(57)【要約】本開示は、目的の生体分子を産生する、異種細菌ヘモグロビン遺伝子を発現する微生物株を生成するための方法について記載する。諸態様では、本開示は、天然Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍプロモーターまたはそれに由来する変異体プロモーターによって発現が制御される異種細菌ヘモグロビン遺伝子を発現する新規の細菌株を提供する。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに由来する複数のプロモーターを含むプロモーターラダーを使用して細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーを生成するための方法も本明細書で提供される。
2019519242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のプロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結した異種細菌ヘモグロビン遺伝子を含む宿主細胞であって、該第１のプロモーターポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される配列を含む、宿主細胞。
【請求項２】
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、配列番号２６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、細菌フラボヘモグロビン遺伝子である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記細菌フラボヘモグロビン遺伝子が、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項１から６までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項８】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項９】
生体分子を産生させる方法であって、請求項１から８までのいずれか一項に記載の宿主細胞を該生体分子の産生に適した条件下で培養するステップを含む方法。
【請求項１０】
前記生体分子が、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アミノ酸が、リシン、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、またはメチオニンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記有機酸が、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
生体分子の産生を増加させることが可能な微生物を生成するための方法であって、
ａ）宿主微生物を遺伝子改変するステップであって、該改変するステップは、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子を、該宿主微生物のゲノムに導入することを含み、細菌ヘモグロビン遺伝子の該ライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子のそれぞれは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターに機能的に連結しており、該改変は、該細菌ヘモグロビン遺伝子を発現する該宿主微生物の株を生成させる、ステップと；
ｂ）該宿主微生物の複数の株が生成するまで、ステップａ）を複数ラウンド繰り返すステップであって、該宿主微生物の該複数の株の各株は、細菌ヘモグロビン遺伝子の該ライブラリー由来の別々の細菌ヘモグロビン遺伝子を発現する、ステップと；
ｃ）該宿主微生物の該複数の株の各株を、発酵条件下で、炭素源と接触させるステップと；
ｄ）対照微生物から産生される生体分子の量と比較して増加した量の該生体分子を産生する該宿主微生物の各株を選択するステップであって、該対照微生物は、細菌ヘモグロビン遺伝子の該ライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子を発現しない、ステップと
を含む方法。
【請求項１５】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０から選択されるヌクレオチド配列を有する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号２６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択される１種または複数種のポリペプチド配列をコードする１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、細菌フラボヘモグロビン遺伝子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
細菌フラボヘモグロビン遺伝子のライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヘモグロビンの前記ライブラリー内の前記細菌ヘモグロビンの少なくとも１種が、細菌フラボヘモグロビンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子および表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記宿主微生物が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項１４から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主微生物が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項１４から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記導入することが、形質転換、形質導入または電気穿孔によって実施される、請求項１４から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記生体分子が、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである、請求項１４から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記アミノ酸が、リシン、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、またはメチオニンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記有機酸が、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーであって、細菌ヘモグロビン遺伝子の該ライブラリー内の各細菌ヘモグロビン遺伝子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターに機能的に連結している、ライブラリー。
【請求項３０】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０から選択される１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、請求項２９に記載のライブラリー。
【請求項３１】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが配列番号２６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択される１種または複数種のポリペプチド配列をコードする１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、請求項２９に記載のライブラリー。
【請求項３２】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、請求項２９に記載のライブラリー。
【請求項３３】
前記ライブラリー内の前記細菌ヘモグロビン遺伝子のそれぞれが、細菌フラボヘモグロビン遺伝子である、請求項２９に記載のライブラリー。
【請求項３４】
細菌フラボヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む、請求項３３に記載のライブラリー。
【請求項３５】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリー内の前記細菌ヘモグロビン遺伝子の少なくとも１種が、細菌フラボヘモグロビン遺伝子である、請求項２９に記載のライブラリー。
【請求項３６】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子および表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む、請求項３５に記載のライブラリー。
【請求項３７】
生体分子を産生させる方法であって、請求項２９から３６までのいずれか一項に記載のライブラリーに由来する細菌ヘモグロビン遺伝子を宿主細胞に導入するステップと、該宿主細胞を該生体分子の産生に適した条件下で培養するステップとを含む方法。
【請求項３８】
前記生体分子が、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記アミノ酸が、リシン、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、またはメチオニンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記有機酸が、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記宿主細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項３７から４１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記宿主細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項３７から４２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記導入するステップが、形質転換、形質導入または電気穿孔によって実施される、請求項３７から４３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０から選択される配列を有するコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
【請求項４６】
前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項４５に記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年６月３０日に出願された米国仮出願第６２／３５６，９３４号の優先権の利益を主張し、その全体が、すべての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記述
【０００２】
本願に添付された配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供されており、参照により本明細書に組み込まれている。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＺＹＭＲ＿００６＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、２９ＫＢであり、２０１７年６月２８日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００３】
本開示は、微生物ゲノム操作を対象とする。開示されるゲノム操作方法は、酸素が乏しいまたは実質的に嫌気的な条件下で成長すると同時に、目的の産物を産生することができる株を生成するための、原核生物ヘモグロビン遺伝子のライブラリーの生成および前記ライブラリーの微生物宿主への導入を伴う。
【背景技術】
【０００４】
種々の望ましい代謝産物および重要な医薬の商業生産では、酸素要求性細菌、真菌および哺乳動物細胞の過剰発現能力を使用することができる。さらに、通性好気性菌または酸素を要求する産生経路に関連する商業的産物を生成するためのプロセス（例えば、発酵）の最適化の間、微生物への酸素送達が律速になることが多い。これは、工業規模のプロセス（例えば、発酵）の体積に対する表面積比が極めて低いことに主に起因し得る。酸素は水への溶解度が非常に低く、また、種々の微生物および培養細胞型で、特に大規模および高細胞密度産生プロセスにおいて酸素に対する栄養上の需要が大きい。酸素に対する大きな需要は、プロセスパラメータおよびバイオリアクターの形態を改善すること、例えば、すべて産生培地中の酸素の分圧を上昇させる機能を果たし得る、混合速度の改善、効率の高い分散系および培地の改変によって部分的に満たすことができる。しかし、これらの改善は、多くの場合、産生プロセス実行の資本費用および運転費用に直接寄与する。さらに、このような改善では、培養容器中の乱流および／またはせん断速度などの望ましくない流体力学的性質が生じる可能性がある方法が使用されることに加えて、所望の宿主微生物に対して最適以下の成長速度が生じる可能性がある培養培地が利用されることが多い。
【０００５】
よって、様々な微生物に広範に適用可能であり、物理的なバイオリアクターの構成要素または発酵培地の最適化に依存しない、工業的発酵における酸素制限の問題に対する創造的解決法についての当技術分野における大きな必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、工業的発酵における微生物に対する酸素制限の有害作用を緩和するために、遺伝子操作手法をとることによって上記の制限を克服する。具体的には、本開示は、工業的発酵における制限された酸素環境に関する問題を解決するためのライブラリー手法を提供する。例えば、ある実施形態では、本開示は、工業用微生物における異種細菌ヘモグロビン遺伝子および／またはフラボヘモグロビン遺伝子の試験、ならびに、工業用微生物における導入の、とりわけ、酸素の分圧、成長、および／または生産性の増大に対する効果の評定を提供する。
【０００７】
一態様では、第１のプロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結した異種細菌ヘモグロビン遺伝子を含む宿主細胞であって、第１のプロモーターポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される配列を含む宿主細胞が本明細書に提供される。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子は、配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子である。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子は、配列番号２６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子は、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子は、細菌フラボヘモグロビン遺伝子である。一部の場合では、細菌フラボヘモグロビン遺伝子は、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する。一部の場合では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。一部の場合では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。一部の場合では、宿主細胞は、生体分子を産生させる方法であって、宿主細胞を生体分子の産生に適した条件下で培養するステップを含む方法において使用される。一部の場合では、生体分子は、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである。一部の場合では、アミノ酸は、リシン、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、またはメチオニンである。一部の場合では、有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである。一部の場合では、アルコールは、エタノールまたはイソブタノールである。
【０００８】
別の態様では、生体分子の産生を増加させることが可能な微生物を生成するための方法であって、ａ）宿主微生物を遺伝子改変するステップであって、改変するステップは、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子を、宿主微生物のゲノムに導入することを含み、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子のそれぞれは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターに機能的に連結しており、改変は、細菌ヘモグロビン遺伝子を発現する宿主微生物の株を生成させる、ステップと；ｂ）宿主微生物の複数の株が生成するまで、ステップａ）を複数ラウンド繰り返すステップであって、宿主微生物の複数の株の各株は、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリー由来の別々の細菌ヘモグロビン遺伝子を発現する、ステップと；ｃ）宿主微生物の複数の株の各株を、発酵条件下で、炭素源と接触させるステップと；ｄ）対照微生物により産生される生体分子の量と比較して増加した量の生体分子を産生する宿主微生物の各株を選択するステップであって、対照微生物は、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子を発現しない、ステップとを含む方法が本明細書に提供される。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０から選択されるヌクレオチド配列を有する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、配列番号２６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択される１種または複数種のポリペプチド配列をコードする１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子は、細菌フラボヘモグロビン遺伝子である。一部の場合では、細菌フラボヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む。一部の場合では、ヘモグロビンのライブラリー内の細菌ヘモグロビンの少なくとも１種は、細菌フラボヘモグロビンである。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子および表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む。一部の場合では、宿主微生物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。一部の場合では、宿主微生物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである���一部の場合では、導入するステップは、形質転換、形質導入または電気穿孔によって実施される。一部の場合では、生体分子は、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである。一部の場合では、アミノ酸は、リシン、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、またはメチオニンである。一部の場合では、有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである。一部の場合では、アルコールは、エタノールまたはイソブタノールである。
【０００９】
さらに別の態様では、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーであって、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリー内の各細菌ヘモグロビン遺伝子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターに機能的に連結している、ライブラリーが本明細書に提供される。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０から選択されるヌクレオチド配列を有する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、配列番号２６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択される１種または複数種のポリペプチド配列をコードする１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む。一部の場合では、ライブラリー内の細菌ヘモグロビン遺伝子のそれぞれは、細菌フラボヘモグロビン遺伝子である。一部の場合では、細菌フラボヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリー内の細菌ヘモグロビン遺伝子の少なくとも１種は、細菌フラボヘモグロビン遺伝子である。一部の場合では、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子および表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む。一部の場合では、ライブラリーは、生体分子を産生させる方法であって、ライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子を宿主細胞に導入するステップと、宿主細胞を生体分子の産生に適した条件下で培養するステップとを含む方法において使用される。一部の場合では、生体分子は、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである。一部の場合では、アミノ酸は、リシン、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、またはメチオニンである。一部の場合では、有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである。一部の場合では、アルコールは、エタノールまたはイソブタノールである。一部の場合では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。一部の場合では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。一部の場合では、導入するステップは、形質転換、形質導入または電気穿孔によって実施される。
【００１０】
さらなる態様では、配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０から選択されるコドン最適化ポリヌクレオチドを含む配列を有する単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、ポリヌクレオチドが本明細書に提供される。一部の場合では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本開示の形質転換プラスミドのアセンブリー、および宿主生物中へのプラスミドの組込みを例示する。挿入配列挿入ＤＮＡ（insert  sequence  insert  DNA）を、アセンブリー反応において１つまたは複数の合成オリゴヌクレオチドを組み合わせることによって生成する。ＤＮＡ挿入体は、続くステップでＤＮＡをループアウトするように設計されているダイレクトリピート領域（すなわち、ホモロジーアーム）が隣接した所望のプロモーター配列を含有する。アセンブルされたプラスミドは、挿入ＤＮＡ（本明細書に提供されるプロモーターに機能的に連結した細菌ヘモグロビン遺伝子）を含有し、必要に応じて、１種または複数種の選択マーカーも含有する。
【００１２】
【図２】図２は、選択された、宿主株に由来するＤＮＡ領域をループアウトするための手順を例示する。挿入されたＤＮＡのダイレクトリピート（ＤＲ）領域は宿主株のゲノム内の対応する配列とループを形成する。選択マーカーについて対抗選択された細胞は、ループＤＮＡのＤＮＡ欠失を示す。
【００１３】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｂは、実施例１に記載の評価方法における異種細菌ヘモグロビン遺伝子の性能を例示する。図３Ａは、各コンテクスト（バックグラウンド）において試験した各ヘモグロビン遺伝子についての予測生産性の変化を例示する。図３Ｂは、各コンテクスト（バックグラウンド）において試験した各ヘモグロビン遺伝子についての予測される収率の変化を例示する。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｂは、実施例１に記載の評価方法における異種細菌ヘモグロビン遺伝子の性能を例示する。図３Ａは、各コンテクスト（バックグラウンド）において試験した各ヘモグロビン遺伝子についての予測生産性の変化を例示する。図３Ｂは、各コンテクスト（バックグラウンド）において試験した各ヘモグロビン遺伝子についての予測される収率の変化を例示する。
【００１４】
【図４】図４は、実施例１に記載の所望の発酵条件における異種細菌ヘモグロビン遺伝子の性能を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。
【００１６】
用語「１つの（ある）（ａ）」または「１つの（ある）（ａｎ）」は、その実体の１つまたは複数を指し、すなわち、複数の指示対象を指すことができる。よって、用語「１つの（ある）（ａ）」または「１つの（ある）（ａｎ）」、「１つまたは複数（１種または複数種）（one  or  more）」および「少なくとも１つ（少なくとも１種）（at  least  one）」は、本明細書で互換的に使用される。さらに、不定冠詞「１つの（ある）（ａ）」または「１つの（ある）（ａｎ）」による「１つの（ある）要素（an  element）」への言及は、文脈により唯一の要素が存在することが明確に要求されない限り、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。
【００１７】
文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語およびその変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（comprising）」などは、制限のない、包括的な意味で、すなわち、「これらに限定されないが、〜を含む（including,  but  not  limited  to）」と解釈されるべきである。
【００１８】
本明細書全体を通して「一実施形態（one  embodiment）」または「ある実施形態（an  embodiment）」への言及は、実施形態に関連して記載されている特定のフィーチャ、構造または特性が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれ得ることを意味する。よって、本明細書全体を通して各所での「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態に関するものではない可能性がある。明確にするために別々の実施形態との関連で記載されている本開示のある特定のフィーチャは、単一の実施形態において組み合わせて提供される場合もあることが理解される。逆に、簡潔のために単一の実施形態との関連で記載されている本開示の様々なフィーチャは、別々にまたは任意の適切な部分組合せで提供される場合もある。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「細胞生物」、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」は、広く解釈されるべきである。これらの用語は、互換的に使用することができ、これらに限定されない可能性があるが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌および原生生物を含む。一部の実施形態では、本開示は、本開示内に存在するリスト／表および図面の「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「細胞生物」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」に言及する。この特徴付けは、表および図面の同定された分類学的な属だけでなく、前記表または図面内の任意の生物の同定された分類学的な種、ならびに様々な新規のおよび新しく同定または設計された株も参照することができる。同じ特徴付けが、実施例などの本明細書の他の部分におけるこれらの用語の記述にも当てはまる。
【００２０】
用語「原核生物」は、当技術分野で認識されており、核または他の細胞小器官を含有しない細胞を指す。原核生物は一般に、２つのドメイン、細菌および古細菌の１つに分類される。古細菌ドメインと細菌ドメインの生物間の決定的な差異は、１６ＳリボソームＲＮＡ内のヌクレオチド塩基配列の基本的な差異に基づく。
【００２１】
用語「古細菌」は、Ｍｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ門の生物の分類を指し、典型的には、普通でない環境内で見つかり、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如を含めたいくつかの判定基準によって原核生物の残りと区別される。ｓｓｒＲＮＡ分析に基づいて、古細菌は、２つの系統学的に別個の群：ＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａからなる。これらの生理機能に基づいて、古細菌は、３つのタイプ：メタン生成菌（メタンを産生する原核生物）；高度好塩菌（非常に高濃度の塩（ＮａＣｌ）で生きる原核生物）；および高度（超）好熱菌（thermophilus）（非常に高温で生きる原核生物）へと組織化することができる。古細菌を細菌と区別する統一的古細菌フィーチャ（すなわち、細胞壁にムレインが無いこと、エステル連結膜脂質など）に加えて、これらの原核生物は、これらをその特定の生息環境に適応させるユニークな構造的または生化学的属性を呈する。Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａは、超好熱性硫黄依存性原核生物から主になり、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａは、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。
【００２２】
「細菌」または「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌は、以下の少なくとも１１の別個の群を含む：（１）２つの主要な亜門：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、その他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）が存在するグラム陽性（グラム＋）細菌；（２）Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む）；（３）シアノバクテリア、例えば、酸素発生型光合成生物；（４）スピロヘータおよび関連種；（５）Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ；（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ；（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も）；（１０）放射線抵抗性ミクロコッカスおよび近縁；（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。
【００２３】
「真核生物」は、細胞が、膜内に囲まれた核および他の小器官を含有する任意の生物である。真核生物は、分類群ＥｕｋａｒｙａまたはＥｕｋａｒｙｏｔａに属する。真核細胞を原核細胞（上記の細菌および古細菌）から分離する決定的なフィーチャは、これらが膜結合型小器官、特に、遺伝物質を含有し、核膜によって囲まれている核を有することである。
【００２４】
用語「遺伝的に改変された微生物」、「組換え微生物」、「組換え宿主細胞」、および「組換え株」は、本明細書で互換的に使用することができ、遺伝的に改変された微生物を指すことができる。よって、この用語は、微生物（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞など）であって、それが由来した自然に存在する微生物と比較して、それが変更された、改変された、または異なる遺伝子型および／または表現型（例えば、遺伝子改変が微生物のコーディング核酸配列に影響するとき）を呈するように遺伝的に変更、改変、または操作された、微生物を含む。この用語は、問題の特定の組換え微生物だけでなく、このような微生物の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。
【００２５】
用語「野生型微生物」は、自然に存在する細胞、すなわち、遺伝的に改変されていない細胞を記述することができる。
【００２６】
用語「遺伝子操作された（genetically  engineered）」は、微生物のゲノムの任意の操作（manipulation）（例えば、核酸の挿入または欠失による）を指すことができる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子（複数可）」は、遺伝子の１つまたは複数の代替形態のいずれかを意味することができ、これらの対立遺伝子すべては、少なくとも１つの形質または特性と関係する。二倍体細胞では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占有し得る。本開示は、諸実施形態においてＱＴＬ、すなわち、１種または複数種の遺伝子または調節配列を含み得るゲノム領域に関するので、一部の例では、「対立遺伝子」の代わりに「ハプロタイプ」（すなわち、染色体セグメントの対立遺伝子）を指すことがより正確であるが、これらの例では、用語「対立遺伝子」が用語「ハプロタイプ」を含むと理解されるべきである。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座（locus）」（複数の遺伝子座（loci））は、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見出される染色体上の具体的な１つもしくは複数の場所または部位を意味し得る。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝的に連結された」は、２種またはそれよりも多くの形質であって、これらが交雑によって分離するのが困難であるように、増殖中に高い割合で共遺伝される、形質を指すことができる。
【００３０】
「組換え」または「組換え事象」は、本明細書で使用される場合、染色体交差または独立組合せを指すことができる。用語「組換え体」は、組換え事象の結果として生じる新しい遺伝子構造を有する生物を指すことができる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「表現型」は、個々の遺伝子構造（すなわち、遺伝子型）と環境との相互作用から生じる個々の細胞、細胞培養物、生物、または生物の群の観察可能な特性を指すことができる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ」または「組換え体」は、核酸配列またはタンパク質配列を記述するとき、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドもしくは２つの異種ポリペプチドを連結して単一の巨大分子にする、または少なくとも１つの自然の核酸もしくはタンパク質配列の１つもしくは複数のエレメントを再編成することができる核酸またはタンパク質配列を指すことができる。例えば、用語「組換え体」は、例えば、化学合成による、または遺伝子操作技法による核酸の単離セグメントの操作による、配列の２つの別の方法で分離されたセグメントの人工の組合せを指すことができる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、自然に存在することが知られていない、または自然に存在しないヌクレオチド配列であり得る。一般に、このような合成ヌクレオチド配列は、任意の他の自然に存在するヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも１つのヌクレオチド差異を含む。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはこれらの類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すことができる。この用語は、分子の一次構造を指すことができ、よって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。これは、修飾核酸、例えば、メチル化および／またはキャッピングされた核酸、修飾塩基、主鎖修飾を含有する核酸なども含み得る。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用することができる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連したＤＮＡの任意のセグメントを指すことができる。よって、遺伝子は、これらに限定されないが、コード配列および／またはこれらの発現に要求される調節配列を含み得る。遺伝子は、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含み得る。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、または公知のもしくは予測された配列情報からの合成を含めた、様々な供給源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含み得る。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「相同の」または「相同体」または「オルソログ」は当技術分野で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指すことができる。用語「相同性」、「相同の」、「実質的に同様の」、および「実質的に対応する」は、本明細書で互換的に使用することができる。これらは、核酸断片であって、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介し、またはある特定の表現型を生じさせる核酸断片の能力に影響しない、核酸断片を指すことができる。これらの用語は、本開示の核酸断片の修飾、例えば、最初の無修飾断片と比べて得られる核酸断片の機能的性質を実質的に変更しない１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入なども指すことができる。したがって、当業者が十分に理解するように、本開示は、具体的な例示的な配列より多くを包含し得ることが理解される。これらの用語は、１つの種、亜種、変種、培養変種、または株内に見出される遺伝子と、別の種、亜種、変種、培養変種、または株内の対応するまたは等価な遺伝子との間の関係を記述することができる。本開示の目的に関して、相同配列を比較することができる。「相同配列」または「相同体」または「オルソログ」は、機能的に関連しているとみなされている、考えられている、または知られている場合がある。機能的関係は、これらに限定されないが、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じもしくは同様の生物学的機能を含めた、いくつかのやり方のいずれか１つにおいて示され得る。好ましくは（ａ）および（ｂ）の両方が示される。相同性は、当技術分野で容易に利用可能なソフトウェアプログラム、例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（F.M.  Ausubelら編、１９８７年）補遺３０、セクション７．７１８、表７．７１に論じられたものを使用して判定することができる。いくつかのアラインメントプログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、およびＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を指すことができる。例えば、変異は、サイレント置換、付加、または欠失を生じさせるが、コードされるタンパク質の性質もしくは活性、またはタンパク質が作製される方法を変更しない変更を含有する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質修飾」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸修飾、欠失、および／または挿入を指すことができる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」は、このような配列の最小限のサイズ特性を有する部分、または最大で全長分子の、および全長分子を含めた、全長分子の任意のより大きい断片を意味することができる。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物活性部分をコードすることができる。遺伝子調節エレメントの生物活性部分は、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの１つの部分を単離し、本明細書に記載の活性を評定することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの部分は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであり得、最大で全長ポリペプチドまで伸び得る。使用される部分の長さは、特定の用途に依存し得る。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の部分は、１２ヌクレオチドという短さであり得；一部の実施形態では、それは、２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの部分は、４アミノ酸という短さであり得る。完全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの部分は一般に、４アミノ酸より長くてよい。
【００４０】
バリアントポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリングなどの変異誘発および組換え誘導手順（recombinogenic  procedure）に由来し得る配列も包含する。このようなＤＮＡシャッフリングのストラテジーは、当技術分野で公知である。例えば、Stemmer（１９９４年）、PNAS、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁；Stemmer（１９９４年）、Nature、３７０巻：３８９〜３９１頁；Crameriら（１９９７年）、Nature  Biotech.、１５巻：４３６〜４３８頁；Mooreら（１９９７年）、J.  Mol.  Biol.、２７２巻：３３６〜３４７頁；Zhangら（１９９７年）、PNAS、９４巻：４５０４〜４５０９頁；Crameriら（１９９８年）、Nature、３９１巻：２８８〜２９１頁；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照。
【００４１】
本明細書に開示のポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に関して、オリゴヌクレオチドプライマーを、目的の任意の生物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応で使用するのに設計することができる。ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲクローニングを設計するための方法は、当技術分野で一般に公知であり、Sambrookら（２００１年）、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual（３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Plainview、New  York）に開示されている。Innisら編（１９９０年）、PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications（Academic  Press、New  York）；InnisおよびGelfand編（１９９５年）、PCR  Strategies（Academic  Press、New  York）；ならびにInnisおよびGelfand編（１９９９年）PCR  Methods  Manual（Academic  Press、New  York）も参照。ＰＣＲの公知の方法は、これらに限定されないが、対合プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを使用する方法を含み得る。
【００４２】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、増幅標的にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼを付着させ、それによって、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための作用物質の存在下で、かつ適当な温度およびｐＨで配置されたとき、ＤＮＡ合成の開始点として機能を果たすことができるオリゴヌクレオチドを指すことができる。（増幅）プライマーは、好ましくは、増幅の効率を最大にするために一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための作用物質の存在下で伸長産物の合成をプライムするのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマーの組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含有量）を含めた多くの因子に依存する。一対の双方向性プライマーは、ＰＣＲ増幅などのＤＮＡ増幅の技術分野で一般に使用されるように、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーからなる。
【００４３】
「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などハイブリッドの安定性に影響を及ぼすハイブリダイゼーション条件を指すことができる。これらの条件は、プライマーまたはプローブとその標的核酸配列との特異的結合が最大になり、かつ非特異的結合が最小になるように経験的に最適化することができる。使用される用語は、プローブまたはプライマーが、その標的配列に、他の配列よりも検出可能に大きな程度（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）までハイブリダイズする条件への言及を含み得る。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり得、異なる環境では異なるものになる。温度がより高いとより長い配列が特異的にハイブリダイズすることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨにおいて、特異的な配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択することができる。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブまたはプライマーとハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度およびｐＨの下で）であり得る。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のＮａ＋イオン、典型的には、約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）のものであり得、温度は、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブまたはプライマー（例えば、５０ヌクレオチドよりも長いもの）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することで実現することもできる。例示的な低ストリンジェント条件または「ストリンジェンシーが低下した条件」は、３０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液を用いた、３７℃でのハイブリダイゼーションおよび２×ＳＳＣ、４０℃での洗浄を含み得る。例示的な高ストリンジェンシー条件は、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ、６０℃での洗浄を含む。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野で周知であり、例えば、Ausubelら、１９９８年およびSambrookら、２００１年によって記載されている。一部の実施形態では、ストリンジェントな条件は、４５℃での、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％などの０．５〜２０％のドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）中でのハイブリダイゼーション、その後の、５５℃〜６５℃での、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５×ＳＳＣでの洗浄である。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」または「プロモーターポリヌクレオチド」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指すことができる。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、多くの場合、エンハンサーと呼ばれ得る。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり得、プロモーターの生来のエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来する場合があり、または自然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成される場合があり、または合成ＤＮＡセグメントを含むことさえできる。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型における、または発生の異なる段階における、または異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を指示することができることが当業者によって理解されている。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は、完全には画定されていないので、あるバリエーションのＤＮＡ断片は、同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識されている。
【００４５】
本明細書で使用される場合、語句「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書で互換的に使用することができる。組換えコンストラクトは、核酸断片の人工の組合せ、例えば、自然に一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む。例えば、キメラコンストラクトは、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、自然に見出されるものと異なる様式で配列されている調節配列およびコード配列を含み得る。一部の場合では、キメラコンストラクトは、調節配列（例えば、プロモーター）およびコード配列（例えば、原核生物ヘモグロビン遺伝子）を含む組換えコンストラクトであり得る。複数のコード配列を含むキメラコンストラクト中の各コード配列は、別々の調節配列によって制御することができるまたは別々の調節配列に機能的に連結することができる）。本明細書に記載のこのようなコンストラクトは、それ自体で使用することができ、またはベクターと併せて使用することができる。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に依存し得る。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本開示の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換する、選択する、および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントをよく知っている。当業者は、異なる独立した形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらすことになり（Jonesら（１９８５年）、EMBO  J.、４巻：２４１１〜２４１８頁；De  Almeidaら（１９８９年）、Mol.  Gen.  Genetics、２１８巻：７８〜８６頁）、よって、所望の発現レベルおよびパターンを表わす系統（line）を得るために、複数の事象がスクリーニングされなければならないことも認識する。このようなスクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析によって達成することができる。ベクターは、自律的に複製する、または宿主細胞の染色体内に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロ−ウイルス、ファージミド、トランスポゾン、および人工染色体などであり得る。ベクターは、自律複製していない裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡなどでもあり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟）の産生を指す。
【００４６】
「作動可能に連結した」または「機能的に連結した」は、本文脈において、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（例えば、原核生物ヘモグロビン遺伝子）との、前記さらなるポリヌクレオチド（例えば、原核生物ヘモグロビン遺伝子）の転写をもたらす、逐次配置（sequential  arrangement）を意味することができる。言い換えれば、「作動可能に連結した」または「機能的に連結した」は、プロモーターにより、前記プロモーターに隣接するまたはその下流またはそれに対して３’側の遺伝子（例えば、原核生物ヘモグロビン遺伝子）の転写が制御されることを意味することができる。
【００４７】
用語「炭素源」は一般に、細胞成長のための炭素の供給源として使用されるのに適した物質を指すことができる。炭素源は、これらに限定されないが、バイオマス加水分解産物、デンプン、スクロース、セルロース、ヘミセルロース、キシロース、およびリグニン、ならびにこれらの基質のモノマーコンポーネントを含み得る。炭素源は、これらに限定されないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含めた様々な形態での種々の有機化合物を含み得る。これらは、例えば、種々の単糖、例えば、グルコース、キシロース、デキストロース（Ｄ−グルコース）、マルトース、オリゴ糖、多糖、飽和または不飽和脂肪酸、スクシネート、ラクテート、アセテート、エタノールなど、またはこれらの混合物を含み得る。光合成生物は、光合成の産物として炭素源をさらに産生することができる。一部の実施形態では、炭素源は、バイオマス加水分解産物およびグルコースから選択され得る。
【００４８】
用語「供給材料」は、他の産物が作製され得る微生物または発酵プロセスに供給される原料または原料の混合物として定義することができる。例えば、バイオマスまたはバイオマスに由来する炭素化合物などの炭素源は、発酵プロセスにおいて目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）を産生する微生物のための供給材料であり得る。しかし、供給材料は、炭素源以外の栄養分を含有し得る。
【００４９】
用語「体積生産性」または「産生速度」は、単位時間当たり、媒体の体積当たりに形成される産物の量として定義することができる。体積生産性は、１時間当たり１リットル当たりのグラム（ｇ／Ｌ／ｈ）で報告することができる。
【００５０】
用語「比生産性」は、産物の形成の速度として定義することができる。生産性を発酵プロセスではなく微生物の生来のパラメータとして記述するために、生産性は、１時間当たり細胞乾燥重量（ＣＤＷ）１グラム当たりの産物のグラム（ｇ／ｇ  ＣＤＷ／ｈ）での比生産性として本明細書でさらに定義され得る。所与の微生物についてのＯＤ６００に対するＣＤＷの関係式を使用して、比生産性を、１時間当たり６００ｎｍにおける培養ブロスの光学密度（ＯＤ）当たり培養培地１リットル当たりの産物のグラム（ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ）として表現することもできる。
【００５１】
用語「収率」は、原料の単位重量当たりに得られる産物の量として定義することができ、基質１ｇ当たりの産物のｇ（ｇ／ｇ）として表現することができる。収率は、理論的収率のパーセンテージとして表現することができる。「理論的収率」は、産物を作製するのに使用される代謝経路の化学量論によって決まる所与の量の基質あたりに産生され得る産物の最大量として定義される。
【００５２】
用語「力価（titre）」または「力価（titer）」は、溶液の強度または溶液中の物質の濃度として定義することができる。例えば、発酵ブロス中の目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）の力価は、発酵ブロス１リットル当たりの溶液中の目的の産物のｇ（ｇ／Ｌ）として記述することができる。
【００５３】
用語「総力価」は、プロセスにおける初期体積またはプロセスにおける操作体積に対する、プロセスから取り出され、回収される溶液中の目的の産物、適用可能な場合、気相中の目的の産物、および任意の目的の産物を含むがこれらに限定されない、プロセスにおいて産生されるすべての目的の産物の和として定義することができる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「原核生物ヘモグロビン」は、１種または複数種のグロビンドメインを含有する、ヘムを含有する酸素結合タンパク質および／または輸送タンパク質である、原核細胞（すなわち、細菌または古細菌）に由来する任意のタンパク質を指すことができる。原核生物ヘモグロビンは、本明細書に記載のヘモグロビンタンパク質または関連するタンパク質、例えば、フラボヘモグロビンなどを指すことができる。原核生物ヘモグロビンタンパク質は、当技術分野で公知の細菌または古細菌の任意の属および／または種に由来するものであり得る。用語「細菌ヘモグロビン」は、本明細書で使用される場合、細菌に由来する、本明細書に記載のヘモグロビンタンパク質を指すことができる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「原核生物ヘモグロビン遺伝子」は、転写および／または翻訳されたとき、本明細書に記載の原核生物ヘモグロビンタンパク質をコードする任意の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を指すことができる。用語「細菌ヘモグロビン遺伝子」は、本明細書で使用される場合、細菌に由来する、本明細書に記載の細菌ヘモグロビンタンパク質を指すことができる。
【００５６】
本明細書で使用される用語「目的の産物」または「生体分子」は、供給材料から微生物によって産生される任意の産物を指す。一部の場合では、目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコールなどであり得る。例えば、目的の産物または生体分子は、任意の一次または二次細胞外代謝産物であり得る。一次代謝産物は、とりわけ、エタノール、クエン酸、乳酸、グルタミン酸、グルタメート、リシン、トレオニン、トリプトファン、および他のアミノ酸、ビタミン、多糖などであり得る。二次代謝産物は、とりわけ、ペニシリンのような抗生物質化合物、またはシクロスポリンＡのような免疫抑制剤、ジベレリンのような植物ホルモン、ロバスタチンのようなスタチン薬、グリセオフルビンのような殺真菌薬などであり得る。目的の産物、または生体分子は、微生物によって産生される任意の細胞内コンポーネント、例えば、カタラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼ、およびその他多くを含めた微生物酵素などでもあり得る。細胞内コンポーネントとして、組換えタンパク質、例えば、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなども挙げることができる。
概要
【００５７】
現代の工業用微生物の代謝プロセスに由来する膨大な量の産物を考慮すると、技術者が、所与の微生物が標的産物を産生できるスピードおよび効率を改善するよう非常に迫られているのは驚くことではない。したがって、代謝的操作手法では、例えば、微生物に対する酸素制限に関する有害作用を緩和するための、遺伝学的ストラテジーが探求される。１つの手法では、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａヘモグロビン遺伝子（ｖｈｂ）のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉへの移入が成功しており、ＶＨｂの発現に際して、微好気的条件下でＥ．ｃｏｌｉの成長およびタンパク質産生が増強された（Khosla  C.、Bailey  J.E.（１９８８年）、Heterologous  expression  of  a  bacterial  haemoglobin  improves  the  growth  properties  of  recombinant  E.coli.  Nature、３３１巻、６３３〜６３５頁およびKhosla  C.、Curtis  J.E.、DeModena  J.、Rinas  U.、Bailey  J.E.（１９９０年）、Expression  of  intracellular  hemoglobin  improves  protein  synthesis  in  oxygen-limited  E.coli.  Bio-Technology、８巻、８４９〜８５３頁参照）。さらに、Frey  ADら（２００３年）Bacterial  hemoglobins  and  flavohemoglobins:  versatile  proteins  and  their  impact  on  microbiology  and  biotechnology、FEMS  Microbiol  Rev.Oct、２７巻（４号）、５２５〜５４５頁において示されている通り、この手法により、多数の微生物における酸素により制限される成長ならびに／または一次および二次代謝産物の産生の効率の促進などの正の影響が生じている。しかし、Ｖｈｂの生化学的性質をすべての外来宿主細胞に対して最適化することはできず、また、従来の微生物ゲノム操作方法を使用して特定の宿主微生物においていずれのヘモグロビン遺伝子により正の影響が生じるかを決定することは労力を要し、かつ／または法外な費用がかかる可能性がある。
【００５８】
本開示は、従来の微生物株改善プログラムに関連する無数の問題を被らない微生物ゲノム操作方法を提供する。
【００５９】
本明細書に提供される一態様は、目的の生体分子または産物の産生増加が可能な微生物（例えば、細菌）を生成するための方法である。一般に、本明細書に提供される任意の生体分子の産生において使用するための微生物を生成するための方法は、標的遺伝子のライブラリーのメンバーを前記宿主微生物に導入して、前記微生物の、ゲノムが操作された株を生成することによって宿主微生物を遺伝子改変するステップと、前記操作された株を目的の生体分子または産物を産生させるのに適した条件下で培養するステップと、前記操作された株が増加した量の目的の生体分子または産物を産生する場合、前記操作された株を選択するステップとを伴い得る。量の増加は、宿主微生物の野生型株と比較したものであり得る。量の増加は、標的遺伝子のライブラリーのメンバーを含有しない宿主微生物の株と比較したものであり得る。標的遺伝子のライブラリーは、複数のベクターを含み得、ライブラリー内の各ベクターが、標的遺伝子に機能的に連結またはカップリングした少なくとも１つのプロモーターポリヌクレオチドを含むキメラコンストラクトを含む。
【００６０】
本開示の実施形態の１つの例示的なワークフローは、標的遺伝子を選択すること、標的遺伝子のための核酸（例えば、ＤＮＡ）を獲得または合成すること、および前記獲得または合成された標的遺伝子を適切なベクターにクローニングすることを伴う。標的遺伝子（複数可）を適切なベクター中にアセンブルするまたはクローニングするために、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意の方法を使用することができる。ベクターは、利用される宿主微生物に適合する、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意のベクターであり得る。標的遺伝子（複数可）を含むベクターがアセンブルされたら、宿主微生物に導入することができる。ベクターの導入は、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意の方法を使用することであり得る。宿主微生物は、本明細書に提供される任意の宿主微生物であり得る。宿主微生物に導入されたら、遺伝的に改変された宿主を選択することができ、標的遺伝子（複数可）の挿入を評価することができる。標的遺伝子（複数可）を、宿主微生物のゲノムの特定の場所に挿入されるように操作することができる。一部の場合では、標的遺伝子（複数可）を、宿主微生物内の意図されない経路／プロセスを撹乱せずに標的遺伝子（複数可）の発現を促進する、ゲノムの中立の部位に挿入する。一部の場合では、標的遺伝子（複数可）で宿主微生物内の特定の遺伝子（複数可）を置き換える。特定の遺伝子は、宿主微生物内に通常存在する相同標的遺伝子であり得る。例えば中立の組込み部位などの組込み部位は、経験的に決定することができ、したがって、種々の部位を試験することができ、宿主細胞にとって有害になることなく組込まれた標的遺伝子（複数可）を発現させることが可能な部位を選択することができる。所望の部位（例えば、中立の部位）への組込みは、標的遺伝子（複数可）を所望の組込み部位と相同の配列の部分（すなわち、ホモロジーアーム）を含むベクターにクローニングし、その後、宿主細胞において組換え事象を行うことによって容易にすることができる。標的遺伝子（複数可）は、相同配列の部分の間に挿入することができる。一実施形態では、ベクターは、所望の組込み部位と相同の約２ｋｂの配列を含む。所望の部位と相同の配列を、原核生物ヘモグロビン遺伝子挿入体に、配列の第１の部分が遺伝子挿入体の上流（すなわち、５’側）にあり、配列の第２の部分が遺伝子挿入体の下流（すなわち、３’側）にあるように隣接させることができる。別の実施形態では、ベクターは、所望の組込み部位と相同の約４ｋｂの配列を含む。この実施形態では、ベクターは、原核生物ヘモグロビン遺伝子挿入体の上流（すなわち、５’側）にある、所望の組込み部位と相同の約２ｋｂの配列および原核生物ヘモグロビン遺伝子挿入体の下流（すなわち、３’側）にある、所望の組込み部位と相同の約２ｋｂの配列を含む。一実施形態では、組込みを、シングルクロスオーバーによる組込み、および続く、ベクター骨格内に存在するマーカーに対する対抗選択によって容易になるプラスミド骨格のループアウトによって実施する。一実施形態では、標的遺伝子は、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意の原核生物ヘモグロビン遺伝子である。
【００６１】
挿入の評価は、例えば、遺伝的に改変された微生物のゲノムまたはその一部の増幅および／または配列決定などの当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施することができる。一部の場合では、本明細書に提供される方法は、本明細書に記載の対抗選択による選択マーカーの除去またはループアウトも伴う。ループアウトは、本明細書に提供される方法のいずれかを使用して実施することができる。
【００６２】
標的遺伝子（複数可）の挿入、および、必要に応じた、選択マーカーの除去の評価後、遺伝的に改変された株を、目的の生体分子または産物を産生するその能力について評価することができる。評価の前に、必要に応じたステップにより、株を増やすことができる。増大は、遺伝的に改変された株をプレート上またはマルチウェルプレートのウェル中、増大に適した成長培地で培養することを伴い得る。評価ステップは、遺伝的に改変された株を、目的の生体分子または産物の産生のための実際の条件を模倣するように設計された成長培地／条件を含むプレート上またはマルチウェルプレートのウェル中で培養することを伴い得る。一部の場合では、このステップにおける成長培地は、グルコースの代謝プロセシングに由来する目的の生体分子または産物の産生に適する。評価ステップにより決定したところ、遺伝的に改変された株が、目的の生体分子または産物の所望のまたは閾値の産生率または収率を有するまたはそれを生じることが予測される場合、その株を選択し、低温貯蔵することができる。予測は、株の培養中の様々な時点で形成された目的の産物およびバイオマスの量を測定することに基づき得、その測定値を使用して、増やされたまたはより大きな規模の条件（例えば、発酵条件）下で前記株がどのように働くかを予測する。一実施形態では、予測は、評価方法中の株の性能の線形回帰分析に基づく。
【００６３】
一部の場合では、目的の生体分子または産物の所望のまたは閾値の産生率または収率を有するまたはそれを生じると予測される、遺伝的に改変された株を、目的の生体分子または産物を産生させるための条件（例えば、発酵条件）下、より大きな培養物に移すまたはその中で成長させる。このステップを、選択された株が、目的の生体分子または産物の産生のための実際の条件下で予測された通りに働くことができるかどうかを決定するために使用することができる。一部の場合では、目的の生体分子または産物の所望のまたは閾値の収率および／または生産率を生じる遺伝的に改変された微生物の１種または複数種の株を選択するために、本明細書に提供されるものなどの標的遺伝子のライブラリー由来の各標的遺伝子の導入および評価のための本明細書に提供されるステップをライブラリー由来の各標的遺伝子に対して繰り返す。
【００６４】
一実施形態では、目的の生体分子または産物は、酸素の乏しい環境で成長した微生物に由来し、したがって、本明細書に提供される方法は、微生物内の酸素の分圧が増加している微生物の株（複数可）を生成し、それにより、微生物が、前記酸素の乏しい環境で成長させたときに、増加した量の目的の生体分子または産物を産生することを可能にすることを伴う。一実施形態では、本明細書に提供される方法は、酸素結合および／または輸送に関与する１種または複数種の標的遺伝子の導入を伴う。一実施形態では、標的遺伝子は、原核生物ヘモグロビン遺伝子であり、したがって、本明細書に提供される方法で原核生物ヘモグロビン遺伝子を宿主微生物に導入する。原核生物ヘモグロビン遺伝子は、宿主微生物において異種遺伝子であり得る。一実施形態では、原核生物ヘモグロビン遺伝子の宿主微生物への導入により、宿主微生物内の酸素のレベルまたは分圧を上昇させるための系がもたらされる。レベルまたは分圧の上昇は、前記微生物の野生型株または前記異種原核生物ヘモグロビン遺伝子を発現しない微生物に対するものであり得る。本明細書に提供される方法によって生じる目的の生体分子または産物は、微生物により産生されるあらゆる商業的産物であり得る。一部の場合では、目的の生体分子または産物は、発酵により産生される。一部の場合では、目的の生体分子または産物は、医薬、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである。アミノ酸は、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンであり得る。有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートであり得る。アルコールは、エタノールまたはイソブタノールであり得る。
【００６５】
一実施形態では、開示される微生物ゲノム操作方法では、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーを利用する。細菌ヘモグロビン遺伝子は、酸素の結合および／または細胞内への輸送に関するヘモグロビン親和性に基づいて選択することができる。操作後、微生物を、得られる転帰、例えば、成長速度および／または本明細書に提供される産物の産生について効率的にスクリーニングまたは評価することができる。本明細書に提供されるライブラリーを利用して特定のゲノムの変更を定義し、次いで、変更を有する宿主微生物ゲノムを試験／スクリーニングするこのプロセスは、効率的かつ反復的に実行することができ、また、宿主細胞における発現により所望のまたは閾値のレベルの成長または目的の生体分子もしくは産物の産生を生じる特定の細菌ヘモグロビン遺伝子を同定するために使用することができる。
【００６６】
一実施形態では、本明細書に提供される方法において使用するための本明細書に提供される各原核生物ヘモグロビン遺伝子（例えば、細菌ヘモグロビン遺伝子）は、天然プロモーターまたは本明細書に提供されるプロモーターポリヌクレオチドのいずれかの制御下にあるまたは機能的に連結している。「プロモーターポリヌクレオチド」または「プロモーター」または「プロモーター活性を有するポリヌクレオチド」は、転写されるポリヌクレオチドに機能的に連結している場合、コーディングポリヌクレオチド（例えば、原核生物ヘモグロビン遺伝子または細菌ヘモグロビン遺伝子）の転写の開始の点および頻度を決定し、それにより、制御されるポリヌクレオチドの発現の強度に影響を及ぼすことを可能にする、ポリヌクレオチド、好ましくはデオキシリボポリヌクレオチド、または核酸、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を意味することができる。一実施形態では、原核生物ヘモグロビン遺伝子（例えば、細菌ヘモグロビン遺伝子）を含むライブラリー内の各原核生物ヘモグロビン遺伝子（例えば、細菌ヘモグロビン遺伝子）は、同じまたは同一のプロモーターの制御下にある。一実施形態では、原核生物ヘモグロビン遺伝子（例えば、細菌ヘモグロビン遺伝子）を含むライブラリー内の各原核生物ヘモグロビン遺伝子（例えば、細菌ヘモグロビン遺伝子）は、別々のまたは異なるプロモーターの制御下にある。
【００６７】
一実施形態では、原核生物ヘモグロビン遺伝子（例えば、細菌ヘモグロビン遺伝子）のライブラリーの生成において使用するためのプロモーターラダーが本明細書に提供される。用語「プロモーターラダー」は、本明細書で使用される場合、プロモーター活性のレベルが漸増して上昇する複数のプロモーターを指す。用語「プロモーター活性」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を開始させるプロモーターの能力を指す。プロモーター活性を評定する方法は当業者には周知であり、例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１５年１２月７日に出願されたＵＳ６２／２６４，２３２の実施例２、およびＰＣＴ／ＵＳ１６／６５４６４（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１００３７６号）に記載されている方法を挙げることができる。用語「構成的プロモーター」は、本明細書で使用される場合、内部または外部の細胞条件にかかわらず、定速でその関連する遺伝子の転写を指示するプロモーターを指すことができる。
プロモーター
【００６８】
一部の実施形態では、本開示は、ＲＮＡ分解機能をモジュレートし、全体的な宿主株生産性に対する有益な効果を生じさせるために最適な発現性質を有するプロモーターを選択する方法を教示する。
【００６９】
プロモーターは、遺伝子が転写される速度を調節し、様々なやり方で転写に影響を与えることができる。構成的プロモーターは、例えば、内部または外部の細胞条件にかかわらず、定速でこれらの関連する遺伝子の転写を指示し、一方、調節可能プロモーターは、内部および／または外部の細胞条件、例えば、成長速度、温度、具体的な環境化学物質に対する応答などに応じて遺伝子が転写される速度を増減する。プロモーターは、これらの正常な細胞コンテクストから単離することができ、操作されて、実質的に任意の遺伝子の発現を調節することができ、細胞成長、産物収率、および／または目的の他の表現型の有効な改変を可能にする。
【００７０】
一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度（例えば、以下に論じられるプロモーターラダー）、または優れた調節性質（すなわち、選択された遺伝子のより厳格な調節制御）を呈する、宿主細胞内の１つもしくは複数のプロモーターを同定し、かつ／または１つもしくは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を教示する。これらの同定および／または生成されるプロモーターの特定の組合せを、以下でより詳細に説明されるＲＮＡ分解撹乱実験において使用するためのプロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【００７１】
一部の実施形態では、プロモーターラダーは、一連の発現強度を有する目的の標的遺伝子と関連がある自然、天然、または野生型プロモーターを同定することによって作製される。これらの同定されたプロモーターは、プロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【００７２】
一部の実施形態では、プロモーターラダーは、目的の標的遺伝子と関連がある自然、天然、または野生型プロモーターを同定し、次いで、前記プロモーターを変異させて、複数の変異プロモーター配列を誘導することによって、作製される。これらの変異プロモーターのそれぞれは、標的遺伝子発現に対する効果について試験される。一部の実施形態では、編集されたプロモーターは、様々な条件にわたって発現活性について試験され、その結果、各プロモーターバリアントの活性がデータベース内に記録され／特徴付けられ／アノテートされ、かつ記憶される。結果として生じる編集されたプロモーターバリアントは、引き続いて組織化されて、これらの発現の強度に基づいて配列されたプロモーターラダーにされる（例えば、頂部付近に高度発現バリアントおよび底部付近に減弱された発現を有し、したがって、用語「ラダー」をもたらす）。
【００７３】
一部の実施形態では、本開示は、同定された自然に存在するプロモーターおよび変異されたバリアントプロモーターの組合せであるプロモーターラダーを教示する。
【００７４】
一部の実施形態では、本開示は、以下の判定基準：１）構成的プロモーターのラダーを表した；および２）短いＤＮＡ配列、理想的には１００塩基対未満によってコードされ得る、の両方を満たした自然、天然、または野生型プロモーターを同定する方法を教示する。一部の実施形態では、本開示の構成的プロモーターは、２つの選択された成長条件（典型的には、工業的な培養中に経験した条件の間で比較した）にわたって一定の遺伝子発現を呈する。一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、約６０塩基対のコアプロモーターおよび長さが２６から４０塩基対の間の５’ＵＴＲからなる。
【００７５】
一部の実施形態では、上記の同定した自然に存在するプロモーター配列の１つまたは複数が、遺伝子編集のために選択される。一部の実施形態では、自然のプロモーターは、任意の公知の遺伝子変異方法を介して編集される。他の実施形態では、本開示のプロモーターは、所望の配列を有する新しいプロモーターバリアントを合成することによって編集される。
【００７６】
２０１５年１２月７日に出願された米国特許出願第６２／２６４，２３２号および２０１６年１２月７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１６／６５４６４（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１００３７６号）の開示全体は、すべての目的に関してそれぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００７７】
本開示のプロモーターの非網羅的なリストを以下の表１に提供する。表１のプロモーター配列のそれぞれは、異種プロモーターまたは異種プロモーターポリヌクレオチドと呼ぶことができる。
【表１】
2019519242.tif 000003
【００７８】
一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、表１由来のプロモーター配列に対して少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、または７５％の配列同一性を呈する。
原核生物ヘモグロビン遺伝子
【００７９】
本明細書に提供される方法において使用するための原核生物ヘモグロビン遺伝子のライブラリーが本明細書に提供される。原核生物ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、１種または複数種の原核生物ヘモグロビン遺伝子を含み得る。ライブラリー内の各原核生物ヘモグロビン遺伝子は、原核生物ヘモグロビン遺伝子の天然形態または変異形態であり得る。変異形態は、挿入、欠失、一塩基多型（ＳＮＰ）、または転座から選択される１つまたは複数の変異を含み得る。ライブラリー内の各原核生物ヘモグロビン遺伝子は、細菌ヘモグロビン遺伝子であり得る。細菌ヘモグロビン遺伝子は、当技術分野で公知の任意の細菌ヘモグロビン遺伝子であり得る。細菌ヘモグロビン遺伝子は、細菌ヘモグロビンライブラリーの生成のために、例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ１９９２００３５４６およびＵＳ６７５９２１８などの文献において報告されているそれらの特性に基づいて選択され得る。宿主細胞は、本明細書に提供される任意の宿主細胞であり得る。一実施形態では、原核生物ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｈａｓｓａｌｌｉａ、Ｈｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓａｎｄａｒａｃｉｎｕｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｕｌｆｕｒｉｍｏｎａｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａまたはこれらの組合せの任意の株／種／亜種に由来する原核生物ヘモグロビン遺伝子を含む。一実施形態では、原核生物ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、表２に列挙された生物またはこれらの組合せから選択される１種または複数種の原核生物ヘモグロビン遺伝子を含む。本明細書に提供されるヘモグロビン遺伝子のライブラリーに含めるための、表２に列挙された生物に由来するヘモグロビン遺伝子を、本明細書に提供される宿主細胞における発現のために、本明細書に記載の通りコドン最適化することができる。
【００８０】
【表２−１】
2019519242.tif 000004
【表２−２】
2019519242.tif 000005
【表２−３】
2019519242.tif 000006
【００８１】
一実施形態では、原核生物ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０またはこれらの組合せから選択される１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、本開示のヘモグロビン遺伝子は、本明細書に提供されるヘモグロビン遺伝子に対して少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、または７５％の配列同一性を呈する。
【００８３】
一実施形態では、原核生物ヘモグロビン遺伝子のライブラリーは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４またはこれらの組合せから選択されるポリペプチド配列をコードする原核生物ヘモグロビン遺伝子を含む。
【００８４】
一部の実施形態では、本開示のヘモグロビン遺伝子によりコードされるヘモグロビンポリペプチドは、本明細書に提供されるヘモグロビンポリペプチドに対して少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、または７５％の配列同一性を呈する。
【００８５】
ライブラリー内の各原核生物ヘモグロビン遺伝子は、その天然プロモーターまたはその天然プロモーターの変異形態に機能的に連結するまたはその制御下におくことができる。ライブラリー内の各原核生物ヘモグロビン遺伝子は、本明細書に提供される任意のプロモーターに機能的に連結するまたはそれにより制御することができる。ライブラリー内の各原核生物ヘモグロビン遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される配列を含むプロモーターポリヌクレオチド配列によって制御することができる。ライブラリー内の各原核生物ヘモグロビン遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される配列を含有するプロモーターポリヌクレオチド配列によって制御することができる。一実施形態では、ライブラリー内の各原核生物ヘモグロビン遺伝子は、原核生物ヘモグロビン遺伝子のセットとして存在し、各セットは、配列番号１に機能的に連結した１つの原核生物ヘモグロビン遺伝子、配列番号２に機能的に連結した１つの原核生物ヘモグロビン遺伝子、配列番号３に機能的に連結した１つの原核生物ヘモグロビン遺伝子、配列番号４に機能的に連結した１つの原核生物ヘモグロビン遺伝子、配列番号５に機能的に連結した１つの原核生物ヘモグロビン遺伝子、配列番号６に機能的に連結した１つの原核生物ヘモグロビン遺伝子、配列番号７に機能的に連結した１つの原核生物ヘモグロビン遺伝子および配列番号８に機能的に連結した１つの原核生物ヘモグロビン遺伝子またはこれらの組合せを有する。原核生物ヘモグロビン遺伝子のライブラリー内の各原核生物ヘモグロビン遺伝子は、キメラコンストラクト中に、遺伝子が１種または複数種の調節配列および／または宿主細胞のゲノム内に存在する配列と相同の配列と隣接することができるように存在することができる。宿主細胞に存在する配列と相同の配列により、相補配列を含む宿主細胞のゲノムの部位または遺伝子座への原核生物ヘモグロビン遺伝子の組込みを促進することができる。組込みは、組換え事象を介したものであり得る。調節配列は、例えば、宿主細胞の遺伝機構によって使用される、プロモーター配列、開始配列、停止配列、シグナル配列、分泌配列および／または終結配列などの、当技術分野で公知のまたは本明細書に提供される任意の調節配列であり得る。終結配列は、配列番号２１または配列番号２２から選択することができる。
【００８６】
一実施形態では、本明細書に提供されるライブラリーまたは方法に含めるための候補原核生物ヘモグロビンを当技術分野で公知の１種または複数種の原核生物ヘモグロビンとのその類似性に基づいて選択する。類似性は、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムなどの、核酸またはタンパク質配列間の配列アラインメントを実施するための当技術分野で公知のアルゴリズムを使用して決定することができる。例えば、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ  ｓｔｅｒｃｏｃａｒｉａ由来のヘモグロビンのアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用したＴＲＥＭＢＬタンパク質データベース検索のシードに使用することができる。シードヘモグロビン（例えば、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ  ｓｔｅｒｃｏｃａｒｉａ由来のヘモグロビンのアミノ酸配列）に対するある特定の類似性の範囲内に入るすべての候補ヘモグロビンを選択することができる。ある特定の類似性は、シードとして使用されるヘモグロビン（例えば、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ  ｓｔｅｒｃｏｃａｒｉａ由来のヘモグロビンのアミノ酸配列）と概ねアラインする候補ヘモグロビンが選択されるような閾値であり得る。一部の場合では、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用し、シードヘモグロビン（例えば、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ  ｓｔｅｒｃｏｃａｒｉａ由来のヘモグロビンのアミノ酸配列）と概ねアラインする候補ヘモグロビンは、ＢＬＡＳＴ  Ｅ値が５のものである。その後、セット内の各選択された候補配列間のペアワイズアラインメントを行って、各配列をセット内の任意の他の配列と関連付ける類似性スコアを生成することができる。ペアワイズアラインメントは、例えば、http://efi.igb.illinois.edu/efi-est/において利用可能なオンラインツールなどの当技術分野で公知の任意のペアワイズアラインメントツールを使用して行うことができる。選択された候補をほぼ類似の候補配列のセットにサブグループ化することができる。サブグループ化は、例えばソフトウェアツールＣｙｔｏｓｃａｐｅ（ｃｙｔｏｓｃａｐｅ．ｏｒｇ）などのクラスタリングアルゴリズムを使用して実施することができる。次いで、ライブラリー内に存在し得る配列の多様性を最大にするために、各サブグループからの代表的な候補を選択することができる。各選択された候補ヘモグロビンは、続く本明細書に提供されるヘモグロビン遺伝子のライブラリーへの包含のために、本明細書に記載の通りその対応する核酸配列をコドン最適化させることができる。
原核生物ヘモグロビン遺伝子の変異形態の生成
【００８７】
本明細書に提供される通り、本明細書に提供される方法において使用するための原核生物ヘモグロビン遺伝子は、それが由来する遺伝子の変異形態であり得る。変異遺伝子は、当技術分野で公知のまたは本明細書に提供される任意のやり方で変異させたものであり得る。
【００８８】
一部の実施形態では、本開示は、ゲノムＤＮＡの選択された部分を導入し、欠失させ、または置き換えることによって細胞集団を変異させることを教示する。よって、一部の実施形態では、本開示は、特定の遺伝子座（例えば、原核生物ヘモグロビン遺伝子）に変異を標的化するための方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ領域を選択的に編集するための遺伝子編集技術、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮＳ、またはＣＲＩＳＰＲの使用を教示する。細胞集団を変異させた後、標的化された変異を細胞から単離し、その後、本明細書に記載の原核生物ヘモグロビン遺伝子のライブラリーを生成するために使用することができる。
【００８９】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物の外で選択されたＤＮＡ領域（例えば、原核生物ヘモグロビン遺伝子）を変異させることを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、天然原核生物ヘモグロビン遺伝子を変異することを教示する。
【００９０】
一部の実施形態では、ＤＮＡの選択された領域は、自然バリアントの遺伝子シャッフリング、または合成オリゴとのシャッフリング、プラスミド−プラスミド組換え、ウイルスプラスミド組換え、またはウイルス−ウイルス組換えを介してｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成される。他の実施形態では、ゲノム領域は、エラープローンＰＣＲまたは部位特異的変異誘発を介して生成される。
【００９１】
一部の実施形態では、原核生物ヘモグロビン遺伝子を含有する選択された遺伝領域で変異を生成するステップは、「リアセンブリーＰＣＲ」によって達成される。簡単に言えば、オリゴヌクレオチドプライマー（オリゴ体）が、目的の核酸配列（例えば、原核生物ヘモグロビン遺伝子）のセグメントをＰＣＲ増幅するために合成され、その結果、オリゴヌクレオチドの配列は、２つのセグメントの接合部と重複する。重複領域は、典型的には、長さが約１０〜１００ヌクレオチドである。セグメントのそれぞれは、一連のこのようなプライマーで増幅される。次いでＰＣＲ産物は、アセンブリープロトコールに従って「リアセンブルされる」。簡単に説明すると、アセンブリープロトコールでは、ＰＣＲ産物は、例えば、ゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーによって最初に精製されてプライマーから離れる。精製産物は、一緒に混合され、追加のプライマーの非存在下で（「セルフプライミング」）、ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）および適切な緩衝塩の存在下で、約１〜１０サイクルの変性、リアニーリング、および伸長に供される。遺伝子に隣接するプライマーを用いた後続のＰＣＲが使用されて、完全にリアセンブルおよびシャッフルされた遺伝子の収量が拡大される。
【００９２】
本開示の一部の実施形態では、上記に論じたものなどの変異ヘモグロビンＤＮＡ領域は、変異体配列について富化され、その結果、複数の変異体スペクトル、すなわち、変異の可能な組合せが、より効率的にサンプリングされる。一部の実施形態では、変異配列は、アセンブリー反応の前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで親和性精製材料を増幅する好適なステップを用いて、ｍｕｔＳタンパク質親和性マトリックスを介して同定される（Wagnerら、Nucleic  Acids  Res.、２３巻（１９号）：３９４４〜３９４８頁（１９９５年）；Suら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.(U.S.A.)、８３巻：５０５７〜５０６１頁（１９８６年））。次いでこの増幅された材料は、アセンブリーまたはリアセンブリーＰＣＲ反応にかけられる。
原核生物ヘモグロビン遺伝子を含むライブラリーの生成
【００９３】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物の原核生物ヘモグロビン遺伝子を含むＤＮＡセグメントを挿入することおよび／または置き換えることおよび／または欠失させることを教示する。一部の態様では、本明細書に教示の方法は、宿主生物のゲノム内に組み込むことができる目的のオリゴヌクレオチド（すなわち、原核生物ヘモグロビンセグメント）を形成することを伴う。一部の実施形態では、本開示の原核生物ヘモグロビンＤＮＡセグメントは、公知の鋳型からのコピーもしくはカット、変異、またはＤＮＡ合成を含む、当技術分野で公知の任意の方法を介して得ることができる。一部の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列を生成するための市販の遺伝子合成産物（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）、ＧｅｎｅＭａｋｅｒ（商標）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）、Ａｎａｇｅｎ（商標）、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ（商標）、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（商標）、ＧｅＮＯｓｙｓ，Ｉｎｃ．、またはＱｉａｇｅｎ（商標））に適合する。
【００９４】
一部の実施形態では、原核生物ヘモグロビンＤＮＡセグメントは、宿主生物の選択されたＤＮＡ領域内に原核生物ヘモグロビンＤＮＡセグメントを組み込むように設計されている。選択されたＤＮＡ領域は、中立の組込み部位であり得る。他の実施形態では、原核生物ヘモグロビンＤＮＡセグメントは、宿主生物のＤＮＡから天然原核生物ヘモグロビン遺伝子を除去するように設計されている。
【００９５】
一部の実施形態では、本発明の方法で使用される原核生物ヘモグロビン遺伝子は、当技術分野で公知の酵素合成または化学合成の方法のいずれかを使用してオリゴヌクレオチドとして段階的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは、固体支持体、例えば、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレンビーズ、またはＣＰＧを含有し得る熱可塑性ポリマーから構成される膜上で合成することができる。オリゴヌクレオチドは、アレイ上で、マイクロフルイディクスを使用して並列の微小規模で（Tianら、Mol.  BioSyst.、５巻、７１４〜７２２頁（２００９年））、または両方の組合せを提供する公知の技術で（Jacobsenら、米国特許出願第２０１１／０１７２１２７号を参照）合成することもできる。
【００９６】
アレイ上の、またはマイクロフルイディクスによる合成は、より低い試薬使用を通じてコストを低減することによって、慣例的な固体支持体合成にまさって利点を提供する。遺伝子合成に要求される規模は低く、したがって、アレイから、またはマイクロフルイディクスを通じて合成されるオリゴヌクレオチド産物の規模は、許容される。しかし、合成されるオリゴヌクレオチドは、固体支持体合成を使用するときより低い品質のものである（Tian、以下を参照；Staehlerら、米国特許出願第２０１０／０２１６６４８号も参照）。
【００９７】
伝統的な４ステップホスホスホルアミダイト化学において、それが１９８０年代に最初に記載されて以来、多数の進歩が実現されている（例えば、ペルオキシアニオンの脱保護を使用するSierzchalaら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１２５巻、１３４２７〜１３４４１頁（２００３年）；代替の保護基についてHayakawaら、米国特許第６，０４０，４３９号；ユニバーサル支持体についてAzhayevら、Tetrahedron、５７巻、４９７７〜４９８６頁（２００１年）；大孔ＣＰＧの使用によるより長いオリゴヌクレオチドの改善された合成についてKozlovら、Nucleosides,  Nucleotides,  and  Nucleic  Acids、２４巻（５〜７号）、１０３７〜１０４１頁（２００５年）；および改善された誘導体化についてDamhaら、NAR、１８巻、３８１３〜３８２１頁（１９９０年）を参照）。
【００９８】
合成のタイプにかかわらず、次いで結果として生じるオリゴヌクレオチドは、より長いオリゴヌクレオチド（すなわち、原核生物ヘモグロビン遺伝子）のためのより小さいビルディングブロックを形成することができる。一部の実施形態では、より小さいオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知のプロトコール、例えば、ポリメラーゼ連鎖アセンブリ（polymerase  chain  assembly）（ＰＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および熱力学的にバランスの取れたインサイドアウト合成（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＴＢＩＯ）を使用して一緒に接合することができる（Czarら、Trends  in  Biotechnology、２７巻、６３〜７１頁（２００９年）を参照）。ＰＣＡでは、所望のより長い産物の全長にわたるオリゴヌクレオチドを、複数のサイクル（典型的には約５５サイクル）においてアニールおよび伸長させて、完全長産物を最終的に達成する。ＬＣＲは、リガーゼ酵素を使用して２つのオリゴヌクレオチドを接合し、これらはともにアニールされて第３のオリゴヌクレオチドになる。ＴＢＩＯ合成は、所望の産物の中心から開始し、遺伝子の５’末端における順方向鎖と、かつ遺伝子の３’末端における逆方向鎖と相同性である重複オリゴヌクレオチドを使用することによって両方向で漸進性に伸長される。
【００９９】
より大きい二本鎖ＤＮＡ断片を合成する別の方法は、トップストランドＰＣＲ（ＴＳＰ）によってより小さいオリゴヌクレオチドを組み合わせることである。本方法では、複数のオリゴヌクレオチドが所望の産物の全長にわたり、隣接するオリゴヌクレオチド（複数可）に対して重複領域を含有する。増幅は、ユニバーサル順方向および逆方向プライマーを用いて、かつ複数のサイクルの増幅を通じて実施することができ、全長の二本鎖ＤＮＡ産物が形成される。次いでこの産物は、必要に応じた誤差補正およびさらなる増幅を受けることができ、それにより、所望の二本鎖ＤＮＡ断片最終産物がもたらされる。
【０１００】
ＴＳＰの一方法では、全長の所望の産物を形成するのに組み合わされるより小さいオリゴヌクレオチドのセットは、４０〜２００塩基の間の長さであり、少なくとも約１５〜２０塩基互いに重複する。実用的な目的のために、重複領域は、オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングを確実にするために最小でも十分長く、使用される反応温度でアニールするために十分高い融解温度（Ｔｍ）を有するべきである。重複は、所与のオリゴヌクレオチドが隣接するオリゴヌクレオチドによって完全に重複されるポイントまで伸長することができる。重複の量は、最終産物の品質に対していずれの効果も有さないようである。アセンブリー内の最初および最後のオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、順方向および逆方向増幅プライマーのための結合部位を含有するべきである。一実施形態では、最初および最後のオリゴヌクレオチドの端末側終端配列は、同じ相補性を有する配列を含有してユニバーサルプライマーの使用を可能にする。
プラスミドのアセンブリング／クローニング
【０１０１】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物のゲノム内に所望の原核生物ヘモグロビン遺伝子を挿入することができるベクターを構築するための方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、挿入ＤＮＡ（例えば、原核生物ヘモグロビン遺伝子）、ホモロジーアーム、および少なくとも１つの選択マーカーを含むベクターをクローニングする方法を教示する（図１を参照）。
【０１０２】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物内への形質転換に適した任意のベクターに適合する。一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞に適合するシャトルベクターの使用を教示する。一実施形態では、本明細書に提供される方法において使用するためのシャトルベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主細胞に適合するシャトルベクターである。本明細書に提供される方法において使用するためのシャトルベクターは、本明細書に記載の選択および／または対抗選択のためのマーカーを含み得る。マーカーは、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意のマーカーであり得る。シャトルベクターは、任意の調節配列（複数可）および／または当技術分野で公知の前記シャトルベクターのアセンブリーにおいて有用な配列をさらに含み得る。シャトルベクターは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなど本明細書に提供される宿主細胞内での増殖に必要とされ得る任意の複製起点をさらに含むことができる。調節配列は、当技術分野で公知の、または本明細書に提供される任意の調節配列、例えば、宿主細胞の遺伝機構によって使用される、プロモーター配列、開始配列、停止配列、シグナル配列、分泌配列、および／または終結配列などであり得る。終結配列は、配列番号２０または２１であり得る。ある特定の事例では、標的ＤＮＡは、任意のリポジトリまたはカタログ製品から入手可能なベクター、コンストラクト、またはプラスミド、例えば、市販のベクター（例えば、ＤＮＡ２．０特注またはＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクターを参照）内に挿入することができる。
【０１０３】
一部の実施形態では、本開示のアセンブリー／クローニング方法は、以下のアセンブリーストラテジー：ｉ）ＩＩ型従来クローニング、ｉｉ）ＩＩ  Ｓ型媒介または「ゴールデンゲート」クローニング（例えば、Engler,  C.、R.  Kandzia、およびS.  Marillonnet、２００８年、「A  one  pot,  one  step,  precision  cloning  method  with  high  throughput  capability」、PLos  One、３巻：ｅ３６４７頁；Kotera,  I.およびT.  Nagai、２００８年、「A  high-throughput  and  single-tube  recombination  of  crude  PCR  products  using  a  DNA  polymerase  inhibitor  and  type  IIS  restriction  enzyme」、J  Biotechnol、１３７巻：１〜７頁；Weber,  E.、R.  Gruetzner、S.  Werner、C.  Engler、およびS.  Marillonnet、２０１１年、Assembly  of  Designer  TAL  Effectors  by  Golden  Gate  Cloning、PloS  One、６巻：ｅ１９７２２頁を参照）、ｉｉｉ）ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え、ｉｖ）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング、エキソヌクレアーゼ媒介アセンブリー（Aslanidisおよびde  Jong、１９９０年、「Ligation-independent  cloning  of  PCR  products  (LIC-PCR)」、Nucleic  Acids  Research、１８巻、２０号、６０６９頁）、ｖ）相同組換え、ｖｉ）非相同末端接合またはこれらの組合せの少なくとも１つを使用することができる。モジュラーＩＩＳ型ベースアセンブリーストラテジーは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１５４１４７に開示されており、その開示は、参照により本明細書に含まれている。
【０１０４】
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの選択マーカーを有するベクターをクローニングすることを教示する。選択圧下で原核細胞（例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（chloramphenycol）、ゼオシン、スペクチノマイシン／ストレプトマイシンに対する）、または真核細胞（例えば、ジェネテシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン）における選択のための抗生物質耐性機能をコードすることが多い様々な選択マーカー遺伝子が当技術分野で公知である。他のマーカーシステム、例えば、成功裡に形質導入された宿主細胞内で発現されるＸ−ｇａｌまたは緑色もしくは赤色蛍光タンパク質などの蛍光レポーターの存在下で陽性クローンを選択するのに細菌において使用される周知のブルー／ホワイトスクリーニングシステムは、望まれるまたは望まれない細胞のスクリーニングおよび同定を可能にする。そのほとんどが原核生物系内でのみ機能的である選択マーカーの別のクラスは、産生細胞を殺滅する毒性遺伝子産物を発現する、「デス遺伝子（ｄｅａｔｈ  ｇｅｎｅ）」とも呼ばれることが多い対抗選択可能マーカー遺伝子に関する。このような遺伝子の例としては、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｇａｔａ−１、またはｃｃｄＢが挙げられ、その機能は、（Reyratら、１９９８年、「Counterselectable  Markers:  Untapped  Tools  for  Bacterial  Genetics  and  Pathogenesis」、Infect  Immun.、６６巻（９号）：４０１１〜４０１７頁）に記載されている。
【０１０５】
一実施形態では、標的ＤＮＡセグメントがクローニングされるベクターは、本明細書に提供されるプロモーターラダーまたはライブラリーに由来するプロモーターポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８から選択される配列を含むまたは含有するプロモーターラダーが本明細書に提供される。プロモーターポリヌクレオチドは、いずれの場合においても、宿主微生物において原核生物ヘモグロビン遺伝子を過剰発現または過少発現するために使用することができる。
【０１０６】
一部の実施形態では、異種原核生物ヘモグロビンを含む生成された株それぞれは、培養され、本開示の１つまたは複数の判定基準（例えば、目的の生体分子または産物の成長および／または生産性）下で分析される。分析された宿主株のそれぞれからのデータは、特定の原核生物ヘモグロビンと関連付けられる／相関付けられ、将来使用するために記録される。よって、本開示は、任意の数の目的の微生物の遺伝的形質または表現型形質に対する原核生物ヘモグロビン遺伝子の効果を同定する、大きい、高度にアノテートされた遺伝的多様性ライブラリー／デポジトリーの作製を可能にする。
【０１０７】
一部の実施形態では、本開示は、開始および／または停止コドンバリアントを有する原核生物ヘモグロビン遺伝子をクローニングし、その結果、クローニングされた遺伝子が開始および／または停止コドンバリアントを利用するようにするためのベクターの使用を教示する。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物の典型的な停止コドンは、それぞれＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物の典型的な停止コドンはＵＧＡであり、一方、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは一般に、停止コドンとしてＵＡＡを使用する（Dalphinら（１９９６年）Nucl.  Acids  Res.、２４巻：２１６〜２１８頁）。
【０１０８】
一実施形態では、提供した開示の方法は、宿主生物が発現する１種または複数種の遺伝子をコドン最適化すること含む。様々な宿主内での発現を改善するためにコドンを最適化するための方法は、当技術分野で公知であり、文献において記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００７／０２９２９１８号を参照）。特定の原核または真核生物宿主に好適なコドンを含有する最適化コード配列（Murrayら、（１９８９年）、Nucl.  Acids  Res.、１７巻：４７７〜５０８頁も参照）を調製して、例えば、翻訳の速度を増加させ、または非最適化配列から産生される転写物と比較して、より長い半減期などの望ましい性質を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができる。
【０１０９】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるヘモグロビン遺伝子またはポリヌクレオチドは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの、本明細書に提供される宿主細胞における翻訳のためにコドン最適化された分子を含む。遺伝子またはポリヌクレオチドは、単離された、合成または組換え核酸であり得る。コドン最適化ヘモグロビン遺伝子またはポリヌクレオチドは、表２に列挙された生物から選択することができる。コドン最適化ヘモグロビン遺伝子またはポリヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０から選択することができる。一部の場合では、表２に列挙された生物から選択されるヘモグロビンポリペプチドのポリペプチド配列をコードするようにコドン最適化されているヘモグロビン遺伝子またはポリヌクレオチドが本明細書に提供される。一部の場合では、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４から選択されるポリペプチド配列をコードするようにコドン最適化されているヘモグロビン遺伝子またはポリヌクレオチドが本明細書に提供される。本明細書に提供されるコドン最適化ヘモグロビン遺伝子またはポリヌクレオチドは、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）遺伝子設計システムまたはＤＮＡ２．０  ＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ技術などの、コドン最適化ポリヌクレオチドを生成するための当技術分野で公知の方法を使用して生成することができる。
【０１１０】
タンパク質発現は、転写、ｍＲＮＡプロセシング、ならびに翻訳の安定性および開始に影響するものを含めた多数の因子によって支配される。よって、最適化は、任意の特定の遺伝子のいくつかの配列フィーチャのいずれかに対処することができる。具体例として、希少コドン誘導翻訳休止（rare  codon  induced  translational  pause）は、タンパク質発現を低減し得る。希少コドン誘導翻訳休止は、宿主生物において稀に使用される目的のポリヌクレオチド中のコドンの存在が、利用可能なｔＲＮＡプールにおけるその不足に起因してタンパク質翻訳に対して負の効果を有し得ることを含む。
【０１１１】
代替翻訳開始も、異種タンパク質発現を低減し得る。代替翻訳開始は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として機能することができるモチーフを偶発的に含有する合成ポリヌクレオチド配列を含み得る。これらの部位は、遺伝子内部部位からトランケート型のタンパク質の翻訳を開始することができる。精製中に除去することが困難であり得るトランケート型のタンパク質を産生する可能性を低減する一方法は、最適化ポリヌクレオチド配列から推定上の内部ＲＢＳ配列を排除するステップを含む。
【０１１２】
リピート誘導ポリメラーゼ（repeat-induced  polymerase）のスリッページは、異種タンパク質発現を低減し得る。リピート誘導ポリメラーゼのスリッページは、フレームシフト変異をもたらし得るＤＮＡポリメラーゼのスリッページまたはスタッタリング（stuttering）を引き起こすことが示されているヌクレオチド配列リピートを伴う。このようなリピートは、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページも引き起こし得る。高いＧ＋Ｃ含有量偏りを有する生物では、ＧまたはＣヌクレオチドリピートから構成されるより高い程度のリピートが存在し得る。したがって、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページを誘導する可能性を低減する一方法は、ＧまたはＣヌクレオチドの伸長したリピートを変更するステップを含む。
【０１１３】
干渉二次構造も異種タンパク質発現を低減し得る。二次構造は、ＲＢＳ配列または開始コドンを隔離することができ、タンパク質発現の低減と相関している。ステムループ構造も、転写休止および減衰に関与することができる。最適化ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列のＲＢＳおよび遺伝子コード領域内に最小限の二次構造を含有して、転写および翻訳の改善を可能にすることができる。
【０１１４】
例えば、最適化プロセスは、宿主が発現する所望のアミノ酸配列を同定することによって始めることができる。アミノ酸配列から、候補ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ配列を設計することができる。合成ＤＮＡ配列の設計中に、コドン使用の頻度を、宿主発現生物のコドン使用と比較することができ、希有な宿主コドンを合成配列から除去することができる。さらに、合成候補ＤＮＡ配列を、望ましくない酵素制限部位を除去し、任意の所望のシグナル配列、リンカー、または非翻訳領域を付加または除去するために修飾することができる。合成ＤＮＡ配列は、翻訳プロセスを妨害し得る二次構造、例えば、Ｇ／Ｃリピートおよびステムループ構造の存在について分析することができる。
宿主細胞の形質転換
【０１１５】
一部の実施形態では、本開示のベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはＴｉ媒介遺伝子移入を含めた様々な技法のいずれかを使用して宿主細胞内に導入することができる。特定の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔がある（Davis,  L.、Dibner,  M.、Battey,  I.、１９８６年、「Basic  Methods  in  Molecular  Biology」）。形質転換の他の方法としては、例えば、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔が挙げられる。例えば、Gietzら、Nucleic  Acids  Res.、２７巻：６９〜７４頁（１９９２年）；Itoら、J.  Bacterol.、１５３巻：１６３〜１６８頁（１９８３年）；ならびにBeckerおよびGuarente、Methods  in  Enzymology、１９４巻：１８２〜１８７頁（１９９１年）を参照。一部の実施形態では、形質転換宿主細胞は、組換え宿主株と呼ばれる。
【０１１６】
一部の実施形態では、本開示は、当技術分野で公知の９６ウェルプレートロボットプラットフォームおよび液体ハンドリング機械を使用する細胞のハイスループット形質転換を教示する。
【０１１７】
一部の実施形態では、本開示は、１種または複数種の選択マーカーを有する形質転換細胞をスクリーニングすることを教示する。このような一実施形態では、カナマイシン耐性マーカー（ＫａｎＲ）を含むベクターで形質転換された細胞を、有効量のカナマイシン抗生物質を含有する培地上に蒔く。カナマイシンが入った培地上で目に見えるコロニー形成単位は、ベクターカセットをこれらのゲノム内に組み込んだと推定される。所望の配列の挿入は、ＰＣＲ、制限酵素分析、および／または関連した挿入部位のシーケンシングを介して確認することができる。
選択された配列のループアウト
【０１１８】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物からＤＮＡの選択された領域をループアウトする方法を教示する。ループアウト法は、Nakashimaら、２０１４年、「Bacterial  Cellular  Engineering  by  Genome  Editing  and  Gene  Silencing.」、Int.  J.  Mol.  Sci.、１５巻（２号）、２７７３〜２７９３頁に記載された通りのものであり得る。一部の実施形態では、本開示は、陽性形質転換体から選択マーカーをループアウトすることを教示する。ループアウト欠失技法は、当技術分野で公知であり、（Tearら、２０１４年、「Excision  of  Unstable  Artificial  Gene-Specific  inverted  Repeats  Mediates  Scar-Free  Gene  Deletions  in  Escherichia  coli.」、Appl.  Biochem.  Biotech.、１７５巻：１８５８〜１８６７頁）に記載されている。本明細書に提供される方法で使用されるループアウト法は、シングルクロスオーバー相同組換えまたはダブルクロスオーバー相同組換えを使用して実施することができる。一実施形態では、本明細書に記載の選択された領域のループアウトは、本明細書に記載のシングルクロスオーバー相同組換えを使用することを必然的に伴い得る。
【０１１９】
第１に、ループアウトベクター（loop  out  vector）が、宿主生物のゲノム内の選択された標的領域内に挿入される（例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ、または他の遺伝子編集技法を介して）。一実施形態では、シングルクロスオーバー相同組換えが、図１に表したものなどの環状プラスミドまたはベクターをループインするために、環状プラスミドまたはベクターと宿主細胞ゲノムとの間に使用される。挿入されるベクターは、既存のまたは導入される近傍の宿主配列のダイレクトリピートである配列を用いて設計することができ、その結果、ダイレクトリピートがルーピングおよび欠失を予定しているＤＮＡの領域に隣接する。挿入されると、ループアウトプラスミドまたはベクターを含有する細胞を、選択領域の欠失について対抗選択することができる（例えば、図２；選択遺伝子に対する耐性の欠如を参照）。
宿主微生物
【０１２０】
本明細書に提供されるゲノム操作方法は、工業用微生物細胞培養で例示されるが、所望の形質を遺伝子変異体の集団内で同定することができる任意の生物に適用可能である。
【０１２１】
よって、本明細書で使用される場合、用語「微生物」は、広く解釈されるべきである。これは、これらに限定されないが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌および原生生物を含む。しかし、ある特定の態様では、「高等」真核生物、例えば、昆虫、植物、および動物を本明細書に教示の方法において利用することができる。
【０１２２】
適当な宿主細胞としては、これらに限定されないが、細菌細胞、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。一例示的な実施形態では、適当な宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  ｉｎ  Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．から入手可能なＳＨｕｆｆｌｅ（商標）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ）が含まれる。
【０１２３】
本開示の他の適当な宿主生物としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物が挙げられる。一部の実施形態では、好適なＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株／種としては、寄託基準株がＤＳＭ４４５４９であるＣ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、寄託基準株がＡＴＣＣ１３０３２であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、および寄託基準株がＡＴＣＣ６８７１であるＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓが挙げられる。一部の実施形態では、本開示の好適な宿主は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【０１２４】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の、特に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種の適当な宿主株は、特に、公知の野生型株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ  ＡＴＣＣ１４０２０；ならびにこれらから調製されるＬ−アミノ酸産生変異体または株、例えば、Ｌ−リシン産生株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７１２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６３、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＭ５８−１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＧ５２−５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ５７１４、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ１２８６６などである。
【０１２５】
用語「Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ」も、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍについて使用されている。Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ種のいくつかの代表は、例えば、株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９など、先行技術においてＣ．ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓとも呼ばれている。
【０１２６】
一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、真核細胞である。適当な真核宿主細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、動物細胞、および植物細胞が挙げられる。適当な真菌宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられる。ある特定の好適な真菌宿主細胞には、酵母細胞および糸状菌細胞が含まれる。適当な糸状菌宿主細胞としては、例えば、ＥｕｍｙｃｏｔｉｎａおよびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門の任意のフィラメント形が挙げられる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Hawksworthら、In  Ainsworth  and  Bisby's  Dictionary  of  The  Fungi、８版、１９９５年、CAB  International、University  Press、Cambridge、UKを参照）。糸状菌は、キチン、セルロース、および他の複合多糖から構成される細胞壁を有する栄養菌糸体によって特徴付けられる。糸状菌宿主細胞は、酵母と形態学的に別個のものである。
【０１２７】
ある特定の例示的であるが限定されない実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフおよび同義語もしくは分類学的均等物の種の細胞であり得る。
【０１２８】
適当な酵母宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａが挙げられる。一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、藻類、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．Ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）である。
【０１３０】
他の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。適切な原核細胞としては、グラム陽性、グラム陰性、およびグラム可変性細菌細胞が挙げられる。宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓの種であり得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【０１３１】
一部の実施形態では、細菌宿主株は、工業用株である。多数の細菌工業用株が公知であり、本明細書に記載の方法および組成物において適している。
【０１３２】
一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｒｕｂｉ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｒｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のものである。特定の実施形態では、宿主細胞は、これらに限定されないが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含めた工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｅ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ���である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｚ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、などである。
【０１３３】
様々な実施形態では、原核生物株および真核生物株の両方を含めた本開示の実践において使用され得る株は、いくつかの培養細胞保存機関（culture  collection）、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）から一般人に容易にアクセス可能である。
【０１３４】
一部の実施形態では、本開示の方法は、多細胞生物にも適用可能である。例えば、プラットフォームは、作物の性能を改善するのに使用することができる。生物は、複数の植物、例えば、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ、Ｆｅｔｕｃｏｉｄｅａｅ、Ｐｏａｃｏｉｄｅａｅ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｓｏｒｇｕｍ、Ｓｅｔａｒｉａ、Ｚｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ａｖｅｎａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｐｏａ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｃｏｉｘ、Ｏｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｅａｅ、Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ、またはＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅを含み得る。例えば、植物は、トウモロコシ、イネ、ダイズ、綿、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、エンドウマメ、マメ、レンズマメ、ピーナッツ、ヤムビーン、ササゲ、ハッショウマメ、クローバー、アルファルファ、ルピナス、ベッチ、ハス、スイートクローバー、フジ、スイートピー、モロコシ、キビ、ヒマワリ、セイヨウアブラナなどであり得る。同様に、生物は、複数の動物、例えば、非ヒト哺乳動物、魚、昆虫などを含み得る。
細胞発酵および培養
【０１３５】
本明細書に記載の遺伝子操作された微生物を含めた本開示の微生物は、任意の所望の生合成反応または選択のために適切に改変された慣例的な栄養培地中で培養することができる。一部の実施形態では、本開示は、プロモーターを活性化するための誘導培地中での培養を教示する。一部の実施形態では、本開示は、形質転換体の選択剤（例えば、抗生物質）を含めた選択剤を含む培地、または阻害条件（例えば、高エタノール条件）下で成長させるのに適した生物の選択を教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞成長のために最適化された培地中で細胞培養物を成長させることを教示する。他の実施形態では、本開示は、例えば、目的の産物または生体分子などの産物収率のために最適化された培地中で細胞培養物を成長させることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞成長を誘導することができ、最終産物産生に必要な前駆体（例えば、エタノール産生のための高レベルの糖）も含有する培地中で培養物を成長させることを教示する。本明細書に提供される方法によって生じる目的の生体分子または産物は、微生物により産生されるあらゆる商業的産物であり得る。一部の場合では、目的の生体分子または産物は、医薬、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである。アミノ酸は、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンであり得る。有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートであり得る。アルコールは、エタノールまたはイソブタノールであり得る。
【０１３６】
温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに使用するのに適したものであり、当業者に明らかである。記載したように、多くの参考文献が、細菌、植物、動物（哺乳動物を含む）、および古細菌起源の細胞を含めた多くの細胞の培養および産生に利用可能である。例えば、Sambrook、Ausubel（すべて上記）、ならびにBerger、Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques、Methods  in  Enzymology、１５２巻、Academic  Press,  Inc.、San  Diego、CA；ならびにFreshney（１９９４年）、Culture  of  Animal  Cells、a  Manual  of  Basic  Technique、３版、Wiley-Liss、New  York、およびそれに引用された参考文献；DoyleおよびGriffiths（１９９７年）、Mammalian  Cell  Culture:Essential  Techniques、John  Wiley  and  Sons、NY；Humason（１９７９年）、Animal  Tissue  Techniques、４版、W.H.  Freeman  and  Company；ならびにRicciardelleら、（１９８９年）、In  Vitro  Cell  Dev.  Biol.、２５巻：１０１６〜１０２４頁を参照。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。植物細胞培養および再生について、Payneら（１９９２年）、Plant  Cell  and  Tissue  Culture  in  Liquid  Systems、John  Wiley  &  Sons,  Inc.、New  York、N.Y.；GamborgおよびPhillips（編）（１９９５年）、Plant  Cell,  Tissue  and  Organ  Culture;  Fundamental  Methods  Springer  Lab  Manual、Springer-Verlag（Berlin  Heidelberg  N.Y.）；Jones編（１９８４年）、Plant  Gene  Transfer  and  Expression  Protocols、Humana  Press、Totowa、N.J．、ならびにPlant  Molecular  Biology（１９９３年）、R.  R.  D.  Croy編、Bios  Scientific  Publishers、Oxford、U.K.  ISBN  0  12  198370  6。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。一般に細胞培養培地は、AtlasおよびParks（編）、The  Handbook  of  Microbiological  Media（１９９３年）、CRC  Press、Boca  Raton、Fla.に示されており、これは、参照により本明細書に組み込まれている。細胞培養の追加の情報は、Sigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのLife  Science  Research  Cell  Culture  Catalogue（「Sigma-LSRCCC」）、および例えば、やはりSigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのThe  Plant  Culture  Catalogue  and  supplement（「Sigma-PCCS」）などの入手可能な商業的文献に見出され、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３７】
使用される培養培地または発酵培地は、適当な様式で、それぞれの株の要求を満たさなければならない。様々な微生物の培養培地の記載は、American  Society  for  Bacteriology（Washington  D.C.、USA、１９８１年）の「Manual  of  Methods  for  General  Bacteriology」に存在する。培養培地および発酵培地という用語は、互換的である。一部の場合では、本明細書に提供される方法によって生成された遺伝的に改変された株の成長のために培養培地または発酵培地中に供給される酸素のレベルは、野生型株または本明細書に提供される異種ヘモグロビン遺伝子を発現しない株よりも低くなり得る。
【０１３８】
一部の実施形態では、本開示は、生成される微生物を、所望の目的の生体分子または産物を産生させる目的で、例えば、ＷＯ０５／０２１７７２に記載されているように連続的に、あるいはバッチプロセス（バッチ培養）またはフェドバッチもしくは繰り返しフェドバッチプロセスで不連続に培養することができることを教示する。公知の培養方法についての全般的な特質の概要はChmiel（Bioprozesstechnik.  1:  Einfuehrung  in  die  Bioverfahrenstechnik（Gustav  Fischer  Verlag、Stuttgart、１９９１年））による教科書、またはStorhas（Bioreaktoren  and  periphere  Einrichtungen（Vieweg  Verlag、Braunschweig/Wiesbaden、１９９４年））による教科書において入手可能である。
【０１３９】
一部の実施形態では、本開示の細胞を、バッチまたは連続発酵条件下で増殖させる。古典的なバッチ発酵は、クローズドシステムであり、培地の組成は、発酵の開始時に設定され、発酵中に人為的な交代に供されない。バッチシステムの変形は、フェドバッチ発酵であり、これは、本開示においても使用を見出す。この変形では、基質は、発酵が進行するにつれて徐々に添加される。フェドバッチシステムは、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害しそうなとき、および培地中の基質の量が制限されていることが望ましい場合、有用である。バッチ発酵およびフェドバッチ発酵は、一般的であり、当技術分野で周知である。連続発酵は、所望のタンパク質を処理および回収するために、規定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、等量の馴化培地が同時に除去されるシステムである。一部の実施形態では、連続発酵は一般に、一定の高密度で培養物を維持し、この場合、細胞は、主に、対数期成長にある。一部の実施形態では、連続発酵は一般に、静止または後期対数／静止期成長で培養物を維持する。連続発酵システムは、定常状態成長条件を維持しようと努める。
【０１４０】
連続発酵プロセスのための栄養分および成長因子をモジュレートするための方法、ならびに産物形成の速度を最大化するための技法は、工業微生物学の技術分野で周知である。
【０１４１】
例えば、本開示の培養のための炭素源の限定されないリストとしては、糖および炭水化物、例えば、グルコース、キシロース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、サトウダイコンまたはサトウキビ加工からのスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物、およびセルロースなど；油および脂肪、例えば、ダイズ油、ヒマワリ油、落花生油、およびココナツ脂肪など；脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸など；アルコール、例えば、グリセロール、メタノール、およびエタノールなど；ならびに有機酸、例えば、酢酸または乳酸などが挙げられる。
【０１４２】
本開示の培養物のための窒素源の限定されないリストとしては、有機窒素含有化合物、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、ダイズ粉、および尿素など；または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、アンモニウムクロリド、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムなどが挙げられる。窒素源は、個々に、または混合物として使用され得る。
【０１４３】
本開示の培養のための可能なリン源の制限されないリストとしては、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩が挙げられる。培養培地は、例えば、金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、および鉄などの塩化物または硫酸塩、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの形態で塩をさらに含み得、これらは、成長に必要である。最後に、アミノ酸などの必須の成長因子、例えば、ホモセリンおよびビタミン、例えば、チアミン、ビオチン、またはパントテン酸を、上記した物質に加えて使用することができる。
【０１４４】
一部の実施形態では、培養物のｐＨは、これらに限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水あるいは適当な様式でのリン酸または硫酸などの酸性化合物を含めた任意の酸もしくは塩基または緩衝塩によって制御することができる。一部の実施形態では、ｐＨは一般に、６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８の値に調整される。
【０１４５】
一部の実施形態では、本開示の培養物は、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を含み得る。一部の実施形態では、本開示の培養物は、例えば、抗生物質などの適当な選択物質を添加することによって、培養物のプラスミドを安定化するように改変される。
【０１４６】
一部の実施形態では、培養は、好気性条件下で実行される。これらの条件を維持するために、酸素または酸素含有気体混合物、例えば、空気などが、培養物に導入される。過酸化水素で富化した液体を使用することが同様に可能である。発酵は、適切な場合、高圧で、例えば、０．０３〜０．２ＭＰａの高圧で実行される。培養の温度は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、特に好ましくは３０℃〜３７℃である。バッチプロセスまたはフェドバッチプロセスでは、培養は、好ましくは、回収されるのに十分な所望の有機−化学化合物の量が形成されるまで継続される。一部の実施形態では、培養は、嫌気性条件下で実行される。
産物回収および定量
【０１４７】
目的の産物の産生についてスクリーニングするための方法は、当業者に公知であり、本明細書全体にわたって論じられている。このような方法は、本開示の株をスクリーニングするとき使用することができる。本明細書に提供される方法によって生じる目的の生体分子または産物は、グルコースまたは任意の供給材料またはエネルギー供給源から生成されるあらゆる商業的産物であり得る。一部の場合では、目的の生体分子または産物は、医薬、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである。アミノ酸は、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンであり得る。有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートであり得る。アルコールは、エタノールまたはイソブタノールであり得る。
【０１４８】
一部の実施形態では、本開示は、非分泌型細胞内産物を産生するように設計された株を改善する方法を教示する。例えば、本開示は、細胞内酵素、油、医薬、または他の貴重な低分子もしくはペプチドを産生する細胞培養物のロバスト性、収率、効率、または全体的な望ましさを改善する方法を教示する。非分泌型細胞内産物の回収または単離は、本明細書に記載のものを含めて当技術分野で周知である溶解および回収技法によって実現することができる。
【０１４９】
例えば、一部の実施形態では、本開示の細胞は、遠心分離、濾過、沈殿、または他の方法によって回収することができる。次いで回収された細胞は、当業者に周知である凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または他の方法を含めた任意の好都合な方法によって破壊される。
【０１５０】
結果として生じる目的の産物、例えば、ポリペプチドは、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって回収／単離および必要に応じて精製することができる。例えば、産物ポリペプチドは、これらに限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、または沈降を含めた慣例的な手順によって栄養培地から単離することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製ステップで使用することができる。（例えば、ともに参照により本明細書に組み込まれている、Parryら、２００１年、Biochem.  J.、３５３巻：１１７頁およびHongら、２００７年、Appl.  Microbiol.  Biotechnol．、７３巻：１３３１頁に記載の細胞内タンパク質の精製を参照）。
【０１５１】
上記した参考文献に加えて、様々な精製方法は、例えば、Sandana（１９９７年）、Bioseparation  of  Proteins、Academic  Press,  Inc.；Bollagら（１９９６年）、Protein  Methods、２版、Wiley-Liss、NY；Walker（１９９６年）、The  Protein  Protocols  Handbook、Humana  Press、NJ；HarrisおよびAngal（１９９０年）、Protein  Purification  Applications:  A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；HarrisおよびAngal  Protein  Purification  Methods:A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；Scopes（１９９３年）、Protein  Purification:  Principles  and  Practice、３版、Springer  Verlag、NY；JansonおよびRyden（１９９８年）、Protein  Purification:  Principles,  High  Resolution  Methods  and  Applications、２版、Wiley-VCH、NY；ならびにWalker（１９９８年）、Protein  Protocols  on  CD-ROM、Humana  Press、NJに示されたものを含めて、当技術分野で周知である。これらの文献のすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５２】
一部の実施形態では、本開示は、分泌産物を産生させるように設計された株を改善する方法を教示する。例えば、本開示は、貴重な低分子またはペプチドを産生する細胞培養物のロバスト性、収率、効率、または全体的な望ましさを改善する方法を教示する。
【０１５３】
一部の実施形態では、免疫学的方法は、本開示の細胞によって産生される分泌型または非分泌型産物を検出および／または精製するのに使用することができる。一例示的手法では、従来の方法を使用して産物分子に対して（例えば、インスリンポリペプチドまたはその免疫原性断片に対して）産生される抗体は、ビーズ上に固定化され、エンドグルカナーゼが結合する条件下で細胞培養培地と混合され、沈降される。一部の実施形態では、本開示は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の使用を教示する。
【０１５４】
他の関連した実施形態では、米国特許第５，５９１，６４５号、米国特許第４，８５５，２４０号、米国特許第４，４３５，５０４号、米国特許第４，９８０，２９８号、およびSe-Hwan  Paekら、「Development  of  rapid  One-Step  Immunochromatographic  assay,  Methods」、２２巻、５３〜６０頁、２０００年に開示された免疫クロマトグラフィーが使用される。これらの文献のそれぞれは、本明細書に参照により組み込まれている。一般的な免疫クロマトグラフィーは、２つの抗体を使用することによって検体を検出する。第１の抗体は、試験溶液中に、または試験溶液が滴下される、多孔質膜から作製されたおよそ矩形状をした試験片の末端の部分に存在する。この抗体は、ラテックス粒子または金コロイド粒子で標識される（この抗体は、本明細書の以下で標識抗体と呼ばれる）。滴下された試験溶液が検出されるべき検体を含むとき、標識抗体は、検体を認識して検体と結合する。検体と標識抗体との複合体は、吸収体に向けて毛管現象によって流れ、この吸収体は、濾紙から作製され、標識抗体を含んだ末端と反対の末端に付着している。流れている間に、検体と標識抗体との複合体は、多孔質膜の中間に存在している第２の抗体（これは、本明細書の以下でタッピング抗体（tapping  antibody）と呼ばれる）によって認識および捕捉され、この結果として、複合体は、可視シグナルとして多孔質膜上の検出部分に現れ、検出される。
【０１５５】
一部の実施形態では、本開示のスクリーニング方法は、測光検出技法（吸収、蛍光）に基づく。例えば、一部の実施形態では、検出は、抗体に結合したＧＦＰなどのフルオロフォア検出剤の存在に基づき得る。他の実施形態では、測光検出は、細胞培養物からの所望の産物の蓄積に基づき得る。一部の実施形態では、産物は、培養物または前記培養物からの抽出物のＵＶを介して検出可能であり得る。
【０１５６】
一部の実施形態では、産物回収方法により、各候補原核生物ヘモグロビン遺伝子の性能に対する効果の定量的決定が可能になる。一部の実施形態では、産物回収方法により、各候補原核生物ヘモグロビン遺伝子の性能に対する効果の定量的決定ならびに所望の目的の生体分子または産物の最適な成長および／または生産率を促進する候補原核生物ヘモグロビン遺伝子を発現する微生物の選択が可能になる。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法により、細胞湿重量１グラム当たり０ｎｍｏｌｅよりも高く１２５ｎｍｏｌｅ未満の細胞内ヘモグロビンの濃度を生じる候補異種原核生物ヘモグロビン遺伝子（例えば、細菌ヘモグロビン遺伝子）を発現する微生物または微生物の株の選択が可能になる。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法により、細胞湿重量１グラム当たり０ｎｍｏｌｅよりも高く１００ｎｍｏｌｅ未満の細胞内ヘモグロビンの濃度を生じる候補異種原核生物ヘモグロビン遺伝子（例えば、細菌ヘモグロビン遺伝子）を発現する微生物または微生物の株の選択が可能になる。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法により、細胞湿重量１グラム当たり０ｎｍｏｌｅよりも高く７５ｎｍｏｌｅ未満の細胞内ヘモグロビンの濃度を生じる候補異種原核生物ヘモグロビン遺伝子（例えば、細菌ヘモグロビン遺伝子）を発現する微生物または微生物の株の選択が可能になる。
選択判断基準および目標
【０１５７】
異種原核生物ヘモグロビン遺伝子（例えば、細菌ヘモグロビン遺伝子）を発現する宿主細胞の特定の株の選択は、具体的な目標に基づき得る。例えば、一部の実施形態では、プログラム目標は、差し迫った期限なしで反応物の単一バッチ収量を最大化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、生合成収量をリバランスして、特異的な産物を産生させ、または特定の比の産物を産生させることであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、性能特性、例えば、収率、力価、生産性、副生成物排除、プロセスエクスカーションに対する寛容性、最適な成長温度、および成長速度を改善することであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、微生物によって産生される目的の産物の体積生産性、比生産性、収率、または力価によって測定した宿主性能の改善である。一部の実施形態では、プログラム目標は、細胞湿重量１グラム当たり０ｎｍｏｌｅよりも高く１２５ｎｍｏｌｅ未満の細胞内ヘモグロビンの濃度を生じる微生物または微生物の株を提供することである。一部の実施形態では、プログラム目標は、細胞湿重量１グラム当たり０ｎｍｏｌｅよりも高く１００ｎｍｏｌｅ未満の細胞内ヘモグロビンの濃度を生じる微生物または微生物の株を提供することである。一部の実施形態では、プログラム目標は、細胞湿重量１グラム当たり０ｎｍｏｌｅよりも高く７５ｎｍｏｌｅ未満の細胞内ヘモグロビンの濃度を生じる微生物または微生物の株を提供することである。
【０１５８】
一部の実施形態では、プログラム目標は、低レベルの酸素（酸素制限）の下で成長する遺伝的に改変された宿主微生物または宿主微生物の株を提供することである。一部の実施形態では、プログラム目標は、酸化ストレスまたはニトロソ化ストレスの条件下で成長する遺伝的に改変された宿主微生物または宿主微生物の株を提供することである。成長は、宿主微生物の野生型株に対して増加し得る。成長は、異種原核生物ヘモグロビン遺伝子を発現するように遺伝的に改変されていない宿主微生物の株に対して増加し得る。一部の実施形態では、原核生物ヘモグロビン遺伝子を発現するように遺伝的に改変された本開示の宿主微生物または宿主微生物の株は、酸化ストレス、ニトロソ化ストレス、または酸素制限条件下で、対照または参照よりも少なくともまたは約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％大きな成長を呈する。対照または参照は、宿主微生物の野生型株または異種原核生物ヘモグロビン遺伝子を発現するように遺伝的に改変されていない宿主微生物であり得る。
【０１５９】
他の実施形態では、プログラム目標は、投入量当たりの最終産物収率（例えば、スクロース１ポンド当たりに産生されるエタノールの合計量）の観点から市販の株の合成効率を最適化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、例えば、バッチ完了率、または連続培養システムにおける歩留まり率の観点から測定した、合成速度を最適化することであり得る。一実施形態では、プログラム目標は、目的の生体分子または産物の最終産物収率および／または産生速度を最適化することである。本明細書に提供される方法によって生じる目的の生体分子または産物は、グルコース微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）または微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）から産生されるあらゆる商業的産物であり得る。一部の場合では、目的の生体分子または産物は、医薬、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである。アミノ酸は、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンであり得る。有機酸は、スクシネート、ラクテートまたはピルベートであり得る。アルコールは、エタノールまたはイソブタノールであり得る。
【０１６０】
当業者は、特定のプロジェクト目標を満たすように株選択判定基準をどのように適合させる（tailor）かを認識する。例えば、反応が飽和しているときの株の単一バッチ最大収量の選択は、単一バッチ収量が高い株を同定するのに適切であり得る。一連の温度および条件にわたる収率の一貫性に基づく選択は、ロバスト性および信頼性が増大した株を同定するのに適切であり得る。
【０１６１】
一部の実施形態では、初期相およびタンクベースの検証の選択判定基準は、同一である。他の実施形態では、タンクベースの選択は、追加のおよび／または異なる選択判定基準下で動作し得る。
【実施例】
【０１６２】
本開示を以下の実施例を参照することによってさらに例示する。しかし、これらの実施例は、上記の実施形態と同じように、例示的なものであり、いかなる形でも本開示の範囲を制限するものと解釈されるべきでないことに留意するべきである。
（実施例１）
細菌ヘモグロビンライブラリーの生成のための細菌ヘモグロビンライブラリーを用いたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換
【０１６３】
細菌ヘモグロビンライブラリーを生成するために、特定の細菌ヘモグロビンと候補細菌ヘモグロビンの間の配列類似性を検索するために設計されたアルゴリズムを使用するコンピュータに基づく方法を使用して、いくつかの細菌ヘモグロビンを選択した。より詳細には、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ  ｓｔｅｒｃｏｃａｒｉａ由来のヘモグロビンのアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するＴＲＥＭＢＬタンパク質データベース検索のシードに使用した。シードヘモグロビンとのある特定の類似性の範囲内（すなわち、ＢＬＡＳＴ  Ｅ値５）に入るすべての配列をデータベースから得た。次に、セット内の各配列間のペアワイズアラインメントを行い、その結果、各配列をセット内の任意の他の配列と関連付ける類似性スコアを生成した。これは、http://efi.igb.illinois.edu/efi-est/において利用可能なオンラインツールを使用して行った。次いで、ソフトウェアツールＣｙｔｏｓｃａｐｅ（ｃｙｔｏｓｃａｐｅ．ｏｒｇ）を使用して有機クラスタリングアルゴリズムを展開して、セットのメンバーをほぼ類似の群にサブグループ化した。配列多様性が機能的多様性に対応するという見込みで、ライブラリー内に存在する配列の多様性を最大にするために、各サブグループからの代表的な候補を選択した。
【０１６４】
ライブラリーに含めるために選択された細菌ヘモグロビンをコードする細菌ヘモグロビン遺伝子を、ＤＮＡ２．０  ＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ技術を使用してコドン最適化した。したがって、ライブラリーに含めるために選択された細菌ヘモグロビン遺伝子は、細菌ヘモグロビン遺伝子Ｖｈｂ０１（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉａ；配列番号９）、Ｖｈｂ０２（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｔｅｒｒａｅ  Ｃ−６；配列番号１０）、Ｖｈｂ０３（Ｓａｎｄａｒａｃｉｎｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ；配列番号１１）、Ｖｈｂ０４（Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＪＳＣ−１１；配列番号１２）、Ｖｈｂ０５（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｅｎｔｏｔｈｅｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．ＴＳＹ１；配列番号１３）、Ｖｈｂ０６（Ｈａｓｓａｌｌｉａ  ｂｙｓｓｏｉｄｅａ  ＶＢ５１２１７０；配列番号１４）、Ｖｈｂ０７（ｍｉｎｅ  ｄｒａｉｎａｇｅ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ；配列番号１５）、Ｖｈｂ０８（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｍｏｌｌｕｓｃｏｒｕｍ  ８４８；配列番号１６）、Ｖｈｂ０９（Ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒ  ｇａｌｌａｅｃｉｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２６６４０；配列番号１７）、Ｖｈｂ１０（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ；配列番号１８）、Ｖｈｂ１１（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｌｏｉｈｉｃａ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１０８８／ＰＶ−４株）；配列番号１９）およびＶｈｂ１２（Ｓｕｌｆｕｒｉｍｏｎａｓ  ｇｏｔｌａｎｄｉｃａ（ＤＳＭ  １９８６２／ＪＣＭ  １６５３３／ＧＤ１株）；配列番号２０）であった。
【０１６５】
ヘモグロビンライブラリーを生成するために、上記の各コドン最適化ヘモグロビン遺伝子を配列決定して、配列の完全性を確実にし、続いて、ＩＩ型制限およびライゲーションクローニング技術を使用してＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ／Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ適合発現ベクターにクローニングした。さらに、各ヘモグロビン構築物中に、Ｐ１プロモーター（配列番号１）を、それぞれのヘモグロビン遺伝子の前にクローニングした。最後に、構築物中の各ヘモグロビン遺伝子を終結配列（配列番号２１）で終わらせた。
Ｅ．ｃｏｌｉ中へのアセンブルされたクローンの形質転換
【０１６６】
コドン最適化ヘモグロビン遺伝子を含有するベクターを、配列決定によって検証し、続いて、正確にアセンブルされたクローンを同定し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換のためのベクターＤＮＡを増幅するために、それぞれ個々にＥ．ｃｏｌｉ中へ形質転換した。増幅されたＤＮＡを、ＰＣＲ／配列決定を介して検証した。陽性クローンを、後に使用するために−２０℃の冷蔵庫で保存した。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中へのアセンブルされたクローンの形質転換
【０１６７】
次いで、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞中へ、検証されたクローンを個々に、電気穿孔により形質転換した。構築物の性能に対する株バックグラウンドの影響を試験するために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの３つの異なる株バックグラウンド（すなわち、図３Ａ〜３Ｂのコンテクスト１、コンテクスト２、およびコンテクスト３）を使用し、各構築物を、各バックグラウンドへと形質転換した。各ベクターを、異種ヘモグロビン遺伝子の発現を可能にするが、宿主細胞にとって有害にならないように経験的に決定されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノム内の中立の組込み部位に組込まれるように設計した。組込みを容易にするために、発現ベクターは、所望の組込み部位に相同な約４ｋｂの配列（すなわち、ホモロジーアーム）をさらに含み、それによって、上に記載した各ヘモグロビン遺伝子カセットが、いずれかの側の所望の組込み部位と相同の２ｋｂの配列の間に挿入された。ゲノム中への組込みは、シングルクロスオーバーによる組込み、次いでプラスミド骨格に含まれる第２のマーカーに対する対抗選択によって促進されるプラスミド骨格のループアウトにより行った。
【０１６８】
次いで、形質転換した細菌を、アセンブリーの成功（ゲノム中への正確な組込み）について試験した。各Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換プレート由来のコロニーを培養し、正確な組込みについてＰＣＲにより試験した。各細菌ヘモグロビン構築物について実施した形質転換のそれぞれについて、このプロセスを繰り返した。各形質転換のゲノムの組込みを、各プラスミドについて標的化されたゲノムの場所に関しても分析した。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中の個々の細菌ヘモグロビン構築物の評価
【０１６９】
次いで、各形質転換体の表現型を、各宿主細胞バックグラウンドにおける各構築物の発現が所望の表現型（すなわち、所望の発酵最終産物を産生する能力の改善）に対して有する効果を決定するために、所望の発酵最終産物を産生するための具体的な発酵プロセスを模倣またはシミュレートするように設計された評価方法で試験した。簡単に言えば、評価方法は、形質転換体を、９６ウェルプレート形式で、発酵条件を模倣することが意図された条件下で培養する実験であった。様々な時点で形成される産物およびバイオマスの量を測定し、それを使用して、発酵条件下で各株がどのように働くかを予測した。この予測は、評価方法において種々の発酵性能を有する株を試験し、測定値と性能の相関を決定することにより生成した線形回帰であった。
【０１７０】
各ヘモグロビン形質転換体について所望の発酵最終産物の予測される産生率および収率を決定し、その一部の例を図３Ａ〜３Ｂに示す。図３Ａに示されている通り、示されている具体的なヘモグロビン挿入体について、発酵プロセスにおける生産性は、数種の特定のヘモグロビン／バックグラウンド組合せ（すなわち、Ｖｈｂ０５とコンテクスト１および２との組合せ；Ｖｈｂ１０およびＶｈｂ１１とコンテクスト１との組合せ）以外は、示されている各ヘモグロビン挿入体では親株に対して各コンテクスト（すなわち、宿主バックグラウンド）において一般に増加すると予測された。Ｖｈｂ０４を発現する株は、試験した各コンテクストにおいて親株に対する％としての予測生産性の増大を示した。対照的に、図３Ｂに示されている通り、予測される収率は、親株に対して、ヘモグロビン挿入体とコンテクストの組合せに関して大きく変動した。要約すると、一般に、ヘモグロビン遺伝子は、生産性に対する効果を有したが、収率に対する有意な効果ははるかに低かった。Ｖｈｂ０４を発現する株は、試験した各コンテクストにおいて親株に対する％としての同様の予測収率を示した。
発酵条件下での個々の細菌ヘモグロビン構築物の評定
【０１７１】
上に記載した評価の後、性能の増大（すなわち、予測生産性および／または予測収率の上昇）が予測される異種ヘモグロビン遺伝子を有する形質転換体を選択し、続いて、培地中、発酵および所望の発酵最終産物の産生を促進するように設計した条件下で成長させた。各形質転換体を、所望の最終産物がもたらされるように設計した発酵条件下で所定の時間の長さにわたって成長させた後、次いで、各形質転換体について、最終産物の収率および体積生産性を決定した。簡単に言えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、供給されたある特定の量の基質に対して産生された産物の量（すなわち、平均収率）を決定した。時間および体積データを追加して生産性（すなわち、平均生産性）を同様に決定した。
【０１７２】
図４に示されている通り、Ｖｈｂ０４構築物は、親株単独に対して親株の生産性を増大させたが、収率の低下を示した。したがって、この実施例は、本明細書に提供される方法を使用して、発酵最終産物の産生に関して微生物株の性能を増大させることができることを示す。
（実施例２）
異種細菌ヘモグロビン構築物を用いたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換：第２の発酵最終産物を産生させるための発酵条件下で成長させたＶｈｂ０１を発現するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ形質転換体の評定。
【０１７３】
実施例１の追跡調査として、上に記載した評価の後、性能の増大（すなわち、予測生産性および／または予測収率の上昇）が予測される、Ｖｈｂ０１を異種発現する形質転換体を選択し、続いて、培地中、発酵および実施例１において試験された最終産物とは別の異なる第２の所望の発酵最終産物の産生が促進されるように設計した条件下で成長させた。各形質転換体を、所望の第２の最終産物がもたらされるように設計した発酵条件下で所定の時間の長さにわたって成長させた後、次いで、各形質転換体について、最終産物の収率および体積生産性を決定した。簡単に言えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、供給されたある特定の量の基質に対して産生された産物の量（すなわち、平均収率）を決定した。時間および体積データを追加して生産性（すなわち、平均生産性）を同様に決定した。
【０１７４】
Ｖｈｂ０１構築物は、異種Ｖｈｂ０１構築物を含有しないＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａと比べて、第２の発酵産物の生産性の２０％の改善を呈した。したがって、この実施例は、本明細書に提供される方法を使用して、複数の発酵最終産物の産生に関して微生物株の性能を増大させることができることを示す。
参照による組込み
【０１７５】
以下の出願は、すべての説明、参考文献、図面、および請求項を含めたその全体が、すべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれている：２０１６年１２月３０日に出願された米国特許出願第１５／３９６，２３０号；２０１６年１２月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５４６５号；２０１６年４月２７日に出願された米国特許出願第１５／１４０，２９６号；２０１６年７月２９日に出願された米国仮出願第６２／３６８，７８６号；および２０１５年１２月７日に出願された米国仮出願第６２／２６４，２３２号。
【０１７６】
本明細書に引用したすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれる。
【０１７７】
しかし、本明細書に引用した任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、これらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれかの国における共通の一般的知識の一部を形成するという承認または何らかの形式の示唆として解釈されず、かつそのように解釈されるべきでない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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