(57)【要約】  本発明は、ＳＣ機能制御のための、および／または、ＳＣ機能障害に起因する疾患の治療または緩和のための、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、ならびに、それらの使用に関する。より具体的には、本発明は、人工的なＳＣ機能制御を実行すること、および／または、ＳＣ機能障害に起因する疾患を治療または緩和することが可能なシステムに関し、当該システムは、ＳＣ機能制御のための、および／または、ＳＣ機能障害に起因する疾患の治療または緩和のための、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子；および／または、ＳＣ機能障害に起因する疾患を治療または緩和するための組成物を備える。具体的な態様において、本発明は、人工的に操作されたＰＭＰ２２などのＳＣ機能制御因子によるＳＣ機能制御システムおよび／またはその発現産物に関する。
2019537446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＭＰ２２遺伝子であり、核酸配列における改変を有する、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子。
【請求項２】
前記核酸配列における前記改変は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体によって人工的に引き起こされる、人工的に操作された請求項１に記載のＳＣ機能制御因子。
【請求項３】
ＰＭＰ２２遺伝子の前記核酸配列は、核酸配列における改変を有する、調節領域、非コード領域、および、コード領域から成る群から選択される１または複数である、人工的に操作された請求項１または２に記載のＳＣ機能制御因子。
【請求項４】
前記遺伝子は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体によって人工的に操作されたＳＣ機能制御因子であり、
人工的に操作された前記ＳＣ機能制御因子は、
血管新生関連因子を構成する核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ配列（ＰＡＭ配列）における、または、その５'末端および／または３'末端に隣接する連続する１ｂｐ〜５０ｂｐの塩基配列領域における、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、野性型遺伝子と異なる１または複数のヌクレオチドでの置換、ならびに、１または複数の外来ヌクレオチドの挿入のうち少なくとも１つ、または、
前記ＳＣ機能制御因子を構成する核酸配列における１または複数のヌクレオチドの化学修飾
である核酸の１または複数の改変を含む、人工的に操作された請求項１から３のいずれか一項に記載のＳＣ機能制御因子。
【請求項５】
核酸の前記改変は、前記遺伝子のプロモーター領域に生じる、人工的に操作された請求項１から４のいずれか一項に記載のＳＣ機能制御因子。
【請求項６】
核酸の前記改変は、前記遺伝子のエクソン領域に生じる、人工的に操作された請求項１から５のいずれか一項に記載のＳＣ機能制御因子。
【請求項７】
核酸の前記改変は、前記遺伝子のエンハンサー領域に生じる、人工的に操作された請求項１から６のいずれか一項に記載のＳＣ機能制御因子。
【請求項８】
核酸の前記改変は、前記遺伝子のイントロン領域に生じる、人工的に操作された請求項１から７のいずれか一項に記載のＳＣ機能制御因子。
【請求項９】
核酸の前記改変は、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、開始部位、終結部位、ドナースプライス部位、アクセプタスプライス部位、ポリＡ部位、エンハンサー、３'ＵＴＲ（非翻訳領域）、５'ＵＴＲ、アテニュエーターおよびＧＣボックスから成る群から選択される１または複数の配列に生じる、人工的に操作された請求項１から８のいずれか一項に記載のＳＣ機能制御因子。
【請求項１０】
前記ＰＡＭ配列は、
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（各Ｎは独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（各Ｎは独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（各Ｎは独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（各Ｎは独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧである）、および、
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
の（５'から３'の方向に記載される）配列のうち１または複数である、人工的に操作された請求項４に記載のＳＣ機能制御因子。
【請求項１１】
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、および、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数を含む、人工的に操作された請求項２に記載のＳＣ機能制御因子。
【請求項１２】
ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、開始部位、終結部位、ドナースプライス部位、アクセプタスプライス部位、ポリＡ部位、エンハンサー、３'ＵＴＲ（非翻訳領域）、５'ＵＴＲ、アテニュエーター、および、ＧＣボックスから成る群から選択される１または複数の配列の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸。
【請求項１３】
前記ＰＭＰ２２遺伝子の前記核酸配列における配列識別番号１〜６６の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能な、請求項１２に記載のガイド核酸。
【請求項１４】
配列識別番号１から８の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸、配列識別番号１４から２９の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成可能なガイド核酸、および、配列識別番号４１から５３の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸から成る群から選択される１または複数のガイド核酸を含む、請求項１３に記載のガイド核酸。
【請求項１５】
配列識別番号１、３、２５、２７、２８、４１、４４または４５のうち１または複数の標的配列に対して相補結合を形成することが可能である、請求項１３または１４に記載のガイド核酸。
【請求項１６】
前記ガイド核酸は、１８〜２３ｂｐのヌクレオチド分子である、請求項１３から１５のいずれか一項に記載のガイド核酸。
【請求項１７】
ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、開始部位、終結部位、ドナースプライス部位、アクセプタスプライス部位、ポリＡ部位、エンハンサー、３'ＵＴＲ（非翻訳領域）、５'ＵＴＲ、アテニュエーター、および、ＧＣボックスから成る群から選択される１または複数の配列の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸と、
エディタータンパク質またはそれをコードする核酸配列と
を備える遺伝子操作のための組成物。
【請求項１８】
前記ＰＭＰ２２遺伝子の前記核酸配列における配列識別番号１〜６６の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、
エディタータンパク質またはそれをコードする核酸配列と
を備える、請求項１７に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項１９】
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、および、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質を含む、請求項１７または１８に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項２０】
前記遺伝子操作は、
ＳＣ機能制御因子を構成する核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ配列（ＰＡＭ配列）における、または、その５'末端および／または３'末端に隣接する連続する１ｂｐ〜５０ｂｐの塩基配列領域における、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドでの置換、および、１または複数の外来ヌクレオチドの挿入のうち少なくとも１つ、または、
前記ＳＣ機能制御因子を構成する核酸配列における１または複数のヌクレオチドの化学修飾
である、核酸の１または複数の改変を含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項２１】
前記ＰＡＭ配列は、
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
の（５'から３'の方向に記載される）配列のうち１または複数を含む、請求項２０に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項２２】
前記遺伝子操作のための組成物は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態である、請求項１７に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項２３】
前記遺伝子操作のための組成物は、ウイルスベクターのシステムにおいて形成される、請求項１７に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項２４】
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスから選択される１または複数を含む、請求項２３に記載の遺伝子操作のための組成物。
【請求項２５】
（ａ）ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における配列識別番号１〜６６の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列、および、
（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質をそれぞれ含むエディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列
を備える遺伝子操作のためのキット。
【請求項２６】
ＰＭＰ２２の核酸配列における、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、開始部位、終結部位、ドナースプライス部位、アクセプタスプライス部位、ポリＡ部位、エンハンサー、３'ＵＴＲ（非翻訳領域）、５'ＵＴＲ、アテニュエーター、および、ＧＣボックスから成る群から選択される１または複数の配列の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、
エディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列と
を備える、ＳＣ機能不全障害を治療するための組成物。
【請求項２７】
ＰＭＰ２２遺伝子の前記核酸配列における１または複数の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、
エディタータンパク質またはそれをコードする核酸配列と
を備える、請求項２６に記載のＳＣ機能不全障害を治療するための組成物。
【請求項２８】
前記標的配列は、配列識別番号１〜６６の標的配列のうち１または複数の配列である、請求項２６または２７に記載のＳＣ機能不全障害を治療するための組成物。
【請求項２９】
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２６から２８のいずれか一項に記載のＳＣ機能不全障害を治療するための組成物。
【請求項３０】
前記ＳＣ機能不全障害は、ＰＭＰ２２の重複に起因するＰＭＰ２２遺伝子過剰発現により引き起こされるシュワン細胞機能障害である、請求項２６から２９のいずれか一項に記載のＳＣ機能不全障害を治療するための組成物。
【請求項３１】
前記ＳＣ機能不全障害は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジュリーヌ・ソッタス病（ＤＳＳ）、先天性低髄鞘形成ニューロパチー（ＣＨＮ）またはルシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）である、請求項３０に記載のＳＣ機能不全障害を治療するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＣ機能制御のための、および／または、ＳＣ機能障害に起因する疾患の治療または緩和のための、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、ならびに、それらの使用に関する。より具体的には、本発明は、人工的なＳＣ機能制御を実行すること、および／または、ＳＣ機能障害に起因する疾患を治療または緩和することが可能なシステムに関し、当該システムは、ＳＣ機能制御のための、および／または、ＳＣ機能障害に起因する疾患の治療または緩和のための、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子；および／または、ＳＣ機能障害に起因する疾患を治療または緩和するための組成物を備える。
【背景技術】
【０００２】
シュワン細胞（以下、ＳＣとも省略される）または神経髄鞘細胞（ｎｅｕｒｏｌｅｍｍｏｃｙｔｅｓ）は、末梢神経系の主なグリア細胞である。グリア細胞は、神経を支持するように機能し、末梢神経系において、衛星細胞、嗅神経鞘細胞、消化管グリア細胞、パチニ小体などの感覚神経末端に存在するグリア細胞、および同様のものが含まれる。
【０００３】
有髄軸索において、シュワン細胞は髄鞘を形成する。鞘は連続するものではなく、各々のシュワン細胞が、約１００μｍの軸索を包んでいる。隣接するシュワン細胞間の間隙は、ランヴィエ絞輪と呼ばれる。脊椎動物の神経系は、軸索の膜電気容量を維持するために髄鞘で絶縁されている。活動電位は、ランヴィエ絞輪の間で跳躍する。このプロセスを通して、軸索直径を増加させることなく、伝導速度が最大１０倍に増加し、エネルギーが節約され得る。シュワン細胞は、中央神経系において同一の役割を果たす希突起膠細胞と類似し得る。しかしながら、希突起膠細胞とは異なり、シュワン細胞は、１つの軸索のみにおいて髄鞘を形成する。
【０００４】
遺伝性疾患であるシャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）病は、末梢神経系において髄鞘を形成するシュワン細胞の異常に起因して、四肢の筋肉が次第に委縮する疾患である。それらの種類の中で、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）は、末梢神経系において最も頻繁に発生する遺伝性疾患の１つである。動物モデルから取得される情報を用いてＣＭＴ１Ａの遺伝的原因およびＣＭＴ１Ａの解決法を発見するための動物モデルとヒトとの間には、遺伝情報の大きな差異があるので、マッチングにおいて問題がある。
【０００５】
ＣＭＴ１Ａは、すべてのＣＭＴ症例の半分以上、および、ＣＭＴ１症例の約７０％を占め、ＣＭＴの有病率は１／２５００である。ＣＭＴ１Ａは、筋力低下および喪失、反射減弱、肢端触覚異常、肢異常、神経伝導速度（ＮＣＶ）低下、肥大節性脱髄、オニオンバルブのように見える髄鞘再生などの病理学的特徴を示す。
【０００６】
現在、ＣＭＴ１Ａなど、シュワン細胞の機能不全によって引き起こされる疾患に対する根本的な治療剤または治療方法は無い。理学療法、整形外科的な補助、および、整形外科手術を使用して、症状の悪化を部分的に低減するための方法があるだけである。従って、シュワン細胞の機能不全によって引き起こされる疾患に対する根本的な治療方法を開発することについての大きな需要が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この問題を解決するべく、本発明は、ＳＣ機能制御効果が改善された、人工的に操作されたＳＣ機能制御システムに関する。より具体的には、本発明は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、および、ＳＣ機能制御システム（ＳＣ機能制御改変システムとも呼ばれる）に関し、これらは、ＳＣ機能を人工的に制御し、および／または、ＳＣ機能制御因子の発現を改変する。
【０００８】
本発明は、特定の目的のための遺伝的に操作または改変されたＳＣ機能制御因子を提供する。
【０００９】
本発明は、一実施形態として、人工的に操作されたＳＣ機能制御システムを提供することを意図する。
【００１０】
本発明は、一実施形態として、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子改変システムを提供することを意図する。
【００１１】
本発明は、一実施形態として、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、および、それらの発現産物を提供することを意図する。
【００１２】
本発明は、一実施形態として、ＳＣ機能制御因子の操作のために遺伝子を操作するための組成物と、それを使用する方法とを提供することを意図する。
【００１３】
本発明は、一実施形態として、ＳＣ機能を制御するための方法を提供することを意図する。
【００１４】
本発明は、一実施形態として、ＳＣ機能不全関連疾患を治療するための治療または医薬組成物、および、それらの様々な使用を提供することを意図する。
【００１５】
本発明は、一実施形態として、人工的に操作されたＰＭＰ２２のＳＣ機能制御因子、および／または、それらの発現産物を提供することを意図する。
【００１６】
本発明は、一実施形態として、ＰＭＰ２２のＳＣ機能制御因子の人工的操作のための遺伝子操作のための組成物を提供することを意図する。
【００１７】
本発明は、一実施形態として、人工的に操作されたＰＭＰ２２のＳＣ機能制御因子の治療用途、および／または、人工的操作のための遺伝子操作のための組成物を提供することを意図する。
【００１８】
本発明は、一実施形態として、人工的に操作されたＰＭＰ２２のＳＣ機能制御因子の追加的用途、および／または、人工的操作のための遺伝子操作のための組成物を提供することを意図する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
問題を解決するために、本発明は、ＳＣ機能を人工的に制御可能なシステムに関し、当該システムは、ＳＣ機能制御、および／または、ＳＣ機能不全関連疾患の治療もしくは緩和のための人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、および／または、ＳＣ機能制御因子を人工的に操作可能な組成物を備える。
【００２０】
本発明は、特定の目的のための人工的に操作されたＳＣ機能制御因子を提供する。
【００２１】
「ＳＣ機能制御因子」とは、ＳＣ機能制御に直接関与する、または、間接的に影響するすべてのエレメントを指す。この場合、エレメントは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。加えて、ＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞およびグリア細胞、および／または、線維芽細胞の機能制御に直接関与する、または、間接的に影響するすべてのエレメントを含む。
【００２２】
実施形態において、エレメントは、非天然の、すなわち、人工的に操作されたＳＣ機能制御に関与する様々な物質をすべて含む。例えば、エレメントは、シュワン細胞において発現される、遺伝的操作または改変された遺伝子またはタンパク質であり得る。
【００２３】
ＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞、グリア細胞および／または線維芽細胞の増殖を抑制または阻害し得る、または、シュワン細胞の増殖を促進もしくは増加させ得る。
【００２４】
ＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞、グリア細胞および／または線維芽細胞の細胞周期の進行を遮断または停止し得る、または、シュワン細胞の細胞周期の進行を促進し得る。
【００２５】
ＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞、グリア細胞、および／または、線維芽細胞分化を促進もしくは抑制し得る。
【００２６】
ＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞、グリア細胞および／または線維芽細胞の死亡を促進もしくは抑制し得る。
【００２７】
ＳＣ機能制御因子は、末梢神経細胞の生存の補助または干渉を行い得る。
【００２８】
ＳＣ機能制御因子は、末梢神経細胞の維持およびシグナリングの補助または干渉を行い得る。ＳＣ機能制御因子は、神経細胞線維の髄鞘形成を制御し得る。
【００２９】
この場合、髄鞘形成は、髄鞘の生成、髄鞘の変性、髄鞘の再生、髄鞘の維持、および、髄鞘のコンパクトミエリンなど、髄鞘形成の全体のプロセス、ならびに、髄鞘変性または髄鞘の機能に関連するすべての機構を含む。
【００３０】
ＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞の機能異常または欠陥に起因する疾患の緩和および治療に使用され得る。
【００３１】
本発明の一実施形態において、ＳＣ機能制御因子は、例えば、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子であり得る。
【００３２】
本発明の一実施形態において、ＳＣ機能制御因子は、１または複数の人工的に操作された遺伝子を含み得る。例えば、ＰＭＰ２２遺伝子は、人工的に操作され得る。
【００３３】
従って、本発明の一実施形態は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子として、核酸配列において改変を有するＰＭＰ２２遺伝子を提供する。
【００３４】
核酸配列における改変は、これに限定されないが、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体によって人工的に操作され得る。
【００３５】
「ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体」という用語は、ガイド核酸とエディタータンパク質との間の相互作用を通して形成される複合体を指し、核酸タンパク質複合体は、ガイド核酸およびエディタータンパク質を含む。
【００３６】
ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は対象を改変するように機能し得る。対象は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質であり得る。
【００３７】
例えば、遺伝子は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体によって人工的に操作されたＳＣ機能制御因子であり得て、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子は、ＳＣ機能制御因子を構成する核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、または、その５'末端および／または３'末端に隣接する連続する１ｂｐ〜５０ｂｐの塩基配列領域における、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドでの置換、および、１または複数の外来ヌクレオチドの挿入のうち少なくとも１つ、または、ＳＣ機能制御因子を構成する核酸配列における１または複数のヌクレオチドの化学修飾である、核酸の１または複数の改変を含む。核酸の改変は、遺伝子のプロモーター領域において生じ得る。核酸の改変は、遺伝子のエクソン領域において生じ得る。 核酸の改変は、遺伝子のイントロン領域において生じ得る。核酸の改変は、遺伝子のエンハンサー領域において生じ得る。
【００３８】
ＰＡＭ配列は、例えば、以下の（５'から３'の方向に記載される）配列のうち１または複数であり得る。   ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎの各々は、独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）
ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎの各々は、独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎの各々は、独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎの各々は、独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧである）
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
【００３９】
エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカスｓｐ．、スタフィロコッカス・アウレウス 、ノカルジオプシス−ダッソンビエイ、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネ、ストレプトスポランジウム・ロゼウム、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、バチルス・シュードミコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、エクシグオバクテリウム・シビリカム、ラクトバチルス・デルブルエッキイー、ラクトバチルス・サリバリウス、マイクロシーラ・マリナ、バークホルデリア・バクテリウム、ポラロモナス・ナフタレニボランス、ポラロモナスｓｐ．、クロコスファエラ・ワトソニー、クロコスファエラｓｐ．、ミクロキスティス・エルギノーサ、シネココッカスｓｐ．、アセトハロビウム・アラビティカム、アンモニフェックス・デゲンシ、カルディセルロシルプター・ベスシー、カンジダ・デスルフォルディス、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・ディフィシル、フィネゴルディア・マグナ、ナトラナエロビウス・サーモフィルス、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム、アシジチオバシラス・カルダス、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、アロクロマチウム・ビノスム、マリノバクターｓｐ．、ニトロソコッカス・ハロフィラス、ニトロソコッカス・ワトソニイ、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス、クテドノバクター・ラセミファー、メタノハロビウム・エベスチガタム、アナベナ・バリアビリス、ノジュラリア・スプミゲナ、ノストックｓｐ．、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラｓｐ．、リングビアｓｐ．、ミクロコレウス・クソノプラステス、オシキラトリアｓｐ．、ペトロトガ・モビリス、サーモシフォ・アフリカヌス、または、アカリオクロリス・マリナに由来し得る。
【００４０】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数であり得る。例として、エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質またはカンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質であり得る。加えて、別の実施形態において、
【００４１】
本発明は、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、１７番染色体１５，２６７，９７７から１５，２７３，９７７（調節領域）、１７番染色体１５，２２９，７７７から１５，２６５，３２６（コード領域）、または、１７番染色体１５，２６８，１９１から１５，４３７，０４５、１７番染色体１５，２３９，８３３から１５，２５８，６６７、または、１７番染色体１５，３４２，７７０から１５，４３５，６３９（非コード領域）を含む領域の部分を標的化するガイド核酸を提供する。
【００４２】
例示的な実施形態において、本発明は、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、配列識別番号：１〜６６、例えば、配列識別番号：１〜８、１４〜２９、または、４１〜５３の標的配列それぞれとの相補結合を形成可能なガイド核酸を提供する。
【００４３】
ガイド核酸は、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列の一部との相補結合を形態し得る。０〜５、０〜４、０〜３、または、０〜２個のミスマッチを含み得る。例示的な例として、ガイド核酸は、配列識別番号：１〜６６、例えば、配列識別番号：１〜８、１４〜２９、または、４１〜５３の標的配列のうち１または複数それぞれとの相補結合を形成するヌクレオチドであり得る。
【００４４】
例えば、本発明は、以下に記載される群から選択される１または複数のガイド核酸を提供し得る。
【００４５】
ガイド核酸は、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における配列識別番号：１、３、２５、２７、２８、４１、４４、４５および５３の標的配列それぞれとの相補結合を形成可能である。
【００４６】
ガイド核酸は、これに限定されないが、１８〜２５ｂｐ、１８〜２４ｂｐ、１８〜２３ｂｐ、１９〜２３ｂｐ、または、２０〜２３ｂｐのヌクレオチドであり得る。０〜５、０〜４、０〜３、または、０〜２個のミスマッチが生じ得る。
【００４７】
加えて、本発明は、特定の目的のためのＳＣ機能制御因子の人工的操作において採用され得る、遺伝子操作のための組成物を提供する。
【００４８】
別の実施形態において、遺伝子操作のための組成物は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体、または、それをコードする核酸配列を含み得る。
【００４９】
例示的な実施形態として、遺伝子操作のための組成物は、（ａ）ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における１７番染色体１５，２６７，９７７から１５，２７３，９７７（調節領域）、１７番染色体１５，２２９，７７７から１５，２６５，３２６（コード領域）、または、１７番染色体１５，２６８，１９１から１５，４３７，０４５、１７番染色体１５，２３９，８３３から１５，２５８，６６７、または、１７番染色体１５，３４２，７７０から１５，４３５，６３９（非コード領域）を含む領域の部分を標的化するガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、（ｂ）ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における標的部位を切断または改変するために、ガイド核酸との複合体を形成するエディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列とを含み得る。
【００５０】
例示的な実施形態において、遺伝子操作のための組成物は、（ａ）ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、配列識別番号：１〜６６、例えば、配列識別番号：１〜８、１４〜２９、または、４１〜５３の標的配列それぞれとの相補結合を形成可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質それぞれを含むエディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列とを含み得る。
【００５１】
例示的な一実施形態において、ガイド核酸は、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における配列識別番号：１、３、２５、２７、２８、４１、４４、４５および５３の標的配列のうち１または複数それぞれとの相補結合を形成する核酸配列であり得る。例示的な一実施形態において、遺伝子操作のための組成物はウイルスベクターシステムであり得る。
【００５２】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスから成る群から選択される１または複数を含み得る。
【００５３】
更に別の例示的な実施形態において、本発明は、細胞を人工的に操作するための方法を提供し得て、当該方法は、（ａ）ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、１７番染色体１５，２６７，９７７から１５，２７３，９７７（調節領域）、１７番染色体１５，２２９，７７７から１５，２６５，３２６（コード領域）、または、１７番染色体１５，２６８，１９１から１５，４３７，０４５、１７番染色体１５，２３９，８３３から１５，２５８，６６７、または、１７番染色体１５，３４２，７７０から１５，４３５，６３９（非コード領域）を含む領域の部分を標的化するガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、（ｂ）ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における標的部位を切断または改変するために、ガイド核酸との複合体を形成するエディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列とを備え得る。
【００５４】
例示的な実施形態において、本発明は、細胞を人工的に操作するための方法を提供し、当該方法は、（ａ）ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、配列識別番号：１〜６６、例えば、配列識別番号：１〜８、１４〜２９、または、４１〜５３の標的配列それぞれとの相補結合を形成可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質それぞれを含むエディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列とを細胞に導入する段階を含み得る。
【００５５】
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、核酸配列の形態で１または複数のベクターに存在し得る、または、ガイド核酸がエディタータンパク質と結合することにより形成される複合体として存在し得る。導入はインビボまたはエクスビボで実行され得る。
【００５６】
導入は、電気穿孔、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子およびタンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される１または複数の方法によって実行され得る。
【００５７】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスから成る群から選択される１または複数であり得る。
【００５８】
別の例示的な実施形態において、本発明は、ＳＣ機能不全関連疾患および／またはＳＣ機能制御因子関連疾患を治療するための医薬組成物を提供する。
【００５９】
医薬組成物は、ＳＣ機能制御因子の人工的操作において採用され得る遺伝子操作のための組成物を含み得る。遺伝子操作のための組成物の剤型は、上述と同一である。
【００６０】
一実施形態は、ＰＭＰ２２遺伝子のシーケンシングを通じて、対象における、人工的に操作されることが可能な標的位置の配列に関する情報を提供するための方法を提供する。
【００６１】
更に、一実施形態は、当該方法によって提供される情報を使用することによって、ライブラリを構築するための方法を提供する。
【００６２】
一実施形態は、遺伝子操作のためのキットを提供し、当該キットは、（ａ）ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、１７番染色体１５，２６７，９７７から１５，２７３，９７７（調節領域）、１７番染色体１５，２２９，７７７から１５，２６５，３２６（コード領域）、または、１７番染色体１５，２６８，１９１から１５，４３７，０４５、１７番染色体１５，２３９，８３３から１５，２５８，６６７、または、１７番染色体１５，３４２，７７０から１５，４３５，６３９（非コード領域）を含む領域の部分を標的化するガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、（ｂ）ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における標的部位を切断または改変するために、ガイド核酸との複合体を形成するエディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列とを備える。
【００６３】
例示的な実施形態において、本発明は、遺伝子操作のためのキットを提供し、当該キットは、成分として、（ａ）ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、配列識別番号：１〜６６、例えば、配列識別番号：１〜８、１４〜２９、または、４１〜５３の標的配列それぞれとの相補結合を形成可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質それぞれを含むエディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列とを含み得る。目的の遺伝子は、そのようなキットを使用して人工的に操作され得る。
【００６４】
例示的な一実施形態において、本発明は、ＳＣ機能不全障害を治療するための組成物を提供し得て、当該組成物は、ＰＭＰ２２遺伝子における核酸配列における１または複数の標的配列とそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、エディタータンパク質またはそれをコードする核酸配列とを含む。
【００６５】
標的配列は、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、１７番染色体１５，２６７，９７７から１５，２７３，９７７（調節領域）、１７番染色体１５，２２９，７７７から１５，２６５，３２６（コード領域）、または、１７番染色体１５，２６８，１９１から１５，４３７，０４５、１７番染色体１５，２３９，８３３から１５，２５８，６６７、または、１７番染色体１５，３４２，７７０から１５，４３５，６３９（非コード領域）を含む領域の部分であり得る。
【００６６】
標的配列は、配列識別番号：１から６６、例えば、配列識別番号：１〜８、１４〜２９、または、４１〜５３の１または複数の配列であり得る。
【００６７】
例示的な一実施形態において、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質がエディタータンパク質として採用され得る。
【００６８】
一例において、ＳＣ機能不全障害はＳＣ機能制御因子関連疾患であり得る。
【００６９】
一例において、ＳＣ機能制御因子関連疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジュリーヌ・ソッタス病（ＤＳＳ）、先天性低髄鞘形成ニューロパチー（ＣＨＮ）またはルシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）である。
【００７０】
例示的な一実施形態において、本発明は、対象において疾患を治療するためのＳＣ機能制御因子の人工的操作において採用される、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、または、遺伝子操作のための組成物の使用のすべての態様を提供する。
【００７１】
治療のための対象は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類、および同様のものを含む哺乳類であり得る。
【００７２】
［有利な効果］
人工的に操作されたＳＣ機能制御因子およびそれによって機能が人工的に改変されたＳＣ機能制御システムは、例えば、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジュリーヌ・ソッタス病（ＤＳＳ）、先天性低髄鞘形成ニューロパチー（ＣＨＮ）またはルシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）などのＳＣ機能制御因子関連疾患など、ＳＣ機能不全障害の効果的な治療用途に使用され得る。ＳＣ機能制御因子が関与する様々なインビボ機構を通じて、ＳＣ機能制御システムの有効性が改善され得る。例えば、ＰＭＰ２２遺伝子が使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１ａ】ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡを介した遺伝子操作に起因するインデル頻度を図示する結果の組であり、ｓｇＲＮＡの標的部位を区分したうちＣＤＳのインデル頻度を図示する。
【図１ｂ】ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡを介した遺伝子操作に起因するインデル頻度を図示する結果の組であり、ｓｇＲＮＡの標的部位を区分したうちＴＡＴＡボックスのインデル頻度を図示する。
【図１ｃ】ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡを介した遺伝子操作に起因するインデル頻度を図示する結果の組であり、ｓｇＲＮＡの標的部位を区分したうちエンハンサーのインデル頻度を図示する。
【図２ａ】ＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡを介する遺伝子操作に起因するインデル頻度を図示する結果の組であり、ｓｇＲＮＡの標的部位を区分したうちＣＤＳのインデル頻度を図示する。
【図２ｂ】ＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡを介する遺伝子操作に起因するインデル頻度を図示する結果の組であり、ｓｇＲＮＡの標的部位を区分したうちＴＡＴＡボックスのインデル頻度を図示する。
【図２ｃ】ＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡを介する遺伝子操作に起因するインデル頻度を図示する結果の組であり、ｓｇＲＮＡの標的部位を区分したうちエンハンサーのインデル頻度を図示する。
【図３】シュワン様細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の制御因子（調節エレメント）を標的化するＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによる遺伝子操作効果を図示する。
【図４】ヒトＰＭＰ２２のＣＤＳを標的化するＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによって誘導されるフレームシフト変異の比率を図示する。
【図５】デュアルｓｇＲＮＡの処理による、ヒトＰＭＰ２２の調節エレメントについての重要部位の欠失を図示する。
【図６】ヒトシュワン様細胞における、ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるヒトＰＭＰ２２のｍＲＮＡ発現の低下を図示するグラフである。
【図７ａ】ヒト初代培養シュワン細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の各標的部位における、ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の効果的かつ特異的な発現の低下を図示するグラフであり、各標的部位におけるＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるインデル頻度測定結果を図示する。
【図７ｂ】ヒト初代培養シュワン細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の各標的部位における、ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の効果的かつ特異的な発現の低下を示すグラフであり、各標的部位についての、ミエリン化シグナル因子およびＲＮＰ複合体で処理して、または、処理せず、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された、ＰＭＰ２２の相対的なｍＲＮＡ発現の比較結果を図示する（ｎ＝３、一元配置分散分析およびテューキーの事後検定：＊ｐ＜０．０５）。
【図７ｃ】ヒト初代培養シュワン細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の各標的部位における、ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＰＭＰ２２の効果的かつ特異的な発現の低下を示すグラフであり、遠位エンハンサー部位（遠位エンハンサー領域）ＢおよびＣを標的化するＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるインデル頻度測定結果を図示する。
【図８ａ】インビトロでの、ヒトＰＭＰ２２遺伝子のＴＡＴＡボックス部位を標的化するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を通じたＰＭＰ２２の効果的かつ特異的な発現低下を図示するグラフであり、ヒトＰＭＰ２２位置のプロモーター部位を標的化する標的配列を図示する。
【図８ｂ】左のグラフは、ヒト初代培養シュワン細胞において標的ディープシーケンシングを使用したインデル頻度測定結果を図示し、中央のグラフは、総インデル頻度のうちのＴＡＴＡボックス１変異頻度測定結果（ｎ＝３）を図示し、右のグラフは、ＰＭＰ２２の相対的なｍＲＮＡ発現比較結果を図示し、これらは、ヒト初代培養シュワン細胞において、ミエリン化シグナル因子およびＲＮＰ複合体で処理して、または、処理せず、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定される（ｎ＝３、一元配置分散分析およびテューキーの事後検定：＊ｐ＜０．０５）。
【図９ａ】ヒト初代培養シュワン細胞における標的ディープシーケンシングによるインシリコオフターゲット解析を通じて判明した、オフターゲットおよびオンターゲットにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるインデル頻度を図示し、インデル頻度を図示するグラフである。
【図９ｂ】ヒト初代培養シュワン細胞における標的ディープシーケンシングによるインシリコオフターゲット解析を通じて判明した、オフターゲットおよびオンターゲットにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるインデル頻度を図示し、高頻度のインデルパターンを図示する。
【図９ｃ】ヒト初代培養シュワン細胞における標的ディープシーケンシングによるインシリコオフターゲット解析を通じて判明した、オフターゲットおよびオンターゲットにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるインデル頻度を図示し、インシリコオフターゲット解析を通じて判明したオフターゲット位置を示す。
【図１０ａ】ヒトのゲノム全体におけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによって切断される位置を図示する結果の組であり、ゲノム全体のＣｉｒｃｏｓプロットを図示する。
【図１０ｂ】ヒトのゲノム全体におけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによって切断される位置を図示する結果の組であり、インシリコオフターゲット解析を通じて判明した、オフターゲット位置のうちの、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって現れたオフターゲット位置を図示する。
【図１０ｃ】ヒトのゲノム全体におけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによって切断される位置を図示する結果の組であり、オフターゲット位置におけるインデル頻度を図示するグラフである。
【図１１】Ｃ２２マウスにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＡ治療を使用する治療手法を概略的に図示する。
【図１２ａ】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を通じた疾病表現型の緩和を図示する結果の組であり、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で処理した坐骨神経における、標的ディープシーケンシングを使用したインデル頻度を図示するグラフである（ｎ＝３）。
【図１２ｂ】ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を通じた疾病表現型の緩和を図示する結果の組であり、総インデル頻度のうちのＴＡＴＡボックス１変異頻度測定結果である（ｎ＝３）。
【図１２ｃ】ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で処理した坐骨神経からの、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した、ＰＭＰ２２のｍＲＮＡ発現の相対的な量を比較するグラフである。
【図１３ａ】インシリコ解析による、マウスゲノムにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ｓｇＲＮＡのオフターゲット位置およびインデル頻度を図示する結果の組であり、オフターゲット位置を図示する。
【図１３ｂ】インシリコ解析による、マウスゲノムにおけるＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ｓｇＲＮＡのオフターゲット位置およびインデル頻度を図示する結果の組であり、各オフターゲット位置でのインデル頻度を図示するグラフである。
【図１４ａ】ＣＭＴ１Ａマウスにおける、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を通じた疾病表現型の緩和を図示する結果の組であり、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で処理した坐骨神経組織の半薄切片の画像の組である。
【図１４ｂ】ＣＭＴ１Ａマウスにおける、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を通じた疾病表現型の緩和を図示する結果の組であり、上のグラフは、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで治療されたマウスにおいてｇ比が増加することを図示する散乱プロットであり、下のグラフは、ＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理したマウスにおいて有髄軸索の直径が増加することを図示するグラフである。
【図１５ａ】ＣＭＴ１Ａマウスにおける、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を通じた電気生理学変化を図示する結果の組であり、遠位潜時（ＤＬ）の変化を図示するグラフである。
【図１５ｂ】ＣＭＴ１Ａマウスにおける、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を通じた電気生理学変化を図示する結果の組であり、運動神経伝導速度（ＮＣＶ）の変化を図示するグラフである。
【図１５ｃ】ＣＭＴ１Ａマウスにおける、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害を通じた電気生理学変化を図示する結果の組であり、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の変化を図示するグラフである（ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰについてはｎ＝７、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡについてはｎ＝１０）。
【図１６ａ】ＣＭＴ１Ａマウスにおける、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害に起因する運動行動の解析結果の組であり、上のグラフは、ロータロッド試験結果であり（ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰについてはｎ＝７、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡについてはｎ＝１１）、下のグラフは、マウスが８週齢から１６週齢になるまで毎週測定されたロータロッド試験結果である（ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰについてはｎ＝７、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡについてはｎ＝１１）。
【図１６ｂ】ＣＭＴ１Ａマウスにおける、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２の発現阻害に起因する運動行動の解析結果の組であり、上のグラフは、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で処理されたＣ２２マウスの腓腹筋重量／体重の比を図示するグラフであり、下の画像は、ｍＲｏｓａ２６またはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰ複合体で処理されたＣ２２マウスの腓腹筋画像の組である。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
特別の定めのない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の当業者によって一般に理解される意味と同一である。明細書に記載されるものと同様または同一の方法および材料が本発明の実践または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は下に記載される。明細書において言及されるすべての公報、特許出願、特許、および、他の参考文献は、参照によって全体として引用される。加えて、材料、方法および例は、単に例示を目的とし、限定の意図はない。
【００７５】
本発明の態様は、シュワン細胞機能不全の緩和または回復の効果を有する、人工的に操作されたＳＣ機能制御システムに関する。
【００７６】
具体的には、本発明の態様は、ＳＣ機能制御因子を人工的に操作してＳＣ機能制御因子の発現を調節する、または、シュワン細胞の異常な機能を回復することにより、ＳＣ機能制御因子発現障害またはシュワン細胞機能不全関連疾患を緩和または治療することが可能な様々な態様の構成に関する。本発明の態様は、人工的に発現されるＳＣ機能制御因子および／または機能が改変されたＳＣ機能制御因子、それらの調製方法、および、それらを含む組成物、それらの治療用途などを含む。
【００７７】
本発明の別の態様は、人工的に発現されるＳＣ機能制御因子および／または機能が改変されたＳＣ機能制御因子の様々な機能が付随する、第３のインビボ機構を制御するための追加のシステムに関する。
【００７８】
具体的には、本発明の別の態様は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子が関与するミエリン化機能だけでなく、第３のインビボ機能も標的することにより、対応する機構を制御し得る。本発明の別の態様は、人工的に発現されるＳＣ機能制御因子および／または機能が改変されたＳＣ機能制御因子、それらの調製方法、それらを含む組成物、および、第３の機能に関連する疾患を緩和または治療可能なそれらの治療用途などを含む。
【００７９】
［ＳＣ機能］
本発明の一実施形態は、ＳＣ機能制御システムの改善および改変に関する。
【００８０】
「ＳＣ機能制御」は、ＰＭＰ２２遺伝子の機能により影響を受ける、例えば、シュワン細胞、グリア細胞、および／または、線維芽細胞などのＳＣ機能因子の全体機能制御を指し、明細書において、機能は、シュワン細胞、グリア細胞および／または線維芽細胞の増殖、分化および死亡という全体な成長および増殖プロセスを含み、また、シュワン細胞の末梢神経細胞の生存および維持、ならびに、軸索上の髄鞘形成（ミエリン化）などのすべての機能を含む。更に、ＳＣ機能制御は、シュワン細胞、グリア細胞および／または線維芽細胞の全体機能、例えば、細胞増殖および分化から細胞死にわたる成長および増殖プロセス全体の制御を含む。
【００８１】
ＳＣ機能制御は、シュワン細胞、グリア細胞および／または線維芽細胞の増殖を抑制もしくは阻害する、または、シュワン細胞、グリア細胞および／または線維芽細胞の増殖を促進もしくは増加させるすべての機構の制御を含む。
【００８２】
ＳＣ機能制御は、シュワン細胞、グリア細胞および／または線維芽細胞の細胞周期の進行を遮断または停止する、または、シュワン細胞、グリア細胞および／または線維芽細胞の細胞周期の進行を促進するすべての機構の制御を含む。
【００８３】
ＳＣ機能制御は、シュワン細胞の分化、グリア細胞および／または線維芽細胞を促進または抑制するすべての機構の制御を含む。
【００８４】
ＳＣ機能制御は、シュワン細胞、グリア細胞、および／または、線維芽細胞の死亡、例えばアポトーシスを促進または抑制する機構の制御などのすべての機構の制御を含む。
【００８５】
加えて、ＳＣ機能制御は、末梢神経細胞の生存の補助または干渉を行うすべての機構の制御を含む。
【００８６】
ＳＣ機能制御は、末梢神経細胞の維持およびシグナリングの補助または干渉を行うすべての機構を含む。
【００８７】
ＳＣ機能制御は、神経細胞の軸索の髄鞘形成に関与するすべての機構の制御を含む。
【００８８】
この場合、髄鞘形成は、髄鞘の生成、髄鞘の変性、髄鞘の再生、髄鞘の維持、および、髄鞘のコンパクトミエリンなど、髄鞘形成の全体のプロセス、ならびに、髄鞘変性または髄鞘の機能に関連するすべての機構を含む。
【００８９】
更に、ＳＣ機能制御は、線維芽細胞またはグリア細胞の増殖を抑制または阻害する、または、線維芽細胞またはグリア細胞の増殖を促進または増加させる、すべての機構の制御を含む。
【００９０】
ＳＣ機能制御は、線維芽細胞またはグリア細胞の活性に関与するすべての機構の制御を含む。
【００９１】
一実施形態において、ＳＣ機能制御は、ＰＭＰ２２の重複によって引き起こされる疾患の治療または緩和に関与し得る。
【００９２】
例えば、ＳＣ機能制御因子は、例えば、ＰＭＰ２２の発現の（変異を含む）改変によって引き起こされる疾患の治療または緩和に関与し得る。一実施形態において、ＳＣ機能制御は髄鞘形成を制御し得る。
【００９３】
例えば、ＳＣ機能制御因子、例えばＰＭＰ２２の過剰発現は、髄鞘を不安定化させて髄鞘の維持および形成に対する干渉をもたらすことによりニューロパチーを引き起こすという特徴を有するので、ＳＣ機能制御因子の発現の制御を通じたＳＣ機能制御は髄鞘形成を制御し得る。別の実施形態において、ＳＣ機能制御はシュワン細胞の分化を制御し得る。
【００９４】
例えば、ＳＣ機能制御因子、例えばＰＭＰ２２は、シュワン細胞の分化中に発現を増加させるという特徴を有するので、ＳＣ機能制御因子の発現の制御を通じたＳＣ機能制御はシュワン細胞の分化を制御し得る。一実施形態において、ＳＣ機能制御は、神経細胞のシグナリングを制御し得る。
【００９５】
例えば、ＳＣ機能制御因子、例えばＰＭＰ２２の過剰発現は、髄鞘を不安定化させて髄鞘の維持および形成に対する干渉をもたらすことにより、神経細胞のシグナリング、すなわち、伝導速度を低下させるという特徴を有するので、ＳＣ機能制御因子の発現の制御を通じたＳＣ機能制御は髄鞘形成を制御し得る。
【００９６】
［ＳＣ機能制御因子］
ＳＣ機能制御因子  本発明の一実施形態は、人工的に操作または改変されたＳＣ機能制御因子である。
【００９７】
「ＳＣ機能制御因子」とは、ＳＣ機能制御に直接関与する、または、間接的に影響するすべてのエレメントを指す。この場合、エレメントは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【００９８】
実施形態において、エレメントは、非天然の、すなわち、人工的に操作されたＳＣ機能制御に関与する様々な物質をすべて含む。例えば、エレメントは、シュワン細胞において発現される、遺伝的操作または改変された遺伝子またはタンパク質であり得る。
【００９９】
「人工的に操作」という用語は、天然状態に生じる、そのまま存在する状態ではない、人工的に改変された状態を指す。
【０１００】
「遺伝的操作」というという用語は、本発明において言及される生物または非生物由来の材料を人工的な遺伝子改変の対象とする操作が実行される場合を指し、例えば、特定の目的のためにゲノムが人工的に改変される遺伝子および／または遺伝子産物（ポリペプチドおよびタンパク質など）であり得る。
【０１０１】
好ましい例において、本発明は、特定の目的のために遺伝的に操作または改変されたＳＣ機能制御因子を提供する。
【０１０２】
以下では、列挙された機能を有する遺伝子またはタンパク質は、１つの種類のＳＣ機能制御関連機能だけでなく、複数の機能も有し得る。更に、本発明は、必要な場合、２つ以上のＳＣ機能制御関連機能および因子を提供し得る。
【０１０３】
ＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞の増殖を抑制または阻害し得る、または、シュワン細胞の増殖を促進または増加させ得る。
【０１０４】
ＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞の細胞周期の進行を遮断または停止し得る、または、シュワン細胞の細胞周期の進行を促進し得る。ＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞の分化を促進または抑制し得る。ＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞の死亡を促進または抑制し得る。
【０１０５】
ＳＣ機能制御因子は、末梢神経細胞の生存の補助または干渉を行い得る。
【０１０６】
ＳＣ機能制御因子は、末梢神経細胞の維持およびシグナリングの補助または干渉を行い得る。ＳＣ機能制御因子は、神経細胞線維の髄鞘形成を制御し得る。
【０１０７】
この場合、髄鞘形成は、髄鞘の生成、髄鞘の変性、髄鞘の再生、髄鞘の維持、および、髄鞘のコンパクトミエリンなど、髄鞘形成の全体のプロセス、ならびに、髄鞘変性または髄鞘の機能に関連するすべての機構を含む。
【０１０８】
ＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞の機能異常または欠陥に起因する疾患の緩和および治療に使用され得る。
【０１０９】
更に、ＳＣ機能制御因子は、線維芽細胞またはグリア細胞の増殖を抑制または阻害する、または、線維芽細胞またはグリア細胞の増殖を促進または増加させる、すべての機構を制御し得る。
【０１１０】
ＳＣ機能制御因子は、線維芽細胞またはグリア細胞の活性に関与するすべての機構を制御し得る。実施形態において、ＳＣ機能制御因子はＰＭＰ２２であり得る。任意の実施形態において、ＳＣ機能制御因子はＰＭＰ２２であり得る。
【０１１１】
末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子は、ＧＡＳ３またはＧＡＳ−３とも呼ばれるＰＭＰ２２タンパク質をコードする遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または、ｍＲＮＡ）を指す。一例において、ＰＭＰ２２遺伝子は、これらに限定されないが、ヒトＰＭＰ２２をコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００２９５．１、ＮＰ＿００１２６８３８４．１、ＮＰ＿００１２６８３８５．１、ＮＰ＿００１３１７０７２．１、ＮＰ＿６９６９９６．１、ＮＰ＿６９６９９７．１など）から成る群から選択される１または複数、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００３０４．３、ＮＭ＿００１２８１４５５．１、ＮＭ＿００１２８１４５６．１、ＮＭ＿００１３３０１４３．１、ＮＭ＿１５３３２１．２、ＮＭ＿１５３３２２．２などによって表されるＰＭＰ２２遺伝子であり得る。
【０１１２】
末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）は、ミエリンの２２ｋＤａの膜貫通糖タンパク質であり、ＰＭＰ２２は、末梢神経系のミエリンを形成するシュワン細胞において発現し、コンパクトミエリンの形成および維持において重要な役割を果たす。ＰＭＰ２２遺伝子は、ヒト染色体１７ｐ１１．２−ｐ１２にマッピングされ、ＰＭＰ２２糖タンパク質の生成をコードする。ＰＭＰ２２遺伝子発現の改変は、遺伝性脱髄末梢神経ニューロパチーに関連し、髄鞘の異常な合成および機能を引き起こす。ＰＭＰ２２の重複に起因するＰＭＰ２２の発現増加は、疾患を引き起こす最も一般的な機構である。
【０１１３】
ＰＭＰ２２の点突然変異またはフレームシフト変異は、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）を引き起こし、ミスセンス変異は、デジュリーヌ・ソッタス症候群（ＤＳＳ）および先天性低髄鞘形成ニューロパチー（ＣＨＮ）と呼ばれる様々な種類のＣＭＴを引き起こす。更に、ルシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）はＰＭＰ２２の重複により引き起こされ、一般に、ＣＭＴ１Ａの表現型バリアントとみなされる。
【０１１４】
ＳＣ機能制御因子は、ヒトおよびサルなどの霊長類、ラットおよびマウスなどの齧歯類などを含む哺乳類に由来し得る。
【０１１５】
遺伝子情報は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなど、既知のデータベースから取得され得る。
【０１１６】
本発明の一実施形態として、ＳＣ機能制御因子、例えばＰＭＰ２２は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子であり得る。
【０１１７】
任意の実施形態において、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子は遺伝的に操作され得る。
【０１１８】
遺伝子操作または遺伝子改変は、野性型遺伝子のゲノム配列の部分的または全体的領域において挿入、欠失、置換または逆位変異を人工的に引き起こすことによって取得され得る。加えて、遺伝子操作または遺伝子改変は、２つ以上の操作または改変された遺伝子を融合することによっても取得され得る。
【０１１９】
例えば、遺伝子は、遺伝子操作または遺伝子改変によって不活性化され、その結果、その遺伝子によってコードされるタンパク質は、固有の機能を有するタンパク質の形態で発現しないことがあり得る。
【０１２０】
例えば、遺伝子は更に、遺伝子操作または遺伝子改変によって活性化され得て、その結果、その遺伝子によってコードされるタンパク質は、固有の機能と比較して改善された機能を有するタンパク質の形態で発現する。例として、特定の遺伝子によってコードされるタンパク質の機能がＡであるとき、操作された遺伝子によって発現されるタンパク質の機能はＡとまったく異なり得る、または、Ａを含む追加の機能（Ａ＋Ｂ）を有し得る。
【０１２１】
例えば、２種類以上のタンパク質の融合物が、遺伝子操作または遺伝子改変に起因して異なるまたは相補的機能を有する２以上の遺伝子を使用して発現され得る。
【０１２２】
例えば、２種類以上のタンパク質は、遺伝子操作または遺伝子改変に起因して異なるまたは相補的な機能を有する２以上の遺伝子を使用することによって細胞において別個にまたは独立して発現され得る。
【０１２３】
操作されたＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞の増殖を抑制または阻害し得る、または、シュワン細胞の増殖を促進または増加させ得る。
【０１２４】
操作されたＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞の細胞周期の進行を遮断または停止し得る、または、シュワン細胞の細胞周期の進行を促進し得る。
【０１２５】
操作されたＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞の分化を促進または抑制し得る。操作されたＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞の死亡を促進または抑制し得る。
【０１２６】
操作されたＳＣ機能制御因子は、末梢神経細胞の生存の補助または干渉を行い得る。
【０１２７】
操作されたＳＣ機能制御因子は、末梢神経細胞の維持およびシグナリングの補助または干渉を行い得る。
【０１２８】
操作されたＳＣ機能制御因子は、神経細胞線維の髄鞘形成を制御し得る。
【０１２９】
この場合、髄鞘形成は、髄鞘の生成、髄鞘の変性、髄鞘の再生、髄鞘の維持、および、髄鞘のコンパクトミエリンなど、髄鞘形成の全体のプロセス、ならびに、髄鞘変性または髄鞘の機能に関連するすべての機構を含む。
【０１３０】
操作されたＳＣ機能制御因子は、シュワン細胞の機能異常または欠陥に起因する疾患の緩和および治療に使用され得る。
【０１３１】
更に、操作されたＳＣ機能制御因子は、線維芽細胞またはグリア細胞の増殖を抑制または阻害する、または、線維芽細胞またはグリア細胞の増殖を促進または増加させる、すべての機構を制御し得る。
【０１３２】
操作されたＳＣ機能制御因子は、線維芽細胞またはグリア細胞の活性に関与するすべての機構を制御し得る。
【０１３３】
操作は、ＳＣ機能制御因子のすべての構造または機能改変を含む。
【０１３４】
ＳＣ機能制御因子の構造的改変は、天然状態に存在する野性型と同一ではないすべての改変を含む。
【０１３５】
例えば、ＳＣ機能制御因子がＤＮＡまたはＲＮＡ遺伝子であるとき、構造的改変は、１または複数のヌクレオチドが失われた構造的改変であり得る。
【０１３６】
構造的改変は、１または複数のヌクレオチドが挿入された構造的改変であり得る。
【０１３７】
この場合、挿入されたヌクレオチドは、ＳＣ機能制御因子を含む対象から、または、対象の外から導入されたすべてのヌクレオチドを含む。
【０１３８】
構造的改変は、１または複数のヌクレオチドが置換される構造的改変であり得る。構造的改変は、１または複数のヌクレオチドの化学修飾を含み得る。
【０１３９】
この場合、化学修飾は、官能基の追加、除去、または置換のすべてを含む。
【０１４０】
別の例として、ＳＣ機能制御因子がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であるとき、構造的改変は、１または複数のアミノ酸が失われた構造的改変であり得る。
【０１４１】
構造的改変は、１または複数のアミノ酸が挿入された構造的改変であり得る。
【０１４２】
この場合、挿入されたアミノ酸は、ＳＣ機能制御因子を含む対象から、または、対象の外から導入されたすべてのアミノ酸を含む。
【０１４３】
構造的改変は、１または複数のアミノ酸が置換される構造的改変であり得る。構造的改変は、１または複数のアミノ酸の化学修飾を含み得る。
【０１４４】
この場合、化学修飾は、官能基の追加、除去または置換のすべてを含む。
【０１４５】
構造的改変は、別のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の一部または全部が取り付けられる構造的改変であり得る。
【０１４６】
この場合、他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ＳＣ機能制御因子であり得る、または、別の機能を実行するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０１４７】
ＳＣ機能制御因子の機能改変は、天然状態に存在する野性型と比較して改善された機能または低下した機能、または、第３の異なる機能を有するすべての改変を含む。
【０１４８】
例えば、ＳＣ機能制御因子がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であるとき、機能改変はＳＣ機能制御因子の変異であり得る。
【０１４９】
この場合、変異は、ＳＣ機能制御因子の機能が改善または阻害される変異であり得る。
【０１５０】
機能改変は、ＳＣ機能制御因子の機能が追加される機能改変であり得る。
【０１５１】
この場合、追加された機能は、同一の機能または異なる機能であり得る。更に、機能が追加されるＳＣ機能制御因子は、他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合され得る。
【０１５２】
機能改変は、ＳＣ機能制御因子の発現の増加に起因する機能の増加であり得る。
【０１５３】
機能改変は、ＳＣ機能制御因子の発現の低下に起因する機能の低下であり得る。
【０１５４】
機能改変は、ＳＣ機能制御因子の発現の低下に起因する機能の回復であり得る。
【０１５５】
一実施形態として、ＳＣ機能制御因子は、ＳＣ機能制御因子、すなわち、操作される遺伝子（以下、標的遺伝子と呼ばれる）の全体的または部分的欠失、例えば、標的遺伝子の１〜３０ｂｐ、１〜２７ｂｐ、１〜２５ｂｐ、１〜２３ｂｐ、１〜２０ｂｐ、１〜１５ｂｐ、１〜１０ｂｐ、１〜５ｂｐ、１〜３ｂｐ、または１ｂｐヌクレオチドの欠失と、野性型とは異なるヌクレオチドによる、標的遺伝子のうちの、１ｂｐ以上の長さのヌクレオチド、例えば、１〜３０ｂｐ、１〜２７ｂｐ、１〜２５ｂｐ、１〜２３ｂｐ、１〜２０ｂｐ、１〜１５ｂｐ、１〜１０ｂｐ、１〜５ｂｐ、１〜３ｂｐまたは１ｂｐヌクレオチドの置換と、標的遺伝子の任意の位置への１ｂｐ以上のヌクレオチド、例えば、１〜３０ｂｐ、１〜２７ｂｐ、１〜２５ｂｐ、１〜２３ｂｐ、１〜２０ｂｐ、１〜１５ｂｐ、１〜１０ｂｐ、１〜５ｂｐ、１〜３ｂｐまたは１ｂｐヌクレオチド（各々はＡ、Ｔ、ＣおよびＧから独立して選択される）の挿入とのうち１または複数によって誘導され得る。
【０１５６】
標的遺伝子の改変部分（標的領域）は、遺伝子の１ｂｐ以上、３ｂｐ以上、５ｂｐ以上、７ｂｐ以上、１０ｂｐ以上、１２ｂｐ以上、１５ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、または２０ｂｐ以上、例えば、１ｂｐ〜３０ｂｐ、３ｂｐ〜３０ｂｐ、５ｂｐ〜３０ｂｐ、７ｂｐ〜３０ｂｐ、１０ｂｐ〜３０ｂｐ、１２ｂｐ〜３０ｂｐ、１５ｂｐ〜３０ｂｐ、１７ｂｐ〜３０ｂｐ、２０ｂｐ〜３０ｂｐ、１ｂｐ〜２７ｂｐ、３ｂｐ〜２７ｂｐ、５ｂｐ〜２７ｂｐ、７ｂｐ〜２７ｂｐ、１０ｂｐ〜２７ｂｐ、１２ｂｐ〜２７ｂｐ、１５ｂｐ〜２７ｂｐ、１７ｂｐ〜２７ｂｐ、２０ｂｐ〜２７ｂｐ、１ｂｐ〜２５ｂｐ、３ｂｐ〜２５ｂｐ、５ｂｐ〜２５ｂｐ、７ｂｐ〜２５ｂｐ、１０ｂｐ〜２５ｂｐ、１２ｂｐ〜２５ｂｐ、１５ｂｐ〜２５ｂｐ、１７ｂｐ〜２５ｂｐ、２０ｂｐ〜２５ｂｐ、１ｂｐ〜２３ｂｐ、３ｂｐ〜２３ｂｐ、５ｂｐ〜２３ｂｐ、７ｂｐ〜２３ｂｐ、１０ｂｐ〜２３ｂｐ、１２ｂｐ〜２３ｂｐ、１５ｂｐ〜２３ｂｐ、１７ｂｐ〜２３ｂｐ、２０ｂｐ〜２３ｂｐ、１ｂｐ〜２０ｂｐ、３ｂｐ〜２０ｂｐ、５ｂｐ〜２０ｂｐ、７ｂｐ〜２０ｂｐ、１０ｂｐ〜２０ｂｐ、１２ｂｐ〜２０ｂｐ、１５ｂｐ〜２０ｂｐ、１７ｂｐ〜２０ｂｐ、２１ｂｐ〜２５ｂｐ、１８ｂｐ〜２２ｂｐまたは２１ｂｐ〜２３ｂｐの連続する塩基配列部位であり得る。
【０１５７】
一方、本発明の異なる実施形態は、機能が人工的に改変された、上述のＳＣ機能制御因子の様々な機能が付随する、第３のインビボ機構を制御するための追加のシステムに関する。一実施形態として、ＰＭＰ２２は、第３のインビボ機構の制御に関与し得る。
【０１５８】
多くの研究から、ＰＭＰ２２の発現が腫瘍細胞において増加すること（これは、ＰＭＰ２２の発現が様々な癌疾患における腫瘍細胞の増殖関連機構に影響することを意味する）が確認されているので、例えば、ＰＭＰ２２の発現の阻害、または、ＰＭＰ２２を非活性化するための操作により、人工的に操作されたＰＭＰ２２は、様々な腫瘍（例えば、乳癌、胃癌、膵癌など）の細胞の増殖を抑制または阻害し得る。加えて、人工的に操作されたＰＭＰ２２により、様々な癌疾患の進行または転移を抑制または阻害する、または、癌疾患を緩和または治療する効果を提供することが可能である。
【０１５９】
上述のように、本発明の人工的に操作された例示的な因子は、ＳＣ機能を制御し得て、第３のインビボ機能を標的化することにより、対応する機構を制御し得る。本発明の実施形態は、機能が人工的に改変されたＳＣ機能制御因子、それらの調製方法、それらを含む組成物、第３の機能に関連する疾患を緩和または治療が可能なそれらの治療用途などを含む。
【０１６０】
［ＳＣ機能制御システム］
本発明の一実施形態は、ＳＣ機能制御因子を人工的に操作することによりＳＣ機能を制御するＳＣ機能制御システムである。
【０１６１】
本発明の「ＳＣ機能制御システム」は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子の発現の変更および／または機能の変化による、ＳＣ機能の促進、増加、阻害、抑制および／または正常機能回復に影響するすべての現象を含む用語であり、ＳＣ機能制御システムに直接的または間接的に関与するすべての材料、組成物、方法および使用を含む。
【０１６２】
ＳＣ機能制御システムを構成するそれぞれのエレメントは、ＳＣ機能制御エレメントとも総称される。
【０１６３】
更に、ＳＣ機能制御システムは、ＳＣ機能制御因子を人工的に操作することにより、発現が改変された、および／または、機能が改変されたＳＣ機能制御改変システムを含む。
【０１６４】
「ＳＣ機能制御因子改変システム」は、対象のゲノムに存在する、または、外から導入された、ＳＣ機能制御因子の転写と、転写された遺伝情報（例えばｍＲＮＡ）からタンパク質として発現される全体的なＳＣ機能制御因子の発現の改変、すなわち、発現の低下、発現の増加、および、発現の維持などのプロセスと、それらの産物とをまとめて指す。
【０１６５】
加えて、「ＳＣ機能制御因子改変システム」は、ＳＣ機能制御因子の変異による、正常なＳＣ機能制御因子の発現および／または機能に対する干渉、または、正常なＳＣ機能制御因子の変異、異常なＳＣ機能制御因子、および、人工的に改変されたＳＣ機能制御因子の発現など、正常なＳＣ機能制御因子の発現の全体のプロセス、および、それらの産物も含む。
【０１６６】
一実施形態として、本発明のシステムは、ＳＣ機能制御エレメントとして、ＳＣ機能制御因子、すなわち、ＰＭＰ２２改変システムを含み、この場合、ＳＣ機能制御因子、すなわち、ＰＭＰ２２は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子を含む。
【０１６７】
「ＰＭＰ２２改変システム」は、対象のゲノムに存在する、または、外から導入された、ＰＭＰ２２遺伝子の転写と、転写された遺伝情報（例えばｍＲＮＡ）からタンパク質として発現される全体的なＰＭＰ２２の発現の改変、すなわち、発現の低下、発現の増加、および、発現の維持などのプロセスと、それらの産物とをまとめて指す。
【０１６８】
加えて、「ＰＭＰ２２改変システム」はまた、ＰＭＰ２２の変異による、正常なＰＭＰ２２の発現および／または機能に対する干渉、または、ＰＭＰ２２の変異、異常なＰＭＰ２２および人工的に改変されたＰＭＰ２２の発現など、正常なＰＭＰ２２の発現の全体のプロセス、および、それらの産物を含む。
【０１６９】
ＰＭＰ２２改変システムでは、人工的に操作されたＰＭＰ２２によって、任意の実施形態において、ＰＭＰ２２の発現が増加または促進され得る。任意の実施形態において、ＰＭＰ２２の発現は阻害または抑制され得る。
【０１７０】
例えば、ＰＭＰ２２遺伝子が重複および過剰発現するとき、発現は、人工的に操作されたＰＭＰ２２により、正常な発現量まで抑制または減少され得る。任意の実施形態において、ＰＭＰ２２の機能は強化または促進され得る。任意の実施形態において、ＰＭＰ２２の機能は低下または抑制され得る。
【０１７１】
更に、ＰＭＰ２２改変システムでは、人工的に操作されたＰＭＰ２２により、任意の実施形態において、シュワン細胞の増殖が抑制または阻害され得る、または、シュワン細胞の増殖が促進または増加され得る。
【０１７２】
任意の実施形態では、シュワン細胞の細胞周期の進行は遮断または停止され得る、または、シュワン細胞の細胞周期の進行は促進され得る。任意の実施形態において、シュワン細胞の分化は促進または抑制され得る。任意の実施形態において、シュワン細胞の死亡は促進または抑制され得る。任意の実施形態において、末梢神経細胞の生存の補助または干渉が行われ得る。
【０１７３】
任意の実施形態において、末梢神経細胞の維持およびシグナリングの補助または干渉が行われ得る。任意の実施形態において、神経細胞線維の髄鞘形成は制御され得る。
【０１７４】
この場合、髄鞘形成は、髄鞘の生成、髄鞘の変性、髄鞘の再生、髄鞘の維持、および、髄鞘のコンパクトミエリンなど、髄鞘形成の全体のプロセス、ならびに、髄鞘変性または髄鞘の機能に関連するすべての機構を含む。
【０１７５】
任意の実施形態において、シュワン細胞の機能異常または欠陥に起因する疾患の緩和および治療のために使用されることが可能である。
【０１７６】
一実施形態において、線維芽細胞またはグリア細胞の増殖を抑制または阻害するすべての機構を制御する、または、線維芽細胞またはグリア細胞の増殖を促進または増加することが可能である。
【０１７７】
任意の実施形態において、線維芽細胞またはグリア細胞の活性に関与するすべての機構を制御することが可能である。
【０１７８】
任意の実施形態において、対応する機構は、ＰＭＰ２２が関与する第３のインビボ機能を標的化することにより制御され得る。
【０１７９】
実施形態において、本発明のＳＣ機能制御システムは、ＳＣ機能制御エレメントとしてＳＣ機能制御因子を操作するための組成物を含む。
【０１８０】
実施形態において、本発明のＳＣ機能制御因子改変システムは、ＳＣ機能制御因子を操作するための組成物を含む。
【０１８１】
操作のための組成物は、ＳＣ機能制御因子、好ましくは、遺伝子操作のための組成物を人工的に操作可能な組成物であり得る。以下、遺伝子操作のための組成物を記載する。
【０１８２】
［ＳＣ機能制御因子を操作するための組成物］
本発明のＳＣ機能制御因子および（ＳＣ機能制御因子改変システムを含む）ＳＣ機能制御システムに関与する材料の操作または改変は、好ましくは遺伝子操作によって達成され得る。
【０１８３】
一態様において、遺伝子を操作するための組成物および方法は、ＳＣ機能制御因子の調節領域、非コード領域またはコード領域の一部または全部を標的化することによって提供され得る。
【０１８４】
組成物および方法については、実施形態において、（ＳＣ機能制御因子改変システムを含む）標的ＳＣ機能制御システムの形成に関与するＳＣ機能制御遺伝子のうち１または複数は、標的ＳＣ機能制御システムの形成のために操作または改変され得る。操作または改変は、遺伝子を構成する核酸の改変を通じて達成され得る。操作結果として、ノックダウン、ノックアウトおよびノックインのすべての形態が含まれる。
【０１８５】
実施形態において、調節領域、非コード領域またはコード領域の全部または一部が標的として使用され得る。
【０１８６】
任意の実施形態において、ＳＣ機能制御遺伝子を構成する核酸の中の調節領域が操作標的として使用され得る。
【０１８７】
例えば、近位プロモーター、エンハンサー、ＴＡＴＡボックス、および、イニシエーターの調節エレメントなどの部分的または全体的配列が標的として使用され得る。具体例として、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、開始部位、終結部位、ドナースプライス部位、アクセプタスプライス部位、ポリＡ部位、エンハンサー、３'−非翻訳領域（ＵＴＲ）、５'−ＵＴＲ、アテニュエーターおよびＧＣボックスの部分的または全体的配列が標的として使用され得る。
【０１８８】
任意の実施形態において、エンハンサー部位（例えば、ＥＧＲ２−、ＳＯＸ１０−、または、ＴＥＡＤ１−結合部位）、または、遠位エンハンサー部位（遠位エンハンサー領域）は、ＳＣ機能制御遺伝子を構成する核酸配列の中で標的化され得る。
【０１８９】
任意の実施形態において、ＳＣ機能制御遺伝子を構成する核酸の中のコード領域は操作標的として使用され得る。
【０１９０】
例えば、イントロンまたはエクソン配列が標的として使用され得る。加えて、コード配列、例えば、コード領域、初期コード領域は、発現およびノックアウトの変化のために標的化され得る。
【０１９１】
実施形態において、核酸の改変は、１ｂｐ以上のヌクレオチド、例えば、１〜３０ｂｐ、１〜２７ｂｐ、１〜２５ｂｐ、１〜２３ｂｐ、１〜２０ｂｐ、１〜１５ｂｐ、１〜１０ｂｐ、１〜５ｂｐ、１〜３ｂｐまたは１ｂｐヌクレオチドの置換、欠失、および／または、挿入であり得る。
【０１９２】
実施形態において、１または複数のＳＣ機能制御遺伝子のノックアウト、１または複数の遺伝子の発現の除去、または、１、２、もしくは３つの対立遺伝子のノックアウトのために、上述の領域が標的化され得て、その結果、１または複数のＳＣ機能制御遺伝子は欠失または変異を含む。
【０１９３】
例示的な実施形態において、遺伝子のノックダウンは、望ましくない対立遺伝子またはトランスクリプトームの発現を減少させるために使用され得る。
【０１９４】
実施形態において、遺伝子のノックダウンは、調節領域、非コード領域またはコード領域の一部または全部を標的化することによって、シュワン細胞の機能に影響するＳＣ機能制御遺伝子を変更するために使用され得る。
【０１９５】
実施形態において、ＳＣ機能制御遺伝子の活性が制御され得て、例えば、遺伝子の核酸の変化によって活性化または不活性化され得る。更に、シュワン細胞の機能は、遺伝子の核酸の変化によって活性化または不活性化され得る。
【０１９６】
実施形態において、遺伝子の核酸の改変は、一本鎖または二本鎖の切断、すなわち、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体による、標的遺伝子における特異的部位での核酸鎖の切断を触媒し得て、標的遺伝子の不活性化をもたらす。
【０１９７】
実施形態において、核酸鎖の切断は、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの機構を通じて修復され得る。
【０１９８】
この場合、ＮＨＥＪ機構が発生するとき、切断部位においてＤＮＡ配列の変化が誘導され得て、遺伝子の不活性化をもたらす。ＮＨＥＪによる修復は、短い遺伝子断片の置換、挿入または欠失を引き起こし得て、対応する遺伝子のノックアウトまたはノックダウンの誘導において使用され得る。更に、シュワン細胞の機能、および／または、その作用機構は、ＳＣ機能制御遺伝子のノックアウトまたはノックダウンの誘導によって影響され得る。
【０１９９】
別の態様において、本発明は、ＳＣ機能制御因子を操作するための組成物を提供する。
【０２００】
操作のための組成物は、ＳＣ機能制御因子、好ましくは、遺伝子操作のための組成物を人工的に操作可能な組成物であり得る。
【０２０１】
組成物は、標的ＳＣ機能制御システムの形成のために、（ＳＣ機能制御因子改変システムを含む）標的ＳＣ機能制御システムの形成に関与するＳＣ機能制御遺伝子のうち１または複数の遺伝子操作に採用され得る。遺伝子操作は、遺伝子発現制御プロセスを考慮して実行され得る。
【０２０２】
例示的な実施形態において、遺伝子操作は、転写、ＲＮＡプロセシング、ＲＮＡ輸送、ＲＮＡ分解、翻訳、および、タンパク質改変制御ステップの各ステップのための適切な操作手段を選択することによって実行され得る。
【０２０３】
実施形態において、スモールＲＮＡ（ｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＲＮＡサイレンシングを使用して、ｍＲＮＡを分解する、または、それらの安定性を低減し、いくつかの場合、ｍＲＮＡを破壊してタンパク質合成情報の移入に干渉し、遺伝情報の発現の制御をもたらす。
【０２０４】
遺伝子操作は、ＳＣ機能制御因子を構成する核酸の改変により実行され得る。操作結果は、ノックダウン、ノックアウトおよびノックインのすべての形態が含まれる。
【０２０５】
任意の実施形態において、核酸の改変は、１ｂｐ以上のヌクレオチド、例えば、１〜３０ｂｐ、１〜２７ｂｐ、１〜２５ｂｐ、１〜２３ｂｐ、１〜２０ｂｐ、１〜１５ｂｐ、１〜１０ｂｐ、１〜５ｂｐ、１〜３ｂｐまたは１ｂｐヌクレオチドの置換、欠失、および／または、挿入であり得る。
【０２０６】
任意の実施形態において、１または複数のＳＣ機能制御因子のノックアウト、１または複数の因子の発現の除去、または、１、２もしくは３つの対立遺伝子のノックアウトのために、遺伝子が操作され得て、その結果、１または複数のＳＣ機能制御因子は欠失または変異を含む。
【０２０７】
任意の実施形態において、ＳＣ機能制御因子のノックダウンは、望ましくない対立遺伝子またはトランスクリプトームの発現を低下させるために使用され得る。
【０２０８】
任意の実施形態において、核酸の改変は、１または複数の核酸断片または遺伝子の挿入であり得る。この場合、核酸断片は、１または複数のヌクレオチドから成る核酸配列であり得て、核酸断片の長さは、１〜４０ｂｐ、１〜５０ｂｐ、１〜６０ｂｐ、１〜７０ｂｐ、１〜８０ｂｐ、１〜９０ｂｐ、１〜１００ｂｐ、１〜５００ｂｐまたは１〜１，０００ｂｐであり得る。この場合、挿入遺伝子は、異なる機能を有するＳＣ機能制御因子または遺伝子の１つであり得る。
【０２０９】
実施形態において、核酸の改変は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子における核酸、好ましくはＤＮＡ分子間の結合の加水分解（切断）を触媒可能な野性型またはバリアント酵素を採用し得る。核酸の改変は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体を採用し得る。
【０２１０】
例えば、遺伝子は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃａｓ９タンパク質）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（Ｃｐｆ１タンパク質）、および、ＴＡＬＥヌクレアーゼから成る群から選択される１または複数のヌクレアーゼを使用して操作され得て、それにより、遺伝情報の発現を制御する。
【０２１１】
任意の実施形態において、遺伝子操作は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体、例えば、これに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）によって媒介され得る。
【０２１２】
この場合、ＮＨＥＪ機構が発生するとき、切断部位においてＤＮＡ配列の変化が誘導され得て、遺伝子の不活性化、または、その発現の阻害をもたらす。ＮＨＥＪによる修復は、短い遺伝子断片の置換、挿入または欠失を引き起こし得て、対応する遺伝子のノックアウトまたはノックダウンの誘導において使用され得る。別の態様において、本発明は遺伝子操作部位を提供し得る。
【０２１３】
実施形態において、遺伝子がＮＨＥＪを介した変更によって変更されるとき、遺伝子操作部位は、ＳＣ機能制御遺伝子産物の発現の低下または除去を引き起こす、遺伝子における部位を指す。例えば、当該部位は、初期コード領域にあり得る。当該部位はプロモーター配列であり得る。当該部位はエンハンサー配列であり得る。当該部位は特異的イントロン配列であり得る。当該部位は特異的エクソン配列であり得る。
【０２１４】
一実施形態として、ＳＣ機能制御因子を操作するための組成物は、操作対象として、シュワン細胞の機能に影響するＰＭＰ２２遺伝子を標的化し得る。
【０２１５】
標的部位、すなわち、遺伝子操作が生じる、または、遺伝子操作のために認識される部位の標的配列の例は、表１、表２、表３、表４、表５、表６および表７にまとめられている。標的配列は１または複数の遺伝子を標的化し得る。
【０２１６】
標的配列は２以上の遺伝子を同時に標的化し得る。この場合、２以上の遺伝子は、相同遺伝子または異種遺伝子であり得る。遺伝子は１または複数の標的配列を含み得る。遺伝子は、２つ以上の標的配列で同時に標的化され得る。
【０２１７】
遺伝子は、標的配列の数に応じて、遺伝子操作の位置および数が変更され得る。
【０２１８】
遺伝子操作は、標的配列の数および位置に応じて様々な方式で設計され得る。
【０２１９】
遺伝子操作は、２つ以上の標的配列において同時に生じ得る。この場合、２つ以上の標的配列は、相同遺伝子または異種遺伝子に存在し得る。
【０２２０】
遺伝子操作は、２以上の遺伝子について同時に実行され得る。この場合、２以上の遺伝子は、相同遺伝子または異種遺伝子であり得る。
【０２２１】
以下、本発明の一実施形態において使用され得る標的配列の例が以下の表において示される。
表１．ＰＭＰ２２遺伝子のコード配列に関するＳｐＣａｓ９の標的配列
表２．ＰＭＰ２２遺伝子のコード配列に関するＣｊＣａｓ９の標的配列
表３．ＰＭＰ２２遺伝子のプロモーター配列に関するＳｐＣａｓ９の標的配列
表４．ＰＭＰ２２遺伝子のプロモーター配列に関するＣｊＣａｓ９の標的配列
表５．ＰＭＰ２２遺伝子のエンハンサー配列に関するＳｐＣａｓ９の標的配列
表６．ＰＭＰ２２遺伝子のエンハンサー配列に関するＣｊＣａｓ９のための標的配列
表７．ＰＭＰ２２遺伝子の遠位エンハンサー領域ＢおよびＣに関するＳｐＣａｓ９の標的配列
［表１］
【表１】
2019537446.tif 000003
［表２］
【表２】
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［表３］
【表３】
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［表４］
【表４】
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［表５］
【表５】
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［表６］
【表６】
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［表７］
【表７】
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【０２２２】
［操作遺伝子はさみシステムのための組成物］
本発明の（ＳＣ機能制御改変システムを含む）ＳＣ機能制御システムは、ＳＣ機能制御因子すなわちＰＭＰ２２遺伝子を操作するための組成物としてガイド核酸−エディタータンパク質の複合体を含み得る。
【０２２３】
［ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体］
「ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体」という用語は、ガイド核酸とエディタータンパク質との間の相互作用を通して形成される複合体を指し、核酸タンパク質複合体は、ガイド核酸およびエディタータンパク質を含む。
【０２２４】
「ガイド核酸」という用語は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を認識可能な核酸を指す。
【０２２５】
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの形態で存在し得て、５〜１５０塩基の核酸配列を有し得る。ガイド核酸は、１または複数のドメインを含み得る。
【０２２６】
ドメインは、これらに限定されないが、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカードメイン、第２相補ドメイン、近位ドメインまたは尾部ドメインであり得る。
【０２２７】
ガイド核酸は、同一ドメインの反復または異なるドメインであり得る２つ以上のドメインを含み得る。ガイド核酸は１つの連続する核酸配列を有し得る。
【０２２８】
例えば、１つの連続する核酸配列は、（Ｎ）ｍであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧを表し、ｍは１〜１５０の整数である。ガイド核酸は、２つ以上の連続する核酸配列を有し得る。
【０２２９】
例えば、２つ以上の連続する核酸配列は、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｏであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧを表し得て、ｍおよびｏは、１〜１５０の整数であり、ｍおよびｏは同一であり得る、または、互いに異なり得る。
【０２３０】
「エディタータンパク質」という用語は、核酸に直接結合する、または、直接結合することなく相互作用することが可能なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。エディタータンパク質は酵素であり得る。エディタータンパク質は融合タンパク質であり得る。
【０２３１】
ここで、「融合タンパク質」とは、酵素を追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合させることによって生成されるタンパク質を指す。
【０２３２】
「酵素」という用語は、核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を切断可能なドメインを含むタンパク質を指す。
【０２３３】
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素と同一または異なる機能を有する機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０２３４】
融合タンパク質は、酵素のアミノ末端（Ｎ末端）またはその付近、カルボキシル末端（Ｃ末端）またはその付近、酵素の中央部分、および、それらの組み合わせのうち１または複数の領域において、追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
【０２３５】
融合タンパク質は、酵素のＮ末端またはその付近、Ｃ末端またはその付近、酵素の中央部分、および、それらの組み合わせのうち１または複数の領域において、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は対象を改変するように機能し得る。対象は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質であり得る。
【０２３６】
例えば、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、目的のタンパク質の発現、タンパク質の除去、または、新規のタンパク質の発現の最終的な調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）をもたらし得る。
【０２３７】
ここで、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体のレベルで作用し得る。
【０２３８】
ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、遺伝子転写および翻訳の段階で作用し得る。ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体はタンパク質レベルで作用し得る。
【０２３９】
［１．ガイド核酸］
ガイド核酸は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を認識することが可能な核酸であり、ガイド核酸−タンパク質の複合体を形成する。
【０２４０】
ここで、ガイド核酸は、ガイド核酸−タンパク質の複合体によって標的化される核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を認識または標的化するよう構成される。
【０２４１】
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物の形態で存在し得て、５〜１５０の核酸配列を有し得る。ガイド核酸は鎖状または環状形で存在し得る。ガイド核酸は１つの連続する核酸配列であり得る。
【０２４２】
例えば、１つの連続する核酸配列は、（Ｎ）ｍであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧであり、ｍは１〜１５０の整数である。ガイド核酸は２つ以上の連続する核酸配列であり得る。
【０２４３】
例えば、２つ以上の連続する核酸配列は、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｏであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧを表し得て、ｍおよびｏは、１〜１５０の整数であり、同一または互いに異なり得る。ガイド核酸は１または複数のドメインを含み得る。
【０２４４】
ここで、ドメインは、これらに限定されないが、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカードメイン、第２相補ドメイン、近位ドメインまたは尾部ドメインであり得る。
【０２４５】
ガイド核酸は、同一ドメインの反復または異なるドメインであり得る２つ以上のドメインを含み得る。ドメインは以下で説明する。
【０２４６】
［ｉ）ガイドドメイン］
「ガイドドメイン」という用語は、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補ガイド配列を有するドメインであり、標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用するように機能する。
【０２４７】
ガイド配列は、例えば、少なくとも５０％以上、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の相補性または完全相補性を有する、標的遺伝子または核酸上の標的配列に相補的な核酸配列である。ガイドドメインは５〜５０塩基の配列であり得る。
【０２４８】
一例において、ガイドドメインは、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０または４５〜５０塩基の配列であり得る。
【０２４９】
別の例において、ガイドドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５または４５〜５０塩基の配列であり得る。ガイドドメインはガイド配列を有し得る。
【０２５０】
ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列と相補結合を形成可能な相補的塩基配列であり得る。
【０２５１】
ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列に相補的な核酸配列であり得て、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有する。ガイド配列は５〜５０塩基配列であり得る。
【０２５２】
一例において、ガイドドメインは、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０または４５〜５０塩基配列であり得る。
【０２５３】
別の例において、ガイド配列は１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５または４５〜５０塩基配列であり得る。加えて、ガイドドメインは、ガイド配列および追加の塩基配列を含み得る。
【０２５４】
追加の塩基配列は、ガイドドメインの機能を改善または低減するために利用され得る。
【０２５５】
追加の塩基配列は、ガイド配列の機能を改善または低減するために利用され得る。追加の塩基配列は１〜３５塩基配列であり得る。
【０２５６】
一例において、追加の塩基配列は、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５の塩基配列であり得る。
【０２５７】
別の例において、追加の塩基配列は、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５の塩基配列であり得る。追加の塩基配列はガイド配列の５'末端に位置し得る。追加の塩基配列はガイド配列の３'末端に位置し得る。
【０２５８】
［ｉｉ）第１相補ドメイン］
「第１相補ドメイン」という用語は、第２相補ドメインに相補的な核酸配列を含む核酸配列であり、十分な相補性を有するので、第２相補ドメインと二本鎖を形成する。第１相補ドメインは５〜３５塩基配列であり得る。
【０２５９】
一例において、第１相補ドメインは、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５の塩基配列であり得る。
【０２６０】
別の例において、第１相補ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５の塩基配列であり得る。
【０２６１】
［ｉｉｉ）リンカードメイン］
「リンカードメイン」という用語は、２つ以上の同一または異なるドメインである２つ以上のドメインを接続する核酸配列である。リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって２つ以上のドメインに接続され得るか、または、共有結合または非共有結合によって２つ以上のドメインを接続し得る。リンカードメインは１〜３０塩基配列であり得る。
【０２６２】
一例において、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０塩基配列であり得る。
【０２６３】
別の例において、リンカードメインは、１〜３０、５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０または２５〜３０塩基配列であり得る。
【０２６４】
［ｉｖ）第２相補ドメイン］
「第２相補ドメイン」という用語は、第１相補ドメインに相補的な核酸配列を含む核酸配列のことであり、十分な相補性を有するので、第１相補ドメインと二本鎖を形成する。
【０２６５】
第２相補ドメインは第１相補ドメインに相補的な塩基配列、および、第１相補ドメインと相補性を有しない塩基配列、例えば、第１相補ドメインと二本鎖を形成しない塩基配列を有し得るので、第１相補ドメインより長い塩基配列を有し得る。第２相補ドメインは５〜３５塩基配列を有し得る。
【０２６６】
一例において、第２相補ドメインは、１〜３５、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５の塩基配列であり得る。
【０２６７】
別の例において、第２相補ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５の塩基配列であり得る。
【０２６８】
［ｖ）近位ドメイン］
「近位ドメイン」という用語は、第２相補ドメインに隣接して配置される核酸配列である。
【０２６９】
近位ドメインは、その中に相補的塩基配列を有し得て、相補的塩基配列に起因して二本鎖に形成され得る。近位ドメインは、１〜２０塩基配列であり得る。一例として、近位ドメインは、１〜２０、５〜２０、１０〜２０または１５〜２０塩基配列であり得る。
【０２７０】
別の例において、近位ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、または１５〜２０塩基配列であり得る。
【０２７１】
［ｖｉ）尾部ドメイン］
「尾部ドメイン」という用語は、ガイド核酸の両方の末端のうち１または複数の末端に位置する核酸配列である。
【０２７２】
尾部ドメインは、その中に相補的塩基配列を有し得て、相補的塩基配列に起因して、二本鎖に形成され得る。尾部ドメインは、１〜５０塩基配列であり得る。
【０２７３】
一例において、尾部ドメインは、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、または、４５〜５０塩基配列であり得る。
【０２７４】
別の例において、尾部ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または、４５〜５０塩基配列であり得る。
【０２７５】
一方、ドメインに含まれる核酸配列、すなわち、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカードメイン、第２相補ドメイン、近位ドメインおよび尾部ドメインの一部または全部は、選択的に、または、追加的に化学修飾を含み得る。
【０２７６】
化学修飾は、これらに限定されないが、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'−Ｏ−メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得る。ガイド核酸は１または複数のドメインを含む。ガイド核酸はガイドドメインを含み得る。ガイド核酸は第１相補ドメインを含み得る。ガイド核酸はリンカードメインを含み得る。ガイド核酸は第２相補ドメインを含み得る。ガイド核酸は近位ドメインを含み得る。ガイド核酸は尾部ドメインを含み得る。ここでは、１、２、３、４、５または６以上のドメインがあり得る。ガイド核酸は、１、２、３、４、５または６以上のガイドドメインを含み得る。ガイド核酸は、１、２、３、４、５または６以上の第１相補ドメインを含み得る。ガイド核酸は、１、２、３、４、５または６以上のリンカードメインを含み得る。ガイド核酸は、１、２、３、４、５または６以上の第２相補ドメインを含み得る。ガイド核酸は、１、２、３、４、５または６以上の近位ドメインを含み得る。ガイド核酸は、１、２、３、４、５または６以上の尾部ドメインを含み得る。ここで、ガイド核酸において、１つの種類のドメインが重複し得る。ガイド核酸は、重複がある、または、重複が無い、いくつかのドメインを含み得る。
【０２７７】
ガイド核酸は、同一の種類のドメインを含み得る。ここで、同一の種類のドメインは、同一の核酸配列または異なる核酸配列を有し得る。
【０２７８】
ガイド核酸は２種類のドメインを含み得る。ここで、２つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【０２７９】
ガイド核酸は、３種類のドメインを含み得る。ここで、３つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【０２８０】
ガイド核酸は、４種類のドメインを含み得る。ここで、４つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【０２８１】
ガイド核酸は、５種類のドメインを含み得る。ここで、５つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【０２８２】
ガイド核酸は、６種類のドメインを含み得る。ここで、６つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【０２８３】
例えば、ガイド核酸は、［ガイドドメイン］−［第１相補ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２相補ドメイン］−［リンカードメイン］−［ガイドドメイン］−［第１相補ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２相補ドメイン］から成り得る。ここで、２つのガイドドメインは、異なる、または、同一の標的に対するガイド配列を含み得て、２つの第１相補ドメインおよび２つの第２相補ドメインは、同一または異なる核酸配列を有し得る。ガイドドメインが、異なる標的に対するガイド配列を含むとき、ガイド核酸は、２つの異なる標的に特異的に結合し得て、ここでは、特異的結合は、同時または順番に実行され得る。加えて、リンカードメインは、特異的酵素によって切断され得て、ガイド核酸は、特異的酵素の存在下で、２または３つの部分に分割され得る。
【０２８４】
本発明のガイド核酸の具体例として、ｇＲＮＡが以下に記載される。
【０２８５】
［ｇＲＮＡ］
「ｇＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子または核酸に関して、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を特異的に標的化可能な核酸を指す。加えて、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素に結合してＣＲＩＳＰＲ酵素を標的遺伝子または核酸へ誘導し得る核酸特異的ＲＮＡである。
【０２８６】
ｇＲＮＡは、複数のドメインを含み得る。各ドメインに起因して、ｇＲＮＡ鎖の３次元構造もしくは活性形態において、または、これらの鎖の間で、相互作用が生じ得る。
【０２８７】
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一のＲＮＡ分子）、または、二本鎖ｇＲＮＡ（１つより多くの、一般的には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と称され得る。
【０２８８】
例示的な一実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'から３'の方向に、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または核酸との相補結合を形成可能なガイド配列を含むドメインと、第１相補ドメインと、リンカードメインと、第２相補ドメイン、すなわち、第１相補ドメイン配列に相補的な配列を有し、それにより、第１相補ドメインと共に二本鎖核酸を形成するドメインと、近位ドメインと、任意で、尾部ドメインとを含み得る。
【０２８９】
別の実施形態において、二本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または核酸との相補結合を形成可能なガイド配列を含むドメイン、および、第１相補ドメインを含む第１鎖と、５'から３'の方向に、第２相補ドメイン、すなわち、第１相補ドメイン配列に相補的な配列を有し、それにより、第１相補ドメインと共に二本鎖核酸を形成するドメイン、近位ドメイン、任意で、尾部ドメインを含む第２鎖とを含み得る。
【０２９０】
ここで、第１鎖はｃｒＲＮＡと称され得て、第２鎖はｔｒａｃｒＲＮＡと称され得る。ｃｒＲＮＡは、ガイドドメインおよび第１相補ドメインを含み得て、ｔｒａｃｒＲＮＡは、第２相補ドメイン、近位ドメイン、任意で尾部ドメインを含み得る。
【０２９１】
更に別の実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'から３'の方向に、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または核酸との相補結合を形成可能なガイド配列を含むドメインと、第１相補ドメインと、第２相補ドメイン、すなわち、第１相補ドメイン配列に相補的な配列を有し、それにより、第１相補ドメインと共に二本鎖核酸を形成するドメインとを含み得る。
【０２９２】
［ｉ）ガイドドメイン］
ガイドドメインは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補ガイド配列を含む。ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補性、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有する核酸配列であり得る。ガイドドメインは、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用することを可能にすると考えられる。ガイドドメインは５〜５０塩基配列であり得る。
【０２９３】
例示的な実施形態として、ガイドドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
【０２９４】
例示的な実施形態として、ガイドドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列を含み得る。ここで、ガイドドメインはガイド配列を含み得る。
【０２９５】
ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補的塩基配列であり得る。
【０２９６】
ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列に相補的な核酸配列であり得て、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有する。
【０２９７】
例示的な一実施形態において、ガイド配列は、標的遺伝子に相補的な核酸配列、すなわち、ＰＭＰ２２遺伝子の標的配列であり得て、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有する。ガイド配列は５〜５０塩基配列であり得る。
【０２９８】
例示的な実施形態において、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
【０２９９】
例示的な一実施形態において、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列を含み得る。
【０３００】
例示的な一実施形態において、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列である、ＰＭＰ２２遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。
【０３０１】
ここで、標的遺伝子、すなわち、ガイド配列のためのＰＭＰ２２遺伝子の標的配列はそれぞれ、表１、表２、表３、表４、表５、表６および表７において上で列挙されているが、本発明はこれに限定されない。ここで、ガイドドメインは、ガイド配列および追加の塩基配列を含み得る。追加の塩基配列は、１〜３５塩基配列であり得る。
【０３０２】
例示的な一実施形態において、追加の塩基配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基配列であり得る。
【０３０３】
例えば、追加の塩基配列は、単一塩基配列、グアニン（Ｇ）、または、２塩基、ＧＧの配列であり得る。追加の塩基配列は、ガイド配列の５'末端に位置し得る。追加の塩基配列は、ガイド配列の３'末端に位置し得る。
【０３０４】
選択的に、ガイドドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を含み得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'−Ｏ−メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれに限定されない。
【０３０５】
［ｉｉ）第１相補ドメイン］
第１相補ドメインは、第２相補ドメインに相補的な核酸配列を含み、第２相補ドメインとの二本鎖を形成することが可能であるように十分な相補性を有する。
【０３０６】
ここで、第１相補ドメインは、５〜３５塩基配列であり得る。第１相補ドメインは、５〜３５塩基配列を含み得る。
【０３０７】
例示的な一実施形態において、第１相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
【０３０８】
別の実施形態において、第１相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列を含み得る。
【０３０９】
第１相補ドメインは、天然第１相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第１相補ドメインに由来し得る。加えて、第１相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第１相補ドメインの塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０３１０】
例示的な一実施形態において、第１相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの第１相補ドメイン、または、それらに由来する第１相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【０３１１】
例えば、第１相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'であり得る、または、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、もしくは、完全相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（Ｘ）ｎ−３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、５〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧであり得る。
【０３１２】
別の実施形態において、第１相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'であり得る、または、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上、または、完全相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ（Ｘ）ｎ−３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、５〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０３１３】
別の実施形態において、第１相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラシカス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラｓｐ（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム、または、ユウバクテリウム・エリゲンスの第１相補ドメイン、または、それらに由来する第１相補ドメインとの少なくとも５０％以上の部分的または完全相同性を有し得る。
【０３１４】
例えば、第１相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'であり得る、または、５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'と部分的な、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'−（Ｘ）ｎＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、１〜５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０３１５】
選択的に、第１相補ドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'−Ｏ−メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれに限定されない。
【０３１６】
［ｉｉｉ）リンカードメイン］
リンカードメインは、２つ以上のドメインを接続する核酸配列であり、２つ以上の同一または異なるドメインを接続する。リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって、２つ以上のドメインに接続され得る、または、２つ以上のドメインを接続し得る。
【０３１７】
リンカードメインは、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続して一本鎖ｇＲＮＡを生成する核酸配列であり得る。
【０３１８】
リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって第１相補ドメインおよび第２相補ドメインに接続され得る。
【０３１９】
リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続し得る。
【０３２０】
リンカードメインは、１〜３０塩基配列であり得る。リンカードメインは、１〜３０塩基配列を含み得る。
【０３２１】
例示的な実施形態において、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０塩基配列であり得る。
【０３２２】
例示的な実施形態において、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０塩基配列を含み得る。
【０３２３】
リンカードメインは、一本鎖ｇＲＮＡ分子において使用されるのに好適であり、共有結合または非共有結合により、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖および第２鎖と接続されることによって、または、第１鎖を第２鎖と接続することによって、一本鎖ｇＲＮＡを生成するのに使用され得る。リンカードメインは、二本鎖ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと接続されることによって、または、共有結合または非共有結合でｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡに接続することによって、一本鎖ｇＲＮＡを生成するために使用され得る。
【０３２４】
リンカードメインは、天然配列、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡの部分的配列との相同性を有し得る、または、それに由来し得る。
【０３２５】
選択的に、リンカードメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'−Ｏ−メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれに限定されない。
【０３２６】
［ｉｖ）第２相補ドメイン］
第２相補ドメインは、第１相補ドメインに相補的な核酸配列を含み、第１相補ドメインと共に二本鎖を形成するように十分な相補性を有する。第２相補ドメインは、第１相補ドメインに相補的な塩基配列、および、第１相補ドメインとの相補性を有しない塩基配列、例えば、第１相補ドメインと共に二本鎖を形成しない塩基配列を含み得て、第１相補ドメインより長い塩基配列を有し得る。
【０３２７】
ここで、第２相補ドメインは、５〜３５塩基配列であり得る。第１相補ドメインは、５〜３５塩基配列を含み得る。
【０３２８】
例示的な実施形態において、第２相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
【０３２９】
例示的な実施形態において、第２相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列を含み得る。
【０３３０】
加えて、第２相補ドメインは、天然第２相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第２相補ドメインに由来し得る。加えて、第２相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第２相補ドメインの塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０３３１】
例示的な実施形態において、第２相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有する第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインを有し得る。
【０３３２】
例えば、第２相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'であり得る、または、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と部分的な、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを更に含み得て、５'−（Ｘ）ｎＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ−３'を生じさせる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１〜１５の整数であり得て、ｍは、１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、混在したｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０３３３】
別の例において、第２相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'−（Ｘ）ｎＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ−３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１〜１５の整数であり得て、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、混在したｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０３３４】
別の実施形態において、第２相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラシカス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラｓｐ（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム、または、ユウバクテリウム・エリゲンスの第１相補ドメイン、または、それらに由来する第２相補ドメインとの少なくとも５０％以上の部分的または完全相同性を有し得る。
【０３３５】
例えば、第２相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'−（Ｘ）ｎＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ（Ｘ）ｍ−３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１〜１０の整数であり得て、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、混在したｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０３３６】
選択的に、第２相補ドメインの塩基配列の一部または全部は化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'−Ｏ−メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０３３７】
［ｖ）近位ドメイン］
近位ドメインは、第２相補ドメインの３'末端方向に配置されたドメインである第２相補ドメインに隣接して配置された１〜２０塩基の配列である。ここで、近位ドメインは、その中の相補的塩基配列の間に二本鎖を形成するのに使用され得る。
【０３３８】
例示的な一実施形態において、近位ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５塩基配列であり得る。
【０３３９】
別の実施形態において、近位ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５塩基配列を含み得る。
【０３４０】
加えて、近位ドメインは、天然近位ドメインとの相同性を有し得る、または、天然近位ドメインに由来し得る。加えて、近位ドメインは、天然に存在する種に従って、塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる近位ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０３４１】
例示的な実施形態において、近位ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの近位ドメイン、または、それらに由来する近位ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【０３４２】
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインであるとき、近位ドメインは、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、近位ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（Ｘ）ｎ−３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在したｎ個の塩基を表し得る。
【０３４３】
更なる別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインであるとき、近位ドメインは、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、近位ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ（Ｘ）ｎ−３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１〜４０の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０３４４】
選択的に、近位ドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'−Ｏ−メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれに限定されない。
【０３４５】
［ｖｉ）尾部ドメイン］
尾部ドメインは、一本鎖ｇＲＮＡまたは二本鎖ｇＲＮＡの３'末端に選択的に追加可能なドメインである。尾部ドメインは、１〜５０塩基配列であり得る、または、１〜５０塩基配列を含み得る。ここで、尾部ドメインは、その中の相補的塩基配列の間に二本鎖を形成するのに使用され得る。
【０３４６】
例示的な実施形態において、尾部ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または、４５〜５０塩基配列であり得る。
【０３４７】
例示的な実施形態において、尾部ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または、４５〜５０塩基配列を含み得る。
【０３４８】
加えて、尾部ドメインは、天然尾部ドメインと相同性を有し得る、または、天然尾部ドメインに由来し得る。加えて、尾部ドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０３４９】
例示的な一実施形態において、尾部ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインと、部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【０３５０】
例えば、尾部ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインであるとき、尾部ドメインは、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'であり得る、または、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、尾部ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（Ｘ）ｎ−３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、Ａ、Ｔ、ＵおよびＧなどの混在したｎ個の塩基を表し得る。
【０３５１】
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインであるとき、尾部ドメインは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'であり得る、または、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、尾部ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ（Ｘ）ｎ−３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１〜１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
【０３５２】
別の実施形態において、尾部ドメインは、３'末端において、インビトロまたはインビボ転写方法に関与する１〜１０塩基配列を含み得る。
【０３５３】
例えば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのインビトロ転写において使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがインビボ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、Ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
【０３５４】
選択的に、尾部ドメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'−Ｏ−メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれに限定されない。
【０３５５】
ｇＲＮＡは、上述のように、複数のドメインを含み得て、従って、核酸配列の長さは、ｇＲＮＡに含まれるドメインに従って調節され得て、各ドメインに起因して、ｇＲＮＡの３次元構造もしくは活性形態の鎖において、または、これらの鎖の間に相互作用が生じ得る。
【０３５６】
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一のＲＮＡ分子）、または、二本鎖ｇＲＮＡ（１つより多くの、一般的には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と称され得る。
【０３５７】
［二本鎖ｇＲＮＡ］
二本鎖ｇＲＮＡは、第１鎖および第２鎖から成る。  ここで、第１鎖は、５'−［ガイドドメイン］−［第１相補ドメイン］−３'から成り得て、第２鎖は、５'−［第２相補ドメイン］−［近位ドメイン］−３'、または、５'−［第２相補ドメイン］−［近位ドメイン］−［尾部ドメイン］−３'から成り得る。
【０３５８】
ここで、第１鎖はｃｒＲＮＡと称され得て、第２鎖はｔｒａｃｒＲＮＡと称され得る。
【０３５９】
［第１鎖］
［ガイドドメイン］
第１鎖において、ガイドドメインは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補ガイド配列を含む。ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列に相補的な核酸配列であり、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有する。ガイドドメインは、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体が標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用することを可能にすると考えられる。
【０３６０】
ここで、ガイドドメインは、５〜５０塩基配列であり得る、または、５〜５０塩基配列を含み得る。例えば、ガイドドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。加えて、ガイドドメインはガイド配列を含み得る。
【０３６１】
ここで、ガイド配列は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補的塩基配列であり得る。
【０３６２】
例示的な実施形態において、ガイド配列は、標的遺伝子に相補的な核酸配列、すなわち、ＰＭＰ２２遺伝子の標的配列であり得て、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有する。
【０３６３】
ここで、ガイド配列は、５〜５０塩基配列であり得る、または、５〜５０塩基配列を含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
【０３６４】
例示的な一実施形態において、ガイド配列は、ＰＭＰ２２遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列である。ガイド配列は、５〜５０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
【０３６５】
ここで、ガイド配列について、ＰＭＰ２２遺伝子の標的配列である標的遺伝子は、表１、表２、表３、表４、表５、表６および表７において上で列挙されるが、本発明はこれに限定されない。選択的に、ガイドドメインは、ガイド配列および追加の塩基配列を含み得る。
【０３６６】
ここで、追加の塩基配列は、１〜３５塩基配列であり得る。例えば、追加の塩基配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基配列であり得る。
【０３６７】
例示的な一実施形態において、追加の塩基配列は、１つの塩基グアニン（Ｇ）、または、２つの塩基ＧＧを含み得る。
【０３６８】
ここで、追加の塩基配列は、ガイドドメインの５'末端、または、ガイド配列の５'末端に位置し得る。
【０３６９】
追加の塩基配列は、ガイドドメインの３'末端、または、ガイド配列の３'末端に位置し得る。
【０３７０】
［第１相補ドメイン］
第１相補ドメインは、第２鎖の第２相補ドメインに相補的な核酸配列を含み、第２相補ドメインとの二本鎖を形成するように、十分な相補性を有するドメインである。
【０３７１】
ここで、第１相補ドメインは、５〜３５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、第１相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
【０３７２】
第１相補ドメインは、天然第１相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第１相補ドメインに由来し得る。加えて、第１相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列に差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインに由来し得る、または、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０３７３】
例示的な一実施形態において、第１相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの第１相補ドメイン、または、それらに由来する第１相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【０３７４】
選択的に、第１相補ドメインは、第２鎖の第２相補ドメインとの相補的結合を経ない追加の塩基配列を含み得る。
【０３７５】
ここで、追加の塩基配列は、１〜１５塩基の配列であり得る。例えば、追加の塩基配列は、１〜５、５〜１０、または、１０〜１５塩基の配列であり得る。
【０３７６】
選択的に、ガイドドメインおよび／または第１相補ドメインの塩基配列の一部または全部は化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'−Ｏ−メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれに限定されない。
【０３７７】
このため、第１鎖は、上述のような５'−［ガイドドメイン］−［第１相補ドメイン］−３'から成り得る。加えて、第１鎖は、追加の塩基配列を任意で含み得る。
【０３７８】
一例において、第１鎖は、５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−３'または５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−３'であり得る。
【０３７９】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な塩基配列であり、標的遺伝子または核酸上の標的配列に従って変化し得る塩基配列領域である。
【０３８０】
例示的な一実施形態において、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子、すなわち、ＰＭＰ２２遺伝子の標的配列との相補結合を形成可能な塩基配列であり得る。
【０３８１】
ここで、（Ｑ）ｍは、第２鎖の第２相補ドメインとの相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、起源の種に従って変化し得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５〜３５の整数である。
【０３８２】
例えば、第１相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'であり得る、または、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０３８３】
別の例において、第１相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、カンピロバクター・ジェジュニ由来の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'であり得る、または、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０３８４】
更に別の例において、第１相補ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの第１相補ドメイン、または、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'であり得る、または、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０３８５】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃの各々は、選択的に、追加の塩基配列であり、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され、ａ、ｂ、ｃの各々は塩基の数であり得て、０または１〜２０の整数であり得る。
【０３８６】
［第２鎖］
第２鎖は、第２相補ドメインおよび近位ドメインから成り得て、選択的に尾部ドメインを含み得る。
【０３８７】
［第２相補ドメイン］
第２鎖において、第２相補ドメインは、第１鎖の第１相補ドメインに相補的な核酸配列を含み、第１相補ドメインと二本鎖を形成するように、十分な相補性を有する。第２相補ドメインは、第１相補ドメインに相補的な塩基配列、および、第１相補ドメインに相補的でない塩基配列、例えば、第１相補ドメインと共に二本鎖を形成しない塩基配列を含み得て、第１相補ドメインより長い塩基配列を有し得る。
【０３８８】
ここで、第２相補ドメインは、５〜３５塩基配列であり得て、または、５〜３５塩基配列を含み得る。例えば、第２相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得るが、本発明はこれに限定されない。
【０３８９】
第２相補ドメインは、天然第２相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第２相補ドメインに由来し得る。加えて、第２相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、その塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０３９０】
例示的な一実施形態において、第２相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【０３９１】
選択的に、第２相補ドメインは更に、追加の塩基配列を含み得て、第１鎖の第１相補ドメインとの相補的結合を経ない。
【０３９２】
ここで、追加の塩基配列は、１〜２５塩基配列であり得る。例えば、追加の塩基配列は、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０または２０〜２５塩基配列であり得る。
【０３９３】
［近位ドメイン］
第２鎖において、近位ドメインは、１〜２０塩基の配列であり、第２相補ドメインの３'末端方向に位置するドメインである。例えば、近位ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５塩基の配列であり得る、または、それを含み得る。
【０３９４】
ここで、近位ドメインは、その中の相補的塩基配列の間に二本鎖結合を有し得る。
【０３９５】
加えて、近位ドメインは、天然近位ドメインとの相同性を有し得る、または、天然近位ドメインに由来し得る。加えて、近位ドメインは、天然に存在する種に応じて塩基配列に差異を有し得て、天然に存在する種の近位ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種の近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０３９６】
例示的な一実施形態において、近位ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの近位ドメイン、または、それらに由来する近位ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【０３９７】
［尾部ドメイン］
選択的に、第２鎖において、尾部ドメインは、第２鎖の３'末端に選択的に追加されるドメインであり得て、尾部ドメインは、１〜５０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、尾部ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５または４５〜５０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。ここで、尾部ドメインは、相補的塩基配列の間に二本鎖結合を有し得る。
【０３９８】
加えて、尾部ドメインは、天然尾部ドメインとの相同性を有し得る、または、天然尾部ドメインに由来し得る。加えて、尾部ドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０３９９】
例示的な一実施形態において、尾部ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの尾部ドメイン、または、それらに由来する尾部ドメインと部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【０４００】
別の実施形態において、尾部ドメインは、３'末端において、インビトロまたはインビボ転写方法に関与する１〜１０塩基の配列を含み得る。
【０４０１】
例えば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのインビトロ転写において使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがインビボ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、Ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、いくつかのウラシル塩基または代替的塩基を含み得る。
【０４０２】
選択的に、第２相補ドメイン、近位ドメイン、および／または、尾部ドメインの塩基配列の各々の一部または全部は化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'−Ｏ−メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれに限定されない。
【０４０３】
従って、第２鎖は、上述のように５'−［第２相補ドメイン］−［近位ドメイン］−３'または５'−［第２相補ドメイン］−［近位ドメイン］−［尾部ドメイン］−３'から成り得る。加えて、第２鎖は、追加の塩基配列を選択的に含み得る。
【０４０４】
例示的な一実施形態において、第２鎖は、５'−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−３'、または、５'−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−３'であり得る。
【０４０５】
別の実施形態において、第２鎖は、５'−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−（Ｆ）ｉ−３'、または、５'−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−（Ｆ）ｉ−３'であり得る。
【０４０６】
ここで、（Ｚ）ｈは、第１鎖の第１相補ドメインとの相補結合を形成可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり得て、５〜５０の整数である。
【０４０７】
例えば、第２相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'であり得る、または、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４０８】
別の例において、第２相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインと部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４０９】
更に別の例において、第２相補ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'であり得る、または、５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４１０】
（Ｐ）ｋは天然に存在する種の近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る近位ドメインを含む塩基配列であり、近位ドメインの塩基配列は起源の種に従って改変され得る。Ｐは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｋは塩基の数であり得て、１〜２０の整数である。
【０４１１】
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４１２】
別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４１３】
更に別の例において、近位ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４１４】
（Ｆ）ｉは、尾部ドメインを含む塩基配列であり得て、天然に存在する種の尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し、尾部ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｆは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｉは塩基の数であり得て、１〜５０の整数である。
【０４１５】
例えば、尾部ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'であり得る、または、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４１６】
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'であり得る、または、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４１７】
更に別の例において、尾部ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'であり得る、または、５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４１８】
加えて、（Ｆ）ｉは３'末端において、インビトロまたはインビボ転写方法に関与する１〜１０塩基の配列を含み得る。
【０４１９】
例えば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのインビトロ転写において使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがインビボ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、Ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
【０４２０】
加えて、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に追加される塩基配列であり得て、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｄ、ｅ、ｆの各々は、塩基の数であり得て、０または１〜２０の整数である。
【０４２１】
［一本鎖ｇＲＮＡ］
一本鎖ｇＲＮＡは２種類に分類され得る。
［ｉ）一本鎖ｇＲＮＡ］
第１に、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖または第２鎖がリンカードメインによって連結される一本鎖ｇＲＮＡがあり、ここで、一本鎖ｇＲＮＡは、５'−［第１鎖］−［リンカードメイン］−［第２鎖］−３'から成る。
【０４２２】
具体的には、一本鎖ｇＲＮＡは、５'−［ガイドドメイン］−［第１相補ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２相補ドメイン］−［近位ドメイン］−３'、または、５'−［ガイドドメイン］−［第１相補ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２相補ドメイン］−［近位ドメイン］−［尾部ドメイン］−３'から成り得る。
【０４２３】
リンカードメインを除く各ドメインは、二本鎖ｇＲＮＡの第１および第２鎖の各ドメインの説明と同一である。
【０４２４】
［リンカードメイン］
ここで、リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインに接続され得る、または、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続し得る。
【０４２５】
リンカードメインは、１〜３０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
【０４２６】
リンカードメインは、一本鎖ｇＲＮＡ分子に使用するのに好適であり、一本鎖ｇＲＮＡの生成に使用される共有結合または非共有結合によって、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖および第２鎖に接続され得る、または、第１鎖を第２鎖に接続し得る。リンカードメインは、一本鎖ｇＲＮＡの生成に使用される共有結合または非共有結合によって二本鎖ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに接続され得る、または、ｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡに接続し得る。
【０４２７】
リンカードメインは、天然配列、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡの部分的配列との相同性を有し得る、または、それに由来し得る。
【０４２８】
選択的に、リンカードメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または２'−Ｏ−メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０４２９】
このため、一本鎖ｇＲＮＡは、上述のように５'−［ガイドドメイン］−［第１相補ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２相補ドメイン］−［近位ドメイン］−３'、または、５'−［ガイドドメイン］−［第１相補ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２相補ドメイン］−［近位ドメイン］−［尾部ドメイン］−３'から成り得る。加えて、一本鎖ｇＲＮＡは選択的に、追加の塩基配列を含み得る。
【０４３０】
例示的な一実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−３'または、５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−（Ｆ）ｉ−３'であり得る。
【０４３１】
別の実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−３'または５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−（Ｆ）ｉ−３'であり得る。
【０４３２】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な塩基配列であり、標的遺伝子または核酸上の標的配列に従って変化可能であり得る塩基配列領域である。
【０４３３】
例示的な一実施形態において、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子、すなわち、ＰＭＰ２２遺伝子の標的配列との相補結合を形成可能な塩基配列である。
【０４３４】
（Ｑ）ｍは、第２相補ドメインとの相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列を含む。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、起源の種に従って変化し得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５〜３５の整数である。
【０４３５】
例えば、第１相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'であり得る、または、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４３６】
別の例において、第１相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'であり得る、または、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４３７】
更に別の例において、第１相補ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'であり得る、または、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４３８】
加えて、（Ｌ）ｊは、リンカードメインを含み、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続し、それにより一本鎖ｇＲＮＡを生成する塩基配列である。ここで、Ｌは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｊは塩基の数であり得て、１〜３０の整数である。
【０４３９】
（Ｚ）ｈは、第１相補ドメインとの相補結合を有することが可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインと部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、起源の種に従って変化し得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり、５〜５０の整数であり得る。
【０４４０】
例えば、第２相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'であり得る、または、５'−ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４４１】
別の例において、第２相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ−３'との少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４４２】
更に別の例において、第２相補ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'であり得る、または、５'−ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４４３】
（Ｐ）ｋは天然に存在する種の近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る近位ドメインを含む塩基配列であり、近位ドメインの塩基配列は起源の種に従って改変され得る。Ｐは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｋは塩基の数であり得て、１〜２０の整数である。
【０４４４】
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４４５】
別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４４６】
更に別の例において、近位ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４４７】
（Ｆ）ｉは、尾部ドメインを含み、天然に存在する種の尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する塩基配列であり得て、尾部ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｆは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｉは塩基の数であり得て、１〜５０の整数である。
【０４４８】
例えば、尾部ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'であり得る、または、５'−ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４４９】
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'であり得る、または、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４５０】
更に別の例において、尾部ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'であり得る、または、５'−ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４５１】
加えて、（Ｆ）ｉは３'末端において、インビトロまたはインビボ転写方法に関与する１〜１０塩基の配列を含み得る。
【０４５２】
例えば、ｇＲＮＡのインビトロ転写においてＴ７プロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがインビボ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
【０４５３】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃ、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に追加される塩基配列であり得て、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆの各々は塩基の数であり得て、０または１〜２０の整数である。
【０４５４】
［ｉｉ）一本鎖ｇＲＮＡ］
第２に、一本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインから成る一本鎖ｇＲＮＡであり得て、ここで、一本鎖ｇＲＮＡは、５'−［第２相補ドメイン］−［第１相補ドメイン］−［ガイドドメイン］−３'、または、５'−［第２相補ドメイン］−［リンカードメイン］−［第１相補ドメイン］−［ガイドドメイン］−３'から成り得る。
【０４５５】
［ガイドドメイン］
一本鎖ｇＲＮＡにおいて、ガイドドメインは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補ガイド配列を含む。ガイド配列は、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補性、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する核酸配列であり得る。ガイドドメインは、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、標的遺伝子または核酸と特異的に相互作用することを可能にすると考えられる。
【０４５６】
ここで、ガイドドメインは、５〜５０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、ガイドドメインは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。加えて、ガイドドメインはガイド配列を含み得る。
【０４５７】
ここで、ガイド配列は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な相補的塩基配列であり得る。
【０４５８】
例示的な一実施形態において、ガイド配列は、標的遺伝子に相補的な核酸配列、すなわち、ＰＭＰ２２遺伝子の標的配列であり得て、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有する。
【０４５９】
ここで、ガイド配列は、５〜５０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
【０４６０】
例示的な一実施形態において、ガイド配列は、ＰＭＰ２２遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。ガイド配列は、５〜５０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、ガイド配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
【０４６１】
ここで、標的遺伝子、すなわち、ガイド配列のためのＰＭＰ２２遺伝子の標的配列はそれぞれ、表１、表２、表３、表４、表５、表６および表７において上で列挙されているが、本発明はこれに限定されない。選択的に、ガイドドメインは、ガイド配列および追加の塩基配列を含み得る。
【０４６２】
ここで、追加の塩基配列は、１〜３５塩基配列であり得る。例えば、追加の塩基配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基配列であり得る。
【０４６３】
例示的な一実施形態において、追加の塩基配列は、単一塩基配列グアニン（Ｇ）、または、２塩基配列ＧＧであり得る。
【０４６４】
ここで、追加の塩基配列は、ガイドドメインの５'末端、または、ガイド配列の５'末端に配置され得る。
【０４６５】
追加の塩基配列は、ガイドドメインの３'末端、または、ガイド配列の３'末端に位置し得る。
【０４６６】
［第１相補ドメイン］
第１相補ドメインは、第２相補ドメインに相補的な核酸配列を含み、第２相補ドメインとの二本鎖を形成するように十分な相補性を有するドメインである。
【０４６７】
ここで、第１相補ドメインは、５〜３５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、第１相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
【０４６８】
第１相補ドメインは、天然第１相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第１相補ドメインに由来し得る。加えて、第１相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第１相補ドメインの塩基配列に差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインに由来し得るか、または、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０４６９】
例示的な一実施形態において、第１相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラシカス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラｓｐ（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム、または、ユウバクテリウム・エリゲンス、または、それらに由来する第１相補ドメインの第１相補ドメインとの少なくとも５０％以上の部分的または完全相同性を有し得る。
【０４７０】
選択的に、第１相補ドメインは、第２相補ドメインとの相補的結合を経ない追加の塩基配列を含み得る。
【０４７１】
ここで、追加の塩基配列は、１〜１５塩基配列であり得る。例えば、追加の塩基配列は、１〜５、５〜１０、または、１０〜１５塩基配列であり得る。
【０４７２】
［第２相補ドメイン］
第２相補ドメインは、第１相補ドメインに相補的な核酸配列を含み、第１相補ドメインと共に二本鎖を形成するように十分な相補性を有する。第２相補ドメインは、第１相補ドメインに相補的な塩基配列、および、第１相補ドメインとの相補性を有しない塩基配列、例えば、第１相補ドメインと共に二本鎖を形成しない塩基配列を含み得て、第１相補ドメインより長い塩基配列を有し得る。
【０４７３】
ここで、第２相補ドメインは、５〜３５塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、第２相補ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
【０４７４】
第２相補ドメインは天然第２相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第２相補ドメインに由来し得る。加えて、第２相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第２相補ドメインの塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【０４７５】
例示的な一実施形態において、第２相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラシカス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラｓｐ（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム、または、ユウバクテリウム・エリゲンス第２相補ドメイン、または、それらに由来する第２相補ドメインのとの少なくとも５０％以上の部分的または完全相同性を有し得る。
【０４７６】
選択的に、第２相補ドメインは、第１相補ドメインとの相補的結合を経ない追加の塩基配列を含み得る。
【０４７７】
ここで、追加の塩基配列は、１〜１５塩基配列であり得る。例えば、追加の塩基配列は、１〜５、５〜１０、または、１０〜１５塩基配列であり得る。
【０４７８】
［リンカードメイン］
選択的に、リンカードメインは、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続して一本鎖ｇＲＮＡを生成する核酸配列である。ここで、リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインに接続され得る、または、第１および第２相補ドメインを接続し得る。
【０４７９】
リンカードメインは、１〜３０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。例えば、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
【０４８０】
選択的に、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、第２相補ドメインおよびリンカードメインの塩基配列の一部または全部は、化学修飾を有し得る。化学修飾は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'−Ｏ−メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０４８１】
このため、一本鎖ｇＲＮＡは、上述のように５'−［第２相補ドメイン］−［第１相補ドメイン］−［ガイドドメイン］−３'、または、５'−［第２相補ドメイン］−［リンカードメイン］−［第１相補ドメイン］−［ガイドドメイン］−３'から成り得る。加えて、一本鎖ｇＲＮＡは選択的に、追加の塩基配列を含み得る。
【０４８２】
例示的な一実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'−（Ｚ）ｈ−（Ｑ）ｍ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'または５'−（Ｘ）ａ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'であり得る。
【０４８３】
別の実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'−（Ｚ）ｈ−（Ｌ）ｊ−（Ｑ）ｍ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'または５'−（Ｘ）ａ−（Ｚ）ｈ−（Ｌ）ｊ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'であり得る。
【０４８４】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な塩基配列であり、標的遺伝子または核酸上の標的配列に従って変化し得る塩基配列領域である。
【０４８５】
例示的な一実施形態において、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子、すなわち、ＰＭＰ２２遺伝子の標的配列との相補結合を形成可能な塩基配列であり得る。
【０４８６】
（Ｑ）ｍは、第２鎖の第２相補ドメインとの相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、起源の種に従って変化し得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５〜３５の整数である。
【０４８７】
例えば、第１相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'であり得る、または、５'−ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４８８】
（Ｚ）ｈは、第１鎖の第１相補ドメインとの相補結合を形成可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、起源の種に従って改変され得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり得て、５〜５０の整数である。
【０４８９】
例えば、第２相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第２相補ドメイン、または、パルクバクテリア・バクテリウム由来第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'であり得る、または、５'−ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ−３'との少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【０４９０】
加えて、（Ｌ）ｊは、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続するリンカードメインを含む塩基配列である。ここで、Ｌは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｊは塩基の数であり得て、１〜３０の整数である。
【０４９１】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃの各々は選択的に、追加の塩基配列であり、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ａ、ｂ、ｃは塩基の数であり得て、０または１〜２０の整数である。
【０４９２】
［２．エディタータンパク質］
「エディタータンパク質」は、核酸に直接結合する、または、直接結合することなく相互作用することが可能なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。核酸は、標的核酸、遺伝子または染色体に含まれる核酸であり得る。 核酸はガイド核酸であり得る。エディタータンパク質は酵素であり得る。エディタータンパク質は融合タンパク質であり得る。
【０４９３】
ここで、融合タンパク質とは、酵素を追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合させることによって生成されるタンパク質を指す。
【０４９４】
酵素とは、核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を切断可能なドメインを含むタンパク質を指す。酵素は、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、または、制限酵素であり得る。
【０４９５】
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素と同一または異なる機能を有する機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０４９６】
融合タンパク質は、酵素のＮ末端またはその近接部位、酵素のＣ末端またはその近接部位、酵素の中央領域、および、それらの組み合わせのうちの１または複数に、追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
【０４９７】
融合タンパク質は、酵素のＮ末端またはその近接部位、酵素のＣ末端またはその近接部位、酵素の中央領域、および、その組み合わせのうちの１または複数に、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
【０４９８】
ここで、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性もしくは核酸結合活性を有するドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、または、タンパク質（ペプチドを含む）の単離および精製のためのタグもしくはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はこれに限定されない。機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質はデアミナーゼであり得る。
【０４９９】
タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む）を含むが、本発明はこれらに限定されない。
【０５００】
加えて、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、核局在配列もしくはシグナル（ＮＬＳ）、または、核外搬出配列もしくはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
【０５０１】
ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有する、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原のＮＬＳ、核質に由来するＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有する核質双極型ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ、または、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ、インポーチンα由来ＩＢＢドメイン配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、筋腫Ｔタンパク質配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ、ヒトｐ５３配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ、マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶ配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、インフルエンザウイルスＮＳ１配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ、Ｄ型肝炎ウイルス抗原配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、マウスＭｘ１タンパク質配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ヒトポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、または、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイド配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫであり得るが、本発明はこれらに限定されない。エディタータンパク質は完全活性酵素を含み得る。
【０５０２】
ここで、「完全活性酵素」とは、野性型酵素の機能と同一の機能を有する酵素を指し、例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素は、ＤＮＡの二本鎖を完全に切断する完全な酵素活性を有する。
【０５０３】
加えて、完全活性酵素は、野性型酵素の機能と比較して改善された機能を有する酵素を含み、例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の、特定の改変または操作された種類は、野性型酵素と比較して改善された完全な酵素活性、すなわち、ＤＮＡの二本鎖を切断する活性を有する。エディタータンパク質は、不完全な、または、部分的に活性のある酵素を含み得る。
【０５０４】
ここで、「不完全または部分的な活性酵素」とは、野性型酵素の機能の一部を有する酵素を指し、例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の、特定の改変または操作された種類は、二本鎖の一部、すなわち、ＤＮＡの一本鎖を切断する不完全または部分的な酵素活性を有する。エディタータンパク質は不活性酵素を含み得る。
【０５０５】
ここで、「不活性酵素」は、野性型酵素の機能が完全に不活性化された酵素を指す。例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の、特定の改変または操作された種類は、ＤＮＡ二本鎖を完全に切断しないように、不活性を有する。エディタータンパク質は、天然酵素または融合タンパク質であり得る。
【０５０６】
エディタータンパク質は、部分的に改変された天然の酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
【０５０７】
エディタータンパク質は、天然に存在しない人工的に生成された酵素または融合タンパク質であり得る。
【０５０８】
エディタータンパク質は、天然に存在しない、部分的に改変された人工酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
【０５０９】
ここで、改変は、エディタータンパク質に含まれるアミノ酸の置換、除去、追加、または、それらの組み合わせであり得る。
【０５１０】
加えて、改変は、エディタータンパク質をコードする塩基配列におけるいくつかの塩基の置換、除去、追加、または、それらの組み合わせであり得る。
【０５１１】
本発明のエディタータンパク質の例示的な一実施形態として、ＣＲＩＳＰＲ酵素を以下で説明する。
【０５１２】
［ＣＲＩＳＰＲ酵素］
「ＣＲＩＳＰＲ酵素」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの主なタンパク質成分であり、ｇＲＮＡと複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをもたらす。
【０５１３】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を有する核酸またはポリペプチド（またはタンパク質）であり、代表的なものとして、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が広く使用されている。
【０５１４】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカスｓｐ．、スタフィロコッカス・アウレウス 、ノカルジオプシス−ダッソンビエイ、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネ、ストレプトスポランジウム・ロゼウム、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、バチルス・シュードミコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、エクシグオバクテリウム・シビリカム、ラクトバチルス・デルブルエッキイー、ラクトバチルス・サリバリウス、マイクロシーラ・マリナ、バークホルデリア・バクテリウム、ポラロモナス・ナフタレニボランス、ポラロモナスｓｐ．、クロコスファエラ・ワトソニー、クロコスファエラｓｐ．、ミクロキスティス・エルギノーサ、シネココッカスｓｐ．、アセトハロビウム・アラビティカム、アンモニフェックス・デゲンシ、カルディセルロシルプター・ベスシー、カンジダ・デスルフォルディス、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・ディフィシル、フィネゴルディア・マグナ、ナトラナエロビウス・サーモフィルス、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム、アシジチオバシラス・カルダス、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、アロクロマチウム・ビノスム、マリノバクターｓｐ．、ニトロソコッカス・ハロフィラス、ニトロソコッカス・ワトソニイ、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス、クテドノバクター・ラセミファー、メタノハロビウム・エベスチガタム、アナベナ・バリアビリス、ノジュラリア・スプミゲナ、ノストックｓｐ．、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラｓｐ．、リングビアｓｐ．、ミクロコレウス・クソノプラステス、オシキラトリアｓｐ．、ペトロトガ・モビリス、サーモシフォ・アフリカヌス、および、アカリオクロリス・マリナなどの様々な微生物に由来し得るＣａｓ９である。
【０５１５】
「Ｃａｓ９」という用語は、標的遺伝子または核酸上の標的配列または位置を切断または改変するようにｇＲＮＡに結合する酵素であり、核酸鎖を切断してｇＲＮＡとの相補結合を形成可能なＨＮＨドメインと、核酸鎖を切断してｇＲＮＡとの相補結合を形成可能なＲｕｖＣドメインと、標的を認識するＲＥＣドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとから成り得る。Ｃａｓ９の具体的な構造特性については、Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｃｅｌｌ  １５６：９３５−９４９を参照されたい。
【０５１６】
加えて、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ストレプトコッカス、カンピロバクター、ニトラチフラクター、スタフィロコッカス、パルビバクラム、ローズブリア、ナイセリア、グルコアセトバクター、アゾスピリラム、スフェロケタ、ラクトバシラス、ユーバクテリウム、コリネバクター、カルノバクテリウム、ロドバクター、リステリア、パルディバクター、クロストリジウム、ラクノスピラ、クロストリジアリジウム、レプトトリキア、フランシセラ、レジオネラ、アリシクロバチルス、メタノメチオフィラス、ポルフィロモナス、プレボテラ、バクテロイデス、ヘルココッカス、レトスピラ、デススルホビブリオ、デスルフォナトロナム、オピトゥトゥス、チュベリバチルス、バチルス、ブレビバチルス、メチロバクテリウムまたはアシダミノコッカスに由来し得るＣｐｆ１であり得る。
【０５１７】
Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインと同様の対応するＲｕｖＣドメイン、Ｃａｓ９のＨＮＨドメイン無しのＮｕｃドメイン、標的を認識するＲＥＣドメイン、ＰＡＭを認識するＷＥＤドメインおよびＰＩドメインから成り得る。Ｃｐｆ１の具体的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ  Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｃｅｌｌ  １６５：９４９−９６２を参照されたい。
【０５１８】
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１タンパク質のＣＲＩＳＰＲ酵素は、天然に存在する微生物から単離され得る、または、組み換えまたは合成方法によって非天然に生成され得る。
【０５１９】
［ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素］
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の結晶構造は、２種類以上の天然の微生物ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素分子に関する研究（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３４３（６１７６）：１２４７９９７，  ２０１４）、および、ｇＲＮＡと複合化されたストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）に関する研究（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  １５６：９３５−９４９，  ２０１４；Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５７９）に従って決定された。
【０５２０】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は２つのローブ．すなわち、認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含み、各ローブはいくつかのドメインを含む。
【０５２１】
ＲＥＣローブは、アルギニンリッチブリッジへリックス（ＢＨ）ドメイン、ＲＥＣ１ドメインおよびＲＥＣ２ドメインを含む。
【０５２２】
ここで、ＢＨドメインは、ロングαへリックスおよびアルギニンリッチ領域であり、ＲＥＣ１およびＲＥＣ２ドメインは、例えば、一本鎖ｇＲＮＡ、二本鎖ｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡなど、ｇＲＮＡに形成される二本鎖の認識において重要な役割を果たす。
【０５２３】
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメインおよびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ここで、ＲｕｖＣドメインはＲｕｖＣ様ドメインを含む、または、ＨＮＨドメインはＨＮＨ様ドメインを含むために使用される。
【０５２４】
ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素を有する、天然に存在する微生物ファミリーのメンバーと構造類似性を共有し、例えば、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖などの一本鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、当技術分野において、ＲｕｖＣ  Ｉドメイン、ＲｕｖＣ  ＩＩドメイン、または、ＲｕｖＣ  ＩＩＩドメインと呼ばれることがあり、一般に、ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩまたはＲｕｖＣ  ＩＩＩと呼ばれる。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、ＲｕｖＣドメインは、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列１〜５９、７１８〜７６９、および、９０９〜１０９８にそれぞれ位置する３つの分割されたＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ、ＲｕｖＣ  ＩＩＩ）の各々から組み立てられる。
【０５２５】
ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造類似性を共有し、例えば、標的核酸分子の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖など、一本鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣ  ＩＩとＩＩＩモチーフとの間に位置する。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、ＨＮＨドメインは、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列７７５〜９０８に位置する。
【０５２６】
ＰＩドメインは、標的遺伝子または核酸における特定の塩基配列、すなわち、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する、または、ＰＡＭと相互作用する。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＩドメインは、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸１０９９〜１３６８の配列に配置する。
【０５２７】
ここで、ＰＡＭは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に従って変動し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９であるとき、ＰＡＭは、５'−ＮＧＧ−３'であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がストレプトコッカス・サーモフィラスＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）であるとき、ＰＡＭは５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がナイセリア・メニンジティディスＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）であるとき、ＰＡＭは５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）であるとき、ＰＡＭは５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ）であり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣであり得る。
【０５２８】
［Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素］
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインに対応する同様のＲｕｖＣドメインを含み、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインの代わりにＮｕｃドメインと、標的を認識するＲＥＣおよびＷＥＤドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとから成り得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の具体的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ  Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｃｅｌｌ  １６５：９４９−９６２を参照されたい。
【０５２９】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡと相互作用し得て、それにより、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ｇＲＮＡと協働して、ＰＡＭ配列を含む標的配列にガイド配列が接近することを可能にし得る。ここで、標的遺伝子または核酸との相互作用のためのＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の能力は、ＰＡＭ配列に依存する。
【０５３０】
ＰＡＭ配列は、標的遺伝子または核酸に存在する配列であり、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインによって認識され得る。ＰＡＭ配列は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に従って変動し得る。すなわち、種に応じて特異的に認識されることが可能な異なるＰＡＭ配列がある。一例において、Ｃｐｆ１によって認識されるＰＡＭ配列は、５'−ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）であり得る。
【０５３１】
［ＣＲＩＳＰＲ酵素活性］
ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖を切断し、二本鎖または一本鎖の切断または除去を引き起こすヌクレアーゼ活性を有する。一般的に、野性型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的遺伝子または核酸の二本鎖を切断する。
【０５３２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素の上述のヌクレアーゼ活性を操作または改変するべく、ＣＲＩＳＰＲ酵素は操作または改変され得て、そのような操作または改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、不完全または部分的活性または不活性酵素となるように改変され得る。
【０５３３】
［不完全な、または部分的に活性のある酵素］
酵素活性を変化させ、それにより、不完全または部分的な活性を示すよう改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、ニッカーゼと称される。
【０５３４】
「ニッカーゼ」という用語は、標的遺伝子または核酸の二本鎖のうち一本鎖のみを切断するように操作または改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素を指し、ニッカーゼは、例えば、標的遺伝子または核酸のｇＲＮＡに相補的でない、または、相補的な鎖である一本鎖を切断するヌクレアーゼ活性を有する。このため、二本鎖を切断するには、２つのニッカーゼのヌクレアーゼ活性が必要である。
【０５３５】
例えば、ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を含み得て、この目的で、ＨＮＨドメインは操作または改変され得る。
【０５３６】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であれば、例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基８４０がヒスチジンからアラニンに変異されるとき、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼとして使用されるために不活性化される。それにより生成されたニッカーゼはＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形態しない鎖を切断可能である。
【０５３７】
別の例示的な実施形態において、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列における残基５５９がヒスチジンからアラニンに変異されるとき、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼとして使用されるように不活性化される。それにより生成されたニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖を切断可能である。
【０５３８】
例えば、ニッカーゼは、ＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を含み得て、この目的で、ＲｕｖＣドメインは操作または改変され得る。
【０５３９】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるならば、例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基１０がアスパラギン酸からアラニンに変異されるとき、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼとして使用されるように不活性化される。それにより生成されたニッカーゼは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を有し、よって、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖を切断可能である。
【０５４０】
別の例示的な実施形態において、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列における残基８がアスパラギン酸からアラニンに変異されるとき、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼとして使用されるように不活性化される。それにより生成されるニッカーゼは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を有し、よって、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖を切断可能である。
【０５４１】
［不活性酵素］
酵素活性を完全に不活性にするように改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素と称される。
【０５４２】
「不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素」という用語は、標的遺伝子または核酸の二本鎖を完全に切断しないように改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素を指し、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性を有するドメインにおける変異に起因するヌクレアーゼ不活性を有する。不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたものであり得る。
【０５４３】
例えば、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヌクレアーゼ活性を不活性するように、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインにおいて操作または改変され得る。
【０５４４】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるならば、例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基１０および８４０がそれぞれアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンに変異されるとき、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性は不活性化され、それにより、二本鎖が標的遺伝子または核酸の二本鎖を完全に切断しないことがあり得る。
【０５４５】
別の例示的な実施形態において、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列における残基８および５５９がアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンに変異されるとき、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性は不活性化され、それにより、二本鎖が標的遺伝子または核酸の二本鎖を完全に切断しないことがあり得る。
【０５４６】
［他の活性］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、上述のヌクレアーゼ活性に加えて、エンドヌクレアーゼ活性、エクソヌクレアーゼ活性、または、ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のへリックス構造をアニールする能力を有し得る。
【０５４７】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、エンドヌクレアーゼ活性、エクソヌクレアーゼ活性、または、ヘリカーゼ活性を完全に、不完全に、または、部分的に活性化するように改変され得る。
【０５４８】
［ＣＲＩＳＰＲ酵素の標的化］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡと相互作用し得て、それにより、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ｇＲＮＡと協働して、ＰＡＭ配列を含む標的配列にガイド配列が接近するように誘導する。ここで、標的遺伝子または核酸と相互作用するＣＲＩＳＰＲ酵素の能力は、ＰＡＭ配列に依存する。
【０５４９】
ＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインによって認識され得る、標的遺伝子または核酸に存在する配列である。ＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素の起源に応じて変動し得る。すなわち、種に従って特異的に認識されることが可能な様々なＰＡＭ配列がある。
【０５５０】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるなら、ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＧＧ−３'、５'−ＮＡＧ−３'および／または５'−ＮＧＡ−３'であり得て、ＳｔＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＧＧＮＧ−３'、および／または、５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）であり得て、ＮｍＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'および／または５'−ＮＮＮＧＣＴＴ−３'であり得て、ＣｊＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列は５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ）であり得て、ストレプトコッカス・ミュータンスＣａｓ９（ＳｍＣａｓ９）の場合、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＧＧ−３'、および／または、５'−ＮＡＡＲ−３'（Ｒ＝ＡまたはＧ）であり得て、スタフィロコッカス・アウレウス Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）の場合、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＮＧＲＲ−３'、５'−ＮＮＧＲＲＴ−３'、および／または、５'−ＮＮＧＲＲＶ−３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ）であり得る。
【０５５１】
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるなら、Ｃｐｆ１の場合、ＰＡＭ配列は、５'−ＴＴＮ−３'であり得る。ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣであり得る、または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣであり得る。
【０５５２】
特異的なＰＡＭ配列を認識可能なＣＲＩＳＰＲ酵素は、種に従って特異的に認識されることが可能なＰＡＭ配列を使用して操作または改変され得る。例えば、ＳｐＣａｓ９のＰＩドメインは、ＳｐＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を有し、かつ、ＣｊＣａｓ９特異的ＰＡＭ配列を認識するように、ＣｊＣａｓ９のＰＩドメインと置換され得て、それにより、ＣｊＣａｓ９特異的ＰＡＭ配列を認識するＳｐＣａｓ９が生成される。具体的には、認識されるＰＡＭ配列は、ＰＩドメインの置換または交換によって変化され得る。
【０５５３】
［ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体］
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヌクレアーゼ活性、ヘリカーゼ活性、ｇＲＮＡと相互作用する能力、標的遺伝子または核酸に接近する能力、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＡＭ認識能力など、様々な特性を改善または阻害するように改変され得る。
【０５５４】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ｇＲＮＡと相互作用してｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素であり得て、標的遺伝子または核酸に接近または局在化するとき、標的特異性を改善するように改変または操作され、それにより、ｇＲＮＡとの相補結合を部分的に形成する非標的遺伝子または核酸、および、それとの相補結合を形成しない非標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖を切断することなく、標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖のみが切断される。
【０５５５】
ここで、ｇＲＮＡとの相補結合を部分的に形成する非標的遺伝子または核酸、および、それとの相補結合を形成しない非標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖を切断する効果は、オフターゲット効果と称され、ｇＲＮＡとの相補結合を部分的に形成する非標的遺伝子または核酸の位置または塩基配列、および、それとの相補結合を形成しない非標的遺伝子または核酸は、オフターゲットと称される。ここで、１または複数のオフターゲットがあり得る。他方で、標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖の切断効果は、オンターゲット効果と呼ばれ、標的遺伝子または核酸の位置または標的配列は、オンターゲットと呼ばれる。
【０５５６】
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸の少なくとも１つにおいて改変され、例えば、改変されていないＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ヌクレアーゼ活性、ヘリカーゼ活性、ｇＲＮＡと相互作用する能力、標的遺伝子または核酸に接近する能力、標的特異性などの様々な特性のうち１または複数が改善または阻害されるように改変され得る。ここで、改変は、アミノ酸の置換、欠失、追加、または、それらの混在であり得る。
【０５５７】
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体において、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、正電荷を有するアミノ酸から成る領域に位置する１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
【０５５８】
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）など、正電荷アミノ酸のうち１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
【０５５９】
改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する非正電荷アミノ酸から構成される領域に配置された１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
【０５６０】
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する非正電荷アミノ酸、すなわち、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）のうち１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
【０５６１】
別の例において、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する非荷電アミノ酸、すなわち、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）のうちの１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
【０５６２】
加えて、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、疎水性残基を有するアミノ酸のうち１または２以上の改変であり得る。
【０５６３】
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）のうちの１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
【０５６４】
改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、極性残基を有するアミノ酸のうち１または２以上の改変であり得る。
【０５６５】
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）のうち１または複数のアミノ酸の改変であり得る。
【０５６６】
加えて、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）を含むアミノ酸のうち１または２以上の改変であり得る。
【０５６７】
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）を含むアミノ酸のうち１または２以上の置換であり得る。
【０５６８】
改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）を含むアミノ酸のうち１または２以上の改変であり得る。
【０５６９】
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）を含むアミノ酸のうち１または２以上の置換であり得る。
【０５７０】
改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸のうち１または２以上の改変であり得る。
【０５７１】
例えば、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在する、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を含むアミノ酸のうち１または２以上の置換であり得る。
【０５７２】
加えて、改変は、自然発生ＣＲＩＳＰＲ酵素に存在するアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７以上の改変であり得る。
【０５７３】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインに存在するアミノ酸のうち１または２以上の改変であり得る。ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩまたはＲｕｖＣ  ＩＩＩドメインであり得る。
【０５７４】
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインに存在するアミノ酸のうち１または２以上の改変であり得る。
【０５７５】
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣドメインに存在するアミノ酸のうち１または２以上の改変であり得る。
【０５７６】
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインに存在するアミノ酸のうち１または２以上であり得る。
【０５７７】
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインのうち少なくとも２つ以上のドメインに含まれるアミノ酸の２つ以上の改変であり得る。
【０５７８】
一例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣおよびＲｕｖＣドメインに含まれるアミノ酸の２つ以上の改変であり得る。
【０５７９】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣおよびＲｕｖＣドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｍ７６３、Ｄ９６５、Ｆ１０３８アミノ酸のうち少なくとも２つ以上の改変であり得る。
【０５８０】
別の例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣおよびＨＮＨドメインに含まれるアミノ酸のうち２つ以上の改変であり得る。
【０５８１】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣおよびＨＮＨドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｋ８９０アミノ酸のうち少なくとも２つ以上の改変であり得る。
【０５８２】
一例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の２つ以上の改変であり得る。
【０５８３】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣおよびＰＩドメインに含まれる、Ａ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸のうち少なくとも２つ以上の改変であり得る。
【０５８４】
別の例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨドメインに含まれるアミノ酸の３つ以上の改変であり得る。
【０５８５】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨドメインに含まれる、Ａ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｍ７６３、Ｋ８９０、Ｄ９６５、Ｆ１０３８アミノ酸の少なくとも３つ以上の改変であり得る。
【０５８６】
一例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素に含まれるＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＰＩドメインに含まれるアミノ酸の３つ以上の改変であり得る。
【０５８７】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＰＩドメインに含まれるＡ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｍ７６３、Ｄ９６５、Ｆ１０３８、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸のうち少なくとも３つ以上の改変であり得る。
【０５８８】
別の例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の３つ以上の改変であり得る。
【０５８９】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれる、Ａ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｋ８９０、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸の少なくとも３つ以上の改変であり得る。
【０５９０】
一例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の３つ以上の改変であり得る。
【０５９１】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれる、Ｍ７６３、Ｋ８９０、Ｄ９６５、Ｆ１０３８、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸の少なくとも３つ以上の改変であり得る。
【０５９２】
別の例において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれるアミノ酸の４つ以上の改変であり得る。
【０５９３】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、ＳｐＣａｓ９のＲＥＣ、ＲｕｖＣ、ＨＮＨおよびＰＩドメインに含まれる、Ａ２０３、Ｈ２７７、Ｇ３６６、Ｆ５３９、Ｉ６０１、Ｍ７６３、Ｋ８９０、Ｄ９６５、Ｆ１０３８、Ｔ１１０２およびＤ１１２７アミノ酸の少なくとも４つ以上の改変であり得る。
【０５９４】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体において、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性に関与する１または２以上のアミノ酸の改変であり得る。
【０５９５】
例えば、ＳｐＣａｓ９変異体において、改変は、アミノ酸Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３およびＤ９８６から成る群のうち１または２以上、または、他のＣａｓ９オーソログに対応するアミノ酸から成る群の１または２以上の改変であり得る。
【０５９６】
改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性の部分的不活性化のための改変であり得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体はニッカーゼであり得る。
【０５９７】
ここで、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を不活性化するための改変であり得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖を切断しないことがあり得る。
【０５９８】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９の場合、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列の残基１０がアスパラギン酸からアラニンに変異するとき、すなわち、Ｄ１０Ａに変異するとき、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化され、よって、ＳｐＣａｓ９はニッカーゼとして使用され得る。それにより、生成されたニッカーゼは、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖を切断しないことがあり得る。
【０５９９】
別の例示的な実施形態において、ＣｊＣａｓ９の場合、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の残基８がアスパラギン酸からアラニンに変異するとき、すなわち、Ｄ８Ａに変異するとき、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化され、よって、ＣｊＣａｓ９はニッカーゼとして使用され得る。それにより生成されるニッカーゼは、標的遺伝子または核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖を切断しないことがあり得る。
【０６００】
加えて、ここでは、改変はＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を不活性化するための改変であり得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖を切断しないことがあり得る。
【０６０１】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９の場合、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列の残基８４０がヒスチジンからアラニンに変異するとき、すなわち、Ｈ８４０Ａに変異するとき、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化され、よって、ＳｐＣａｓ９はニッカーゼとして使用され得る。それにより生成されるニッカーゼは、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖を切断しないことがあり得る。
【０６０２】
別の例示的な実施形態において、ＣｊＣａｓ９の場合、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の残基５５９がヒスチジンからアラニンに変異するとき、すなわち、Ｈ５５９Ａに変異するとき、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化され、よって、ＣｊＣａｓ９はニッカーゼとして使用され得る。それにより生成されるニッカーゼは、標的遺伝子または核酸の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖を切断しないことがあり得る。
【０６０３】
加えて、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化するための改変であり得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【０６０４】
ここで、改変は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を不活性化するための改変であり得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、標的遺伝子または核酸の二本鎖を切断しないことがあり得る。
【０６０５】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９の場合、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基１０および８４０がアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンに変異するとき、すなわち、それぞれＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａに変異するとき、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性は不活性化され、標的遺伝子または核酸の二本鎖は完全に切断されないことがあり得る。
【０６０６】
別の例示的な実施形態において、ＣｊＣａｓ９の場合、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列の残基８および５５９がアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンに変異するとき、すなわち、それぞれＤ８ＡおよびＨ５５９Ａに変異するとき、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性は不活性化され、よって、標的遺伝子または核酸の二本鎖は完全に切断されないことがあり得る。
【０６０７】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は更に、ＣＲＩＳＰＲ酵素の先天的特性に加え、機能ドメインを任意で含み得て、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、先天的特性に加えて追加的特性を有し得る。
【０６０８】
ここで、機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、または、核酸結合活性を有するドメイン、または、タンパク質（ペプチドを含む）を単離および精製するためのタグまたはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はこれらに限定されない。機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質はデアミナーゼであり得る。
【０６０９】
例えば、不完全または部分的なＣＲＩＳＰＲ酵素は、機能ドメインとしてシチジンデアミナーゼを追加的に含み得る。例示的な一実施形態において、シチジンデアミナーゼ、例えば、アポリポタンパク質Ｂ編集複合体１（ＡＰＯＢＥＣ１）は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼに追加され得て、それにより、融合タンパク質を生成する。それにより形成される［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］−［ＡＰＯＢＥＣ１］は、塩基修復、または、ＣをＴもしくはＵにする編集、または、ＧをＡにする編集において使用され得る。
【０６１０】
タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む）を含むが、本発明はこれらに限定されない。
【０６１１】
加えて、機能ドメインは、核局在配列またはシグナル（ＮＬＳ）、または、核外搬出配列またはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
【０６１２】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は１または複数のＮＬＳを含み得る。ここで、１または複数のＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端もしくはその近位、酵素のＣ末端もしくはその近位、または、それらの組み合わせに含まれ得る。ＮＬＳは、以下のＮＬＳ、すなわち、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原のＮＬＳ、核質からのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有する核質双極型ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ、インポーチン−αからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ、ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ、マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ、Ｄ型肝炎ウイルス抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、または、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列に由来するＮＬＳ配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０６１３】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ＣＲＩＳＰＲ酵素を２つ以上の部分に分割することによって調製されたスプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得る。「スプリット」という用語は、タンパク質を機能的または構造的に分割する、または、タンパク質をランダムに分割することにより２つ以上の部分にすることを指す。
【０６１４】
ここで、スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全に、不完全に、または、部分的に、活性酵素または不活性酵素であり得る。
【０６１５】
例えば、ＳｐＣａｓ９は、残基６５６チロシンと残基６５７スレオニンとの間で２つの部分に分割され得て、それにより、スプリット型ＳｐＣａｓ９を生成する。
【０６１６】
加えて、スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は選択的に、再構成のために、追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
【０６１７】
ここで、「再構成」とは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と構造的に同一または同様となるようにスプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素を形成することを指す。
【０６１８】
再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ二量体化ドメイン、インテイン、ＥＲＴおよびＶＰＲドメイン、または、特定の条件下でヘテロダイマーを形成するドメインであり得る。
【０６１９】
例えば、ＳｐＣａｓ９は、残基７１３セリンと残基７１４グリシンとの間で２つの部分に分割され得て、それにより、スプリット型ＳｐＣａｓ９を生成する。ＦＲＢドメインは、２つの部分のうち１つに接続され得て、ＦＫＢＰドメインは、他方に接続され得る。それにより生成されるスプリット型ＳｐＣａｓ９において、ＦＲＢドメインおよびＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンが存在する環境において二量体として形成され得て、それにより、再構成されたＣＲＩＳＰＲ酵素を生成する。
【０６２０】
本発明において説明されるＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ポリペプチド、タンパク質、または、それをコードする配列を有する核酸であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素変異体を導入するべく対象に対してコドン最適化され得る。
【０６２１】
「コドン最適化」という用語は、宿主細胞における発現を改善するように、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置換しながら、天然アミノ酸配列を維持することによって核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸の特定のコドンへの特定のバイアスを有し、コドンバイアス（生物間におけるコドン使用率の差異）は、翻訳されるコドンの特徴、および、特定のｔＲＮＡ分子の入手可能性に依存すると考えられる、ｍＲＮＡの翻訳の効率と頻繁に相関する。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性（ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）は一般的に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映する。このため、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現によりカスタマイズされ得る。
【０６２２】
［３．標的配列］
「標的配列」という用語は、標的遺伝子または核酸に存在する塩基配列であり、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との相補性を有する。標的配列は、標的遺伝子または核酸に従って様々な形態で設計され得る標的遺伝子または核酸、すなわち、遺伝子操作または修正の対象に従って変動し得る塩基配列である。
【０６２３】
標的配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との相補結合を形成し得て、標的配列の長さは、ガイド配列と同一であり得る。標的配列は、５〜５０塩基配列であり得る。 
【０６２４】
一実施形態において、標的配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
【０６２５】
標的配列は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％以上の相補性または完全相補性を有し得る、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的な核酸配列であり得る。
【０６２６】
一例において、標的配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的でない１〜８塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
【０６２７】
加えて、標的配列は、エディタータンパク質によって認識されることが可能な核酸配列に隣接する塩基配列であり得る。
【０６２８】
一例において、標的配列は、エディタータンパク質によって認識されることが可能な核酸配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する５〜５０塩基配列であり得る。
【０６２９】
例示的な一実施形態において、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の標的配列は以下で説明される。
【０６３０】
標的遺伝子または核酸がｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって標的化されるとき、標的配列は、ｇＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列との相補性を有する。標的配列は、標的遺伝子または核酸に従って様々な形態に設計され得る標的遺伝子または核酸、すなわち、遺伝子操作または修正の対象に従って変動する塩基配列である。
【０６３１】
加えて、標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、すなわち、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１によって認識されることが可能なＰＡＭ配列に隣接する塩基配列であり得る。
【０６３２】
一例において、標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって認識されるＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する５〜５０塩基配列であり得る。
【０６３３】
例示的な一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９であるとき、標的配列は、５'−ＮＧＧ−３'、５'−ＮＡＧ−３'、および／または、５'−ＮＧＡ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６〜２５の塩基配列であり得る。
【０６３４】
別の例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９であるとき、標的配列は、５'−ＮＧＧＮＧ−３'、および／または、５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６〜２５塩基配列であり得る。
【０６３５】
更に別の例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９であるとき、標的配列は、５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'、および／または、５'−ＮＮＮＧＣＴＴ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６〜２５の塩基配列であり得る。
【０６３６】
例示的な一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９であるとき、標的配列は、５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６〜２５塩基配列であり得る。
【０６３７】
別の例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｍＣａｓ９であるとき、標的配列は、５'−ＮＧＧ−３'および／または５'−ＮＡＡＲ−３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６〜２５の塩基配列であり得る。
【０６３８】
更なる別の例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳａＣａｓ９であるとき、標的配列は、５'−ＮＮＧＲＲ−３'、５'−ＮＮＧＲＲＴ−３' および／または５'−ＮＮＧＲＲＶ−３'（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６〜２５の塩基配列であり得る。
【０６３９】
例示的な一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｐｆ１であるとき、標的配列は、５'−ＴＴＮ−３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１６〜２５の塩基配列であり得る。
【０６４０】
本発明の例示的な一実施形態において、標的配列は、ＰＭＰ２２遺伝子に含まれる核酸配列であり得る。代替的に、標的配列は、ＰＭＰ２２遺伝子の部分的な核酸配列であり得る。
【０６４１】
代替的に、標的配列は、ＰＭＰ２２遺伝子のコードまたは非コード領域またはそれらの混合の核酸配列であり得る。
【０６４２】
代替的に、標的配列は、ＰＭＰ２２遺伝子のプロモーター、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、開始部位、終結部位、ドナースプライス部位、アクセプタスプライス部位、ポリＡ部位、エンハンサー、３'ＵＴＲ（非翻訳領域）、５'ＵＴＲ、アテニュエーターおよびＧＣボックス、または、それらの混合の核酸配列であり得る。
【０６４３】
代替的に、標的配列は、ＰＭＰ２２遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらの混合の核酸配列であり得る。
【０６４４】
代替的に、標的配列は、ＰＭＰ２２遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する核酸配列であり得る。
【０６４５】
代替的に、標的配列は、ＰＭＰ２２遺伝子の連続する５〜５０核酸配列であり得る。
【０６４６】
本発明の例示的な一実施形態として、上のＰＭＰ２２遺伝子の標的配列は、表１、表２、表３、表４、表５、表６および表７にまとめられている。
【０６４７】
［ＳＣ機能制御因子によって操作された産物］
［４．ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体およびその使用］
ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体が標的を改変し得る。標的は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質であり得る。
【０６４８】
例えば、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、目的のタンパク質の発現を最終的に調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、または、新規のタンパク質を発現させるために使用され得る。
【０６４９】
ここで、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体レベルで作用し得る。
【０６５０】
例えば、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、標的ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、または、標的ＤＮＡの操作または改変を通して改変タンパク質を発現させ得る。
【０６５１】
別の例において、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、標的ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、または、標的ＲＮＡの操作または改変を通して改変タンパク質を発現させ得る。
【０６５２】
一例において、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、標的ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、または、標的遺伝子の操作または改変を通して改変タンパク質を発現させ得る。
【０６５３】
別の例において、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、標的ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、タンパク質を除去し、タンパク質活性を調節し（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）、または、標的染色体の操作または改変を通して改変タンパク質を発現させ得る。
【０６５４】
ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、遺伝子転写および翻訳の段階で作用し得る。
【０６５５】
一例において、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、標的遺伝子の転写を促進または抑制し得て、それにより、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）する。
【０６５６】
別の例において、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、標的遺伝子の翻訳を促進または抑制し得て、それにより、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）する。ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体はタンパク質レベルで作用し得る。
【０６５７】
一例において、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、標的タンパク質を操作または改変し得て、それにより、標的タンパク質を除去し、または、タンパク質活性を調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）する。
【０６５８】
例示的な一実施形態において、本発明は、ＳＣ機能制御因子、例えば、ＰＭＰ２２遺伝子を操作するために使用されるガイド核酸−エディタータンパク質の複合体を提供する。好ましくは、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が提供される。
【０６５９】
具体的には、本発明は、遺伝子の標的配列との相補結合を形成可能なガイドドメインを含むｇＲＮＡ、例えば、単離された、または、非天然のｇＲＮＡおよびそれをコードするＤＮＡを提供し得る。ｇＲＮＡ、および、それをコードするＤＮＡ配列は、表１、表２、表３、表４、表５、表６および表７において列挙される標的配列に相補的に結合することを可能にするよう設計され得る。 
【０６６０】
加えて、ｇＲＮＡの標的領域は、例えば二本鎖または一本鎖の切断、または、ＰＭＰ２２遺伝子における標的部位での特定の機能などの核酸改変を有する第３の遺伝子を提供するよう設計される。
【０６６１】
加えて、２つ以上のｇＲＮＡが、例えば、二本鎖または一本鎖の切断など、標的遺伝子における２つ以上の切断イベントを誘導するために使用されるとき、２つ以上の切断イベントが、同一または異なるＣａｓ９タンパク質に起因して生じ得る。
【０６６２】
ｇＲＮＡは、例えば、ＰＭＰ２２遺伝子の２つ以上の領域を標的化し得て、ＰＭＰ２２遺伝子の二本鎖および／または一本鎖の切断を独立して誘導し得る、または、ＰＭＰ２２遺伝子の切断部位への１つの外来ヌクレオチドの挿入を誘導し得る。
【０６６３】
加えて、本発明の別の例示的な実施形態において、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体を構成する核酸は、（ａ）明細書に記載されるように、ＰＭＰ２２遺伝子の標的配列に相補的なガイドドメインを含むガイド核酸をコードする配列と、（ｂ）エディタータンパク質をコードする配列とを含み得る。
【０６６４】
ここで、標的領域に応じて、２つ以上の（ａ）があり得て、（ｂ）は、同一または２つ以上のエディタータンパク質を採用し得る。
【０６６５】
一実施形態において、ＰＭＰ２２遺伝子の発現を低減、低下または阻害するために、当該核酸は、その酵素活性または部分的活性のあるエディタータンパク質を標的化し、ノックアウトまたはノックダウン標的部位の十分近くに隣接するようにそれを配置するよう設計され得る。
【０６６６】
別の実施形態において、ＰＭＰ２２遺伝子の発現を低減、低下または阻害するために、核酸は、酵素不活性エディタータンパク質、または、その融合タンパク質（例えば、転写リプレッサードメイン融合）を標的化し、ノックダウン標的部位の十分近くに隣接するようにそれを配置するよう設計され得る。
【０６６７】
その上、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の上述の構造、機能およびすべての適用は、ＳＣ機能制御因子、すなわち、ＰＭＰ２２遺伝子の操作において利用されることが明らかとなるはずである。
【０６６８】
［ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の使用］
本発明のガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の使用についての一実施形態において、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を使用する標的ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体の操作または改変を以下に記載する。
【０６６９】
［遺伝子操作］
標的遺伝子または核酸は、上述のｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して操作または修正され得る。ここで、標的遺伝子または核酸の操作または修正は、ｉ）標的遺伝子または核酸の切断または損傷、および、ｉｉ）損傷した標的遺伝子または核酸の修復の段階のすべてを含む。
【０６７０】
［ｉ）標的遺伝子または核酸の切断または損傷］
ｉ）標的遺伝子または核酸の切断または損傷は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する、標的遺伝子または核酸の切断または損傷、具体的には、標的遺伝子または核酸における標的配列の切断または損傷であり得る。
【０６７１】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する、標的遺伝子または核酸の切断または損傷は、標的配列の二本鎖に対する完全な切断または損傷であり得る。
【０６７２】
例示的な一実施形態において、野性型ＳｐＣａｓ９が使用されるとき、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は完全に切断され得る。
【０６７３】
別の例示的な実施形態において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得て、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得て、切断は、順番または同時に起き得る。
【０６７４】
更に別の例示的な実施形態において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）、ならびに、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡが使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得て、切断は、順番または同時に起き得る。
【０６７５】
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する、標的遺伝子または核酸の切断または損傷は、標的配列の一本鎖のみに対する切断または損傷であり得る。ここで、一本鎖は、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖、または、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖であり得る。
【０６７６】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）が使用されるとき、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得るが、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、切断されないことがあり得る。
【０６７７】
別の例示的な実施形態において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得るが、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、切断されないことがあり得る。
【０６７８】
更なる別の例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する、標的遺伝子または核酸の切断または損傷は、核酸断片の部分的除去であり得る。
【０６７９】
例示的な一実施形態において、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡ、および、野性型ＳｐＣａｓ９が使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は切断され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は切断され得て、第１および第２ｇＲＮＡ、ならびに、ＳｐＣａｓ９による、核酸断片の除去をもたらす。
【０６８０】
別の例示的な実施形態において、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡ、野性型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は、野性型ＳｐＣａｓ９によって切断され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得て、非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得て、第１および第２ｇＲＮＡ、野性型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）による核酸断片の除去をもたらす。
【０６８１】
更に別の例示的な実施形態において、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡ、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得て、非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補的二本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得て、非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得て、第１および第２ｇＲＮＡ、ならびに、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）による核酸断片の除去をもたらす。
【０６８２】
更なる別の例示的な実施形態において、異なる標的配列を有する３つのｇＲＮＡ、野性型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は、野性型ＳｐＣａｓ９によって切断され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得て、第３のｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得て、第１ｇＲＮＡ、第２ｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、野性型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）による核酸断片の除去をもたらす。
【０６８３】
更なる別の例示的な実施形態において、異なる標的配列を有する４つのｇＲＮＡ、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得て、第３のｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得て、第４ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得て、第１ｇＲＮＡ、第２ｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、第４ｇＲＮＡ、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）による核酸断片の除去をもたらす。
【０６８４】
［ｉｉ）損傷した標的遺伝子または核酸の修復または復元］
ＣＲＩＳＰＲ複合体によって切断または損傷した標的遺伝子または核酸は、ＮＨＥＪおよび相同組換え修復（ＨＤＲ）を通して修復または復元され得る。
【０６８５】
［非相同末端結合（ＮＨＥＪ）］
ＮＨＥＪは、切断された二本鎖または一本鎖の両方の末端を共に結合することによって、ＤＮＡにおける二本鎖の切断を復元または修復する方法である。一般的に、二本鎖の切断（例えば切断）によって形成される２つの適合する末端が、頻繁に互いに接触して、２つの末端を完全に連結するとき、切断された二本鎖が回復する。ＮＨＥＪは、細胞周期全体で使用されることが可能な復元方法であり、通常、Ｇ１期など、鋳型として使用される相同ゲノムが細胞に無いときに生じる。
【０６８６】
ＮＨＥＪを使用する、損傷した遺伝子または核酸の修復プロセスにおいて、核酸配列におけるいくつかの挿入および／または欠失（インデル）がＮＨＥＪ修復領域において生じ、そのような挿入および／または欠失は、リーディングフレームのシフトを引き起こし、トランスクリプトームｍＲＮＡのフレームシフトをもたらす。結果として、ナンセンス媒介分解、または、正常タンパク質の合成の失敗が原因で、先天的機能が失われる。加えて、リーディングフレームが維持される一方で、タンパク質の機能を破壊するために、相当量の配列の挿入または欠失が引き起こされる変異が引き起こされ得る。重要な機能ドメインにおける変異は、タンパク質の重要でない領域における変異より、おそらく許容性が低いので、変異は座位依存的である。
【０６８７】
天然状態においてＮＨＥＪによりインデル変異が生じると予期するのは不可能であるが、所与の切断された領域では特定のインデル配列が好適であり、マイクロホモロジーの小さい領域に由来し得る。従来、欠失の長さは、１ｂｐ〜５０ｂｐの範囲に及び、挿入は、より短い傾向があり、切断された領域を直接囲む短い反復配列を頻繁に含む。
【０６８８】
加えて、ＮＨＥＪは、変異を引き起こすプロセスであり、特定の最終的な配列を生成する必要がないとき、小さい配列のモチーフの除去に使用され得る。
【０６８９】
ＣＲＩＳＰＲ複合体によって標的化される遺伝子の特異的なノックアウトは、そのようなＮＨＥＪを使用して実行され得る。標的遺伝子または核酸の二本鎖または２つの一本鎖は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して切断され得て、標的遺伝子または核酸の切断された二本鎖または２つの一本鎖は、ＮＨＥＪを通してインデルを有し得て、それにより、標的遺伝子または核酸の特異的なノックアウトを誘導する。ここで、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって切断される標的遺伝子または核酸の部位は、非コードまたはコード領域であり得て、加えて、ＮＨＥＪにより復元される標的遺伝子または核酸の部位は、非コードまたはコード領域であり得る。
【０６９０】
［相同組換え修復（ＨＤＲ）］
ＨＤＲは、損傷した遺伝子または核酸を修復または復元するために、および、一般に、切断されたＤＮＡを修復または復元するために、相同性配列を鋳型として使用する、エラーの無い修正方法である。すなわち、細胞の先天的情報を復元するために、改変されていない相補的塩基配列の情報、または、姉妹染色分体の情報を使用して、切断されたＤＮＡが修復される。最も一般的な種類のＨＤＲは相同組換え（ＨＲ）である。ＨＤＲは、活発に分裂している細胞のＳまたはＧ２／Ｍ期に通常生じる修復または復元方法である。
【０６９１】
細胞の相補的塩基配列または姉妹染色分体を使用する代わりにＨＤＲを使用して、損傷したＤＮＡを修復または復元するために、相補的塩基配列または相同塩基配列の情報を使用して人工的に合成されるＤＮＡ鋳型、すなわち、相補的塩基配列または相同塩基配列を含む核酸鋳型が細胞に提供され得て、それにより、切断されたＤＮＡを修復する。ここで、切断されたＤＮＡを修復するために核酸配列または核酸断片が核酸鋳型に更に追加されるとき、切断されたＤＮＡに更に追加される核酸配列または核酸断片は、ノックインの対象になり得る。更に追加される核酸配列または核酸断片は、変異によって改変された標的遺伝子または核酸を正常な遺伝子または核酸に、または、細胞において発現されるべき遺伝子または核酸に修正するための核酸配列または核酸断片であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０６９２】
一例において、標的遺伝子または核酸の二本鎖または一本鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得て、切断部位に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸鋳型は細胞に提供され得て、標的遺伝子または核酸の切断された塩基配列は、ＨＤＲを通して修復または復元され得る。
【０６９３】
ここで、相補的塩基配列を含む核酸鋳型は、切断されたＤＮＡ、すなわち、相補的塩基配列の切断された二本鎖または一本鎖を有し得て、更に、切断されたＤＮＡに挿入される核酸配列または核酸断片を含み得る。追加の核酸配列または核酸断片は、相補的塩基配列に挿入される核酸配列または核酸断片を含む核酸鋳型を使用して、切断されたＤＮＡの切断部位、すなわち、標的遺伝子または核酸に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片、および、追加の核酸配列または核酸断片は、変異によって改変された標的遺伝子または核酸を正常な遺伝子または核酸に、または、細胞において発現されるべき遺伝子または核酸に修正するための核酸配列または核酸断片であり得る。相補的塩基配列は、切断されたＤＮＡとの相補結合を有する塩基配列、すなわち、標的遺伝子または核酸の切断された二本鎖または一本鎖の左右の塩基配列であり得る。代替的に、相補的塩基配列は、切断されたＤＮＡとの相補結合を有する塩基配列、すなわち、標的遺伝子または核酸の切断された二本鎖または一本鎖の３'末端および５'末端であり得る。相補的塩基配列は、１５〜３０００塩基配列であり得て、相補的塩基配列の長さまたはサイズは、核酸鋳型または標的遺伝子のサイズに従って好適に設計され得る。ここで、核酸鋳型として、二本鎖または一本鎖の核酸が使用され得る、または、核酸鋳型は鎖状または環状であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０６９４】
別の例において、二本鎖または一本鎖の標的遺伝子または核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され、切断部位に隣接する塩基配列を有する相同塩基配列を含む核酸鋳型は細胞に提供され、標的遺伝子または核酸の切断された塩基配列は、ＨＤＲによって修復または復元され得る。
【０６９５】
ここで、相同塩基配列を含む核酸鋳型は、切断されたＤＮＡ、すなわち、切断された二本鎖または一本鎖相同塩基配列であり得て、更に、切断されたＤＮＡに挿入される核酸配列または核酸断片を含む。追加の核酸配列または核酸断片は、相同塩基配列、および、挿入される核酸配列または核酸断片を含む核酸鋳型を使用して、切断されたＤＮＡ、すなわち、標的遺伝子または核酸の切断部位に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片、および、追加の核酸配列または核酸断片は、変異によって改変された標的遺伝子または核酸を正常な遺伝子または核酸に、または、細胞において発現されるべき遺伝子または核酸に修正するための核酸配列または核酸断片であり得る。相同塩基配列は、切断されたＤＮＡ、すなわち、切断された二本鎖塩基配列、または、標的遺伝子または核酸の左右の一本鎖塩基配列との相同性を有する塩基配列であり得る。代替的に、相補的塩基配列は、切断されたＤＮＡ、すなわち、標的遺伝子または核酸の切断された二本鎖または一本鎖の３'末端および５'末端との相同性を有する塩基配列であり得る。相同塩基配列は、１５〜３０００塩基配列であり得て、相同塩基配列の長さまたはサイズは、核酸鋳型のサイズ、または、標的遺伝子または核酸に従って好適に設計され得る。ここで、核酸鋳型として、二本鎖または一本鎖の核酸が使用され得て、鎖状または環状であり得るが、本発明はこれらに限定されない。ＮＨＥＪおよびＨＤＲ以外に、切断されたＤＮＡを修復または復元する方法がある。
【０６９６】
［一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）］
ＳＳＡは、標的核酸に存在する２つの反復配列の間の二本鎖の切断を修復する方法であり、一般的に、３０より多くの塩基の反復配列を使用する。反復配列は、切断末端の各々において、標的核酸の二本鎖に関して、一本鎖を有するように（付着末端を有するように）切断され、切断後、反復配列を含む一本鎖のオーバーハングは、ＲＰＡタンパク質でコーティングされ、それにより、反復配列が互いに不適切にアニーリングすることを防止する。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の各反復配列に結合し、相補的反復配列をアニーリング可能な配列が構成される。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップが切断され、新規のＤＮＡの合成が特定のギャップを満たし、ＤＮＡ二本鎖を復元する。この修復の結果、２つの反復の間のＤＮＡ配列は除去され、除去される長さは、本明細書において使用される２つの反復の場所、および、切断の進捗の経路または程度を含む、様々な因子に依存し得る。
【０６９７】
ＨＤＲと同様に、ＳＳＡは相補的配列、すなわち、相補的反復配列を利用し、対照的に、標的核酸配列を改変または修正するために核酸鋳型を必要としない。
【０６９８】
［一本鎖切断修復（ＳＳＢＡ）］
ゲノムにおける一本鎖切断は、上述の修復機構とは別個の機構であるＳＳＢＲを通して修復される。一本鎖ＤＮＡ切断の場合、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２は、切断を認識し、修復機構を集める。ＤＮＡ切断部に関するＰＡＲＰ１の結合および活性は一時的であり、ＳＳＢＲは、損傷領域におけるＳＳＢＲタンパク質複合体の安定性を促進することによって促進される。ＳＳＢＲ複合体における最も重要なタンパク質は、ＤＮＡの３'末端および５'末端処理を促進するタンパク質と相互作用してＤＮＡを安定化するＸＲＣＣ１である。末端処理は一般的に、損傷３'末端をヒドロキシル化状態に、および／または、損傷５'末端をリン酸塩部分に修復することに関与し、末端の処理後、ＤＮＡギャップフィリングが起きる。ＤＮＡギャップフィリングには２つの方法、すなわち、短いパッチの修復、および長いパッチの修復があり、短いパッチの修復は、単一の塩基の挿入を伴う。ＤＮＡギャップフィリング後、ＤＮＡリガーゼは末端の連結を促進する。
【０６９９】
［ミスマッチ修復（ＭＭＲ）］
ＭＭＲは、ミスマッチしたＤＮＡ塩基に作用する。ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３複合体の各々は、ＡＴＰａｓｅ活性を有し、よって、ミスマッチの認識および修復の開始において重要な役割を果たす。ＭＳＨ２／６は主に、塩基と塩基とのミスマッチを認識し、１または２つの塩基ミスマッチを識別するが、ＭＳＨ２／３は主に、より大きいミスマッチを認識する。
【０７００】
［塩基除去修復（ＢＥＲ）］
ＢＥＲは、細胞周期全体を通してはたらく修復方法であり、小さい非らせん歪み塩基損傷領域をゲノムから除去するのに使用される。損傷したＤＮＡにおいては、塩基をリン酸デオキシリボース骨格に連結するＮグリコシド結合を切断することによって、損傷した塩基が除去され、次いで、ホスホジエステル骨格が切断され、よって、一本鎖ＤＮＡにおける切断部を生成する。形成される切断された一本鎖末端はそれにより除去され、除去された一本鎖に起因して生成されるギャップは新規の相補的塩基で充填され、次いで、新規に充填された相補的塩基の末端は、ＤＮＡリガーゼによって骨格とライゲーションされ、損傷したＤＮＡの修復がもたらされる。
【０７０１】
［ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）］
ＮＥＲは、ＤＮＡから大きいへリックス歪み損傷を除去するために重要な切除機構であり、損傷が認識されるとき、損傷した領域を含む短い一本鎖ＤＮＡセグメントが除去され、２２〜３０塩基の一本鎖ギャップがもたらされる。生成されたギャップは、新規の相補的塩基で充填され、新規に充填された相補的塩基の末端は、ＤＮＡリガーゼによって骨格とライゲーションされ、損傷したＤＮＡの修復がもたらされる。
【０７０２】
［遺伝子操作の効果］
標的遺伝子または核酸の操作または修正は概ね、ノックアウト、ノックダウン、ノックインの効果をもたらし得る。
【０７０３】
［ノックアウト］
「ノックアウト」という用語は、標的遺伝子または核酸の不活性化を指し、「標的遺伝子または核酸の不活性化」とは、標的遺伝子または核酸の転写および／または翻訳が生じない状態を指す。疾患を引き起こす遺伝子、または、異常な機能を有する遺伝子の転写および翻訳は、ノックアウトを通して阻害され得て、タンパク質発現の防止がもたらされる。
【０７０４】
例えば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子または核酸が編集または修正されるとき、標的遺伝子または核酸はＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得る。損傷した標的遺伝子または核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用してＮＨＥＪを通して修復され得る。損傷した標的遺伝子または核酸は、ＮＨＥＪに起因するインデルを有し得て、それにより、標的遺伝子または核酸に対する特異的なノックアウトが誘導され得る。
【０７０５】
［ノックダウン］
「ノックダウン」という用語は、標的遺伝子または核酸の転写および／または翻訳、または、標的タンパク質の発現の減少を指す。ノックダウンを通して遺伝子またはタンパク質の過剰発現を調節することによって、疾患の発現は防止され得る、または、疾患は治療され得る。
【０７０６】
例えば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ不活性酵素−転写阻害活性ドメイン複合体、すなわち、転写阻害活性ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ不活性複合体を使用して、標的遺伝子または核酸が編集または修正されるとき、ＣＲＩＳＰＲ不活性複合体は具体的には、標的遺伝子または核酸に結合し得て、標的遺伝子または核酸の転写は、ＣＲＩＳＰＲ不活性複合体に含まれる転写阻害活性ドメインによって阻害され得て、それにより、対応する遺伝子または核酸の発現が阻害されるノックダウンを誘導する。
【０７０７】
［ノックイン］
「ノックイン」という用語は、特定の核酸または遺伝子を標的遺伝子または核酸に挿入することを指し、ここでは、「特定の核酸」は、挿入または発現させる、目的の遺伝子または核酸を指す。ノックインを通じて正常遺伝子の発現を誘導するために、疾患を引き起こす変異遺伝子が、正常への修正または正常遺伝子の挿入により、疾患治療において利用され得る。加えて、ノックインはドナーを更に必要とし得る。
【０７０８】
例えば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子または核酸が編集または修正されるとき、標的遺伝子または核酸はＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して損傷される標的遺伝子または核酸は、ＨＤＲを通じて修復され得る。ここで、特定の核酸は、ドナーを使用して、損傷した遺伝子または核酸に挿入され得る。
【０７０９】
「ドナー」という用語は、損傷した遺伝子または核酸のＨＤＲベースの修復を助ける核酸配列を指し、ここで、ドナーは、特定の核酸を含み得る。ドナーは二本鎖または一本鎖の核酸であり得る。ドナーは、鎖状または環状形で存在し得る。ドナーは、標的遺伝子または核酸との相同性を有する核酸配列を含み得る。
【０７１０】
例えば、ドナーは、特定の核酸が挿入される位置、例えば、損傷した核酸の上流（左）および下流（右）における塩基配列の各々との相同性を有する核酸配列を含み得る。ここで、挿入される特定の核酸は、損傷した核酸の下流の塩基配列との相同性を有する核酸配列と、損傷した核酸の上流の塩基配列との相同性を有する核酸配列との間に位置し得る。ここで、相同核酸配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性もしくは完全相同性を有し得る。
【０７１１】
ドナーは任意で、追加の核酸配列を含み得る。ここで、追加の核酸配列は、ドナー安定性、ノックイン効率、または、ＨＤＲ効率を増加させるよう機能し得る。
【０７１２】
例えば、追加の核酸配列は、Ａ、Ｔリッチ核酸配列、すなわち、Ａ−Ｔリッチドメインであり得る。加えて、追加の核酸配列は、スカフォールド／マトリクス付着領域（ＳＭＡＲ）であり得る。
【０７１３】
本発明の遺伝子操作効果に関する例示的な一実施形態において、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を使用して取得される、操作された標的遺伝子、すなわち、操作されたＳＣ機能制御因子、好ましくは、操作されたＰＭＰ２２は、以下の構成を有し得る。
【０７１４】
例示的な一実施形態において、ＰＭＰ２２が遺伝子であるとき、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって人工的に操作されたＰＭＰ２２の構成は、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入のうち１または複数の核酸の改変と、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドでの置換と、ＰＭＰ２２遺伝子を構成する核酸配列におけるＰＡＭ配列内に、または、その５'末端および／または３'末端に隣接するように位置する、塩基配列における連続する１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、または、１ｂｐ〜３０ｂｐ、好ましくは、３ｂｐ〜２５ｂｐ領域において、１または複数の外来ヌクレオチドの挿入を含み得る。
【０７１５】
加えて、１または複数のヌクレオチドの化学修飾は、ＰＭＰ２２遺伝子を構成する核酸配列に含まれ得る。
【０７１６】
ここで、「外来ヌクレオチド」は、ＰＭＰ２２遺伝子に先天的に含まれるヌクレオチド以外の、すべての外因性、例えば、異種の、または、人工的に合成されたヌクレオチドを含む概念である。外来ヌクレオチドはまた、特定の機能を有するタンパク質を発現するために、数百、数千、または、数万ｂｐのサイズのヌクレオチド、ならびに、５０ｂｐ以下のサイズの小さいオリゴヌクレオチドを含む。そのような外来ヌクレオチドはドナーであり得る。
【０７１７】
化学修飾は、例えば、水素原子、フッ素原子、Ｏ−アルキル基、Ｏ−アシル基、および、アミノ基のいずれか１つによる、ヌクレオチドに含まれるいくつかの官能基の置換など、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボース化、ミリスチル化およびグリコシル化を含み得るが、本発明はこれに限定されない。加えて、核酸分子の転写性を増加させるために、官能基はまた、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−Ｒ、−Ｒ'ＯＲ、−ＳＨ、−ＳＲ、−Ｎ３および−ＣＮのいずれか１つで置換され得る（Ｒ＝アルキル、アリール、アルキレン）。加えて、少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸骨格は、アルキルホスホン酸形態、ホスホロアミド酸形態およびボラノリン酸形態のいずれか１つで置換され得る。加えて、化学修飾は、架橋型核酸（ＬＮＡ）、非架橋型核酸（ＵＮＡ）、モルホリノ、および、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれか１つによる、核酸分子に含まれる少なくとも１つの種類のヌクレオチドの置換であり得て、化学修飾は、脂質、細胞貫通ペプチド、および、細胞標的化リガンドから成る群から選択される１または複数と核酸分子との結合であり得る。
【０７１８】
所望のＳＣ機能制御システム（ＳＣ機能制御改変システムを含む）を形成するべく、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を使用する人工的改変が、ＳＣ機能制御因子、すなわち、ＰＭＰ２２遺伝子を構成する核酸に適用され得る。
【０７１９】
ＰＭＰ２２遺伝子の核酸改変を含む領域が、標的領域または標的配列であり得る。
【０７２０】
そのような標的配列は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の標的であり得て、標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって認識されるＰＡＭ配列を含み得る、または、含まないことがあり得る。そのような標的配列は、ｇＲＮＡ設計段階における重要な基準を当業者に提供し得る。そのような核酸改変は、核酸の「切断」を含む。
【０７２１】
標的領域における「切断」という用語は、ポリヌクレオチドの共有結合骨格の破損を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、本発明はこれに限定されず、様々な他の方法も含む。切断は、一本鎖および二本鎖の両方に実行されることが可能であり、二本鎖の切断は、異なる一本鎖切断の結果であり得る。二本鎖切断は、平滑末端または付着末端を生じさせ得る。
【０７２２】
不活性化されたＣＲＩＳＰＲ酵素が使用されるとき、切断プロセス無しで標的領域の特定領域またはＰＭＰ２２遺伝子に接近するための特定の機能を有する因子を誘導し得る。そのような特定の機能に従って、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における１または複数のヌクレオチドの化学修飾が含まれ得る。
【０７２３】
一例において、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって形成される核酸切断を通じた標的および非標的活性に起因して、様々なインデルが生じ得る。
【０７２４】
「インデル」という用語は、ＤＮＡ塩基配列におけるいくつかの塩基の間に発生する挿入または欠失変異についての総称である。ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が上述のように血管新生関連因子の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を切断するとき、インデルは、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ機構によって、修復中に標的配列に導入され得る。
【０７２５】
本発明の人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子は、そのような核酸のドナーを使用した、切断、インデル、または、挿入による、天然型遺伝子の核酸配列の改変を指し、所望のＳＣ機能制御システム（ＳＣ機能制御因子改変システムを含む）、例えば、ＰＭＰ２２の発現および／または機能改変を通じた、シュワン細胞の機能を制御する効果の表出に寄与する。
【０７２６】
例えば、特定のタンパク質の発現および活性は、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって阻害され得る。特定のタンパク質は、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって不活性化され得る。
【０７２７】
例として、ゲノムにおけるＰＭＰ２２遺伝子の特異的標的部位が、遺伝子をノックダウンまたはノックアウトするために切断され得る。
【０７２８】
別の例として、標的化ノックダウンは、転写を変化させるために、例えば、ＰＭＰ２２遺伝子の転写を阻害、低減または低下させるために、転写リプレッサードメインまたはクロマチン改変タンパク質に融合された、酵素的に不活性化されたＣＲＩＳＰＲ酵素を使用することによって媒介され得る。
【０７２９】
シュワン細胞の増殖は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、すなわち、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって、抑制もしくは阻害され得る、または、促進もしくは増加され得る。
【０７３０】
シュワン細胞の細胞周期の進行は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、すなわち、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって、遮断もしくは停止され得る、または、促進され得る。
【０７３１】
シュワン細胞の分化は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、すなわち、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって促進または抑制され得る。
【０７３２】
シュワン細胞の死亡は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、すなわち、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって促進または抑制され得る。
【０７３３】
末梢神経細胞の生存は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、すなわち、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって補助または干渉され得る。
【０７３４】
末梢神経細胞のシグナリングの維持は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、すなわち、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって補助または干渉され得る。
【０７３５】
神経細胞線維の髄鞘形成は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、すなわち、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって制御され得る。
【０７３６】
この場合、髄鞘形成は、髄鞘の生成、髄鞘の変性、髄鞘の再生、髄鞘の維持、および、髄鞘のコンパクトミエリンなど、髄鞘形成の全体のプロセス、ならびに、髄鞘変性または髄鞘の機能に関連するすべての機構を含む。
【０７３７】
機能異常または欠陥のあるシュワン細胞の緩和および治療は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、すなわち、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって使用され得る。
【０７３８】
更に、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、すなわち、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって、線維芽細胞もしくはグリア細胞の増殖を抑制もしくは阻害するすべての機構を制御すること、または、線維芽細胞もしくはグリア細胞の増殖を促進もしくは増加させることが可能である。
【０７３９】
人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、すなわち、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって、線維芽細胞またはグリア細胞の活性に関与するすべての機構を制御することが可能である。
【０７４０】
本発明の例示的な一実施形態において、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、すなわち、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子は、（例えば、ＰＭＰ２２遺伝子の標的領域に含まれる、または、隣接する主なＰＡＭ配列において異なる）ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の構成的特徴に従って、様々な人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子を提供し得る。
【０７４１】
以下では、ＣＲＩＳＰＲ酵素の代表的な例を図示しているが、これらは具体例に過ぎず、よって、本発明は、これに限定されない。
【０７４２】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９タンパク質であるとき、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＧＧ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣ）であり、切断された塩基配列領域（標的領域）は、標的遺伝子における５'−ＮＧＧ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐ、または、２１ｂｐ〜２３ｂｐの領域であり得る。
【０７４３】
本願は、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子を提供し得て、これは、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、ａ）５'−ＮＧＧ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐ領域の１または複数のヌクレオチドの欠失、ｂ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドによる、５'−ＮＧＧ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの置換、ｃ）５'−ＮＧＧ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、または、ｄ）ａ）〜ｃ）から選択される２つ以上の組み合わせによって調製される。
【０７４４】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９タンパク質であるとき、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３'（各Ｎは独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴ）であり、切断された塩基配列領域（標的領域）は、標的遺伝子における５'−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐ、または、２１ｂｐ〜２３ｂｐの領域であり得る。
【０７４５】
本発明は、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子を提供し得て、これは、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、ａ'）５'−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３'（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの欠失、ｂ'）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドによる、５'−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３'配列の５'末端および／または３' 末端に隣接する塩基配列における、連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの置換、ｃ'）５'−ＮＮＮＮＲＹＡＣ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、または、ｄ'）ａ'）〜ｃ'）から選択される２つ以上の組み合わせによって調製される。
【０７４６】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９タンパク質であるとき、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）であり、切断された塩基配列領域（標的領域）は、標的遺伝子における５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐ、または、２１ｂｐ〜２３ｂｐの領域であり得る。
【０７４７】
本発明は、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子を提供し得て、これは、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、ａ''）５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの欠失、ｂ''）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドによる、５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの置換、ｃ''）５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'配列に隣接する塩基配列における連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、または、ｄ''）ａ''）〜ｃ''）から選択される２つ以上の組み合わせによって調製される。
【０７４８】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９タンパク質であるとき、ＰＡＭ配列は、５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）であり、切断された塩基配列領域（標的領域）は、標的遺伝子における５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐ、または２１ｂｐ〜２３ｂｐの領域であり得る。
【０７４９】
本発明は、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子を提供し得て、これは、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、ａ'''）５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの欠失、ｂ'''）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドによる、５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの置換、ｃ'''）５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、または、ｄ'''）ａ'''）〜ｃ'''）から選択される２つ以上の組み合わせによって調製される。
【０７５０】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳａＣａｓ９タンパク質であるとき、ＰＡＭ配列は５'−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３'（各Ｎは、独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、（Ｔ）はランダムに追加可能な配列である）であり、切断された塩基配列領域（標的領域）は、標的遺伝子における５'−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐ、または、２１ｂｐ〜２３ｂｐの領域であり得る。
【０７５１】
本発明は、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子を提供し得て、これは、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、ａ''''）５'−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３'配列（各Ｎは独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、（Ｔ）はランダムに追加可能な配列である）の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの欠失、ｂ''''）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドによる、５'−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの置換、ｃ''''）５'−ＮＮＧＲＲ（Ｔ）−３'配列に隣接する塩基配列における連続する１ｂｐ〜２５ｂｐ、例えば、１７ｂｐ〜２３ｂｐの領域への１または複数のヌクレオチドの挿入、または、ｄ''''）ａ''''）〜ｃ''''）から選択される２つ以上の組み合わせによって調製される。
【０７５２】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｐｆ１タンパク質であるとき、ＰＡＭ配列は、５'−ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）であり、切断塩基配列領域（標的領域）は、５'−ＴＴＮ−３'配列の５'末端または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１０ｂｐ〜３０ｂｐ、例えば、１５ｂｐ〜２６ｂｐ、１７ｂｐ〜３０ｂｐ、または、１７ｂｐ〜２６ｂｐの領域であり得る。
【０７５３】
Ｃｐｆ１タンパク質は、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラシカス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラｓｐ（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム、または、ユウバクテリウム・エリゲンス、例えば、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム、または、ユウバクテリウム・エリゲンスなどの微生物に由来し得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０７５４】
本発明は、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子を提供し得て、これは、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、ａ'''''）５'−ＴＴＮ−３'配列（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における連続する１０ｂｐ〜３０ｂｐ、例えば、１５ｂｐ〜２６ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの欠失、ｂ'''''）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドによる、５'−ＴＴＮ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における連続する１０ｂｐ〜３０ｂｐ、例えば、１５ｂｐ〜２６ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの置換、ｃ'''''）５'−ＴＴＮ−３'配列の５'末端および／または３'末端に隣接する塩基配列における、連続する１０ｂｐ〜３０ｂｐ、例えば、１５ｂｐ〜２６ｂｐの領域の１または複数のヌクレオチドの挿入、または、ｄ'''''）ａ'''''）〜ｃ'''''）から選択される２つ以上の組み合わせによって調製される。
【０７５５】
別の例示的な実施形態において、ＰＭＰ２２がタンパク質であるとき、人工的に操作されたタンパク質は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の直接的または間接的作用によって、新しい、または、改変された血管の形成に関与するすべてのタンパク質を含む。
【０７５６】
例えば、人工的に操作されたタンパク質は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子によって発現されるタンパク質、または、そのようなタンパク質活性による影響によって増加または低減される別のタンパク質であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０７５７】
人工的に操作されたＰＭＰ２２タンパク質は、人工的に操作されたＰＭＰ２２遺伝子の組成物に対応するアミノ酸組成物および活性を有し得る。
【０７５８】
一実施形態として、（ｉ）発現特性が変更される人工的に操作されたタンパク質が提供され得る。
【０７５９】
例えば、タンパク質改変は、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列におけるＰＡＭ配列の塩基配列における、または、その５'末端および／または３'末端に隣接する、連続する１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、１ｂｐ〜３０ｂｐ、好ましくは、３ｂｐ〜２５ｂｐ領域における１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入に従う、発現量の増減；野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドによる置換に従う、発現量の増減；１または複数の外来ヌクレオチドの挿入に従う、発現量、融合タンパク質の発現、または、特定のタンパク質の独立的な発現の増減；および、上述のタンパク質の発現特性により影響される第３のタンパク質の発現量の増減など、１または複数の特性を有し得る。
【０７６０】
（ｉｉ）構造特性が変更される人工的に操作されたタンパク質が提供され得る。
【０７６１】
例えば、タンパク質改変は、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、または、その５'末端および／または３'末端に隣接するＰＡＭ配列の塩基配列における、連続する１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、１ｂｐ〜３０ｂｐ、および、好ましくは３ｂｐ〜２５ｂｐの領域における１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入に従う、コドン、アミノ酸、および、３次元構造の変化；野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドでの置換に従う、コドン、アミノ酸、および、それによる３次元構造の変化；１または複数の外来ヌクレオチドの挿入に従う、コドン、アミノ酸および３次元構造の変化、または、特定のタンパク質が分離される、特定のタンパク質または独立的構造を有する融合構造；および、構造特性が変化した上述のタンパク質によって影響される、第３のタンパク質のコドン、アミノ酸および３次元構造の変化など、１または複数の特性を有し得る。
【０７６２】
（ｉｉｉ）機能特性が変更される、人工的に操作されたタンパク質が提供され得る。
【０７６３】
例えば、タンパク質改変は、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、または、その５'末端および／または３'末端に隣接するＰＡＭ配列の塩基配列における、連続する１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、１ｂｐ〜３０ｂｐ、好ましくは３ｂｐ〜２５ｂｐの領域における１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入によって引き起こされるタンパク質改変による、特定の機能の活性化もしくは不活性化、または、新しい機能の導入；野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドでの置換によって引き起こされるタンパク質改変による、特定の機能の活性化もしくは不活性化、または、新しい機能の導入；１または複数の外来ヌクレオチドの挿入によって引き起こされるタンパク質改変による、特定の機能の活性化もしくは不活性化、または、新しい機能の導入、具体的には、特定のタンパク質の融合または独立した発現に起因する、既存機能への第３の機能の導入；および、機能特性が変更された上述のタンパク質によって影響される第３のタンパク質の機能の変更など、１または複数の特性を有し得る。
【０７６４】
加えて、ＰＭＰ２２遺伝子を構成する核酸配列における１または複数のヌクレオチドの化学修飾によって人工的に操作されたタンパク質が含まれ得る。
【０７６５】
例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボース化、ミリスチル化およびグリコシル化によって引き起こされるタンパク質の発現、構造および機能特性のうち１または複数が変更され得る。
【０７６６】
例えば、第３の構造および機能は、ヌクレオチドの化学修飾に起因する、遺伝子の核酸配列への第３のタンパク質の結合によって達成され得る。
【０７６７】
［５．他の追加の成分］
ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の効率を増加させる、または、損傷した遺伝子または核酸の修復効率を改善するため、追加の成分が選択的に追加され得る。
【０７６８】
追加の成分は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の効率を改善するために選択的に使用され得る。
【０７６９】
［活性化因子］
追加の成分は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の、標的核酸、遺伝子または染色体の切断効率を増加させるために、活性化因子として使用され得る。
【０７７０】
「活性化因子」という用語は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体と標的核酸、遺伝子または染色体との間の結合を安定化させるように、または、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体がより容易に標的核酸、遺伝子または染色体に接近することを可能にするように機能する核酸を指す。活性化因子は、二本鎖核酸または一本鎖核酸であり得る。活性化因子は鎖状または環状であり得る。
【０７７１】
活性化因子は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体と標的核酸、遺伝子または染色体との間の結合を安定化させる「ヘルパー」と、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体がより容易に標的核酸、遺伝子または染色体に接近することを可能にするように機能する「エスコーター」とに区分され得る。
【０７７２】
ヘルパーは、標的核酸、遺伝子または染色体に関するガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の切断効率を増加させ得る。
【０７７３】
例えば、ヘルパーは、標的核酸、遺伝子または染色体との相同性を有する核酸配列を含む。このため、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体が標的核酸、遺伝子または染色体に結合するとき、ヘルパーに含まれる相同核酸配列は、標的核酸、遺伝子または染色体との追加の相補結合を形成し得て、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体と標的核酸、遺伝子または染色体との間の結合を安定化させる。
【０７７４】
エスコーターは、標的核酸、遺伝子または染色体に関するガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の切断効率を増加させ得る。
【０７７５】
例えば、エスコーターは、標的核酸、遺伝子または染色体との相同性を有する核酸配列を含む。ここで、エスコーターに含まれる相同核酸配列は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体のガイド核酸との相補結合を部分的に形成し得る。このため、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体との相補結合を部分的に形成するエスコーターは、標的核酸、遺伝子または染色体との相補結合を部分的に形成し得て、結果として、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体が標的核酸、遺伝子または染色体の位置に正確に接近することを可能にし得る。
【０７７６】
相同核酸配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【０７７７】
加えて、追加の成分は、損傷した遺伝子または核酸の修復効率を改善するために選択的に使用され得る。
【０７７８】
［アシスタ］
損傷した遺伝子または核酸の修復効率を改善するためのアシスタとして、追加の成分が使用され得る。
【０７７９】
「アシスタ」という用語は、修復プロセスに関与する、または、例えば、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体によって切断される遺伝子または核酸など、損傷した遺伝子または核酸の修復効率を増加させるように機能する核酸を指す。アシスタは二本鎖核酸または一本鎖核酸であり得る。アシスタは鎖状または環状形に存在し得る。
【０７８０】
「アシスタ」は、ＮＨＥＪを使用する修復プロセスに関与する、または、修復効率を改善する「ＮＨＥＪアシスタ」と、ＨＤＲを使用する修復プロセスに関与する、または、修復方法に従って修復効率を改善する「ＨＤＲアシスタ」とに区分され得る。
【０７８１】
ＮＨＥＪアシスタは、ＮＨＥＪを使用して、修復プロセスに関与し得る、または、損傷した遺伝子または核酸の修復効率を改善し得る。
【０７８２】
例えば、ＮＨＥＪアシスタは、損傷した核酸配列の一部との相同性を有する核酸配列を含み得る。ここで、相同核酸配列は、損傷した核酸配列の一端（例えば、３'末端）における核酸配列との相同性を有する核酸配列を含み得て、損傷した核酸配列の他端（例えば、５'末端）における核酸配列との相同性を有する核酸配列を含み得る。加えて、損傷した核酸配列の上流および下流の塩基配列の各々との相同性を有する核酸配列が含まれ得る。そのような相同性を有する核酸配列は、損傷した核酸配列の２つの部分が近接して配置されるように補助し得て、それにより、ＮＨＥＪによる、損傷した核酸の修復効率を増加させる。
【０７８３】
ＨＤＲアシスタは、ＨＤＲを使用する修復プロセスに関与し得る、または、損傷した遺伝子または核酸の修復効率を改善し得る。
【０７８４】
例えば、ＨＤＲアシスタは、損傷した核酸配列の一部との相同性を有する核酸配列を含み得る。ここで、相同核酸配列は、損傷した核酸配列の一端（例えば、３'末端）における核酸配列との相同性を有する核酸配列、および、損傷した核酸配列の他端（例えば、５'末端）における核酸配列との相同性を有する核酸配列を含み得る。代替的に、損傷した核酸配列の上流および下流の塩基配列の各々との相同性を有する核酸配列が含まれ得る。そのような相同性を有する核酸配列は、損傷した核酸配列の鋳型として機能し得て、ＨＤＲによる、損傷した核酸の修復効率を増加させる。
【０７８５】
別の例において、ＨＤＲアシスタは、損傷した核酸配列の一部、および、特定の核酸、例えば、挿入される核酸または遺伝子との相同性を有する核酸配列を含み得る。ここで、相同核酸配列は、損傷した核酸配列の上流および下流の塩基配列の各々との相同性を有する核酸配列を含み得る。特定の核酸は、損傷した核酸の下流の塩基配列との相同性を有する核酸配列と、損傷した核酸の上流の塩基配列との相同性を有する核酸配列との間に位置し得る。そのような相同性を有する核酸配列、および、特定の核酸は、特定の核酸を損傷した核酸に挿入するドナーとして機能し得て、それにより、ノックインのためのＨＤＲ効率を増加させる。
【０７８６】
相同核酸配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％。７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【０７８７】
［６．対象］
「対象」という用語は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質の複合体が導入される生物、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質の複合体がはたらく生物、または、当該生物から取得される標本または試料を指す。
【０７８８】
対象は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を含む生物であり得る。生物は、細胞、組織、植物、動物またはヒトであり得る。細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。
【０７８９】
真核細胞は、植物細胞、動物細胞、または、ヒト細胞であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０７９０】
組織は、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳または筋肉組織など、動物または人体の組織であり得る。
【０７９１】
対象は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を含む標本または試料であり得る。
【０７９２】
標本または試料は、標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を含む生物から取得され得て、唾液、血液、皮膚組織、シュワン細胞、癌細胞、または、幹細胞であり得る。
【０７９３】
本発明において、具体例として、対象はガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の標的遺伝子または核酸を含み得る。ここで、標的遺伝子はＳＣ機能制御因子であり得る。ＳＣ機能制御因子はＰＭＰ２２遺伝子であり得る。標的遺伝子は野性型、または、野性型の改変形態であり得る。
【０７９４】
本発明の例示的な一実施形態において、対象は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体によって操作された遺伝子または核酸を含み得る。ここで、操作された遺伝子はＳＣ機能制御因子であり得る。ＳＣ機能制御因子はＰＭＰ２２遺伝子であり得る。ここで、ガイド核酸は、ＰＭＰ２２遺伝子を標的化し得る。
【０７９５】
ガイド核酸はＰＭＰ２２遺伝子の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。ガイド核酸は１または複数の遺伝子を標的化し得る。
【０７９６】
ガイド核酸は、２以上の遺伝子を同時に標的化し得る。ここで、２以上の遺伝子は、相同遺伝子または異種遺伝子であり得る。ガイド核酸は１または複数の標的配列を標的化し得る。
【０７９７】
ガイド核酸は、標的配列の数または位置に従って、様々な形式で設計され得る。
【０７９８】
本発明の例示的な一実施形態において、ガイド核酸は、表１、表２、表３、表４、表５、表６および表７に列挙される配列の１または複数の標的配列に相補的な核酸配列であり得る。
【０７９９】
特定の実施形態において、ＰＭＰ２２遺伝子の人工的操作のために、配列識別番号１〜６６の標的配列のいずれか１つに対応するガイド核酸配列。
【０８００】
特定の実施形態において、ＰＭＰ２２の人工的操作のために、例えば、配列識別番号１〜６６、例えば、配列識別番号１〜８、１４〜２９、または、４１〜５３の標的配列のいずれか１つと複合体を形成することに対応する、ガイド核酸配列と相互作用するエディタータンパク質が提供される。
【０８０１】
特定の実施形態において、配列識別番号１〜６６、例えば、配列識別番号１〜７９、１４〜２９、または、４１〜５３のいずれか１つの標的配列領域で人工的操作が生じる各遺伝子の核酸改変産物、および、その発現産物が提供される。 
【０８０２】
［７．移入］
ガイド核酸、エディタータンパク質、または、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、様々な移入方法および様々な形態によって、対象に移入または導入され得る。
【０８０３】
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの形態、または、その混合物の形態で対象に移入または導入され得る。
【０８０４】
エディタータンパク質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物、ペプチド、エディタータンパク質をコードするポリペプチド、または、タンパク質の形態で対象に移入または導入され得る。
【０８０５】
ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、各成分、すなわち、ガイド核酸またはエディタータンパク質をコードする、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、その混合物の形態で標的に移入または導入され得る。
【０８０６】
ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、その混合物の形態を有するガイド核酸と、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態を有するエディタータンパク質との複合体として対象に移入または導入され得る。
【０８０７】
加えて、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の効率を増加させる、または、阻害することが可能な追加の成分は、様々な移入方法によって、および、様々な形態で対象に移入または導入され得る。
【０８０８】
追加の成分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態で対象に移入または導入され得る。
【０８０９】
［ｉ）ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの混合物の形態での移入］
ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡ、または、その混合物の形態は、当技術分野において既知の方法によって対象に移入または導入され得る。
【０８１０】
または、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物の形態は、ベクター、非ベクターまたはその組み合わせによって対象に移入または導入され得る。ベクターは、ウイルスまたは非ウイルスベクター（例えばプラスミド）であり得る。非ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体またはｍＲＮＡであり得る。
【０８１１】
［ベクターを利用した導入］
ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、ベクターによって対象に移入または導入され得る。
【０８１２】
ベクターは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
【０８１３】
例えば、ベクターは、ガイド核酸およびエディタータンパク質をそれぞれコードする複数の核酸配列を同時に含み得る。例えば、ベクターは、ガイド核酸をコードする核酸配列を含み得る。
【０８１４】
例として、ガイド核酸に含まれるドメインはすべて１つのベクターに含まれ得る、または、分割されて、次いで、異なるベクターに含まれ得る。例えば、ベクターは、エディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
【０８１５】
一例において、エディタータンパク質の場合、エディタータンパク質をコードする核酸配列は、１つのベクターに含まれ得る、または、分割され、次いで、いくつかのベクターに含まれ得る。ベクターは１または複数の調節／制御成分を含み得る。
【０８１６】
ここで、調節／制御成分は、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアセプターおよび／または２Ａ配列を含み得る。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。プロモーターは誘導プロモーターであり得る。プロモーターは対象特異的プロモーターであり得る。プロモーターはウイルスまたは非ウイルスプロモーターであり得る。
【０８１７】
プロモーターは、制御領域（すなわち、ガイド核酸またはエディタータンパク質をコードする核酸配列）に従って好適なプロモーターを使用し得る。
【０８１８】
例えば、ガイド核酸に有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。例えば、エディタータンパク質に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、または、ＣＡＧプロモーターであり得る。ベクターは、ウイルスベクター、または、組み換えウイルスベクターであり得る。ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
【０８１９】
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
【０８２０】
ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０８２１】
一般的に、ウイルスは、宿主（例えば細胞）に感染し得て、それにより、ウイルスの遺伝情報をコードする核酸を宿主に導入する、または、遺伝情報をコードする核酸を宿主ゲノムに挿入する。ガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、そのような特徴を有するウイルスを使用して対象に導入され得る。ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、対象（例えば細胞）において一時的に発現され得る。代替的に、ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、対象（例えば細胞）において継続的に長時間（例えば、１、２または３週、１、２、３、６または９か月、１または２年、または、恒久的）発現され得る。
【０８２２】
ウイルスのパッケージング能力は、ウイルスの種類に従って、少なくとも２ｋｂ〜５０ｋｂ変動し得る。そのようなパッケージング能力に応じて、ガイド核酸またはエディタータンパク質を含むウイルスベクター、または、ガイド核酸およびエディタータンパク質の両方を含むウイルスベクターが設計され得る。代替的に、ガイド核酸、エディタータンパク質、および、追加の成分を含むウイルスベクターが設計され得る。
【０８２３】
一例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列が、組み換えレンチウイルスによって移入または導入され得る。
【０８２４】
別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、組み換えアデノウイルスによって移入または導入され得る。
【０８２５】
更に別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列が組み換えＡＡＶによって移入または導入され得る。
【０８２６】
更なる別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、ハイブリッドウイルスによって、例えば、本明細書において列挙されるウイルスの１または複数のハイブリッドによって、移入または導入され得る。
【０８２７】
［非ベクターを利用した導入］
ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、非ベクターを使用して対象に移入または導入され得る。
【０８２８】
非ベクターは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。非ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、ｍＲＮＡまたはそれらの混合物であり得る。
【０８２９】
非ベクターは、電気穿孔、パーティクルボンバードメント、ソノポレーション、マグネットフェクション、一過性細胞圧縮またはスクイ―ジング（例えば、文献Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ，  （２０１２）  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，  １２，  ６３２２−６３２７］において説明されている）、脂質を介したトランスフェクション、デンドリマー、ナノ粒子、リン酸カルシウム、シリカ、ケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、または、それらの組み合わせによって対象に移入または導入され得る。
【０８３０】
例として、電気穿孔を通した移入は、細胞と、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列とをカートリッジ、チャンバー、または、キュベットにおいて混合し、予め定められた期間および強度で細胞に電気刺激を加えることによって実行され得る。
【０８３１】
別の例において、非ベクターは、ナノ粒子を使用して移入され得る。ナノ粒子は、無機ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子、シリカなど）、または、有機ナノ粒子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされた脂質など）であり得る。ナノ粒子の外側表面には、付着可能な正電荷ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリンなど）が結合され得る。特定の実施形態において、非ベクターは、脂質シェルを使用して移入され得る。
【０８３２】
特定の実施形態において、非ベクターは、エキソソームを使用して移入され得る。エキソソームは、タンパク質およびＲＮＡを輸送するための内因性のナノ小胞であり、ＲＮＡを脳および別の標的臓器へ移入できる。
【０８３３】
特定の実施形態において、非ベクターは、リポソームを使用して移入され得る。リポソームは、内側の水性区画を囲む単一または複数の層状の脂質二重層と、比較的非透過性である外側の親油性リン脂質二重層とから構成される球状の小胞構造である。リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質からできていてよいが、薬物担体としてリポソームを生成するために、リン脂質が最も一般に使用される。他の添加剤が含まれ得る。
【０８３４】
［ｉｉ）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態での移入］
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態のエディタータンパク質は、当技術分野において既知の方法によって対象に移入または導入され得る。
【０８３５】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態は、電気穿孔、マイクロインジェクション、一過性細胞圧縮、または、スクイ―ジング（例えば、文献［Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ，  （２０１２）  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，  １２，  ６３２２−６３２７］において説明される）、脂質を介したトランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチドを媒介した移入、または、それらの組み合わせによって、対象に移入または導入され得る。
【０８３６】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ガイド核酸をコードする核酸配列と共に移入され得る。
【０８３７】
一例において、電気穿孔を通した移入は、エディタータンパク質がガイド核酸と共に、または、ガイド核酸無しで導入されることになる細胞をカートリッジ、チャンバー、または、キュベットにおいて混合し、予め定められた期間および強度で細胞に電気刺激を加えることによって実行され得る。
【０８３８】
［ｉｉｉ）核酸−タンパク質混合物の形態での移入］
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の形態で、対象に移入または導入され得る。
【０８３９】
例えば、ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物であり得る。エディタータンパク質はペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【０８４０】
一例において、ガイド核酸およびエディタータンパク質は、ＲＮＡ型ガイド核酸、および、タンパク質型エディタータンパク質、すなわち、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含むガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の形態で対象に移入または導入され得る。
【０８４１】
本発明において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質を対象に移入するための方法の一実施形態として、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素、または、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の移入は以下で説明される。
【０８４２】
本発明の一実施形態においてｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、ベクターを使用して対象へ移入または導入される。ベクターは、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を含み得る。
【０８４３】
例えば、ベクターは、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を同時に含み得る。例えば、ベクターは、ｇＲＮＡをコードする核酸配列を含み得る。
【０８４４】
一例において、ｇＲＮＡに含まれるドメインは、１つのベクターに含まれ得る、または、分割され、次いで、異なるベクターに含まれ得る。例えば、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を含み得る。
【０８４５】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素の場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、１つのベクターに含まれ得る、または、分割され、次いで、いくつかのベクターに含まれ得る。ベクターは、１または複数の調節／制御成分を含み得る。
【０８４６】
ここで、調節／制御成分は、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアセプターおよび／または２Ａ配列を含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。プロモーターは誘導プロモーターであり得る。プロモーターは対象特異的プロモーターであり得る。プロモーターはウイルスまたは非ウイルスプロモーターであり得る。
【０８４７】
プロモーターは、制御領域（すなわち、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列）に従って適切なプロモーターを使用し得る。
【０８４８】
例えば、ｇＲＮＡに有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、または、ＣＡＧプロモーターであり得る。ベクターは、ウイルスベクターまたは組み換えウイルスベクターであり得る。ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
【０８４９】
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
【０８５０】
ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０８５１】
一般的に、ウイルスは、宿主（例えば細胞）に感染し得て、それにより、ウイルスの遺伝情報をコードする核酸を宿主に導入する、または、遺伝情報をコードする核酸を宿主ゲノムに挿入する。ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、そのような特性を有するウイルスを使用して対象に導入され得る。ウイルスを使用して導入されるｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、対象（例えば細胞）において一時的に発現され得る。代替的に、ウイルスを使用して導入されるｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、長時間（例えば、１、２または３週間、１、２、３、６または９か月、１または２年、または恒久的）にわたって対象（例えば細胞）において継続的に発現され得る。
【０８５２】
ウイルスのパッケージング能力は、ウイルスの種類に従って、少なくとも２ｋｂ〜５０ｋｂ変動し得る。そのようなパッケージング能力に応じて、ｇＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ酵素だけを含むウイルスベクター、または、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素の両方を含むウイルスベクターが設計され得る。代替的に、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素、および、追加の成分を含むウイルスベクターが設計され得る。
【０８５３】
一例において、ｇＲＮＡをコードする核酸配列および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、組み換えレンチウイルスによって移入または導入され得る。
【０８５４】
別の例において、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列が組み換えアデノウイルスによって移入または導入され得る。
【０８５５】
更に別の例において、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列が組み換えＡＡＶによって移入または導入され得る。
【０８５６】
更に別の例において、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列が、ハイブリッドウイルス、例えば、明細書に記載のウイルスの１または複数のハイブリッドによって移入または導入され得る。
【０８５７】
本発明の例示的な一実施形態において、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は対象に移入または導入され得る。
【０８５８】
例えば、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、それらの混合物の形態で存在し得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態で存在し得る。
【０８５９】
一例において、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡ型ｇＲＮＡおよびタンパク質型ＣＲＩＳＰＲを含むｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態で対象に移入または導入され得る。
【０８６０】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、電気穿孔、マイクロインジェクション、一過性細胞圧縮、または、スクイ―ジング（例えば、文献［Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ，  （２０１２）  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，  １２，  ６３２２−６３２７］において説明される）、脂質を介したトランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチドを媒介した移入、または、それらの組み合わせによって、対象に移入または導入され得る。
【０８６１】
［８．形質転換体］
「形質転換体」という用語は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質の複合体が導入される生物、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質の複合体が発現される生物、または、当該生物から取得される標本または試料を指す。
【０８６２】
形質転換体は、ガイド核酸、エディタータンパク質、または、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体がＤＮＡ、ＲＮＡ、または、それらの混合物の形態で導入された生物であり得る。
【０８６３】
例えば、形質転換体は、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含むベクターが導入された生物であり得る。ここで、ベクターは、非ウイルスベクター、ウイルスベクター、または、組み換えウイルスベクターであり得る。
【０８６４】
別の例において、形質転換体は、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列が非ベクターの形態で導入された生物であり得る。ここで、非ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、ｍＲＮＡ、または、それらの混合物であり得る。
【０８６５】
形質転換体は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質の複合体が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態で導入された生物であり得る。
【０８６６】
形質転換体は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質の複合体が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または、それらの混合物の形態で導入された生物であり得る。
【０８６７】
例えば、形質転換体は、ＲＮＡ型ガイド核酸およびタンパク質型エディタータンパク質を含むガイド核酸−エディタータンパク質の複合体が導入された生物であり得る。
【０８６８】
形質転換体は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体の標的核酸、遺伝子、染色体、またはタンパク質を含む生物であり得る。生物は、細胞、組織、植物、動物またはヒトであり得る。細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。
【０８６９】
真核細胞は植物細胞、動物細胞、または、ヒト細胞であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【０８７０】
組織は、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳または筋肉組織などの動物または人体組織であり得る。
【０８７１】
形質転換体は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸−エディタータンパク質の複合体が導入または発現される生物、または、当該生物から取得される標本または試料であり得る。
【０８７２】
標本または試料は、唾液、血液、皮膚組織、シュワン細胞、癌細胞、または、幹細胞であり得る。
【０８７３】
［用途］
本発明の一実施形態は、ＳＣ機能制御因子、好ましくは、ＰＭＰ２２を人工的に操作するために組成物、または、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、好ましくは、人工的に操作されたＰＭＰ２２を使用する、シュワン細胞機能不全関連疾患を有する対象の治療の用途である。
【０８７４】
治療される対象は、ヒトおよびサルなどの霊長類、ラットおよびマウスなどの齧歯類、および同様のものを含む哺乳類であり得る。
【０８７５】
［治療される疾患］
実施形態において、治療される疾患はＳＣ機能不全関連疾患であり得る。
【０８７６】
「ＳＣ機能不全関連疾患」は、シュワン細胞の異常な機能によって生じるすべての状態を指す。「ＳＣ機能不全関連疾患」は、シュワン細胞の増殖および分化からシュワン細胞の死亡にわたる全体的な成長および増殖プロセス中に生じ得る、シュワン細胞の異常または欠陥に起因する疾患を含み、また、シュワン細胞の末梢神経細胞の生存および維持、ならびに、軸索における髄鞘形成（ミエリン化）などの機能における異常または欠陥に起因するすべての疾患を含む。
【０８７７】
更に、ＳＣ機能不全関連疾患はまた、線維芽細胞および／またはグリア細胞の異常な機能によって生じるすべての状態を含む。ＳＣ機能不全関連疾患は、線維芽細胞および／またはグリア細胞の増殖および分化から線維芽細胞および／またはグリア細胞の死亡にわたる全体的な成長および増殖プロセス中に生じ得る、細胞の異常または欠陥に起因する疾患を含む。
【０８７８】
ＳＣ機能不全関連疾患の例は、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、急性炎症性脱髄性多発根神経炎型、神経鞘腫症、および、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）を含むが、これらに限定されない。一例において、ＳＣ機能不全関連疾患は脱髄疾患であり得る。
【０８７９】
この場合、脱髄疾患は、髄鞘の損傷、欠陥、不安定性、変性、および、髄鞘再生に起因して生じるすべての疾患を含む。
【０８８０】
加えて、ＳＣ機能不全関連疾患はＳＣ機能制御因子関連疾患を含む。
【０８８１】
「ＳＣ機能制御因子関連疾患」は、ＳＣ機能制御因子の変異、ＳＣ機能制御遺伝子の重複、ＳＣ機能制御因子の異常発現、および同様のものに起因して生じるすべての状態を指す。
【０８８２】
ＳＣ機能制御因子関連疾患の例は、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、デジュリーヌ・ソッタス病、先天性低髄鞘形成ニューロパチー（ＣＨＮ）、ルシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）、および、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）を含むが、これらに限定されない。
【０８８３】
一例において、ＳＣ機能制御因子関連疾患はＰＭＰ２２関連疾患であり得る。
【０８８４】
この場合、ＰＭＰ２２関連疾患は、ＰＭＰ２２の変異、ＰＭＰ２２遺伝子の重複、ＰＭＰ２２の異常発現および同様のもの起因して生じるすべての疾患を含む。
【０８８５】
一実施形態において、ＳＣ機能制御因子関連疾患は、ＰＭＰ２２遺伝子の重複に起因して生じる疾患であり得る。
【０８８６】
好ましくは、ＳＣ機能制御因子関連疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジュリーヌ・ソッタス病（ＤＳＳ）、先天性低髄鞘形成ニューロパチー（ＣＨＮ）、または、ルシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）であり得る。
【０８８７】
［シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）］
ＣＭＴ疾患は、ヒト染色体において生じる遺伝子重複によって引き起こされる遺伝性疾患であり、手および足における末梢神経の成長に関与する遺伝子が変異により重複し、それにより、逆シャンペンボトル様の形状などの変形を生じさせる。ＣＭＴ疾患は、米国において１００，０００人中３６人に生じる比較的一般的な神経の遺伝性疾患であり、患者数は世界中で２８０万人であり、韓国でも約１７，０００人いると見積もられている。ＣＭＴ疾患は、遺伝的な性質に従って、全部で概ね５種類、すなわち、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２、ＣＭＴ３、ＣＭＴ４およびＣＭＴＸに分類され、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２およびＣＭＴ３は優性であり、子供に５０％の確率で遺伝し、ＣＭＴ４は劣性であり、２５％の確率で遺伝する。ＣＭＴ１およびＣＭＴ２は、大部分の国内の患者において優性遺伝し（それぞれ８０％、２０〜４０％）、ＣＭＴ３およびＣＭＴ４は非常に珍しい。ＣＭＴＸは、Ｘ染色体と共に母系から遺伝するが、その頻度は１０〜２０％である。
【０８８８】
ＣＭＴ１は、神経軸索を囲む髄鞘のタンパク質の形成に関与する遺伝子重複に起因して、遺伝子発現の正常プロセスを実行できないことによって引き起こされる疾患である。ＣＭＴ１Ａは、１７番染色体１７ｐ１１．２−ｐ１２上に位置するＰＭＰ２２遺伝子の重複により引き起こされる常染色体優性遺伝性疾患であり、髄鞘の重要な成分であるＰＭＰ２２の過剰発現により引き起こされる、髄鞘の構造および機能的異常をもたらす。
【０８８９】
ＣＭＴ２は、軸索の異常に関連し、神経伝導速度は正常状態に近い一方で運動感覚神経の活動電位が大幅に低減されるニューロパチーであり、ＣＭＴ３は、非常に珍しい常染色体劣性遺伝性疾患として幼少期に生じ、臨床症状および神経伝導速度の低下が非常に深刻な種類である。また、ＣＭＴ４は、発病年齢が早く、臨床症状が深刻である種類であり、常染色体劣性遺伝し、ＣＭＴＸはＸ染色体に関連して生じ、男性におけるその症状は、女性より深刻である。
【０８９０】
［デジュリーヌ・ソッタス病（ＤＳＳ）］
ＤＳＳは、若年齢に生じる脱髄運動性感覚性ニューロパチーであり、通常は常染色体優性遺伝するが常染色体劣性遺伝もする疾患であり、深刻な脱髄ニューロパチーを示し、乳児期から運動神経の異常を示し、非常に遅い神経伝導、および、脳脊髄液における特定のタンパク質の増加を示すという特徴を有する。デジュリーヌ・ソッタス病は、進行速度が非常に急激であり、歩行障害が若年齢から開始し、また、遺伝するが、散発的にも生じるという特徴を有する。ＣＭＴ１Ａと同様に、ＰＭＰ２２重複は、ＤＳＳの一部の患者の間に見られ、加えて、対応する遺伝子のミスセンス変異が存在することが確認された。
【０８９１】
［先天性低髄鞘形成ニューロパチー（ＣＨＮ）］
ＣＨＮは、症状が出産後すぐに現れる神経系疾患であり、その主な症状として、呼吸不全、筋力低下、筋肉運動不協和、筋肉緊張の低下、反射消失、運動失調（運動神経症、失調症）、麻痺、または、異常感覚が現れ、同一の割合で男性および女性に影響する。ＣＨＮは、障害が運動および感覚神経に生じる遺伝性疾患であり、髄鞘の脱髄および髄鞘再生が繰り返される一方で髄鞘形成が低減するという特徴がある。
【０８９２】
［ルシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）］
ＲＬＳは、珍しい種類の遺伝性運動感覚ニューロパチーであり、１９２６年にＲｏｕｓｓｙおよびＬｅｖｙらによって最初に記載され、四肢の震え、歩行消失などが、他の遺伝性運動感覚ニューロパチーより深刻な症例であるが、同一の症状が様々な遺伝性運動感覚ニューロパチーのサブタイプでも後に見つかったので、ＲＬＳは現在、遺伝性運動感覚ニューロパチーに現れる１つの症状として見られている。ＲＬＳについては、ミエリンタンパク質ゼロ遺伝子としてのＭＰＺ遺伝子の変異が、ＲＬＳを有すると最初に報告された患者の遺伝子試験において見つかり、他の患者では、末梢神経のミエリンタンパク質２２の遺伝子としてＰＭＰ２２遺伝子の重複がある症例が報告された。
【０８９３】
他の実施形態において、本発明は、機能が人工的に改変された特異的因子（例えばＳＣ機能制御因子）の様々な機能が付随する、第３のインビボ機構を制御するための追加のシステムを提供し得る。例えば、人工的に改変された特異的因子はＰＭＰ２２遺伝子であり得る。
【０８９４】
第３の機構は、シュワン細胞の機能以外の、遺伝子が関与するインビボ機構であり得る。
【０８９５】
［医薬組成物］
本発明の例示的な一実施形態は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子を使用する疾患の治療において使用される組成物に関する。
【０８９６】
組成物は、ＳＣ機能制御因子を人工的に操作することが可能な操作組成物を含み得る。組成物は、治療組成物または医薬組成物と呼ばれ得る。
【０８９７】
例示的な実施形態において、組成物は、ＳＣ機能制御因子を人工的に操作可能な操作組成物を含み得る。操作組成物は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体を含み得る。操作組成物は、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質を含み得る。
【０８９８】
操作組成物は、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸を含み得る。
【０８９９】
操作組成物は、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸を含むウイルスを含み得る。別の例示的な実施形態において、組成物は更に、追加のエレメントを含み得る。追加のエレメントは、対象の身体に移入するための適切な担体を含み得る。
【０９００】
例示的な一実施形態において、以下の治療組成物が提供される。
ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における１または複数の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸またはそれをコードする核酸配列と、エディタータンパク質またはそれをコードする核酸配列を含む、ＳＣ機能不全障害および／またはＳＣ機能制御因子関連疾患を治療するための組成物。
配列識別番号１〜６６、例えば、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列の配列識別番号１〜８、１４〜２９、または、４１〜５３の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸またはそれをコードする核酸配列と、エディタータンパク質またはそれをコードする核酸配列と含む、ＳＣ機能不全障害および／またはＳＣ機能制御因子関連疾患を治療するための組成物。
配列識別番号１〜６６、例えば、ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列の配列識別番号１から８、１４〜２９、または、４１〜５３の標的配列の各々との相補結合を形成可能なガイド核酸またはそれをコードする核酸配列と、エディタータンパク質とから形成される複合体を含む、ＳＣ機能不全障害および／またはＳＣ機能制御因子関連疾患を治療するための組成物。
【０９０１】
ここで、ガイド核酸またはそれをコードする核酸配列、および、エディタータンパク質をコードする核酸配列が、１または複数のベクターの形態で存在し得る。ガイド核酸またはそれをコードする核酸配列、および、エディタータンパク質をコードする核酸配列は、相同または異種ベクターの形態で存在し得る。
【０９０２】
［治療方法］
本発明の別の例示的な実施形態において、上述の組成物を生成する段階と、それを必要とする患者に有効量の組成物を投与する段階とを備える、患者の疾患を治療するための方法が提供される。
【０９０３】
［遺伝子操作治療］
生体の遺伝子を操作することによって、ＳＣ機能制御因子、好ましくはＰＭＰ２２遺伝子の発現を調節するための治療方法が使用され得る。そのような治療方法は、生体の遺伝子を操作するための遺伝子を操作するための組成物を生物へ直接注射することによって達成され得る。遺伝子操作のための組成物はガイド核酸−エディタータンパク質の複合体を含み得る。遺伝子操作のための組成物は、身体の特定の位置に注射され得る。
【０９０４】
ここで、身体の特定の位置は、ＳＣ機能制御因子、好ましくはＰＭＰ２２の発現および／または機能が異常である組織、または、その組織に近い位置であり得る。例えば、身体の特定の位置は、例えば、末梢神経組織であり得る。
【０９０５】
組成物の投与の対象は、ヒトもしくはサルなどの霊長類、または、マウスもしくはラットなどの齧歯類などを含む哺乳類であり得る。
【０９０６】
組成物は、注射、輸血、インプラントまたは移植などの任意の簡易な方法によって投与され得る。組成物は、皮下、皮内、眼内、硝子体内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内、リンパ管内または腹腔内で投与され得る。
【０９０７】
組成物の投与量（予め定められた所望の効果を得るための医薬有効量）は、投与の対象のｋｇあたり、１０４〜１０９細胞の値範囲におけるすべての整数、例えば、１０５〜１０６細胞／ｋｇ（体重）から選択され得るが、本発明はこれに限定されない。組成物は、投与の対象の年齢、健康条件および体重、同時に受ける治療の種類（存在する場合）、併用治療の頻度、および、所望の効果の特徴を考慮して適切に処方され得る。
【０９０８】
一態様において、本発明は、インビボ、エクスビボ、または、インビトロで達成され得る、原核細胞における標的ポリヌクレオチドを改変するための方法を提供する。
【０９０９】
いくつかの実施形態において、方法は、ヒトまたはヒト以外の動物から細胞または細胞集団を採取する段階と、細胞または細胞集団を改変する段階とを備え得る。培養は、任意のステップにおいてエクスビボで生じ得る。また、細胞または細胞集団は、ヒト以外の動物または植物に再導入され得る。再導入された細胞は、最も好ましくは、幹細胞である。
【０９１０】
更に別の例示的な実施形態において、本発明は、細胞を人工的に操作するための方法を提供し得て、当該方法は、（ａ）ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、配列識別番号：１〜６６、例えば、配列識別番号：１〜８、１４〜２９、または、４１〜５３の標的配列との相補結合を形成可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質を含むエディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列とを細胞に導入する段階を含み得る。
【０９１１】
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、核酸配列の形態で１または複数のベクターに、または、ガイド核酸およびエディタータンパク質の組み合わせの複合体に存在し得る。導入段階は、インビボまたはエクスビボで実行され得る。
【０９１２】
導入段階の前に、上述の「７．移入」の章の技法を参照されたい。
【０９１３】
例えば、導入段階は、電気穿孔、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子およびタンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される１または複数の方法によって達成され得る。
【０９１４】
例えば、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスから成る群から選択される１または複数であり得る。
【０９１５】
ＳＣ機能制御因子、好ましくは、ＰＭＰ２２が、本発明のいくつかの実施形態の方法および組成物によって人工的に操作されるとき、ＰＭＰ２２の異常発現および／または機能を制御することが可能であり、ＰＭＰ２２の異常発現および／または機能を制御することにより、異常なＰＭＰ２２の発現および／または機能は正常に改善され、その結果、ＰＭＰ２２の異常発現によって引き起こされる、シュワン細胞の異常な機能などを回復または改善する効果を得ることが可能である。
【０９１６】
［追加的用途］
特定の実施形態において、本発明は、ＳＣ機能不全障害および／またはＳＣ機能制御因子関連疾患を治療するための組成物を調製するためのキットを提供し得る。キットは、当技術分野において既知である従来の調製方法によって調製され得る。
【０９１７】
キットは更に検出可能な標識を含み得る。「検出可能な標識」という用語は、標識の無い同一の種類の分子の中から、標識を含む分子を特異的に検出するための原子または分子を指す。検出可能な標識は、タンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体、相互作用タンパク質、リガンド、ナノ粒子またはアプタマーに付着され得る。検出可能な標識は、放射性核種、フルオロフォアおよび酵素を含み得る。
【０９１８】
特定の実施形態において、本発明は、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子、好ましくはＰＭＰ２２遺伝子の発現量を調節することが可能な材料をスクリーニングするための方法を提供し得る。
【０９１９】
特定の実施形態において、本発明は、ＳＣ機能制御因子、好ましくはＰＭＰ２２遺伝子の配列を解析することによって対象において人工的に操作可能な標的部位の配列に関する情報を提供するための方法を提供し得る。加えて、そのような方法によって提供される情報を使用してライブラリを構築するための方法。ここで、既知のデータベースが使用され得る。
【０９２０】
具体的な実施形態において、本発明の方法を使用する研究のために使用できる動物または細胞が提供され得る。
【０９２１】
疾患に関連する１または複数の核酸配列における染色体編集を含む動物または細胞が、上述の方法を使用して調製され得る。そのような核酸配列は、疾患関連タンパク質配列をコードし得る、または、疾患に関連し得る参照配列であり得る。
【０９２２】
例示的な一実施形態において、本発明の方法によって調製された動物または細胞を用いる疾患研究において従来使用された測定を使用して、変異の効果と、疾患の発生および／または進行とが動物または細胞において調査され得る。代替的に、そのような動物または細胞を使用して疾患における活性化合物の薬学的効果が調査され得る。
【０９２３】
別の例示的な実施形態において、可能な遺伝子治療の手法の効果が、本発明の方法によって調製された動物または細胞を使用して評価され得る。すなわち、対応する疾患の発症および／または進行は、疾患関連タンパク質をコードする染色体配列を改変することによって抑制または低減され得る。具体的に、本方法は、疾患関連タンパク質をコードする染色体配列を編集することによって改変タンパク質を形成する段階を備え、その結果、動物または細胞の応答の改変を実現する。従って、いくつかの実施形態において、遺伝的に改変された動物は、対応する疾患の発症を起こしやすい動物と比較され得て、それにより、遺伝子治療プロセスの効果が評価される。
【０９２４】
使用は、疾患モデル、薬理学モデル、成長モデル、細胞機能モデル、および、ヒト化モデルを含み得る。例えば、使用は、ＰＭＰ２２によるシュワン細胞の異常機能関連疾患モデル、薬理学モデル、成長モデル、細胞機能モデル、および、ヒト化モデルを含み得る。
【０９２５】
人工的に操作されたＳＣ機能制御因子およびそれによるＳＣ機能制御システム（ＳＣ機能制御改変システム）は、それにより、有効なＳＣ機能不全および／またはＳＣ機能制御因子関連疾患、例えば、ＰＭＰ２２過剰発現またはＰＭＰ２２遺伝子重複関連疾患を治療するために使用され得る。更に、ＳＣ機能制御因子、好ましくは、ＰＭＰ２２が関与する様々なインビボ機構を通じて、（ＳＣ機能制御因子改変システムを含む）ＳＣ機能制御システムの有効性を改善することが可能である。以下に、実施例を参照しつつ本発明について更に詳細に記載する。
【０９２６】
例は、本発明を更に詳細に説明するために提供されるに過ぎず、本発明の範囲が以下の例に限定されなされないことは当業者にとって明らかであろう。
【０９２７】
［実験方法］
［１．ｇＲＮＡの設計］
ヒトＰＭＰ２２遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＧＥＮ  Ｔｏｏｌｓ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）を使用して選択された。ＰＭＰ２２遺伝子の標的部位は、ＣＲＩＳＰＲ酵素の種類に応じて変動し得て、ＳｐＣａｓ９のためのＰＭＰ２２遺伝子のコード部位の標的配列（コード配列、ＣＤＳ）、ＴＡＴＡボックス部位およびエンハンサー部位（例えば、ＥＧＲ２−、ＳＯＸ１０−、または、ＴＥＡＤ１−結合部位、または、遠位エンハンサー部位（遠位エンハンサー領域）ＢまたはＣ）は、上述の表１、３、５および７にまとめられており、ＣｊＣａｓ９のためのＰＭＰ２２遺伝子のコード部位（コード配列、ＣＤＳ）、ＴＡＴＡボックス部位およびエンハンサー部位（例えば、ＥＧＲ２−またはＳＯＸ１０結合部位）の標的配列は表２、４および６にまとめられている。 
【０９２８】
すべてのｇＲＮＡは、キメラ一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態で生成された。標的配列を除くＣｊおよびＳｐ特異的ｓｇＲＮＡの骨格配列は、それぞれ、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＧＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'および５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ−３'である。
【０９２９】
［２．ｇＲＮＡの構築および合成］
ｓｇＲＮＡはＡＡＶベクターに入れられた、または、ＲＮＡと共に合成された。ｓｇＲＮＡをウイルスベクターに挿入するために、ｓｇＲＮＡの２０〜２２塩基配列に対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計およびアニーリングされ、ＢｓｍＢＩ部位を使用してｐＲＧＥＮ−ＣＡＳ９（組織内で開発）ベクターにライゲーションされた。Ｃａｓ９および５'末端に可変標的配列を含むｓｇＲＮＡは、それぞれ、ＣＭＶおよびＵ６プロモーターを通じて発現された。
【０９３０】
更に、ＲＮＰによる移入システムについては、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｔａｑを介した重合によって生成された２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって鋳型が生成された後にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによってｓｇＲＮＡが転写された。転写されたｓｇＲＮＡは、分光解析を使用して精製および定量化された。
【０９３１】
［３．Ｃａｓ９タンパク質の精製］
ＮＬＳおよびＨＡエピトープを含む、コドン最適化されたＣａｓ９  ＤＮＡ配列が、ｐＥＴ２８ベクターにサブクローニングされ、最適な培養条件下でＩＰＴＧを使用してＢＬ２１（ＤＥ３）において発現された。発現されたＣａｓ９タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビードを使用して精製され、適切なバッファで透析された。Ｃａｓ９の活性は、既知の有効なｓｇＲＮＡを使用して、インビトロ切断試験を通じて確認された。
【０９３２】
［４．細胞培養］
ヒトシュワン様細胞系列（ＡＴＣＣ）およびヒト初代培養シュワン細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）が製造元のマニュアルに従って培養された。ヒトシュワン様細胞は、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）および１０％ウシ胎仔血清（Ｗｅｌｇｅｎｅ）が添加された高濃度のグルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｗｅｌｇｅｎｅ）において培養された。
【０９３３】
ヒト初代培養シュワン細胞は、ベンダによって提供されるシュワン細胞培養溶液（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）において維持された。分化のために、細胞は、１％ウシ胎仔血清（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、髄鞘形成（ミエリン化）シグナルのための１００ｎｇ／ｍＬ  Ｎｒｇ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および、１００μＭ  ｄｂｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加された低濃度のグルコースを含むＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）において７日間培養された。
【０９３４】
［５．形質導入（トランスフェクション）］
形質導入（トランスフェクション）のために、４μｇのＣａｓ９タンパク質（Ｔｏｏｌｇｅｎ）および１μｇのｓｇＲＮＡを含むＲＮＰ複合体が室温で１５分間インキュベートされた。その後、ＲＮＰ複合体は、１０μｌの電気穿孔チップおよびＮｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して電気穿孔され、２×１０５個の細胞に移入された。標的ディープシーケンシングのために、形質導入の７２時間後に、形質導入細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が回収された。
【０９３５】
［６．インビトロのリアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）］
ｍＲＮＡが、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造元のプロトコルに従って、ヒト初代培養シュワン細胞から抽出された。その後、高容量のｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、１００ｎｇのｍＲＮＡが逆転写されされた。ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、製造元のプロトコルに従って、１０ｎｇのＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックスを用いて実行された。ＰＭＰ２２発現量は、Ｃｔ値を使用して算出され、ＧＡＰＤＨは、内在性コントロールとして使用された。本試験において使用されたＴａｑＭａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を下の表８にまとめた。
［表８］
【表８】
2019537446.tif 000010
【０９３６】
［７．標的ディープシーケンシング］
オンターゲット部位は、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼｔａｑ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、形質導入細胞から抽出されたｇＤＮＡからＰＣＲにより増幅された。その後、ＰＣＲ増幅産物としてＭｉ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してペアエンドディープシーケンシングが実行された。ディープシーケンシング結果は、オンラインＣａｓ−Ａｎａｌｙｚｅｒツール（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）を使用して解析された。Ｃａｓ９によるインデルの結果として、ＰＡＭ配列から３ｂｐ上流において変異が発生したかどうかが確認された。本試験において使用されるプライマーは、下の表８にまとめられている。
［表９］
【表９】
2019537446.tif 000011
【表１０】
2019537446.tif 000012
【０９３７】
［８．オフターゲット部位のインシリコ設計］
オフターゲット潜在部位は、オンラインツール（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）を使用してインシリコで設計された。最大３ｂｐのミスマッチが、オフターゲット部位として考慮された。
【０９３８】
［９．Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ］
Ｈｅｌａ細胞のゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ベンダのプロトコルに従って精製された。予めインキュベートされたＣａｓ９タンパク質（１００ｎＭ）およびｓｇＲＮＡ（３００ｎＭ）は、１ｍＬの反応溶液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ｐＨ７．９）において、３７℃で８時間にわたってゲノムＤＮＡ（１０μｇ）と混合された。切断されたゲノムＤＮＡは、ＲＮａｓｅ  Ａ（５０μｇ／ｍＬ）で処理され、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して再度精製された。１μｇの切断されたゲノムＤＮＡは、Ｃｏｖａｒｉｓシステムを使用して断片に分割され、ライブラリを生成するためのアダプタがＤＮＡ断片に接続された。その後、ＨｉＳｅｑ  ｘ  Ｔｅｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、３０〜４０倍のシーケンシング深度で、ライブラリが全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）にかけられた（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）。ゲノムにおける各塩基配列切断の位置において、インビトロ切断スコアが、ＤＮＡ切断スコアシステムによって算出された。
【０９３９】
［１０．マウスおよび神経内注射］
本試験において使用されるＣ２２マウス系列（Ｂ６、ＣＢＡＣａ−Ｔｇ（ＰＭＰ２２）Ｃ２２Ｃｌｈ／Ｈ）は、ＭＲＣ  Ｈａｒｗｅｌｌ（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、英国）から購入した。Ｃ２２マウス（４匹の雄、および、７匹の雌）はＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された。神経内注射は、以前の試験（Ｄａｉｓｕｋｅ  Ｉｎｏ．，  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．，  （２０１６）  １１５）と同一の方式で実行された。６日齢マウスが麻酔され、マウスの坐骨神経が手術によって露出された。神経の損傷を最小限に抑えるために、マイクロインジェクターに付着した引抜ガラスマイクロピペットを使用して、坐骨切痕の末端に神経内注射がすぐに実行された。マウスあたり、１１μｇのＣａｓ９タンパク質および２．７５μｇのｓｇＲＮＡのＲＮＰ複合体がリポフェクタミン（登録商標）３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）と共にマウスに注射された。本試験において使用されたすべての動物の管理、使用および治療は、国際実験動物ケア評価認証協会に従ってＳａｍｓｕｎｇ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  （ＳＭＣ−２０１７０２０６００１）によって作成されたガイドラインの下で実行された。
【０９４０】
［１１．ロータロッド実験（ロータロッド試験）］
運動協調性は、ロータロッドデバイス（Ｂ．Ｓ．    Ｔｅｃｈｎｏｌａｂ  ＩＮＣ．、韓国）を使用して評価された。この実験は、マウスのバランスおよび運動協調性を評価するために実行された。実験前に、マウスは３日間の訓練期間を経た。実験において、ロータロッド実験のために、水平回転ロッド（２１ｒｐｍ）が使用された。マウスの回転ロッド上での保持時間が測定され、最大で３００秒間にわたってマウスがロッド上に留まるようにした。
【０９４１】
［１２．電気生理学試験］
電気生理学状態を評価するために、神経伝導試験（ＮＣＳ）が、以前の試験（Ｊｉｎｈｏ  Ｌｅｅ．，  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ．，  （２０１５）  ２２，  ４３）と同一の方式で実行された。まとめると、マウスは二酸化炭素ガスで麻酔され、実験中に１．５％のイソフルランを供給するためにノーズコーンを使用して麻酔が維持された。末端から後足まで体毛は完全に除去された。ＮＣＳは、Ｎｉｃｏｌｅｔ  ＶｉｋｉｎｇＱｕｅｓｔデバイス（Ｎａｔｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して実行された。坐骨神経の運動神経伝導試験のために、参照電極を腱に取り付けた状態で、活性記録針電極を腓腹筋に配置し、股関節の内側の身体中央および眼窩後部と大腿部の中心線に向かって６ｍｍの距離で、刺激する負電極を記録電極の近くの位置に配置することによって、遠位部分および近位部分からの応答が各々決定された。遠位潜時（ＤＬ）、運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）、および、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の強度が測定された。ＣＭＡＰは、最大超過刺激で測定された。
【０９４２】
［１３．神経組織学および画像］
マウスの坐骨神経は生検され、顕微鏡を用いた解析により、影響を受けた試料の病理検査が実行された。試料はそれぞれ、２％グルタルアルデヒドを含む２５ｍＭカコジル酸塩バッファを使用して固定された。半薄切片はトルイジンブルーで染色された。１％ＯｓＯ４における１時間のインキュベーション後、試料はエタノール系列において脱水され、次に、酸化プロピレンに通され、エポキシ樹脂（Ｅｐｏｎ  ８１２、日本、長野、応研）に包埋された。細胞は、Ｌｅｉｃａウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して特定の厚さ（１μｍ）に切られ、トルイジンブルーで３０〜４５秒間染色された。Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎ  ２プログラム（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、オーバーコッヘン）を使用してミエリンの内径および外径を測定することによって、ｇ比（軸索直径／繊維直径）が算出された。
【０９４３】
［１４．統計的解析］
ｍＲＮＡ発現量に関連するデータの統計的有意は、テューキーの事後検定の多重比較を使用する一元配置分散分析によって評価された。他の種類の提示データは、マン・ホイットニーのＵ検定（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｃｓｃｉｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｔｅｓｔｓ／ｍａｎｎｗｈｉｔｎｅｙ／Ｄｅｆａｕｌｔ２．ａｓｐｘ）を使用して算出された。本試験から得られたデータおよびグラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して解析された。有意水準は０．０５に設定された。
【０９４４】
［例１：ｓｇＲＮＡスクリーニング］
ヒトＰＭＰ２２の発現を正常範囲に低減し得る、治療効果のあるｓｇＲＮＡ配列をスクリーニングするために、ＰＭＰ遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）およびＴＡＴＡボックス、ならびに、イントロンエンハンサー結合部位を標的化するよう設計された様々なｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９を用いてヒト細胞系列が形質導入された。簡潔に説明すると、ジャーカットヒトＴ細胞がＳｐＣａｓ９スクリーニングに使用され、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞がＣｊＣａｓ９に使用された。ｇＤＮＡが細胞から回収され、標的ディープシーケンシングにかけられた。ｓｇＲＮＡ配列によって誘導される様々なパターンの変異は、ＮＨＥＪを介したインデルによって識別された。いくつかのＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡは、ＣＤＳおよび２つの調節部位においてインデルを強力に誘導した（図１ａ〜図１ｃ）。インデルの３０〜４０％が、特異的なＣｊＣａｓ９−ｓｇＲＮＡにおいて誘導された（図２ａ〜図２ｃ）ことが確認された。
【０９４５】
［例２．シュワン様細胞の遺伝子操作］
ｓｇＲＮＡによって引き起こされる効果的なインデル変異がヒト細胞において識別されたが、シュワン細胞においても効果があり得るかどうかは未知である。よって、シュワン細胞におけるＰＭＰ２２発現阻害および遺伝子操作の効果を調査するために、シュワン様細胞であるｓＮＦ２．０細胞を使用してＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ効果が確認された。ジャーカット細胞において識別された有効なＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡは、ｓＮＦ２．０細胞において反復的に試験された。形質導入後、ディープシーケンシング解析を通じて、同一の高いインデル頻度が同一のｓｇＲＮＡによって取得されたことが確認された。特に、インデルのほぼ７０〜８０％は、ＣＤＳを標的化するｓｇＲＮＡに起因して発生するＰＭＰ２２のフレームシフトであることが確認された（図４）。プロモーター（ＴＡＴＡボックス）部位およびエンハンサー結合位置を標的化する単一ｓｇＲＮＡの形質導入により、それぞれ、３１％および５９％のインデルが誘導された（図３）。興味深いことに、ミエリン遺伝子の主な制御因子（例えば、ＥＧＲまたはＳＯＸ１０結合位置）を含む４０〜５０ｂｐの小さい欠失、または、重要なＴＡＴＡボックスが、デュアルｓｇＲＮＡで治療された細胞のうち、非常に多くの細胞において見つかった（図５）。
【０９４６】
［例３．遺伝子操作によるＰＭＰ２２の発現制御］
有効なｓｇＲＮＡによる、ＰＭＰ２２の発現の変化を評価するために、シュワン様細胞が分化され、ｑＲＴ−ＰＣＲが実行された。結果として、ＰＭＰ２２を標的化するｓｇＲＮＡの大部分は、ＰＭＰ２２の発現を効果的に阻害した（図６）。単一のｓｇＲＮＡが使用されたとき、ＰＭＰ２２の発現は、Ｃａｓ９だけで処理された対照と比較して約３０％減少し、デュアルｓｇＲＮＡが使用されたとき、ＰＭＰ２２の発現は、Ｃａｓ９だけで処理された対照と比較して約５０％減少した。
【０９４７】
［例４．シュワン細胞の遺伝子操作］
シュワン様細胞において、ＰＭＰ２２の発現阻害および遺伝子操作効果が以前に確認された後、以前の結果がヒト初代培養シュワン細胞において同様の効果を示すかどうかが確認された。標的部位に応じたインデル頻度は、ヒト初代培養シュワン細胞におけるヒトＰＭＰ２２遺伝子の各標的部位でＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡを使用して確認された。その結果、インデル頻度は、ＰＭＰ２２遺伝子のＴＡＴＡボックス、エンハンサー、および、コード配列を標的化するｓｇＲＮＡの大部分における標的部位で高いことが確認された（図７ａ）。更に、ＴＡＴＡボックスおよびエンハンサーを各々標的化するデュアルｓｇＲＮＡが使用されるときでも、高いインデル頻度が示された。遠位エンハンサー部位ＢおよびＣをコードする配列を追加的に標的するｓｇＲＮＡを使用して、標的部位でインデルが発生したことが確認された（図７ｃ）。この場合、ＡＰＯＣ３を標的化するｓｇＲＮＡが対照として使用された。
【０９４８】
加えて、各標的部位におけるＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡがＰＭＰ２２遺伝子の発現の低下を引き起こすかどうかを確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析が実行された。ＰＭＰ２２は、シュワン細胞の分化の最終段階で転写されるので、ヒト初代培養シュワン細胞は、ニューレグリン１（Ｎｒｇ１）およびジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）を含む、既知である種々のシグナル因子で７日間処理された。その結果、Ｎｒｇ１およびｄｂｃＡＭＰで処理されていない細胞と比較して、Ｎｒｇ１およびｄｂｃＡＭＰで処理された細胞では、ＰＭＰ２２の発現が９倍増加したことが確認された。対照的に、細胞が、各標的部位において、ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡで処理されたとき、ＰＭＰ２２の発現が４〜６倍誘導されたことが確認された。これは、各標的部位における、ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによる、ＰＭＰ２２の各標的部位改変に起因する、ＰＭＰ２２の発現阻害に起因して決定される（図７ｂ）。
【０９４９】
［例５．ヒトＰＭＰ２２遺伝子のＴＡＴＡボックス部位を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用する、ＰＭＰ２２の効果的および特異的な発現の低下の効果］
【０９５０】
以前にスクリーニングされたＴＡＴＡボックス部位を標的化するｓｇＲＮＡの間で、高いインデル効率を示し、ＴＡＴＡボックスを標的化し得るｓｇＲＮＡ＿ＴＡＴＡ＿Ｓｐ＃１（以下、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ｓｇＲＮＡと記載）を選択することにより、ヒト初代培養シュワン細胞において実験が実行された。ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を含むＲＮＰ複合体を用いてヒト初代培養シュワン細胞に形質導入することによりインデルが誘導され（図８ｂ）、標的ディープシーケンシング解析を通じて、総インデルの８９．５４±１．３９％は、ヒトＰＭＰ２２のＴＡＴＡボックス部位において生成されたことが確認された（図８ｂ）。
【０９５１】
加えて、ＰＭＰ２２のＴＡＴＡボックスにおいて形成される変異が、ＰＭＰ２２遺伝子の発現の低下を引き起こしたかどうかを確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析が実行された。ＰＭＰ２２は、シュワン細胞の分化の最終段階で転写されるので、ヒト初代培養シュワン細胞は、ニューレグリン１（Ｎｒｇ１）およびジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）を含む、既知である種々のシグナル因子で７日間処理された。その結果、Ｎｒｇ１およびｄｂｃＡＭＰで処理されていない細胞と比較して、Ｎｒｇ１およびｄｂｃＡＭＰで処理された細胞では、ＰＭＰ２２の発現が９倍増加したことが確認された。対照的に、細胞がＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたとき、ＰＭＰ２２の発現が６倍誘導されたことが確認された。これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＰＭＰ２２のＴＡＴＡ改変によるＰＭＰ２２の発現阻害に起因して決定される（図８ｂ）。分化シグナル因子およびＡＡＶＳ１標的ＲＮＰの両方で処理された対照において、ＰＭＰ２２遺伝子の分化の差異は確認できなかった。
【０９５２】
ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰの特異性を確認するために、インシリコベースのオフターゲット解析が実行された。標的ディープシーケンシングを通じて、インシリコ解析によって確認されたオフターゲット位置では、シーケンシングエラー率（平均０．１％）を超えるインデル変異は確認されなかった（図９ａ〜図９ｃ）。インシリコベースのオフターゲット解析は、偏向した手法であり得るので、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ（偏向していない全シーケンシングベースのオフターゲット解析）も実行された。その結果、インビトロでＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによって切断された９個のオフターゲット位置を確認することが可能であった（図１０ａ、図１０ｂ）。しかしながら、標的ディープシーケンシングを通じた再解析の結果、異常なインデル変異は、オフターゲット位置で見られなかった（図１０ｃ）。
【０９５３】
これらの結果は、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによる、ＰＭＰ２２のＴＡＴＡボックスの効果的および特異的な改変が、ヒト初代培養シュワン細胞におけるＰＭＰ２２の転写量を制御し得ることを示す。
【０９５４】
［例６．ＣＭＴ１ＡマウスにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＰＭＰ２２の発現阻害による疾病表現型の緩和効果］
インビボでＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによるＰＭＰ２２転写制御を試験するために、リポソームによって囲まれたＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰは、Ｃ２２マウスの坐骨神経に直接注射された（図１１）。この場合、Ｒｏｓａ２６を標的化するＲＮＰ複合体（ｍＲｏｓａ２６）が対照として使用された。ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰまたはＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰが、６日齢（ｐ６）マウスの左坐骨神経（同側）に神経内注射および移入され、右坐骨神経（反対側）は内部対照として使用された。注射の４週間後、ＲＮＰ複合体の神経内移入効率は、坐骨神経からゲノムＤＮＡを回収することにより、標的ディープシーケンシングを通じて確認された。その結果、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰおよびＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたすべての坐骨神経は、約１１％のインデル効率を示した（図１２ａ）。更に、インビトロの結果と一致して、全体的なインデルシーケンシングのリードにおいて、９８．４８±０．１５％のＴＡＴＡボックス変異が確認された（図１２ｂ）。
【０９５５】
加えて、インビボでのＴＡＴＡボックス変異によるＰＭＰ２２の発現阻害を確認するために、全坐骨神経から抽出されたｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ解析が、ＲＮＰで処理された坐骨神経に対して実行された。インビトロの結果と同様に、ＰＭＰ２２遺伝子の発現は、対照と比較して、３８％低減したことが確認された（図１２ｃ）。
【０９５６】
ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによってオフターゲット変異が坐骨神経において発生したかどうかを確認するために、インシリコベースのオフターゲット解析が実行された。その結果、３ｂｐ以上のミスマッチを含む８個のオフターゲットが、マウスゲノムから確認され（図１３ａ）、標的ディープシーケンシングを実行した結果、シーケンシングエラー率を超えるインデル変異は、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された神経（同側）から確認されなかった（図１３ｂ）。
【０９５７】
ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＡによって引き起こされるＰＭＰ２２の転写の低下が脱髄を防止できたかとうかを試験するために、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰまたはｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理されたＣ２２マウスの坐骨神経が取得され、その半薄切片は、トルイジンブルーで染色された（ミエリン染色）。更に、ｇ比を測定するために、軸索直径および繊維（ミエリンを含む軸索）直径が測定された。その結果、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された実験群において、厚いミエリンシートが形成されたことが確認された（図１４ａ、図１４ｂ）。加えて、実験群がＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたとき、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理された対照と比較して、大きい直径を有する軸索の数が増加したことが分かった（図１４ａ、図１４ｂ）。ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された実験群（１６．５％）における、６μｍ以上の直径を有する大きい有髄繊維の数の測定結果は、対照より明確な治療効果を示す（２．６％、ｐ＜０．０１）。
【０９５８】
ミエリン化の組織学的解析の相当な改善を考慮して、２つの群の電気生理学プロファイルが調査された。その結果、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで処理された対照と比較して、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された実験群の坐骨神経において遠位潜時（ＤＬ）が減少し、運動神経伝導速度（ＮＣＶ）が増加することが確認され（図１５ａ、図１５ｂ）、結果は、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された神経におけるミエリンの厚さおよび軸索の直径の増加に対応する。更に、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の振幅は、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理された神経において大幅に増加したことが確認された（図１５ｃ）。これは以前の結果に対応する。
【０９５９】
ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰによる、組織学的および電気生理学的に改善された効果を考慮して、ロータロッド実験によってマウスの運動行動が解析された。その結果、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたマウス（１１〜１６週齢）は、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰ（図１６ａ）で処理されたマウス（１１〜１６週齢）より長くロッド上に留まったことが確認された。更に、ＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰで処理されたマウスは、ｍＲｏｓａ２６  ＲＮＰで治療されたマウスと比較して筋肉が増加したことが確認された（図１６ｂ）。
【０９６０】
これらの結果は、ＣＭＴ１Ａなどの、ＰＭＰ２２の過剰発現による脱髄を緩和または治療するための、ＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰの治療効果を示す。
【０９６１】
従って、上記の結果は、ＰＭＰ２２のプロモーター部位を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用する、ＰＭＰ２２の発現阻害効果を示す。更に、結果は、Ｃ２２マウスの坐骨神経へＰＭＰ２２−ＴＡＴＡ  ＲＮＰを直接的に非ウイルス移入することにより、ＰＭＰ２２の過剰発現によって引き起こされれる脱髄に関連する臨床的および神経病理学的表現型が改善し得ることを示す。従って、ＰＭＰ２２の制御因子部位のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した改変は、ＣＭＴ１Ａ、および、脱髄ニューロパチーを示す他の疾患の治療のための優れた手法であり得ると考えられる。
【０９６２】
［産業上の適用］
人工的に操作されたＳＣ機能制御因子およびそれによって機能が人工的に改変されたＳＣ機能制御システムは、例えば、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジュリーヌ・ソッタス病（ＤＳＳ）、先天性低髄鞘形成ニューロパチー（ＣＨＮ）またはルシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）などのＳＣ機能制御因子関連疾患など、ＳＣ機能不全障害の効果的な治療に使用され得る。ＳＣ機能制御因子が関与する様々なインビボ機構を通じて、ＳＣ機能制御システムの有効性が改善され得る。
【０９６３】
（項目１）
ＰＭＰ２２遺伝子であり、核酸配列における改変を有する、人工的に操作されたＳＣ機能制御因子。
（項目２）
上記核酸配列における上記改変は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体によって人工的に引き起こされる、人工的に操作された項目１に記載のＳＣ機能制御因子。
（項目３）
ＰＭＰ２２遺伝子の上記核酸配列は、核酸配列における改変を有する、調節領域、非コード領域、および、コード領域から成る群から選択される１または複数である、人工的に操作された項目１または２に記載のＳＣ機能制御因子。
（項目４）
上記遺伝子は、ガイド核酸−エディタータンパク質の複合体によって人工的に操作されたＳＣ機能制御因子であり、
人工的に操作された上記ＳＣ機能制御因子は、
血管新生関連因子を構成する核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ配列（ＰＡＭ配列）における、または、その５'末端および／または３'末端に隣接する連続する１ｂｐ〜５０ｂｐの塩基配列領域における、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、野性型遺伝子と異なる１または複数のヌクレオチドでの置換、ならびに、１または複数の外来ヌクレオチドの挿入のうち少なくとも１つ、または、
上記ＳＣ機能制御因子を構成する核酸配列における１または複数のヌクレオチドの化学修飾
である核酸の１または複数の改変を含む、人工的に操作された項目１から３のいずれか一項に記載のＳＣ機能制御因子。
（項目５）
核酸の上記改変は、上記遺伝子のプロモーター領域に生じる、人工的に操作された項目１から４のいずれか一項に記載のＳＣ機能制御因子。
（項目６）
核酸の上記改変は、上記遺伝子のエクソン領域に生じる、人工的に操作された項目１から５のいずれか一項に記載のＳＣ機能制御因子。
（項目７）
核酸の上記改変は、上記遺伝子のエンハンサー領域に生じる、人工的に操作された項目１から６のいずれか一項に記載のＳＣ機能制御因子。
（項目８）
核酸の上記改変は、上記遺伝子のイントロン領域に生じる、人工的に操作された項目１から７のいずれか一項に記載のＳＣ機能制御因子。
（項目９）
核酸の上記改変は、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、開始部位、終結部位、ドナースプライス部位、アクセプタスプライス部位、ポリＡ部位、エンハンサー、３'ＵＴＲ（非翻訳領域）、５'ＵＴＲ、アテニュエーターおよびＧＣボックスから成る群から選択される１または複数の配列に生じる、人工的に操作された項目１から８のいずれか一項に記載のＳＣ機能制御因子。
（項目１０）
上記ＰＡＭ配列は、
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（各Ｎは独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（各Ｎは独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（各Ｎは独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（各Ｎは独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧである）、および、
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
の（５'から３'の方向に記載される）配列のうち１または複数である、人工的に操作された項目４に記載のＳＣ機能制御因子。
（項目１１）
上記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、および、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数を含む、人工的に操作された項目２に記載のＳＣ機能制御因子。
（項目１２）
ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、開始部位、終結部位、ドナースプライス部位、アクセプタスプライス部位、ポリＡ部位、エンハンサー、３'ＵＴＲ（非翻訳領域）、５'ＵＴＲ、アテニュエーター、および、ＧＣボックスから成る群から選択される１または複数の配列の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸。
（項目１３）
上記ＰＭＰ２２遺伝子の上記核酸配列における配列識別番号１〜６６の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能な、項目１２に記載のガイド核酸。
（項目１４）
配列識別番号１から８の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸、配列識別番号１４から２９の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成可能なガイド核酸、および、配列識別番号４１から５３の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸から成る群から選択される１または複数のガイド核酸を含む、項目１３に記載のガイド核酸。
（項目１５）
配列識別番号１、３、２５、２７、２８、４１、４４または４５のうち１または複数の標的配列に対して相補結合を形成することが可能である、項目１３または１４に記載のガイド核酸。
（項目１６）
上記ガイド核酸は、１８〜２３ｂｐのヌクレオチド分子である、項目１３から１５のいずれか一項に記載のガイド核酸。
（項目１７）
ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、開始部位、終結部位、ドナースプライス部位、アクセプタスプライス部位、ポリＡ部位、エンハンサー、３'ＵＴＲ（非翻訳領域）、５'ＵＴＲ、アテニュエーター、および、ＧＣボックスから成る群から選択される１または複数の配列の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸と、
エディタータンパク質またはそれをコードする核酸配列と
を備える遺伝子操作のための組成物。
（項目１８）
上記ＰＭＰ２２遺伝子の上記核酸配列における配列識別番号１〜６６の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、
エディタータンパク質またはそれをコードする核酸配列と
を備える、項目１７に記載の遺伝子操作のための組成物。
（項目１９）
上記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、および、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質を含む、項目１７または１８に記載の遺伝子操作のための組成物。
（項目２０）
上記遺伝子操作は、
ＳＣ機能制御因子を構成する核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ配列（ＰＡＭ配列）における、または、その５'末端および／または３'末端に隣接する連続する１ｂｐ〜５０ｂｐの塩基配列領域における、１または複数のヌクレオチドの欠失または挿入、野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドでの置換、および、１または複数の外来ヌクレオチドの挿入のうち少なくとも１つ、または、
上記ＳＣ機能制御因子を構成する核酸配列における１または複数のヌクレオチドの化学修飾
である、核酸の１または複数の改変を含む、項目１７から１９のいずれか一項に記載の遺伝子操作のための組成物。
（項目２１）
上記ＰＡＭ配列は、
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（各Ｎは独立して、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
の（５'から３'の方向に記載される）配列のうち１または複数を含む、項目２０に記載の遺伝子操作のための組成物。
（項目２２）
上記遺伝子操作のための組成物は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態である、項目１７に記載の遺伝子操作のための組成物。
（項目２３）
上記遺伝子操作のための組成物は、ウイルスベクターのシステムにおいて形成される、項目１７に記載の遺伝子操作のための組成物。
（項目２４）
上記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスから選択される１または複数を含む、項目２３に記載の遺伝子操作のための組成物。
（項目２５）
（ａ）ＰＭＰ２２遺伝子の核酸配列における配列識別番号１〜６６の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列、および、
（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質をそれぞれ含むエディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列
を備える遺伝子操作のためのキット。
（項目２６）
ＰＭＰ２２の核酸配列における、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、開始部位、終結部位、ドナースプライス部位、アクセプタスプライス部位、ポリＡ部位、エンハンサー、３'ＵＴＲ（非翻訳領域）、５'ＵＴＲ、アテニュエーター、および、ＧＣボックスから成る群から選択される１または複数の配列の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、
エディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列と
を備える、ＳＣ機能不全障害を治療するための組成物。
（項目２７）
ＰＭＰ２２遺伝子の上記核酸配列における１または複数の標的配列に対してそれぞれ相補結合を形成することが可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、
エディタータンパク質またはそれをコードする核酸配列と
を備える、項目２６に記載のＳＣ機能不全障害を治療するための組成物。
（項目２８）
上記標的配列は、配列識別番号１〜６６の標的配列のうち１または複数の配列である、項目２６または２７に記載のＳＣ機能不全障害を治療するための組成物。
（項目２９）
上記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質である、項目２６から２８のいずれか一項に記載のＳＣ機能不全障害を治療するための組成物。
（項目３０）
上記ＳＣ機能不全障害は、ＰＭＰ２２の重複に起因するＰＭＰ２２遺伝子過剰発現により引き起こされるシュワン細胞機能障害である、項目２６から２９のいずれか一項に記載のＳＣ機能不全障害を治療するための組成物。
（項目３１）
上記ＳＣ機能不全障害は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、デジュリーヌ・ソッタス病（ＤＳＳ）、先天性低髄鞘形成ニューロパチー（ＣＨＮ）またはルシー・レヴィー症候群（ＲＬＳ）である、項目３０に記載のＳＣ機能不全障害を治療するための組成物。
【０９６４】
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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