(57)【要約】本開示は、ゲノム編集組成物の改善およびＰＤ−１遺伝子を編集する方法を提供する。本開示は、癌、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全の少なくとも１つの症状の防止、治療、または改善のためのゲノム編集細胞をさらに提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ−１）遺伝子の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＨＥバリアントが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、前記ＨＥバリアントの生物学的に活性な断片を含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠く、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠く、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠く、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸を欠く、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、Ｃ末端アミノ酸を欠く、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠く、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＨＥバリアントが、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＨＥバリアントが、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ＨＥバリアントが、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置のＤＮＡ認識界面中に１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置のＤＮＡ認識界面中に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の２６、２８、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、１３８、１４３、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９７、１９９、２０１、２０３、２０７、２２３、２２４、２２５、２２７、２２９、２３２、２３６、および２３８位からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｋ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｓ７２Ｒ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｋ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｓ２０１Ｍ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｉ２２４Ｔ、Ｋ２２５Ｒ、Ｋ２２９Ｉ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｋ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｋ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｒ、Ｋ２２９Ｉ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｒ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｉ２２４Ｔ、Ｋ２２５Ｒ、Ｋ２２９Ｉ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｉ２２４Ｔ、Ｋ２２５Ｒ、Ｋ２２９Ｉ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｒ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ｍ、Ｔ２０３Ｇ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｒ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、１００、１３２、１３８、１４３、１５５、１５９、１７８、１８０、１８４、１８６、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、２０１、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２３６、２３８、および２４０位からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｖ３７Ｇ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ａ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｖ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｉ、Ｖ６８Ｓ、Ａ７０Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ａ７０Ｌ、Ｓ７２Ｄ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｒ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ８０Ｃ、Ｋ８０Ｅ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｆ、Ｔ８２Ｙ、Ｉ１００Ｖ、Ｖ１３２Ａ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ａ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｄ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｒ、Ｉ１００Ｖ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｖ３７Ｇ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｄ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｃ、Ｉ１００Ｖ、Ｖ１３２Ａ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｉ１００Ｖ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｓ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｅ、Ｔ８２Ｆ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｓ、Ａ７０Ｌ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ｇ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｓ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン２標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７４、７５、７６、７８、８０、８２、１１６、１３８、１４３、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９９、２０３、２０７、２２５、２２７、２２９、２３２、２３６、および２３８位からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン２標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片のＳ２４Ｃ、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｙ、Ｒ２８Ｈ、Ｒ３０Ｓ、Ｎ３２Ｖ、Ｎ３２Ｌ、Ｋ３４Ｎ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３５Ｔ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｖ３７Ｔ、Ｇ３８Ｒ、Ｇ３８Ｋ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ａ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｑ４６Ａ、Ｔ４８Ｅ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｉ、Ｄ７４Ｎ、Ｎ７５Ｔ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｓ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｔ８２Ｇ、Ｔ８２Ｒ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｎ、Ｆ１８２Ｙ、Ｎ１８４Ｈ、Ｉ１８６Ｋ、Ｋ１８９Ｇ、Ｓ１９０Ｒ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｙ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ａ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｎ、Ｋ２２５Ｔ、Ｋ２２７Ｗ、Ｋ２２７Ｓ、Ｋ２２９Ａ、Ｋ２２９Ｐ、Ｆ２３２Ｒ、Ｗ２３４Ａ、Ｗ２３４Ｄ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｒ位からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン２標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｙ、Ｒ３０Ｓ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ａ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ａ、Ｔ４８Ｅ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｉ、Ｎ７５Ｔ、Ａ７６Ｓ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｔ８２Ｇ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｎ、Ｆ１８２Ｙ、Ｎ１８４Ｈ、Ｉ１８６Ｋ、Ｋ１８９Ｇ、Ｓ１９０Ｒ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｙ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ａ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｎ、Ｋ２２７Ｗ、Ｋ２２９Ａ、Ｆ２３２Ｒ、Ｗ２３４Ａ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｒのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ＨＥバリアントが、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｓ２４Ｃ、Ｒ２８Ｈ、Ｎ３２Ｌ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｔ、Ｖ３７Ｔ、Ｇ３８Ｋ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｅ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｉ、Ｄ７４Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｔ８２Ｒ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｎ、Ｆ１８２Ｙ、Ｎ１８４Ｈ、Ｉ１８６Ｋ、Ｋ１８９Ｇ、Ｓ１９０Ｒ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｙ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｔ、Ｋ２２７Ｓ、Ｋ２２９Ｐ、Ｆ２３２Ｒ、Ｗ２３４Ｄ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｒのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ＨＥバリアントが、配列番号６〜１４および６０〜６３のいずれか１つのアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、もしくはさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ＨＥバリアントが、配列番号６に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記ＨＥバリアントが、配列番号７に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記ＨＥバリアントが、配列番号８に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記ＨＥバリアントが、配列番号９に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１２に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記ＨＥバリアントが、配列番号６０に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記ＨＥバリアントが、配列番号６１に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記ＨＥバリアントが、配列番号６２に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記ＨＥバリアントが、配列番号６３に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記ポリペプチドが、配列番号２５に記載のポリヌクレオチド配列に結合する、請求項１〜２１および３０〜３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、配列番号３０に記載のポリヌクレオチド配列に結合する、請求項１〜１４、２２〜２９、４０〜４１、および４４〜４７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記ポリペプチドが、配列番号３５に記載のポリヌクレオチド配列に結合する、請求項１〜１４、３０〜３３および４２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される、請求項５１に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項５２に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、ＰＤ−１遺伝子内のポリヌクレオチド配列に結合する、請求項５２または請求項５３に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号２６に記載のポリヌクレオチド配列に結合する、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが、配列番号２７に記載のポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号３１に記載のポリヌクレオチド配列に結合する、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
前記ポリペプチドが、配列番号３２に記載のポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する、請求項５７に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号３６に記載のポリヌクレオチド配列に結合する、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
前記ポリペプチドが、配列番号３７に記載のポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、２、３、４、５、６、７、または８個のジンクフィンガーモチーフを含む、請求項５２に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
ペプチドリンカー、およびエンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む、請求項１〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
ウイルス性自己切断型２Ａペプチド、およびエンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む、請求項１〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
前記エンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片が、５’−３’エキソヌクレアーゼ、５’−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項６２または請求項６３に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
前記エンドプロセシング酵素が、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
前記ポリペプチドが、配列番号１５〜２３、および６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
前記ポリペプチドが、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
前記ポリペプチドが、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
前記ポリペプチドが、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
前記ポリペプチドが、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
前記ポリペプチドが、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
前記ポリペプチドが、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
前記ポリペプチドが、配列番号２１に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
前記ポリペプチドが、配列番号２２に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
前記ポリペプチドが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
前記ポリペプチドが、配列番号６４に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
前記ポリペプチドが、配列番号２５、２７、３０、３２、３５、または３７に記載のポリヌクレオチド配列で、ヒトＰＤ−１遺伝子を切断する、請求項１〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
請求項１〜７７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項７９】
請求項１〜７７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ｍＲＮＡ。
【請求項８０】
請求項１〜７７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ｃＤＮＡ。
【請求項８１】
請求項１〜７７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項８２】
請求項１〜７７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、細胞。
【請求項８３】
請求項１〜７７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項８４】
請求項８１に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項８５】
請求項１〜７７のいずれか一項に記載のポリペプチドにより導入される１つ以上のゲノム編集を含む、細胞。
【請求項８６】
前記細胞が、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうち１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項８２〜８５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８７】
前記ポリヌクレオチドが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む、請求項８６に記載の細胞。
【請求項８８】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーのｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される、請求項８７に記載の細胞。
【請求項８９】
前記ポリヌクレオチドが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、その間で分散され、および／または隣接する１つ以上の自己切断型ウイルス性ペプチドをさらにコードする、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９０】
前記自己切断型ウイルス性ペプチドが、２Ａペプチドである、請求項８９に記載の細胞。
【請求項９１】
前記ポリヌクレオチドが、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項８６〜９０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９２】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む、請求項８６〜９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９３】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、キヌレニナーゼ活性を含む、請求項９２に記載の細胞。
【請求項９４】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、
（ａ）免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインであって、任意に、抗体もしくはその抗原結合断片である、細胞外ドメイン、
（ｂ）免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または
（ｃ）免疫抑制因子、膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメインと、免疫抑制シグナルを前記細胞に伝達できない修飾細胞内ドメインと、を含む、請求項８６〜９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９５】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、優性ネガティブＴＧＦβＲＩＩ受容体である、請求項８６〜９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９６】
前記免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される、請求項８６〜９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９７】
前記免疫賦活因子が、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項９６に記載の細胞。
【請求項９８】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１からなる群から選択される、請求項９７に記載の細胞。
【請求項９９】
前記サイトカインが、内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結された、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１からなる群から選択される、請求項９７に記載の細胞。
【請求項１００】
前記サイトカインがＩＬ−７であり、前記内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結する、請求項９７に記載の細胞。
【請求項１０１】
前記サイトカインがＩＬ−１２であり、前記内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結する、請求項９７に記載の細胞。
【請求項１０２】
前記サイトカインがＩＬ−１５であり、内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結する、請求項９７に記載の細胞。
【請求項１０３】
前記フリップ受容体が、ＰＤ−１細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインと、フレーム内でＰＤ−１膜貫通ドメインのＣ末端に融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む、請求項９６に記載の細胞。
【請求項１０４】
前記フリップ受容体が、ＰＤ−１細胞外ドメインと、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインと、フレーム内で前記ＰＤ−１細胞外ドメインのＣ末端に融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む、請求項９６に記載の細胞。
【請求項１０５】
前記フリップ受容体が、ＰＤ−１細胞外ドメインと、フレーム内で前記ＰＤ−１細胞外ドメインのＣ末端に融合されたＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと、を含む、請求項９６に記載の細胞。
【請求項１０６】
前記遺伝子操作された抗原受容体が、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはゼータカインからなる群から選択される、請求項８６〜９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０７】
前記遺伝子操作された受容体が、ＰＤ−１遺伝子に統合されない、請求項１０６に記載の細胞。
【請求項１０８】
免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうち１つ以上をコードする前記ポリヌクレオチドが、前記ＰＤ−１遺伝子に統合される、請求項８６〜９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０９】
免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうち１つ以上をコードする前記ポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートが、請求項１〜７７のいずれか一項に記載のポリペプチドによって導入されるＤＮＡ２本鎖切断部位で前記ＰＤ−１遺伝子に統合される、請求項８６〜９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１０】
前記細胞が、造血細胞である、請求項８２〜１０９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１１】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項８２〜１１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１２】
前記細胞が、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋細胞である、請求項８２〜１１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１３】
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項８２〜１１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１４】
前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項８２〜１１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１５】
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項８２〜１１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１６】
前記細胞の源が、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題（ｉｓｓｕｅ）、感染部位由来組織、復水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、請求項８２〜１１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１７】
前記細胞が、１つ以上の修飾ＰＤ−１対立遺伝子を含む、請求項８２〜１１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１８】
前記１つ以上の修飾ＰＤ−１対立遺伝子が、機能不全であるか、または実質的に低減されたＰＤ−１機能および／もしくは細胞内シグナル伝達を有する、請求項１１７に記載の細胞。
【請求項１１９】
前記細胞が、前記１つ以上の修飾ＰＤ−１対立遺伝子に導入される免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする核酸を含む、請求項８２〜１１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２０】
前記細胞が、前記１つ以上の修飾ＰＤ−１対立遺伝子に導入される免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードする核酸を含み、前記細胞が、前記１つ以上の修飾ＰＤ−１対立遺伝子に導入されていない遺伝子操作された抗原受容体をさらに含む、請求項８２〜１１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２１】
請求項８２〜１２０のいずれか一項に記載の１つ以上の細胞を含む、複数の細胞。
【請求項１２２】
請求項８２〜１２１のいずれか一項に記載の１つ以上の細胞を含む、組成物。
【請求項１２３】
請求項８２〜１２１のいずれか一項に記載の１つ以上の細胞と、生理学的に許容される担体と、を含む、組成物。
【請求項１２４】
細胞内のヒトＰＤ−１遺伝子を編集する方法であって、請求項１〜７７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトＰＤ−１遺伝子の標的部位で２本鎖切断を作り出す、方法。
【請求項１２５】
細胞内のヒトＰＤ−１遺伝子を編集する方法であって、請求項１〜７７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトＰＤ−１遺伝子の標的部位で２本鎖切断を作り出し、前記切断が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される、方法。
【請求項１２６】
細胞内のヒトＰＤ−１遺伝子を編集する方法であって、請求項１〜７７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ドナー修復テンプレートとを前記細胞に導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトＰＤ−１遺伝子の標的部位で２本鎖切断を作り出し、前記ドナー修復テンプレートが、前記２本鎖切断（ＤＳＢ）の前記部位での相同組換え修復（ＨＤＲ）によって前記ヒトＰＤ−１遺伝子に組込まれる、方法。
【請求項１２７】
前記細胞が、造血細胞である、請求項１２４〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記細胞が、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋細胞である、請求項１２４〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項１２４〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項１２４〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項１２４〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記細胞の源が、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題（ｉｓｓｕｅ）、感染部位由来組織、復水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、請求項１２４〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、請求項１２４〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
３’−５’エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記細胞に導入される、請求項１２４〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドが、前記細胞に導入される、請求項１２４〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ドナー修復テンプレートが、野生型ＰＤ−１遺伝子と比較して、１つ以上の変異を含むＰＤ−１遺伝子またはその部分をコードする、請求項１２４〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記ドナー修復テンプレートが、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうち１つ以上をコードする、請求項１２４〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記ドナー修復テンプレートが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１  （ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーのｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記ドナー修復テンプレートが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、その間で分散され、および／または隣接する１つ以上の自己切断型ウイルス性ペプチドをさらにコードする、請求項１３８〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記自己切断型ウイルス性ペプチドが、２Ａペプチドである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記ドナー修復テンプレートが、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１３８〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む、請求項１３８〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、キヌレニナーゼ活性を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、
（ａ）免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインであって、任意に、抗体もしくはその抗原結合断片である、細胞外ドメイン、
（ｂ）免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または
（ｃ）免疫抑制因子、膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメインと、免疫抑制シグナルを前記細胞に伝達できない修飾細胞内ドメインと、を含む、請求項１３８〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、優性ネガティブＴＧＦβＲＩＩ受容体である、請求項１３８〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される、請求項１３８〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記免疫賦活因子が、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１からなる群から選択される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１からなる群から選択され、前記内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結する、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５２】
前記サイトカインがＩＬ−７であり、前記内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結する、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５３】
前記サイトカインがＩＬ−１２であり、前記内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結する、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５４】
前記サイトカインがＩＬ−１５であり、前記内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結する、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５５】
前記フリップ受容体が、ＰＤ−１細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインと、フレーム内で前記ＰＤ−１膜貫通ドメインのＣ末端に融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５６】
前記フリップ受容体が、ＰＤ−１細胞外ドメインと、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインと、フレーム内で前記ＰＤ−１細胞外ドメインのＣ末端に融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５７】
前記フリップ受容体が、ＰＤ−１細胞外ドメインと、フレーム内で前記ＰＤ−１細胞外ドメインのＣ末端に融合されたＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと、を含む、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５８】
前記遺伝子操作された抗原受容体が、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはゼータカインからなる群から選択される、請求項１３８〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記ドナー修復テンプレートが、前記ＤＳＢのヒトＰＤ−１遺伝子配列５´に相同な５´相同アームと、前記ＤＳＢのヒトＰＤ−１遺伝子配列３´に相同な３´相同アームとを含む、請求項１３８〜１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記５´および３´相同アームの長さが、約１００ｂｐ〜約２５００ｂｐから独立して選択される、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記５´および３´相同アームの前記長さが、約６００ｂｐ〜約１５００ｂｐから独立して選択される、請求項１５９または請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記５´相同アームが約１５００ｂｐであり、前記３´相同アームが約１０００ｂｐである、請求項１５９〜１６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記５´相同アームが約６００ｂｐであり、前記３´相同アームが約６００ｂｐである、請求項１５９〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
ウイルス性ベクターが、前記ドナー修復テンプレートを前記細胞に導入するために使用される、請求項１５９〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２由来の１つ以上のＩＴＲを有する、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する、請求項１６５または請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６の血清型を有する、請求項１６５〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１７０】
前記レンチウイルスが、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
請求項１２２または請求項１２３に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む、癌、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、または改善する方法。
【請求項１７２】
請求項１２２または請求項１２３に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、固形癌を治療する方法。
【請求項１７３】
前記固形癌が、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、脳癌、肉腫、頭頸部癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌を含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
請求項１２２または請求項１２３に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、血液系腫瘍を治療する方法。
【請求項１７５】
前記血液系腫瘍が、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である、請求項１７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０１６年１０月２８日出願の米国仮出願第６２／４１４，２７９号、および２０１６年９月８日出願の米国仮出願第６２／３８５，０７９号の利益を主張するものであり、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【０００２】
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組込まれる。配列表を含むこのテキストファイルの名前は、ＢＬＢＤ＿０７６＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。本テキストファイルは２６６ＫＢであり、２０１７年９月８日に作成され、本明細書の出願と同時に、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、ゲノム編集組成物の改善に関する。とりわけ、本開示は、ヌクレアーゼバリアント、組成物、およびヒトプログラム細胞死１（ＰＤ−１）遺伝子を編集するためのその使用方法に関する。
【０００４】
先行技術の記載
癌の世界的な負担は１９７５年から２０００年の間に２倍となった。癌は、世界中の疾病率および死亡率の２番目に高い要因であり、２０１２年において新たな症例はおよそ１４１０万件、癌関連死は８２０万件となっている。最もよく見られる癌は、乳癌、肺および気管支癌、前立腺癌、結腸および直腸癌、膀胱癌、皮膚の黒色腫、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、腎臓および腎盂癌、子宮内膜癌、白血病、ならびに膵臓癌である。新たな癌症例件数は、今後２０年以内で２２００万件に上昇すると予想される。
【０００５】
免疫系は、ヒト癌の検出および撲滅において主要な役割を有する。形質転換細胞の大部分は、免疫センチネルによって迅速に検出され、クローン的に発現されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した抗原特異的Ｔ細胞の活性化を通して破壊される。したがって、癌は、免疫学的障害、すなわち、この疾患を恒久的に抑制および排除するために必要な抗腫瘍応答を開始する免疫系の機能障害とみなすことができる。癌をより有効に撲滅するために、過去数十年間にわたって開発された特定の免疫療法介入は、Ｔ細胞免疫性を強化することに特に注力してきた。これらの治療は、疾患寛解の孤発例をもたらしてきたのみであり、実質的な全体的奏功は達成していない。ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１などのＴ細胞活性化を阻害する分子を標的とするモノクローナル抗体を使用する、より最近の療法は、より実質的な抗腫瘍効果を示してきたが、これらの治療はまた、全身免疫活性化に起因する実質的な毒性にも関連する。
【０００６】
より最近では、Ｔ細胞の単離、修飾、増殖、および再注入に基づく養子細胞免疫療法戦略が探索されており、初期段階の臨床試験で試験されている。Ｔ細胞はしばしば、それらの選択的認識および強力なエフェクター機構に起因して、癌免疫療法のための一般的に好まれるエフェクター細胞となっている。これらの治療は、まちまちな奏効率を示してきたが、少数の患者は、恒久的な寛解を経験しており、Ｔ細胞ベースの癌免疫療法の未だ理解されていない可能性を強調している。
【０００７】
細胞溶解性Ｔ細胞による腫瘍細胞関連抗原の成功裏の認識は、標的とする腫瘍の溶解を惹起し、任意の有効な癌免疫療法アプローチを実証する。腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）は、腫瘍関連抗原に特異的に指向されたＴＣＲを発現するが、実質的な数のＴＩＬは、少数のヒト癌のみに限定される。遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、多くの癌および他の免疫障害に対するＴ細胞ベースの免疫療法の適用性を増加させる可能性がある。
【０００８】
その上、最新技術による遺伝子操作されたＴ細胞は依然として、癌細胞、炎症性細胞、間質細胞、およびサイトカインからなる複合の免疫抑制腫瘍微小環境によって調節される。これらの構成要素のうち、癌細胞、炎症性細胞、および抑制性サイトカインがＴ細胞表現型および機能を調節する。集合的に、腫瘍微小環境は、Ｔ細胞が疲弊したＴ細胞へと最終的に分化するよう駆り立てる。
【０００９】
Ｔ細胞疲弊は、阻害性受容体の増加した発現または阻害性受容体による増加したシグナル伝達、低減されたエフェクターサイトカイン産生、および持続して癌を排除する能力の減少によって特徴付けられる慢性的環境における、Ｔ細胞機能不全の状態である。疲弊したＴ細胞はまた、階層的様態で機能喪失を示す。すなわち、減少したＩＬ−２産生およびエクスビボでの殺傷能力が疲弊の早期段階で失われ、ＴＮＦ−α産生が中間段階で失われ、ＩＦＮ−γおよびＧｚｍＢ産生が疲弊の後期段階で失われる。腫瘍微小環境におけるほとんどのＴ細胞は、疲弊したＴ細胞へと分化し、癌を排除する能力を失い、最終的には取り除かれる。
【００１０】
プログラム細胞死１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞上で発現され、腫瘍微小環境に存在する免疫抑制因子、例えば、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２への結合による免疫抑制を媒介する。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現は、いくつかのヒト悪性腫瘍における予後と相関する。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１シグナル伝達経路は、Ｔ細胞疲弊のある重要な調節経路である。ＰＤ−Ｌ１は、癌細胞および間質細胞において多量に発現され、モノクローナル抗体を用いたＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１の遮断が、Ｔ細胞抗腫瘍機能を増強する。ＰＤ−Ｌ２もまた、ＰＤ−１に結合し、Ｔ細胞機能を負に調節する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は概して、部分的に、ヒトＰＤ−１遺伝子中の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびｍｅｇａＴＡＬを含む組成物、ならびにその使用方法に関する。
【００１２】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ−１）遺伝子の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含むポリペプチドを企図する。
【００１３】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである。
【００１４】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＨＥバリアントの生物学的に活性な断片を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、前記生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠く。
【００１６】
追加の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠く。
【００１７】
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠く。
【００１８】
特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸を欠く。
【００１９】
特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、Ｃ末端アミノ酸を欠く。
【００２０】
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠く。
【００２１】
さらなる実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。
【００２２】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。
【００２３】
さらなる実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントである。
【００２４】
追加の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置のＤＮＡ認識界面中に１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００２５】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置のＤＮＡ認識界面中に、少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上アミノ酸置換を含む。
【００２６】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の２６、２８、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、１３８、１４３、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９７、１９９、２０１、２０３、２０７、２２３、２２４、２２５、２２７、２２９、２３２、２３６、および２３８位からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む。
【００２７】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｋ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｓ７２Ｒ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｋ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｓ２０１Ｍ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｉ２２４Ｔ、Ｋ２２５Ｒ、Ｋ２２９Ｉ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｋ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｋ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｒ、Ｋ２２９Ｉ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００２９】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｒ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｉ２２４Ｔ、Ｋ２２５Ｒ、Ｋ２２９Ｉ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００３０】
追加の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｉ２２４Ｔ、Ｋ２２５Ｒ、Ｋ２２９Ｉ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００３１】
さらなる実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｒ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００３２】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ｍ、Ｔ２０３Ｇ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｒ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００３３】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、１００、１３２、１３８、１４３、１５５、１５９、１７８、１８０、１８４、１８６、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、２０１、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２３６、２３８、および２４０位からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む。
【００３４】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片のＬ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｖ３７Ｇ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ａ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｖ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｉ、Ｖ６８Ｓ、Ａ７０Ｔ、Ａ７０Ｙ、Ａ７０Ｌ、Ｓ７２Ｄ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｒ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ８０Ｃ、Ｋ８０Ｅ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｆ、Ｔ８２Ｙ、Ｉ１００Ｖ、Ｖ１３２Ａ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅ位からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む。
【００３５】
さらなる実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ａ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｄ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｒ、Ｉ１００Ｖ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００３６】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｖ３７Ｇ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｄ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｃ、Ｉ１００Ｖ、Ｖ１３２Ａ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００３７】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｉ１００Ｖ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００３８】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｓ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｅ、Ｔ８２Ｆ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００３９】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｓ、Ａ７０Ｌ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００４０】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ｇ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｓ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００４１】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン２標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７４、７５、７６、７８、８０、８２、１１６、１３８、１４３、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９９、２０３、２０７、２２５、２２７、２２９、２３２、２３６、および２３８位からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む。
【００４２】
追加の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン２標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片のＳ２４Ｃ、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｙ、Ｒ２８Ｈ、Ｒ３０Ｓ、Ｎ３２Ｖ、Ｎ３２Ｌ、Ｋ３４Ｎ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３５Ｔ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｖ３７Ｔ、Ｇ３８Ｒ、Ｇ３８Ｋ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ａ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｑ４６Ａ、Ｔ４８Ｅ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｉ、Ｄ７４Ｎ、Ｎ７５Ｔ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｓ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｔ８２Ｇ、Ｔ８２Ｒ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｎ、Ｆ１８２Ｙ、Ｎ１８４Ｈ、Ｉ１８６Ｋ、Ｋ１８９Ｇ、Ｓ１９０Ｒ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｙ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ａ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｎ、Ｋ２２５Ｔ、Ｋ２２７Ｗ、Ｋ２２７Ｓ、Ｋ２２９Ａ、Ｋ２２９Ｐ、Ｆ２３２Ｒ、Ｗ２３４Ａ、Ｗ２３４Ｄ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｒ位からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む。
【００４３】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン２標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｙ、Ｒ３０Ｓ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ａ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ａ、Ｔ４８Ｅ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｉ、Ｎ７５Ｔ、Ａ７６Ｓ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｔ８２Ｇ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｎ、Ｆ１８２Ｙ、Ｎ１８４Ｈ、Ｉ１８６Ｋ、Ｋ１８９Ｇ、Ｓ１９０Ｒ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｙ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ａ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｎ、Ｋ２２７Ｗ、Ｋ２２９Ａ、Ｆ２３２Ｒ、Ｗ２３４Ａ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｒのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン２標的部位を切断し、配列番号１〜５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換、Ｓ２４Ｃ、Ｒ２８Ｈ、Ｎ３２Ｌ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｔ、Ｖ３７Ｔ、Ｇ３８Ｋ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｅ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｉ、Ｄ７４Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｔ８２Ｒ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｎ、Ｆ１８２Ｙ、Ｎ１８４Ｈ、Ｉ１８６Ｋ、Ｋ１８９Ｇ、Ｓ１９０Ｒ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｙ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｔ、Ｋ２２７Ｓ、Ｋ２２９Ｐ、Ｆ２３２Ｒ、Ｗ２３４Ｄ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｒのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上、または全てを含む。
【００４５】
追加の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号６〜１４および６０〜６３のいずれか１つのアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、もしくはさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４６】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号６に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００４７】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号７に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号８に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００４９】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号９に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５０】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５１】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５３】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号６０に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号６１に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号６２に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号６３に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５９】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２５に記載のポリヌクレオチド配列に結合する。
【００６０】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３０に記載のポリヌクレオチド配列に結合する。
【００６１】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３５に記載のポリヌクレオチド配列に結合する。
【００６２】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される。
【００６４】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【００６５】
追加の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、ＰＤ−１遺伝子内のポリヌクレオチド配列に結合する。
【００６６】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２６に記載のポリヌクレオチド配列に結合する。
【００６７】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２７に記載のポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。
【００６８】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号３１に記載のポリヌクレオチド配列に結合する。
【００６９】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３２に記載のポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。
【００７０】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号３６に記載のポリヌクレオチド配列に結合する。
【００７１】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３７に記載のポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。
【００７２】
特定の実施形態において、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８つのジンクフィンガーモチーフを含む。
【００７３】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、ペプチドリンカー、およびエンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む。
【００７４】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ウイルス性自己切断型２Ａペプチド、およびエンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む。
【００７５】
追加の実施形態において、エンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片は、５’−３’エキソヌクレアーゼ、５’−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【００７６】
特定の実施形態において、エンドプロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００７７】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１５〜２３、および６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００７８】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００７９】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００８０】
様々な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００８１】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００８２】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００８３】
様々な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００８４】
様々な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００８５】
追加の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００８６】
様々な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００８７】
追加の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６４に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００８８】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００８９】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２５、２７、３０、３２、３５、または３７に記載のポリヌクレオチド配列で、ヒトＰＤ−１遺伝子を切断する。
【００９０】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを企図する。
【００９１】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを企図する。
【００９２】
特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、配列番号４０〜４２および６５〜６８の配列を含む。
【００９３】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするｃＤＮＡを企図する。
【００９４】
特定の実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを企図する。
【００９５】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図されるポリペプチドを含む細胞を企図する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を企図する。
【００９７】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図されるベクターを含む細胞を企図する。
【００９８】
追加の実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図されるポリペプチドによって導入される１つ以上のゲノム編集を含む細胞を企図する。
【００９９】
特定の実施形態において、細胞は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうち１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１００】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む。
【０１０１】
特定の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ  ２６遺伝子座、ユビキチンＣプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１  （ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーのｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、その間で分散され、および／または隣接する１つ以上の自己切断型ウイルス性ペプチドをさらにコードする。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、自己切断型ウイルスペプチドは、２Ａペプチドである。
【０１０４】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、キヌレニナーゼ活性を含む。
【０１０７】
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、任意に、その抗体もしくはその抗原結合断片である、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメイン、免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または免疫抑制因子、膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、および免疫抑制シグナルを細胞に伝達できない修飾細胞内ドメインを含む。
【０１０８】
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、優性ネガティブＴＧＦβＲＩＩ受容体である。
【０１０９】
特定の実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される。
【０１１０】
特定の実施形態において、免疫賦活因子は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそのバリアントからなる群から選択される。
【０１１１】
特定の実施形態において、サイトカイン受容体は、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１８受容体、およびＩＬ−２１受容体からなる群から選択される。
【０１１２】
好ましい実施形態において、細胞は、内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結するＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１８受容体、およびＩＬ−２１受容体からなる群から選択されるサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１１３】
別の好ましい実施形態において、細胞は、内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結するＩＬ−１２サイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１１４】
特定の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１からなる群から選択される。
【０１１５】
好ましい実施形態において、細胞は、内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結するＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１からなる群から選択されるサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１１６】
別の好ましい実施形態において、細胞は、内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結するＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１１７】
追加の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ−１細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインと、フレーム内でＰＤ−１膜貫通ドメインのＣ末端に融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。
【０１１８】
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ−１細胞外ドメインと、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインと、フレーム内でＰＤ−１細胞外ドメインのＣ末端に融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。
【０１１９】
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ−１細胞外ドメインと、フレーム内でＰＤ−１細胞外ドメインのＣ末端に融合されたＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと、を含む。
【０１２０】
追加の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはゼータカインからなる群から選択される。
【０１２１】
特定の実施形態において、遺伝子操作された受容体は、ＰＤ−１遺伝子に統合されない。
【０１２２】
特定の実施形態において、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうち１つ以上をコードするポリヌクレオチドは、ＰＤ−１遺伝子に統合される。
【０１２３】
さらなる実施形態において、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうち１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートは、本明細書において企図されるポリペプチドによって導入されるＤＮＡ２本鎖切断部位でＰＤ−１遺伝子に統合される。
【０１２４】
特定の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１からなる群から選択されるサイトカインをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートは、本明細書において企図されるポリペプチドによって導入されるＤＮＡ２本鎖切断部位でＰＤ−１遺伝子に統合される。好ましい実施形態において、サイトカインは、内在性ＰＤ−１プロモーターと作動可能に連結するＰＤ−１遺伝子に統合される。
【０１２５】
特定の実施形態において、ＩＬ−１２サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートは、本明細書において企図されるポリペプチドによって導入されるＤＮＡ２本鎖切断部位でＰＤ−１遺伝子に統合される。好ましい実施形態において、ＩＬ−１２サイトカインは、内在性ＰＤ−１プロモーターと作動可能に連結するＰＤ−１遺伝子に統合される。
【０１２６】
特定の実施形態において、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１８受容体、およびＩＬ−２１受容体からなる群から選択されるサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートは、本明細書において企図されるポリペプチドによって導入されるＤＮＡ２本鎖切断部位でＰＤ−１遺伝子に統合される。好ましい実施形態において、サイトカイン受容体は、内在性ＰＤ−１プロモーターと作動可能に連結するＰＤ−１遺伝子に統合される。
【０１２７】
特定の実施形態において、ＩＬ−１２サイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートは、本明細書において企図されるポリペプチドによって導入されるＤＮＡ２本鎖切断部位でＰＤ−１遺伝子に統合される。好ましい実施形態において、ＩＬ−１２サイトカイン受容体は、内在性ＰＤ−１プロモーターと作動可能に連結するＰＤ−１遺伝子に統合される。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、細胞は、造血細胞である。
【０１２９】
追加の実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。
【０１３０】
特定の実施形態において、細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋細胞である。
【０１３１】
特定の実施形態において、細胞は、免疫エフェクター細胞である。
【０１３２】
さらなる実施形態において、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。
【０１３３】
特定の実施形態において、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。
【０１３４】
特定の実施形態において、細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題（ｉｓｓｕｅ）、感染部位由来組織、復水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
【０１３５】
特定の実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図される１つ以上の細胞を含む複数の細胞を企図する。
【０１３６】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図される１つ以上の細胞を含む組成物を企図する。
【０１３７】
特定の実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図される１つ以上の細胞と、生理学的に許容される担体を含む組成物を企図する。
【０１３８】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することで、ポリペプチドの発現がヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位で２本鎖切断を作り出すことを含む、細胞内のヒトＰＤ−１遺伝子を編集する方法を企図する。
【０１３９】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することで、ポリペプチドの発現がヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位で２本鎖切断を作り出し、切断が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復されることを含む、細胞内のヒトＰＤ−１遺伝子を編集する方法を企図する。
【０１４０】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ドナー修復テンプレートとを細胞に導入することで、ポリペプチドの発現がヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位で２本鎖切断を作り出し、ドナー修復テンプレートが、２本鎖切断（ＤＳＢ）の部位で相同組換え修復（ＨＤＲ）によってヒトＰＤ−１遺伝子に組込まれることを含む、細胞内のヒトＰＤ−１遺伝子を編集する方法を企図する。
【０１４１】
さらなる実施形態において、細胞は、造血細胞である。
【０１４２】
特定の実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。
【０１４３】
特定の実施形態において、細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋細胞である。
【０１４４】
特定の実施形態において、細胞は、免疫エフェクター細胞である。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。
【０１４６】
特定の実施形態において、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。
【０１４７】
特定の実施形態において、細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題（ｉｓｓｕｅ）、感染部位由来組織、復水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
【０１４８】
特定の実施形態において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。
【０１４９】
追加の実施形態において、３’−５’エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、細胞に導入される。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドは、細胞に導入される。
【０１５１】
さらなる実施形態において、ドナー修復テンプレートは、野生型ＰＤ−１遺伝子と比較して、１つ以上の変異を含むＰＤ−１遺伝子またはその部分をコードする。
【０１５２】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうち１つ以上をコードする。
【０１５３】
追加の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む。
【０１５４】
さらなる実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ  ２６遺伝子座、ユビキチンＣプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーのｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される。
【０１５５】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、その間で分散され、および／または隣接する１つ以上の自己切断型ウイルス性ペプチドをさらにコードする。
【０１５６】
追加の実施形態において、自己切断型ウイルスペプチドは、２Ａペプチドである。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、ドナー修復テンプレートは、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【０１５８】
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む。
【０１５９】
さらなる実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、キヌレニナーゼ活性を含む。
【０１６０】
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、任意に、その抗体もしくはその抗原結合断片である、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメイン、免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または免疫抑制因子、膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、および免疫抑制シグナルを細胞に伝達できない修飾細胞内ドメインを含む。
【０１６１】
追加の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、優性ネガティブＴＧＦβＲＩＩ受容体である。
【０１６２】
特定の実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される。
【０１６３】
さらなる実施形態において、免疫賦活因子は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそのバリアントからなる群から選択される。
【０１６４】
特定の実施形態において、免疫賦活因子は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそのバリアントからなる群から選択される。
【０１６５】
特定の実施形態において、サイトカイン受容体は、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１８受容体、およびＩＬ−２１受容体からなる群から選択される。
【０１６６】
好ましい実施形態において、細胞は、内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結するＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１８受容体、およびＩＬ−２１受容体からなる群から選択されるサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１６７】
別の好ましい実施形態において、細胞は、内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結するＩＬ−１２受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１６８】
特定の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１からなる群から選択される。
【０１６９】
好ましい実施形態において、細胞は、内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結するＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１からなる群から選択されるサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１７０】
別の好ましい実施形態において、細胞は、内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結するＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１７１】
追加の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ−１細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインと、フレーム内でＰＤ−１膜貫通ドメインのＣ末端に融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。
【０１７２】
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ−１細胞外ドメインと、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインと、フレーム内でＰＤ−１細胞外ドメインのＣ末端に融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインを含む。
【０１７３】
さらなる実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ−１細胞外ドメインと、フレーム内でＰＤ−１細胞外ドメインのＣ末端に融合されたＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと、を含む。
【０１７４】
追加の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはゼータカインからなる群から選択される。
【０１７５】
追加の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢのヒトＰＤ−１遺伝子配列５´に相同な５´相同アームと、ＤＳＢのヒトＰＤ−１遺伝子配列３´に相同な３´相同アームとを含む。
【０１７６】
特定の実施形態において、５´および３´相同アームの長さは、約１００ｂｐ〜約２５００ｂｐから独立して選択される。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、５´および３´相同アームの長さは、約６００ｂｐ〜約１５００ｂｐから独立して選択される。
【０１７８】
いくつかの施形態において、５’相同アームは、約１５００ｂｐであり、３’相同アームは、約１０００ｂｐである。
【０１７９】
特定の実施形態において、５’相同アームは、約６００ｂｐであり、３’相同アームは、約６００ｂｐである。
【０１８０】
特定の実施形態において、ウイルスベクターはドナー修復テンプレートを細胞に導入するのに使用される。
【０１８１】
追加の実施形態において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである。
【０１８２】
さらなる実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来の１つ以上のＩＴＲを有する。
【０１８３】
特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する。
【０１８４】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６血清型を有する。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
【０１８６】
特定の実施形態において、レンチウイルスは、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である。
【０１８７】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図される組成物の有効量を対象に投与することを含む、癌、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、または改善する方法を企図する。
【０１８８】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図される組成物の有効量を対象に投与することを含む、固形癌を治療する方法を企図する。
【０１８９】
さらなる実施形態において、固形癌は、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、脳癌、肉腫、頭頸部癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌を含む。
【０１９０】
様々な実施形態において、本開示は、部分的に、本明細書において企図される組成物の有効量を対象に投与することを含む、血液系腫瘍を治療する方法を企図する。
【０１９１】
追加の実施形態において、血液系腫瘍は、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１Ａ】エクソンのｍｅｇａＴＡＬの位置に関する、ＰＤ−１のＩｇＶドメイン、ＩＴＩＭ、およびＩＴＳＭモチーフの位置を図示する模式図を示す。
【図１Ｂ】エクソン５（配列番号１０６〜１０８）によってコードされたＩＴＳＭモチーフ内の標的部位のＰＤ−１遺伝子および配列を示し、位置２４８のＩＴＳＭホスホチロシン残基に対してコドンに位置するＨＥ中央４モチーフを強調する。
【図２】どのようにＩ−ＯｎｕＩが、２回の選別と、続いて再プログラムされたドメイン（配列番号１１１）の融合と、十分に再プログラムされたＨＥを単離するための、完全なＰＤ−１エクソン５標的部位に対するスクリーニングとを通して、キメラ「ハーフ部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅｓ）」（配列番号１０９および１１０）に対してＮＴＤおよびＣＴＤの遺伝子操作を介して再プログラムされるかを示す。
【図３Ａ】染色体受容体アッセイでの活性のための、ＰＤ−１エクソン５ＨＥバリアントの開始スクリーニングを示す。
【図３Ｂ】ＰＤ−１  ＨＥバリアント（ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ１＿ＣＶ３−０８）が、平衡気質滴定法によって測定された際、適度なＤＮＡ結合親和性特性を有することを示す。
【図４−１】改善された活性を有するバリアントを単離するために、よりストリンジェントな切断および親和性条件下で実施されたＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ１＿ＣＶ３−０８のバリアントの、ランダムに変異誘発されたライブラリのディスプレイベース流動選別からの強化されたバリアントの単離に従った、染色体受容体アッセイにおける活性のための、ＰＤ−１  ＨＥのスクリーニングを示す。
【図４−２】改善された活性を有するバリアントを単離するために、よりストリンジェントな切断および親和性条件下で実施されたＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ１＿ＣＶ３−０８のバリアントの、ランダムに変異誘発されたライブラリのディスプレイベース流動選別からの強化されたバリアントの単離に従った、染色体受容体アッセイにおける活性のための、ＰＤ−１  ＨＥのスクリーニングを示す。
【図４−３】改善された活性を有するバリアントを単離するために、よりストリンジェントな切断および親和性条件下で実施されたＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ１＿ＣＶ３−０８のバリアントの、ランダムに変異誘発されたライブラリのディスプレイベース流動選別からの強化されたバリアントの単離に従った、染色体受容体アッセイにおける活性のための、ＰＤ−１  ＨＥのスクリーニングを示す。
【図５】ＰＤ−１エクソン５ＨＥ内に存在するＣｐＧモチーフ（配列番号１１３）のメチル化状況を決定するための、活性化された一次ヒトＴ細胞内のＰＤ−１エクソン５（配列番号１１２）のバイサルファイト配列決定アッセイの結果を示す。
【図６−１】部分的かつ全体的にメチル化したＰＤ−１エクソン５基質に対する、ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ＨＥバリアントのＤＮＡ結合親和性および切断解析の結果を示す。
【図６−２】部分的かつ全体的にメチル化したＰＤ−１エクソン５基質に対する、ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ＨＥバリアントのＤＮＡ結合親和性および切断解析の結果を示す。
【図７Ａ】ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ｍｅｇａＴＡＬとＴＲＥＸ２とのＴ細胞への共送達が、ＴＩＤＥ解析によって測定した場合、６０％の割合で標的遺伝子座を編集することを示す。
【図７Ｂ】Ｔｒｅｘ２の存在下でＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ｍｅｇａＴＡＬによって切断された場合の、ＰＤ−１  ＩＴＳＭコンセンサスモチーフでのインデル分配を示す。
【図８−１】ＰＤ−１エクソン５ＨＥの中央４特異性のプロファイリングの結果を示す。
【図８−２】ＰＤ−１エクソン５ＨＥの中央４特異性のプロファイリングの結果を示す。
【図８−３】ＰＤ−１エクソン５ＨＥの中央４特異性のプロファイリングの結果を示す。
【図８−４】ＰＤ−１エクソン５ＨＥの中央４特異性のプロファイリングの結果を示す。
【図８−５】ＰＤ−１エクソン５ＨＥの中央４特異性のプロファイリングの結果を示す。
【図８−６】ＰＤ−１エクソン５ＨＥの中央４特異性のプロファイリングの結果を示す。
【図８−７】ＰＤ−１エクソン５ＨＥの中央４特異性のプロファイリングの結果を示す。
【図８−８】ＰＤ−１エクソン５ＨＥの中央４特異性のプロファイリングの結果を示す。
【図９Ａ】エクソン１、２、および５の位置に関する、ＰＤ−１のＩｇＶドメイン、ＩＴＩＭ、およびＩＴＳＭドメインの位置を図示する模式図を示す。
【図９Ｂ】ＰＤ−１遺伝子およびにエクソン１（配列番号１１４〜１１６）、２（配列番号１１７〜１１９）、および５（配列番号１０６〜１０８）内の標的部位の位置を示す。
【図１０】、ＰＤ−１エクソン１（ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ１＿Ｂ１、上部パネル）を標的とする最初に再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩに対する触媒活性のディスプレイベース流動選別（より活性なバリアント（ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｈ８もしくはＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｇ２、中央パネル）を同定するための標的切断を補助する変異を同定するための、よりストリンジェントな触媒条件下での変異誘発およびスクリーニングによる、ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ１＿Ｂ１の洗練）、かつＰＤ−１エクソン２（ＰＤ−１．ＩｇＶ．ｅｘｏｎ２＿ＲＤ１＿Ｇ５、下部パネル）を標的とする最初に再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩに対する触媒活性のディスプレイベース流動選別に従った、染色体受容体アッセイの結果を示す。結果は、Ｔｒｅｘ２存在下での（左パネル）、かつｍｅｇａＴＡＬとしてフォーマットされた（右パネル）、ヌクレアーゼを示す。
【図１１−１】ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｈ８およびＰＤ−１．ＩｇＶ．ｅｘｏｎ２＿ＲＤ１＿Ｇ５の（それらのそれぞれの標的配列決定を使用した平衡基質滴定によって測定された場合の）ＤＮＡ結合親和性を示す。
【図１１−２】塩基対−８、−７、および−６で変動する６４ＤＮＡ標的に対して、ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１（ＲＤ２＿Ｂ１Ｇ２、ＲＤ３＿Ｂ１Ｇ２Ｃ４、ＲＤ３＿Ｂ１Ｇ２Ｃ１１、ＲＤ３＿Ｂ１Ｇ２Ｃ５）の特異性に関して洗練されたヌクレアーゼにおけるＤＮＡ切断活性の比較を示す。ヒートマップは、ドットプロットから得られた、非切断対切断平均値の比を示す。
【図１１−３】塩基対−８、−７、および−６で変動する６４ＤＮＡ標的に対して、ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１（ＲＤ２＿Ｂ１Ｇ２、ＲＤ３＿Ｂ１Ｇ２Ｃ４、ＲＤ３＿Ｂ１Ｇ２Ｃ１１、ＲＤ３＿Ｂ１Ｇ２Ｃ５）の特異性に関して洗練されたヌクレアーゼにおけるＤＮＡ切断活性の比較を示す。ヒートマップは、ドットプロットから得られた、非切断対切断平均値の比を示す。
【図１１−４】塩基対−８、−７、および−６で変動する６４ＤＮＡ標的に対して、ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１（ＲＤ２＿Ｂ１Ｇ２、ＲＤ３＿Ｂ１Ｇ２Ｃ４、ＲＤ３＿Ｂ１Ｇ２Ｃ１１、ＲＤ３＿Ｂ１Ｇ２Ｃ５）の特異性に関して洗練されたヌクレアーゼにおけるＤＮＡ切断活性の比較を示す。ヒートマップは、ドットプロットから得られた、非切断対切断平均値の比を示す。
【図１２】活性化された一次ヒトＴ細胞（左パネル）における、ＰＤ−１エクソン１（配列番号１２０）およびエクソン２（配列番号１２２）のバイサルファイト配列決定アッセイの結果を示し、ＰＤ−１エクソン１ＣｐＧモチーフ（配列番号１２１）が、メチル化されていないままであるが、ＰＤ−１エクソン２ＣｐＧモチーフ（配列番号１２３）はメチル化されていることを実証している。図１２はさらに、ＰＤ−１．ＩｇＶ．ｅｘｏｎ２＿ＲＤ１＿Ｇ５が、非メチル化およびメチル化標的部位（それぞれ右上および右下パネル）を効率的に切断することを示す。
【図１３Ａ】ビヒクル、ＣＦＰ、ａ  ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ、ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ｍｅｇａＴＡＬ、またはＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｈ８  ｍｅｇａＴＡＬを用いて電気穿孔され、かつその後、ビヒクルまたはホルボール１２ミリステート１３酢酸（ＰＭＡ）／イオノマイシン（Ｐ／Ｉ）を用いて刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞でのＰＤ−１表面発現を示す。
【図１３Ｂ】洗練されたバージョンのＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１（ＲＤ２＿Ｂ１Ｇ２、ＲＤ３＿Ｂ１Ｇ２Ｃ４、ＲＤ３＿Ｂ１Ｇ２Ｃ１１、ＲＤ３＿Ｂ１Ｇ２Ｃ５）ｍｅｇａＴＡＬを用いて電気穿孔されたＴ細胞での、ＰＤ−１表面発現を示す。
【図１４】Ｔｒｅｘ２あり、あるいは無しのＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ｍｅｇａＴＡＬおよびＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｈ８  ｍｅｇａＴＡＬの同時配達が、ＰＤ−１細胞表面発現を顕著に増加させることを示す。
【図１５Ａ】ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫまたはＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｈ８  ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、媒体、またはＣＦＰをコードするｍＲＮＡ、またはＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬを用いて電気穿孔された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＰＤ−Ｌ１媒介サイトカイン抑制の減少を示すことを示す。
【図１５Ｂ】ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫまたはＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｈ８  ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、媒体、または触媒的に不活性のＴＣＲαｍｅｇａＴＡＬ（未処理と予期される）をコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＰＤ−Ｌ１媒介サイトカイン抑制の減少を示すことを示す。培地へのＰＤ−１抗体の追加が、媒体、または触媒的に不活性のＴＣＲαｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞での、サイトカイン抑制を抑止した。
【図１６Ａ】様々な発現カセット（ＧＦＰ、上部パネル、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、中央パネル、および抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、下部パネル）を、相同組換えによってＰＤ−１エクソン１導入する戦略を示す。
【図１６Ｂ】ＧＦＰ、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、または抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現カセットを含有するベクターを標的とするＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｈ８  ｍｅｇａＴＡＬおよびｒＡＡＶで処理されたＴ細胞内の染色体外に統合されたカセットの、長期発現を決定するための代表的なフローサイトメトリーを示す。
【図１７】ｍＣｈｅｒｒｙ受容体遺伝子をエクソン１内のＰＤ−１開始コドンにおいて導入する戦略と、および媒体、またはＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｈ８  ｍｅｇａＴＡＬを用いて電気穿孔され、かつ媒体、または２４時間のＰＭＡ／イオノマイシン処理あり、なしの両方においてｍＣｈｅｒｒｙをコードするベクターを標的とするｒＡＡＶを用いて伝達されたＴ細胞内のｍＣｈｅｒｒｙ発現のフローサイトメトリー解析とを示す。
【図１８】ＭＮＤプロモーターＢＦＰ発現カセットをＰＤ−１エクソン５内のＩＴＳＭモチーフにおいて導入する戦略と、および媒体、またはＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ｍｅｇａＴＡＬを用いて電気穿孔され、かつ媒体、またはｐＭＮＤ−ＢＦＰ発現カセットを含有するベクターを標的とするｒＡＡＶを用いて伝達されたＴ細胞内のＢＦＰ発現のフローサイトメトリー解析とを示す。
【図１９】ＭＮＤプロモーターＢＦＰ発現カセットをＰＤ−１エクソン５内のＩＴＳＭモチーフにおいて導入する戦略と、および媒体、またはＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ｍｅｇａＴＡＬを用いて電気穿孔され、かつ媒体、またはｐＭＮＤ−ＢＦＰ発現カセットを含有するベクターを標的とするｒＡＡＶを用いて伝達されたＴ細胞内のＰＤ−１およびＢＦＰ発現に対するフローサイトメトリー解析とを示す。
【図２０】ＭＮＤプロモーターＢＦＰ発現カセットを、ＰＤ−１エクソン５内のＩＴＳＭモチーフにおいて導入し、相同アームが一塩基多型ポリモーフィズム（ＳＮＰ）を含有するための戦略を示す（上部パネル）。下部パネルは、ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ｍｅｇａＴＡＬを用いて電気穿孔され、かつ野生型相同アーム、ＳＮＰを含有する５’相同アーム、またはＳＮＰを含有する３’相同アームを有する、ｐＭＮＤ−ＢＦＰ発現カセットを含有するベクターを標的とするｒＡＡＶを用いて伝達された、Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。
【図２１】ＭＮＤプロモーターＰＤ−１．ＣＤ２８フリップ受容体発現カセットをＰＤ−１エクソン５内のＩＴＳＭモチーフにおいて導入する戦略と、および媒体、またはＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ｍｅｇａＴＡＬを用いて電気穿孔され、かつ媒体、またはｐＭＮＤ−ＰＤ−１．ＣＤ２８フリップ受容体発現カセットを含有するベクターを標的とするｒＡＡＶを用いて伝達されたＴ細胞内のＰＤ−１およびＢＦＰ発現に対するフローサイトメトリー解析とを示す。
【図２２】ＰＤ−１遺伝子内の大型欠失を、ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ｍｅｇａＴＡＬと、エクソン５標的部位のキロベース上流より多い相同アームを含有するｒＡＡＶカセットとを送達することによってキレートするための戦略を示す。
【図２３】サイトカインをＰＤ−１遺伝子に挿入し、発現を内在性ＰＤ−１プロモーターの制御下にするための戦略を示す（上部パネル）。ＰＭＡ／イオノマイシン処理の２４時間後、ＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡを用いて電気穿孔され、かつＩＬ−１２をコードするｒＡＡＶを用いて伝達された、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、対照処理細胞と比較してＰＤ−１発現の減少を示した（下部パネル）。
【図２４Ａ】ＰＭＡ／イオノマイシン処理の２４時間後、ＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡを用いて電気穿孔され、かつＩＬ−１２をコードするｒＡＡＶを用いて伝達された、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、対照処理細胞と比較してＩＬ−１２産生の増加を示した（左パネル）。ＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡを用いて電気穿孔され、かつＩＬ−１２をコードするｒＡＡＶを用いて伝達され、Ｋ５６２−ＢＣＭＡ標的細胞の存在下で培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、対照処理細胞と比較してＩＬ−１２産生の増加を示した（右パネル）。
【図２４Ｂ】連続刺激アッセイの結果を示す。Ｋ５２−ＢＣＭＡ細胞および抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を混合し、７日間培養し、追加のＫ５６２−ＢＣＭＡ標的細胞を加え、反復された刺激を模倣した。再刺激の後、組換えＩＬ−１２を用いて処理した、あるいはＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬおよびＩＬ−１２  ＨＤＲテンプレートを用いて処理した抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、対照処理細胞と比較してＩＦＮγ産生および細胞傷害活性の増加を示した。
【発明を実施するための形態】
【０１９３】
配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）のアミノ酸配列である。
【０１９４】
配列番号２は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥのアミノ酸配列である。
【０１９５】
配列番号３は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
【０１９６】
配列番号４は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
【０１９７】
配列番号５は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
【０１９８】
配列番号６は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０１９９】
配列番号７は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０２００】
配列番号８は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０２０１】
配列番号９は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０２０２】
配列番号１０は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０２０３】
配列番号１１は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０２０４】
配列番号１２は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０２０５】
配列番号１３は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０２０６】
配列番号１４は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０２０７】
配列番号１５は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０２０８】
配列番号１６は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０２０９】
配列番号１７は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０２１０】
配列番号１８は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０２１１】
配列番号１９は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０２１２】
配列番号２０は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０２１３】
配列番号２１は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０２１４】
配列番号２２は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０２１５】
配列番号２３は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０２１６】
配列番号２４は、マウスＴｒｅｘ２をコードするアミノ酸配列である。
【０２１７】
配列番号２５は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン５内のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントである。
【０２１８】
配列番号２６は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン５内のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン標的部位である。
【０２１９】
配列番号２７は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン５内のｍｅｇａＴＡＬ標的部位である。
【０２２０】
配列番号２８は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン５内のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＮ末端ドメイン標的部位である。
【０２２１】
配列番号２９は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン５内のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＣ末端ドメイン標的部位である。
【０２２２】
配列番号３０は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン１内のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントである。
【０２２３】
配列番号３１は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン１内のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン標的部位である。
【０２２４】
配列番号３２は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン１内のｍｅｇａＴＡＬ標的部位である。
【０２２５】
配列番号３３は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン１内のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＮ末端ドメイン標的部位である。
【０２２６】
配列番号３４は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン１内のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＣ末端ドメイン標的部位である。
【０２２７】
配列番号３５は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン２内のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントである。
【０２２８】
配列番号３６は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン２内のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン標的部位である。
【０２２９】
配列番号３７は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン２内のｍｅｇａＴＡＬ標的部位である。
【０２３０】
配列番号３８は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン２内のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＮ末端ドメイン標的部位である。
【０２３１】
配列番号３９は、ヒトＰＤ−１遺伝子のエクソン２内のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＣ末端ドメイン標的部位である。
【０２３２】
配列番号４０は、ＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡである。
【０２３３】
配列番号４１は、ＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡである。
【０２３４】
配列番号４２は、ＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡである。
【０２３５】
配列番号４３は、マウスＴｒｅｘ２タンパク質をコードするｍＲＮＡである。
【０２３６】
配列番号４４は、ＰＤ−１相同アームを有するベクターを標的とするｒＡＡＶおよびｐＭＮＤ−ＢＦＰ−ＳＶ４０ポリＡ発現カセットをコードする、ポリヌクレオチド配列である。
【０２３７】
配列番号４５は、配列番号４４の５’相同アームをコードするポリヌクレオチドである。
【０２３８】
配列番号４６は、配列番号４４の３’相同アームをコードするポリヌクレオチドである。
【０２３９】
配列番号４７は、ＰＤ−１相同アームを有するベクターを標的とするｒＡＡＶおよびｐＭＮＤ−ＢＦＰ−ＳＶ４０ポリＡ発現カセットをコードする、ポリヌクレオチド配列である。３’は、野生型ゲノム配列に関して一塩基多型ポリモーフィズム（ＳＮＰ）を含有する。
【０２４０】
配列番号４８は、ＰＤ−１相同アームを有するベクターを標的とするｒＡＡＶおよびｐＭＮＤ−ＢＦＰ−ＳＶ４０ポリＡ発現カセットをコードする、ポリヌクレオチド配列である。５’は、野生型ゲノム配列に関して一塩基多型ポリモーフィズム（ＳＮＰ）を含有する。
【０２４１】
配列番号４９は、配列番号４８の５’相同アームをコードするポリヌクレオチドである。
【０２４２】
配列番号５０は、配列番号４７の３’相同アームをコードするポリヌクレオチドである。
【０２４３】
配列番号５１は、ｐＭＮＤ−ＰＤ−１．ＣＤ２８スウィッチ受容体．ＳＶ４０ポリＡ発現カセットを有するベクターを標的とするｒＡＡＶをコードする、ポリヌクレオチド配列である。
【０２４４】
配列番号５２は、ＰＤ−１相同アームを有するベクターを標的とするｒＡＡＶと、ＰＤ−１エクソン５内のＩＴＳＭモチーフの約１．３ｋｂ上流の５’相同アームを有する、ｐＭＮＤ−ＢＦＰ．ＳＶ４０ポリＡ発現カセットとをコードするポリヌクレオチド配列である。
【０２４５】
配列番号５３は、ＰＤ−１相同アームを有するベクターを標的とするｒＡＡＶおよびｐＭＮＤ−ＧＦＰ−ＳＶ４０ポリＡ発現カセットをコードする、ポリヌクレオチド配列である。
【０２４６】
配列番号５４は、配列番号５３の５’相同アームをコードするポリヌクレオチドである。
【０２４７】
配列番号５５は、配列番号５３の３’相同アームをコードするポリヌクレオチドである。
【０２４８】
配列番号５６は、ＰＤ−１相同アームを有するベクターを標的とするｒＡＡＶおよびｐＭＮＤ抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−ＳＶ４０ポリＡ発現カセットをコードする、ポリヌクレオチド配列である。
【０２４９】
配列番号５７は、ＰＤ−１相同アームを有するベクターを標的とするｒＡＡＶおよびｐＭＮＤ抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−ＳＶ４０ポリＡ発現カセットをコードする、ポリヌクレオチド配列である。
【０２５０】
配列番号５８は、ＰＤ−１相同アームを有するベクターを標的とするｒＡＡＶと、ｍＣｈｅｒｒｙをコードするｃＤＮＡとをコードする、ポリヌクレオチド配列である。
【０２５１】
配列番号６０は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０２５２】
配列番号６１は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０２５３】
配列番号６２は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０２５４】
配列番号６３は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０２５５】
配列番号６４は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０２５６】
配列番号６５は、ＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡである。
【０２５７】
配列番号６６は、ＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡである
【０２５８】
配列番号６７は、ＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡである。
【０２５９】
配列番号６８は、ＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡである。
【０２６０】
配列番号６９〜７９は、様々なリンカーのアミノ酸配列を記載する。
【０２６１】
配列番号８０〜１０４は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を記載する。
【０２６２】
先述の配列において、Ｘは、任意のアミノ酸（もし存在する場合）、またはアミノ酸の不在を指す。
［発明を実施するための形態］
【０２６３】
Ａ．概観
本開示は、概して、部分的に、ゲノム編集組成物の改善およびその使用方法に関する。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、様々な実施形態において企図されるゲノム編集組成物は、癌、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する状態を防止または治療するか、あるいはそれらの少なくとも１つの症状を改善するのに使用することができる。既存の養子細胞療法を悩ませるある限定または問題は、腫瘍微小環境によって媒介された疲弊による免疫エフェクター細胞の低応答性である。疲弊したＴ細胞は、ナイーブ、エフェクターまたはメモリーＴ細胞と著しく異なる固有の分子シグネチャを有する。それらは、減少したサイトカイン発現およびエフェクター機能を有するＴ細胞として定義される。ＰＤ−１は、Ｔ細胞疲弊マーカーであり、ＰＤ−１発現の増加は、Ｔ細胞増殖の減少ならびにＩＬ−２、ＴＮＦ、およびＩＦＮ−γの産生の減少に関連する。
【０２６４】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集免疫エフェクター細胞は、ＰＤ−１発現および／もしくはシグナル伝達を排除、減少、または減衰することによって、疲弊に対してより耐性になるように作製される。
【０２６５】
様々な実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ−１）遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するように設計されたヌクレアーゼバリアントを含む。特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントを使用して、標的ポリヌクレオチド配列における２本鎖切断を導入することができ、これは、ポリヌクレオチドテンプレート、例えば、ドナー修復テンプレートの不在下で非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、またはドナー修復テンプレートの存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）、すなわち相同組換えによって、修復され得る。特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントはまた、ニッカーゼとして設計され得、これは、ドナー修復テンプレートの存在下で細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）機構または相同組換えを用いて修復され得る、１本鎖ＤＮＡ切断を生成する。ＮＨＥＪは、遺伝子機能を撹乱する小さな挿入および欠失の形成を頻繁にもたらす、エラーの起こりやすいプロセスである。相同組換えは、修復用のテンプレートとして相同ＤＮＡを必要とし、これを活用して、標的部位に隣接する領域に対して相同性を有する配列が両側に位置する、標的部位における所望の配列を含有するドナーＤＮＡの導入によって指定される限りなく多様な修飾を作り出すことができる。
【０２６６】
ある好ましい実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集組成物は、ヒトＰＤ−１遺伝子を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬを含む。
【０２６７】
ある好ましい実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集組成物は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、およびエンドプロセシング酵素、例えばＴｒｅｘ２を含む。
【０２６８】
様々な実施形態において、ゲノム編集細胞が企図される。ゲノム編集細胞は、編集ＰＤ−１遺伝子を含み、編集戦略は、ＰＤ−１発現を減少または排除し、かつ／あるいはＰＤ−１を選出し、ＰＤ−１の細胞外リガンド結合ドメインを発現する（しかし免疫抑制細胞内シグナルを伝達するその能力を破壊する）ことにより優性ネガティブとして作用するように設計される。
【０２６９】
様々な実施形態において、ＤＮＡ切断は、Ｔ細胞、例えば免疫エフェクター細胞内のＰＤ−１遺伝子の標的部位において生じ、切断ゲノム配列の末端のＮＨＥＪは、細胞内にほとんど、もしくは全くＰＤ−１発現をもたらさない可能性があり、好ましくはＴ細胞は機能的ＰＤ−１発現および／またはシグナル伝達を欠くか、あるいは実質的に欠き、例えば、Ｔ細胞疲弊を増加させる能力を欠く。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、機能的ＰＤ−１発現を欠くＴ細胞は、免疫抑制およびＴ細胞疲弊により耐性があり、したがってより持続的かつ治療的に効果的である。
【０２７０】
様々な他の実施形態において、切断されたＰＤ−１ゲノム配列の修復のためのドナーテンプレートが提供される。ＰＤ−１遺伝子は、ＤＮＡ切断部位での相同組換えによって、テンプレートの配列を用いて修復される。特定の実施形態において、修復テンプレートは、ＰＤ−１発現を破壊し、かつ好ましくは実質的に減少または排除するポリヌクレオチド配列を含む。
【０２７１】
特定の実施形態において、ＰＤ−１遺伝子は、ＰＤ−１細胞外ドメインをコードするテンプレート（そのリガンドへの親和性の増加を有する）を用いて修復される。
【０２７２】
特定の実施形態において、ＰＤ−１遺伝子は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを用いて修復される。
【０２７３】
特定の実施形態において、ＰＤ−１遺伝子は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを用いて修復され、ポリヌクレオチドはＰＤ−１遺伝子に導入され、内在性ＰＤ−１プロモーターを選出し、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体の発現を転写的に制御する。
【０２７４】
好ましい実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヒトＰＤ−１遺伝子を編集するために使用される。
【０２７５】
したがって、本明細書において企図される方法および組成物は、既存の養子細胞療法と比較して飛躍的改善を表す。
【０２７６】
特定の実施形態の実践は、特にそれとは反対の指定がない限り、当業者の技能の範囲内にある、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用いることになり、これらの多くが例示説明の目的で下記に記載される。かかる技法は、文献で完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００８年７月に更新）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ  および  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  および  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ等の機関紙に掲載の論文を参照されたい。
【０２７７】
Ｂ．定義
別途規定されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等のいずれの方法および材料も、特定の実施形態の実践または試験において使用することができるが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示において、次の用語が下記で定義される。
【０２７８】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上）を指すように本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
【０２７９】
二者択一（例えば、「または」）の使用は、その二者択一対象の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するように理解されるべきである。
【０２８０】
「および／または」という用語は、その二者択一対象の一方、または両方のいずれかを意味するように理解されるべきである。
【０２８１】
本明細書において使用される「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％異なる、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
【０２８２】
一実施形態において、範囲、例えば、１〜５、約１〜５、または約１〜約５は、その範囲によって包含される各数値を指す。例えば、１つの非限定的かつ単に例示的な実施形態において、範囲「１〜５」は、１、２、３、４、５、または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０、または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０という表現と同等である。
【０２８３】
本明細書において使用される「実質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である、またはそれよりも高い数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとおよそ同じである作用、例えば、生理学的作用を生み出す、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
【０２８４】
本明細書全体を通して、文脈上他の解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、述べられる工程もしくは要素または工程または要素の群を包含するが、任意の他の工程もしくは要素または工程または要素の群は排除することを暗示するように理解されよう。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句に続くあらゆるものを含み、それに限定される。したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、列挙される要素が必要または義務とされ、他のいかなる要素も存在し得ないことを意味する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、その語句の後に列挙される任意の要素を含み、かつ、その列挙される要素に関して本開示で指定される活性または作用に干渉しないまたは寄与しない他の要素に限定されることを意味する。故に、「から本質的になる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、ただし、列挙される要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素が何ら存在しないことを示す。
【０２８５】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態（ａ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態（ａ  ｃｅｒｔａｉｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。故に、本明細書全体を通した種々の箇所での上述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、それらの特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様態で組み合わされてもよい。一実施形態におけるある特徴の肯定的列挙が、特定の実施形態におけるその特徴の排除の根拠としての機能を果たすことも理解される。
【０２８６】
「エクスビボ」という用語は、一般に、好ましくは自然条件を最小限に変化させた生物の外側の人口的環境において、生体組織内もしくは生体組織上で行われる実験または測定などの、生物の外側で起こる活性を指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、実験室装置において、通常は滅菌条件下で、典型的に数時間または最大約２４時間であるが、状況に応じて最大４８もしくは７２時間を含む期間、培養または調節された、生体細胞または組織を伴う。特定の実施形態において、かかる組織または細胞は、収集および凍結され、後にエクスビボ処理のために解凍され得る。生体細胞または組織を使用した数日よりも長く持続する組織培養実験または手順は、典型的に、「インビトロ」とみなされるが、特定の実施形態においては、この用語は、エクスビボと交換可能に使用され得る。
【０２８７】
「インビボ」という用語は、一般に、生物の内側で起こる活性を指す。一実施形態において、細胞遺伝子は、インビボで遺伝子操作、編集、または改変される。
【０２８８】
「強化する」または「促進する」または「増加させる」または「拡大する」または「増強する」とは、一般に、媒体もしくは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより高い応答（すなわち、生理的応答）を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書において企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集細胞の能力を指す。測定可能な応答には、当該技術分野における理解から明らかであり、かつ本明細書に記載されるものの中でもとりわけ、触媒活性、結合親和性、持続性、細胞溶解性活性の増加、および／または炎症誘発性サイトカインの増加が含まれ得る。「増加した」または「強化された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、媒体または対照によって生み出される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれを超える倍率（例えば、５００、１０００倍）（それらの間の、かつ１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）である増加を含み得る。
【０２８９】
「減少させる」または「低下させる」または「減らす」または「低減する」または「弱める」または「破壊する」または「阻害する」または「減衰する」とは、一般に、媒体もしくは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより低い応答（すなわち、生理的応答）を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書において企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集細胞の能力を指す。測定可能な応答には、オフ標的結合親和性、オフ標的切断特異性、Ｔ細胞疲弊などの増加が含まれ得る。「減少した」または「低減された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、媒体または対照によって生み出される応答（参照応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれを超える倍率（例えば、５００、１０００倍）（それらの間の、かつ１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）である減少を含み得る。
【０２９０】
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的な変化なし」、または「実質的な減少なし」とは、一般に、ビヒクル、媒体または対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、実質的に同様のまたは同等の生理的応答（すなわち、下流作用）を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書において企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集細胞の能力を指す。同等の応答は、参照応答と有意に異なるまたは測定可能な異なる（ｍｅａｓｕｒａｂｌｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）ことはないものである。
【０２９１】
本明細書において使用される「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的結合」または「特異的に標的とする」という用語は、バックグラウンド結合よりもより高い結合親和性での１つの分子の、別の分子への結合、例えばＤＮＡへ結合するポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインを説明する。結合ドメインは、それが、例えば、約１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的部位に結合するか、またはそれと会合する場合、標的部位に「特異的に結合する」。特定の実施形態において、結合ドメインは、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１以上のＫａで標的部位に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１以上のＫａを有するそれらの結合ドメインを指す。
【０２９２】
代替として、親和性は、Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３以下）として定義されてもよい。特定の実施形態において企図されるＤＮＡ標的部位への１つ以上のＤＮＡ結合ドメインを含む、ヌクレアーゼバリアントの親和性は、従来の技術、例えば酵母細胞表面ディスプレイを使用して、または標識リガンドを使用した結合会合もしくは置換アッセイによって、容易に決定され得る。
【０２９３】
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合よりも約２倍高い、バックグラウンド結合よりも約５倍高い、バックグラウンド結合よりも約１０倍高い、バックグラウンド結合よりも約２０倍高い、バックグラウンド結合よりも約５０倍高い、バックグラウンド結合よりも約１００倍高い、もしくはバックグラウンド結合よりも約１０００倍高い、またはそれを超える。
【０２９４】
「選択的に結合する」、または「選択的に結合した」、または「選択的に結合している」、または「選択的に標的とする」という用語は、複数のオフ標的分子の存在下での１つの分子の、標的分子への優先的な結合（オン標的結合）を説明する。特定の実施形態において、ＨＥまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＨＥまたはｍｅｇａＴＡＬがオフ標的ＤＮＡ標的結合部位に結合するよりも５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、または１０００倍頻繁に、オン標的ＤＮＡ結合部位を選択的に結合する。
【０２９５】
「オン標的」は、標的部位の配列を指す。
【０２９６】
「オフ標的」は、標的部位の配列に同様であるが、同一ではない配列を指す。
【０２９７】
「標的部位」または「標的配列」は、結合および／または切断に十分な条件が存在することを条件として結合分子が結合するおよび／または切断する核酸の部分を規定する、染色体または染色体外核酸配列である。標的部位もしくは標的配列の１本鎖のみを参照するポリヌクレオチド配列または配列番号を指す場合、ヌクレアーゼバリアントによって結合した、かつ／あるいは切断された標的部位もしくは標的配列が、２本鎖であり、かつ参照配列およびその相補性を含むことが理解されるであろう。好ましい実施形態において、標的部位は、ヒトＰＤ−１遺伝子内の配列である。
【０２９８】
「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナーキャプチャを含むがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換プロセスを指す。本開示において、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を介した細胞における２本鎖切断の修復中に起こる、かかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子をテンプレートとして使用して「標的」分子（すなわち、２本鎖切断を経験したもの）を修復し、それがドナーから標的への遺伝情報の伝播につながることから「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に知られている。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、かかる伝播は、破損した標的とドナーとの間でのヘテロ２本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーを使用して、標的の一部となる遺伝情報を再合成する「合成依存性単鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスを伴い得る。かかる特殊なＨＲはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組込まれるような標的分子の配列の変化をもたらす。
【０２９９】
「ＮＨＥＪ」または「非相同末端結合」は、ドナー修復テンプレートまたは相同配列の非存在下での、２本鎖切断の回復を指す。ＮＨＥＪは、切断部位での挿入および欠失をもたらし得る。ＮＨＥＪは、いくつかのサブ経路を媒介し、それぞれは別個の変異的結果を有する。標準的なＮＨＥＪ経路（ｃＮＨＥＪ）は、ＫＵ／ＤＮＡ−ＰＫｃｓ／Ｌｉｇ４／ＸＲＣＣ４複合体を必要とし、融合は最小のプロセシングで元に戻し、しばしば切断の精密な修復をもたらす。代替的なＮＨＥＪ経路（ａｌｔＮＨＥＪ）はまた、回復中のｄｓＤＮＡ切断中でも活性であるが、これらの経路は、大幅により変異原性であり、しばしば挿入および欠失によって特徴付けられる不精密な修復をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、例えば、エキソヌクレアーゼ、例えばＴＲｅｘ２などのエンドプロセシング酵素による、ｄｓＤＮＡ切断の修飾は、不精密な修復の可能性を増加させることが企図される。
【０３００】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合性骨格の切断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素加水分解または化学加水分解を含むがこれらに限定されない、多様な方法によって開始され得る。１本鎖切断および２本鎖切断の両方が可能である。２本鎖切断は、２つの別々の１本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または段違い末端のいずれかの生成をもたらし得る。特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドおよびヌクレアーゼバリアント、例えばホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴａｌなどは、標的２本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。エンドヌクレアーゼ切断認識部位は、どちらかのＤＮＡ鎖であり得る。
【０３０１】
「外来性」分子は、細胞内に通常は存在しないが、１つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞に導入される分子である。代表的な外来性分子には、有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体が含まれるが、これらに限定されない。外来性分子を細胞に導入するための方法は、当該技術分野で知られており、脂質媒介移入（すなわち、中性および陽イオン性脂質を含む、リポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入、およびウイルスベクター媒介移入が含まれるが、これらに限定されない。
【０３０２】
「内在性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生段階で細胞内に通常存在するものである。追加の内在性分子は、タンパク質を含む。
【０３０３】
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに、調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接するか否かに関わらず遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を指す。遺伝子はとしては、プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、ターミネーター、ポリアデニル化配列、転写後応答要素、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、複製起源、基質付着部位、ならびに遺伝子座制御領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０４】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【０３０５】
本明細書において使用される「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態での外部遺伝物質の、細胞内の総遺伝物質への染色体または染色体外付加を指す。遺伝子改変は、細胞のゲノム内の特定の部位に標的化されても標的化されなくてもよい。一実施形態において、遺伝子改変は、部位特異的である。一実施形態において、遺伝子改変は、部位特異的ではない。
【０３０６】
本明細書において使用される「ゲノム編集」という用語は、遺伝子または遺伝子産物の発現および／または機能を回復させる、補正する、破壊する、かつ／あるいは修飾する、細胞のゲノム内の標的部位における遺伝物質の置換、欠失、および／または導入を指す。特定の実施形態において企図されるゲノム編集は、細胞のゲノム内の標的部位に、もしくはその近辺にＤＮＡ損傷を生成するために、任意にドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のヌクレアーゼ変異原を細胞に導入することを含む。
【０３０７】
本明細書において使用される「遺伝子治療」という用語は、遺伝子または遺伝子産物の発現を回復させる、補正する、または修飾するか、あるいは治療ポリペプチドの発現のための、追加の遺伝子物質の細胞内の総遺伝子物質への導入を指す。特定の実施形態において、遺伝子または遺伝子産物の発現を回復させる、補正する、破壊する、あるいは修飾するか、治療ポリペプチドの発現のための、遺伝子物質のゲノム編集による細胞のゲノムへの導入は、遺伝子治療であると考えられる。
【０３０８】
「免疫障害」は、免疫系からの応答を喚起する疾患を指す。特定の実施形態において、「免疫障害」という用語は、癌、移植片対宿主病、自己免疫疾患、または免疫不全を指す。一実施形態において、免疫障害は、感染疾患を包含する。
【０３０９】
本明細書において使用される「癌」という用語は一般に、異常な細胞が制限なく分裂し、近隣組織に浸潤し得る、疾患または病態の分類を指す。
【０３１０】
本明細書において使用される「悪性」という用語は、腫瘍細胞の群が無制限の成長（すなわち、正常な限度を超えた分裂）、浸潤（すなわち、隣接組織への侵入およびその破壊）、および転移（すなわち、リンパまたは血液を介した体内の他の場所への広がり）のうちの１つ以上を示す、癌を指す。
【０３１１】
本明細書において使用される「転移する」という用語は、身体の１つの部分から別の部分への癌の広がりを指す。広がりを有する、細胞によって形成される腫瘍は、「転移性腫瘍」または「転移」と呼ばれる。転移性腫瘍は、元の（一次）腫瘍のもののような細胞を含有する。
【０３１２】
本明細書において使用される「両性」または「非悪性」という用語は、より大きく成長し得るが、身体の他の部分には広がらない腫瘍を指す。両性腫瘍は、自己制限的であり、典型的には浸潤または転移しない。
【０３１３】
「癌細胞」または「腫瘍細胞」は、癌性成長または組織を伴う個々の細胞を指す。腫瘍は一般に、良性、前悪性、または悪性であり得る、細胞の異常な成長によって形成される腫脹または病変を指す。ほとんどの癌が腫瘍を形成するが、一部、例えば、白血病は、必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成する癌に関して、癌（細胞）および腫瘍（細胞）という用語は、交換可能に使用される。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。
【０３１４】
「移植片対宿主病」または「ＧＶＨＤ」は、細胞、組織、または固形臓器の移植後に発生する合併症を指す。ＧＶＨＤは、幹細胞または骨髄の移植後に発生し得、移植されたドナー細胞が被移植者の体を攻撃する。ヒトの急性のＧＶＨＤは、移植後の６０日以内に行われ、皮膚、肝臓、および腸に細胞溶解性リンパ球の作用による損傷をもたらす。慢性ＧＶＨＤは、後に発生し、皮膚に一次的に影響を及ぼす全身性自己免疫疾患は、Ｂ細胞のポリクローン性活性化、ならびにＩｇおよび自己抗体の過剰産生をもたらす。固形臓器移植移植片対宿主病（ＳＯＴ−ＧＶＨＤ）は、２種類の形態で発生する。より一般的な種類は、血液型Ｏを有するドナーからの抗体が、血液型Ａ，Ｂ、またはＡＢを有する移植患者において、移植患者の赤血球を攻撃すし、穏やかな一過性の溶血性貧血をもたらす、媒介された抗体である。ＳＯＴ−ＧＶＨＤの第２の形態は、ドナー由来のＴ細胞が、最も頻繁には皮膚、肝臓、胃腸管、および骨髄内にある、免疫学的に異なる宿主組織に対して免疫学的攻撃を発生させ、これらの臓器との合併症をもたらす、高い死亡率に関連する細胞型である。
【０３１５】
「移植片対白血病」または「ＧＶＬ」は、骨髄または末梢血などのドナーからの移植された組織内に存在する、免疫細胞によるヒトの白血病細胞への免疫応答を指す。
【０３１６】
「自己免疫疾患」は、身体がその自己の組織の一部の構成要素に対する免疫原性（すなわち、免疫系）応答を生み出す疾患を指す。換言すると、免疫系は、体内の一部の組織または系を「自己」として認識するその能力を喪失し、それをあたかも異物であるかのように標的とし攻撃する。自己免疫疾患の例示的な例としては、関節炎、炎症性腸疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、溶血性貧血、抗免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１７】
「免疫不全」は、疾患によってまたは化学物質の投与によって免疫系が損なわれた患者の状態を意味する。この病態では、系は、異物に対して防御するのに必要とされる血球の数および種類が不足するようになる。免疫不全病態または疾患は当該技術分野で知られており、例えば、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症）、選択的ＩｇＡ欠損症、分類不能型免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫性疾患、高ＩｇＭ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、および糖尿病が挙げられる。
【０３１８】
「感染疾患」は、人から人へと、または生物から生物へと伝染し得、微生物またはウイルス因子によって引き起こされる疾患（例えば、感冒）を指す。感染疾患は当該技術分野で知られており、例えば、肝炎、性行為感染症（例えば、クラミジア感染症、淋病）、結核症、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ジフテリア、肝炎Ｂ、肝炎Ｃ、コレラ、およびインフルエンザが含まれる。
【０３１９】
本明細書において使用される「個体」および「対象」という用語は、しばしば交換可能に使用され、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、遺伝子治療ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集細胞、および本明細書の他の箇所で企図される方法で治療され得る免疫障害の症状を呈する、任意の動物を指す。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、および飼育動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、および好ましくは、ヒト対象が含まれる。典型的な対象としては、免疫障害を有する、そうであると診断された、またはそれを有する危険性があるヒト患者が挙げられる。
【０３２０】
本明細書において使用される「患者」という用語は、しばしば交換可能に使用され、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、遺伝子治療ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集細胞、および本明細書の他の箇所で企図される方法で治療され得る免疫障害と診断された、対象を指す。
【０３２１】
本明細書において使用される「治療」または「治療すること」は、疾患または病理学的状態の症状または病理に対するいずれの有益なまたは望ましい効果も含み、治療されている疾患または病態、例えば、癌、ＧＶＨＤ、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全などの１つ以上の測定可能マーカーにおける最小限の低減さえも含み得る。治療には、任意に、疾患または病態の進行を遅延させることが関わり得る。「治療」は必ずしも、疾患もしくは病態、またはその関連する症状の完全な撲滅または治癒を指すものではない。
【０３２２】
本明細書において使用される「予防する」、および「予防」、「予防される」、「予防すること」などの同様の語は、疾患または病態、例えば、癌、ＧＶＨＤ、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全などの発生または再発の可能性を予防する、阻害する、または低減するための手法を指す。それはまた、疾患もしくは病態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは病態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書において使用される「予防」および同様の語は、疾患または病態の発症または再発前に疾患または病態の強度、影響、症状、および／または負荷を低減することも含む。
【０３２３】
本明細書において使用される「〜の少なくとも１つの症状を改善すること」という語句は、対象が治療されている疾患または病態、例えば、癌、ＧＶＨＤ、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全の１つ以上の症状を減少させることを指す。特定の実施形態において、治療されている疾患または病態は癌であり、改善される１つ以上の症状には、衰弱、疲労、息切れ、打撲および出血の起こりやすさ、頻繁な感染、腫脹したリンパ節、膨張したまたは痛みのある腹部（肥大した腹部臓器に起因）、骨または関節痛、骨折、意図しない体重減少、食欲不振、寝汗、持続する微熱、および減少した排尿（腎機能不全に起因）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３２４】
本明細書において使用される「量」という用語は、臨床結果を含めて、有益なまたは所望の予防結果または治療結果を達成するために十分な、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集細胞の「有効量（ａｍｏｕｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」を指す。
【０３２５】
「予防上有効量」は、所望の予防的結果を達成するのに十分な、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集細胞の量を指す。必然的ではないが典型的には、疾患の前またはその早期に予防的用量が対象において使用されるため、予防上有効量は、治療上有効量よりも少ない。
【０３２６】
ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集細胞の「治療上有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を引き出す能力などの要因に応じて、異なり得る。治療上有効量はまた、治療上有益な効果が、任意の毒性効果または有害効果を上回るものでもある。「治療上有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療」するのに有効である量を含む。治療的量が指示されるとき、特定の実施形態において企図される組成物の、投与されるべき精確な量は、医師によって、規格に鑑みて、かつ患者（対象）の年齢、重量、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態における個体差を考慮して決定され得る。
【０３２７】
Ｃ．ヌクレアーゼバリアント
本明細書の特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、ＰＤ−１遺伝子内の標的部位をゲノム編集する好適であり、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメイン（例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼドメイン）、ならびに任意に、本明細書において企図される１つ以上のリンカーを含む。「再プログラムされたヌクレアーゼ」、「遺伝子操作されたヌクレアーゼ」、または「ヌクレアーゼバリアント」という用語は、交換可能に使用され、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含み、ＰＤ−１遺伝子内の２本鎖ＤＮＡ標的配列に結合し、それを切断するために、親または自然発生ヌクレアーゼから設計され、かつ／あるいは修飾されている、ヌクレアーゼを指す。
【０３２８】
特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、ＰＤ−１遺伝子のエクソン５内の標的配列を、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン５内の配列番号２５で、およびより好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン５内の配列番号２５の配列「ＡＴＡＣ」で結合し、それを切断する。
【０３２９】
特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、ＰＤ−１遺伝子のエクソン１内の標的配列を、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン１内の配列番号３０で、およびより好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン１内の配列番号３０の「ＡＴＣＣ」で結合し、それを切断する。
【０３３０】
特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、ＰＤ−１遺伝子のエクソン２内の標的配列を、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン２内の配列番号３５で、およびより好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン２内の配列番号３５の「ＡＣＴＴ」で結合し、それを切断する。
【０３３１】
ヌクレアーゼバリアントは、自然発生ヌクレアーゼまたは以前のヌクレアーゼから設計され、かつ／あるいは修飾されてもよい。特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
【０３３２】
ＰＤ−１遺伝子の標的配列に結合し、それを切断するヌクレアーゼバリアントの例示的な例としては、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）バリアントおよびｍｅｇａＴＡＬが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３３】
１．ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）バリアント
様々な実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、再プログラムされ、ＰＤ−１遺伝子の標的部位に２本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、ＰＤ−１遺伝子のエクソン５内、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン５内の配列番号２５で、およびより好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン５内の配列番号２５の配列「ＡＴＡＣ」で２本鎖切断を導入する。特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、ＰＤ−１遺伝子のエクソン１内、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン１内の配列番号３０で、およびより好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン１内の配列番号３０の「ＡＴＣＣ」で２本鎖切断を導入する。特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、ＰＤ−１遺伝子のエクソン２内、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン２内の配列番号３５で、およびより好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン２内の配列番号３５の配列「ＡＣＴＴ」で２本鎖切断を導入する。
【０３３４】
「ホーミングエンドヌクレアーゼ」および「メガヌクレアーゼ」は、交換可能に使用され、１２〜４５個の塩基対切断部位を認識し、一般的に配列および構造モチーフに基づいて５つのファミリー、すなわちＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックス、およびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫに分類される、自然発生ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
【０３３５】
「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」または「参照メガヌクレアーゼ」は、自然界で見出される野生型ホーミングエンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼを指す。一実施形態において、「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、基礎活性を増加するように修飾されている野生型ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
【０３３６】
「遺伝子操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「再プログラムされたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント」、「遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ」、「再プログラムされたメガヌクレアーゼ」、または「メガヌクレアーゼバリアント」は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含み、ＰＤ−１遺伝子内のＤＮＡ標的配列に結合し、それを切断するために、親または生前発生ホーミングエンドヌクレアーゼから設計され、かつ／あるいは修飾されている、ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、自然発生ホーミングエンドヌクレアーゼから、あるいは別のホーミングエンドヌクレアーゼバリアントから設計され、かつ／あるいは修飾されてもよい。特定の実施形態において企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
【０３３７】
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントは、自然界に存在せず、組換えＤＮＡ技術によってまたはランダム変異誘発によって得ることができる。ＨＥバリアントは、自然発生ＨＥまたはＨＥバリアント内で、１つ以上のアミノ酸改変を行うことによって、例えば、１つ以上のアミノ酸を変異させる、置換する、付加する、または欠失させることによって、得られてもよい。特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースに対する１つ以上のアミノ酸改変を含む。
【０３３８】
特定の実施形態において企図されるＨＥバリアントは、１つ以上のリンカーおよび／または１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素とともに、Ｔ細胞に導入される。ＨＥバリアントおよび３´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において、導入されてもよい。
【０３３９】
「ＤＮＡ認識インターフェース」は、核酸標的塩基と相互作用するＨＥアミノ酸残基、ならびに隣接している残基を指す。各ＨＥに関して、ＤＮＡ認識インターフェースは、側鎖−側鎖間および側鎖−ＤＮＡ接触点間の広範囲のネットワークを含み、これらのほとんどは、特定の核酸標的配列を認識するために必然的に固有である。故に、特定の核酸配列に対応するＤＮＡ認識インターフェースのアミノ酸配列は、著しく異なり、任意の自然またはＨＥバリアントの特徴である。非限定的な例として、特定の実施形態において企図されるＨＥバリアントは、自然ＨＥ（または以前に産生されたＨＥバリアント）のＤＮＡ認識インターフェースに局在する１つ以上のアミノ酸残基が変化に富む、ＨＥバリアントのライブラリを構築することによってもたらされてもよい。ライブラリは、切断アッセイを用いて、各々予測されるＰＤ−１標的部位に対する標的切断活性についてスクリーニングされてもよい（例えば、Ｊａｒｊｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（２０）：６８７１−６８８０）。
【０３４０】
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）は、最も詳細に研究されているメガヌクレアーゼのファミリーであり、主に古細菌においてならびに緑藻類および真菌類のオルガネラＤＮＡにおいてコードされ、最も高い全体的なＤＮＡ認識特異性を示す。ＬＨＥは、１つのタンパク質鎖につき１つまたは２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ触媒モチーフ、およびそれぞれホモ二量体または１本鎖モノマーとしての機能を含む。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質の構造的研究により、αββαββα折り畳みによって特徴付けられる、高度に保存されたコア構造が特定され（Ｓｔｏｄｄａｒｄ  ２００５）、このうちＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフは、この折り畳みの第１のヘリックスに属する。ＬＨＥによる高度に効率的および特異的な切断は、新規の高度に特異的なエンドヌクレアーゼを得るためのタンパク質足場を代表する。しかしながら、非天然または非標準的な標的部位に結合し、それを切断するようＬＨＥを遺伝子操作することは、適切なＬＨＥ足場の選択、標的遺伝子座の検査、推定標的部位の選択、ならびに標的部位における塩基対位置のうちの最大３分の２でのそのＤＮＡ接触点および切断特異性を改変するためのＬＨＥの大規模な改変を必要とする。
【０３４１】
一実施形態において、再プログラムされたＬＨＥまたＬＨＥバリアントが設計され得るＬＨＥとしては、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４２】
再プログラムされたＬＨＥが設計され得るＬＨＥの例示的な例としては、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４３】
一実施形態において、遺伝子操作されたＬＨＥは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、および−ＳｍａＭＩからなる群から選択される。
【０３４４】
さらなる実施形態において、再プログラムされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントである。例えば、配列番号６〜１４および６０〜６３を参照されたい。
【０３４５】
一実施形態において、ＰＤ−１遺伝子を標的とする、再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥまたはＩ−ＯｎｕＩバリアントは、自然Ｉ−ＯｎｕＩまたはその生物学的に活性な断片（配列番号１〜５）から生成される。好ましい実施形態において、ヒトＰＤ−１遺伝子を標的とする再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥまたはＩ−ＯｎｕＩバリアントは、存在しているＩ−ＯｎｕＩから生成された。一実施形態において、再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、配列番号２５のヒトＰＤ−１遺伝子標的部位に対して生成された。一実施形態において、再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、配列番号３０のヒトＰＤ−１遺伝子標的部位に対して生成された。一実施形態において、再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、配列番号３５のヒトＰＤ−１遺伝子標的部位に対して生成された。
【０３４６】
特定の実施形態において、ヒトＰＤ−１遺伝子に結合し、それを切断する、再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥまたはＩ−ＯｎｕＩバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェース内に１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ヒトＰＤ−１遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、配列番号６〜１４および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片、および／もしくはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１  Ａｕｇ  ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）またはＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのＤＮＡ認識インターフェースとの、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。
【０３４７】
一実施形態において、ヒトＰＤ−１遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、配列番号６〜１４および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片、および／もしくはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１  Ａｕｇ  ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）またはＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのＤＮＡ認識インターフェースとの、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を含む。
【０３４８】
特定の実施形態において、ヒトＰＤ−１遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１〜１４および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片、ならびに／またはそのさらなるバリアントのＩ−ＯｎｕＩのＤＮＡ認識インターフェース内に１つ以上のアミノ酸置換もしくは修飾を含む。
【０３４９】
特定の実施形態において、ヒトＰＤ−１遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、バリアントのＤＮＡ認識インターフェース内に、特に、配列番号６〜１４および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片、ならびに／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１−５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの位置２４〜５０、６８〜８２、１８０〜２０３、および２２３〜２４０に位置するサブモチーフ内に、１個以上のアミノ酸置換もしくは修飾を含む。
【０３５０】
特定の実施形態において、ヒトＰＤ−１遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、配列番号６〜１４および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片、ならびに／またはそのさらなるバリアントのＩ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６  ７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置のＤＮＡ認識インターフェース内に、１個以上のアミノ酸置換もしくは修飾を含む。
【０３５１】
特定の実施形態において、ヒトＰＤ−１遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェース内に、特に、配列番号６−１４および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片、ならびに／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１−５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの２４〜５０、６８〜８２、１８０〜２０３、および２２３〜２４０位に位置するサブモチーフ内に、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０個以上のアミノ酸置換もしくは修飾を含む。
【０３５２】
特定の実施形態において、ヒトＰＤ−１遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号６〜１４および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片、ならびに／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置のＤＮＡ認識インターフェース内に、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０個以上のアミノ酸置換もしくは修飾を含む。
【０３５３】
一実施形態において、ヒトＰＤ−１遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ配列内全体のどこにでも位置する追加の位置に１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。置換されかつ／または修飾され得る残基には、核酸標的に接触する、または直接もしくは水分子を介して核酸骨格もしくはヌクレオチド塩基と相互作用するアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。ある非限定的な実施形態において、本明細書において企図される、ヒトＰＤ−１遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号６〜１４および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片、ならびに／あるいはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの２６、２８、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、１３８、１４３、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９７、１９９、２０１、２０３、２０７、２２３、２２４、２２５、２２７、２２９、２３２、２３６、および２３８位からなる群から選択される少なくとも１つの位置に、１個以上の置換および／または修飾、好ましくは少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３０個、さらにより好ましくは３５個、もしくはさらにより好ましくは４０個以上のアミノ酸置換を含む。
【０３５４】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号６〜１０のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントのＩ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｋ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｓ７２Ｒ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｋ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｓ２０１Ｍ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｉ２２４Ｔ、Ｋ２２５Ｒ、Ｋ２２９Ｉ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３５５】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号６〜１０のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｋ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｋ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｒ、Ｋ２２９Ｉ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３５６】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号６〜１０のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｒ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｉ２２４Ｔ、Ｋ２２５Ｒ、Ｋ２２９Ｉ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３５７】
追加の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号６〜１０のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｉ２２４Ｔ、Ｋ２２５Ｒ、Ｋ２２９Ｉ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３５８】
さらなるの実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号６〜１０のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｇ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｒ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３５９】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン５標的部位を切断し、配列番号６〜１０のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｅ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ｐ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｄ、Ｎ５９Ｄ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｑ、Ｎ７５Ｓ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ａ、Ｓ１８８Ｒ、Ｋ１８９Ｒ、Ｓ１９０Ｐ、Ｋ１９１Ａ、Ｌ１９２Ｓ、Ｇ１９３Ｐ、Ｑ１９７Ｒ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ｍ、Ｔ２０３Ｇ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｒ、Ｆ２３２Ｋ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３６０】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１１〜１２および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、１００、１３２、１３８、１４３、１５５、１５９、１７８、１８０、１８４、１８６、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、２０１、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２３６、２３８、および２４０位からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む。
【０３６１】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１１〜１２および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ａ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｄ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ８０Ｃ、Ｉ１００Ｖ、Ｖ１３２Ａ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３６２】
さらなるの実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１１−１２および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ａ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｄ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｒ、Ｉ１００Ｖ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３６３】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１１〜１２および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｄ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｃ、Ｉ１００Ｖ、Ｖ１３２Ａ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３６４】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１１−１２および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｉ１００Ｖ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３６５】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１１−１２および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｓ、Ａ７０Ｌ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３６６】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１１−１２および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ｇ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｓ、Ａ７０Ｔ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３６７】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン１標的部位を切断し、配列番号１１−１２および６０〜６３のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｇ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｌ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｇ、Ｓ３６Ｔ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｔ、Ｔ４８Ｍ、Ｖ６８Ｓ、Ａ７０Ｙ、Ｓ７２Ｎ、Ｎ７５Ｈ、Ａ７６Ｙ、Ｋ８０Ｅ、Ｔ８２Ｆ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３６８】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＰＤ−１エクソン２標的部位を切断し、配列番号１３〜１４のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７４、７５、７６、７８、８０、８２、１１６、１３８、１４３、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９９、２０３、２０７、２２５、２２７、２２９、２３２、２３６、および２３８位からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む。
【０３６９】
追加の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１３〜１４のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｓ２４Ｃ、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｙ、Ｒ２８Ｈ、Ｒ３０Ｓ、Ｎ３２Ｖ、Ｎ３２Ｌ、Ｋ３４Ｎ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３５Ｔ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｖ３７Ｔ、Ｇ３８Ｒ、Ｇ３８Ｋ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ａ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ｅ、Ｑ４６Ａ、Ｔ４８Ｅ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｉ、Ｄ７４Ｎ、Ｎ７５Ｔ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｓ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｔ８２Ｇ、Ｔ８２Ｒ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｎ、Ｆ１８２Ｙ、Ｎ１８４Ｈ、Ｉ１８６Ｋ、Ｋ１８９Ｇ、Ｓ１９０Ｒ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｙ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ａ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｎ、Ｋ２２５Ｔ、Ｋ２２７Ｗ、Ｋ２２７Ｓ、Ｋ２２９Ａ、Ｋ２２９Ｐ、Ｆ２３２Ｒ、Ｗ２３４Ａ、Ｗ２３４Ｄ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｒのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３７０】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１３〜１４のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｌ２６Ｑ、Ｒ２８Ｙ、Ｒ３０Ｓ、Ｎ３２Ｖ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｎ、Ｓ３６Ｒ、Ｖ３７Ｓ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ａ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｒ、Ｑ４６Ａ、Ｔ４８Ｅ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｉ、Ｎ７５Ｔ、Ａ７６Ｓ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｔ８２Ｇ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｎ、Ｆ１８２Ｙ、Ｎ１８４Ｈ、Ｉ１８６Ｋ、Ｋ１８９Ｇ、Ｓ１９０Ｒ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｙ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ａ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｎ、Ｋ２２７Ｗ、Ｋ２２９Ａ、Ｆ２３２Ｒ、Ｗ２３４Ａ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｒのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３７１】
追加の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１３〜１４のいずれか１つ、その生物学的に活性な断片および／またはそのさらなるバリアントの、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）またはＩ−ＯｎｕＩバリアントの、以下のアミノ酸置換、Ｓ２４Ｃ、Ｒ２８Ｈ、Ｎ３２Ｌ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｔ、Ｖ３７Ｔ、Ｇ３８Ｋ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｓ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｅ、Ｖ６８Ｉ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｉ、Ｄ７４Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｔ８２Ｒ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｎ、Ｆ１８２Ｙ、Ｎ１８４Ｈ、Ｉ１８６Ｋ、Ｋ１８９Ｇ、Ｓ１９０Ｒ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｙ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｔ、Ｋ２２７Ｓ、Ｋ２２９Ｐ、Ｆ２３２Ｒ、Ｗ２３４Ｄ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｒのうち少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０３７２】
特定の実施形態において、ヒトＰＤ−１遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号６〜１４および６０〜６３のいずれか１つのアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、もしくはさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０３７３】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号６〜１４および６０−６３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３７４】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号６に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３７５】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号７に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３７６】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号８に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３７７】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号９に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３７８】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３７９】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３８０】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３８１】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３８２】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３８３】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号６０に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３８４】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号６１に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３８５】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号６２に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３８６】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号６３に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０３８７】
２．ＭｅｇａＴＡＬ
様々な実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むｍｅｇａＴＡＬは、再プログラムされ、ＰＤ−１遺伝子の標的部位に２本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＰＤ−１遺伝子のエクソン５内、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン５内の配列番号２７で、およびより好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン５内の配列番号２７の配列「ＡＴＡＣ」でＤＳＢを導入する。特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＰＤ−１遺伝子のエクソン１内、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン１内の配列番号３２で、およびより好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン１内の配列番号３２の配列「ＡＴＣＣ」で２本鎖切断を導入する。特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＰＤ−１遺伝子のエクソン２内、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン２内の配列番号３７で、およびより好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン２内の配列番号３７の配列「ＡＣＴＴ」で２本鎖切断を導入する。
【０３８８】
「ｍｅｇａＴＡＬ」は、ＰＤ−１遺伝子内のＤＮＡ標的配列に結合し、それを切断する、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むポリペプチドを指し、任意に、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含む。
【０３８９】
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素とともに細胞に導入され得る。ｍｅｇａＴＡＬおよび３´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において、導入されてもよい。
【０３９０】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」は、植物のトランスクリプトームを操作するために植物の転写活性化因子を模倣する、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥまたはＴＡＬ−エフェクター）のＤＮＡ結合部分である（例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。特定の実施形態で企図されるＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、デノボで、または自然発生ＴＡＬＥ、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｇａｒｄｎｅｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｌｆａｌｆａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＡｖｒＢｓ３から、ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来のｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７から、遺伝子操作される。ＤＮＡ結合ドメインを誘導し、設計するためのＴＡＬＥタンパク質の例示的な例は、米国特許第９，０１７，９６７号、および同特許で引用される参考文献に開示され、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組込まれる。
【０３９１】
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの、その対応する標的ＤＮＡ配列への結合に関与する１つ以上の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的に３３〜３５アミノ酸長である。各ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位は、典型的に反復の１２位および／または１３位に、反復可変Ｄｉ−残基（Ｒｅｐｅａｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｉ−Ｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）を構成する１つまたは２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ認識のための天然（標準的）コードは、位置１２および１３のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように、決定されている。特定の実施形態においては、非標準的（非典型）ＲＶＤが企図される。
【０３９２】
特定の実施形態で企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおいて使用するのに好適な非標準的ＲＶＤの例示的な例としては、グアニン（Ｇ）の認識のためのＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、ＳＳ、ＮＮ、ＳＮ、ＫＮと、アデニン（Ａ）の認識のためのＮＩ、ＫＩ、ＲＩ、ＨＩ、ＳＩ；チミン（Ｔ）の認識のためのＮＧ、ＨＧ、ＫＧ、ＲＧと、シトシン（Ｃ）の認識のためのＲＤ、ＳＤ、ＨＤ、ＮＤ、ＫＤ、ＹＧと、ＡまたはＧの認識のためのＮＶ、ＨＮと、およびＡまたはＴまたはＧまたはＣの認識のためのＨ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、Ｓ＊（（＊）は、１３位のアミノ酸が不在であることを意味する）とが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態で企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおいて使用するのに好適なＲＶＤの追加の例示的な例としては、米国特許第８，６１４，０９２号に開示されるものがさらに挙げられ、同特許は参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【０３９３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３〜３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５〜１５個の反復単位、より好ましくは７〜１５個の反復単位、より好ましくは９〜１５個の反復単位、およびより好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０３９４】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３〜３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、１組のＴＡＬＥ反復単位のＣ末端に位置する２０個のアミノ酸を含む追加の単一のトランケートされたＴＡＬＥ反復単位、すなわち、追加のＣ末端ハーフＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位（本明細書の他の箇所で開示される（下記を参照）Ｃキャップのアミノ酸−２０〜−１）とを含む。故に、特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３．５〜３０．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５個のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５．５〜１５．５個の反復単位、より好ましくは７．５〜１５．５個の反復単位、より好ましくは９．５〜１５．５個の反復単位、およびより好ましくは９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、または１５．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０３９５】
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチド、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位と、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドと、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むＴＡＬエフェクター構造を含む。いくつかの実施形態において、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ反復、および／またはＣＴＤドメインは、同じ種からのものである。他の実施形態において、１つ以上のＮＴＤ、ＴＡＬＥ反復、および／またはＣＴＤドメインは、異なる種からのものである。
【０３９６】
本明細書において使用される「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドという用語は、自然発生ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＮＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも１２０個〜少なくとも１４０個またはそれよりも多くのアミノ酸を含む（０は、最もＮ末端側の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または少なくとも１４０個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約＋１〜＋１２２から少なくとも約＋１〜＋１３７のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端側の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸＋１〜＋１２１のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端側の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。
【０３９７】
本明細書において使用される「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドという用語は、自然発生ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＣＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも２０〜少なくとも８５またはそれよりも多くのアミノ酸を含む（最初の２０個のアミノ酸は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端側のハーフ反復単位である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または少なくとも８５アミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約−２０〜−１のＣＴＤポリペプチドを含む（−２０は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端側のハーフ反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約−２０〜−１のＣＴＤポリペプチドを含む（−２０は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端側のハーフ反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。
【０３９８】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、標的配列に結合するように遺伝子操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、標的配列に結合し、それを切断するように再プログラムされたホーミングエンドヌクレアーゼと、任意に、本明細書の他の箇所で企図される１つ以上のリンカーポリペプチドと任意に互いに接合されたＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドを含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、任意にＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドとを含むｍｅｇａＴＡＬはリンカーポリペプチドに融合され、これがホーミングエンドヌクレアーゼバリアントにさらに融合されることが、企図される。したがって、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントのＤＮＡ結合ドメインが結合した標的配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド以内離れているＤＮＡ標的配列に結合する。このようにして、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ゲノム編集の特異性および効率を増加させる。
【０３９９】
一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、再プログラムされたホーミングエンドヌクレアーゼの結合部位の約２、３、４、５、または６ヌクレオチド以内、好ましくは２または４ヌクレオチド以内上流のヌクレオチド配列に結合する、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０４００】
一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントによって結合、かつ切断されたヌクレオチド配列（配列番号２５）の５ヌクレオチド上流である配列番号２６のヌクレオチド配列に結合する、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。好ましい実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬ標的配列は、配列番号２７である。
【０４０１】
一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントによって結合、かつ切断されたヌクレオチド配列（配列番号３０）の２ヌクレオチド上流である配列番号３１のヌクレオチド配列に結合する、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。好ましい実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬ標的配列は、配列番号３２である。
【０４０２】
一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントによって結合、かつ切断されたヌクレオチド配列（配列番号３５）の５ヌクレオチド上流である配列番号３６のヌクレオチド配列に結合する、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。好ましい実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬ標的配列は、配列番号３７である。
【０４０３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、Ｉ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、およびそのバリアント、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、そのバリアント、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥから設計されるか、あるいは再プログラムされた１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合反復単位およびＬＨＥバリアントを含む。
【０４０４】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤ、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合反復単位、ＣＴＤ、ならびにＩ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、Ｉ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、およびそれらのバリアント、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、およびそれらのバリアント、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩ、およびそのバリアントから成る群から選択されるＬＨＥバリアントを含む。
【０４０５】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、約９．５〜約１５．５ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合反復単位のＮＴＤ、ならびにＩ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、Ｉ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、およびそれらのバリアント、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、およびそれらのバリアント、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩ、およびそのバリアントから成る群から選択されるＬＨＥバリアントを含む。
【０４０６】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、約１２２個のアミノ酸〜１３７個のアミノ酸のＮＴＤ、約９．５、約１０．５、約１１．５、約１２．５、約１３．５、約１４．５、または約１５．５の結合反復単位、約２０個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸のＣＴＤ、およびＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントを含む。特定の実施形態において、ＮＴＤ、ＤＮＡ結合ドメイン、およびＣＴＤのうちいずれか１つ、２つ、または全ては、あらゆる好適な組み合わせで、同種または異種から設計することができる。
【０４０７】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、配列番号１５〜２３、および６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０４０８】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、配列番号４０〜４２および６５〜６８のいずれか１つのｍＲＮＡ配列によってコードされる。
【０４０９】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
【０４１０】
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含み、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは配列番号２７のヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。特定の実施形態において、配列番号２７のヌクレオチド配列に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬは、配列番号１５〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０４１１】
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含み、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは配列番号３２のヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。特定の実施形態において、配列番号３２のヌクレオチド配列に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬは、配列番号２０〜２１および６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０４１２】
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含み、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは配列番号３７のヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。特定の実施形態において、配列番号３７のヌクレオチド配列に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬは、配列番号２２〜２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０４１３】
３．エンドプロセシング酵素
特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセシング酵素の１つ以上のコピーを用いて細胞ゲノムを編集することを含む。特定の実施形態において、単一のポリヌクレオチドは、リンカー、自己切断型ペプチド配列、例えば２Ａ配列によって、あるいはＩＲＥＳ配列によって単離された、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセシング酵素をコードする。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドおよびエンドプロセシング酵素をコードする分離ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、自己切断型ペプチドによって分離されたエンドプロセシング酵素のタンデムコピーに加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントエンドプロセシング酵素単一ポリペプチド融合をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０４１４】
「エンドプロセシング酵素」という用語は、ポリヌクレオチド鎖の露出された末端を修飾する酵素を指す。ポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの２本鎖ハイブリッド、ならびに合成ＤＮＡ（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ以外の塩基を含有する）であり得る。エンドプロセシング酵素は、１つ以上のヌクレオチド付加し、１つ以上のヌクレオチドを除去し、リン酸基を除去もしくは修飾し、および／またはヒドロキシル基を除去もしくは修飾することで、露出したポリヌクレオチド鎖末端を修飾し得る。エンドプロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部の末端、または他の化学物質もしくは機械的手法（せん断（例えば、ファインゲージ針を通すこと、加熱、超音波分解、ミニビーズタンブリング、および噴霧）、電離放射線、紫外線、酸素ラジカル、化学加水分解、および化学療法剤など）によって生成された末端を修飾し得る。
【０４１５】
特定の実施形態において、特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、またはｍｅｇａＴＡＬ、およびＤＮＡエンドプロセシング酵素を用いて細胞ゲノムを編集することを含む。
【０４１６】
「エンドプロセシング酵素」という用語は、ＤＮＡの露出された末端を修飾する酵素を指す。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、平滑末端または段違い末端（５’または３’オーバーハングを有する末端）を修飾し得る。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、１本鎖または２本鎖ＤＮＡを修飾し得る。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部の末端、または他の化学物質もしくは機械的手法（せん断（例えば、ファインゲージ針を通すこと、加熱、超音波分解、ミニビーズタンブリング、および噴霧）、電離放射線、紫外線、酸素ラジカル、化学加水分解、および化学療法剤など）によって生成された末端を修飾し得る。エンドプロセシング酵素は、１つ以上のヌクレオチド付加し、１つ以上のヌクレオチドを除去し、リン酸基を除去もしくは修飾し、および／またはヒドロキシル基を除去もしくは修飾することで、露出したＤＮＡ末端を修飾し得る。
【０４１７】
本明細書において企図される、特定の実施形態における使用に好適なＤＮＡエンドプロセシング酵素の例示的な例としては、５’−３’エキソヌクレアーゼ、５’−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、およびテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１８】
本明細書において企図される、特定の実施形態における使用に好適なＤＮＡエンドプロセシング酵素の追加の例示的な例としては、Ｔｒｅｘ２、Ｔｒｅｘ１、膜貫通ドメインなしのＴｒｅｘ１、Ａｐｏｌｌｏ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ２、Ｅｘｏ１、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＩＩＩ、Ｆｅｎ１、Ｆａｎ１、ＭｒｅＩＩ、Ｒａｄ２、Ｒａｄ９、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ＰＮＫＰ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｓｏｘ、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ＮＤＫ１、ＮＤＫ５、ＮＤＫ７、ＮＤＫ８、ＷＲＮ、Ｔ７−エキソヌクレアーゼ遺伝子６、トリ骨髄芽球症ウイルス組込みタンパク質（ＩＮ）、ブルーム、アントアーティックホスファターゼ、アルカリホスフェターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＡｐｅＩ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｈｅｘ１、ＴＴＲＡＰ（ＴＤＰ２）、Ｓｇｓ１、Ｓａｅ２、ＣＵＰ、Ｐｏｌ  ｍｕ、Ｐｏｌラムダ、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＥＭＥ２、ＳＬＸ１、ＳＬＸ４、およびＵＬ−１２が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１９】
特定の実施形態において、本明細書において企図される細胞ゲノムを編集するためのゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、またはｍｅｇａＴＡＬ、およびエキソヌクレアーゼを含む、ポリペプチドを含む。「エキソヌクレアーゼ」という用語は、３’または５’末端のいずれかのホスホジエステル結合を切断する加水分解反応を介して、ポリヌクレオチド鎖の末端のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。
【０４２０】
本明細書において企図される、特定の実施形態における使用に好適なエキソヌクレアーゼの例示的な例としては、ｈＥｘｏＩ、酵母ＥｘｏＩ、大腸菌ＥｘｏＩ、ｈＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ２、ラットＴＲＥＸ２、ｈＴＲＥＸ１、マウスＴＲＥＸ１、ラットＴＲＥＸ１、およびラットＴＲＥＸ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４２１】
特定の実施形態において、ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、３’〜５’エキソヌクレアーゼ、好ましくはＴｒｅｘ１またはＴＲｅｘ２、より好ましくはＴｒｅｘ２、より好ましくはヒトまたはマウスＴｒｅｘ２である。
【０４２２】
Ｄ．標的部位
特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、自然発生のヌクレアーゼと比較して、あらゆる好適な標的配列にも結合するように設計することができ、新規の結合特異性を有し得る。特定の実施形態において、標的部位は、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、レプレッサー要素などを含む遺伝子の調節領域である、特定の実施形態において、標的部位は、遺伝子のコード領域またはスプライス部位である。特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、下方調節または遺伝子の発現を減少するように設計される。特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよびドナー修復テンプレートは、所望の標的配列を修復または欠失するように設計することができる。
【０４２３】
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、プログラム死受容体１（ＰＤ−１）遺伝子内の標的配列に結合し、それを切断する。ＰＤ−１はまた、プログラム細胞死１（ＰＤＣＤ１）、全身性エリテマトーデス感受性１（ＳＬＥＢ２）、ＣＤ２７９、ＨＰＤ１、ＰＤ１、ＨＰＤ−Ｌ、およびＨＳＬＥ１とも称される。ＰＤ−１は、共刺激受容体のＢ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバーである。ＰＤ−１分子は、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）および／または免疫受容体抑制性チロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）とともに位置する潜在的な有リン酸化部位をする受容体の細胞外リガンド結合ＩｇＶドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインからなる。ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇｓ、疲弊したＴ細胞、Ｂ細胞、活性化したモノサイト、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞上で発現された抑制性共受容体である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞活性化を、そのリガンド、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、およびプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）への結合を通して、負に調節する。ＰＤ−１結合は、Ｔ細胞の増殖、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ、およびＩＬ−２産生を阻害し、Ｔ細胞の生存を減少させる。ＰＤ−１発現は、ハイレベルの刺激を経験した疲弊したＴ細胞の特徴である。慢性感染症および癌の間に生じる疲弊のこの記述は、感染および腫瘍の最適以下の制御をもたらすＴ細胞機能不全を特徴とする。
【０４２４】
特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＰＤ−１遺伝子の標的部位に２本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＰＤ−１遺伝子のエクソン５内、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン５内の配列番号２５（または配列番号２７）で、およびより好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン５内の配列番号２５（または配列番号２７）の配列「ＡＴＡＣ」でＤＳＢを導入する。
【０４２５】
好ましい実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、２本鎖ＤＮＡを切断し、ＤＳＢを配列番号２５または２７のポリヌクレオチド配列に導入する。
【０４２６】
特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＰＤ−１遺伝子のエクソン１内、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン１内の配列番号３０（または配列番号３２）で、およびより好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン１内の配列番号３０（または配列番号３２）の配列「ＡＴＣＣ」でＤＳＢを導入する。
【０４２７】
好ましい実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、２本鎖ＤＮＡを切断し、ＤＳＢを配列番号３０または３２のポリヌクレオチド配列に導入する。
【０４２８】
特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＰＤ−１遺伝子のエクソン２内、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン２内の配列番号３５（または配列番号３７）で、およびより好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン２内の配列番号３５（または配列番号３７）の配列「ＡＣＴＴ」でＤＳＢを導入する。
【０４２９】
好ましい実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、２本鎖ＤＮＡを切断し、ＤＳＢを配列番号３５または３７のポリヌクレオチド配列に導入する。
【０４３０】
好ましい実施形態において、ＰＤ−１遺伝子は、ヒトＰＤ−１遺伝子である。
【０４３１】
Ｅ．ドナー修復テンプレート
ヌクレアーゼバリアントは、ＤＳＢを標的配列に導入するために使用され得、１つ以上のドナー修復テンプレートの存在下でＤＳＢは相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を介して修復され得る。
【０４３２】
様々な実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０４３３】
様々な実施形態において、異なる免疫抑制経路を標的とする免疫力エンハンサーおよび／または免疫抑制シグナルダンパーを独立してコードする複数のドナー修復テンプレートの存在下で、細胞を遺伝子操作されたヌクレアーゼを提供することは、治療有効性および持続性の増加を有するゲノム編集Ｔ細胞を産出することが企図される。例えば、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＩＬ−１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、およびＴＧＦβＲＩＩ経路の組み合わせを標的とする免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルは、特定の実施形態において好ましい場合がある。
【０４３４】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、配列をゲノムに挿入するのに使用される。特定の好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ゲノム内の配列を修復または修飾するのに使用される。
【０４３５】
様々な実施形態において、ドナー修復テンプレートは、細胞を、ドナー修復テンプレートを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、例えばレンチウイルス、ＩＤＬＶ、例えば、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、またはワクシニアウイルスベクターとともに伝達することで、造血細胞、例えば、Ｔ細胞内に導入される。
【０４３６】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢ部位に隣接する１つ以上の相同アームを含む。
【０４３７】
本明細書において使用される「相同アーム」という用語は、標的部位でヌクレアーゼによって導入されるＤＮＡ切断を隣接するＤＮＡ配列と同一、またはほぼ同一であるドナー修復テンプレート中の核酸配列を指す。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＮＡ切断部位のＤＮＡ配列５’と同一、またはほぼ同一である核酸配列を含む５’相同アームを含む。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＮＡ切断部位のＤＮＡ配列３’と同一、またはほぼ同一である核酸配列を含む３’相同アームを含む。好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５’相同アームおよび３’相同アームを含む。ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢ部位の直傍に隣接しているゲノム配列に対する相同性、またはＤＳＢ部位からのあらゆる数の塩基対内のゲノム配列に対する相同性を含む。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、相同配列の任意の介在する長さを含む、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２５ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約５０００ｂｐ、約１００００ｂｐ以上のゲノム配列に対して相同である核酸配列を含む。
【０４３８】
特定の実施形態で企図される相同アームの好適な長さの例示的な例としては、独立して選択され得、相同アームの全ての介在する長さを含む、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約２６００ｂｐ、約２７００ｂｐ、約２８００ｂｐ、約２９００ｂｐ、または約３０００ｂｐ、またはそれより長い相同アームが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３９】
好適な相同アーム長さの追加の例示的な例としては、相同アームの全ての介在する長さを含む、約１００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約１５００ｂｐ、または約１０００ｂｐ〜約１５００ｂｐが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４０】
特定の実施形態において、５’および３’相同アームの長さは、独立して、約５００ｂｐ〜約１５００ｂｐから選択される。一実施形態において、５’相同アームは、約１５００ｂｐであり、３’相同アームは、約１０００ｂｐである。一実施形態において、５’相同アームは、約２００ｂｐ〜約６００ｂｐであり、３’相同アームは、約２００ｂｐ〜約６００ｂｐである。一実施形態において、５’相同アームは、約２００ｂｐであり、３’相同アームは、約２００ｂｐである。一実施形態において、５’相同アームは、約３００ｂｐであり、３’相同アームは、約３００ｂｐである。一実施形態において、５’相同アームは、約４００ｂｐであり、３’相同アームは、約４００ｂｐである。一実施形態において、５’相同アームは、約５００ｂｐであり、３’相同アームは、約５００ｂｐである。一実施形態において、５’相同アームは、約６００ｂｐであり、３’相同アームは、約６００ｂｐである。
【０４４１】
ドナー修復テンプレートは、本明細書の他の箇所において企図される、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含み得る。
【０４４２】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＰＤ−１遺伝子またはその部分を含むポリヌクレオチドを含み、変異ＰＤ−１遺伝子産物が発現されるように、１つ以上の変異をゲノムＰＤ−１配列に導入するように設計される。一実施形態において、変異ＰＤ−１は、減少したリガンド結合および／または細胞内シグナル伝達の減少を有する。
【０４４３】
種々の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５’相同アーム、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、および３’相同アームを含む。
【０４４４】
様々な実施形態において、標的部位は、５’相同アーム、自己切断型ウイルス性ペプチド、例えば、Ｔ２Ａ、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、任意にポリ（Ａ）シグナルまたは自己切断型ペプチド、および３’相同アームを有するドナー修復テンプレートで修飾され、１つ以上のポリヌクレオチドの発現は、内在性ＰＤ−１プロモーターによって決定される。
【０４４５】
１．免疫力エンハンサー
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集免疫エフェクター細胞は、免疫力エンハンサーをコードするドナー修復テンプレートの存在下でＰＤ−１遺伝子にＤＳＢを導入することによって免疫抑制因子に対してより強力かつ／あるいは耐性で作製される。本明細書において使用される「免疫力エンハンサー」という用語は、Ｔ細胞または他の免疫細胞中で腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルを免疫刺激シグナルに変換する、Ｔ細胞の活性化および／または機能、免疫賦活因子、ならびに非自然発生のポリペプチドを刺激かつ／あるいは増強する非自然発生の分子を指す。
【０４４６】
特定の実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子；サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、および／またはサイトカイン受容体が挙げられるが、これらに限定されない、免疫賦活因子；ならびにフリップ受容体からなる群から選択される。
【０４４７】
いくつかの実施形態において、免疫力エンハンサー、免疫賦活因子、またはフリップ受容体は、タンパク質不安定化ドメインを含む融合ポリペプチドである。
【０４４８】
ａ．二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集免疫エフェクター細胞は、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子をコードするドナー修復テンプレートの存在下でＰＤ−１遺伝子にＤＳＢを導入することによってより強力になるように作製される。ＢｉＴＥ分子は、本明細書の他の箇所で企図される、標的抗原、リンカー、またはスペーサーに結合する第１の結合ドメインと、免疫エフェクター細胞上の刺激または共刺激分子に結合する第２の結合ドメインとを含む二分分子である。第１のおよび第２の結合ドメインは、独立して、リガンド、受容体、抗体またはその抗原結合断片、レクチン、および炭水化物から選択され得る。
【０４４９】
特定の実施形態において、第１のおよび第２の結合ドメインは、抗原結合ドメインである。
【０４５０】
特定の実施形態において、第１のおよび第２の結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態において、第１のおよび第２の結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【０４５１】
特定の実施形態において第１の結合ドメインによって認識および結合され得る標的抗原の例示的な例としては、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５２】
標的抗原の他の例示的な実施形態は、ＭＨＣ−ペプチド複合体を含み、任意に、ペプチドは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＭＡＧＥ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１から処理される。
【０４５３】
特定の実施形態において第２の結合ドメインによって認識および結合される免疫エフェクター細胞上の刺激または共刺激分子の例示的な例としては、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７８が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５４】
特定の実施形態において、ＤＳＢは、遺伝子操作されたヌクレアーゼによってＰＤ−１遺伝子内で誘導され、ＢｉＴＥを含むドナー修復テンプレートは、細胞内に導入され、相同組換えによってＰＤ−１遺伝子に挿入される。
【０４５５】
ｂ．免疫賦活因子
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集免疫エフェクター細胞は、ゲノム編集細胞または腫瘍微小環境における細胞のいずれかにおいて免疫賦活因子を増加させることによってより強力になるように作製される。免疫賦活因子は、免疫エフェクター細胞における免疫応答を増強する特定のサイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、およびサイトカイン受容体を指す。一実施形態において、Ｔ細胞は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、またはサイトカイン受容体をコードするドナー修復テンプレートの存在下でＰＤ−１遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。
【０４５６】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＴＮＦ−αからなる群から選択されるサイトカインをコードする。
【０４５７】
好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＰＤ−１遺伝子内の標的部位で統合される場合、サイトカインを内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結し、したがって内在性ＰＤ−１プロモーターの制御下でサイトカインの転写制御を配置する、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１からなる群から選択されるサイトカインをコードする。
【０４５８】
別の好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＰＤ−１遺伝子内の標的部位で統合される場合、サイトカインを内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結し、したがって内在性ＰＤ−１プロモーターの制御下でサイトカインの転写制御を配置する、ＩＬ−１２をコードする。
【０４５９】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、およびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるケモカインをコードする。
【０４６０】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢからなる群から選択される細胞毒素をコードする。
【０４６１】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、およびＩＬ−２１受容体からなる群から選択されるサイトカイン受容体をコードする。
【０４６２】
好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＰＤ−１遺伝子内の標的部位で統合される場合、サイトカイン受容体を内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結し、したがって内在性ＰＤ−１プロモーターの制御下でサイトカイン受容体の転写制御を配置する、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１８受容体、およびＩＬ−２１受容体からなる群から選択されるサイトカイン受容体をコードする。
【０４６３】
別の好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＰＤ−１遺伝子内の標的部位で統合される場合、サイトカイン受容体を内在性ＰＤ−１プロモーターに作動可能に連結し、したがって内在性ＰＤ−１プロモーターの制御下でサイトカイン受容体の転写制御を配置する、ＩＬ−１２受容体をコードする。
【０４６４】
ｃ．フリップ受容体
さらなる実施形態において、ドナー修復テンプレートは、フリップ受容体またはその部分をコードする。本明細書において使用される「フリップ受容体」という用語は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをＴ細胞中の免疫刺激シグナルに変換する非自然発生のポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ＰＤ−１フリップ受容体は、ＰＤ−１細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインまたはそのバリアントと、膜貫通ドメインと、免疫刺激シグナルをＴ細胞に伝達する細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ＰＤ−１フリップ受容体は、ＰＤ−１細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインまたはそのバリアントと、ＰＤ−１膜貫通ドメインと、免疫刺激シグナルをＴ細胞に伝達する細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ＰＤ−１フリップ受容体は、ＰＤ−１細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインまたはそのバリアントと、膜貫通ドメインと、免疫刺激シグナルをＴ細胞に伝達する、タンパク質からの細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ＰＤ−１細胞外ドメインバリアントは、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２への結合親和性を増加させる。
【０４６５】
一実施形態において、膜貫通は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ−１から単離される。
【０４６６】
一実施形態において、膜貫通は、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ３ポリペプチド、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離される。
【０４６７】
一実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離される。
【０４６８】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＰＤ−１細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または主要シグナル伝達ドメインとを含むＰＤ−１フリップ受容体を含む。膜貫通および細胞内ドメインは、同じタンパク質または異なるタンパク質から単離され得る。
【０４６９】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＰＤ−１細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインと、ＰＤ−１膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または主要シグナル伝達ドメインとを含むＰＤ−１フリップ受容体を含む。
【０４７０】
２．免疫抑制シグナルダンパー
既存の養子細胞療法を悩ませるある限定または問題は、腫瘍微小環境によって媒介された疲弊による免疫エフェクター細胞の低応答性である。疲弊したＴ細胞は、ナイーブ、エフェクターまたはメモリーＴ細胞と著しく異なる固有の分子シグネチャを有する。それらは、減少したサイトカイン発現およびエフェクター機能を有するＴ細胞として定義される。
【０４７１】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集免疫エフェクター細胞は、免疫抑制因子によるシグナル伝達を低下または減衰することによって疲弊に対してより耐性になるように作製される。一実施形態において、Ｔ細胞は、免疫抑制シグナルダンパーをコードするドナー修復テンプレートの存在下でＰＤ−１遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。
【０４７２】
本明細書において使用される「免疫抑制シグナルダンパー」という用語は、腫瘍微小環境からＴ細胞への免疫抑制シグナルの伝達を低下させる非自然発生のポリペプチドを指す。一実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する抗体またはその抗原結合断片である。好ましい実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ダンパーが、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、任意に、膜貫通ドメインと、任意に、修飾細胞内ドメイン（例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含むため、特定の免疫抑制因子またはシグナル伝達経路への抑制する、抑える、または優性ネガティブ効果を誘発するポリペプチドを指す。
【０４７３】
特定の実施形態において、細胞外ドメインは、免疫抑制因子を認識および結合する細胞外結合ドメインである。
【０４７４】
特定の実施形態において、修飾細胞内ドメインは、免疫抑制シグナルを減少または阻害するように変異される。好適な変異戦略としては、アミノ酸置換、付加、または欠失が挙げられるが、これらに限定されない。好適な変異としては、さらに、シグナル伝達ドメインを除去するための細胞内ドメイントランケーション、シグナル伝達モチーフ活性にとって重要な残基を除去するための変異細胞内ドメイン、および受容体循環を遮断するための変異細胞内ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、細胞内ドメインは、存在するとき、免疫抑制シグナルを伝達しないか、または実質的に低減されたシグナル伝達を有する。
【０４７５】
したがって、いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、腫瘍微小環境から１つ以上の免疫抑制因子のためのシンクの役割を果たし、Ｔ細胞内で対応する免疫抑制シグナル伝達経路を阻害する。
【０４７６】
ある免疫抑制シグナルは、トリプトファン異化によって媒介される。癌細胞においてインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）によるトリプトファン異化は、腫瘍微小環境におけるＴ細胞への免疫抑制効果を有することが示されているキヌレニンの産生をもたらす。例えば、Ｐｌａｔｔｅｎら（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２（２１）：５４３５−４０を参照されたい。
【０４７７】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、キヌレニナーゼ活性を有する酵素を含む。
【０４７８】
特定の実施形態での使用に好適なキヌレニナーゼ活性を有する酵素の例示的な例としては、Ｌ−キヌレニンヒドロラーゼが挙げられるが、これに限定されない。
【０４７９】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫抑制因子によって媒介される免疫抑制シグナル伝達を減少または遮断する免疫抑制シグナルダンパーをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０４８０】
特定の実施形態において企図される免疫抑制シグナルダンパーによって標的化される免疫抑制因子の例示的な例としては、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、マクロファージコロニー刺激因子１（Ｍ−ＣＳＦ１）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＳｉＳｏ細胞リガンド上で発現される受容体結合癌抗原（ＲＣＡＳ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ４７、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４８１】
様々な実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０４８２】
種々の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインを含む。
【０４８３】
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとを含む。
【０４８４】
別の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子、膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメインと、免疫抑制シグナルを伝達しないか、あるいは免疫抑制シグナルを伝達する実質的に低減された能力を有する修飾細胞内ドメインとを含む。
【０４８５】
本明細書において使用される「細胞外ドメイン」という用語は、抗原結合ドメインを指す。一実施形態において、細胞外ドメインは、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをＴ細胞に伝達する免疫抑制受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。特定の実施形態において、細胞外ドメインは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）および／または免疫受容体チロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインを指す。
【０４８６】
免疫抑制シグナルダンパーの特定の実施形態における使用に好適な細胞外ドメインの例示的な例としては、抗体もしくはその抗原結合断片、または以下のポリペプチド：プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、バンドＴリンパ球減弱因子（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容体抑制性チロシン依存性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、形質転換成長因子β受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）、インターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＸＣＲ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２（ＣＸＣＲ２）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０Ｒ）、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ１３Ｒα２）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬＲ１）、受容体結合癌抗原上で発現されるＳｉＳｏ細胞（ＲＣＡＳ１Ｒ）、およびＦａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）から単離された細胞外リガンド結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４８７】
一実施形態において、細胞外ドメインは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、およびＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【０４８８】
多くの膜貫通ドメインは、特定の実施形態において使用され得る。特定の実施形態で企図される免疫抑制シグナルダンパーの特定の実施形態での使用に好適な膜貫通ドメインの例示的な例としては、タンパク質：Ｔ細胞受容体、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖の膜貫通ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４８９】
特定の実施形態において、本明細書において企図される養子細胞療法は、ＴＧＦβＲＩＩを通して腫瘍微小環境からの免疫抑制ＴＧＦβシグナルの伝達を阻害または遮断する免疫抑制シグナルダンパーを含む。一実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外リガンド結合を含む細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ膜貫通ドメインと、およびトランケートされた、機能不全ＴＧＦβＲＩＩ細胞内ドメインとを含む。別の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外リガンド結合を含む細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ膜貫通ドメインとを含み、細胞内ドメインを欠いている。
【０４９０】
３．遺伝子操作された抗原受容体
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作された抗原受容体を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、遺伝子操作された抗原受容体をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＰＤ−１遺伝子にＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。
【０４９１】
特定の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体である。
【０４９２】
ａ．遺伝子操作されたＴＣＲ
【０４９３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作されたＴＣＲを含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、遺伝子操作されたＴＣＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＰＤ−１遺伝子にＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲは、単一のＰＤ−１遺伝子内のＤＳＢで挿入される。別の実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖は、１つのＰＤ−１遺伝子内でＤＳＢに挿入され、遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖は、他のＰＤ−１遺伝子内でＤＳＢ内に挿入される。
【０４９４】
一実施形態において、本明細書において企図される遺伝子操作されたＴ細胞は、ＰＤ−１遺伝子で挿入されていない遺伝子操作されたＴＣＲを含み、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよび／またはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの１つ以上が、１つ以上のＰＤ−１遺伝子内でＤＳＢに挿入される。
【０４９５】
自然発生のＴ細胞受容体は、２つのサブユニット、アルファ鎖およびベータ鎖サブユニットを含み、これらのそれぞれは、各Ｔ細胞のゲノムにおいて組換え事象によって産生される固有のタンパク質である。ＴＣＲのライブラリは、特定の標的抗原に対してそれらの選択性についてスクリーニングされ得る。このように、標的抗原に対して高い結合活性および反応性を有する天然ＴＣＲは、選択され、クローン化され、その後、養子免疫療法に対して使用されるＴ細胞の集団に導入され得る。
【０４９６】
一実施形態において、Ｔ細胞は、１つ以上のＰＤ−１遺伝子内で、ＤＳＢでＴＣＲのサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートに導入することによって修飾され、ＴＣＲサブユニットは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対してＴ細胞への特異性を与えるＴＣＲを形成する能力を有する。特定の実施形態において、サブユニットは、サブユニットが、ＴＣＲを形成する能力を保持し、トランスフェクトＴ細胞が標的細胞に誘導される能力を与え、免疫学的に関連するサイトカインシグナル伝達に関与する限り、自然発生のサブユニットと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、または修飾を有する。遺伝子操作されたＴＣＲはまた、好ましくは、高い結合活性を有する関連のある腫瘍関連ペプチドを表示する標的細胞に結合し、および任意に、インビボで関連ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷を媒介する。
【０４９７】
遺伝子操作されたＴＣＲをコードする核酸は、好ましくは、Ｔ細胞の（自然発生）染色体においてそれらの天然の状況から単離され、本明細書の他の箇所で記載される、好適なベクターに組込まれ得る。それらを含む核酸およびベクターの両方が、細胞に、好ましくは、特定の実施形態において、Ｔ細胞に移動され得る。次いで、修飾Ｔ細胞は、伝達された核酸または核酸によってコードされるＴＣＲのうちの１つ以上の鎖を発現することができる。好ましい実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲは、特定のＴＣＲを正常に発現しないＴ細胞に導入されるため、外因性ＴＣＲである。遺伝子操作されたＴＣＲの本質的態様は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または同様の免疫学的構成要素によって提示される腫瘍抗原に対して高い結合活性を有することである。遺伝子操作されたＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、ＭＨＣの独立した様式で標的抗原に結合するように遺伝子操作される。
【０４９８】
ＴＣＲは、付着された追加のポリペプチドが、機能的Ｔ細胞受容体およびＭＨＣ依存性抗原認識を形成するアルファ鎖またはベータ鎖の能力に干渉しない限り、ＴＣＲの本発明のアルファ鎖またはベータ鎖のアミノ末端またはカルボキシル末端部分に付着する追加のポリペプチドで発現され得る。
【０４９９】
特定の実施形態において企図される遺伝子操作されたＴＣＲによって認識される抗原としては、血液癌および固形腫瘍の両方における抗原を含む、癌抗原が挙げられるが、これに限定されない。例示的な抗原としては、アルファ葉酸受容体、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５００】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをコードするポリヌクレオチドまたは第１の自己切断型ウイルスペプチド、ならびに１つの修飾および／または機能不全ＰＤ−１遺伝子に組込まれた遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖および／またはベータ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０５０１】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをコードするポリヌクレオチドまたは第１の自己切断型ウイルスペプチド、ならびに１つの修飾および／または機能不全ＰＤ−１遺伝子に組込まれた遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖およびベータ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０５０２】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５’〜３’の、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチド、遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチド、第２の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに１つの修飾および／または機能不全ＰＤ−１遺伝子に組込まれた遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。このような場合には、他のＰＤ−１遺伝子は、機能的であり得る、あるいは機能を低下させたか、またはＤＳＢによる機能不全およびＮＨＥＪによる修復されている可能性がある。一実施形態において、他のＰＤ−１遺伝子は、本明細書において企図される遺伝子操作されたヌクレアーゼによって修飾されており、機能を低下させるかまたは機能不全になっている可能性がある。
【０５０３】
特定の実施形態において、両方のＰＤ−１遺伝子が修飾され、機能を低下するかまたは機能不全であり、第１の修飾ＰＤ−１遺伝子は、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、第２の修飾ＰＤ−１遺伝子は、第２の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０５０４】
ｂ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
特定の実施形態において、本明細書において企図される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＰＤ−１遺伝子にＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、ＣＡＲは、単一のＰＤ−１遺伝子内のＤＳＢで挿入される。
【０５０５】
一実施形態において、本明細書において企図される遺伝子操作されたＴ細胞は、ＰＤ−１遺伝子で挿入されていないＣＡＲを含み、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよび／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの１つ以上が、１つ以上のＰＤ−１遺伝子内でＤＳＢ内に挿入される。
【０５０６】
様々な実施形態において、ゲノム編集Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を再指向するＣＡＲを発現する。ＣＡＲは、特異的抗腫瘍細胞性免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するために、Ｔ細胞受容体を活性化する細胞内ドメインを有する標的抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体系特異性を組み合わせる分子である。本明細書において使用される「キメラ」という用語は、異なるタンパク質の部分または異なる起源からのＤＮＡからなることを説明する。
【０５０７】
様々な実施形態において、ＣＡＲは、特異的標的抗原（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される）に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。ＣＡＲの主な特性は、免疫エフェクター細胞特異性を再指向するそれらの能力であり、それによって、主要組織適合性（ＭＨＣ）の独立した様式で、標的抗原を発現する細胞の細胞死を媒介し得る、分子の増殖、サイトカイン産生、食作用、または産生を引き起こし、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的標的能力を利用する。
【０５０８】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、標的ポリペプチド、例えば、腫瘍細胞上で発現される標的抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含む。本明細書において使用される「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は、交換可能に使用され、キメラ受容体、例えば、目的となる標的抗原に特異的に結合する能力を有するＣＡＲまたはＤａｒｉｃを提供する。結合ドメインは、生物学的分子（例えば、細胞表面受容体または腫瘍タンパク質、脂質、多糖、または他の細胞表面標的分子、またはその構成要素）に特異的に認識および結合する能力を有する、任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを含み得る。結合ドメインは、目的となる生物学的分子に対する、任意に自然発生の、合成、半合成、または組換え技術によって産生された結合パートナーを含む。
【０５０９】
特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０５１０】
「抗体」は、ペプチド、脂質、多糖、または抗原決定基を含有する核酸、例えば、免疫細胞によって認識されるものである、標的抗原のエピトープに特異的に認識および結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合剤を指す。抗体には、抗原結合断片、例えば、ラクダＩｇ（ラクダ科抗体またはそのＶＨＨ断片）、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ）またはその他の抗体断片が含まれる。用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役抗体（二重特異性抗体など）、およびその抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
【０５１１】
１つの好ましい実施形態において、結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【０５１２】
別の好ましい実施形態において、結合ドメインは、ラクダ科抗体である。
【０５１３】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
【０５１４】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外結合ドメイン、例えば、抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、抗原は、クラスＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体である。
【０５１５】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、様々なドメイン間のリンカー残基を含む。「可変領域連結配列」は、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に接続し、得られるポリペプチドが、同じ軽鎖および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に特異的結合親和性を保持するように、２つの結合ドメインの相互作用に適合性のあるスペーサー機能を提供するアミノ酸配列である。特定の実施形態において、ＣＡＲは、１つの、２つの、３つの、４つの、または５つもしくはそれ以上のリンカーを含む。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約１〜約２５のアミノ酸、約５〜約２０のアミノ酸、または約１０〜約２０のアミノ酸、またはアミノ酸の任意の介在する長さである。いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のアミノ酸長である。
【０５１６】
特定の実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインの後ろに、１つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して適切な細胞／細胞接触、抗原結合および活性化を可能にする領域を指す（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。特定の実施形態において、スペーサードメインは、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない、免疫グロブリンの部分である。スペーサードメインは、自然発生の免疫グロブリンヒンジ領域または変化した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【０５１７】
一実施形態において、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【０５１８】
一実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合および活性化を可能にするためにエフェクター細胞表面から離れて抗原結合ドメインを位置決めする役割を果たす、１つ以上の「ヒンジドメイン」に連結される。ＣＡＲは、一般には、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間に１つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、自然発生の免疫グロブリンヒンジ領域または変化した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【０５１９】
本明細書において記載されるＣＡＲでの使用に好適な例示的なヒンジドメインは、ＣＤ８α、およびＣＤ４などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これは、これらの分子から野生型ヒンジ領域であり得るか、または変化され得る。別の実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【０５２０】
一実施形態において、ヒンジは、ＰＤ−１ヒンジまたはＣＤ１５２ヒンジである。
【０５２１】
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分および細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の形質膜に固定するＣＡＲの部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。
【０５２２】
例示的なＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖の少なくとも膜貫通領域（複数可）に由来し得る（すなわち、それらを含む。
【０５２３】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態において、本明細書において企図されるＣＡＲは、好ましくは、ＴＭドメインおよびＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長のＣＤ８αおよび短オリゴまたはポリペプチドリンカーに由来するＴＭドメインを含む。グリシン−セリンリンカーは、特定の好適なリンカーを提供する。
【０５２４】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、標的抗原への有効なＣＡＲ結合のメッセージを、免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、ＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害性因子の放出、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合で引き出される他の細胞応答を含む、活性化、サイトカイン産生、増殖、および細胞傷害性活性を引き出すことに関与するＣＡＲの部分を指す。
【０５２５】
「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解性活性またはサイトカインの分泌を含む、補助もしくは活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞を、特殊機能を行うように誘導するタンパク質の部分を指す。通常は、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分を使用する範囲内で、そのようなトランケートされた部分を、エフェクター機能シグナルを伝達する限りは、ドメイン全体の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意のトランケートされた部分を含むことを意味する。
【０５２６】
ＴＣＲ単独によって生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化に不十分であること、および二次または共刺激シグナルも必要であることが公知である。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの別個のクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン：ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存性一次活性化を開始する主要シグナル伝達ドメインと、抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルをもたらす共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されるということができる。好ましい実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「主要シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０５２７】
主要シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性に、または阻害性に調節する。刺激性に作用する主要シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシン依存性モチーフまたはＩＴＡＭとして公知であるシグナル伝達モチーフを含有し得る。
【０５２８】
特定の実施形態において企図されるＣＡＲでの使用に好適な主要シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの例示的な例には、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特に好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインおよび１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内主要シグナル伝達および共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結することができる。
【０５２９】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および増殖を増強するための１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書において使用される「共刺激シグナル伝達ドメイン」、または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。
【０５３０】
特定の実施形態で企図されるＣＡＲでの使用に好適なかかる共刺激分子の例示的な例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４、およびＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインからなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０５３１】
様々な実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインと、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択されるポリペプチドから単離された１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインとを含む。
【０５３２】
ｃ．Ｄａｒｉｃ受容体
特定の実施形態において、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のＤａｒｉｃ受容体を含む。本明細書において使用される「Ｄａｒｉｃ受容体」という用語は、多鎖遺伝子操作された抗原受容体を指す。一実施形態において、Ｔ細胞は、Ｄａｒｉｃの１つ以上の構成要素をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＰＤ−１遺伝子内にＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃまたはその１つ以上の構成要素は、単一のＰＤ−１遺伝子内のＤＳＢで挿入される。
【０５３３】
一実施形態において、遺伝子操作されたＴ細胞は、ＰＤ−１遺伝子、ならびに免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよび／またはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のうちの１つ以上で挿入されないＤａｒｉｃを含むか、またはＤａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素は、１つ以上のＰＤ−１遺伝子内でＤＳＢ内に挿入される。
【０５３４】
Ｄａｒｉｃアーキテクチャおよび構成要素の例示的な例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／０１７２１４および米国特許公開第２０１５０２６６９７３号に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【０５３５】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、以下のＤａｒｉｃ構成要素：第１の多量体化ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および／または主要シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ポリペプチドと、結合ドメイン、第２の多量体化ドメイン、および任意に第２の膜貫通ドメインを含む結合ポリペプチドとを含む。機能的Ｄａｒｉｃは、シグナル伝達ポリペプチドおよび結合ポリペプチドの多量体化ドメインに関連するおよびそれらとの間に配置される架橋因子を有する細胞表面上にＤａｒｉｃ受容体複合体の形成を促進する架橋因子を含む。
【０５３６】
特定の実施形態において、第１のおよび第２の多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログ、クーママイシンまたはその誘導体、ジベレリンまたはその誘導体、アブシジン酸（ＡＢＡ）またはその誘導体、メトトレキサートまたはその誘導体、シクロスポリンＡまたはその誘導体、ＦＫＣｓＡまたはその誘導体、ＦＫＢＰ（ＳＬＦ）のためのトリメトプリム（Ｔｍｐ）−合成リガンドまたはその誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される架橋因子と関連する。
【０５３７】
ラパマイシン類似体（ラパログ）の例示的な例は、米国特許第６，６４９，５９５号に開示されるものを含み、ラパログ構造は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。特定の実施形態において、架橋因子は、ラパマイシンと比較して、実質的に低減された免疫抑制効果を有するラパログである。「実質的に低減された免疫抑制効果」は、臨床的にまたはヒト免疫抑制活性の適切なインビトロ（例えば、Ｔ細胞増殖の阻害）もしくはインビボでのサロゲートで測定される、等モル量のラパマイシンに観察されたまたは期待された免疫抑制効果を少なくとも０．１〜０．００５倍未満有するラパログを指す。一実施形態において、「実質的に低減された免疫抑制効果」は、同じアッセイにおいてラパマイシンに観察されたＥＣ５０値よりも少なくとも１０〜２５０倍大きいかかるインビトロアッセイにおいてＥＣ５０値を有するラパログを指す。
【０５３８】
ラパログの他の例示的な例としては、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、およびゾタロリムスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５３９】
特定の実施形態において、多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログである架橋因子と関連があるであろう。例えば、第１のおよび第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰおよびＦＲＢから選択される対である。ＦＲＢドメインは、ＦＫＢＰタンパク質およびラパマイシンまたはそのラパログとともに三部分複合体を形成することができるポリペプチド領域（タンパク質「ドメイン」）である。ＦＲＢドメインは、ヒトおよび他の種からのｍＴＯＲタンパク質（文献においてＦＲＡＰ、ＲＡＰＴ１、またはＲＡＦＴとも称される）、Ｔｏｒ１およびＴｏｒ２を含む酵母タンパク質、ならびにカンジダＦＲＡＰホモログを含む、多くの自然発生のタンパク質中に存在する。ヌクレオチド配列、クローニング、およびこれらのタンパク質の他の態様に関する情報は、既に当該技術分野で既知である。例えば、ヒトｍＴＯＲにおけるタンパク質配列アクセッション番号は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３４０７５．１である（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：７５６，１９９４）。
【０５４０】
本明細書において企図される特定の実施形態での使用に好適なＦＲＢドメインは、一般に、少なくとも約８５〜約１００個のアミノ酸残基を含有する。特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質で使用するＦＲＢアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３４０７５．１のアミノ酸配列に基づいて、９３アミノ酸配列Ｉｌｅ−２０２１〜Ｌｙｓ−２１１３およびＴ２０９８Ｌの変異を含むであろう。特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃｓで使用するＦＲＢドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合したＦＫＢＰタンパク質の複合体に結合することができるであろう。特定の実施形態において、ＦＲＢドメインのペプチド配列は、（ａ）相同タンパク質のヒトｍＴＯＲの少なくとも示された９３アミノ酸領域または対応する領域に及ぶ自然発生のペプチド配列、（ｂ）自然発生のペプチドの、最大約１０個のアミノ酸、または約１〜約５個のアミノ酸または約１〜約３個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態において、わずか１個のアミノ酸が、欠失、挿入、または置換されている自然発生のＦＲＢのバリアント、または（ｃ）自然発生のＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子によって、または遺伝コードの縮重がなかったら、自然発生のＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができ得るＤＮＡ配列によってコードされるペプチドを含む。
【０５４１】
ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）は、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、およびラパマイシンなどのマクロライドの細胞質受容体であり、種線にわたって高度に保存される。ＦＫＢＰは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、ＦＲＢを含有するタンパク質または融合タンパク質を用いて三部分複合体をさらに形成することができるタンパク質またはタンパク質ドメインである。ＦＫＢＰドメインはまた、「ラパマイシン結合ドメイン」とも称される。ヌクレオチド配列、クローニング、および種々のＦＫＢＰ種の他の態様に関連する情報は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓｔａｅｎｄａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：６７１，１９９０（ヒトＦＫＢＰ１２）、Ｋａｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：３６１，１９９６を参照されたい）。他の哺乳動物種、酵母、および他の生物における相同ＦＫＢＰタンパク質はまた、当該技術分野で既知であり、本明細書に開示されている融合タンパク質において使用され得る。特定の実施形態で企図されるＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、ＦＲＢを含有するタンパク質を用いて三部分複合体に関与することができるであろう（かかる結合を検出するために、任意の手段によって、直接または間接的に決定され得るように）。
【０５４２】
特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃでの使用に好適なＦＫＢＰドメインの例示的な例としては、好ましくはヒトＦＫＢＰ１２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ５８４７６．１）から、またはそこから単離されたペプチド配列、別のヒトＦＫＢＰから、マウスもしくは他の哺乳動物ＦＫＢＰから、またはいくつかの他の動物、酵母、もしくは真菌ＦＫＢＰから単離された自然発生のＦＫＢＰペプチド配列、自然発生のペプチドの、最大約１０個のアミノ酸、または約１〜約５個のアミノ酸または約１〜約３個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態において、わずか１個のアミノ酸が、欠失、挿入、または置換されている自然発生のＦＫＢＰ配列のバリアント、あるいは自然発生のＦＫＢＰをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子によって、または遺伝コードの縮重がなかったら、自然発生のＦＫＢＰをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができ得るＤＮＡ配列によってコードされるペプチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５４３】
特定の実施形態で企図されるＤａｒｉｃでの使用に好適な多量体化ドメイン対の他の例示的な例としては、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、またはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５４４】
さらに他の実施形態において、抗架橋因子は、シグナル伝達ポリペプチドおよび結合ポリペプチドと架橋因子との関連性を遮断する。例えば、シクロスポリンまたはＦＫ５０６は、ラパマイシンを滴定するための抗架橋因子として使用され、したがって、１つの多量体化ドメインのみが結合するため、シグナル伝達を停止し得る。特定の実施形態において、抗架橋因子（例えば、シクロスポリン、ＦＫ５０６）は、免疫抑制剤である。例えば、免疫抑制抗架橋因子は、特定の実施形態で企図されるＤａｒｉｃ構成要素の機能を遮断または最小限に抑え、同時に、臨床設定において望ましくないまたは病理学的炎症応答を阻害または遮断するために使用され得る。
【０５４５】
一実施形態において、第１の多量体化ドメインは、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌを含み、第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰ１２を含み、架橋因子は、ラパログＡＰ２１９６７である。
【０５４６】
別の実施形態において、第１の多量体化ドメインは、ＦＲＢを含み、第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰ１２を含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０５４７】
特定の実施形態において、シグナル伝達ポリペプチド、第１の膜貫通ドメインおよび結合ポリペプチドは、第２の膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカーを含む。第１および第２の膜貫通ドメインの例示的な例は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ−１からなる群から独立して選択されるポリペプチドから、単離される。
【０５４８】
一実施形態において、シグナル伝達ポリペプチドは、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または主要シグナル伝達ドメインを含む。
【０５４９】
特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃシグナル伝達構成要素での使用に好適な主要シグナル伝達ドメインの例示的な例には、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。特に好ましい実施形態において、Ｄａｒｉｃシグナル伝達構成要素は、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインおよび１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内主要シグナル伝達および共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結することができる。
【０５５０】
特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃシグナル伝達構成要素での使用に好適なかかる共刺激分子の例示的な例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態において、Ｄａｒｉｃシグナル伝達構成要素は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４、およびＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインからなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０５５１】
特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃ結合構成要素は、結合ドメインを含む。一実施形態において、結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片である。
【０５５２】
抗体またはその抗原結合断片は、ペプチド、脂質、多糖、または抗原決定基を含有する核酸、例えば、免疫細胞によって認識されるものである、標的抗原のエピトープに特異的に認識および結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含む。抗体には、抗原結合断片、例えば、ラクダＩｇ（ラクダ科抗体またはそのＶＨＨ断片）、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ）またはその他の抗体断片が含まれる。用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役抗体（二重特異性抗体など）、およびその抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
【０５５３】
１つの好ましい実施形態において、結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【０５５４】
別の好ましい実施形態において、結合ドメインは、ラクダ科抗体である。
【０５５５】
特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃ結合構成要素は、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
【０５５６】
一実施形態において、Ｄａｒｉｃ結合構成要素は、細胞外ドメイン、例えば、クラスＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０５５７】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるＤａｒｉｃ構成要素は、２つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ドメイン、領域、またはモチーフを接続するリンカーまたはスペーサーを含む。特定の実施形態において、リンカーは、約２〜約３５個のアミノ酸、または約４〜約２０個のアミノ酸または約８〜約１５個のアミノ酸または約１５〜約２５個のアミノ酸を含む。他の実施形態において、スペーサーは、抗体ＣＨ２ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメインなどの特定の構造を有し得る。一実施形態において、スペーサーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
【０５５８】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるＤａｒｉｃ構成要素は、適切な細胞／細胞接触、抗原結合および活性化を可能にするためにドメインを位置決めする役割を果たす、１つ以上の「ヒンジドメイン」を含む。Ｄａｒｉｃは、結合ドメインと多量体化ドメインおよび／または膜貫通ドメイン（ＴＭ）または多量体化ドメインと膜貫通ドメインとの間に１つ以上のヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、自然発生の免疫グロブリンヒンジ領域または変化した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８αヒンジまたはＣＤ４ヒンジである。
【０５５９】
一実施形態において、Ｄａｒｉｃは、シグナル伝達ポリペプチドを含み、シグナル伝達ポリペプチドは、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインを含み、結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインおよびＣＤ４膜貫通ドメインを含み、架橋因子は、ラパログＡＰ２１９６７である。
【０５６０】
一実施形態において、Ｄａｒｉｃは、シグナル伝達ポリペプチドを含み、シグナル伝達ポリペプチドは、ＦＲＢの第１の多量体化ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインを含み、結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメイン、およびＣＤ４膜貫通ドメインを含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０５６１】
ｄ．ゼータカイン
特定の実施形態において、本明細書において企図される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のキメラサイトカイン受容体を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＰＤ−１遺伝子にＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、単一のＰＤ−１遺伝子内のＤＳＢで挿入される。
【０５６２】
一実施形態において、本明細書において企図される遺伝子操作されたＴ細胞は、ＰＤ−１遺伝子で挿入されていないキメラサイトカイン受容体を含み、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよび／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの１つ以上が、１つ以上のＰＤ−１遺伝子内でＤＳＢ内に挿入される。
【０５６３】
様々な実施形態において、ゲノム編集Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を再指向するキメラサイトカイン受容体を発現する。ゼータカインは、細胞外ドメインを細胞表面に連結することができる支援領域に連結された可溶性受容体リガンドを含む細胞外ドメインと、膜貫通領域と、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ膜貫通免疫受容体である。ゼータカインは、Ｔリンパ球の表面上で発現されるとき、可溶性受容体リガンドが特異的である受容体を発現するような細胞に、Ｔ細胞活性を誘導する。ゼータカインキメラ免疫受容体は、様々な癌の治療への適用とともに、具体的には、ヒト悪性腫瘍によって利用される自己分泌／パラクリンサイトカイン系を介してＴ細胞の抗原特異性を再指向する。
【０５６４】
特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、免疫抑制サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアント、リンカー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０５６５】
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアントは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択される。
【０５６６】
特定の実施形態において、リンカーは、ＣＨ２ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメインなどを含む。一実施形態において、リンカーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。一実施形態において、リンカーは、ＣＤ８αまたはＣＤ４ヒンジドメインを含む。
【０５６７】
特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択される。
【０５６８】
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、主要シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激ドメインを含有するＩＴＡＭからなる群から選択される。
【０５６９】
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択される。
【０５７０】
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択される。
【０５７１】
一実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４、およびＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインからなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０５７２】
Ｆ．ポリペプチド
様々なポリペプチドが本明細書において企図され、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および融合ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１〜２４および６０〜６４に記載されるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として交換可能に使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、様々な公知の組換えおよび／または合成技術のうちのいずれかを用いて調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含み得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに自然発生または非自然発生の両方の、当該技術分野で既知の他の修飾を含み得る。
【０５７３】
本明細書において使用される「単離されたタンパク質」、「単離されたペプチド」、または「単離されたポリペプチド」などは、ペプチドまたはポリペプチド分子の、細胞環境からの、および細胞の他の構成要素との会合からのインビトロ合成、単離、および／または精製を指し、すなわち、それは、インビボ物質と強く会合していない。
【０５７４】
特定の実施形態において企図されるポリペプチドの例示的な例としては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシングヌクレアーゼ、融合ポリペプチド、およびそのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７５】
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入において自然発生のポリペプチドとは異なり得る。かかるバリアントは、自然発生であり得るか、または例えば、上述のポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって合成によって生成され得る。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチドへの１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入を導入することによって、ヒトＰＤ−１遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するホーミングエンドヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬなどの生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドには、本明細書において企図される任意の参照配列に対して少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、バリアントが、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
【０５７６】
ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。生物学的に活性なポリペプチド断片の例示的な例としては、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなどが挙げられる。本明細書において使用される「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」という用語は、少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％の自然発生のポリペプチド活性を保持するポリペプチド断片を指す。好ましい実施形態において、生物学的活性は、標的配列への結合親和性および／または切断活性である。特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約１７００アミノ酸長さのアミノ酸鎖を含み得る。特定の実施形態において、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００またはそれ以上のアミノ酸長であることが認識されよう。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片を含む。特定の実施形態において、本明細書のポリペプチドは、「Ｘ」として示される１つ以上のアミノ酸を含み得る。「Ｘ」は、もしアミノ酸配列番号に存在する場合、あらゆるアミノ酸をも指す。１つ以上の「Ｘ」残基は、本明細書において企図される特定の配列番号のアミノ酸配列の、ＮおよびＣ末端に存在し得る。「Ｘ」のアミノ酸が存在しない場合、配列番号の残りのアミノ酸配列は、生物学的に活性な断片と考慮される。
【０５７７】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片、例えば、配列番号３〜１４、および６０〜６３、またはｍｅｇａＴＡＬ（配列番号１５〜２３、および６４）を含む。生物学的に活性な断片は、Ｎ末端トランケーションおよび／またはＣ末端トランケーションを含み得る。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸の欠失、より好ましくは対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４個のＮ末端アミノ酸の欠失を欠くか、あるいは含む。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸の欠失、より好ましくは対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの２個のＣ末端アミノ酸の欠失を欠くか、あるいは含む。特定の好ましい実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４個のＮ末端アミノ酸および２個のＣ末端アミノ酸の欠失を欠くか、あるいは含む。
【０５７８】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の以下のＮ末端アミノ酸、Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失、および／または以下の１、２、３、４、もしくは５個のＣ末端アミノ酸、Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖの欠失を含む。
【０５７９】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の以下のＮ末端アミノ酸、Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失もしくは置換、および／または以下の１、２、３、４、もしくは５個のＣ末端アミノ酸、Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖの欠失もしくは置換を含む。
【０５８０】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の以下のＮ末端アミノ酸、Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失、および／または以下の１もしくは２個のＣ末端アミノ酸、Ｆ、Ｖの欠失を含む。
【０５８１】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の以下のＮ末端アミノ酸、Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失もしくは置換、および／または以下の１もしくは２個のＣ末端アミノ酸、Ｆ、Ｖの欠失もしくは置換を含む。
【０５８２】
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、トランケーション、および挿入を含む様々な方法で変更することができる。かかる操作のための方法は、一般に当該技術分野で既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８７３，１９２、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）およびそこに引用される参考文献を参照されたい。目的となるタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に対するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出され得る。
【０５８３】
特定の実施形態において、バリアントは、１つ以上の保存的置換を含有するであろう。「保存的置換」は、アミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸で置換され、そのためペプチド化学分野の当業者によってポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー特性が実質的に変化しないことが予期されるような置換である。修飾は、特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において行われ得、ポリペプチドは、少なくとも約を有し、依然として望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を含むポリペプチドを含む。同等の、またはさらに改良された、バリアントポリペプチドを作製するためポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが望ましいとき、当業者は、例えば、表１に従って例えば、コードするＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変化させ得る。
【表１】
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【０５８４】
アミノ酸残基が、生物学的活性を廃止することなく、置換、挿入、または欠失され得る決定するためのガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃベクター、またはベクターＮＴＩソフトウェアなどの当該技術分野で公知のコンピュータプログラムを用いて見出され得る。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したまたは非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を伴う。自然発生のアミノ酸は、一般に、４つのファミリー：酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸に分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は、当業者に知られており、一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく行われ得る。当業者は、全般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変更しないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。
【０５８５】
一実施形態において、２つ以上のポリペプチドの発現が所望である場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列を、本明細書の他の箇所で開示されているＩＲＥＳ配列によって分離することができる。
【０５８６】
特定の実施形態において企図されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、融合ポリペプチドおよび融合ポリヌクレオチドをコードするポリペプチドが、提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。
【０５８７】
別の実施形態において、２つ以上のポリペプチドは、本明細書の他の箇所で開示される、１つ以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
【０５８８】
一実施形態において、本明細書において企図される融合タンパク質は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のヌクレアーゼ、ならびに１つ以上のリンカーおよび／または自己切断型ポリペプチドを含む。
【０５８９】
一実施形態において、本明細書において企図される融合タンパク質は、ヌクレアーゼバリアント、リンカーまたは自己切断型ペプチド、ならびに５’−３’エキソヌクレアーゼ、５’−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、および３’−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）を含むが、これらに限定されないエンドプロセシング酵素を含む。
【０５９０】
融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、細胞透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなど、エピトープタグ（例えば、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＩＳ６、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、およびＨＡ）、ポリペプチドリンカー、およびポリペプチド切断シグナルを含むが、これらに限定されない、１つ以上のポリペプチドドメインまたはセグメントを含み得る。融合ポリペプチドは、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端、またはＮ末端からＣ末端に連結することも可能であるが、それらは、典型的に、Ｃ末端からＮ末端に連結される。特定の実施形態において、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順番であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の活性が保存されている限りは、保守的に修飾されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異、部分配列、および種間ホモログも含むことができる。融合ポリペプチドは、化学的な合成方法によって、または２つの部分間の化学連結によって産生することができるか、または一般に、他の標準の技法を使用して調製することもできる。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で開示されるように、好適な転写または翻訳制御要素に作動可能に連結されている。
【０５９１】
融合ポリペプチドは、任意に、１つ以上のポリペプチドまたはポリペプチド内のドメインを連結させるために使用することができるリンカーを含み得る。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮することができるように、各ポリペプチドがその適切な二次および三次構造に折り畳むのを確保するのに十分な距離により、任意の２つ以上のポリペプチド構成要素を分離するために使用され得る。かかるペプチドリンカー配列は、当該技術分野で標準的な技術を使用して融合ポリペプチドに組込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、以下の因子：（１）可撓性延長配座を採用するそれらの能力、（２）第１のおよび第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を採用できないそれらの能力、ならびに（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基の欠如、に基づいて選択され得る。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の近い中性アミノ酸はまた、リンカー配列において使用され得る。リンカーとして有用に使用され得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６，１９８５、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２，１９８６、米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるものを含む。リンカー配列は、特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能的ドメインを分離し、立体干渉を防ぐために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を含むとき、必要とされない。好ましいリンカーは、典型的に、組換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。リンカーポリペプチドは、１〜２００アミノ酸長、１〜１００アミノ酸長、または１〜５０アミノ酸長であり得、その間の全ての整数値を含む。
【０５９２】
代表的なリンカーとしては、以下のアミノ酸配列：グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシンセリンポリマー（Ｇ１〜５Ｓ１〜５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）、グリシンアラニンポリマー、アラニンセリンポリマー、ＧＧＧ（配列番号６９）、ＤＧＧＧＳ（配列番号７０）、ＴＧＥＫＰ（配列番号７１）（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）を参照されたい）、ＧＧＲＲ（配列番号７２）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、上記を参照）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ  （式中、ｎは、１、２、３、４または５である）（配列番号７３）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号７４）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号７５）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号７６）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号７７）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号７８）、ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号７９）が挙げられるが、これらに限定されない。代替として、可撓性リンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデリングし得るコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）を使用して、またはファージディスプレイ方法によって理性的に設計され得る。
【０５９３】
融合ポリペプチドは、本明細書において記載されるポリペプチドドメインのそれぞれの間または内在性オープンリーディングフレームとドナー修復テンプレートによってコードされるポリペプチドとの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。その上、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。代表的なポリペプチド切断シグナルには、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、希な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位）、および自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が含まれる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照されたい）。
【０５９４】
好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断型ペプチドは、当業者に既知である（例えば、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２、Ｓｃｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照されたい）。代表的なプロテアーゼ切断部位としては、ポチウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコｅｔｃｈウイルスプロテアーゼ）、ポチウイルスＨＣプロテアーゼ、ポチウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロスフェリカルウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられるが、これらに限定されない。その高い切断ストリンジェンシーにより、ＴＥＶ（タバコｅｔｃｈウイルス）プロテアーゼ切断部位は、一実施形態において、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号８０）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号８１）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号８２）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧまたはＱとＳとの間に生じる）が好ましい。
【０５９５】
特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。特定の実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポチウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
【０５９６】
一実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾーシーアシグナウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ−１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。
【０５９７】
２Ａ部位の例示的な例を表２に提供する。
【表２】
2019526268.tif 000004
【０５９８】
Ｇ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本明細書において企図される、１つ以上のホーミングエンドヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシング酵素、および融合ポリペプチドが提供される。本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖、および組み合わせ、合成、または単離のいずれかであり得る。ポリヌクレオチドとしては、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、合成ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型、ならびに全ての中間の長さの、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００以上のヌクレオチド長のヌクレオチドの多量体型を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、６、７、８、９などの、１０１、１０２、１０３などの、１５１、１５２、１５３などの、２０１、２０２、２０３などの引用された値の間の任意の長さを意味することは容易に理解されよう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０５９９】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。本明細書において使用される「コドン最適化される」という用語は、ポリペプチドの発現、安定性、および／または活性を増加させるために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド内のコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響する因子としては、（ｉ）２つ以上の生物または遺伝子または合成的に構築されたバイアス表の間のコドンバイアスの変動、（ｉｉ）生物、遺伝子、もしくは遺伝子対内のコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）状況を含むコドンの系統的変動、（ｉｖ）それらのデコードｔＲＮＡによるコドンの変動、（ｖ）トリプレットの全体または１つの位置のいずれかでの、ＧＣ％によるコドンの変動、（ｖｉ）参照配列、例えば自然発生の配列への類似性の程度の変動、（ｖｉｉ）コドン周波数カットオフの変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造特性、（ｉｘ）コドン置換セットの設計が基づくＤＮＡ配列の機能についての予備知識、（ｘ）各アミノ酸へのコドンセットの系統的変動、および／または（ｘｉ）偽翻訳開始部位の単離除去のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６００】
本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、リン酸化糖と連結するＮグリコシド内の窒素性複素環状塩基を指す。ヌクレオチドは、天然塩基、および多種多様な、当該技術分野で認識される修飾塩基を含むと理解される。かかる塩基は一般に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは一般に、塩基、糖、およびリン酸基を含む。リボ核酸（ＲＮＡ）において、糖はリボースであり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）において、糖はデオキシボース、すなわち、リボース内に存在するヒドロキシル基を欠く糖である。例示的な天然窒素性塩基は、プリン、アデノシン（Ａ）およびグアニジン（Ｇ）、ならびにピリミジン、シチジン（Ｃ）およびチミジン（Ｔ）（またはＲＮＡの文脈ではウラシル（Ｕ））を含む。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合される。ヌクレオチドは通常、モノ、ジ、またはトリホスフェートである。ヌクレオチドは、糖、ホスフェート、および／または塩基部分において修飾されていないか、あるいは修飾され得る（また、交換可能に、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、修飾ヌクレオチド、非自然発生のヌクレオチド、および非標準ヌクレオチドとも称される、例えばＷＯ９２／０７０６５およびＷＯ９３／１５１８７を参照されたい）。修飾核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈら（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３−２１９６）によって要約される。
【０６０１】
ヌクレオチドはまた、糖のＣ−５に付着したヒドロキシル基上で起こるエステル化を有する、ヌクレオシドのリン酸エステルとみなされる。本明細書において使用される「ヌクレオシド」という用語は、糖と連結するＮグリコシド内の窒素性複素環状塩基を指す。ヌクレオシドは、天然塩基を含み、また公知の修飾塩基も含むと当該技術分野で認識される。かかる塩基は一般に、ヌクレオシド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオシドは一般に、塩基および糖基を含む。ヌクレオシドは、糖および／または塩基部分において修飾されていないか、あるいは修飾され得る（また、交換可能に、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド誘導体、修飾ヌクレオシド、非自然発生のヌクレオシド、または非標準ヌクレオシドとも称される）。上述のように、修飾核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈら（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３−２１９６）によって要約される。
【０６０２】
ポリヌクレオチドの例示的な例としては、配列番号１〜２４および６０〜６４をコードするポリヌクレオチド、配列番号２５〜５９および６５〜６８のポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０３】
様々な例示的な実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドとしては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシング酵素、融合ポリペプチド、および発現ベクター、ウイルス性ベクター、ならびに本明細書において企図されるポリヌクレオチドを含む移入プラスミドをコードする、ポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０４】
本明細書において使用される「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、以下に定義されるストリンジェントな条件下で、参照配列でハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドで実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語には、１つ以上のヌクレオチドが、付加または欠失され、または修飾される、または異なるヌクレオチドで置き換えられるポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、変異、付加、欠失、および置換を含む、特定の変更が、参照ポリヌクレオチドに行われ得、それによって、変更されたポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することが当該技術分野で十分に理解される。
【０６０５】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズすることは、互いに少なくとも６０％と同一するヌクレオチド配列がハイブリダイズのままである、ハイブリダイゼーションプロトコルを説明する。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特異的な配列に対して熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）である。標的配列が、一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が、平衡状態で占有されている。
【０６０６】
本明細書において使用される「配列同一性」または、例えば、「配列５０％同一性」を含むという記述は、配列が比較ウィンドウ上のヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を指す。故に、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウ上の２つの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列中に生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）中の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じることによって計算し、配列同一性の割合を得ることができる。典型的に、ポリペプチドバリアントが、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する場合に、本明細書に記載の参照配列のうちのいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
【０６０７】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも１２個、しばしば、１５〜１８個、多くの場合、少なくとも２５個のモノマー単位である。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似性がある配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で多様性がある配列を含み得るため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を特定および比較するために、「比較ウィンドウ」上の２つのポリヌクレオチドを比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、配列が同数の連続した位置の参照配列と比較される少なくとも６個の連続した位置、一般的には約５０〜約１００個、より一般的には約１００〜約１５０個の概念セグメントを指す。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアライメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ実装によって、または検査および選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウ上で最も高い割合の相同性を生じること）によって行うことができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されるようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照することができる。配列解析の詳細な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５のユニット１９．３に見出すことができる。
【０６０８】
本明細書において使用される「単離ポリヌクレオチド」は、自然発生の状態でそれに隣接する配列から精製されているポリヌクレオチド、例えば、通常、断片に隣接する配列から除去されているＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、自然界に存在せず、人間の手によって作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または他のポリヌクレオチドを指す。
【０６０９】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、およびエンドプロセシング酵素を含むが、これらに限定されない、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップ、１つ以上のヌクレオチド、およびポリ（Ａ）尾部を含む。
【０６１０】
本明細書において使用される「５’キャップ」または「５’キャップ構造」または「５’キャップ部分」という用語は、ｍＲＮＡの５’末端で組込まれている化学修飾を指す。５’キャップは、核輸送、ｍＲＮＡ安定性、および翻訳に関与する。
【０６１１】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドの間に連結した５’−ｐｐｐ−５’トリホスフェートを含む、５’キャップを含む。次いで、この５’グアニレートキャップは、メチル化され、Ｎ７メチルグアニレート残基を生成する。
【０６１２】
本明細書において企図されるｍＲＮＡポリヌクレオチドの特定の実施形態における使用に好適な５’キャップの例示的な例としては、非メチル化５´キャップ類似体、例えば、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、メチル化５´キャップ類似体、例えば、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、およびｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、ジメチル化５´キャップ類似体、例えば、ｍ２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、およびｍ２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、トリメチル化５´キャップ類似体、例えば、ｍ２，２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ２，２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、およびｍ２，２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、ジメチル化対称性５´キャップ類似体、例えば、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐｍ７（５´）Ｇ、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐｍ７（５´）Ｃ、およびｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐｍ７（５´）Ａ、ならびに抗逆５´キャップ類似体、例えば、抗逆キャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップ（３´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、２´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、２´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、２´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、ｍ７２´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ７２´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、ｍ７２´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、３´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、３´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、ｍ７３´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ７３´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、ｍ７３´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａと呼ばれる）、ならびにそれらのテトラホスフェート誘導体が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照されたい）。
【０６１３】
特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、トリホスフェート架橋を介して、第１の転写ヌクレオチドの５’末端へ連結され、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドを指す）をもたらす、７メチルグアニレート（「ｍ７Ｇ」）である５’キャップを含む。
【０６１４】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップが、キャップ０構造（キャップ０構造が、塩基１および２に付着したリボースの２’−Ｏ−メチル残基を欠く）、キャップ１構造（キャップ１構造が、塩基２において２’−Ｏ−メチル残基を有する）、またはキャップ２構造（キャップ２構造が、塩基２および３の両方に付着した２’−Ｏ−メチル残基を有する）である、５’キャップを含む。
【０６１５】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップを含む。
【０６１６】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含む。
【０６１７】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【０６１８】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、シュードウリジン、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオウリジン、４−チオシュードウリジン、２−チオシュードウリジン、５−ヒドロキシルウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチルウリジン、１−カルボキシメチルシュードウリジン、５−プロピニルウリジン、１−プロピニルシュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチルシュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン、１−タウリノメチル−４−チオウリジン、５−メチルウリジン、１−メチルシュードウリジン、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、２−チオ−１−メチルシュードウリジン、１−メチル−１−デアザシュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザシュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオジヒドロウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオウリジン、４−メトキシシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオシュードウリジン、５−アザシチジン、シュードイソシチジン、３−メチルシチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシルメチルシチジン、１−メチルシュードイソシチジン、ピロロシチジン、ピロロシュードイソシチジン、２−チオシチジン、２−チオ−５−メチルシチジン、４−チオシュードイソシチジン、４−チオ−１−メチルシュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザシュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザシュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザゼブラリン、５−メチルゼブラリン、５−アザ−２−チオゼブラリン、２−チオゼブラリン、２−メトキシシチジン、２−メトキシ−５−メチルシチジン、４−メトキシシュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチルシュードイソシチジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシルイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シスヒドロキシルイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−メトキシアデニン、イノシン、１−メチルイノシン、ウイオシン、ウイブトシン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオグアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザグアノシン、７−メチルグアノシン、６−チオ−７−メチルグアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソグアノシン、７−メチル−８−オキソグアノシン、１−メチル−６−チオグアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオグアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオグアノシンからなる群から選択される、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【０６１９】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、シュードウリジン、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオウリジン、４−チオシュードウリジン、２−チオシュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチルウリジン、１−カルボキシメチルシュードウリジン、５−プロピニルウリジン、１−プロピニルシュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチルシュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオウリジン、５−メチルウリジン、１−メチルシュードウリジン、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、２−チオ−１−メチルシュードウリジン、１−メチル−１−デアザシュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザシュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオジヒドロウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオウリジン、４−メトキシシュードウリジン、および４−メトキシ−２−チオシュードウリジンからなる群から選択される、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【０６２０】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、５−アザシチジン、シュードシチジン、３−メチルシチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチルシュードシチジン、ピロロシチジン、ピロロシュードシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチルシチジン、４−チオシュードシチジン、４−チオ−１−メチルシュードシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザシュードシチジン、１−メチル−１−デアザシュードシチジン、ゼブラリン、５−アザゼブラリン、５−メチルゼブラリン、５−アザ−２−チオゼブラリン、２−チオゼブラリン、２−メトキシシチジン、２−メトキシ−５−メチルシチジン、４−メトキシシュードシチジン、および４−メトキシ−１−メチルシュードシチジンからなる群から選択される、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【０６２１】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シスヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シスヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、および２−メトキシアデニンからなる群から選択される、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【０６２２】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、イノシン、１−メチルイノシン、ウイオシン、ウイブトシン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−８−アザグアノシン、６−チオグアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザグアノシン、７−メチルグアノシン、６−チオ−７−メチルグアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシグアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソグアノシン、７−メチル−８−オキソグアノシン、１−メチル−６−チオグアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオグアノシンおよびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオグアノシンからなる群から選択される、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【０６２３】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のシュードウリジン、１つ以上の５−メチルシトシン、および／または１つ以上の５−メチルシチジンを含む。
【０６２４】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のシュードウリジンを含む。
【０６２５】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上の５−メチルシチジンを含む。
【０６２６】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上の５−メチルシトシンを含む。
【０６２７】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護し、ｍＲＮＡを安定化させ、翻訳を促進させるのを助けるポリ（Ａ）尾部を含む。特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）尾部構造を含む。
【０６２８】
特定の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さは、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または少なくとも約５００個以上のアデニンヌクレオチド、あるいはアデニンヌクレオチドの任意の介在する数である。特定の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さは、少なくとも約１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、または２７５個以上のアデニンヌクレオチドである。
【０６２９】
特定の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さは、約１０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約３００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約５０〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約５０〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約５０〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約３００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約３００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約２５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約２００個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約３００個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、または約２５０〜約３００個のアデニンヌクレオチド、あるいはアデニンヌクレオチドの任意の介在する範囲である。
【０６３０】
ポリヌクレオチドの方向を説明する用語としては、５’（通常は、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチド末端）および３’（通常は、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチド末端）が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向または３’から５’の方向で注記され得る。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについて、５’から３’の鎖は、「センス」、「プラス」、または「コード」鎖と呼ばれ、これは、その配列が、［ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりのＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除いて］プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるからである。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写される鎖である相補的な３’から５’の鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書において使用される「逆方向」という用語は、３’から５’の方向で書かれた５’から３’の配列または５’から３’の方向で書かれた３’から５’の配列を指す。
【０６３１】
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’Ａ  Ｇ  Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  ３’の相補的鎖は、３’Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｇ  Ｔ  Ａ  Ｃ  ５’である。後者の配列は、左に５’末端および右に３’末端を有する逆相補鎖、５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’として書かれることが多い。その逆相補鎖に等しい配列は、回文配列と言われる。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従ってマッチしている、「部分的」であり得る。または、核酸の間に「完璧な」または「完全な」相補性が存在し得る。
【０６３２】
本明細書において使用される「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ＲＮＡを発現し、その後ポリペプチドを発現することができる、ベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的となる遺伝子（複数可）、例えば、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。別の実施形態において、核酸カセットは、１つ以上の発現対照配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および目的となる遺伝子（複数可）、例えば、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要であればタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性のために必要な適切な翻訳後修飾を受け、かつ、適切な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって生物学的活性のために適した区画にトランスロケーションされ得るような位置および配列でベクター内に方向付けられる。好ましくは、カセットは、ベクターへの即座の挿入に適合させたその３’および５’末端を有し、例えば、カセットは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態において、核酸カセットは、遺伝的障害を治療、予防、または改善するために使用される治療遺伝子の配列を含有する。カセットを除去し、単一ユニットとしてプラスミドまたはウイルスベクターに挿入することができる。
【０６３３】
ポリヌクレオチドは、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。本明細書において使用される「目的となるポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において企図される、阻害性ポリヌクレオチドの転写のためのテンプレートとして機能するポリペプチドまたは融合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０６３４】
さらに、本明細書において企図されるように、遺伝子コードの縮重の結果として、ポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードすることができる多くのヌクレオチド配列があることは、当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、いかなる天然遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用における相違により変動するポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび／または霊長類コドン選択に最適化されるポリヌクレオチドは、特定の実施形態で具体的に企図される。一実施形態において、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つ以上の変異の結果として変更される内在性ポリヌクレオチド配列である。
【０６３５】
特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ドナー修復テンプレートを含む。
【０６３６】
特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、または別の阻害性ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない、阻害性ポリヌクレオチドを含む。
【０６３７】
一実施形態において、阻害性ＲＮＡを含むドナー修復テンプレートは、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば、強力な構造的なｐｏｌ  ＩＩＩ、例えば、ヒトまたはマウスＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトおよびマウスＨ１  ＲＮＡプロモーター、またはヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター、または強力な構造的なｐｏｌ  ＩＩプロモーターなどの１つ以上の調節配列を含む。
【０６３８】
コード配列それ自体の長さに関わらず、特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所で開示されるまたは当該技術分野で既知であるように、プロモーターならびに／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、翻訳後応答要素、かつ自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされ得、それにより、それらの全体的な長さが、大幅に変動し得る。したがって、ほとんどのいかなる長さのポリヌクレオチド断片も採用することができ、合計の長さは、好ましくは調製の容易さおよび意図される組換えＤＮＡプロトコルの使用によって制限されることが特定の実施形態で企図される。
【０６３９】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知であり、入手可能な様々な十分に確立された技術のいずれかを使用して、調製、操作、発現、および／または送達され得る。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、適切なベクターに挿入され得る。所望のポリペプチドはまた、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを細胞内に送達することにより、発現され得る。
【０６４０】
ベクターの例示的な例としては、プラスミド、自律的に複製する配列、および置き換え可能な要素、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６４１】
ベクターの追加の例示的な例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６４２】
ベクターとして有用なウイルスの例示的な例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６４３】
発現ベクターの例示的な例としては、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子移入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書において開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためのかかる発現ベクターにライゲーションされ得る。
【０６４４】
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外に維持されるベクターである。本明細書において使用される「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡ内に組込むことなしに、および宿主細胞の分裂により徐々に失われることなく複製することができるベクターを指し、当該ベクターは染色体外またはエピソームで複製することも意味する。
【０６４５】
発現ベクター中に存在する「発現制御配列」、「制御要素」、または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する、複製のベクター起点のそれらの非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ  Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）イントロン、転写後調節要素、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳領域である。かかる要素は、それらの強度および特異性が異なり得る。利用されるベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写および翻訳要素を使用することができる。
【０６４６】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルス性ベクターを含むが、これらに限定されないベクターを含む。ベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの１つ以上の外因性、内因性、または異種制御配列を含み得る。「内在性制御配列」は、ゲノムにおいて所与の遺伝子と自然に連結するものである。「外因性制御配列」は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターにより指向されるように、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技法）により遺伝子と並立に配置されるものである。「異種制御配列」は、遺伝子操作された細胞とは異なる種からの外因性配列である。「合成」制御配列は、もう１つの内在性および／もしくは外因性配列、ならびに／またはインビトロもしくはシリコン内で特定の遺伝子療法のための最適なプロモーターおよび／もしくはエンハンサー活性を提供することが決定された配列の要素を含んでもよい。
【０６４７】
本明細書において使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始および転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞において作動されるプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチな領域を含み、および／または転写の開始から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、式中、Ｎは、任意のヌクレオチドであってよい。
【０６４８】
「エンハンサー」という用語は、転写の増強をもたらすことができる配列を含有し、いくつかの場合には別の制御配列に対するその方向とは独立して機能することができるＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサー要素と協同的または相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方をもたらすことができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
【０６４９】
「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成要素が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列（プロモーター、および／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的となるポリヌクレオチドとの間の機能的連結であって、発現制御配列により、第２の配列に対応する核酸の転写が指向される機能的連結を指す。
【０６５０】
本明細書において使用される「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよく、制限された様々な細胞および組織型をそれぞれ可能にする、「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、または「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。
【０６５１】
特定の実施形態での使用に好適な例示的な遍在発現制御配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルスシリアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルスからのＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、短伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ−短）プロモーター、長伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ−長）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ  ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失した、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８−５５（１９９５））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６５２】
特定の実施形態において、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、細胞系列特異的、または組織特異的な発現を達成するために（例えば、ポリペプチドをコードする特定の核酸を細胞型、細胞系列、または組織のサブセットにおいてのみ、または特定の発生段階に発現させるために）細胞、細胞型、細胞系列、または組織特異的発現制御配列を使用するすることが望ましい場合がある。
【０６５３】
本明細書において使用される「条件発現」は、誘導性発現、抑圧可能な発現、特定の生理学的、生物学的、または疾患の状態を有する細胞または組織における発現などが挙げられるが、これらに限定されない、任意の種類の条件発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を除外することを意図しない。特定の実施形態において、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理もしくは条件、または目的となるポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現の増大または減少を引き起こす処理または条件に供することによって発現が制御される、目的となるポリヌクレオチドの条件発現を提供する。
【０６５４】
誘導性プロモーター／系の例示的な例としては、ステロイド誘導性プロモーター、例えば、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなど（対応するホルモンで処理することによって誘導される）、メタロチオネインプロモーター（種々の重金属で処理することによって誘導される）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導される）、「遺伝子スイッチ」ミフェプリストン調節可能系（Ｓｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６５５】
条件発現はまた、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも１つの（典型的に、２つの）部位（複数可）を含む。本明細書において使用される「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であってよい、１つ以上の組換え部位（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０もしくはそれ以上）が関与する組換え反応に関与する切除的または統合的なタンパク質、酵素、補因子もしくは関連するタンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７（１９９３）を参照されたい）、または変異、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含む融合タンパク質）、それらの断片、およびバリアントを含む。特定の実施形態での使用に好適なリコンビナーゼの例示的な例としては、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられるが、これに限定されない。
【０６５６】
ポリヌクレオチドは、多種多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１つ以上の組換え部位を含んでもよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位が、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組込みのために必要な任意の部位（複数可）に加えたものであることが理解されるべきである。本明細書において使用される「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。
【０６５７】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの組換え部位は、８塩基対コア配列と隣接した２つの１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位としての機能を果たす）を含む３４塩基対の配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ、Ｂ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。他の代表的なｌｏｘＰ部位としては、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｂｅｔｈｋｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６５８】
ＦＬＰリコンビナーゼのために好適な認識部位としては、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、Ｆ４、Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６５９】
認識配列の他の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列であり、これらは、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ−ｃ３１によって認識される。φＣ３１  ＳＳＲは、ヘテロタイプの部位ａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さ３９ｂｐ）の間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ａｔｔＢおよびａｔｔＰは、それぞれ、細菌ゲノムおよびファージゲノムに対するファージインテグラーゼの付着部位に対して名づけられ、どちらも、φＣ３１ホモ二量体が結合する可能性がある不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。産物の部位であるａｔｔＬおよびａｔｔＲは、さらなるφＣ３１媒介性組換えに対して有効に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、それにより反応が不可逆的になる。挿入を触媒するために、ゲノムのａｔｔＰ部位へのａｔｔＢを有するＤＮＡの挿入が、ゲノムのａｔｔＢ部位へのａｔｔＰ部位の挿入よりも容易であることが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。故に、典型的な戦略では、相同組換えによってａｔｔＰを有する「ドッキング部位」を定義済みの遺伝子座に位置付け、次いでそれを挿入のために、ａｔｔＢを有する入ってくる配列とパートナーにする。
【０６６０】
一実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、一対のリコンビナーゼ認識部位に隣接したドナー修復テンプレートポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、修復テンプレートポリヌクレオチドは、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、またはａｔｔ部位によって隣接する。
【０６６１】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の目的となるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断型ポリペプチドをコードする１つ以上のＩＲＥＳ配列またはポリヌクレオチド配列によって分離することができる。
【０６６２】
本明細書において使用される「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＡＴＧなどの開始コドンへのシストロン（タンパク質をコードする領域）の直接内部リボソーム侵入を促進し、それにより、キャップに依存しない遺伝子の翻訳を導く要素を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３）およびＪａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ  １（１０）：９８５−１０００を参照されたい。当業者によって一般に用いられるＩＲＥＳの例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されるものを含む。当該技術分野で既知の「ＩＲＥＳ」のさらなる例としては、ピコルナウイルスから得られるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）およびウイルスまたは細胞ｍＲＮＡ源から得られるＩＲＥＳ、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ、ならびに酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販の脳心筋炎（ｅｎｃｅｐｈｅｌｏｍｙｃａｒｄｉｔｉｓ）ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６（３）：１６０２−９）、およびＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８（１１）：６１７８−９０）が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳはまた、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ種のウイルスゲノム、およびＨＣＶ、Ｆｒｉｅｎｄマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）において報告されている。
【０６６３】
一実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドに使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳである。
【０６６４】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を有し、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書において使用される「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、リボソームの小さなサブユニットに対するｍＲＮＡの初期結合を大幅に促進し、翻訳を増加させる、短ヌクレオチド配列を指す。コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号１０５）であり、式中、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２、およびＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。
【０６６５】
異種核酸転写物の効率的な終止およびポリアデニル化を指向する要素は、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書において使用される「ポリＡ部位」、「ポリＡ配列」、「ポリ（Ａ）部位」、「ポリ（Ａ）配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって発生期のＲＮＡ転写物の終止およびポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリ（Ａ）尾部からコード配列の３’末端の付加によってｍＲＮＡの安定性を促進し、したがって、転写効率の増加に寄与し得る。組換え転写物の効率的なポリアデニル化は、ポリ（Ａ）尾部を欠いている転写物が不安定であり、急速に分解されるため、望ましい。ベクターに使用され得るポリ（Ａ）シグナルの例示的な例には、理想的なポリ（Ａ）配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野で既知である別の好適な異種または内在性ポリＡ配列を含む。
【０６６６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたは細胞は、直接毒性および／または制御されていない増殖のリスクを低減させるために、誘導性自殺遺伝子を含む、自殺遺伝子を用いる。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を含む宿主に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子の特定の例は、カスパーゼ−９またはカスパーゼ−８またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−９は、二量化の特定の活性化された化学誘導物質（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。
【０６６７】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、インビボでネガティブ選択の影響を受けやすい本明細書において企図される遺伝子改変細胞を生じる遺伝子セグメントを含む。「ネガティブ選択」は、個体のインビボでの状態の変化の結果として除去され得る注入された細胞を指す。陰性の選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入から生じ得る。ネガティブ選択遺伝子は、当該技術分野で既知であり、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ）遺伝子；細胞ヒポキサンチンホスフリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、および細菌シトシンデアミナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６６８】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、インビトロでネガティブ選択可能な表現型の細胞の選択を可能にするポジティブマーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含む。ポジティブ選択可能なマーカーは、宿主細胞へ導入されたとき、その遺伝子を有する細胞のポジティブ選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であってもよい。この型の遺伝子は当技術分野で既知であり、ハイグロマイシンＢに対する耐性を与える、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６６９】
一実施形態において、ポジティブ選択可能なマーカーおよびネガティブ選択可能な要素は、ネガティブ選択可能な要素の消失がまた必ず、ポジティブ選択可能なマーカーの消失を伴うように連結される。特定の実施形態において、ポジティブおよびネガティブ選択可能なマーカーは、一方の消失が、義務的に、他方の消失をもたらすように、融合される。発現産物として、上述の所望のポジティブ選択特徴およびネガティブ選択特徴の両方を与えるポリペプチドを生じる融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ・チミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでのポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、およびインビボでのネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を与えるポリペプチドを生じる。優性ポジティブ選択可能なマーカーをネガティブ選択可能なマーカーと融合することに由来する二機能性選択可能な融合遺伝子の使用について記載する、Ｓ．Ｄ．ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴ  ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の刊行物も参照されたい。
【０６７０】
好ましいポジティブ選択可能なマーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましいネガティブ選択可能なマーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ、ＶＺＶ  ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴおよびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来する。特定の実施形態で企図される代表的な二機能性選択可能な融合遺伝子としては、ポジティブ選択可能なマーカーが、ｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、ネガティブ選択可能なマーカーが、シトシンデアミナーゼまたはＴＫ遺伝子または選択可能なマーカーに由来する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６７１】
特定の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシング酵素、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、造血細胞、例えばＴ細胞内に、非ウイルス方法およびウイルス方法の両方によって、導入され得る。特定の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートの送達は、同じ方法によってまたは異なる方法によって、および／または同じベクターもしくは異なるベクターによって提供され得る。
【０６７２】
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指すように本明細書において使用される。移入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結され、例えば、それに挿入される。ベクターは、細胞中に自律複製を指向する配列を含んでもよいか、または宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書において企図される１つ以上のポリヌクレオチドをＴ細胞に送達するために使用される。
【０６７３】
非ウイルスベクターの例示的な例としては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６７４】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法としては、電気穿孔、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ウイロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸共役体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６７５】
本明細書において企図される特定の実施形態での使用に好適なポリヌクレオチド送達系の例示的な例としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃによって提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕら（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０−１８７、およびＢａｌａｚｓら（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１−１２を参照されたい。抗体標的のバクテリア由来の非生存のナノ細胞系送達もまた、特定の実施形態で企図される。
【０６７６】
特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、以下に記載されるように、個々の患者への投与によって、典型的に、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所適用によって、インビボで送達され得る。代替として、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、動員された末梢血、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）などの細胞にエクスビボで、または万能ドナー造血幹細胞に送達し、続いて、患者に細胞を再移植することができる。
【０６７７】
一実施形態において、ヌクレアーゼおよび／またはドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターは、インビボで細胞の伝達のために生物に直接投与される。代替として、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない、血液または組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常用いられる任意の経路による。かかる核酸を投与する好適な方法は、利用可能でかつ当業者に周知であり、１つを超える経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、別の経路よりもさらに即時的かつさらに有効な反応を提供し得る場合が多い。
【０６７８】
本明細書において企図される特定の実施形態での使用に好適なウイルス性ベクター系の例示的な例としては、遺伝子移入のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６７９】
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）で伝達することによって、造血細胞、例えば、Ｔ細胞に導入される。
【０６８０】
ＡＡＶは、小さな（約２６ｎｍ）複製欠損、主に、エピソーム、非エンベロープウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組込み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、典型的に、最低限で、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）からなる。ＩＴＲ配列は、長さが約１４５ｂｐである。２つのＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターは、約４．４ｋＢのペイロード容量を有する。
【０６８１】
自己相補的なｒＡＡＶベクターは、第３のＩＴＲを含有し、本明細書において企図されるポリヌクレオチドに約２．１ｋＢのみを残すベクターの組換え部分の２本鎖を、パッケージする。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ｓｃＡＡＶベクターである。
【０６８２】
ｒＡＡＶ（約９ｋＢ）の約２倍のパッケージ容量である延長されたパッケージ容量は、二重ｒＡＡＶベクター戦略を使用することで達成されている。本明細書において企図されるｒＡＡＶを生成するのに有用な二重ベクター戦略としては、スプライシング（トランススプライシング）、相同組換え（重複）、または２つの組み合わせ（ハイブリッド）が挙げられるが、これらに限定されない。二重ＡＡＶトランススプライシング戦略では、スプライスドナー（ＳＤ）シグナルは、５’ハーフベクターの３’末端に配置され、スプライスアクセプター（ＳＡ）シグナルは、３’ハーフベクターの５’末端に配置される。二重ＡＡＶベクターによる同じ細胞の重感染と２つ半分の逆方向末端反復（ＩＴＲ）媒介頭尾コンカテマー化の際、トランススプライシングは、成熟ｍＲＮＡおよびフルサイズのタンパク質の生成をもたらす（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。トランススプライシングは、筋肉および網膜内の大型遺伝子を発現するのに順調に使用された（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２００３、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。代替として、二重ＡＡＶベクター内に含有される２つの半分の大型導入遺伝子発現カセットは、相同組換えによる単一の大型ゲノムの再構成を媒介するであろう相同重複配列（５’ハーフベクターの３’末端および３’ハーフベクターの５’末端での二重ＡＡＶ重複）を含有し得る（Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。この戦略は、配列を重複する導入遺伝子の組換え誘導特性に依存する（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。第３の二重ＡＡＶ戦略（ハイブリッド）は、外因性遺伝子（すなわち、アルカリホスファターゼ；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ，２００８、Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１１））からのトランススプライシングベクターへの高度な組換え誘導領域の付加に基づく付加された領域は、二重ＡＡＶ間の組換えを増加させるために、５’ハーフベクターＳＤシグナルの下流および３’ハーフベクターＳＡシグナルの上流に配置される。
【０６８３】
「ハイブリッドＡＡＶ」、「ハイブリッドｒＡＡＶ」、「キメラＡＡＶ」、または「キメラｒＡＡＶ」は、異なるＡＡＶ血清型のカプシド（好ましくは、１つ以上のＡＡＶ  ＩＴＲからの異なる血清型のもの）とともにパッケージされたｒＡＡＶゲノムを指し、別様にシュードタイプｒＡＡＶと称される場合がある。例えば、ｒＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６型ゲノムは、ＡＡＶカプシドおよび遺伝子（好ましくは、１つ以上のＡＡＶ  ＩＴＲ）が異なる血清型であるという条件で、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは１６の型カプシド、またはそのバリアント内にカプシド形成され得る。特定の実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ粒子は、「ｘ／ｙ」型であるとして称される場合があり、「ｘ」はＩＴＲの源を示し、「ｙ」はカプシドの血清型を示し、例えば２／５ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ２からのＩＴＲおよびＡＡＶ６からのカプシドを有する。
【０６８４】
特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、またはＡＡＶ１６から単離される、ＩＴＲおよびカプシド配列を含む。
【０６８５】
いくつかの実施形態において、キメラｒＡＡＶが使用され、ＩＴＲ配列は、１つのＡＡＶ血清型から単離され、カプシド配列は、異なるＡＡＶ血清型から単離される。例えば、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来するカプシド配列を有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と称される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からのＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のうちの任意の１つからのカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来するカプシド配列を含む。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ２に由来するカプシド配列を含む。
【０６８６】
いくつかの実施形態において、遺伝子操作および選択方法を、ＡＡＶカプシドに適用して、それらを目的となる細胞を伝達する可能性を高くする。
【０６８７】
ｒＡＡＶベクターの構築、産生、およびその精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号、同第９，１６９，４９２号、同第９，０１２，２２４号、同第８，８８９，６４１号、同第８，８０９，０５８号および、同第８，７８４，７９９号に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【０６８８】
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含むレトロウイルス、例えばレンチウイルスで伝達することによって、造血細胞に導入される。
【０６８９】
本明細書において使用される「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖２本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合するＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態における使用に好適な例示的なレトロウイルスとしては、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、Ｆｒｉｅｎｄマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））およびレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６９０】
本明細書において使用される「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または族）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列要素）が、好ましい。
【０６９１】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、本明細書の他の箇所で論じられるように、１つ以上のＬＴＲ、および以下のアクセサリー要素、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、プシー（Ψ）パッケージングシグナル、輸出要素、ポリ（Ａ）配列のうちの１つ以上または全てを含み、任意に、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、絶縁体要素、選択可能なマーカー、および細胞自殺遺伝子を含み得る。
【０６９２】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、組込みまたは非組込みまたは組込み欠損レンチウイルスであり得る。本明細書において使用される「組込み欠損レンチウイルス」または「ＩＤＬＶ」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組込む能力を欠いているインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組込み−インコンピテントウイルスベクターは、特許出願ＷＯ２００６／０１０８３４に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【０６９３】
インテグラーゼ活性を低減させるために好適なＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子における例示的な変異としては、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、およびＫ２６４Ｈが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６９４】
一実施形態において、ＨＩＶ−１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１５２Ｇ、もしくはＥ１５２Ａ変異、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、およびＥ１５２Ｇ変異、またはＤ６４Ｖ、Ｄ１１６Ａ、およびＥ１５２Ａ変異を含む。
【０６９５】
一実施形態において、ＨＩＶ−１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ変異を含む。
【０６９６】
「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、それらの天然の配列の状況では、直接反復であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を含有する、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指す。
【０６９７】
本明細書において使用される「ＦＬＡＰ要素」または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、配列が、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の中央ポリプリン区域および中央終止配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。好適なＦＬＡＰ要素は、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕら、２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴおよび／またはＣＴＳ要素に１つ以上の変異を有するＦＬＡＰ要素を含有する。さらに別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴまたはＣＴＳ要素のいずれかを含む。さらに別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴまたはＣＴＳ要素を含まない。
【０６９８】
本明細書において使用される「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子へのウイルスＲＮＡの挿入に必要とされるレトロウイルスゲノム内に位置するプシー［Ψ］配列を指し、例えば、Ｃｌｅｖｅｒら、１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。
【０６９９】
「輸送要素」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節要素を指す。ＲＮＡ輸送要素の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ５８：４２３を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７００】
特定の実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節要素、効率的なポリアデニル化部位、および任意に、転写終止シグナルをベクターに組込むことによって増大する。様々な転写後調節要素は、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節要素（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：３８６４）；および同様のもの（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）タンパク質における異種核酸の発現が増大し得る。
【０７０１】
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲの改変の結果としていくつかの安全性の増強を含有する。「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、例えば、１回目のウイルス複製を越えてウイルスが転写されることを防ぐために、Ｕ３領域として公知の右側の（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が改変された（例えば、欠失または置換によって）複製欠損性ベクターを指す。追加の安全性の増強は、ウイルス粒子の産生時にウイルスゲノムの転写を駆動させるために、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換えることによって提供される。使用することができる異種プロモーターの例は、例えば、ウイルスサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、早期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター。
【０７０２】
本明細書において使用される「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を保有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧ−タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングすることができ、これにより、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）は通常ウイルスをＣＤ４＜７７９２＞＋＜／７７９２＞提示細胞に標的化するため、ＨＩＶがより広い範囲の細胞に感染することが可能になる。
【０７０３】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、既知の方法に従って産生される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、ＫｕｔｎｅｒらＮａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
【０７０４】
本明細書において企図される特定の具体的な実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のほとんどまたは全てが、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび／またはレンチウイルス配列の多くの異なる源を用いることができるか、または特定のレンチウイルス配列の組み合わせられたおよび多数の置換および変更を、移入ベクターの本明細書に記載の機能を行う能力を損なうことなく適応させることができることが理解されるべきである。さらに、様々なレンチウイルスベクターが、当該技術分野で既知であり、Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６ａ、１９９６ｂ、および１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）、Ｄｕｌｌら、１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照されたく、これらの多くは、本明細書において企図されるウイルスベクターまたは移入プラスミドを生成するために適合され得る。
【０７０５】
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで伝達することによって、造血細胞に導入される。
【０７０６】
アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において極めて高い伝達効率が可能であり、細胞分裂を必要しない。かかるベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に生成することができる。ほとんどのアデノウイルスベクターが、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように遺伝子操作され、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増幅する。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見出されるものなどの非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで伝達することができる。従来のＡｄベクターは、高い輸送能力を有する。
【０７０７】
複製欠損である現行のアデノウイルスベクターの作製および増殖は、Ａｄ５  ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎臓細胞から形質転換されて、Ｅ１タンパク質を構造的に発現する２９３と呼ばれる特有のヘルパー細胞株を利用し得る（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムから可欠であるため（Ｊｏｎｅｓ＆Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、現行のアデノウイルスベクターは２９３細胞を利用して、Ｅ１、Ｄ３、または両方の領域のいずれかに外来ＤＮＡを運搬する（Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核性遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ＆Ｈｏｒｗｉｔｚ、１９９２、Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）に使用されている。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与した研究には、気管点滴（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、末梢静脈内注入（Ｈｅｒｚ＆Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳内への定位接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）が含まれる。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。
【０７０８】
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペスウイルス、例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２で伝達することによって、造血細胞に導入される。
【０７０９】
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである直鎖２本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを含むエンベロープで覆われた二十面体カプシドからなる。一実施形態において、ＨＳＶベースのウイルスベクターは、１つ以上の必須または非必須ＨＳＶ遺伝子において欠損している。一実施形態において、ＨＳＶベースのウイルスベクターは、複製欠損である。ほとんどの複製欠損  ＨＳＶベクターは、複製を防止するために１つ以上の最初期、早期、または後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含む。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子において欠損され得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期間のＤＮＡ発現をもたらすことができる潜伏期に入る能力、および最大２５ｋｂの外因性ＤＮＡを収容することができるその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶベースのベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、および同第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願ＷＯ９１／０２７８８、ＷＯ９６／０４３９４、ＷＯ９８／１５６３７、およびＷＯ９９／０６５８３において記載されており、これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組込まれる。
【０７１０】
Ｈ．ゲノム編集細胞
特定の実施形態において企図される方法によって製造されたゲノム編集細胞は、ＰＤ−１遺伝子内に１つ以上の遺伝子編集を含み、癌、ＧＶＨＤ、感染疾患、自己免疫疾患、免疫不全またはそれらと関連する病態のうち、少なくとも１つの症状の防止、治療、または改善に対する、細胞ベースの治療の改善を提供する。いかなる特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、本明細書において企図される組成物および方法は、部分的に、治療用細胞を、免疫抑制シグナルおよび疲弊に対してより耐性にすることで、養子細胞療法の有効性を増加させると考えられる。
【０７１１】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集細胞は、自己移植／自家（「自己（ｓｅｌｆ）」）または非自己移植（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であり得る。本明細書において使用される、「自己移植」は、同じ対象からの細胞を指す。本明細書において使用される「自家」は、相対的に遺伝的に細胞とは異なる同じ種の細胞を指す。本明細書において使用される「同系」は、相対的に遺伝的に細胞と同一である異なる対照の細胞を指す。本明細書において使用される「異種」は、相対的に細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物対象から得られる。より好ましい実施形態において、細胞は、霊長類対象、任意に非ヒト霊長類から得られる。最も好ましい実施形態において、細胞は、ヒト対象から得られる。
【０７１２】
「単離された細胞」は、インビボ組織または臓器から得られたもので、細胞外基質を実質的に含まない、非自然発生細胞、例えば、自然界に存在しない細胞、修飾細胞、遺伝子操作された細胞、組換え細胞などを指す。
【０７１３】
本明細書において使用される「細胞の集団」という用語は、本明細書の他の箇所に記載される、同種または異種の細胞型の任意の数および／または組み合わせからなり得る複数の細胞を指す。例えば、Ｔ細胞の伝達のために、細胞の集団は、末梢血から単離されるか、あるいはそれから得られる場合がある。細胞の集団は、編集される標的細胞型の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％をなし得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、既知の方法を使用して異種の細胞の集団から単離されるか、あるいは精製され得る。
【０７１４】
本明細書において企図される組成物および方法を使用してゲノムが編集され得る細胞型の例示的な例としては、細胞株、一次細胞、幹細胞、前駆体細胞、および分化細胞、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７１５】
好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物および方法は、造血細胞、より好ましくは免疫細胞、およびさらにより好ましくはＴ細胞を編集するのに使用され得る。
【０７１６】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野で認識されており、胸腺細胞、免疫エフェクター細胞、調節性Ｔ細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことを意図する。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、すなわちＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ、すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。一実施形態において、Ｔ細胞は、免疫エフェクター細胞である。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＮＫＴ細胞である。特定の実施形態において使用するのに好適なＴ細胞の他の例示的な集団には、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞が含まれる。
【０７１７】
様々な実施形態において、ゲノム編集細胞は、本明細書において企図される組成物および方法によって編集されるＰＤ−１遺伝子を含む免疫エフェクター細胞を含む。「免疫エフェクター細胞」は、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。特定の実施形態で企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、すなわちＣＤ４＋Ｔ細胞）である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。
【０７１８】
「強力なＴ細胞」および「幼若Ｔ細胞」は、特定の実施形態において交換可能に使用され、Ｔ細胞が増殖と同時に分化の減少が可能であるＴ細胞表現型を指す。特定の実施形態において、幼若Ｔ細胞は、「ナイーブＴ細胞」の表現型を有する。特定の実施形態において、幼若Ｔ細胞は、以下の生物学的マーカー、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの１つ以上、または全てを含む。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、次の生物学的マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの１つ以上、または全てを含む。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、およびＬＡＧ３の発現を欠く。
【０７１９】
Ｔ細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題（ｉｓｓｕｅ）、感染部位由来組織、復水、胸水、脾臓組織、および腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない、多くの源から得られ得る。
【０７２０】
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む細胞の集団は、編集がＮＨＥＪによって修復されるＤＳＢである、編集ＰＤ−１遺伝子を含む。特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞は、編集がＮＨＥＪによって修復されるＤＳＢである、編集ＰＤ−１遺伝子を含む。特定の実施形態において、編集は、ＰＤ−１遺伝子のコード配列内の、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン５、エクソン１、もしくはエクソン２内、より好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン５内の配列番号２５（もしくは配列番号２７）、ＰＤ−１遺伝子のエクソン１内の配列番号３０（もしくは配列番号３２）、またはＰＤ−１遺伝子のエクソン２内の配列番号３５（もしくは配列番号３７）での、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４  １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個以上のヌクレオチドの挿入または欠失（ＩＮＤＥＬ）である。
【０７２１】
特定の実施形態において、編集は、ＰＤ−１遺伝子のコード配列内の、好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン５、エクソン１、もしくはエクソン２内、より好ましくはＰＤ−１遺伝子のエクソン５内の配列番号２５（もしくは配列番号２７）、ＰＤ−１遺伝子のエクソン１内の配列番号３０（もしくは配列番号３２）、またはＰＤ−１遺伝子のエクソン２内の配列番号３５（もしくは配列番号３７）での、約＋１、−１、−２、−３、または−４個のヌクレオチドの欠失である。
【０７２２】
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む細胞の集団は、ＨＤＲによって修復されたＤＳＢにおいて組込まれたドナー修復テンプレートを含む、編集ＰＤ−１遺伝子を含む。
【０７２３】
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む細胞の集団は、ＰＤ−１遺伝子またはその部分を含むドナー修復テンプレートを含む、編集ＰＤ−１遺伝子を含み、１つ以上の変異をゲノムＰＤ−１配列に導入し、ＰＤ−１発現またはシグナル伝達を修飾するように、好ましくはＰＤ−１発現および／またはシグナル伝達を減少あるいは排除するように設計される。
【０７２４】
様々な実施形態において、ゲノム編集細胞は、ＰＤ−１遺伝子内に編集を含み、さらにＰＤ−１フリップ受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子をコードするポリヌクレオチド、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＴＮＦ−α）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、およびＲＡＮＴＥＳ）、細胞毒素（例えば、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢ）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、およびＩＬ−２１受容体）、または遺伝子操作された抗原受容体（例えば、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体、もしくはその構成要素、もしくはキメラサイトカイン受容体）を含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドおよびヌクレアーゼバリアントを含むドナー修復テンプレートは、細胞内に導入され、ポリヌクレオチドはＨＤＲ修復によってＰＤ−１遺伝子内のＤＳＢ部位の細胞のゲノム内に組込まれる。ポリヌクレオチドは、ＰＤ−１遺伝子以外の部位の細胞内に、例えば、細胞をポリヌクレオチドを含むベクターを用いて伝達することで、導入され得る。
【０７２５】
Ｉ．組成物および製剤
特定の実施形態において企図される組成物は、本明細書において企図される、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、ならびにゲノム編集組成物およびゲノム編集細胞組成物を含み得る。特定の実施形態において企図される、ゲノム編集組成物および方法は、細胞または細胞の集団内のヒトプログラム細胞死１（ＰＤ−１）遺伝子内の標的部位を編集するのに有用である。好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物は、造血細胞、例えば、Ｔ細胞または免疫エフェクター細胞内のＰＤ−１遺伝子を編集するのに使用される。
【０７２６】
様々な実施形態において、本明細書において企図される組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および任意選択でエンドプロセシング酵素、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ（Ｔｒｅｘ２）を含む。ヌクレアーゼバリアントは、先に開示されるポリヌクレオチド送達方法、例えば電気穿孔、脂質ナノ粒子などを介して細胞内に導入される、ｍＲＮＡの形態であり得る。一実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡ、および任意選択で３’−５’エキソヌクレアーゼを含む組成物は、先に開示されるポリヌクレオチド送達方法を介して細胞に導入される。組成物は、エラーの起こりやすいＮＨＥＪによって、ゲノム編集細胞またはゲノム編集細胞の集団を生成するために使用され得る。
【０７２７】
様々な実施形態において、本明細書において企図される組成物は、ドナー修復テンプレートを含む。組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および任意選択でエンドプロセシング酵素を発現するか、あるいは発現するであろう細胞に送達され得る。一実施形態において、組成物は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、および任意選択で３’−５’エキソヌクレアーゼを発現するか、あるいは発現するであろう細胞に送達され得る。ドナー修復テンプレートの存在下での遺伝子編集酵素の発現は、ＨＤＲによりゲノム編集細胞またはゲノム編集細胞の集団を生成するために使用され得る。
【０７２８】
特定の実施形態において本明細書において企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、および任意選択でドナー修復テンプレートを含む。特定の実施形態において本明細書において企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、エンドプロセシング酵素、および任意選択でドナー修復テンプレートを含む。ヌクレアーゼバリアントおよび／またはエンドプロセシング酵素は、先に開示されるポリヌクレオチド送達方法を介して細胞内に導入される、ｍＲＮＡの形態であり得る。
【０７２９】
特定の実施形態において本明細書において企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および任意選択でドナー修復テンプレートを含む。特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、３’−５’エキソヌクレアーゼ、および任意選択でドナー修復テンプレートを含む。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および／または３’−５’エキソヌクレアーゼは、先に開示されるポリヌクレオチド送達方法を介して細胞内に導入される、ｍＲＮＡの形態であり得る。
【０７３０】
特定の実施形態において、細胞の集団は、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞である。
【０７３１】
組成物としては、薬学的組成物が挙げられるが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独でまたは療法の１つ以上の他のモダリティと組み合わせて、細胞または動物への投与のために、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液中に製剤化される組成物を指す。必要に応じて、組成物が、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法薬プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤などの他の薬剤と組み合わせて投与することができることも理解されよう。組成物に含めることができる他の構成成分に対する限定は、追加の薬剤が、組成物に悪影響を及ぼさないのであれば、実質的に存在しない。
【０７３２】
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、または妥当な利益／リスク比に釣り合った他の問題もしくは合併症などを伴うことなく、ヒトおよび動物の組織との接触での使用に好適である、これらに組成物、材料、組成物、および／または剤形を指すように本明細書で使用される。
【０７３３】
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療用細胞とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的な担体の例示的な例は、細胞培養培地、水、およびピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物または合成由来のものを含む、油などの無菌液体であり得る。食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、特に注射可能な溶液のために、液体担体として用いられる。特定の実施形態における好適な薬学的な賦形剤としては、スターチ、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。あらゆる従来の培地または薬剤も、活性材料と適合しない範囲を除いて、治療用組成物におけるその使用が企図される。補充性活性材料はまた、組成物内に組込まれ得る。
【０７３４】
一実施形態において、薬学的に許容される担体を含む組成物は、対象への投与に好適である。特定の実施形態において、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される担体を含む組成物は、脳室内、脊髄内、またはくも膜下腔内投与に好適である。薬学的に許容される担体は、無菌水性溶液、細胞培養培地、または分散剤を含む。薬学的に活性な物質へのかかる培地および薬剤の使用は、当該技術分野で公知である。あらゆる従来の培地または薬剤も、伝達細胞と適合しない範囲を除いて、薬学的組成物におけるその使用が企図される。
【０７３５】
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、遺伝子改変されたＴ細胞および薬学的に許容される担体を含む。本明細書において企図される細胞ベースの組成物を含む組成物は、腸内、または非経口投与方法、または所望の治療目標に影響するのに好適な化合物との組み合わせによって別個に投与され得る。
【０７３６】
薬学的に許容される担体は、それを治療されるヒト対象への投与に好適にさせるのに、十分に高い純度および十分に低い毒性でなければならない。さらに、それは、組成物の安定性を維持および増加するべきである。薬学的に許容される担体は、液体または固体であり得、組成物の他の構成要素と組み合わせる場合、投与を念頭において計画的に選択され、所望の大きさ、一貫性を提供する。例えば、薬学的に許容される担体は、結合剤（例えば、アルファ化コーンスターチ、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、増量剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩類、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、スターチ、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）であり得、これらに限定されない。本明細書において企図される組成物への他の好適な薬学的に許容される担体としては、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７３７】
かかる担体溶液はまた、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤を含有し得る。本明細書において使用される「緩衝液」という用語は、化学組成がｐＨの顕著な変化なしに酸または塩基を中和する、溶液または液体を指す。本明細書において企図される緩衝液の例としては、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リンガー溶液、水中での５％のデキストロース（Ｄ５Ｗ）、通常／生理食塩水（０．９％のＮａＣｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７３８】
薬学的に許容される担体は、約７の組成物のｐＨを維持するのに十分な量で存在し得る。代替として、組成物は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨ、例えば６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、および７．４を有する。さらに別の実施形態において、組成物は、約７．４のｐＨを有する。
【０７３９】
本明細書において企図される組成物は、非毒性の薬学的に許容される培地を含む。組成物は、懸濁液であり得る。本明細書において使用される「懸濁液」という用語は、細胞が固相担体に付着していない非粘着性状態を指す。例えば、懸濁液として維持される細胞は、かき混されるか、撹拌され得、培養ディッシュなどの担体には粘着しない。
【０７４０】
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、懸濁液内で製剤化され、ゲノム編集Ｔ細胞は、点滴用バッグの中で、許容される液体培地また溶液、例えば、生理食塩水または無血清培地内で拡散される。許容される希釈剤としては、水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、リンガー溶液、等張性塩化ナトリウム（食塩水）溶液、無血清培養培地、および極低温記憶装置に好適な培地、例えばＣｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）培地が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７４１】
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、ヒトまたは動物由来の天然タンパク質を実質的に含まず、ゲノム編集Ｔ細胞の集団を含む組成物を保存するのに好適である。治療用組成物は、ヒト患者内に投与されることが意図され、したがって、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、およびウシ胎児血清などの細胞培養組成物を実質的に含まない。
【０７４２】
いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地内で製剤化される。かかる組成物は、ヒト対象への投与のために好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清培地である。
【０７４３】
無血清培地は、簡易化およびより良好な定義された組成物、低減された度合いの汚染物質、感染剤の潜在源の除外、ならびにより低い費用を含む、血清含有培地にわたっていくらかの利点を有する。種々の実施形態において、無血清培地は、動物質を含まず、任意選択で、タンパク質を含み得ない。任意選択で、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含有し得る。「動物質を含まない」培地は、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中の天然動物タンパク質に置き換え、栄養素は、合成、植物、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は、タンパク質を実質的に含まないと定義される。
【０７４４】
特定の組成物中に使用される無血清培地の例示的な例としては、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＸ−ＶＩＶＯ  １０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７４５】
好ましい実施形態において、ゲノム編集Ｔ細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ内で製剤化される。
【０７４６】
様々な実施形態において、ゲノム編集Ｔ細胞を含む組成物は、凍結保存培地内で製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地は、解凍後に、高い細胞生存率の結果を維持するために使用され得る。特定の組成物中に使用された凍結保存培地の例示的な例としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７４７】
一実施形態において、組成物は、５０：５０のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ対ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０を含む、溶液内で製剤化される。
【０７４８】
特定の実施形態において、組成物は、実質的にマイコプラズマ、内毒素、および微生物汚染を実質的に含まない。内毒素に関して「実質的に含まない」ということは、細胞の用量毎に、ＦＤＡによって生物学のために許容されるよりも少ない内毒素（平均の７０ｋｇの人が、細胞の総用量当たり３５０ＥＵであるのに対し、１日当たり５ＥＵ／ｋｇ体重量の総内毒素）を含むことを意味する。特定の実施形態において、本明細書において企図されるレトロウイルスベクターとともに伝達された造血幹細胞または前駆体細胞は、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬ、または約０．５ＥＵ／ｍＬ、１．０ＥＵ／ｍＬ、１．５ＥＵ／ｍＬ、２．０ＥＵ／ｍＬ、２．５ＥＵ／ｍＬ、３．０ＥＵ／ｍＬ、３．５ＥＵ／ｍＬ、４．０ＥＵ／ｍＬ、４．５ＥＵ／ｍＬ，、もしくは５．０ＥＵ／ｍＬを含有する。
【０７４９】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドの送達に好適な組成物および製剤は、１つ以上の再プログラムされたヌクレアーゼをコードする１つ以上のｍＲＮＡ、および任意選択でエンドプロセシング酵素を含むが、これらに限定されないことが企図される。
【０７５０】
エクスビボでの送達のための例示的な製剤は、リン酸カルシウム電気穿孔、熱ショックおよび様々なリポソーム製剤（すなわち、脂質媒介トランスフェクション）などの、当該技術分野で既知の様々なトランスフェクション剤を含む。以下により詳細に記載されるリポソームは、水性液体の断片を封入する脂質二層である。ＤＮＡは、自発的に、カチオン性リポソームの外部表面に関与し（その電荷のため）、これらのリポソームは、細胞膜と相互作用するであろう。
【０７５１】
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体溶液の製剤化は、例えば、腸内および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、心室内、大脳内、頭蓋内、脊髄内、髄腔内、および骨髄内の投与および製剤を含む様々な治療レジメンにおいて、本明細書において記載される特定の組成物を使用するための好適な投与および治療レジメンの開発であるとして、当業者に周知である。本明細書において企図される特定の実施形態は、医薬技術分野で公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ  ａｎｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ．２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｏｙｄ  Ｖ．Ａｌｌｅｎ  Ｊｒ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ；２０１２（参照によりその全体が本明細書に組込まれる）に記載されるものなどの、他の製剤を含み得ることが当業者に理解されるであろう。
【０７５２】
Ｊ．ゲノム編集細胞療法
本明細書において企図される組成物および方法により製造されたゲノム編集細胞は、癌、ＧＶＨＤ、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全のうち少なくとも１つの症状の防止、治療、または改善における使用のための薬剤産生物の改善を提供する。本明細書において使用される「薬剤産生物」は、本明細書において企図される組成物おより方法を使用して産生された、遺伝子改変された細胞を指す。特定の実施形態において、薬剤産生物は、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む。さらに、特定の実施形態において企図されるゲノム編集Ｔ細胞は、それらがＴ細胞疲弊に対して耐性であり、療法の持続につながり得る腫瘍微小環境内での耐久性および持続性の増加を提示するため、より安全かつより効果的な養子細胞療法を提供する。
【０７５３】
特定の実施形態において、編集ＰＤ−１遺伝子を含む、ゲノム編集免疫エフェクター細胞またはＴ細胞の有効量は、癌、ＧＶＨＤ、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全のうち少なくとも１つの症状を予防、治療、または改善するために対象に投与される。
【０７５４】
特定の実施形態において、ＰＤ−１編集細胞は、実質的にＰＤ−１を発現しないか、あるいはその発現を欠き、したがって、Ｔ細胞疲弊を増加させ、炎症誘発性サイトカインの発現を阻害する能力を欠く。特定の実施形態において、ＰＤ−１を欠くゲノム編集免疫エフェクター細胞は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルにより耐性であり、持続性およびＴ細胞疲弊への耐性の増加を提示する。
【０７５５】
特定の実施形態において、癌のうちの少なくとも１つの症状を予防、治療、または改善する方法は、対象に、編集ＰＤ−１遺伝子、および細胞を腫瘍もしくは癌へ再指向させる遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、もしくはＤａｒｉｃ、または他の治療導入遺伝子を含む、ゲノム編集免疫エフェクター細胞またはＴ細胞の有効量を投与することを含む。遺伝子改変された細胞は、細胞が、ＰＤ−１遺伝子を改変し、ＰＤ−１発現を減少または排除する力により、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルに対してより耐性であるため、より耐久性および持続性のある薬剤産生物である。
【０７５６】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、固形腫瘍または癌の治療で使用される。
【０７５７】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集細胞は、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織肉腫、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、頭頸部癌、血管芽細胞腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼内黒色腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽細胞腫、髄膜腫、黒色腫、メルケル細胞癌、正中線管癌、口腔癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口腔癌、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌腫、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、膣癌、外陰癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない、固形腫瘍または癌の治療で使用される。
【０７５８】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集細胞は、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない、固形腫瘍または癌の治療で使用される。
【０７５９】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された細胞は、膵臓、膀胱、および肺が挙げられるが、これらに限定されない、様々な癌の治療で使用される。
【０７６０】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集細胞は、液体癌または血液癌の治療で使用される。
【０７６１】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された細胞は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療で使用される。
【０７６２】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集細胞は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞性白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽細胞性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない、液体癌の治療で使用される。
【０７６３】
本明細書において企図されるゲノム編集方法における使用のための好ましい細胞は、自己移植／自家（「自己（ｓｅｌｆ）」）細胞、好ましくは造血細胞、より好ましくはＴ細胞、より好ましくは免疫エフェクター細胞またはＴｒｅｇ細胞を含む。
【０７６４】
特定の実施形態において、有効上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集細胞またはそれを含む組成物を、単独でまたは１つ以上の治療剤と組み合わせてそれを必要とする患者に投与することを含む方法が、提供される。特定の実施形態において、細胞は、癌、ＧＶＨＤ、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全を発症するリスクがある患者の治療に使用される。したがって、特定の実施形態は、治療上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全のうち少なくとも１つの症状の治療または予防または改善を含む。
【０７６５】
一実施形態において、治療を必要とする対象における癌、ＧＶＨＤ、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全を治療する方法は、有効量、例えば、治療上有効量の、本明細書において企図されるゲノム編集細胞を含む組成物を投与することを含む。投与の量および頻度は、適切な投与量が臨床試験によって決定され得るが、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度のような因子によって決定されよう。
【０７６６】
ある例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集細胞の有効量は、細胞の全ての介在する用量を含む、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０６細胞／ｋｇ、または少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇ以上である。
【０７６７】
別の例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集細胞の有効量は、細胞の全ての介在する用量を含む、約２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、または約１０×１０６細胞／ｋｇ以上である。
【０７６８】
別の例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集細胞の有効量は、細胞の全ての介在する用量を含む、約２×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、または６×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇである。
【０７６９】
当業者は、特定の実施形態で企図される組成物の複数回投与が所望の療法に影響を及ぼすために必要とされ得ることを認識するであろう。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、１年間、２年間、５年間、１０年間、またはそれ以上の間にわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回またはそれ以上投与され得る。
【０７７０】
特定の実施形態において、活性化されたＴ細胞を対象に投与し、その後、再採血し（またはアフェレーシスを実施し）、その血液からＴ細胞を活性化し、患者にこれらの活性化し、増大させたＴ細胞を再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回行うことができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃもしくはそれ以上採血から活性化される。理論に拘束されるものではないが、この複数の採血／複数の再注入プロトコルを使用することは、ある特定のＴ細胞の集団を選択するのに役立ち得る。
【０７７１】
特定の実施形態において企図される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋め込み、または移植によるものを含む、任意の都合のよい様式で行うことができる。好ましい実施形態において、組成物は、非経口に投与される。本明細書において使用される「非経口投与」および「非経口に投与される」という語句は、経腸および局所投与以外の投与形式、通常は注射によるものを指し、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内への注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書で企図される組成物は、対象に、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射することによって投与する。
【０７７２】
一実施形態において、癌と診断された対象を治療する方法は、対象から免疫エフェクター細胞を取り出すことと、当該免疫エフェクター細胞のゲノムを編集することと、ゲノム編集免疫エフェクター細胞の集団を生成することと、ゲノム編集免疫エフェクター細胞の集団を同じ対象に投与することと、を含む。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
【０７７３】
特定の実施形態において企図される細胞組成物を投与するための方法は、エクスビボでゲノム編集免疫エフェクター細胞の再導入、または対象に導入されると、成熟免疫エフェクター細胞に分化する、免疫エフェクター細胞のゲノム編集前駆体の再導入をもたらすために有効な任意の方法を含む。１つの方法は、エクスビボにおいて末梢血Ｔ細胞をゲノム編集し、伝達された細胞を対象に戻すことを含む。
【０７７４】
本明細書において引用される刊行物、特許出願、および発行特許は全て、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許のそれぞれが参照により組込まれることが具体的にかつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組込まれる。
【０７７５】
前述の実施形態は、明瞭な理解のために図解および実施例により少し詳細に記載されているが、本明細書において企図される教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変化および改変を成すことができることが当業者には容易に明らかになろう。以下の実施例は、単に例示として提供され、限定としては提供されない。基本的に同様の結果を得るために変化または改変され得る種々の重大でないパラメータは当業者には容易に認識されよう。
【実施例】
【０７７６】
実施例１
プログラム死受容体１（ＰＤ−１）遺伝子内の細胞内シグナル伝達モチーフを破壊するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ
ＰＤ−１は、抗原受容体刺激および活性に続いて、Ｔ細胞プラズマ膜上で発現される。ＰＤ−１は、単一のペプチド、細胞外ＩｇＶ様ドメイン、膜貫通スパンニングドメイン、ならびに免疫受容体抑制性チロシン依存性モチーフ（ＩＴＩＭ、コンセンサス配列Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ）および免疫受容体スイッチチロシン依存性モチーフ（ＩＴＳＭ、コンセンサス配列ＴｘＹｘｘＶ／Ｉ）の両方を含有する細胞内尾部を含む。図１Ａ．ＰＤ−１  ＩＴＳＭ内のアミノ酸２４８位でのチロシンは、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ（ＳＨＰ２、Ｃｈｅｍｎｉｔｚ  ＪＭ  ｅｔ．ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４  Ｊｕｌ  １５；１７３（２）：９４５−５４．を参照されたい）のための結合基質を構築することで、Ｔ細胞活性と同時にＰＤ−Ｌ１／２リガンド結合の際に、リン酸化される。プラズマ膜へのＳＨＰ２の動員は、Ｔ細胞内のホスホチロシンによって駆動された活性シグナル（Ｙｏｋｏｓｕｋａ  Ｔ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ”Ｍｅｄ．”２０１２  Ｊｕｎ  ４；２０９（６）：１２０１−１７）に対抗し、Ｔ細胞活性状態の期間を抑制する。
リン酸化されたＩＴＳＭチロシンのためのコドンは、標準的Ｉ−ＯｎｕＩ「中央４」切断モチーフ、ＡＴＡＣによって包含される。図１Ｂ．２２ｂｐ標的配列（配列番号２５）（ＰＤ−１遺伝子のエクソン５内のこの中央４モチーフ上の中央に位置する）を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを開発した。
【０７７７】
いかなる特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、ＡＴＡＣ中央４配列内または近辺での全ての推定挿入／欠失事象（「インデル」）は、チロシン２４８コドン自体を破壊する最も現実味のあるインデルを用いて、１つ以上の必須の特徴、ＩＴＳＭモチーフを完全に廃止することが企図される。これらのインデルは、通常の細胞外ドメインおよび機能不全細胞内シグナル伝達ドメインを含む、優性ネガティブＰＤ−１タンパク質を産生する可能性が高い。優性ネガティブＰＤ−１タンパク質は、ＰＤ−１リガンドのためのシンクの役割を果たし得、したがって免疫抑制シグナル伝達を低減または排除する。加えて、活性Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１の発現を上方調節し、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用がＴ細胞間でシスまたはトランスで起こり、これらの相互作用がＴ細胞機能に重要なため、発現に影響を与えることなくＰＤ−１シグナル伝達を破壊するゲノム編集が、推定のＰＤ−Ｌ１によって駆動される機能を保持し得る。
【０７７８】
したがって、Ｉ−ＯｎｕＩを再プログラムし、ＤＮＡ認識インターフェース内の可変アミノ酸残基を含有するモジュラーライブラリを構築することによって、領域をコードするＩＴＳＭを標的とした。バリアントを構築するために、変性コドンを、オリゴヌクレオチドを使用してＩ−ＯｎｕＩ  ＤＮＡ結合ドメイン内に組込んだ。変性コドンをコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲテンプレートとして使用し、酵母菌株Ｓセレビシエ内でのギャップ組換えによりバリアントライブラリを産生した。各バリアントライブラリは、ＮまたはＣ末端Ｉ−ＯｎｕＩ  ＤＮＡ認識ドメインをスパンし、約１０７〜１０８の特有の形質転換体を含有した。もたらされた表面ディスプレイライブラリを、図２に示されるように、対応するドメイン「ハーフ部位」（配列番号２８〜２９）を含む標的部位に対する切断活性のために、フローサイトメトリーでスクリーンした。
【０７７９】
ＮおよびＣ末端ドメイン再プログラムＩ−ＯｎｕＩをディスプレイする酵母を精製し、プラスミドＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ反応を実施し、再プログラムされたドメインを増幅し、それをその後、Ｓセレビシエに形質転換し、再プログラムされたドメインの組み合わせのライブラリを生成した。ＰＤ−１遺伝子のエクソン５内の領域をコードするＩＴＳＭ内に存在する完全標的部位（配列番号２５）を認識する、完全に再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩバリアントを、このライブラリから同定し、精製した。
【０７８０】
エクソン５内の領域をコードするＰＤ−１  ＩＴＳＭを標的とする再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥの活性を、染色体的に組込まれた蛍光レポーターシステム（Ｃｅｒｔｏ  ｅｔ．ａｌ．，２０１１）を用いて測定した。ＰＤ−１  ＩＴＳＭ標的配列に結合し、それを切断する、完全に再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥを、哺乳動物発現プラスミドへとクローン化し、次いで蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードするフレーム外遺伝子の上流のＰＤ−１エクソン５標的配列を含有するＨＥＫ２９３Ｔ線維芽細胞株へと、個々にトランスフェクトした。ＨＥによって包埋された標的部位の切断および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介したＤＮＡ修復に続くインデルの蓄積により、３つの修復された遺伝子座のうちおよそ１つが「フレーム内」に蛍光レポーター遺伝子を戻して配置することになる。したがって、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を蛍光するｍＣｈｅｒｒｙの割合を、染色体的に包埋された標的部位でのエンドヌクレアーゼ活性の読み取りとして使用する。ＰＤ−１エクソン５部位を標的とする、完全に再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥ（ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ１＿ＣＶ３−０８、配列番号６）は、細胞染色体状況において、ｍＣｈｅｒｒｙ発現の適度な効率性を示した。図３Ａ．ＨＥバリアントは、平衡基質滴定によって測定された際、適度なＤＮＡ親和性特性を有した（図３Ｂ）。
【０７８１】
二次Ｉ−ＯｎｕＩバリアントライブラリを、次に、ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ１＿ＣＶ３−０８  ＨＥバリアント上でランダムの変異誘発を実施することで産生した。ディスプレイベースの流動選別を、触媒効率の増加とともに、バリアントを単離するために、よりストリンジェントな切断状況下で実施した。このプロセスは、ＲＤ１バリアントに対する４個のアミノ酸変異を含有し、細胞対ＲＤ１バリアントを発現するｍＣｈｅｒｒｙの数倍高い割合を有するＩ−ＯｎｕＩバリアントＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ２＿７３、配列番号７）を同定した。図４．３つの追加のラウンドの活性洗練スクリーンを実施し、エクソン５標的部位（ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ３＿０３、配列番号８、ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ４＿ＣＶ２３、配列番号９、およびＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ、配列番号１０）での遺伝子編集効率を増加させた。
【０７８２】
実施例２
ＰＤ−１エクソン５を標的とするＩ−ＯｎｕＩバリアントおよびｍｅｇａＴＡＬの特徴化
ＰＤ−１エクソン５標的部位は、メガヌクレアーゼ結合部位および近隣のＴＡＬアレイ結合部位内の両方にＣｐＧジヌクレオチドモチーフを含む（図１Ｂ）。これらのジヌクレオチドメチル化ステータスを、ＣＤ３およびＣＤ２８で活性化され、ＩＬ−２を補充した完全培地中で培養された一次ヒトＴ細胞におけるバイサルファイト配列決定によって評価した。３日後、ゲノムＤＮＡを単離し、バイサルファイトを用いて処理し、あらゆる非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換した。次いで、エクソン５標的部位を、配列決定し、各シトシンの非メチル化（チミンに変換された）対メチル化（シトシンのままである）ステータスを明らかにした。結果は、標的部位内のＣｐＧモチーフシトシンの両方が、主にメチル化され（図５）、典型的な遺伝子体のメチル化パターンと一致した。
【０７８３】
ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ＨＥバリアントが、メチル化されたエクソン５標的部位を認識し、切断したことを確認するために、活性化Ｔ細胞内の標的部位のメチル化ステータスの代表である、標的部位部分ｐ５に、あるいはｐ６のグアニン塩基の逆相補鎖上に、あるいは標的配列の鎖の両方に、５−メチルシトシンを含有する基質を用いて、ＤＮＡ結合親和性および切断解析を実施した。図６．ＨＥバリアントは、メチル化されたＤＮＡ基質および同様に非修飾基質に結合し、それを切断した。
【０７８４】
ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ＨＥバリアントを、１１塩基対ＴＡＬアレイ標的部位（配列番号２６）に対応する５−メチルシトシン耐性１０．５ユニットＴＡＬアレイを、メガヌクレアーゼドメインのＮ末端に付加することにより、ｍｅｇａＴＡＬ（配列番号１９）として形式化した（Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３に記載される通り）。ｍｅｇａＴＡＬ標的部位配列は、配列番号２７のものである。ｍｅｇａＴＡＬを、ＴＡＬアレイの標的部位内に存在するメチル化ＣｐＧジヌクレオチドに対して試験した。ＴＡＬアレイを、‘Ｎ＊’ＲＶＤを対応するアレイ位置で組込むことでメチル化塩基に耐えるように設計した。
【０７８５】
ｍｅｇａＴＡＬ編集効率性は、一次ヒトＴ細胞を、サイトカイン補充培地中で４８〜７２時間、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いて事前に刺激し、次いで細胞を、ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ｍｅｇａＴＡＬをコードする、インビトロで転写され（ＩＶＴ）、キャップされ、かつポリアデニル化されたｍＲＮＡ（配列番号４０）で、電気穿孔することで評価した。加えて、３’〜５’エキソヌクレアーゼＴｒｅｘ２をコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡを、付加し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって切断処理を促進した（Ｃｅｒｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２を参照されたい）。電気穿孔後、細胞をサイトカイン補充培地内で７〜１０日培養し、その期間、一定分量をゲノムＤＮＡ単離のために除去し、ＰＤ−１エクソン５標的部位にわたるＰＣＲ増幅を行った。
【０７８６】
インデルの頻度を、Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｄｅｌｓ  ｂｙ  ＤＥｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＩＤＥ，Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４を参照されたい）または抗処理量配列決定を用いて測定した。Ｔｒｅｘ２の存在下でのＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫ  ｍｅｇａＴＡＬの編集効率性は、およそ６０％であった。図７Ａ．標的部位で観察された優性インデル型は、＋１、−１、−２、−３、または−４ヌクレオチドであった。図７Ｂ．この解析は、ＰＤ−１．ＩＴＳＭ．ｅｘ５＿ＲＤ５＿ＣＶ２３ＭＫバリアントが、ヒトＴ細胞で処理されたｍｅｇａＴＡＬの顕著な部分内でＰＤ−１  ＩＴＳＭコンセンサスモチーフを破壊したことを確認した。
【０７８７】
実施例３
プログラム死受容体１（ＰＤ−１）遺伝子内の細胞外ドメインを破壊するために再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩメガヌクレアーゼドメイン
ＰＤ−１エクソン５標的部位（配列番号２５）を標的とするＩ−ＯｎｕＩバリアントＨＥの中央４特異性を、インビトロのエンドヌクレアーゼアッセイにおいて抗処理量酵母表面ディスプレイを使用してプロファイルした（Ｊａｒｊｏｕｒ，Ｗｅｓｔ−Ｆｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＰＤ−１エクソン５を標的とするＨＥバリアントをコードするプラスミドを、表面ディスプレイのためにＳセレビシエへと形質転換し、次いで２５６可能性中央４配列の各々を含有するＰＤ−１エクソン５標的部位ＤＮＡ配列を含む、ＰＣＲ産生２本鎖ＤＮＡ基質に対する切断活性のために試験した。特異性プロファイルは、この再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩが、中央４標的標的部位（図８）に対して非常に選択的であり、また追加の非標準的中央４標的部位を切断し得ることを示した。ＰＤ−１遺伝子内の他の場所に位置する標準的Ｉ−ＯｎｕＩ中央４標的部位が非常に少ないため、ＰＤ−１エクソン１およびエクソン２内の非標準的中央４標的部位を使用して、追加のホーミングエンドヌクレアーゼを再プログラムした。
【０７８８】
ＰＤ−１エクソン１およびエクソン２内のこれらの非標準的中央４標的部位は、それぞれシグナルペプチドおよびＩｇＶドメインをコードする領域にある。いかなる特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、これらの領域を遺伝子編集インデルによって標的化することは、ＰＤ−１タンパク質発現を廃止または不安定化し、清潔なノックアウト表現型を生成することが企図される。加えて、より高度な遺伝子改変操作（導入遺伝子カセットの標的化された挿入が挙げられるが、これらに限定されない）のためのこれらの部位は、固有制御性の制御化にある表現型を生成し得る。
【０７８９】
Ｉ−ＯｎｕＩを再プログラムし、標的部位（配列番号３０および３５）を含有し、対応するＴＡＬアレイ標的部位（配列番号２６および３１）および完全ｍｅｇａＴＡＬ標的部位（配列番号３１および３７）まで延長される、２つの非標準化中央４（これらの２つのエクソン／モチーフのそれぞれ中のもの）を標的とした。図９Ａおよび９ＢＩ−ＯｎｕＩを再プログラムし、ＤＮＡ認識インターフェース内の可変アミノ酸残基を含有するモジュラーライブラリを構築することによって、ＰＤ−１遺伝子の標的エクソン１またはエクソン２を標的とした。バリアントを構築するために、変性コドンを、オリゴヌクレオチドを使用してＩ−ＯｎｕＩ  ＤＮＡ結合ドメイン内に組込んだ。変性コドンをコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲテンプレートとして使用し、酵母菌株Ｓセレビシエ内でのギャップ組換えによりバリアントライブラリを産生した。各バリアントライブラリは、ＮまたはＣ末端Ｉ−ＯｎｕＩ  ＤＮＡ認識ドメインをスパンし、約１０７〜１０８の特有の形質転換体を含有した。もたらされた表面ディスプレイライブラリを、対応するドメイン「ハーフ部位」（エクソン１：配列番号３４および３５、エクソン２：配列番号３８および３９）を含む標的部位に対する切断活性のために、フローサイトメトリーでスクリーンした：
【０７９０】
ＮおよびＣ末端ドメイン再プログラムＩ−ＯｎｕＩをディスプレイする酵母を精製し、プラスミドＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ反応を実施し、再プログラムされたドメインを増幅し、それをその後、Ｓセレビシエに形質転換し、再プログラムされたドメインの組み合わせのライブラリを生成した。ＰＤ−１エクソン１シグナルペプチドをコードする領域内の、かつＰＤ−１エクソン２内のＩｇＶドメインをコードする領域内の、完全標的部位に対する完全に再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩバリアント活性を、同定し、これらのライブラリから精製した。
【０７９１】
ＰＤ−１エクソン１およびエクソン２標的部位を標的とする、完全に再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥを、哺乳動物発現プラスミドへとクローン化し、次いで蛍光ｉＲＦＰタンパク質をコードするフレーム外遺伝子の上流の対応する標的配列を含有するＨＥＫ２９３Ｔ線維芽細胞株へと、個々にトランスフェクトした。
【０７９２】
ＰＤ−１エクソン１部位（ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ１＿Ｂ１、配列番号１１）を標的とする、再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥは、独立型のＨＥバリアントとして、あるいはｍｅｇａＴＡＬ（配列番号２０）として形式化した後のいずれかで、細胞染色体状況においてｉＲＦＰ発現の適度な効率性を示した。二次Ｉ−ＯｎｕＩバリアントライブラリを、初期ライブラリスクリーニングプロセスにおいて同定されたＰＤ−１エクソン１  ＲＤ１バリアントにわたる、ランダム変異誘発を実施することで生成した。ディスプレイベースの流動選別を、触媒効率の増加とともに、バリアントを単離するために、よりストリンジェントな切断状況下で実施した。このプロセスは、２つのＩ−ＯｎｕＩバリアント（それぞれＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｈ８、ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｇ２、配列番号１２および６０）を同定した。バリアントは、ＲＤ１バリアントに対する４個（ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｈ８）または５個（ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｇ２）のアミノ酸変異を含有し、ＰＤ−１エクソン１  ＲＤ１バリアント（独立型のＨＥバリアントとして、かつｍｅｇａＴＡＬ（配列番号２１および配列番号６４）として形式化した後の両方）と比較して、細胞を発現するｉＲＦＰの顕著に高い割合を有する。図１０．
【０７９３】
ＰＤ−１エクソン２部位（ＰＤ−１．ＩｇＶ．ｅｘｏｎ２＿ＲＤ１＿Ｇ５、配列番号１３）を標的とする、再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥは、独立型のＨＥバリアントとして、あるいはｍｅｇａＴＡＬ（配列番号２２）として形式化した後のいずれかで、ｉＲＦＰ発現の高い効率性を示した。
【０７９４】
エクソン１およびエクソン２標的ＨＥバリアントは、それらのそれぞれの標的配列を使用して平衡基質滴定によって測定された際、強いＤＮＡ親和性特性をディスプレイした。図１１Ａ．
【０７９５】
エクソン１ヌクレアーゼを、さらに洗練し、塩基対−８、−７、および−６に接触する領域でのその特異性を改善した。マイクロライブラリを、アミノ酸残基６８、７０、７８、８０、および８２をランダム化することで構築し、フローサイトメーターによる６ラウンドの選別後、３つのクローン（ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｇ２Ｃ４、ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｇ２Ｃ１１、およびＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｇ２Ｃ５、それぞれ配列番号６１、６２、および６３）が、親のヌクレアーゼ（ＰＤ−１．ｉｌｅ３．ｅｘｏｎ１＿ＲＤ２＿Ｂ１Ｇ２、配列番号６０）より高い特異性を示した。図１１Ｂ．
【０７９６】
バイサルファイト配列決定を使用し、ＰＤ−１エクソン１およびエクソン２標的部位内に存在するＣｐＧモチーフのメチル化ステータスを評価した。図１２．ＰＤ−１エクソン１標的部位内のＣｐＧモチーフは、ＰＤ−１エクソン２標的内のＣｐＧモチーフの両方がメチル化された場合、活性化Ｔ細胞内で非メチル化されることが示された。ディスプレイベースの活性解析を実施し、完全ＣｐＧメチル化ＰＤ−１エクソン２標的配列が、対応するＨＥバリアントによって効率的に切断されたことを確認した。
【０７９７】
加えて、完全ＣｐＧメチル化エクソン２標的部位を使用し、ＣｐＧメチル化標的部位に対する改善された結合および切断活性を用いて、Ｉ−ＯｎｕＩバリアント（ＰＤ−１．ＩｇＶ．ｅｘｏｎ２＿ＲＤ１＿ＰＳ３、配列番号１４）を同定した。実施例４
一次ヒトＴ細胞ＰＤ−１遺伝子の標的化された破壊はＴ細胞機能のＰＤ−Ｌ１媒介抑制を救助する
ＰＤ−１遺伝子内の様々な標的配列を切断するように再プログラムされたｍｅｇａＴＡＬの機能的影響を、ＣＤ３およびＣＤ２８内で活性化され、ＩＬ−２で補充された完全培地内で培養された一次ヒトＴ細胞内で評価した。活性化されたＰＢＭＣを、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするレンチウイルス性ベクターを用いて伝達した。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｔｒｅｘ２（配列番号４３）をコードするｍｅｇａＴＡＬ（それぞれ配列番号４０および４１）およびｍＲＮＡを標的とする、ＰＤ−１エクソン５またはＰＤ−１エクソン１のいずれかをコードする、インビトロで転写されたｍＲＮＡを用いて、電気穿孔した。制御は、未処理のＴ細胞、またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）もしくはＣＣＲ５標的ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡで処理されたＴ細胞を含んだ（Ｓａｔｈｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ”Ｍｅｄ．”２０１５  Ｓｅｐ  ３０；７（３０７）：３０７ｒａ１５６を参照されたい）。
１０日の拡大に続いて、Ｔ細胞をポリクローン性活性化試薬ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン（Ｐ／Ｉ）を用いて刺激した。ＰＤ−１は、Ｔ細胞活性化後に細胞表面上で自然に上方調節される。ＰＤ−１上方調節を、この領域内のインデルがＰＤ−１タンパク質の通常の産生を破壊することを示している、ＰＤ−１エクソン１ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡのトランスフェクション後に抑制した。対照的に、制御ＣＣＲ５ｍｅｇａＴＡＬ、またはｍｅｇａＴＡＬを標的とするＰＤ−１エクソン５をコードするｍＲＮＡでの処理は、高い割合のインデルがＩＴＳＭ内でこのｍｅｇａＴＡＬによって誘発されたにも関わらず、ＰＤ−１表面発現上に影響を与えたなかった。図１３Ａ．ＰＤ−１エクソン１ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡ（配列番号６５、６６、６７、および６８）の特異性洗練バージョンを用いた同様の条件下で反復されたさらなる実験はまた、Ｔ細胞内の同様のＰＤ−１発現破壊も示した。図１３Ｂ
【０７９８】
ＰＤ−１エクソン１およびエクソン５ｍｅｇａＴＡＬの両方の刺激送達は、Ｔｒｅｘ２エキソヌクレアーゼの送達に依存せずに、ＰＤ−１細胞表面発現の破壊を顕著に改善した。図１４．これは、同時に近位のＤＮＡ切断形成が、エキソヌクレアーゼによって駆動されるインデル増強に依存しない、高い親和性での大型の遺伝子欠失事象を促進する機序であることを示す。
【０７９９】
その発現またはそのシグナル伝達機能のいずれかを標的とすることによる、Ｔ細胞内のＰＤ−１シグナル伝達の破壊の影響を、ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−Ｌ１を発現するように遺伝子操作された細胞に応答する、ＣＡＲ−Ｔ細胞サイトカイン産生により解析した。腫瘍細胞株を発現するＢＣＭＡを用いた抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の共培養は、上清内で測定された高レベルのＴＮＦαおよびＩＬ−１７Ａによって例証される、Ｔ細胞活性化およびその後の炎症性サイトカイン分泌をもたらした。腫瘍細胞を発現するＢＣＭＡ上でのＰＤ−Ｌ１の共培養は、炎症性サイトカイン産生を抑制した。しかしながら、ＰＤ−１エクソン１またはエクソン５ｍｅｇａＴＡＬのいずれかをコードするｍＲＮＡを用いた抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のトランスフェクションは、炎症性サイトカイン産生がこれらの試料の基準値レベルまで救助されるため、ＰＤ−Ｌ１媒介サイトカイン抑制を低減する。図１５Ａ．
【０８００】
実施例５
導入遺伝子のＰＤ−１遺伝子のエクソン１への相同組換え
相同領域を標的とする遺伝子の間に位置する、異種プロモーター、蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含むプロモーター導入遺伝子カセットを含有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラスミドが、設計され、構築された。ＡＡＶ  ＩＴＲ要素の完全性は、ＸｍａＩ消化で検証された。導入遺伝子カセットを、２つの相同領域の間（およそ６００〜７００ｂｐの長さ、ＰＤ−１エクソン１  ｍｅｇａＴＡＬ切断部位（配列番号２７）に隣接する）に配置した。５’相同アーム（配列番号５４）は、第１のＰＤ−１エクソンの部分およびｍｅｇａＴＡＬ切断部位の上流の他の配列を含有した。３’相同アーム（配列番号５５）は、ＰＤ−１エクソンの部分およびｍｅｇａＴＡＬ切断部位の下流の他の配列を含有した。どちらの相同領域も完全ｍｅｇａＴＡＬ標的部位を含有しなかった。この代表的な発現カセットは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーと、欠失した陰性対照領域と、蛍光ポリペプチド、例えば、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターとを含有した。加えて、発現カセットは、導入遺伝子終止コドンの下流に配置されたＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルを含有した。図１６Ａ．組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を、ウイルス性産生に必要な複製、カプシド、およびアデノウイルスヘルパー要素を提供するプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一次的に共トランスフェクトすることによって調製した。ｒＡＡＶを、イオジキサノール系勾配における超遠心分離を使用して共トランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞培養から精製した。
【０８０１】
ｍｅｇａＴＡＬで誘発された相同組換えは、ＣＤ３およびＣＤ２８で活性化され、ＩＬ−２を補充した完全培地中で培養された一次ヒトＴ細胞において評価された。培地中での３日後、Ｔ細胞を洗浄し、インビトロで転写されたＰＤ−１エクソン１ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡ（配列番号４１）で電気穿孔し、その後、ＭＮＤ−ＧＦＰ導入遺伝子カセット（配列番号５３）をコードする精製された組換えＡＡＶで伝達した。制御は、ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡまたはｒＡＡＶを標的とするベクターのいずれかで処理されたＴ細胞を含んだ。フローサイトメトリーは、蛍光タンパク質を発現するＴ細胞の頻度を測定し、染色体的に組込まれたカセットの長期発現からの非統合ｒＡＡＶを標的としたベクターからの蛍光タンパク質の一時的発現を分化するために、複数の時点で使用された。図１６Ｂ．ＰＤ−１遺伝子のｍｅｇａＴＡＬ媒介破壊を、配列決定によって、かつポリクローン性Ｔ細胞活性化に続くＰＤ−１発現の消失によって検出した。
【０８０２】
長期導入遺伝子発現は、ｍｅｇａＴＡＬおよびｒＡＡＶを標的としたベクターの両方で処理されたＴ細胞の２０〜６０％で観察された。対照試料中で、ｒＡＡＶ処理単独は、可変レベルの一時的蛍光タンパク質発現、ゲノムへの統合の欠如と一致する、処理されたＴ細胞中の非常に低いレベル（＜１％）の長期蛍光タンパク質発現を生成した。結果は、いくつかの独立したドナーから単離されたＴ細胞で行われた実験において確認された。
【０８０３】
実施例６
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子のＰＤ−１遺伝子への相同組換え
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラスミドを、抗ＣＤ１９ＣＡＲ  （配列番号５６）または抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（配列番号５７）をコードする導入遺伝子カセットを、相同領域を標的とするＰＤ−１エクソン１の間に配置したことを除いて、上記のように設計、構築、および検証した。ＣＡＲ発現カセットは、ＣＤ８α由来のシグナルペプチド、ＣＤ１９抗原またはＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とした一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＣＤ８α由来のヒンジ領域および膜貫通ドメイン、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、およびＰＤＣＤ１エクソン１標的部位（配列番号５４および５５）を標的とするように設計された相同アームを含む、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターを含有した。
【０８０４】
一次ヒトＴ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８で活性化し、上記のサイトカイン補充培地内で成長させた。ＰＤ−１エクソン１標的部位へのＣＡＲ導入遺伝子の相同組換えを、インビトロで転写されたＰＤ−１エクソン１ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡ（配列番号４１）を用いて電気穿孔され、次いでその後、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするｒＡＡＶで伝達された、活性化一次ヒトＴ細胞を使用して評価した。ＣＡＲ発現を検出するためのフローサイトメトリーを、１０日目の時点で、電気穿孔および伝達の７日後に実施した。制御試料は、ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡまたはｒＡＡＶを標的とするベクターのいずれかで処理されたＴ細胞を含んだ。ＣＤ１９−ＣＡＲおよびＢＣＭＡ−ＣＡＲ発現を、組換えＰＥ共役ＣＤ１９−ＦｃまたはＰＥ共役ＢＣＭＡ−Ｆｃ染色試薬を使用して解析した。ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡおよびｒＡＡＶ−ＣＡＲで処理されたＴ細胞は、Ｔ細胞の３０〜６０％のＣＤ１９−ＣＡＲ発現およびＴ細胞の１０〜２０％のＢＣＭＡ−ＣＡＲ発現を示した。図１６Ｂ．同様の割合のＴ細胞拡大および識別不能なＴ細胞表現型を、未処理の、ｒＡＡＶで処理された、かつｍｅｇａＴＡＬ／ｒＡＡＶ  ＣＡＲで処理されたＴ細胞の間で観察した。
【０８０５】
実施例７
プロモーターレス導入遺伝子のＰＤ−１遺伝子への相同組換え
蛍光レポーター受容体（ｍＣｈｅｒｒｙ）導入遺伝子およびポリアデニル化シグナルを含有するが、外因性プロモーターを欠く組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラスミドを、設計、構築、および検証した（配列番号５８）。図１７．ｍＣｈｅｒｒｙ開始コドンは、内在性ＰＤ−１開始コドンと合併および重複し、一方、ＰＤ−１エクソン１の残りをｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードするｃＤＮＡと置き換える。この戦略は、内在性ＰＤ−１プロモーターからの蛍光タンパク質の発現を駆動し、また、一方、ＰＤ−１タンパク質の通常の発現を破壊する。
【０８０６】
一次ヒトＴ細胞を、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡで、活性化、電気穿孔し、上記のｒＡＡＶで伝達した。対照試料は、ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡまたはｒＡＡＶを標的とするベクターのいずれかで処理されたＴ細胞を含んだ。蛍光レポーター発現を、トランスフェクション後の様々な時点で、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン（Ｐ／Ｉ）を使用して、ポリクローン性Ｔ細胞活性化の存在下または非存在下で、フローサイトメトリーにより解析した。レポーター発現は、ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡまたはｒＡＡＶを標的としたベクターのみで処理されたＴ細胞内では、観察されたなかった。同様のｍｅｇａＴＡＬ活性率を、ｒＡＡＶ伝達の有無にかかわらず観察した。低レベルの蛍光レポーター発現を、ｍｅｇａＴＡＬおよびｒＡＡＶを標的としたベクターを受け取るＴ細胞内で観察し、Ｐ／Ｉで４８時間活性化した。内在性ＰＤ−１プロモーターによって駆動された蛍光レポーター発現は、異種プロモーター駆動型受容体発現と比較してより低かった（蛍光強度の約５倍の低下）。
【０８０７】
実施例８
蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子の、ＰＤ−１遺伝子のエクソン５への相同組換えに続く構成的ＰＤ−１発現
異種プロモーターを含有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラスミド、青蛍光タンパク質（ＢＦＰ）導入遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを、ＰＤ−１エクソン５への導入のために設計、構築、および検証（配列番号４４）した。導入遺伝子カセットを、ＰＤ−１エクソン５ｍｅｇａＴＡＬ切断部位に隣接する１．３ｋｂおよび１．０ｋｂの相同アームの間に配置した。５’相同アーム（配列番号４５）は、ｍｅｇａＴＡＬ切断部位の上流のＰＤ−１エクソン５の部分および他の上流配列を含んだ。３’相同アーム（配列番号４６）は、ＰＤ−１エクソン５の末端コード配列および他の下流配列を含有した。どちらの相同領域も完全ｍｅｇａＴＡＬ標的部位を含有しなかった。図１８．
【０８０８】
一次ヒトＴ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８で活性化し、インビトロで転写したＰＤ−１エクソン５ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡ（配列番号４０）で電気穿孔し、次いで蛍光レポーター導入遺伝子をコードするｒＡＡＶで、伝達した。対照は、未処理Ｔ細胞およびｒＡＡＶを標的としたベクターのみで処理されたＴ細胞を含んだ。蛍光レポーター発現を、トランスフェクション後の様々な時点でフローサイトメトリーにより解析した。ｒＡＡＶのみで処理された細胞は、細胞拡大の間にバックグラウンドレベルまで減少した一次的なＢＦＰ発現を呈した。ＰＤ−１エクソン５ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡおよびｒＡＡＶベクターを受けたＴ細胞は、エクスビボ培養の過程にわたって持続されたＢＦＰ発現Ｔ細胞の安定した集団を呈した。
【０８０９】
ＰＤ−１エクソン５ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡおよびｒＡＡＶベクターで処理されたＴ細胞は別個のＰＤ−１発現パターンを有し、それにより活性化の存在下で、ほぼ全てのＢＦＰ発現細胞もまた、ＰＤ−１タンパク質を発現した。これは、標的戦略が、ＰＤ−１遺伝子の通常の調節を、誘導性発現パターンよりもむしろ構成的に変更したことを示す。さらには、ＰＤ−１エクソン５の標的化により、この標的戦略における構成的に発現されたタンパク質は、抑制性シグナル伝達を損なっているＰＤ−１バリアントであり、優性ネガティブ受容体としての役割を果たし得る。ＰＤ−１発現は、ＰＤ−１エクソン５ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡのみで処理されたＴ細胞内で、あるいはエクソン１に対して相同アームを含むｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡおよびｒＡＡＶ処理されたＴ細胞内で上方調節されなかった。図１９．
【０８１０】
実施例９
導入遺伝子のＰＤ−１遺伝子への相同組換えは、単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の非依存性である。
ＰＤ−１遺伝子座は、一般に、イントロンおよびエクソン領域内の両方に存在するＳＮＰの高い有症率を有する異種性である。ｍｅｇａＴＡＬ切断部位近辺の分岐ＳＮＰの存在は、ＰＤ−１遺伝子座での相同組換え効率性に潜在的に影響を与える。異種プロモーター、蛍光タンパク質導入遺伝子、および後期ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラスミドを設計して、ＳＮＰの影響を評価し、次いで、上記のように構築および検証した（配列番号４７および４８）。相同アームはコンセンサスＰＤ−１配列に同一性であるか、それが、ＰＤ−１エクソン５ｍｅｇａＴＡＬ標的部位に近位の共通ＳＮＰからの点変異を含むように設計されているかのいずれかである。これらの設計において、５’相同アーム（Ｌ−ＳＮＰ、配列番号４９）は、ｍｅｇａＴＡＬ切断部位の２２０ｂｐ上流に位置するイントロンＧ／Ａ  ＳＮＰ（ｒｓ６７０５６５３）を含有し、一方３’相同アーム（Ｒ−ＳＮＰ、配列番号５０）は、ＰＤ−１ｍｅｇａＴＡＬ切断部位の６８ｂｐ上流に位置するサイレントＣ／Ｔ  ＳＮＰ（ｒｓ２２２７９８１）を含有する。図２０．
【０８１１】
一次ヒトＴ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８で活性化し、インビトロで転写したｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡで電気穿孔し、コンセンサス相同アームをコードするｒＡＡＶで、あるいはＬ−ＳＮＰまたはＲ−ＳＮＰ相同アームのいずれかを運搬するｒＡＡＶで伝達した。対照は、ｒＡＡＶを標的としたベクターのみで伝達されたＴ細胞を含んだ。蛍光タンパク質発現を、トランスフェクション後の異なる時点でフローサイトメトリーにより解析した。蛍光タンパク質発現は、ｒＡＡＶのみを受ける試料内でバックグラウンドレベルまで減退し、一方、ｒＡＡＶと組み合わせてｍｅｇａＴＡＬで処理されたＴ細胞は、蛍光タンパク質発現の安定したレベルを実証した。全ての試料は、ｒＡＡＶベクターを含有する非ＳＮＰ、またはＬもしくはＲ  ＳＮＰバリアントを含有するもので処理されているにも関わらず、同様の蛍光レベルを呈し、ｍｅｇａＴＡＬ標的部位の近位のＳＮＰは、標的部位のＨＲに影響を与えないか、あるいは実質的に影響を与えなかった。
【０８１２】
実施例１０
スイッチ受容体をコードする導入遺伝子のＰＤＣＤ１遺伝子座への相同組換え
スイッチ受容体は、細胞外抑制性シグナルを細胞内活性化シグナルに変換することのできる、遺伝子操作されたキメラ分子であるが、しかしながらそれらの有効性はしばしば、天然受容体の天然発現を圧倒するそれらの能力と関連する。この制限を回避する１つの方法は、スイッチ受容体を天然の遺伝子座内に包理し、天然の受容体を破壊することである。異種プロモーター、ＰＤ−１細胞外リガンド結合ドメインをコードする導入遺伝子、および細胞内ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン（ＰＤ−１スイッチ受容体、配列番号５９）、ならびに後期ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラスミドを、標的ＰＤ−１エクソン５のために設計し、構築および検証した。５’相同アームは、ＩＴＩＭを含有するｍｅｇａＴＡＬ切断部位の上流のＰＤ−１エクソン５の部分および他の上流配列を含んだ。３’相同アームは、ＰＤ−１エクソン５の末端コード配列およびＵＴＲ領域の部分を含有し、約６５０ｂｐまで短縮され、スイッチ受容体ｃＤＮＡを収容した。どちらの相同領域も完全ｍｅｇａＴＡＬ標的部位を含有しなかった。図２１．
【０８１３】
一次ヒトＴ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８で活性化し、インビトロで転写したＰＤ−１エクソン５ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡで電気穿孔し、ＰＤ−１スイッチ受容体をコードするｒＡＡＶを標的とするベクターで伝達した。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはＡＡＶのみを受け取った試料を含んだ。ＰＤ−１スイッチ受容体の発現を、Ｔ細胞刺激の非存在下において抗ＰＤ−１抗体を用いた染色により解析した。ＰＤ−１エクソン５ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡで処理され、ｒＡＡＶで伝達されたＴ細胞内の高発現レベルを観察した。
【０８１４】
実施例１１
ＨＤＲを使用したＰＤ−１細胞内シグナル伝達領域の広範囲の除去
相同組換え機序は、遠位のゲノム配列にスパンし得る、相同「サーチ」機序に関与すると知られている。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、標的遺伝子または染色体領域のより実質的なスパンは、ｍｅｇａＴＡＬおよびｒＡＡＶ送達の組合せを使用した効率的な操作である傾向があることが企図される。遠位のＨＲ事象を評価するための、異種プロモーター、ＢＦＰ導入遺伝子、およびに相同アーム隣接される後期ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラスミドを設計、構築、および検証した（配列番号５２）。導入遺伝子を、ＰＤ−１エクソン３の上流で開始し、エクソン４の開始直前に終了するように設計された１．３ｋｂの５’相同アームに隣接させた。３’相同アームは、ＰＤ−１エクソン５の末端コード配列およびＵＴＲ領域の部分を含有した。どちらの相同領域も完全ｍｅｇａＴＡＬ標的部位を含有しなかった。成功した相同組換えを、処理された細胞に残っているＰＤ−１の細胞外および膜貫通部分を用いて、ＰＤ−１細胞内シグナル伝達領域全体を排除するように設計した。図２２．
【０８１５】
一次ヒトＴ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８で活性化し、インビトロで転写したｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡで電気穿孔し、遠位５’相同アームを含む、ｒＡＡＶを標的とするベクターをコードするＢＦＰで伝達した。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはｒＡＡＶを標的とするベクターのいずれかで処理されたＴ細胞を含む。安定したＢＦＰ発現を、ｒＡＡＶおよびＰＤＣＤ１エクソン５標的ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡの両方を受け取る試料内のみで観察する。
【０８１６】
実施例１２
インビトロの一次ヒトＴ細胞内のＰＤ−１遺伝子破壊および抗体媒介ＰＤ１遮断
ＰＤ−１遺伝子内の様々な標的配列を切断するように再プログラムされたｍｅｇａＴＡＬの機能的影響を、ＣＤ３およびＣＤ２８内で活性化され、ＩＬ−２で補充された完全培地内で培養された一次ヒトＴ細胞内で評価した。活性化されたＰＢＭＣを、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするレンチウイルス性ベクターを用いて伝達した。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｔｒｅｘ２（配列番号４３）をコードするｍｅｇａＴＡＬ（それぞれ配列番号４０および４１）およびｍＲＮＡを標的とする、ＰＤ−１エクソン５またはＰＤ−１エクソン１のいずれかをコードする、インビトロで転写されたｍＲＮＡを用いて、電気穿孔した。対照は、ｍＲＮＡ（疑似ＥＰ）なしで電気穿孔されたＴ細胞、または触媒活性を欠くＴＣＲαに対して特異的なｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡで電気穿孔されたＴ細胞を含んだ。
【０８１７】
１０日の拡大に続いて、Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ−ＧＦＰをコードするレンチウイルス性ベクターで伝達されたＡ５４９細胞で、共培養した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ａ５４９標的細胞のみで、もしくは２０μｇ／ｍｌ抗ＰＤ−１抗体の存在下で共培養した。細胞を、７２時間共培養し、上清内のサイトカインレベルを、ビーズベースのアッセイ（インテリサイトＱＢｅａｄｓ）を使用して解析した。抗ＰＤ−１抗体の非存在下で、ＰＤ−１−Ｅｘ１またはＰＤ−１−Ｅｘ５ｍｅｇａＴＡＬで処理された細胞は、疑似ＥＰおよびＴＣＲの死滅した対照と比較してＩＦＮγおよびＴＮＦα産生の上昇を示した。αＰＤ−１に加えて、抗体はこの違いを抑止し、対照およびＰＤ−１ｍｅｇａＴＡＬで処理された細胞から得られた上清内の、ＩＦＮγおよびＴＮＦα分泌の平衡レベルをもたらした（図１５Ｂ）。
【０８１８】
実施例１３
プロモーターレス導入遺伝子のＰＤ−１遺伝子への相同組換え
蛍光レポーター受容体（ｍＣｈｅｒｒｙ）導入遺伝子およびポリアデニル化シグナルを含有するが、外因性プロモーターを欠く組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラスミドを、設計、構築、および検証した（配列番号５８）。図１７．ｍＣｈｅｒｒｙ開始コドンは、内在性ＰＤ−１開始コドンと合併および重複し、一方、ＰＤ−１エクソン１の残りをｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードするｃＤＮＡと置き換える。この戦略は、内在性ＰＤ−１プロモーターからの蛍光タンパク質の発現を駆動し、また、一方、ＰＤ−１タンパク質の通常の発現を破壊する。
【０８１９】
一次ヒトＴ細胞を、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡで、活性化、電気穿孔し、上記のｒＡＡＶで伝達した。対照試料は、ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡまたはｒＡＡＶを標的とするベクターのいずれかで処理されたＴ細胞を含んだ。蛍光レポーター発現を、トランスフェクション後の様々な時点で、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン（Ｐ／Ｉ）を使用して、ポリクローン性Ｔ細胞活性化の存在下または非存在下で、共刺激後２４時間でフローサイトメトリーにより解析した。レポーター発現は、未処理のＴ細胞内では観察されなかった。Ｐ／Ｉ刺激前、蛍光受容体発現の低基礎レベルを、ｍｅｇａＴＡＬおよびＨＤＲのためのｒＡＡＶを標的とするベクターの両方を受け取るＴ細胞内で観察した。２４時間のＰ／Ｉ刺激は、３％〜２７．３％（図１７中、上部を下部の最も右のパネルと比較して）の内在性ＰＤ−１によって駆動される蛍光受容体発現を上方調節した。
【０８２０】
実施例１４
プロモーターレスサイトカイン導入遺伝子のＰＤ−１遺伝子座への相同組換え
ＩＬ−１２またはＩＬ−１５導入遺伝子およびポリアデニル化シグナルを含有するが、外因性プロモーターを欠く組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラスミドを、設計、構築、および検証した（配列番号５８）。導入遺伝子開始コドンは、内在性ＰＤ−１開始コドンと合併および重複し、一方、ＰＤ−１エクソン１の残りをＩＬ−１２またはＩＬ−１５サイトカインをコードするｃＤＮＡと置き換える（図２３、上部右パネル）。この戦略は、内在性ＰＤ−１プロモーターからの導入遺伝子の発現を駆動し、また、一方、ＰＤ−１の通常の発現を破壊する。
【０８２１】
一次ヒトＴ細胞を、活性化の２４時間後に抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするレンチウイルス性ベクターで活性化し、伝達した。細胞を２日間増殖し、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡで電気穿孔し、上記のｒＡＡＶで伝達した。対照試料は、伝達されていないＴ細胞、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲのみで処理されたＴ細胞、または抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲで処理され、かつ組換えＩＬ−１２の存在下で培養されたＴ細胞を含んだ。ＰＤ−１ｍｅｇａＴＡＬの活性を、ＰＭＡ／イオノマイシンで２４時間刺激されたＴ細胞上で、ＰＤ−１発現のフローサイトメトリー解析により評価した。ＩＬ−１２  ＡＡＶと組み合わせたＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬは、対照試料と比較してＰＤ−１発現の約４０％の増加を示した（図２３、下部パネル）。
【０８２２】
ＩＬ−１２発現レベルを、ＰＭＡ／イオノマイシン活性後、またはＫ５６２−ＢＣＭＡ細胞株を発現する抗体を用いたＴ細胞の共培養に続いて、ＥＬＩＳＡによって測定した。刺激されていないＴ細胞内での最小のＩＬ−１２産生が存在し、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激および抗原ポジティブＫ５６２細胞での共培養はＩＬ−１２分泌をもたらした（図２４Ａ）。反復される刺激アッセイを使用し、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能性疲弊を測定した。腫瘍細胞および抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を混合し、７日間培養し、追加のＫ５６２−ＢＣＭＡ標的細胞を加え、反復された刺激を模倣した。第１の刺激後、ＩＦＮγ産生のレベルおよび細胞傷害活性は、全てのＴ細胞試料内で同様であった。第２の刺激後、ＩＦＮγ産生および細胞傷害活性は、組換えＩＬ−１２で試験されたか、あるいはＰＤ−１  ｍｅｇａＴＡＬおよびＩＬ−１２ＨＤＲテンプレートの両方で処理された抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ  Ｔ細胞において、対照の処理された細胞と比較して増加した（図２４Ｂ）。
【０８２３】
全般に、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態への特許請求の範囲に限定するものと解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲とともに全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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