(57)【要約】  Ｃａｓ９−シチジンデアミナーゼ融合タンパク質による植物（例えば作物）のゲノムにおける標的配列に対する効率的な塩基編集を実施するための方法、並びに該方法により製造した植物及びそれらの子孫を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）〜（ｖ）の少なくとも１つを含む、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集を実施するためのシステム：
ｉ）塩基編集融合タンパク質、及びガイドＲＮＡ、
ｉｉ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドＲＮＡ、
ｉｉｉ）塩基編集融合タンパク質、及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
ｉｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
ｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
ここで、塩基編集融合タンパク質は、ヌクレアーゼ−不活性化Ｃａｓ９ドメイン及びデアミナーゼドメインを含み、ガイドＲＮＡは、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集融合タンパク質を標的化できる。
【請求項２】
前記デアミナーゼが、シチジンデアミナーゼ、例えばアポリポタンパク質Ｂ−ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記シチジンデアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ又は活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）であり、例えば前記シチジンデアミナーゼが、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９が、野生型Ｃａｓ９と比較してＤ１０Ａ及び／又はＨ８４０Ａのアミノ酸置換を含み、例えば前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９が、配列番号１３又は１４に示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記デアミナーゼドメインを、前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９ドメインのＮ末端に融合させるか、又は前記デアミナーゼドメインを、前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９ドメインのＣ末端に融合させる、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記デアミナーゼドメイン及び前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９ドメインを、リンカーによって融合させ、例えば前記リンカーが、配列番号１２において示したＸＴＥＮリンカーである、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記塩基編集融合タンパク質が、さらに、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含み、例えば前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤が、配列番号１５において示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記塩基編集融合タンパク質が、さらに、核局在化配列（ＮＬＳ）を含み、例えば前記ＮＬＳが、配列番号３０又は３１において示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記塩基編集融合タンパク質が、配列番号２２又は２３において示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、塩基編集するために植物についてコドン最適化し、例えば前記塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号１９又は２０において示す、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記ガイドＲＮＡが、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又は前記ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を、植物のための発現調節エレメントに操作可能に連結する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記発現調節エレメントが、プロモーター、例えば３５Ｓプロモーター、トウモロコシＵｂｉ−１プロモーター、コムギＵ６プロモーター、イネＵ３プロモーター、又はトウモロコシＵ３プロモーターである、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
請求項１から１３までのいずれか１項に記載のシステムを植物に導入し、それによりガイドＲＮＡが、塩基編集融合タンパク質を前記植物のゲノムにおける標的配列に標的化し、前記標的配列における１つ以上のＣからＴへの置換をもたらすことを含む、遺伝子改変植物を製造するための方法であって、好ましくは前記導入が任意の選択圧の非存在下で実施される、遺伝子改変植物を製造するための方法。
【請求項１５】
前記標的配列中の３〜９位における１つ以上のＣをＴに置換する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、所望のヌクレオチド置換で植物についてスクリーニングすることを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物が、単子葉植物及び双子葉植物から選択される、請求項１４から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記植物が、作物、例えばコムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、モロコシ、ナタネ、アルファルファ、ワタ、オオムギ、キビ、サトウキビ、トマト、タバコ、キャッサバ、又はジャガイモである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的配列を、植物形質、例えば農学的形質と関連付け、それにより前記塩基編集が、野生型植物と比較して植物における形質の変化をもたらす、請求項１４から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記システムが、微粒子銃、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換、植物ウイルス媒介形質転換、花粉管アプローチ、及び子房注入アプローチから選択される方法によって前記植物に導入される、請求項１４から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、遺伝子改変植物の子孫を得ることを含む、請求項１４から２０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１４から２１までのいずれか１項に記載の方法によって得られる、遺伝子改変植物又はそれらの子孫又はそれらの部位。
【請求項２３】
請求項１４から２１までのいずれか１項に記載の方法によって遺伝子改変した第一の植物と、前記遺伝子改変を含まない第二の植物とを交雑させて、前記第二の植物中に前記遺伝子改変を導入することを含む、植物の育種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の遺伝子操作の分野に属する。特に、本発明は、植物における塩基編集のための方法に関する。より詳述すれば、本発明は、Ｃａｓ９−シチジンデアミナーゼ融合タンパク質による植物（例えば作物）のゲノムにおける標的配列に対する効率的な塩基編集を実施するための方法、並びに該方法により製造した植物及びそれらの子孫に関する。
【０００２】
背景技術
効率的に作物を改良するための必要条件は、現代の品種に容易に導入されてよい新規の遺伝子変異の利用能である。遺伝子研究、特にそのゲノム全体に関する研究は、１ヌクレオチドの変化が、作物における形質の差異についての主な理由であることを示す。１ヌクレオチドの変動は、アミノ酸置換を導き、それにより良好なアレル及び形質を導きうる。ゲノム編集の出現前に、Targeting Induced Local Lesions In Genomes（ＴＩＬＬＩＮＧ）を、作物の改良において多く要求される変異を生み出すための方法として使用できる。しかしながら、ＴＩＬＬＩＮＧスクリーニングは、時間を消費し、かつ費用が高く、同定された点変異は、数及びレパートリーの双方においてしばしば制限される。ゲノム編集技術、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に基づくゲノム編集技術は、相同組換え（ＨＲ）によって媒介されるＤＮＡ修復により特異的なゲノム部位において特定の塩基置換を導入することを可能にする。しかし今日まで、この方法の成功した使用は非常に限られており、それは、おそらく植物における低頻度のＨＲ媒介二本鎖切断修復のためである。さらに、ＤＮＡ修復のために十分な鋳型を効率的に提供することも困難な作業である。これらの問題は、植物におけるＨＲを介して効率的かつ容易に標的化点変異を得ることを大きな課題としている。したがって、植物ゲノムにおける標的化点変異を得る新たな方法に対する技術的な強い要求が依然としてある。
【０００３】
発明の要約
第一の態様において、本発明は、以下の（ｉ）〜（ｖ）の少なくとも１つを含む、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集を実施するためのシステムを提供する：
ｉ）塩基編集融合タンパク質、及びガイドＲＮＡ、
ｉｉ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドＲＮＡ、
ｉｉｉ）塩基編集融合タンパク質、及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
ｉｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
ｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
ここで、塩基編集融合タンパク質は、ヌクレアーゼ−不活性化Ｃａｓ９ドメイン及びデアミナーゼドメインを含み、ガイドＲＮＡは、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集融合タンパク質を標的化できる。
【０００４】
第二の態様において、本発明は、本発明の植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集を実施するためのシステムを植物中に導入し、それにより塩基編集融合タンパク質をガイドＲＮＡによって前記植物ゲノムにおける標的配列に標的化させ、前記標的配列における１つ以上のＣからＴへの置換をもたらすステップを含む、遺伝子改変植物を製造する方法を提供する。
【０００５】
第三の態様において、本発明は、本発明の方法により得られた遺伝子改変植物又はそれらの子孫を提供する。
【０００６】
第四の態様において、本発明は、本発明の方法より得られた遺伝子改変を含む第一の植物と、前記遺伝子改変を含まない第二の植物とを交雑させて、前記第二の植物中に前記遺伝子改変を導入するステップを含む、植物の育種方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＢＦＰからＧＦＰへのレポーターシステムによる植物プロトプラストにおける標的化−植物塩基編集（ＰＢＥ）により媒介されるゲノム編集システムの確立。（ａ）ｎ／ｄＣａｓ９−ＰＢＥ発現ベクターの図示。ＡＰＯＢＥＣ１、ｎ／ｄＣａｓ９、ＸＴＥＮ及びＵＧＩは、コムギについて全てコドン最適化されており、ＮＬＳは、ｎ／ｄＣａｓ９−ＰＢＥの両末端に付着されている。融合タンパク質は、トウモロコシのユビキチン−１プロモーターによって駆動される。（ｂ）植物プロトプラストにおける標的化−ＰＢＥにより媒介される正確な遺伝子編集を検出するためのＢＦＰからＧＦＰへのレポーターシステムの図解。（ｃ）フローサイトメトリーによるコムギ及びトウモロコシのプロトプラストにおける標的化−ＰＢＥにより媒介されるＢＦＰからＧＦＰへの変異効率の測定。４つの場のプロトプラストを示す。プロトプラストを、次のＤＮＡ構築物（左から右）で形質転換した：（ｉ）ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ、ｐＵｂｉ−ＢＦＰｍ、及びｐＢＦＰ−ｓｇＲＮＡ；（ｉｉ）ｐｄＣａｓ９−ＰＢＥ、ｐＵｂｉ−ＢＦＰｍ及びｐＢＦＰ−ｓｇＲＮＡ；（ｉｉｉ）ｐＵｂｉ−ＢＦＰｍ及びＢＦＰ−ｓｇＲＮＡのみ；（ｉｖ）トウモロコシのユビキチン−１プロモーターにより駆動されるＧＦＰ発現のための陽性対照ｐＵｂｉ−ＧＦＰ。スケールバーは８００μｍ。（ｄ）標的化−ＰＢＥシステムによって誘導されたＢＦＰ標的部位の遺伝子型及び頻度。配列において、標的塩基は４番目の位置に位置するＣである。下の数は標的配列におけるそれらの位置を示す。次のそれぞれの配列は、合計シーケンシングリードに対する対応する塩基のパーセンテージである。３つの隣接するＣ（Ｃ３、Ｃ６及びＣ９）もＴに変換されるが、タンパク質配列に対する変更はない。
【図２】植物プロトプラストにおける内在性遺伝子の標的化−ＰＢＥシステム媒介点変異。（ａ）標的化した単一のＣからＴへの置換の頻度。値及び誤差バーは、異なる日での３つの生物学的複製の平均及び標準偏差（ｓ．ｄ．）を反映する。（ｂ）捕捉したリードの合計数に対する変異体リードの数に基づく、ｎＣａｓ９−ＰＢＥによって生じた複数のシチジン置換の頻度。「−−」は利用可能ではないことを示す。（ｃ）植物プロトプラストにおける内在性遺伝子の７つの標的部位の挿入欠失形成の頻度。示した標的位置でのＴ又は挿入欠失を伴う合計ＤＮＡシーケンシングリードのパーセンテージを、ｎＣａｓ９−ＰＢＥ、ｄＣａｓ９−ＰＢＥ、又は野生型Ｃａｓ９での処理について示す。値及び誤差バーは、異なる日で実施した３つの生物学的複製についての平均及びｓ．ｄ．を反映する。（ｄ）ＺｍＣＥＮＨ３のＣＥＮＰ−Ａターゲティングドメイン（ＣＡＴＤ）におけるｎＣａｓ９−ＰＢＥを使用することによって生じた点変異のスペクトル。野生型ＺｍＣＥＮＨ３における３つの連続した残基、アラニン−ロイシン−ロイシン（ＡＬＬ）を、ＡＦＬ、ＶＬＬ、ＡＬＦ、ＡＦＦ、ＶＦＬ、ＶＬＦ、又はＶＦＦに変異させた。アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）ＣＥＮＨ３（ＡｔＣＥＮＨ３）及びオオムギＬ．（Hordeum vulgare L.）ＣＥＮＨ３（ＨｖβＣＥＮＨ３）のＣＡＴＤ領域を、比較を容易にするためにこの図において含んだ。下線を引いたロイシン残基は、ＡｔＣＥＮＨ３及びＨｖＣＥＮＨ３の固有の機能についての要求を予め示している。ＡｔＣＥＮＨ３において下線を引いたロイシン及びアラニン残基を置換して一倍体誘導をもたらすことが見出されている。ＺｍＣＥＮＨ３、ＡｔＣＥＮＨ３、及びＨｖＣＥＮＨ３についてのＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、それぞれＡＦ５１９８０７、ＡＦ４６５８００及びＪＦ４１９３２９である。
【図３】標的化−ＰＢＥシステムの適用によって得られた遺伝子操作したコムギ及びイネ植物。（ａ）ＴａＬＯＸ２のエキソン５の部位を標的とするために設計されたｓｇＲＮＡの配列。脱アミノ化領域における標的とされたＣは太字及びイタリックである。ＰＡＭ配列をイタリックで示し、ＳａｌＩ制限酵素部位はＧＴＣＧＡＣである。（ｂ）ＴａＬＯＸ２点変異を有する２つの変異体を分析するＴ７Ｅ１及びＰＣＲ−ＲＥアッセイの結果。レーンＴ０−１〜Ｔ０−１２は、Ｔ７Ｅ１及びＳａｌＩで消化した独立したコムギ植物から増幅したＰＣＲ断片のブロットを示す。レーン標識ＷＴ／Ｄ及びＷＴ／Ｕは、それぞれＴ７Ｅ１及びＳａｌＩで消化した又は消化していない野生型植物から増幅したＰＣＲ断片である。矢印によりマークしたバンドは、標的化−ＰＢＥ誘発変異によって生じる。点変異を有する２つの変異体の遺伝子型を、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによってさらに同定した。（ｃ）ＯｓＣＤＣ４８遺伝子をターゲティングするために使用したアグロバクテリウム（Agrobacterium）発現ベクターｐＡＧ−ｎ／ｄＣａｓ９−ＰＢＥの略図。Ｈｙｇは、２ｘ３５Ｓプロモーターによって駆動する。（ｄ）ＯｓＣＤＣ４８のエクソン９を標的とするために設計されたｓｇＲＮＡの配列。ＯｓＣＤＣ４８点変異を有する１２個の別個の変異体を分析するＴ７Ｅ１の結果を示す。（ｅ）Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって同定したＯｓＣＤＣ４８点変異を有するイネ変異体の遺伝子型及び頻度。それぞれの遺伝子型（合計でのそれぞれの遺伝子型変異体 対 イネ変異体）についての点変異の頻度を右側に示す。標的塩基は、Ｃ3、Ｃ4、Ｃ7及びＣ8であり、下付数字は標的配列におけるその位置を示す。下の配列はイネ変異体についてのシーケンスの結果である。
【図４】Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって同定したＯｓＣＤＣ４８点変異を有する１２個の代表的な変異体の遺伝子型。イタリック及び太字の塩基Ｃは、脱アミノ化領域の３位、４位、７位及び８位で変異させたＣｓを示す。ｔは、標的部位での成功したＣからＴへの置換を示す。
【図５】ｎＣａｓ９−ＰＢＥシステムによるＺｍＡＬＳ１／ＺｍＡＬＳ２の塩基編集。（ａ）ＺｍＡＬＳ１／ＺｍＡＬＳ２及び一般的なｓｇＲＮＡ標的配列のゲノム構造；（ｂ）異なるｎＣａｓ９−ＰＢＥ改変系列におけるＺｍＡＬＳ１／ＺｍＡＬＳ２のＣからＴへの置換型の検出。
【０００８】
発明の詳細な説明
１．定義
本発明において、特に明記されない限り、本明細書において使用される科学的及び技術的用語は、当業者に通常理解される意味を示す。また、本明細書において使用される用語及び実験法は、タンパク質及びヌクレオチド化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学、専門用語に属する全て、及び当該技術分野において一般に使用される慣用的な方法に関する。例えば、本明細書において使用される標準ＤＮＡ組換え及び分子クローニング技術は、当業者に周知であり、かつ以下の文献において詳細に記載されている：Sambrook, J.、Fritsch, E. F.及びManiatis, T.、Molecular Cloning: ALaboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989（以下「Sambrookら」と示す）。その一方で、関連する専門用語について本発明、定義及び実施例をより良く理解するために、以下を提供する。
【０００９】
「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」及び「Ｃａｓ９」は、本明細書において互換的に使用でき、Ｃａｓ９タンパク質又はそれらの断片（例えば、Ｃａｓ９の活性ＤＮＡ切断ドメイン及び／又はＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含むＲＮＡ指向性ヌクレアーゼを示す。Ｃａｓ９は、ＤＮＡ標的配列を標的として切断して、ガイドＲＮＡの誘導下でＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）及びその関連するシステム）ゲノム編集システムの構成要素である。
【００１０】
「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」は、本明細書において互換的に使用でき、典型的に、部分補体による複合体を形成するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子から構成され、ここでｃｒＲＮＡは、ハイブリダイゼーションのための標的配列に十分に相補的である配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓ９＋ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）を標的配列に特異的に結合させる。しかしながら、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの双方の特徴を含む一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計することができることは当該技術分野において公知である。
【００１１】
「デアミナーゼ」は、脱アミノ化反応を触媒作用する酵素を示す。本発明のある実施形態において、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼであり、シチジン又はデオキシシチジンをウラシル又はデオキシウリジンに脱アミノ化することをそれぞれ触媒作用する。
【００１２】
植物細胞に適用する「ゲノム」は、核内で見出される染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内区画内で見出されるオルガネラＤＮＡ（例えばミトコンドリア、色素体）を含む。
【００１３】
本明細書において使用されるように、「植物」という用語は、全植物及び任意の子孫、細胞、組織、又は植物部位を含む。「植物部位」という用語は、例えば、種子（成熟種子及び未成熟種子を含む）、植物切片、植物細胞、植物細胞培養物、植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、苗条、葉、根、茎、及び外植片）を含むがこれらに制限されない、植物の任意の部分を含む。植物組織又は植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、又は構造又は機能単位に組織化された任意の植物細胞の他の群であってよい。植物細胞又は組織培養物は、細胞又は組織を得る植物形の生理学的及び形態学的特徴を有する植物を再生することができ、かつ実質的に植物として同一の遺伝子型を有する植物を再生することができてよい。対照的に、いくつかの植物細胞は、再生して植物を生じることができない。植物細胞及び組織培養物において再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、絹糸、花、仁、雌穂、穂軸、穀皮又は葉柄であってよい。
【００１４】
植物部位は、採取可能な部位及び子孫植物の繁殖のために有用な部位を含む。繁殖のために有用な植物部位は、例えば種子、果実、切片、実生、塊茎及び根茎を含むが、これらに制限されない。植物の採取可能な部位は、例えば花、花粉、実生、塊茎、葉、茎、果実、種子及び根を含むがこれらに制限されない、任意の植物の有用な部位であってよい。
【００１５】
植物細胞は、植物の構造及び生理学的単位であり、細胞壁を有さないプロトプラスト細胞及び細胞壁を有する植物細胞を含む。植物細胞は、単離された単細胞、又は細胞のアグリゲート（例えば脆いカルス及び培養細胞）の形であってよく、かつ高組織化単位の部位（例えば植物組織、植物器官及び植物）であってよい。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子生成細胞、又は全植物に再生できる細胞もしくは細胞の合集であってよい。それ自体、複数の植物細胞を含み、全植物に再生することができる種子は、本明細書の実施形態における「植物細胞」と考えられる。
【００１６】
本明細書において使用される「プロトプラスト」という用語は、その細胞壁が完全に又は部分的に除去され、その脂質二重層膜がむき出しである植物細胞を示し、したがって、それらの細胞壁を完全に除去したプロトプラスト、及びそれらの細胞壁を部分的にのみ除去したスフェロプラストが含まれるが、それらに限定されない。典型的に、プロトプラストは、細胞壁を有さない単離された植物細胞であり、これは細胞培養物又は全植物への再生のための潜在能を有する。
【００１７】
植物の「子孫」は、植物の任意の次世代を含む。
【００１８】
「遺伝子改変植物」は、そのゲノム内で外因性ポリヌクレオチドを含む植物を含む。例えば、外因性ポリヌクレオチドは、ゲノム内に安定して組み込まれ、その結果、そのポリヌクレオチドが次の世代に受け継がれる。外因性ポリヌクレオチドは、ゲノムのみに組み込まれてよく、又は組換えＤＮＡ構築物の一部として組み込まれてよい。改変遺伝子又は発現調節配列は、植物ゲノムにおいて、該配列が１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び付加を含むことを意味する。例えば、本発明により得られる遺伝子改変植物は、野生型植物（遺伝子改変されていない対応する植物）に対して１つ以上のＣからＴへの置換を含みうる。
【００１９】
配列に関する「外因性」という用語は、外来種から生じる配列、又は同一種からである場合に、意図的な人間の介入によって組成及び／又はゲノム遺伝子座においてその天然型から実質的に改変されている配列を意味する。
【００２０】
「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」又は「核酸断片」は、互換的に使用でき、一本鎖又は二本鎖であり、場合により合成、非天然又は変更したヌクレオチド塩基を含むＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーを示す。ヌクレオチド（通常、それらの５’−一リン酸の形で見出される）は、以下のようにそれらの一文字表記によって示される：（それぞれＲＮＡ又はＤＮＡについて）アデニレート又はデオキシアデニレートについて「Ａ」、シチジレート又はデオキシシチジレートについて「Ｃ」、グアニレート又はデオキシグアニレートについて「Ｇ」、ウリジレートについて「Ｕ」、デオキシチミジレートについて「Ｔ」、プリン（Ａ又はＧ）について「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ又はＴ）について「Ｙ」、Ｇ又はＴについて「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴについて「Ｈ」、イノシンについて「Ｉ」、及び任意のヌクレオチドについて「Ｎ」。
【００２１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用でき、アミノ酸残基のポリマーを示す。前記用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに、及び天然に生じるアミノ酸ポリマーに適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」及び「タンパク質」という用語は、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰリボシル化を含むがこれらに制限されない改変も含まれる。
【００２２】
本明細書において使用されるように、「発現構築物」は、植物における目的のヌクレオチド配列の発現に適したベクター、例えば組換えベクターを示す。「発現」は、機能的生成物の生成を示す。例えば、ヌクレオチド配列の発現は、ヌクレオチド配列の転写（ｍＲＮＡ又は機能性ＲＮＡを生成するために転写すること）及び／又はタンパク質前駆体又は成熟タンパク質へのＲＮＡの翻訳を示しうる。
【００２３】
本発明の「発現構築物」は、直鎖核酸断片、環状プラスミド、ウイルスベクター、又はある実施形態において、翻訳されうるＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）であってよい。
【００２４】
本発明の「発現構築物」は、異なる源に由来する目的の調節配列及びヌクレオチド配列、又は同一の源に由来するが通常天然に見出される方法とは異なる方法で配置された目的の調節配列又はヌクレオチド配列を含んでよい。
【００２５】
「調節配列」又は「調節エレメント」は、互換的に使用でき、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内又はコード配列の下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を示し、転写、ＲＮＡプロセシング又は安定化、又は関連するコード配列の翻訳に影響する。植物の発現調節エレメントは、植物における目的のヌクレオチド配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定化、又は翻訳を制御することができるヌクレオチド配列を示す。
【００２６】
調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化認識配列を含んでよいが、これらに制限されない。
【００２７】
「プロモーター」は、他の核酸断片の転写を制御することができる核酸断片を示す。本発明のある実施形態において、プロモーターは、その起源が植物細胞からであろうとなかろうと、植物細胞における遺伝子転写を制御することができるプロモーターである。プロモーターは、構成的プロモーター又は組織特異性プロモーター又は発生調節プロモーター又は誘導性プロモーターであってよい。
【００２８】
「構成的プロモーター」は、一般的にほとんどの状況下でほとんどの細胞型において遺伝子発現を生じるプロモーターを示す。「組織特異的プロモーター」及び「組織選択プロモーター」は互換的に使用でき、１つの組織又は器官において主にしかし必ずしも排他的ではなく発現されるが、１つの特定の細胞又は細胞型においても発現されうるプロモーターを示す。「発生調節プロモーター」は、活性が発生事象により決定されるプロモーターを示す。「誘導性プロモーター」は、内因性又は外因性の刺激（環境、ホルモン、又は化学的シグナル等）に対する応答において、それに操作可能に連結されたＤＮＡ配列を選択的に発現する。
【００２９】
本明細書において使用されるように、「操作可能に連結された」という用語は、調節エレメント（例えば、プロモーター配列、転写終結配列等であるが、これらに制限されない）を、核酸配列（例えばコード配列又はオープンリーディングフレーム）に会合させて、ヌクレオチド配列の転写を、転写調節エレメントにより制御及び調節することを意味する。調節エレメント領域を核酸分子に操作可能に連結するための技術は当業者に公知である。
【００３０】
植物への核酸分子（例えばプラスミド、直鎖核酸断片、ＲＮＡ等）又はタンパク質の「導入」は、核酸又はタンパク質で植物細胞を形質転換して、核酸又はタンパク質を植物細胞中で融合することができることを意味する。本明細書において使用される「形質転換」は、安定な形質転換及び一過性形質転換を含む。
【００３１】
「安定な形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、植物ゲノムへの外因性ヌクレオチド配列の導入を示す。一度安定に形質転換されると、外因性核酸配列は、植物のゲノム及びそれらの任意の次世代に安定に組み込まれる。
【００３２】
「一過性形質転換」は、安定して遺伝せずにその機能を実施する、植物細胞への核酸分子又はタンパク質の導入を示す。一過性形質転換において、外因性核酸配列は、植物ゲノムに組み込まれない。
【００３３】
「形質」は、植物又は特定の植物材料もしくは細胞の、生理学的、形態学的、生化学的、又は物理的特性を示す。ある実施形態において、前記特性は、人間の目に見え（例えば種子又は植物のサイズ）、又は生化学的技術によって（例えば種子又は葉のタンパク質、デンプン又は油状物の含有量）、又は代謝もしくは生態学的プロセスの観察によって、例えば水分欠乏又は特定の塩分もしくは糖分濃度に対する耐性の測定によって、又は１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの観察によって、又は農学的観察（例えば浸透圧ストレス耐性又は収率）によって測定することができる。ある実施形態において、形質は、植物の倍数性、例えば植物の育種のために重要である単相性も含む。ある実施形態において、形質は、除草剤に対する植物の耐性も含む。
【００３４】
「農学的形質」は、葉の緑色、収率、成長速度、バイオマス、成熟時の生体重、成熟時の乾燥量、果実収率、種子収率、全植物窒素含有量、果実窒素含有量、種子窒素含有量、栄養組織における窒素含有量、全植物遊離アミノ酸含有量、果実遊離アミノ酸含有量、種子遊離アミノ酸含有量、栄養組織における遊離アミノ酸含有量、全植物タンパク質含有量、果実タンパク質含有量、種子タンパク質含有量、栄養組織におけるタンパク質含有量、耐干性、窒素吸収、根の倒伏、収穫指数、葉柄の倒伏、草高、穂高、穂長、耐病性、耐寒性、耐塩性、及び分げつ数等を含むがこれらに限定されない測定可能なパラメータである。
【００３５】
２．植物のための塩基編集システム
本発明は、以下の（ｉ）〜（ｖ）の少なくとも１つを含む、植物のゲノムにおける標的配列に対して塩基編集を実施するためのシステムを提供する：
ｉ）塩基編集融合タンパク質、及びガイドＲＮＡ、
ｉｉ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドＲＮＡ、
ｉｉｉ）塩基編集融合タンパク質、及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
ｉｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
ｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
ここで、塩基編集融合タンパク質は、ヌクレアーゼ−不活性化Ｃａｓ９ドメイン及びデアミナーゼドメインを含み、ガイドＲＮＡは、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集融合タンパク質を標的化できる。
【００３６】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインは、２つのサブドメイン：ＨＮＨヌクレアーゼサブドメイン及びＲｕｖＣサブドメインを含むことが公知である。ＨＮＨサブドメインは、ｇＲＮＡに対して相補的である鎖を切断する一方で、ＲｕｖＣサブドメインは、非相補鎖を切断する。これらのサブドメインの変異は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを不活性化して「ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９」を形成することができる。ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡによって指示されたＤＮＡ結合能力を保持している。したがって、原則として、追加のタンパク質と融合する場合に、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、適切なガイドＲＮＡとの同時発現によってほぼあらゆるＤＮＡ配列に対して前記追加のタンパク質を単純に標的とすることができる。
【００３７】
シチジンデアミナーゼは、ＤＮＡにおけるシチジン（Ｃ）の脱アミノ化を触媒作用してウラシル（Ｕ）を形成することができる。ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９がシチジンデアミナーゼと融合する場合に、融合タンパク質は、ガイドＲＮＡの方向によって植物のゲノムにおける標的配列を標的とすることができる。ＤＮＡ二本鎖は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性の喪失により切断されない一方で、融合タンパク質におけるデアミナーゼドメインは、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の形成中に生成された一本鎖ＤＮＡのシチジンをＵに変換することができ、そしてＣからＴへの置換を、塩基ミスマッチ修復によって達成しうる。
【００３８】
したがって、本発明のある実施形態において、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ、例えばアポリポタンパク質Ｂ−ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼである。特に、本明細書において記載されるデアミナーゼは、基質として一本鎖ＤＮＡを許容できるデアミナーゼである。
【００３９】
本明細書において使用されてよいシチジンデアミナーゼの例は、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、又はＣＤＡ１を含むが、これらに制限されない。
【００４０】
本発明のある実施形態において、シチジンデアミナーゼは、配列番号１１において示したアミノ酸配列を含む。
【００４１】
本発明のヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、異なる種のＣａｓ９に由来してよく、例えばＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）（化膿性ブドウ球菌）（ＳｐＣａｓ９、配列番号１８において示されたヌクレオチド配列；アミノ酸配列は配列番号２１に示される）に由来してよい。ＳｐＣａｓ９のＨＮＨヌクレアーゼサブドメインとＲｕｖＣサブドメインの双方における変異（例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ変異を含む）は、ヌクレアーゼ失活Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をもたらす、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９ヌクレアーゼを不活性化する。変異によるサブドメインの１つの不活性化は、Ｃａｓ９がニッカーゼ活性を得ることを可能にし、すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、例えばＤ１０Ａ変異のみを有するｎＣａｓ９をもたらす。
【００４２】
したがって、本発明のある実施形態において、本発明のヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９と比較してアミノ酸置換Ｄ１０Ａ及び／又はＨ８４０Ａを含む。
【００４３】
本発明のある好ましい実施形態において、本発明のヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、ニッカーゼ活性を有する。あらゆる理論に縛られることなく、真核生物のミスマッチ修復は、ＤＮＡ鎖中のミスマッチ塩基の除去及び修復のためにＤＮＡ鎖上のニックを使用すると考えられる。シチジンデアミナーゼによって形成されるＵ：Ｇミスマッチは、Ｃ：Ｇに修復されうる。未編集のＧを含む鎖上のニックの導入によって、好ましくは、Ｕ：Ｇミスマッチを所望のＵ：Ａ又はＴ：Ａに修復することができるであろう。しがたって、好ましくは、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９のＨＮＨサブドメインの切断活性を保持するＣａｓ９ニッカーゼであり、一方でＲｕｖＣサブドメインの切断活性は不活性化される。例えば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９と比較してアミノ酸置換Ｄ１０Ａを含む。
【００４４】
本発明のある実施形態において、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【００４５】
本発明のある実施形態において、デアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９ドメインのＮ末端に融合している。ある実施形態において、デアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９ドメインのＣ末端に融合している。
【００４６】
本発明のある実施形態において、デアミナーゼドメイン及びヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９ドメインは、リンカーを介して融合している。リンカーは、１〜５０（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２０〜２５、２５〜５０）又はそれ以上のアミノ酸の長さである二次構造以上の構造を有さない非機能的アミノ酸配列であってよい。例えば、リンカーは、可動性リンカー、例えばＧＧＧＧＳ、ＧＳ、ＧＡＰ、（ＧＧＧＧＳ）ｘ３、ＧＧＳ、（ＧＧＳ）ｘ７等であってよい。ある好ましい実施形態において、リンカーは、配列番号１２において示されるＸＴＥＮリンカーである。
【００４７】
細胞において、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮＡからＵの除去を触媒作用し、塩基除去修復（ＢＥＲ）を開始し、Ｕ：ＧのＣ：Ｇへの修復をもたらす。したがって、あらゆる理論に制限されることなく、本発明の塩基編集融合タンパク質又は本発明のシステムにおけるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤を含むことは、塩基編集の効率を高めることができるであろう。
【００４８】
したがって、本発明のある実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、さらに、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含む。ある実施形態において、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号１５において示したアミノ酸配列を含む。
【００４９】
本発明のある実施形態において、本発明の塩基編集融合タンパク質は、さらに、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一般に、塩基編集融合タンパク質における１つ以上のＮＬＳは、塩基編集融合のために十分な量で植物細胞の核において塩基編集融合タンパク質の蓄積を操作するために十分な強度を有するべきである。一般に、核局在化活性の強度は、ＮＬＳ、及び塩基編集融合タンパク質中で使用される１つ以上の特異的ＮＬＳ、又はそれらの組合せの数及び位置によって決定される。
【００５０】
本発明のある実施形態において、本発明の塩基編集融合タンパク質のＮＬＳは、Ｎ末端及び／又はＣ末端に位置しうる。ある実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のＮＬＳを含む。ある実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、Ｎ末端で又はＮ末端の近くで、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のＮＬＳを含む。ある実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、Ｃ末端で又はＣ末端の近くで、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のＮＬＳを含む。ある実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、これらの組合せ、例えばＮ末端で１つ以上のＮＬＳ及びＣ末端で１つ以上のＮＬＳを含む。１超のＮＬＳがある場合に、それぞれのＮＬＳは、他のＮＬＳから独立して選択されうる。本発明のある好ましい実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、２つのＮＬＳを含み、例えば２つのＮＬＳは、それぞれＮ末端及びＣ末端に位置している。
【００５１】
一般に、ＮＬＳは、タンパク質の表面上で曝された正に帯電したリジン又はアルギニンの１つ以上の短い配列からなるが、ＮＬＳの他のタイプも当業者に公知である。ＮＬＳの制限のない例は、ＫＫＲＫＶ（ヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＣ−３’）、ＰＫＫＫＲＫＶ（ヌクレオチド配列５’−ＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧ−３’又はＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＴ）、又はＳＧＧＳＰＫＫＫＲＫＶ（ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＧ−３’）を含む。
【００５２】
本発明のある実施形態において、塩基編集融合タンパク質のＮ末端は、ＰＫＫＫＲＫＶにより示されるアミノ酸配列を有するＮＬＳを含む。本発明のある実施形態において、塩基編集融合タンパク質のＣ末端は、ＳＧＧＳＰＫＫＫＲＫＶにより示されるアミノ酸配列を有するＮＬＳを含む。
【００５３】
さらに、本発明の塩基編集融合タンパク質は、編集されるべきＤＮＡの位置に依存する、他の局在化配列、例えば細胞質局在化配列、葉緑体局在化配列、ミトコンドリア局在化配列等も含みうる。
【００５４】
本発明のある実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、配列番号２２又は２３において示したアミノ酸配列を含む。
【００５５】
植物において十分な発現を得るために、本発明のある実施形態において、塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、塩基編集されるべき植物についてコドン最適化される。
【００５６】
コドン最適化は、天然アミノ酸配列を維持しながらその宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンを有する天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、又はそれ以上のコドン）を置換することにより、目的の宿主細胞における発現を高めるために核酸配列を改変するプロセスを示す。種々の種が、特定のアミノ酸のあるコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度における差異）は、しばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率に相関し、これはとりわけ翻訳されるコドンの性質及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整されてよい。コドン使用頻度表は、例えばwww. kazusa. orjp/codon/で入手可能な「Codon Usage Database（コドン使用頻度データベース）」で容易に入手でき、前記表は、多くの方法で適合されてよい。Nakamura, Y.ら、“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl. Acids Res. 28: 292 (2000)を参照されたい。
【００５７】
本発明のある実施形態において、塩基編集融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１９又は２０において示される。
【００５８】
本発明のある実施形態において、ガイドＲＮＡは、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。所与の標的配列に従って適したｓｇＲＮＡを構築する方法は当業者に公知である。例えば、Wang, Y.ら、Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat. Biotechnol. 32, 947-951 (2014)；Shan, Q.ら、Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31, 686-688 (2013)；Liang, Z.ら、Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system. J Genet Genomics. 41, 63-68 (2014)を参照されたい。
【００５９】
本発明のある実施形態において、塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、植物の発現調節エレメント、例えばプロモーターに操作可能に連結される。
【００６０】
本発明において使用されてよいプロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Odellら、(1985) Nature 313: 810-812）、トウモロコシＵｂｉ−１プロモーター、コムギＵ６プロモーター、イネＵ３プロモーター、トウモロコシＵ３プロモーター、イネアクチンプロモーター、ＴｒｐＰｒｏ５プロモーター（２００５年３月１６に出願された米国特許明細書番号第１０／３７７，３１８号）、ｐＥＭＵプロモーター（Lastら、Theor. Appl. Genet. 81: 581-588）、ＭＡＳプロモーター（Veltenら、(1984) EMBO J. 3: 2723-2730）、トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター（Lepetitら、Mol. Gen. Genet. 231: 276-285及びAtanassovaら、(1992) Plant J. 2 (3) : 291-300）、及びブラシカ・ナプス（Brassica napus）（セイヨウアブラナ）ＡＬＳ３（ＰＣＴ出願国際公開第９７／４１２２８号（ＷＯ ９７／４１２２８））プロモーターを含むが、これらに制限されない。本発明において使用されてよいプロモーターは、Mooreら(2006) Plant J. 45 (4) : 651-683において概説されている、慣用的に使用される組織特異性プロモーターも含む。
【００６１】
３．遺伝子改変植物を製造する方法
他の態様において、本発明は、本発明の植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集を実施するためのシステムを植物中に導入し、それにより、塩基編集融合タンパク質を、ガイドＲＮＡによって前記植物ゲノムにおける標的配列に標的化させ、前記標的配列における１つ以上のＣからＴへの置換をもたらすことを含む、遺伝子改変植物を製造する方法を提供する。
【００６２】
Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡ複合体によって認識及び標的化されてよい標的配列の設計は、当業者の技術的技術の範囲内である。一般に、標的配列は、ガイドＲＮＡにおいて含まれる約２０ヌクレオチドのリーダー配列に対して相補性がある配列であり、その３’末端は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）ＮＧＧのすぐ隣にある。
【００６３】
例えば、本発明のある実施形態において、標的配列は、構造５’−ＮX−ＮＧＧ−３’を有しており、ここで、Ｎは、独立してＡ、Ｇ、Ｃ及びＴから選択され、Ｘは、１４≦Ｘ≦３０の整数であり、ＮXは、Ｘに近接しているヌクレオチドを示し、かつＮＧＧはＰＡＭ配列である。本発明のある特定の実施形態において、Ｘは２０である。
【００６４】
本発明の塩基編集システムは、植物における広い脱アミノ化領域、例えば７ヌクレオチド長を有する脱アミノ化領域を有する。本発明の方法のある実施形態において、標的配列の３〜９位内にある１つ以上のＣ塩基は、Ｔで置換される。例えば、存在する場合に、標的配列における３〜９位内にある任意に１、２、３、４、５、６、又は７個のＣがＴに置き換えられてよい。例えば、標的配列の３〜９位内に４個のＣがある場合に、任意に１、２、３、４個のＣがＴに置き換えられてよい。Ｃ塩基は、連続しているか又は他のヌクレオチドにより分けられていてよい。したがって、標的配列において複数のＣがある場合に、種々の変異の組合せが、本発明の方法により得られる。本発明の方法のある実施形態において、さらに、所望のヌクレオチド置換を有する植物をスクリーニングすることを含む。植物におけるヌクレオチド置換は、Ｔ７Ｅ１、ＰＣＲ／ＲＥ又はスクリーニング法によって検出されてよく、例えば、Shan, Q., Wang, Y., Li, J. &Gao, C. Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system. Nat. Protoc. 9, 2395-2410 (2014)を参照されたい。
【００６５】
本発明の方法において、塩基編集システムは、当業者に周知の種々の方法により植物に導入されてよい。本発明の塩基編集システムを植物に導入するために使用されてよい方法は、微粒子銃、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換、植物ウイルス媒介形質転換、花粉管アプローチ、及び子房注入アプローチを含むが、これらに制限されない。
【００６６】
本発明の方法において、標的配列の改変は、植物細胞において塩基編集融合タンパク質及びガイドＲＮＡを導入又は製造することによって単純に達成されてよく、かつ前記改変は、塩基編集システムでの植物の安定した形質転換の必要なしに安定して遺伝されてよい。これは、安定な塩基編集システムの潜在的なオフターゲット効果を妨げ、かつ植物ゲノムへの外因性ヌクレオチド配列の組込みも妨げ、それによりより高いバイオセーフティーをもたらす。
【００６７】
ある好ましい実施形態において、導入は、選択圧の非存在下で実施され、それによって植物ゲノムへの外因性ヌクレオチド配列の組込みを妨げる。
【００６８】
ある実施形態において、導入は、本発明の塩基編集システムを単離された植物細胞又は組織に形質転換すること、そして形質転換した植物細胞又は組織をインタクトな植物に再生することを含む。好ましくは、再生は、選択圧の非存在下で実施され、すなわち、発現ベクター上に有している選択遺伝子に対する選択剤は、組織培養中に使用されない。選択剤を使用せずに、植物の再生効率を高めて、外因性ヌクレオチド配列を含まない改変植物を得てよい。
【００６９】
他の実施形態において、本発明の塩基編集システムは、インタクトな植物上の特定の部位、例えば葉、茎端、花粉管、幼穂、又は胚軸に形質転換されてよい。これは、組織培養による再生が困難である植物の形質転換に特に適している。
【００７０】
本発明のある実施形態において、インビボで発現したタンパク質及び／又はインビトロで転写したＲＮＡ分子は、植物に直接形質転換される。タンパク質及び／又はＲＮＡ分子は、植物細胞において塩基編集を得ることができ、続いて、細胞によって分解されて植物ゲノムへの外因性ヌクレオチド配列の組込みを妨げる。
【００７１】
本発明の方法によって塩基編集されてよい植物は、単子葉植物及び双子葉植物を含む。例えば、植物は、作物、例えばコムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、モロコシ、ナタネ、アルファルファ、ワタ、オオムギ、キビ、サトウキビ、トマト、タバコ、キャッサバ、又はジャガイモであってよい。
【００７２】
本発明のある実施形態において、標的配列は、植物の形質、例えば農学的形質に関連しており、それにより塩基編集は、野生型植物と比較して変更された形質を有する植物をもたらす。
【００７３】
本発明において、改変されべき標的配列は、ゲノム内の任意の場所に、例えば機能的遺伝子内に、例えばタンパク質コード遺伝子に位置していてもよく、又は例えば、遺伝子発現調節領域内に、例えばプロモーター領域又はエンハンサー領域に位置していてもよく、それによって前記遺伝子の機能的改変を達成するか又は遺伝子発現の改変を達成する。したがって、本発明のある実施形態において、ＣからＴへの置換は、標的タンパク質におけるアミノ酸置換、又は標的タンパク質の短縮化をもたらす（終止コドンをもたらす）。本発明の他の実施形態において、ＣからＴへの置換は、標的遺伝子の発現における変化をもたらす。
【００７４】
ある実施形態において、本発明の方法によって改変された遺伝子は、コムギＬＯＸ２遺伝子、イネＣＤＣ４８遺伝子、ＮＲＴ１．１Ｂ遺伝子及びＳＰＬ１４遺伝子、トウモロコシＣＥＮＨ３遺伝子、並びにＡＬＳ遺伝子であってよい。
【００７５】
本発明のある実施形態において、前記方法は、さらに、遺伝子改変植物の子孫を得ることを含む。
【００７６】
他の態様において、本発明は、遺伝子改変植物又はそれらの子孫又はそれらの部位も提供し、ここで、植物は前記した本発明の方法により得られる。
【００７７】
他の態様において、本発明は、本発明の前記方法により得られた第一の遺伝子改変植物を、該遺伝子改変を含まない第二の植物と交雑させて、それにより該第二の植物に前記遺伝子改変を導入することを含む、植物の育種方法も提供する。
【００７８】
４．トウモロコシ一倍体植物の製造方法及びそれらの使用
ＣＥＮＨ３は、動物及び植物におけるセントロメアの通常の機能化に必須であるセントロメアヒストンをコードする。ＴＩＬＬＩＮＧ研究は、アラビドプシスＣＥＮＨ３（ＡｔＣＥＮＨ３）のＣ末端領域におけるいくつかの残基のアミノ酸置換が、作物育種を加速するために有利である一倍体誘導をもたらすことができることを示している。植物ＣＥＮＨ３タンパク質のＣＥＮＰ−Ａターゲティングドメイン（ＣＡＴＤ、図２ｄ）における高保存ロイシン残基のフェニルアラニン（Ｆ）での置換は、アラビドプシスにおいて一倍体誘導をもたらすが、一方でオオムギにおいて、セントロメア中へのＣＥＮＨ３の導入は損なわれているが、一倍体誘導は起こらない。本発明は、本発明の塩基編集方法によるＺｍＣＥＮＨ３におけるＣＡＴＤドメインの変異、特に保存ロイシン残基の変異を、トウモロコシ一倍体の誘導のために使用することができ、かつトウモロコシ変種の改良において広く使用できることを見出した。
【００７９】
本発明は、本発明の塩基編集方法によるトウモロコシ植物においてＺｍＣＥＮＨ３遺伝子を改変し、ＺｍＣＥＮＨ３におけるＣＡＴＤドメインにおいて１つ以上のアミノ酸置換をもたらし、１つ以上のアミノ酸置換が一倍体誘導物質活性をトウモロコシ植物に付与することを含むトウモロコシ一倍体誘導物質系列を製造するための方法を提供する。
【００８０】
特定の実施形態において、改変は、配列番号２５のＺｍＣＥＮＨ３における１０９〜１１１位で保存モチーフアラニン−ロイシン−ロイシン（ＡＬＬ）において１つ以上のアミノ酸置換をもたらす。例えば、ＡＬＬモチーフは、一置換：ＡＦＬ、ＶＬＬ、又はＡＬＦ；二重置換：ＡＦＦ、ＶＦＬ、又はＶＬＦ；又は三重置換：ＶＦＦとして改変される。
【００８１】
ある実施形態において、本発明の塩基編集方法によるＺｍＣＥＮＨ３の改変のための標的配列は、ＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧであり、ここで下線を引いた配列はＰＡＭ配列である。
【００８２】
ある実施形態において、トウモロコシ植物は、Ｚｏｎｇ３１変種である。ある実施形態において、トウモロコシ植物は、ＨｉＩＩ変種である。
【００８３】
本発明は、本発明の方法によって得られるトウモロコシ一倍体誘導物質系列と野生型トウモロコシ植物とを交雑し、そしてハイブリッド子孫を収穫してトウモロコシ一倍体植物を得ることを含む、トウモロコシ一倍体の製造方法を提供する。ある実施形態において、トウモロコシ一倍体誘導物質系列を雄性親として使用し、野生型トウモロコシ植物を交雑のための母性親として使用する。
【００８４】
本発明は、本発明の方法によって得られるトウモロコシ一倍体誘導物質系列及びトウモロコシ一倍体植物、並びにトウモロコシ育種におけるそれらの使用も含む。
【００８５】
５．除草剤耐性トウモロコシ植物の製造方法
本発明は、本発明の塩基編集方法によってトウモロコシ植物においてＺｍＡＬＳ遺伝子（アセト乳酸シンターゼをコードする）を改変し、ＺｍＡＬＳにおいて１つ以上のアミノ酸置換をもたらすことを含む除草剤耐性トウモロコシ植物を製造するための方法であって、１つ以上のアミノ酸置換が除草剤耐性をトウモロコシ植物に付与する方法を提供する。
【００８６】
特定の実施形態において、改変は、同時に、配列番号２７のＺｍＡＬＳ１及び配列番号２９のＺｍＡＬＳ２の双方の１つ以上のアミノ酸置換をもたらす。例えば、ＺｍＡＬＳ１及びＺｍＡＬＳ２の１６５番目の残基を置換する。
【００８７】
ある実施形態において、本発明の塩基編集方法によるＺｍＡＬＳ１及びＺｍＡＬＳ２の改変のための標的配列は、ＣＡＧＧＴＧＣＣＧＣＧＡＣＧＣＡＴＧＡＴＴＧＧであり、ここで下線を引いた配列はＰＡＭ配列である。
【００８８】
ある実施形態において、トウモロコシ植物は、Ｚｏｎｇ３１変種である。ある実施形態において、トウモロコシ植物は、ＨｉＩＩ変種である。
【００８９】
本発明は、本発明の前記方法により得られた第一の除草剤耐性トウモロコシ植物を第二の植物と交雑させて、第二の植物に除草剤耐性を導入することを含む、除草剤耐性トウモロコシ植物を育種する方法も提供する。
【００９０】
本発明は、本発明の方法によって得られた除草剤耐性トウモロコシ植物又はそれらの子孫も含む。
【００９１】
トウモロコシ植物の生育範囲における望ましくない植物を制御する、その範囲における植物にＡＬＳ阻害剤除草剤を適用することを含む方法であって、トウモロコシ植物は本発明の方法により得られる除草剤耐性トウモロコシ植物である。
【００９２】
実施例
材料及び方法
ｐｎ／ｄＣａｓ９−ＰＢＥ発現ベクターの構築
ＡＰＯＢＥＣ１、ＸＴＥＮ、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、ｄＣａｓ９及びＵＧＩ配列を、コムギについてコドン最適化し（配列番号１〜５）、そしてＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｎａｎｊｉｎｇ）から整列した。完全長ｎ／ｄＣａｓ９断片を、ＡｆｌＩＩ−Ｆ（ＡｆｌＩＩ制限酵素部位を有する）及びＭｌｕＩ−Ｒ（ＭｌｕＩ制限酵素部位を有する）のプライマーセットを使用して増幅させた。そのＰＣＲ産物を、ＡｆｌＩＩ及びＭｌｕＩで消化し、そして双方の酵素で消化したｐＵＣ５７−ＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ＵＧＩベクター（ベクターの配列を配列番号１０に示す）に挿入して、融合クローニングベクターｐＵＣ５７−ＡＰＯＢＥＣＩ−ＸＴＥＮ−ｎ／ｄＣａｓ９−ＵＧＩを生成した。そして、ＢａｍＨＩ−Ｆ及びＢｓｐ１０４７Ｉ−Ｒのプライマーセットを使用して、ＡＰＯＢＥＣＩ−ＸＴＥＮ−ｎ／ｄＣａｓ９−ＵＧＩの断片を増幅させた。その産物を、ＢａｍＨＩ及びＢｓｐ１０４７Ｉで消化し、そしてさらにＢａｍＨＩ及びＢｓｐ１０４７Ｉで消化したｐＵｂｉ−ＧＦＰ（ベクターの配列を配列番号８に示す）に挿入して、融合発現ベクターｐｎ／ｄＣａｓ９−ＰＢＥを生成した。
【００９３】
ｓｇＲＮＡ発現ベクターの構築
この実験にけるｓｇＲＮＡ標的配列を以下の表１において示す：
【表１】
2019523011.tif 000002
【００９４】
前記記載（Wang, Y.ら、Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat. Biotechnol. 32, 947-951, 2014；Shan, Q.ら、Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31, 686-688, 2013；及びLiang, Z.ら、Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system. J Genet Genomics. 41, 63-68, 2014）に従って、ｓｇＲＮＡ発現ベクターは、ｐＴａＵ６−ｓｇＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ５３０６２）、ｐＯｓＵ３−ｓｇＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ５３０６３）、又はｐＺｍＵ３−ｓｇＲＮＡ  （Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ５３０６１）に基づいて構築される：
ｐＴａＵ６−ＢＦＰ−ｓｇＲＮＡ、ｐＯｓＵ３−ＢＦＰ−ｓｇＲＮＡ、ｐＺｍＵ３−ＢＦＰ−ｓｇＲＮＡ、ｐＴａＵ６−ＬＯＸ２−Ｓ１−ｓｇＲＮＡ、ｐＴａＵ６−ＬＯＸ２−Ｓ２−ｓｇＲＮＡ、ｐＴａＵ６−ＬＯＸ２−Ｓ３−ｓｇＲＮＡ、ｐＯｓＵ３−ＣＤＣ４８−ｓｇＲＮＡ、ｐＯｓＵ３−ＮＲＴ１．１−ｓｇＲＮＡ、ｐＯｓＵ３−ＳＰＬ１４−ｓｇＲＮＡ、及びｐＺｍＵ３−ＣＥＮＨ３−ｓｇＲＮＡ。
【００９５】
ＢＦＰ及びＧＦＰ発現ベクター
ｐＵｂｉ−ＢＦＰｍの配列を、配列番号９において示す。ＢＦＰのアミノ酸配列を、配列番号１７において示す。
【００９６】
ｐＵｂｉ−ＧＦＰの配列を、配列番号８において示す。ＧＦＰのアミノ酸配列を、配列番号１６において示す。
【００９７】
ｐＡＧ−ｎ／ｄＣａｓ９−ＰＢＥ−ＣＤＣ４８−ｓｇＲＮＡ発現ベクターの構築
ＡＰＯＢＥＣＩ−ＸＴＥＮ−ｄ／ｎＣａｓ９−ＵＧＩ断片を、Ｇｉｂｓｏｎクローニング法によりＧｉｂｓｏｎ−Ｆ及びＧｉｂｓｏｎ−ＲのプライマーセットでＳｔｕＩ及びＳａｃＩで消化したｐＨＵＥ４１１（Ａｄｄｇｅｎ  ＃６２２０３）に融合させ、ｓｇＲＮＡ標的部位を有さないベクターｐＨＵＥ４１１−ＡＰＯＢＥＣＩ−ＸＴＥＮ−ｄ／ｎＣａｓ９−ＵＧＩを生成した。ＯｓＣＤＣ４８標的配列を含む一対のオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｓ）を合成し、アニールし、そしてＢｓａＩで消化したｐＨＵＮ４１１ベクターにクローニングして、ｐＨＵＥ４１１−ｓｇＲＮＡ−ＣＤＣ４８を得た。そして、ＰｍｅＩ及びＡｖｒＩＩでのｐＨＵＥ４１１−ｓｇＲＮＡ−ＣＤＣ４８の消化から得られた断片を、これもＰｍｅＩ及びＡｖｒＩＩで消化したｐＨＵＥ４１１−ＡＰＯＢＥＣＩ−ＸＴＥＮ−ｄ／ｎＣａｓ９−ＵＧＩに挿入し、最終的にアグロバクテリウム媒介形質転換ベクターｐＡＧ−ｎ／ｄＣａｓ９−ＰＢＥ−ＣＤＣ４８−ｓｇＲＮＡを得た。
【００９８】
プロトプラストアッセイ
コムギＢｏｂｗｈｉｔｅ変種、イネＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ及びトウモロコシ近交系変種Ｚｏｎｇ３１をこの研究において使用した。プロトプラスト形質転換を以下のように実施した。平均形質転換効率は５５〜７０％であった。形質転換を、ＰＥＧ媒介形質転換によりそれぞれのプラスミド１０μｇで実施した。プロトプラストを４８時間後に採取し、ＤＮＡをＴ７Ｅ１及びＰＣＲ−ＲＥアッセイのために抽出した。
【００９９】
コムギ（トウモロコシ）プロトプラストの製造及び形質転換
１）コムギ（トウモロコシ）の柔らかい葉の中間部位を、幅０．５〜１ｍｍの細片に切断した。その細片を、０．６Ｍマンニトール溶液中に１０分間置き、濾過し、そして２０〜２５℃の酵素溶液５０ｍｌ中で暗所で、穏やかに撹拌（１０ｒｐｍ）しながら５時間置いた。
２）Ｗ５  １０ｍｌを添加して、酵素分解産物を希釈し、その産物を７５μｍナイロンフィルターで丸底遠心管（５０ｍｌ）中で濾過した。
３）３分間２３℃で１００ｇ遠心分離し、その上清を棄てた。
４）その産物をＷ５  １０ｍｌで穏やかに懸濁し、氷上に３０分間置いて、プロトプラストを徐々に沈降させ、そしてその上清を棄てた。
５）プロトプラストを、適量のＭＭＧを添加することにより懸濁し、形質転換まで氷上に置いた。
６）プラスミド１０〜２０μｇ、プロトプラスト２００μｌ（約４×１０5細胞）、新鮮なＰＧＥ溶液２２０μｌを、２ｍｌの遠心管に添加し、混合し、そして暗所で１０〜２０分間室温に置いて形質転換を誘導した。
７）形質転換の誘導後に、Ｗ５溶液８８０μｌをゆっくりと添加し、そしてその管を混合のために穏やかに上下をひっくり返し、３分間１００ｇで水平遠心分離し、そしてその上清を棄てた。
８）その産物をＷ５溶液２ｍｌ中に再懸濁させ、６ウェルプレートに移し、室温（又は２５℃）で暗所で培養した。プロトプラストゲノムＤＮＡ抽出のために、その産物は４８時間培養する必要がある。
【０１００】
イネプロトプラストの製造及び形質転換
１）実生の葉鞘を、プロトプラスト単離のために使用し、鋭利な刃で幅約０．５ｍｍに切断した。
２）切開直後に、０．６Ｍマンニトール溶液に移し、そして暗所に１０分間置いた。
３）マンニトール溶液を濾過により取り出し、そしてその産物を酵素分解溶液中に移して、３０分間排除した。
４）酵素分解を、５〜６時間暗所で穏やかに撹拌しながら（脱色撹拌機、速度１０）実施した。
５）酵素分解の完了後に、Ｗ５の等量を添加し、１０秒間水平撹拌してプロトプラストを放出させた。
６）プロトプラストを、４０μｍナイロン膜を有する５０ｍｌ丸底遠心管で濾過し、そしてＷ５溶液で洗浄した。
７）３分間２５０ｇ水平遠心分離して、プロトプラストを沈澱させ、そしてその上清を棄てた。
８）プロトプラストを、Ｗ５  １０ｍｌを添加することにより再懸濁し、そして３分間２５０ｇで遠心分離し、その上清を棄てた。
９）適量のＭＭＧ溶液を添加して、２×１０6／ｍｌの濃度にプロトプラストを再懸濁した。
注：全ての前記ステップを室温で実施した。
１０）プラスミド１０〜２０μｇ、プロトプラスト２００μｌ（約４×１０5細胞）、及び新鮮なＰＧＥ溶液２２０μｌを、２ｍｌの遠心管に添加し、混合し、そして暗所で１０〜２０分間室温に置いて形質転換を誘導した。
１１）形質転換の完了後に、Ｗ５溶液８８０μｌをゆっくりと添加し、そしてその管を混合のために穏やかに上下をひっくり返し、３分間２５０ｇで水平遠心分離し、そしてその上清を棄てた。
１２）その産物をＷＩ溶液２ｍｌ中に再懸濁させ、６ウェルプレートに移し、室温（又は２５℃）で暗所で培養した。プロトプラストゲノムＤＮＡ抽出のために、その産物は４８時間培養する必要がある。
【０１０１】
微粒子銃によるコムギカルスへのＤＮＡ構築物の形質転換
プラスミドＤＮＡ（ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ及びｐＴａＵ６−ＬＯＸ２−Ｓ１−ｓｇＲＮＡ）を使用して、Ｂｏｂｗｈｉｔｅ未成熟胚を照射した。微粒子銃形質転換を、前記（Zhang, K., Liu, J., Zhang, Y., Yang, Z. &Gao, C. Biolistic genetic transformation of a wide range of Chinese elite wheat (Triticum aestivum L. ) varieties. J. Genet Genomics 42, 39-42 (2015)）のように実施した。照射後に、胚を文献に従って処理したが、組織培養中に選択剤を使用しなかった。
【０１０２】
アグロバクテリウムによるイネカルスへのｐＡＧ−ｎ／ｄＣａｓ９−ＰＢＥ−ＣＤＣ４８−ｓｇＲＮＡの形質転換
ｐＡＧ−ｎ／ｄＣａｓ９−ＰＢＥ−ＣＤＣ４８−ｓｇＲＮＡバイナリーベクターを、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウムＡＧＬ１株に形質転換した。アグロバクテリウム媒介形質転換、組織培養、及びイネＮｉｐｐｏｎｂａｒｅの再生を、Shanら（Shan, Q. et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31, 686-688 (2013)）に従って実施した。ハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）をスクリーニングのために全ての続く組織培養プロセスにおいて使用した。
【０１０３】
Ｔ７Ｅ１及びＰＣＲ／ＲＥアッセイによる変異の同定
個々のイネ植物からのＤＮＡを抽出して、Ｔ７Ｅ１アッセイによる変異を検出し、そして変異をＳａｎｇｅｒ配列により確認した。コムギにおいて、費用及び労力を省くために、３〜４個の植物を群としてランダムに選択し、Ｔ７Ｅ１及びＰＣＲ／ＲＥによる変異を検出した。ある群が陽性の結果を示した場合に、その群における全ての植物をＴ７Ｅ１及びＰＣＲ／ＲＥによってさらに試験し、そしてその結果をＳａｎｇｅｒ配列決定によって確認した。
【０１０４】
Ｔ７Ｅ１検出法：
１）ゲノムＤＮＡを植物から抽出し、ＰＣＲによって増幅させ、そして電気泳動により検出した。
２）ＰＣＲ産物を、以下のＴ７Ｅ１緩衝液に添加した：
【数１】
2019523011.tif 000003
３）その混合物を、ＰＣＲ装置中で９５℃まで５分間加熱し、そして室温まで冷却してＰＣＲ産物を再アニールして、ヘテロ二本鎖ＤＮＡを形成した。
４）以下のＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼを添加した：
【数２】
2019523011.tif 000004
５）３７℃で１時間、全ての産物１１μｌをゲル電気泳動した。ＰＣＲ産物の切断は、産物が挿入欠失変異を含むことを示す。
【０１０５】
ＰＣＲ／ＲＥ：
１）植物ゲノムＤＮＡを抽出した。
２）３５０〜１０００ｂｐの長さである標的部位を含む断片を、合成遺伝子特異的プライマーで増幅させた：
【数３】
2019523011.tif 000005
３）一般の反応条件は、５分間９４℃で変性、３０秒間９４℃で変性、３０秒間５８℃でアニール、３０秒間７２℃で伸長、３０〜３５サイクルで増幅、５分間７２℃でインキュベート、１２℃でインキュベートである。ＰＣＲ産物５μｌを電気泳動した。
４）ＰＣＲ産物を、以下の制限エンドヌクレアーゼで消化した：
【数４】
2019523011.tif 000006
５）３７℃で２〜３時間消化した。その産物を１．２％アガロースゲル電気泳動により分析した。
６）ＰＣＲ産物における未切断の変異体バンドを回収し、精製し、そして以下のようにＴＡクローニングした：
【数５】
2019523011.tif 000007
７）ライゲーションを２２℃で１２分間実施した。そしてその産物を、大腸菌コンピテントセル中に形質転換し、そしてＬＢプレート（Ａｍｐ１００、ＩＰＴＧ、及びＸ−ｇａｌ）上に置き、２２℃で１２〜１６時間インキュベートした。白色のコロニーを陽性クローンを同定しシーケンシングするために選び取った。
【０１０６】
徹底的なシーケンシング（In-depth Sequencing）
それぞれｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ、ｐｄＣａｓ９−ＰＢＥ及びｐｗＣａｓ９と組み合わせた異なるｓｇＲＮＡ発現ベクターを、コムギ、イネ又はトウモロコシのプロトプラストに４８時間形質転換させた。その後、プロトプラストを採取し、そしてＤＮＡを徹底的なシーケンシングのために抽出した。一巡目のＰＣＲにおいて、標的領域を部位特異的プライマー（表５）で増幅した。二巡目のＰＣＲにおいて、フォワードタグ及びリバースタグを、ライブラリー構築のためにＰＣＲ産物の末端に付加した（表５）。等量の異なるＰＣＲ産物を貯蔵した。そしてその試料を、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｇｈ−Ｓｅｑ ４０００でシーケンシングした。
【０１０７】
実施例１．ｎＣａｓ９−ＰＢＥ及びｄＣａｓ９−ＰＢＥによる植物プロトプラストにおけるＢＦＰの塩基編集
ｎＣａｓ９−ＰＢＥ融合タンパク質において、Ｎ末端からＣ末端は、それぞれＮＬＤ（配列番号３０）、ＡＰＯＢＥＣ１（配列番号１１）、ＸＴＥＮリンカー（配列番号１２）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９、配列番号１３）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ、配列番号１５）及びＮＬＳ（配列番号３１）であり、一方で、ｄＣａｓ９−ＰＢＥ融合タンパク質においては、それぞれＮ末端からＣ末端は、ＮＬＳ、ＡＰＯＢＥＣ１、ＸＴＥＮリンカー、触媒不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９、配列番号１４）、ＵＧＩ及びＮＬＳである。作物における効率的な発現のためのコドン最適化融合タンパク質をコードする配列を、プラスミド構築物ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ及びｐｄＣａｓ９−ＰＢＥにおけるユビキチン−１遺伝子プロモーターＵｂｉ−１の下流に置いた（図１ａ）。
【０１０８】
コムギ及びイネのプロトプラストにおける２つの構築物の青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に変換する能力を比較した。この変換は、ＢＦＰコード遺伝子の６６番目のコドンの第一のヌクレオチドをＣからＴに変異して、ＣＡＣ（ヒスチジン）からＴＡＣ（チロシン）への変化をもたらすことを含む。
【０１０９】
ＢＦＰ特異的ｓｇＲＮＡの標的領域をコドン６５〜７１の範囲のコドン及びコドン７２の第一の２つのヌクレオチドを包含するために設計し、少なくとも３つの塩基（ＣＡＧ）は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を構築する（図１ｂ）。変異されるＣ塩基は、標的配列の４位に位置する。ｓｇＲＮＡを、それぞれプロモーターＴａＵ６及びＯｓＵ３を使用して転写する（図１ｂ）。ｓｇＲＮＡ発現ベクターｐＴａＵ６−ＢＦＰ−ｓｇＲＮＡ及びｐＯｓＵ３−ＢＦＰ−ｓｇＲＮＡの構築を前記する。
【０１１０】
ＣＡＧがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のために最適なＰＡＭではないため、ＣＡＧをＣＧＧに人工的に変異させ、そして得られたＢＦＰ配列（ＢＦＰｍ）を、Ｕｂｉ−１プロモーターの下流にクローニングして、プロトプラストにおいて編集される標的として発現構築物ｐＵｂｉ−ＢＦＰｍ（図１ｂ）を形成した。
【０１１１】
ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ、ｐＵｂｉ−ＢＦＰｍ及びｐＯｓＵ３−ＢＦＰ−ｓｇＲＮＡの組み合わせは、イネプロトプラストに導入した場合に細胞の５．８％でのＧＦＰ発現をもたらした一方で、ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥのｐｄＣａｓ９−ＰＢＥでの置換は、ＧＦＰ発現細胞０．５％のみをもたらし、ＧＦＰ発現細胞はｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ又はｐｄＣａｓ９−ＰＢＥを含まなかった場合に検出されなかった。５８．４％の細胞が並行して陽性対照でＧＦＰを発現した（図１ｃ）（細胞をＧＦＰ発現構築物ｐＵｂｉ−ＧＦＰで形質転換した）。
【０１１２】
コムギプロトプラストにおいて、ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ（６．８％）を使用することにより、ｐｄＣａｓ９−ＰＢＥ（０．３％）よりも多くのＧＦＰ発現細胞を製造した。
【０１１３】
ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ、ｐＵｂｉ−ＢＦＰｍ、及びｐＯｓＵ３−ＢＦＰ−ｓｇＲＮＡ（ｐＴａＵ６−ＢＦＰ−ｓｇＲＮＡ又はｐＺｍＵ３−ＢＦＰ−ｓｇＲＮＡ）で形質転換したイネ（コムギ又はトウモロコシ）プロトプラストの徹底的なシーケンシングは、合計ＤＮＡの約４．００％がＣからＴへの変異を有することを示した（図１ｄ）。変異は、プロトプラスト配列（標的配列）における３位、４位、６位及び９位でのＣ塩基に対してのみに生じ、変異頻度は、それぞれ、２．４８〜３．９２％、３．０６〜３．７９％、５．８６〜８．７５％、及び６．４７〜７．８６％であった（図１ｄ）。所望のＣ（４位）も変異させるが、その変異頻度は高くない。ｐｄＣａｓ９−ＰＢＥをｐｎＣａｓ９−ＰＢＥに置き換える場合に、前記位置でＣ塩基も変異させるが、変異頻度（０．０６〜０．２２％）は、ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ（２．４８〜８．７５％）よりも著しく低かった（図１ｄ）。
【０１１４】
したがって、蛍光タンパク質レポーターアッセイの結果は、ｎＣａｓ９−ＰＢＥ及びｄＣａｓ９−ＰＢＥの双方が、コムギ、イネ及びトウモロコシのプロトプラストにおける標的領域においてＣからＴに変換することができ、脱アミノ化領域がプロトプラスト配列（標的配列）の３〜９位を含むことを示す。そして、ｎＣａｓ９−ＰＢＥの活性は、ｄＣａｓ９−ＰＢＥよりも強い。
【０１１５】
実施例２．ｎＣａｓ９−ＰＢＥ及びｄＣａｓ９−ＰＢＥによる植物プロトプラストにおける内在性遺伝子の塩基編集
この実施例において、コムギ、イネ及びトウモロコシの内在性遺伝子に対するｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ又はｐｄＣａｓ９−ＰＢＥの活性をさらに研究した。挿入欠失の導入のための対照として、構築物ｐｗＣａｓ９（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ５３０６４）を発現する野生型Ｃａｓ９もこの実験において使用した。
【０１１６】
３つの異なるｓｇＲＮＡ標的部位（Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３）を、コムギのＴａＬＯＸ２遺伝子において設計した。それぞれの３つのイネ遺伝子ＯｓＣＤＣ４８、ＯｓＮＲＴ１．１Ｂ、及びＯｓＳＰＬ１４について、１つのｓｇＲＮＡ標的部位を設計した。１つのｓｇＲＮＡ標的部位を、トウモロコシＺｍＣＥＮＨ３遺伝子中で設計した（表１を参照されたい）。
【０１１７】
それぞれのｓｇＲＮＡ発現構築物を、それぞれｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ、ｐｄＣａｓ９−ＰＢＥ、及びｐｗＣａｓ９と組み合わせ、そしてそれぞれコムギ、イネ及びトウモロコシのプロトプラスト中で同時発現させた。プロトプラストＤＮＡを抽出した。７つの異なる標的についてのＰＣＲ増幅産物を製造し、配列決定した。１０００００〜２７００００シーケンシングリードを、変異誘発性の詳細な分析のために使用した。
【０１１８】
ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥについて、ＣからＴへの移行は全ての７つの標的において観察され、かつ脱アミノ化領域は、プロトプラスト配列（標的配列）の３〜６位を含む（図２ａ）。ＣからＴへの一置換頻度は、０．５７％〜７．０７％であり、７位又は７位の近くでのＣ塩基は、最も高い置換頻度を有し、編集事象は、配列の構造に依存していない（図２ａ）。多重Ｃ編集（２〜５つのＣを含む）頻度は、０．３１％〜１２．４８％の間であり、一方で２又は３つのＣを編集する頻度はより高い（図２ｂ）。ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥで誘導される挿入欠失頻度は、ｐｗＣａｓ９で誘導される挿入欠失頻度（６．２７％〜１１．６８％）と比較して、標的部位７で非常に低い（０．０１％〜０．３４％）（図２ｃ及び表３）。
【０１１９】
一方で、ｐｄＣａｓ９−ＰＢＥの発現は、７つの標的部位で低頻度の１つのＣ編集（＜０．９６％）又は複数Ｃ編集（＜１．２９％）しか生じず（図２ａ及び表２）、挿入欠失の出現頻度（＜０．０６％）は、ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥと同程度であった（図２ｃ及び表３）。この実施例の結果は、ｎＣａｓ９−ＰＢＥがｄＣａｓ９−ＰＢＥよりも優れているというレポーター遺伝子アッセイにおける以前の結果を証明し、そして穀物植物細胞における脱アミノ化領域のサイズ（３〜９位での７つヌクレオチド領域）を証明することは明らかである。ｎＣａｓ９−ＰＢＥが、１つのＣ及び複数のＣを高効率で編集するために標的部位構成配列に依存しないことも証明する。
【０１２０】
一例としてＺｍＣＥＮＨ３を使用して、標的ゲノム領域においてｎＣａｓ９−ＰＢＥによって生じるアミノ酸変異を分析した。図２ｄにおいて示されるように、野生型ＺｍＣＥＮＨ３において、保存残基はアラニン−ロイシン−ロイシン（ＡＬＬ、１０９〜１１１残基）セグメントの中間に位置するロイシン残基である。ｎＣａｓ−ＰＢＥで処理したプロトプラストから得られたＺｍＣＥＮＨ３標的部位の増幅産物において、Ａ１０９Ｖ、Ｌ１１０Ｖ、及び／又はＬ１１１Ｆ置換を同定することは容易である（図２ｄ）。ｎＣａｓ９−ＰＢＥの１つのＣ及び複数のＣを編集する能力は、ＡＬＬに対する合計７つの異なるタイプの置換を可能にし、それぞれの残基について一置換（ＡＦＬ、ＶＬＬ、及びＡＬＦ）、２つの残基の二重置換（ＡＦＦ、ＶＦＬ、及びＶＬＦ）及び３つ全ての残基の三重置換（ＶＦＦ）を含む（図２ｄ）。置換事象ＺｍＣＥＮＨ３−ＡＦＬは、アラビドプシス及びオオムギにおいて研究されているが、一重、二重、及び三重置換事象は、これまでにあらゆる研究で報告されていない。
【０１２１】
【表２】
2019523011.tif 000008
【０１２２】
【表３】
2019523011.tif 000009
【０１２３】
実施例３．変異体植物についての分析
この実施例では、さらに、ｎＣａｓ９−ＰＢＥとｄＣａｓ９−ＰＢＥとの間の機能的差異を調査し、そして変異体植物を分析することによるｎＣａｓ９−ＰＢＥの機能的特性を試験した。
【０１２４】
コムギの形質転換のために、ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ及びｐＴａＵ６−ｓｇＲＮＡ−ＬＯＸ２−ｓ１（図３ａ）を、パンコムギ変種、Ｂｏｂｗｈｉｔｅに微粒子銃により同時形質転換し、そして植物を除草剤選択なしに再生した。ｓｇＲＮＡ−ＬＯＸ２−ｓ１の標的部位を、再生した植物のゲノムＤＮＡから特異的プライマーを使用して増幅させた（表４）。ヌクレオチド置換を有する２つの系列を、Ｔ７Ｅ１及び制限酵素消化（ＰＣＲ−ＲＥ）によって１６０個の未成熟胚から同定した。変異効率は１．２５％（２／１６０）である（図３ｂ）。Ｓａｎｇｅｒシーケンシングは、変異体Ｔ０−３が、ＰＡＭの下流の３位、６位及び９位で全ての３つのＣからＴへの置換を含む一方で、変異体Ｔ０−７が３位でＣからＴへの変異を有することを確認した（図３ｂ）。これら２つの突異体植物における挿入欠失を検出することに失敗した。
【０１２５】
イネ変種Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）をイネ形質転換のために使用した。それというのもこの変種は、遺伝子操作に非常に感受性があり、その全ゲノム配列が利用可能だからである。イネ老化及び細胞死を調節することが見出されているＯｓＣＤＣ４８遺伝子を、標的として採用した（図３ｃ及び表１）。ｐＡＧ−ｎ／ｄＣａｓ９−ＰＢＥ−ＣＤＣ４８−ｓｇＲＮＡバイナリーベクターを、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入法によってイネに形質転換した。
【０１２６】
９２個及び８７個の独立トランスジェニックＴ０植物を、それぞれｎＣａｓ９−ＰＢＥ及びｄＣａｓ９−ＰＢＥのために得た。Ｔ７Ｅ１分析及びＳａｎｇｅｒシーケンシングの後に、９２個のｎＣａｓ９−ＰＢＥ植物のうち４０個を、少なくとも１つのＣからＴへの置換をＯｓＣＤＣ４８標的領域において実施し、変異製造効率は４３．４８％（４０／９２）（図３ｄ）であることを見出した。代表的なシーケンシングの結果を図４において示す。４０個の変異体のうち、変異を、標的領域の３位、４位、７位及び８位でのＣ塩基についてのみ検出し、合計で７つの異なるタイプの点変異を同定する（図３ｅ）。特に、４つの１ヌクレオチド変異（Ｃ３Ｔ、Ｃ４Ｔ、Ｃ７Ｔ、及びＣ８Ｔ）、２つの二重ヌクレオチド変異（Ｃ３Ｃ４からＴ３Ｔ４及びＣ７Ｃ８からＴ７Ｔ８）、及び１つの三重ヌクレオチド変異（Ｃ３Ｃ４Ｃ７からＴ３Ｔ４Ｔ７）がある（図３ｅ）。したがって、ｎＣａｓ９−ＰＢＥは、これらのイネ変異体における脱アミノ化領域において７ヌクレオチド（３〜９位）を含む。それぞれのＣについての変異頻度は、７位でＣについて最も高い編集頻度を有する５．００％（Ｃ３、２／４０）〜３２．５０％（Ｃ７、１３／４０）の範囲である。４０個の変異体の標的領域において挿入欠失は観察されない。驚くべきことに、Ｔ７Ｅ１アッセイ及びＳａｎｇｅｒシーケンシング分析を使用する場合に、８７個のｄＣａｓ９−ＰＢＥ植物についてＯｓＣＤＣ４８の標的領域に点突然変異又は挿入欠失は検出されなかった。
【０１２７】
本発明の塩基編集方法の潜在的なオフターゲット効果を、得られた４０株のｎＣａｓ−ＰＢＥ変異体に基づいて調査した。５つの可能性のあるオフターゲット部位が、Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅゲノム配列において見出され、それらのそれぞれは、ＯｓＣＤＣ４８のｓｇＲＮＡ標的領域を有する３ヌクレオチドミスマッチを有する（表４）。これら５つの部位の増幅産物を、Ｔ７Ｅ１アッセイ及びＳａｎｇｅｒシーケンシングを使用して慎重に分析する。点変異又は挿入欠失は検出されず、ｎＣａｓ９−ＰＢＥによる塩基編集が非常に特異的であったことを示した。
【０１２８】
【表４】
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【０１２９】
実施例４．トウモロコシＡＬＳ遺伝子の塩基編集
シード配列としてＡｔＡＬＳ  （ＡＴ３Ｇ４８５６０．１）を使用して、２つのＺｍＡＬＳ相同遺伝子を、トウモロコシデータベース（https: //phytozome. jgi. doe.gov）におけるＢＬＡＳＴＮアライメント分析によって得て、２つのＺｍＡＬＳ相同遺伝子を、ＺｍＡＬＳ１（Ｌｏｃｕｓ Ｎａｍｅ：ＧＲＭＺＭ２Ｇ１４３３５７）及びＺｍＡＬＳ２（Ｌｏｃｕｓ Ｎａｍｅ：ＧＲＭＺＭ２Ｇ１４３００８）と名付けた。ＺｍＡＬＳ１及びＺｍＡＬＳ２は、９３．８４％の配列同一性を有する。通常のsｇＲＮＡ標的配列を、ＣＡＧＧＴＧＣＣＧＣＧＡＣＧＣＡＴＧＡＴＴＧＧであるＺｍＡＬＳ１（配列番号２６）及びＺｍＡＬＳ２（配列番号２８）（Svitashevら、Plant Physiol., 2015）の保存領域に設計した。塩基編集システムを、前記したように構築し、そして微粒子銃法によってトウモロコシ変種Ｚｏｎｇ３１に形質転換した。ＰＣＲ／ＲＥ検出後に、ＺｍＡＬＳ１及びＺｍＡＬＳ２に対してＣ７からＴ７への置換を有する植物を得た（図５）。
【０１３０】
前記データに基づいて、改変及び最適化されたｎＣａｓ９−ＰＢＥは、コムギ、イネ、及びトウモロコシの細胞において非常に効率的かつ特異的なＣからＴへの塩基編集を誘導し、ｎＣａｓ９−ＰＢＥによって生成された点変異は、ＴＩＬＬＩＮＧによって生成された点変異と比較して特有である。適切に設計されたｓｇＲＮＡと組み合わせたｎＣａｓ９−ＰＢＥは、所望の残基及び隣接する残基への点変異を実施することを可能にしてよく、したがって、タンパク質の重要なドメインに位置するアミノ酸の単一又は組み合わせた変異の影響についての分析を容易にする。一方で、ＴＩＬＬＩＮＧによって同定された点変異は、通常、単一のアミノ酸残基にのみに現れ、したがってＴＩＬＬＩＮＧによって標的残基及びその隣接残基の変異を同時に得ることは困難である。したがって、ｎＣａｓ９−ＰＢＥは、複数の突異を迅速に生成するために明らかに有利であり、かつ重要なタンパク質ドメインにおける１つ以上のアミノ酸の機能の詳細な分析に使用することができる。ｎＣａｓ９−ＰＢＥの重要な機能的特性は、比較的大きな脱アミノ化領域（プロトスペース配列／標的配列の７塩基を包含する）を含み、その塩基編集は、標的領域の配列構成構造から独立しており、そして挿入欠失変異がほとんどない。ｎＣａｓ９−ＰＢＥは、穀物において、より多様な変異を生じるために有利であるより大きな脱アミノ化領域を有する。
【０１３１】
本発明は、Ｃａｓ９多様体−シチジンデアミナーゼ融合タンパク質によって媒介されるＣからＴへの塩基編集が、植物ゲノムに部位特異的点変異を生じるために非常に効率的なツールであり、それによってゲノム操作によって作物を改良する効率を高めることを証明する。
【０１３２】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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