(57)【要約】  記載発明は、不均一細胞集団から標的細胞型を分離／単離するための自動化閉鎖システム及び方法を提供する。【選択図】図１
2019509763.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞集団を選択するための自動化閉鎖システムであって、下記：
a.  生理学的媒体に懸濁した細胞の集団を含むインプットバッグ；
b.  前記細胞の集団がその中を通る、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバー；
c.  a.前記細胞の集団の亜集団を同定し、
b.前記細胞の集団の亜集団を選択し；及び
c.前記選択後に前記細胞の集団の亜集団から遊離されるように
適応された薬剤を含む捕獲粒子注射器；
d.  前記遊離した捕獲粒子、若しくは前記選択された細胞、又は両方を含むアウトプットバッグ；及び
e.  洗浄緩衝液を含む緩衝液バッグを
含む、前記自動化閉鎖システム。
【請求項２】
前記捕獲粒子注射器が、前記細胞の集団の亜集団の表面上の細胞表面マーカーを認識してそれに結合するように適応された捕獲粒子を含む、請求項1に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項３】
前記捕獲粒子が、前記細胞表面マーカーを認識してそれに結合する標識薬剤を含む、請求項2に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項４】
前記捕獲粒子に結合していない細胞及び細胞に結合していない捕獲粒子を含む標識バッグをさらに含む、請求項2に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項５】
捕獲粒子に結合した細胞及び細胞に結合した捕獲粒子を含む標識バッグをさらに含む、請求項2に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項６】
前記薬剤がさらにビーズに結合している、請求項1に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項７】
前記細胞の集団が均一細胞集団である、請求項1に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項８】
前記細胞の集団が不均一細胞集団である、請求項1に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項９】
さらにポンプを含む、請求項1に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項１０】
前記チャンバーが三角形である、請求項1に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項１１】
前記細胞表面マーカーを認識してそれに結合するように適応された前記標識薬剤が抗体である、請求項3に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項１２】
前記洗浄緩衝液が、トリス緩衝食塩水(TBS)、リン酸緩衝食塩水(PBS)、トリス緩衝食塩水-ツイーン20(TBST)、リン酸緩衝食塩水-ツイーン20(PBST)、PBS中のトリエタノールアミン及び生理学的媒体から成る群より選択される、請求項1に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項１３】
前記生理学的媒体が、イーグル基礎培地(BME)、ダルベッコリン酸緩衝食塩水(DPBS)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、DMEM-F12培地、F-10栄養混合物、グラスゴー改変最小必須培地(GMEM)、イスコヴ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ライボビッツL-15培地、マッコイ5A培地、MCDB 153培地、培地199、最小必須培地(MEM)、最小必須培地α (MEMA)、RPMI 1640培地、CliniMACS(登録商標)緩衝液、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、TexMACs(商標)培地、及びウェイマスMB752/1培地から成る群より選択される、請求項12に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項１４】
前記ビーズを溶解させるのに有効な溶解剤を含む溶解剤バッグをさらに含む、請求項6に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項１５】
前記溶解剤バッグがカルシウムキレート剤を含む、請求項14に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項１６】
前記カルシウムキレート剤が、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)；エチレングリコール四酢酸(EGTA)；1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N’,N’-四酢酸 (BAPTA)；メシル酸デフェロキサミン、鉄キレート剤IV、21H7；及びN,N,N’,N’-テトラキス(2-ピリジルメチ)エタン-1,2-ジアミン(TPEN)から成る群より選択される、請求項15に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項１７】
前記カルシウムキレート剤がエチレンジアミン四酢酸(EDTA)である、請求項15に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項１８】
前記ビーズが天然高分子を含む、請求項6に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項１９】
前記天然高分子が、アルギナート、アルギン酸誘導体、アガロース、架橋アガロース(Sepharose(登録商標))、コラーゲン及びキトサンから成る群より選択される、請求項18に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項２０】
前記天然高分子がアルギナートである、請求項18に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項２１】
前記ビーズが、アルギナートで被覆されたデキストランを含む、請求項6に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項２２】
前記ビーズがミクロビーズである、請求項6に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項２３】
前記抗体が、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体及び合成抗体模倣物から成る群より選択される、請求項11に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項２４】
前記モノクロナール抗体が、合成抗体及び改変抗体から成る群より選択される、請求項23に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項２５】
前記合成抗体が組換え抗体である、請求項24に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項２６】
前記組換え抗体が、単鎖可変フラグメント(scFv)抗体、核酸アプタマー及び非免疫グロブリンタンパク質スキャフォールドから成る群より選択される、請求項25に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項２７】
前記改変抗体が、キメラ抗体及びヒト化抗体から成る群より選択される、請求項24に記載の自動化閉鎖システム。
【請求項２８】
請求項1に記載の自動化閉鎖システムを用いて不均一細胞懸濁液から細胞の実質的に純粋な集団を単離する方法であって、下記工程：
a.  遠心機ローターに埋め込まれたチャンバー内で、前記ローターが動いて前記チャンバー内の対向流が前記チャンバー内に反力をもたらしている間に、不均一細胞集団を捕獲粒子と混合する工程（ここで、前記捕獲粒子は、特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤に結合したビーズを含む）；
b.  前記遠心機ローターに埋め込まれた前記チャンバー内で、前記ローターが動いて前記対向流が前記チャンバー内に反力をもたらしている間に、細胞を前記捕獲粒子に結合する工程（ここで、前記捕獲粒子に結合した細胞は、前記特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤によって認識された前記特異的細胞表面マーカーを発現する）；
c.  前記遠心機ローターに埋め込まれた前記チャンバーに、前記ローターが動いて前記対向流が前記チャンバー内に反力をもたらしている間に、洗浄緩衝液を通す工程（ここで、前記洗浄緩衝液は、非結合細胞及び非結合捕獲粒子を前記チャンバーから除去する）；
d.  前記特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤に結合した細胞を収集する工程（ここで、前記特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤に結合した細胞は、前記不均一細胞懸濁液に対して濃縮されている）；及び
e.  d工程の細胞を、前記特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤から解離させる工程
を含み、この方法は、
(i)前記収集細胞の汚染のリスクを減らすため；
(ii)前記収集細胞への損傷を減らすため；
(iii)前記収集細胞の生存能を維持するため；又は
(iv)(i)〜(iii)の組み合わせ
に有効である、前記方法。
【請求項２９】
前記ビーズが天然高分子を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記天然高分子が、アルギナート、アルギン酸誘導体、アガロース、架橋アガロース(Sepharose(登録商標))、コラーゲン及びキトサンから成る群より選択される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記天然高分子がアルギナートである、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
前記ビーズが、アルギナートで被覆されたデキストランを含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３３】
前記ビーズがミクロビーズである、請求項28に記載の方法。
【請求項３４】
前記特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤が抗体である、請求項28に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体が、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、改変抗体、及び合成抗体模倣物から成る群より選択される、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記合成抗体模倣物が組換え抗体である、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記組換え抗体が、単鎖可変フラグメント(scFv)抗体、核酸アプタマー及び非免疫グロブリンタンパク質スキャフォールドから成る群より選択される、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記改変抗体が、キメラ抗体及びヒト化抗体から成る群より選択される、請求項35に記載の方法。
【請求項３９】
前記洗浄緩衝液が、トリス緩衝食塩水(TBS)、リン酸緩衝食塩水(PBS)、トリス緩衝食塩水-ツイーン20(TBST)、リン酸緩衝食塩水-ツイーン20(PBST)、PBS中のトリエタノールアミン及び生理学的媒体から成る群より選択される、請求項28に記載の方法。
【請求項４０】
前記生理学的媒体が、イーグル基礎培地(BME)、ダルベッコリン酸緩衝食塩水(DPBS)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、DMEM-F12培地、F-10栄養混合物、グラスゴー改変最小必須培地(GMEM)、イスコヴ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ライボビッツL-15培地、マッコイ5A培地、MCDB 153培地、培地199、最小必須培地(MEM)、最小必須培地α (MEMA)、RPMI 1640培地、CliniMACS(登録商標)緩衝液、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、TexMACs(商標)培地、及びウェイマスMB752/1培地から成る群より選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
さらに下記工程
前記遠心機ローターに埋め込まれた前記チャンバーに、前記ローターが動いて前記対向流が前記チャンバー内に反力をもたらしている間に、溶解剤を添加する工程（ここで、前記溶解剤は、ビーズを溶解させる）
を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項４２】
さらに下記工程
前記遠心機ローターに埋め込まれた前記チャンバーに、前記ローターが動いて前記対向流が前記チャンバー内に反力をもたらしている間に、洗浄緩衝液を通す工程（ここで、前記洗浄緩衝液は、前記溶解剤及び前記溶解したビーズを除去する）
を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記溶解剤がカルシウムキレート剤である、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
前記カルシウムキレート剤が、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)；エチレングリコール四酢酸(EGTA)；1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N’,N’-四酢酸 (BAPTA)；メシル酸デフェロキサミン、鉄キレート剤IV、21H7；及びN,N,N’,N’-テトラキス(2-ピリジルメチ)エタン-1,2-ジアミン(TPEN)から成る群より選択される、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記カルシウムキレート剤がエチレンジアミン四酢酸(EDTA)である、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
前記(d)の収集工程が、前記遠心機ローターの動きを止めるか、前記対向流の速度を上げるか又はその組み合わせによって行なわれる、請求項28に記載の方法。
【請求項４７】
前記汚染が、細菌汚染、ウイルス汚染、真菌汚染及び細胞デブリから成る群より選択される、請求項28に記載の方法。
【請求項４８】
前記損傷が、細胞膨潤、脂肪蓄積、代謝不全、構造的損傷／劣化及びアポトーシスから成る群より選択される、請求項28に記載の方法。
【請求項４９】
前記(e)の解離工程が、解離溶液を用いて行なわれる、請求項28に記載の方法。
【請求項５０】
前記解離溶液が、pH溶液、イオン強度溶液、変性溶液及び有機溶液から成る群より選択される、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記pH溶液が、100mMのグリシン-HCl、pH 2.5〜3.0；100mMのクエン酸、pH 3.0；50〜100mMのトリメチルアミン又はトリエタノールアミン、pH 11.5；及び150mMの水酸化アンモニウム、pH 10.5から成る群より選択される、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記イオン強度溶液が、10mMのトリス中3.5〜4.0Mの塩化マグネシウム、pH 7.0；10mMのリン酸緩衝液中5Mの塩化リチウム、pH 7.2；2.5Mのヨウ化ナトリウム、pH 7.5；及び0.2〜3.0Mのチオシアン酸ナトリウムから成る群より選択される、請求項50に記載の方法。
【請求項５３】
前記変性溶液が、2〜6Mのグアニジン-HCl；2〜8Mの尿素；1%のデオキシコラート；及び1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)から成る群より選択される、請求項50に記載の方法。
【請求項５４】
前記有機溶液が、10%のジオキサン及び50%のエチレングリコール、pH 8〜11.5から成る群より選択される、請求項50に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞の標識化標的亜集団のサイズ、密度、浮力又はその組み合わせに基づいて前記不均一細胞集団から前記細胞の標識化標的亜集団を単離する工程をさらに含み、ここで、
(a)前記捕獲粒子は、前記標的細胞のサイズ、密度、浮力又はその組み合わせを変えるのに有効であり、かつ
(b)前記不均一細胞懸濁液内で前記細胞の標的亜集団を特異的に認識してそれに結合する薬剤を含む前記捕獲粒子の結合工程は、前記不均一細胞集団中の非標識細胞に対して各標的細胞のサイズ、密度及び浮力の少なくとも1つを変えるのに有効である、
請求項28に記載の方法。
【請求項５６】
哺乳動物細胞における効率的なウイルス媒介遺伝子導入方法であって、下記工程：
a.  哺乳動物細胞集団を含有する第1のインプットバッグ及び前記哺乳動物細胞集団にとって異質な遺伝子材料がパッケージングされている濃縮ウイルスベクターを含む形質導入緩衝液を含有する第2のインプットバッグを準備する工程；
b.  前記哺乳動物細胞集団を含有する第1のインプットバッグ及び前記哺乳動物細胞集団にとって異質な遺伝子材料がパッケージングされている濃縮ウイルスベクターを含む形質導入緩衝液を、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、前記ローターが動いて前記チャンバー内の対向流が前記チャンバー内に反力をもたらしている間に添加する工程；
c.  興味ある遺伝子材料がパッケージングされている濃縮ウイルスベクターを含む形質導入緩衝液を細胞の周囲で循環させることによって、前記哺乳動物細胞集団にとって異質な遺伝子材料がパッケージングされた濃縮ウイルスベクターと共に前記哺乳動物細胞集団をインキュベートする工程（ここで、前記インキュベート工程は、前記ウイルスベクターから遺伝子材料を前記哺乳動物細胞集団の亜集団に導入して、前記哺乳動物細胞のトランスフェクトされた亜集団を形成するのに有効である）；
d.  下記
(i)不均一細胞集団内のトランスフェクトされた亜集団によって選択的に発現される細胞抗原を特異的に認識してそれに結合する薬剤を含む捕獲粒子と共に前記哺乳動物細胞集団をインキュベートし；
(ii)前記薬剤を含む捕獲粒子を細胞の標的集団に結合して、細胞のトランスフェクトされた標識化亜集団を形成することによって、
前記哺乳動物細胞のトランスフェクトされた亜集団を選択的に標識する工程；
e.  遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、前記ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に、洗浄緩衝液を通す工程（ここで、前記洗浄緩衝液は、非結合細胞及び非結合捕獲粒子を前記チャンバーから除去する）；
f.  前記特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤に結合した細胞が前記不均一細胞懸濁液に対して濃縮されるように、前記特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤を含む捕獲粒子に結合した細胞のトランスフェクトされた亜集団をアウトプットバッグに収集する工程；及び
g.  前記(f)の細胞を、前記特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤から解離させる工程
を含み、この方法は、下記：
(i)前記収集細胞の汚染のリスクを減らすため；
(ii)前記収集細胞への損傷を減らすため；
(iii)前記収集細胞の生存能を維持するため；又は
(iv)(i)〜(iii)の組み合わせに
有効である、前記方法。
【請求項５７】
前記不均一細胞集団内のトランスフェクトされた細胞の亜集団を特異的に認識してそれに結合する薬剤を含む捕獲粒子の結合工程が、前記不均一細胞集団内の非標識細胞に比べて、各々のトランスフェクトされた細胞のサイズ、密度及び浮力の少なくとも1つを変えるのに有効である、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
さらに下記工程
前記遠心機ローターに埋め込まれた前記チャンバーに、前記ローターが動いて前記対向流が前記チャンバー内に反力をもたらしている間に、溶解剤を添加する工程（ここで、前記溶解剤はビーズを溶解させる）；及び
前記遠心機ローターに埋め込まれた前記チャンバーに、前記ローターが動いて前記対向流が前記チャンバー内に反力をもたらしている間に、洗浄緩衝液を通す工程（ここで、前記洗浄緩衝液は、前記溶解剤及び前記溶解したビーズを除去する）
を含む、請求項56に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、「生細胞を標識及び選択するための閉鎖システム」と称する米国仮特許出願第62/304,781号(2016年3月7日提出)、及び「生細胞を標識及び選択するための閉鎖システム」と称する米国仮特許出願第62/305,779号(2016年3月9日提出)に対する優先権の利益を主張する。各出願の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
記載発明は、一般的に細胞標識化、細胞分離及び不均一細胞懸濁液からの細胞の純粋集団の単離に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
細胞分離
細胞分離は、生物学的及び生物医学的研究並びに臨床治療に広く用いられている強力な手段である。細胞を別個の集団に選別する能力は、不均一出発集団(すなわち、混合物)から、他の細胞型が混入することなく単離された個々の細胞型の研究を可能にする(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng January-December 2013 vol.4 2041731412472690)。この技術は、細胞生物学の多くの発見を支え、さらに再生医療、癌治療及びHIV病因等の様々な分野の研究を可能にしている(Yang J et al. Biophys J 1999; 76: 3307-3314; Chan JW et al. Anal Chem 2008; 80: 2180-2187)。
【０００４】
生物学的／生物医学的研究における細胞分離
生物医学的研究では、組織工学及び再生医療、癌治療、並びに感染性疾患の病因といった多くの様々な目的のために細胞精製が広く利用されている(Guo KT et al. Stem Cells 2006; 24: 2220-2231; Takaishi S. et al. Stem Cells 2009; 27: 1006-1020; Terry VH et al. Virology 2009; 388: 294-304)。精製細胞集団の利用能は、例えば、細胞遺伝学的／分子マーカーの非存在下でのクローン性の診断を促進し、様々な新生物の腫瘍内細胞遺伝学的異種性及びクローン進化経路のみならず非腫瘍性障害についての知識増加に寄与し、幾つかある疾患の中で特に新生物(例えば多発性骨髄腫及び肥満細胞症)及び非新生物性免疫障害(例えば原発性免疫不全症)の診断及び予後評価に役立つ(Teodosio C et al. J Allergy Clin Immunol 2013; 132: 1213-1224; Escribano L et al. J Allergy Clin Immunol 2009; 124: 514-521; Lopez-Corral L et al. Clin Cancer Res 2011; 17: 1692-1700; Schmidt-Heiber M et al. Haematologica 2013; 98: 279-287; Fernandez C et al. Leukemia 2013; 27: 2149-2156)。
【０００５】
治療的／臨床的細胞分離
臨床展望からは、高効率細胞精製技術の利用が複数のヒト疾患の診断及び治療に顕著に貢献した(Will B et al. Best Pract Res Clin Haematol 2010; 23: 391-401; Jamieson CH et al. N Engl J Med 2004; 351: 657-667; Majeti R et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106: 3396-3401)。例えば、アフェレーシス(aphaeresis)による白血球の分離 (採血；血漿及び細胞への分離；細胞の再導入)及び免疫磁気分離による造血幹細胞の濃縮を含め、治療的又は臨床的細胞分離は、濃縮細胞集団を、当該細胞を臨床的に必要とする患者に導入できるようにする(Handgretinger R et al.Bone Marrow Transplant 1998; 21: 987-993; To LB et al.Blood 1997; 89: 2233-2258)。それは、個体の血液系内の細胞の計数をも可能にし、例えば、免疫アブレーション治療(患者の免疫能力の全身的破壊)を受けた多発性硬化症患者の免疫系の再生を助けることができる(Mancardi G and Saccarci R Lancet Neurol 2008; 7: 626-636)。
【０００６】
細胞分離に基づくほとんどの再生治療は、血液及び骨髄等の組織に限定されていた(To LB et al. Blood 1997; 89: 2233-2258; Stamm C et al.Lancet 2003; 361: 45-46)。しかしながら、幹細胞治療、組織工学及び再生医療の進歩により、脂肪及び腸等の種々の組織由来の細胞を用いる臨床的細胞ベース治療の可能性が明らかになった(Zuk PA et al. Mol Biol Cell 2002; 13: 4279-4295; Lanzoni G et al. Cytotherapy 2009; 11: 1020-1031)。臨床的細胞ベース治療における高選択性細胞分離手技の使用には、修復及びその後の臨床成績の質を改善する可能性がある。従って、組織工学及び再生医療におけるこれらの方法論の使用は増加したが、これらの分野に限定されていない。実際に、細胞選別は、例えば生化学、電気工学、物理学及び材料科学等の他の科学分野で使用されている(Ackerman SJ et al. J Biol Chem 2002; 277: 14859-14868; Howard D et al. Biochem Biophys Res Commun 2002; 299: 208-215; Yang J et al. Biophys J 1999; 76: 3307-3314; Chan JW et al. Anal Chem 2008; 80: 2180-2187)。
【０００７】
細胞精製技術
多種の細胞分離方法が利用可能であり、主に以下の4つの特徴に基づいている：(i) 細胞接着特性；(ii)密度及びサイズ；(iii)形態学的特性；並びに(iv)抗体結合免疫表現型特性(Almeida M et al. Pathobiology 2014; 81: 261-275; Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 2013; 4: 2041731412472690)。
【０００８】
細胞接着特性に基づく細胞精製
興味ある細胞集団のユニークな接着特性を利用する精製技術は、かなり単純で安価であり、酵素的に消化され、機械的に脱凝集され、及び／又は外植された細胞からの一次組織の単離のために広く使用されている(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 2013; 4: 2041731412472690)。しかしながら、ほとんどの場合、興味ある細胞の接着能がサンプル中の他の接着細胞によって共有されることも多いので、これらの技術は高純度をもたらさない。使用する接着表面の多様性及び特性に関しては顕著な進歩が見られたが(例えば細胞の高分子ブラシグラフト化ガラスビーズへの接着、ミクロ構造／ナノ構造化表面上の細胞接着及びリガンド特異性(タンパク質、ペプチド及びアプタマー)細胞接着)、接着ベース細胞単離の利用は、高純度を必要としない用途又は特異的細胞集団のネガティブ選択を必要とする用途に限定されている(例えば末梢血サンプルからの単球の枯渇)(Nagase K et al. Macromol Biosci 2012; 12: 333-340; Didar TF et al. Lab Chip 2010; 10: 3043-3053)。接着細胞が選択又は枯渇され得るまでインキュベーション時間(細胞培養条件で)が必要とされるので、これらの技術は、選択された接着細胞の微生物汚染をもたらす恐れがあり、選択された接着細胞の生化学的特性及び分子特性を変える可能性もある(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 2013; 4: 2041731412472690)。
【０００９】
細胞の密度及び／又はサイズに基づく細胞精製
頻繁に、興味ある細胞のユニークな密度及び／又はサイズが細胞精製に用いられる。密度に基づく技術は、現在はとんど遠心分離の使用に基づいているが、歴史的には沈降に基づく方法が利用されていた(Miller RG, Phillips RA J Cell Physiol 1969; 73: 191-201)。多数の細胞を、漸加的分離媒体(通常は糖に基づく)に対するそれらの密度に基づいて選別する能力は、これらの技術を特に、4×109〜6.5×109個の細胞/mLを含有する血液の使用を伴う分離に適用できるようにする。最も一般的に用いられる臨床細胞分離方法は、種々の状態の治療のために白血球を含め、単核細胞を単離するための全血のアフェレーシスである(Buckner D et al. Blood 1969; 33: 353-369)。しかしながら、密度に基づく方法の大規模使用にもかかわらず、異なる細胞集団の密度の違いとしての特異性に関する問題が未だにあり、場合によっては、個々の細胞型を分離するのに十分でない。これらの問題は、例えば、異なる濃度の遠心分離媒体及び異なる角速度を用いて繰り返し遠心分離を行なうことによって克服可能である。これらの技術を用いることによって、破壊した固形組織を含む複雑な混合物から様々な細胞型を単離することができる(Liu W et al. Proteomics 2011; 11: 2556-3564)。これは、技術的に実行可能であるが、高い特異性で行うのは未だに困難である。そのようなものとして、遠心分離法は一般的に、アフェレーシスにおいてのように、又は赤血球及び血小板のような細胞を除去するための前濃縮段階のように、特異性が絶対必要なわけではない場合に用いられる(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 2013; 4: 2041731412472690).。
【００１０】
主に血液含有サンプルから単核細胞(MNC)の特異的亜集団を単離するために用いられる、別の広く使用されている密度に基づく方法は、抗体媒介赤血球ロゼット形成に基づいている。この方法は、抗体結合法と密度に基づく細胞精製法の組み合わせに頼る。簡潔には、望ましくない細胞が抗体で特異的に標識され、その後、興味ある細胞の密度より高い密度の免疫ロゼットを形成する赤血球と複合体を形成する。サンプルの遠心分離後、望ましくない細胞を含有する免疫ロゼットは、サンプル中に共存する赤血球とペレットにされ、このようにして密度勾配遠心分離後静止期に標的細胞(例えば、MNC)の単離が可能になる(Strelkauskas AJ et al. Clin Exp Immunol 1975; 22: 62-71)。これらの技術は、赤血球ロゼット形成細胞のポジティブ選択のためにも使用可能である。該場合には、興味あるペレット化細胞の最終精製のためにはさらに赤血球溶解手順が必要とされる。
【００１１】
濾過技術は、細胞のユニークなサイズ関連特徴に基づく標的細胞の単離を伴う。濾過技術は、特に固形組織からの単一細胞懸濁液の調製中のデブリ、死細胞及び細胞凝集体の除去に有用な手法である。これらの技術は、比較的簡単な方法であり、一般的にさらなる細胞精製工程のための準備手段として細胞濃縮に利用される(Poynton CH et al. Lancet 1983; 1: 524)。単離すべき特異的細胞及び／又は細胞成分に応じて、異なる孔径を有し、別個の材料で作られるフィルターが用いられる(Autebert J et al. Methods 2012; 57: 297-307; Hosokawa M et al. Anal Chem 2010; 82: 6629-6635; Ji HM et al. Biomed Microdevices 2008; 10: 251-257; Lin HK et al. Clin Cancer Res 2010; 16: 5011-5018)。さらに、これらの方法は、大型細胞の単離に適用可能である(Orfao A and Riuz-Arguelles A Clin Biochem 1996; 29: 5-9)。しかしながら、濾過技術は通常、濾過プロセス中の顕著な細胞損失のため不十分な回収率を伴う。
【００１２】
細胞のサイズと密度の両特徴を併用する他の細胞選別技術が存在する。1つの該方法である遠心溶出法は、細胞精製目的に用いて成功した。この技術は、単工程手順において不必要な細胞による比較的低い相互汚染で生細胞の高回収率を可能にする(Bauer KD et al. Cancer Res 1982; 42: 72-78; Chavez-Crooker P et al. J Exp Biol 2001; 2014: 1433-1444; Worthington RE and Nakeff A Blood 1981; 58: 175-178; Schwarze PE et al. Cancer Res 1986; 46: 4732-4737)。細胞は、それらのユニークな沈降速度によって標的にされ；分離は、細胞サイズ、サンプル中の個別細胞の密度の差及び選択細胞単離媒体によって左右される(Lindahl PE Nature 1948; 161: 648)。
遠心溶出法の欠点としては、相対的に大量(>100mL)の種々のフラクション(特に少数の細胞を分離すべき場合)、特異的特徴(例えば、表面タンパク質、細胞形状等)を用いる分離の非存在及び同様の沈降特性を有する細胞を分離できないことが挙げられる(例えば、Figdor CG et al. J Immunol Methods 1984 Mar 30; 68(1-2): 73-87参照)。
【００１３】
抗体結合に基づく細胞精製
用語「抗体結合法」は通常、蛍光活性化細胞選別(fluorescence-activated cell sorting)(FACS)及び磁気活性化細胞選別(magnetic-activated cell sorting)(MACS)という一般的に用いられている技術を指す(Bonner WA et al. Rev Sci Instrum 1972: 43: 404-409; Miltenyi S et al. Cytomwtry 1990; 11: 231-238; Rembaum A et al. J Immunol Methods 1982; 52: 341-351)。両技術は、分離のために、抗体がそれに対して産生される細胞表面抗原を利用する。FACS分離はこれらの抗体への蛍光標識の結合に頼り、一方でMACSは酸化鉄含有ミクロビーズへの結合を利用する。複合抗体の結合後、FACS及びMACSは異なる経路を進行する。FACS分離は、結合したフルオロフォアのレーザー励起によって達成され、励起は、分離すべき対応細胞に信号を送る閾値準位より高い。MACSは、磁場に置いて保持すべき抗体標識細胞を必要とし；結合していない非標識細胞が溶出され、標識細胞は、磁気から引き離されると溶出され得、細胞集団が分離されることになる(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 4: 2041731412472690)。MACSは、個々のマーカー(いくつかのキットは、ミクロビーズの酵素的除去を用いるが、細胞を引き続き抗体で再標識できるようにする)に限定され、バルク法、すなわち、個々の細胞分析が存在しない方法と見なされることがある。しかしながら、FACSは、複数抗体で標識可能なそれぞれ個々の細胞を分析する。この個々の細胞分析は、FACSはより特異的であり得るが、MACSより顕著に遅いことを意味する。FACSによって数時間かかる選別がMACSでは1時間未満で達成可能である(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 4: 2041731412472690)。
【００１４】
抗体に基づく分離方法は、個々の細胞集団選択の現在のゴールドスタンダードであり、FACS及びMACSの両方法を用いて細胞集団を高純度に単離することができる。これにもかかわらず、これらの技術を用いることには依然として欠点がある。抗体を細胞に結合する通常の方法は、手動のオープンプロセスである。すなわち、抗体及び細胞を容器に加えてロッキング装置上でインキュベートする。インキュベーション後に、非結合抗体を除去しなければならない。これは伝統的に遠心分離によって達成され、細胞をペレット化し、結果として物理的損傷及び細胞死をもたらすことが多い。さらに、ユニークな細胞内マーカーを含有する細胞の生きた均一集団の単離も、マーカーを染色するために必要な透過処理工程が細胞膜を傷つけて細胞死につながることがあるので、問題になり得る(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 4: 2041731412472690)。これらの技術はオープンプロセス(すなわち、環境にさらされる)を伴うので、細胞分離生成物の微細物汚染が課題として残る(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 4: 2041731412472690)。
【００１５】
臨床細胞治療
臨床細胞治療のために現在行われている分離の大半は、骨髄及び血液等の組織から単離した細胞を用いる(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 4: 2041731412472690)。これらの分離は、幹細胞を含め、単核細胞を単離し、例えば、慢性骨髄性白血病を患う患者の造血系を免疫アブレーション治療後に修復するために使用可能である(Mancardi G and Saccardi R Lancet Neurol 2008; 7: 626-636)。これらの分離は主に、遠心分離に基づくシステム、例えばアフェレーシス(ドナーの体からの血液の回収、1種以上の血液成分(例えば、血漿、血小板、白血球)の除去、及び残存血液をドナーに戻す輸注)を利用する。これらの技術は、細胞移植に必要な多数の単核細胞の迅速な単離を可能にするからである(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 4: 2041731412472690)。
臨床診断に使用できるフローサイトメーターもあるが、細胞治療のための臨床使用には、FACSに基づく標準システムがない(Brown M and Wittwer C Clin Chem 2000; 46: 1221-1229)。これは、一部は、単回使用の無菌流体開発の困難さ、流体を複数回用いた場合の相互汚染の可能性、及びバッチ間の一貫性の問題のためである(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 4: 2041731412472690)。
【００１６】
診療細胞分離は、厳密な要件並びに克服する課題及び困難さを伴う確立された分野である。主要件は、一貫した無菌細胞集団を確実に単離することである。細胞分離生成物の微生物汚染は、多くの場合、免疫無防備状態で、感染症と闘うことができないレシピエント患者の感染症につながる恐れがある。従って、臨床細胞分離生成物が、ストリンジェントなバッチ試験を伴う閉じた(すなわち、無菌の、環境に対して自己完結／閉鎖した)厳密なGMP条件で生成されることが不可避である。移植中に所要の細胞型及び細胞数をレシピエントが確実に受けるためには単離細胞集団の一貫性も非常に重要である(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 4: 2041731412472690)。
【００１７】
現在、臨床細胞分離の主要課題は、細胞の大きい初期プールからの、複数の表面マーカーを有する希少細胞集団のロバストな単離である。例えば、遠心分離に基づく技術は、大きい初期細胞数からの細胞の単離を可能にし、MACSに基づく技術は、細胞の特異的集団を単離することができる。しかしながら、細胞をペレット化する遠心分離は、物理的損傷及び細胞死をもたらすことが多い。さらに、遠心分離法もMACS法もオープンプロセスを伴い(すなわち、環境にさらされ)、細胞分離生成物の微生物汚染が課題として残る(Tomlinson MJ et al. J Tissue Eng 4: 2041731412472690)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、最初の原料物質から選択細胞集団への細胞選択プロセスを、選択細胞集団への損傷、及びその汚染を排除しながら実施できるシステム及び方法に対する必要性がある。記載発明は、最初の細胞濃縮、細胞標識化、及び細胞洗浄を効率的に実施し、サイズに基づいて選択された細胞の直接送達をもたらすことができる自動化閉鎖オールインワンシステムを提供する。記載発明は、人的過誤のリスクを減らし(すなわち、自動化され)、汚染のリスクを減らし(すなわち、閉鎖システム)、選択細胞集団の損傷を防止する(すなわち、細胞の沈降／ペレット化を必要としない)。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の簡単な概要
一態様によれば、記載発明は、標的細胞集団を選択するための自動化閉鎖システムであって、下記：生理学的媒体に懸濁した細胞の集団を含むインプットバッグ；細胞の集団がその中を通る、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバー；細胞の集団の亜集団を同定し、細胞の集団の亜集団を選択し、選択後に細胞の集団の亜集団から遊離されるように適応された薬剤を含む捕獲粒子注射器；遊離した捕獲粒子、若しくは選択された細胞、又は両方を含むアウトプットバッグ；及び洗浄緩衝液を含む緩衝液バッグを含むシステムを提供する。
一実施形態によれば、捕獲粒子注射器は、細胞の集団の亜集団の表面上の細胞表面マーカーを認識してそれに結合するように適応された捕獲粒子を含む。別の実施形態によれば、捕獲粒子は、細胞表面マーカーを認識してそれに結合する標識薬剤を含む。
一実施形態によれば、自動化閉鎖システムは、捕獲粒子に結合していない細胞及び細胞に結合していない捕獲粒子を含む標識バッグをさらに含む。
一実施形態によれば、薬剤はさらにビーズに結合している。
一実施形態によれば、細胞の集団は均一細胞集団である。別の実施形態によれば、細胞の集団は不均一細胞集団である。
一実施形態によれば、自動化閉鎖システムはさらにポンプを含む。
一実施形態によれば、チャンバーは三角形である。
一実施形態によれば、細胞表面マーカーを認識してそれに結合するように適応された標識薬剤は抗体である。
【００２０】
一実施形態によれば、洗浄緩衝液は、トリス緩衝食塩水(TBS)、リン酸緩衝食塩水(PBS)、トリス緩衝食塩水-ツイーン20(TBST)、リン酸緩衝食塩水-ツイーン20(PBST)、PBS中のトリエタノールアミン及び生理学的媒体から成る群より選択される。別の実施形態によれば、生理学的媒体は、イーグル基礎培地(BME)、ダルベッコリン酸緩衝食塩水(DPBS)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、DMEM-F12培地、F-10栄養混合物、グラスゴー改変最小必須培地(GMEM)、イスコヴ(Iscove)改変ダルベッコ培地(IMDM)、ライボビッツ(Leibovitz)L-15培地、マッコイ(McCoy)5A培地、MCDB 153培地、培地199、最小必須培地(MEM)、最小必須培地α(MEMA)、RPMI 1640培地、CliniMACS(登録商標)緩衝液、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、TexMACs(商標)培地、及びウェイマス(Waymouth)MB752/1培地から成る群より選択される。
【００２１】
一実施形態によれば、自動化閉鎖システムは、ビーズの溶解に有効な溶解剤を含む溶解剤バッグをさらに含む。別の実施形態によれば、溶解剤バッグはカルシウムキレート剤を含む。別の実施形態によれば、カルシウムキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)；エチレングリコール四酢酸(EGTA)；1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N’,N’-四酢酸(BAPTA)；メシル酸デフェロキサミン、鉄キレート剤IV、21H7；及びN,N,N’,N’-テトラキス(2-ピリジルメチ)エタン-1,2-ジアミン(TPEN)から成る群より選択される。別の実施形態によれば、カルシウムキレート剤はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)である。
一実施形態によれば、ビーズは天然高分子を含む。別の実施形態によれば、天然高分子は、アルギナート、アルギン酸誘導体、アガロース、架橋アガロース(Sepharose(登録商標))、コラーゲン及びキトサンから成る群より選択される。別の実施形態によれば、天然高分子はアルギナートである。別の実施形態によれば、ビーズはアルギナートで被覆されたデキストランを含む。別の実施形態によれば、ビーズはミクロビーズである。
【００２２】
一実施形態によれば、抗体は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体及び合成抗体模倣物から成る群より選択される。別の実施形態によれば、モノクロナール抗体は、合成抗体及び改変(engineered)抗体から成る群より選択される。別の実施形態によれば、合成抗体は組換え抗体である。別の実施形態によれば、組換え抗体は、単鎖可変フラグメント(scFv)抗体、核酸アプタマー及び非免疫グロブリンタンパク質スキャフォールドから成る群より選択される。別の実施形態によれば、改変抗体は、キメラ抗体及びヒト化抗体から成る群より選択される。
【００２３】
別の態様によれば、記載発明は、請求項1に記載の自動化閉鎖システムを用いて不均一細胞懸濁液から細胞の実質的に純粋な集団を単離する方法であって、下記工程：遠心機ローターに埋め込まれたチャンバー内で、ローターが動いてチャンバー内の対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に、不均一細胞集団を捕獲粒子と混合する工程（ここで、捕獲粒子は、特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤に結合したビーズを含む）；遠心機ローターに埋め込まれたチャンバー内で、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に、細胞を捕獲粒子に結合する工程（ここで、捕獲粒子に結合した細胞は、特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤によって認識された特異的細胞表面マーカーを発現する）；遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に、洗浄緩衝液を通す工程（ここで、洗浄緩衝液は非結合細胞及び非結合捕獲粒子をチャンバーから除去する）；特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤に結合した細胞を収集する工程（ここで、特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤に結合した細胞は、不均一細胞懸濁液に対して濃縮されている）；及びd.の細胞を、特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤から解離させる工程を含み、この方法は、収集細胞の汚染のリスクを減らすため；収集細胞への損傷を減らすため；収集細胞の生存能を維持するため；又はその組み合わせに有効である、方法を提供する。
【００２４】
一実施形態によれば、ビーズは天然高分子を含む。別の実施形態によれば、天然高分子は、アルギナート、アルギン酸誘導体、アガロース、架橋アガロース(Sepharose(登録商標))、コラーゲン及びキトサンから成る群より選択される。別の実施形態によれば、天然高分子はアルギナートである。別の実施形態によれば、ビーズはアルギナートで被覆されたデキストランを含む。別の実施形態によれば、ビーズはミクロビーズである。
一実施形態によれば、特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤は抗体である。別の実施形態によれば、抗体は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、改変抗体、及び合成抗体模倣物から成る群より選択される。別の実施形態によれば、合成抗体模倣物は組換え抗体である。別の実施形態によれば、組換え抗体は、単鎖可変フラグメント(scFv)抗体、核酸アプタマー及び非免疫グロブリンタンパク質スキャフォールドから成る群より選択される。別の実施形態によれば、改変抗体は、キメラ抗体及びヒト化抗体から成る群より選択される。
【００２５】
一実施形態によれば、細胞表面マーカーを認識する薬剤は抗体である。別の実施形態によれば、抗体は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、改変抗体、及び合成抗体模倣物から成る群より選択される。別の実施形態によれば、合成抗体模倣物は組換え抗体である。別の実施形態によれば、組換え抗体は、単鎖可変フラグメント(scFv)抗体、核酸アプタマー及び非免疫グロブリンタンパク質スキャフォールドから成る群より選択される。別の実施形態によれば、改変抗体は、キメラ抗体及びヒト化抗体から成る群より選択される。
一実施形態によれば、洗浄緩衝液は、トリス緩衝食塩水(TBS)、リン酸緩衝食塩水(PBS)、トリス緩衝食塩水-ツイーン20(TBST)、リン酸緩衝食塩水-ツイーン20(PBST)、PBS中のトリエタノールアミン及び生理学的媒体から成る群より選択される。別の実施形態によれば、生理学的媒体は、イーグル基礎培地(BME)、ダルベッコリン酸緩衝食塩水(DPBS)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、DMEM-F12培地、F-10栄養混合物、グラスゴー改変最小必須培地(GMEM)、イスコヴ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ライボビッツL-15培地、マッコイ5A培地、MCDB 153培地、培地199、最小必須培地(MEM)、最小必須培地α(MEMA)、RPMI 1640培地、CliniMACS(登録商標)緩衝液、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、TexMACs(商標)培地及びウェイマスMB752/1培地から成る群より選択される。
【００２６】
一実施形態によれば、本方法は、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に溶解剤を添加する工程（ここで、溶解剤はビーズを溶解させる）をさらに含む。
一実施形態によれば、本方法は、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に洗浄緩衝液を通す工程（ここで、洗浄緩衝液は、溶解剤及び溶解したビーズを除去する）をさらに含む。
一実施形態によれば、溶解剤はカルシウムキレート剤である。別の実施形態によれば、カルシウムキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)；エチレングリコール四酢酸(EGTA)；1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N’,N’-四酢酸(BAPTA)；メシル酸デフェロキサミン、鉄キレート剤IV、21H7；及びN,N,N’,N’-テトラキス(2-ピリジルメチ)エタン-1,2-ジアミン(TPEN)から成る群より選択される。別の実施形態によれば、カルシウムキレート剤はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)である。
一実施形態によれば、収集工程は、遠心機ローターの動きを止めるか、対向流の速度を上げるか又はその組み合わせによって行なわれる。
一実施形態によれば、汚染は、細菌汚染、ウイルス汚染、真菌汚染及び細胞デブリから成る群より選択される。
一実施形態によれば、損傷は、細胞膨潤、脂肪蓄積、代謝不全、構造的損傷／劣化及びアポトーシスから成る群より選択される。
【００２７】
一実施形態によれば、解離工程は、解離溶液を用いて行なわれる。別の実施形態によれば、解離溶液は、pH溶液、イオン強度溶液、変性溶液及び有機溶液から成る群より選択される。別の実施形態によれば、pH溶液は、100mMのグリシン-HCl、pH 2.5〜3.0；100mMのクエン酸、pH 3.0；50〜100mMのトリメチルアミン又はトリエタノールアミン、pH 11.5；及び150mMの水酸化アンモニウム、pH 10.5から成る群より選択される。別の実施形態によれば、イオン強度溶液は、10mMのトリス中3.5〜4.0Mの塩化マグネシウム、pH 7.0；10mMのリン酸緩衝液中5Mの塩化リチウム、pH 7.2；2.5Mのヨウ化ナトリウム、pH 7.5；及び0.2〜3.0Mのチオシアン酸ナトリウムから成る群より選択される。別の実施形態によれば、変性溶液は、2〜6Mのグアニジン-HCl；2〜8Mの尿素；1%のデオキシコラート；及び1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)から成る群より選択される。別の実施形態によれば、有機溶液は、10%のジオキサン及び50%のエチレングリコール、pH 8〜11.5から成る群より選択される。
【００２８】
一実施形態によれば、本方法は、細胞の標識化標的亜集団のサイズ、密度、浮力又はその組み合わせに基づいて不均一細胞集団から細胞の標識化標的亜集団を単離する工程（ここで、捕獲粒子は、標的細胞のサイズ、密度、浮力又はその組み合わせを変えるのに有効であり、かつ不均一細胞集団内で細胞の標的亜集団を特異的に認識してそれに結合する薬剤を含む捕獲粒子の結合は、不均一細胞集団中の非標識細胞に対して各標的細胞のサイズ、密度及び浮力の少なくとも1つを変えるのに有効である）をさらに含む。
【００２９】
別の態様によれば、記載発明は、哺乳動物細胞における効率的なウイルス媒介遺伝子導入方法であって、下記工程：哺乳動物細胞集団を含有する第1のインプットバッグ及び哺乳動物細胞集団にとって異質な遺伝子材料がパッケージングされている濃縮ウイルスベクターを含む形質導入緩衝液を含有する第2のインプットバッグを準備する工程；哺乳動物細胞集団を含有する第1のインプットバッグ及び哺乳動物細胞集団にとって異質な遺伝子材料がパッケージングされている濃縮ウイルスベクターを含む形質導入緩衝液を、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いてチャンバー内の対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に添加する工程；興味ある遺伝子材料がパッケージングされている濃縮ウイルスベクターを含む形質導入緩衝液を細胞の周囲で循環させることによって、哺乳動物細胞集団にとって異質な遺伝子材料がパッケージングされた濃縮ウイルスベクターと共に哺乳動物細胞集団をインキュベートする工程（ここで、インキュベート工程は、ウイルスベクターからの遺伝子材料を哺乳動物細胞集団の亜集団に導入して哺乳動物細胞のトランスフェクトされた亜集団を形成するのに有効である）；不均一細胞集団内のトランスフェクトされた亜集団によって選択的に発現される細胞抗原を特異的に認識してそれに結合する薬剤を含む捕獲粒子と共に哺乳動物細胞集団をインキュベートすることによって、哺乳動物細胞のトランスフェクトされた亜集団を選択的に標識する工程；薬剤を含む捕獲粒子を細胞の標的集団に結合して、トランスフェクトされた標識亜集団を形成する工程；遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に洗浄緩衝液を通す工程（ここで、洗浄緩衝液は、非結合細胞及び非結合捕獲粒子をチャンバーから除去する）；特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤に結合した細胞が不均一細胞懸濁液に対して濃縮されるように、特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤を含む捕獲粒子に結合した細胞のトランスフェクトされた亜集団をアウトプットバッグに収集する工程；及び(f)の細胞を、特異的細胞表面マーカーを認識する薬剤から解離させる工程を含み、この方法は、収集細胞の汚染のリスクを減らすため；収集細胞への損傷を減らすため；収集細胞の生存能を維持するため；又はその組み合わせに有効である、方法を提供する。
【００３０】
一実施形態によれば、不均一細胞集団内の細胞のトランスフェクトされた亜集団を特異的に認識してそれに結合する薬剤を含む捕獲粒子の結合は、不均一細胞集団中の非標識細胞に比べて各々のトランスフェクトされた細胞のサイズ、密度及び浮力の少なくとも1つを変えるのに有効である。
一実施形態によれば、本方法は、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いて対向流がチャンバー内で反力をもたらしている間に溶解剤を添加する工程（ここで、溶解剤はビーズを溶解させる）；及び遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いて対向流がチャンバー内で反力をもたらしている間に洗浄緩衝液を通す工程（ここで、洗浄緩衝液は、溶解剤及び溶解したビーズを除去する）をさらに含む。
本発明のこれら及び他の利点は、下記詳細な説明及び添付図面を参照して当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】記載発明の略図を示す。
【図２】向流遠心分離の原理の略図を示す(Beckman Coulter’s Optimizing Cell Separation with Beckman Coulter’s Centrifugal Elutriation Systemから)。
【図３】記載発明の方法の略図を示す。
【図４】記載発明を用いて実施される形質導入プロセスの略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
用語集
本明細書で使用する用語「アブレーション」は、外科手技若しくは病的プロセス、又は有害物質の存在若しくは適用による体の一部の除去又はその機能の破壊を指す。本明細書で使用する用語「免疫アブレーション」、「イムノアブレーション」、「免疫アブレーション療法」、「イムノアブレーション療法」、「免疫アブレーション治療」及び「イムノアブレーション治療」は、患者の免疫応答能の全身破壊を指す。例えば、臓器移植のために患者を整えるため、又は特に、限定するものではないが、自家幹細胞を含め、細胞の移植術による免疫再構築がその後に続くときに難治性自己免疫疾患を治療するために利用されることが多い。
本明細書で使用する用語「親和性」は、単一の抗原結合部位と単一の抗原決定基(例えば、抗体と抗原)との間の相互作用の強度の熱力学的表現を指す。親和性は、会合定数Kとして表される。本明細書で使用する用語「高親和性」は、強い分子間引力(すなわち、高／強結合性)を指す。本明細書で使用する用語「低親和性」は、弱い分子間引力(すなわち、低／弱結合性)を指す。
【００３３】
本明細書で使用する用語「抗体」には、例として天然起源の抗体と非天然起源の抗体が両方含まれる。詳細には、用語「抗体」には、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体、並びにそのフラグメントが含まれる。さらに、用語「抗体」には、キメラ抗体及び完全合成抗体、並びにそのフラグメントが含まれる。
抗体は、血清タンパク質であり、その分子は、それらの標的に関する小さい化学分類に相補性である、それらの表面の小領域を有する。これらの相補領域(抗体結合部位又は抗原結合部位と呼ばれる)は、抗体1分子当たり少なくとも2つあり、抗体分子のタイプによっては10、8個、又は一部の種では12個もあり、抗原上のそれらの対応相補領域と反応して、多価抗原のいくつかの分子を結び付けて格子を形成することができる。
全抗体分子の基本的構造単位は、4つのポリペプチド鎖、すなわち2つの同一軽(L)鎖(それぞれ約220のアミノ酸を含有する)及び2つの同一重(H)鎖(それぞれ通常は約440のアミノ酸を含有する)から成る。2つの重鎖及び2つの軽鎖は、非共有結合及び共有(ジスルフィド)結合の組み合わせによって一緒に保持されている。分子は2つの同一の半分で構成され、それぞれ軽鎖のN末端領域と重鎖のN末端領域で構成された同一の抗原結合部位を有する。軽鎖も重鎖も通常は協同して抗原結合表面を形成する。
【００３４】
ヒト抗体は、2種類の軽鎖、κ及びλを示し；免疫グロブリンの個々の分子は一般的にどちらか一方のみである。正常血清では、分子の60%がκ決定基を有し、30パーセントがλを有することが分かった。多くの他の種は、2種類の軽鎖を示すが、それらの特性は異なることが分かっている。例えば、マウス及びラットでは、λ鎖を構成するが全体の数パーセントであり；イヌ及びネコでは、κ鎖が非常に少なく；ウマはいずれのκ鎖をも持たないようであり；ウサギは、株及びb遺伝子座アロタイプに応じて5〜40%のλを有することがあり；ニワトリ軽鎖はκよりλに相同性である。
哺乳動物では、5クラスの抗体、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMがあり、それぞれそれ自体のクラスの重鎖α(IgAについて)、δ(IgDについて)、ε(IgEについて)、γ(IgGについて)及びμ(IgMについて)がある。さらに、それぞれγ1、γ2、γ3、及びγ4重鎖を有する4つのサブクラスのIgG免疫グロブリン(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)がある。その分泌形態では、IgMは、全部で10個の抗原結合部位をそれに与える5つの4鎖単位で構成される五量体である。各五量体は、2つの隣接尾部間に共有結合により挿入されているJ鎖の1つのコピーを含有する。
全ての5つの免疫グロブリンクラスは、それらが広範な電気泳動移動度を示し、均一でないという点で他の血清タンパク質と異なる。個々のIgG分子が、例えば、互いに正味電荷が異なるというこの不均一性は、免疫グロブリンの内在特性である。
【００３５】
モノクロナール抗体(mAb)は、免疫化ドナーからのマウス脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞株と融合して、選択培地内で成長する樹立マウスハイブリドーマクローンをもたらすことによって作製可能である。ハイブリドーマ細胞は、抗体分泌B細胞と骨髄腫細胞のインビトロ融合から生じる不死化ハイブリッド細胞である。培養内の抗原特異性B細胞の一次活性化を指すインビトロ免疫化は、マウスモノクロナール抗体を作製するための別の確立した手段である。
末梢血リンパ球からの免疫グロブリン重鎖(VH)及び軽鎖(Vκ及びVλ)可変遺伝子の多様なライブラリーはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅法によって増幅することもできる。重鎖及び軽鎖可変ドメインがその中でポリペプチドスペーサー(単鎖Fv又はscFv)によって連結されている単一ポリペプチドをコードする遺伝子は、重鎖及び軽鎖のV遺伝子をPCRを用いてランダムに組み合わせることによって作製可能である。次に糸状バクテリオファージの表面上のディスプレイ用にファージ先端における微量コートタンパク質への融合によってコンビナトリアルライブラリーをクローンニングすることができる。
【００３６】
先導選択の技術は、ヒト免疫グロブリンV遺伝子とげっ歯類の免疫グロブリンV遺伝子のシャフリングに基づいている。この方法は、(i)ヒトλ軽鎖のレパートリーと、興味ある抗原と反応性のマウスモノクロナール抗体の重鎖可変領域(VH)ドメインのシャフリング；(ii)当該抗原上の半ヒトFabsの選択；(iii)選択したλ軽鎖遺伝子を第2のシャフリングでヒト重鎖のライブラリー用「ドッキングドメイン」として用いて、ヒト軽鎖遺伝子を有するクローンFabを単離すること；(v)該遺伝子を含有する哺乳動物細胞発現ベクターを用いてエレクトロポレーションによりマウス骨髄腫細胞にトランスフェクトすること；及び(vi)抗原と反応性のFabのV遺伝子を、マウス骨髄腫のλ抗体分子である完全IgG1として発現させることを必要とする。
用語「抗原」及びその種々の文法的形態は、抗体の産生を刺激することができ及び／又はそれらと特異的に結合できるいずれの物質をも指す。本明細書で使用する用語「抗原決定基」又は「エピトープ」は、分子上の抗原性部位を指す。連続的抗原決定基／エピトープは、本質的に直鎖である。らせん状高分子又はタンパク質等の規則正しい構造においては、抗原決定基／エピトープは、アミノ酸側鎖を含む構造の表面の中又は上の、互いに接近し得る、分子の異なる部分から本質的に限定された領域又はパッチとなる。これらはコンフォメーション決定基である。
【００３７】
本明細書で使用する用語「抗原提示細胞(APC)」は、T細胞に抗原を提示するために用いられる免疫系の細胞を指す。APCとしては、限定するものではないが、樹状細胞、単球、マクロファージ、マージナルゾーンクッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、T細胞、及びB細胞が挙げられる。抗原提示細胞は、それらの表面上でタンパク質分子のいくつかの型を呈する。それには、限定するものではないが、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)タンパク質；共刺激タンパク質；及び細胞-細胞接着分子がある。
本明細書で使用する用語「アフェレーシス」は、ドナーの体からの血液の回収、1種以上の血液成分(例えば、血漿、血小板、白血球等)の除去、及び残存血液をドナーに戻す輸注を指す。
本明細書で使用する用語「会合する(associate)」及びその種々の文法的形態は、直接、間接的に、活発に、不活発に、不活性に、不活性でなく、完全に又は不完全に接合すること(joining)、連結すること(connecting)又は化合すること(combining)を意味する。会合したには「連結した」が含まれる。
本明細書で使用する用語「自動化する」は、手動操作を用いる代わりに、機械、コンピューター等を用いることによって、装置、システム等を実行又は操作することを指す。
【００３８】
用語「結合する」は、〜と化合することを意味する。
本明細書で使用する用語「特異的に結合する」は、相補性の原理を指し、鍵穴に鍵を指し込むことと比べられることが多く、2個の反応分子が互いに非常に密接に接近でき、かつ実際に非常に近いので、一方の分子の突出する構成原子又は原子群が他方の分子の相補的くぼみ又は凹所に適合できるときにだけ効果的に作用できる比較的弱い結合力(疎水性水素結合、ファンデルワールス力、及びイオン相互作用)を伴う。抗原-抗体相互作用は、多くのレベルで顕性な高度の特異性を示す。分子レベルまで引き下げると、結合特異性は、抗原への抗体の結合部位が、非関連抗原の結合決定基と全く類似しない相補性を有することを意味する。2つの異なる抗原の抗原決定基がいくつかの構造的類似性を有するときはいつでも、いくつかの抗体の結合部位への一方の決定基の適合が他方の決定基にある程度生じることがあり、この現象が交差反応を引き起こす。抗原-抗体反応の相補性又は特異性の理解には交差反応が非常に重要である。免疫学的特異性又は相補性は、抗原の中の少量の不純物／汚染物の検出を可能にする。本明細書で使用する用語「多特異性」は、複数の抗原への抗体の結合性を指す。
【００３９】
用語「結合」、又は「化学結合」、又は「結合した」は、本明細書では互換的に用いられ、より大きい化合物の形成を可能にする原子、より大きい分子のみ又はその一部の間の引力を指す。結合という用語は、例えば、共有結合、イオン結合、ハロゲン結合、水素結合、ファンデルワールス力、及び疎水性効果等の全ての異なる強度及び型を含む。
本明細書で使用する用語「細胞表面マーカー」は、特定型の細胞の表面上に見られる抗原決定基又はエピトープを指す。細胞表面マーカーは、細胞型の特徴づけ、細胞型の同定、及び細胞型の単離を促進することができる。細胞選別技術は、細胞バイオマーカーに基づき、細胞表面マーカー(複数可)は、ポジティブ選択又はネガティブ選択、すなわち、細胞集団を含めるか又は排除するかに利用可能である。
本明細書で使用する用語「キメラ抗体」は、げっ歯類抗体定常領域がヒト抗体に見られる配列と交換されている抗体を指す。
本明細書で使用する用語「閉鎖システム」又は「単離システム」は、その周囲から単離され、その周囲との物質又はエネルギーの交換を許さず、かつ該システムの外部にその起源がある如何なる力をも受けない物理システムを指す。
本明細書で使用する用語「表面抗原分類(cluster of differentiation)(CD)」は、細胞型及び分化段階を特定し、かつ抗体によって認識される、細胞表面分子の規定サブセットを指す。CD分子は、多数のやり方で作用することができ、多くの場合、受容体又はリガンドとして作用し；CD分子によってシグナルカスケードが開始されて、細胞の挙動を変える。いくつかのCDタンパク質は、細胞シグナル伝達に役割を果たさないが、細胞接着等の他の機能を有する。一般に、提唱された表面分子は、該分子に2つの特定モノクロナール抗体(mAb)が結合することが分かり次第、CDメンバーに割り当てられる。分子が十分に特徴づけされないか、又は1つのmAbしか持たなければ、該分子は通常、仮の指標「w」が与えられる。ヒトについては350超のCD分子が同定されている。
CD分子は、フローサイトメトリーを含め、種々の方法によって細胞選別に利用される。細胞集団は、通常は「+」又は「-」記号を用いて定義されて、特定細胞フラクションが発現する(「+」)か又はCD分子を欠く(「-」)かを表す。例えば、「CD34+、CD31-」細胞は、CD34を発現するが、CD31を発現しない細胞である。下表1は、区別した白血球型を同定及び特徴づけするために当業者が利用する一般的なマーカーを示す。
【００４０】
2019509763.tif 000003
【００４１】
白血球の定義に用いられるCD分子は、細胞表面上に限らないマーカーである。大部分のCD分子は重要な機能を有するが、既知CD分子の小部分しか特徴づけされていない。
本明細書で使用する用語「相補性決定領域」は、特異的抗体(Ab)結合を決定する免疫グロブリン(Ig)超可変ドメインを指す。軽鎖(VL)及び重鎖(VH)の両可変領域に6個のCDRがあり、これらのCDRの両側にバックグラウンド可変性がある。特異性が異なる抗体(Abs)は、異なるVHドメインを有する同一VLドメインを構築することができる。CDR間のフレームワーク配列は、類似又は同一であり得る。
本明細書で使用する用語「抱合する(conjugate)」又は「抱合された(conjugated)」は、別の物質と可逆的に結合すること、共役すること(coupling)又は連結すること(connecting)を指す。
本明細書で使用する用語「連結された(connected)」は、密接な連関で接合され(joined)、連結され(linked)、又は一緒に固定され(fastened)ていることを指す。例えば、化合物の文脈では、用語「に連結された」は、直接又は間接的化学結合を介した2個の原子又は分子間の引力又は連結を指す。
本明細書で使用する用語「培地」、「培養液」、及び「生理学的媒体」は、一般的に生きている細胞の培養のために用いるいずれの調合液をも指す。「細胞培養」は、インビトロで培養される細胞を指す。
【００４２】
本明細書で使用する用語「サイトメトリー」は、ほぼ同じサイズ又は段階の単細胞、或いは拡張して、他の生物学的又は非生物学的粒子の物理的及び／又は化学的特性を測定するプロセスを指す。フローサイトメトリーにおいては、流体ストリーム中で測定装置(フローサイトメーター)を通過する細胞又は粒子として測定を行なう。セルソーター、又はフローソーターは、電気的及び／又は機械的手段を用いて、使用者が選択した値の範囲内に入る測定特性を有する細胞(又は他の小粒子)を迂回させ、収集するフローサイトメーターである。
本明細書で使用する用語「誘導体」は、1つ以上の工程で、類似構造の別の化合物から生成され得る化合物を指す。ペプチド又は化合物の「誘導体(複数可)」は、該ペプチド又は化合物の望ましい機能を少なくともある程度保持する。従って、「誘導体」の代替用語は「機能性誘導体」であり得る。誘導体は、ペプチドの化学的修飾、例えばアルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨウ素化、又はペプチドを誘導体化するいずれの修飾をも含むことができる。このような誘導体化分子としては、例えば、フリーのアミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルマール基を形成する当該分子が挙げられる。フリーのカルボキシル基が誘導体化されて、塩、エステル、アミド、又はヒドラジドを形成し得る。フリーのヒドロキシル基が誘導体化されて、O-アシル又はO-アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素が誘導体化されてN-im-ベンジルヒスチジンを形成し得る。誘導体又は類似体として、12個の標準的アミノ酸、例えば、4-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシリシン、3-メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチン又はカルボキシグルタミアト(carboxyglutamiate)の1つ以上の天然起源のアミノ酸誘導体を含有し、かつペプチド結合で連結されていないアミノ酸を含むことができる当該ペプチドも含まれる。このようなペプチド誘導体は、ペプチドの合成中に組み込まれることがあり、或いは周知化学的修飾法によってペプチドを修飾することができる(例えば、Glazer et al., Chemical Modification of Proteins, Selected Methods and Analytical Procedures, Elsevier Biomedical Press, New York (1975)参照)。
【００４３】
本明細書で使用する用語「識別標識」は、一般的に、単一細胞又は生物の成分、小分子、巨大分子、例えば、タンパク質、及び他の構造体を特徴づけるか又は対比させるために用いられる染色、色素、マーカー、抗体若しくは抗体と色素の組み合わせ、又は内因的蛍光細胞関連分子を指す。本明細書で使用する用語「色素」(「蛍光色素」又は「フルオロフォア」とも呼ばれる)は、分子を蛍光性にする分子の成分を指す。この成分は、分子中の、特異的な波長のエネルギーを吸収し、異なる(が等しく特異的な)波長でエネルギーを再放出する官能基である。放出されるエネルギーの量及び波長は、色素及び色素の化学的環境の両方に左右される。多くの色素が知られており、限定するものではないが、FITC、R-フィコエリトリン(PE)、PE-Texas Red Tandem、PE-Cy5 Tandem、プロピジウムヨーデム(propidium iodem)、EGFP、EYGP、ECF、DsRed、アロフィコシアニン(APC)、PerCp、SYTOX Green、クマリン(courmarin)、Alexa Fluors (350、430、488、532、546、555、568、594、633、647、660、680、700、750)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Hoechst 33342、DAPI、Hoechst 33258、SYTOX Blue、クロモマイシンA3、ミトラマイシン、YOYO-1、SYTOX Orange、臭化エチジウム、7-AAD、アクリジンオレンジ、TOTO-1、TO-PRO-1、チアゾールオレンジ、TOTO-3、TO-PRO-3、チアゾールオレンジ、ヨウ化プロピジウム(PI)、LDS 751、Indo-1、Fluo-3、DCFH、DHR、SNARF、Y66F、Y66H、EBFP、GFPuv、ECFP、GFP、AmCyanl、Y77W、S65A、S65C、S65L、S65T、ZsGreenl、ZsYellowl、DsRed2、DsRed単量体、AsRed2、mRFP1、HcRedl、モノクロロビマン、カルセイン、DyLight Fluors、シアニン、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリン、Cascade Blue、Lucifer Yellow、NBD、PE-Cy5抱合体、PE-Cy7抱合体、APC-Cy7抱合体、Red 613、フルオレセイン、FluorX、BODIDY-FL、TRITC、X-ローダミン、Lissamine Rhodamine B、Texas Red、TruRed、及びこれらの誘導体が挙げられる。
【００４４】
本明細書で使用する用語「濃縮された(enriched)」又は「濃縮(enrichment)」は、所与の物質の濃度を該物質の初期濃度より高くすることを指す。例えば、本明細書で使用する用語「細胞濃縮」は、ある細胞集団の濃度を該細胞集団の初期濃度より高くすることを指す。
本明細書で使用する用語「エピトープ又は抗原決定基」又は「エピトープ」は、分子上の抗原性部位を意味する。Robert C. Ladner, Biotechnol. & Genetic Engineering Revs. 24 (1-30 (2007)から：エピトープを直鎖状エピトープ(連続性エピトープとしても知られる)及び非直鎖状エピトープ(立体的又は不連続エピトープとしても知られる)に分けることができる。直鎖状エピトープは、タンパク質が変性されるか又は小ペプチドフラグメントになった後に存続する。立体的エピトープは、正しく折り畳まれたタンパク質又大きい折り畳みフラクション状態でのみ存続する。いくつかの方法で「エピトープ」を修飾又は限定することができる。例えば、「機能性エピトープ」(Sanchez-Madrid, et al., 1983)、「構造エピトープ」(Abraham, et al., 1985)、「接触エピトープ」(Jin, et al., 1992)、「結合エピトープ」(Bock, et al., 1985)、「保護エピトープ」(Seyer, et al., 1986)、「中和エピトープ」(Wimmer, et al., 1984)、「細胞外エピトープ」(Khan, 2001)、及び「細胞質エピトープ」(Froehner, et al., 1983)がある。
【００４５】
本明細書で使用する用語「フローサイトメトリー」は、細胞の表現型及び特性を調べる手段である。それは、細胞又は粒子が液体ストリーム内でレーザー(放射線の刺激放出による光増幅)／光ビームを介して感知領域を越えて動くときに細胞又は粒子を感知する。微視的粒子の関連性のある光散乱及び色識別蛍光が測定される。細胞の分析及び区別は、サイズ、粒度、及び細胞が抗体又は色素のどちらの形態で蛍光分子を持っているかに基づいている。細胞がレーザービームを通過すると、光が全ての方向に散乱し、前方向に軸から低角度(0.5〜10°)で散乱される光は、球の半径の二乗、ひいては細胞又は粒子のサイズに比例する。光は細胞に入ることができ；従って、90°の光(直角、側面)散乱を蛍光色素連結抗体で標識するか又は蛍光膜、細胞質、若しくは核色素で染色することができる。このようにして、細胞型の区別、膜受容体及び抗原の存在、膜電位、pH、酵素活性、及びDNA含量の測定を促進することができる。フローサイトメーターはマルチパラメーターであり、各細胞について幾つかの測定値を記録するので、不均一集団内の均一亜集団を同定することができる[Marion G. Macey, Flow cytometry: principles and applications, Humana Press, 2007]。
本明細書で使用する用語「不均一」は、種々の似ていない特性を有する要素を含み；構造又は組成が一様でない物質を指す。例えば、不均一細胞集団は、異なる型の細胞(例えば、赤血球、白血球等)を含む。
本明細書で使用する用語「均一」は、構造又は組成が一様である物質を指す。
【００４６】
本明細書で使用する用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する抗体を指すが、この定義からは、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列由来のCDR配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体を除外する。
本明細書で使用する用語「ヒト化抗体」は、げっ歯類の可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体配列と交換されている抗体を指す。
本明細書で使用する用語「免疫グロブリン(Ig)」は、構造的に関連するタンパク質のクラスを指し、それぞれ2対のポリペプチド鎖から成り、1対の軽(L)(低分子量)鎖(k又はl)、及び1対の重(H)鎖(g、a、m、d、及びe)が、通常は4つ全て一緒にジスルフィド結合によって連結されている。H鎖の構造特性及び抗原特性に基づいて、Igは(正常ヒト血清中に存在する相対量の順に)IgG、IgA、IgM、IgD、及びIgEと分類されている。各クラスのH鎖は、kL鎖又はlL鎖のどちらかと結びつくことができる。Igのサブクラスは、H鎖の差異に基づき、IgG1等と呼ばれる。
パパインで分解されると、IgGは3つの断片をもたらす：H鎖のC末端部分から成り、抗体活性はないが、補体を固定することができ、結晶化可能なFc断片；及びそれぞれ抗原結合部位を有し、それぞれH鎖の残部に結合したL鎖から成る2つの同一Fab断片。
全てのL鎖は、可変配列の領域(VL)と定常配列の領域(CL)に分かれており、それぞれL鎖の長さの約半分を構成する。同型(κ又はλ)の全てのヒトL鎖の定常領域は、遺伝子制御下では、単一のアミノ酸置換以外は同一である。H鎖も同様に分かれているが、VH領域は、VL領域に対する長さが同様でありながら、CH領域の長さの1/3又は1/4しかない。結合部位は、VL及びVHタンパク質領域の組み合わせである。L及びH鎖の多数の可能な組み合わせが各個体の抗体の「ライブラリー」を構成する。
用語Igには、限定するものではないが、天然起源及び非天然起源のIgGs、ポリクロナールIgGs、モノクロナールIgGs、キメラIgGs、完全合成IgGs、及びこれらのフラグメントが含まれる。
【００４７】
用語「単離する」及び「分離する」は、本明細書では互換的に用いられて、細胞、タンパク質、分子、物質、核酸、ペプチド、又は粒子を、汚染又は一般的にそれと関連する他の材料が本質的にない形態に置き、分けておき、又は該形態で得ることを意味する。
本明細書で使用する用語「標識すること」は、抗体、追跡可能成分を導入することによって、化合物、構造、タンパク質、ペプチド、抗体、細胞又は細胞成分を区別するプロセスを指す。一般的な追跡可能成分としては、限定するものではないが、蛍光抗体、フルオロフォア、色素若しくは蛍光色素、染色若しくは蛍光染色、マーカー、蛍光マーカー、化学染色、差次的染色、差次的標識、及びラジオアイソトープが挙げられる。
本明細書で使用する用語「レクチン」は、ある一定の糖に特異的に結合するタンパク質のクラスを指す。
本明細書で使用する用語「白血球」は、血液及び体液内で循環し、異物及び疾患と対抗する際に関与する無色細胞(すなわち、白色血液細胞)を指す。白血球には、限定するものではないが、リンパ球、顆粒球、単球及びマクロファージが含まれる。
本明細書で使用する用語「リンパ球」は、全身のリンパ組織内で形成される小型白血球を指し、健康成人では循環血液中の白血球の総数の約22〜28%を構成する。
【００４８】
本明細書で使用する用語「模倣物」又は「模倣する」は、抗体の機能を模倣する化学的部分を含有する化学薬品を指す。例えば、抗体結合部位が、機能的活性を有する2つの荷電化学的部分を含有する場合、荷電化学的機能が三次元空間に維持されるように、模倣物は2つの荷電化学的部分を空間定位及び束縛構造状態に置く。
本明細書で使用する用語「単核細胞」又は「MNC」は、単一の円形核を有するいずれの細胞をも指す。非限定例としては血液細胞、例えばリンパ球、単球及び樹状細胞がある。
本明細書で使用する用語「ネガティブ選択」は、残存する興味ある細胞型以外の全ての細胞型の枯渇又は除去を指す。
本明細書で使用する表現「動作可能に連結された(operatively linked)」又は「使用可能に連結された(operably linked)」は、2つ以上のタンパク質ドメインが、組換えDNA技術又は化学反応によって、結果として生じる融合タンパク質の各タンパク質ドメインがその本来の機能を保持するように連結又は組み合わされている結合を指す。
本明細書で使用する用語「表現型」は、細胞又は生物の観察可能な特性又は物理的形質(例えば、形態学的、発達的、生化学的、物理的特性)を指す。
本明細書で使用する用語「ポジティブ選択」は、標的細胞集団の単離を指す。
本明細書で使用する用語「純粋な」は、いずれの他の物質又は材料とも混合されず、それらによって質を落とされず、又はそれらで汚染されていない細胞、タンパク質、分子、物質、核酸、ペプチド、又は粒子を指す。
【００４９】
本明細書で使用する用語「単鎖可変フラグメント」、「単鎖Fv」又は「scFv」は、抗体のVH及びVLドメインを含む抗体フラグメントを指す。これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般的に、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間に、scFvが抗原結合に望ましい構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをさらに含む。
本明細書で使用する用語「実質的に純粋な」は、分析プロトコルによって決まる少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%の純度を指す。該プロトコルには、例えば、限定するものではないが、FACS、HPLC、ゲル電気泳動法、クロマトグラフィー等がある。
本明細書で使用する用語「Tリンパ球」又は「T細胞」は、一般的に、全身のリンパ組織内で形成される小型白血球を指し、正常成人では、循環血液中の白血球の総数の約22〜28%を構成し、体を疾患から防御する際に大きな役割を果たす。個々のリンパ球は、限定セットの構造的に関連性のある抗原に応答するように深く関与するいう点で特殊化されている。免疫系と所与の抗原との最初の接触前に存在するこの深い関与は、抗原上の決定基(エピトープ)に特異的な受容体のリンパ球の表面膜の存在によって発現される。各リンパ球は、全てが同一の結合部位を有する受容体の集団を持つ。リンパ球の1セット、又はクローンは、その受容体の結合領域の構造が別のクローンと異なり、ひいては認識できるエピトープに差がある。リンパ球は、それらの受容体の特異性の点で異なるのみならず、それらの機能にも差がある。以下の2つの広範なクラスのリンパ球が認められている：抗体分泌細胞の前駆体であるBリンパ球(B細胞)、及びTリンパ球(T細胞)。
【００５０】
造血組織内の前駆体由来のTリンパ球は、胸腺内で分化を受けてから、末梢リンパ系組織及びリンパ球の再循環プールに播種される。Tリンパ球又はT細胞は、種々多様の免疫機能を媒介する。これらには、B細胞の抗体産生細胞への発育を助ける能力、単球／マクロファージの殺菌作用を高める能力、特定タイプの免疫応答の抑制、標的細胞の直接死滅、及び炎症応答の可動化が含まれる。これらの効果は、特異的細胞表面分子のそれらの発現及びサイトカインの分泌に左右される(Paul, W.E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,” Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed.Paul, W.E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。
【００５１】
T細胞は、それらの抗原認識機構がB細胞と異なる。B細胞の受容体である免疫グロブリンは、可溶性分子又は粒子表面上の個々のエピトープに結合する。B細胞受容体は、天然分子の表面に発現されるエピトープが分かる。抗体及びB細胞受容体は、細胞外流体内の微生物に結合して該微生物から防御するように進化した。対照的に、T細胞は、他の細胞の表面上の抗原を認識し、これらの抗原提示細胞(APC)の挙動と相互作用し、該挙動を変えることによってそれらの機能を媒介する。T細胞を活性化できる末梢リンパ系器官内には以下の3つの主要タイプの抗原提示細胞がある：樹状細胞、マクロファージ及びB細胞。これらの中で最も強力な細胞は樹状細胞であり、その唯一の機能は、T細胞に外来抗原を提示することである。皮膚、腸、及び気道を含め、全身の組織内に未熟樹状細胞がある。それらがこれらの部位で侵入する微生物に遭遇すると、未熟樹状細胞はこれらの病原体及びそれらの産物を取り込み、それらをリンパ経由で局所リンパ節又は腸関連リンパ系器官に運ぶ。病原体との遭遇により、樹状細胞が、抗原捕獲細胞から、T細胞を活性化できる抗原提示細胞(APC)に成熟するように誘導される。APCは、それらの表面に、T細胞を活性化してエフェクター細胞になる祭に役割を果たす3つの型のタンパク質分子を表す：(1)T細胞受容体に外来抗原を提示するMHCタンパク質；(2)T細胞表面上の相補性受容体に結合する共刺激タンパク質；及び(3)T細胞が、活性化されるのに十分長い間抗原提示細胞(APC)に結合できるようにする細胞-細胞接着分子(“Chapter 24: The adaptive immune system,” Molecular Biology of the Cell, Alberts, B. et al., Garland Science, NY, 2002)。
【００５２】
T細胞は、それらが発現する細胞表面受容体に基づいて2つの別個のクラスに細分されている。大多数のT細胞は、α鎖及びβ鎖でできているT細胞受容体(TCR)を発現する。小群のT細胞は、γ鎖及びδ鎖から成る受容体を発現する。α／βT細胞の中には、以下の2つの重要なサブ系列がある：共受容体分子CD4(CD4+ T細胞)を発現するもの；及びCD8(CD8+ T細胞)を発現するもの。これらの細胞は、それらがどうやって抗原を認識するか並びにそれらのエフェクター機能及び制御機能の点で異なる。
CD4+ T細胞は、免疫系の主要な制御性細胞である。それらの制御機能は、それらの細胞表面分子、例えばその発現はT細胞が活性化されると誘導されるCD40リガンド等の発現、及び活性化されるとそれらが分泌する多彩なサイトカインの両方に左右される。
T細胞は、重要なエフェクター機能をも媒介し、そのいくつかはT細胞が分泌するサイトカインのパターンによって決まる。サイトカインが標的細胞に直接毒性であることがあり、強力な炎症機構を起動することができる。
さらに、T細胞、特にCD8+ T細胞は、Tリンパ球(CTL)によって認識された抗原を発現する標的細胞を効率的に溶解できる細胞傷害性CTLに発育し得る(Paul, W.E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,” Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed.Paul, W.E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。
【００５３】
T細胞受容体(TCR)は、クラスII又はクラスIのMHCタンパク質の特殊グルーブに結合した抗原のタンパク質分解によって誘導されたペプチドから成る複合体を認識する。CD4+ T細胞は、ペプチド／クラスII複合体のみを認識するが、CD8+ T細胞は、ペプチド／クラスI複合体をを認識する(Paul, W.E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,” Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W.E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。
TCRのリガンド(すなわち、ペプチド／MHCタンパク質複合体)は、抗原提示細胞(APC)内で作り出される。一般に、クラスIIのMHC分子は、エンドサイトーシスプロセスを通じてAPCによって取り込まれたタンパク質由来のペプチドと結合する。これらのペプチド負荷クラスII分子は、次に細胞の表面に発現され、そこでそれらは、発現された細胞表面複合体を認識できるTCRを有するCD4+ T細胞による結合に利用可能である。このように、CD4+ T細胞は、細胞外ソース由来の抗原と反応するように特殊化される(Paul, W.E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,” Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。
【００５４】
対照的に、クラスIのMHC分子は、主に内部合成タンパク質、例えばウイルスタンパク質由来ペプチドが負荷される。これらのペプチドは、プロテオソーム(proteosome)によるタンパク質分解によって細胞質タンパク質から産生され、粗面小胞体(rough endoplasmic reticulum)中に移動される。一般的に9アミノ酸長である該ペプチドは、クラスIのMHC分子に結合し、細胞表面に運ばれ、そこで、適切な受容体を発現するCD8+ T細胞によって認識され得る。このことがT細胞系、特にCD8+ T細胞に、インタクト形態のこれらのタンパク質が細胞表面上で発現されず、分泌もされない場合でさえ、生物(例えば、ウイルス抗原)又はミュータント抗原(例えば活性オンコジーン産物)の残渣の細胞の量と異なるか、又はずっと多い量で産生されるタンパク質を発現する細胞を検出する能力を与える(Paul, W. E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,” Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。
【００５５】
T細胞は、それらの機能に基づいて、ヘルパーT細胞、細胞性免疫の誘導に関与するT細胞、サプレッサーT細胞、及び細胞傷害性T細胞として分類することもできる。
ヘルパーT細胞は、B細胞を刺激して、タンパク質及び他のT細胞依存性抗原に対する抗体応答を引き起こすT細胞である。T細胞依存性抗原は、個々のエピトープがB細胞の膜免疫グロブリン(Ig)を架橋できないか又は不十分に架橋するように、一度又は限定回数だけ個々のエピトープが現れる免疫原である。B細胞はそれらの膜Igを介して抗原と結合し、この複合体がエンドサイトーシスを受ける。エンドソーム及びリソソーム区画内で、抗原はタンパク質分解酵素によってペプチドに断片化され、生成ペプチドの1つ以上がクラスIIのMHC分子に負荷され、これがこの小胞区画の中を通る。結果として生じるペプチド／クラスII MHC複合体は次にB細胞表面膜に運び出される。ペプチド／クラスII分子複合体に特異的な受容体を有するT細胞が、B細胞表面上のこの複合体を認識する(Paul, W. E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,” Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed.Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。
【００５６】
B細胞の活性化は、T細胞のそのTCRを介した結合及びB細胞上でのT細胞CD40リガンド(CD40L)とCD40の相互作用の両方に依存する。T細胞は、恒常的にはCD40Lを発現しない。むしろ、CD40L発現は、T細胞のTCRによって認識される同種抗原及びCD80又はCD86を両方とも発現するAPCとの相互作用の結果として誘導される。CD80／CD86は一般的に、静止ではなく活性化したB細胞によって発現され、その結果、活性化B細胞及びT細胞を巻き込むヘルパー相互作用が効率的な抗体産生につながり得る。しかしながら、多くの場合、T細胞上におけるCD40Lの初期誘導は、恒常的にCD80／86を発現する樹状細胞等のAPCの表面上でのそれらの抗原認識に依存している。該活性化ヘルパーT細胞が次にB細胞と効率的に相互作用してB細胞を助ける。B細胞上の膜Igの架橋結合は、非効率的な場合でさえ、CD40L／CD40相互作用と協力して活発なB細胞活性化をもたらすことができる。B細胞応答におけるその後の事象、例えば増殖、Ig分泌、及びクラススイッチ(発現されるIgクラスの)等は、T細胞由来サイトカインの作用に依存し、それによって増強される(Paul, W.E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,” Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。
【００５７】
CD4+ T細胞は、主にサイトカインIL-4、IL-5、IL-6、及びIL-10を分泌する細胞(TH2細胞)又は主にIL-2、IFN-γ、及びリンホトキシンを産生する細胞(TH1細胞)に分化する傾向がある。TH2細胞は、B細胞の抗体産生細胞への発育を助けるのに非常に有効であり、一方、TH1細胞は、単球及びマクロファージの殺菌活性の増強、及び結果として細胞内小胞区画内で微生物を溶解させる際の効率上昇を引き起こす細胞性免疫応答の有効なインデューサーである。TH2細胞の表現型を有するCD4+ T細胞(すなわち、IL-4、IL-5、IL-6及びIL-10)は有効なヘルパー細胞であるが、TH1細胞もヘルパーとなる能力を有する(Paul, W. E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,” Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。Tヘルパー1(Th1)細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体1(CCR1)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(CCR5)、表面抗原分類3(CD3)、表面抗原分類4(CD4)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体3(CXCR3)、インターフェロンγ受容体1/表面抗原分類119(IFN-γR1/CD119)、インターフェロンγ受容体2(IFN-γR2)、インターロイキン12受容体サブユニットβ2(IL-12Rβ2)、インターロイキン18受容体α(IL-18Rα)、及び／又はインターロイキン27受容体α／t細胞サイトカイン受容体(IL-27Rα/TCCR)が含まれる。T-ヘルパー2(Th2)細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体3(CCR3)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体4(CCR4)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体8(CCR8)、表面抗原分類3(CD3)、表面抗原分類4(CD4)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4(CXCR4)、インターフェロンγ受容体1／表面抗原分類119(IFN-γR1/CD119)、インターフェロンγ受容体2(IFN-γR2)、インターロイキン4受容体α(IL-4Rα)、インターロイキン17受容体β(IL-17Rβ)、インターロイキン1受容体4(IL-1R4)、及び／又は胸腺間質性リンホポエチン受容体(hymic stromal lymphopoietin receptor)(TSLPR)が含まれる。
【００５８】
免疫ホメオスタシスを維持するためには、免疫応答の惹起と下方制御との間のコントロールされたバランスが重要である。アポトーシス及びT細胞アネルギー(抗原遭遇後にT細胞が内因的機能的に不活性化される耐性機構)(Scwartz, R.H., “T cell anergy,” Annu.Rev.Immunol., 21: 305-334 (2003))は両方とも免疫応答の下方制御に寄与する重要な機構である。第3の機構は、サプレッサー又は制御性CD4+ T(Treg)細胞による活性化T細胞の活発な抑制によって実現される(Reviewed in Kronenberg, M. et al., “Regulation of immunity by self-reactive T cells,” Nature 435: 598-604 (2005))。恒常的にIL-2受容体α(IL-2Rα)鎖(CD4+ CD25+)を発現するCD4+ Tregは、アネルギー性かつ抑制性である天然起源のT細胞サブセットである(Taams, L. S. et l., “Human anergic/suppressive CD4+CD25+ T cells: a highly differentiated and apoptosis-prone population,” Eur. J. Immunol., 31: 1122-1131 (2001))。CD4+CD25+ Tregの欠失は、マウスの全身性自己免疫疾患をもたらす。さらに、これらのTregの導入は、自己免疫疾患の発症を予防する。ヒトCD4+CD25+ Treg（それらのマウス対応物に類似）は、胸腺内で産生され、レスポンダーT細胞の増殖を細胞-細胞接触依存性機構によって抑制する能力、IL-2を産生できないこと、及びインビトロでのアネルギー性表現型を特徴とする。ヒトCD4+CD25+ T細胞は、CD25発現レベルに応じて、抑制性(CD25高)及び非抑制性(CD25低)細胞に分けられる。転写因子のフォークヘッドファミリーのメンバーであるFOXP3は、マウス及びヒトCD4+CD25+ Tregにおいて発現されることが示され、これはCD4+CD25+ Treg発生を制御するマスター遺伝子であるように見える(Battaglia, M. et al., “Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+Foxp3+ regulator T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients,” J.Immunol., 177: 8338-8347 (200))。制御性T細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類3(CD3)、表面抗原分類4(CD4)、表面抗原分類5(CD5)、表面抗原分類25(CD25)、表面抗原分類39(CD39)、表面抗原分類127(CD127)、表面抗原分類152(CD152)、表面抗原分類45RA(CD45RA)、表面抗原分類45RO(CD45RO)、表面抗原分類39(CD39)、表面抗原分類73(CD73)、表面抗原分類357(CD357)、表面抗原分類103(CD103)、表面抗原分類223(CD223)、表面抗原分類134(CD134)、表面抗原分類62L(CD62L)、及び／又は表面抗原分類101(CD101)が含まれる。Th9細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類3(CD3)、表面抗原分類4(CD4)、インターロイキン4受容体α(IL-4Rα)、インターロイキン17受容体β(IL-17Rβ)、及び／又は形質転換成長因子β受容体II(TGF-βRII)が含まれる。Th17細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体4(CCR4)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体6(CCR6)、表面抗原分類3(CD3)、表面抗原分類4(CD4)、インターロイキン1受容体1(IL-1R1)、インターロイキン6受容体α(IL-6Rα)、インターロイキン2受容体(IL-21R)、インターロイキン23受容体(IL-23R)、及び／又は形質転換成長因子β受容体II(TGF-βRII)が含まれる。
【００５９】
本明細書で使用する用語「Bリンパ球」又は「B細胞」は、胸腺依存性でなく、かつ体液性免疫に関与する免疫学的に重要な短命なリンパ球を指す。Bリンパ球は、骨髄の造血細胞に由来する。成熟B細胞は、その細胞表面によって認識されるエピトープを発現する抗原で活性化され得る。活性化プロセスは、抗原による膜Ig分子の架橋結合に依存する直接的であり得(架橋結合依存性B細胞活性化)、又は同種ヘルプと呼ばれるプロセスにおけるヘルパーT細胞との相互作用による間接的であり得る。多くの生理学的状況では、受容体の架橋結合刺激と同種ヘルプが協力して、より活発なB細胞応答をもたらす(Paul, W. E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,” Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。
【００６０】
架橋結合依存性B細胞活性化は、各B細胞が同一の可変領域を有するIg分子を発現するので、抗原が細胞表面受容体の結合部位に相補的なエピトープの複数のコピーを発現することを必要とする。このような要件は、反復エピトープ、例えば微生物の莢膜多糖又はウイルスエンベロープタンパク質等を有する他の抗原によって満たされる。架橋結合依存性B細胞活性化は、これらの微生物に対して開始される主な防御免疫応答である(Paul, W. E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,” Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。
同種ヘルプは、B細胞が、受容体と架橋結合できない抗原に対して応答を開始できるようにし、同時に、B細胞が弱い架橋結合事象によって刺激されたときにB細胞を不活性化から救出する共刺激シグナルを提供する。同種ヘルプは、B細胞の膜免疫グロブリン(Ig)による抗原の結合、抗原のエンドサイトーシス、及び細胞のエンドソーム／リソソーム区画内でのペプチドへの抗原の断片化に依存している。結果として生じるペプチドのいくつかが、クラスII主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子として知られる特殊セットの細胞表面タンパク質中のグルーブに負荷される。結果として生じるクラスII／ペプチド複合体が細胞表面に発現され、CD4+ T細胞と称する一連のT細胞の抗原特異性受容体用リガンドとして作用する。CD4+ T細胞は、それらの表面上に、B細胞のクラスII／ペプチド複合体に特異的な受容体を有する。B細胞活性化は、そのT細胞受容体(TCR)を介したT細胞の結合に依存するのみならず、この相互作用は、T細胞上の活性化リガンド(CD40リガンド)がB細胞上のその受容体(CD40)に結合してB細胞活性化シグナル伝達できるようにもする。さらに、Tヘルパー細胞は、B細胞上のサイトカイン受容体に結合することによって、刺激されたB細胞の成長及び分化を制御するいくつかのサイトカインを分泌する(Paul, W. E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,” Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。
【００６１】
抗体産生のための同種ヘルプ中、CD40リガンドは、活性化CD4+ Tヘルパー細胞上に過渡的に発現され、抗原特異性B細胞上のCD40に結合し、それによって第2の共刺激シグナルを伝達する(tranducing)。この第2の共刺激シグナルは、B細胞の成長及び分化のため、並びに抗原に遭遇した胚中心B細胞のアポトーシスを防止することによるメモリーB細胞の生成のために必須である。ヒトSLE患者においては、B細胞でもT細胞でもCD40リガンドの過剰発現は、病原性自己抗体産生に関係づけられる(Desai-Mehta, A. et al., “Hyperexpression of CD40 ligand by B and T cells in human lupus and its role in pathogenic autoantibody production,” J. Clin. Invest., 97(9): 2063-2073 (1996))。
【００６２】
用語「活性化」又は「リンパ球活性化」は、特異性抗原、非特異性マイトジェン、又はアロジェネイック細胞によるリンパ球の刺激を指し、結果としてRNA、タンパク質及びDNAの合成並びにリンホカインの産生をもたらし；その後に種々のエフェクター細胞及びメモリー細胞の増殖及び分化が続く。例えば、成熟B細胞は、その細胞表面免疫グロブリン(Ig)によって認識されるエピトープを発現する抗原との遭遇によって活性化され得る。活性化プロセスは、抗原による膜Ig分子の架橋結合に依存性の直接プロセス(架橋結合依存性B細胞活性化)、又はヘルパーT細胞との密接な相互作用の状況で最も効率的に起こる間接的プロセス(「同種ヘルププロセス」)であり得る。T細胞活性化は、TCR／CD3複合体とその同種リガンドの相互作用、クラスI又はクラスII MHC分子のグルーブ内に結合しているペプチドに依存性である。受容体関与による動きに入りこむ分子事象は複雑である。最早工程の間の、いくつかのシグナル伝達経路を制御する一連の基質のチロシンリン酸化につながるチロシンキナーゼの活性化であるように思われる。これらは、TCRをras経路に関連づける一連のアダプタータンパク質、ホスホリパーゼCγ1、チロシンの触媒活性を高め、イノシトールリン脂質代謝経路に関与するチロシンリン酸化を含み、細胞内の遊離カルシウム濃度の上昇並びにタンパク質キナーゼC、細胞の成長及び分化を制御する他の酵素系列の活性化につながる。T細胞の完全応答性は、受容体関与に加えて、アクセサリー細胞送達共刺激活性、例えば、抗原提示細胞(APC)上のCD80及び／又はCD86によるCD28のT細胞への関与を必要とする。活性化B細胞の可溶性産物が免疫グロブリン(immmunoglobulin)(抗体)である。活性化Tリンパ球の可溶性産物がリンホカインである。
【００６３】
本明細書で使用する用語「プロB細胞」は、成熟B細胞の生成につながる一連の発達段階で早期に同定できる中間細胞型を指す。ヒトプロB細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類19(CD19)、表面抗原分類20(CD20)、表面抗原分類34(CD34)、表面抗原分類38(CD38)、及び／又は表面抗原分類45R(CD45R)が含まれる。
本明細書で使用する用語「プレB細胞」は、成熟B細胞の未熟前駆細胞を指す。ヒトプレB細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類19(CD19)、表面抗原分類20(CD20)、表面抗原分類38(CD38)、表面抗原分類40(CD40)、及び／又は表面抗原分類45R(CD45R)が含まれる。
本明細書で使用する用語「未熟B細胞」は、骨髄で産生され、二次リンパ系組織に遊走し、そこで成熟B細胞に発育し得る細胞を指す。ヒト未熟B細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類19(CD19)、表面抗原分類20(CD20)、表面抗原分類40(CD40)、表面抗原分類45R(CD45R)、及び／又は免疫グロブリンM(IgM)が含まれる。
【００６４】
本明細書で使用する用語「移行期B細胞」は、二次リンパ系組織(例えば、脾臓又はリンパ節)に遊走した未熟B細胞を指す。ヒト移行期1B細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類10(CD10)、表面抗原分類19(CD19)、表面抗原分類20(CD20)、表面抗原分類24(CD24)、表面抗原分類28(CD28)、及び／又はB細胞リンパ腫2(BCL-2)が含まれる。
本明細書で使用する用語「ナイーブB細胞」は、抗原に曝されたことがないB細胞を指す。ヒトナイーブB細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類19(CD19)、表面抗原分類20(CD20)、表面抗原分類23(CD23)、表面抗原分類38(CD38)、表面抗原分類40(CD40)、表面抗原分類150(CD150)、免疫グロブリンM(IgM)、及び／又は免疫グロブリンD(IgD)が含まれる。
本明細書で使用する用語「メモリーB細胞」は、一次感染後に胚中心内で形成され、再感染の場合に抗体媒介免疫応答を引き起こすのに重要なB細胞亜型を指す。ヒトメモリーB細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類19(CD19)、表面抗原分類20(CD20)、表面抗原分類23(CD23)、表面抗原分類27(CD27)、表面抗原分類40(CD40)、免疫グロブリンA(IgA)、及び／又は免疫グロブリンG(IgG)が含まれる。
【００６５】
本明細書で使用する用語「プラズマ細胞」は、単一の型の抗体を産生する完全に分化したB細胞を指す。ヒトプラズマ細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類9(CD9)、表面抗原分類19(CD19)、表面抗原分類27(CD27)、表面抗原分類31(CD31)、表面抗原分類38(CD38)、表面抗原分類40(CD40)、表面抗原分類95(CD95)、及び／又はC-X-C ケモカイン受容体4型(CXCR-4)が含まれる。
本明細書で使用する用語「B1細胞」は、液性免疫応答に関与するサブクラスのB細胞を指す。それらは適応免疫系の一部でない(すなわち、それらは記憶を持たない)が、抗原に対して抗体を産生することができ、抗原提示細胞として作用し得る。ヒトB1細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類19(CD19)、表面抗原分類20(CD20)、表面抗原分類27(CD27)、免疫グロブリンM(IgM)、及び／又は免疫グロブリンD(IgD)が含まれる。
本明細書で使用する用語「単球」は、単純な楕円形の核及びクリアな灰色がかった細胞質を有する大型貪食白血球を指す。単球は、骨髄内で産生されてから血液に入り、組織(例えば、脾臓、肝臓、肺、及び骨髄組織)に遊走し、そこでマクロファージに成熟する。マクロファージは、免疫系の主要なスカベンジャー細胞であり；アポトーシス細胞及び病原体を貪食して、免疫応答を誘発する免疫エフェクター分子を作り出す。ヒト由来の単球／マクロファージは、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類14(CD14)、及び／又は表面抗原分類33(CD33)が含まれる。
【００６６】
本明細書で使用する用語「樹状細胞」は、抗原材料をプロセシングし、それを細胞表面上でT細胞に提示する機能を果たす抗原提示細胞(APC)を指す。樹状細胞は、主要組織適合性クラスI(MHC-I)及び主要組織適合性クラスII(MHC-II)の両抗原を提示することができる。それらは、自然免疫系と適応免疫系との間のメッセンジャーとして作用する。樹状細胞の型としては、限定するものではないが、骨髄性(通常の)樹状細胞及び形質細胞様樹状細胞がある。
ヒト由来の骨髄性樹状細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類11c(CD11c)、表面抗原分類123(CD123)、表面抗原分類1c／血液樹状細胞抗原-1(CD1c／BDCA-1)及び／又は表面抗原分類141／血液樹状細胞抗原-3(CD141/BDCA-3)が含まれる。
本明細書で使用する用語「形質細胞様樹状細胞」は、血液内で循環し、末梢器官に見られる自然免疫細胞を指す。ヒト由来の形質細胞様樹状細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類304／血液樹状細胞抗原-4(CD304/BDCA-4)が含まれる。
【００６７】
本明細書で使用する用語「オープンシステム」は、材料、エネルギー等が周囲環境から得られ、或いは周囲環境に失われる物理的システムを指す。
本明細書では用語「飽和する」、「飽和状態」及び「飽和した状態」を互換的に用いて、ある物質が別の物質と可能な最大程度まで合体されている状態を指す。例えば、抗体分子上の全ての利用可能な結合部位の抗体の抗原による充填。本明細書では、用語「非飽和する」、「非飽和状態」及び「非飽和した状態」を互換的に用いて、ある物質が別の物質と、可能な最大程度未満の程度まで合体されている状態、例えば、抗体上の全ての利用可能な結合部位が抗体の抗原によって充填されているわけではない状態を指す。
本明細書で使用する用語「幹細胞」は、複数の別個の細胞表現型への最終分化を受け得る娘細胞を産生することができる自己再生能力による高い増殖ポテンシャルを有する未分化細胞を指す。幹細胞の型には、限定するものではないが、胚性幹細胞、非胚性体細胞性又は成体幹細胞及び誘導多能性幹細胞(iPSC)が含まれる。
【００６８】
胚性幹細胞は、インビトロで受精された卵子から発生する胚に由来する。ヒト対象由来の胚性幹細胞は、少なくとも1つの細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、段階特異的胚性抗原-1(SSEA-1)、段階特異的胚性抗原-3(SSEA-3)、段階特異的胚性抗原-4(SSEA-4)、表面抗原分類324(CD324/E-カドヘリン)、表面抗原分類90／胸腺細胞抗原-1(CD90/Thy-1)、表面抗原分類117／チロシンタンパク質キナーゼキット／マスト／幹細胞成長因子受容体(CD117/c-KIT/SCFR)、表面抗原分類326(CD326)、表面抗原分類9／多剤耐性タンパク質1／膜貫通型4スーパーファミリー／ジフテリア毒素受容体関連タンパク質27／24kDタンパク質(CD9/MRP1/TM4SF/DRAP-27/p24)、表面抗原分類29(CD29)／β1インテグリン、表面抗原分類24／熱安定性抗原(CD24/HSA)、表面抗原分類59(CD59)／プロテクチン、表面抗原分類133(CD133)、表面抗原分類31／血小板内皮細胞接着分子-1(CD31/PECAM-1)、表面抗原分類49f(CD49f)／インテグリンα6／表面抗原分類29(CD29)、腫瘍拒絶抗原1-60(TRA-1-60)、腫瘍拒絶抗原1-81(TRA-1-81)、Frizzled-5(FZD5)、幹細胞因子(SCF／c-キットリガンド)、及び／又はCripto／テラトカルシノーマ誘導成長因子-1(TDGF-1)が含まれる。
【００６９】
体細胞性又は成体幹細胞は、組織又は器官の分化細胞間で見られる未分化細胞である。これらの細胞は自己再生することができ、分化して、最初の組織又は器官の主要特殊細胞型のいくつか又は全てをもたらすことができる。体細胞性／成体幹細胞の主要な役割は、それらが見られる組織を維持及び修復することである。体細胞性／成体幹細胞としては、限定するものではないが、造血幹細胞及び間葉系幹細胞がある。
本明細書で使用する用語「造血幹細胞(HSC)」は、血液又は骨髄から単離され、自己再生でき、種々の特殊細胞に分化し、骨髄から循環血液中に動員し、プログラム細胞死(アポトーシス)を受け得る細胞を指す。ヒト対象由来の造血幹細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、表面抗原分類34(CD34)、表面抗原分類38(CD38)、表面抗原分類45RA(CD45RA)、ヒト白血球抗原-抗原D関連(HLA-DR)、表面抗原分類117／チロシンタンパク質キナーゼキット／マスト／幹細胞成長因子受容体(CD117/c-KIT/SCFR)、表面抗原分類59(CD59)、幹細胞抗原1(Sca-1)、表面抗原分類90／胸腺細胞抗原1(CD90/Thy-1)、及び／又はC-X-Cケモカイン受容体4型(CXCR-4)が含まれる。
【００７０】
本明細書で使用する用語「間葉系幹細胞(MSC)」は、種々の細胞、例えば、限定するものではないが、骨芽細胞(骨細胞)、軟骨細胞(軟骨組織細胞)、筋細胞(筋肉細胞)及び脂肪細胞(adipocyte)(脂肪細胞)等に分化し得る多能性間質細胞を指す。インビボでは、MSCは、HSCと結合し、造血発生の早期段階で重要な制御効果を発揮する。MSCは、分化経路にも入って、骨髄内で成熟骨芽細胞、脂肪細胞及び血液支持性間質を補充する。MSCは、交感神経系線維によって神経支配され、造血発生の神経性調節を媒介する。ヒト対象由来の間葉系幹細胞は、単一の特異性同定マーカーを発現しないが、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現することが分かっており、これには、限定するものではないが、間質性前駆体抗原-1(Stro-1)、段階特異的胚性抗原-4(SSEA-4)、表面抗原分類70(CD70)、表面抗原分類271(CD271)、表面抗原分類200(CD200)、表面抗原分類146／メラノーマ細胞接着分子(CD146/MCAM)、表面抗原分類73(CD73)／5’-ヌクレオチダーゼ、表面抗原分類90／胸腺細胞抗原-1(CD90/Thy-1)、表面抗原分類105(CD105)／エンドグリン、表面抗原分類106／血管細胞接着分子-1(CD106/VCAM-1)、ガングリオシドGD2、Frizzled-9(FZD9)、組織非特異性アルカリホスファターゼ(TNAP)、及び／又はSushiドメイン含有2(SUSD2)が含まれる。
【００７１】
本明細書で使用する用語「誘導多能性幹細胞(iPSC)」は、成体細胞から直接産生され得る型の多能性幹細胞を指す。これらの細胞は、胚性幹細胞の規定特性を維持するために重要な遺伝子及び因子を発現するように強制されることによって、胚性幹細胞様状態に遺伝的に再プログラムされる。ヒト対象由来の誘導多能性幹細胞は、少なくとも1つの型の細胞表面マーカーを発現し、これには、限定するものではないが、段階特異的胚性抗原-1(SSEA-1)、段階特異的胚性抗原-4(SSEA-4)、アルカリホスファターゼ、オクタマー結合転写因子3/4(Oct-3/4)、ホメオボックスタンパク質Nanog(NANOG)、性決定領域Y-box2(Sox2)、Krueppel様因子4(KLF4)、腫瘍拒絶抗原1-60(TRA-1-60)、腫瘍拒絶抗原1-81(TRA-1-81)、及び／又は腫瘍拒絶抗原2-54(TRA-2-54)が含まれる。
本明細書では用語「対象」又は「個体」を互換的に用いて、哺乳動物起源の動物種を指し、これには、限定するものではないが、マウス、ラット、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ハムスター、フェレット、ブタ、イヌ、カモノハシ、モルモット、ウサギ及び霊長類、例えば、サル、類人猿、又はヒト等が含まれる。
本明細書で使用する用語「標的細胞(target cell)」又は「標的細胞(argeted cell)」は、特異的抗体と反応するか又は結合する特異的細胞表面マーカーを指す。
【００７２】
一態様によれば、記載発明は、細胞の標的集団を効率的に標識し、細胞の標的集団を洗浄し、細胞の標識化標的集団について濃縮し、結果として選択細胞の標的集団の直接送達をもたらす自動化閉鎖システムを提供する。
一部の実施形態によれば、生理学的媒体に懸濁した細胞の集団を単独でシステムに添加することができ；一部の該実施形態によれば、細胞表面マーカーを特異的に認識する標識薬剤と、該標識薬剤で標識された細胞に結合し、ひいては引き続き標識細胞の亜集団を細胞の集団から選択的に分離するように適応された捕獲粒子とを添加する。一部の実施形態によれば、記載発明の自動化閉鎖システム内部で細胞の集団を標識する。一部の実施形態によれば、記載発明の自動化閉鎖システムの外部で細胞を標識する。一部の該実施形態によれば、細胞の集団に加えて、細胞表面マーカーを特異的に認識する標識薬剤をシステムの外部で混ぜ合わせ；細胞の集団に加えて、細胞表面マーカーを特異的に認識する標識薬剤をシステムの外部で混ぜ合わせてからシステムに添加し；次に、標識薬剤で標識された細胞の亜集団に結合するように適応された、引き続き細胞の集団からの標識細胞の亜集団の分離／選択を促進するのに有効な捕獲粒子をシステムに添加する。一部の実施形態によれば、記載発明の自動化閉鎖システム内で細胞を標識する。一部の該実施形態によれば、細胞の集団に加えて、細胞表面マーカーを特異的に認識する標識薬剤をシステムの内部で混ぜ合わせ；標識薬剤で標識された細胞の亜集団に結合するように適応された、引き続き標識細胞の亜集団の細胞の集団からの分離／選択を促進するのに有効な捕獲粒子をシステムに添加する。一部の実施形態によれば、細胞の集団と、細胞表面マーカーを特異的に認識する標識薬剤と、標識薬剤で標識された細胞に結合し、ひいては標識細胞の亜集団を細胞の集団から分離／選択するように適応された捕獲粒子とをシステム内で添加して混ぜ合わせる。いずれの場合にも、選択後、捕獲された細胞から捕獲粒子を放出することができる。
【００７３】
別の態様によれば、記載発明は、哺乳動物細胞の集団における効率的な遺伝子導入のために使用可能である。一部の実施形態によれば、遺伝子導入は、ウイルスベクターによって媒介される。一部の実施形態によれば、遺伝子導入はトランスフェクションによる。一部の実施形態によれば、哺乳動物細胞の集団は、標識細胞を含む。一部の実施形態によれば、哺乳動物細胞の集団は、哺乳動物細胞の集団の亜集団上の細胞表面マーカーを認識する標識薬剤を用いて所望細胞をポジティブ選択することによって、標識細胞について濃縮されている。一部の実施形態によれば、哺乳動物細胞の集団は、標識細胞を除去した後残存する細胞を含む。
一部の実施形態によれば、自動化閉鎖システムは、初期生成物バッグ(110)、遠心機ローター／チャンバーに埋め込まれたチャンバー(120)、最終生成物バッグ(130)、緩衝液バッグ(140)、標識バッグ(160)及び捕獲粒子注射器(170)を含む。一部の実施形態によれば、自動化閉鎖システム(100)は、初期生成物バッグ(110)、遠心機ローター／チャンバーに埋め込まれたチャンバー(120)、最終生成物バッグ(130)、緩衝液バッグ(140)、溶解剤バッグ(150)、標識バッグ(160)及び捕獲粒子注射器(170)を含む(図1参照)。一部の実施形態によれば、自動化閉鎖システムはポンプを含む。
一態様によれば、記載発明は、自動化閉鎖システム(100)を用いて細胞を標識する方法を提供する。
別の態様によれば、記載発明は、自動化閉鎖システム(100)を用いて細胞を分離／単離する方法を提供する。
別の態様によれば、記載発明は、自動化閉鎖システム(100)を用いて細胞を標識し、標識細胞を洗浄し、濃縮／選択し、選択細胞を直接送達する方法を提供する。
一部の実施形態によれば、記載発明は、自動化閉鎖システム(100)を用いて不均一細胞懸濁液から細胞の実質的に純粋な集団を単離する方法を提供する。
【００７４】
一部の実施形態によれば、本方法は、不均一細胞集団と、細胞を特異的に認識してそれに結合する薬剤を含む捕獲粒子とを、遠心機ローター／チャンバーに埋め込まれたチャンバー(120)に、ローターが動いている(すなわち、回転してる)間に通す工程を含む。一部の実施形態によれば、細胞を特異的に認識してそれに結合する薬剤は、特異的細胞表面マーカーを含有する不均一細胞集団内で特異的細胞表面マーカーを認識し、当該細胞に結合する抗体である。一部の実施形態によれば、細胞を特異的に認識してそれに結合する薬剤はレクチンである。一部の実施形態によれば、本方法は、非結合細胞(すなわち、特異的細胞表面マーカーを含有しない細胞)を除去するため、遠心機ローター／チャンバーに埋め込まれたチャンバー(120)に、ローターが動いている間に洗浄緩衝液を通す工程を含む。次に、一部の実施形態によれば、本方法は、捕獲粒子を溶解させるため、遠心機ローター／チャンバーに埋め込まれたチャンバー(120)に、ローターが動いている間に溶解剤(例えば、EDTA)を通す工程と、溶解剤及び溶解した捕獲粒子を除去するため、遠心機ローター／チャンバーに埋め込まれたチャンバー(120)に、ローターが動いている間に洗浄緩衝液を通す工程を含む。一部の実施形態によれば、ローターを止めて(すなわち、無回転)、細胞を特異的に認識してそれに結合する薬剤に結合した(すなわち、濃縮された)細胞を最終生成物バッグ(130)に収集する。一部の実施形態によれば、対向流の流速を上昇させて、細胞を特異的に認識してそれに結合する薬剤に結合した細胞(すなわち、濃縮された)を最終生成物バッグ(130)に収集する。一部の実施形態によれば、ローターを止め(すなわち、無回転)、対向流の流速を上昇させ、細胞を特異的に認識してそれに結合する薬剤に結合した細胞(すなわち、濃縮された)を最終生成物バッグ(130)に収集する(例えば、図3参照)。
【００７５】
一部の実施形態によれば、記載発明は、細胞の亜集団を選択するためのチャンバーに捕獲粒子を添加するように適応された注射器を含む。一部の実施形態によれば、注射器は、細胞の亜集団を選択するためのチャンバーに標識薬剤及び捕獲粒子を添加するように適応されている。一部の実施形態によれば、注射器は、細胞の亜集団を選択するためのチャンバーに細胞の集団、標識薬剤、及び捕獲粒子を添加するように適応されている。
一部の実施形態によれば、チャンバーは、速度勾配を形成するのに有用な形状のものである。一部の実施形態によれば、チャンバーは三角形である。
一部の実施形態によれば、洗浄工程は、洗浄緩衝液を用いて行なわれる。市販の洗浄緩衝液の非限定例としては、トリス緩衝食塩水(TBS)、リン酸緩衝食塩水(PBS)、トリス緩衝食塩水-ツイーン20(TBST)、リン酸緩衝食塩水-ツイーン20(PBST)、PBS中のトリエタノールアミン及び生理学的媒体が挙げられる。生理学的媒体としては、限定するものではないが、イーグル基礎培地(BME)、ダルベッコリン酸緩衝食塩水(DPBS)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、DMEM-F12培地、F-10栄養混合物、グラスゴー改変最小必須培地(GMEM)、イスコヴ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ライボビッツL-15培地、マッコイ5A培地、MCDB 153培地、培地199、最小必須培地(MEM)、最小必須培地α(MEMA)、RPMI 1640培地、CliniMACS(登録商標)緩衝液、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、TexMACs(商標)培地、及びウェイマスMB752/1培地が挙げられる。
【００７６】
一部の実施形態によれば、自動化されている記載発明は、人的過誤のリスク低減に有効である。
一部の実施形態によれば、記載発明は、例えば、細菌、ウイルス、真菌、細胞デブリ及び選択／単離細胞が一般に関連する他の不要物質による汚染のリスク低減に有効である。
一部の実施形態によれば、記載発明は細胞の沈降／ペレット化を必要としないので、記載発明は、選択／単離される細胞集団への損傷低減に有効である。損傷のタイプには、限定するものではないが、細胞膨潤、脂肪蓄積、代謝不全、構造的損傷／劣化及びアポトーシス(すなわち、細胞死)が含まれる。
一部の実施形態によれば、記載発明は、選択／単離される細胞の生存能(生き、成長し、拡大する等の細胞の能力を意味する)を維持する。
一部の実施形態によれば、記載発明は、選択／単離される細胞の形態を維持する。
【００７７】
一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも75%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも76%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも77%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも78%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも79%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも80%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも81%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも82%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも83%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも84%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも85%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも86%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも87%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも88%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも89%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも90%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも91%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも92%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも93%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも94%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも95%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも96%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも97%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも98%純粋である。一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞集団は、少なくとも99%純粋である。
【００７８】
一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞の起源としては、限定するものではないが、皮膚、血液、骨髄、脳、心臓、肝臓、膵臓、肺、胃、腸、腎臓、膀胱、卵巣、子宮、精巣、胸腺、脂肪組織及びリンパ節が挙げられる。
一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞は幹細胞である。幹細胞には、限定するものではないが、胚性幹細胞、体細胞性幹細胞及び誘導多能性幹細胞が含まれる。体細胞性幹細胞には、限定するものではないが、造血幹細胞及び間葉系幹細胞が含まれる。
一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞は単核細胞である。単核細胞の非限定例としては、リンパ球、単球及び樹状細胞がある。リンパ球としては、限定するものではないが、Tリンパ球及びBリンパ球がある。Tリンパ球には、限定するものではないが、Tヘルパー細胞及び制御性T細胞が含まれる。Bリンパ球には、限定するものではないが、プロB細胞、プレB細胞、未熟B細胞、移行期B細胞、ナイーブB細胞、メモリーB細胞、プラズマ細胞及びB1細胞が含まれる。樹状細胞には、限定するものではないが、骨髄性(通常の)樹状細胞及び形質細胞様樹状細胞が含まれる。
【００７９】
一部の実施形態によれば、細胞の集団は、細胞の自然環境(例えば、血液)内で見られる細胞の集団に伴うか又は該集団と相互作用する成分からサイズに基づいて分離／単離される。理論に束縛されるものではないが、細胞を特異的に認識してそれに結合する薬剤を含む捕獲粒子は、細胞表現型に特異的に結合して分離／単離を促進することができる。記載発明の自動化閉鎖システム内で細胞及び捕獲粒子が混合及びインキュベートされる。インキュベーション後、捕獲粒子に結合した細胞は、非結合細胞より大きいサイズを示し、記載発明のシステム内での分離を可能にする。閉鎖システム内で洗浄が自動的に行われて非結合細胞が除去される。洗浄後、閉鎖システム内に解離溶液が自動的に添加されて、選択／単離された細胞が捕獲粒子から除去される。選択／単離された細胞は、閉鎖システム内で自動的に洗浄され、体積が減少する。
【００８０】
一部の実施形態によれば、解離溶液はpH溶液である。pH溶液の非限定例としては、100mMのグリシン-HCl、pH 2.5〜3.0；100mMのクエン酸、pH 3.0；50〜100mMのトリメチルアミン又はトリエタノールアミン、pH 11.5；及び150mMの水酸化アンモニウム、pH 10.5が挙げられる。一部の実施形態によれば、解離溶液はイオン強度溶液である。イオン強度溶液としては、限定するものではないが、10mMのトリス中3.5〜4.0Mの塩化マグネシウム、pH 7.0；10mMのリン酸緩衝液中5Mの塩化リチウム、pH 7.2；2.5Mのヨウ化ナトリウム、pH 7.5；及び0.2〜3.0Mのチオシアン酸ナトリウムが挙げられる。一部の実施形態によれば、解離溶液は変性溶液である。変性溶液の非限定例としては、2〜6Mのグアニジン-HCl；2〜8Mの尿素；1%のデオキシコラート；及び1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)が挙げられる。一部の実施形態によれば、解離溶液は有機溶液である。有機溶液としては、限定するものではないが、10%のジオキサン及び50%のエチレングリコール、pH 8〜11.5が挙げられる。
【００８１】
一部の実施形態によれば、記載発明は、捕獲粒子、例えば、ペレット、凝集体、結晶、又はビーズを利用する。一部の実施形態によれば、捕獲粒子は、細胞を特異的に認識してそれに結合する薬剤を含む。一部の実施形態によれば、捕獲粒子はビーズである。一部の実施形態によれば、細胞を特異的に認識してそれに結合する薬剤は抗体である。一部の実施形態によれば、細胞を特異的に認識してそれに結合する薬剤はレクチンである。
一部の実施形態によれば、ビーズは、薬剤との抱合に有用なサイズのものである。非限定例としては、ミクロビーズ及びナノビーズがある。一部の実施形態によれば、ビーズは生体適合性である。一部の実施形態によれば、ビーズは、薬剤への抱合に有用な形状のものである。一部の実施形態によれば、ビーズの形状は不規則である。一部の実施形態によれば、ビーズの形状は均一である。ビーズの形状としては、限定するものではないが、球、卵円、円柱、立方体、錐体、涙滴、小球体、小球等が挙げられる。一部の実施形態によれば、ビーズは、細胞表面マーカーを特異的に認識してそれに結合する薬剤への抱合に有用な材料のものである。材料の非限定例としては、高分子又は異なる高分子の混合物、例えば、限定するものではないが、乳酸-グリコール酸共重合体(PLGA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリエステル、ポリ無水物、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸及び乳酸-カプロラクトン共重合体が挙げられる。一部の実施形態によれば、高分子は合成高分子である。合成高分子としては、限定するものではないが、低密度ポリエチレン(LDPE)、高密度ポリエチレン(HDPE)、ポリプロピレン(PP)、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリスチレン(PS)、ナイロン、熱可塑性ポリウレタン(TPU)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(エチレングリコール)及びTeflon(商標)が挙げられる。一部の実施形態によれば、高分子は天然高分子である。天然高分子としては、限定するものではないが、アルギナート、アルギン酸誘導体、アガロース、Sepharose(登録商標)、コラーゲン及びキトサンが挙げられる。アルギン酸誘導体には、限定するものではないが、アルギン酸ナトリウム、両性アルギナート及び細胞相互作用性アルギナートが含まれる。
【００８２】
アルギナートは、典型的に褐色海藻から得られる天然起源のアニオン性高分子であり、広範に調査され、その生体適合性、低毒性、相対的に低いコスト、及びCa2+等の二価カチオンの添加による穏やかなゲル化のため多くの生化学用途に使用されている。市販アルギナートは典型的に褐色藻類(褐藻類(Phaeophyceae))、例えば、ラミナリア・ヒペルボレア(Laminaria hyperborea)、ラミナリア・ディギタータ(Laminaria digitata)、マコンブ(Laminaria japonica)、アスコフィルム・ノドスム(Ascophyllum nodosum)、及びオオウキモ(Macrocystis pyrifera)等から、アルカリ水溶液、典型的に水酸化ナトリウム(NaOH)で処理して得られる抽出物である。アルギナートを沈殿させるために抽出物は濾過され、濾液に塩化ナトリウム又は塩化カルシウムが添加される。このアルギン酸塩は、希HClで処理してアルギン酸塩に変換可能である。さらなる精製及び変換後に、水溶性アルギン酸ナトリウム粉末が生成される。
アルギナートは、細菌によって合成されることもある。アゾトバクター属又はシュードモナス属(Azotobacter oe Pseudomonas)による細菌の生合成は、海藻由来アルギナートから得ることができるより明確な化学的構造及び物理的性質を有するアルギナートを与える。アルギナート生合成の経路は、一般的に(i)前駆基質の合成；(ii)重合及び細胞質 膜導入；(iii)周辺質導入及び修飾；並びに(iv)外膜経由の排出に分けられる。細菌修飾は、テーラーメイドの特徴及び広範な生化学用途を有するアルギナートの生産を可能にする。
【００８３】
アルギナートは、(1,4)-連鎖β-D-マンヌロン酸(M)残基及びα-L-グルロン酸(G)残基のブロックを含有する直鎖共重合体のファミリーである。ブロックは、連続的G残基(GGGGGG)、連続的M残基(MMMMMM)、及び交互のM残基とG残基(GMGMGM)で構成されている。異なる起源から抽出されたアルギナートは、M及びGの含量並びに各ブロックの長さが異なる。アルギナートのGブロックだけが二価カチオン(例えば、Ca2+)と分子間架橋結合してヒドロゲルを形成することに関与すると考えられている。従って組成(すなわち、M/G比)、配列、Gブロック長、及び分子量は、アルギナート及びその結果として生じるヒドロゲルの物理的性質に影響を与える極めて重要な因子である。ラミナリア・ハイパーボリアン(Laminaria hyperborean)基部のGブロック含量は60%であるが、他の市販アルギナートは14.0〜31.0%の範囲のGブロック含量を有する。市販のアルギン酸ナトリウムの分子量は32,000〜400,000g/モルの範囲である。アルギナート溶液の粘度は、pHが下がるにつれて上昇し、アルギン酸骨格中のカルボン酸基がプロトン化されて水素結合を形成するにつれてpH=約3〜3.5の最大値に達する。
【００８４】
種々のアルギン酸誘導体が利用可能であり、幅広い生化学用途で使用されている。例えば、疎水性部分(例えば、アルキル鎖、疎水性高分子)をアルギン酸骨格に導入することによって、両親媒性アルギン酸誘導体が合成された。これらの誘導体は、水性媒体中で粒子及びゲル等の自己構築構造を形成することができる。アルギン酸ナトリウムの両親媒性誘導体は、エステル結合形成による長いアルキル鎖(すなわち、ドデシル、オクタデシル)のアルギン酸骨格への抱合によって調製された。塩化ナトリウム溶液中での分散によってこれらの誘導体からミクロ粒子を調製することができ、この技術は、タンパク質のカプセル化及び分子間疎水性接合部を破壊する界面活性剤又はアルキル鎖とアルギン酸骨格との間のエステル結合を加水分解するエステラーゼの添加によるそれらのその後の遊離を可能にし得る。カップリング試薬として2-クロロ-1-メチルピリジニウムヨージドを用いるアミン結合形成によってドデシルアミンをアルギン酸骨格に抱合させることもできる。このアルギン酸誘導体から調製されるヒドロゲルは、アルギン酸誘導体とドデシルエステルから調製される、加水分解に不安定なヒドロゲルに比べて長期間安定性を示す。カップリング試薬としてN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド及び触媒として4-(N,N'-ジメチルアミノ)ピリジンを室温で用て、コレステリル基がグラフトされた水溶性の両親媒性アルギン酸誘導体を合成することもできる。これらの誘導体は、塩化ナトリウム水溶液中で136nmの平均径を有する自己凝集体を形成する。アルギン酸ナトリウムをポリ(メタクリル酸ブチル)で疎水性アリル修飾することもでき、非修飾アルギナートゲルに比べてモデル薬物の持続放出をもたらす。
【００８５】
細胞相互作用性アルギナート(すなわち、細胞接着ペプチドを含有するアルギン酸誘導体)は、糖残基のカルボン酸基によって連結するカルボジイミド化学を用いて、側鎖としてペプチドを化学的に導入することによって調製可能である。アルギナートは本質的に哺乳動物細胞接着性を欠いているので、特に細胞培養及び組織工学用途で細胞相互作用を促進及び制御するためには、適切なリガンドが必要である。配列アルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)を含むペプチドは、種々の細胞型に対するこのリガンド用のインテグリン受容体(例えば、αvβ3、α5β1)の広範な存在のため、モデル接着リガンドとして広く使用されている。RGD含有ペプチドは、水溶性カルボジイミド化学を用いて化学的にアルギン酸骨格に連結することができる。細胞の接着及び成長にはアルギナートゲル中のRGDペプチドの最小濃度が必要であり、この最小値は細胞型特異的という可能性がある。例えば、インビトロでのMC3T3-E1及びC2C12細胞のアルギナートゲルへの実質的な接着のための最小濃度は、それぞれ12.5及び10.0μg/mg(アルギナート)と報告された。RGDペプチドの親和性も重要な役割を果たし、環状RGDペプチドは、直鎖RGDペプチドより強力であることが実証され、より低い濃度が必要とされる。アルギナートゲルを修飾して、種々の細胞型との接着相互作用を増強するために、他の細胞外マトリックスタンパク質由来のDGEA(Asp-Gly-Glu-Ala)及びYIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)配列を含有する種々のペプチドも開発された。例えば、水溶性カルボジイミド化学を用いてアルギナートがYIGSRペプチドで修飾されて神経細胞接着を促進した(例えば、Lee KY and Mooney DJ Prog Polym Sci 2012 Jan; 37(1): 106-126参照)。
【００８６】
アガロースは、寒天又は寒天保有海藻類から単離される精製直鎖状ガラクタンハイドロコロイドである。アガロースは、交互のD-ガラクトース単位と3,6-アンヒドロ-L-ガラクトース単位から成る直鎖状高分子である。アガロースは、ゲル化剤として用いられて、例えば、核酸を電気泳動的に分離し；免疫電気泳動(IEP)における交差反応及び抗体-抗原沈降素系統がその中で研究される二重拡散プレートを実証し；組織培養の細胞用のゲルプレート又はオーバーレイを作製し；並びに例えば、クロマトグラフ分離に使用できるゲルマトリックス(ビーズ状及び／又は架橋型)を形成する。
Sepharose(登録商標)は、主に生体分子のクロマトグラフ分離に用いられる架橋型ビーズ形態のアガロースである。Sepharose(登録商標)の種々の等級及び化学が利用可能であり、ペプチドの固定化のためのシステイン側鎖の選択的結合を可能にする。それは、抗体、酵素、タンパク質及びペプチドを共有結合によって固定化するため、活性化化学、例えば臭化シアン(CNBr)及びアルデヒドの還元的アミノ化等と併用することができる。
【００８７】
コラーゲンは、哺乳動物に最も広く見られるタンパク質であり、組織への強度の主要プロバイダーである。典型的なコラーゲン分子は、ヘリックスを形成する3つの絡み合ったタンパク質鎖から成る。これらの分子が一緒に重合して、長さ、厚さ、及び交織パターンが異なるコラーゲン線維を形成する(例えば、いくつかのコラーゲン分子はロープ様構造を形成するが、他のコラーゲン分子はメッシュ又は網目構造を形成することになる)。少なくとも15の異なるタイプのコラーゲンがあり、それらの構造、機能、位置、及び他の特性が異なる。生体材料用途で主に用いられる形態は、「ロープ形成」コラーゲンであり、皮膚及び骨を含め、体内に広範に分布するI型コラーゲンである。コラーゲンは、骨中に再吸収されることがあり、無毒で、最小限の免疫応答のみを引き起こし(異なる種間でさえ)、細胞との結合及び生物学的相互作用に役立つ。コラーゲンは、例えば多孔性スポンジ、ゲル、及びシート等の種々の形式に加工可能であり、化学薬品と架橋させてその強度又はその分解速度を変えることができる。
【００８８】
キトサンは、多糖類(すなわち、糖)の1種であり、エビ及びカニ等の甲殻類の硬い外骨格内に存在するキチンから誘導される。キチンは、実際に、自然に見られる最も豊富な多糖類の1つであり、キトサンを豊富かつ比較的安価な産物にしている。キトサンは、いくつかの望ましい特性を有し、それには、限定するものではないが、最小限の異物反応；穏やかな加工条件(合成高分子は刺激の強い化学薬品に溶かす必要があることが多いがが、キトサンはpHに基づいて水に溶ける)；制御可能な機械的／生分解特性(例えば、スキャフォールド多孔度又は高分子長)；及び他の分子への付着に化学的側鎖基を利用できることが挙げられる。キトサンは、その強度及び細胞接着ポテンシャルを高めるために他の材料と併用することができる。ポリ(ビニルアルコール)及びポリ(エチレングリコール)等の合成高分子又はコラーゲン等の天然高分子との混合物が利用可能であり、どちらかの成分のみの挙動を超える改善された性能を示した。
【００８９】
一部の実施形態によれば、捕獲粒子は、アルギナートで被覆されたデキストランビーズである。デキストランは、分子量≧1,000ダルトンの多糖である。デキストランは、α結合グルコピラノシル反復単位をの直鎖状骨格を有する。デキストランは、それらの構造特徴に基づいて3つのクラスに分けられる。クラス1デキストランは、微生物産生株及び培養条件に応じて、それらの分子量、空間配置、分岐のタイプと度合、及び分岐鎖の長さが異なるα(1→2)、α(1→3)、及びα(1→4)結合を有するD-グルコース分岐の小側鎖で修飾されたα(1→6)結合D-グルコピラノシル骨格を含有する。イソマルトース及びイソマルトトリオースは、クラス1デキストラン骨格構造を有するオリゴ糖である。クラス2デキストラン(アルテルナン)は、α(1→3)結合分岐を有する交互のα(1→3)及びα(1→6)結合D-グルコピラノシル単位の骨格構造を含有する。クラス3デキストラン(ミュータンス(mutans))は、α(1→6)結合分岐を有する連続的α(1→3)結合D-グルコピラノシル単位の骨格構造を有する。デキストランの構造解析には一次元及び二次元NMR分光法が利用されている。精製デキストランの物理的及び化学的性質は、それらが産生される微生物株及び産生方法に応じて異なる。デキストランは、高い水溶性を有し、その溶液はニュートン流体として振る舞う。溶液粘度は、濃度、温度、及び特徴的分布を有する分子量によって決まる。デキストランに存在するヒドロキシル基は、誘導体化のための多くの部位を提供し、これらの官能化複合糖質は、非常に予想外のクラスの生体適合性かつ環境上安全な化合物となる。
【００９０】
一部の実施形態によれば、捕獲粒子は溶解剤で溶解される。一部の実施形態によれば、溶解剤は キレート剤である。一部の実施形態によれば、キレート剤は、カルシウム(Ca2+)キレート剤である。カルシウムキレート剤としては、限定するものではないが、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)；エチレングリコール四酢酸(EGTA)；1,2-ビス(o-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N’,N’-四酢酸(BAPTA)；メシル酸デフェロキサミン、鉄キレート剤IV、21H7；及びN,N,N’,N’-テトラキス(2-ピリジルメチ)エタン-1,2-ジアミン (TPEN)が挙げられる。
一部の実施形態によれば、捕獲粒子は抱合体で被覆される。抱合体の非限定例としては、重鎖抱合体、軽鎖抱合体、アビジン及びストレプトアビジンが挙げられる。重鎖抱合体の例としては、限定するものではないが、プロテインA、組換えプロテインA、プロテインG及び組換えプロテインGが挙げられる。軽鎖抱合体の例としては、限定するものではないが、プロテインL及び組換えプロテインLが挙げられる。
【００９１】
プロテインAは、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に由来する。プロテインGは、ストレプトコッカス種(Streptococcus species)に由来する。両方とも哺乳動物IgGのFc部用の結合部位を有する。これらのタンパク質のIgGに対する親和性は、動物種によって異なる。プロテインGは、ラット、ヤギ、ヒツジ、及びウシIgG、並びにマウスIgG1及びヒトIgG3に対して親和性がより高い。プロテインAは、ネコ及びモルモットIgGに対して親和性がより高い。天然プロテインGは、アルブミン、IgのFab領域、及び膜結合領域用の結合部位を有し、非特異的相互作用をもたらす可能性がある。組換えプロテインGは、アルブミン結合領域を排除するように改変されている。また組換えプロテインG′は、アルブミン、Fab、及び膜結合部位を欠きながら、Fc結合部位を保持し、天然形態よりIgGに対してそれを特異的にしている切断型タンパク質である。プロテインAもプロテインGも、IgA若しくはIgMの検出、Fabフラグメントの検出、又はトリIgGの検出のためには推奨されない。アルギナート、アガロース又はSepharose(登録商標)等の樹脂に結合すると、プロテインA及びプロテインGを親和性吸収剤として用いて免疫グロブリン及び免疫グロブリン亜型を血清、ハイブリドーマ腹水、組織培養上清、及び他の生物学的流体から精製することができる。これらの試薬は、免疫沈降実験で生じた免疫複合体を捕獲するためにも一般的に使用される。
【００９２】
プロテインLは、ペプトストレプトコッカス・マグヌス(Peptostreptococcus magnus)に由来する。それは、様々な種のκ軽鎖に対して親和性を有し、κ軽鎖を含有するモノクロナール又はポリクロナールIgG、IgA、及びIgM並びにFab、F(ab′)2、及び組換え単鎖Fv(scFv)フラグメントを検出することになる。それは、ニワトリIgGにも結合する。それらのIgがほぼ排他的にλ鎖を含有するウシ、ヤギ、ヒツジ、及びウマ等の種は、仮にプロテインLに結合したとしても十分には結合しない。プロテインLは、主要な哺乳動物若しくはトリの抗体又は全てのクラスの表面Igと結合するための一般試薬として用いられる。それは、Fab、F(ab′)2フラグメント、組換えscFvフラグメント、Fc受容体に結合したIgの検出、又はウシIg保有κ軽鎖の存在下でのモノクロナール抗体の検出に有用である。
【００９３】
卵白タンパク質であるアビジンは、高カチオン性の66,000ダルトンの糖タンパク質であり、約10.5の等電点を有する。その細菌対応物であるストレプトアビジンは、非グリコシル化52,800ダルトンタンパク質であり、中性に近い等電点を有する。ストレプトアビジンは、特異的に細胞接着を促進する細胞外マトリックスの成分であるフィブロネクチンのArg-Gly-Asp(RGD)結合配列を明白に模倣するトリペプチド配列Arg-Tyr-Asp(RYD)を含有する。この普遍的な認識配列は、インテグリン及び関連細胞表面分子と結合する。各アビジン及びストレプトアビジンタンパク質は、高い親和性(10-14〜10-15モル/LのKd)及び選択性で4つのビオチン分子と結合する。ビタミンB7、ビタミンH又は補酵素Rとしても知られるビオチンは、テトラヒドロチオフェン環と縮合したテトラヒドロイミジザロン環で構成された水溶性Bビタミンである。アビジンもストレプトアビジンも高い親和性と選択性でビオチンと結合するので、ビオチンに結合した、つまり「ビオチン化」したタンパク質は、例えば、サンプルから単離されるか又はアビジン／ストレプトアビジン被覆表面に抱合され得る。
【００９４】
一部の実施形態によれば、記載発明は、細胞表面マーカーと結合する抗体を提供する。一部の実施形態によれば、抗体は完全長型である。一部の実施形態によれば、抗体はフラグメントである。一部の実施形態によれば、フラグメントは抗原結合部のみを含む。別の実施形態によれば、抗原結合部は軽鎖可変領域(VL)及び重鎖可変領域(VH)を含む。一部の実施形態によれば、抗体は高親和性抗体である。一部の実施形態によれば、抗体は低親和性抗体である。
記載発明の抗体には、限定するものではないが、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体及び合成抗体模倣物(SyAMs)が含まれる。モノクロナール抗体としては、限定するものではないが、合成抗体及び改変抗体が挙げられる。合成抗体には、限定するものではないが、組換え抗体が含まれる。組換え抗体としては、限定するものではないが、単鎖可変フラグメント(scFv)抗体、核酸アプタマー及び非免疫グロブリンタンパク質スキャフォールドが挙げられる。改変抗体としては、限定するものではないが、キメラ抗体及びヒト化抗体がある。
【００９５】
モノクロナール抗体は、興味ある抗原の単一の特異的エピトープを認識する抗体の均一集団である。モノクロナール抗体は、所望抗原で免疫化されたマウスの骨髄腫細胞と脾臓細胞との間の融合の結果であるか又は所望抗原で免疫化されたウサギの骨髄腫細胞及びB細胞由来であるハイブリドーマ細胞によって細胞培養内で産生される。
組換え抗体は、インビトロ発現系によって産生される(すなわち、動物を所望抗原で免疫化することによって産生されない)抗体である。例えば、全長抗体又はVH及びVL抗原結合ドメインをコードする核酸を、クローニング(DNAの増幅)用又は発現用の複製可能ベクターに挿入することができる。種々のベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態であってよい。例えば、プラスミドベクターとしては、限定するものではないが、pET-26+及びpCMV6-ACが挙げられる。ベクター成分は、一般的に、限定するものではないが、1つ以上のシグナル配列、複製開始点、1つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の1つ以上を含有する適切なベクターの構築は、標準的なライゲーション技術を利用する。
【００９６】
非限定例によって、抗体コード化核酸配列にmRNA合成に向けて動作可能に連結されたプロモーターを含有することができる。種々の可能性のある宿主細胞によって認識されるプロモーターは周知である。原核生物宿主での使用に適したプロモーターには、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系(Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776)、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983))等がある。細菌系に用いるプロモーターも、抗体をコードするDNAに動作可能に連結されたシャイン・ダルガーノ配列(S.D.)配列を含有する。
発現ベクターもクローニングベクターもベクターが1種以上の選択宿主細胞内で複製できるようにする核酸配列を含有し得る。該配列は、種々の細菌、酵母、及びウイルスについて知られている。
【００９７】
発現ベクター及びクローニングベクターは典型的に、選択可能マーカーとも称する選択遺伝子を含有することになる。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質又は他の毒素(例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリン)に対する抵抗性を与えるか、(b)栄養要求欠損を補完するか、又は(c)複合培地から入手できない重大な意味を持つ栄養素(例えば、桿菌(Bacilli)のためのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子)を供給するタンパク質をコードする。哺乳動物細胞のための選択可能マーカーの例としては、限定するものではないが、抗体コード化核酸を取り込むのにコンピテントな細胞の同定を可能にするもの、例えばDHFR又はチミジンキナーゼが挙げられる。野生型DHFRを利用するときの例となる宿主細胞は、DHFR活性が欠損しているCHO細胞株であり、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載のように調製及び増殖される。酵母に用いる例示選択遺伝子は、酵母プラスミドYRp7中に存在するtrp1遺伝子である(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980))。trp1遺伝子は、トリプトファン中で成長する能力を欠いている酵母の突然変異株用の選択マーカー、例えばATCC No.44076又はPEP4-1を提供する(Jones, Genetics, 85:12 (1977))。
【００９８】
抗体産生のためには本明細書に記載の発現ベクター又はクローニングベクターで宿主細胞がトランスフェクト又は形質転換され、必要に応じてプロモーターを誘発し、形質転換体を選択し、又は所望配列をコードする遺伝子を増幅するために改変された通常の栄養培地内で培養される。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル、及び実践的技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed.(IRL Press, 1991)で見つけられる。
真核生物細胞のトランスフェクトション法及び原核生物細胞の形質転換法には、例えば、CaCl2、Ca2PO4、リポソーム媒介法及びエレクトロポレーションが含まれる。使用宿主細胞に応じて、該細胞に適した標準的技術を用いて形質転換が行なわれる。原核生物ではSambrookらに記載のように塩化カルシウムを利用するカルシウム処理、又はエレクトロポレーションが一般的に用いられる。哺乳動物細胞では、Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を利用することができる。酵母への形質転換は、典型的にVan Solingen et al., J.Bact., 130:946 (1977)及びHsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829 (1979)に従って行なわれる。しかしながら、核のマイクロインジェクション法、エレクトロポレーション、インタクト細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチンとの細菌プロトプラスト融合による等の細胞へのDNAの他の導入方法を使用してもよい。哺乳動物細胞を形質転換する種々の技術については、Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及びMansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)を参照されたい。
【００９９】
DNAのクローニング及び発現、並びに組換え抗体の産生に適した宿主細胞としては限定するものではないが、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、酵母、真菌、原生動物、昆虫細胞、哺乳動物細胞及びトランスジェニック植物が挙げられる。
大腸菌は、細胞外産生のために1リットル当たりグラムスケールの容積測定収量に到達する組換えタンパク質用の最も重要なグラム陰性産生系である。しかしながら、ミニ抗体及びscFvの産生のためには、グラム陰性細菌プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)及びシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putidas)の細胞壁を持たないL型(cell wall-less L-form)が使用されている。
グラム陽性細菌は、抗体フラグメントの産生を促す外膜を欠いているので、培地中に直接タンパク質を分泌する。グラム陽性細菌ブレビバチルス(Bacillus brevis)、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)、及びバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)は、様々な抗体フラグメントの産生にうまく使用されている。さらに、バチルス・メガテリウム(B. megaterium)はアルカリプロテアーゼを産生せず、成長中にプラスミドベクターの高安定性をもたらし、バイオリアクター内での長期培養中に安定した導入遺伝子の発現を可能にする。乳酸桿菌(Lactobacilli)も抗体産生用に試験され、「一般に安全と認められる(generally regarded as safe)」(GRAS)微生物である。現在までに、2つの乳酸桿菌株ラクトバチルス・ゼア／カゼイ(Lactobacillus zeae／casei)、及びラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)がscFvsの産生に用いられている。
【０１００】
酵母は、短い産生時間と、単細胞微生物宿主の頑強性及び単純な培地要件による遺伝子操作の容易さとを併せ持つ。ピキア・パストリス(Pichia pastoris)は、組換え抗体産生に用いられる例示酵母株である。他の酵母、例えばサッカロミセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラ ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、スクワンニオミセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、及びヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)もタンパク質産生のために記載されている。
【０１０１】
哺乳動物細胞は、高度な哺乳動物フォールディング、並びに免疫原性修飾のために最少の懸念で人体内の抗体と区別できない抗体を産生できる分泌及び翻訳後器官を提供する。哺乳動物細胞は、大きくて複雑なIgGの分泌にも非常に効率的であり、フォールディング及び翻訳後コントロールと共に、高い産物品質を達成して、その後の労力及びコスト並びにより高価な下流プロセシング工程を減らすことができる。病原体又はウシ海綿状脳症(TSE/BSE)薬による汚染のリスクは、文書で十分に裏付けられた優良医薬品製造基準(Good Manufacturing Practice)(GMP)準拠デザイナー細胞基質及び動物血清成分の補充を必要としない化学的限定培地によって排除された。哺乳動物細胞培養技術は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において約5g/LのIgGの産生レベルに到達し得る。産業的IgG産生レベルは、主に改良された高産生細胞株、至適産生培地、及び高細胞密度での持続性産生プロセスのため、哺乳動物細胞培養技術の着実に進行する進歩の結果として、12g/Lを超えることが多い。産生細胞株は、産物均一性、代謝改善、アポトーシス減少、及び誘導可能細胞周期停止に関しても遺伝子操作された。これは、高い細胞生存率及び細胞密度でのほぼ3週間の持続性産生時間を可能にする。
【０１０２】
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、バイオ医薬品の商業的製造に適用される最も一般的な細胞である。1950年代に単離されたこの細胞株は、タンパク質産物品質及び達成できる収率が異なる広範な遺伝的に異なる子孫、例えばK1細胞株、DukX B11細胞株、DG44細胞株等をもたらした。さらに、Per.C6細胞、マウス骨髄腫NS0細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞及びヒト胚性腎臓細胞株HEK293も組換えタンパク質産生に使用されている。哺乳動物糖タンパク質の糖化パターンはヒトの糖化パターンに非常に似ているが、小さい差異でさえ抗体の薬物動態及びエフェクター機能に影響を及ぼし得る。糖化パターンが改良された代替デザイナー細胞株、例えば、特異的翻訳後修飾を必要とするか又はタンパク質分解に対する不安定性若しくは感受性に悩まされる抗体の産生のために特異的かつ複雑な糖構造を支持するヒト神経前駆細胞株AGE1.HN(Probiogen, Berlin, Germany)が作製された。CHO細胞バリアントLec13(Glycotope)も、フコースを欠くN結合グリカンを有するヒトIgG1を産生し、これはFc-γRIII結合及び抗体依存性細胞媒介細胞傷害性を改善する。
【０１０３】
単鎖フラグメント可変フラグメント(scFv)抗体は、重鎖(VH)及び軽鎖(VL)の可変領域から成り、これらがフレキシブルなペプチドリンカーによって連結されている。scFv遺伝子を作り出すためには、mRNAが免疫化動物(例えば、マウス)のハイブリドーマ細胞から(又は脾臓、リンパ細胞、及び骨髄細胞からも)単離された後にcDNA中に逆転写されて、抗体遺伝子増幅(PCR)用の鋳型として働く。VH及びVLセグメントをコードするDNAフラグメントが得られると(上述したように、生殖系列VH及びVL遺伝子の増幅及び突然変異誘発によって)、これらのDNAフラグメントをさらに標準的組換えDNA技術によって操作して、例えば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Fabフラグメント遺伝子又はscFv遺伝子に変換することができる。VH領域をコードする単離されたDNAは、VHコード化DNAを、重鎖定常領域(CH1、CH2及びCH3)をコードする別のDNA分子に動作可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換可能である。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は知られており、これらの領域を包含するDNAフラグメントは、標準的PCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM又はIgD定常領域であり得る。Fabフラグメント重鎖遺伝子のためには、VHコード化DNAを、重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子に動作可能に連結することができる。VL領域をコードする単離されたDNAは、VLコード化DNAを、軽鎖定常領域、CLをコードする別のDNA分子に動作可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子(並びにFab軽鎖遺伝子)に変換可能である。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は知られており、これらの領域を包含するDNAフラグメントは、標準的PCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であり得る。VHコード化及びVLコード化DNAフラグメントが、フレキシブルなリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列(Gly4 Ser)3、又は(Gly4Ser)4をコードする別のフラグメントに動作可能に連結され、その結果、VH及びVL配列が、フレキシブルなリンカーで連結されたVL及びVH領域を有する近接単鎖タンパク質として発現され得る。この文脈で用いる用語「動作可能に連結される」は、2つのDNAフラグメントによってコードされたアミノ酸配列がインフレームに残るように2つのDNAフラグメントが連結されること意味するものと定義される。
【０１０４】
核酸アプタマーは、特異的にタンパク質又は他の細胞標的と結合できる二次及び三次構造を形成し得る小さいRNA／DNA分子である。それらは本質的に抗体の化学的等価物であり、それらは、高度に特異的で、サイズが比較的小さく、非免疫原性であるという利点を有する。アプタマーは、例えば、試験管内進化法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)(SELEX)と呼ばれるプロセスによって作製可能である。SELEXは、可変性のDNA結合及び／又はRNA結合の親和性及び特異性を有するDNA及び／又はRNAリガンドの大きいコンビナトリアルオリゴヌクレオチドライブラリーからの、分割と増幅の反復ラウンドによる漸進的選択を必要とする。
非免疫グロブリン(non-Ig)タンパク質スキャフォールドは小さい単ドメインタンパク質であり、翻訳後修飾を必要とせず、ジスルフィド結合を欠いていることが多く、かつ多量体化を受け得る。これらのスキャフォールドは、コンビナトリアル改変法、例えばファージディスプレイ又は他の分子選択技術と組み合わせた部位特異的ランダム突然変異誘発を利用することによって、新規な結合部位を備えることができる。それらは、頑強で小さい可溶性単量体タンパク質(例えば、Kunitzインヒビター又はリポカリン)に由来するか又は細胞表面受容体(例えば、プロテインA、フィブロネクチン又はアンキリンリピート)の安定的に折り畳まれた細胞外ドメインに由来する。抗体又はそれらの組換えフラグメントに比べて、これらのタンパク質スキャフォールドは、限定するものではないが、微生物発現系における高い安定性及び高生産性といった利点をもたらすことが多い。
【０１０５】
キメラモノクロナール抗体は、興味ある抗原を標的にするマウス又は他の非ヒト可変領域、及び抗体の免疫原性を減じるヒトFc Ig成分を含有する治療用生物学的薬剤である。これらの抗体は、特異的にデザインされたベクター及び選択可能マーカーを用いて哺乳動物発現系内で産生される。例えば、ヒトIgG骨格(IgG1、2、3、又は4)を有するキメラ抗体の構築用ベクターに抗体(マウス又は他の非ヒト)可変領域をサブクローニングすることができる。発現が確認されたら、Amaxa Nucleofector IIを用いてチャイニーズハムスター卵巣(CHO-S)等の哺乳動物細胞中に発現ベクターをトランスフェクトすることができる。トランスフェクタントプールの上清をプロテインAクロマトグラフィーによって精製することができる。
ヒト化モノクロナール抗体は、典型的にマウス(又は他の非ヒト)抗体の超可変領域又は相補性決定領域(CDR)のみを保持するが、抗体の残部はヒト抗体である。ヒト化抗体は、典型的に約5%〜約10%のマウス(又は他の非ヒト)組成物を含有する。ヒト化モノクロナール抗体は、マウスCDRをヒト抗体に移植することによって合成可能である。組換えDNA技術を用いて、ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅することができる。結果として生じるヒトリンパ系cDNAライブラリーは、CDRを除く全抗体のインビトロ合成用の鋳型として使用可能である。マウス(又は非ヒト)CDRがクローニングされ、同時に成長する。次にそれぞれの遺伝子をベクターDNAにスプライシングし、成長用の宿主細胞(例えば、細菌)中に組み入れることができる。プロセスを合理化するため、ヒトcDNAとマウス(又は他の非ヒト)cDNAを両方含有するベクターを同一宿主細胞に組み入れて(同時トランスフェクション)、インタクトなヒト化モノクロナール抗体を産生させ得る。
【０１０６】
細菌培養へのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加を利用して、lacプロモーターの制御下での組換えペプチドの産生のためのプラスミドに基づく遺伝子の発現を誘発することができる。IPTGは大腸菌内でlacリプレッサーに結合し、それによってリプレッサータンパク質のDNAへの結合を阻止し、遺伝子転写を遮断する。
抗体、又は抗体部分を発現させるためには、遺伝子が転写又は翻訳制御配列に動作可能に連結されるように、部分長又は全長の軽鎖及び重鎖をコードするDNAを発現ベクターに挿入する。この文脈では、用語「動作可能に連結される」は、抗体遺伝子がベクターに連結され、その結果、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するというそれらの意図した機能を果たすことを意味するように定義される。発現ベクター及び発現制御配列は、用いる発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入することができ、より典型的には、両遺伝子を同一の発現ベクターに挿入する。標準的方法(例えば、抗体遺伝子フラグメント及びベクター上の相補性制御部位のライゲーション、又は制御部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション)によって抗体遺伝子を発現ベクターに挿入する。挿入前に、発現ベクターが既に抗体定常領域配列を持っていてもよい。組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促すシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドがインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)であり得る。
【０１０７】
発現後、培地又は宿主細胞ライセートから組換え抗体を回収することができる。膜が結合している場合、適切な洗浄剤溶液(例えばトリトンX100)を用いるか又は酵素的開裂によって膜から組換え抗体を遊離させ得る。抗体の発現に用いる細胞は、種々の物理的又は化学的手段、例えば凍結-解凍周期、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤等によって破壊され得る。
組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから抗体を単離又は精製するのが望ましいことがある。例となる単離及び精製手順としては、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、硫酸アンモニウム沈降法、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属キレートクロマトグラフィー、硫黄親和性(thiophilic)吸着法、メロンゲルクロマトグラフィー、プロテインA、プロテインG、プロテインL及び抗原特異的親和性精製法がある。種々のタンパク質精製方法を利用することができる(例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)参照)。選択される精製工程(複数可)は、例えば、用いられる産生プロセス及び産生される特定粒子によって決まることになる。
【０１０８】
ポリクロナール抗体は、様々なB細胞系列によって分泌され、従って特異抗体の様々な(複数の)エピトープに対して反応する免疫グロブリン分子のコレクションである。これらの抗体は、動物に抗原を注射することによって産生される。ポリクロナール抗体産生に適した動物としては、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ヒツジ及びニワトリが挙げられる。注射は、4〜6週間毎に行なうことができる。各注射の7〜10日後に動物から血を出すことができる。血清(すなわち、出血の)中の質と量を酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)等の免疫学的アッセイでモニターすることができる。抗体価は、アッセイで最大半量の吸光度をもたらす希釈度と定義することができる。抗体は、例えば、プロテインA親和性クロマトグラフィーによって精製(すなわち、他の血清タンパク質から分離)することができる。
合成抗体模倣物(SyAMs)の、抗体の標的及びエフェクター細胞活性化の両機能を有しながら、それらの分子量の1/20(5%)未満である合成分子は、抗原結合ドメインと、構造ペプチドによって隔てられたFcγ受容体結合ドメインとで合成される。SyAMsは分子インプリンティングによって作製可能である。分子インプリンティングは、分子認識に使用すべき鋳型分子のメモリーを有する高分子マトリックス内で鋳型形状のキャビティを作り出すための技術である。この技術は、「鍵と鍵穴モデル」としても知られる酵素-基質認識に基づいている。
【０１０９】
一部の実施形態によれば、抗体はヒト抗体である。
一部の実施形態によれば、記載発明は、捕獲粒子、例えば、ビーズに結合した抗体を利用する。抗体の結合方法は既知であれ、それには限定ではなく、親和性固定化、アミン反応性固定化、スルフヒドリル反応性固定化、カルボニル反応性固定化、カルボキシル反応性固定化及び活性水素固定化がある。
親和性固定化には、限定するものではないが、プロテインA被覆ビーズ、プロテインG被覆ビーズ、プロテインL被覆ビーズ及びアビジン／ストレプトアビジン被覆ビーズビオチン標識抗体が含まれる。
アミン反応性固定化としては、限定するものではないが、臭化シアン(CNBr)活性化、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル活性化、アルデヒド活性化、アズラクトン活性化及びカルボニルジイミダゾール(CDI)活性化が挙げられる。アミン反応性固定化法は、タンパク質分子のアミン基(-NH2)を標的にする。この基は各ポリペプチド鎖のN末端(αアミンと呼ばれる)及びリシン(Lys、K)残基の側鎖に存在する(εアミンと呼ばれる)。生理的条件でのそれらの正電荷のため、一級アミンは通常、タンパク質の外側を向いている(すなわち、外表面上)。従って、一級アミンは通常、タンパク質構造の変性なしで結合しやすい。
【０１１０】
スルフヒドリル反応性固定化としては、限定するものではないが、マレイミド活性化、ヨードアセチル活性化及びピリジルジスルフィド活性化がある。スルフヒドリル反応性固定化は、タンパク質分子のチオール基を用いて、特定タンパク質分子上の活性中心又は結合部位から離れたカップリング反応に方向づける。スルフヒドリル(-SH)は、システイン(Cys、C)の側鎖に存在する。タンパク質の二次又は三次構造の一部として、システインはそれらの側鎖間でジスルフィド結合(-S-S-)によって連結され得る。これらはスルフヒドリルに還元されて、それらを固定化に利用できるようにしなければならない。スルフヒドリル基は典型的に一級アミンより少数で存在するので、タンパク質及びペプチドの選択的固定化を可能にする。結合用のスルフヒドリルは、ペプチド合成時にシステイン残基を分子の一端に付加させることによってペプチドリガンドに付加させ得る。これにより確実に、固定化後にあらゆるペプチド分子が同じように支持体(例えば、ビーズ)上に配向されることになる。チオール基(スルフヒドリル)は、タンパク質分子内で常在性であり得るか又はジスルフィドの還元によるか若しくは種々のチオレーション試薬の使用によって付加可能である。
【０１１１】
カルボニル反応性固定化には、限定するものではないが、ヒドラジド活性化がある。カルボニル反応性固定化は、カルボニルを介したカップリングを伴う。ほとんどの生体分子は、それらの天然状態にカルボニルケトン又はアルデヒドを含有しない。しかしながら、活性中心又は結合部位から離れて共有結合に方向づける固定化用の部位を形成するためにタンパク質上に該基を作り出すことができる。糖タンパク質又は糖脂質等の複合糖質は、隣接炭素原子上にヒドロキシルを有する糖残基を含有する。これらのcis-ジオールは、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されて、共有結合的固定化用の部位としてアルデヒドを作り出すことができる。
カルボキシル反応性固定化には、限定するものではないが、カルボジイミド媒介固定化がある。カルボジイミドの非限定例は1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)である。カルボキシル反応性固定化法は、タンパク質分子のカルボキシル基(-COOH)を標的にする。ペプチド及びタンパク質は、各ポリペプチド鎖のC末端並びにアスパラギン酸(Asp、D)及びグルタミン酸(Glu、E)の側鎖にカルボキシル(-COOH)を含有する。一級アミンと同様に、カルボキシルは通常、タンパク質構造の表面上にある。カルボン酸を用いて、カルボジイミド媒介反応の使用を経て生体分子を固定化することができる。活性化支持体は、カルボキシラートと自発的に反応できる反応基を含有しないが、アミン(又はヒドラジド)を含有するクロマトグラフィー支持体を用いて、水溶性カルボジイミド架橋剤EDCで活性化されたカルボキシラートとアミド結合を形成することができる。
活性水素固定化法は、マンニッヒ反応と呼ばれる反応を用いて反応性水素をホルムアルデヒド及びアミンと縮合させることによる反応性水素を介したカップリングを伴う。マンニッヒ反応は、ホルムアルデヒド(又は別のアルデヒド)と、活性水素を含有するアンモニア及び別の化合物の縮合から成る。アンモニアを用いる代わりに、一級アミン若しくは二級アミン又はアミドでさえこの反応を遂行することができる。この反応の一級アミンとしてジアミノジプロピルアミン(DADPA)樹脂を用いると固定化が起こる。
【０１１２】
一部の実施形態によれば、記載発明の閉鎖自動化システムは、向流遠心分離(遠心溶出法)を含む。
向流遠心分離は、粒子(例えば、細胞)を密度及びサイズに基づいて分離する。向流遠心分離中、遠心機ローター／チャンバーに埋め込まれたチャンバー(例えば、三角形)に、ローターが動いている(すなわち、回転している)間に不均一細胞のサンプルを通す。遠心力が細胞をチャンバーのより幅広の端部から遠ざけ、同時に対向流がより小幅の端部に向かう反力をもたらす。チャンバーのより幅広の端部にある入口に向かって沈降が起こり得る。
向流遠心分離においては、半径方向の粒子の沈降は、反対方向に流れる流体の速度によってバランスが保たれる。任意点の流速(V)は、当該点の断面積(A)で除した流量(F)に等しく、すなわち、V=F/Aである。流量は、チャンバー内のあらゆる点で同一なので、断面積の変化のみが流速の変化をもたらす。従って、断面積が小さい(例えば、最大半径の位置又はrmax)チャンバーの位置では、流速が最高であり、逆もまた同様である。チャンバーデザインによって、一定流を用いる水簸チャンバーに速度勾配が生じる。遠心力はローターの半径又はローターの中心からの距離と関係があるので、チャンバーの半径方向に沿って遠心力の勾配が導入される。rmaxでは、遠心分離力が最大である。しかしながら、この点ではチャンバーの断面積が最小なので、流速も最大である。ローターの中心に近いほど、それぞれ、r(半径方向位置)が短くなり、チャンバーを横切るA(断面積)が増加するので、遠心力も流速も低減する。反力が等しいとき、システムは平衡している；すなわち、より小さい細胞が水簸境界近傍(すなわち、ローターの中心の最も近く)で静止して留まり、より大きい細胞が流れ入口の近傍(rmax)に静止したままの状態であると言われる。従って、分離は、チャンバー内の異なる半径方向位置で平衡している細胞の沈降速度は異なるという結果である。流量が増加する(又は速度が低減する)と、水簸境界近傍で平衡していた細胞(すなわち、より小さい細胞)がチャンバーからまず最初に洗い出され、平衡状態の細胞の分布が回転の中心の方にシフトする。
【０１１３】
一部の実施形態によれば、記載発明は、垂直回転軸を有する遠心機ローターを提供するする。一部の実施形態によれば、記載発明は、水平回転軸を有する遠心機ローターを提供する。
一部の実施形態によれば、選択／単離される細胞は、ローター速度を下げることによって；対向流の流量を増やすことによって；又はその組み合わせによって最終生成物バッグに収集される。
一部の実施形態によれば、捕獲粒子は、分離可能なサイズ、密度、浮力又はその組み合わせのものである。一部の実施形態によれば、捕獲粒子は、不均一細胞集団内の標的細胞を認識してそれに結合する。一部の実施形態によれば、不均一細胞集団の標的細胞に結合した捕獲粒子は、標的細胞のサイズ、密度及び浮力の少なくとも1つを変えるのに有効である。一部の実施形態によれば、捕獲粒子に結合した標的細胞は、サイズ、密度、浮力又はその組み合わせに基づいて選択／単離される。一部の実施形態によれば、捕獲粒子に結合した標的細胞は、向流遠心分離によって選択／単離される。
【０１１４】
一部の実施形態によれば、記載発明は、磁気成分を含む捕獲粒子で細胞を標識する方法を提供する。一部の実施形態によれば、磁気成分は磁気粒子である。一部の実施形態によれば、磁気粒子はミクロ粒子である。一部の実施形態によれば、磁気粒子はナノ粒子である。一部の実施形態によれば、磁気粒子は鉄を含む。一部の実施形態によれば、磁気粒子は鉄デキストランを含む。一部の実施形態によれば、捕獲粒子は、抗体が結合している鉄デキストラン粒子を含む。
一部の実施形態によれば、本方法は、不均一細胞集団を捕獲粒子とインキュベートして、細胞の標的集団を標識する工程を含む。一部の実施形態によれば、捕獲粒子は磁気成分を含む。一部の実施形態によれば、磁気成分を含む捕獲粒子の不均一細胞集団内の標的細胞への結合工程は、不均一細胞集団中の非標識細胞に対して標的細胞のサイズ、密度及び浮力の少なくとも1つを変えるのに有効である。一部の実施形態によれば、磁気成分を含む捕獲粒子に結合した標的細胞は、そのサイズ、密度、浮力又はその組み合わせに基づいて選択／単離される。一部の実施形態によれば、磁気成分を含む捕獲粒子に結合した標的細胞は、向流遠心分離によって選択／単離される。
【０１１５】
一部の実施形態によれば、記載発明は、自動化閉鎖システム(100)を用いて、磁気成分を含む捕獲粒子で細胞を標識し、この標識細胞を分離／単離する方法を提供する。
一部の実施形態によれば、磁気成分を含む捕獲粒子は、不均一細胞集団内の標的細胞を認識してそれに結合する。一部の実施形態によれば、磁気捕獲粒子に結合した標的細胞は、磁場の適用によって磁気的に分離／単離される。一部の実施形態によれば、磁気捕獲粒子に結合した標的細胞は、向流遠心分離によって分離／単離される。
一部の実施形態によれば、本方法は、不均一細胞集団と、磁気成分を含む捕獲粒子を混合する工程を含む。一部の実施形態によれば、捕獲粒子は、鉄デキストランナノ粒子に結合した抗体である。一部の実施形態によれば、抗体は、特異的細胞表面マーカーを認識し、不均一細胞集団内で、該特異的細胞表面マーカーを含有する当該細胞(すなわち、標的細胞)に結合(すなわち、標識)する。一部の実施形態によれば、標的細胞は、向流遠心分離を受ける前に標識される。一部の実施形態によれば、不均一細胞集団内の標的細胞に結合した捕獲粒子は、標的細胞のサイズ、密度及び浮力の少なくとも1つを変えるのに有効である。一部の実施形態によれば、捕獲粒子に結合した標的細胞は、サイズ、密度、浮力又はその組み合わせに基づいて選択／単離される。一部の実施形態によれば、捕獲粒子に結合した標的細胞 は、向流遠心分離によって分離／単離される。一部の実施形態によれば、標識された標的細胞は、磁場を用いて、非結合非標的から分離される。一部の実施形態によれば、磁気を用いて過剰の捕獲粒子を収集することができる。一部の実施形態によれば、分離／単離後に、標的細胞を洗浄することができる。一部の実施形態によれば、分離／単離された標的細胞を溶出緩衝液、例えば、100mMのクエン酸、pH 3.0を用いて捕獲粒子から溶出することができる。
【０１１６】
値の範囲を提供している場合、各中間値は、文脈により明らかに他の指示がない限り、当該範囲の上限と下限との間の下限の単位の10分の1まで、また当該規定範囲内のいずれの他の規定値又は介在値も本発明の範囲内に包含されるという共通認識がある。独立により小さい範囲に含められ得るこれらのより小さい範囲の上限及び下限も、規定範囲内のいずれもの具体的に除外された範囲の支配下で、本発明の範囲内に包含される。規定範囲が限界値の1つ又は両方を含む場合、当該含まれる限界値のどちらか又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
特に定義のない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と類似するか又は等価ないずれの方法及び材料をも本発明の実施又は試験に使用することができるが、例となる方法及び材料について記載した。本明細書で言及した全ての公表文献は、該公表文献がそれらと関連して引用されている方法及び／又は材料を開示及び記載するために参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「an」、及び「the」には、文脈により明らかに他の指示がない限り複数の言及が含まれることに留意しなければならない。
本明細書で開示した公表文献は、本出願の出願日前のそれらの開示を単に提供するものであり、それぞれ参照によってその内容全体が組み込まれる。本明細書の何も、先行発明の理由で本発明が該公表文献に先立つ権利を認めないとの承認と解釈すべでない。さらに、提供した公表文献の日付は、実際の公表日付と異なることがあり、独立に確認する必要があり得る。
【実施例】
【０１１７】
実施例
下記実施例は、本発明をどのように作り、使用するかの完全な開示及び説明を当業者に与えるために提示するものであり、発明者らが自らの発明と見なす範囲を限定する意図でなく、或いは下記実験が全てであり又は下記実験しか行わなかったことを表す意図でもない。用いた数値(例えば、量、温度等)については正確さを保証する努力を行なったが、ある程度の実験誤差及び偏差を斟酌すべきである。特に指定のない限り、部は質量部であり、分子量は質量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又は大気圧に近い。
【０１１８】
実施例1.  細胞の不均一集団からの制御性T細胞(Treg細胞)の選択／単離
記載発明のシステム及び方法を用いて白血球の不均一集団から制御性T細胞(Treg細胞)を選択／単離する。
アフェレーシスを用いて全血から白血球の不均一集団を調製する。簡潔には、全血を回転遠心機チャンバーに導入し、チャンバーの壁に沿って重力により血漿、血小板リッチ血漿、白血球及び赤血球に分離する。分離された白血球のレベルに吸引装置を動かすことによって白血球を除去し、生理学的媒体に懸濁させる。
抗ヒトCD4抗体(sc-514571、Santa Cruz Biotechnology、Dallas、TX)、抗ヒトCD25抗体(MAB623、R&D Systems、Minneapolis、MN)、抗ヒトCD127抗体(306-IR、R&D Systems)、抗ヒトFOXP3抗体(ab54501、abcam、Cambridge、MA)又はこれらの抗体の組み合わせをアルギナートミクロスフェア上に固定化することによって捕獲粒子を調製する。例えば、アルギナートの二価又は多価カチオン(例えば、CaCl2からのCa2+)との外部架橋結合中に、アルギナートミクロスフェアの多孔性網目構造上に抗体又は抗体組み合わせを固定化する。CaCl2を含有するアルギン酸ナトリウム(Na)-トリス緩衝(TBS)溶液のバイアルに抗体又は抗体組み合わせを添加し、10rpmで穏やかに動く往復シェイカー(Thermo Scientific)上にバイアルを置く。次にアルギナートゲルミクロスフェアを800gで5分間遠心分離して、固定化抗体を有するアルギナートミクロスフェアを収集する。
【０１１９】
記載発明のシステムを用いて、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバー内で、ローターが動いてチャンバー内の対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に、生理学的媒体に懸濁した白血球の不均一集団を捕獲粒子と混合する。遠心機ローターに埋め込まれたチャンバー内で、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に捕獲粒子をTreg細胞に結合させる。次いで非結合細胞及び非結合捕獲粒子をチャンバーから除去するため、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に洗浄緩衝液(例えば、生理学的媒体)を通す。次に、アルギナートビーズを溶解させるため、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に溶解剤(例えば、EDTA)を添加する。溶解剤及び溶解したビーズをチャンバーから除去するため、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に洗浄緩衝液を通す。次に、抗体に結合したTreg細胞を収集し、引き続き解離溶液(例えば、100mMのクエン酸、pH 3.0)を用いて抗体からTreg細胞を解離させる。
【０１２０】
実施例2.  細胞の不均一集団からの造血幹細胞の選択／単離
記載発明のシステム及び方法を用いて白血球の不均一集団から造血幹細胞を選択／単離する。
アフェレーシスを用いて全血から白血球の不均一集団を調製する。簡潔には、全血を回転遠心機チャンバーに導入し、チャンバーの壁に沿って重力により血漿、血小板リッチ血漿、白血球及び赤血球に分離する。分離された白血球のレベルに吸引装置を動かすことによって白血球を除去し、生理学的媒体に懸濁させる。
抗ヒトCD34抗体(EPR2999、abcam、Cambridge、MA)をアルギナートミクロスフェア上に固定化することによって捕獲粒子を調製する。例えば、アルギナートの二価又は多価カチオン(例えば、CaCl2からのCa2+)との外部架橋結合中に、アルギナートミクロスフェアの多孔性網目構造上に抗体を固定する。CaCl2を含有するアルギン酸ナトリウム(Na)-トリス緩衝(TBS)溶液のバイアルに抗体を添加し、10rpmで穏やかに動く往復シェイカー(Thermo Scientific)上にバイアルを置く。次にアルギナートゲルミクロスフェアを800gで5分間遠心分離して、固定化抗CD34抗体を有するアルギナートミクロスフェアを収集する。
【０１２１】
記載発明のシステムを用いて、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバー内で、ローターが動いてチャンバー内の対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に、生理学的媒体に懸濁した白血球の不均一集団を捕獲粒子と混合する。遠心機ローターに埋め込まれたチャンバー内で、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に捕獲粒子を造血幹細胞に結合させる。次いで非結合細胞及び非結合捕獲粒子をチャンバーから除去するため、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に洗浄緩衝液(例えば、生理学的媒体)を通す。次に、アルギナートビーズを溶解させるため、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に溶解剤(例えば、EDTA)を添加する。溶解剤及び溶解したビーズをチャンバーから除去するため、遠心機ローターに埋め込まれたチャンバーに、ローターが動いて対向流がチャンバー内に反力をもたらしている間に洗浄緩衝液を通す。次に、抗体に結合した造血幹細胞を収集し、引き続き解離溶液(例えば、100mMのクエン酸、pH 3.0)を用いて抗体から造血幹細胞を解離させる。
【０１２２】
実施例3.  細胞の形質導入(Transduction)
本明細書使用する用語「トランスフェクション(transfection)」は、培養内における細胞への外来DNAの実験的導入を指し、通常はその後に、導入されたDNAの遺伝子の発現が続く。ウイルス媒介トランスフェクション又は形質導入は、ある細胞から別の細胞への遺伝子材料(及びその表現型発現)の移動が、ウイルス感染によって起こるプロセスである。ウイルス媒介トランスフェクションは非常に効率的であり、宿主ゲノムへのDNA組込み、及び組み込まれたDNAの宿主における発現というウイルスの性質のおかげで、持続可能な導入遺伝子発現を達成しやすい。
【０１２３】
哺乳動物細胞をトランスフェクトするための標準プロトコルは以下のとおりである。2×106個のヒト胚性腎臓細胞(293T細胞；ATCC、Manassas、VA)を100cmの組織培養皿(Corning、Inc.、Corning、NY)に播種し、細胞が約70%のコンフルエントになるまで(ほぼ1〜2日)インキュベートする。94μLの血清フリーDMEM(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)を含有するポリプロピレン管に、8:1比の、興味ある遺伝子材料を含有するパッケージングプラスミド(細胞内で自己複製できる小さい円形染色体外DNA分子を意味する)(例えば、pUMVC3(Aldevron、Fargo、North Dakota)又はpLenti-C-Myc-DDK-IRES-Puro(Origene、Rockville、MD))と、パッケージング又はエンベローププラスミド(例えば、pCMV-VSV-G(Cell Biolabs、Inc.、San Diego、CA))とを全部で1μg添加することによって、ウイルスベクター(DNAを細胞又は生物中に運べる薬剤を意味する)を調製する。次に、6μLのFuGENE(登録商標)トランスフェクション試薬(Promega、Madison、WI)を管に添加し；管の中身をピペット操作により混合し、室温で20〜30分間インキュベートする。インキュベーション後、ウイルスベクター混合物を293T細胞に滴加し、細胞を一晩インキュベートすることによって293T細胞のトランスフェクションを行なう。最初はトランスフェクションの48時間後にウイルス含有培地を収集し、その後は12時間毎に全部で3回収集する。収集細胞を0.45μMの低タンパク質結合フィルター(EMD Millipore、Billerica、MA)に通す。次に、濾過したバイアル培地をAmiconフィルター(EMD Millipore、Billerica、MA)に移し、4℃で3,000rpmにて10〜20分間遠心分離することによってウイルスベクターを濃縮する。
【０１２４】
細胞に形質導入するために有効であり、細胞を傷つけ得る細胞ペレット化を必要としない記載発明のシステム及び方法を用いて哺乳動物細胞に形質導入することができる。哺乳動物細胞は、遠心機ローター／チャンバーに埋め込まれたチャンバー内の流動床内に捕獲される(図4)。次に、興味ある遺伝子材料がパッケージングされている濃縮ウイルスベクターを含む形質導入緩衝液が細胞周囲を循環する(すなわち、連続的に通過する)。この循環は、ウイルス媒介遺伝子導入をもたらすウイルス-細胞相互作用の確率を高める(図4)。理論に束縛されるものではないが、このプロセスは、改良された混合をもたらし、結果としてより高い形質導入効率を実現し；かつ、より短いインキュベーション時間をもたらすことができる。
【０１２５】
本発明をその特定実施形態を参照して説明したが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の変更を加えることができ、等価物と置換できることを当業者は理解すべきである。さらに、多くの修正を加えて特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセス工程(複数可)を本発明の客観的精神及び範囲に採択することができる。全てのこのような修正は、本明細書に添付した特許請求の範囲内であるよう意図される。
【図１】
2019509763.tif 000004
【図２】
2019509763.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
2019509763.tif 000008
2019509763.tif 000009