、mir-3648、およびlet-7iより選択される、工程
を含む、患者における1種または複数種のmiRNAを検出する方法。
【請求項５８】
前記1種または複数種のmiRNAが患者由来のサンプルにおいて上昇している場合、食道癌について患者を治療する工程
をさらに含む、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
患者由来のサンプルにおける前記miRNAの発現レベルと、対照サンプルにおける前記miRNAの発現レベルとを比較する工程
をさらに含む、請求項57または58記載の方法。
【請求項６０】
サンプルが血清サンプルを含む、請求項57〜59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
対照サンプルが、食道癌（EC）を有しないヒト患者由来の生物学的サンプルを含む、請求項59〜60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
ヒト患者が、食道癌を有すると疑われる、請求項57〜61のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本出願は、参照によりその全体として本明細書によって組み入れられる、2016年8月4日に提出された米国仮特許出願第62/371,028号に対する優先権の恩典を主張する。
【０００２】
政府支援の声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号R01 CA184792の下で政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
1．発明の分野
本発明は、概して、分子生物学および腫瘍学の分野に関する。より具体的には、マイクロRNA（miRNA）分子に関連する方法および組成物、ならびに癌の予後、診断、および治療に関わる。
【背景技術】
【０００４】
2．関連技術の説明
食道癌は、喉から胃に延びる管様構造である食道において癌細胞が発生した場合に生じる。食物は、食道を通って口から胃まで行く。癌は食道の内層から始まり、食道の他の層全体におよび身体の他の部分まで広がり得る（転移）。
【０００５】
2つの主なタイプの食道癌が存在する。一方のタイプは食道扁平上皮細胞癌である。扁平上皮細胞は食道の内側を裏打ちし、扁平上皮細胞から発生する癌は、食道全体に沿って生じ得る。他方のタイプは食道腺癌と呼ばれる。これは、腺細胞から発生する癌である。食道の腺癌を発生させるために、通常では食道を裏打ちしている扁平上皮細胞は、腺細胞によって置き換えられる。これは、典型的に胃の付近の下部食道において生じ、下部食道への酸曝露に大いに関係すると思われる。
【０００６】
食道癌（EC）は、癌関連死の第6位および世界で8番目に多い癌であり、発生率は地理的位置および民族によって大きく変動する。食道扁平上皮細胞癌（ESCC）は、全EC症例のほぼ80％を占め、東アジアならびにアフリカ東部および南部において特に高い。全ESCCの5年生存率の平均は、およそ10〜41％である。その予後不良の主な理由の1つは、食道が漿膜を有せずかつリンパ管の広範囲に及ぶネットワークを有することであり、癌の局所的広がりに対する抵抗性を低下させかつ早期の局所性腫瘍の発達および早期転移を可能にする。さらには、ESCCの早期ステージは典型的に無症状であり、その結果として診断の遅れをもたらす。癌胎児性抗原（CEA）、扁平上皮細胞癌抗原（SCC-Ag）、サイトケラチン-19フラグメント（CYFRA21-1）、およびp53抗体を含む、様々な生化学的な血液に基づくマーカーがESCC患者の診断において検討されているものの、これらの循環バイオマーカーは、ESCCの早期検出に対する信頼性に欠ける。それゆえ、ESCCの早期検出のための新規な循環バイオマーカーの発見は、ESCC患者の全般的転帰を向上させるために臨床上最も重要である。
【０００７】
ゆえに、食道癌の検出、特に早期検出のためのより有効な方法の必要性が当技術分野において存在する。さらには、CRCステージのより正確な診断は、CRCを治療するための新規でかつより有効な治療法につながるであろう。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、miRNAバイオマーカーの発現レベルに基づく、食道癌に対するより有効な治療的処置および診断法を提供することによって、当技術分野における必要性を満たす。本開示の局面は、患者における食道癌（EC）を治療する方法に関し、該方法は、対照サンプルにおける、mir-15b、miR-17、mir-18a、mir-21、mir-23a、mir-24-2、mir-25、mir-27a、mir-93、mir-103、mir-106b、mir-129-2、mir-139、mir-146b、mir-148a、mir-151、miR-155、mir-181a-1、mir-181a、mir-181b-1、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-192、mir-194-1、mir-194-2、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-205、mir-215、mir-223、mir-224、mir-335、mir-338、mir-375、mir-421、mir-484、mir-505、mir-769、mir-944、mir-1468、mir-3648、およびlet-7iより選択される1種または複数種のmiRNAの発現レベルと比べて、患者が、患者由来のサンプルにおける該1種または複数種のmiRNAの上昇したまたは減少したレベルの発現を有すると判定される場合、患者を食道癌であると診断する工程；ならびに診断された患者に有効量の食道治療を施す工程を含む。
【０００９】
さらなる局面は、患者に食道癌治療を施す工程であって、対照サンプルにおける、mir-15b、miR-17、mir-18a、mir-21、mir-23a、mir-24-2、mir-25、mir-27a、mir-93、mir-103、mir-106b、mir-129-2、mir-139、mir-146b、mir-148a、mir-151、miR-155、mir-181a-1、mir-181a、mir-181b-1、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-192、mir-194-1、mir-194-2、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-205、mir-215、mir-223、mir-224、mir-335、mir-338、mir-375、mir-421、mir-484、mir-505、mir-769、mir-944、mir-1468、mir-3648、およびlet-7iより選択される1種または複数種のmiRNAの発現レベルと比べて、患者が、患者由来のサンプルにおける該1種または複数種のmiRNAの上昇したまたは減少したレベルの発現を有すると判定された、工程を含む、食道癌を有すると判定された患者を治療するための方法に関する。
【００１０】
さらなる局面は、患者における1種または複数種のmiRNAを検出する方法に関し、該方法は、ヒト患者からサンプルを獲得する工程；ならびに、サンプルとmiRNA検出剤とを接触させることによって、1種または複数種のmiRNAがサンプルにおいて上昇したまたは低下した発現を有するかどうかを検出する工程であって、該1種または複数種のmiRNAが、mir-15b、miR-17、mir-18a、mir-21、mir-23a、mir-24-2、mir-25、mir-27a、mir-93、mir-103、mir-106b、mir-129-2、mir-139、mir-146b、mir-148a、mir-151、miR-155、mir-181a-1、mir-181a、mir-181b-1、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-192、mir-194-1、mir-194-2、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-205、mir-215、mir-223、mir-224、mir-335、mir-338、mir-375、mir-421、mir-484、mir-505、mir-769、mir-944、mir-1468、mir-3648、およびlet-7iより選択される、工程を含む。一部の態様において、方法は、1種または複数種のmiRNAが患者由来のサンプルにおいて上昇している場合、食道癌について患者を治療する工程をさらに含む。一部の態様において、方法は、患者由来のサンプルにおけるmiRNAの発現レベルと、対照サンプルにおけるmiRNAの発現レベルとを比較する工程をさらに含む。一部の態様において、サンプルは血清サンプルを含む。一部の態様において、対照サンプルは、食道癌（EC）を有しないヒト患者由来の生物学的サンプルを含む。一部の態様において、ヒト患者は、食道癌を有すると疑われる。
【００１１】
本開示のさらなる局面は、患者に食道癌治療を施す工程であって、対照サンプルにおける、miR-103、miR-106b、miR-151、miR-17、miR-181a、miR-21、miR-25、およびmiR-93より選択される1種または複数種のmiRNAの発現レベルと比べて、患者が、患者由来のサンプルにおける該1種または複数種のmiRNAの上昇したレベルの発現を有すると判定された、工程を含む、食道癌を有すると判定された患者を治療するための方法に関する。一部の態様において、患者由来のサンプルは血清サンプルを含む。一部の態様において、食道癌は食道扁平上皮細胞癌（ESCC）である。
【００１２】
なおさらなる局面は、患者由来のサンプルにおける、mir-15b、miR-17、mir-18a、mir-21、mir-23a、mir-24-2、mir-25、mir-27a、mir-93、mir-103、mir-106b、mir-129-2、mir-139、mir-146b、mir-148a、mir-151、miR-155、mir-181a-1、mir-181a、mir-181b-1、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-192、mir-194-1、mir-194-2、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-205、mir-215、mir-223、mir-224、mir-335、mir-338、mir-375、mir-421、mir-484、mir-505、mir-769、mir-944、mir-1468、mir-3648、およびlet-7iより選択される1種または複数種のmiRNAの発現のレベルを判定する工程；ならびに該1種または複数種のmiRNAの発現レベルに基づいて食道癌を診断する工程を含む、患者を食道癌であると診断するための方法に関する。
【００１３】
本明細書において記載される任意の方法またはキットは、以下のmiRNA：mir-15b、miR-17、mir-18a、mir-21、mir-23a、mir-24-2、mir-25、mir-27a、mir-93、mir-103、mir-106b、mir-129-2、mir-139、mir-146b、mir-148a、mir-151、miR-155、mir-181a-1、mir-181a、mir-181b-1、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-192、mir-194-1、mir-194-2、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-205、mir-215、mir-223、mir-224、mir-335、mir-338、mir-375、mir-421、mir-484、mir-505、mir-769、mir-944、mir-1468、mir-3648、およびlet-7iのうちの少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、または44種（またはその中に導き出せる任意の値域）を伴い得ることが企図される。一部の態様において、これらmiRNA分子のうちの1種または複数種の発現が、検出され得、測定され得、比較され得、記録され得、解析され得、特徴付けされ得、および/または定量化され得る。一部の態様において、1種または複数種の検出されたmiRNAの発現レベルが、対照サンプルと比較して有意に異なる場合、患者はECであると診断される。
【００１４】
一部の態様において、方法は、患者からサンプルを獲得する工程をさらに含む。一部の態様において、1種または複数種のmiRNAの発現のレベルは、対照と比較して上昇している。一部の態様において、1種または複数種のmiRNAの発現のレベルは、対照と比較して減少している。
【００１５】
態様は、miRNAの発現のレベルを判定することに関わる。一部の態様において、miRNAの発現のレベルを対照と比較して、miRNAの発現レベルまたは活性が、非癌性生物学的サンプルにおけるレベルと比較して上昇しているかどうかを判定する。対照は非癌性食道組織であり得る、または癌性食道組織であり得る。対照が癌性組織である場合、対照および患者サンプルにおけるレベルは同程度であるため、例えば、互いの1、2、3、もしくは4標準偏差（またはその中に導き出せる任意の値域）以内か、少なくともそれらの値であるか、または多くともそれらの値であるため、サンプルは、miRNAの上昇したレベルを有すると判定され得る。一部の態様において、対照は、非EC患者サンプルにおける1種または複数種のmiRNAのレベルである。一部の態様において、対照サンプルは非癌性生物学的サンプルである。一部の態様において、対照は、本明細書において記載される特定のコホート由来のものである。1つもしくは複数の対照を試験サンプルとして同時に測定し得る、またはそれは、多数の対照サンプルから収集された正規化された値であり得ることが企図される。
【００１６】
一部の態様において、方法は、患者由来のサンプルにおける1種または複数種のmiRNAの発現のレベルを判定する工程をさらに含む。
【００１７】
一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、mir-21、mir-93、mir-106b、mir-27a、mir-17、および/またはmir-181aのうちの1種または複数種を含む。一部の態様において、1種または複数種のmiRNAはmir-93を含む。一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、mir-93およびmir-21を含む。一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、mir-181a、mir-21、およびmir-17を含む。一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、mir-181a、mir-17、mir-21、およびmir-27aを含む。一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、mir-21、mir-93、およびmir-27aを含む。
【００１８】
一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、上昇したレベルのmir-205を含む。
【００１９】
一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、対照と比較して、上昇したレベルのmiR-21、miR-93、miR-27a、miR-24-2、およびmiR-17のうちの1種または複数種を含む。一部の態様において、miR-21、miR-93、miR-27a、miR-24-2、およびmiR-17のうちの1種または複数種の発現レベルが、非ECまたは非癌性対照におけるmiRNAの発現のレベルなどの対照と比較して上昇している場合、患者はECについて治療されるまたはECであると診断される。
【００２０】
一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、対照と比較して、上昇したレベルのmiR-103、miR-106b、miR-151、miR-17、miR-181a、miR-21、miR-25、およびmiR-93のうちの1種または複数種を含む。一部の態様において、miR-103、miR-106b、miR-151、miR-17、miR-181a、miR-21、miR-25、およびmiR-93のうちの1種または複数種の発現レベルが、非ECまたは非癌性対照におけるmiRNAの発現のレベルなどの対照と比較して上昇している場合、患者はECについて治療されるまたはECであると診断される。
【００２１】
一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、mir-103、mir-106b、mir-151、mir-17、miR-181a、mir-21、miR-25、およびmir-93のうちの少なくとも2種を含む。一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、mir-103、mir-106b、mir-151、mir-17、miR-181a、mir-21、miR-25、およびmir-93のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、または8種を含む。一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、mir-103、mir-106b、mir-17、miR-181a、mir-21、miR-25、およびmir-93のうちの少なくとも2種を含む。
【００２２】
一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、let-7i、mir-103、mir-106b、mir-17、mir-151、mir-155、mir-181a、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-18a、mir-21、mir-223、mir-23a、mir-25、mir-484、mir-505、およびmir-93を含む。
【００２３】
一部の態様において、食道癌は食道扁平上皮細胞癌（ESCC）である。
【００２４】
一部の態様において、1種または複数種のmiRNAは、上昇したレベルのmir-196a-1、mir-196b、および/またはmir-21を含む。一部の態様において、食道癌は食道腺癌（EAC）である。
【００２５】
一部の態様において、患者サンプルおよび/または対照サンプルは組織サンプルである。一部の態様において、患者サンプルおよび/または対照サンプルは血清サンプルである。一部の態様において、患者サンプルおよび/または対照サンプルは、本明細書において記載される生物学的サンプルである。
【００２６】
一部の態様において、食道癌治療には、化学療法、放射線療法、外科手術、またはその組み合わせが含まれる。一部の態様において、化学療法には、カルボプラチン、パクリタキセル、シスプラチン、5-フルオロウラシル、エピルビシン、ドセタキセル、カペシタビン、オキサリプラチン、およびその組み合わせが含まれる。
【００２７】
一部の態様において、方法は、患者由来の生物学的サンプルにおける1種または複数種のmiRNAの発現レベルを測定する工程をさらに含む。一部の態様において、方法は、患者由来の生物学的サンプルにおける1種または複数種のmiRNAの発現レベルと、対照生物学的サンプルにおける1種または複数種のmiRNAの発現レベルとを比較する工程をさらに含む。
【００２８】
一部の態様において、患者は、ステージI、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IIIC、またはIVの食道癌を有するか、または有すると判定される。一部の態様において、患者は、早期ステージのECまたはステージIのEC、例えばESCC、を有するもしくは有すると判定される、または方法はその診断のためのものである。一部の態様において、患者由来の生物学的サンプルは、原発性腫瘍由来のサンプルである。一部の態様において、食道癌は、カテゴリーT1、T2、T3、またはT4の食道癌を含む。一部の態様において、食道癌は、カテゴリーN0、N1、N2、またはN3の食道癌を含む。一部の態様において、食道癌は、カテゴリーM0またはM1の食道癌を含む。一部の態様において、食道癌はリンパ節転移を含む。一部の態様において、食道癌は遠隔転移を含む。一部の態様において、遠隔転移は、肺、肝臓、および/または骨転移である。一部の態様において、食道癌は、本明細書において記載されるECの1つまたは複数の局面を含む。一部の態様において、方法は、本明細書において記載されるECの1つまたは複数のステージまたはタイプを区別するためのものである。
【００２９】
一部の態様において、上昇したまたは減少したレベルの発現は、カットオフ値から判定される。一部の態様において、カットオフ値は、ROC解析によって決定される。
【００３０】
一部の態様において、患者は食道癌について以前に治療を受けている。
【００３１】
一部の態様において、miRNAマーカーは、EACとESCCとを、またはEACと非ECとを、またはESCCと非ECとを区別するためのものである。一部の態様において、EACとESCCとを、またはEACと非ECとを識別し得るEAC特異的マーカーは、mir-196a-1、mir-196b、mir-21、mir-181a-1、mir-196a-2、mir-335、mir-181b-1、mir-15b、mir-17、およびmir-106bのうちの1種または複数種を含む。一部の態様において、ESCCとEACとを、またはESCCと非ECとを識別し得るESCC特異的マーカーは、mir-205、mir-944、mir-194-2、mir-192、mir-194-1、mir-23a、mir-215、mir-27a、mir-338、および/またはmir-21のうちの1種または複数種を含む。
【００３２】
本開示のさらなる局面は、mir-15b、miR-17、mir-18a、mir-21、mir-23a、mir-24-2、mir-25、mir-27a、mir-93、mir-103、mir-106b、mir-129-2、mir-139、mir-146b、mir-148a、mir-151、miR-155、mir-181a-1、mir-181a、mir-181b-1、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-192、mir-194-1、mir-194-2、mir-196a-1、mir-196a-2、mir-196b、mir-205、mir-215、mir-223、mir-224、mir-335、mir-338、mir-375、mir-421、mir-484、mir-505、mir-769、mir-944、mir-1468、mir-3648、およびlet-7iより選択される1種または複数種のmiRNAを検出するための作用物質を含むキットに関する。一部の態様において、作用物質は、生物学的サンプルからのmiRNAの増幅のための1種または複数種の核酸プローブを含む。一部の態様において、作用物質は標識されている。一部の態様において、キットは、使用のための取扱説明書をさらに含む。
【００３３】
一部の局面において、本開示は、EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットに関し、該差次的に発現したmiRNAは、mir-21、mir-93、mir-106b、mir-27a、mir-17、およびmir-181aからなる。一部の局面において、本開示は、EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットに関し、該差次的に発現したmiRNAはmir-205からなる。一部の態様において、本開示は、EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットに関し、該差次的に発現したmiRNAはmir-196a-1からなる。一部の態様において、本開示は、EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットに関し、該差次的に発現したmiRNAはmir-196bからなる。一部の態様において、本開示は、EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットに関し、該差次的に発現したmiRNAはmir-21からなる。一部の態様において、本開示は、EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットに関し、該差次的に発現したmiRNAは、mir-103、mir-106b、mir-151、mir-17、mir-181a、mir-21、mir-25、およびmir-93からなる。一部の態様において、本開示は、EC差次的に発現したmiRNAを検出するための作用物質を含むキットに関し、該差次的に発現したmiRNAは、let-7i、mir-103、mir-106b、mir-17、mir-151、mir-155、mir-181a、mir-181b、mir-182、mir-183、mir-18a、mir-21、mir-223、mir-23a、mir-25、mir-484、mir-505、およびmir-93からなる。
【００３４】
一部の態様において、キットは、1つまたは複数の対照を検出するための1種または複数種の作用物質をさらに含む。一部の態様において、キットは、生物学的サンプルから核酸を単離するための試薬をさらに含む。一部の態様において、試薬は、血清サンプルから核酸を単離するためのものである。一部の態様において、試薬は、本明細書において記載されるサンプルから核酸を単離するためのものである。
【００３５】
対象または患者という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、イヌ、またはブタを含むがそれらに限定されない動物（例えば、哺乳類）を指し得る。本明細書において提供される獲得する方法には、微細針吸引、コア針生検、真空補助生検、切開生検、切除生検、パンチ生検、薄片生検（shave biopsy）、または皮膚生検など、生検の方法が含まれる。
【００３６】
ある特定の態様において、サンプルは、食道、胃、または筋肉組織、その粘膜または粘膜下組織から獲得される。他の態様において、サンプルは、胆嚢、皮膚、心臓、肺、乳房、膵臓、肝臓、筋肉、腎臓、平滑筋、膀胱、腸、脳、前立腺、または甲状腺組織を含むがそれらに限定されない、本明細書において提供される組織のいずれかから獲得され得る。
【００３７】
あるいは、サンプルには、血液、血清、汗、毛包、口腔組織、涙液、月経分泌物、尿、糞便、または唾液が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。特定の態様において、サンプルは、組織サンプル、全血サンプル、尿サンプル、唾液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、または糞便サンプルであり得る。
【００３８】
ある特定の態様において、サンプルは、嚢胞液、または腫瘍もしくは新生物に由来する流体から獲得される。さらに他の態様において、嚢胞、腫瘍、または新生物は消化器系にある。本方法のある特定の局面において、医師、看護師、または医療技術者などの任意の医療専門家が、検査のための生物学的サンプルを獲得し得る。本方法のさらなる局面において、患者または対象は、全血サンプル、尿サンプル、糞便サンプル、口腔サンプル、または唾液サンプルを獲得するなど、医療専門家の援助なしに、検査のための生物学的サンプルを獲得し得る。
【００３９】
さらなる態様において、サンプルは、新鮮な、凍結された、もしくは保存されたサンプル、または微細針吸引物であり得る。特定の態様において、サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプルである。入手されたサンプルは、適切な媒体、賦形剤、溶液、または容器中に入れることによって、短期または長期の保管に置かれ得る。ある特定の場合には、保管は、冷蔵または凍結環境にサンプルを保つことを要し得る。サンプルは、凍結環境における保管前に急速に凍結され得る。ある特定の場合には、凍結サンプルを、適切な冷凍保存用媒体または化合物と接触させ得る。冷凍保存用媒体または化合物の例には、グリセロール、エチレングリコール、スクロース、またはグルコースが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４０】
一部の態様は、生物学的サンプルからまたは患者のサンプルにおける、リボ核酸（ribonucleic）またはRNAなどの核酸を単離する工程をさらに伴う。他の段階は、サンプル中の核酸を増幅する工程、および/または増幅されたもしくは増幅されていない核酸に1種もしくは複数種のプローブをハイブリダイズさせる工程を含んでも含まなくてもよい。方法は、サンプル中の核酸をアッセイする工程をさらに含み得る。ある特定の態様において、マイクロアレイを用いて、サンプルにおけるmiRNA発現のレベルを測定し得るまたはアッセイし得る。方法は、有形媒体にmiRNA発現レベルを記録する工程、または患者、保健医療費支払者（health care payer）、医師、保険代理店、もしくは電子システムに発現レベルを報告する工程をさらに含み得る。
【００４１】
発現レベルの加重係数の間もしくは中での、または加重比較の間もしくは中での差異は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000倍（times）もしくは倍（-fold）（またはその中に導き出せる任意の値域）であり得るか、少なくとも、または多くともそれらの割合であり得る。
【００４２】
一部の態様において、診断スコア、予後スコア、またはリスクスコアの算出の判定は、約0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.011、0.012、0.013、0.014、0.015、0.016、0.017、0.018、0.019、0.020、0.021、0.022、0.023、0.024、0.025、0.026、0.027、0.028、0.029、0.03、0.031、0.032、0.033、0.034、0.035、0.036、0.037、0.038、0.039、0.040、0.041、0.042、0.043、0.044、0.045、0.046、0.047、0.048、0.049、0.050、0.051、0.052、0.053、0.054、0.055、0.056、0.057、0.058、0.059、0.060、0.061、0.062、0.063、0.064、0.065、0.066、0.067、0.068、0.069、0.070、0.071、0.072、0.073、0.074、0.075、0.076、0.077、0.078、0.079、0.080、0.081、0.082、0.083、0.084、0.085、0.086、0.087、0.088、0.089、0.090、0.091、0.092、0.093、0.094、0.095、0.096、0.097、0.098、0.099、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、もしくはそれよりも高い値（またはその中に導き出せる任意の値域）、約それらの値の間の、または多くとも約それらの値の差次的発現p値を有するバイオマーカーの発現値に基づく分類アルゴリズムを適用することによって実施される。ある特定の態様において、予後スコアは、1つまたは複数の統計的に有意に差次的に発現したバイオマーカーを用いて（個々にまたは異なるペアとして）算出される。
【００４３】
本明細書において記載される方法のいずれかは、コンピューターによって実行されると、該コンピューターに1つまたは複数の操作を実施させる、コンピューター可読コードを含む有形コンピューター可読媒体で遂行され得る。一部の態様において、コンピューターによって実行されると、該コンピューターに、a）患者由来のサンプルにおける、miRNAをコードする遺伝子の発現レベルに相当する情報を受け取る工程；およびb）該遺伝子についての対照または参照発現レベルと比較した、該サンプルにおける発現レベルに相当する情報を用いて発現レベルの差異値を決定する工程、を含む操作を実施させる、コンピューター可読コードを含む有形コンピューター可読媒体が存在する。
【００４４】
他の局面において、有形コンピューター可読媒体は、コンピューターによって実行されると、該コンピューターに、段階a）における患者が食道癌に対する第一の治療下または治療後にある場合において、患者が増加した発現レベルを有しない場合には第一の治療と同じ治療を患者に施すこと；患者が増加した発現レベルを有する場合には第一の治療とは異なる治療を患者に施すことを含む推奨する工程を含む、1つまたは複数の付加的な操作を実施させる、コンピューター可読コードをさらに含む。
【００４５】
一部の態様において、情報を受け取る工程は、有形記憶装置から発現レベルに相当する情報を有形データ記憶装置から受け取ることを含む。付加的な態様において、媒体は、コンピューターによって実行されると、該コンピューターに、差異値に相当する情報を有形データ記憶装置に送信する工程、患者に対する予後スコアを算出する工程、患者が発現レベルを有しない場合には患者を伝統的な食道療法で治療する工程、および/または患者が増加した発現レベルを有する場合には患者を代替的な食道療法で治療する工程を含む、1つまたは複数の付加的な操作を実施させる、コンピューター可読コードをさらに含む。
【００４６】
有形のコンピューター可読媒体は、コンピューターによって実行されると、該コンピューターに、患者に対する予後スコアを算出する工程を含む、1つまたは複数の付加的な操作を実施させる、コンピューター可読コードをさらに含む。操作は、減少した発現レベルを有すると判定される患者に治療を施すことを含む推奨する工程をさらに含み得る。
【００４７】
本明細書において使用するとき、「1つの（a）」または「1つの（an）」は、1つまたは複数を意味し得る。本明細書における特許請求の範囲において使用するとき、「含む（comprising）」という単語と合わせて用いられる場合、「1つの（a）」または「1つの（an）」という単語は、1つまたは1つよりも多い数を意味し得る。
【００４８】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことまたは代替物は相互排他的であることが明示的に示されていない限り、「および/または」を意味するために用いられるが、とはいえ本開示は、代替物のみを指す定義および「および/または」を支持する。本明細書において使用するとき、「他の」は、少なくとも第二のまたはそれを上回るものを意味し得る。
【００４９】
本明細書および特許請求の範囲において使用するとき、「含む（comprising）」（ならびに、「含む（comprise）」および「含む（comprises）」など、含む（comprising）の任意の形態）、「有する（having）」（ならびに、「有する（have）」および「有する（has）」など、有する（having）の任意の形態）、「含む（including）」（ならびに、「含む（includes）」および「含む（include）」など、含む（including）の任意の形態）、または「含有する（containing）」（ならびに、「含有する（contains）」および「含有する（contain）」など、含有する（containing）の任意の形態）という単語は、包括的すなわちオープンエンドであり、付加的な列挙されていない要素または方法の段階を除外しない。列挙された請求項の要素を含むものとして上記で記載される方法およびキットは、方法が、列挙された請求項の要素からなるまたはそれらから本質的になる態様も含み得る。
【００５０】
組成物に関して本明細書において用いられる、から本質的になるという用語は、組成物中の活性成分が、特許請求の範囲において挙げられた活性成分のみからなることを意味することが意図される。それゆえ、例えばシスプラチンおよび5-フルオロウラシルから本質的になる組成物は、いかなる他の活性成分も除外するが、他の任意の薬学的賦形剤または担体を含み得る。
【００５１】
本出願を通して、「約」という用語は、装置もしくは値を決定するために採用されている方法に固有の誤差の変動、または調査対象の間に存在する変動が、値に含まれることを示すために用いられる。
【００５２】
本発明の他の目的、特質、および利点は、下記の詳細な説明から明白になるであろう。しかしながら、この詳細な説明から、本発明の精神および範囲の内にある様々な変化および改変が当業者に明白になるであろうため、本発明の好ましい態様が示されているものの、詳細な説明および具体的な例は、例証としてのみ与えられることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の局面をさらに実証するために含まれる。本明細書において提示される具体的な態様についての詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することにより、本発明はよりよく理解され得る。
【００５４】
【図１】食道癌miRNAマイクロアレイ解析。Aには、食道癌の発見フェーズのフローチャートが示されている。12種のmiRNA候補が選択された。Bには、miRNA候補のランキングがAUC（曲線下面積）順に示されている。
【図２−１】発見フェーズ−食道癌に対する最善のmiRNA。上位5位にランク付けされたmiRNAのROC曲線解析および正常対癌における発現レベルが示されている。miR-21、miR-93、miR-27a、miR-24-2、およびmiR-17は、癌において有意に上昇した。
【図２−２】発見フェーズ−食道癌に対する最善のmiRNA。上位5位にランク付けされたmiRNAのROC曲線解析および正常対癌における発現レベルが示されている。miR-21、miR-93、miR-27a、miR-24-2、およびmiR-17は、癌において有意に上昇した。
【図３】ロジスティック回帰モデルによる食道癌（EC）miRNAの組み合わせ。Aには、上位5位にランク付けされたmiRNAのmiRNA組み合わせのランキングがAUC順に示されている。Bには、上位4位にランク付けされたmiRNAの組み合わせについてのROC曲線解析が示されている。
【図４】ESCC組織コホート1。上位5位のmiRNA候補（mir-21、93、27a、24-2、17）のレベルは、癌において有意に上昇した。
【図５Ａ】ESCC組織コホート1−ロジスティック回帰モデルによるmiRNA組み合わせ。Aには、miRNA組み合わせのランキングがAUC順に示されている。
【図５Ｂ】ESCC組織コホート1−ロジスティック回帰モデルによるmiRNA組み合わせ。Bには、最善の組み合わせmiRNAのROC曲線解析が示されている。5種類の組み合わせmiRNAは、100％の感度および100％の特異度を実証した。
【図６】血清フェーズ−ESCC血清。Aに示されたデータは、血清miR-21、93レベルが癌において有意に上昇したことを実証している。血清miR-21、93のAUC値は、それぞれ0.871および0.925であった。Bには、ロジスティック回帰モデルによる血清miR-21＋93組み合わせのAUC値（0.927）が示されている。
【図７−１】発見フェーズ−ESCC対EAC。Aには、ESCC特異的マーカーのランキングが示されている。miR205は、ESCCとEACとを区別するための最も高い感度および特異度を有するマーカーである。miR-205のAUC値は0.998である。Bには、EAC特異的マーカーのランキングが示されている。
【図７−２】発見フェーズ−ESCC対EAC。Cには、ESCC対EACにおけるmiR-205発現レベルおよびROC曲線解析が示されている。
【図８】検証フェーズ−コホート1組織miR-205によるESCC対EAC。Aに示されたデータは、miR-205レベルがEACCにおいて有意に上昇したことを実証している。Bに示されたデータは、ESCCとEACとを区別するmiR-205のAUC値が0.974であることを実証している。
【図９】血清検証1：アジアコホート（名古屋）。アジアコホートからのサンプルの血清における、表示されたmiRNAマーカーおよび組み合わせの特異度および感度を示している。
【図１０】血清検証2：西洋コホート（イタリア）。西洋コホートからのサンプルの血清における、表示されたmiRNAマーカーおよび組み合わせの特異度および感度を示している。
【図１１】血清検証3：アフリカコホート（南アフリカ）。アフリカコホートからのサンプルの血清における、表示されたmiRNAマーカーおよび組み合わせの特異度および感度を示している。
【図１２】血清：全体（西洋＋アジア＋アフリカコホート）。3つのコホートからのデータをプールした場合の、血清における、表示されたmiRNAマーカーおよび組み合わせの特異度および感度を示している。
【図１３Ａ】組織におけるESCC関連miRNA候補の同定のためのインシリコ発見。A）3つのmiRNA発現データセット（TCGA、GSE55856、GSE43732）を用いた、ESCC組織において上方調節されたmiRNAの同定のためのインシリコmiRNA候補選択。18種のmiRNAが3つのデータセット間で重複した。
【図１３Ｂ−１】組織におけるESCC関連miRNA候補の同定のためのインシリコ発見。B）3つのmiRNA発現データセットに関する、18種のmiRNA候補のヒートマップ。18種のmiRNAの組み合わせパネルは、100回繰り返される反復2分割交差検証を用いて、3つのデータセットに対して癌組織と正常組織とを正確に区別することができた（それぞれAUC＝0.98、0.99、0.98）。
【図１３Ｂ−２】組織におけるESCC関連miRNA候補の同定のためのインシリコ発見。B）3つのmiRNA発現データセットに関する、18種のmiRNA候補のヒートマップ。18種のmiRNAの組み合わせパネルは、100回繰り返される反復2分割交差検証を用いて、3つのデータセットに対して癌組織と正常組織とを正確に区別することができた（それぞれAUC＝0.98、0.99、0.98）。
【図１４−１】血清検査コホートにおけるmiRNA候補の選択。血清検査コホートに関して、8種のmiRNA候補がESCC血清において有意に上方調節された。
【図１４−２】血清検査コホートにおけるmiRNA候補の選択。血清検査コホートに関して、8種のmiRNA候補がESCC血清において有意に上方調節された。
【図１５Ａ】8-miRNAシグネチャーモデルの確立、検証、および診断性能評価。A）訓練コホートにおける、8-miRNAシグネチャーモデルによるESCC血清と健常対照とを区別することについてのROC曲線およびウォーターフォールプロット。
【図１５Ｂ】8-miRNAシグネチャーモデルの確立、検証、および診断性能評価。B）検証コホート1における、8-miRNAシグネチャーモデルによるESCC血清と健常対照とを区別することについてのROC曲線およびウォーターフォールプロット。
【図１５Ｃ】8-miRNAシグネチャーモデルの確立、検証、および診断性能評価。C）検証コホート2における、8-miRNAシグネチャーモデルによるESCC血清と健常対照とを区別することについてのROC曲線およびウォーターフォールプロット。
【図１５Ｄ】8-miRNAシグネチャーモデルの確立、検証、および診断性能評価。D）8-miRNAシグネチャーモデルの診断性能評価。これは、全ステージのESCC患者（ステージI〜IV、n＝123）と健常対照（n＝42）とを区別し得、SCC-Agよりも優れており（それぞれAUC＝0.89、0.71）、ステージIのESCC患者（n＝20）と健常対照（n＝42）とを区別し得、SCC-Agよりも優れていた（それぞれAUC＝0.81、0.63）。
【図１６】ESCC検出のための循環miRNAパネルの同定のための調査設計。
【図１７−１】初回miRNA候補に対する組織検証。32例のESCCおよび32例のマッチした近接正常組織に対するqRT-PCRにより、18種のインシリコmiRNA候補のすべては、近接正常組織と比較してESCC組織サンプルにおいて有意に上方調節された。
【図１７−２】初回miRNA候補に対する組織検証。32例のESCCおよび32例のマッチした近接正常組織に対するqRT-PCRにより、18種のインシリコmiRNA候補のすべては、近接正常組織と比較してESCC組織サンプルにおいて有意に上方調節された。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
例証的な態様の説明
本発明のある特定の局面は、医師が、いくつかの代替的な治療選択肢から患者にとって最適な療法を選択するのを手助けし得る検査を提供する。癌治療における主要な臨床上の課題は、転移およびアジュバント設定の両方において、療法レジメンから恩恵を受けるであろう患者の部分集合を同定することである。抗癌薬および多剤併用の数は過去10年で実質的に増加しているが、しかしながら、治療は、依然として試行錯誤手法を用いて経験的に適用されている。患者を診断して癌患者にとって最適な治療選択肢を決定するための方法および組成物がここで提供される。
【００５６】
I．定義
実質的に同じまたは有意に異ならないという用語は、それを比較しているものと有意に異ならない発現のレベルを指す。あるいはまたは併せて、実質的に同じという用語は、それを比較している発現レベルと2、1.5、もしくは1.25倍未満異なる、または発現の20、15、10、もしくは5％未満の差異である、発現のレベルを指す。
【００５７】
「対象」または「患者」は、ヒト、ウシ、イヌ、モルモット、ウサギ、ニワトリなどを含む、療法が望まれる任意の単一の対象を意味する。疾患のいかなる臨床兆候も示さない臨床研究の試みに関与する任意の対象、または疫学調査に関与する対象、または対照として用いられる対象も、対象として含まれることが意図される。
【００５８】
本明細書において用いられる「プライマー」という用語は、鋳型依存的過程で新生核酸の合成をプライミングし得る任意の核酸を包含することを意味する。典型的に、プライマーは、長さが10〜20および/または30塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列が採用され得る。プライマーは、二本鎖および/または一本鎖形態で提供され得るが、とはいえ一本鎖形態が好ましい。
【００５９】
本明細書において使用するとき、「増加した発現」または「上昇した発現」または「減少した発現」は、同じバイオマーカーまたは異なるバイオマーカーを表す参照レベルと比較した、対象のサンプルにおけるバイオマーカーの発現レベルを指す。ある特定の局面において、参照レベルは、同じ対象由来の非癌性組織からの発現の参照レベルであり得る。あるいは、参照レベルは、異なる対象または対象の群からの発現の参照レベルであり得る。例えば、発現の参照レベルは、癌を有しない対象もしくは対象の群のサンプル（例えば、組織、体液、または細胞サンプル）から獲得された発現レベル、または癌を有する対象もしくは対象の群の非癌性組織から獲得された発現レベルであり得る。参照レベルは、単一の値であり得る、または値の範囲であり得る。発現の参照レベルは、当業者に公知の任意の方法を用いて決定され得る。一部の態様において、参照レベルは、癌を有するまたは癌を有しない対象のコホートから決定された、発現の平均レベルである。参照レベルは、グラフ上のエリアとしてグラフでも描写され得る。ある特定の態様において、参照レベルは正規化されたレベルであり、一方で他の態様において、それは、検査されている組織または生物学的サンプルに関して安定していないレベルであり得る。
【００６０】
「約」および「およそ」は、一般的に、測定の性質または精度を考慮して、測定された分量に対する誤差の許容される程度を意味するものとする。典型的に、誤差の例示的な程度は、所与の値または値の域の20パーセント（％）以内、好ましくは10％以内、およびより好ましくは5％以内である。あるいは、および特に生物学的システムにおいて、「約」および「およそ」という用語は、所与の値の1桁以内、好ましくは5倍以内、およびより好ましくは2倍以内である値を意味し得る。一部の態様において、本明細書において記述される数値は、「約」または「およそ」という用語とともに用いられ得ることが企図される。
【００６１】
II．miRNA
ある特定の局面は、一部には、食道癌のmiRNAバイオマーカーの体系的な発見および検証に基づく。ある特定の態様において、予後を判定するための、対象を診断するための、特定の癌治療への特定の患者の応答を判定するための、および食道癌を有する個体を治療するための方法および組成物において、マイクロRNA（miRNAと略される）が用いられ得る。
【００６２】
miRNAは、それらの生物学的活性形態にある長さが約17〜約25ヌクレオチド塩基（nt）である、天然に存在する小さなノンコーディングRNAであり得る。miRNAは、標的mRNA翻訳を抑制することによって、遺伝子発現を転写後に調節する。miRNAは負の調節因子として機能すると考えられ、すなわち特異的miRNAの量がより多いほど、より低いレベルの標的遺伝子発現と相関する。
【００６３】
一次miRNA（プリmiRNA）、未成熟miRNA（プレmiRNA）、および成熟miRNAという、インビボで存在する3つの形態のmiRNAがあり得る。一次miRNA（プリmiRNA）は、約数百塩基〜1kbを超えるステム-ループ構造をした転写産物として発現される。プリmiRNA転写産物は、ステムループの基部付近でステムの両鎖を切断するドローシャ（Drosha）と呼ばれるRNase IIエンドヌクレアーゼによって核内で切断される。ドローシャは、互い違いのカットでRNA二重鎖を切断し、5'ホスフェートおよび3'末端における2nt突出を残す。
【００６４】
切断産物である未成熟miRNA（プレmiRNA）は、折り曲げられた様式で形成されるヘアピン構造を有し、約60〜約110nt長であり得る。プレmiRNAは、Ran-GTPおよびエクスポーチン-5によって核から細胞質に輸送される。プレmiRNAは、ダイサー（Dicer）と呼ばれる別のRNase IIエンドヌクレアーゼによって細胞質でさらにプロセシングされる。ダイサーは、5'ホスフェートおよび3'突出を認識し、ステム-ループ接合部でループを切り離して、miRNA二重鎖を形成する。miRNA二重鎖はRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に結合し、そこで成熟miRNAのアンチセンス鎖は優先的に分解され、センス鎖はRISCをその標的部位に向かわせる。miRNAの生物学的活性形態でありかつ長さが約17〜約25ntであるのは、成熟miRNAである。
【００６５】
マイクロRNAは、それらの標的遺伝子のメッセージ（mRNA）における特異的配列との塩基対合（完全または不完全な）に関わることによって機能する。miRNAは、mRNAを分解しまたはその翻訳を抑制し、標的遺伝子の発現を転写後に下方調節させる、抑制させる、またはサイレンシングさせる。動物において、miRNAは必ずしもそれらの標的部位との完全な相同性を有せず、部分的相同性は翻訳抑制につながるが、一方で、miRNAが標的部位との完全な相同性を示す傾向がある植物では、メッセージ（mRNA）の分解が優勢である。
【００６６】
マイクロRNAはゲノムに広く分布し、遺伝子調節を支配し、多くの生理学的および病理学的過程に積極的に参加する。例えば、ある特定のmiRNAの調節様態は、細胞の増殖、分化、およびアポトーシスを制御することが見出され；異常なmiRNAプロファイルは発癌と関連している。加えて、ウイルス感染は、「細胞生存促進（pro-cell survival）」遺伝子をサイレンシングすることを標的にしたmiRNAの増加、およびアポトーシス（プログラム細胞死）と関連した遺伝子を抑制するmiRNAの減少を引き起こし、ゆえにアポトーシスシグナル伝達を増大させる方向にバランスを傾ける。
【００６７】
本発明の他の態様において、miRNA阻害剤またはアンタゴニストである合成核酸が存在する。一部の態様において、miRNA阻害剤またはアンタゴニストはアンタゴミル（antagomir）である。miRNA阻害剤は、長さが約17〜25ヌクレオチドであり、成熟miRNAの5'から3'配列に対して少なくとも90％相補的である5'から3'配列を含む。ある特定の態様において、miRNA阻害剤分子は、長さが17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチド、またはその中に導き出せる任意の値域である。さらに、miRNA阻害剤は、成熟miRNA、特に、成熟した天然に存在するmiRNAの5'から3'配列に対して、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9、もしくは100％相補的であるまたは少なくともそれらの割合で相補的である配列（5'から3'へ）を有する。当業者であれば、成熟miRNAの配列と相補的であるプローブ配列の一部分を、miRNA阻害剤のための配列として使用し得るであろう。さらに、プローブ配列のその部分は、それが成熟miRNAの配列と依然として90％相補的であるように変更され得る。
【００６８】
ある特定の態様において、合成miRNAは、1つまたは複数の改変された核酸残基を有する。ある特定の態様において、糖修飾は、2'O-Me修飾、2'F修飾、2'H修飾、2'アミノ修飾、4'リボース修飾、または6位における炭素に連結したカルボキシ基でのホスホロチオエート修飾である。さらなる態様において、相補的領域の最初もしくは最後の2〜4残基、または相補的領域の最初もしくは最後の4〜6残基に1つまたは複数の糖修飾が存在する。
【００６９】
なおさらに、miRNAの核酸構造を、2 酸素と4'炭素の間にメチレン架橋を有するロックド核酸（LNA）に改変して、核酸のA型立体構造における3'-エンド（North）立体構造にリボースをロックし得る（Lennox, et al, 2011；Bader, et al 2011）。この改変は、分子の標的特異性およびハイブリダイゼーション特性の両方を有意に増加させる。
【００７０】
miRNA領域および相補的領域は、同じまたは別個のポリヌクレオチド上にあり得る。それらが同じポリヌクレオチドの上または中に含有される場合、miRNA分子は単一ポリヌクレオチドと見なされる。異なる領域が別個のポリヌクレオチド上にある態様において、合成miRNAは、2つのポリヌクレオチドから構成されると見なされる。
【００７１】
RNA分子が単一ポリヌクレオチドである場合、miRNA領域と相補的領域との間にリンカー領域が存在する。一部の態様において、単一ポリヌクレオチドは、miRNA領域と相補的領域との間の結合の結果として、ヘアピンループ構造を形成し得る。リンカーは、ヘアピンループを構成する。一部の態様において、リンカー領域は、長さが2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40残基、またはその中に導き出せる任意の値域であるか、少なくとも、あるいは多くともそれらの数または値域である。ある特定の態様において、リンカーは、長さが3〜30残基（両端を含む）である。
【００７２】
miRNA領域および相補的領域を有することに加えて、領域の5'または3'末端のいずれかに隣接配列も存在し得る。一部の態様において、これらの領域の一方または両方の側に隣接する、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個のヌクレオチドもしくはそれを上回る数、またはその中に導き出せる任意の値域のヌクレオチド、あるいは少なくともそれらの数または値域のヌクレオチドが存在する。
【００７３】
発癌性miRNAを負に操縦する、他のmiRNAに基づく療法には、miRNAスポンジ、miRNAマスク、またはロックド核酸（LNA）がさらに含まれ得る。本明細書において使用するとき、「miRNAスポンジ」という用語は、関心対象のmiRNAに対する複数のタンデム結合部位を含有する、および関心対象の内因性miRNAと競合する（titrate out）ように働き、ゆえに関心対象のmiRNAのその内因性標的への結合を阻害する、合成核酸（例えば、mRNA転写産物）を指す。
【００７４】
ある特定の局面における方法は、miRNA阻害剤、アンタゴニスト、もしくはアンタゴミルを細胞内に導入する工程；または、細胞において1種もしくは複数種のmiRNAの活性を供給するもしくは増強する工程を含む、細胞において1種または複数種のmiRNAの活性および/または発現を低下させる、排除する、または阻害することを含む。ある特定の態様は、特異的合成miRNA分子または合成miRNA阻害剤分子など、特定の核酸を細胞に提供することによって、ある特定の細胞特徴を誘導することにも関わる。しかしながら、本発明の方法において、miRNA分子またはmiRNA阻害剤は合成である必要はない。それらは、天然に存在するmiRNAと同一である配列を有し得る、またはそれらはいかなる設計改変も有し得ない。ある特定の態様において、miRNA分子および/またはmiRNA阻害剤は、上述されるように合成である。
【００７５】
III．食道癌ステージ分類および治療
miRNA発現レベルの特定の適用により食道癌を治療するための方法および組成物が提供され得る。miRNA発現レベルのプロファイルに基づき、種々の癌患者に対して種々の治療が処方され得るまたは推奨され得る。
【００７６】
食道癌（esophagus cancer）とも呼ばれる食道癌（esophageal cancer）は、食道を裏打ちする細胞において始まる。具体的には、食道の癌は、食道壁の内層において始まり、外側に成長する。食道壁を通じて広がる場合、食道癌は、感染と闘うのを助ける小さな豆形の器官であるリンパ節、ならびに胸部における血管および近くの他の器官に移動し得る。食道癌は、肺、肝臓、胃、および身体の他の部分にも広がり得る。
【００７７】
2つの主要なタイプの食道癌：食道を裏打ちする扁平上皮細胞において開始し、通常では食道の上部および中間部において発生する食道扁平上皮細胞癌（ESCC）；ならびに食道腺癌（EAC）が存在する。このタイプは、食道と胃が一体となる食道下部における腺組織において始まる。
【００７８】
A．癌ステージ分類
本明細書において記載される食道癌は、以下のステージのいずれかの食道癌であり得る。
【００７９】
1．TNMステージ分類システム
医師がステージを記載するために用いる1つのツールは、TNMシステムである。
腫瘍（T）：原発性腫瘍が食道の壁および周辺組織にどれぐらい深く成長しているか。
節（N）：腫瘍はリンパ節に広がっているか。その場合、どこにおよびどれぐらいの数広がっているか。
転移（M）：癌は身体の他の部分に転移しているか。その場合、どこにおよびどれぐらい転移しているか。
5つのステージ、ステージ0（ゼロ）およびステージI〜IV（1〜4）がある。以下は、TNMステージ分類システムに関するより多くの情報を提供する。
【００８０】
TNMシステムを用いる場合、「T」＋文字または数字（0〜4）を用いて、癌が食道の壁内にまたは近くの組織内に成長しているかどうか。その場合どれぐらい深くか、を含めて、腫瘍を記載する。一部のステージは、腫瘍をさらにより詳細に記載するのを助けるより小さな群にも分けられる。具体的な腫瘍ステージ情報が下記で挙げられる。
2019529351.tif 000003
【００８１】
TNMステージ分類システムにおける「N」は、リンパ節を表す。食道癌において、食道付近および胸部におけるリンパ節は所属リンパ節と呼ばれる。身体の他の部分におけるリンパ節は遠隔リンパ節と呼ばれる。
2019529351.tif 000004
【００８２】
TNMシステムにおける「M」は、癌が身体の他の部分に広がっているかどうかを示す。
2019529351.tif 000005
【００８３】
2．悪性度（G）
食道癌は、顕微鏡下で見た場合、癌細胞がどれぐらい健常細胞のように見えるかを記載する、その悪性度（G）によっても記載され得る。医師は、癌性組織と健常組織とを比較する。健常組織は、通常、一緒にグループ化された多くの異なるタイプの細胞を含有する。癌が健常細胞と類似して見えかつ種々の細胞群を含有する場合、それは分化型または低悪性度の腫瘍と呼ばれる。癌性組織が健常組織とは非常に異なって見える場合、それは低分化型または高悪性度の腫瘍と呼ばれる。癌の悪性度は、医師が、どれぐらい急速に癌が広がるかを予測するのを助け得る。一般的に、腫瘍の悪性度が低いほど、予後はより良好である。
2019529351.tif 000006
【００８４】
3．癌ステージのグループ化
医師は、T、N、およびM分類を組み合わせることによって癌のステージを決める。2つの最もよく見られるタイプの食道癌：扁平上皮細胞癌および腺癌に関して、別個のステージ分類システムがある。それぞれに対するステージ分類システムが下記で記載される。
【００８５】
a．食道の扁平上皮細胞癌のステージ分類
TNM分類に加えて、扁平上皮細胞癌に関して、腫瘍が食道の上部、中間部、または下部に位置するかどうか、ならびに腫瘍細胞の悪性度（G）に基づいて、ステージは細分され得る。
2019529351.tif 000007
2019529351.tif 000008
2019529351.tif 000009
【００８６】
b．食道の腺癌のステージ分類
腺癌に関して、医師は、T、N、およびM分類、ならびに悪性度（G）を用いる。
2019529351.tif 000010
2019529351.tif 000011
【００８７】
再発癌は、治療後に復活した癌である。再発癌は、食道においてまたは身体の別の部分において復活し得る。癌が再発したきた場合、再発の程度を知るための別のラウンドの検査が存在する。これらの検査および精査は、元の診断の際に行われたものに類似している場合もある。
【００８８】
B．療法
以下の治療段階/活性成分は、本明細書において記載される方法において有用である。以下の治療段階/治療剤は、本明細書において記載される態様において特異的に除外され得ることも企図される。食道およびリンパ節を超えて広がっていない腫瘍を有する人々に対して、種々のタイプの治療：放射線療法、化学療法、および外科手術を組み合わせることが推奨されることもある。治療の順序は変動し、食道癌のタイプを含むいくつかの因子が考慮される。
【００８９】
特に扁平上皮細胞癌に関して、化学療法および放射線療法、すなわち、化学放射線療法と呼ばれる併用が、第一の治療として一般に推奨され、化学放射線療法がどれぐらいよく効いたかに応じて、その後外科手術を行う。最近の調査は、外科手術の前に化学放射線療法を用いることが、外科手術単独よりも良好であることを示している。
【００９０】
腺癌に関して、米国において最もよく見られる治療は、化学療法および放射線療法、その後に続く外科手術である。患者の年齢または全般的健康状態など、外科手術によるリスクを増加させる因子がない限り、外科手術は化学放射線療法の後にほぼ必ず推奨される。
【００９１】
進行性食道癌に関して、治療は、通常では化学療法および放射線療法を含む。
【００９２】
癌およびその治療は、副作用をしばしば引き起こす。癌を遅らせる、止める、または排除する治療に加えて、癌ケアの重要な部分は、人の症状および副作用を軽くすることである。この手法は緩和ケアまたはサポーティブケアと呼ばれ、それは、患者をその身体的、精神的、または社会的ニーズに合わせて支援することを含む。
【００９３】
緩和ケアは、症状を低減し、生活の質を向上させ、ならびに患者およびその家族を支援することに重点を置くあらゆる治療である。年齢または癌のタイプおよびステージにかかわらず、いかなる人も緩和ケアを受け得る。緩和ケアは、癌治療過程においてできるだけ早期に開始される場合に、最もよく効く。人々は、癌に対する治療と、副作用を和らげる治療とを同時に受ける場合もある。実際、両方を受ける患者は、往々にして、より重症でない症状、より良好な生活の質を有し、治療により満足していると報告する。
【００９４】
緩和治療は非常に多様であり、医薬、栄養変化、リラクゼーション技法、精神的支援、および他の療法を含む場合もある。緩和治療は、化学療法、外科手術、または放射線療法など、癌を排除することを意図されるものと類似のものも含み得る。
【００９５】
1．外科手術
外科手術とは、外科治療における、腫瘍および健常組織を取り囲む一部の除去である。外科腫瘍学者とは、外科手術を用いて癌を治療することを専門にする医師である。外科手術は、伝統的に、食道癌に対する最も一般的な治療である。しかしながら、現在、外科手術は、早期ステージの食道癌を有する患者に対してのみ、主な治療として用いられる。
【００９６】
局所進行性食道癌を有する患者に対して、外科手術の前に、化学療法および放射線療法の併用（下記を参照されたい）を用いて腫瘍を縮小させ得る。外科手術を行うことのできない患者に対して、最善の治療選択肢は、化学療法および放射線療法の併用である場合がある。
【００９７】
食道癌を治療するための最もよく見られる外科手術は食道切除術と呼ばれ、医師は食道の罹患部分を除去し、次いで、患者が正常に嚥下することができるように、食道の残りの健常部分を胃に接続する。接続部を作製するために、胃または腸の一部がときとして用いられ得る。外科医は、食道周囲のリンパ節も除去する。
【００９８】
前記疾患を治療する外科手術に加えて、患者が食事をするのをおよび癌によって引き起こされた症状を軽くするのを助ける外科手術が用いられ得る。これは緩和手術と呼ばれる。これを行うために、外科医および胃腸科医は、
1．）栄養供給チューブとも呼ばれる経皮胃瘻造設術もしくは空腸造瘻術を行い得、それにより人は胃もしくは腸内に栄養を直接受け取り得る。これは、患者が、治療中に体重および体力を維持するのに十分な食料を取り得ることを確実にするために、化学療法および放射線療法が与えられる前に行われ得る；または
2．）腫瘍が食道を遮断しているが外科手術で除去することができない場合、胃へのバイパス、つまり新たな経路を創出し得る；この手順は滅多に用いられない。
【００９９】
食事をするおよび飲み物を飲むのに苦労をしている人々は、外科手術の前および後の数日間、静脈内（IV；静脈の中への）栄養供給および水分、ならびに感染症を防止するまたは治療する抗生物質を必要とし得る。患者は、肺を綺麗な状態に保つため、特別な咳および呼吸運動を学ぶ。
【０１００】
2．内視鏡療法
以下の治療は、内視鏡（予後を参照されたい）を用いて、食道癌を治療しおよび腫瘍によって引き起こされた副作用を管理する。内視鏡術および拡張術は、食道を拡大する手順である。これは、腫瘍が成長した場合には繰り返される必要があり得る。ステント留置術と合わせた内視鏡術は、内視鏡術を用いて食道にステントを挿入する手順である。食道用ステントは、食道を開かれた状態に保つために拡大される金属のメッシュデバイスである。
【０１０１】
光線力学療法とは、とりわけ、外科手術、放射線療法、または化学療法を行うことのできないまたは行わないことを選択する人々に対する、嚥下をより容易にするために用いられる緩和ケアまたはサポーティブケア選択肢である。光線力学療法では、感光性物質が腫瘍内に注射され、健常細胞においてよりも癌細胞において長く留まる。次いで、光が腫瘍を目指し、癌細胞を破壊する。光線力学療法は嚥下問題を短期間軽くし得るが、食道癌を治癒させない。
【０１０２】
電気凝固とは、電流で加熱することによって癌細胞を殺傷するのを助ける、緩和治療の1つのタイプである。これは、腫瘍によって引き起こされた遮断を除去することによって、症状を軽くするのを助けるために用いられることもある。
【０１０３】
冷凍療法とは、腫瘍組織を凍結させ得かつ除去し得るプローブが取り付けられた内視鏡を用いる、緩和治療の1つのタイプである。これを用いて腫瘍のサイズを低下させて、患者がより良好に嚥下するのを助け得る。
【０１０４】
3．放射線療法
放射線療法とは、癌細胞を破壊するための高エネルギーx線または他の粒子の使用である。放射線療法レジメン（スケジュール）は、通常、一定期間にわたって与えられる特定の数の治療からなる。放射線治療の最もよく見られるタイプは外照射療法と呼ばれ、それは、身体の外側にある機器から与えられる放射線療法である。放射線治療が身体の内側で直接与えられる場合、それは内照射療法または小線源療法と呼ばれる。食道癌に関して、これは、内視鏡を用いて食道内に放射性ワイヤを一時的に挿入する工程を伴う。
【０１０５】
4．化学療法
食道癌に対する化学療法および放射線療法は、術前に、術後に、または外科手術とは独立して、送達され得る。食道癌の治療に現在用いられているほとんどの化学療法は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン剤、および抗微小管剤を含む。一般的な扁平上皮細胞癌と同様に、食道扁平上皮細胞癌に対する化学療法は、シスプラチンに基づき得る。
【０１０６】
一部の態様において、化学放射線療法が施され、その後に外科手術が続く。一部の態様において、ネオアジュバント療法が用いられる。一部の態様において、ネオアジュバント療法は、白金化合物およびDNA複製阻害剤を用いた、放射線療法と化学療法との併用を含む。一部の態様において、白金化合物は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、フェナントリプラチン（phenathriplatin）、ピコプラチン、およびサトラプラチンより選択される。一部の態様において、白金化合物はシスプラチンである。一部の態様において、DNA複製阻害剤は5-フルオロウラシルである。
【０１０７】
一部の態様において、化学療法には、カルボプラチン、パクリタキセル、シスプラチン、5-フルオロウラシル、エピルビシン、ドセタキセル、カペシタビン、オキサリプラチン、およびその組み合わせが含まれる。一部の態様において、併用治療には、カルボプラチンおよびパクリタキセル；シスプラチンおよび5-フルオロウラシル；エピルビシン、シスプラチン、および5-フルオロウラシル；ドセタキセル、シスプラチン、および5-フルオロウラシル；シスプラチンおよびカペシタビン；オキサリプラチンおよび5-フルオロウラシル；ならびにオキサリプラチンおよびカペシタビンが含まれる。
【０１０８】
5．標的療法
標的療法とは、癌の特異的遺伝子、タンパク質、または癌の成長および生存に寄与する組織環境を標的にする治療である。このタイプの治療は、健常細胞への損傷を限定しながら、癌細胞の成長および広がりを遮断する。
【０１０９】
食道癌においては、転移性食道腺癌を有する患者に対して、標的療法トラスツズマブ（ハーセプチン）が化学療法とともに用いられ得る。トラスツズマブは、ヒト上皮成長受容体2（HER2）と呼ばれるタンパク質を標的にする。食道腺癌の約20％〜30％は、過剰なHER2を作り出す。
【０１１０】
標的療法ラムシルマブ（サイラムザ）も、第一選択療法（すなわち、与えられた第一の治療）が効かなかった後の選択肢である。それは、単独で、または化学療法の1つのタイプであるパクリタキセル（タキソール）とともに、与えられ得る。
【０１１１】
C．モニタリング
ある特定の局面において、患者が、再発のリスクが高いまたは予後が不良であると判定される場合、バイオマーカーに基づく方法を、漸増頻度で、1つまたは複数の他の食道癌診断またはスクリーニング検査と組み合わせ得る。
【０１１２】
食道モニタリングには、当技術分野において公知の任意の方法が含まれ得る。特に、モニタリングは、サンプルを獲得する工程、および診断のためにサンプルを検査する工程を含む。例えば、モニタリングは、食道の内視鏡術および/または生検を含み得る。他のモニタリング検査には、画像検査、バリウム嚥下検査、CATスキャン（コンピューター断層撮影スキャン）、磁気共鳴画像（MRI）スキャン、ポジトロン放出断層撮影（PET）スキャン、上部内視鏡術などの内視鏡術、超音波内視鏡術、気管支鏡術、胸腔鏡術、腹腔鏡術、またはその組み合わせが含まれる。
【０１１３】
さらなる局面において、モニタリング診断には、生検サンプルのHER2検査、貧血を探す全血球計算（CBC）血液検査、潜血についての排泄物サンプルのチェック、および/または正常な腎機能もしくは肝機能についてチェックする血液検査などの、ラボ検査が含まれ得る。
【０１１４】
IV．ROC解析
統計学において、受信者操作特性（ROC）またはROC曲線とは、その識別閾値が変動するにつれての、二項分類器システムの性能を図解するグラフプロットである。曲線は、様々な閾値設定における偽陽性率に対する真陽性率をプロットすることによって作成される。（真陽性率は、バイオメディカルインフォマティクスにおける感度、または機械学習における再現率としても知られる。偽陽性率はフォールアウトとしても知られ、1−特異度として算出され得る。）ゆえに、ROC曲線は、フォールアウトの関数としての感度である。一般的に、検出および偽陽性の両方に対する確率分布が知られている場合、ROC曲線は、y軸における検出確率の累積分布関数（−無限から＋無限までの確率分布下の面積）対x軸における偽陽性の累積分布関数をプロットすることによって作出され得る。
【０１１５】
ROC解析は、コスト背景またはクラス分布とは無関係に（かつそれを特定する前に）、最適の可能性があるモデルを選択し、準最適なものを廃棄するツールを提供する。ROC解析は、診断意思決定の費用/便益分析に直接的および自然な形で関連している。
【０１１６】
ROCは、それが基準が変化するにつれての2つの操作特性（TPRおよびFPR）の比較であるため、相対操作特性曲線としても知られる。ROC解析曲線は当技術分野において公知であり、Metz CE (1978) Basic principles of ROC analysis. Seminars in Nuclear Medicine 8:283-298；Youden WJ (1950) An index for rating diagnostic tests. Cancer 3:32-35；Zweig MH, Campbell G (1993) Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clinical Chemistry 39:561-577；およびGreiner M, Pfeiffer D, Smith RD (2000) Principles and practical application of the receiver-operating characteristic analysis for diagnostic tests. Preventive Veterinary Medicine 45:23-41に記載されており、それらは参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられる。
【０１１７】
V．サンプル調製
ある特定の局面において、方法は、対象からサンプルを獲得する工程を含む。本明細書において提供される獲得する方法には、微細針吸引、コア針生検、真空補助生検、切開生検、切除生検、パンチ生検、薄片生検、または皮膚生検などの、生検の方法が含まれ得る。ある特定の態様において、サンプルは、先に言及された生検方法のいずれかによって食道組織から生検により獲得される。他の態様において、サンプルは、非癌性または癌性組織、および血清、胆嚢、粘膜、皮膚、心臓、肺、乳房、膵臓、血液、肝臓、筋肉、腎臓、平滑筋、膀胱、結腸、腸、脳、前立腺、食道、または甲状腺組織由来の非癌性または癌性組織を含むがそれらに限定されない、本明細書において提供される組織のいずれかから獲得され得る。あるいは、サンプルは、血液、汗、毛包、口腔組織、涙液、月経分泌物、糞便、または唾液を含むがそれらに限定されない、他の任意の供給源から獲得され得る。本方法のある特定の局面において、医師、看護師、または医療技術者などの任意の医療専門家が、検査のための生物学的サンプルを獲得し得る。なおさらに、生物学的サンプルは、医療専門家の援助なしに獲得され得る。
【０１１８】
サンプルには、組織、細胞、または細胞由来もしくは対象の細胞に由来する生物学的材料が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。生物学的サンプルは、細胞または組織の不均一または均一な集団であり得る。生物学的サンプルは、本明細書において記載される解析法に適切なサンプルを提供し得る、当技術分野に公知の任意の方法を用いて獲得され得る。サンプルは、皮膚または頸部の剥離、頬のスワブによる採取、唾液採取、尿採取、糞便採取、月経分泌物、涙液、または精液の採取を含むがそれらに限定されない、非侵襲的方法によって獲得され得る。
【０１１９】
サンプルは、当技術分野において公知の方法によって獲得され得る。ある特定の態様において、サンプルは生検によって獲得される。他の態様において、サンプルは、スワブによる採取、内視鏡術、剥離、瀉血、または当技術分野において公知の他の任意の方法によって獲得される。一部の場合には、サンプルは、本方法のキットの構成要素を用いて獲得され得る、保管され得る、または輸送され得る。一部の場合には、複数の食道サンプルなどの、複数のサンプルが、本明細書において記載される方法によって診断のために獲得され得る。他の場合には、一方の組織タイプ（例えば、食道）由来の1つまたは複数のサンプル、および別の試料（例えば、血清）由来の1つまたは複数のサンプルなどの、複数のサンプルが、該方法によって診断のために獲得され得る。一部の場合には、一方の組織タイプ（例えば、食道）由来の1つまたは複数のサンプル、および別の試料（例えば、血清）由来の1つまたは複数のサンプルなどの、複数のサンプルが、同じまたは異なる時点で獲得され得る。サンプルは、異なる時点で獲得され得、種々の方法によって保管されおよび/または解析される。例えば、サンプルは獲得され得、ルーチン的な染色法または他の任意の細胞学的解析法によって解析され得る。
【０１２０】
一部の態様において、生物学的サンプルは、医師、看護師、または医療技術者、内分泌科医、細胞学者、瀉血専門医、放射線科医、もしくは呼吸器科医などの他の医療専門家によって獲得され得る。医療専門家は、サンプルに対して実施する適当な検査またはアッセイを示し得る。ある特定の局面において、分子プロファイリングビジネスが、どのアッセイまたは検査が最も適当に示されるかについて協議し得る。本方法のさらなる局面において、患者または対象は、全血サンプル、尿サンプル、糞便サンプル、口腔サンプル、または唾液サンプルを獲得するなど、医療専門家の援助なしに検査のための生物学的サンプルを獲得し得る。
【０１２１】
他の場合には、サンプルは、生検、針吸引、内視鏡術、または瀉血を含むがそれらに限定されない、侵襲的手順によって獲得される。針吸引の方法には、微細針吸引、コア針生検、真空補助生検、またはラージコア生検がさらに含まれ得る。一部の態様において、複数のサンプルを本明細書における方法によって獲得して、十分量の生物学的材料を確保し得る。
【０１２２】
生物学的サンプルを獲得するための一般的方法も、当技術分野において公知である。参照によりその全体として本明細書に組み入れられるRamzy, Ibrahim Clinical Cytopathology and Aspiration Biopsy 2001などの刊行物は、生検のための一般的方法および細胞学的方法を記載している。1つの態様において、サンプルは、食道の微細針吸引物、または食道の腫瘍または新生物の疑いのあるものの微細針吸引物である。一部の場合には、微細針吸引物サンプリング手順は、超音波、X線、または他の画像装置の使用によって導かれ得る。
【０１２３】
本方法の一部の態様において、分子プロファイリングビジネスは、対象から直接、医療専門家から、第三者から、または分子プロファイリングビジネスもしくは第三者によって提供されたキットから、生物学的サンプルを獲得し得る。一部の場合には、生物学的サンプルは、対象、医療専門家、または第三者が生物学的サンプルを入手し、分子プロファイリングビジネスにそれを送った後に、分子プロファイリングビジネスによって獲得され得る。一部の場合には、分子プロファイリングビジネスは、生物学的サンプルの保管および分子プロファイリングビジネスへの輸送のための適切な容器および賦形剤を提供し得る。
【０１２４】
本明細書において記載される方法の一部の態様において、医療専門家は、初回診断またはサンプル入手に関与する必要はない。あるいは、個体は、店頭（OTC）キットの使用によりサンプルを獲得し得る。OTCキットは、本明細書において記載されるサンプルを獲得するための手段、点検のためにサンプルを保管するための手段、およびキットの適正な使用のための取扱説明書を含有し得る。一部の場合には、分子プロファイリングサービスは、キットの購入の価格に含まれる。他の場合には、分子プロファイリングサービスは、別個に請求される。分子プロファイリングビジネスによる使用に適切なサンプルは、検査される対象となる個体の組織、細胞、核酸、遺伝子、遺伝子フラグメント、発現産物、遺伝子発現産物、または遺伝子発現産物フラグメントを含有する任意の材料であり得る。サンプル適性および妥当性を判定するための方法が提供される。
【０１２５】
一部の態様において、対象は、癌専門医、外科医、内分泌科医などの専門医に紹介され得る。専門医が、検査のための生物学的サンプルを同様に獲得し得る、または個体に検査センターもしくは生物学的サンプルの寄託のための研究室を紹介し得る。一部の場合には、医療専門家が、対象に検査センターもしくは生物学的サンプルの寄託のための研究室を紹介し得る。他の場合には、対象がサンプルを提供し得る。一部の場合には、分子プロファイリングビジネスがサンプルを獲得し得る。
【０１２６】
VI．核酸アッセイ
本発明の局面は、核酸をアッセイして発現レベルを判定する工程を含む。アレイを用いて、2つのサンプル間の差異を検出し得る。具体的に企図される適用には、正常であるサンプル由来および正常でないサンプル由来のmiRNA間、癌性病状および非癌性病状の間、または2つの差次的に処理されたサンプル間の差異を同定する工程および/または定量化する工程が含まれる。また、miRNAは、特定の疾患または病状に罹患しやすいと思われるサンプルと、その疾患または病状に罹患しにくいもしくは抵抗性があると思われるサンプルとの間で比較され得る。正常でないサンプルとは、疾患もしくは病状の表現型形質を呈するもの、またはその疾患もしくは病状に関して正常でないと思われるものである。それは、その疾患または病状に関して正常である細胞と比較され得る。表現型形質には、その構成要素が遺伝的であるまたは1つもしくは複数の過剰増殖性もしくは新生細胞によって引き起こされる、あるいは遺伝的であり得るまたは1つもしくは複数の過剰増殖性もしくは新生細胞によって引き起こされ得る、あるいはそうでなくてもよい、疾患または病状の症状またはそれへの罹患しやすさが含まれる。
【０１２７】
アレイは、支持体に付着した核酸プローブを有する固体支持体を含む。アレイは、典型的に、種々の公知の位置で基板の表面にカップリングされている複数の種々の核酸プローブを含む。「マイクロアレイ」または口語的に「チップ」とも記載されるこれらのアレイは、当技術分野において、例えば米国特許第5,143,854号、第5,445,934号、第5,744,305号、第5,677,195号、第6,040,193号、第5,424,186号、およびFodor et al., 1991に一般的に記載されており、そのそれぞれはすべての目的のために参照によりその全体として組み入れられる。機械的合成法を用いたこれらのアレイの合成のための技法は、例えば、すべての目的のために参照によりその全体として本明細書に組み入れられる米国特許第5,384,261号に記載されている。ある特定の局面では平面的なアレイ表面が用いられるものの、アレイは、事実上任意の形状の表面にまたは多様な表面にさえ作られ得る。アレイは、ビーズ、ゲル、高分子表面、光ファイバーなどの繊維、ガラス、または他の任意の適当な基板上の核酸であり得、すべての目的のためにそれらの全体として本明細書によって組み入れられる米国特許第5,770,358号、第5,789,162号、第5,708,153号、第6,040,193号、および第5,800,992号を参照されたい。
【０１２８】
アレイおよびマイクロアレイの使用に加えて、いくつかの差異アッセイを採用して、miRNA、それらの活性、およびそれらの効果を解析し得ることが企図される。そのようなアッセイには、核酸（nucleic）増幅、ポリメラーゼ連鎖反応、定量PCR、RT-PCR、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（HPA）（GenProbe）、分岐DNA（bDNA）アッセイ（Chiron）、ローリングサークル増幅（RCA）、単一分子ハイブリダイゼーション検出（US Genomics）、Invaderアッセイ（ThirdWave Technologies）、および/またはBridge Litigationアッセイ（Genaco）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１２９】
VII．薬学的組成物
ある特定の局面において、化学療法剤などの、方法における使用のための組成物または作用物質は、薬学的に許容される担体中に適切に含有される。担体は、非毒性で生体適合性であり、作用物質の生物学的活性に悪い影響を及ぼさないように選択される。本発明の一部の局面における作用物質は、経口、非経口、または外科的投与を可能にする、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐薬（depository）、吸入剤、および注射液など、固体、半固体、ゲル、液体、または気体の形態の、局所送達（すなわち、骨格筋または他の組織など、身体の特異的位置への）または全身送達のための調製物中に製剤化され得る。本発明のある特定の局面は、医療装置等をコーティングすることによる組成物の局所投与も企図する。
【０１３０】
注射、注入または潅注を介した非経口送達、および局所送達のための適切な担体には、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、正常もしくは乳酸リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、またはプロパンジオールが含まれる。加えて、無菌の固定油が、溶媒または懸濁化媒体として採用され得る。この目的のために、合成モノ-またはジグリセリドを含む、任意の生体適合性油が採用され得る。加えて、オレイン酸などの脂肪酸は、注射液の調製において用途を見出す。担体および作用物質は、液体、懸濁液、重合性もしくは非重合性ゲル、ペースト、または軟薬として調合され得る。
【０１３１】
担体は、作用物質の送達を持続させる（すなわち、延長する、遅らせる、または調節する）ための、または治療剤の送達、取り込み、安定性、もしくは薬物動態を増強するための送達ビヒクルも含み得る。そのような送達ビヒクルには、非限定的な例として、タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成有機化合物、無機化合物、高分子または共重合体ヒドロゲル、および高分子ミセルから構成される微粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、またはナノ粒子が含まれ得る。
【０１３２】
ある特定の局面において、患者または対象に投与される組成物の実際の投薬量は、体重、病状の重症度、治療されている疾患のタイプ、以前のまたは並行した治療的介入、患者の突発性疾患、および投与の経路などの、身体的および生理学的な因子によって決定され得る。投与に関与する実践者は、いずれにしても、個々の対象に対する、組成物における活性成分の濃度および適当な用量を決定する。
【０１３３】
ある特定の態様において、薬学的組成物は、例えば、単離されたエクソソーム、関連脂質ナノ小胞、または治療剤もしくは診断剤を搭載したエクソソームもしくはナノ小胞など、少なくとも約0.1％の活性剤を含み得る。他の態様において、活性剤は、単位の重量の約2％〜約75％、または例えば約25％〜約60％、およびその中に導き出せる任意の値域を構成し得る。他の非限定的な例において、用量には、投与あたり約1マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重〜約1000mg/kg/体重、またはそれを上回る量、およびその中に導き出せる任意の値域も含まれ得る。本明細書において挙げられる数からの導き出せる値域の非限定的な例において、約5マイクログラム/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重〜約500ミリグラム/kg/体重等の値域が投与され得る。
【０１３４】
薬学的組成物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、その混合物中、および油中でも調製され得る。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止する防腐剤を含有する。
【０１３５】
ある特定の局面において、薬学的組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとしての注射可能な組成物の形態で有利に投与され；注射前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態も調製され得る。これらの調製物は、乳化されてもよい。そのような目的のための典型的な組成物は、薬学的に許容される担体を含む。例えば、組成物は、1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水あたり10mgもしくはそれ未満、25mg、50mg、または最高約100mgのヒト血清アルブミンを含有し得る。他の薬学的に許容される担体には、塩、防腐剤、バッファー等などの、水溶液、非毒性賦形剤が含まれる。
【０１３６】
非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール溶液/水溶液、生理食塩溶液、非経口ビヒクル、例えば塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースが含まれる。静脈内ビヒクルには、水分および栄養補充薬が含まれる。防腐剤には、抗微生物剤、抗真菌剤、抗酸化物質、キレート剤、および不活性ガスが含まれる。薬学的組成物の様々な構成要素のpHおよび精確な濃度は、周知のパラメーターに従って調整される。
【０１３７】
付加的な製剤が経口投与に適切である。経口製剤は、例えば薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような典型的な賦形剤を含む。組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤、または粉末の形態を取る。
【０１３８】
さらなる局面において、薬学的組成物は、古典的な薬学的調製物を含み得る。ある特定の局面に従った薬学的組成物の投与は、その経路を介して標的組織が利用可能である限り、任意の一般経路を介したものであり得る。これには、経口、経鼻、口腔、直腸、膣内、または局所が含まれ得る。局所投与は、化学療法誘発性脱毛症または他の皮膚過剰増殖性障害を防止するために、皮膚癌の治療に特に有利であり得る。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射によるものであり得る。そのような組成物は、通常、生理学的に許容される担体、バッファー、または他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として投与される。肺の病状の治療に関しては、エアロゾル送達が用いられ得る。エアロゾルの量は、約0.01ml〜0.5mlである。
【０１３９】
薬学的組成物の有効量は、意図される目標に基づいて決定される。「単位用量」または「投薬量」という用語は、対象における使用に適切な物理的に個別の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち適当な経路および治療レジメンに伴って上記で記述される所望の応答をもたらすように算出された、薬学的組成物の所定の分量を含有する。治療の回数および単位用量の両方に従って、投与される対象となる分量は、所望される保護または効果に依存する。
【０１４０】
薬学的組成物の精確な量は、実践者の判断にも依存し、各個体に特有である。用量に影響を及ぼす因子には、患者の身体的および臨床的状態、投与の経路、治療の意図される目標（例えば、症状の軽減対治癒）、ならびに特定の治療物質の効力、安定性、および毒性が含まれる。
【０１４１】
VIII．キット
本発明のある特定の局面は、本発明の組成物または本発明の方法を遂行するための組成物を含有するキットにも関わる。一部の態様において、キットを用いて、1種または複数種のmiRNA分子を評価し得る。ある特定の態様において、キットは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、500、1,000種、もしくはそれを上回る種類のmiRNAプローブ、合成miRNA分子、もしくはmiRNA阻害剤、またはその中に導き出せる任意の値もしくは値域および組み合わせを含有するか、少なくともそれらを含有するか、または多くともそれらを含有する。一部の態様において、細胞におけるmiRNA活性を評価するためのキットが存在する。
【０１４２】
キットは、チューブ、ボトル、バイアル、シリンジ、または他の適切な容器手段などの容器内に個々にパッケージされ得るまたは入れられ得る構成要素を含み得る。
【０１４３】
個々の構成要素は、キットにおいて濃縮された量でも提供され得；一部の態様において、構成要素は、それが他の構成要素とともに溶液中にあるであろう同じ濃度で個々に提供される。構成要素の濃度は、1×、2×、5×、10×、もしくは20×、またはそれを上回る割合として提供され得る。
【０１４４】
予後的または診断的適用のための本発明のmiRNAプローブ、合成miRNA、非合成miRNA、および/またはmiRNA阻害剤を用いるためのキットは、本発明の一部として含まれる。本明細書において同定される任意のmiRNAに相当する任意のそのような分子が具体的に企図される。
【０１４５】
ある特定の局面において、陰性および/または陽性対照の合成miRNAおよび/またはmiRNA阻害剤が、一部のキットの態様に含まれる。対照分子を用いて、トランスフェクション効率を検証し得、および/または細胞におけるトランスフェクションにより誘導される変化を制御し得る。
【０１４６】
本明細書において記載される任意の方法または組成物は、本明細書において記載される他の任意の方法または組成物に関して遂行され得ること、および種々の態様は組み合わせられ得ることが企図される。miRNA分子またはmiRNAに関して本明細書において記述される任意の方法および組成物は、合成miRNAが、それが生理学的状況下で成熟miRNAになるのを可能にする適正な条件に曝露されるという範囲において、合成miRNAに関して遂行され得ることが具体的に企図される。出願当初の特許請求の範囲は、任意の請求項または請求項の組み合わせに多重従属している請求項を網羅することが企図される。
【０１４７】
特異的miRNAを名前で含む本発明の任意の態様は、指定されたmiRNAの成熟配列と配列が少なくとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一であるmiRNAを含む態様を網羅することも企図される。
【０１４８】
本発明の態様は、適切な容器手段に2種またはそれを上回る種類のmiRNAプローブを含む、サンプルについてmiRNAプロファイルを検査することによる病的サンプルの解析のためのキットを含み、該miRNAプローブは、本明細書において同定されるmiRNAのうちの1種または複数種を検出する。キットは、サンプル中のmiRNAを標識するための試薬をさらに含み得る。キットは、アミン修飾ヌクレオチド、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびポリ(A)ポリメラーゼバッファーのうちの少なくとも1つを含む、標識試薬も含み得る。標識試薬はアミン反応性色素を含み得る。
【実施例】
【０１４９】
IX．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。後に続く実施例において開示される技法は、本発明の実践において十分に機能することを本発明者によって発見された技法であり、ゆえにその実践のための好ましい形式をなすと見なされ得ることは、当業者によって解されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更が、開示される具体的な態様において加えられ得、かつなおも同様または類似の結果を獲得し得ることを解するはずである。
【０１５０】
実施例1
本願の図において提供されるデータを収集する際に、以下の方法を遂行した。
【０１５１】
A．調査設計および臨床試料
本調査は3つの部分：miRNA候補パネル選択のための発見フェーズ、検証フェーズ、および変換（translation）フェーズからなった。最後のフェーズは、食道癌患者の血清におけるmiRNAパネルの潜在性を評価することを目指した。発見フェーズにおいて、本発明者らは、98例の食道扁平上皮細胞癌組織および88例の食道腺癌組織を含む186例のステージI〜IV食道癌組織のコホート、ならびにThe Cancer Genome Atlas（TCGA）データからの12例の正常粘膜組織を用いた。食道癌患者に関するmiRNAの発現データおよび対応する臨床データを、The Cancer Genome Atlasデータポータルからダウンロードした。それぞれ年齢66.1±11.8歳および61.8±11.7歳の27人の女性患者および157人の男性患者が存在した。原材料およびTCGAのデータの収集は、ヒト対象の保護のためのすべての適用法、規制、および政策を順守して行われ、必要なIRB承認を得た。データは、対数スケールで95％信頼区画を有する平均として集約されるか、またはこれらの値をべき乗して倍率変化を求めた。検証フェーズは、224例のステージ0〜IV食道癌組織および224例のマッチした対応する正常食道粘膜組織を含んだ。変換フェーズは、miRNAの血清レベルを調べるための136例のステージ0〜IV食道癌患者および112例の健常対照を含んだ。合計224例の食道癌組織、および224例のマッチした対応する正常食道粘膜組織、および日本の名古屋大学医学部附属病院におけるステージ0〜IVからの136例の血清サンプル、およびベイラーユニバーシティメディカルセンター（Baylor University Medical Center）、TX、USにおける112例の健常対照が、本調査において用いられた。書面によるインフォームド・コンセントをすべての患者から獲得し、調査はすべての参加施設の施設内審査委員会によって承認された。
【０１５２】
B．組織からのRNA単離およびqRT-PCR
スモールRNAを含む全RNAを、メーカーのプロトコールに従ってRNeasy Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA）を用いて組織から単離し、QIAcube装置（Qiagen, Valencia, CA）を用いて30μLのRNase不含水中に溶出し、NanoDrop分光光度計（NanoDrop Technologies, Wilmington, DE）を用いて定量化した。miRNAに基づくRT-PCRアッセイに関して、組織サンプル由来の2μLの富化したスモールRNAを、以下の条件：16℃30分間、42℃30分間、85℃5分間で、10μLの総反応量でTaqMan MicroRNA Reverse Transcriotion Kit（Applied Biosystems, San Diego, CA）を用いて逆転写し、4℃で維持する。リアルタイムPCRを、MicroRNA Assay KitおよびTaqMan Universal Master Mix II, no UNG（Applied Biosystems）を用いて行った。miRNAの定量化のためのPCR反応を、以下のサイクル条件：95℃10分間、それに続く40サイクルの95℃15秒間および60℃1分間で、QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて実施した。結果を2-ΔΔCtとして表現し、結果をRNU6B（Applied Biosystems）に対して正規化し、二つ組で実施した。
【０１５３】
C．血清からのRNA単離およびqRT-PCR
Qiagen miRNAeasy Serum/Plasma Kit（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、すべての血清サンプルからスモールRNAを富化した。簡潔には、250μLの血清を氷上で融解し、10,000rpmで5分間遠心分離して細胞残屑を除去した。次に、200μLの上清を1000μLのQiazol Lysis Reagent中で溶解した。RNA単離手順中のサンプル間の変動の正規化に関して、25fmolの合成C.エレガンス（C. elegans）miRNA（cel-miR-39）を、各変性サンプルに添加した。QIAcube装置（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、スモールRNAを含む全RNAを抽出し、30μLのRNase不含水中に溶出した。miRNAに基づくRT-PCRアッセイに関して、血清サンプル由来の2μLの富化したスモールRNAを、以下の条件：16℃30分間、42℃30分間、85℃で、10μLの総反応量でTaqMan MicroRNA Reverse Transcriotion Kit（Applied Biosystems, San Diego, CA）を用いて逆転写し、4℃で維持する。リアルタイムPCRを、MicroRNA Assay KitおよびTaqMan Universal Master Mix II, no UNG（Applied Biosystems）を用いて行った。miRNAの定量化のためのPCR反応を、以下のサイクル条件：95℃10分間、それに続く40サイクルの95℃15秒間および60℃1分間で、QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて実施した。結果を2-ΔΔCtとして表現し、結果をcel-miR-39に対して正規化し、二つ組で実施した。
【０１５４】
D．統計解析
サンプルの2つのマッチしたペア群間または2つの独立した群間の有意な差異を評価するために、対応のあるt検定およびマン・ホイットニーU検定をそれぞれ用いた。すべてのP値は両側であり、＜0.05のP値を有意と見なした。受信者操作特性（ROC）曲線を作出し、95％信頼区画（CI）を有するROC曲線下面積（AUC）を計算して、miRNAの識別性能を検査した。1つまたは複数の独立変数が存在するデータセットを解析するために、ロジスティック回帰を用い、それにより結果を判定する。すべての統計解析を、Medcalc統計ソフトウェアv.12.7.7.（Medcalc Software bvba, Ostend, Belgium）を用いて実施した。
【０１５５】
下記の表は、EACまたはESCC特異的マーカーに対するmRNA候補およびそれらのパーセンテージを示している。
2019529351.tif 000012
【０１５６】
下記の表は、EAC/ESCCマーカーに対するmRNA候補およびそれらのパーセンテージを示している。
2019529351.tif 000013
【０１５７】
実施例2：食道扁平上皮細胞癌の検出のための新規miRNAに基づく非侵襲的診断用パネル
本実施例に記載されるように、包括的インシリコ解析を用いて、ESCCにおいて過剰発現したmiRNA候補を同定した。その後、これらのmiRNAを血清サンプルにおいて検査し、8-miRNA診断用パネルまで洗練させた。パネルの堅牢性を2つの大きな独立コホートにおいて検証した。さらに、パネルは、早期ステージのESCC患者と健常対照とを区別し、現在用いられている血清学的ESCCマーカーのSCC-Agよりも有意に優れていた。
【０１５８】
食道扁平上皮細胞癌（ESCC）は、全食道癌のほぼ80％を占めるにもかかわらず、現在、その早期診断のための確立された血清学的分子マーカーは存在しない。本調査の目的は、複数の独立したESCC患者コホートにおける体系的かつ包括的なmiRNA発現解析により、ESCCに対する循環miRNAに基づく診断用パネルを確立することであった。3つの組織RNA-Seqデータセットを用いて初回miRNA候補を同定し、これらmiRNA候補の発現を臨床組織サンプルにおいて検証した。健常対照のものに対して、年齢、性別、および人種がマッチしたESCC患者由来の血清サンプルを用いて、本発明者らは循環miRNAパネルを数学的に開発した。2つの独立した患者コホートを用いて、miRNAパネルの診断性能を検査した。初めに、18種の一貫して過剰発現したmiRNAを3つのデータセットにおいて同定した。その後、これらのmiRNAの発現を臨床組織サンプルにおいて検証した。これらの組織候補の発現を血清試料において検査し、8-miRNAパネル（miR-103、106b、151、17、181a、21、25、および93）を採用して、多変量リスク採点公式を導き出した。miRNAシグネチャーの診断性能を、訓練コホート（AUC＝0.83）および2つの大きな独立した検証コホート（それぞれ、AUC：0.80、0.89）の両方において実証した。さらには、miRNAパネルは、早期ステージのESCC患者（ステージI）と健常対照とを区別し（AUC＝0.81）、それは臨床血清学的マーカーのSCC-Ag（AUC＝0.63）よりも優れていた（p値＝0.02）。これまでに解析されたESCC患者の潜在的に最も大きなコホートにおける統合的な包括的バイオマーカー発見および検証手法を用いて、本発明者らは、ESCCの早期検出のための新規でかつ堅牢なmiRNAに基づくパネルを開発しかつ検証した。
【０１５９】
A．材料および方法
1．データソース
ESCCのスモールRNA-Seqデータセットおよび対応する臨床データを、The Cancer Genome Atlas（TCGA）データポータルからダウンロードした。TCGAデータセットは、98例のステージI〜IV ESCC組織および13例の正常食道粘膜を含有した。ESCC miRNAマイクロアレイデータセットを、アクセッションコードGSE55856（108例のステージI〜IV ESCC組織および108例の近接正常食道組織）およびGSE43732（119例のステージI〜IV ESCC組織および119例の近接正常食道組織）で、Gene Expression Omnibus（GEO）から獲得した。Affymetrix Multispecies miRNA 2.0アレイプラットフォーム（Affymetrix, Santa Clara, California, USA）をGSE55856に対して用い、Agilent-038166 cbc Human miRNA 18.0マイクロアレイプラットフォーム（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）をGSE43732に対して用いた。
【０１６０】
2．臨床試料
559例のESCC血清サンプル、240例の健常血清サンプル、32例のESCC組織サンプル、および32例の近接正常食道粘膜を含む、合計863例の臨床試料が2001年〜2016年に収集された。組織検証に関して、32例のステージI〜III ESCC組織および32例のマッチした対応する正常食道粘膜組織が、いかなる術前療法も伴わずにESCCに対する食道切除術を受けた患者から収集された。まず、血清洗練コホートに関して、50例のステージI〜III ESCC血清サンプルおよび50例の健常対照が、日本の熊本県の熊本大学医学部附属病院から2009年〜2011年に収集された。次に、血清訓練コホートに関して、本発明者らは、280例のステージI〜IV ESCC血清サンプルおよび128例の健常対象を、南アフリカにおけるケープタウン・Groote Schuur Hospitalから2001年〜2015年に収集した。最後に、本発明者らは、2012年〜2016年に熊本大学医学部附属病院から収集された106例のステージI〜III ESCC血清サンプルおよび20例の健常対照を含む血清検証コホート1、ならびに2001年〜2015年に日本の名古屋市の名古屋大学医学部附属病院から収集された123例のステージI〜III ESCC血清サンプルおよび42例の健常対照を含む血清検証コホート2を収集した。すべての手順は各病院の施設内審査委員会によって承認され、書面によるインフォームド・コンセントを各参加者から得た。各参加者の全血サンプルを治療前に収集し、収集後12時間以内に3000gに10分間供した。次いで、細胞不含血清を、10,000gで2分間の遠心分離によってさらに分解して、細胞残屑の完全な除去を保証した。血清サンプルを使用まで-80℃でRNase不含エッペンドルフチューブ中に保管した。
【０１６１】
3．調査設計
調査設計（図16）は、以下の段階を含んだ。（1）インシリコ発見フェーズ。組織に基づく3つのmiRNA発現データセット（TCGA、GSE55856、GSE43732）を、堅牢なmiRNAパネルの発見のために用いた。各データセットに関して、有意に過剰発現したmiRNAを各データセットからまず同定した（基準：log2倍率変化＞0.5、FDR調整p値＜0.05、ESCCにおいて上方調節された、AUC＞0.7、および平均miRNA発現レベルは、すべての差次的に発現したmiRNAの中央値より大きくなければならない）。3つのデータセットにおいて共通して同定される18種のmiRNAを、miRNA候補として選択した。（2）組織検証フェーズ。18種のmiRNA候補の発現レベルを、32例のESCC組織サンプルおよび32例のマッチした近接正常組織においてqRT-PCRによって評価した。すべてのmiRNA候補が、ESCC組織サンプルにおいて有意に上方調節されている（p値＜0.05）ことが裏付けられた。（3）血清洗練フェーズ。診断用miRNAパネルを開発するために、本発明者らは、年齢、性別、および人種がマッチした50例のESCC患者および50例の健常対照を含む血清洗練コホートを用いて、血清中の18種のmiRNA候補の発現レベルを検査した。8種のmiRNAは、ESCC血清サンプルにおいて有意に上方調節されたことが見出され（p値＜0.05）、以下の解析に選択された。（4）血清訓練および検証フェーズ。その後、本発明者らは、多変量ロジスティック回帰を採用して、南アフリカのGroote Schuur Hospitalからの280例のESCC患者および128例の健常対照を伴う血清訓練コホートを用いて、ESCC診断のためのリスク採点公式を確立した。さらには、本発明者らは、血清検証コホート1（熊本大学医学部附属病院からの106例のESCC患者および20例の健常対照）および血清検証コホート2（名古屋大学医学部附属病院からの123例のESCC患者および42例の健常対照）を用いて、8-miRNAパネルの診断値を検証した。miRNAシグネチャーモデルを用いて、本発明者らは、感度、特異度、曲線下面積（AUC）、および対応する95％信頼区画によって、訓練、検証1、および検証2コホートに対する診断性能を評価した。すべての血清コホートに対して、ロジスティクス関数1/(1＋exp(−線形予測子))を用いてリスクスコアを算出し、カットオフは訓練コホートのヨーデン指標（Youden's index）：0.582である。本発明者らは、血清検証コホート2において血清SCC-Agを含めることによって、ESCCの予測性能も検査した。
【０１６２】
4．組織からのRNA単離
スモールRNAを含む全RNAを、メーカーのプロトコールに従ってRNeasy Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA）を用いて組織から単離し、QIAcube半自動ロボット装置（Qiagen, Valencia, CA）を用いて30μLのRNase不含水中に溶出し、NanoDrop分光光度計（NanoDrop Technologies, Wilmington, DE）を用いて定量化し、さらなる使用のために-80℃で保管した。
【０１６３】
5．血清からのRNA単離
Qiagen miRNAeasy Serum/Plasma Kit（Qiagen）を用いて、すべての血清サンプルからスモールRNAを富化した。簡潔には、血清サンプルを氷上で融解し、10,000rpmで5分間遠心分離して細胞残屑を除去した。次に、200μLの上清を1000μLのQiazol Lysis Reagent中で溶解した。RNA単離手順中のサンプル間の変動の正規化に関して、25fmolの合成C.エレガンスmiRNA（cel-miR-39、Qiagen）を、各変性サンプルに添加した。QIAcube半自動ロボット装置（Qiagen）を用いて、スモールRNAを含む全RNAを抽出し、30μLのRNase不含水中に溶出し、さらなる使用のために-80℃で保管した。
【０１６４】
6．定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）
miRNAに基づくRT-PCRアッセイに関して、組織/血清サンプル由来の1.2μLの富化したスモールRNAを、以下の条件：16℃30分間、42℃30分間、85℃で、6μLの総反応量でTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems）を用いて逆転写し、4℃で維持する。リアルタイムPCRを、MicroRNA Assay KitおよびTaqMan Universal Master Mix II, no UNG（Applied Biosystems）を用いて行った。miRNAの定量化のためのPCR反応を、以下のサイクル条件：95℃10分間、それに続く40サイクルの95℃15秒間および60℃1分間で、QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて実施した。結果を2-ΔΔCtとして表現した。組織試料では、結果をU6（Ambion, Austin, TX）に対して正規化し、血清試料では、結果を内部内在性対照miR-16に対して正規化した。
【０１６５】
7．統計解析
サンプルの2つのマッチしたペア群間または2つの独立した群間の差次的miRNA発現の統計的有意性を定量化するために、対応のあるt検定および両側スチューデントt検定をそれぞれ用いた。すべてのp値は両側であり、＜0.05のp値を有意と見なした。受信者操作特性（ROC）曲線を作出し、95％信頼区画（CI）を有するROC曲線下面積（AUC）を計算して、miRNAの識別性能を検査した。ESCC診断に関して、多変量ロジスティック回帰モデルを訓練して、8種のシグネチャーmiRNAの発現レベルに基づいて癌リスクを予測した。すべての統計解析を、Medcalc統計ソフトウェア（v.12.7.7.、Medcalc Software bvba, Ostend, Belgium）、JMPソフトウェア（10.0.2.、SAS Institute, Cary, NC, USA）、およびR（3.3.3、R Development Core Team、https://cran.r-project.org/）を用いて実施した。
【０１６６】
B．結果
1．対象の特徴
ESCC血清サンプルには、切除可能な腫瘍を有する患者（n＝538）に対する外科手術前に、および切除不能な腫瘍を有する患者（n＝21）に対する化学療法前に採取されたすべての治療前サンプルが含まれた。加えて、合計240例の血清サンプルを健常対照から獲得した。血清洗練コホート、血清訓練コホート、および血清検証コホート1におけるESCC患者と健常対照との間で、年齢の分布に有意な差異はなくかつ有意な人種的および性別的差異はなく、健常参加者のサンプリングにおける制限により、血清検証コホート2におけるESCCを有する患者と健常参加者との間で、年齢の有意な差異があった（平均差異、26.7歳［95％CI、26.4〜28.9歳］）。
【０１６７】
2．ESCC関連miRNAパネル候補の同定
図16におけるフローチャートは、全般的な調査設計を解説している。発見フェーズにおいて、本発明者らは、組織に基づく3つのmiRNA発現データセット（TCGA、GSE55856、GSE43732）を調べて、miRNAパネル候補に優先順位を付けた。各データセットに関して、miRNAは、それが（1）ESCCと正常サンプルとの間で差次的に発現している（log2倍率変化＞0.5、FDR調整p値＜0.05）；（2）ESCCと正常サンプルとを識別できる（AUC＞0.7）；（3）ESCCにおいて上方調節されておりかつ臨床における検出を容易にする比較的高い発現を有する（平均発現＞すべての差次的に発現したmiRNAの平均発現の中央値）場合、潜在的候補として見なされる。その結果として、79、431、および136種のmiRNAがTCGA、GSE55856、およびGSE43732データセットからそれぞれ同定され、そのうち3つのデータセットの間で重複した18種のmiRNAに、miRNAパネル候補として優先順位を付けた（図13A）。18-miRNAパネルの診断値を評価するために、2つの異なるストラテジーを採用した。（1）各コホート内において、2分割交差検証（100回繰り返し）を用いた多変量ロジスティック回帰は、堅牢な診断値を実証した（それぞれ平均AUC＝0.98、0.99、0.98）（図13B）。（2）GSE55856で訓練された多変量ロジスティック回帰モデルは、3つすべてのデータセットに対して高い予測性能も達成した（それぞれAUC＝0.99、1.00、0.99）（データ示さず）。さらには、本発明者らは、32例のESCCおよび32例のマッチした近接正常組織に対してqRT-PCRを実施し、18種のmiRNAすべてが、ESCC臨床組織サンプルにおいて有意に上方調節されている（p値＜0.05）ことを裏付けた（図17）。
【０１６８】
3．ESCCの予測のための循環miRNAパネルの確立
血清洗練コホート（50例のESCC、50例の健常対照）を用いて、本発明者らは、次に、18種の組織由来候補を洗練させて循環miRNAパネルを開発することを目指した。全18種の候補のうち、検出限界（平均サイクル閾値＞35）を下回る4種のmiRNA（miR-182、miR-183、miR-18a、miR-505）を除外した。他の14種の検出可能なmiRNAの中で、8種（miR-103、miR-106b、miR-151、miR-17、miR-181a、miR-21、miR-25、miR-93）はESCC血清において有意に上方調節された（図14）。その後、本発明者らは、血清訓練コホート（208例のESCC、128例の健常対照）で8種のmiRNAに対するqRT-PCRを実施し、多変量ロジスティック回帰モデルを訓練した。以下のとおり、リスク採点公式が多変量モデルから導き出された：logit(P)＝0.209*miR21＋0.968*miR93＋0.454*miR106b＋3.753*miR17−8.505*miR181a＋4.149*miR25−1.375*miR103−3.278*miR151−0.998。訓練コホートで、8-miRNAモデルは、0.83のAUC（95％CI、0.79〜0.87）、78％の感度、および75％の特異度を達成した（図15A）。
【０１６９】
4．2つの検証コホートにおける循環miRNAパネルの診断性能
8-miRNAの診断値を検証するために、本発明者らは、2つの付加的な独立した血清コホート：血清検証コホート1（106例のESCC患者、20例の健常対照）および血清検証コホート2（123例のESCC患者、42例の健常対照）に対してqRT-PCRを実施した。各コホートに関して、本発明者らは、8-miRNAモデルを用いてリスクスコアを算出し、血清訓練コホートから導き出された対応するカットオフ値（0.582）を用いて高リスクまたは低リスク群を判定した。8-miRNAモデルは、血清検証コホート1（図15B、AUC：0.80、95％CI：0.69〜0.91、感度：89％、特異度：60％）および血清検証コホート2（図15C、AUC：0.89、95％CI：0.83〜0.94、感度：87％、特異度：85％）の両方に対して堅牢な予測性能を達成した。重要なことには、扁平上皮細胞癌関連抗原の従来的腫瘍マーカー（SCC-Ag）は、血清検証コホート2（123例のステージI〜IV ESCC患者対42例の健常対照）に対してESCC診断のある値（AUC：0.71、95％CI：0.60〜0.84、感度：0.91、特異度：0.69）を示したが、8-miRNAモデルは、有意により高い診断性能を実証した（p値＝0.003、DeLong検定）。とりわけ、8-miRNAパネルは、ステージI ESCC患者（n＝20）と健常対照（n＝42）とを区別し得（AUC：0.81、95％CI：0.70〜0.94、感度：0.76、特異度：0.91）、それはSCC-Ag（AUC＝0.63、95％CI：0.50〜0.78、感度：0.75、特異度：0.69）よりも優れている（p値＝0.025、DeLong検定）。これらの検証結果は、臨床におけるESCCの非侵襲的早期検出のための堅牢なバイオマーカーとして8-miRNAモデルを用いる有望な潜在性を実証した。
【０１７０】
C．考察
ESCCは、予後の不良な最も侵攻性の高い癌の1つであり、患者の低い生存率は診断の遅れに大いに起因する。それゆえ、ESCCの早期検出は、有効な治療および患者転帰を向上させる適時介入を遂行する機会を提供する。しかしながら、現在、ESCC診断のための臨床上実行可能な分子マーカーは存在しない。本調査において、本発明者らは、バイオインフォマティクス手法を利用して、3つのインシリコデータセットからmiRNA候補を同定した。次いで、本発明者らは、血清におけるこれらmiRNAの発現を評価し、ESCCに対する非侵襲的診断マーカーとしての堅牢なmiRNAパネルを確立し、3つの独立したコホートにおいて検証した。興味深いことには、早期ステージESCC患者に対してさえ、本発明者らは、miRNAパネルが、ESCCの最もよく用いられている血清診断マーカーのSCC-Agよりも有意に良好な検出能を有することを示した。結論として、3つの大きな独立した検証コホートを有する包括的バイオマーカー発見過程を用いて、本発明者らは、ESCCの早期検出のための新規でかつ堅牢なmiRNAに基づくパネルを開発しかつ検証することに初めて成功し、それは、将来、ESCC患者の非侵襲的診断を変換する潜在性を有する。
【０１７１】
本明細書において開示されかつ主張される方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験なしに作製され得かつ実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい態様の観点から記載されているものの、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書において記載される方法に、および方法の段階においてまたは一連の段階において、変動が適用され得ることは当業者に明白であろう。より具体的には、化学的および生理学的の両方で関連しているある特定の作用物質は、本明細書において記載される作用物質に代わって置換され得る一方で、同じまたは類似の結果が達成されることは明白であろう。当業者に明白なすべてのそのような類似の置換物および改変物は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲、および概念の内にあると見なされる。本開示を通して参照されるすべての参考文献および刊行物は、すべての目的のために参照により組み入れられる。
【図１】
2019529351.tif 000015
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ−１】
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【図１３Ｂ−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【国際調査報告】
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