(57)【要約】  本明細書においては、いくつかの側面において、リボ核酸の無細胞的生産のための方法および組成物が提供される。
2019510504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸（ＲＮＡ）を生合成する無細胞的方法であって、該方法が：
（ａ）ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する酵素活性、耐熱性キナーゼ活性、および耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性とを含む細胞ライセート混合物を、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下においてインキュベートして、ヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセート混合物を生産すること；
（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセート混合物を、耐熱性キナーゼ活性および耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ活性を完全に不活性化することなしに内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化または部分的に不活性化する温度に加熱して、熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセート混合物を生産すること；および
（ｃ）（ｂ）において生産された細胞ライセート混合物を、エネルギー供給源と関心のＲＮＡをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型との存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートして、関心のＲＮＡを含む細胞ライセート混合物を生産すること、
を含む、
前記方法。
【請求項２】
細胞ライセート混合物が、ＲＮＡを含み、かつリボヌクレアーゼとして働く、キナーゼとして働く、および／またはＲＮＡポリメラーゼとして働く少なくとも１つの酵素または融合酵素を発現する細胞から得られる単一の細胞ライセートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞ライセート混合物が、少なくとも２つの細胞ライセートを含み、少なくとも１つの細胞ライセートが、ＲＮＡを含む細胞から得られ、少なくとも１つの細胞ライセートが、ヌクレアーゼとして働く、キナーゼとして働く、および／またはＲＮＡポリメラーゼとして働く少なくとも１つの酵素または融合酵素を発現する細胞から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）のＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞ライセート混合物が、少なくとも１つのリボヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性キナーゼ、および／または少なくとも１つの耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのリボヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、ＲＮａｓｅ  ＩＩ、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ｒ、ＲＮａｓｅ  ＪＩ、ＮｕｃＡ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ  Ｔ、ＲＮａｓｅ  Ｅ、およびＲＮａｓｅＧからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのリボヌクレアーゼがEscherichia coli  ＲＮａｓｅ  Ｒである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの耐熱性キナーゼが、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、および耐熱性ポリリン酸キナーゼからなる群から選択される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼが、耐熱性ウリジル酸キナーゼ、耐熱性シチジル酸キナーゼ、耐熱性グアニル酸キナーゼ、および耐熱性アデニル酸キナーゼからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼが、ｐｙｒＨ遺伝子によってコードされる耐熱性Pyrococcus furiosusウリジル酸キナーゼ（ＰｆＰｙｒＨ）、ａｄｋ遺伝子によってコードされる耐熱性Thermus thermophilusアデニル酸キナーゼ（ＴｔｈＡｄｋ）、ｃｍｋ遺伝子によってコードされる耐熱性Thermus thermophilusシチジル酸キナーゼ（ＴｔｈＣｍｋ）、およびｇｍｋ遺伝子によってコードされる耐熱性Thermotoga maritimaグアニル酸キナーゼ（ＴｍＧｍｋ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼが、Aquifex aeolicus ｎｄｋ遺伝子によってコードされる耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼからなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
耐熱性ポリリン酸キナーゼが、耐熱性ポリリン酸キナーゼ１（ＰＰＫ１）酵素および耐熱性ポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）酵素からなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
耐熱性ＰＰＫ１酵素が、耐熱性Thermosynechococcus elongatus ＰＰＫ１酵素からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
耐熱性ＰＰＫ２酵素が、耐熱性クラスＩＩＩ ＰＰＫ２酵素からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
耐熱性クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素が、Meiothermus ruber、Meiothermus silvanus、Deinococcus geothermalis、Thermosynechococcus elongates、Anaerolinea thermophile、Caldilinea aerophila、Chlorobaculum tepidum、Oceanithermus profundus、Roseiflexus castenholzii、Roseiflexus sp.、およびTruepera radiovctrix ＰＰＫ２酵素からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
耐熱性クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素が、配列番号８〜１８のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む耐熱性クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
耐熱性クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素が、配列番号８〜１８のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む耐熱性クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞ライセート混合物が、少なくとも１つのリボヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、少なくとも１つの耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、および少なくとも１つのポリリン酸キナーゼを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの耐熱性ＲＮＡポリメラーゼが、耐熱性ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
耐熱性ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、および耐熱性Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの耐熱性ＲＮＡポリメラーゼが、耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
エネルギー供給源が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
エネルギー供給源が、ＡＴＰ再生系である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＡＴＰ再生系が、ポリリン酸、任意にヘキサメタリン酸、ヌクレオシド一リン酸、およびポリリン酸キナーゼを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
エネルギー供給源、またはエネルギー供給源の少なくとも１つのコンポーネントがステップ（ｃ）の細胞ライセート混合物に追加される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの精製された酵素または融合酵素がステップ（ａ）の細胞ライセート混合物に追加され、該少なくとも１つの精製された酵素または融合酵素は、ＲＮＡの解重合をもたらしてヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセート混合物を生産する条件下において、ＲＮＡを解重合する酵素活性、耐熱性キナーゼ活性、および耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ活性からなる群から選択される酵素活性を有する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの精製された酵素または融合酵素がステップ（ｃ）の細胞ライセート混合物に追加され、該少なくとも１つの精製された酵素または融合酵素は、ＲＮＡの解重合をもたらしてヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセート混合物を生産する条件下において、ＲＮＡを解重合する酵素活性、耐熱性キナーゼ活性、および耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ活性からなる群から選択される酵素活性を有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ａ）の細胞ライセート混合物が、関心のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
関心のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型がステップ（ｃ）の細胞ライセート混合物に追加される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
関心のＲＮＡが、一本鎖ＲＮＡである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
一本鎖ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
一本鎖ＲＮＡが、アンチセンスＲＮＡである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
関心のＲＮＡが、二本鎖ＲＮＡである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
二本鎖ＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
関心のＲＮＡが、ヒンジドメインによって互いに連結された相補的なドメインを含有する一本鎖ＲＮＡである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ａ）の細胞ライセート混合物が、さらにＭｇ２＋キレート剤を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
Ｍｇ２＋キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ａ）の細胞ライセート混合物が、さらに塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）および／または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｂ）の温度が、５０℃〜８０℃である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
関心のＲＮＡが、少なくとも１ｇ／Ｌの濃度で生産される、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
関心のＲＮＡが、少なくとも５ｇ／Ｌの濃度で生産される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
関心のＲＮＡが、少なくとも１０ｇ／Ｌの濃度で生産される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
任意に、熱不活性化された細胞ライセート混合物と蛋白質沈殿剤とを組み合わせること、および沈殿した蛋白質、脂質、およびＤＮＡを除去することによって、関心のＲＮＡを精製することをさらに含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
細胞が、細菌細胞である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
細菌細胞が、Escherichia coli細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
細胞が酵母細胞である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
細胞培養培地中で、（ａ）ＲＮＡを含む細胞と、（ｂ）少なくとも１つのリボヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性キナーゼ、および任意に少なくとも１つの耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含む細胞とを培養することを含む、方法。
【請求項４８】
（ａ）および（ｂ）の細胞を溶解して細胞ライセートを生産することおよび該細胞ライセートを組み合わせて複数の酵素活性を含有する混合物を生産すること；あるいは（ａ）および（ｂ）の細胞を組み合わせること、および組み合わせられた細胞を溶解して複数の酵素活性を含有する混合物を生産することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
細胞ライセートを、耐熱性キナーゼを完全に不活性化することなしに内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化または部分的に不活性化する温度に加熱して、熱不活性化された細胞ライセートを生産することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
熱不活性化された細胞ライセートを、エネルギー供給源および関心のＲＮＡをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型の存在下、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下でインキュベートして、関心のＲＮＡを含む細胞ライセート混合物を生産することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも１つの耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、少なくとも１つの耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、および少なくとも１つの耐熱性ポリリン酸キナーゼを含む、改変細胞。
【請求項５２】
さらに少なくとも１つのリボヌクレアーゼおよび／または少なくとも１つの耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５３】
ヌクレオシド三リン酸、関心のリボ核酸（ＲＮＡ）をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を含む、細胞ライセート。
【請求項５４】
さらに、エネルギー供給源、ヌクレオシド一リン酸、および５’−ヌクレオシド一リン酸から５’−ヌクレオシド三リン酸への変換を直接的または間接的に触媒する少なくとも１つのキナーゼ活性を含む、請求項５３に記載の細胞ライセート。
【請求項５５】
さらに多量体ＲＮＡとＲＮＡを解重合する酵素活性とを含む、請求項５３または５４に記載の細胞ライセート。
【請求項５６】
請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の細胞ライセートであって、該細胞ライセートおよび／または該細胞ライセートの少なくとも１つのコンポーネントは改変細胞から得られる、前記細胞ライセート。
【請求項５７】
請求項５３〜５６のいずれか一項に記載の細胞ライセートであって、該細胞ライセートおよび／または該細胞ライセートの少なくとも１つのコンポーネントは細菌細胞から得られる、前記細胞ライセート。
【請求項５８】
細菌細胞が、Escherichia coli細胞である、請求項５７に記載の細胞ライセート。
【請求項５９】
請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の細胞ライセートであって、該細胞ライセートは、ＲＮＡを含み、かつリボヌクレアーゼとして働く、キナーゼとして働く、および／またはＲＮＡポリメラーゼとして働く少なくとも１つの酵素または融合酵素を発現する細胞から得られる、前記細胞ライセート。
【請求項６０】
請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の細胞ライセートであって、該細胞ライセートは少なくとも２つの細胞ライセートの混合物を含み、少なくとも１つの細胞ライセートは、ＲＮＡを含む細胞から得られ、少なくとも１つの細胞ライセートは、ヌクレアーゼとして働く、キナーゼとして働く、および／またはＲＮＡポリメラーゼとして働く少なくとも１つの酵素または融合酵素を発現する細胞から得られる、前記細胞ライセート。
【請求項６１】
多量体ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【請求項６２】
細胞ライセートが、少なくとも１つのリボヌクレアーゼ、少なくとも１つのキナーゼ、および／または少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項５３〜６１のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【請求項６３】
少なくとも１つのリボヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、ＲＮａｓｅ  ＩＩ、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ｒ、ＲＮａｓｅ  ＪＩ、ＮｕｃＡ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ  Ｔ、ＲＮａｓｅ  Ｅ、およびＲＮａｓｅＧからなる群から選択される、請求項６２に記載の細胞ライセート。
【請求項６４】
少なくとも１つのリボヌクレアーゼが、Escherichia coli  ＲＮａｓｅ  Ｒである、請求項６３に記載の細胞ライセート。
【請求項６５】
少なくとも１つのキナーゼが、少なくとも１つの耐熱性キナーゼであり、および／または少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼが、少なくとも１つの耐熱性ＲＮＡポリメラーゼである、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【請求項６６】
少なくとも１つのキナーゼが、ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、およびポリリン酸キナーゼからなる群から選択される、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【請求項６７】
ヌクレオシド一リン酸キナーゼが、ウリジル酸キナーゼ、シチジル酸キナーゼ、耐熱性グアニル酸キナーゼ、およびアデニル酸キナーゼからなる群から選択される、請求項６５に記載の細胞ライセート。
【請求項６８】
ヌクレオシド一リン酸キナーゼが、ｐｙｒＨ遺伝子によってコードされるPyrococcus furiosusウリジル酸キナーゼ（ＰｆＰｙｒＨ）、ａｄｋ遺伝子によってコードされるThermus thermophilusアデニル酸キナーゼ（ＴｔｈＡｄｋ）、ｃｍｋ遺伝子によってコードされるThermus thermophilusシチジル酸キナーゼ（ＴｔｈＣｍｋ）、およびｇｍｋ遺伝子によってコードされるThermotoga maritimaグアニル酸キナーゼ（ＴｍＧｍｋ）からなる群から選択される、請求項６７に記載の細胞ライセート。
【請求項６９】
ヌクレオシド二リン酸キナーゼが、Aquifex aeolicus  ｎｄｋ遺伝子によってコードされるヌクレオシド二リン酸キナーゼからなる群から選択される、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【請求項７０】
ポリリン酸キナーゼが、ポリリン酸キナーゼ１（ＰＰＫ１）酵素およびポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）酵素からなる群から選択される、請求項６６〜６９のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【請求項７１】
ＰＰＫ１酵素が、Thermosynechococcus elongatus  ＰＰＫ１酵素からなる群から選択される、請求項７０に記載の細胞ライセート。
【請求項７２】
ＰＰＫ２酵素が、クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素からなる群から選択される、請求項７０または７１に記載の細胞ライセート。
【請求項７３】
クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素が、Meiothermus ruber、Meiothermus silvanus、Deinococcus geothermalis、Thermosynechococcus elongates、Anaerolinea thermophile、Caldilinea aerophila、Chlorobaculum tepidum、Oceanithermus profundus、Roseiflexus castenholzii、Roseiflexus sp.、およびTruepera radiovctrix  ＰＰＫ２酵素からなる群から選択される、請求項７２に記載の細胞ライセート。
【請求項７４】
クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素が、配列番号８〜１８のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むクラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素からなる群から選択される、請求項７２または７３に記載の細胞ライセート。
【請求項７５】
クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素が、配列番号８〜１８のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むクラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素からなる群から選択される、請求項７４に記載の細胞ライセート。
【請求項７６】
細胞ライセート混合物が、少なくとも１つのリボヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、少なくとも１つの耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、および少なくとも１つのポリリン酸キナーゼを含む、請求項５３〜７５のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【請求項７７】
少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項６２〜７６のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【請求項７８】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、およびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項７７に記載の細胞ライセート。
【請求項７９】
少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項７８に記載の細胞ライセート。
【請求項８０】
エネルギー供給源が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である、請求項５４〜７９のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【請求項８１】
エネルギー供給源が、ＡＴＰ再生系である、請求項５４〜７９のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【請求項８２】
ＡＴＰ再生系が、ポリリン酸、任意にヘキサメタリン酸、ヌクレオシド一リン酸、およびポリリン酸キナーゼを含む、請求項８１に記載の細胞ライセート。
【請求項８３】
関心のＲＮＡが、一本鎖ＲＮＡである、請求項５３〜８２のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【請求項８４】
一本鎖ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項８３に記載の細胞ライセート。
【請求項８５】
一本鎖ＲＮＡが、アンチセンスＲＮＡである、請求項８４に記載の細胞ライセート。
【請求項８６】
関心のＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである、請求項５３〜８２のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【請求項８７】
二本鎖ＲＮＡが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項８６に記載の細胞ライセート。
【請求項８８】
関心のＲＮＡが、ヒンジドメインによって互いに連結された相補的なドメインを含有する一本鎖ＲＮＡである、請求項５３〜８２のいずれか一項に記載の細胞ライセート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、米国特許法第119条（e）の下において、2016年4月6日出願のU.S.仮出願番号62/319,220および2017年1月31日出願のU.S.仮出願番号62/452,550の利益を主張し、これらのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
リボ核酸（ＲＮＡ）は生命に遍在する。ＲＮＡは、蛋白質の制御および合成のためのＤＮＡからの命令を運搬する、細胞内における情報の重要なメッセンジャーとして働く。細胞内におけるｍＲＮＡレベルの合成的な調節（ｍＲＮＡの導入によって正に、またはｓｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡの導入によって負に）は、農作物保護、抗癌治療、およびワクチンなどの分野への適用を有するため、ＲＮＡはバイオテクノロジーにおいて関心がある。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子のＤＮＡ配列を用いて遺伝子を「オフ」にする細胞機序−「サイレンシング」と言われるプロセスを言う。動物、植物、および真菌を含む多種多様な生物において、ＲＮＡｉは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘発される。機能的な一本鎖（例えばｍＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ分子は、生細胞内で、および精製された組換え体酵素と精製されたヌクレオチド三リン酸とを用いてin vitroで生産されてきた（例えば、欧州特許Ｎｏ．１６３１６７５およびＵ．Ｓ．特許出願公開Ｎｏ．２０１４／０２７１５５９Ａ１を参照。これらのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる）。とはいえ、広範な商業的適用を可能にするスケールでのＲＮＡの生産は、現在は法外なコストがかかる。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書においてはＲＮＡの生産（生合成）のための方法、組成物、細胞、構築物、およびシステムが提供される。一般的には、バイオマス材料からの多量体ＲＮＡがその成分モノマーへと酵素的に解重合され、それから、それらのモノマーは（一連のキナーゼによって）それらの同族の三リン酸化されたバリアントへとリン酸化され、これらはその後対応する核酸（例えばＤＮＡ）鋳型を用いて多量体ＲＮＡへと重合される。
【０００４】
いくつかの態様において、本開示の方法、組成物、細胞、構築物、およびシステムは、例えば、少なくとも１つの細胞ライセート、精製蛋白質の組み合わせ、または細胞ライセート（単数または複数）と精製蛋白質（単数または複数）との組み合わせを用いた無細胞的条件下におけるＲＮＡの生産のために用いられる。いくつかの態様において、本開示は、細胞ライセートを用いたバイオマスからのＲＮＡ（例えば、細胞の内在性ＲＮＡ）からの所望の合成ＲＮＡ（例えば、合成の一本鎖または二本鎖ＲＮＡ）への変換に基づく。第１に、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、および／またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）（例えば、細胞ライセート中に存在する）などのバイオマスからのＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）は、１つ以上のヌクレアーゼによってそのモノマー形態、５’−ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）へと解重合される（図１、反応１）。次に、それらのヌクレアーゼ、ならびに天然のヌクレアーゼおよびホスファターゼは（例えば熱不活性化によって）不活性化または部分的に不活性化され、ＮＭＰは一連の耐熱性キナーゼ活性によってリボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）へとリン酸化される（図１、反応２）。最後に、ＮＴＰは核酸（例えばＤＮＡ）鋳型を用いてＲＮＡポリメラーゼ（例えば、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ）によって重合されて所望のＲＮＡを形成する（図１、反応３）。所望の合成ＲＮＡは任意に細胞ライセートから精製され得る。
【０００５】
それゆえに、本開示のいくつかの側面はリボ核酸（ＲＮＡ）を生産する（生合成する）無細胞的方法を提供し、該方法は：（ａ）（ｉ）ＲＮＡと（ｉｉ）ＲＮＡを解重合する酵素活性、耐熱性キナーゼ活性、および耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性とを含む、少なくとも１つの細胞ライセート混合物を、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下においてインキュベートして、ヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセート混合物を生産すること；（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセート混合物を、耐熱性キナーゼ活性および耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ活性を完全に不活性化することなしに内在性のヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化または部分的に不活性化する温度（例えば５０〜８０℃）に加熱して、熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセート混合物を生産すること；および（ｃ）ステップ（ｂ）において生産された細胞ライセート混合物を、エネルギー供給源（例えばＡＴＰ再生系）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型（例えば、関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する）の存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートして、関心のＲＮＡを含む細胞ライセート混合物を生産することを含む。
【０００６】
細胞ライセート混合物は、ＲＮＡを含み、かつリボヌクレアーゼとして働く、キナーゼとして働く、および／またはＲＮＡポリメラーゼとして働く少なくとも１つの酵素（少なくとも１つの融合酵素を包む）を発現する細胞から得られる、単一の細胞ライセートを含み得る。代替的には、細胞ライセート混合物は少なくとも２つの（例えば、少なくとも３、４、５、または６つの）細胞ライセートを含み得、少なくとも１つの細胞ライセートはＲＮＡを含む細胞から得られ、少なくとも１つの細胞ライセート（例えば、少なくとも２、３、４、または５つ）は、ヌクレアーゼとして働く、キナーゼとして働く、および／またはＲＮＡポリメラーゼとして働く少なくとも１つの酵素を発現する細胞から得られる。
【０００７】
酵素または融合酵素は、融合酵素の酵素がヌクレアーゼ活性を発揮する（核酸を切断または解重合する；例えばＲＮａｓｅ  Ｒ）場合に「ヌクレアーゼとして働く」と見なされる。酵素または融合酵素は、融合酵素の酵素がキナーゼ活性を発揮する（１つの分子から別の分子へのリン酸基の転移を触媒する；例えばポリリン酸キナーゼ）場合に「キナーゼとして働く」と見なされる。酵素または融合酵素は、融合酵素の酵素がポリメラーゼ活性を発揮する（ヌクレオチドをアセンブリして核酸を生産する；例えばＲＮＡポリメラーゼ）場合に「ポリメラーゼとして働く」と見なされる。
【０００８】
いくつかの態様において、ステップ（ａ）のＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である。
【０００９】
いくつかの態様において、細胞ライセート混合物は、少なくとも１つのリボヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性キナーゼ、および／または少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ（例えば、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ）を含む。融合酵素の使用もまた本開示に包含される。例えば、細胞ライセート混合物はリボヌクレアーゼとキナーゼとの融合体または複数のキナーゼの融合体を含み得る。他の融合酵素は本開示に包含される。
【００１０】
本開示の他の側面は、少なくとも１つのヌクレオシド一リン酸キナーゼ（例えば、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ）、少なくとも１つのヌクレオシド二リン酸キナーゼ（例えば、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ）、および少なくとも１つのポリリン酸キナーゼ（例えば、耐熱性ポリリン酸キナーゼ）を含む、改変細胞、細胞ライセート、および細胞ライセート混合物を提供する。いくつかの態様において、細胞は少なくとも１つのリボヌクレアーゼおよび／または少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ（例えば、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ）をもまた含み得る。
【００１１】
いくつかの態様において、ＲＮＡを生産する（生合成する）方法は、（ａ）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および／またはｒＲＮＡ）、ＲＮａｓｅ  Ｒ、耐熱性キナーゼ（例えば、ＰｆＰｙｒＨ、ＴｔｈＡｄｋ、ＴｔｈＣｍｋ、ＰｆＧｍｋ、ＡａＮｄｋ、ＴｅＰｐｋ、および／またはＰＰＫ２（例えば表６参照）、および耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む培養細胞（例えば改変細胞）を溶解し、それによって細胞ライセートを生産すること、（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセートを、ＲＮＡから５’−ＮＭＰへの解重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによって５’−ＮＭＰを含む細胞ライセートを生産すること、（ｃ）ステップ（ｂ）において生産された細胞ライセートを６０〜８０℃に加熱して、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを完全に不活性化することなしに内在性のヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化し、それによって熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセートを生産することと、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された細胞ライセートを、エネルギー供給源（例えば、ポリリン酸を含むＡＴＰ再生系）および改変核酸（例えばＤＮＡ）鋳型（例えば、関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する）の存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートして、関心のＲＮＡを生産することを含む。
【００１２】
いくつかの態様において、ＲＮＡ、ＲＮａｓｅ  Ｒ、耐熱性キナーゼ、および耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは培養細胞（例えば改変細胞）の単一の株内に含有される。他の態様においては、上記活性／コンポーネントのサブセットを含有する培養細胞（例えば改変細胞）が溶解され、ライセートが組み合わせられて、上記ステップ（ａ）に記載されている全ての酵素活性を含む細胞ライセート混合物を生成する。いくつかの態様において、酵素活性は、精製酵素の形態で、上記ステップ（ａ）に記載されているライセートに追加される。いくつかの態様において、ライセートおよび／または精製蛋白質は上記ステップ（ｃ）に記載されている熱不活性化ステップ前に組み合わせられる。他の態様において、ライセートおよび／または精製蛋白質は上記ステップ（ｃ）に記載されている熱不活性化ステップ後に組み合わせられる。
【００１３】
関心のＲＮＡはＲＮＡのいずれかの形態であり得、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡを包含する。例えば、関心のＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。他のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子は本明細書に包含される。
【００１４】
本発明のいくつかの態様の詳細は付随する図および発明を実施するための形態に提示されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は明細書および請求項から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本明細書に記載される無細胞的ＲＮＡ生産の概略図を示している。バイオマスからのＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）、ヌクレアーゼ、耐熱性キナーゼ、および／または耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含有する細胞を溶解し（または組み合わせて溶解し）、もたらされた細胞ライセート（単数または複数）を、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下においてインキュベートする。それから、細胞ライセートを加熱して、ヌクレアーゼおよびいずれかの内在性ホスファターゼを不活性化する（耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することなしに）。それから、細胞ライセートを、関心のＲＮＡをコードする改変ＤＮＡ鋳型の存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下でインキュベートし、それによって関心のＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ）を生産する。代替的には、個々の精製された経路酵素（例えば、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ）を熱不活性化ステップ後の細胞ライセートに追加し得る。それゆえに、いくつかの場合には、細胞ライセートを生産するために用いられる改変細胞は、上に記載されている酵素活性の１つ以上、例えばヌクレアーゼ、耐熱性キナーゼ、および／または耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを発現しない。
【００１６】
【図２】図２Ａは、エネルギー生成のためのポリリン酸依存性キナーゼ経路の概略図を示している。図２Ｂは、本開示の方法およびシステムへの使用のための追加の例示的なエネルギー変換経路の概略図を示している。ＵＭＰキナーゼ（例えばPyrococcus furiosusから得られる）およびポリリン酸キナーゼ（例えば、Thermosynechococcus elongatus、Caldilinea aerophila、Deinococcus geothermalis、Meiothermus ruber、Meiothermus silvanus、Deinococcus geothermalis、Anaerolinea thermophila、Chlorobaculum tepidum、Oceanithermus profundus、Roseiflexus castenholzii、Roseiflexus ｓｐ．、またはTruepera radiovctrixから得られる）がＵＭＰをＵＤＰに変換するために用いられ得、ＮＤＰキナーゼ（例えばAquifex aeolicus  ｎｄｋ遺伝子によってコードされる）およびポリリン酸キナーゼがＵＤＰをＵＴＰに変換するために用いられ得る。ＣＭＰキナーゼ（例えばThermus thermophilusから得られる）およびポリリン酸キナーゼがＣＭＰをＣＤＰに変換するために用いられ得、ＮＤＰキナーゼおよびポリリン酸キナーゼがＣＤＰをＣＴＰに変換するために用いられ得る。ＧＭＰキナーゼ（例えばThermotoga maritimaから得られる）およびポリリン酸キナーゼがＧＭＰをＧＤＰに変換するために用いられ得、ＮＤＰキナーゼおよびポリリン酸キナーゼがＧＤＰをＧＴＰに変換するために用いられ得る。ＡＭＰキナーゼ（例えばThermus thermophilusから得られる）およびポリリン酸キナーゼがＡＭＰをＡＤＰに変換するために用いられ得、ＮＤＰキナーゼ（例えばAquifex aeolicus ndk遺伝子によってコードされる）およびポリリン酸キナーゼがＡＤＰをＡＴＰに変換するために用いられ得る。代替的には、クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素（例えば表６参照）がＡＭＰをＡＴＰに変換するために用いられ得る。
【００１７】
【図３】図３Ａは、二本鎖ＲＮＡの生合成のために用いられるＤＮＡ鋳型の例の概略図を示している。プラスミドの一部としてコードされたＤＮＡ鋳型は単一のコード領域を含有し、関心のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターと１つ以上のターミネーターとを包含する。転写後に、ＲＮＡは分子内ヌクレオチド塩基対形成によってヘアピン構造へとフォールディングする。単独かまたはプラスミドの一部としてコードされたかどちらかのＤＮＡ鋳型は、ドメイン２によって離間された２つの相補的なドメイン（１および３）を含有する。図３Ｂは、二本鎖ＲＮＡの生合成のために用いられるＤＮＡ鋳型の別の例の概略図を示している。ＤＮＡ鋳型はコンバージェントなプロモーター配列を相補鎖上に含有する。各鋳型鎖から転写されたＲＮＡ配列は、転写後にアニーリングする。図３Ｃは、二本鎖ＲＮＡの生合成のために用いられるＤＮＡ鋳型の別の例の概略図を示している。プラスミドの一部としてコードされたＤＮＡ鋳型は、相補鎖上の関心のコード領域に作動可能に連結されたコンバージェントなプロモーター配列と、リードスルー転写を防ぐための１つ以上のターミネーター配列とを含有する。図３Ｄは、二本鎖ＲＮＡの生合成のために用いられるＤＮＡ鋳型の別の例の概略図を示している。プラスミドの一部としてコードされたＤＮＡ鋳型は独立したカセットを含有し、そのそれぞれは関心のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターと１つ以上のターミネーターとを包含し、相補的な配列の転写を駆動し、これらは転写後にアニーリングする。図３Ｅは、二本鎖ＲＮＡの生合成のために用いられるＤＮＡ鋳型の別の例の概略図を示している。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてｓｓＲＮＡ鋳型を生産し、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＲＮＡを生産する。
【００１８】
【図４】図４は、本開示の無細胞的ＲＮＡ生産方法の別の例の概略図を示している。プロセスは、改変細胞が生産される単一の発酵ベッセルから、標準的な発酵技術を用いて始まる。発酵により生成したバイオマスは例えば任意に精密濾過（ＭＦ）によって濃縮された後、機械的ホモジナイゼーションにより溶解される。それから、ライセートは第２の発酵ベッセルに圧送され、発現されたヌクレアーゼ酵素がＲＮＡをそのモノマー成分に変換する。反応全体を加熱して、任意の内在性ホスファターゼまたはヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅ）活性、ならびにＲＮＡ産物安定性および／または忠実性にとって不利であろう任意の他の外来性の／導入された細胞（例えばヌクレアーゼ）活性を不活性化する。熱不活性化後に、ポリリン酸を一連の耐熱性キナーゼによるＮＭＰからＮＴＰへのリン酸化のための高エネルギーリン酸供給源として反応に供給し、続けてｄｓＲＮＡへの重合が起こる。９９重量％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％）ｄｓＲＮＡほどまで純度を増大させるための下流処理が用いられ得る。例えば、純度を５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、７０〜８０％、７０〜９０％、または７０〜９５％に増大させるための処理が用いられ得る。例示的な下流プロセスは、蛋白質沈殿剤（例えば酢酸アンモニウム）の追加によって始まり、ディスク型遠心（ＤＳＣ）またはタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による製品流からの蛋白質、脂質、および何らかのＤＮＡの除去に続く。それから、塩を除去し体積を低減させるために限外濾過を実行する。製品流への塩化リチウムの追加はｄｓＲＮＡ産物の沈殿をもたらし、その後ディスク型遠心を用いてバルク液体から分離され、８０％純度のｄｓＲＮＡ製品流を得る。さらなるクロマトグラフィーポリッシングで９９％純粋な産物を得る（Nilsen, TW. Cold Spring Harb Protoc. 2012 Dec 1;2012(12)）。
【００１９】
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、精製E. coli  ＲＮＡの消化によるリボヌクレアーゼ活性の比較を示している。（図５Ａ）ヌクレアーゼ処置による酸可溶性のヌクレオチド（モノヌクレオチドおよび短いオリゴヌクレオチド）の遊離はベンゾナーゼ、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｒ、およびヌクレアーゼＰ１で最も急速であった。（図５Ｂ）反応産物のＬＣ−ＭＳ分析は、ＲＮａｓｅ  ＲおよびヌクレアーゼＰ１処置によるＲＮＡからのＮＭＰ遊離を実証した。
【００２０】
【図６】図６は、外来性ＲＮａｓｅ  Ｒを用いたライセートＲＮＡの解重合を示すグラフであり、５’−ＮＭＰを特異的に同定するために、産物はＵＰＬＣによって分析されている。ＲＮａｓｅ  Ｒの非存在下では、ライセートは内在性のＲＮａｓｅ活性を発揮し、これは５’−ＮＭＰのゆっくりした蓄積をもたらした（濃灰色の実線）。外来性ＲＮａｓｅ  Ｒの追加は、２’または３’ＮＭＰ蓄積の速度に影響することなしに（薄灰色の線）、急速な５’−ＮＭＰ遊離（濃灰色の点線）をもたらした。それゆえに、ＲＮａｓｅ  Ｒの過剰発現は多量体ＲＮＡから５’−ＮＭＰへの変換の速度を加速させ、抽出液中に存在するホスファターゼ／ヌクレアーゼ活性の有害な効果を低減させる。実験は５０％ライセートの終濃度で実施した。
【００２１】
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、バッチ段階で増殖した１Ｌバイオリアクター培養物中のＲＮａｓｅ  Ｒ過剰発現の結果を示している。（図７Ａ）二つの培養物における蛋白質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。空ベクター培養物は空の蛋白質発現ベクターを含有した（ｐＥＴＤｕｅｔ−１）。ＲＮａｓｅ  Ｒ培養物はｐＥＴＤｕｅｔ−１にクローニングされたE. coli  ｒｎｒを含有した。誘導した培養物からのサンプル（＋）は、右の矢印によって示されるＲＮａｓｅ  Ｒ（ＭＷ  ９２．９ｋＤａ。Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを有する）の強い発現を示した。（図７Ｂ）空ベクター（濃灰色）およびＲＮａｓｅ  Ｒ発現株（薄灰色）の増殖キネティクス（誘導前および後の増殖を包含する）は、ＲＮａｓｅ  Ｒ過剰発現が細胞増殖にとって有害ではないということを実証した。点線は指数曲線フィットを表す。（図７Ｃ）過剰発現されたＲＮａｓｅ  Ｒはバッチ増殖したバイオマスのライセート中において活性であり、酸可溶性のヌクレオチドを遊離させた。空ベクター株（濃灰色実線）では、外来性ＲＮａｓｅ  Ｒを追加することはヌクレオチド遊離の速度を増大させた（濃灰色点線）。対照的に、ＲＮａｓｅ  Ｒを発現する株は溶解によって急速なヌクレオチド遊離を示した（薄灰色実線）。外来性ＲＮａｓｅ  Ｒを追加することはヌクレオチド遊離の速度または最終的なヌクレオチド収量を増大させなかった（薄灰色点線）。実験は５０％ライセートの終濃度で実施した。
【００２２】
【図８】図８は、Ｍｇ２＋をキレートすることが高密度ライセート中の解重合速度に及ぼす効果を描写するグラフである。空ベクターを含有するバイオマスから調製されたライセート（濃灰色）はＥＤＴＡに不感であった。過剰発現されたＲＮａｓｅ  Ｒを有するライセート（薄灰色）はＭｇ２＋除去に伴って急速なＲＮＡ解重合を示し、８ｍＭ  ＥＤＴＡが最大の解重合速度を提供した。実験は９０％ライセートの終濃度で実施した。
【００２３】
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、ライセート中における外来性の同位体標識された「重い」ＮＭＰ（ｈＮＭＰ）の安定性を実証するグラフを示している：（図９Ａ）ｈＡＭＰはライセート中において比較的安定であり、３７℃での１時間インキュベーション後に９０％が残った。（図９Ｂ）ｈＣＭＰはライセート中において分解され、およそ３０分後に７０％が残った。１０ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（点線）（いくつかのホスファターゼおよびキナーゼの阻害剤）の追加は安定性を有意に改善した。（図９Ｃ）ｈＵＭＰはライセート中において分解され、およそ２０分後に７０％が残った。リン酸ナトリウム（１５０ｍＭ）（点線）およびオルトバナジン酸ナトリウム（点線）は安定性を有意に改善した。（図９Ｄ）ｈＧＭＰはライセート中において分解され、およそ１０分後に７０％が残った。オルトバナジン酸ナトリウムは安定性を有意に改善し、７０％ｈＧＭＰが３０分後に残った。
【００２４】
【図１０】図１０は、ライセート中の外来性ＮＴＰの安定性に及ぼす熱不活性化の効果を実証するグラフである。ライセートを７０℃でプレインキュベートした後に、温度を３７℃に下げ、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰ）の等モル混合物を追加した。プレインキュベーション時間は右のレジェンドに列記されている。コントロールライセート（熱不活性化に付されない）はＮＴＰを急速に消費した（Ｔ＝０ｍｉｎ）。プレインキュベーション時間を増大させることはＮＴＰを安定化し、７０℃での１５分はＮＴＰａｓｅ活性を消去した（Ｔ＝１５ｍｉｎ）。
【００２５】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、ライセート中のＮＭＰおよびｄｓＲＮＡの安定性に及ぼす熱不活性化の効果を実証するグラフである。（図１１Ａ）熱不活性化はライセート中のＮＭＰを安定化した。ライセートを３７℃で外来性ＲＮａｓｅ  Ｒ（ライセート＋ＲＮａｓｅ  Ｒ）によって処置して（ｔ＝０ｍｉｎ−５ｍｉｎ）、ＮＭＰを遊離させ、それから７０℃で熱不活性化した（ｔ＝５ｍｉｎから２５ｍｉｎ）。それから温度を３７℃に下げ、反応物をさらに６０ｍｉｎインキュベートした。ＮＭＰは熱不活性化後のライセート中において概ね安定であった。（図１１Ｂ）熱不活性化はライセート中における転写反応の反応物および産物を安定化した。ライセートを示されている温度で１５分間プレインキュベートし、それから温度を３７℃に下げ、転写反応物を追加した。７０℃および８０℃での熱不活性化は、正のコントロール（ライセートなし）と同様の検出可能な転写産物を生産するのに十分に基質および産物を安定化したが、６０℃ではしなかった。
【００２６】
【図１２】図１２は、P. furiosusからのＵＭＰキナーゼ（ＰｆＰｙｒＨ）の温度依存的な活性を実証するグラフであり、ＡＴＰ消費についてルシフェラーゼアッセイによって定量した。精製ＰｆＰｙｒＨの比活性はインキュベーション温度に概ね不感であった。
【００２７】
【図１３】図１３は、E. coliからのＡｄｋ（ＥｃＡｄｋ）と比較したT. thermophilusからのＡＭＰキナーゼ（ＴｔｈＡｄｋ）の温度依存的な活性を実証するグラフであり、ルシフェラーゼによって測定した。精製ＥｃＡｄｋは６０℃よりも下の温度で活性であった。ＴｔｈＡｄｋはより高い比活性を有し、７０℃に最大を有した。
【００２８】
【図１４】図１４は、T. thermophilusからのＣＭＰキナーゼ（ＴｔｈＣｍｋ）の温度依存的な活性を実証するグラフであり、ルシフェラーゼによって測定した。精製ＴｔｈＣｍｋは温度に比較的不感であり、３７〜８０℃で高い活性を有した。
【００２９】
【図１５】図１５は、E. coli（ＥｃＧｍｋ）、T. thermophilus（ＴｔｈＧｍｋ）、およびT. maritima（ＴｍＧｍｋ）からのＧＭＰキナーゼの温度依存的な活性を実証するグラフであり、ルシフェラーゼによって測定した。精製ＥｃＧｍｋ（濃灰色）はより低温でより活性であり、一方、ＴｔｈＧｍｋ（薄灰色）およびＴｍＧｍｋ（中間の灰色）は７０℃で最も活性であった。
【００３０】
【図１６】図１６は、A. aeolicusからの精製ＮＤＰキナーゼ（ＡａＮｄｋ）の活性を実証するデータのグラフであり、ルシフェラーゼによって測定した。精製ＡａＮｄｋはＡＴＰおよびＧＤＰを基質として用いると３７〜８０℃で高度に活性であり、５０℃で最適活性であった。
【００３１】
【図１７】図１７は、E. coli（ＥｃＰｐｋ）、Thermosynechococcus elongatus（ＴｅＰｐｋ）、およびThermus thermophilus（ＴｔｈＰｐｋ）からの精製ポリリン酸キナーゼ１（ＰＰＫ１）酵素の活性を実証するグラフであり、ルシフェラーゼによって測定した。ＥｃＰｐｋは温度≦６０℃で最も活性であり、一方、ＴｅＰｐｋは７０℃で最適活性であった。ＴｔｈＰｐｋは比較的低い活性を示した。
【００３２】
【図１８】図１８は、緩衝液中における市販のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの活性を実証するグラフであり、３７℃でそれらのそれぞれの製造者によって推奨される条件を用いた。ＴｈｅｒｍｏＴ７およびＭｅｇａＳｃｒｉｐｔポリメラーゼは、（例えば、図３Ｂの）二重鎖ＤＮＡ鋳型による試験された条件下において、ＮＥＢポリメラーゼよりも高い比活性を示した。
【００３３】
【図１９】図１９は、二重鎖ＤＮＡ鋳型による標準化された反応条件下において、３７℃および５０℃での希釈ライセート中におけるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ活性を比較するグラフである。３７℃では、ＴｈｅｒｍｏＴ７が最も高い比活性を示した。５０℃ではＴｈｅｒｍｏＴ７のみが検出可能な活性を有し、１０ｇ／Ｌ／ｈｒを超えるｄｓＲＮＡを生じさせた。
【００３４】
【図２０】図２０は、緩衝液および高密度の熱不活性化されたライセート中のＴｈｅｒｍｏＴ７活性の活性を実証するグラフである。ＴｈｅｒｍｏＴ７活性は熱不活性化後の遠心によって清澄化されたライセートにおいて最も高かった。清澄化されていないマトリックス中のポリメラーゼ活性は緩衝液単独を超えたが、清澄化ステップを省くことは活性の６０％減少をもたらした。
【００３５】
【図２１】図２１は、上昇した温度に対するＴｈｅｒｍｏＴ７の耐容性を実証するグラフである。ＴｈｅｒｍｏＴ７を５０℃でプレインキュベートすることは、３７℃でアッセイしたその後のポリメラーゼ活性に効果を有さなかった。６０℃および７０℃でのプレインキュベーションは酵素機能の急速な不可逆的阻害をもたらした。
【００３６】
【図２２】図２２Ａは、E. coli株ＧＬ１６−１７０中のA. thermophila  ＰＰＫ２について発現および可溶性データを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。ＭＷ：未染色蛋白質標準ブロードレンジ（New England Biolabs Cat#P7704）。−：誘導前培養物。＋：収穫時の誘導した培養物。Ｌ：清澄化されたライセート中の可溶性蛋白質。A. thermophila  ＰＰＫ２：３３ｋＤａ。図２２Ｂは、熱不活性化されたライセート中におけるA. thermophila  ＰＰＫ２のＡＴＰ生産を示すグラフである。黒丸はＡＤＰからのＡＴＰ生産を表す。白丸はＡＭＰからのＡＴＰ生産を表す。両方の基質について、A. thermophila  ＰＰＫ２は４００ｍＭ／ｈｒを超過する速度でＡＴＰを生産する。
【００３７】
【図２３】図２３は、無細胞的ｄｓＲＮＡ生産におけるエネルギー生成のための耐熱性クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２の適用を実証するアガロースゲルの画像である。左のレーンは正のコントロールを含有しており、ＮＴＰからのｄｓＲＮＡ合成を実証している。真ん中のレーンは正のコントロールを含有しており、外来性ＡＴＰをエネルギー供給源として用いて、ヌクレオチドキナーゼ発現ライセート中におけるＮＭＰからのｄｓＲＮＡ合成を実証している。右のレーンは、ヌクレオチドキナーゼおよびC. aerophila  Ｐｐｋ発現ライセートを用いたＮＭＰおよびＨＭＰからのｄｓＲＮＡ合成を実証する反応を含有する。各ケースにおいて、無細胞的ＲＮＡ合成反応はＭｎ２＋非依存的である。ポリメラーゼなしの反応が負のコントロールとして包含されており、各ライセート含有反応のバックグラウンド核酸含量を例解している。
【００３８】
【図２４】図２４は、無細胞的ｄｓＲＮＡ生産におけるエネルギー生成のための耐熱性クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２の適用を実証するアガロースゲルの画像である。左のレーンは正のコントロールを含有しており、ＮＴＰからのｄｓＲＮＡ合成を実証している。真ん中のレーンは正のコントロールを含有しており、外来性ＡＴＰをエネルギー供給源として用いて、ヌクレオチドキナーゼ発現ライセート中におけるＮＭＰからのｄｓＲＮＡ合成を実証している。右のレーンは、ヌクレオチドキナーゼおよびC. aerophila  Ｐｐｋ発現ライセートを用いたＮＭＰおよびＨＭＰからのｄｓＲＮＡ合成を実証する反応を含有している。C. aerophila  ＰＰＫ２では、ｄｓＲＮＡ合成はＡＭＰキナーゼおよび外来性ＡＤＰの非存在下において進む。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書は、いくつかの側面において、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の無細胞的生産（生合成）のための方法、組成物、細胞、構築物、およびシステムが提供される。いくつかの態様においては、生物の単一の型（例えば、細菌細胞の集団）が、少なくとも１つのヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性キナーゼ、および少なくとも１つの耐熱性ポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼ）を発現するように改変され得る。改変細胞は酵素発現をもたらす条件下において増殖させられる（培養される）。いくつかの態様において、改変細胞は所望の細胞密度まで増殖させられ得、それから、ある種の酵素の発現が誘導（活性化）され得る。それゆえに、ある種の酵素の転写は誘導型プロモーターのコントロール下にあり得る。それから、細胞（例えば、改変および／または未改変細胞）は溶解（例えば、機械的に、化学的に、または酵素的に破壊）されて、ＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ）の無細胞的生産のために要求される酵素活性を含む細胞ライセートを生産する。いくつかの態様においては、多量体ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および／またはｒＲＮＡ）を含有する細胞が、細胞溶解ステップに先立って、経路酵素を含有する改変細胞と混合される。他の態様においては、多量体ＲＮＡを含有する細胞から得られた細胞ライセート（単数または複数）が、経路酵素を含有する改変細胞から得られた細胞ライセート（単数または複数）と組み合わせられる（混合される）。まだ他の態様においては、１つ以上の精製された経路酵素が、改変細胞から得られた細胞ライセート（単数または複数）と組み合わせられる（混合される）。「経路酵素」は、関心のＲＮＡを（例えば、多量体ＲＮＡから出発して）生合成するために要求される酵素である。
【００４０】
ＲＮＡを合成するためには、細胞ライセート（または細胞ライセート混合物）は、ホスト由来の（内在性の）ＲＮＡの、所望の収量の５’−ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰまたはヌクレオシド一リン酸）への、ヌクレアーゼ媒介性（例えば、ＲＮａｓｅ媒介性）解重合をもたらす条件下でインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞ライセート（または細胞ライセート混合物）はそれから加熱されて、ホスファターゼおよびヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅ）を包含するホスト由来の酵素と、ホスト由来のＲＮＡの解重合を促すために細胞ライセートに先に追加されたいずれかの外来性ヌクレアーゼ（単数または複数）との大部分を不活性化する。熱不活性化ステップ後に、細胞ライセートは、例えば耐熱性ポリリン酸キナーゼとエネルギー供給源としてのポリリン酸の追加とを用いて、耐熱性キナーゼ（例えば、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼおよびヌクレオシド二リン酸キナーゼ）によるＮＭＰからＮＴＰ（ヌクレオシド三リン酸）へのリン酸化をもたらす条件下でインキュベートされる。その後、もたらされたＮＴＰは、ライセート中に存在する（例えば、改変細胞によって発現され、細胞ライセートの細胞内コンポーネントとして包含されるか、または後で細胞ライセートに追加されるかどちらかの）改変鋳型（例えばＤＮＡ鋳型）を用いて、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ）によってＲＮＡへと重合される。
無細胞的生産
【００４１】
「無細胞的生産」は、生細胞を用いることのない生体分子または化学物質の合成のための生物学的プロセスの使用である。細胞は溶解され、両方が酵素を含有する未精製（クルード）部分または部分精製部分が、所望の産物の生産のために用いられる。いくつかの態様においては、精製された酵素が細胞ライセートに追加され得る。例として、細胞は培養され、収穫され、および高圧ホモジナイゼーションまたは他の細胞溶解方法（例えば化学的な細胞溶解）によって溶解される。無細胞的反応はバッチまたはフェドバッチモードで行われ得る。いくつかの場合には、酵素経路は反応器の有効体積を満たし、細胞内環境よりも希釈され得る。それでもやはり、膜結合している触媒を含む細胞内触媒の実質的に全てが提供される。内膜は細胞溶解の間に断片化され、それらの膜の断片は膜小胞を形成し得る。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるSwartz, AIChE Journal, 2012, 58(1), 5-13参照。
【００４２】
本開示の無細胞的方法、組成物、およびシステムは、本明細書においてより詳細に論じられる細胞ライセート（例えば、クルードなまたは部分精製された細胞ライセート）を利用する。例えば機械的手段（例えば、剪断または粉砕）によって調製された細胞ライセートは、化学的に透過処理された細胞とは別物である。上で論じられているように、いくつかの態様においては、細胞溶解（例えば、機械的な細胞溶解）の間に、細胞内膜は断片化され、その結果、細胞ライセート中に反転膜小胞が形成される。かかる反転膜小胞は化学的な細胞透過処理方法によっては生産されない。溶解される細胞（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％）はもはや原形ではない。それゆえに、パーフォレーション（小さい穴）を含有する原形の細胞である透過処理された細胞は、溶解された細胞とは見なされない。
【００４３】
本明細書において提供される方法は一般的に無細胞的であり、細胞ライセートを用いるが、いくつかの態様において、少なくとも本方法のいくつかのステップについては透過処理された細胞を用いることが有利であり得る。それゆえに、本開示は、本ＲＮＡ生産方法の少なくとも１つのステップへの透過処理された細胞の使用を除外しない。
【００４４】
本明細書に記載される態様の多くは特定の酵素を含む「培養細胞を溶解すること」に言及するが、この語句は、単一の培養物（例えば、ＲＮＡを合成するために必要とされる全ての酵素を含有する）から得られた細胞のクローン集団を溶解すること、ならびにそれぞれ異なる細胞培養物（例えば、それぞれが、ＲＮＡおよび／または多量体ＲＮＡ基質を合成するために必要とされる１つ以上の酵素を含有する）から得られた、１よりも多くの細胞のクローン集団を溶解することとを包含することが意図されているということが理解されるべきである。例えば、いくつかの態様においては、１つの耐熱性キナーゼを発現する細胞（例えば、改変細胞）の集団が一緒に培養され、１つの細胞ライセートを生産するために用いられ得、異なる耐熱性キナーゼを発現する細胞（例えば、改変細胞）の別の集団が一緒に培養され、別の細胞ライセートを生産するために用いられ得る。それから、それぞれ異なる耐熱性キナーゼを含むこれらの２つの細胞ライセートは、本開示のＲＮＡ生合成方法への使用のために組み合わせられ得る。
リボ核酸からヌクレオシド一リン酸への解重合
【００４５】
本開示は、一連の酵素反応が関わる無細胞的プロセスによる、細胞ライセートを用いるバイオマスからのＲＮＡ（例えば、細胞の内在性ＲＮＡ）から所望の合成ＲＮＡへの変換に基づく。第１に、ホスト細胞に由来する細胞ライセート中に存在するＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）がヌクレアーゼによってその成分モノマーに変換される。バイオマスからのＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）は、典型的にはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、他のＲＮＡ、またはその組み合わせを包含する。ＲＮＡの解重合または分解は、単純に「モノマー」ともまた言われる５’−ヌクレオシド一リン酸（５’−ＮＭＰ）のプールをもたらす。それらのモノマーは関心のＲＮＡの下流の重合／合成のための出発材料として用いられ、それらはヌクレオシド二リン酸に変換され、これらはヌクレオシド三リン酸に変換される。いくつかの態様において、関心のＲＮＡはｓｓＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）である。いくつかの態様において、関心のＲＮＡはｄｓＲＮＡである。
【００４６】
関心のＲＮＡを合成するために要求されるＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）の量は変わり得、例えば、関心のＲＮＡの所望の長さおよび収量と、細胞（例えばE. coli細胞）のＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）のヌクレオチド組成に対して相対的なＲＮＡのヌクレオチド組成とに依存する。典型的には、細菌細胞では、例えばＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）含量はトータルの細胞質量の５〜５０％の範囲である。出発材料の質量は例えば次の等式を用いて計算され得る：（ＲＮＡのキログラム（ｋｇ）／乾燥細胞重量のキログラム）×１００％。
【００４７】
内在性ＲＮＡは化学的または酵素的手段によってその成分モノマーへと解重合または分解され得る。しかしながら、ＲＮＡの化学的加水分解は典型的には２’−および３’−ＮＭＰを生産し、これらはＲＮＡへと重合され得ない。それゆえに、本明細書において提供される方法、組成物、およびシステムは、主として内在性ＲＮＡの解重合のために酵素を用いる。「ＲＮＡを解重合する酵素」は、ＲＮＡ中の２つのヌクレオチド間のホスホジエステル結合の加水分解を触媒する。それゆえに、「ＲＮＡを解重合する酵素」は、ＲＮＡ（多量体ＲＮＡ）をそのモノマー状形態のヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）に変換する。酵素に依存して、ＲＮＡの酵素的解重合は３’−ＮＭＰ、５’−ＮＭＰ、または３’−ＮＭＰおよび５’−ＮＭＰの組み合わせを生み得る。３’−ＮＴＰ（３’−ＮＭＰから変換される３’−ＮＤＰから変換される）を重合することは可能ではないので、５’−ＮＭＰ（これらは、それから５’−ＮＤＰに、それから５’−ＮＴＰに変換される）を生む酵素（例えばＲＮａｓｅ  Ｒ）が好ましい。いくつかの態様において、３’−ＮＭＰを生む酵素は、ＲＮＡ生産の効率を増大させるために改変細胞のゲノムＤＮＡから除去される。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合に用いられる酵素はＲＮａｓｅ  Ｒである。いくつかの態様において、用いられるＲＮａｓｅ  Ｒの濃度は０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０ｍｇ／ｍＬ）である。いくつかの態様において、用いられるＲＮａｓｅ  Ｒの濃度は０．４〜０．６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様において、用いられるＲＮａｓｅ  Ｒの濃度は０．５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様において、用いられるＲＮａｓｅ  Ｒの濃度は１．０ｍｇ／ｍＬを超える。
【００４８】
ＲＮＡを解重合する酵素の例は、限定なしに、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ、例えばＲＮａｓｅ  Ｒ）を包含するヌクレアーゼ、およびホスホジエステラーゼを包含する。ヌクレアーゼは核酸からより小さいコンポーネント（例えば、ヌクレオシド一リン酸ともまた言われるモノマー、またはオリゴヌクレオチド）への分解を触媒する。ホスホジエステラーゼはホスホジエステル結合の分解を触媒する。ＲＮＡを解重合するこれらの酵素は全長遺伝子または遺伝子融合体（例えば、２つの異なる酵素活性をコードする少なくとも２つの異なる遺伝子（または遺伝子の断片）を包含するＤＮＡ）によってコードされ得る。
【００４９】
ＲＮａｓｅは細胞内においてＲＮＡ成熟およびターンオーバーを制御するために機能する。各ＲＮａｓｅは特異的な基質選好性を有する−ｄｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ。それゆえに、いくつかの態様においては、一般的に、異なるＲＮａｓｅの組み合わせまたは異なるヌクレアーゼの組み合わせがバイオマス由来の多量体ＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡ）を解重合するために用いられ得る。例えば、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、または１〜１０個の異なるヌクレアーゼがＲＮＡを解重合するために組み合わせで用いられ得る。いくつかの態様においては、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の異なるヌクレアーゼがＲＮＡを解重合するために組み合わせで用いられ得る。本明細書において提供される使用のためのヌクレアーゼの限定しない例が表１に包含されている。いくつかの態様において、用いられるヌクレアーゼはＲＮａｓｅ  Ｒである。
【表１】
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【００５０】
ＲＮＡを解重合する酵素（例えばＲＮａｓｅ）はホスト細胞にとって内在性（ホスト由来）であり得、またはそれらはホスト細胞内に外来的に導入された（例えば、エピソームベクター上の、またはホスト細胞のゲノム中にインテグレーションされた）改変核酸によってコードされ得る。
【００５１】
いくつかの態様において、ＲＮＡを解重合する酵素をコードする改変核酸は誘導型プロモーターに作動可能に連結される。それゆえに、いくつかの態様において、ＲＮＡを解重合する酵素をコードする改変核酸の発現は時間的または空間的に制御される。例えば、核酸はホスト細胞のペリプラズムに転置または隔離される酵素（例えばＲＮａｓｅ）をコードするように改変され得、その結果、酵素の活性が細胞増殖または他の代謝プロセスに干渉しない。細胞溶解によって、転置された酵素はペリプラズムから遊離し、内在性ＲＮＡとの接触をし、ＲＮＡをモノマー形態に解重合する。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる２０１１年１１月１０日公開の国際公開Ｎｏ．ＷＯ２０１１／１４０５１６参照。
【００５２】
「ＲＮＡの解重合をもたらす条件」は当分野において公知である。または、当業者によって決定され得、例えば、ｐＨ、温度、時間の長さ、および細胞ライセートの塩濃度、ならびにいずれかの外来性補因子を包含するヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅ）活性の最適条件を考慮に入れる。例は、先に記載されているものを包含する（例えばWong, C.H. et al. J. Am. Chem. Soc., 105: 115-117, 1983)、EP1587947B1、Cheng ZF, Deutscher MP. J Biol Chem. 277:21624-21629, 2002参照）。
【００５３】
いくつかの態様においては、金属イオン（例えばＭｇ２＋）が解重合反応から枯渇させられる。いくつかの態様において、金属イオン（例えばＭｇ２＋）の濃度は８ｍＭ以下（例えば、８ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ未満、５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、３ｍＭ未満、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満）である。いくつかの態様において、金属イオン（例えばＭｇ２＋）の濃度は０．１ｍＭ−８ｍＭ、０．１ｍＭ−７ｍＭ、または０．１ｍＭ−５ｍＭである。
【００５４】
ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートのｐＨは３．０から８．０の値を有し得る。いくつかの態様において、細胞ライセートのｐＨ値は３．０〜８．０、４．０〜８．０、５．０〜８．０、６．０〜８．０、７．０〜８．０、３．０〜７．０、４．０〜７．０、５．０〜７．０、６．０〜７．０、３．０〜６．０、４．０〜６．０、５．０〜６．０、３．０〜５．０、３．０〜４．０、または４．０〜５．０である。いくつかの態様において、細胞ライセートのｐＨ値は３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、または８．０である。いくつかの態様において、細胞ライセートのｐＨ値は７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５である。細胞ライセートのｐＨ値は必要とされるように調整され得る。
【００５５】
ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートの温度は１５℃から７０℃であり得る。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートの温度は１５〜６０℃、１５〜５０℃、１５〜４０℃、１５〜３０℃、２５〜７０℃、２５〜６０℃、２５〜５０℃、２５〜４０℃、３０〜７０℃、３０〜６０℃、または３０〜５０℃である。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートの温度は３７℃である。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートの温度は１５℃、２５℃、３２℃、３７℃、４０℃、４２℃、４５℃、５０℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、または７０℃である。
【００５６】
ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは５分（ｍｉｎ）から７２時間（ｈｒ）インキュベートされ得る。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは５〜１０ｍｉｎ、５〜１５ｍｉｎ、５〜２０ｍｉｎ、５〜３０ｍｉｎ、または５ｍｉｎ−４８ｈｒインキュベートされる。例えば、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、２５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、１ｈｒ、２ｈｒ、３ｈｒ、４ｈｒ、５ｈｒ、６ｈｒ、７ｈｒ、８ｈｒ、９ｈｒ、１０ｈｒ、１１ｈｒ、１２ｈｒ、１８ｈｒ、２４ｈｒ、３０ｈｒ、３６ｈｒ、４２時間、または４８時間インキュベートされ得る。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは３７℃の温度で２４時間インキュベートされる。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは３７℃の温度で５〜１０ｍｉｎインキュベートされる。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは７．０のｐＨを有し、３７℃の温度で１５分間インキュベートされる。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセートは、ＲＮＡから５’−ＮＭＰへの６５％超の変換をもたらす条件下においてインキュベートされ得る。いくつかの態様において、ＲＮＡは（または少なくとも）５０ｍＭ／ｈｒ、１００ｍＭ／ｈｒ、または２００ｍＭ／ｈｒの速度で５’−ＮＭＰに変換される。
【００５７】
いくつかの態様においては、例えば酵素凝集を防ぐために、塩が細胞ライセートに追加される。例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、またはその組み合わせが細胞ライセートに追加され得る。ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセート中の塩の濃度は５ｍＭから１Ｍであり得る。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセート中の塩の濃度は５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、または１Ｍである。いくつかの態様において、細胞ライセートは、４０〜６０ｍＭリン酸カリウム、１〜５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、および／または１０〜５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（例えば、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を包含する混合物を含む。
【００５８】
いくつかの態様においては、例えば特定のｐＨ値および／または塩濃度を達成するために、緩衝液が細胞ライセートに追加される。緩衝液の例は、限定なしに、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｂｉｓ−ｔｒｉｓ緩衝液、およびエタノールアミン緩衝液を包含する。
【００５９】
ＲＮＡの解重合は、５’−ＡＭＰ、５’−ＵＭＰ、５’−ＣＭＰ、および５’−ＧＭＰを包含する５’−ＮＭＰの生産をもたらす。ＮＭＰは細胞ライセート中において比較的等モル量で存在し得、一方、ＲＮＡの解重合はＮＭＰのいずれかの所定の比をもたらさない。
【００６０】
いくつかの態様においては、溶解によって、細胞内の内在性ＲＮＡの５０〜９８％が５’−ＮＭＰに変換される（解重合される）。例えば、５０〜９５％、５０〜９０％、５０〜８５％、５０〜８０％、７５〜９８％、７５〜９５％、７５〜９０％、７５〜８５％、または７５〜８０％ＲＮＡが５’−ＮＭＰに変換される（解重合される）。いくつかの態様においては、溶解によって、細胞内の内在性ＲＮＡの６５〜７０％が５’−ＮＭＰに変換される（解重合される）。より低い収量もまた許容可能である。
無益回路の消去
【００６１】
内在性および／または外来性ヌクレアーゼによるバイオマス（例えば内在性ＲＮＡ）からそのモノマー成分へのＲＮＡの変換後に、典型的には、細胞ライセート中にはヌクレアーゼおよびホスファターゼを包含するいくつかの酵素が残っており、それらはＲＮＡ生合成に有害な効果を有し得る。例えば、Escherichia coliは数々のホスファターゼを有し、それらの多くはＮＴＰ、ＮＤＰ、およびＮＭＰを脱リン酸化する。ＲＮＡ解重合後のＮＭＰの脱リン酸化は、リン酸化されていないヌクレオシドの蓄積と使用可能なＮＭＰ基質の喪失とをもたらし、それゆえに合成ＲＮＡ収量を低減する。ＲＮＡ解重合後のＮＭＰ、ＮＤＰ、またはＮＴＰの脱リン酸化は無益エネルギー回路（合成ＲＮＡの低い収量を生じさせるエネルギー回路）をもたらし、その間にＮＭＰはＮＤＰおよびＮＴＰへとリン酸化され、これらは翻ってそれらのＮＭＰまたはヌクレオシド出発点へと再び脱リン酸化される。無益回路は単位エネルギー入力（例えば、ポリリン酸、ＡＴＰ、または他の高エネルギーリン酸供給源）あたりのＲＮＡ産物の収量を低減する。いくつかの態様において、酵素活性はホストゲノムからの除去によって消去される。いくつかの態様において、酵素活性は熱不活性化によって消去される。いくつかの態様において、酵素活性はプロテアーゼ標的化によって消去される。いくつかの態様において、酵素活性は化学的阻害剤の使用によって消去される。前述のアプローチのいずれかの組み合わせもまた用いられ得る。
【００６２】
本明細書において提供されるＲＮＡの生合成にとって有害な酵素は、ホスト細胞を改変するプロセスの間にホスト細胞ゲノムから欠失させられ得る。ただし、酵素はホスト細胞（例えば、細菌細胞）生存および／または増殖にとって必須ではないものとする。酵素または酵素活性の欠失は、例えばホスト細胞ゲノム中の必須酵素をコードする遺伝子を欠失させるかまたは修飾することによって達成され得る。酵素は、酵素がホスト細胞の生存にとって必要である場合には「ホスト細胞生存にとって必須」である。すなわち、ホスト細胞が特定の酵素の発現および／または活性なしには生存し得ない場合には、その酵素はホスト細胞生存にとって必須と見なされる。類似に、酵素は、酵素がホスト細胞の増殖に必要である場合には「ホスト細胞増殖にとって必須」である。すなわち、ホスト細胞が特定の酵素の発現および／または活性なしには分裂および／または増殖し得ない場合には、その酵素はホスト細胞増殖にとって必須と見なされる。
【００６３】
ＲＮＡの生合成にとって有害な酵素がホスト細胞生存および／または増殖にとって必須である場合には、酵素をコードする遺伝子を欠失させるかまたは修飾することが可能ではなくあり得る。かかる場合に、酵素は熱不活性化され得る。「熱不活性化」は、細胞ライセートを、内在性のヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化する（または少なくとも部分的に不活性化する）ために十分な温度に加熱するプロセスを言う。一般的に、熱不活性化のプロセスには有害な酵素の変性（アンフォールディング）が関わる。細胞の内在性蛋白質が変性する温度は生物間で変わる。E. coliにおいては、例えば、細胞の内在性酵素は一般的に４１℃よりも上の温度で変性する。変性温度は他の生物では４１℃よりも高くまたは低くあり得る。ここで提供される細胞ライセートの酵素は４０℃〜９５℃の、またはより高い温度で熱不活性化され得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの酵素は４０〜９０℃、４０〜８０℃、４０〜７０℃、４０〜６０℃、４０〜５０℃、５０〜８０℃、５０〜７０℃、５０〜６０℃、６０〜８０℃、６０〜７０℃、または７０〜８０℃の温度で熱不活性化され得る。例えば、細胞ライセートの酵素は４０℃、４２℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、または９５℃の温度で熱不活性化され得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの酵素は５０〜８０℃の温度で熱不活性化され得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの酵素は７０℃の温度で熱不活性化され得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの酵素は６０℃の温度で熱不活性化され得る。有害な酵素の化学的阻害剤を導入することもまた可能であり得る。かかる阻害剤はオルトバナジン酸ナトリウム（蛋白質ホスホチロシンホスファターゼの阻害剤）、フッ化ナトリウム（ホスホセリンおよびホスホトレオニンホスファターゼの阻害剤）、ピロリン酸ナトリウム（ホスファターゼ阻害剤）、リン酸ナトリウム、および／またはリン酸カリウムを包含し得るが、これに限定されない。
【００６４】
細胞ライセートが内在性酵素の熱不活性化を達成するために上昇した温度でインキュベートされる時期は、例えば細胞ライセートの体積および細胞ライセートが調製された生物に依存して変わり得る。いくつかの態様において、細胞ライセートは３５℃〜８０℃の温度で２分間（ｍｉｎ）から４８時間（ｈｒ）インキュベートされる。例えば、細胞ライセートは３５℃〜８０℃の温度で２ｍｉｎ、４ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、または１ｈｒインキュベートされ得る。いくつかの態様において、細胞ライセートは３５℃〜８０℃の温度で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、３６、４２、または４８ｈｒインキュベートされる。
【００６５】
いくつかの態様において、酵素は６０〜８０℃の温度で１０〜２０ｍｉｎ熱不活性化される。いくつかの態様において、酵素は７０℃の温度で１５ｍｉｎ熱不活性化される。
【００６６】
いくつかの態様において、内在性ＲＮＡを解重合する酵素は、酵素を熱に対してより感受性にする１つ以上の修飾（例えば変異）を含む。それらの酵素は「熱感受性酵素」と言われる。熱感受性酵素はそれらの野生型カウンターパートのものよりも低い温度で変性し不活性化されるようになり、および／または熱感受性酵素の活性を低減するために要求される時期はそれらの野生型カウンターパートのものよりも短い。
【００６７】
熱不活性化される酵素はいくつかの場合には何らかの程度の活性を保持し得るということが理解されるべきである。例えば、熱不活性化された酵素の活性レベルは熱不活性化されていない同じ酵素の活性レベルの５０％未満であり得る。いくつかの態様において、熱不活性化された酵素の活性レベルは熱不活性化されていない同じ酵素の活性レベルの４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．１％未満である。
【００６８】
それゆえに、酵素の活性は完全に消去または低減され得る。酵素は、酵素の変性した（熱不活性化された）形態がその自然状態の形態の酵素によって触媒される反応をもはや触媒しない場合に、完全に不活性と見なされる。熱不活性化された変性した酵素は、熱不活性化された酵素の活性が（例えば、その自然状態の環境において）加熱されない酵素の活性に対して相対的に少なくとも５０％低減されるときに、「不活性化された」と見なされる。いくつかの態様において、熱不活性化された酵素の活性は、加熱されない酵素の活性に対して相対的に５０〜１００％低減される。例えば、熱不活性化された酵素の活性は、加熱されない酵素の活性に対して相対的に５０〜９０％、５０〜８５％、５０〜８０％、５０〜７５％、５０〜７０％、５０〜６５％、５０〜６０％、または５０〜５５％低減される。いくつかの態様において、熱不活性化された酵素の活性は、加熱されない酵素の活性に対して相対的に２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％低減される。
【００６９】
熱不活性化されるかまたはホスト細胞のゲノムから欠失させられ得る酵素の例は、限定なしに、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ｉ、ＲＮａｓｅ  Ｒ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ  ＩＩ、およびＲＮａｓｅ  Ｔ）、ホスファターゼ（例えば、ヌクレオシドモノホスファターゼ、ヌクレオシドジホスファターゼ、ヌクレオシドトリホスファターゼ）、ならびにＲＮＡを解重合またはヌクレオチドを脱リン酸化する他の酵素を包含する。ＲＮＡを解重合する酵素は、ＲＮＡ分子を切断、部分的に加水分解、または完全に加水分解することができるいずれかの酵素を包含する。表２は、熱不活性化されるかまたはいくつかの場合には改変ホスト細胞から欠失させられ得る、ヌクレアーゼの限定しない例のリストを提供している。表３は、熱不活性化されるかまたはいくつかの場合には改変ホスト細胞から欠失させられ得る、ホスファターゼの限定しない例のリストを提供している。これらおよび他のヌクレアーゼおよびホスファターゼの熱不活性化は本開示によって包含される。
【表２】
2019510504.tif 000004
【表３】
2019510504.tif 000005
【００７０】
E. coli  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩはｄｓＲＮＡおよびいくつかの一本鎖ｍＲＮＡ分子を選好的に切断する。細胞ライセート中のＲＮａｓｅ  ＩＩＩの存在は、高濃度の合成ＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）の蓄積を限定し得る。なぜなら合成ＲＮＡが難なく切断されるからである。ＲＮａｓｅ  ＩＩＩもＲＮａｓｅ  ＩＩＩをコードする遺伝子ｒｎｃも細胞生存能にとって必須ではない。それゆえに、いくつかの態様においては、ｒｎｃが改変ホスト細胞において欠失または変異させられる。他の態様においては、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩが内在性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化される。
【００７１】
E. coli  ＲＮａｓｅ  Ｉは、原形の細胞内のペリプラズム空間に局在し、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｔＲＮＡを包含する広範囲のＲＮＡ分子の解重合を触媒する。生理条件下においては、この酵素のペリプラズム局在は、酵素が細胞内のＲＮＡ安定性にはほとんど影響を有さないということを意味する；しかしながら、細胞ライセート中のペリプラズムおよび細胞質の混合は、細胞内ＲＮＡへのＲＮａｓｅ  Ｉのアクセスを許可する。細胞ライセート中のＲＮａｓｅ  Ｉの存在はＲＮＡ分解によって合成ＲＮＡの収量を低減し得る。ＲＮａｓｅ  ＩもＲＮａｓｅ  Ｉをコードする遺伝子ｒｎａも細胞生存能にとって必須ではない。それゆえに、いくつかの態様においては、ｒｎａが改変ホスト細胞において欠失または変異させられる。他の態様においては、ＲＮａｓｅ  Ｉが内在性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化される。
【００７２】
E. coli  ＲＮａｓｅ  ＲおよびＲＮａｓｅ  ＴはｄｓＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ、ならびに小さい無構造ＲＮＡ分子の解重合を触媒する。酵素もそれぞれ酵素をコードする遺伝子ｒｎｒおよびｒｎｔも細胞生存能にとって必須ではない。それゆえに、いくつかの態様においては、ｒｎｒおよび／またはｒｎｔが改変ホスト細胞（例えばE. coliホスト細胞）において欠失または変異させられる。他の態様においては、ＲＮａｓｅ  Ｒおよび／またはＲＮａｓｅ  Ｔが内在性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化される。
【００７３】
E. coli  ＲＮａｓｅ  ＥおよびＰＮＰａｓｅはデグラドソームのコンポーネントであり、これは細胞内のｍＲＮＡターンオーバーを担う。ＲＮａｓｅ  Ｅは、ＰＮＰａｓｅおよびＲＮａｓｅ  ＩＩと一緒に機能して細胞内ｍＲＮＡプールをターンオーバーさせると考えられている。ＲＮａｓｅ  Ｅをコードする遺伝子ｒｎｅの破壊はE. coliにおいては致死的である。それゆえに、いくつかの態様においては、ＲＮａｓｅ  Ｅが内在性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化される。ＰＮＰａｓｅもＰＮＰａｓｅをコードする遺伝子ｐｎｐも細胞生存能にとって必須ではない。それゆえに、いくつかの態様においては、ｐｎｐが改変ホスト細胞（例えばE. coliホスト細胞）において欠失または変異させられる。他の態様においては、ＰＮＰａｓｅが内在性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化される。
【００７４】
E. coli  ＲＮａｓｅ  ＩＩはｍＲＮＡおよびｔＲＮＡ両方を３’−＞５’方向に解重合する。ＲＮａｓｅ  ＩＩもＲＮａｓｅ  ＩＩをコードする遺伝子ｒｎｂも細胞生存能にとって必須ではない。それゆえに、いくつかの態様においては、ｒｎｂが改変ホスト細胞において欠失または変異させられる。他の態様においては、ＲＮａｓｅ  ＩＩが内在性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化される。
【００７５】
ｐｎｐもｒｎｂもホスト細胞生存にとって必須ではなく、一方で、同時に両方の破壊は致死的であり得る。それゆえに、いくつかの態様においては、ＰＮＰａｓｅおよびＲＮａｓｅ  ＩＩ両方が熱不活性化される。
ヌクレオシド一リン酸からヌクレオシド三リン酸へのリン酸化
【００７６】
内在性ＲＮＡからそのモノマー状形態への変換後に、および内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼの熱不活性化後に、細胞ライセート中のもたらされたヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）はリン酸化された後に、重合させられて、所望の合成ＲＮＡ、例えば二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）を形成する。このプロセスは高度にエネルギー依存的であり、それゆえにこのプロセスはエネルギー供給源を要求する。典型的には、リン酸は、例えばホスホエノールピルビン酸、ＡＴＰ、またはポリリン酸などの高エネルギーリン酸供給源から供与される。
【００７７】
いくつかの態様において、エネルギー供給源は細胞ライセートに直接的に追加されるＡＴＰである。他の態様において、エネルギー供給源はＡＴＰ再生系を用いて提供される。例えば、ポリリン酸およびポリリン酸キナーゼがＡＴＰを生産するために用いられ得る。他の例は、ＡＴＰを生産するためのアセチルリン酸および酢酸キナーゼ；ＡＴＰを生産するためのクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼ；ならびにＡＴＰを生産するためのホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼの使用を包含した。他のＡＴＰ（または他のエネルギー）再生系が用いられ得る。いくつかの態様においては、エネルギー供給源の少なくとも１つのコンポーネントが細胞ライセートまたは細胞ライセート混合物に追加される。エネルギー供給源の「コンポーネント」は、エネルギー（例えばＡＴＰ）を生産するために要求される基質（単数または複数）および酵素（単数または複数）を包含する。それらのコンポーネントの限定しない例は、ポリリン酸、ポリリン酸キナーゼ、アセチルリン酸、酢酸キナーゼ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを包含する。
【００７８】
キナーゼは、ＡＴＰなどの高エネルギーリン酸供与分子から特異的な基質／分子へのリン酸基の転移を触媒する酵素である。このプロセスはリン酸化と言われ、そこでは基質はリン酸基を獲得し、高エネルギーＡＴＰ分子はリン酸基を供与する。このエステル交換はリン酸化された基質とＡＤＰとを生産する。いくつかの態様において、本開示のキナーゼは、ＮＭＰをＮＤＰに、ＮＤＰをＮＴＰに変換する。
【００７９】
いくつかの態様において、キナーゼはヌクレオシド一リン酸キナーゼであり、これがＡＴＰからＮＭＰへの高エネルギーリン酸の転移を触媒し、ＡＤＰおよびＮＤＰをもたらす。ヌクレオシド一リン酸キナーゼの限定しない例が表４および５に提供されている。下で論じられているように、表４および５に列記されている酵素の耐熱性バリアントは本開示に包含される。いくつかの態様において、細胞ライセートは次の４つのヌクレオシド一リン酸キナーゼの１つ以上（または全て）を含む：耐熱性ウリジル酸キナーゼ、耐熱性シチジル酸キナーゼ、耐熱性グアニル酸キナーゼ、および耐熱性アデニル酸キナーゼ。いくつかの態様において、ＵＭＰキナーゼはPyrococcus furiosusから得られる（例えば、配列番号３、または配列番号３によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアント）。いくつかの態様において、ＣＭＰキナーゼはThermus thermophilusから得られる（例えば、配列番号４、または配列番号４によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアント）。いくつかの態様において、ＧＭＰキナーゼはThermotoga maritimaから得られる（例えば、配列番号５、または配列番号５によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアント）。いくつかの態様において、ＡＭＰキナーゼはThermus thermophilusから得られる（例えば、配列番号６、または配列番号６によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアント）。
【００８０】
それゆえに、いくつかの態様において、ＮＭＰキナーゼは、配列番号３〜６のいずれか１つのアミノ酸配列によって同定されるアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、ＮＭＰキナーゼは、配列番号３〜６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、ＮＭＰキナーゼは、配列番号３〜６のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【００８１】
本開示は、本明細書に記載される酵素および酵素のバリアント（例えば「ＰＰＫ２バリアント」）のいずれか１つ以上の使用を包含するということが理解されるべきである。バリアント酵素は参照酵素に対してある種の程度の配列同一性を共有し得る。用語「同一性」は、２つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係性を言い、配列同士を比較することによって決定される。同一性は、２つ以上の配列のより小さいものの間における同一のマッチのパーセントを測定し、ギャップアラインメント（いずれかがある場合）が特定の数理モデルまたはコンピュータプログラム（例えば「アルゴリズム」）によって取り扱われる。近縁分子同士の同一性は公知の方法によって難なく計算され得る。アミノ酸または核酸配列に適用される「パーセント（％）同一性」は、最大のパーセント同一性を達成するように配列同士をアラインメントし、必要な場合にはギャップを導入した後に、第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸または核酸配列中の残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージとして定められる。同一性はパーセント同一性の計算に依存するが、計算時に導入されるギャップおよびペナルティーが原因で値が異なり得る。特定の配列のバリアントはその特定の参照配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、しかし１００％未満の配列同一性を有し得、本明細書に記載され当業者に公知の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される。
【００８２】
２つの配列間における配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数理アルゴリズムを用いて成し遂げられ得る。同一性を決定するための技術は公に利用可能なコンピュータプログラムにコード化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J. et al. Nucleic Acids Research, 12(1): 387, 1984）、ＢＬＡＳＴスイート（Altschul, S. F. et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389, 1997）、およびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al. J. Molec. Biol. 215: 403, 1990）を包含するが、これに限定されない。他の技術は：Smith-Watermanアルゴリズム（Smith, T.F. et al. J. Mol. Biol. 147: 195, 1981；Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman, S.B. et al. J. Mol. Biol. 48: 443, 1970；およびFast Optimal Global Sequence Alignmentアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）（Chakraborty, A. et al. Sci Rep.3 : 1746, 2013）を包含する。
【表４】
2019510504.tif 000006
【００８３】
いくつかの態様において、キナーゼはヌクレオシド二リン酸キナーゼであり、これはホスホリル基をＮＤＰに転移させ、ＮＴＰをもたらす。ホスホリル基のドナーは、限定なしに、ＡＴＰ、ポリリン酸ポリマー、またはホスホエノールピルビン酸であり得る。ＮＤＰをＮＴＰに変換するキナーゼの限定しない例は、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびピルビン酸キナーゼを包含する。下で論じられているように、前述の酵素の耐熱性バリアントは本開示に包含される。いくつかの態様において、ＮＤＰキナーゼ（単数または複数）はAquifex aeolicusから得られる（例えば、配列番号９、または配列番号９によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアント）。いくつかの態様において、ＮＤＰキナーゼは配列番号９によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、ＮＤＰキナーゼは、配列番号９によって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【００８４】
いくつかの態様において、ＮＭＰからＮＴＰへのリン酸化はポリリン酸依存性キナーゼ経路によって生じ（図２Ａおよび２Ｂ）、そこでは、高エネルギーリン酸がポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）によってポリリン酸からＡＤＰに転移させられる。いくつかの態様において、ポリリン酸キナーゼはポリリン酸キナーゼ１（ＰＰＫ１）ファミリーに属し、これは高エネルギーリン酸をポリリン酸からＡＤＰに転移させてＡＴＰを形成する。このＡＴＰはその後ＮＭＰキナーゼ（例えば、ＡＭＰキナーゼ、ＵＭＰキナーゼ、ＧＭＰキナーゼ、およびＣＭＰキナーゼ）によって用いられて、ＮＭＰをそれらの対応するリボヌクレオチド二リン酸（ＮＤＰ）に変換する。さらにその上、その後、ＡＴＰはＮＤＰをＮＴＰに変換するためにヌクレオチド二リン酸キナーゼによって用いられる。例えば、例示的な酵素については表５および６参照。
【００８５】
いくつかの態様において、ポリリン酸キナーゼはポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）ファミリーに属する。いくつかの態様において、ポリリン酸キナーゼはクラスＩ  ＰＰＫ２ファミリーに属し、これは高エネルギーリン酸をポリリン酸からＮＤＰに転移させてＮＴＰを形成する。システムによって生産されたＡＴＰはＮＭＰをＮＤＰに変換するための高エネルギーリン酸ドナーとして用いられる。いくつかの態様において、ポリリン酸キナーゼはクラスＩＩＩ  ＰＰＫ２ファミリーに属し、これは高エネルギーリン酸をポリリン酸からＮＭＰおよびＮＤＰに転移させてＮＴＰを形成する。いくつかの態様において、クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２はＮＭＰからＮＴＰを生産するために単独で用いられる。他の態様において、クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２は他のキナーゼとの組み合わせで用いられる。クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２はＡＤＰ、ＡＭＰ、およびポリリン酸からＡＴＰを生産し、これはその後ＮＭＰをＮＴＰに変換するためにＮＭＰおよびＮＤＰキナーゼによって用いられる。
【００８６】
本明細書において提供される使用のためのＰＰＫ２酵素の限定しない例が、表６に列記されている（配列番号８〜１８）。それゆえに、いくつかの態様において、ＰＰＫ２酵素は耐熱性である。例えば、ＰＰＫ２酵素は耐熱性クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素であり得、これらはポリリン酸重合よりもＡＴＰ合成を選好し、ＡＤＰおよびＡＭＰ両方をＡＴＰに変換する。いくつかの態様において、ＰＰＫ２酵素は、例えば時間あたり１０から８００ｍＭの範囲である速度（例えば、時間あたり１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、または８００ｍＭ）で、ヘキサメタリン酸などのポリリン酸をＡＴＰに変換するために用いられる。
【００８７】
いくつかの態様において、本開示のＲＮＡ生合成方法は、配列番号８〜１８のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むＰＰＫ２酵素を利用する。いくつかの態様において、ＰＰＫ２酵素は配列番号８〜１８のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、ＰＰＫ２酵素は、配列番号８〜１８のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
【００８８】
本開示は融合酵素をもまた包含する。融合酵素は複数の活性を発揮し得、それぞれが異なる酵素の活性に対応する。例えば、独立のヌクレオシド一リン酸キナーゼおよび独立のヌクレオシド二リン酸キナーゼを用いるよりもむしろ、ヌクレオシド一リン酸キナーゼ活性およびヌクレオシド二リン酸キナーゼ活性両方を有する融合酵素（またはいずれかの他の酵素）が用いられ得る。
【表５】
2019510504.tif 000007
【表６】
2019510504.tif 000008
ヌクレオシド三リン酸からリボ核酸への重合
【００８９】
関心のＲＮＡの生合成の最後のステップはＮＴＰからＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ）最終産物への重合であり、例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いる。プロセスのこのステップにおいては、関心のＲＮＡをコードするように設計されたＤＮＡが関心のＲＮＡの合成のための鋳型としての用をなす。いくつかの場合には、ＤＮＡ鋳型は関心のＲＮＡの転写を選択的に駆動する転写プロモーターを有するように改変され得る。例のＤＮＡ鋳型が図３Ａに示されている。ＤＮＡ鋳型は３つのＲＮＡドメインをコードする：センスドメイン（ドメイン１）、柔軟なヒンジドメイン（ドメイン２）、およびセンスドメインに対して相補的なドメイン（アンチセンスドメイン３）。ＤＮＡ鋳型の転写後に、アンチセンスドメインはセンスドメインに結合して（ハイブリダイゼーションして）、二本鎖ＲＮＡヘアピンステムドメインおよび隣接するヘアピンループドメインを形成する。ＤＮＡ鋳型の他の例が図３Ｂ〜３Ｅに示されている。図３ＢのＤＮＡ鋳型は相補鎖同士の上にコンバージェントなプロモーター配列同士を含有する。各鋳型鎖から転写されたＲＮＡ配列同士は転写後にアニーリングする。プラスミドの一部としてコードされた図３ＣのＤＮＡ鋳型は、相補鎖同士の上のコンバージェントなプロモーター配列同士と、リードスルー転写を最小化するための１つ以上のターミネーター配列とを含有する。プラスミドの一部としてコードされた図３ＤのＤＮＡ鋳型は、相補配列同士の転写を駆動する独立のプロモーター−ターミネーターカセットを含有し、これらは転写後にアニーリングする。図３ＥのＤＮＡ鋳型は単一のＲＮＡドメインをコードする。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ両方の使用が二本鎖ＲＮＡ最終産物を生産する。
【００９０】
ＲＮＡの重合は、ＮＴＰ、転写プロモーターを含むＤＮＡ鋳型、および転写プロモーターに特異的なポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）を要求する。典型的には、本明細書において提供される使用のためのポリメラーゼは単一サブユニットポリメラーゼであり、その対応する転写プロモーターに対して高度に選択的であり、高い正確性を有し、高度に効率的である。ポリメラーゼの例は、限定なしに、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを包含する。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、これは高度にＴ７ファージプロモーターに特異的である。９９ＫＤ酵素はＴ７プロモーターのコントロール下のクローニングされたＤＮＡ配列からのインビトロＲＮＡ合成を触媒する。バクテリオファージＴ３  ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、これは高度にＴ３ファージプロモーターに特異的である。９９ＫＤ酵素はＴ３プロモーター下のクローニングされたＤＮＡ配列からのインビトロＲＮＡ合成を触媒する。バクテリオファージＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、これは高度にＳＰ６ファージプロモーターに特異的である。９８．５ＫＤポリメラーゼはＳＰ６プロモーター下のクローニングされたＤＮＡ鋳型からのインビトロＲＮＡ合成を触媒する。Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ポリメラーゼのそれぞれは３７〜４０℃で最適活性である。いくつかの態様においては、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ポリメラーゼの耐熱性バリアントが用いられる。耐熱性バリアントポリメラーゼは典型的には４０℃よりも上の温度（または約５０〜６０℃）で最適活性である。
【００９１】
「ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件」は、「ＲＮＡの生合成のための条件」ともまた言われる。これは当業者によって決定され得、例えば、ｐＨ、温度、時間の長さ、および細胞ライセートの塩濃度、ならびにいずれかの外来性の補因子を包含するポリメラーゼ活性の最適条件を考慮に入れる。
【００９２】
ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートのｐＨは３．０から８．０の値を有し得る。いくつかの態様において、細胞ライセートのｐＨ値は３．０〜８．０、４．０〜８．０、５．０〜８．０、６．０〜８．０、７．０〜８．０、３．０〜７．０、４．０〜７．０、５．０〜７．０、６．０〜７．０、３．０〜６．０、４．０〜６．０、５．０〜６．０、３．０〜５．０、３．０〜４．０、または４．０〜５．０である。いくつかの態様において、細胞ライセートのｐＨ値は３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、または８．０である。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートのｐＨ値は７．０である。
【００９３】
ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートの温度は１５℃から７０℃であり得る。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートの温度は１５〜６０℃、１５〜５０℃、１５〜４０℃、１５〜３０℃、２５〜７０℃、２５〜６０℃、２５〜５０℃、２５〜４０℃、３０〜７０℃、３０〜６０℃、３０〜５０℃、４０〜７０℃、４０〜６０℃、４０〜５０℃、５０〜７０℃、または５０〜６０℃である。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートの温度は１５℃、２５℃、３２℃、３７℃、４２℃、４５℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、または７０℃である。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートの温度は５０℃である。
【００９４】
ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートは１５分（ｍｉｎ）から７２時間（ｈｒ）インキュベートされ得る。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートは３０ｍｉｎ〜４８ｈｒインキュベートされる。例えば、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートは３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、１ｈｒ、２ｈｒ、３ｈｒ、４ｈｒ、５ｈｒ、６ｈｒ、７ｈｒ、８ｈｒ、９ｈｒ、１０ｈｒ、１１ｈｒ、１２ｈｒ、１８ｈｒ、２４ｈｒ、３０ｈｒ、３６ｈｒ、４２時間、または４８時間インキュベートされ得る。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートは３時間インキュベートされる。いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートは３７℃の温度で２４時間インキュベートされる。
【００９５】
いくつかの態様において、ＲＮＡの生合成の間の細胞ライセートは７．０のｐＨにおいて５０℃の温度で２〜４時間インキュベートされる。
【００９６】
いくつかのポリメラーゼ活性は金属イオンの存在を要求し得る。それゆえに、いくつかの態様においては、金属イオンが細胞ライセートに追加される。金属イオンの限定しない例はＭｇ２＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｎｉ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、およびＭｎ２＋を包含する。他の金属イオンが用いられてもよい。いくつかの態様においては、１つよりも多くの金属イオンが用いられ得る。細胞ライセート中の金属イオンの濃度は０．１ｍＭから１００ｍＭ、または１０ｍＭから５０ｍＭであり得る。いくつかの態様において、細胞ライセート中の金属イオンの濃度は０．１、０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、または１００．０ｍＭである。
【００９７】
いくつかの態様においては、例えば酵素凝集を防ぐために、塩が細胞ライセートに追加される。例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、またはその組み合わせが細胞ライセートに追加され得る。ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセート中の塩の濃度は５ｍＭから１Ｍであり得る。いくつかの態様において、ＲＮＡ解重合反応の間の細胞ライセート中の塩の濃度は５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、または１Ｍである。
耐熱性酵素
【００９８】
本開示の無細胞的ＲＮＡ生合成方法の１つの利点は、内在性ＲＮＡを合成二本鎖ＲＮＡに変換するために必要とされる酵素の全てが例えば単一の改変細胞内で発現され得る（ただし、そうである必要はない）ということである。例えば、改変細胞のクローン系集団が所望の細胞密度まで培養され、細胞は溶解され、内在性ＲＮＡからそのモノマー形態への解重合をもたらす条件下において（例えば、３０〜３７℃の温度で）インキュベートされ、内在性のヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化するために十分な温度（例えば４０〜９０℃）に付され、ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ）の重合をもたらす条件下においてインキュベートされる（例えば３０〜５０℃）。最終産物の合成ＲＮＡまで進むためには、ＮＭＰからＮＤＰ（例えば、ヌクレオシド一リン酸キナーゼおよび／またはポリリン酸キナーゼ）、ＮＤＰからＮＴＰ（例えば、ヌクレオシド二リン酸キナーゼおよび／またはポリリン酸キナーゼ）、およびＮＴＰからＲＮＡ（例えばポリメラーゼ）への変換に要求される酵素は、内在性ヌクレアーゼ（および／または外来性ヌクレアーゼ）およびホスファターゼの熱不活性化の間の変性を避けるために耐熱性であるべきである。耐熱性は、酵素が比較的高温での変性に堪える品質を言う。例えば、酵素が４２℃の温度で変性（不活性化）される場合には、類似の活性（例えばキナーゼ活性）を有する酵素は、それが４２℃で変性しない場合には「耐熱性」と見なされる。
【００９９】
酵素（例えば、キナーゼまたはポリメラーゼ）は、酵素が（ａ）他の自然状態の酵素を変性させる高温への一時的暴露後に活性を保持するか、または（ｂ）自然状態の酵素が低い速度で機能する中間温度から高温への一時的暴露後に高い速度で機能する場合に、耐熱性と見なされる。
【０１００】
いくつかの態様において、耐熱性酵素は、さもなければ類似の（非耐熱性の）自然状態の酵素を変性させるであろう比較的高温（例えば、E. coliから得られるキナーゼの４１℃よりも高く、多くのＲＮＡポリメラーゼの３７℃よりも高い）への一時的暴露後に、５０％超の活性を保持する。いくつかの態様において、耐熱性酵素は、さもなければ類似の（非耐熱性の）自然状態の酵素を変性させるであろう比較的高温への一時的暴露後に、５０〜１００％の活性を保持する。例えば、耐熱性酵素は、さもなければ類似の（非耐熱性の）自然状態の酵素を変性させるであろう比較的高温への一時的暴露後に、５０〜９０％、５０〜８５％、５０〜８０％、５０〜７５％、５０〜７０％、５０〜６５％、５０〜６０％、または５０〜５５％の活性を保持し得る。いくつかの態様において、耐熱性酵素は、さもなければ類似の（非耐熱性の）自然状態の酵素を変性させるであろう比較的高温への一時的暴露後に、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の活性を保持する。
【０１０１】
いくつかの態様において、中間温度から高温（例えば４２〜８０℃）への一時的暴露後の耐熱性酵素の活性は、類似の（非耐熱性の）自然状態の酵素の活性を超える（例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％超える）。
【０１０２】
例えば、耐熱性キナーゼの活性は、キナーゼがリン酸化することができるＮＭＰまたはＮＤＰの量によって測定され得る。それゆえに、いくつかの態様において、耐熱性キナーゼは、３７℃で類似の変換を完了するために要求される同じ量の時間で、比較的高温（例えば４２℃）でＮＭＰの５０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの５０％超をＮＴＰに変換する。いくつかの態様において、耐熱性キナーゼは、３７℃で類似の変換を完了するために要求される同じ量の時間で、比較的高温（例えば４２℃）でＮＭＰの６０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの６０％超をＮＴＰに変換する。いくつかの態様において、耐熱性キナーゼは、３７℃で類似の変換を完了するために要求される同じ量の時間で、比較的高温（例えば４２℃）でＮＭＰの７０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの７０％超をＮＴＰに変換する。いくつかの態様において、耐熱性キナーゼは、３７℃で類似の変換を完了するために要求される同じ量の時間で、比較的高温（例えば４２℃）でＮＭＰの８０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの８０％超をＮＴＰに変換する。いくつかの態様において、耐熱性キナーゼは、３７℃で類似の変換を完了するために要求される同じ量の時間で、比較的高温（例えば４２℃）でＮＭＰの９０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの９０％超をＮＴＰに変換する。
【０１０３】
例えば、耐熱性ポリメラーゼの活性は正確性および重合キネティクス（例えば、重合の速度）に基づいて算定される。それゆえに、例えば、耐熱性Ｔ７ポリメラーゼの１単位は、３７℃よりも上の温度で（例えば５０℃で）３０分間に１０ｎモルのＮＴＰを酸不溶性の材料に組み込み得る。
【０１０４】
耐熱性酵素（例えば、キナーゼまたはポリメラーゼ）は４２℃から８０℃の、またはより高い温度で活性なままであり得る（反応を触媒することができる）。いくつかの態様において、耐熱性酵素は、４２〜８０℃、４２〜７０℃、４２〜６０℃、４２〜５０℃、５０〜８０℃、５０〜７０℃、５０〜６０℃、６０〜８０℃、６０〜７０℃、または７０〜８０℃の温度で活性なままである。例えば、耐熱性酵素は、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、または８０℃の温度で活性なままであり得る。耐熱性酵素は比較的高温で１５分間から４８時間、またはより長く活性なままであり得る。例えば、耐熱性酵素は比較的高温で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、３６、４２、または４８時間活性なままであり得る。
【０１０５】
耐熱性ＮＭＰキナーゼの限定しない例が表５および７に列記されている。他の耐熱性キナーゼは、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、耐熱性ピルビン酸キナーゼ、および耐熱性ポリリン酸キナーゼを包含する（例えば表６参照）。他の耐熱性キナーゼが本開示に包含される。
【表７】
2019510504.tif 000009
【０１０６】
ＲＮＡポリメラーゼの限定しない例が表８に列記されている。耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを包含する他のＲＮＡポリメラーゼが本開示に包含される。
【表８】
2019510504.tif 000010
【０１０７】
耐熱性ＲＮＡポリメラーゼは野生型酵素を修飾することによって調製され得る。かかる修飾（例えば変異）は公知である。例えば、バリアント耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは次の点変異の１つ以上を包含し得る：Ｖ４２６Ｌ、Ａ７０２Ｖ、Ｖ７９５Ｉ、Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、Ｓ６３３Ｉ、Ｆ８８０Ｙ、Ｃ５１０Ｒ、およびＳ７６７Ｇ（ＥＰ２３７７９２８およびＥＰ１２６１６９６Ａ１。そのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、バリアント耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼはＶ４２６Ｌ、Ａ７０２Ｖ、およびＶ７９５Ｉ変異を包含する。いくつかの態様において、バリアント耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼはＳ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、Ｓ６３３Ｉ、およびＦ８８０Ｙ変異を包含する。いくつかの態様において、バリアント耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼはＦ８８０Ｙ、Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、Ｓ６３３Ｉ、Ｃ５１０Ｒ、およびＳ７６７Ｇ変異を包含する。いくつかの態様において、バリアント耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼはＹ６３９Ｖ、Ｈ７８４Ｇ、Ｅ５９３Ｇ、およびＶ６８５Ａ変異を包含する。いくつかの態様において、バリアント耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼはＳ４３０Ｐ、Ｎ４３３Ｔ、Ｓ６３３Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、およびＦ８８０Ｙ変異を包含する。他のバリアントおよび組換え体耐熱性ポリメラーゼが本開示に包含される。
【０１０８】
いくつかの態様においては、耐熱性Ｔ７ポリメラーゼが関心のＲＮＡを生産するために用いられる。例えば、１〜２％総蛋白質の濃度を有する耐熱性Ｔ７ポリメラーゼ（例えば、４０〜６０℃の温度でインキュベートされる）が、関心のＲＮＡを２ｇ／Ｌ／ｈｒ超（または例えば２ｇ／Ｌ／ｈｒ〜１０ｇ／Ｌ／ｈｒ）の速度で合成するために用いられ得る。別の例として、３〜５％総蛋白質の濃度を有する耐熱性Ｔ７ポリメラーゼ（例えば、４０〜６０℃の温度でインキュベートされる）が、関心のＲＮＡを１０ｇ／Ｌ／ｈｒ超（または例えば１０ｇ／Ｌ／ｈｒ〜２０ｇ／Ｌ／ｈｒ）の速度で合成するために用いられ得る。
【０１０９】
本開示の多くの態様は耐熱性ポリメラーゼ／酵素の使用を記載するが、他の酵素／ポリメラーゼが用いられ得るということが理解されるべきである。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、例えば耐熱性酵素（単数または複数）の活性のいずれかの低減または喪失を補うために、熱不活性化された細胞ライセートに外来的に追加され得る。
関心のＲＮＡ
【０１１０】
本開示の方法は関心のＲＮＡを生合成するために用いられる。ＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの態様において、ＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ干渉分子である。例えば、関心のＲＮＡはｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡ干渉分子であり得る。上で論じられているように、関心のＲＮＡはＤＮＡ鋳型によってコードされ、その例は図３Ａ〜３Ｅに示されている。図３Ａの鋳型を用いて生産されるＲＮＡは、センスドメイン（ドメイン１）、柔軟なヒンジドメイン（ドメイン２）、およびセンスドメインに対して相補的なドメイン（アンチセンスドメイン３）を包含する。ＤＮＡ鋳型の転写後に、アンチセンスドメインはセンスドメインに結合して（ハイブリダイゼーションして）、二本鎖ＲＮＡヘアピンステムドメインおよび隣接するヘアピンループ（ヒンジ）ドメインを形成する。
【０１１１】
二本鎖ヘアピンステムドメインは、２つの相補的な核酸ドメイン同士（例えば、別々のヌクレオチド配列同士）の互いへの結合によって形成される。核酸ドメイン同士は、それらが互いに結合（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用によって塩基対形成、ハイブリダイゼーション）して二本鎖核酸を形成する場合に「相補的」である。関心のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型の相補的なドメイン同士は、所望の最終産物に依存して変わり得る。相補的なドメイン同士は、例えば４から１０００ヌクレオチドの、またはより長い長さを有し得る。例えば、相補的なドメイン同士は４から１０、４から２０、４から３０、４から５０、４から６０、４から７０、４から８０、４から９０、４から１００、４から２００、４から３００、４から４００、または４から５００、または４から１０００ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、相補的なドメイン同士は１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、相補的なドメイン同士は４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチドの長さを有する。
【０１１２】
ヘアピンループドメインもまた２つの相補的な核酸ドメイン同士の結合によって形成される。ヘアピンループドメインは２つの相補的なドメイン同士の間の介在配列である。典型的には、ヘアピンループドメインは非特異的であり、それが分子内でまたは別の核酸に結合するように設計されてはいないということを意味する。ヘアピンループドメインは相補的なドメイン同士の結合によってループ様構造を形成して、二本鎖ヘアピンステムドメインを形成する。いくつかの態様において、ヘアピンループドメインは、４から５００ヌクレオチドの長さ、またはより多くを有する。例えば、ヘアピンループドメインは４から１０、４から２０、４から３０、４から５０、４から６０、４から７０、４から８０、４から９０、４から１００、４から２００、４から３００、４から４００、または４から５００ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、ヘアピンループドメインは４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチドの長さを有する。
【０１１３】
本開示の「二本鎖ＲＮＡ」は、一本鎖領域（例えば、ループまたはオーバーハング）を含有しない全くの二本鎖分子、ならびに二本鎖領域および一本鎖領域（例えば、ループまたはオーバーハング）を含有する部分的二本鎖分子を包含する。図３Ａの一番下に図示されているｄｓＲＮＡ産物は部分的二本鎖分子と見なされ、一方、図３Ｂの一番下に図示されているｄｓＲＮＡ産物は全くの二本鎖分子と見なされる。
【０１１４】
関心の「一本鎖ＲＮＡ」の例は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびアンチセンスＲＮＡを包含する。それゆえに、本明細書においてはｍＲＮＡおよび他の一本鎖ＲＮＡ分子を合成する方法が提供される。
【０１１５】
それらの方法は、（ａ）ＲＮＡ、ＲＮＡを解重合する酵素、耐熱性キナーゼ、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含む培養改変細胞を溶解し、それによって細胞ライセートを生産することと、（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセートを、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによってヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセートを生産することと、（ｃ）ステップ（ｂ）において生産された細胞ライセートを、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することなしに内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化する温度に加熱し、それによって熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセートを生産することと、（ｄ）（ｃ）において生産された細胞ライセートを、エネルギー供給源と関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する改変ＤＮＡ鋳型との存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによって関心のｍＲＮＡを含む細胞ライセートを生産することとを含み得る。
【０１１６】
代替的には、かかる方法は、（ａ）内在性の多量体ＲＮＡ、ＲＮＡを解重合する酵素、耐熱性ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、耐熱性ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、耐熱性ＰＰＫ２キナーゼ、および／またはポリリン酸を含む改変細胞から得られた細胞ライセート同士を組み合わせて、細胞ライセート混合物を生産することと、（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセート混合物を、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによってヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセートを生産することと、（ｃ）ステップ（ｂ）において生産された細胞ライセートを、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することなしにホスファターゼおよびＲＮａｓｅ（ならびにＲＮＡ安定性または重合正確性にとって不利であり得るいずれかの他の活性、例えば自然状態のＲＮＡポリメラーゼ、ＮＭＰレダクターゼ、および／またはヌクレオシダーゼ）を不活性化する温度に加熱し、それによって、熱不活性化されたホスファターゼおよびＲＮａｓｅ（ならびに他の有害な細胞活性）を含む細胞ライセートを生産することと、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された細胞ライセートを、エネルギー供給源と関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する改変ＤＮＡ鋳型との存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによってｍＲＮＡを含む細胞ライセートを生産することとを含み得る。
【０１１７】
いくつかの態様において、単一の標的ドメインを含有するＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型は例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、もたらされたＲＮＡ転写物は例えばファージφ６  ＲｄＲＰなどのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの鋳型としての用をなして、相補的なＲＮＡ分子を合成し、ｄｓＲＮＡを生む。例えば図３Ｂ参照。ファージφ６は二本鎖ＲＮＡウイルスであり、これはPseudomonas属のメンバーに感染する。このファージはＲＮＡ鋳型を用いてＲＮＡを合成する能力があるＲｄＲＰをコードし、ｄｓＲＮＡ分子を生む。φ６  ＲｄＲＰはプライマー分子なしでＲＮＡを重合する能力があり、それゆえにポリメラーゼは鋳型ＲＮＡのみを要求する（Wright, S. et al, 2012. Journal of Virology. Mar;86(5):2837-49; Van Dijk, AA., et al, 2004. J Gen Virol. May;85(Pt 5）。参照によって本明細書に組み込まれる）。他のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）が本開示に包含される。
【０１１８】
いくつかの態様において、改変細胞は関心のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型を含む。ＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型は改変細胞のゲノムＤＮＡ中にインテグレーションされ得、またはＤＮＡ鋳型はプラスミド上で改変細胞内に導入され得る。他の態様においては、ＤＮＡ鋳型は関心のＲＮＡの生合成の間に（例えば熱不活性化ステップ後に）細胞ライセートに追加される。いくつかの態様において、細胞ライセート中のＤＮＡ鋳型の濃度は０．０５〜１μｇ／μｌである。いくつかの態様において、細胞ライセート中のＤＮＡ鋳型の濃度は０．０５μｇ／μｌ、０．１μｇ／μｌ、０．５μｇ／μ１、１．０μｇ／μ１である。
【０１１９】
上で論じられているように、関心のＲＮＡ最終産物の他の例はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびショート／短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（分解に向けて特定のｍＲＮＡを特異的に標的化するように設計された合成ＲＮＡ二重鎖）を包含する。
【０１２０】
いくつかの態様において、ＲＮＡ最終産物（生合成された関心のＲＮＡ）の濃度は、少なくとも１ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌ細胞ライセートである。例えば、ＲＮＡ最終産物の濃度は１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｇ／Ｌ、またはより多くであり得る。
【０１２１】
いくつかの態様において、関心のＲＮＡは関心の標的核酸に結合するように設計され、例えば治療、予防、または診断薬として用いられる。
プロテアーゼ標的化
【０１２２】
本開示の改変細胞は、ＲＮＡなどの核酸の生産に負の影響を有し得る細胞の健康に必要な酵素を発現（例えば内在的に発現）し得る。かかる酵素は本明細書においては「標的酵素」と言われる。例えば、改変細胞によって発現される標的酵素は、基質または補因子について、ＲＮＡ生合成経路に供給される前駆体の速度を増大させる酵素と競合し得る。別の例として、改変細胞によって発現された標的酵素は、基質または補因子について、ＲＮＡ生合成経路の鍵となる経路入り口酵素である酵素と競合し得る。まだ別の例として、改変細胞によって発現された標的酵素は、基質または補因子について、ＲＮＡ生合成経路の基質または補因子を供給する酵素と競合し得る。
【０１２３】
この負の影響を無効化または低減するために、標的酵素はそれらの蛋白質配列中に部位特異的プロテアーゼ認識配列を包含するように修飾され得、その結果、標的酵素はＲＮＡ生産の間の不活性化に向けて「標的化」および切断され得る（例えば、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれる２０１２年３月１日公開のＵ．Ｓ．公開Ｎｏ．２０１２／００５２５４７Ａｌ；および２０１５年２月１２日公開の国際公開Ｎｏ．ＷＯ２０１５／０２１０５８Ａ２参照）。
【０１２４】
部位特異的プロテアーゼ認識配列を含有する標的酵素の切断は、対応する部位特異的プロテアーゼとの接触からもたらされる。これは細胞増殖段階の間には（例えば改変細胞が培養されているときには）細胞のペリプラズムに（標的酵素から離れて）隔離されており、ＲＮＡ生産段階の間に（例えば、細胞ライセートを生産するための細胞溶解後に）標的酵素との接触をさせられる。それゆえに、いくつかの態様において、本開示の改変細胞は、（ｉ）ＲＮＡ生産の速度に負に影響しかつ標的酵素の蛋白質配列中に部位特異的プロテアーゼ認識配列を包含する標的酵素をコードする改変核酸と（ｉｉ）標的酵素の部位特異的プロテアーゼ認識配列を切断しかつペリプラズム標的化配列を包含する部位特異的プロテアーゼをコードする改変核酸とを含む。このペリプラズム標的化配列は、細胞が溶解されるまで部位特異的プロテアーゼを細胞のペリプラズム空間に隔離することを担う。ペリプラズム標的化配列の例は下で提供されている。
【０１２５】
本開示に従って用いられ得るプロテアーゼの例は、限定なしに、アラニンカルボキシペプチダーゼ、Armillaria melleaから得られるプロテアーゼ、アスタシン、細菌ロイシルアミノペプチダーゼ、癌由来凝固促進因子、カテプシンＢ、クロストリパイン、細胞質アラニルアミノペプチダーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＢｒｇ−Ｃ、エンテロキナーゼ、ガストリシン、ゼラチナーゼ、Ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、グリシルエンドペプチダーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ヒポデルミンＣ、Ｉｇａ特異的セリンエンドペプチダーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ロイシルエンドペプチダーゼ、ｌｙｓＣ、リソソームｐｒｏ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、ミクソバクター（myxobacter）、ナルディライジン、膵エンドペプチダーゼＥ、ピコルナイン（picornain）２Ｂ、ピコルナイン（picornain）３Ｃ、プロエンドペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、プロ蛋白質転換酵素Ｉ、プロ蛋白質転換酵素ＩＩ、ラッセルライジン（russellysin）、サッカロペプシン（saccharopepsin）、セメノゲラーゼ、Ｔ−プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、組織カリクレイン、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）から得られるプロテアーゼ、トガビリン、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、Ｕ−プラスミノーゲン活性化因子、Ｖ８、ベノムビンＢ、ベノムビンＢＢ、およびＸａａ−Ｐｒｏアミノペプチダーゼを包含する。
ペリプラズム標的化
【０１２６】
核酸（例えばＲＮＡ）生合成経路の酵素は、細胞の健康（例えば生存能）に負の影響を有する少なくとも１つの酵素を包含し得る。この負の影響を無効化または低減するために、酵素は転置配列を包含するように修飾され得、その結果、酵素は、それが天然には位置せずかつ酵素が細胞の健康に負に影響しない細胞内または細胞外区画に転置される（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる２０１１年１１月１０日公開の公開Ｎｏ．ＵＳ−２０１１−０２７５１１６−Ａ１参照）。例えば、生合成経路の酵素は細胞のペリプラズム空間に転置され得る。
【０１２７】
それゆえに、いくつかの態様において、本開示の改変細胞はペリプラズム標的化配列に連結された核酸（例えばＲＮＡ）生合成経路の少なくとも１つの酵素を含む。「ペリプラズム標的化配列」は、それが連結されている蛋白質を細胞のペリプラズムに標的化するアミノ酸配列である。ペリプラズム標的化配列に連結されている蛋白質は、蛋白質が発現される細胞のペリプラズムに隔離されるであろう。
【０１２８】
例えば、ペリプラズム標的化配列は細菌分泌蛋白質のＮ末端に由来し得る。配列は長さが約１５から約７０アミノ酸まで変わる。ペリプラズム標的化配列の一次アミノ酸配列は変わるが、一般的には次のコンポーネントを包含する共通の構造を有する：（ｉ）Ｎ末端部は可変的な長さを有し、一般的に正味の正電荷を持ち；（ｉｉ）約６から約１５アミノ酸の疎水性の中心コアが後続し；（ｉｉｉ）最後のコンポーネントはシグナルペプチダーゼの切断部位を定める４から６アミノ酸を包含する。
【０１２９】
いくつかの態様において、本開示のペリプラズム標的化配列はグラム陰性細菌によって分泌される蛋白質に由来し得る。分泌蛋白質は、細菌によってまたは細菌に感染するバクテリオファージによってコードされ得る。分泌蛋白質のグラム陰性細菌供給源の例は、限定なしに、Escherichia、Pseudomonas、Klebsiella、Salmonella、Caulobacter、Methylomonas、Acetobacter、Achromobacter、Acinetobacter、Aeromonas、Agrobacterium、Alcaligenes、Azotobacter、Burkholderia、Citrobacter、Comamonas、Enterobacter、Erwinia、Rhizobium、Vibrio、およびXanthomonas属のメンバーを包含する。
【０１３０】
本開示に従う使用のためのペリプラズム標的化配列の例は、限定なしに：
ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡ（配列番号１９）；
ＭＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＴＫＡ（配列番号２０）；
ＭＭＩＴＬＲＫＬＰＬＡＶＡＶＡＡＧＶＭＳＡＱＡＭＡ（配列番号２１）；
ＭＮＫＫＶＬＴＬＳＡＶＭＡＳＭＬＦＧＡＡＡＨＡ（配列番号２２）；
ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号２３）；
ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡ（配列番号２４）；
ＭＭＴＫＩＫＬＬＭＬＩＩＦＹＬＩＩＳＡＳＡＨＡ（配列番号２５）；
ＭＫＱＡＬＲＶＡＦＧＦＬＩＬＷＡＳＶＬＨＡ（配列番号２６）；
ＭＲＶＬＬＦＬＬＬＳＬＦＭＬＰＡＦＳ（配列番号２７）；および
ＭＡＮＮＤＬＦＱＡＳＲＲＲＦＬＡＱＬＧＧＬＴＶＡＧＭＬＧＰＳＬＬＴＰＲＲＡＴＡ（配列番号２８）、
からなる群から選択される配列を包含する。
改変細胞
【０１３１】
典型的には、本開示の改変細胞は、ＲＮＡを生合成するために要求される酵素活性の少なくとも１つ、大多数、または全てを含む。「改変細胞」は、少なくとも１つの改変（例えば、組換え体または合成）核酸を含むか、またはそれらの天然に生ずるカウンターパートとは構造的および／もしくは機能的に別物であるように別様に修飾されている細胞である。それゆえに、改変核酸を含有する細胞は「改変細胞」と見なされる。
【０１３２】
いくつかの態様において、本開示の改変細胞は、ＲＮＡ、ＲＮＡを解重合する酵素、耐熱性キナーゼ、および／または耐熱性ポリメラーゼを含む。いくつかの態様において、改変細胞は、関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有するＤＮＡ鋳型をさらに含む。
【０１３３】
いくつかの態様において、改変細胞は選択マーカーを発現する。選択マーカーは、細胞のトランスフェクション後に（または外来性の核酸を細胞内に導入するために用いられる他の手続き後に）、改変核酸を取り込み発現した改変細胞を選択するために典型的に用いられる。それゆえに、産物をコードする核酸は選択マーカーをもまたコードし得る。選択マーカーの例は、限定なしに、抗生物質（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子）または他の化合物に対する耐性または感受性どちらかを増大または減少させる蛋白質をコードする遺伝子を包含する。選択マーカーの追加の例は、限定なしに、細胞がさもなければ必須の栄養素が欠乏した培地で増殖することを可能にする蛋白質をコードする遺伝子（栄養要求性マーカー）を包含する。他の選択マーカーが本開示に従って用いられ得る。
【０１３４】
改変細胞は、核酸（例えば改変核酸）によってコードされる産物が細胞内で生産される場合に、産物を「発現する」。遺伝子発現が、核酸の形態の遺伝子命令が用いられて蛋白質（例えば酵素）などの産物を合成するプロセスを言う、ということは当分野において公知である。
【０１３５】
改変細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。いくつかの態様において、改変細胞は細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、または細胞の他の型である。
【０１３６】
本開示の改変細菌細胞は、限定なしに、改変Escherichia spp.、Streptomyces spp.、Zymomonas spp.、Acetobacter spp.、Citrobacter spp.、Synechocystis spp.、Rhizobium spp.、Clostridium spp.、Corynebacterium spp.、Streptococcus spp.、Xanthomonas spp.、Lactobacillus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Alcaligenes spp.、Pseudomonas spp.、Aeromonas spp.、Azotobacter spp.、Comamonas spp.、Mycobacterium spp.、Rhodococcus spp.、Gluconobacter spp.、Ralstonia spp.、Acidithiobacillus spp.、Microlunatus spp.、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、Arthrobacter spp.、Flavobacterium spp.、Serratia spp.、Saccharopolyspora spp.、Thermus spp.、Stenotrophomonas spp.、Chromobacterium spp.、Sinorhizobium spp.、Saccharopolyspora spp.、Agrobacterium spp.、およびPantoea spp.を包含する。
【０１３７】
本開示の改変酵母細胞は、限定なしに、改変Saccharomyces spp.、Schizosaccharomyces、Hansenula、Candida、Kluyveromyces、Yarrowia、およびPichiaを包含する。
【０１３８】
いくつかの態様において、本開示の改変細胞は、改変Escherichia coli細胞、Bacillus subtilis細胞、Pseudomonas putida細胞、Saccharomyces cerevisae細胞、またはLactobacillus brevis細胞である。いくつかの態様において、本開示の改変細胞は改変Escherichia coli細胞である。
改変核酸
【０１３９】
「核酸」は、共有結合的に一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドであり、いくつかの場合にはホスホジエステル結合（例えばホスホジエステル「バックボーン」）を含有し得る。核酸（例えば、核酸のコンポーネントまたは部分）は天然に生ずるかまたは改変され得る。「天然に生ずる」核酸は、ヒトの介入の非存在下において天然に存在する細胞内に存在する。「改変核酸」は組換え体核酸および合成核酸を包含する。「組換え体核酸」は、（例えば同じ種からのまたは異なる種からの）核酸分子同士を繋ぎ合わせることによって構築される分子を言い、典型的には生細胞内で複製し得る。「合成核酸」は、生物学的に合成、化学的に合成、または他の手段によって合成もしくは増幅される分子を言う。合成核酸は、化学的に修飾または別様に修飾されているが、天然に生ずる核酸分子と塩基対形成し得る核酸を包含する。組換え体および合成核酸は、前述のどちらかの複製からもたらされる分子をもまた包含する。改変核酸は天然に生ずる核酸の部分を含有し得るが、全体としては、改変核酸は天然には生じず、ヒトの介入を要求する。いくつかの態様において、本開示の産物をコードする核酸は組換え体核酸または合成核酸である。他の態様において、産物をコードする核酸は天然に生ずる。
【０１４０】
本明細書において提供されるＲＮＡをコードする改変核酸は、核酸のコントロール領域である「プロモーター」に作動可能に連結され得、そこでは核酸の残りの転写の開始および速度がコントロールされる。プロモーターは、それが制御する核酸の発現を駆動しまたは転写を駆動する。
【０１４１】
プロモーターは、遺伝子または配列に天然に結び付けられているものであり得、所与の遺伝子または配列のコードセグメントの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られ得る。かかるプロモーターは「内在性」と言われ得る。
【０１４２】
いくつかの態様において、コード核酸配列は組換え体または異種プロモーターのコントロール下に配置され得、これは、通常ではその天然環境においてはコードされている配列に結びつけられていないプロモーターを言う。かかるプロモーターは、他の遺伝子のプロモーター；いずれかの他の細胞から単離されたプロモーター；および例えば、異なる転写制御領域の異なるエレメント同士および／または当分野において公知である遺伝子工学の方法によって発現を変改する変異を含有するものなどの、「天然に生じ」ない合成プロモーターまたはエンハンサーを包含し得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生産することに加えて、配列は、組換えクローニングおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を包含する核酸増幅テクノロジーを用いて生産され得る。
【０１４３】
プロモーターは、それが制御する核酸に対して正しい機能的な位置および向きにあって、その核酸の転写開始および／または発現をコントロールする（「駆動する」）ときに、「作動可能に連結」されていると見なされる。
【０１４４】
本開示の改変核酸は恒常的プロモーターまたは誘導型プロモーターを含有し得る。「恒常的プロモーター」は細胞内において常に活性であるプロモーターを言う。「誘導型プロモーター」は、誘導因子もしくは誘導剤の存在下にあるか、それによって影響されるか、もしくはそれと接触するか、または抑圧を引き起こす因子の非存在下において活性化されるときに、転写活性を開始または増強するプロモーターを言う。本開示に従う使用のための誘導型プロモーターは、本明細書に記載されるかまたは当業者に公知のいずれかの誘導型プロモーターを包含する。誘導型プロモーターの例は、限定なしに、化学的／生化学的に制御および物理的に制御されるプロモーター、例えばアルコールによって制御されるプロモーター、テトラサイクリンによって制御されるプロモーター、ステロイドによって制御されるプロモーター、金属によって制御されるプロモーター、発病機構によって制御されるプロモーター、温度／熱誘導型、リン酸によって制御される（例えばＰｈｏＡ）、および光によって制御されるプロモーターを包含する。
【０１４５】
誘導因子または誘導剤は、内在的もしくは通常では外来的な条件（例えば光）、化合物（例えば、化学もしくは非化学化合物）、または誘導型プロモーターからの転写活性を制御する点で活性であるようなやり方で誘導型プロモーターに接触する蛋白質であり得る。それゆえに、核酸の「転写を制御するシグナル」は誘導型プロモーターに作用する誘導因子シグナルを言う。転写を制御するシグナルは、用いられる制御システムに依存して転写を活性化または不活性化し得る。転写の活性化には、プロモーターに直接的に作用して転写を駆動すること、またはプロモーターが転写を駆動することを防ぐリプレッサーを不活性化することによってプロモーターに間接的に作用することが関わり得る。反対に、転写の脱活性化には、プロモーターに直接的に作用して転写を防ぐこと、またはリプレッサーを活性化し、これがそれからプロモーターに作用することによってプロモーターに間接的に作用することが関わり得る。
【０１４６】
改変核酸は当分野において公知のいずれかの手段を用いてホスト細胞内に導入され得、限定なしに、形質転換、トランスフェクション（例えば、化学的（例えば、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、もしくはリポソーム）または非化学的（例えば、エレクトロポレーション、ソノポレーション、インペイルフェクション（impalefection）、光学的トランスフェクション、流体力学的トランスフェクション））、および形質導入（例えば、ウイルス系形質導入）を包含する。
【０１４７】
天然に生ずる細胞内核酸によってコードされる酵素または他の蛋白質は「内在性酵素」または「内在性蛋白質」と言われ得る。
細胞培養物および細胞ライセート
【０１４８】
典型的には、改変細胞は培養される。「培養する」は、細胞がコントロールされた条件下において、典型的にはそれらの天然環境の外において増殖させられるプロセスを言う。例えば、改変細菌細胞などの改変細胞は、液体「培養培地」ともまた言われる液体栄養素ブロス中において細胞懸濁液として増殖させられ得る。
【０１４９】
普通に用いられる細菌Escherichia coli増殖培地の例は、限定なしに、ＬＢ（溶原ブロス）Ｍｉｌｌｅｒブロス（１％ＮａＣｌ）：１％ペプトン、０．５％酵母エキス、および１％ＮａＣｌ；ＬＢ（溶原ブロス）Ｌｅｎｎｏｘブロス（０．５％ＮａＣｌ）：１％ペプトン、０．５％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ；ＳＯＢ培地（スーパーオプティマルブロス）：２％ペプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣ１、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４；ＳＯＣ培地（異化抑制因子を有するスーパーオプティマルブロス）：ＳＯＢ＋２０ｍＭグルコース；２×ＹＴブロス（２×酵母エキスおよびトリプトン）：１．６％ペプトン、１％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ；ＴＢ（テリフィックブロス）培地：１．２％ペプトン、２．４％酵母エキス、７２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、および０．４％グリセロール；ならびにＳＢ（スーパーブロス）培地：３．２％ペプトン、２％酵母エキス、および０．５％ＮａＣｌ、ならびに／またはＫｏｒｚ培地（Korz, DJ et al. 1995）を包含する。
【０１５０】
高密度の細菌Escherichia coli増殖培地の例は、ＤＮＡＧｒｏ（商標）培地、ＰｒｏＧｒｏ（商標）培地、ＡｕｔｏＸ（商標）培地、ＤｅｔｏＸ（商標）培地、ＩｎｄｕＸ（商標）培地、およびＳｅｃＰｒｏ（商標）培地を包含するが、これに限定されない。
【０１５１】
いくつかの態様において、改変細胞は酵素または核酸の発現をもたらす条件下において培養される。かかる培養条件は発現されようとする特定の産物と産物の所望の量とに依存し得る。
【０１５２】
いくつかの態様において、改変細胞は３０℃から４０℃の温度で培養される。例えば、改変細胞は３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、または４０℃の温度で培養され得る。典型的には、改変細胞、例えば改変E. coli細胞は３７℃の温度で培養される。
【０１５３】
いくつかの態様において、改変細胞は、１２時間から７２時間の、またはより多くの時期培養される。例えば、改変細胞は、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、または７２時間の時期培養され得る。典型的には、改変細菌細胞などの改変細胞は１２から２４時間の時期培養される。いくつかの態様において、改変細胞は３７℃の温度で１２から２４時間培養される。
【０１５４】
いくつかの態様において、改変細胞は（例えば、液体細胞培養培地中において）５から２００の６００ｎｍの波長で測定される光学密度（ＯＤ６００）まで培養される。いくつかの態様において、改変細胞は５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、または２００のＯＤ６００まで培養される。
【０１５５】
いくつかの態様において、改変細胞は、１×１０８（ＯＤ＜１）から２×１０１１（ＯＤ〜２００）生存可能細胞／ｍｌ細胞培養培地の密度で培養される。いくつかの態様において、改変細胞は１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、または２×１０１１生存可能細胞／ｍｌの密度まで培養される（変換係数：ＯＤ１＝８×１０８細胞／ｍｌ）。
【０１５６】
いくつかの態様において、改変細胞はバイオリアクター内で培養される。バイオリアクターは単純に細胞が培養される容器、例えば培養フラスコ、ディッシュ、またはバッグを言い、これらは単回使用（使い捨て）、オートクレーブ可能、または滅菌可能であり得る。バイオリアクターはガラスから作られ得、またはこれはポリマーに基づき得、またはこれは他の材料から作られ得る。
【０１５７】
バイオリアクターの例は、限定なしに、撹拌槽（例えば完全混合）バイオリアクターおよび管型（例えば押し出し流れ）バイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、膜撹拌槽、スピンフィルター撹拌槽、バイブロミキサー、流動床反応器、ならびに膜バイオリアクターを包含する。バイオリアクターを作動させるモードはバッチまたは連続プロセスであり得、培養されようとする改変細胞に依存するであろう。バイオリアクターは、フィードおよび製品流が連続的にフィードされ、システムから取り出されるときに、連続的である。バッチ式バイオリアクターは連続的な再循環流れを有し得るが、栄養素の連続的なフィードまたは産物収穫はない。断続的収穫およびフェドバッチ（fed-batch）（またはバッチフェド（batch fed））培養では、細胞は、組成がバッチ培地に類似である培地に、より低い生存可能細胞密度で接種される。細胞は、栄養素がやや枯渇し細胞が定常増殖段階に近づくまで、本質的に外的操作なしに指数増殖することを許される。この時点において、断続的収穫バッチフェド（batch fed）プロセスでは、細胞および産物の部分が収穫され得、除去された培養培地が新しい培地によって補充される。このプロセスは数回繰り返され得る。組換え体蛋白質および抗体の生産のためには、フェドバッチプロセスが用いられ得る。細胞が指数増殖していくが栄養素が枯渇してくる一方で、濃縮されたフィード培地（例えば、１０〜１５倍濃縮された基礎培地）が連続的または断続的にどちらかで追加されて、追加の栄養素を供給し、細胞濃度と生産段階の長さとのさらなる増大を許す。新しい培地が、培養培地（ブロス）の除去なしに細胞濃度に比例して追加され得る。培地の追加を収容するように、フェドバッチ培養はバイオリアクターの満容量よりも大分低い体積（例えば、最大の体積のおよそ４０％から５０％）で始められる。
【０１５８】
本開示のいくつかの方法は、ＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ）の大スケール生産を対象とする。大スケール生産方法では、改変細胞は、５リットル（Ｌ）から２５０，０００Ｌの、またはより多くの体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。いくつかの態様において、改変細胞は、１０Ｌ、１００Ｌ、１０００Ｌ、１００００Ｌ、または１０００００Ｌ超の（またはそれに等しい）体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。いくつかの態様において、改変細胞は、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、３５Ｌ、４０Ｌ、４５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、５０００Ｌ、１００００Ｌ、１０００００Ｌ、１５００００Ｌ、２０００００Ｌ、２５００００Ｌ、またはより多くの体積の液体培養培地中で増殖させられる。いくつかの態様において、改変細胞は、５Ｌから１０Ｌ、５Ｌから１５Ｌ、５Ｌから２０Ｌ、５Ｌから２５Ｌ、５Ｌから３０Ｌ、５Ｌから３５Ｌ、５Ｌから４０Ｌ、５Ｌから４５Ｌ、１０Ｌから１５Ｌ、１０Ｌから２０Ｌ、１０Ｌから２５Ｌ、２０Ｌから３０Ｌ、１０Ｌから３５Ｌ、１０Ｌから４０Ｌ、１０Ｌから４５Ｌ、１０Ｌから５０Ｌ、１５Ｌから２０Ｌ、１５Ｌから２５Ｌ、１５Ｌから３０Ｌ、１５Ｌから３５Ｌ、１５Ｌから４０Ｌ、１５Ｌから４５Ｌ、または１５から５０Ｌの体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。いくつかの態様において、改変細胞は、１００Ｌから３０００００Ｌ、１００Ｌから２０００００Ｌ、または１００Ｌから１０００００Ｌの体積の液体培養培地中で増殖させられ得る。
【０１５９】
典型的には、改変細胞を培養することには、細胞を溶解することが後続する。「溶解する」は、細胞が例えばウイルス的、酵素的、機械的、または浸透圧的機序によって破片化されるプロセスを言う。「細胞ライセート」は、溶解された細胞（例えば、溶解された改変細胞）の内容物を含有する液を言い、例えばオルガネラ、膜脂質、蛋白質、核酸、および反転膜小胞を包含する。本開示の細胞ライセートは、本明細書において提供される改変細胞いずれかの集団を溶解することによって生産され得る。
【０１６０】
「溶解する」と言われる細胞溶解の方法は当分野において公知であり、それらのいずれかが本開示に従って用いられ得る。かかる細胞溶解方法は、限定なしに、ホモジナイゼーションなどの物理的溶解を包含する。
【０１６１】
細胞溶解は綿密にコントロールされた細胞内環境を撹乱し得、無制御な内在性プロテアーゼおよびホスファターゼによる蛋白質分解および修飾をもたらす。それゆえに、いくつかの態様においては、プロテアーゼ阻害剤および／またはホスファターゼ阻害剤が細胞ライセートまたは溶解前の細胞に追加され得、またはそれらの活性は熱不活性化、遺伝子不活性化、またはプロテアーゼ標的化によって除去され得る。
【０１６２】
いくつかの態様において、細胞ライセートは少なくとも１つの栄養素と組み合わせられ得る。例えば、細胞ライセートはＮａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２と組み合わせられ得る。他の栄養素の例は、限定なしに、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、オロト酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム、三塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、三塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸アンモニウム、二塩基性リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、および水酸化アンモニウムを包含する。
【０１６３】
いくつかの態様において、細胞ライセートは少なくとも１つの補因子と組み合わせられ得る。例えば、細胞ライセートは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、または酵素の活性のために要求される他の非蛋白質化学化合物（例えば、無機イオンおよび補酵素）と組み合わせられ得る。
【０１６４】
いくつかの態様において、細胞ライセートはＲＮＡ解重合をもたらす条件下においてインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞ライセートはｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの生産をもたらす条件下においてインキュベートされる。
【０１６５】
単一の反応に用いられる細胞ライセートの体積は変わり得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの体積は０．００１から２５０ｍ３である。例えば、細胞ライセートの体積は０．００１ｍ３、０．０１ｍ３、０．１ｍ３、１ｍ３、５ｍ３、１０ｍ３、１５ｍ３、２０ｍ３、２５ｍ３、３０ｍ３、３５ｍ３、４０ｍ３、４５ｍ３、５０ｍ３、５５ｍ３、６０ｍ３、６５ｍ３、７０ｍ３、７５ｍ３、８０ｍ３、８５ｍ３、９０ｍ３、９５ｍ３、１００ｍ３、１０５ｍ３、１１０ｍ３、１１５ｍ３、１２０ｍ３、１２５ｍ３、１３０ｍ３、１３５ｍ３、１４０ｍ３、１４５ｍ３、１５０ｍ３、１５５ｍ３、１６０ｍ３、１６５ｍ３、１７０ｍ３、１７５ｍ３、１８０ｍ３、１８５ｍ３、１９０ｍ３、１９５ｍ３、２００ｍ３、２０５ｍ３、２１０ｍ３、２１５ｍ３、２２０ｍ３、２２５ｍ３、２３０ｍ３、２３５ｍ３、２４０ｍ３、２４５ｍ３、または２５０ｍ３であり得る。いくつかの態様において、細胞ライセートの体積は２５ｍ３から２５０ｍ３、５０ｍ３から２５０ｍ３、または１００ｍ３から２５０ｍ３である。
下流処理
【０１６６】
本明細書において提供される方法およびシステムは、いくつかの態様において、ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ）産物を１〜５０ｇ／Ｌ（例えば、３０、３５、４０、４５、または５０ｇ／Ｌ）の濃度で生む。下流処理は９９重量％（例えば、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％）ｄｓＲＮＡほどまで純度を増大させる。下流処理の例が図４に示されており、蛋白質沈殿剤（例えば酢酸アンモニウム）の追加によって出発し、蛋白質、脂質、および何らかのＤＮＡを製品流から除去するためのディスク型遠心（ＤＳＣ）が後続する。それから、塩および体積を除去するために限外濾過が実行される。製品流への塩化リチウムの追加はＲＮＡ産物の沈殿に至り、これはその後ディスク型遠心を用いてバルク液体から分離され、例えば〜８０％純度のＲＮＡ製品流を生む。さらなるクロマトグラフィーポリッシングは〜９９％純粋な産物を生む。
追加の態様
【０１６７】
本開示の追加の態様は次の番号つきのパラグラフ１〜４６に包含される：
１．  リボ核酸（ＲＮＡ）を生合成する無細胞的方法であって、方法が：
（ａ）ＲＮＡ、ＲＮＡを解重合する酵素、耐熱性キナーゼ、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含む培養改変細胞を溶解し、それによって細胞ライセートを生産することと；
（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセートを、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによってヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセートを生産することと；
（ｃ）ステップ（ｂ）において生産された細胞ライセートを、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することなしに内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化する温度に加熱し、それによって、熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセートを生産することと；
（ｄ）（ｃ）において生産された細胞ライセートを、エネルギー供給源と関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する改変ＤＮＡ鋳型との存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートし、それによって関心のＲＮＡを含む細胞ライセートを生産することと、
を含む。
２．  パラグラフ１の方法であって、エネルギー供給源がポリリン酸、ポリリン酸キナーゼ、またはポリリン酸およびポリリン酸キナーゼ両方である。
３．  パラグラフ１または２の方法であって、培養改変細胞が改変ＤＮＡ鋳型を含む。
４．  パラグラフ１または２の方法であって、改変ＤＮＡ鋳型がステップ（ｄ）の細胞ライセートに追加される。
５．  パラグラフ１〜４のいずれか１つの方法であって、ＡＴＰ再生系がステップ（ｄ）の細胞ライセートに追加される。
６．  パラグラフ１の方法であって、培養改変細胞がさらに耐熱性ポリリン酸キナーゼを含む。
７．  パラグラフ１〜６のいずれか１つの方法であって、ステップ（ａ）の改変細胞のＲＮＡが内在性ＲＮＡである。
８．  パラグラフ１〜７のいずれか１つの方法であって、ＲＮＡがリボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、またはその組み合わせを含む。
９．  パラグラフ１〜８のいずれか１つの方法であって、培養改変細胞がＲＮＡを解重合する少なくとも２つの酵素を含む。
１０．  パラグラフ１〜９のいずれか１つの方法であって、ＲＮＡを解重合する酵素が：Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、ＲＮａｓｅ  ＩＩ、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ｒ、ＲＮａｓｅ  ＪＩ、ＮｕｃＡ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ  Ｔ、ＲＮａｓｅ  Ｅ、ＲＮａｓｅＧ、およびその組み合わせからなる群から選択される。
１１．  パラグラフ１０の方法であって、ＲＮＡを解重合する酵素がヌクレアーゼＰ１である。
１２．  パラグラフ１〜１１のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｂ）の細胞ライセートがＭｇ２＋キレート剤を含む。
１３．  パラグラフ１２の方法であって、Ｍｇ２＋キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
１４．  パラグラフ１３の方法であって、ＥＤＴＡの濃度が０．１ｍＭから２５ｍＭである。
１５．  パラグラフ１４の方法であって、ＥＤＴＡの濃度が８ｍＭである。
１６．  パラグラフ１〜１５のいずれか１つの方法であって、耐熱性キナーゼが耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼを含む。
１７．  パラグラフ１６の方法であって、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼが、耐熱性ウリジル酸キナーゼ、耐熱性シチジル酸キナーゼ、耐熱性グアニル酸キナーゼ、および耐熱性アデニル酸キナーゼからなる群から選択される。
１８．  パラグラフ１７の方法であって、安定なヌクレオシド一リン酸キナーゼが、ｐｙｒＨ遺伝子によってコードされる耐熱性Pyrococcus furiosusウリジル酸キナーゼ（ＰｆＰｙｒＨ）、ａｄｋ遺伝子によってコードされる耐熱性Thermus thermophilusアデニル酸キナーゼ（ＴｔｈＡｄｋ）、ｃｍｋ遺伝子によってコードされる耐熱性Thermus thermophilusシチジル酸キナーゼ（ＴｔｈＣｍｋ）、およびｇｍｋ遺伝子によってコードされる耐熱性Pyrococcus furiosusグアニル酸キナーゼ（ＰｆＧｍｋ）からなる群から選択される。
１９．  パラグラフ１〜１８のいずれか１つの方法であって、耐熱性キナーゼが耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼを含む。
２０．  パラグラフ１９の方法であって、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼが、耐熱性ヌクレオシドリン酸キナーゼ、耐熱性ピルビン酸キナーゼ、および耐熱性ポリリン酸キナーゼからなる群から選択される。
２１．  パラグラフ２０の方法であって、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼの少なくとも１つがｎｄｋ遺伝子によってコードされる耐熱性Aquifex aeolicus酵素である。
２２．  パラグラフ１〜２１のいずれか１つの方法であって、細胞が耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼおよび耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼを含む。
２３．  パラグラフ１〜２２のいずれか１つの方法であって、培養改変細胞が耐熱性ウリジル酸キナーゼ、耐熱性シチジル酸キナーゼ、耐熱性グアニル酸キナーゼ、耐熱性アデニル酸キナーゼ、および耐熱性ポリリン酸キナーゼを含む。
２４．  パラグラフ１〜２３のいずれか１つの方法であって、耐熱性ＲＮＡポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
２５．  パラグラフ２４の方法であって、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、および耐熱性Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。
２６．  パラグラフ２５の方法であって、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
２７．  パラグラフ１〜２６のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｃ）の温度が少なくとも５０℃である。
２８．  パラグラフ２７の方法であって、ステップ（ｃ）の温度が５０℃〜８０℃である。
２９．  パラグラフ１〜２８のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｃ）が、細胞ライセートを少なくとも１５分間加熱することを含む。
３０．  パラグラフ１〜２９のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｃ）が、細胞ライセートを少なくとも６５℃の温度で１５分間加熱することを含む。
３１．  パラグラフ１〜３０のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｄ）のヌクレオシド三リン酸が１５〜３０ｍＭ／時間の速度で生産される。
３２．  パラグラフ１〜３１のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｄ）において生産される関心のＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである。
３３．  パラグラフ１〜３２のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｄ）において生産される関心のＲＮＡがＲＮＡ干渉分子である。
３４．  パラグラフ１〜３３のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｄ）において生産される関心のＲＮＡが、ヒンジドメインによって連結された相補的なドメイン同士を含有するｍＲＮＡである。
３５．  パラグラフ１〜３４のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｄ）において生産される関心のＲＮＡが、少なくとも４ｇ／Ｌ、少なくとも６ｇ／Ｌ、少なくとも６ｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｇ／Ｌの濃度で生産される。
３６．  パラグラフ３５の方法であって、さらに、二本鎖ＲＮＡを精製することを含む。
３７．  パラグラフ３６の方法であって、精製ステップが、ステップ（ｄ）の細胞ライセートを蛋白質沈殿剤と組み合わせることと、沈殿した蛋白質、脂質、およびＤＮＡを除去することとを含む。
３８．  パラグラフ１〜３７のいずれか１つの方法によって生産される細胞ライセート。
３９．  ＲＮＡ、ＲＮＡを解重合する酵素、耐熱性キナーゼ、および耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含む、改変細胞。
４０．  パラグラフ３９の改変細胞であって、さらに、関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する改変ＤＮＡ鋳型を含む。
４１．  パラグラフ３９または４０の改変細胞の集団。
４２．  方法であって：細胞培養培地中においてパラグラフ３９の改変細胞を維持することを含む。
４３．  パラグラフ４２の方法であって、さらに、培養改変細胞を溶解して細胞ライセートを生産することを含む。
４４．  パラグラフ４３の方法であって、さらに、ＲＮＡの解重合をもたらす条件下において細胞ライセートをインキュベートして、ヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセートを生産することを含む。
４５．  パラグラフ４４の方法であって、さらに、細胞ライセートを、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することなしに内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化する温度に加熱して、熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセートを生産することを含む。
４６．  パラグラフ４５の方法であって、さらに、熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセートを、エネルギー供給源と関心のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する改変ＤＮＡ鋳型との存在下において、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下においてインキュベートして、関心のＲＮＡを含む細胞ライセートを生産することを含む。
【実施例】
【０１６８】
例１
ヌクレアーゼの絞り込み
ライセートＲＮＡを消化するための最適なヌクレアーゼ（単数または複数）を同定するために、一連のスクリーニング実験を、５’−ＮＭＰまたはオリゴヌクレオチドを生成するそれらの能力に基づいて選ばれた市販の酵素を用いて実施した。第１に、それらの酵素の活性を精製E. coli  ＲＮＡと製造者が推奨する反応条件とを用いて決定した。ここでは、ＲＮＡ解重合を酸可溶性のヌクレオチドの遊離によってモニターした。これらの条件下においては、４つのヌクレアーゼはバックグラウンドを上回る解重合活性を実証した。正のコントロールとしての用をなすエンドヌクレアーゼのベンゾナーゼおよびＲＮａｓｅ  Ａは、ＲＮＡから酸可溶性のヌクレオチドへの迅速な変換を生んだ（図５Ａ）。エキソヌクレアーゼＰ１およびＲＮａｓｅ  ＲによるＲＮＡの処置はＲＮＡから酸可溶性のヌクレオチドへの時間依存的な変換を生み、ＲＮａｓｅ  Ｒは２時間で１００％近くの解重合に達した。残りのヌクレアーゼ（ターミネーターエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ、およびＲＮａｓｅ  Ｔ）はこのアッセイでは検出可能な解重合を生じさせなかった。ＬＣ−ＭＳによるその後の分析は、ベンゾナーゼまたはＲＮａｓｅ  ＡではなくＲＮａｓｅ  ＲおよびヌクレアーゼＰ１によって処置されたサンプルにおいて、ＮＭＰ遊離を明らかにした（図５Ｂ）。これらの結果は、ＲＮａｓｅ  ＲおよびヌクレアーゼＰ１がライセートＲＮＡを５’−ＮＭＰへと解重合することにとって好適であろうということを示唆している。そのＤＮＡｓｅ活性の欠如、そのｄｓＲＮＡおよび有構造ＲＮＡを分解する能力、ならびにそのプロセッシブな３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性を含むいくつかの理由から、ＲＮａｓｅ  Ｒをさらなる研究のために選んだ。
ライセート中におけるＲＮＡ解重合
【０１６９】
それから、ＲＮａｓｅ  Ｒを、細菌ライセート中の内在性ＲＮＡを解重合するその能力について試験した。これらの実験においては、精製ＲＮａｓｅ  Ｒ（０．５ｍｇ／ｍＬ終濃度）をライセート（５０％終濃度）に追加し、遊離のヌクレオチドをＵＰＬＣによって定量した。代表的な実験が図６に示されている。精製ＲＮａｓｅ  Ｒをライセートに追加することは、ライセートＲＮＡからの５’−ＮＭＰの急速な遊離をもたらし、最大のＮＭＰ遊離は５〜１０分後であった。急速な解重合のこの初期期間後に、ＮＭＰ濃度は安定化し、それからゆっくり低下しはじめた。大分より低い速度でではあるが、内在性ＲＮａｓｅ活性もまた５’−ＮＭＰ遊離をもたらした。重要なことに、その公知の作用機序と整合して、ＲＮａｓｅ  Ｒ追加はＲＮＡからの２’または３’ＮＭＰ遊離の速度を増大させなかった。複数の独立の実験において、ライセートへのＲＮａｓｅ  Ｒの追加は、２００ｍＭ／ｈｒを超過する速度で５〜１０分でライセートＲＮＡの６８％から５’−ＮＭＰへの変換をもたらした。
【０１７０】
ＲＮａｓｅ  Ｒ発現の毒性を算定するために、２つの細菌株を構築した。１つの株は空の蛋白質発現ベクターによって形質転換された元株（ＧＬ１６−１７０）を包含し、別のものはＲＮａｓｅ  Ｒをコードする同じ蛋白質発現ベクターによって形質転換されたＧＬ１６−１７０を包含した。両方の株をバッチ条件下において１Ｌバイオリアクター内で増殖させ、ＯＤ６００＝２０で誘導し、グルコース消耗前に収穫した。誘導は、増殖速度の検出可能な変化なしに（図７Ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｒの強い発現を生んだ（図７Ａ）。溶解および５０％希釈によって、ＲＮａｓｅ  Ｒを発現する株はＲＮＡから酸可溶性のヌクレオチドへの急速な解重合を発揮し（図７Ｃ）、過剰発現されたＲＮａｓｅ  Ｒが機能的であるということを示した。特に、精製酵素を反応に追加することによって供給された追加のＲＮａｓｅ  Ｒ活性は、解重合の速度または酸可溶性のヌクレオチドの収量を増大させず、過剰発現されたＲＮａｓｅ  Ｒが溶解および希釈によって充分に活性であるということを示唆した。
【０１７１】
次に、過剰発現されたＲＮａｓｅ  Ｒの活性を高密度ライセート中で算定した。リボソーム構造を安定化しｒＲＮＡをヌクレアーゼから保護することが公知であるＭｇ２＋は、ＲＮａｓｅ  Ｒ活性のためにもまた（低い量で）要求される。よって、解重合速度を様々な濃度のＥＤＴＡの存在下において測定した（図８）。空ベクター株からのライセートは比較的ゆっくりした解重合速度を発揮し、それらはＥＤＴＡに不感であり、一方、過剰発現されたＲＮａｓｅ  Ｒを有するライセートは増大していくＥＤＴＡ濃度によって解重合のより高い速度を発揮し、８ｍＭ  ＥＤＴＡにおいて最大の速度であった。おそらくはＭｇ２＋依存性ＲＮａｓｅ  Ｒの不活性化が原因で、８ｍＭよりも上では解重合速度は減少した。一緒にすると、これらの結果は、過剰発現されたＲＮａｓｅ  Ｒが非毒性であり、溶解によって活性化され得るということを示唆している。
ライセート中におけるＮＭＰ安定性
【０１７２】
ＲＮＡ解重合の後に、もたらされたＮＭＰプールはｄｓＲＮＡへの重合前にＮＴＰへと漸次リン酸化される。有害な酵素活性、例えばヌクレオシドへのＮＭＰ分解と糖および塩基へのその後の加水分解とは、ｄｓＲＮＡ収量に負に影響する。よって、個々のＮＭＰの安定性をライセート中で算定した。安定性算定は、同位体標識した「重い」ＮＭＰ（ｈＡＭＰ、ｈＣＭＰ、ｈＵＭＰ、およびｈＧＭＰ）をライセートに追加することと、ＬＣ−ＭＳを用いて経時的に存在量を定量することとによって実施した（図９Ａ〜９Ｄ、実線）。比較的安定であるｈＡＭＰとは対照的に、ｈＣＭＰ、ｈＵＭＰ、およびｈＧＭＰはライセートによって盛んに分解され、それぞれ１時間、３０分、および２０分というおよその半減期（ｔ１／２）を有する。
【０１７３】
ＮＭＰの代謝の１つの経路はヌクレオシドへの脱リン酸化である。脱リン酸化がＮＭＰ分解に寄与しているかどうかを算定するために、安価なホスファターゼ阻害剤の追加によって安定性算定を繰り返した。リン酸（ＰＯ４、１５０ｍＭ）および構造的模倣物オルトバナジン酸（ＶＯ４、１０ｍＭ）の増大した濃度をｈＮＭＰ追加前のライセートとプレインキュベートした。リン酸濃度を増大させることはｈＵＭＰを安定化し（ｔ１／２≒６０分）、一方、ｈＣＭＰおよびｈＧＭＰには最小に影響した（図９Ａ〜９Ｄ、点線）。対照的に、オルトバナジン酸はｈＣＭＰ（ｔ１／２＞＞６０分）、ｈＵＭＰ（ｔ１／２≒６０分）、およびｈＧＭＰ（ｔ１／２≒４５分）を安定化した（図９Ａ〜９Ｄ、点線）。一緒にすると、これらの安定性算定はライセート中における１３ｍＭ／ｈｒという総体的なＮＭＰ分解速度を定め、外来的に追加されたＮＭＰの７０％が１５分後に存在する。ホスファターゼ阻害剤の非存在下においてであっても、ＲＮａｓｅ  Ｒ依存的な解重合の速度（＞２００ｍＭ／ｈｒ）と比較してｈＮＭＰ消費の比較的低い速度（１３ｍＭ／ｈｒ）は、ＲＮＡから遊離したＮＭＰがｄｓＲＮＡへの重合に利用可能であるはずであるということを示唆した。
熱不活性化の開発
【０１７４】
ＮＭＰ、ならびにＮＤＰ、ＮＴＰ、およびｄｓＲＮＡを安定化するために、熱不活性化プロトコールを開発した。目的は、ライセート中のヌクレオチドおよびＲＮＡ分解活性を消去するであろう最も低い温度および最も短いインキュベーション時間を同定することであった。熱不活性化の効力を算定するために、（３７℃での）ＮＴＰ消費速度を熱不活性化されたライセートの間でＬＣ−ＭＳによって比較し、熱不活性化の時間および温度を変えた。熱不活性化前には、ライセートはＮＴＰをおよそ１２０ｍＭ／ｈｒで消費した（図１０）。７０℃よりも下の温度はＮＴＰａｓｅ活性に影響せず、一方、７０℃でのインキュベーションはＮＴＰａｓｅ活性の時間依存的な減少を生じさせた。ＮＴＰａｓｅ活性の完全な阻害は７０℃での１５分インキュベーション後に生じた（図１０）。
【０１７５】
次に、これらの条件を、ライセート中のＮＭＰおよびｄｓＲＮＡを安定化するそれらの能力について評価した。ＮＭＰ分解に及ぼす熱不活性化の効果を評価するために、ライセートを外来性ＲＮａｓｅ  Ｒによって処置してＲＮＡを遊離させ、それから７０℃での熱不活性化に付した。不活性化後に、温度を３７℃に下げ、反応を追加の６０分間インキュベートした。図１１Ａに示されているように、５分間のＲＮａｓｅ  Ｒによる処置はＲＮＡを急速に解重合した。熱不活性化および３７℃でのインキュベーション後に、ＮＭＰ濃度は不変であり、選んだ熱不活性化条件がＮＭＰを安定にしたということを示唆した。
【０１７６】
最後に、これらの条件を、ライセート中のインビトロ転写反応の反応物および産物（ＮＴＰおよびｄｓＲＮＡを包含する）を安定化するそれらの能力について評価した。第１に、ライセートを上昇した温度で１５分間プレインキュベートした。それから温度を３７℃に下げ、転写反応物（外来性のＮＴＰ、ＤＮＡ鋳型、および精製Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを包含する）を追加した。図１１Ｂに示されているように、≧７０℃で熱不活性化されたライセート中における転写反応は、正のコントロール反応（緩衝液中で実施した）に定性的に類似のＲＮＡ産物を生んだ。６０℃で実施した反応ではＲＮＡ産物は明らかではなかった。
【０１７７】
一緒にすると、これらの結果は、１５分間の７０℃インキュベーションが無細胞的反応においてＮＭＰ、ＮＴＰ、およびｄｓＲＮＡを安定化するために十分であるということを示唆している。
耐熱性キナーゼの選択および評価
【０１７８】
熱不活性化後には、ＲＮＡから遊離した５’−ＮＭＰを、ｄｓＲＮＡを形成するために重合され得るＮＴＰへと逐次的にリン酸化するために、一連のキナーゼ活性が要求される。ＡＴＰからの高エネルギーリン酸基を用いてＮＭＰおよびＮＤＰをリン酸化するそれらのキナーゼは、高温インキュベーション後に活性なままであるために十分に耐熱性であり、かつ高い速度でＮＴＰ（１ｇ  ｄｓＲＮＡ／Ｌ／ｈｒで２１ｍＭ／ｈｒ  ＮＴＰ）を生産するために十分に活性でなければならない。E. coliによる上首尾な発現および組換え体酵素の生化学的キャラクタリゼーションの文献報告に基づいて、好熱生物からの酵素を評価のために選んだ（表９）。
【表９】
2019510504.tif 000011
【０１７９】
ｄｓＲＮＡの無細胞的生産にとってのこれらの酵素の好適性を評価するために、酵素をＮ末端ヘキサヒスチジンタグと共にE. coli蛋白質発現ベクターにクローニングし、過剰発現し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて精製した。精製酵素の活性を第１にルシフェラーゼアッセイを用いて定量した。そこでは、ＡＴＰの消費がＮＭＰおよびＮＤＰリン酸化のプロキシとしての用をなした。アッセイをいろいろなインキュベーション温度で実施して、各酵素の最適反応温度を決定した。
【０１８０】
T thermophilusおよびE. coliからのＵＭＰキナーゼ（ｐｙｒＨ遺伝子によってコードされる）の発現は、試験された誘導および精製条件下において不溶性の蛋白質を生んだ。P. furiosusからの精製ＰｙｒＨはおよそ２μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白質の比活性を発揮し、これは概ね温度非依存的であった（図１２）。この比活性に基づいて、ＰｆＰｙｒＨを１％総蛋白質で発現する高密度細胞ライセート（９０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ）は、過剰なＡＴＰの存在下においては、５０ｍＭ／ｈｒを超過する速度でＵＭＰをリン酸化するであろう（表１０）。１ｇ／Ｌ／ｈｒでのｄｓＲＮＡ生産はおよそ５．２５ｍＭ／ｈｒのＵＭＰキナーゼ活性を要求するので、ＰｆＰｙｒＨをさらなる評価のために選んだ。表１０は高密度（９０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ）ライセート中における予測されるＰｙｒＨ速度を示しており、ＰｆＰｙｒＨが総ライセート蛋白質の１％を構成していると想定している。
【表１０】
2019510504.tif 000012
【０１８１】
E. coliおよびT. thermophilusからのＡＭＰキナーゼ（ａｄｋ遺伝子によってコードされる）の発現は可溶性の組換え体蛋白質を生んだが、一方、Thermosynechococcus酵素は試験された発現および精製条件下において不溶性であった。精製E. coli酵素は３７℃および５０℃では活性であったが、より高温では検出可能な活性を発揮しなかった（図１３）。T. thermophilus酵素は、全ての試験された温度でE. coli酵素よりも高い比活性を発揮し、７０℃でｍｇ酵素あたり１ｍＭ／ｍｉｎ近くの最適活性を有した。この活性は、酵素が高密度ライセート中において総蛋白質の０．０１％で発現されているときには、ライセート中におけるＡＭＰリン酸化の２５０ｍＭ／ｈｒを超過する予想される速度に帰着する（表１１）。およそ５．２５ｍＭ／ｈｒのＡＭＰキナーゼ活性が、１ｇ／Ｌ／ｈｒでｄｓＲＮＡを合成するためには要求されるので、ＴｔｈＡｄｋをさらなる研究のために選んだ。表１１は高密度（９０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ）ライセート中における予測されるＡｄｋ反応速度を示しており、ＴｔｈＡｄｋが総ライセート蛋白質の０．０１％を構成していると想定している。
【表１１】
2019510504.tif 000013
【０１８２】
E. coliおよびP. furiosusからのＣＭＰキナーゼ（ｃｍｋ遺伝子によってコードされる）の発現は不溶性の蛋白質を生み、一方、T. thermophilus酵素の発現は試験された条件下においては可溶性蛋白質を生んだ。T. thermophilus  ＣＭＰキナーゼは概ね温度に非依存的な活性を示したが、酵素活性は６０℃よりも上の温度では僅かに減少した（図１４）。これらの結果に基づくと、総蛋白質の０．０２％での高密度ライセート中におけるＴｔｈＣｍｋの発現は、５．２５ｍＭ／ｈｒの目標をかなり超過する３０〜４５ｍＭ／ｈｒというＣＭＰキナーゼ活性を生むであろう（温度に依存する。表１２）。よって、ＴｔｈＣｍｋをさらなる評価のために選んだ。表１２は、高密度（９０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ）ライセート中における予測されるＣｍｋ反応速度を示しており、ＴｔｈＣｍｋが総ライセート蛋白質の０．０２％を構成していると想定している。
【表１２】
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【０１８３】
試験されたＣＭＰキナーゼとは対照的に、E. coli、T. thermophilus、およびT. maritimaからのＧＭＰキナーゼの発現は可溶性の組換え体蛋白質を生んだ。E. coli酵素は試験された最も高い比活性を３７℃で有したが、より高温ではより活性でなかった（図１４）。T. thermophilusおよびT. maritima酵素両方は最適活性をより高温で発揮し、一方、T. maritima酵素は全ての試験された温度でより活性であった。ＴｍＧｍｋの測定された比活性に基づくと、総蛋白質の０．１％での高密度細胞ライセート中における発現は、５．２５ｍＭ／ｈｒという目標速度と比較して、過剰なＡＴＰの存在下において７０℃では６０ｍＭ／ｈｒを超過する予想される速度を生むであろう（表１３）。よって、ＴｍＧｍｋをさらなる評価のために選んだ。表１３は高密度（９０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ）ライセート中における予測されるＧｍｋ反応速度を示しており、ＴｍＧｍｋが総ライセート蛋白質の０．１％を構成していると想定している。
【表１３−１】
2019510504.tif 000015
【表１３−２】
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【０１８４】
概ね単一の基質に特異的であるＮＭＰキナーゼとは違って、ＮＤＰキナーゼはＡＤＰ、ＣＤＰ、ＵＤＰ、およびＧＤＰをリン酸化する。ＮＤＰキナーゼ同士を比較するために、好熱菌T. thermophilusおよびA. aeolicusからの酵素をクローニングし、E. coliによって発現した。T. thermophilus酵素は試験された条件下において不溶性であったが、一方、A. aeolicus酵素の発現は可溶性蛋白質を生んだ。ＡＴＰおよびＧＤＰを基質として用いたルシフェラーゼアッセイでの活性測定は、ＡａＮｄｋが広い範囲の温度に渡って高度に活性であり、５０℃の至適温度を有するということを明らかにした（図１６）。基質間の比較は、各ヌクレオチドについて５０℃では１００μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇを超過する比活性を明らかにし、ＡａＮｄｋが複数のＮＤＰ基質をリン酸化し得るということを確認した（表１４）。これらの測定に基づくと、０．０１％総蛋白質での高密度ライセート中におけるＡａＮｄｋの発現は、６０ｍＭ／ｈｒをかなり超過するＵＤＰキナーゼ速度に帰着する。２１ｍＭ／ｈｒのＮＤＰキナーゼ活性が１ｇ／Ｌ／ｈｒのｄｓＲＮＡ合成をサポートするために要求されるということに鑑みて、ＡａＮｄｋをさらなる評価のために選んだ。表１４は、５０℃ではＡａＮｄｋがＣＤＰ、ＵＤＰ、およびＧＤＰ基質について高度に活性であるということを示している。
【表１４】
2019510504.tif 000017
【０１８５】
ポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）は高エネルギーリン酸基を多量体リン酸鎖とアデノシンヌクレオチドとの間で可逆的に転移させる。E. coliならびに好熱生物T. thermophilusおよびThermosynechococcus elongatusからの酵素を包含する、ポリリン酸キナーゼのＩ型ファミリーに属する複数のＰｐｋ酵素を活性について評価した。これらの酵素は、これらが良くキャラクタリゼーションされたＩ型ファミリーに属するか、または活性であることが先に示されていたので、試験のために選択した。Ｐｐｋ酵素の発現および精製は可溶性蛋白質を生んだ。それから、これを、基質としてＡＤＰおよびヘキサメタリン酸ナトリウムを用いて、ルシフェラーゼアッセイシステムによって活性について試験した。図１７に示されているように、全ての試験されたＰｐｋ酵素の比活性は他のキナーゼ活性に対して相対的に低かった。E. coli  Ｐｐｋはより低温（最高で６０℃）で最も高い比活性を有し、一方、Thermosynechococcus酵素は７０℃で最も高い活性を有した。加えて、熱不活性化条件（７０℃、１５分間）下におけるE. coli酵素のインキュベーションは不可逆的な不活性化をもたらした（示されていない）。Thermosynechococcus酵素の比活性に基づくと、総蛋白質の２％での高密度ライセート中における発現は、７０℃では、１ｇ／Ｌ／ｈｒ  ｄｓＲＮＡ合成をサポートするための要求されるＡＴＰ生産速度にマッチする４２ｍＭ／ｈｒという予想される速度をもたらすであろう（表１５）。しかしながら、より低温（例えば５０℃）での無細胞的ｄｓＲＮＡ合成はＴｅＰｐｋのより高い発現（４％総蛋白質を超過する）を要求するであろう。表１５は高密度（９０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ）ライセート中における予測されるＰｐｋ反応速度を示しており、ＴｅＰｐｋが総ライセート蛋白質の２％を構成していると想定している。
【表１５】
2019510504.tif 000018
【０１８６】
精製されたシステムにおける各酵素活性を評価した後に、酵素を熱不活性化されたライセート中における活性について試験した。個々のキナーゼを発現するライセートを７０℃で１５分間プレインキュベートした後に、基質を追加した。精製された反応のように、ＡＴＰ消費（ＮＭＰおよびＮＤＰキナーゼについて）またはＡＴＰ生産（ポリリン酸キナーゼについて）を、ルシフェラーゼアッセイキットを用いて定量した。下の表１６に示されているように、ＮＭＰおよびＮＤＰリン酸化の速度は目標をかなり超過する。
【表１６】
2019510504.tif 000019
【０１８７】
個々のキナーゼがライセート中において十分に活性である（Ｐｐｋを例外とする）ということを確認した後に、ＮＭＰをＮＴＰに変換するそれらの能力について、キナーゼをマルチ酵素システムによって評価した。これらの研究においては、個々のキナーゼ（５）を発現する同体積のライセートを組み合わせ、熱不活性化し、それから、ＬＣ−ＭＳによってＮＭＰの等モルミックスからのＮＴＰのＡＴＰ依存的生産についてアッセイした。表１７に示されているように、総体的なＮＴＰ生産速度はＵＴＰ、ＣＴＰ、およびＧＴＰについては２４ｍＭ／ｈｒを超過し、ライセートの単純混合物が、反応条件のいずれかの最適化なしに、充分なＡＴＰの存在下において１ｇ／Ｌ／ｈｒ  ｄｓＲＮＡの合成をサポートするために十分な速度でＮＴＰを提供し得るということを示唆した。
【表１７】
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ＲＮＡポリメラーゼの絞り込み
【０１８８】
ＲＮＡからＮＭＰへの解重合とＮＭＰからそれらの対応するＮＴＰへのリン酸化との後には、ＮＴＰをｄｓＲＮＡ産物に変換するためにＲＮＡポリメラーゼが要求される。バクテリオファージＴ７からのＲＮＡポリメラーゼは、いくつかの理由から組換え体システムへの使用にとって魅力的な酵素である。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは（細菌および真核生物からの多くのＲＮＡポリメラーゼとは違って）単一のサブユニットを包含し、生化学的および分子生物学研究によって鋭意にキャラクタリゼーションされてきた。加えて、改善された耐熱性を付与する複数のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異が記載されている（表１８参照）。
【表１８】
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【０１８９】
第１に、市販のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの活性を二重鎖ＤＮＡ鋳型（例えば図３Ｂ）および３７℃の反応温度を用いて評価した。ＲＮＡの生産をＱｕａｎｔ−ｉＴ  ＲＮＡキット（ブロードレンジ）（Thermo Fisher Scientific）を用いて経時的に定量した。各製造者が推奨する条件下において、ＴｈｅｒｍｏＴ７およびＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ酵素は高度に活性であり、一方、ＮＥＢ酵素は有意により低い活性を見せた（図１８）。
【０１９０】
次に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのＬＶＩ変異をＮ末端ヘキサヒスチジンタグと共にクローニングし、E. coliで発現し、ＩＭＡＣを用いて精製した。
【０１９１】
次に、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔおよびＴｈｅｒｍｏＴ７ポリメラーゼの活性を、ＬＶＩ変異ポリメラーゼと並べて、希釈された熱不活性化されたライセート（３５％ライセート終濃度）中において、標準化された反応条件下において試験した（図１９）。精製されたシステムのように、ＴｈｅｒｍｏＴ７は３７℃ではＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ酵素よりも高い比活性を示した（３．１ｎｍｏｌ  ＲＮＡ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白質）。ＬＶＩ変異は試験された３つの酵素のうち最も低い比活性（０．３３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）を有した。さもなければ同一の条件下において５０℃で試験したときには、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ酵素もＬＶＩ変異もいずれかの検出可能な活性を発揮しなかった。対照的に、ＴｈｅｒｍｏＴ７の活性は３７℃でより高かった。アッセイの総蛋白質のおよそ４％をＴｈｅｒｍｏＴ７ポリメラーゼとして、ＲＮＡ合成速度は二重鎖ＤＮＡ鋳型およびＴｈｅｒｍｏＴ７ポリメラーゼでは５０℃で１１ｇ／Ｌ／ｈｒを超過した（図１９）。そこで、ＴｈｅｒｍｏＴ７をさらなるキャラクタリゼーションのために選択した。
【０１９２】
希釈された熱不活性化されたライセート中における５０℃でのＴｈｅｒｍｏＴ７の活性を確認した後に、ＴｈｅｒｍｏＴ７の活性を大規模な無細胞的ｄｓＲＮＡ生産の代表的な条件下において検討した。ライセートの増大した濃度に加えて、大規模な反応は、熱不活性化プロセスに起因する沈殿したライセートコンポーネント（例えば蛋白質）を包含し得る。これらの条件下におけるＴｈｅｒｍｏＴ７の性能を算定するために、ＲＮＡ重合を、熱不活性化後の沈殿した蛋白質を除去するための清澄化ありまたはなしで、熱不活性化された高密度ライセート（６８％ライセート終濃度）中で定量した（図２０）。ＲＮＡ合成速度は緩衝液中よりもマトリックス中において有意に高く、最も高い速度は遠心によって清澄化された熱不活性化されたマトリックスにおいて生じた。清澄化されていない反応では、総体的なＲＮＡ合成速度（２時間反応による）は、アッセイの総蛋白質の１．４％をＴｈｅｒｍｏＴ７ポリメラーゼとして２ｇ／Ｌ／ｈｒを超過した。
【０１９３】
最後に、ＴｈｅｒｍｏＴ７の耐熱性をより高温で試験して、このプログラムにおいて以前に確立された熱不活性化条件との適合性を評価した。これらの研究では、ＴｈｅｒｍｏＴ７酵素を上昇した温度（５０〜７０℃）で様々な長さの時間（０〜１５分）プレインキュベートし、残っている活性を３７℃で定量した。図２１に示されているように、５０℃でのインキュベーションは酵素によって良く耐容性を示すが、より高温はポリメラーゼ活性の急速な不可逆的不活性化をもたらす。よって、これらの実験では、この特定のＴｈｅｒｍｏ  Ｔ７は５０〜７０℃での熱不活性化とは適合性ではなかった。それゆえに、いくつかの場合には、精製ＴｈｅｒｍｏＴ７酵素が熱不活性化後の無細胞的反応に追加され得、または例えば７０℃で十分な半減期を有する替わりのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異体が用いられ得る。
材料および方法
ヌクレオチド分析
【０１９４】
ヌクレオチド一リン酸（ＡＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、およびＧＭＰ）の分析を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって実施した。サンプルは、ＺＩＣ−ｃＨＩＬＩＣカラム（２．１×２０ｍｍ，３μｍ  ｉ．ｄ．）（Ｍｅｒｃｋ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣを用いて、室温で、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流量および２μＬ注入体積によって分離した。移動相は２０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ａ）と９０％アセトニトリル中の２０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｂ）とからなった。分離方法は３．５分間の１５〜５０％（Ｂ）の勾配からなり、１．５分間の５０％（Ｂ）、それから３分間の１５％Ｂが後続した。定量は、ＡＢＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ３２００質量分析計によって、エレクトロスプレーイオン化（キャピラリー電圧：−３０００Ｖ、温度：６００℃、脱溶媒ガス：２０ｐｓｉ）を用いて複数反応モニター（ＭＲＭ）モードで実施した。ヌクレオチド一リン酸、二リン酸、および三リン酸種（ＮＭＰ、ＮＤＰ、およびＮＴＰ）の分析は、上に記載されている方法を次の分離勾配で用いた：３．５分間の１５％Ｂから５０％Ｂに、続いて２．５ｍｉｎの５０％Ｂ、それから４分間の１５％Ｂが後続する。ピーク面積を、精製化合物（Sigma-Aldrich）からなる標準曲線と比較した。ライセート中のサンプルの分析では、標準曲線を、下に記載されているサンプル調製ステップのように酸クエンチ、清澄化、ｐＨ中和、および濾過したライセートバックグラウンドで作成した。
【０１９５】
２’、３’、および５’−ＮＭＰの分析は、ACQUITY CSHフルオロフェニルカラム（２．１×１５０ｍｍ，１．７μｍ  ｉ．ｄ．）（Ｗａｔｅｒｓ）を備えたACQUITY HクラスＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いる液体クロマトグラフィーによって、４０℃で、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流量および０．５μＬ注入体積によって実施した。移動相は、０．２％ギ酸中の１０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ａ）および９５％アセトニトリル，０．２％ギ酸中の１０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｂ）からなった。分離方法は２．８分間の１％Ｂからなり、２．２分間のｌ％〜３０％Ｂの勾配が後続し、７分間の１００％Ｂ、それから３分間の１％Ｂが後続した。定量を、ACQUITY UPLC PDA（Waters）を用いて２６０、２５４、および２１０ｎｍで実施した。ピーク面積を、精製化合物（Biolog Life Science Instituteから購入した２’および３’ＣＭＰ、ＵＭＰ、およびＧＭＰを例外として、Sigma-Aldrichから購入）からなる標準曲線と比較した。ライセート中のサンプルの分析では、標準曲線を、下に記載されているサンプル調製ステップのように酸クエンチ、清澄化、ｐＨ中和、および濾過したライセートバックグラウンドで作成した。
E. coli  ＲＮＡの抽出および精製
【０１９６】
ＲＮＡを確立されたプロトコールに従って高密度E. coliライセート（蛋白質濃度：４０〜５０ｍｇ／ｍＬ）から抽出および精製した（Mohanty, B. K., Giladi, H., Maples, V. F., & Kushner, S. R. (2008). Analysis of RNA decay, processing, and polyadenylation in Escherichia coli and other prokaryotes. Methods in enzymology, 447, 3-29）。凍結E. coliライセートの４００μＬ毎に、６７μＬの２０ｍＭ酢酸を追加してＲＮａｓｅ活性を低減した。サンプルをビーズバス中において３７℃で融解した。融解直後に、トリメチル（テトラデシル）アンモニウムブロミド（Sigma-Aldrich）の１０％（ｗ／ｖ）溶液の４００μＬを追加した。それから、もたらされた懸濁液を４℃におけるマイクロ遠心機による１０，０００×ｇでの遠心によって清澄化し、上清を除去した。ペレットを３５％エタノール中の塩化リチウム（Sigma-Aldrich）の２Ｍ溶液の１ｍＬ中に再懸濁した。懸濁液を室温で５分間インキュベートし、それから４℃における６分間の１５，０００×ｇでの遠心によって清澄化し、上清を除去した。それから、ペレットを水中の塩化リチウムの２Ｍ溶液の１ｍＬ中に再懸濁し、６分間の１５，０００×ｇでの清澄化前に室温で２分間インキュベートした。それから上清を除去し、残っているペレットを、７０％エタノール中への再懸濁と４℃における５分間の最大スピード（２１，０００×ｇ）での遠心とによって洗浄した。それから上清を除去し、ペレットを室温で１５分間風乾した。それから、ペレットを２００μＬヌクレアーゼ不含水中に再懸濁し、４℃で一晩インキュベートしてＲＮＡを可溶化した。ＲＮＡ溶液を遠心（４℃での５分間の最大スピード）によって清澄化し、可溶性ＲＮＡを含有する上清を無菌のＲＮａｓｅ不含チューブに移し、−２０℃で保存した。
ヌクレアーゼの絞り込み
【０１９７】
ヌクレアーゼは次の商業的供給源から得た：ベンゾナーゼおよびヌクレアーゼＰ１はSigma-Aldrichから得、ＲＮａｓｅ  Ｒ、ターミネーターエキソヌクレアーゼ、およびＲＮａｓｅ  ＩＩＩはEpicentreから得、ＲＮａｓｅ  ＡはThermo Fisherから得、エキソヌクレアーゼＴはNew England BioLabsから得た。スクリーニングアッセイのためには、各酵素溶液の１μＬを２×アッセイ緩衝液（１００ｍＭ  リン酸カリウムｐＨ７．４、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化亜鉛）の１００μＬに追加し、それから時間ｔ＝０において等体積の１ｍＭ  ＲＮＡ溶液（〜３４０ｎｇ／μＬ）と組み合わせ、良く混合した。反応を３７℃でインキュベートし、２０μＬを氷上の酸クエンチ溶液（１８０μＬの０．２Ｍ硫酸）に移すことによって定期的にサンプリングした。時系列の完了後に、クエンチされたサンプルを４℃における５分間の３，０００×ｇでの遠心によって清澄化した。それから、各サンプルからの上清の１７０μＬをＵＶ透明９６ウェルハーフエリアプレート（Corning）に移し、酸可溶性のヌクレオチドを、マイクロプレートリーダーと各モノヌクレオチドの個々の減衰係数を平均することによって概算された１０６６５Ｍ−１ｃｍ−１の減衰係数とを用いて、２６０ｎｍの吸光度によって定量した。ＬＣ−ＭＳによるその後の分析のために、４５μＬの清澄化された上清を５μＬの２．５Ｍ水酸化カリウムによってｐＨ中和した。トータルヌクレオチドプール（すなわち１００％解重合）をＲＮＡのアルカリ加水分解によって決定した：ＲＮＡを等体積の０．２Ｍ水酸化カリウムと組み合わせ、それから９９℃に２０分間加熱した。それから、アルカリ加水分解されたサンプルをクエンチし、上に記載されているように分析した。
蛋白質発現および精製
【０１９８】
組換え体蛋白質を、ヘキサヒスチジンタグと併せて当該遺伝子をコードする合成ＤＮＡからｐＥＴＤｕｅｔ−１（Novagen）にクローニングした。プラスミドをE. coli  Ｔ７Ｅｘｐｒｅｓｓ（New England Biolabs）に形質転換し、それから、１Ｌ培養によって、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを添加したＺＹＭ−５０５培地（Studier, F. W. (2005). Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein expression and purification, 41(1), 207-234）を用いて増殖させた。発現をＡ６００＝０．６において誘導した。ＲＮａｓｅ  Ｒおよびキナーゼについては、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧによって発現を誘導し、温度を１６℃に下げ、培養物は１６℃で２４時間増殖させた。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼについては、０．８ｍＭ  ＩＰＴＧによって発現を誘導し、培養物は３７℃で３時間増殖させた。バイオマスを遠心によって収穫し、上清を傾瀉した後に、細胞ペレットを−８０℃で保存した。細胞ペレットを融解し、ベンゾナーゼ（０．０４μＬ／ｍＬ）を添加した４体積のＢ−ＰＥＲ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Thermo Fisher Scientific）中への再懸濁と、穏やかな振盪をしながらの室温における１５分間のインキュベーションとによって溶解した。それから、ライセートを４℃における１時間の１６，０００×ｇでの遠心によって清澄化した。ＡＫＴＡPrime Plus FPLCシステム（GE Healthcare）に接続されたＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（GE Healthcare）またはＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラムを用いる固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、蛋白質を精製した。両方の精製方法について、カラムを平衡化／洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）によって平衡化し、ライセートをローディングし、それから３０カラム体積の平衡化／洗浄緩衝液によって洗浄した。溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）によって蛋白質を溶出した。キナーゼの精製のためには、平衡化／洗浄および溶出緩衝液はリン酸緩衝液の代わりに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５を用いた。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、蛋白質含量をＢＣＡ（Thermo Fisher Scientific）によって定量した。それから、画分を組み合わせ、緩衝液を１０００体積の２×保存緩衝液による透析によって交換した。ＲＮａｓｅ  Ｒについては、２×保存緩衝液は追加の５００ｍＭ  ＮａＣｌを添加した２×ＰＢＳからなった。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼについては、２×保存緩衝液は２×ＰＢＳからなった。キナーゼについては、２×保存緩衝液は１００ｍＭ  ＮａＣｌを有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０からなった。透析後に、蛋白質を等体積の１００％グリセロールと混合し（５０％終濃度）、−２０℃で保存した。
細胞ライセート調製
【０１９９】
E. coli株ＧＬ１６−１７０（ＢＬ２１（ＤＥ３）．ｔ５２６ｐｇｉ．Δｅｄｄ．ΔｔｋｔＢ．ΔｔｏｌＣ＿ｗｔ−７−Ｅ１．ΔｍｇｓＡ＊−Ｆ３．ΔａｐｐＡ＊．Δａｍｎ＊−Ｆ１．ｎａｇＤ（ｋｅｉｏ）：：ｚｅｏＲ−１．ΔｐｈｏＡ＊．ｔ３５２ＢＡＡ１６４４．ΔｕｓｈＡ＊−Ｃ４．ｒｎａ：：ｔｏｌＣ−Ｂ０４）およびＧＬ１４−３２２（ＢＬ２１（ＤＥ３）．ｔ５２６ｐｇｉ．Δｅｄｄ．ΔｔｋｔＢ．ΔｔｏｌＣ＿ｗｔ−７−Ｅ１．ΔｍｇｓＡ＊−Ｆ３．ΔａｐｐＡ＊．Δａｍｎ＊−Ｆ１．ｎａｇＤ（ｋｅｉｏ）：：ｚｅｏＲ−１．ΔｐｈｏＡ＊．ｔ３５２ＢＡＡ１６４４．ΔｕｓｈＡ：：ｔｏｌＣ−Ａ０１）を、Ｋｏｒｚ培地によって１０Ｌバイオリアクター内でバッチ段階の終わりまで増殖させ、それから遠心によって収穫し、−８０℃で凍結した。ペレットを１０％乾燥細胞重量になるよう５８．８ｍＭ二塩基性リン酸カリウム中に再懸濁し、１５，０００ｐｓｉで４℃に冷却されたPandaPLUSホモジナイザー（GEA Niro Soavi）による２パスを用いて溶解した。ライセートを４℃における１時間の１６，０００×ｇでの遠心によって清澄化し、蛋白質含量を−８０℃での保存前にＢＣＡアッセイ（Thermo Fisher）によって分析した。
外来性ＲＮａｓｅ  ＲによるライセートＲＮＡの解重合
【０２００】
ＧＬ１６−１７０ライセート（蛋白質含量３４．５ｍｇ／ｍＬ）およびＲＮａｓｅ  Ｒ溶液（３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４，２００ｍＭ  ＫＣ１，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中に１ｍｇ／ｍＬ）を２℃で予め平衡化した後に、反応を開始した。時間ｔ＝０において、５０μＬのE. coliライセートおよび５０μＬ  ＲＮａｓｅ  Ｒ溶液を混合し、予熱された３７℃ブロックに移すことによって反応を開始した。ライセートを水中の５×デオキシコール酸ナトリウム溶液の０．２体積と予め混合し、開始前に２℃で１５分間インキュベートしたことを例外として、デオキシコール酸を包含する反応を上に記載されているようにアセンブリした。開始後に、反応を３７℃でインキュベートし、１０μＬを氷上の酸クエンチ溶液（９０μＬの０．２Ｍ硫酸）に移すことによって定期的にサンプリングした。時系列の完了後に、クエンチされたサンプルを２℃における１０分間の３，２００×ｇでの遠心によって清澄化した。解重合を第１に酸可溶性のヌクレオチドの吸光度によって定量した：クエンチおよび清澄化された反応の１０μＬをＵＶ透明９６ウェルハーフエリアプレート（Corning）上で１６０μＬの０．２Ｍ硫酸に追加した。酸可溶性のヌクレオチドを、マイクロプレートリーダーを用いて２６０ｎｍの吸光度によって定量した（上参照）。解重合は５’、２’、および３’ＮＭＰのＵＰＬＣ分析によってもまた定量した：各酸クエンチされたサンプルの３０μＬを、１０μＬの１Ｍ  ＫＯＨを追加することによってｐＨ中和し、それから、ＵＰＬＣ分析前に０．２μｍフィルターに通した。トータルヌクレオチドプール（すなわち１００％解重合）をライセートＲＮＡのアルカリ加水分解によって決定した：５０μＬライセートを１５０μＬの０．２Ｍ水酸化カリウムと組み合わせ、それから９９℃で２０分間加熱した。それから、アルカリ加水分解されたサンプルを上に記載されているようにクエンチし、分析した。
過剰発現されたＲＮａｓｅ  Ｒによるライセート中のＲＮＡの解重合
【０２０１】
E. coli株ＧＬ１６−１７０を、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを有するE. coli  ｒｎｒ遺伝子をコードするｐＥＴＤｕｅｔ−１によって形質転換した。この株を、空のｐＥＴＤｕｅｔ−１によって形質転換されたＧＬ１６−１７０と並べて、５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを添加したＫｏｒｚ培地によってバッチ段階で増殖させた。培養物をＡ６００＝２０において０．８ｍＭ  ＩＰＴＧによって誘導し、誘導時に追加の１０ｇ／Ｌグルコースを添加した。誘導の１時間後に、バイオマスを遠心によって収穫し、凍結した。ライセートを上に記載されているように凍結されたバイオマスから調製した（蛋白質濃度：空のｐＥＴＤｕｅｔ−１を有するＧＬ１６−１７０バイオマスでは３６．６ｍｇ／ｍＬ；クローニングされたＲＮａｓｅ  Ｒを持つｐＥＴＤｕｅｔ−１を有するＧＬ１６−１７０では５３．２ｍｇ／ｍＬ）。希釈ライセート中における解重合を、反応中の５０％ライセート終濃度について上に記載されているように算定した。濃縮されたライセート中における解重合を、９体積のライセートを１体積の１０×ＥＤＴＡ溶液と２℃で５分間プレインキュベートすることによって算定した。それから、上に記載されているように予熱された３７℃ブロックに移すこととサンプリングすることとによって、反応を開始した。
ＮＭＰ安定性算定
【０２０２】
４体積のＧＬ１４−３２２ライセート（蛋白質濃度：５０．５ｍｇ／ｍＬ）を１体積のホスファターゼ阻害剤溶液（５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４，  １５０ｍＭ  リン酸カリウムｐＨ７．４、または１０ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウムという終濃度）と氷上で組み合わせた。同位体標識したＮＭＰ（アデノシン−１３Ｃ１０，１５Ｎ５  ５’−一リン酸、シチジン−１５Ｎ３−５’−一リン酸、ウリジン−１５Ｎ２−５’−一リン酸、およびグアノシン−１５Ｎ５−５’−一リン酸［Sigma-Aldrich］、各２５ｍＭ）の等モル溶液を水中に調製した。ライセートおよびＮＭＰを３７℃に１０分間平衡化した後に、反応を開始した。反応を開始するためには、９０μＬライセート溶液を１０μＬＮＭＰ溶液に追加し、反応を良く混合した。反応は指定されているタイムポイントにおけるサンプリングによってモニターした。サンプリングの間には、反応混合物の１２μＬを氷上の１０８μＬの０．２Ｍ硫酸に移した。それから、クエンチされた反応を、上に記載されているようにＬＣ−ＭＳ分析のために遠心によって清澄化、ｐＨ中和、および濾過した。
熱不活性化の開発
【０２０３】
ＧＬ１４−３２２ライセートを氷上の５つのマイクロ遠心チューブに分注し、それから、所望の熱不活性化温度で平衡化されたヒートブロックに移した。指定されている時間において、チューブを氷上で冷却し、それから遠心（５分間の２１，０００×ｇ）によって清澄化し、上清を収穫した。熱不活性化されたライセートからの上清を、ＮＴＰの等モル混合物（Sigma-Aldrich、各２５ｍＭ）と共に３７℃で１０分間平衡化した。時間ｔ＝０において、９体積の熱不活性化されたライセート上清を１体積のＮＴＰ溶液と組み合わせ、反応を上に記載されているように酸クエンチ溶液中へのサンプリングによってモニターし、ｐＨ中和し、濾過し、ＬＣ−ＭＳによって分析した。ライセート中における転写反応では、酵素ミックスの低減された量（最終反応体積の５％）と熱不活性化されたライセート上清（最終反応体積の４０％）を包含することとを例外として、１０μＬ反応をキット取扱説明にならってＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ  Ｔ７転写キット（Thermo Fisher）を用いて実施した。正のコントロール反応はＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ反応緩衝液単独の中で実施し、一方、負のコントロール反応はライセートを包含したが、酵素ミックスを省いた。反応を１ｋｂ  ＤＮＡラダー（New England Biolabs）と並べて、SYBR Safe（Invitrogen）によって染色したアガロースゲル電気泳動によって分析した。
ヌクレオチドキナーゼ活性アッセイ
【０２０４】
ヌクレオチドキナーゼを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、４ｍＭ  ＡＴＰ、および４ｍＭの対応するＮＭＰまたはＮＤＰからなる緩衝液中において、様々な温度（３７℃、５０℃、６０℃、７０℃、および８０℃）でアッセイした。反応緩衝液（１．２×濃縮液）および酵素溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）を反応温度で１分間予め平衡化した後に、反応を開始した。時間ｔ＝０において、８０μＬ反応緩衝液を２０μＬ酵素と混合することによって反応を開始した。反応は指定されているタイムポイントにおけるサンプリングによってモニターした。サンプリングの間には、反応混合物の１５μＬを氷上の１３５μＬの０．２Ｍ硫酸に移した。反応の完了後に、サンプルを上に記載されているように１Ｍ  ＫＯＨによってｐＨ中和し、それから氷冷水によって１：１０希釈した。キット取扱説明にならってＡＴＰ生物発光アッセイキット（Sigma-Aldrich）を用いて各サンプル中のＡＴＰを定量した。ライセート中における反応のために、上のプロトコールを次のように修飾した：ライセートを個々の反応チューブに分注し、それから１５分間の７０℃でのインキュベーションによって熱不活性化した。反応緩衝液（２×濃縮液）および熱不活性化されたライセートを反応温度で予め平衡化し、ライセートおよび反応緩衝液の等体積同士を組み合わせることによって反応を開始した。反応は個々の反応チューブを９体積の酸クエンチ溶液によってクエンチすることによってサンプリングし、それから上に記載されているように分析した。
【０２０５】
ライセート中のキナーゼの組み合わせられた（すなわち、ＮＭＰからＮＴＰへの）活性をアッセイするために、各キナーゼを個々に発現するライセート同士を１：１比で混合し、１０μＬアリコートに分割し、それから上に記載されているように熱不活性化した。キナーゼ活性は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、１６ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２ｍＭ各ヌクレオチド一リン酸（ＡＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、およびＧＭＰ）、および１６ｍＭ  ＡＴＰからなる緩衝液中において分析した。反応温度で予め平衡化した反応緩衝液（２×濃縮液）を等体積のライセートと組み合わせて、反応を開始した。反応は７０℃で実施し、個々の反応チューブを９体積の酸クエンチ溶液によってクエンチすることによってサンプリングし、それから上に記載されているように分析した。
ポリリン酸キナーゼ活性アッセイ
【０２０６】
ポリリン酸キナーゼを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭ  ＡＤＰ、および１ｍＭヘキサメタリン酸ナトリウムからなる緩衝液中において、様々な温度（３７℃、５０℃、６０℃、７０℃、および８０℃）でアッセイした。反応緩衝液（１．２×濃縮液）および酵素溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ）を反応温度で１分間予め平衡化した後に、反応を開始した。時間ｔ＝０において、８０μＬ反応緩衝液を２０μＬ酵素と混合することによって反応を開始した。反応は指定されているタイムポイントにおけるサンプリングによってモニターした。サンプリングの間には、反応混合物の１５μＬを氷上の１３５μＬの０．２Ｍ硫酸に移した。反応の完了後に、サンプルを上に記載されているように１Ｍ  ＫＯＨによってｐＨ中和し、それから氷冷水によって１：１０希釈した。キット取扱説明にならってＡＴＰ生物発光アッセイキット（Sigma-Aldrich）を用いて、各サンプル中のＡＴＰを定量した。ライセート中における反応のためには、上のプロトコールを次のように修飾した：ライセートを個々の反応チューブに分注し、それから１５分間の７０℃でのインキュベーションによって熱不活性化した。反応緩衝液（２×濃縮液）および熱不活性化されたライセートを反応温度で予め平衡化し、等体積のライセートおよび反応緩衝液を組み合わせることによって反応を開始した。反応は個々の反応チューブを９体積の酸クエンチ溶液によってクエンチすることによってサンプリングし、それから上に記載されているように分析した。ライセート中における反応速度を、同じ反応条件下のコントロールライセート（過剰発現されたポリリン酸キナーゼなし）からのシグナルを差し引くことによって計算した。
転写鋳型の生成
【０２０７】
二重鎖ＤＮＡ鋳型を合成ｇＢｌｏｃｋ  ＤＮＡ（Integrated DNA Technologies）のＰＣＲ増幅によって調製した。反応をイソプロパノール沈殿によって精製および濃縮した。
ＲＮＡポリメラーゼの絞り込み
【０２０８】
市販のＲＮＡポリメラーゼ同士を、各製造者が推奨する条件を用いて比較した。各５０μＬ反応は１０×反応緩衝液（製造者によって供給）、ＮＴＰ、ＤＮＡ鋳型（０．５μｇ）、および酵素からなった。ＮＥＢ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼについては、反応は０．５ｍＭ各ＮＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ、および１００Ｕ酵素を包含した。ＴｈｅｒｍｏＴ７ポリメラーゼによる反応は、ＤＴＴを省いたことを例外として同一であった。ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ  Ｔ７による反応は７．５ｍＭの各ＮＴＰおよび５μＬ酵素ミックスを包含した。酵素濃度はＢＣＡアッセイ（Thermo Fisher）によって決定した。反応は指定されているタイムポイントにおけるサンプリングによってモニターした。サンプリングの間には、反応混合物の１０μＬをＲＮＡクエンチ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）の９０μＬに移し、氷上で保存した。クエンチ溶液中のＲＮＡサンプルを、キット取扱説明にならってQuant-iT ＲＮＡブロードレンジアッセイキット（Thermo Fisher）を用いて定量した。キット取扱説明にならってＭｅｇａＳｃｒｉｐｔキットを用いて調製および精製された精製ｄｓＲＮＡの段階希釈物を用いて、定量化のための標準曲線を構築した。反応をアガロースゲル電気泳動によって定性的に分析した。
ライセート中におけるＲＮＡポリメラーゼ評価
【０２０９】
ＧＬ１４−３２２ライセートを先に記載されているように熱不活性化し、遠心によって清澄化した。各２０μＬ反応は、清澄化されたライセート（７μＬ）、１０×補因子溶液（３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭスペルミジン）、ＮＴＰ（各７．５ｍＭ。ｐＨ中和されたストック溶液から調製）、ＤＮＡ鋳型（０．６μｇ）、および酵素（１μＬ）からなった。反応を３７℃または５０℃で１時間インキュベートし、それから９体積のＲＮＡクエンチ溶液を追加することによってクエンチした。クエンチされた反応をさらにクエンチ溶液によって１０倍希釈した（最終希釈：１００倍）。それから、希釈した反応をQuant-iTキットを用いて定量した（上参照）。反応によって生産されたＲＮＡを、コントロール反応（ＲＮＡポリメラーゼを省いた）において定量されたＲＮＡを差し引くことによって計算した。
【０２１０】
高密度ライセート中におけるＲＮＡポリメラーゼアッセイを、次の修飾と共に、上に記載されているように実施した。各１００μＬ反応はライセート（６７．５μＬ）、１０×補因子溶液（３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭスペルミジン）、ＮＴＰ（各７．５ｍＭ。ｐＨ中和されたストック溶液から調製）、ＤＮＡ鋳型（３μｇ）、および酵素（１０μＬ）からなった。清澄化されていない反応マトリックス中において実施される反応では、ＧＬ１４−３２２ライセート（６７．５μＬ）を個々の反応チューブに分注し、それから先に記載されているように熱不活性化した。追加の反応物を熱不活性化されたマトリックスに追加し、それから均質までボルテックスすることによって良く混合した。緩衝液中において実施される反応では、１０×補因子溶液は３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭスペルミジン、および４００ｍＭ  ＤＴＴからなった。加えて、緩衝液のみの反応には５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４が包含された。全ての反応は５０℃で２時間インキュベートした。各反応からのサンプルは９体積のＲＮＡクエンチ溶液を追加することによってクエンチし、それから最大スピード（２１，０００×ｇ）での１分の遠心によって清澄化した。これらの反応からの上清をクエンチ溶液によってさらに４０倍希釈し（最終希釈：４００倍）、それからQuant-iTキットを用いて定量した（上参照）。
例２
【０２１１】
耐熱性ＰＰＫ２酵素をE. coliでの発現のためにコドン最適化し、合成し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。それから、プラスミドをＧＬ１６−１７０に形質転換した。コントロール株を生成するためには、空のｐＥＴＤｕｅｔ−１プラスミドをＧＬ１６−１７０に形質転換した。５ｍＬ溶原ブロス（ＬＢ）中における一晩の前培養後に、細胞密度がおよそ０．５のＯＤ６００に達するまで、株を１ＬのＬＢ中において３７℃で培養した。それから培養物を氷上で手短に冷やし、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．２５ｍＭの終濃度で追加することによって、ＰＰＫ２発現を誘導した。誘導後に、培養物を２０℃でおよそ１６時間増殖させた。培養物を遠心によって収穫し、細胞ペレットを−８０℃に保存した。凍結ペレットを融解することと、２ペレット体積の１５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７中への再懸濁と、１５，０００ｐｓｉでEmulsiFlex C3ホモジナイザー（Avestin）による４パスを用いるホモジナイゼーションとによって、ライセートを生産した。それから、ライセートを４℃における１時間の１５，０００×ｇでの遠心によって清澄化した。ライセートのアリコートを使用前に−８０℃で凍結した。
【０２１２】
それから、熱不活性化されたライセート中の耐熱性ＰＰＫ２活性を測定した。ＰＰＫ２酵素を発現する融解したライセートを、第１に、１：１０希釈されたD. geothermalis  ＰＰＫ２ライセートを例外として、コントロール株から調製されたライセートによって１：１００希釈した。塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）およびヘキサメタリン酸ナトリウム（ＨＭＰ）の予冷溶液をそれぞれ１０ｍＭおよび１ｍＭの終濃度で追加した。それから、予熱された７０℃サーモサイクラーによる１５分間のインキュベーションによってライセートを熱不活性化した。それから、熱不活性化されたライセートを１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）またはアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、および９ｍＭ  ＨＭＰからなる２×反応緩衝液の等体積と混合することによって、反応を開始した。反応を７０℃でインキュベートし、反応混合物のアリコートを除去することと氷上の９部のクエンチ溶液（２００ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４）による希釈とによって、タイムポイントを取った。初期タイムポイント（ｔ０）は、ライセートをクエンチ溶液と直接的に混合すること、クエンチされたライセートを氷上に１５分間保存すること、それから２×反応緩衝液を追加することによって取った。アッセイの締め括りに、クエンチされたタイムポイント溶液を１０分間の３，２００×ｇでの遠心によって清澄化した。それから、３部のクエンチされた反応溶液を１部の中和溶液（１Ｍ  ＫＯＨ）と混合することによって、クエンチされた反応からの上清をｐＨ中和した。それから、キット取扱説明にならってアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）生物発光アッセイキット（Sigma-Aldrich cat#:FLAA）を用いる定量化前に、クエンチおよび中和されたサンプルを水によって１：１０希釈した。ＰＰＫ２含有反応中のＡＴＰの蓄積に基づき、コントロールライセートからのＡＴＰ濃度を差し引いて、初期反応速度を計算した。
【０２１３】
５つのクラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素は、ライセート中において７０℃で可溶性の発現、耐熱性、および高い反応速度を示した。代表的な発現および活性データが図２２Ａ〜２２Ｂに示されている。
【０２１４】
試験された各酵素の発現およびキネティクスデータの概要が表１７に示されている。C. aerophila、Roseiflexus、A. thermophila、およびR. castenholzii酵素は、基質としてＨＭＰを用いてＡＭＰおよびＡＤＰを急速にＡＴＰに変換した。D. geothermalis酵素は、ＡＭＰおよびＡＤＰ基質両方について他の試験されたＰＰＫ２よりも大体２０×低い変換速度を示した。
【表１９−１】
2019510504.tif 000022
【表１９−２】
2019510504.tif 000023
例３
【０２１５】
それから、耐熱性C. aerophila  ＰＰＫ２を用いて、ＮＭＰ、ＡＤＰ、およびＨＭＰからのｄｓＲＮＡの無細胞的生産のためのＡＴＰを供給した。無細胞的なｄｓＲＮＡ合成反応を、表１８に挙げられているキナーゼを個々に過剰発現する６つのE. coliライセートの混合物によって実施した。
【表２０】
2019510504.tif 000024
【０２１６】
第１に、表１８に挙げられているライセート同士を氷上において等体積で組み合わせた。塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、およびヘキサメタリン酸ナトリウム（ＨＭＰ）の予冷溶液を、それぞれ０〜２．５ｍＭ、３０ｍＭ、および１ｍＭの終濃度まで追加した。それから、予熱された７０℃サーモサイクラーによる１５分間のインキュベーションによってライセート混合物を熱不活性化した。反応を開始するためには、熱不活性化されたライセートを次のコンポーネントと組み合わせた：２０μＬの総体積中に、ヌクレオチド一リン酸（アデノシン５’−一リン酸、シチジン５’−一リン酸、ウリジン５’−一リン酸、およびグアノシン５’−一リン酸。各２ｍＭ）の等モル混合物，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０，３０ｍＭ  ＭｇＳＯ４，０〜２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２；１ｍＭアデノシン５’−二リン酸、２ｍＭスペルミジン、１．５μｇプラスミドＤＮＡ鋳型、および３μｇ耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｓ４３０Ｐ，Ｆ８４９Ｉ，Ｆ８８０Ｙ）。コントロールとして、ｄｓＲＮＡを２ｍＭ  ＮＴＰの等モル混合物から合成した（ライセート、ＡＤＰ、およびＨＭＰは省いた）。追加のコントロールとして、ｄｓＲＮＡを２ｍＭ  ＮＭＰの等モル混合物から合成した（ＰＰＫ２発現ライセート、ＡＤＰ、およびＨＭＰは省いたが、エネルギー供給源として８ｍＭ  ＡＴＰを包含した）。負のコントロールとして、ポリメラーゼを省いた二重の反応を実施した。全ての反応は５０℃で２時間インキュベートし、それから９体積のＴＥ＋緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）の追加によって停止させた。サンプルを等体積の２×ＲＮＡローディング色素（New England Biolabs）と混合し、７０℃に１０分間加熱し、アガロース／ＴＡＥゲル電気泳動が後続した。
【０２１７】
図２３に示されているように、所望のｄｓＲＮＡ産物を、緩衝液中においてＮＴＰを用いて（左のレーン）、ヌクレオチドキナーゼ発現ライセート中においてＮＭＰおよびＡＴＰから（真ん中のレーン）、ヌクレオチドキナーゼおよびポリリン酸キナーゼ発現ライセート中においてＮＭＰおよびＨＭＰから（右のレーン）生産した。塩化マンガンはいずれかの反応に要求されず、C. aerophila酵素が補因子としてＭｎ２＋およびＭｇ２＋を利用し得るということを実証した。よって、Ｍｎ２＋はC. aerophila  ＰＰＫ２を含有する無細胞的反応のためにアプリオリには要求されない。
【０２１８】
図２４に示されているように、所望のｄｓＲＮＡ産物を、緩衝液中においてＮＴＰを用いて（左のレーン）、ヌクレオチドキナーゼ発現ライセート中においてＮＭＰおよびＡＴＰから（真ん中のレーン）、ヌクレオチドキナーゼおよびポリリン酸キナーゼ発現ライセート中においてＮＭＰおよびＨＭＰから（右のレーン）生産した。ＮＭＰおよびＨＭＰからのｄｓＲＮＡ生産は外来性ＡＤＰまたはT. thermophilus  ＡＭＰキナーゼを要求しなかった。よって、C. aerophila  ＰＰＫ２は、無細胞的反応によってＮＭＰおよびＨＭＰからｄｓＲＮＡを生産するために５−キナーゼシステムの一部として用いられ得る。
他の態様
【０２１９】
請求項において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、それと反対に示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。群の１つ以上のメンバーの間に「または」を包含する請求項または記載は、それと反対に示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、群のメンバーの１つ、１つよりも多く、または全てが所与の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別様に関係する場合には、満足されると見なされる。本発明は、群の厳密に１つのメンバーが所与の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別様に関係する態様を包含する。本発明は、群のメンバーの１つよりも多くまたは全てが所与の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別様に関係する態様を包含する。
【０２２０】
さらにその上、本発明は、列記されている請求項の１つ以上から１つ以上の限定、要素、節、および記述用語が別の請求項に導入される全ての変形、組み合わせ、および順列を包含する。例えば、別の請求項に従属するいずれかの請求項は、同じ元の請求項に従属するいずれかの他の請求項に見出される１つ以上の限定を包含するように修飾され得る。要素がリストとして、例えばマーカッシュ群フォーマットで提出されているところでは、要素の各下位群もまた開示され、いずれかの要素（単数または複数）は群から除去され得る。一般的に、本発明または本発明の側面が特定の要素および／または特徴を含むと言われるところでは、ある種の本発明の態様または本発明の側面がかかる要素および／または特徴からなるかまたは本質的になるということが理解されるべきである。単純の目的のために、それらの態様は本明細書において一々具体的には提示しなかった。用語「含む」および「含有する」は開放的であることが意図されており、追加の要素またはステップの包含を許可するということもまた注意される。範囲が与えられているところでは、エンドポイントが包含される。さらにその上、別様に示されていないかまたは文脈および当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現されている値は、文脈が明らかに別様に指示しない限り、本発明の異なる態様において、述べられている範囲内のいずれかの具体的な値または部分範囲を、範囲の下限の単位の１／１０までとり得る。
【０２２１】
本明細書は種々の発行済み特許、公開特許出願、雑誌記事、および他の刊行物を参照し、その全ては参照によって本明細書に組み込まれる。組み込まれる参照のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合には、本明細書がコントロールするものとする。加えて、従来技術のうちである本発明のいずれかの特定の態様は請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得る。かかる態様は当業者に公知であると判断されるので、それらは、除外が本明細書において明示的に提示されていない場合であっても除外され得る。本発明のいずれかの特定の態様は、従来技術の存在に関するか否かにかかわらず、いずれかの請求項からいずれかの理由で除外され得る。
【０２２２】
当業者は、本明細書に記載される具体的な態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜい慣例の実験作業を用いて確かめることができるであろう。本明細書に記載される本態様の範囲は上の明細書に限定されることを意図されず、むしろ添付の請求項に提示されている通りである。当業者は、次の請求項に定められている本発明の趣旨または範囲から外れることなしに、本明細書の種々の変化および修飾がなされ得るということを理解するであろう。
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配列
E. coli RNase R
MSQDPFQEREAEKYANPIPSREFILEHLTKREKPASRDELAVELHIEGEEQLEGLRRRLR
AMERDGQLVFTRRQCYALPERLDLVKGTVIGHRDGYGFLRVEGRKDDLYLSSEQMKTCIH
GDQVLAQPLGADRKGRREARIVRVLVPKTSQIVGRYFTEAGVGFVVPDDSRLSFDILIPP
DQIMGARMGFVVVVELTQRPTRRTKAVGKIVEVLGDNMGTGMAVDIALRTHEIPYIWPQA
VEQQVAGLKEEVPEEAKAGRVDLRDLPLVTIDGEDARDFDDAVYCEKKRGGGWRLWVAIA
DVSYYVRPSTPLDREARNRGTSVYFPSQVIPMLPEVLSNGLCSLNPQVDRLCMVCEMTVS
SKGRLTGYKFYEAVMSSHARLTYTKVWHILQGDQDLREQYAPLVKHLEELHNLYKVLDKA
REERGGISFESEEAKFIFNAERRIERIEQTQRNDAHKLIEECMILANISAARFVEKAKEP
ALFRIHDKPSTEAITSFRSVLAELGLELPGGNKPEPRDYAELLESVADRPDAEMLQTMLL
RSMKQAIYDPENRGHFGLALQSYAHFTSPIRRYPDLTLHRAIKYLLAKEQGHQGNTTETG
GYHYSMEEMLQLGQHCSMAERRADEATRDVADWLKCDFMLDQVGNVFKGVISSVTGFGFF
VRLDDLFIDGLVHVSSLDNDYYRFDQVGQRLMGESSGQTYRLGDRVEVRVEAVNMDERKI
DFSLISSERAPRNVGKTAREKAKKGDAGKKGGKRRQVGKKVNFEPDSAFRGEKKTKPKAA
KKDARKAKKPSAKTQKIAAATKAKRAAKKKVAE（配列番号１）
T. elongatus Ppk (PPK1)
MPSAKSPRRKAPEPIDLDNPQYYFNRSLSWLEFNKRVLHEAYDPRTPLLERLKFMAIFSS
NLDEFFMVRVAGLKQQVESGILQVGADGMPPAEQLQAVRQYLLPIVTEQHRYFDQELRAL
LAKESIFLTRFNELTPEQQAYLNDYFQAQVFPVLTPLAVDPAHPFPYISSLSLNLAVLIR
DPESGQERLARVKVPNQFPRFVALPQHLHSPQGVHWLGVPLEEIIAHNLSALFPGMEIEA
YFAFRITRSADLELETDKADDLLIAIEQEIRKRRFGSVVRLEVQRGIPPLLRQTLMEEMD
LEEIDVYELEGLLCLNDLFAFMGLPLPQFKDPEWQPQVPPSFQRVEERESMFDTSSEITT
LGTDYWEAVANELFSLIREGDIIVHHPYHSFAATVQRFITLAAHDPQVLAIKITLYRTSG
DSPIVSALIKAAENGKQVAVLVELKARFDEENNILWARKLEKVGVHVVYGVPGLKTHTKT
VLVVRQEAGQIRRYVHIGTGNYNPKTASLYEDLGLFSCREELGADLSELFNVLTGYARQR
DYRKLLVAPVTMRDRTLQLIYREIEHARNGQPARIIAKMNAITDTQVIRALYEASQAGVD
IDLIIRGMCCLRPGVPGVSDRIRVISIIGRFLEHSRIFYFGNNGDPEYYIGSADWRSRNL
DRRVEAITPIEDPAIQLELKERLEIMLADNRQAWELQPDGTYRQRQPAPGEAERGTHSVL
MARTLKDVQGSH（配列番号２）
P. furiosus Umk
MRIVFDIGGSVLVPENPDIDFIKEIAYQLTKVSEDHEVAVVVGGGKLARKYIEVAEKFNSSE
TFKDFIGIQITRANAMLLIAALREKAYPVVVEDFWEAWKAVQLKKIPVMGGTHPGHTTDAVA
ALLAEFLKADLLVVITNVDGVYTADPKKDPTAKKIKKMKPEELLEIVGKGIEKAGSSSVIDP
LAAKIIARSGIKTIVIGKEDAKDLFRVIKGDHNGTTIEP（配列番号３）
T. thermophilius Cmk
MRGIVTIDGPSASGKSSVARRVAAALGVPYLSSGLLYRAAAFLALRAGVDPGDEEGLLAL
LEGLGVRLLAQAEGNRVLADGEDLTSFLHTPEVDRVVSAVARLPGVRAWVNRRLKEVPPP
FVAEGRDMGTAVFPEAAHKFYLTASPEVRAWRRARERPQAYEEVLRDLLRRDERDKAQSA
PAPDALVLDTGGMTLDEVVAWVLAHIRR（配列番号４）
T. maritima Gmk
MKGQLFVICGPSGAGKTSIIKEVLKRLDNVVFSVSCTTRPKRPHEEDGKDYFFITEEEFL
KRVERGEFLEWARVHGHLYGTLRSFVESHINEGKDVVLDIDVQGALSVKKKYSNTVFIYV
APPSYADLRERILKRGTEKEADVLVRLENAKWELMFMDEFDYIVVNENLEDAVEMVVSIV
RSERAKVTRNQDKIERFKMEVKGWKKL（配列番号５）
T. thermophilus Adk
MDVGQAVIFLGPPGAGKGTQASRLAQELGFKKLSTGDILRDHVARGTPLGERVRPIMERG
DLVPDDLILELIREELAERVIFDGFPRTLAQAEALDRLLSETGTRLLGVVLVEVPEEELV
RRILRRAELEGRSDDNEETVRRRLEVYREKTEPLVGYYEARGVLKRVDGLGTPDEVYARI
RAALGI（配列番号６）
A. aeolicus Ndk
MAVERTLIIVKPDAMEKGALGKILDRFIQEGFQIKALKMFRFTPEKAGEFYYVHRERPFF
QELVEFMSSGPVVAAVLEGEDAIKRVREIIGPTDSEEARKVAPNSIRAQFGTDKGKNAIH
ASDSPESAQYEICFIFSGLEIV（配列番号７）
Meiothermus ruber DM 1279 PPK2
MGFCSIEFLMGAQMKKYRVQPDGRFELKRFDPDDTSAFEGGKQAALEALAVLNRRLEKLQEL
LYAEGQHKVLVVLQAMDAGGKDGTIRVVFDGVNPSGVRVASFGVPTEQELARDYLWRVHQQV
PRKGELVIFNRSHYEDVLVVRVKNLVPQQVWQKRYRHIREFERMLADEGTTILKFFLHISKD
EQRQRLQERLDNPEKRWKFRMGDLEDRRLWDRYQEAYEAAIRETSTEYAPWYVIPANKNWYR
NWLVSHILVETLEGLAMQYPQPETASEKIVIE（配列番号８）
Meiothermus silvanus DSM 9946 PPK2
MAKTIGATLNLQDIDPRSTPGFNGDKEKALALLEKLTARLDELQEQLYAEHQHRVLVILQGM
DTSGKDGTIRHVFKNVDPLGVRVVAFKAPTPPELERDYLWRVHQHVPANGELVIFNRSHYED
VLVARVHNLVPPAIWSRRYDHINAFEKMLVDEGTTVLKFFLHISKEEQKKRLLERLVEADKH
WKFDPQDLVERGYWEDYMEAYQDVLDKTHTQYAPWHVIPADRKWYRNLQVSRLLVEALEGLR
MKYPRPKLNIPRLKSELEKM（配列番号９）
Deinococcus geothermalis DSM 11300 PPK2
MQLDRYRVPPGQRVRLSNWPTDDDGGLSKAEGEALLPDLQQRLANLQERLYAESQQALLIVL
QARDAGGKDGTVKHVIGAFNPSGVQVSNFKVPTEEERAHDFLWRIHRQTPRLGMIGVFNRSQ
YEDVLVTRVHHLIDDQTAQRRLKHICAFESLLTDSGTRIVKFYLHISPEEQKKRLEARLADP
SKHWKFNPGDLQERAHWDAYTAVYEDVLTTSTPAAPWYVVPADRKWFRNLLVSQILVQTLEE
MNPQFPAPAFNAADLRIV（配列番号１０）
Thermosynechococcus elongatus BP-1 PPK2
MIPQDFLDEINPDRYIVPAGGNFHWKDYDPGDTAGLKSKVEAQELLAAGIKKLAAYQDVLYA
QNIYGLLIIFQAMDAAGKDSTIKHVMSGLNPQACRVYSFKAPSAEELDHDFLWRANRALPER
GCIGIFNRSYYEEVLVVRVHPDLLNRQQLPPETKTKHIWKERFEDINHYERYLTRNGILILK
FFLHISKAEQKKRFLERISRPEKNWKFSIEDVRDRAHWDDYQQAYADVFRHTSTKWAPWHII
PANHKWFARLMVAHFIYQKLASLNLHYPMLSEAHREQLLEAKALLENEPDED（配列番号１１）
Anaerolinea thermophila UNI-1 PPK2
MGEAMERYFIKPGEKVRLKDWSPDPPKDFEGDKESTRAAVAELNRKLEVLQERLYAERKHKV
LVILQGMDTSGKDGVIRSVFEGVNPQGVKVANFKVPTQEELDHDYLWRVHKVVPGKGEIVIF
NRSHYEDVLVVRVHNLVPPEVWKKRYEQINQFERLLHETGTTILKFFLFISREEQKQRLLER
LADPAKHWKFNPGDLKERALWEEYEKAYEDVLSRTSTEYAPWILVPADKKWYRDWVISRVLV
ETLEGLEIQLPPPLADAETYRRQLLEEDAPESR（配列番号１２）
Caldilinea aerophila OSM 14535 PPK2
MDVDRYRVPPGSTIHLSQWPPDDRSLYEGDKKQGKQDLSALNRRLETLQELLYAEGKHKVLI
ILQGMDTSGKDGVIRHVFNGVNPQGVKVASFKVPTAVELAHDFLWRIHRQTPGSGEIVIFNR
SHYEDVLVVRVHGLVPPEVWARRYEHINAFEKLLVDEGTTILKFFLHISKEEQRQRLLERLE
MPEKRWKFSVGDLAERKRWDEYMAAYEAVLSKTSTEYAPWYIVPSDRKWYRNLVISHVIINA
LEGLNMRYPQPEDIAFDTIVIE（配列番号１３）
Chlorobaculum tepidum TLS PPK2
MKLDLDAFRIQPGKKPNLAKRPTRIDPVYRSKGEYHELLANHVAELSKLQNVLYADNRYAIL
LIFQAMDAAGKDSAIKHVMSGVNPQGCQVYSFKHPSATELEHDFLWRTNCVLPERGRIGIFN
RSYYEEVLVVRVHPEILEMQNIPHNLAHNGKVWDHRYRSIVSHEQHLHCNGTRIVKFYLHLS
KEEQRKRFLERIDDPNKNWKFSTADLEERKFWDQYMEAYESCLQETSTKDSPWFAVPADDKK
NARLIVSRIVLDTLESLNLKYPEPSPERRKELLDIRKRLENPENGK（配列番号１４）
Oceanithermus profundus DSM 14977 PPK2
MDVSRYRVPPGSGFDPEAWPTREDDDFAGGKKEAKKELARLAVRLGELQARLYAEGRQALLI
VLQGMDTAGKDGTIRHVFRAVNPQGVRVTSFKKPTALELAHDYLWRVHRHAPARGEIGIFNR
SHYEDVLVVRVHELVPPEVWGRRYDHINAFERLLADEGTRIVKFFLHISKDEQKRRLEARLE
NPRKHWKFNPADLSERARWGDYAAAYAEALSRTSSDRAPWYAVPADRKWQRNRIVAQVLVDA
LEAMDPRFPRVDFDPASVRVE（配列番号１５）
Roseiflexus castenholzii DSM 13941 PPK2
MYAQRVVPGMRVRLHDIDPDANGGLNKDEGRARFAELNAELDVMQEELYAAGIHALLLILQG
MDTAGKDGAIRNVMLNLNPQGCRVESFKVPTEEELAHDFLWRVHRVVPRKGMVGVFNRSHYE
DVLVVRVHSLVPESVWRARYDQINAFERLLADTGTIIVKCFLHISKEEQEQRLLARERDVSK
AWKLSAGDWRERAFWDDYMAAYEEALTRCSTDYAPWYIIPANRKWYRDLAISEALVETLRPY
RDDWRRALDAMSRARRAELEAFRAEQHAMEGRPQGAGGVSRR（配列番号１６）
Roseiflexus sp. RS-1 PPK2
MHYAHTVIPGTQVRLRDIDPDASGGLTKDEGRERFASFNATLDAMQEELYAAGVHALLLILQ
GMDTAGKDGAIRNVMHNLNPQGCRVESFKVPTEEELAHDFLWRVHKVVPRKGMVGVFNRSHY
EDVLVVRVHSLVPEHVWRARYDQINAFERLLTDTGTIIVKCFLHISKDEQEKRLLAREQDVT
KAWKLSAGDWRERERWDEYMAAYEEALTRCSTEYAPWYIIPANRKWYRDLAISEVLVETLRP
YRDDWQRALDAMSQARLAELKAFRHQQTAGATRL（配列番号１７）
Truepera radiovictrix DSM 17093 PPK2
MSQGSAKGLGKLDKKVYARELALLQLELVKLQGWIKAQGLKVVVLFEGRDAAGKGSTITRIT
QPLNPRVCRVVALGAPTERERTQWYFQRYVHHLPAAGEMVLFDRSWYNRAGVERVMGFCTEA
EYREFLHACPTFERLLLDAGIILIKYWFSVSAAEQERRMRRRNENPAKRWKLSPMDLEARAR
WVAYSKAKDAMFYHTDTKASPWYVVNAEDKRRAHLSCIAHLLSLIPYEDLTPPPLEMPPRDL
AGADEGYERPDKAHQTWVPDYVPPTR（配列番号１８）
【図１】
2019510504.tif 000025
【図２】
2019510504.tif 000026
【図３Ａ−Ｂ】
2019510504.tif 000027
【図３Ｃ】
2019510504.tif 000028
【図３Ｄ】
2019510504.tif 000029
【図３Ｅ】
2019510504.tif 000030
【図４】
2019510504.tif 000031
【図５Ａ】
2019510504.tif 000032
【図５Ｂ】
2019510504.tif 000033
【図６】
2019510504.tif 000034
【図７Ａ−Ｂ】
2019510504.tif 000035
【図７Ｃ】
2019510504.tif 000036
【図８】
2019510504.tif 000037
【図９Ａ−Ｂ】
2019510504.tif 000038
【図９Ｃ−Ｄ】
2019510504.tif 000039
【図１０】
2019510504.tif 000040
【図１１】
2019510504.tif 000041
【図１２】
2019510504.tif 000042
【図１３】
2019510504.tif 000043
【図１４】
2019510504.tif 000044
【図１５】
2019510504.tif 000045
【図１６】
2019510504.tif 000046
【図１７】
2019510504.tif 000047
【図１８】
2019510504.tif 000048
【図１９】
2019510504.tif 000049
【図２０】
2019510504.tif 000050
【図２１】
2019510504.tif 000051
【図２２】
2019510504.tif 000052
【図２３】
2019510504.tif 000053
【図２４】
2019510504.tif 000054
【配列表】
2019510504000001.app
【国際調査報告】
2019510504.tif 000055
2019510504.tif 000056
2019510504.tif 000057
2019510504.tif 000058
2019510504.tif 000059
2019510504.tif 000060