(57)【要約】本発明は、ＳＬＩＴ−ＲＯＢＯシステムを利用した筋減少症の予防または治療用組成物に関することで、より詳細には、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から選ばれた遺伝子またはその発現タンパク質を有効成分として含有する筋肉疾患の予防および治療用、または筋機能改善用組成物に関する。
2019529334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、
筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項２】
下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、
筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２タンパク質。
【請求項３】
前記Ｓｌｉｔ３タンパク質は、配列番号５の塩基配列から構成されるｓｌｉｔ３遺伝子から発現されることを特徴とする
請求項２に記載の筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記Ｒｏｂｏ１タンパク質は、配列番号６の塩基配列から構成されるｒｏｂｏ１遺伝子から発現されることを特徴とする
請求項２に記載の筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記Ｒｏｂｏ２タンパク質は、配列番号７の塩基配列から構成されるｒｏｂｏ２遺伝子から発現されることを特徴とする
請求項２に記載の筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記ＬＲＲＤ２タンパク質は、配列番号８の塩基配列から構成される遺伝子から発現されることを特徴とする
請求項２に記載の筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項７】
Ｓｌｉｔおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の活性化剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を有効成分として含む、
筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項８】
Ｒｏｂｏおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の活性化剤を有効成分として含む、
筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項９】
前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗または筋肉退化による筋肉疾患であることを特徴とする
請求項１、２、７または８に記載の筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
前記筋肉疾患は、無緊張症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋無力症、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）および筋肉減弱症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする
請求項９に記載の筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項１１】
Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはこれらの活性化剤を有効成分として含む、
筋肉疾患の予防および改善用健康機能食品。
【請求項１２】
下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、
筋肉疾患の予防および改善用健康機能食品：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２タンパク質。
【請求項１３】
Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはこれらの活性化剤を有効成分として含む、
筋機能改善用化粧料組成物。
【請求項１４】
下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、
筋機能改善用化粧料組成物：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２タンパク質。
【請求項１５】
Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはこれらの活性化剤を有効成分として含む、
筋機能改善用飼料添加物。
【請求項１６】
下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、
筋機能改善用飼料添加物：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２タンパク質。
【請求項１７】
ｉ）実験群である被検体由来試料で配列番号１のアミノ酸配列から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質の発現水準を測定する段階と；
ｉｉ）前記段階ｉ）で測定したＳｌｉｔ３タンパク質の発現水準を対照群である正常個体由来試料のＳｌｉｔ３タンパク質発現水準と比較する段階と；
ｉｉｉ）前記段階ｉｉ）で比較した実験群のＳｌｉｔ３タンパク質発現水準が対照群に比べて減少する場合、実験群を筋肉疾患と判断する段階と；を含む、
筋肉疾患診断の情報を提供するためのタンパク質検出方法。
【請求項１８】
前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗または筋肉退化による筋肉疾患であることを特徴とする
請求項１７に記載の筋肉疾患診断の情報を提供するためのタンパク質検出方法。
【請求項１９】
前記筋肉疾患は、無緊張症、筋萎縮症、筋ジストロフィー、筋無力症、悪液質および
筋肉減弱症よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする
請求項１８に記載の筋肉疾患診断の情報を提供するためのタンパク質検出方法。
【請求項２０】
ｉ）被検化合物または組成物を、配列番号１のアミノ酸配列から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質、配列番号２のアミノ酸配列から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質および配列番号３のアミノ酸配列から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質よりなる群から選ばれたいずれか一つ以上を発現する細胞株に処理する段階と；
ｉｉ）前記段階ｉ）の処理した細胞株で前記Ｓｌｉｔ３タンパク質の発現程度または前記Ｒｏｂｏ１タンパク質またはＲｏｂｏ２タンパク質の活性を測定する段階と；
ｉｉｉ）前記段階ｉｉ）の前記Ｓｌｉｔ３タンパク質の発現程度、またはＲｏｂｏ１タンパク質または前記Ｒｏｂｏ２タンパク質の活性が被検化合物または組成物を処理しない対照群細胞株と比較して増加した被検化合物または組成物を選別する段階と；を含む、
筋肉疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２１】
前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗または筋肉退化による筋肉疾患であることを特徴とする
請求項２０に記載の筋肉疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２２】
前記筋肉疾患は、無緊張症、筋萎縮症、筋ジストロフィー、筋無力症、悪液質および
筋肉減弱症よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする
請求項２１に記載の筋肉疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２３】
必要な個体にＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を投与する段階を含む、
筋肉疾患の治療方法。
【請求項２４】
必要な個体に下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を投与する段階を含む、
筋肉疾患の治療方法：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２ドメイン。
【請求項２５】
必要な個体にＳｌｉｔおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の活性化剤を投与する段階を含む、
筋肉疾患の治療方法。
【請求項２６】
必要な個体にＲｏｂｏおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の活性化剤を投与する段階を含む、
筋肉疾患の治療方法。
【請求項２７】
Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物に使用するための用途。
【請求項２８】
下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物に使用するための用途：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２ドメイン。
【請求項２９】
Ｓｌｉｔおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の活性化剤を筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物に使用するための用途。
【請求項３０】
Ｒｏｂｏおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の活性化剤を筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物に使用するための用途。
【請求項３１】
Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはこれらの活性化剤を筋肉疾患の予防および改善用健康機能食品に使用するための用途。
【請求項３２】
下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を筋肉疾患の予防および改善用健康機能食品に使用するための用途：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２タンパク質。
【請求項３３】
Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはこれらの活性化剤を筋機能改善用化粧料組成物に使用するための用途。
【請求項３４】
下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を筋機能改善用化粧料組成物に使用するための用途：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２タンパク質。
【請求項３５】
Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはこれらの活性化剤を筋機能改善用飼料添加物に使用するための用途。
【請求項３６】
下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を筋機能改善用飼料添加物に使用するための用途：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年０６月０８日付けで出願された韓国特許出願第１０−２０１６−００７１２５２号および２０１７年０１月３１日付けで出願された韓国特許出願第１０−２０１７−００１３７９９号を優先権として主張し、前記明細書の全体は、本出願の参考文献である。
【０００２】
本発明は、ＳＬＩＴ−ＲＯＢＯシステムを利用した筋減少症の予防または治療用組成物に関し、より詳細には、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から選ばれた遺伝子またはその発現タンパク質；および／またはその活性化剤を有効成分として含有する筋肉疾患の予防および治療用、または筋機能改善用組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｓｌｉｔタンパク質は、神経系の発生過程の間にニューロンとエキソンの移動を調節するものとしてよく知られているタンパク質である。Ｓｌｉｔタンパク質は、Ｒｏｂｏ受容体と作用して生理学的活性を調節することができ、心臓、肺、腎臓、乳房組織など多様な組織において多様な細胞内過程を調節する因子として役割をするものと知られており、最近、細胞の生長、付着能および移動能の調節に重要な役割をすることが報告されて、細胞の分化過程での移動および癌の発生と転移過程にＳｌｉｔタンパク質が関与できることが報告されたことがある。具体的に、脊椎動物の胚芽発達段階でＳｌｉｔタンパク質およびＲｏｂｏタンパク質が発現し、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１およびＲｏｂｏ２タンパク質の発現が筋肉組織で増加することが報告されたことがある（Ｎｅｉｌ  Ｖａｒｇｅｓｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０６．１（２００１）：１７５−１８０）。この報告によれば、Ｓｌｉｔ３タンパク質は、胚芽の後足の筋肉組織の筋芽細胞で発現が増加するが、移動能（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に関与するだけであり、筋芽細胞の分化には関連しないものと言及している。
【０００４】
ヒトＲｏｂｏタンパク質は、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、Ｒｏｂｏ３およびＲｏｂｏ４の四つの形態で存在する。ＳｌｉｔとＲｏｂｏは、どのような亜型が互いに結合するかによって多様な役割をすることができるものと報告されたが、発現細胞によって役割が変わることができ、まだ活発に研究されている。これと関連して、韓国登録特許第１０−１６１７４９７号には、Ｓｌｔ３タンパク質がＲｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２と相互作用して活性を示し、これにより、造骨細胞の分化を誘導することができ、骨形成を増加させることができることが記載されている。
【０００５】
筋減少症は、骨格筋の量および機能が低下した状態をいう。筋減少症は、老化、ホルモン異常、栄養不足、身体活動不足、炎症および退行性疾患など多様な原因により発生するが、それらのうち、老化および性ホルモンの不足が主な原因となり得ると知られており、医療技術の発展および多様な治療剤の開発によって全世界的に平均寿命が増加するに伴って、高齢化人口が増加しており、これに伴い、筋減少症に対する治療の要求も持続的に増加するものと予想されている。
【０００６】
筋減少症患者において、筋芽細胞の幹細胞である衛星細胞の募集、活性または増殖の障害による筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）の個数が減少し、筋芽細胞の増殖および分化が減少し、これに伴い、筋減少症患者の筋肉は、組織学的な水準で筋線維の大きさおよび数が減少して、筋機能が減少する症状が現れる。
【０００７】
過去１０余年間米国およびヨーロッパを中心に筋減少症の力学に対する研究が活発に行われて、最近、筋減少症の臨床的重要性に対する関心が急増している。初期の研究では、筋減少症が全身衰弱、活動障害および筋力減少によって人生の質の低下を誘発するという結果が主流をなしたが、最近に発表される研究では、人生の質以外にも、骨粗しょう症性の骨折危険が顕著に増加できることが報告された。また、筋減少症患者において糖尿病および代謝症候群、肥満、慢性腎不全、慢性肝不全などの慢性疾患が誘発され、究極的には、死亡率も増加させるので、筋減少症は、適切に治療を受けなければならない疾患として関心が集中している。
【０００８】
最近、米国では、筋減少症患者において身体障害が発生する可能性が約１．５倍〜約３．５倍が増加することにより、年間１８５億ＵＳＤの社会的費用を誘発すると報告されたことがある。韓国では、国民健康栄養調査によれば、筋減少症の有病率は、６０才以上男性の４２．０％と女性の４２．７％と非常にありふれている疾患であり、特に韓国は、全世界でも高齢化の速度が最も高いので、今後重要な社会的問題になることが確実である。
【０００９】
現在、筋減少症には、運動、タンパク質およびカロリー補充が役に立つと知られているが、筋減少症患者の大部分を占める老人にとっては、大きく役に立たないため、筋減少症の治療剤が切実に必要である。しかしながら、現在筋減少症に使用される治療剤は、筋肉減少の改善および筋肉量の増進に直接的な効果を示す薬物はまだ臨床実験水準の段階にあり、現在、最終的にＦＤＡ承認を受けた薬剤はないのが現況である。それ故に、筋減少症の治療のために、一部選択的アンドロゲン受容体モジュレーター、アクチビン受容体アンタゴニスト、速骨格筋トロポニンインヒビターなどを筋減少症の治療剤として開発しようとする努力はあるが、現在初期臨床を試みる水準である。
【００１０】
筋減少症の治療剤の動向に対するレポートによれば、２０１０年に全世界的な筋減少症の治療剤の市場は、約１０００万ドル（ＵＳ）であり、２０１８年２０００万ドル（ＵＳ）規模に成長すると予測されると報告された（“Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ−Ｐｉｐｅｌｉｎｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｅｔ  Ｆｏｒｅｃａｓｔｓ  ｔｏ  ２０１８”，２０１１．１１．１７）。また、２０１３年にＥＵ傘下の民間保管協力体であるＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｉｃｉｎｅｓ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅでは、４大保健研究主題の一つとして老人筋減少症の治療剤の開発に約５千万ユーロを投資することに発表して進行中にある。
【００１１】
これより、本発明者らは、筋減少症に対して直接的に治療効果を示すことができる治療剤を開発するために努力した結果、Ｓｌｉｔタンパク質が欠乏したマウスで筋肉量が減少し、Ｓｌｉｔタンパク質がＲｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２受容体と結合して、Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏシステムを介して筋芽細胞のＭ−カドヘリンに結合されていたβ−カテニンが遊離（ｒｅｌｅａｓｅ）してβ−カテニンを活性化し、ミオゲニンの発現を増加させて、筋芽細胞の分化を誘導することにより、筋肉の形成を促進し得ることを確認した。また、特にＳｌｉｔタンパク質全長だけでなく、その活性断片であるＬＲＲＤ２タンパク質を処理する場合にも、筋芽細胞の分化を促進させて筋肉量の増加を誘導することができるので、Ｓｌｉｔタンパク質、Ｒｏｂｏタンパク質、これらの活性断片、またはこれを暗号化する遺伝子は、筋減少症の予防および治療用／改善用組成物の有効成分として使用することができることを確認することにより、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＫＲ１０−１６１７４９７Ｂ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このように、本発明者らは、Ｓｌｉｔタンパク質がＲｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２受容体と結合して、Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏシステムを介して筋芽細胞のＭ−カドヘリンに結合されていたβ−カテニンを遊離してβ−カテニンを活性化し、ミオゲニンの発現を増加させて、筋芽細胞の分化を誘導することにより、筋肉の形成を促進することができることを確認した。また、Ｓｌｉｔタンパク質全長だけでなく、特にその活性断片を処理する場合にも、筋芽細胞の分化を促進させて筋肉量の増加を誘導することができることを確認することにより、本発明を完成した。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、筋肉疾患の予防および改善用健康機能食品、または飼料添加物を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、筋機能改善用化粧料組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、筋肉疾患診断の情報を提供するためのタンパク質検出方法を提供することにある。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、筋肉疾患治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
前記目的を達成するために、本発明は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはその活性化剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を有効成分として含む、筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
【００２０】
本発明の好ましい一実施例では、下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物を提供する：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２タンパク質。
【００２１】
また、本発明は、必要な個体にＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を投与する段階を含む、筋肉疾患の治療方法を提供する。
【００２２】
また、本発明は、必要な個体に前記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を投与する段階を含む、筋肉疾患の治療方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は、必要な個体にＳｌｉｔおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の活性化剤を投与する段階を含む、筋肉疾患の治療方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、必要な個体にＲｏｂｏおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の活性化剤を投与する段階を含む、筋肉疾患の治療方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物に使用するための用途を提供する。
【００２６】
また、本発明は、前記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物に使用するための用途を提供する。
【００２７】
また、本発明は、Ｓｌｉｔおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の活性化剤を筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物に使用するための用途を提供する。
【００２８】
また、本発明は、Ｒｏｂｏおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の活性化剤を筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物に使用するための用途を提供する。
【００２９】
また、本発明は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはこれらの活性化剤を有効成分として含む、筋肉疾患の予防および改善用健康機能食品を提供する。
【００３０】
また、本発明は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはこれらの活性化剤を筋肉疾患の予防および改善用健康機能食品に使用するための用途を提供する。
【００３１】
また、本発明は、前記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を筋肉疾患の予防および改善用健康機能食品に使用するための用途を提供する。
【００３２】
本発明の好ましい一実施例では、前記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、筋肉疾患の予防および改善用健康機能食品を提供する。
【００３３】
また、本発明は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはこれらの活性化剤を有効成分として含む、筋機能改善用化粧料組成物を提供する。
【００３４】
また、本発明は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはこれらの活性化剤を筋機能改善用化粧料組成物に使用するための用途を提供する。
【００３５】
また、本発明は、前記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を筋機能改善用化粧料組成物に使用するための用途を提供する。
【００３６】
本発明の好ましい一実施例では、前記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、筋機能改善用化粧料組成物を提供する。
【００３７】
また、本発明は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはこれらの活性化剤を有効成分として含む、筋機能改善用飼料添加物を提供する。
【００３８】
また、本発明は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはこれらの活性化剤を筋機能改善用飼料添加物に使用するための用途を提供する。
【００３９】
また、本発明は、前記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を筋機能改善用飼料添加物に使用するための用途を提供する。
【００４０】
本発明の好ましい一実施例では、前記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、筋機能改善用飼料添加物を提供する。
【００４１】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記Ｓｌｉｔ３タンパク質は、配列番号５の塩基配列から構成されるｓｌｉｔ３遺伝子から発現されるものであってもよい。
【００４２】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記Ｒｏｂｏ１タンパク質は、配列番号６の塩基配列から構成されるｒｏｂｏ１遺伝子から発現されるものであってもよい。
【００４３】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記Ｒｏｂｏ２タンパク質は、配列番号７の塩基配列から構成されるｒｏｂｏ２遺伝子から発現されるものであってもよい。
【００４４】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ＬＲＲＤ２タンパク質は、配列番号８の塩基配列から構成される遺伝子から発現されるものであってもよい。
【００４５】
本発明の他の好ましい一実施例によれば、前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗または筋肉退化による筋肉疾患であってもよく、前記筋肉疾患は、無緊張症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉退化、筋無力症、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）および筋肉減弱症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上のものであってもよい。
【００４６】
また、本発明は、
ｉ）実験群である被検体由来試料で配列番号１のアミノ酸配列から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質の発現水準を測定する段階と；
ｉｉ）前記段階ｉ）で測定したＳｌｉｔ３タンパク質の発現水準を対照群である正常個体由来試料のＳｌｉｔ３タンパク質発現水準と比較する段階と；
ｉｉｉ）前記段階ｉｉ）で比較した実験群のＳｌｉｔ３タンパク質発現水準が対照群に比べて減少する場合、実験群を筋肉疾患と判断する段階と；を含む、筋肉疾患診断の情報を提供するためのタンパク質検出方法を提供する。
【００４７】
また、本発明は、
ｉ）被検化合物または組成物を、配列番号１のアミノ酸配列から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質、配列番号２のアミノ酸配列から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質および配列番号３のアミノ酸配列から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質よりなる群から選ばれたいずれか一つ以上を発現する細胞株に処理する段階と；
ｉｉ）前記段階ｉ）の処理した細胞株で前記Ｓｌｉｔ３タンパク質の発現程度または前記Ｒｏｂｏ１タンパク質またはＲｏｂｏ２タンパク質の活性を測定する段階と；
ｉｉｉ）前記段階ｉｉ）のＳｌｉｔ３タンパク質の発現程度、またはＲｏｂｏ１タンパク質またはＲｏｂｏ２タンパク質の活性が被検化合物または組成物を処理しない対照群細胞株と比較して増加した被検化合物または組成物を選別する段階と；を含む、筋肉疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００４８】
本発明は、ＳＬＩＴ−ＲＯＢＯシステムを利用した筋減少症の予防または治療用組成物を提供することができる。特に本発明は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から選ばれた遺伝子またはその発現タンパク質；またはその活性化剤を含有する筋肉疾患の予防および治療用、または筋機能改善用組成物を提供することができる。
【００４９】
特に、具体的には、本発明のＳｌｉｔタンパク質は、Ｒｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２受容体と結合して、Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏシステムを介して筋芽細胞のＭ−カドヘリン（Ｍ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）に結合されていたβ−カテニン（β−ｃａｔｅｎｉｎ）を遊離してβ−カテニンを活性化し、ミオゲニンの発現を増加させて、筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）の分化を誘導することにより、筋肉の形成を促進することができる。また、Ｓｌｉｔタンパク質全長だけでなく、その活性断片、特に好ましくはＬＲＲＤ２タンパク質を処理する場合にも、筋芽細胞の分化を促進させて筋肉量の増加を誘導することができるので、本発明のＳｌｉｔタンパク質、Ｒｏｂｏタンパク質、これらの活性断片、またはこれを暗号化する遺伝子は、筋減少症の予防および治療用薬学的組成物の有効成分として使用することができるので効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
図１ａ〜図１ｅは、Ｓｌｉｔ３が欠乏した雄性マウスモデル群において体重変化および筋減少指標を示す。
図２ａ〜図２ｅは、Ｓｌｉｔ３が欠乏した雌性マウスモデル群において体重変化および筋減少指標を示す。
図３ａ〜図３ｄは、Ｓｌｉｔ３が欠乏した雄性マウスモデル群のＥＤＬ筋肉をＨ＆Ｅ染色した結果を示す。
図４ａ〜図４ｄは、Ｓｌｉｔ３が欠乏した雄性マウスモデル群のＧＣ筋肉をＨ＆Ｅ染色した結果を示す。
図５ａ〜図５ｄは、Ｓｌｉｔ３が欠乏した雄性マウスモデル群のＧＣ筋肉を免疫組織化学染色した結果を示す。
図６は、Ｓｌｉｔ３の筋芽細胞分化促進効果を確認するためにＳｌｉｔ３処理によるＣ２Ｃ１２細胞株の細胞生存能の変化の確認を示す。
図７ａ〜図７ｅは、筋芽細胞から筋管細胞（ｍｙｏｔｕｂｅ）への分化においてＳｌｉｔ３の分化増加効果を示す。
図８ａ〜図８ｆは、筋芽細胞の分化過程でＳｌｉｔ３処置による多様な筋原性調節因子のｍＲＮＡ発現水準の変化を示す。
図９ａおよび図９ｂは、筋芽細胞の分化過程でＳｌｉｔ３処置によるミオゲニンのタンパク質発現水準の変化を示す。
図１０は、筋芽細胞の分化過程でＳｌｉｔ３処置によるミオゲニン陽性細胞数の差異を示す。
図１１は、筋芽細胞で発現するカドヘリンタンパク質の種類および発現水準を確認した図である：
図１１ａは、筋芽細胞でＭ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンのｍＲＮＡ発現水準を示し；および
図１１ｂは、筋芽細胞でＭ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンのタンパク質発現水準を示す。
図１２は、Ｓｌｉｔ３のβ−カテニン活性化による筋芽細胞の分化誘導効果を確認した図である：
図１２ａは、筋芽細胞でＳｌｉｔ３の添加によるβ−カテニン活性の確認を示し；
図１２ｂは、Ｓｌｉｔ３処置によるＭ−カドヘリンおよびβ−カテニンの結合水準の変化を共同免疫沈降法で確認した結果を示し；
図１２ｃ〜図１２ｅは、β−カテニン発現抑制によるＳｌｉｔ３の筋芽細胞の分化収率の確認を示し；および
図１２ｆは、β−カテニン発現抑制によるＳｌｉｔ３処置した筋芽細胞でミオゲニンの発現水準の変化を示す。
図１３は、筋芽細胞でＳｌｉｔ３と結合するＲｏｂｏ受容体亜型を確認した図である：
図１３ａは、筋芽細胞であるＣ２Ｃ１２細胞で発現するＲｏｂｏ受容体の亜型を示し；および
図１３ｂ〜図１３ｄは、Ｃ２Ｃ１２細胞でＲｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２ノックアウトによってＳｌｉｔ３によるミオゲニン発現増加効果が有意的に増加しないことを示す。
図１４ａ〜図１４ｅは、Ｒｏｂｏ受容体が欠乏したマウスモデルにおいて体重変化および筋減少指標の確認を示す。
図１５ａ〜図１５ｄは、試験管内水準でＳｌｉｔ３のＬＲＲＤ２による筋芽細胞分化効果を示す。
図１６ａ〜図１６ｅは、生体内水準でＳｌｉｔ３のＬＲＲＤ２による体重変化および筋減少指標増加効果の確認を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
前述したように、全世界的に平均寿命が増加するに伴って、高齢化人口が増加しており、これに伴い、筋減少症に対する治療要求も持続的に増加するものと予想されるが、まだ筋減少症の治療剤としてＦＤＡの承認を受けた水準の薬剤は報告されたことがない。
【００５２】
本発明の一具体例では、Ｓｌｉｔタンパク質またはその活性断片は、Ｒｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２受容体と結合して、Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏシステムを介して筋芽細胞のＭ−カドヘリン（Ｍ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）に結合されていたβ−カテニンを遊離してβ−カテニンを活性化し、ミオゲニンの発現を増加させて、筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）の分化を誘導することにより、筋肉の形成を促進することができるので、直接的に筋減少症に対する治療に効果を示すことができることを確認した。
【００５３】
したがって、本発明は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３タンパク質、Ｒｏｂｏ１タンパク質、Ｒｏｂｏ２タンパク質およびＬＲＲＤ２タンパク質から構成される群から選ばれるいずれか一つ以上のタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子；またはその活性化剤を有効成分として含む、筋肉疾患の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
【００５４】
本発明の「Ｓｌｉｔ３タンパク質」は、配列番号１のアミノ酸から構成され、本発明の「Ｒｏｂｏ１タンパク質」は、配列番号２のアミノ酸から構成され、本発明の「Ｒｏｂｏ２タンパク質」は、配列番号３のアミノ酸から構成され、本発明の「ＬＲＲＤ２タンパク質」は、配列番号４のアミノ酸から構成されることが好ましく、前記タンパク質またはペプチドの機能的同等物を含むことができる。
【００５５】
前記「機能的同等物」は、タンパク質またはペプチドのアミノ酸の付加、置換または欠失により、前記配列番号１〜４のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有するものであって、配列番号１〜４のアミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドと実質的に同質の生理活性を示すタンパク質またはペプチドを言う。
【００５６】
本発明の「活性化剤」は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、および／またはこれらの断片の発現を増強させることができるか、またはＳＬＩＴ−ＲＯＢＯシステムを活性化させることができる各種化合物、タンパク質またはペプチド、塩基配列などを含む。前記化合物、タンパク質またはペプチド、塩基配列の各種メタボローム、前駆体、薬剤学的等価物も、前記活性化剤に含まれる。
【００５７】
本発明の「Ｓｌｉｔ３タンパク質」は、配列番号５の塩基配列から構成されるｓｌｉｔ３遺伝子から発現されることが好ましく、「Ｒｏｂｏ１タンパク質」は、配列番号６の塩基配列から構成されるｒｏｂｏ１遺伝子から発現されることが好ましく、「Ｒｏｂｏ２タンパク質」は、配列番号７の塩基配列から構成されるｒｏｂｏ２遺伝子から発現されることが好ましく、「ＬＲＲＤ２タンパク質」は、配列番号８の塩基配列から構成される遺伝子から発現されることが好ましいが、これらに限らない。
【００５８】
本発明の筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗または筋肉退化による筋肉疾患として当業界に報告された疾病であることが好ましく、具体的に、無緊張症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉退化、筋無力症、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）および筋肉減弱症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることがより好ましいが、これらに限らない。
【００５９】
前記筋肉消耗または退化は、先天的要因、後天的要因、老化などを原因として発生し、筋肉消耗は、筋肉量の漸進的損失、筋肉、特に骨格筋または随意筋および心臓筋肉の弱化および退行を特徴とする。
【００６０】
より具体的に、前記筋肉は、筋、筋肉、腱を包括して称し、筋機能または筋肉機能は、筋肉の収縮により力を発揮できる能力を意味し、筋肉が抵抗に耐えるために最大限の収縮力を発揮できる筋力；筋肉が与えられた重量にどのくらい長い間または何回くらい収縮と弛緩を繰り返すことができるかを示す能力である筋持久力；および短時間内に強い力を発揮する能力である瞬発力を含む。前記筋機能は、筋肉量に比例し、用語「筋機能改善」は、筋機能をより肯定的な方向に向上させることを意味する。
【００６１】
本発明の好ましい実施例において、本発明者らは、Ｓｌｉｔ３発現と筋肉量の関係を確認した結果、Ｓｌｉｔ３が欠乏したマウスは、骨格筋が減少し（図１、図２、表１および表２）、筋線維の面積は、顕著に減少するが、筋芽細胞およびその衛星細胞の個数自体には、変化がないことを確認した（図３〜図５）。
【００６２】
また、本発明者らは、Ｓｌｉｔ３の筋芽細胞分化促進効果を確認した結果、Ｓｌｉｔ３は、筋芽細胞の生存能には影響を及ぼさないものであり、筋芽細胞が筋線維へ分化することができるようにすることを確認し（図６および図７）、このような分化に関与する筋原性調節因子のうちＳｌｉｔ３によりミオゲニンの発現が増加することを確認した（図８〜図１０）。
【００６３】
また、本発明者らは、筋芽細胞が筋線維へ分化する過程において、筋芽細胞に発現したＭ−カドヘリンがＮ−カドヘリンに比べて発現が豊富であることと、Ｍ−カドヘリンと結合するβ−カテニンが遊離してβ−カテニン活性がＳｌｉｔ３により増加することを確認して（図１１ａ、図１１ｂおよび図１２ａ）、筋芽細胞の分化過程でＳｌｉｔ３を通じてＭβ−カテニンの活性が増加し、ミオゲニンの発現を増加させて、筋芽細胞の分化を誘導することにより、筋肉の形成の促進に関与することができることを確認した（図１２ｂ、図１２ｃ〜図１２ｅおよび図１２ｆ）。
【００６４】
また、本発明者らは、筋芽細胞でＳｌｉｔ３と結合するＲｏｂｏ受容体亜型を確認した結果、筋芽細胞の表面にＲｏｂｏ１およびＲｏｂｏ２受容体が発現していて、これらがＳｌｉｔ−Ｒｏｂｏシステムを成してＳｌｉｔ３の効果を示すことを確認した（図１３ａおよび図１３ｂおよび図１３ｃ）。特にＲｏｂｏ１が欠乏する場合、生体水準で筋肉量が減少することを示すので、Ｓｌｉｔ３および、Ｒｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２の結合システムを介して筋減少症の改善効果が示されることを確認した（表３および図１４）。
【００６５】
また、本発明者らは、Ｓｌｉｔ３のＬＲＲＤ２ドメインによる筋芽細胞の分化および筋肉量増進効果を確認した結果、試験管内水準では、Ｓｌｉｔ３のＬＲＲＤ２による筋芽細胞分化効果が増加し、生体内水準では、Ｓｌｉｔ３のＬＲＲＤ２を投与した筋減少症のモデルマウスで体重および筋減少指標が増加することを確認した（図１５、図１６および表４）。
【００６６】
したがって、本発明のＳｌｉｔタンパク質は、Ｒｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２受容体と結合して、Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏシステムを介して筋芽細胞のＭ−カドヘリンに結合されていたβ−カテニンを遊離してβ−カテニンを活性化し、ミオゲニンの発現を増加させて、筋芽細胞の分化を誘導することにより、筋肉の形成を促進することができる。また、Ｓｌｉｔタンパク質全長だけでなく、その活性断片を処理する場合にも、筋芽細胞の分化を促進させて、筋肉量の増加を誘導することができるので、本発明において特に好ましくは、Ｓｌｉｔ３タンパク質またはＳｌｉｔ３のＬＲＲＤ２タンパク質、またはこれを暗号化する遺伝子は、筋減少症の予防および治療用薬学的組成物の有効成分として使用することができる。
【００６７】
本発明のタンパク質またはペプチドは、その野生型アミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドだけでなく、そのアミノ酸配列の変異体も、本発明の範囲に含まれ得る。前記アミノ酸配列の変異体とは、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２またはＬＲＲＤ２の野生型アミノ酸配列と一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合せによって異なる配列を有するタンパク質またはペプチドを意味する。
【００６８】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドで可能なアミノ酸の交換は、当該分野に公知されている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も通常的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）等に変更（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されることもできる。
【００６９】
本発明のＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質およびＬＲＲＤ２タンパク質、またはこれらの変異体は、天然から抽出したり、合成（Ｍｅｒｒｉｆｌｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６，１９６３）またはＤＮＡ配列を基本とする遺伝子組換え方法により製造され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ、２版、１９８９）。
【００７０】
本発明のＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質およびＬＲＲＤ２タンパク質は、タンパク質の形態だけでなく、遺伝子治療やワクチンなどに使用されるために、細胞内でＳｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質およびＬＲＲＤ２タンパク質を暗号化する遺伝子を発現することができる発現ベクターの形態で提供され得る。
【００７１】
前記発現ベクターは、前記Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質を暗号化する遺伝子を挿入して発現することができる当業界に公知となっている発現ベクターを利用することができ、例えばｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等の発現ベクターを使用することができる。
【００７２】
また、本発明のＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質およびＬＲＲＤ２タンパク質を暗号化する塩基配列、すなわちポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子を発現を調節する核酸配列に作動可能に連結した形態、例えば発現ベクターの形態で治療対象の患者内でこれが発現するように前記ポリヌクレオチドを投与することができる。前記ベクターは、コード配列を発現させることができるプロモーター部位を含む適当な転写調節信号を含み、前記プロモーターは、治療されるべき患者内で作動可能なものであることが好ましい。したがって、ヒト遺伝子治療用で、ＲＮＡポリメラーゼを転写開始部位に導くのに必要な配列だけでなく、適当ならエンハンサーを含む他の作動配列または調節配列を含む用語であるプロモーターは、好ましくはヒト遺伝子からのヒトプロモーター配列または一般的にヒトから発現される遺伝子からのヒトプロモーター配列、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのプロモーターであってもよい。このような観点から、適当な公知の真核プロモーターのうちＣＭＶ、すなわち初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のもののようなレトロウイルスＬＴＲプロモーター、およびマウスメタロチオネイン−１プロモーターのようなメタロチオネインプロモーターが適合している。
【００７３】
前記ポリヌクレオチド配列および転写調節配列は、商業的に入手可能なｐＢＲ３２２のようなプラスミドに基づいて複製可能なプラスミドベクター内にクローニングされて提供されるか、またはよく知られている公開された手続の日常的な応用により入手可能なプラスミドから構築されることもできる。
【００７４】
また、前記ベクターは、前記遺伝子配列の３’に位置する転写調節配列、およびヒト治療に使用されるとき、ＳＶ４０ウイルスのようなウイルスからの相当する配列のように治療されるべき患者から認識可能なポリアデニル化配列を含むことができる。その他、転写調節配列がこの技術分野によく知られていて、利用可能である。
【００７５】
また、前記発現ベクターは、前記ベクターが伝播され得るように抗生剤抵抗性のような選択可能なマーカーを含むことができる。
【００７６】
それ自体で前記タンパク質またはペプチドを合成することができる発現ベクターを物理的方法で直接に傷部位に導入させることができる。これらの例としては、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような製薬学的に許容される賦形剤中の溶液内に適当なピヒクル内の「ネイキッド」核酸ベクターを局部的に適用すること、または当業界に知られている方法により「遺伝子銃」技術とも知られている粒子弾丸のような物理的方法でベクターを投与することを含む。前記「遺伝子銃」技術は、米国特許第５３７１０１５号に記述されたように、推進装置からの高圧力下で放出させる方法であり、ベクターでコートされた金ビーズのような不活性粒子を傷部位、例えば皮膚細胞の表面を通過することができるほど十分な速力で加速することである。また、ＤＮＡを直接受容体に投与するその他物理的方法としては、超音波、電気的刺激、電気透過およびマイクロシーディング等がある。
【００７７】
また、前記遺伝子配列は、形質転換された宿主細胞の手段で傷部位に投与され得る。細胞は、患者から回収された細胞を含み、前記核酸配列をこの細胞内に当業界に公知となっている遺伝子導入方法により導入して、形質転換された細胞を培養液中で成長させて、患者に移植することができる。
【００７８】
前述したような発現構造体を本発明の治療に多様な方法で使用することができる。したがって、前記発現構造体は、患者にとって治療が必要な部位に直接投与され得る。
【００７９】
また、本発明の薬学的組成物は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質の発現を増加させる活性因子を有効成分として含むことができる。
【００８０】
前記Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質の発現を増加させる活性因子は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２遺伝子またはＬＲＲＤ２を暗号化する遺伝子に直接または間接に作用して、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質の生物学的活性を改善、誘導、刺激、増加させる物質を意味する。前記物質は、有機または無機化合物のような単一化合物、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物および脂質のような生体高分子化合物および複数化合物の複合体などを含む。前記ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３の発現を増加させる活性因子は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３の発現、活性、または機能の減少により発病する疾病の予防、改善および治療に用いられる。
【００８１】
前記物質がｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２遺伝子またはＬＲＲＤ２を暗号化する遺伝子を活性化させる機作は、特に制限されない。例えば、前記物質は、転写、翻訳などの遺伝子発現を増大させるか、非活性型を活性型に転換させる機作として作用することができる。好ましくは、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２遺伝子またはＬＲＲＤ２を暗号化する遺伝子を活性化させる物質は、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物および脂質のような生体高分子化合物である。核酸およびタンパク質配列が既に公知となっているｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３に対して、当業者は、誘導剤または活性剤として作用する有機または無機化合物のような単一化合物ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物および脂質ような生体高分子化合物および複数化合物の複合体などを当該分野の技術を利用して製造したり、スクリーニングすることができる。
【００８２】
本発明の組成物は、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。前記組成物を剤形化する場合には、一つ以上の緩衝剤（例えば、食塩水またはＰＢＳ）、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、充填剤、増量剤、結合剤、アジュバント（例えば、アルミニウムヒドロキシド）、懸濁剤、濃厚剤、湿潤剤、崩解剤または界面活性剤、希釈剤または賦形剤を使用して調製され得る。
【００８３】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン（トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプンなどを含む）、カルシウムカーボネート、スクロース、ラクトース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチル−セルロースまたはゼラチンなどを混ぜて調製される。例えば、活性成分を固体賦形剤と配合した後、これを粉砕し、適合な補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工することにより、錠剤または糖衣錠を収得することができる。
【００８４】
また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルク等のような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤またはシロップ剤などが該当するが、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤または保存剤などが含まれ得る。また、場合によって、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはナトリウムアルギネートなどを崩解剤として添加することができ、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤および防腐剤などをさらに含むことができる。
【００８５】
非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥製剤または坐剤などが含まれる。非水性溶剤および懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用され得る。坐剤の基剤としては、ウィテプソル、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリンジ、グリセロール、ゼラチンなどが使用され得る。
【００８６】
本発明の組成物は、経口または非経口で投与され得、非経口投与時に皮膚外用；腹腔内、直腸、静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射する注射剤；経皮投与剤；または鼻腔吸入剤の形態で当業界に公知となっている方法により剤形化することができる。
【００８７】
前記注射剤の場合には、必ず滅菌されなければならないし、バクテリアおよび真菌のような微生物の汚染から保護されなければならない。注射剤の場合、適合な担体の例としては、これらに限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、これらの混合物および／または植物油を含む溶媒または分散媒質であってもよい。より好ましくは、適合な担体としては、ハンクス溶液、リンガー液、トリエタノールアミンが含まれたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）または注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコールおよび５％デキストロースのような等張溶液などを使用することができる。前記注射剤を微生物の汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのような多様な抗菌剤および抗真菌剤をさらに含むことができる。また、前記注射剤は、多くの場合、糖またはナトリウムクロリドのような等張化剤をさらに含むことができる。
【００８８】
経皮投与剤の場合、軟こう剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスタ剤、リニメント剤、エアロゾル剤などの形態が含まれる。前記で経皮投与は、薬学組成物を局所的に皮膚に投与して、薬学組成物に含有された有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。
【００８９】
吸入投与剤の場合、本発明によって使用される組成物は、適合な推進剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適合な気体を使用して、加圧パックまたは煙霧機からエアロゾルスプレー形態で便利に伝達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を伝達するバルブを提供して決定することができる。例えば、吸入器または吹込器に使用されるゼラチンカプセルおよびカートリッジは、化合物、およびラクトースまたはデンプンのような適合な粉末基剤の粉末混合物を含有するように剤形化することができる。非経口投与用剤形は、すべての製薬化学に一般的に公知となった処方書である文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）に記載されている。
【００９０】
本発明の組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬剤学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／危険割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られている要素によって決定され得る。本発明の組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤と順次にまたは同時に投与され得、単一または多重投与され得る。すなわち、本発明の組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ）で患者に投与され得、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与され得る。上記した要素を全部考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者により容易に決定され得る。
【００９１】
本発明の薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度によってその範囲が多様である。一日投与量とては、非経口投与時にＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質を基準として一日に体重１ｋｇ当たり好ましくは０．０１〜５０ｍｇ、より好ましくは０．１〜３０ｍｇの量で投与されるように、そして、経口投与時には、本発明のＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質を基準として一日に体重１ｋｇ当たり好ましくは０．０１〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇの量で投与されるように、１〜数回に分けて投与することができる。しかしながら、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減することができるので、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００９２】
本発明の組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療および生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００９３】
また、本発明の薬学組成物は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質、またはこれを暗号化する塩基配列を有効成分として含む外用剤の剤形で提供することができる。本発明の筋肉疾患の予防および治療用薬学組成物を皮膚外用剤として使用する場合、さらに、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤およびゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型乳化剤、非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性活性剤、親油性活性剤または脂質小胞など皮膚外用剤に通常使用される任意の他の成分のような皮膚科学分野において通常使用される補助剤を含有することができる。また、前記成分は、皮膚科学分野において一般的に使用される量で導入され得る。
【００９４】
本発明の筋肉疾患の予防および治療用薬学組成物が皮膚外用剤として提供される場合、これに制限されるものではないが、軟膏、パッチ、ゲル、クリームまたは噴霧剤などの剤形であってもよい。
【００９５】
また、本発明は、Ｓｌｉｔ１タンパク質、Ｓｌｉｔ２タンパク質、Ｓｌｉｔ３タンパク質、Ｒｏｂｏ１タンパク質、Ｒｏｂｏ２タンパク質およびＬＲＲＤ２タンパク質から構成される群から選ばれるいずれか一つ以上のタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、筋肉疾患の予防および改善用健康機能食品を提供する。
【００９６】
本発明の「Ｓｌｉｔ３タンパク質」は、配列番号１のアミノ酸から構成され、本発明の「Ｒｏｂｏ１タンパク質」は、配列番号２のアミノ酸から構成され、本発明の「Ｒｏｂｏ２タンパク質」は、配列番号３のアミノ酸から構成され、本発明の「ＬＲＲＤ２タンパク質」は、配列番号４のアミノ酸で構成されることが好ましく、前記タンパク質またはペプチドの機能的同等物を含むことができる。
【００９７】
前記「機能的同等物」は、タンパク質またはペプチドのアミノ酸の付加、置換または欠失により、前記配列番号１〜４のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有するものであり、配列番号１〜４のアミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドと実質的に同質の生理活性を示すタンパク質またはペプチドをいう。
【００９８】
本発明の「Ｓｌｉｔ３タンパク質」は、配列番号５の塩基配列から構成されるｓｌｉｔ３遺伝子から発現されることが好ましく、「Ｒｏｂｏ１タンパク質」は、配列番号６の塩基配列から構成されるｒｏｂｏ１遺伝子から発現されることが好ましく、「Ｒｏｂｏ２タンパク質」は、配列番号７の塩基配列から構成されるｒｏｂｏ２遺伝子から発現されることが好ましく、「ＬＲＲＤ２タンパク質」は、配列番号８の塩基配列から構成される遺伝子から発現されることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
本発明の筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗または筋肉退化による筋肉疾患として当業界に報告された疾病であることが好ましく、具体的に、無緊張症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉退化、筋無力症、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）および筋肉減弱症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることがより好ましいが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
前記筋肉消耗または退化は、先天的要因、後天的要因、老化などを原因として発生し、筋肉消耗は、筋肉量の漸進的損失、筋肉、特に骨格筋または随意筋および心臓筋肉の弱化および退行を特徴とする。
【０１０１】
より具体的に、前記筋肉は、筋、筋肉、腱を包括して称し、筋機能または筋肉機能は、筋肉の収縮により力を発揮できる能力を意味し、筋肉が抵抗に耐えるために最大限の収縮力を発揮できる筋力；筋肉が与えられた重量にどのくらい長い間または何回くらい収縮と弛緩を繰り返すことができるかを示す能力である筋持久力；および短時間内に強い力を発揮する能力である瞬発力を含む。前記筋機能は、筋肉量に比例し、用語「筋機能改善」は、筋機能をより肯定的な方向に向上させることを意味する。
【０１０２】
本発明のＳｌｉｔタンパク質は、Ｒｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２受容体と結合して、Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏシステムを介して筋芽細胞のＭ−カドヘリンに結合されていたβ−カテニンを遊離してβ−カテニンを活性化し、ミオゲニンの発現を増加させて、筋芽細胞の分化を誘導することにより、筋肉の形成を促進することができる。また、Ｓｌｉｔタンパク質全長だけでなく、その活性断片、特に好ましくはＬＲＲＤ２タンパク質を処理する場合にも、筋芽細胞の分化を促進させて筋肉量の増加を誘導することができるので、本発明のＳｌｉｔタンパク質またはＳｌｉｔの活性断片、またはこれを暗号化する遺伝子は、筋減少症の予防および改善用健康機能食品の有効成分として使用することができる。また、本発明のＳｌｉｔタンパク質またはＳｌｉｔの活性断片、またはこれを暗号化する遺伝子は、筋減少症の予防および改善用飼料組成物の有効成分として使用することができる。
【０１０３】
本発明による食品組成物は、当業界に公知となっている通常の方法により多様な形態で製造することができる。一般食品としては、これらに限定されるものではないが、飲料（アルコール性飲料を含む）、果実およびその加工食品（例：果物缶詰め、瓶詰、ジャム、 マーマレードなど）、魚類、肉類およびその加工食品（例：ハム、ソーセージ、コーンビーフなど）、パン類および麺類（例：うどん、ソバ、ラーメン、スパゲッティ、マカロニなど）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例：バター、チーズなど）、食用植物油脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例：韓国式味噌、醤油、ソースなど）等に本発明のＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質を添加して製造することができる。また、栄養補助剤としては、これらに限定されるものではないが、カプセル、タブレット、丸などに本発明のＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質を添加して製造することができる。また、健康機能食品としては、これらに限定されるものではないが、例えば、本発明のＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質自体をお茶、ジュースおよびドリンクの形態で製造して飲用（健康飲料）することができるように、液状化、顆粒化、カプセル化および粉末化して摂取することができる。また、本発明のＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質を食品添加剤の形態で使用するためには、粉末または濃縮液の形態で製造して使用することができる。また、本発明のＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質と筋肉疾患予防および筋機能改善効果があると知られている公知の活性成分と共に混合して組成物の形態で製造することができる。
【０１０４】
本発明のＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質を健康飲料として利用する場合、前記健康飲料組成物は、通常の飲料のように、様々な香味剤または天然炭水化物などを更なる成分として含有することができる。前述した天然炭水化物は、葡萄糖、果糖のようなモノサッカライド；マルトース、スクロースのようなジサッカライド；デキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド；キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールであってもよい。甘味剤は、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤；サッカリン、アスパルタムのような合成甘味剤などを使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の組成物１００ｍＬ当たり一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。
【０１０５】
また、本発明のＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質は、筋肉疾患の予防および筋機能改善用食品組成物の有効成分として含有され得るが、その量は、筋肉疾患の予防および筋機能改善用作用を達成するのに有効な量であって、特に限定されるものではないが、全体組成物の総重量に対して０．０１〜１００重量％であることが好ましい。本発明の食品組成物は、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質と共に筋肉疾患の予防および筋機能改善用組成物に効果があるものと知られている他の活性成分と共に混合して製造され得る。
【０１０６】
前記以外に、本発明の健康食品は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸の塩、アルギン酸、アルギン酸の塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコールまたは炭酸化剤などを含有することができる。その他、本発明の健康食品は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料、または野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立して、または混合して使用することができる。このような添加剤の比率は、大きく重要なことではないが、本発明の組成物１００重量部当たり０．０１  〜  ０．１重量部の範囲で選ばれることが一般的である。
【０１０７】
また、本発明は、Ｓｌｉｔ１タンパク質、Ｓｌｉｔ２タンパク質、Ｓｌｉｔ３タンパク質、Ｒｏｂｏ１タンパク質、Ｒｏｂｏ２タンパク質およびＬＲＲＤ２タンパク質から構成される群から選ばれるいずれか一つ以上のタンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、筋機能改善用化粧料組成物を提供する。前記化粧料組成物は、特に制限されるものではないが、皮膚外用で使用したり、経口摂取することができる。
【０１０８】
本発明の「Ｓｌｉｔ３タンパク質」は、配列番号１のアミノ酸から構成され、本発明の「Ｒｏｂｏ１タンパク質」は、配列番号２のアミノ酸から構成され、本発明の「Ｒｏｂｏ２タンパク質」は、配列番号３のアミノ酸から構成され、本発明の「ＬＲＲＤ２タンパク質」は、配列番号４のアミノ酸から構成されることが好ましく、前記タンパク質またはペプチドの機能的同等物を含むことができる。
【０１０９】
前記「機能的同等物」は、タンパク質またはペプチドのアミノ酸の付加、置換または欠失により、前記配列番号１〜４のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有するものであって、配列番号１〜４のアミノ酸配列から構成されるタンパク質またはペプチドと実質的に同質の生理活性を示すタンパク質またはペプチドをいう。
【０１１０】
本発明の「Ｓｌｉｔ３タンパク質」は、配列番号５の塩基配列から構成されるｓｌｉｔ３遺伝子から発現されることが好ましく、「Ｒｏｂｏ１タンパク質」は、配列番号６の塩基配列から構成されるｒｏｂｏ１遺伝子から発現されることが好ましく、「Ｒｏｂｏ２タンパク質」は、配列番号７の塩基配列から構成されるｒｏｂｏ２遺伝子から発現されることが好ましく、「ＬＲＲＤ２タンパク質」は、配列番号８の塩基配列から構成される遺伝子から発現されることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
本発明の筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗または筋肉退化による筋肉疾患として当業界に報告された疾病であることが好ましく、具体的に、無緊張症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉退化、筋無力症、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）および筋肉減弱症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることがより好ましいが、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
前記筋肉消耗または退化は、先天的要因、後天的要因、老化などを原因として発生し、筋肉消耗は、筋肉量の漸進的損失、筋肉、特に骨格筋または随意筋および心臓筋肉の弱化および退行を特徴とする。
【０１１３】
より具体的に、前記筋肉は、筋、筋肉、腱を包括して称し、筋機能または筋肉機能は、筋肉の収縮により力を発揮できる能力を意味し、筋肉が抵抗に耐えるために最大限の収縮力を発揮できる筋力；筋肉が与えられた重量にどのくらい長い間または何回くらい収縮と弛緩を繰り返すことができるかを示す能力である筋持久力；および短時間内に強い力を発揮する能力である瞬発力を含む。前記筋機能は、筋肉量に比例し、用語「筋機能改善」は、筋機能をより肯定的な方向に向上させることを意味する。
【０１１４】
本発明のＳｌｉｔタンパク質は、Ｒｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２受容体と結合して、Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏシステムを介して筋芽細胞のＭ−カドヘリンに結合されていたβ−カテニンを遊離してβ−カテニンを活性化し、ミオゲニンの発現を増加させて、筋芽細胞の分化を誘導することにより、筋肉の形成を促進することができる。また、Ｓｌｉｔタンパク質全長だけでなく、その活性断片、特に好ましくはＬＲＲＤ２タンパク質を処理する場合にも、筋芽細胞の分化を促進させて筋肉量の増加を誘導することができるので、本発明のＳｌｉｔタンパク質またはＳｌｉｔの活性断片、またはこれを暗号化する遺伝子は、筋機能改善用化粧料組成物の有効成分として使用され得る。
【０１１５】
また、本発明の筋機能改善用組成物は、化粧料組成物であってもよい。本発明の化粧料組成物は、Ｓｌｉｔ１タンパク質、Ｓｌｉｔ２タンパク質、Ｓｌｉｔ３タンパク質、Ｒｏｂｏ１タンパク質、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質を有効成分として含有し、皮膚学的に許容可能な賦形剤とともに基礎化粧品組成物（化粧水、クリーム、エッセンス、クレンジングフォームおよびクレンジングウォーターのような洗顔剤、パック、ボディーオイル）、着色化粧品組成物（ファウンデイション、リップスティック、マスカラ、メイクアップベース）、ヘアー製品組成物（シャンプー、リンス、ヘアーコンディショナー、ヘアージェル）および石鹸などの形態で製造され得る。
【０１１６】
前記賦形剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、皮膚軟化剤、皮膚浸透増強剤、着色剤、芳香剤、乳化剤、濃化剤および溶媒を含むことができる。また、香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤および保湿剤などをさらに含むことができ、物性改善を目的に増粘剤、無機塩類、合成高分子物質などを含むことができる。例えば、本発明の化粧料組成物において洗顔剤および石鹸を製造する場合には、通常の洗顔剤および石鹸ベースに前記Ｓｌｉｔ１タンパク質、Ｓｌｉｔ２タンパク質、Ｓｌｉｔ３タンパク質、Ｒｏｂｏ１タンパク質、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質を添加して容易に製造することができる。クリームを製造する場合には、一般的な水中油滴型（Ｏ／Ｗ）のクリームベースにＳｌｉｔ１タンパク質、Ｓｌｉｔ２タンパク質、Ｓｌｉｔ３タンパク質、Ｒｏｂｏ１タンパク質、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質、またはこれを暗号化する塩基配列を添加して製造することができる。これに香料、キレート剤、色素、酸化防止剤、防腐剤などと物性改善を目的としたタンパク質、ミネラル、ビタミンなど合成または天然素材をさらに添加することができる。
【０１１７】
本発明の化粧料組成物に含有されるＳｌｉｔ１タンパク質、Ｓｌｉｔ２タンパク質、Ｓｌｉｔ３タンパク質、Ｒｏｂｏ１タンパク質、Ｒｏｂｏ２タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質の含量は、これらに限定されるものではないが、全体組成物の総重量に対して０．００１〜１０重量％であることが好ましく、０．０１〜５重量％であることがさらに好ましい。前記含量が０．００１重量％未満では、目的とする抗老化またはシワ改善効果を期待することができず、１０重量％超過では、安全性または剤形上の製造に困難がありえる。
【０１１８】
また、本発明は、
ｉ）実験群である被検体由来試料で配列番号１のアミノ酸配列から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質の発現水準を測定する段階と；
ｉｉ）前記段階ｉ）で測定したＳｌｉｔ３タンパク質の発現水準を対照群である正常個体由来試料のＳｌｉｔ３タンパク質発現水準と比較する段階と；
ｉｉｉ）前記段階ｉｉ）で比較した実験群のＳｌｉｔ３タンパク質発現水準が対照群に比べて減少する場合、実験群を筋肉疾患と判断する段階と；を含む、筋肉疾患診断の情報を提供するためのタンパク質検出方法を提供する。
【０１１９】
本発明において「タンパク質の発現水準を測定」することは、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定することにより確認することができる。
【０１２０】
また、本発明は、
ｉ）被検化合物または組成物を、配列番号１のアミノ酸配列から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質、配列番号２のアミノ酸配列から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質および配列番号３のアミノ酸配列から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質よりなる群から選ばれたいずれか一つ以上を発現する細胞株に処理する段階と；
ｉｉ）前記段階ｉ）の処理した細胞株で前記Ｓｌｉｔ３タンパク質の発現程度または前記Ｒｏｂｏ１タンパク質またはＲｏｂｏ２タンパク質の活性を測定する段階と；
ｉｉｉ）前記段階ｉｉ）のＳｌｉｔ３タンパク質の発現程度、またはＲｏｂｏ１タンパク質またはＲｏｂｏ２タンパク質の活性が被検化合物または組成物を処理しない対照群細胞株と比較して増加した被検化合物または組成物を選別する段階と；を含む、筋肉疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【０１２１】
本発明の筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗または筋肉退化による筋肉疾患として当業界に報告された疾病であることが好ましく、具体的に、無緊張症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉退化、筋無力症、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）および筋肉減弱症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることがより好ましいが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
前記筋肉消耗または退化は、先天的要因、後天的要因、老化などを原因として発生し、筋肉消耗は、筋肉量の漸進的損失、筋肉、特に骨格筋または随意筋および心臓筋肉の弱化および退行を特徴とする。
【０１２３】
より具体的に、前記筋肉は、筋、筋肉、腱を包括して称し、筋機能または筋肉機能は、筋肉の収縮により力を発揮できる能力を意味し、筋肉が抵抗に耐えるために最大限の収縮力を発揮できる筋力；筋肉が与えられた重量にどのくらい長い間または何回くらい収縮と弛緩を繰り返すことができるかを示す能力である筋持久力；および短時間内に強い力を発揮する能力である瞬発力を含む。前記筋機能は、筋肉量に比例し、用語「筋機能改善」は、筋機能をより肯定的な方向に向上させることを意味する。
【０１２４】
本発明のＳｌｉｔタンパク質またはそのＬＲＲＤ２タンパク質は、Ｒｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２受容体と結合して、Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏシステムを介して筋芽細胞のＭ−カドヘリンに結合されていたβ−カテニンを遊離してβ−カテニンを活性化し、ミオゲニンの発現を増加させて、筋芽細胞の分化を誘導することにより、筋肉形成促進することができる。したがって、Ｓｌｉｔタンパク質またはそのＬＲＲＤ２タンパク質の発現水準を通じて、直接的な症状が現れる以前に、筋減少症に対する発病有無を判断することができる。また、Ｓｌｉｔタンパク質発現水準またはＲｏｂｏ受容体の活性を増加させることができる化合物または組成物を筋減少症の治療剤の候補物質として選別することができる。
【０１２５】
本発明の方法において、ｍＲＮＡの発現水準を測定することは、生物学的試料でＳＬＩＴ３タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質を暗号化するｍＲＮＡの存在有無と発現程度を確認する過程でｍＲＮＡの量を測定する。このための分析方法としては、当業界に公知となっている方法を利用することができ、例えば重合酵素反応（ＰＣＲ）、逆転写重合酵素反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競争的逆転写重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＤＮＡチップなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１２６】
本発明の方法において、タンパク質の発現水準を測定することは、生物学的試料でＳＬＩＴ３タンパク質またはＬＲＲＤ２タンパク質の存在有無および発現程度を確認する過程であって、タンパク質の量を測定することを意味する。好ましくは、前記遺伝子のタンパク質に対して特異的に結合する抗体を利用してタンパク質の量を確認することができる。このための分析方法としては、当業界に公知となっている方法を利用することができ、例えばウェスタンブロット、エライサ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、補体結合分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、蛍光活性化セルソーター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）、タンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ）等があるが、これらに制限されるものではない
【０１２７】
前記筋肉疾患診断の情報を提供するためのタンパク質検出方法および筋肉疾患治療剤のスクリーニング方法において、好ましい一実施例のＳｌｉｔ３を使用して記載しているが、Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２；またはＳｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３の活性断片を使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【０１２８】
以下、実施例により本発明を詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明だろう。
【０１２９】
＜実施例１＞Ｓｌｉｔ３発現と筋肉量の関係の確認
＜１−１＞Ｓｌｉｔ３が欠乏したマウスモデルで体重変化および筋減少指標の確認
Ｓｌｉｔ３が生体で骨格筋の形成に関与するかを確認するために、Ｓｌｉｔ３発現有無によるマウスモデルの筋肉量の変化を確認した。
【０１３０】
具体的に、Ｍｕｔａｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ（Ｓｔｏｃｋ  ｎｕｍｂｅｒ  ０３０７５９−ＭＵ；ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ，ＵＳＡ）からｓｌｉｔ３ノックアウトマウスの胚芽を購入し、雄性および雌性ｓｌｉｔ３＋／−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを交配して、Ｓｌｉｔ３欠乏マウスモデルを製造した。Ｓｌｉｔ３欠乏マウスモデルは、雄性群と雌性群とにさらに分けて、Ｓｌｉｔ３発現が欠乏したマウスモデルの体重を測定した。マウスモデルが７週齢になると、雄性群と雌性群を犠牲にして、それぞれの長趾伸筋（ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ  ｌｏｎｇｕｓ、ＥＤＬ）および、腓腹筋とヒラメ筋（ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓとｓｏｌｅｕｓ，ＧＣ＋ＳＯＬ）の筋肉を収得して、重さを測定した。筋減少指標（ｓａｒｃｏｐｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ）は、マウス体重に対する筋肉量を百分率で示すために、「筋減少指標（％）＝１００×筋肉の重量×体重」の数式を使用して示した。
【０１３１】
その結果、図１、図２、下記表１および表２に示されたように、Ｓｌｉｔ３が欠乏したマウスモデルでは、雄群および雌群の両方で正常対照群マウスに比べて体重が低く、ＥＤＬの重量およびＧＣ＋ＳＯＬの重量も低く、ＥＤＬの筋減少指標およびＧＣ＋ＳＯＬの筋減少指標も、正常対照群に比べて有意的に減少することを確認した（図１、図２、表１および表２）。これにより、性別および筋肉の種類と関係なく、生体でＳｌｉｔ３が欠乏すると、骨格系の筋肉量も減少することを確認した。
【０１３２】
【表１】
2019529334.tif 000003
【０１３３】
【表２】
2019529334.tif 000004
【０１３４】
＜１−２＞Ｓｌｉｔ３が欠乏したマウスモデルで筋肉面積の変化の確認
Ｓｌｉｔ３が欠乏したマウスは、骨格筋が減少することを確認したので、これを具体的に確認するために、筋肉を染色して筋肉の面積を比較した。
【０１３５】
具体的に、７週齢のＳｌｉｔ３が欠乏した雄性マウスモデル群を犠牲にして、ＥＤＬおよびＧＣ＋ＳＯＬ筋肉組織を収得した後、４％ホルムアルデヒドで固定し、ＯＣＴ化合物に包埋した（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）。次に、ヘマトキシリンおよびエオシンを処理して、Ｈ−Ｅ染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＆  Ｅｏｓｉｎ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を通じて筋肉組織を染色した。染色した筋肉組織の写真を撮って、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して筋肉の組織の核と線維質の部分の数を比較し、面積を確認した。
【０１３６】
また、細胞の数をより具体的に比較するために、筋線維鞘（ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ）、核（ｎｕｃｌｅｕｓ）および筋芽細胞の幹細胞である衛星細胞のマーカータンパク質を免疫組織化学染色した。ＧＣ筋肉組織の断面に１次抗体として抗−ラミニン抗体および抗−ＰＡＸ７抗体をそれぞれ処理して、製造社のプロトコルによって反応した後、２次抗体で発色して、筋線維鞘および筋芽細胞の幹細胞である衛星細胞のマーカータンパク質を染色し、４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（４’６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ，ＤＡＰＩ）を処理して核を染色した後、蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察して、ＧＣ筋肉組織内細胞のうち筋芽細胞の幹細胞の比率を求めた。
【０１３７】
その結果、図３〜図５に示されたように、Ｓｌｉｔ３が欠乏したマウスモデルでは、ＥＤＬおよびＧＣ筋肉の両方で正常対照群マウスに比べて筋線維および核の数が類似していることを確認した（図３および図４）。ＧＣ組織断面を免疫組織化学染色したとき、ラミニン染色を通じてＳｌｉｔ３欠乏マウスで筋線維の面積が有意的に減少するのに対し、核およびＰＡＸ７を染色したものを通じて組織内全体核の数およびＰＡＸ７陽性細胞の数では、有意的な差異を示さないことを確認した（図５）。これにより、生体水準でＳｌｉｔ３が欠乏したとき、筋線維の面積は顕著に減少するが、筋芽細胞およびその衛星細胞の個数自体には、変化がなくて、Ｓｌｉｔ３欠乏による筋肉量の減少は、筋芽細胞の増殖、その衛星細胞の増殖および増加（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）とは関係ないことを確認した。
【０１３８】
＜実施例２＞Ｓｌｉｔ３の筋芽細胞分化促進効果の確認
＜２−１＞Ｓｌｉｔ３による筋芽細胞の生存能の変化有無の確認
Ｓｌｉｔ３欠乏によって骨格筋の量が減少することを確認したので、Ｓｌｉｔ３が筋肉量を増加させるためにどのような役割をするかを確認した。まず、筋肉量を増加させるに際して、Ｓｌｉｔ３の役割が筋肉細胞の生存能増加効果であるかを確認した。
【０１３９】
具体的に、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地に筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）のＣ２Ｃ１２細胞株（ＡＴＣＣ購入、米国）を接種して、３７℃で５％ＣＯ２が維持されるように培養した。培養２４時間後、組換えＳｌｉｔ３（Ａｂｃａｍ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａ，ＵＳＡ；およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を１μｇ／ｍｌまたは３μｇ／ｍｌの濃度で培養した細胞に処理して、２４時間の間追加培養した。次に、ＰＢＳ溶液で２回洗浄し、ＭＴＴ試薬を処理した後、２時間の間追加培養して、４５０ｎｍでエライサプレートリーダー（ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）で吸光度を測定した。未処理対照群としては、Ｓｌｉｔ３を処理しないＣ２Ｃ１２細胞株を同じ条件で培養し、陽性対照群としては、ＴＮＦ−αを処理したＣ２Ｃ１２細胞株を使用した。
【０１４０】
その結果、図６に示されたように、ＴＮＦ−αを処理した陽性対照群では、未処理対照群に比べて細胞生存能が有意的に増加するのに対し、Ｓｌｉｔ３を処理した実験群では、細胞生存能に対する有意的な変化が現れないことを確認した（図６）。
【０１４１】
＜２−２＞筋芽細胞から筋線維（ｍｙｏｔｕｂｅ）への分化においてＳｌｉｔ３の分化増加効果の確認
Ｓｌｉｔ３欠乏によって骨格筋の量が減少することを確認したので、Ｓｌｉｔ３が筋肉量を増加させるためにどのような役割をするかを確認した。Ｓｌｉｔ３により筋芽細胞の生存に有意的な変化がないので、筋芽細胞が筋線維へ分化する過程でＳｌｉｔ３の効果を確認した。
【０１４２】
具体的に、Ｃ２Ｃ１２細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に接種して、１００％飽和（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）するまで培養した。その後、培養培地を１μｇ／ｍｌのＳｌｉｔ３組換えタンパク質および２％の馬血清（ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ培地に交換し、培養して、Ｃ２Ｃ１２細胞を筋線維へ分化するように誘導した。誘導後、分化した細胞を収得して、４％ホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を処理して室温で１５分間固定し、０．１％トリトンＸ−１００を処理して、細胞膜に透過性（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を付与した。その後、処理した細胞に４％正常ロバ血清を添加して、１時間の間常温で遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、１次抗体として抗−ミオシンＨ鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ，ＭｙＨＣ）抗体を処理して、４℃で一晩培養し、０．１％ツイーン２０を含むＰＢＳであるＰＢＳＴで数回洗浄した。洗浄後、アレクサフルオル５９４（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４）が結合した２次抗体を処理して１時間の間培養して、ＭｙＨＣを免疫蛍光染色（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＣＣ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）した。その後、ＤＡＰＩを処理して細胞の核を染色し、これを蛍光顕微鏡で観察した。
【０１４３】
その結果、図７に示されたように、Ｓｌｉｔ３組換えタンパク質を添加しない未処理対照群に比べてＳｌｉｔ３処置下で分化した実験群で細胞個数の変化はないが、筋線維の面積が有意的に増加し、融合指数（ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）が顕著に増加することを確認した（図７）。
【０１４４】
＜実施例３＞筋芽細胞の分化過程においてＳｌｉｔ３関与因子の確認
筋芽細胞が筋線維へ分化する過程で、Ｍｙｆ５、Ｍｒｆ４、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、Ｍｅｆ２ＡおよびＭｅｆ２ｃのような多様な筋原性調節因子（ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ，ＭＲＦ）が筋芽細胞の分化を誘発することが知られているので、Ｓｌｉｔ３がこのような調節因子の発現を誘導することにより、筋芽細胞の分化を誘導するか否かを確認した。
【０１４５】
具体的に、Ｃ２Ｃ１２細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に接種して、１００％飽和するまで培養した後、培養培地を１μｇ／ｍｌのＳｌｉｔ３組換えタンパク質および２％馬血清を含むＤＭＥＭ培地に交換し、総５日間培養して、Ｃ２Ｃ１２細胞を筋線維へ分化するように誘導した。培養しつつ、２４時間ごとに細胞を収得し、トリゾール（ＴＲＩｚｏｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）試薬に懸濁し、製造社のプロトコルによって分化した筋線維の全体ＲＮＡを抽出して、１μｇのＲＮＡを鋳型として当該プライマーおよびスーパースクリプトＩＩＩキット（ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を使用して逆転写して、Ｍｙｆ５、Ｍｒｆ４、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、Ｍｅｆ２ＡおよびＭｅｆ２ｃのｃＤＮＡをそれぞれ合成した。合成のための増幅条件は、９５℃で３０秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、６０℃で３０秒間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）および７２℃で３０秒間伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の３０サイクルで構成した。合成したｃＤＮＡは、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、９５℃で１０分間前反応、９５℃で１０秒間、５５℃で１５秒間および７２℃で２０秒間セット（ｓｅｔ）である４５サイクルの増幅反応条件でＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ）機器でリアルタイムＰＣＲを行って、分化が誘導される筋芽細胞でＳｌｉｔ３の処理有無によって筋原性調節因子の発現水準の変化を確認した。
【０１４６】
また、２日間分化誘導したＣ２Ｃ１２細胞を収得して、前記実施例＜２−２＞と同じ方法で抗−ミオゲニン抗体を使用して分化誘導された細胞でＳｌｉｔ３により発現増加誘導されたミオゲニンを蛍光免疫染色して、タンパク質水準で発現を確認した。
【０１４７】
その結果、図８〜図１０に示されたように、Ｓｌｉｔ３は、Ｍｙｆ５、Ｍｒｆ４、ＭｙｏＤ、Ｍｅｆ２ＡおよびＭｅｆ２ｃなどの発現には、有意的な変化を示さないが、Ｓｌｉｔ３を処理した実験群では、ミオゲニンのｍＲＮＡの発現水準が顕著に増加して、未処理対照群におけるミオゲニンｍＲＮＡ発現水準に比べて約１．８倍増加した水準を示すことを確認した（図８）。また、ミオゲニンタンパク質発現水準を蛍光免疫染色して確認したとき、Ｓｌｉｔ３を処置した実験群で未処理対照群に比べてミオゲニン−陽性細胞の個数が顕著に増加することを示して（図９および図１０）、Ｓｌｉｔ３は、ミオゲニンの発現を増加させて、筋芽細胞の分化を促進することにより、筋肉の形成を誘発することができることを確認した。
【０１４８】
＜実施例４＞Ｓｌｉｔ３のβ−カテニン活性化による筋芽細胞分化誘導効果の確認
＜４−１＞筋芽細胞で発現するカドヘリンタンパク質の種類および発現水準の確認
Ｓｌｉｔタンパク質の受容体は、細胞膜タンパク質であるＲｏｂｏタンパク質であるとよく知られている。Ｒｏｂｏタンパク質は、細胞膜でカドヘリンと結合した形態で細胞膜に存在するが、ＳｌｉｔがＲｏｂｏと結合すると、Ｒｏｂｏとカドヘリンの結合が広がって、カドヘリンに結合されていたβ−カテニンが細胞内に移動して活性化するものと知られている。筋芽細胞で発現するカドヘリンは、Ｎ−カドヘリンおよびＭ−カデリニムであるので、筋芽細胞でＲｏｂｏタンパク質と関連してＳｌｉｔ３により影響を受けることができるカドヘリンがどのような種類であるかを確認した。
【０１４９】
具体的に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にＣ２Ｃ１２細胞株、ＨＥＫ２９７細胞株（伸長細胞株）を接種して、３７℃で５％ＣＯ２が維持されるように培養した。培養２４時間後、それぞれの細胞および脳組織を収得して、＜実施例３＞と同じ過程でリアルタイムＰＣＲを行って、Ｃ２Ｃ１２細胞、ＨＥＫ２９３細胞または脳組織でＭ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンのｍＲＮＡ発現水準を確認した。
【０１５０】
また、前記収得したそれぞれの細胞に溶解バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのグリセロリン酸、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのＮａＦ、およびプロテアーゼ阻害剤混合物）を混合し、４℃で２０分間反応して、細胞溶解物を製造し、ＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を利用して溶解物内のタンパク質の濃度を確認した。１０〜２０μｇのタンパク質を含む細胞溶解物試料は、１０％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロースメンブレイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に移動させた。次に、５％スキムミルクを含むＴＢＳＴ緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ［ｐＨ７．４］、１．５ＭのＮａＣｌ、０．１％ツイーン２０）メンブレインに処理し、１時間の間室温でブロッキングした後、抗−Ｍ−カドヘリン抗体または抗−Ｎ−カドヘリン抗体を１次抗体として処理して、４℃で一晩培養し、ＴＢＳＴで洗浄して、ガチョウ由来の抗−マウスＩｇＧ抗体（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ）を２次抗体として１％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉ，ＢＳＡ）を含むＴＢＳＴとともにメンブレインに処理して、一時間の間培養して、ウェスタンブロットを行った。
【０１５１】
その結果、図１１ａおよび図１１ｂに示されたように、Ｃ２Ｃ１２細胞では、Ｍ−カドヘリンがＮ−カドヘリンに比べてｍＲＮＡ発現水準が有意的に高いことを確認し（図１１ａ）、タンパク質発現水準でもＣ２Ｃ１２細胞でＭ−カドヘリンのタンパク質発現がＮ−カドヘリンより顕著に高い水準で発現することを確認した（図１１ｂ）。
【０１５２】
＜４−２＞Ｓｌｉｔ３の添加による筋芽細胞でβ−カテニン活性の確認
Ｓｌｉｔタンパク質は、β−カテニンを活性化し、β−カテニンは、また、ミオゲニンのプロモーター部位に結合して、ミオゲニンの発現を増加させて、筋芽細胞の分化を促進することが知られているので、本発明でも、Ｓｌｉｔ３により筋芽細胞のβ−カテニン活性が変化するか否かを確認した。
【０１５３】
具体的に、β−カテニン−ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、ｌｕｃ）レポーター遺伝子を含むβ−カテニン発現ベクターでＣ２Ｃ１２細胞に形質感染した。次に、形質感染したＣ２Ｃ１２細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に接種して、１００％飽和するまで培養した後、培養培地を１μｇ／ｍｌのＳｌｉｔ３組換えタンパク質および２％馬血清を含むＤＭＥＭ培地に交換して培養し、レポーター溶解緩衝液（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）に前記培養したＣ２Ｃ１２細胞を懸濁して、細胞タンパク質を抽出した。前記抽出した細胞タンパク質１０μｌにルシフェラーゼ基質（ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）と混合して、ルミノメーターで発光度を測定して、β−カテニン−ルシフェラーゼの活性を確認した。
【０１５４】
その結果、図１２ａに示されたように、Ｓｌｉｔ３は、筋芽細胞でβ−カテニン−ルシフェラーゼの活性を未処理対照群に比べて約１．５倍水準に増加させることを確認した（図１２ａ）。
【０１５５】
＜４−３＞Ｓｌｉｔ３処置によるＭ−カドヘリンおよびβ−カテニンの結合水準変化の確認
Ｃ２Ｃ１２細胞にＳｌｉｔ３を処理したとき、β−カテニンの活性が高いことを通じてＳｌｉｔ３がＲｏｂｏ受容体と結合してβ−カテニンの活性が増加することができ、Ｃ２Ｃ１２細胞でＭ−カドヘリンの発現水準がＮ−カドヘリンの発現水準より高いことを確認したので、Ｍ−カドヘリンとβ−カテニンの結合がＳｌｉｔ３処置によって変化するか否かを共同−免疫沈降（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）して確認した。
【０１５６】
具体的に、ＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ  Ｍ−カドヘリンのヒトｃＤＮＡを購入して、リポフェクタミン２０００（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）でＣ２Ｃ１２細胞に形質転換した後、１μｇ／ｍｌのＳｌｉｔ３組換えタンパク質を処理して、細胞を培養した。次に、培養した細胞を収得して、プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）およびホスファターゼ阻害剤（１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのＮａＦ）を含むＴＮＥバッファー（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶解した。溶解した溶解物は、４℃で３０分間Ｍ−カドヘリン抗体およびＩｇＧで免疫沈降し、前記実施例＜４−１＞の方法で抗−β−カテニン抗体を使用してウェスタンブロットを行った。
【０１５７】
その結果、図１２ｂに示されたように、Ｓｌｉｔ３を処置した実験群でＭ−カドヘリンと結合したβ−カテニンの水準が顕著に減少することを確認して、Ｓｌｉｔ３を通じてＭ−カドヘリンがＲｏｂｏタンパク質の結合が広がって、β−カテニンもやはりＭ−カドヘリンから遊離して活性が増加することができることを確認した（図１２ｂ）。
【０１５８】
＜４−４＞β−カテニン発現有無によるＳｌｉｔ３の筋芽細胞分化促進効果差異の確認
Ｓｌｉｔ３が筋芽細胞の分化を促進する過程でβ−カテニンが関与することを確認したので、Ｓｌｉｔ３を処理したとき、β−カテニンの発現有無によって筋肉形成効果に差異が現れるかを確認した。
【０１５９】
具体的に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭでＣ２Ｃ１２細胞を培養した後、β−カテニンに対するｓｉＲＮＡ（ＣＴＮＮＢ１  ｓｉＲＮＡ）を含むリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）混合物を添加した後、Ｃ２Ｃ１２細胞をさらに６時間の間追加培養した。培養後、培養培地を新鮮なＤＭＥＭ培地に交替して２日間追加培養して、β−カテニンがノックアウトされたＣ２Ｃ１２細胞を製造した。β−カテニンを発現する正常対照群に使用するために、ＣＴＮＮＢ１  ｓｉＲＮＡの代わりに、スクランブルＳｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ＳｉＲＮＡ）を形質転換して、正常対照群細胞を製造した。
【０１６０】
次に、製造したβ−カテニンノックアウトＣ２Ｃ１２細胞または正常対照群細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に接種して、１００％飽和するまで培養した後、培養培地を１μｇ／ｍｌのＳｌｉｔ３組換えタンパク質および２％馬血清を含むＤＭＥＭ培地に交換して培養した。培養後、細胞を収得して、１次抗体として抗−ＭｙＨＣ抗体を使用して前記実施例＜２−２＞の方法で免疫蛍光染色（ＩＣＣ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）した。次に、ＤＡＰＩを処理して細胞の核を染色し、これを蛍光顕微鏡で観察して、蛍光値で細胞の数を定量した。融合指数（％）は、全体ＭｙＨＣ発現細胞の核数に対するＭｙＨＣ発現筋線維の核数を百分率で示した。また、前記培養後に収得した細胞を前記実施例＜４−１＞の方法で、抗−ミオゲニン抗体を使用してウェスタンブロットを行った。
【０１６１】
その結果、図１２ｃ〜図１２ｅおよび図１２ｆに示されたように、β−カテニンｓｉＲＮＡでβ−カテニンの発現を抑制した実験群では、Ｓｌｉｔ３により促進された筋線維の肥大化および融合指数が顕著に抑制することを確認し、ミオゲニンの発現も顕著に減少することを確認した（図１２ｃ〜図１２ｅおよび図１２ｆ）。これにより、Ｓｌｉｔ３は、Ｍ−カドヘリンに結合されていたβ−カテニンを遊離して筋芽細胞のβ−カテニンを活性化し、ミオゲニンの発現を増加させて、筋芽細胞の分化を誘導することにより、筋肉形成の促進に関与することができることを確認した。
【０１６２】
＜実施例５＞筋芽細胞でＳｌｉｔ３と結合するＲｏｂｏ受容体亜型の確認
＜５−１＞筋芽細胞で発現するＲｏｂｏ受容体亜型の確認
筋芽細胞の分化過程でＳｌｉｔ３がβ−カテニン活性およびミオゲニンの発現を増加させる可能性があることを確認し、これは、Ｓｌｉｔ３−Ｒｏｂｏ受容体の結合を通じて誘導され得ることを確認した。Ｓｌｉｔタンパク質の受容体は、Ｒｏｂｏタンパク質として、現在までＲｏｂｏ１〜Ｒｏｂｏ４の四つの亜型が存在することが知られているので、筋芽細胞では、Ｓｌｉｔ３と関連したＲｏｂｏ受容体がどのような亜型であるかを確認するために、筋芽細胞で発現するＲｏｂｏ受容体を確認した。
【０１６３】
具体的に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にＣ２Ｃ１２細胞株、ＨＥＫ２９７細胞株（伸長細胞株）を接種して、３７℃で５％ＣＯ２が維持されるように培養した。培養２４時間後、それぞれの細胞を収得して、前記＜実施例４＞と同じ過程で抗−Ｒｏｂｏ１抗体、抗−Ｒｏｂｏ２抗体、抗−Ｒｏｂｏ３抗体および抗−Ｒｏｂｏ４抗体を使用してウェスタンブロットを行って、Ｃ２Ｃ１２細胞、ＨＥＫ２９３細胞または脳組織でＲｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、Ｒｏｂｏ３およびＲｏｂｏ４のタンパク質発現水準を確認した。
【０１６４】
その結果、図１３ａに示されたように、Ｃ２Ｃ１２細胞でＲｏｂｏ１およびＲｏｂｏ２タンパク質が有意的な水準で発現したが、Ｒｏｂｏ３およびＲｏｂｏ４タンパク質は発現しないことを確認した（図１３ａ）。
【０１６５】
＜５−２＞筋芽細胞でＳｌｉｔ３−Ｒｏｂｏ１およびＳｌｉｔ３−Ｒｏｂｏ２結合可否の確認
筋芽細胞でＲｏｂｏ１およびＲｏｂｏ２タンパク質が発現することを確認したので、Ｓｌｉｔ３タンパク質の受容体がＲｏｂｏ１およびＲｏｂｏ２であるものと判断した。これを確認するために、Ｒｏｂｏ１およびＲｏｂｏ２の発現が抑制されたとき、Ｓｌｉｔ３の作用が消失するか否かを確認した。
【０１６６】
具体的に、前記実施例＜４−４＞と同じ方法を行って、Ｒｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２に対するｓｉＲＮＡでそれぞれ形質転換して、Ｒｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２がノックアウトされたＣ２Ｃ１２細胞を製造し、これを１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に接種して、１００％飽和するまで培養した後、培養培地を１μｇ／ｍｌのＳｌｉｔ３組換えタンパク質および２％馬血清を含むＤＭＥＭ培地に交換して培養した。培養後、細胞を収得し、前記＜実施例３＞と同じ過程でリアルタイムＰＣＲを行って、Ｒｏｂｏ１およびＲｏｂｏ２の発現が抑制されたとき、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２およびミオゲニンのｍＲＮＡ発現水準を確認した。
【０１６７】
その結果、図１３ｂおよび図１３ｃに示されたように、Ｓｌｉｔ３により発現が増加したミオゲニンは、Ｒｏｂｏ１およびＲｏｂｏ２発現が抑制されるに伴って、発現が有意的に抑制されて、Ｓｌｉｔ３未処理対照群と類似した水準でミオゲニンを発現することを確認した（図１３ｂおよび図１３ｃ、図１３ｄ）。
【０１６８】
＜実施例６＞生体内でＳｌｉｔ３による筋肉形成促進効果においてＲｏｂｏ受容体の役割の確認
本発明で確認した結果を生体内で具体的に確認するために、Ｒｏｂｏ受容体が欠乏したマウスモデルで筋肉量の変化を確認した。
【０１６９】
具体的に、Ｍｕｔａｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ（Ｓｔｏｃｋ  ｎｕｍｂｅｒ  ０３０７５９−ＭＵ；ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＯ、ＵＳＡ）からＲｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２ノックアウトマウスの胚芽を購入し、雄性および雌性ｓｌｉｔ３＋／−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを交配して、Ｒｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２ノックアウトマウスモデルをそれぞれ製造した。このうち雄を実験群に選別して、前記実施例＜１−１＞と同じ方法で７週齢のマウスモデルの体重および筋肉重さと筋減少に対する指標を確認した。Ｒｏｂｏ２欠乏群は、７週まで生存しないので、実験群として使用せず、Ｒｏｂｏ１欠乏群のみに対して実験を行った後、正常対照群と比較した。
【０１７０】
その結果、下記表３および図１４に示されたように、Ｒｏｂｏ１が欠乏したマウスモデルでは、正常対照群マウスに比べて体重が低く、ＥＤＬの重量およびＧＣ＋ＳＯＬの重量も低く、ＥＤＬの筋減少指標およびＧＣ＋ＳＯＬの筋減少指標も正常対照群に比べて有意的に減少することを確認した（図１４および表３）。これにより、Ｓｌｉｔ３が骨格筋の形成に関与する筋芽細胞の受容体は、Ｒｏｂｏ１およびＲｏｂｏ２であり、特にＲｏｂｏ１が欠乏する場合、生体水準で筋肉量が減少することを示すので、Ｓｌｉｔ３および、Ｒｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２の結合システムを介して筋減少症の改善効果が示されることを確認した。
【０１７１】
【表３】
2019529334.tif 000005
【０１７２】
＜実施例７＞Ｓｌｉｔ３のＬＲＲＤ２ドメインによる筋芽細胞分化および筋肉量増進効果の確認
ヒトＳｌｉｔ３タンパク質は、１，５２３個のアミノ酸から構成されて、約１７０ｋＤａの分子量を有する非常に大きい物質であるので、Ｓｌｉｔ３タンパク質全長を使用する薬剤は、実用性が高くないものと判断して、Ｓｌｉｔ３全長のうち筋芽細胞分化および筋肉量増進効果を示すものと判断されるドメイン断片のみを選別しようとした。Ｓｌｉｔ３タンパク質は、ロイシンが豊富なドメイン（Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ）を４個含み、このうち１３０個のアミノ酸から構成されるロイシンが豊富なドメイン２（ＬＲＲＤ２）が受容体と結合する部分であり、これにより、多様な細胞作用ができると判断されて、本発明の筋芽細胞分化促進および筋肉量増進効果においてもＬＲＲＤ２がＳｌｉｔ３全長の効果を示すことができるか否かを確認した。
【０１７３】
＜７−１＞試験管内水準でＳｌｉｔ３のＬＲＲＤ２による筋芽細胞分化効果の確認
具体的に、Ｃ２Ｃ１２細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に接種して、１００％飽和するまで培養した後、培養培地を１０ｎＭの組換えＬＲＲＤ２（特許文献１）および２％馬血清を含むＤＭＥＭ培地に交換して培養した。培養後、細胞を収得して、１次抗体として抗−ＭｙＨＣ抗体を使用して前記実施例＜２−２＞の方法で免疫蛍光染色（ＩＣＣ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）した。次に、ＤＡＰＩを処理して細胞の核を染色し、これを蛍光顕微鏡で観察して蛍光値で細胞の数を定量した。融合指数（％）は、全体ＭｙＨＣ発現細胞の核数に対するＭｙＨＣ発現筋線維の核数を百分率で示した。
【０１７４】
その結果、図１５に示されたように、組換えＬＲＲＤ２タンパク質を処置した実験群で未処理対照群に比べて筋線維の面積および融合指数水準が顕著に増加し、これは、Ｓｌｉｔ３タンパク質全長を処置する場合と類似した水準を示すことを確認した（図１５）。
【０１７５】
＜７−２＞生体内水準でＳｌｉｔ３のＬＲＲＤ２による体重および筋減少指標増加効果の確認
具体的に、８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを開腹し、卵巣を切除して、性ホルモンが欠乏するように誘導された筋減少症マウスモデルを作って、９週齢から４週間組換えＬＲＲＤ２ドメインを２μｇまたは１０μｇの投与量で１日１回、１週間５回の投与回数で筋減少症のマウスモデルに静脈注射した。４週後、前記実施例＜１−１＞と同じ方法で１３週齢のマウスモデルの体重および筋肉重さと筋減少指標を確認した。
【０１７６】
その結果、下記表４および図１６に示されたように、ＬＲＲＤ２を投与したマウスモデルの体重は、ＬＲＲＤ２未投与対照群に比べて有意的な変化を示さないが、筋肉量および筋減少指標と関連して、ＬＲＲＤ２を投与したマウスモデルでＬＲＲＤ２未投与対照群に比べてＥＤＬの重量およびＧＣ＋ＳＯＬの重量が有意的に増加し、ＥＤＬの筋減少指標およびＧＣ＋ＳＯＬの筋減少指標もＬＲＲＤ２未投与対照群に比べて有意的に増加することを確認した（図１６および表４）。
【０１７７】
【表４】
2019529334.tif 000006
【図１ａ】
2019529334.tif 000007
【図１ｂ】
2019529334.tif 000008
【図１ｃ】
2019529334.tif 000009
【図１ｄ】
2019529334.tif 000010
【図１ｅ】
2019529334.tif 000011
【図２ａ】
2019529334.tif 000012
【図２ｂ】
2019529334.tif 000013
【図２ｃ】
2019529334.tif 000014
【図２ｄ】
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【図２ｅ】
2019529334.tif 000016
【図３ａ】
2019529334.tif 000017
【図３ｂ】
2019529334.tif 000018
【図３ｃ】
2019529334.tif 000019
【図３ｄ】
2019529334.tif 000020
【図４ａ】
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【図４ｂ】
2019529334.tif 000022
【図４ｃ】
2019529334.tif 000023
【図４ｄ】
2019529334.tif 000024
【図５ａ】
2019529334.tif 000025
【図５ｂ】
2019529334.tif 000026
【図５ｃ】
2019529334.tif 000027
【図５ｄ】
2019529334.tif 000028
【図６】
2019529334.tif 000029
【図７ａ】
2019529334.tif 000030
【図７ｂ】
2019529334.tif 000031
【図７ｃ】
2019529334.tif 000032
【図７ｄ】
2019529334.tif 000033
【図７ｅ】
2019529334.tif 000034
【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
2019529334.tif 000037
【図８ｄ】
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【図８ｅ】
2019529334.tif 000039
【図８ｆ】
2019529334.tif 000040
【図９ａ】
2019529334.tif 000041
【図９ｂ】
2019529334.tif 000042
【図１０】
2019529334.tif 000043
【図１１ａ】
2019529334.tif 000044
【図１１ｂ】
2019529334.tif 000045
【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
2019529334.tif 000049
【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
2019529334.tif 000051
【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
2019529334.tif 000053
【図１３ｃ】
2019529334.tif 000054
【図１３ｄ】
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【図１４ａ】
2019529334.tif 000056
【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１４ｅ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
2019529334.tif 000062
【図１５ｃ】
2019529334.tif 000063
【図１５ｄ】
2019529334.tif 000064
【図１６ａ】
2019529334.tif 000065
【図１６ｂ】
2019529334.tif 000066
【図１６ｃ】
2019529334.tif 000067
【図１６ｄ】
2019529334.tif 000068
【図１６ｅ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月12日(2018.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質又はこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、
筋肉疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項２】
下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質又はこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、
筋肉疾患の予防又は治療用薬学的組成物：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２タンパク質。
【請求項３】
前記Ｓｌｉｔ３タンパク質は、配列番号５の塩基配列から構成されるｓｌｉｔ３遺伝子から発現されることを特徴とする
請求項２に記載の筋肉疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記Ｒｏｂｏ１タンパク質は、配列番号６の塩基配列から構成されるｒｏｂｏ１遺伝子から発現されることを特徴とする
請求項２に記載の筋肉疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記Ｒｏｂｏ２タンパク質は、配列番号７の塩基配列から構成されるｒｏｂｏ２遺伝子から発現されることを特徴とする
請求項２に記載の筋肉疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記ＬＲＲＤ２タンパク質は、配列番号８の塩基配列から構成される遺伝子から発現されることを特徴とする
請求項２に記載の筋肉疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項７】
Ｓｌｉｔおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質又はこれを暗号化する遺伝子の活性化剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を有効成分として含む、
筋肉疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項８】
Ｒｏｂｏおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質又はこれを暗号化する遺伝子の活性化剤を有効成分として含む、
筋肉疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項９】
前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗又は筋肉退化による筋肉疾患であることを特徴とする
請求項１、２、７又は８に記載の筋肉疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
前記筋肉疾患は、無緊張症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋無力症、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）および筋肉減弱症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする
請求項９に記載の筋肉疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１１】
Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質、これを暗号化する遺伝子又はこれらの活性化剤を有効成分として含む、
筋機能改善用組成物。
【請求項１２】
下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質又はこれを暗号化する遺伝子を有効成分として含む、
筋機能改善用組成物：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２タンパク質。
【請求項１３】
ｉ）実験群である被検体由来試料で配列番号１のアミノ酸配列から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質の発現水準を測定する段階と；
ｉｉ）前記段階ｉ）で測定したＳｌｉｔ３タンパク質の発現水準を対照群である正常個体由来試料のＳｌｉｔ３タンパク質発現水準と比較する段階と；
ｉｉｉ）前記段階ｉｉ）で比較した実験群のＳｌｉｔ３タンパク質発現水準が対照群に比べて減少する場合、実験群を筋肉疾患と判断する段階と；を含む、
筋肉疾患診断の情報を提供するためのタンパク質検出方法。
【請求項１４】
前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗又は筋肉退化による筋肉疾患であることを特徴とする
請求項１３に記載の筋肉疾患診断の情報を提供するためのタンパク質検出方法。
【請求項１５】
前記筋肉疾患は、無緊張症、筋萎縮症、筋ジストロフィー、筋無力症、悪液質および
筋肉減弱症よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする
請求項１４に記載の筋肉疾患診断の情報を提供するためのタンパク質検出方法。
【請求項１６】
ｉ）被検化合物又は組成物を、配列番号１のアミノ酸配列から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質、配列番号２のアミノ酸配列から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質および配列番号３のアミノ酸配列から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質よりなる群から選ばれたいずれか一つ以上を発現する細胞株に処理する段階と；
ｉｉ）前記段階ｉ）の処理した細胞株で前記Ｓｌｉｔ３タンパク質の発現程度、あるいは、前記Ｒｏｂｏ１タンパク質又はＲｏｂｏ２タンパク質の活性を測定する段階と；
ｉｉｉ）前記段階ｉｉ）の前記Ｓｌｉｔ３タンパク質の発現程度、あるいはＲｏｂｏ１タンパク質又は前記Ｒｏｂｏ２タンパク質の活性が、被検化合物又は組成物を処理しない対照群細胞株と比較して増加した被検化合物又は組成物を選別する段階と；を含む、
筋肉疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗又は筋肉退化による筋肉疾患であることを特徴とする
請求項１６に記載の筋肉疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記筋肉疾患は、無緊張症、筋萎縮症、筋ジストロフィー、筋無力症、悪液質および
筋肉減弱症よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする
請求項１７に記載の筋肉疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１９】
Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質又はこれを暗号化する遺伝子を、筋肉疾患の予防又は治療用薬剤の製造のために使用するための用途。
【請求項２０】
下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質又はこれを暗号化する遺伝子を、筋肉疾患の予防又は治療用薬剤の製造のために使用するための用途：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２タンパク質。
【請求項２１】
Ｓｌｉｔおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質又はこれを暗号化する遺伝子の活性化剤を、筋肉疾患の予防又は治療用薬剤の製造のために使用するための用途。
【請求項２２】
Ｒｏｂｏおよびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質又はこれを暗号化する遺伝子の活性化剤を、筋肉疾患の予防又は治療用薬剤の製造のために使用するための用途。
【請求項２３】
Ｓｌｉｔ１、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびこれらの断片から構成される群から選ばれたいずれか一つのタンパク質、これを暗号化する遺伝子又はこれらの活性化剤を、筋機能改善用組成物を製造するために使用するための用途。
【請求項２４】
下記配列番号１〜４のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質又はこれを暗号化する遺伝子を、筋機能改善用組成物を製造するために使用するための用途：
配列番号１のアミノ酸から構成されるＳｌｉｔ３タンパク質；
配列番号２のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ１タンパク質；
配列番号３のアミノ酸から構成されるＲｏｂｏ２タンパク質；および
配列番号４のアミノ酸から構成されるＬＲＲＤ２タンパク質。
【国際調査報告】
2019529334.tif 000070
2019529334.tif 000071
2019529334.tif 000072
2019529334.tif 000073
2019529334.tif 000074
2019529334.tif 000075
2019529334.tif 000076