(57)【要約】  複数の異なる標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、前記標的細菌に対して毒性である毒素タンパク質をコードする毒素遺伝子を含み、溶菌性であり、複数の細菌宿主特異性を有する宿主域決定因子タンパク質を発現することを特徴とする改変バクテリオファージ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なる標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、前記標的細菌に対して毒性である毒素タンパク質をコードする毒素遺伝子を含み、溶菌性であり、複数の細菌宿主特異性を有する宿主域決定因子タンパク質を発現することを特徴とする改変バクテリオファージ。
【請求項２】
前記毒素遺伝子が、ＳＡＳＰをコードするα／β低分子酸可溶性胞子タンパク質（ＳＡＳＰ）遺伝子を含む請求項１に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３】
前記ＳＡＳＰが、ＳＡＳＰ−Ｃである請求項１から２のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項４】
前記ＳＡＳＰ−Ｃが、バシラス・メガテリウム由来である請求項３に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項５】
前記宿主域決定因子の細菌宿主特異性が、同一細菌種内にある請求項１に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項６】
前記毒素遺伝子が、構成的プロモーターの制御下にある請求項１から５のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項７】
前記構成的プロモーターが、ｐｄｈＡ、ｒｐｓＢ、ｐｇｉ、ｆｄａ、ｌａｓＢ、及びそれらと９０％を超える配列同一性を有するプロモーターから選択される請求項６に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項８】
前記構成的プロモーターが、ｆｄａである請求項７に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項９】
前記標的細菌の少なくとも１つが、シュードモナスである請求項１から８のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１０】
前記複数の異なる標的細菌が、複数の異なるシュードモナス細菌である請求項９に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１１】
前記シュードモナス細菌が、緑膿菌を含む請求項９から１０のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１２】
ハイブリッド宿主域決定因子が、複数の異なる感染部位に由来し、且つ抗生物質耐性表現型の範囲を含む、少なくとも３５種、好ましくは５０種を超える臨床分離株の集団の５０％超により定義される広い宿主域を有する請求項１から１１のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１３】
前記宿主域決定因子が、尾部繊維タンパク質を含む請求項１から１２のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１４】
各尾部繊維タンパク質が、前記標的細菌に結合するための受容体結合領域、及び前記受容体結合領域をバクテリオファージの本体に連結する領域を含む請求項１３に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１５】
前記受容体結合領域がＣ末端受容体結合領域であり、前記Ｃ末端受容体結合領域を前記バクテリオファージの本体に連結する領域がＮ末端領域である請求項１４に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１６】
バクテリオファージＰｈｉ３３のアミノ酸配列に基づいて、前記Ｎ末端領域が前記尾部繊維タンパク質のアミノ酸１〜６２８を含み、前記Ｃ末端領域が前記尾部繊維タンパク質のアミノ酸６２９〜９６４を含む請求項１５に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１７】
前記Ｃ末端領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３のＣ末端領域と９６％以下のアミノ酸配列同一性を有する請求項１５から１６のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１８】
前記Ｃ末端領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＪＧ０２４、ＮＨ４、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、Ｃ３６、及びＰＴＰ９３のいずれか１つに由来する請求項１７に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項１９】
前記Ｃ末端領域のアミノ配列同一性が、８０％未満である請求項１８に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項２０】
前記Ｃ末端領域のアミノ酸配列同一性が、７０％未満である請求項１９に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項２１】
前記Ｃ末端領域のアミノ酸配列同一性が、６０％未満である請求項２０に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項２２】
前記Ｎ末端領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３のＮ末端領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する請求項１４から２１のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項２３】
前記Ｎ末端領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＪＧ０２４、ＮＨ４、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、Ｃ３６、及びＰＴＰ９３のいずれか１つに由来する請求項２２に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項２４】
前記宿主域決定因子タンパク質が、複数の異なるバクテリオファージ由来のアミノ酸配列をそれぞれが含むハイブリッド宿主域決定因子タンパク質である請求項１から２３のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項２５】
前記ハイブリッド宿主域決定因子タンパク質が、Ｃ末端受容体結合領域及び前記Ｃ末端受容体結合領域を前記バクテリオファージの本体に連結するＮ末端領域を含むハイブリッド尾部繊維タンパク質を含み、前記Ｃ末端及びＮ末端領域がそれぞれ異なるバクテリオファージに由来する請求項２４に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項２６】
各ハイブリッド尾部繊維タンパク質が、バクテリオファージＰＴＰ４７のＣ末端受容体結合領域及びバクテリオファージＰｈｉ３３のＮ末端領域を含む請求項２５に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項２７】
各ハイブリッド尾部繊維タンパク質が、バクテリオファージＰＴＰ９２のＣ末端受容体結合領域及びバクテリオファージＰｈｉ３３のＮ末端領域を含む請求項２５に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項２８】
前記バクテリオファージが、複数の異なる宿主域決定因子を発現し、各宿主域決定因子は異なる細菌宿主特異性を有する請求項１から２３のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項２９】
各宿主域決定因子タンパク質が、Ｐｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＪＧ０２４、ＮＨ４、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、Ｃ３６、及びＰＴＰ９３から選択されるバクテリオファージに由来する尾部繊維タンパク質を含む請求項２８に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３０】
バクテリオファージＰＴＰ３８７である請求項２３に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３１】
標的細菌に感染することができ、前記標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰをコードするＳＡＳＰ遺伝子を含む少なくとも１つの他の改変バクテリオファージと混合される請求項１から３０のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３２】
薬剤としての使用のための、請求項１から３１のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３３】
細菌感染の治療に使用するための、請求項１から３２のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３４】
前記細菌感染が、限局性臓器感染又は多臓器感染を含む請求項３３に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３５】
前記感染が、局所感染、経口感染、呼吸器感染、眼感染、又は血流感染を含む請求項３４に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３６】
ヒトの治療用である、請求項３２から３５のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３７】
細菌細胞増殖の治療的阻害又は予防における使用のための、請求項１から３１のいずれかに記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３８】
請求項１から３１のいずれかに記載の改変バクテリオファージ及びそのための担体を含むことを特徴とする細菌細胞増殖を阻害又は予防するための組成物。
【請求項３９】
少なくとも２つが異なる宿主特異性を有する複数の前記改変バクテリオファージを含む請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
バクテリオファージＰＴＰ３８７、バクテリオファージＰＴＰ３８８、及びバクテリオファージＰＴＰ３８９を含む請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
医薬における使用のために製剤化される、請求項３８から４０のいずれかに記載の組成物。
【請求項４２】
局所使用のために製剤化される、請求項３８から４１のいずれかに記載の組成物。
【請求項４３】
呼吸器への送達のために製剤化される、請求項３８から４１のいずれかに記載の組成物。
【請求項４４】
細菌除染剤としての、請求項１から３１のいずれかに記載の改変バクテリオファージの使用。
【請求項４５】
表面細菌汚染の処理、土地修復、又は水処理を含む請求項４４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変バクテリオファージ、その使用、及び前記改変バクテリオファージを含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関の２０１４年の抗菌剤耐性の世界規模調査に関する報告では、抗生物質耐性が世界的な問題であり、地域社会や病院における一般的な感染症を治療する能力を危うくしていることが明らかにされた。迅速な対応なしでは、世界はポスト抗生物質の時代に向かっており、何十年にも亘って治療可能であった一般的な感染症や軽傷が再び死に繋がり得る可能性がある（非特許文献１）。抗生物質耐性は、軽微な手術からの患者の回復を困難にし、ますます治療上の失敗を引き起こす。事実、利用可能な全ての抗生物質に対して耐性がある、世界中を循環する細菌の幾つかの属の新たな株が存在する。そのような株は、一般に、いわゆるＥＳＫＡＰＥ病原菌、即ち、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種の範囲に入る（非特許文献２）。ＥＳＫＡＰＥ病原菌という用語は、現在、これらの細菌が米国及び欧州で大多数の院内感染を引き起こし、現在の汎抗生物質耐性感染症が発生している状況において、利用可能な抗生物質の全てではないにしても、その大部分から効果的に「エスケープ」できることを強調するために、Ｂｏｕｃｈｅｒらによって名付けられた。病院で治療される一般的な細菌によって引き起こされる重篤な感染症の患者の死亡率は、同じ非耐性細菌によって引き起こされる感染症に罹患する患者の死亡率の約２倍である。例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の感染症は、非耐性型感染症の罹患者よりも、死亡する可能性が６４％高いと推定されている（非特許文献１）。グラム陽性細菌のうち、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌は、米国及び欧州の病院において、罹患率及び死亡率の主要原因となり続けている。しかし、より最近になって、アシネトバクター種、多剤耐性（ＭＤＲ）緑膿菌、カルバペネム耐性クレブシエラ種、及び大腸菌などの幾つかの高度に耐性なグラム陰性病原体が、重篤な、時に治療不能な感染症を引き起こす主要病原体として浮上している。医学の進歩はますます複雑な処置が行われることを意味し、これらの進歩は、高齢患者数及び手術、移植、及び化学療法を受ける患者数の増加につながり、これらはいずれも、感染症のリスクにさらされる免疫不全個体数の更なる増加をもたらす（非特許文献３）。この現象は、効果的な抗生物質へのより大きな依存及び要求につながっている。
【０００３】
緑膿菌は、高頻度の多剤耐性（ＭＤＲ）である１つの細菌であり、その外膜の浸透性が低いことによる内因的な抵抗性を有し、細胞内に薬剤が入るのを制限し、且つ細胞内に成功裏に入った薬剤を放出する多数の流出ポンプを有する。緑膿菌は、グラム陰性菌に対する「最終手段の抗生物質」であるカルバペネムに対する耐性など、更なる耐性機構も獲得している。緑膿菌は、全ての院内感染症の約１０％を引き起こし、院内感染性肺炎の第２位の原因であり、全ての院内感染症処方の５０％を占めている。病院での緑膿菌感染症は、通常、患者が少なくとも２つの抗生物質で治療されることを記載する緑膿菌感染の現在の標準的ケアによる静脈内（ＩＶ）治療を必要とする。残念なことに、耐性は、患者の治療中に頻繁に発生する。過去３０〜４０年内に開発され承認された抗生物質の数は非常に少なく、新規で安全で効果的な抗菌剤が強く求められている。
【０００４】
従来の抗生物質の代替として、細菌内で広いスペクトルの抗菌活性を示すタンパク質の１つのファミリーは、α／β型の低分子酸可溶性胞子タンパク質（以下、ＳＡＳＰと称する）を含む。細菌内では、ＳＡＳＰは、細菌ＤＮＡに結合する：極低温電子顕微鏡を用いたこのプロセスの視覚化は、最も研究されたＳＡＳＰがＤＮＡを覆い、突起ドメインを形成し、Ｂ型（ピッチ３．４ｎｍ）からＡ型（３．１８ｎｍ；Ａ型のＤＮＡは２．８ｎｍのピッチを有する）にＤＮＡ構造を変化させることを示している（非特許文献４及び非特許文献５）。突出したＳｓｐＣモチーフは、隣接するＤＮＡ−ＳｓｐＣフィラメントと相互作用し、このフィラメントを核タンパク質ヘリックスの緊密なアセンブリにパッケージする。２００８年、Ｌｅｅらは、１０ｂｐのＤＮＡ二本鎖に結合したα／β型ＳＡＳＰの２．１Å分解能での結晶構造を報告した。この複合体では、α／β型ＳＡＳＰはヘリックスターンヘリックスモチーフを採用し、小溝接触を介してＤＮＡと相互作用し、約６ｂｐのＤＮＡと二量体として結合する。このＤＮＡはＡ−Ｂ型立体構造である。このようにして、ＤＮＡ複製が停止され、結合すると、ＳＡＳＰはＤＮＡ転写を妨げる。ＳＡＳＰは、非配列特異的な様式でＤＮＡに結合する（非特許文献６）ので、細菌ＤＮＡの変異はＳＡＳＰの結合に影響しない。α／β型ＳＡＳＰの配列は、好ましいα／β型ＳＡＳＰであるバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＳＡＳＰ−Ｃを含む特許文献１の付属書１に見出すことができる。
【０００５】
特許文献１は、ＳＡＳＰ遺伝子を組み込むように改変されたバクテリオファージの抗菌剤としての使用を記載している。細菌宿主における改変バクテリオファージの効果的な産生を提供するために、特許文献１は、産生中のＳＡＳＰ遺伝子の発現など、産生宿主の増殖を妨害し得る因子を回避することを目的とする。この目的のために、ＳＡＳＰ遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に配した。好ましい構成では、溶菌プロセスに関与する遺伝子コード産物の少なくとも１つが不活性化された。
【０００６】
特許文献２は、バクテリオファージの効果的な産生が達成できることを記載しており、ここでは、バクテリオファージが溶菌遺伝子を欠失し、バクテリオファージとは独立に制御され且つ外因的制御又はトランス制御（ｉｎ  ｔｒａｎｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が必要でなく提供されない構成的なプロモーターの制御下でＳＡＳＰをコードする遺伝子を有するように改変されている。そのような改変バクテリオファージは、製造宿主株においてプロファージとして維持され、適切な誘導方法によって増幅されて、製造宿主株内に新しいファージを合成することができる。この場合、生存可能なファージを放出させるためには、製造宿主株を、外因性物質、例えば、溶菌酵素又は化学物質の添加によって溶菌させなければならない。好適なプロモーターの例は、黄色ブドウ球菌由来のｆｂａＡプロモーターであり、これは、バシラス・メガテリウムからのＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の発現を駆動するために使用されると共に、例えば複数のコピーで存在する場合、例えば標的細胞の感染後に、ＳＡＳＰ発現の毒性レベルを駆動する。
【０００７】
ＳＡＳＰ遺伝子を含むように改変されたバクテリオファージベクターは、一般に、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターと称される。ＳＡＳＰ遺伝子が標的細菌に送達されると、これらの細菌ＤＮＡの中にＳＡＳＰが生成され、細菌ＤＮＡに結合し、ＤＮＡの立体構造をＢ型からＡ型に変化させる。標的細菌細胞内に十分なＳＡＳＰを産生すると、罹患細胞の生存率が低下する。
【０００８】
バクテリオファージは、１９２０年代又は３０年代以来、細菌感染症の治療薬として使用されている。一般に、バクテリオファージは、それらの細菌宿主に対して特異的である。バクテリオファージは、テンプレートファージであるものと、非テンプレートファージであるものとがある。テンプレートファージは、宿主細胞に感染することができ、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、この状態で宿主細胞に一般的には無害なプロファージになる。非テンプレート又は「溶菌性」ファージは、新しいバクテリオファージの子孫を作り、宿主細胞の溶菌及び成熟ファージ粒子を放出することによって、溶菌の生活様式においてのみ複製することができる。有用な医薬品のためには、有効な方法で種々の異なる細菌からの感染を治療するために使用することができるバクテリオファージ組成物を提供することが課題である。これは、最も強力なバクテリオファージ組成物：バクテリオファージの混合物又は「カクテル」として広範な宿主域を有するもの（非特許文献７及び非特許文献８）を用いて達成されると一般に考えられている。野生型ファージのカクテルが、臨床的菌株に対する十分な活性スペクトルを確保するために用いられている（非特許文献９）。このようなカクテルは、最大２０種類の無関係のファージからなることができる（非特許文献１０）。カクテルアプローチの代替法として、大腸菌バクテリオファージＫ１−５が単離されている。これは、大腸菌のＫ１株及びＫ５株の両方に感染及び複製することを可能にする、１つ以上の宿主域決定因子（ＨＲＤ）を有する天然の恒常的溶菌ファージである（非特許文献１１）。これらのファージは非常に強力であると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ０２／４０６７８
【特許文献２】ＷＯ２００９０１９２９３
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＷＨＯ，  ２０１４
【非特許文献２】Ｂｏｕｃｈｅｒら，  ２００９
【非特許文献３】Ｗａｌｋｅｒら，  ２００９
【非特許文献４】Ｆｒａｎｃｅｓｃｏｎｉら，  １９８８
【非特許文献５】Ｆｒｅｎｋｉｅｌ−Ｋｒｉｓｐｉｎら，  ２００４
【非特許文献６】Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら，  １９９０
【非特許文献７】Ｃａｒｌｔｏｎ，  １９９９
【非特許文献８】Ｋｕｔａｔｅｌａｄｚｅ及びＡｄａｍｉａ，  ２０１０
【非特許文献９】Ｂｕｒｒｏｗｅｓ及びＨａｒｐｅｒ，  ２０１２
【非特許文献１０】Ａｂｅｄｏｎ  ２００８
【非特許文献１１】Ｓｃｈｏｌｌら，  ２００１
【発明を実施するための形態】
【００１１】
医学における細菌感染症の治療、ならびに医療及び非医学的状況における細菌細胞増殖の阻害又は予防に使用するための改善されたバクテリオファージを提供する必要性が依然として存在する。
【００１２】
第１の態様において、本発明は、複数の異なる標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、前記標的細菌に対して毒性である毒素タンパク質をコードする毒素遺伝子を含み、溶菌性であり、複数の細菌宿主特異性を有する宿主域決定因子（ＨＲＤ）タンパク質を発現するバクテリオファージを提供する。ＨＲＤの細菌宿主特異性は、有利には同一細菌種内にある。
【００１３】
驚くべきことに、様々な異なる標的細菌に感染することができると共に、毒素タンパク質の遺伝子を有するように設計されたときに、医薬品における使用に有効である、改変バクテリオファージが産生できることが見出された。改変バクテリオファージは、細菌細胞にとって致死的であり、溶菌性であるために細胞から放出されるファージライフサイクルの完了を必要とするにもかかわらず、数回の感染及び複製によって宿主細胞内で製造することができる。
【００１４】
１つの態様では、複数の細菌宿主特異性を有するＨＲＤタンパク質は、複数の異なるバクテリオファージ由来のアミノ酸配列をそれぞれ含むハイブリッドＨＲＤタンパク質である。改変バクテリオファージはハイブリッドＨＲＤタンパク質を発現するので、これはファージ上に広範な宿主域を付与する。本発明に係るバクテリオファージは、例えば、密接に関連するファージからＨＲＤを選択することにより、遺伝子工学によって作製することができる。そのような非常に強力な溶菌ファージを作製した後、毒素遺伝子を含むベクターであって、宿主細胞中で産生することができると共にインビボで抗菌剤として有効なベクターが得られるように設計することができる。
【００１５】
別の態様では、バクテリオファージによって発現されるＨＲＤタンパク質は複数の異なるＨＲＤを含み、各ＨＲＤは異なる細菌宿主特異性を有する。この態様において、ＨＲＤは、ホモロガス、ヘテロガス、ホモロガス及びハイブリッドＨＲＤの混合物又は（ハイブリッド）であり得る。複数の異なるＨＲＤは、バクテリオファージに広範な宿主域を付与する。そのようなバクテリオファージは、遺伝子工学によって、例えば、同じ細菌種に感染するファージからＨＲＤを選択することによって作製することができる。そのような非常に強力な溶菌ファージを作製した後、毒素遺伝子を含むベクターであって、宿主細胞中で産生することができると共にインビボで抗菌剤として有効なベクターが得られるように設計することができる。
【００１６】
好ましい構成において、毒素遺伝子は、ＳＡＳＰをコードするα／β低分子酸可溶性胞子タンパク質（ＳＡＳＰ）遺伝子を含む。１つの態様では、本明細書中で使用される「ＳＡＳＰ」という用語は、α／β型ＳＡＳＰ活性を有するタンパク質、即ち、ＤＮＡに結合し、その構造をＢ型形態からＡ型形態に変化させる能力を意味し、ＷＯ０２／４０６７８の付属書１に列挙されるタンパク質だけでなく、その任意のホモログ、及びα／β型ＳＡＳＰ活性を有する他のタンパク質も包含する。別の態様では、本明細書中で使用される「ＳＡＳＰ」という用語は、ＷＯ０２／４０６７８の付属書１に列挙される任意のタンパク質、又はＷＯ０２／４０６７８の付属書１に列挙されるタンパク質の１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するホモログを意味する。別の代替態様では、本明細書中で使用される用語「ＳＡＳＰ」は、ＷＯ０２／４０６７８の付属書１に列挙される任意のタンパク質を意味する。
【００１７】
ＳＡＳＰ遺伝子は、ＷＯ０２／４０６７８の付属書１に開示されているＳＡＳＰをコードする遺伝子のいずれか１つから選択することができる。好ましい構成では、ＳＡＳＰはＳＡＳＰ−Ｃである。ＳＡＳＰ−Ｃは、バシラス・メガテリウム由来のものであってもよい。
【００１８】
ＳＡＳＰ遺伝子は、改変バクテリオファージが標的細菌中に複数のコピーで存在する場合に、ＳＡＳＰの毒性レベルの産生を促進するのに有利且つ十分に強力な構成的プロモーターの制御下にあることが好ましい。有用な構成的プロモーターとしては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分アルファサブユニットのｐｄｈＡ、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２のｒｐｓＢ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼのｐｇｉ、及びフルクトースビスリン酸アルドラーゼ遺伝子プロモーターｆｄａが挙げられる。感染中に活性である好ましい調節プロモーターは、エラスターゼに対するｌａｓＢである。これらのプロモーターは、典型的には緑膿菌由来である。これらのプロモーター配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す配列を有するプロモーターもまた使用することができる。
【００１９】
本発明は、一般に、様々な異なる標的細菌に感染するバクテリオファージに適用可能である。１つの構成では、標的細菌の少なくとも１つがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）である。有利なことに、複数の異なる標的細菌は、複数の異なるシュードモナス細菌である。重要な標的は緑膿菌である。
【００２０】
ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターの要件は、最適な治療用途のために特異的に溶菌性ではないということであるので、絶対的溶菌ファージ（ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｌｙｔｉｃ  ｐｈａｇｅ）は、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターとしての使用には適切ではないとこれまで考えられていた。非溶菌性ベクターは、ＳＡＳＰ発現のための長い時間ウィンドウを可能にし、それにより、治療の効力を増加させる。更に、インビボでの治療時の迅速な溶菌の防止は、危険な炎症応答をもたらし得る抗生物質耐性遺伝子及び毒性のある細胞壁成分の潜在的な放出を制限するので、有利であると考えられた。
【００２１】
本発明に記載のアプローチは、先に記載したファージカクテルアプローチと比較して有利である。ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターなどの改変バクテリオファージの混合物は、異なるＨＲＤ又はハイブリッドＨＲＤを有する以外は、構造及びゲノム配列が同一である。１つの利点は、ＳＡＳＰｊｅｃｔのミックスの製造プロセスを制御することが容易であることであり、これは製薬製剤の重要な側面である。即ち、これらが同一又は略同一の生物物理学的特性を有するので、このプロセスは、ヘテロガスＨＲＤを有するように改変されたファージについて物質的に同一となる。別の利点は、各ベクターが構造的に同一又は類似しているので、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターのインビボ特性（例えば、薬物動態学／薬力学）が類似している可能性が高いことである。
【００２２】
本発明の１つの側面において、複数の細菌宿主特異性を有するＨＲＤを有する非常に強力な絶対的溶菌性バクテリオファージであるファージを作製できることが見出された。驚くべきことに、そのようなファージは、溶菌表現型を維持し、インビボで有効性を維持する向上したＳＡＳＰｊｅｃｔベクターを作製するために使用することができ、このようなファージは、細菌宿主において適切な力価を有するまで製造することができる。ＷＯ０２／４０６７８及びＷＯ２００９０１９２９３は、１つ以上の溶菌遺伝子が除去されるように改変され、宿主細胞にプロファージとして存在するバクテリオファージからのＳＡＳＰｊｅｃｔベクターの作製を教示している。そのようなＳＡＳＰｊｅｃｔベクターは、プロファージ誘導によって製造され、細胞は、溶菌剤、例えば、細胞壁分解酵素又は化学物質（クロロホルムなど）の外的添加によって溶菌される。このように、最終溶菌段階が、改変されたファージ自身の溶菌タンパク質の宿主細胞における合成及び蓄積に依存しないので、細胞はファージライフサイクルの終わりまで生存可能である必要はない。ＳＡＳＰタンパク質の毒性及び本発明に記載の改変ファージの非常に強力な性質を考慮すると、このようなファージは、絶対的溶菌ライフサイクルを経て製造することができるＳＡＳＰｊｅｃｔを作製するための改変に適しているとは考えられず、生存可能なＳＡＳＰｊｅｃｔベクターを作製するために、ファージが溶菌ライフサイクルを完了することを必要とする。しかし、このようなＳＡＳＰｊｅｃｔベクターは、宿主細胞中で適切な力価まで複製することができることが見出されている。これにより、インビボ使用に有効な適切な量のＳＡＳＰｊｅｃｔベクターの製造が可能になる。有利には、このような改変された絶対的溶菌ファージに基づくＳＡＳＰｊｅｃｔベクターは、感染部位で複製することができる。これは、溶菌性ＳＡＳＰｊｅｃｔに必要な用量が、インビトロで使用される場合に非溶菌性ＳＡＳＰｊｅｃｔに必要とされる用量よりも低くできることを意味する。本発明に係る溶菌性ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターは、それらの非溶菌性対応物よりも強力であると考えられ得る。
【００２３】
そのような改変に適したファージは、選択された細菌種に感染することができるファージをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、緑膿菌に感染するファージは、代表的な緑膿菌株でプラークを形成することができるファージの環境源をスクリーニングすることによって単離することができる（Ｇｉｌｌ及びＨｙｍａｎ，  ２０１０）。単離されたファージについて、その全ゲノムを配列決定し、アノテートすることができる。ＨＲＤは、宿主細菌への初期の認識／結合を担うタンパク質、例えばファージＴ４、Ｔ５、及びＴ７において一般的に見出される尾部繊維タンパク質であることができる（Ｒａｋｈｕｂａら，  ２０１０）。或いは、他のＨＲＤは、ベースプレートタンパク質であってもよい。ファージゲノムは、ＢＬＡＳＴ検索を用いて、ファージゲノム中の全てのタンパク質の既知配列との相同性を評価することによって潜在的なＨＲＤ配列を検索することができる。
【００２４】
本発明によれば、各ＨＲＤは広い宿主域を有することが好ましい。これは、多様な集合体又は臨床分離株（少なくとも合計で３５種、好ましくは少なくとも４０種、より好ましくは少なくとも４４種、最も好ましくは＞５０種）の＞５０％に感染する能力として定義することができる。そのような分離株は、欧州、米国、アジアなどのある範囲の地理的位置に由来すべきであり、多剤耐性（ＭＤＲ）株を含む多様な範囲の抗生物質耐性表現型を有するべきであり、多様な範囲の感染部位、例えば、血液、肺、及び皮膚感染から培養された菌株であるべきである。そのような分離株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）及びナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー（ＮＣＴＣ）のような公的な株コレクションから得ることができる。一般に、各尾部繊維タンパク質は、標的細菌への結合のためのＣ末端受容体結合領域及びＣ末端受容体結合領域をバクテリオファージの本体に連結するＮ末端領域を含む。Ｃ末端及びＮ末端領域のそれぞれは、異なるバクテリオファージ由来のものであってもよい。１つの構成において、Ｎ末端領域は、尾部繊維タンパク質のアミノ酸１〜６２８を含み、Ｃ末端領域は、尾部繊維タンパク質のアミノ酸６２９〜９６４を含む。
【００２５】
Ｃ末端領域は、バクテリオファージＰｈｉ３３のＣ末端領域と９６％以下のアミノ酸配列同一性を有することができ、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＪＧ０２４、ＮＨ−４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、及びＰＴＰ９３のうちの１つに由来することができる。Ｃ末端領域におけるより低いアミノ酸配列同一性が好ましい。有利には、配列同一性は、９０％未満、より有利には８０％未満、好ましくは７０％未満、より好ましくは６０％未満、更により好ましくは５０％未満、特に好ましくは４０％未満、より特に好ましくは３０％未満である。Ｎ末端領域は、バクテリオファージＰｈｉ３３のＮ末端領域と少なくとも９０％、有利には少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＪＧ０２４、ＮＨ−４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、及びＰＴＰ９３のうちの１つに由来することができる。Ｎ末端領域及びＣ末端領域は、同じバクテリオファージ由来であり、ホモロガスな尾部繊維タンパク質を提供することができる。或いは、Ｎ末端領域及びＣ末端領域は、異なるバクテリオファージ尾部繊維タンパク質由来であり、ヘテロガスな尾部繊維タンパク質を提供することができる。ファージ尾部繊維タンパク質がホモロガスである１つの構成において、各尾部繊維タンパク質は、Ｐｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＪＧ０２４、ＮＨ−４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、及びＰＴＰ９３から選択されるバクテリオファージ由来である。
【００２６】
Ｎ末端領域において９０％を超える配列同一性を有するファージ尾部繊維タンパク質を同定することが有利である。例えば、緑膿菌株に対して広い宿主域を有する幾つかのファージ、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、及びＣ３６（２６０株に対して分析したときに、これらのファージはいずれも＞６０％に感染）が、単離／同定され、それらのゲノムが配列決定されている。Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、及びＣ３６のゲノム配列の分析は、Ｐｈｉ３３尾部繊維タンパク質１〜６２８と比較した２配列ＢＬＡＳＴアラインメントの結果、それらがＮ末端領域に高レベルの配列同一性（＞９５％のアミノ酸配列同一性）を有する推定尾部繊維タンパク質をコードする遺伝子を含むことが示されている（Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ４７（９８％）、ＰＴＰ９２（９７％）（括弧内はアミノ酸同一性））。ＢＬＡＳＴ検索により、これらの４種のファージが、ＰＢ１、ＳＰＭ１、Ｆ８、ＬＢＬ３、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、ＪＧ０２４、ＮＨ−４、及び１４−１などのＰＢ１様ファージのファミリーを共に形成する１０種の他の寄託ファージゲノム配列に関連することが示されている（Ｃｅｙｓｓｅｎｓら，  ２００９）。これらの推定尾部繊維タンパク質の相同性を評価した。Ｐｈｉ３３尾部繊維タンパク質と比較した２配列ＢＬＡＳＴアラインメントの結果、ＬＢＬ３（９６％）、ＳＰＭ−１（９５％）、Ｆ８（９５％）、ＰＢ１（９５％）、ＫＰＰ１２（９４％）、ＬＭＡ２（９４％）、ＳＮ（８７％）、１４−１（８６％）、ＪＧ０２４（８３％）、ＮＨ−４（８３％）、Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ４７（８６％）、ＰＴＰ９２（８３％）（括弧内はアミノ酸同一性）であった。前記ファージ尾部繊維タンパク質の全１４個のアラインメントを図１３に示す。
【００２７】
これらの１４個のファージからアノテートされた尾部繊維タンパク質配列の分析により、タンパク質のＮ末端領域（Ｐｈｉ３３尾部繊維アミノ酸１〜６２８に対応）が、アミノ酸レベルにおいて、その全長に亘るこれらのタンパク質の配列同一性よりも更に高いレベルの配列同一性を示すことが示されている（全１４種のタンパク質について９６〜１００％の範囲である）。Ｐｈｉ３３尾部繊維タンパク質のＮ末端アミノ酸１〜６２８と比較した２配列ＢＬＡＳＴアラインメントの結果、ＬＢＬ３（９６％）、ＳＰＭ−１（９６％）、Ｆ８（９６％）、ＰＢ１（９６％）、ＫＰＰ１２（９８％）、ＬＭＡ２（９９％）、ＳＮ（９９％）、１４−１（９７％）、ＪＧ０２４（９７％）、ＮＨ−４（９７％）、ＰＴＰ４７（９８％）、Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ９２（９７％）（括弧内はアミノ酸同一性）であった。しかし、タンパク質のＣ末端領域（Ｐｈｉ３３尾部繊維アミノ酸６２９〜９６４に対応）は、タンパク質の幾つかのＮ末端領域ほど保存されておらず、配列同一性の範囲は典型的には５７〜９６％である。Ｐｈｉ３３尾部繊維タンパク質のＣ末端６２９〜９６４アミノ酸と比較した２配列ＢＬＡＳＴアラインメントの結果、ＬＢＬ３（９４％）、ＳＰＭ−１（９３％）、Ｆ８（９３％）、ＰＢ１（９４％）、ＫＰＰ１２（８７％）、ＬＭＡ２（８５％）、ＳＮ（６５％）、１４−１（６５％）、ＪＧ０２４（５７％）、ＮＨ−４（５７％）、ＰＴＰ４７（６４％）、Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ９２（５７％）（括弧内はアミノ酸同一性）であった。よく特徴付けられた他のファージ由来のファージ尾部繊維の分析により、それらがＮ末端尾部ベースプレート結合領域及びＣ末端受容体結合領域を有することが示されている（Ｖｅｅｓｌｅｒ及びＣａｍｂｉｌｌａｕ、２０１１）。プラークアッセイ又は増殖阻害試験を用いた細菌株宿主域の実験分析において、ファージＰｈｉ３３、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、及びＣ３６は、重複はするが同一ではない宿主域を有する（表１）。細菌宿主受容体結合に関与するファージ尾部繊維のＣ末端領域の役割、及びこれらの４種のファージのＣ末端領域における配列変異、及びそれらと類似しているが同一ではない宿主域に関する確立された証拠をまとめると、Ｃ末端変異が、評価されたファージにおける宿主域に関連していると推定される。
【００２８】
本発明によれば、更に、ホモロガスな尾部繊維タンパク質の遺伝子を１つのファージから採取し、これを、Ｎ末端領域における高レベルの配列同一性に基づき別のものに加えて、常在性尾部繊維に置き換えることができる。Ｎ末端領域は、ファージ尾部への結合に関与する尾部繊維と考えられており（Ｖｅｅｓｌｅｒ及びＣａｍｂｉｌｌａｕ，  ２０１１）、ドナーファージの尾部繊維に関連する宿主域を有する生存可能なファージの形成を可能にする。本明細書に記載されているものなどの尾部繊維遺伝子を用いて、ホモロガスなドナーファージ尾部繊維タンパク質由来の可変Ｃ末端受容体結合領域と共に、レシピエントファージからの尾部繊維の保存されたＮ末端尾部結合領域を有するハイブリッド尾部繊維遺伝子を作製することができる。そのような尾部繊維ハイブリッド遺伝子は、ファージの尾部繊維を置き換えるために使用することができる。これはハイブリッド尾部繊維（レシピエントファージ由来）のＮ末端領域を提供し、ドナーファージの尾部繊維Ｃ末端受容体結合領域に関連する宿主域を有する生存可能なファージの形成を可能にする。設計された尾部繊維ハイブリッド遺伝子のレシピエントファージへの移植が、本発明において示されている。標準的な分子遺伝学的技法を用いて、Ｐｈｉ３３が、以下のファージに由来するヘテロガスな尾部繊維ハイブリッドを有するように改変されている：即ち、ＰＴＰ９２、ＰＴＰ４７、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＮＨ−４。改変ファージはいずれも、生存可能であり、緑膿菌でプラークを形成することができることが示されている。（尾部繊維ハイブリッドの命名は、以下のようである。一例として、Ｐｈｉ３３のＮ末端尾部結合領域がＰＴＰ４７のＣ末端受容体結合領域とハイブリダイズするようなハイブリッド遺伝子は、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）である。）
【００２９】
そのような改変ファージの１つでは、Ｐｈｉ３３は、その尾部繊維遺伝子がＰＴＰ９２のＣ末端受容体結合領域を有し、ＰＴＰ９３（Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ））を生成するように設計された。これは、３５種類の緑膿菌臨床分離株に対する宿主域を試験することにより、より詳細に評価された。前駆体ファージ（Ｐｈｉ３３）、尾部繊維ドナー（ＰＴＰ９２）、及びハイブリッドファージ（ＰＴＰ９３）の宿主域を比較すると、ＰＴＰ９３ハイブリッドファージの宿主域は、Ｐｈｉ３３ではなく尾部繊維ドナーファージ（ＰＴＰ９２）と同等であるが、驚くべきことに、ある例では、ＰＴＰ９３が、ＰＴＰ９２が感染することができない株にＰｈｉ３３の宿主域を有し、したがって、ＰＴＰ９３が両方のファージの宿主域を受け継ぐことが見出された（表２）。ＰＴＰ９３は、Ｐｈｉ３３（７４％）又はＰＴＰ９２（６６％）よりも広い宿主域（９２％）を有する（表２）。ＰＴＰ９３は、未改変状態で示されるものよりも高い特性を有するので、「非常に強力である」とみなすことができる絶対的溶菌バクテリオファージの例である。このような非常に強力なファージは、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターを作製するための更なる改変に適している。
【００３０】
当業者による配列相同性の評価によれば、Ｐｈｉ３３は、ＰＢ１様ファージのグループに属することができ（Ｃｅｙｓｓｅｎｓら，  ２００９）、先に与えられた定義により広い宿主域のファージとみなすことができる。このようなファージは、先に記載した方法によって単離することができた。Ｐｈｉ３３は、プロモーターの制御下でＳＡＳＰの遺伝子を導入するための遺伝子改変に適している。このような改変されたファージは、感受性緑膿菌によって引き起こされる感染症の治療に、単独又は他の改変バクテリオファージと組み合わせて使用するのに適している。１つの構成では、本発明は、単離されたバクテリオファージＰＴＰＸ３１又はＰＴＰＸ３２にまで及ぶことはない。
【００３１】
本発明に係る好ましいアプローチは、それぞれが構成的プロモーターから発現されるＳＡＳＰ遺伝子を有するように設計された１つ以上の絶対的溶菌ファージを使用することであり、各ファージは尾部繊維又は尾部繊維ハイブリッド遺伝子以外は遺伝的に同一である。尾部繊維遺伝子又は尾部繊維ハイブリッド遺伝子を作製するための尾部繊維遺伝子の改変及び提供のための好ましい絶対的溶菌ファージは、他の単離又は同定ファージの尾部繊維のＮ末端領域に比べて、Ｎ末端領域において≧９０％のアミノ酸配列同一性を有する予測タンパク質をコードする尾部繊維遺伝子を有するファージである。
【００３２】
本発明に係る別の好ましいアプローチは、それぞれが構成的プロモーターから発現されるＳＡＳＰ遺伝子を有するように設計された２つ以上のＨＲＤを発現するように設計された１つ以上の絶対的溶菌ファージ（非常に強力な絶対的溶菌ファージ）を使用することであり、各ファージは異なる尾部繊維遺伝子又は尾部繊維ハイブリッド遺伝子を有する以外は遺伝的に同一である。複数の尾部繊維遺伝子又は尾部繊維ハイブリッド遺伝子を有するファージを作製するための尾部繊維遺伝子の改変及び提供のための好ましい絶対的溶菌ファージは、他の単離又は同定ファージの尾部繊維のＮ末端領域に比べて、Ｎ末端領域において≧９０％のアミノ酸配列同一性を有する予測タンパク質をコードする尾部繊維遺伝子を有するファージである。
【００３３】
これらの基準を満たす好ましい絶対的溶菌ファージは、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ９２、ＰＴＰ４７、ＬＢＬ３、ＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４−１、ＮＨ−４、ＰＴＰ９３、ＪＧ０２４、ＰＴＰ４７、及びＣ３６である。このようなファージは、単離されたファージのプラークを、尾部遺伝子のＮ末端領域の高度に保存された領域に特異的なプライマーを用いたＰＣＲに付すことによって、簡単なＰＣＲアッセイによって同定することができる。このようにして、完全ゲノム配列決定を行うことなしに、適切なファージを同定することができる。ファージＰＢ１は、公的な株コレクションから取得することができる。ファージは、尾部繊維配列を生成するために単離又は提供される必要がない。これは、そのような配列は、ＤＮＡ配列データベース又は他のＤＮＡ配列源で同定することができるからである。これらは、標準的な方法によって、そのような配列を合成及びクローニングするために必要な情報、又はハイブリッド尾部繊維配列を作製するために必要な情報を提供し得る。
【００３４】
改変に特に好ましいファージは、ＰＴＰ９３、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ９２、ＰＴＰ４７、及びＣ３６である。特に好ましい非常に強力な絶対的溶菌ファージは、常在尾部繊維に代えて尾部繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）を有するように改変されたＰｈｉ３３、常在尾部繊維に代えて尾部繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）を有するように改変されたＰｈｉ３３である。本発明の１つの態様では、Ｐｈｉ３３の好ましい非常に強力な非溶菌ＳＡＳＰｊｅｃｔ誘導体は、常在尾部繊維に代えて尾部繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）を有し、且つ、緑膿菌フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（ｆｄａ）遺伝子プロモーターの制御下で緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたバシラス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ−Ｃを有するように改変されたＰｈｉ３３、常在尾部繊維に代えて尾部繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）を有し、且つ、緑膿菌フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（ｆｄａ）遺伝子の制御下で緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたバシラス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ−Ｃを有するように改変されたＰｈｉ３３、緑膿菌フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（ｆｄａ）遺伝子プロモーターの制御下で緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたバシラス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ−Ｃを有するように改変されたＰｈｉ３３を含む。特に好ましい態様において、本発明は、共に製剤化された３つの前記ＳＡＳＰｊｅｃｔを含む又はからなるＳＡＳＰｊｅｃｔの混合物を提供する。
【００３５】
ＰＴ３．９と命名された３つの改変バクテリオファージの混合物を構築し、その緑膿菌を殺滅する効力を試験した。この混合物は、以下のものからなる：ｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ（緑膿菌コドン最適化配列）（ＰＴＰ３８８）を有するように改変されたＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾部繊維を有するＰｈｉ３３、ｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ（緑膿菌コドン最適化配列）（ＰＴＰ３８９）を有するように改変されたＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾部繊維を有するＰｈｉ３３、ｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ（緑膿菌コドン最適化配列）（ＰＴＰ３８７）を有するように改変されたＰｈｉ３３（Ｎ）Ｐｈｉ３３（Ｃ）尾部繊維を有するＰｈｉ３３。
【００３６】
緑膿菌の多剤耐性（ＭＤＲ）臨床分離株、株３５０３及び参照株ＡＴＣＣ２７８５３（気管単離部位、セフタジジム、ピペラシリン−タゾバクタム及びイミペネムに対する抗生物質耐性）に対する６時間の時間殺傷曲線実験で、ＰＴ３．９の有効性を試験した。簡単に述べると、５ｍＭ塩化カルシウム、５ｍＭ硫酸マグネシウム、及び０．１％グルコース（ＬＣブロス）を添加したＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中に培養物をセットし、３７℃で増殖させた。緑膿菌の１ミリリットル当たり５×１０５コロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍｌ）を、ＰＴ３．９の１ｍｌ当たり３×１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）、又は対照（未処理培養）として余りのＬＣブロスと共にインキュベートした。連続希釈及びＬＣ寒天プレート上へのプレーティングのために０、１、２、４、及び６時間でサンプルを取り出し、次いで３２℃で一晩インキュベートした。両方の株について、生存細胞数は、処理１時間以内に５×１０５ｃｆｕ／ｍｌから検出限界（１０２ｃｆｕ／ｍｌ）まで低下し、６時間後に生存細胞は検出されなかった（図１４）。対照的に、未処理対照培養物は、両方の株の場合において、５×１０８〜１×１０９ｃｆｕ／ｍｌに増殖した。これは、ＰＴ３．９の緑膿菌の臨床株を殺滅する能力を実証する。
【００３７】
ＰＴ３．９の成分ＳＡＳＰｊｅｃｔであるＰＴＰ３８７を、溶菌遺伝子（エンドリシン）の１つを欠如している以外はＰＴＰ３８７に相当するＳＡＳＰｊｅｃｔであるＰＴＰ２８４と比較するインビボ試験を行った。緑膿菌菌血症の免疫適格マウスモデルを用いて、２つのＳＡＳＰｊｅｃｔベクターの効力を評価した。簡単に述べると、動物に、緑膿菌株ＡＴＣＣ２７８５３の７．５ｌｏｇ１０ｃｆｕの接種物を静脈注射により感染させた。感染の２時間後に、マウスを、ＰＴＰ２８４、ＰＴＰ３８７、ビヒクル（緩衝液）、又はセフタジジム（５０ｍｇ／ｋｇ）を静脈注射により処置した。ＰＴＰ２８４及びＰＴＰ３８７を以下の用量で投与した：３×１０１０、１×１０１０、３×１０９、及び１×１０９ｐｆｕ。処置後２２時間で、マウスを二酸化炭素窒息により安楽死させ、肝臓を取り出し、秤量した。肝組織をトリプトン大豆ブロス（ＴＳＢ）中でホモジナイズし、肝組織中の生存細胞の数を、連続希釈及びＣｅｔｒｉｍｉｄｅ寒天プレート上でのプレーティングによって計数した。感染の２時間後に対照（未処置）マウス群を安楽死させ、肝組織中の生存細胞を計数して、処置時の肺組織における生存細胞数を評価した。肝組織中の緑膿菌のバイオバーデンレベルの幾何平均を評価すると、ＰＴＰ２８４及びＰＴＰ３８７の両方について用量反応が見られた（図１５）。処置時に評価したレベルと比較して、ｃｆｕ／ｇ肝組織における対数減少を評価すると、ＰＴＰ３８７の効力はＰＴＰ２８４の効力よりも大きかった。処置後２２時間で、ＰＴＰ３８７は、１×１０９ｐｆｕの用量で、肝組織バイオバーデンの３ｌｏｇ減少をもたらし、一方、ＰＴＰ２８４と同等の効果が１×１０１０ｐｆｕで見られた。ＰＴＰ３８７は、３×１０１０ｐｆｕの用量で、ＰＴＰ２８４に比べて、肝組織バイオバーデンの減少により大きな最大効果をもたらした。ＰＴＰ３８７は、処置の２２時間後に肝組織のバイオバーデンで５．４ｌｏｇの減少をもたらし、一方、ＰＴＰ２８４は２．４ｌｏｇの減少をもたらした。これは、同等の非溶菌性ＳＡＳＰｊｅｃｔと比較したとき、インビボでの溶菌性ＳＡＳＰｊｅｃｔの効力の増加を実証する。
【００３８】
ＰＴ３．９を含む溶菌性改変ＳＡＳＰｊｅｃｔファージの混合物を、ＰＴ３．８を含む非溶菌性改変ＳＡＳＰｊｅｃｔファージの混合物と比較するインビボ試験を行った。ＰＴ３．８の改変ファージは、ＰＴ３．９に存在する溶菌遺伝子（エンドリシン）が欠如している以外は、ＰＴ３．９のものと同一である。緑膿菌肺炎の好中球減少性マウスモデルを使用して、ＳＡＳＰｊｅｃｔファージの２つの混合物の効力を評価した。簡単に述べると、動物を、シクロホスファミド２００ｍｇ／ｋｇを感染の４日前に、感染の１日前に１５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射して、免疫抑制によって好中球減少症にした。動物を麻酔し、４．５×１０３ｃｆｕの緑膿菌株ＡＴＣＣ２７８５３で鼻腔内感染させた。６頭のマウスからなる各群に各処置を施した。感染の１５分後に、ＰＴ３．８及びＰＴ３．９をエアロゾル化形態で、以下の用量にて気管支を介して投与した：即ち、１×１０９、３×１０９、１×１０１０、及び１．５×１０１０ｐｆｕ。トブラマイシン（２００μｇ）をエアロゾル化形態で対照群のマウスに投与し、別の群をプラセボ緩衝液で処置した。動物を、処置の２４時間後に安楽死させ、肺組織を取り出し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でホモジナイズした。組織ホモジネートを連続希釈し、寒天プレート上にプレーティングして、肺組織中の細菌を計数した。対照（未処置）マウス群を感染後１５分で安楽死させ、肺組織中の生存細胞を計数して、処置時の組織中の生存細胞数を評価した。肺組織中のＰ．緑膿菌のバイオバーデンレベルの幾何平均を評価すると、ＰＴ３．８及びＰＴ３．９の両方について用量反応が見られた（図１６）。ＰＴ３．９の効力はＰＴ３．８の効力よりも大きかった。処置時に評価したレベルと比較してｃｆｕ／ｇ肺組織の対数減少を評価すると、処置後２４時間では、ＰＴ３．９は、肺組織バイオバーデンの１×１０９ｐｆｕ用量で＞２ｌｏｇ減少をもたらし、一方、１×１０１０〜１．５×１０１０ｐｆｕの用量でＰＴ３．８の同等の効果が見られた。したがって、ＰＴ３．９は、ＰＴ３．８よりも１０倍超強力であった。
【００３９】
宿主細胞中で増殖し、更なる精製に適した細菌溶菌産物を生成するＰＴＰ３８７の能力を、未改変ファージ（Ｐｈｉ３３）と比較して評価した。簡単に述べると、緑膿菌株１８６８の一晩培養物を用いて、０．５Ｌのリッチブロス培地をそれぞれ含む２×１Ｌのバイオリアクター容器にＯＤ６００が０．０５になるように植菌した。培養物をＯＤ６００＝０．３〜０．４になるまで増殖させ、その後、ファージＰｈｉ３３又はＰＴＰ３８７を最終濃度で１×１０７ｐｆｕ／ｍｌとなるように感染させ、３７℃で更に増殖させた。増殖の５時間後、培養物をベンゾナーゼで処理し、滅菌濾過した。プラークアッセイによって各ファージの濃度を決定した。ＰＴＰ３８７について得られた溶菌産物の力価は、Ｐｈｉ３３：２×１０１１ｐｆｕ／ｍｌ（ＰＴＰ３８７）及び５×１０１１ｐｆｕ／ｍｌ（Ｐｈｉ３３）で得られた溶菌物力価に匹敵した。ＰＴＰ３８７の力価は、５時間で４ｌｏｇ増加し、これは、毒性のあるＳＡＳＰ遺伝子が存在するにもかかわらず、幾つか感染、増殖、及び溶菌のサイクルを完了させるこのファージの能力を示している。
【００４０】
ＰＴ３．９を含む改変ファージの３つ全てについて、１５．５〜１６Ｌのスケールで発酵を行った。簡単に述べると、緑膿菌の一晩培養物を用いて、１５．５〜１６Ｌの濃縮ブイヨン培地を含む１６ＬバイオリアクターにＯＤ６００が０．０５になるように植菌した。各培養物をＯＤ６００＝０．４〜０．７に増殖させた後、ＰＴＰ３８７、ＰＴＰ３８８、又はＰＴＰ３８９（ＰＴ３．９を含むＳＡＳＰｊｅｃｔファージ）を最終濃度１×１０７ｐｆｕ／ｍｌまで感染させた。培養物を更に５時間培養した後、Ｂｅｎｏｎｚａｓｅ処理を行った。サンプルを取り出し、滅菌濾過し、プラークアッセイによって分析した。各ＳＡＳＰｊｅｃｔファージについて２回の発酵を行った。ＰＴ３．９を含む改変ＳＡＳＰｊｅｃｔファージの３つ全てが、５×１０１１〜１×１０１２ｐｆｕ／ｍｌまで増殖することができた。したがって、改変されたＳＡＳＰｊｅｃｔファージの３つ全てが、毒性のあるＳＡＳＰ遺伝子が存在するにもかかわらず、幾つか感染、増殖、及び溶菌のサイクルを完了させることができる。
【００４１】
１Ｌスケールでのこのような製造プロセスによって得られたＰＴＰ３８７の量は、マウス感染モデルにおけるこのような調製物の使用によって実証されるように、インビボでの有効な使用に適している（図１５及び図１６）。１５．５〜１６Ｌのスケールでこのような製造プロセスによって得られたＰＴ３８７、ＰＴＰ３８８、及びＰＴＰ３８９のレベルは、マウス感染モデルにおいて、混合物（ＰＴ３．９）として組み合わせた場合、そのような調製物の使用によって実証されるように、有効なインビボでの使用に適している（図１５及び図１６）。
【００４２】
別の実施形態では、、構成的プロモーターの制御下にＳＡＳＰ遺伝子を挿入することによって、ＳＡＳＰｊｅｃｔを作製するように絶対的溶菌ファージを改変することができ、尾部繊維遺伝子を完全に欠失させることができる。このようなファージは、尾部繊維遺伝子又は尾部繊維ハイブリッド遺伝子がトランスで発現される株において増殖されなければならない。この場合、そのような株からのＳＡＳＰｊｅｃｔ子孫は、増殖株に由来する単一の尾部繊維を有するが、それらのゲノムには、依然として、尾部繊維又は尾部繊維ハイブリッド遺伝子が存在しないであろう。そのような幾つかの増殖株を構築することができ、同じ尾部繊維は、それぞれにおいて発現されたＳＡＳＰｊｅｃｔを欠失した。このように、幾つかの異なるＳＡＳＰｊｅｃｔ誘導体を作製することができ、その各々が、異なる尾部繊維又は尾部繊維ハイブリッドタンパク質を有する。これらのＳＡＳＰｊｅｃｔを使用して混合物を処方することができた。
【００４３】
別の実施形態では、構成的プロモーターから発現されるＳＡＳＰ遺伝子を有するように設計された絶対的溶菌ファージは、適切なプロモーターの制御下でハイブリッド尾部繊維タンパク質の遺伝子をトランスで有する宿主株で増殖することができる。尾部繊維ハイブリッド遺伝子の適切なプロモーターは、ファージプロモーターであることができ、特に設計された絶対的溶菌ファージ中の尾部繊維遺伝子の発現を駆動するプロモーターであることができる。他の適切なプロモーターは、それらの同族の調節タンパク質と同様に、ｌａｃ及びｔｒｐなどの誘導性プロモーターである。そのような株から得られたＳＡＳＰｊｅｃｔ子孫は、非常に強力であり、トランスで及びその株自身から発現される尾部繊維ハイブリッドを有する。或いは、絶対的溶菌ファージ由来の尾部繊維遺伝子を完全に欠失させることができる。但し、この場合には、尾部繊維遺伝子又は尾部繊維ハイブリッド遺伝子がトランスで発現され、派生的ＳＡＳＰｊｅｃｔの形成を可能にする増殖のために株が使用される。そのような場合、そのような株由来のＳＡＳＰｊｅｃｔ子孫は、複数の尾部繊維を有するが、それらのゲノムには尾部繊維又は尾部繊維ハイブリッド遺伝子が依然として存在しないであろう。
【００４４】
更なる態様において、本発明は、本明細書で定義される改変バクテリオファージ又はその混合物及びそのための担体を含む、細菌細胞増殖を阻害又は防止するための組成物を提供する。改変バクテリオファージは、標的細菌に毒性を示すＳＡＳＰをコードするＳＡＳＰ遺伝子などの毒素遺伝子を含む、標的細菌に感染することができる少なくとも１つの他の改変バクテリオファージと混合して提供することができる。少なくとも１つの他の改変バクテリオファージは、複数の異なるＨＲＤを発現してもしなくてもよい。このような組成物は、広範囲の用途を有することができ、したがって、意図される用途にしたがって製剤化される。前記組成物は、特にヒトの治療用の医薬品として処方することができ、細菌感染症を含む様々な状態を治療することができる。本発明にしたがって治療可能な感染症としては、血流感染、局所感染、虫歯を含む口腔感染、呼吸器感染、及び眼感染などの、限局された組織及び器官感染又は多臓器感染がある。担体は、薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤であることができる。このような組成物の成分の正確な性質及び量は、経験的に決定することができ、組成物の投与経路に一部依存する。
【００４５】
レシピエントへの投与経路としては、静脈内、動脈内、経口、バッカル、舌下、鼻腔内、吸入、局所（点眼など）、筋肉内、皮下、膣内、髄腔内、及び関節内が挙げられる。使用の便宜上、本発明にしたがう投与量は、治療又は予防すべき感染の部位及び種類に依存する。呼吸器感染症は、吸入投与により治療することができ、眼感染症は点眼剤を用いて治療することができる。改変バクテリオファージを含有する口腔衛生製品も提供され、歯垢形成に関連する細菌を排除するように製剤化される本発明に係る改変バクテリオファージを含むうがい薬又は歯磨き粉を使用することができる。
【００４６】
本発明に係る改変バクテリオファージ又はその混合物は、例えば、表面細菌汚染、ならびに土地修復又は水処理の処理における細菌除染剤として使用することができる。バクテリオファージは、医療従事者及び／又は患者の処置において使用することができ、例えば、手洗い用剤中の汚染除去剤として使用することができる。作業面及び装置の処理も提供され、特に病院の手続又は食品の調製に使用される。１つの特定の実施形態は、１つの個体から別の個体への細菌及び汚染の移動を予防、排除、又は低減するための局所使用のために製剤化される組成物を含む。微生物感染の伝播を制限することは、特に従来の抗生物質に対して耐性である細菌が蔓延する病院環境において重要である。このような使用のために、改変バクテリオファージは、トリス緩衝生理食塩水又はリン酸緩衝化生理食塩水に含有させることができ、又はゲル又はクリーム内に製剤化することができる。複数回使用する場合は、防腐剤を添加してもよい。或いは、生成物を凍結乾燥し、賦形剤、例えばスクロースなどの砂糖を添加してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
以下、添付図面を参照しつつ、本発明を単なる例として、より詳細に説明する。
【００４８】
【図１−１】図１は、ｌａｃＺΔＭ１５を含むプラスミドの構築を示す概略図である。
【図１−２】図１は、ｌａｃＺΔＭ１５を含むプラスミドの構築を示す概略図である。
【図２−１】図２は、置換された尾部繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図である。
【図２−２】図２は、置換された尾部繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図である。
【図２−３】図２は、置換された尾部繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図である。
【図２−４】図２は、置換された尾部繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図である。
【図３−１】図３は、本発明に係るＳＡＳＰ−Ｃを導入するように後に改変することができる、ハイブリッド尾部繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図である。
【図３−２】図３は、本発明に係るＳＡＳＰ−Ｃを導入するように後に改変することができる、ハイブリッド尾部繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図である。
【図３−３】図３は、本発明に係るＳＡＳＰ−Ｃを導入するように後に改変することができる、ハイブリッド尾部繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図である。
【図３−４】図３は、本発明に係るＳＡＳＰ−Ｃを導入するように後に改変することができる、ハイブリッド尾部繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図である。
【図４−１】図４は、本発明に係るＳＡＳＰ−Ｃを導入するように後に改変することができる、更なるハイブリッド尾部繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図である。
【図４−２】図４は、本発明に係るＳＡＳＰ−Ｃを導入するように後に改変することができる、更なるハイブリッド尾部繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図である。
【図４−３】図４は、本発明に係るＳＡＳＰ−Ｃを導入するように後に改変することができる、更なるハイブリッド尾部繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図である。
【図４−４】図４は、本発明に係るＳＡＳＰ−Ｃを導入するように後に改変することができる、更なるハイブリッド尾部繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図である。
【図５−１】図５は、ｌａｃＺαマーカーが除去された、ハイブリッド尾部繊維遺伝子を有するバクテリオファージの構築を示す概略図である。
【図５−２】図５は、ｌａｃＺαマーカーが除去された、ハイブリッド尾部繊維遺伝子を有するバクテリオファージの構築を示す概略図である。
【図６−１】図６は、ＳＡＳＰ−Ｃが適切なＰｈｉ３３挿入部位に導入されたプラスミドの構築を示す概略図である。
【図６−２】図６は、ＳＡＳＰ−Ｃが適切なＰｈｉ３３挿入部位に導入されたプラスミドの構築を示す概略図である。
【図６−３】図６は、ＳＡＳＰ−Ｃが適切なＰｈｉ３３挿入部位に導入されたプラスミドの構築を示す概略図である。
【図６−４】図６は、ＳＡＳＰ−Ｃが適切なＰｈｉ３３挿入部位に導入されたプラスミドの構築を示す概略図である。
【図７−１】図７は、本発明に係る更なるバクテリオファージの作製を示す概略図である。
【図７−２】図７は、本発明に係る更なるバクテリオファージの作製を示す概略図である。
【図８−１】図８は、緑膿菌における発現のために最適化されたＳＡＳＰ−Ｃコドンが適切なＰｈｉ３３挿入部位に導入されたプラスミドの構築を示す概略図である。
【図８−２】図８は、緑膿菌における発現のために最適化されたＳＡＳＰ−Ｃコドンが適切なＰｈｉ３３挿入部位に導入されたプラスミドの構築を示す概略図である。
【図８−３】図８は、緑膿菌における発現のために最適化されたＳＡＳＰ−Ｃコドンが適切なＰｈｉ３３挿入部位に導入されたプラスミドの構築を示す概略図である。
【図８−４】図８は、緑膿菌における発現のために最適化されたＳＡＳＰ−Ｃコドンが適切なＰｈｉ３３挿入部位に導入されたプラスミドの構築を示す概略図である。
【図９】図９は、緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたバシラス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の配列を示す図である。
【図１０−１】図１０は、緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたＳＡＳＰ−Ｃが適切なＰｈｉ３３挿入部位に導入されたバクテリオファージの作製を示す概略図である。
【図１０−２】図１０は、緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたＳＡＳＰ−Ｃが適切なＰｈｉ３３挿入部位に導入されたバクテリオファージの作製を示す概略図である。
【図１０−３】図１０は、緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたＳＡＳＰ−Ｃが適切なＰｈｉ３３挿入部位に導入されたバクテリオファージの作製を示す概略図である。
【図１０−４】図１０は、緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたＳＡＳＰ−Ｃが適切なＰｈｉ３３挿入部位に導入されたバクテリオファージの作製を示す概略図である。
【図１１−１】図１１は、本発明に係る更なるバクテリオファージの作製を示す概略図である。
【図１１−２】図１１は、本発明に係る更なるバクテリオファージの作製を示す概略図である。
【図１１−３】図１１は、本発明に係る更なるバクテリオファージの作製を示す概略図である。
【図１１−４】図１１は、本発明に係る更なるバクテリオファージの作製を示す概略図である。
【図１２−１】図１２は、本発明に係る更なるバクテリオファージの作製を示す概略図である。
【図１２−２】図１２は、本発明に係る更なるバクテリオファージの作製を示す概略図である。
【図１３−１】図１３は、ファージＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、Ｃ３６、ＬＢＬ３、Ｐｈｉ３３、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、ＰＴＰ９２、ＮＨ−４，１４−１、ＰＴＰ４７、ＳＮからの尾部繊維タンパク質のＣＬＵＳＴＡＬ  ２．１多重配列アライメントである。
【図１３−２】図１３は、ファージＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、Ｃ３６、ＬＢＬ３、Ｐｈｉ３３、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、ＰＴＰ９２、ＮＨ−４，１４−１、ＰＴＰ４７、ＳＮからの尾部繊維タンパク質のＣＬＵＳＴＡＬ  ２．１多重配列アライメントである。
【図１３−３】図１３は、ファージＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、Ｃ３６、ＬＢＬ３、Ｐｈｉ３３、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、ＰＴＰ９２、ＮＨ−４，１４−１、ＰＴＰ４７、ＳＮからの尾部繊維タンパク質のＣＬＵＳＴＡＬ  ２．１多重配列アライメントである。
【図１３−４】図１３は、ファージＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、Ｃ３６、ＬＢＬ３、Ｐｈｉ３３、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、ＰＴＰ９２、ＮＨ−４，１４−１、ＰＴＰ４７、ＳＮからの尾部繊維タンパク質のＣＬＵＳＴＡＬ  ２．１多重配列アライメントである。
【図１３−５】図１３は、ファージＳＰＭ−１、Ｆ８、ＰＢ１、Ｃ３６、ＬＢＬ３、Ｐｈｉ３３、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、ＰＴＰ９２、ＮＨ−４，１４−１、ＰＴＰ４７、ＳＮからの尾部繊維タンパク質のＣＬＵＳＴＡＬ  ２．１多重配列アライメントである。
【図１４】図１４は、緑膿菌株３５０３（Ａ）及びＡＴＣＣ２７８５３（Ｂ）に対するＰＴ３．９のインビトロでの有効性を示す２４時間の時間殺滅曲線を示す。培養物を、１０ｍＭの塩化カルシウム、１ｍＭの硫酸マグネシウム、及び１％のグルコースを添加したＬｕｒｉａ  ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中で３７℃で培養した。
【図１５】図１５は、感染のマウス菌血症モデルにおけるＰＴ３．９のインビボでの有効性を示す。マウスをビヒクル（１ｍＭ硫酸マグネシウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、及び１０％ｖ／ｖグリセロールを含むトリス緩衝生理食塩水）、ＰＴＰ２８４又はＰＴＰ３８７（緑膿菌感染後２時間）でＩＶで処置した。処置後２２時間の肝組織における生存細胞数を各群（群サイズ＝６）の各動物について示し、各データセットの幾何平均は水平線によって表される。
【図１６】図１６は、好中球減少性マウス肺炎モデルにおけるＰＴ３．９のインビボでの有効性を示す。マウスを、プラセボビヒクル（１ｍＭ硫酸マグネシウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、及び１０％ｖ／ｖグリセロールを含むトリス緩衝生理食塩水）、ＰＴ３．９、ＰＴ３．８、又はトブラマイシン（緑膿菌感染後１５分で）でＩＴ（気管支内）処置した。処置後２４時間での肺組織における生存細胞数を各群（群サイズ＝６）の各動物について示し、各データセットの幾何平均は水平線によって表される。
【００４９】
本発明の製品は、１つの態様において、個々のファージ内に単一の尾部繊維を提供する、又は各タイプのファージがそれぞれ単一の異なる尾部繊維を有するファージのミックスを提供する。
【００５０】
これは、溶菌性のバクテリオファージを非溶菌性にするための遺伝子改変の要約であり、通常は緑膿菌３０Ｓリボソームサブユニットタンパク質Ｓ２遺伝子（ｒｐｓＢ）の発現を制御するプロモーターの制御下にあるＳＡＳＰ−Ｃに加えて、多数の可能な尾部繊維変異体の１つを有する、又は通常は緑膿菌フルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ遺伝子（ｆｄａ）の発現を制御するプロモーターの制御下で緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたＳＡＳＰ−Ｃを有する。
【００５１】
相同組換えを用いて遺伝子を除去し、ファージゲノムに加えることができる。外来遺伝子及びプロモーターを有するファージを構築することができる幾つかの方法があり、以下はそのような方法の例である。
【００５２】
Ｐｈｉ３３誘導体の構築のために、大腸菌／緑膿菌の広宿主域ベクター（ほんの一例であるが）を使用して、バクテリオファージゲノム中の既存の尾部繊維又は尾部繊維部分を、相同組換えによって異なるバクテリオファージ由来の代替尾部繊維又は尾部繊維部分で置き換えることができる方法が示される。また、ほんの一例であるが、緑膿菌のｒｐｓＢプロモーターの制御下にあるバシラス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子、又は緑膿菌のｒｐｓＢプロモーターの制御下にある緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたバシラス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子などの更なるＤＮＡ配列を、相同組換えによってバクテリオファージゲノムに付加することができる方法が示される。
【００５３】
広宿主域大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、ｌａｃＺα遺伝マーカーと共に、別のファージ由来の尾部繊維遺伝子又は尾部繊維遺伝子の部分を、ネイティブの尾部繊維又はその部分に隣接するＰｈｉ３３ＤＮＡの２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入し、得られた株をＰｈｉ３３に感染させることができる。後代ファージの採取後、ネイティブのＰｈｉ３３尾部繊維又は尾部繊維部分が新しい尾部繊維又は尾部繊維部分及びｌａｃＺαで置き換えられた二重組換え体を、β−ガラクトシダーゼの作用を検出する発色性基質を含有する培地を用いて、適切な緑膿菌（ｌａｃＺΔＭ１５＋）宿主にプラーク形成させることによって単離することができる。
【００５４】
後続の工程で、ｌａｃＺαマーカーをバクテリオファージゲノムから除去することができる。これは、ｌａｃＺαマーカーを含まない前述の尾部繊維領域組換えプラスミドのバージョンを作製し、新しいプラスミドを適切な緑膿菌宿主株に導入し、ｌａｃＺαマーカーと共に代替の尾部繊維遺伝子又はその部分を有する以前に改変されたＰｈｉ３３のバクテリオファージ誘導体に感染させることによって行うことができる。新しい尾部繊維又は尾部繊維部分を保持するがｌａｃＺαが除去された組換え体は、β−ガラクトシダーゼの作用を検出する発色性基質を含有する培地を用いて適切な緑膿菌（ｌａｃＺΔＭ１５＋）宿主株にプラーク形成させることによって単離することができる。
【００５５】
後続の工程で、同様の相同組換えを用いて、緑膿菌ｒｐｓＢプロモーターの制御下でＳＡＳＰ−Ｃの遺伝子を導入すると共に、同時に、組換えファージの同定のための大腸菌ｌａｃＺαレポーター遺伝子を、Ｐｈｉ３３、又は先に記載したＰｈｉ３３誘導体のいずれか、又は類似のバクテリオファージ又は類似の誘導体に付加することができる。広宿主域大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、ｒｐｓＢプロモーターによって制御されるＳＡＳＰ−Ｃ及び大腸菌ｌａｃＺα対立遺伝子からなる領域を、適切な挿入部位に隣接するＰｈｉ３３の２つの領域の間にクローニングすることができる。このような部位としては、例えば、Ｐｈｉ３３尾部繊維オペロンのすぐ下流に位置する遺伝子間領域などである。このプラスミドは、適切な緑膿菌（ｌａｃＺΔＭ１５＋）株、及びＰｈｉ３３の感染によって得られた株、又は以前に構築されたＰｈｉ３３誘導体（最初のｌａｃＺαマーカーが除去されている）に導入することができる。子ファージを採取し、二重組換え体を同定することができる。これは、緑膿菌（ｌａｃＺΔＭ１５＋）上にプラーク形成させ、β−ガラクトシダーゼの作用を検出する発色性基質を含む培地上の新しいｌａｃＺαレポーターの獲得を探索することによって行うことができる。
【００５６】
別の後続工程で、同様の相同組換えを用いて、緑膿菌ｆｄａプロモーターの制御下で緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたＳＡＳＰ−Ｃの遺伝子を導入すると共に、同時に、組換えファージの同定のための大腸菌ｌａｃＺαレポーター遺伝子を、Ｐｈｉ３３、又は先に記載したＰｈｉ３３誘導体のいずれか、又は類似のバクテリオファージ又は類似の誘導体に付加することができる。広宿主域大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、ｆｄａプロモーターによって制御されるコドン最適化されたＳＡＳＰ−Ｃ及び大腸菌ｌａｃＺα対立遺伝子からなる領域を、適切な挿入部位に隣接するＰｈｉ３３の２つの領域の間にクローニングすることができる。このような部位としては、例えば、Ｐｈｉ３３尾部繊維オペロンのすぐ下流に位置する遺伝子間領域などである。このプラスミドは、適切な緑膿菌（ｌａｃＺΔＭ１５＋）株、及びＰｈｉ３３の感染によって得られた株、又は以前に構築されたＰｈｉ３３誘導体（最初のｌａｃＺαマーカーが除去されている）に導入することができる。子ファージを採取し、二重組換え体を同定することができる。これは、緑膿菌（ｌａｃＺΔＭ１５＋）上にプラーク形成させ、β−ガラクトシダーゼの作用を検出する発色性基質を含む培地上の新しいｌａｃＺαレポーターの獲得を探索することによって行うことができる。
【００５７】
これらの改変バクテリオファージは溶菌性であるため（テンプレートではない）、バクテリオファージ構築のこれらの記載された工程の別の要件は、所望の組換えバクテリオファージのｌａｃＺα表現型を補完するための、細菌ゲノム中の適切な位置に大腸菌ｌａｃＺΔＭ１５遺伝子を有する適切な宿主緑膿菌株の構築である。一例として、これらの緑膿菌株の構築は、緑膿菌中で複製することができない大腸菌ベクターを用いた相同組換えによって達成することができる。ｌａｃＺΔＭ１５導入遺伝子の挿入のためのゲノム位置は、必須遺伝子が影響を受けず、隣接する遺伝子の発現に対する極性効果によって望ましくない表現型が生成されないように選択されるべきである。一例として、そのような位置の１つは、緑膿菌株ＰＡＯ１ｐｈｏＡ相同体のすぐ下流であることができる。
【００５８】
大腸菌ｌａｃＺΔＭ１５対立遺伝子は、ｐｈｏＡの３’末端に隣接する緑膿菌株ＰＡＯ１ゲノムＤＮＡの２つの領域の間で、緑膿菌において複製することができない大腸菌ベクターにクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入し、テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）耐性の獲得にしたがって選択されたゲノムにプラスミド全体を組み込むための単一の相同組換えを受けた分離体を得ることができる。次いで、第２相同組換えを受けた分離体（ｌａｃＺΔＭ１５＋）を、１０％スクロースを含む培地（プラスミド骨格上に存在するｓａｃＢ対抗選択マーカーを利用する）上で単離することができる。
【００５９】
後続の工程で、同様の相同組換えを使用して、緑膿菌ｒｐｓＢプロモーターの制御下でＳＡＳＰ−Ｃの遺伝子を導入するように改変された前述の（ｌａｃＺα＋）Ｐｈｉ３３誘導体からｌａｃＺαマーカーを除去することができる。広宿主域大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、ｒｐｓＢプロモーターによって制御されるＳＡＳＰ−Ｃからなる領域を、選択した挿入部位に隣接するＰｈｉ３３の２つの領域の間でクローニングすることができる。このプラスミドは、適切な緑膿菌（ｌａｃＺΔＭ１５＋）株、及び先に記載した（ｌａｃＺα＋）Ｐｈｉ３３誘導体の感染によって得られた株に導入することができる。これらの誘導体は、緑膿菌ｒｐｓＢプロモーターの制御下でＳＡＳＰ−Ｃの遺伝子を導入するように改変されたものである。子ファージを採取し、二重組換え体を同定することができる。これは、緑膿菌（ｌａｃＺΔＭ１５＋）上にプラーク形成させ、β−ガラクトシダーゼの作用を検出する発色性基質を含む培地上でｌａｃＺαレポーターがないことを探索することによって同定することができる。
【００６０】
別の後続工程で、同様の相同組換えを用いて、緑膿菌ｆｄａプロモーターの制御下にある、緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたＳＡＳＰ−Ｃのための遺伝子を導入するように改変された、先に記載した（ｌａｃＺα＋）Ｐｈｉ３３誘導体からｌａｃＺαマーカーを除去することができる。広宿主域大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、ｆｄａプロモーターによって制御される緑膿菌における発現のために最適化されたＳＡＳＰ−Ｃからなる領域は、選択した挿入部位に隣接するＰｈｉ３３の２つの領域の間でクローニングすることができる。このプラスミドを適切な緑膿菌（ｌａｃＺΔＭ１５＋）株、及び先に記載した（ｌａｃＺα＋）Ｐｈｉ３３誘導体の感染によって得られた株に導入することができる。これらの誘導体は、緑膿菌ｆｄａプロモーターの制御下にある、緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたＳＡＳＰ−Ｃの遺伝子を導入するように改変されたものである。子ファージを採取し、二重組換え体を同定することができる。これは、緑膿菌（ｌａｃＺΔＭ１５＋）上にプラーク形成させ、β−ガラクトシダーゼの作用を検出する発色性基質を含む培地上でｌａｃＺαレポーターがないことを探索することによって同定することができる。
【００６１】
実験手順
クローニング目的のためのＤＮＡを生成するためのＰＣＲ反応は、製造業者の指示にしたがって、プライマーの融解温度（Ｔｍ）に応じて、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行うことができる。スクリーニング目的のためのＰＣＲ反応は、製造業者の指示にしたがって、プライマーのＴｍに依存して、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して行うことができる。特段の断りがない限り、制限酵素による消化、アガロースゲル電気泳動、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ依存性ライゲーション、コンピテント細胞調製、及び形質転換などの一般的な分子生物学技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）に記載の方法に基づくことができる。酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ又はＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入することができる。ＤＮＡは、酵素反応物から精製し、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ精製キットを用いて細胞から調製することができる。プラスミドは、コンジュゲーションヘルパー株大腸菌ＨＢ１０１（ｐＲＫ２０１３）によって媒介されるコンジュゲーションによって、大腸菌株から緑膿菌株に導入することができる。β−ガラクトシダーゼによる消化時に、第二鉄でキレート化されて黒色沈殿を形成するβ−ガラクトシダーゼの発色性基質、Ｓ−ｇａｌは、Ｓｉｇｍａ（Ｓ９８１１）から購入することができる。
【００６２】
プライマーは、Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得ることができる。プライマーが制限酵素の認識配列を含む場合、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡの消化を確実にするために、５’末端に更に２〜６ヌクレオチドを付加することができる。
【００６３】
特段の断りがない限り、クローニングはいずれも、文献記載されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、ＤＮＡをＴ４  ＤＮＡリガーゼで一晩ライゲーションし、次に、ＤＨ５α又はＴＯＰ１０などの大腸菌クローニング株に形質転換し、選択培地で単離することにより達成することができる。
【００６４】
大腸菌／緑膿菌広宿主域ベクター（例えば、ｐＳＭ１０８０Ａ）を、大腸菌と緑膿菌との間に遺伝子を導入するために使用することができる。ｐＳＭ１０８０Ａは、緑膿菌プラスミド由来の広宿主域複製起点、ｐＲＫ２由来のｏｒｉＴ、プラスミドｐＲＫ４１５由来の大腸菌及び緑膿菌の両方で使用するためのｔｅｔＡＲ選択可能マーカー、及びプラスミドｐＵＣ１９由来の、高コピー数の大腸菌複製起点ｏｒｉＶを組み合わせることによって先に作製された。
【００６５】
緑膿菌中で複製できない大腸菌ベクター、ｐＳＭ１１０４を用いて対立遺伝子交換により、緑膿菌突然変異体を生成することができる。ｐＳＭ１１０４は、ｐＲＫ２由来のｏｒｉＴ、プラスミドｐＲＫ４１５由来の大腸菌及び緑膿菌の両方で使用するためのｔｅｔＡＲ選択可能マーカー、プラスミドｐＵＣ１９由来の、高コピー数の大腸菌複製起点ｏｒｉＶ、及び対抗選択可能マーカーとしての使用のための、強力なプロモーターの制御下における、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株由来のｓａｃＢ遺伝子を組み合わせることによって先に作製された。
【００６６】
ＰＣＲによるＰｈｉ３３様ファージ（ＰＢ１様ファージファミリー）の保存されたＮ末端尾部繊維領域の検出
【００６７】
１．実験ファージ試料中のＰｈｉ３３様ファージ様尾部繊維遺伝子の検出のためのプライマーは、以下のように設計することができる。
【００６８】
全配列が決定されたＰｈｉ３３様ファージ（Ｐｈｉ３３、ＰＢ１、ＮＨ−４，１４−１、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、Ｆ８、ＳＰＭ−１、ＬＢＬ３、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、及びＳＮを含む）に由来する尾部繊維遺伝子のＤＮＡ配列を、ＥＢＩウェブサイトで入手可能なＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａを用いてアラインさせることができ、この遺伝子の５’配列にマッピングする約２ｋｂ長の高度に保存された領域を同定することができる（ＰＢ１ゲノム配列中の３１６８０〜３３５５７、Ａｃｃ．ＥＵ７１６４１４）。１１個の尾部繊維遺伝子配列において１００％同一の部分は、目視検査によって同定することができる。選択された完全に保存された領域を標的とし、１ｋｂ以下のＰＣＲ産物を増幅する３対のＰＣＲプライマーを、以下のように選択することができる。即ち、Ｂ４５００とＢ４５０１の対（１９３ｂｐ長の領域を規定する）；Ｂ４５０２及びＢ４５０３の対（７７４ｂｐ長の領域を規定する）；及びＢ４５０４及びＢ４５０５の対（３６５ｂｐ長の領域を規定する）である。
【００６９】
プライマーＢ４５００は、位置３１６８０〜３１６９７の範囲のＰＢ１ファージゲノム（Ａｃｃ．ＥＵ７１６４１４）の配列からなる。プライマーＢ４５０１は、３１８５１〜３１８７２の範囲のＰＢ１ファージゲノム（Ａｃｃ．ＥＵ７１６４１４）の配列からなる。プライマーＢ４５０２は、３１７８５〜３１８０４の範囲のＰＢ１ファージゲノム（Ａｃｃ．ＥＵ７１６４１４）の配列からなる。プライマーＢ４５０３は、３２５４１〜３２５５８の範囲のＰＢ１ファージゲノム（Ａｃｃ．ＥＵ７１６４１４）の配列からなる。プライマーＢ４５０４は、３２８６８〜３２８８８の範囲のＰＢ１ファージゲノム（Ａｃｃ．ＥＵ７１６４１４）の配列からなる。プライマーＢ４５０５は、３３２１３〜３３２３２の範囲のＰＢ１ファージゲノム（Ａｃｃ．ＥＵ７１６４１４）の配列からなる。
Ｂ４５００（配列番号：１）
５’−ＧＴＧＡＴＣＡＣＡＣＣＣＧＡＡＣＴＧ−３’
Ｂ４５０１（配列番号：２）
５’−ＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＴＴＴＧ−３’
Ｂ４５０２（配列番号：３）
５’−ＡＣＧＣＣＧＧＡＣＴＡＣＧＡＡＡＴＣＡＧ−３’
Ｂ４５０３（配列番号：４）
５’−ＴＣＣＧＧＡＧＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＴ−３’
Ｂ４５０４（配列番号：５）
５’−ＣＣＴＴＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＴＣ−３’
Ｂ４５０５（配列番号：６）
５’−ＴＴＣＧＴＧＧＡＣＧＣＣＣＡＧＴＣＣＣＡ−３’
【００７０】
２．Ｐｈｉ３３様尾部繊維遺伝子は、以下のように実験ファージ試料中に検出することができる。
【００７１】
環境由来の単離されたファージのプラークを寒天プレートから採取し、水に加え、３０分間インキュベートして、プラークソークアウト（ｐｌａｑｕｅ  ｓｏａｋ  ｏｕｔｓ）を形成することができる。このプラークソークアウトを希釈し、その一部を、前記プライマー対の１つ又は全てを含有するＰＣＲ反応物に加え、標準的なプロトコールにしたがってＰＣＲを行うことができる。ＰＣＲ産物をエチジウムブロミド染色で１．５％アガロースゲル上で可視化し、それらのサイズを評価することができる。使用されるプライマー対について正しいサイズのＰＣＲ産物をゲル抽出し、配列決定のための外部施設に提出することができる。配列決定結果を、ＰＣＲ産物の同一性を確認するために、利用可能な尾部繊維遺伝子配列と比較することができる。
【００７２】
大腸菌ｌａｃＺΔＭ１５遺伝子を有する緑膿菌株を、細菌ゲノムのｐｈｏＡ遺伝子座のすぐ下流に生成させるプラスミドの構築
【００７３】
１．緑膿菌ＰＡＯ１ｐｈｏＡホモログの３’末端に隣接するＤＮＡを有するｐＳＭ１１０４を含むプラスミドｐＳＭＸ２００（図１）は、以下のように構築することができる。
【００７４】
緑膿菌由来のｐｈｏＡ遺伝子の約１ｋｂの末端を含む領域は、プライマーＢ４２００及びＢ４２０１（図１）を用いるＰＣＲによって増幅することができる。次いで、ＰＣＲ産物を洗浄し、ＳｐｅＩ及びＢｇｌＩＩで消化することができる。ＰＡ３２９７オープンリーディングフレームの３’末端を含む、緑膿菌由来のｐｈｏＡ遺伝子の下流約１ｋｂを含む第２の領域は、プライマーＢ４２０２及びＢ４２０３（図１）を用いるＰＣＲによって増幅することができる。次いで、この第２のＰＣＲ産物を洗浄し、ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで消化することができる。２つの消化物を再び洗浄し、３方向ライゲーションでＳｐｅＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＳＭ１１０４にライゲーションして、プラスミドｐＳＭＸ２００（図１）を得ることができる。
【００７５】
プライマーＢ４２００は、５’ＳｐｅＩ制限部位（下線部）と、それに続く、緑膿菌ＰＡＯ１株由来のｐｈｏＡの停止コドンの下流約１ｋｂに位置する配列とからなる（図１）。プライマーＢ４２０１は、５’ＢｇｌＩＩ及びＡｆｌＩＩ制限部位（下線部）と、それに続く、緑膿菌ＰＡＯ１株由来のｐｈｏＡ遺伝子の末端に相補的な配列とからなる（停止コドンは小文字である；図１）。プライマーＢ４２０２は、５’ＢｇｌＩＩ及びＮｈｅＩ制限部位（下線部）と、それに続く、緑膿菌ＰＡＯ１株由来のｐｈｏＡ遺伝子の停止コドンのすぐ下流の配列とからなる（図１）。プライマーＢ４２０３は、５’ＸｈｏＩ制限部位（下線部）と、それに続く、ＰＡ３２９７オープンリーディングフレーム内の配列、緑膿菌ＰＡＯ１株由来のｐｈｏＡ遺伝子の下流約１ｋｂとからなる（図１）。
プライマーＢ４２００（配列番号：７）
５’−ｇａｔａＡＣＴＡＧＴＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＧＧＧＧＴＣＡＡＧ−３’
プライマーＢ４２０１（配列番号：８）
５’−ｇｃｔｃａｇａｔｃｔｔｃｃｔｔａａｇｔｃａＧＴＣＧＣＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧ−３’
プライマーＢ４２０２（配列番号：９）
５’−ａｇｇａａｇａｔｃｔｇａｇｃｔａｇｃＴＣＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＡＧ−３’
プライマーＢ４２０３（配列番号：１０）
５’−ｇａｔａＣＴＣＧＡＧＧＣＧＧＡＴＧＡＡＣＡＴＴＧＡＧＧＴＧ−３’
【００７６】
２．ｌａｃプロモーターの制御下にｌａｃＺΔＭ１５を有するｐＳＭＸ２００を含むプラスミドｐＳＭＸ２０３（図１）は、以下のように構築することができる。
【００７７】
ｌａｃプロモーターの制御下にあるｌａｃＺΔＭ１５遺伝子は、プライマーＢ４２０８及びＢ４２０９を用いて大腸菌株ＤＨ１０ＢからＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次いで、得られたＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩ及びＮｈｅＩで消化し、ＢｇｌＩＩ及びＮｈｅＩで消化したｐＳＭＸ２００にライゲーションしてプラスミドｐＳＭＸ２０３を得ることができる（図１）。
【００７８】
プライマーＢ４２０８は、５’ＢｇｌＩＩ制限部位（下線部）と、それに続く、ｌａｃプロモーターの配列とからなる（図１）。プライマーＢ４２０９は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線部）と、それに続く、二方向転写ターミネーター及びｌａｃＺΔＭ１５の３’末端に相補的な配列とからなる（太字で下線、図１）。
プライマーＢ４２０８（配列番号：１１）
５’−ｇａｔａａｇａｔｃｔｇａｇｃｇｃａａｃｇｃａａｔｔａａｔｇｔｇ−３’
プライマーＢ４２０９（配列番号：１２）
５’−ｇａｔａｇｃｔａｇｃＡＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＴＣＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣ−３’
【００７９】
細菌ゲノムのｐｈｏＡ遺伝子座のすぐ下流に大腸菌ｌａｃＺΔＭ１５遺伝子を導入するための緑膿菌の遺伝子改変
【００８０】
１．プラスミドｐＳＭＸ２０３（図１）を、コンジュゲーションにより緑膿菌に導入し、テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）に対する耐性の獲得で一次組換え体を選択することができる。
【００８１】
２．次に、１０％スクロースを含む培地上にプレーティングすることにより、ｓａｃＢ仲介対抗選択によって二重組換え体を選択することができる。
【００８２】
３．次に、１０％スクロース上で増殖する単離体をＰＣＲによってスクリーニングして、ｌａｃＺΔＭ１５が緑膿菌ｐｈｏＡ遺伝子の下流に導入されたことを確認することができる。
【００８３】
４．次に、単離体（ＰＡＸ２１）の確認後、この株は、ｌａｃＺαレポーターの相補性が必要とされるバクテリオファージの更なる改変のための宿主として使用することができる。
【００８４】
ｌａｃＺαスクリーニングプロセスを利用して、Ｐｈｉ３３尾部繊維の３’部分をＰＴＰ９２の３’部分で置き換えるためのプラスミドの構築
【００８５】
１．Ｐｈｉ３３尾部繊維遺伝子のすぐ下流の領域を有するｐＳＭ１０８０Ａを含むＰｉＭＸ２８４（図２）は、以下のように構築することができる。
【００８６】
Ｐｈｉ３３尾部繊維の末端２０塩基及び隣接する下流領域をカバーするＰｈｉ３３配列の１ｋｂ領域は、プライマーＢ４２２２及びＢ４２４９（図２）を用いるＰＣＲによって増幅することができる。次いで、得られたＰＣＲ産物を洗浄し、ＮｈｅＩで消化し、ｐＳＭ１０８０Ａ（同様にＮｈｅＩで消化し、次にライゲーションの前にアルカリホスファターゼで処理したものである）にライゲーションし、プラスミドｐＳＭＸ２８４（図２）を得ることができる。
【００８７】
プライマーＢ４２２２は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線部）と、それに続く、Ｐｈｉ３３由来の配列、Ｐｈｉ３３尾部繊維遺伝子の末端の下流約１ｋｂとからなる（図２）。Ｂ４２４９は、５’ＮｈｅＩ−ＫｐｎＩ−ＡｖｒＩＩ制限部位（下線部）と、それに続く、Ｐｈｉ３３尾部繊維の３’末端及び尾部繊維オープンリーディングフレームのすぐ下流の配列に相補的な配列とからなる（図２）。
Ｂ４２２２（配列番号：１３）
５’−ｇａｔａＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＴＣＡＣＧＡＣＣＡＴＧ−３’
Ｂ４２４９（配列番号：１４）
５’−ＧＡＴＡＧＣＴＡＧＣＧＡＧＧＴＡＣＣＧＡＣＣＴＡＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＣＧＡＧＴＧＡＣＧＴＡＡＡＡＴＧ−３’
【００８８】
２．ｌａｃＺαを有するｐＳＭＸ２８４、ＰＴＰ９２尾部繊維遺伝子配列の３’部分、及び尾部繊維遺伝子の５’末端及びＰｈｉ３３尾部繊維遺伝子のすぐ上流に位置する配列を含むＰｈｉ３３配列の領域を含むｐＳＭＸ２８５（図２）は、以下のように構築することができる。
【００８９】
ｌａｃＺαオープンリーディングフレームは、プライマーＢ４２５０及びＢ４２５２（図２）を用いてｐＵＣ１９からＰＣＲによって増幅することができる。ＰＴＰ９２尾部繊維３’部分は、プライマーＢ４２５１及びＢ４２５４（図２）を用いてＰＴＰ９２からＰＣＲによって増幅することができる。次いで、ｌａｃＺαオープンリーディングフレームを、外側プライマーＢ４２５０及びＢ４２５４を用いてＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲによってＰＴＰ９２尾部繊維遺伝子３’部分に連結することができる。Ｐｈｉ３３尾部繊維遺伝子の５’末端の配列及びＰｈｉ３３尾部繊維遺伝子のすぐ上流に位置する配列を含む領域は、プライマーＢ４２５３及びＢ４２２９（図２）を用いるＰＣＲによって増幅することができる。次いで、このＰＣＲ産物を、外側プライマーＢ４２５０及びＢ４２２９を用いてＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲによってｌａｃＺα及びＰＴＰ９２尾部繊維遺伝子３’部分を含むＰＣＲ産物に連結することができる。次いで、得られたＰＣＲ産物を洗浄し、ＡｖｒＩＩ及びＫｐｎＩで消化し、同様にＡｖｒＩＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＳＭＸ２８４にライゲーションして、プラスミドｐＳＭＸ２８５（図２）を得ることができる。
【００９０】
プライマーＢ４２５０は、５’ＡｖｒＩＩ制限部位と、それに続く、ｌａｃＺαオープンリーディングフレームの３’末端に相補的な配列とからなる（図２）。プライマーＢ４２５２は、ＰＴＰ９２尾部繊維遺伝子（下線部）の３’末端と重複する配列の５’部分と、それに続く、ｌａｃＺαオープンリーディングフレームの５’末端の配列とからなる。プライマーＢ４２５１は、プライマーＢ４２５２の逆相補物である（図２）。プライマーＢ４２５４は、Ｐｈｉ３３尾部繊維遺伝子（下線部）内の５’配列と、それに続く、ＰＴＰ９２尾部繊維遺伝子の３’末端内の配列とからなる（図２）。プライマーＢ４２５３は、プライマーＢ４２５４の逆相補物である。プライマーＢ４２２９は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線部）と、それに続く、Ｐｈｉ３３の尾部繊維遺伝子の約１ｋｂ上流領域に相補的な配列とからなる（図２）。
プライマーＢ４２５０（配列番号：１５）
５’−ＧａｔａＣＣＴＡＧＧｔｔａｇｃｇｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｔｃ−３’
プライマーＢ４２５２（配列番号：１６）
５’−ＣＴＡＴＴＣＣＡＧＣＧＧＧＴＡＡＣＧＴＡＡＡａｔｇａｃｃａｔｇａｔｔａｃｇｇａｔｔＣ−３’
プライマーＢ４２５１（配列番号：１７）
５’−ＧａａｔｃｃｇｔａａｔｃａｔｇｇｔｃａｔＴＴＴＡＣＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧ−３’
プライマーＢ４２５４（配列番号：１８）
５’−ＣＡＡＧＣＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＴＡＡＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴＣ−３’
プライマーＢ４２５３（配列番号：１９）
５’−ＧＡＴＣＡＣＡＴＡＧＧＡＧＴＴＡＴＴＧＣＣＧＡＧＡＧＡＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＣＧＣＴＴＧ−３’
プライマーＢ４２２９（配列番号：２０）
５’−ｇａｔａＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣ−３’
【００９１】
尾部繊維遺伝子の３’部分をＰＴＰ９２の３’部分で置き換えるためのＰｈｉ３３の遺伝子改変
【００９２】
１．プラスミドｐＳＭＸ２８５（図２；図３）を、コンジュゲーションにより緑膿菌株ＰＡＸ２１に導入し、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいてトランスコンジュガントを選択し、ＰＴＡ８０株を生成することができる。
【００９３】
２．ＰＴＡ８０株をファージＰｈｉ３３に感染させ、子ファージを回収することができる。
【００９４】
３．Ｐｈｉ３３尾部繊維遺伝子の３’末端がＰＴＰ９２の３’末端で置換され、ｌａｃＺαが付加された組換えファージは、工程（２）由来の溶菌物を緑膿菌ＰＡＸ２１株に、Ｓ−ｇａｌを含有する培地上でプラーク形成させ、β−ガラクトシダーゼ活性を示す黒色プラークを探索することによって同定することができる。
【００９５】
４．尾部繊維遺伝子が置換されており、ｌａｃＺαが存在することを確認するためにＰＣＲを行うことができる。
【００９６】
５．確認された単離物（ＰＴＰＸ８１；図３）の同定の後、この単離物は、更なる使用の前に、緑膿菌ＰＡＸ２１株で更に２回プラーク精製することができる。
【００９７】
ｌａｃＺαスクリーニングプロセスを利用して、Ｐｈｉ３３尾部繊維の３’部分をＰＴＰ４７の３’部分で置き換えるためのプラスミドの構築
【００９８】
１．ｌａｃＺαを有するｐＳＭＸ２８４、ＰＴＰ４７尾部繊維遺伝子配列の３’部分、及び尾部繊維遺伝子の５’末端及びＰｈｉ３３尾部繊維遺伝子のすぐ上流に位置する配列を含むＰｈｉ３３配列の領域を含むｐＳＭＸ２８６（図２）は、以下のように構築することができる。
【００９９】
ｌａｃＺαオープンリーディングフレームは、プライマーＢ４２５０及びＢ４２５８（図２）を用いてｐＵＣ１９からＰＣＲによって増幅することができる。ＰＴＰ４７尾部繊維の３’部分は、プライマーＢ４２５９及びＢ４２６０を用いてＰＴＰ４７からＰＣＲによって増幅することができる（図２）。次に、ｌａｃＺαオープンリーディングフレームを、外側プライマーＢ４２５０及びＢ４２６０を用いてＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲによってＰＴＰ４７尾部繊維遺伝子３’部分に連結することができる。Ｐｈｉ３３尾部繊維遺伝子の５’末端の配列及びＰｈｉ３３尾部繊維遺伝子のすぐ上流に位置する配列を含む領域は、プライマーＢ４２６１及びＢ４２２９（図２）を用いるＰＣＲによって増幅することができる。次いで、このＰＣＲ産物を、外側プライマーＢ４２５０及びＢ４２２９を用いるＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲによって、ｌａｃＺα及びＰＴＰ４７尾部繊維遺伝子の３’部分を含むＰＣＲ産物に連結することができる。次いで、得られたＰＣＲ産物を洗浄し、ＡｖｒＩＩ及びＫｐｎＩで消化し、同様にＡｖｒＩＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＳＭＸ２８４にライゲーションして、プラスミドｐＳＭＸ２８６（図２）を得ることができる。
【０１００】
プライマーＢ４２５０は、５’ＡｖｒＩＩ制限部位と、それに続く、ｌａｃＺαオープンリーディングフレームの３’末端に相補的な配列とからなる（図２）。プライマーＢ４２５８は、ＰＴＰ４７尾部繊維遺伝子（下線部）の３’末端と重複する配列の５’部分と、それに続く、ｌａｃＺαオープンリーディングフレームの５’末端の配列とからなる。プライマーＢ４２５９は、プライマーＢ４２５８の逆相補物である（図２）。プライマーＢ４２６０は、Ｐｈｉ３３尾部繊維遺伝子（下線部）内の５’配列と、それに続く、ＰＴＰ４７尾部繊維遺伝子の３’末端内の配列とからなる（図２）。プライマーＢ４２６１は、プライマーＢ４２６０の逆相補物である。プライマーＢ４２２９は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線部）と、それに続く、Ｐｈｉ３３の尾部繊維遺伝子の上流約１ｋｂの領域に相補的な配列とからなる（図２）。
プライマーＢ４２５０（配列番号：１５）
５’−ＧａｔａＣＣＴＡＧＧｔｔａｇｃｇｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｔｃ−３’
プライマーＢ４２５８（配列番号：２１）
５’−ＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＧＡＧＴＧＡＣＧＴＡＡＡａｔｇａｃｃａｔｇａｔｔａｃｇｇａｔｔＣ−３’
プライマーＢ４２５９（配列番号：２２）
５’−ｇａａｔｃｃｇｔａａｔｃａｔｇｇｔｃａｔＴＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧ−３’
プライマーＢ４２６０（配列番号：２３）
５’−ＣＡＡＧＣＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＴＡＡＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴＣ−３’
プライマーＢ４２６１（配列番号：２４）
５’−ＧＡＴＣＡＣＡＴＡＧＧＡＧＴＴＡＴＴＧＣＣＧＡＧＡＧＡＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＣＧＣＴＴＧ−３’
プライマーＢ４２２９（配列番号：２０）
５’−ｇａｔａＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣ−３’
【０１０１】
尾部繊維遺伝子の３’部分をＰＴＰ４７の３’部分と置換するためのＰｈｉ３３の遺伝子改変
【０１０２】
１．プラスミドｐＳＭＸ２８６（図２；図４）を、コンジュゲーションにより緑膿菌ＰＡＸ２１株に導入し、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいてトランスコンジュガントを選択し、ＰＴＡ８１株を産生することができる。
【０１０３】
２．ＰＴＡ８１株をファージＰｈｉ３３に感染させ、子ファージを回収する。
【０１０４】
３．Ｐｈｉ３３尾部繊維遺伝子の３’末端がＰＴＰ４７のもので置き換えられ、ｌａｃＺαが付加された組換えファージは、工程（２）由来の溶菌物を緑膿菌ＰＡＸ２１株に、Ｓ−ｇａｌを含有する培地上でプラーク形成させ、β−ガラクトシダーゼ活性を示す黒色プラークを探索することによって同定することができる。
【０１０５】
４．尾部繊維遺伝子が置換されており、ｌａｃＺαが存在することを確認するためにＰＣＲを行うことができる。
【０１０６】
５．確認された単離物（ＰＴＰＸ８２；図４）の同定の後、この単離物は、更なる使用の前に、緑膿菌ＰＡＸ２１株で更に２回プラーク精製することができる。
【０１０７】
ＰＴＰＸ８１からｌａｃＺαマーカーを除去するためのプラスミドの構築
【０１０８】
１．ＰＴＰ９２尾部繊維遺伝子の３’部分及びＰｈｉ３３尾部繊維遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列の領域を有するｐＳＭ１０８０Ａを含むｐＳＭＸ２８７（図５）は、以下のように構築することができる。
【０１０９】
Ｐｈｉ３３尾部繊維のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列の領域は、プライマーＢ４２２２及びＢ４２５５（図５）を用いるＰＣＲによって増幅することができる。ＰＴＰ９２尾部繊維遺伝子の３’末端は、プライマーＢ４２５６及びＢ４２５７（図５）を用いるＰＣＲによって増幅することができる。次いで、これらの２つのＰＣＲ産物を、２つの外側プライマーＢ４２２２及びＢ４２５７を用いるＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲによって連結することができる。次いで、得られたＰＣＲ産物を洗浄し、ＮｈｅＩで消化し、再度洗浄し、ｐＳＭ１０８０Ａ（同様にＮｈｅＩで消化し、ライゲーション前にアルカリホスファターゼで処理したもの）にライゲーションして、プラスミドｐＳＭＸ２８７（図５）を得ることができる。
【０１１０】
プライマーＢ４２５５は、ＰＴＰ９２尾部繊維遺伝子の末端の５’部分（下線部）と、それ続く、Ｐｈｉ３３尾部繊維遺伝子のすぐ下流の配列とからなる（図５）。プライマーＢ４２５６は、プライマーＢ４２５５の逆相補体である（図５）。プライマーＢ４２５７は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線部）と、それに続く、ＰＴＰ９２テイル繊維遺伝子の末端１ｋｂの配列とからなる（図５）。
プライマーＢ４２５５（配列番号：２５）
５’−ＣＴＡＴＴＣＣＡＧＣＧＧＧＴＡＡＣＧＴＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＡＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧ−３’
プライマーＢ４２５６（配列番号：２６）
５’−ＣＴＧＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＣＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧ−３’
プライマーＢ４２５７（配列番号：２７）
５’−ｇａｔａＧＣＴＡＧＣＧＧＣＡＡＴＡＡＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴＣ−３’
【０１１１】
ｌａｃＺαマーカーを除去するためのＰＴＰＸ８１の遺伝子改変
【０１１２】
１．プラスミドｐＳＭＸ２８７（図５；図３）を、コンジュゲーションにより緑膿菌株ＰＡＸ２１に導入し、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいてトランスコンジュガントを選択し、ＰＴＡ８２株を生成することができる。
【０１１３】
２．ＰＴＡ８２株をファージＰＴＰＸ８１に感染させ、子ファージを回収する。
【０１１４】
３．ｌａｃＺαマーカーが除去された組換えファージは、工程（２）由来の溶菌物を緑膿菌ＰＡＸ２１株に、Ｓ−ｇａｌを含有する培地上でプラーク形成させ、β−ガラクトシダーゼ活性がないことを示す白色プラークを探索することによって同定することができる。
【０１１５】
４．尾部繊維遺伝子が保持されていること、及びｌａｃＺαが除去されていることを確認するためにＰＣＲを行うことができる。
【０１１６】
５．確認された単離物（ＰＴＰＸ８３；図３）の同定の後に、この単離物を、更なる使用の前に、緑膿菌ＰＡＸ２１株で更に２回プラーク精製することができる。
【０１１７】
ＰＴＰＸ８２からｌａｃＺαマーカーを除去するためのプラスミドの構築
【０１１８】
１．ＰＴＰ４７尾部繊維遺伝子の３’部分及びＰｈｉ３３尾部繊維遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列の領域を有するｐＳＭ１０８０Ａを含むｐＳＭＸ２８８（図５）は、以下のように構築することができる。
【０１１９】
Ｐｈｉ３３尾部繊維のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列の領域は、プライマーＢ４２２２及びＢ４２６２（図５）を用いるＰＣＲによって増幅することができる。ＰＴＰ４７尾部繊維遺伝子の３’末端は、プライマーＢ４２６３及びＢ４２６４（図５）を用いるＰＣＲによって増幅することができる。次いで、これらの２つのＰＣＲ産物を、２つの外側プライマーＢ４２２２及びＢ４２６４を用いてＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲによって連結することができる。次いで、得られたＰＣＲ産物を洗浄し、ＮｈｅＩで消化し、再度洗浄し、ｐＳＭ１０８０Ａ（同様にＮｈｅＩで消化し、ライゲーション前にアルカリホスファターゼで処理したもの）にライゲーションして、プラスミドｐＳＭＸ２８８（図５）を得ることができる。
【０１２０】
プライマーＢ４２６２は、ＰＴＰ４７尾部繊維遺伝子の末端の５’部分（下線部）と、それに続く、Ｐｈｉ３３尾部繊維遺伝子のすぐ下流の配列とからなる（図５）。プライマーＢ４２６３は、プライマーＢ４２６２の逆相補物である（図５）。プライマーＢ４２６４は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線部）と、それに続く、ＰＴＰ４７尾部繊維遺伝子の末端１ｋｂの配列とからなる（図５）。
プライマーＢ４２６２（配列番号：２８）
５’−ＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＧＡＧＴＧＡＣＧＴＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＡＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧ−３’
プライマーＢ４２６３（配列番号：２９）
５’−ＣＴＧＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧ−３’
プライマーＢ４２６４（配列番号：３０）
５’−ｇａｔａＧＣＴＡＧＣＧＧＣＡＡＴＡＡＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴＣ−３’
【０１２１】
ｌａｃＺαマーカーを除去するためのＰＴＰＸ８２の遺伝子改変
【０１２２】
１．プラスミドｐＳＭＸ２８８（図５；図４）を、コンジュゲーションにより緑膿菌ＰＡＸ２１株に導入し、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいてトランスコンジュガントを選択し、ＰＴＡ８３株を生成することができる。
【０１２３】
２．ＰＴＡ８３株をファージＰＴＰＸ８２に感染させ、子ファージを回収する。
【０１２４】
３．ｌａｃＺαマーカーが除去された組換えファージは、工程（２）由来の溶菌物を緑膿菌ＰＡＸ２１株に、Ｓ−ｇａｌを含有する培地上でプラーク形成させ、β−ガラクトシダーゼ活性がないことを示す白色プラークを探索することによって同定することができる。
【０１２５】
４．尾部繊維遺伝子が保持されていること、及びｌａｃＺαが除去されていることを確認するためにＰＣＲを行うことができる。
【０１２６】
５．確認された単離物（ＰＴＰＸ８４；図４）の同定の後に、この単離物を、更なる使用の前に、緑膿菌ＰＡＸ２１株で更に２回プラーク精製することができる。
【０１２７】
Ｐｈｉ３３、ＰＴＰＸ８３、ＰＴＰＸ８４、及び類似のファージのファージゲノムに、ｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−Ｃ及びｌａｃＺαを導入するためのプラスミドの構築
【０１２８】
１．ｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−Ｃの選択された挿入部位（例えば、尾部繊維オペロンのすぐ下流の遺伝子間領域など）に隣接するＰｈｉ３３の領域を含むｐＳＭ１０８０Ａを含むプラスミドｐＳＭＸ２５１（図６）は、以下のように構築することができる。
【０１２９】
選択された挿入部位のすぐ下流のＰｈｉ３３配列の領域は、プライマーＢ４９００及びＢ４９０１（図６）を用いるＰＣＲによって増幅することができる。次いで、このＰＣＲ産物を洗浄し、ＮｈｅＩ及びＡｖｒＩＩで消化することができる。選択された挿入部位のすぐ上流のＰｈｉ３３配列の領域は、プライマーＢ４９０２及びＢ４９０３（図６）を用いるＰＣＲによって増幅することができる。次いで、この第２のＰＣＲ産物を洗浄し、ＡｖｒＩＩ及びＮｈｅＩで消化することができる。次いで、２つのＰＣＲ産物消化物を再度洗浄し、ＮｈｅＩで消化し、ライゲーション前にアルカリホスファターゼで処理したｐＳＭ１０８０Ａにライゲーションすることができる。２つのＰＣＲ産物の各々の１つのインサートを有するクローンは、プライマーＢ４９００及びＢ４９０３を用いるＰＣＲ、及び精製された推定クローンのＮｈｅＩ制限消化分析によって同定し、プラスミドｐＳＭＸ２５１（図６）を同定することができる。
【０１３０】
プライマーＢ４９００は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線部）と、それに続く、尾部繊維オペロンのすぐ下流の遺伝子間領域内にあるＰｈｉ３３挿入部位の約５００ｂｐ下流に位置するＰｈｉ３３配列とからなる（図６）。プライマーＢ４９０１は、５’ＡｖｒＩＩ及びＸｈｏＩ制限部位（下線部）と、それに続く、Ｐｈｉ３３挿入部位のすぐ下流に位置する配列に相補的なＰｈｉ３３の配列とからなる（図６）。プライマーＢ４９０２は、５’ＡｖｒＩＩ制限部位（下線部）と、それに続く、挿入部位のすぐ上流に位置するＰｈｉ３３配列とからなる（図６）。プライマーＢ４９０３は、５’ＮｈｅＩ部位（下線部）と、それに続く、Ｐｈｉ３３挿入部位の約５００ｂｐ上流に位置する配列に相補的なＰｈｉ３３配列とからなる（図６）。
プライマーＢ４９００（配列番号：３１）
５’  ｇａｔａｇｃｔａｇｃＴＴＴＣＴＣＧＴＴＴＴＡＡＴＧＴＣＧ  ３’
プライマーＢ４９０１（配列番号：３２）
５’  ｇａｔａＣＣＴＡＧＧｔｇＣＴＣＧＡＧＴＡＴＴＣＧＣＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧ  ３’
プライマーＢ４９０２（配列番号：３３）
５’  ｇａｔａＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＴＴＧＡＴＴＧＡＴＣ  ３’
プライマーＢ４９０３（配列番号：３４）
５’  ｇａｔａｇｃｔａｇｃＧＧＡＣＴＧＧＴＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧ  ３’
【０１３１】
２．ｒｐｓＢプロモーターの制御下にあるＳＡＳＰ−Ｃを含むｐＳＭＸ２５１を含むプラスミドｐＳＭＸ２５２（図６）は、以下のように構築することができる。
【０１３２】
バシラス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ１３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子は、プライマーＢ４９０４及びＢ４２７０を用いるＰＣＲによって増幅することができる（図６）。次いで、得られたＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで消化することができる。ｒｐｓＢプロモーターは、プライマーＢ４２７１及びＢ４９０５を用いて緑膿菌からＰＣＲによって増幅することができる（図６）。次いで、得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＡｖｒＩＩで消化することができる。次いで、２つの消化したＰＣＲ産物を洗浄し、ＸｈｏＩ及びＡｖｒＩＩで消化したｐＳＭＸ２５１にライゲーションして、プラスミドｐＳＭＸ２５２（図６）を得ることができる。
【０１３３】
プライマーＢ４９０４は、５’ＸｈｏＩ制限部位、それに続く５塩基、次いで、二方向転写ターミネーター、次いで、バシラス・メガテリウム菌株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の３’末端に相補的な配列（太字下線；図６）を含む。プライマーＢ４２７０は、５’ＮｃｏＩ制限部位（下線部）、それに続く、バシラス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の５’末端の配列を含む（図６）。プライマーＢ４２７１は、５’ＮｃｏＩ制限部位（下線部）、それに続く、緑膿菌ＰＡＯ１由来のｒｐｓＢプロモーターの末端に相補的な配列を含む（図６）。プライマーＢ４９０５は、５’ＡｖｒＩＩ制限部位（下線部）、それに続く、緑膿菌ＰＡＯ１由来のｒｐｓＢプロモーターの開始配列を含む（図６）。
プライマーＢ４９０４（配列番号：３５）
５’−ｇａｔａＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＴＣＣＧＡＣＣＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＧＡＣＴｔｔａｇｔａｃｔｔｇｃｃｇｃｃｔａｇ−３’
プライマーＢ４２７０（配列番号：３６）
５’−ｇａｔａｃｃＡＴＧＧｃａａａｔｔａｔｃａａａａｃｇｃａｔｃ−３’
プライマーＢ４２７１（配列番号：３７）
５’−ｇａｔａＣＣＡＴｇｇＴＡＧＴＴＣＣＴＣＧＡＴＡＡＧＴＣＧ−３’
プライマーＢ４９０５（配列番号：３８）
５’−ｇａｔａＣＣＴＡＧＧＣＣＴＡＧＧｇａｔｃｔＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＴＣＴＡＣＴＣＣ−３’
【０１３４】
３．ｌａｃＺαを含むｐＳＭＸ２５２を含むｐＳＭＸ２５３（図６）は、以下のように構築することができる。
【０１３５】
ｌａｃＺαは、プライマーＢ４９０６及びＢ４９０７を用いてＰＣＲ増幅することができる（図６）。次いで、得られたＰＣＲ産物をＸｈｏＩで消化し、同様にＸｈｏＩで消化し、ライゲーション前にアルカリホスファターゼで処理したｐＳＭＸ２５２にライゲーションして、ｐＳＭＸ２５３を得ることができる（図６）。
【０１３６】
プライマーＢ４９０６は、５’ＸｈｏＩ制限部位（下線部）と、それに続く、ｌａｃＺαの３’末端に相補的な配列とからなる（図６）。プライマーＢ４９０７は、５’ＸｈｏＩ制限部位（下線部）と、それに続く、ｌａｃＺαの発現を駆動するｌａｃプロモーターの配列とからなる（図６）。
プライマーＢ４９０６（配列番号：３９）
５’−ｇａｔａＣＴＣＧＡＧｔｔａｇｃｇｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｔｃ−３’
プライマーＢ４９０７（配列番号：４０）
５’−ｇａｔａＣＴＣＧＡＧｇｃｇｃａａｃｇｃａａｔｔａａｔｇｔｇ−３’
【０１３７】
ｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−Ｃ及びｌａｃＺαを導入するための、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰＸ８３、ＰＴＰＸ８４、及び類似のファージの遺伝子改変
【０１３８】
１．プラスミドｐＳＭＸ２５３（図６；図３；図４；図７）を、コンジュゲーションにより緑膿菌ＰＡＸ２１株に導入し、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいてトランスコンジュガントを選択し、ＰＴＡ５１株を生成することができる。
【０１３９】
２．ＰＴＡ５１株は、個々の実験において、ファージＰｈｉ３３、又はＰＴＰＸ８３、又はＰＴＰＸ８４、又は他の類似のファージで感染させ、子ファージを回収することができる。
【０１４０】
３．ｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−Ｃ及びｌａｃＺαが選択された挿入部位に導入された組換えファージは、工程（２）由来の溶菌物を緑膿菌ＰＡＸ２１株に、Ｓ−ｇａｌを含有する培地上でプラーク形成させ、β−ガラクトシダーゼ活性を示す黒色プラークを探索することによって同定することができる。
【０１４１】
４．ｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−Ｃ及びｌａｃＺαが存在することを確認するためにＰＣＲを行うことができる。
【０１４２】
５．確認された単離物（例えば、ＰＴＰＸ８５（図７）、ＰＴＰＸ８６（図３）、ＰＴＰＸ８７（図４））を同定した後、更なる使用の前に、単離体を緑膿菌ＰＡＸ２１株で更に２回プラーク精製することができる。
【０１４３】
ＰＴＰＸ８５、ＰＴＰＸ８６、ＰＴＰＸ８７、及びＰｈｉ３３の類似の誘導体からｌａｃＺαマーカーを除去するための遺伝子改変
【０１４４】
１．プラスミドｐＳＭＸ２５２（図６；図３；図４；図７）を、コンジュゲーションにより緑膿菌ＰＡＸ２１株に導入し、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいてトランスコンジュガントを選択し、ＰＴＡ８５株を生成することができる。
【０１４５】
２．ＰＴＡ８５株は、個々の実験において、ファージＰＴＰＸ８５、又はＰＴＰＸ８６、又はＰＴＰＸ８７、又は他の類似のファージで感染させ、子ファージを回収することができる。
【０１４６】
３．ｌａｃＺαマーカーが除去された組換えファージは、工程（２）由来の溶菌物を緑膿菌ＰＡＸ２１株に、Ｓ−ｇａｌを含有する培地上でプラーク形成させ、β−ガラクトシダーゼ活性がないことｗ示す白色プラークを探索することによって同定することができる。
【０１４７】
４．ｒｐｓＢ−ＳＡＳＰ−Ｃが依然として存在することを確認しつつ、ｌａｃＺαマーカーの除去を確認するためにＰＣＲを行うことができる。
【０１４８】
５．確認された単離物（例えば、ＰＴＰＸ８８（図７）、ＰＴＰＸ８９（図３）、ＰＴＰＸ９０（図４））を同定した後、更なる使用の前に、単離体を緑膿菌ＰＡＸ２１株で更に２回プラーク精製することができる。
【０１４９】
Ｐｈｉ３３、ＰＴＰＸ８３、ＰＴＰＸ８４、及び類似のファージのゲノム内の尾部繊維オペロンのすぐ下流の遺伝子間領域に位置する、選択された挿入部位にｆｄａ−ＳＡＳＰ−Ｃ（コドン最適化）及びｌａｃＺαを導入するためのプラスミドの構築
【０１５０】
１．ｆｄａプロモーターの制御下で、緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたＳＡＳＰ−Ｃを含むｐＳＭＸ２５１を含むプラスミドｐＳＭＸ２５４（図８）は、以下のように構築することができる。
【０１５１】
バシラス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子は、緑膿菌（図９）における発現のためにコドン最適化され、インビトロで合成することができる。次いで、コドン最適化されたＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子を、プライマーＢ４３１２及びＢ４３１３を用いるＰＣＲによって増幅することができる（図８）。ｆｄａプロモーターは、プライマーＢ４３１４及びＢ４３１５（図８）を用いて緑膿菌からＰＣＲによって増幅することができる。次いで、得られた２つのＰＣＲ産物を、外側プライマーＢ４３１２及びＢ４３１４（図８）を用いたオーバーラップ伸長（ＳＯＥｉｎｇ）ＰＣＲによるスプライシングによって連結することができる。次に、得られたｆｄａコドン最適化ＳＡＳＰ−Ｃ−ターミネーターＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＡｖｒＩＩで消化し、洗浄し、ＸｈｏＩ及びＡｖｒＩＩで消化したｐＳＭＸ２５１にライゲーションして、プラスミドｐＳＭＸ２５４（図８）を得ることができる。
【０１５２】
プライマーＢ４３１２は、５’ＸｈｏＩ制限部位、それに続く、二方向性転写ターミネーター、次いで、緑膿菌における発現のためにコドン最適化されたバシラス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ  １３６３２）由来のＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の３’末端に相補的な配列（下線、太字；図８）を含む。プライマーＢ４３１３は、緑膿菌ＰＡＯ１由来のｆｄａプロモーターの３’末端の配列（太字）、それに続く、コドン最適化されたＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の５’末端の配列を含む。プライマーＢ４３１４は、コドン最適化ＳＡＳＰ−Ｃ遺伝子の５’末端に相補的な配列、それに続く、緑膿菌ＰＡＯ１由来のｆｄａプロモーターの３’末端に相補的な配列を含む（図８）。プライマーＢ４３１５は、５’ＡｖｒＩＩ制限部位（下線部）、それに続く、緑膿菌ＰＡＯ１由来のｆｄａプロモーターの開始配列を含む（図８）。
プライマーＢ４３１２（配列番号：４１）
５’−ｇａｔａＣＴＣＧＡＧＡＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＴＣＣＧＡＣＣＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＧＡＣＴＴＣＡＧＴＡＣＴＴＧＣＣＧＣＣＣＡＧ−３’
プライマーＢ４３１３（配列番号：４２）
５’−ＧＡＴＴＧＧＧＡＧＡＴＡＣＧＡＧＡＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＡＡＣＧＣ−３’
プライマーＢ４３１４（配列番号：４３）
５’−ＧＣＧＴＴＣＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＴＣＴＣＧＴＡＴＣＴＣＣＣＡＡＴＣ−３’
プライマーＢ４３１５（配列番号：４４）
５’−ＧＡＴＡＣＣＴＡＧＧＡＡＣＧＡＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧ−３’
【０１５３】
３．ｌａｃＺαを含むｐＳＭＸ２５４を含むｐＳＭＸ２５５（図８）は、以下のように構築することができる。
【０１５４】
ｌａｃＺαは、プライマーＢ４９０６及びＢ４９０７を用いてＰＣＲ増幅することができる（図８）。次いで、得られたＰＣＲ産物をＸｈｏＩで消化し、同様にＸｈｏＩで消化し、ライゲーション前にアルカリホスファターゼで処理したｐＳＭＸ２５４にライゲーションし、ｐＳＭＸ２５５を得ることができる（図８）。
【０１５５】
プライマーＢ４９０６は、５’ＸｈｏＩ制限部位（下線部）と、それに続く、ｌａｃＺαの３’末端に相補的な配列とからなる（図８）。プライマーＢ４９０７は、５’ＸｈｏＩ制限部位（下線部）と、それに続く、ｌａｃＺαの発現を駆動するｌａｃプロモーターの配列とからなる（図８）。
プライマーＢ４９０６（配列番号：４０）
５’−ｇａｔａＣＴＣＧＡＧｔｔａｇｃｇｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｔｃ−３’
プライマーＢ４９０７（配列番号：４１）
５’−ｇａｔａＣＴＣＧＡＧｇｃｇｃａａｃｇｃａａｔｔａａｔｇｔｇ−３’
【０１５６】
ｆｄａコドン最適化ＳＡＳＰ−Ｃ及びｌａｃＺαを導入するための、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰＸ８３、ＰＴＰＸ８４、及び類似のファージの遺伝子改変
【０１５７】
１．プラスミドｐＳＭＸ２５５（図８；図１０；図１１；図１２）を、コンジュゲーションにより緑膿菌ＰＡＸ２１株に導入し、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいてトランスコンジュガントを選択し、ＰＴＡ８６株を生成することができる。
【０１５８】
２．株ＰＴＡ８６は、個々の実験において、ファージＰｈｉ３３、又はＰＴＰＸ８３、又はＰＴＰＸ８４、又は他の類似のファージに感染させ、子ファージを回収することができる。
【０１５９】
３．ｆｄａコドン最適化ＳＡＳＰ−Ｃ及びｌａｃＺαが導入された組換えファージは、工程（２）由来の溶菌物を緑膿菌ＰＡＸ２１株に、Ｓ−ｇａｌを含有する培地上でプラーク形成させ、β−ガラクトシダーゼ活性を示す黒色プラークを探索することによって同定することができる。
【０１６０】
４．ｆｄａコドン最適化ＳＡＳＰ−Ｃ及びｌａｃＺαが存在することを確認するためにＰＣＲを行うことができる。
【０１６１】
５．確認された単離物（例えば、ＰＴＰＸ９１（図１２）、ＰＴＰＸ９２（図１０）、ＰＴＰＸ９３（図１１））を同定した後、更なる使用の前に、単離体を緑膿菌ＰＡＸ２１株で更に２回プラーク精製することができる。
【０１６２】
ＰＴＰＸ９１、ＰＴＰＸ９２、ＰＴＰＸ９３、及びＰｈｉ３３の類似の誘導体からｌａｃＺαマーカーを除去するための遺伝子改変
【０１６３】
１．プラスミドｐＳＭＸ２５４（図８；図１０；図１１；図１２）を、コンジュゲーションにより緑膿菌ＰＡＸ２１株に導入し、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいてトランスコンジュガントを選択し、ＰＴＡ８７株を生成することができる。
【０１６４】
２．株ＰＴＡ８７は、個々の実験において、ファージＰＴＰＸ９１、又はＰＴＰＸ９２、又はＰＴＰＸ９３、又は他の類似のファージに感染させ、子ファージを回収することができる。
【０１６５】
３．ｌａｃＺαマーカーが除去された組換えファージは、工程（２）由来の溶菌物を緑膿菌ＰＡＸ２１株に、Ｓ−ｇａｌを含有する培地上でプラーク形成させ、β−ガラクトシダーゼ活性がないことを示す白色プラークを探索することによって同定することができる。
【０１６６】
４．ｆｄａコドン最適化ＳＡＳＰ−Ｃが依然として存在することを確認しつつ、ｌａｃＺαマーカーの除去を確認するためにＰＣＲを行うことができる。
【０１６７】
５．確認された単離物（例えば、ＰＴＰ３８７（図１２）、ＰＴＰ３８８（図１０）、ＰＴＰ３８９（図１１））を同定した後、更なる使用の前に、単離体を緑膿菌ＰＡＸ２１株で更に２回プラーク精製することができる。
【０１６８】
参考文献
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【０１６９】
表１．緑膿菌の４４種の欧州臨床分離株に対するＰｈｉ３３、ＰＴＰ９２、Ｃ３６、及びＰＴＰ４７の宿主域。
細菌を植菌した軟寒天オーバーレイプレート上に１０μｌの粗ファージ溶菌物を滴下することにより、各ファージに対する株の感受性を試験した。プレートを３２℃で一晩増殖させ、植菌箇所でのクリアランスゾーンを評価することにより、各株の各ファージに対する感受性をスコア化した。細菌叢のクリアランスによって観察されるように、ファージが増殖を阻害した場合には、株は、感受性（＋）であると示し、増殖の阻害が観察されない場合には、株は、非感受性（−）であると示した。
【表１】
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【０１７０】
表２．緑膿菌の３５種の欧州臨床分離株に対するＰｈｉ３３、ＰＴＰ９２、及びＰＴＰ９３の宿主域。
細菌を植菌した軟寒天オーバーレイプレート上に１０μｌの粗ファージ溶菌物を滴下することにより、各ファージに対する株の感受性を試験した。プレートを３２℃で一晩増殖させ、植菌箇所でのクリアランスゾーンを評価することにより、各株の各ファージに対する感受性をスコア化した。細菌叢のクリアランスによって観察されるように、ファージが増殖を阻害した場合には、株は、感受性（＋）であると示し、増殖の阻害が観察されない場合には、株は、非感受性（−）であると示した。
【表２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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