(57)【要約】  本発明は、結腸直腸癌の病期診断、予後及び監視ならびに、結腸直腸癌を有する個人又は結腸直腸癌を発病し易い場合がある個人における治療介入のために有用な最小に侵襲性の方法、試薬、診断及び予後マーカーを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法であって：
（ａ）生体試料を１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに関してアッセイをすること、及び
（ｂ）生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出する
ことを含み、ここでタンパク質バイオマーカーは、ロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、ＣＤ４４、カドヘリン  ２、Ｃ−反応性タンパク質、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３、凝固因子  Ｖ、上皮成長因子受容体、Ｆｅｔｕｉｎ−Ｂ、ヘモペキシン、血清アミロイド  Ｐ成分、ビタミン  Ｄ結合タンパク質、補体因子  Ｉ、スーパーオキシドジスムターゼ  ３、ビトロネクチン、トロンボスポンジン−４又はクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １である、方法。
【請求項２】
前記生体試料が患者中の癌性又は前癌性結腸病変からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに相同性を有する１種以上の検出可能的に標識された合成ペプチドを選択すること
（ｂ）検出可能的に標識された合成ペプチドを生体試料と合わせること、及び
（ｃ）組み合わせを物理的分離方法に供すること
を含む方法により前記生体試料をアッセイする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記物理的分離法が液体クロマトグラフィーである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記合成ペプチドを同位体標識する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルの検出が前記生体試料中のタンパク質バイオマーカーの濃度の定量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アッセイすることが免疫学的アッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫学的アッセイが酵素結合イムノソルベントアッセイを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検出することが質量分析を含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
さらに（ｃ）前記癌性又は前癌性結腸病変において、前記生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、そのステージを同定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーを、ステージ０、ステージ１、ステージ２、ステージ３又はステージ４癌腫における癌性又は前癌性結腸病変において検出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに（ｃ）前記癌性又は前癌性結腸病変において、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、進行性腺腫又は低リスク腺腫と同定することを含み、ここで前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルを、進行性腺腫、低リ
スク腺腫又は正常な組織を有する患者において検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーがＣ−反応性タンパク質及び上皮成長因子受容体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
さらに（ｃ）前記癌性又は前癌性結腸病変において、前記生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、絨毛腺腫又は低リスク腺腫を同定することを含み、ここで前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルを、絨毛腺腫、低リスク腺腫又は正常な組織を有する患者において検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーが、Ｃ−反応性タンパク質、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖
Ｈ３及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに（ｃ）前記癌性又は前癌性結腸病変において、前記生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、限局性（ステージ１及び２）又は局所性（ステージ３）結腸直腸癌と同定することを含み、ここで前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルを、限局性（ステージ１及び２）又は局所性（ステージ３）結腸直腸癌を有する患者において検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーが、Ｃ−反応性タンパク質、ＣＤ４４、上皮成長因子受容体及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
さらに（ｃ）前記癌性又は前癌性結腸病変において、前記生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、成長している腺腫と同定することを含み、ここで前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルを、成長している腺腫、静止性腺腫又は退行している腺腫を有する患者において検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーが、凝固因子  Ｖ、Ｃ−反応性タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４及びロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料が、ポリープ切除後、結腸切除後又は他の治療介入後の前記患者からのものである、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
さらに（ｃ）前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルがポリープ切除前の癌性又は前癌性結腸病変において検出されたレベルと異なる場合に、ポリープ切除、結腸切除又は他の治療介入の後の癌性又は前癌性結腸病変の再発を同定することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体試料をポリープ切除から１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月又は６ヵ月後以内に回収する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生体試料をポリープ切除から１年又は２年後以内に回収する請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
さらに（ｃ）前記生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、ポリープ切除又は他の治療介入の後にポリープを有する個人を同定することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーが、Ｃ−反応性タンパク質及びペプチダーゼ阻害剤  １６を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
さらに（ｃ）前記癌性又は前癌性結腸病変において、前記生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、進行性腺腫又は低リスク腺腫と同定することを含み、ここで前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルが前記患者の性別に依存し、且つここで前記１種又は複数種のタンパク質の参照レベルが、進行性腺腫、低リスク腺腫又は正常な組織を有する患者において検出される、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記患者が女性であり、且つここで前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーが、凝固因子  Ｖ、ＣＤ４４及び上皮成長因子受容体を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者が男性であり、且つここで前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーが、Ｃ−反応性タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４及び補体因子  Ｉを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体試料が患者における癌性又は前癌性結腸又は直腸病変からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
さらに（ｃ）前記生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、前記患者における直腸ポリープを同定することを含み、ここで前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルを直腸ポリープ、結腸ポリープ又は正常な組織を有する患者において検出する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーが、ペプチダーゼ阻害剤  １６、ＣＤ４４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
さらに（ｃ）前記生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより患者における結腸直腸癌を同定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記１種又は複数種のバイオマーカーが、ロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、ＣＤ４４、Ｃ−反応性タンパク質、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３、凝固因子  Ｖ、上皮成長因子受容体、Ｆｅｔｕｉｎ−Ｂ、ヘモペキシン又はクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記患者が男性であり、且つここで前記１種又は複数種のバイオマーカーがさらに、補体因子  Ｉ及び血清アミロイド  Ｐ成分を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記患者が女性であり、且つ前記１種又は複数種のバイオマーカーがさらにカドヘリン
２を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記１種又は複数種のバイオマーカーが、ロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ＣＤ４４、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３又は上皮成長因子受容体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が非侵襲性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
結腸直腸癌を有する患者の同定方法であって、
該患者からの生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーを検出する
ことを含み、ここで１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーが、ロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、ＣＤ４４、Ｃ−反応性タンパク質、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３、凝固因子  Ｖ、上皮成長因子受容体、Ｆｅｔｕｉｎ−Ｂ、ヘモペキシン又はクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法を提供し、ここでタンパク質バイオマーカーはロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、ＣＤ４４、カドヘリン  ２、Ｃ−反応性タンパク質、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３、凝固因子  Ｖ、上皮成長因子受容体、Ｆｅｔｕｉｎ−Ｂ、ヘモペキシン、血清アミロイド  Ｐ成分、ビタミンＤ結合タンパク質、補体因子  Ｉ、スーパーオキシドジスムターゼ  ３、ビトロネクチン、トロンボスポンジン−４及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １である。本発明はさらに、癌性又は前癌性結腸病変の病期診断、予後及び監視ならびに結腸直腸癌を有する個人又は結腸直腸癌を発病し易い場合がある個人における治療介入のために有用な最小に侵襲性の方法、試薬、診断及び予後マーカーを提供する。本発明の特定の実施態様は、結腸の癌性又は前癌性病変の臨床的病期を同定する血清バイオマーカーを用いる。
【背景技術】
【０００２】
関連出願へのクロスリファレンス
本特許出願は、２０１６年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／３４８，２９０号明細書の優先権の利益を主張し、前記特許のすべてはその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【０００３】
電子的に提出されるテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出される以下のテキストファイルの内容は、引用によりその全体が本明細書に取り込まれる：配列表のコンピューター可読フォーマットコピー（ファイル名：１６−８１６−ＰＲＯ＿ＳＴ２５＿６−９−１６．ｔｘｔ，記録日：２０１６年６月９日，ファイルサイズ  １１ＫＢ）。
【０００４】
関連技術の説明
２０１６年に約１３５，０００の結腸及び直腸癌の新しい症例が診断され、ほとんど５０，０００人がこの疾患で死亡し、結腸及び直腸癌を合衆国における癌関連死の最も多く見られる原因の１つとしている。非特許文献１。早期の診断は高い生存率を有するが、推奨されるスクリーニング指針を順守する割合は低く、約２３００万人の合衆国国民（３０−４０％）はスクリーニングされないままである。非特許文献２。
【０００５】
合衆国において、結腸直腸癌予防の主な方法は、スクリーニング大腸内視鏡検査による早期検出である。非特許文献２。合衆国における大腸内視鏡検査による慣例的な結腸癌スクリーニング／監視のリスク−便益を評価する最近の研究は、繰り返される大腸内視鏡検査が医療制度への負担であり、患者にとって期待されるより低い便益を有することを示している。非特許文献３；非特許文献４。最近の研究は、施術（ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の１週間以内での大腸内視鏡検査からの合併症の故の２％の再入院率を同定した。非特許文献５。２０１６年２月に、カナダの防疫係官は、結腸直腸癌の家族歴がない低リスクの無症候性の患者はもはや大腸内視鏡検査によりスクリーニングされるべきではないと述べる新しい結腸癌スクリーニング指針を発した。カナダの専門家であるＢｏｇｇｓ  Ｗ．は、結腸癌スクリーニングのための大腸内視鏡検査に「否」と言っている。非特許文献６。便潜血試験又は便免疫化学試験（ＦＯＢＴ及びＦＩＴ）のような侵襲性の低い排せつ物に基づく試験が推奨された。
【０００６】
結腸癌の大部分は良性の腺腫性ポリープとして始まり、遺伝子突然変異の逐次的累積を
介して浸潤性の癌腫に進行する（図１）。非特許文献７；非特許文献８。大腸内視鏡検査の間に同定されるポリープの生検は、ポリープが癌性であるかどうかを決定する病理学者により評価される。非癌性ポリープと診断される大腸内視鏡検査の症例は癌を発病するリスクにより分類され、予測されるリスクに基づいて追跡監視が推奨される。
【０００７】
結腸直腸腫瘍の局所的な進行を正確に予測する可能性は、結腸癌生物学の分野で大部分は未解決のままである。分子遺伝学法は、再発に関するリスクを予測するために遺伝子アレーを用いる試験の開発を生じたが、それらの能力は診断の時点におけるリンパ節転移（ステージ３）の予測に限られたままである。非特許文献９。ステージ４転移を同定するために用いられる画像化法（ＣＴスキャン）は、リンパ節浸潤の存在を確実に同定することができなかった。さらに、現在の患者精密検査法（ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＰＥＴ／ＭＲＩ）の間に用いられる画像化法のいずれによっても所属リンパ節は適切に可視化されず、小さい罹患（ａｆｆｅｃｔｅｄ）リンパ節か部分的に罹患したリンパ節かの鑑別（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）は、これらの画像化分野内の将来の技術的躍進を以てしても可能性が低い。
【０００８】
現在、リンパ節の外科手術的切除及び病理学的分析によってのみ、リンパ節浸潤を確実に検出することができる。結腸直腸外科手術患者の最高で３５％が術後合併症に苦しめられ、それは死亡、悪い腫瘍学的予後、追加の合併症及びより悪い生活の質に関するより高いリスクにあることが示された。非特許文献１０。所属リンパ節の状況が既知であれば、患者の罹患率（ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）を下げる内視鏡的切除のような局所的外科手術法が可能である。
【０００９】
直腸癌は、処置されている領域の感受性の故に、結腸癌と比較して有意な患者の罹患及び死亡の原因となる。直腸癌と関連する罹患率及び死亡率のレベルは、臨床的処置の間の継続的な懸念である。結腸癌及び直腸癌の両方のための一次的治療は、腫瘍を除去するための外科手術である。何人かの直腸癌患者は放射線及び／又は化学療法の形態における術前補助処置（外科手術前）から便益を受ける。しかしながらすべての患者が術前補助療法から便益を受けるわけではないであろう。さらに継続的な処置の料金は、しばしば一時的な人工肛門（補助的化学療法処置の後に２回目の外科手術により除去されねばならない）が必要であることと一緒になって、処置が毎日の健康及びライフスタイルに要する料金の故に直腸癌の患者が必要な処置を拒否することがあることを意味する。
【００１０】
かくして当該技術分野において、術前補助処置から便益を受けるであろう直腸癌の患者を正確に且つ確実に同定する必要もある。特に術前補助処置を与える前に患者のリンパ節の状況の一貫した病期診断を達成する方法が必要である。病期診断をしない医師は、多くの場合に、特に患者がＴ１又はＴ２腫瘍を有している場合に患者を過剰処置している。処置の前に直腸癌の患者を病期診断する医師は、多くの場合にＴ３又はＴ４腫瘍を有するいずれの患者のためにも（リンパ節の状況について何も知らずに）術前補助処置を与えるであろう。これは、原発腫瘍がさらに腸壁内に成長してしまった場合のリンパ節転移の可能性の故である。しかしながらこれは、多くの患者が過剰処置され、不必要な化学療法及び放射線を経る痛みに加えて患者が治療を経験している時間を長くしていることを意味する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｉｅｇｅｌ  ＲＬ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＫＤ，Ｊｅｍａｌ  Ａ．Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１６．ＣＡ：ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ．２０１６；６６（１）：７−３０．ｄｏｉ：１０．３３２２／ｃａａｃ．２１３３２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２６７４２９９８
【非特許文献２】Ｗｉｎａｗｅｒ  ＳＪ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＳＥ，Ｌｅｖｉｎ  Ｂ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ，Ｒｅａｌｉｔｙ−Ｄｒｉｖｅｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：Ｔｈｅ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ．ＪＡＭＡ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．２０１６；３１５（１９）：２０６５−６．ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａ．２０１６．３３７７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２７１８７２９４
【非特許文献３】Ｋｒｕｓｅ  ＧＲ，Ｋｈａｎ  ＳＭ，Ｚａｓｌａｖｓｋｙ  ＡＭ，Ａｙａｎｉａｎ  ＪＺ，Ｓｅｑｕｉｓｔ  ＴＤ．Ｏｖｅｒｕｓｅ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．２０１５；３０（３）：２７７−８３．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１６０６−０１４−３０１５−６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２５２６６４０７；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣＰＭＣ４３５１２８６
【非特許文献４】Ａｕｓｔｉｎ  ＧＬ，Ｆｅｎｎｉｍｏｒｅ  Ｂ，Ａｈｎｅｎ  ＤＪ．Ｃａｎ  ｃｏｌｏｎｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｍａｉｎ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ？  Ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｗｉｌｌ  Ｒｏｇｅｒｓ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ  ｏｎ  ｃｏｓｔ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１３；１０８（３）：２９６−３０１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ａｊｇ．２０１２．１９５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２３２０８２７３
【非特許文献５】Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅ  Ｉ，Ｐａｒｚｙｎｓｋｉ  ＣＳ，Ｓｅａｒｆｏｓｓ  Ｒ，Ｍｏｎｔａｇｕｅ  Ｊ，Ｌｉｎ  Ｚ．Ａｌｌｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎＣｏｌｏｎｏｓｃｏｐｙ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ａｍｏｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｓｔ−Ｃｏｌｏｎｏｓｃｏｐｙ  Ｒｉｓｋ−Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  Ｒａｔｅ  ｏｆ  Ｕｎｐｌａｎｎｅｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｖｉｓｉｔｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１６；１５０（１）：１０３−１３．ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１５．０９．００９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２６４０４９５２
【非特許文献６】Ｒｅｕｔｅｒｓ（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ）．２０１６  ４／１４／２０１６．Ａｖｅｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ：ｗｗｗ．ｒｅｕｔｅｒｓ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｕｓ−ｈｅａｌｔｈ−ｃｏｌｏｎｏｓｃｏｐｙ−ｃａｎａｄａ−ｉｄＵＳＫＣＮ０ＶＶ２８Ａ
【非特許文献７】Ｓｕｅｈｉｒｏ  Ｙ．Ｈｉｎｏｄａ  Ｙ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ｃｒｙｐｔ  ｆｏｃｉ  ａｎｄ  ｓｅｒｒａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｓ．Ｃａｎｃｅ  Ｓｃｉ．２００８；９９（６）：１０７１−６．Ｅｐｕｂ  ２００８／０４／０４．ｄｏｉ：１０．ｌ１１ｌ／ｊ．１３４９−７００６．２００８．００７８４ｘＣＡＳ７８４  ［ｐｉｉ］．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８３８４４３５
【非特許文献８】Ｆｅａｒｏｎ  ＥＲ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＳＲ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ．Ｃｌｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８７；２３８（４８２４）：１９３−７．Ｅｐｕｂ  １９８７／１０／０９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２８８９２６７
【非特許文献９】Ｍａａｋ  Ｍ，Ｓｉｍｏｎ  Ｉ，Ｎｉｔｓｃｈｅ  Ｕ，Ｒｏｅｐｍａｎ  Ｐ，Ｓｎｅｌ  Ｍ，Ｇｌａｓ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ（ＣｏｌｏＰｒｉｎｔ）  ｆｏｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｔａｇｅ  ＩＩ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ．２０１３．Ｅｐｕｂ  ２０１３／０１／０９．ｄｏｉ：１０．１０９７／ＳＬＡ．０ｂ０１３ｅ３１８２７ｃ１１８０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２３２９５３１８
【非特許文献１０】Ａｒｔｉｎｙａｎ  Ａ，Ｏｒｃｕｔｔ  ＳＴ，Ａｎａｙａ  ＤＡ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐ，Ｃｈｅｎ  ＧＪ，Ｂｅｒｇｅｒ  ＤＨ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｃｕｒａｔｉｖｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  １２，０７５  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｓｕｒｇｅｒｙ．２０１５；２６１（３）：４９７−５０５．ｄｏｉ：１０．１０９７／ＳＬＡ．０００００００００００００８５４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２５１８５４６５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法を提供し、ここでタンパク質バイオマーカーはロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、ＣＤ４４、カドヘリン  ２、Ｃ−反応性タンパク質、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤，重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３、凝固因子  Ｖ、上皮成長因子受容体、Ｆｅｔｕｉｎ−Ｂ、ヘモペキシン、血清アミロイド  Ｐ成分、ビタミン  Ｄ結合タンパク質、補体因子  Ｉ、スーパーオキシドジスムターゼ  ３、ビトロネクチン、トロンボスポンジン−４及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １である。本発明はさらに、結腸直腸癌の病期診断、予後及び監視ならびに結腸直腸癌を有する個人か、結腸直腸癌を発病し易い場合がある個人かにおける治療介入のために有用な、侵襲性が最小の方法、試薬、診断及び予後マーカーを提供する。
【００１３】
１つの側面において、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法を本明細書で提供する。該方法は：生体試料を１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに関してアッセイすること、及び、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーはロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、ＣＤ４４、Ｃ−反応性タンパク質、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３、凝固因子  Ｖ、上皮成長因子受容体、Ｆｅｔｕｉｎ−Ｂ、ヘモペキシン及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １である。
【００１４】
別の側面において、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法を本明細書で提供する。該方法は：生体試料を１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに関してアッセイすること、及び、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーはロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ＣＤ４４、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤，重鎖  Ｈ３、上皮成長因子受容体である。
【００１５】
さらに別の側面において、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法を本明細書で提供する。該方法は：生体試料を１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに関してアッセイすること、及び、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーはＣ−反応性タンパク質、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １である。
【００１６】
いくつかの実施態様において、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法を本明細書で提供する。該方法は：生体試料を１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに関してアッセイすること、及び生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーはＣ−反応性タンパク質、ＣＤ４４、上皮成長因子受容体及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １である。
【００１７】
他の実施態様において、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法を本明細書で提供する。該方法は：生体試料を１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに関してアッセイすること、及び、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーは凝固因子  Ｖ、Ｃ−反応性タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４及びロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質である。
【００１８】
さらに別の実施態様において、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法を本明細書で提供する。該方法は：生体試料を１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに関してアッセイすること、及び、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーはＣ−反応性タンパク質及びペプチダーゼ阻害剤  １６である。
【００１９】
代表的な非排他的実施態様において、本開示は正常な組織、低リスク腺腫及び高リスク腺腫（進行性腺腫（ａｄｖａｎｃｅｄ  ａｄｅｎｏｍａ）としても既知）を区別するための血清バイオマーカーを提供する。
【００２０】
他の代表的な非排他的実施態様において、本開示は正常な組織、低リスク腺腫及び絨毛腺腫を区別するための血清バイオマーカーを提供する。
【００２１】
さらに別の代表的な非排他的実施態様において、本開示は限局性（ステージ１及び２）又は局所性（ステージ３）結腸直腸癌を区別するための血清バイオマーカーを提供する。
【００２２】
さらなる代表的な非排他的実施態様において、本開示は成長している腺腫の検出のための血清バイオマーカーを提供する。
【００２３】
さらに別の代表的な非排他的実施態様において、本開示はポリープ切除、結腸切除又は他の治療介入の後の癌性又は前癌性結腸病変の再発を同定するための血清バイオマーカーを提供する。
【００２４】
本開示のいくつかの代表的な非排他的実施態様は、正常な組織、低リスク腺腫及び進行性腺腫を区別するための男女別（ｇｅｎｄｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）血清バイオマーカーを提供する。
【００２５】
他の代表的な非排他的実施態様は、患者における直腸ポリープの存在を同定するための特異的血清バイオマーカーを提供する。
【００２６】
いくつかの側面において、本開示は生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、患者における結腸直腸癌を同定するための血清バイオマーカー及び方法を提供する。
【００２７】
特定の実施態様において、生体試料は癌性又は前癌性結腸病変からのものである。他の実施態様において、前記方法はさらに、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルをステージ０、ステージ１、ステージ２、ステージ３又はステージ４癌腫における前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、癌性又は前癌性結腸病変のステージを同定することを含む。
【００２８】
特定の実施態様において、生体試料は癌性又は前癌性結腸病変からのものである。他の実施態様において、前記方法はさらに、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを低リスク腺腫、高リスク腺腫及び結腸直腸癌腫における前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、病変を高リスク腺腫、進行性腺腫、低リスク腺腫又は結腸直腸癌腫と同定することを含む。
【００２９】
特定の実施態様において、生体試料は癌性又は前癌性結腸病変からのものである。他の実施態様において前記方法はさらに、１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルがポリープ切除前の癌性又は前癌性結腸病変において検出されるレベルと異なる場合に、ポリープ切除の後の（本明細書ではポリープ切除後と呼ばれる）あるいは結腸直腸癌を除去するための外科手術的切除の後の癌性又は前癌性結腸病変の再発を同定することを含む。
【００３０】
実施態様において、本開示は：１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに相同性を有する１種以上の検出可能的に標識された合成ペプチドを選択し；検出可能的に標識された合成ペプチドを生体試料と合わせ；そして組み合わせを物理的分離方法に供することを含む生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法を提供する。
【００３１】
本明細書で用いられる「相同性」は、バイオマーカーの核酸又はアミノ酸配列と同一性を有する核酸、ペプチド、アミノ酸又はタンパク質配列を指す。特定の実施態様において、バイオマーカーの核酸又はアミノ酸配列と同一性を有する核酸、ペプチド、アミノ酸又はタンパク質配列は、バイオマーカーの配列のすべて又は一部との約８０％、８５％、９０％、９５％又はそれより高い同一性を有する。
【００３２】
いくつかの実施態様において、本開示の物理的分離方法は液体クロマトグラフィーであり、合成ペプチドは同位体標識される。
【００３３】
本発明のこれらの及び他の特徴及び利点は、添付の請求項と一緒に読まれる以下の本発明の詳細な記述からもっと完全に理解されるであろう。請求項の範囲はその中の詳述によって定義され、本説明中に示される特徴及び利点の特定の議論により定義されないことに注意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】結腸直腸癌の一般的（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ）ステージを同定する米国国立癌研究所からの画像である。ステージ０は多くの場合に腺腫と呼ばれる前癌性ポリープである。ステージ１及び２は癌性であるが所属リンパ節に浸潤していない。ステージ３は所属リンパ節が冒される段階（ｐｏｉｎｔ）である。ステージ４は転移性癌である。
【図２】結腸の組織におけるポリープ成長の局在を強調する結腸直腸癌病期診断を示す。上皮層は４種の組織層に分類される：粘膜、粘膜下、筋肉組織及び漿膜。結腸及び直腸壁の外側を超えてすぐに隣接リンパ節があり、それに結腸腫瘍形成に冒され得る体の他の組織が続いている。結腸癌の第１ステージはステージ０であり、そのステージでは腸粘膜上にポリープが形成される。このステージは癌性ではない。他のすべてのステージは癌腫と呼ばれ、癌性である。
【図３】標的化定量的プロテオミクス実験のワークフローを示す略図である。安定同位体で標識された参照標準をタンパク質抽出物中に添加してから酵素消化する。これらの標準は問題の標的タンパク質の内在性ペプチド配列と一致するが１つの重い安定同位体で標識されたアミノ酸を含有する。ペプチドを逆相クロマトグラフィーによりクロマトグラフィー分離し、続いてトリプル四重極質量分析（ＱＱＱ−ＭＳ）と直列に分析し、そこで標的とされる前駆体及びフラグメントイオン質量（遷移）を選択する。２つの感受性の四重極質量フィルターを用いて問題の前駆体（Ｑ１）及びフラグメントペプチドイオン（Ｑ３）を選択し、衝突セルとしてｑ２を用いる。抽出イオンクロマトグラム面積を用いて重い及び軽いペプチドの定量を行う。内在性クロマトグラム面積対参照標準クロマトグラム面積の比を用いて相対的な比を得る。生物学的試料全体にわたって参照標準への相対的な比を比較し、生物学的グループの中で相対的な差次的発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を決定することができる。
【図４】３つの別個の患者登録集団（楕円）及び登録患者に由来する続く患者グループ（白い四角形）を示す。大腸内視鏡検査からの患者の３つの別個のクラス：高リスクポリープ（進行性腺腫）を有するもの、低リスクポリープを有するもの及びポリープのないものがあった。「ポリープなし」及び「低リスクポリープ」患者すべてを全体的な低リスクグループ内に入れた。高リスクポリープを有するいずれの患者も高リスクグループ内に入れた。「前／後」研究からのポリープ切除前の患者はＣＴコロノグラフィーにより示される既知のポリープを有した。これらの患者のポリープのそれぞれは低リスク又は高リスクグループのいずれかに含まれた。結腸直腸外科手術（結腸切除）を受けている患者のほとんどは、非転移性癌グループに含まれた。一人の患者は進行性腺腫（高リスク）に至り、他の数人の患者は他の診断（例えば神経内分泌腫瘍）に至った。非転移性のグループは、結腸直腸癌の３つの非転移性ステージ：ステージ１、ステージ２及びステージ３に分かれた。ステージ３の証明は所属リンパ節浸潤である。
【図５】さらに本開示の実施例に登録される患者の性別及び年齢構成を示す。大体同数の男性及び女性が登録された。患者の年齢範囲は３０〜８８才であり、大体中央の年齢は６０才であった。ポリープを有するほとんどの患者は１−２個のポリープを有し、ポリープ保有患者の中の７１人は進行性腺腫を有した。癌の症例の大部分は腸壁に限局されていた（ステージ１及び２）が、１２の症例は局所性であった（ステージ３）。これらの非転移の症例の中で、報告されたＣＥＡレベルの大部分は２．５ｎｇ／ｍｌ未満の正常なレベルにあった。
【図６】研究に登録された患者の年齢グループ全体に及ぶ非癌の症例に関する性別内訳及びそれぞれの結腸癌ステージに関する性別内訳を説明する。一般に登録患者において、年齢グループ又は癌ステージ全体にわたって有意な性別の差はなかった。
【図７】ポリープ切除前／後比の計算の略図を示す。ポリープ切除前／後比は、比の比である（ここで各個別の比は本明細書で「参照標準データに対する相対的な比」と呼ばれる）。第１に重同位体で標識された（ｈｅａｖｙ−ｌａｂｅｌｅｄ）内部参照標準と比較してそれぞれの生物学的試料の比を得る。第２に比を用いて最終的なポリープ切除前／後比を計算する。結腸腺腫又は癌腫において上方調節されるタンパク質は、やはり上方調節されるポリープ切除前／後比を示すはずである。結腸腺腫又は癌腫において下方調節されるタンパク質は、やはり下方調節されるポリープ切除前／後比を有するはずである。
【図８】低リスクの症例と比較される進行性腺腫（高リスク）大腸内視鏡検査の症例におけるＣＲＰ及びＥＧＦＲに関する参照標準データに対する相対的な比を示す。この図において、低リスクはスクリーニング大腸内視鏡検査が正常であったか又は結腸直腸癌への発達に関して低リスクのポリープを有していたすべての症例を指す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図９】高リスク腺腫の同定のためのＣＲＰ及びＥＧＦＲの感度及び特異度を表現する（ｃｏｎｖｅｙｉｎｇ）それぞれの受信者動作特性（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）曲線を示す。対角線の左へのデータ点は、進行性腺腫の同定に関する正の予測値を表現する。対角線上又は比較的それに近いデータ点は、進行性腺腫の同定の５０％「コイン投げ」の確率を示すが、対角線の右へのデータ点は負の確率を示す。
【図１０】患者の性別に基づく進行性腺腫の同定のためのＣＲＰ及びＥＧＦＲの感度及び特異度を表現するそれぞれの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。右のパネル中のＲＯＣ曲線を女性及び男性に関してそれぞれ「Ｆ」及び「Ｍ」と標識する。
【図１１Ａ】すべての性別を合わせた場合（左のパネル）及び性別により分けた場合（右のパネル）における進行性腺腫の同定のためのＩＴＩＨ４及びＣＦＩの感度及び特異度を表現するそれぞれの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。右のパネル中のＲＯＣ曲線を女性及び男性に関してそれぞれ「Ｆ」及び「Ｍ」と標識する。
【図１１Ｂ】すべての性別を合わせた場合（左のパネル）及び性別により分けた場合（右のパネル）における進行性腺腫の同定のためのＣＤ４４及びＦ５の感度及び特異度を表現するそれぞれの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。右のパネル中のＲＯＣ曲線を女性及び男性に関してそれぞれ「Ｆ」及び「Ｍ」と標識する。
【図１２Ａ】多数の非癌性ポリープ組織病理学全体に及ぶＣＲＰに関する参照標準データに対する相対的な比を示す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図１２Ｂ】多数の非癌性ポリープ組織病理学全体に及ぶＩＴＩＨ４に関する参照標準データに対する相対的な比を示す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図１２Ｃ】多数の非癌性ポリープ組織病理学全体に及ぶＩＴＩＨ３に関する参照標準データに対する相対的な比を示す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図１３】他の型のポリープの組織病理学と比較される管状絨毛腺腫中のＱＳＯＸ  １の発現における性別の差を示す参照標準データに対する相対的な比を示す。
【図１４】結腸対直腸癌の比較に関する４つの範疇：正常なスクリーニング大腸内視鏡検査、結腸ポリープのみを有する患者、結腸及び直腸ポリープを有する患者及び直腸ポリープのみを有する患者の中の１つに含まれるポリープを有する患者の症例の数を示す。これらの４つの範疇内の腺腫の位置の関係においてバイオマーカー発現を分析した。
【図１５Ａ】結腸ポリープを有する症例対直腸ポリープを有する症例におけるＰＩ１６及びＩＴＩＨ３に関する発現の差を示す参照標準データに対する相対的な比を示す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図１５Ｂ】結腸ポリープを有する症例対直腸ポリープを有する症例におけるＣＤ４４及びＱＳＯＸ１に関する発現の差を示す参照標準データに対する相対的な比を示す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図１６Ａ】非転移性癌（「癌の症例」）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（「低リスク及び正常な症例」）における標記バイオマーカーに関する参照標準に対する相対的な比を示す。Ｐ値は、９５％の信頼度（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ）におけるＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのｐ値を示す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図１６Ｂ】非転移性癌（「癌の症例」）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（「低リスク及び正常な症例」）における標記バイオマーカーに関する参照標準に対する相対的な比を示す。Ｐ値は、９５％の信頼度（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ）におけるＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのｐ値を示す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図１６Ｃ】非転移性癌（「癌の症例」）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（「低リスク及び正常な症例」）における標記バイオマーカーに関する参照標準に対する相対的な比を示す。Ｐ値は、９５％の信頼度（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ）におけるＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのｐ値を示す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図１７Ａ】非転移性癌と比較される低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例におけるＥＧＦＲ及びＣＤ４４に関するＲＯＣ曲線を示す。
【図１７Ｂ】非転移性癌と比較される低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例におけるＤＰＰ４及びＦＥＴＵＢに関するＲＯＣ曲線を示す。
【図１７Ｃ】非転移性癌と比較される低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例におけるＰＩ１６に関するＲＯＣ曲線を示す。
【図１８Ａ】非転移性癌（「癌の症例」）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（「低リスク及び正常な症例」）における標記バイオマーカーに関する参照標準データに対する相対的な比を示す。Ｐ値は、９５％の信頼度におけるＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのｐ値を示す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図１８Ｂ】非転移性癌（「癌の症例」）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（「低リスク及び正常な症例」）における標記バイオマーカーに関する参照標準データに対する相対的な比を示す。Ｐ値は、９５％の信頼度におけるＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのｐ値を示す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図１８Ｃ】非転移性癌（「癌の症例」）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（「低リスク及び正常な症例」）における標記バイオマーカーに関する参照標準データに対する相対的な比を示す。Ｐ値は、９５％の信頼度におけるＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのｐ値を示す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図１８Ｄ】非転移性癌（「癌の症例」）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（「低リスク及び正常な症例」）における標記バイオマーカーに関する参照標準データに対する相対的な比を示す。Ｐ値は、９５％の信頼度におけるＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのｐ値を示す。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図１９Ａ】非転移性癌（「癌の症例」）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（「低リスク及び正常な症例」）における上方調節されるタンパク質のそれぞれに関するＲＯＣ曲線を示す。
【図１９Ｂ】非転移性癌（「癌の症例」）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（「低リスク及び正常な症例」）における上方調節されるタンパク質のそれぞれに関するＲＯＣ曲線を示す。
【図１９Ｃ】非転移性癌（「癌の症例」）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（「低リスク及び正常な症例」）における上方調節されるタンパク質のそれぞれに関するＲＯＣ曲線を示す。
【図１９Ｄ】非転移性癌（「癌の症例」）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（「低リスク及び正常な症例」）における上方調節されるタンパク質のそれぞれに関するＲＯＣ曲線を示す。
【図２０Ａ】非転移性癌（右のパネル）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（左のパネル）でのタンパク質に関する感度及び特異度における性別関連差を示す標記バイオマーカーに関するＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣ曲線を女性及び男性に関してそれぞれ「Ｆ」及び「Ｍ」と標識する。
【図２０Ｂ】非転移性癌（右のパネル）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（左のパネル）でのタンパク質に関する感度及び特異度における性別関連差を示す標記バイオマーカーに関するＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣ曲線を女性及び男性に関してそれぞれ「Ｆ」及び「Ｍ」と標識する。
【図２０Ｃ】非転移性癌（右のパネル）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（左のパネル）でのタンパク質に関する感度及び特異度における性別関連差を示す標記バイオマーカーに関するＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣ曲線を女性及び男性に関してそれぞれ「Ｆ」及び「Ｍ」と標識する。
【図２０Ｄ】非転移性癌（右のパネル）と比較されるプールされた低リスク及び正常な大腸内視鏡検査の症例（左のパネル）でのタンパク質に関する感度及び特異度における性別関連差を示す標記バイオマーカーに関するＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣ曲線を女性及び男性に関してそれぞれ「Ｆ」及び「Ｍ」と標識する。
【図２１】ロジスティック回帰分析を用いる５−マーカーパネルＲＯＣ曲線を示す。最も左の曲線は５つのマーカー：ＣＤ４４、ＤＰＰ４、ＥＧＦＲ、ＩＴＩＨ３及びＬＲＧ１に関するバリデーションデータを示す。同じデータに関するトレーニング曲線は最も右のＲＯＣ曲線である。灰色の球は信頼区間を示す。商業的に入手可能なＣＲＣのためのスクリーニング試験に関するセット感度及び特異度点（ｓｅｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｏｉｎｔｓ）がＲＯＣ曲線に含まれる。
【図２２】エキストラツリーズ回帰分析（ｅｘｔｒａ  ｔｒｅｅｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いる５−マーカーパネルＲＯＣ曲線を示す。最も左の曲線は５つのマーカー：ＣＤ４４、ＤＰＰ４、ＥＧＦＲ、ＩＴＩＨ３及びＬＲＧ１に関するバリデーションデータを示す。同じデータに関するトレーニング曲線は最も右のＲＯＣ曲線である。灰色の球は信頼区間を示す。商業的に入手可能なＣＲＣのためのスクリーニング試験に関するセット感度及び特異度点がＲＯＣ曲線に含まれる。
【図２３Ａ】所属リンパ節浸潤がある（「局所性癌」）又はない（「限局性癌」）非転移性癌における標記バイオマーカーに関する参照標準データに対する相対的な比を示す。ステージ３は１つ以上の冒された所属リンパ節を有すると特徴付けられる。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図２３Ｂ】所属リンパ節浸潤がある（「局所性癌」）又はない（「限局性癌」）非転移性癌における標記バイオマーカーに関する参照標準データに対する相対的な比を示す。ステージ３は１つ以上の冒された所属リンパ節を有すると特徴付けられる。点プロット上のそれぞれの円は一人の患者の症例を示す。
【図２４】非転移性癌患者と比較される冒された所属リンパ節を有する患者の症例における標記バイオマーカーに関する感度対特異度ＲＯＣ曲線を示す。
【図２５】限局性非転移性癌患者と比較される局所性リンパ節転移の存在を予測することができる標記バイオマーカーを含むバイオマーカーパネルのＲＯＣ曲線を示す。
【図２６Ａ】一般的に腺腫に関するポリープ切除前及び後のＰＩ１６バイオマーカー発現を示す。図２６Ａに示される点プロットにおいて、ｘ軸上に示される範疇内のそれぞれの円は一人の患者を示す。ＰＩ１６は典型的に下方調節されるので、１未満の前／後比はポリープ切除後の正常なタンパク質発現レベルへの復帰と考えられる。
【図２６Ｂ】癌に発達するリスクにより分けられた腺腫に関するポリープ切除前及び後のＰＩ１６バイオマーカー発現を示す。図２６Ｂにおいて、それぞれの棒は一人の患者に関するポリープ切除前／後比を示す。ＰＩ１６は典型的に下方調節されるので、１未満の前／後比はポリープ切除後の正常なタンパク質発現レベルへの復帰と考えられる。
【図２７Ａ】一般的に腺腫に関するポリープ切除前及び後のＣＲＰバイオマーカー発現を示す。図２７Ａに示される点プロットにおいて、ｘ軸上に示される範疇内のそれぞれの円は一人の患者を示す。ＣＲＰは典型的に上方調節されるので、１より高い前／後比はポリープ切除後の正常なタンパク質発現レベルへの復帰と考えられる。この場合、有意な復帰のほとんどは進行性腺腫の症例で起こった。
【図２７Ｂ】癌に発達するリスクにより分けられた腺腫に関するポリープ切除前及び後のＰＩ１６バイオマーカー発現を示す。図２７Ｂにおいて、それぞれの棒は一人の患者に関するポリープ切除前／後比を示す。ＣＲＰは典型的に上方調節されるので、１より高い前／後比はポリープ切除後の正常なタンパク質発現レベルへの復帰と考えられる。この場合、有意な復帰のほとんどは進行性腺腫の症例で起こった。
【図２８】ポリープ切除前及び後研究において、個々の患者がポリープ切除前にＣＴコロノグラフィー（ＣＴ  Ｃｏｌｏｎｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＴＣ）による長期監視に供された期間をプロットしている。それぞれの円は一人の患者の症例を示し、メジアン監視期間は約５年であった。
【図２９Ａ】既知の成長している腺腫を有する患者及び未知の成長の腺腫が同定された患者の症例における標記バイオマーカーに関する参照標準データに対する相対的な比を示す。
【図２９Ｂ】既知の成長している腺腫を有する患者及び未知の成長の腺腫が同定された患者の症例における標記バイオマーカーに関する参照標準データに対する相対的な比を示す。
【図２９Ｃ】既知の成長している腺腫を有する患者及び未知の成長の腺腫が同定された患者の症例における標記バイオマーカーに関する参照標準データに対する相対的な比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本明細書で引用されるすべての出版物、特許及び特許出願は、すべての目的に関して、引用により明示的に本明細書に取り込まれる。
【００３６】
結腸の癌性又は前癌性病変を有する患者における結果の診断及び予後、特に病期診断、型分類又は予測のための非侵襲性方法を本明細書に提供する。本明細書で用いられる「病変」は結腸の異常な領域を指し、異形成、異常陰窩ならびに良性又は癌性ポリープが含まれる。
【００３７】
本明細書で用いられる「ポリープ」は、結腸直腸癌の４つのステージのいずれかで存在するポリープ又は前癌性状態のポリープを指す。本明細書で用いられる場合、「結腸直腸癌」はＴＮＭシステム（組織学的性質（Ｔ）、近辺のリンパ節における腫瘍存在（Ｎ）及び転移拡大（Ｍ）を評価する）に従って対癌米国合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｒ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ）（ＡＪＣＣ）により分類されるステージ１からステージ４までの範囲の４つのステージのいずれかで構成される状態を指す。Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ  ＬＬ，Ｊｅｓｓｕｐ  ＪＭ，Ｓａｒｇｅｎｔ  ＤＪ，Ｇｒｅｅｎｅ  ＦＬ，Ｓｔｅｗａｒｔ  ＡＫ，Ｒｅｖｉｓｅｄ  ＴＮ  ｃａｔｅｇｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｄａｔａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１０；２８（２）：２６４−７１．Ｅｐｕｂ  ２００９／１２／０２．ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２００９．２４．０９５２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１９９４９０１４；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２８１５７１５；Ｇｒｅｅｎｅ  ＦＬ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ：ｕｐｄａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｇｉｎｇ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ．２００２；８７（７）：１３−５．Ｅｐｕｂ  ２００７／０３／２９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１７３８７９０２．（表１）
【００３８】
【表１】
2019526038.tif 000002
【００３９】
本明細書で用いられる「前癌性状態」は、人を結腸癌と位置付ける（ｄｉｓｐｏｓｅｓ）浸潤前、転移前病変を有する患者を指す。例には異形成、異常陰窩の存在及び腺腫の存在が含まれる。ＡＪＣＣは正式に腺腫を「Ｔｉｓ」のＴステージにより前癌性ポリープ（「ステージ０」）として特徴付け、ここで「ｉｓ」はその場癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）を示す。Ｔｉｓ腺腫は大腸粘膜内に止まり、腸壁の浸潤がないポリープにより特徴付けられる。（表１）
【００４０】
本明細書で用いられる「正常な組織」は、大腸内視鏡検査及び／又は組織病理学により見かけが健康に見える結腸及び／又は直腸の組織を指す。
【００４１】
本明細書で用いられる「進行性腺腫」は、癌への進行に関する高リスクを呈する患者内のポリープ又は前癌性ポリープの集まりを指す。
【００４２】
本明細書で用いられる「絨毛腺腫」は、特に癌性になる傾向がある特別な組織病理学を有するポリープの型を指す。それは顕微鏡により診断され、多くの場合に「カリフラワー」様外観を有する。管状腺腫は組織病理学を必要とせずに大腸内視鏡検査によりわかる腺腫の１つの形状である。管状絨毛は管状の形を有するが顕微鏡下で絨毛病理学を有する腺腫を指す。
【００４３】
本明細書で用いられる「限局性」結腸直腸癌は、ＴＮＭステージ１及びＴＮＭステージ２結腸直腸癌を指す。具体的には、これらはどこかで粘膜から漿膜に大腸壁を貫通した癌である（図２）。
【００４４】
本明細書で用いられる「局所性」結腸直腸癌は、大腸壁のいくつもの領域に浸潤し、腸壁のすぐ外側に位置するリンパ節を冒した結腸直腸癌を指す（図２）。
【００４５】
いくつかの実施態様において：（ａ）生体試料を１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに関してアッセイすること、及び、（ｂ）生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含む１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法であって、ここでタンパク質バイオマーカーはロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、ＣＤ４４、カドヘリン  ２、Ｃ−反応性タンパク質、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３、凝固因子  Ｖ、上皮成長因子受容体、Ｆｅｔｕｉｎ−Ｂ、ヘモペキシン、血清アミロイド  Ｐ成分、ビタミン  Ｄ結合タンパク質、補体因子  Ｉ、スーパーオキシドジスムターゼ  ３、ビトロネクチン、トロンボスポンジン−４及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １である検出方法を提供する。
【００４６】
他の実施態様において、前記方法はさらに、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルをステージ０、ステージ１、ステージ２、ステージ３又はステージ４癌腫における前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、癌性又は前癌性結腸病変のステージを同定することを含む。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、「ステージ」又は「病期診断」は、結腸における癌性又は前−癌性病変の進行及び重度を説明するために用いられる１つ以上の臨床的分類システムを指す。結腸直腸腫瘍ステージは腸壁、所属リンパ節及び隣接するか又は遠隔の組織中への腫瘍浸潤の位置及びレベルを説明する。
【００４８】
本開示の実施態様と関連して用いられる腫瘍病期診断システムの非排他的な例はＴＮＭシステムである（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ  ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．；Ｇｒｅｅｎｅ，ＦＬ，同上を参照されたい）（表１）。ＴＮＭシステムにおいて、ステージ１及び２はそれぞれＴ１又はＴ２及びＴ３又はＴ４のＴステージを有し、リンパ節への浸潤又は転移はない（Ｎ０
Ｍ０）。ステージ１病変は粘膜下及びおそらく粘膜層中に通過している。ステージ２病変は漿膜に浸潤しており、腸壁を介して成長している場合があるが、近くのリンパ節に浸潤していない。ステージ３病変は非常に複雑で３つの細分類を有するが、広くはいずれかのＴステージ及びいくつかの又は多くの近くのリンパ節の浸潤を有することにより特徴付けられ得る。悪性転移性結腸癌を構成するステージ４はいずれのＴ又はいずれのＮ分類も有し得るが、他の臓器、最も一般的には肝臓に転移している。（表１）
【００４９】
本開示の１つの実施態様において、腫瘍の「病期診断」は、低リスク腺腫に対する進行性腺腫のような相対的な範疇においてそれらを分類することにより行われる。他の実施態様において、病期診断は、低リスク腺腫及び正常な組織をまとめている範疇に対する進行性腺腫に腫瘍を分類することにより行われる。
【００５０】
他の実施態様において、病期診断は、腫瘍の病態生理学又は解剖学に関連する範疇に腫瘍を分類することにより行われる。例えば病期診断は低リスク腺腫（絨毛又は管状絨毛特性がない）に対してあるいは正常な組織に対して絨毛又は管状絨毛腺腫に腫瘍を分類することにより行われる。あるいはまた、病期診断は成長している腺腫対静止性（ｓｔａｔｉｃ）又は退行している（ｒｅｇｒｅｓｓｉｎｇ）腺腫のような成長特性に基づいて腫瘍を分類することにより行われる。
【００５１】
さらに別の実施態様において、病期診断は、患者における腫瘍の限局化に基づいて腫瘍を分類することにより行われる。かくしていくつかの実施態様において、結腸直腸癌における限局性（ステージ１及び２）腫瘍は局所性（ステージ３）腫瘍と区別される。
【００５２】
当業者は、本開示の方法と関連して有用な別の病期診断システムを認識するであろう。他の病期診断システムの例にはＤｕｋｅの分類システム（Ｄｕｋｅｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １９３２，３５：３２３）及びＡｓｔｌｅｒ−Ｃｏｌｌｅｒ分類システム（Ａｓｔｌｅｒ  Ｖ．Ｂ．ａｎｄ  Ｃｏｌｌｅｒ  Ｆ．Ａ．，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  １９５４，１３９：８４６）が含まれる。
【００５３】
いくつかの実施態様において、患者の結腸における病変の臨床的悪性度（ｇｒａｄｅ）を分析するための方法を提供する。本明細書で用いられる場合、「腫瘍悪性度」は腫瘍細胞が正常な結腸組織細胞に分化した程度を説明する組織学的評価を指す。現在の腫瘍悪性度分類は結腸癌分類のＴＮＭ指針の一部であり、Ｇ１からＧ４の範囲である。Ｇ１と等級
分けされる細胞は、組織学的に健康な結腸組織細胞に最も似て見える。Ｇ２と等級分けされる細胞は中程度に分化しており、Ｇ３と等級分けされる細胞はあまり分化しておらず、そしてＧ４細胞は分化していない。より高い悪性度の細胞はより急速に成長する傾向があり、癌処置の方法に影響を与え得る。いくつかの実施態様において、本明細書で提供されるタンパク質バイオマーカー及び方法を用い、細胞分化のレベル（腫瘍悪性度）を評価し、患者処置戦略に影響を与えることができる。
【００５４】
いくつかの実施態様において、前記方法は、患者における１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出すること、次いでレベルを参照レベル又は範囲と比較することを含む。典型的には、参照レベルは、結腸癌を有し且つ組織試料又は生検あるいは細胞、血清又は血液のような他の生物学的試料を用いて測定されるその臨床的予後データが入手可能である多数の人又は組織におけるタンパク質バイオマーカーを代表する。
【００５５】
いくつかの実施態様において、生体試料を１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに関してアッセイすること、及び、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含む生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法を提供し、ここでタンパク質バイオマーカーはロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、ＣＤ４４、カドヘリン  ２、Ｃ−反応性タンパク質、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３、凝固因子  Ｖ、上皮成長因子受容体、Ｆｅｔｕｉｎ−Ｂ、ヘモペキシン、血清アミロイド  Ｐ成分、ビタミン  Ｄ結合タンパク質、補体因子  Ｉ、スーパーオキシドジスムターゼ  ３、ビトロネクチン、トロンボスポンジン−４及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １である。他の実施態様において、前記方法はさらに生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを低リスク腺腫、高リスク腺腫及び結腸直腸癌腫中の前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、癌性又は前癌性結腸病変を高リスク（進行性）腺腫、低リスク腺腫又は結腸直腸癌腫と同定することを含む。
【００５６】
結腸直腸癌を発病するリスクは、「低」又は「高」と分類される（表２）。低リスク患者は５−１０年以内の大腸内視鏡検査による追跡スクリーニングを薦められる。高リスクと考えられるポリープを有する患者は、３−５年以内の大腸内視鏡検査による追跡スクリーニングを薦められる。高リスクポリープは「進行性腺腫」とも呼ばれる。結腸直腸癌の発病に関する高リスクを有する患者は、以下の特徴：結腸直腸癌の病歴又は家族歴；１０ミリメーターより大きいポリープ；３−１０個の管状腺腫、絨毛性を有する１個以上の腺腫；あるいは異形成を有する鋸歯状腺腫の１つ又はいくつかを有する。結腸直腸癌の発病に関する低リスクを有する患者は：大腸内視鏡検査においてポリープがなく；鋸歯状でないか又は１０ミリメーターより大きくなければ過形成性を有するポリープ；１０ミリメーターより小さい３個未満の管状腺腫；あるいは異形成のない無柄（ｓｅｓｓｉｌｅ）鋸歯状ポリープを有する。
【００５７】
【表２】
2019526038.tif 000003
【００５８】
さらなる実施態様において、本開示は生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを前記１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、患者において結腸直腸癌を同定する方法を提供する。
【００５９】
いくつかの実施態様において、生体試料を１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに関してアッセイすることを含む、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法を提供し、ここで前記タンパク質バイオマーカーはロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、ＣＤ４４、Ｃ−反応性タンパク質、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３、凝固因子  Ｖ、上皮成長因子受容体、Ｆｅｔｕｉｎ−Ｂ、ヘモペキシン及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １を含む。
【００６０】
他の実施態様において、生体試料を１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに関してアッセイすることを含む、生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの検出方法を本明細書で提供し、ここでタンパク質バイオマーカーは、ロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ＣＤ４４、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３、上皮成長因子受容体を含む。
【００６１】
さらなる実施態様において、本開示は患者における進行性腺腫、低リスク腺腫又は正常な組織の同定方法を提供する。いくつかの実施態様において、患者における進行性腺腫、低リスク腺腫又は正常な組織の同定は、１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーは、Ｃ−反応性タンパク質及び上皮成長因子受容体を含む。
【００６２】
さらに別の実施態様において、本開示は、患者における管状絨毛腺腫、低リスク腺腫又は正常な組織の同定方法を提供する。いくつかの実施態様において、患者における管状絨毛腺腫、低リスク腺腫又は正常な組織の同定は、１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーは、Ｃ−反応性タンパク質、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １を含む。
【００６３】
一部の実施態様において、本開示は患者における限局性（ステージ１及び２）又は局所性（ステージ３）結腸直腸癌の同定方法を提供する。実施態様において、患者における限局性（ステージ１及び２）又は局所性（ステージ３）結腸直腸癌の同定は、１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーは、Ｃ−反応性タンパク質、ＣＤ４４、上皮成長因子受容体及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １を含む。
【００６４】
他の実施態様において、本開示は患者中で成長している腺腫を同定する方法を提供する。実施態様において、患者中で成長している腺腫を同定することは、１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーは、凝固因子  Ｖ、Ｃ−反応性タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４及びロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質を含む。
【００６５】
さらに別の実施態様において、前記方法はさらに、１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルがポリープ切除前の癌性又は前癌性結腸病変において検出されるレベルと異なる場合に、ポリープ切除の後の癌性又は前癌性結腸病変の再発を同定することを含む。いくつかの実施態様において、ポリープ切除の後の癌性又は前癌性結腸病変の再発を同定することは、１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーはＣ−反応性タンパク質及びペプチダーゼ阻害剤
１６を含む。
【００６６】
いくつかの実施態様において、前記方法は、女性の患者における進行性腺腫、低リスク腺腫又は正常な組織を同定することを含む。実施態様において、女性の患者における進行性腺腫、低リスク腺腫又は正常な組織を同定することは、１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーは凝固因子  Ｖ、ＣＤ４４及び上皮成長因子受容体を含む。
【００６７】
他の実施態様において、前記方法は男性の患者における進行性腺腫、低リスク腺腫又は正常な組織を同定することを含む。実施態様において、男性の患者における進行性腺腫、低リスク腺腫又は正常な組織を同定することは、１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーはＣ−反応性タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ４及び補体因子  Ｉを含む。
【００６８】
さらなる実施態様において、前記方法は生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、患者における直腸ポリープの存在を同定することを含む。一部の実施態様において、患者における直腸ポリープの存在を同定することは１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出することを含み、ここでタンパク質バイオマーカーはペプチダーゼ阻害剤  １６、ＣＤ４４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １を含む。
【００６９】
当業者は、例えば結腸直腸癌又はポリープの家族歴及び切除されるポリープ又は病変のステージに基づいて、結腸の監視を行うべき間隔を決定するためのパラメーターを理解するであろう。特定の実施態様において、監視のための生体試料をポリープ切除から１ヵ月後以内、２ヵ月後以内、３ヵ月後以内、４ヵ月後以内、５ヵ月後以内又は６ヵ月後以内に回収する。他の実施態様において、生体試料をポリープ切除から１年後以内又は２年後以内に回収する。
【００７０】
インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３（ＩＴＩＨ３）及び重鎖４、イソ型１（ＩＴＩＨ４）は、本方法の実施に有用なバイオマーカーとして与えられる。インター−アルファトリプシン阻害剤は細胞外マトリックス上のヒアルロン酸の共有結合及び安定化に含まれる。Ｃｈｅｎ  Ｌ，Ｍａｏ  ＳＪ，ＭｃＬｅａｎ  ＬＲ，Ｐｏｗｅｒｓ  ＲＷ，Ｌａｒｓｅｎ  ＷＪ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒ−ａｌｐｈａ−ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅ  ｔｈｅ  ｃｕｍｕｌｕｓ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅｉｒ
ｄｉｒｅｃｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｔｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９４，２６９（４５）：２８２８２−７．Ｅｐｕｂ  １９９４／１１／１１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：７５２５５７２．ヒアルロナンは結腸ポリープ及び腫瘍の成長と共に大きさが増すことが知られている大きな上皮グリコサミノグリカン複合体である［１４］。さらにＩＴＩＨ３は以前にヒト胃癌患者の血漿において上方調節されることが同定されており、結腸癌における転移及び腫瘍浸潤活性の予防における役割が予測されている。Ｍｉｓｒａ  Ｓ，Ｈａｓｃａｌｌ  ＶＣ，Ｂｅｒｇｅｒ  ＦＧ，Ｍａｒｋｗａｌｄ  ＲＲ，Ｇｈａｔａｋ  Ｓ．Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ，ＣＤ４４，ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００８；４９（３）：２１９−２４．Ｅｐｕｂ  ２００８／０７／２９．ｄｏｉ：１０．１０８０／０３００８２００８０２１４３３５６，ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８６６１３４７；Ｃｈｏｎｇ  ＰＫ，Ｌｅｅ  Ｈ，Ｚｈｏｕ  Ｊ，Ｌｉｕ  ＳＣ，Ｌｏｈ  ＭＣ，Ｗａｎｇ  ＴＴ，ｅｔ  ａｌ．ＩＴＩＨ３  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１０；９（７）：３６７１−９／Ｅｐｕｂ  ２０１０／０６／０３．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｐｒ１００１９２ｈ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２０５１５０７３．
【００７１】
さらに、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は本方法の実施に有用なバイオマーカーとして与えられる。ＥＧＦＲは悪い腫瘍予後に関係があるとされる。Ｌｉｅｔｏ  Ｅ，Ｆｅｒｒａｒａｃｃｉｏ  Ｆ，Ｏｒｄｉｔｕｒａ  Ｍ，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ  Ｐ，Ｍｕｒａ  ＡＬ，Ｐｉｎｔｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）  ｉｓ  ａｎ
ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｗｏｒｓｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００８；１５（１）：６９−７９．Ｅｐｕｂ  ２００７／０９／２７．ｄｏｉ：１０．１２４５／ｓ１０４３４−００７−９５９６−０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１７８９６１４０．
【００７２】
炎症反応に関係があるとされる一部の酵素は本方法の実施に有用なバイオマーカーとして与えられる。ロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質（ＬＲＧ１）は急性期反応及び炎症において役割を果たすと考えられる。Ｈｓｕ  ＳＪ，Ｎａｇａｓｅ  Ｈ，Ｂａｌｍａｉｎ  Ａ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｅｔｕｉｎ−Ｂ  ａｓ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａ  ｃｙｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｎ  
ｍｏｕｓｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １６  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｇｅｎｏｍｅ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ＝Ｇｅｎｏｍｅ／Ｃｏｎｓｅｉｌ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ  Ｃａｎａｄａ．２００４；４７（５）：９３１−４６．Ｅｐｕｂ  ２００４／１０／２３．ｄｏｉ：１０．１１３９／ｇ０４−０４３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１５４９９４０７；Ｓｈｉｒａｉ  Ｒ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｆ，Ｏｈｋｕｒａ  Ｎ，Ｉｋｅｄａ  Ｋ，Ｉｎｏｕｅ  Ｓ．Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｌｐｈａ（２）−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ−ｐｈａｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２００９；３８２（４）：７７６−９．Ｅｐｕｂ  ２００９／０３／２８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２００９．０３．１０４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１９３２４０１０．ＬＲＧ１は多くのマウスの研究において上方調節が示されており、ヒト結腸癌患者の血漿において上方調節されることが示された。Ｃｈｏｎｇ，ＰＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｉｒａｉ，ｅｔａｌ．，同上；Ｌａｄｄ  ＪＪ，Ｂｕｓａｌｄ  Ｔ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＭＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｑ，Ｐｉｔｔｅｒｉ  ＳＪ，Ｗａｎｇ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰＣ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＡＰＲＥ１，ＬＲＧ１，ａｎｄ  ＩＧＦＢＰ２  ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ  ａ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｗｏｍｅｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ（Ｐｈｉｌａ）．２０１２；５（４）：６５５−６４．Ｅｐｕｂ  ２０１２／０１／２７．ｄｏｉ：１０．１１５８／１９４０−６２０７．ＣＡＰＲ−１１−０４１２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２２２７７７３２；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３４１９１４１；Ｈｕｎｇ  ＫＥ，Ｆａｃａ  Ｖ，Ｓｏｎｇ  Ｋ，Ｓａｒｒａｃｉｎｏ  ＤＡ，  Ｒｉｃｈａｒｄ  ＬＧ，Ｋｒａｓｔｉｎｓ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  Ａｐｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｕｎｃｏｖｅｒｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ（Ｐｈｉｌａ）．２００９；２（３）：２２４−３３．Ｅｐｕｂ  ２００９／０２／２６．ｄｏｉ：１０．１１５８／１９４０−６２０７．ＣＡＰＲ−０８−０１５３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１９２４０２４８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２８７４８６４．
【００７３】
ＬＲＧ１は結腸癌のヒト及びネズミモデルの血液中で上方調節される急性期反応タンパク質である。Ｃｈｏｎｇ，ＰＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｄｄ，ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．，同上；Ｉｖａｎｃｉｃ  ＭＭ，Ｈｕｔｔｌｉｎ  ＥＬ，Ｃｈｅｎ  Ｘ，Ｐｌｅｉｍａｎ  ＪＫ，Ｉｒｖｉｎｇ  ＡＡ，Ｈｅｇｅｍａｎ  ＡＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｓｅｒｕｍ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  １５Ｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＡｐｃＭｉｎ／＋  ｍｏｕｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１３；１２（９）：４１５２−６６．Ｅｐｕｂ  ２０１３／０８／０９．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｐｒ４００４６７ｃ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２３９２４１５８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３７９２５６３．研究は、このタンパク質も潰瘍性大腸炎の患者の血清中で上方調節されることを示し、ＬＲＧ１も腸疾患の全身性指示物質（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）の場合があることを示唆している。Ｓｅｒａｄａ  Ｓ，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  Ｍ，Ｔｅｒａｂｅ  Ｆ，Ｉｉｊｉｍａ  Ｈ，Ｓｈｉｎｚａｋｉ  Ｓ，Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｒｕｍ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｌｐｈａ−２  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ．Ｉｎｆｒａｍａｔ
ｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１２；１８（１１）：２１６９−７９．Ｅｐｕｂ  ２０１２／０３／０１．ｄｏｉ：１０．１００２／ｉｂｄ．２２９３６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２２３７４９２５．１つの研究は、ＬＲＧ１がＡＬＫ１−ＳＭＡＤ  １、５及び８との相互作用を介するＴＧＦ−β経路によるシグナリングを介して内皮細胞形成を促進し、かくして脈管形成状態を誘発することを示した。Ｗａｎｇ  Ｘ，Ａｂｒａｈａｍ  Ｓ，ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ＪＡ，Ｊｅｆｆｓ  Ｎ，Ｓｗｉｒｅ  Ｍ，Ｔｒｉｐａｔｈｉ  ＶＢ，ｅｔ  ａｌ．ＬＲＧ１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｙｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；４９９（７４５８）：３０６−１１．Ｅｐｕｂ  ２０１３／０７／２３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４５．ＰｕｂＭｅｄ
ＰＭＩＤ：２３８６８２６０；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３８３６４０２．腫瘍浸潤及び転移の基本的な属性の１つである脈管形成は腫瘍形成の非常に初期に起こり得る。Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ，Ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．２０１１；１４４（５）：６４６−７４．Ｅｐｕｂ  ２０１１／０３／０８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０２．０１３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：：２１３７６２３０．他の研究は、血漿中のＬＲＧ１の循環レベルが結腸直腸癌の診断ならびに結腸、直腸Ｓ状結腸移行部及び直腸内の局所性腫瘍局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）の同定に有用なことがあることを示した（Ｓｕｒｉｎｏｖａ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２０１５，７，１１５３−１１６５；Ｓｕｒｉｎｏｖａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２０１５，７，１１６６−１１７８）。
【００７４】
Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）も本方法の実施に有用なバイオマーカーの１つとして与えられる。ＣＲＰは血漿中で見出される環状（輪の形の）五量体タンパク質であり、そのレベルは炎症に反応して向上する。ＣＲＰは肝臓由来の急性期タンパク質であり、それはマクロファージ及びＴ細胞によるインターロイキン−６分泌に続いて増加する。
【００７５】
凝固因子  Ｖ（Ｆ５）も本方法の実施に有用なバイオマーカーの１つとして与えられる。Ｆ５は、血液凝固のために非常に重要な活性トロンビンタンパク質を形成するためのプロトロンビンの切断を助ける活性化凝固因子  Ｘ（Ｘａ）のための補因子である。Ｄａｖｉｅ  ＥＷ，Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｋ，Ｋｉｓｉｅｌ  Ｗ．Ｔｈｅ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｃａｓｃａｄｅ：ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ，ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ，ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：１９９１；３０（４３）：１０３６３−７０．Ｅｐｕｂ  １９９１／１０／２９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１９３１９５９．止血における撹乱は通常観察される癌の副作用であり、結腸癌患者において実証されている合併症として静脈血栓塞栓症がある。Ｆａｌａｎｇａ  Ａ，Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ  Ｍ，Ｖｉｇｎｏｌｉ  Ａ．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ：ＪＴＨ．２０１３；１１（２）：２２３−３３．Ｅｐｕｂ  ２０１３／０１／０３．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊｔｈ．１２０７５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２３２７９７０８；Ａｌｃａｌａｙ  Ａ，Ｗｕｎ  Ｔ，Ｋｈａｔｒｉ  Ｖ，Ｃｈｅｗ  ＨＫ，Ｈａｒｖｅｙ  Ｄ，Ｚｈｏｕ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｓｕｖｉｖａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００６；２４（７）：１１１２−８．Ｅｐｕｂ
２００６／０３／０１．ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２００５．０４．２１５０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１６５０５４３１．フィブリノゲン、Ｆ５及び他の凝固因子のような凝固物質（ｃｏａｇｕｌａｎｔｓ）は、結腸癌患者においてレベルが向上してい
る。Ｐａｓｐａｔｉｓ  ＧＡ，Ｓｆｙｒｉｄａｋｉ  Ａ，Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｎ，Ｔｒｉａｎｔａｆｙｌｌｏｕ  Ｋ，Ｌｉｖａｄｉｏｔａｋｉ  Ａ，Ｋａｐｓｏｒｉｔａｋｉｓ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ，ｆａｃｔｏｒ  Ｖ  ｌｅｉｄｅｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｇ２０２１０Ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．２００２；３２（１）：２−７．Ｅｐｕｂ  ２００２／０９／０６．ｄｏｉ：５７２８２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１２２１４１５７；Ｖｏｓｓｅｎ  ＣＹ，Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ  Ｍ，Ｃｈａｎｇ−Ｃｌａｕｄｅ  ＪＣ，Ｒｏｓｅｎｄａａｌ  ＦＲ，Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｈ．Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ
ｒｉｓｋ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１１；２９（１３）：１７２２−７．Ｅｐｕｂ
２０１１／０３／２３．ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１０．３１．８８７３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２１４２２４０８．さらに、Ｆ５は第Ｖ因子ライデン（Ｆａｃｔｏｒ  Ｖ  Ｌｅｉｄｅｎ）凝固疾患とのその関連に関して最も知られている。第Ｖ因子ライデンはＲ５０６Ｑ突然変異を含む一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＮＰ）により引き起こされる。この突然変異は活性化プロテインＣ抗凝固タンパク質のＦ５への結合能力を下げる。活性化プロテインＣとＦ５の間の正常な相互作用はＦ５の分解に導く。しかしながらこの相互作用の不在下で、Ｆ５のレベルは向上し、過剰の凝固を引き起こす。第Ｖ因子ライデン突然変異に関してホモ接合性の患者は結腸直腸癌に関して６倍近く増したリスクを示す。Ｖｏｓｓｅｎ，ＣＹ，ｅｔ  ａｌ．，同上。最近のバイオマーカー研究は、Ｆ５が転移性結腸直腸癌に対して限局性結腸直腸癌を区別する血漿マーカーの場合があることを示した（Ｓｕｒｉｎｏｖａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２０１５，７，１１５３−１１６５）。
【００７６】
ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ４）も本明細書に開示される方法でバイオマーカーとして用いられ得る。ＤＰＰ４遺伝子によりコードされるタンパク質は、ほとんどの細胞型の表面上で発現される抗原性酵素であり、免疫調節、シグナル伝達及びアポトーシスと関連する。それは固有の膜糖タンパク質であり且つポリペプチドのＮ末端からＸ−プロリンジペプチドを切断するセリンエキソペプチダーゼである。
【００７７】
【表３】
2019526038.tif 000004
【００７８】
本発明のある側面は、タンパク質バイオマーカーに関して生体試料をアッセイすることを提供し、ここでアッセイすることは生体試料から所望のペプチドを抽出し、抽出されたペプチド混合物を分離することを含む。特定の実施態様において、問題の生物学的材料からタンパク質を抽出し、単離されたタンパク質をプロテアーゼを用いて酵素消化してペプチドフラグメントを生成する。複雑なペプチド混合物を、逆相クロマトグラフィーを用いてクロマトグラフィー分離する。特定の実施態様において、逆相クロマトグラフィーは高ｐＨ逆相クロマトグラフィーである。あるいはまた、複雑なペプチド混合物を、オフラインイオン交換クロマトグラフィー又は高ｐＨ逆相クロマトグラフィーを用いてクロマトグラフィー分離する。さらに当業者は、他の抽出及び分離法が本方法の実施態様の実施に適していることを認識するであろう。
【００７９】
特定の実施態様において、安定な同位体で標識された標準試料（ｓｔａｎｄａｒｄ）を酵素消化の前にタンパク質抽出物中に添加する。参照標準を相対的又は絶対的定量のために用いることができる。Ｙｏｃｕｍ  ＡＫ，Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ＡＭ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｆｆａｉｒｓ  ｉｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００９；８（２）：１４５−５７．Ｅｐｕｂ
２００９／０３／１３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｆｇｐ／ｅｌｎ０５６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１９２７９０７１；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２７２２２６３．通常の絶対的定量法はＡＱＵＡ（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ＱＵＡｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎを示す）として知られている。ＡＱＵＡペプチドは、既知の濃度で試料中
に添加された重安定同位体アミノ酸を除いて内在性ペプチドと配列において同一である。かくしてＡＱＵＡペプチドと比較すると内在性ペプチドの正確な濃度を決定することができる。Ｇｅｒｂｅｒ  ＳＡ，Ｒｕｓｈ  Ｊ，Ｓｔｅｍｍａｎ  Ｏ，Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ  ＭＷ，Ｇｙｇｉ  ＳＰ．Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅｓ  ｂｙ  ｔａｎｄｅｍ  ＭＳ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．２００３；１００（１２）：６９４０−５．Ｅｐｕｂ  ２００３／０５／２９．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８３２２５４１００．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１２７７１３７８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ１６５８０９．安定同位体で標識されたペプチドの正確な濃度が未知である場合、ペプチドを既知の比で試料中に添加し、相対的な定量のために用いることができる。安定同位体で標識されたタンパク質（ＰＳＡＱ）又はコンカテマー（ＱｃｏｎＣＡＴ）を用い、参照標準をそれぞれ全タンパク質又は合成鎖状（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ）トリプシンペプチドとして生体内で作ることもできる。Ｋａｉｓｅｒ  ＳＥ，Ｒｉｌｅｙ
ＢＥ，Ｓｈａｌｅｒ  ＴＡ，Ｔｒｅｖｉｎｏ  ＲＳ，Ｂｅｃｋｅｒ  ＣＨ，Ｓｃｈｕｌｍａｎ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＰＳＡＱ）  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｏｏｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ
ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１；８（８）：６９１−６．Ｅｐｕｂ  ２０１１／０７／１２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１６４９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２１７４３４６０；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３１９６３３５；Ｐｒａｔｔ  ＪＭ，Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＤＭ，Ｄｏｈｅｒｔｙ  ＭＫ，Ｒｉｖｅｒｓ  Ｊ，Ｇａｓｋｅｌｌ  ＳＪ，Ｂｅｙｎｏｎ  ＲＪ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ＱｃｏｎＣＡＴ  ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２００６；１（２）：１０２９−４３．Ｅｐｕｂ  ２００７／０４／０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００６．１２９  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１７４０６３４０．
【００８０】
本明細書で開示される特定の実施態様は、低レベル内在性ペプチドを分離し（ｒｅｓｏｌｖｅ）、定量的ピーク積分のためにピークの形を最適化するように最適化された逆相クロマトグラフィーを用いる。例えば一部の実施態様において、ＨＰＬＣ系はＮａｎｏｆｌｅｘ  ｃＨｉＰＬＣ系が備えられたＥｋｓｉｇｅｎｔ  Ｎａｎｏ  ２Ｄ  ＬＣである。Ｎａｎｏｆｌｅｘ系には場合によりペプチドを捕獲し且つ逆相勾配においてクロマトグラフィー的に溶離するために用いられるＣ１８マイクロ流体チップが備えられる場合がある。さらに、Ｎａｎｏｆｌｅｘ系には場合によりピーク分解への温度の効果を最適化するためにカラムヒーターが備えられている場合がある。
【００８１】
特定の実施態様において、本明細書で提供される方法は、共溶離する種の数を変え（ｓｈｉｆｔｉｎｇ）、局在する（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）試料の複雑性を低下させることにより低含量の内在性ペプチドを同定するために最適化されたクロマトグラフィー勾配長を用いる。従って特定の実施態様において、本明細書の方法はクロマトグラフィー分離のために９０分の有効勾配長を提供する。
【００８２】
高い特異度を達成するために、参照標準のペプチドアミノ酸配列はタンパク質バイオマーカーに固有である。Ｌａｎｇｅ  Ｖ，Ｐｉｃｏｔｔｉ  Ｐ，Ｄｏｍｏｎ  Ｂ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ．Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｆｏｒ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ａ  ｔｕｔｏｒｉａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２００８；４：２２２．Ｅｐｕｂ  ２０
０８／１０／１６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ  ２００８．６１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８８５４８２１；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２５８３０８６．優れたクロマトグラフィーピークの形、適切なイオン化及び最適のフラグメント化を達成するために、ペプチド長は約６−２０個のアミノ酸に保たれる。Ｅｌｉａｓ
ＪＥ，Ｈａａｓ  Ｗ，Ｆａｈｅｒｔｙ  ＢＫ，Ｇｙｇｉ  ＳＰ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５；２（９）：６６７−７５．Ｅｐｕｂ  ２００５／０８／２５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ７８５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１６１１８６３７；Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ  ＤＳ，Ｇｅｒｂｅｒ
ＳＡ，Ｇｙｇｉ  ＳＰ．Ｔｈｅ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ：ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５；３５（３）：２６５−７３．Ｅｐｕｂ  ２００５／０２／２２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２００４．０８．０１８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１５７２２２２３；Ｐｉｃｏｔｔｉ  Ｐ，Ｃｌｅｍｅｎｔ−Ｚｉｚａ  Ｍ，Ｌａｍ  Ｈ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＤＳ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ａ，Ｄｅｕｔｓｃｈ  ＥＷ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍａｓｓ  −ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｍａｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；４９４（７４３６）：２６６−７０．Ｅｐｕｂ  ２０１３／０１／２２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１８３５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２３３３４４２４．一部の実施態様において、ペプチド衝突エネルギーは最も強いフラグメントイオンを与えるように最適化され、与えられるサイクル時間にわたって限られた数の遷移のみが分析されるようにスケジューリング法が実施される。当業者は、特定のイオンに関するシグナルを最大にするために、スケジューリングが滞留時間（遷移が分析される時間の長さ）を長くする能力を有することを認識するであろう。１つの実施態様において、５−７分のスケジューリングウインドウを選び、本方法で用いられるペプチドのために１．５秒のサイクル時間内に少なくとも２０ミリ秒以上の滞留時間を生ずる。あるいはまた、異なる長さのスケジューリングウインドウ及びサイクル時間も包含される。
【００８３】
参照標準としての安定な同位体の使用は、同じ分析内で２つ以上の試料を直接比較する可能性を与え、かくして標識を含まない方法において観察される実験毎の（ｒｕｎ−ｔｏ−ｒｕｎ）変動と関連する問題を取り除く。標的タンパク質バイオマーカーに固有のこれらの標準試料は、標的内在性ペプチドバイオマーカーからそれを区別するために重い安定同位体で標識されたアミノ酸を含有する。さらにこれらの参照標準は、複数の類似のペプチド配列が複雑なタンパク質消化物中に存在する場合に、問題の正しいペプチド異性体を同定することを助ける能力も有し、かくしてアッセイの特異性に寄与する。Ｂａｎａｃｋ
ＳＡ，Ｄｏｗｎｉｎｇ  ＴＧ，Ｓｐａｃｉｌ  Ｚ，Ｐｕｒｄｉｅ  ＥＬ，Ｍｅｔｃａｌｆ  ＪＳ，Ｄｏｗｎｉｎｇ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｂｅｔａ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ（ＢＭＡＡ）  ｆｒｏｍ  ｉｔｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ｉｓｏｍｅｒ  ２，４−ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（２，４−ＤＡＢ）．Ｔｏｘｉｃｏｎ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｎ  Ｔｏｘｉｎｏｌｏｇｙ．２０１０；５６（６）：８６８−７９．Ｅｐｕｂ  ２０１０／０６／２２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｏｘｉｃｏｎ．２０１０．０６．００６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２０５６１５４０．
【００８４】
一部の実施態様において、質量分析法を用いて生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出する。特定の実施態様において、選択反応モニタリング
質量分析法（ＳＲＭ−ＭＳ）を用いてタンパク質バイオマーカーのレベルを検出する。他の実施態様において、スペクトラルカウンティング（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｃｏｕｎｔｉｇ）、アイソバリックマスタギング（ｉｓｏｂａｒｉｃ  ｍａｓｓ  ｔａｇｇｉｎｇ）又はイオンモビリティー（ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ）質量分析法を含むがこれらに限られない他の定量的質量分析法を用いて生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出する。
【００８５】
さらなる実施態様において、１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの絶対濃度を決定する。いくつかの実施態様において、ＡＱＵＡ法と組み合わされたＳＲＭ−ＭＳを用いて１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーの絶対濃度を決定する。
【００８６】
他の実施態様において、本発明の方法の検出することは質量分析法の代替策を用いる。例えば一部の実施態様において、当該技術分野に既知のルーティン化したイムノアッセイ法を用いてタンパク質バイオマーカーのレベルを検出する。そのようなイムノアッセイ法には、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、タンパク質アレー、ウエスターンブロッティング、フローサイトメトリー細胞選別、免疫組織化学、免疫細胞化学又はイムノサイトメトリーが含まれるが、これらに限られない。本開示の方法のいくつかの実施態様において、検出することは、マイクロ流体チップに基づくＥＬＩＳＡｓ又はウエスターンを含む慣例的なイムノアッセイ法への変形を含むが、これらに限られない。
【００８７】
さらに別の実施態様において、本開示の方法の検出することは電気泳動による定量を用いる。例えばいくつかの実施態様において、検出することは、１次元又は２次元電気泳動あるいはキャピラリー電気泳動を含むが、これらに限られない。当業者は、本開示の実施のために適したさらに別の定量的電気泳動法を認識するであろう。
【００８８】
さらに別の実施態様において、通常のタンパク質定量法により生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを検出する。例えば一部の実施態様において、ＵＶ−ＶＩＳ分光分析法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、ＢＣＡ又はＬｏｗｒｙアッセイに限られない手法を用いて１種又は複数種のバイオマーカーのレベルを検出する。いくつかの実施態様において、生体試料からバイオマーカーを精製した後に１種又は複数種のバイオマーカーのレベルの検出を行う。
【００８９】
他の実施態様において、本開示の検出することは生体試料を１つ以上のクロマトグラフィー定量法に供することを含む。液体クロマトグラフィー法の例にはカチオン交換、アニオン交換、逆相及びサイズ排除クロマトグラフィーが含まれる。当業者は、クロマトグラフィーピークの下の面積が生体試料中に存在するバイオマーカーの相対的な量を表していることを認識するであろう。
【００９０】
本明細書で用いられる「差次的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）発現される」とは、２つ以上の生体試料中で決定されるバイオマーカーの間又は生体試料中で決定されるバイオマーカーとバイオマーカー参照標準の間の比較を指し、ここで測定されるバイオマーカーの発現レベルは比較される生体試料の間で又は生体試料と参照標準の間で異なる。いくつかの実施態様において、差次的発現は比較されるバイオマーカーレベルにおける向上を含む。他の実施態様において、差次的発現は比較されるバイオマーカーレベルにおける低下を含む。さらに別の実施態様において、差次的発現は比較されるバイオマーカーにおける時間に及ぶ変化を含む。さらに別の実施態様において、差次的発現は患者の結腸内に存在するポリープ又は腫瘍の異なるステージの間での比較されるバイオマーカーにおける変化を含む。さらに別の実施態様において、差次的発現は患者の結腸内に存在する病変の処置の間の比較されるバイオマーカーにおける変化を含む。
【００９１】
実施態様において、本開示の１種又は複数種のバイオマーカーの差次的発現は、患者の結腸中の病変のステージの決定に用いられる。特定の実施態様において、差次的発現は生体試料中の１種又は複数種のバイオマーカーのレベルにおける参照生体試料から又はバイオマーカー参照標準からの変動を含む。いくつかの実施態様において、対応する参照量からの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％又は約９０％の１種又は複数種のバイオマーカーにおける変動は、患者の結腸中の病変の存在又はステージを示している。別の実施態様において、対応する参照量からの約２倍、約４倍、約８倍、約１０倍、約２０倍、約４０倍、約８０倍又は約１００倍の１種又は複数種のバイオマーカーにおける変動は、患者の結腸中の病変の存在又はステージを示している。
【００９２】
ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ又はウシから回収された生体試料中の１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルの決定方法を提供する。本明細書で用いられる場合、「生体試料」は患者から単離された生物学的材料からなり、血液、血清、組織、血漿又は血球を含むがこれらに限られない。
【００９３】
注目すべきことに、本開示の方法に有用なバイオマーカーは、腫瘍又は腺腫又はポリープ細胞から離隔した部位で時々起こる身体的反応を含む。主な例には肝臓で生産される急性期及び炎症反応タンパク質が含まれる。急性期、炎症及び免疫反応は腫瘍の存在への普通の反応と同定されている。Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  Ａ，Ａｌｌａｖｅｎａ  Ｐ，Ｓｉｃａ
Ａ，Ｂａｌｋｗｉｌｌ  Ｆ．Ｃａｎｃｅｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．２００８；４５４（７２０３）：４３６−４４．Ｅｐｕｂ  ２００８／０７／２５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７２０５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８６５０９１４；Ｇｒｉｖｅｎｎｉｋｏｖ  ＳＩ，Ｇｒｅｔｅｎ  ＦＲ，Ｋａｒｉｎ  Ｍ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ．２０１０；１４０（６）：８８３−９９．Ｅｐｕｂ  ２０１０／０３／２３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０１．０２５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２０３０３８７８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２８６６６２９．そして細胞接着は癌転移に関連する重要な機能である。インター−アルファ−トリプシン阻害剤のようなヒアルロナン結合タンパク質は、成長している腫瘍へのこのグリコサミノグリカンの活発な輸送を与える。これらは癌への全身的な反応に関連して本明細書で与えられるいくつかの例にすぎない。従って当業者は、本発明の生体試料が腫瘍細胞及び非腫瘍細胞の両方に由来することを認識するであろう。さらに当業者は、本発明の生体試料が場合により、血液、血清、血漿、組織、腹水、尿及び便を含むがこれらに限られない広範囲の材料から単離され得ることを認識するであろう。
【００９４】
本開示の実施態様は、一次スクリーニング又は診断機構として大腸内視鏡検査を用いるルーティンスクリーニングの代わりとなる感度及び特異度を有する結腸直腸癌のための生体試料に基づく試験を提供する。スクリーニング法の実施態様は、高処理量標的化質量分析法を用い、それは多くのタンパク質マーカーを１つの定量的スクリーニングアッセイに多重に送る（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｓ）。
【００９５】
特定の実施態様において、ＳＲＭ−ＭＳを用いる結腸直腸癌のための生体試料に基づく試験は、有利なことにバイオマーカー当たりのコストの軽減、バイオマーカーパネル分析における処理量の向上の可能性ならびに感度及び特異度の向上を与える。
【００９６】
一部の実施態様は、前癌性又は癌性状態の存在に関する集団のルーティンのスクリーニングのための方法を提供する。これらの方法は、血液及び診断目的のために有用な他の材料の慣例的な収集を含む。さらに一部の実施態様において、本発明の生体試料は大腸内視鏡検査又はポリープ切除術の間に又はそれらと同時に得られる。さらに別の実施態様にお
いて、本発明の実施態様の生体試料は、大腸内視鏡検査又はポリープ切除に続いて周期的に得られる。さらに別の実施態様において、生体試料は大腸内視鏡検査の前に得られ、大腸内視鏡検査を必要とする患者の同定のためにタンパク質バイオマーカーのレベルが決定される。
【００９７】
本方法の実施態様は、患者集団のルーティンのスクリーニングのために有用である。本方法は、主に現存するスクリーニング法が侵襲性、高価及び辺地で利用不可能であり得るために、適格な患者が現存するスクリーニング勧告を順守する程度が低い場合に特に有利である。さらに本方法の実施態様は、結腸直腸癌に関する高いリスク因子（例えば家族歴）を示さないその他の現存するスクリーニング又は診断法を指示されないであろう患者集団のスクリーニングのために有用である。
【００９８】
さらに別の実施態様において、大腸内視鏡検査又はポリープ切除術によるさらなる評価又は処置を含むがこれらに限られない、さらなる臨床的な評価又は処置から便益を得るであろう個人を同定するための方法を提供する。他の実施態様において、外科手術後又はポリープ切除後の患者の監視を提供する。さらに別の実施態様において、本方法は化学予防薬又は化学療法薬に対する患者の反応性を監視するために有用である。
【００９９】
さらに、現存する結腸直腸スクリーニング、診断、予後及び処置法の診断及び予後的効用を強化することができる方法を提供する。従って本明細書で開示される一部の実施態様は、大腸内視鏡検査、ＣＴスキャン又は便潜血試験を含む当該技術分野で既知の他の方法との組み合わせにおいて有用である。
【０１００】
さらなる側面において、本開示は患者における結腸直腸病変の病期診断のためのキットを目的とする。キットは本開示の１種又は複数種のバイオマーカーを検出するための１種以上の検出試薬を含み、場合により癌性又は前癌性結腸直腸病変のステージと関連する１種又は複数種のタンパク質バイオマーカーに関する１組の標準値を含む場合がある。
【０１０１】
さらに本開示は、ａ）本開示の生体試料中の１種又は複数種のバイオマーカーの量を検出するための手段、ｂ）段階ａ）で決定された量を参照量と比較するための手段を含む上記で言及した本開示の方法を行うために適応させたキットに関する。いくつかの実施態様において、前記キットは本開示の方法を行うための使用説明書を含む。他の特定の実施態様において、前記キットは生体試料を回収する回収集容器を含む。該回収容器はアッセイ用に生体試料を準備するための溶液を含む場合がある。
【０１０２】
本明細書で用いられる「キット」という用語は、適切には別々に又は１個の容器内で提供される前記の手段の集合体を指す。容器は、やはり適切には本開示の方法を行うための使用説明書を含む。
【０１０３】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、該実施例は請求項中に記載される本発明の範囲を制限しない。
【０１０４】
以下の実施例は本発明の特別な実施態様及びその種々の使用の例である。それらは説明目的のみのために示され、本発明を制限すると理解されるべきではない。
【実施例】
【０１０５】
患者集団
患者は３つの別個の患者グループから登録された（図４）。ルーティンのスクリーニング大腸内視鏡検査を受けている無症候性成人（ｎ＝１８０）、疾患の除去及び病期診断のために外科手術的切除を受けている結腸直腸癌の患者（ｎ＝５０）及びＣＴコロノグラフ
ィー（バーチャル大腸内視鏡検査）により観察されるポリープを有する患者（ｎ＝３３）。ポリープを有するＣＴコロノグラフィーの患者はその後それらの除去ために大腸内視鏡検査を受けた（ポリープ切除）。
【０１０６】
すべての生検ポリープ又は外科手術切除片（ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ）は、分析のために臨床病理学部門に送られた。非癌性ポリープを有する患者は、表２に概述される管理基準の現在の標準に従って進行性腺腫（高リスク）又は低リスクポリープを有すると分類された。外科手術切除片は、表１に示されるＴＮＭ病期診断システムに従って病期診断された。
【０１０７】
大腸内視鏡検査又は結腸直腸外科手術の前に、各患者から血液試料を採取した。ＣＴコロノグラフィー及び続いて大腸内視鏡検査を受けた患者は、ポリープが除去された後のバイオマーカー発現における変化を監視するための２回目の血液採取のためにポリープ切除から３−４週間後に戻された。
【０１０８】
縦断ＣＴコロノグラフィー／大腸内視鏡検査研究における患者のそれぞれをＣＴコロノグラフィーにより２〜１１年間監視し、監視期間の間にポリープが成長しているらしいと分類されたら大腸内視鏡検査の際にポリープの生検を行った。最終的な成長分類は、ＣＴコロノグラフィーにより決定されるポリープ長又は測定される体積に基づいてなされた。しかしながらいくらかの患者は１個より多いポリープを有し、一人の患者内のすべてのポリープが必ずしも成長していると分類されるわけではなかった。表９は、大腸内視鏡検査の時点に１個より多いポリープが存在する症例においてどのように患者の成長を分類したかを記載している。従ってポリープ切除前／後の症例に関する分析の１つの様式は、成長の状況にかかわらず大腸内視鏡検査のみの症例に関して行われると同じ低及び高リスク範疇に患者の症例を分類し、症例を特にそれらのポリープ切除前及び後の状況に基づいて分析することであった（表２）。分析の第２の様式は、成長している腺腫の症例におけるポリープ切除前の値をルーティンのスクリーニング大腸内視鏡検査からの未知の成長の腺腫（すなわちＣＴコロノグラフィーにより長期間監視されなかった症例）と比較することにより、実効（ｅｆｆｅｃｔ）長期間成長を調べることであった。
【０１０９】
タンパク質バイオマーカー候補選択
ＳＲＭ−ＭＳ分析用の血清タンパク質を２つの異なる研究から選んだ。第１に、Ｉｖａｎｃｉｃ，ＭＭ，Ｈｕｔｔｌｉｎ，ＥＬ，ｅｔ  ａｌ．，前出に記載されている通り、野生型と比較されるＡｐｃＭｉｎ／＋マウスの血清からの定量的プロテオミクスデータからいくつかのタンパク質を選んだ。ＡｐｃＰｉｒｃ／＋ラットバイオマーカーバリデーション研究において妥当性が確認されたタンパク質のほとんどすべても用いた。Ｉｖａｎｃｉｃ  ＭＭ，Ｉｒｖｉｎｇ  ＡＡ，Ｊｏｎａｋｉｎ  ＫＧ，Ｄｏｖｅ  ＷＦ，Ｓｕｓｓｍａｎ  ＭＲ．Ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＥＧＦＲ，ＬＲＧ１，ＩＴＩＨ４，ａｎｄ  Ｆ５  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｄｅｎｏｍａｓ  ｉｎ  ＡｐｃＰｉｒｃ／＋  ｒａｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  （Ｐｈｉｌａ）．２０１４；７（１１）：１１６０−９．Ｅｐｕｂ  ２０１４／０９／１０．ｄｏｉ：１０．１１５８／１９４０−６２０７．ＣＡＰＲ−１４−００５６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２５２００８３４；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４２２１４６６．それぞれの選択されたバイオマーカー候補に固有の同位体標識されたペプチド参照標準をＵＷ−Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒのペプチド合成コア施設により合成し、各参照ペプチド中に１つの重安定同位体で標識されたアミノ酸（例：１３Ｃ１５Ｎ炭素及び窒素）を導入した。選択されたバイオマーカーを表３に挙げる。
【０１１０】
【表４】
2019526038.tif 000005
【０１１１】
【表５】
2019526038.tif 000006
【０１１２】
試料処理
各患者からの血液を処理して血清と  した。５ミリリットルの血液を１−５ｍｌのレッドトップ血清管中に回収し、室温（１５−２５℃）で３０分−４時間インキュベーションした。管を１５００ｘｇで１５分間遠心した。すべての遠心段階を室温でスイングアウトローターにおいて行った。血清を１００μｌ又は３００μｌのアリコートにおいて０．５ｍＬの低結合Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中に分注し、−８０℃で保存した。
【０１１３】
血清を室温で解凍し、Ｈｕｍａｎ  ４．６ｍｍｘ１００ｍｍ  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｃｏｌｕｍｎを用いて上部７つの主要な血液タンパク質を取り除いた。すべての独占権のある緩衝液及びフィルターは製造者の指示に従って用いられた。手動の試料注入器及び１ｍＬの試料ループが備えられたＷａｔｅｒｓ  １７４０  ＨＰＬＣを用いた。枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）の前に５０μｌの血清を４００μｌのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａに加えてからろ過した。Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６フォトダイオードアレー検出器を用いて２１５及び２８０ｎｍにおいて各試料注入を監視し、結合及び非結合画分の両方を回収した。さらなる使用まで画分を−８０℃で保存した。
【０１１４】
非結合画分を室温で解凍し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ５ｋＤａ  ＭＷＣＯ濃縮フィルター装置を用いて４０００ｘｇ（４℃）で、約５００μＬ以下の液体が残るまでろ過した。濃縮されたタンパク質を、５０％の冷トリクロロ酢酸を１０％の最終的な濃度まで加え、試料を氷上で５分間インキュベーションすることにより沈殿させた。４℃において４０００ｘｇで５分間、微量遠心機を用いてタンパク質をペレット化した。冷たい水中の８０％アセトンの４回の洗浄及び続いて冷たい水中の５０％メタノール中の１回の洗浄を用い、遠心段階を繰り返した。各洗浄の後に上澄み液を除去し、最後の洗浄の後にペレットを空気乾燥した。ペレットを４℃において５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、８Ｍウレア、ｐＨ８中で終夜、再可溶化した。部分的に溶解したペレットを１．６Ｍウレア、５０ｍＭ重炭酸アンモニウムｐＨ８に希釈した。音波処理プローブを用い、各試料を５秒間パルスで合成３回音波処理した。
【０１１５】
ＢＣＡタンパク質濃度アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造者の指示に従って行った。各試料からの血清タンパク質の１００μｇのアリコートを還元し、システイン残基をアルキル化し、続いて１：５０トリプシン−タンパク質比においてシークエンシンググレード（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｇｒａｄｅ）ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３７℃において終夜消化した。還元及びアルキル化の前に、各標的内在性ペプチドの安定同位体標識されたペプチド参照標準を血清タンパク質試料に加えた。得られるペプチドをＳＰＥＣ
Ｃ１８  Ｐｉｐｅｔｔｅ  Ｔｉｐｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で製造者の指示に従って脱塩した。溶離したペプチドを真空遠心機を用いて乾燥し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで−８０℃で保存した。
【０１１６】
液体クロマトグラフィー−質量分析法
３７℃に設定されたｎａｎｏｆｌｅｘ  ｃＨｉＰＬＣが備えられたＮａｎｏＬＣ  Ｕｌｔｒａ  ２Ｄ  ＨＰＬＣ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ）を用いる逆相クロマトグラフィーにより、２μｇの試料の液体クロマトグラフィー分離を行った。Ｉｖａｎｃｉｃ，ＭＭ，Ｈｕｔｔｌｉｎ，ＥＬ，ｅｔ  ａｌ．，同上に記載されている通りにペプチド分離のために９０分勾配を用い、続いて５５００  ＱＴｒａｐ（ＡｂＳｃｉｅｘ）中に直接溶離した。ペプチド前駆体を四重極  １（Ｑ１）で選択し、ｑ２でフラグメント化させ、Ｑ３における監視のために上位３〜４の遷移を選択した。すべてのＱ１及びＱ３質量を装置分解能（ｕｎｉｔ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）において測定した。７分のスケジューリングウインドウを２秒のサイクル時間と共に適用した。方法の開発及びピーク分析は、Ｓｋｙｌｉｎｅソアトウェア（Ｉｖａｎｃｉｃ  ＭＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＥＧＦＲ，ＬＲＧ１，ＩＴＩＨ４，ａｎｄ  Ｆ５  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｄｅｎｏｍａｓ
ｉｎ  ＡｐｃＰｉｒｃ／＋  ｒａｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  （Ｐｈｉｌａ）．２０１４；７：１１６０−９．）を用いて行われた。すべての生物学的試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより３回の技術的反復において分析した。
【０１１７】
質量分析データ処理及び分析
質量分析の結果をＳｋｙｌｉｎｅ中に取り込み、ピークを積分した。３回の技術的反復について最も強い遷移の平均ピーク面積を用いて各ペプチドを評価した。各タンパク質に関し、ペプチドのそれぞれに関して平均比を算出し、表５に示される通りに患者グループを比較した。
【０１１８】
さらに、低リスク、高リスク及び絨毛／鋸歯状ポリープに関するポリープ切除前／後比を比較した。両側ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔ−検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔ−ｔｅｓｔ）を用い、９５％の信頼区間でＰ値を得た。腺腫及び癌腫のステージを比較する例の場合、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ  ５％偽発見率（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）計算を用いてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｐ値をろ過した。ＣＴＣ研究及びポリープ切除前／後研究はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｐ値を用いたが、サンプルサイズ（ｓａｍｐｌｅ  ｓｉｚｅ）を見て多すぎる偽陰性の結果の可能性に基づき、偽発見に関してろ過しなかった。ロジスティック回帰アルゴリズムを用いてそれぞれのタンパク質ＲＯＣ曲線を決定した。Ｌｉｎｅａｒ  ＳＶＭ、Ｌｏｇｉｓｔｉｃ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ及びＲａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓを含む数種の機械学習アルゴリズムを用いてＲＯＣパネル曲線を最適化した。ｉａｗ  ＡＷ，Ｍ．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ
Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ．Ｒ  Ｎｅｗｓ．２００２；２／３：５；Ｂｕｒｇｅｓ  ＣＪＣ．Ａ  Ｔｕｔｏｒｉａｌ  ｏｎ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｎｇｉｔｉｏｎ．Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．１９９８；２：１２１−６７；Ｚｏｕ  ＫＨ，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ  ＡＪ，Ｍａｕｒｉ  Ｌ．Ｒｅｃｅｉｖｅｒ−ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００７；１１５（５）：６５４−７．ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮＡＨＡ．１０５．５９４９２９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１７２８３２８０．
【０１１９】
【表６】
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【実施例１】
【０１２０】
バイオマーカーは結腸直腸癌及び前癌性状態の検出のための診断的及び予後的効用を有する
大腸内視鏡検査、結腸切除又はＣＴコロノグラフィー／大腸内視鏡検査法からの２６０人を超える患者の症例に関して血清を回収し、分析した（図５）。ほとんどの大腸内視鏡検査の症例はポリープなし（正常な組織、ｎ＝５６）か又は低リスクポリープ（ｎ＝８７）を有する低リスクグループに分類された。合計７１人の患者は結腸直腸癌の発病に関して高リスクである進行性腺腫と考えられるポリープを有した。５０の結腸切除の症例から患者の４７人は非転移性癌を有した。症例のほとんど半分はステージ１（ｎ＝２２）と分類されたが、残りはステージ２（ｎ＝１３）及びステージ３（ｎ＝１２）結腸直腸癌で分けられた。患者から合計で２５のポリープ切除前／後対を回収し、その患者のポリープはＣＴコロノグラフィー後に大腸内視鏡検査により生検された。８人の患者はポリープ切除後血液収集のために戻らなかった。この長期監視グループにおいて、１１の低リスク、２２の高リスクの症例が分析された（８つの低リスク前／後対及び前／後対を有する１７の高リスクの症例）。
【０１２１】
バイオマーカーは高リスク結腸直腸腺腫と低リスク結腸直腸腺腫の間の区別を与える
大体同数の男性及び女性を、患者の年齢及び癌ステージ全体に及ぶ研究に登録した（図６）。ＣＲＰは、すべての性別を合わせた場合に進行性腺腫と低リスクの症例の間で発現における平均上方調節を示す（図８、表６）。類似してＥＧＦＲは進行性腺腫の症例において穏やかな下方調節を示す。ロジスティック回帰分析に基づく感度及び特異度受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、これらのタンパク質が進行性腺腫を予測することを示す（図９）。
【０１２２】
ＣＲＰ及びＥＧＦＲ  ＲＯＣ曲線は、性別により分けた場合に感度及び特異度における
差を示す（図１０）。類似して進行性腺腫感度及び特異度における性別の差がＣＤ４４、Ｆ５、ＣＦＩ及びＩＴＩＨ４に関して観察された（図１１）。
【０１２３】
一部のタンパク質はポリープ組織学に基づいて、発現における特別な変化を示した。いずれかの程度の異形成を有する絨毛（管状絨毛）腺腫は他の型のポリープより有意に高い癌腫への発達の可能性を有する。ＩＴＩＨ３、ＩＴＩＨ４及びＣＲＰは、管状絨毛腺腫において他のポリープ組織病理学のメジアン上方調節より高いメジアン上方調節を示した（図１２）。
【０１２４】
ＱＳＯＸＩは管状絨毛腺腫の症例において性別の関数として差次的発現を示す（図１３）。管状絨毛腺腫を有する女性においてＱＳＯＸ１発現は低下したが、管状絨毛腺腫を有する男性においてＱＳＯＸ１発現は向上した。
【０１２５】
バイオマーカーは直腸腺腫と結腸腺腫の間の区別を与える
ポリープの位置によって分けられるバイオマーカーは、結腸中に存在する腺腫と比較して直腸中に存在する腺腫を区別する。大腸内視鏡検査患者を４つの範疇：スクリーニング正常、結腸ポリープのみ、結腸及び直腸ポリープ及び直腸ポリープのみに分けた。ポリープを有するほとんどの患者は結腸ポリープ又は結腸と直腸の混合を示したが、いくつかの症例は直腸のみに特異的であった（図１４）。ＣＤ４４及びＰＩ１６は両方とも直腸ポリープのみが存在する症例において下方調節された（図１５）。ＩＴＩＨ３及びＱＳＯＸ１は両方とも、直腸及び結腸ポリープの両方の混合を有する患者における場合を含んで直腸ポリープが存在する症例において上方調節された。
【０１２６】
バイオマーカーは結腸直腸腺腫と結腸直腸癌腫の間の区別を与える
スクリーニング正常大腸内視鏡検査又は低リスク腺腫を有する患者を結腸直腸癌の症例と区別した。低リスクの症例及び正常な症例と比較されるすべての非転移性結腸直腸癌の平均は、ＥＧＦＲ、ＤＰＰ４、ＣＤ４４、ＰＩ１６及びＦＥＴＵＢにおける下方調節を示した（図１６、表６）。これらのタンパク質に関するＲＯＣ曲線（図１７）は、ＥＧＦＲが結腸直腸癌の予測に関する最も高い感度及び特異度を有するが、ＤＰＰ４及びＣＤ４４も優れた予測物質であることを示している。ＬＲＧ１、ＩＴＩＨ３、ＩＴＩＨ４、ＨＰＸ、ＣＲＰ、ＱＳＯＸ１及びＦ５は低リスク大腸内視鏡検査の症例と比較して癌において上方調節される（図１８、表６）。分析されたすべてのタンパク質の中で、ＬＲＧ１、ＩＴＩＨ３及びＩＴＩＨ４は個別のマーカーとしての結腸直腸癌腫の存在の予測に関して全体的に最も高い感度及び特異度を有した（図１９）。
【０１２７】
【表７】
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【０１２８】
【表８】
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【０１２９】
マルチマーカーパネルはスクリーニング目的のための結腸直腸癌検出の感度及び特異度を向上させる可能性を有する
マルチマーカーパネルを用いることにより感度及び特異度を向上させることができる。数種の機械学習法を用い、低リスク患者と比較して結腸直腸癌を検出するための感度及び特異度を最大にするバイオマーカーパネルのための候補の可能性のあるものとして、すべてのバイオマーカーを調べた。２種の機械学習アルゴリズムを用い、ＣＤ４４、ＤＰＰ４、ＥＧＦＲ、ＩＴＩＨ３及びＬＲＧ１を含む５−マーカータンパク質パネルを、低リスク及び正常な症例と比較して癌を検出するための最適なパネルと同定した（図２１及び２２）。第１に３７の癌及び７１の低リスク腺腫及び正常な症例のトレーニングセットを用いてアルゴリズムをトレーニングした。第２に１０の癌及び６９の低リスク腺腫及び正常な症例を用い、トレーニング後のアルゴリズムの妥当性を確認した。信頼区間は灰色の球で示され、それはＴｉｌｂｕｒｙ  ＪＢ，Ｖａｎ  Ｅｅｔｖｅｌｔ  ＰＷ，Ｇａｒｉｂａｌｄｉ  ＪＭ，Ｃｕｒｎｏｗ  ＪＳ，Ｉｆｅａｃｈｏｒ  ＥＣ．Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ−−ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ
ｆｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌｓ．ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ
Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．２０００；４７（７）：９５２−６３．ｄｏｉ：１０／１１０９／１０．８４６６９０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１０９１６２６７．に従って算出された。ロジスティック回帰及びエキストラツリーズトレーニングセットの両方に関するＡ
ＵＣｓは０．９に近かったが、エキストラツリーズに関するバリデーションセットは０．８８であり、ロジスティック回帰分析により行われたいずれの個別のマーカーよりも実質的に高かった。重要なことに、マルチマーカーパネルは全体的な特異性を、結腸直腸癌のための現存するスクリーニング手段と競合するレベルに向上させた。
【０１３０】
バイオマーカーは癌のステージにおける所属リンパ節浸潤の同定を可能にする
バイオマーカーを、初期癌（ステージ１及び２）と所属リンパ節浸潤（ステージ３）を区別するそれらの能力に関して調べた（図２３、表６）。個別のマーカーに関するＡＵＣｓ（図２４）は、所属リンパ節存在の同定に関する予測可能性を示し、ＣＤ４４はステージ３  ＣＲＣに関する最高の感度及び特異度を示した。
【０１３１】
Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔ回帰モデルを用い、ＣＤ４４、ＣＲＰ、ＤＰＰ４、ＩＴＩＨ３及びＶＩＴＤ（ＧＣ）の５−バイオマーカーパネルを、分析された４７人の患者の中での感度及び特異度を用いて同定した（図２５）。灰色の球はＲＯＣ曲線を通じての全体的な信頼度を示し、紫色の四角は所属リンパ節の同定のための目標信頼範囲を示す。トレーニングデータは１０のステージ３の癌及び２７のステージ１又は２の癌から成ったが、バリデーションデータは２つのステージ３の癌及び８つのステージ１又は２の癌から成った。
【０１３２】
ポリープ切除後と比較されるポリープ切除前のバイオマーカー発現
ポリープ切除前及び後の試料を与えた各患者に関し、ポリープ切除前／後バイオマーカー発現の比を決定した。調べられたタンパク質バイオマーカーはロイシン−リッチアルファ−２−糖タンパク質、ペプチダーゼ阻害剤  １６、ＣＤ４４、カドヘリン  ２、Ｃ−反応性タンパク質、ジペプチジルペプチダーゼ  ４、インター−アルファトリプシン阻害剤，重鎖  Ｈ４、インター−アルファトリプシン阻害剤、重鎖  Ｈ３、凝固因子  Ｖ、上皮成長因子受容体、Ｆｅｔｕｉｎ−Ｂ、ヘモペキシン、血清アミロイド  Ｐ成分、ビタミン  Ｄ結合タンパク質、補体因子  Ｉ、スーパーオキシドジスムターゼ  ３及びクイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ  １、トロンボスポンジン−４及びビトロネクチンを含む。以下が真である場合に、タンパク質はポリープ切除後に正常なレベルに復帰していると定義される（図６）：
１．ポリープ切除前の試料が正常なレベルから上方調節される場合、ポリープ切除後の参照標準に対する比はポリープ切除前の参照標準に対する比より低くなければならない。従ってポリープ切除前／後の比は１より大きい。
２．ポリープ切除前の試料が正常なレベルから下方調節される場合、ポリープ切除後の参照標準に対する比はポリープ切除前の参照標準に対する比より高くなければならない。従ってポリープ切除前／後の比は１より小さい。
【０１３３】
すべての患者のポリープ切除前／後の比の平均は、２つのグループ間の統計的に有意な変化を有するタンパク質バイオマーカーを同定した。ＰＩ１６はポリープ除去後に正常なレベルに向かう平均発現変化を示した（図２６Ａ、表７）。ＰＩ１６は典型的に腺腫を有する患者において下方調節を示し、そしてこの症例において参照標準に対するポリープ切除前のメジアン比（０．３９１）及び参照標準に対するポリープ切除後の上昇したメジアン比（０．５４４）を有した。観察されたポリープ切除前対ポリープ切除後発現変化は、症例をＰＩ１１６に関する高リスク（進行性腺腫）の症例と低リスクの症例の間でビニングした（ｂｉｎｎｅｄ）場合、統計的に有意でなく（図２６Ｂ、表７）、ポリープ除去に対する一般的な反応としてＰＩ１６における全体的な変化があることを意味した。
【０１３４】
Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）は高リスクの症例においてポリープ切除前対ポリープ切除後の比における差を示した（図２７、表７）。
【０１３５】
【表９】
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【０１３６】
【表１０】
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【０１３７】
未知の成長の前癌性ポリープと比較される既知の成長している前癌性ポリープにおけるバイオマーカー発現
ポリープ切除前及び後に血液バイオマーカー発現が監視された患者の症例もＣＴコロノグラフィーＣＴＣを用いて２−１０年にわたって長期間監視した（図２８）。表９は、成長している、静止性、退行している又は未知の成長と患者を標識するために用いられた規則を説明している。要するに、成長しているポリープを有するいずれの患者も、存在するすべての他のポリープにかかわらず成長していると分類された。未知の成長のポリープは、より大きな成長の可能性をそれらが有しているので、静止性及び退行しているポリープより優先された。成長しているポリープ又は未知の成長のポリープがない場合、静止性ポリープは退行しているポリープよりリスクが高いと考えられ、それはそれらが縮小しておらず、成長しているポリープの状況に、より変化しそうだからである。ＣＴＣにより監視されなかった患者の症例を、スクリーニング正常の標準試料及び未知の成長のポリープの形態で、成長しているポリープのグループへの追加の比較として役立てるために、ルーティンのスクリーニング大腸内視鏡検査のグループから引き抜いた。
【０１３８】
【表１１】
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【０１３９】
Ｆ５、ＣＲＰ、ＰＩ１６、ＩＴＩＨ４及びＬＲＧ１はすべて未知の成長の腺腫の症例と比較して既知の成長している腺腫の症例において統計的に有意な変化を示した（図２９、表８）。ＩＴＩＨ４以外のすべてはスクリーニング正常大腸内視鏡検査と比較して成長している腺腫における統計的に有意なタンパク質発現変化も示した。
【０１４０】
本発明を詳細に且つその特定の実施態様に言及することにより説明してきたが、添付の請求の範囲中で定義されている本発明の範囲から逸脱することなく修正及び変更が可能であることは明らかであろう。さらに具体的に、本発明のいくつかの側面が本明細書で特に有利であると同定されているが、本発明が必ずしも本発明のこれらの特定の側面に制限されないことが意図されている。
【図１】
2019526038.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
2019526038.tif 000030
【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2019526038.tif 000033
【図１６Ｃ】
2019526038.tif 000034
【図１７Ａ】
2019526038.tif 000035
【図１７Ｂ】
2019526038.tif 000036
【図１７Ｃ】
2019526038.tif 000037
【図１８Ａ】
2019526038.tif 000038
【図１８Ｂ】
2019526038.tif 000039
【図１８Ｃ】
2019526038.tif 000040
【図１８Ｄ】
2019526038.tif 000041
【図１９Ａ】
2019526038.tif 000042
【図１９Ｂ】
2019526038.tif 000043
【図１９Ｃ】
2019526038.tif 000044
【図１９Ｄ】
2019526038.tif 000045
【図２０Ａ】
2019526038.tif 000046
【図２０Ｂ】
2019526038.tif 000047
【図２０Ｃ】
2019526038.tif 000048
【図２０Ｄ】
2019526038.tif 000049
【図２１】
2019526038.tif 000050
【図２２】
2019526038.tif 000051
【図２３Ａ】
2019526038.tif 000052
【図２３Ｂ】
2019526038.tif 000053
【図２４】
2019526038.tif 000054
【図２５】
2019526038.tif 000055
【図２６Ａ】
2019526038.tif 000056
【図２６Ｂ】
2019526038.tif 000057
【図２７Ａ】
2019526038.tif 000058
【図２７Ｂ】
2019526038.tif 000059
【図２８】
2019526038.tif 000060
【図２９Ａ】
2019526038.tif 000061
【図２９Ｂ】
2019526038.tif 000062
【図２９Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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