(57)【要約】本開示は、核酸増幅のための試薬をもたらす乾燥組成物を提供し、これは本質的には無機塩を含まない。無機塩の欠如は、こうした組成物の安定性を増加させ、副産物の形成を減少させる。組成物における酵素の使用に必要な塩は、再構成で供給される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのポリメラーゼを含有する水性溶液、充填剤、洗浄剤、及び有機緩衝液を含む組成物であって、前記水性溶液が、７ｍＭ以下の無機塩濃度を有する、組成物。
【請求項２】
前記水性溶液が、分子アッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、増幅オリゴヌクレオチド、検出プローブオリゴヌクレオチド、標的捕捉プローブオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、検出プローブオリゴヌクレオチドを含み、前記検出プローブオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの標識をさらに含む、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記標識が、蛍光分子、消光分子、発光分子、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記標識が、蛍光または発光分子である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記検出プローブが、ＴａｑＭａｎ検出プローブオリゴヌクレオチド、分子ビーコン検出プローブオリゴヌクレオチド、または分子トーチ検出プローブオリゴヌクレオチドである、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、標的捕捉プローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記標的捕捉プローブオリゴヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下で標的核酸に特異的にハイブリダイズする、標的ハイブリダイズ部分を有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記水性溶液が、マルチプレックス分子アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドを含む、請求項２〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、ヘアピンを形成するように構成されたアダプターオリゴヌクレオチドを含む、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記水性溶液が、核酸シークエンシングアッセイを行うためのオリゴヌクレオチドを含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記充填剤が、トレハロース、ラフィノース、またはこれらの組み合わせである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記充填剤が、トレハロースである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記充填剤が、約０．１６Ｍ〜約０．３２Ｍの濃度で存在する、請求項１、１３、及び１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記水性溶液が、５ｍＭ以下の無機塩濃度を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記無機塩が、約０．３７３ｕｇ／ｕｌ〜約０．０２９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記水性溶液が、約０．２９２ｕｇ／ｕｌの塩化ナトリウム〜約０．０２９ｕｇ／ｕｌの塩化ナトリウムを含有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記水性溶液が、約０．３７３ｕｇ／ｕｌの塩化カリウム〜約０．０１９ｕｇ／ｕｌの塩化カリウムを含有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記水性溶液が、約０．１１５ｕｇ／ｕｌのナトリウムイオン〜約０．００６ｕｇ／ｕｌのナトリウムイオンを含有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記水性溶液が、約０．１９６ｕｇ／ｕｌのカリウムイオン〜約０．０１０ｕｇ／ｕｌのカリウムイオンを含有する、請求項１〜４または２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記水性溶液が、約０．３５５ｕｇ／ｕｌの塩化物イオン〜約０．００９ｕｇ／ｕｌの塩化物イオンを含有する、請求項１〜１７、２０、または２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記水性溶液が、４ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記水性溶液が、約０．２９８ｕｇ／ｕｌ〜約０．２３４ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記水性溶液が、約０．２８４ｕｇ／ｕｌ〜約０．０７１ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記水性溶液が、３ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記水性溶液が、約０．２２４ｕｇ／ｕｌ〜約０．１７５ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記水性溶液が、約０．２１３ｕｇ／ｕｌ〜約０．０５３ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記水性溶液が、２ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記水性溶液が、約０．１４９ｕｇ／ｕｌ〜約０．１１７ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記水性溶液が、約０．１４２ｕｇ／ｕｌ〜約０．０３６ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記水性溶液が、１ｍＭ以下の無機塩濃度を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記水性溶液が、約０．０７５ｕｇ／ｕｌ〜約０．０５８ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記水性溶液が、約０．０７１ｕｇ／ｕｌ〜約０．０１８ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、請求項３２または３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記水性溶液が、５００ｕＭ以下の無機塩濃度を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記水性溶液が、約０．０３７ｕｇ／ｕｌ〜約０．０２９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記水性溶液が、約０．０３６ｕｇ／ｕｌ〜約０．００９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む、請求項３５または３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記水性溶液の前記無機塩濃度は、１ｍＭ未満の塩化ナトリウムである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記水性溶液が、塩化ナトリウムを含有しない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記水性溶液が、１ｍＭ未満のマグネシウムイオンを含有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記水性溶液が、０．１ｍＭ未満のマグネシウムイオンを含有し、適切には、マグネシウムイオンを含有しない、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記水性溶液が、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ｄＮＴＰが、ｄＡＴＰを前記水性溶液中０．１ｍＭ〜０．３ｍＭの濃度で含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ｄＡＴＰが、前記水性溶液中０．２ｍＭの濃度である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ｄＮＴＰが、ｄＧＴＰを前記水性溶液中０．１ｍＭ〜０．３ｍＭの濃度で含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ｄＧＴＰが、前記水性溶液中０．２ｍＭの濃度である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ｄＮＴＰが、ｄＣＴＰを前記水性溶液中０．１ｍＭ〜０．３ｍＭの濃度で含む、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ｄＣＴＰが、前記水性溶液中０．２ｍＭの濃度である、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ｄＮＴＰが、ｄＴＴＰを前記水性溶液中０．２ｍＭ〜０．６ｍＭの濃度で含む、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ｄＮＴＰが、ｄＵＴＰを前記水性溶液中０．２ｍＭ〜０．６ｍＭの濃度で含む、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、前記水性溶液中約０．２０Ｕ／ｕｌ〜約０．７２Ｕ／ｕｌの濃度で前記水性溶液中に存在するポリメラーゼを含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、０．２５Ｕ／ｕｌ、０．３０Ｕ／ｕｌ、０．３２Ｕ／ｕｌ、０．４Ｕ／ｕｌ、０．５Ｕ／ｕｌ、０．４５Ｕ／ｕｌ、及び０．７２Ｕ／ｕｌから選択される濃度で前記水性溶液中に存在するポリメラーゼを含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼであるポリメラーゼを含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記ホットスタートポリメラーゼが、前記ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を特異的に遮断する抗体により結合された組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記ホットスタートポリメラーゼが、化学修飾された組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、前記化学修飾が、前記ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５６】
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、約０．１Ｕ／ｕｌ〜約０．６Ｕ／ｕｌの濃度で前記水性溶液中に存在する逆転写酵素を含む、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素である、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記逆転写酵素が、ＭＭＬＶ逆転写酵素である、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記水性溶液が、ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、約０．１２Ｕ／ｕｌ〜約０．２０Ｕ／ｕｌの濃度で前記水性溶液中に存在する、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記水性溶液が、キレート剤をさらに含む、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＤＤＳ、ＭＧＤＡ、ＥＧＴＡ、及びＤＴＰＡからなる群から選択される、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記キレート剤が、ＥＤＴＡであり、１．５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度で前記水性溶液中に存在する、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記洗浄剤が、イオン性洗浄剤である、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記洗浄剤が、カチオン性洗浄剤である、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記洗浄剤が、アニオン性洗浄剤である、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６７】
請求項１〜６６のいずれかに記載の組成物の乾燥形態。
【請求項６８】
少なくとも１つのポリメラーゼ、充填剤、有機緩衝液、１つ以上の無機塩、及び洗浄剤を含む乾燥組成物であって、前記１つ以上の無機塩が、前記乾燥組成物の総質量の０．３５０％以下である質量で前記乾燥組成物中に存在する、乾燥組成物。
【請求項６９】
前記１つ以上の無機塩が、前記乾燥組成物の総質量の約０．３１１％〜約０．０２４％である質量で前記乾燥組成物中に存在する、請求項６８に記載の乾燥組成物。
【請求項７０】
前記１つ以上の無機塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ならびに塩化ナトリウム及び塩化カリウムの両方からなる群から選択される、請求項６８に記載の乾燥組成物。
【請求項７１】
前記乾燥組成物が、分子アッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項６８〜７０に記載の乾燥組成物。
【請求項７２】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、増幅オリゴヌクレオチド、検出プローブオリゴヌクレオチド、標的捕捉プローブオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７１に記載の乾燥組成物。
【請求項７３】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、検出プローブオリゴヌクレオチドであり、前記検出プローブオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの標識をさらに含む、請求項７１または７２に記載の乾燥組成物。
【請求項７４】
前記標識が、蛍光分子、消光分子、発光分子、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７３に記載の乾燥組成物。
【請求項７５】
前記標識が、蛍光または発光分子である、請求項７４に記載の乾燥組成物。
【請求項７６】
前記検出プローブが、ＴａｑＭａｎ検出プローブオリゴヌクレオチド、分子ビーコン検出プローブオリゴヌクレオチド、または分子トーチ検出プローブオリゴヌクレオチドである、請求項７４または７５に記載の乾燥組成物。
【請求項７７】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、標的捕捉プローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項７１〜７６のいずれか一項に記載の乾燥組成物。
【請求項７８】
前記標的捕捉プローブオリゴヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下で標的核酸に特異的にハイブリダイズする標的ハイブリダイズ部分を有する、請求項７７に記載の乾燥組成物。
【請求項７９】
前記乾燥組成物が、マルチプレックス分子アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドを含む、請求項７１〜７８のいずれか一項に記載の乾燥組成物。
【請求項８０】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、ヘアピンを形成するように構成されたアダプターオリゴヌクレオチドを含む、請求項７１〜７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８１】
前記水性溶液が、核酸シークエンシングアッセイを行うためのオリゴヌクレオチドを含む、請求項７１〜８０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８２】
前記充填剤が、トレハロース、ラフィノース、またはこれらの組み合わせである、請求項６８に記載の乾燥組成物。
【請求項８３】
前記充填剤が、トレハロースである、請求項８２に記載の乾燥組成物。
【請求項８４】
前記組成物が、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む、請求項６８〜８３のいずれか一項に記載の乾燥組成物。
【請求項８５】
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼを含む、請求項６８〜８４のいずれか一項に記載の乾燥組成物。
【請求項８６】
前記ホットスタートポリメラーゼが、ポリメラーゼ活性を特異的に阻害する抗体に結合された組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼである、請求項８５に記載の乾燥組成物。
【請求項８７】
前記ホットスタートポリメラーゼが、化学修飾された組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼである、請求項８５に記載の乾燥組成物。
【請求項８８】
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、逆転写酵素を含む、請求項６８〜８７のいずれか一項に記載の乾燥組成物。
【請求項８９】
前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素である、請求項８８に記載の乾燥組成物。
【請求項９０】
前記逆転写酵素が、ＭＭＬＶ逆転写酵素である、請求項８８に記載の乾燥組成物。
【請求項９１】
前記組成物が、ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、請求項６８〜９０のいずれか一項に記載の乾燥組成物。
【請求項９２】
前記組成物が、キレート剤をさらに含む、請求項６８〜９１のいずれか一項に記載の乾燥組成物。
【請求項９３】
前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＳ、及びＭＧＤＡからなる群から選択される、請求項９２に記載の乾燥組成物。
【請求項９４】
前記洗浄剤が、イオン性洗浄剤である、請求項６８〜９３のいずれか一項に記載の乾燥組成物。
【請求項９５】
前記洗浄剤が、カチオン性洗浄剤である、請求項９４に記載の乾燥組成物。
【請求項９６】
前記洗浄剤が、アニオン性洗浄剤である、請求項９５に記載の乾燥組成物。
【請求項９７】
核酸ベースの増幅反応を行うのに使用される混合物を形成する方法であって、前記方法が、再構成溶液及び請求項６８〜９７のいずれか一項に記載の乾燥組成物を組み合わせることを含み、前記再構成溶液が、少なくとも１つの無機塩を含む、方法。
【請求項９８】
前記再構成溶液が、１ｍＭ未満の無機塩濃度を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記再構成溶液が、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、塩化物イオン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される無機塩を含む、請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記再構成溶液が、約３．８ｍＭ〜約４．４ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２、約５０ｍＭ〜約８０ｍＭの濃度のＫＣｌ、または両方を含む、請求項９７または９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記再構成溶液が、約０．０１２重量／体積％〜約０．０２０重量／体積％の濃度のメチルパラベン、約０．００６重量／体積％〜約０．０１０重量／体積％の濃度のプロピルパラベン、約０．２０体積／体積％〜約０．３０体積／体積％の濃度の絶対エタノール、またはこれらの組み合わせを含む、請求項９７〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記再構成溶液中の前記メチルパラベンの濃度が、０．０１６重量／体積％である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記再構成溶液中の前記プロピルパラベンの濃度が、０．００８重量／体積％である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記絶対エタノールの濃度が、約０．２６体積／体積％で前記再構成溶液中に存在する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
分子アッセイを行うのに使用される乾燥組成物を調製するための方法であって、（ｉ）請求項１〜６６のいずれか一項に記載の水性溶液を凍結し、これにより前記水性溶液の凍結形態を形成するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの前記凍結形態を凍結乾燥条件に曝露し、これにより乾燥組成物を形成するステップと、を含む、方法。
【請求項１０６】
前記乾燥組成物が、湿潤環境に曝露され、前記湿潤環境の絶対湿度レベルが、１立方メートルの空気当たり２．３グラムの水を上回る、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記湿潤環境が、２５℃の温度を有する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記乾燥組成物が、前記湿潤環境に最大３時間曝露される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
前記乾燥組成物を密封された容器中に保存するステップをさらに含む、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記水性溶液が、単一単位用量である、請求項１０５〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記水性溶液が、マルチウェルプレートのウェル中に存在する、請求項１０５〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
核酸ベースの増幅反応を行うのに使用される乾燥組成物を調製するための方法であって、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の水性溶液を、脱水、乾燥、凍結乾燥、及び噴霧乾燥からなる群から選択される乾燥方法を使用して乾燥させ、これにより乾燥組成物を形成するステップを含む、方法。
【請求項１１３】
乾燥方法が、凍結乾燥であり、前記乾燥組成物が、凍結乾燥組成物である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記乾燥組成物を密封された容器中に保存するステップをさらに含む、請求項１１２〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記水性溶液が、単一単位用量である、請求項１１２〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記水性溶液が、マルチウェルプレートのウェル中に存在する、請求項１１２〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
分子アッセイを行うのに使用されるキットであって、前記キットが、請求項６８〜９６のいずれか一項に記載の乾燥組成物を含有する第１の容器と、再構成溶液を含有する第２の容器と、を含み、前記再構成溶液が、少なくとも１つの無機塩、適切にはＭｇＣｌ２を含む、キット。
【請求項１１８】
前記再構成溶液が、ＭｇＣｌ２を約３．８ｍＭ〜約４．４ｍＭの濃度で含む、請求項１１７に記載のキット。
【請求項１１９】
前記第１の容器が、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートである、請求項１１７または１１８に記載のキット。
【請求項１２０】
前記１つ以上のウェルの各々が、０．３１１％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１２１】
前記第１及び第２の容器が、前記第２の容器から前記第１の容器への前記再構成溶液の自動移送に適したデバイス内に組み込まれている、請求項１１７〜１２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２２】
分子アッセイを行うための混合物の使用であって、前記混合物が、再構成溶液と請求項６８〜９６のいずれか一項に記載の乾燥組成物との組み合わせであり、前記再構成溶液が、少なくとも１つの無機塩を含む、使用。
【請求項１２３】
前記分子アッセイが、マルチプレックス分子アッセイである、請求項１２２に記載の使用。
【請求項１２４】
前記分子アッセイが、核酸増幅アッセイである、請求項１２２または１２３に記載の使用。
【請求項１２５】
前記分子アッセイが、核酸検出アッセイである、請求項１２２または１２３に記載の使用。
【請求項１２６】
前記分子アッセイが、核酸増幅及び検出アッセイである、請求項１２２または１２３に記載の使用。
【請求項１２７】
前記分子アッセイが、核酸シークエンシングアッセイである、請求項１２２または１２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、本明細書に参照により組み込まれる、２０１６年２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／２９１，７７０号の優先権を主張する。
【０００２】
背景
核酸増幅及び／または検出反応を行うための市販キットは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）のような１つ以上のポリメラーゼを含む、酵素、ヌクレオチド、洗浄剤、緩衝液、プライマー、プローブ、ならびにＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、及びＫＣｌを含む、無機塩のような、試薬を含有することが多い（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈ．１，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＰＣＲｓ）。無機塩は、核酸反応混合物の成分の安定化及び核酸ベースの反応の特定のステップを行うのに有用である。しかしながら、これらの同じ塩は、乾燥凍結組成物の安定性及び乾燥性に悪影響を及ぼすので、凍結乾燥及び／または使用前に保存する配合物の望ましくない成分である。
【０００３】
マグネシウムイオンは、ポリメラーゼ及び他の酵素の活性を増加させることが報告されている。塩化カリウムは、核酸ハイブリダイゼーションを促進することが報告されている。マグネシウムを有するものを含む、多数の無機塩は、熱、カオトロピック剤曝露、及び凍結乾燥を含むストレスの様々な条件下でタンパク質を保護することも報告されている（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ（２００７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．５８１：１０４７、Ｋａｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３２７２９、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈ．１，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＰＣＲｓ、Ｍｅｎｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６７、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１６０１、Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ（１９７１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：５７３９、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２７７：４６６３、Ｒｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９５８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：３７４、Ｈｕｓｚａｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：５８０−５８８、Ｗａｎｇ（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２０３：１−６０参照）。
反応混合物中の塩の存在は、酵素の変性を回避するのに必要であると考えられている。しかしながら、凍結乾燥された物質の安定性は、凍結乾燥ケーキ中に存在するいかなる塩によっても影響される。凍結乾燥物質の吸湿性は、ひいては、凍結乾燥物質をパッケージングするのに利用可能な時間に影響を及ぼし、凍結乾燥物質を保存及び輸送することができる継続時間及び条件に影響を及ぼす。凍結乾燥物質の望ましくない再水和は、凍結乾燥成分の活性に悪影響を及ぼす。凍結乾燥物質の望ましくない再水和からの悪影響を最小化するために、こうした物質の長期保存は、通常は冷蔵で行われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈ．１，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＰＣＲｓ
【非特許文献２】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ（２００７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．５８１：１０４７
【非特許文献３】Ｋａｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３２７２９
【非特許文献４】Ｍｅｎｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６７
【非特許文献５】Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１６０１
【非特許文献６】Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ（１９７１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：５７３９
【非特許文献７】Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２７７：４６６３
【非特許文献８】Ｒｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９５８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：３７４
【非特許文献９】Ｈｕｓｚａｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：５８０−５８８
【非特許文献１０】Ｗａｎｇ（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２０３：１−６０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、ポリメラーゼを含有する水性溶液、ならびに／または逆転写酵素、充填剤、洗浄剤、及び有機緩衝液を含む組成物が開示され、水性溶液は、７ｍＭ以下の無機塩濃度を有する。
【０００６】
水性溶液のいくつかの実施形態では、水性溶液は、分子アッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、マルチプレックス分子アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、増幅オリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、検出プローブを含む。いくつかの実施形態では、検出プローブは、オリゴヌクレオチドに共有結合した標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光または化学発光分子である。いくつかの実施形態では、検出プローブは、ＴａｑＭａｎ検出プローブである。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴヌクレオチドは、ヘアピンを形成するように構成される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ヘアピンを形成するように構成されたアダプターを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、標的捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、標的捕捉プローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸に特異的にハイブリダイズする、標的ハイブリダイズ部分を有する。いくつかの実施形態では、分子アッセイは、核酸増幅アッセイを含む。いくつかの実施形態では、分子アッセイは、核酸検出アッセイを含む。いくつかの実施形態では、分子アッセイは、核酸シークエンシングアッセイを含む。いくつかの実施形態では、分子アッセイは、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを含む。
【０００７】
水性溶液のいくつかの実施形態では、充填剤は、トレハロース、ラフィノース、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、充填剤は、約０．１６Ｍ〜約０．３２Ｍの濃度で存在する。
【０００８】
水性溶液のいくつかの実施形態では、無機塩は、約０．０２９ｕｇ／ｕｌ〜約０．３７３ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０２９ｕｇ／ｕｌの塩化ナトリウム〜約０．２９２ｕｇ／ｕｌの塩化ナトリウムを含有する。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０１９ｕｇ／ｕｌの塩化カリウム〜約０．３７３ｕｇ／ｕｌの塩化カリウムを含有する。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．００６ｕｇ／ｕｌのナトリウムイオン〜約０．１１５ｕｇ／ｕｌのナトリウムイオンを含有する。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０１０ｕｇ／ｕｌのカリウムイオン〜約０．１９６ｕｇ／ｕｌのカリウムイオンを含有する。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．００９ｕｇ／ｕｌの塩化物イオン〜約０．３５５ｕｇ／ｕｌの塩化物イオンを含有する。
【０００９】
水性溶液のいくつかの実施形態では、水性溶液は、４ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．２３４ｕｇ〜約０．２９８ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０７１ｕｇ〜約０．２８４ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、３ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．１７５ｕｇ〜約０．２２４ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０５３ｕｇ〜約０．２１３ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、２ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．１１７ｕｇ〜約０．１４９ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０３６ｕｇ〜約０．１４２ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、１ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０５８ｕｇ〜約０．０７５ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０１８ｕｇ〜約０．０７１ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、５００ｕＭ以下の無機塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０２９ｕｇ〜約０．０３７ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．００９ｕｇ〜約０．０３６ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。
【００１０】
水性溶液のいくつかの実施形態では、水性溶液の無機塩濃度は、１ｍＭ未満の塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、水性溶液は、塩化ナトリウムを含有しない。いくつかの実施形態では、水性溶液は、１ｍＭ未満のマグネシウムイオンを含有する。いくつかの実施形態では、水性溶液は、０．１ｍＭ未満のマグネシウムイオンを含有し、適切にはマグネシウムイオンを含有しない。
【００１１】
水性溶液のいくつかの実施形態では、水性溶液は、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰを水性溶液中０．１ｍＭ〜０．３ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、ｄＡＴＰは、水性溶液中０．２ｍＭの濃度である。いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰは、ｄＧＴＰを水性溶液中０．１ｍＭ〜０．３ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、ｄＧＴＰは、水性溶液中０．２ｍＭの濃度である。いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰは、ｄＣＴＰを水性溶液中０．１ｍＭ〜０．３ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、ｄＣＴＰは、水性溶液中０．２ｍＭの濃度である。いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰは、ｄＴＴＰを水性溶液中０．２ｍＭ〜０．６ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰは、ｄＵＴＰを水性溶液中０．２ｍＭ〜０．６ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰは、標識されたｄＮＴＰを含む。
【００１２】
水性溶液のいくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、水性溶液中約０．２０Ｕ／ｕｌ〜約０．７２Ｕ／ｕｌの濃度である。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、水性溶液中、０．２５Ｕ／ｕｌ、０．３０Ｕ／ｕｌ、０．３２Ｕ／ｕｌ、０．４Ｕ／ｕｌ、０．５Ｕ／ｕｌ、０．４５Ｕ／ｕｌ、及び０．７２Ｕ／ｕｌから選択される濃度である。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ホットスタートポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を特異的に阻害する抗体により結合された組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、化学修飾された組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、化学修飾がポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、標識されたｄＮＴＰの核酸伸長反応生成物への組み込みのために修飾される。
【００１３】
水性溶液のいくつかの実施形態では、水性溶液は、逆転写酵素を約０．１Ｕ／ｕｌ〜約０．６Ｕ／ｕｌの濃度で含む。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＡＭＶ逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＭＭＬＶ逆転写酵素である。
【００１４】
水性溶液のいくつかの実施形態では、水性溶液は、ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、約０．１２Ｕ／ｕｌ〜約０．２０Ｕ／ｕｌの濃度で水性溶液中に存在する。
【００１５】
水性溶液のいくつかの実施形態では、水性溶液は、キレート剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、及びエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ´−四酢酸（ＥＧＴＡ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キレート剤は、ＥＤＴＡであり、１．５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度で水性溶液中に存在する。
【００１６】
本明細書では、上述の水性溶液の乾燥形態が開示される。
【００１７】
本明細書では、ポリメラーゼ及び逆転写酵素からなる群から選択される酵素、充填剤、有機緩衝液、ならびに洗浄剤を含む乾燥組成物が開示される。乾燥組成物は、１つ以上の無機塩も含み、１つ以上の無機塩は、乾燥組成物の総質量の０．３５０％以下である質量で乾燥組成物中に存在する。
【００１８】
乾燥組成物のいくつかの実施形態では、１つ以上の無機塩は、乾燥組成物の総質量の約０．３１１％〜約０．０２４％である質量で乾燥組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上の無機塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ならびに塩化ナトリウム及び塩化カリウムの両方からなる群から選択される。
【００１９】
乾燥組成物のいくつかの実施形態では、乾燥組成物は、分子アッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、乾燥組成物は、マルチプレックス分子アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、増幅オリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、検出プローブを含む。いくつかの実施形態では、検出プローブは、オリゴヌクレオチドに共有結合した標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光または化学発光分子である。いくつかの実施形態では、検出プローブは、ＴａｑＭａｎ検出プローブである。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴヌクレオチドは、ヘアピンを形成するように構成される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ヘアピンを形成するように構成されたアダプターを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、標的捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、標的捕捉プローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸に特異的にハイブリダイズする、標的ハイブリダイズ部分を有する。いくつかの実施形態では、分子アッセイは、核酸増幅アッセイを含む。いくつかの実施形態では、分子アッセイは、核酸検出アッセイを含む。いくつかの実施形態では、分子アッセイは、核酸シークエンシングアッセイを含む。いくつかの実施形態では、分子アッセイは、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを含む。
【００２０】
乾燥組成物のいくつかの実施形態では、充填剤は、トレハロース、ラフィノース、またはこれらの組み合わせである。
【００２１】
乾燥組成物のいくつかの実施形態では、乾燥組成物は、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む。
【００２２】
乾燥組成物のいくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ホットスタートポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性を特異的に阻害する抗体に結合された組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、化学修飾された組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、標識されたｄＮＴＰの核酸伸長反応生成物への組み込みのために修飾される。
【００２３】
乾燥組成物のいくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＡＭＶ逆転写酵素であるか、または逆転写酵素は、ＭＭＬＶ逆転写酵素である。
【００２４】
乾燥組成物のいくつかの実施形態では、乾燥組成物は、ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む。
【００２５】
乾燥組成物のいくつかの実施形態では、乾燥組成物は、キレート剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＤＳ、ＤＴＰＡ、及びＭＧＤＡからなる群から選択される。
【００２６】
本明細書では、核酸ベースの増幅反応を行うのに使用される混合物を形成する方法が開示され、その方法は、再構成溶液及び上述の乾燥組成物を組み合わせることを含み、再構成溶液は、少なくとも１つの無機塩を含む。
【００２７】
方法のいくつかの実施形態では、再構成溶液は、１ｍＭ未満の無機塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、再構成溶液は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、塩化物イオン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される無機塩を含む。いくつかの実施形態では、再構成溶液は、約３．８ｍＭ〜約４．４ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含むか、または約５０ｍＭ〜約８０ｍＭの濃度のＫＣｌ、もしくは両方を含む。いくつかの実施形態では、再構成溶液は、再構成された乾燥組成物中に必要なＭｇＣｌ２濃度を超えるＭｇＣｌ２濃度を含む（再構成された乾燥組成物中に必要なＭｇＣｌ２の量は、酵素要件、分子アッセイ要件、及び分子アッセイ最適化結果のような多数の因子に基づいて決定される）。過剰なＭｃＣｌ２を含むこれらの再構成溶液は、普遍的再構成溶液と称される。普遍的再構成溶液は、異なる分子アッセイを行うための様々な成分を含有する乾燥組成物を再構成するのに有用である。例としてのみ、普遍的再構成溶液は、ＭｇＣｌ２を濃度Ｘで含むことができる。乾燥組成物＃１は、０．８Ｘの濃度のＭｇＣｌ２についての要件を有し、乾燥組成物＃２は、０．９５Ｘの濃度のＭｇＣｌ２についての要件を有する。乾燥組成物＃１及び乾燥組成物＃２の両方は、同じ普遍的再構成溶液で再構成され、再構成された乾燥組成物中のＭｇＣｌ２濃度は、キレート剤の使用により所望のレベルまで低減される。好ましくは、乾燥組成物＃１及び＃２は、過剰なＭｇＣｌ２をその後使用される普遍的再構成溶液から隔離するであろう量のキレート剤を含むように（例えば、乾燥前のバルク試薬中で）各々配合される。再構成後、キレート剤は、ＭｇＣｌ２の一部を隔離し、これにより溶液中に所望の濃度（例えば、この例示的な記載についてそれぞれ０．８Ｘ及び０．９５Ｘ）のＭｇＣｌ２のみを自由なままにするであろう。
【００２８】
方法のいくつかの実施形態では、再構成溶液は、約０．０１２重量／体積％〜約０．０２０重量／体積％の質量濃度のメチルパラベンを含むか、または０．００６重量／体積％〜約０．０１０重量／体積％の質量濃度のプロピルパラベンを含むか、または約０．２０体積／体積％〜約０．３０体積／体積％の体積濃度の絶対エタノール、もしくはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、再構成溶液中のメチルパラベンの濃度は、０．０１６重量／体積％である。いくつかの実施形態では、再構成溶液中のプロピルパラベンの濃度は、０．００８重量／体積％である。いくつかの実施形態では、絶対エタノールは、約０．２６体積／体積％で再構成溶液中に存在する。
【００２９】
本明細書では、核酸ベースの増幅反応、核酸ベースの検出反応、核酸ベースのシークエンシング反応、核酸ベースのハイブリダイゼーション反応、及びこれらの組み合わせのような、分子アッセイを行うのに使用される乾燥組成物を調製するための方法が開示される。いくつかの実施形態では、方法は、脱水、乾燥、凍結乾燥、及び噴霧乾燥からなる方法群から選択される乾燥ステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）本明細書に記載されるような水性溶液組成物を凍結し、これにより組成物の凍結形態を形成する乾燥ステップ、及び（ｉｉ）組成物の凍結形態を凍結乾燥条件に曝露し、これにより組成物の乾燥形態を形成する乾燥ステップを含む。いくつかの実施形態では、水性組成物は、凍結乾燥組成物を生成するように凍結乾燥機で乾燥させる。
【００３０】
乾燥組成物は、再構成後の核酸ベースの反応（例えば、増幅及び／または検出反応）に有用である。湿潤環境への長期曝露が行われた乾燥組成物は、驚くべきことに、核酸増幅及び／または検出アッセイにおいて再構成及び使用される場合、ロバストな増幅及び／または検出結果をもたらす。湿潤環境の絶対湿度レベルが１立方メートルの空気当たり２．３グラムの水を上回る、湿潤環境に、最大３時間の時間、好ましくは９０分〜１８０分、好ましくは約９０分、または好ましくは約１８０分の時間曝露させた組成物の乾燥形態は、次に再構成され、核酸増幅及び／または検出アッセイにおいて有用である。特定の実施形態では、乾燥組成物の再構成形態は、乾燥組成物に湿潤環境への曝露が行われても、増幅及び／または検出反応において有用であり、湿潤環境の相対湿度レベルは、最大８時間の時間１０％以下である。特定の実施形態では、乾燥組成物の再構成形態は、乾燥組成物に湿潤環境への曝露が行われても、増幅及び／または検出反応において有用であり、湿潤環境の絶対湿度レベルは、１立方メートルの空気当たり２．３グラムの水、２５℃以下で、最大８時間の時間である。特定の実施形態では、水性バルク試薬は、長時間インキュベートされ、次に水性バルク試薬の全てまたは一部分は、乾燥組成物を形成するように乾燥させ、これは乾燥組成物の再構成後、驚くべきことに、核酸増幅及び／または検出アッセイにおいて使用される場合、ロバストな核酸増幅及び／または検出結果をもたらす。
【００３１】
いくつかの実施形態では、乾燥組成物は、密封された容器中に保存される。いくつかの実施形態では、乾燥組成物は、乾燥組成物を密封された容器中に保存するステップの前に、湿潤環境に曝露され、湿潤環境の絶対湿度レベルは、１立方メートルの空気当たり２．３グラムの水を上回る。いくつかの実施形態では、乾燥前の水性溶液は、乾燥ステップを開始する前に、室温で最大８時間保存される。いくつかの実施形態では、乾燥前の水性溶液は、乾燥ステップを開始する前に、室温で約４５分〜約８時間の時間保存される。いくつかの実施形態では、乾燥組成物は、乾燥組成物を密封された容器中に保存するステップの前に、湿潤環境に曝露され、湿潤環境の相対湿度レベルは、１０％未満である。いくつかの実施形態では、乾燥組成物は、乾燥組成物を密封された容器中に保存するステップの前に、湿潤環境に曝露され、湿潤環境の絶対湿度レベルは、２５℃以下の１立方メートルの空気当たり２．３グラムの水である。いくつかの実施形態では、乾燥水性溶液は、乾燥組成物を密封された容器中に保存するステップの前に、室温で最大８時間保存される。
【００３２】
本明細書では、分子アッセイを行うのに使用されるキットが開示される。いくつかの実施形態では、キットは、核酸ベースの増幅反応を行うためのものである。いくつかの実施形態では、キットは、核酸ベースの検出反応を行うためのものである。いくつかの実施形態では、キットは、核酸ベースのシークエンシング反応を行うためのものである。いくつかの実施形態では、キットは、核酸ベースのハイブリダイゼーション反応を行うためのものである。いくつかの実施形態では、キットは、例えば、核酸ベースの増幅及び検出反応のような、分子アッセイの組み合わせを行うためのものである。いくつかの実施形態では、キットは、容器内に、本明細書に記載されるような乾燥組成物を含む。いくつかの実施形態では、キットは、容器中に、例えば、増幅反応及び／または検出反応のような、分子アッセイにおいて使用される乾燥組成物を再構成するための溶液を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような乾燥組成物を含有する第１の容器、及び約３．８ｍＭ〜約４．４ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２を含む再構成溶液を含有する第２の容器を含む。いくつかの実施形態では、第１の溶液は、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートである。いくつかの実施形態では、１つ以上のウェルの少なくとも１つは、乾燥組成物を含有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のウェルの各々は、乾燥組成物を含有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のウェルのうちの２つ以上は、異なる分子アッセイを行うための乾燥組成物を含有する。この実施形態の１つの態様では、２つ以上のウェル中の各乾燥ペレットは、異なるＭｇＣｌ２濃度要件を有する。さらにこの実施形態のある態様では、異なるＭｇＣｌ２濃度要件を有する各乾燥ペレットは、各分子アッセイに必要な追加のＭｇＣｌ２に等しい、またはこれを上回るＭｇＣｌ２濃度を有する普遍的再構成で構成される。いくつかの実施形態では、１つ以上のウェルの少なくとも１つは、０．３１１％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のウェルの各々は、０．３１１％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する。いくつかの実施形態では、第１の容器は、熱伝導性である、光透過性である、低い自家蛍光をもたらす、またはこれらの組み合わせである、低い透湿度を有する材料で構成される。１つの実施形態では、第１の容器は、容器の開口部を密封するキャップを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、ホイル、プラグ、またはエラストマー物質である。いくつかの実施形態では、キャップは、低い透湿度を有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の容器は、第２の容器から第１の容器への再構成溶液の自動移送に適したデバイス内に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】マグネシウムありまたはなしで凍結乾燥後、様々な温度で乾燥状態で保存された試料において決定された活性を示す。
【図２】凍結乾燥ペレットから回復した活性に対する室温保存時間（凍結乾燥の前のバルク試薬の保存）の影響を示す。バルク試薬は、多数の条件下で保存し、乾燥させ、試料からインフルエンザＡ型を同定する核酸増幅及び検出反応において使用した。
【図３−１】図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃは、ＫＣｌを含まず、ＭｇＣｌ２を含むまたは含まないバルク試薬からなり、室温または氷上で一定時間インキュベートされた乾燥単一単位用量（ＳＵＤ）ペレット組成物の再構成形態を使用して行われる増幅及び検出アッセイについての相対蛍光単位（ＲＦＵ）データを示す、ヒストグラムプロットである。
【図３−２】図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃは、ＫＣｌを含まず、ＭｇＣｌ２を含むまたは含まないバルク試薬からなり、室温または氷上で一定時間インキュベートされた乾燥単一単位用量（ＳＵＤ）ペレット組成物の再構成形態を使用して行われる増幅及び検出アッセイについての相対蛍光単位（ＲＦＵ）データを示す、ヒストグラムプロットである。
【図４】乾燥前のバルク試薬をＭｇＣｌ２の存在または非存在下でインキュベートすることが、その後のインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する核酸マルチプレックス増幅アッセイに対して有する効果を示す、バイオアナライザーゲル様画像である。ＭｇＣｌ２を含まず、次に乾燥させてＭｇＣｌ２を含まない乾燥組成物を生成したバルク試薬に、増幅反応の前にＭｇＣｌ２を添加した。乾燥前のバルク試薬においてＭｇＣｌ２ありでインキュベートされた試薬は、非特異的低分子量増幅（塗抹）を示し、その後意図された核酸標的のより低い増幅効率をもたらすプライマーダイマー及び他のスプリアス事象を示す低分子量副産物の形成を示す。乾燥前のバルク試薬においてＭｇＣｌ２なしでインキュベートされた試薬は、乾燥前のバルク試薬中にＭｇＣｌ２が存在する条件との比較において、より強い別個の標的バンド及び低い副産物形成を示し、ＭｇＣｌ２を除外することによりバルク形成マスターミックスにおける安定性が向上することを示す。レーン１は、マスターミックスにおいて２．５ｍＭのＭｇＣｌ２ありで氷冷プレート上９０分後に得られた結果であり、レーン２は、マスターミックスにおいてＭｇＣｌ２なしで氷プレート上９０分後に得られた結果であり、レーン３は、マスターミックスにおいて２．５ｍＭのＭｇＣｌ２ありで予め冷却したプレート上室温で９０分後に得られた結果であり、レーン４は、マスターミックスにおいてＭｇＣｌ２なしで予め冷却したプレート上室温で９０分後に得られた結果であり、レーン５は、マスターミックスにおいて２．５ｍＭのＭｇＣｌ２ありで氷冷プレート上１８０分後に得られた結果であり、レーン６は、マスターミックスにおいてＭｇＣｌ２なしで氷冷プレート上１８０分後に得られた結果であり、レーン７は、マスターミックスにおいて２．５ｍＭのＭｇＣｌ２ありで室温で１８０分後に得られた結果であり、レーン８は、マスターミックスにおいてＭｇＣｌ２なしで室温で１８０分後に得られた結果である。
【図５】インフルエンザＡ型をマーカーとして使用して、ＭｇＣｌ２を含まないバルク配合物の長期安定性を示す。室温で３．７５及び７．７５時間インキュベートされたバルク試薬の相対蛍光単位（ＲＦＵ）として測定される増幅応答を、新鮮液体対照と比較し、ＭｇＣｌ２がマスターミックスから除外される場合の室温で７．７５時間超のバルク試薬の安定性を確認した。
【図６】フーリエ変換近赤外線（ＦＴ−ｎＩＲ）分光法により５１７０ｃｍ−１（Ａ５１７０）の空間波長で決定される３つの配合物の相対吸光度として測定される凍結乾燥試薬の平均残留水分を示す。
【図７】吸光度として測定される、残留水分に対するＫＣｌ濃度の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
「約」という用語は、組成物の活性または安定性に対していかなる顕著な効果も有さない組成物の成分の量における非実質的なばらつきを示す。
【００３５】
「充填剤」は、乾燥及び保存中のタンパク質及び他の試薬の貯蔵のためのマトリックスをもたらす。（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１０９−１３３）。充填剤は、生成物「ケーキ」または他の構造物を形成するのに使用することができ、乾燥中にタンパク質のバイアルからの損失を防止し、タンパク質安定性を増加させることができる。
【００３６】
キレート剤は、酵素活性に必要なＭｇ２＋イオンまたはＭｎ２＋イオンのような二価イオンを含む、二価イオンを隔離する薬剤である。
【００３７】
「凍結乾燥」、「凍結乾燥された」、及び「凍結−乾燥された」という用語は、乾燥させる材料をまず凍結させた後、氷または凍結溶媒を真空環境において昇華により除去するプロセスを指す。
【００３８】
（「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」を含む）核酸ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェント」という用語は、特定のオリゴヌクレオチドが、試験試料中に存在する他の核酸に対して、その標的核酸とハイブリダイズすることができる条件を指す。これらの条件は、オリゴヌクレオチドのＧＣ含有量及び長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成、ならびに求めるハイブリダイゼーション特異度を含む因子に応じて変化し得ることが理解されるであろう。適切なハイブリダイゼーション条件は、プローブ、増幅オリゴヌクレオチド、標的捕捉オリゴヌクレオチド、阻害剤、及び他のオリゴヌクレオチドの技術分野において周知であり、配列組成に基づいて予測され得、または日常的な試験方法を使用することにより決定され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１、及び１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７、及び１１．５５−１１．５７）。
【００３９】
増幅オリゴマーは、標的核酸のテンプレート依存性複製を支持することができるプライマーまたはプロモータープライマーである。増幅オリゴマー対は、テンプレートの対向鎖のテンプレート依存性複製を支持するこうしたオリゴマーの対である。マルチプレックス増幅は、複数の増幅オリゴマー対で同時に行われる増幅である。
【００４０】
プローブは、増幅産物にハイブリダイズして増幅産物の存在または量を明らかにすることができるオリゴヌクレオチドである。こうしたプローブは、蛍光または他の検出可能なシグナルをもたらす分子を組み込むことが多く、この場合それらは検出可能に標識されたプローブと称される。
【００４１】
プライマー−プローブセットは、テンプレート核酸から増幅産物を生成及びテンプレート核酸から増幅産物を検出するために構成されたプライマー及びプローブの組み合わせである。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「標識」とは、検出可能であるか、または検出可能なシグナルをもたらす、プローブまたはｄＮＴＰに直接または間接的に結合した部分または化合物を指す。直接標識は、共有結合または非共有結合相互作用、例えば、水素結合、疎水性及びイオン性相互作用、またはキレートもしくは配位錯体の形成を含む、標識をプローブに連結する結合または相互作用を通して起こり得る。間接標識は、直接または間接的のいずれかで標識され、検出可能なシグナルを増幅し得る、結合対メンバー、抗体、または追加のオリゴマーのような、架橋部分または「リンカー」の使用を通して起こり得る。標識は、放射性核種、配位子（例えば、ビオチン、アビジン）、酵素もしくは酵素基質、反応性基、またはクロモフォア（例えば、検出可能な色を与える色素、粒子、もしくはビーズ）、発光化合物（例えば、生物発光、リン光、もしくは化学発光標識）、もしくはフルオロフォアのような、いずれかの検出可能な部分を含む。標識は、混合物中の結合標識プローブが、非結合標識プローブとは異なる検出可能な変化、例えば、不安定性または段階的分解特性を示す、均一系アッセイにおいて検出可能であり得る。合成ならびに標識を核酸に付着及び標識を検出する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９），Ｃｈａｐｔｅｒ  １０、米国特許第５，６５８，７３７号、５，６５６，２０７号、５，５４７，８４２号、５，２８３，１７４号、及び４，５８１，３３３号）。２つ以上の標識、及び２つ以上のタイプの標識は、特定のプローブ上に存在し得るか、または検出は、各プローブが、検出可能なシグナルを生成する化合物で標識される、プローブの混合物を使用し得る（例えば、米国特許第６，１８０，３４０号及び６，３５０，５７９号）。
【００４３】
「再構成時間」とは、乾燥配合物を溶液で再水和して溶液をもたらすのに必要な時間である。好ましいが、必ずしも配合物に依存せず、再構成溶液は、肉眼には粒子も濁りも含まないものである。
【００４４】
相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、増幅産物、及び暗に増幅産物を生じさせる試料中の核酸分析物の尺度である。
【００４５】
Ｃｔとは、リアルタイムＰＣＲにおいて対数期に到達するのに必要であったサイクル数を指す。Ｃｔは、試料中の分析物の量に逆相関する。
【００４６】
陽性とは、アッセイ反応結果に言及する場合、試料から生成され、（ＲＦＵ値のような）閾値を超えた実験データを指す。閾値は、ユーザーにより設定され、典型的には、所定のアッセイについて得られた経験的データに基づいて決定される。典型的には核酸増幅アッセイについて、閾値は、陽性試料が閾値を超え、アッセイの対数増殖期に入ったように設定される。陽性値とは、閾値を超えた単一の試料または閾値を超えた複数の試料の百分率を指す。例えば、複数の試料が１２の試料である場合、かつ超える試料の数が６であると決定された場合、陽性は「５０％」である。閾値は、バックグラウンド値を除外するように設定されることが多い。
【００４７】
「単一単位用量」または「ＳＵＤ」とは、単一試料に分子アッセイを行うのに使用される反応混合物の体積を指す。単一単位用量は、液体形態または乾燥形態であり得る。例として、単一単位用量は、単一容器中の単一試料の増幅に有用な試薬を含有する乾燥ペレットであり得る。
【００４８】
ＬＯＤとは、分析物の検出限界である。ＬＯＤ＋１とは、ユーザーが検出したＬＯＤ＋１対数である。換言すると、ＬＯＤ＋１とは、ＬＯＤである分析物の数の１０倍である。
【００４９】
本明細書における値の範囲は、その中の全ての全数及び、実用的な場合、その中の全ての部分数を含む。例えば、ｐＨ２．０〜ｐＨ５．０のｐＨ値の範囲は、その中の全ての全数及び部分数を含み、２３〜３０の連続ヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドについての長さ範囲は、その中の全ての全数のみを含むであろう。
【００５０】
開示が特定の成分を含む組成物に言及するときはいつでも、開示は、特定の成分からなるか、または本質的にそれらからなる組成物も開示するものと理解されるべきである。
【００５１】
（詳細な説明）
Ｉ．一般
本開示は、核酸増幅のような分子アッセイを行うための従来の凍結乾燥キットの不安定性が無機塩の存在によるものであるという見識にある程度基づいている。これらの塩は、乾燥の前、その間、及びその後に、望ましくないハイブリダイゼーション産物または他の副産物をもたらし得る。これらの塩はまた、乾燥組成物を、組成物がその周囲環境から水を吸収するように、吸湿性にする。よって、乾燥組成物中の含塩量のために、湿気への限られた曝露、冷蔵もしくは急速冷凍保存、及び／または乾燥剤の存在下での保存が必要である。水及び塩の存在は、乾燥組成物のポリメラーゼ成分に活性を早期に喪失させ、また核酸の互いへのハイブリダイゼーションを促進し得る。塩の存在はまた、例えば、凍結乾燥により、乾燥試薬を調製する能力を低減し得る。逆に、酵素含有組成物中の塩の非存在は、酵素成分の変性をもたらすことが知られ、よってこれらの酵素の塩を含まない組成物も望ましくない。本開示は、本質的には無機塩を含まないバルク試薬からの核酸ベースの反応混合物を処理するためのバルク試薬を乾燥させることにより、これらの問題を克服した。こうした塩は、乾燥組成物の再構成後に供給される。ポリメラーゼの安定性には無機塩が必要であるという予想とは対照的に、本質的には無機塩を含まずに乾燥させた核酸ベースの反応混合物は、再構成に対する活性を完全または実質的に保持しながら、氷点より高く長期保存することができることが見出された。
【００５２】
ＩＩ．バルク試薬及び乾燥ペレット。
本開示に従った（予め凍結乾燥させた混合物、溶液、水性溶液、または組成物と称されることがある）バルク試薬は、典型的には、ポリメラーゼ、核酸ベースの増幅反応に使用されるヌクレオチド、有機緩衝液、好ましくはトリス、及びトレハロースもしくはラフィノース、またはこれらの組み合わせのような充填剤を含む。バルク試薬は、１つ以上の核酸を含んでも含まなくてもよい。バルク試薬は、逆転写酵素、キレート剤、及びＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含んでよい。バルク試薬という用語は、上述されるような水性溶液を指して使用され、水性溶液は、実質的には同じ濃度の試薬を有する２つ以上のアリコートに分けられるであろう。また、バルク試薬の分別部分を、バルク試薬と称してよい。文脈にかかわらず、バルク試薬は、本明細書に記載されるような水性溶液である。
【００５３】
こうしたバルク試薬は、本質的には無機塩を含まず、個別的及び集合的な無機塩の濃度が、７ｍＭ未満、及び好ましくは１ｍＭ未満であることを意味する。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満、または０．０５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満、または０．０５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｋ＋の濃度は、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満、または０．０５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｃｌ−の濃度は、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満、または０．０５ｍＭ未満である。
【００５４】
好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満である。
【００５５】
好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満である。
【００５６】
好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．０５ｍＭ未満である。
【００５７】
好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満である。
【００５８】
好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．０５ｍＭ未満である。
【００５９】
好ましくは、Ｋ＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｋ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｋ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｋ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．０５ｍＭ未満である。
【００６０】
好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満である。
【００６１】
好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｎａ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．０５ｍＭ未満である。
【００６２】
好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．０５ｍＭ未満である。
【００６３】
好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．０５ｍＭ未満である。
【００６４】
好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．５ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．１ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．１ｍＭ未満である。好ましくは、Ｍｇ２＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｎａ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｋ＋の濃度は、０．０５ｍＭ未満であり、Ｃｌ−の濃度は、０．０５ｍＭ未満である。
【００６５】
増幅反応への組み込みのためのヌクレオチドは、典型的にはｄＮＴＰとして提供される。ｄＮＴＰについての例示的な濃度は、０．１〜０．３ｍＭのｄＡＴＰ、０．１〜０．３ｍＭのｄＧＴＰ、０．１〜０．３ｍＭのｄＣＴＰ、０．２〜０．６ｍＭのｄＴＴＰ、０．２〜０．６ｍＭのｄＵＴＰ、ならびに好ましくは約０．２ｍＭのｄＡＴＰ、約０．２ｍＭのｄＧＴＰ、約０．２ｍＭのｄＣＴＰ、及び０．４ｍＭのｄＴＴＰまたはｄＵＴＰである。増幅反応への組み込みのためのヌクレオチドは、シークエンシング反応に有用であるような、標識ｄＮＴＰとしても提供することができる。
【００６６】
こうした混合物は、酵素及び他の成分の選択により、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、及び転写媒介性増幅を含む異なるタイプの増幅についてカスタマイズすることができる。
【００６７】
ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、市販されているか、またはユーザーにより調製され得る。ポリメラーゼ酵素の１つの例は、Ｑｉａｇｅｎから市販されているＴａｑポリメラーゼ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ｃａｔ＃２０１２０３）である。Ｔａｑポリメラーゼの別の例は、ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇ２  Ｆｌｅｘｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ｃａｔ＃Ｍ７８０１）として市販されている。市販されている他のＤＮＡポリメラーゼとしては、これらに限定されないが、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ｃａｔ＃１１４８００２２００１）、及びＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ｃａｔ＃Ｍ０５３０Ｓ）のようなキメラＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。同様に市販されているのは、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ酵素である。例えば、Ｔａｑポリメラーゼは、ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ＃Ｍ５００１）として市販されている。ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｔａｑポリメラーゼが、ポリメラーゼ活性を遮断する抗体に結合される、抗体媒介性ホットスタート酵素である。遮断抗体は高熱を使用して変性され、よってＰＣＲ反応の初期加熱ステップ中、抗体は変性され、ポリメラーゼ活性は回復される。様々な抗体を、ホットスタート法、例えば、ＴＡＱＳＴＡＲＴ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ｃａｔ＃Ｒ０２８Ａ）と共に使用することができる。同様に、化学媒介性ホットスタートポリメラーゼを含む、他のホットスタートポリメラーゼ酵素が利用可能である。同等のポリメラーゼ及び抗体は、様々な商業的供給源から入手可能であり、あるいは、ユーザーにより調製され得る。
【００６８】
逆転写酵素は、市販されているか、またはユーザーにより調製され得る。市販されている逆転写酵素の例としては、これらに限定されないが、ＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ｃａｔ＃２８０２５−０１３及び１８０８０−０４４）、ＭＭＬＶ  ＲＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｃａｔ＃Ｍ１３０２）、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ｃａｔ＃Ｍ０２７７Ｓ）、ならびにＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ＃Ａ５０００３）が挙げられる。ＧｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素は、定量的ＰＣＲ増幅について最適化された一本鎖ｃＤＮＡの合成のための逆転写酵素及び試薬のセットを含む。同等の逆転写酵素及び試薬は、様々な商業的供給源から入手可能であり、あるいは、ユーザーにより調製され得る。
【００６９】
単一単位用量中のＤＮＡポリメラーゼ酵素についての例示的な濃度は、０．０１〜１．０Ｕ／ｕｌである。例えば、０．３２Ｕ／ｕｌ、または０．４Ｕ／ｕｌ、または０．７２Ｕ／ｕｌ、または０．３２〜０．４Ｕ／ｕｌ、または０．４〜０．７２Ｕ／ｕｌ、または０．０５〜０．３Ｕ／ｕｌ、または０．８〜１．０Ｕ／ｕｌである。ＤＮＡポリメラーゼの１単位は、７４℃で３０分での１０ナノモルのｄＮＴＰの酸不溶性材料への組み込みを触媒するのに必要な酵素の量として定義される。単一単位用量中の逆転写酵素の例示的な濃度は、０．０１Ｕ／ｕｌ〜１．０Ｕ／ｕｌである。逆転写酵素の１単位は、３７℃で１０分での１ｎｍｏｌのデオキシヌクレオチドの酸沈殿性材料への転移を触媒するのに必要な酵素の量として定義される。
【００７０】
好ましい有機緩衝液は、トリスである。本開示のバルク試薬に組み込むことができる代替の有機緩衝液としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ＣＨＥＳ、ヒスチジン、ならびにＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、トリシン、及びグリシンアミドのような、Ｇｏｏｄの緩衝液、ならびに緩衝液の組み合わせが挙げられる。他の有機緩衝液としては、コハク酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、リン酸塩、等が挙げられる。好ましい緩衝液は、約５．５〜約７．０または約６．０〜約７．５のｐＨ範囲、好ましくは約６．５のｐＨで効果的である。ｐＨをこの範囲中に制御する緩衝液の例としては、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、及び他の有機酸緩衝液が挙げられる。
【００７１】
好ましい充填剤は、トレハロース、またはラフィノース、またはこれらの組み合わせである。使用することができる他の充填剤としては、スクロース、マンニトール、トレハロースとマンニトール、スクロースとマンニトール、スクロースとグリシン、及びヒドロキシエチルデンプンが挙げられる。Ｃｌｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９０：３１０、Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．３８：２９、Ｗｅｂｂ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９２：７１５、Ｇａｒｚｏｎ  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：６８４、Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．４３７：５１、Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ−Ｗｏｌｔｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｐｏｌｙｍｅｒ．３８：６２３５  ６２４２を参照されたい。ヒドロキシエチルデンプンは、ヘタスターチ、ヘキサスターチ、ペンタスターチ、及びテトラスターチとして分類される（例えば、ＣｈｏｗのＷＯ２０１４／０９９１９８参照）。充填剤は、好ましくは０．１６Ｍ〜０．３２Ｍの濃度で、またはあるいは、０．０４〜０．１２Ｍ、０．０８〜０．１６Ｍ、０．１２〜０．２０Ｍ、０．１６〜０．２４Ｍ、０．２０〜０．２８Ｍ、０．２４〜０．３２Ｍ、０．２８〜０．３６Ｍ、０．３２〜０．４０Ｍ、もしくは上記範囲のいずれかの組み合わせ、例えば、０．０８〜０．２４Ｍで存在する。
【００７２】
バルク試薬は、例えば、増幅オリゴマー（例えば、プライマー、Ｔ７プロモーターオリゴヌクレオチド）、捕捉プローブ、検出プローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、ヘアピン検出プローブ、アダプター、ヘアピンアダプター、陽性対照テンプレート、及び陰性対照テンプレートのような、１つ以上の核酸を含み得る。
【００７３】
バルク試薬の任意の追加成分としては、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＰＣＲ試薬、洗浄剤、双性イオン性洗浄剤、アニオン性洗浄剤、カチオン性洗浄剤、非イオン性洗浄剤、界面活性剤、プライマー、プローブ、テンプレート、キレート剤、メチルパラベン、及びプロピルパラベンが挙げられる。メチルパラベンについての例示的な濃度は、０．０１〜０．０２４重量％、例えば約０．０１６％、またはあるいは、約０．０１０％、約０．０１４％、約０．０１６％、約０．０２０％、約０．０２４％、及びこれらの値を限界とするいずれかの範囲である。プロピルパラベンの例示的な濃度範囲は、０．００２〜０．０１６％もしくは０．００８％、またはあるいは、約０．００２％、約０．００４％、約０．００６％、約０．００８％、約０．０１０％、約０．０１２％、約０．０１４％、約０．０１６％、またはこれらの値を限界とするいずれかの範囲である。１単位は、５ｎｇのリボヌクレアーゼＡの活性を５０％阻害するのに必要なＲＮａｓｉｎ（登録商標）Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの量として定義される。活性は、リボヌクレアーゼＡによるシチジン２’，３’−環状一リン酸の加水分解の阻害により測定される。
【００７４】
キレート剤は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＥＤＤＳ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸）、ＭＧＤＡ（メチルグリシン二酢酸）、及びＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）のうちの１つ以上を含む。キレート剤についての例示的な濃度は、１．０ｍＭ〜２．５ｍＭである。
【００７５】
ＲＮａｓｅ阻害剤タンパク質は、天然及び組換えがあり、ＲＮａｓｅに１：１比で非共有結合することによりＲＮａｓｅＡファミリー及びヒト胎盤ＲＮａｓｅを阻害する５０ｋＤａタンパク質である。Ｂｏｔｅｌｌａ−Ｅｓｔｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２７８、Ｐｏｌａｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）ＥＸＳ．６１：４２８を参照されたい。ＲＮａｓｅ阻害剤タンパク質は、組換えまたは天然タンパク質のいずれかであり得る。ＲＮａｓｅ阻害剤の例示的な濃度は、約０．０４Ｕ／ｕｌ〜約０．４Ｕ／ｕｌである。
【００７６】
バルク試薬は、洗浄剤を低濃度で含有することができる。洗浄剤としては、多数の商業的供給元（例えば、Ｇｅｎｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能なイオン性（カチオン性またはアニオン性）、非イオン性、及び双性イオン性洗浄剤が挙げられる。例としては、これらに限定されないが、ラウリル硫酸リチウム、塩酸アンプロリウム、塩化ベンザルコニウム、コリンｐ−トルエンスルホナート塩、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート、臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムｐ−トルエンスルホナート、Ｌｕｖｉｑｕａｔ（商標）、塩化メチルベンゼトニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−タロウ−１，３−ジアミノプロパン液体、臭化オキシフェノニウム、臭化テトラヘプチルアンモニウム、臭化テトラキス（デシル）アンモニウム、塩化トリカプリリルメチルアンモニウム、アミドスルホベタイン−１６、塩化トリドデシルメチルアンモニウム、臭化トリメチルオクタデシルアンモニウム、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ−８０（登録商標）、Ｂｒｉｊ−３５（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）が挙げられる。
【００７７】
バルク試薬の例示的な体積としては、約１ｕｌ、約５ｕｌ、約１０ｕｌ、約２０ｕｌ、約２４ｕｌ、約５０ｕｌ、約１００ｕｌ、約２００ｕｌ、約３００ｕｌ、約４００ｕｌ、約５００ｕｌ、約６００ｕｌ、約７００ｕｌ、約８００ｕｌ、約９００ｕｌ、約１，０００ｕｌ（１ｍＬ）、約２ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約２０ｍＬ、約５０ｍＬ、等が挙げられる。単一単位用量の例示的な体積は、約１ｕｌ〜約１ｍＬを含む。再構成乾燥組成物は、乾燥組成物を形成するのに使用されるのと同じ液体体積で、より低い体積で、またはより大きな体積で形成することができる。より低い体積は、バルク試薬に対して、約９０％、約８０％、約６０％、約４０％、約２０％、約１０％、または約５％であり得る。より大きな体積は、バルク試薬の約１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％（２倍）、約４倍、約６倍、約８倍、約１０倍、約２０倍であり得る。
【００７８】
分析される試料はバルク試薬に、再構成の前、再構成と同時、または再構成の後のいずれかに添加することができる。好ましい実施形態では、再構成後の乾燥組成物全体は、試料と組み合わせるのに使用され、ここで再構成溶液／試料の相対体積は、例えば、約９．９／０．１、９．８／０．２、９．５／０．５、９／１、８／２、７／３、６／４、５／５、等であり得る。
【００７９】
特に指定のない限り、バルク試薬中の試薬の濃度は、例えば、０．０％（試薬抜き）、０．００１％、０．００４％、０．００８％、０．００１２％、０．００１６％、０．００２０％、０．００３０％、０．００４０％、０．００５０％、０．００６０％、０．００８０％、０．０１％、０．０２％、０．０４％、０．０６％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．８％、１％、２％、３％、４％、５％、等であり得る。「約」上記濃度の、上記濃度を下回る、上記濃度を上回る、及び上記濃度のうちのいずれか２つを含む範囲の試薬も提供される。
【００８０】
例示的なバルク試薬組成物は、０．１〜０．３ｍＭ及びより好ましくは０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、ならびに０．２〜０．６ｍＭ及びより好ましくは０．４ｍＭのｄＵＴＰまたはｄＴＴＰ、ならびに０．３〜０．８Ｕ／μＬのポリメラーゼを有する。いくつかの組成物では、ポリメラーゼは、ホットスタートＴａｑポリメラーゼである。いくつかの組成物では、ポリメラーゼは、ＧｏＴａｑ（登録商標）ＭＤｘ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。いくつかの組成物はまた、ＲＮＡｓｉｎ（登録商標）ＲＮＡａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを０．１２〜０．２０Ｕ／μＬで含む。いくつかの組成物はまた、ＥＤＴＡを、任意で１．５〜２．０ｍＭで含む。こうした組成物はまた、トレハロースを０．１６〜０．３２Ｍで、ＥＤＴＡを１．５〜２．０ｍＭで含み、ポリメラーゼは、０．３〜０．４５Ｕ／μＬのＴａｑである。
【００８１】
本開示は、リアルタイムＰＣＲ反応を含む、ＰＣＲ反応のための試薬を提供する。（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２０１４）、Ｋｕｔｙａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：６５５、Ａｆｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．３２：９４０）。リアルタイムＰＣＲでは、マグネシウム塩は、典型的には最終濃度３〜６ｍＭで使用される（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、上記）。いくつかの実施形態では、本開示は、マルチプレックスＰＣＲ反応のための試薬を提供し、すなわち、複数のプライマー対が、複数の標的の増幅及び検出のために提供される。本開示は、ＰＣＲ反応のためのプライマー及びプローブを提供する。プライマー及び／またはプローブは、標的ハイブリダイズ配列を含み、非標的ハイブリダイズ配列、ヌクレオチド類似体、検出可能部分、及び非ヌクレオチドリンカーのうちの１つ以上をさらに含むことができる（例えば、ＷＯ２０１０／１５１５６６及びＷＯ２０１３／１２６７９３参照）。サーモサイクラーが利用可能である（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰｒｏＦｌｅｘ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ及びＶｅｒｉｔｉ（登録商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ）。ＰＣＲ産物を定量化するためのゲルスキャナーが利用可能である（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）。
【００８２】
バルク試薬の形成後、これは乾燥前に室温でかなりの期間放置され得る。期間は、乾燥ステップが開始される前の最大８時間、またはあるいは、乾燥ステップが開始される前の、最大１時間、最大２時間、最大４時間、最大６時間、最大１０時間、最大１２時間、最大１４時間であり得る。バルク試薬中に塩を含むことは、このインキュベーション期間中に望ましくないハイブリダイゼーション産物及び他の副産物をもたらす。こうした望ましくないハイブリダイゼーション及び副産物は、本開示に従って、７ｍＭ以下の無機塩濃度を有する、例えば、本質的には無機塩を含まないバルク試薬組成物を形成することにより、低減または排除される。
【００８３】
バルク試薬中の無機塩の存在は、下記の望ましくない特性のうちの１つ以上をもたらす。核酸は、共にハイブリダイズし得、ハイブリダイゼーションは、カリウム、ナトリウム、マンガン、マグネシウム、及び／または塩化物のような無機塩の存在により刺激される。またマンガン及びマグネシウムのような無機塩の存在下では、ポリメラーゼ処理能力及び／または三リン酸塩の枯渇のような、望ましくない酵素活性が発生し得る。こうした望ましくない活性は、非ホットスタート酵素及びホットスタート酵素で発生し得る。塩の存在下での核酸ハイブリダイゼーション及び酵素活性の結果として、望ましくない副産物の形成が開始され得る。さらに、無機塩は、吸湿性であり、水分を乾燥ペレットに引き込むであろう。乾燥ペレットの再水和は、保存安定性、酵素安定性を低減し、追加のスプリアスな副産物形成を可能にする。
【００８４】
乾燥ペレットは、１つの単一単位用量（ＳＵＤ）、または任意で、２つ以上のＳＵＤをもたらすように試薬を含有することができる。単一単位用量は、単一試料のみで増幅及び／または検出反応を行うのに必要な試薬の集合である。単一単位用量とは、液体試薬または乾燥ペレットを指し得る。本明細書で言及されるような、単一単位用量が、単一試料で増幅及び／または検出反応を行うのに必要な試薬の全てを含有する必要はないことに注目すべきである。単一単位用量は、増幅及び／または検出反応を行うのに必要な試薬が不足し得る。同様に、単一単位用量は、増幅及び／または検出反応を行うには不十分な量の試薬を含有し得る。例としてのみ、乾燥単一単位用量ペレットは、増幅反応を行うのに十分な単位のＴａｑポリメラーゼを含み得るが、マグネシウムを含まない場合がある。特定の実施形態では、ＥＤＴＡは、ペレット中に存在し得るか、または再構成溶液により添加され得る過剰な二価イオン（例えば、マグネシウム及び／またはマンガン）をキレート化するように、乾燥単一単位用量ペレットに添加され得る。このような例では、マグネシウム及び／またはマンガンはその後、乾燥単一単位用量ペレットに、例えば再構成溶液により、添加することができる。また例としてのみ、乾燥単一単位用量は、増幅反応を行うには不十分な量のｄＮＴＰを含み得る。このような例では、ｄＮＴＰの残部は、乾燥単一単位用量ペレットに、例えば再構成溶液により、添加することができる。これらの例は非限定的であるので、本開示を把握する当業者であれば、ＳＵＤ及び乾燥ペレットＳＵＤを様々な組成で容易に生成するであろう。
【００８５】
好ましい実施形態では、バルク試薬は、７ｍＭ以下の無機塩含有量、より好ましくは６ｍＭ以下の無機塩含有量、より好ましくは５ｍＭ以下の無機塩含有量、より好ましくは４ｍＭ以下の無機塩含有量、より好ましくは３ｍＭ以下の無機塩含有量、より好ましくは２ｍＭ以下の無機塩含有量、より好ましくは１ｍＭ以下の無機塩含有量、より好ましくは５００ｕＭ以下の無機塩含有量を含む。よってバルク試薬中の無機塩の好ましい濃度範囲は、約０ｍＭ〜７ｍＭの無機塩含有量である。バルク試薬中の無機塩の別の好ましい濃度範囲は、約０ｍＭ〜６ｍＭの無機塩含有量である。バルク試薬中の無機塩の別の好ましい濃度範囲は、約０ｍＭ〜７ｍＭの無機塩含有量である。バルク試薬中の無機塩の別の好ましい濃度範囲は、約０ｍＭ〜４ｍＭの無機塩含有量である。バルク試薬中の無機塩の別の好ましい濃度範囲は、約０ｍＭ〜３ｍＭの無機塩含有量である。バルク試薬中の無機塩の別の好ましい濃度範囲は、約０ｍＭ〜２ｍＭの無機塩含有量である。バルク試薬中の無機塩の別の好ましい濃度範囲は、約０ｍＭ〜１ｍＭの無機塩含有量である。バルク試薬中の無機塩の別の好ましい濃度範囲は、約０ｍＭ〜０．５ｍＭの無機塩含有量である。増幅及び検出反応混合物のための一般的な無機塩は、数例を挙げれば、ナトリウム、カリウム、マンガン、マグネシウム、及び塩化物のうちの１つ以上を含む。
【００８６】
１つの態様では、バルク試薬は、５ｍＭ以下の無機塩を含み、無機塩は、０．３７３ｕｇ／ｕｌ以下、または０．３３２ｕｇ／ｕｌ以下、または０．２９２ｕｇ／ｕｌ以下のマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、５ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．２９２ｕｇ／ｕｌ以下、０．１４６ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、５ｍＭ以下の無機塩を含み、ナトリウムは、０．１１５ｕｇ／ｕｌ以下、０．０５７ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、５ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化カリウムは、０．３７３ｕｇ／ｕｌ以下、０．１８６ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、５ｍＭ以下の無機塩を含み、カリウムは、０．１９６ｕｇ／ｕｌ以下、０．０９８ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、５ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化物は、０．３５５ｕｇ／ｕｌ以下、０．１７８ｕｇ／ｕｌ以下、０．０８９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【００８７】
別の態様では、バルク試薬は、５ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．２９２ｕｇ／ｕｌ以下、０．１４６ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、ナトリウムは、０．１１５ｕｇ／ｕｌ以下、０．０５７ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化カリウムは、０．３７３ｕｇ／ｕｌ以下、０．１８６ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、カリウムは、０．１９６ｕｇ／ｕｌ以下、０．０９８ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化物は、０．３５５ｕｇ／ｕｌ以下、０．１７８ｕｇ／ｕｌ以下、０．０８９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【００８８】
さらなる態様では、乾燥ペレットは、５ｍＭ以下の無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．３１１％以下、０．２７７％以下、または０．２４４％以下である。さらなる態様では、０．３１１％以下、０．２７７％以下、または０．２４４％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する容器が提供される。さらなる態様では、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、０．３１１％以下、０．２７７％以下、または０．２４４％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する。
【００８９】
１つの態様では、バルク試薬は、４ｍＭ以下の無機塩を含み、無機塩は、０．２９８ｕｇ／ｕｌ以下、または０．２６６ｕｇ／ｕｌ以下、または０．２３４ｕｇ／ｕｌ以下のマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、４ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．２３４ｕｇ／ｕｌ以下、０．１１７ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、４ｍＭ以下の無機塩を含み、ナトリウムは、０．０９２ｕｇ／ｕｌ以下、０．０４６ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、４ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化カリウムは、０．２９８ｕｇ／ｕｌ以下、０．１４９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、４ｍＭ以下の無機塩を含み、カリウムは、０．１５６ｕｇ／ｕｌ以下、０．０７８ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、４ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化物は、０．２８４ｕｇ／ｕｌ以下、０．１４２ｕｇ／ｕｌ以下、０．０７１ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【００９０】
別の態様では、バルク試薬は、４ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．２３４ｕｇ／ｕｌ以下、０．１１７ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、ナトリウムは、０．０９２ｕｇ／ｕｌ以下、０．０４６ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化カリウムは、０．２９８ｕｇ／ｕｌ以下、０．１４９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、カリウムは、０．１５６ｕｇ／ｕｌ以下、０．０７８ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化物は、０．２８４ｕｇ／ｕｌ以下、０．１４２ｕｇ／ｕｌ以下、０．０７１ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【００９１】
さらなる態様では、乾燥ペレットは、４ｍＭ以下の無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．２４９％以下、０．２２２％以下、または０．１９５％以下である。さらなる態様では、０．２４９％以下、０．２２２％以下、または０．１９５％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する容器が提供される。さらなる態様では、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、０．２４９％以下、０．２２２％以下、または０．１９５％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する。
【００９２】
１つの態様では、バルク試薬は、３ｍＭ以下の無機塩を含み、無機塩は、０．２２４ｕｇ／ｕｌ以下、または０．１９９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．１７５ｕｇ／ｕｌ以下のマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、３ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．１７５ｕｇ／ｕｌ以下、０．０８８ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、３ｍＭ以下の無機塩を含み、ナトリウムは、０．０６９ｕｇ／ｕｌ以下、０．０３４ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、３ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化カリウムは、０．２２４ｕｇ／ｕｌ以下、０．１１２ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、３ｍＭ以下の無機塩を含み、カリウムは、０．１１７ｕｇ／ｕｌ以下、０．０５９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、３ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化物は、０．２１３ｕｇ／ｕｌ以下、０．１０７ｕｇ／ｕｌ以下、０．０５３ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【００９３】
別の態様では、バルク試薬は、３ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．１７５ｕｇ／ｕｌ以下、０．０８８ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、ナトリウムは、０．０６９ｕｇ／ｕｌ以下、０．０３４ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化カリウムは、０．２２４ｕｇ／ｕｌ以下、０．１１２ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、カリウムは、０．１１７ｕｇ／ｕｌ以下、０．０５９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化物は、０．２１３ｕｇ／ｕｌ以下、０．１０７ｕｇ／ｕｌ以下、０．０５３ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【００９４】
さらなる態様では、乾燥ペレットは、３ｍＭ以下の無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．１８６％以下、０．１６６％以下、または０．１４６％以下である。さらなる態様では、０．１８６％以下、０．１６６％以下、または０．１４６％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する容器が提供される。さらなる態様では、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、０．１８６％以下、０．１６６％以下、または０．１４６％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する。
【００９５】
１つの態様では、バルク試薬は、２ｍＭ以下の無機塩を含み、無機塩は、０．１４９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．１３３ｕｇ／ｕｌ以下、または０．１１７ｕｇ／ｕｌ以下のマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、２ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．１１７ｕｇ／ｕｌ以下、０．０５８ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、２ｍＭ以下の無機塩を含み、ナトリウムは、０．０４６ｕｇ／ｕｌ以下、０．０２３ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、２ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化カリウムは、０．１４９ｕｇ／ｕｌ以下、０．０７５ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、２ｍＭ以下の無機塩を含み、カリウムは、０．０７８ｕｇ／ｕｌ以下、０．０３９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、２ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化物は、０．１４２ｕｇ／ｕｌ以下、０．０７１ｕｇ／ｕｌ以下、０．０３６ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【００９６】
別の態様では、バルク試薬は、２ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．１１７ｕｇ／ｕｌ以下、０．０５８ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、ナトリウムは、０．０４６ｕｇ／ｕｌ以下、０．０２３ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化カリウムは、０．１４９ｕｇ／ｕｌ以下、０．０７５ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、カリウムは、０．０７８ｕｇ／ｕｌ以下、０．０３９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化物は、０．１４２ｕｇ／ｕｌ以下、０．０７１ｕｇ／ｕｌ以下、０．０３６ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【００９７】
さらなる態様では、乾燥ペレットは、２ｍＭ以下の無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．１２４％以下、０．１１１％以下、または０．０９７％以下である。さらなる態様では、０．１２４％以下、０．１１１％以下、または０．０９７％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する容器が提供される。さらなる態様では、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、０．１２４％以下、０．１１１％以下、または０．０９７％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する。
【００９８】
１つの態様では、バルク試薬は、１ｍＭ以下の無機塩を含み、無機塩は、０．０７５ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０６６ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０５８ｕｇ／ｕｌ以下のマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、１ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．０５８ｕｇ／ｕｌ以下、０．０２９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、１ｍＭ以下の無機塩を含み、ナトリウムは、０．０２３ｕｇ／ｕｌ以下、０．０１１ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、１ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化カリウムは、０．０７５ｕｇ／ｕｌ以下、０．０３７ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、１ｍＭ以下の無機塩を含み、カリウムは、０．０３９ｕｇ／ｕｌ以下、０．０２０ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、１ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化物は、０．０７１ｕｇ／ｕｌ以下、０．０３６ｕｇ／ｕｌ以下、０．０１８ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【００９９】
別の態様では、バルク試薬は、１ｍＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．０５８ｕｇ／ｕｌ以下、０．０２９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、ナトリウムは、０．０２３ｕｇ／ｕｌ以下、０．０１１ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化カリウムは、０．０７５ｕｇ／ｕｌ以下、０．０３７ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、カリウムは、０．０３９ｕｇ／ｕｌ以下、０．０２０ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化物は、０．０７１ｕｇ／ｕｌ以下、０．０３６ｕｇ／ｕｌ以下、０．０１８ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【０１００】
さらなる態様では、乾燥ペレットは、１ｍＭ以下の無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．０６２％以下、０．０５５％以下、または０．０４９％以下である。さらなる態様では、０．０６２％以下、０．０５５％以下、または０．０４９％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する容器が提供される。さらなる態様では、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、０．０６２％以下、０．０５５％以下、または０．０４９％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する。
【０１０１】
１つの態様では、バルク試薬は、５００ｕＭ以下の無機塩を含み、無機塩は、０．０３７ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０３３ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０２９ｕｇ／ｕｌ以下のマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、５００ｕＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．０２９ｕｇ／ｕｌ以下、０．０１５ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、５００ｕＭ以下の無機塩を含み、ナトリウムは、０．０１１ｕｇ／ｕｌ以下、０．００６ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、５００ｕＭ以下の無機塩を含み、塩化カリウムは、０．０３７ｕｇ／ｕｌ以下、０．０１９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、５００ｕＭ以下の無機塩を含み、カリウムは、０．０２０ｕｇ／ｕｌ以下、０．０１０ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、５００ｕＭ以下の無機塩を含み、塩化物は、０．０３６ｕｇ／ｕｌ以下、０．０１８ｕｇ／ｕｌ以下、０．００９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【０１０２】
別の態様では、バルク試薬は、５００ｕＭ以下の無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．０２９ｕｇ／ｕｌ以下、０．０１５ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、ナトリウムは、０．０１１ｕｇ／ｕｌ以下、０．００６ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化カリウムは、０．０３７ｕｇ／ｕｌ以下、０．０１９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、カリウムは、０．０２０ｕｇ／ｕｌ以下、０．０１０ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化物は、０．０３６ｕｇ／ｕｌ以下、０．０１８ｕｇ／ｕｌ以下、０．００９ｕｇ／ｕｌ以下、または０．０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【０１０３】
さらなる態様では、乾燥ペレットは、５００ｕＭ以下の無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．０３１％以下、０．０２８％以下、または０．０２４％以下である。さらなる態様では、０．０３１％以下、０．０２８％以下、または０．０２４％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する容器が提供される。さらなる態様では、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、０．０３１％以下、０．０２８％以下、または０．０２４％以下のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する。
【０１０４】
１つの態様では、バルク試薬は、約５ｍＭ〜約５００ｕＭの無機塩を含み、無機塩は、約０．３７３ｕｇ／ｕｌ〜約０．０２９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、約５ｍＭ〜約５００ｕＭの無機塩を含み、塩化ナトリウムは、約０．２９２ｕｇ／ｕｌ〜約０．０２９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、約５ｍＭ〜約５００ｕＭの無機塩を含み、ナトリウムは、約０．１１５ｕｇ／ｕｌ〜約０．００６ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、約５ｍＭ〜約５００ｕＭの無機塩を含み、塩化カリウムは、約０．３７３ｕｇ／ｕｌ〜約０．０１９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、約５ｍＭ〜約５００ｕＭの無機塩を含み、カリウムは、約０．１９６ｕｇ／ｕｌ〜約０．０１０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、約５ｍＭ〜約５００ｕＭの無機塩を含み、塩化物は、約０．３５５ｕｇ／ｕｌ〜約０．００９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、約５ｍＭ〜約５００ｕＭの無機塩を含み、無機塩は、約０．３７３ｕｇ／ｕｌ〜約０．０２９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化ナトリウムは、約０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、バルク試薬は、約５ｍＭ〜約５００ｕＭの無機塩を含み、無機塩は、約０．３７３ｕｇ／ｕｌ〜約０．０２９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化カリウムは、約０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。さらなる態様では、乾燥ペレットは、５ｍＭ〜５００ｕＭの無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．３１１％〜０．０２４％である。
【０１０５】
さらなる態様では、バルク試薬は、約５ｍＭ〜約５００ｕＭの無機塩を含み、塩化ナトリウムは、０．２９２ｕｇ／ｕｌ〜約０．０２９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、ナトリウムは、０．１１５ｕｇ／ｕｌ〜約０．００６ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化カリウムは、約０．３７３ｕｇ／ｕｌ〜約０．０１９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、カリウムは、０．１９６ｕｇ／ｕｌ〜約０．０１０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化物は、０．３５５ｕｇ／ｕｌ〜約０．００９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【０１０６】
さらなる態様では、バルク試薬は、約５ｍＭ〜約５００ｕＭの無機塩を含み、無機塩は、約０．３７３ｕｇ／ｕｌ〜約０．０２９ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化ナトリウムは、約０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在し、塩化カリウムは、約０ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。
【０１０７】
さらなる態様では、乾燥ペレットは、５ｍＭ〜５００ｕＭの無機塩を含む液体バルク試薬を乾燥させることから作製され、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．３１１％〜０．０２４％であり、ペレットの質量に対する塩化ナトリウムの質量パーセントは、約０％であり、及び／またはペレットの質量に対する塩化カリウムの質量パーセントは、約０％である。さらなる態様では、約０．３１１％〜０．０２４％のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを有する乾燥単一単位用量ペレットを含有する容器が提供され、ペレットの質量に対する塩化ナトリウムの質量パーセントは、約０％であり、及び／またはペレットの質量に対する塩化カリウムの質量パーセントは、約０％である。さらなる態様では、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供され、１つ以上のウェルの各々は、約０．３１１％〜０．０２４％のペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントを含有する乾燥単一単位用量ペレットを含有し、ペレットの質量に対する塩化ナトリウムの質量パーセントは、約０％であり、及び／またはペレットの質量に対する塩化カリウムの質量パーセントは、約０％である。
【０１０８】
１つの実施形態では、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートが提供される。１つの態様では、１つ以上のウェルは、低い透湿度、熱伝導性、光透過性、低い自家蛍光、またはこれらの組み合わせを含む材料から構成される壁を含む。１つの態様では、１つ以上のウェルは、円錐形状の壁を含む。１つの態様では、１つ以上のウェルは、ウェル内に含有される反応混合物でＰＣＲ増幅反応を行うために、ＰＣＲサーマルサイクラーに適合するように構成された壁を含む。１つの態様では、ウェルは、ＰＣＲ、ＴＭＡ、または他の核酸増幅反応を行うために、デバイスの熱伝導性チューブ受容領域に適合するように構成された壁を含む。１つの態様では、１つ以上のウェルは、加熱ブロック（例えば、製品ＳＫＵｓ  ＢＳＨ１００Ｇとして、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｃｕｍｍｉｎｇ  ＧＡから入手可能なデジタルドライブロックヒーターと共に使用されるドライブロック参照）に適合するように構成された壁を含む。１つの態様では、マルチウェルプレートの１つ以上のウェルは、ウェルのチャンバーへのアクセスのための開口部を含む。１つの態様では、１つ以上のウェルは各々、関連ウェルの開口部を密封するキャップを含む。１つの態様では、１つ以上のウェルの各々の開口部は、低透湿度ホイルであるキャップで密封される。１つの態様では、１つ以上のウェルの各々の開口部は、低透湿度エラストマー物質であるキャップで密封される。１つの態様では、マルチウェルプレートは、本明細書に記載されるような１つ以上のウェルを含み、ウェルのチャンバーは、ポリメラーゼ酵素及び無機塩を含む乾燥単一単位用量ペレットを含有し、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、約０．３１１％〜０．０２４％である。１つの態様では、マルチウェルプレートは、本明細書に記載されるような１つ以上のウェルを含み、ウェルのチャンバーは、逆転写酵素及び無機塩を含む乾燥単一単位用量ペレットを含有し、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、約０．３１１％〜０．０２４％である。１つの態様では、マルチウェルプレートは、本明細書に記載されるような１つ以上のウェルを含み、ウェルのチャンバーは、ポリメラーゼ酵素、逆転写酵素、及び無機塩を含む乾燥単一単位用量ペレットを含有し、ペレットの質量に対する無機塩の質量パーセントは、約０．３１１％〜０．０２４％である。
【０１０９】
反応混合物は、収集することができ、反応は、例えば、ＰＣＲ反応、転写媒介性増幅、及び標的捕捉ハイブリダイゼーションを使用する同時の複数のアッセイを行うことができる、ピペッター、ミキサー、インキュベーター、及びウォッシュステーションを備えるロボットデバイスである、Ｈｏｌｏｇｉｃ（登録商標）Ｐａｎｔｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，ＭＡ）のような、自動化サンプリングハンドリング装置において実施することができる。
【０１１０】
ＩＩＩ．乾燥のための装置及び方法
バルク試薬は、標準的な方法及び装置を使用して凍結乾燥させることができる。凍結乾燥機は、例えば、ＧＥＡ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤから入手可能である。契約凍結乾燥サービスは、多数の会社（例えば、Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ及びＢｉｏＰｈａｒｍａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）により提供される。凍結乾燥のガイダンスは、多数の供給源（例えば、Ｌ．Ｒｅｙ，Ｊ．Ｃ．Ｍａｙ（ｅｄｓ．）（２０１０）Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｉｎｇ／Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，３ｒｄ．ｅｄ．Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＹもしくはＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２、Ｐａｇｅｓ  ３３−３９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７１）、またはＦｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｉｎｇ，Ｅ．Ｗ．Ｆｌｏｓｄｏｒｆ，Ｒｈｅｉｎｈｏｌｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９４９））から入手可能である。任意で、酸素含有量を凍結乾燥中に低減することができる（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．１９：２１９）。
【０１１１】
様々な入れ物が乾燥に適している。入れ物は、密封され、部分真空下で保存される場合、外部圧力に耐えることができなければならない。入れ物は、外部から内部への適切な熱移動を可能にする材料でできていなければならない。入れ物のサイズは、好ましくは、乾燥させる溶液がオーバーフローを回避するように総容積の２０％以下を占めるようなものである。
【０１１２】
試料は、別個の容器または多検体容器中で乾燥させることができる。多検体容器とは、少なくとも２つの検体を含有することができ、それらを同時だが別々に保存及び操作することができる連続した容器を意味する。多検体レセプタクルについての標準的な形式は、６、２４、９６、３８４、または１５３６のウェルを含む。９６ウェル形式の例における各ウェルの容積は、約３００〜４００マイクロリットルであり、作業容積は、約７５〜２００マイクロリットルである。容積は、一般的にはウェルの数に反比例して、典型的には各ウェルについて１ｎＬ〜１０ｍＬの範囲内で変動するが、他のサイズも考慮される。例示的なウェルは、とりわけ平底、丸底、またはＶ字底を有し得る。本明細書で使用されるとき、容器は、ウェルとも称される。本明細書で使用されるとき、多検体容器は、マルチウェルプレートとも称される。加えて、ウェルは、さらに反応ウェルと称されることもある。反応ウェルという用語は、いずれかの反応が反応ウェル中で実際に起こることを必要としない。むしろ、その用語は、試薬を含有し、その中で反応が起こらない、その中で部分反応が起こる、またはその中で完全反応が起こる場合がある容器またはウェルを指すのに使用される。
【０１１３】
マルチウェルプレートに、本明細書におけるいくつかの実施形態では、凍結乾燥を行い、水性溶液から乾燥組成物を形成することができる。凍結乾燥は、ネストデバイスにおいて起こり得る（同時係属国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５１６６号参照）。ネストは、マルチウェルプレートを保持するための入れ物であり、ネストは、密封された凍結乾燥チャンバーの外部から操作可能なメカニズムにより閉鎖することができる通気孔を含む。マルチウェルプレートを含有するネストは、１つ以上の通気孔が開放位置にあるように凍結乾燥チャンバー内に配置される。チャンバーが次に密封され、凍結乾燥雰囲気が、ネスト内の空間を含むチャンバー全体を通して適用される。１つ以上の通気孔が次に閉鎖され、これによりネストを密封する。凍結乾燥チャンバーの密封はその後開放され、マルチウェルプレートを含有するネストが取り出される。ネストは次に移転され、マルチウェルプレートをその中に配置して、オペレータがその中にある凍結乾燥組成物を使用するか、またはさらなる保存もしくは販売のために凍結乾燥検体を含有するマルチウェルプレートを再密封する準備ができるまで、保存され得る。マルチウェルプレートのウェルは、次に密封し、周囲空気からの水分の侵入を実質的に阻害することができる。密封されたマルチウェルプレートへの少量の水分侵入は、密封されたマルチウェルプレートを、乾燥剤を含有するパウチ中に保存することにより防止することができる。同様に、別個の容器に、凍結乾燥を行うことができ、ネスト中での凍結乾燥を行うことができる。
【０１１４】
他の乾燥方法としては、噴霧乾燥、流動層乾燥、除湿機、及び濾過ケーキを低温で真空下で自由流動乾燥生成物まで乾燥させるバッチ接触乾燥が挙げられる（ＮＰ  Ｃｈｅｒｅｍｉｓｉｎｏｆｆ（２０００）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｅｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。除湿機は、Ｂｒｙ  Ａｉｒ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｂｕｒｙ，Ｏｈｉｏ、及びＤＳＴ  Ｓｅｉｂｕ  Ｇｉｋｅｎ，Ｗｙｏｍｉｓｓｉｎｇ，ＰＡから入手可能である。回転乾燥機、コニカルドライヤー、及び棚段乾燥機が利用可能である（ＭｃＧｉｌｌ  ＡｉｒＰｒｅｓｓｕｒｅ  ＬＬＣ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ）。１つの実施形態では、真空乾燥機は、材料を減圧に曝露することにより水分を除去し、気化を通して失われるものを置換するのに十分なだけの熱が使用される。乾燥剤としては、シリカゲル乾燥剤、アルミノシリケート及び合成ゼオライトのような分子ふるい乾燥剤、ならびにベントナイト乾燥剤が挙げられる。
【０１１５】
反応混合物は好ましくは、その中でそれらが使用のために再構成されるであろう同じ容器において乾燥させる。
【０１１６】
凍結乾燥またはその他の乾燥配合物は、低い含水量、例えば、５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１．０重量％未満、０．５重量％未満、０．２重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、０．０２重量％未満、０．０１重量％未満、等の水、または５重量％未満〜０．０１重量％未満、４重量％未満〜０．０１重量％未満、３重量％未満〜０．０１重量％未満、２重量％未満〜０．０１重量％未満、１．０重量％未満〜０．０１重量％未満、０．５重量％未満〜０．０１重量％未満、０．２重量％未満〜０．０１重量％未満、０．１重量％未満〜０．０１重量％未満、０．０５重量％未満〜０．０１重量％未満、０．０２重量％未満〜０．０１重量％未満の水を有する。
【０１１７】
ＩＶ．保存
凍結乾燥またはその他の乾燥組成物は、使用前に保存される。保存の期間は、乾燥組成物が周囲空気に曝露されて室温で保存される時間を含み得る。こうした期間は、最大３時間、またはあるいは、最大１．０時間、最大１．５時間、最大２．０時間、最大２．５時間、最大３．５時間、最大４．０時間、最大５．０時間、最大６．０時間、最大８．０時間、または９０分〜１８０分のような時間のいずれかの範囲であり得る。こうした保存中の絶対湿度は、２５℃で１立方メートルの空気当たり少なくとも２．３グラムの水、またはあるいは、１立方メートルの空気当たり１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０グラムを上回る水であり得る。あるいは、相対湿度は、例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％の相対湿度であり得る。特定の実施形態では、相対湿度は、約１０％であり得、保存時間は、最大８時間であり得る。特定の実施形態では、絶対湿度は、２５℃で１立方メートルの空気当たり約２．３グラムであり得、保存時間は、最大８時間であり得る。
【０１１８】
保存はまた、乾燥組成物が密封され、密封外部の周囲空気との接触を実質的に防止する、より長い期間を含み得る。この保存時間は、長期間、例えば、少なくとも１週間、少なくとも１か月、少なくとも６か月、少なくとも１年、または少なくとも２年であり得る。１か月〜２年の期間が例示的である。
【０１１９】
長期保存または長期もしくは短期安定性研究のための保存温度としては、例えば、０〜２℃、０〜４℃、２〜４℃、２〜６℃、２０℃、２５℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、及び液体窒素下、−４〜−２℃、−６〜−２℃、−８〜−２℃、−１０〜−２℃、−２０℃、−４０℃、−６０℃、−８０℃のような０℃以下の温度が挙げられる。好ましくは、保存は、氷点より高く、約４〜８℃の範囲内である。加速分解研究は、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃で、例えば、１時間、２時間、４時間、２４時間、２日、４日、８日、１か月、等の期間行うことができる。保存または、あるいは安定性試験についての条件は、温度が変動するもの、例えば、氷点より高い温度からこれより低い温度まで変動するものであり得る。
【０１２０】
無機塩の非存在は、乾燥前のバルク試薬の保存中、密封前の乾燥組成物の短期保存中、及び密封後の長期保存中、酵素活性の喪失及び副産物の形成を低減する。好ましくは、全ての保存後の酵素活性は、保存開始直前の値の少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、及び保存開始前の値の、またはあるいは最適条件下で保存された比較試料の値に対する、これらの百分率を限界とする範囲である。
【０１２１】
Ｖ．再構成
好ましい再構成溶液は、水中の３．８〜４．４ｍＭのＭｇＣｌ２、及び５０〜８０ｍＭのＫＣｌをもたらす。再構成溶液はまた、他の成分の中でも、０．０１２〜０．０２０％のメチルパラベン、０．００６〜０．０１０％のプロピルパラベン、及び／または０．２６％の絶対エタノールを含有し得る。
【０１２２】
再構成時間は、乾燥組成物の意図する用途に適した水性溶液の添加物が乾燥組成物に接触後、１秒未満、２秒未満、５秒未満、１０秒未満、１５秒未満、２０秒未満、５０秒未満、または６０秒（１分）未満であり、接触は任意で、振ること、タッピングボルテックスすること、揺らすこと、ピペットチップで吸い出すこと、または展性バイアルを折りたたむもしくは押しつぶすことのうちのいずれかにより促進され得る。例示的な再構成時間は、２〜１０秒である。再構成時間は、冷蔵庫温度（約４℃）の再構成溶液、周囲温度溶液（約２３℃）、または温溶液（約３７℃）のいずれかの再構成溶液で測定することができる。典型的には、乾燥組成物は、冷蔵庫から取り出されており、再構成溶液の添加前は冷たい。これらの手順のいずれかのための環境（室内）は、典型的には約２３℃の周囲温度である。物質が再構成されていると決定される時間は、例えば、物質が完全に可溶化されていると決定される時間であり得る。完全な可溶化は、目視検査により決定することができ、例えば、濁りの非存在またはシュリーレンパターンの非存在が、完全な可溶化の尺度である。あるいは、完全な可溶化は、光散乱を測定する機械のような、光学装置により決定することができる。
【０１２３】
ＶＩ．組成物の安定性
組成物の安定性は、典型的には、乾燥生成物の再構成後に活性（すなわち、増幅の割合または収率）または副産物の形成から評価される。安定性の欠如は、乾燥前または後のいずれかの保存中の活性の喪失または副産物の形成から引き起こされ得る。活性または副産物の形成は、絶対または相対尺度であり得る。相対の場合、比較のためのベースラインは、乾燥及び再構成前のバルク試薬混合物または規定の方法（例えば、マグネシウムもしくは他の塩またはこれらのイオンの存在）で試験されるものとは異なる対照再構成混合物であり得る。活性は、リアルタイム増幅の割合または増幅産物の最終収率またはヒット率により評価することができる。副産物は、ゲル電気泳動、ゲルスキャナー、アガロースゲル、キャピラリー電気泳動、等のうちの１つ以上により分析することができる。
【０１２４】
（乾燥前の試薬の体積に対して再構成物の異なる体積によるいずれかの相違について必要に応じて補正された）再構成増幅混合物の活性は、好ましくは７５、８０、８５、９０、もしくは９５％以内であるか、または乾燥前の試薬のそれとは実験誤差内で区別できない。（乾燥前の試薬の体積に対して再構成物の異なる体積によるいずれかの相違について必要に応じて補正された）再構成増幅混合物内に存在する副産物は、好ましくは２０、１５、１０、５、４、３、２、もしくは１重量％未満であるか、または乾燥前のバルク試薬中に存在する元の化合物の平均モルである。好ましくは、副産物は検出限界を下回る。
【０１２５】
ＶＩＩ．キット
上述される乾燥組成物は、キットで提供することができる。こうしたキットは、チューブのような、容器中の乾燥組成物を含有し得る。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上のウェルを含むマルチウェルプレートを含有する。いくつかのキットは、別個の容器で供給される複数の乾燥組成物を含有する。いくつかのキットは、マルチウェルプレートの１つ以上の密封されたウェルメンバー中の複数の乾燥組成物を含む１つ以上のマルチウェルプレートを含む。
【０１２６】
いくつかのキットはまた、乾燥組成物とは別個の容器中の再構成溶液を含む。再構成溶液は、アリコートを個別の乾燥組成物容器に分注するためにバルクで提供され得るか、または各々乾燥組成物を含有する単一容器と組み合わせるための、１つ以上の単位用量の形態で提供され得る。
【０１２７】
任意で、乾燥組成物を含有する容器及び再構成溶液を含有する容器は、脆性材料により分離することができる。脆性材料は、アルミニウムホイル、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレン、または他の同様の材料であり得る。バリアは、１つ、２つ、３つ以上の層を含むことができ、各層は、同じ組成物を有するか、または各層は、ＰＶＣ層に接触したホイル層のような、異なる組成物を有する。フィルムは、例えば、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩまたはＡｒｋｅｍａ，Ｉｎｃ．，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡから取得することができる。脆性材料の穿孔は、再構成溶液が凍結乾燥組成物に接触することを可能にする。
【０１２８】
キットは、酵素反応がキットのコンパートメント中でそのまま起こり、組成物を異なる反応容器またはこうした容器を保持する入れ物に移す必要性を回避するように、サーモサイクラーまたはインキュベーターに適合するように設計することができる。
【０１２９】
キットは、例えば、セプタムに穿刺するポート、ホース、シリンジによる、ユーザー供給試薬のキット内の容器への導入に適合させることができ（ＵＳ２０１４／０１２１５１５及びＵＳ２０１４／０２７６３５６参照）、またはあるいは、核酸テンプレートのような、ユーザー供給試薬を、ユーザー供給の入れ物の中で本開示の試薬と混合することができる。キットのコンパートメントの１つ以上は、空の状態で供給され、混合チャンバーとして使用され得る。
【実施例】
【０１３０】
実施例１．バルク試薬
実施例１〜３は、バルク試薬を作製すること、容器中で単一単位用量体積のバルク試薬を乾燥させてＳＵＤ乾燥ペレットを得ること、ならびに乾燥ペレットを再構成してＳＵＤ増幅及び検出混合物を得ることを示す。表１及び表２は、乾燥のための例示的なバルク試薬の成分を開示する。２つの表は、例示的な単一単位用量濃度も開示する。マスターミックス１は、０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰの各々、０．８ｍＭのｄＵＴＰ、ＢＳＡを含み、実質的には無機塩を含まない２Ｘマスターミックスであった。表１中のＴａｑポリメラーゼは、カチオン性洗浄剤を含有するグリセロールフリーのトリス緩衝液中であった。
【０１３１】
２Ｘマスターミックス２は、０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、０．８ｍＭのｄＵＴＰ、０．７４単位／μＬのＧｏＴａｑ（登録商標）ＭＤｘ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、トリス及び非アセチル化ＢＳＡを含有するグリセロールフリーの緩衝液、０．４８Ｍのトレハロースである。
【０１３２】
５０Ｘ  ＧｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴミックスは、次の通りである：表２中の２０Ｕ／μＬのＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、８単位／μＬのＲＮａｓｉｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、表１中の１０Ｕ／μＬのＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、８単位／μＬのＲＮａｓｉｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ。
【０１３３】
ＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴカスタムは、１６０Ｕ／μＬのＧｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ、グリセロールフリー、ＲＮａｓｅ阻害剤なしの濃縮溶液である。
【０１３４】
含めることができる安定化剤、脱アミド化阻害剤、抗酸化剤、洗浄剤、ならびに界面活性剤：ポリエトキシル化ソルビタンの脂肪酸エステル（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）、及びポロキサマー１８８のような、界面活性剤。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【０１３５】
表１〜３についてのバルク増幅試薬の各々中の１０Ｘオリゴヌクレオチドミックスは、下の実施例において増幅及び検出反応を行うためのプライマー及びプローブの集合物を含んだ。当業者であれば、増幅反応のためのプライマー及びプローブ混合物をどのように調製するかを理解するであろう（例えば、Ｉｎｎｉｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）参照）。下の実施例について、プライマー及びプローブは、約８ｕＭ〜約１２ｕＭのバルク濃度でバルク試薬中に存在した。
【０１３６】
実施例２．凍結乾燥
この実施例では、バルク反応混合物は、凍結乾燥機を使用して乾燥させる。２４マイクロリットルの実施例１において一般的に記載されるバルク増幅試薬を、容器に添加した後、凍結乾燥チャンバーに装填する。本明細書における実施例について、２４ｕｌは、（単一単位用量またはＳＵＤとも称される）単一試料に増幅及び検出反応を行うのに使用されるバルク試薬の量を表す。この実施例では、マルチウェルプレート（特に１２ウェルプレート）を、凍結乾燥反応及びマルチウェルプレートのウェル中に存在する凍結乾燥ペレットの保存の両方に使用した。１２ウェルプレートの１２のウェルの各々は、２４ｕｌアリコートのバルク試薬混合物を受容した。ウェルの各々中の試薬は、標的核酸に増幅及び検出反応を行うための単一単位用量を表した。凍結乾燥サイクルを開始する（約３６時間ラン）。凍結乾燥サイクル後、１２ウェルプレートを回収し、１２ウェルプレートの個別の容器が密封される場所に移す。容器を容器開口部にわたって金属ホイルで密封する。金属ホイルは、低透湿度ホイルである。密封された１２ウェルプレートを次に、乾燥剤と共にパウチ包装する。増幅反応における使用のために、１２ウェルプレートを装置に直接装填した。各容器内の乾燥組成物を手動で再構成するか、または再構成溶液を備え、乾燥組成物の再構成を自動化するようにプログラムされた装置の場合、乾燥組成物を装置により再構成する。試料を試薬と組み合わせ、増幅及び検出反応を行う。
【０１３７】
実施例３．再構成溶液。
この実施例は、１つの再構成溶液について説明した。再構成溶液の目的は、再構成ペレットを使用して試料に増幅及び検出反応を行うため、調製において乾燥ペレットを再水和することである。実施例２からの１２ウェルプレートの１２ウェルの各々に、２４ｕｌの再構成緩衝液を、ウェル上のホイルカバーに予め穿孔した後、緩衝液をウェルに分注することにより、分注した。表４は、これらの実施例に使用される再構成溶液を開示し、バルク再構成溶液濃度及び最終アッセイ濃度の両方を提供する。乾燥物の再構成後、試料からの標的核酸をウェルに添加し、ＰＣＲ増幅及び検出反応を行った。
【表４】
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【０１３８】
実施例４．バルク試薬に対する無機塩の悪影響
この実施例は、バルク試薬に対する無機塩の悪影響について説明する。２つのバルク試薬混合物を、一般的に実施例１及び表５に従って調製した。表５中のバルク試薬Ａとバルク試薬Ｂとの間の相違は、反応混合物中のＭｇＣｌ２の存在または非存在であった。
【表５】
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【０１３９】
液体バルク試薬Ａ及びＢの各々を、氷上で調製した。バルク試薬Ａ及びＢを次に、各々別々に多数のマルチウェルプレートのウェルに分別した（特にここでは、１２ウェルプレートを使用した）。１２アリコートのバルク試薬Ａまたは１２アリコートのバルク試薬Ｂのいずれかを含有するこれらの１２ウェルプレートを次に、４つの異なるインキュベーション条件：（１）氷上での９０分インキュベーション、（２）室温での９０分インキュベーション、（３）氷上での１８０分インキュベーション、または（４）室温での１８０分インキュベーションに分けた。よって、各バルク試薬混合物の一部分を室温で１８０分間インキュベートし、他の部分を氷上で１８０分間インキュベートした。同様に、各バルク試薬混合物の一部分を室温で９０分間インキュベートし、他の部分を氷上で９０分間インキュベートした。すべての場合において、（最終成分として添加される）反応混合物への核酸成分の添加は、インキュベーション時間の開始を示した。
【０１４０】
インキュベーション時間後、１２ウェルプレート中の分別された増幅反応物を次に、実質的に乾燥した組成物が得られるまで凍結乾燥させた。１２ウェルプレートのウェル中の得られた乾燥組成物の各々は、トリプレックス増幅及び検出反応についての乾燥単一単位用量を表し、試料中のインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、呼吸器合胞体ウイルスＢ型のうちの１つ以上を同定した。
【０１４１】
乾燥組成物を、６５ｍＭのＫＣｌ、メチル及びプロピルパラベンをそれぞれ０．０２重量／体積％及び０．０１重量／体積％で、ならびに０．３３体積／体積％の絶対エチルアルコールを含有する緩衝液で再構成した。バルク試薬Ａから作製された乾燥組成物のための再構成溶液は、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２も含有した。
【０１４２】
インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、及び呼吸器合胞体ウイルスＢ型陽性試料の３つ全てを、再構成ミックスの成分全てがそれらのバルク試薬濃度の約８０％であったように、再構成反応混合物にそれらのＬｏＤの３倍で組み合わせた。これらの陽性試料は、輸送媒体と組み合わされ、（ＲＳＶＢ試料連続希釈が１０倍異なったことを除き）所望の濃度まで連続希釈された陰性血漿中の抽出ウイルスである。表６について示されるように、プライマー及びプローブミックスを、別個の蛍光チャネルにおいて、単一分子反応にもかかわらず、３つのウイルス標的、すなわち、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、または呼吸器合胞体ウイルスＢ型の各々を特異的に検出するように設計した。
【０１４３】
試料を、リアルタイムＰＣＲ互換性サーマルサイクラーを使用して分析した（ＡＢＩ  ７５００ＦＡＳＴ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。結果は下記の通りである（表６、図３Ａ〜Ｃ）。表中の陽性パーセント値は、閾値を超えたＲＦＵ値を有した試料の数を試験された１２の試料の百分率として表す。アッセイの設計及び収集において、好ましいのは、ウイルス（アッセイ当たりのウイルス粒子）の量が、陽性対照として指定された特定のアッセイについて少なくとも９５％陽性をもたらすのに十分な量であることである。
【０１４４】
【表６】
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【０１４５】
これらの結果は、バルク試薬（ＭｇＣｌ２及びＫＣｌを含まない凍結乾燥前の溶液）が、室温で少なくとも１８０分まで安定であることを示す。バルク試薬Ａからの乾燥ＳＵＤペレットは、再構成及び試料との組み合わせ後、バルク試薬Ｂからの乾燥ＳＵＤペレットによりもたらされるものよりロバストな増幅及び検出反応をもたらす。バルク試薬Ｂは、室温またはさらに氷上で９０分間の短い時間インキュベートされた後、乾燥及び再構成されて増幅反応混合物が生成される場合、増幅反応において、同じ条件下のバルク試薬Ａより比較的に低いシグナル及び多数の小さな副産物をもたらした。無機塩をほとんど〜全く含有しないバルク試薬は、乾燥させて、ポリメラーゼ酵素成分、ｄＮＴＰ、及び核酸を含む、増幅反応のための成分を含有する乾燥組成物を生成するのに有用である。
【０１４６】
実施例５．塩を含むまたは含まない、乾燥ペレットの安定性
この実施例は、塩を含有する単一単位用量乾燥ペレットの安定性を、塩を含有しない（この実施例では５ｍＭ未満の無機塩）単一単位用量乾燥ペレットと比較する。単一単位用量ペレットを、一般的に上述されるようなバルク試薬を乾燥させることにより作製した。合成直後、バルク試薬Ａ及びバルク試薬Ｂを、各々別個のマルチウェル反応プレート（１２ウェル）に分別し、凍結乾燥機を使用して乾燥させた。凍結乾燥後、乾燥ペレットを含有するマルチウェルプレートを、約５％の相対湿度を有する窒素ガス環境に配置し、マルチウェルプレートを、ウェル開口部をホイルで覆うことにより密封した。密封されたプレートを乾燥剤を含有するアルミニウムパウチ中に配置し、パウチを次に密封した。マルチウェルプレート中の乾燥ペレットを含有する密封されたパウチを、８日間４℃で保存した。
【０１４７】
第８日後、パウチ包装されたマルチウェルプレートを、次のような３つの条件のうちの１つに移した。条件＃１−１サブセットのバルク試薬Ａからの乾燥ペレットを含有するパウチ包装されたマルチウェルプレート及び１サブセットのバルク試薬Ｂからの乾燥ペレットを含有するパウチ包装されたマルチウェルプレートを、パウチから取り出し、７０％相対湿度を有する１５℃の環境に配置した。条件＃２−１サブセットのバルク試薬Ａからの乾燥ペレットを含有するパウチ包装されたマルチウェルプレート及び１サブセットのバルク試薬Ｂからの乾燥ペレットを含有するパウチ包装されたマルチウェルプレートを、パウチから取り出し、１５％相対湿度を有する４５℃の環境に配置した（加速安定性）。条件＃３−１サブセットのバルク試薬Ａからの乾燥ペレットを含有するパウチ包装されたマルチウェルプレート及び１サブセットのバルク試薬Ｂからの乾燥ペレットを含有するパウチ包装されたマルチウェルプレートを、４℃に配置した（マルチウェルプレートは、乾燥剤と共にパウチ中にあり、よって湿度は０パーセントであった）。プレートを、これらの条件でさらに３０日間放置した。
【０１４８】
インキュベーション終了時、条件の各々からの乾燥ペレットを、１００ｍＭのＫＣｌ及び２．５ｍＭの最終濃度には十分なＭｇＣｌ２を含有する緩衝液中で再構成し、インフルエンザＡ型標的の増幅及び検出反応について、リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して試験した。簡潔に、インフルエンザＡ型標的を、陰性プール中、同等の液体対照と共に、ＬＯＤ１０＾０（＋／−１対数）で抽出した。結果を表７及び図１に示す。
【表７】
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【０１４９】
これらの結果は、５ｍＭ未満の無機塩を含有する単一増幅反応乾燥ペレットが、５ｍＭ超の無機塩を含有する単一増幅反応乾燥ペレットと比較して、多数の異なる温度及び湿度条件での保存後に、より高いＲＦＵ値を有することを示す。
【０１５０】
実施例６．カートリッジを試薬で充填する前の保持時間の影響
表８は、全ての凍結乾燥試料が同じバルク試薬から調製された、安定性研究からの結果を開示する。この実施例は、一般的に上で示されるように調製された乾燥ペレットの安定性について説明する。ポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ、及び核酸を含有するバルク試薬を、ＭｇＣｌ２なし及びＫＣｌなしで調製した。バルク試薬を、同等の組成物の４つの別個の部分に分け、４つの部分の各々は、（１）室温で４５分間インキュベート後に乾燥、（２）室温で４時間インキュベート後に乾燥、（３）室温で８時間インキュベート後に乾燥、または（４）インキュベーションなしでそのまま乾燥のいずれかであった。
【０１５１】
得られた乾燥組成物を次に１．５ｇの乾燥剤ピローを含有するアルミニウムパウチに移し、パウチを次に密封した。密封されたパウチを、５℃で２２．５か月に等しい加速安定性をシミュレートする条件下で保存した。加速安定性インキュベーション後、乾燥組成物を再構成し、得られた増幅反応物を、インフルエンザＡ型試料の増幅及び検出についてのアッセイに使用した（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ＝１）。表８中の結果は、ＭｇＣｌ２もＫＣｌも含有しないバルク溶液が乾燥前に最大８時間室温でインキュベートされる場合、増幅及び検出アッセイ性能の混乱がないことを示す。再構成乾燥組成物は、ロバストな増幅及び検出反応をもたらし、低いウイルス力価を含有する試料について試験される場合であっても、再現可能な結果もたらす。
【表８】
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【０１５２】
この研究は、容器の充填中の液体溶解試薬について変動するバルク保持時間が、酵素活性を低減しないことを明らかにする（図２）。容器の充填中のバルク試薬の安定性を試験するために、バルクミックスを凍結乾燥前に最大８時間周囲温度に曝露する研究を行った。個別のＦｌｕＡ／Ｂ／ＲＳＶバルク液体溶解試薬ミックスを調製し、４５分間、４時間、及び８時間、室温でインキュベートした後、凍結乾燥ペレットを生成するのに使用した。これらのペレットを次にパウチ包装し、低レベルのウイルス力価で試験する前に、５℃で２２．５か月の貯蔵寿命に等しい加速安定性をシミュレートするように４５℃に２２日間曝露した。結果（図２）は、液体溶解バルクが周囲条件で最大８時間保存される場合、アッセイ性能の混乱がないことを示す。
【０１５３】
ヒストグラムバーについてのそれぞれのＲＦＵは、８２４，８９５、８０６，５７０、８５５，７７２、及び１，１６２，９６７である。Ｃｔ（発生時間）の値は、次の通りであった。液体対照（平均Ｃｔ＝３４．３）について、４５分間（平均Ｃｔ＝３４．５）、４時間（平均Ｃｔ＝３４．４）、及び８時間（平均Ｃｔ＝３３．９）。Ｃｔ値についてのそれぞれの標準偏差は、０．３９、０．５８、０．３２、及び０．６０であった（図２）。
【０１５４】
実施例７．再構成時間経過研究
これは表９に示される実験に関する。ＫＣｌを含まず、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む乾燥ペレットを再構成溶液中でインキュベートすることが、アッセイ活性に影響を及ぼすかを決定する実験構成。要約すると、ＫＣｌを含まないが２．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む乾燥ペレットＳＵＤを、一般的に上述されるように、バルク試薬の凍結乾燥により調製した。凍結乾燥後、乾燥ペレットＳＵＤを、窒素下、５％相対湿度で密封し、乾燥剤と共にパウチ包装した後、４℃で２７日間保存した。２７日のインキュベーション後、乾燥ペレットを再構成し、試料からＦｌｕ−Ａを検出するのに使用し、全てのアッセイは、反応混合物中の最終濃度として、１００ｍＭのＫＣｌ及び２．０ｍＭのＭｇＣｌ２を有した。
【０１５５】
ＫＣｌなし／２．５ｍＭのＭｇＣｌ２のＳＵＤを、１２５ｍＭのＫＣｌで再構成し、０、５、１０、または１５分間氷上でインキュベートさせた後、予め冷却したＰＣＲプレートに移し、標的を添加した。プレートを密封し、試料を１分間回転させた。プレートを次に、予め加熱したＡＢＩ  ７５００  ＦＡＳＴ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に移した。アッセイをＡＢＩ上、５４分の熱プロファイル下、Ｎ＝４レプリケート、及び２５，０００に設定された閾値で行った。表９は結果を開示する。
【表９】
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実施例８．安定化に対する塩化マグネシウムの影響
この実施例は、緩衝液、トレハロース、ＥＤＴＡ、ヌクレオチド三リン酸、プライマー、プローブ、及び酵素を含む、バルク試薬マスターミックスからのＭｇＣｌ２の除去の、安定化に対する影響を調査した。バルク試薬からのＭｇＣｌ２の除去は、水及びＭｇＣｌ２での再構成後の活性により測定されるように、配合物を凍結乾燥前に室温で９０分から７．７５時間まで安定化することが見出された。ＥＤＴＡの凍結乾燥ペレットへの添加は、再構成緩衝液中の過剰なＭｇＣｌ２をキレート化するのに有用である。
【０１５６】
プライマー、プローブ、及び三リン酸塩は、増幅反応前に酵素が添加された、緩衝化マスターミックスで提供することができる。いくつかの増幅反応について、最終マスターミックス中に酵素を有し、これを水及びＭｇＣｌ２の普遍的再構成溶液と「いつでも使用できる」形態で凍結乾燥することが所望であり得る。これは増幅反応前にミックスを添加する必要性を回避する。マグネシウムは、重合反応のための錯化剤（触媒）として作用する。標的が存在しない場合、非特異的増幅が起こり得、これは必要な三リン酸塩の反応ミックスを枯渇させ得る。材料を２〜８℃で保持し、予め冷却した凍結乾燥機に装填することは、反応速度を遅らせるのに使用することができ、これは反応ミックスからの三リン酸塩の枯渇を遅らせることができる。しかしながら、２〜８℃であっても、反応ミックスの安定性は、９０分のみであり得る。また、日常的な製造中のこれらの制限の順守は、予備冷却ステップ等と同様に、バルク溶液温度を所望の温度で維持する冷却システムの使用を必要とする。
【０１５７】
緩衝液、トレハロース、三リン酸塩、ＥＤＴＡ、プライマー、プローブ、及び酵素を含むバルク試薬からのＭｇＣｌ２の除去ならびに水及びＭｇＣｌ２を含有する再構成溶液中への配置は、これが重合反応のための触媒として作用するとしても、非特異的増幅を防止または最小化する方法とみなされた。ＥＤＴＡ溶液の、緩衝液、トレハロース、三リン酸塩、プライマー、プローブ、及び酵素を含有するマスターミックスへの添加は、各分析物についての普遍的再構成物中の過剰なマグネシウムをキレート化するのに使用することができた。ＭｇＣｌ２あり及びなしでの対の増幅反応を、湿潤化学反応条件下で行い、安定性に対する影響を評価した。結果を図４に示す。緩衝液、トレハロース、三リン酸塩、ＥＤＴＡ、プライマー、プローブ、及び酵素を含有するバルク試薬中のマグネシウムなしでの研究は、１８０分間の室温安定性を示した（ＭｇＣｌ２が存在するレーン５及び７における非特異的飛沫と比較してバイオアナライザーゲルで同じバンドを示す、レーン６及び８を参照されたい）。追跡研究を図２に示す。ここで、標的の核酸増幅を、３つの異なる条件下で実施した。（１）緩衝液、トレハロース、三リン酸塩、ＥＤＴＡ、プライマー、プローブ、ＭｇＣｌ２、及び酵素を含み、酵素がＰＣＲ反応を開始する直前に添加された、新鮮液体対照、（２）緩衝液、トレハロース、三リン酸塩、ＥＤＴＡ、プライマー、プローブ、及び酵素を含むＬｙｏ  ６７  ＲＴ  ３．７５時間。溶液を３．７５時間保持した後、凍結乾燥した。凍結乾燥後、ペレットを、ＰＣＲ反応の開始直前に、水及びＭｇＣｌ２中で再構成、ならびに（３）緩衝液、トレハロース、三リン酸塩、ＥＤＴＡ、プライマー、プローブ、及び酵素を含むＬｙｏ  ６７  ＲＴ  ７．７５時間。溶液を７．７５時間保持した後、凍結乾燥した。凍結乾燥後、ペレットを、ＰＣＲ反応の開始直前に、水及びＭｇＣｌ２中で再構成した。この実験は、緩衝液、トレハロース、三リン酸塩、ＥＤＴＡ、プライマー、プローブ、及び酵素を含有するバルク試薬の安定性を、非特異的増幅なしで凍結乾燥前に室温で７．７５時間構築した。
【０１５８】
バルク試薬からのＭｇＣｌ２の除去は、緩衝液、トレハロース、三リン酸塩、ＥＤＴＡ、プライマー、プローブ、及び酵素を含有する室温安定マスターミックスをもたらす。
【０１５９】
実施例９  凍結乾燥中の昇華に対する塩化カリウム（ＫＣｌ）の効果。
この実施例は、凍結乾燥中の昇華に対する塩化カリウム（ＫＣｌ）の効果を調査した。ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅にＫＣｌを必要とする。この研究の結果は、低濃度のＫＣｌ（＜１０ｍＭ、０．３９１μｇ／μＬカリウム）が凍結乾燥に顕著な影響を及ぼさないことを示した。逆に、１２６ｍＭ（４．９２μｇ／μＬカリウム）程の高いＫＣｌ濃度は、凍結乾燥中、ペレットからの水の除去を阻害する。残留水は、安定性に悪影響を及ぼす「不純物」とみなされる。凍結乾燥バルク試薬中のＫＣｌの量を除外または最小化することは、特定の実施形態では望ましい。
【０１６０】
３つの濃度のＫＣｌの存在下での凍結乾燥の有効性を、その中の凍結乾燥後の残留水分含有量を測定することにより調査した。より高レベルの残留水分は、昇華プロセスを阻害することが知られている。
【０１６１】
フーリエ変換近赤外線（ＦＴ−ｎＩＲ）分光分析法を使用し、凍結乾燥バルク試薬中の相対水分含有量を測定した。水−ＯＨ結合は、５１７０ｃｍ−１（Ａ５１７０）のｎＩＲ空間波長でエネルギーを吸収することが知られている。
【０１６２】
３つの水性バルク試薬配合物を調製した。各々の組成を表１０に示す。
【表１０】
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【０１６３】
１．４５ｍＬの各配合物を、各ＫＣｌ濃度について２つの１０ｍＬガラスバイアルに充填した。バイアルをブチル栓で半打栓した。全てのバイアルを一緒に凍結乾燥した。凍結乾燥の終了時、バイアルを無水窒素ガス下で密封した。密封されたバイアルを全て凍結乾燥機から取り出し、クリンプシールを適用した。バイアルを次に、残留水分含有量について、ＦＴ−ｎＩＲ分光分析法により測定した。水分レベルの時間ずれの傾向を説明するために、測定値を１０日にわたって得た。時点は次の通りであった：０日目、１日目、３日目、７日目、及び１０日目。残留水分含有量を、ＦＴ−ｎＩＲ分光分析法により測定し、５１７０ｃｍ−１でのｎＩＲ吸光度パラメータを得た。各配合物について、吸光度パラメータを平均化した後、参照試料、配合物１（０μｇ／μＬ  ＫＣｌ）から得られた平均パラメータに対して正規化した。下記の計算を使用した。
【数１】
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【０１６４】
表１１及び１２は、ＦＴ−ｎＩＲ吸光度結果を示す。
【表１１】
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【表１２】
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【０１６５】
図６及び７は、ＫＣｌの濃度を増加させる効果を示す。グラフは、６．３ｍＭのＫＣｌの存在が、正規化吸光度パラメータを顕著に増加させなかったことを示す。よって、これらのデータから、低濃度のＫＣｌは、凍結乾燥中に水の除去を顕著に阻害しなかった。逆に、１２６ｍＭのＫＣｌ（２０倍増加）は、正規化吸光度パラメータの２倍増加を誘発し、参照と比較してより高い残留水分レベルを示した。よって、より高濃度のＫＣｌは、水分除去に影響を及ぼす。
【０１６６】
水性バルク試薬の凍結乾燥は、少量のＫＣｌ（この実施例では約６．３ｍＭ）を許容する。より高濃度のＫＣｌは、乾燥ペレットの吸湿性に影響を及ぼし、環境からの水の吸収を引き起こし、及びひいてはロバストでない反応混合物をもたらし得る。
【０１６７】
実施例１０  凍結乾燥バルク試薬の凍結乾燥後の安定性の決定
バルク試薬の凍結乾燥後のアリコートを使用する周囲及び制御グローブボックス実験は、１０％相対湿度に８時間未満曝露された最小限の塩を含む／塩を含まない配合物が、許容可能なアッセイ性能をもたらしたことを示した。塩を含む配合物及び／または凍結乾燥後により高い相対湿度に曝露された配合物は、許容可能なアッセイ性能をもたらさなかった。
【０１６８】
この実施例の目的は、マルチウェルプレート中に密封され、周囲湿度条件下及び制御された１０％相対湿度条件下で（パウチ中の）周囲水分から保護するように密封された、凍結乾燥バルク試薬の凍結乾燥後の安定性を決定することであった。ここで記載される特定の実験に加えて、追加の時点及び配合物多様体を使用する複数の追加の研究を完了した。
【０１６９】
マルチウェルプレートを、氷上で２〜８℃に保持しながら、バルク試薬のアリコートで充填した。十分な量の全ての必要な成分を混合し、３０マルチウェルプレートを充填するのに十分な体積及び５％過剰分を有するバルク試薬を生成した。混合を下記の指示に従って行った。ヌクレアーゼフリーの水、２ＸグリセロールフリーのＧｏＴａｑマスターミックス（配合物は下に示す）、１．２Ｍトレハロース、１０Ｘプローブ／プライマーミックス、及び５０ＸＰｒｏｍｅｇａ  ＲＴ（凍結乾燥のための０．５％グリセロール配合物）の順で添加する。多数のマルチウェルプレートのウェルを、ウェル当たり２４ｕＬのバルク試薬で１時間以内に充填した。マルチウェルプレートを氷上に配置し、チューブの充填前に２℃〜８℃で予め平衡化した。液体バルク試薬を、各チューブの底に分注した。１時間の充填窓中、マルチウェルプレートを氷上に保持した。充填されたマルチウェルプレートを、充填の完了後３０分以内に凍結乾燥チャンバー中に装填した。充填されたマルチウェルプレートを次に、凍結乾燥条件に曝露した。凍結乾燥プロセス後、マルチウェルプレートに、凍結乾燥チャンバーから回収する前に、カバー／栓をした。２つのマルチウェルプレートを実験台に移した。残ったマルチウェルプレートを、１０％相対湿度の予め平衡化したグローブボックスに移し、Ｔ＝０試料とし、それらにはカバー／栓をせず、次に表１３に示されるような様々な時間後に加熱密封した。６秒の密封時間及び１６９℃の密封温度を使用する。５分以内に、密封されたマルチウェルプレートを、乾燥剤ピローを含有するジップロックホイルパウチに移した後、加熱密封した。実験台上の他のマルチウェルプレートについて、それらにはカバー／栓をせず、下の表１３に示されるように、周囲雰囲気に様々な時間曝露した。
【０１７０】
曝露、密封、及びパウチ包装の時点での相対湿度及び温度を記録した。曝露後、マルチウェルプレートを、６秒の密封時間及び１６９℃の密封温度を使用して、ホイルストックで加熱密封した。加熱密封プロセスを、上記の同じ密封時間／温度パラメータを使用して、曝露条件で行った（すなわち、実験室雰囲気に曝露されたマルチウェルプレートを実験室おいて密封し、除湿条件に曝露されたマルチウェルプレートを除湿条件で密封した）。５分以内に、密封されたマルチウェルプレートを、乾燥剤ピローを含有するジップロックホイルパウチに移し、パウチを加熱密封する。密封されたパウチは全て、次に２〜８℃で保存した。
【０１７１】
２つのマルチウェルプレートのランを時点毎に行った。周囲条件下、凍結乾燥後、マルチウェルプレートを、０、４、及び８時間密封した（表１３参照）。１０％相対湿度条件下、凍結乾燥後、マルチウェルプレートを、０、４、８、及び２４時間密封した（表１３参照）。時点毎の２つのマルチウェルプレート掛ける条件数は、それぞれ、２＊３（周囲＝６）、及び２＊４（１０％相対湿度グローブボックス＝８）である。
【０１７２】
塩を含まない配合物を、２Ｘ  ＧｏＴａｑマスターミックス、グリセロールフリー＋１０ｘプローブ／プライマー＋トレハロース＋５０Ｘ  ＲＴを使用して調製した。例えば、３０マルチウェルプレートについて、４４９μＬのヌクレアーゼフリーの水、４．８１ｍｌの２Ｘ  ＧｏＴａｑマスターミックス（Ｂ、塩なし）（１．２５Ｘ最終）、１．２８ｍｌの１．２Ｍトレハロース（０．２Ｍ最終）、９６３μｌの１０Ｘプローブ／プライマーミックス（１．２５Ｘ最終）、１９３μｌの５０Ｘ  ＲＴ（１．２５Ｘ最終）＝７．７０ｍｌの塩なしミックスの順に添加し、３００のチューブについて２４μｌを分注し、リピートピペットを使用する。
【０１７３】
塩を含む配合物を、２Ｘ  ＧｏＴａｑマスターミックス、グリセロールフリー＋１０ｘプローブ／プライマー＋トレハロース＋５０Ｘ  ＲＴを使用して調製した。例えば、３８マルチウェルプレートについて、５６０μＬのヌクレアーゼフリーの水、６．００ｍｌｓの２Ｘ  ＧｏＴａｑマスターミックス（Ｂ、塩含有）（１．２５Ｘ最終）、１．６０ｍｌの１．２Ｍトレハロース（０．２Ｍ最終）、１．２０ｍｌｓの１０Ｘ  プローブ／プライマーミックス（１．２５Ｘ最終）、２４０μｌの５０Ｘ  ＲＴ（１．２５Ｘ最終）＝９．６０ｍｌｓの塩含有ミックスの順に添加し、３８０のチューブについて２４μｌを分注し、リピートピペットを使用する。
【０１７４】
マルチウェルプレートを、表１３に従って性能について試験した。表１３のステップＡでは、塩を含まない配合物を、マルチウェルプレートに充填し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、マルチウェルカートリッジを、条件への指示された期間の曝露後に密封した。表１３のステップＢでは、塩を含まない配合物を、マルチウェルカートリッジに充填し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、マルチウェルカートリッジを、条件への指示された期間の曝露後に密封した。表１３のステップＣでは、塩を含む配合物を、マルチウェルカートリッジに充填し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、マルチウェルカートリッジを、条件への指示された期間の曝露後に密封した。
【表１３】
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【０１７５】
周囲及びグローブボックス温度は、約２５℃であった。この実験及び関連実験の結果は、塩を含まない配合物の１０％相対湿度への８時間未満の曝露が、許容可能なアッセイ性能をもたらしたことを示した。この実施例では、最小限の塩を含む／塩を含まない配合物での１０％相対湿度（２５℃で２．３ｇ／ｍ３）で８時間未満の期間は、許容可能なアッセイ性能をもたらす。
【０１７６】
本開示は、本開示の組成物、試薬、方法、診断、実験室データ、等により限定されるものではなく、本開示は、本明細書に開示されるいかなる好ましい実施形態によっても限定されない。特に文脈から明らかでない限り、いずれかの実施形態、ステップ、特性、態様、等は、その他と組み合わせて使用することができる。本明細書に引用される全ての参考文献は、各個別の特許、及び公開特許出願、ならびに図、図面、配列リスト、コンパクトディスク、等が、具体的かつ個別に参照により組み込まれていることが示されたのと同じ程度まで、参照により組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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