(57)【要約】本発明は、水溶液中のセルロースへのリグニンの共有結合方法に関し、この方法は、トール油脂肪酸（ＴＯＦＡ）で改質されたリグニン粒子の水性混合物を調製すること、これらのＴＯＦＡ改質リグニン粒子をセルロース粒子と反応させることを特徴とする。得られた変性セルロース粒子は、生分解性であり、抗菌性を有するので、それらは抗菌性繊維表面（スポーツウェア、医療用織物）、組織接着剤および薬物送達における多孔性担体としての使用に適している。さらに、その材料は、接着剤および分散剤などの大量製品に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグニン粒子の水性混合物を調製すること、
これらの粒子を脂肪酸を用いて改質すること、および
得られた脂肪酸改質リグニン粒子をセルロース繊維またはセルロース粒子と反応させること、
により、特徴づけられる、水溶液中のセルロースへのリグニンの共有結合のための方法。
【請求項２】
前記リグニンが、軟材または硬材パルプから、好ましくはクラフトパルプから、そして最も適切にはリグノブーストリグニンから抽出された、単離されたリグニンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リグニンが、リグニンナノ粒子（NP）、好ましくは500nm未満、より好ましくは50〜300nm、最も好ましくは70〜200nmの直径を有するリグニンナノ粒子（NP）から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リグニンを改質するために使用される前記脂肪酸が、トール油脂肪酸（TOFA）を含有する、またはトール油脂肪酸（TOFA）から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記リグニンを改質するために使用される前記脂肪酸が、脂肪酸混合物、例えば、８０〜９９重量％、好ましくは８５〜９９重量％の不飽和脂肪酸を含有するトール油脂肪酸（ＴＯＦＡ）から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リグニンを改質するために使用される前記脂肪酸が、脂肪酸混合物、例えば、０．１〜１０重量％、好ましくは≦５重量％のロジン酸を含有し、最も好適には≦５重量％のロジン酸および不けん化物の合計含有量を含有するＴＯＦＡから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記リグニンを改質するために使用される前記脂肪酸が、脂肪酸混合物、例えば、１６〜２０個の炭素原子を有する脂肪酸を主に含有するＴＯＦＡから選択され、その主成分が、好ましくは不飽和Ｃ１８脂肪酸であり、最も好適にはオレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、リノレン酸および／またはピノレン酸（どちらもＣ１８：３）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記リグニンを改質するために使用される前記脂肪酸が、脂肪酸混合物、例えば、１０重量％以下のＣ１８：３脂肪酸、２０〜７０重量％のＣ１８：２脂肪酸および２０〜７０重量％のＣ１８：１脂肪酸を含む脂肪酸を主に含有するＴＯＦＡから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記リグニンを改質するために使用される前記脂肪酸、例えば、TOFAが、前記リグニンとの反応の前に、対応する脂肪酸塩化物混合物に変換される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
その改質反応が、前記リグニン中の脂肪酸により、４０〜１００％、好ましくは５０〜１００％、最も適切には約５０％または約１００％の置換度を対象とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記水性混合物が、適切な有機溶媒、例えばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の脂肪酸改質リグニンの溶液に水を添加すること、および前記有機溶媒を蒸発させることによって達成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記セルロースが、前記反応の前にアリル化されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂肪酸改質リグニンと前記セルロースとの間の反応が、水溶液中で、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）などのラジカル開始剤の助けを借りて行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記脂肪酸改質リグニンと前記セルロースとの間の反応が、＜１００℃の温度、好ましくは約６５℃または８０℃の温度で行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により調製された脂肪酸−リグニン−セルロースを含有する従来の被覆材材料を含むことを特徴とする、抗菌性創傷被覆材。
【請求項１６】
１〜１０ｍｇ／ｍｌの前記脂肪酸−リグニン−セルロースを含有する溶液を含浸させた、請求項１５に記載の抗菌性創傷被覆材。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により調製された１〜１０ｍｇ／ｍｌの前記脂肪酸−リグニン−セルロースを含有するコーティング混合物または接着剤混合物を含む、抗菌性コーティングまたは接着剤。
【請求項１８】
抗菌剤として使用するための、脂肪酸で改質されたリグニン粒子。
【請求項１９】
リグニン中の脂肪酸によって４０〜１００％、好ましくは５０〜１００％、最も適切には約５０％または約１００％の置換度を有する、請求項１８に記載の抗菌改質リグニン粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性表面として利用することができる高価値リグニン製品を製造するためのリグニンを用いたセルロースの官能化方法に関する。適切な最終生成物には、例えば、抗菌創傷被覆材および抗菌接着剤またはコーティング（塗料を含む）が挙げられる。
【０００２】
特に、本発明の方法は、水溶液中のセルロースへの修飾リグニン粒子の共有結合を用いて行われる。
【背景技術】
【０００３】
黒液は、クラフトおよびソーダパルプ化などのアルカリパルプ化プロセスからの副生成物であり、リグノセルロース原料から大部分のリグニンが除去され、セルロース繊維が製紙用に遊離される。
【０００４】
リグニンは黒液の主な有機成分である（２５〜３０％）。現在、世界中で生産されているリグニンの９８％が燃料として使用されているが、高価値製品に中間留出液リグニンを利用するニーズがあり、様々な、特に環境上の可能性が広範囲に研究されている。
【０００５】
リグニンの環境利用に関する１つの問題は、水性分散液におけるその低い安定性である。現在、その官能化は厳しい条件および溶媒の使用を必要とする。とりわけ、Hultらはリグニンを板紙上にコーティングするための溶媒ベースの方法を記載している。しかしながら、有機溶媒の水による置換が、当然好ましい。
【０００６】
最近、安定した水ベースの分散液としてリグニンを取り扱うことができるナノ粒子にリグニンを加工することができることが示された（Qianら）。これは、リグニンの低い溶解性と困難な加工という問題を解決し、結果としてリグニンの適用性を高めることが予見される。しかしながら、この公報では、ナノ粒子（ＮＰｓ）の形成には、リグニン原料のアセチル化が必要であると記載されている。また、国際公開第２００６１０８６３７Ａ２号には、ナノ粒子を製造する方法が記載されているが、これは比較的苛酷な方法である凍結乾燥を使用する。
【０００７】
官能化のためにリグニンを使用する場合、１つの有利な選択肢は官能化セルロースにそれを結合することである。Saastamoinenらおよび国際公開第２０１０５０１１３６４Ａ２号は両方とも、セルロース表面を改質し、それをより疎水性の形態に変えるためのアプローチを記載している。同様に、AulinおよびStroemは、パッケージング溶液に使用する油性コーティングを記載している。しかしながら、これらのプロセスはリグニンを使用しないが、リグニンは、より環境的なタイプのコーティングを提供するはずである。
【０００８】
最近、板紙のバリア性を高めるためにトール油脂肪酸（TOFA）改質リグニンを利用する研究が行われている（Hultら）。
【０００９】
官能化におけるリグニンの使用はまた、国際公開第2013050661A1号に記載されている。しかしながら、このリグニンはナノ粒子として使用されておらず、その多用途性および使用範囲はより小さく、その特性は異なる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、中間留出液リグニンの新規な用途を提供することである。
【００１１】
特に、本発明の目的は、このリグニンを生態学的原材料として利用する機能化抗菌製品を提供することである。
【００１２】
本発明は、独立請求項の特徴によって規定される。いくつかの特定の実施形態は、従属請求項に規定されている。
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、水溶液中のセルロースへのリグニンの共有結合方法が提供される。
【００１４】
本発明の第２の態様によれば、本発明のリグニン改質セルロースを含有する抗菌性創傷被覆材が提供される。
【００１５】
本発明の第３の態様によれば、本発明のリグニン改質セルロースを含有する抗菌性コーティングまたは接着剤が提供される。
【００１６】
したがって、本発明の基本的な考え方は、水ベースの溶液中のセルロース（任意にナノセルロース）へのリグニンの共有結合である。これは、脂肪酸混合物（例えば、ＴＯＦＡ）を使用して改質されたリグニンからのＮＰｓの安定した分散体の製造と、セルロースのアリル化によって促進され、ＴＯＦＡ中の二重結合およびセルロース中のアリル基は、共有結合のための反応性官能基として働く。
【００１７】
本発明によりかなりの利点が得られる。ナノ粒子としてのリグニンは、安定な水分散液としてリグニンを利用するという問題を解決する。ＴＯＦＡ−リグニンは、ナノ粒子としても製造することができ、これにより（ナノ）セルロースとリグニンとの共有官能化、および水ベースの溶液中の機能性添加剤または作用物質としてのリグニンの利用が可能になる。ＴＯＦＡ−リグニンＮＰ（ＴＬＮＰ）は、それらが水中で安定な単分散コロイド分散体であるため、他の物質と容易に混合することができ、したがって分散液中の添加剤として使用することができる。ＴＬＮＰ溶液は、凍結乾燥にも耐えることができるが、本実施形態では溶液中のＴＬＮＰを用いて以下の処理工程を実施することが好ましい。
【００１８】
生成したＴＬＮＰは抗菌特性を有する。その抗菌性は銀ＮＰほど強力ではないが、この効果は重要であり、これにより本発明は、金属ＮＰが環境および健康因子の両方に関連する欠点を有する抗菌製品中の銀（または他の金属）ＮＰを置換する適用可能性がある。ＴＬＮＰ−ナノセルロース混合物はまた、抗菌性コーティング材料として、または接着剤および塗料における添加剤として働くことができる。
【００１９】
次に、添付図面および詳細な説明を参照して本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図1は、アリル化セルロース表面（左）およびアリル化セルロース上のTLNP（右）の走査型電子顕微鏡（SEM）画像を示す。
【図２】図2は、Pseudomonas aeruginosa E-96726細胞に対する銀NP（AgNP）の抗菌活性、すなわち抗菌剤に対する用量応答（最小阻止濃度（MIC）0.01mg / ml）のグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、黄色ブドウ球菌（図3A）に対するTLNPの抗菌活性のグラフ表示である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、大腸菌細胞（図3B）に対するTLNPの抗菌活性のグラフ表示である。
【発明の実施の形態】
【００２１】
定義
「ナノ粒子」（ＮＰ）は、本発明の文脈では、５００ｎｍ未満の直径を有する粒子を含むことが意図される。本発明では、主としてリグニンがナノサイズで使用されるが、ナノセルロースの使用は任意である。典型的には、セルロース繊維の長さは少なくとも１μｍ、好ましくは１〜３０μｍである。
【００２２】
本明細書で言及される「脂肪酸混合物」は、乾燥物質の重量で少なくとも８０％の脂肪酸を含む全ての混合物を包含することを意図している。これらの混合物の他の典型的な成分には、ロジン酸および不けん化物が含まれるが、他の成分の少量も可能である。本発明の文脈において特に好ましいのは、少なくとも主成分としてトール油脂肪酸（ＴＯＦＡ）を含む混合物である。
【００２３】
開示される本発明の実施形態は、本明細書に開示される特定のプロセスステップまたは材料に限定されず、関連技術分野の当業者によって認識されるように、それらの等価物まで拡張されることが理解される。また、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明するためだけに使用され、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００２４】
本明細書を通して、一つの実施形態または一実施形態の参照は、この実施形態に関連して説明される特定の特徴または特性が、本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の様々な箇所における「一つの実施形態では」または「一実施形態では」という表現の出現は、必ずしもすべて同じ実施形態を指しているわけではない。例えば、約または実質的になどの用語を用いて数値を参照する場合、正確な数値も開示される。
【００２５】
本明細書で使用されるように、複数の項目、構造要素、構成要素、および／または材料は、便宜上共通のリストに提示されてもよい。しかし、これらのリストは、リストの各要素が別々の特有の要素として個々に識別されるように解釈されるべきである。したがって、そのようなリストの個々の要素は、同一のリストの他の要素と実質的に等価であると解釈されるべきではなく、逆の示唆がない共通グループ内の提示のみに基づいて解釈されるべきである。さらに、本発明の様々な実施形態および実施例は、本明細書において、その様々な構成要素の代替案と共に参照されてもよい。そのような実施形態、実施例、および代替物は、互いに事実上等価であると解釈されるべきではなく、本発明の独立した自律的な表現としてみなされるべきであることが理解される。
【００２６】
したがって、一実施形態では、本発明は、水溶液中のセルロースへのリグニンの共有結合方法であって、トール油脂肪酸（ＴＯＦＡ）で改質されたリグニン粒子（典型的にはナノ粒子）の水性混合物を調製すること、およびこれらのＴＯＦＡ改質リグニン粒子（ＴＬＮＰ）をセルロース繊維または粒子（ナノクリスタル、ＣＮＣを含む）と反応させることによって特徴づけられる。
【００２７】
この実施形態の主な概念は、水系溶液中での任意にナノセルロースの形態での、セルロースへのリグニンの共有結合である。これは、ＴＯＦＡ改質リグニンからのナノ粒子（ＮＰ）の安定な分散物の製造、およびアリルまたは３−アリルオキシ−２−ヒドロキシプロピル置換基による（ナノ）セルロースのアリル化によって促進され、ここでＴＯＦＡ中の二重結合およびセルロース中のアリル基は、共有結合のための反応性官能基として働く。ＴＬＮＰによって提供される化学は、水ベースの溶液中の機能性添加剤または作用物質としてＮＰを使用することによっても利用することができる。
【００２８】
本発明の一実施形態では、ＴＬＮＰは、天然脂肪酸、好ましくはＴＯＦＡ、の混合物を用いてリグニンをエステル化することによって形成される。好ましい実施形態によれば、エステル化は、リグニンＮＰが形成される前に実施される。
【００２９】
ＴＯＦＡは、パルプ化プロセスの副生成物である粗トール油（ＣＴＯ）から、脂肪酸リッチ画分を他の成分から分離および回収することによって得られる。
【００３０】
本発明の一実施形態によれば、使用されるＴＯＦＡは、約９５〜９８％の脂肪酸と、合計２〜５％の飽和脂肪酸、ロジン酸および不けん化物とを含む、脂肪酸混合物である。脂肪酸の総含有量のうち、約３０〜７０％がＣ１８：２脂肪酸であり、４０〜６０％がＣ１８：１脂肪酸である。
【００３１】
本発明の別の実施形態によれば、リグニンのヒドロキシル基は、ＴＯＦＡに含まれる不飽和脂肪酸でエステル化される。これらの不飽和脂肪酸は、通常、ＴＯＦＡ組成物の８０〜９９質量％、好ましくは８５〜９９質量％を構成する。好ましくは、ＴＯＦＡ中のロジン酸の含有量は約０．１〜１０％であり、不けん化物の含有量は５％未満である。ロジン酸および不けん化物の合計含有量が５％以下である組成物が特に好ましい。
【００３２】
使用されるＴＯＦＡの脂肪酸は、典型的には１６〜２０個の炭素原子を含み、主成分はそれぞれ１および２個の二重結合を有するオレイン酸およびリノール酸（すなわちＣ１８：１およびＣ１８：２脂肪酸）などの不飽和Ｃ１８脂肪酸と、リノレン酸およびピノレン酸（いずれも３つの二重結合を有する、すなわち、Ｃ１８：３脂肪酸）である。
【００３３】
典型的には、脂肪酸のうち、Ｃ１８：３脂肪酸は１０％まで形成するが、主成分は１個と２個の二重結合を含む脂肪酸である。典型的には、Ｃ１８：２脂肪酸の含有量は２０〜７０重量部であり、Ｃ１８：１脂肪酸の含有量は２０〜７０重量部である。
【００３４】
本開示は主にＴＯＦＡ組成物の使用に関するものであるが、天然脂肪酸の他の同様の組成物も本目的に適することに留意すべきである。したがって、適切な脂肪酸組成物は大豆、ヒマワリ、菜種、キャノーラおよびオリーブ油；マスタード、パーム、ピーナッツ、ヒマシ油およびヤシ油などからの、菜種油、アマニ油、麻実油などの様々な供給源から得ることができる。また、魚および海藻由来の油は、原則として本文脈において有用である。
【００３５】
脂肪酸画分の比率または純度を上げ、上記の脂肪酸含量を得るために、例えば蒸留などの分離処理を含む、種々の処理工程に前記脂肪酸源を投入することが必要な場合がある。
【００３６】
一実施形態によれば、ＴＯＦＡなどの使用される脂肪酸混合物の酸、主に脂肪酸、特に不飽和脂肪酸は、様々な置換度でリグニンに共有結合する。典型的には、この置換度は（ＴＯＦＡ  Ｌ  ５０の生成物を与えるために）４０〜１００％、好ましくは５０〜１００％、最も適切には約５０％または（ＴＯＦＡ  Ｌ  １００の生成物を与えるために）約１００％である。
【００３７】
本発明の一実施形態によれば、使用されるリグニンは、木材加工から単離されたリグニンから選択され、典型的には軟材または硬材パルプから、好ましくはクラフトパルプから、最も好ましくはリグノブーストリグニンを使用して、抽出される。そのようなリグニンの化学的性質は、（ｉ）リグノセルロース源および（ｉｉ）その源の繊維が処理された方法によって影響される。
【００３８】
例えば脂肪酸によるリグニンのエステル化は、公知の多くのエステル化方法によって実施することができる。この反応は液体媒体中または乾燥相中で行うことができる。適切な方法の例としては、トランスエステル化、酸基の反応性誘導体（例えば酸無水物、酸塩化物）を用いるエステル化、触媒による直接エステル化、および溶媒の使用を避けるためのスクリュー反応器の使用が挙げられる。
【００３９】
典型的なエステル化は、周囲圧力で操作する場合、一般に０〜１００℃の温度で実施される。反応物に応じて、０〜５０℃の温度が特に有利であり得る。
【００４０】
従来の酸またはアルカリ触媒を用いることができる。
【００４１】
一実施形態では、エステル化は、乾燥雰囲気、例えば窒素またはアルゴンなどの不活性ガス中で実施される。他の実施形態では、エステル化は、減圧下、例えば、０．０００１〜０．１バールの絶対圧力で、実施される。
【００４２】
リグニンエステル（例えば、ＴＯＦＡ−リグニン）を反応混合物から単離し、例えば、洗浄（エタノールなど）により精製し、次いで、典型的には真空オーブン中で、穏やかに乾燥させる。
【００４３】
１つの選択肢では、エステル化は、最初に脂肪酸混合物を対応する脂肪酸塩化物混合物に変換し、続いてそれをリグニンと反応させることによって実施される。反応の程度は、リグニンとＴＯＦＡの比を調節することによって調整することができる。
【００４４】
上述のように、エステル化に使用される酸の少なくとも一部は不飽和を含む。リグニンは、フェノール性ヒドロキシル基、脂肪族ヒドロキシル基またはそれらの組み合わせを含み、特に、ヒドロキシル基は、シリンギル、グアイアシルまたは類似の基を含む。本反応により、ヒドロキシル基の少なくとも４０％、好ましくは５０〜１００％が置換またはエステル化される。
【００４５】
TOFAの活性な複数の二重結合官能基は、生成物特性のさらなる調整を可能にする。
【００４６】
改質リグニンＮＰの調製のために、改質リグニンをＴＨＦなどの適当な有機溶媒に溶解し、その後水を添加することにより、有機溶媒を蒸発させて水溶液中にＮＰを得ることができる。
【００４７】
上記の実施形態によるＴＯＦＡ−エステル化リグニンをセルロースと反応させる場合、さらなる利点が得られ、これにより、可塑剤を添加しなくても、低温、すなわち１００℃より低い温度、例えば６５または８０℃で配合反応を行うことができる。
【００４８】
上記のように脂肪酸を用いてエステル化したリグニンは、抗菌目的のためにそのまま使用することもできるし、またはセルロース表面に付着させることもできる。
【００４９】
そのようなものとして使用するために、典型的には、最初にその物質をその水性混合物から分離し、それによって脂肪酸改質リグニンの粒子が得られる。
【００５０】
ＴＯＦＡ−リグニン粒子（ＴＬＮＰ）との反応において使用されるセルロース原料は、例えばパルプ化プロセスにおける木材材料から単離される、任意の従来の植物セルロースから選択することができる。あるいは、バクテリアセルロースを使用することができる。
【００５１】
本発明の一実施形態によれば、セルロースとＴＯＦＡ−リグニンの適切な比は、１０〜６０  ｍｇセルロース／ｍｌ  ＴＯＦＡ−リグニンである。
【００５２】
ＴＬＮＰとの反応の前の、例えばアリル化による、セルロースの改質は必ずしも必要ではない。ＴＬＮＰは未改質セルロースにも付着するが、例えばアリル化によって改質された、セルロースに付着することが判明しており、改質リグニンはより均一な被覆を提供する。我々の結果は、ＴＬＮＰがアリル化セルロースに均一に分布しているのに対して、ＮＰは基準セルロースサンプルに大きなクラスターとして付着していることを示している。
【００５３】
我々は、本明細書に記載のＴＬＮＰが抗菌特性を有することを示している。この特性は、健康リスクと環境リスクの両方を有することが知られている銀（または他の）ＮＰの代わりに、ＴＬＮＰの適用可能性をもたらす。したがって、潜在的な適用領域は、例えば、抗菌性塗料、スポーツウェアおよび医療用織物（例えば、組織接着剤およびプラスターコーティング）であり得る。
【００５４】
これらの抗菌特性を利用するための別の選択肢は、被覆材料としてナノセルロースにグラフトされたＴＬＮＰの使用、すなわちバルク材料全体にＮＰを付ける代わりに表面上に抗菌層を適用することであり得る。
【００５５】
ＴＬＮＰは、その適切な疎水性および他の有益な特性のために、接着剤および塗料の添加剤としても役立ち得る。
【００５６】
したがって、最も潜在的な用途は、接着剤および分散剤などの大量生産製品、および生分解性抗菌繊維表面（スポーツウェア、医療用繊維）、組織接着剤および薬剤送達における多孔性担体などのより困難な用途の両方である。
【００５７】
以下の非限定的な例は、本発明の実施形態で得られる利点を単に例示することを意図したものである。
【実施例】
【００５８】
実施例１−ＴＯＦＡ−リグニンＮＰの調製
ＴＯＦＡ−リグニンＮＰの調製のために、トール油脂肪酸改質リグニン試料ＴＯＦＡ−Ｌ−５０およびＴＯＦＡ−Ｌ−１００をＴＨＦに溶解した（工程１）。Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水をゆっくりとその溶液に添加した（工程２）。その後、回転蒸発器を用いてＴＨＦを蒸発させた（工程３）。この後、試料をセルロースアセテート透析膜（ＭＷＣＯ  １０００Ｄａ）を用いて３日間水に対して透析した。２つの異なるバッチを、溶媒交換の時間を変更することによって調製した。
【００５９】
得られた生成物粒子（ＴＬＮＰ５０およびＴＬＮＰ１００）を動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析し、表１に列挙する特性を有することが示された。「サイズ」は溶液中の粒子のサイズ分布を表し、「ゼータ」は対応するゼータ電位を表す。原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）によって得られた寸法は、バッチ１試料についてはＤＬＳと同じ範囲にあった（表２）。
【００６０】
【表１】
2019502767.tif 000002
【００６１】
【表２】
2019502767.tif 000003
【００６２】
実施例２−ＴＯＦＡ−リグニン誘導体を用いたセルロース繊維の改質
反応手順
【化１】
2019502767.tif 000004
２つのサンプルを調製した。１）２５０ｍｌのＴＯＦＡ−リグニン−５０ＮＰ（ＴＬＮＰ５０）または２）ＴＯＦＡ−リグニン−１００ＮＰ（ＴＬＮＰ１００）（前の実施例からの）を５００ｍｌの反応器に加えた。１）５ｇまたは２）１０ｇの改質セルロース繊維（Domsjo、酵素処理、アリル化）をそれぞれ添加した。
【００６３】
反応混合物を３５０ｒｐｍの速度で撹拌し、６５℃まで加熱した。１時間後、０．２５ｇの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を５ｍｌの水に加えた。次いで、反応混合物を６５℃で一晩（約１６〜１８時間）撹拌した。
【００６４】
反応混合物を２２℃に冷却した。ＴＬＮＰを有するセルロース繊維を、ブフナー漏斗を用いて濾紙（Ｓ＆Ｓ  ５９５）を通してろ過し、脱イオン水で数回洗浄した。
【００６５】
生成物試料、セルロース上のＴＯＦＡ−リグニン（ＴＯＦＡ−リグニン−５０−５ｇ−セルロース／ＴＯＦＡ−Ｌ５０−５ＣおよびＴＯＦＡ−リグニン−１００−１０ｇ−セルロース／ＴＯＦＡ−Ｌ１００−１０Ｃ）を室温で一晩乾燥させ、秤量した。
【００６６】
収率は、ＴＯＦＡ−Ｌ５０−５Ｃの９２％およびＴＯＦＡ−Ｌ１００−１０Ｃの１０６％であった。
【００６７】
アセトン中30％水の溶液中で生成物を分析する場合、数日後でも溶液に色がない。これは、アリル化セルロースとTOFA-リグニンとの間に共有結合が形成されている可能性が最も高いことを示している。
【００６８】
次に、アセトン中の０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液３０％を用いた加水分解試験では、液相にすぐに褐色が形成された。これは、ＴＯＦＡとリグニンとの間のエステル結合の加水分解を示している。
【００６９】
さらに、ＳＥＭ画像（図１）は、ＴＯＦＡ１００改質リグニン粒子がセルロース表面を覆っている様子を示した。
【００７０】
実施例３−溶液中のTOFA改質リグニンナノ粒子とTOFA改質リグニンでコーティングしたセルロース試料の抗菌特性の検討
試験試料の抗菌活性を、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ  ＩＩ−ブロス中の改質ＣＬＳＩ  Ｍ１００−Ｓ１９法を用いて分析した。試験試料からの２倍希釈液を培養液に調製し、一晩増殖させた細菌接種液と混合した。３７℃で試料の増殖を、自動濁度計Bioscreenで４８時間モニターした。最小阻害濃度（ＭＩＣ）値および増殖阻害％値を計算した。
【００７１】
試験した試料は、いくつかの抗菌性製品に用いられる従来の銀ナノ球（Sigma）、ならびに本発明のTOFA-リグニン粒子（TLNP50およびTLNP100）を含んでいた。この例で使用したストック濃度を以下の表3に列挙する。
【００７２】
【表３】
2019502767.tif 000005
【００７３】
分析に使用した微生物を以下の表4に列挙する。
【００７４】
【表４】
2019502767.tif 000006
【００７５】
分析結果を図２（銀のみ）および図３に示し、銀ナノ粒子、ＴＬＮＰ５０（２９５ｎｍ）およびＴＬＮＰ１００（４２０ｎｍ）の抗菌活性をそれぞれ例として示す。試験した全ての試料の増殖阻害活性（％）を表５に示す。結果から明らかなように、全ての試験試料は抗菌活性を有していた。
【００７６】
グラム陽性の黄色ブドウ球菌は、グラム陰性の標的微生物よりもリグニン−ＮＰ試料に対して感受性が高いようであった。リグニン−ＮＰ試料については、試験した最高濃度よりも高い最小阻害濃度（ＭＩＣ）値を有する。
【００７７】
【表５】
2019502767.tif 000007
【００７８】
ＴＬＮＰ１００−改質セルロース試料の抗菌活性を、試料表面に直接標的細胞を適用することによって、黄色ブドウ球菌ＶＴＴ  Ｅ−７００４５に対して試験した。簡潔に述べると、一晩増殖した細胞を希釈し、１０５個の細胞を試験片（直径１２ｍｍ）に塗布した。試料を３７℃で１時間インキュベートし、細胞の生存率をプレートカウント技術で分析した。結果（試料当たりのコロニー形成単位）を表６に示す。インキュベーション期間中、基準表面（ろ紙）上で細胞は生存した。
【００７９】
【表６】
2019502767.tif 000008
【００８０】
実施例４−ＴＯＦＡ−リグニン改質セルロースフィルムの抗菌特性の検討
溶媒としてＴＨＦを用いてＴＯＦＡリグニンナノ粒子（ＴＬＮＰ５０およびＴＬＮＰ１００）を調製した。０．４８ｇのＴＯＦＡ−Ｌ−５０またはＴＯＦＡ−Ｌ−１００を３６０ｍｌのＴＨＦに溶解した。４８０ｇのミリＱ水を、室温で撹拌しながらその溶液にゆっくりと（３０分間）添加した。その後、ロータリーエバポレーターを用いてＴＨＦの主要部分を蒸発させ、最後に、３５００Ｄａの分離を有する膜を用いてＴＬＮＰ懸濁液を透析した。水懸濁液中のリグニンナノ粒子の最終濃度は１ｍｇ／ｍｌであった。
【００８１】
２５０ｍｌのこれらのＴＬＮＰ−５０およびＴＬＮＰ−１００ナノ粒子懸濁液を各官能化バッチに使用し、５００ｍｌの反応器に加えた。３．７ｇのセルロース繊維を添加し、３５０ｒｐｍで撹拌した。反応混合物を＋６５℃まで加熱し、５ｍｌの水中の０．２５ｇの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を添加した。撹拌を＋６５℃で１８時間続けた。次いで、反応混合物を＋２２℃に冷却した。ブフナー漏斗を使用してＴＬＮＰを有するセルロース繊維をろ紙（φ１２５ｍｍ、Ｓ＆Ｓ５９５）上にろ過し、脱イオン水で数回洗浄し、室温で乾燥した。
【００８２】
２５０ｍｌの脱イオン水中でのみ開始剤としてＡＰＳを使用して、３．７ｇのセルロース繊維を有する対照ろ紙を上記と同様の方法で調製した。
【００８３】
このように調製したＴＯＦＡ−リグニンナノ粒子溶液（ＴＬＮＰ５０およびＴＬＮＰ１００）の抗菌活性を、Mueller-Hinton II−ブロス中の改変ＣＬＳＩ  Ｍ１００−Ｓ１９法を用いて分析した。銀ナノ球（Sigma-Aldrich 795925、平均サイズ１０ｎｍ）を参照として使用した。大腸菌  VTT E-94564、黄色ブドウ球菌  VTT E-70045および緑膿菌  VTT E-96726は、VTT Culture Collectionから入手した。簡潔には、試験試料からの２倍希釈液をブロス中に調製し、３７℃で増殖させた細菌細胞で一晩調製した接種材料（１０６細胞ｍｌ−１）と混合した。自動濁度計、Bioscreen C（商標）（Thermo Scientific、Finland）およびResearch Expressソフトウェア（Transgalactic Ltd、Finland）を用いて、３７℃でマイクロウェルシステムでの試料の増殖を４８時間モニターした。増殖阻害％値を増殖曲線から計算した。
【００８４】
これらの改質セルロースフィルムの抗菌活性を、試料表面に直接標的細胞を塗布することによって、黄色ブドウ球菌VTT E-70045および大腸菌VTT E-94564に対して試験した。ろ紙、未改質セルロースおよび市販の銀ブラスタを参照として使用した。簡潔には、トリプチカーゼ中で一晩、大豆ブロス増殖細胞をペプトン生理食塩水で希釈し、１０５個の細胞を試験片（直径１２ｍｍ）に塗布した。試料を３７℃で３０分間インキュベートし、細胞の生存率をプレートカウント寒天上でプレートカウント技術で分析した。
【００８５】
結果を以下の表７に示す。
【００８６】
【表７】
2019502767.tif 000009
【００８７】
結果から明らかなように、０．５ｍｇｍｌ−１濃度のＴＬＮＰ−５０およびＴＬＮＰ−１００試料は抗菌活性を有し、黄色ブドウ球菌Ｅ−７００４５に対する増殖阻害率はそれぞれ５１±２１および３１±６であった（表７）。試料の抗菌活性は、グラム陽性黄色ブドウ球菌細胞よりも、グラム陰性の標的微生物である大腸菌および緑膿菌に対して弱かった。
【００８８】
アリル化セルロースおよびリグニン粒子官能化セルロース表面は抗菌活性を有し、３０分の曝露の間に表面に塗布された細胞は死んだ（表８）。実験中、細胞はろ紙、未改質セルロースおよび銀プラスター上に生存した。これは、標的細胞とアリル化セルロースおよび官能化セルロース表面との迅速な相互作用を示す。
【００８９】
【表８】
2019502767.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の材料は、生分解性抗菌繊維表面（スポーツウエア、医療用繊維製品）、組織接着剤、および薬物送達における多孔性担体、すなわちより一般的には従来の抗菌性表面の置換用として使用することができる。さらに、本発明の材料は、接着剤および分散剤などの大量製品に有用である。
【００９１】
引用リスト
特許文献
国際公開第2006108637A2号
国際公開第2013050661A1号
国際公開第2015011364A2号
非特許文献
Hult, E.-L., Ropponen, J., Poppius-Levlin, K., Ohra-Aho, T., Tamminen, T., Industrial Crops and Products (2013), 50, 694-700
Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D., Green Chemistry (2014), 16(4), 2156-2163
Saastamoinen, P., Mattinen, M.-L., Hippi, U., Nousiainen, P., Sipila, J., Lille, M., Suurnakki, A., Pere, J., BioResources (2012), 7(4), 5749-5770 
Aulin, C. and Stroem, G., Industrial & Engineering Chemistry Resaearch (2013), 52(7), 2582-2589
【図１】
2019502767.tif 000011
【図２】
2019502767.tif 000012
【図３Ａ】
2019502767.tif 000013
【図３Ｂ】
2019502767.tif 000014
【国際調査報告】
2019502767.tif 000015
2019502767.tif 000016
2019502767.tif 000017
2019502767.tif 000018
2019502767.tif 000019