(57)【要約】  本開示は、グルタチオン（ＧＳＨ）の産生および蓄積のための遺伝子修飾された宿主細胞に関する。遺伝子修飾された宿主細胞は、活性が増加した変異型Ｃｙｓ４ｐの発現を可能にし得る。追加または代替として、遺伝子修飾された宿主細胞は、核から細胞質への転位が低下している変異型Ｙａｐ１ｐを発現し得る。さらに、追加または代替として、遺伝子修飾された宿主細胞は、異種スレオニンアルドラーゼ（Ｇｌｙ１ｐ）を発現し得る。【選択図】図３
2019509758.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタチオンを製造するプロセスであって、遺伝子修飾された宿主細胞で基質を発酵させてグルタチオンを含む発酵混合物を得るステップを含み、前記遺伝子修飾された宿主細胞が、
・野生型Ｃｙｓ４ｐと比較して生物学的活性が増加した変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質（Ｃｙｓ４ｐ）をコードする第１の異種核酸分子、
・野生型Ｙａｐ１ｐと比較して核から細胞質に転位する能力が低下した変異型Ｙａｐ１ｐをコードする第２の異種核酸分子、および／または
・スレオニンアルドラーゼタンパク質（Ｇｌｙ１ｐ）をコードする第３の異種核酸分子
のうちの少なくとも１つを有する、プロセス。
【請求項２】
前記遺伝子修飾された宿主細胞が、前記第１の異種核酸分子と、前記第２の核酸分子または前記第３の異種核酸分子のうちの少なくとも１つとを有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記変異型Ｃｙｓ４ｐが、前記野生型Ｃｙｓ４ｐの断片である、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記変異型Ｃｙｓ４ｐが、前記野生型Ｃｙｓ４ｐから１つまたは複数のＣ末端アミノ酸残基を欠失させることによって得られる、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記変異型Ｃｙｓ４ｐが、前記野生型Ｃｙｓ４ｐから制御ドメインを欠失させることによって得られる、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記変異型Ｃｙｓ４ｐが、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記遺伝子修飾された宿主細胞において、前記野生型Ｃｙｓ４ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピーが、前記第１の異種核酸分子によって置換される、請求項１から６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記遺伝子修飾された宿主細胞が、前記第１の異種核酸分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのコピーを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記変異型Ｙａｐ１ｐが、前記野生型Ｙａｐ１ｐと比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、前記野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインに対応するドメインに位置する、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記変異型Ｙａｐ１ｐが、前記野生型Ｙａｐ１ｐの前記システインリッチドメインに対応する前記ドメイン中のシステイン残基を親水性アミノ酸残基で置換することによって得られる、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記親水性アミノ酸残基が、アスパラギン酸残基である、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記置換システイン残基が、配列番号３の残基６２６に対応する位置に位置する、請求項１１または１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記変異型Ｙａｐ１ｐが、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記遺伝子修飾された宿主細胞において、前記野生型Ｙａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピーが、前記第２の異種核酸分子によって置換される、請求項１から１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記遺伝子修飾された宿主細胞が、前記第２の異種核酸分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのコピーを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記遺伝子修飾された宿主細胞が、前記第３の異種核酸分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのコピーを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記遺伝子修飾された宿主細胞が、
・前記第１の異種核酸分子および前記第２の異種核酸分子、
・前記第１の異種核酸分子および前記第３の異種核酸分子、
・前記第２の異種核酸分子および前記第３の異種核酸分子、または
・前記第１の異種核酸分子、前記第２の異種核酸分子、および前記第３の異種核酸分子
を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記発酵混合物を、酵母抽出物または酵母加水分解物に加工するステップをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記発酵混合物から前記遺伝子修飾された宿主細胞を精製するステップをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記発酵混合物からの前記遺伝子修飾された宿主細胞を不活性化するステップをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記発酵混合物からグルタチオンを精製するステップをさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記遺伝子修飾された宿主細胞が、遺伝子修飾された酵母宿主細胞である、請求項１から２２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記遺伝子修飾された酵母宿主細胞が、サッカロミセス属に由来する、請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記遺伝子修飾された酵母宿主細胞が、サッカロミセス・セレビシアエ種に由来する、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
請求項１から２５のいずれか一項に記載のプロセスによって得ることができる発酵基質。
【請求項２７】
請求項１９に記載のプロセスによって得ることができる酵母抽出物または酵母加水分解物。
【請求項２８】
請求項２０に記載のプロセスによって得られる精製された遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２１に記載のプロセスによって得られる不活性化された遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項３０】
遺伝子修飾された宿主細胞であって、
・野生型Ｃｙｓ４ｐと比較して生物学的活性が増加した変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質（Ｃｙｓ４ｐ）をコードする第１の異種核酸分子、
・野生型Ｙａｐ１ｐと比較して核から細胞質に転位する能力が低下した変異型Ｙａｐ１ｐをコードする第２の異種核酸分子、および／または
・スレオニンアルドラーゼタンパク質（Ｇｌｙ１ｐ）をコードする第３の異種核酸分子
のうちの少なくとも２つを含む、遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項３１】
前記第１の異種核酸分子と、前記第２の異種核酸分子または前記第３の異種核酸分子のうちの少なくとも１つとを含む、請求項３０に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項３２】
前記変異型Ｃｙｓ４ｐが、前記野生型Ｃｙｓ４ｐの断片である、請求項３０または３１に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項３３】
前記変異型Ｃｙｓ４ｐが、前記野生型Ｃｙｓ４ｐから１つまたは複数のＣ末端アミノ酸残基を欠失させることによって得られる、請求項３２に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項３４】
前記変異型Ｃｙｓ４ｐが、前記野生型Ｃｙｓ４ｐから制御ドメインを欠失させることによって得られる、請求項３３に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項３５】
前記変異型Ｃｙｓ４ｐが、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項３４に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項３６】
前記野生型Ｃｙｓ４ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピーが、前記第１の異種核酸分子によって置換される、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項３７】
前記第１の異種核酸分子の少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのコピーを含む、請求項３０から３６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項３８】
前記変異型Ｙａｐ１ｐが、前記野生型Ｙａｐ１ｐと比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項３０から３７のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項３９】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、前記野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインに対応するドメインに位置する、請求項３８に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項４０】
前記変異型Ｙａｐ１ｐが、前記野生型Ｙａｐ１ｐの前記システインリッチドメインに対応する前記ドメイン中のシステイン残基を親水性アミノ酸残基で置換することによって得られる、請求項３９に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項４１】
前記親水性アミノ酸残基が、アスパラギン酸残基である、請求項４０に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項４２】
前記置換システイン残基が、配列番号３の残基６２６に対応する位置に位置する、請求項４０または４１に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項４３】
前記変異型Ｙａｐ１ｐが、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項４４】
前記野生型Ｙａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピーが、前記第２の異種核酸分子によって置換される、請求項３０から４３のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項４５】
前記第２の異種核酸分子の少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのコピーを含む、請求項３０から４４のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項４６】
前記第３の異種核酸分子の少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのコピーを含む、請求項３０から４５のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項４７】
遺伝子修飾された酵母宿主細胞である、請求項３０から４６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項４８】
前記遺伝子修飾された酵母宿主細胞が、サッカロミセス属に由来する、請求項４７に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項４９】
前記遺伝子修飾された酵母宿主細胞が、サッカロミセス・セレビシアエ種に由来する、請求項４８に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願および文書への相互参照
本出願は、２０１６年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１５，７９６号の優先権を主張する。電子書式の配列表が同時に提出されている。優先出願および配列表の内容は、その全体が本明細書に含まれる。
【０００２】
本開示は、グルタチオンを産生および蓄積することができる遺伝子修飾された宿主細胞（好ましくは、遺伝子修飾された酵母宿主細胞）およびそれを用いるプロセスに関する。遺伝子修飾された宿主細胞は、増大した生物学的活性を有する突然変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質（Ｃｙｓ４ｐ）、核から細胞質への転位能力が制限された突然変異型Ｙａｐ１ｐおよび／または異種スレオニンアルドラーゼ（Ｇｌｙ１ｐ）を発現する。
【背景技術】
【０００３】
グルタチオン（ＧＳＨ、Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシン）は、いくつかの重要な生理学的プロセスにおいて役割を果たすユビキタスな非タンパク質チオールトリペプチドであり、医薬品、化粧品および食品添加剤産業において使用が増大している。この強力な酸化防止剤は、ベーキング（例えば、生地の緩和）、オノロジーおよび醸造（芳香成分安定剤）または酵母抽出物中の香味料エンハンサー（「コクミ」味）として高い関心がある。ＧＳＨの高い需要のために、生産の効率を高めることは商業的に重要である。サッカロミセス・セレビシアエは、「一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）」（ＧＲＡＳ）であり、低分泌性であり、安価な基質上で高細胞密度に比較的容易に増殖するため、ＧＳＨ微生物合成に使用することができる。
【０００４】
細胞内で、グルタチオンは、主に還元型（ＧＳＨ）および酸化型（ＧＳＳＧ）の形態で存在し、２つの連続するＡＴＰ依存性反応で３つの前駆体アミノ酸（グルタミン酸、システインおよびグリシン）から合成される。まず、Ｌ−γ−グルタミルシステイン合成酵素（Ｇｓｈ１ｐ）はシステインをγ−グルタミルシステインに変換し、その後、ＧＳＨ合成酵素（Ｇｓｈ２ｐ）によってグルタチオンに変換される。ＧＳＨ生合成は、３つの異なるレベル：転写、翻訳後および基質利用可能性で厳密に制御される。
【０００５】
グルタチオン（ＧＳＨ）の生合成には、システイン、グルタミン酸およびグリシンの３つのアミノ酸が必要である。酵母の増殖中、システインの添加は、ＧＳＨおよび中間体γ−グルタミルシステイン（γ−ＧＣ）の両方の産生の増加をもたらす。システインとグリシンを同時に供給すると、（γ−ＧＣ）の一部のＧＳＨへの変換をもたらす。
【０００６】
酵母においてはグリシンの合成に至る主な経路が２つ存在する。１つの経路においては、ＧＬＹ１によってコードされるＬ−スレオニンアルドラーゼは、Ｌ−スレオニン（解糖中間体であるオキサロ酢酸から産生される）からグリシンを産生する。グリシンはまた、ＳＨＭ１（ミトコンドリア）およびＳＨＭ２（細胞質ゾル）によってコードされる２つのヒドロキシメチルトランスフェラーゼを介して、Ｌ−セリンから形成され得る。
【０００７】
遺伝子操作された酵母株を用いたＧＳＨの微生物生産は、増加する産業需要を満たす可能性がある。従来の方法では、細胞内のＧＳＨ含有量を天然レベルと比較してわずか２倍に増加させることができ、したがって、ＧＳＨ濃度をさらに増加させることにより、これらの生成物の効率をかなり向上させることができる。Ｓ．セレビシアエにおけるＧＳＨの濃度範囲は、乾燥細胞重量の０．１〜１％である。これは、使用される株、成長条件およびＧＳＨ測定方法によって様々である。
【０００８】
増大した量の細胞内ＧＳＨ（好ましくはほとんどが還元型である）を産生および蓄積し、細胞内γ−グルタミルシステインまたは遊離システインの量を親株のその対応する量と比較して減少させることができる遺伝子修飾された宿主細胞を提供することが非常に望ましい。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞を用いたＧＳＨ産生段階（例えば、発酵）の間のシステインまたはグリシンの補充を低減または排除することが望ましいであろう。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞を用いてＧＳＨおよびＧＳＨを含む調製物（生、半精製および精製）を作製するためのプロセスもまた提供されることが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本開示は、遺伝子修飾された宿主細胞（好ましくは、遺伝子修飾された宿主細胞）およびＧＳＨの産生のためのその使用に関する。遺伝子修飾された宿主細胞は、遊離細胞内システイン、γ−グルタミルシステイン（ｇ−ＧＣまたはγ−ＧＣ）および真のＧＳＨを含む、より多くの全チオール（全ＧＨＳおよび見かけのＧＳＨとしても知られている）を合成する。さらに、遺伝子修飾された株は、対応する野生株と比較して真のＧＳＨの割合を高く蓄積し、ｇ−ＧＣはごくわずかしか蓄積しない。
【００１０】
第１の態様によれば、本開示は、グルタチオンを製造するプロセスを提供する。概して、本プロセスは、遺伝子修飾された宿主細胞で基質を発酵させてグルタチオンを含む発酵混合物を得るステップを含む。この遺伝子修飾された宿主細胞は、（ｉ）野生型Ｃｙｓ４ｐと比較して生物学的活性が増加した変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質（Ｃｙｓ４ｐ）をコードする第１の異種核酸分子、（ｉｉ）野生型Ｙａｐ１ｐと比較して核から細胞質に転位する能力が低下した変異型Ｙａｐ１ｐをコードする第２の異種核酸分子および／または（ｉｉｉ）スレオニンアルドラーゼタンパク質（Ｇｌｙ１ｐ）をコードする第３の異種核酸分子を有する。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第１の異種核酸分子、および第２の異種核酸分子または第３の異種核酸分子のうちの少なくとも１つを有する。一実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐは野生型Ｃｙｓ４ｐの断片である。例えば、変異型Ｃｙｓ４ｐは、野生型Ｃｙｓ４ｐから１つまたは複数のＣ末端アミノ酸残基を欠失させることによって得ることができる。さらに別の例において、変異型Ｃｙｓ４ｐは、野生型Ｃｙｓ４ｐから制御ドメインを欠失させることによって得ることができる。一実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐは配列番号２のアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Ｃｙｓ４ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピーが第１の異種核酸分子によって置換される。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第１の異種核酸分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのコピーを含む。さらなる実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは、遺伝子修飾された宿主細胞の核内に実質的に位置する。さらに別の実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐと比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。例えば、少なくとも１つのアミノ酸置換は、野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインに対応するドメインに位置することができる。さらに別の例において、変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインに対応するドメイン中のシステイン残基を親水性アミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸残基など）で置換することによって得ることができる。さらに別の例において、変異型Ｙａｐ１ｐの置換システイン残基は、配列番号３の残基６２６に対応する位置に位置する。さらに別の実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Ｙａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピーが第２の異種核酸分子によって置換される。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第２の異種核酸分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのコピーを含む。さらなる実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第３の異種核酸分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのコピーを含む。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第１の異���核酸分子および第２の異種核酸分子；第１の異種核酸分子および第３の異種核酸分子；第２の異種核酸分子および第３の異種核酸分子；または第１の異種核酸分子、第２の異種核酸分子および第３の異種核酸分子を含む。一実施形態において、本プロセスは、発酵混合物を酵母抽出物または酵母加水分解物に加工するステップをさらに含む。さらに別の実施形態において、本プロセスは、発酵混合物からの遺伝子修飾された宿主細胞を精製または不活性化するステップをさらに含む。なお別の実施形態において、このプロセスは、発酵混合物からグルタチオンを精製するステップをさらに含む。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、遺伝子修飾された酵母宿主細胞である。例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に由来することができる。別の例において、遺伝子修飾された酵母宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種に由来する。
【００１１】
第２の態様によれば、本開示は、本明細書に記載のプロセスによって得ることが可能または得られる発酵基質、酵母抽出物、酵母加水分解物、精製された遺伝子修飾された宿主細胞および／または不活性化遺伝子修飾された宿主細胞を提供する。
【００１２】
第３の態様によれば、本開示は、遺伝子修飾された宿主細胞におけるグルタチオン蓄積を増加させるためのプロセスに関する。概して、このプロセスは、親酵母宿主細胞中に第１の異種核酸分子、第２の異種核酸分子および／または第３の異種核酸分子を導入して遺伝子修飾された宿主細胞を生成するステップを含む。このプロセスにおいて、第１の異種核酸分子は、野生型Ｃｙｓ４ｐと比較して生物学的活性が増加した変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質（Ｃｙｓ４ｐ）をコードする。さらに、第２の異種核酸分子は、野生型Ｙａｐ１ｐと比較した場合、細胞質内に輸送される能力が限定された変異型Ｙａｐ１ｐをコードする。さらに、第３の異種核酸分子は、異種スレオニンアルドラーゼ（Ｇｌｙ１ｐ）をコードする。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第１の異種核酸分子、および第２の異種核酸分子または第３の異種核酸分子のうちの少なくとも１つを有する。一実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐは野生型Ｃｙｓ４ｐの断片である。例えば、変異型Ｃｙｓ４ｐは、野生型Ｃｙｓ４ｐから１つまたは複数のＣ末端アミノ酸残基を欠失させることによって得ることができる。さらに別の例において、変異型Ｃｙｓ４ｐは、野生型Ｃｙｓ４ｐから制御ドメインを欠失させることによって得ることができる。一実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Ｃｙｓ４ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピーが第１の異種核酸分子によって置換される。なお別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第１の異種核酸分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのコピーを含む。さらなる実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは、遺伝子修飾された宿主細胞の核内に実質的に位置する。さらに別の実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐと比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。例えば、少なくとも１つのアミノ酸置換は、野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインに対応するドメインに位置することができる。なお別の例では、変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインに対応するドメイン中のシステイン残基を親水性アミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸残基など）で置換することによって得ることができる。さらに別の例では、変異型Ｙａｐ１ｐの置換されたシステイン残基は、配列番号３の残基６２６に対応する場所に位置する。さらに別の例では、変異型Ｙａｐ１ｐは、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Ｙａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピーが第２の異種核酸分子によって置換される。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第２の異種核酸分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのコピーを含む。なお別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第３の異種核酸分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのコピーを含む。別���実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、遺伝子修飾された酵母宿主細胞である。例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞はサッカロミセス属に由来することができる。別の例において、遺伝子修飾された酵母宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシアエ種に由来する。
【００１３】
第４の態様によれば、本開示は、本明細書に記載のプロセスによって得られる遺伝子修飾された宿主細胞に関する。
第５の態様によれば、本開示は、（ｉ）野生型Ｃｙｓ４ｐと比較した場合、生物学的活性が上昇した変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質（Ｃｙｓ４ｐ）をコードする第１の異種核酸分子；（ｉｉ）野生型Ｙａｐ１ｐと比較した場合、核から細胞質に転位する能力が低下した変異型Ｙａｐ１ｐをコードする第２の異種核酸分子；および／または（ｉｉｉ）スレオニンアルドラーゼ（Ｇｌｙ１ｐ）をコードする第３の異種核酸分子の少なくとも２つを含む遺伝子修飾された宿主細胞に関する。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第１の異種核酸分子、および第２の異種核酸分子または第３の異種核酸分子のうちの少なくとも１つを有する。一実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐは野生型Ｃｙｓ４ｐの断片である。例えば、変異型Ｃｙｓ４ｐは、野生型Ｃｙｓ４ｐから１つまたは複数のＣ末端アミノ酸残基を欠失させることによって得ることができる。さらに別の例において、変異型Ｃｙｓ４ｐは、野生型Ｃｙｓ４ｐから制御ドメインを欠失させることによって得ることができる。一実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Ｃｙｓ４ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピーが第１の異種核酸分子によって置換される。なお別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第１の異種核酸分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのコピーを含む。さらなる実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは、遺伝子修飾された宿主細胞の核内に実質的に位置する。さらに別の実施形態において、変異Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐと比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。例えば、少なくとも１つのアミノ酸置換は、野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインに対応するドメインに位置することができる。なお別の例では、変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインに対応するドメイン中のシステイン残基を親水性アミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸残基など）で置換することによって得ることができる。さらに別の例では、変異型Ｙａｐ１ｐの置換されたシステイン残基は、配列番号３の残基６２６に対応する場所に位置する。さらに別の例では、変異型Ｙａｐ１ｐは、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Ｙａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピーが第２の異種核酸分子によって置換される。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第２の異種核酸分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのコピーを含む。なお別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第３の異種核酸分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのコピーを含む。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、遺伝子修飾された酵母宿主細胞である。例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞はサッカロミセス属に由来することができる。別の例において、遺伝子修飾された酵母宿主細胞は、サッ���ロミセス・セレビシアエ種に由来する。
【００１４】
本発明の性質を一般的に記載したので、ここで添付の図面を参照して、その好ましい実施形態を例示として示す。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】対照非改変Ｓ．セレビシアエ株（親株）および様々な遺伝子修飾されたＳ．セレビシアエ株ＳＩＬ００５、ＳＩＬ０１６、ＳＩＬ０６４、ＳＩＬ０１０、ＳＩＬ０１９、ＳＩＬ０２０、ＳＩＬ０２２、ＳＩＬ０２４、ＳＩＬ０３０、ＳＩＬ０７８、ＳＩＬ０４３、ＳＩＬ０７０、ＳＩＬ０８５、ＳＩＬ０６８およびＳＩＬ０９０の相対総チオール含量を提供する図である。値は、親（野生型、親、遺伝子修飾されていない）Ｓ．セレビシアエ株の相対値である。値は２つの平均である。
【図２】２０Ｌ発酵槽中、糖蜜内で増殖させたＳ．セレビシアエ株ＳＩＬ０６８の真のグルタチオン（真のＧＳＨ）、システイン（Ｃｙｓ）、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン（γ−ＧＣまたはｇ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）および総チオール含量を提供する図である。値は、発酵条件の関数における乾燥重量のｍｇ／ｇとして提供される。値は２つまたは３つの平均である。
【図３】ベーキング試験におけるバゲットの長さに対する総チオールおよび真のＧＳＨの影響を示す図である。バゲットは、（１）無添加（対照）、（２）４０ｐｐｍ  Ｌ−システイン、（３）０．２５％  Ｆｅｒｍａｉｄ−ＳＲ（商標）、（４）０．５％  Ｆｅｒｍａｉｄ−ＳＲ（商標）、（５）０．０７１％  ＳＩＬ０６８  ＩＤＹ１、（６）０．１４％  ＳＩＬ０６８  ＩＤＹ１、（７）０．０８３％  ＳＩＬ０６８  ＩＤＹ２または（８）０．１６７％  ＳＩＬ０６８  ＩＤＹ２を用いて得られた。
【図４】システインを補充した最小培地で増殖させたＳ．セレビシアエ株ＳＩＬ０６１（ｎ＝１）およびＳＩＬ１４３（ｎ＝２）のシステイン（Ｃｙｓ）、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン（ｇ−ＧＣ）、真のＧＳＨおよび総チオール含量を提供する図である。値は、発酵条件の関数として乾燥重量のｍｇ／ｇとして提供される。
【図５】システインを補充した最小培地で増殖させたＰ．パストリス株Ｘ３３、ＳＩＬ１４８およびＳＩＬ１５０のシステイン（Ｃｙｓ）、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン（ｇ−ＧＣ）、真のＧＳＨおよび総チオール含量を提供する図である（ｎ＝２）。値は、発酵条件の関数として乾燥重量のｍｇ／ｇとして提供される。
【図６】システインを補充した最小培地で増殖させたＰ．パストリス株Ｘ３３、ＳＩＬ１５１およびＳＩＬ１５３のシステイン（Ｃｙｓ）、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン（ｇ−ＧＣ）、真のＧＳＨおよび総チオール含量を提供する図である（ｎ＝２）。値は、発酵条件の関数として乾燥重量のｍｇ／ｇとして提供される。
【図７−１】サッカロミセス・セレビシアエ（配列番号６）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）（配列番号８）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ）（配列番号１２）、トルラスポラ・デルブルエキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）（配列番号１４）、チゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）（配列番号１６）、スケフェルソミセス（ピキア）・スチピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ（Ｐｉｃｈｉａ）  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）（配列番号１９）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）（配列番号２０）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（配列番号２２）由来の野生型Ｃｙｓ４ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。触媒および制御ドキュメントを四角で囲み、示した。Ｓ．セレビシアエの配列を使用する場合、必須の活性部位残基はスレオニン−８１、セリン−８２、スレオニン−８５、グルタミン−１５７およびチロシン−１５８である（Ａｉｔｋｅｎら、２００４）。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図７−２】サッカロミセス・セレビシアエ（配列番号６）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）（配列番号８）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ）（配列番号１２）、トルラスポラ・デルブルエキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）（配列番号１４）、チゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）（配列番号１６）、スケフェルソミセス（ピキア）・スチピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ（Ｐｉｃｈｉａ）  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）（配列番号１９）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）（配列番号２０）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（配列番号２２）由来の野生型Ｃｙｓ４ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。触媒および制御ドキュメントを四角で囲み、示した。Ｓ．セレビシアエの配列を使用する場合、必須の活性部位残基はスレオニン−８１、セリン−８２、スレオニン−８５、グルタミン−１５７およびチロシン−１５８である（Ａｉｔｋｅｎら、２００４）。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図７−３】サッカロミセス・セレビシアエ（配列番号６）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）（配列番号８）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ）（配列番号１２）、トルラスポラ・デルブルエキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）（配列番号１４）、チゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）（配列番号１６）、スケフェルソミセス（ピキア）・スチピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ（Ｐｉｃｈｉａ）  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）（配列番号１９）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）（配列番号２０）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（配列番号２２）由来の野生型Ｃｙｓ４ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。触媒および制御ドキュメントを四角で囲み、示した。Ｓ．セレビシアエの配列を使用する場合、必須の活性部位残基はスレオニン−８１、セリン−８２、スレオニン−８５、グルタミン−１５７およびチロシン−１５８である（Ａｉｔｋｅｎら、２００４）。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図７−４】サッカロミセス・セレビシアエ（配列番号６）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）（配列番号８）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ）（配列番号１２）、トルラスポラ・デルブルエキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）（配列番号１４）、チゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）（配列番号１６）、スケフェルソミセス（ピキア）・スチピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ（Ｐｉｃｈｉａ）  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）（配列番号１９）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）（配列番号２０）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（配列番号２２）由来の野生型Ｃｙｓ４ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。触媒および制御ドキュメントを四角で囲み、示した。Ｓ．セレビシアエの配列を使用する場合、必須の活性部位残基はスレオニン−８１、セリン−８２、スレオニン−８５、グルタミン−１５７およびチロシン−１５８である（Ａｉｔｋｅｎら、２００４）。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図７−５】サッカロミセス・セレビシアエ（配列番号６）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）（配列番号８）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ）（配列番号１２）、トルラスポラ・デルブルエキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）（配列番号１４）、チゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）（配列番号１６）、スケフェルソミセス（ピキア）・スチピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ（Ｐｉｃｈｉａ）  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）（配列番号１９）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）（配列番号２０）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（配列番号２２）由来の野生型Ｃｙｓ４ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。触媒および制御ドキュメントを四角で囲み、示した。Ｓ．セレビシアエの配列を使用する場合、必須の活性部位残基はスレオニン−８１、セリン−８２、スレオニン−８５、グルタミン−１５７およびチロシン−１５８である（Ａｉｔｋｅｎら、２００４）。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図８−１】サッカロミセス・セレビシアエ株（配列番号７）、サッカロミセス・バヤヌス（配列番号９）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）（配列番号１１）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（配列番号１３）、トルラスポラ・デルブルエキイ（配列番号１５）、チゴサッカロミセス・バイリイ（配列番号１７）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（配列番号１８）、クルイベロミセス・ラクティス（配列番号２１）およびピキア・パストリス（配列番号２３）からの野生型Ｙａｐ１ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。塩基性領域（ＤＮＡ結合）、ロイシンジッパーおよびシステインリッチドメインを四角で囲み、示した。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図８−２】サッカロミセス・セレビシアエ株（配列番号７）、サッカロミセス・バヤヌス（配列番号９）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）（配列番号１１）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（配列番号１３）、トルラスポラ・デルブルエキイ（配列番号１５）、チゴサッカロミセス・バイリイ（配列番号１７）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（配列番号１８）、クルイベロミセス・ラクティス（配列番号２１）およびピキア・パストリス（配列番号２３）からの野生型Ｙａｐ１ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。塩基性領域（ＤＮＡ結合）、ロイシンジッパーおよびシステインリッチドメインを四角で囲み、示した。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図８−３】サッカロミセス・セレビシアエ株（配列番号７）、サッカロミセス・バヤヌス（配列番号９）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）（配列番号１１）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（配列番号１３）、トルラスポラ・デルブルエキイ（配列番号１５）、チゴサッカロミセス・バイリイ（配列番号１７）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（配列番号１８）、クルイベロミセス・ラクティス（配列番号２１）およびピキア・パストリス（配列番号２３）からの野生型Ｙａｐ１ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。塩基性領域（ＤＮＡ結合）、ロイシンジッパーおよびシステインリッチドメインを四角で囲み、示した。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図８−４】サッカロミセス・セレビシアエ株（配列番号７）、サッカロミセス・バヤヌス（配列番号９）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）（配列番号１１）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（配列番号１３）、トルラスポラ・デルブルエキイ（配列番号１５）、チゴサッカロミセス・バイリイ（配列番号１７）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（配列番号１８）、クルイベロミセス・ラクティス（配列番号２１）およびピキア・パストリス（配列番号２３）からの野生型Ｙａｐ１ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。塩基性領域（ＤＮＡ結合）、ロイシンジッパーおよびシステインリッチドメインを四角で囲み、示した。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図８−５】サッカロミセス・セレビシアエ株（配列番号７）、サッカロミセス・バヤヌス（配列番号９）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）（配列番号１１）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（配列番号１３）、トルラスポラ・デルブルエキイ（配列番号１５）、チゴサッカロミセス・バイリイ（配列番号１７）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（配列番号１８）、クルイベロミセス・ラクティス（配列番号２１）およびピキア・パストリス（配列番号２３）からの野生型Ｙａｐ１ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。塩基性領域（ＤＮＡ結合）、ロイシンジッパーおよびシステインリッチドメインを四角で囲み、示した。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図８−６】サッカロミセス・セレビシアエ株（配列番号７）、サッカロミセス・バヤヌス（配列番号９）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）（配列番号１１）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（配列番号１３）、トルラスポラ・デルブルエキイ（配列番号１５）、チゴサッカロミセス・バイリイ（配列番号１７）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（配列番号１８）、クルイベロミセス・ラクティス（配列番号２１）およびピキア・パストリス（配列番号２３）からの野生型Ｙａｐ１ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。塩基性領域（ＤＮＡ結合）、ロイシンジッパーおよびシステインリッチドメインを四角で囲み、示した。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図８−７】サッカロミセス・セレビシアエ株（配列番号７）、サッカロミセス・バヤヌス（配列番号９）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）（配列番号１１）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（配列番号１３）、トルラスポラ・デルブルエキイ（配列番号１５）、チゴサッカロミセス・バイリイ（配列番号１７）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（配列番号１８）、クルイベロミセス・ラクティス（配列番号２１）およびピキア・パストリス（配列番号２３）からの野生型Ｙａｐ１ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。塩基性領域（ＤＮＡ結合）、ロイシンジッパーおよびシステインリッチドメインを四角で囲み、示した。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図９−１】サッカロミセス・セレビシアエ株（配列番号２４）、サッカロミセス・バヤヌス（配列番号２５）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（配列番号２６）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（配列番号２７）、トルラスポラ・デルブルエキイ（配列番号２８）、チゴサッカロミセス・バイリイ（配列番号２９）、シゾサッカロミセス・ポンベ（配列番号３０）、クルイベロミセス・ラクティス（配列番号３１）およびピキア・パストリス（配列番号３２）由来の野生型Ｇｌｙ１ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。塩基性領域（ＤＮＡ結合）、ロイシンジッパーおよびシステインリッチドメインを四角で囲み、示した。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図９−２】サッカロミセス・セレビシアエ株（配列番号２４）、サッカロミセス・バヤヌス（配列番号２５）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（配列番号２６）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（配列番号２７）、トルラスポラ・デルブルエキイ（配列番号２８）、チゴサッカロミセス・バイリイ（配列番号２９）、シゾサッカロミセス・ポンベ（配列番号３０）、クルイベロミセス・ラクティス（配列番号３１）およびピキア・パストリス（配列番号３２）由来の野生型Ｇｌｙ１ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。塩基性領域（ＤＮＡ結合）、ロイシンジッパーおよびシステインリッチドメインを四角で囲み、示した。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図９−３】サッカロミセス・セレビシアエ株（配列番号２４）、サッカロミセス・バヤヌス（配列番号２５）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（配列番号２６）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（配列番号２７）、トルラスポラ・デルブルエキイ（配列番号２８）、チゴサッカロミセス・バイリイ（配列番号２９）、シゾサッカロミセス・ポンベ（配列番号３０）、クルイベロミセス・ラクティス（配列番号３１）およびピキア・パストリス（配列番号３２）由来の野生型Ｇｌｙ１ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。塩基性領域（ＤＮＡ結合）、ロイシンジッパーおよびシステインリッチドメインを四角で囲み、示した。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【図９−４】サッカロミセス・セレビシアエ株（配列番号２４）、サッカロミセス・バヤヌス（配列番号２５）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（配列番号２６）、サイバーリンドネラ・ジャディニイ（配列番号２７）、トルラスポラ・デルブルエキイ（配列番号２８）、チゴサッカロミセス・バイリイ（配列番号２９）、シゾサッカロミセス・ポンベ（配列番号３０）、クルイベロミセス・ラクティス（配列番号３１）およびピキア・パストリス（配列番号３２）由来の野生型Ｇｌｙ１ｐのアミノ酸配列アライメントを提供する図である。塩基性領域（ＤＮＡ結合）、ロイシンジッパーおよびシステインリッチドメインを四角で囲み、示した。アミノ酸アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（登録商標）ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して、整列から入力に変更された順序を除いて、デフォルトのパラメータを使用して生成した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示は、発酵の間にグルタチオンを産生するためのプロセスにおける遺伝子修飾された宿主細胞、およびそれらの使用に関する。本開示はまた、特に、発酵の間にグルタチオンを産生するためのプロセスにおける遺伝子修飾された酵母宿主細胞、およびそれらの使用に関する。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞の使用により、総チオールの実質的な増加、特にグルタチオンの産生および蓄積が可能となる。特定の状況下で、遺伝子修飾された宿主細胞の総チオール含量は、対応する野生型（すなわち、親または非遺伝子修飾された）細胞と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上増加する。他の状況において、遺伝子修飾された宿主細胞は、対応する野生型（すなわち、親または非遺伝子修飾された宿主）細胞と比較して、そのγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン副産物よりも高い割合の真のＧＳＨを生成する。いくつかの状況において、遺伝子修飾された宿主細胞は、対応する野生型（すなわち、親または非遺伝子修飾された宿主）細胞と比較した場合、より少ない細胞内遊離システインを生成する。さらに他の状況において、遺伝子修飾された宿主細胞は、対応する野生型（すなわち、親または非遺伝子修飾された）細胞よりも、同じＧＳＨ含量を達成するための発酵の間、より少ない補充（例えば、より少ないシステイン補充および／または少ないグリシン補充）を要求する。
遺伝子修飾された宿主細胞
本開示は、対応する親または非遺伝子修飾された宿主細胞よりも多くのＧＳＨを産生および蓄積することができる遺伝子修飾された宿主細胞を提供する。遺伝子修飾された宿主細胞は、遺伝子修飾された酵母宿主細胞であり得る。本開示の文脈において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異したシスタチオニンβ−シンターゼタンパク質Ｃｙｓ４ｐの発現を可能にする少なくとも１つの遺伝子修飾、変異型Ｙａｐ１ｐの発現を可能にする第２の遺伝子修飾および／または異種スレオニンアルドラーゼ（Ｇｌｙ１ｐ）の発現を可能にする第３の遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、例えば、異種ガンマグルタミルシステインシンテターゼ１タンパク質（Ｇｓｈ１ｐ）および／または異種グルタチオンシンテターゼ２タンパク質（Ｇｓｈ２ｐ）を発現させるためのさらなる遺伝子修飾されたもまた含む。
【００１７】
遺伝子修飾された宿主細胞は、酵母宿主細胞であり得る。本明細書に記載されるように遺伝子修飾され得る適切な酵母宿主細胞は、例えば、アルキスラ（Ａｒｘｕｌａ）、ブレッタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、クロエッケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、メトシュニコウィア（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スケフェルソミセス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シュワンニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、スタルメレラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ）、テトラピシスポラ（Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはチゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来であり得る。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞は、油性酵母細胞であり得る。例えば、油性酵母宿主細胞は、ブラケスレア（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、カンジダ、クリプトコックス、クンニンガメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）、リポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、フィコミセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ピチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、ロドスポリズム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｕｍ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）またはヤロウィア属由来であり得る。いくつかの代替的な実施形態において、酵母宿主細胞は、油性微細藻類宿主細胞（例えば、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属由来）であり得る。適切な酵母種としては、例えば、アルキスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ブレッタノミセス・ブルキセレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・コリコサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｏｌｉｃｕｌｏｓａ）／トルラスポラ・デルブルエキイ、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）（サイバーリンドネラ・ジャディニイ）、クリプトコックス・スキンネリ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｋｉｎｎｅｒｉ）、デバリオミセス種（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、デバリオミセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、デバリオミセス・ポリモルフス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、ハンセニアスポラ・ビネア（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｖｉｎｅａ）、ハンセニアスポラ・オッシデンタリス（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、ハンセニアスポラ・ウバルム（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・ラクティス、クルイベロミセス・マルキシアヌス  ｖａｒ  ドロソフィラルム（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）、クルイベロミセス・テルモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、クルイベロミセス・ウィッケラミイ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）、クルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、メトスクニコウィア・プルケリマ（カンジダ・プルケリマ）（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ））、メトスクニコウィア・フルクチコラ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ）、ファフィア・ロドチマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）、ピキア・クドリアブゼビイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、ピキア・オッシデンタリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、ピキア・パストリス、サッカロミセス・ブルガリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｕｌｇａｒｉ）、サッカロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・エキシグオス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｉｇｕｏｕｓ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）、シェフェルソミセス・スチピチス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、シュワンニオミセス・オッシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、スタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌｌａ）、テトラピシスポラ・ファフィイ（Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ  ｐｈａｆｆｉｉ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、チゴサッカロミセス・バイリイまたはチゴサッカロミセス・ロウキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）が挙げられる。１つの特定の実施形態において、遺伝子修飾された酵母宿主細胞はサッカロミセス属由来であり、さらなる実施形態においては、サッカロミセス・セレビシアエ種由来である。
【００１８】
遺伝子修飾された宿主細胞は細菌であり得る。本明細書に記載のように遺伝子修飾され得る適切な細菌宿主細胞は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であり得る。遺伝子修飾された細菌宿主細胞は、アシドバクテリア（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アキフィカ（Ａｑｕｉｆｉｃａｅ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、コロロビ（Ｃｈｏｌｏｒｏｂｉ）、クロロフレキシ（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ）、クリシオゲネテス（Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ）、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デフェリバクテレス（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、デイノコックス−テルムス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓ）、ジクチオグロミ（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ）、フィブロバクテレス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ）、フィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、フソバクテリア（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ゲンマチモナデテス（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ）、レンチスファエラ（Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ）、ニトロスピラ（Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ）、プランクトミセテス（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）、サーモデススルフォバクテリア（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サーモトガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ）またはベルコミクロビア（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門由来であり得る。１つの特定の実施形態において、遺伝子修飾された細菌宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００１９】
上に示したように、遺伝子修飾された宿主細胞は、１つまたは複数の異種タンパク質（例えば、変異型Ｃｙｓ４ｐ、変異型Ｙａｐ１ｐ、Ｇｌｙ１ｐ、Ｇｓｈ１ｐおよび／またはＧｓｈ２ｐ）をコードする１つまたは複数の異種核酸分子を含む。「異種」という用語は、核酸分子（プロモーターまたはコーディング配列など）またはタンパク質に関して使用される場合、宿主生物または細胞において天然に見出されない核酸分子またはタンパク質を指す。「異種」はまた、供給源の生物から除去または増幅され、続いて、対応する天然の遺伝子とは異なる形態、例えば、その生物のゲノムの天然の位置ではないように、供給源の生物に再導入される天然のコーディング領域またはその一部を含む。異種核酸分子は、宿主細胞に意図的に導入される。「異種」核酸分子またはタンパク質は、任意の供給源（例えば、真核生物、原核生物、ウイルスなど）に由来し得る。一実施形態において、異種核酸分子は、真核生物（例えば、遺伝子修飾された宿主細胞と同じ属からまたは同じ種からの酵母のような）に由来し得る。本明細書で使用される「異種」という用語は、内因性供給源以外の供給源に由来する要素（核酸またはタンパク質）のことも指す。したがって、例えば、異種の要素は、宿主細胞の異なる株から、または異なる分類学的グループ（例えば、異なる界、門、綱、目、科、属もしくは種、またはこれらの分類の１つの中の任意の下位群）の生物から由来してもよい。「異種」という用語はまた、本明細書において「外因性」という用語と同義に使用される。
（ｉ）変異型シスタチオニンβ−シンターゼ（Ｃｙｓ４ｐ）
システインはＧＳＨ産生の律速段階にあることが知られている。シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質（本明細書においてはＣｙｓ４ｐとも呼ばれる）は、ホモシステインからのシステイン生合成における最初の関与段階を触媒する。ＧＳＨ産生の増加を示す酵母株は、Ｃｙｓ４ｐをコードする転写物を過剰発現することが示された（Ｎｉｓａｍｅｄｔｉｎｏｖら、２０１０、Ｎｉｓａｍｅｄｔｉｎｏｖら、２０１１およびＯｒｕｍｅｔｓら、２０１２）。Ｃｙｓ４ｐの過剰発現はサイバーリンドネラ・ジャディニイ（以前のカンジダ・ユティリス）（Ｓｕｚｕｋｉら、２０１１）、ピキア・パストリス（ＣＮ１０１２２０３３８ＡおよびＣＮ１０１２４５３６３Ａ参照）およびサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓｕｚｕｋｉら、２０１１）において、ＧＳＨ含量を増加させることが示されている。しかしながら、本出願で示されるように、酵母宿主細胞中の野生型Ｃｙｓ４ｐの過剰発現は、総チオールにおいて中程度の増加しかもたらさない（例えば、図１の株ＳＩＬ００５について得られた結果を参照のこと）。
【００２０】
ＣＹＳ４、ＣＹＳ４．３５３の機能獲得対立遺伝子が、その制御ドメインを除外したシスタチオニンβ−シンターゼをコードし、より高い比活性を生じることになり（Ｊｈｅｅら、２０００）、Ｓ．セレビシアエにおいて細胞増殖速度の加速および細胞分裂をもたらす（Ｂｌａｎｋら、２００９）ことが報告されている。驚くべきことに、本出願で示されるように、遺伝子ＣＹＳ４．３５３が遺伝子修飾された酵母宿主細胞において発現される場合、総チオールの激しい増加が観察される（例えば、図１の株ＳＩＬ０１０について得られた結果を参照）。
【００２１】
本開示の遺伝子修飾された宿主細胞（および特に本開示の遺伝子修飾された酵母宿主細胞）は、野生型Ｃｙｓ４ｐと比較して生物学的活性が増加した変異型Ｃｙｓ４ｐをコードする第１の異種核酸分子を含み得る。したがって、このような遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Ｃｙｓ４ｐを発現することができ、適切な条件に置かれた場合、遺伝子修飾された宿主細胞は、発酵中に総チオール（およびＧＳＨ産生）を最終的に増加させる変異型Ｃｙｓ４ｐを発現する。第１の異種核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞中の１つまたは複数のコピーに（１つまたは複数の中立的組込み部位で）組み込まれ得る。第１の異種核酸分子は、天然のＣｙｓ４ｐをコードする天然の核酸分子の１つまたは複数のコピーを置換してもよい。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞（および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞）は、第１の異種核酸分子のコピーが組み込まれた１つまたは複数のコピーを（１つまたは複数の中立的組込み部位で）有することができ、天然のＣｙｓ４ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピー（または両方のコピー）が、第１の異種核酸によって置換されている。
【００２２】
遺伝子修飾された宿主細胞において発現される場合、変異型Ｃｙｓ４ｐは、野生型Ｃｙｓ４ｐよりも生物学的活性が増加している。本開示の文脈において、野生型Ｃｙｓ４ｐは、シスタチオニンβ−シンターゼ活性を有するタンパク質、すなわちホモシステインをシスタチオニンに酵素的に変換することができるタンパク質を指す。野生型または天然のＣｙｓ４ｐは、酵母ゲノムによってコードされ、触媒ドメインおよび制御ドメインの両方を含む。野生型Ｃｙｓ４ｐは、必須の活性部位残基スレオニン−８１、セリン−８２、スレオニン−８５、グルタミン−１５７およびチロシン−１５８を含む（Ａｉｔｋｅｎら、２００４）。図７は、様々な酵母種から得られた野生型Ｃｙｓ４ｐのアミノ酸アライメントを提供する。一実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐは、図７に示すように、スレオニン−８１、セリン−８２、スレオニン−８５、グルタミン−１５７およびチロシン−１５８に対応する必須の活性部位残基を有する。
【００２３】
一実施形態において、野生型Ｃｙｓ４ｐは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２０または２２のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、野生型Ｃｙｓ４ｐは、図７に示される野生型Ｃｙｓ４ｐのいずれか１つである。さらに別の実施形態において、野生型Ｃｙｓ４ｐは、図７に示されるコンセンサス配列に対応する。
【００２４】
さらに別の実施形態において、本開示の野生型Ｃｙｓ４ｐ（変異体と呼ぶことができる）は、野生型Ｃｙｓ４ｐがシスタチオニンβ−シンターゼ活性を示す条件で、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、２０または２２のいずれか１つと図７に示されるコンセンサス配列で少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を共有する。「同一性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９１）に記載されているものを含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにまとめられている。配列アラインメントおよびパーセント同一性計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ）（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて行うことができる。本明細書中に開示の配列の複数のアライメントは、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３頁）を使用してデフォルトのパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用いて行った。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いたペアワイズアライメントのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＢ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であった。
【００２５】
上に示したように、本開示の遺伝子修飾された宿主細胞（遺伝子修飾された酵母宿主細胞など）は、いくつかの実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐをコードする第１の核酸分子を含むことができる。本開示の文脈において、「変異型」Ｃｙｓ４ｐは、野生型Ｃｙｓ４ｐに対して増加したシスタチオニンβ−シンターゼ活性を有するタンパク質を指す。さらに、野生型Ｃｙｓ４ｐと比較した場合、変異型Ｃｙｓ４ｐは、野生型Ｃｙｓ４ｐと１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有する。しかしながら、変異型Ｃｙｓ４ｐはシスタチオニンβ−シンターゼ活性を示すため、変異型Ｃｙｓ４ｐは、その触媒部位内の８１位（または対応する位置）のスレオニン、８２位（または対応する位置）のセリン、８５位（または対応する位置）のスレオニン、１５７位（または対応する位置）のグルタミンおよび１５８位（または対応する位置）のチロシンを有する。
【００２６】
一実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐは、「野生型」Ｃｙｓ４ｐに対して増加したシスタチオニンβ−シンターゼ活性および／または安定性を示す野生型Ｃｙｓ４ｐの断片である。本開示の文脈において使用される場合、「断片」という用語は、野生型タンパク質より少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を有するタンパク質を指す。この欠失は、野生型Ｃｙｓ４ｐのＮ末端、Ｃ末端のいずれかまたはＮ末端およびＣ末端の両方で起こり得る。本開示の文脈において、変異型Ｃｙｓ４ｐが野生型Ｃｙｓ４ｐの断片である場合、それは野生型Ｃｙｓ４ｐの触媒ドメインを少なくとも含む。いくつかの実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐは、野生型Ｃｙｓ４ｐの少なくとも３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０以上の連続したアミノ酸残基を有することができる。特定の実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐは、野生型Ｃｙｓ４ｐのカルボキシ末端から１つまたは複数のアミノ酸残基を欠失させることによって得られ、例えば、野生型Ｃｙｓ４ｐの制御ドメインの一部または全てを欠失させることによって得られる。Ｃｙｓ４ｐの制御ドメインは図７に図示され、配列番号１の３５４位〜５０７位に対応する。一実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐは、配列番号１の残基１〜３５３によって定義される配列、ならびに配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２の対応する配列からなる。いくつかの特定の実施形態において、変異型Ｃｙｓ４ｐは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【００２７】
本開示は、そのような断片および変異体が野生型Ｃｙｓ４ｐに対して増加したシスタチオニンβ−シンターゼ活性および／または安定性を示す場合には、変異型Ｃｙｓ４ｐの断片および／または変異体の使用も含む。変異型Ｃｙｓ４ｐの断片は、変異型Ｃｙｓ４ｐよりも少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を有する変異型Ｃｙｓ４ｐを指す。欠失は、野生型タンパク質のＮ末端、Ｃ末端のいずれか、またはＮ末端およびＣ末端の両方で起こり得る。変異型Ｃｙｓ４ｐの変異体は、アミノ酸残基の１つまたは複数が保存または非保存アミノ酸残基で置換されたものであり得る。変異型Ｃｙｓ４ｐの「変異体」は、保存的変異体または対立遺伝子変異体であり得る。本明細書において使用されるように、保存的変異体は、変異型Ｃｙｓ４ｐの生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変更を指す。置換、挿入または欠失は、変更された配列が変異型Ｃｙｓ４ｐに関連する生物学的機能を妨害または破壊する場合、タンパク質に悪影響を与えると言われる。例えば、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、タンパク質の全体的な電荷、構造または疎水性−親水性特性を変更することができる。したがって、変異型Ｃｙｓ４ｐの生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、変異型Ｃｙｓ４ｐを例えばより疎水性または親水性にするためにアミノ酸配列を変更することができる。
（ｉｉ）変異型Ｙａｐ１ｐ
Ｙａｐ１ｐはＳ．セレビシアエ酸化的ストレス応答に関与する転写因子である。これは、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＣＹＳ３およびＣＹＳ４遺伝子の正の転写制御因子である。Ｙａｐ１ｐをコードする転写物を過剰発現することが示されている、ＧＳＨ産生の増加を示す酵母株（Ｎｉｓａｍｅｄｔｉｎｏｖら、２０１０およびＮｉｓａｍｅｄｔｉｎｏｖら、２０１１）。野生型Ｙａｐ１ｐ過剰発現もまた、ＧＳＨ蓄積を増強することが示された（Ｏｒｕｍｅｔｓら、２０１２）。
【００２８】
Ｙａｐ１ｐの生物学的活性は、その細胞内局在化によって影響を受ける：酸化ストレス下で、野生型Ｙａｐ１ｐは核内に局在し、その生物学的活性を媒介するが、酸化ストレスが減少すると野生型Ｙａｐ１ｐは細胞質に移行し、その生物学的活性を停止させる（Ｋｕｇｅら、１９９７）。野生型Ｙａｐ１ｐの可逆的核局在は、そのＣ末端システインリッチドメイン（ＣＲＤ）によって媒介される。ＣＲＤは、特定のシステイン残基間にジスルフィド結合を形成することができ、ある状況では、Ｙａｐ１ｐの核輸出配列を隠蔽し、ＲＮＡレベルでの発現が変化がなく、さらにより低いタンパク質レベルにもかかわらず、核内で活性状態を保持させる（Ｋｕｇｅら、２００１およびＫｕｇｅら、１９９７）。
【００２９】
本開示の遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Ｙａｐ１ｐをコードする異種核酸分子を含むことができる。変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐと比較した場合、核から細胞質に転移する能力が低下する。したがって、細胞質におけるその最初の翻訳後、変異型Ｙａｐ１ｐは、実質的に、いくつかの実施形態においては専ら、遺伝子修飾された宿主細胞の核内に（例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞の核内に）位置する。遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Ｙａｐ１ｐを発現する能力があり、適切な条件に置かれた場合、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Ｙａｐ１ｐを発現する。変異型Ｙａｐ１をコードする異種核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞中の１つまたは複数のコピーで（１つまたは複数の中立的組込み部位で）組み込むことができる。第２の異種核酸分子は、天然のＹａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の１つまたは両方のコピーを置換することができる。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞（および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞）は、（１つまたは複数の中立的組込み部位で）異種核酸分子のコピーが組み込まれた１つまたは複数のコピーを有することができ、ここで、天然のＹａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピー（または両方のコピー）が第１の異種核酸によって置換されている。
【００３０】
遺伝子修飾された宿主細胞において（特に、遺伝子修飾された酵母宿主細胞において）発現される場合、変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐの能力と比較して核から細胞質に転移する能力が低下している。本開示の文脈において、野生型Ｙａｐ１ｐは、塩基性ロイシンジッパー転写因子活性を有するタンパク質、すなわち、様々な遺伝子の発現を調節することができるタンパク質を指す。例えば、野生型Ｙａｐ１ｐの転写因子活性の一つは、γグルタミルシステイン合成酵素タンパク質（Ｇｓｈ１ｐ）およびグルタチオン合成２タンパク質（Ｇｓｈ２ｐ）をそれぞれコードするＧＳＨ１およびＧＳＨ２遺伝子の発現を増加させることである。一実施形態において、野生型Ｙａｐ１ｐは、例えば、酵母ゲノムなどの真核生物ゲノムによってコードされる。図８は、様々な酵母種由来の野生型Ｙａｐ１ｐのアミノ酸アライメントを提供する。一実施形態において、野生型Ｙａｐ１ｐは、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２１または２３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、野生型Ｙａｐ１ｐは、図８に示す野生型Ｙａｐ１ｐのいずれか１つである。さらに別の実施形態において、野生型Ｙａｐ１ｐは、図８に示されるコンセンサス配列に対応する。
【００３１】
さらに別の実施形態において、本開示の野生型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐに酸化的ストレスが減少したときに核から細胞質に転移する能力がある限りにおいて、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２１または２３のいずれか１つまたは図８に示されるコンセンサス配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を共有することができる。「同一性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９１）に記載されているものを含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにまとめられている。配列アラインメントおよびパーセント同一性計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて行うことができる。本明細書中に開示の配列の複数のアライメントは、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３頁）を使用してデフォルトのパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用いて行った。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いたペアワイズアライメントのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＢ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であった。
【００３２】
上に示したように、本開示の遺伝子修飾された宿主細胞は、いくつかの実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐをコードする異種核酸分子を含むことができる。本開示の文脈において、「変異型」Ｙａｐ１ｐは、「野生型」Ｙａｐ１ｐの能力と比較した場合、宿主細胞の核から細胞質に転移する能力が低下しているか、または欠如しているタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、細胞質におけるその最初の翻訳後、変異型Ｙａｐ１ｐは、宿主細胞の核において構成的に発現される。さらに、野生型Ｙａｐ１ｐと比較した場合、変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐと１つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有する。
【００３３】
一実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは、「野生型」Ｙａｐ１ｐと比較した場合、酵母宿主細胞の核から細胞質へ転移する能力が低下しているか、または欠如していることを示す野生型Ｙａｐ１ｐの断片である。本開示の文脈において使用される場合、「断片」という用語は、野生型タンパク質より少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を有するタンパク質を指す。この欠失は、野生型タンパク質のＮ末端、Ｃ末端のいずれかまたはＮ末端およびＣ末端の両方で起こり得る。本開示の文脈において、変異型Ｙａｐ１ｐが野生型Ｙａｐ１ｐの断片である場合、野生型Ｙａｐ１ｐの塩基性領域およびロイシンジッパーを少なくとも含む。例えば、変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐからシステインリッチドメインを（少なくとも部分的におよびいくつかの実施形態においては完全に）欠失させることによって得ることができる。選択されたＹａｐ１ｐのシステインリッチドメインを図８に示す。いくつかの実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは野生型Ｙａｐ１ｐの少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００以上の連続したアミノ酸残基を有することができる。
【００３４】
一実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐの１つまたは複数のアミノ酸残基を置換することによって得ることができる。一実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメイン内のアミノ酸置換を含む。野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインは図８に図示されており、配列番号３の残基６０４〜６３５に対応する。野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインは、３つのシステイン残基：配列番号３の６０４位に対応する第１のシステイン残基、配列番号３の６２６位に対応する第２のシステイン残基、および配列番号３の６３５位に対応する第３のシステイン残基を含む。一実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐ（Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインに対応するドメイン内の）は、第１のシステイン残基（配列番号３の６０４位の残基に対応する）および野生型Ｙａｐ１ｐの第３のシステイン残基（配列番号３の６３５位の残基に対応する）を有し、第２のシステイン残基（配列番号３の６２６位の残基に対応する）における置換を含む。変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインの第２のシステイン残基を、例えばアスパラギン酸、ロイシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、セリン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンなどの親水性アミノ酸残基により置換することによって得ることができる。別の実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは、野生型Ｙａｐ１ｐのシステインリッチドメインの第２のシステイン残基をアスパラギン酸残基で置換することによって得ることができる。一実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは、配列番号４または５のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、変異型Ｙａｐ１ｐは、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２１または２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、システインリッチドメインの第２のシステイン（配列番号３の６２６位の残基に対応する）は親水性アミノ酸残基（上に示したような）、好ましくはアスパラギン酸残基により置換されている。
【００３５】
本開示はまた、そのような断片および変異体が、野生型Ｙａｐ１ｐと比較したとき宿主細胞の核から細胞質へ転移する能力の低下または欠如を示す場合に、変異型Ｙａｐ１ｐの断片および／または変異体を使用することを含む。変異型Ｙａｐ１ｐの断片は、変異型Ｙａｐ１ｐより少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を有する変異型Ｙａｐ１ｐを指す。この欠失は、野生型タンパク質のＮ末端、Ｃ末端のいずれかまたはＮ末端およびＣ末端の両方で起こり得る。変異型Ｙａｐ１ｐの変異体は、１つまたは複数のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基で置換されたものであり得る。変異型Ｙａｐ１ｐの「変異体」は、保存的変異体または対立遺伝子変異体であり得る。本明細書において使用されるように、保存的変異体とは、変異型Ｙａｐ１ｐの生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変更を指す。置換、挿入または欠失は、変更された配列が変異型Ｙａｐ１ｐに関連する生物学的機能を妨害または破壊する場合、タンパク質に悪影響を与えると言われる。例えば、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、タンパク質の全体的な電荷、構造または疎水性−親水性特性を変更することができる。したがって、変異型Ｙａｐ１ｐの生物学的活性に有害な影響を与えることなく、変異型Ｙａｐ１ｐを例えばより疎水性または親水性にするためにアミノ酸配列を変更することができる。
（ｉｉｉ）異種スレオニンアルドラーゼ（Ｇｌｙ１ｐ）
グリシンはＧＳＨの産生に必要である。Ｌ−スレオニンアルドラーゼタンパク質（Ｇｌｙ１ｐとも呼ばれる）は、スレオニンからアセトアルデヒドを除去してグリシンを生成することを触媒する。
【００３６】
本開示の遺伝子修飾された宿主細胞（および特に本開示の遺伝子修飾された酵母宿主細胞）は、異種Ｇｌｙ１ｐをコードする異種核酸分子を含み得る。したがって、このような遺伝子修飾された宿主細胞は、異種Ｇｌｙ１ｐを発現することができ、適切な条件に置かれた場合、遺伝子修飾された宿主細胞は、場合によって、異種Ｇｓｈ１ｐおよび／または変異型Ｃｙｓ４ｐの発現と組み合わせて、総チオール（およびＧＳＨ産生）の増加を好む異種Ｇｌｙ１ｐを発現する。Ｇｌｙ１ｐをコードする異種核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞中の１つまたは複数のコピーに（１つまたは複数の中立的組込み部位で）組み込まれ得る。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞（および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞）は、Ｇｌｙ１ｐをコードする異種核酸分子のコピーを（１つまたは複数の中立的組込み部位に）組み込んだ１つまたは複数（例えば、少なくとも２つ、３つまたは４つ）のコピーを有する。
【００３７】
一実施形態において、異種Ｇｌｙ１ｐは、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、異種Ｇｌｙ１ｐは、図９に示される異種Ｇｌｙ１ｐの任意の１つである。さらに別の実施形態において、異種Ｇｌｙ１ｐは、図９に示されるコンセンサス配列に対応する。
【００３８】
本開示はまた、１つまたは複数のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基で置換されたものであり得る異種Ｇｌｙ１ｐの変異体に関する。異種Ｇｌｙ１ｐの「変異体」は、保存的変異体または対立遺伝子変異体であり得る。本明細書において使用されるように、保存的変異体は、異種Ｇｌｙ１ｐの生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化を指す。置換、挿入または欠失は、変化した配列が異種Ｇｌｙ１ｐに関連する生物学的機能を妨害または破壊する場合、タンパク質に悪影響を与えると言われている。例えば、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、タンパク質の全体的な電荷、構造または疎水性−親水性特性を変更することができる。したがって、異種Ｇｌｙ１ｐの生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、異種Ｇｌｙ１ｐを例えばより疎水性または親水性にするために、アミノ酸配列を変更することができる。
【００３９】
さらに別の実施形態において、本開示の異種Ｇｌｙ１ｐの変異体は、異種Ｇｌｙ１ｐがスレオニンアルドラーゼ活性を示すならば、図９に示されたコンセンサス配列と配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を共有し得る。「同一性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９１）に記載されているものを含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにまとめられている。配列アラインメントおよびパーセント同一性計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて行うことができる。本明細書中に開示の配列の複数のアライメントは、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３頁）を使用してデフォルトのパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用いて行った。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いたペアワイズアライメントのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＢ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であった。
【００４０】
一実施形態において、異種Ｇｌｙ１ｐは、スレオニンアルドラーゼ活性を示す野生型Ｇｌｙ１ｐの断片である。本開示の文脈において使用される場合、「断片」という用語は、野生型タンパク質より少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を有するタンパク質を指す。この欠失は、野生型異種Ｇｌｙ１ｐのＮ末端、Ｃ末端のいずれかまたはＮ末端およびＣ末端の両方で起こり得る。本開示の文脈において、異種Ｇｌｙ１ｐが野生型Ｇｌｙ１ｐの断片である場合、それは野生型Ｇｌｙ１ｐの触媒ドメインを少なくとも含む。いくつかの実施形態において、異種Ｇｌｙ１ｐの断片は、野生型Ｇｌｙ１ｐの少なくとも２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０またはそれ以上の連続したアミノ酸残基を有することができる。
（ｉｖ）さらなる異種核酸分子
遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Ｃｙｓ４ｐをコードする第１の異種核酸分子、変異型Ｙａｐ１ｐをコードする第２の異種核酸分子および／または異種Ｇｌｙ１ｐをコードする第３の異種核酸分子の少なくとも１つを含む。さらなる実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第１の異種核酸分子（変異型Ｃｙｓ４ｐをコードする）および第２の核酸分子（変異型Ｙａｐ１ｐをコードする）の少なくとも１つまたは第３の異種核酸分子（スレオニンアルドラーゼタンパク質（Ｇｌｙ１ｐ）をコードする）を含む。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Ｃｙｓ４ｐをコードする第１の異種核酸分子および変異型Ｙａｐ１ｐをコードする第２の異種核酸分子の両方を含む。さらなる実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Ｃｙｓ４ｐをコードする第２の異種核酸分子および異種のＧｌｙ１ｐをコードする第３の異種核酸分子の両方を含む。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Ｙａｐ１ｐをコードする第２の異種核酸分子および異種Ｇｌｙ１ｐをコードする第３の異種核酸分子の両方を含む。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Ｃｙｓ４ｐをコードする第１の異種核酸分子、変異型Ｙａｐ１ｐをコードする第２の異種核酸分子および異種Ｇｌｙ１ｐをコードする第３の異種核酸分子を含む。
【００４１】
複数の異種核酸分子が遺伝子修飾された宿主細胞（遺伝子修飾された酵母宿主細胞など）に存在する実施形態において、各々の異種核酸分子は、（１つまたは複数のコピーにおける）中立的組込み部位に組み込まれるか、および／または天然の（野生型）核酸分子（例えば、Ｃｙｓ４ｐまたはＹａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子）をコードする核酸分子のコピーの一方または両方を置換することができる。例えば、第１、第２および第３の異種核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞中の１つまたは複数のコピーで（１つまたは複数の中立的組込み部位で）両方を組み込むことができる。このような実施形態において、中立的組込み部位は同じであっても異なっていてもよい。別の例において、第１の異種核酸分子は、天然のＣｙｓ４ｐをコードする天然の核酸分子の１つまたは複数のコピーを置換することができ、第２の異種核酸分子の１つまたは複数のコピーは、１つまたは複数の中立的組込み部位に組み込むことができる。さらに別の例において、遺伝子修飾された宿主細胞（および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞）は、第１および第２の異種核酸分子（１つ又は複数の中立的組込み部位で）のコピーが組み込まれた１つまたは複数のコピーを有することができ、天然のＣｙｓ４ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピー（または両方のコピー）は第１の異種核酸によって置換される。さらに別の例では、第１の異種核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞中の１つまたは複数のコピーで（１つまたは複数の中立的組込み部位に）組み込むことができる一方で、第２の核酸分子は、天然の野生型Ｙａｐ１ｐをコードする核酸分子の１つまたは両方のコピーを置換することができる。第１の異種核酸分子は、天然のＣｙｓ４ｐをコードする天然の核酸分子の１つまたは複数のコピーを置換することができ、第２の異種核酸は、天然のＹａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の１つまたは複数のコピーを置換することができる。さらに別の例において、遺伝子修飾された宿主細胞（および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞）は、（１つまたは複数の中立的組込み部位で）第１の異種核酸分子のコピーが組み込まれた１つまたは複数のコピーを有することができ、ここで、天然のＣｙｓ４ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピー（または両方のコピー）が第１の異種核酸によって置換され、天然のＹａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピー（または両方のコピー）が第２の異種核酸分子によって置換されている。さらに別の例において、遺伝子修飾された宿主細胞（および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞）は、（１つまたは複数の中立的組込み部位で）第１および第２の異種核酸分子のコピーが組み込まれた１つまたは複数のコピーを有することができ、ここで、天然のＣｙｓ４ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピー（または両方のコピー）が第１の異種核酸によって置換され、天然のＹａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つのコピー（または両方のコピー）が第２の異種核酸分子によって置換されている。
【００４２】
遺伝子修飾された宿主細胞は、グルタチオンの産生および蓄積に好ましい追加の遺伝子をコードするさらなる異種核酸分子を含み得る。例えば、遺伝子修飾された宿主細胞は、Ｇｓｈ１ｐをコードする第４の核酸分子および／またはＧｓｈ２ｐをコードする第５の核酸分子を含み得る。さらに別の例において、遺伝子修飾された宿主細胞は、Ｇｓｈ１ｐをコードする第４の核酸分子およびＧｓｈ２ｐをコードする第５の核酸分子の両方を含み得る。組換え宿主細胞の異種核酸分子の各々は、遺伝子修飾された宿主細胞中の１つまたは複数のコピー内に存在し得る。例えば、異種核酸分子の各々は、遺伝子修飾された宿主細胞において１、２、３または４つのコピー内に存在し得る。異種核酸分子の各々のコピー数は独立して選択される。
【００４３】
一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Ｃｙｓ４ｐ（中立的な位置で組み込まれる）をコードする第１の異種核酸分子の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つのコピーを含み、ここで、野生型Ｙａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の少なくとも１つ、好ましくは２つのコピーは、変異型Ｙａｐ１をコードする第２の異種核酸分子によって置換されている。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Ｃｙｓ４ｐ（中立的な位置で組み込まれる）をコードする第１の異種核酸分子の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つのコピーおよび異種Ｇｌｙ１ｐをコードする第２の異種核酸分子少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つのコピーを含む。このような実施形態において、Ｇｓｈ１ｐをコードする第３の異種核酸分子およびＧｓｈ２ｐをコードする第４の異種核酸分子の各々の少なくとも２つ、好ましくは４つのコピーを含むことが必要であり得る。
【００４４】
一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞（および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞）は、第２、第３、第４および第５の異種核酸分子を（組み込まれた形態で）担持する。天然の野生型Ｙａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の両方のコピーはそれぞれ、第２の異種核酸分子によって置換される。さらに、第２の核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞のゲノムにおいて複数コピー（好ましくは４つ）に組み込まれる。さらに、第３および第４の核酸分子の両方は各々、遺伝子修飾された宿主細胞のゲノム中に複数コピー（好ましくは４つ）に組み込まれる。
【００４５】
さらなる実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞（および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞）は、第１、第２、第３、第４および第５の異種核酸分子を（組み込まれた形態で）担持する。天然の野生型Ｃｙｓ４ｐおよび天然の野生型Ｙａｐ１ｐをコードする天然の核酸分子の各々の両方のコピーはそれぞれ、第１および第２の異種核酸分子によって置換される。さらに、第２の核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞のゲノムにおいて複数コピー（好ましくは４つ）に組み込まれる。さらに、第３および第４の核酸分子は各々、遺伝子修飾された宿主細胞のゲノム中に複数コピー（好ましくは４つ）に組み込まれる。
【００４６】
一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、野生型または変異型シスタチオニンγ−リアーゼタンパク質（Ｃｙｓ３ｐ）をコードする異種核酸分子を含まないが、それにもかかわらず、天然のシスタチオニンγ−リアーゼタンパク質（Ｃｙｓ３ｐ）を発現する。
遺伝子修飾された宿主細胞を製造するプロセス
遺伝子修飾された宿主細胞は、従来的な分子生物学的なツールおよび教示を使用して、調製することができる。本開示の文脈において、遺伝子修飾された宿主細胞を製造するためのプロセスは、変異型Ｃｙｓ４ｐをコードする第１の異種核酸分子、変異型Ｙａｐ１ｐをコードする第２の異種核酸分子、および／または異種Ｇｌｙ１ｐをコードする第３の異種核酸分子を導入するステップを含む。場合によって、本プロセスはまた、Ｇｓｈ１ｐをコードする第４の異種核酸分子および／またはＧｓｈ２ｐをコードする第５の異種核酸分子を導入するステップも含み得る。一実施形態において、本プロセスは、野生型または変異型シスタチニンγ−リアーゼタンパク質（Ｃｙｓ３ｐ）をコードする異種核酸分子の導入を含まない（例えば、除外する）が、それにもかかわらず、天然のシスタチオニンγ−リアーゼタンパク質（Ｃｙｓ３ｐ）を発現する。
【００４７】
異種核酸分子の各々は、独立して、遺伝子修飾された宿主細胞に組み込まれ得るか、または独立して、そこで複製し得る。本明細書において使用される「組み込まれる」という用語は、分子生物学技法によって、宿主細胞のゲノムに入れられる、遺伝子要素を指す。例えば、遺伝子要素は、宿主細胞によって保持されるプラスミドなどのベクターとは対照的に、宿主細胞の染色体内に入れることができる。遺伝子要素を宿主細胞のゲノムに組み込むための方法は、当該技術分野において周知であり、これには、相同的組換えが挙げられる。異種核酸分子は、宿主細胞のゲノムに１つまたは複数のコピーで存在し得る。代替として、異種核酸分子は、独立して、宿主細胞のゲノムから複製していてもよい。このような実施形態において、異種核酸分子は、安定であり、自己複製が可能である。
【００４８】
一実施形態において、少なくとも１つの異種核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞のゲノムに組み込まれる。さらに別の実施形態において、すべての異種核酸分子が、遺伝子修飾された宿主細胞のゲノムに組み込まれる。異種核酸分子の各々は、中立的組込み部位（同じかもしくは異なる部位）に組み込まれ得るか、または対応する野生型タンパク質をコードする対応する天然の核酸分子を特異的に置換するように設計され得るかのいずれかである。
【００４９】
一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞に導入されることが意図される１つまたは複数の異種核酸分子は、それが意図されるレシピエント宿主細胞に導入される前に、少なくとも部分的または完全に、コドン最適化されることが企図される。
【００５０】
一実施形態において、存在する場合、変異型Ｃｙｓ４ｐをコードする第１の異種核酸分子は、中立的組込み部位に組み込まれる。複数のコピー（例えば、２つ、３つ、または４つのコピー）に存在する場合、第１の異種核酸分子の各々は、同じかまたは異なる中立的組込み部位に組み込まれ得る。代替としてまたは組み合わせて、第１の異種核酸分子は、野生型Ｃｙｓ４ｐをコードする核酸分子の１つまたは両方のコピーを置換することができる。
【００５１】
なお別の実施形態において、存在する場合、変異型Ｙａｐ１ｐをコードする第２の異種核酸分子は、酵母宿主細胞において、野生型Ｙａｐ１ｐをコードする核酸分子の１つまたは好ましくは両方のコピーを置換することができる。代替としてまたは組み合わせて、第２の異種核酸分子は、中立的組込み部位（これは、第１の異種核酸分子の組込み部位と同じであっても異なってもよい）に組み込まれ得る。複数のコピー（例えば、２つ、３つ、または４つ）に存在する場合、第２の異種核酸分子の各々は、同じかまたは異なる組込み部位（これは、第１の異種核酸分子の組込み部位と同じであっても異なってもよい）に組み込まれ得る。
【００５２】
なおさらなる実施形態において、存在する場合、第３の異種核酸分子（Ｇｌｙ１ｐをコードする）は、同じかまたは異なる中立的組込み部位（これは、第１または第２の異種核酸分子の組込み部位と同じであっても異なってもよい）に組み込まれ得る。
【００５３】
一実施形態において、存在する場合、第４の異種核酸分子（Ｇｓｈ１ｐをコードする）および第５の異種核酸分子（Ｇｓｈ２ｐをコードする）は、同じかまたは異なる中立的組込み部位（これは、第１または第２の異種核酸分子の組込み部位と同じであっても異なってもよい）に組み込まれ得る。
【００５４】
さらに別の実施形態において、本プロセスは、変異型Ｃｙｓ４ｐをコードする第１の異種核酸分子の１つまたは複数のコピーを１つまたは複数の中立的組込み部位に組み込むステップと、宿主細胞（例えば、酵母宿主細胞）において野生型Ｙａｐ１ｐをコードする核酸分子の１つまたは好ましくは両方のコピーを、変異型Ｙａｐ１ｐをコードする第２の異種核酸分子と置換するステップとを含み得る。このような実施形態において、本プロセスはまた、スレオニンアルドラーゼ（Ｇｌｙ１ｐ）をコードする第３の異種核酸分子、Ｇｓｈ１ｐをコードする第４の異種核酸分子、およびＧｓｈ２ｐをコードする第５の核酸分子の１つまたは複数のコピーを、同じかまたは異なる中立的組込み部位に組み込むステップを含み得る。
【００５５】
異種核酸分子は、ベクターを使用して、宿主細胞に導入することができる。「ベクター」、例えば、「プラスミド」、「コスミド」、または「ＹＡＣ」（酵母人工染色体）は、染色体外要素を指し、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態をしている。このようなベクターは、任意の供給源に由来する、自律的複製配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列、線形、環状、もしくはスーパーコイルの一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡであり得、いくつかのヌクレオチド配列が、接合または組み換えられて、プロモーター断片および選択された遺伝子産物のためのＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列とともに細胞に導入することが可能な固有の構成となっている。
【００５６】
異種核酸分子が、中立的組込み部位に組み込まれることが意図される場合、異種核酸分子にプロモーターを含めることが必要であり得る。このような実施形態において、プロモーターおよび目的のタンパク質をコードする核酸分子は、互いに作動可能に連結されている。本開示の文脈において、「作動可能に連結されている」または「作動可能に結合している」という表現は、プロモーターが、ある特定の条件下において、核酸分子からの異種タンパク質の発現を可能にする様式で、異種タンパク質をコードする核酸分子と物理的に結合しているという事実を指す。一実施形態において、プロモーターは、異種タンパク質をコードする核酸配列の上流（５’）に位置し得る。本開示の文脈において、１つまたは１つを上回るプロモーターが、異種核酸分子に含まれてもよい。１つを上回るプロモーターが、異種核酸分子に含まれる場合、プロモーターの各々は、異種タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。
【００５７】
異種核酸分子が、中立的組込み部位に組み込まれることが意図される場合、異種核酸分子にターミネーターを含めることが必要であり得る。このような実施形態において、ターミネーターおよび目的のタンパク質をコードする核酸分子は、互いに作動可能に連結されている。本開示の文脈において、「作動可能に連結されている」または「作動可能に結合している」という表現は、ターミネーターが、ある特定の条件下において、異種タンパク質のコーディング配列の末端を示すことを可能にする様式で、異種タンパク質をコードする核酸と物理的に結合しているという事実を指す。一実施形態において、ターミネーターは、異種タンパク質をコードする核酸配列の上流（３’）に位置し得る。本開示の文脈において、１つまたは１つを上回るターミネーターが、異種核酸分子に含まれてもよい。１つを上回るターミネーターが、異種核酸分子に含まれる場合、ターミネーターの各々は、異種タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。
【００５８】
グルタチオンを製造するプロセス
本開示はまた、本明細書に記載されるかまたは本明細書に記載されるプロセスによって得られる遺伝子修飾された宿主細胞の使用に基づいて、グルタチオンを製造するためのプロセスにも関する。概して、本プロセスは、遺伝子修飾された宿主細胞で基質を発酵させてグルタチオンを含む発酵混合物を得るステップを含む。本開示の文脈において使用されるとき、「基質」という用語は、発酵の間に使用することができる、宿主細胞のための炭素の供給源を指す。基質は、液体形態であることが好ましく、場合によっては、炭水化物（例えば、グルコース）、糖アルコール（例えば、グリセロール）、ビタミン、ミネラル、ならびに／またはアミノ酸（例えば、システインおよび／もしくはグリシン）が補充されていてもよい。遺伝子修飾された宿主細胞が、遺伝子修飾された酵母宿主細胞である場合、このような基質は、限定することなく、組成規定培地または非組成規定培地、例えば、糖蜜（テンサイまたはサトウキビから得られる）などであり得る。発酵は、異種核酸分子の発現およびグルタチオンの蓄積を可能にする状況下において行われる。
【００５９】
本プロセスは、遺伝子修飾された宿主細胞で基質を発酵させてＧＳＨを含む発酵混合物を得るステップを含む。「発酵混合物」という用語は、発酵基質、遺伝子修飾された宿主細胞、および遺伝子修飾された宿主細胞による発酵の間に産生される代謝産物を指す。発酵混合物は、様々な後続の操作によってさらに処理され得る。例えば、発酵したものの抽出物を得ることができ、このような抽出物を、場合によっては、脱水または乾燥させてもよい。本開示の文脈において、発酵混合物の抽出物中、遺伝子修飾された宿主細胞は、不活性化されており、全体として存在してもよく（すなわち、遺伝子修飾された宿主細胞が、相対的にインタクトである）、またはさらに成分に分けられていてもよい（すなわち、遺伝子修飾された宿主細胞は、意図的に破壊される）。遺伝子修飾された宿主細胞が、酵母である場合、酵母抽出物が、発酵混合物から産生され得る。例えば、酵母抽出物は、発酵混合物を加水分解または自己分解し（化学的、熱的、および／もしくは酵素的に）、続いて可溶性画分から不溶物を分離（単離）することによって、得ることができる（酵母抽出物に対応する）。酵母抽出物は、加水分解された遺伝子修飾された宿主細胞からなる。発酵混合物は、加水分解して、加水分解物を得ることができ、これを、場合によっては、脱水または乾燥させてもよい。遺伝子修飾された酵母宿主細胞が、酵母である場合、酵母加水分解物を、発酵混合物から得ることができる。酵母加水分解物は、遺伝子修飾された酵母細胞を、それ自体の酵素によって溶解させることによって、得ることができる。酵母加水分解物は、通常、可溶性画分および不溶性画分の両方を含む。いくつかの実施形態において、本プロセスは、発酵混合物から遺伝子修飾された宿主細胞（例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞など）を精製するステップをさらに含む。精製された遺伝子修飾された宿主細胞は、細胞の完全性を維持し、後続の増殖を可能にするために、処理（アリコートへ分割、希釈、凍結、濾過、および／または凍結乾燥）してもよい。代替として、遺伝子修飾された宿主細胞（例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞など）は、処理（アリコートへ分割、希釈、凍結、濾過、および／または凍結乾燥）される前に、不活性化（例えば、殺滅）されてもよい。場合によって、グルタチオンは、精製され得る（少なくとも部分的に、およびいくつかの実施形態では完全に）。
【００６０】
発酵混合物またはそれから得ることができ様々な生成物は、例えば、医薬用途、化粧品用途、ならびに動物およびヒトの食品用途（例えば、栄養、製パン、およびワイン製造）などの多数の用途において有利に使用することができる。グルタチオンおよびグルタチオンを含む生成物は、経口投与、局所投与、または非経口投与のために製剤化され得る。
【００６１】
本発明は、本発明の範囲を限定するのではなく本発明を例示するために提供される以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００６２】
実施例１
遺伝子修飾されたサッカロミセス・セレビシアエ宿主細胞
遺伝子カセット（天然のプロモーターおよびターミネーターを含む）を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、相同的組換えによって、示される標的部位（表１）に組み込んだ。
【００６３】
【表１−１】
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【００６４】
【表１−２】
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【００６５】
チオール含量の判定。単独または組み合わせで、これらの構築物を含む株の５ミリリットル培養物を、３２℃で、２００ｒｐｍの振盪フラスコにおいて、規定培地で１８時間増殖させた。次いで、エルマン試薬を使用して総チオールの測定を行った。
【００６６】
株は、ＣＹＳ４の２つのコピーを付加した場合に、１．２倍多いチオールを産生したが、この効果は、ＣＹＳ４．３５３を使用した場合に、有意により顕著であり、１．７倍のチオール含量の増加があった。Ｙａｐ１ｐの構成的発現により、１．３倍の総チオール含量の増加があり、ＣＹＳ４．３５３と組み合わせた場合には１．８倍であった。
【００６７】
構成的に活性なＹａｐ１ｐのさらなるコピー、ＣＹＳ４．３５３のさらなるコピー、ならびにＧＳＨ１およびＧＳＨ２の余分なコピーを発現する追加の株を、設計した（３つの遺伝子は、Ｙａｐ１ｐによって正に制御される）。ＧＳＨ１およびＧＳＨ２は、中立的組込み部位に付加した。すべての遺伝子は、天然のプロモーターおよびターミネーターの制御下にある。親株と比較した、結果として得られる総チオール（見かけのＧＳＨ）の増加を、図１に表し、表２に示す。
【００６８】
【表２】
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【００６９】
無添加（市販のクリーム）、システインのみを添加（市販のクリーム＋Ｃｙｓ）、またはシステインおよびグリシンの両方を添加（市販のクリーム＋Ｃｙｓ＋Ｇｌｙ）の工業用２０Ｌ発酵槽中で増殖させた後、ＳＩＬ０６８株から不活性な乾燥酵母を産生した。遊離システイン、γ−ＧＣ、および真のＧＳＨの分布を正確に測定するために、ＨＰＬＣを使用してチオールを定量化し、結果を、図２に示す。興味深いことに、工業条件下において糖蜜中で増殖させたＳＩＬ０６８は、１．６％の真のＧＳＨ含量を示した（１．９％の総チオール）。システインおよびグリシンを添加すると、真のＧＳＨは、４．８％まで増加し得る（６．３％の総チオール）。
【００７０】
ＣＹＳ３の追加のコピーを、ＣＹＳ４（ＳＩＬ０１６）またはＣＹＳ４．３５３（ＳＩＬ０２０）の余分なコピーとともに含む追加の株を、構築した（表１）。このような株は、単にＣＹＳ４またはＣＹＳ４．３５３を過剰発現するものと比較して、見かけのＧＳＨ含量の増加を示さなかった（図１、表２）。
【００７１】
不活性な乾燥酵母（ＩＤＹ）を、システインまたはシステインおよびグリシンの添加によって繁殖させた市販のクリームから産生した。ＩＤＹを、標準的なノータイムドウのレシピを使用して、バゲットにおいて、そのパン生地緩和作用について試験した。緩和作用は、バゲットを測定することによって評価する（生地緩和作用が高いほど、バゲットは長くなる）。
【００７２】
この試験に使用したＳＩＬ０６８  ＩＤＹ１（システインおよびグリシンで繁殖させたＳＩＬ０６８株で不活性な乾燥酵母を作製することによって得た）は、４．９２％の真のＧＳＨが測定され、総チオールについては６％であった。ＳＩＬ０６８  ＩＤＹ２（システインのみで繁殖させたＳＩＬ０６８株で不活性な乾燥イーストを作製することによって得た）は、１．９％の真のＧＳＨが測定され、総チオールについては５．７％であった。使用したＩＤＹの量は、Ｆｅｒｍａｉｄ−ＳＲ（商標）市販製品からの総チオール量を反映するように、必要に応じて調節したが、これは、特定のロットでは、１７％総チオールであることが測定された。
【００７３】
図３および以下の表３において見られるように、いずれのＳＩＬ０６８  ＩＤＹも、総チオール含量に比例する生地緩和作用を有する。サンプルの生地緩和性能は、その見かけのＧＳＨ含量と関連すると見られる。
【００７４】
【表３】
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【００７５】
組換え宿主細胞におけるＧＳＨ含量をさらに増加させるために、ＧＬＹ１の役割をさらに調査した。遺伝子修飾された酵母株ＳＩＬ０６１は、構成的プロモーターの制御下にあるＧＳＨ１の８つの余分なコピー、構成的プロモーターの制御下にあるＧＳＨ２の２つの余分なコピー、および内因性ＣＹＳ４プロモーターの制御下にあるＣＹＳ４．３５３の２つのコピーを含む。ＳＩＬ０６１は、構成的プロモーターの制御下にあるＧＬＹ１の４つの追加のコピーを含むように、さらに操作した（ＳＩＬ１４３）。１ｍＭのシステインを添加した最小培地において増殖させると、ＧＬＹ１の余分なコピーが、中間体γ−ＧＣからＧＳＨへの６０％を上回る変換をもたらした（図４）。
【００７６】
実施例２
遺伝子修飾されたピキア・パストリス宿主細胞
実施例１の遺伝子修飾が、他の属に適用できるかどうかを判定するために、遺伝子修飾されたＰ．パストリス宿主細胞を作製した。遺伝子カセット（天然のプロモーターおよびターミネーターを含む）を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、相同的組換えによって、示される標的部位（表２）に組み込んだ。
【００７７】
【表４】
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【００７８】
野生型または遺伝子修飾されたＰ．パストリスの５ミリリットル培養物を、３２℃で、２００ｒｐｍの振盪フラスコにおいて、規定培地で１８時間増殖させた。エルマン試薬を使用して、チオールを誘導体化させ、実施例１に記載されるように、ＨＰＬＣによって定量化した。
【００７９】
野生型ＣＹＳ４を有する株（ＳＩＬ１４８）は、野生型株と比較して、総チオール含量に改善を示さない。しかしながら、図５に示されるように、ＣＹＳ４．３４０を発現する株（ＳＩＬ１５０）は、真のＧＳＨ含量に１．５８倍の増加を有する。これは、変異型ＣＹＳ４（制御ドメインを有さないＣｙｓ４ｐをコードする）が、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属におけるＧＳＨ産生に肯定的な作用を有することを示す。
【００８０】
ＹＡＰ１の余分なコピーを有する株ＳＩＬ１５１は、野生型Ｘ−３３と比較して、ＧＳＨ含量に１．３９倍の増加を示す。変異型ＹＡＰ１、ＹＡＰ１．Ｃ４１４Ｄの余分なコピーを株ＳＩＬ１５３に組み込むことにより、ＧＳＨ産生がＸ−３３のものより２．０７倍増加し、したがって、野生型ＹＡＰ１よりも有意に多い。株ＳＩＬ１５３は、株ＳＩＬ１５１よりも真のＧＳＨ含量に１．４８倍の増加を示した。これは、変異型ＹＡＰ１が、コマガタエラ属におけるＧＳＨ産生に肯定的な作用を有することを示す。
【００８１】
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されているが、特許請求の範囲が、実施例に記載される好ましい実施形態によって限定されるものではなく、全体として記述に一致する最も広範な解釈が与えられるべきであることを、理解されたい。
（参考文献）
【００８２】
【表５】
2019509758.tif 000008
【図１】
2019509758.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
2019509758.tif 000012
【図５】
2019509758.tif 000013
【図６】
2019509758.tif 000014
【図７−１】
2019509758.tif 000015
【図７−２】
2019509758.tif 000016
【図７−３】
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【図７−４】
2019509758.tif 000018
【図７−５】
2019509758.tif 000019
【図８−１】
2019509758.tif 000020
【図８−２】
2019509758.tif 000021
【図８−３】
2019509758.tif 000022
【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
2019509758.tif 000030
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019509758.tif 000032
2019509758.tif 000033
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