(57)【要約】  本開示は、アクネ菌を検出する方法、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列のゲノム配列における変異、特に変異Ａ２０５８Ｇを検出するための方法に関する。方法は、配列番号１及び２のプライマーを使用してアクネ菌に対して特異的な２３Ｓ  ｒＲＮＡの領域を増幅し、続いて前記変異又はポストハイブリダイゼーションの部位での特異的アクネ菌２３Ｓ領域とのミスマッチにおけるエンドヌクレアーゼの選択的作用と、それに続くミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼ作用によって変異を検出することを含む。Ａ２０５８Ｇ変異の存在は、抗生物質耐性、特にクリンダマイシン及びエリスロマイシン耐性を付与し、かくして本開示はまた、フルオロキノロン系抗生物質を使用することによって、クリンダマイシン耐性アクネ菌により引き起こされるざ瘡を治療する方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のアクネ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ：Ｐ．ａｃｎｅｓ）を検出するための方法であって、前記試料を、配列番号１に示す順方向プライマー及び配列番号２に示す逆方向プライマー、あるいは、配列番号７に示す順方向プライマー及び配列番号８に示す逆方向プライマーと接触させ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供して増幅産物を得ることを含み、ここで、前記増幅産物を得ることにより、前記試料中のアクネ菌の存在が確認される、前記方法。
【請求項２】
前記プライマーが、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に示すアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを特異的に増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配列番号４が位置２０５８（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ナンバリング）で野生型配列番号３に対して変異を有し、前記変異がＡ２０５８Ｇであり；前記配列番号５が位置２０５９（大腸菌ナンバリング）で野生型配列番号３に対して変異を有し、前記変異がＡ２０５９Ｇであり；前記配列番号６が位置２０５８及び２０５９（大腸菌ナンバリング）で野生型配列番号３に対して変異を有し、前記変異がＡ２０５８Ｇ及びＡ２０５９Ｇである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、水、食物、環境試料及び生体試料を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列における変異を検出する方法であって：
（ａ）アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡと、アクネ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列に対して特異的なプライマーとを接触させる工程であって、順方向プライマーが配列番号１に示されかつ逆方向プライマーが配列番号２に示されるか、あるいは、順方向プライマーが配列番号７に示されかつ逆方向プライマーが配列番号８に示される工程；と、
（ｂ）アクネ菌の前記接触させた配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供して増幅産物を得る工程；と、
（ｃ）前記変異を検出するために、前記増幅産物を制限酵素消化、又はＤＮＡハイブリダイゼーションとそれに続くエンドヌクレアーゼ消化に供する工程；と
を含む、前記方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲ増幅は、ｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、緩衝液、ヌクレアーゼフリー水及びＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される増幅試薬の存在下で実施される、請求項１又は５に記載の方法。
【請求項７】
制限酵素消化による変異の前記検出が：
（ａ）前記増幅産物と、検出対象の前記変異に対する親和性を有する制限酵素とを接触させて、変異点で前記産物の切断を可能にする工程；と、
（ｂ）前記増幅産物を制限酵素消化に供した後に切断された増幅産物の存在を判定することによって前記変異を検出する工程；と
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記制限酵素がＢｐｕＪＩである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡハイブリダイゼーションとそれに続くエンドヌクレアーゼ消化による変異の前記検出が：
（ａ）前記増幅産物の１つと、野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡもしくは検出対象の前記特異的変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとを接触させるか、又は前記増幅産物を個々に両者と接触させ、そしてハイブリダイゼーションに供して二本鎖を得る工程；と、
（ｂ）前記二本鎖とＤＮＡエンドヌクレアーゼとを接触させる工程；と、
（ｃ）前記二本鎖をエンドヌクレアーゼ消化に供した後に、変異点で切断された二本鎖の有無を判定することによって前記変異を検出する工程；と
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅産物が変異を有する場合、野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードする前記ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、ＤＮＡエンドヌクレアーゼとの接触後に二本鎖が切断され；前記増幅産物が変異を有する場合、前記特異的変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードする前記ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼとの接触後に二本鎖は切断されない；又は前記増幅産物が変異を有さない場合、野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードする前記ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼとの接触後に二本鎖が切断されない；又は前記増幅産物が変異を有さないか又はそれがハイブリダイズされる前記配列中に存在する前記変異以外の変異を有する場合、前記特異的変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードする前記ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼとの接触後に二本鎖が切断され；そして、前記ＤＮＡハイブリダイゼーションを、前記接触させた増幅産物を約９０℃〜約９５℃の範囲の温度にて約５分〜約１０分の範囲の時間融解させることによって実施して、融解した鎖を得、続いて約２０℃〜約２７℃の範囲の温度に冷却することにより前記融解した鎖を再アニーリングして前記二本鎖を得；そして前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＣＥＬＩＩ、ＣＥＬＩ及びＴ７エンドヌクレアーゼを含む群から選択されるミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
増幅産物、切断された増幅産物又は切断された二本鎖の判定が、アガロースゲル電気泳動を使用して実施される、請求項１、７又は９に記載の方法。
【請求項１２】
前記アクネ菌が水、食物、環境試料及び生体試料を含む群から選択される試料中に存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
アクネ菌の前記２３Ｓ  ｒＲＮＡにおける前記変異が、Ａ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリング）、Ａ２０５９Ｇ（大腸菌ナンバリング）又はそれらの組み合わせ、好ましくはＡ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリング）から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記変異がＡ２０５８Ｇ又はＡ２０５８ＧとＡ２０５９Ｇとの組み合わせとなる場合、前記アクネ菌が抗生物質耐性となる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アクネ菌に感染した患者におけるざ瘡を治療する方法であって：
（ａ）患者から試料を得る工程；と、
（ｂ）請求項５に記載の方法によってアクネ菌における変異の有無を検出して、前記アクネ菌が抗生物質Ａに対して耐性であるか又は感受性であるかを判定する工程；と、
（ｃ）アクネ菌が前記抗生物質Ａに対して耐性である場合は、前記患者に抗生物質Ｂを投与する工程；と
を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記アクネ菌が検出用の前記試料から単離されない、請求項１、１２又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が、体液、組織、皮膚、ざ瘡病変及び骨、又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生体試料、好ましくはざ瘡病変であり；前記体液が血液である、請求項４、１２又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗生物質がリンコサミドもしくはマクロライド又はそれらの組み合わせであり、好ましくはクリンダマイシン、エリスロマイシン又はそれらの組み合わせである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗生物質Ａがリンコサミドもしくはマクロライド又はそれらの組み合わせ、好ましくはクリンダマイシン、エリスロマイシン又はそれらの組み合わせであり；前記抗生物質Ｂがベシフロキサシン、ナジフロキサシン及びレボフロキサシンを含む群から選択されるフルオロキノロン抗生物質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗生物質Ｂが、約０．１％ｗ／ｗ〜約１０％ｗ／ｗ、好ましくは約０．２％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは約１％ｗ／ｗ〜約２％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在し；前記抗生物質Ｂが、局所製剤、固体経口製剤、液体経口製剤、吸入製剤、鼻腔投与製剤、眼科用製剤、非経口製剤、植物性医薬品、栄養補助食品及び食糧又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される製剤、好ましくは局所製剤の形態である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記局所製剤が、クリーム、ゲル、スプレー、フォーム、ローション又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記固体経口製剤が、錠剤、カプセル、トローチ、ロゼンジ、分散性粉末、分散性顆粒又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記液体経口製剤が、水性もしくは油性懸濁液、エマルジョン、滴剤、ハードもしくはソフトゲルカプセル中エマルジョン、シロップ、エリキシル又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記非経口製剤が、静脈内注射、筋肉内注射、筋肉内デポー、皮下注射、経皮注射又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記吸入製剤が、吸入具、乾燥粉末吸入具、ネブライザー又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記鼻腔投与製剤が、点鼻剤、鼻腔用スプレー又はそれらの組み合わせを含む群から選択され；前記眼科用製剤が点眼薬を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記製剤がテトラサイクリン、アダパレン、過酸化ベンゾイル、又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
アクネ菌を検出し、場合により治療するためのキットであって、配列番号１及び２のプライマー配列もしくは配列番号７及び８のプライマー配列、又は両者を、場合によりｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ヌクレアーゼフリー水、塩化マグネシウム、バイアル、制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、アクネ菌野生型株、Ａ２０５８Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ａ２０５９Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ａ２０５８Ｇ及びＡ２０５９Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、取扱説明書、及び抗生物質、又はそれらの任意の組み合わせとともに含む、前記キット。
【請求項２４】
前記抗生物質が、フルオロキノロンであり、場合によりリンコサミド、マクロライド、レチノイド、テトラサイクリン及び過酸化ベンゾイルを含む群から選択される抗生物質、又はそれらの任意の組み合わせを伴う、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記フルオロキノロン抗生物質が、ベシフロキサシン、ナジフロキサシン及びレボフロキサシン、又はそれらの組み合わせを含む群から選択され；前記リンコサミドがクリンダマイシンであり；前記マクロライドがエリスロマイシンであり；前記レチノイドがアダパレンである、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記キットが、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡにおける変異を検出するために使用され；前記変異が、Ａ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリング）、Ａ２０５９Ｇ（大腸菌ナンバリング）又は野生型アクネ菌に関するそれらの組み合わせから選択され、好ましくはＡ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリング）であり；前記制限エンドヌクレアーゼがＢｐｕＪＩであり；そして前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＣＥＬＩＩ、ＣＥＬＩ及びＴ７エンドヌクレアーゼを含む群から選択されるミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼである、請求項２３に記載のキット。
【請求項２７】
前記検出対象の変異がＡ２０５８Ｇ又はＡ２０５８ＧとＡ２０５９Ｇとの組み合わせである場合、前記検出対象のアクネ菌は、リンコサミド及びマクロライドから選択される抗生物質又はそれらの組み合わせ、好ましくはクリンダマイシン、エリスロマイシン又はそれらの組み合わせに対して耐性となる、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記抗生物質が約０．１％ｗ／ｗ〜約１０％ｗ／ｗ、好ましくは約０．２％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗ、そしてさらに好ましくは約１％ｗ／ｗ〜約２％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在し；そして前記抗生物質が局所製剤、固体経口製剤、液体経口製剤、吸入製剤、鼻腔投与製剤、眼科用製剤、非経口製剤、植物性医薬品、栄養補助食品及び食糧又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される製剤、好ましくは局所製剤の形態である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２９】
前記局所製剤が、クリーム、ゲル、スプレー、フォーム、ローション又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記固体経口製剤が、錠剤、カプセル、トローチ、ロゼンジ、分散性粉末、分散性顆粒又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記液体経口製剤が水性もしくは油性懸濁液、エマルジョン、滴剤、ハードもしくはソフトゲルカプセル中エマルジョン、シロップ、エリキシル又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記非経口製剤が静脈内注射、筋肉内注射、筋肉内デポー、皮下注射、経皮注射又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記吸入製剤が、吸入具、乾燥粉末吸入具、ネブライザー又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記鼻腔投与製剤は点鼻剤、鼻腔用スプレー又はそれらの組み合わせを含む群から選択され；そして前記眼科用製剤が点眼薬を含む、請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示はアクネ菌を検出するための方法に関する。本開示はまた、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡゲノム配列における点突然変異を検出することによりアクネ菌の抗生物質耐性又は感受性株を検出するための方法にも関する。本開示はまた、患者が感染しているアクネ菌の株に基づいた、患者にとって好適な治療レジメンにも関する。
【背景技術】
【０００２】
尋常性ざ瘡は、全世界の人口のおよそ９．４％が罹患しているため、８番目に流行している疾患となっている(Tan & Bhate 2015, Br J Dermatol 172: 3)。ざ瘡は多因子性疾患であることが知られているが、ざ瘡の発症における重要な病因は、皮膚の天然の細菌叢の一部として存在するグラム陽性桿菌であるアクネ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ：Ｐ．ａｃｎｅｓ）である(Cunliffe et al 1981 Clin Exp Dermatol 6: 461; Holland et al 1981 J Appl Bacteriol 51: 195)。
【０００３】
抗生物質は、それらの抗菌効果によるだけでなく、それらの抗炎症作用によっても、ざ瘡治療の不可欠な部分である。抗生物質は、軽度から中等度の混合型丘疹性／膿疱性、及び中等度の結節性ざ瘡の治療の第一の選択肢の一部として、また重度の結節性／球状（ｃｏｎｇｌｏｂａｔｅ）ざ瘡における別の選択肢として推奨される。抗生物質は特定の細菌標的に作用して、ざ瘡患者の皮脂腺毛包における細菌負荷の減少をもたらす。ざ瘡のために主に処方される局所抗生物質としては、エリスロマイシン（マクロライドクラス）及びクリンダマイシン（リンコサミドクラス）が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、抗生物質を見境無く使用すると、アクネ菌の耐性株発生の問題が起こり、現在処方されている抗生物質の治療不成功に至る可能性がある。皮膚アクネ菌におけるエリスロマイシン及びクリンダマイシンに対する複合耐性が米国で１９７９年にいずれかの薬物の局所製剤を用いたざ瘡患者の２０％において最初に報告された(Crawford et al 1979 J Invest Dermatol 72: 187)。一般的な抗生物質に対する世界中の様々な研究で報告されている様々なアクネ菌単離株の抗生物質感受性は、米国、ヨーロッパ、及びアジアからエリスロマイシン及びクリンダマイシンの驚くべき耐性率を示している。クリンダマイシンに対する耐性は、アクネ菌耐性株を保有する米国の患者の実に１／３にまで発展している(Ross et al 2001 Br J Dermatol 144: 339)。ある研究から、スペインにおいてクリンダマイシン耐性アクネ菌株の発生率は９０％を上回ることが明らかになった(Ross et al 2003 Br J Dermatol 148: 467)。同様に、エリスロマイシンの平均ＭＩＣは、薬物による長期の抗生物質治療を受けている者において１００倍増加することが判明した(Leyden et al 1983 J Am Acad Dermatol 8: 41)。
【０００５】
いくつかの研究では、クリンダマイシン耐性アクネ菌株の存在が実際、反応低下、無反応、又は再発のいずれかの治療不全として現れ得ることが示された(Mills et al 2002 Acta Derm Venereol 82: 260)。ある研究により、耐性アクネ菌株に感染した患者は、感受性株に感染した患者よりも多くの細菌数を有し、臨床成績が悪いことが判明した(Leyden et al 1983 J Am Acad Dermatol 8: 41)。炎症性及び非炎症性病変に対する局所エリスロマイシンの有効性が時間とともに漸減するのがざ瘡の治療介入の臨床試験で観察されたが、これはおそらくは抗生物質耐性アクネ菌の発生に関連する(Simonart & Dramaix 2005 Br J Dermatol 153: 395)。最近の症例研究で、アクネ菌のクリンダマイシン−耐性株を有する患者は、従来の抗生物質治療に対しては反応しないが、抗生物質投薬療法を変更した場合にざ瘡の消散を示すことが判明した(Sadhasivam et al 2016 Dermatol Ther 29: 451)。これらの知見は、耐性の出現が、実際に、ざ瘡における抗生物質療法の不成功の原因となることを示す。しかしながら、誘導試験（ｇｕｉｄｉｎｇ  ｔｅｓｔ）が無い場合は、患者が抗生物質に対してすでに耐性である場合でも、患者はその薬物で治療される。これは、抗生物質の過剰使用を意味し、他の治療指標における交差耐性をもたらす可能性がある。適切な抗生物質での治療についての患者の選択を可能にできる試験が緊急に必要とされている。
【０００６】
クリンダマイシンは５０Ｓサブユニットの２３Ｓ  ｒＲＮＡに結合することにより細菌タンパク質合成を阻害することによってその抗菌効果を発揮する。それはＡ部位及びＰ部位基質結合を妨げ、成長するペプチド鎖の経路を物理的に妨害する。アクネ菌のクリンダマイシン耐性は、２３Ｓ  ｒＲＮＡのドメインＶにおける点突然変異によるか、又はｅｒｍ（Ｘ）によってコードされる２３Ｓジメチラーゼによる標的部位の変更によって引き起こされる。ＡからＧへの２０５８（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ナンバリング）での変異は非常に重要であり、他の残基と比較して、アクネ菌において高いクリンダマイシン耐性をもたらす(Ross et al 1997 Antimicrob Agents Chemother 41: 1162; Ross et al 1998 Dermatology 196: 69)。いくつかの研究では、Ａ２０５８がリンコサミド結合の極めて重要なヌクレオチドの１つとして報告されている(Poehlsgaard et al 2005 Antimicrob Agents Chemother 49: 1553; Schlunzen et al 2001 Nature 413: 814)。したがって、この残基におけるＡからＧへの変異は、薬物結合を深刻に妨害する。Ａ２０５８Ｇ変異を有する耐性アクネ菌株を保有する患者は、クリンダマイシンが処方された場合に治療不成功を示す(Mills et al 2002 Acta Derm Venereol 82: 260)。
【０００７】
過酸化ベンゾイル又はレチノイドのような非抗生物質とクリンダマイシンとを使用する現行の併用療法は、組み合わせのうちの過酸化ベンゾイル又はレチノイド成分のみがこれらの患者において活性であるので、クリンダマイシン耐性株をすでに保有している患者において無効であり得る。クリンダマイシン耐性を付与する変異を有するアクネ菌の存在についての知見は、クリンダマイシン非応答者をスクリーニングするのに役立つ可能性があり、それによってこの抗生物質の見境のない使用を減じることができる。しかしながら、現在、ざ瘡の管理における抗生物質の選択はランダムであり、細菌が治療に応答するか否かに関する遺伝的な洞察が無く、患者は一般的な抗生物質、ほとんどの場合はクリンダマイシンで治療される。さらに、ルーチン的なアクネ菌単離、同定及び抗生物質感受性試験は、患者が薬物耐性アクネ菌に感染しているか否かの結論に達するのに１０〜２０日を要する。また、細菌のクリンダマイシン耐性を付与する領域（２３Ｓ  ｒＲＮＡ）における変異の検出について現在入手可能な文献は、まず、その生物に対して特異的な領域を増幅し、次に第２の方法（ＰＣＲ、配列決定又は変異特異的プローブハイブリダイゼーション技術）を使用して２３Ｓ  ｒＲＮＡ領域における特異的変異を検出することによって生物を同定することを報告し、この場合、変異を含む領域は、生物を同定するために増幅された領域とは異なる(J. Med. Microbiol. 63(5):721-728 doi: 10.1099/jmm.0.067611-0; Microbiology and Immunology, 52: 621-624)。さらに、現在、配列決定、プローブを用いたハイブリダイゼーション、増幅プライマーの使用などによる耐性を付与する変異の検出は、検出ステップの前に試料からのアクネ菌をまず培養し、単離することを含む。したがって、これらの技術は時間がかかり、また費用がかかる。
【０００８】
したがって、アクネ菌クリンダマイシン及びエリスロマイシン耐性の存在を評価するための迅速な手法が必要とされる。これにより、抗生物質治療を必要とするざ瘡患者の適切な管理及び細菌耐性の疫学的進化のモニタリングの両方が可能になる。耐性を付与する変異がないことに基づいて患者を抗生物質で治療する、目的に合わせた治療は、ざ瘡の管理におけるパラダイムシフトとなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本開示は、試料中のアクネ菌（Ｐ．ａｃｎｅｓ）を検出するための方法であって、試料を、配列番号１に示す順方向プライマー及び配列番号２に示す逆方向プライマー、あるいは、配列番号７に示す順方向プライマー及び配列番号８に示す逆方向プライマーと接触させ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけて増幅産物を得ることを含み、ここで、増幅産物を得ることにより、試料中のアクネ菌の存在が確認される、前記方法；アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列における変異を検出する方法であって、（ａ）アクネ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを、アクネ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列に対して特異的なプライマーと接触させる工程であって、順方向プライマーは配列番号１に示されかつ逆方向プライマーは配列番号２に示されるか、あるいは、順方向プライマーは配列番号７に示されかつ逆方向プライマーは配列番号８に示される工程と、（ｂ）アクネ菌の接触させた配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供して、増幅産物を得る工程と、（ｃ）変異を検出するために、増幅産物を制限酵素消化、又はＤＮＡハイブリダイゼーションとそれに続いてエンドヌクレアーゼ消化に供する工程とを含む前記方法；アクネ菌に感染した患者におけるざ瘡を治療する方法であって、（ａ）患者から試料を得る工程と、（ｂ）アクネ菌における変異の有無を検出して、前記アクネ菌が抗生物質Ａに対して耐性であるか又は感受性であるかを判定する工程と、（ｃ）アクネ菌が抗生物質Ａに対して抗生物質耐性であるならば、患者に抗生物質Ｂを投与する工程とを含む、前記方法；アクネ菌を検出し、場合により治療するためのキットであって、配列番号１及び２のプライマー配列もしくは配列番号７及び８のプライマー配列、又は両者を、場合により、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ヌクレアーゼフリー水、塩化マグネシウム、バイアル、制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、アクネ菌野生型株、Ａ２０５８Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ａ２０５９Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ａ２０５８Ｇ及びＡ２０５９Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、取扱説明書、及び抗生物質、又はそれらの任意の組み合わせとともに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本開示が容易に理解され得るために、そして容易に実施され得るために、添付の図面を参照して説明される好ましい実施形態を参照する。図面は、下記詳細な説明とあわせて、本明細書中に組み込まれ本明細書の一部を形成し、そして本開示に従って、実施形態をさらに説明し、様々な原則及び利点を説明する役割をする。
【図１】図１（ａ）は野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を示す。図１（ｂ）はＡ２０５８Ｇ変異（大腸菌ナンバリング）を保有するアクネ菌株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を示す。図１（ｃ）はＡ２０５９Ｇ変異（大腸菌ナンバリング）を保有するアクネ菌株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を示す。
【図２】図２は、本開示によるアクネ菌の抗生物質耐性の診断方法に含まれるステップのシーケンスを示すフローチャートである。
【図３】図３（ａ）及び（ｂ）は、アクネ菌（野生型）２３Ｓ  ｒＲＮＡ及びアクネ菌（変異したＡ２０５８Ｇ）２３Ｓ  ｒＲＮＡの検出における制限エンドヌクレアーゼの作用を示す。
【図４−１】図４（ａ）は、アクネ菌の異なる株由来の配列番号１及び２のプライマーを使用して２３Ｓ  ｒＲＮＡのゲノム配列の増幅プロファイルを示すアガロースゲルを示し、図中、レーン１：ＭＴＣＣ１９５１、レーン２：ＣＣＡＲＭ９０１０、レーン３：ＭＴＣＣ３２９７、レーン４：Ｖ２１Ａ６、レーン５：Ｖ２１Ａ７、レーン６：Ｖ２１Ｂ２、レーン７：マーカー（１００ｂｐラダー）。図４（ｂ）は、異なる細菌由来の配列番号１及び２のプライマーを用いる２３Ｓ  ｒＲＮＡのゲノム配列の増幅プロファイルを示すアガロースゲルを示し、図中、レーン１：表皮ブドウ球菌Ｍ３−１、レーン２：表皮ブドウ球菌Ｍ４−１、レーン３：Ｐ．アビダム  Ｓ１５Ａ−１、レーン４：Ｐ．アビダム  Ｓ３−１、レーン５：アクネ菌ＣＣＡＲＭ  ９０１０、レーン６：アクネ菌ＭＴＣＣ１９５１、レーン７：水、レーン８：マーカー（１００ｂｐラダー）。
【図４−２】図４（ｃ）は、混合培養による配列番号１及び２のプライマーを用いた２３Ｓ  ｒＲＮＡのゲノム配列の増幅プロファイルを示すアガロースゲルを示し、図中、レーン１：マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２：混合培養１（アクネ菌あり）、レーン３：混合培養２（アクネ菌なし）、レーン４：水。
【図５−１】図５（ａ）は、未知試料中のアクネ菌（野生型）  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ、アクネ菌（Ａ２０５８Ｇ）２３Ｓ  ｒＲＮＡ及びアクネ菌（Ａ２０５９Ｇ）２３Ｓ  ｒＲＮＡを検出するために、供給された鋳型ＤＮＡでハイブリダイズ（変性及び再アニール化）された増幅試料に対するミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼの作用を示すフローチャートである。
【図５−２】図５（ｂ）は、ミスマッチ特異的制限エンドヌクレアーゼでの消化後に得られる産物を示すアガロースゲルを示し、図中、レーン１：マーカー、レーン２：ＭＴＣＣ１９５１＋ＣＣＡＲＭ９０１０（それぞれ１０μｌ）−ヌクレアーゼＳ−３μ１、レーン３：ＭＴＣＣ１９５１＋ＣＣＡＲＭ９０１０（それぞれ１０μｌ）−ヌクレアーゼＳ−３μ１、レーン４：ＭＴＣＣ１９５１＋ＭＴＣＣ１９５１（それぞれ１０μｌ）−ヌクレアーゼ８−３μ１、レーン５：正の対照Ｃ＋Ｇ（それぞれ１０μｌ）、レーン６：負の対照Ｃ＋Ｃ（それぞれ１０μｌ）。
【図６】図６は、マウスにおいてアクネ菌皮膚感染症のベシフロキサシン局所製剤での細菌数の減少を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、試料におけるアクネ菌（Ｐ．ａｃｎｅｓ）を検出するための方法に関し、前記方法は、試料を配列番号１に示す順方向プライマー及び配列番号２に示す逆方向プライマー、あるいは、配列番号７に示す順方向プライマー及び配列番号８に示す逆方向プライマーと接触させ、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供して増幅産物を得ることを含み、ここで、増幅産物を得ることにより、試料中のアクネ菌の存在が確認される。
【００１２】
本開示の１つの実施形態において、プライマーは、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に示すアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを特異的に増幅する。
【００１３】
本開示の別の実施形態において、配列番号４は、野生型配列番号３に関して位置２０５８（大腸菌ナンバリング）で変異を有し、その変異はＡ２０５８Ｇであり；配列番号５は、野生型配列番号３に関して位置２０５９（大腸菌ナンバリング）で変異を有し、その変異はＡ２０５９Ｇであり；そして配列番号６は野生型配列番号３に関して位置２０５８及び２０５９（大腸菌ナンバリング）で変異を有し、その変異はＡ２０５８Ｇ及びＡ２０５９Ｇである。
【００１４】
本開示のさらに別の実施形態において、試料は、水、食物、環境試料及び生体試料を含む群から選択される。
【００１５】
本開示はまた、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列における変異を検出する方法にも関し、前記方法は：
（ａ）アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを、アクネ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列に対して特異的なプライマーと接触させる工程であって、ここで、順方向プライマーが配列番号１に示されかつ逆方向プライマーが配列番号２に示されている、あるいは、順方向プライマーが配列番号７に示されかつ逆方向プライマーが配列番号８に示される工程と、
（ｂ）アクネ菌の接触させた配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供して増幅産物を得る工程と、
（ｃ）変異を検出するために、増幅産物を制限酵素消化、又はＤＮＡハイブリダイゼーションとそれに続くエンドヌクレアーゼ消化に供する工程と
を含む。
【００１６】
本開示の１つの実施形態において、ＰＣＲ増幅は、ｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、緩衝液、ヌクレアーゼフリー水及びＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される増幅試薬の存在下で実施される。
【００１７】
本開示の別の実施形態において、制限酵素消化による変異の検出は：
（ａ）増幅産物を、検出対象の変異に対する親和性を有する制限酵素と接触させて、変異点での増幅産物の切断を可能にする工程と、
（ｂ）増幅産物を制限酵素消化に供した後の切断された増幅産物の存在を判定することによって変異を検出する工程と
を含む。
【００１８】
本開示のさらに別の実施形態において、制限酵素はＢｐｕＪＩである。
【００１９】
本開示のさらに別の実施形態において、ＤＮＡハイブリダイゼーションとそれに続くエンドヌクレアーゼ消化による変異の検出は：
（ａ）増幅産物の１つを、野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡもしくは検出対象の特異的変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡと接触させるか、又は増幅産物を個々に両者と接触させ、そしてハイブリダイゼーションに供して二本鎖を得る工程と、
（ｂ）二本鎖をＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触させる工程と、
（ｃ）二本鎖をエンドヌクレアーゼ消化に供した後に変異点で切断された二本鎖の有無を判定することによって変異を検出する工程と
を含む。
【００２０】
本開示のさらに別の実施形態において、増幅産物が変異を有する場合、野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、ＤＮＡエンドヌクレアーゼとの接触後に切断された二本鎖が得られる；増幅産物が変異を有する場合、特異的変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、ＤＮＡエンドヌクレアーゼとの接触後に切断されていない二本鎖が得られる；又は増幅産物が変異を有さない場合、野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、ＤＮＡエンドヌクレアーゼとの接触後に切断されていない二本鎖が得られる；又は増幅産物が変異を有さないかもしくはそれとハイブリダイズされる配列中に存在する変異以外の変異を有する場合、特異的変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、ＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触した後に切断された二本鎖が得られる；接触させた増幅産物を約９０℃〜約９５℃の範囲の温度で約５分〜約１０分の範囲の時間融解させることによってＤＮＡハイブリダイゼーションを実施して融解した鎖を得、続いて約２０℃〜約２７℃の範囲の温度に冷却することによって、融解した鎖を再アニーリングして二本鎖を得；そしてＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＣＥＬＩＩ、ＣＥＬＩ及びＴ７エンドヌクレアーゼを含む群から選択されるミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼである。
【００２１】
本開示のさらに別の実施形態において、増幅産物、切断された増幅産物又は切断された二本鎖の決定は、アガロースゲル電気泳動を使用して実施する。
【００２２】
本開示のさらに別の実施形態において、アクネ菌は、水、食物、環境試料及び生体試料を含む群から選択される試料中に存在する。
【００２３】
本開示のさらに別の実施形態において、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡにおける変異は、Ａ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリング）、Ａ２０５９Ｇ（大腸菌ナンバリング）又はそれらの組み合わせから選択される。
【００２４】
本開示のさらに別の実施形態において、変異はＡ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリング）である。
【００２５】
本開示のさらに別の実施形態において、変異がＡ２０５８Ｇ又はＡ２０５８ＧとＡ２０５９Ｇとの組み合わせである場合、アクネ菌は抗生物質耐性となる。
【００２６】
本開示はまたアクネ菌に感染した患者におけるざ瘡を治療する方法にも関し、前記方法は：
（ａ）患者から試料を得る工程と、
（ｂ）前記方法によってアクネ菌における変異の有無を検出して、前記アクネ菌が抗生物質Ａに対して耐性であるか又は感受性であるかを判定する工程と、
（ｃ）アクネ菌が抗生物質Ａに対して耐性である場合、患者に抗生物質Ｂを投与する工程と
を含む。
【００２７】
本開示の１つの実施形態において、アクネ菌は検出のために試料から選択されない。
【００２８】
本開示の別の実施形態において、試料は、体液、組織、皮膚、ざ瘡病変及び骨、又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生体試料である、ここで生体試料は好ましくはざ瘡病変であり、体液は血液である。
【００２９】
本開示のさらに別の実施形態において、生体試料は、ざ瘡病変である。
【００３０】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質は、リンコサミドもしくはマクロライド又はそれらの組み合わせである。
【００３１】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質はクリンダマイシン、エリスロマイシン又はそれらの組み合わせである。
【００３２】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質Ａは、リンコサミドもしくはマクロライド又はそれらの組み合わせであり；抗生物質Ｂは、ベシフロキサシン、ナジフロキサシン及びレボフロキサシンを含む群から選択されるフルオロキノロン抗生物質である。
【００３３】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質Ａはクリンダマイシン、エリスロマイシン又はそれらの組み合わせである。
【００３４】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質Ｂは、約０．１％ｗ／ｗ〜約１０％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在し；抗生物質Ｂは、局所製剤、固体経口製剤、液体経口製剤、吸入製剤、鼻腔投与製剤、眼科用製剤、非経口製剤、植物性医薬品（ｐｈｙｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ）、栄養補助食品及び食糧又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される製剤の形態である。
【００３５】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質Ｂは、約０．２％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在する。さらなる実施形態において、抗生物質Ｂは約１％ｗ／ｗ〜約２％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在する。
【００３６】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質Ｂは局所製剤の形態である。
【００３７】
本開示のさらに別の実施形態において、局所製剤は、クリーム、ゲル、スプレー、フォーム、ローション又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；固体経口製剤は、錠剤、カプセル、トローチ、ロゼンジ、分散性粉末、分散性顆粒又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；液体経口製剤は、水性もしくは油性懸濁液、エマルジョン、滴剤、ハードもしくはソフトゲルカプセル中エマルジョン、シロップ、エリキシル又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；非経口製剤は、静脈内注射、筋肉内注射、筋肉内デポー、皮下注射、経皮注射又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；吸入製剤は、吸入具、乾燥粉末吸入具、ネブライザー又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；鼻腔投与製剤は、点鼻剤、鼻腔用スプレー又はそれらの組み合わせを含む群から選択され；そして眼科用製剤は点眼薬を含む。
【００３８】
本開示のさらに別の実施形態において、製剤は、テトラサイクリン、アダパレン、過酸化ベンゾイル、又はそれらの組み合わせをさらに含む。
【００３９】
本開示はさらに、アクネ菌を検出し、場合により治療するためのキットに関し、前記キットは、配列番号１及び２のプライマー配列もしくは配列番号７及び８のプライマー配列、又は両者を、場合により、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ヌクレアーゼフリー水、塩化マグネシウム、バイアル、制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、アクネ菌野生型株、Ａ２０５８Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ａ２０５９Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ａ２０５８Ｇ及びＡ２０５９Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、取扱説明書、及び抗生物質、又はそれらの任意の組み合わせとともに含む。
【００４０】
本開示の１つの実施形態において、抗生物質はフルオロキノロンであり、場合によりリンコサミド、マクロライド、レチノイド、テトラサイクリン及び過酸化ベンゾイル、又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される抗生物質を伴う。
【００４１】
本開示の別の実施形態において、フルオロキノロン抗生物質は、ベシフロキサシン、ナジフロキサシン及びレボフロキサシン、又はそれらの組み合わせを含む群から選択され、リンコサミドはクリンダマイシンであり、マクロライドはエリスロマイシンであり、レチノイドはアダパレンである。
【００４２】
本開示のさらに別の実施形態において、キットをアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡにおける変異を検出するために使用し、変異は、野生型アクネ菌に関してＡ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリング）、Ａ２０５９Ｇ（大腸菌ナンバリング）又はそれらの組み合わせから選択され、制限エンドヌクレアーゼはＢｐｕＪＩであり、そしてＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣＥＬＩＩ、ＣＥＬＩ及びＴ７エンドヌクレアーゼを含む群から選択されるミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。
【００４３】
本開示のさらに別の実施形態において、キットは、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡにおける変異を検出するために使用され、変異は野生型アクネ菌に関してＡ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリング）である。
【００４４】
本開示のさらに別の実施形態において、検出対象の変異がＡ２０５８Ｇ又はＡ２０５８ＧとＡ２０５９Ｇとの組み合わせである場合、検出対象のアクネ菌は、リンコサミド及びマクロライドから選択される抗生物質又はそれらの組み合わせに対して耐性となる。
【００４５】
本開示のさらに別の実施形態において、検出対象の変異がＡ２０５８Ｇ又はＡ２０５８ＧとＡ２０５９Ｇとの組み合わせである場合、検出対象のアクネ菌は、クリンダマイシン、エリスロマイシン又はそれらの組み合わせから選択される抗生物質に対して耐性となる。
【００４６】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質は、約０．１％ｗ／ｗ〜約１０％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在し；抗生物質は、局所製剤、固体経口製剤、液体経口製剤、吸入製剤、鼻腔投与製剤、眼科用製剤、非経口製剤、植物性医薬品、栄養補助食品及び食糧又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される製剤の形態である。
【００４７】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質Ｂは約０．２％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在する。さらなる実施形態において、抗生物質Ｂは約１％ｗ／ｗ〜約２％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在する。
【００４８】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質Ｂは局所製剤の形態である。
【００４９】
本開示のさらに別の実施形態において、局所製剤は、クリーム、ゲル、スプレー、フォーム、ローション又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され、固体経口製剤は、錠剤、カプセル、トローチ、ロゼンジ、分散性粉末、分散性顆粒又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され、液体経口製剤は、水性もしくは油性懸濁液、エマルジョン、滴剤、ハードもしくはソフトゲルカプセル中エマルジョン、シロップ、エリキシル又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され、非経口製剤は、静脈内注射、筋肉内注射、筋肉内デポー、皮下注射、経皮注射又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され、吸入製剤は、吸入具、乾燥粉末吸入具、ネブライザー又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され、鼻腔投与製剤は、点鼻剤、鼻腔用スプレー又はそれらの組み合わせを含む群から選択され、そして眼科用製剤は点眼薬を含む。
【００５０】
プレシジョンメディシンは将来的なものであり、ざ瘡の治療はその方向で進化する必要がある。抗生物質の使用を合理化するための重要なステップは、迅速に軽減するために最も適切な抗生物質で患者が治療されることを確実にすること、ならびに耐性の出現の増大をチェックすることである。耐性問題を抑制するための既存の処方薬は、尋常性ざ瘡の影響を回避するには不適切であり、またざ瘡治療において耐性を示す細菌株の数が増大しているために不適切である。
【００５１】
さらに、従来技術の欠点を克服するために、保存された２３Ｓ  ｒＲＮＡドメイン内のアクネ菌特異的領域の迅速な検出を可能にする発明を開発すること、試料中の他の細菌叢に存在するアクネ菌の容易かつ迅速な同定を可能にすること、そしてアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡにおける抗生物質耐性変異も確認することが必要とされる。
【００５２】
これに関連して、本開示は試料中のアクネ菌を検出する方法であって、試料を配列番号１及び配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対と接触させ、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅にかける方法に関する。ここで、配列番号１は順方向プライマーであり、一方、配列番号２は逆方向プライマーである。
順方向プライマー  ５’−ＣＴＧＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＧＣＧＴＡＧＣ−３’  配列番号１
逆方向プライマー  ５’−ＡＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡＡＡＣＣＡＴ−３’  配列番号２
【００５３】
本開示はまた、試料中のアクネ菌を検出する方法に関し、この方法では、試料を、前記で開示し配列番号７及び配列番号８に記載のプライマー配列に対して相補性であるオリゴヌクレオチドプライマー対と接触させ、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に供する。ここで、配列番号７は順方向プライマーであり、その一方で、配列番号８は逆方向プライマーである。
順方向プライマー  ５’−ＧＡＣＡＣＴＣＡＣＡＣＴＡＣＧＣＡＴＣＧ−３’  配列番号７
逆方向プライマー  ５’−ＴＧＴ  ＡＧＣＴＣＣ  ＡＣＧＧＴＴＴＧＧＴ  Ａ−３’  配列番号８
【００５４】
本発明者らは、変異した場合に、アクネ菌に非常に特異的であるアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ内にクリンダマイシン耐性を付与するヌクレオチドを含む特定の領域を認識し、したがって、他の微生物の２３Ｓ  ｒＲＮＡドメインではなく、このアクネ菌特異的領域のみを増幅するように、この特定の領域に対するプライマーを設計した。したがって、試料を、本開示の配列番号１及び２のプライマー又は配列番号７及び８のプライマーを用いたＰＣＲ増幅に供すると、増幅産物が得られる場合、試料中のアクネ菌の存在が確認され、したがって検出が可能になる。
【００５５】
さらに、本開示のプライマーは非常に特異的であるので、検出対象の試料を、アクネ菌を培養し単離する必要なしにアクネ菌を検出するためにプライマーと直接接触させる。特に、試料を、ｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、緩衝液、ヌクレアーゼフリー水及びＤＮＡポリメラーゼなどの増幅試薬を配列番号１及び２のプライマー又は配列番号７及び８のプライマーとともに含むＰＣＲ管中に接種し、ＰＣＲに供する。最初の変性ステップの間、試料中のアクネ菌細胞を溶解させ、ゲノムＤＮＡを次に増幅させる。
【００５６】
１つの実施形態において、ＰＣＲ増幅は、約９０℃〜約９７℃の範囲の温度で約５〜１０分間、好ましくは約９４℃の温度で約１０分間の初期変性を含む。これに続いて、約９０℃〜約９７℃の範囲の温度で約３０〜９０秒間、好ましくは約９４℃の温度で約４５秒間の３０〜４０の変性サイクルを行う。これに続いて、約４８℃〜約５２℃の範囲の温度で約０．５〜２分間、好ましくは約５０℃の温度で約１分間のアニーリングを行う。これに続いて、約６８℃〜約７２℃の温度で約０．５〜２分間、好ましくは約７２℃の温度で約１分間の伸長を行う。続いて、約６８℃〜約７２℃の範囲の温度で約５〜１０分間、好ましくは約７２℃の温度で約５分間の最終伸長を行う。
【００５７】
本開示の別の実施形態において、配列番号１及び２のプライマーによって認識される２３Ｓ  ｒＲＮＡのゲノム配列の領域は、位置２０５８及び２０５９（大腸菌ナンバリングによる）も含む。したがって、前記プライマーを使用して得られる増幅産物は、前述の位置も含み、前記位置で任意の変異、例えばＡ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリングによる）、Ａ２０５９Ｇ（大腸菌ナンバリングによる）も増幅産物中に存在し得る。
【００５８】
別の実施形態において、配列番号１及び２のプライマー及び配列番号７及び８のプライマーは、アクネ菌（野生型）の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ−配列番号３（図１（ａ））を増幅し、また変異（複数可）を有するアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ（配列番号４、５又は６）も増幅する（図１（ｂ）〜１（ｄ））。したがって、アクネ菌の存在を特定するため、そして変異の領域を特定／増幅するためにオリゴマーのセットを分離する必要はない。
【００５９】
野生型アクネ菌株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号３）、Ａ２０５８Ｇ変異を有するアクネ菌株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号４）、Ａ２０５９Ｇ変異を有するアクネ菌株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号５）ならびにＡ２０５８Ｇ及びＡ２０５９Ｇ変異を有するアクネ菌株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号６）を図１（ａ）、１（ｂ）、１（ｃ）及び１（ｄ）にそれぞれ示す。提示した配列からわかるように、図１（ｂ）の変異株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列は位置２０５８で、野生型株で見られるようなヌクレオチド「Ａ」の代わりにヌクレオチド「Ｇ」を含み、図１（ｃ）の変異株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、位置２０５９で、野生型株で見られるようなヌクレオチド「Ａ」の代わりにヌクレオチド「Ｇ」を含み、図１（ｄ）の変異株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、位置２０５８及び２０５９で、野生型株で見られるようなヌクレオチド「Ａ」の代わりにヌクレオチド「Ｇ」を含む。図１はまた、本開示の順方向プライマー及び逆方向プライマーの配列（配列番号１及び２）も示す。さらに、本開示のプライマーが合成される２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡの特異的領域を図１に示す。
【００６０】
本開示はまた、単一の点突然変異、つまり、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡサブユニットにおけるＡ２０５８Ｇの存在を検出する方法にも関する。方法は、アクネ菌に対して特異的であり、クリンダマイシン耐性を付与する領域を含む、２３Ｓ  ｒＲＮＡゲノム配列上の領域の増幅と、それに続くに前記変異の部位におけるミスマッチでのエンドヌクレアーゼの選択的作用による変異の検出に基づく。
【００６１】
１つの実施形態において、方法は、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅に供し、その後、単一の点突然変異の存在を確認する２ステップアッセイを含む。単一の点突然変異の存在は、制限エンドヌクレアーゼ、又はＤＮＡハイブリダイゼーションとそれに続いてエンドヌクレアーゼ活性を用いて決定される。特定のエンドヌクレアーゼでの切断後のアガロースゲルパターンによって得られるバンドのシグネチャーは、Ａ２０５８Ｇクリンダマイシン耐性アクネ菌を選択的にスクリーニングする。
【００６２】
１つの実施形態において、本開示の方法は、増幅及び検出ステップに先立って試料からアクネ菌を培養し単離する必要がないので、迅速かつ費用効果的である。これは、先に開示したように、本開示の方法の第１ステップで用いられるプライマー（配列番号１及び２／配列番号７及び８）が、特定の種に特有（任意の他の細菌又はアクネ菌以外の任意の他のプロピオニバクテリア種において存在しない）であり、また重要な２０５８ヌクレオチドも含み、クリンダマイシン−マクロライド耐性を付与する、アクネ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡゲノム配列の特定の領域を認識し増幅するように設計されているからである。したがって、本開示のプライマーは、アクネ菌特異的２３Ｓ  ｒＲＮＡゲノム配列を、試料から、例えば対象のざ瘡病変から集めた試料から直接、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて選択的に増幅する。これはまた、試料中に存在する他の細菌種の２３Ｓ  ｒＲＮＡゲノム配列の増幅によって擬陽性の結果が生じないことを保証する。
【００６３】
１つの実施形態において、試料は、水、食物、環境試料及び生体試料を含む群から選択することができる。別の実施形態において、試料は、組織、皮膚、ざ瘡病変、骨及び血液を含むがこれに限定されない体液を含む群から選択される生体試料である。
【００６４】
本開示の１つの実施形態において、ＰＣＲ増幅が起こるためには、アクネ菌又はアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む試料を配列番号１及び２の順方向プライマー及び逆方向プライマー又は配列番号７及び８の順方向プライマー及び逆方向プライマーと接触させ、そして増幅試薬の存在下、同じ条件下で増幅させて、６４６ｂｐの増幅産物を得る。さらなる実施形態において、増幅試薬は、塩化マグネシウム、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレアーゼフリー水及び緩衝液を含む群から選択される。
【００６５】
１つの実施形態において、得られる増幅産物を分析して、２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列の位置２０５８での単一の点突然変異、すなわちＡ２０５８Ｇの存在を検出する。そのような検出は、制限消化によるか、又はＤＮＡベースのハイブリダイゼーションとそれに続くエンドヌクレアーゼ消化によって行われる。
【００６６】
１つの実施形態において、Ａ２０５８Ｇ点突然変異を検出するために、６４６ｂｐの増幅産物を制限エンドヌクレアーゼＢｐｕＪＩで消化する。変異が存在する場合、ＢｐｕＪＩは配列を切断して１９８ｂｐと４４７ｂｐに２分割する。しかしながら、変異がない場合、ＢｐｕＪＩは配列を認識せず、したがって、増幅産物の切断は起こらない。切断／非切断産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて可視化し、この場合、２つのバンドが存在することは変異を確認するものであり、１つのバンドが存在することは、変異が存在しないことを確認するものである。
【００６７】
別の実施形態において、Ａ２０５８Ｇ点突然変異を検出するために、６４６ｂｐの増幅産物を野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物と接触させ、核酸を約９０℃〜約９５℃の範囲の温度で約５〜１０分の範囲の時間、好ましくは約９５℃の温度で約１０分間融解／変性することによりハイブリダイゼーションに供する。これに続いて、温度を段落ち方式で約２０℃〜２７℃まで、好ましくは約２５℃の温度まで徐々に低下させることにより鎖を再アニーリングする。再アニーリングして、ホモ二本鎖が得られる場合、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡゲノム配列は変異を含まない。他方、ヘテロ二本鎖が形成される場合、アクネ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡゲノム配列はＡ２０５８Ｇ変異を含む。さらに、ホモ二本鎖又はヘテロ二本鎖の存在は、ミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼによって検出される。エンドヌクレアーゼで消化した後、アガロースゲル電気泳動を用いた産物の可視化により、さらなる低分子量バンド（複数可）の存在が示され、それはヘテロ二本鎖ＤＮＡ（エンドヌクレアーゼによって切れ目を入れる）の存在を意味し、それによってＡ２０５８Ｇ変異の存在が確認される。他方、１つのバンドの存在は、ホモ二本鎖ＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼ作用がないことによるホモ二本鎖ＤＮＡの存在を意味し、それによってＡ２０５８Ｇ変異が存在しないことが確認される。
【００６８】
別の実施形態において、点突然変異は２つのＤＮＡハイブリダイゼーション、すなわち、一方は６４６ｂｐ増幅産物と野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡのＰＣＲ産物、他方は６４６ｂｐ増幅産物とＡ２０５８Ｇを含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡのＰＣＲ産物のＤＮＡハイブリダイゼーションを平行して実施することによって検出される。第一のケースでヘテロ二本鎖が形成され、第二のケースでホモ二本鎖が形成される場合、検出対象のアクネ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡゲノム配列はＡ２０５８Ｇ変異を含む。ヘテロ二本鎖及びホモ二本鎖の存在は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ処理後に、第一のケースではさらなる低分子量バンド（複数可）によって確認され、第二の場合では１つのバンドの存在によってアガロースゲル電気泳動後に確認される。別の代替的実施形態において、Ａ２０５８Ｇ変異の検出は、６４６ｂｐ増幅産物のＡ２０５８Ｇを含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物とのハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼ処理によって実施される。アガロースゲル電気泳動にかけて１つのバンドがあると、Ａ２０５８Ｇ変異の存在が確認されるが、アガロースゲル電気泳動にかけて低分子量バンドがあると、Ａ２０５８Ｇ変異が存在しないことが確認される。
【００６９】
１つの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣＥＬＩＩ、ＣＥＬＩ及びＴ７エンドヌクレアーゼを含む群から選択される。
【００７０】
本開示はさらに、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡにおける任意の点突然変異又は点突然変異Ａ２０５８Ｇとアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡにおける他の変異との組み合わせを検出するための方法に関する。方法は、アクネ菌を含む試料を接触させるか、又はアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、配列番号１及び２の順方向プライマー及び逆方向プライマー又は配列番号７及び８の順方向プライマー及び逆方向プライマーと接触させ、そして詳細に上述した増幅に供することを含む。増幅後、検出対象の特異的変異（複数可）に基づいて、増幅産物を異なる制限エンドヌクレアーゼ（複数可）に供し、これで変異（複数可）の点において増幅産物を切断する。
【００７１】
１つの実施形態において、点突然変異（複数可）は、６４６ｂｐ増幅産物の野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡのＰＣＲ産物でのＤＮＡハイブリダイゼーションと、上記開示のミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼを使用することによる変異（複数可）の存在／不在を検出することによっても、検出することができる。例えば、増幅産物上に複数の変異が存在する場合、ヘテロ二本鎖中の複数の場所でミスマッチが起こり、ヘテロ二本鎖はエンドヌクレアーゼによって切断され、その結果、アガロースゲル電気泳動を用いて可視化すると複数のバンドが生じる。
【００７２】
別の実施形態において、点突然変異（複数可）は、６４６ｂｐ増幅産物の、野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物でのＤＮＡハイブリダイゼーションと、平行して６４６ｂｐ増幅産物の、Ａ２０５８Ｇを含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物でのＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出される。両方の場合でのヘテロ二本鎖の形成は、２０５８残基以外の部位での変異の存在を確認するものであり、これは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ処理後にアガロースゲル電気泳動にかけるとさらなる低分子量バンド（複数可）が存在することによって確認される。別の代替的実施形態において、６４６ｂｐ増幅産物の、Ａ２０５８Ｇを含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物でのハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼ処理によって変異（複数可）の検出を実施する。アガロースゲル電気泳動にかけるとさらなる低分子量バンド（複数可）が存在することで、２０５８残基以外の部位での変異の存在が確認される。
【００７３】
別の実施形態において、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡの２０５９残基における点突然変異は、６４６ｂｐ増幅産物の、野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物でのハイブリダイゼーションと、平行して６４６ｂｐ増幅産物の、Ａ２０５９Ｇを含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物でのＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出される。ＤＮＡエンドヌクレアーゼ処理後にアガロースゲル電気泳動にかけて、第一のケースではさらなる低分子量バンド（複数可）が存在し、第二のケースでは１つのバンドが存在することで、検出対象のアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡのゲノム配列がＡ２０５９Ｇ変異を含むことが確認される。別の実施形態において、Ａ２０５９Ｇ変異の検出は、６４６ｂｐ増幅産物の、Ａ２０５９Ｇを含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物でのハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼ処理によって実施される。アガロースゲル電気泳動にかけると１つのバンドが存在することによって、変異が存在することが確認されるのに対し、さらなる低分子量バンド（複数可）が存在することによってＡ２０５９Ｇ変異は存在しないことが確認される。
【００７４】
さらなる実施形態において、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡの２０５８及び２０５９残基における変異の組み合わせは、６４６ｂｐ増幅産物の、野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物でのハイブリダイゼーションと、平行して６４６ｂｐ増幅産物の、Ａ２０５８Ｇ及びＡ２０５９Ｇを含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物でのＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出される。ＤＮＡエンドヌクレアーゼ処理後にアガロースゲル電気泳動にかけて、第一のケースではさらなる低分子量バンド（複数可）が存在し、第二のケースでは１つのバンドが存在することで、検出対象のアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡのゲノム配列がＡ２０５８Ｇ及びＡ２０５９Ｇ変異を含むことが確認される。あるいは、２０５８及び２０５９残基における変異の組み合わせは、６４６ｂｐ増幅産物とＡ２０５８Ｇ及びＡ２０５９Ｇを含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅産物でのハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼ処理によって検出される。アガロースゲル電気泳動にかけて単一のバンドが存在することによって変異が存在することが確認されるのに対し、さらなる低分子量バンド（複数可）が存在することによって変異は存在しないことが確認される。
【００７５】
詳細に上述したアクネ菌のゲノム配列における変異（複数可）を検出するための様々な可能なハイブリダイゼーションとそれに続くエンドヌクレアーゼ消化を図５（ａ）に示す。
【００７６】
本開示はさらに、試料中に存在するアクネ菌における抗生物質耐性の同定にも関する。抗生物質耐性の同定は、本開示の方法によってアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列における点突然変異を検出することによって実施される。特異的点突然変異の存在は、アクネ菌において抗生物質耐性を付与し、したがって同定を可能にする。
下記表１は、様々な抗生物質に対するアクネ菌単離株の抗菌薬感受性を示す：
【００７７】
【表１】
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【００７８】
表１からわかるように、Ａ２０５９Ｇ変異を有するアクネ菌株（網掛け部分）は、Ａ２０５８Ｇ変異を有する株と比べるとクリンダマイシンに対する耐性が低い。
【００７９】
１つの非限定的実施形態において、アクネ菌の抗生物質耐性の同定は、図２で示すようにして実施し、ざ瘡含有物質を、抽出器を用いて絞り出し、緩衝液を入れた管に接種する。アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを次に、配列番号１及び２のプライマー又は配列番号７及び８のプライマーを使用するＰＣＲ増幅に供し、その後、詳細に上述した方法によって制限消化又はＤＮＡハイブリダイゼーションを実施することにより、点突然変異（複数可）を検出する。試料からのアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡのゲノム配列がＡ２０５８Ｇ変異又はＡ２０５８Ｇ変異と他の変異との組み合わせを含むことが判明したならば、アクネ菌はリンコサミド耐性、特にクリンダマイシン耐性と同定され、試料の入手元である患者は、リンコサミド耐性、特に、クリンダマイシン耐性アクネ菌に感染していると診断される。さらに、Ａ２０５８での変異は、エリスロマイシンとの水素結合のパターンを破壊し、したがって結合を損ない、細菌を耐性にする。したがって、このアプローチはまた、アクネ菌におけるマクロライド（エリスロマイシン）耐性も検出する。
【００８０】
１つの実施形態において、試料由来のアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡがＡ２０５８Ｇ変異又は他の変異を有さない場合、アクネ菌はリンコサミド及びマクロライド感受性、特にクリンダマイシン及びエリスロマイシン感受性と同定され、試料の入手元である患者は、リンコサミド及びマクロライド感受性、特にクリンダマイシン及びエリスロマイシン感受性アクネ菌に感染していると診断される。
【００８１】
別の実施形態において、試料からのアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡはＡ２０５９Ｇ変異のみを保有する場合、アクネ菌はマクロライド耐性と同定されるが、Ａ２０５８Ｇ変異を有する株と比べて、リンコサミドに対する耐性が低く、特にクリンダマイシンに対する耐性が低い。
【００８２】
別の実施形態において、試料は、アクネ菌を含む任意の試料であり得、水、食物、環境及び生体試料を含む群から選択され得る。別の実施形態において、試料は、組織、皮膚、ざ瘡病変、骨、及び血液を含むがこれに限定されない体液を含む群から選択される生体試料である。
【００８３】
本開示はさらに、アクネ菌に感染した患者の抗生物質投薬療法を決定する方法に関する。方法は、前記開示の方法により抗生物質Ａに対する患者試料からのアクネ菌の耐性を同定／診断することを含み、アクネ菌が抗生物質Ａに対して耐性である場合は患者に抗生物質Ｂを投与することを含む。
【００８４】
１つの実施形態において、抗生物質Ｂは、耐性アクネ菌株を治療することができる任意の抗生物質である。
【００８５】
１つの非限定的実施形態において、患者の試料からのアクネ菌が２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列中にＡ２０５８Ｇ変異を含むことが判明した場合、患者はリンコサミド及び／又はマクロライド耐性アクネ菌に感染していると診断され、したがって、患者にリンコサミド及びマクロライド以外の抗生物質をレチノイド及び／又は過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）とともに、又はレチノイド及び／又は過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）なしで投与する。
【００８６】
特定の非限定的実施形態において、患者には、フルオロキノリンベースの抗生物質を、場合によりアダパレン、ＢＰＯ、テトラサイクリンクラスの抗生物質又はそれらの組み合わせとともに投与する。
【００８７】
別の非限定的実施形態において、フルオロキノロンベースの抗生物質は、ナジフロキサシン、ベシフロキサシン、及びレボフロキサシンを含む群から選択される。
【００８８】
本開示の別の実施形態において、患者の試料からのアクネ菌が変異を含まないことが判明している場合、患者はリンコサミド及びマクロライド感受性アクネ菌に感染していると診断され、したがって、その患者には、リンコサミド又はマクロライド抗生物質を、場合によりＢＰＯ、レチノイド、例えばアダパレン、又はそれらの組み合わせとともに投与する。
【００８９】
本開示の別の実施形態において、患者の試料からのアクネ菌が２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列中にＡ２０５９Ｇ変異を含むことが判明している場合、患者に、リンコサミド又はフルオロキノロンから選択される抗生物質を、場合によりＢＰＯ、レチノイド、例えばアダパレン、又はそれらの組み合わせとともに投与する。
【００９０】
１つの非限定的実施形態において、フルオロキノロンベースの抗生物質はナジフロキサシン、ベシフロキサシン、及びレボフロキサシンを含む群から選択され、リンコサミド抗生物質はクリンダマイシンである。
【００９１】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質を、局所製剤、固体経口製剤、液体経口製剤、吸入製剤、鼻腔投与製剤、眼科用製剤、非経口製剤、植物性医薬品、栄養補助食品及び食糧又はそれらの任意の組み合わせとして投与する。好ましい実施形態では、抗生物質を局所製剤として投与する。
【００９２】
本開示のさらに別の実施形態において、局所製剤は、クリーム、ゲル、スプレー、フォーム、ローション又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；固体経口製剤は、錠剤、カプセル、トローチ、ロゼンジ、分散性粉末、分散性顆粒又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；液体経口製剤は、水性もしくは油性懸濁液、エマルジョン、滴剤、ハードもしくはソフトゲルカプセル中エマルジョン、シロップ、エリキシル又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；非経口製剤は、静脈内注射、筋肉内注射、筋肉内デポー、皮下注射、経皮注射又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；吸入製剤は、吸入具、乾燥粉末吸入具、ネブライザー又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；鼻腔投与製剤は、点鼻剤、鼻腔用スプレー又はそれらの組み合わせを含む群から選択され；そして眼科用製剤は点眼薬を含む。
【００９３】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質は、製剤を調製するための薬剤的に許容される賦形剤と組み合わせる。薬剤的に許容される賦形剤は、ガム、造粒剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、甘味剤、添加剤、溶媒、流動促進剤、抗粘着剤（ａｎｔｉ−ａｄｈｅｒｅｎｔ）、帯電防止剤、抗酸化剤、界面活性剤、粘度促進剤、植物セルロース系材料、着色剤、香味剤、コーティング剤、可塑剤、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤及び球形化剤（ｓｐｈｅｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。
【００９４】
１つの実施形態において、製剤中の抗生物質は、約０．１％ｗ／ｗ〜約１０％ｗ／ｗ、好ましくは約０．２％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは約１％ｗ／ｗ〜約２％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在する。
【００９５】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質の局所製剤を少なくとも１日１回であるが、１日２回以下投与する。
【００９６】
本開示のさらに別の実施形態において、抗生物質の経口製剤は少なくとも１日１回で最高１日４回投与する。
【００９７】
本開示はさらに、アクネ菌を検出するため、又はアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列における変異を検出するための、配列番号１及び２のプライマー配列もしくは配列番号７及び８のプライマー配列、又は両者を、場合によりｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ヌクレアーゼフリー水、塩化マグネシウム、バイアル、制限エンドヌクレアーゼＢｐｕＪＩ、ＣＥＬＩＩ、ＣＥＬＩ及びＴ７エンドヌクレアーゼを含む群から選択されるヌクレオチドミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、アクネ菌野生型株、例えばアクネ菌ＭＴＣＣ  １９５１及びアクネ菌ＭＴＣＣ  ３２９７、Ａ２０５８Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ａ２０５９Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ａ２０５８Ｇ及びＡ２０５９Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、取扱説明書、又はそれらの任意の組み合わせとともに含むキットに関する。
【００９８】
本開示はさらに、アクネ菌における抗生物質耐性を検出し、アクネ菌によって引き起こされる感染症を治療するためのキットに関し、前記キットにおいて記載した成分とは別に、キットは抗生物質も含む。
【００９９】
１つの実施形態において、キットは、フルオロキノロンベースの抗生物質を、場合によりＢＰＯ、レチノイド、例えばアダパレン、テトラサイクリンクラスの抗生物質又はそれらの組み合わせとともに含む。キットはまた、リンコサミド及びマクロライドクラスの抗生物質、例えばクリンダマイシン及びエリスロマイシンを、場合によりＢＰＯ、レチノイド、例えばアダパレン、テトラサイクリンクラスの抗生物質又はそれらの組み合わせとともに含み得る。
【０１００】
別の実施形態において、フルオロキノロンベースの抗生物質は、ナジフロキサシン、ベシフロキサシン、及びレボフロキサシンを含む群から選択される。
【０１０１】
本開示の別の実施形態において、抗生物質（複数可）は、局所製剤、固体経口製剤、液体経口製剤、吸入製剤、鼻腔投与製剤、眼科用製剤、非経口製剤、植物性医薬品、栄養補助食品及び食糧又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される製剤、好ましくは局所製剤の形態である。
【０１０２】
本開示のさらに別の実施形態において、局所製剤は、クリーム、ゲル、スプレー、フォーム、ローション又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；固体経口製剤は、錠剤、カプセル、トローチ、ロゼンジ、分散性粉末、分散性顆粒又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；液体経口製剤は、水性もしくは油性懸濁液、エマルジョン、滴剤、ハードもしくはソフトゲルカプセル中エマルジョン、シロップ、エリキシル又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；非経口製剤は、静脈内注射、筋肉内注射、筋肉内デポー、皮下注射、経皮注射又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；吸入製剤は、吸入具、乾燥粉末吸入具、ネブライザー又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；鼻腔投与製剤は、点鼻剤、鼻腔用スプレー又はそれらの組み合わせを含む群から選択され；そして眼科用製剤は点眼薬を含む。
【０１０３】
本開示のさらに別の実施形態において、キット中の抗生物質製剤は、ガム、造粒剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、甘味剤、添加剤、溶媒、流動促進剤、抗粘着剤、帯電防止剤、抗酸化剤、界面活性剤、粘度促進剤、植物セルロース系材料、着色剤、香味剤、コーティング剤、可塑剤、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤及び球形化剤又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される薬剤的に許容される賦形剤と組み合わせた抗生物質を含む。
【０１０４】
１つの実施形態において、製剤中の抗生物質は、約０．１％ｗ／ｗ〜約１０％ｗ／ｗ、好ましくは約０．２％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは約１％ｗ／ｗ〜約２％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在する。
【０１０５】
本開示のさらなる実施形態及び特徴は、本明細書中に提示する説明に基づくと当業者には明らかであろう。本明細書中の実施形態は、その記載中に様々な特徴及びその有利な詳細を提供する。本明細書中の実施形態をいたずらに曖昧にしないように、周知の従来法及び技術の説明は省略する。さらに、本明細書中の発明は、前記実施形態を説明する実施例を提供し、本発明の実施形態を説明するために、ある特定の態様を用いている。そのような例示のために本明細書中で使用する実施例は、単に、本明細書中の実施形態を実施し得る方法の理解を容易にするため、そして当業者が本明細書中の実施形態を実施することをさらに可能にするためだけを意図する。したがって、以下の実施例は本明細書中の実施形態の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０６】
実施例１：アクネ菌に特異的な２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列の領域を増幅し、プライマーの特異性を決定するための特異的プライマーの設計
プライマー（順方向５’−ＣＴＧＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＧＣＧＴＡＧＣ−３’及び逆方向５’−ＡＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡＡＡＣＣＡＴ−３’）を、アクネ菌に特異的な２３Ｓ  ｒＲＮＡゲノム配列の領域を特異的に増幅するように設計する。このように設計されたプライマーは、以下のアクネ菌株の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅のために使用される：ＭＴＣＣ１９５１及びＭＴＣＣ３２９７（標準的な野生型株）、ＣＣＡＲＭ９０１０及びＶ２１Ｂ２（クリンダマイシン耐性株）、ならびにＶ２１Ａ６及びＶ２１Ａ７（Ａ２０５９Ｇ変異を含む）。約９４℃で約１０分の初期変性と、約９４℃の温度で約４５秒間の変性、約５０℃の温度で約１分間のアニーリング、約７２℃の温度で約１分間の伸長、及び約７２℃の温度で約５分間の最終伸長の３０サイクルを行うことで、ＰＣＲ反応をセットアップする。約５μＬの産物を１．５％アガロースゲル中電気泳動にかける。アガロースゲル電気泳動によって観察するとすべてのアクネ菌株から６４６ｂｐの増幅されたＰＣＲ産物がから得られることがわかる（図４（ａ））。
【０１０７】
アクネ菌に対するプライマーの特異性をさらに確認するために、前述のプライマーを使用して、同じＰＣＲ反応条件を用いて表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（Ｍ３−１及びＭ４−１）ならびにＰ．アビダム（Ｐ．ａｖｉｄｕｍ）（Ｓ１５−Ａ１及びＳ３−１）の２３Ｓ領域を増幅し、そして１０μＬの産物を１．５％アガロースゲル中電気泳動にかける。図４（ｂ）で示すように、表皮ブドウ球菌及びＰ．アビダムの２３Ｓ領域の産物は得られない（レーン１〜４はバンドを示さない）が、その一方で、ＰＣＲ産物がアクネ菌野生型及び変異２３Ｓ  ｒＲＮＡについて得られる（レーン５及び６はバンドを示す）。これは、本開示のプライマー配列がアクネ菌種に対して非常に特異的であることを意味する。
【０１０８】
プライマーの特異性を試験するさらなる確認実験として、２つの混合培養を得、両試料を本開示のプライマーと別に接触させ、同じ反応条件下でＰＣＲにかける。各試料からの産物約５μ１を１．５％アガロースゲル中電気泳動にかける。図４（ｃ）からわかるように、６４６ｂｐのバンドが１つだけ（レーン２）得られ、一方、レーン３はバンドを示さない。さらに、各試料に存在する微生物の同定により、混合培養物１（レーン２）は表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、Ｐ．アビダム及びアクネ菌を含み、その一方で、混合培養物２（レーン３）は表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びＰ．アビダムを含むことが示される。したがって、増幅産物はアクネ菌を含む試料に関してのみ得られるので、本開示のプライマーは選択的にアクネ菌を検出し、他の微生物を検出しないことを確認するものである。
【０１０９】
実施例２：ＢｐｕＪＩ制限エンドヌクレアーゼを使用するアクネ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列におけるＡ２０５８Ｇ変異の検出
制限酵素／制限エンドヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド配列においてＤＮＡを認識し切断することができる。アクネ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列における２０５８変異を検出するために、好適な制限酵素を、ＮＥＢカッターウェブサイトを使用してスクリーニングする。このツールを使用することにより、４つの制限酵素（ＢｐｕＪＩ、ＰｓｕＧＩ、Ｓｔｈｌ３２１、ＡｓｐＢＨＩ）が、Ａ２０５８Ｇ変異を認識するそれらの親和性に基づいて最終選考に残る。しかしながら、ＢｐｕＪＩとは別に、他の酵素は２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列において複数の切断部位を示す。ＢｐｕＪＩは、アクネ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列におけるヌクレオチドＡ２０５８Ｇ（大腸菌相当ナンバリング）変異配列内に含まれる配列  ５’−ＣＣＣＧＴ−３’を特異的に認識する。
【０１１０】
２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの６４６ｂｐ増幅配列を、実施例１で提供するのと同じ条件下で、配列番号１及び２のプライマーを使用して野生型アクネ菌株に関して得る。この配列及び実施例１で得られる変異（Ａ２０５８Ｇ）アクネ菌株の６４６ｂｐ増幅配列を、ＢｐｕＪＩを使用する制限消化に供する。図３（ａ）に示すように、野生型配列を酵素ＢｐｕＪＩに供する場合、ＢｐｕＪＩは野生型配列を認識せず、したがってＤＮＡを切断せず、６４６ｂｐの単一産物を得る。他方、図３（ｂ）に示すように、Ａ２０５８Ｇ変異を有するアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ増幅配列を酵素ＢｐｕＪＩに供すると、ＢｐｕＪＩは変異Ａ２０５８Ｇを含む配列を認識し、第１９８ｂｐのＤＮＡを切断し、１９８ｂｐ及び４４７ｂｐの２つの産物をもたらす。これにより、制限酵素を、アクネ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列におけるＡ２０５８Ｇ変異を検出するために使用できることが確認される。
【０１１１】
実施例３：ＤＮＡハイブリダイゼーションを使用してクリンダマイシン耐性を付与する２３Ｓ  ｒＲＮＡのゲノムＤＮＡにおけるＡ２０５８Ｇ及び他の点突然変異の検出
ＰＣＲ管中に、等体積（約１０μｌ）の野生型アクネ菌（ＭＴＣＣ１９５１）の２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ＰＣＲ産物及び実施例１で得られたクリンダマイシン耐性アクネ菌（ＣＣＡＲＭ９０１０）からの２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ＰＣＲ産物を添加し、管を約９５℃で約１０分間加熱することにより融解させる。これに続いて温度を段落ち方式で約２５℃まで徐々に低下させることによって鎖を再アニーリングする。ヘテロ二本鎖ＤＮＡを含む再アニーリングされた試料をミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標））で消化させる。ミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは６４６ｂｐのＰＣＲ産物の２０５８ヌクレオチドでの塩基置換ミスマッチ部位を認識し、ＤＮＡを切断する。試料を約−２０℃で保存し、全試料（約２０μ１）を２．０％アガロースゲルにかけ、ＤＮＡの切断は、６４６ｂｐでの未消化バンド上の４５０ｂｐでのさらなるバンドによって確認される（図５（ｂ）−レーン２及び３）。このさらなるバンドは、クリンダマイシン感受性アクネ菌（ＭＴＣＣ１９５１）の２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ＰＣＲ産物を用いて同じプロセスを繰り返した場合、すなわち、ＭＴＣＣ１９５１＋ＭＴＣＣ１９５１（それぞれ約１０μＬ）のハイブリダイゼーションでは観察されない（図５（ｂ）−レーン４）。これにより、野生型株がハイブリダイズされると、それらはホモ二本鎖を形成し、したがって、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは配列を切断しないことが示され、その結果、１つのバンドだけが観察される。
【０１１２】
したがって、ＤＮＡハイブリダイゼーション技術は、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列における変異、特にＡ２０５８Ｇを検出するのに役立つ。
【０１１３】
実施例４：クリンダマイシン耐性アクネ菌に対するフルオロキノロン抗生物質の活性
クリンダマイシン耐性アクネ菌を保有する患者から様々な臨床単離株を得、フルオロキノロン抗生物質に対するそれらの抗菌薬感受性を、クリンダマイシン及びエリスロマイシンに対する感受性に対して研究する。結果を下記表２に表化する：
【０１１４】
【表２】
2019502399.tif 000003
【０１１５】
前記表中に提示する最小阻止濃度（ＭＩＣ）値は、全てのクリンダマイシン、エリスロマイシン耐性株がフルオロキノロンレボフロキサシン、ナジフロキサシン及びベシフロキサシンに対して感受性であることを示す。
【０１１６】
実施例５：ベシフロキサシン局所製剤を用いた動物実験
クリンダマイシン耐性アクネ菌に対するベシフロキサシン製剤のインビボ有効性を試験するために、ネズミの耳の感染モデルを使用し、この場合、感染は、クリンダマイシン耐性を示すアクネ菌株（ＣＣＡＲＭ９０１０）を使用して誘発させる。生アクネ菌（１×１０７ＣＦＵ）をマウスの耳に皮内注射し、達成された細菌負荷を注射後８時間で測定する。ベシフロキサシン１％もしくは２％ゲルを用いた局所治療、又はクリンダマイシン１％ゲルの基準治療を感染後８時間から始めて１２時間ごとに実施する。結果を図６にグラフで表し、図中、データは平均±ＳＤとして表す。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（対応する感染対照と比較した場合）。観察からわかるように、両ベシフロキサシン製剤（１％及び２％）は、治療の開始から約４０時間後にアクネ菌数の有意な減少をもたらす。これは、クリンダマイシンゲル（１％）を使用して同様の実験条件下で同じ時間にて達成されるアクネ菌負荷における減少よりも有意に大きい。
【０１１７】
実施例６：アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列における変異の検出に基づく患者の治療
中等度から重度のざ瘡病変に罹患したざ瘡患者（クリンダマイシン抗生物質治療に反応しなかった者）のざ瘡病変を集め、試料中に存在するアクネ菌ゲノムＤＮＡを、実施例１で記載するような配列番号１及び２のプライマーを使用したＰＣＲ増幅に供し、続いて実施例２及び３に記載するようにＡ２０５８Ｇ変異を検出した。患者由来のアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列のゲノム配列はＡ２０５８Ｇ変異を保有することが確認される。
【０１１８】
変異分析に基づいて、患者を、１日にミノサイクリンの経口製剤約１００ｍｇ、夜にアダパレンの約０．１％局所製剤及び朝に約１％ナジフロキサシンゲルで治療する。４週間の治療後、臨床病変において有意な改善が観察され、修正された抗生物質治療の成功を示す。
【０１１９】
本発明のさらなる実施形態及び特徴は、本明細書中で提示される記載に基づいて当業者には明らかになるであろう。本明細書中に実施形態は説明において様々な特徴及び有利な詳細を提供する。周知／従来型方法及び技術の説明は、本明細書中の実施形態をいたずらに不明瞭にしないために省略する。
【０１２０】
特定の実施形態の前述の記載事項は、現在の知識を適用することによって、他の者が一般的概念から逸脱することなく容易に改変及び／又は適応させることができる本明細書中の実施形態の全般的な性質の全容を明らかにし、またそのような特定の実施形態の様々な適用について、したがって、そのような適応及び改変は、開示された実施形態の均等物の意味及び範囲内に含まれるべきであり、また含まれることが意図される。本明細書中で用いられる表現又は専門用語は、説明のためであって、限定のためではないと理解されたい。したがって、本発明における実施形態を好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者は、本明細書中の実施形態を、本明細書中に記載する実施形態の精神及び範囲内の改変を加えて実施できることを認めるであろう。
【０１２１】
明細書全体にわたって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、どこで使用されていようとも、記載した要素、整数もしくはステップ、又は要素、整数もしくはステップの群の包含を意味するが、他の要素、整数もしくはステップ、又は他の要素、整数もしくはステップの群を排除するものではないと理解される。
【０１２２】
本明細書において実質的にすべての複数及び／単数の語句の使用に関して、当業者は文脈及び／又は適用に対して適切である場合は、複数を単数に、及び／又は単数を複数に置き換えることができる。明確にするために様々な単数／複数形を本明細書中では明示する場合がある。
【０１２３】
本明細書に含まれる文書、行為、物質、装置、物品及び同種のもののあらゆる議論は、開示のためだけのものである。これらのもののいずれかもしくはすべてが従来技術の基礎の一部をなすか、又は本願の優先日以前にどこかで存在していたので本開示が関連する分野における一般常識であったということを認めるものと解釈されるべきではない。
【０１２４】
本開示の特定の特徴がかなり強調されているが、様々な改変を行うことができること、そして本発明の原則から逸脱することなく好ましい実施形態において多くの変更を行うことができることは、理解されるであろう。本発明又は好ましい実施形態の性質におけるこれらや他の改変は、本明細書の開示から当業者には明らかであり、前述の記載は本発明を限定するものではなく、単なる例示であると解釈されるべきである。本発明の範囲は、したがって、添付の特許請求の範囲以外の何物によっても限定されないことは当業者には明らかになるであろうことがさらに理解される。
【図１】
2019502399.tif 000004
【図２】
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【図３】
2019502399.tif 000006
【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
2019502399.tif 000009
【図５−２】
2019502399.tif 000010
【図６】
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【配列表】
2019502399000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月20日(2018.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のアクネ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ：Ｐ．ａｃｎｅｓ）を検出するための方法であって、前記試料を、配列番号１に示す順方向プライマー及び配列番号２に示す逆方向プライマー、あるいは、配列番号７に示す順方向プライマー及び配列番号８に示す逆方向プライマーと接触させ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供して増幅産物を得ることを含み、ここで前記増幅産物を得ることにより、前記試料中のアクネ菌の存在が確認される、前記方法。
【請求項２】
前記プライマーが、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に示すアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを特異的に増幅し；
前記配列番号４が位置２０５８（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ナンバリング）で野生型配列番号３に対して変異を有し、前記変異がＡ２０５８Ｇであり；前記配列番号５が位置２０５９（大腸菌ナンバリング）で野生型配列番号３に対して変異を有し、前記変異がＡ２０５９Ｇであり；前記配列番号６が位置２０５８及び２０５９（大腸菌ナンバリング）で野生型配列番号３に対して変異を有し、前記変異がＡ２０５８Ｇ及びＡ２０５９Ｇであり；
前記試料が、水、食物、環境試料及び生体試料を含む群から選択され、ここで前記生体試料が、体液、組織、皮膚、ざ瘡病変及び骨、又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され、好ましくはざ瘡病変であり；前記体液が血液であり；
前記ＰＣＲ増幅は、ｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、緩衝液、ヌクレアーゼフリー水及びＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される増幅試薬の存在下で実施され；前記アクネ菌が検出用の前記試料から単離されず；増幅産物の判定が、アガロースゲル電気泳動を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列における変異を検出する方法であって：
（ａ）アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡと、アクネ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列に対して特異的なプライマーとを接触させる工程であって、順方向プライマーが配列番号１に示されかつ逆方向プライマーが配列番号２に示されるか、あるいは、順方向プライマーが配列番号７に示されかつ逆方向プライマーが配列番号８に示される工程；と、
（ｂ）アクネ菌の前記接触させた配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供して増幅産物を得る工程；と、
（ｃ）前記変異を検出するために、前記増幅産物を制限酵素消化、又はＤＮＡハイブリダイゼーションとそれに続くエンドヌクレアーゼ消化に供する工程；と
を含む、前記方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲ増幅は、ｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、緩衝液、ヌクレアーゼフリー水及びＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される増幅試薬の存在下で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
制限酵素消化による変異の前記検出が：
（ａ）前記増幅産物と、検出対象の前記変異に対する親和性を有する制限酵素とを接触させて、変異点で前記産物の切断を可能にする工程；と、
（ｂ）前記増幅産物を制限酵素消化に供した後に切断された増幅産物の存在を判定することによって前記変異を検出する工程；と
を含み；
前記制限酵素がＢｐｕＪＩであり、そして切断された増幅産物の前記判定が、アガロースゲル電気泳動を使用して実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡハイブリダイゼーションとそれに続くエンドヌクレアーゼ消化による変異の前記検出が：
（ａ）前記増幅産物の１つと、野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡもしくは検出対象の前記特異的変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとを接触させるか、又は前記増幅産物を個々に両者と接触させ、そしてハイブリダイゼーションに供して二本鎖を得る工程；と、
（ｂ）前記二本鎖とＤＮＡエンドヌクレアーゼとを接触させる工程；と、
（ｃ）前記二本鎖をエンドヌクレアーゼ消化に供した後に、変異点で切断された二本鎖の有無を判定することによって前記変異を検出する工程；と
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅産物が変異を有する場合、野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードする前記ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、ＤＮＡエンドヌクレアーゼとの接触後に二本鎖が切断され；前記増幅産物が変異を有する場合、前記特異的変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードする前記ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼとの接触後に二本鎖は切断されない；又は前記増幅産物が変異を有さない場合、野生型アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードする前記ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼとの接触後に二本鎖が切断されない；又は前記増幅産物が変異を有さないか又はそれがハイブリダイズされる前記配列中に存在する前記変異以外の変異を有する場合、前記特異的変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードする前記ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの結果、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼとの接触後に二本鎖が切断され；前記ＤＮＡハイブリダイゼーションを、前記接触させた増幅産物を約９０℃〜約９５℃の範囲の温度にて約５分〜約１０分の範囲の時間融解させることによって実施して、融解した鎖を得、続いて約２０℃〜約２７℃の範囲の温度に冷却することにより前記融解した鎖を再アニーリングして前記二本鎖を得；そして前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＣＥＬＩＩ、ＣＥＬＩ及びＴ７エンドヌクレアーゼを含む群から選択されるミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼであり；かつ、
切断された二本鎖の前記判定が、アガロースゲル電気泳動を使用して実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アクネ菌が水、食物、環境試料及び生体試料を含む群から選択される試料中に存在し；
アクネ菌の前記２３Ｓ  ｒＲＮＡにおける前記変異が、Ａ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリング）、Ａ２０５９Ｇ（大腸菌ナンバリング）又はそれらの組み合わせ、好ましくはＡ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリング）から選択され；
前記変異がＡ２０５８Ｇ又はＡ２０５８ＧとＡ２０５９Ｇとの組み合わせである場合、前記アクネ菌が抗生物質耐性となり；
前記アクネ菌が検出用の前記試料から単離されず；前記試料が、体液、組織、皮膚、ざ瘡病変及び骨、又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生体試料、好ましくはざ瘡病変であり；前記体液が血液である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
アクネ菌に感染した患者におけるざ瘡を治療する方法であって：
（ａ）患者から試料を得る工程；と、
（ｂ）請求項５に記載の方法によってアクネ菌における変異の有無を検出して、前記アクネ菌が抗生物質Ａに対して耐性であるか又は感受性であるかを判定する工程；と、
（ｃ）アクネ菌が前記抗生物質Ａに対して耐性である場合は、前記患者に抗生物質Ｂを投与する工程；と
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記アクネ菌が検出用の前記試料から単離されず；
前記試料が、体液、組織、皮膚、ざ瘡病変及び骨、又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される生体試料、好ましくはざ瘡病変であり；前記体液が血液である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗生物質がリンコサミドもしくはマクロライド又はそれらの組み合わせであり、好ましくはクリンダマイシン、エリスロマイシン又はそれらの組み合わせである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗生物質Ａがリンコサミドもしくはマクロライド又はそれらの組み合わせ、好ましくはクリンダマイシン、エリスロマイシン又はそれらの組み合わせであり；前記抗生物質Ｂがベシフロキサシン、ナジフロキサシン及びレボフロキサシンを含む群から選択されるフルオロキノロン抗生物質であり；
前記抗生物質Ｂが、約０．１％ｗ／ｗ〜約１０％ｗ／ｗ、好ましくは約０．２％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは約１％ｗ／ｗ〜約２％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在し；前記抗生物質Ｂが、局所製剤、固体経口製剤、液体経口製剤、吸入製剤、鼻腔投与製剤、眼科用製剤、非経口製剤、植物性医薬品、栄養補助食品及び食糧又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される製剤、好ましくは局所製剤の形態であり；
前記局所製剤が、クリーム、ゲル、スプレー、フォーム、ローション又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記固体経口製剤が、錠剤、カプセル、トローチ、ロゼンジ、分散性粉末、分散性顆粒又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記液体経口製剤が、水性もしくは油性懸濁液、エマルジョン、滴剤、ハードもしくはソフトゲルカプセル中エマルジョン、シロップ、エリキシル又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記非経口製剤が、静脈内注射、筋肉内注射、筋肉内デポー、皮下注射、経皮注射又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記吸入製剤が、吸入具、乾燥粉末吸入具、ネブライザー又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記鼻腔投与製剤が、点鼻剤、鼻腔用スプレー又はそれらの組み合わせを含む群から選択され；前記眼科用製剤が点眼薬を含み；
前記製剤がテトラサイクリン、アダパレン、過酸化ベンゾイル、又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
アクネ菌を検出し、場合により治療するためのキットであって、配列番号１及び２のプライマー配列もしくは配列番号７及び８のプライマー配列、又は両者を、場合によりｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ヌクレアーゼフリー水、塩化マグネシウム、バイアル、制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、アクネ菌野生型株、Ａ２０５８Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ａ２０５９Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ａ２０５８Ｇ及びＡ２０５９Ｇ変異を含むアクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、取扱説明書、及び抗生物質、又はそれらの任意の組み合わせとともに含む、前記キット。
【請求項１４】
前記抗生物質が、フルオロキノロンであり、場合によりリンコサミド、マクロライド、レチノイド、テトラサイクリン及び過酸化ベンゾイルを含む群から選択される抗生物質、又はそれらの任意の組み合わせを伴い； 
前記フルオロキノロン抗生物質が、ベシフロキサシン、ナジフロキサシン及びレボフロキサシン、又はそれらの組み合わせを含む群から選択され；前記リンコサミドがクリンダマイシンであり；前記マクロライドがエリスロマイシンであり；前記レチノイドがアダパレンであり；
前記抗生物質が約０．１％ｗ／ｗ〜約１０％ｗ／ｗ、好ましくは約０．２％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗ、そしてさらに好ましくは約１％ｗ／ｗ〜約２％ｗ／ｗの範囲の濃度で存在し；そして前記抗生物質が局所製剤、固体経口製剤、液体経口製剤、吸入製剤、鼻腔投与製剤、眼科用製剤、非経口製剤、植物性医薬品、栄養補助食品及び食糧又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される製剤、好ましくは局所製剤の形態であり；前記局所製剤が、クリーム、ゲル、スプレー、フォーム、ローション又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記固体経口製剤が、錠剤、カプセル、トローチ、ロゼンジ、分散性粉末、分散性顆粒又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記液体経口製剤が水性もしくは油性懸濁液、エマルジョン、滴剤、ハードもしくはソフトゲルカプセル中エマルジョン、シロップ、エリキシル又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記非経口製剤が静脈内注射、筋肉内注射、筋肉内デポー、皮下注射、経皮注射又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記吸入製剤が、吸入具、乾燥粉末吸入具、ネブライザー又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され；前記鼻腔投与製剤は点鼻剤、鼻腔用スプレー又はそれらの組み合わせを含む群から選択され；そして前記眼科用製剤が点眼薬を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記キットが、アクネ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡにおける変異を検出するために使用され；前記変異が、Ａ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリング）、Ａ２０５９Ｇ（大腸菌ナンバリング）又は野生型アクネ菌に関するそれらの組み合わせから選択され、好ましくはＡ２０５８Ｇ（大腸菌ナンバリング）であり；前記制限エンドヌクレアーゼがＢｐｕＪＩであり；そして前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＣＥＬＩＩ、ＣＥＬＩ及びＴ７エンドヌクレアーゼを含む群から選択されるミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼであり； 
前記検出対象の変異がＡ２０５８Ｇ又はＡ２０５８ＧとＡ２０５９Ｇとの組み合わせである場合、前記検出対象のアクネ菌は、リンコサミド及びマクロライドから選択される抗生物質又はそれらの組み合わせ、好ましくはクリンダマイシン、エリスロマイシン又はそれらの組み合わせに対して耐性となる、請求項１３に記載のキット。
【国際調査報告】
2019502399.tif 000012
2019502399.tif 000013
2019502399.tif 000014
2019502399.tif 000015