(57)【要約】【課題】本発明はポリミキシンＢ硫酸塩結晶及びその製造方法を提供する。【解決手段】本発明の製造方法は、ポリミキシンＢ発酵液を樹脂に吸着させ、硫酸又は酸性エタノールを添加して脱着させる工程；濃縮してポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液を得る工程；並びに有機溶媒を用いて該飽和溶液から結晶を沈殿させ、ろ過及び乾燥を行って、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶を得る工程を含む。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリミキシンＢ硫酸塩結晶を製造する方法であって、
ポリミキシンＢ発酵液を樹脂に吸着させ、硫酸水溶液及び／又は酸性エタノール水溶液を添加して脱着させ、脱着液を得る工程１）；
前記工程１）で得た前記脱着液のｐＨを５．０〜７．０に調整し、固体が沈殿するまで濃縮して、ポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液を得る工程２）；並びに
前記工程２）で得た前記ポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液を撹拌しながらこれに有機溶媒を滴下するか、或いは前記有機溶媒を撹拌しながらこれに前記工程２）で得た前記ポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液を滴下して結晶を沈殿させ、ろ過し、ろ過ケーキを乾燥して、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶を得る工程３）
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法において、前記工程１）では、前記硫酸水溶液の濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の製造方法において、
前記工程１）では、前記ポリミキシンＢ発酵液を前記樹脂に吸着させる前に、前記ポリミキシンＢ発酵液に前処理を施し、
前記前処理が、前記ポリミキシンＢ発酵液を酸性にする工程ａ）、セライトを添加してろ過する工程ｂ）を含み、
好ましくは、前記ポリミキシンＢ発酵液を前記樹脂に吸着させる際に、（ｉ）イオン交換処理、（ｉｉ）マクロポーラス吸着樹脂処理を行い、
より好ましくは、前記前処理において、前記ポリミキシンＢ発酵液のｐＨを１．８に調整し、前記工程ｂ）で前記セライトを添加し、均一に撹拌した後にろ過し、ろ液の力価が０．２ｇ／Ｌ未満となるまで水洗し、更に好ましくは、前記ポリミキシンＢ発酵液のｐＨ調整をシュウ酸添加によって行い、
更に好ましくは、前記イオン交換処理において、酸性にした前記ポリミキシンＢ発酵液のろ液のｐＨを６．７に調整し、弱酸性イオン交換樹脂に吸着させ、完全に吸着させた後に、カラム容積の２〜３倍の体積の水で流出液が無色となるまで洗浄し、０．２ｍｏｌ／Ｌの前記硫酸水溶液で脱着させ、好ましくは、前記弱酸性イオン交換樹脂がＬＸＤ−１３５弱酸性イオン交換樹脂であり、前記ポリミキシンＢ発酵液の前記ろ液のｐＨ調整を２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いて行い、
更に好ましくは、前記マクロポーラス吸着樹脂処理において、前記イオン交換処理した前記ポリミキシンＢ発酵液のｐＨを６．５に調整し、マクロポーラス吸着樹脂に完全に吸着させた後に、カラム容積の２倍の体積の水で洗浄し、前記酸性エタノール水溶液で脱着させ、好ましくは、前記イオン交換処理した前記ポリミキシンＢ発酵液のｐＨの調整を２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いて行い、更に好ましくは、前記酸性エタノール水溶液がｐＨ３の４０ｖｏｌ％エタノール水溶液であり、
更に好ましくは、工程１）において、得られた前記脱着液を濃縮し、活性炭を用いて脱色し、ろ過することを特徴とする製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法において、前記工程２）では、０．５〜１０Ｍの水酸化ナトリウム溶液を用いて前記脱着液のｐＨを５．０〜７．０に調整することを特徴とする製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法において、前記工程３）では、前記有機溶媒がＣ１〜Ｃ４アルコール、Ｃ３〜Ｃ４ケトン、酢酸エチル、及び酢酸ブチルから選択される１種以上であり、好ましくは、前記Ｃ１〜Ｃ４アルコールがメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、及びブタノールから選択される１種以上であり、更に好ましくは、前記Ｃ３〜Ｃ４ケトンがアセトン及び２−ブタノンから選択される１種以上であることを特徴とする製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法において、前記工程３）では、０〜４０℃の温度で前記結晶を沈殿させ、好ましくは、前記滴下が完了してから前記撹拌を０〜８時間継続し、より好ましくは、前記乾燥を真空下で４０〜６０℃の温度で３〜２０時間行うことを特徴とする製造方法。
【請求項７】
図３に示す粉末Ｘ線回折パターン（ＣｕＫα線を使用して測定した２θ）を示すことを特徴とするポリミキシンＢ硫酸塩結晶。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法によって製造したポリミキシンＢ硫酸塩結晶又は請求項７に記載のポリミキシンＢ硫酸塩結晶と、薬学的に許容される担体とを含む抗菌医薬組成物であって、
好ましくは前記医薬組成物が錠剤、カプセル、又は顆粒の形態であり、より好ましくは前記錠剤が速放性錠剤、チュアブル錠剤、分散錠剤、発泡錠剤、徐放性錠剤、放出制御錠剤、及び腸溶性錠剤から選択され、前記カプセルがハードカプセル、ソフトカプセル、徐放性カプセル、放出制御カプセル、及び腸溶性カプセルから選択され、且つ前記顆粒が懸濁顆粒、発泡顆粒、腸溶性顆粒、徐放性顆粒、又は放出制御顆粒から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の医薬組成物において、更にポリミキシンＢ硫酸塩以外の抗菌活性成分を１種以上含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法によって製造したポリミキシンＢ硫酸塩結晶又は請求項７に記載のポリミキシンＢ硫酸塩結晶の使用であって、
前記ポリミキシンＢ硫酸塩結晶を抗菌薬の調製に使用し、好ましくはグラム陰性菌に対する薬剤の調製に使用し、より好ましくは薬物耐性菌に対する薬剤の調製に使用し、好ましくは前記薬物耐性菌が薬物耐性グラム陰性菌であることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬学分野に属し、特にポリミキシンＢ硫酸塩結晶及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリミキシンＢはバチルス・ポリミキサによって産生されるアルカリ性環状ポリペプチド抗生物質であり、様々なアミノ酸及び脂肪酸を含有する。ポリミキシンＢ製品はポリミキシンＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１−Ｉを含む多成分混合物であり（ヨーロッパ薬局方では、これら４成分の合計質量が８０．０％以上であることが必要とされる）、通常はその硫酸塩が臨床的に用いられる。ポリミキシンＢ硫酸塩は白色又はオフホワイト色の吸湿性粉末である。ポリミキシンＢ硫酸塩はグラム陰性菌に対して強い殺菌効果を示し、特にＮＤＭ−１細菌（スーパーバクテリア）に対してインビトロで高い感受性を示し、そのため注目を集めている。
【０００３】
ポリミキシンＢ硫酸塩は結晶化が困難であるため、通常、噴霧乾燥法（特許出願第ＣＮ２０１２１０５１９３３１．７号）又は凍結乾燥法（特許出願第ＣＮ２０１５１０７７５５８０．６号）を用いてポリミキシンＢ硫酸塩製品を精製する。ポリミキシンＢ結晶に関する最新の特許として、ポリミキシンＢ１二水和物結晶を開示している特許出願第ＣＮ２０１２１０３７９２３１．９号が挙げられる。このポリミキシンＢ１二水和物結晶はアセトンとジエチルエーテルの混合溶媒を用いて沈殿させて得られる。しかしながら、ジエチルエーテルは揮発性が極めて高く、空気中で容易に酸化され爆発を起こすため、工業生産には適していない。加えて、市販品は全てポリミキシンＢ硫酸塩との混合物である。本願出願人によるポリミキシンＢ１硫酸塩モノマーの調製に関する特許出願が既に特許登録されているが（特許第ＺＬ２０１１１０３９０６２４．５号）、その最終製品も噴霧乾燥法によって製造される。噴霧乾燥法で製造したポリミキシンＢ硫酸塩と市販のポリミキシンＢ硫酸塩製品はいずれも強い吸湿性を示し、その溶液は透明度が低く一定の濁度を示すことが確認されており、品質を改善する必要がある。従来の結晶化法を用いて母液を結晶化する場合、不純物をある程度除去することはできるが、ポリミキシンＢ硫酸塩の沈殿は粘着性が高く凝集しやすいため結晶化操作は困難である。従って、新たなポリミキシンＢ硫酸塩結晶及びその製造方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
従来のポリミキシンＢ硫酸塩製品は透明度及び純度が高くなく、その結晶沈殿物は凝集しやすいという問題を鑑み、本発明は、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶及びその製造方法を提供する。
【０００５】
本発明のポリミキシンＢ硫酸塩結晶の製造方法は、ポリミキシンＢ発酵液を樹脂に吸着させ、硫酸水溶液及び／又は酸性エタノール水溶液を添加して脱着させ、脱着液を得る工程１）；工程１）で得た脱着液のｐＨを５．０〜７．０に調整し、固体が沈殿するまで濃縮して、ポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液を得る工程２）；並びに工程２）で得たポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液を撹拌しながらこれに有機溶媒を滴下するか、或いは有機溶媒を撹拌しながらこれに工程２）で得たポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液を滴下して結晶を沈殿させ、ろ過し、ろ過ケーキを乾燥して、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶を得る工程３）を含む。
【０００６】
本発明の製造方法の工程１）において、好ましくは、硫酸水溶液の濃度は０．２ｍｏｌ／Ｌである。
【０００７】
本発明の製造方法の特定の実施形態では、工程１）において、１時間あたり０．５カラム容積の０．２ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液を用いて脱着させ、脱着液を部分的に回収する。脱着液の力価が５００μｇ／ｍｌを超えているときにこの回収を開始し、力価が５００μｇ／ｍｌ未満であるときに回収を停止する。
【０００８】
本発明の製造方法の工程１）において、好ましくは、ポリミキシンＢ発酵液を樹脂に吸着させる前に、ポリミキシンＢ発酵液に前処理を施し、該前処理はポリミキシンＢ発酵液を酸性にする工程ａ）、セライトを添加してろ過する工程ｂ）を含む。本発明の製造方法の工程１）において、好ましくは、ポリミキシンＢ発酵液を樹脂に吸着させる際に、（ｉ）イオン交換処理、（ｉｉ）マクロポーラス吸着樹脂処理を行う。
【０００９】
本発明の製造方法の特定の実施形態では、前処理において、ポリミキシンＢ発酵液のｐＨを１．８に調整し、セライトを添加し、均一に撹拌した後にろ過し、ろ液の力価が０．２ｇ／Ｌ未満となるまで水洗する。好ましくは、ポリミキシンＢ発酵液を酸性にする工程は、ポリミキシンＢ発酵液のｐＨをシュウ酸添加によって１．８に調整する工程であり、その後にセライトを添加し、均一に撹拌した後にフレームろ過を行い、ろ液の力価が０．２ｇ／Ｌ未満となるまで水洗する。
【００１０】
本発明の製造方法の特定の実施形態では、イオン交換処理において、酸性にしたポリミキシンＢ発酵液のろ液のｐＨを６．７に調整し、弱酸性イオン交換樹脂に吸着させ、完全に吸着させた後に、カラム容積（即ち、カラム中の弱酸性イオン交換樹脂の容積）の２〜３倍の体積の水で流出液が無色となるまで洗浄し、硫酸水溶液で脱着させる。好ましくは、弱酸性イオン交換樹脂はＬＸＤ−１３５弱酸性イオン交換樹脂である。より具体的には、イオン交換処理において、酸性にしたポリミキシンＢ発酵液のろ液のｐＨを２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で６．７に調整し、弱酸性イオン交換樹脂に吸着させ、完全に吸着させた後に、カラム容積の２〜３倍の体積の水で流出液が無色となるまで洗浄し、０．２Ｍ硫酸水溶液で脱着させ、好ましくは、弱酸性イオン交換樹脂はＬＸＤ−１３５弱酸性イオン交換樹脂である。
【００１１】
本発明の製造方法の特定の実施形態では、マクロポーラス吸着樹脂処理において、イオン交換処理したポリミキシンＢ発酵液のｐＨを６．５に調整し、マクロポーラス吸着樹脂に完全に吸着させた後に、カラム容積の２倍の体積の水で洗浄し、酸性エタノール水溶液で脱着させる。好ましくは、マクロポーラス吸着樹脂処理において、イオン交換処理したポリミキシンＢ発酵液のｐＨを２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で６．５に調整し、マクロポーラス吸着樹脂に完全に吸着させた後に、カラム容積の２倍の体積の水で洗浄し、ｐＨ３の４０％（ｖ/ｖ）エタノール水溶液で脱着させる。
【００１２】
本発明の製造方法の工程１）において、好ましくは、脱着液を濃縮し、活性炭を用いて脱色し、ろ過する。
【００１３】
本発明の製造方法の工程２）において、好ましくは、０．５〜１０Ｍの水酸化ナトリウム溶液を用いて脱着液のｐＨを５．０〜７．０に調整する。
【００１４】
本発明の製造方法の工程３）において、好ましくは、有機溶媒はＣ１〜Ｃ４アルコール、Ｃ３〜Ｃ４ケトン、酢酸エチル、及び酢酸ブチルから選択される１種以上である。より好ましくは、Ｃ１〜Ｃ４アルコールはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、及びブタノールから選択される１種以上である。より好ましくは、Ｃ３〜Ｃ４ケトンはアセトン又は２−ブタノンである。
【００１５】
本発明の製造方法の工程３）において、好ましくは、０〜４０℃の温度で結晶を沈殿させる。
【００１６】
本発明の製造方法の特定の実施形態では、当該方法は、ポリミキシンＢ発酵液を酸性にし、セライトを添加し、ろ過し、イオン交換処理し、マクロポーラス吸着樹脂処理し、硫酸水溶液を添加して脱着させて脱着液を得て、脱着液を濃縮し、活性炭で脱色し、ろ過してろ液を得る工程１）；水酸化ナトリウム水溶液を用いてろ液のｐＨを５．０〜７．０に調整し、固体が沈殿するまで濃縮して、ポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液を得る工程２）；並びに工程２）で得たポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液を撹拌しながら、結晶が沈殿するまで有機溶媒を滴下し、滴下中の温度を０〜１０℃に保持し、ポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液体積の０．５〜５倍の体積の有機溶媒の滴下を続け、０〜８時間撹拌し、ろ過し、ろ液を廃棄し、ろ過ケーキを真空下で３〜２０時間乾燥して、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶を得る工程３）を含む。
【００１７】
本発明は、上記製造方法によって製造したポリミキシンＢ硫酸塩結晶も提供する。即ち、本発明は、図３に示す粉末Ｘ線回折パターン（ＣｕＫα線を使用して測定した２θで示される）を有するポリミキシンＢ硫酸塩結晶も提供する。図３から明らかなように、本発明の製造方法によって製造したポリミキシンＢ硫酸塩は結晶質である。
【００１８】
更に、本発明は、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。この医薬組成物は更にポリミキシンＢ硫酸塩以外の抗菌活性成分を１種以上含んでいてもよい。好ましくは、該医薬組成物は錠剤、カプセル、又は顆粒の形態である。より好ましくは、錠剤は速放性錠剤、チュアブル錠剤、分散錠剤、発泡錠剤、徐放性錠剤、放出制御錠剤、及び腸溶性錠剤から選択され、カプセルはハードカプセル、ソフトカプセル、徐放性カプセル、放出制御カプセル、及び腸溶性カプセルから選択され、顆粒は懸濁顆粒、発泡顆粒、腸溶性顆粒、徐放性顆粒、及び放出制御顆粒から選択される。
【００１９】
本発明は、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶を抗菌薬の調製、好ましくはグラム陰性菌に対する薬剤の調製に使用する方法も提供する。本発明は、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶を薬物耐性菌（特に薬物耐性グラム陰性スーパーバクテリア等の薬物耐性グラム陰性菌）に対する薬剤の調製に使用する方法も提供する。
【００２０】
換言すると、本発明は、細菌（特にグラム陰性菌）に抵抗するために用いられるポリミキシンＢ硫酸塩結晶も提供する。本発明は、薬物耐性菌（特に薬物耐性グラム陰性スーパーバクテリア等の薬物耐性グラム陰性菌）に抵抗するために用いられるポリミキシンＢ硫酸塩結晶も提供する。
【００２１】
本発明は、細菌感染症（特にグラム陰性菌が引き起こす疾患又は症状）を予防及び／又は治療する方法も提供する。この方法では、予防有効量且つ／或いは治療有効量の上記ポリミキシンＢ硫酸塩結晶を含む医薬製剤を、これを必要とする対象又は患者に投与する。
【００２２】
本発明は、薬物耐性菌感染症（特に薬物耐性グラム陰性スーパーバクテリア等の薬物耐性グラム陰性菌が引き起こす疾患又は症状）を予防及び／又は治療する方法も提供する。この方法では、予防有効量且つ／或いは治療有効量の上記ポリミキシンＢ硫酸塩結晶を含む医薬製剤を、これを必要とする対象又は患者に投与する。
【００２３】
本発明はポリミキシンＢ硫酸塩結晶製品を提供する。該製品が結晶形を有し、より優れた透明度及び純度を有し、且つ低い吸湿性を示すことは、実験結果から明らかである。加えて、本発明の製造方法は操作が容易であり、結晶化に用いる溶媒は低コストで容易に入手できるため大規模な工業生産に適している。本発明はポリミキシンＢ硫酸塩結晶の臨床的応用範囲を広げる基盤となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】ｎ−ブタノール／エタノール水溶液中のポリミキシンＢ硫酸塩結晶を示す図である。
【図１Ｂ】乾燥後のポリミキシンＢ硫酸塩結晶試料を示す図である。
【図２Ａ】ポリミキシンＢ硫酸塩結晶を４０倍の倍率で示す顕微鏡写真である。
【図２Ｂ】ポリミキシンＢ硫酸塩結晶を１００倍の倍率で示す顕微鏡写真である。
【図３】ポリミキシンＢ硫酸塩結晶試料の粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）パターンである。
【図４Ａ】噴霧乾燥ポリミキシンＢ硫酸塩試料のＨＰＬＣクロマトグラム及びクロマトグラフピークデータである。
【図４Ｂ】ポリミキシンＢ硫酸塩結晶試料のＨＰＬＣクロマトグラム及びクロマトグラフピークデータである。
【図５】ポリミキシンＢ硫酸塩結晶（左）と噴霧乾燥試料（右）との透明度の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明をより適切に解説し、本発明の技術的解決法の理解を容易にするために、以下、添付図面及び実施形態との関連で、本発明をより詳細に説明する。なお、下記具体例は本発明の説明を意図したものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２６】
本願では、バチルス・ポリミキサ及び綿実粕粉を原料として用い、４０〜５０時間純粋発酵することによって、ポリミキシンＢ発酵液を調製する。対照試料はポリミキシンＢ硫酸塩原料試料及び市販品試料である。
【００２７】
実施例１
５ＬのポリミキシンＢ発酵液（力価１．８ｇ／Ｌ）にシュウ酸固体を添加し、ｐＨを１．８に調整した。３０分間撹拌した後、２５０ｇのセライトを添加し、更に３０分間撹拌した。得られた混合物をフレームろ過し、力価が０．２ｇ／Ｌ未満となるまで水洗した。ろ過を終了して７．１Ｌのろ液（８．５ｇのポリミキシンＢを含有）を得た。２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてろ液のｐＨを６．７に調整し、６０ｍｌのＬＸＤ−１３５弱酸性イオン交換樹脂を含むクロマトグラフィーカラムに入れて吸着させた。完全に吸着させた後、ＬＸＤ−１３５弱酸性イオン交換樹脂の２〜３倍の体積の水を用いて流出液が無色となるまでカラムを洗浄し、０．２Ｍ硫酸水溶液を用いて脱着させ、８００ｍｌの脱着液（７．４ｇのポリミキシンＢ硫酸塩を含有）を得た。脱着液のｐＨを２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で６．５に調整し、８０ｍｌのＬＸＴ−０８１マクロポーラス吸着樹脂を含むカラムに入れて吸着させた。完全に吸着させた後、カラム容積の２倍の体積の水を用いてカラムを洗浄し、４０％（ｖ／ｖ）酸性エタノール水溶液（ｐＨ３）を用いて脱着させ、１６００ｍｌの脱着液（６．７４ｇのポリミキシンＢ硫酸塩を含有）を得た。
【００２８】
５０℃の温度でロータリーエバポレーターによって脱着液を１／３の体積まで濃縮した後、濃縮物の体積に対し１％（ｗ／ｖ）の活性炭を５ｇ添加した。得られた混合物を６０℃で３０分間撹拌し、ろ過した。ろ液は６．１ｇのポリミキシンＢを含んでいた。２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いてろ液のｐＨを５．０〜７．０に調整した後、体積が約７０ｍｌとなるまで濃縮を続行した。撹拌を開始し、溶液が懸濁するまで無水エタノールをゆっくり滴下した。無水エタノールの滴下を停止し、系を０〜５℃まで冷却した。固体が沈殿するまで撹拌を続け、濃縮物の１〜２倍の体積の無水エタノールを継続して滴下して、計３倍の体積の無水エタノールを添加した。次に、０〜５℃で６時間撹拌し、ろ過によって固体を単離した。ろ取した固体を真空下で６０℃の温度で４時間乾燥し、白色固体（５．４ｇ）を得た。結晶収率は８８．５％、純度は９１．３８％であった。得られたポリミキシンＢ硫酸塩結晶の粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）パターンを図３に示す。透明度試験（２０１０年版中国薬局方、第ＩＩ巻、付属書ＩＸＢ）を行った結果はＮｏ．1（図５の左）より劣っており、市販のポリミキシンＢ硫酸塩の透明度はＮｏ．２（図５の右）よりも高い。本発明の製造方法で得たポリミキシンＢ硫酸塩の力価をカッププレート法で測定したところ、８３００Ｕ／ｇであった。得られたポリミキシンＢ硫酸塩結晶試料及び噴霧乾燥試料のＨＰＬＣクロマトグラムを図４Ｂ及び図４Ａにそれぞれ示す。
【００２９】
実施例２
５ＬのポリミキシンＢ発酵液（力価１．８ｇ／Ｌ）を採取し、実施例１の手順に従って脱着液を調製した。本例では、得られた脱着液を体積５０ｍｌの濃縮物（５．３ｇのポリミキシンＢ硫酸塩を含有）まで濃縮した。撹拌を開始し、溶液が懸濁するまで濃縮物に酢酸エチルをゆっくり滴下した。酢酸エチルの滴下を停止し、系を０〜５℃まで冷却した。固体が沈殿するまで撹拌を続行し、残りの酢酸エチルを続けて滴下して、トータルで濃縮物の３倍の体積の酢酸エチルを滴下した。その後、０〜５℃で撹拌を７時間続け、ろ過によって固体を単離した。ろ取した固体を真空下で６０℃の温度で３時間乾燥し、白色固体（４．８２ｇ）を得た。結晶収率は９１％、純度は８９．５８％であった。透明度試験の結果はＮｏ．１であり、カッププレート法で測定した力価は８３５５Ｕ／ｇであった。
【００３０】
実施例３
７ＬのポリミキシンＢ発酵液（力価１．８ｇ／Ｌ）を採取し、実施例１の手順に従って脱着液を調製した。本例では、脱着液を体積８５ｍｌの濃縮物（６．７ｇのポリミキシンＢ硫酸塩を含有）まで濃縮した。撹拌を開始し、溶液が懸濁するまで濃縮物にアセトンをゆっくり滴下した。アセトンの滴下を停止し、系を０〜５℃まで冷却した。固体が沈殿するまで撹拌し、残りのアセトンを続けて滴下して、トータルで濃縮物の３．５倍の体積のアセトンを滴下した。次に、０〜５℃で６時間撹拌し、ろ過によって固体を単離した。ろ取した固体を真空下で６０℃の温度で４時間乾燥し、白色固体（５．８３ｇ）を得た。結晶収率は８７％、純度は９０．９８％、透明度はＮｏ．１、カッププレート法で測定した力価は８１００Ｕ／ｇであった。本例の結晶試料及び市販製品を用いて同じ条件下で生物学的力価試験及びＨＰＬＣ検出を行った結果、本例の結晶試料の生物学的力価は市販製品よりも８．８％高かった。生物学的力価を市販製品よりも８．８％高くすることは難しく、本発明のポリミキシンＢ硫酸塩結晶製品の生物学的力価の向上は、品質の観点から有利である。市販製品（噴霧乾燥によって製造）のＨＰＬＣクロマトグラフによる主成分（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、及びＢ１−Ｉ）の純度は８９．９９％であった（図４Ａ）。一方、本発明の結晶試料のＨＰＬＣクロマトグラフによる活性成分（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、及びＢ１−Ｉ）の純度は９２．６２％であり（図４Ｂ）、ヨーロッパ薬局方の４成分の合計が８０．０％以上という条件よりも大幅に高かった。現在主に使用されている噴霧乾燥法と比較して、本発明の製造方法はクロマトグラフ純度及び結晶物含有量を大きく改善することができ、品質を向上させることが可能である。
【００３１】
実施例４
４ＬのポリミキシンＢ発酵液（力価１．５ｇ／Ｌ）を採取し、実施例１の手順に従って脱着液を調製した。本例では、脱着液を体積２５ｍｌの飽和溶液（サンプリング測定によるポリミキシンＢ硫酸塩の含有量は２．６０ｇ）まで濃縮した。２５０ｍｌ（ポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液の１０倍の体積）のイソプロパノールを撹拌しながら、これに飽和溶液をゆっくり滴下した。滴下中、イソプロパノールの温度は常に５〜１０℃の範囲内に調整した。滴下中、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶の沈殿が徐々に増加し、付着の無い均一な分散状態であった。１時間撹拌し、混合物をろ過し、ろ取した固体を真空下で５０℃の温度で１０時間乾燥して、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶粉末（２．４０ｇ）を得た。結晶収率は９２．３％であった。
【００３２】
実施例５
１０ＬのポリミキシンＢ発酵液（力価２．０ｇ／Ｌ）を採取し、実施例１の手順に従って脱着液を調製した。本例では、脱着液を体積１４０ｍｌの飽和溶液（サンプリング測定によるポリミキシンＢ硫酸塩の含有量は１３．５０ｇ）まで濃縮した。７００ｍｌ（ポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液の５倍の体積）のｎ−ブタノールを撹拌しながら、これに飽和溶液をゆっくり滴下した。滴下中、ｎ−ブタノール溶液系の温度は常に２５〜３０℃の範囲内に調整した。滴下中、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶の沈殿が徐々に増加したが、付着の無い均一な分散状態であり、良好な粒度を有していた。ポリミキシンＢ硫酸塩水溶液の滴下が完了した後、３０分間撹拌し、混合物をろ過し、ろ取した固体を真空下で４０℃の温度で２０時間乾燥して、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶粉末（１２．４０ｇ）を得た。結晶収率は９１．９％であった。
【００３３】
実施例６
７ＬのポリミキシンＢ発酵液（力価１．５ｇ／Ｌ）を採取し、実施例１の手順に従って脱着液を調製した。脱着液を体積５０ｍｌの飽和溶液（サンプリング測定によるポリミキシンＢ硫酸塩の含有量は５．００ｇ）まで濃縮した。４００ｍｌ（ポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液の８倍の体積）の混合溶媒（２００ｍｌのエタノールと２００ｍｌのｎ−ブタノールの混合溶媒）を撹拌しながら、これに飽和溶液をゆっくり滴下した。滴下中の温度は常に０〜５℃の範囲内に調整した。滴下中、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶の沈殿が徐々に増加したが、この沈殿は均一に分散しており、良好な粒度を有していた（図１）。ポリミキシンＢ硫酸塩水溶液の滴下が完了した後、２時間撹拌し、混合物をろ過し、ろ取した固体を真空下で６０℃の温度で８時間乾燥して、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶粉末（４．５２ｇ）を得た。結晶収率は９０．４％であった。４０倍及び１００倍の倍率での顕微鏡観察の結果、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶の存在は非常に明確であり、個々の結晶は均一であることが分かった（図２Ａ及び図２Ｂ）。
【００３４】
実施例７
１５ＬのポリミキシンＢ発酵液（力価１．５ｇ／Ｌ）を採取し、実施例１の手順に従って脱着液を調製した。脱着液を体積１００ｍｌの飽和溶液（サンプリング測定によるポリミキシンＢ硫酸塩の含有量は１０．００ｇ）まで濃縮した。１０００ｍｌ（ポリミキシンＢ硫酸塩飽和溶液の１０倍の体積）の混合溶媒（５００ｍｌのエタノールと５００ｍｌのイソプロパノールの混合溶媒）を撹拌しながら、これに飽和溶液をゆっくり滴下した。滴下中の温度は常に０〜５℃の範囲内に調整した。結晶が沈殿した後、残余の溶媒を連続的に滴下して結晶を得た。この結晶は均一に分散しており、良好な粒度を有していた。これを３０分間放置してから迅速に固液分離する。３０分間撹拌し、混合物をろ過し、ろ取した固体を真空下で５５℃の温度で１０時間乾燥して、ポリミキシンＢ硫酸塩結晶粉末（９．２３ｇ）を得た。結晶収率は９２．３％であった。
【００３５】
以上、本発明の具体的実施形態を詳細に説明したが、本発明はこれら実施形態に限定されるものではなく、本発明の主旨を逸脱しない範囲で種々の変更、改良、及び修正が可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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