(57)【要約】  抗微生物ペプチドであって、上記ペプチドが２個〜２０個の可変ドメイン含み、各可変ドメインが２個〜２０個の連続する塩基性アミノ酸の配列であり、ここで、（ａ）上記可変ドメインは可変リンカーによって互いに分離され、（ｂ）上記可変リンカーは、２個以上の連続する塩基性アミノ酸以外の１個〜２０個の任意のアミノ酸を有することができ、（ｃ）上記ペプチドは１００個以下のアミノ酸を有する、抗微生物ペプチド。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗微生物ペプチドであって、
前記ペプチドが２個〜２０個の可変ドメイン含み、各可変ドメインが２個〜２０個の連続する塩基性アミノ酸の配列であり、
ここで、
（ａ）前記可変ドメインは可変リンカーによって互いに分離され、
（ｂ）前記可変リンカーは、２個以上の連続する塩基性アミノ酸以外の１個〜２０個の任意のアミノ酸を有することができ、
（ｃ）前記ペプチドは１００個以下のアミノ酸を有する、
抗微生物ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、少なくとも３個の可変ドメインを有する、請求項１に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、Ｃ末端システインを有する、請求項１に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項４】
前記可変ドメイン中の前記塩基性アミノ酸の少なくとも１個がアルギニンである、請求項１に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項５】
各可変ドメイン中の前記塩基性アミノ酸の全てがアルギニン残基である、請求項４に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項６】
前記塩基性アミノ酸の少なくとも１個が化学的に改変されたアミノ酸である、請求項１に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項７】
前記化学的に改変されたアミノ酸がＤ−アミノ酸である、請求項６に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項８】
前記Ｄ−アミノ酸がＤ−アルギニンである、請求項７に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項９】
前記可変ドメイン及び前記可変リンカーが、ヘパドナウイルスコアタンパク質のアルギニンリッチドメイン（ＨＢｃＡＲＤ）に由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１０】
前記ＨＢｃＡＲＤが、ヘパドナウイルスコアタンパク質の残基１４７からＣ末端残基までの配列を含む、請求項９に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１１】
各可変ドメインが３個又は４個のアルギニン残基を有し、各可変リンカーが２個〜４個のアミノ酸を有する、請求項１０に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、
（ｉ）（Ｘ１）ＧＲＸ２Ｐ（Ｘ３）Ｘ４ＰＸ５Ｐ（Ｘ６）Ｘ７ＱＸ８Ｐ（Ｘ９）（配列番号１）
（ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ６及びＸ９の各々は、個別に可変ドメインであり、
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７及びＸ８の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である）、
（ｉｉ）（Ｘ１）ＧＲＸ２Ｐ（Ｘ３）Ｘ４ＰＸ５Ｐ（Ｘ６）（配列番号２）
（ここで、Ｘ１、Ｘ３及びＸ６の各々は、個別に可変ドメインであり、
Ｘ２、Ｘ４及びＸ５の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である）、及び、
（ｉｉｉ）（Ｘ１）Ｘ２ＰＸ３Ｐ（Ｘ４）Ｘ５ＱＸ６Ｐ（Ｘ７）（配列番号３）
（ここで、Ｘ１、Ｘ４及びＸ７の各々は、個別に可変ドメインであり、
Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５及びＸ６の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である）からなる群から選択されるコンセンサス配列を含む、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドがＣ末端システインを有する、請求項１２に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが、
（ｉ）（Ｘ１）ＧＲＸ２Ｐ（Ｘ３）Ｘ４ＰＸ５Ｐ（Ｘ６）Ｘ７ＱＸ８Ｐ（Ｘ９）Ｘ１０Ｃ（配列番号４）、及び、
（ｉｉ）（Ｘ１）ＧＲＸ２Ｐ（Ｘ３）Ｘ４ＰＸ５Ｐ（Ｘ６）Ｘ７ＱＸ８Ｐ（Ｘ９）Ｘ１０Ｑ（配列番号５）、
（ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ６、及びＸ９の各々は、個別に可変ドメインであり、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ８、及びＸ１０の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である）からなる群から選択されるコンセンサス配列を有する、請求項１２に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが、
（ｉ）ＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号６）（ここで、前記アルギニン残基の少なくとも１個はＤ−アルギニンである）、
（ｉｉ）ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＣ（配列番号７）、
（ｉｉｉ）ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱ（配列番号８）、
（ｉｖ）ＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲＣ（配列番号９）、
（ｖ）ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＣ（配列番号１０）、
（ｖｉ）ＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＣ（配列番号１１）、
（ｖｉｉ）ＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＣ（配列番号１２）、又は、
（ｖｉｉｉ）ＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲＣ（配列番号１３）、
からなる群から選択される配列を含む、請求項１２に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドがＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＣ（配列番号７）の配列を含み、
ここで、前記配列中の前記アルギニン残基の各々がＬ−アルギニンである、請求項１５に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１７】
前記ペプチドがＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＣ（配列番号７）の配列を含み、前記配列中の前記アルギニン残基の少なくとも１個がＤ−アルギニンである、請求項１５に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１８】
前記配列中の前記アルギニン残基の各々がＤ−アルギニンである、請求項１７に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１９】
前記配列がｒＲｒＧＲＳＰｒＲｒＴＰＳＰｒＲｒＲＳＱＳＰｒＲｒＲＳＣ（配列番号７）であり、ここで、ＲがＬ−アルギニンであり、ｒがＤ−アルギニンである、請求項１７に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項２０】
前記配列がＲｒＲＧＲＳＰＲｒＲＴＰＳＰＲｒＲｒＳＱＳＰＲｒＲｒＳＣ（配列番号７）であり、ここで、ＲがＬ−アルギニンであり、ｒがＤ−アルギニンである、請求項１７に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドがＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲＣ（配列番号９）の配列を含み、ここで、前記配列中の前記アルギニン残基の少なくとも１個がＤ−アルギニンである、請求項１５に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項２２】
前記配列がｒＲｒＧＲＰｒＲｒＰＰｒＲｒＲＱＰｒＲｒＲＣ（配列番号９）であり、ここで、ＲがＬ−アルギニンであり、ｒがＤ−アルギニンである、請求項１５に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項２３】
前記配列が前記ペプチドのＣ末端にある、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項２４】
非ＨＢｃＡＲＤペプチドを更に含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項２５】
前記非ＨＢｃＡＲＤペプチドが、アフィニティータグ、シグナル配列、リガンド、又は別の抗微生物ペプチド若しくはそのフラグメントである、請求項２４に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項２６】
前記非ＨＢｃＡＲＤペプチドがポリヒスチジン又はその類縁体である、請求項２５に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項２７】
前記ペプチドが、
（ｉ）ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１４）、
（ｉｉ）ＨＨＨＨＨＨＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳ（配列番号１５）、
（ｉｉｉ）ＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲＨＨＨＨＨＨ（配列番号１６）、及び、
（ｉｖ）ＨＨＨＨＨＨＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲ（配列番号１７）、
からなる群から選択される配列を有する、請求項２６に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項２８】
少なくとも１個の可変ドメインがリジンを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項２９】
少なくとも１個の可変ドメインがヒスチジンを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項３０】
前記ペプチドが環状構造を有する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３１】
前記ペプチドが、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌、寄生生物、又はウイルスに対して広域スペクトルの抗微生物活性を示す、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のペプチドと、非ペプチド部分とを含む、抗微生物ペプチドコンジュゲート。
【請求項３３】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項３４】
請求項３２に記載の抗微生物ペプチドコンジュゲートと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項３５】
微生物感染症を治療する方法であって、請求項３３又は３４に記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
抗生物質は、６０年を超えて細菌感染症の治療に使用されてきた。最近では、抗生物質耐性菌が増えつつあり、公衆衛生にとって大きな脅威となっている。臨床治療用の新たな抗生物質の開発が急務である。様々な種に由来する抗微生物ペプチド（ＡＭＰ：Antimicrobial peptides）は病原性微生物に対する宿主の防御兵器としての役割を果たすことができる。それらのＡＭＰは、様々な作用様式で細菌及び真菌を死滅させることができるため、抗生物質耐性の問題を克服する有力候補と見されている。
【発明の概要】
【０００２】
一態様では、抗微生物ペプチドが本明細書に記載される。上記ペプチドが２個〜２０個の可変ドメイン含み、各可変ドメインが２個〜２０個の連続する塩基性アミノ酸の配列であり、ここで、（ａ）上記可変ドメインは可変リンカーによって互いに分離され、（ｂ）上記可変リンカーは、２個以上の連続する塩基性アミノ酸以外の１個〜２０個の任意のアミノ酸を有することができ、（ｃ）上記ペプチドは１００個以下のアミノ酸を有する。一実施の形態では、ペプチドが、少なくとも３個又は４個の可変ドメインを有する。上記ペプチドが、Ｃ末端システインを有することができる。幾つかの実施の形態では、上記可変ドメイン中の上記塩基性アミノ酸の少なくとも１個がアルギニンである。例えば、上記ペプチドにおける各可変ドメイン中の上記塩基性アミノ酸の全てがアルギニン残基であり得る。代替的には又は加えて、上記抗微生物ペプチド中の少なくとも１個の可変ドメインがリジンを有する。一実施の形態では、少なくとも１個の可変ドメインがヒスチジンを有する。上記ペプチドが環状構造を有することができる。
【０００３】
上記ペプチドにおける上記塩基性アミノ酸の少なくとも１個が化学的に改変されたアミノ酸であり得る。一実施の形態では、上記化学的に改変されたアミノ酸がＤ−アミノ酸、例えばＤ−アルギニンである。上記可変ドメイン及び上記可変リンカーが、ヘパドナウイルスコアタンパク質のアルギニンリッチドメイン（ＨＢｃＡＲＤ）に由来することができる。一実施の形態では、上記ＨＢｃＡＲＤがヘパドナウイルスコアタンパク質の残基１４７からＣ末端残基までの配列を含む。上記ペプチドにおける各可変ドメインが３個又は４個のアルギニン残基を有することができ、上記ペプチドにおける各可変リンカーが２個〜４個のアミノ酸を有することができる。上記ペプチドが、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌、寄生生物、又はウイルスに対して広域スペクトルの抗微生物活性を示すことができる。
【０００４】
一実施の形態では、上記抗微生物ペプチドが、
（ｉ）（Ｘ１）ＧＲＸ２Ｐ（Ｘ３）Ｘ４ＰＸ５Ｐ（Ｘ６）Ｘ７ＱＸ８Ｐ（Ｘ９）（配列番号１）
（ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ６及びＸ９の各々は、個別に可変ドメインであり、
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７及びＸ８の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である）、
（ｉｉ）（Ｘ１）ＧＲＸ２Ｐ（Ｘ３）Ｘ４ＰＸ５Ｐ（Ｘ６）（配列番号２）
（ここで、Ｘ１、Ｘ３及びＸ６の各々は、個別に可変ドメインであり、
Ｘ２、Ｘ４及びＸ５の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である）、及び、
（ｉｉｉ）（Ｘ１）Ｘ２ＰＸ３Ｐ（Ｘ４）Ｘ５ＱＸ６Ｐ（Ｘ７）（配列番号３）
（ここで、Ｘ１、Ｘ４及びＸ７の各々は、個別に可変ドメインであり、
Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５及びＸ６の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である）からなる群から選択されるコンセンサス配列を含む。各可変ドメインが２個〜２０個の連続する塩基性アミノ酸の配列である。
【０００５】
上記ペプチドが、
（ｉ）（Ｘ１）ＧＲＸ２Ｐ（Ｘ３）Ｘ４ＰＸ５Ｐ（Ｘ６）Ｘ７ＱＸ８Ｐ（Ｘ９）Ｘ１０Ｃ（配列番号４）、及び、
（ｉｉ）（Ｘ１）ＧＲＸ２Ｐ（Ｘ３）Ｘ４ＰＸ５Ｐ（Ｘ６）Ｘ７ＱＸ８Ｐ（Ｘ９）Ｘ１０Ｑ（配列番号５）
（ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ６、及びＸ９の各々は、個別に可変ドメインであり、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ８、及びＸ１０の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である）からなる群から選択されるコンセンサス配列を有することができる。
【０００６】
一実施の形態では、上記抗微生物ペプチドが、
（ｉ）ＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号６）（ここで、上記アルギニン残基の少なくとも１個はＤ−アルギニンである）、
（ｉｉ）ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＣ（配列番号７）、
（ｉｉｉ）ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱ（配列番号８）、
（ｉｖ）ＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲＣ（配列番号９）、
（ｖ）ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＣ（配列番号１０）、
（ｖｉ）ＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＣ（配列番号１１）、
（ｖｉｉ）ＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＣ（配列番号１２）、及び、
（ｖｉｉｉ）ＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲＣ（配列番号１３）、
からなる群から選択される配列を含む。
【０００７】
例えば、上記抗微生物ペプチドがＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＣ（配列番号７）の配列を含むことができ、ここで、上記配列中の上記アルギニン残基の各々がＬ−アルギニンである。代替的には、上記ペプチドがＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＣ（配列番号７）の配列を有することができ、上記配列中の上記アルギニン残基の少なくとも１個がＤ−アルギニンである。
【０００８】
一実施の形態では、上記抗微生物ペプチドがｒＲｒＧＲＳＰｒＲｒＴＰＳＰｒＲｒＲＳＱＳＰｒＲｒＲＳＣ（配列番号７）の配列を含み、ここで、ＲがＬ−アルギニンであり、ｒがＤ−アルギニンである。代替的には、上記ペプチドがＲｒＲＧＲＳＰＲｒＲＴＰＳＰＲｒＲｒＳＱＳＰＲｒＲｒＳＣ（配列番号７）の配列を含むことができ、ここで、ＲがＬ−アルギニンであり、ｒがＤ−アルギニンである。
【０００９】
上記抗微生物ペプチドは、ＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲＣ（配列番号９）の配列を含むことができ、ここで、上記配列中の上記アルギニン残基の少なくとも１個（例えばアルギニン残基の２０％、３０％、４０％又は５０％）がＤ−アルギニンである。例えば、上記配列がｒＲｒＧＲＰｒＲｒＰＰｒＲｒＲＱＰｒＲｒＲＣ（配列番号９）とすることができ、ここで、ＲがＬ−アルギニンであり、ｒがＤ−アルギニンである。
【００１０】
一実施の形態では、上記抗微生物ペプチドは非ＨＢｃＡＲＤペプチド（例えばアフィニティータグ、シグナル配列、リガンド、又は別の抗微生物ペプチド若しくはそのフラグメント）を更に含む。上記非ＨＢｃＡＲＤペプチドがポリヒスチジン又はその類縁体でもよい。一実施の形態では、上記ペプチドが、
（ｉ）ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１４）、
（ｉｉ）ＨＨＨＨＨＨＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳ（配列番号１５）、
（ｉｉｉ）ＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲＨＨＨＨＨＨ（配列番号１６）、及び、
（ｉｖ）ＨＨＨＨＨＨＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲ（配列番号１７）、
からなる群から選択される配列を有する。
【００１１】
別の態様では、本明細書に開示される抗微生物ペプチドと、非ペプチド部分とを含む抗微生物ペプチドコンジュゲートが、本明細書に記載される。
【００１２】
更に別の態様では、医薬組成物が本明細書に記載される。該組成物は、抗微生物ペプチド又は抗微生物コンジュゲートと、薬学的に許容可能な担体とを含む。
【００１３】
また、感染症の治療を、それを必要とする被験体において行う方法が、本明細書において意図される。該方法は、本明細書に記載される抗微生物ペプチド、抗微生物ペプチドコンジュゲート又は医薬組成物を、被験体に投与することを含む。
【００１４】
１つ以上の実施形態の詳細を添付の図面及び下記明細書に記載する。本実施形態の他の特徴、目的、及び利点は、明細書及び図面及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＨＢｃＡＲＤドメインの２セットの配列アラインメントを含む図である。（Ａ）ＨＢｃＡＲＤ配列は、ヒト（配列番号６）、ウーリーモンキー（配列番号１８）、ジリス（配列番号１９）、ウッドチャック（配列番号２０）、及びコウモリ（配列番号２１）の間で高度に保存される。（Ｂ）また、アヒル（配列番号２２）、サギ（配列番号２３）、オウム（配列番号２４）、ヒメハクガン（配列番号２５）及びハクガンのＢ型肝炎ウイルス（配列番号２６）のＨＢｃ  Ｃ末端にて分離された４個の正電荷クラスターも存在する。
【図２】Ｌ−ＨＢｃＡＲＤペプチドとＤ−ＨＢｃＡＲＤペプチドとの間の血清耐性の比較を示すグラフのセットである。ペプチド（Ｌ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤ）を、５％ウシ胎児血清（Ａ）、５％マウス血清（Ｂ）、又はヒト血清（男性及び女性）（Ｃ）を含むＭＢＣバッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム及び５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）と共に、３７℃で３時間インキュベートした。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動及びグリーンエンジェル染色（green angel staining）を使用してペプチドの量を特定した。（Ｄ）ペプチドＤ−ＨＢｃＡＲＤは、ＭＢＣアッセイにおいてＬ−ＨＢｃＡＲＤよりも１００００倍高い効力を示した。ペプチド（Ｌ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤ）を、５％マウス血清と共に又はそれを含まずにＳ．アウレウス（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６と３７℃で３時間インキュベートした。抗微生物活性をコロニー形成アッセイにより判定した。＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図３】Ｌ−ＨＢｃＡＲＤペプチドとＤ−ＨＢｃＡＲＤペプチドとの間の溶血効果の比較を示すグラフである。ヒト赤血球を種々の濃度のペプチドと共にインキュベートした。溶血は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００誘導性溶血のパーセンテージとして提示される。＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図４】Ｓ．アウレウスに感染したマウス敗血症モデルにおいて、Ｌ型ＨＢｃＡＲＤペプチドとＤ型ＨＢｃＡＲＤペプチドとの間のｉｎ  ｖｉｖｏ保護活性の比較を示すグラフのセットである。（Ａ）３週齢のＩＣＲマウスにＳ．アウレウス（４×１０６ＣＦＵ／マウス）を接種し、接種から２時間後にＰＢＳ、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤ又はＤ−ＨＢｃＡＲＤを腹腔内注射した。各群は１０匹のマウスを含んだ。（Ｂ）及び（Ｃ）０日目、３日目及び６日目に３週齢のＩＣＲマウスをＬ−ＨＢｃＡＲＤペプチド及びＤ−ＨＢｃＡＲＤペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）でそれぞれ免疫した。１４日目にマウスにＳ．アウレウス（４×１０６ＣＦＵ／マウス）を接種し、接種から１時間後にＰＢＳ、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤ又はＤ−ＨＢｃＡＲＤ（１０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ腹腔内注射した。別の群のマウスを、対照としてＰＢＳで平行して処置した。各群の動物は、５匹のマウスを含んだ。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意性なし。
【図５】ＩＣＲマウス敗血症モデルにおける種々の用量の様々な改変ＨＢｃＡＲＤペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ保護効能を示すグラフである。
【図６】ＢＡＬＢ／ｃマウス肺感染症モデルにおける１５０−１７７Ｃ及び１５０−１７７Ｑのペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ保護効能を示すグラフである。コリスチン耐性Ａ．バウマニ（A. baumannii）を気管内経路により接種した。
【図７】ポリミキシンＢとの比較における、ＨＢｃＡＲＤペプチドＤ−１５０−１７７Ｃのより低いｉｎ  ｖｉｖｏ毒性を示すグラフのセットである。０日目に雄性ＩＣＲマウス（５匹のマウス／群）に種々の用量のＤ−１５０−１７７Ｃペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ〜８０ｍｇ／ｋｇ）、及びポリミキシンＢ（５０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ腹腔内注射した。（Ａ）全ての群の生存率を７日間モニターした。（Ｂ）Ｄ−１５０−１７７Ｃ及びポリミキシンＢで処置されたマウスから収集した血清試料を１日目にアラニンアミノトランスフェラーゼ活性（ＡＬＴ）について判定した。破線は、ＩＣＲマウス（Charles River Laboratories）のＡＬＴ値（４５Ｕ／Ｌ）の平均を表す。
【図８】全てがＤ−アルギニンで置換された、及び部分的にＤ−アルギニンで置換された１５０−１７７Ｃペプチドのマウス敗血症モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ保護効能を示すグラフである。接種から２時間後、マウス（ｎ＝１０匹／群）を５ｍｇ／ｋｇの様々なペプチドＤ−、ＤＬ−、ＬＤ−１５０−１７７Ｃ及びＰＢＳでそれぞれ処置した。ペプチドＤ−及びＤＬ−１５０−１７７Ｃは、全てのＳ．アウレウス感染マウスを死亡させずに保護したのに対し、ペプチドＬＤ−１５０−１７７Ｃは８０％のマウスしか保護しなかった。
【図９】ペプチドＤＬ−１５０−１７７Ｃからのセリン残基及びトレオニン残基の欠失が、種々の用量でマウス敗血症モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ保護効能を改善したことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
予想外なことに、ＨＢＶコアタンパク質のアルギニンリッチドメインに由来する特定の改変ペプチドが、広域スペクトルの抗微生物活性を示すことを発見した。
【００１７】
抗微生物ペプチドが本明細書に記載される。該抗微生物ペプチドは、少なくとも２個（例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個）の可変ドメインを含む。可変ドメインはタンデムであり、可変リンカーによって互いに分離される。抗微生物ペプチドは、最大１００個のアミノ酸長（例えば１０個未満、１０個、１４個、１５個、２０個、２１個、２２個、２５個、２８個、３０個、３５個、３７個、４０個、４５個、４７個、５０個、５５個、５７個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸）を有し得る。一実施形態では、ペプチドは、Ｃ末端システインを有する。
【００１８】
可変ドメインは各々、個別に、少なくとも２個（例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個）の連続する塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、ヒスチジン及びリジンの配列である。各可変ドメインは、同一の塩基性アミノ酸又は異なる塩基性アミノ酸の配列を含み得る。例えば、抗微生物ペプチドは２個〜２０個の同一又は異なる可変ドメインを含んでもよく、それぞれがＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０（配列番号２７）であって、ここで、Ｘ１〜Ｘ２０は各々、個別にアルギニン、ヒスチジン又はリジン（天然又は化学的に改変される）であり、Ｘ３〜Ｘ２０のいずれかは存在してもよく、又は存在しなくてもよい。例えば、各可変ドメインは、２個〜１０個の塩基性アミノ酸を有し得る。
【００１９】
一実施形態では、ペプチド中の少なくとも１個の可変ドメインは、アルギニン残基のみからなる。別の実施形態では、ペプチド中の全ての可変ドメインが、アルギニン残基のみを含む。或いは、上記ペプチドは、１個以上のヒスチジン残基又はリジン残基を有する、少なくとも１個の可変ドメインを含み得る。
【００２０】
各可変リンカーは、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個）のアミノ酸を有し、任意のアミノ酸も含むことができる。可変リンカーは、２個以上の連続する塩基性アミノ酸を含むことはできない。
【００２１】
「アミノ酸」の用語は、２０個の標準アミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン）のうちのいずれかを指す。また、上記用語は、非標準アミノ酸、非タンパク質新生アミノ酸若しくは化学的に改変されたアミノ酸、又はアミノ酸類縁体を指す場合がある。アミノ酸は、Ｌ型又はＤ型の立体異性体であってもよい。
【００２２】
「塩基性アミノ酸」の用語は、アルギニン、リジン若しくはヒスチジン、それらのＬ型若しくはＤ型、又はそれらの類縁体を指す。
【００２３】
非標準アミノ酸として、セレノシステイン、ピロリジン、Ｎ−ホルミルメチオニン、非タンパク質新生アミノ酸、アミノ酸類縁体、及び化学的に改変されたアミノ酸が挙げられる。化学的に改変されたアミノ酸又はアミノ酸類縁体は、典型的には、その天然相当物とは異なる側鎖を有する。アミノ酸類縁体及びポリペプチドにそれらを組み込む方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Nguyen et al., Biochemica et Biophysica Acta 1808 (2011), 2297-2303、Knappe, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 54(9) 2010, 4003-4005、米国特許第７８７９９７９号、米国特許第５９７２９４０号、米国特許第８８３５１６２号、及び米国特許出願公開第２００８０１９９９６４号を参照されたい。また、アミノ酸類縁体を商業的に入手することもできる。抗微生物ペプチドの安定性、バイオアベイラビリティー、薬物動態、組織内分布、安全性、耐容性及び／又は効能を改善するため、アミノ酸類縁体を抗微生物ペプチドに組み込むことができる。
【００２４】
本明細書に記載される抗微生物ペプチドのいずれかは、２０個の標準アミノ酸のうちの１つではない１個以上の残基を含み得る。特に、可変ドメイン又は抗微生物ペプチド全体において１個以上（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２％、３％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％）の塩基性アミノ酸が、Ｄ型の天然のアルギニン、リジン若しくはヒスチジン、又は天然のアルギニン、リジン若しくはヒスチジンの類縁体であってもよい。
【００２５】
抗微生物ペプチドは、ヘパドナウイルスコアタンパク質のアルギニンリッチドメイン（ＨＢｃＡＲＤ）に由来し得る。ＨＢｃＡＲＤは、コアタンパク質（ＨＢｃ）の高度に保存されたアルギニンに富むＣ末端領域を指す。図１を参照されたい。ＨＢｃは、哺乳動物のＨＢｃであってもよく、又は鳥類のＨＢｃであってもよい。哺乳動物のＨＢｃは、ヒトＨＢｃ、ウーリーモンキーＨＢｃ、ジリスＨＢｃ、ウッドチャックＨＢｃ及びコウモリＨＢｃであってもよい。鳥類のＨＢｃは、アヒル、サギ、オウム、ヒメハクガン又はハクガンのＨＢｃであってもよい。ＨＢｃは、任意の遺伝子型のヘパドナウイルスに由来し得る。
【００２６】
例えば、抗微生物ペプチドは、ＨＢｃＡＲＤのフラグメント又はその変異体（例えば、１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む）を含み得る。可変ドメイン及びリンカーはＨＢｃＡＲＤに由来してもよい。例えば、ＨＢｃＡＲＤ又はその変異体における任意の２個のアルギニンリピートの間の配列をリンカーとして使用することができる。
【００２７】
一実施形態では、上記抗微生物ペプチドが、
（ｉ）（Ｘ１）ＧＲＸ２Ｐ（Ｘ３）Ｘ４ＰＸ５Ｐ（Ｘ６）Ｘ７ＱＸ８Ｐ（Ｘ９）（配列番号１）
（ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ６及びＸ９の各々は、個別に可変ドメインであり、
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７及びＸ８の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である）、
（ｉｉ）（Ｘ１）ＧＲＸ２Ｐ（Ｘ３）Ｘ４ＰＸ５Ｐ（Ｘ６）（配列番号２）
（ここで、Ｘ１、Ｘ３及びＸ６の各々は、個別に可変ドメインであり、
Ｘ２、Ｘ４及びＸ５の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である）、及び、
（ｉｉｉ）（Ｘ１）Ｘ２ＰＸ３Ｐ（Ｘ４）Ｘ５ＱＸ６Ｐ（Ｘ７）（配列番号３）
（ここで、Ｘ１、Ｘ４及びＸ７の各々は、個別に可変ドメインであり、
Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５及びＸ６の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である）からなる群から選択されるコンセンサス配列を含む。各可変ドメインが２個〜２０個の連続する塩基性アミノ酸の配列である。
【００２８】
上記ペプチドが、
（ｉ）（Ｘ１）ＧＲＸ２Ｐ（Ｘ３）Ｘ４ＰＸ５Ｐ（Ｘ６）Ｘ７ＱＸ８Ｐ（Ｘ９）Ｘ１０Ｃ（配列番号４）、及び、
（ｉｉ）（Ｘ１）ＧＲＸ２Ｐ（Ｘ３）Ｘ４ＰＸ５Ｐ（Ｘ６）Ｘ７ＱＸ８Ｐ（Ｘ９）Ｘ１０Ｑ（配列番号５）
（ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ６、及びＸ９の各々は、個別に可変ドメインであり、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ８、及びＸ１０の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である）からなる群から選択されるコンセンサス配列を有することができる。
【００２９】
抗微生物ペプチドは、非ＨＢｃＡＲＤペプチドを更に含む、融合ペプチド又はキメラペプチドであってもよい。非ＨＢｃＡＲＤペプチドは、どのＨＢｃＡＲＤにも由来せず、上に記載されるリンカーによって接続される少なくとも２個の可変ドメインを含まない。非ＨＢｃＡＲＤペプチドは、別の供給源（例えば、ＨＢｃＡＲＤ以外のタンパク質由来）、操作されたペプチド（例えば別の抗微生物ペプチド）、アフィニティータグ（例えばＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、ＨＡ、ＣＢＰ、ＨＢＨ又はＶ５タグ）、シグナル配列（例えばリーダー配列又は局在化シグナル）、又はリガンド（例えば受容体リガンド）に由来するペプチドであってもよい。
【００３０】
例えば、抗微生物ペプチドは、最大１００個のアミノ酸を有することができ、以下からなる群から選択される配列を含むことができる：
（ｉ）ＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号６）（ここで、アルギニン残基の少なくとも１個はＤ−アルギニンである）、
（ｉｉ）ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＣ（配列番号７）、
（ｉｉｉ）ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱ（配列番号８）、
（ｉｖ）ＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲＣ（配列番号９）、
（ｖ）ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＣ（配列番号１０）、
（ｖｉ）ＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＣ（配列番号１１）、
（ｖｉｉ）ＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＣ（配列番号１２）、
（ｖｉｉｉ）ＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲＣ（配列番号１３）、
（ｉｘ）ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１４）、
（ｘ）ＨＨＨＨＨＨＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳ（配列番号１５）、
（ｘｉ）ＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲＨＨＨＨＨＨ（配列番号１６）、及び、
（ｘｉｉ）ＨＨＨＨＨＨＲＲＲＧＲＰＲＲＲＰＰＲＲＲＲＱＰＲＲＲＲ（配列番号１７）。
【００３１】
本明細書に記載されるように、上記抗微生物ペプチドは１個以上の改変アミノ酸を有し得る。例えば、上記配列又はコンセンサス配列のいずれかで、可変ドメイン又は抗微生物ペプチド全体において１個以上の塩基性アミノ酸がＤ型の天然のアルギニン、リジン若しくはヒスチジンであってもよく、又は天然のアルギニン、リジン若しくはヒスチジンの類縁体であってもよい。
【００３２】
上記配列又はコンセンサス配列のいずれかは、抗微生物ペプチドのＮ末端又はＣ末端に存在し得る。
【００３３】
また、本明細書に記載される抗微生物ペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端の非ペプチド部分に複合化されてペプチドコンジュゲートを形成し得る。非ペプチド部分は、ポリマー（例えばポリエチレングリコールポリマー）、オリゴ糖、脂質、糖脂質、固体支持体（例えばビーズ又はナノ粒子）、低分子薬物、ビオチン、核酸分子、抗体、ビタミン、キャリアタンパク質（例えばＫＬＨ、ＢＳＡ又はＯＶＡ）、又は検出可能な標識（例えば蛍光性、放射性、又は酵素の標識）であってもよい。ペプチドコンジュゲートも抗微生物活性を示す。ペプチドコンジュゲートを生成する方法は、当該技術分野で知られている。
【００３４】
本明細書に記載される抗微生物ペプチド又はペプチドコンジュゲートは、薬学的に許容可能な担体と混合されて医薬組成物を形成し得る。
【００３５】
上記組成物は、リン酸緩衝生理食塩水、重炭酸塩溶液及び／又はアジュバント等の薬学的に許容可能な担体と共に製剤化され得る。好適な薬学的な担体及び希釈剤と並んで、それらの使用に対して薬学的に必要とされるものは当該技術分野で知られている。この組成物は、注射用の液体溶液、エマルジョン又は別の好適な製剤として調製されてもよい。
【００３６】
有効量の上に記載される組成物が、鼻腔内の吸入、局所塗布、又は非経口経路、例えば静脈注射、皮下注射又は筋肉注射によって投与され得る。代替的には、坐剤及び経口製剤を含む他の投与様式が望ましい場合がある。坐剤に対して、結合剤及び担体は、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含み得る。経口製剤は、薬学的グレードのサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常利用される賦形剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、又は粉体の形態をとる。
【００３７】
上記組成物を、被験体において微生物感染症を治療するため又は微生物の生育を阻害するために被験体（例えばヒト、別の哺乳動物又は実験動物）に投与することができる。上記組成物を、グラム陽性若しくはグラム陰性の細菌、真菌、寄生生物、又はウイルス、例えばシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、クラブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、シゲラ・ディゼンテリエ（Shigella dysenteriae）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium Difficile）、カンジダ（Candida）、アスペルギルス（Aspergillus）、ブラストミセス（Blastomyces）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、クリプトコッカス・ガッティ（Cryptococcus gattii）、コクシジオイデス（Coccidioides）、ヒストプラズマ（Histoplasma）、ニューモシスチス・イロベチイ（Pneumocystis jirovecii）、白癬菌（ringworm）、スポロトリクス（Sporothrix）、エクセロヒルム（Exserohilum）又はクラドスポリウム（Cladosporium）によって引き起こされる感染症を治療するために使用することができる。
【００３８】
以下の特定の開示は単なる例示と解釈され、それ以外の開示を何ら限定するものではない。更に詳述しなくても、当業者であれば本明細書における説明に基づき、最大限に本開示を使用することができると思われる。本明細書に引用した全ての刊行物の全体は引用することにより本明細書の一部をなす。
【実施例】
【００３９】
ヒトＨＢｃＡＲＤに由来する改変抗微生物ペプチド
以前にヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質（ＨＢｃ）のアルギニンリッチドメイン（ＡＲＤ）に由来する新規な抗微生物ペプチドが同定された。Chen et al. (2013), PLoS Pathog 9:e1003425 doi:10.1371/journal.ppat.1003425、及びChen et al., (2016), Appl Microbiol Biotechnol. 100(21): 9125-9132を参照されたい。このＨＢｃＡＲＤペプチドは、グラム陰性及びグラム陽性の細菌に対する広域スペクトルの抗微生物活性を示した。本発明者らのマウス敗血症モデルでは、接種から２時間後のＨＢｃＡＲＤペプチドの注射は、Ｓ．アウレウスに感染したマウスの４０％を死亡させずに保護することができる。Chen et al. (2013)を参照されたい。
【００４０】
ＨＢｃＡＲＤペプチドは、様々な種のヘパドナウイルスにおいて高度に保存される。ＨＢｃＡＲＤの抗微生物効能を改善するため、本発明者らは、哺乳動物、齧歯類及び鳥類のヘパドナウイルスの様々なＨＢｃＡＲＤペプチドの配列及び抗微生物活性を比較した。ヒトヘパドナウイルスのＨＢｃＡＲＤペプチドが、最も強い抗微生物活性を示した。
【００４１】
本発明者らのリード化合物であるＨＢｃＡＲＤの効力を更に改善するため、本発明者らは、トランケーション及びＬ−アルギニンのＤ−アルギニンへの置換によって改変されたペプチドを含む、幾つかのＨＢｃＡＲＤ誘導体の各々の抗微生物活性を試験した。表１を参照されたい。
【００４２】
【表１】
2019523220.tif 000003
【００４３】
ヒト及び非ヒトのＨＢｃＡＲＤペプチドの配列及び抗微生物活性の比較
多重配列アラインメントによって、本発明者らは、ヒト（ＡＡＰ３１５７１．１）、ウーリーモンキー（ＡＡＯ７４８５９．１）、ジリス（ＡＡＢ０８０３１．１）、ウッドチャック（ＡＡＡ４６７６１．１）、コウモリ（ＡＧＴ１７５７６．１）、アヒル（ＡＡＯ４９４９０．１）、サギ（ＡＡＡ４５７３７．１）、オウム（ＡＦＹ９７７８６．１）、ヒメハクガン（ＡＡＲ８９９２８．１）及びハクガン（ＡＡＤ２２００１．１）を含む、様々なヘパドナウイルスのＨＢｃＡＲＤペプチドの配列を比較した。図１を参照されたい。ヒトＢ型肝炎ウイルスのＨＢｃＡＲＤペプチドと同様に、他の哺乳動物（ウーリーモンキー、ジリス、ウッドチャック及びコウモリ）のヘパドナウイルスのＨＢｃＡＲＤペプチドは、４個のクラスター化するアルギニンリッチドメインを含んでいた。鳥類ヘパドナウイルスと哺乳動物ヘパドナウイルスとの間のＨＢｃＡＲＤペプチドの配列相同性は低かったが、それらはいずれも４個の高度に正に帯電したドメインを含んでいた。上記ペプチドの各抗微生物活性を比較するため、本発明者らは、コウモリ、ウッドチャック、アヒル及びサギのヘパドナウイルスに由来する４つのＨＢｃＡＲＤペプチドの最小殺菌濃度を決定した。結果は、コウモリ及びウッドチャックのヘパドナウイルスに由来するペプチドは、ヒトＢ型肝炎ウイルスに由来するペプチドに匹敵する強力な抗微生物活性を表したことを示した。表２を参照されたい。対照的に、鳥類のヘパドナウイルスに由来するペプチドは、より低い抗微生物活性を示した。ヒトＨＢＶ由来のＨＢｃＡＲＤペプチドの長さはより短い（１４７−１８３；３７個のアミノ酸）ことから、本発明者らは、後の改変及び最適化の実験でこのペプチドに注目した。
【００４４】
【表２】
2019523220.tif 000004
【００４５】
Ｌ−ＨＢｃＡＲＤペプチド及びＤ−ＨＢｃＡＲＤペプチドの抗微生物活性の比較
本発明者らは、ＨＢｃＡＲＤ１４７−１８３ペプチド（３７−ｍｅｒ）上の可能性のあるプロテアーゼ切断部位を予測するために、ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒを使用した。結果は、ＨＢｃＡＲＤペプチドのアルギニン残基にプロテアーゼ切断部位の７０％超がマッピングされたことを示した（データは示されていない）。血清中でのペプチド安定性を改善するため、本発明者らは、全てのアルギニン残基をそのＤ異性体で置換するＤ−アミノ酸置換によって、改変ペプチドであるＤ−ＨＢｃＡＲＤ１４７−１８３ペプチドを合成した。
【００４６】
Ｄ−アルギニン置換が抗微生物活性を改善するかどうかを調べるため、Ｐ．エルギノーサ、Ｋ．ニューモニエ、Ａ．バウマニ、Ｅ．コリ、Ｓ．ディセンテリエ及びＳ．アウレウスを含む多種多様な細菌に対して、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤのペプチド（３７−ｍｅｒ）をサイドバイサイド（side-by-side）で試験した。Ｌ−ＨＢｃＡＲＤと比較して、Ｄ−ＨＢｃＡＲＤペプチドは、Ａ．バウマニ（ＭＢＣ＝２．３ｍｇ／Ｌ〜４．６ｍｇ／Ｌ）に対して同様の抗微生物活性、並びにＰ．エルギノーサ（ＭＢＣ＝４．６ｍｇ／Ｌ）、Ｋ．ニューモニエ（ＭＢＣ＝４．６ｍｇ／Ｌ）及びＳ．アウレウス（ＭＢＣ＝４．６ｍｇ／Ｌ〜９．２ｍｇ／Ｌ）に対してより良好な抗微生物活性を示した。しかしながら、理由はわからないが、Ｅ．コリ及びＳ．ディセンテリエに対するＤ−ＨＢｃＡＲＤペプチドの抗微生物活性は、１８．４ｍｇ／Ｌから７３．６ｍｇ／Ｌに減少した。表３を参照されたい。
【００４７】
【表３】
2019523220.tif 000005
【００４８】
Ｌ−ＨＢｃＡＲＤとＤ−ＨＢｃＡＲＤとの間の血清耐性の比較
血清プロテアーゼ分解に対する３７−ｍｅｒのＬ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤのペプチドの安定性を比較するため、本発明者らは、プロテアーゼ耐性アッセイを行った。３７℃で３時間の５％ウシ血清とのインキュベーションの後、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤペプチドの８０％超は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのグリーンエンジェルによる染色でもはや検出できなかった。対照的に、Ｄ−ＨＢｃＡＲＤペプチドのシグナル強度は、同じ条件下で減少しなかった。図２Ａを参照されたい。Ｌ−ＨＢｃＡＲＤを５％のマウス又はヒト（男性及び女性）の血清と共にインキュベートした場合に同様の結果が得られた。図２のＢ及びＣを参照されたい。これらの結果は、Ｄ−ＨＢｃＡＲＤが、ウシ胎児、マウス及びヒトの血清のプロテアーゼ消化に対して、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤよりも耐性であったことを示唆した。
【００４９】
さらに、本発明者らは、血清の存在下でＬ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤのペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗微生物活性を判定した。結果は、１８．４ｍｇ／Ｌの濃度のＬ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤの両方のペプチドが、ＭＢＣアッセイにおいてＳ．アウレウスを死滅させることができることを示した。図２Ｄを参照されたい。５％マウス血清の添加により、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤペプチドとＤ−ＨＢｃＡＲＤペプチドとの間の抗微生物活性に有意差があった（Ｐ＜０．０００１）。５％マウス血清の存在下でのＬ−ＨＢｃＡＲＤペプチドによる処置は、１０７個の細菌コロニーをもたらしたのに対し、Ｄ−ＨＢｃＡＲＤペプチドによる処置は、およそ１０３個のコロニーをもたらした。したがって、本発明者らのＤ−ＨＢｃＡＲＤペプチドは、５％マウス血清の存在下において、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤペプチドよりも高い抗微生物活性を示した。この観察は、Ｄ−ＨＢｃＡＲＤがより安定で、タンパク質分解に対して耐性であることを示唆した。
【００５０】
Ｄ−ＨＢｃＡＲＤペプチドの溶血活性
溶血アッセイにおいて、連続希釈用量（０ｍｇ／Ｌ〜４６０ｍｇ／Ｌ）のＤ−ＨＢｃＡＲＤ、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤ又はメリチンと共に、ヒトＲＢＣを３７℃で１時間インキュベートした。図３に示されるように、メリチンは８．９ｍｇ／Ｌの濃度で１００％の溶血を引き起こした。対照的に、Ｄ−ＨＢｃＡＲＤ及びＬ−ＨＢｃＡＲＤの両方のペプチドの溶血活性は、４６０ｍｇ／Ｌまで検出されなかった（Ｐ＜０．０００１）。
【００５１】
Ｓ．アウレウスに感染したマウス敗血症モデルにおけるＬ型ＨＢｃＡＲＤペプチドとＤ型ＨＢｃＡＲＤペプチドとの間のｉｎ  ｖｉｖｏ保護効能の比較
３７−ｍｅｒのＬ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤのペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ保護効能を調べるため、本発明者らは、Ｓ．アウレウスに感染したマウス敗血症モデルを行った。初めに、ＩＣＲマウスにＳ．アウレウス（４×１０６ＣＦＵ／マウス）を腹腔内で接種し、続いて、接種から２時間後にＬ−ＨＢｃＡＲＤ、Ｄ−ＨＢｃＡＲＤ及びＰＢＳの単回の腹腔内注射をそれぞれ行った。ＰＢＳが投与されたマウス（ｎ＝１０）は全て１日目に死亡した。図４Ａを参照されたい。接種から７日後、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスの４０％が生存した。図４Ａを参照されたい。対照的に、Ｄ−ＨＢｃＡＲＤペプチドは、はるかに高い生存率（５ｍｇ／ｋｇ用量で６０％、及び１０ｍｇ／ｋｇ用量で１００％）を達成することができた。図４Ａを参照されたい。これらの結果は、ＨＢｃＡＲＤのｉｎ  ｖｉｖｏ効能がＤ−アルギニン置換の戦略によって改善され得ることを示した（Ｐ＜０．０００１）。
【００５２】
Ｓ．アウレウスに感染したマウス敗血症モデルにおけるＬ型ＨＢｃＡＲＤペプチドとＤ型ＨＢｃＡＲＤペプチドとの間の免疫原性の比較
ｉｎ  ｖｉｖｏで中和抗体を誘導することによって、３７−ｍｅｒのＨＢｃＡＲＤペプチドによる反復処置が上記効能を損なう可能性があるかどうかを調べるため、本発明者らは、細菌感染に先立って、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤのペプチドのそれぞれを用いて３週齢のマウスを３回免疫した。その後、最初の免疫から２週間後に免疫したマウスにＳ．アウレウスを接種し、続いて、接種から１時間後にＬ−ＨＢｃＡＲＤペプチド又はＤ−ＨＢｃＡＲＤペプチドのいずれかを腹腔内注射した。本発明者らの先の報告（Chen et al., 2013）と一致して、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤは、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤペプチドによる事前の免疫の有無にかかわらず、ここでも全てのマウスを死亡させずに保護した。図４Ｂを参照されたい。ＰＢＳで免疫してＰＢＳで処置した対照マウスは、細菌チャレンジ後２４時間以内に８０％近くの死亡率を示した（Ｐ＜０．０５）。接種から７日後、Ｄ−ＨＢｃＡＲＤによる事前の免疫の有無にかかわらず、Ｌ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した全てのマウスが細菌チャレンジを生き延びた。図４Ｃを参照されたい。したがって、Ｄ型又はＬ型のいずれかのペプチドによる事前の免疫は、後のＨＢｃＡＲＤペプチドによる処置のｉｎ  ｖｉｖｏ抗微生物活性に対する中和活性を誘導しなかった。
【００５３】
末端のシステインの重要性
本発明者らは、更なるＨＢｃＡＲＤ誘導体の抗微生物活性を試験した。表１を参照されたい。これらのペプチドの抗微生物活性を、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）によって判定した。親ペプチドＨＢｃＡＲＤ  １４７−１８３（３７−ｍｅｒ）（Chen et al., 2013を参照されたい）とは異なり、誘導体ペプチドＨＢｃＡＲＤ  １５０−１７７Ｑ（２８−ｍｅｒ）は、Ｓ．アウレウスに対して検出可能な殺菌活性を示さなかった。表４を参照されたい。カルボキシル末端にシステインを有する親ペプチドＨＢｃＡＲＤ  １４７−１８３を模倣するため、本発明者らは、ＨＢｃＡＲＤ  １５０−１７７Ｑの末端のＱ（グルタミン）残基をＣ（システイン）残基に置換することによって別の２８−ｍｅｒの誘導体であるＨＢｃＡＲＤ  １５０−１７７Ｃを設計した。表１を参照されたい。興味深いことに、このＱからＣへの置換は、Ｓ．アウレウスに対する殺菌活性を効果的に回復した（rescued）。表４を参照されたい。
【００５４】
【表４】
2019523220.tif 000006
【００５５】
長さ又はアルギニン含有量の重要性
末端システインが殺菌活性にとって重要なようであるという事実を考慮して、本発明者らは、ＨＢｃＡＲＤ  １５０−１７７Ｃペプチド（２８−ｍｅｒ）の全長を更に減らせるかを求めた。本発明者らは、１５０−１７１Ｃ（２０−ｍｅｒ）、１５７−１７７Ｃ（２１−ｍｅｒ）及び１６４−１７７Ｃ（１４−ｍｅｒ）のペプチド間のＳ．アウレウスに対する効力を比較した。表４に示されるように、これらのペプチドのいずれも検出可能な活性を示さなかった。ここでの結果は、アルギニン数が減じられたより短いペプチドは、Ｓ．アウレウスに対して抗微生物活性を表さないことを示した。表４を参照されたい。一方、本発明者らは、３個の可変ドメインを含むより短いペプチドが他の細菌を死滅させるのに十分であることを示した（データは示されていない）。
【００５６】
２８−ｍｅｒペプチドＤ−１５０−１７７Ｃは敗血症マウスモデルにおける保護効能を改善した
本発明者らは、Ｄ型又はＬ型のアルギニンのいずれかを含むＨＢｃＡＲＤ  １５０−１７７Ｃペプチド（２８−ｍｅｒ）のｉｎ  ｖｉｖｏ保護効能を比較した。表１及び図５を参照されたい。ＩＣＲマウス（ｎ＝１０匹／群）にＳ．アウレウスＡＴＣＣ１９６３６（４×１０６個／マウス）を腹腔内で接種し、続いて、接種から２時間後、改変ペプチドで処置した。全てのＰＢＳ対照マウスは１日目に死亡し、対照ペプチド（１５０−１７７Ｑ）で処置したマウスのわずか２０％が生存した。５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量のＬ−１５０−１７７Ｃペプチドの投与は、それぞれ、３０％及び７０％のマウスを死亡させずに保護した。図５を参照されたい。５ｍｇ／ｋｇのＤ−１５０−１７７Ｃで処置した場合、全てのマウス（１００％）が生存した。
【００５７】
２８−ｍｅｒペプチドＤ−１５０−１７７Ｃはコリスチン耐性Ａ．バウマニによる肺感染症からマウスを保護した
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８匹／群）にコリスチン耐性Ａ．バウマニＴＣＧＨ４６７０９（３．４×１０８ｃｆｕ／マウス）を気管内接種した。これらの肺感染マウスをコリスチン（５ｍｇ／ｋｇ／日）又はＤ−１５０−１７７Ｃ（５ｍｇ／ｋｇ／日及び１０ｍｇ／ｋｇ／日）でそれぞれ腹腔内処置した。コリスチンで処置したマウスは全て、薬剤耐性Ａ．バウマニによる接種から６０時間後に死亡した。図６を参照されたい。対照的に、Ｄ−１５０−１７７Ｃに由来する用量依存的な保護効果があった。マウスを１０ｍｇ／ｋｇ／日のＤ−１５０−１７７Ｃペプチドで処置した場合に有意差が観察された（ｐ＜０．０５）。図６を参照されたい。
【００５８】
ペプチドＤ−１５０−１７７ＣとポリミキシンＢとの間のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性の比較
敗血症マウスモデルを使用して、本発明者らは、２８−ｍｅｒのＤ−１５０−１７７Ｃペプチド（２０ｍｇ／体重ｋｇ〜８０ｍｇ／体重ｋｇ）及びポリミキシンＢ（コリスチン関連化合物）（５０ｍｇ／体重ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したＩＣＲマウスの生存率を調査した。図７Ａを参照されたい。腎臓に対するコリスチン及びポリミキシンＢの周知の腎毒性から予想されたように、ポリミキシンＢ（５０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスは全て１日目に死亡した。図７Ａを参照されたい。対照的に、急性毒性は、２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇのＤ−１５０−１７７Ｃで処置されたマウスでは観察されなかった。図７Ａを参照されたい。用量を６０ｍｇ／ｋｇ及び８０ｍｇ／ｋｇに増加させた場合、マウスの生存率は、それぞれ８０％及び４０％まで減少した。図７Ａを参照されたい。肝傷害は、血清ＡＬＴレベルによって検出され得る。２０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの用量範囲のＤ−１５０−１７７Ｃで処置されたマウスは、ポリミキシンＢより高いＡＬＴレベルを示したが、ｐ値は有意ではない。図７Ｂを参照されたい。６０ｍｇ／ｋｇで処置されたマウスのＡＬＴレベルは、２０ｍｇ／ｋｇのポリミキシンＢで処置されたものより有意に高かった（ｐ＜０．０１）。図７Ｂを参照されたい。
【００５９】
様々な改変１５０−１７７Ｃペプチド間のｉｎ  ｖｉｖｏ保護効能の比較
２８−ｍｅｒのペプチドＤ−１５０−１７７Ｃは、１４個のＤ−アルギニンで置換された合計１４個のＬ−アルギニンを含む。表１及び図６を参照されたい。Ｄ−アルギニンはＬ−アルギニンよりはるかに高価である。ペプチド合成のコストを削減するため、本発明者らは、完全な又は部分的なＤ−アルギニン置換を含むペプチド間のｉｎ  ｖｉｖｏ保護効能を比較した。表１及び図８を参照されたい。ペプチドＤＬ−１５０−１７７Ｃは一部のみがＤ−アルギニン置換されており、全てがＤ−アルギニンで置換されたペプチドＤ−１５０−１７７Ｃ（１００％置換）と非常に類似する保護効能を示した。図８を参照されたい。対照的に、ペプチドＬＤ−１５０−１７７Ｃ（これもまた部分的に置換されている）の保護効能はＤＬ−１５０−１７７Ｃよりも低いようである。図８を参照されたい。
【００６０】
セリン及びトレオニンは必須ではない
本発明者らは、２つの主な改変、すなわち、（１）ペプチドＤＬ−１５０−１７７Ｃの骨格を使用することによる部分的なＤ−アルギニン置換、並びに（２）２８−ｍｅｒの親ペプチドＤＬ−１５０−１７７Ｃに由来する５個のセリン残基及び１個のトレオニン残基の欠失を有する新たな２２−ｍｅｒのペプチド、ＤＬ−ｄＳＴ−１５０−１７７Ｃ（表１を参照されたい）を操作した。この２２−ｍｅｒのペプチドＤＬ−ｄＳＴ−１５０−１７７Ｃは、２８−ｍｅｒのＤＬ−１５０−１７７Ｃ及びＬ−１５０−１７７Ｃと比較して、著しく改善された保護効能を示した。図９を参照されたい。
【００６１】
細菌単離株
シュードモナス・エルギノーサミグラ（Migula）株（ＡＴＣＣ２７８５３、アンピシリン耐性、及びＡＴＣＣ９０２７、アンピシリン耐性）、クラブシエラ・ニューモニエ株（ＡＴＣＣ１３８８４）、シゲラ・ディゼンテリエＸｅｎ２７（Caliper Co.）、エシェリキア・コリ株（ＡＴＣＣ２５９２２）、スタフィロコッカス・アウレウス亜種株（ＡＴＣＣ２５９２３、メチシリン耐性、ＡＴＣＣ２９２１３、メチシリン耐性、及びＡＴＣＣ１９６３６、メチシリン耐性）及びアシネトバクター・バウマニ株（ＡＴＣＣ１７９７８、ＡＴＣＣ１７９７８  ＣＲ、ＡＴＣＣ１９６０６、ＡＴＣＣ１９６０６  ＣＲ、ＴＣＧＨ４５５３０及びＴＣＧＨ４６７０９）を含む、数多くの細菌株を使用して、ＨＢｃＡＲＤペプチドの抗微生物活性を試験した。台湾の慈済仏教徒総合病院（ＴＣＧＨ）から臨床分離株ＴＣＧＨ４５５３０及びＴＣＧＨ４６７０９を得て、Ｖｉｔｅｋシステム（米国ミズーリ州ヘイゼルウッドのBiomerieux Vitek, Inc.）を使用して同定した。Chang et al. (2012), J Microbiol Immunol Infect 45:37-42 doi:10.1016/j.jmii.2011.09.019を参照されたい。
【００６２】
抗微生物アッセイ
Ｌ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤのペプチドをYao-Hong Biotechnology Inc.（台湾、台北）から購入した。抗微生物活性を記載される通りに判定した。Chen et al., 2013.を参照されたい。簡潔には、細菌を３７℃で対数中期までＭＨブロス（Difco）中で増殖させ、リン酸バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム及び５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）中に１０６ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍｌまで希釈した。ペプチドを同じバッファー中に段階希釈した。５０マイクロリットル（μｌ）の細菌を、様々な濃度のペプチド５０μｌと混合し、続いて、振蕩せずに３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーションの終了時、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）の測定のため、細菌をミュラー−ヒントンブロス寒天プレートに入れ、３７℃で一晩増殖させた。細菌増殖を示さなかった（０コロニー）最低ペプチド濃度をＭＢＣとして定義した。全てのペプチドを３回繰り返して試験した。
【００６３】
プロテアーゼに対する安定性
Ｌ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤのペプチド（０．５ｎｍｏｌ）をウシ、マウス及びヒトの起源から収集した５％血清の存在下又は不在下でＭＢＣバッファーと混合した。３７℃で３時間のインキュベーションの後、プロテアーゼ消化から残存するペプチドの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及びグリーンエンジェルによる染色によって特定した。画像をｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して定量し、血清を含まない対照を用いて強度を正規化した。ＨＢｃＡＲＤペプチドの抗微生物活性に対する血清の効果を調べるため、各ＭＢＣ濃度のＬ−ＨＢｃＡＲＤペプチド及びＤ−ＨＢｃＡＲＤペプチドをＳ．アウレウスＡＴＣＣ１９６３６株（１０６ＣＦＵ／ｍｌ）と共に３７℃で３時間インキュベートした。細菌をＭＨ寒天上に蒔き、抗微生物活性をコロニー形成によって判定した。
【００６４】
溶血活性
ペプチドの溶血活性をヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対して溶血によって判定した。ヒト血液をＥＤＴＡ含有チューブに得て、４５０ｇで１０分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳバッファーで３回洗浄し、１０％ｈＲＢＣの溶液を調製した。ｈＲＢＣ溶液を、ＰＢＳバッファー中のペプチドの段階希釈物と混合し、該反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４５０ｇで１０分間の遠心分離の後、４０５ｎｍの波長での上清の吸光度を測定することにより溶血のパーセンテージを決定した。ブランク及び１００％溶血を、ＰＢＳバッファー及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下でそれぞれ判定した。
【００６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ動物研究
３週齢の雄性ＩＣＲマウス（１９ｇ〜２１ｇ）をBioLASCO（台湾）から購入した。ＨＢｃＡＲＤペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ保護効能を試験するため、全てのマウスにＳ．アウレウスＡＴＣＣ１９６３６（４×１０６ＣＦＵ／マウス）を腹腔内で接種した。細菌接種から２時間後、ＨＢｃ１４７−１８３（Ｌ−ＨＢｃＡＲＤ又はＤ−ＨＢｃＡＲＤ）又はＰＢＳ対照をそれぞれ腹腔内投与した。各群は１０匹のマウスを含んだ。細菌接種に続いて７日間に亘って毎日、死亡率をモニターした。
【００６６】
ＨＢｃＡＲＤペプチドの免疫原性の可能性を調べるため、本発明者らは、ペプチドで免疫したマウスにおけるＨＢｃＡＲＤペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ抗微生物活性を判定した。簡潔には、３週齢の雄性マウスを、それぞれ０日目、３日目及び６日目に０．２ｍｌのＬ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤのペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）で３回免疫した。１４日目に、免疫したマウスにＳ．アウレウスＡＴＣＣ１９６３６（４×１０６ＣＦＵ／マウス）を接種し、接種から１時間後、０．２ｍｌのＰＢＳ、又はＬ−ＨＢｃＡＲＤ及びＤ−ＨＢｃＡＲＤのペプチド（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。別の群のマウスは、対照としてのＰＢＳによる同一のプロトコルを受けた。各群は５匹のマウスを含んだ。細菌接種に続いて７日間に亘って毎日、死亡率をモニターした。
【００６７】
統計学的解析
Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用して統計学的解析を行った。結果を平均±ＳＤで示し、個々の群間の差をスチューデントｔ試験によって解析した。生存曲線をカプラン−マイヤー法によってプロットし、ログランク検定によって解析した。
【００６８】
その他の実施形態
本明細書に開示される全ての特徴は、あらゆる組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される各々の特徴は、同じ目的、同等の目的又は同様の目的にかなう代替となる特徴によって置き換えられてよい。このように、特に明示的に述べられない限り、開示される各々の特徴は、包括的な一連の同等の特徴又は同様の特徴のうちの単なる一例である。
【００６９】
上記詳細な説明から、当業者であれば、記載される実施形態の本質的な特性を容易に特定することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な使用法及び条件に適合するために上記実施形態の様々な変更、派生及び修正を行うことができる。このように、その他の実施形態も特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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