(57)【要約】  ２−（Ｒ１フェニル）−５−（２−スルホン酸フェニル）−２Ｈ−テトラゾールの構造を有するモノスルホン酸フェニルテトラゾールの化合物のクラスが提供される。本発明の２−スルホン酸フェニルテトラゾリウム塩は、低毒性、短合成経路、純度及び品質の容易な制御という利点を有する。還元性堆積物がより大きな吸収を有する４５０ｎｍにおいて、２−スルホン酸フェニルテトラゾリウム塩は吸収がほとんどないため、分光光度測定法は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの活性又はＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの含有量を簡単かつ迅速に測定することができる。
2019502655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物の組成物であって、一般式Ｉ：
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を含み、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、置換基Ｗ又はＨから選択され、置換基Ｗは、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲンから選択される１〜５０個の原子の群を含む、ことを特徴とするモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物の組成物。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、置換基Ｗ又はＨから選択され、置換基Ｗは、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ又はハロゲンを含む群から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、置換基Ｗ又はＨから選択され、置換基Ｗは、ヒドロキシ、スルホンアミド又はアミノを含む群から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、置換基Ｗ又はＨから選択され、置換基Ｗは、置換アルキル基、置換アルコキシ、置換カルボキシ、置換スルホンアミド又は置換アミノを含む群から選択され、置換基は、アルキル、アリール、アラルキルを含む群から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して置換基Ｗ又はＨから選択され、置換基Ｗは、ヘテロシクロアルキル又はポリシクロアルキルを含む群から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項６】
前記式Ｉのスルホン酸基は、フェニルのメタ位又はパラ位にある、ことを特徴とする請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項７】
前記式Ｉのスルホン酸基は、フェニルのメタ位又はパラ位にあり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、置換基Ｗ又はＨから選択され、置換基Ｗは、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、スルホンアミド、アミノ、ヘテロシクロアルキル又はポリシクロアルキルを含む群から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項８】
前記一般式Ｉのスルホン酸基は、フェニルのメタ位又はパラ位にあり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、置換基Ｗ又はＨから選択され、置換基Ｗは、置換アルキル基、置換アルコキシ、置換カルボキシ、置換スルホンアミド又は置換アミノを含む群から選択され、置換基は、アルキル、アリール、アラルキルを含む群から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項９】
以下の化合物
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2019502655.tif 000014
2019502655.tif 000015
から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項１０】
ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨレベル、デヒドロゲナーゼ酵素活性、血清中デヒドロゲナーゼレベルの定量化、及び／又は細胞生存率を測定するための請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物の用途。
【請求項１１】
モノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物の組成物であって、一般式ＩＩ：
2019502655.tif 000016
を含み、Ｒ１は、未置換の置換基Ｘ１、又は１つ以上の置換可能な置換基Ｘ２で独立に置換された置換基Ｘ１であり、置換基Ｘ１及び／又は置換基Ｘ２は、以下の置換又は未置換の基：フェニル、ニトロ、スルホン酸基、スルホンアミド、ハロゲン、アルコキシ、アルキル、１又は２個のＮ原子を含む６員のヘテロシクロアルキル基、それぞれ独立してＮ、Ｓ、Ｏから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む５員のヘテロシクロアルキル基、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む二環性へテロアリール基から任意に選択され、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、置換基Ｙ又はＨから選択され、置換基Ｙは、置換又は未置換のアルキル、アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、アゾ、フェニル、置換スルホン酸基、１Ｎ置換基を含む複素環アルキル、シクロアルキルから、任意に選択される、ことを特徴とするモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物の組成物。
【請求項１２】
Ｒ１は置換基Ｘで置換され、置換基Ｘは、フェニル、ニトロフェニル、マルチニトロフェニル、ベンゼンスルホン酸基、ベンゼンスルホンアミド、ハロフェニル、メチルニトロフェニル、１又は２個のＮ原子を含む６員のヘテロシクロアルキル、それぞれ独立してＮ、Ｓ、Ｏから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む５員のヘテロシクロアルキル基、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む二環性へテロアリールを含む群から選択され、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、置換基Ｙ又はＨから選択され、置換基Ｙは、アルキル、ニトロ、アルコキシ、シクロアルキル、１個のＮ原子を含むヘテロシクロアルキル及びアルコキシニトロフェニル基を含む群から選択される、ことを特徴とする請求項１１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項１３】
前記一般式ＩＩにおけるスルホン酸基は、フェニルのメタ位又はパラ位にある、ことを特徴とする請求項１１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項１４】
前記一般式ＩＩにおけるスルホン酸基は、フェニルのメタ位又はパラ位にある、ことを特徴とする請求項１２に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１１月９日に出願された「モノスルホン酸フェニルテトラゾールの構造を有する化合物のクラス及びそれらの用途」と題された中国出願第２０１５１０７５７０７８．２号に基づいて、その優先権を主張し、その開示内容全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、医薬品バイオテクノロジーの分野に関し、特に、モノスルホン酸フェニルテトラゾールの化合物のクラス及びそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨは、有機体における重要な酸化還元メディエーターである。それらの化学構造の相違はただ１つのリン酸基であるが、それらの生物学的機能は大きく異なる。ＮＡＤＨは分解反応に関与し、細胞呼吸と栄養素の代謝に重要な役割を果たす。一方、ＮＡＤＰＨは合成反応に関与し、巨大分子の生合成にエネルギーを供給するために消費される。ＮＡＤＰＨはまた、細胞内抗酸化防御システムの重要な構成要素として、細胞防御酸素（ＲＯＳ）傷害において重要な役割を果たす。従って、生物学的作用の検出及び疾患の診断には、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨの濃度の正確な定量化が重要である。
【０００４】
ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨは、テトラゾリウム塩との酸化還元反応で生じる色によって検出することができる。ＴＴＣ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩）は、１８９４年に最初に合成され、種子生存率の検出のための脂溶性光感応性化合物である。ＭＴＴアッセイは、細胞の生存と増殖を検出するための別の方法である。ＭＴＴは、生細胞ミトコンドリアからコハク酸デヒドロゲナーゼによって水不溶性の青紫色結晶であるホルマザンに還元され、そして、ホルマザンがＤＭＳＯによって溶解された後、５４０ｎｍ又は７２０ｎｍにおいて吸光度を検出することができる。このアッセイは、高感度、有利な経済的利益などの利点を有するが、欠点は検出プロセスにおける複数のステップが必要なことである。１９９７年に水溶性のＷＳＴ（ビスルホン酸フェニルテトラゾリウム塩）が合成され、細胞生存率用の市販アッセイに使用された。
【０００５】
しかしながら、水溶性のＷＳＴ−８は、容易に合成及び精製されず、その純度及び品質を制御することが困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの検出のための高感度試薬である新規な構造のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物のクラスを提供することである。これらの化合物は、式Ｉの構造を含む。
【０００７】
2019502655.tif 000003
【０００８】
ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、置換基Ｗ又はＨから選択される。
【０００９】
置換基Ｗは、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、及びＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉのようなハロゲンを含む群から選択される１〜５０個の原子の群を含む。
【００１０】
また、Ｒ１は、置換及び未置換の芳香族基、又は置換及び未置換の複素環式芳香族基である。
【００１１】
置換基Ｗは、水素、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、スルホンアミド、アミノ、置換アルキル、置換アルコキシ、置換カルボキシ、置換スルホンアミド若しくは置換アミノ（置換基はアルキル、アリール、アラルキルを含む群から選択される）、ヘテロシクロアルキル又はポリシクロアルキルを含む群から選択される。
【００１２】
Ａは、置換及び未置換の芳香族基、又は置換及び未置換の複素環式芳香族基を含有するモノスルホネートである。
【００１３】
本発明は、請求項９で示されるような一連のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物を更に提供する。請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物は、以下の化合物から選択される。
【００１４】
2019502655.tif 000004
2019502655.tif 000005
2019502655.tif 000006
【００１５】
本発明は、式ＩＩの構造を有する別のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物を更に提供する。
【００１６】
2019502655.tif 000007
【００１７】
ここで、
Ｒ１は、未置換の置換基Ｘ１、又は１つ以上の置換可能な置換基Ｘ２で独立に置換された置換基Ｘ１であり、置換基Ｘ１及び／又は置換基Ｘ２は、以下の置換又は未置換の基：フェニル、ニトロ、スルホン酸基、スルホンアミド、ハロゲン、アルコキシ、アルキル、１又は２個のＮ原子を含む６員のヘテロシクロアルキル基、それぞれ独立してＮ、Ｓ、Ｏから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む５員のヘテロシクロアルキル基、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む二環性へテロアリール基、から任意に選択される。
【００１８】
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して置換基Ｙ又はＨから選択され、置換基Ｙは、置換又は未置換のアルキル、アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、アゾ、フェニル、置換スルホン酸基、１Ｎ置換基を含む複素環アルキル、シクロアルキルから任意に選択される。
【００１９】
置換基Ｘ、Ｘ１、Ｘ２は、フェニル、ニトロフェニル、マルチニトロフェニル、ベンゼンスルホン酸基、ベンゼンスルホンアミド、ハロフェニル、メチルニトロフェニル、１又は２個のＮ原子を含む６員のヘテロシクロアルキル、それぞれ独立してＮ、Ｓ、Ｏから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む５員のヘテロシクロアルキル、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む二環性へテロアリールを含む群から選択される。
【００２０】
置換基Ｙは、好ましくは、アルキル、ニトロ、アルコキシ、シクロアルキル、１個のＮ原子を含むヘテロシクロアルキル、１〜３個のニトロを含むニトロフェニルアゾ、ベンゼンスルホニルアゾ基（ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｚｏ  ｇｒｏｕｐ）、及びアルコキシニトロフェニル基を含む群から選択される。
【００２１】
また、置換基Ｘ、Ｘ１、Ｘ２は、好ましくは、フェニル、任意の数のスルホン酸基又はスルホンアミド置換基を有する５員複素環又は６員複素環を含む群から選択される。
【００２２】
さらに、本出願の式Ｉ又は式ＩＩのベンゼンスルホン酸基は、さらに修飾されてもよく、スルホン酸基はフェニルのメタ位又はパラ位にあってもよい。
【００２３】
本発明のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物は、式Ｉ及びＩＩによって表される全ての異性体からなるべきである。各構造式のエナンチオマー及びジアステレオマーに関わらず、本発明は、不斉中心のＲ及びＳ立体異性体、並びにＺ及びＥ二重結合異性体、並びにＺ及びＥ配座異性体を含む。
【００２４】
さらに、本発明のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物は、式Ｉ及び式ＩＩの化合物によって生成される塩も含む。このような塩は、好ましくは、アルカリ塩又はアルカリ土類塩を含むが、ナトリウム塩、カリウム塩及びカルシウム塩に限定されない。
【００２５】
本発明の別の目的は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミナーゼの活性の測定、又は細胞中のＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨの含有量測定のためのモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物の用途を提供することである。それは、例えば、１）ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨレベルの測定、２）様々なデヒドロゲナーゼ酵素活性、３）血清中デヒドロゲナーゼレベル及び／又は４）細胞生存率である。
【００２６】
本発明は、以下のような重要な技術的改良を有する。
【００２７】
本発明のフェニルテトラゾリウム塩は、伝統的な脂溶性テトラゾリウム塩の高い毒性を克服し、低毒性の利点を有する。一方、水溶性テトラゾリウム塩の難しい合成及び精製とは異なり、フェニルテトラゾリウム塩は、短い合成経路、純度及び品質の容易な制御というメリットを有する。
【００２８】
還元形であるホルマザンがより高い吸収を有する４５０ｎｍにおいて、テトラゾリウム塩は吸収がほとんどないため、分光光度測定法は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの活性、細胞中のＮＡＤＨの含有量を簡単かつ迅速に測定することができる。また、その水溶性のため、アッセイは、分光測定を用いて連続的に追跡することができる。また、ＷＳＴ−８よりも安定であり、多くの抗酸化剤と反応しないため、化合物スクリーニングに適している。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
発明は、７つの図面を伴う。
【図１】約４５０ｎｍにおいて弱いＵＶ吸光度を有する化合物（テトラゾリウム）、約４５０ｎｍにおいて強いＵＶ吸光度を有するその還元フェニル化合物（ホルマザン）の全波長走査曲線を示す。請求されたすべての化合物は、そのテトラゾリウム形態とホルマザン形態の間で、大きなＵＶ吸光度差を示した。
【図２】グルタミン酸デヒドロゲナーゼと反応させた後のモノスルホン酸フェニルテトラゾールの構造を有する化合物の４５０ｎｍにおける吸収を示す。
【図３】グルタミン酵素と反応させた後のモノスルホン酸フェニルテトラゾールの構造を有する化合物の４５０ｎｍにおける吸収を示す。
【図４】生細胞と反応させた後のモノスルホン酸フェニルテトラゾールの構造を有する化合物の４５０ｎｍにおける吸収を示す。
【図５】テトラゾリウム検出試薬に対する界面活性剤及び抗酸化剤の効果を示す。ＮＡＤＨが存在していない場合の（Ａ）Ｔｗｅｅｎ２０、（Ｂ）ＳＤＳ、（Ｃ）ＢＭＥの用量応答。ＮＡＤＨが存在している場合の（Ｄ）Ｔｗｅｅｎ２０、（Ｅ）ＳＤＳの用量応答。
【図６】−２０℃及び４℃におけるＷＳＴ−８又はＥＺＭＴＴ検出試薬の安定性を示す。
【図７】動力学研究及びＧＤＨアッセイ評価を示す。（Ａ）このアッセイは、大腸菌ＧＤＨに対する線形用量応答を示した。（Ｂ）高濃度の大腸菌ＧＤＨについてＮＡＤＰ基質阻害が観察されたが、ＮＡＤは大腸菌ＧＤＨの基質ではない。（Ｃ）最大初速度は、１００μＭのＮＡＤＰの存在下で５ｍＭのグルタメートで観察された。（Ｄ）ＥＺＭＴＴ試薬（Ｚ因子０．９）アッセイ再現性測定。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
〈実施例〉
【００３１】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲を通して、以下の用語は、特に明記しない限り、以下の意味で定義される。
【００３２】
本発明の用語は、特に定義されていなければ、当業者に理解されるような通常の意味をとる。
【００３３】
用語「ハロゲン」は、フルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）又はヨード（−Ｉ）を含む群からのハロゲン置換基を意味する。用語「ハロゲン化」は、化合物中の水素の置換基として上記ハロゲン置換基を表す。
用語「アルキル」は、直鎖／分枝鎖及び環状飽和脂肪族炭化水素基を意味する。それは、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、第一級／第二級／第三級ブチル、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、シクロブチルなどの単結合、並びに、例えば、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２−などの２つ以上のフリーな結合を有するが原子価結合理論を満たすアルキル基を含む。
用語「アルコキシ」は、ＯＲ基を意味し、ここで、Ｒは、様々な直鎖、直鎖／分枝鎖アルキル及びシクロアルキル基などの様々なアルキル基である。
用語「シアノ」は、三重結合を介して結合した炭素原子と窒素原子を含む官能基又は置換基を意味する。
【００３４】
用語「置換基」は、基の水素原子が他の官能基又は置換基で置き換えられていることを表す。
用語「ポリニトロフェニル」は、フェニルの少なくとも２個の水素原子がニトロで置き換えられ、置換水素の位置がパラ、メタ及びオルトのように任意に選択され得ることを表す。
用語「メチルニトロフェニル」は、フェニルの２個の水素原子をメチル及びニトロで置換して得られた官能基又は置換基を意味し、メチルとニトロの位置は任意に選択することができる。
用語「マルチニトロフェニル」は、フェノール基のいずれかの適切な位置に１つ以上のニトロ置換基が存在する一置換、二置換、又は多置換の置換基又は基を意味する。
【００３５】
用語「ベンゼンスルホン酸基」は、ベンゼンスルホン酸を含む置換基又は基を意味する。
用語「ハロフェニル」は、任意の適切な位置の一置換、二置換、又は多置換のフェニルを意味する。
用語「ニトロフェニルアゾ」は、フェニルの２個の水素原子をニトロ及びアゾで置換して得られた官能基又は置換基を意味し、ニトロとアゾの位置は任意に選択することができる。
用語「ベンゼンスルホニルアゾ」は、フェニルの２個の水素原子をベンゼンスルホン酸基及びアゾで置換して得られた官能基又は置換基を意味し、ベンゼンスルホン酸基とアゾの位置は任意に選択することができる。
用語「アルコキシニトロフェニル」は、フェニル基の２個の水素原子をアルコキシ及びアゾで置換して得られた官能基又は置換基を意味し、アルコキシとアゾの位置は任意に選択することができる。アルコキシの意味は上記と同じである。
【００３６】
用語「フェニル」は、置換又は非置換の−Ｃ６Ｈ５を含むベンゼン環アリールを意味する。
用語「アリール」は、単純な芳香族化合物に由来する官能基又は置換基を意味し、他の仕様の非存在下では、炭素環式アリール基又はＮ、Ｓ、Ｏなどに限定されないヘテロ原子を含む複素環式アリール基であってもよい。さらに、アリール基は、単環又は縮合環アリールであってもよく、アリール環で非アリール環と縮合した多環式置換基であってもよい。
用語「ヘテロアリール」は、異なる数のＮ、Ｓ、Ｏ、又は他の原子のヘテロ原子を含有する芳香族環に由来する官能基又は置換基を意味する。
用語「ヘテロシクロアルキル」は、異なる数のＮ、Ｓ、Ｏ又は他の原子のヘテロ原子を含むシクロアルキル基を意味する。
用語「ハロフェニル」は、他のタイプの置換基を有していてもよいハロゲン置換基で置換されたフェニル基を意味する。
【００３７】
用語「ポリシクロアルキル」は、炭素環式アリール基、Ｎ、Ｓ、Ｏ原子を含むがこれらに限定されない複素環式アリール、並びに、アリール環基で非アリール環と縮合した縮合環アリール又は多環式置換基を意味することができる。
用語「ＮＡＤＰＨ」は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、すなわち還元型補酵素ＩＩを意味する。
用語「ＮＡＤＨ」は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、すなわち還元型補酵素Ｉを意味する。
【００３８】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、以下の実施例は本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。
【００３９】
〈実施例１〉
以下の化合物を調製した。
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ＥＺＭＴＴとしての２−（４−ニトロフェニル）−３−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホン酸フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩
【００４０】
代表的な合成ステップ以下のとおりである。
ステップＡでは、メタノール（３０ｍＬ）にｐ−ニトロフェニルヒドラジン（６ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、ベンズアルデヒド−２−ナトリウムスルホネート（６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を撹拌しながら６０℃の温度で１時間〜２４時間撹拌した。粗生成物をろ過し乾燥させて、橙赤色固体生成物であるベンズアルデヒド−２−スルホン酸ナトリウムｐ−ニトロフェニルヒドラゾンを収率８７．１％で得た。
【００４１】
ステップＢでは、フラスコ内の２−メトキシ−４−ニトロアニリン（２  ｍｍｏｌ）の固体に、氷冷下で１ｍＬの水を加え、次いで、０．６ｍｌの濃塩酸を加え、その後、水（１ｍＬ）中のＮａＮＯ２（２．２２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を２０分〜５時間撹拌し、生成物を２−メトキシ−４−ニトロアニリンジアゾニウム塩とした。
【００４２】
ステップＣでは、０℃に冷却したメタノールにベンズアルデヒド−２−スルホン酸ナトリウムｐ−ニトロフェニルヒドラゾン（２ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、ステップＢからの２−メトキシ−４−ニトロアニリンジアゾニウム塩（２ｍｍｏｌ）を添加し、次いでＮａＯＨ溶液を添加した。混合物を１時間〜２４時間撹拌した。粗生成物をろ過し乾燥させて、カラムクロマトグラフィーにより分離して最終生成物であるホルマザンを収率８７．２％で得た。
【００４３】
ステップＤでは、メタノールにステップＣからのホルマザン（１ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、氷冷下で濃塩酸（１８  ｍｍｏｌ）を加えた後、過酸化水素（１８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５時間撹拌した。粗生成物をろ過し、乾燥させ、カラムクロマトグラフィーにより分離して、濃い褐色がかった黄色の固体生成物であるテトラゾリウム塩を収率３３％で得た。
【００４４】
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ８．５４（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），８．３７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．２４（ｄ，Ｊ＝８．８，２．０Ｈｚ  １Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，３Ｈ），７．８１−７．７０（ｍ，３Ｈ），７．４４−７．３５（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ）。
ＭＰ：１０５℃
ＦＡＢ−ＭＳ：  ｍ／ｚ＝４９９  ［Ｍ＋Ｈ］＋
【００４５】
これらの請求項のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物は、上記の適切な基質によって合成することができる。異なる基質が選択される限り、調製ステップを実質的に変更せずに、必要とされるモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物を得ることが可能である。
【００４６】
例えば、この実施例のベンズアルデヒド−２−スルホン酸ナトリウムをベンズアルデヒド−３−スルホン酸ナトリウム又はベンズアルデヒド−４−スルホン酸ナトリウムに変更することにより、最終生成物である２−（４−ニトロフェニル）−３−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−５−（３−スルホン酸フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩、及び２−（４−ニトロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−５−（４−スルホン酸フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩を得ることができる。以下の実施例も同様である。
【００４７】
〈実施例２〉
ステップＢの基質を１−ナフチルアミンに変更して実施例１と同様の合成手順に基づいて以下の化合物を調製した。生成物は１−ナフチルアミンのジアゾニウム塩であった。
2019502655.tif 000009
黒色固体の２−（４−ニトロフェニル）−３−（１−ナフチル）−５−（２−ジスルホン酸フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩を収率４７．４％で得た。
【００４８】
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ８．４６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），  ８．２９（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），８．２１（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ  １Ｈ），８  ．  ０６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３６（ｔ，  Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ  ２Ｈ）
ＭＰ：１０２℃
ＦＡＢ−ＭＳ：  ｍ／ｚ＝４２９  ［Ｍ＋Ｈ］＋
【００４９】
〈実施例３〉
ステップＢの基質を８−アミノキノリンに変更して実施例１又は２と同様の合成手順に基づいて以下の化合物を調製した。生成物は８−アミノキノリンのジアゾニウム塩であった。
2019502655.tif 000010
【００５０】
黒赤色固体の２−（４−ニトロフェニル）−３−（８−キノリル）−５−（２−スルホン酸フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩を収率６７．１７％で得た。
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ８．８１（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ），８．７２（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），８．６６−８．５５（ｍ，２Ｈ），８．３５（ｄ，  Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７２−７．６８  （ｍ，２Ｈ），７．５８−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），  ７．３６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）
ＭＰ：１０２℃
ＦＡＢ−ＭＳ：  ｍ／ｚ＝４７５  ［Ｍ＋Ｈ］＋
【００５１】
〈実施例４〉
フェニルテトラゾリウム塩及び還元フェニルホルマザンの全波長ＵＶ−可視吸収スペクトルを図１に示す。
前記フェニルテトラゾリウム塩は、実施例１で合成された２−（４−ニトロフェニル）−３−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホン酸フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩であった。
１−メトキシＰＭＳ及びＴｒｉｓｐＨ８（５０ｍＭ）の存在下で、ＮＡＤＨによってフェニルテトラゾリウム塩（１０ｍＭ、４５０ｎｍにおいてほとんど吸収がない。下の曲線）を橙色のホルマザン（最大吸光度が４５０ｎｍである。上の曲線）に還元することができる。従って、それはＮＡＤＨ還元体の検出に用いることができる。
【００５２】
〈実施例５〉
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性は、図２に示すように、グルタミン酸を触媒的に脱水素化してＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨを生成し、フェニルテトラゾリウムを橙色のザンザンに還元することによって検出された。
前記フェニルテトラゾリウム塩は、実施例２で合成された２−（４−ニトロフェニル）−３−（１−ナフチル）−５−（２−スルホン酸フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩であった。
【００５３】
フェニルテトラゾリウム塩は４５０ｎｍにおいてほとんど吸収がなかったが、１−メトキシ−５−メチルフェナジン硫酸メチルエステル、ＮＡＤＰ、グルタミン酸、グルタミン酸デヒドロゲナーゼと反応した後、４５０ｎｍにおいて吸収があった。一方、光吸収の強度はグルタミン酸デヒドロゲナーゼの量に比例した。
フェニルテトラゾリウム塩は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの活性及び薬物スクリーニングを測定するために使用することができる。
【００５４】
〈実施例６〉
グルタミナーゼの触媒反応ではグルタミン酸が生成された。グルタミン酸は、実施例５のグルタミン酸デヒドロゲナーゼとの反応により定量された。４５０ｎｍにおける吸光度を図３に示す。
フェニルテトラゾリウム塩は、４５０ｎｍにおいてほとんど吸収がなかった。０．１〜２５ｍＭｏｌ／Ｌのフェニルテトラゾリウム塩を、１−メチルＰＭＳ、ＮＡＤＰ、グルタミン、グルタミナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素と緩衝系中で２時間反応させ、４５０ｎｍにおいて異なる濃度のフェニルテトラゾリウム基質の吸光度を測定した。
吸収された光の強度は、グルタミナーゼの量に比例した。
フェニルテトラゾリウム塩は、グルタミナーゼの活性及び薬物スクリーニングを測定するために使用することができる。
【００５５】
〈実施例７〉
フェニルテトラゾリウム塩が生細胞と反応した後、図４に示されるように、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
前記フェニルテトラゾリウム塩は、実施例３で合成された２−（４−ニトロフェニル）−３−（８−キノリル）−５−（２−スルホン酸フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩であった。
フェニルテトラゾリウム塩は、４５０ｎｍにおいてほとんど吸収がなかったが、細胞中のＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨと反応した後、４５０ｎｍにおいて吸収があった。一方、光吸収の強度は生細胞数に相関する。
フェニルテトラゾリウム塩は、生存細胞の量を測定するために使用することができる。
【００５６】
〈実施例８〉実施例１におけるＥＺＭＴＴとＷＳＴ−８の比較
ＷＳＴ−８の化学合成は、２−（３−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）ベンゼンジスルホネートナトリウム塩であるベンゼンジスルホネートナトリウム塩として提供された水溶性テトラゾリウム塩である。
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【００５７】
テトラゾリウム−ホルマザン−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ系のアッセイ干渉
アッセイ干渉を評価するために、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの非存在下又は１００μＭのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下でのテトラゾリウム検出試薬（ＷＳＴ−８又はＥＺＭＴＴ）を、一般に使用される洗剤（０〜１％のＳＤＳ、０〜０．２％のＴｗｅｅｎ２０）や還元剤（ＢＭＥ）などの様々な化学物質と混合した。アッセイ干渉の指標である異常な用量応答を検出するために、４５０ｎｍにおける吸光度（基準波長は６２０ｎｍである）を測定した。
【００５８】
図５に示されるように、最大０．２％のＴｗｅｅｎ２０又は１％のＳＤＳのＥＺＭＴＴ及びＷＳＴ−８検出試薬の両方とも、ＮＡＤＨの非存在下（図５Ａ、５Ｂ）又は１００μＭのＮＡＤＨの存在下で干渉がないことを示した。しかしながら、抗酸化剤ＢＭＥを試験した場合、ＷＳＴ−８検出試薬（図５Ｃ）は、強い用量依存性の偽陽性シグナルを示したが、ＥＺＭＴＴ試薬は本質的にシグナル変化を示さなかった。
【００５９】
試薬安定性アッセイ
テトラゾリウム検出試薬（ＷＳＴ−８又はＥＺＭＴＴ）をそれぞれ４℃及び−２０℃で保存した。月１回、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）における１００μＭのＮＡＤＨを使用して、保存したテトラゾリウム検出試薬を試験し、応答を４５０ｎｍにおいて測定した。
安定性試験のために、ＷＳＴ−８、ＥＺＭＴＴ検出試薬を４℃及び−２０℃で最長１年間保存した。両方の試薬をＮＡＤＨ滴定で毎月それらの活性について試験した。図６Ａに示されるように、−２０℃で保存すると、ＷＳＴ−８又はＥＺＭＴＴ溶液は、最長１年間実質的に活性の変化を示さなかった。しかしながら、４℃で１ヶ月間保存した後、ＥＺＭＴＴは比較的安定であり、２５％だけの活性を失う（図６Ｂ）一方、ＷＳＴ−８は６０％の活性を失った。これらの結果は、ＥＺＭＴＴ検出試薬がＷＳＴ−８試薬より安定であり、デヒドロゲナーゼ又は細胞に基づく阻害薬スクリーニングアッセイに適していることを示した。
【００６０】
大腸菌ＧＤＨ活性アッセイ
ＧＤＨ（最終０−８ｎＭ）に、ＮＡＤＰ＋（１００μＭ）、グルタメート（５ｍＭ）及び５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）におけるＥＺＭＴＴ検出試薬の混合物を加え、ＵＶ吸光度は４５０ｎｍが変化して、初速度を測定するために２分ごとにＵＶ吸光度を測定した。大腸菌ＧＤＨ（４ｎＭ）は、２時間以上のアッセイ期間にわたって線形初速度を示した。ＮＡＤ又はＮＡＤＰのＫｍは、ＮＡＤ（Ｐ）＋の希釈溶液（０〜１０  ｍＭ）、５ｍＭのグルタメート及び５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８、１００μｌ）におけるテトラゾリウム検出試薬（０．５ｍＭのＥＺＭＴＴ、１０μＭの１−メトキシＰＭＳ）を混合することによって測定し、反応はＧＤＨ（４ｎＭ）添加後に開始した。４５０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を２分毎に測定して初速度を得た。
【００６１】
ＧＤＨは、２−オキソグルタレート及び遊離ＮＨ４＋を形成するようにグルタメートの可逆酸化的脱アミノ反応を触媒し、同時にＮＡＤ（Ｐ）＋をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換する。得られたＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、ＧＤＨ活性の指標としてＥＺＭＴＴ検出試薬によって測定することができる。図７Ａに示されるように、Ｎ−末端Ｈｉｓ６タグを有する組換え大腸菌ＧＤＨは、高い酵素活性を指示する１６ｎＭまでのＧＤＨ酵素の存在下での線形初速度及び線形用量応答（ｒ＝０．９９）を示した。大腸菌ＧＤＨは補因子としてＮＡＤＰを使用し、マウス肝臓におけるＧＤＨと同様の高いＮＡＤＰ濃度で基質阻害を示した（図７Ｂ）。
しかしながら、ＮＡＤを補因子として使用すると、大腸菌ＧＤＨは酵素活性を示さなかった。大腸菌ＧＤＨは強いＮＡＤＰ基質阻害を示したので、１００μＭのＮＡＤＰの存在下でそのグルタメート（０〜２５ｍＭ）用量応答を測定し、５ｍＭのグルタメート濃度でＶｍに達した（図７Ｃ）。大腸菌ＧＤＨ活性アッセイにおいて４ｎＭのＧＤＨ、１００μＭのＮＡＤＰ及び５ｍＭのグルタメートを使用して、反応時間が最長２時間の線形初速度を得た。
【００６２】
さらに、陽性対照として４ｎＭの大腸菌ＧＤＨを使用し、陰性対照としてＧＤＨを使用しないで、Ｚ因子０．９で優れたアッセイ再現性を観察した（図７Ｄ）。このアッセイが阻害剤スクリーニングに適していることが示された。
【００６３】
結論として、前述の実施例は本発明の好ましい実施形態であるが、本発明の精神から逸脱せずに修正を行うことができることが理解されよう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲に入ることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月3日(2018.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物であって、一般式Ｉ：
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を含み、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、置換基Ｗ又はＨから選択され、置換基Ｗは、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲンから選択される１〜５０個の原子の群を含む、ことを特徴とするモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、置換基Ｗ又はＨから選択され、置換基Ｗは、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ又はハロゲンを含む群から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、置換基Ｗ又はＨから選択され、置換基Ｗは、ヒドロキシ、アミノを含む群から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項４】
前記式Ｉのスルホン酸基は、フェニルのメタ位又はパラ位にある、ことを特徴とする請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項５】
以下の化合物
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2019502655.tif 000026
2019502655.tif 000027
から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項６】
ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨレベル、デヒドロゲナーゼ酵素活性、血清中デヒドロゲナーゼレベルの定量化、及び／又は細胞生存率を測定するための請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物の用途。
【請求項７】
モノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物であって、一般式ＩＩ：
2019502655.tif 000028
を含み、Ｒ１は、未置換の置換基Ｘ１、又は１つ以上の置換可能な置換基Ｘ２で独立に置換された置換基Ｘ１であり、置換基Ｘ１及び／又は置換基Ｘ２は、以下の置換又は未置換の基：フェニル、ニトロ、スルホン酸基、スルホンアミド、ハロゲン、アルコキシ、アルキル、１又は２個のＮ原子を含む６員のヘテロシクロアルキル基、それぞれ独立してＮ、Ｓ、Ｏから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む５員のヘテロシクロアルキル基、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む二環性へテロアリール基から任意に選択され、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、置換基Ｙ又はＨから選択され、置換基Ｙは、置換又は未置換のアルキル、アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、アゾ、フェニル、置換スルホン酸基、１Ｎ置換基を含む複素環アルキル、シクロアルキルから、任意に選択される、ことを特徴とするモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項８】
Ｒ１は置換基Ｘで置換され、置換基Ｘは、フェニル、ニトロフェニル、マルチニトロフェニル、ベンゼンスルホン酸基、ベンゼンスルホンアミド、ハロフェニル、メチルニトロフェニル、１又は２個のＮ原子を含む６員のヘテロシクロアルキル、それぞれ独立してＮ、Ｓ、Ｏから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む５員のヘテロシクロアルキル基、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択される１又は２個のヘテロ原子を含む二環性へテロアリールを含む群から選択され、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、置換基Ｙ又はＨから選択され、置換基Ｙは、アルキル、ニトロ、アルコキシ、シクロアルキル、１個のＮ原子を含むヘテロシクロアルキル及びアルコキシニトロフェニル基を含む群から選択される、ことを特徴とする請求項７に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項９】
前記一般式ＩＩにおけるスルホン酸基は、フェニルのメタ位又はパラ位にある、ことを特徴とする請求項７に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【請求項１０】
前記一般式ＩＩにおけるスルホン酸基は、フェニルのメタ位又はパラ位にある、ことを特徴とする請求項８に記載のモノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物。
【国際調査報告】
2019502655.tif 000029
2019502655.tif 000030
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