(57)【要約】少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含むポリヌクレオチド、例えば、アプタマーなどを提供し、ここで、第１の５位修飾ピリミジンと第２の５位修飾ピリミジンは異なる。そのようなポリヌクレオチド、例えば、アプタマーなどを選択し、使用する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、前記第１の５位修飾ピリミジンと前記第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンであるアプタマーであって、
前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであるか、または
前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、
前記５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含み、前記５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、前記アプタマー。
【請求項２】
前記５位修飾ウリジンの前記部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される群に含まれるリンカーを介して共有結合で連結されている、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
前記５位修飾シチジンの前記部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される群に含まれるリンカーを介して共有結合で連結されている、請求項１または請求項２に記載のアプタマー。
【請求項４】
前記５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項５】
前記５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項６】
前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項７】
前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項８】
前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンはＴｙｒｄＵである、請求項６または請求項７に記載のアプタマー。
【請求項９】
前記アプタマーは、前記アプタマーの５’末端に、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長の領域を含み、ここで、前記アプタマーの前記５’末端領域は５位修飾ピリミジンを欠く、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１０】
前記アプタマーは、前記アプタマーの３’末端に、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長の領域を含み、ここで、前記アプタマーの前記３’末端領域は５位修飾ピリミジンを欠く、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１１】
前記アプタマーは、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜８０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または４０〜１００、または４０〜９０、または４０〜８０、または４０〜７０、または４０〜６０、または４０〜５０のヌクレオチド長である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１２】
複数のポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、前記第１の５位修飾ピリミジンと前記第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンである組成物であって、
前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであるか、または
前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、
前記５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含み、前記５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、前記組成物。
【請求項１３】
各ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの５’末端に固定領域を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
各ポリヌクレオチドの前記５’末端固定領域は、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
各ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの３’末端に固定領域を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドの前記３’末端固定領域は、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記５位修飾ウリジンの前記部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される群に含まれるリンカーを介して共有結合で連結されている、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記５位修飾シチジンの前記部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される群に含まれるリンカーを介して共有結合で連結されている、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｒｙｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンはＴｙｒｄＵである、請求項２１または請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
各ポリヌクレオチドはランダム領域を含む、請求項１２〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ランダム領域は、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または３０〜４０のヌクレオチド長である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
各ポリヌクレオチドは、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜８０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または４０〜１００、または４０〜９０、または４０〜８０、または４０〜７０、または４０〜６０、または４０〜５０のヌクレオチド長である、請求項１２〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
アプタマー及び標的を含む組成物であって、前記アプタマー及び前記標的は複合体を形成することができ、前記アプタマーは請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアプタマーである、前記組成物。
【請求項２８】
第１のアプタマー、第２のアプタマー、及び標的を含む組成物であって、
前記第１のアプタマーは、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、
前記第２のアプタマーは、少なくとも１つの第３の５位修飾ピリミジンを含むか、または前記第２のアプタマーは、少なくとも１つの第３の５位修飾ピリミジンと少なくとも１つの第４の５位修飾ピリミジンとを含み、
前記第１のアプタマー、第２のアプタマー及び前記標的は、三量体複合体を形成することができ、
前記第１の５位修飾ピリミジンと前記第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンであり、かつ
前記第１のアプタマーは請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアプタマーである、前記組成物。
【請求項２９】
前記標的は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、低分子、細胞及び組織から選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
（ａ）標的分子に結合することができるアプタマーと試料とを接触させること、
（ｂ）前記アプタマーを前記試料と共にインキュベートしてアプタマー−標的複合体を形成させること、
（ｃ）前記試料中の前記アプタマー−標的複合体を濃縮すること、及び
（ｃ）前記アプタマー、アプタマー−標的複合体または標的分子の存在について検出し、前記アプタマー、アプタマー−標的複合体または標的分子の検出は、前記試料中に前記標的分子が存在することを指し、前記アプタマー、アプタマー−標的複合体または標的分子の検出がないことは、前記試料中に前記標的分子が存在しないことを指すこと
を含む方法であって、
前記アプタマーは請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアプタマーである、前記方法。
【請求項３１】
前記方法は、前記試料への競合分子の添加、前記アプタマー−標的複合体の固体支持体への捕捉、ならびに競合分子の添加及び前記試料の希釈から選択される少なくとも１つのさらなるステップを含み、ここで、前記少なくとも１つのさらなるステップは、ステップ（ａ）またはステップ（ｂ）の後で行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記競合分子は、ポリアニオン性競合物質から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリアニオン性競合物質は、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン及びｄＮＴＰから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ポリデキストランは硫酸デキストランであり、ＤＮＡはニシン精子ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、低分子、細胞及び組織から選択される、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料は、全血、白血球、末梢血単核球、血漿、血清、痰、呼気、尿、精液、唾液、髄液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引物、気管支吸引物、滑液、関節吸引物、細胞、細胞抽出物、便、組織、組織生検、及び脳脊髄液から選択される、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ａ）前記試料を、前記標的に結合して第１の複合体を形成することができる前記第１のアプタマーと接触させ、混合物を形成させること、
ｂ）前記混合物を、前記第１の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすること、
ｃ）前記混合物を、前記第１の複合体と結合して第２の複合体を形成することができる第２のアプタマーと接触させること、
ｄ）前記混合物を、前記第２の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすること、
ｅ）前記混合物中の前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー、前記標的、前記第１の複合体または前記第２の複合体の有無について検出し、前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー、前記標的、前記第１の複合体または前記第２の複合体の存在は、前記試料中の前記標的の存在を指すことを含む、試料中の標的を検出する方法であって、
前記第１のアプタマーは請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアプタマーであり、
前記第２のアプタマーは、少なくとも１つの第３の５位修飾ピリミジンを含むか、または前記第２のアプタマーは、少なくとも１つの第３の５位修飾ピリミジンと少なくとも１つの第４の５位修飾ピリミジンとを含む、前記方法。
【請求項３８】
前記標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、低分子、細胞及び組織から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１のアプタマー、第２のアプタマー及び前記標的は、三量体複合体を形成することができる、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）アプタマーのライブラリーを前記標的分子と接触させて混合物を形成させ、アプタマーが前記標的分子に対して親和性である場合に形成されるアプタマー−標的複合体の形成を可能にすること、
（ｂ）前記混合物の残部から前記アプタマー−標的複合体を分配すること（または前記アプタマー−標的複合体を濃縮すること）、
（ｃ）前記アプタマー−標的複合体を解離させること、及び
（ｄ）前記標的分子に対する結合能のある前記１つ以上のアプタマーを同定すること
を含む、標的分子に対する結合能がある１つ以上のアプタマーを同定する方法であって、
前記アプタマーのライブラリーは、複数のポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、前記第１の５位修飾ピリミジンと前記第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンであり、
前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであるか、または
前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、
前記５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含み、前記５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、前記方法。
【請求項４１】
各ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの５’末端に固定領域を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
各ポリヌクレオチドの前記５’末端固定領域は、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
各ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの３’末端に固定領域を含む、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリヌクレオチドの前記３’末端固定領域は、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記５位修飾ウリジンの前記部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される群に含まれるリンカーを介して共有結合で連結されている、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記５位修飾シチジンの前記部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される群に含まれるリンカーを介して共有結合で連結されている、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｒｙｄＵ、ＴｒｐｄＵ及びＴｈｒｄＵから選択される、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
各ポリヌクレオチドはランダム領域を含む、請求項４０〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ランダム領域は、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または３０〜４０のヌクレオチド長である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
各ポリヌクレオチドは、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜８０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または４０〜１００、または４０〜９０、または４０〜８０、または４０〜７０、または４０〜６０、または４０〜５０のヌクレオチド長である、請求項４０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
各ポリヌクレオチドは標的と結合するアプタマーであり、前記ライブラリーは少なくとも１０００アプタマーを含み、各アプタマーは別々のヌクレオチド配列を含む、請求項４０〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
ステップ（ａ）、（ｂ）及び／または（ｃ）を少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回繰り返す、請求項４０〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的分子に対する結合能のある前記１つ以上のアプタマーを増幅させる、請求項４０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記混合物はポリアニオン性競合分子を含む、請求項４０〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリアニオン性競合物質は、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン及びｄＮＴＰから選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ポリデキストランは硫酸デキストランであり、ＤＮＡはニシン精子ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、低分子、細胞及び組織から選択される、請求項４０〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１の５位修飾ピリミジン及び前記第２の５位修飾ピリミジンは、ポリメラーゼ酵素によって取り込まれることができる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアプタマー、または請求項１２〜２９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３０〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記アプタマーは、前記第１の５位修飾ピリミジンの各々の代わりに非修飾ピリミジンを含むかまたは前記第２の５位修飾ピリミジンの各々の代わりに非修飾ピリミジンを含む長さ及び核酸塩基配列が同一のアプタマーと比べて、改善されたヌクレアーゼ安定性及び／またはヒト血清中での長い半減期を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアプタマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年７月１日に提出された米国仮出願第６２／３５７，６２３号、及び２０１６年１２月２１日に提出された米国仮出願第６２／４３７，５９２号の優先権の利益を主張するものであり、その各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年６月１５日に作成された前記ＡＳＣＩＩ形式のコピーは、ファイル名０１１３７−００２０−００ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔ、及びサイズ２１，８６３バイトである。
【０００３】
技術分野
本開示は、一般に、標的分子結合することができるアプタマーのような修飾ヌクレオシドを含む、オリゴヌクレオチドの分野に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、１種以上の塩基修飾ヌクレオシドを含むアプタマーなどのオリゴヌクレオチド、及びそのようなアプタマーを作製し使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
修飾ヌクレオシドは、治療剤、診断用薬として使用されるほか、オリゴヌクレオチドに組み込み、その特性（例えば、安定性）を改善するために使用されている。
【０００５】
ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）は、標的分子に選択的に結合するオリゴヌクレオチド（「アプタマー」と呼ぶ）を同定する方法である。ＳＥＬＥＸ工程は、例えば、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている。ＳＥＬＥＸ法では、オリゴヌクレオチドのランダムな混合物からオリゴヌクレオチドを選択し、同定して、いかなる所望基準の結合親和性及び結合選択性もほぼ達成する。ＳＥＬＥＸ工程の過程で同定されたオリゴヌクレオチドに特定の種類の修飾ヌクレオシドを導入することにより、ヌクレアーゼ安定性、実効電荷、親水性または親油性を改変して、オリゴヌクレオチドの三次元構造及び標的結合能に違いを与える。
【発明の概要】
【０００６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含むアプタマーを提供し、ここで、第１の５位修飾ピリミジンと第２の５位修飾ピリミジンは異なる。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンである。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンである。いくつかの実施形態では、５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む。いくつかの実施形態では、５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む。ある実施形態では、部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される群に含まれるリンカーを介して塩基の５位に共有結合で連結されている。いくつかの実施形態では、５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される。いくつかの実施形態では、５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンはＴｙｒｄＵである。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジン及び第２の５位修飾ピリミジンは、ポリメラーゼ酵素によって取り込まれることができる。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジン及び第２の５位修飾ピリミジンは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれることができる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、ＰＣＳＫ９、ＰＳＭＡ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＦＸＮ、ＫＤＭ２Ａ、ＩＧＦ１Ｒ、ｐＩＧＦ１Ｒ、ａ１−アンチトリプシン、ＣＤ９９、ＭＭＰ２８及びＰＰＩＢから選択される標的タンパク質と結合する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、アプタマーの５’末端に、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長の領域を含み、ここで、アプタマーの５’末端領域は５位修飾ピリミジンを欠く。いくつかの実施形態では、アプタマーは、アプタマーの３’末端に、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長の領域を含み、ここで、アプタマーの３’末端領域は５位修飾ピリミジンを欠く。いくつかの実施形態では、アプタマーは、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜８０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または４０〜１００、または４０〜９０、または４０〜８０、または４０〜７０、または４０〜６０、または４０〜５０のヌクレオチド長である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、第１の５位修飾ピリミジンの各々の代わりに非修飾ピリミジンを、及び／または第２の５位修飾ピリミジンの各々の代わりに非修飾ピリミジンを含む長さ及び核酸塩基配列が同一のアプタマーと比べて、ヌクレアーゼ安定性が改善されている。いくつかの実施形態では、アプタマーは、第１の５位修飾ピリミジンの各々の代わりに非修飾ピリミジンを、または第２の５位修飾ピリミジンの各々の代わりに非修飾ピリミジンを含む長さ及び核酸塩基配列が同一のアプタマーと比べて、ヒト血清中の半減期が長い。
【００１０】
いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドを含む組成物を提供し、ここで、各ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、第１の５位修飾ピリミジンと第２の５位修飾ピリミジンは異なる。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端に固定領域を含む。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドの５’末端固定領域は、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの３’末端に固定領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの３’末端固定領域は、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンである。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンである。いくつかの実施形態では、５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、トリプトファニル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む。いくつかの実施形態では、５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む。ある実施形態では、部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される群に含まれるリンカーを介して塩基の５位に共有結合で連結されている。いくつかの実施形態では、５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される。いくつかの実施形態では、５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｒｙｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンはＴｙｒｄＵである。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジン及び第２の５位修飾ピリミジンは、ポリメラーゼ酵素によって取り込まれることができる。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジン及び第２の５位修飾ピリミジンは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれることができる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、組成物の各ポリヌクレオチドはランダム領域を含む。いくつかの実施形態では、ランダム領域は、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または３０〜４０のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドは、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜８０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または４０〜１００、または４０〜９０、または４０〜８０、または４０〜７０、または４０〜６０、または４０〜５０のヌクレオチド長である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、第１のアプタマー、第２のアプタマー、及び標的を含む組成物を提供し、ここで、第１のアプタマーは、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、第２のアプタマーは、少なくとも１つの第３の５位修飾ピリミジンを含むか、または第２のアプタマーは、少なくとも１つの第３の５位修飾ピリミジンと少なくとも１つの第４の５位修飾ピリミジンとを含み、第１のアプタマー、第２のアプタマー及び標的は三量体複合体を形成することができ、第１の５位修飾ピリミジンと第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンである。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンである。いくつかの実施形態では、５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む。いくつかの実施形態では、５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む。ある実施形態では、部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される群に含まれるリンカーを介して塩基の５位に共有結合で連結されている。いくつかの実施形態では、５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される。いくつかの実施形態では、５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンはＴｙｒｄＵである。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジン及び第２の５位修飾ピリミジンは、ポリメラーゼ酵素によって取り込まれることができる。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジン及び第２の５位修飾ピリミジンは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれることができる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第３の５位修飾ピリミジンは、５位修飾シチジン及び５位修飾ピリミジンから選択される。いくつかの実施形態では、第３の５位修飾ピリミジンと第４の５位修飾ピリミジンとは異なる５位修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、第３の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、第４の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンである。いくつかの実施形態では、第３の５位修飾シチジンは、ＢｎｄＣ、ＰＥｄＣ、ＰＰｄＣ、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＮＥｄＣ、２ＮＥｄＣ、及びＴｙｒｄＣから選択される。いくつかの実施形態では、５位修飾ウリジンは、ＢＮｄＵ、ＮａｐｄＵ、ＰＥｄＵ、ＩｂｄＵ、ＦＢｎｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＮＥｄＵ、ＭＢｎｄＵ、ＢＦｄＵ、ＢＴｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、標的は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、低分子、細胞及び組織から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、
（ａ）標的分子に結合することができるアプタマーと試料とを接触させること、
（ｂ）アプタマーを試料と共にインキュベートしてアプタマー−標的複合体を形成させること、
（ｃ）試料中のアプタマー−標的複合体を濃縮すること、及び
（ｃ）アプタマー、アプタマー−標的複合体または標的分子の存在について検出することを含み、
ここで、アプタマー、アプタマー−標的複合体または標的分子の検出は、試料中に標的分子が存在することを指し、アプタマー、アプタマー−標的複合体または標的分子の検出がないことは、試料中に標的分子が存在しないことを指し、かかるアプタマーは、本明細書で提供する二重修飾アプタマーである方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、試料への競合分子の添加、アプタマー−標的複合体の固体支持体への捕捉、ならびに競合分子の添加及び試料の希釈から選択される少なくとも１つのさらなるステップを含み、ここで、少なくとも１つのさらなるステップは、ステップ（ａ）またはステップ（ｂ）の後で行われる。いくつかの実施形態では、競合分子は、ポリアニオン性競合物質から選択される。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性競合物質は、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン及びｄＮＴＰから選択される。いくつかの実施形態では、ポリデキストランは硫酸デキストランであり、ＤＮＡはニシン精子ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、低分子、細胞及び組織から選択される。いくつかの実施形態では、試料は、全血、白血球、末梢血単核球、血漿、血清、痰、呼気、尿、精液、唾液、髄液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引物、気管支吸引物、滑液、関節吸引物、細胞、細胞抽出物、便、組織、組織生検、及び脳脊髄液から選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、試料中の標的を検出する方法を提供し、かかる方法は、
ａ）試料を、標的に結合して第１の複合体を形成することができる第１のアプタマーと接触させて混合物を形成させること、
ｂ）混合物を、第１の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすること、
ｃ）混合物を、第１の複合体と結合して第２の複合体を形成することができる第２のアプタマーと接触させること、
ｄ）混合物を、第２の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすること、
ｅ）混合物中の第１のアプタマー、第２のアプタマー、標的、第１の複合体または第２の複合体の有無について検出し、第１のアプタマー、第２のアプタマー、標的、第１の複合体または第２の複合体の存在は、試料中の標的の存在を指すことを含み、
ここで、第１のアプタマーは、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、
第２のアプタマーは、少なくとも１つの第３の５位修飾ピリミジンを含むか、または、第２のアプタマーは、少なくとも１つの第３の５位修飾ピリミジンと少なくとも１つの第４の５位修飾ピリミジンとを含み、
第１の５位修飾ピリミジンと第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンである。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンである。いくつかの実施形態では、５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む。いくつかの実施形態では、５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む。ある実施形態では、部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される群に含まれるリンカーを介して塩基の５位に共有結合で連結されている。いくつかの実施形態では、５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される。いくつかの実施形態では、５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンはＴｙｒｄＵである。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジン及び第２の５位修飾ピリミジンは、ポリメラーゼ酵素によって取り込まれることができる。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジン及び第２の５位修飾ピリミジンは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれることができる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、第３の５位修飾ピリミジンは、５位修飾シチジン及び５位修飾ピリミジンから選択される。いくつかの実施形態では、第３の５位修飾ピリミジンと第４の５位修飾ピリミジンとは異なる５位修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、第３の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、第４の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンである。いくつかの実施形態では、第３の５位修飾シチジンは、ＢｎｄＣ、ＰＥｄＣ、ＰＰｄＣ、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＮＥｄＣ、２ＮＥｄＣ、及びＴｙｒｄＣから選択される。いくつかの実施形態では、５位修飾ウリジンは、ＢＮｄＵ、ＮａｐｄＵ、ＰｅｄＵ、ＩｂｄＵ、ＦｂｎｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＮｅｄＵ、ＭｂｎｄＵ、ＢｆｄＵ、ＢｔｄＵ、ＰｐｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、低分子、細胞及び組織から選択される。いくつかの実施形態では、第１のアプタマー、第２のアプタマー及び標的は、三量体複合体を形成することができる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、標的分子に対する結合能がある１つ以上のアプタマーを同定する方法を提供し、かかる方法は、
（ａ）アプタマーのライブラリーを標的分子と接触させて混合物を形成させ、アプタマーが標的分子に対して親和性である場合に形成されるアプタマー−標的複合体の形成を可能にすること、
（ｂ）混合物の残部からアプタマー−標的複合体を分配（またはアプタマー−標的複合体を濃縮）すること、
（ｃ）アプタマー−標的複合体を解離させること、及び
（ｄ）標的分子に対する結合能のある１つ以上のアプタマーを同定すること
を含み、ここで、アプタマーのライブラリーは複数のポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、第１の５位修飾ピリミジンと第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）及び／または（ｃ）を少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回繰り返す。
【００２２】
いくつかの実施形態では、標的分子に対する結合能のある１つ以上のアプタマーを増幅させる。いくつかの実施形態では、混合物はポリアニオン性競合分子を含む。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性競合物質は、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン及びｄＮＴＰから選択される。いくつかの実施形態では、ポリデキストランは硫酸デキストランであり、ＤＮＡはニシン精子ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、低分子、細胞及び組織から選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端に固定領域を含む。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドの５’末端固定領域は、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの３’末端に固定領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの３’末端固定領域は、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンである。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンである。いくつかの実施形態では、５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む。いくつかの実施形態では、５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む。ある実施形態では、部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される群に含まれるリンカーを介して塩基の５位に共有結合で連結されている。いくつかの実施形態では、５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される。いくつかの実施形態では、５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｒｙｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンはＴｙｒｄＵである。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジン及び第２の５位修飾ピリミジンは、ポリメラーゼ酵素によって取り込まれることができる。いくつかの実施形態では、第１の５位修飾ピリミジン及び第２の５位修飾ピリミジンは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれることができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドはランダム領域を含む。いくつかの実施形態では、ランダム領域は、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または３０〜４０のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドは、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜８０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または４０〜１００、または４０〜９０、または４０〜８０、または４０〜７０、または４０〜６０、または４０〜５０のヌクレオチド長である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドは標的と結合するアプタマーであり、ここで、ライブラリーは少なくとも１０００アプタマーを含み、各アプタマーは別々のヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９タンパク質と結合するアプタマーを提供する。そのようないくつかの実施形態では、アプタマーは配列５’−ｙＧｐｐｐＧ−３’を含み、ここで、各ｙはＴｙｒｄＵであり、各ｐはＮａｐｄＣである。いくつかの実施形態では、アプタマーは配列５’−ｙＥＡｙＧＡｎｐＡｐ−３’をさらに含み、ここで、Ｅはｙ、Ａ、及びＧから選択され、ｎは０または１である。いくつかの実施形態では、ｎは０である。いくつかの実施形態では、配列５’−ｙＥＡｙＧＡｎｐＡｐ−３’は、配列５’−ｙＧｐｐｐＧ−３’の５’に位置する。いくつかの実施形態では、Ｅはｙである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９と結合するアプタマーを提供し、ここで、アプタマーは配列５’−ＦｎｐｐｐＡＡＧＲＪｒｐＲｐｐＷｍ−３’（配列番号８１）を含み、ここで、Ｆはｒ及びＧから選択され、各Ｒは独立してＧ及びＡから選択され、Ｊはｒ及びＡから選択され、Ｗはｒ、Ｇ、及びＡから選択され、ｎは０または１であり、ｍは０または１であり、ｒはＰｐｄＣであり、ｐはＮａｐｄＵである。いくつかの実施形態では、ｍは１である。いくつかの実施形態では、Ｆはｒである。いくつかの実施形態では、Ｊはｒである。いくつかの実施形態では、ＷはＧである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９と結合するアプタマーを提供し、ここで、アプタマーは配列５’−ＴＴｐｐＧＧｐｐ−３’を含み、ここで、各ｐはＮａｐｄＣである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９と結合するアプタマーは長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜８０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または４０〜１００、または４０〜９０、または４０〜８０、または４０〜７０、または４０〜６０、または４０〜５０のヌクレオチド長である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、アプタマーはＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒへの結合を阻害する。いくつかの実施形態では、アプタマーはＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒへの結合を阻害し、ＩＣ５０が３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、または１５ｎＭ未満である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、対象のコレステロールを低下させる方法であり、それを必要とする対象にＰＣＳＫ９と結合するアプタマーを投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９と結合するアプタマーは、本明細書で提供するアプタマーである。いくつかの実施形態では、コレステロールは低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）である。いくつかの実施形態では、対象は、ヘテロ接合型家族性高コレステロール血症または臨床的動脈硬化性心血管疾患（ＣＶＤ）を有する。
【００３４】
本発明の上述及び他の課題、特徴、及び利点は、添付の図を参照しながら進められる以下の詳細な説明からより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Ｃ５位修飾したウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸を含有するＤＮＡライブラリーを用いて修飾した核酸アプタマーの選択である。２つの修飾塩基を用いた選択の概略図である。３０Ｎの化学合成したランダムのマスターアンチセンスのビオチン化テンプレートライブラリーを使用してプライマー伸長反応により修飾及び非修飾のさまざまなライブラリーを酵素合成した、選択方法の概要である。
【図２】さまざまな修飾ライブラリーを使用して作製した４０ｍｅｒ（３０Ｎ＋５＋５）アプタマーのＰＣＳＫ９に対する結合親和性である。結合曲線で、親和性≧１ｎＭのアプタマーは灰色の網掛けで強調表示されており、親和性３２０ｎＭに示されるアプタマーは３２ｎＭの最高濃度で検出可能な結合がなかったことを表す。ライブラリーの各々にある黒線は、そのライブラリー内の全アプタマーの中央値を指す。
【図３】ｄＵまたはｄＣのいずれかの単一修飾−対−２修飾のｄＣ及びｄＵについての親和性及びコピー数の割合（％）である。各点は、Ｙ軸に示される親和性値と、Ｘ軸に示されるそのコピー数の割合（％）を有するアプタマーの１つを表す。赤色の点は単一修飾アプタマー、また緑色の点（中抜きの点と塗りつぶした点）は２修飾アプタマーである。塗りつぶした緑色の点は、一部のＮａｐ−ｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵアプタマー及びＰＰ−ｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵアプタマーを表す。
【図４】単一塩基修飾アプタマー及び２塩基修飾アプタマーの切断性である。Ａでは、すべての高親和性４０ｍｅｒ配列を、５’末端と３’末端から５ヌクレオチドずつ除去して、そのランダム領域長のみの３０ｍｅｒにさらに切断した。ＰＣＳＫ９に対する改善された結合親和性を保持するかまたは有するアプタマーのパーセンテージをＹ軸にプロットした。Ｂは、個別のライブラリー各々から得た単一塩基修飾アプタマー及び２塩基修飾アプタマーの親和性比較及び切断性である。親和性≧１ｎＭのアプタマーは灰色の網掛けで強調表示されており、平均親和性が最も高かったのは、ＰＰ−ｄＵ、Ｎａｐ−ｄＵ及びＴｙｒ−ｄＵをＰＰ−ｄＣと組み合わせた２修飾塩基の組み合わせを有するアプタマーであった。
【図５】各ライブラリーの３つの高親和性アプタマーの、他の前駆体タンパク質転換酵素（ＰＣ）に対する標的結合特異性。溶液親和性測定を、単一修飾塩基を有する１１アプタマー（すなわち、Ｎａｐ−ｄＣ／ｄＴを有する３アプタマー、ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵを有する３アプタマー、ｄＣ／Ｐｐ−ｄＵを有する３アプタマー、及びｄＣ／Ｔｙ−ｄＵを有する２アプタマー）、及び二重修飾塩基を有する２２アプタマー（すなわち、Ｎａｐ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵを有する３アプタマー、Ｎａｐ−ｄＣ／Ｐｐ−ｄＵを有する３アプタマー、Ｎａｐ−ｄＣ／Ｍｏｅ−ｄＵを有する３アプタマー、Ｎａｐ−ｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵを有する３アプタマー、Ｐｐ−ｄＣ／Ｐｐ−ｄＵを有する３アプタマー、Ｐｐ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵを有する３アプタマー、Ｐｐ−Ｔｙ−ｄＵを有する３アプタマー、及びＰｐ−ｄＣ／Ｍｏｅ−ｄＵを有する１アプタマー）の合計３３アプタマー（４０ｍｅｒ）について行った。親和性１００ｎＭの点線より下のアプタマーは、濃度１００ｎＭで検出可能な結合がないことを指す。これ以外のＰＣ（ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６及びＰＣＳＫ８）に対する親和性の試験は行わなかった。
【図６】単一塩基修飾アプタマー及び２塩基修飾アプタマーの種交差反応性である。単一修飾（３アプタマー）及び２修飾（３８アプタマー）の切断型３０ｍｅｒアプタマー（Ｋｄ値≦１ｎＭ）のヒト、サル、マウス及びラットそれぞれのＰＣＳＫ９に対する親和性である。単一修飾アプタマーはヒト及びサルのＰＳＣＫＳ９に結合したが、マウスまたはラットのＰＳＫＣ９には結合しなかった。対照的に、２修飾アプタマーはヒト、サル、マウス及びラットに結合した。ヒトＰＳＣＫ９と比較したそれぞれの種のＰＣＳＫ９タンパク質のパーセント同一性が記載されている。
【図７】ビーズを用いるＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイでのサンドイッチペアスクリーニング法である。Ａは、アプタマーのサンドイッチペアスクリーニング法の概略図である。Ｂは、ＰＣＳＫ９濃度１０ｎＭにおいてタンパク質不含緩衝液でのシグナルの５０倍以上のシグナルを示すサンドイッチペアである。サンドイッチアッセイで試験したアプタマーはすべてＫｄ≦１ｎＭの４０ｍｅｒであった。合計７０対が５０倍以上のシグナルを示した。ペアのアプタマーそれぞれを単一修飾ライブラリーから選択すると、サンドイッチペアが３対同定された（サンドイッチアプタマーペア３対／単一塩基修飾ライブラリー３つ）。対照的に、ペアの一方のアプタマーを３つの単一塩基修飾ライブラリーから選択し、ペアのもう一方のアプタマーを４つの二重塩基修飾ライブラリーから選択すると、サンドイッチペア２２対が同定され（すなわち、サンドイッチアプタマーペア２２対／単一塩基修飾ライブラリー３つと二重塩基修飾ライブラリー４つ）、また、ペアの両アプタマーを二重修飾ライブラリーから選択すると、サンドイッチペア４５対が同定された（サンドイッチアプタマーペア４５対／二重塩基修飾ライブラリー５つ）。Ｃは、単一塩基修飾アプタマーを有する捕捉アプタマーライブラリーと単一塩基修飾アプタマーを有する検出アプタマーライブラリー、単一塩基修飾アプタマーを有する捕捉アプタマーライブラリーと２塩基修飾アプタマーを有する検出アプタマーライブラリー、及び２塩基修飾アプタマーを有する捕捉アプタマーライブラリーと２塩基修飾アプタマーを有する検出アプタマーライブラリーの各組み合わせから得た、標的タンパク質ＰＣＳＫ９に対するサンドイッチペア数の比較である。
【図８】ビーズを用いるＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイにおいてＰＣＳＫ９濃度依存的シグナルを示すサンドイッチペアである。Ａは、性能が最良の捕捉アプタマーすなわち一次アプタマーと、選択した二次アプタマーすなわち検出アプタマーとの対の場合に濃度依存的シグナルが観察されたことを示す。Ｂは、性能が最良の二次アプタマーすなわち検出アプタマーと、選択した一次アプタマーすなわち捕捉アプタマーとの対の場合に濃度依存的シグナルが観察されたことを示す。Ｃは、アプタマーの配置を交換した場合の主要サンドイッチペアのｄＣ／ＰＰ−ｄＵアプタマー（一次）とＮａｐ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵアプタマー（二次）のシグナルを示す。Ｄは、組換え野生型ＰＣＳＫ９及び機能獲得型変異体ＰＣＳＫ９  Ｄ３７４Ｙで得た標準曲線である。サンドイッチペアの検出用野生型ＰＣＳＫ９（円形）と機能獲得型変異体ＰＣＳＫ９  Ｄ３７４Ｙ（三角形）タンパク質で濃度依存的線形シグナルを得た。
【図９】サンドイッチアッセイの感度：緩衝液中でＰＣＳＫ９濃度の検出限界を示すアプタマーのサンドイッチアッセイ（ｄＣ／ＰＰ−ｄＵアプタマー（一次）及びＮａｐ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵアプタマー（二次））の性能を示す。Ａは、アプタマーのサンドイッチアッセイで濃度依存的線形シグナルが観察され、定量下限は約８０ｐｇ／ｍＬ（ＬＬＯＱ）であったことを示す。Ｂは、アプタマーのサンドイッチアッセイで濃度依存的線形シグナルが観察され、定量上限は約１０ｎｇ／ｍＬ（ＵＬＯＱ）であったことを示す。
【図１０】ｄＣ／ＰＰ−ｄＵアプタマー（一次）及びＮａｐ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵアプタマー（二次）を使用したサンドイッチアッセイの希釈直線性を示す。
【図１１】単一塩基修飾一次アプタマー及び２塩基修飾二次アプタマー（ｄＣ／ＰＰ−ｄＵアプタマー（一次）及びＮａｐ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵアプタマー（二次））を含むサンドイッチアッセイである。
【図１２】野生型ＨｅｐＧ２細胞におけるＰＣＳＫ９の過剰発現を示す。
【図１３】プレートを用いるインビトロＰＣＳＫ９阻害アッセイ：アプタマーを用いたＰＣＳＫ９阻害の概略図である。
【図１４】単一塩基修飾アプタマーまたは２塩基修飾アプタマーの阻害についてのスクリーニングである。
【図１５】治療薬として可能性の高い種交差反応性２塩基修飾アプタマーである。Ａは、ヒトＰＣＳＫ９（塗りつぶした青の円）、ヒト機能獲得型変異体ＰＣＳＫ９  Ｄ３７４Ｙ（塗りつぶした赤の円）、アカゲザルＰＣＳＫ９（塗りつぶした緑の四角形）、ラットＰＣＳＫ９（塗りつぶしたピンクの六角形）、マウスＰＣＳＫ９（塗りつぶした逆三角形）及びスクランブルした対照アプタマー（中抜きの黒いひし形）に対する、２塩基修飾型（ＰＰ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵ）げっ歯類交差反応性３０ｍｅｒアプタマー（１１７３３−４４、配列番号４４）の親和性を示す。Ｂは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒとの相互作用への阻害を示す、治療薬として可能性の高い種交差反応性２塩基修飾アプタマーを示す。アプタマーは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒとの相互作用をＥＣ５０値２．１ｎＭ（青で塗りつぶした円）で、またＰＣＳＫ９  Ｄ３７４Ｙとの相互作用をＥＣ５０値３．６ｎＭ（赤で塗りつぶした三角形）で強力に阻害するが、スクランブル対照アプタマーは、野生型ＰＣＳＫ９（緑で塗りつぶした四角形）及び機能獲得型変異体ＰＣＳＫ９  Ｄ３７４Ｙ（中抜きの黒い四角形）の阻害を示さない。
【図１６】ＬＤＬ取り込み逆転アッセイの概略図を示す。
【図１７】種交差反応性ＰＰ−ｄＣ／Ｎａｐ−ＤＵアプタマーは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒとの相互作用を遮断することによりＬＤＬ−Ｒの分解を阻害し、ＨｅｐＧ２細胞表面のＬＤＬ−Ｒレベルを高めることを示す。活性ＳＯＭＡｍｅｒ（赤の円）によるＬＤＬ取り込み逆転のＥＣ５０値は１３．５ｎＭであり、これは、同一配列のスクランブル対照（青の三角形）では観察されなかった。
【図１８】９０％ヒト血清での単一修飾アプタマー及び二重修飾アプタマーの経時的安定性を示す。単一Ｃ−５修飾アプタマーまたは二重Ｃ−５修飾アプタマーの修飾パターンを図の凡例と共に提供する（例えば、Ｘ／Ｙにおいて、ＸはｄＣ（非修飾ヌクレオチド）、ＮａｐｄＣ（Ｎａｐ）、またはＰＰｄＣ（ＰＰ）を表し、ＹはｄＵまたはｄＴ（非修飾ヌクレオチド、ＴｙｒｄＵ（Ｔｙｒ）、ＮａｐｄＵ（Ｎａｐ）、ＰＰｄＵ（ＰＰ）またはＭＯＥｄＵ（ＭＯＥ）を表す）。
【図１９】さまざまな修飾ライブラリーを使用して作製された４０ｍｅｒ（３０Ｎ＋５＋５）アプタマーの、ＥｒｂＢ２（Ａ）、ＥｒｂＢ３（Ｂ）、及びＰＳＭＡ（Ｃ）に対する結合親和性を示す。結合曲線で、親和性≧１ｎＭのアプタマーは灰色の網掛けで強調表示されており、親和性３２０ｎＭに示されるアプタマーは３２ｎＭの最高濃度で検出可能な結合がなかったことを表す。ライブラリーの各々にある黒線は、そのライブラリー内の全アプタマーの中央値を指す。
【図２０】アプタマーに組み込まれ得る、特定の例示的な５位修飾型のウリジン及びシチジンである。
【図２１】ウリジンの５位で存在し得る特定の例示的な修飾を示す。Ｃ−５修飾の化学構造としては、ウリジンの５位への修飾を連結する例示的アミド結合が含まれる。図示の５位部分には、ベンジル部分（例えば、Ｂｎ、ＰＥ及びＰＰ）、ナフチル部分（例えば、Ｎａｐ、２Ｎａｐ、ＮＥ）、ブチル部分（例えば、ｉＢｕ）、フルオロベンジル部分（例えば、ＦＢｎ）、チロシル部分（例えば、Ｔｙｒ）、３，４−メチレンジオキシベンジル（例えば、ＭＢｎ）、モルホリノ部分（例えば、ＭＯＥ）、ベンゾフラニル部分（例えば、ＢＦ）、インドール部分（例えば、Ｔｒｐ）及びヒドロキシプロピル部分（例えば、Ｔｈｒ）が含まれる。
【図２２】シチジンの５位に存在し得る特定の例示的修飾を示す。Ｃ−５修飾の化学構造としては、シチジンの５位への修飾を連結する例示的アミド結合が含まれる。図示の５位部分には、ベンジル部分（例えば、Ｂｎ、ＰＥ及びＰＰ）、ナフチル部分（例えば、Ｎａｐ、２Ｎａｐ、ＮＥ、及び２ＮＥ）及びチロシル部分（例えば、Ｔｙｒ）が含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
特に断りのない限り、慣例用法に従った技術用語を使用する。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；及びＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出され得る。
【００３７】
別段の説明がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示の属する当該技術分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈で特に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれる。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡ及びＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに与えられるすべての塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさ、及びすべての分子量または分子質量の値は概数であり、説明用に提供されていることをさらに理解されるべきである。
【００３８】
さらに、本明細書に提供される範囲は、当該範囲内のすべての値が省略されているものと理解されるべきである。例えば、１〜５０という範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群のいかなる数字、数字の組み合わせ、または下位範囲（ならびにその分数、ただし、文脈で明確な指示がある場合を除く）も含まれるものと理解される。いかなる濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲、または整数範囲も、特に明記しない限り、記述範囲内のあらゆる整数値、及び必要に応じ、その分数値（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むものと理解されるべきである。また、ポリマーのサブユニット、大きさまたは厚さなど、任意の物理的特徴に関して本明細書で引用される任意の数字範囲には、特に明記しない限り、記述範囲内のあらゆる整数が含まれると理解されるべきである。本明細書で使用する場合、「約」または「で本質的に構成される」とは、特に明記しない限り、示されている範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用する場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は非限定的であり、これらは同義で使用される。
【００３９】
方法及び材料は、本明細書に記載するものと類似または同等のものを本開示の実践または試験で使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献はすべて参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合は、用語の説明も含め、本明細書が優先することとする。さらに、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定的ではないものとする。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはその修飾形態、ならびにその類似体を指す。ヌクレオチドには、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、及びその誘導体と類似体）及びピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン、及びその誘導体と類似体）を含む種が含まれる。本明細書で使用する場合、用語「シチジン」は総称的に使用され、特に具体的に明示しない限り、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾リボヌクレオチドを指す。用語「シチジン」には、２’−フルオロ、２’−メトキシ等などの２’−修飾シチジンが含まれる。同様に、用語「修飾シチジン」または特定の修飾シチジンは、特に具体的に明示しない限り、修飾シトシン塩基を含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾リボヌクレオチド（２’−フルオロ、２’−メトキシ等など）も指す。用語「ウリジン」は総称的に使用され、特に具体的に明示しない限り、ウラシル塩基を含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾リボヌクレオチドを指す。用語「ウリジン」には、２’−フルオロ、２’−メトキシ等などの２’−修飾ウリジンが含まれる。同様に、用語「修飾ウリジン」または特定の修飾ウリジンは、特に具体的に明示しない限り、修飾ウラシル塩基を含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾リボヌクレオチド（２’−フルオロ、２’−メトキシ等など）も指す。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「５位修飾シチジン」または「Ｃ−５修飾シチジン」は、シチジンのＣ−５位に修飾を有するシチジン、例えば、図２０に示すようなシチジンを指す。５位修飾シチジンの非限定的な例には、図２２に示されるようなものが含まれる。５位修飾シチジンの非限定的な例には、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＢｎｄＣ」と呼ばれ、図２１に示される）、５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＰＥｄＣ」と呼ばれ、図２１に示される）、５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＰＰｄＣ」と呼ばれ、図２１に示される）、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＮａｐｄＣ」と呼ばれ、図２１に示される）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「２ＮａｐｄＣ」と呼ばれ、図２１に示される）、５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＮＥｄＣ」と呼ばれ、図２１に示される）、５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「２ＮＥｄＣ」と呼ばれ、図２１に示される）、及び５−（Ｎ−チロシルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（ＴｙｒｄＣと呼ばれ、図２１に示される）が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、Ｃ５修飾シチジンは、例えば、その三リン酸形態にある場合、ポリメラーゼ（例えば、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ）によりオリゴヌクレオチドに取り込まれることができる。
【００４２】
本明細書に記載するＣ−５修飾シチジンの化学修飾は、２’位糖修飾（例えば、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ）、環外アミンでの修飾、及び４−チオシチジンの置換等を単独または任意の組み合わせで用いて組み合わせることもできる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「Ｃ−５修飾ウリジン」または「５位修飾ウリジン」は、ウリジンのＣ−５位に修飾を有するウリジン（典型的にデオキシウリジン）、例えば、図２０に示すようなウリジンを指す。いくつかの実施形態では、Ｃ５修飾ウリジンは、例えば、その三リン酸形態にある場合、ポリメラーゼ（例えば、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ）によりオリゴヌクレオチドに取り込まれることができる。５位修飾ウリジンの非限定的な例には、図２１に示されるようなものが含まれる。５位修飾ウリジンの非限定的な例には、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキサミド（ｉｍｉｄｉｚｏｌｙｌｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ））−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−トレオニニルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキサミド）−２’−デオキシウリジン塩化物、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキサミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）
が含まれる。
【００４４】
本明細書に記載するＣ−５修飾ウリジンの化学修飾は、２’位糖修飾（例えば、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ）、環外アミンでの修飾、及び４−チオウリジンの置換等を単独または任意の組み合わせで用いて組み合わせることもできる。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「修飾する」、「修飾された」、「修飾」という用語、及びその任意の変形は、オリゴヌクレオチドに関して使用する場合、そのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド構成塩基４つ（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、及びＣ）のうち少なくとも１つが、天然に生じるヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。さらなる修飾としては、イソ塩基のイソシチジンとイソグアニジンのようなまれな塩基対合の組み合わせ、骨格修飾、メチル化等が含まれ得る。修飾には、キャッピングのような３’及び５’の修飾も含まれ得る。他の修飾には、天然に生じるヌクレオチドの１つ以上を類似体で置換すること、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）、カルバマート等）を用いる修飾、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオアート等）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレン等）を用いる修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、及び修飾結合（例えば、アルファアノマー型核酸等）を用いる修飾などが含まれる。さらに、ヌクレオチドの糖に通常存在する任意のヒドロキシル基は、ホスホナート基またはリン酸基で置き換えること、標準的な保護基で保護すること、またはさらなるヌクレオチドもしくは固体支持体へのさらなる結合が作製されるよう活性化させることが可能である。５’末端及び３’末端のＯＨ基はリン酸化または置換が可能であり、置換には、アミン、炭素原子約１〜約２０個の有機キャッピング基部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー（一実施形態では約１０〜約８０ｋＤａの範囲、別の実施形態では約２０〜約６０ｋＤａの範囲）、または他の親水性または疎水性の生体高分子もしくは合成ポリマーを用いることができる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は互換的に使用されてヌクレオチドのポリマーを指し、これには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ならびにこれらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの修飾が含まれ、ここで、さまざまな分子成分または部分のヌクレオチド単位に対するいかなる位置での結合も含まれる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語には、二本鎖または一本鎖の分子ならびに三重らせん分子が含まれる。核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語よりも広義の用語であり、したがって、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語には、アプタマー、すなわちヌクレオチドのポリマーが含まれるが、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語はアプタマーに限られるわけではない。
【００４７】
ポリヌクレオチドは、一般に当該技術分野で公知のリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態を含有することもでき、これには、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−フルオロ、２’−ＮＨ２もしくは２’−アジド、炭素環状糖類似体、α−アノマー型糖、アラビノース、キシロースもしくはリキソースのようなエピマー型糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及びメチルリボシドのような脱塩基ヌクレオシド類似体が含まれる。本明細書に記載のように、１つ以上のホスホジエステル結合を代替的結合基で置き換えてよい。これらの代替的結合基には、リン酸基をＰ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、（Ｏ）ＮＲＸ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）ＲＸ、Ｐ（Ｏ）ＯＲＸ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置換する実施形態が含まれ、これにおいて、各ＲＸまたはＲＸ’は独立してＨ、または任意選択でエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルキルを含有する置換または非置換のアルキル（Ｃ１〜Ｃ２０）である。ポリヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。糖、プリン、及びピリミジンの類似形態で代用することは、代替的骨格構造、例えば、ポリアミド骨格のような構造が可能になるので、最終生成物を設計する際に有利になり得る。
【００４８】
ポリヌクレオチドは、炭素環状糖類似体、α−アノマー型糖、アラビノース、キシロースもしくはリキソースのようなエピマー型糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及びメチルリボシドのような脱塩基ヌクレオシド類似体の類似形態を含有することもできる。
【００４９】
ヌクレオチド構造への修飾は、存在する場合、ポリマーアセンブリの前でも後でも可能である。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分で中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分と結合させることにより、重合後にさらに修飾することができる。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「少なくとも１つのヌクレオチド」は、核酸の修飾に言及する場合、その核酸にある１つ、いくつか、またはすべてのヌクレオチドを指し、核酸にあるＡ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵのいずれかもしくは全部の任意またはすべての出現が修飾されても修飾されなくてもよいことを示す。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「核酸リガンド」、「アプタマー」、「ＳＯＭＡｍｅｒ」、及び「クローン」は同じ意味で使用され、標的分子に対し望ましい作用を及ぼす天然には生じない核酸を指す。望ましい作用には、標的の結合、触媒による標的の変化、標的または標的の機能活性を修飾もしくは改変するような標的との反応、標的への共有結合による結合（自殺阻害剤の場合）、及び標的と別の分子との間の反応促進が挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、作用は、標的分子に対する特異的結合親和性であり、そのような標的分子は、ワトソン・クリック型塩基対合または三重らせん形成とは独立した機構を介してアプタマーに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、ここで、前記アプタマーは、標的分子と結合するという既知の生理機能を有する核酸ではない。所与の標的に対するアプタマーには、候補核酸混合物から同定される核酸が含まれ、その場合、アプタマーは標的のリガンドであり、手段とする方法は、ａ）候補混合物と標的とを接触させること、ただし、候補混合物の他の核酸よりも標的に対する親和性の高い核酸は、残りの候補混合物から分配することができる、（ｂ）親和性の高い核酸を残りの候補混合物から分配すること、（ｃ）親和性の高い核酸を増幅させ、リガンドが濃縮された核酸混合物を得、それにより標的分子のアプタマーを同定することを含む。親和性相互作用は程度の問題であると認識されるが、ここでは、アプタマーのその標的に対する「特異的結合親和性」は、アプタマーがその標的に結合する際、混合物または試料中の他の非標的成分に結合する場合より親和性の程度が概してはるかに高いことを意味する。「アプタマー」、「ＳＯＭＡｍｅｒ、」または「核酸リガンド」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つの型または種のコピーセットである。アプタマーには、好適な任意の数のヌクレオチドが含まれ得る。「アプタマー（複数）」は、分子のそのようなセット２つ以上を指す。異なるアプタマーは、同数のヌクレオチドを有しても、異なる数のヌクレオチドを有してもよい。アプタマーはＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、一本鎖であっても二本鎖であっても、または二本鎖もしくは三重鎖の領域を含有してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するＳＥＬＥＸ工程、または当該技術分野で公知のＳＥＬＥＸ工程を使用してアプタマーを調製する。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「ＳＯＭＡｍｅｒ」すなわちＳｌｏｗ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｐｔａｍｅｒは、解離速度特性が改善されたアプタマーを指す。ＳＯＭＡｍｅｒは、”Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ”と題された米国特許第７，９４７，４４７号に記載の改良ＳＥＬＥＸ法を使用して作製可能である。
【００５３】
本明細書で使用する場合、異なる２種の５位修飾ピリミジンまたはＣ−５修飾ピリミジンを含むアプタマーは、「二重修飾アプタマー」、「２つの修飾塩基」を有するアプタマー、「２塩基修飾」または「修飾された２塩基」を有するアプタマー、「二重修飾塩基」を有するアプタマーと呼ばれてよく、そのいずれも同じ意味で使用され得る。アプタマーのライブラリーまたはアプタマーライブラリーもまた同一用語として使用される。したがって、いくつかの実施形態では、アプタマーは、２つの異なる５位修飾ピリミジンを含み、ここで、かかる２つの異なる５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＣとＮａｐｄＵ、ＮａｐｄＣとＰＰｄＵ、ＮａｐｄＣとＭＯＥｄＵ、ＮａｐｄＣとＴｙｒｄＵ、ＮａｐｄＣとＴｈｒｄＵ、ＰＰｄＣとＰＰｄＵ、ＰＰｄＣとＮａｐｄＵ、ＰＰｄＣとＭＯＥｄＵ、ＰＰｄＣとＴｙｒｄＵ、ＰＰｄＣとＴｈｒｄＵ、ＮａｐｄＣと２ＮａｐｄＵ、ＮａｐｄＣとＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＣとＮａｐｄＵ、及び２ＮａｐｄＣと２ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＣとＰＰｄＵ、２ＮａｐｄＣとＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＣとＴｙｒｄＵ、ＰＰｄＣと２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＣとＴｒｐｄＵ、ＰＰｄＣとＴｙｒｄＵ、ＴｙｒｄＣとＴｙｒｄＵ、ＴｒｙｄＣと２ＮａｐｄＵ、ＴｙｒｄＣとＰＰｄＵ、ＴｙｒｄＣとＴｒｐｄＵ、ＴｙｒｄＣとＴｙｒｄＵ、及びＴｙｒｄＣとＴｙｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、少なくとも１つの修飾ウリジン及び／またはチミジンならびに少なくとも１つの修飾シチジンを含み、ここで、かかる少なくとも１つの修飾ウリジン及び／またはチミジンは５位において、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される部分で修飾され、少なくとも１つの修飾シチジンは５位において、ナフチル部分、チロシル部分、及びベンジル部分から選択される部分で修飾される。ある実施形態では、部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバマートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される群に含まれるリンカーを介して塩基の５位に共有結合で連結されている。
【００５４】
本明細書で使用する場合、１種の５位修飾ピリミジンまたはＣ−５修飾ピリミジンを含むアプタマーは、「単一修飾アプタマー」、「単一修飾塩基」を有するアプタマー、「単一塩基修飾」または「修飾された単一塩基」を有するアプタマーと呼ばれてよく、そのいずれも同じ意味で使用され得る。アプタマーのライブラリーまたはアプタマーライブラリーもまた同一用語として使用される。本明細書で使用する場合、「タンパク質」は、「ペプチド」、「ポリペプチド、」または「ペプチド断片」と同義で使用される。「精製された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはペプチド断片は、細胞材料、または細胞、組織、もしくはアミノ酸配列を取得する細胞不含材料に由来する他の混入タンパク質を実質的に含まない、または化学合成した場合に化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
【００５５】
ある実施形態では、アプタマーは、第１の５位修飾ピリミジン及び第２の５位修飾ピリミジンを含み、ここで、かかる第１の５位修飾ピリミジンは、第１の５位修飾ピリミジンの５位にチロシル部分を含み、第２の５位修飾ピリミジンは、第２の５位修飾ピリミジンの５位にナフチル部分またはベンジル部分を含む。関連実施形態では、第１の５位修飾ピリミジンはウラシルである。関連実施形態では、第２の５位修飾ピリミジンはシトシンである。関連実施形態では、アプタマーのウラシルの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は５位で修飾されている。関連実施形態では、アプタマーのシトシンの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は５位で修飾されている。
【００５６】
修飾ヌクレオチド
ある実施形態では、本開示は、異なる２種の塩基修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、例えば、アプタマーを提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、異なる２種の５位修飾ピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣ５修飾シチジン及び少なくとも１つのＣ５修飾ウリジンを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２つの異なるＣ５修飾シチジンを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２つの異なるＣ５修飾ウリジンを含む。Ｃ５修飾されたウリジン及びシチジンの非限定的な例は、例えば、下記式Ｉ及び図２０に示されている。Ｃ５修飾ウリジンの非限定的な特定の例は図２１に示され、Ｃ５修飾シチジンの非限定的な特定の例は図２２に示されている。
【００５７】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式Ｉ
【化１】
2019527043.tif 000002
［式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であり、ここで、ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数であり、
ＲＸ１は独立して
【化２】
2019527043.tif 000003
からなる群から選択され、ここで、
【化３】
2019527043.tif 000004
は、−（ＣＨ２）ｎ−基に対するＲＸ１基の結合点を表し、
ここで、
ＲＸ４は独立して、分岐または直鎖の低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ２０）、ヒドロキシル基、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ニトリル（ＣＮ）、ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）、第一級アミド（ＣＯＮＨ２）、第二級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）、第三級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）、スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）、Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）からなる群から選択され、
ＲＸ２及びＲＸ３は、出現ごとに独立して、分岐または直鎖の低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ２０）、フェニル（Ｃ６Ｈ５）、ＲＸ４が上記定義によるＲＸ４置換フェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、ＲＸ５が分岐または直鎖の低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ２０）であるカルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）、ならびに、ＲＸ２とＲＸ３が互いに結合して置換または非置換の５員環もしくは６員環を形成するシクロアルキルからなる群から選択され、
Ｘは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドからなる群から選択され、
Ｒ’は独立して、−Ｈ、−ＯＡｃ、−ＯＢｚ、−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、及び−ＯＳｉＭｅ２ｔＢｕからなる群から選択され、
Ｒ’’は独立して、水素、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及び三リン酸（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）またはその塩からなる群から選択され、
Ｚは独立して、−Ｈ、置換または非置換Ｃの（１〜４）アルキルからなる群から選択される］
のピリミジンを少なくとも１つ、及びその塩を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、図２１に示される少なくとも１つの修飾ピリミジンを含み、ここで、各Ｘは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドから選択される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、図２２に示される少なくとも１つの修飾ピリミジンを含み、ここで、各Ｘは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドから選択される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、図２１に示される少なくとも１つの修飾ピリミジン、及び図２２に示される少なくとも１つの修飾ピリミジンを含み、ここで、各Ｘは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドから選択される。修飾ピリミジンの対の非限定的な特定の例は、本明細書に記載の実施例に示される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、図２０に示される少なくとも１つの修飾ピリミジンを含み、ここで、かかるリボースの２’位は独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドから選択される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、図２０に示される少なくとも２修飾ピリミジンを含み、ここで、かかるリボースの２’位は独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドから選択される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、図２０に示される少なくとも１つの修飾ピリミジン、及び図２１または図２２に示される少なくとも１つの修飾ピリミジンを含み、ここで、かかるリボースの２’位は独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドから選択される。修飾ピリミジンの対の非限定的な特定の例は、本明細書に記載の実施例に示される。
【００６３】
本明細書に記載する実施形態のいずれにおいても、オリゴヌクレオチドはアプタマーであってよい。そのようないくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的ポリペプチドと特異的に結合するアプタマーである。
【００６４】
オリゴヌクレオチドの調製
オリゴデオキシヌクレオシドの自動合成は多くの研究機関で日常的に実施されている（例えば、その記載内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，（１９９０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５−３１９１を参照のこと）。オリゴリボヌクレオシドの合成も周知である（例えば、その記載内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５４３３−５４４１を参照のこと）。本明細書に記載のように、ホスホルアミダイトは、化学合成によりオリゴヌクレオチドに修飾ヌクレオシドを組み込むのに有用であり、三リン酸は、酵素合成によりオリゴヌクレオチドに修飾ヌクレオシドを組み込むのに有用である。（例えば、Ｖａｕｇｈｔ，Ｊ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２６：１１２３１−１１２３７；Ｖａｕｇｈｔ，Ｊ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２，４１４１−４１５１；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”（１９８４）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（２００５）（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【００６５】
ＳＥＬＥＸ法
「ＳＥＬＥＸ」及び「ＳＥＬＥＸ工程」という用語は本明細書では同じ意味で使用され、一般に、（１）望ましい様態で標的分子と相互作用する、例えば、タンパク質に高い親和性で結合する核酸の選択と、（２）それらの選択された核酸の増幅との組み合わせを指す。ＳＥＬＥＸ工程を使用して、特定の標的分子またはバイオマーカーに対する親和性の高いアプタマーを同定することができる。
【００６６】
ＳＥＬＥＸには一般に、候補核酸混合物を調製すること、候補混合物と所望の標的分子とを結合させて親和性複合体を形成させること、未結合の候補核酸と親和性複合体とを分離すること、親和性複合体から核酸を分離して単離すること、核酸を精製すること、及び特定のアプタマー配列を同定することが含まれる。工程には、選択アプタマーの親和性をさらに精密化するため複数ラウンドが含まれ得る。工程には、その工程の１つ以上のポイントにおける増幅ステップが含まれ得る。例えば、”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題された米国特許第５，４７５，０９６号を参照のこと。ＳＥＬＥＸ工程を使用して、その標的と共有結合で結合するアプタマー、ならびにその標的と非共有結合で結合するアプタマーを作製することができる。例えば、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ”と題された米国特許第５，７０５，３３７号を参照のこと。
【００６７】
ＳＥＬＥＸ工程を使用して、例えば、改善された生体内安定性または改善された送達特性など、改善された特徴をアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含有する高親和性アプタマーを同定することができる。そのような修飾の例には、リボース及び／またはリン酸及び／または塩基の位置での化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸ工程で同定された、修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーは、“Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題された米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、これには、ピリミジンの５’位及び２’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。米国特許第５，５８０，７３７号（上記参照）には、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的なアプタマーが記載されている。物理的特性及び化学的特性が拡張された核酸ライブラリー、ならびにＳＥＬＥＸ及びｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸにおけるそれらの使用が記載された“ＳＥＬＥＸ  ａｎｄ  ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ”と題された米国特許出願公開第２００９００９８５４９号も参照のこと。
【００６８】
ＳＥＬＥＸを使用して、望ましい解離速度特性を有するアプタマーを同定することもできる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、標的分子に結合できるアプタマーを作製する改良ＳＥＬＥＸ法が記載されている“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ”と題された米国特許第７，９４７，４４７号を参照のこと。各自の標的分子からの解離速度の遅いアプタマー及びフォトアプタマーを作製する方法を記載する。方法は、候補混合物と標的分子とを接触させ、核酸−標的複合体を生じさせ、解離速度の遅い濃縮工程を実施し、ここで、解離速度が速い核酸−標的複合体は解離して再形成されることはないが、解離速度が遅い複合体は完全な状態のままである。さらに、方法には、解離速度性能が改善されたアプタマーを作製するための候補核酸混合物の作製において修飾ヌクレオチドを使用することが含まれる（“ＳＥＬＥＸ  ａｎｄ  ＰｈｏｔｏＳＥＬＥＸ”と題された米国特許第８，４０９，７９５号を参照のこと）。（米国特許第７，８５５，０５４号及び米国特許公開第２００７０１６６７４０号も参照のこと）。これらの出願各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６９】
本明細書では「標的」または「標的分子」または「標的」は、望ましい様態で核酸により作用を及ぼされ得る任意の化合物を指す。標的分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害物質、薬物、色素、栄養素、成長因子、細胞、組織、上述のいずれかの任意の部分または断片などであり得るが、これに限定されない。事実上あらゆる化学的または生物学的エフェクターが好適な標的であり得る。どの大きさの分子でも標的とすることができる。また、標的を特定の方法で修飾して、標的と核酸の間の相互作用の確率または強さを高めることができる。標的には、特定の化合物または分子のあらゆるわずかな変形、例えば、タンパク質の場合は、例えば、アミノ酸配列、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合のような他の任意の操作もしくは修飾でのわずかな変形も含めることができ、分子の同一性は実質的に改変されることがない。「標的分子」または「標的」は、アプタマーに対する結合能がある分子または多分子構造の１つの型または種のコピーのセットである。「標的分子」または「標的」は、２つ以上のそのようなセットの分子を指す。標的がペプチドであるＳＥＬＥＸ工程の実施形態は、“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＳＥＬＥＸ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ”と題された米国特許第６，３７６，１９０号に記載されている。いくつかの実施形態では、標的はタンパク質である。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「競合分子」及び「競合物質」は同じ意味で使用され、非標的分子と非特異的複合体を形成することができるあらゆる分子を指す。これに関して、非標的分子には遊離のアプタマーが含まれ、その場合、例えば、競合物質を使用して、別の非標的分子に対するアプタマーの非特異的な結合（再結合）を阻害することができる。「競合分子」または「競合物質」は分子の１つの型または種のコピーのセットである。「競合分子（複数）」または「競合物質（複数）」は、２つ以上のそのようなセットの分子を指す。競合分子には、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン（例えば、ヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、硫酸デキストラン、ポリデキストラン、脱塩基ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、及びピロホスファート）が挙げられるが、これに限定されるものではない。さまざまな実施形態では、１つ以上の競合物質の組み合わせを使用することができる。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「非特異的複合体」は、アプタマーとその標的分子の会合以外の２つ以上の分子間の非共有結合による会合を指す。非特異的複合体は、分子分類群間の相互作用を表す。非特異的複合体には、形成された複合体、アプタマーと非標的分子、競合物質と非標的分子、競合物質と標的分子、及び標的分子と非標的分子が含まれる。
【００７２】
本明細書で使用する場合、用語「解離速度が遅い濃縮工程」は、解離速度が速く望ましくないアプタマー親和性複合体の濃度に対し、解離速度が遅いアプタマー親和性複合体の相対濃度が高くなるよう、候補混合物の特定の成分の相対濃度を改変する工程を指す。一実施形態では、解離速度が遅い濃縮工程は溶液を用いる解離速度が遅い濃縮工程である。この実施形態では、溶液を用いる解離速度が遅い濃縮工程を溶液中で行い、混合物中でアプタマー親和性複合体を形成する標的も核酸も、解離速度が遅い濃縮工程の間に固体支持体上に固定化されないようにする。さまざまな実施形態では、解離速度が遅い濃縮工程には、競合分子を添加し、それらとインキュベーションするステップ、混合物を希釈するステップ、またはこれらの組み合わせ（例えば、競合分子存在下での混合物の希釈）など、１つ以上のステップが含まれ得る。解離速度が遅い濃縮工程の効果は一般に、異なるアプタマー親和性複合体（すなわち、候補混合物中の標的分子と各種核酸との間で形成される各種アプタマー親和性複合体）の間の解離速度の相違に依存するため、解離速度が遅い濃縮工程の持続時間は、解離速度が遅いアプタマー親和性複合体が高い割合で保持され、解離速度が速いアプタマー親和性複合体の数が実質的に減少するように選択する。解離速度が遅い濃縮工程は、ＳＥＬＥＸ工程中の１つ以上のサイクルで使用され得る。希釈と競合物質の添加とを併用する場合、それらを同時に実施しても、または任意の順序で順次実施してもよい。混合物中の総標的（タンパク質）濃度が低い場合、解離速度が遅い濃縮工程を使用することができる。一実施形態では、解離速度が遅い濃縮工程に希釈が含まれる場合、混合物を実用的な量に希釈することができるが、その際、核酸を保持するアプタマーは、ＳＥＬＥＸ工程のその後のラウンド用に回収されることに留意する。一実施形態では、解離速度が遅い濃縮工程には、競合物質の使用ならびに希釈が含まれ、競合物質を使用しない場合に必要となり得る量より少ない量で混合物の希釈が可能となる。
【００７３】
一実施形態では、解離速度が遅い濃縮工程には、競合物質の添加が含まれ、競合物質はポリアニオン（例えば、ヘパリンまたは硫酸デキストラン（デキストラン））である。ヘパリンまたはデキストランは、従来のＳＥＬＥＸ選択法で特定のアプタマーの同定に使用されてきた。しかしながら、そのような方法では、ヘパリンまたはデキストランは、標的とアプタマーとが結合して複合体を形成する平衡ステップの「最中に」存在する。そのような方法では、ヘパリンまたはデキストランの濃度上昇に伴い、低親和性標的／アプタマー複合体に対する高親和性標的／アプタマー複合体の比は増加する。しかしながら、ヘパリンまたはデキストランの濃度が高いことにより、核酸と競合物質間で標的結合を競合するため、平衡時の高親和性標的／アプタマー複合体の数は減少し得る。対照的に、本願に記載の方法では、標的／アプタマー複合体が形成された「後で」競合物質を添加するため、形成される複合体数に影響することはない。標的とアプタマー間の平衡結合が生じた後に競合物質を添加することにより、非平衡状態が生じ、これが、時間と共に展開して標的／アプタマー複合体の少ない新たな平衡状態になる。新たな平衡に達する前に標的／アプタマー複合体を捕捉すると、解離速度が速い複合体は最初に解離するので、試料は解離速度が遅いアプタマーで濃縮されている。
【００７４】
別の実施形態では、解離速度が遅い濃縮工程でポリアニオン性競合物質（例えば、硫酸デキストランまたは別のポリアニオン性物質）を使用し、ポリアニオンの存在に不応なアプタマーを容易に同定できるようにする。これに関して、「ポリアニオン不応性アプタマー」は、非ポリアニオンに不応性のアプタマーを含むアプタマー／標的複合体よりも、ポリアニオン不応性物質も含有する溶液中での解離の可能性が低いアプタマー／標的複合体を形成することができるアプタマーである。この様態では、ポリアニオン不応性アプタマーを分析法実施の際に使用して、試料中の標的の存在または量または濃度を検出することができ、その場合、検出方法には、アプタマーが反応しないポリアニオン性物質（例えば、硫酸デキストラン）の使用が含まれる。
【００７５】
したがって、一実施形態では、ポリアニオン不応性アプタマーを作製する方法を提供する。この実施形態では、候補核酸混合物と標的との接触後である。候補混合物中の標的と核酸を平衡状態にさせる。ポリアニオン性競合物質を導入し、候補混合物中の解離速度の速いアプタマーが標的分子から確実に解離するのに十分な時間、溶液中でインキュベートする。また、ポリアニオン性競合物質の存在下で解離し得る、候補混合物中のアプタマーは、標的分子から遊離することになる。混合物を分配して、標的分子と会合したままの、高親和性の解離速度が遅いアプタマーを単離し、複合体を形成していないあらゆる物質を溶液から除去する。その後、アプタマーを標的分子から遊離させて単離することができる。単離されたアプタマーを増幅させ、さらなるラウンドの選択を適用して選択アプタマーの全体の性能を高めることもできる。特定の用途で、解離速度が遅いアプタマーの選択が不要の場合は、インキュベーション時間を最小にしてこの工程を使用してもよい。
【００７６】
したがって、一実施形態では、解離速度が遅い（長い）アプタマーを同定または作製する変形ＳＥＬＥＸ工程を提供し、ここで、標的分子と候補混合物を接触させ、候補混合物に含有された標的分子と核酸の間の平衡結合が生じるのに十分な時間、共にインキュベートする。平衡結合の後、過剰の競合分子、例えば、ポリアニオン競合物質を混合物に加え、その混合物を過剰の競合分子と共に所定の時間インキュベートする。解離速度がこの所定のインキュベーション時間よりも短い有意な割合のアプタマーは、所定のインキュベーション時間の間に標的から解離することになる。これらの解離速度が「速い」アプタマーと標的との再会合は、標的と非特異的に結合して標的結合部位を占有できる競合分子が過剰にあるため最小限となる。解離速度がそれより長い有意な割合のアプタマーは、所定のインキュベーション時間の間、標的に結合したままであろう。インキュベーション時間終了時、核酸−標的複合体と混合物の残部とを分配することにより、解離速度が遅いアプタマー集団と解離速度が速いアプタマー集団を分離することができる。解離ステップを使用して、解離速度が遅いアプタマーをそれらの標的から解離させることができ、これにより、標的分子に対する親和性と特異性が高い、解離速度の遅いアプタマー（解離速度が遅いアプタマーの個々のアプタマーまたは解離速度が遅いアプタマー群）の単離、同定、シークエンシング、合成及び増幅が可能になる。従来のＳＥＬＥＸの場合同様、変形ＳＥＬＥＸ工程の１ラウンドで同定されたアプタマー配列を新たな候補混合物の合成に使用することができるため、接触、平衡結合、競合分子の添加、競合分子とのインキュベーション、及び解離速度が遅いアプタマーの分配というステップを所望の回数繰り返す（ｉｔｅｒａｔｅｄ）／繰り返す（ｒｅｐｅａｔ）ことができる。
【００７７】
競合物質の添加に先立つ候補混合物と標的との平衡結合、続く過剰競合物質の添加、及び競合物質との所定の時間のインキュベーションを組み合わせることにより、先に達成した解離速度をはるかに上回る解離速度のアプタマー集団の選択が可能になる。
【００７８】
平衡結合を達成するため、候補混合物を標的と共に少なくとも約５分、または少なくとも約１５分、約３０分、約４５分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間または約６時間インキュベートしてよい。
【００７９】
候補混合物と標的分子の混合物を用いた競合分子の所定のインキュベーション時間は、標的の性質及び標的に対する既知のアプタマーの既知の解離速度（分かっている場合）などの因子を考慮して、所望の時間を選択してよい。所定のインキュベーション時間は、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも４５約分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間から選ばれてよい。
【００８０】
他の実施形態では、希釈を解離速度改善工程として使用するが、希釈した候補混合物、標的分子／アプタマー複合体のインキュベーションを所定の時間実施してよく、その時間は、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間から選ばれてよい。
【００８１】
本開示の実施形態は、解離速度が遅いアプタマーの同定、作製、合成及び使用に関する。これらは、非共有結合のアプタマー−標的複合体からの解離速度（ｔ１／２）が、従来のＳＥＬＥＸで通常得られるアプタマーの解離速度よりも高いアプタマーである。非共有結合のアプタマー複合体及び標的を含有する混合物の場合、ｔ１／２は、アプタマー−標的複合体からアプタマーの半分が解離するのに要した時間を表す。本開示による解離速度の遅いアプタマーのｔ１／２は、約３０分以上、約３０分〜約２４０分、約３０分〜約６０分、約６０分〜約９０分、約９０分〜約１２０分、約１２０分〜約１５０分、約１５０分〜約１８０分、約１８０分〜約２１０分、約２１０分〜約２４０分のうち１つから選ばれる。
【００８２】
ＳＥＬＥＸ法により同定されるアプタマーを特徴付ける特性は、その標的に対するその高い親和性である。アプタマーは、その標的に対し約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約１００ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約１ｐＭ未満のうち１つから選ばれる解離定数（ｋｄ）を有するであろう。
【００８３】
オリゴヌクレオチドのライブラリー
いくつかの実施形態では、ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドのライブラリーを提供する。そのようなライブラリーは、いくつかの実施形態では、ＳＥＬＥＸ実施に有用であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのライブラリーの各オリゴヌクレオチドは、多数のランダム化された位置、例えば、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０、または２０〜１００、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、もしくは３０〜４０のランダム化された位置を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのライブラリーの各オリゴヌクレオチドは、ランダム化された位置に隣接する固定配列を含む。そのような隣接固定配列は、互いに同一であっても異なっていてもよく（すなわち、５’隣接配列と３’隣接配列は同一であっても異なっていてもよい）、また、いくつかの実施形態では、ライブラリーのすべてのメンバーは同一であってよい（すなわち、ライブラリーのすべてのメンバーが同一の５’隣接配列を有し得る、及び／またはライブラリーのすべてのメンバーが同一の３’隣接配列を有し得る）。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ランダム化された位置を４つ以上の異なるヌクレオチド塩基で構成し、その１つ以上を修飾してよい。いくつかの実施形態では、１種類のヌクレオチド塩基をすべて修飾するかまたは修飾しない（例えば、ランダム化された領域にあるシチジンをすべて修飾するか、またはどのシチジンも修飾しない）。いくつかの実施形態では、ランダム化された領域にある１種類のヌクレオチド塩基は、修飾形態及び非修飾形態のいずれでも存在する。そのようないくつかの実施形態では、ランダム化された位置を２つの修飾ヌクレオチド塩基及び２つの非修飾ヌクレオチド塩基で構成する。そのようないくつかの実施形態では、ランダム化された位置を、アデニン、グアニン、Ｃ５修飾シチジン、及びＣ５修飾ウリジンで構成する。Ｃ５修飾シチジン及びＣ５修飾ウリジンの非限定的な例を図１９〜２１に示す。オリゴヌクレオチドのライブラリー及びそれらの作製方法は、例えば、本明細書の実施例に詳述される。
【００８５】
例示的アプタマー
いくつかの実施形態では、標的分子と結合するアプタマーを提供する。いくつかの実施形態では、標的分子は標的タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９と結合するアプタマーを提供する。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９と結合するアプタマーは、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒへの結合を阻害する。そのようないくつかの実施形態では、アプタマーは配列５’−ｙＧｐｐｐＧ−３’を含み、ここで、各ｙはＴｙｒｄＵであり、各ｐはＮａｐｄＣである。いくつかの実施形態では、アプタマーは配列５’−ｙＥＡｙＧＡｎｐＡｐ−３’をさらに含み、ここで、Ｅはｙ、Ａ、及びＧから選択され、ｎは０または１である。いくつかの実施形態では、ｎは０である。いくつかの実施形態では、配列５’−ｙＥＡｙＧＡｎｐＡｐ−３’は、配列５’−ｙＧｐｐｐＧ−３’の５’に位置する。いくつかの実施形態では、Ｅはｙである。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９と結合するアプタマーを提供し、ここで、かかるアプタマーは配列５’−ＦｎｐｐｐＡＡＧＲＪｒｐＲｐｐＷｍ−３’（配列番号８１）を含み、ここで、Ｆはｒ及びＧから選択され、各Ｒは独立してＧ及びＡから選択され、Ｊはｒ及びＡから選択され、Ｗはｒ、Ｇ、及びＡから選択され、ｎは０または１であり、ｍは０または１であり、ｒはＰｐｄＣであり、ｐはＮａｐｄＵである。いくつかの実施形態では、ｍは１である。いくつかの実施形態では、Ｆはｒである。いくつかの実施形態では、Ｊはｒである。いくつかの実施形態では、ＷはＧである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９と結合するアプタマーを提供し、ここで、かかるアプタマーは配列５’−ＴＴｐｐＧＧｐｐ−３’を含み、ここで、各ｐはＮａｐｄＣである。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９と結合するアプタマーは長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜８０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または４０〜１００、または４０〜９０、または４０〜８０、または４０〜７０、または４０〜６０、または４０〜５０のヌクレオチド長である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、アプタマーはＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒへの結合を阻害する。いくつかの実施形態では、アプタマーはＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒへの結合を阻害し、ＩＣ５０が３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、または１５ｎＭ未満である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、対象のコレステロールを低下させる方法であり、それを必要とする対象にＰＣＳＫ９と結合するアプタマーを投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９と結合するアプタマーは、本明細書で提供するアプタマーである。いくつかの実施形態では、コレステロールは低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）である。いくつかの実施形態では、対象は、ヘテロ接合型家族性高コレステロール血症または臨床的動脈硬化性心血管疾患（ＣＶＤ）を有する。
【００９１】
塩
化合物の対応する塩、例えば、薬理学的に許容される塩の調製、精製、及び／または取り扱いが好都合または望ましい場合がある。薬理学的に許容される塩の例は、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  Ｓａｌｔｓ”Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９で考察されている。
【００９２】
例えば、化合物がアニオン性である、またはアニオン性（例えば、−ＣＯＯＨは、−ＣＯＯ−であってよい）であり得る官能基を有する場合は、好適なカチオンで塩を形成してよい。好適な無機カチオンの例には、Ｎａ＋及びＫ＋などのアルカリ金属イオン、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋などのアルカリ土類のカチオン、ならびにＡｌ＋３などの他のカチオンが挙げられるが、これに限定されるものではない。好適な有機カチオンの例には、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４＋）及び置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３ＲＸ＋、ＮＨ２ＲＸ２＋、ＮＨＲＸ３＋、ＮＲＸ４＋）が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの好適な置換アンモニウムイオンの例は、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミン、ならびにリシン及びアルギニンなどのアミノ酸に由来するものである。一般的な第四級アンモニウムイオンの一例はＮ（ＣＨ３）４＋である。
【００９３】
化合物がカチオンである、またはカチオン（例えば、−ＮＨ２が−ＮＨ３＋であり得る）であり得る官能基を有する場合は、好適なアニオンで塩を形成してよい。好適な無機アニオンの例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、及び亜リン酸といった無機酸に由来するものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９４】
好適な有機アニオンの例には、２−アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、ケイ皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、粘液酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、及び吉草酸といった有機酸に由来するものが挙げられるが、これに限定されるものではない。好適な高分子有機アニオンの例には、タンニン酸、カルボキシメチルセルロースといった高分子酸に由来するものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９５】
特に明記しない限り、特定の化合物への言及にはその塩形態も含まれる。
【００９６】
特定の非限定的な実施形態例
実施形態１．少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含むアプタマーであって、前記第１の５位修飾ピリミジンと前記第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンである、前記アプタマー。
【００９７】
実施形態２．前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンである、実施形態１に記載のアプタマー。
【００９８】
実施形態３．前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンである、実施形態１に記載のアプタマー。
【００９９】
実施形態４．前記５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、実施形態２または実施形態３に記載のアプタマー。
【０１００】
実施形態５．前記５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、実施形態２〜４のいずれか１形態に記載のアプタマー。
【０１０１】
実施形態６．前記５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される、実施形態２〜５のいずれか１形態に記載のアプタマー。
【０１０２】
実施形態７．前記５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態２〜６のいずれか１形態に記載のアプタマー。
【０１０３】
実施形態８．前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態１に記載のアプタマー。
【０１０４】
実施形態９．前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態１に記載のアプタマー。
【０１０５】
実施形態１０．前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンはＴｙｒｄＵである、実施形態８または実施形態９に記載のアプタマー。
【０１０６】
実施形態１１．前記アプタマーは、ＰＣＳＫ９、ＰＳＭＡ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＦＸＮ、ＫＤＭ２Ａ、ＩＧＦ１Ｒ、ｐＩＧＦ１Ｒ、ａ１−アンチトリプシン、ＣＤ９９、ＭＭＰ２８及びＰＰＩＢから選択される標的タンパク質と結合する、実施形態１〜１０のいずれか１形態に記載のアプタマー。
【０１０７】
実施形態１２．前記アプタマーは、前記アプタマーの５’末端に、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長の領域を含み、ここで、前記アプタマーの前記５’末端領域は５位修飾ピリミジンを欠く、実施形態１〜１１のいずれか１形態に記載のアプタマー。
【０１０８】
実施形態１３．前記アプタマーは、前記アプタマーの３’末端に、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長の領域を含み、ここで、前記アプタマーの前記３’末端領域は５位修飾ピリミジンを欠く、実施形態１〜１２のいずれか１形態に記載のアプタマー。
【０１０９】
実施形態１４．前記アプタマーは、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜８０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または４０〜１００、または４０〜９０、または４０〜８０、または４０〜７０、または４０〜６０、または４０〜５０のヌクレオチド長である、実施形態１〜１３のいずれか１形態に記載のアプタマー。
【０１１０】
実施形態１５．複数のポリヌクレオチドを含む組成物であって、各ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、前記第１の５位修飾ピリミジンと前記第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンである、前記組成物。
【０１１１】
実施形態１６．各ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの５’末端に固定領域を含む、実施形態１５に記載の組成物。
【０１１２】
実施形態１７．各ポリヌクレオチドの前記５’末端固定領域は、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長である、実施形態１６に記載の組成物。
【０１１３】
実施形態１８．各ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの３’末端に固定領域を含む、実施形態１５〜１７のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１１４】
実施形態１９．前記ポリヌクレオチドの前記３’末端固定領域は、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長である、実施形態１８に記載の組成物。
【０１１５】
実施形態２０．前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンである、実施形態１５〜１９のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１１６】
実施形態２１．前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンである、実施形態１５〜１９のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１１７】
実施形態２２．前記５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、実施形態２０または実施形態２１に記載の組成物。
【０１１８】
実施形態２３．前記５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、実施形態２０〜２２のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１１９】
実施形態２４．前記５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される、実施形態２０〜２３のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１２０】
実施形態２５．前記５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態２０〜２４のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１２１】
実施形態２６．前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態１５に記載の組成物。
【０１２２】
実施形態２７．前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｒｙｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態１５に記載の組成物。
【０１２３】
実施形態２８．前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンはＴｙｒｄＵである、実施形態２６または実施形態２７に記載の組成物。
【０１２４】
実施形態２９．各ポリヌクレオチドはランダム領域を含む、実施形態１５〜２８のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１２５】
実施形態３０．前記ランダム領域は、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または３０〜４０のヌクレオチド長である、実施形態２９に記載の組成物。
【０１２６】
実施形態３１．各ポリヌクレオチドは、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜８０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または４０〜１００、または４０〜９０、または４０〜８０、または４０〜７０、または４０〜６０、または４０〜５０のヌクレオチド長である、実施形態１５〜２９のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１２７】
実施形態３２．第１のアプタマー、第２のアプタマー、及び標的を含む組成物であって、
前記第１のアプタマーは、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、
前記第２のアプタマーは、少なくとも１つの第３の５位修飾ピリミジンを含み、
前記第１のアプタマー、第２のアプタマー及び前記標的は、三量体複合体を形成することができ、
前記第１の５位修飾ピリミジンと前記第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンである、前記組成物。
【０１２８】
実施形態３３．前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンである、実施形態３２に記載の組成物。
【０１２９】
実施形態３４．前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンである、実施形態３２に記載の組成物。
【０１３０】
実施形態３５．前記５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、実施形態３３または実施形態３４に記載の組成物。
【０１３１】
実施形態３６．前記５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、実施形態３３〜３５のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１３２】
実施形態３７．前記５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される、実施形態３３〜３６のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１３３】
実施形態３８．前記５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態３３〜３７のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１３４】
実施形態３９．前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態３２に記載の組成物。
【０１３５】
実施形態４０．前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態３２に記載の組成物。
【０１３６】
実施形態４１．前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンはＴｙｒｄＵである、実施形態３９または実施形態４０に記載の組成物。
【０１３７】
実施形態４２．前記第３の５位修飾ピリミジンは、５位修飾シチジン及び５位修飾ピリミジンから選択される、実施形態３２〜４１のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１３８】
実施形態４３．前記第３の５位修飾ピリミジンは、ＢｎｄＣ、ＰＥｄＣ、ＰＰｄＣ、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＮＥｄＣ、２ＮＥｄＣ、ＴｙｒｄＣ、ＢｎｄＵ、ＮａｐｄＵ、ＰＥｄＵ、ＩｂｄＵ、ＦＢｎｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＮＥｄＵ、ＭＢｎｄＵ、ＢＦｄＵ、ＢＴｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態４２に記載の組成物。
【０１３９】
実施形態４４．前記標的は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、低分子、細胞及び組織から選択される、実施形態３２〜４３のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１４０】
実施形態４５．（ａ）標的分子に結合することができるアプタマーと試料とを接触させること、
（ｂ）前記アプタマーを前記試料と共にインキュベートしてアプタマー−標的複合体を形成させること、
（ｃ）前記試料中の前記アプタマー−標的複合体を濃縮すること、及び
（ｃ）前記アプタマー、アプタマー−標的複合体または標的分子の存在について検出し、
前記アプタマー、アプタマー−標的複合体または標的分子の検出は、前記試料中に前記標的分子が存在することを指し、前記アプタマー、アプタマー−標的複合体または標的分子の検出がないことは、前記試料中に前記標的分子が存在しないことを指すことを含む方法であって、
前記アプタマーは実施形態１〜１４のいずれか１形態に記載のアプタマーである、前記方法。
【０１４１】
実施形態４６．前記方法は、前記試料への競合分子の添加、前記アプタマー−標的複合体の固体支持体への捕捉、ならびに競合分子の添加及び前記試料の希釈から選択される少なくとも１つのさらなるステップを含み、ここで、前記少なくとも１つのさらなるステップは、ステップ（ａ）またはステップ（ｂ）の後で行われる、実施形態４５に記載の方法。
【０１４２】
実施形態４７．前記競合分子はポリアニオン性競合物質から選択される、実施形態４６に記載の方法。
【０１４３】
実施形態４８．前記ポリアニオン性競合物質は、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン及びｄＮＴＰから選択される、実施形態４７に記載の方法。
【０１４４】
実施形態４９．ポリデキストランは硫酸デキストランであり、ＤＮＡはニシン精子ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡである、実施形態４８に記載の方法。
【０１４５】
実施形態５０．前記標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、低分子、細胞及び組織から選択される、実施形態４５〜４９のいずれか１形態に記載の方法。
【０１４６】
実施形態５１．前記試料は、全血、白血球、末梢血単核球、血漿、血清、痰、呼気、尿、精液、唾液、髄液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引物、気管支吸引物、滑液、関節吸引物、細胞、細胞抽出物、便、組織、組織生検、及び脳脊髄液から選択される、実施形態４５〜５０のいずれか１形態に記載の方法。
【０１４７】
実施形態５２．ａ）前記試料を、前記標的に結合して第１の複合体を形成することができる前記第１のアプタマーと接触させ、混合物を形成させること、
ｂ）前記混合物を、前記第１の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすること、
ｃ）前記混合物を、前記第１の複合体と結合して第２の複合体を形成することができる第２のアプタマーと接触させること、
ｄ）前記混合物を、前記第２の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすること、
ｅ）前記混合物中の前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー、前記標的、前記第１の複合体または前記第２の複合体の有無について検出し、前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー、前記標的、前記第１の複合体または前記第２の複合体の存在は、前記試料中の前記標的の存在を指すこと
を含む、試料中の標的を検出する方法であって、
前記第１のアプタマーは、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、
前記第２のアプタマーは、少なくとも１つの第３の５位修飾ピリミジンを含み、
前記第１の５位修飾ピリミジンと前記第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンである、前記方法。
【０１４８】
実施形態５３．前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンである、実施形態５２に記載の方法。
【０１４９】
実施形態５４．前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンである、実施形態５３に記載の方法。
【０１５０】
実施形態５５．前記５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、実施形態５３または実施形態５４に記載の方法。
【０１５１】
実施形態５６．前記５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、実施形態５３〜５５のいずれか１形態に記載の方法。
【０１５２】
実施形態５７．前記５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される、実施形態５３〜５６のいずれか１形態に記載の方法。
【０１５３】
実施形態５８．前記５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態５３〜５７のいずれか１形態に記載の方法。
【０１５４】
実施形態５９．前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態５２に記載の方法。
【０１５５】
実施形態６０．前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態５２に記載の方法。
【０１５６】
実施形態６１．前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンはＴｙｒｄＵである、実施形態５９または実施形態６０に記載の方法。
【０１５７】
実施形態６２．前記第３の５位修飾ピリミジンは、５位修飾シチジン及び５位修飾ピリミジンから選択される、実施形態５２〜６１のいずれか１形態に記載の方法。
【０１５８】
実施形態６３．前記第３の５位修飾ピリミジンは、ＢｎｄＣ、ＰＥｄＣ、ＰＰｄＣ、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＮＥｄＣ、２ＮＥｄＣ、ＴｙｒｄＣ、ＢＮｄＵ、ＮａｐｄＵ、ＰｅｄＵ、ＩｂｄＵ、ＦｂｎｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＮｅｄＵ、ＭｂｎｄＵ、ＢｆｄＵ、ＢｔｄＵ、ＰｐｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態６２に記載の方法。
【０１５９】
実施形態６４．前記標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、低分子、細胞及び組織から選択される、実施形態５２〜６３のいずれか１形態に記載の方法。
【０１６０】
実施形態６５．前記第１のアプタマー、第２のアプタマー及び標的は、三量体複合体を形成することができる、実施形態５２〜６４のいずれか１形態に記載の方法。
【０１６１】
実施形態６６．（ａ）アプタマーのライブラリーを標的分子と接触させて混合物を形成させ、アプタマーが前記標的分子に対して親和性である場合に形成されるアプタマー−標的複合体の形成を可能にすること、
（ｂ）前記混合物の残部から前記アプタマー−標的複合体を分配すること（または前記アプタマー−標的複合体を濃縮すること）、
（ｃ）前記アプタマー−標的複合体を解離させること、及び
（ｄ）前記標的分子に対する結合能のある前記１つ以上のアプタマーを同定すること
を含む、標的分子に対する結合能がある１つ以上のアプタマーを同定する方法であって、
アプタマーのライブラリーは複数のポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジン及び少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンを含み、前記第１の５位修飾ピリミジンと前記第２の５位修飾ピリミジンは異なる５位修飾ピリミジンである、前記方法。
【０１６２】
実施形態６７．各ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの５’末端に固定領域を含む、実施形態６６に記載の方法。
【０１６３】
実施形態６８．各ポリヌクレオチドの前記５’末端固定領域は、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長である、実施形態６７に記載の方法。
【０１６４】
実施形態６９．各ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの３’末端に固定領域を含む、実施形態６６〜６８のいずれか１形態に記載の方法。
【０１６５】
実施形態７０．前記ポリヌクレオチドの前記３’末端固定領域は、長さが少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５もしくは少なくとも３０のヌクレオチド長、または５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、５〜２０、もしくは１０〜２０のヌクレオチド長である、実施形態６９に記載の方法。
【０１６６】
実施形態７１．前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンである、実施形態６６〜７０のいずれか１形態に記載の方法。
【０１６７】
実施形態７２．前記第１の５位修飾ピリミジンは５位修飾シチジンであり、前記第２の５位修飾ピリミジンは５位修飾ウリジンである、実施形態６６〜７１のいずれか１形態に記載の方法。
【０１６８】
実施形態７３．前記５位修飾ウリジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分、インドール部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、実施形態７１または実施形態７２に記載の方法。
【０１６９】
実施形態７４．前記５位修飾シチジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、チロシル部分及びモルホリノ部分から選択される部分を５位に含む、実施形態７１〜７３のいずれか１形態に記載の方法。
【０１７０】
実施形態７５．前記５位修飾シチジンは、ＮａｐｄＣ、２ＮａｐｄＣ、ＴｙｒｄＣ、及びＰＰｄＣから選択される、実施形態７１〜７４のいずれか１形態に記載の方法。
【０１７１】
実施形態７６．前記５位修飾ウリジンは、ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態７１〜７５のいずれか１形態に記載の方法。
【０１７２】
実施形態７７．前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＮａｐｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｒｙｄＵ、ＴｒｐｄＵ及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態６６に記載の方法。
【０１７３】
実施形態７８．前記少なくとも１つの第１の５位修飾ピリミジンはＰＰｄＣであり、前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＵ、ＭＯＥｄＵ、ＴｙｒｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＴｈｒｄＵから選択される、実施形態６６に記載の方法。
【０１７４】
実施形態７９．前記少なくとも１つの第２の５位修飾ピリミジンはＴｙｒｄＵである、実施形態７７または実施形態７８に記載の方法。
【０１７５】
実施形態８０．各ポリヌクレオチドはランダム領域を含む、実施形態６６〜７９のいずれか１形態に記載の方法。
【０１７６】
実施形態８１．前記ランダム領域は、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または３０〜４０のヌクレオチド長である、実施形態８０に記載の方法。
【０１７７】
実施形態８２．各ポリヌクレオチドは、長さが２０〜１００、または２０〜９０、または２０〜８０、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または３０〜１００、または３０〜９０、または３０〜８０、または３０〜７０、または３０〜６０、または３０〜５０、または４０〜１００、または４０〜９０、または４０〜８０、または４０〜７０、または４０〜６０、または４０〜５０のヌクレオチド長である、実施形態６６〜８１のいずれか１形態に記載の方法。
【０１７８】
実施形態８３．各ポリヌクレオチドは標的と結合するアプタマーであり、前記ライブラリーは少なくとも１０００アプタマーを含み、各アプタマーは別々のヌクレオチド配列を含む、実施形態６６〜８２のいずれか１形態に記載の方法。
【０１７９】
実施形態８４．ステップ（ａ）、（ｂ）及び／または（ｃ）を少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回繰り返す、実施形態６６〜８３のいずれか１形態に記載の方法。
【０１８０】
実施形態８５．前記標的分子に対する結合能のある前記１つ以上のアプタマーを増幅させる、実施形態６６〜８４のいずれか１形態に記載の方法。
【０１８１】
実施形態８６．前記混合物はポリアニオン性競合分子を含む、実施形態６６〜８５のいずれか１形態に記載の方法。
【０１８２】
実施形態８７．前記ポリアニオン性競合物質は、オリゴヌクレオチド、ポリデキストラン、ＤＮＡ、ヘパリン及びｄＮＴＰから選択される、実施形態８６に記載の方法。
【０１８３】
実施形態８８．ポリデキストランは硫酸デキストランであり、ＤＮＡはニシン精子ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡである、実施形態８７に記載の方法。
【０１８４】
実施形態８９．前記標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、低分子、細胞及び組織から選択される、実施形態６６〜８８のいずれか１形態に記載の方法。
【０１８５】
実施形態９０．前記第１の５位修飾ピリミジン及び前記第２の５位修飾ピリミジンは、ポリメラーゼ酵素によって取り込まれることができる、実施形態１〜１４のいずれか１形態に記載のアプタマー。
【０１８６】
実施形態９１．前記第１の５位修飾ピリミジン及び前記第２の５位修飾ピリミジンは、ポリメラーゼ酵素によって取り込まれることができる、実施形態１５〜４４のいずれか１形態に記載の組成物。
【０１８７】
実施形態９２．前記第１の５位修飾ピリミジン及び前記第２の５位修飾ピリミジンは、ポリメラーゼ酵素によって取り込まれることができる、実施形態４５〜８９のいずれか１形態に記載の方法。
【０１８８】
実施形態９３．前記アプタマーは、前記第１の５位修飾ピリミジンの各々の代わりに非修飾ピリミジンを含むかまたは前記第２の５位修飾ピリミジンの各々の代わりに非修飾ピリミジンを含む長さ及び核酸塩基配列が同一のアプタマーと比べて、ヌクレアーゼ安定性が改善されている、実施形態１〜１４及び９０のいずれか１形態に記載のアプタマー。
【０１８９】
実施形態９４．前記アプタマーは、前記第１の５位修飾ピリミジンの各々の代わりに非修飾ピリミジンを含むかまたは前記第２の５位修飾ピリミジンの各々の代わりに非修飾ピリミジンを含む長さ及び核酸塩基配列が同一のアプタマーと比べて、ヒト血清中の半減期が長い、実施形態１〜１４、９０、及び９３のいずれか１形態に記載のアプタマー。
【実施例】
【０１９０】
本発明のいくつかの実施形態をより詳細に説明するため、以下の実施例を記載する。ただし、それらは本発明の広い範囲を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。当業者は、本発見の根底にある原則を容易に採用して、本発明の趣旨から逸脱することなくさまざまな化合物を設計することができる。
【０１９１】
実施例１：２つの修飾塩基を含むアプタマー
２つの修飾塩基を用いるＳＥＬＥＸの相対的有効性を比較するため、非修飾ｄＴを対照とする５つのｄＵ単一修飾（Ｎａｐ−ｄＵ、ＰＰ−ｄＵ、ＭＯＥ−ｄＵ、Ｔｙｒ−ｄＵ及びＴｈｒ−ｄＵ）、及び非修飾ｄＣを対照とするｄＣ修飾（Ｎａｐ−ｄＣ及びＰＰ−ｄＣ）との組み合わせの、合計１８の出発ライブラリーを分析した（図１）。被験修飾の種類には、アミノ酸の疎水性側鎖に類似した疎水性芳香族側鎖が含まれる。ｄＵの親水性側鎖（ＭＯＥ−ｄＵ及びＴｈｒ−ｄＵ）もまた試験した。１８のライブラリーは各々３０のランダム化されたヌクレオチドを含有し、≧１０１５の異なる配列が得られる。天然ヌクレオチド三リン酸及び／またはＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼＥｘｏ−使用修飾ヌクレオチド三リン酸を使用して、ライブラリーを酵素合成した（データ図示せず）。
【０１９２】
単一修飾ｄＵを用いた先の４０Ｎランダム化ライブラリーに代えて、３０ヌクレオチド（３０Ｎ）ランダム化ライブラリーを使用した。いかなる特定の理論にも拘束されるわけではないが、修飾塩基の密度を高くすれば、より短い高親和性アプタマーができるであろうと仮定した。さらに、短いオリゴヌクレオチドライブラリーは収率が高い。各ヌクレオチドの比はｄＡ／ｄＣ／ｄＧ／ｄＴ＝１：１：１：１であった（それぞれ２５％ずつ）。いずれの場合でも、ランダム領域は、ＰＣＲ増幅プライマーをハイブリダイズする固定配列に隣接させ（表２）、５’末端及び３’末端にさらなるスペーサーを設けた。合成用マスターテンプレートを使用して、置換プライマー伸長反応でｄＵ位置及び／またはｄＣ位置のすべてが均一に修飾されている修飾ライブラリーを作製した。
【０１９３】
合計１８の酵素合成ライブラリーは、非修飾ｄＴを対照とする単一修飾ｄＵ（Ｎａｐ−ｄＵ、ＰＰ−ｄＵ、ＭＯＥ−ｄＵ、Ｔｙｒ−ｄＵ及び／Ｔｈｒ−ｄＵ）；非修飾ｄＣを対照とする単一修飾ｄＣ（Ｎａｐ−ｄＣ及びＰＰ−ｄＣ）；及び２つの修飾塩基の組み合わせ、すなわち、Ｎａｐ−ｄＣまたはＰＰ−ｄＣいずれかと、すべての可能な修飾ｄＵ（Ｎａｐ−ｄＵ、ＰＰ−ｄＵ、ＭＯＥ−ｄＵ、Ｔｙｒ−ｄＵ及びＴｈｒ−ｄＵ）との組み合わせを含む。アンチセンステンプレート、天然ヌクレオチド三リン酸または修飾ヌクレオチド三リン酸を有する放射性標識５’プライマー及びＫＯＤポリメラーゼ（Ｅｘｏ−）の溶液を使用して、以下のとおり定性的プライマー伸長反応（３連）を行った。６０μＬプライマー伸長反応では、２０ｐｍｏｌｅのビオチン化アンチセンスライブラリーを、４０ｐｍｏｌｅの５’ｃｏｌｄプライマー（２Ｘ）及び微量の３２Ｐ標識５’プライマー、０．５ｍＭの天然ｄＮＴＰもしくは修飾ｄＮＴＰ含有１×ＳＱ２０緩衝液（１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８；１０ｍＭ  ＫＣｌ；６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４；７ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）ならびに０．２５Ｕ／ｍＬ  ＫＯＤポリメラーゼ（Ｅｘｏ−）と混合した。混合物の熱を冷ましてからＤＮＡポリメラーゼを加え、６８℃で２時間反応させた後、１０℃で冷却した。ライブラリーの反応各々から得た画分を無標識プライマーと共に１０％  ＴＢＵ尿素ゲル上で反応させた。少量の分注を変性ゲル上で反応させ、それを蛍光スクリーンに曝露させてホスフォイメージャー（Ｆｕｊｉ製）で画像を解析した後、ＩｍａｇｅＧａｕｇｅ４．０ソフトウェアを使用してバンドを定量化して結果をＧｒａｐｈ  ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア６．０５にプロットした。初期ライブラリー作製のため、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に捕捉したマスタービオチン化アンチセンスランダムライブラリーを使用して大規模プライマー伸長反応を行った。２つの修飾ヌクレオシドの特定の組み合わせではライブラリーが低収率で得られ、例えば、対照の非修飾ＤＮＡ（ｄＣ／ｄＴ）ライブラリーの１００％と比較して、Ｎａｐ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵは２８±１．３％、Ｎａｐ−ｄＣ／ＭＯＥ−ｄＵは４０±５．２％、及びＰＰ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵは４３±２．７％であった。初期ライブラリー、ならびに単一塩基修飾ライブラリー及び２塩基修飾ライブラリーの各々の作製に使用したマスターアンチセンスランダムテンプレートから得られたシークエンシング結果から、各ヌクレオチドの頻度を計算した。マスターランダムアンチセンステンプレート（３０Ｎ）の化学合成を、ｄＡ：ｄＧ：ｄＣ：ｄＴ比１：１：１：１（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１μＭスケールにて行った。単一塩基修飾及び２塩基修飾の初期ランダムライブラリーを大規模反応で酵素合成し、選択実験に使用した。濃縮プールと共にこれらのライブラリーの配列決定を行い、３０Ｎランダム領域の全４塩基で合計１００％としてヌクレオチド頻度をプロットした。ディープシークエンシ��グを使用してライブラリーの塩基組成を決定した場合、合成の天然ＤＮＡテンプレート出発ライブラリー及び酵素合成した非修飾ＤＮＡ対照初期ライブラリーと比較して、ヌクレオチド頻度における有意な偏りは観察されなかった（データ図示せず）。
【０１９４】
ライブラリーを使用して、ＰＣＳＫ９と結合するアプタマーを選択した。選択は、実質的には先の報告と同様に行い、ポリアニオン性競合物質に硫酸デキストランを使用し、選択ラウンドごとに標的希釈を漸増させて計６ラウンドを実施した。表１（Ｒ１＝ラウンド１、Ｒ２＝ラウンド２等）を参照のこと。選択は、ランダム修飾ライブラリー（または非修飾の対照）（≧１０００ｐｍｏｌ）と、容積１００μＬ中０．５μＭの濃度で存在させたヒト組換え型Ｈｉｓタグ標的タンパク質のＰＣＳＫ９とを混合することにより開始された。選択された複合体を磁性Ｈｉｓタグ捕捉Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）に分配し、未結合配列を洗浄し、選択されたアプタマーを溶出させ、全天然ヌクレオチド及び３’ビオチン−プライマーを使用してＰＣＲで増幅させた。３’末端がビオチン化された天然二本鎖ＤＮＡをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＣ１ビーズに捕捉し、アルカリ変性によりセンス鎖を消失させ、それをプライマー伸長反応で修飾ｄＣ及び／またはｄＵで置換して、濃縮プールを再構成し、その後、希釈タンパク質を用いて選択サイクルを繰り返した。試料ごとの重要サイクル時間（Ｃｔ）値から計算した、シグナルとバックグラウンドの比に基づいて次ラウンドのＳＥＬＥＸ用のタンパク質濃度を決定した。
【表１】
2019527043.tif 000005
【０１９５】
増幅用５’プライマーに（ＡＴ４）−テールを含め、３’プライマーに（Ａ−ビオチン）２−Ｔ８−テール（配列番号８２）を含めたことにより、修飾ライブラリーを合成する際、修飾ｄＣまたは修飾ｄＵの付加が回避される。
【表２】
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【０１９６】
６ラウンドの選択を行った後、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ装置を使用して天然ヌクレオチド含有アプタマーのディープシークエンシングを行った。局所的アラインメントのバッチ処理を使用する特注ソフトウェアを使用してシークエンス解析を実施した。濃縮プールすべてのシークエンス解析から得られたデータから、修飾ライブラリー２つの組み合わせは、単一修飾ライブラリーと比較して、濃縮された配列の多様性が高いことが実証された（データ図示せず）。アプタマーの結合親和性を試験するため、異なるファミリー由来の固有の高コピー配列だけではなく低コピー配列も表す一連の広範囲の配列（データ図示せず）を選択した。修飾／非修飾ホスホルアミダイト試薬を用いる標準的な固相ホスホルアミダイト化学によって全アプタマーを化学合成した。放射性標識フィルター結合アッセイを用いた溶液中で全アプタマーのスクリーニングを初めに行い、３０ヌクレオチドのランダム領域、及びＰＣＳＫ９結合親和性用に５’末端と３’末端の各固定プライマー領域の５ヌクレオチドずつをさらに含有する、切断型４０ｍｅｒとした。切断型アプタマー（４０ｍｅｒ）は、固定領域の１０ヌクレオチドを含んだ。対照の非修飾ＤＮＡライブラリー（ｄＣ／ｄＴ）からは活性な配列（Ｋｄ＜３２ｎＭ）は何ら得られず、これは、このライブラリーのプール親和性が無変化であるためと予測され（データ図示せず）、またディープシークエンシングのデータからも濃縮された多コピー配列は得られなかった（データ図示せず）。ｄＣまたはｄＵいずれかにＮａｐ（ナフチル）修飾を有する単一修飾ライブラリーは、標的に対し親和性のあるアプタマーをもたらしたが、標的に対する親和性が最も大きいアプタマーは、Ｎａｐ（ナフチル部分）またはＰＰ（ベンジル部分）で修飾されたｄＣがＴｙｒ（チロシル部分）修飾ｄＵを有する場合に得られた（図２）。Ｔｙｒ−ｄＵをｄＴに置き換えたところ標的への結合が消失し、これは、標的であるＰＣＳＫ９表面への結合相互作用にとってチロシル部分が重要であることを示している（データ図示せず）。親和性データから、２修飾ヌクレオチドのアプタマーは一般に単一修飾ヌクレオチドのアプタマーより親和性が高く、また、単一修飾ヌクレオチドのアプタマーと比較すると、ＰＣＳＫ９に結合したアプタマーを多数得られることが実証された（図３）。さらに、単一修飾ヌクレオチドの高コピーのアプタマーは平均親和性が０．１〜１００ｎＭであるのに対し、２修飾ヌクレオチドの高コピーのアプタマーは平均親和性が≦０．１ｎＭである。
【０１９７】
ＰＣＳＫ９に対する単一修飾アプタマー（４０ｍｅｒ）及び二重修飾アプタマー（４０ｍｅｒ）を比較するデータ概要を下記表３に示す。
【表３】
2019527043.tif 000007
【０１９８】
表３の情報に基づくと、結合を示さないすべての被験単一修飾アプタマーの割合は６２％であった。未結合は、Ｋｄが３２０ｎＭ以上であるアプタマーと定義した。Ｋｄ＜１０ｎＭであるすべての単一修飾アプタマーの割合は２１％未満であり、すべての単一修飾アプタマーの平均Ｋｄは５，２ｎＭであった。対照的に、結合を示さないすべての被験２修飾（二重修飾）アプタマーの割合は４３％であった。さらに、Ｋｄ＜１０ｎＭであるすべての２修飾アプタマーの割合は４７％であり、すべての２修飾アプタマーの平均Ｋｄは０．１２ｎＭであった。
【０１９９】
実施例２：二重修飾アプタマーの切断
さらなる切断が高親和性（Ｋｄ＜１ｎＭ）アプタマーの結合に及ぼす影響を検討した。アプタマーを切断し、長さが２５％短縮された３０ｍｅｒとした。３０ｍｅｒに切断可能で、なおも結合親和性を保持するアプタマー数は、ＰＰ−ｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵの組み合わせが最も多かった（図４Ａ）。単一塩基修飾アプタマーは２１．５％（青の棒、３／１４）の切断性を示し、修飾ｄＵを有する２塩基修飾Ｎａｐ−ｄＣアプタマーは約２３％（赤の棒、１１／４８）の切断性を示した一方、他の修飾ｄＵを有する２塩基修飾ＰＰ−ｄＣは６０％（緑の棒、２７／４５）の高い切断性を示した。３０ｍｅｒに切断可能な４０ｍｅｒの割合及び数もまた、ＰＰ−ｄＣにＰＰ−ｄＵ、Ｎａｐ−ｄＵ、またはＴｙｒ−ｄＵを組み合わせた２塩基修飾が他のライブラリーよりも高かった（図４Ｂ）。親和性≦１ｎＭのアプタマーは３ライブラリーからの１４アプタマーしかなかったため、単一塩基修飾ライブラリーの少数アプタマーを試験した（４０ｍｅｒ、図４Ｂの灰色領域の単一修飾）。対照的に、親和性の高い２塩基修飾ライブラリーのアプタマー数は９３（４０ｍｅｒ、図４Ｂの灰色領域の２修飾）で、修飾ｄＵを有するＮａｐ−ｄＣが４８、修飾ｄＵを有するＰＰ−ｄＣが４５であった。ライブラリー各々の黒の水平線は、そのライブラリー内の全アプタマーの中央値を指す。いかなる特定の理論にも拘束されるわけではないが、ＰＰ修飾塩基の伸長した炭素鎖（他の修飾との比較）が、到達しにくい標的表面エピトープへの到達を助け、構造の折り畳み及び効果的なタンパク質結合相互作用に固定プライマー領域を必要としないということが考えられる。
【０２００】
さまざまな他の前駆体タンパク質転換酵素（ＰＣ）に対するＰＣＳＫ９アプタマーの特異性も評価した。各ライブラリーから親和性が最も高いアプタマーを３つ選択し（ｎ＝３３の４０ｍｅｒ；非修飾ＤＮＡ対照ライブラリーからはなし、ｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵライブラリーからはアプタマー２つのみ、ＰＰ−ｄＣ／ＭＯＥ−ｄＵライブラリーからはアプタマー１つ）、他のＰＣに対する特異性について試験した。結果から、アプタマーはＰＣＳＫ９に特異的であり、他のＰＣとの検出可能な結合は濃度１００ｎＭにおいて観察されなかったことが実証された（図５）。
【０２０１】
Ｋｄ値≦１ｎＭの切断型アプタマー（ｎ＝４１、３０ｍｅｒ）の種交差反応性をげっ歯類（マウス及びラット）及びアカゲザルのＰＣＳＫ９について試験した（表４を参照のこと）。さまざまな種のＰＣＳＫ９同士のパーセント同一性を図６のグラフ上部に示す。マウス／ラットのＰＣＳＫ９はサル及びヒトのタンパク質と約７６％同一である。ほとんどのアプタマーはアカゲザルＰＣＳＫ９に結合し、親和性は同様（同一性９６．４％）であったが、２修飾ライブラリーの少数アプタマー（ＰＰ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵ及びＰＰ−ｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵ）はラット及びマウスのＰＣＳＫ９に結合した（同一性約７６％）。これらの結果から、２塩基修飾の特定のライブラリー（例えば、ＰＰ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵ及びＰＰ−ｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵ）により、げっ歯類及びヒト／サルのいずれのＰＣＳＫ９にも結合することができる親和性が同様のアプタマーが作製されること（図６）が実証された。
【表４】
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2019527043.tif 000009
「−」は、アッセイでは結合が検出されなかったことを指す。
【０２０２】
実施例３：サンドイッチアッセイでのアプタマーの結合
ＳＥＬＥＸ法では、時として、標的表面の「アプタ原性（ａｐｔａｇｅｎｉｃ）」優性エピトープに選択的に結合するアプタマーが得られることがある。そのため、アプタマーのサンドイッチペアに関する報告は文献では限られている。標的タンパク質上の異なるエピトープに結合することができるアプタマーを探索するため、選択方法の改変が可能であり、例えば、多価アプタマー単離法（ＭＡＩ−ＳＥＬＥＸ）、アレイを用いる多価アプタマー探索プラットフォーム（ＡＤ−ＭＡＰ）サンドイッチ選択法などでは、一次アプタマーを過剰に使用して第１のエピトープのブロッキングを行い、非競合シグナル伝達エピトープに結合する第２のアプタマーの発見を目指す。化学的多様性を拡張させた場合に、ｄＣとｄＵとに共に行う修飾の多重性によって、アプタマー選択に際し、異なる標的表面のエピトープに結合することができるアプタマーが生じること示すため、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）アビジン結合磁性ビーズを使用してビオチン化一次アプタマーを捕捉するビーズ系サンドイッチペアスクリーニング法を開発した（図７Ａ）。捕捉ビーズを個々のアプタマーと共に混合し、ペアワイズな多重組み合わせで第２の結合パートナーを探索した（図７Ａ）。この実験では、単一塩基修飾ライブラリー及び２塩基修飾ライブラリーから親和性がＫｄ≦１ｎＭである４０ｍｅｒアプタマー（ｎ＝９６、９２１６対）を使用した。簡単に言えば、個々のアプタマー（試料あたり０．０５ｐｍｏｌｅ）を単一ＭａｇＰｌｅｘアビジンビーズタイプに捕捉して併せて混合し（実験１回あたりビーズ２４個、試料あたりビーズ１０００個）、２０分間室温にて１８５０ｒｐｍで振盪させて捕捉した。ビーズを１×ＳＢＴで２分洗浄し、続いて、０．５ｍＭ遊離ビオチン洗浄を１×ＳＢＴで５分間行い、その後、１×ＳＢＴでの洗浄を２分間ずつ３回行った。ビーズを遊離のストレプトアビジンで５分間ブロッキングし、再度、１×ＳＢＴで２分間洗浄した。捕捉アプタマー各々に対するサンドイッチパートナーをスクリーニングするために、個々のアプタマーを有する２４の異なるビーズ種を併せて混合した。検出すなわち二次アプタマーを１×ＳＢＴ中５００ｎＭに希釈し、熱−冷却してＰＣＳＫ９（最終１０ｎＭ）と混合し、２５℃で１時間インキュベートした。１０００個の捕捉ビーズを加え、さらに１時間、振盪しながらインキュベートした。その後、ビーズを磁石に捕捉し、１×ＳＢＴで２分間ずつ３回洗浄し、０．１％ＢＳＡ及び１００ｕＭ  ＤｘＳＯ４を添加した７５μＬ  １×ＳＢＴに再懸濁させた。この７５μＬのストレプトアビジンにフィコエリスリン（最終５μｇ／ｍＬ）を加え、２５℃で２０分間振盪させながらインキュベートした。最後に、ビーズを再度１×ＳＢＴで２分間洗浄し、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ３Ｄ  ｘＭＡＰ機で読み取った。
【０２０３】
単一塩基修飾ライブラリーからは少数のサンドイッチペア（３対）が作製されたが、２塩基修飾ライブラリーのアプタマーを単一塩基修飾アプタマーと組み合わせて加えたところ、より多くのサンドイッチペア（２２対）が得られた。さらに、パートナーの双方（捕捉及び検出）のアプタマーを２塩基修飾ライブラリーのアプタマーにした場合に、ライブラリーあたりのサンドイッチペア数は劇的に増加した（４５対、図７Ｃ、図７Ｂ）。
【０２０４】
サンドイッチスクリーニングから得られた複数エピトープの結合結果により、初期ランダムライブラリーで化学的多様性を高めると、標的表面の非競合部位に結合することができる修飾アプタマーが得られることが示唆された。次に、シグナルの最も高かったサンドイッチペア（ＰＣＳＫ９濃度１０ｎＭ；全被験対の０．７５％、９２１６対中７０対；図７Ｃ）でＰＣＳＫ９濃度依存的応答について測定し、結果のサブセットを図８Ａ（単一塩基修飾一次アプタマーｄＣ／ＰＰ−ｄＵの濃度依存的シグナルを示し、良好に機能した最良二次アプタマーは２塩基修飾アプタマーＮａｐ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵ［三角形］であった）及び図８Ｂ（２塩基修飾二次アプタマーＮａｐ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵの濃度依存的シグナルを示し、良好に機能した最良一次アプタマーは単一塩基修飾アプタマーｄＣ／ＰＰ−ｄＵ［塗りつぶした四角形］であった）に示した。興味深いことに、単一塩基修飾一次アプタマー（ＰＰ−ｄＵ、親和性、Ｋｄ値１７５ｐＭ）と２塩基修飾二次アプタマー（Ｎａｐ−ｄＵ／Ｎａｐ−ｄＣ、親和性、Ｋｄ値５３１ｐＭ）で構成される特定の１対では、１つの配置において、他のどの対よりもシグナルが強固であった（図８Ｃ）。しかしながら、この単一塩基修飾の一次アプタマーと二次アプタマーとを交換するとシグナルが消失したことから、このサンドイッチペアでは、アプタマーの配置が重要であることが示された。また、このアプタマーサンドイッチペアでは、ＬＤＬ−Ｒに対する親和性が野生型ＰＣＳＫ９よりも高く、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）重症型の患者での過剰発現が報告されている機能獲得型変異タンパク質ＰＣＳＫ９  Ｄ３７４Ｙの活性も測定できる（図８Ｄ）。変異体ＰＣＳＫ９  Ｄ３７４Ｙの感度及びＭＦＵ値は、野生型タンパク質のそれよりも高かった。
【０２０５】
また、アプタマーサンドイッチペアの特異性についても、組換え型ヒトＰＣＳＫ９を新生仔ウシ血清（ＮＢＣＳ）に添加した場合の内因性シグナルの欠失によりヒト血漿と比較して測定した（データ図示せず）。
【０２０６】
このサンドイッチペアのさらなる特徴付けを行い、ヒトの臨床試料で血漿中ＰＣＳＫ９の循環濃度を検出するアプタマーのサンドイッチアッセイを開発した。試験、例えば、感度測定（図９Ａ及び９Ｂならびに表５及び６）、精度測定（表７及び８）、真度測定（表９）及び血漿中の希釈直線性測定（図１０）などを実施してサンドイッチアッセイの性能を評価したところ、いずれにおいても頑健なアッセイ枠が確認された。アッセイの試料の希釈直線性を評価するため、高濃度のＰＣＳＫ９を含有する試料及び／または高濃度のＰＣＳＫ９を添加した試料を用いてサンドイッチアッセイを実施した。血漿試料（ｎ＝５）をアッセイ緩衝液で段階希釈し、アッセイの動的範囲内に各値を適合させた。
【０２０７】
検出限界（ＬＬｏＤ）は、ブランク（希釈緩衝液）の平均ＲＦＵ値よりも高いＲＦＵ値を与えるＰＣＳＫ９濃度（４０ｐｇ／ｍＬ）に標準偏差３を加えた値と定義し、表５に示されている。定量下限（ＬＬｏＱ）及び定量上限（ＵＬｏＱ）は、４パラメータロジスティック（４ＰＬ）フィッティングを使用して標準曲線に適合させると８０〜１２０％の既知標的濃度が回収される方法で定量可能な、最も低いＰＣＳＫ９濃度及び最も高いＰＣＳＫ９濃度と定義し、表６に示されている。アッセイ内の変動性を決定するため、既知濃度の血漿試料５つを単一プレートで１６回試験した。表７を参照のこと。アッセイ内の変動係数（ＣＶ）は４．３％〜６％の範囲であった。アッセイ間の変動性を決定するため、既知濃度の血漿試料５つを別々の５アッセイで測定した。表８を参照のこと。アッセイ間のＣＶは２．３％〜９．８％の範囲であった。最後に、標的測定における真度を決定するため、５つの血漿試料に異なる量のＰＣＳＫ９を添加して測定を行った。アッセイ範囲全体の添加ＰＣＳＫ９量の回収率を評価した。表９を参照のこと。試料回収率は、平均して添加標的の８３．１％〜１３７．５％であった。
【０２０８】
スタチンの使用によりＰＣＳＫ９の血漿中濃度が上昇することが知られていることから、１つの対照群（ｎ＝４２）、及び対象がＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）スタチン療法を受けている別の試験群（ｎ＝４２、自己報告による）の２群の個人から血漿試料セットを取得し、アッセイによりこれら２群間を統計的に差別化できるか否かを決定するための評価を行った。捕捉すなわち一次ＳＯＭＡｍｅｒ（１１７２３−５）を単一塩基修飾アプタマー（ＰＰ−ｄＵ／ｄＣ）として、また二次すなわち検出アプタマー（１１７２７−２０）を２塩基修飾アプタマー（Ｎａｐ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵ）として使用してサンドイッチアッセイを開発した。
【０２０９】
これらの結果から、アプタマーのサンドイッチアッセイは、マン・ホイットニー検定によりＰ値０．００４４で２群間の統計的差別化が可能であること（図１１）、及びこのアッセイは、血漿中ＰＣＳＫ９濃度が高いために抗ＰＣＳＫ９療法の恩恵が受けられると思われる患者を同定する際に使用され得るであろうということが示された。
【０２１０】
また、過剰発現クローンを同定し、研究上のアッセイの有用性を示すため、アプタマーのサンドイッチアッセイを使用して、ＰＣＳＫ９を過剰発現しているＨｅｐＧ２細胞由来の無細胞上清中のＰＣＳＫ９濃度を測定した（図１２）。ＳＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬｅｎｔｉＶｉｒａｌシステム（ＬＶ３００Ａ−１）を使用してＨｅｐＧ２細胞にＰＣＳＫ９を過剰発現させた。安定細胞株作製用のＯｒｉｇｅｎｅから入手したレンチウイルス野生型ヒトＰＣＳＫ９発現クローン（ＲＣ２２００００Ｌ１）でＨｅｐＧ２細胞株に形質導入した。計９６の個々のクローンで、それらのＰＣＳＫ９分泌能についてスクリーニングを行った。各クローンに対しアプタマーのサンドイッチアッセイを行って培地中に分泌されたＰＣＳＫ９の相対量を測定し、野生型ＨｅｐＧ２細胞からの発現と比較した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存率アッセイを使用して組換えタンパク質作製に使用した細胞数を正規化した。クローン番号４５は野生型ＨｅｐＧ２細胞より約１００倍多いＰＣＳＫ９を分泌した。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【０２１１】
実施例４：二重修飾アプタマーによる標的の活性阻害
ＬＤＬ−ＲへのＰＣＳＫ９の結合を遮断するＰＣＳＫ９阻害物質を見出すため、プレートがＬＤＬ−Ｒでコートされたプレートを用いるアッセイで、Ｋｄ≦１ｎＭの４１の切断型３０ｍｅｒアプタマーのスクリーニングを行い、ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体を使用して化学発光試薬によりビオチン化ＰＣＳＫ９の結合を検出した（図１３）。組換え型ＬＤＬ−Ｒ（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＥＬＩＳＡプレート（２．５μｇ／ｍＬ）を４℃で一晩コートし、その後、ウェルを洗浄し、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ビオチン化ＰＣＳＫ９（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｖｉタグ付き）とアプタマーを併せて混合し、室温で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートに加え、振盪しながら室温で２時間さらにインキュベートした。ＰＣＳＫ９の最高濃度は０．５ｎＭ、またアプタマーの最高濃度は１００ｎＭであり、その後、これらを阻害曲線に対し１／２ｌｏｇで段階希釈した。ストレプトアビジン結合ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１μｇ／ｍｌ）をウェルに加え、振盪しながら室温で３０分インキュベートし、Ｐｉｃｏ感度化学発光基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、ルミノメーター（Ｈｉｄｅｘ  Ｐｌａｔｅ  Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ）で発光を測定し、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６．０ソフトウェアでデータをプロットしてＥＣ５０値を計算した。ＰＣＳＫ９中和抗体（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を対照として使用した。
【０２１２】
阻害アッセイ（アプタマーの被験濃度１００ｎＭ、ＰＣＳＫ９濃度１ｎＭ）の結果から、アプタマーの７０％が阻害物質であったこと（９０％超の阻害）、及び一部の２修飾アプタマーはＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒとの相互作用を強力に阻害したことが示された（データ図示せず）。アプタマーを用量反応曲線でさらに評価し、阻害についてそれらのＥＣ５０値を決定した。結果から、多くの阻害物質はＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒとの相互作用を強力に阻害し、ＥＣ５０は０．１〜１ｎＭの範囲であることが示された（図１４）。２修飾アプタマーの持つ治療薬としての潜在的価値を実証するため、１つの種の交差反応性ＰＣＳＫ９アプタマー（３０ｍｅｒ、配列番号１１７３３−９１＿５（１１７３３−１９８））を、さまざまな種のＰＣＳＫ９に対する標的親和性測定用に選択した。このアプタマーは、ヒト（野生型）、アカゲザル、ヒト（ＧＯＦ変異体Ｄ３７４Ｙ）、マウス、及びラットのＰＣＳＫ９に対する親和性がそれぞれ１４．７ｐＭ、１１．３ｐＭ、５．２ｐＭ、７７ｐＭ及び１６５ｐＭであった（図１５Ａ）。また、このアプタマーは、ヒト野生型ＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒとの相互作用をＥＣ５０値２．１ｎＭで遮断し、ＧＯＦ変異ＰＣＳＫ９  Ｄ３７４ＹとＬＤＬ−Ｒとの相互作用をＥＣ５０値３．６ｎＭで遮断した（図１５Ｂ）。ＰＣＳＫ９に対するこのアプタマーの特異性を他のＰＣに対する場合と比較して評価したところ、結果から、このアプタマーはＰＣＳＫ９にのみ結合し、他のＰＣには結合しなかったことが示された（データ図示せず）。
【０２１３】
ＬＤＬＲ分解遮断におけるＰＣＳＫ９アプタマーの中和作用を検討するため、ＬＤＬ取り込み逆転アッセイでＰＰ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵアプタマーを試験し、その際、野生型ＨｅｐＧ２細胞を組換え型ＰＣＳＫ９と共に１６時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、蛍光標識したＬＤＬを３時間加えた。結果から、アプタマーは、ＬＤＬ取り込みをＥＣ５０値１５９ｎＭで逆転させることができることが示された（図１６及び図１７）。さらに、アプタマー処置により、ＦＡＣＳで測定した場合、ＰＣＳＫ９過剰発現ＨｅｐＧ２細胞のＬＤＬ−Ｒレベルを上昇させることができる（図１７）。種交差反応性、高親和性の切断型、特異的、かつ非常に強力なアプタマーを含むこれらの結果から、２塩基修飾アプタマーの治療薬としての潜在的価値は、ＳＥＬＥＸ後の修飾によって長さ及び生体内安定性がさらに最適化され得ることが示唆される。
【０２１４】
実施例５：二重修飾アプタマーの血清安定性
ヒト血清中での二重修飾アプタマーの血清安定性を決定するため、１μＭゲル精製アプタマーを、９０％ヒト血清プール含有ＰＢＳ緩衝液（総容量２００μＬ）中で３７℃にてインキュベートした。さまざまな測定ポイントにおいて２０μＬずつ分注を採取し、等容量のＥＤＴＡ／ホルムアミド／色素ミックス（ホルムアミド８７．７％、ＳＤＳ、０．０３％、ＥＤＴＡナトリウム、２０ｍＭ、キシレンシアノール、０．０５％、ブロモフェノールブルー、０．０５％、オレンジＧ、０．１％）を加えた。その後、分注ミックスを−２０℃で保存した。分析に先立ち、４０μＬの分注ミックスを１００μＬ  Ｈ２Ｏで希釈し、１５０μＬのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出した。試料を１６，１００ｘｇ、１５分の遠心分離にかけてアプタマーを含有する水相を除去し、ゲル分析まで−２０℃で保存した。
【０２１５】
アプタマー試料を１５％  ＴＢＥ  ＰＡＧＥ変性ゲル（８Ｍ尿素）に担持させ、アプタマーを１×（約２μＭ）ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで１０分間染色した。ＦｌｕｏｒＣｈｅｍＱ解析ソフトウェア（ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ）を使用して、各測定時点の完全長アプタマーの量を定量した。
【０２１６】
その実験結果を表１０及び図１８に示す。表１０は、その実験の被験アプタマーの組成、９６時間後に９０％ヒト血清中に残存していた完全長アプタマーの割合、及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアでゲル定量データを使用して直線回帰フィッティングにより計算した各アプタマーの半減期を示す。図１８は、完全長アプタマーの経時的残存割合を示す。一般に、二重修飾アプタマーは、ヒト血清中で単一修飾アプタマーよりも高い経時的安定性を示した。
【表１０】
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【０２１７】
実施例６：２つの修飾塩基を含むアプタマー
実施例１に記載のライブラリーを使用してＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、及びＰＳＭＡと結合するアプタマーを選択した。各標的について実質的に実施例１に記載のように選択を行った。ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３には、Ｎａｐ−ｄＣ／ｄＴ、ＰＰ−ｄＣ／ｄＴ、及びｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵの各単一修飾ライブラリー、ならびにＮａｐ−ｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵ及びＰＰ−ｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵの各二重修飾ライブラリーを使用した。ＰＳＭＡには、非修飾ｄＣ／ｄＴライブラリー、Ｎａｐ−ｄＣ／ｄＴ、ＰＰ−ｄＣ／ｄＴ、ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵ、ｄＣ−ＰＰ−ｄＵ、ｄＣ−ＭＯＥ−ｄＵ、及びｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵの各単一修飾ライブラリー、ならびにＮａｐ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵ、Ｎａｐ−ｄＣ／ＰＰ−ｄＵ、Ｎａｐ−ｄＣ／ＭＯＥ−ｄＵ、Ｎａｐ−ｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵ、ＰＰ−ｄＣ／ＰＰ−ｄＵ、ＰＰ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵ、及びＰＰ−ｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵの各二重修飾ライブラリーを使用した。
【０２１８】
先のように、ＰＳＭＡに使用した対照の非修飾ＤＮＡライブラリー（ｄＣ／ｄＴ）はＰＳＭＡに結合するアプタマーを何ら生じなかった。ｄＣまたはｄＵいずれかにＮａｐ修飾（ナフチル部分）を有する単一修飾ライブラリーは、３つの標的すべてに対して結合物質となったが、二重修飾ライブラリーからは、単一修飾ライブラリーより親和性の高いアプタマーが得られた（図１９Ａ−Ｃ）。
【０２１９】
ＰＳＭＡ、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３各々に対する単一修飾アプタマー（４０ｍｅｒ）と二重修飾アプタマー（４０ｍｅｒ）の比較データの概要をそれぞれ、表１１、１２及び１３に示す。
【表１１】
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Ｎ．Ｔ．は「試験せず」；Ｎ／Ａは適用不可またはデータなしを意味する。
【０２２０】
表１１の情報に基づくと、結合を示さないすべての被験単一修飾アプタマーの割合は７１％であった。未結合は、Ｋｄが３２０ｎＭ以上であるアプタマーと定義した。Ｋｄ＜１０ｎＭであるすべての単一修飾アプタマーの割合は１２％であり、すべての単一修飾アプタマーの平均Ｋｄは１２．３ｎＭであった。対照的に、結合を示さないすべての被験２修飾（二重修飾）アプタマーの割合は５４％であった。さらに、Ｋｄ＜１０ｎＭであるすべての２修飾アプタマーの割合は２０％であり、すべての２修飾アプタマーの平均Ｋｄは６．６ｎＭであった。
【表１２】
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【０２２１】
表１２の情報に基づくと、結合を示さないすべての被験単一修飾アプタマーの割合は７０％であった。未結合は、Ｋｄが３２０ｎＭ以上であるアプタマーと定義した。Ｋｄ＜１０ｎＭであるすべての単一修飾アプタマーの割合は２％未満であり、すべての単一修飾アプタマーの平均Ｋｄは１５．１ｎＭであった。対照的に、結合を示さないすべての被験２修飾（二重修飾）アプタマーの割合は４４％であった。さらに、Ｋｄ＜１０ｎＭであるすべての２修飾アプタマーの割合は２５％であり、すべての２修飾アプタマーの平均Ｋｄは０．７ｎＭであった。
【表１３】
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【０２２２】
表１３の情報に基づくと、結合を示さないすべての被験単一修飾アプタマーの割合は３８％であった。未結合は、Ｋｄが３２０ｎＭ以上であるアプタマーと定義した。Ｋｄ＜１０ｎＭであるすべての単一修飾アプタマーの割合は４０％であり、すべての単一修飾アプタマーの平均Ｋｄは６ｎＭであった。対照的に、結合を示さないすべての被験２修飾（二重修飾）アプタマーの割合は２４％であった。さらに、Ｋｄ＜１０ｎＭであるすべての２修飾アプタマーの割合は６９％であり、すべての２修飾アプタマーの平均Ｋｄは０．０２ｎＭであった。
【０２２３】
実施例７：２つの修飾塩基を含むさらなるアプタマー
表１４に示す修飾対の各々を含むライブラリーを以下のとおり作製する。いくつかの実施形態では、各ライブラリーは４０以上のランダム化されたヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、各ライブラリーは３０のランダム化されたヌクレオチドを含有し、１０１５以上の異なる配列を可能にする。ライブラリーは、天然ヌクレオチド三リン酸及び／またはＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼＥｘｏ−使用修飾ヌクレオチド三リン酸を使用して酵素合成してよい。いくつかの実施形態では、ランダム領域はＰＣＲ増幅プライマーをハイブリダイズする固定配列に隣接させ、５’末端及び３’末端にさらなるスペーサーを設けるか、または設けない。ある場合には、合成用マスターテンプレートを使用して、置換プライマー伸長反応でｄＵ位置及び／またはｄＣ位置のすべてが均一に修飾されている修飾ライブラリーを作製する。ライブラリー合成は、実質的に実施例１に記載のように実施してよい。
【表１４】
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【０２２４】
表１４のライブラリーの１つ以上を使用して、タンパク質標的などの標的と結合するアプタマーを選択してよい。２つの修飾塩基を含むライブラリーからは典型的に、標的に対する特異性及び／または親和性の高いアプタマーが得られる。
【０２２５】
実施例８：例示的な二重修飾アプタマー
プール１１７２０（Ｎａｐ−ｄＣ／ｄＴ）からの保存された配列ファミリーのＰＣＳＫ９結合アプタマーを表１５に示す。各配列のランダム領域のみを示す。計１１，３８０配列中の各配列のコピー数（同一であるかまたは最高５のミスマッチを含む同等なもの）が示されている。このファミリーの全アプタマーは保存された配列要素ＴＴｐｐＧＧｐｐを共有しており、ここでｐ＝Ｎａｐ−ｄＣである。代謝安定性アッセイ用にこのプールの代表としてアプタマー１１７３０−６（配列番号４、Ｋｄ＝０．１ｎＭ）を選んだ。
【表１５】
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【０２２６】
プール１１７３０（Ｎａｐ−ｄＣ／Ｔｙｒ−ｄＵ）からの保存された配列ファミリーのＰＣＳＫ９結合アプタマーを表１６に示す。各配列のランダム領域のみを示す。計１７，６９５配列中の各配列のコピー数（同一であるかまたは最高５のミスマッチを含む同等なもの）が示されている。このファミリーの全アプタマーは保存された配列要素ｙＧｐｐｐＧを共有しており、ここでｐ＝Ｎａｐ−ｄＣ及びＹ＝Ｔｙｒ−ｄＵである。多くの配列が保存された配列要素ｙｙＡｙＧｐＡｐも含有していた。代謝安定性アッセイ用にこのプールの代表としてアプタマー１１７３０−１９（配列番号２７、Ｋｄ＝０．２ｎＭ）を選んだ。
【表１６】
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【０２２７】
プール１１７３３（Ｐｐ−ｄＣ／Ｎａｐ−ｄＵ）からの保存された配列ファミリーのＰＣＳＫ９結合アプタマーを表１７に示す。各配列のランダム領域のみを示す。計１６，１１８配列中の各配列のコピー数（同一であるかまたは最高５のミスマッチを含む同等なもの）が示されている。このファミリーの全アプタマーは保存された配列要素ｒＰＰＰＡＡＧＧｒｒＰＡＰＰＧ（配列番号８３）を共有しており、ここでｒ＝Ｐｐ−ｄＣ及びＰ＝Ｎａｐ−ｄＵである。アプタマー１１７３３−４４（配列番号４４、ＳＬ１０６３）はヒト野生型ＰＣＳＫ９の最も強力な３０ｍｅｒ阻害物質であった（ＩＣ５０＝２．８ｎＭ）。代謝安定性アッセイ用にこのプールの代表としてアプタマー１１７３３−１９８（配列番号４６、Ｋｄ＝０．０７ｎＭ）を選んだ。
【表１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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