(57)【要約】  本明細書で提供した技術は、新規種類の組換えタンパク質複合体、特に、病原体の表面上に提示されることが好ましいが必須ではないタンパク質から得られる複数の抗原または抗原ドメインを含む、動物およびヒトワクチンとして適切な、以後イムノアセンブリン（ＩＡ）と称する抗体様組換え融合タンパク質複合体に関する。前記組換えタンパク質をコードする核酸分子、ベクター、核酸を含有する宿主細胞ならびにこのようなタンパク質およびタンパク質複合体を調製および生成するための方法、前記ワクチンまたは前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子の使用によって誘導または作製される抗体ならびに受動免疫療法のためのこのような抗体または組換え誘導体の使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１の融合タンパク質単位がイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第１の抗原を含み、前記第１の抗原が前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも１つのＮ末端および／またはＣ末端に結合しており（ＨＣ融合ポリペプチド単位１、ＨＣ単位１）、
ｂ）第２の融合タンパク質単位がイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第２の抗原を含み、前記第２の抗原がＣＬ−ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に結合しており（ＬＣ融合ポリペプチド単位１、ＬＣ単位１）、
ｃ）第３の融合タンパク質単位がイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第３の抗原を含み、前記第３の抗原が前記第３の融合タンパク質の前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に融合している、または
ｄ）第３の融合タンパク質単位がイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第３の抗原を含み、前記第３の抗原がＣＬ−ドメインのＮまたはＣ末端に融合しており、
ｅ）前記３つの組換え融合タンパク質単位の前記抗原のアミノ酸配列が異なっている、
少なくとも３つの組換え融合タンパク質単位を含むワクチンとして適切な単離されたイムノアセンブリン（ＩＡ）タンパク質複合体。
【請求項２】
前記第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）および前記第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）が互いに共有結合または非共有結合している、請求項１に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項３】
前記第１および第２の融合タンパク質単位が互いにジスルフィド結合によって共有結合している、請求項１または２に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項４】
前記第３の融合タンパク質単位がイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第３の抗原を含み（第２のＨＣ融合ポリペプチド単位２、ＨＣ単位２）、前記第３の抗原が前記第３の融合タンパク質の前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に融合している、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項５】
前記第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）および前記第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）が互いに共有結合または非共有結合している、請求項４に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項６】
前記第１および第３の融合タンパク質単位が互いにジスルフィド結合によって共有結合している、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項７】
前記ＩＡタンパク質複合体がイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第４の抗原を含む第４の組換え融合タンパク質単位を含み、前記第４の抗原がＣＬドメインのＮ末端またはＣ末端に融合している（第２のＬＣ融合ポリペプチド単位、ＬＣ単位２）、請求項４から６のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項８】
前記第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）および前記第４の融合タンパク質単位（ＬＣ単位２）が互いに共有結合または非共有結合している、請求項７に記載のＩＡタンパク質複合体。
【請求項９】
前記第３および第４の融合タンパク質単位が互いにジスルフィド結合によって共有結合している、請求項７または８に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項１０】
前記抗原のタンパク質配列が、９９％以下、好ましくは９８％以下、より好ましくは９５％以下、さらにより好ましくは９０％以下、さらにより好ましくは８０％以下、最も好ましくは７０％以下の配列同一性を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項１１】
前記第１の融合タンパク質単位および／または前記第３の融合タンパク質単位がＦｃ受容体結合部分を含む、請求項４から１０のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項１２】
前記Ｆｃ受容体結合部分が、配列番号３２、配列番号７６および配列番号７７からなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらのバリアントを含む、請求項１１に記載のＩＡタンパク質複合体。
【請求項１３】
１つまたは複数の前記融合タンパク質単位がヒンジ領域を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項１４】
前記ヒンジ領域が前記第１および／または前記第３の融合タンパク質単位の前記ＣＨ１−ドメインと前記ＣＨ３−ドメインの間に位置する、請求項１３に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項１５】
前記第１の融合タンパク質単位および／または前記第３の融合タンパク質単位がイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ２をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項１６】
前記第１の融合タンパク質単位および／または前記第３の融合タンパク質単位が前記ＣＨ１−ドメインと前記ＣＨ２−ドメインの間にヒンジ領域を含む、請求項１５に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項１７】
前記第１の融合タンパク質単位および／または前記第３の融合タンパク質単位が前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ならびにヒンジ領域を前記ＣＨ１−ドメインと前記ＣＨ２−ドメインの間に含む、請求項１６に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項１８】
ａ）前記第１の融合タンパク質単位が前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第１の抗原を含み、前記第１の抗原が前記ＣＨ１−ドメインのＮ末端に融合しており（ＨＣ単位１）、
ｂ）前記第２の融合タンパク質単位がイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第２の抗原を含み、前記第２の抗原が前記ＣＬ−ドメインのＮ末端に融合しており（ＬＣ単位１）、前記第１および前記第２の融合タンパク質単位が、特に少なくとも１つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
ｃ）前記第３の融合タンパク質単位が前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第３の抗原を含み、前記第３の抗原が前記第３の融合タンパク質単位の前記ＣＨ１−ドメインのＮ末端に融合しており（ＨＣ単位２）、前記ＨＣ単位１およびＨＣ単位２が、特に少なくとも１つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
ｄ）前記第４の融合タンパク質単位がイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第４の抗原を含み、前記第４の抗原が前記第４の融合タンパク質の前記ＣＬ−ドメインのＮ末端に融合しており（ＬＣ単位２）、前記第３および前記第４の融合タンパク質単位が、特に少なくとも１つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合している、
請求項７から１７のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項１９】
前記融合タンパク質単位のうちの少なくとも１つが追加的抗原を含み、前記追加的抗原が前記融合タンパク質単位のＮ末端および／またはＣ末端に結合している、請求項１から１８のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項２０】
前記第１の融合タンパク質単位における前記第１の抗原が前記ＣＨ１−ドメインのＮ末端に結合し、前記第１の融合タンパク質のさらなる抗原が前記ＣＨ３−ドメインのＣ末端に結合している、請求項１から１９のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項２１】
前記第３の融合タンパク質単位における前記第３の抗原が前記ＣＨ１−ドメインのＮ末端に結合し、前記第３の融合タンパク質単位のさらなる抗原が前記ＣＨ３−ドメインのＣ末端に結合している、請求項４から２０のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項２２】
前記組換え融合タンパク質単位の前記抗原のアミノ酸配列が異なっている、請求項２１に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項２３】
前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインのそれぞれが、ＩｇＧ、ＩｇＭもしくはＩｇＡ重鎖定常ドメインのアミノ酸配列またはそのバリアントを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項２４】
前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインのそれぞれが、ほ乳類重鎖定常ドメイン、好ましくはヒト重鎖定常ドメインのアミノ酸配列またはそのバリアントを含み、前記イムノグロブリン軽鎖定常ドメインが、ほ乳類軽鎖定常ドメイン、好ましくはヒト軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列またはそのバリアントを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項２５】
前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインおよび前記イムノグロブリン軽鎖定常ドメインのそれぞれが、ＩｇＧ重鎖定常または軽鎖定常ドメイン、好ましくはヒトＩｇＧ、好ましくはヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項２６】
前記ＣＬ−ドメインがヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項２７】
前記ＣＬ−ドメインが配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項２８】
前記抗原が、腫瘍抗原、自己抗原、食物アレルゲン、チクングニアウイルス、狂犬病ウイルス、連鎖球菌（Streptococcus）、ナイセリア（Neisseria）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、クロストリジウム（Clostridiu）、トリパノソーマ（Trypanosoma）、リーシュマニア（Leishmania）、サルモネラ（Salmonella）、フラビウイルス（Flavivirus）、フィロウイルス（Filiovirus）の群から選択される病原体から得られる抗原および／またはマラリア、トキソプラズマ症のようなアピコンプレクサ（Apicomplexan）寄生生物から生じる感染性疾患、および／またはエボラ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、肝炎、結核、ジカ熱、インフルエンザまたは百日咳のようなウイルス感染に関与する１つまたは複数の病原体から得られる、および／またはがんを生じる悪性腫瘍を引き起こす疾患から得られる抗原である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項２９】
異なる株、単離株、対立遺伝子バリアント、変異体および／または一塩基多型を表す同じ抗原の２つ以上のバリアントを含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項３０】
２つの異なる病原体から得られた抗原を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項３１】
前記抗原が、プラスモジウム（Plasmodium）寄生生物のようなアピコンプレクサ（Apicomplexan）寄生生物から得られた抗原である、請求項１から３０のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項３２】
前記プラスモジウム（Plasmodium）寄生生物が、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、卵形マラリア（P. ovale）、二日熱マラリア原虫（P. knowlesi）および四日熱マラリア原虫（P. malariae）からなる群から選択される、請求項３１に記載のＩＡタンパク質複合体。
【請求項３３】
前記プラスモジウム（Plasmodium）寄生生物が熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）である、請求項３２に記載のＩＡタンパク質複合体。
【請求項３４】
前記抗原が、配列番号１から配列番号３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のＩＡタンパク質複合体。
【請求項３５】
前記抗原が、前記寄生生物の表面上に提示される少なくとも２つの異なるタンパク質から得られる、請求項３１から３４のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項３６】
前記抗原が、前記寄生生物の少なくとも２つの異なる生活環主要段階において前記寄生生物の表面上に提示される少なくとも２つの異なるタンパク質から得られる、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項３７】
前記寄生生物が熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）であり、前記異なる生活環主要段階が前赤内期段階および血液段階である、請求項３６に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項３８】
前記抗原が、前記寄生生物の表面上に提示される少なくとも３つの異なるタンパク質から得られる、請求項３１から３７のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項３９】
前記抗原が、前記寄生生物の少なくとも３つの異なる生活環主要段階において前記寄生生物の表面上に提示される少なくとも３つの異なるタンパク質から得られる、請求項３１から３８のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項４０】
前記寄生生物が、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）であり、前記異なる生活環主要段階が前赤内期段階、血液段階および有性生殖段階である、請求項３９に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項４１】
抗原Ｐｆｓ２５ＦＫＯ、ＡＭＡ１ＧＫＯおよびＣＳＰ＿ＴＳＲＧＫＯを含む、請求項４０に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項４２】
前記ＨＣ単位１が抗原ＡＭＡ１ＧＫＯおよびＣＳＰ＿ＴＳＲＧＫＯを含み、前記ＡＭＡ１ＧＫＯが前記ＣＨ１−ドメインにＮ末端融合しており、前記ＣＳＰ＿ＴＳＲＧＫＯが前記ＣＨ３−ドメインにＣ末端融合しており、前記第２の融合タンパク質が抗原Ｐｆｓ２５ＦＫＯを含み、前記Ｐｆｓ２５ＦＫＯが前記ＣＬ−ドメインにＮ末端融合している、請求項４１に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項４３】
ａ）配列番号３３から配列番号５２、配列番号６７から配列番号７５および配列番号７８から配列番号１０４の群から選択されるアミノ酸配列を有する第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）、ならびに
ｂ）配列番号５１から配列番号６６の群から選択されるアミノ酸配列を有する第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）
を含む、請求項１から４２のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項４４】
前記の２つの組換え融合タンパク質が、
ａ）第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）：配列番号９７
ｂ）第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）：配列番号５３
のアミノ酸配列を有する、請求項１から４３のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項４５】
前記第１の融合タンパク質単位に含まれるＦｃ受容体結合部分が、配列番号３２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、
ａ）配列番号３２と比較して少なくとも２つの置換を有し、前記置換が配列番号３２のＧｌｕ３５６およびＡｓｐ３９９の位置で生じており、
ｂ）Ｇｌｕ３５６およびＡｓｐ３９９の位置のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換されており、
ｃ）前記第３の融合タンパク質に含まれる前記Ｆｃ受容体結合部分が、配列番号３２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、
ｄ）配列番号３２と比較して少なくとも２つの置換を有し、前記置換が配列番号３２のＬｙｓ３９２およびＬｙｓ４０９の位置で生じており、
ｅ）Ｌｙｓ３９２およびＬｙｓ４０９の位置のアミノ酸が負電荷アミノ酸で置換されている、
請求項１１から４４のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項４６】
前記第１および／または第３の融合タンパク質単位に含まれる前記Ｆｃ受容体結合部分が、配列番号７６または配列番号７７のアミノ酸配列を含む、請求項１１から４５のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項４７】
ａ）前記第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）が抗原ＡＭＡ１ＧＫＯおよびＣＳＰ＿ＴＳＲＧＫＯを含み、前記ＡＭＡ１ＧＫＯがＣＨ１−ドメインにＮ末端融合しており、ＣＳＰ＿ＴＳＲＧＫＯがＣＨ３−ドメインにＣ末端融合しており、前記第１の融合タンパク質単位に含まれる前記Ｆｃ受容体結合部分が、配列番号３２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、配列番号３２と比較して少なくとも２つの置換を有し、前記置換が配列番号３２のＧｌｕ３５６およびＡｓｐ３９９の位置で生じており、Ｇｌｕ３５６およびＡｓｐ３９９の位置のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換されており、
ｂ）前記第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）が抗原Ｐｆｓ２５ＦＫＯを含み、Ｐｆｓ２５ＦＫＯが前記ＣＬ−ドメインにＮ末端融合しており、
ｃ）前記第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）が、前記ＣＨ１−ドメインにＮ末端融合した抗原Ｒｈ２ＧＫＯを含み、前記第１の融合タンパク質に含まれる前記Ｆｃ受容体結合部分が、配列番号３２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、配列番号３２と比較して少なくとも２つの置換を有し、前記置換が配列番号３２のＬｙｓ３９２およびＬｙｓ４０９の位置で生じている、
請求項４から４６のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項４８】
ａ）配列番号３３から配列番号５２、配列番号６７から配列番号７５および配列番号７８から配列番号１０４の群から選択されるアミノ酸配列を有する第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）、ならびに
ｂ）配列番号５１から配列番号６６の群から選択されるアミノ酸を有する第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）、ならびに
ｃ）配列番号３３から配列番号５２、配列番号６７から配列番号７５および配列番号７８から配列番号１０４の群から選択されるアミノ酸配列を有する第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）
を含む、請求項４から４７のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項４９】
前記融合タンパク質が、
ａ）第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）：配列番号９７
ｂ）第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）：配列番号５３
ｃ）第２の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）：配列番号８８
のアミノ酸配列を有する、請求項４８に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項５０】
前記第４の融合タンパク質単位（ＬＣ単位２）が、抗原Ｐｆｓ２５ＦＫＯを含む第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）と同一で、Ｐｆｓ２５ＦＫＯが前記第４の融合タンパク質単位の前記ＣＬ−ドメインにＮ末端融合している、請求項７から４９のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項５１】
ａ）配列番号３３から配列番号５２、配列番号６７から配列番号７５および配列番号７８から配列番号１０４の群から選択されるアミノ酸配列を有する第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）、ならびに
ｂ）配列番号５１から配列番号６６の群から選択されるアミノ酸を有する第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）、ならびに
ｃ）配列番号３３から配列番号５２、配列番号６７から配列番号７５および配列番号７８から配列番号１０４の群から選択されるアミノ酸配列を有する第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）、ならびに
ｄ）配列番号５１から配列番号６６の群から選択されるアミノ酸配列を有する第４の融合タンパク質単位（ＬＣ単位２）
を含む、請求項７から５０のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項５２】
ａ）第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）：配列番号９７、および
ｂ）第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）：配列番号５３、および
ｃ）第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）：配列番号８８、配列番号９９または配列番号１００、および
ｄ）第４の融合タンパク質単位（ＬＣ単位２）：配列番号５３
を含む、請求項５１に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項５３】
請求項１から５２のいずれか一項に記載の１つまたは複数の組換え融合タンパク質をコードするコード部分を含む核酸分子。
【請求項５４】
請求項５３に記載のヌクレオチド分子を含む発現ベクター。
【請求項５５】
請求項１から５２のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体の１つまたは複数の融合タンパク質をコードする少なくとも１つまたは好ましくは全部の核酸分子を含む、請求項５４に記載のベクターまたは請求項５３に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項５６】
ほ乳類細胞、酵母細胞または植物細胞である、請求項５５に記載の宿主細胞。
【請求項５７】
前記ほ乳類細胞がチャイニーズ卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト胚性腎２９３細胞（ＨＥＫ−２９３）である、請求項５６に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
前記酵母がピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項５６に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
前記植物細胞が、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、タバコ（Nicotiana tabacum）、もしくはタバコＢＹ２細胞株から得られる、またはオオムギ（Hordeum vulgare Ｌ．）、トウモロコシ（Zea mays）またはコムギ（Triticum）種から得られる、請求項５６に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
請求項１から５２のいずれか一項に記載のイムノアセンブリンタンパク質複合体および薬学的に許容される担体および／またはアジュバントを含むワクチン組成物。
【請求項６１】
ａ）請求項５５から５９のいずれか一項に記載の宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップであって、前記宿主細胞が、請求項１から５２のいずれか一項に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体の前記融合タンパク質単位をコードする全核酸分子を含み、前記ＩＡタンパク質複合体が前記宿主細胞中で形成されるステップ、
ｂ）前記ＩＡタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
ｃ）前記ＩＡタンパク質複合体を処理するステップ
を含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載のＩＡタンパク質複合体を生成する方法。
【請求項６２】
（ａ）請求項５５から５９のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップ、
（ｂ）前記生成した融合タンパク質を単離するステップ、
（ｃ）前記ＩＡタンパク質複合体を生成するために前記融合タンパク質を混合するステップ、
（ｄ）前記生成したＩＡタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
（ｅ）前記ＩＡタンパク質複合体を処理するステップ
を含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載のＩＡタンパク質複合体を生成する方法。
【請求項６３】
異なる抗原を含む複数の異なるＨＣおよびＬＣ融合ポリペプチドを生成し、好ましくは、病原体の少なくとも２つまたは３つの異なる生活環主要段階において、好ましくは前記病原体の表面上に提示される異なるタンパク質から得られる複数の異なる抗原を含むヘテロ多量体ＩＡタンパク質複合体を得るために前記生成したＨＣおよびＬＣ融合ポリペプチドを混合する、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記融合タンパク質単位および／またはＩＡタンパク質複合体を、プロテインＡ／Ｇ／Ｌクロマトグラフィーを使用して単離する、請求項６１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
（ｉ）少なくとも２つの組換え融合タンパク質、（ｉｉ）少なくとも２つの異なる抗原、（ｉｉｉ）少なくとも１つの異なるホモオリゴマー化および／またはヘテロオリゴマー化ドメインを含み、前記第１の組換え融合タンパク質が、前記第２の組換え融合タンパク質には存在しない少なくとも１つのホモオリゴマー化またはヘテロオリゴマー化ドメインを含む、ワクチンとして適切な単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項６６】
前記ホモオリゴマー化および／またはヘテロオリゴマー化ドメインが、抗体可変ドメインを含むイムノグロブリンドメイン、Ｔ細胞受容体可変および定常ドメイン、コイルドコイルドメイン、ロイシンジッパードメイン、コラーゲン関連トリプルヘリックス、Ｔ４バクテリオファージフィブリチンフォルドン（Ｆｄ）３量体化ドメイン、ＰＤＺおよびＰＤＺ様ドメインからなる群から選択される、請求項６５に記載の単離されたＩＡタンパク質複合体。
【請求項６７】
請求項１から５２のいずれか一項に記載の少なくとも２つの異なるイムノアセンブリンタンパク質複合体を含むワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、新規種類の組換えタンパク質複合体、特に、病原体の表面上に提示されることが好ましいが必須ではないタンパク質から得られる複数の抗原または抗原ドメインを含む、動物およびヒトワクチンとして適切な、以後イムノアセンブリン（ＩＡ）と称する抗体様組換え融合タンパク質複合体に関する。前記組換えタンパク質をコードする核酸分子、ベクター、核酸を含有する宿主細胞ならびにこのようなタンパク質およびタンパク質複合体を調製および生成するための方法、前記ワクチンまたは前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子の使用によって誘導または作製される抗体ならびに受動免疫療法のためのこのような抗体または組換え誘導体の使用。
【背景技術】
【０００２】
免疫系に絶対必要な機能は、感染に対する防御である。体液性免疫系は、最初の接触によって、抗原として作用する感染因子に対して特異的に生じる抗体を使用して、病原体などの非自己として認識した分子と戦う。天然の抗体は、典型的には、内部鎖ジスルフィド結合によって結合した重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を含む多価分子である。ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭを含む、抗体の数種のアイソタイプが知られている。ＩｇＧは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含有する。各鎖は、定常（Ｃ）および可変（Ｖ）領域を含有し、これらはさらにＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨおよびＣＬ、ＶＬと呼ばれるドメインにさらに分類される（図３）。抗体は、Ｆａｂ部分に含有される可変領域ドメインを介して抗原に結合し、結合後、定常ドメインによって、ほとんどはＦｃ部分を通じて、免疫系の分子および細胞と相互作用することができる。
【０００３】
微生物に対するヒトおよび動物の予防的免疫には、ヒトまたは動物において抗体および／または抗原の細胞性免疫応答を増加させる物質と併用した、微生物から得られた抗原の投与が含まれる。しかし、数種の新たな顧みられない疾患（例えば、ＭＥＲＳ、エボラ、ＨＩＶ、狂犬病、マラリア、インフルエンザ）に対する今日のワクチン開発およびそれらに対する効果的な対応策には、未だにいくつかの困難が存在している。いくつかの感染因子は、抗原が非常に変化しやすく多様であることが特徴で（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザ、プラスモディウム（Plasmodium）種およびアピコンプレクサ（Apicomplexa）のその他のメンバー）、ワクチン開発の大きな課題となっている。いくつかの場合には、非常に特殊かつ希少で広範な中和抗体（ｂｎＡｂ）が同定されており、ヒトにおいてこのようなｂｎＡｂを効率的に誘導することができる抗原同等物を同定して開発できることが期待されている。現場に出現する循環型の病原体種、エスケープ変異体およびバリアントの広がりは危機的で、しばしば、臨床開発および市場導入が難しい範囲にワクチンまたはワクチン候補の使用は制限されている。
【０００４】
さらに、当業者であれば、ワクチンによって誘導される免疫応答の質および量はいずれも、抗原分子自体だけでなく、使用する製剤、特にアジュバントに左右されることを知っている。ワクチンの効力は、使用する製剤およびアジュバントに著しく左右される。アジュバントがないと所与の用量で誘導される免疫応答は弱く、高用量が必要なためワクチンの費用が高くなるだけでなく、副作用の危険性も増大する。さらに、アジュバントは免疫応答の質にも影響を及ぼすため、防御を実現するのに不可欠である。いくつかの病原体、例えば、狂犬病ウイルスは、体液性応答によって効率的に中和されるが、その他はＴ細胞応答の効率的な誘導に左右される。数種のアジュバント、特に、ミョウバンは数十年にわたって使われ成功してきたが、様々な作用機序を有する新たなアジュバントの必要性は大きい。最後に、有効性の高い集団接種を実現しながら、費用を抑え、注射回数を減らすためにワクチンを組み合わせることも必要である。
【０００５】
数種の抗原およびワクチンを単一のワクチン製品に組み合わせる場合、または数種のワクチンを同時に投与する場合、免疫応答が全成分に対して確実に生じることが非常に重要である。単一または数種の成分によって誘導される応答が優位であると、その他の成分が実質的に不活性化し、したがって使えなくなる。また、多数の成分を含むいかなる複合ワクチンも、特に、異なる発現および精製方法が使用された場合、製造費用がたちまち制限要素となり得る。
【０００６】
例えば、マラリアはアピコンプレクサ（Apicomplexa）門の原生動物寄生生物、すなわちプラスモジウム（Plasmodium）属の寄生生物による感染によって引き起こされる疾患であり、全世界で毎年２億人以上の新規感染、および７０万人以上の死亡を引き起こしている。マラリアは、アフリカでは特に深刻な問題であり、小児の死亡の５人に１人（２０％）はこの疾患の影響によるものである。アフリカの小児は毎年、マラリア熱を平均して１．６から５．４回発症する。
【０００７】
効率的なマラリアワクチンの開発の主な障害は、寄生生物の多段階の生活環によって生じる。寄生生物発達の各段階は、異なる種類の免疫応答を誘発する異なる一連の表面抗原を特徴とする。多種多様な表面抗原が出現するにもかかわらず、それらに対する免疫応答は有効でないことが多い。理由の１つはマラリア原虫抗原の幅広い配列多型性であり、これが様々な単離株の免疫回避を容易にする（それらの単離株の交差範囲の欠如が交差防御の不足を引き起こす）。
【０００８】
マラリアワクチンの開発に対する研究は１９６０年代から推し進められてきたが、未だに利用可能な認可されたマラリアワクチンはないので、熱帯熱マラリアの原因病原体、熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）は、依然として科学者等にとって手強い強敵である。抗マラリアワクチンの開発を妨げている主な障害には、寄生生物の多くの生活環段階に関連した多様な抗原レパートリー、抗原の変化および野生型単離株の多様性ならびに宿主の限定された遺伝応答性が含まれる。
【０００９】
マラリア寄生生物に対する免疫は、段階依存的および種依存的である。多くのマラリア研究者等および教本の記述は、生活環の１段階のみに対応する単一抗原ワクチンでは十分ではなく、効果的な免疫性を誘導するには、寄生生物発達の異なる段階、すなわち少なくとも２段階を標的とする多抗原、多段階ワクチンが必要であると考え結論づけている（Mahajan，Berzofsky et al. 2010）。多抗原ワクチンの構築（異なる寄生生物段階を網羅し、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）エスケープ突然変異体の可能性を回避するためにワクチンによって誘導される免疫応答の幅を増大することを目的とした）は、遺伝子的に一緒に結合した（フルサイズ）抗原、組換えタンパク質の混合物、または異なる寄生生物タンパク質および段階から得られる数種のペプチドを含有する、合成ペプチドベースの（１５〜２５マー）化学合成ワクチンのいずれかによって達成することができる。
【００１０】
数種の異なる抗原または単一抗原の数種の異なる対立遺伝子から構成される単一融合タンパク質アプローチ（寄生生物に対して相乗的活性を有する抗体を誘導するため）は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の抗原多様性および免疫回避能力によって妨害される（Richards,Beeson, 2009）。可能性があるワクチン候補として多数の抗原が評価されたが、ほとんどの臨床試験は臨床マラリアを防ぐことに対してあまり効果を示さなかったものの、それらのうちのいくつかは寄生生物増殖を低減させることが示された。得られた融合タンパク質／ワクチン候補のサイズは別の制限因子で、数種の選択された抗原の組合せのみが可能となるが、選択された抗原が自然免疫の標的ではない、および／または顕著な遺伝的多型性を示すことが排除されるわけではない。複数の対立遺伝子を有する可変性の高い抗原が自然曝露下での免疫応答の明白な標的であり、ＰｆＡＭＡ１およびＰｆＭＳＰ２のワクチン研究は対立遺伝子特異的効果を達成することができることを示唆している（Schwartz, 2012）。現在併用ワクチン（ＰｆＣＳＰおよびＰｆＡＭＡ１から構成される）のみが、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の前赤内期および無性生殖血液段階を標的とする臨床試験を受けている（Schwartz, 2012）。プラスモジウム属（Plasmodium）の３つの生活環主要段階全てを標的とする（ハマダラカ属（Anopheles）の蚊の有性生殖段階を含み、したがって寄生生物伝染をブロックする）、融合物でも組合せアプローチでもない多抗原ワクチン候補は、未だに臨床試験で試験されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、新規および改善された多成分の、特に多段階ヒトおよび／または動物ワクチンを利用できると、非常に有利となる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、組換え融合タンパク質単位を含むワクチンとして適切な新規タンパク質複合体に関する。本開示は、特に、単離された組換えイムノアセンブリン（ＩＡ）、特に、ウイルス、細菌および／または真核寄生生物に起因する感染症、自己免疫疾患およびがんに対する、動物またはヒトワクチンとして適切な、抗体様組換え融合タンパク質複合体に関し、ＩＡは、病原体または細胞の表面上に提示されていることが好ましいが必須ではないタンパク質から得られる複数の抗原または抗原ドメインを含む。特に、組換えポリペプチドの新規種類の複合体には、単一または２つ以上の病原体の複数の異なる抗原、および／または同じ抗原の複数のバリアント、および／または病原体から得られない少なくとも１つの成分が含まれる。
【００１３】
第１の態様では、本開示は、少なくとも３つの組換え融合タンパク質単位を含むワクチンとして適切なイムノアセンブリン（ＩＡ）タンパク質複合体に関し、
ａ）第１の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第１の抗原を含み、前記第１の抗原はイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも１つのＮ末端および／またはＣ末端に結合しており（ＨＣ融合ポリペプチド単位１、ＨＣ単位１）、
ｂ）第２の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第２の抗原を含み、前記第２の抗原はＣＬ−ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に結合しており（ＬＣ融合ポリペプチド単位１、ＬＣ単位１）、
ｃ）第３の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第３の抗原を含み、前記第３の抗原は前記第３の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に融合している、または
ｄ）第３の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第３の抗原を含み、前記第３の抗原はＣＬ−ドメインのＮ−またはＣ末端に融合しており、
前記３つの組換え融合タンパク質単位の前記抗原はアミノ酸配列が異なっている。
【００１４】
本開示の一部の態様は、ＩＡタンパク質複合体に関し、
ａ）第１の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第１の抗原を含み、前記第１の抗原はＣＨ１−ドメインのＮ末端に融合しており（ＨＣ単位１）、
ｂ）前記第２の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第２の抗原を含み、前記第２の抗原はＣＬ−ドメインのＮ末端に融合しており（ＬＣ単位１）、前記第１および前記第２の融合タンパク質単位は、特に少なくとも１つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
ｃ）前記第３の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第３の抗原を含み、前記第３の抗原は前記第３の融合タンパク質単位のＣＨ１−ドメインのＮ末端に融合しており（ＨＣ単位２）、前記ＨＣ単位１およびＨＣ単位２は、特に少なくとも１つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
ｄ）前記第４の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第４の抗原を含み、前記第４の抗原は前記第４のタンパク質のＣＬ−ドメインのＮ末端に融合しており（ＬＣ単位２）、前記第３および第４の融合タンパク質単位は、特に少なくとも１つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合している。
【００１５】
ＩＡタンパク質複合体に含まれる前記組換え融合タンパク質をコードする核酸分子、前記核酸を含有するベクターおよび宿主細胞ならびにこのような融合タンパク質および／またはタンパク質複合体を調製および生成するための方法、ならびにワクチンに適切な前記複合体の使用によって誘導または作製される抗体ならびに免疫療法のためのこのような複合体および／または抗体またはそれらの組換え誘導体の使用も開示する。
【００１６】
したがって、さらなる態様では、本開示の実施形態はまた、本開示によるタンパク質複合体および薬学的に許容される担体および／またはアジュバントを含むワクチン組成物に関する。一部の有利な態様では、本開示はまた、アジュバントを追加しない本開示によるタンパク質複合体を含むワクチン組成物に関する。
【００１７】
別の態様では、本開示は、本開示によるＩＡタンパク質複合体に結合する様々な単離された抗体もしくはそれらの断片を含む抗体組成物または本開示によるＩＡタンパク質複合体における様々な組換えタンパク質に結合する様々な単離された抗体もしくはそれらの断片を含む抗体組成物を対象とする。
【００１８】
さらなる態様では、本開示の実施形態は、生理学的に許容される媒体中に活性成分として本開示によるタンパク質複合体および担体を含む、特にマラリアに対して、ほ乳類、特にヒトを免疫するためのワクチン組成物に関する。
【００１９】
さらに、本開示のＩＡタンパク質複合体、本開示の組換え融合タンパク質のＩＡタンパク質複合体を含む組成物または本開示によるワクチン組成物の有効量を投与することを含む、病原体に対して、特にプラスモディウム（plasmodium）感染に対して、特に熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）に対して、ヒトを免疫する方法を開示する。
【００２０】
別の態様は、
ａ）本開示による宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップであって、宿主細胞が本開示による単離されたＩＡタンパク質複合体の融合タンパク質単位をコードする全核酸分子を含み、前記ＩＡタンパク質複合体が宿主細胞中で形成されるステップ、
ｂ）前記ＩＡタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
ｃ）前記ＩＡタンパク質複合体を処理するステップ
を含む、本開示によるＩＡタンパク質複合体を生成する方法に関する。
【００２１】
別の態様は、
（ａ）本開示による複数の宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップ、
（ｂ）前記生成した融合タンパク質を単離するステップ、
（ｃ）前記ＩＡタンパク質複合体を生成するために前記融合タンパク質を混合するステップ、
（ｄ）前記生成したＩＡタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
（ｅ）ＩＡタンパク質複合体を処理するステップ
を含む、本開示によるＩＡタンパク質複合体を生成する方法に関する。
【００２２】
別の重要な態様は、（ｉ）少なくとも２つの組換え融合タンパク質、（ｉｉ）少なくとも２つの異なる抗原、（ｉｉｉ）少なくとも１つの異なるホモオリゴマー化および／またはヘテロオリゴマー化ドメインを含み、前記第１の組換え融合タンパク質が、前記第２の組換え融合タンパク質には存在しない少なくとも１つのホモオリゴマー化またはヘテロオリゴマー化ドメインを含む、ワクチンとして適切な単離されたＩＡタンパク質複合体に関する。
【００２３】
別の重要な態様は、本開示による少なくとも２つの異なるイムノアセンブリンタンパク質複合体、すなわち、種々の異なる抗原または抗原組成物を含む異なるＩＡタンパク質複合体の混合物を含むワクチン組成物に関する。
【００２４】
本開示を詳細に記載する前に、本明細書で使用した用語は、特定の実施形態を記載することを目的とするのみであって、限定するものではないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用したように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明確に他のことを指示していない限り、単数および／または複数の指示対象が含まれることに注意されたい。数値によって限定されたパラメーターの範囲が与えられた場合、その範囲はこれらの限定値を含むものとみなすことをさらに理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】最先端のイムノアドヘシンの概略を示した図である。目的のタンパク質がＩｇＧ１重鎖の可変抗体領域（ＶＨ＋ＶＬ、Ｆｖ）と置換し、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが続く。得られた有益な特徴を右側に挙げる。
【図２】熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）の生活環を示したスキームである。この概略図は、最も致死的なマラリア原因微生物、熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）の複雑な多段階生活環を例示する。プラスモディウム（Plasmodium）生活環の３つの主要／中心的な相は、肝臓で起こる赤内期段階、感染した赤血球細胞（ＲＢＣ）内で生じる無性生殖血液段階で、有性生殖段階は蚊の内部で行われる。
【図３】ＩＡタンパク質複合体、例えば、マラリアイムノアセンブリン（ＭＩＡ、右）の一実施形態と比較したヒトＩｇＧ１抗体（左）の構造を示したスキームである。選択した目的のタンパク質は、（マラリア）抗原／アドヘシン、受容体細胞外ドメイン、サイトカイン、インターロイキン、酵素、毒素等を含む様々な機能種のいずれかであってもよい。古典的な最新型イムノアドヘシンのイムノグロブリンＦｃ領域（ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）と比較して、ＭＩＡ分子はさらに、ＣＨ１ドメインならびにマラリアアドヘシンにＮ末端融合した定常カッパ軽鎖を含む。示したその他の潜在的エフェクター機能の中でも、Ｆｃ骨格はＦｃＲｎ結合を介してインビボにおける安定性を付与する。
【図４】最初の２つのＭＩＡの組合せ、ＭＳＰ１１９＿３Ｄ７−ＨＣ：Ｐｆｓ２５ＦＫＯ−ＬＣおよびＭＳＰ１１９＿３Ｄ７−ＨＣ：Ｐｆｓ２８−ＬＣのクーマシー染色およびイムノブロット分析を示した図である。Ａ＋Ｃ：還元した精製試料のクーマシー染色したポリアクリルアミドゲル（１２％）、Ｂ＋Ｄ：両精製物の、プールして透析した溶出画分Ｅ１およびＥ２の還元および非還元条件下でのウェスタンブロット。各試料の一部１０μＬを添加した。ＭＩＡ重鎖および軽鎖融合タンパク質の免疫検出は、アルカリホスファターゼをプローブとした抗体ＧＡＨ−Ｆｃ−ＡＰおよびＧＡＨ−ＬＣカッパ−ＡＰを同時に使用して実施した。標的タンパク質バンドの視覚化は、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質の添加および暗所での短期インキュベーション（２〜３分）の後で実現した。Ｍ：Ｐａｇｅルーラー（商標）、ｂｐＨ：ｐＨシフト前の試料、Ｌ：処理した植物抽出物（添加）、Ｆ：植物抽出物の素通り画分、Ｗ：使用したプロテインＡカラムの洗浄試料（１０ＣＶ、１×ＰＢＳ＋ＰＢＳ  ５００ｍＭ、ｐＨ７．４）、Ｅ１〜Ｅ５：分析した溶出画分。
【図５】追加的なＣ末端融合した候補抗原を有するように得られたマラリアイムノアセンブリン（ＭＩＡ−Ｃｓ、右）とその構成要素としてのヒトＩｇＧ１をベースにしたマラリアイムノアセンブリン（ＭＩＡ、左）の構造を示したスキームである。
【図６】テトラ＿ＭＳＰ１１９−ＨＣ−ＣＳＰＴＳＲ−ＥＲＨを含む２段階の精製試料およびそのタンパク質分析評価を示した図である。Ａ）還元した精製試料のクーマシー染色ポリアクリルアミドゲル（１２％）、Ｂ）プールして透析した溶出画分Ｅ１およびＥ２の染色ＳＤＳゲルおよびウェスタンブロット。各試料の一部１０μＬを添加した。ＭＩＡ−Ｃ融合タンパク質の免疫検出は、アルカリホスファターゼをプローブとした抗体ＧＡＨ−Ｆｃ−ＡＰを使用して実施した。標的タンパク質バンドの視覚化は、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質の添加および暗所での短期インキュベーション（２〜３分）の後で実現した。Ｍ：Ｐａｇｅルーラー（商標）、Ｌ：処理した植物抽出物（添加）、Ｆ：植物抽出物の素通り画分、Ｗ：使用したプロテインＡカラムの洗浄試料（１０ＣＶ、１×ＰＢＳ＋ＰＢＳ  ５００ｍＭ、ｐＨ７．４）、Ｅ１〜Ｅ５：分析した溶出画分。
【図７】還元および非還元条件下での未修飾ＨＣバリアントＭＳＰ１１９−ＨＣ：ＡＭＡ１ＧＫＯ−Ｈと変異バリアントＭＳＰ１１９−ｍｏｄＨＣ１＿Ｅ３５６Ｋ−Ｄ３９９Ｋ：ＡＭＡ１ＧＫＯ−ｍｏｄＨＣ２＿Ｋ３９２Ｄ−Ｋ４０９Ｄとの間のクーマシー染色ポリアクリルアミドの移動パターンの差を示した図である。Ａ）電荷対変異の挿入は、ヘテロ二量体ＭＩＡ−ＨＣの生成を可能にする。Ｂ）還元条件下での前記未修飾および変異ＭＩＡ−ＨＣバリアントのクーマシー染色ポリアクリルアミドゲル（１２％）。Ｃ）非還元条件下での全く同じ試料。試料は全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に７０℃で１０分間インキュベートした。染色したゲル画像抽出物の右の絵は、例示して、理解を容易にするためにまとめられた。＊：ＬＣポリペプチド単位（複数可）は、組立て物の違いの視覚的例示を簡単にするために、この実験では除外した。後の実験では、ＬＣ単位はＨＣ単位を含む２つの相補的電荷対変異と一緒に同時発現した。
【図８】異なるＩＡタンパク質複合体構築物、例えば、ＭＩＡタンパク質複合体およびＣＨ２ドメインが欠如したそれらの最小バージョンの概要を示した図である。
【図９】本開示によるイムノアセンブリン（ＩＡ）アプローチに備わっているコンビナトリアルの可能性を示した図である。本明細書で記載したＨＣおよびＬＣ融合ポリペプチド（ＨＣおよびＬＣ単位）を使用するコンビナトリアルの可能性を視覚化するために最も簡単なＩＡ型を選択した。より簡単に表示するために、含まれるＨＣおよびＬＣの数（ｎ）は、ｎ＝２に限定した。関与する成分（ｎ＞２）の量が増加するにつれて、得られるそれらの組合せの範囲は大きく増加する。
【図１０】マラリアワクチン抗原を含む分子組成物およびそれらの作用段階を表す、組み立てたＭＩＡワクチン候補ＡＲＣ２５の絵（Ａ）を示した図である。
【図１１】ＡＲＣ２５のプロテインＡクロマトグラフィーおよびその後の調製用ゲル濾過の後の還元条件下でのクーマシー染色ゲルを示した図である。予測された標的タンパク質バンドは矢印で示し、タンパク質ＩＤは左に示した。Ｍ：タンパク質ラダーＰａｇｅルーラー、Ｌ：添加物、Ｆ：素通り画分、Ｗ：洗浄画分、Ｅ１〜Ｅ６：プロテインＡ溶出試料１から６、Ａ７〜Ａ１１：標的タンパク質を含むゲル濾過試料。
【図１２】熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）の前赤内期段階および無性生殖血液段階の、ＡＲＣ２５およびＢＳＳＣに対して作製したウサギ免疫血清による免疫標識を示した図である。ＩＦＡは、メタノール固定したスポロゾイトおよび血液段階シゾントについて、ＡＲＣ２５またはＢＳＳＣのいずれかで免疫して７０日後に収集したウサギ血清試料のプロテインＡ精製ウサギＩｇＧを使用して実施した。示した例は、２つのウサギＩｇＧ試料（ウサギ２４７０１番（ＡＲＣ２５について）、ウサギ２４７０４番）で免疫標識したスポロゾイトの全表面ならびにシゾントに封入されたメロゾイトの頂端極である。スポロゾイト表面を検出するためにマウス抗ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲモノクローナル抗体６．７５Ｍを適用し、メロゾイト原形質膜を対比染色するためにマウス抗ＰｆＭＳＰ１１９抗血清を使用し、寄生生物の核はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で強調した。免疫したウサギの精製したＩｇＧ画分を１５ｍｇ／ｍＬの濃度で使用し、天然の熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）表面への結合を評価した。
【図１３】新規ＩＡ  タンパク質複合体の２つの例を示した図である。１２Ａ）ＡＲＣ２５  Ａｄｍｉｘｔｕｒｅ（ＡＲＣ２５Ａｄ）は、実験的ＭＩＡワクチン候補ＡＲＣ２５および合成ＲＯＮ２Ｌペプチドから構成される。ＡＭＡ１の疎水性ポケットにＲＯＮ２Ｌが結合すると優れた阻害抗体のためにエピトープがほどける。１２Ｂ）任意のＡＭＡ１バリアントとの複合体における、Ｃ末端にマラリア抗原融合タンパク質を有する抗ＡＭＡ１阻害ｍＡｂ１Ｅ４の１価型。
【図１４】新規ＩＡタンパク質複合体のさらなる例を示した図である。ＯｐｔＡＲＣ２５は、第一世代同等物と同じ方法で生成した。ＲＯＮ２ＬのＲｈ２＿ＧＫＯ−ｍｏｄＨＣ２．２へのＣ末端付加は、２ＭｅｇａＤａを上回る非常に大きい分子量の免疫鎖様複合体を生じた。
【図１５】新規ＩＡタンパク質複合体のさらなる例を示した図である。少なくとも３つの抗原成分ならびに異なる機能の最低限３つのタンパク質様要素（受容体部分、サイトカイン、トール様受容体リガンド、インターロイキン等）を含むことができるヘテロ３量体ＩＡタンパク質複合体。
【図１６】「ＨｅｘａＭｉｘ」（左側）の精製物試料のクーマシー染色したポリアクリルアミドゲルおよびプールして透析したＥ１〜Ｅ６溶出画分（右側）を使用した個々の成分のイムノブロット分析を示した図である。
【図１７】多疾患ＩＡ（ｍＤＩＡ）精製試料のクーマシー染色したＰＡＡゲルおよび透析した溶出試料Ｅ１のイムノブロットを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
前述したように、本開示は、組換え融合タンパク質単位を含むワクチンとして適切な新規タンパク質複合体に関する。本開示は、特に、単離された組換えイムノアセンブリン（ＩＡ）、特に、ウイルス、細菌および／または真核寄生生物に起因する感染症、自己免疫疾患およびがんに対する、動物またはヒトワクチンとして適切な、抗体様組換え融合タンパク質複合体に関し、ＩＡは、病原体または細胞の表面上に提示されていることが好ましいが必須ではないタンパク質から得られる複数の抗原または抗原ドメインを含む。特に、組換えポリペプチドの新規種類の複合体には、単一または２つ以上の病原体の複数の異なる抗原、および／または同じ抗原の複数のバリアント、および／または病原体から得られない少なくとも１つの成分が含まれる。
【００２７】
特に、本開示の実施形態は、ＣＨ１ドメインおよび軽鎖を欠如した、Ｆｃホモ二量体として伝統的に生成された古典的なイムノアドヘシン以外の組成物中における、ＣＨ１ドメインおよび軽鎖を含むイムノアセンブリン（ＩＡ）に関する。本開示のＩＡは、１つの単一の分子中に異なる重鎖および軽鎖融合タンパク質を組み立てる（図１０参照）、または混合物もしくはカクテル中に様々な異なる融合ポリペプチドを一緒にする（図９、図１６参照）ことができる。それによって、免疫学的に適当なコアを多数の重要なワクチン候補、治療薬またはその他の薬物を曝露するための骨格として提供するだけでなく、さらに、多成分ワクチンのために報告されてきた多大な苦労を現代のタンパク質設計によって手際よく解決することができる。
【００２８】
さらなる利点は、組換えポリペプチドの新種の複合体のこれらの混合物およびワクチンカクテルを、同じ発現宿主、組織および／または細胞内で数種のコーディング遺伝子を同時発現することによって（図１６参照）、あるいは数種の遺伝子を個々に発現させ、その後一緒にすることによって作製することである。これらの混合物および得られたワクチン製剤（カクテル）は、多数のＨＣ融合ポリペプチド単位および多数のＬＣ融合ポリペプチド単位を含み、単一の一般的なクロマトグラフィー法、すなわち、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製することができる（図１６参照）。これは、本発明によるＩＡは新規抗原を迅速に取り込むことが可能で、それによって季節的な種の変動またはその他の出現する疾患に対して迅速な応答が容易になることを示す。
【００２９】
さらに、本開示によるＩＡタンパク質複合体は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含むことによって免疫学的な宿主応答性の改善をもたらし、作製したコンビナトリアル分子の免疫細胞とのエフェクター機能／相互作用を増加させる。さらに、ＩＡタンパク質複合体を生成する方法（生成系）は、容易に規模を拡大することができる対費用効果の高い生成系であり、例えば、規制機関ならびに優良医薬品製造基準に関して、可能性があるタンパク質の組合せ全てについて単一の一般的なクロマトグラフィー法（プロテインＡクロマトグラフィー）の利用を可能にする。
【００３０】
特に、新規種類のタンパク質複合体には、単一または２つ以上の病原体の複数の異なる抗原、および／または同じ抗原の複数のバリアント、および／または病原体から得られない少なくとも１つの成分が含まれる。さらに、本開示によるＩＡタンパク質複合体は、いくつかの機能的単位、すなわち、少なくとも１つの抗原、ホモもしくはヘテロマー組立て物を媒介する少なくとも２つの異なるタンパク質ドメイン、および免疫系の細胞上の受容体との相互作用を可能にする少なくとも１つのタンパク質ドメインを含むことができる。本開示の実施形態は、熱帯熱マラリアのためのワクチンとして適切なＩＡタンパク質複合体、ヒトＩｇＧ１定常重鎖および軽鎖ドメインに遺伝子的に融合したマラリア抗原およびその融合タンパク質から構成される組換えタンパク質に関する。組換えＨＣおよびＬＣ融合タンパク質を含む異なるマラリア抗原を同時発現することによって、主要な熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）生活環段階（前赤内期、無性生殖血液段階および有性生殖段階）全てを網羅する有効な多成分および多段階マラリアワクチン候補を作製し、ヒトにおいて防御免疫応答を誘発するために使用する。
【００３１】
本開示では、前述したワクチンの限界のいくつかの新たな解決法を示す。例えば、抗体定常ドメインまたは遺伝子操作したそれらのバリアントは、免疫細胞上のＦｃ受容体と相互作用することによって免疫調節効果を発揮する。さらに、その他の免疫調節特性は、例えば、サイトカインまたはインターロイキン、トール様受容体リガンドとの融合または結合によって導入することができ、したがって、本開示による分子自体がアジュバント特性を示し、提供する。
【００３２】
この場合、驚くべきことに、提示される抗原全てに対して応答を誘導するために、本開示によるＩＡタンパク質複合体が特に適していることが認められた。さらに、本開示によるＩＡタンパク質複合体は、生産が容易で、したがって、対費用効果の高いワクチンアプローチとなる。本開示によるＩＡタンパク質複合体は、多数の抗原だけでなく抗原によって提示される多数の機能性、抗体定常ドメインおよび、イムノアドヘシンのポリペプチドに融合または結合し、アジュバントとして機能する、サイトカイン、インターロイキン、トール様受容体リガンドなどのその他のエフェクター分子を含むことができる。
【００３３】
本開示のイムノアドヘシンは、多くの病原体、特にウイルスの表面上に見いだされるホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマータンパク質から得られた特有の組立て物を作製するために特に適している。標的分子には、例えば、限定はしないが、ＨＩＶの外被、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン、狂犬病ウイルス糖タンパク質、デングウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスなどのフラビウイルスのＥ−糖タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス外被糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、エボラウイルスＧＰ１、２、ＢＭＦＰ、ブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）の膜融合活性を有する基本的３量体コイルドコイルタンパク質、サルモネラ（Salmonella enterica）血清型ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＹｑｉＣが含まれる。本開示によれば、これらの組立て物は、同じまたは異なる病原体の１つまたは複数の抗原を含むことができ、同じ抗原の多数の配列バリアントを含むことができ、さらに、例えば、アジュバント特性を備えた１つまたは複数のその他の機能性を含むことができる。さらなる抗原の例は、配列番号１０５から配列番号１０７のアミノ酸配列のいずれか１つを含むポリペプチドである。
【００３４】
イムノアドヘシンは、キメラタンパク質、特に、例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含有するカルボキシ（Ｃ）末端に結合した目的の任意のタンパク質様分子（抗原）から構成されるアミノ（Ｎ）末端を有する抗体様分子である（図１参照）。キメラ分子の非Ｉｇ部分は、ＩｇＧの可変領域に機能が類似していてもよく、その役割は標的認識を媒介することである。Ｆｃ部分を含めることによって、再生新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合、したがってリソソームによる分解の阻止によって標的タンパク質を再利用することによって、胎盤への移行、補体の固定および血清半減期の延長のようなヒト抗体の生物学的、免疫学的および薬理学的に有利な特性が付与される(Mekhaiel et al., 2011)。さらに、エフェクター機能は、免疫系のある種の細胞、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在するＦｃ受容体との相互作用の結果としてもたらされる(Perez de la Lastra et al., 2009)。さらに、技術的な観点から、Ｆｃ領域は、プロテインＡ／Ｇアフィニティークロマトグラフィーによる、簡単で対費用効果が高い、より重要なことに一般性のある精製法の利用を可能にする。１９８９年にいくつかのＣＤ４−イムノグロブリンハイブリッド分子がＡＩＤＳ治療薬としての可能性を意図して生産され、初めて発表されてから(Capon et al.，1989）、ＩｇＧ要素は拡張が可能で望ましくないことが見いだされたので、ほとんど全てのイムノアドヘシンは、想定／所望／標的とする単一の「機能性」のためにＣＨ１ドメインおよび軽鎖を欠如したＦｃホモ二量体として発現された。
【００３５】
利点は、組換えポリペプチドの新種の複合体の混合物は、同じ発現宿主内でコードされるいくつかの遺伝子が同時発現することによって、あるいはいくつかの遺伝子を個々に発現させ、その後一緒にすることによって作製することができることである。組換えポリペプチドまたはその成分の新種の複合体は、個々に、または混合物として精製することができる。
【００３６】
さらに、本開示によるＩＡタンパク質複合体は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含むことによって免疫学的な宿主応答性の改善をもたらし、作製したコンビナトリアル分子の免疫細胞とのエフェクター機能／相互作用を増加させる。さらに、ＩＡタンパク質複合体を生成する方法（生成系）は、容易に規模を拡大することができる対費用効果の高い生産系であり、例えば、規制機関ならびに優良医薬品製造基準に関して、可能性があるタンパク質の組合せ全てについて単一の一般的なクロマトグラフィー法の利用を可能にする。
【００３７】
本開示によるＩＡタンパク質複合体は、複雑な生活環および多段階および多くの可能性がある標的抗原を有する病原体のワクチンとして適切である。したがって、複数の異なる抗原、特に２つ以上の生活環を表す抗原の使用は、着実な免疫を導く。
【００３８】
単一のポリペプチドから構成されるワクチン候補は主に、再現性があり着実で費用効率のよい生産に対する実際的、技術的および経済的需要によって所望される。しかし、当業者には、組換え発現タンパク質には大きさの制限があることも明らかである。タンパク質に特異的な違いも同様に考慮しなければならないが、ポリペプチドの長さが増大するにつれて発現レベルおよび収率が大きく減少する。多数の課題が大きさによって比例する以上に増大し、大きなタンパク質の全体的な特性は小さいタンパク質、ドメインまたは断片の特性よりもかなり最適化されにくい。これらの問題は全て、今までアピコンプレクサ（apicomplexan）寄生生物に対する効率的なワクチンの開発の重大なボトルネックであり、多数の線形エピトープ、１つまたは２つの生活環段階の１つまたは２つの抗原のみを含む最適以下の、圧倒的な数のワクチン候補が得られてきた。代替法として、化学的または遺伝的に弱毒化し、または不活性化した生ワクチンが提案されているが（例えば照射されたスポロゾイト）、このようなアプローチは、バッチ間の一貫性、規模を拡大した生産および最も重要なこととして生成物の安全性に取り組まなければならない。
【００３９】
全般的に、本明細書で使用した命名法および本発明において利用した実験室手順には、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual”Sambrook et al., (1989)、“Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)、Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第４６６６８２８号、第４６８３２０２号、第４８０１５３１号、第５１９２６５９号および第５２７２０５７明細書に記載された方法、“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley-Liss, N.Y. (1994), Third Edition、“Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, Conn. (1994)、Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W.H. Freeman and Co., New York (1980)参照。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されており、例えば、米国特許第３７９１９３２号、第３８３９１５３号、第３８５０７５２号、第３８５０５７８号、第３８５３９８７号、第３８６７５１７号、第３８７９２６２号、第３９０１６５４号、第３９３５０７４号、第３９８４５３３号、第３９９６３４５号、第４０３４０７４号、第４０９８８７６号、第４８７９２１９号、第５０１１７７１号および第５２８１５２１号明細書、“Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984)、“Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)、“Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984)、“Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986)、“Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986)、“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal, B., (1984) and “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press、“PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)、Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)参照。その全ては本明細書において完全に記載されるかのように参考により組み込まれる。その他の一般的な参考文献は、本文書を通じて提供される。本明細書における手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。本明細書に含有される情報は全て参考により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
本開示によるイムノアセンブリン（ＩＡ）複合体は、少なくとも３つの異なる組換え遺伝子の発現から生じるものを含むヘテロオリゴマータンパク質複合体である。異なる組換え遺伝子は、同じ発現宿主内で発現してもよく、発現しなくてもよい。有利な実施形態では、３つ以上の異なる組換え遺伝子は、同じ発現宿主中で発現する。
【００４１】
本開示の別の実施形態では、３つ以上の異なる組換え遺伝子は、同じ細胞内で同時発現する。しかし、当業者であれば、技術的および生物学的限界があること、３つ以上の異なる組換え遺伝子全てがどの単一細胞でも、すなわち、宿主細胞の１００％で発現することを意味するのではないこと、本開示によれば、「同じ細胞内で同時発現した」とは、３つ以上の異なる組換え遺伝子が宿主細胞の大部分、すなわち、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％で発現することを意味することを理解するだろう。
【００４２】
当業者であれば、３つ以上の異なる組換え遺伝子を発現するための遺伝子情報は、限定はしないが、プラスミドＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡおよび１本鎖ＲＮＡを含む様々な核酸によってコードされ得ることを知っているであろう。核酸は、センスおよびアンチセンス、１本鎖または２本鎖、環状または直鎖状の両方であってもよく、遊離、すなわち、裸であってもよく、あるいはタンパク質、ポリマー、リポソームなどによって覆われていてもよい。さらに、遺伝子情報は、ウイルス、細菌またはその他の生物によって運搬されてもよい。当業者であればまた、遺伝子情報を細胞、組織および生物（細菌、微生物、植物およびほ乳類細胞）に送達するために様々な方法があることを理解している。さらに、３つ以上の融合タンパク質単位をコードする３つ以上の異なる組換え遺伝子または遺伝情報は、物理的に結合し、例えば、同じプラスミド上でコードされていてもよいが、別個の核酸上に分離していてもよく、または結合した、および結合していない配置の組合せを使用してもよい。
【００４３】
３つ以上の異なる組換え遺伝子の同時発現および得られた個々のポリペプチド鎖（融合タンパク質単位）の組立て物によって、例えば、ＡＲＣ２５の場合に示したように（実施例参照）、別個のタンパク質複合体を導くことができるが、可変量の融合タンパク質単位を含むタンパク質複合体の混合物を導くこともできる。単一のイムノアセンブリン（ＩＡ）複合体、または２つ以上のイムノアセンブリン（ＩＡ）複合体の形成は、発現中および／またはインキュベーション中および／または抽出中および／または、さらに下流処理中および／または製剤化中に行われてもよい。１つまたは複数のイムノアセンブリン（ＩＡ）複合体は、単一の上流処理を使用して生成する、または２つ以上の別々の上流処理を使用して生成することができる。同様に、１つまたは複数のイムノアセンブリン（ＩＡ）複合体が、例えば、限定はしないが、加熱、抽出、濾過、クロマトグラフィーまたはウイルス不活性化を含む同じ下流処理ステップ中に存在してもよく、それらのステップによって処理されてもよい。有利な実施形態では、イムノアセンブリン（ＩＡ）複合体（１つまたは複数）は、同じ精製方法から得られる。
【００４４】
本開示は、少なくとも２つの組換え融合タンパク質単位を含む、ワクチンとして適切な単離されたイムノアセンブリン（ＩＡ）タンパク質複合体に関し、
ａ）第１の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第１の抗原を含み、前記第１の抗原はイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも１つのＮ末端および／またはＣ末端に結合しており（ＨＣ融合ポリペプチド単位１、ＨＣ単位１）、
ｂ）第２の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第２の抗原を含み、前記第２の抗原はＣＬ−ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に結合しており（ＬＣ融合ポリペプチド単位１、ＬＣ単位１）、
ｃ）前記第１および前記第２の抗原は異なるアミノ酸配列
を含む。
【００４５】
特に、本開示は、少なくとも３つの組換え融合タンパク質単位を含むワクチンとして適切な単離されたイムノアセンブリン（ＩＡ）タンパク質複合体に関し、
ａ）第１の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第１の抗原を含み、前記第１の抗原はイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも１つのＮ末端および／またはＣ末端に結合しており（ＨＣ融合ポリペプチド単位１、ＨＣ単位１）、
ｂ）第２の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第２の抗原を含み、前記第２の抗原はＣＬ−ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に連結しており（ＬＣ融合ポリペプチド単位１、ＬＣ単位１）、
ｃ）第３の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第３の抗原を含み、前記第３の抗原は前記第３の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に融合している、または
ｄ）第３の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第３の抗原を含み、前記第３の抗原はＣＬ−ドメインのＮ−またはＣ末端に融合しており、
ｅ）前記３つの組換え融合タンパク質単位の前記抗原はアミノ酸配列が異なっている。
【００４６】
さらに有利な実施形態では、本開示による単離されたタンパク質複合体は、第３の組換え融合タンパク質単位としてイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第３の抗原を含み、前記第３の抗原は前記第３の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に融合している（ＨＣ単位２）。
【００４７】
さらに有利な実施形態では、本開示による単離されたタンパク質複合体は、イムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよびさらなる抗原を含む第４の組換え融合タンパク質単位を含み、前記さらなる抗原はＣＬドメインのＮ末端またはＣ末端に融合しており（ＬＣ単位２）、ＬＣ単位は好ましくは異なるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
本開示によれば、第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）および第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）は互いに結合していてもよい。さらに、第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）および前記第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）は互いに結合していてもよい。さらに、第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）および第４の融合タンパク質単位（ＬＣ単位２）は互いに結合していてもよい。
【００４９】
本開示の一部のさらなる実施形態では、融合タンパク質単位は本開示のタンパク質複合体中で互いに共有結合または非共有結合することができる。本開示によれば、「共有結合した」という用語は、原子間の電子対の共有が関与する共有結合を含む。これらの電子対は、共有対または結合対として知られており、それらが電子を共有するとき、原子間の引力および反発力の安定したバランスが共有結合として知られている。「非共有結合した」という用語は、電子の共有は関与しないが、分子間または分子内の電磁気的相互作用のより分散した変動が関与する、共有結合とは異なる非共有結合的相互作用を含む。本開示の一部の有利な実施形態では、融合タンパク質はジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
【００５０】
したがって、本開示では、「結合した」という用語は、２つ以上の分子間の非共有および共有結合を含む。結合は直接的であっても間接的であってもよい。２つの分子がヒンジ領域のような連結分子（リンカー）を介して結合しているとき、２つの分子は間接的に結合している。２つの分子を結合する介在分子がないとき、２つの分子は直接結合している。本開示によるＩＡタンパク質複合体に含まれる融合タンパク質単位は、互いに共有結合または非共有結合していてもよい。一部の有利な実施形態では、本開示によるＩＡタンパク質複合体に含まれる融合タンパク質単位は、ジスルフィド結合によって互いに共有結合していてもよい。
【００５１】
本開示による「タンパク質複合体」は、２つ以上のポリペプチドを含む組成物である。本開示の有利な実施形態では、「タンパク質複合体」という用語は、２つ以上の関連したポリペプチド鎖の群を対象とする。異なるポリペプチド鎖は異なる機能を有していてもよい。タンパク質複合体は、４次構造の形態であってもよい。タンパク質複合体中のタンパク質は、共有結合的および／または非共有結合的タンパク質−タンパク質相互作用によって結合していてもよく、異なるタンパク質複合体は経時的に安定性の程度が異なっていてもよい。本開示の有利な実施形態では、タンパク質複合体は抗体様タンパク質複合体である。
【００５２】
典型的な抗体は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって内部連結した２つの重（Ｈ）鎖（完全長のとき約５０〜７０ｋＤａ）および２つの軽（Ｌ）鎖（完全長のとき約２５ｋＤａ）から構成されるイムノグロブリン分子である。軽鎖は、カッパおよびラムダに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、抗体アイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと定義する。
【００５３】
各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡでは３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成され、ＩｇＭおよびＩｇＥでは４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１ドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称する、より保存された領域が組み入れられた相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変の領域にさらに分割される。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知のやり方に従う（Chothia and Lesk 1987; Chothia et al. n.d.; Kabat et al. 1992)。抗体が特定の抗原に結合する機能的能力は、概ねＣＤＲによって決定される。
【００５４】
一部の有利な実施形態では、本開示のイムノアセンブリン（ＩＡ）タンパク質複合体は、少なくとも２つの重鎖定常領域ＣＨ１およびＣＨ３、特に３つの重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ならびにイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬを含む抗体様タンパク質複合体であり、抗原は重鎖定常領域に結合／融合し、別の抗原はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインに結合／融合している。
【００５５】
しかし、有利な実施形態では、本開示によるワクチンとして適切なイムノアセンブリン（ＩＡ）タンパク質複合体は、抗体様タンパク質複合体であるが、抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域は含まない。
【００５６】
一部の有利な実施形態では、ＩＡタンパク質複合体は単離されたタンパク質複合体である。「単離された」という用語は、タンパク質複合体、タンパク質または核酸に関連して使用された場合、天然材料において通常関連している少なくとも１つの混入物（それぞれ、核酸またはタンパク質）から同定し、分離した核酸配列、タンパク質またはタンパク質複合体を意味する。単離した核酸またはタンパク質は、天然において見いだされるものとは異なる形態または状況で存在する。対照的に、単離していない核酸またはタンパク質は、天然に存在する状態で見いだされる。
【００５７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、隣接する残基のアルファアミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結合によって一方が他方に連結した線状のアミノ酸残基を示すために、本明細書では同義に使用される。アミノ酸残基は、好ましくは天然の「Ｌ」型異性体である。しかし、所望する機能的特性がポリペプチドに保持されている限り、「Ｄ」型異性体の残基を任意のＬ−アミノ酸残基と置換することができる。さらに、アミノ酸には、２０個の「標準的」アミノ酸に加えて、修飾された稀なアミノ酸が含まれる。
【００５８】
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたＩＡタンパク質複合体は、ワクチンとして、特にヒトおよび／または動物ワクチンとして適切である。「ワクチン」は、例えば、対象に投与したとき、免疫応答を誘導する物質分子の組成物である。ワクチンは、ポリヌクレオチド分子、ポリペプチド分子および炭水化物分子ならびに糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、２つ以上のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの融合物などのそれぞれの誘導体および組合せ物を含むことができる。
【００５９】
一部のさらなる実施形態では、ワクチンとして適切な単離されたＩＡタンパク質複合体は少なくとも２つの組換えタンパク質を含む。「組換えタンパク質」という語句には、タンパク質、特に、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現したタンパク質などの組換え手段によって調製、発現、生成または単離された組換え融合タンパク質が含まれる。
【００６０】
一部の有利な実施形態では、ワクチンとして適切な単離されたＩＡタンパク質複合体は少なくとも２つの組換えタンパク質を含む。「組換え融合タンパク質」という用語は特に、異なるタンパク質、異なるタンパク質ドメインまたは異なる生物などの異種原料由来のセグメント、すなわち、アミノ酸配列を含む、組換え技術によって生成したタンパク質を意味する。セグメントは、互いにペプチド結合を介して直接的または間接的に結合している。間接的結合とは、ペプチドリンカーなどの介在性アミノ酸配列がセグメント間に並置されて融合タンパク質を形成することを意味する。組換え融合タンパク質は、１つの遺伝子の異なる領域から得られたヌクレオチド配列を遺伝子的に結合することによって、および／または２つ以上の別々の遺伝子から得られたヌクレオチド配列を結合することによって得られるヌクレオチド配列によってコードされる。これらのヌクレオチド配列は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）から得ることができるが、その他の生物、クローニング手順のために使用したプラスミド、またはその他のヌクレオチド配列からも得ることができる。
【００６１】
さらに、コーディングヌクレオチド配列は、最初に鋳型ＤＮＡ試料を必要とすることなく、例えば、デジタル遺伝子配列からのオリゴヌクレオチド合成およびその後の得られた断片のアニーリングによって、インビトロにおいて合成することができる。所望するタンパク質配列は、例えば、適当なソフトウェアツールを使用して、「逆翻訳」することができる。汎用遺伝暗号の縮重のために、オープンリーディングフレーム（すなわち、組換えタンパク質コーディング領域）内の同義のコドンは、例えば、シス作用性不安定要素（例えば、ＡＵＵＵＡ）を除去し、二次および三次ｍＲＮＡ構造（例えば、シュードノット、ステム−ループなど）を除去、導入または修飾し、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＧＴＳ）を誘発し得る自己相補性領域を回避し、全体的なＡＴ：ＧＣ含量を変化させ、または発現宿主にコドン使用を適応させるために、様々な方法で交換することができる。このような変化は手作業で、または適当なソフトウェアツールを使用して、または組合せによって設計することができる。
【００６２】
組換え融合タンパク質は、当技術分野で公知のように、適切な宿主細胞において組換えＤＮＡ法および発現を使用して調製された組換え生成物であってもよい(例えば、Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y参照）。特定の単離されたタンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列は、例えば、単離に必要なドメインの５’および３’領域に対応する適当なオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに鋳型として単離されたタンパク質ドメイン配列の完全長コーディングを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、都合よく調製することができる。完全長コーディングタンパク質配列の供給源は、例えば、感染因子／病原体／病原体細胞またはクローニングされた完全長遺伝子を含有するプラスミドベクターから抽出されたＤＮＡであってもよい。あるいは、タンパク質コード配列は、インビトロにおいて部分的に、もしくは完全に合成する、または様々なアプローチの組合せを使用することができる。
【００６３】
本開示によるイムノアセンブリン/タンパク質複合体の場合では、融合タンパク質単位のそれぞれは抗原を含んでいてもよい。本明細書では、「抗原」および「免疫原」という用語は同義に使用される。しかし、本開示によれば、抗原および免疫源はいずれも、生物の免疫系による免疫応答を誘発することができる分子を意味する。本開示を通じて、抗原という用語は、免疫応答の生成物−抗体に結合する分子を直接的に意味するので、使用される。ＩＡタンパク質複合体中の抗原は、免疫応答を誘導することができる抗原である。適切な抗原は、例えば、固有の領域対関連のない領域の居住者から得られたヒト血液試料を、文献で公知の有望なタンパク質を生成する組換え体に対する反応性をスクリーニングして分析することによって同定することができる。本開示による抗原には、病原体のプロテオームの一部である、それらのバリアント、変異体、断片を含む任意の成分が含まれ、特に、抗原は病原体の表面タンパク質または表面構造から得られる。「抗原」という用語には、例えば、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、トール様受容体、ペプチドおよび抗体可変ドメインを含めることができる。
【００６４】
例えば、本開示による抗原は、腫瘍抗原、自己抗原、食物アレルゲン、チクングニアウイルス、狂犬病ウイルス、連鎖球菌（Streptococcus）、ナイセリア（Neisseria）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、クロストリジウム（Clostridiu）、トリパノソーマ（Trypanosoma）、リーシュマニア（Leishmania）、サルモネラ（Salmonella）、フラビウイルス（Flavivirus）、フィロウイルス（Filiovirus）の群から選択される病原体から得られる抗原および／またはマラリア、トキソプラズマ症のようなアピコンプレクサ（Apicomplexan）寄生生物から生じる感染性疾患、および／またはエボラ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、肝炎、結核、ジカ熱、インフルエンザまたは百日咳のようなウイルス感染に関与する１つまたは複数の病原体から得られる、および／またはがんを生じる悪性腫瘍を引き起こす疾患から得られる抗原である。例えば、「熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）表面タンパク質から得られる抗原」には、完全長熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）表面タンパク質、または特に、特定のドメインもしくはその他の部分のような完全長タンパク質の一部のみのアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。
【００６５】
前述したように、本開示によるＩＡタンパク質複合体の異なる融合タンパク質に含まれる抗原は、異なるアミノ酸配列を含み、すなわち、前記組換え融合タンパク質単位の前記抗原はアミノ酸配列が異なっている。特に、ＨＣ融合ポリペプチド中のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも１つのＮ末端および／またはＣ末端に融合／結合している第１の抗原は、ＬＣ融合ポリペプチド中のＣＬ−ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に結合している第２の抗原とはアミノ酸配列が異なっている。したがって、ＩＡの融合タンパク質単位に含まれる抗原は、異なるアミノ酸配列を含む異なる抗原である。
【００６６】
一部の有利な実施形態では、前記抗原のタンパク質配列は、９９％以下、好ましくは９８％以下、より好ましくは９５％以下、さらにより好ましくは９０％以下、さらにより好ましくは８０％以下、最も好ましくは７０％以下の配列同一性を有する。
【００６７】
アミノ酸またはポリヌクレオチド配列に関して、「パーセント配列同一性」とは、配列を最適に整列させたとき、２つの配列において同一である残基の比率を意味する。したがって、８０％アミノ酸配列同一性とは、最適に整列させた２つのポリペプチド配列においてアミノ酸の８０％が同一であることを意味する。パーセント同一性は、例えば、配列を整列させ、２つの整列した配列の間の一致の正確な数を計数し、短い方の配列の長さによって除し、その結果に１００を乗じることによって、２分子間の配列情報を直接比較して決定することができる。ペプチド分析のためのSmith and Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489の局所相同性アルゴリズムに適応した、ALIGN, Dayhoff, M.O.の"Atlas of Protein Sequence and Structure", M.O. Dayhoff et., Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DCなどの容易に利用可能なコンピュータプログラムを分析のために使用することができる。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、同様にＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに基づくウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから利用可能）における、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムを利用することができる。これらのプログラムは、製造者によって推奨され、上記のウィスコンシン配列解析パッケージに記載された初期パラメーター５を用いて容易に利用される。配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの一例は、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。
【００６８】
一部の有利な実施形態では、本開示によるタンパク質複合体は、異なる株、単離株、対立遺伝子バリアント、変異体および／または一塩基多型を表す同じ抗原の２つ以上のバリアントを含む。非常に特異的なワクチンを開発するための標的抗原のほとんどが、特にＢ細胞およびＴ細胞エピトープに位置することが多い多型を示すという事実は厄介である(Proietti and Doolan, 2014)。これらの天然のバリアントは、対立遺伝子多型(例えば、ＭＳＰ１：観察された対立遺伝子は全て、ＭＡＤ２０およびＷｅｌｌｃｏｍｅハプロタイプのような２種の対立遺伝子に明確に分けられる）、抗原多型（古典的な突然変異／組換え事象によって生じる抗原をコードする遺伝子の多数の遺伝子的に安定な別の形態）、または抗原変動を導く同じクローンの寄生生物系列による抗原の別の形態、例えば、ＰｆＥＭＰ−１およびｒｉｆｉｎｓ（Roy et al., 2008）の時系列発現によって生じ得る。第２世代ワクチンは主要な生活環段階の多数の重要な抗原を含まなければならないだけでなく、天然株を超える獲得免疫を模倣した望ましい種を実現しなければならず、次世代ＲＴＳ，Ｓは、当分野の別の循環株全てに対して確実に有効であるために、抗原または対立遺伝子標的バリアントに対しても効果的でなければならないことは疑う余地がない(Moorthy and Kieny, 2010)。最近、抗原多様性および対立遺伝子特異性を克服するという試みによって、（１０８個の免疫原−寄生生物の組合せ全てを試験することによって）４つまたは５つの異なるＡＭＡ１対立遺伝子を組み合わせた非常に多型のワクチン候補ＡＭＡ１が、天然に認められる多型の大部分を網羅し、インビトロにおいて株特異的な障害を克服するために十分であることが示された（Proietti, C. and D. L. Doolan (2014). "The case for a rational genome-based vaccine against malaria." Front Microbiol 5: 741, Roy, S. W.et al., (2008). "Evolution of allelic dimorphism in malarial surface antigens." Heredity (Edinb) 100(2): 103-110, Moorthy, V. S. and M. P. Kieny (2010). "Reducing empiricism in malaria vaccine design." Lancet Infect Dis 10(3): 204-211, Miura, K. et al., (2013). "Overcoming allelic specificity by immunization with five allelic forms of plasmodium falciparum apical membrane antigen 1." Infect Immun 81(5): 1491-1501参照）。
【００６９】
さらに、一部の実施形態では、本開示によるタンパク質複合体は２つの異なる病原体から得られた抗原を含む。
【００７０】
好ましくは、本開示によるタンパク質複合体に含まれる抗原は、アピコンプレクサ（Apicomplexan）寄生生物から得られた抗原である。アピコンプレクサ(Apicomplexa)（Apicomplexiaとも称する）は、原生動物の大きな群で、そのほとんどはアピコプラストと呼ばれる特有の細胞器官および宿主細胞の貫通に関与する頂端複合体構造を有する。これらは、コクシジウム（coccidia）、グレガリナ（gregarine）、ピロプラズマ（piroplasm）、ヘモグレガリナ（haemogregarine）およびマラリア原虫（plasmodia）(熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、二日熱マラリア原虫（Plasmodium knowlesi）)などの生物を含む多様な群である。アピコンプレクサ（Apicomplexan）生物によって引き起こされる疾患には、限定はしないが、バベシア症(バベシア（Babesia））、マラリア（プラスモディウム（Plasmodium））、クリプトスポリジウム症(クリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum））を含むコクシジウム病、シクロスポラ症（シクロスポラ・カイエタネンシス（Cyclospora cayetanensis））、イソスポーラ症（(戦争イソスポーラ（Isospora belli））およびトキソプラズマ症(トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii））が含まれる。例えば、本開示によるタンパク質複合体に含まれる抗原には、アピコンプレクサ（Apicomplexa）門の寄生生物の表面上に提示される細胞表面構造から得られた抗原が含まれる。
【００７１】
アピコンプレクサ（Apicomplexa）表面構造および／または表面タンパク質は、好ましくは膜結合もしくは膜関連タンパク質または分泌することが知られているタンパク質である。これらのタンパク質は、例えば、一般的に利用可能なソフトウェアツールを使用して、Ｎ末端シグナルペプチドの存在、ＰＥＸＥＬモチーフの存在、ＧＰＩアンカーモチーフの存在あるいは１つまたは複数の膜貫通ドメインの存在についてゲノムまたは公知の遺伝子を分析することによって同定することができる。これらのタンパク質およびそれらの相同体には、例えば、限定はしないが以下が含まれる：
−  ＣｅｌＴＯＳ（オーキネートおよびスポロゾイトの細胞横断タンパク質）、抗原２（ＰｆＡｇ２、ＰｖＡｇ２、ＰｏＡｇ２など）
−  ＣＳＰ（スポロゾイト周囲タンパク質）
−  ＥＢＡ１７５（赤血球結合抗原１７５）
−  ＥＸＰ１（輸送タンパク質１）；別称：ＣＲＡ１（スポロゾイト周囲関連抗原−１／交差反応抗原−１）、ＡＧ５．１（輸送された抗原５．１）、ＱＦ１１９
−  ＭＳＰ１（メロゾイト表面タンパク質１）；別称：ＭＳＡ１（メロゾイト表面抗原１）、ＰＭＭＳＡ、ｐ１９０、ｐ１９５、ｇｐ１９０、ｇｐ１９５
−  ＭＳＰ２（メロゾイト表面タンパク質２）；
−  ＭＳＰ３（メロゾイト表面タンパク質３）；別称：ＳＰＡＭ（メロゾイトに関連した分泌型多型抗原）
−  ＭＳＰ４（メロゾイト表面タンパク質４）
−  ＭＳＰ５（メロゾイト表面タンパク質５）
−  ＭＳＰ７（メロゾイト表面タンパク質７）
−  ＭＳＰ８（メロゾイト表面タンパク質８）
−  ＭＳＰ９（メロゾイト表面タンパク質９）
−  ＭＳＰ１０（メロゾイト表面タンパク質１０）
−  ＭＴＲＡＰ（メロゾイトＴＲＡＰ相同体、メロゾイトＴＲＡＰ相同体、メロゾイトＴＲＡＰ様タンパク質）
−  Ｐｆ３８；別称：６−システインタンパク質
−  Ｒｈ２ａ（網状赤血球結合タンパク質２相同体ａ）
−  Ｒｈ２ｂ（網状赤血球結合タンパク質２相同体ｂ）
−  Ｒｈ４（網状赤血球結合タンパク質相同体４）
−  Ｒｈ５（網状赤血球結合タンパク質相同体５）
−  Ｒｉｐｒ、ＰｆＲｉｐｒ（Ｒｈ５相互作用タンパク質）
−  Ｒｏｎ２（ロプトリー頸部タンパク質２）
−  Ｒｏｎ４（ロプトリー頸部タンパク質４）
−  Ｒｏｎ５（ロプトリー頸部タンパク質５）
−  Ｒｏｎ６（ロプトリー頸部タンパク質６）
−  ＴＲＡＭＰ（トロンボスポンジン関連頂端膜タンパク質）；別称：ＰＴＲＡＭＰ
−  ＴＲＡＰ（トロンボスポンジン関連匿名タンパク質）；別称：ＳＳＰ２（スポロゾイト表面タンパク質２）
−  ＡＭＡ１（頂端膜抗原１）
−  ＧＬＵＲＰ（グルタミン豊富なタンパク質）
−  ＲｈｏｐＨ２（高分子量ロプトリータンパク質２）
−  ＲｈｏｐＨ３（高分子量ロプトリータンパク質３）
【００７２】
ヒトにおけるマラリア疾患は、例えば、５種のプラスモジウム属（Plasmodium）寄生生物：熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）および二日熱マラリア原虫（P. knowlesi）によって引き起こされ、最も蔓延しているのは熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）および三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax））である。熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）によって引き起こされるマラリア（悪性マラリア、熱帯熱マラリアまたは熱帯性マラリアとも呼ばれる）は最も危険な形態のマラリアであり、合併症の割合および死亡率が最高である。ほとんど全てのマラリアによる死亡は熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）によって引き起こされる。
【００７３】
したがって、一部の有利な実施形態では、本開示によるＩＡタンパク質複合体に含まれる抗原は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、二日熱マラリア原虫（P. knowlesi）および四日熱マラリア原虫（P. malariae）からなる群から選択される少なくとも１つのプラスモジウム（Plasmodium）寄生生物から得られた抗原である。特に、本開示によるタンパク質複合体に含まれる抗原は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）から得られた抗原である。一部の実施形態では、本開示によるタンパク質複合体に含まれる抗原は、配列番号１から３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれらからなる抗原である。
【００７４】
さらに、本開示によるタンパク質複合体および組成物は、病原体、特に、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）および／または卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）を含むプラスモディウム（Plasmodium）属の寄生生物に対するヒトおよび／または動物ワクチンとして適切である。有利な実施形態では、寄生生物は熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）である。
【００７５】
熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）に対するヒトワクチンとして適切な、特に、本開示によるタンパク質複合体の融合タンパク質を含む、またはそれらからなる有利な抗原を以下の表１に挙げる。
【００７６】
【表１−１】
2019502749.tif 000002
【００７７】
【表１−２】
2019502749.tif 000003
【００７８】
【表１−３】
2019502749.tif 000004
【００７９】
【表１−４】
2019502749.tif 000005
【００８０】
【表１−５】
2019502749.tif 000006
【００８１】
簡単に説明すると、ヒトにおけるマラリア原虫の生活環（図２）は、ハマダラカ属（Anopheles）の蚊が刺して数個のスポロゾイトが播種されることによって開始する。数分内にスポロゾイトは肝細胞に侵入して発達を開始し、シゾゴニーによって増殖する（肝臓段階または前赤内期段階）。マラリア原虫の種に応じて５〜１４日の期間の後、シゾントは何千ものメロゾイトに発達し、これが血流中に放出され、赤血球（ＲＢＣ）に侵入し、血液段階を開始する。ＲＢＣ中で、各メロゾイトがトロホゾイトに発達し、マラリア原虫の種に応じて４２〜７２時間以内に成熟、分裂し、シゾントが生じ、これが十分に成熟した後、最大３２個のメロゾイトを生じさせる。血流中に放出されたメロゾイトはその他のＲＢＣに侵入し、その生活環を維持することとなる。いくつかのメロゾイトはＲＢＣに侵入した後、有性型の雄または雌のガメトサイトに発達し、これも成熟および赤血球破裂後に血流に入る。雌のハマダラカ属（Anopheles）の蚊が吸血し、ガメトサイトを摂取すると、感染することとなり、プラスモジウム属（Plasmodium）生活環の有性生殖段階を開始する。蚊の腸では、雄ガメトサイトは雌ガメトサイトと融合してオーキネートを形成し、それが腸壁と結合して通過し、その外面に付着したままオーシストに変換する。オーシストはスポロゴニーによって分裂し、数千ものスポロゾイトを生じ、それらが蚊の体腔中に放出され、最終的にその唾液腺に移動し、ここでスポロゾイトは成熟し、蚊が吸血のために宿主を刺すときにヒトにおいて新規感染を開始できるようになる。
【００８２】
一部の実施形態では、本開示によるタンパク質複合体に含まれる抗原は、寄生生物の表面上に提示される少なくとも２つの異なるタンパク質から得られる抗原である。特に、抗原は、前記寄生生物の少なくとも２つの異なる生活環主要段階において前記寄生生物の表面上に提示される少なくとも２つの異なるタンパク質から得られる。
【００８３】
一部の有利な実施形態では、本開示によるタンパク質複合体は細胞表面構造から得られた抗原を含み、この細胞表面構造は前赤内期段階、有性生殖段階および／または血液段階のようなアピコンプレクサ（Apicomplexa）生活環段階の少なくとも１つの主要段階において、寄生生物の表面上に提示される。好ましくは、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）表面タンパク質は、赤内期段階および／または血液段階において寄生生物の表面上に提示される。
【００８４】
前赤内期主要段階：
ａ）スポロゾイト
スポロゾイトは、肝細胞に侵入する前の非常に短い期間血流中に存続する。スポロゾイト中に発現したプラスモジウム（Plasmodium）タンパク質抗原の例は、スポロゾイトの外膜の主要な構成物であるスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）である(Nussenzweig and Nussenzweig., 1989)。誘導された抗体は、肝細胞へのスポロゾイトの結合および進入をブロックすることができる。
【００８５】
ｂ）肝臓段階
この段階中、免疫はほとんど、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびγδＴ細胞が関与する細胞依存性機構によって媒介される。ＣＳＰは、スポロゾイト中および肝臓段階中の両方で発現する。したがって、ＣＳＰに関する研究の多くは、体液性応答を誘導する免疫優性反復から細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導できる領域に転換した。その他の同定された肝臓段階抗原には、特に、肝臓段階抗原１（ＬＳＡ−１）、ＬＳＡ−２、ＬＳＡ−３、ＳＡＬＳＡおよびＳＴＡＲＰが含まれる（Garcia, Puentes et al. 2006）。
【００８６】
無性生殖血液主要段階：
ｃ）メロゾイト
スポロゾイトの他に、メロゾイトはマラリア寄生生物が細胞外にあるヒト宿主における唯一の段階である。スポロゾイトとは対照的に、数回のメロゾイト放出がマラリア感染中に起こり、それらを利用できることが多い。熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）における主要なリガンドは、ミクロネームに位置する赤血球結合抗原−１７５（ＥＢＡ−１７５）である(Sim, Toyoshima et al. 1992)。数個のメロゾイト表面タンパク質（ＭＳＰ）が同定されたことがあるが、それらのほとんどにおいてその機能はまださらなる解明が待たれる。ＭＳＰ−１と称する主要なＭＳＰの場合、役割はＲＢＣへのメロゾイト結合および侵入に関与するその後の生化学的機構にあるとみなされたことがある。このタンパク質は、後期シゾント段階における１８５〜２１０ｋＤａの前駆体として合成され、プロセシングされて分子量が異なる数種のポリペプチドを生じる。４２ｋＤａのポリペプチド（ＭＳＰ１−４２）は、メロゾイト膜に付着し続け、さらにプロセシングされて１９ｋＤａのポリペプチド（ＭＳＰ１−１９）を生じ、これが宿主細胞中に入る。ＭＳＰ−１の他に、少なくとも８つのその他のＭＳＰ：ＭＳＰ−２、ＭＳＰ−３、ＭＳＰ−４、ＭＳＰ−５、ＭＳＰ−６、ＭＳＰ−７、ＭＳＰ−８およびＭＳＰ−１０が熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）において記載された。別のメロゾイト表面関連抗原は酸性−塩基性反復抗原（ＡＢＲＡ）である。メロゾイト頂端細胞内小器官に位置するタンパク質も同定された（例えば、ロプトリータンパク質頂端膜抗原−１（ＡＭＡ−１）、ロプトリー関連タンパク質−１（ＲＡＰ−１）およびＲＡＰ−２）。
【００８７】
ｄ）感染したＲＢＣ
一旦ＲＢＣに侵入すると、寄生生物は留まるのに安全な場所を見いだしたと考えられる。最も研究された分子の１つは、リング赤血球表面抗原（ＲＥＳＡ）である。さらに、セリンが豊富なタンパク質（ＳＥＲＰまたはＳＥＲＡ）はシゾント段階で発現し、寄生体胞中に分泌される可溶性タンパク質である。ＲＢＣ膜に位置するその他のタンパク質は、赤血球膜タンパク質−１（ＥＭＰ−１）、ＥＭＰ−２およびＥＭＰ−３である。内皮においてＣＤ３６などの受容体に結合するＰｆＥＭＰ−１は、いわゆるｖａｒ遺伝子によってコードされるタンパク質のファミリーである。
【００８８】
一部の実施形態では、成分Ａはアピコンプレクサ（Apicomplexa）門の寄生生物の表面上に提示される細胞表面構造または寄生された宿主細胞上に提示される寄生生物抗原のいずれかに対して結合活性を有する。
【００８９】
有性生殖主要段階：
ｅ）胞子形成サイクル
Ｐｓ２５、Ｐｓ２８、Ｐｓ４８／４５またはＰｓ２３０などのその他のプラスモディウム（Plasmodium）タンパク質抗原は、有性に分化した寄生生物段階で発現する。これらの有性生殖段階タンパク質に対する抗体は、蚊における寄生生物の発達をブロックすることができる。
【００９０】
有利な実施形態では、熱安定性断片のそれぞれは、プラスモディウム（Plasmodium）生活環の少なくとも２つの異なる段階で発現した異なるプラスモディウム（Plasmodium）表面タンパク質由来である。
【００９１】
有利な実施形態では、熱安定性断片は、ＭＳＰ１、ＭＳＰ４、ＭＳＰ８、ＭＳＰ１０、ＰｆＲｉｐｒおよびＰｆｓ２５のＥＧＦ様ドメインを含む熱安定性断片からなる群から選択する。
【００９２】
さらに有利な実施形態では、熱安定性断片は、ＣＳＰ、ＭＴＲＡＰ、ＴＲＡＰおよびＴＲＡＭＰから選択されるＴＳＲドメインを含む熱安定性断片からなる群から選択される。
【００９３】
その他の有利な実施形態では、熱安定性断片は、Ｐｆｓ２３０、Ｐｆｓ４５／４８、ＣｅｌＴｏｓおよびＲｏｎ２、ＭＳＰ１１９およびＥＸＰ１の熱安定性断片からなる群から選択される。
【００９４】
前述したように、一部の有利な実施形態では、抗原は寄生生物、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）から得られ、抗原は前赤内期主要段階および血液主要段階において寄生生物の表面上に提示される細胞表面タンパク質から得られる。
【００９５】
別の有利な実施形態では、抗原は、寄生生物の表面上に提示される少なくとも３つの異なるタンパク質から得られる。特に、抗原は、寄生生物の少なくとも３つの異なる生活環主要段階において寄生生物の表面上に提示される少なくとも３つの異なるタンパク質から得られる。特に、寄生生物は熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）であり、異なる生活環主要段階は前赤内期段階、血液段階および有性生殖段階である。３つの抗原の例は、Ｐｆｓ２５  ＦＫＯ、ＡＭＡ１  ＧＫＯおよびＣＳＰ＿ＴＳＲ  ＧＫＯである。
【００９６】
本開示によれば、抗原は本開示のタンパク質複合体における融合タンパク質中／へのＮ末端および／またはＣ末端（例えば、イムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも１つおよびＣＬ−ドメインへのＮ末端および／またはＣ末端）に結合していてもよい。
【００９７】
前述のように、「結合した」とは、２つ以上の分子間の非共有および共有結合を意味する。結合は直接的であっても間接的であってもよい。２つの分子が、連結分子（リンカー）を介して結合しているとき、この２つの分子は間接的に結合している。２つの分子を結合する介在分子がないとき、この２つの分子は直接結合している。前述のように、融合タンパク質単位は、好ましくはペプチド結合またはジスルフィド結合を介して、直接的または間接的に互いに結合している。間接的共有結合の一例は、ペプチドリンカーなどの介在性アミノ酸配列がセグメント間に並置されて融合タンパク質を形成することである。本開示による「結合した」には、特にまた、１つのタンパク質が別のタンパク質に融合し、融合タンパク質または融合タンパク質単位を生じることを含む。したがって、好ましくは、抗原は、本開示によるＩＡタンパク質複合体の融合タンパク質単位において、イムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも１つのＮ末端および／またはＣ末端ならびにＣＬ−ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に融合している。
【００９８】
本開示の一部のさらなる実施形態では、融合タンパク質は本開示のタンパク質複合体中で互いに共有結合または非共有結合することができる。本開示によれば、「共有結合した」という用語は、原子間の電子対の共有が関与する共有結合を含む。これらの電子対は、共有対または結合対として知られており、電子を共有するときの原子間の引力および反発力の安定したバランスが共有結合として知られている。「非共有結合した」という用語は、電子の共有は関与しないが、分子間または分子内の電磁気的相互作用のより分散した変動が関与する、共有結合とは異なる非共有結合的相互作用を含む。本開示の一部の有利な実施形態では、融合タンパク質はジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
【００９９】
一部の有利な実施形態では、第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）および第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）は互いに共有結合または非共有結合しており、特に、第１および第２の融合タンパク質単位はジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
【０１００】
前述のように、一部の有利な実施形態では、本開示によるＩＡタンパク質複合体は、イムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第３の抗原を含む第３の組換え融合タンパク質単位を含み、前記第３の抗原は、前記第３の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に融合している（第２のＨＣ融合ポリペプチド単位２、ＨＣ単位２）。
【０１０１】
一部の有利な実施形態では、第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）および第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）は互いに共有結合または非共有結合しており、特に、第１および第３の融合タンパク質単位はジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
【０１０２】
別の有利な実施形態では、本開示によるＩＡタンパク質複合体は、イムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第４の抗原を含む第４の組換え融合タンパク質単位を含み、前記第４の抗原はＣＬドメインのＮ末端またはＣ末端に融合している（第２のＬＣ融合ポリペプチド単位、ＬＣ単位２）。
【０１０３】
一部の有利な実施形態では、第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）および第４の融合タンパク質単位（ＬＣ単位２）は互いに共有結合または非共有結合しており、特に、第３および第４の融合タンパク質単位はジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
【０１０４】
特に、一部の有利な実施形態はＩＡタンパク質複合体に関し、第１の融合タンパク質（ＨＣ単位１）および第２の融合タンパク質（ＬＣ単位１）は互いに結合しており、第３の融合タンパク質（ＨＣ単位２）および第４の融合タンパク質（ＬＣ単位２）は互いに結合しており、第１の融合タンパク質（ＨＣ単位１）および第３の融合タンパク質（ＨＣ単位２）は互いに結合している（例えば、図３参照）。この構築物は、抗体様タンパク質複合体と呼ばれることがある。特に、融合タンパク質単位はジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
【０１０５】
一部の実施形態では、本開示による単離されたＩＡタンパク質複合体は異なるアミノ酸配列を含む少なくとも３つの抗原を含む。
【０１０６】
有利な実施形態では、本開示による単離されたタンパク質複合体は少なくとも４つの組換え融合タンパク質を含み、
ａ）第１の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第１の抗原を含み、前記第１の抗原はＣＨ１−ドメインのＮ末端に結合しており（ＨＣ単位１）、
ｂ）第２の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第２の抗原を含み、前記第２の抗原はＣＬ−ドメインのＮ末端に融合しており（ＬＣ単位１）、前記第１および前記第２の融合タンパク質単位は、特に少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
ｃ）第３の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第３の抗原を含み、前記第３の抗原は前記融合タンパク質単位のＣＨ１−ドメインのＮ末端に融合しており（ＨＣ単位２）、前記ＨＣ単位１およびＨＣ単位２は、特に少なくとも１つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
ｄ）第４の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第４の抗原を含み、前記第４の抗原は前記第４の融合タンパク質のＣＬ−ドメインのＮ末端に融合しており（ＬＣ単位２）、前記第３および前記第４の融合タンパク質単位は、特に少なくとも１つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合している。
【０１０７】
一部の実施形態では、融合タンパク質はさらに追加的抗原を含み、前記追加的抗原は前記組換え融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に融合している（図５参照）。
【０１０８】
Ａ）ＨＣ融合ポリペプチド
前述のように、一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたＩＡタンパク質複合体は、少なくとも２つ組換え融合タンパク質を含み、第１の融合タンパク質はイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第１の抗原を含み、前記第１の抗原は、イムノグロブリン重鎖定常ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に結合／融合している（ＨＣ融合ポリペプチド単位またはＨＣ単位１）。
【０１０９】
さらに有利な実施形態では、本開示による単離されたタンパク質複合体はさらに、イムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第３の抗原を含む第３の組換え融合タンパク質を含み、前記第３の抗原は前記第３の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に融合している（ＨＣ単位２）。
【０１１０】
以下では、第１および第２のＨＣ融合ポリペプチド単位はＨＣ融合ポリペプチドと称する。
【０１１１】
典型的に、本開示による単離されたタンパク質複合体に含まれるＨＣ融合ポリペプチドは、ＩｇＧ、ＩｇＭもしくはＩｇＡ重鎖定常領域のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。特に、イムノグロブリン重鎖定常ドメインのそれぞれは、ほ乳類重鎖定常ドメイン、好ましくはヒト重鎖定常ドメインのアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。好ましくは、イムノグロブリン重鎖定常ドメインのそれぞれは、ＩｇＧ重鎖定常ドメイン、好ましくはヒトＩｇＧ、好ましくはヒトＩｇＧ１のアミノ酸またはそのバリアントを含む（例えば、配列番号３２参照）。
【０１１２】
「重鎖」または「イムノグロブリン重鎖」という語句には、任意の生物のイムノグロブリン重鎖定常領域配列が含まれる。特に指定しなければ、重鎖可変ドメインには、３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域が含まれる。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲならびにそれらの組合せが含まれる。典型的な重鎖は、可変ドメイン（Ｎ末端からＣ末端まで）に続いて、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する（Kapelski et al., Malaria Journal 2015, 14:50参照）。Ｋａｂａｔ番号付けスキームによれば、位置は、ＨＣ＿ｈＩｇＧ１についてはＥＵ／Ｋａｂａｔ番号：１２１〜４４７／１１７〜４７８で、ｈＬＣカッパについてはＥＵ／Ｋａｂａｔ番号：１１１〜２１４である。重鎖の１機能断片の例には、細胞で発現して細胞から分泌され得るエピトープを特異的に認識することができ（例えば、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫＤでエピトープを認識する）、少なくとも１個のＣＤＲを含む断片が含まれる。
【０１１３】
「イムノグロブリン重鎖定常ドメイン」という用語は、天然のイムノグロブリン重鎖領域から得られたポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片である。典型的に、イムノグロブリン重鎖定常ドメインは、イムノグロブリンのＦｃ部分を典型的に含むＦｃ受容体結合部分の一部またはその断片もしくはバリアントである。
【０１１４】
「Ｆｃ部分」という用語には、ＩｇＧのヒンジ領域で作用する酵素パパインによる制限タンパク質分解によって得られるＩｇＧ分子の断片が含まれる。この方法で得られたＦｃ部分は、ＩｇＧの重鎖ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有するペプチドに結合した、それぞれＣｙ２およびＣｙ３ドメインとも称される２つの同一のジスルフィドを含有する。２つのペプチドは、ペプチドのＮ末端部分中のシステイン残基間の２つのジスルフィド結合によって結合することができる。「Ｆｃ部分」はまた、その他の４つのイムノグロブリン種のいずれか、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥの対応する部分を含む。ＩｇＭのＦｃ部分は、２つの同一のジスルフィドで結合した、Ｃｐ２、Ｃｐ３およびＣｐ４とも称されるペプチド重鎖ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含有する。ペプチドは、Ｃｐ２およびＣｐ３ドメインの間にあるシステイン残基でジスルフィド結合されていてもよい。ＩｇＡのＦｃ部分は、２つの同一のジスルフィドで結合した、Ｃａ２およびＣａ３とも称されるペプチド重鎖ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する。ペプチドは、Ｎ末端にあるシステイン残基でＣｐ２ドメインにジスルフィド結合されている。ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡで記載したジスルフィド結合の配置は、天然のヒト抗体に関する。その他のほ乳類種の抗体ではいくつかの変動があり得るが、このような抗体は本発明の場合に適切であり得る。抗体はまた、鳥類、は虫類および両生類において発見され、それらも同様に適切であり得る。ヒトＦｃＩｇＧのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、Ellison et al. (1982) NUCLEIC AIDS RES. 10: 4071- 4079に開示されている。マウスＦｃＩｇＧ２ａのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、Bourgois et al. (1974) EUR. J. BIOCHEM. 43; 423-435に開示されている。
【０１１５】
一部の実施形態では、ＨＣ融合ポリペプチドはＦｃ受容体結合部分を含む。Ｆｃ受容体結合部分の例は、配列番号３２、配列番号７６および配列番号７７またはそれらのバリアントである。
【０１１６】
典型的に、本開示によるタンパク質複合体に含まれるＨＣ融合ポリペプチドにおいて、イムノグロブリン重鎖定常領域のそれぞれは、ＩｇＧ、ＩｇＭもしくはＩｇＡ重鎖定常領域のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。典型的に、イムノグロブリン重鎖定常領域のそれぞれは、ほ乳類重鎖定常領域、好ましくはヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。イムノグロブリン重鎖定常領域のそれぞれは、ＩｇＧ重鎖定常領域、好ましくはヒトＩｇＧのアミノ酸配列を含むことが適切である。適切なヒトＩｇＧサブタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびｌｇＧ４であるが、ＩｇＧ１またはｌｇＧ３が好ましい。
【０１１７】
本開示によれば、ＣＨ１およびＣＨ３は、本開示によるＨＣ融合ポリペプチドにおいて互いに結合することができる。本開示では、「結合した」という用語は、２つ以上の分子間の非共有および共有結合を意味する。結合は直接的であっても間接的であってもよい。２つの分子がヒンジ領域のような連結分子（リンカー）を介して結合しているとき、２つの分子は間接的に結合している。２つの分子を結合する介在分子がないとき、２つの分子は直接結合している。
【０１１８】
前述のように、本開示によるＨＣ融合ポリペプチドにおけるイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３は、好ましくはペプチド結合またはジスルフィド結合を介して、直接的または間接的に互いに結合することができる。間接的共有結合の一例は、ペプチドリンカーなどの介在性アミノ酸配列がセグメント間に並置されて融合タンパク質を形成することである。
【０１１９】
一部の実施形態では、ＣＨ１およびＣＨ３は、互いに直接結合している。その他の実施形態では、ＣＨ１およびＣＨ３は１５個のアミノ酸（ＥＵ番号Ｅ２１６〜Ｐ２３０；Ｋａｂａｔ番号Ｅ２２６〜Ｐ２４３）を含むヒトＩＧＧ１ヒンジ領域を介して互いに間接的に結合しており、一部の例では、リンカーは、２０個以下のアミノ酸、特に２から６個のアミノ酸の大きさのポリペプチドである。例えば、ＣＨ１およびＣＨ３は天然のイムノグロブリンのＣＨ１とＣＨ２ドメインの間で通常生じるイムノグロブリンのヒンジ領域によって互いに間接的に結合することができる。さらに、一部の有利な実施形態では、イムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ２は、第１の融合タンパク質におけるＣＨ１とＣＨ３の間であってもよい。しかし、一部の有利な実施形態では、第１の融合タンパク質（ＨＣ単位１）はＣＨ２ドメインおよび／または重鎖可変領域ドメイン（ＶＨ）が欠如している。
【０１２０】
その他の有利な実施形態では、本開示のタンパク質によるＨＣ融合ポリペプチドはまた、イムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ２を含む。これらの実施形態では、ＣＨ１およびＣＨ２は互いに直接結合している、またはＣＨ１およびＣＨ２は前述したヒンジ領域のようなリンカーを介して互いに間接的に結合している。例えば、ＣＨ１およびＣＨ２は天然のイムノグロブリンのＣＨ１とＣＨ２ドメインの間で生じるイムノグロブリンのヒンジ領域によって互いに間接的に結合することができる。このような適切なヒンジ領域の例は、免疫遺伝学および免疫情報学において世界的に参考にされているＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）のＩＭＧＴ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅデータベースにおいて示される。
【０１２１】
したがって、一部の実施形態では、ＨＣ融合ポリペプチドはヒンジ領域を含む。特に、ＨＣ融合ポリペプチドは、ＣＨ１−ドメインとＣＨ３−ドメインの間にヒンジ領域を含む。その他の実施形態では、ＨＣ融合ポリペプチドは、ＣＨ１−ドメインとＣＨ２−ドメインの間にヒンジ領域を含む。一部のその他の実施形態では、ＨＣ融合ポリペプチド（ＨＣ単位１および２）は、ＣＨ１−ドメインとＣＨ２−ドメインの間にイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ならびにヒンジ領域を含む。
【０１２２】
前述のように、本開示の有利な実施形態では、単離されたタンパク質複合体における第１の融合タンパク質は、イムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第１の抗原を含む。
【０１２３】
本開示によれば、第１の抗原は、第１の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に結合／融合していてもよい（ＨＣ融合ポリペプチド）。抗原は、第１の融合タンパク質のＣＨ１ドメインのＮ末端に、および／またはＣＨ３ドメインのＣ末端に直接的または間接的に結合していてもよい。一部の実施形態では、第１の抗原はＣＨ１ドメインのＮ末端に結合し、別の抗原はＣＨ３のＣ末端に結合している。その他の抗原は、同じまたは異なるポリペプチドから得ることができ、例えば、ＣＨ１ドメインのＮ末端に結合した抗原は、ＣＨ３ドメインのＣ末端に結合した抗原と同一であるまたは少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の有利な実施形態では、ＣＨ１ドメインのＮ末端に結合した抗原は、ＣＨ３ドメインのＣ末端に結合した抗原と異なるアミノ酸配列を含む。したがって、より高い可変性がタンパク質複合体にもたらされる。
【０１２４】
別の実施形態では、第３の抗原は、第３の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に結合／融合していてもよい（ＨＣ単位２）。抗原は、第１の融合タンパク質のＣＨ１ドメインのＮ末端に、および／またはＣＨ３ドメインのＣ末端に直接的または間接的に結合していてもよい。一部の実施形態では、第１の抗原はＣＨ１ドメインのＮ末端に結合し、別の抗原はＣＨ３のＣ末端に結合している。その他の抗原は、同じまたは異なるポリペプチドから得ることができ、例えば、ＣＨ１ドメインのＮ末端に結合した抗原は、ＣＨ３ドメインのＣ末端に結合した抗原と同一であるまたは少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の有利な実施形態では、ＣＨ１ドメインのＮ末端に結合した抗原は、ＣＨ３ドメインのＣ末端に結合した抗原と異なるアミノ酸配列を含む。したがって、より高い可変性がタンパク質複合体にもたらされる。特に、前記第１の融合タンパク質における第１の抗原は、ＣＨ１−ドメインのＮ末端に融合し、前記第１の融合タンパク質のさらなる抗原はＣＨ３−ドメインのＣ末端に融合している。
【０１２５】
一部の有利な実施形態では、前記第３の融合タンパク質における第３の抗原はＣＨ１−ドメインのＮ末端に融合し、前記第３の融合タンパク質のさらなる抗原はＣＨ３−ドメインのＣ末端に融合している（ＨＣ単位２）。特に、融合／結合した抗原は異なるアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
以下の表２に、ＨＣ融合ポリペプチドの例を示す。
【０１２７】
【表２−１】
2019502749.tif 000007
【０１２８】
【表２−２】
2019502749.tif 000008
【０１２９】
【表２−３】
2019502749.tif 000009
【０１３０】
【表２−４】
2019502749.tif 000010
【０１３１】
【表２−５】
2019502749.tif 000011
【０１３２】
【表２−６】
2019502749.tif 000012
【０１３３】
【表２−７】
2019502749.tif 000013
【０１３４】
以下の表３に、追加的Ｃ末端融合ポリペプチドを含むＨＣ融合ポリペプチドの例を示す。
【０１３５】
【表３−１】
2019502749.tif 000014
【０１３６】
【表３−２】
2019502749.tif 000015
【０１３７】
【表３−３】
2019502749.tif 000016
【０１３８】
【表３−４】
2019502749.tif 000017
【０１３９】
【表３−５】
2019502749.tif 000018
【０１４０】
【表３−６】
2019502749.tif 000019
【０１４１】
以下の表４に、Ｆｃヘテロ二量体化のために修飾したＣＨ３領域を有するＨＣ融合ポリペプチドの例を示す。
【０１４２】
【表４−１】
2019502749.tif 000020
【０１４３】
【表４−２】
2019502749.tif 000021
【０１４４】
【表４−３】
2019502749.tif 000022
【０１４５】
【表４−４】
2019502749.tif 000023
【０１４６】
【表４−５】
2019502749.tif 000024
【０１４７】
以下の表５に、Ｆｃヘテロ二量体化のために修飾したＣＨ３領域および追加的なＣ末端融合した（第２または第４の）マラリア抗原を有するさらなるＨＣ融合ポリペプチドの例を示す。
【０１４８】
【表５−１】
2019502749.tif 000025
【０１４９】
【表５−２】
2019502749.tif 000026
【０１５０】
【表５−３】
2019502749.tif 000027
【０１５１】
【表５−４】
2019502749.tif 000028
【０１５２】
【表５−５】
2019502749.tif 000029
【０１５３】
【表５−６】
2019502749.tif 000030
【０１５４】
【表５−７】
2019502749.tif 000031
【０１５５】
Ｂ）ＬＣ融合ポリペプチド
前述のように、一部の有利な実施形態では、本開示の単離されたＩＡタンパク質複合体は、少なくとも２つの組換え融合タンパク質単位を含み、第２の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第２の抗原を含み、前記第２の抗原はＣＬドメインのＮ末端および／またはＣ末端に結合している（ＬＣ融合ポリペプチド単位、ＬＣ単位１）。
【０１５６】
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたタンパク質複合体は、イムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第４の抗原を含む第４の組換え融合タンパク質単位を含み、前記第４の抗原はＣＬドメインのＮ末端またはＣ末端に融合している（第２のＬＣ融合ポリペプチド単位、ＬＣ単位２）。
【０１５７】
以下では、第１および第２のＬＣ融合ポリペプチド単位はＬＣ融合ポリペプチドと称する。
【０１５８】
典型的に、本開示による単離されたタンパク質複合体に含まれるＬＣ融合ポリペプチド（ＬＣ単位１および／またはＬＣ単位２）は、ＩｇＧ、ＩｇＭもしくはＩｇＡイムノグロブリン軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。特に、イムノグロブリン軽鎖定常ドメインは、ほ乳類軽鎖定常ドメイン、好ましくはヒト軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。好ましくは、イムノグロブリン軽鎖定常ドメインのそれぞれは、ＩｇＧ軽鎖定常ドメイン、好ましくはヒトカッパまたはラムダ軽鎖のアミノ酸またはそのバリアントを含む。
【０１５９】
「軽鎖」という語句には、任意の生物のイムノグロブリン軽鎖配列が含まれ、特に指定しない限り、ヒトκおよびλ軽鎖およびＶｐｒｅＢならびに代替軽鎖が含まれる。特に指定しなければ、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインには典型的に、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が含まれる。
【０１６０】
一般的に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含むＶＬドメインおよびカッパまたはラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインが含まれる。軽鎖には、例えば、エピトープ結合タンパク質が選択的に結合して出現する第１および第２のエピトープのいずれにも選択的に結合しない軽鎖が含まれる。軽鎖にはまた、エピトープ結合タンパク質が選択的に結合して出現する１つまたは複数のエピトープに結合して認識し、重鎖がそれらに結合し認識するのを援助する軽鎖が含まれる。
【０１６１】
「イムノグロブリン軽鎖定常ドメイン」という用語は、イムノグロブリンカッパ遺伝子座（ＩＧＫ＠）によってコードされるカッパ（κ）鎖またはイムノグロブリンラムダ遺伝子座（ＩＧＬ＠）によってコードされるラムダ（λ）鎖のような天然のイムノグロブリン軽鎖から得られるポリペプチドまたはそれらのバリアントもしくは断片である（例えば、Kapelski et al., Malaria Journal 2015, 14:50参照）。Ｋａｂａｔ番号付けスキームによれば、位置は、ｈＬＣカッパ：ＥＵ／Ｋａｂａｔ番号：１１１〜２１４である。抗体定常領域の例は、免疫遺伝学および免疫情報学において世界的に参考にされているＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）のＩＭＧＴ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅデータベースにおいて示される。
【０１６２】
一部の有利な実施形態では、第２の融合タンパク質はＶＬドメインを有さないイムノグロブリン軽鎖配列から得られたイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬを含む。
【０１６３】
一部の有利な実施形態では、ＣＬ−ドメインはヒトカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖、特に、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＬ−ドメインである。
【０１６４】
典型的に、ＬＣ融合ポリペプチド（ＬＣ融合ポリペプチドおよび／または第２のＬＣ融合ポリペプチド）は、ＩｇＧ、ＩｇＭもしくはＩｇＡ軽鎖定常領域のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。典型的に、イムノグロブリン軽鎖定常領域のそれぞれは、ほ乳類軽鎖定常領域、好ましくはヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。イムノグロブリン軽鎖定常領域は、ＩｇＧ軽鎖定常領域、好ましくはヒトＩｇＧのアミノ酸配列を含むことが適切である。適切なヒトＩｇＧサブタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびｌｇＧ４であるが、ＩｇＧ１またはｌｇＧ３が好ましい。
【０１６５】
本開示によれば、抗原は、第２の融合タンパク質のイムノグロブリン軽鎖定常ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に融合していてもよい（ＬＣ融合単位１）。抗原は、ＣＬのＮ末端および／またはＣ末端に直接的または間接的に結合していてもよい。一部の実施形態では、第２の抗原はＣＬのＮ末端に結合し、別の抗原はＣＬのＣ末端に結合している。その他の抗原は、同じまたは異なるポリペプチドから得ることができ、例えば、ＣＬのＮ末端に結合した抗原は、ＣＬのＣ末端に結合した抗原と同一であるまたは少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の有利な実施形態では、ＣＬのＮ末端に結合した抗原は、ＣＬのＣ末端に結合した抗原と異なるアミノ酸配列を含む。したがって、より高い可変性がタンパク質複合体にもたらされる。
【０１６６】
以下の表６に、ＨＣ融合ポリペプチドの例を示す。
【０１６７】
【表６−１】
2019502749.tif 000032
【０１６８】
【表６−２】
2019502749.tif 000033
【０１６９】
【表６−３】
2019502749.tif 000034
【０１７０】
【表６−４】
2019502749.tif 000035
【０１７１】
本開示によるＩＡタンパク質複合体の実施形態
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたイムノアセンブリン（ＩＡ）タンパク質複合体は、少なくとも２つの組換え融合タンパク質単位を含み、マラリアワクチンとして適切であり、
ａ）第１の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインＣＨ１およびＣＨ３ならびに第１の抗原を含み、前記第１の抗原はイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも１つのＮ末端および／またはＣ末端に結合しており（ＨＣ融合ポリペプチド単位１、ＨＣ単位１）、
ｂ）第２の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインＣＬおよび第２の抗原を含み、前記第２の抗原はＣＬ−ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に結合しており（ＬＣ融合ポリペプチド単位１、ＬＣ単位１）、
ｃ）前記第１および前記第２の抗原は異なるアミノ酸配列を含み、抗原はＰｆｓ２５ＦＫＯ、ＡＭＡ１ＧＫＯおよびＣＳＰ＿ＴＳＲＧＫＯである。
【０１７２】
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたイムノアセンブリン（ＩＡ）タンパク質複合体は、抗原ＡＭＡ１ＧＫＯおよびＣＳＰ＿ＴＳＲＧＫＯを含むＨＣ単位１を含み、ＡＭＡ１ＧＫＯはＣＨ１−ドメインにＮ末端融合しており、ＣＳＰ＿ＴＳＲＧＫＯはＣＨ３−ドメインにＣ末端融合しており、前記第２の融合タンパク質は抗原Ｐｆｓ２５ＦＫＯを含み、Ｐｆｓ２５ＦＫＯはＣＬ−ドメインにＮ末端融合している。
【０１７３】
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたイムノアセンブリン（ＩＡ）タンパク質複合体は、
ａ）配列番号３３から配列番号５２、配列番号６７から配列番号７５および配列番号７８から配列番号１０４の群から選択されるアミノ酸配列を有する第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）、および
ｂ）配列番号５１から配列番号６６の群から選択されるアミノ酸配列を有する第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）を含む。
【０１７４】
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたイムノアセンブリン（ＩＡ）タンパク質複合体は、
ａ）第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）：配列番号９７
ｂ）第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）：配列番号５３
のアミノ酸配列を有する２つの組換え融合タンパク質を含む。
【０１７５】
一部のさらに有利な実施形態では、本開示による単離されたイムノアセンブリン（ＩＡ）タンパク質複合体はＦＣ−受容体結合部分を含み、第１の融合タンパク質単位に含まれるＦｃ受容体結合部分は、配列番号３２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、
ａ）配列番号３２と比較して少なくとも２つの置換を有し、前記置換が配列番号３２のＧｌｕ３５６およびＡｓｐ３９９の位置で生じており、
ｂ）Ｇｌｕ３５６およびＡｓｐ３９９の位置のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換されており、
ｃ）第３の融合タンパク質に含まれるＦｃ受容体結合部分は、配列番号３２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、
ｄ）配列番号３２と比較して少なくとも２つの置換を有し、前記置換が配列番号３２のＬｙｓ３９２およびＬｙｓ４０９の位置で生じており、
ｅ）Ｌｙｓ３９２およびＬｙｓ４０９の位置のアミノ酸が負電荷アミノ酸で置換されている。
【０１７６】
一部の有利な実施形態では、第１および／または第３の融合タンパク質単位に含まれるＦｃ受容体結合部分は、配列番号７６または配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
【０１７７】
一部のさらに有利な実施形態では、本開示による単離されたＩＡタンパク質複合体は、
ａ）抗原ＡＭＡ１ＧＫＯおよびＣＳＰ＿ＴＳＲＧＫＯを含む第１の融合タンパク質単位(ＨＣ単位１)であって、ＡＭＡ１ＧＫＯはＣＨ１−ドメインにＮ末端融合しており、ＣＳＰ＿ＴＳＲＧＫＯはＣＨ３−ドメインにＣ末端融合しており、第１の融合タンパク質単位に含まれるＦｃ受容体結合部分が、配列番号３２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、配列番号３２と比較して少なくとも２つの置換を有し、前記置換が配列番号３２のＧｌｕ３５６およびＡｓｐ３９９の位置で生じており、Ｇｌｕ３５６およびＡｓｐ３９９の位置のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換されている第１の融合タンパク質単位、
ｂ）抗原Ｐｆｓ２５ＦＫＯを含む第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）であって、Ｐｆｓ２５ＦＫＯはＣＬ−ドメインにＮ末端融合している第２の融合タンパク質単位、
ｃ）ＣＨ１−ドメインにＮ末端融合した抗原Ｒｈ２ＧＫＯを含む第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）であって、第１の融合タンパク質単位に含まれるＦｃ受容体結合部分は、配列番号３２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、配列番号３２と比較して少なくとも２つの置換を有し、前記置換が配列番号３２のＬｙｓ３９２およびＬｙｓ４０９の位置で生じている第３の融合タンパク質単位
を含む。
【０１７８】
一部のさらに有利な実施形態では、本開示による単離されたＩＡタンパク質複合体は、
ａ）配列番号３３から配列番号５２、配列番号６７から配列番号７５および配列番号７８から配列番号１０４の群から選択されるアミノ酸配列を有する第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）、および
ｂ）配列番号５１から配列番号６６の群から選択されるアミノ酸を有する第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）、および
ｃ）配列番号３３から配列番号５２、配列番号６７から配列番号７５および配列番号７８から配列番号１０４の群から選択されるアミノ酸配列を有する第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２２）を含む。
【０１７９】
一部のさらなる有利な実施形態では、本開示による単離されたＩＡタンパク質複合体は、
ａ）第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）：配列番号９７
ｂ）第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）：配列番号５３
ｃ）第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）：配列番号８８を含む。
【０１８０】
一部のさらに有利な実施形態では、本開示による単離されたＩＡタンパク質複合体は第４の融合タンパク質単位を含み、第４のタンパク質単位（ＬＣ単位２）は抗原Ｐｆｓ２５ＦＫＯを含む第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）と同一で、Ｐｆｓ２５ＦＫＯは第４の融合タンパク質単位のＣＬ−ドメインにＮ末端融合している。
【０１８１】
一部のさらに有利な実施形態では、本開示による単離されたＩＡタンパク質複合体は、
ａ）配列番号３３から配列番号５２、配列番号６７から配列番号７５および配列番号７８から配列番号１０４の群から選択されるアミノ酸配列を有する第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）、および
ｂ）配列番号５１から配列番号６６の群から選択されるアミノ酸を有する第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）、および
ｃ）配列番号３３から配列番号５２、配列番号６７から配列番号７５および配列番号７８から配列番号１０４の群から選択されるアミノ酸配列を有する第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）、および
ｄ）配列番号５１から配列番号６６の群から選択されるアミノ酸配列を有する第４の融合タンパク質単位（ＬＣ単位２）を含む。
【０１８２】
一部のさらに有利な実施形態では、本開示による単離されたＩＡタンパク質複合体は、
ａ）第１の融合タンパク質単位（ＨＣ単位１）：配列番号９７、および
ｂ）第２の融合タンパク質単位（ＬＣ単位１）：配列番号５３、および
ｃ）第３の融合タンパク質単位（ＨＣ単位２）：配列番号８８、配列番号９９または配列番号１００、および
ｄ）第４の融合タンパク質単位（ＬＣ単位２）：配列番号５３を含む。
【０１８３】
さらに、本開示は、ＩＡタンパク質複合体をコードする核酸分子もしくは核酸またはその一部、特に、本開示による前記組換え融合タンパク質単位および核酸分子を含むベクターおよび前記組換え融合タンパク質単位をコードする核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。本開示はまた、組換え発現系における前記ＩＡタンパク質複合体および／または融合タンパク質単位の製造方法に関する。
【０１８４】
したがって、本開示は本開示による１つまたは複数の融合タンパク質単位をコードするコーディング部分を含む核酸分子および前記ヌクレオチド分子のうちの少なくとも１つを含む発現ベクターおよび前記ベクターのうちの少なくとも１つまたは前記核酸分子のうちの少なくとも１つを含む宿主細胞に関する。特に、前記宿主細胞は、本開示による単離されたＩＡタンパク質複合体に含まれる融合タンパク質単位をコードする少なくとも１つまたは好ましくは全部の核酸分子を含む。
【０１８５】
組換え発現系において本開示による融合タンパク質（融合タンパク質単位）を発現するために、遺伝子が動作可能に転写および翻訳コントロール配列に結合するように、融合タンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部を発現ベクターに挿入することができる。この文脈では、「動作可能に結合した」という用語は、ベクター内の転写および翻訳コントロール配列がタンパク質遺伝子の転写および翻訳を調節する目的の機能を果たすように、タンパク質遺伝子がベクターに連結されることを意味する。発現ベクターおよび発現コントロール配列は、使用した発現宿主細胞と適合するように選択する。単離されたタンパク質ドメイン配列は典型的に、同じ発現ベクターに挿入する。タンパク質遺伝子は、標準的方法によって発現ベクターに挿入する。さらに、組換え発現ベクターは、新生ポリペプチド鎖の小胞体（ＥＲ）への同時翻訳的転位を容易するシグナルペプチドをコードすることができる。折り畳まれたポリペプチド（本開示による組換え融合タンパク質）は宿主細胞から分泌されてもよい、または宿主細胞内に保持されていてもよい。細胞内での保持またはターゲッティングは、ＥＲ検索のためのＣ末端ＫＤＥＬタグなどの適当なターゲッティングペプチドの使用によって達成することができる。
【０１８６】
一般的に、当業者であればおそらく、ベクターを構築し、組換え遺伝子発現のための方法を設計することができる（Sambrook, Maniatis et al. 1989,またはこの文献の後著、Ausubel 1992）。
【０１８７】
「ベクター」という用語は、それが結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子を含む。ベクターの１種は「プラスミド」で、これは追加的ＤＮＡセグメントを連結することができる環状２本鎖ＤＮＡループを意味する。ベクターの別の種類はウイルスベクターで、追加的ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソームほ乳類ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソームほ乳類ベクター）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能で、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、動作可能に結合した遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現システム」または「組換え発現ベクター」（または、単に「発現ベクター」）と称する。一般的に、組換えＤＮＡ技術において実用的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態なので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は同義に使用することができる。しかし、本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターのこのようなその他の形態を含むものとする。
【０１８８】
本開示はまた、本開示による組換え融合タンパク質を含むベクターを有する宿主細胞を対象とする。「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という語句は、組換え発現ベクターが導入された細胞を含む。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も意味するものと理解されたい。ある種の変更は、変異または環境の影響のいずれかによって後世代で生じる可能性があるので、そのような後代は、実際には、親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書では「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。
【０１８９】
宿主細胞は単一の宿主細胞の後代を含み、後代は天然の、偶発的または計画的な突然変異および／または変化により、元の親細胞と必ずしも完全に同一でない場合もある（形態において、または全ＤＮＡ相補性において）。宿主細胞には、本開示の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いて、インビボまたはインビトロにおいてトランスフェクトされた、または感染した細胞が含まれる。本開示の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれることもある。
【０１９０】
「宿主細胞（複数可）」という用語は、本開示による組換えタンパク質を精製する方法において使用することができる細胞（複数可）を意味する。このような宿主細胞は目的のタンパク質（ＰＯＩ）を有する。宿主細胞はまた、タンパク質発現細胞と呼ばれることがある。本発明による宿主細胞は、限定はしないが、原核細胞、真核細胞、古細菌、細菌細胞、昆虫細胞、酵母、哺乳細胞および／または植物細胞であってもよい。宿主細胞として想定される細菌は、グラム陰性またはグラム陽性のいずれか、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、エルウィニア（Erwinia）種、クレブジエラ（Klebsellia）種、ラクトバチルス（Lactobacillus）種、枯草菌（Bacillus subtilis）またはシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）であってもよい。典型的な酵母宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）からなる群から選択される。一部の有利な実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞などのＨＥＫ２９３細胞である。
【０１９１】
原核細胞（細菌）および真核細胞発現系（酵母、バキュロウイルス、植物、ほ乳類およびその他の動物細胞、トランスジェニック動物ならびにハイブリドーマ細胞など）、ならびにファージディスプレイ発現系を含む多種多様な宿主発現系は、ＩＡタンパク質複合体に含まれるＩＡタンパク質複合体または融合タンパク質単位を発現するために使用することができる。適切な細菌発現ベクターの一例はｐＵＣｌ１９（Ｓｆｉ）であり、適切な真核細胞発現ベクターは弱めたＤＨＦＲ選択系を有する修飾されたｐｃＤＮＡ３．１ベクターである。適切な真核細胞発現ベクターの別の例は、ゼオシン耐性およびＩＲＥＳ部位を有するように修飾されたｐＭＳベクターである（Stocker et al. 2003）。適切な発現ベクターの別の例は、改善されたＣＭＶ発現カセットおよびＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞における複製を増強するためのｏｒｉＰ部位を有するｐＴＴベクター系である（Durocher et al. 2002）。植物発現ベクターの一例は、アグロバクテリウムにエレクトロポレーションした後タバコ植物に浸潤するｐＴＲＡｋｔである（Boes et al. 2011）。その他の抗体または抗体様発現系も当技術分野では知られており、本明細書で検討する。
【０１９２】
さらに、ＥＢＶ形質転換ヒトリンパ芽球様Ｂ細胞株は、発現系として使用することができ、あるいは、抗体またはそれらの結合部分は、例えば、大腸菌（E. coli）抽出物から得られた無細胞タンパク質合成系において発現することができる。
【０１９３】
有利な実施形態では、宿主細胞はベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）植物細胞、タバコ（Nicotiana tabacum）植物細胞またはそれらのＢＹ２細胞であり、ほ乳類ならば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯまたは２９３細胞が好ましく、酵母ならば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）が好ましい。
【０１９４】
本開示によって使用するための植物には、被子植物（Angiosperms）、コケ植物（Bryophytes）（例えば、ゼニゴケ類（Hepaticae）、スギゴケ類（Musci）など）、シダ植物（Ptepdophytes）（例えば、シダ類（ferns）、ツクシ（horsetails）、ヒゲノカズラ（lycopods））、裸子植物（Gymnosperms）（例えば、針葉樹（conifers）、サイカセ（cycase）、銀杏（Ginko）、グネツム目（Gnetales））および藻類(Algae)（例えば、緑藻類（Chlorophyceae）、褐藻類（Phaeophyceae）、紅藻類（Rhodophyceae）、藍藻類（Myxophyceae）、黄緑藻類（Xanthophyceae）およびユーグレナ藻類（Euglenophyceae））が含まれる。例となる植物は、マメ科（Leguminosae）（マメ科（Fabaceae）、例えば、エンドウマメ、アルファルファ、ダイズ）、イネ科（Gramineae）（イネ科（Poaceae）、例えばトウモロコシ、コムギ、ニー）、ナス科（Solanaceae）、特にトマト属（Lycopersicon）（例えば、トマト）、ナス属（Solarium）（例えば、ジャガイモ、ナス）、トウガラシ属（Capsium）（例えば、コショウ）またはタバコ属（Nicotiana）（例えば、タバコ）、セリ科（Umbelhferae）、特にニンジン属（Daucus）（例えば、ニンジン）、オランダミツバ属（Apium）（例えば、セロリ）、またはミカン科（Rutaceae）（例えば、オレンジ）、キク科（Compositae）、特に、アキノノゲシ属（Lactuca）（例えば、レタス）、アブラナ科（Brassicaceae）（アブラナ科（Cruciferae））、特に、ブラシカ属（Brassica）またはシロガラシ属（Sinapis）のメンバーである。ある種の態様では、本発明による植物は、アブラナ属（Brassica）またはシロイヌナズナ属（Arabidopsis）の種であってもよい。いくつかの例となるアブラナ科（Brassicaceae）のメンバーには、ブラシカ・カンペストンス（Brassica campestns）、カンナタ（B cannata）、カラシナ（B juncea）、アブラナ（B napus）、クロガラシ（B nigra）、オレラセアエ（B oleraceae）、トウニフォルツ（B tournifortu）、シロガラシ（Sinapis alba）およびダイコン（Raphanus sativus）が含まれる。形質転換を受け入れることができ、発芽実生として食用できるいくつかの適切な植物には、アルファルファ、リョクトウ、ラディッシュ、コムギ、マスタード、ホウレンソウ、ニンジン、ビート、タマネギ、ニンニク、セロリ、ダイオウ、キャベツまたはレタスなどの葉物植物、オランダカラシまたはクレス、パセリ、ミントまたはクローバーなどのハーブ、カリフラワー、ブロッコリー、ダイズ、レンティル、ヒマワリなど食用花などが含まれる。
【０１９５】
有利な実施形態では、宿主細胞はベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、タバコ（Nicotiana tabacum）もしくはタバコＢＹ２細胞株から得られる、またはオオムギ（Hordeum vulgare Ｌ．）、トウモロコシ（Zea mays）またはコムギ（Triticum）種から得られる。
【０１９６】
したがって、有利な実施形態では、発現ベクターは公知の技術に従って植物に送達することができる。例えば、ベクター自体を植物に直接適用することができる（例えば、こすりつけ接種、機械化した噴霧接種、真空浸潤、微粒子銃またはエレクトロポレーションによって）。あるいは、またはさらに、ウイルス粒子を調製することができ（例えば、すでに感染した植物から）、公知の技術に従ってその他の植物に適用することができる。様々な植物種に感染する多種多様なウイルスが公知であり、本開示によるポリヌクレオチド発現のために使用することができる(例えば、いずれも参考として本明細書に組み込んだ、Classification and Nomenclature of Viruses, "Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses" (Ed Murphy et al), Springer Verlag New York, 1995, Grierson et al, Plant Molecular Biology, Blackie, London, pp 126-146, 1984, Gluzman er al, Communications in Molecular Biology Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sppng Harbor, NY, pp 172-189, 1988,およびMathew, Plant Viruses Online参照）。ある種の実施形態では、単一ウイルスベクターを植物細胞に送達するよりも、一緒になるとウイルスベクター（複数可）の複製（場合によって、細胞から細胞および／または長距離移動）を可能にする多数の異なるベクターを送達する。タンパク質の一部または全ては、トランスジェニック植物のゲノムによってコードすることができる。本明細書でさらに詳細に記載するある種の態様では、これらの系は１つまたは複数のウイルスベクター成分を含む。
【０１９７】
本開示はまた、本開示によるＩＡタンパク質複合体および薬学的に許容される担体および／またはアジュバントを含むワクチン組成物（ヒトおよび／または動物ワクチン)に関する。有利な実施形態では、本開示によるＩＡタンパク質複合体および／または組成物は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）および／または卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）を含むプラスモディウム（Plasmodium）属の寄生生物に対するヒトおよび／または動物ワクチンとして適切である。有利な実施形態では、寄生生物は熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）である。
【０１９８】
本開示はまた、本開示によるＩＡタンパク質複合体を含むワクチン組成物に関する。このようなワクチン組成物の最適な性能を確実にするために、免疫学的および薬学的に許容される担体、ビヒクルまたはアジュバントを含むことが好ましい。ワクチン組成物および担体は、生理学的に許容される媒体に入れることが好ましい。
【０１９９】
「ワクチン」は、対象に投与したとき、免疫応答を誘導する製剤を含む物質の組成物である。ワクチンはポリヌクレオチド分子、ポリペプチド分子および炭水化物分子ならびに糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、２つ以上のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの融合物などのそれぞれの誘導体および組合せ物を含むことができる。当業者には容易に理解されるように、ワクチンはさらに、希釈剤、アジュバント、担体またはそれらの組合せを含むことができる。例えば、Ｆｃ受容体部分、サイトカインまたはインターロイキン、トール様受容体リガンドと融合または結合して導入したために、本開示によるＩＡタンパク質複合体自体はアジュバント特性を示して提供する。一実施形態では、したがって、本開示のワクチン組成物はさらにアジュバントを含まない。
【０２００】
本開示のＩＡタンパク質複合体が動物によって認識される効果的なワクチンは、動物モデルにおいて、ワクチン接種していない動物と比較して、血液および／または標的器官での寄生生物負荷を低減し、例えば、マラリア寄生生物に曝露した後の生存時間を延長し、および／または体重減少を軽減することができる。
【０２０１】
さらに、本開示の融合タンパク質単位は、炭水化物または脂質部分、例えば、担体に連結する、またはその他の方法で修飾、例えばアセチル化することができる。
【０２０２】
適切な担体は、ポリペプチド（複数可）が疎水性非共有結合的相互作用によって結合しているプラスチック、例えば、ポリスチレンなどのポリマー、またはポリペプチド（複数可）が共有結合している多糖もしくはポリペプチド、例えば、ウシ血清アルブミン、オボアルブミンもしくはキーホールリンペットヘマトシアニンなどのポリマーからなる群から選択される。適切なビヒクルは、希釈剤および懸濁剤からなる群から選択される。アジュバントは、好ましくは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、Ｑｕｉｌ  Ａ、ポリＩ：Ｃ、水酸化アルミニウム、フロイントの不完全アジュバント、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、トレハロースジベヘナートおよびムラミルジペプチド（ＭＤＰ）からなる群から選択される。
【０２０３】
活性成分としてペプチド配列を含有するワクチンの調製は、全てを参考として本明細書に組み込んだ、米国特許第４６０８２５１号明細書、第４６０１９０３号明細書、第４５９９２３１号明細書および第４５９９２３０号明細書によって例示されるように、一般的に当技術分野で十分に理解されている。
【０２０４】
ワクチンのアジュバント効果を達成するその他の方法には、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム（ミョウバン）などの薬剤の使用、糖の合成ポリマー（カーボポール）、熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集、アルブミンに対するペプシン処理された（Ｆａｂ）抗体による再活性化による凝集、Ｃ．パルバム（parvum）などの細菌細胞またはグラム陰性菌の内毒素もしくはリポ多糖類成分との混合が含まれ、モノオレイン酸マンニド（Ａｒａｃｅｌ  Ａ）などの生理学的に許容されるオイルビヒクル中のエマルジョンまたはブロック代用物として使用されるパーフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０％溶液を有するエマルジョンも使用することができる。その他の可能性には、上記のアジュバントと組み合わせたサイトカインまたはポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−ガンマ誘導因子などの免疫調節物質の使用が含まれる。
【０２０５】
アジュバント効果を達成するための別の可能性は、Gosselin et al, 1992に記載された技術を使用することである。簡単に説明すると、本発明の抗原などの関連抗原は、単球／マクロファージ上のＦｃ受容体に対する抗体（または抗原結合抗体断片）とコンジュゲートすることができる。
【０２０６】
ワクチンは、投薬製剤と適合する方法で、治療上有効となり免疫原性となるような量で投与する。投与する量は、例えば、免疫応答を開始する個体の免疫系の能力および所望する防御の程度を含む、治療対象によって左右される。適切な投薬量範囲は、ワクチン接種当たり数百マイクログラム程度の活性成分、好ましくは約０．１マイクロｇから１０００マイクロｇの範囲、例えば、約１マイクロｇから３００マイクロｇの範囲、特に、約１０マイクロｇから５０マイクロｇの範囲である。最初の投与および追加投与のための適切な投与計画も可変性であるが、最初の投与と、それに続くその後の接種またはその他の投与が典型的である。適用の方法は大きく変化し得る。従来のワクチン投与法のいずれも適用可能である。これらは、固体の生理学的に許容される基剤での、または生理学的に許容される分散物中での経口適用、注射などによる非経口的投与を含むと考えられている。ワクチンの投薬量は投与経路に左右され、ワクチン接種するヒトの年齢、程度は少ないがワクチン接種するヒトの大きさに応じて変化する。
【０２０７】
ワクチンは、注射、例えば皮下注射または筋肉内注射のいずれかによって、従来通り非経口的に投与する。その他の投与様式に適切なさらなる製剤には、坐剤、場合によっては、経口製剤が含まれる。坐剤について、伝統的な結合剤および担体には、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドを含めることができ、このような坐剤は、０．５パーセントから１０パーセント、好ましくは１〜２パーセントの範囲の活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤には、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤または散剤の形態をとり、有利には１０〜９５パーセント、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含有する。
【０２０８】
多くの場合、ワクチンの多回投与が必要であろう。特に、ワクチンはマラリアの感染を防ぐために、および／または確定したマラリア感染を治療するために投与することができる。感染を防ぐために投与する場合、ワクチンは感染の決定的な臨床徴候または症状が存在する前に、予防的に投与する。
【０２０９】
「薬学的に許容される担体」という用語には、当業者には公知なように、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、矯臭剤、色素、このような物質およびそれらの組合せが含まれる。
【０２１０】
薬学的に許容される担体は、好ましくは、ヒトへの投与のために処方されるが、ある種の実施形態では、イヌなどの非ヒト動物への投与のために処方されるがヒトへの投与には許容されない（例えば、政府規制のため）薬学的に許容される担体を使用することが望ましいことがある。いかなる従来の担体も、活性成分と適合しない場合を除いて、治療または医薬組成物におけるその使用を検討する。
【０２１１】
対象に投与する本開示の組成物の実際の投薬量は、体重、状態の重症度、治療する疾患の種類、これまでのまたは同時に行っている治療的介入、患者の特発性疾患および投与経路などの物理的および生理学的要素によって決定することができる。投与に責任のある医師が、いかなる事象においても、組成物中の活性成分（複数可）の濃度および個々の対象に適当な用量（複数可）を決定するものとする。
【０２１２】
有利な実施形態では、本開示による融合タンパク質は、マラリア、特に熱帯熱マラリアを予防または治療するための医薬品を調製するために使用する。
【０２１３】
本開示はまた、
ａ）本開示による宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップであって、宿主細胞が、本開示による単離されたタンパク質複合体の融合タンパク質単位をコードする全核酸分子を含み、前記ＩＡタンパク質複合体が宿主細胞によって形成されるステップ、
ｂ）前記タンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
ｃ）前記タンパク質複合体を処理するステップ
を含む、本開示によるＩＡタンパク質複合体を生成する方法に関する。
【０２１４】
別の実施形態では、本開示は、
（ａ）本開示による複数の宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップ、
（ｂ）前記生成した融合タンパク質を単離するステップ、
（ｃ）前記タンパク質複合体を生成するために前記融合タンパク質を混合するステップ、
（ｄ）前記生成したタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
（ｅ）タンパク質複合体を処理するステップ
を含む、本開示によるタンパク質複合体を生成する方法に関する。
【０２１５】
一部の有利な実施形態では、異なる抗原を含む複数の異なるＨＣおよびＬＣ融合ポリペプチドを生成し、好ましくは、病原体の少なくとも２つまたは３つの異なる生活環主要段階において、好ましくは病原体の表面上に提示される、異なるタンパク質から得られる複数の異なる抗原を含むヘテロ多量体ＩＡタンパク質複合体を得るために生成したＨＣおよびＬＣ融合ポリペプチドを混合した。
【０２１６】
上記で論じたように、本開示によれば、組換えタンパク質単位および／またはＩＡタンパク質複合体全体は任意の所望する系において生成することができる。ベクター構築物および発現系は当技術分野では周知であり、本明細書において提供した組換え融合ポリペプチドの使用を組み入れるために適応させることができる。例えば、トランスジェニック植物作出は公知であり、構築物の作製および植物作出は当技術分野で公知の技術に従って適応させることができる。一部の実施形態では、植物における一時的な発現系が望ましい（国際特許出願番号第１００３７０６３Ａ２号参照）。
【０２１７】
一般的に、組換えポリペプチドの生成のために、本開示による植物、植物細胞および／または植物組織（例えば、クローン植物、クローン植物細胞、クローン根、クローン根株、スプラウト、発芽実生、植物など）を培養または増殖させるために、当技術分野で公知の標準法を使用することができる。毛根細胞、根細胞株および植物細胞を培養するために、多種多様な培養培地およびバイオリアクターが使用されたことがある（例えば、Rao et al, 2002, Biotechnol Adv, 20 101参照）。
【０２１８】
ある種の実施形態では、本明細書による組換えポリペプチドは任意の公知の方法によって生成することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は植物またはその一部において発現する。タンパク質は、当技術分野で公知の従来の条件および技術に従って単離および精製することができる。これらには、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの方法が含まれる。本発明は、当技術分野で公知であり、本明細書において提供する多種多様な植物発現系のいずれかを使用する、組換えポリペプチド（複数可）の生成物の精製および手頃な規模拡大を含む。
【０２１９】
本開示の一部の実施形態では、ワクチン生成物のために組換えポリペプチド（複数可）を単離することが望まれるだろう。本開示によるタンパク質を、それらを発現する植物組織（複数可）またはその一部、例えば、根、根細胞、植物、植物細胞から生成する場合は、植物材料からの部分的または完全な単離のいずれかのために、当技術分野で公知の方法を使用することができる。発現生成物を発現する植物細胞または組織の一部、または全部から発現生成物を単離することが望ましい場合は、任意の利用可能な精製技術を使用することができる。当業者は、幅広い分画および分離手順に精通している（例えば、それぞれ本明細書に参考として組み込んだ、Scopes et al, Protein Purification Principles and Practice, 3 rd Ed, Janson et al, 1993, Protein Purification Principles High Resolution Methods, and Applications, Wiley- VCH, 1998, Springer-Verlag, NY, 1993, and Roe, Protein Purification Techniques, Oxford University Press, 2001参照）。当業者ならば、所望の組換え融合ポリペプチド（複数可）生成物（複数可）を得る方法が抽出によることを理解するだろう。植物材料（例えば、根、葉など）は、残りのバイオマスから所望の生成物を取り出すために抽出し、それによって生成物の濃度および純度を高めることができる。植物は緩衝溶液中で抽出することができる。例えば、植物材料は、例えば、リン酸緩衝液で緩衝されたある量の氷冷水中に、重量で１対１の割合で移すことができる。必要に応じて、プロテアーゼ阻害剤を添加することができる。植物材料は、緩衝溶液中に懸濁しながら激しく混ぜるかまたはすりつぶすことによって破壊し、濾過または遠心分離によって取り出したバイオマスを抽出することができる。溶液中に得られた生成物は、追加ステップによってさらに精製する、または凍結乾燥もしくは沈殿によって乾燥粉末に変換することができる。抽出物は圧搾することによって得ることができる。植物または根は、プレス機での圧搾によって、または密接した間隔のローラーを通すときに潰すことによって抽出することができる。潰した植物または根から得られた流体を集め、当技術分野で周知の方法に従って処理する。圧搾による抽出によって、より濃縮された形態での生成物の放出が可能となる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、限定はしないが、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑカラム）または限外濾過を含むクロマトグラフィー法によってさらに精製することができる。Ｈｉｓタグを含有するポリペプチドは、標準法によってニッケル交換クロマトグラフィーを使用して精製することができる。一部の実施形態では、生成したタンパク質またはポリペプチドは植物組織から単離されず、むしろ生きた植物（例えば、発芽実生）の状態で供給される。一部の実施形態では、植物が食用である場合、発現したタンパク質またはポリペプチドを含有する植物組織は消費のために直接に供給される。したがって、本開示は、発現したタンパク質またはポリペプチドを含有する食用の若い植物バイオマス（例えば、食用発芽実生）を提供する。
【０２２０】
ほ乳類細胞には、リポフェクションなどの任意の適切な技術によってトランスフェクトすることができる。あるいは、当業者によく理解されている標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションまたはエレクトロポレーションを使用することができる。これらの発現系から生成した組換え抗体および本開示の核酸分子は、好ましくは実質的に純粋かまたは均一な形態で提供される。
【０２２１】
組換え抗体は、任意の適切な方法、選択したｍＡＢまたはプロテインＡセファロースを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。場合によって、この後、例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用したゲル濾過ステップを行ってもよい。
【０２２２】
本開示による抗体様組換え融合タンパク質複合体または抗体様組換え融合タンパク質単位を発現するために、前述した通りに得られたイムノグロブリン軽鎖定常ドメインおよび／またはイムノグロブリン重鎖定常ドメインをコードするＤＮＡは、その遺伝子が転写および翻訳コントロール配列に動作可能に結合するように、発現ベクターに挿入することができる。この文脈では、「動作可能に結合した」という用語は、ベクター内の転写および翻訳コントロール配列がイムノグロブリン遺伝子の転写および翻訳を調節する目的の機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターに連結することを意味する。発現ベクターおよび発現コントロール配列は、使用した発現宿主細胞と適合するように選択する。イムノグロブリン軽鎖定常ドメイン遺伝子および／またはイムノグロブリン重鎖定常ドメイン遺伝子は、別々のベクターに挿入する、あるいは、より典型的には、両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入する。イムノグロブリン遺伝子は、標準的方法によって発現ベクターに挿入する。さらに、組換え発現ベクターは、イムノグロブリン軽鎖定常ドメインおよび／またはイムノグロブリン重鎖定常ドメインの宿主細胞からの分泌を容易するシグナルペプチドをコードすることができる。イムノグロブリン軽鎖定常ドメインおよび／またはイムノグロブリン重鎖定常ドメイン遺伝子は、シグナルペプチドがイムノグロブリン鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで動作可能に結合するように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドであってもよい。
【０２２３】
抗体重鎖および／または軽鎖遺伝子（複数可）に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子（複数可）の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」という用語は、必要ならば、抗体鎖遺伝子（複数可）の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルのような要素に左右され得る。ほ乳類宿主細胞発現のために好ましい調節配列には、ほ乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を対象とする、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマウイルスから得られたプロモーターおよび／またはエンハンサーなどのウイルス要素が含まれる。
【０２２４】
抗体重鎖および／または軽鎖遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば、複製開始点)および１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子などの追加配列を有することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞の選択を容易にする。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子はＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性をベクターが導入した宿主細胞に与える。
【０２２５】
選択マーカー遺伝子のさらなる例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ＤＨＦＲを含まない宿主細胞においてメトトレキセート選択／増幅を使用するため）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）およびグルタミン合成酵素（ＧＳ）陰性細胞株（ＮＳＯなど）における選択／増幅のためのＧＳが含まれる。
【０２２６】
軽鎖および／または重鎖の発現のために、重鎖および／または軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）を標準的技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどによって宿主細胞にトランスフェクトする。
【０２２７】
本開示のＩＡタンパク質複合体またはそれらに含まれる融合タンパク質単位は、理論的に、原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて、好ましくは真核細胞において、最も好ましくはほ乳類宿主細胞において、発現することができる。このような細胞が、適切に折り畳まれた免疫学的に活性のある抗体を組み立てて分泌しやすいからである。本発明の組換え抗体の発現のために好ましいほ乳類宿主細胞には、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用したチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞３２を含む）、例えば、前述したような３３ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２／０細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターをほ乳類宿主細胞に導入する場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、または、より好ましくは、宿主細胞が増殖する培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって生成される。抗体は、標準的精製方法を使用して、宿主細胞および／または培養培地から回収することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質単位および／またはＩＡタンパク質複合体は、プロテインＡ／Ｇ／Ｌクロマトグラフィーを使用して単離する。
【０２２８】
本開示はまた、本開示によるＩＡタンパク質複合体またはそれらに含まれる組換え融合タンパク質単位に結合する単離された抗体またはそれらの断片を含む抗体組成物に関する。
【０２２９】
本開示によれば、「抗体」という用語には、限定はしないが、組換え抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、１本鎖抗体、ヒト化抗体、ミニボディ、ダイアボディ、トリボディならびにＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２および前述したような１ドメイン抗体などの本開示による抗体の抗原結合部分を含む抗体断片が含まれる。
【０２３０】
前述したように、本開示は、（ｉ）少なくとも２つの組換え融合タンパク質、（ｉｉ）少なくとも２つの異なる抗原、（ｉｉｉ）少なくとも１つの異なるホモオリゴマー化および／またはヘテロオリゴマー化ドメインを含み、前記第１の組換え融合タンパク質が、前記第２の組換え融合タンパク質には存在しない少なくとも１つのホモオリゴマー化またはヘテロオリゴマー化ドメインを含む、ワクチンとして適切な単離されたＩＡタンパク質複合体に関する。一部の有利な実施形態では、ホモオリゴマー化および／またはヘテロオリゴマー化ドメインは、抗体可変ドメインを含むイムノグロブリンドメイン、Ｔ細胞受容体可変および定常ドメイン、コイルドコイルドメイン、ロイシンジッパードメイン、コラーゲン関連トリプルヘリックス、Ｔ４バクテリオファージフィブリチンフォルドン（Ｆｄ）３量体化ドメイン、ＰＤＺおよびＰＤＺ様ドメインからなる群から選択される。
【実施例】
【０２３１】
方法および実施例
以下の実施例では、本開示の材料および方法を提供する。これらの実施例は単に例示のためであって、決して本開示を限定するものではないことを理解されたい。本明細書において引用した刊行物、特許および特許出願は全て、その全文が参考として本明細書に組み込まれる。
【０２３２】
最初の実施例として、ＰｆＭＳＰ１１９（配列番号１）およびｈＩｇＧ１（配列番号３２））を特徴とする、ＰｆＭＳＰ１１９−ＨＣ（（配列番号３３）と称する融合タンパク質、遺伝子的にｈＬＣカッパ（配列番号５０））に結合した主要な有性生殖段階ワクチン候補Ｐｆｓ２５＿ＦＫＯ（配列番号６）を含む融合タンパク質、Ｐｆｓ２５＿ＦＫＯ−ＬＣ（（配列番号５３）ならびにＰｆｓ２８（配列番号８）およびｈＬＣカッパ（配列番号５０））を特徴とする融合タンパク質、Ｐｆｓ２８−ＬＣ（（配列番号５５）の３つの異なる組換え融合ポリペプチドを、それぞれ１：１のＨＣ／ＬＣ比に従ってベンサミアナタバゴ（N. benthamiana）植物で同時生成した。精製後、これらの第１のタンパク質を使用して植物におけるそれらの蓄積ならびに２つの別個の発達段階の少なくとも２つの異なるプラスモディウム（plasmodial）抗原を組み込んだ抗体様分子への組立てを検証した。この最初の概念実証を図４および図９に例示的に示し、さらに本明細書で記載した本発明に備わっているコンビナトリアルの可能性を例示する。
【０２３３】
後の時点で、数種の異なる重鎖（配列番号３４〜４９、６７〜７５、７８〜１０７）および軽鎖融合ポリペプチド鎖（配列番号５１〜６６）をクローニングして生成した後、熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）寄生生物の３つの主要な発達段階：図２に示した前赤内期、無性生殖血液段階ならびに有性生殖段階を網羅する、２つの異なる重鎖および１つの特定の軽鎖融合ポリペプチド（ＡＲＣ２５−ＨＣ１．２（配列番号９７）からなる特定の組合せ（本明細書では、以後ＡＲＣ２５と呼ぶ）：Ｃ末端融合したＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ（配列番号９）とインフレームであるヒトＩｇＧ１重鎖（配列番号７６）を含有する、修飾したＣＨ３に遺伝子的に結合したＰｆＡＭＡ１＿ＧＫＯ（配列番号２３）からなる融合タンパク質；ＡＲＣ２５−ＨＣ２．２（配列番号８８）：ヒトＩｇＧ１重鎖（配列番号７７）を含有する第２の修飾したＣＨ３にＮ末端融合したＰｆＲｈ２ａ１５（配列番号２５）を含有する融合タンパク質；および前述のＰｆｓ２５＿ＦＫＯ−ＬＣ（配列番号５３））は、ベンサミアナタバゴ（N. benthamiana）植物においてそれぞれ１：１：１のＨＣ１．２／ＨＣ２．２／ＬＣ比で生成した。精製後、この特定のＭＩＡの組合せを凍結乾燥し、ミョウバンとともに製剤化し、ウサギの免疫化に使用した。得られた免疫血清からの抗体調製物は、異なる方法によって異なる段階の熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）寄生生物に対して免疫原性および阻害効果を示すことが特徴である。
【０２３４】
天然のイムノグロブリン重鎖および軽鎖の組立て／組合せ理論に基づいて、多数のヘテロおよびホモポリマーＩＡタンパク質複合体の混合物（図９）を構成する、２つを超える同一ではないＨＣ（ｎ＝＞２）融合ポリペプチド単位および２つを超える同一ではないＬＣ（ｎ＝＞２）融合ポリペプチド単位からなる融合タンパク質カクテルから構成されるＩＡタンパク質複合体の一例として、ＰｆＡＭＡ１＿ＧＫＯ−ＨＣ（配列番号４８）、ＭＳＰ３Ａ−ＨＣ（配列番号４２）およびテトラ＿ＭＳＰ１１９−ＨＣ（配列番号３４）と称する３つの異なる組換えＨＣ融合ポリペプチド単位ならびにＰｆＭＴＲＡＰ＿ＴＳＲ−ＬＣ（配列番号５７）、Ｐｆｓ２５＿ＦＫＯ−ＬＣ（配列番号５３）およびＰｆＥｘｐ１−ＬＣ（配列番号６３）と称する３つの異なる組換えＬＣ融合ポリペプチド単位を、等モル比（１：１：１：１：１：１）でベンサミアナタバゴ（N. benthamiana）植物の葉において同時生成した。３つの異なるＨＣおよび３つの異なるＬＣ融合ポリペプチド単位のこの混合物は、「ＨｅｘａＭｉｘ」と呼ばれ、精製後、このカクテルを使用して３つの主な発達段階全ての６つの異なるプラスモディウム（plasmodial）抗原を一緒に組み込んだ植物における６つのポリペプチド単位全ての蓄積を評価する。クーマシー染色ＰＡＡゲル分析および６つのＨＣおよびＬＣ融合ポリペプチド単位内に組み込まれたマラリア抗原に特異的な抗体を利用したイムノブロットに基づいて、成功したプロテインＡクロマトグラフィーの結果を図１６に例示した。
【０２３５】
図１６は、「ＨｅｘａＭｉｘ」（左側）の精製物の試料のクーマシー染色したポリアクリルアミドゲルおよびプールして透析したＥ１〜Ｅ６溶出画分（右側）を使用した個々の成分のイムノブロット分析を示す。３つのマラリアＨＣ融合ポリペプチド単位（ｐＴＲＡｋｃ−ＡＭＡ１ＧＫＯ−ＨＣ−ＥＲ、ｐＴＲＡｋｃ−ＭＳＰ３Ａ−ＨＣ−ＥＲ、ｐＴＲＡｋｃ−テトラ＿ｍｓｐ１１９−ｈＣ−ＥＲ）および３つのマラリアＬＣ融合ポリペプチド単位（ｐＴＲＡｋｃ−ＭＴＲＡＰ＿ＴＳＲ−ＬＣカッパ、ｐＴＲＡｋｃ−Ｐｆｓ２５＿ＦＫＯ−ＬＣカッパ、ｐＴＲＡｋｃ−Ｅｘｐ１−ＬＣカッパ）の発現ベクターを保有する等量のアグロバクテリウム（Agrobacteria）を一緒にして、得られた懸濁液をベンサミアナタバゴ（N. benthamiana）の葉に浸透させた。浸透した葉を浸透して５日後に収穫し、抽出およびその後のプロテインＡクロマトグラフィーのために使用した。精製試料を還元ＳＤＳ試料緩衝液で５倍に希釈し、電気泳動によって分離した（４０ｍＡ、４５分）。ウェスタンブロッティング（１００Ｖ、６０分）後の免疫染色は、示した１次および２次検出抗体を使用して実施した。Ｍ：Ｐａｇｅルーラー、Ｌ：添加物（処理した植物抽出物）、Ｆ：素通り画分、Ｅ１−６：中和した溶出画分、Ｒα−：ウサギ抗−、Ｍα−：マウス抗−、ｍＡｂ５．２：ＰｆＭＳＰ１１９に特異的なマウスＩｇＧ、ｍＡｂ４Ｂ７：Ｐｆｓ２５に特異的なマウスＩｇＧ、ＧαＭ／Ｒ−ＡＰ：ヤギ抗マウス／ウサギ−アルカリホスファターゼ標識。
【０２３６】
（今までのところ以前の実施例におけるように）マラリアだけでなく多数の疾患に対するワクチンとして適切な少なくとも３つの組換え融合タンパク質単位を含む単離されたＩＡタンパク質複合体の一例として、２つの異なる重鎖（ＭＰＴ６４−ＨＣ１（配列番号１０５）、ＨＶＲ１−ＨＣ２（配列番号１０６））および１つの特定の軽鎖融合ポリペプチド単位（ＣＬＣＴ−ＬＣｅｄｌｋｗａ（配列番号１０７））からなる特定の組合せ（本明細書では以後ｍＤＩＡと呼ぶ）を、それぞれ１：１：１のＨＣ１／ＨＣ２／ＬＣ比でベンサミアナタバゴ（N. benthamiana）において生成した。数種の細菌、ウイルスおよび寄生生物抗原を組み込むことによって、唯一の単離されたＩＡタンパク質複合体、ｍＤＩＡを使用することによって、結核（ＭＰＴ６４）、Ｃ型肝炎（ＨＶＲ１）、マラリア（ＣＬＣＴ）およびＨＩＶ（ｅｌｄｋｗａ）の疾患をそれぞれ標的とすることができた。植物を浸透して６日後に、浸透した葉を収穫し、抽出するために使用した。図１７に例示したように、組換えｍＤＩＡタンパク質複合体は、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、精製試料は全てＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって分析した。
【０２３７】
図１７は、多疾患ＩＡ精製試料のクーマシー染色したＰＡＡゲルおよび透析した溶出試料Ｅ１のイムノブロットを示す。２つのＨＣ融合ポリペプチド単位（ｐＴＲＡｋｃ−ＭＰＴ６４−ＨＣ−ＥＲおよびｐＴＲＡｋｃ−ＨＶＲ１−ＨＣ−ＥＲ）および１つのＬＣ融合ポリペプチド単位（ｐＴＲＡｋｃ−ＣＬＣＴ−ＬＣカッパ−ＥＬＤＥＫＷＡ）の発現ベクターを保有するアグロバクテリウム（Agrobacteria）を使用して、ベンサミアナタバゴ（N. benthamiana）の葉に等モル比（１：１：１）で浸透させた。浸透して５日後に葉を収穫し、抽出およびその後のプロテインＡクロマトグラフィーのために使用した。精製試料を還元ＳＤＳ試料緩衝液で５倍に希釈し、電気泳動によって分離した（４０ｍＡ、４５分）。ウェスタンブロッティング（１００Ｖ、６０分）後の免疫染色は、示した１次および２次検出抗体を使用して実施した。Ｍ：Ｐａｇｅルーラー、Ｌ：添加物（処理した植物抽出物）、Ｆ：素通り画分、Ｅ１：中和し、透析した溶出画分。ＭＰＴ６４：結核菌（Mycobacterium tuberculosis）から分泌されたタンパク質、ＨＶＲ１：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原Ｅ２の超可変領域１、ＣＬＣＴ：ＰｆＣｅｌＴｏｓ−Ｌｏｎｇ＿Ｒｅｐｅａｔｓ＋ＰｆＣＳＰ−ＴＲＡＰＴＳＲのＴＳＲ、ＥＬＤＫＷＡ：ｍＡｂ２Ｆ５に対して反応するＨＩＶ１−ｇｐ４１のエピトープ、Ｒα−：ウサギ抗−、Ｍα−：マウス抗−、ｍＡｂ５．２：ＰｆＭＳＰ１１９に特異的なマウス−ＩｇＧ、ｍＡｂ４Ｂ７：Ｐｆｓ２５に特異的なマウス−ＩｇＧ、ＧαＭ／Ｒ−ＡＰ：ヤギ抗マウス／ウサギ−アルカリホスファターゼ標識。
【０２３８】
１．発現構築物のクローニング
表１に挙げた抗原断片配列（配列番号１〜３１）は、植物発現（ＧｅｎｅＡｒｔ）のために最適化した。図３に概略を示したようにマラリア抗原を組み込んでいるヒトＨＣおよびＬＣ融合ポリペプチドのためのＭＩＡ開始ベクターを作製するために、シャトルベクターｐＵＣ５７−ＨＣｇａｍｍａおよびＰＣＲ鋳型としてｐＵＣ５７−ＬＣカッパを使用してヒトＩｇＧ１定常ドメインおよびヒト軽鎖カッパ定常ドメインの遺伝子情報を増幅した。増幅した配列をＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ断片として植物発現ベクターｐＴＲＡｋｃ−ＭＳＰ１１９＿３Ｄ７−ＥＲＨに挿入し、ｐＴＲＡｋｃ−ＭＳＰ１１９＿３Ｄ７−ＨＣ＿ｈＩｇＧ１−ＥＲおよびｐＴＲＡｋｃ−ＭＳＰ１１９＿３Ｄ７−ｈＬＣカッパと呼ぶ植物発現ベクターを生成した。マラリア抗原／リガンド／機能的成分ＯＲＦをＮ末端で交換するために、最後に構築した、記載したＭＳＰ１１９＿３Ｄ７遺伝子を含有する植物発現ＭＩＡ開始ベクター（ｐＴＲＡｋｃ−ＭＳＰ１１９＿３Ｄ７−ＨＣ＿ｈＩｇＧ１−ＥＲおよびｐＴＲＡｋｃ−ＭＳＰ１１９＿３Ｄ７−ｈＬＣカッパそれぞれ）をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで処理して、このプレースホルダーマラリア抗原を除去し、以下の抗原／リガンド／機能的成分ＯＲＦ全てをＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ消化断片として挿入した。この方法で作製した重鎖融合ポリペプチド構築物は全て、Ｃ末端にＥＲ検索用のＳＥＫＤＥＬタグを有した(Pelham、1990)。インビボおよび植物中における重鎖および軽鎖融合ポリペプチドの理論的組立てのため、後で記載したものは前記Ｃ末端タグの追加は行わなかった。ｐＴＲＡｋｃプラスミドの詳細な説明は、Ｂｏｅｓ等（Boes et al., 2011）に報告されている。
【０２３９】
マラリア抗原／リガンド／機能的成分の図５で示したような重鎖ポリペプチド融合物へのさらなるＣ末端付加を可能にするために、第１ステップでは、ｐＴＲＡｋｃ−ＭＳＰ１１９−ＥＲＨのベクターをＰＣＲ鋳型として使用して、ＭＳＰ１１９＿３Ｄ７（配列番号１）ＯＲＦを増幅し、それのＮ末端にＰｃｉＩ制限部位を備え付けた。同様に、第２のステップでは、テトラ＿ＭＳＰ１１９−ＨＣ（配列番号３４）の遺伝子情報を含有するプラスミドをＰＣＲによって濃縮し、Ｃ末端にＰｃｉＩ認識配列をもたらした。ＰｃｉＩで実施した消化がＮｃｏＩと互換性がある末端を生じることを認識すべきである。最初に言及した単位複製配列をＰｃｉＩ／ＮｏｔＩで処理し、第２のＰＣＲ生成物をＮｃｏＩ／ＰｃｉＩ消化し、両切断断片をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで処理したｐＴＲＡｋｃプラスミドに挿入し、こうして本明細書で以後「ＰｃｉＩベクター」と呼ぶＭＩＡ−Ｃ開始ベクターｐＴＲＡｋｃ−テトラ＿ＭＳＰ１１９−ＨＣ−ＰｃｉＩ−ＭＳＰ１１９＿３Ｄ７−ＥＲＨを得た。マラリア抗原／リガンド／機能的成分ＯＲＦをＣ末端で交換するために、最後に構築したＰｃｉＩベクターをさらにＰｃｉＩ／ＮｏｔＩ処理して、ＭＳＰ１１９＿３Ｄ７（配列番号１）のこのプレースホルダーマラリア抗原を確実に除去し、以下の抗原／リガンド／機能的成分ＯＲＦ全てをＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ消化断片として挿入した。遺伝子的なＣ末端付加による抗原レパートリー伸長について記載した図６Ａ＋Ｂは、２段階を網羅する候補テトラ＿ＭＳＰ１１９−ＨＣ−ＣＳＰＴＳＲ−ＥＲＨを例として示す。含まれるマラリア抗原全ての利用しやすさは、特異的な抗体を使用してＥＬＩＳＡおよびＳＰＲによって実証した。
【０２４０】
コンビナトリアル能／潜在力をさらに増強するため、および図７Ａで概略を示したような２つの異なる（マラリア）重鎖融合ポリペプチドが静電的撹拌効果によってホモ二量体化せず、ほぼヘテロ二量体のみを形成できるようにするために、ＭＳＰ１１９＿３Ｄ７−ＨＣ（配列番号３３）およびＡＭＡ１＿ＧＫＯ−ＨＣ（配列番号４８）の発現ベクターを、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３部分の２つの特異的なアミノ酸位置それぞれにおいてＰＣＲ部位特異的変異誘発によって遺伝子的に修飾した。ＭＳＰ１１９＿３Ｄ７−ＨＣ（配列番号３３）のＥ３５６およびＤ３９９の負電荷残基対を正電荷Ｌｙｓと交換してＭＳＰ１１９＿３Ｄ７−ＨＣ１．２−ＥＲ（配列番号７８）を生成した。ＡＭＡ１＿ＧＫＯ−ＨＣ（配列番号４８）のＫ３９２およびＫ４０９位の正電荷残基は、同様に負電荷Ａｓｐに転換し、発現ベクターＡＭＡ１＿ＧＫＯ−ＨＣ２．２（配列番号８５）を作製した。適用したアミノ酸置換は、野生型残基のＫａｂａｔ（Kabat et al., 1991）／結晶構造番号付けシステムおよび１文字コードでの変異残基を使用した位置に従って指定している。適用した変化を検証し、ホモおよびヘテロ二量体の形成収率を評価するために、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施し、予想に合致する結果を図７Ｂ＋Ｃに示す。前述の電荷対修飾を含むＭＩＡおよびＭＩＡ−Ｃ重鎖ポリペプチドをさらに作製するために、発現ベクターＭＳＰ１１９＿３Ｄ７−ＨＣ１．２−ＥＲ（配列番号７８）およびＡＭＡ１＿ＧＫＯ−ＨＣ２．２（配列番号８５）ならびに選択したマラリア抗原ＨＣ融合ポリペプチドのプラスミドをＫａｓＩ／ＮｓｉＩ（重鎖定常ドメイン内のシングルカッター）処理した。電荷対変異を有するＩｇＧ１定常ドメインは元の未修飾物と交換し、Ｆｃヘテロ二量体化のために修飾したＣＨ３領域を有するＭＩＡ（配列番号７６〜９２）およびＭＩＡ−Ｃ（配列番号９３〜１０４）構築物を多数生じた。
【０２４１】
組換え遺伝子構築物は全て、配列決定によって確認し、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＧＶ３１０１中に導入した（ｐＭＰ９０ＲＫ）。組換えアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）は、以前に記載されたように培養した（Vaquero et al., 1999, Sack et al., 2007）。培養物の光学密度（ＯＤ）を決定し、発現株をサイレンシング抑制因子ｐ１９を有するアグロバクテリウム（agrobacterium）株（Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｅｎｇｌａｎｄ）と５：１の比で混合し、最終ＯＤを１とした。
【０２４２】
図８は、異なるＭＩＡ構築物形式の概略図であり、図１３Ａ＋Ｂは、ヒトワクチン接種のために望ましい、最適化して伸長したＡＲＣ２５ベースのＭＩＡの概念を示す。
【０２４３】
２．一時的な発現
各構築物のために、それぞれの発現カセットを含有する組換え細菌を別々に培養した。ロックウール中で成長した６〜８週齢のベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）植物に手作業または真空で注射する前に、（マラリア）重鎖および軽鎖融合ポリペプチドを有する発現株を１：１（：１）比で混合して最終ＯＤを１とした（サイレンシング抑制因子ｐ１９を全浸透培地の５：１の比で供給した）。浸透したベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）植物を１６時間の光周期で、２２℃で５日間インキュベートした。植物葉組織をタンパク質抽出および精製のために収穫した。
【０２４４】
３．タンパク質抽出
葉組織を乳鉢および乳棒を使用して液体窒素中で破砕し、可溶性タンパク質を葉材料１ｇ当たり抽出緩衝液（２硫化ナトリウム１０ｍＭを供給したＰＢＳ  ｐＨ７．４）２ｍｌを用いて抽出した。不溶性物質を遠心分離（１６０００×ｇ、２０分、４℃）によって除去した。他の植物宿主細胞成分を効率的に除去するために塩追加（ＮａＣｌ５００ｍＭを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）およびｐＨシフト（最高ｐＨ８．０）を、マラリアＨＣおよびＬＣ融合ポリペプチド全てについて実施した。その後、不溶性物質を２回目の遠心分離（１６０００×ｇ、２０分、４℃）およびその後の一連の濾過ステップ（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ，Ｍｅｒｃｋ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｗｈａｔｍａｎ  Ｋｌａｒｉｆｌｅｘ  ０．２２μｍＰＥＳフィルター単位、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって除去した。
【０２４５】
４．プロテインＡ精製
目的のタンパク質の組合せは全て、プロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製した。標的タンパク質は、プロテインＡを負荷したキレーティングセファロースで捕捉した。ＮａＣｌ５００ｍＭを含むＰＢＳによる洗浄ステップ後、ｐＨ８．０に調整し、標的タンパク質はｄｄＨ２Ｏに溶解したグリシン１００ｍＭ、ｐＨ３．０を使用して溶出した。その後の中和は、溶出体積の１／１０の１Ｍ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．８で達成した。
【０２４６】
５．固定した金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）
Ｃ末端ヘキサヒスチジンおよびＥＲ検索タグ用のＣ末端ＳＥＫＤＥＬタグを特徴とする単一のマラリア抗原／リガンド／機能的ポリペプチド成分（異なるＭＩＡ構築物を作製するために使用した（配列番号１〜３１））は、固定した金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。抽出物のｐＨをｐＨ８．０に調整し、ＮａＣｌを最終濃度５００ｍＭまで添加した後、標的タンパク質をニッケルを負荷したキレーティングセファロースで捕捉した。ｐＨ８．０に調整したＰＢＳによる洗浄ステップ後、標的タンパク質はＰＢＳ、ｐＨ８．０に溶解したイミダゾール１５ｍＭ、５０ｍＭおよび２５０ｍＭのステップ勾配で溶出した。
【０２４７】
６．ウサギの免疫
精製したポリペプチド混合物ＡＲＣ２５（配列番号９７、８８、５３）を生理食塩水１．１５０μＬに導入して２００μｇ／ｍｌを含有する溶液を調製し、次に、ＡＬＰＨＡ１−４ＬＳＣ装置（Ｃｈｒｉｓｔ、Ｏｓｔｅｒｏｄｅ  ａｍ  Ｈａｒｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて陰圧０．３１０ｍｂａｒを７２時間加えて直接凍結乾燥した。凍結乾燥したＡＲＣ２５試料をＢｉｏｇｅｎｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に送り、ウサギの免疫のために使用した。動物にワクチン接種する前に、この凍結乾燥混合物を解凍し、アジュバントＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）２％（Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）１．１５０μＬでさらに希釈し、相対的ＡＲＣ２５濃度を１００μｇ／ｍＬにした。この製剤を使用して、０、２８および５６日目に、製剤化したＡＲＣ２５  ５００μＬ（ＡＲＣ２５  ５０μｇ／免疫ステップの用量となる）を用いてウサギを免疫した。７０日目、最後の追加免疫の２週間後に、ワクチン接種した動物の最終採血血清を入手し、その後の実験のために使用した。
【０２４８】
ＡＲＣ２５に加えて、同量のＡＭＡ１＿ＧＫＯ（配列番号２３）およびＰｆｓ２５＿ＦＫＯ（配列番号６）を特徴とする、本明細書で以後ＢＳＳＣと称した対照を、ＡＲＣ２５ワクチン組成物に含め、前述のようにＡＲＣ２５と同様に調製し使用した。
【０２４９】
７．ウサギ血清の抗体のプロテインＡ精製
免疫処置後、ウサギ抗血清から得られた抗体を、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。簡単に説明すると、血清試料をＰＢＳで１：５希釈し、精製前に０．４５μｍフィルターで濾過した。抗体をプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に結合させ、結合していない不純物をＰＢＳ  ｐＨ７．４による洗浄ステップによって除去した。結合した抗体をグリシン  １００ｍＭ  ｐＨ３．０で溶出し、溶出体積の１／１０のＴＲＩＳ  １Ｍ  ｐＨ８．８で直接中和した。ＨＥＰＥＳ  ２５ｍＭを含有し、Ｌ−グルタミン（Ｅ１５−０４１、ＰＡＡ）を含有しないＲＰＭＩ１６４０に対する緩衝液交換を、ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラムを使用して実施し、抗体を、遠心濃縮装置（ＶｉｖａＳｐｉｎ１５Ｒ  ３０．０００ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｕｉｓ）によって、１２ｍｇ／ｍｌを超える濃度に濃縮し、滅菌濾過した。抗体を４℃で保存した。
【０２５０】
８．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析
タンパク質を、自分で注入したＳＤＳ（８％、１２％もしくは１５％）または市販の４〜１２％（ｗ／ｖ）勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で還元および／または非還元条件下で分離し、Ｆａｉｒｂａｎｋｓプロトコール（Wong et al. 2000）に従ってクーマシーＲ−２５０で染色した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上にブロッティングし、ＰＢＳに溶解した５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を用いてブロックした。ＭＩＡは、いずれもアルカリホスファターゼで標識した検出抗体ヤギ抗ヒトＦｃおよびヤギ抗ヒトＬＣカッパで探索した。力価決定のために望ましい単一のマラリア抗原／リガンド／機能的ポリペプチド成分は、一次抗体として１：５０００希釈したウサギ抗Ｈｉｓ６タグで探索した。この場合、適用した二次抗体は、アルカリホスファターゼ標識したヤギ抗ウサギＨ＋Ｌであった。バンドは、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（基質緩衝液：ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ９．６中、１ｍｇ／ｍＬ）で視覚化した。インキュベーションステップの間に、膜を０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を補給したＰＢＳで３回洗浄した。
【０２５１】
図１０：本実施例による精製組換えタンパク質ＡＲＣ２５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＡＲＣ２５は還元条件下で分離した。図１０は、熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）の主要な発達段階を網羅するＡＲＣ２５および含まれる成分の概略を示した図である。図１１は、ＡＲＣ２５のクーマシー染色および脱染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示しており、１番目はプロテインＡ後、２番目はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後である。分子量標準物は左側に示されている。
【０２５２】
図１１の略語は：
Ｍ：ＰＡＧＥルーラーとして予め染色したタンパク質ラダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
Ｌ：添加物（処理した抽出物）
Ｆ：素通り画分
Ｗ：洗浄（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４）
Ｅ１〜Ｅ６：標的タンパク質（複数可）を含有するプロテインＡ溶出画分
Ａ７−Ａ１１：標的タンパク質（複数可）を含有するＳＥＣ溶出画分
ＨＣ１：ＡＲＣ２５−ＨＣ１．２（配列番号９７）
ＨＣ２：ＡＲＣ２５−ＨＣ２．２（配列番号８８）
ＬＣ：Ｐｆｓ２５＿ＦＫＯ−ＬＣ（配列番号５３）
【０２５３】
９．ＥＬＩＳＡ
免疫処置のために使用したタンパク質ＡＲＣ２５（配列番号９７、８８、５３）に対する血清における特異的抗体（ＩｇＧ）力価、ならびに単一のマラリア抗原／リガンド／機能的ポリペプチド成分全てに対する反応性を、１００ｎｇ／ｍｌの濃度の組換えタンパク質でコーティングした高結合性９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。室温で１時間インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳに溶かした５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳でブロックし、再度室温で１時間インキュベートした。血清および免疫前血清（陰性対照として、および差し引いたブランクとして）の段階希釈を９６ウェルプレートに適用し、室温で１時間インキュベートした。抗原が結合した抗体をＨＲＰＯ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃで探索し、３０分後にＡＢＴＳ基質を用いて４０５ｎｍで検出した。各ステップの間に、プレートを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を補給したＰＢＳで３回洗浄した。特異的ＩｇＧ力価は、免疫前血清の値の１．５倍のＯＤ４０５ｎｍを生じる希釈として規定した。
【０２５４】
【表７】
2019502749.tif 000036
【０２５５】
１０．免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）
熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）寄生生物の異なる発達段階を視覚化するために、間接ＩＦＡを以前に記載されたように実施した（Pradel et al, 2004）。熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）株ＮＦ５４の無性生殖段階およびガメトサイトの培養は、以前に記載されたように実施した（Ifediba and Vanderberg, 1981）。寄生生物調製物を８ウェル診断用スライド（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で風乾させ、−８０℃のメタノールを用いて１０分間固定化した。非特異的結合をブロックし膜を透過処理するために、固定した細胞を、ＰＢＳに溶かした０．５％ＢＳＡ、０．０１％サポニン中で、室温で３０分間、続いてＰＢＳに溶かした０．５％ＢＳＡ、０．０１％サポニン、１％中性ヤギ血清中で、室温で３０分間インキュベートした。ヤギ血清を含まないブロッキング溶液で希釈したＡＲＣ２５に特異的な精製抗体で、試料を３７℃で１時間インキュベートした。精製した抗体を５０μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。異なる熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）生活環段階の対比染色のために、ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ（スポロザイトの対比染色）、ＭＳＰ１１９（シゾントの対比染色）またはＰｆｓ２５（マクロガメートおよび接合子の対比染色）の単一の熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）抗原断片に特異的なマウス抗血清はＦｒａｕｎｈｏｆｅｒ  ＩＭＥによって作製され、２０μｇ／ｍＬの最終濃度で使用した。ヤギ血清を含まないブロッキング溶液中において蛍光をコンジュゲートしたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ａ−１１００１；１：１００）またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（ＪＩＲ  １１１−５８５−１４４；１：２００）ヤギ抗ウサギ抗体で細胞をインキュベートすることによって、一次抗体を視覚化した。核を強調するために、試料を０．０１％サポニンを供給したＰＢＳに溶かしたヘキスト３３３４２（１０μｇ／ｍＬ）でインキュベートした。最後に、細胞を抗退色溶液ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｐ３６９３４）とともにマウントし、マニキュア液で密閉した。ライカＴＣＳ−ＳＰ８スペクトル共焦点顕微鏡を使用して、標識された細胞の検査および画像の読み取りを実施した。本開示によるＡＲＣ２５に対して生じた精製ウサギ抗体を用いた、異なる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）段階の免疫蛍光アッセイの例を図１２に例示する。図の各部分では、左側にＡＲＣ２５に対して生じた精製ウサギｐＡｂによる染色（Ａｌｅｘａ５９４で標識した抗ウサギｐＡｂで検出）を示し、左から２番目に陽性対照染色（マウス対照ｐＡｂ、Ａｌｅｘａ４８８で標識した抗マウスｐＡｂで検出）、左から３番目にヘキスト核染色を示す。一番右側に混合して重ね合わせた画像を示す。陰性対照（免疫前のウサギ血清を使用して実施）は、最後の行に示す。
【０２５６】
図１２：熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）の前赤内期段階および無性生殖血液段階の、ＡＲＣ２５およびＢＳＳＣに対して作製したウサギ免疫血清による免疫標識。ＩＦＡは、メタノール固定したスポロゾイトおよび血液段階シゾントについて、ＡＲＣ２５またはＢＳＳＣのいずれかで免疫して７０日後に収集したウサギ血清試料のプロテインＡ精製ウサギＩｇＧを使用して実施した。示した例は、２つのウサギＩｇＧ試料（ウサギ２４７０１番（ＡＲＣ２５について）、ウサギ２４７０４番）で免疫標識したスポロゾイトの全表面ならびにシゾントによって封入されたメロゾイトの頂端極である（赤）。スポロゾイト表面を検出するためにマウス抗ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲモノクローナル抗体６．７５Ｍを適用し、メロゾイト原形質膜を対比染色するためにマウス抗ＰｆＭＳＰ１１９抗血清を使用し（緑）、寄生生物の核はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で強調した（青）。免疫したウサギの精製したＩｇＧ画分を１５ｍｇ／ｍＬの濃度で使用し、天然の熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）表面への結合を評価した（赤）。
【０２５７】
１１．スポロゾイト滑走運動（ＳＧＭ）、肝細胞通過（ＨＣＴ）およびスポロゾイト侵入および肝臓段階での発達（ＳＩＬＳＤ）の阻害
滑走運動および細胞通過アッセイは、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）スポロゾイトの滑走能力および肝細胞通過能力に対する免疫したウサギから得られた精製ＩｇＧ画分の効果を試験するために実施した。いずれのアッセイも、Behet et al. (2014)に記載されたものを少し変更して実施した。滑走運動アッセイでは、抗ＣＳＰｍＡｂ３ＳＰ２  ３０μｇで予めコーティングした９６ウェルのガラス底黒色プレートを使用してｓｈｅｄＣＳＰタンパク質を捕捉した。１００００個の熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）スポロゾイトを、ウサギＩｇＧ（（抗ＡＲＣ２５：プールしたＡＲＣ２５試料；抗ＢＳＳＣ）１０ｍｇと共に３連で予めインキュベートし、３０分間氷上にプールし、次いで３ＳＰ２コーティングしたスライド上に移した。３７℃で５％ＣＯ２中で９０分インキュベートした後、スポロゾイトを洗浄除去した。滑走痕跡を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）でＲＴで２０分間固定し、抗ＣＳＰビオチン、続いてストレプトアビジン−ＡＦ５９４を用いて染色した。１０００倍の倍率で蛍光顕微鏡によって滑走痕跡を視覚化し、画像をＦＩＪＩイメージングソフトウェアを用いて分析した。
【０２５８】
ＨＣＴについては、肝細胞株ＨＣ−０４細胞を９６ウェル透明底黒色プレートに播種し、コンフルエントになるまで増殖させた。ウェル当たり５００００個の熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）スポロゾイトをウサギＩｇＧ１０ｍｇと３０分間予めインキュベートし、次いでローダミン−デキストランの存在下で肝細胞に重層した。３時間インキュベートした後、スポロゾイトを洗浄除去した。スポロゾイト通過の結果としてのローダミン−デキストランの摂取は、プレートリーダーで蛍光シグナルを測定することによって定量した（励起：５４０／３５ｎｍ、放射：６００／４０ｎｍ）。
【０２５９】
免疫したウサギから精製してプールしたＩｇＧ画分の、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）スポロゾイトがヒト初代肝細胞に感染する能力に対する効果を試験するために、ＳＩＬＳＤアッセイをvan Schaijk et al. (2008)に従って実施した。５００００個の凍結保存したヒト初代肝細胞を９６ウェル透明底黒色プレートに播種し、毎日２日間リフレッシュしたので、わずかな適応が実施された。唾液腺スポロゾイトを熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）ＮＦ５４に感染した蚊から単離した。ウェル当たり５００００個のスポロゾイトをＩｇＧと３０分間氷上で予めインキュベートして、その後肝細胞上に移した。３時間後、侵入してないスポロゾイトを洗浄除去し、肝細胞を毎日６日間リフレッシュした。細胞を洗浄し、細胞内を固定して染色した。ビヒクルおよび３ＳＰ２試料は、ＤＡＰＩおよびウサギ抗ＰｆＨＳＰ７０で染色した。ビヒクルおよびウサギＩｇＧ試料は、ＤＡＰＩならびにＰｆＢｉｐ（結合タンパク質、ＥＲマーカー）、ＰｆＥｘｐ１（輸送されたタンパク質１）、ＰｆＨＳＰ７０（熱ショックタンパク質７０）およびＰｆＭＳＰ１（メロゾイト特異的タンパク質１）に特異的なマウスｍＡｂで染色した。陽性に染色した感染肝細胞の数は、自動顕微鏡によって、２５領域で１００倍の倍率でＦＩＪＩイメージ分析ソフトウェアを使用して判定した。本開示によるＡＲＣ２５に対して生じた精製ウサギ抗体のＳＧＭ、ＨＣＴおよびＳＩＬＳＤアッセイの結果を以下の表８に挙げる。
【０２６０】
１２．成長阻害アッセイ（ＧＩＡ）
プラスモジウム属（Plasmodium）寄生生物に対する成長阻害の可能性を、標準化された方法を使用して実施した。熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）寄生生物株３Ｄ７Ａ（ＭＲ４によって提供された）を、３７℃および５％ＣＯ２、５％Ｏ２および９０％Ｎ２で、１０％ＡｌｂｕｍａｘＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｈｅｐｅｓ  ２５ｍＭ、ゲンタマイシン１２μｇ／ｍｌおよびヒポキサンチン１００μΜを補給したＲＰＭＩ培地中において、４％のヘマトクリットで、５％未満の寄生虫血症の培養で維持した。培養備置を日常的な作業で維持し、ギムザ染色によって寄生虫血症を推定した。アッセイに使用した赤血球は１５人のマラリア無感作血液ドナーから混合し、それらは３週間以内のものだった。赤血球はＳＡＧ−マンニトール中、４℃で保存した。寄生生物を、侵襲後１〜１６時間の時間枠内で１０％ソルビトール処理によって同調させた。アッセイには、侵襲後３６〜４０時間の高度に同調した培養物のみを使用した。
【０２６１】
寄生生物、新鮮なＲＢＣおよび抗体を、だいたい０．１％の最終寄生虫血症および２％の最終ヘマトクリットを有するように、９６ウェルプレート中で混合した。バックグラウンド対照のために、寄生生物を含まないＲＢＣのみを寄生生物と同一条件下で培養して維持した。添加せずに熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）寄生生物を培養することによって、寄生生物成長をモニタリングするための成長制御を実施した。試料は全て３連で測定した。陰性対照として、マラリア無感作ウサギおよびヒト血漿を得て、精製した抗体を試験した。完全な侵襲阻害の陽性対照として、ＥＤＴＡ（最終濃度４ｍＭ）およびＢＧ９８ウサギ抗ＡＭＡ−１ポリクローナル抗体を使用した。プレートは、３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ２、５％Ｏ２および９０％Ｎ２で４０から４４時間インキュベートした。収集時に、冷ＰＢＳを用いて１回ウェルを洗浄し、凍結した。寄生生物成長はＭａｌｓｔａｔ（商標）アッセイ３２によって推定した。吸光度は分光光度計を使用して６５５ｎｍの波長で３０分後に測定した。阻害能は以下の式によって推定した：
阻害％＝１００％−（（Ａ６５５  ＩｇＧ試料−Ａ６５５  ＲＢＣ対照））／（（Ａ６５５シゾント対照−Ａ６５５  ＲＢＣ対照））＊１００％
【０２６２】
上記のように、成長阻害アッセイは、抗体の阻害の可能性を評価するための標準のインビトロアッセイである。アッセイは、無性生殖段階／血液段階をシミュレートする。ＡＲＣ２５およびＢＳＳＣに対して生じた精製ウサギ抗体のＧＩＡ結果を表５に挙げる。
【０２６３】
１３．ルミネセント標準膜栄養アッセイ（ＴｒｏｐＩＱ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）
熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）段階Ｖガメトサイトがアンフェレス・ステファンシ（Anopheles stephensi）蚊に感染する能力に対する免疫したウサギから精製したＩｇＧ画分の効果を評価するために、膜栄養アッセイを実施した(Bishop and Gilchrist, 1946)。簡単に説明すると、試験試料を熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）株ＮＦ５４−ｈｓｐ７０−ｌｕｃの段階Ｖガメトサイト、ヒト赤血球細胞と一緒にして、アンフェレス・ステファンシ（Anopheles stephensi）蚊に給餌した。実験は活性補体の存在下で実施した。８日後、個々の蚊におけるルシフェラーゼ発現を分析した。
【０２６４】
・  試料希釈当たり１回投与、試料／給餌当たり蚊２４匹のルミネセンス強度を分析（Ｎ＝１、ｎ＝２４）
・  ルミネセンスバックグラウンドレベルを決定するために感染していない蚊２４匹を分析
・  ２連の対照：ＰＢＳビヒクルおよび伝染をブロックするｍＡｂ８５ＲＦ４５．１、ＩＣ９０
【０２６５】
データ分析および報告
・  データは、ルミネセンス強度として表現する（秒当たりのカウント（ｃｐｓ））
・  報告したデータには、分析した蚊の数、ビヒクル対照における蚊当たりのオーシストの数、オーシスト強度およびオーシスト有病率、生データが含まれる。
【０２６６】
アッセイ品質基準
・陰性対照給餌のうちの少なくとも１つにおける７０％オーシスト有病率
・給餌の少なくとも５０％で２０回の観察（蚊）を行い、最少でも各給餌について１５回観察した。
・ＩＣ９０の陽性対照ｍＡｂ８５ＲＦ４５．１によるルシフェラーゼシグナルの少なくとも７５％阻害
【０２６７】
【表８】
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【０２６８】
２つのＰＢＳ餌を給餌された蚊は、１匹当たり平均４２．４のオーシストを示し、これは秒当たり約５７５５ルミネセンスカウントに対応した。ｍＡｂ８５ＲＦ４５．１  ５μｇ／ｍｌの餌を給餌した蚊は、秒当たり平均約２９２ルミネセンスカウントを示した。
【０２６９】
様々な濃度のＮＲＳを含有する血液食を給餌した蚊は、ＮＲＳ濃度が増加するにつれて用量依存的にルミネセンスカウントの減少を示したが、これらはいずれもＰＢＳ対照と同等であった。
【０２７０】
ＡＲＣ２５（ウサギ＃２４７００〜＃２４７０２のプール）０．５ｍｇ／ｍｌまたはＢＳＳＣ（＃２４７０３〜＃２４７０５）０．５ｍｇ／ｍｌのいずれかを含有する血液食を給餌した蚊は、ＮＲＳ０．５ｍｇ／ｍｌと比較して、それぞれ９２％および９３％の著しい阻害を示した。
【０２７１】
ＡＲＣ２５およびＢＳＳＣに対して生じた精製ウサギ抗体の段階Ｖガメトサイトに対するＳＭＦＡ結果を表９に含めてまとめる。
【０２７２】
【表９】
2019502749.tif 000038
【０２７３】
結果は、３種のプラスモジウム属（Plasmodium）生活環段階の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質またはタンパク質ドメインに基づいて、本開示による例示的抗原の生成を実現する可能性を示す。生成は、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）植物において達成された。精製後、組換えタンパク質ＡＲＣ２５は、動物においてバランスが保たれた抗体反応を誘発し、力価は２×１０４を上回っていた。免疫蛍光アッセイによって、誘導された抗体は天然プラスモジウム属（Plasmodium）抗原に特異的に結合することが確認された。さらに、機能アッセイによって、対応するプラスモジウム属（Plasmodium）生活環段階全てにおいて３０〜１００％の範囲の特異的な寄生生物阻害が示された。
【０２７４】
参考文献
本明細書を通じて引用した文献参考文献、発行された特許および公開された特許出願を含む引用した参考文献全ての内容は、参考により本明細書に明確に組み込む。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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