(57)【要約】  本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子；ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ；およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡを含む抗腫瘍組成物に関する。
2019502375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子；ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含むＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体。
【請求項２】
前記ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、配列番号１または配列番号２で表示される、請求項１に記載の遺伝子伝達体。
【請求項３】
前記Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子は、配列番号３で表示される、請求項１に記載の遺伝子伝達体。
【請求項４】
前記ｓｈＴＧＦ−βは、ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２である、請求項１に記載の遺伝子伝達体。
【請求項５】
前記ｓｈＴＧＦ−β１は、配列番号４または配列番号５で表示される、請求項４に記載の遺伝子伝達体。
【請求項６】
前記ｓｈＴＧＦ−β２は、配列番号６または配列番号７で表示される、請求項４に記載の遺伝子伝達体。
【請求項７】
前記ｓｈＨＳＰは、ｓｈＨＳＰ２５またはｓｈＨＳＰ２７である、請求項１に記載の遺伝子伝達体。
【請求項８】
前記ｓｈＨＳＰ２５は、配列番号８で表示される、請求項７に記載の遺伝子伝達体。
【請求項９】
前記ｓｈＨＳＰ２７は、配列番号９で表示される、請求項７に記載の遺伝子伝達体。
【請求項１０】
前記遺伝子伝達体は、プラスミド、組換えアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、リポソームまたはニオソームである、請求項１に記載の遺伝子伝達体。
【請求項１１】
前記遺伝子伝達体は、組換えアデノウイルスベクターである、請求項１０に記載の遺伝子伝達体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかか一項に記載の遺伝子伝達体を含む腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子；ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含む腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
前記ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、配列番号１または配列番号２で表示される、請求項１３に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１５】
前記Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子は、配列番号３または配列番号４で表示される、請求項１３に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１６】
前記ｓｈＴＧＦ−βは、ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２である、請求項１３に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１７】
前記ｓｈＴＧＦ−β１は、配列番号５または配列番号６で表示される、請求項１６に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１８】
前記ｓｈＴＧＦ−β２は、配列番号７または配列番号８で表示される、請求項１６に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１９】
前記ｓｈＨＳＰは、ｓｈＨＳＰ２５またはｓｈＨＳＰ２７である、請求項１３に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２０】
前記ｓｈＨＳＰ２５は、配列番号８で表示される、請求項１９に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２１】
前記ｓｈＨＳＰ２７は、配列番号９で表示される、請求項１９に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、免疫活性および免疫原性を増大させる、請求項１２または１３に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２３】
前記遺伝子またはｓｈＲＮＡは一つ以上の遺伝子伝達体により導入される、請求項１３に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２４】
ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含むｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体。
【請求項２５】
前記ｓｈＴＧＦ−βは、ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２である、請求項２４に記載の遺伝子伝達体。
【請求項２６】
前記ｓｈＴＧＦ−β１は、配列番号５または配列番号６で表示される、請求項２５に記載の遺伝子伝達体。
【請求項２７】
前記ｓｈＴＧＦ−β２は、配列番号７または配列番号８で表示される、請求項２５に記載の遺伝子伝達体。
【請求項２８】
前記ｓｈＨＳＰは、ｓｈＨＳＰ２５またはｓｈＨＳＰ２７である、請求項２４に記載の遺伝子伝達体。
【請求項２９】
前記ｓｈＨＳＰ２５は、配列番号８で表示される、請求項２８に記載の遺伝子伝達体。
【請求項３０】
前記ｓｈＨＳＰ２７は、配列番号９で表示される、請求項２８に記載の遺伝子伝達体。
【請求項３１】
前記遺伝子伝達体は、プラスミド、組換えアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、リポソームまたはニオソームである、請求項２４に記載の遺伝子伝達体。
【請求項３２】
前記遺伝子伝達体は、組換えアデノウイルスベクターである、請求項３１に記載の遺伝子伝達体。
【請求項３３】
請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の遺伝子伝達体を含む腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項３４】
ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含む腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項３５】
前記ｓｈＴＧＦ−βは、ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２である、請求項３４に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項３６】
前記ｓｈＴＧＦ−β１は、配列番号５または配列番号６で表示される、請求項３５に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項３７】
前記ｓｈＴＧＦ−β２は、配列番号７または配列番号８で表示される、請求項３５に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項３８】
前記ｓｈＨＳＰは、ｓｈＨＳＰ２５またはｓｈＨＳＰ２７である、請求項３４に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項３９】
前記ｓｈＨＳＰ２５は、配列番号８で表示される、請求項３８に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項４０】
前記ｓｈＨＳＰ２７は、配列番号９で表示される、請求項３８に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項４１】
前記組成物は、免疫活性および免疫原性を増大させる、請求項３３または３４に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項４２】
前記遺伝子またはｓｈＲＮＡは、一つ以上の遺伝子伝達体により導入される、請求項３４に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項４３】
治療上の有効量の、顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子；ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含むＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体を対象体に投与することを含む腫瘍治療方法。
【請求項４４】
前記ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、配列番号１または配列番号２で表示される、請求項４３に記載の腫瘍治療方法。
【請求項４５】
前記Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子は、配列番号３で表示される、請求項４３に記載の腫瘍治療方法。
【請求項４６】
前記ｓｈＴＧＦ−βはｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２である、請求項４３に記載の腫瘍治療方法。
【請求項４７】
前記ｓｈＴＧＦ−β１は、配列番号４または配列番号５で表示される、請求項４６に記載の腫瘍治療方法。
【請求項４８】
前記ｓｈＴＧＦ−β２は、配列番号６または配列番号７で表示される、請求項４６に記載の腫瘍治療方法。
【請求項４９】
前記ｓｈＨＳＰは、ｓｈＨＳＰ２５またはｓｈＨＳＰ２７である、請求項４３に記載の腫瘍治療方法。
【請求項５０】
前記ｓｈＨＳＰ２５は、配列番号８で表示される、請求項４９に記載の腫瘍治療方法。
【請求項５１】
前記ｓｈＨＳＰ２７は、配列番号９で表示される、請求項４９に記載の腫瘍治療方法。
【請求項５２】
前記遺伝子伝達体は、プラスミド、組換えアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、リポソームまたはニオソームである、請求項４３に記載の腫瘍治療方法。
【請求項５３】
前記遺伝子伝達体は、組換えアデノウイルスベクターである、請求項５２に記載の腫瘍治療方法。
【請求項５４】
治療上の有効量の、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含むｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体を対象体に投与することを含む腫瘍治療方法。
【請求項５５】
前記ｓｈＴＧＦ−βは、ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２である、請求項５４に記載の腫瘍治療方法。
【請求項５６】
前記ｓｈＴＧＦ−β１は、配列番号５または配列番号６で表示される、請求項５５に記載の腫瘍治療方法。
【請求項５７】
前記ｓｈＴＧＦ−β２は、配列番号７または配列番号８で表示される、請求項５５に記載の腫瘍治療方法。
【請求項５８】
前記ｓｈＨＳＰは、ｓｈＨＳＰ２５またはｓｈＨＳＰ２７である、請求項５４に記載の腫瘍治療方法。
【請求項５９】
前記ｓｈＨＳＰ２５は、配列番号８で表示される、請求項５８に記載の腫瘍治療方法。
【請求項６０】
前記ｓｈＨＳＰ２７は、配列番号９で表示される、請求項５８に記載の腫瘍治療方法。
【請求項６１】
前記遺伝子伝達体は、プラスミド、組換えアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、リポソームまたはニオソームである、請求項５４に記載の腫瘍治療方法。
【請求項６２】
前記遺伝子伝達体は、組換えアデノウイルスベクターである、請求項６１に記載の腫瘍治療方法。
【請求項６３】
治療上の有効量の顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子；ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を対象体に投与することを含む腫瘍治療方法。
【請求項６４】
前記ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、配列番号１または配列番号２で表示される、請求項６３に記載の腫瘍治療方法。
【請求項６５】
前記Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子は、配列番号３または配列番号４で表示される、請求項６３に記載の腫瘍治療方法。
【請求項６６】
前記ｓｈＴＧＦ−βは、ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２である、請求項６３に記載の腫瘍治療方法。
【請求項６７】
前記ｓｈＴＧＦ−β１は、配列番号５または配列番号６で表示される、請求項６６に記載の腫瘍治療方法。
【請求項６８】
前記ｓｈＴＧＦ−β２は、配列番号７または配列番号８で表示される、請求項６６に記載の腫瘍治療方法。
【請求項６９】
前記ｓｈＨＳＰは、ｓｈＨＳＰ２５またはｓｈＨＳＰ２７である、請求項６３に記載の腫瘍治療方法。
【請求項７０】
前記ｓｈＨＳＰ２５は、配列番号８で表示される、請求項６９に記載の腫瘍治療方法。
【請求項７１】
前記ｓｈＨＳＰ２７は、配列番号９で表示される、請求項６９に記載の腫瘍治療方法。
【請求項７２】
治療上の有効量のＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を対象体に投与することを含む腫瘍治療方法。
【請求項７３】
前記ｓｈＴＧＦ−βは、ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２である、請求項７２に記載の腫瘍治療方法。
【請求項７４】
前記ｓｈＴＧＦ−β１は、配列番号５または配列番号６で表示される、請求項７３に記載の腫瘍治療方法。
【請求項７５】
前記ｓｈＴＧＦ−β２は、配列番号７または配列番号８で表示される、請求項７３に記載の腫瘍治療方法。
【請求項７６】
前記ｓｈＨＳＰは、ｓｈＨＳＰ２５またはｓｈＨＳＰ２７である、請求項７２に記載の腫瘍治療方法。
【請求項７７】
前記ｓｈＨＳＰ２５は、配列番号８で表示される、請求項７６に記載の腫瘍治療方法。
【請求項７８】
前記ｓｈＨＳＰ２７は、配列番号９で表示される、請求項７６に記載の腫瘍治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子；ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ；およびＨＳＰ発現を抑制するｓｈＲＮＡを含む抗腫瘍組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）は、多様な方法で作用するが、まず自然殺傷細胞や樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）のような抗原伝達細胞などを呼び集める役割をする。また、ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍の近所で樹枝状細胞を刺激して共刺激分子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現を増加させてＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が免疫反応を強化させる役割をし、樹枝状細胞の分化を促進させる機能の他に、一次単球（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ）でＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩを構成する分子の発現調節にも関与すると知られている［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：２３７４  ｂｙ  Ｈｏｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＭＨＣ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ．］。それだけでなく、腫瘍内でＧＭ−ＣＳＦを発現させると、腫瘍の周辺にＡＰＣが集まり、腫瘍抗原を効果的に処理して抗癌免疫反応を強く誘導するものと知られている［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５３：１７  ｂｙ  Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ＧＭ−ＣＳＦ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．］。
【０００３】
Ｆｌｔ３ＬとＴＲＡＩＬを同時に発現することにより、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬは、二重機能、すなわち樹枝状細胞をＤＣ肝細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）からＤＣへの増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を強力に刺激すること（Ｆｌｔ３Ｌ）と同時に、癌細胞の細胞死（ＴＲＡＩＬ）を誘導することができるようにする。細胞死滅腫瘍体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｂｏｄｙ）に由来する抗原を樹枝状細胞が取得して腫瘍に対抗する魅力的な予防接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）が可能である。このような接近法は、腫瘍に特異的な抗原性エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を同定する必要がなく、広範囲な目録のＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞反応を始発させることができる。したがって、ＨＬＡ単相型（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）とは関係なく、すべての癌患者に包括的に適用することができる［Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：３６８  ｂｙ  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈＦｌｅｘ−ＴＲＡＩＬ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．；Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：６７４  ｂｙ  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｈｕｉ，２００４．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ＴＲＡＩＬ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｈＦＬＥＸ／ｆｕｒｉｎ／ＴＲＡＩＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．］。
【０００４】
ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２およびＨＳＰ２７の発現を抑制するｓｈＲＮＡについては、本出願人により特許登録を受けたことがある［韓国特許登録第１２８６０５３号、韓国特許登録第１４２０５６４号、韓国特許登録第１３７４５８５号］。
【０００５】
ＨＳＰ２７の免疫学的な作用は、ＨＳＰ２７をサイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）させると、プロテアソーム活性を増加させて、ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される腫瘍殺傷と記憶反応を増加させるものと良く知られている。
【０００６】
これと関連して、ＴＧＦ−βおよびＨＳＰの発現を同時に抑制するｓｈＲＮＡをＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬと共に使用した有機的複合体を製造して、抗腫瘍の治療に適用した研究については、まだ報告されたことがない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国特許登録第１２８６０５３号
【特許文献２】韓国特許登録第１４２０５６４号
【特許文献３】韓国特許登録第１３７４５８５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：２３７４  ｂｙ  Ｈｏｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＭＨＣ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ．
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５３：１７  ｂｙ  Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ＧＭ−ＣＳＦ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．
【非特許文献３】Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：３６８  ｂｙ  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈＦｌｅｘ−ＴＲＡＩＬ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．
【非特許文献４】Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：６７４  ｂｙ  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｈｕｉ，２００４．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ＴＲＡＩＬ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｈＦＬＥＸ／ｆｕｒｉｎ／ＴＲＡＩＬ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これより、本発明者らは、腫瘍特異的細胞毒性作用および免疫活性と腫瘍の免疫原性を同時に増加させることにより、抗腫瘍活性が最大化した遺伝子抗腫瘍組成物を開発するために鋭意研究努力した結果、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）共発現用遺伝子伝達体を利用して対象細胞に形質導入させる場合、それぞれの遺伝子を発現する場合やなおさらＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬが発現する場合より、抗腫瘍効果が格別に改善されることを確認し、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体を利用して対象細胞に形質導入させる場合、それぞれの遺伝子を発現する場合より、特にｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ発現する場合より、抗腫瘍効果にさらに優れていることを確認することにより、本発明を完成するに至った。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰ発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含むＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体およびこれを含む抗腫瘍組成物を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰ発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含むｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体およびこれを含む抗腫瘍組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するための手段として、本発明は、顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ２７）を含むＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体を提供する。
【００１３】
前記課題を解決するための他の手段として、本発明は、顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含む抗腫瘍組成物を提供する。
【００１４】
前記課題を解決するためのさらに他の手段として、本発明は、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含むｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体を提供する。
【００１５】
前記課題を解決するためのさらに他の手段として、本発明は、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含む抗腫瘍組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、疾病誘発の原因となるタンパク質であるＴＧＦ−β腫瘍関連遺伝子に作用するｓｈＲＮＡ方式のＲＮＡ干渉を利用してＴＧＦ−βの発現を抑制して、免疫耐性を誘発する要素を制限し、ＧＭ−ＣＳＦによる免疫増強反応を誘導することにより、抗腫瘍効果を向上させると同時に、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを発現し、ＴＧＦ−βとＨＳＰの発現を同時に抑制させることにより、癌疾患動物モデルにおいても抗腫瘍効果を顕著に向上させた。これらの融合遺伝子を含む合計４個の個別遺伝子間の結合は、単に抗腫瘍効果機能を有する遺伝子のランダム組合せというよりは、それぞれの遺伝子の機能が互いに密接に有機的に関連しているように製作された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明による組換えアデノウイルスベクターに含まれている４個の遺伝子の個別的な作用方式を図式化したものである。
【図２】図２は、本発明の４種の遺伝子が別個の作用でなく有機的に相関関係を有しながら相互協同的に抗癌作用を示すことを示す図である。
【図３】図３は、本発明による２種の組換えアデノウイルスベクターおよび４種の組換えアデノウイルスベクターＹＳＣ−０２、ＹＳＣ−０１を示すものである。
【図４ａ】図４ａは、ＡｄｌｏｘベクターにＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬがＳａｌＩ／ＢａｍＨＩで挿入されていることを示すものである。
【図４ｂ】図４ｂは、ｐＩＲＥＳベクターにＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬが挿入されていることをＸｂａＩとＭｆｅＩで切断して確認したものである。
【図４ｃ】図４ｃは、ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ（−Ｅ１Ｒ）シャトルベクターにＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬが挿入されたことをＰｍｅＩで切断して確認したものである。
【図４ｄ】図４ｄは、ヒトＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図５ａ】図５ａは、ヒトｓｈＴＧＦ−βを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えを示すものである。
【図５ｂ】図５ｂは、ヒトｓｈＴＧＦ−βを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β２とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えを示すものである。
【図６】図６は、ヒトｓｈＨＳＰ２７を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えを示すものである。
【図７】図７は、ｐＳＰ７２−Ｈ１−ｍｓｈＨＳＰ２５−１、−２または−３からＨＳＰ２５  ｓｈＲＮＡ効果を確認するために、ＢＮＬ−ＨＳＰ２５細胞株にそれぞれのＨＳＰ２５  ｓｈＲＮＡをトランスフェクションしてＨＳＰ２５の発現減少効果を確認したものである。
【図８】図８は、マウスｓｈＨＳＰ２５を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＩＸとシャトルベクターであるｐＳＰ７２−ｓｈＨＳＰ２５−２との相同組換えを示すものである。
【図９】図９は、マウスｓｈＨＳＰ２５を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＩＸとシャトルベクターであるｐＳＰ７２−ｓｈＨＳＰ２５−３との相同組換えを示すものである。
【図１０】図１０は、図８と図９のＨＳＰ２５  ｓｈＲＮＡを発現するそれぞれのアデノウイルスから発現減少効果を確認したものである。
【図１１】図１１は、ｐＩＲＥＳ−ＧＭ−ＣＳＦにＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入されたことを制限酵素で確認したものである［レーン１：陰性ＤＮＡ；レーン２、３：Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ挿入確認］。
【図１２ａ】図１２ａは、ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−ΔＥ１Ｂ−Ｅ１ＲにヒトＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入されたことを制限酵素で確認したものである。
【図１２ｂ】図１２ｂは、ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−ΔＥ１Ｂ−Ｅ１ＲにマウスＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入されたことを制限酵素で確認したものである［サブクローニングは、ＰｍｅＩで切断して、インサートおよびベクターサイズが大きくなったことを確認した］。
【図１３ａ】図１３は、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入された腫瘍選択的複製可能アデノウイルスＤＮＡの相同組換えを制限酵素で確認したものであって、図１３ａは、ヒトＧＭ−ＣＳＦである場合を示すものであり［レーン１、２、３、４がいずれも陽性である］、図１３ｂは、マウスＧＭ−ＣＳＦである場合を示すものである［レーン１と４が陽性である］。
【図１３ｂ】図１３は、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入された腫瘍選択的複製可能アデノウイルスＤＮＡの相同組換えを制限酵素で確認したものであって、図１３ａは、ヒトＧＭ−ＣＳＦである場合を示すものであり［レーン１、２、３、４がいずれも陽性である］、図１３ｂは、マウスＧＭ−ＣＳＦである場合を示すものである［レーン１と４が陽性である］。
【図１４ａ】図１４は、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子のサブクローニング過程およびシャトルベクターの製作そして複製可能アデノウイルスの生産のための相同組換え過程を図式化したものである。
【図１４ｂ】図１４は、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子のサブクローニング過程およびシャトルベクターの製作そして複製可能アデノウイルスの生産のための相同組換え過程を図式化したものである。
【図１４ｃ】図１４は、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子のサブクローニング過程およびシャトルベクターの製作そして複製可能アデノウイルスの生産のための相同組換え過程を図式化したものである。
【図１５ａ】図１５ａは、ヒトのＧＭ−ＣＳＦとヒトのＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入された腫瘍選択的複製可能アデノウイルスにおいてＧＭ−ＣＳＦとＴＲＡＩＬタンパク質が発現することをＥＬＩＳＡで確認したものである。
【図１５ｂ】図１５ｂは、マウスのＧＭ−ＣＳＦとヒトのＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入された腫瘍選択的複製可能アデノウイルスにおいてＧＭ−ＣＳＦとＴＲＡＩＬタンパク質が発現することをＥＬＩＳＡで確認したものである。
【図１６ａ】図１６ａは、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入された腫瘍選択的複製可能アデノウイルスにおいてＴＲＡＩＬによる細胞死が起こることをＰＡＲＰ分割で確認したものである。
【図１６ｂ】図１６ｂは、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入された腫瘍選択的複製可能アデノウイルスにおいてＦｌｔ３Ｌが発現することを示すものである。
【図１７】図１７は、ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７またはｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１シャトルベクターの製作過程を示すものである。
【図１８】図１８は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＩＸとシャトルベクターｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７との相同組換えを示すものである。
【図１９】図１９は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＩＸとシャトルベクターｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１との相同組換えを示すものである。
【図２０】図２０は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとシャトルベクターｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１との相同組換えを示すものである。
【図２１】図２１は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとシャトルベクターｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７との相同組換えを示すものである。
【図２２】図２２は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えを示すものである。
【図２３】図２３は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えを示すものである。
【図２４ａ】図２４ａは、ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦ−β１にＨ１−ｍｓｈＨＳＰ２５遺伝子が挿入されたクローンを示すものである。
【図２４ｂ】図２４ｂは、バックボーンであるｄｌ３２４−ＩＸとシャトルベクターであるｐＳＰ７２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１との相同組換えを示すものである。
【図２５ａ】図２５ａは、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとシャトルベクターであるｐＳＰ７２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１との相同組換えを示すものである。
【図２５ｂ】図２５ｂは、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えを示すものである。
【図２６】図２６は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−β１を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＴＧＦ−β１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図２７】図２７は、マウスＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｍＴＧＦβ１を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図２８】図２８は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＨＳＰ２７を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ｍｓｈＨＳＰ２７とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図２９】図２９は、マウスＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＨＳＰ２５を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ｓｈＨＳＰ２５（マウス由来）とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図３０】図３０は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ｓｈＴＧＦβ１，ｓｈＨＳＰ２７を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ｓｈＨＳＰ２７−ｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｈＧＭＣＳＦとの相同組換えを示すものである。
【図３１】図３１は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ｓｈＴＧＦβ２、ｓｈＨＳＰ２７を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦとの相同組換えを示すものである。
【図３２】図３２は、マウスＧＭＣＳＦ、ｓｈＴＧＦβ１、ｓｈＨＳＰ２５を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｍｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭ−ＣＳＦとの相同組換えを示すものである。
【図３３】図３３は、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＨＳＰ２７およびｓｈＴＧＦβ１共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図３４】図３４は、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＨＳＰ２７およびｓｈＴＧＦβ２共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図３５】図３５は、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＨＳＰ２５およびｓｈＴＧＦβ１共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｍｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦ−β１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図３６】図３６は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−β２およびｓｈＨＳＰ２７搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルス（ＹＳＣ−０１）製作を確認したものであって、ｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬシャトルベクターとの相同組換えを示すものである。
【図３７】図３７は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−β１およびｓｈＨＳＰ２７搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルス（ＹＳＣ−０２）の製作を確認したものであって、ｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β１とｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬシャトルベクターとの相同組換えを示すものである。
【図３８】図３８は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬシャトルベクターとの相同組換えを示すものである。
【図３９】図３９は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３ＬＴＲＡＩＬとの相同組換えをそれぞれ示すものである。
【図４０】図４０は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換え（ｍＹＳＣ−０２）を示すものである。
【図４１】図４１は、マウス肝癌細胞株由来ＢＮＬ−ＣＡＲ−Ｅ１Ｂ５５Ｋ−ＨＳＰ２５細胞にｍＹＳＣ−０２感染させたとき、ウイルスに搭載された遺伝子が正常に発現していることを示すものである。
【図４２】図４２は、ｓｈＴＧＦ−β１、ｓｈＨＳＰ２７単独あるいは両方とも発現する腫瘍選択的複製可能ウイルスによる抗腫瘍効果をヌードマウス動物実験で確認したものである。
【図４３】図４３は、ＴＧＦ−βのアイソタイプによって生存率が異なることを様々な癌細胞株においてクローン形成法を通じて確認したものである。
【図４４ａ】図４４ａは、Ｕ２５１Ｎ、Ａ５４９、Ｈｕｈ７、Ａ３７５癌細胞株において細胞内ＴＧＦ−β１水準を低下させたとき、細胞生存信号およびＳＡＰＫ関連信号に対する効果を確認したものである。
【図４４ｂ】図４４ｂは、ＭｉａＰａＣａ−２、ＨＰＡＣ、Ａｓｐｃ−１、Ｃａｐａｎ−１癌細胞株において細胞内ＴＧＦ−β１水準を低下させたとき、細胞生存信号およびＳＡＰＫ関連信号に対する効果を確認したものである。
【図４５ａ】図４５ａは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１−Ｈｅｒ２癌細胞株においてＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２を低下させたときのＲＯＳ生成量をＤＣＦ−ＤＡ酸化による蛍光量で測定したのである。
【図４５ｂ】図４５ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１−Ｈｅｒ２癌細胞株においてＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２を低下させたとき、細胞生存信号およびＳＡＰＫ関連信号に対する効果を確認したものである。
【図４５ｃ】図４５ｃは、Ａ５４９、Ａ３７５、Ｈｕｎ７、Ｕ２５１Ｎ癌細胞株においてＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２を低下させたときのＲＯＳ生成量をＤＣＦ−ＤＡ酸化による蛍光量で測定したものである。
【図４６】図４６は、多様な癌細胞株においてＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β１とＨＳＰ２７を同時に低下させたときの細胞生存信号およびＳＡＰＫ関連信号に対する効果を確認したものである。
【図４７】図４７は、多様な癌細胞株でＨＳＰ２７を低下させたとき、腫瘍のプログレッションに関係する多様なマーカー信号の低下を確認したものである。
【図４８】図４８は、多様な癌細胞株においてＨＳＰ２７のみを低下させたときより、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２とＨＳＰ２７を同時に低下させたとき、腫瘍のプログレッションに関係する多様なマーカー信号の低下がさらに明確になることを確認したものである。
【図４９】図４９は、多様な癌細胞株においてＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２のみを低下させたときより、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２とＨＳＰ２７を同時に低下させたとき、生存率が低下することをクローン形成法を通じてその効果を確認したものである。
【図５０】図５０は、多様な癌細胞株においてＨＳＰ２７のみを低下させたときより、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２とＨＳＰ２７を同時に低下させたとき、ＴＲＡＩＬ受容体の増加およびＴＲＡＩＬ抵抗性関連ＣＤＫ９の減少効果があることを確認したものである。
【図５１ａ】図５１ａは、乳癌細胞株、神経膠腫、黒色腫細胞株においてＴＧＦ−β１とＨＳＰ２７を同時に低下させたとき、そしてそこにＴＲＡＩＬ発現を誘導したときの細胞生存信号およびＳＡＰＫ関連信号に対する効果を確認したものである。
【図５１ｂ】図５１ｂは、膵臓癌細胞株、肝癌細胞株においてＴＧＦ−β１とＨＳＰ２７を同時に低下させたとき、そしてそこにＴＲＡＩＬ発現を誘導したときの細胞生存信号およびＳＡＰＫ関連信号に対する効果を確認したものである。
【図５２ａ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ａは、ＹＳＣ−０１のＧＭ−ＣＳＦ塩基配列挿入を確認したものである。
【図５２ｂ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｂは、ＹＳＣ−０１のＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬにおいてＦｌｔ３Ｌ（１〜１８１アミノ酸該当）塩基配列確認したものである。
【図５２ｃ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｃは、ＹＳＣ−０１のＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬにおいてＴＲＡＩＬ（９５〜２８１アミノ酸該当塩基配列を確認したものである［三番目行の右側ＴＣＴがＴＣＣとなっているが、アミノ酸はセリンであって、同一］。
【図５２ｄ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｄは、ＹＳＣ−０１のｓｈＴＧＦ−β２においてｓｈＴＧＦ−β２塩基配列を確認したものである。
【図５２ｅ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｅは、ＹＳＣ−０１のｓｈＨＳＰ２７においてｓｈＨＳＰ２７塩基配列を確認したものである。
【図５２ｆ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｆは、ＹＳＣ−０２のＧＭ−ＣＳＦ塩基配列挿入を確認したものである。
【図５２ｇ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｇは、ＹＳＣ−０２のＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬでＦｌｔ３Ｌ（１〜１８１アミノ酸該当）塩基配列を確認したものである。
【図５２ｈ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｈは、ＹＳＣ−０２のＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬでＴＲＡＩＬ（９５〜２８１アミノ酸該当塩基配列を確認したものである［三番目列の左側ＴＣＴがＴＣＣとなっているが、アミノ酸はセリンであって、同一］。
【図５２ｉ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｉは、ＹＳＣ−０２のｓｈＨＳＰ２７においてｓｈＨＳＰ２７塩基配列を確認したものである。
【図５２ｊ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｊは、ＹＳＣ−０２のｓｈＴＧＦ−β１においてｓｈＴＧＦ−β１塩基配列を確認したものである。
【図５３ａ】図５３は、ＹＳＣ−１とＹＳＣ−０２を明記した膵臓癌細胞株にＭＯＩ別に感染させたときに導入した４個の遺伝子が正常に発現したり、ｓｈＲＮＡに起因して発現が低下していることを確認したものである。図５３ａは、ＹＳＣ−０１感染によるＧＭ−ＣＳＦおよびＴＲＡＩＬの分泌を確認したものである。
【図５３ｂ】図５３は、ＹＳＣ−１とＹＳＣ−０２を明記した膵臓癌細胞株にＭＯＩ別に感染させたときに導入した４個の遺伝子が正常に発現したり、ｓｈＲＮＡに起因して発現が低下していることを確認したものである。図５３ｂは、ＹＳＣ−０１感染によるＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡの発現抑制確認およびＰＡＲＰの分割およびＦｌｔ３Ｌの発現およびＨＳＰ２７の発現抑制を確認したものである。
【図５３ｃ】図５３は、ＹＳＣ−１とＹＳＣ−０２を明記した膵臓癌細胞株にＭＯＩ別に感染させたときに導入した４個の遺伝子が正常に発現したり、ｓｈＲＮＡに起因して発現が低下していることを確認したものである。図５３ｃは、ＹＳＣ−０２感染によるＧＭ−ＣＳＦおよびＴＲＡＩＬの分泌を確認したものである。
【図５３ｄ】図５３ｄは、ＹＳＣ−０２感染によるＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡの発現抑制確認およびＰＡＲＰの分割およびＦｌｔ３Ｌの発現およびＨＳＰ２７の発現抑制を確認したものである。
【図５４ａ】図５４ａは、ｐ５３変異型を有する数種類の癌細胞株においてＹＳＣ−１またはＹＳＣ−０２によりＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ発現する腫瘍溶解性アデノウイルスより生存率をさらに低下させていることをクローン形成法を通じて確認したものである。
【図５４ｂ】図５４ｂは、ｐ５３野生型の癌細胞株においてＹＳＣ−１またはＹＳＣ−０２によりＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ発現する腫瘍溶解性アデノウイルスより生存率をさらに低下させていることをクローン形成法を通じて確認したものであり（左）、正常細胞では、これとは異なって、ＹＳＣ−１またはＹＳＣ−０２であるか、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ発現する腫瘍溶解性アデノウイルスであるか、なおさら対照群の腫瘍溶解性アデノウイルスとも生存率に大きな差異がないことをクローン形成法を通じて確認したものである（右）。
【図５５ａ】図５５ａは、正常細胞およびｐ５３変異型を有する数種類の癌細胞株においてＹＳＣ−０２のＭＯＩの増加によって生存関係信号、ＴＲＡＩＬ関連信号などを確認して、腫瘍選択性を有しながら生存率の低下誘導および腫瘍殺傷能の増加を確認したものである。
【図５５ｂ】図５５ｂは、ｐ５３野生型を有する二種類の癌細胞株においてＹＳＣ−０２のＭＯＩ増加によって生存関係信号、ＴＲＡＩＬ関連信号などを確認して、腫瘍選択性を有しながら生存率の低下誘導および腫瘍殺傷能の増加を確認したものである。
【図５６】図５６は、正常細胞を含む数種類の癌細胞株においてＹＳＣ−１またはＹＳＣ−０２によりクローン形成法を通じてＹＳＣ−０２が相対的に腫瘍殺傷能に優れていることを確認したものである。
【図５７ａ】図５７ａは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ発現する腫瘍選択性複製可能ウイルスよりＹＳＣ−０１、ＹＳＣ−０２、特にＹＳＣ−０２がヒトの膵臓癌細胞株を移植した免疫欠乏ヌードマウスにおいて抗腫瘍効果を確認したものである。
【図５７ｂ】図５７ｂは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ発現する腫瘍選択性複製可能ウイルスよりＹＳＣ−０１、ＹＳＣ−０２、特にＹＳＣ−０２がヒトの膵臓癌細胞株を移植した免疫欠乏ヌードマウスにおいて生存率効果を確認したものである。
【図５８】図５８は、マウスに対するアデノウイルスの感染力と複製率を向上させることができる遺伝子を導入し、クローンを選択して挿入された遺伝子発現するマウス由来肝癌細胞株（ＢＮＬ−ＣＡＲ−Ｅ１Ｂ５５Ｋ−ＨＳＰ２５）を示すものである。
【図５９】図５９は、４種の遺伝子を発現するアデノウイルス（ＹＳＣ−０１，ＹＳＣ−０２）による抗腫瘍効果を確認したものであって、免疫要素の寄与を確認するために、免疫力があるマウスに感染させたすべての種類のウイルスをヒトとマウスに互換性があるＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを除いた残りの遺伝子をマウス遺伝子を使用してＹＳＣ−０１、０２およびＧＸ−０３等の抗腫瘍効果を比較したものである。
【図６０】図６０は、多様な癌細胞株においてＴＧＦ−β１またはＨＳＰ２７のみを低下させたり、またはＴＧＦ−β１とＨＳＰ２７を同時に低下させたときの生存率であるか、あるいはＧＸ−０３を感染させたときよりＹＳＣ−０２を感染させたときの生存率の低下効果が大部分の癌細胞株において最も大きいことをクローン形成法を通じてその効果を確認したものである。
【図６１】図６１は、免疫要素の寄与を確認するために、免疫力があるマウスに感染させたすべての種類のウイルスをヒトとマウスに互換性があるＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを除いた残りの遺伝子をマウス遺伝子を使用してＹＳＣ−０１、０２およびＧＸ−０３等のＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞免疫能を比較したものである。
【図６２】図６２は、免疫要素の寄与を確認するために、免疫力があるマウスに感染させたすべての種類のウイルスをヒトとマウスに互換性があるＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを除いた残りの遺伝子をマウス遺伝子を使用してＹＳＣ−０１、０２およびＧＸ−０３等のＴ制御性細胞の細胞免疫能を比較したものである。
【図６３ａ】図６３は、免疫要素の寄与を確認するために、免疫力があるマウスに感染させたすべての種類のウイルスをヒトとマウスに互換性があるＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを除いた残りの遺伝子は、マウス遺伝子を使用してＹＳＣ−０１、０２およびＧＸ−０３等のＤＣ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の細胞免疫能を比較したものである。図６３ａは、ＰＢＳ、腫瘍溶解性対照区アデノウィルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、マウスＧＭ−ＣＳＦのみを発現する腫瘍溶解性アデノウイルス、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスによるＤＣ活性を比較したものである。
【図６３ｂ】図６３は、免疫要素の寄与を確認するために、免疫力があるマウスに感染させたすべての種類のウイルスをヒトとマウスに互換性があるＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを除いた残りの遺伝子は、マウス遺伝子を使用してＹＳＣ−０１、０２およびＧＸ−０３等のＤＣ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の細胞免疫能を比較したものである。図６３ｂは、マウスＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを発現する腫瘍溶解性アデノウイルス、マウスＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、マウス形態のＨＳＰ２５のｓｈＲＮＡを発現する腫瘍溶解性アデノウイルス、マウス形態のＴＧＦ−β１のｓｈＲＮＡを発現する腫瘍溶解性アデノウイルス、そしてマウス形態のＹＳＣ−０２によるＤＣ活性を比較したものである。
【図６３ｃ】図６３は、免疫要素の寄与を確認するために、免疫力があるマウスに感染させたすべての種類のウイルスをヒトとマウスに互換性があるＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを除いた残りの遺伝子は、マウス遺伝子を使用してＹＳＣ−０１、０２およびＧＸ−０３等のＤＣ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の細胞免疫能を比較したものである。図６３ｃは、マウス形態のＹＳＣ−０２とマウス形態のＧＸ−０３によるＤＣ活性を互いに比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含むｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体（以下、２種の遺伝子伝達体という）に関する。
【００１９】
また、本発明は、顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含むＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体（以下、４種の遺伝子伝達体という）に関する。
【００２０】
ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）共発現用遺伝子伝達体を利用して対象細胞に形質導入させる場合、それぞれの遺伝子を発現する場合やなおさらＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬが発現する場合より抗腫瘍効果が格別に改善されることを確認した。
【００２１】
ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体を利用して対象細胞に形質導入させる場合、それぞれの遺伝子を発現する場合より、特にｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰの発現する場合より、抗腫瘍効果にさらに優れていることを確認した。
【００２２】
特に、本発明者らは、顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰ２７の発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ２７）が互いに非常に密接に細胞死滅と生存要素および免疫学的要素が連結されており、これらを効果的に調節する方式で組み合わせて現在の癌治療における障害者細胞内異なる信号ネットワーク間の混線（Ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ）、腫瘍細胞と免疫細胞間の混線（Ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ）、そして腫瘍内異質性（Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を克服して、広範囲な癌類型の範囲で非常に効果的に究極的な癌細胞の制御が可能であることを確認した。
【００２３】
本明細書で、用語「顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）」は、実施例に例示されたＧＭ−ＣＳＦだけでなく、免疫増強反応を誘導するＧＭ−ＣＳＦのすべての相同物（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）を含む。
【００２４】
マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、Ｄｒ．Ｇｅｒａｌｄ  Ｃ．Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ（Ｃｏｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｍｅｒｃｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｌｅｓｌｉｅ  Ｃ．Ｑｕｉｃｋ  Ｊｎｒ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｃｏｒｋ，Ｃｏｒｋ，Ｉｒｅｌａｎｄ）から入手し、塩基配列は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６）１３、１０６１−１０７１０に示された通りであり、配列番号１で表示される。
【００２５】
［配列番号１］
ａｔｇｔａｃａｇｇａ  ｔｇｃａａｃｔｃｃｔ  ｇｔｃｔｔｇｃａｔｔ  ｇｃａｃｔａａｇｔｃ  ｔｔｇｃａｃｔｔｇｔ  ｃａｃｇａａｔｔｃｇ  ６０
ｃｃｃａｃｃｃｇｃｔ  ｃａｃｃｃａｔｃａｃ  ｔｇｔｃａｃｃｃｇｇ  ｃｃｔｔｇｇａａｇｃ  ａｔｇｔａｇａｇｇｃ  ｃａｔｃａａａｇａａ  １２０
ｇｃｃｃｔｇａａｃｃ  ｔｃｃｔｇｇａｔｇａ  ｃａｔｇｃｃｔｇｔｃ  ａｃｇｔｔｇａａｔｇ  ａａｇａｇｇｔａｇａ  ａｇｔｃｇｔｃｔｃｔ  １８０
ａａｃｇａｇｔｔｃｔ  ｃｃｔｔｃａａｇａａ  ｇｃｔａａｃａｔｇｔ  ｇｔｇｃａｇａｃｃｃ  ｇｃｃｔｇａａｇａｔ  ａｔｔｃｇａｇｃａｇ  ２４０
ｇｇｔｃｔａｃｇｇｇ  ｇｃａａｔｔｔｃａｃ  ｃａａａｃｔｃａａｇ  ｇｇｃｇｃｃｔｔｇａ  ａｃａｔｇａｃａｇｃ  ｃａｇｃｔａｃｔａｃ  ３００
ｃａｇａｃａｔａｃｔ  ｇｃｃｃｃｃｃａａｃ  ｔｃｃｇｇａａａｃｇ  ｇａｃｔｇｔｇａａａ  ｃａｃａａｇｔｔａｃ  ｃａｃｃｔａｔｇｃｇ  ３６０
ｇａｔｔｔｃａｔａｇ  ａｃａｇｃｃｔｔａａ  ａａｃｃｔｔｔｃｔｇ  ａｃｔｇａｔａｔｃｃ  ｃｃｔｔｔｇａａｔｇ  ｃａａａａａａｃｃａ  ４２０
ｇｇｃｃａａａａａｔ  ｇａ  ４３２
【００２６】
ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手し、塩基配列は、ジーンバンクＭ１１２２０に示された通りであり、配列番号２で表示される。
【００２７】
［配列番号２］
ａｔｇｔｇｇｃｔｇｃ  ａｇａｇｃｃｔｇｃｔ  ｇｃｔｃｔｔｇｇｇｃ  ａｃｔｇｔｇｇｃｃｔ  ｇｃａｇｃａｔｃｔｃ  ｔｇｃａｃｃｃｇｃｃ  ６０
ｃｇｃｔｃｇｃｃｃａ  ｇｃｃｃｃａｇｃａｃ  ｇｃａｇｃｃｃｔｇｇ  ｇａｇｃａｔｇｔｇａ  ａｔｇｃｃａｔｃｃａ  ｇｇａｇｇｃｃｃｇｇ  １２０
ｃｇｔｃｔｃｃｔｇａ  ａｃｃｔｇａｇｔａｇ  ａｇａｃａｃｔｇｃｔ  ｇｃｔｇａｇａｔｇａ  ａｔｇａａａｃａｇｔ  ａｇａａｇｔｃａｔｃ  １８０
ｔｃａｇａａａｔｇｔ  ｔｔｇａｃｃｔｃｃａ  ｇｇａｇｃｃｇａｃｃ  ｔｇｃｃｔａｃａｇａ  ｃｃｃｇｃｃｔｇｇａ  ｇｃｔｇｔａｃａａｇ  ２４０
ｃａｇｇｇｃｃｔｇｃ  ｇｇｇｇｃａｇｃｃｔ  ｃａｃｃａａｇｃｔｃ  ａａｇｇｇｃｃｃｃｔ  ｔｇａｃｃａｔｇａｔ  ｇｇｃｃａｇｃｃａｃ  ３００
ｔａｃａａｇｃａｇｃ  ａｃｔｇｃｃｃｔｃｃ  ａａｃｃｃｃｇｇａａ  ａｃｔｔｃｃｔｇｔｇ  ｃａａｃｃｃａｇａｔ  ｔａｔｃａｃｃｔｔｔ  ３６０
ｇａａａｇｔｔｔｃａ  ａａｇａｇａａｃｃｔ  ｇａａｇｇａｃｔｔｔ  ｃｔｇｃｔｔｇｔｃａ  ｔｃｃｃｃｔｔｔｇａ  ｃｔｇｃｔｇｇｇａｇ  ４２０
ｃｃａｇｔｃｃａｇｇ  ａｇｔｇａ  ４３５
【００２８】
ヒトＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子は、Ｆｌｔ３Ｌ（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３  ｌｉｇａｎｄ）の１−１８１アミノ酸をコードする遺伝子とＴＲＡＩＬ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）の９５−２８１アミノ酸をコードする遺伝子がロイシンジッパー（ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ）で融合したものであって、ジーンバンクＵ０３８５８（Ｆｌｔ３Ｌ）とジーンバンクＢ０３２７２２またはＵ５７０５９（ＴＲＡＩＬ）で示されたように、配列番号３で表示される。
【００２９】
［配列番号３］
ａｔｇａｃａｇｔｇｃ  ｔｇｇｃｇｃｃａｇｃ  ｃｔｇｇａｇｃｃｃａ  ａｃａａｃｃｔａｔｃ  ｔｃｃｔｃｃｔｇｃｔ  ｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇ  ６０
ａｇｃｔｃｇｇｇａｃ  ｔｃａｇｔｇｇｇａｃ  ｃｃａｇｇａｃｔｇｃ  ｔｃｃｔｔｃｃａａｃ  ａｃａｇｃｃｃｃａｔ  ｃｔｃｃｔｃｃｇａｃ  １２０
ｔｔｃｇｃｔｇｔｃａ  ａａａｔｃｃｇｔｇａ  ｇｃｔｇｔｃｔｇａｃ  ｔａｃｃｔｇｃｔｔｃ  ａａｇａｔｔａｃｃｃ  ａｇｔｃａｃｃｇｔｇ  １８０
ｇｃｃｔｃｃａａｃｃ  ｔｇｃａｇｇａｃｇａ  ｇｇａｇｃｔｃｔｇｃ  ｇｇｇｇｇｃｃｔｃｔ  ｇｇｃｇｇｃｔｇｇｔ  ｃｃｔｇｇｃａｃａｇ  ２４０
ｃｇｃｔｇｇａｔｇｇ  ａｇｃｇｇｃｔｃａａ  ｇａｃｔｇｔｃｇｃｔ  ｇｇｇｔｃｃａａｇａ  ｔｇｃａａｇｇｃｔｔ  ｇｃｔｇｇａｇｃｇｃ  ３００
ｇｔｇａａｃａｃｇｇ  ａｇａｔａｃａｃｔｔ  ｔｇｔｃａｃｃａａａ  ｔｇｔｇｃｃｔｔｔｃ  ａｇｃｃｃｃｃｃｃｃ  ｃａｇｃｔｇｔｃｔｔ  ３６０
ｃｇｃｔｔｃｇｔｃｃ  ａｇａｃｃａａｃａｔ  ｃｔｃｃｃｇｃｃｔｃ  ｃｔｇｃａｇｇａｇａ  ｃｃｔｃｃｇａｇｃａ  ｇｃｔｇｇｔｇｇｃｇ  ４２０
ｃｔｇａａｇｃｃｃｔ  ｇｇａｔｃａｃｔｃｇ  ｃｃａｇａａｃｔｔｃ  ｔｃｃｃｇｇｔｇｃｃ  ｔｇｇａｇｃｔｇｃａ  ｇｔｇｔｃａｇｃｃｃ  ４８０
ｇａｃｔｃｃｔｃａａ  ｃｃｃｔｇｃｃａｃｃ  ｃｃｃａｔｇｇａｇｔ  ｃｃｃｃｇｇｃｃｃｃ  ｔｇｇａｇｇｃｃａｃ  ａｇｃｃｃｃｇａｃａ  ５４０
ｇｃｃｃｃｇｇｃｔａ  ｇｃａｇａａｔｇａａ  ｇｃａｇａｔｃｇａｇ  ｇａｃａａａａｔｔｇ  ａｇｇａａａｔｃｃｔ  ｇｔｃｃａａａａｔｔ  ６００
ｔａｃｃａｃａｔｃｇ  ａｇａａｃｇａｇａｔ  ｃｇｃｃｃｇｇａｔｔ  ａａｇａａａｃｔｃａ  ｔｔｇｇｃｇａｇａｇ  ｇｇａａｔｔｃａｃｃ  ６６０
ｔｃｔｇａｇｇａａａ  ｃｃａｔｔｔｃｔａｃ  ａｇｔｔｃａａｇａａ  ａａｇｃａａｃａａａ  ａｔａｔｔｔｃｔｃｃ  ｃｃｔａｇｔｇａｇａ  ７２０
ｇａａａｇａｇｇｔｃ  ｃｔｃａｇａｇａｇｔ  ａｇｃａｇｃｔｃａｃ  ａｔａａｃｔｇｇｇａ  ｃｃａｇａｇｇａａｇ  ａａｇｃａａｃａｃａ  ７８０
ｔｔｇｔｃｔｔｃｔｃ  ｃａａａｃｔｃｃａａ  ｇａａｔｇａａａａｇ  ｇｃｔｃｔｇｇｇｃｃ  ｇｃａａａａｔａａａ  ｃｔｃｃｔｇｇｇａａ  ８４０
ｔｃａｔｃａａｇｇａ  ｇｔｇｇｇｃａｔｔｃ  ａｔｔｃｃｔｇａｇｃ  ａａｃｔｔｇｃａｃｔ  ｔｇａｇｇａａｔｇｇ  ｔｇａａｃｔｇｇｔｃ  ９００
ａｔｃｃａｔｇａａａ  ａａｇｇｇｔｔｔｔａ  ｃｔａｃａｔｃｔａｔ  ｔｃｃｃａａａｃａｔ  ａｃｔｔｔｃｇａｔｔ  ｔｃａｇｇａｇｇａａ  ９６０
ａｔａａａａｇａａａ  ａｃａｃａａａｇａａ  ｃｇａｃａａａｃａａ  ａｔｇｇｔｃｃａａｔ  ａｔａｔｔｔａｃａａ  ａｔａｃａｃａａｇｔ  １０２０
ｔａｔｃｃｔｇａｃｃ  ｃｔａｔａｔｔｇｔｔ  ｇａｔｇａａａａｇｔ  ｇｃｔａｇａａａｔａ  ｇｔｔｇｔｔｇｇｔｃ  ｔａａａｇａｔｇｃａ  １０８０
ｇａａｔａｔｇｇａｃ  ｔｃｔａｔｔｃｃａｔ  ｃｔａｔｃａａｇｇｇ  ｇｇａａｔａｔｔｔｇ  ａｇｃｔｔａａｇｇａ  ａａａｔｇａｃａｇａ  １１４０
ａｔｔｔｔｔｇｔｔｔ  ｃｔｇｔａａｃａａａ  ｔｇａｇｃａｃｔｔｇ  ａｔａｇａｃａｔｇｇ  ａｃｃａｔｇａａｇｃ  ｃａｇｔｔｔｔｔｔｃ  １２００
ｇｇｇｇｃｃｔｔｔｔ  ｔａｇｔｔｇｇｃｔａ  ａ  １２２１
【００３０】
Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子の場合には、前記ヒトタイプ遺伝子がマウスでも活性を有するので、マウスＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子を別に製作せずに、ヒトＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子を使用した。
【００３１】
本明細書で、用語「ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）」は、ＴＧＦ−β１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β１）またはＴＧＦ−β２の発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β２）を意味する。
【００３２】
前記「ＴＧＦ−β１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β１）」は、韓国特許公開第２０１３−００１２０９５号に開示されたものを使用し（韓国特許公開第２０１３−００１２０９５号に開示された配列は、ＲＮＡ配列で表記されている。ＤＮＡで表示される場合には、ＲＮＡ配列のＵをＴで置換すればよいので、同じものである）、前記ｓｈＴＧＦ−β１は、マウスｓｈＲＮＡの場合、配列番号４で表示され、ヒトｓｈＲＮＡの場合には、配列番号５で表示される。
【００３３】
［配列番号４］
ｃｃｃｔｃｔａｃａａ  ｃｃａａｃａｃａａｃ  ｃｃｇｇｇｔｃｔｃｃ  ｃｃｇｇｇｔｔｇｔｇ  ｔｔｇｇｔｔｇｔａｇ  ａｇｇｇ  ５４
【００３４】
［配列番号５］
ａｃｃａｇａａａｔａ  ｃａｇｃａａｃａａｔ  ｔｃｃｔｇｕｃｔｃｔ  ｃｃａｇｇａａｔｔｇ  ｔｔｇｃｔｇｇｔａｔ  ｔｔｃｔｇｇｔｔｔ  ５９
【００３５】
前記「ＴＧＦ−β２の発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β２）」は、韓国特許公開第２０１３−００８８７９２号に開示されたものを使用し、前記ｓｈＴＧＦ−β２は、マウスｓｈＲＮＡの場合、配列番号６で表示され、ヒトｓｈＲＮＡの場合には、配列番号７で表示される。（ＲＮＡで表示される場合には、ＤＮＡ配列のＴをＵで置換すればよい）
【００３６】
［配列番号６］
ｇｇａｔｔｇａａｃｔ  ｇｔａｔｃａｇａｔｃ  ｃｔｔａａｔｃｔｃｔ  ｔａａｇｇａｔｃｔｇ  ａｔａｃａｇｔｔｃａ  ａｔｃｃ  ５４
【００３７】
［配列番号７］
ｇｇａｔｔｇａｇｃｔ  ａｔａｔｃａｇａｔｔ  ｃｔｃａａｔｃｔｃｔ  ｔｇａｇａａｔｃｔｇ  ａｔａｔａｇｃｔｃａ  ａｔｃｃ  ５４
【００３８】
本明細書で、用語「ＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）」は、マウスｓｈＲＮＡに該当するｓｈＨＳＰ２５またはヒトｓｈＲＮＡに該当するｓｈＨＳＰ２７を含むことができ、前記ｓｈＨＳＰ２５は、配列番号８で表示され、前記ｓｈＨＳＰ２７は、韓国特許公開第２０１３−０１２３２４４号に開示されたものを使用し、配列番号９で表示される（ＲＮＡで表示される場合には、ＤＮＡ配列のＴをＵで置換すればよい）。
【００３９】
［配列番号８］
ｇｃｔａｃ  ａｔｃｔｃ  ｔｃｇｇｔ  ｇｃｔｔｃ  ａ  ｔｃｔｃ  ｔ  ｇａａｇｃ  ａｃｃｇａ  ｇａｇａｔ  ｇｔａｇｃ
【００４０】
［配列番号９］
ｇａｔｃｃｇａｃｇａ  ｇｃａｔｇｇｃｔａｃ  ａｔｃｔｃｃｃｇｇｔ  ｔｃｔｃａｃｃｇｇｇ  ａｇａｔｇｔａｇｃｃ  ａｔｇｃｔｃｇｔｃｔ
【００４１】
本発明の遺伝子伝達体を製造するために、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ；またはＧＭ−ＣＳＦ遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰは、適合した発現構造体（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）内に存在することが好ましい。前記発現構造体において、前記遺伝子は、プロモーターに作動的に結合することが好ましい。本明細書で、用語「作動的に結合した」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列の間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写および／または解読を調節する。本発明において、本発明の前記目的遺伝子に結合したプロモーターは、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞で作動してデコリン遺伝子の転写を調節できるものであって、哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターおよび哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーターを含み、例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーターおよびヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーターを含むが、これに限定されるものではない。
【００４２】
好ましくは、本発明に利用される発現構造体は、ポリアネニル化配列を含む（例えば、ウシ成長ホルモンターミネーターおよびＳＶ４０由来ポリアデニル化配列）。
【００４３】
本発明の遺伝子伝達体は、多様な形態で製作できるが、これは、（ｉ）ネイキッド（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子、（ｉｉ）プラスミド、（ｉｉｉ）ウイルスベクター、そして、（ｉｖ）前記ネイキッド組換えＤＮＡ分子またはプラスミドを内包するリポソームまたはニオソームの形態で製作することができる。
【００４４】
ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子、ｓｈＴＧＦ−β（ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２）および／またはｓｈＨＳＰは、通常の遺伝子治療に利用されるすべての遺伝子伝達システムに適用され得、好ましくは、プラスミド、アデノウイルス（Ｌｏｃｋｅｔｔ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：２０７５−２０８０（１９９７））、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ，Ｌａｓｈｆｏｒｄ  ＬＳ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｅｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ、１９９９）、レトロウイルス（Ｇｕｎｚｂｕｒｇ  ＷＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｅｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ、１９９９）、レンチウイルス（Ｗａｎｇ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：Ｒ５５−６２（１９９９））、単純ヘルペスウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１４１１−１４１５（１９９５））、ワクチニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：６４９−６５７（１９９９））、リポソーム（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １９９，Ｓ．Ｃ．Ｂａｓｕ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂａｓｕ（Ｅｄｓ．），Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２）またはニオソームに適用され得る。最も好ましくは、本発明の遺伝子伝達体は、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子；ｓｈＴＧＦ−β；および／またはｓｈＨＳＰをアデノウイルスに適用して製造される。
【００４５】
ｉ．アデノウイルス
アデノウイルスは、中間程度のゲノムサイズ、操作の便宜性、高いタイター、広範囲なターゲット細胞および優れた感染性に起因して、遺伝子伝達ベクターとして多く利用されている。ゲノムの両末端は、１００〜２００ｂｐのＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）を含み、これは、ＤＮＡの複製およびパッケージングに必須のシスエレメントである。ゲノムのＥ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、転写および宿主細胞遺伝子の転写を調節するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）は、ウイルスＤＮＡの複製に関与するタンパク質をコードする。現在開発されたアデノウイルスベクターのうち、Ｅ１領域が欠如した複製不能アデノウイルスが多く利用されている。一方、Ｅ３領域は、通常のアデノウイルスベクターから除去されて外来遺伝子が挿入されるサイトを提供する（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ、３１：５４３−５５１（１９８２）；およびＲｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５：１０６６−１０７３（１９８９））。
【００４６】
したがって、本発明のｓｈＴＧＦ−β（ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２）およびｓｈＨＳＰ；またはＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子、ｓｈＴＧＦ−β（ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２）およびｓｈＨＳＰは、欠失したＥ１領域（Ｅ１Ａ領域および／またはＥ１Ｂ領域、好ましくはＥ１Ｂ領域）またはＥ３領域に挿入されることが好ましい。本明細書でウイルスゲノム配列と関連して使用される用語「欠失」は、当該配列が完全に欠失したものだけでなく、部分的に欠失したものをも含む意味を有する。
【００４７】
また、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％までパッキングし得るので、約２ｋｂをさらにパッケージングすることができる（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：１７３３−１７３９（１９８７））。したがって、アデノウイルスに挿入される前述した外来配列は、アデノウイルスのゲノムにさらに結合させることもできる。アデノウイルスは、４２個の異なる血清型およびＡ−Ｆのサブグループを有する。このうち、サブグループＣに属するアデノウイルスタイプ５が、本発明のアデノウイルスベクターを得るための最も好ましい出発物質である。アデノウイルスタイプ５に対する生化学的および遺伝的情報は良く知られている。アデノウイルスにより運搬される外来遺伝子は、エピソームと同じ方式で複製され、これにより、宿主細胞に対して遺伝的毒性が非常に低い。したがって、本発明のアデノウイルス遺伝子伝達システムを利用した遺伝子の治療が非常に安全なものと判断される。
【００４８】
ｉｉ．レトロウイルス
レトロウイルスは、自分の遺伝子を宿主のゲノムに挿入させ、大量の外来遺伝物質を運搬することができ、感染させることができる細胞のスペクトルが広いので、遺伝子伝達ベクターとして多く利用されている。
【００４９】
レトロウイルスベクターを構築するために、運搬しようとする目的ヌクレオチド配列は、レトロウイルスの配列の代わりに、レトロウイルスゲノムに挿入されて複製不能のウイルスを生産する。バイリオンを生産するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）とΨ配列がないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９（１９８３））。運搬しようとする目的ヌクレオチド配列、ＬＴＲおよびΨ配列を含む組換えプラスミドを前記細胞株に移入すれば、Ψ配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写体の生産を可能にし、この転写体は、ウイルスでパッケージングされ、ウイルスは、培地に排出される（ＮｉｃｏｌａｓＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  “Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ，”  Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ（ｅｄｓ．），Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４９４−５１３（１９８８））。組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し濃縮して、遺伝子伝達体として利用する。
【００５０】
２世代レトロウイルスベクターを利用した遺伝子伝達が発表された。Ｋａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１３７３−１３７６（１９９４））は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）の変異体を製造し、ここでＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）配列をエンベロープ部位に挿入して、新しい結合特性を有するキメリクタンパク質を生産した。本発明の遺伝子伝達体も、このような２世代レトロウイルスベクターの構築戦略によって製造することができる。
【００５１】
ｉｉｉ．ＡＡＶベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非分裂細胞を感染させることができ、多様な種類の細胞に感染できる能力を有しているので、本発明の遺伝子伝達体として適合している。ＡＡＶベクターの製造および用途に関する詳細な説明は、米国特許第５，１３９，９４１号および第４，７９７，３６８号に詳細に開示されている。
【００５２】
遺伝子伝達体としてのＡＡＶに対する研究は、ＬａＦａｃｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｏｌｏｇｙ，１６２：４８３４８６（１９８８），Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（ＮＹ），２１：９２８−９３３（１９９３），Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４：１４４０−１４４８（１９９４）およびＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２：２９−３７（１９９５）に開示されている。最近、ＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症の治療剤として臨床Ｉを実施している。
【００５３】
典型的に、ＡＡＶウイルスは、二つのＡＡＶ末端リピートが側方に位置している目的の遺伝子配列を含むプラスミド（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３−１９７３（１９８８）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２−３８２８（１９８９））および末端リピートがない野生型ＡＡＶコーディング配列を含む発現プラスミド（ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５：２９３６−２９４５（  １９９１））を同時形質転換させて製造される。
【００５４】
ｉｖ．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明の遺伝子伝達体として利用することができる。ワクチニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：６４９−６５７（１９９９）；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，“ Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、４６７−４９２（１９８８）；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，“Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ，”  Ｉｎ：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ、ｅｄ．Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１１７−１４８（  １９８６）およびＣｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ、６８：１−１０（１９８８））、レンチウイルス（Ｗａｎｇ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：Ｒ５５−６２（１９９９））または単純ヘルペスウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１４１１−１４１５（１９９５））に由来するベクターも、運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を細胞内に運搬できる運搬システムとして利用することができる。
【００５５】
ｖ、リポソーム
リポソームは、水相に分散したリン脂質により自動的に形成される。外来ＤＮＡ分子をリポソームで成功裏に細胞内に運搬した例は、ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０（１９８２）およびＮｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６（１９８７）に開示されている。一方、リポソームを利用した動物細胞の形質転換に最も多く利用される試薬としては、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）がある。運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を内包したリポソームは、エンドサイトーシス、細胞表面への吸着またはプラズマ細胞膜との融合などの機序を通じて細胞と相互作用して細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を運搬する。
【００５６】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の遺伝子伝達体は、組換えアデノウイルスベクターである。
【００５７】
本発明のより好ましい具現例によれば、本発明の組換えアデノウイルスベクターは、Ｅ１ＢおよびＥ３領域が欠失したものであり、前記ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２は、欠失したＥ３領域に挿入され、前記ｓｈＨＳＰは、欠失したＥ３領域に挿入される。また、４種の遺伝子が導入された組換えアデノウイルスベクターは、前記ＧＭ−ＣＳＦエンコーディングヌクレオチドおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬエンコーディングヌクレオチドは、欠失したＥ１Ｂ領域に挿入され、前記ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２およびｓｈＨＳＰは、欠失したＥ３領域に挿入される。
【００５８】
活性のＥ１Ａ遺伝子を含む組換えアデノウイルスは、複製可能な特性を有し、Ｅ１Ｂ領域が欠失した場合には、細胞死能を増大させることができる。本明細書でウイルスゲノム配列と関連して使用される用語「欠失」は、当該配列が完全に欠失したものだけでなく、部分的に欠失したものをも含む意味を有する。本発明の組換えアデノウイルスは、変異しないＥ１Ａ遺伝子を含んだり、または変異された活性のＥ１Ａ遺伝子を含むことができる。
【００５９】
最も好ましくは、本発明の組換えアデノウイルスベクターは、欠失したＥ３領域に５’から３’方向にｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２、および欠失したＥ３領域に５’から３’方向にｓｈＨＳＰ２７を含む（図３）。
【００６０】
本発明の４種の遺伝子が導入された組換えアデノウイルスベクターは、欠失したＥ１領域に３から５方向にＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、Ｅ３領域に５から３方向にｓｈＴＧＦ−β２、ｓｈＨＳＰ２７またはｓｈＨＳＰ２７、ｓｈＴＧＦ−β１を含む（図３）。
【００６１】
また、本発明は、前記ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体；またはＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体を含む抗腫瘍組成物を提供する。
【００６２】
本発明で使用される用語「抗腫瘍組成物」は、「腫瘍治療における使用のための医薬組成物」を意味する。
【００６３】
本発明の抗腫瘍組成物に有効成分として含まれる遺伝子伝達体は、前述した本発明の遺伝子伝達体と同じものであるから、遺伝子伝達体に対する詳細な説明は、本発明の組成物にもそのまま適用される。したがって、本明細書の不要な反復記載による過度な複雑性を避けるために、共通事項はその記載を省略する。
【００６４】
本発明の組成物に含まれる組換えアデノウイルスは、前述したように、多様な腫瘍細胞に対して殺傷効能を示すので、本発明の薬剤学的組成物は、腫瘍に関連した多様な疾病または疾患、例えば胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、子宮頸癌および黒色腫などの治療に利用され得る。本明細書で用語「治療」は、（ｉ）腫瘍細胞形成の予防；（ｉｉ）腫瘍細胞の除去による腫瘍に関連した疾病または疾患の抑制；および（ｉｉｉ）腫瘍細胞の除去による腫瘍に関連した疾病または疾患の軽減を意味する。したがって、本明細書で用語「治療学的有効量」は、上記した薬理学的効果を達成するのに十分な量を意味する。
【００６５】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００６６】
本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【００６７】
本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与が好ましく、例えば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与または局部投与を利用して投与することができる。卵巣癌において腹腔内に投与する場合、および肝癌において門脈に投与する場合には、注入方法で投与することができ、肝癌、黒色腫および乳癌の場合には、腫瘍マスに直接注射して投与することができ、結腸癌の場合には、灌腸で直接注射して投与することができ、膀胱癌の場合には、カテーテル内に直接注射して投与することができる。
【００６８】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病気症状の程度、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様であり、通常の熟練した医師は、目的する治療に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。一般的に、本発明の薬剤学的組成物は、１×１０５〜１×１０１５ｐｆｕ／ｍｌの組換えアデノウイルスを含み、通常的に１×１０８〜１×１０１３ｐｆｕを二日に一回ずつ２週間注射する。
【００６９】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を利用して製剤化されることにより、単位用量の形態で製造されたり、または多用量の容器内に内入させて製造されることができる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態であるか、エキス剤、粉末、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００７０】
本発明の薬剤学的組成物は、単独の療法で利用され得るが、他の通常の化学療法または放射療法と共に利用されてもよく、このような並行療法を実施する場合には、より効果的に癌治療を行うことができる。本発明の組成物と共に利用され得る化学療法剤は、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、 ビスルファン(ｂiｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチン（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）およびメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）等を含む。本発明の組成物と共に利用され得る放射療法は、Ｘ線照射およびγ線照射などである。
【００７１】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、腫瘍の細胞死および免疫活性および免疫原性を増大させる。
【００７２】
また、本発明は、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含む抗腫瘍組成物を提供する。
【００７３】
上記抗腫瘍組成物と関連して記述したすべての内容が前述した本発明の遺伝子共同体および／または抗腫瘍組成物にそのまま適用または準用され得る。
【００７４】
特に、本発明の組成物は、前記ｓｈＴＧＦ−βおよび／またはｓｈＨＳＰは、一つ以上の遺伝子伝達体に導入されて、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）および／またはＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）が共発現するようにする。
【００７５】
また、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含む抗腫瘍組成物を提供する。
【００７６】
前記抗腫瘍組成物と関連して記述したすべての内容が前述した本発明の遺伝子共同体および／または抗腫瘍組成物にそのまま適用または準用され得る。
【００７７】
特に、本発明の組成物は、前記ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子、ｓｈＴＧＦ−βおよび／またはｓｈＨＳＰは一つ以上の遺伝子伝達体に導入されて、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）および／またはＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）が共発現するようにする。
【００７８】
また、本発明は、前記遺伝子伝達体を導入したアデノウイルスを提供する。
【００７９】
本発明でＲＮＡｉのための核酸分子を伝達するのに有用なウイルス（ウイルスベクター）としては、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスなどがあり、腫瘍のように一時的な発現誘導が必要であるという理由からアデノウイルスが好ましい。
【００８０】
また、本発明は、治療上の有効量の、ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含んだり、顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子；ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含む遺伝子伝達体（２種または４種）を対象体に投与することを含む腫瘍治療方法を含む。
【００８１】
また、本発明は、治療上の有効量のＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を対象体に投与することを含む腫瘍治療方法を含む。
【００８２】
また、本発明は、治療上の有効量の顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子；ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を対象体に投与することを含む腫瘍治療方法を含む。
【００８３】
前記腫瘍治療方法と関連して記述したすべての内容が前述した本発明の遺伝子共同体および／または抗腫瘍組成物にそのまま適用または準用され得る。
【００８４】
ここで使用された用語「対象体」は、治療、観察または実験の対象である哺乳動物をいい、好ましくはヒトをいう。
【００８５】
ここで使用された用語「治療上有効量」は、研究者、獣医師、医師またはその他臨床医により考えられる組織系、動物またはヒトで生物学的または医学的反応を誘導する有効成分または薬学的組成物の量を意味するものであり、これは、治療される疾患または障害の症状の緩和を誘導する量を含む。本発明の有効成分に対する治療上有効量および投与回数は、所望の効果によって変化することは当業者に自明である。したがって、投与される最適な投与量は、当業者により容易に決定され得、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分および他の成分の含量、剤形の種類、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率などによってその範囲が多様である。本発明の治療方法において、１×１０５〜１×１０１５ｐｆｕ／ｍｌの組換えアデノウイルスを含み、通常、１×１０８〜１×１０１３ｐｆｕを二日に一回ずつ２週間注射する。
【００８６】
本発明の治療方法において本発明の抗腫瘍組成物は、目的する方法によって経口投与したり、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができる。
【００８７】
以下、本発明による実施例を通じて本発明をより詳細に説明するか、本発明の範囲が下記提示された実施例によって制限されるわけではない。
【実施例】
【００８８】
参照例１：ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の用意
マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、Ｄｒ．Ｇｅｒａｌｄ  Ｃ．Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ（Ｃｏｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｍｅｒｃｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｌｅｓｌｉｅ  Ｃ．Ｑｕｉｃｋ  Ｊｎｒ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｃｏｒｋ，Ｃｏｒｋ，Ｉｒｅｌａｎｄ）から入手し、塩基配列は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６）１３，１０６１−１０７１０に示された通りであり、配列番号１で表示される。
【００８９】
ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手し、塩基配列は、ジーンバンクＭ１１２２０に示された通りであり、配列番号２で表示される。
【００９０】
韓国特許出願第２０１５−００４４５０７号で使用された塩基配列は、実際にジーンバンクＭ１１２２０に示された７８９ｂｐ塩基配列のうち３３−４６７ｂｐに該当する本願配列番号２に記載された塩基配列を意味する。
【００９１】
製造例１：ＧＭ−ＣＳＦ発現用アデノウイルスの製作（複製不能：ｄｌ３２４−ＧＭ−ＣＳＦ、複製可能：ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦ）
韓国特許出願第２０１５−００４４５０７号と同じ遺伝子を使用し、韓国特許出願第２０１５−００４４５０７号の製造例１と同一に製作した。
【００９２】
参照例２：Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子の用意
ヒトＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子は、Ｆｌｔ３Ｌ（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３  ｌｉｇａｎｄ）の１−１８１アミノ酸をコードする遺伝子とＴＲＡＩＬ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）の９５−２８１アミノ酸をコードする遺伝子がロイシンジッパー（ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ）で融合したものであって、ジーンバンクＵ０３８５８（Ｆｌｔ３Ｌ）とジーンバンクＢ０３２７２２またはＵ５７０５９（ＴＲＡＩＬ）で示したように、配列番号３で表示される。
【００９３】
Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子の場合には、前記ヒトタイプ遺伝子がマウスでも活性を有するので、マウスＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子を別に製作せず、ヒトＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子を使用した。
【００９４】
製造例２：Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子（Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ）搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ）
Ａｄｌｏｘ−ＦＥＴＺ（Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ）はｐＦＥＴＺ（Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ）（Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈＦｌｅｘ−ＴＲＡＩＬ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  Ｘｉａｏｆｅｎｇ  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．３  ３６８−３７４，２００１）をＳａｌ／ＢａｍＨＩで処理したＦＥＴＺ（Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌは、可溶型（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍ）のみで構成されており、ＴＲＡＩＬは、細胞外ドメインである９５−２８１部位のみを有するものであって、この二つは、イソロイシンジッパーで連結されている）をＳａｌＩ／ＢａｍＨＩで切断したＡｄｌｏｘベクターに移したものである（図４ａ）。
【００９５】
Ａｄｌｏｘ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬをＢａｍＨＩで切断し、ｐＩＲＥＳをＮｏｔＩで切断した後、ブランティングした。
【００９６】
次に、それぞれをＳａｌＩで切断して連結した。Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ挿入の可否は、ＸｂａＩとＭｆｅＩで切断してインサートの有無を確認した（図４ｂ）。次に、ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ（−Ｅ１Ｒ）シャトルベクター（韓国特許出願第２０１５−００４４５０７号の図５に示したｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｅ１Ｒと同じベクターである）へのＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子挿入のために、ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ（−Ｅ１Ｒ）をＳａｌＩで切断し、ｐＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬをＦｓｐＩで切断して、二つを一緒にブランティングし、また、一緒にＢｇｌＩＩでカットした後、ｐＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ  ＴＲＡＩＬから抜け出したＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬをシャトルベクターでサブクローニングした。図４ｃは、ＰｍｅＩで切断して、インサート挿入の可否を確認したものである。
【００９７】
ウイルス生成のために、ウイルスバックボーン（ｖｉｒａｌ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）であるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩは、Ｂｓｐ１１９１で切断し、前記で製作されたｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬは、ＰｍｅＩで線形化させて、大腸菌ＢＪ５１８３に形質転換させて、相同組換えＤＮＡを生成した。その結果、ＨｉｎｄＩＩＩパターンとＰａｃＩ切断で組換えされたことを確認した（図４ｄ）。
【００９８】
このように相同組換えして、アデノウイルスｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを製作した。
【００９９】
参照例３：ＴＧＦ−β１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦβ１）遺伝子の用意
韓国特許公開第２０１３−００１２０９５号に開示されたように、配列番号４または５で表示されるＴＧＦ−β１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ（以下、ｓｈＴＧＦ−β１という）を製作した。
【０１００】
前記ｓｈＴＧＦ−β１は、マウスｓｈＲＮＡの場合、配列番号４で表示され、ヒトｓｈＲＮＡの場合には、配列番号５で表示される。
【０１０１】
参照例４：ＴＧＦ−β２の発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦβ２）遺伝子の用意
韓国特許公開第２０１３−００８８７９２号に開示されたように、配列番号６または７で表示されるＴＧＦ−β２の発現を抑制するｓｈＲＮＡ（以下、ｓｈＴＧＦ−β２という）を製作した。
【０１０２】
前記ｓｈＴＧＦ−β２は、マウスｓｈＲＮＡの場合、配列番号６で表示され、ヒトｓｈＲＮＡの場合には、配列番号７で表示される。
【０１０３】
製造例３：ｓｈＴＧＦ−β搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１，ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２）
韓国特許公開第２０１３−００８８７９２号および第２０１３−００１２０９５号を基盤として、ウイルス生成のために、ウイルスバックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β（β１  ｏｒβ２）は、Ｂｓｐ１１９１で切断し、ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂは、ＰｍｅＩで線形化させて、大腸菌ＢＪ５１８３に形質転換させて、相同組換えＤＮＡを生成した。その結果、ＨｉｎｄＩＩＩパターンとＰａｃＩ切断で組換えされたことを確認した（図５ａおよび図５ｂ）。
【０１０４】
このように相同組換えして、アデノウイルスｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１またはｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２を製作した。
【０１０５】
参照例５：ＨＳＰ２７発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ２７）遺伝子の用意
韓国特許公開第２０１３−０１２３２４４号に開示されたように、配列番号９で表示されるＨＳＰ２７発現を抑制するｓｈＲＮＡ（以下、ｓｈＨＳＰ２７という）を製作した。
【０１０６】
製造例４：ｓｈＨＳＰ２７搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７）
韓国特許公開第２０１３−０１２３２４４号を基盤として、ウイルス生成のために、ウイルスバックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７はＢｓｐ１１９１で切断し、ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１ＢはＰｍｅＩで線形化させて、大腸菌ＢＪ５１８３に形質転換させて、相同組換えＤＮＡを生成した。その結果、ＨｉｎｄＩＩＩパターンとＰａｃＩ切断で組換えされたことを確認した（図６）。
【０１０７】
このように相同組換えして、アデノウイルスｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７を製作した。
【０１０８】
参照例６：ＨＳＰ２５発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ２５）遺伝子の用意
配列番号８で表示されるＨＳＰ２５発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ２５）を製作した。
【０１０９】
マウスＨＳＰ２５発現を抑制する効果的なｓｈＨＳＰ２５製作のために、三つの候補ｓｈＲＮＡターゲット用塩基配列を製作した。
【０１１０】
マウス標的配列：５‘−  ｇｃｔａｃ  ａｔｃｔｃ  ｔｃｇｇｔ  ｇｃｔｔｃ  ａ−３’
１．ｓｅｎｓｅ  ５’−  ＧＡＴＣＣ  ｇｃｃｔｃ  ｔｔｃｇａ  ｔｃａａｇ  ｃｔｔｔｃ  ｇ  ＴＣＴＣ  ｃ  ｇａａａｇ  ｃｔｔｇａ  ｔｃｇａａ  ｇａｇｇｃ  ＴＴＴＴ  Ａ  −３’
Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ５’−  ＡＧＣＴＴ  ＡＡＡＡ  ｇｃｃｔｃ  ｔｔｃｇａ  ｔｃａａｇ  ｃｔｔｔｃ  ｇ  ＧＡＧＡ  ｃ  ｇａａａｇ  ｃｔｔｇａ  ｔｃｇａａ  ｇａｇｇｃ  Ｇ−３’
２．ｓｅｎｓｅ  ５’−  ＧＡＴＣＣ  ｇｃｔａｃ  ａｔｃｔｃ  ｔｃｇｇｔ  ｇｃｔｔｃ  ａ  ＴＣＴＣ  ｔ  ｇａａｇｃ  ａｃｃｇａ  ｇａｇａｔ  ｇｔａｇｃ  ＴＴＴＴ  Ａ  −３’
Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ５’−  ＡＧＣＴＴ  ＡＡＡＡ  ｇｃｔａｃ  ａｔｃｔｃ  ｔｃｇｇｔ  ｇｃｔｔｃ  ａ  ＧＡＧＡ  ｔ  ｇａａｇｃ  ａｃｃｇａ  ｇａｇａｔ  ｇｔａｇｃ  Ｇ−３’
３．ｓｅｎｓｅ  ５’−  ＧＡＴＣＣ  ｇｇａｇａ  ｔｃａｃｃ  ａｔｔｃｃ  ｇｇｔｔａ  ｃ  ＴＣＴＣ  ｇ  ｔａａｃｃ  ｇｇａａｔ  ｇｇｔｇａ  ｔｃｔｃｃ  ＴＴＴＴ  Ａ  −３’
Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ５’−  ＡＧＣＴＴ  ＡＡＡＡ  ｇｇａｇａ  ｔｃａｃｃ  ａｔｔｃｃ  ｇｇｔｔａ  ｃ  ＧＡＧＡ  ｇ  ｔａａｃｃ  ｇｇａａｔ  ｇｇｔｇａ  ｔｃｔｃｃ  Ｇ−３’
【０１１１】
ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５サブクローニングのために、ｐＳＰ７２ΔＥ３−Ｈ１−ｈｓｈＴＧＦβ２（韓国特許出願第２０１５−００４４５０７号の製造例５参照）をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、アニーリングされた３種類のｓｈＨＳＰ２５を連結させた。このように得たｐＳＰ７２ΔＥ３−Ｈ１−ｍｓｈＨＳＰ２５−１、２または３からＨＳＰ２５  ｓｈＲＮＡ効果を確認するために、ＨＳＰ２５をＢＮＬマウス肝癌細胞株（ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＢＮＬ  １ＭＥ  Ａ．７Ｒ．１）に安定なトランスフェクションさせて得たＢＮＬ−ＨＳＰ２５細胞株に前記３種類のｓｈＨＳＰ２５をトランスフェクションして、ＨＳＰ２５の発現減少効果を確認した（図７）。
【０１１２】
製造例５：ｓｈＨＳＰ２５搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５）
前記参照例５において減少効果がある２番と３番のｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５をｄｌ３２４−ＩＸと相同組換えをした。ｄｌ３２４−ＩＸ−ｓｈＨＳＰ２５  ２番への相同組換えの場合、ｐＳＰ７２−ｓｈＨＳＰ２５−２シャトルベクターはＤｒｄＩで切断し、バックボーンＤＮＡであるｄｌ３２４−ＩＸはＳｐｅＩで切断し、それぞれ線形化させた後、ＢＪ５１８３に形質転換させて得たコロニーをＨｉｎｄＩＩＩパターンとＰａｃＩ切断で選別した（図８）。他方、ｄｌ３２４−ＩＸ−ｓｈＨＳＰ２５  ３番への相同組換えの場合は、ｐＳＰ７２−ｓｈＨＳＰ２５−３シャトルベクターはＸｍｎＩで切断し、バックボーンＤＮＡであるｄｌ３２４−ＩＸはＳｐｅＩで切断し、それぞれ線形化させた後、ＢＪ５１８３に形質転換させて得たコロニーをＨｉｎｄＩＩＩパターンとＰａｃＩ切断で選別した（図９）。このようにして得たコンストラクトからＨＳＰ２５  ｓｈＲＮＡを発現するそれぞれのアデノウイルスから発現減少効果を確認した（図１０）。したがって、今後のマウスｓｈＲＮＡ  ＨＳＰ２５の製作には、ｓｈＨＳＰ２５−２配列［配列番号８］を使用した。
【０１１３】
製造例６：ＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ複製可能アデノウイルスの製作（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ）
ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを同時に発現する腫瘍選択的複製可能アデノウイルスを次のように製作した。
【０１１４】
１．ＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ同時に発現するベクターの製作
（１）ヒト
ｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＭＣＳ（ｍｕｌｔｉ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）ＡにはＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を挿入し、ＭＣＳ  ＢにはＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子を挿入した。
ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をｐＩＲＥＳでＭＣＳ  Ａ部位にサブクローニングするために、ＰＣＲ用プライマーを製作した。センスストランドは、５’末端にＸｈｏＩ部位を有する５’−ＣＣＧ  ＣＴＣＧＡＧ  ＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣ  ＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴ  Ｇ−３’とアンチセンスストランドとして５’末端にＭｌｕＩを有する５’−ＣＣＧＡＣＧＣＧＴＴＣＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡ−３’を製作した。ＰＣＲ鋳型としては、ｐＯＲＦ−ＧＭＣＳＦを使用して初期変性：９５℃、２ｍｉｎ後、変性：９５℃、１ｍｉｎ、アニーリング：５５℃、１ｍｉｎ、伸長：７２℃、１ｍｉｎを３０回繰り返した。そして、最後に、最終伸長：７２℃、５ｍｉｎを行った。
【０１１５】
ヒトＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子をｐＩＲＥＳでＭＣＳ  Ｂ部位にサブクローニングするために、ｐＩＲＥＳ−ｈＧＭ−ＣＳＦはＳａｌＩ／ＳｍａＩＩで切断し、Ａｄｌｏｘ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬもＳａｌＩ／ＳｍａＩで切断し、切断されたＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬをｐＩＲＥＳ−ＧＭ−ＣＳＦに挿入してライゲーションして、ｐＩＲＥＳ−ＧＭＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを得た。
【０１１６】
Ａｄｌｏｘ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬは、ｐＦＥＴＺ（Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ）（Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈＦｌｅｘ−ＴＲＡＩＬ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．３  ３６８−３７４，２００１）をＳａｌ／ＢａｍＨＩで切断したｈＦｌｅｘ−ＴＲＡＩＬ（Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子：配列番号３）をＳａｌＩ／ＢａｍＨＩで切断したＡｄｌｏｘベクターに移したものである。
【０１１７】
挿入されたＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬは、次のように、ＳａｌＩ／ＨｐａＩで切断して、２番と３番レーンでインサートされた（図１１）。
【０１１８】
（２）マウス
マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をｐＩＲＥＳでＭＣＳ  Ａ部位にサブクローニングするために、ＰＣＲ用プライマーを製作した。センスストランドは、５’末端にＸｈｏＩ部位を有する５’−ＣＣＧ  ＣＴＣＧＡＧ  ＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴ−３’とアンチセンスストランドとして５’末端にＭｌｕＩを有する５’−ＣＣＧＡＣＧＣＧＴ  ＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣＡ−３’を製作した。ＰＣＲ鋳型としては、ｐＣＡ１４−ｍＧＭ−ＣＳＦを使用して初期変性：９５℃、２ｍｉｎ後、変性：９５℃、１ｍｉｎ、アニーリング：５５℃、１ｍｉｎ、伸長：７２℃、１ｍｉｎを３０回繰り返した。そして、最後に、最終伸長：−７２℃、５ｍｉｎを行った。
【０１１９】
ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をマウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子に変更するものの、ヒトＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子はマウスで適用可能であるので、ヒト遺伝子をそのまま使用したことを除いて、実験過程は、前記（１）と同一である。
【０１２０】
２．ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬが挿入されたシャトルベクターの製作
腫瘍溶解性（Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）シャトルベクターへのクローニングは、次のように行った。
【０１２１】
ヒトとマウスは、いずれも同じ方式で製造した。
【０１２２】
ｐＩＲＥＳ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬは、ＦｓｐＩ（ブランティング）後、ＢｇｌＩＩで切断して、ｈＧＭ−ＣＳＦ（またはｍＧＭ−ＣＳＦ）とＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを得た。ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−ΔＥ１Ｂ−Ｅ１Ｒは、ＳａｌＩ処理後、ブランティングし、ＢｇｌＩＩした後、ＢｇｌＩＩとＦｓｐＩの断片と連結させた。
【０１２３】
サブクローニングされたものは、ＰｍｅＩで切断し、二つのＤＮＡサイズで確認して、最終的にｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ（ｈｕｍａｎ  ｏｒ  ｍｏｕｓｅ）−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを得た（図１２）。次に、ｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとの相同組換えを通じてｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｈｕｍａｎ  ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬまたはｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍｏｕｓｅ  ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを得た（図１３）。
【０１２４】
３．ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬが発現する腫瘍選択的複製可能アデノウイルスの製作（ヒトとマウスはいずれも同一に）
ウイルス生成のために、ウイルスバックボーンＤＮＡであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩは、Ｂｓｐ１１９１で切断し、ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬはＰｍｅＩで線形化させて、大腸菌ＢＪ５１８３に形質転換させて、相同組換えＤＮＡを生成した。その結果、ＨｉｎｄＩＩＩパターンおよびＰａｃＩ切断で全部成功裏に組換えされたことを確認した（図１３）。
【０１２５】
ヒトＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬタンパク質発現が起こっていることを、ウイルスをＤＵ−１４５ヒトの前立腺癌細胞にＭＯＩ別に感染させ、２４時間後に培地を無血清培地に交替し、一日間培養した後、培地内に放出されたＧＭ−ＣＳＦとＴＲＡＩＬを測定した。その結果、ＧＭ−ＣＳＦとＴＲＡＩＬが正常に発現していることをＥＬＩＳＡで確認することができる（図１５ａ）。
【０１２６】
同様に、マウスＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬタンパク質の発現が起こっていることを、ウイルスをマウス肝癌細胞（ＢＮＬ）由来ＢＮＬ−ＣＡＲ−Ｅ１Ｂ５５−ＨＳＰ２５細胞にＭＯＩ別に感染させ、２４時間後に培地を無血清培地に交替し、一日間培養した後、培地内に放出されたＧＭ−ＣＳＦとＴＲＡＩＬを測定した。その結果、ＧＭ−ＣＳＦとＴＲＡＩＬが正常に発現していることをＥＬＩＳＡで確認することができ（図１５ｂ）、Ｆｌｔ３Ｌの発現もまたウェスタンブロットで確認することができた（図１６ｂ）。
【０１２７】
次に、ウイルスに存在するＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬのうちＴＲＡＩＬが細胞死機能を維持しているかをＤＵ−１４５でウェスタンブロットで確認した。その結果、ＰＡＲＰの分割が、ＭＯＩが増加しつつ（５０  ＭＯＩ）、大きく現れることから見て、良好に機能していることが分かった（図１６ａ）。
【０１２８】
相同組換えが確認されたバクテリアクローンで得たＤＮＡは、ＰａｃＩで切断した後、２９３Ａ（ａ  ｓｕｂｃｌｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２９３  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）細胞株に形質転換して、アデノウイルスを生産した。２９３細胞株で増殖させた後、超遠心分離によるＣｓＣｌ濃度勾配により分離した後、透析(ｄｉａｌｙｓｉｓ)を経て得た純化したアデノウイルスをＱｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）により開発された標準プラーク分析キットで力価を算出した。最終ウイルス力価は、１×１０１２〜５×１０１２であった。
【０１２９】
製造例７：ｓｈＴＧＦβとｓｈＨＳＰ２７同時に発現する複製不能アデノウイルスの製作（ヒト）（ｄｌ３２４−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１，ｄｌ３２４−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７）
１）ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１の製作
ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈ−ｎｅｇａｔｉｖｅ（韓国特許公開第２０１３−００１２０９５号の実施例２のｐＳＰ７２／△Ｅ３／ｓｉ−ｎｅｇａｔｉｖｅベクターと同一）のＵ６プロモーターとｐｏｌｙ  Ａとの間にあるＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、
トップストランド：５’−  ｇａｔｃｃ  ＧＣＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＧ  ｔｃｔｃｔｃ  ＣＡＧＧＡＡＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴ  ｔｔｔｔｔｔ  ａ  −  ３’
バータムストランド：５’−  ａｇｃｔｔ  ａａａａａａ  ＡＣＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＧ  ｇａｇａｇａ  ＣＡＧＧＡＡＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴ  ｇ  −  ３’をアニーリングでライゲーションさせて、ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１を製作した（韓国特許公開第２０１３−００１２０９５号の実施例１および２参照）。
【０１３０】
２）ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２の製作
ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈ−ｎｅｇａｔｉｖｅのＵ６プロモーターとｐｏｌｙ  Ａとの間にあるＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、
トップストランド：５’−  ｇａｔｃｃ  ＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡ  ｔｃｔｃ  ＴＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＣ  ｔｔｔｔ  ａ  −  ３’
バータムストランド：５’−  ａｇｃｔｔ  ａａａａ  ＧＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡ  ｇａｇａ  ＴＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＣ  ｇ  −  ３’をアニーリングでライゲーションさせて、ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２を製作した（韓国特許公開第２０１３−００８８７９２号の実施例２、図２参照）。
【０１３１】
３）ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７の製作
韓国特許出願第２０１５−００４４５０７号の製造例５のｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＴＧＦβ２でＢａｍＨ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断し、
トップストランド：５’−  ｇａｔｃｃ  ｇａｃｇａｇｃａｔｇｇｃｔａｃａｔｃｔｃｃｃｇｇｔ  ｔｃｔｃ  ａｃｃｇｇｇａｇａｔｇｔａｇｃｃａｔｇｃｔｃｇｔｃ  ｔｔｔｔｔｔ  ａ  −  ３’
バータムストランド：５’−  ａｇｃｔｔ  ａａａａ  ｇａｃｇａｇｃａｔｇｇｃｔａｃａｔｃｔｃｃｃｇｇｔ  ｇａｇａ  ａｃｃｇｇｇａｇａｔｇｔａｇｃｃａｔｇｃｔｃｇｔｃ  ｇ  −  ３’をアニーリングでライゲーションさせて、ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７を製作した（韓国特許公開第２０１３−０１２３２４４号の実施例１および２参照）。
【０１３２】
４）ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７およびｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１シャトルベクター製作
前記ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２をＨｉｎｄＩＩＩブランティング処理した後、ＫｐｎＩ処理して、ＳＶ４０  ｐｏｌｙ  Ａ部位を除去した後、前記ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７でＳｐｈＩブランティング後、ＫｐｎＩ処理して、Ｈ１プロモーター−ｓｈＨＳＰ２７−ＳＶ４０  ｐｏｌｙ  Ａを取り出して、前記ＨｉｎｄＩＩＩ（ｂｌｕｎｔ）／ＫｐｎＩ処理したｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２と連結させて、ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７シャトルベクターを製作した。
【０１３３】
他方で、ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７をＨｉｎｄＩＩＩブランティング処理後、ＫｐｎＩ処理して、ＳＶ４０  ｐｏｌｙ  Ａ部位を除去した後、前記ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１でＳｐｈＩブランティング後、ＫｐｎＩ処理して、Ｕ６プロモーター−ｓｈＴＧＦ−β１−ＳＶ４０  ｐｏｌｙ  Ａを取り出して、ＨｉｎｄＩＩＩ（ｂｌｕｎｔ）／ＫｐｎＩ処理したｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７と連結させて、ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１シャトルベクターを製作した。
【０１３４】
ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７またはｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１シャトルベクターの製作過程を図１７に示した。
【０１３５】
完成されたｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とｄｌ３２４−ＩＸバックボーンと相同組換えした。この際、シャトルベクターは、ｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７をＸｍｎＩで切断し、ｂａｃｋｂｏｎｅであるｄｌ３２４−ＩＸをＳｐｅＩで切断して、相同組換えをした（図１８）。同じ方法でｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１とｄｌ３２４−ＩＸ  ｂａｃｋｂｏｎｅと相同組換えした。この際、シャトルベクターは、ｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１をＸｍｎＩで切断し、バックボーンであるｄｌ３２４−ＩＸをＳｐｅＩで切断して、相同組換えをした（図１９）。
【０１３６】
相同組換えが確認されたバクテリアクローンから得たＤＮＡは、ＰａｃＩで切断した後、２９３Ａ（ａ  ｓｕｂｃｌｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２９３  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）細胞株に形質転換して、アデノウイルスを生産した。２９３細胞株で増殖させた後、超遠心分離によるＣｓＣｌ濃度勾配により分離した後、透析を経て得た純化したアデノウイルスをＱｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）により開発された標準プラーク分析キットで力価を算出した。最終ウイルス力価は、１×１０１０〜１×１０１１であった。
【０１３７】
製造例８：ｓｈＴＧＦβとｓｈＨＳＰ２５同時に発現する複製不能アデノウイルスの製作（マウス）（ｄｌ３２４−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１，ｄｌ３２４−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５）
１）ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−マウスｓｈＴＧＦβ１の製作
ヒトｓｈＴＧＦβ１の代わりに、マウスｓｈＴＧＦβ１を使用することを除いて、前記製造例７の１）と同一に製作した。
【０１３８】
２）ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−マウスｓｈＴＧＦβ２の製作
ヒトｓｈＴＧＦβ２の代わりに、マウスｓｈＴＧＦβ２を使用することを除いて、前記製造例７の１）と同一に製作した。
【０１３９】
３）ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５の製作
ヒトｓｈＨＳＰ２７の代わりに、マウスＨＳＰ２５を使用することを除いて、前記製造例７の１）と同一に製作した。
【０１４０】
４）ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１サブクローニング
ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−マウスｓｈＴＧＦβ１をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＳＰ７２ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５をＳｐｈＩで切断した後、ブランティングさせた。そして、それぞれをＫｐｎＩで切断した後、ライゲーションさせて、ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｍｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１を得た（図２４ａ）。
【０１４１】
完成されたｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１とｄｌ３２４−ＩＸ  ｂａｃｋｂｏｎｅと相同組換えした。この際、シャトルベクターは、ｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｈ１−ｍｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１をＸｍｎＩで切断し、バックボーンであるｄｌ３２４−ＩＸをＳｐｅＩで切断して、相同組換えをした（図２４ｂ）。
【０１４２】
このように相同組換えして、ｄｌ３２４−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１を製作した。
【０１４３】
同じ方法でｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｕ６−ｍＴＧＦβ２−Ｈ１−ｍＨＳＰ２５とｄｌ３２４−ＩＸ  ｂａｃｋｂｏｎｅと相同組換えした。この際、シャトルベクターは、ｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｕ６−ＴＧＦβ２−Ｈ１−ＨＳＰ２５をＸｍｎＩで切断し、ｂａｃｋｂｏｎｅであるｄｌ３２４−ＩＸをＳｐｅＩで切断して、相同組換えをした。
【０１４４】
このように相同組換えして、ｄｌ３２４−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５を製作した。
【０１４５】
製造例９：ｓｈＴＧＦβとｓｈＨＳＰ２７同時に発現する腫瘍選択的殺傷可能アデノウイルスの製作（ヒト）（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７）
腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作は、次の通りである。
【０１４６】
一次に、ｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１との相同組換え（図２０）およびｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとｐＳＰ７２ΔＥ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ＨＳＰ２７との相同組換え（図２１）を実施した。
【０１４７】
二次に、ｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１（図２０）またはｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７（図２１）とＥ１シャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えをさらに実施して、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１（図２２）またはｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７（図２３）を製作した。Ｅ１シャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１ＢはＰｍｅＩで切断し、線形化させ、バックボーンＤＮＡであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１またはｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７はＢｓｐ１１９１で切断して、線形化させた後、線形化させた二種類のＤＮＡをＢＪ５１８３に形質転換させて得たコロニーをＨｉｎｄＩＩＩパターンとＰａｃＩ切断による約２ｋｂのバンドの有無で良好に相同組換えされたＤＮＡを確認した。
【０１４８】
このように相同組換えして、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１またはｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７を製作した。
【０１４９】
製造例１０：ｓｈＴＧＦβ１とｓｈＨＳＰ２５同時に発現する腫瘍選択的殺傷可能アデノウイルスの製作（マウス）（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１）
マウス形態のｓｈＲＮＡを発現する腫瘍選択的アデノウイルスの製作のためのｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１の相同組換え過程は、次の通りである。
【０１５０】
製造例８で得たシャトルベクターであるｐＳＰ７２ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１をＸｍｎＩで切断し、ｂａｃｋｂｏｎｅであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩをＳｐｅＩで切断した後、この二つを相同組換えして、ｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１を製作した（図２５ａ）。次に、シャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１ＢをＰｍｅＩで切断し、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１をＢｓｐ１１９１で切断した後、相同組換えして、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１を製作した（図２５ｂ）。
【０１５１】
製造例１１：ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬおよびｓｈＴＧＦ−β１搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（ヒト）（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β１）
ウイルス生成のために、ウイルスバックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β１は、製造例７で提示したｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１とｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとの相同組換えを通じて得た。ｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β１は、Ｂｓｐ１１９１で切断し、製造例６で得たｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬをＰｍｅＩで線形化して、大腸菌ＢＪ５１８３に形質転換させて相同組換えを誘導した。その結果、ＨｉｎｄＩＩＩパターンとＰａｃＩ切断で組換えされたことを確認した（図２６）。
【０１５２】
このように相同組換えして、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β１を製作した。
【０１５３】
製造例１２：ｍＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬおよびｍｓｈＴＧＦ−β１搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（マウス）（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦ−β１）
ウイルス生成のために、ウイルスバックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦ−β１は、製造例８で提示したｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１とｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとの相同組換えを通じて得た。ｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１と製造例６で得たｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ相同組換えのために、シャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ（図１２ｂ）をＰｍｅＩで切断した後、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１をＢｓｐ１１９１で切断した後、相同組換えした（図２７）。
【０１５４】
このように相同組換えして、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦ−β１を製作した。
【０１５５】
製造例１３：ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬおよびｓｈＨＳＰ２７搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（ヒト）（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７）
ウイルス生成のために、ウイルスバックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７は、製造例７で提示したｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとの相同組換えを通じて得た。得られたｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７はＢｓｐ１１９１で切断し、製造例６で得たｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬはＰｍｅＩで線形化して、大腸菌ＢＪ５１８３に形質転換させて、相同組換えを誘導した。その結果、ＨｉｎｄＩＩＩパターンとＰａｃＩ切断でレーン１、２、３がいずれも成功裏に組換えされたことを確認した（図２８）。
【０１５６】
このように相同組換えして、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７を製作した。
【０１５７】
製造例１４：ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬおよびｓｈＨＳＰ２５搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（マウス）（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５）
ウイルス生成のために、ウイルスバックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５は、製造例８で提示したｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５とｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとの相同組換えを通じて得た。得られたｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５は、Ｂｓｐ１１９１で切断し、製造例６で得たｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ相同組換えのために、シャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬをＰｍｅＩで切断し、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ｍｓｈＨＳＰ２５をＢｓｐ１１９１で切断して、相同組換えを実施した（図２９）。
【０１５８】
このように相同組換えして、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５を製作した。
【０１５９】
製造例１５：ＧＭ−ＣＳＦ、ｓｈＨＳＰ２７およびｓｈＴＧＦ−β搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（ヒト）（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７）
ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦシャトルベクターは、ｐＣＡ１４−ＧＭＣＳＦをＢｇｌＩＩ処理後、ブランティングさせて、ＳａｌＩで切断したインサートをＥｃｏＲＩで切断した後、ブラントさせた後、さらにＳａｌＩで切断したｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂにサブクローニングさせて製作した（韓国特許出願第２０１５−００４４５０７号の製造例１参照）。
【０１６０】
ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１への相同組換えは、Ｅ１シャトルベクターである前記ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦは、ＰｍｅＩで切断して線形化させ、バックボーンＤＮＡである製造例９で得たｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１は、Ｂｓｐ１１９１で切断して線形化させた後、ＢＪ５１８３に形質転換させて得たコロニーをＨｉｎｄＩＩＩパターンとＰａｃＩ切断で選別した（図３０）。
【０１６１】
ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７への相同組換えは、Ｅ１シャトルベクターである前記ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｈＧＭＣＳＦは、ＰｍｅＩで切断して線形化させ、バックボーンＤＮＡである製造例９で得たｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７は、Ｂｓｐ１１９１で切断して線形化させた後、ＢＪ５１８３に形質転換させて得たコロニーをＨｉｎｄＩＩＩパターンとＰａｃＩ切断で選別した（図３１）。
【０１６２】
製造例１６：ＧＭ−ＣＳＦ、ｓｈＨＳＰ２５およびｓｈＴＧＦ−β１搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（マウス）（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１）
ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ｓｈＨＳＰ２５−ｍｓｈＴＧＦβ１への相同組換えは、Ｅ１シャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ（製造例１に基づく韓国特許出願第２０１５−００４４５０７号を参照）は、ＰｍｅＩで切断して線形化させ、製造例８で得たｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１とｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩと相同組換えして得たバックボーンＤＮＡであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１は、Ｂｓｐ１１９１で切断して線形化させた後、ＢＪ５１８３に形質転換させて得たコロニーをＨｉｎｄＩＩＩパターンとＰａｃＩ切断で選別した（図３２）。
【０１６３】
このように相同組換えして、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１を製作した。
【０１６４】
製造例１７：Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ２７搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（ヒト）（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７）
製造例２で得たシャトルベクター（ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ）と製造例９で得たバックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢ１−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１またはｄｌ３２４−ＢｓｔＢ１−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７を相同組換えさせた（図３３および図３４）。
【０１６５】
相同組換えが確認されたバクテリアクローンで得たＤＮＡは、ＰａｃＩで切断した後、２９３Ａ（ａ  ｓｕｂｃｌｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２９３  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）細胞株に形質転換して、アデノウイルスを生産した。２９３細胞株で増殖させた後、超遠心分離によるＣｓＣｌ濃度勾配により分離した後、透析を経て得た純化したアデノウイルスをＱｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）により開発された標準プラーク分析キットで力価を算出した。最終ウイルス力価は、１×１０１２〜５×１０１２であった。
【０１６６】
製造例１８：Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＨＳＰ２５およびｓｈＴＧＦ−β１搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（マウス）（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１）
ウイルス生成のために、ウイルスバックボーンである製造例８で得たｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１（製造例８）とｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩを相同組換えして得たバックボーンＤＮＡであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１（製造例９）は、Ｂｓｐ１１９１で切断し、製造例２で得たｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬはＰｍｅＩで線形化させて、大腸菌ＢＪ５１８３に形質転換させて、相同組換えＤＮＡを生成した。その結果、ＨｉｎｄＩＩＩパターンとＰａｃＩ切断で組換えされたことを確認した（図３５）。
【０１６７】
このように相同組換えして、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１を製作した。
【０１６８】
製造例１９：ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ２７搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（ヒト）（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１，ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７）
製造例９で得たｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ΔＥ３−Ｕ６−ＴＧＦ−β２−Ｈ１−ＨＳＰ２７またはｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ΔＥ３−Ｈ１−ＨＳＰ２７−Ｕ６−ＴＧＦ−β１と製造例６で得たｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを通じてｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７（ＹＳＣ−０１）（図３６、図３８）。またはｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１（ＹＳＣ−０２）を製作した（図３７、図３９）。
【０１６９】
相同組換えが確認されたバクテリアクローンから得たＤＮＡは、ＰａｃＩで切断した後、２９３Ａ（ａ  ｓｕｂｃｌｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２９３  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）細胞株に形質転換してアデノウイルスを生産した。２９３細胞株で増殖させた後、超遠心分離によるＣｓＣｌ濃度勾配により分離した後、透析を経て得た純化したアデノウイルスをＱｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）により開発された標準プラーク分析キットで力価を算出した。最終ウイルス力価は、１×１０１２〜５×１０１２であった。
【０１７０】
製造例２０：ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ２５搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルスの製作（マウス）（ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１）
製造例１０で得たｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｍｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１と製造例６で得たｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを相同組換えするために、シャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬをＰｍｅＩで切断し、バックボーンＤＮＡであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１をＢｓｐ１１９１で切断した後、組換えされたことを確認した（図４０および図４１）。
【０１７１】
このように相同組換えして、ｄｌ３２４−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１を製作した。
【０１７２】
実施例１：Ｉｎ  ｖｉｖｏヌードマウスでｓｈＴＧＦ−β、ｓｈＨＳＰ２７単独あるいは両方とも発現する腫瘍選択的複製可能ウイルスによる抗腫瘍効果
ヒトＭＤＡＭＢ−２３１−Ｈｅｒ２細胞株１×１０７ｃｅｌｌ／１００μｌの細胞を腹壁に注入し、腫瘍サイズが６０ｍｍ３に達したとき、二日間隔で３回（１×１０９ｐｆｕ／５０μｌ）、アデノウイルス（対照群：ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｉｒｕｓ、ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ＮＣ、製造例３の１種ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｓｈＴＧＦ−β１、製造例４の１種のｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｓｈＨＳＰ２７）、製造例７の２種（ｓｈＴＧＦ−β１＋ｓｈＨＳＰ２７）腫瘍内注射（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で感染させた。各実験群当たり６匹ずつを使用した。
【０１７３】
その結果、抗腫瘍効果は、２個の遺伝子が入った製造例７の腫瘍溶解性アデノウイルス／ｓｈＴＧＦ−β１＋ｓｈＨＳＰ２７において抗腫瘍効果が最も優れていた（図４２）。
【０１７４】
実施例２：ＴＧＦ−βアイソタイプによる生存率の比較
膵臓癌細胞株ＭｉａＰａＣａ−２、ＨＰＡＣ、ＢｘＰＣ３、ＡｓＰｃ−１、Ｃａｐａｎ−１、肝癌細胞株ＳＫ−Ｈｅｐ１、Ｈｕｈ７、肺癌細胞株Ａ５４９細胞株、前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５、黒色腫細胞株Ａ３７５、神経膠腫Ｕ２５１Ｎ、そして乳癌細胞株ＭＤＡＭＢ２３１にＨｅｒ２を過発現させた細胞株を６ウェルプレートに２×ｘ１０５ｃｅｌｌで敷設し、欠損アデノウイルス／ＮＣ（陰性対照群）、製造例３のアデノウィルス／ｓｈＴＧＦ−β１、アデノウィルス／ｓｈＴＧＦ−β２をそれぞれ１００ｍｏｉで感染させ、二日後、細胞を剥き取って、６ウェルに１×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで分注した後、二日に一回ずつ５％ＦＢＳ含まれた培地に交替した。１０日後、培養液を除去し、４％パラホルムアルデヒドで固定させた後、クリスタルバイオレットで染色して観察した。
【０１７５】
その結果、多くの癌細胞株においてＴＧＦ−β１の減少による生存率の低下効果がＴＧＦ−β２の減少より優れており、Ｃａｐａｎ−１を除いた大部分の膵臓癌細胞株においてＴＧＦ−βの低下効果が相対的に微弱であった（図４３）。これら細胞の生存率の減少効果を生存関連信号およびｐ３８とＨＳＰ２７のリン酸化などを調査した結果、有意的に生存率の減少とｐ３８とＨＳＰ２７のリン酸化が増加したことが分かった（図４４）。そして、特にＴＧＦ−β１の低下効果は、低下時に細胞内ＲＯＳの過多分泌も一つの原因として細胞が死に至ったことが明らかになり（図４５）、ｐｐ６５、ｐＳｔａｔ３等の細胞生存に関与する酵素のリン酸化は、ＴＧＦ−βの低下時に減少することが明らかになった（図４４）。
【０１７６】
実施例３：多様なタイプの癌細胞株に対する２種の遺伝子伝達体効果の確認
ＭＤＡＭＢ２３１−Ｈｅｒ２にｓｈＴＧＦ−β１の他にもｓｈＨＳＰ２７が必要であるかを調べるために、欠損アデノウイルス／ＮＣ（陰性対照群）、製造例３の１種、アデノウイルス／ｓｈＴＧＦ−β１、製造例７の２種（アデノウイルス／ｓｈＴＧＦβ１−ｓｈＨＳＰ２７）をそれぞれ１００ｍｏｉで感染させた後、ウェスタンブロットを行った。
【０１７７】
その結果、Ａｋｔリン酸化の減少は起こらなかったが、その他のｐＳＴＡＴ３、ｐＳｒｃ、ｐＥＧＦＲなどがさらに減少し（図４６）、ＨＳＰ２７単独低下時に癌プログレッションに関係するＮ−カドヘリン、β−カテニン、ｓｔａｔ３、ビメンチン、Ａｋｔなどが顕著に減少したことを確認した（図４７）。それだけでなく、ＴＧＦ−β１またはβ２とＨＳＰ２７の同時減少時にプログレッション に関係するタンパク質の減少効果がさらに最大化した（図４８）。生存率の減少効果をクローン形成法でＴＧＦ−β１または２単独あるいはＴＧＦ−β１または２／ＨＳＰ２７同時減少条件で比較した結果、二個同時減少による生存率の減少が顕著であった（図４９）。
【０１７８】
実施例４：多様なタイプの癌細胞株に対する３種の遺伝子伝達体（実施例３にＴＲＡＩＬ追加）効果の確認
一つの特異な事項は、ＴＧＦ−βとＨＳＰ２７を同時に低下させる場合、ＴＲＡＩＬの受容体であるＤＲ４、ＤＲ５が増加し、その代わりに、ＴＲＡＩＬ抵抗性に寄与するＣＤＫ９は減少するなど、ＴＲＡＩＬによる細胞毒性増加の可能性を増加させる。図５０は、そのような可能性を裏付けている。実際にＴＧＦ−β／ＨＳＰ２７低下およびＴＲＡＩＬ発現させる場合、生存に関係する信号がさらに減少することを確認した（図５１）。
【０１７９】
実施例５：ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２に搭載された４種の遺伝子挿入および発現の確認
ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡからウイルス中に外来遺伝子４個の遺伝子挿入が正常に起こったことをウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて確認した（図５２）。
【０１８０】
膵臓癌細胞ＨＰＡＣとＭｉａＰａＣａ−２を１×１０５／６ｗｅｌｌ分注した後、Ａｄ−３４８４−ＮＣ（陰性対照群、腫瘍溶解性アデノウイルス）１００ＭＯＩで感染させ、ＹＳＣ−１と２は、それぞれ５、１０、５０、１００ＭＯＩで感染させた後、２日間培養しつつ、最後の２４時間は、無血清培地に分泌されたＧＭ−ＣＳＦおよびＴＲＡＩＬの量を測定した。ＧＭ−ＣＳＦとＴＲＡＩＬおよびＴＧＦ−β１の分泌をＥＬＩＳＡで測定して分泌されることを確認し、ＴＧＦ−β２のｍＲＮＡの低下は、リアルタイムＰＣＲで確認し、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬでＦｌｔ３Ｌの発現確認とＨＳＰ２７の発現低下は、ウェスタンブロットで確認した（図５３）。リアルタイムＰＣＲは、１×１０５／６ｗｅｌｌ分注した後、Ａｄ−３４８４−ＮＣ  １００ＭＯＩで感染させ、ＹＳＣ−１は、５、１０、５０、１００ＭＯＩで感染させ、２日後にＲＮＡを分離して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。ヒトＴＧＦ−β２抑制確認のためのリアルタイムＰＣＲ用プライマーは、正方向プライマー：５’ＧＣＴＧＣＣＴＡＣＧＴＣＣＡＣＴＴＴＡＣＡＴ  ３’と逆方向プライマー：５’ＡＴＡＴＡＡＧＣＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧ  ３’を使用し、ＡＢ  ｐｏｗｅｒＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−Ｃｔ  １ステップキットを使用してＲＴ酵素ミックス（１２５Ｘ）０．２μｌ、ＲＴ−ＰＣＲミックス（２ｘ）１２．５μｌ、正方向プライマー（１００  ｐＭ）０．５μｌ、逆方向プライマー（１００  ｐＭ）０．５μｌ、ＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）５μｌ、 ヌクレアーゼフリーウォーター６．３μｌにてトータル体積は２５μｌになるようにし、反応条件は、酵素の活性化を９５℃、１０分間維持したし後、変性を９５℃、１５秒、アニーリング／伸長を６０℃、１分間のサイクルを４０回実施した。
【０１８１】
実施例６：Ａｄ−３４８４−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３ＬＴＲＡＩＬとＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のクローン形成法を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける腫瘍選択的抗癌活性
ＭＤＡ−ＭＢ２３１−Ｈｅｒ２、ＭｉａＰａＣａ−２、Ａ５４９、Ｈｕｈ７、ＤＵ１４５等のｐ５３変異型とＡ３７５、ＨＰＡＣなどのｐ５３正常型癌細胞株、そして正常な膵臓細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｅｌｌ）とＣｈａｎｇなどの正常細胞株を含むいくつかの細胞株において生存率確認のためのクローン形成法を行った。
【０１８２】
実験のために、６０ｍｍのディッシュに様々な細胞株それぞれを４×１０５個で分注した後、翌日にＡｄ−３４８４−ＮＣ（陰性対照群、腫瘍溶解性アデノウイルス）１ＭＯＩ、製造例６のＡｄ−３４８４−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ  １ＭＯＩ、製造例１９のＡｄ  ３４８４−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−ｓｈＴＧＦβ２−ｓｈＨＳＰ２７（ＹＳＣ−０１）１ＭＯＩで感染させ、培地を５％ＦＢＳ入っているＤＭＥＭに交替した。翌日に、６ウェルプレートで１×１０５でさらに分注した後、２日間隔で培地を交替しつつ、群落が形成されるまで培養した。群落が形成された適当な時点（１０日以内）に培地を除去し、４％パラホルムアルデヒドを常温で１５分間処理して固定させ、０．０５％クリスタルバイオレットを利用して１時間染色した後、水で洗浄して、紫色で染色された群落を観察した。その結果、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２は、製造例６のＧＭＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ発現する腫瘍溶解性アデノウイルスよりｐ５３変異型の細胞株だけでなくｐ５３正常タイプの細胞株においても生存率をさらに低下させていることをクローン形成法を通じて確認した（図５４ａ）。他方で、正常細胞では、生存減少効果が全く現れないことから見て、腫瘍選択性も存在したことを確認した（図５４ｂ）。これら実験結果の確認のために、ウェスタンブロットを行った結果、正常細胞株に比べてｐ５３タイプに大きく拘らず、生存に関係する信号の減少だけでなく、ＴＲＡＩＬ敏感性に関与する信号も増加したり（ＤＲ４、ＤＲ５）減少（ＣＤＫ９）することにより、ＹＳＣ−０２の腫瘍選択性殺傷能を確認した（図５５ａ、ｂ）。ところが、数種類の肝癌細胞株と膵臓癌細胞株（ＭｉａＰａＣａ−２）におけるクローン形成法の結果では、ＹＳＣ−２による腫瘍崩壊活性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）がＹＳＣ−０１より相対的に優れていることを確認した（図５６）。
【０１８３】
実施例７：Ｉｎ  ｖｉｖｏヌードマウスで４種の遺伝子を共発現する腫瘍選択的アデノウイルスによる抗腫瘍効果
ＭｉａＰａＣａ−２細胞株８×１０６ｃｅｌｌ／１００μｌの細胞を腹壁に注入し、腫瘍サイズが６０ｍｍ３に達したとき、二日間隔で３回（１×１０９ｐｆｕ／５０μｌ）、アデノウイルス（陰性対照群：Ａｄ−３４８４−ＮＣ）、製造例６の２種（Ａｄ−３４８４−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ）、製造例１９の４種（Ａｄ−３４８４−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−ｓｈＴＧＦβ２−ｓｈＨＳＰ２７（ＹＳＣ−０１）、Ａｄ−３４８４−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−ｓｈＨＳＰ２７−ｓｈＴＧＦβ１（ＹＳＣ−０２））を腫瘍内注射（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で感染させた。各実験群当たり６匹ずつを使用した。
【０１８４】
その結果、抗腫瘍効果は、４個の遺伝子が入った製造例１９のＹＳＣ−０２において抗腫瘍効果が最も優れており、つの次に、製造例１９のＹＳＣ−０１において抗腫瘍効果が優れていた（図５７ａ）。それだけでなく、マウスの生存率も、ＹＳＣ−０２において最も優れた（図５７ｂ）。
【０１８５】
実施例８：Ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫力があるマウスで４種の遺伝子を共発現する腫瘍選択的アデノウイルスによる抗腫瘍効果の確認
マウスタイプのＹＳＣ−０２による抗腫瘍効果を様々な比較対象グループと比較するために、免疫可能マウス  モデルをまず製作した。すなわち、免疫能があるマウス（Ｂａｌｂ  ｃ）にアデノウイルスの感染および複製が可能なマウス肝癌細胞株（ＢＮＬ−ＣＡＲ−Ｅ１Ｂ５５Ｋ−ＨＳＰ２５）を製作した。
【０１８６】
このために、まず、ＢＮＬ  １ＭＥ  Ａ．７Ｒ．１（ＢＮＬ）マウス肝癌細胞株に熱衝撃を４３度で４時間行い、３７度で２４時間培養した後、ＨＳＰ２５、ＨＳＰ２７発現の有無を確認する実験を進めた。次に、ｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲプライマーを利用してＰＣＲを進めてサイズを確認し、クローニングした。この際に使用したプライマーは、ｍｏｕｓｅ  ＨＳＰ２５  ｓｅｎｓｅ：（Ｂａｍ  ＨＩ）５’−ｃｇｃ  ｇｇａｔｃｃ  ａｔｇ  ａｃｃ  ｇａｇ  ｃｇｃ  ｃｇｃ  ｇｔｇ  ｃｃ−３’  ａｎｔｉ  ｓｅｎｓｅ：（Ｘｈｏ  Ｉ）５’−ｃｃｇ  ｃｔｃｇａｇ  ｃｔａｃｔｔｇｇｃｔｃｃａｇａｃｔｇｔｔ−３’であった。クローニングされたＤＮＡ断片は、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断した後、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断したｐＣＤＮＡ３．１に挿入して、ｐｃＤＮＡ３．１−ＨＳＰ２５を得た。ＢＮＬ細胞にｐｃＤＮＡ３．１−ＨＳＰ２５トランスフェクションした後、ハイグロマイシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）で選別を進めて、ＨＳＰ２５が発現するクローンを得た。Ｅ１Ｂ５５ＫＤまたはＣＡＲを発現するレトロウイルスを生成するために、ｐＬＮＣＸベクターを使用した。Ｅ１Ｂ５５ＫＤクローニングのためにｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ１Ｂ５５ＫＤでＨｐａＩ、ＣｌａＩ酵素部位を追加してＰＣＲ方法でＥ１Ｂ５５ＫＤを取り出して、ｐＬＮＣＸベクターに挿入した。ＣＡＲクローニングのためにｐＣＤＮＡ３．１−ＣＡＲでＨｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩ酵素部位を追加してＰＣＲ方法でＣＡＲを取り出して、ｐＬＮＣＸベクターに挿入した。選択されたＢＮＬ−ＨＳＰ２５  ｃｅｌｌにＣＡＲまたはＥ１Ｂ５５ＫＤを発現するレトロウイルスを重感染（ｃｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）して、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）で選別して、ＢＮＬ−ＣＡＲ−Ｅ１ｂ５５ＫＤ−ＨＳＰ２５細胞株を得た（図５８）。
【０１８７】
ＢＮＬ−ＣＡＲ−Ｅ１Ｂ５５ＫＤ−ＨＳＰ２５細胞株１×１０７ｃｅｌｌ／１００μｌの細胞を腹壁に注入して、腫瘍サイズが６０ｍｍ３に達した時、二日間隔で３回（１×１０９ｐｆｕ／５０μｌ）、アデノウイルス（陰性対照群：Ａｄ−３４８４−ＮＣ）、製造例１の１種（Ａｄ−３４８４−ｍＧＭ−ＣＳＦ）、製造例２の１種（Ａｄ−３４８４−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ）、製造例６の２種（Ａｄ−３４８４−ｍＧＭＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ）、製造例１２と製造例１４の３種（Ａｄ−３４８４−ｍＧＭＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−ｓｈＨＳＰ２５、Ａｄ−３４８４−ｍＧＭＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−ｍｓｈＴＧＦβ１）、製造例２０の４種（Ａｄ−３４８４−ｍＧＭＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−ｓｈＨＳＰ２５−ｍｓｈＴＧＦβ１）、そして比較対照群として韓国特許出願第２０１５−００４４５０７号の製造例９のマウスタイプの腫瘍溶解性ウイルス４ｍ（ＧＭＣＳＦ＋ＤＣＮ＋ｓｈＦｏｘｐ３＋ｓｈＴＧＦβ２）［以下、ＧＸ−０３という］を腫瘍内注射（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で感染させた。各実験群当たり６匹ずつを使用した。
【０１８８】
その結果、４種の遺伝子を含むマウスｔｙｐｅのＹＳＣ−０２による抗腫瘍効果が最も優れており、その次に、ＴＧＦ−β１  ｓｈＲＮＡを含む３種の遺伝子を有するアデノウイルスがその次に優れており、ＧＸ−０３より効果が格別に優れていた（図６１）。ＧＸ−０３は、３種よりも抗腫瘍効果に劣った。これにより、ＧＸ−０３よりＹＳＣ−０２が顕著に優れていることを立証した。それだけでなく、ＹＳＣ−０２は、ＧＭ−ＣＳＦ単独、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ単独に比べて格別に抗腫瘍効果に優れていることを示し（図５９）、そしてｓｈＴＧＦ−βまたはｓｈＨＳＰ２７単独そしてｓｈＴＧＦβ−ｓｈＨＳＰ２７複合体に比べて、それだけでなくＧＸ−０３に比べて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで相対的に細胞死および生存能の低下効果が非常に良いを立証した（図６０）。何よりも、図５５でＧＸ−０３を含む様々な種類の比較対象ウイルスに比べて全般的にＹＳＣ−０２感染時に脾臓細胞分離後、Ｔ細胞活性は増加するが（図６１）、Ｔｒｅｇ細胞は増加せず（図６２）、腫瘍組織における浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ）されたＤＣは増加する傾向が明確であった（図６３）。
【図１】
2019502375.tif 000003
【図２】
2019502375.tif 000004
【図３】
2019502375.tif 000005
【図４ａ】
2019502375.tif 000006
【図４ｂ】
2019502375.tif 000007
【図４ｃ】
2019502375.tif 000008
【図４ｄ】
2019502375.tif 000009
【図５ａ】
2019502375.tif 000010
【図５ｂ】
2019502375.tif 000011
【図６】
2019502375.tif 000012
【図７】
2019502375.tif 000013
【図８】
2019502375.tif 000014
【図９】
2019502375.tif 000015
【図１０】
2019502375.tif 000016
【図１１】
2019502375.tif 000017
【図１２ａ】
2019502375.tif 000018
【図１２ｂ】
2019502375.tif 000019
【図１３ａ】
2019502375.tif 000020
【図１３ｂ】
2019502375.tif 000021
【図１４ａ】
2019502375.tif 000022
【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
2019502375.tif 000029
【図１８】
2019502375.tif 000030
【図１９】
2019502375.tif 000031
【図２０】
2019502375.tif 000032
【図２１】
2019502375.tif 000033
【図２２】
2019502375.tif 000034
【図２３】
2019502375.tif 000035
【図２４ａ】
2019502375.tif 000036
【図２４ｂ】
2019502375.tif 000037
【図２５ａ】
2019502375.tif 000038
【図２５ｂ】
2019502375.tif 000039
【図２６】
2019502375.tif 000040
【図２７】
2019502375.tif 000041
【図２８】
2019502375.tif 000042
【図２９】
2019502375.tif 000043
【図３０】
2019502375.tif 000044
【図３１】
2019502375.tif 000045
【図３２】
2019502375.tif 000046
【図３３】
2019502375.tif 000047
【図３４】
2019502375.tif 000048
【図３５】
2019502375.tif 000049
【図３６】
2019502375.tif 000050
【図３７】
2019502375.tif 000051
【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
2019502375.tif 000054
【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４ａ】
2019502375.tif 000058
【図４４ｂ】
2019502375.tif 000059
【図４５ａ】
2019502375.tif 000060
【図４５ｂ】
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【図４５ｃ】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
2019502375.tif 000067
【図５１ａ】
2019502375.tif 000068
【図５１ｂ】
2019502375.tif 000069
【図５２ａ】
2019502375.tif 000070
【図５２ｂ】
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【図５２ｃ】
2019502375.tif 000072
【図５２ｄ】
2019502375.tif 000073
【図５２ｅ】
2019502375.tif 000074
【図５２ｆ】
2019502375.tif 000075
【図５２ｇ】
2019502375.tif 000076
【図５２ｈ】
2019502375.tif 000077
【図５２ｉ】
2019502375.tif 000078
【図５２ｊ】
2019502375.tif 000079
【図５３ａ】
2019502375.tif 000080
【図５３ｂ】
2019502375.tif 000081
【図５３ｃ】
2019502375.tif 000082
【図５３ｄ】
2019502375.tif 000083
【図５４ａ】
2019502375.tif 000084
【図５４ｂ】
2019502375.tif 000085
【図５５ａ】
2019502375.tif 000086
【図５５ｂ】
2019502375.tif 000087
【図５６】
2019502375.tif 000088
【図５７ａ】
2019502375.tif 000089
【図５７ｂ】
2019502375.tif 000090
【図５８】
2019502375.tif 000091
【図５９】
2019502375.tif 000092
【図６０】
2019502375.tif 000093
【図６１】
2019502375.tif 000094
【図６２】
2019502375.tif 000095
【図６３ａ】
2019502375.tif 000096
【図６３ｂ】
2019502375.tif 000097
【図６３ｃ】
2019502375.tif 000098
【配列表】
2019502375000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月8日(2018.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子；ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含むＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−βおよびｓｈＨＳＰ共発現用遺伝子伝達体。
【請求項２】
前記ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、配列番号１または配列番号２で表示される、請求項１に記載の遺伝子伝達体。
【請求項３】
前記Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子は、配列番号３で表示される、請求項１に記載の遺伝子伝達体。
【請求項４】
前記ｓｈＴＧＦ−βは、ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２である、請求項１に記載の遺伝子伝達体。
【請求項５】
前記ｓｈＴＧＦ−β１は、配列番号４または配列番号５で表示される、請求項４に記載の遺伝子伝達体。
【請求項６】
前記ｓｈＴＧＦ−β２は、配列番号６または配列番号７で表示される、請求項４に記載の遺伝子伝達体。
【請求項７】
前記ｓｈＨＳＰは、ｓｈＨＳＰ２５またはｓｈＨＳＰ２７である、請求項１に記載の遺伝子伝達体。
【請求項８】
前記ｓｈＨＳＰ２５は、配列番号８で表示される、請求項７に記載の遺伝子伝達体。
【請求項９】
前記ｓｈＨＳＰ２７は、配列番号９で表示される、請求項７に記載の遺伝子伝達体。
【請求項１０】
前記遺伝子伝達体は、プラスミド、組換えアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、リポソームまたはニオソームである、請求項１に記載の遺伝子伝達体。
【請求項１１】
前記遺伝子伝達体は、組換えアデノウイルスベクターである、請求項１０に記載の遺伝子伝達体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかか一項に記載の遺伝子伝達体を含む腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
顆粒球−大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子；Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子；ＴＧＦ−βの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＧＦ−β）およびＨＳＰの発現を抑制するｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＳＰ）を含む腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
前記ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、配列番号１または配列番号２で表示される、請求項１３に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１５】
前記Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ融合遺伝子は、配列番号３で表示される、請求項１３に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１６】
前記ｓｈＴＧＦ−βは、ｓｈＴＧＦ−β１またはｓｈＴＧＦ−β２である、請求項１３に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１７】
前記ｓｈＴＧＦ−β１は、配列番号４または配列番号５で表示される、請求項１６に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１８】
前記ｓｈＴＧＦ−β２は、配列番号６または配列番号７で表示される、請求項１６に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１９】
前記ｓｈＨＳＰは、ｓｈＨＳＰ２５またはｓｈＨＳＰ２７である、請求項１３に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２０】
前記ｓｈＨＳＰ２５は、配列番号８で表示される、請求項１９に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２１】
前記ｓｈＨＳＰ２７は、配列番号９で表示される、請求項１９に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、免疫活性および免疫原性を増大させる、請求項１２または１３に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２３】
前記遺伝子またはｓｈＲＮＡは一つ以上の遺伝子伝達体により導入される、請求項１３に記載の腫瘍治療における使用のための医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【図１】図１は、本発明による組換えアデノウイルスベクターに含まれている４個の遺伝子の個別的な作用方式を図式化したものである。
【図２】図２は、本発明の４種の遺伝子が別個の作用でなく有機的に相関関係を有しながら相互協同的に抗癌作用を示すことを示す図である。
【図３】図３は、本発明による２種の組換えアデノウイルスベクターおよび４種の組換えアデノウイルスベクターＹＳＣ−０２、ＹＳＣ−０１を示すものである。
【図４ａ】図４ａは、ＡｄｌｏｘベクターにＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬがＳａｌＩ／ＢａｍＨＩで挿入されていることを示すものである。
【図４ｂ】図４ｂは、ｐＩＲＥＳベクターにＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬが挿入されていることをＸｂａＩとＭｆｅＩで切断して確認したものである。
【図４ｃ】図４ｃは、ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ（−Ｅ１Ｒ）シャトルベクターにＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬが挿入されたことをＰｍｅＩで切断して確認したものである。
【図４ｄ】図４ｄは、ヒトＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図５ａ】図５ａは、ヒトｓｈＴＧＦ−βを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えを示すものである。
【図５ｂ】図５ｂは、ヒトｓｈＴＧＦ−βを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β２とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えを示すものである。
【図６】図６は、ヒトｓｈＨＳＰ２７を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えを示すものである。
【図７】図７は、ｐＳＰ７２−Ｈ１−ｍｓｈＨＳＰ２５−１、−２または−３からＨＳＰ２５  ｓｈＲＮＡ効果を確認するために、ＢＮＬ−ＨＳＰ２５細胞株にそれぞれのＨＳＰ２５  ｓｈＲＮＡをトランスフェクションしてＨＳＰ２５の発現減少効果を確認したものである。
【図８】図８は、マウスｓｈＨＳＰ２５を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＩＸとシャトルベクターであるｐＳＰ７２−ｓｈＨＳＰ２５−２との相同組換えを示すものである。
【図９】図９は、マウスｓｈＨＳＰ２５を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＩＸとシャトルベクターであるｐＳＰ７２−ｓｈＨＳＰ２５−３との相同組換えを示すものである。
【図１０】図１０は、図８と図９のＨＳＰ２５  ｓｈＲＮＡを発現するそれぞれのアデノウイルスから発現減少効果を確認したものである。
【図１１】図１１は、ｐＩＲＥＳ−ＧＭ−ＣＳＦにＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入されたことを制限酵素で確認したものである［レーン１：陰性ＤＮＡ；レーン２、３：Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ挿入確認］。
【図１２ａ】図１２ａは、ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−ΔＥ１Ｂ−Ｅ１ＲにヒトＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入されたことを制限酵素で確認したものである。
【図１２ｂ】図１２ｂは、ｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−ΔＥ１Ｂ−Ｅ１ＲにマウスＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入されたことを制限酵素で確認したものである［サブクローニングは、ＰｍｅＩで切断して、インサートおよびベクターサイズが大きくなったことを確認した］。
【図１３ａ】図１３は、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入された腫瘍選択的複製可能アデノウイルスＤＮＡの相同組換えを制限酵素で確認したものであって、図１３ａは、ヒトＧＭ−ＣＳＦである場合を示すものであり［レーン１、２、３、４がいずれも陽性である］、図１３ｂは、マウスＧＭ−ＣＳＦである場合を示すものである［レーン１と４が陽性である］。
【図１３ｂ】図１３は、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入された腫瘍選択的複製可能アデノウイルスＤＮＡの相同組換えを制限酵素で確認したものであって、図１３ａは、ヒトＧＭ−ＣＳＦである場合を示すものであり［レーン１、２、３、４がいずれも陽性である］、図１３ｂは、マウスＧＭ−ＣＳＦである場合を示すものである［レーン１と４が陽性である］。
【図１４ａ】図１４は、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子のサブクローニング過程およびシャトルベクターの製作そして複製可能アデノウイルスの生産のための相同組換え過程を図式化したものである。
【図１４ｂ】図１４は、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子のサブクローニング過程およびシャトルベクターの製作そして複製可能アデノウイルスの生産のための相同組換え過程を図式化したものである。
【図１４ｃ】図１４は、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子のサブクローニング過程およびシャトルベクターの製作そして複製可能アデノウイルスの生産のための相同組換え過程を図式化したものである。
【図１５ａ】図１５ａは、ヒトのＧＭ−ＣＳＦとヒトのＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入された腫瘍選択的複製可能アデノウイルスにおいてＧＭ−ＣＳＦとＴＲＡＩＬタンパク質が発現することをＥＬＩＳＡで確認したものである。
【図１５ｂ】図１５ｂは、マウスのＧＭ−ＣＳＦとヒトのＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入された腫瘍選択的複製可能アデノウイルスにおいてＧＭ−ＣＳＦとＴＲＡＩＬタンパク質が発現することをＥＬＩＳＡで確認したものである。
【図１６ａ】図１６ａは、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入された腫瘍選択的複製可能アデノウイルスにおいてＴＲＡＩＬによる細胞死が起こることをＰＡＲＰ分割で確認したものである。
【図１６ｂ】図１６ｂは、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ遺伝子が挿入された腫瘍選択的複製可能アデノウイルスにおいてＦｌｔ３Ｌが発現することを示すものである。
【図１７】図１７は、ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７またはｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１シャトルベクターの製作過程を示すものである。
【図１８】図１８は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＩＸとシャトルベクターｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７との相同組換えを示すものである。
【図１９】図１９は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＩＸとシャトルベクターｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１との相同組換えを示すものである。
【図２０】図２０は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとシャトルベクターｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１との相同組換えを示すものである。
【図２１】図２１は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとシャトルベクターｐＳＰ７２−ΔＥ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７との相同組換えを示すものである。
【図２２】図２２は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えを示すものである。
【図２３】図２３は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えを示すものである。
【図２４ａ】図２４ａは、ｐＳＰ７２△Ｅ３−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦ−β１にＨ１−ｍｓｈＨＳＰ２５遺伝子が挿入されたクローンを示すものである。
【図２４ｂ】図２４ｂは、バックボーンであるｄｌ３２４−ＩＸとシャトルベクターであるｐＳＰ７２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１との相同組換えを示すものである。
【図２５ａ】図２５ａは、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩとシャトルベクターであるｐＳＰ７２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１との相同組換えを示すものである。
【図２５ｂ】図２５ｂは、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂとの相同組換えを示すものである。
【図２６】図２６は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−β１を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＴＧＦ−β１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図２７】図２７は、マウスＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｍＴＧＦβ１を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図２８】図２８は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＨＳＰ２７を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ｍｓｈＨＳＰ２７とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図２９】図２９は、マウスＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＨＳＰ２５を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ｓｈＨＳＰ２５（マウス由来）とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図３０】図３０は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ｓｈＴＧＦβ１，ｓｈＨＳＰ２７を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ｓｈＨＳＰ２７−ｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｈＧＭＣＳＦとの相同組換えを示すものである。
【図３１】図３１は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ｓｈＴＧＦβ２、ｓｈＨＳＰ２７を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦとの相同組換えを示すものである。
【図３２】図３２は、マウスＧＭＣＳＦ、ｓｈＴＧＦβ１、ｓｈＨＳＰ２５を共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｍｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−ｍＧＭ−ＣＳＦとの相同組換えを示すものである。
【図３３】図３３は、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＨＳＰ２７およびｓｈＴＧＦβ１共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図３４】図３４は、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＨＳＰ２７およびｓｈＴＧＦβ２共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図３５】図３５は、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＨＳＰ２５およびｓｈＴＧＦβ１共発現する腫瘍溶解性アデノウイルスの製作を確認したものであって、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−Ｈ１−ｍｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦ−β１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶｐ−△Ｅ１Ｂ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換えを示すものである。
【図３６】図３６は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−β２およびｓｈＨＳＰ２７搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルス（ＹＳＣ−０１）製作を確認したものであって、ｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬシャトルベクターとの相同組換えを示すものである。
【図３７】図３７は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ｓｈＴＧＦ−β１およびｓｈＨＳＰ２７搭載腫瘍選択的殺傷アデノウイルス（ＹＳＣ−０２）の製作を確認したものであって、ｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−△Ｅ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦ−β１とｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬシャトルベクターとの相同組換えを示すものである。
【図３８】図３８は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−△Ｅ３−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ２−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬシャトルベクターとの相同組換えを示すものである。
【図３９】図３９は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２７−Ｕ６−ｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３ＬＴＲＡＩＬとの相同組換えをそれぞれ示すものである。
【図４０】図４０は、バックボーンであるｄｌ３２４−ＢｓｔＢＩ−ΔＥ３−Ｈ１−ｓｈＨＳＰ２５−Ｕ６−ｍｓｈＴＧＦβ１とシャトルベクターであるｐＶＡＸ１−３４８４−ＣＭＶ−△Ｅ１Ｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬとの相同組換え（ｍＹＳＣ−０２）を示すものである。
【図４１】図４１は、マウス肝癌細胞株由来ＢＮＬ−ＣＡＲ−Ｅ１Ｂ５５Ｋ−ＨＳＰ２５細胞にｍＹＳＣ−０２感染させたとき、ウイルスに搭載された遺伝子が正常に発現していることを示すものである。
【図４２】図４２は、ｓｈＴＧＦ−β１、ｓｈＨＳＰ２７単独あるいは両方とも発現する腫瘍選択的複製可能ウイルスによる抗腫瘍効果をヌードマウス動物実験で確認したものである。
【図４３】図４３は、ＴＧＦ−βのアイソタイプによって生存率が異なることを様々な癌細胞株においてクローン形成法を通じて確認したものである。
【図４４ａ】図４４ａは、Ｕ２５１Ｎ、Ａ５４９、Ｈｕｈ７、Ａ３７５癌細胞株において細胞内ＴＧＦ−β１水準を低下させたとき、細胞生存信号およびＳＡＰＫ関連信号に対する効果を確認したものである。
【図４４ｂ】図４４ｂは、ＭｉａＰａＣａ−２、ＨＰＡＣ、Ａｓｐｃ−１、Ｃａｐａｎ−１癌細胞株において細胞内ＴＧＦ−β１水準を低下させたとき、細胞生存信号およびＳＡＰＫ関連信号に対する効果を確認したものである。
【図４５ａ】図４５ａは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１−Ｈｅｒ２癌細胞株においてＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２を低下させたときのＲＯＳ生成量をＤＣＦ−ＤＡ酸化による蛍光量で測定したのである。
【図４５ｂ】図４５ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１−Ｈｅｒ２癌細胞株においてＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２を低下させたとき、細胞生存信号およびＳＡＰＫ関連信号に対する効果を確認したものである。
【図４５ｃ】図４５ｃは、Ａ５４９、Ａ３７５、Ｈｕｎ７、Ｕ２５１Ｎ癌細胞株においてＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２を低下させたときのＲＯＳ生成量をＤＣＦ−ＤＡ酸化による蛍光量で測定したものである。
【図４６】図４６は、多様な癌細胞株においてＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β１とＨＳＰ２７を同時に低下させたときの細胞生存信号およびＳＡＰＫ関連信号に対する効果を確認したものである。
【図４７】図４７は、多様な癌細胞株でＨＳＰ２７を低下させたとき、腫瘍のプログレッションに関係する多様なマーカー信号の低下を確認したものである。
【図４８】図４８は、多様な癌細胞株においてＨＳＰ２７のみを低下させたときより、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２とＨＳＰ２７を同時に低下させたとき、腫瘍のプログレッションに関係する多様なマーカー信号の低下がさらに明確になることを確認したものである。
【図４９】図４９は、多様な癌細胞株においてＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２のみを低下させたときより、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２とＨＳＰ２７を同時に低下させたとき、生存率が低下することをクローン形成法を通じてその効果を確認したものである。
【図５０】図５０は、多様な癌細胞株においてＨＳＰ２７のみを低下させたときより、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２とＨＳＰ２７を同時に低下させたとき、ＴＲＡＩＬ受容体の増加およびＴＲＡＩＬ抵抗性関連ＣＤＫ９の減少効果があることを確認したものである。
【図５１ａ】図５１ａは、乳癌細胞株、神経膠腫、黒色腫細胞株においてＴＧＦ−β１とＨＳＰ２７を同時に低下させたとき、そしてそこにＴＲＡＩＬ発現を誘導したときの細胞生存信号およびＳＡＰＫ関連信号に対する効果を確認したものである。
【図５１ｂ】図５１ｂは、膵臓癌細胞株、肝癌細胞株においてＴＧＦ−β１とＨＳＰ２７を同時に低下させたとき、そしてそこにＴＲＡＩＬ発現を誘導したときの細胞生存信号およびＳＡＰＫ関連信号に対する効果を確認したものである。
【図５２ａ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ａは、ＹＳＣ−０１のＧＭ−ＣＳＦ塩基配列挿入を確認したものである。
【図５２ｂ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｂは、ＹＳＣ−０１のＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬにおいてＦｌｔ３Ｌ（１〜１８１アミノ酸該当）塩基配列確認したものである。
【図５２ｃ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｃは、ＹＳＣ−０１のＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬにおいてＴＲＡＩＬ（９５〜２８１アミノ酸該当塩基配列を確認したものである［三番目行の右側ＴＣＴがＴＣＣとなっているが、アミノ酸はセリンであって、同一］。
【図５２ｄ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｄは、ＹＳＣ−０１のｓｈＴＧＦ−β２においてｓｈＴＧＦ−β２塩基配列を確認したものである。
【図５２ｅ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｅは、ＹＳＣ−０１のｓｈＨＳＰ２７においてｓｈＨＳＰ２７塩基配列を確認したものである。
【図５２ｆ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｆは、ＹＳＣ−０２のＧＭ−ＣＳＦ塩基配列挿入を確認したものである。
【図５２ｇ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｇは、ＹＳＣ−０２のＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬでＦｌｔ３Ｌ（１〜１８１アミノ酸該当）塩基配列を確認したものである。
【図５２ｈ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｈは、ＹＳＣ−０２のＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬでＴＲＡＩＬ（９５〜２８１アミノ酸該当塩基配列を確認したものである［三番目列の左側ＴＣＴがＴＣＣとなっているが、アミノ酸はセリンであって、同一］。
【図５２ｉ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｉは、ＹＳＣ−０２のｓｈＨＳＰ２７においてｓｈＨＳＰ２７塩基配列を確認したものである。
【図５２ｊ】図５２は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２のウイルスＤＮＡの塩基配列分析を通じて導入した遺伝子が正常に挿入されたことを確認したものである［ＧＭ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＯＲＦ−ＧＭ−ＣＳＦ由来全体アミノ酸残基を有し、Ｆｌｔ３Ｌは、１〜１８１アミノ酸残基を有し、ＴＲＡＩＬは、９５〜２８１アミノ酸残基を有する］。図５２ｊは、ＹＳＣ−０２のｓｈＴＧＦ−β１においてｓｈＴＧＦ−β１塩基配列を確認したものである。
【図５３ａ】図５３は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２を明記した膵臓癌細胞株にＭＯＩ別に感染させたときに導入した４個の遺伝子が正常に発現したり、ｓｈＲＮＡに起因して発現が低下していることを確認したものである。図５３ａは、ＹＳＣ−０１感染によるＧＭ−ＣＳＦおよびＴＲＡＩＬの分泌を確認したものである。
【図５３ｂ】図５３は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２を明記した膵臓癌細胞株にＭＯＩ別に感染させたときに導入した４個の遺伝子が正常に発現したり、ｓｈＲＮＡに起因して発現が低下していることを確認したものである。図５３ｂは、ＹＳＣ−０１感染によるＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡの発現抑制確認およびＰＡＲＰの分割およびＦｌｔ３Ｌの発現およびＨＳＰ２７の発現抑制を確認したものである。
【図５３ｃ】図５３は、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２を明記した膵臓癌細胞株にＭＯＩ別に感染させたときに導入した４個の遺伝子が正常に発現したり、ｓｈＲＮＡに起因して発現が低下していることを確認したものである。図５３ｃは、ＹＳＣ−０２感染によるＧＭ−ＣＳＦおよびＴＲＡＩＬの分泌を確認したものである。
【図５３ｄ】図５３ｄは、ＹＳＣ−０２感染によるＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡの発現抑制確認およびＰＡＲＰの分割およびＦｌｔ３Ｌの発現およびＨＳＰ２７の発現抑制を確認したものである。
【図５４ａ】図５４ａは、ｐ５３変異型を有する数種類の癌細胞株においてＹＳＣ−０１またはＹＳＣ−０２によりＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ発現する腫瘍溶解性アデノウイルスより生存率をさらに低下させていることをクローン形成法を通じて確認したものである。
【図５４ｂ】図５４ｂは、ｐ５３野生型の癌細胞株においてＹＳＣ−１またはＹＳＣ−０２によりＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ発現する腫瘍溶解性アデノウイルスより生存率をさらに低下させていることをクローン形成法を通じて確認したものであり（左）、正常細胞では、これとは異なって、ＹＳＣ−０１またはＹＳＣ−０２であるか、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ発現する腫瘍溶解性アデノウイルスであるか、なおさら対照群の腫瘍溶解性アデノウイルスとも生存率に大きな差異がないことをクローン形成法を通じて確認したものである（右）。
【図５５ａ】図５５ａは、正常細胞およびｐ５３変異型を有する数種類の癌細胞株においてＹＳＣ−０２のＭＯＩの増加によって生存関係信号、ＴＲＡＩＬ関連信号などを確認して、腫瘍選択性を有しながら生存率の低下誘導および腫瘍殺傷能の増加を確認したものである。
【図５５ｂ】図５５ｂは、ｐ５３野生型を有する二種類の癌細胞株においてＹＳＣ−０２のＭＯＩ増加によって生存関係信号、ＴＲＡＩＬ関連信号などを確認して、腫瘍選択性を有しながら生存率の低下誘導および腫瘍殺傷能の増加を確認したものである。
【図５６】図５６は、正常細胞を含む数種類の癌細胞株においてＹＳＣ−０１またはＹＳＣ−０２によりクローン形成法を通じてＹＳＣ−０２が相対的に腫瘍殺傷能に優れていることを確認したものである。
【図５７ａ】図５７ａは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ発現する腫瘍選択性複製可能ウイルスよりＹＳＣ−０１、ＹＳＣ−０２、特にＹＳＣ−０２がヒトの膵臓癌細胞株を移植した免疫欠乏ヌードマウスにおいて抗腫瘍効果を確認したものである。
【図５７ｂ】図５７ｂは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ発現する腫瘍選択性複製可能ウイルスよりＹＳＣ−０１、ＹＳＣ−０２、特にＹＳＣ−０２がヒトの膵臓癌細胞株を移植した免疫欠乏ヌードマウスにおいて生存率効果を確認したものである。
【図５８】図５８は、マウスに対するアデノウイルスの感染力と複製率を向上させることができる遺伝子を導入し、クローンを選択して挿入された遺伝子発現するマウス由来肝癌細胞株（ＢＮＬ−ＣＡＲ−Ｅ１Ｂ５５Ｋ−ＨＳＰ２５）を示すものである。
【図５９】図５９は、４種の遺伝子を発現するアデノウイルス（ＹＳＣ−０１，ＹＳＣ−０２）による抗腫瘍効果を確認したものであって、免疫要素の寄与を確認するために、免疫力があるマウスに感染させたすべての種類のウイルスをヒトとマウスに互換性があるＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを除いた残りの遺伝子をマウス遺伝子を使用してＹＳＣ−０１、０２およびＧＸ−０３等の抗腫瘍効果を比較したものである。
【図６０】図６０は、多様な癌細胞株においてＴＧＦ−β１またはＨＳＰ２７のみを低下させたり、またはＴＧＦ−β１とＨＳＰ２７を同時に低下させたときの生存率であるか、あるいはＧＸ−０３を感染させたときよりＹＳＣ−０２を感染させたときの生存率の低下効果が大部分の癌細胞株において最も大きいことをクローン形成法を通じてその効果を確認したものである。
【図６１】図６１は、免疫要素の寄与を確認するために、免疫力があるマウスに感染させたすべての種類のウイルスをヒトとマウスに互換性があるＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを除いた残りの遺伝子をマウス遺伝子を使用してＹＳＣ−０１、０２およびＧＸ−０３等のＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞免疫能を比較したものである。
【図６２】図６２は、免疫要素の寄与を確認するために、免疫力があるマウスに感染させたすべての種類のウイルスをヒトとマウスに互換性があるＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを除いた残りの遺伝子をマウス遺伝子を使用してＹＳＣ−０１、０２およびＧＸ−０３等のＴ制御性細胞の細胞免疫能を比較したものである。
【図６３ａ】図６３は、免疫要素の寄与を確認するために、免疫力があるマウスに感染させたすべての種類のウイルスをヒトとマウスに互換性があるＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを除いた残りの遺伝子は、マウス遺伝子を使用してＹＳＣ−０１、０２およびＧＸ−０３等のＤＣ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の細胞免疫能を比較したものである。図６３ａは、ＰＢＳ、腫瘍溶解性対照区アデノウィルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、マウスＧＭ−ＣＳＦのみを発現する腫瘍溶解性アデノウイルス、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスによるＤＣ活性を比較したものである。
【図６３ｂ】図６３は、免疫要素の寄与を確認するために、免疫力があるマウスに感染させたすべての種類のウイルスをヒトとマウスに互換性があるＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを除いた残りの遺伝子は、マウス遺伝子を使用してＹＳＣ−０１、０２およびＧＸ−０３等のＤＣ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の細胞免疫能を比較したものである。図６３ｂは、マウスＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを発現する腫瘍溶解性アデノウイルス、マウスＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ、マウス形態のＨＳＰ２５のｓｈＲＮＡを発現する腫瘍溶解性アデノウイルス、マウス形態のＴＧＦ−β１のｓｈＲＮＡを発現する腫瘍溶解性アデノウイルス、そしてマウス形態のＹＳＣ−０２によるＤＣ活性を比較したものである。
【図６３ｃ】図６３は、免疫要素の寄与を確認するために、免疫力があるマウスに感染させたすべての種類のウイルスをヒトとマウスに互換性があるＦｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬを除いた残りの遺伝子は、マウス遺伝子を使用してＹＳＣ−０１、０２およびＧＸ−０３等のＤＣ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の細胞免疫能を比較したものである。図６３ｃは、マウス形態のＹＳＣ−０２とマウス形態のＧＸ−０３によるＤＣ活性を互いに比較したものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
膵臓癌細胞ＨＰＡＣとＭｉａＰａＣａ−２を１×１０５／６ｗｅｌｌ分注した後、Ａｄ−３４８４−ＮＣ（陰性対照群、腫瘍溶解性アデノウイルス）１００ＭＯＩで感染させ、ＹＳＣ−０１と０２は、それぞれ５、１０、５０、１００ＭＯＩで感染させた後、２日間培養しつつ、最後の２４時間は、無血清培地に分泌されたＧＭ−ＣＳＦおよびＴＲＡＩＬの量を測定した。ＧＭ−ＣＳＦとＴＲＡＩＬおよびＴＧＦ−β１の分泌をＥＬＩＳＡで測定して分泌されることを確認し、ＴＧＦ−β２のｍＲＮＡの低下は、リアルタイムＰＣＲで確認し、Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬでＦｌｔ３Ｌの発現確認とＨＳＰ２７の発現低下は、ウェスタンブロットで確認した（図５３）。リアルタイムＰＣＲは、１×１０５／６ｗｅｌｌ分注した後、Ａｄ−３４８４−ＮＣ  １００ＭＯＩで感染させ、ＹＳＣ−０１は、５、１０、５０、１００ＭＯＩで感染させ、２日後にＲＮＡを分離して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。ヒトＴＧＦ−β２抑制確認のためのリアルタイムＰＣＲ用プライマーは、正方向プライマー：５’ＧＣＴＧＣＣＴＡＣＧＴＣＣＡＣＴＴＴＡＣＡＴ  ３’と逆方向プライマー：５’ＡＴＡＴＡＡＧＣＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧ  ３’を使用し、ＡＢ  ｐｏｗｅｒＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−Ｃｔ  １ステップキットを使用してＲＴ酵素ミックス（１２５Ｘ）０．２μｌ、ＲＴ−ＰＣＲミックス（２ｘ）１２．５μｌ、正方向プライマー（１００  ｐＭ）０．５μｌ、逆方向プライマー（１００  ｐＭ）０．５μｌ、ＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）５μｌ、 ヌクレアーゼフリーウォーター６．３μｌにてトータル体積は２５μｌになるようにし、反応条件は、酵素の活性化を９５℃、１０分間維持したし後、変性を９５℃、１５秒、アニーリング／伸長を６０℃、１分間のサイクルを４０回実施した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８２】
実験のために、６０ｍｍのディッシュに様々な細胞株それぞれを４×１０５個で分注した後、翌日にＡｄ−３４８４−ＮＣ（陰性対照群、腫瘍溶解性アデノウイルス）１ＭＯＩ、製造例６のＡｄ−３４８４−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ  １ＭＯＩ、製造例１９のＡｄ  ３４８４−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ−ｓｈＴＧＦβ２−ｓｈＨＳＰ２７（ＹＳＣ−０１）１ＭＯＩで感染させ、培地を５％ＦＢＳ入っているＤＭＥＭに交替した。翌日に、６ウェルプレートで１×１０５でさらに分注した後、２日間隔で培地を交替しつつ、群落が形成されるまで培養した。群落が形成された適当な時点（１０日以内）に培地を除去し、４％パラホルムアルデヒドを常温で１５分間処理して固定させ、０．０５％クリスタルバイオレットを利用して１時間染色した後、水で洗浄して、紫色で染色された群落を観察した。その結果、ＹＳＣ−０１とＹＳＣ−０２は、製造例６のＧＭＣＳＦ−Ｆｌｔ３Ｌ−ＴＲＡＩＬ発現する腫瘍溶解性アデノウイルスよりｐ５３変異型の細胞株だけでなくｐ５３正常タイプの細胞株においても生存率をさらに低下させていることをクローン形成法を通じて確認した（図５４ａ）。他方で、正常細胞では、生存減少効果が全く現れないことから見て、腫瘍選択性も存在したことを確認した（図５４ｂ）。これら実験結果の確認のために、ウェスタンブロットを行った結果、正常細胞株に比べてｐ５３タイプに大きく拘らず、生存に関係する信号の減少だけでなく、ＴＲＡＩＬ敏感性に関与する信号も増加したり（ＤＲ４、ＤＲ５）減少（ＣＤＫ９）することにより、ＹＳＣ−０２の腫瘍選択性殺傷能を確認した（図５５ａ、ｂ）。ところが、数種類の肝癌細胞株と膵臓癌細胞株（ＭｉａＰａＣａ−２）におけるクローン形成法の結果では、ＹＳＣ−０２による腫瘍崩壊活性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）がＹＳＣ−０１より相対的に優れていることを確認した（図５６）。
【国際調査報告】
2019502375.tif 000099
2019502375.tif 000100
2019502375.tif 000101
2019502375.tif 000102
2019502375.tif 000103
2019502375.tif 000104
2019502375.tif 000105