(57)【要約】  本発明は、ドウを製造する方法であって、ドウ構成成分、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素を混合する工程を含む方法に関する。ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用することができるホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素を含む食品用酵素組成物も教示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品用酵素組成物であって、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素を含む食品用酵素組成物。
【請求項２】
ドウを製造する方法であって、ドウ構成成分、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素を混合する工程を含む方法。
【請求項３】
ドウまたはベークド製品の製造における、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素の使用であって、ベークド製品の比体積；ドウの特性（ドウの形成；ドウの伸展性など）を改良するため；ベークド製品のクラストのクリスピー性を改良するため；クラム構造を改良する（ベークド製品のクラム孔径を改良するか、またはベークド製品のクラム孔の均質性を改良するなど）ため；柔らかさを改良する（ベークド製品の柔らかさを改良するなど）ため；ベークド製品のオーブンスプリングを改良するため；前記ドウおよび／またはベークド製品中のＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させる（好ましくは１４〜２０個の炭素原子を含有する脂肪酸部分を備えるＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させる、好ましくは１４〜２０個の炭素原子を含有する飽和脂肪酸部分を備えるＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させる）ため；前記ドウおよび／またはベークド製品中のリソリン脂質を増加させるため；前記ドウおよび／またはベークド製品中のジガラクトシルモノグリセリドおよび／またはモノガラクトシルモノグリセリドを増加させるため；前記ドウおよび／またはベークド製品中のリソリン脂質、および／またはジガラクトシルモノグリセリド、および／またはモノガラクトシルモノグリセリドを増加させることと一緒にＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させるための使用。
【請求項４】
前記ホスホリパーゼＡ２酵素、および前記ｓｎ１位で極性脂質に作用する前記酵素は、同時または連続的のいずれかで混合または使用される、請求項２に記載の方法または請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ホスホリパーゼＡ２酵素は、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミンをドウ条件下でＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンに変換させるものであり、前記生成されたＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンの前記脂肪酸部分は、１４〜２０個の炭素原子を含有する（好ましくは、前記生成されたＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンの前記脂肪酸部分は、飽和しており、かつ１４〜２０個の炭素原子を含有し；より好ましくは、前記脂肪酸は、飽和しており、かつ１６個の炭素原子を含有する）、請求項１に記載の組成物、または請求項２もしくは４に記載の方法、または請求項３もしくは４に記載の使用。
【請求項６】
前記ｓｎ１位で極性脂質に作用する前記酵素は、ホスホリパーゼ活性、ガラクトリパーゼ活性またはそれらの組み合わせを有する酵素である、請求項１もしくは５に記載の組成物、または請求項２、４もしくは５のいずれか一項に記載の方法、または請求項３〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記ｓｎ１位で極性脂質に作用する前記酵素は、ガラクト脂質に作用する、請求項１、５もしくは６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは４〜６のいずれか一項に記載の方法、または請求項３〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記ホスホリパーゼＡ２酵素は、Ｎ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンに作用することができないか、または実質的に作用することができない、請求項１もしくは５〜７のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは４〜７のいずれか一項に記載の方法、または請求項３〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物は、レシチン、好ましくは大豆をベースとするレシチンをさらに含む、請求項１または５〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
レシチンを添加する工程、好ましくは大豆をベースとするレシチンを添加する工程をさらに含む、請求項２もしくは４〜８のいずれか一項に記載の方法、または請求項３〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記レシチンは、酵素的に修飾されたレシチンである、請求項９に記載の組成物、または請求項１０に記載の使用、または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レシチンは、ホスホリパーゼＡ２活性を備える酵素によって酵素的に修飾されている（好ましくは、前記レシチンは、前記ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２によって酵素的に修飾されている）、請求項９もしくは１１に記載の組成物、または請求項１０もしくは１１に記載の方法、または請求項１０もしくは１１に記載の使用。
【請求項１３】
製品、例えばベークド製品、または蒸し製品、または茹で製品、または揚げ製品を生成するために、前記ドウを調理する、例えば焼成するかまたは蒸す、茹でるかまたは揚げる工程をさらに含む、請求項２、４〜８もしくは１０〜１２のいずれか一項に記載の方法、または請求項３〜８もしくは１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記ドウは、パンドウ、パスタドウ、ヌードルドウ、ケーキドウ、ペストリードウまたはバッターからなる群から選択されるドウである、請求項２、４〜８もしくは１０〜１３のいずれか一項に記載の方法、または請求項３〜８もしくは１０〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記ホスホリパーゼＡ２酵素、および極性脂質に作用する前記酵素は、前記ドウから製造されるベークド製品、または蒸し製品、または茹で製品、または揚げ製品の、前記特許請求される酵素の添加を除く同一条件下で製造されたベークド製品、または蒸し製品、または茹で製品、または揚げ製品と比較して少なくとも１０％である比体積の増加を生じさせる有効量で前記ドウ構成成分に混合される、請求項２、４〜８もしくは１０〜１３のいずれか一項に記載の方法、または請求項３〜８もしくは１０〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記ホスホリパーゼＡ２酵素は、５０〜７５００ｅＰＬＵ／ｋｇ（粉）、好ましくは１５０〜２０００ｅＰＬＵ／ｋｇ（粉）、より好ましくは５００〜１０００ｅＰＬＵ／ｋｇ（粉）の濃度で存在する、請求項１もしくは５〜９のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２、４〜８もしくは１０〜１５のいずれか一項に記載の方法、または請求項３〜８もしくは１０〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、１００〜２０００ｅＰＬＵ／ｋｇ（粉）の濃度で存在する、請求項１、５〜９もしくは１６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２、４〜８もしくは１０〜１６のいずれか一項に記載の方法、または請求項３〜８もしくは１０〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
さらなる酵素は、前記組成物またはドウに添加される、請求項１、５〜９もしくは１７のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２、４〜８もしくは１０〜１７のいずれか一項に記載の方法、または請求項３〜８もしくは１０〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記さらなる酵素は、リパーゼ、デンプン分解酵素（例えば、アミラーゼまたはアミログルコシダーゼ）、ヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼ）、セルラーゼ、オキシドレダクターゼ（例えば、グルコースオキシダーゼまたはヘキソースオキシダーゼ）、脂質アシルトランスフェラーゼ、脱分枝酵素（例えば、プルラナーゼ）、ラクターゼおよびプロテアーゼからなる群から選択される１種以上である、請求項１８に記載の方法、または請求項１８に記載の組成物、または請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記ドウ中のＣ１６：０  ＮＡＬＰＥの量は、酵素を添加していないドウと比較して少なくとも１．５倍だけ増加する、請求項２、４〜８もしくは１０〜１９のいずれか一項に記載の方法、または請求項３〜８もしくは１０〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
スポンジアンドドウ法において、ＮＡＰＥに作用することができる前記ホスホリパーゼＡ２酵素は、スポンジに添加され、および前記ｓｎ１位で極性脂質に作用する前記酵素は、前記ドウに添加される、請求項２、４〜８もしくは１０〜２０のいずれか一項に記載の方法、または請求項３〜８もしくは１０〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
キットであって、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用することができるホスホリパーゼＡ２酵素、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素、および使用指示の組を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全て参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１６年４月７日に出願された米国仮特許出願第６２／３１９，３９９号明細書および２０１５年１２月２２日に出願された英国特許第１５２２６８１．４号明細書の利益を主張する国際ＰＣＴ出願である。
【０００２】
本発明は、ドウまたはベークド製品の製造における新規な酵素の組み合わせおよびそれらの使用に関する。本発明は、新規な酵素の組み合わせを使用してドウまたはベークド製品を製造する方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００３】
脂質は、小麦粉のおよそ２％を構成し、これらの脂質は、小麦粉の製パン性にとって非常に重要であると考えられる。小麦粉脂質は、非極性脂質と極性脂質とに分けることができ、改良された製パン特性およびパン特性が主として極性脂質に起因することが示されている。
【０００４】
過去数十年にわたり、一貫性のあるより高い品質のベークド商品に対する需要の高まりが広範囲の添加物の活用をもたらしてきた。製パン業界では、レシチンのような天然極性脂質を含む内因性脂質または例えばリパーゼなどの追加の酵素を補給することが公知である。
【０００５】
小麦粉中に最も豊富に含まれるリン脂質の１つは、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥ）であり、これは、酵素加水分解によってＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＬＰＥ）に変換される。ＮＡＬＰＥのさらなる加水分解は、Ｎ−アシルグリセロホスホエタノールアミン（ＮＡＧＰＥ）を生成する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明の第１態様は、食品用酵素組成物であって、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素を含む食品用酵素組成物を提供する。
【０００７】
さらなる態様では、ドウを製造する方法であって、ドウ構成成分、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素を混合する工程を含む方法が提供される。
【０００８】
なおさらなる態様では、本発明は、ドウまたはベークド製品の製造における、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素の使用であって、ベークド製品の比体積；ドウの特性（ドウの形成；ドウの伸展性など）を改良するため；ベークド製品のクラストのクリスピー性を改良するため；クラム構造を改良する（ベークド製品のクラム孔径を改良するか、またはベークド製品のクラム孔の均質性を改良するなど）ため；柔らかさを改良する（ベークド製品の柔らかさを改良するなど）ため；ベークド製品のオーブンスプリングを改良するため；ドウおよび／またはベークド製品のＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させる（好ましくは１４〜２０個の炭素原子を含有する脂肪酸部分を有するＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させる、好ましくは１４〜２０個の炭素原子を含有する飽和脂肪酸部分を有するＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させる）ため；ドウおよび／またはベークド製品中のリソリン脂質を増加させるため；ドウおよび／またはベークド製品中のジガラクトシルモノグリセリドおよび／またはモノガラクトシルモノグリセリドを増加させるため；ドウおよび／またはベークド製品中のリソリン脂質、および／またはガラクトシルモノグリセリド、および／またはモノガラクトシルモノグリセリドを増加させることと一緒にＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させるための使用を提供する。
【０００９】
なおさらなる態様では、キットであって、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用することができるホスホリパーゼＡ２酵素、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素、および使用指示の組を含むキットが提供される。
【００１０】
本発明は、本発明による方法によって得ることができる（好ましくは得られた）ドウ、または本発明による方法によって得ることができる（好ましくは得られた）ベークド製品をなおさらに提供する。
【００１１】
生物学的配列の簡単な説明
下記の配列は、米国連邦規則法典第３７編規則１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含有する特許出願のための要件  −  配列規則」）を順守しており、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９）、欧州特許条約および特許協力条約（ＰＣＴ）規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則の第２０８章および附属書Ｃの配列表要件と一致している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用した記号およびフォーマットは、米国連邦規則法典第３７編規則１．８２２に規定された規則を順守している。
【００１２】
配列番号１は、ｓｎ１位で極性脂質に作用するＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０およびＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０中の酵素のアミノ酸配列（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０１２，７３２号明細書からの配列番号６と同一）である。この酵素は、ガラクトリパーゼ活性およびホスホリパーゼ活性の両方を有することが公知である。
【００１３】
配列番号２は、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）由来の成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列である（米国特許第９，１７５，２７１号明細書を参照されたい）。
【００１４】
配列番号３は、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）Ａ２中で見いだされるｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素のアミノ酸配列である。
【００１５】
配列番号４は、ｓｎ２位でＮＡＰＥ（Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン）に作用するホスホリパーゼＡ２酵素（ＣＲＣ０８３３５）のアミノ酸配列である。
【００１６】
配列番号５は、ｓｎ２位でＮＡＰＥ（Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン）に作用するホスホリパーゼＡ２酵素（ＣＲＣ０８３３５）のヌクレオチド配列である。
【００１７】
配列番号６は、ＣＲＣ０８３３５のＮ末端予測シグナルペプチド配列である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｍｏｄｅｒｎ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（（１９８７）ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）中のＰｏｍｅｒａｎｚ，Ｙ．からの粉（特に小麦粉）中で見いだされる極性脂質および非極性脂質のリストを示す。
【図２】角食パンを焼成する際にｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素（配列番号３）（ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標））、およびｓｎ１位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用する酵素（ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０）が組み合わせて使用された場合に観察された柔らかさ作用を示す。
【図３】１００％全粒小麦パンを焼成する際にｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素（ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標））、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素（ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０）が組み合わせて使用された場合に観察された柔らかさ作用を示す。
【図４】ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０およびＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０（いずれもＤｕＰｏｎｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡｐＳから市販で入手できる）のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図５】ＣＲＣ０８３３５のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図６】ＣＲＣ０８３３５のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図７】ＣＲＣ０８３３５の合成遺伝子を含んでいるｐＺＫＹ５１２−１のプラスミドマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
略語
ＮＡＰＥ  −  Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン
ＮＡＬＰＥ  −  Ｎ−アシルリソホスファチジルエタノールアミン
ＮＡＧＰＥ  −  Ｎ−アシルグリセロホスホエタノールアミン
ＤＧＤＧ  −  ジガラクトシルジグリセリド
ＤＧＭＧ  −  ジガラクトシルモノグリセリド
ＭＧＤＧ  −  モノガラクトシルジグリセリド
ＭＧＭＧ  −  モノガラクトシルモノグリセリド
ＰＣ  −  ホスファチジルコリン
ＰＬＡ  −  ホスホリパーゼＡ
【００２０】
本発明の独創性に富む発見は、食料品（例えば、ドウおよび／またはベークド製品）における有利な特性が、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥ）に作用するホスホリパーゼＡ２酵素と、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素との組み合わせを使用することによって達成できることである。
【００２１】
本発明者らは、初めて、例えばドウまたはベークド製品などの食料品中においてｓｎ２位でＮＡＰＥに作用することができるホスホリパーゼＡ２酵素と、極性脂質に作用する酵素との組み合わせによって提供される相乗作用を示した。
【００２２】
これらの発見に基づき、ドウまたはドウから入手できる製品の調製において、ｓｎ２位でＮＡＰＥに作用することができるホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素の方法および使用が提供される。本発明は、ｓｎ２位でＮＡＰＥに作用することができるホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素を含む食品用酵素組成物をなおさらに提供する。
【００２３】
本発明は、ドウおよびドウから入手できる食品における特別な方法での特異的極性脂質の溶解に関する。
【００２４】
大多数の穀粉中に含有される極性脂質には、リン脂質およびガラクト脂質が含まれる。
【００２５】
粉、特に小麦粉に含まれる有意な量のリン脂質は、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥ）であり得る。Ｓｃｈａｆｆｅｒｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１４）６２：８２２９−８２３７）は、小麦粉が０．０２％のホスファチジルコリン（ＰＣ）と比較して平均して０．１％のＮＡＰＥを含有することを教示している。
【００２６】
粉、特に小麦粉は、ガラクト脂質を含む可能性がある。例えば、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）またはモノガラクトシルジグリセリド（ＭＧＤＧ）などのガラクト脂質は、粉、特に小麦粉に含まれる天然型（または内因性）の脂質構成成分である。
【００２７】
好ましくは、本発明において使用する酵素が作用するリン脂質および／またはガラクト脂質は、粉中の天然型のリン脂質および／またはガラクト脂質である。
【００２８】
本発明によるｓｎ２位でＮＡＰＥに作用するホスホリパーゼＡ２酵素は、本明細書において「ホスホリパーゼ活性およびＮＡＰＥ上の位置特異性を決定するためのアッセイ」で教示されたＰＬＡ２活性を有する酵素である。
【００２９】
ホスホリパーゼ活性およびＮＡＰＥ上の位置特異性を決定するためのアッセイ：
基質：０．６％の１６：０〜１８：１のＮＡＰＥ（Ｎ−リノレオイル−（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）（依頼してＡｖａｎｔｉから得るか、またはＪ．Ｌ．Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ（１９８６）４２：２４０−２６０に従って生成された）、０．４％のＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ  １００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｘ−１００）および５ｍＭのＣａＣｌ２を０．０５ＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）中に溶解させる。膵酵素に対して０．００３Ｍのデオキシコール酸塩も加えた。
【００３０】
アッセイ手順：
２ｍＬの基質を３０℃でインキュベートし、０．０５ＭのＨＥＰＥＳバッファー中の０．１ｍＬの酵素溶液（およそ５ＴＩＰＵ／ｍＬまたは反応の１０分後に消費された２〜５％の基質に対応する酵素量）を添加し、３０℃で１０分間にわたり磁気攪拌しながらインキュベートした。反応を停止させて遊離脂肪酸をプロトン化するために、４０μＬの４ＭのＨＣｌを加える。１ｍＬの９９％のエタノールを加え、ボルテックスミキサーで混合する。０．５ｍｇのＣ１７：０脂肪酸（マルガリン酸）を含有する５ｍＬのＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）を加えた。試料をボルテックスミキサー上で再び５秒間にわたり混合し、２５ｒｐｍのＲｏｔａｍｉｘ上で３０分間にわたり抽出した。試料を１０分間にわたり１５２０ｇで遠心した。
【００３１】
１基の５００ｍｇアミン（ＮＨ２）−Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  ＳＰＥカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）をＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ真空システム上に配置する。カラムは、８ｍＬの石油エーテルを用いて状態調節する。抽出からのＭＴＢＥ相をカラム上に適用し、
第１分画  ８ｍＬの溶媒Ａ：ＭＴＢＥ：２−プロパノール、２：１
第２分画  ８ｍＬの溶媒Ｂ：アセトン：ギ酸、１００：２
を用いて抽出する。
【００３２】
溶媒は、およそ０．２５ｍＬ／分で抽出した。
【００３３】
収集した脂肪酸分画（第２分画）を乾燥するまで蒸発させ、脂肪酸含量をＧＬＣによって分析する。
【００３４】
内部標準物質のＣ１７：０脂肪酸に基づき、Ｃ１６：０およびＣ１８：１脂肪酸の量を決定する。
【００３５】
ＮＡＰＥへの酵素活性は、アッセイ条件下で１分間当たりに生成された脂肪酸量（μｍｏｌ）として計算する。
【数１】
2019510466.tif 000003
式中、
Ａ＝Ｃ１６：０脂肪酸（％）＋Ｃ１８：１脂肪酸（％）
２＝基質量（ｍＬ）
１００００００＝μｍｏｌへのモル変換
Ｄ＝酵素希釈係数
ＭＶ＝生成されたＣ１６：０脂肪酸およびＣ１８：１脂肪酸の平均分子量
１０＝反応時間（分間）
０．１＝アッセイに添加された酵素量（ｍＬ）
である。
【００３６】
酵素特異性は、下記のように計算する。
【数２】
2019510466.tif 000004
【００３７】
ｓｎ２位でＮＡＰＥを優先的に溶解する、例えば加水分解するホスホリパーゼＡ２酵素は、本明細書において「ホスホリパーゼ活性およびＮＡＰＥ上の位置特異性を決定するためのアッセイ」で教示された、ＮＡＰＥへの少なくとも５０％超の相対ＰＬＡ２活性を有する酵素であろう。５０％超の相対ＰＬＡ２活性を備える酵素は、この酵素が２５％未満のｓｎ１活性および７５％超のｓｎ２活性を有することを意味する。好ましくは、ｓｎ２位でＮＡＰＥを優先的に溶解する、例えば加水分解するホスホリパーゼＡ２酵素は、本明細書において「ホスホリパーゼ活性およびＮＡＰＥ上の位置特異性を決定するためのアッセイ」で教示された、相対ＰＬＡ１活性と比較して少なくとも１０％超の相対ＰＬＡ２活性を有する酵素であろう。
【００３８】
好ましくは、ホスホリパーゼＡ２酵素がｓｎ２位でＮＡＰＥを優先的に溶解する、例えば加水分解することを決定するために、本明細書に教示した「ホスホリパーゼ活性およびＮＡＰＥ上の位置特異性を決定するためのアッセイ」が使用される。しかし、一部の実施形態では、これは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品番号Ｅ１０２１７からのＥｎｚＣｈｅｋホスホリパーゼＡ２アッセイキットを、任意選択的にこの酵素がドウ中のＮＡＬＰＥの形成を増加させながらＮＡＰＥを減少させるかどうかについて分析するドウ試験と一緒に使用することによって決定することができる。
【００３９】
ｓｎ２位でＮＡＰＥに作用するホスホリパーゼＡ２酵素に関連する用語「特に」は、この酵素が１−ＮＡＬＰＥを生成するためにｓｎ２位でＮＡＰＥの唯一の特定反応、例えば溶解（または加水分解）のみを触媒することを意味する。ｓｎ２位でＮＡＰＥを特に溶解する、例えば加水分解するホスホリパーゼＡ２酵素は、本明細書において「ホスホリパーゼ活性およびＮＡＰＥ上の位置特異性を決定するためのアッセイ」で教示された、ＰＬＡ１活性に比して少なくとも８０％超の相対ＰＬＡ２活性を有する酵素であろう。１つの実施形態では、本発明によるｓｎ２位でＮＡＰＥに作用するホスホリパーゼＡ２酵素は、下記の酵素活性：ホスホリパーゼＡ２活性（例えば、Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）または脂質アシルトランスフェラーゼ活性（例えば、Ｅ．Ｃ．２．３．１．４３）の１つ以上を有する。
【００４０】
別の実施形態によると、本発明によるｓｎ２位でＮＡＰＥに作用するホスホリパーゼＡ２酵素は、ドウ条件下でＮＡＰＥを１−ＮＡＬＰＥに変換させることができるものである。
【００４１】
別の実施形態によると、本発明によるｓｎ２位でＮＡＰＥに作用するホスホリパーゼＡ２酵素は、ＮＡＰＥを１−ＮＡＬＰＥに変換させるものであり、生成されたＮＡＬＰＥの脂肪酸部分は、１４〜２０個の炭素原子を含有する。
【００４２】
１つの実施形態では、本発明によるｓｎ２位でＮＡＰＥに作用するホスホリパーゼＡ２酵素は、ＮＡＰＥを１−ＮＡＬＰＥに変換させるものであり、生成されたＮＡＬＰＥの脂肪酸部分は、飽和しており、かつ１４〜２０個の炭素原子を含有する。
【００４３】
さらなる実施形態では、本発明によるｓｎ２位でＮＡＰＥに作用するホスホリパーゼＡ２酵素は、ＮＡＰＥを１−ＮＡＬＰＥに変換させるものであり、生成されたＮＡＬＰＥの脂肪酸部分は、飽和しており、かつ１６個の炭素原子を含有する（Ｃ１６：０）。生成されたＮＡＬＰＥの脂肪酸部分が飽和しており、かつ１６個の炭素原子を含有する、ＮＡＰＥを１−ＮＡＬＰＥに変換させるホスホリパーゼＡ２酵素は、本明細書で教示された「ホスホリパーゼ活性およびＮＡＰＥ上の位置特異性を決定するためのアッセイ」を使用して、および／または本明細書で教示された「ドウから抽出されたリン脂質を分析するためのＨＰＬＣ／ＭＳ法」を使用して決定することができる。
【００４４】
１つの実施形態では、本発明による酵素の組み合わせの使用は、酵素を添加していないドウと比較して少なくとも１．５倍だけ増加したドウ中のＣ１６：０  ＮＡＬＰＥの量を生じさせる。例えば、ドウ中のＣ１６：０  ＮＡＬＰＥの量は、少なくとも２．０倍、好ましくは少なくとも３．０倍だけ増加する可能性がある。
【００４５】
１つの実施形態では、本発明による酵素の組み合わせの使用は、酵素を添加していないドウと比較して少なくとも１．５〜約４．０倍だけ増加したドウ中のＣ１６：０  ＮＡＬＰＥの量を生じさせる。
【００４６】
ドウ条件は、当業者に周知である。これらには、ドウ構成成分の捏ね上げ（ｍｉｘｉｎｇ）中またはドウの静置中および保管中の条件が含まれる。好適なドウ条件には、ドウの捏ね上げ、ドウの静置、ドウのスケーリングおよびドウの成形、ならびにドウの発酵が含まれる。
【００４７】
本発明の別の態様によると、本明細書で特許請求されるｓｎ２位でＮＡＰＥに作用するホスホリパーゼＡ２酵素は、Ｎ−アシルリソホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＬＰＥ）に作用することができないか、または実質的に作用することができない
【００４８】
本明細書で使用する用語「Ｎ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンに実質的に作用することができない」は、「ホスホリパーゼ活性およびＮＡＰＥ上の位置特異性を決定するためのアッセイ」および「Ｎ−アシルリソホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＬＰＥ）へのリソホスホリパーゼ活性を決定するためのアッセイ」の両方において同一用量で試験した酵素が、ＮＡＰＥへの活性と比較して２０％未満のＮＡＬＰＥへの活性を有することを意味する。より好ましくは、Ｎ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンに実質的に作用することができない酵素は、ＮＡＰＥへの活性と比較して、ＮＡＬＰＥへの１０％未満の活性、より好適にはＮＡＬＰＥへの５％未満の活性、一層より好ましくは１％未満のＮＡＬＰＥ活性を有する。脂肪酸の飽和度および長さの決定は、当技術分野において公知の方法によって実施することができる。非限定的な例としての、本明細書に教示したようなガスクロマトグラフィー（ＧＣ）または液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＨＰＬＣ／ＭＳ）である。
【００４９】
Ｎ−アシルリソホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＬＰＥ）へのリソホスホリパーゼ活性を決定するためのアッセイ：
基質：０．６％の１８：１のＮＡＬＰＥ（Ｎ−リノレオイル−（１−オレイル−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）（依頼してＡｖａｎｔｉから得られるか、または「Ｎ−アシルリソホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＬＰＥ）の合成」に従って製造された）、０．４％のＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ  １００（Ｓｉｇｍａ、Ｘ−１００）および５ｍＭのＣａＣｌ２を０．０５ＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）中に溶解させた。膵酵素に対して０．００３Ｍのデオキシコール酸塩も加えた。
【００５０】
アッセイ手順：
２ｍＬの基質を３０℃でインキュベートし、０．０５ＭのＨＥＰＥＳバッファー中の０．１ｍＬの酵素溶液（およそ５ＴＩＰＵ／ｍＬまたは反応の１０分後に消費された２〜５％の基質に対応する酵素量）を添加し、１０分間にわたり磁気攪拌しながらインキュベートした。反応を停止させて遊離脂肪酸をプロトン化するために、４０μＬの４ＭのＨＣｌを加えた。１ｍＬの９９％のエタノールを加え、ボルテックスミキサーで混合した。０．５ｍｇのＣ１７：０脂肪酸（マルガリン酸）を含有する５ｍＬのＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）を添加した。試料をボルテックスミキサー上で再び５秒間にわたり混合し、２５ｒｐｍのＲｏｔａｍｉｘ上で３０分間にわたり抽出した。試料を１０分間にわたり１５２０ｇで遠心した。
【００５１】
１基の５００ｍｇのアミン（ＮＨ２）−Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  ＳＰＥカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）をＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ真空システム上に配置した。カラムは、８ｍＬの石油エーテルを用いて状態調節した。抽出からのＭＴＢＥ相をカラム上に適用し、
第１分画  ８ｍＬの溶媒Ａ：ＭＴＢＥ：２−プロパノール、２：１
第２分画  ８ｍＬの溶媒Ｂ：アセトン：ギ酸、１００：２
を用いて抽出した。
【００５２】
溶媒は、およそ０．２５ｍＬ／分で抽出した。
【００５３】
収集した脂肪酸分画（分画２）を乾燥するまで蒸発させ、脂肪酸含量をＧＬＣによって分析した。
【００５４】
内部標準物質のＣ１７：０脂肪酸に基づき、Ｃ１８：１の量を決定する。
【００５５】
ＮＡＬＰＥへの酵素活性は、アッセイ条件下で１分間当たりに生成された脂肪酸（μｍｏｌ）として計算する。
【数３】
2019510466.tif 000005
式中、
Ａ＝Ｃ１８：１脂肪酸（％）
２＝基質量（ｍＬ）
１００００００＝μｍｏｌへのモル変換
Ｄ＝酵素希釈係数
ＭＶ＝Ｃ１８：１脂肪酸の分子量
１０＝反応時間（分間）
０．１＝アッセイに添加された酵素量（ｍＬ）
である。
【００５６】
Ｎ−アシルリソホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＬＰＥ）の合成
１．５ｇの１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ製の１８：１  Ｌｙｓｏ  ＰＥ）を５０ｍＬのクロロホルム中に溶解させ、５５０μＬのトリエタノールアミンを加え、窒素下で被覆した。この溶液を氷浴上で冷却し、撹拌中に１．９ｇのリノール酸無水物を滴下した。この溶液を窒素下で被覆して２０時間にわたり２２℃で反応させた。粗反応生成物を、真空下でクロロホルムを蒸発させることにより濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製した。反応生成物Ｎ−リノレオイル−１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＮＡＬＰＥ）を単離し、構造をＮＭＲおよびＨＰＬＣ／ＭＳによって確証した。
【００５７】
１つの実施形態では、本発明によるｓｎ２位でＮＡＰＥに作用するホスホリパーゼＡ２酵素は、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ製のＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）、ＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌ、膵ＰＬＡ２、Ｌｉｐｏｍｏｄ  ６９９Ｌであってよい。
【００５８】
本発明によるｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、下記のアッセイ：「ｓｎ１位で極性脂質（ホスホリパーゼ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ」および／または「ｓｎ１位で極性脂質（ガラクト脂質；ＭＧＤＧ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ」の一方または両方を使用して決定される、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素である。
【００５９】
ｓｎ１位で極性脂質（ホスホリパーゼ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ：
ホスホリパーゼＡ１活性（ＰＬＡ１）は、基質としてＰＥＤ−Ａ１（Ｎ−（（６−（２，４−ＤＮＰ）アミノ）ヘキサノイル）−１−（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  Ｃ５）−２−ヘキシル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ａ１００７０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を使用して測定した。
【００６０】
この基質はＰＬＡ１に対して特異的であり、ｓｎ１位にＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ染料標識アシル鎖およびジニトロフェニルクエンチャー修飾頭基を備える染料標識グリセロホスホエタノールアミンである。クエンチング効率は、ｓｎ１位でＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬペンタン酸置換基の切断により、およびｓｎ２位での酵素耐性エーテル結合に伴って減少する。
【００６１】
結果は、５１５ｎｍで検出される蛍光発光におけるＰＬＡ１依存性増加である。
【００６２】
手順：
「脂質ミックス」は、エタノール中の３０μＬの１０ｍＭのジオレオイルホスファチジルコリン、エタノール中の３０μＬの１０ｍＭのジオレイルホスファチジルグリセロール、およびＤＭＳＯ中の３０μＬの２ｍＭのＰＥＤ−Ａ１を混合することによって調製した。
【００６３】
５ｍＬのバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ）、０．１４ｍＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ７．４）を２０ｍＬのビーカーに加える。渦流を形成するために、マグネティックスターラーを用いて撹拌する。基質リポソームミックスを形成するために、開口部の狭いゲル装填チップを装備した１００μＬピペットを用いて、渦流の側面に１分間にわたって５０μＬの脂質ミックスを緩徐に加える。
【００６４】
マイクロタイタープレートウエルに５０μＬの酵素試料（または標準物質もしくは対照）および５０μＬの基質リポソームミックスを加える。光線から保護して、３０分間にわたり室温でインキュベートする。４７０ｎｍでの励起および５１５ｎｍでの発光を用いて、マイクロタイタープレートリーダーを使用して蛍光を測定する。
【００６５】
較正曲線は、０〜１０Ｕ／ｍＬの様々な酵素濃度の多数の標準ＰＬＡ１溶液に基づいて構築する。酵素標準物質は、公知の活性を備えるＰＬＡ１（Ｓｉｇｍａ製のＬ３２９５）である。標準溶液の蛍光測定に基づいて、酵素濃度Ｕ／ｍＬの関数としての蛍光強度の較正曲線を構築した。標準曲線に基づいて、未知の試料の活性を測定した（Ｕ／ｍＬ）。
【００６６】
ｓｎ１位で極性脂質（ガラクト脂質；ＭＧＤＧ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ
基質：０．６％の１−リノレイル−２−オレイル−３−Ｏ−（−Ｄ−ガラクトピラノシル）−ｓｎグリセロール（Ｃ１８：２、Ｃ１８：１  ＭＧＤＧ）、０．４％のＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ  １００（Ｓｉｇｍａ、Ｘ−１００）および５ｍＭのＣａＣｌ２を０．０５ＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７）中に溶解させた。膵酵素に対して０．００３Ｍのデオキシコール酸塩も加えた。
【００６７】
アッセイ手順：
２ｍＬの基質を３０℃でインキュベートし、０．０５ＭのＨＥＰＥＳバッファー中の０．１ｍＬの酵素溶液（およそ２〜５ＴＩＰＵ／ｍＬまたは１０分間の反応によって消費されたおよそ５％の基質に対応する酵素）を添加し、３０℃で１０分間にわたり磁気攪拌しながらインキュベートした。反応を停止させて遊離脂肪酸をプロトン化するために、４０μＬの４ＭのＨＣｌを加えた。１ｍＬの９９％のエタノールを加え、ボルテックスミキサーで混合した。０．５ｍｇのＣ１７：０脂肪酸を含有する５ｍＬのＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）を加えた。試料をＷｏｒｔｅｘミキサー上で再び５秒間混合し、２５ｒｐｍのＲｏｔａｍｉｘ上で３０分間にわたり抽出した。試料を１０分間にわたり１５２０ｇで遠心した。
【００６８】
１基の５００ｍｇのアミン（ＮＨ２）−Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  ＳＰＥカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）をＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ真空システム上に配置した。カラムは、８ｍＬの石油エーテルを用いて状態調節する。抽出からのＭＴＢＥ相は、カラム上に適用し、
第１分画  ８ｍＬの溶媒Ａ：ＭＴＢＥ：２−プロパノール、２：１
第２分画  ８ｍＬの溶媒Ｂ：アセトン：ギ酸、１００：２
を用いて抽出した。
【００６９】
溶媒は、およそ０．２５ｍＬ／分で抽出した。
【００７０】
収集した脂肪酸分画（分画２）を乾燥するまで蒸発させ、脂肪酸をＧＬＣによって分析した。内部標準Ｃ１７：０脂肪酸に基づき、Ｃ１８：２およびＣ１８：１脂肪酸の量を決定した。
【００７１】
酵素活性は、アッセイ条件下で１分間当たりに生成された脂肪酸（μｍｏｌ）として計算した。
【数４】
2019510466.tif 000006
式中、
Ａ＝Ｃ１８：２脂肪酸（％）＋Ｃ１８：１脂肪酸（％）
２＝基質量（ｍＬ）
１００００００＝μｍｏｌへのモル変換
Ｄ＝酵素希釈係数
ＭＶ＝生成されたＣ１８：２脂肪酸およびＣ１８：１脂肪酸の平均分子量
１０＝反応時間（分間）
０．１＝アッセイに添加された酵素量（ｍＬ）
である。
【００７２】
酵素特異性は、下記のように計算する。
【数５】
2019510466.tif 000007
【００７３】
１−リノレイル−２−オレイル−３−Ｏ−（−Ｄ−ガラクトピラノシル）−ｓｎグリセロール（Ｃ１８：２、Ｃ１８：１  ＭＧＤＧ）の合成。
１−リノレイル−２−オレイル−３−Ｏ−（−Ｄ−ガラクトピラノシル）−ｓｎグリセロール（Ｃ１８：２、Ｃ１８：１  ＭＧＤＧ）
１−モノリノレイル−２−ヒドロキシ−３−Ｏ−（−Ｄ−２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチルガラクトピラノシル）−ｓｎ−グリセロールは、Ｓｅｌｍａｉｒ  ａｎｄ  Ｋｏｅｈｌｅｒ（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．（２００８）５６：６６９１−６７００）に従って合成した。１−モノリノレイル−２−ヒドロキシ−３−Ｏ−（＿−Ｄ−２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチルガラクトピラノシル）−ｓｎ−グリセロールは、カラムクロマトグラフィーによって９９％超の純度へ単離および精製した。
【００７４】
１−モノリノレイル−２−ヒドロキシ−３−Ｏ−（−Ｄ−２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチルガラクトピラノシル）−ｓｎ−グリセロールのｓｎ２位のアシル化は、Ｇａｆｆｎｅｙ  ａｎｄ  Ｒｅｅｓｅ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．（２００１）１：１９２−２０５）の方法に従って、アシル供与体としてオレイン酸を使用して実施した。
【００７５】
１−リノレオイル−２−オレイル−３−Ｏ−（−Ｄ−２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチルガラクトピラノシル）−ｓｎ−グリセロールの脱アシル化は、メタノール中のヒドラジンを用いて実施して、その後、カラムクロマトグラフィーによって精製し、構造を質量分光法およびＮＭＲ分析によって確証した。
【００７６】
１つの実施形態では、本発明によるｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、「ｓｎ１位で極性脂質（ホスホリパーゼ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ」と題するアッセイにおいて、相対ｓｎ２活性よりも少なくとも２０％高い相対ｓｎ１位活性を有する酵素である。１つの実施形態では、本発明によるｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、「ｓｎ１位で極性脂質（ホスホリパーゼ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ」と題するアッセイにおいて、相対ｓｎ２活性よりも少なくとも５０％高い相対ｓｎ１位活性を有する酵素である。
【００７７】
１つの実施形態では、本発明によるｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、「ｓｎ１位で極性脂質（ＭＧＤＧ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ」と題するアッセイにおいて、相対ｓｎ２活性よりも少なくとも２０％高い相対ｓｎ１位活性を有する酵素である。１つの実施形態では、本発明によるｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、「ｓｎ１位で極性脂質（ＭＧＤＧ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ」と題するアッセイにおいて、相対ｓｎ２活性よりも少なくとも５０％高い相対ｓｎ１位活性を有する酵素である。
【００７８】
１つの実施形態では、本発明によるｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、ドウ中でドウ脂質のＨＰＴＬＣ分析を使用して、ＤＧＤＧの少なくとも１０％を加水分解することができる酵素である。
【００７９】
本発明の１つの実施形態では、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、ホスホリパーゼ活性、ガラクトリパーゼ活性またはそれらの組み合わせを有する酵素である。
【００８０】
用語「極性脂質」は、粉（好ましくは小麦粉）中で見いだされる極性脂質を意味する。小麦粉中で見いだされる極性脂質は、Ｐｏｍｅｒａｎｚ，Ｙ．によって規定されている（上記；図１を参照されたい）。１つの実施形態では、用語「極性脂質」は、リン脂質、ガラクト脂質またはそれらの組み合わせからなる群の１つ以上を意味する。リン脂質は、ホスファチジルコリン、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールの１つ以上であってよい。１つの実施形態では、好ましくは、リン脂質は、ホスファチジルコリンであってよい。ガラクト脂質は、ジガラクトシルジグリセリド、セラミドジグリセリド、６−ｏ−アセチルステリルグルコシドまたはセラミドジグルコシドの１つ以上であってよい。１つの実施形態では、好ましくは、ガラクト脂質は、ジホスファチジルジグリセリドであってよい。１つの実施形態では、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、ホスホリパーゼＡ１であり、例えば、ホスホリパーゼＡ１活性を有し、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２として分類することができる。
【００８１】
ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、ガラクト脂質（例えば、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）またはモノガラクトシルジグリセリド（ＭＧＤＧ））に作用することができる。これは、そのホスホリパーゼＡ１活性に加えられてよい。
【００８２】
したがって、１つの実施形態では、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、例えばガラクトリパーゼであり、Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６として分類することができる。
【００８３】
さらなる実施形態では、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、ｓｎ１位でＤＧＤＧに作用する。
【００８４】
本明細書で使用するｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素に関連する用語「〜に作用する」は、その酵素が極性脂質のｓｎ１位から脂肪酸を（例えば、加水分解によって）除去し、したがって、例えば遊離脂肪酸を遊離させることを意味する。
【００８５】
ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素に関連した用語「優先的に」は、この酵素が、例えばｓｎ２位での極性脂質の溶解を触媒することと比較して、ｓｎ１位での極性脂質の加水分解を触媒することを優先することを意味する。ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、アッセイ：「ｓｎ１位で極性脂質（ホスホリパーゼ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ」、および／または「ホスホリパーゼ活性ならびにＰＣ（ホスファチジルコリン）へのｓｎ１およびｓｎ２の位置特異性を決定するためのアッセイ」、および／または「ｓｎ１位で極性脂質（ガラクト脂質；ＭＧＤＧ）へ作用する酵素を決定するためのアッセイ」を使用して決定することができる。
【００８６】
ホスホリパーゼ活性ならびにＰＣ（ホスファチジルコリン）へのｓｎ１およびｓｎ２の位置特異性を決定するためのアッセイ
基質：０．６％の１６：０〜１８：１  ＰＣ、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ；製品番号８５０４５７）、０．４％のＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ  １００（Ｓｉｇｍａ，Ｘ−１００）および５ｍＭのＣａＣｌ２を０．０５ＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７）中に溶解させた。膵酵素に対して０．００３Ｍのデオキシコール酸塩も加えた。
【００８７】
アッセイ手順：
２ｍＬの基質を３０℃でインキュベートし、０．０５ＭのＨＥＰＥＳバッファー中の０．１ｍＬの酵素溶液（およそ２〜５ＴＩＰＵ／ｍＬまたは反応の１０分後に消費された２〜５％の基質に対応する酵素量）を添加し、１０分間にわたり磁気攪拌しながらインキュベートした。反応を停止させて遊離脂肪酸をプロトン化するために、４０μＬの４ＭのＨＣｌを加える。１ｍＬの９９％のエタノールを加え、ボルテックスミキサーで混合する。０．５ｍｇのＣ１７：０脂肪酸（マルガリン酸）を含有する５ｍＬのＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）を加えた。試料をボルテックスミキサー上で再び５秒間混合し、２５ｒｐｍのＲｏｔａｍｉｘ上で３０分間にわたり抽出した。試料を１０分間にわたり１５２０ｇで遠心した。
【００８８】
１基の５００ｍｇのアミン（ＮＨ２）−Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  ＳＰＥカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）をＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ真空システム上に配置した。カラムは、８ｍＬの石油エーテルを用いて状態調節する。抽出からのＭＴＢＥ相は、カラム上に適用し、
第１分画  ８ｍＬの溶媒Ａ：ＭＴＢＥ：２−プロパノール、２：１
第２分画  ８ｍＬの溶媒Ｂ：アセトン：ギ酸、１００：２
を用いて抽出した。
【００８９】
溶媒は、およそ０．２５ｍＬ／分で抽出した。
【００９０】
収集した脂肪酸分画（分画２）を乾燥するまで蒸発させ、脂肪酸をＧＬＣによって分析した。内部標準物質のＣ１７：０脂肪酸に基づき、Ｃ１６：０およびＣ１８：１脂肪酸の量を決定する。
【００９１】
酵素活性は、アッセイ条件下で１分間当たりに生成された脂肪酸（μｍｏｌ）として計算する。
【数６】
2019510466.tif 000008
式中、
Ａ＝Ｃ１６：０脂肪酸（％）＋Ｃ１８：１脂肪酸（％）
２＝基質量（ｍＬ）
１００００００＝μｍｏｌへのモル変換
Ｄ＝酵素希釈係数
ＭＶ＝生成されたＣ１６：０脂肪酸およびＣ１８：１脂肪酸の平均分子量
１０＝反応時間（分間）
０．１＝アッセイに添加された酵素量（ｍＬ）
である。
【００９２】
酵素特異性は、下記のように計算する。
【数７】
2019510466.tif 000009
【００９３】
ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素に関連した用語「優先的に」は、この酵素が、例えばｓｎ２位での極性脂質の溶解を触媒することと比較して、ｓｎ１位での極性脂質の加水分解を触媒することを優先することを意味する。ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、アッセイ：「ｓｎ１位で極性脂質（ホスホリパーゼ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ」、および／または「ホスホリパーゼ活性ならびにＰＣ（ホスファチジルコリン）へのｓｎ１およびｓｎ２の位置特異性を決定するためのアッセイ」、および／または「ｓｎ１位で極性脂質（ガラクト脂質；ＭＧＤＧ）へ作用する酵素を決定するためのアッセイ」を使用して決定することができる。
【００９４】
ｓｎ１位で極性脂質に優先的に作用する酵素は、「ホスホリパーゼ活性ならびにＰＣ（ホスファチジルコリン）へのｓｎ１およびｓｎ２位置特異性を決定するためのアッセイ」、および／または「ｓｎ１位で極性脂質（ガラクト脂質；ＭＧＤＧ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ」を使用して決定した場合、相対ＰＬＡ１／ｓｎ１活性が少なくとも６０％であろうことを意味する。
【００９５】
１つの実施形態では、ｓｎ１位で極性脂質に優先的に作用する酵素は、「ホスホリパーゼ活性ならびにＰＣ（ホスファチジルコリン）へのｓｎ１およびｓｎ２位置特異性を決定するためのアッセイ」、および／または「ｓｎ１位で極性脂質（ガラクト脂質；ＭＧＤＧ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ」を使用して決定した場合、相対ＰＬＡ１／ｓｎ１活性が少なくとも７０％であろうことを意味する。
【００９６】
ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素に関連した用語「特異的に」は、この酵素が、ｓｎ１位での極性脂質の加水分解のみを触媒するであろうことを意味する。
【００９７】
ｓｎ１位で極性脂質に特異的に作用する酵素は、「ホスホリパーゼ活性ならびにＰＣ（ホスファチジルコリン）へのｓｎ１およびｓｎ２位置特異性を決定するためのアッセイ」、および／または「ｓｎ１位で極性脂質（ガラクト脂質；ＭＧＤＧ）に作用する酵素を決定するためのアッセイ」を使用して決定した場合、少なくとも６０％（好適には少なくとも７０％）の相対ＰＬＡ１／ｓｎ１活性を有することを意味する。
【００９８】
１つの実施形態によると、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、（参照により本明細書に組み込まれる）国際公開第０２／０３８０５号パンフレットで教示された酵素を含むことができる。１つの実施形態では、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素には、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０、ＰＡＮＡＭＯＲＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＰＡＮ  Ｆ（商標）およびＬＩＰＯＰＡＮ  ＥＸＴＲＡ（商標）が含まれる。
【００９９】
１つの実施形態では、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のホスホリパーゼＡ１（例えば、ＬＩＰＯＰＡＮ  Ｆ（商標））であってよい。１つの実施形態では、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のホスホリパーゼＡ１は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９８／２６０５７号パンフレットで教示された酵素であってよい。
【０１００】
１つの実施形態では、本発明によるｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有する酵素である。
【０１０１】
好ましくは、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、ＮＡＰＥへの低活性を有する。
【０１０２】
本発明の１つの利点は、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥ）に作用するホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素の組み合わせの使用である。
【０１０３】
ｓｎ１位およびｓｎ２位でのリン脂質およびガラクト脂質の脂肪酸組成物は、脂肪酸の長さおよび飽和度レベルの両方において有意に異なる。
【０１０４】
驚くべきことに、ｓｎ１位またはｓｎ２位のいずれかで作用する酵素を組み合わせることにより、例えば、焼成、蒸し加熱、茹で加熱、または揚げ加熱などの調理により、ドウおよびそのドウから得られる製品に対して有意な利点を提供する極性脂質（例えば、リソリン脂質およびリソガラクト脂質（例えば、ＭＧＭＧまたはＤＧＭＧ）の組み合わせを得ることができる。
【０１０５】
ＮＡＰＥ中でさえ、ｓｎ１位またはｓｎ２位に存在する脂肪酸は、一般的にｓｎ２位でより多くの不飽和脂肪酸が見られ、極めて相違する。ホスホリパーゼＡ１は、例えば、ｓｎ２位にある脂肪酸を用いて、ｓｎ１位でＮＡＰＥを加水分解して２−ＮＡＬＰＥを生成することができる（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｗｈｅａｔ  Ｆｌｏｕｒ  Ｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｉｄｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１０，ｐ．７６８−７７６を参照されたい）。
【０１０６】
このため、本発明は、ｓｎ１位で作用する酵素を用いて極性脂質（例えば、さらなる極性脂質）を修飾することと組み合わせて、ｓｎ２位でＮＡＰＥを溶解する（例えば、加水分解する）ことの影響に関する。
【０１０７】
本発明者らは、初めて、ＮＡＰＥおよびさらなる極性脂質を選択的に溶解する（例えば、加水分解する）ことの重要性を示す。
【０１０８】
本発明によると、ホスホリパーゼＡ２酵素、および極性脂質に作用する酵素は、ベークド製品の、本明細書で特許請求される酵素の添加を除く同一条件下で製造されたベークド製品と比較して少なくとも１０％である比体積の増加を生じさせる有効量でドウ構成成分に混合される。
【０１０９】
本発明によると、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、ベークド製品の、本明細書で特許請求される酵素の添加を除く同一条件下で製造されたベークド製品と比較して少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも３０％である増加した柔らかさを生じさせる有効量でドウ構成成分に混合される。
【０１１０】
本明細書で使用する用語「改良された柔らかさ」および「増加した柔らかさ」は、同義語と見なされ、ベークド製品中の比体積当たりの力の減少を意味する可能性がある。
【０１１１】
好適には、食品用酵素組成物は、脂質成分がドウまたはベークド製品から（例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、または液体クロマトグラフィー−質量分光法（ＨＰＬＣ／ＭＳ）、またはＨＰＴＬＣ分析を受けて）抽出されると、酵素が添加されていない場合の同一のドウまたはベークド製品と比較して、（乾燥ドウ重量に基づいてモノガラクトシルモノグリセリドの）約０．００５重量／重量％超の増加、好適には（乾燥ドウ重量に基づいてモノガラクトシルモノグリセリドの）０．０１重量／重量％超の増加、好適には０．０２５重量／重量％超の増加、好適には０．０５重量／重量％の増加、好適には（乾燥ドウ重量に基づいてモノガラクトシルモノグリセリドの）０．０７５重量／重量％超の増加を示し、ドウまたはベークド製品中のモノガラクトシルモノグリセリド含量を増加させると考えられる。
【０１１２】
好適には、食品用酵素組成物は、脂質成分がドウまたはベークド製品から（例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、または液体クロマトグラフィー−質量分光法（ＨＰＬＣ／ＭＳ）、またはＨＰＴＬＣ分析を受けて）抽出されると、酵素が添加されていない場合の同一のドウまたはベークド製品と比較して、モノガラクトシルモノグリセリドの（乾燥ドウ重量に基づいて）約０．００５〜０．１重量／重量％超の増加を示し、ドウまたはベークド製品中のモノガラクトシルモノグリセリド含量を増加させると考えられる。
【０１１３】
本発明によると、食品用酵素組成物は、脂質成分がドウまたはベークド製品から（例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、または液体クロマトグラフィー−質量分光法（ＨＰＬＣ／ＭＳ）、またはＨＰＴＬＣ分析を受けて）抽出されると、食品用酵素組成物が混合されていない場合の同一のドウまたはベークド製品と比較して、ジガラクトシルジグリセリド含量の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、好適には少なくとも４０％の減少を示し、ドウまたはベークド製品中のジガラクトシルジグリセリド含量を減少させると考えられる。
【０１１４】
本発明によると、食品用酵素組成物は、ドウまたはベークド製品中のジガラクトシルジグリセリドを減少させると考えられる。脂質成分が完全にプルーフしたドウまたはベークド製品から（例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、または液体クロマトグラフィー−質量分光法（ＨＰＬＣ／ＭＳ）、またはＨＰＴＬＣ分析を受けて）抽出されると、食品用酵素組成物が混合されていなかった場合の同一のドウまたはベークド製品と比較して、相対ジガラクトシルジグリセリド含量（例えば、乾燥ドウに基づいて約０．０１〜０．１重量／重量％）において約５％〜５０％の減少を示すと分析されている。
【０１１５】
１つの実施形態では、本発明のホスホリパーゼＡ２酵素は、１００〜７５００ｅＰＬＵ／ｋｇ（粉）の濃度で存在する。１つの実施形態では、ホスホリパーゼＡ２酵素は、１５０〜２０００ｅＰＬＵ／ｋｇ（粉）で投与される。
【０１１６】
１つの実施形態では、本発明のｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、５０〜２０００ＴＩＰＵ／ｋｇ（粉）の濃度で存在する。１つの実施形態では、本発明のｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、２００〜８００ＴＩＰＵ／ｋｇ（粉）の濃度で投与される。
【０１１７】
ｅＰＬＵアッセイ：
ホスホリパーゼＡ２酵素（ｅＰＬＵ）は、基質として卵黄を使用する下記のアッセイを使用して決定することができる。
【０１１８】
本アッセイは、食品用公定化学品集に従って実施される（ＦＣＣ，８ｅｄ．，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ５  ｐ．１３２８）。
【０１１９】
基質：
４４ｇの卵黄（ビーカー１つに卵黄２つ）を２００ｍＬの水に加え、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  ｍｉｘｅｒを用いてホモジナイズした。１０ｍＬの０．３Ｍの塩化カルシウムを添加した。１０ｍＬの基質を滴定グラスに移し、１０ｍＬの水および５ｍＬの０．０１６Ｍのデオキシコール酸塩を加えた。基質を４０℃でインキュベートし、ｐＨはｐＨスタット滴定装置を使用して、０．０５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ８へ調整した。０．１Ｍの酵素を加え、滴定データを５分間にわたり収集した。滴定剤は、０．０５ＭのＮａＯＨであった。時間の関数として滴定剤消費についての傾斜（７０秒〜１７０秒）を使用して、アッセイ条件下において１分間当たりで遊離された脂肪酸（μｍｏｌ）として活性（ｅＰＬＵ）を計算した。
【０１２０】
ＴＩＰＵアッセイ：
ホスホリパーゼ活性（ＴＩＰＵ）は、下記のアッセイを使用して決定することができる：
基質：０．６％のＬ−αホスファチジルコリン９５％植物（Ａｖａｎｔｉ、製品番号４４１６０１）、０．４％のＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ  １００（Ｓｉｇｍａ、Ｘ−１００）および５ｍＭのＣａＣｌ２を０．０５ＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７）中に溶解させた。
【０１２１】
アッセイ手順：
試料、較正用試料および対照試料は、０．１％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中に希釈した。分析は、Ｋｏｎｅｌａｂ  Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して実施した。アッセイは、３０℃でランした。３４μＬの基質を３０℃で１８０秒間にわたって温度調節し、その後、４μＬの酵素試料を添加した。酵素化は６００秒間持続した。酵素化中に遊離した遊離脂肪酸の量は、ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したＮＥＦＡキットを使用して測定した。
【０１２２】
このアッセイキットは、２種の試薬から構成される。
ＮＤＦＡ−ＨＲ（１）：
０．５３Ｕ／ｍＬのアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）
０．３１ｍＭの補酵素Ａ（ＣｏＡ）
４．３ｍＭのアデノシン５−三リン酸二ナトリウム塩（ＡＴＰ）
１．５ｍＭの４−アミノ−アンチピリン（４−ＡＡ）
２．６Ｕ／ｍＬのアスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）
０．０６２％のアジ化ナトリウム
を含有する５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）
ＮＤＦＡ−ＨＲ（２）：
２．４ｍＭの３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（Ｅ−ヒドロキシエチル）−アニリン（ＭＥＨＡ）
１２Ｕ／ｍＬのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯＤ）
１４Ｕ／ｍＬのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
【０１２３】
酵素化後、１１３μＬのＮＥＦＡ−ＨＲ（１）を加え、この混合物を３００秒間インキュベートした。その後、５６μＬのＮＥＦＡ−ＨＲ（２）を加え、この混合物を３００秒間インキュベートした。次にＯＤ５２０ｎｍを測定した。酵素活性（μｍｏｌ（ＦＦＡ）／分・ｍＬ）は、オレイン酸から生成した較正曲線に基づいて計算した。酵素活性ＴＩＰＵ（ｐＨ７）は、アッセイ条件下で１分間当たりに生成された脂肪酸（μｍｏｌ）として計算した。
【０１２４】
穀粉ドウは、本発明の組成物のための十分な量の脂質基質の全部を含有していない可能性がある。このため、酵素のための十分な基質を提供するためにドウに少なくとも１種のガラクト脂質、リン脂質またはそれらの組み合わせを補給することは本発明の範囲内に含まれる。表現「十分な基質」は、上述したドウ改良作用またはベークド製品改良作用を得るために、脂質基質のいずれも限定的ではないことを意味することは理解されるであろう。
【０１２５】
本発明の酵素にとっての補助的脂質基質は、極性脂質であってよい。これに関連して、特に有用な脂質は、例えばオート麦オイルなどの穀物由来の油または脂肪である。オート麦オイルは、典型的には、トリグリセリドに加えて、５〜２５％のリン脂質および５〜１２％の糖脂質を含有する。オート麦オイルは、高含量の極性脂質を有する分画を産生するために分別することができる。
【０１２６】
したがって、１種以上のリン脂質をドウに添加できることが企図されている。これに関連して、有用なリン脂質には、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）が含まれる。
【０１２７】
１つの実施形態では、本発明の組成物は、レシチンをさらに含む。
【０１２８】
さらなる実施形態では、本発明によって使用するための組成物は、レシチンをさらに含む。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明の方法は、レシチンを混合する工程をさらに含む。
【０１３０】
１つの実施形態では、本発明のレシチンは、大豆由来レシチンである。
【０１３１】
別の実施形態では、本発明のレシチンは、酵素的に修飾されている。
【０１３２】
好適には、本発明のレシチンは、ホスホリパーゼＡ２活性を備える酵素によって酵素的に修飾されている。
【０１３３】
好ましくは、本発明のレシチンは、Ｎ−アセチルホスファチジルエタノールアミンのｓｎ２位で作用することができるホスホリパーゼＡ２によって修飾されている。
【０１３４】
本発明は、ドウまたはベークド製品の製造における、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素の使用であって、ベークド製品の比体積；ドウの特性（ドウの形成；ドウの伸展性など）を改良するため；ベークド製品のクラストのクリスピー性を改良するため；クラム構造を改良する（ベークド製品のクラム孔径を改良するか、またはベークド製品のクラム孔の均質性を改良するなど）ため；柔らかさを改良する（ベークド製品の柔らかさを改良するなど）ため；ベークド製品のオーブンスプリングを改良するため；ドウおよび／またはベークド製品中のＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させる（好ましくは１４〜２０個の炭素原子を含有する脂肪酸部分を備えるＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させる、好ましくは１４〜２０個の炭素原子を含有する飽和脂肪酸部分を備えるＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させる）ため；ドウおよび／またはベークド製品中のリソリン脂質を増加させるため；ドウおよび／またはベークド製品中のジガラクトシルモノグリセリドおよび／またはモノガラクトシルモノグリセリドを増加させるため；ドウおよび／またはベークド製品中のリソリン脂質、および／またはジガラクトシルモノグリセリド、および／またはモノガラクトシルモノグリセリドを増加させることと一緒にＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させるための使用をさらに提供する。
【０１３５】
本発明は、さらに有利には、改良された品質特徴（ベークド製品の改良された比体積、改良されたクラストのクリスピー性など；改良されたクラム構造（ベークド製品の改良されたクラム孔径またはベークド製品のクラム孔の均質性など）；改良された柔らかさ（ベークド製品の改良された柔らかさなど）；ベークド製品の改良されたキャッピング；ベークド製品の改良されたオーブンスプリング）を得るための方法を提供する。
【０１３６】
したがって、１つの実施形態では、本発明の方法は、ドウがベークド製品を得るために焼成されるさらなる工程を含む。ベークドパン製品の１つの特に望ましい特性は、実施例に規定した高い比体積である。したがって、本発明の酵素の添加は、好ましくは、ベークド製品の、酵素が添加されないことを除く同一条件下で製造されたベークド製品と比較して少なくとも１０％である比体積の増加を生じさせる。より好ましくは、比体積の増加は、少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％である。
【０１３７】
当技術分野では、リパーゼ以外の酵素が、改良されたドウの特性およびベークド製品の品質に寄与できることは公知である。本発明の組成物に加えて、少なくとも１種のさらなる酵素を添加できることが本発明の範囲内に含まれる。そのようなさらなる酵素は、リパーゼ、デンプン分解酵素（例えば、アミラーゼまたはアミログルコシダーゼ）、ヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼ）、セルラーゼ、オキシドレダクターゼ（例えば、ヘキソースオキシダーゼなどのグルコースオキシダーゼ）、脂質アシルトランスフェラーゼ、脱分枝酵素（例えば、プルラナーゼ）、ラクターゼおよびプロテアーゼを含む。
【０１３８】
別の実施形態によると、本明細書で特許請求される方法は、さらなる酵素がドウ構成成分に混合されるさらなる工程を含む。
【０１３９】
比体積
ベークド製品中の比体積は、製品の体積をその重量で割ったものであると定義することができる（ｇ／ｍＬまたはｇ／ｃｃｍ）。
【０１４０】
本発明は、ベークド製品の比体積を改良することに関する。
【０１４１】
ドウの特徴
本発明は、ドウの特徴、例えばドウの形成；ドウの伸展性を改良することに関し得る。本発明は、ドウの粘着性に有害な影響を及ぼさない。
【０１４２】
これらは、ドウ中で下記のように測定できる。
【０１４３】
【表１】
2019510466.tif 000010
【０１４４】
クラストのクリスピー性
本発明は、ベークド製品のクラストのクリスピー性を改良することに関連し得る。
【０１４５】
これは、下記のように、ベークド製品、例えばパンまたはロールパンにおいて測定できる。
【０１４６】
【表２】
2019510466.tif 000011
【０１４７】
クラム構造
本発明は、クラム構造を改良すること（ベークド製品のクラム孔径を改良するか、またはベークド製品のクラム孔の均質性を改良するなど）に関連し得る。
【０１４８】
これらは、下記のように、ベークド製品、例えばパンまたはロールパンにおいて測定できる。
【０１４９】
【表３】
2019510466.tif 000012
【０１５０】
柔らかさ
本発明は、柔らかさを改良する（ベークド製品の柔らかさを改良するなど）ことに関連し得る。
【０１５１】
柔らかさは、当技術分野において公知の任意の方法によって測定できる。
【０１５２】
これは、下記のように、ベークド製品、例えばパンまたはロールパンにおいて測定できる。
【０１５３】
【表４】
2019510466.tif 000013
【０１５４】
１つの実施形態では、スライスパンの柔らかさ（または硬さ）は、Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ製のテクスチャーアナライザーＴＡＸＴプラスを使用してテクスチャープロファイル分析（ＴＰＡ）から決定した。一例として、第１日（Ｄ１）および第３日（Ｄ３）に柔らかさを測定するために３５ｍｍの金属プローブを使用できる。
【０１５５】
キャッピング
本発明は、ベークド製品のキャッピングに有害な影響を及ぼさない。「キャッピング」として公知である１つの一般的焼成特徴は一般に見られ、特に望ましくない。キャッピングは、上部が凝固（すなわち、硬化）した場合に発生し、その後、この上部は押し上げられ、ベークド製品、例えばマフィンまたはロールの内部からバッター（ｂａｔｔｅｒ）を側面へ漏れ出させる。その結果は、望ましくないベークド製品、例えばマフィンまたはロールとなる。
【０１５６】
キャッピングは、ベークド製品を試験することによって主観的に評価され、観察されたキャッピングの量には、定性的数字を指定した。
【０１５７】
これは、ベークド製品中で下記のように測定できる。
【０１５８】
【表５】
2019510466.tif 000014
【０１５９】
オーブンスプリング
本発明は、ベークド製品のオーブンスプリングを改良することに関連し得る。本明細書で使用する用語「オーブンスプリング」は、ベークド製品、例えばパンの、それらが高温のオーブン内に入れられた場合の体積の迅速な増加（上昇）を意味する。
【０１６０】
これは、ベークド製品中で下記のように測定できる。
【０１６１】
【表６】
2019510466.tif 000015
【０１６２】
増加させるかまたは改良すること
本明細書で使用する用語「増加させるかまたは改良すること」は、前記ドウ（例えば、ベークド製品）から入手できる同一の、しかし本発明による酵素を添加していないドウまたは製品と比較して増加させるかまたは改良することを意味する。
【０１６３】
本発明の追加の技術的作用には、ドウおよび／またはベークド製品中でＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させる（好ましくは１４〜２０個の炭素原子を含有する脂肪酸部分を備えるＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させる、好ましくは１４〜２０個の炭素原子を含有する飽和脂肪酸部分を備えるＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミンを増加させる）こと；ドウおよび／またはベークド製品中のリソ−リン脂質を増加させること；ドウおよび／またはベークド製品中のジガラクトシルモノグリセリドおよび／またはモノガラクトシルモノグリセリドを増加させることが含まれる。
【０１６４】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、ドウおよび／またはベークド製品中のリソ−リン脂質、および／またはジガラクトシルモノグリセリド、および／またはモノガラクトシルモノグリセリドを増加させることと一緒にＮ−アシルリソホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＬＰＥ）（好ましくは１−ＮＡＬＰＥ）を増加させることに関する。
【０１６５】
共力作用／相乗作用
本発明者らは、初めて、例えばドウまたはベークド製品などの食料品中においてｓｎ２位でＮＡＰＥに作用することができるホスホリパーゼＡ２酵素と、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素との組み合わせによって提供される相乗作用を示した。
【０１６６】
用語「共力作用」または「相乗作用」は、同一用量において、個別または別個に使用した場合に各酵素から得られる増加より大きい作用（例えば、パンの体積）の増加を意味する。
【０１６７】
食品または食料品
本発明の方法、使用または組成物は、食料品の調製において使用できる。ここで、用語「食料品」は、広い意味に使用され、ヒト用の食料品および動物用の食料品（すなわち飼料）を包含する。１つの好ましい態様では、食料品は、ヒトが消費するためのものである。
【０１６８】
本発明では、用語「ドウ構成成分」は、粉（例えば、穀粉、好ましくは小麦粉）、水もしくは酵母の任意の１つ、または粉、水および／もしくは酵母の１つ以上を含む任意の組成物を意味する。
【０１６９】
好ましくは、本発明の酵素は、ドウ構成成分と混合される。
【０１７０】
好ましくは、本発明の酵素は、粉または粉を含む組成物と混合される。
【０１７１】
１つの実施形態では、食料品は、ドウ、または例えば焼成もしくは蒸し加熱、茹で加熱もしくは揚げ加熱などの調理により、ドウから製造される製品である。
【０１７２】
１つの実施形態では、ベークド製品は、ドウから入手できる（好ましくは入手される）。
【０１７３】
１つの実施形態では、蒸し製品は、ドウから入手できる（好ましくは入手される）。
【０１７４】
１つの実施形態では、茹で製品は、ドウから入手できる（好ましくは入手される）。
【０１７５】
１つの実施形態では、揚げ製品は、ドウから入手できる（好ましくは入手される）。
【０１７６】
１つの実施形態では、食料品は、ベークド製品である。
【０１７７】
１つの実施形態では、食料品は、蒸し製品である。
【０１７８】
１つの実施形態では、食料品は、茹で製品である。
【０１７９】
１つの実施形態では、食料品は、揚げ製品である。
【０１８０】
本発明の方法、使用または組成物は、ドウ、または例えば調理、例えば焼成、蒸し加熱、茹で加熱もしくは揚げ加熱などによってドウから製造された製品の調製において使用できる。
【０１８１】
好ましくは、ベークド製品は、本発明に従って製造されたドウを焼成することによって製造される。
【０１８２】
好ましくは、茹で製品は、本発明に従って製造されたドウを茹でることによって製造される。
【０１８３】
好ましくは、蒸し製品は、本発明に従って製造されたドウを蒸すことによって製造される。
【０１８４】
好ましくは、揚げ製品は、本発明に従って製造されたドウを揚げることによって製造される。
【０１８５】
所定の態様のために、好ましくは、食料品は、ベークド製品、例えばパン（例えば、精白パン、全粒パンもしくはライ麦パン；典型的には、一塊のパンもしくはロールパン、フランスのバゲット型のパン、ピタパン、フラットブレッド、クリスプブレッドもしくはピザパン）、トルティーヤ、パンケーキ、マフィン、パイクラスト、ペストリー、デニッシュペストリー、ケーキ、ビスケットまたはクッキーである。
【０１８６】
１つの態様では、食料品は、蒸し製品、例えば蒸しパン、ダンプリングである。
【０１８７】
１つの態様では、食料品は、茹で製品、例えば麺類またはパスタである。
【０１８８】
１つの態様では、食料品は、揚げ製品、例えばドーナツである。
【０１８９】
本明細書に定義した「食品用酵素組成物」は、ドウに添加するために好適であるか、またはドウ構成成分と混合するために好適である任意の組成物であってよい。
【０１９０】
１つの非限定的例として、本発明の食品製品には、ベークド製品およびドウ製品が含まれる。
【０１９１】
本明細書で使用する用語「ドウ」は、粉と液体（例えば、水）との粘度の高い展性の混合物を意味する。ドウは、酵母または他の膨張剤を含むことができる。ドウは、例えば、脂肪、またはフレーバー剤、または塩、または糖などの他のドウ構成成分をさらに含むことができる。
【０１９２】
本発明によるドウは、小麦粉、トウモロコシ粉、米粉、ライ麦粉、マメ科の粉、アーモンド粉または他の穀粉から選択される粉の１つ以上から製造することができる。
【０１９３】
１つの実施形態では、ドウは、小麦粉から製造される。
【０１９４】
本発明の方法および使用は、任意の製パンプロセスの一部であってよい。本発明の組成物は、任意の製パンプロセスにおいて使用することができる。一例として、製パンプロセスは、スポンジアンドドウ；ストレート；ノータイム（ｎｏ−ｔｉｍｅ）および連続式パン製造からなる群から選択される１つ以上のプロセスであってよい。
【０１９５】
「スポンジアンドドウ」法
理論によって制限されることなく、スポンジアンドドウ捏ね上げ法は、２つの別個の段階であるスポンジ段階およびドウ段階から構成されてよい。第１段階（スポンジ段階）では、スポンジが製造されて、ある期間にわたって発酵され、第２段階（ドウ段階）では、スポンジは、完全処方をもたらす最終ドウ成分に加えられる。「スポンジ」のための他の用語には、酵母スターターまたは酵母前発酵種が含まれる。フランス式製パンでは、スポンジアンドドウ法は、ルバン−ルーブル（ｌｅｖａｉｎ−ｌｅｖｕｒｅ）として公知であり得る。
【０１９６】
第１段階では、スポンジと呼ばれる混合物は、約１／３〜３／４の粉、酵母、イーストフード（例えば、砂糖）およびモルト（麦芽）、ならびに硬いドウまたはより液状のブリューを作成するために十分な水を含有していてよい。ショートニングはこの段階で加えられてよいが、ショートニングは、通常、後に添加され、発酵を制御するために１／３〜３／４の塩が添加されてよい。
【０１９７】
スポンジは、好適には温度制御装置を備えた任意の好適な捏ね上げ装置内で混合されてよい。
【０１９８】
好適には、これは、１バッチ当たり１トンを処理する大型の水平式ドウミキサーであってよく、温度制御を可能にするために、任意選択的に熱交換ジャケットを備えて構築される。
【０１９９】
混合する工程の目標は、グルテンの形成によって成分のほぼ均質なブレンドおよび一塊のパンの基本構造を形成するであろう細長く絡み合ったタンパク質ネットワークへのドウの「形成」である。極度の剪断作用は回避しなければならないため、通常のドウミキサーは、ミキサーの本体に対して平行に方向付けられた、１分間当たり３５〜７５回転で緩徐に回転し、それらの作用によってドウを伸展および混練する数本の平行のバーを有する。典型的な捏ね上げサイクルは、約１２分間であろう。
【０２００】
混合されたスポンジは、ホイール上の浅い長方形の金属製タンクであるボウル内に一気に入れられ、制御された温度および湿度（例えば、２７℃および７５％の相対湿度）の領域内に配置され、そこで体積が減少し始めるまで発酵される。ドロップまたはブレイクと呼ばれるこのプロセスのために必要とされる時間は、約３〜５時間で落下を生じさせるために頻回に調整される、例えば温度、粉のタイプ、酵母の量、吸収および麦芽の量などの変量に左右される。
【０２０１】
第２段階またはドウ段階では、スポンジはミキサーに戻され、残りの成分が加えられる。ドウは、最適粘稠度に伸展され、その後、発酵室に戻されるか、または一層成熟させるために「フロアタイム」に置かれる。
【０２０２】
１つの実施形態では、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、スポンジ段階またはドウ段階のいずれか、好ましくはスポンジ段階で加えられてよい。これらは、同時または連続的に加えられてよい。
【０２０３】
別の実施形態では、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素は、スポンジ段階に（例えば、粉および他のドウ構成成分の混合中に）添加されてよい。代替的にまたは加えて、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、ドウ段階（例えば、捏ね上げ工程中）に添加されてよい。
【０２０４】
１つの実施形態では、ＮＡＰＥに作用することができるホスホリパーゼＡ２酵素は、スポンジに添加され、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、ドウに添加される。
【０２０５】
１つの実施形態では、レシチン、好ましくは大豆をベースとするレシチンは、スポンジ段階（例えば、粉と他のドウ構成成分とを混合する工程中）に追加して添加されてよい。好適には、レシチンは、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用する少なくとも１種のホスホリパーゼＡ２酵素と一緒に添加されてよい。好適には、レシチンは、酵素的に修飾されているレシチンであってよい。１つの実施形態では、レシチンは、ホスホリパーゼＡ２活性を備える酵素によって酵素的に修飾されてよい（好ましくは、レシチンは、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２によって酵素的に修飾されてよい）。
【０２０６】
１つの実施形態では、ホスホリパーゼＡ２またはその一部分は、スポンジ段階中に添加される。
【０２０７】
「ストレートドウ」法
ストレートドウ法は、製パンの単純混合プロセスであってよい。ドウを製造するための全構成成分（例えば、成分）は、全部が一緒に配置され、１回の混練または捏ね上げセッションで結合される。捏ね上げた後、バルク発酵レストが分割前に行われる。
【０２０８】
１つの実施形態では、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、ドウ構成成分と混合されてよい。これらは、同時または連続的に加えられてよい。
【０２０９】
１つの実施形態では、レシチン、好ましくは大豆をベースとするレシチンが追加して添加されてよい。
【０２１０】
好適には、レシチンは、酵素的に修飾されたレシチンであってよい。１つの実施形態では、レシチンは、ホスホリパーゼＡ２活性を備える酵素によって酵素的に修飾されてよい（好ましくは、レシチンは、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２によって酵素的に修飾されてよい）。
【０２１１】
「ノータイム」法
「ノータイム」法は、ストレートドウ法の特別なサブセットである。非限定的例として、増加した量の酵母、ならびに例えばアスコルビン酸およびアゾジカルボンアミドなどの即効性酸化剤は、ストレートドウのバルク発酵期間の大半の排除を可能にする。
【０２１２】
連続式製パン
従来型のドウの調製および構成における多数の工程は、十分に自動化されてきたが、プロセスのいずれも真に連続式ではない。連続システムでは、ドウは、それがパン中に沈着されるまで、成分が混合される時間から中断せずに取り扱われる。初期発酵プロセスは、依然として本質的にバッチ式手順であるが、連続式製パンラインでは、従来のスポンジがブロスまたはブリューと呼ばれる液体前発酵種と取り換えられる。ブリューは、ドウに混合される前の数時間にわたり発酵させた、水、酵母、砂糖および粉と他の成分の部分との混合物から構成される。
【０２１３】
ブリューが発酵を終了した後、ブリューは、乾燥成分と一緒に、全成分を均質な塊に混合する捏ね上げ装置に供給される。バッター様材料が、流量を調節し、混練作業が適用される展開装置に混合物を送達するドウポンプを通って通過する。展開槽は、連続式ラインにおける重要な装置である。
【０２１４】
約５０ｋｇ（１００ポンド）の加工処理は、各９０秒間行うことができ、それは、バッターを、組織構造を全く有さず、伸展性がほとんどなく、不適正なガス残留を備える流体の塊から平滑で弾性の皮膜を形成するドウに変化させる。ドウは、次に展開槽から計量装置内に移動し、この装置は常にドウを押し出し、食パンサイズの塊に断続的に切断し、真下を通過する容器内に落下させる。
【０２１５】
１つの実施形態では、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素、およびｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、液状前発酵種またはドウに例えば発酵後およびドウの捏ね上げ中に添加されてよい。これらは、同時または連続的に加えられてよい。
【０２１６】
別の実施形態では、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素は、液状前発酵種に添加されてよい。代替的にまたは加えて、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素は、ドウの発酵後および捏ね上げ中にドウに添加されてよい。
【０２１７】
１つの実施形態では、レシチン、好ましくは大豆をベースとするレシチンは、前発酵段階またはドウに例えばドウの発酵後および捏ね上げ中のいずれかで追加的に添加されてよい。好適には、レシチンは、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用する少なくとも１種のホスホリパーゼＡ２酵素と一緒に添加されてよい。好適には、レシチンは、酵素的に修飾されたレシチンであってよい。１つの実施形態では、レシチンは、ホスホリパーゼＡ２活性を備える酵素によって酵素的に修飾されてよい（好ましくは、レシチンは、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２によって酵素的に修飾されてよい）。
【０２１８】
特に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２０  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本開示で使用する用語の多くの一般辞書を当業者に提供する。
【０２１９】
本開示は、本明細書に開示の例示的な方法および材料により限定されず、本明細書に記載のものと類似のまたは均等な任意の方法および材料を本開示の実施形態の実施または試験において使用することができる。数値範囲には、範囲を定義する数字が含まれる。特に明記しない限り、核酸配列はいずれも左から右に５’から３’に向けて記載され；アミノ酸配列は、左から右にアミノ基からカルボキシ基に向けてそれぞれ記載される。
【０２２０】
本明細書に提供した見出しは、本明細書を全体として参照することによって得ることができる本発明の種々の態様にも実施形態にも限定されない。したがって、直下に定義した用語は、本明細書全体を参照することによってより詳細に定義される。
【０２２１】
アミノ酸は、本明細書において３文字略称または１文字略称のアミノ酸の名称を使用して称される。
【０２２２】
本明細書において使用する用語「タンパク質」には、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドが含まれる。
【０２２３】
本明細書において使用する用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」および／または用語「タンパク質」と同義語である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義語である。一部の例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義語である。
【０２２４】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。本開示および特許請求の範囲において、アミノ酸残基について従来型の１文字コードおよび３文字コードを使用することができる。アミノ酸についての３文字コードは、ＩＵＰＡＣＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に準拠して定義されるとおりである。ポリペプチドは、遺伝子コードの縮重に起因して２つ以上のヌクレオチド配列によってコードできることも理解されている。
【０２２５】
用語の他の定義は、本明細書全体にわたって出現する可能性がある。例示的な実施形態をより詳細に記載する前に、本開示は、記載の特定の実施形態に限定されず、当然ながら、それ自体変動し得ることを理解すべきである。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためにすぎず、限定するものでないことも理解すべきである。
【０２２６】
数値の範囲が提供される場合、前後の状況が明確に他のことを明示しない限り、下限の単位の少数第一位まで、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値も具体的に開示されていると理解される。表示範囲内の任意の表示値または介在値間のそれぞれのより狭い範囲、およびその表示範囲内の任意の他の表示値または介在値は、本開示に包含される。これらのより狭い範囲の上限および下限は、その範囲内に独立して包含または除外される可能性があり、そのより狭い範囲内にいずれかもしくは両方の限度が含まれるか、または両方の限度が含まれない各範囲も、表示範囲内で任意の限度が具体的に除外されることを前提として本開示に包含される。表示範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【０２２７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、前後の状況が明白に他のことを指示していない限り、複数形の指示対象も含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「酵素」への言及には複数のそのような候補物質が含まれ、「ドウ構成成分」への言及には、当業者などに公知である１種以上のドウ構成成分およびそれらの均等物への言及が含まれる。
【０２２８】
本明細書で考察する刊行物は、本出願の出願日よりも先に開示されているという意味でのみ提供される。本明細書において、このような刊行物が、本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの容認と解釈すべきでない。
【０２２９】
以下では、例としてのみであるが、下記の実施例を参照しながら本発明を説明する。
【実施例】
【０２３０】
材料および方法：
材料：
・ＤＳＭ、ＮＬから市販で入手できる特にｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素  −  ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）、＃４３１３（１００００ｅＰＬＵ／ｍＬ）。
・ＬＩＰＯＭＯＤ（商標）６９９Ｌは、ｓｎ２位でＮＡＰＥに作用するホスホリパーゼＡ２酵素であり、これは、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓから市販で入手できる膵ホスホリパーゼＡ２である（１２０００ｅＰＬＵ／ｍＬ）。
・ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素であるＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０（ＤｕＰｏｎｔから市販で入手できる）  −  この酵素は、ガラクトリパーゼ活性およびホスホリパーゼ活性の両方を有することが公知であり（１００００ＴＩＰＵ／ｇ）、配列番号１に示したアミノ酸配列を有する。
・ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素であるＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０（ＤｕＰｏｎｔから市販で入手できる）  −  この酵素は、ガラクトリパーゼ活性およびホスホリパーゼ活性の両方を有することが公知であり（１５，５００ＴＩＰＵ／ｇ）、配列番号１に示したアミノ酸配列を有する（ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０は、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０と同一酵素であるが、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０では酵素がより濃縮されている）。
・ＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌ、さもなければ脂質アシルトランスフェラーゼとして公知であるグリセロリン脂質コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）（配列番号２；Ｄｕｐｏｎｔから市販で入手できる）。この酵素は、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用することができる。酵素活性、１０００ＴＩＰＵ／ｇ。
・ＬＩＰＯＰＡＮ（商標）は、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素であり、ホスホリパーゼＡ１と呼ばれる。この酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  ＤＫから市販で入手できる（１８５００ＴＩＰＵ／ｇ）。
・ＰＡＮＡＭＯＲＥ（商標）Ｇｏｌｄｅｎ  Ｃｏｎｃ．，＃４２４０は、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素であり、ホスホリパーゼＡ１と呼ばれる。この酵素は、ＤＳＭ，ＮＬから市販で入手できる（２９０００ＴＩＰＵ／ｇ）。
・ＳＵＲＥＢＡＫＥ（登録商標）８００、Ｄｕｐｏｎｔ製のヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）。
【０２３１】
ＴＬＣ分析
装置：
・アプリケーター：オートマチックＴＬＣサンプラー４、７ｃｍの溶出時間にプログラミングされたＣＡＭＡＧ  ＡＤＣ２自動展開槽。
・ＨＰＴＬＣプレート：Ｍｅｒｃｋ製の１０×２０ｃｍのシリカプレートＮｏ．１．０５６４１．０００１。使用前に１６０℃で１０分間にわたりＣＡＭＡＧ  ＴＬＣプレートヒーターＩＩＩ上で活性化した。
・展開：ＨＰＴＬＣシリカプレートは、１６０℃で１０分間にわたりＣＡＭＡＧ  ＴＬＣプレートヒーターＩＩＩ上で乾燥させ、冷却し、１６％のＨ３ＰＯ４中の６％の酢酸銅中に浸漬させた。さらに１６０℃で６分間にわたり乾燥させ、直後に評価した。
【０２３２】
ドウ脂質の分析：
・０．５ｍＬのヘプタン：イソプロパノール（３：２）中に溶解させた５μＬのドウ脂質（２００ｍｇの乾燥ドウから）試料をＨＰＴＬＣプレートに適用した。
標準物質１Ａ：ヘプタン：イソプロパノール（３：２）中に溶解させた０．１％のＤＧＤＧ（ジガラクトシルジアシルグリセロール）（Ａｖａｎｔｉ、製品番号＃８４０５２４）をオートマチックＴＬＣアプリケーターによってＨＰＴＬＣプレートに様々な量（（０．５−１−２−３および５μＬ）で適用した。
・ランニングバッファー４〜１：クロロホルム：メタノール：水（１９２：７８：１２）（ドウ脂質のための標準ランニングバッファー）。
・水中のランニングバッファー６：メチルアセテート：１−プロパノール：メタノール：０．２５％のＫＣｌ（２５：２５：２５：１０：９）（リン脂質をより多く分離させるために使用した）。
・プレートチャンバー中の１０ｍＬのランニングバッファーおよびフィルターペーパーチャンバー内の２５ｍＬ。
・展開後、ＴＬＣクロマトグラムをスキャンし、ＣＡＭＡＧ  ＴＬＣスキャナーを使用して異なる成分の面積を計算した。
・ＤＧＤＧ標準物質の面積に基づいて、較正曲線を構築し、粉脂質の個別成分をこの較正曲線に基づいて計算した。
【０２３３】
Ｐ−ＮＭＲ分析：
レシチン試料（４０±５ｍｇ）を１ｍＬの４：２：３のＣＤＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＣｓＣＤＴＡ（水性）（重水素化クロロホルム：メタノール：セシウム−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、体積／体積）中に溶解させた。ＣＤＴＡ溶液は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で１Ｍの濃度を用いて調製した。次に、ｐＨを１０．５に調整するためにＣｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（水酸化セシウム：水）を添加した。試料を１０秒間ボルテックスミキサーにかけ、２０℃で１０分間にわたり４５００ｒｐｍで遠心し、次に５５０μＬを１０００μＬのハミルトンシリンジを使用して５ｍｍのＮＭＲチューブに移し、分析のためにＮＭＲ機器に配置した。
【０２３４】
トリイソブチレートホスフェートを内部標準物質（２ｍｇ）として使用した。本発明者らは、５℃で収集したＮＭＲスペクトルが、最適なピーク幅およびシグナル分散を伴う理想的なスペクトルを生成することを見いだした。
【０２３５】
ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅ  ＩＩＩ分光計（Ｆａｅｌｌａｎｄｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＳａｍｐｌｅＪｅｔ試料チェンジャー（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｆａｅｌｌａｎｄｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびリンに同調させた５ｍｍのＢＢＯ（Ｂｒｏａｄｂａｎｄ  Ｏｂｓｅｒｖｅ）プローブ（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｆａｅｌｌａｎｄｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、１４．１Ｔでの自動化下で収集した。スペクトルは、定量的条件下で収集した。
【０２３６】
ドウから抽出したリン脂質のＬＣ／ＭＳ分析
ドウ脂質試料は、オンラインで三連四重極質量分析計と結合された液体クロマトグラフィーにより、ポジティブモードおよびネガティブモードで加熱エレクトロスプレーを用いてフルスキャンｍ／ｚ５０〜１５００で分析された。ＮＡＬＰＥは、ネガティブモードで脱プロトン化イオン［Ｍ−Ｈ］−を形成した。
【０２３７】
このカラムは順相カラム（ＤＩＯＬ）であり、移動相は、１Ｌ中に２０ｍＬの水が添加されたアセトニトリル／アセトン（８０／２０）であった。水は、５ｍＭのギ酸アンモニウムを含有していた。
【０２３８】
試料を２ｍＬのアセトニトリル／アセトン（８０：２０）中に溶解させた。微量の選択したＮＡＬＰＥを抽出し、面積を比較した。
【０２３９】
機器
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００
バイナリーポンプ（Ｇ１３１２Ｂ）＋μ−真空脱気剤（Ｇ１３７９Ｂ）
高性能オートサンプラーＡＬＳ（Ｇ１３６７Ｅ）＋サーモスタット１２９０（Ｇ１３３０Ｂ）
カラム区画（Ｇ１３１６Ａ）
加熱エレクトロスプレーインターフェース（ＨＥＳＩ−ＩＩ）を備えるＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ製の三連四重極質量分析計（ＭＳ７）。
カラム：ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｄｉｏｌ１２０  Ｓ−５μｍ、１２ｎｍ  ４．６×５０ｍｍ（＃５２６）
【０２４０】
クロマトグラフィー条件
【０２４１】
【表７】
2019510466.tif 000016
【０２４２】
試料の調製
０．２ｇの乾燥ドウ由来の脂質を２ｍＬのアセトニトリル／アセトン（８０：２０）に加え、１０分間にわたり超音波処理した。
【０２４３】
１６，０００ｇで３分間遠心し、上清をそのまま注入した。
【０２４４】
計算：ＨＰＬＣ／ＭＳ分析に基づき、様々な脂肪酸を備えるＮＡＬＰＥ構成成分の量を決定し、Ｃ１６：０のＮＡＬＰＥ、Ｃ１８：０のＮＡＬＰＥ、Ｃ１８：１のＮＡＬＰＥ、Ｃ１８：２のＮＡＬＰＥ、Ｃ１８：３のＮＡＬＰＥの相対含量を計算した。
【０２４５】
ドウ脂質の抽出：
完全にプルーフしたドウの試料を液体窒素中で直ちに凍結させた。ドウを次に凍結してフリーズドライした。乾燥ドウを細かく挽いてふるいにかけた。１．０ｇの試料を蓋付きの１５ｍＬの遠心管に測り入れた。７．５ｍＬの水飽和ブタノール（ＷＳＢ）を添加してボルテックスミキサー上で混合した。試料を１０分間にわたり９０℃の水浴中に配置し、次に３０分間にわたりＲｏｔａＭｉｘ（２５ｒｐｍ）上に配置した。試料を再び１０分間にわたり９０℃の水浴中に配置し、次に３０分間にわたりＲｏｔａＭｉｘ上に配置した。試料を１０分間にわたり２０００ｒｃｆで遠心した。１．５ｍＬの有機相を小型タンブラーに取り出し、窒素蒸気下で乾燥するまで蒸発させ、いずれかのさらなる分析のために使用した。
【０２４６】
実施例１
ＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌと組み合わせたＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０を試験する焼成実験
この実験では、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０をハードクラストロール用のレシピにおいてＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌと組み合わせて試験した。
【０２４７】
【表８】
2019510466.tif 000017
【０２４８】
Ｄｉｏｓｎａスパイラルミキサー上での混練。分析に従った粉に対する水取込み：４００ＢＵ−２％。
【０２４９】
手順
全成分を緩徐な速度で１分間、ボウル内で混合する  −  水を加え緩徐に２分間、および高速で６．５分間混練する。ドウ温度は、およそ２６℃でなければならない。１３５０ｇのドウを測り、手で丸く成形する。ドウは、３０℃で１０分間にわたり加熱キャビネット内に静置する。
【０２５０】
ドウは、機械上の表に従った設定で「Ｇｌｉｍｉｋ（商標）ラウンダー」上の３０個のドウボールに成形する。
【０２５１】
ドウを３４℃、相対湿度８５％で４５分間にわたりプルーフし、２００℃／２Ｌのスチームで１３分間＋ダンパーを開いて５分間にわたり焼成した（ＭＩＷＥオーブンプログラム１）。焼成した後、ロールパンを周囲温度で２５分間冷却し、その後、計量して体積を測定した。
【０２５２】
ドウおよびパンの特徴は、当業者によって評価される。
【０２５３】
【表９】
2019510466.tif 000018
【０２５４】
実験の構成および焼成評価からの結果は表１に示した。
【０２５５】
【表１０】
2019510466.tif 000019
【０２５６】
完全に発酵させたドウを凍結させ、フリーズドライし、乾燥ドウ中の脂質を、水飽和ブタノールを用いて抽出し、ＨＰＴＬＣによって分析した。
【０２５７】
ＨＰＴＬＣ分析からの構成成分は、表２に示した結果を用いて同一プレート上で分析したＤＧＤＧについての較正曲線に基づいて定量した。
【０２５８】
【表１１】
2019510466.tif 000020
【０２５９】
表１における焼成試験結果は、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０をドウに添加することがパンの体積に強力な作用を及ぼすことを例示している。しかし、３０ｐｐｍのＰｏｗｅｒｂａｋｅと組み合わせたＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌの添加は、さらにパンの体積を増加させ、明確な相乗作用が見られる。この相乗作用は、ドウおよびパンのスコアの改良とも見なされる。１００ｐｐｍのＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌは、最も強力な相乗作用をもたらし、ＨＰＴＬＣ分析は、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０がモノガラクトシルモノグリセリド（ＭＧＭＧ）およびジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）の形成中、モノガラクトシルジグリセリド（ＭＧＤＧ）およびジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）の両方に強力な活性を有することを確証している。この酵素は、さらに、ＮＡＬＰＥの形成中のＮＡＰＥに強力な活性を有する。ＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）ＯｉｌもＮＡＬＰＥの形成中のＮＡＰＥに活性を有する。ＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌのドウ中のガラクト脂質への一部の活性も見られる。
【０２６０】
理論によって拘束されることを望むものではないが、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０とＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌとの間の相乗性焼成性能は、ＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）ＯｉｌがＮＡＰＥのｓｎ２位上に活性であるが、他方では、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）は、極性脂質（ＭＧＤＧおよびＤＧＤＧならびにＮＡＰＥを含むホスホリパーゼを含む）中のｓｎ１位で活性であるという事実に起因する。
【０２６１】
実施例２
ＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌを２５ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの用量で試験する焼成実験
実施例１では、ＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌの最適用量がＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０と組み合わせて１００ｐｐｍであることが示された。用量反応を詳細に試験するために、ＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）ＯｉｌをＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０と組み合わせて２５ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの用量で試験した。結果は表３に示した。
【０２６２】
【表１２】
2019510466.tif 000021
【０２６３】
焼成試験結果は、ＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌと組み合わせた３０ｐｐｍのＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０の相乗作用を確証している。相乗作用および１００ｐｐｍでの最適用量を見るには、少なくとも７５ｐｐｍのＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌが必要とされる。
【０２６４】
完全に発酵させたドウを凍結させ、フリーズドライし、乾燥ドウ中の脂質を、水飽和ブタノールを用いて抽出し、ＨＰＴＬＣによって分析した（表４）。
【０２６５】
【表１３】
2019510466.tif 000022
【０２６６】
ドウ脂質の分析は、ＮＡＰＥへのＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌの活性を確証しているが、さらにＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌの用量の増加とともにＮＡＬＰＥの用量が減少すること、およびＮＡＧＰＥが形成されることも明らかである。２５〜２００ｐｐｍの用量のＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌは、ガラクト脂質に極めてわずかな作用のみを有する。
【０２６７】
ドウ脂質は、さらにまた表５に示したＮＡＬＰＥの異性体組成に焦点を当ててＰ−ＮＭＲによって分析した。表５からの結果は、ＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌの用量が増加するにつれて、この酵素のｓｎ２位特異性のためにより多くの１−ＮＡＬＰＥが生成されることを示している。
【０２６８】
【表１４】
2019510466.tif 000023
【０２６９】
実施例３
ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）と組み合わせたＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０を試験する焼成実験
この実験では、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０をハードクラストロールのレシピでＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）またはＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌと組合わせて試験した。
【０２７０】
ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）は、高いＰＬＡ２特異性を備えるホスホリパーゼである。
【０２７１】
実験の構成および焼成評価からの結果は表６に示した。
【０２７２】
【表１５】
2019510466.tif 000024
【０２７３】
ドウおよびパンの総スコアは、（１０−粘着性）として加えられる、粘着性のスコアとは別の個別スコアの合計として計算する。
実験１：総スコア＝７＋（１０−７）＋４＋（１０−６）＋５＋５＋４＋５＋５＝４２
【０２７４】
表６からの結果は、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０とＭａｘａｐａｌとの組み合わせがパンの体積に関して明白な相乗作用を生成すること、およびドウおよびパンの特徴も改良されることを明白に例示している。さらに、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）が様々な用量に対して極めて耐性であることも観察され、このとき、増加した作用は１００〜７５０ｐｐｍの用量のＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）から見られる。
【０２７５】
完全に発酵させたドウを凍結させ、フリーズドライし、乾燥ドウ中の脂質を、水飽和ブタノールを用いて抽出し、ＨＰＴＬＣによって分析した。
【０２７６】
ＨＰＴＬＣ分析からの構成成分は、表７に示した結果を用いて同一プレート上で分析したＤＧＤＧについての較正曲線に基づいて定量した。
【０２７７】
【表１６】
2019510466.tif 000025
【０２７８】
ＨＰＴＬＣ分析は、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）がＮＡＬＰＥの形成中にＮＡＰＥに極めて活性であることを確証している。
【０２７９】
この酵素はＮＡＰＥに対して極めて特異的であり、ＮＡＧＰＥの有為な形成は観察されない。これは、ＭＡＸＡＰＡＬが様々な用量に対して耐性である理由を説明し得る。ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）は、ＤＧＤＧには活性を有していないが、ＭＧＤＧ形成が観察されたようにＭＧＤＧへの小さい活性が例示された。理論によって拘束されることを望むものではないが、ＮＡＰＥからＮＡＬＰＥへの加水分解に関するＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）の特異性は、この酵素がＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０と組み合わせて正の相乗作用を有する理由を説明し、さらに、これは、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）を容易に過剰投与できない理由も説明する。しかし、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０およびＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）の組み合わせが少量のＮＡＧＰＥを生成することは明らかである。
【０２８０】
これは、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０がｓｎ１位で脂肪酸に活性であるために、ｓｎ２−ＮＡＬＰＥよりもＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０にとってより好ましい基質であるｓｎ１−ＮＡＬＰＥをＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）が生成するという事実によって説明することができる。
【０２８１】
これらの酵素の特異性およびドウ中のＮＡＬＰＥの脂肪酸組成に及ぼす影響をより詳細に試験するために、ドウから抽出された脂質をＨＰＬＣ／ＭＳによって分析し、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２およびＣ１８：３脂肪酸組成を備えるＮＡＬＰＥの相対組成を分析した。ドウ中のＮＡＬＰＥの脂肪酸組成およびドウ脂質のＴＬＣ分析から計算されたＮＡＬＰＥの量に基づいて、ドウ中のＣ１６：０＿ＮＡＬＰＥの相対量を表８に示した表に示したように計算した（対照ドウ中のＣ１６：０＿ＮＡＬＰＥの相対量は、１００％であると規定した）。
【０２８２】
【表１７】
2019510466.tif 000026
【０２８３】
表７および表８の結果は、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０がドウ中で有意な量のＮＡＬＰＥを生成することを確証しているが、Ｃ１６：０＿ＮＡＬＰＥの量はわずかにのみ増加する（３〜８％）。これは、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０がＮＡＰＥのｓｎ１位で脂肪酸を加水分解するという事実によって説明される。ドウを、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）を用いて処理すると、ドウ中のＮＡＬＰＥの量も増加し、この場合、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）がドウ中のＮＡＰＥのｓｎ２位で脂肪酸を加水分解するために、Ｃ１６：０＿ＮＡＬＰＥの量は強力に（３４０％）増加することが観察される。
【０２８４】
ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０をＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）と結び付けると、Ｃ１６：０＿ＮＡＬＰＥの量を増加させることが可能であり、表７に示したように、この酵素の組み合わせは、ＤＧＭＧおよびＭＧＭＧの製造中にドウ中のＤＧＤＧおよびＭＧＤＧのようなガラクト脂質にも活性である。
【０２８５】
ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０およびＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）が焼成性能に及ぼす正の相乗作用は、ＤＧＭＧ、ＭＧＭＧおよび１６：０＿ＮＡＬＰＥの形成中のガラクト脂質およびＮＡＰＥへの組み合わせ作用によって説明された。ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）は、さらに、ドウ中のＰＣおよびＰＥのような他のリン脂質に対して活性であり、これらの構成成分はｓｎ１位でより多くの飽和脂肪酸も有することは公知である。このため、ドウ中で生成されたＬＰＣおよびＬＰＥもより多量の飽和（ｃ１６：０）脂肪酸を有すると予測されている。
【０２８６】
実施例４
ハードクラストロールを用いた焼成実験
この実験の目的は、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ製の別のＰＬＡ２であるＬＩＰＯＭＯＤ（商標）６９９Ｌを試験し、ｓｎ１特異的酵素であるＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０と組み合わせた作用を調査することであった。
【０２８７】
これらの酵素は、ハードクラストロールのための手順（実施例１）に従って試験し、パンの比体積ならびにドウおよびパンの特性を評価した。
【０２８８】
これらの酵素は、表９に略述したように試験したが、焼成試験結果も表９に示した。
【０２８９】
【表１８】
2019510466.tif 000027
【０２９０】
表９からの結果は、ＰＬＡ２であるＬＩＰＯＭＯＤ（商標）６９９Ｌとｓｎ１特異的グリコリパーゼＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０とを組み合わせることによる相乗作用を明白に示している。ＬＩＰＯＭＯＤ（商標）６９９Ｌは、独力でパンの体積をわずかに増加させ、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０もパンの体積を明白に増加させる。しかし、これらの２種の酵素の組み合わせは、パンの体積を個別酵素と比較してより多く増加させる。さらに、ドウおよびパンの総スコアも、これらの２種の酵素を組み合わせることによって明白に改良される。
【０２９１】
実施例５
ハードクラストロールを用いた焼成実験。
以前の焼成試験では、ＰＬＡ２酵素がｓｎ１特異的酵素ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０と組み合わせた場合に相乗作用を示すことが示された。この酵素もｓｎ１特異的ホスホリパーゼ活性を有する。本試験では、他のｓｎ１特異的ホスホリパーゼを表１０に示したようにＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）、ＰＬＡ２と組み合わせて試験した。
【０２９２】
これらの酵素は、新規のリフォーム粉（ＤＫ２０１５−０００４０）を使用した変更以外、ハードクラストロール（実施例１）についての手順に従って試験した。
【０２９３】
【表１９】
2019510466.tif 000028
【０２９４】
ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）とＰＡＮＡＭＯＲＥ（登録商標）およびＬＩＰＯＰＡＮ  Ｆ（商標）との組み合わせによって得られた焼成試験結果は、パンの体積への相乗作用を明白に示した。
【０２９５】
実施例６
ハードクラストロールを用いた焼成実験。
焼成実験は、ｓｎ１特異的酵素ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０およびｓｎ２特異的酵素ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）の組み合わせが、製パンに使用された場合にパンの体積に正の相乗作用を有することを示している。しかし、粉中のリン脂質の量がむしろ制限されることは公知である。本試験の目的は、ドウに大豆レシチンを混入した場合のこれらの酵素の作用を調査することであった。
【０２９６】
焼成実験は、表１１に示した酵素およびレシチンを用いたハードクラストロール（実施例１）の手順に従って実施した。
【０２９７】
【表２０】
2019510466.tif 000029
【０２９８】
表１１に示したパンの体積に及ぼす作用は、０．２％または０．５％のレシチンを含有するドウ中のＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０およびＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）の相乗作用を明白に確証している。
【０２９９】
実施例７
ハードクラストロールを用いた焼成実験。
この焼成実験では、Ｐｏｌａｒ  Ｂｅａｒ（ＤＫ２０１５−０００７１）と呼ばれる米国製の粉を使用したハードクラストロールにおけるＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）ＰＬＡ２およびグリコリパーゼＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０の作用を試験した。焼成実験は、真菌αアミラーゼを添加しなかったこと以外、ハードクラストロール（実施例１）の手順に従って実施した。実験の構成および結果は表１２に示した。
【０３００】
【表２１】
2019510466.tif 000030
【０３０１】
表１２からの焼成試験結果は、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）ＰＬＡ２およびグリコリパーゼＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）の組み合わせによる、これらの酵素が米国製粉において試験した場合の相乗作用を確証している。
【０３０２】
実施例８
スポンジアンドドウパンを用いた焼成実験
焼成実験は、ドウ中のＮＡＰＥへの活性を備えるｓｎ１およびｓｎ２の正の相乗作用を得ることが可能であることを示している。この正の作用は、グリセロール部分で飽和脂肪酸（Ｃ１６：０＿ＮＡＬＰＥ）を用いたＮＡＬＰＥの生成によって説明できる可能性がある。
【０３０３】
しかし、これらの２種のタイプの酵素は、ドウに添加すると、ＮＡＰＥ基質と競合し、このため、２種の酵素の組み合わせが、ｓｎ２特異的ホスホリパーゼ（ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）））が単独で使用された場合よりも少ないＣ１６：０  ＮＡＬＰＥを生成することが観察されている。
【０３０４】
しかし、スポンジアンドドウ手順のような所定の製パン手順では、スポンジ側およびドウ側の両方で酵素を添加することが可能である。ｓｎ２特異的ホスホリパーゼがスポンジ側のみに添加された場合、ＮＡＰＥ基質との競合は生じないであろう。本明細書では、ｓｎ１特異的グリコリパーゼをドウ側で添加できることが想定されている。
【０３０５】
スポンジ側で酵素を添加する別の態様は、スポンジ発酵中に形成された機能的極性成分をドウ捏ね上げ中に利用できることである。
【０３０６】
Ｌ．Ｇｅｒｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７２（２０１５）６１３−６２１）によると、ＤＡＴＥＭのような乳化剤のドウへの添加はドウのレオロジーに影響を有したが、他方では、リパーゼの添加は、加水分解された脂質が発酵中にのみ有意なレベルに放出されたため、影響を及ぼさなかった。
【０３０７】
スポンジアンドドウパンの製造手順におけるスポンジへの酵素の添加は、ドウに正の機能的なレオロジー特性を有する加水分解脂質を形成する。
【０３０８】
下記の焼成試験では、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）がスポンジに添加され、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０がドウ側に添加された。焼成実験は、リフォーム粉（ＤＫ２０１５−０００４０）を使用して下記に教示するスポンジアンドドウ手順に従って実施した。
【０３０９】
【表２２】
2019510466.tif 000031
【０３１０】
スポンジ：
１）全成分を第１速度で１分間混合する  −  Ｈｏｂａｒｔミキサーにおいて第２速度で３分間混合する。
２）スポンジの温度はおよそ２５．５℃でなければならない。
３）スポンジを３０℃、８５％ＲＨで３時間発酵させる  −  蓋のないボウル。
【０３１１】
ドウ：
１）スポンジおよび塩を除く残りの成分全部を、Ｈｏｂａｒｔミキサーにおいて低速で２分間、中速で５分間混合する（氷水を使用する）。
２）塩を加える  −  中速で８分間混合する。
３）５５０ｇのドウを測る。
４）ドウを周囲温度で１０分間静置する。
５）Ｇｌｉｍｅｋモルダー上での成形：１：４−２：３−３：１５−４：１２−幅：両側で８。
６）成形したドウをスズ缶内に配置する。
７）４３℃、９５％ＲＨで６０分間プルーフする。
８）２００℃で２６分間焼成する（Ｍｉｗｅオーブン、プログラム４）。
９）スズ缶からパンを取り出し７０分間冷却し、計量して体積を測定する。
【０３１２】
酵素の用量および焼成試験結果は表１３に示した。
【０３１３】
【表２３】
2019510466.tif 000032
【０３１４】
表１３の結果は、スポンジにＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）が添加され、ドウにＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）が添加された場合、スポンジアンドドウパン手順におけるＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）およびＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０の正の相乗作用を得ることが可能であることを確証している。
【０３１５】
実施例９
スポンジアンドドウパンを用いた焼成実験
スポンジアンドドウパン製造手順は、従来使用されてきており、現在もなお米国の製パン産業で広範囲に使用されている。スポンジアンドドウ手順は、２段階のドウ捏ね上げ工程を特徴とする。スポンジは、粉（粉全体の７０％）、水および酵母を捏ね上げることによって作成され、これは極めて長い時間（３時間）にわたり発酵される。スポンジは、次に、残りの粉、水、砂糖、塩および他の成分と混合される。通常、酵素もドウに添加されるが、同一基質に対して競合するであろう２種の酵素を添加する場合、１種の酵素をスポンジ側、および次に他方の酵素をドウ側に添加することができる。
【０３１６】
以下の実験では、スポンジアンドドウパン製造手順において米国製の粉（Ｐｏｌａｒ  Ｂｅａｒ  ＃ＤＫ２０１５−０００７１）を使用してＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）およびＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０を試験し、これらの酵素については表１４に示したような試験結果が得られた。
【０３１７】
【表２４】
2019510466.tif 000033
【０３１８】
表１４からの結果は、スポンジに添加されたＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）がドウに添加されたＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０と組み合わされると、パンの体積への相乗作用が生じることを確証している。
【０３１９】
実施例１０
スポンジアンドドウを用いた焼成実験
ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０と組み合わせたＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）の添加の作用について、スポンジ側またはドウ側のいずれかに添加されたＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）を用いるスポンジアンドドウパン手順において詳細に調査した。実験の構成および結果は表１５に示した。
【０３２０】
【表２５】
2019510466.tif 000034
【０３２１】
表１５に示したパン体積の結果は、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）およびＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０の組み合わせを添加することによって正の相乗作用が得られたことを確証している。この相乗作用は、スポンジ側およびドウ側の両方にＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）を添加した場合に観察される。これらの結果は、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）がスポンジ側に添加された場合により強力な相乗作用が生じることを示している。
【０３２２】
実施例１１
ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素を、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素と組み合わせて使用して、角食パン（スポンジ＆ドウ）において観察される柔らかさを試験する焼成実験
ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素（ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０）と組み合わせた、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素（ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標））の添加の作用を、スポンジ段階で添加されるＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）およびドウ段階で添加されるＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０を用いて角食パン（スポンジアンドドウパン手順）において詳細に調査した。
【０３２３】
ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０は、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素である。詳細には、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０は、極性脂質へのＰＬＡ１活性を有し、本明細書に開示した配列番号１を有する真菌脂肪分解酵素である。１５，５００ＴＩＰＵの酵素活性を備えるＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０を使用した。
【０３２４】
実験計画：
【０３２５】
【表２６】
2019510466.tif 000035
【０３２６】
ＳＵＲＥＢＡＫＥ（登録商標）８００（ＨＯＸ）およびアスコルビン酸の使用は、全実験についてそれぞれ５０および６０ｐｐｍで一定に維持した。
【０３２７】
各試験変量からの２つのパンの塊を試験し、スライスパンの柔らかさ（または硬さ）は、Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ製のテクスチャーアナライザーＴＡＸＴプラスを使用してテクスチャープロファイル分析（ＴＰＡ）から決定した。第１日および第３日に３５ｍｍの金属製プローブを使用した。
【０３２８】
柔らかさ試験の結果：
ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）およびＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０それぞれの個別の試験は、対照（ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）またはＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０が添加されていない）と比較してより強い力を必要とすることを示し、より硬いパンであることを示した。ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）およびＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０の組み合わせは最良の柔らかさを生じさせた。同一の組み合わせは、さらに体積に関して最高相乗作用を示した（本明細書にはデータを示していない）。
【０３２９】
図２に示したパンの柔らかさ試験の結果は、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）およびＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０の組み合わせを添加することによって正の相乗作用が得られたことを確証している。この相乗作用は、角食パンの製造において観察された。
【０３３０】
実施例１２
ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素を、ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素と組み合わせて使用して、１００％の全粒小麦パン（スポンジ＆ドウ）において観察される柔らかさを試験する焼成実験
ｓｎ１位で極性脂質に作用する酵素（ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０）と組み合わせた、ｓｎ２位でＮ−アシルホスファチジルエタノールアミンに作用するホスホリパーゼＡ２酵素（ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標））の添加の作用を、スポンジ段階で添加されるＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）およびドウ段階で添加されるＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０を用いて全粒小麦（スポンジアンドドウ）パン手順において詳細に調査した。
【０３３１】
実験計画：
【０３３２】
【表２７】
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【０３３３】
ＳＹＲＥＢＡＫＥ（登録商標）８００（ＨＯＸ）およびアスコルビン酸の使用は、全実験についてそれぞれ１００および１００ｐｐｍで一定に維持した。
【０３３４】
各試験変量からの２つのパンの塊を試験し、スライスパンの柔らかさ（または硬さ）は、Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ製のテクスチャーアナライザーＴＡＸＴプラスを使用してテクスチャープロファイル分析（ＴＰＡ）から決定した。第１日および第３日に３５ｍｍの金属製プローブを使用した。
【０３３５】
柔らかさ試験の結果：
ＰＬＡ２の単独は、第１日および第３日のいずれにおいても、対照（ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）またはＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０が添加されていない）と比較して増加した柔らかさを示した。
【０３３６】
ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０は、対照ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）またはＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０と同一以下のレベルの柔らかさを示した。
【０３３７】
ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）およびＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０の組み合わせは、増加した柔らかさを示した。
【０３３８】
図３に示した１００％の全粒小麦パン中におけるパンの柔らかさ試験の結果は、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）単独が対照（ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）またはＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０が添加されていない）と比較して柔らかさを増加させることを示している。しかし、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）とＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０との組み合わせは、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）単独、またはＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０、または対照に比して柔らかさをさらに増加させる。
【０３３９】
実施例１３
ｓｎ２特異的、ＮＡＰＥ活性ＰＬＡ２の特徴および焼成性能
これらの実験の目的は、ｓｎ１特異的酵素であるＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０と組み合わせた場合にｓｎ２特異性およびＮＡＰＥ活性を備える別のホスホリパーゼ（ＣＲＣ０８３３５）に対する焼成用途における相乗作用性能を検証することであった。
【０３４０】
方法：
ガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）
遊離脂肪酸は、ＧＬＣによってトリメチルシリル誘導体（ＴＭＳ）として分析した。
【０３４１】
【表２８】
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【０３４２】
試料の調製
蒸発させた試料を１．５ｍＬのヘプタン：ピリジン（２：１）中に溶解させる。５００μＬの試料溶液をクリンプバイアルに移し、１００μＬのＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオルアセアミド（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅａｍｉｄ））を加え、６０℃で１５分間反応させる。
【０３４３】
ＣＲＣ０８３３５のクローニング
真菌ホスホリパーゼＡ２タイプ２をコードする合成遺伝子（ＣＲＣ０８３３５）は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）中で発現させるためにコドン最適化された遺伝子としてＧｅｎｅｒａｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｒａｙ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｅｎｇｌｉｓｈ／）から注文された。ＣＲＣ０８３３５（配列番号４）（図５）のタンパク質配列は、社内ミセリオフトラ・サーモフィル（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）菌株から同定され、ＮＣＢＩデータベース内の最も近いホモログ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００３６６６４９９．１を備えるサーモテロミセス・サーモフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＡＴＣＣ  ４２４６４由来の分泌性ホスホリパーゼＡ２）との９５％同一性を共有する。ＣＲＣ０８３３５は、ＳｉｇｎａｌＰ  ４．０による予測によるとＮ末端シグナルペプチド配列を有しており（ＳｉｇｎａｌＰ  ４．０：膜貫通領域からシグナルペプチドを識別する。Ｔｈｏｍａｓ  Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｓｏｅｒｅｎ  Ｂｒｕｎａｋ，Ｇｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ＆Ｈｅｎｒｉｋ  Ｎｉｅｌｓｅｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６，２０１１）、これはＣＲＣ０８３３５が細胞外酵素であることを示唆している。
【０３４４】
Ｎ末端天然シグナルペプチドを保持しているＣＲＣ０８３３５の合成遺伝子（配列番号５）（図６）をｐＧＸＴ（参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ出願である国際公開第２０１５／０１７２５６号パンフレットに記載されたｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターと同一）中にクローニングした。ｐＴＴＴｐｙｒ２ベクター中では、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝子は、Ｈ．ジェコリナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ｐｙｒ２遺伝子と置き換えられる。ｐＴＴＴ−ｐｙｒ２発現ベクターは、関心対象の遺伝子の発現を強力に誘導することができるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ−由来プロモーター（ｃｂｈＩ）領域およびｃｂｈＩターミネーター領域を含有していた。Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳおよびｐｙｒ２選択的マーカーは、単独窒素源としてのアセトアミド上での形質転換体の増殖を付与し、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア領域は、真菌細胞中での非染色体プラスミド維持を可能にする。ＣＲＣ０８３３５のクローニング後、結果として生じたプラスミドをｐＺＫＹ５１２−１と表示した。ｐＺＫＹ５１２−１のプラスミドは図７に提供した。
【０３４５】
社内ミセリオフトラ・サーモフィル（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）菌株から同定したＣＲＣ０８３３５のタンパク質配列は、配列番号４として規定した。予測シグナルペプチドのポリペプチド配列は、ＭＫＦＬＳＴＡＬＣＬＡＳＳＶＬＡ（配列番号６）である。
【０３４６】
ＣＲＣ０８３３５の形質転換
プラスミドｐＺＫＹ５１２−１は、プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３９３−９９）を使用して好適なトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）菌株中へ形質転換させた（公表されたＰＣＴ特許出願である国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載された方法）。形質転換体は、単独窒素源としてのアセトアミドを含有する固形培地上で選択した。アセトアミドプレート上での５日間の増殖後、形質転換体を収集し、グルコースおよびソホロースの混合物を含有する合成培地中で２５０ｍＬの振とうフラスコ内で発酵させた。
【０３４７】
結果：
ＳＮ１／ＳＮ２特異性：
ＣＲＣ０８３３５に対する酵素特異性は、「ホスホリパーゼ活性ならびにＰＣ（ホスファチジルコリン）へのｓｎ１およびｓｎ２位置特異性を決定するためのアッセイ」に従って決定した。このアッセイは、ＧＬＣ分析によって遊離したＦＦＡを分析する、特別仕立てのＦＦＡ（遊離脂肪酸）組成物を備えるＰＣ基質を使用する。結果は表１６に略述した。
【０３４８】
【表２９】
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【０３４９】
表１６に記載のデータは、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）およびＣＲＣ０８３３５が「相対ＰＬＡ１活性（％）」と比較して高い「相対ＰＬＡ２活性（％）」によって示されるように、ｓｎ２特異的であることを明白に示している。さらに、データは、ＰＯＷＥＲＢａｋｅ（登録商標）４０８０がｓｎ１特異的であることを明白に反映している。
【０３５０】
ＮＡＰＥ活性：
ＣＲＣ０８３３５のＮＡＰＥ活性は、酵素を添加しておよび添加せずに実施した焼成試行からのドウの脂質プロファイル分析によって評価した。焼成適用は、ハードクラストロールについての手順（実施例１）に従って実施した。
【０３５１】
ＮＡＰＥ活性は、ドウ脂質のＨＰＬＣ分析によって検証した。ドウ脂質は、ドウからの脂質の抽出についての手順に従って完全にプルーフし、フリーズドライしたドウから抽出した。
【０３５２】
単離した脂質は、ＨＩＬＩＣ  ＤＩＯＬカラム、１．７μｍ、５０×２．１ｍｍ（Ｆｏｒｔｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，ＵＫ）を使用するＨＰＬＣによって分析した。使用した溶媒は、下記の勾配：０〜２０分間は１００％の溶媒Ａから１００％の溶媒Ｂ、２０〜３０分間は１００％の溶媒Ｂ、３０〜４０分間は１００％の溶媒の勾配を用いる溶媒Ａ：９６％のアセトン、４％のメタノール、１ｍＭのギ酸アンモニウムおよび溶媒Ｂ：６０％のアセトン、３４％のメタノール、６％のＭｉｌｉＱ水、１ｍＭのギ酸アンモニウムであった。ＮＡＰＥおよびＮＡＬＰＥは、荷電エーロゾル検出器および内部標準物質としての１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−リノエオイル（ｌｉｎｏｅｏｉｌ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）を使用して定量した。ＨＰＬＣ分析からの結果は表１７に示した。
【０３５３】
【表３０】
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【０３５４】
表１７に記載の結果は、ＣＲＣ０８３３５が、ＮＡＰＥの加水分解およびより多くの乳化成分ＮＡＬＰＥの生成によって示されるように、ＮＡＰＥ活性を有することを明白に示している。ＰＯＷＥＲＢａｋｅ（登録商標）４０８０も、ＮＡＰＥの加水分解およびより多くの乳化成分ＮＡＬＰＥの生成によって示されるように、ＮＡＰＥ活性を示している。ＮＡＬＰＥの生成に加えて、ＰＯＷＥＲＢａｋｅ（登録商標）４０８０は、ＮＡＧＰＥの生成もさらに示している（データは示していない）。
【０３５５】
適用性能：
ｓｎ２特異的ＮＡＰＥ活性酵素ＣＲＣ０８３３５のＰＯＷＥＲＢａｋｅ（登録商標）４０８０と組み合わせた場合の相乗作用適用性能は、酵素を添加しておよび添加せずに実施した焼成試行によって評価した。焼成適用は、ハードクラストロールについての手順（実施例１）に従って実施した。
【０３５６】
ＣＲＣ０８３３５およびＰＯＷＥＲＢａｋｅ（登録商標）４０８０の相乗作用適用性能は、表１８に略述したように増加した相対的比体積によって示された。
【０３５７】
【表３１】
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【数８】
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【０３５８】
表１８に記載の結果は、単独成分として使用された場合、ｓｎ２特異的ＮＡＰＥ活性酵素であるＣＲＣ０８３３５が比体積に限定的な作用を有することを示している。ＣＲＣ０８３３５とＰＯＷＥＲＢａｋｅ（登録商標）４０８０との（それぞれの用量での）組み合わせおよび両方のリン脂質およびガラクト脂質加水分解からの乳化成分の形成は、比体積への明白な相乗作用を示している。
【０３５９】
結論
焼成実験およびドウ脂質の分析に基づくと、驚くべきことに、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０、またはＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０とＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）ＰＬＡ２ホスホリパーゼ、またはＬＹＳＯＭＡＸ（登録商標）Ｏｉｌとの組み合わせが焼成において正の相乗作用をもたらすことが見いだされている。これは、パン体積の改良ならびに柔らかさを含むドウおよびパンの特徴の改良によって確証されている。
【０３６０】
パンの体積への正の相乗作用は、さらにＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）が例えばＬＩＰＯＰＡＮ  Ｆ（商標）およびＰＡＮＡＭＯＲＥ（登録商標）のような他のＰＬＡ１酵素と組み合わされた場合にも観察された。
【０３６１】
他のＰＬＡ２酵素であるＬＩＰＯＭＯＤ（商標）６９９ＬおよびＣＲＣ０８３３５を用いた焼成試験も、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０と組み合わせた場合の正の相乗作用を示した。
【０３６２】
この相乗作用は、様々なタイプの小麦粉を使用した様々な焼成実験において確証された。
【０３６３】
ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０およびＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０は、いずれもドウ中のガラクト脂質およびリン脂質へのｓｎ１活性を備えるグリコリパーゼである。ＰＬＡ２ホスホリパーゼであるＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）は、ＮＡＰＥ（および他のリン脂質）をｓｎ１−ＮＡＬＰＥの生成中にｓｎ２位で加水分解するが、ＮＡＬＰＥを有意な程度まで加水分解しない。ＮＡＰＥは、ｓｎ１およびｓｎ２位で異なる脂肪酸組成を有しており、ｓｎ１位では、典型的にはより飽和した脂肪酸（Ｃ１６：０およびＣ１８：０）を有するであろう。ＨＰＬＣ／ＭＳ分析により、ＭＡＸＡＰＡＬがドウ中のＣ１６：０＿ＮＡＬＰＥの強力な増加に寄与することが示された。
【０３６４】
理論によって拘束することを望むものではないが、Ｃ１６：０＿ＮＡＬＰＥは、Ｃ１８：２  ＮＡＬＰよりもドウ安定性により強力な改良を示すと予測されるが、それは、水性系中のＮＡＬＰＥが脂肪酸組成に依存して様々な中間相を形成するためである。
【０３６５】
しかし、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）は、独力ではパン体積に大きい作用を及ぼすことに寄与しなかったが、ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０またはＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０のいずれかと組み合わせると、強力な相乗作用が形成される。これは、２種の酵素の組み合わせによって生成される反応生成物Ｃ１６：０＿ＮＡＬＰＥ、ＭＧＭＧおよびＤＧＭＧによって説明できる。
【０３６６】
一部の系では、ＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）、およびＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０（またはＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）、およびＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０）は、組み合わせて使用されるとＮＡＰＥ基質に対して競合する可能性がある。これは、ドウが２段階で、例えばいわゆるスポンジアンドドウ手順で混合される所定の製パン手順において軽減することができる。このタイプの製パンでは、Ｃ１６：０＿ＮＡＬＰＥの最適生成のためにスポンジ側にＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）（またはＮＡＰＥに活性を備える他のＰＬＡ２）を添加し、その後、ＤＧＭＧおよびＭＧＭＧ生成のためにドウ側でＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０８０またはＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（登録商標）４０９０を添加することが可能である。スポンジ側でＭＡＸＡＰＡＬ（登録商標）を添加することのさらなる別の利点は、ドウ捏ね上げ中にドウの特性の改良に寄与する反応生成物（例えば、ＮＡＬＰＥ）を容易に入手できることであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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