(57)【要約】本明細書は、ミトコンドリア調製物を産生および／または使用するための方法および物質を提供する。例えば、改善されたミトコンドリア調製物を産生するためにキシログルカン(例えば、ポテトから得られたキシログルカン物質)を使用するための方法および物質を提供する。さらに、細胞機能を改善するためにおよび／または疾患もしくは障害の症状を軽減するためにミトコンドリア調製物を細胞に投与するための方法および物質を提供する。2019529434.tif 000005
2019529434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポテトキシログルカン物質と、細胞から分離された生存可能なミトコンドリアとを含む、組成物。
【請求項２】
前記ポテトキシログルカン物質が生のポテトから得られた、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
有機セレンを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
無機ナイトレートを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
(a) 細胞をポテトキシログルカン物質と接触させて、キシログルカン活性化細胞を得る段階、および
(b) 該キシログルカン活性化細胞からミトコンドリアを単離して、ミトコンドリア調製物を得る段階であって、
該ミトコンドリアは、該ポテトキシログルカン物質と接触していない細胞から単離された同等のミトコンドリアよりも活性が高い、段階
を含む、ミトコンドリア調製物を産生するための方法。
【請求項８】
前記ポテトキシログルカン物質が生のポテトから得られた、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がヒト細胞である、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
(a) 細胞をポテトキシログルカン物質と接触させて、キシログルカン活性化細胞を得る段階、
(b) 該キシログルカン活性化細胞からミトコンドリアを単離して、ミトコンドリア調製物を得る段階であって、該ミトコンドリアは、該ポテトキシログルカン物質と接触していない細胞から単離された同等のミトコンドリアよりも活性が高い、段階、および
(c) 該ミトコンドリア調製物を哺乳動物に投与する段階
を含む、生存可能なミトコンドリアを哺乳動物に提供するための方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記ポテトキシログルカン物質が生のポテトから得られた、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞がヒト細胞である、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
前記ミトコンドリア調製物が前記哺乳動物の組織に注射される、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が前記哺乳動物の細胞である、請求項11記載の方法。
【請求項１８】
(a) 第1の細胞をポテトキシログルカン物質と接触させて、キシログルカン活性化細胞を得る段階、
(b) 該キシログルカン活性化細胞からミトコンドリアを単離して、ミトコンドリア調製物を得る段階であって、該ミトコンドリアは、該ポテトキシログルカン物質と接触していない細胞から単離された同等のミトコンドリアよりも活性が高い、段階、および
(c) 第2の細胞を該ミトコンドリア調製物と接触させて、外因性ミトコンドリア含有細胞を得る段階、および
(d) 該外因性ミトコンドリア含有細胞を哺乳動物に投与する段階
を含む、生存可能なミトコンドリアを哺乳動物に提供するための方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記ポテトキシログルカン物質が生のポテトから得られた、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
前記第1の細胞が哺乳動物細胞である、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
前記第1の細胞がヒト細胞である、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
前記第2の細胞が哺乳動物細胞である、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
前記第2の細胞がヒト細胞である、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
前記外因性ミトコンドリア含有細胞が前記哺乳動物の組織に注射される、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
前記第1の細胞が前記哺乳動物の細胞である、請求項18記載の方法。
【請求項２７】
前記第2の細胞が前記哺乳動物の細胞である、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1. 技術分野
本明細書は、ミトコンドリア調製物を産生および/または使用するための方法および物質に関する。例えば、本明細書は、改善されたミトコンドリア調製物を産生するためにキシログルカン(例えば、ポテトから得られたキシログルカン物質)を使用するための方法および物質に関する。場合によっては、細胞機能を改善するためにおよび/または疾患もしくは障害の症状を軽減するために、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物を細胞に投与することができる。
【背景技術】
【０００２】
2. 背景情報
世界中で何百万もの人を苦しめている主要な代謝障害の病因および存続は、全身炎症促進性プロセスと複数の臓器系への正常な酸素送達の虚血性低減との病態生理学的なつながりを伴う。複数の虚血性/低酸素性および炎症促進性事象の相互的な誘発は、解消されない場合、ミトコンドリアのATP産生を著しく損なうように収束し、結果として生じる代謝低下ならびに組織および全臓器の完全性の喪失を伴いうる。ミトコンドリアの生体エネルギー産生の慢性的な機能障害により、ミトコンドリアプロテオームの進行中の遺伝子発現に関与する標準的な生化学的および分子的プロセスが著しく損なわれる可能性があり、これはミトコンドリアの機能および生合成が著しく損なわれることにつながる。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本明細書は、ミトコンドリア調製物を産生するための方法および物質ならびにミトコンドリア調製物を使用するための方法および物質を提供する。例えば、本明細書は、改善されたミトコンドリア調製物を産生するためにキシログルカン(例えば、ポテトから得られたキシログルカン物質)を使用するための方法および物質を提供する。場合によっては、細胞機能を改善するためにおよび/または疾患もしくは障害の症状を軽減するために、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物を細胞に投与することができる。
【０００４】
本明細書において記述されるように、細胞(例えば、血球)は、それらの細胞内のミトコンドリアの活性を改善する条件の下でキシログルカン調製物とともにインキュベートすることができ、またはキシログルカン調製物と接触させた状態で置くことができる。例えば、細胞(例えば、ヒト細胞)を本明細書において提供されるキシログルカン調製物で処理して、ミトコンドリア呼吸複合体1 (NADH:ユビキノンオキシドレダクターゼ, EC 1.6.5.3)ポリペプチドおよび/またはミトコンドリア輸送ポリペプチドの発現を、同等の未処理細胞において観察されるそれらの発現レベルと比較して増加させることができる。場合によっては、細胞(例えば、ヒト細胞)を本明細書において提供されるキシログルカン調製物で処理して、細胞内のミトコンドリアの活性を、同等の未処理細胞において観察されるものと比較して増加させることができる。場合によっては、ミトコンドリア活性の増加は、ミトコンドリア活性を評価することができるプローブ(例えば、色素または染料) (例えば、ローダミン6G)を用いて評価することができる。
【０００５】
場合によっては、ミトコンドリア調製物は、本明細書において提供されるキシログルカン調製物で処理された細胞から調製することができる。例えば、キシログルカン調製物で処理した細胞からミトコンドリアを単離して、ミトコンドリア調製物を作製することができる。そのようなミトコンドリア調製物のミトコンドリアは、同等の未処理細胞(すなわち、キシログルカン調製物で処理されていない同等の細胞)から得られるミトコンドリアにおいて観察されるものと比較して、増加した発現レベルのミトコンドリア呼吸複合体1ポリペプチド、増加した発現レベルのミトコンドリア輸送ポリペプチド、および/または増加したレベルのミトコンドリア活性を有することができる。
【０００６】
場合によっては、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物は哺乳動物に投与することができる。投与されたミトコンドリアは、哺乳動物内の細胞外に存在する場合および細胞内に存在する場合の両方において、哺乳動物の組織および細胞にいくつかの利点を提供することができる。例えば、哺乳動物に投与され、その哺乳動物内で細胞外に存在する場合、本明細書において記述されるように哺乳動物に投与されたインタクトかつ生存可能なミトコンドリアは、細胞および組織にATPを提供することができ、ミトコンドリア経路に関与するポリペプチドの発現を刺激することができる。哺乳動物に投与され、その哺乳動物内で細胞に内在化する場合、本明細書において記述されるように哺乳動物に投与されたインタクトかつ生存可能なミトコンドリアは、それらの細胞に、ATP産生の増加と新しい外因的に添加されるミトコンドリアDNAの供給源とを提供することができる。
【０００７】
本明細書において記述されるキシログルカン調製物に曝露された細胞から単離されたインタクトかつ生存可能なミトコンドリアを有するミトコンドリア調製物を産生する能力を有することにより、臨床医は、改善された活性を有するミトコンドリアを得るだけでなく、改善された活性を有するミトコンドリアを哺乳動物に投与することが可能になる。本明細書において記述されるミトコンドリア機能の障害または欠陥を伴う疾患または障害に罹患している哺乳動物に、改善された活性を有するミトコンドリアを投与することにより、それらの哺乳動物は、その疾患または障害の症状の重症度の軽減を経験することが可能になりうる。
【０００８】
概して、本明細書の1つの局面は、ポテトキシログルカン物質と細胞から分離された生存可能なミトコンドリアとを含む組成物を特徴とする。ポテトキシログルカン物質は、生のポテトから得られた物質であることができる。細胞は哺乳動物細胞であることができる。細胞はヒト細胞であることができる。組成物は有機セレンを含むことができる。組成物は無機ナイトレートを含むことができる。
【０００９】
別の局面において、本明細書はミトコンドリア調製物を産生するための方法を特徴とする。本方法は、(a) 細胞をポテトキシログルカン物質と接触させて、キシログルカン活性化細胞を得る段階、および(b) キシログルカン活性化細胞からミトコンドリアを単離して、ミトコンドリア調製物を得る段階であって、該ミトコンドリアは、ポテトキシログルカン物質と接触していない細胞から単離された同等のミトコンドリアよりも活性が高い、段階を含むか、または本質的にそれらの段階からなる。ポテトキシログルカン物質は、生のポテトから得られた物質であることができる。細胞は哺乳動物細胞であることができる。細胞はヒト細胞であることができる。
【００１０】
別の局面において、本明細書は、生存可能なミトコンドリアを哺乳動物に提供するための方法を特徴とする。本方法は、(a) 細胞をポテトキシログルカン物質と接触させて、キシログルカン活性化細胞を得る段階、(b) キシログルカン活性化細胞からミトコンドリアを単離して、ミトコンドリア調製物を得る段階であって、該ミトコンドリアは、ポテトキシログルカン物質と接触していない細胞から単離された同等のミトコンドリアよりも活性が高い、段階、および(c) ミトコンドリア調製物を哺乳動物に投与する段階を含むか、または本質的にそれらの段階からなる。哺乳動物はヒトであることができる。ポテトキシログルカン物質は、生のポテトから得られた物質であることができる。細胞は哺乳動物細胞であることができる。細胞はヒト細胞であることができる。ミトコンドリア調製物は前記哺乳動物の組織に注射することができる。細胞は前記哺乳動物の細胞であることができる。
【００１１】
別の局面において、本明細書は、生存可能なミトコンドリアを哺乳動物に提供するための方法を特徴とし、ここで本方法は、(a) 第1の細胞をポテトキシログルカン物質と接触させて、キシログルカン活性化細胞を得る段階、(b) キシログルカン活性化細胞からミトコンドリアを単離して、ミトコンドリア調製物を得る段階であって、該ミトコンドリアは、ポテトキシログルカン物質と接触していない細胞から単離された同等のミトコンドリアよりも活性が高い、段階、および(c) 第2の細胞をミトコンドリア調製物と接触させて、外因性ミトコンドリア含有細胞を得る段階、および(d) 外因性ミトコンドリア含有細胞を哺乳動物に投与する段階を含むか、または本質的にそれらの段階からなる。哺乳動物はヒトであることができる。ポテトキシログルカン物質は、生のポテトから得られた物質であることができる。第1の細胞は哺乳動物細胞であることができる。第1の細胞はヒト細胞であることができる。第2の細胞は哺乳動物細胞であることができる。第2の細胞はヒト細胞であることができる。外因性ミトコンドリア含有細胞は、前記哺乳動物の組織に注射することができる。第1の細胞は前記哺乳動物の細胞であることができる。第2の細胞は前記哺乳動物の細胞であることができる。
【００１２】
他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および物質は、本開示で用いるために本明細書において記載されている; 当技術分野において公知の他の適当な方法および物質を用いることもできる。物質、方法、および実施例は例示的なものにすぎず、限定するものであると意図されない。本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み入れられる。矛盾がある場合は、定義を含めて、本明細書が統べるものとする。
【００１３】
本発明の1つまたは複数の態様の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】キシログルカンで24時間処理されかつローダミン6Gで30分間染色されたHTB-11細胞(左パネル)および対照HTB-11細胞(右パネル)の写真を含む。
【図２】キシログルカンで24時間処理されかつローダミン6Gで30分間染色されたHTB-11細胞の写真である。矢印はトンネルナノチューブ内の蛍光ミトコンドリアの存在を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
本明細書は、ミトコンドリア調製物を産生するための方法および物質を提供する。例えば、本明細書は、改善されたミトコンドリア調製物を産生するためにキシログルカン(例えば、ポテトから得られたキシログルカン物質)を使用するための方法および物質を提供する。本明細書において記述されるように、細胞をキシログルカン調製物に曝露して、ミトコンドリア呼吸複合体1ポリペプチドの発現レベルを増加させ、ミトコンドリア輸送ポリペプチドの発現レベルを増加させ、および/またはミトコンドリア活性のレベルを増加させ、それによって、キシログルカン調製物で処理されていない同等の細胞に存在するミトコンドリアよりも活性が高い処理細胞内のミトコンドリアを作製することができる。
【００１６】
概して、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、任意の適切なポテトから得られたキシログルカン調製物を含むことができる。例えば、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、50パーセント超(例えば、60、70、80、90、95、または99パーセント超)が1種または複数種の生のポテトから得られたキシログルカンである、ポテト多糖調製物であることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物のキシログルカン物質は、高度に置換された複合キシログルカン物質であることができ、および/または本質的に不均一であることができる。
【００１７】
場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、ポテト(例えば、生のポテト)から得られるポテトキシログルカンであって、誘導体化されGC/MSを用いて評価された場合、少なくとも4つの主要成分(3,4-フランジメタノール, ジアセテート; 1,2,3,4,5-ペンタ-o-アセチル-D-キシリトール(異性体1); 3,5-ジアセトキシベンジルアルコール; およびD-グルシトール-ヘキサアセテート)をもたらすポテトキシログルカンを含むようにデザインすることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、ポテト(例えば、生のポテト)から得られるキシログルカン調製物であって、誘導体化された場合、GC/MSを用いて評価したときに少なくとも以下のアシル化炭水化物をもたらすキシログルカン調製物であることができる: (a) ミオ-イノシトール(内部標準としての役割を果たすように1倍に設定)、(b) ミオ-イノシトールの約40倍〜約60倍量のグルコース(例えば、ミオ-イノシトールの約50倍量のグルコース)、(c) ミオ-イノシトールの約10倍〜約20倍量のキシロース(例えば、ミオ-イノシトールの約15倍量のキシロース)、(d) ミオ-イノシトールの約5倍〜約15倍量のマンノース(例えば、ミオ-イノシトールの約10倍量のマンノース)、および(e) ミオ-イノシトールの約3倍〜約7倍量のガラクトース(例えば、ミオ-イノシトールの約5倍量のガラクトース)。誘導体化手順は、キシログルカン物質の乾燥残留物を形成し、次いでこれを、トリフルオロ酢酸を用いて加水分解する段階を含むことができる。得られた物質は、その後、水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元され、ボラート除去後に、最終産物が無水酢酸およびピリジンを用いてアシル化される。この反応の最終産物は、その後、アシル化炭水化物を同定するためにGC/MSに直接注入される。
【００１８】
場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、実質的に純粋なキシログルカン調製物であることができる。典型的には、実質的に純粋なキシログルカン調製物は、例えば、HPLCを用いて評価された場合に、単一ピークの物質(例えば、単一ピークのキシログルカン物質)を含有する調製物である。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物の60、70、75、80、85、90、95、または99パーセント超は、ポテトから得られたキシログルカン物質であることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物のキシログルカン物質は、極性の水溶性キシログルカンであることができる。
【００１９】
本明細書において記述されるように細胞を処理するためのキシログルカン調製物を得るために、任意の適切な方法を用いることができる。例えば、キシログルカン調製物は、ポテトの水抽出物から得られる調製物であって、10%アセトニトリルでC18カートリッジ(例えば、Sep-Pak Plus C-18カートリッジ)から溶出される能力を有するキシログルカン物質を含有する調製物であることができる。場合によっては、キシログルカン調製物は、ポテトから得られる調製物であって、他所(例えば、国際特許出願公開番号WO 2013/148282)に記述されているように3.5分の位置で溶出されるピークのもののHPLC特性を有するキシログルカン物質を含有する調製物であることができる。場合によっては、ポテト多糖調製物を作製するための他所に記述されている方法(例えば、国際特許出願公開番号WO 2013/148282)を用いて、本明細書において記述されるように使用できるキシログルカン調製物を作製することができる。
【００２０】
場合によっては、キシログルカン調製物は、生のポテト材料を水中で均質化し、時々振とうしながら一定期間(例えば、約1時間)そのホモジネートを室温に維持することにより得ることができる。ホモジネートを(例えば、10分間4000 gで)遠心分離して、より大きい固体物質を除去することができる。得られた上清を固相抽出(Solid Phase Extraction)カートリッジ(例えば、Sep-Pak Plus C-18カートリッジのようなC18カートリッジ)に充填し、キシログルカン物質を10パーセントのアセトニトリルで溶出することができる。溶出させたら、キシログルカン物質を乾燥かつ貯蔵(例えば、約4℃で)することができる。
【００２１】
任意の適切なポテト種または変種を用いて、本明細書において記述されるキシログルカン調製物を得ることができる。例えば、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、サツマイモ(Ipomoea batatas)、S. アカウレ(S. acaule)、S. ブカソビイ(S. bukasovii)、S. レプトフィエス(S. leptophyes)、S. メギスタクロロバム(S. megistacrolobum)、S. コマーソニイ(S. commersonii)、またはS. インフンジブリフォーメ(S. infundibuliforme)を用いて、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を得ることができる。場合によっては、S. ツネロサム(S. tunerosum)のポテト変種、例えばオーガニック・イエロー、パープルまたはブルー変種、クリーム・オブ・ザ・クロップ(Cream of the Crop)、アディロンダック・ブルー(Adirondack Blue)、アディロンダック・レッド、アガタ(Agata)、アーモンド(Almond)、アンデス・ゴールド(Andes Gold)、アンデス・サン(Andes Sun)、アプライン(Apline)、アルトゥラス(Alturas)、アマンディーヌ(Amandine)、アナベル(Annabelle)、アニヤ(Anya)、アラン・ビクトリー(Arran Victory)、アトランティック(Atlantic)、アバランチ(Avalanche)、バンベルグ(Bamberg)、バノック・ラセット(Bannock Russet)、ベル・ド・フォントネー(Belle de Fontenay)、BF-15、ビルドスター(Bildtstar)、ビンチェ(Bintje)、ブレイザー・ラセット(Blazer Russet)、ブルー・コンゴ(Blue Congo)、ボノット(Bonnotte)、ブリティッシュ・クイーンズ(British Queens)、カブリタス(Cabritas)、カモタ(Camota)、カネラ・ラセット(Canela Russet)、カーラ(Cara)、カローラ(Carola)、シェリナ(Chelina)、チロエ(Chiloe)、シエロ(Cielo)、クラベラ・ブランカ(Clavela Blanca)、デジレ(Desiree)、エスティマ(Estima)、フィアナ(Fianna)、フィンガーリング(Fingerling)、フラバ(Flava)、ジャーマン・バターボール(German Butterball)、ゴールデン・ワンダー(Golden Wonder)、ゴールドラッシュ(Goldrush)、ホーム・ガード(Home Guard)、イノベーター(Innovator)、アイリッシュ・コブラー(Irish Cobbler)、ジャージー・ロイヤル(Jersey Royal)、ケネベック(Kennebec)、ケールズ・ピンク(Kerr's Pink)、ケストレル(Kestrel)、ケウカ・ゴールド(Keuka Gold)、キング・エドワード(King Edward)、キプフラー(Kipfler)、レディ・バルフォア(Lady Balfour)、ラングレード(Langlade)、リンダ(Linda)、マーシー(Marcy)、マルフォナ(Marfona)、マリス・パイパー(Maris Piper)、マークイーズ(Marquis)、メガチップ(Megachip)、モナリザ(Monalisa)、ニコラ(Nicola)、パチャコナ(Pachacona)、パイク(Pike)、ピンク・アイ(Pink Eye)、ピンク・ファー・アップル(Pink Fir Apple)、プリムラ(Primura)、ランガー・ラセット(Ranger Russet)、ラーテ(Ratte)、レコード(Record)、レッド・ラソーダ(Red LaSoda)、レッド・ノーランド(Red Norland)、レッド・ポンティアック(Red Pontiac)、ルースター(Rooster)、ラセット・バーバンク(Russet Burbank)、ラセット・ノーコター(Russet Norkotah)、セルマ(Selma)、シェポーディー(Shepody)、ジーグリンデ(Sieglinde)、シルバートン・ラセット(Silverton Russet)、シルコ(Sirco)、スノーデン(Snowden)、スプンタ(Spunta)、アップ・トゥ・デート(Up to date)、ストブラバ(Stobrawa)、スーペリア(Superior)、ビバルディ(Vivaldi)、ビテロッテ(Vitelotte)、イエロー・フィン(Yellow Finn)、またはユーコン・ゴールド(Yukon Gold)を用いて、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を得ることができる。
【００２２】
本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて任意の適切な細胞を処理し、ミトコンドリア呼吸複合体1ポリペプチドの発現レベルを増加させ、ミトコンドリア輸送ポリペプチドの発現レベルを増加させ、および/またはミトコンドリア活性のレベルを増加させ、それによって、キシログルカン調製物で処理されていない同等の細胞に存在するミトコンドリアよりも活性が高い処理細胞内のミトコンドリアを作製することができる。例えば、血球、筋肉細胞、神経細胞、血管内皮細胞、心血管細胞、脂肪生成/脂肪細胞、または腎臓細胞を、本明細書において提供されるキシログルカン調製物で処理して、ミトコンドリア呼吸複合体1ポリペプチドの発現レベルを増加させ、ミトコンドリア輸送ポリペプチドの発現レベルを増加させ、および/またはミトコンドリア活性のレベルを増加させることができる。本明細書において提供されるキシログルカン調製物で処理された細胞は、非限定的に、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、サル、またはヒトを含む、任意の適切な哺乳動物に由来するものでありうる。
【００２３】
細胞は、インビトロまたはインビボで本明細書において提供されるキシログルカン調製物で処理することができる。例えば、組織培養物中の細胞を、本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露してまたはそれとともにインキュベートして、ミトコンドリア呼吸複合体1ポリペプチドの発現レベルを増加させ、ミトコンドリア輸送ポリペプチドの発現レベルを増加させ、および/またはミトコンドリア活性のレベルを増加させることができる。そのような場合、細胞を本明細書において記述されるように収集および処理して、細胞から取得されかつ(キシログルカン調製物に曝露されていない細胞から得られる同等のミトコンドリアと比較して)上昇した活性レベルを有するインタクトかつ生存可能なミトコンドリアを有するミトコンドリア調製物を得ることができる。
【００２４】
場合によっては、哺乳動物に一定期間、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を投与して(例えば、経口投与して)、細胞をインビボでキシログルカン調製物に曝露し、それによってミトコンドリア呼吸複合体1ポリペプチドの発現レベルを増加させ、ミトコンドリア輸送ポリペプチドの発現レベルを増加させ、および/またはミトコンドリア活性のレベルを増加させることができる。そのような場合、前記哺乳動物の細胞(例えば、血球)を本明細書において記述されるように収集および処理して、細胞から取得されかつ(キシログルカン調製物に曝露されていない細胞から得られる同等のミトコンドリアと比較して)上昇した活性レベルを有するインタクトかつ生存可能なミトコンドリアを有するミトコンドリア調製物を得ることができる。
【００２５】
場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物のキシログルカン物質は、ポテトから得られたものとして用いることができる。例えば、ポテトから抽出されたキシログルカン物質を用いて、いずれのさらなる操作もなしにキシログルカン調製物を作製することができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物のキシログルカン物質は、ポテトから得られたものとして用いることができ、キシログルカン調製物の唯一の活性成分であることができる。
【００２６】
本明細書において提供される任意の適切な量のキシログルカン調製物を用いて、細胞内でのミトコンドリア呼吸複合体1ポリペプチドの発現レベルを増加させ、ミトコンドリア輸送ポリペプチドの発現レベルを増加させ、および/またはミトコンドリア活性のレベルを増加させることができる。例えば、インビトロで細胞を処理する場合、1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約1000 μgのキシログルカン物質(例えば、1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約900 μgのキシログルカン物質、1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約750 μgのキシログルカン物質、1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約500 μgのキシログルカン物質、1 mLあたり約50 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約1000 μgのキシログルカン物質、1 mLあたり約100 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約1000 μgのキシログルカン物質、1 mLあたり約500 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約1000 μgのキシログルカン物質、または1 mLあたり約50 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約500 μgのキシログルカン物質)の量が達成されるように、細胞を、本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露することができる。インビトロで細胞を処理する場合、細胞を適切な期間、本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露することができる。例えば、インビトロで細胞を処理する場合、細胞を約12時間から約5日間(例えば、約12時間から約4日間、約12時間から約3日間、約36時間から約5日間、または約48時間から約5日間)、本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露することができる。
【００２７】
インビボで細胞を処理する場合、1 kgあたり約1.0 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約100 μgのキシログルカン物質(例えば、1 kgあたり約1.0 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約80 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約1.0 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約60 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約1.0 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約50 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約5 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約100 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約100 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約75 μgのキシログルカン物質、または1 kgあたり約25 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約50 μgのキシログルカン物質)の量が哺乳動物(例えば、ヒト)に投与されるように、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。インビボで細胞を処理する場合、細胞を適切な期間、本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露することができる。例えば、インビボで細胞を処理する場合、細胞を約12時間から約5日間(例えば、約12時間から約4日間、約12時間から約3日間、約36時間から約5日間、または約48時間から約5日間)本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露することができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、約10日間から約2ヶ月間(例えば、約10日間から約1.5ヶ月間、約10日間から約1ヶ月間、約20日間から約2ヶ月間、約30日間から約2ヶ月間、または約20日間から約1.5ヶ月間)、毎日、哺乳動物に経口投与し、その後、細胞を収集してミトコンドリア調製物を得ることができる。
【００２８】
場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を一定期間(例えば、数日から数ヶ月)投与された哺乳動物から細胞を収集し、次いで、細胞を一定期間(例えば、数時間から数日)、本明細書において提供されるキシログルカン調製物の存在下においてインビトロでインキュベートし、その後、それらの細胞からミトコンドリア調製物を得ることができる。
【００２９】
場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、ポテトから得られたキシログルカン物質に加えて1つまたは複数の他の成分を含むように製剤化することができる。例えば、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、ポテトから得られたキシログルカン物質に加えて、ミトコンドリア複合体1活性を標的とする1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上)の酵素補因子を含むように製剤化することができる。本明細書において記述されるように用いるためのキシログルカン調製物を作製するためにポテトから得られたキシログルカン物質と組み合わせることができる、ミトコンドリア複合体1活性を標的とする酵素補因子の例としては、非限定的に、チアミン、リボフラビン、ニコチンアミド、ピリドキサルリン酸、ビタミンB12、ユビキノール、無機ナイトレート、l-アルギニン、およびセレンが挙げられる。インビトロで細胞を処理する場合、1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約1000 μgのキシログルカン物質(例えば、1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約750 μgのキシログルカン物質、1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約500 μgのキシログルカン物質、1 mLあたり約50 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約1000 μgのキシログルカン物質、または1 mLあたり約25 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約750 μgのキシログルカン物質)の量および1 mLあたり約0.1 μgの酵素補因子から1 mLあたり約100 μgの酵素補因子(例えば、1 mLあたり約0.1 μgの酵素補因子から1 mLあたり約75 μgの酵素補因子、1 mLあたり約0.1 μgの酵素補因子から1 mLあたり約50 μgの酵素補因子、1 mLあたり約0.5 μgの酵素補因子から1 mLあたり約100 μgの酵素補因子、1 mLあたり約1 μgの酵素補因子から1 mLあたり約100 μgの酵素補因子、または1 mLあたり約5 μgの酵素補因子から1 mLあたり約100 μgの酵素補因子)の量が達成されるように、細胞を、本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露することができる。インビボで細胞を処理する場合、1 kgあたり約1 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約100 μgのキシログルカン物質(例えば、1 kgあたり約1 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約75 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約1 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約50 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約5 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約100 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約100 μgのキシログルカン物質、または1 kgあたり約5 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約75 μgのキシログルカン物質)の量および1 kgあたり約0.01 μgの酵素補因子から1 kgあたり約10 μgの酵素補因子(例えば、1 kgあたり約0.01 μgの酵素補因子から1 kgあたり約8 μgの酵素補因子、1 kgあたり約0.01 μgの酵素補因子から1 kgあたり約5 μgの酵素補因子、1 kgあたり約0.1 μgの酵素補因子から1 kgあたり約10 μgの酵素補因子、1 kgあたり約1 μgの酵素補因子から1 kgあたり約10 μgの酵素補因子、または1 kgあたり約0.1 μgの酵素補因子から1 kgあたり約5 μgの酵素補因子)の量が哺乳動物(例えば、ヒト)に投与されるように、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。
【００３０】
場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、ポテトから得られたキシログルカン物質に加えて1つまたは複数のB複合ビタミンを含むように製剤化することができる。本明細書において記述されるように用いるためのキシログルカン調製物を作製するためにポテトから得られたキシログルカン物質と組み合わせることができるB複合ビタミンの例としては、非限定的に、チアミン、リボフラビン、ニコチンアミド、ピリドキサルリン酸、およびビタミンB12が挙げられる。インビトロで細胞を処理する場合、1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約1000 μgのキシログルカン物質(1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約750 μgのキシログルカン物質、1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約500 μgのキシログルカン物質、1 mLあたり約50 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約1000 μgのキシログルカン物質、または1 mLあたり約25 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約750 μgのキシログルカン物質)の量および1 mLあたり約1 μgのB複合ビタミンから1 mLあたり約100 μgのB複合ビタミン(例えば、1 mLあたり約1 μgのB複合ビタミンから1 mLあたり約80 μgのB複合ビタミン、1 mLあたり約1 μgのB複合ビタミンから1 mLあたり約70 μgのB複合ビタミン、1 mLあたり約5 μgのB複合ビタミンから1 mLあたり約100 μgのB複合ビタミン、1 mLあたり約10 μgのB複合ビタミンから1 mLあたり約100 μgのB複合ビタミン、または1 mLあたり約5 μgのB複合ビタミンから1 mLあたり約75 μgのB複合ビタミン)の量が達成されるように、細胞を、本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露することができる。インビボで細胞を処理する場合、1 kgあたり約1 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約100 μgのキシログルカン物質(例えば、1 kgあたり約1 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約80 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約1 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約70 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約5 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約100 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約100 μgのキシログルカン物質、または1 kgあたり約5 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約75 μgのキシログルカン物質)の量および1 kgあたり約1 μgのB複合ビタミンから1 kgあたり約100 μgのB複合ビタミン(例えば、1 kgあたり約1 μgのB複合ビタミンから1 kgあたり約80 μgのB複合ビタミン、1 kgあたり約1 μgのB複合ビタミンから1 kgあたり約70 μgのB複合ビタミン、1 kgあたり約5 μgのB複合ビタミンから1 kgあたり約100 μgのB複合ビタミン、1 kgあたり約10 μgのB複合ビタミンから1 kgあたり約100 μgのB複合ビタミン、または1 kgあたり約5 μgのB複合ビタミンから1 kgあたり約75 μgのB複合ビタミン)の量が哺乳動物(例えば、ヒト)に投与されるように、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。場合によっては、キシログルカン調製物は、リボフラビン、ニコチンアミド、およびピリドキサルリン酸と組み合わせて、ポテトから得られたキシログルカン物質を含むように製剤化することができる。そのようなキシログルカン調製物は任意で、ミトコンドリア複合体1活性を標的とする1つまたは複数の酵素補因子を含んでもよい。
【００３１】
場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、ポテトから得られたキシログルカン物質に加えてユビキノールを含むように製剤化することができる。例えば、キシログルカン調製物は、ユビキノールと組み合わせて、ポテトから得られたキシログルカン物質を含むように製剤化することができる。インビトロで細胞を処理する場合、1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約100 μgのキシログルカン物質(例えば、1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約80 μgのキシログルカン物質、1 mLあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約70 μgのキシログルカン物質、1 mLあたり約15 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約100 μgのキシログルカン物質、1 mLあたり約25 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約100 μgのキシログルカン物質、または1 mLあたり約25 μgのキシログルカン物質から1 mLあたり約75 μgのキシログルカン物質)の量および1 mLあたり約1 μgのユビキノールから1 mLあたり約100 μgのユビキノール(例えば、1 mLあたり約1 μgのユビキノールから1 mLあたり約80 μgのユビキノール、1 mLあたり約1 μgのユビキノールから1 mLあたり約70 μgのユビキノール、1 mLあたり約5 μgのユビキノールから1 mLあたり約100 μgのユビキノール、1 mLあたり約10 μgのユビキノールから1 mLあたり約100 μgのユビキノール、または1 mLあたり約5 μgのユビキノールから1 mLあたり約75 μgのユビキノール)の量が達成されるように、細胞を、本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露することができる。インビボで細胞を処理する場合、1 kgあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約1000 μgのキシログルカン物質(例えば、1 kgあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約750 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約10 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約500 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約25 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約1000 μgのキシログルカン物質、1 kgあたり約50 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約1000 μgのキシログルカン物質、または1 kgあたり約50 μgのキシログルカン物質から1 kgあたり約750 μgのキシログルカン物質)の量および1 kgあたり約10 μgのユビキノールから1 kgあたり約200 μgのユビキノール(例えば、1 kgあたり約10 μgのユビキノールから1 kgあたり約180 μgのユビキノール、1 kgあたり約10 μgのユビキノールから1 kgあたり約170 μgのユビキノール、1 kgあたり約25 μgのユビキノールから1 kgあたり約200 μgのユビキノール、1 kgあたり約50 μgのユビキノールから1 kgあたり約200 μgのユビキノール、または1 kgあたり約25 μgのユビキノールから1 kgあたり約150 μgのユビキノール)の量が哺乳動物(例えば、ヒト)に投与されるように、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。そのようなキシログルカン調製物は任意で、ミトコンドリア複合体1活性を標的とする1つもしくは複数の酵素補因子および/または1つもしくは複数のB複合ビタミンを含んでもよい。
【００３２】
場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、ポテトから得られたキシログルカン物質に加えてセレン、無機ナイトレート、アルギニン、および/またはカルシウムを含むように製剤化することができる。任意の適切な量の有機セレンを用いて、ポテトから得られたキシログルカン物質を含有するキシログルカン調製物を製剤化することができる。有機セレンは、低い、非毒性濃度のL-セレノメチオニンであることができる。例えば、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、約0.05 nM〜約1 nM (例えば、約0.06 nM〜約0.9 nM、約0.07 nM〜約0.8 nM、約0.08 nM〜約0.7 nM、約0.09 nM〜約0.6 nM、約0.1 nM〜約0.5 nM、または約0.2 nM〜約0.4 nM)の有機セレン成分を含有することができる。インビトロで細胞を処理する場合、1 mLあたり約0.005 ngの有機セレン/セレノメチオニンから1 mLあたり約0.5 ngの有機セレン/セレノメチオニン(例えば、1 mLあたり約0.005 ngの有機セレン/セレノメチオニンから1 mLあたり約0.075 ngの有機セレン/セレノメチオニン、1 mLあたり約0.005 ngの有機セレン/セレノメチオニンから1 mLあたり約0.05 ngの有機セレン/セレノメチオニン、1 mLあたり約0.01 ngの有機セレン/セレノメチオニンから1 mLあたり約0.5 ngの有機セレン/セレノメチオニン、または1 mLあたり約0.01 ngの有機セレン/セレノメチオニンから1 mLあたり約0.025 ngの有機セレン/セレノメチオニン)の量が達成されるように、細胞を、本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露することができる。インビボで細胞を処理する場合、1 kgあたり約1 ngの有機セレン/セレノメチオニンから1 kgあたり約100 ngの有機セレン/セレノメチオニン(例えば、1 kgあたり約1 ngの有機セレン/セレノメチオニンから1 kgあたり約80 ngの有機セレン/セレノメチオニン、1 kgあたり約1 ngの有機セレン/セレノメチオニンから1 kgあたり約70 ngの有機セレン/セレノメチオニン、1 kgあたり約5 ngの有機セレン/セレノメチオニンから1 kgあたり約100 ngの有機セレン/セレノメチオニン、または1 kgあたり約5 ngの有機セレン/セレノメチオニンから1 kgあたり約75 ngの有機セレン/セレノメチオニン)の量が哺乳動物(例えば、ヒト)に投与されるように、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。
【００３３】
本明細書において提供されるキシログルカン調製物に含まれることができる無機ナイトレートの例としては、非限定的に、硝酸ナトリウムおよび硝酸カリウムが挙げられる。無機ナイトレートは、低い、非毒性濃度の無機ナイトレートであることができる。いくつかの態様において、無機ナイトレートは、低い、非毒性濃度の硝酸ナトリウムである。任意の適切な量の無機ナイトレートを用いて、キシログルカン調製物を製剤化することができる。例えば、インビトロで細胞を処理する場合、1 mLあたり約0.5 μgの無機ナイトレートから1 mLあたり約50 μgの無機ナイトレート(例えば、1 mLあたり約0.5 μgの無機ナイトレートから1 mLあたり約40 μgの無機ナイトレート、1 mLあたり約0.5 μgの無機ナイトレートから1 mLあたり約30 μgの無機ナイトレート、1 mLあたり約1 μgの無機ナイトレートから1 mLあたり約50 μgの無機ナイトレート、または1 mLあたり約1 μgの無機ナイトレートから1 mLあたり約25 μgの無機ナイトレート)の量が達成されるように、細胞を、本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露することができる。インビボで細胞を処理する場合、1 kgあたり約5 μgの無機ナイトレートから1 kgあたり約500 μgの無機ナイトレート(例えば、1 kgあたり約5 μgの無機ナイトレートから1 kgあたり約400 μgの無機ナイトレート、1 kgあたり約5 μgの無機ナイトレートから1 kgあたり約300 μgの無機ナイトレート、1 kgあたり約10 μgの無機ナイトレートから1 kgあたり約500 μgの無機ナイトレート、または1 kgあたり約25 μgの無機ナイトレートから1 kgあたり約350 μgの無機ナイトレート)の量が哺乳動物(例えば、ヒト)に投与されるように、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。
【００３４】
L-アルギニンを本明細書において提供されるキシログルカン調製物内に含めて、L-アルギニン代謝からの一酸化窒素合成を介して一酸化窒素を放出する細胞の能力を促進することができる。任意の適切な量のL-アルギニンを用いて、キシログルカン調製物を製剤化することができる。例えば、インビトロで細胞を処理する場合、1 mLあたり約0.1 μgのL-アルギニンから1 mLあたり約10 μgのL-アルギニン(例えば、1 mLあたり約0.1 μgのL-アルギニンから1 mLあたり約7.5 μgのL-アルギニン、1 mLあたり約0.1 μgのL-アルギニンから1 mLあたり約5 μgのL-アルギニン、1 mLあたり約0.5 μgのL-アルギニンから1 mLあたり約10 μgのL-アルギニン、または1 mLあたり約0.5 μgのL-アルギニンから1 mLあたり約7.5 μgのL-アルギニン)の量が達成されるように、細胞を、本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露することができる。インビボで細胞を処理する場合、1 kgあたり約10 μgのL-アルギニンから1 kgあたり約1000 μgのL-アルギニン(例えば、1 kgあたり約10 μgのL-アルギニンから1 kgあたり約750 μgのL-アルギニン、1 kgあたり約10 μgのL-アルギニンから1 kgあたり約500 μgのL-アルギニン、1 kgあたり約50 μgのL-アルギニンから1 kgあたり約1000 μgのL-アルギニン、または1 kgあたり約25 μgのL-アルギニンから1 kgあたり約750 μgのL-アルギニン)の量が哺乳動物(例えば、ヒト)に投与されるように、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。
【００３５】
クエン酸カルシウムまたはCaCO3などのカルシウム源を添加して、カルシウム依存性構成型一酸化窒素合成酵素を介したL-アルギニンの一酸化窒素への代謝の促進を補助することができる。経口用途における呑酸問題を低減するために、CaCO3をカルシウム源として用いることができる。インビトロで細胞を処理する場合、1 mLあたり約0.05 μgのカルシウム源から1 mLあたり約5 μgのカルシウム源(例えば、1 mLあたり約0.05 μgのカルシウム源から1 mLあたり約4 μgのカルシウム源、1 mLあたり約0.05 μgのカルシウム源から1 mLあたり約3 μgのカルシウム源、1 mLあたり約0.1 μgのカルシウム源から1 mLあたり約5 μgのカルシウム源、1 mLあたり約0.25 μgのカルシウム源から1 mLあたり約5 μgのカルシウム源、または1 mLあたり約0.1 μgのカルシウム源から1 mLあたり約2.5 μgのカルシウム源)の量が達成されるように、細胞を、本明細書において提供されるキシログルカン調製物に曝露することができる。インビボで細胞を処理する場合、1 kgあたり約5 μgのカルシウム源から1 kgあたり約200 μgのカルシウム源(例えば、1 kgあたり約5 μgのカルシウム源から1 kgあたり約180 μgのカルシウム源、1 kgあたり約5 μgのカルシウム源から1 kgあたり約170 μgのカルシウム源、1 kgあたり約10 μgのカルシウム源から1 kgあたり約200 μgのカルシウム源、1 kgあたり約50 μgのカルシウム源から1 kgあたり約200 μgのカルシウム源、または1 kgあたり約10 μgのカルシウム源から1 kgあたり約175 μgのカルシウム源)の量が哺乳動物(例えば、ヒト)に投与されるように、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。
【００３６】
任意の適切な方法を用いて、ミトコンドリア複合体1活性を標的とする酵素補因子、B複合ビタミン、ユビキノン、セレン、無機ナイトレート、アルギニン、またはカルシウムを得ることができる。場合によっては、これらの成分は一般的な化学的抽出、単離、または合成技法を用いて得ることができる。場合によっては、これらの成分は商業的供給業者から得ることができる。例えば、有機セレンおよび無機ナイトレートはSigma, Incから注文することができる。
【００３７】
場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、薬学的組成物および/または栄養補助食品(例えば、「栄養補給食品」)として製剤化することができる。例えば、キシログルカン調製物は、哺乳動物への投与のための薬学的におよび/または栄養学的に許容される担体を含むように製剤化することができる。そのような担体の例としては、非限定的に、滅菌水性または非水性溶液、溶媒、懸濁液、および乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例としては、非限定的に、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および有機エステルが挙げられる。水性担体としては、非限定的に、水、アルコール、生理食塩水、および緩衝溶液が挙げられる。許容される担体はまた、生理学的に許容される水性媒体(例えば、生理食塩水)または経口投与に用いられる他の担体を含むことができる。
【００３８】
許容される水性媒体は、例えば、ポテトから得られたキシログルカン物質を溶解することができ、かつ組成物を摂取する特定の哺乳動物(例えば、ヒト)に対して毒性ではない任意の溶液であることができる。許容される水性媒体の例としては、非限定的に、生理食塩水、水、および酢酸が挙げられる。典型的には、許容される水性媒体は無菌である。許容される固体媒体は、キシログルカン調製物が経口投与に適しているように製剤化することができる。各カプセルまたは錠剤によって供給される用量は、1つまたは複数のカプセルまたは錠剤のいずれかを投与することによって有効量を達成することができるので変化しうる。ゼラチンおよびセルロース誘導体のような任意の適切な薬学的または栄養学的に許容される物質を許容される固体媒体として用いることができる。さらに、許容される固体媒体は、非限定的に、デンプン、糖、またはベントナイトを含む固体担体であることができる。さらに、キシログルカン調製物の錠剤または丸剤製剤は、固体の担体または滑沢剤を含むことができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物の製剤は、制御放出用に製剤化することができる。例えば、キシログルカン調製物は、例えば胃酸から内部コア物質を保護する外側コーティングを有するカプセル、錠剤、ジェルキャップ、または丸剤の内部コア内に配置されるように製剤化することができる。場合によっては、制御放出製剤は、キシログルカン物質が胃に送達されることがほとんどなくまたは全くなく、胃を越えて消化管の位置にキシログルカン物質を送達することができる。
【００３９】
キシログルカン調製物により処理されるのがインビトロであるかインビボであるかに関わらず細胞内でのミトコンドリア呼吸複合体1ポリペプチドの発現レベルを増加させ、ミトコンドリア輸送ポリペプチドの発現レベルを増加させ、および/またはミトコンドリア活性のレベルを増加させるために本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いた後に、細胞を、組織培養物から回収するか、または哺乳動物から収集することができる。キシログルカン処理細胞が回収されたら、ミトコンドリア調製物を得るためにそれらの細胞からミトコンドリアを単離することができる。インタクトかつ生存可能なミトコンドリアを細胞から単離するために任意の適切な方法を用いることができる。例えば、細胞溶解および遠心分離法を用いて細胞からミトコンドリアを単離することができる。場合によっては、MITOISO2キット(Sigma-Aldrich)のような市販のキットを用いて、細胞からミトコンドリアを単離することができる。場合によっては、他所に記述されているもの(国際特許出願公開番号WO 2015/192020)などのろ過技法を用いて、細胞からミトコンドリアを単離することができる。
【００４０】
本明細書において記述されるように、本明細書において提供されるキシログルカン調製物で処理された細胞から単離されたミトコンドリアは、キシログルカン調製物で処理されていない同等の細胞から単離されたミトコンドリアよりも高い活性を示すことができる。任意の適切な方法を用いてミトコンドリアの活性を評価することができる。例えば、色素および染料を用いてミトコンドリア活性を評価することができる。そのような染料および色素の例としては、非限定的に、MitoTracker Orange CMTMRos (ThermoFisher; カタログ番号M7510)、MitoTracker Red CMXRos (ThermoFisher; カタログ番号M7512)、およびMitoTracker Red FM (ThermoFisher; カタログ番号M22425)などのMitoTracker(登録商標)プローブ(ThermoFisher)、ローダミン6Gおよびローダミン123などのローダミン、テトラメチルロサミン、RedoxSensor(商標) Red CC-1 (2,3,4,5,6-ペンタフルオロテトラメチルジヒドロロサミン; ThermoFisher; カタログ番号R14060)、JC-1プローブ(5,5',6,6'-テトラクロロ-1,1',3,3'-テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンイオダイド; ThermoFisher; カタログ番号T3168)、JC-9 (3,3'-ジメチル-β-ナフトオキサゾリウムイオダイド; ThermoFisher; カタログ番号D22421)、ならびにDASPMI (4-Di-1-ASP; ThermoFisher; カタログ番号D288)が挙げられる。
【００４１】
場合によっては、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物のミトコンドリアは、キシログルカン調製物で処理された細胞から得られたものとして用いることができる。例えば、キシログルカン調製物で処理された細胞から単離されたミトコンドリアを用いて、さらなる操作なしにミトコンドリア調製物を作製することができる。場合によっては、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物のミトコンドリアは、キシログルカン調製物で処理された細胞から得られたものとして用いることができ、ミトコンドリア調製物の唯一の活性成分であることができる。
【００４２】
場合によっては、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物は、キシログルカン調製物で処理された細胞から単離されたミトコンドリアに加えて、1つまたは複数の他の成分を含むように製剤化することができる。例えば、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物は、ミトコンドリア複合体1活性を標的とする1つもしくは複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つもしくはそれ以上)の酵素補因子、1つもしくは複数(例えば、1つ、2つ、3つもしくはそれ以上)のB複合ビタミン、ユビキノン、セレン、無機ナイトレート、アルギニン、カルシウム、またはその組み合わせを含むように製剤化することができる。場合によっては、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物は、本明細書において提供されるキシログルカン調製物で処理された細胞から単離されたミトコンドリアに加えて、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を含むように製剤化することができる。
【００４３】
細胞機能を改善するためにおよび/または疾患もしくは障害(例えば、ミトコンドリア機能不全もしくは欠乏症に関連する疾患もしくは障害)の症状を軽減するために、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物を哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。例えば、グルコース代謝および輸送、酸化的リン酸化、電子輸送活性、細胞内酸化還元電位、ミトコンドリア生合成および輸送、遺伝子転写およびmRNA編集、タンパク質翻訳および細胞内シグナル伝達のような細胞機能を改善するために、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物を哺乳動物に投与することができる。場合によっては、疾患もしくは障害(例えば、ミトコンドリア機能不全もしくは欠乏症に関連する疾患もしくは障害)を処置するためにおよび/または疾患もしくは障害(例えば、ミトコンドリア機能不全もしくは欠乏症に関連する疾患もしくは障害)の症状を軽減するために、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物を哺乳動物に投与することができる。本明細書において記述されるように処置することができるミトコンドリア機能不全または欠乏症に関連する疾患または障害の例としては、非限定的に、II型糖尿病、脂肪肝疾患、心血管疾患、腎臓病、転移性肺がん、膵臓がん、および乳がん、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、自己免疫疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ミトコンドリア性筋障害、リー脳症、ならびにフリードライヒ失調症が挙げられる。非限定的に、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ種、ヤギ、ブタ、サル、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、またはヒトを含めて細胞機能を改善するためにおよび/または疾患もしくは障害の症状を軽減するために、任意の適切なタイプの哺乳動物に本明細書において提供されるミトコンドリア調製物を投与することができる。
【００４４】
場合によっては、ミトコンドリア調製物を、処置される哺乳動物(例えば、処置される特定のヒト)から得られた細胞(例えば、白血球)から得ることができ、次いでそのミトコンドリア調製物を本明細書において記述されるようにその特定の哺乳動物に投与することができる。例えば、本明細書において記述されるように処置される哺乳動物に、自己ミトコンドリアを含有するミトコンドリア調製物を投与することができる。場合によっては、本明細書において記述されるように処置される哺乳動物に、異種または同種異系のミトコンドリアを含有するミトコンドリア調製物を投与することができる。
【００４５】
本明細書において提供されるミトコンドリア調製物を哺乳動物に投与するために、任意の適切な方法を用いることができる。例えば、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物は、処置される哺乳動物の標的組織(例えば、心筋組織、心血管組織、末梢血管組織、肝組織、または腎臓組織)に直接注射することができる。場合によっては、心筋虚血を処置する場合、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物は、虚血心筋に直接注射することができる。場合によっては、糖尿病(例えば、II型糖尿病)を処置する場合、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物は全身的に(例えば、静脈内投与を介して)投与することができる。本明細書において提供されるミトコンドリア調製物を哺乳動物に投与するための他の投与経路には、非限定的に、腹腔内投与、頭蓋内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、皮内投与、または関節内投与が含まれる。
【００４６】
本明細書において提供されるミトコンドリア調製物を哺乳動物に投与した後、ミトコンドリアは、哺乳動物内の細胞外に存在する場合および細胞内に存在する場合の両方において、哺乳動物の組織および細胞にいくつかの利点を提供することができる。例えば、哺乳動物に投与され、その哺乳動物内で細胞外に存在する場合、本明細書において記述されるように哺乳動物に投与されたインタクトかつ生存可能なミトコンドリアは、細胞および組織にATPを提供することができ、ミトコンドリア経路に関与するポリペプチドの発現を刺激することができる。哺乳動物に投与され、その哺乳動物内で細胞に内在化する場合、本明細書において記述されるように哺乳動物に投与されたインタクトかつ生存可能なミトコンドリアは、それらの細胞に、ATP産生の増加と新しい外因的に添加されるミトコンドリアDNAの供給源とを提供することができる。
【００４７】
本明細書において提供されるミトコンドリア調製物は、哺乳動物への投与のために任意の適切な濃度のミトコンドリアを有することができる。例えば、哺乳動物(例えば、ヒト)への投与のために本明細書において提供されるミトコンドリア調製物は、1 mLあたり約1×103〜約1×109個のミトコンドリア(例えば、約1×104〜約1×109個のミトコンドリア、約1×105〜約1×109個のミトコンドリア、約1×103〜約1×108個のミトコンドリア、約1×103〜約1×107個のミトコンドリア、約1×104〜約1×108個のミトコンドリア、約1×105〜約1×108個のミトコンドリア、または約1×106〜約1×108個のミトコンドリア)を含有することができる。本明細書において提供される任意の適切な容量のミトコンドリア調製物を哺乳動物に投与することができる。例えば、1 mLあたり約1×106〜約1×108個のミトコンドリアを含有する約10 mL〜約100 mL (例えば、約10 mL〜約80 mL、約10 mL〜約70 mL、約10 mL〜約100 mL、約15 mL〜約100 mL、または約15 mL〜約75 mL)のミトコンドリア調製物を哺乳動物に投与することができる。
【００４８】
場合によっては、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物のミトコンドリアは、リポソーム内にパッケージングされ、リポソームパッケージングミトコンドリアとして哺乳動物に投与されることができる。他所に記述されているもの(Durazo and Kompella, Mitochondrion, 12(2):190-201 (2012))などの任意の適切な方法を用いて、ミトコンドリアをリポソーム中にパッケージングすることができる。場合によっては、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物のミトコンドリアはリポソームを含まなくてもよい。
【００４９】
場合によっては、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物のミトコンドリアは、他所(Yang and Koob, Nucl. Acid Res., 40(19):e148 (2012))に記述されているように内在化のためにインビトロで細胞に送達することができる。任意の適切な細胞タイプを本明細書において提供されるミトコンドリア調製物に曝露して、それらの細胞に外因性ミトコンドリアを送達することができる。例えば、心筋細胞、心血管細胞、神経細胞、末梢血管内皮細胞、肝細胞、ニューロン、および腎臓細胞をインビトロで、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物に曝露して、それらの細胞にそのミトコンドリア調製物由来のミトコンドリアを送達することができる。場合によっては、細胞をインビトロで、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物に曝露した後、それらの細胞を哺乳動物に投与することができる。場合によっては、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物からミトコンドリアを受け取りかつ哺乳動物に投与される細胞は、その同じ哺乳動物由来であることができる。例えば、細胞を、処置される特定の哺乳動物から得て、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物(例えば、自己、同種異系、または異種のミトコンドリアを含有するミトコンドリア調製物)に曝露し、その同じ特定の哺乳動物へ再導入することができる。場合によっては、処置される特定の哺乳動物から得られたのではない細胞を、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物に曝露し、その特定の哺乳動物へ導入することができる。場合によっては、本明細書において提供されるミトコンドリア調製物から自己、同種異系、または異種のミトコンドリアを受け取りかつ哺乳動物に投与される細胞は、その哺乳動物に対して自己、同種異系、または異種の細胞であることができる。
【００５０】
本明細書において記述されるようにミトコンドリア調製物を用いて疾患または障害(例えば、ミトコンドリア機能不全または欠乏症に関連する疾患または障害)を処置するための方法は、ミトコンドリア機能不全または欠乏症に関連する疾患または障害を有すると哺乳動物を同定する段階を含むことができる。例えば、哺乳動物は、リアルタイムfNMRおよびPET画像化技法を用いて心血管疾患を有すると同定することができ、次いで同定された哺乳動物に、本明細書において記述されるようにミトコンドリア調製物を、または本明細書において記述されるようにミトコンドリア調製物で処理された細胞を、投与することができる。
【００５１】
本明細書において提供されるミトコンドリア調製物を含有する、または本明細書において提供されるミトコンドリア調製物に曝露された細胞を含有する任意の適切な量の組成物を用いて、疾患または障害(例えば、ミトコンドリア機能不全または欠乏症に関連する疾患または障害)を有する哺乳動物を処置することができる。例えば、ミトコンドリア調製物を含有する組成物は、約50 mg〜約500 mg (例えば、約50 mg〜約480 mg、約50 mg〜約470 mg、約60 mg〜約500 mg、約70 mg〜約500 mg、または約75 mg〜約450 mg)のミトコンドリア調製物を含有するように製剤化することができる。場合によっては、有効量は、哺乳動物に有意な毒性を生じることなく、哺乳動物へ投与したときに疾患または障害の症状を軽減する、予防する、または取り除く、任意の量であることができる。特定の用途に用いられる実際の量にはさまざまな要因が影響しうる。例えば、投与頻度、処置期間、他の薬剤の組み合わせ、投与部位、(存在する場合)疾患の病期、および処置部位の解剖学的構成は、実際の投与量の増加または減少を必要としうる。
【００５２】
本明細書において提供されるミトコンドリア調製物を含有する、または本明細書において提供されるミトコンドリア調製物に曝露された細胞を含有する組成物の任意の適切な投与頻度を用いて、疾患または障害(例えば、ミトコンドリア機能不全または欠乏症に関連する疾患または障害)を有する哺乳動物を処置することができる。例えば、投与頻度は、1日に約2回から月に約60回までであることができる。さらに、投与の頻度は、処置の期間中、一定のままであってもよく、または変動してもよい。場合によっては、有効頻度は、哺乳動物に有意な毒性を生じることなく、哺乳動物へ投与したときに疾患または障害の症状を軽減する、予防する、または取り除く、任意の頻度であることができる。投与される量と同様に、特定の用途に用いられる実際の投与頻度にはさまざまな要因が影響しうる。例えば、量、処置期間、薬剤の組み合わせ、投与部位、(存在する場合)疾患の病期、および処置部位の解剖学的構成は、投与頻度の増加または減少を必要としうる。
【００５３】
本明細書において提供されるミトコンドリア調製物を含有する、または本明細書において提供されるミトコンドリア調製物に曝露された細胞を含有する組成物の任意の適切な投与期間を用いて、疾患または障害(例えば、ミトコンドリア機能不全または欠乏症に関連する疾患または障害)を有する哺乳動物を処置することができる。例えば、投与期間は、1週間、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、1年、2年、3年、またはそれ以上であることができる。場合によっては、有効期間は、哺乳動物に有意な毒性を生じることなく、哺乳動物へ投与したときに疾患または障害の症状を軽減する、予防する、または取り除く、任意の期間であることができる。特定の処置レジメンに用いられる実際の期間には複数の要因が影響しうる。例えば、有効期間は、投与頻度、投与される量、複数の薬剤の組み合わせ、投与部位、(存在する場合)疾患の病期、および処置部位の解剖学的構成によって変化しうる。
【００５４】
いかなる特定の作用様式にも限定されないが、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、細胞内での特定のポリペプチドの発現を増加または減少させるために用いることができる。例えば、本明細書において提供されるキシログルカン調製物は、Ndufa8(NADH:ユビキノン還元酵素サブユニットA8)、Ndufa10(NADH:ユビキノン還元酵素サブユニットA10)、Ndufa11(NADH:ユビキノン還元酵素サブユニットA11)、Ndufa12(NADH:ユビキノン還元酵素サブユニットA12)、Ndufa13(NADH:ユビキノン還元酵素サブユニットA13)、Ndufb4(NADH:ユビキノン還元酵素サブユニットB4)、Ndufb5(NADH:ユビキノン還元酵素サブユニットB5)、Ndufb7(NADH:ユビキノン還元酵素サブユニットB7)、Ndufb9(NADH:ユビキノン還元酵素サブユニットB9)、Ndufb10(NADH:ユビキノン還元酵素サブユニットB10)、Ndufs4(NADH:ユビキノン還元酵素コアサブユニットS4)、Ndufs6(NADH:ユビキノン還元酵素コアサブユニットS6)、Ndufs7(NADH:ユビキノン還元酵素コアサブユニットS7)、Fez2(線維束形成および伸長タンパク質ζ2 (fasciculation and elongation protein zeta 2))、Pin1(ペプチジルプロリルシス/トランスイソメラーゼNIMA-相互作用1)、Ranbp1(RAN結合タンパク質1)、Rhot2(rasホモログファミリーメンバーT2)、またはそれらの組み合わせの発現を増加させるために用いることができる。
【００５５】
場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufa8ポリペプチドの発現を少なくとも約1.5倍(例えば、約1.7倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufa10ポリペプチドの発現を少なくとも約1.2倍(例えば、約1.4倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufa11ポリペプチドの発現を少なくとも約1.8倍(例えば、約2.0倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufa12ポリペプチドの発現を少なくとも約1.5倍(例えば、約1.7倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufa13ポリペプチドの発現を少なくとも約1.8倍(例えば、約2.0倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufb4ポリペプチドの発現を少なくとも約1.5倍(例えば、約1.7倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufb5ポリペプチドの発現を少なくとも約1.1倍(例えば、約1.3倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufb7ポリペプチドの発現を少なくとも約1.3倍(例えば、約1.5倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufb9ポリペプチドの発現を少なくとも約1.5倍(例えば、約1.8倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufb10ポリペプチドの発現を少なくとも約1.3倍(例えば、約1.5倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufs4ポリペプチドの発現を少なくとも約1.2倍(例えば、約1.4倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufs6ポリペプチドの発現を少なくとも約1.7倍(例えば、約1.9倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ndufs7ポリペプチドの発現を少なくとも約1.5倍(例えば、約1.7倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Fez2ポリペプチドの発現を少なくとも約1.2倍(例えば、約1.4倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Pin1ポリペプチドの発現を少なくとも約1.0倍(例えば、約1.2倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Ranbp1ポリペプチドの発現を少なくとも約1.0倍(例えば、約1.2倍)増加させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Rhot2ポリペプチドの発現を少なくとも約1.2倍(例えば、約1.4倍)増加させることができる。
【００５６】
場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Trak1 (輸送キネシンタンパク質1)の発現を減少させることができる。場合によっては、本明細書において提供されるキシログルカン調製物を用いて、Trak1ポリペプチドの発現を少なくとも-7.0倍(例えば、約-7.7倍)減少させることができる。
【００５７】
ヒトNdufa8ポリペプチドは、例えば、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information; NCBI)アクセッション番号NG_042279 (GI No. 1003701614)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトNdufa10ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NG_031855 (GI No. 1046552732)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトNdufa11ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NG_027808 (GI No. 308387358)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトNdufa12ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NG_032672(GI No. 385719181)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトNdufa13ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NG_013380 (GI No. 262359939)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトNdufb4ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NM_001168331.1 (GI No. 270288779)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトNdufb5ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NM_002492 (GI No. 316659417)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトNdufb7ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NM_004146 (GI No. 316983134)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトNdufb9ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NG_042266 (GI No. 906847380)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトNdufb10ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NM_004548 (GI No. 161169039)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトNdufs4ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NG_008200 (GI No. 194018396)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトNdufs6ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NG_013354 (GI No. 262331551)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトNdufs7ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NG_008283(GI No. 194394212)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトFez2ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NM_005102.2 (GI No. 110349753)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトPin1ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NG_029167 (GI No. 336455056)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトRanbp1ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NM_001278639.1 (GI No. 520975476)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトRhot2ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NG_031824 (GI No. 359279883)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。ヒトTrak1ポリペプチドは、例えば、NCBIアクセッション番号NM_001042646.2 (GI No. 388490360)に記載されているアミノ酸配列を有しうる。
【００５８】
本発明を以下の実施例においてさらに記述するが、これは特許請求の範囲に記述される発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５９】
実施例1−改善されたミトコンドリアの産生
方法および物質
キシログルカン調製物の抽出および精製
ポテト約6 gを50 mLの遠心分離管内の水20 mL中でPolytronホモジナイザーを用いてホモジナイズし、1時間室温に保った。ホモジネートを4000 rpmで10分間遠心分離し、上清画分を取っておいた。100%アセトニトリル(ACN) 10 mL、続いて水中0.05%のトリフルオロ酢酸(TFA水) 10 mLで予め活性化したSep-Pak Plus C-18カートリッジを通して上清画分10 mLをろ過した。連続的な低ACN洗浄の後、半精製キシログルカン物質を0.05%TFA水中10%のACN 10 mLで溶出させた。溶出画分を乾燥させ、HPLCによるさらなる精製のために0.05% TFA水1 mL中で再構成した。
【００６０】
再構成した10% ACN溶出液画分を、Waters Xterra RP C18カラム(4.6×150 mm)およびフォトダイオードアレイ検出器を備えたWaters 2695分離モジュールを用いてHPLC精製に供した。HPLC精製には、0.5 mL/分の流速で0.05% TFA水中0から2.5%の範囲の緩やかな20分の勾配を用いることが含まれた。3.5分での198 nmの主UV吸収ピークの収集およびHPLC再精製により、高度に精製されたキシログルカン物質を含有する対称HPLCピークが得られた。キシログルカン物質の精製HPLC画分を乾燥し、生物学的実験に用いるためにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で再構成した。
【００６１】
実験動物
7週齢雄性ホモ接合型Zucker糖尿病肥満ラット(ZDF, コード: 370) 22匹および7〜8週齢雄性ヘテロ接合型Zucker Lean対照ラット(ZLC, コード: 371) 22匹をCharles Rivers Laboratories (Wilmington, MA)から購入した。試験動物はベースライン採血の前に4日の順応期間を許容され、その時点で各系統由来の余分な動物2匹をベースライン体重に基づいて試験から除外した。ラットをケージあたり2匹収容し、Innoviveケージングシステム(San Diego, CA)で維持した。ケージを毎日モニターして、Innoviveシステムにより1時間あたり80回の空気交換および陽圧が維持されたことを確実にした。ラット室内は66〜75°Fの温度および30%〜70%の相対湿度に維持した。室内は毎日12時間(午前7時〜午後7時)人工光で照らした。動物は、絶食実験中を除き試験の期間中、水とPurina 5008げっ歯類食品(Waldschimdt’s Town & Country Mart; Madison, WI)を自由に摂取させた。
【００６２】
キシログルカン製剤
精製キシログルカン(5 mg/mL濃度の10 mLストック溶液)を4℃で保存した。試験用の媒体は滅菌水(カタログ番号002488, Butler Schein)であった。毎週、ストック溶液を滅菌水中に100分の1に希釈(0.05 mg/mL)し、毎日アリコートに分注した。全ての媒体および薬物溶液を4℃で保存し、経口胃管栄養法(PO)により1 mL/動物の容量(推定体重350 gに基づいて0.15 mg/kg用量)で毎日室温にて投与した。
【００６３】
投薬および群化
2種類のラット、すなわちホモ接合型肥満ZDF糖尿病動物およびヘテロ接合型ZLC同腹仔を試験に用いた。次いで群内のラットを無作為に選択し、7匹の群に分けた。群1は媒体を給餌したZDFラットからなった; 群2はキシログルカンを給餌したZDFラットからなった; 群3は媒体を給餌したZLCラットからなった; および群4はキシログルカンを給餌したZLCラットからなった。媒体は蒸留水であり、キシログルカンは、動物1匹あたり0.05 mgの投与量で経口胃管栄養法によって毎朝与えられた。用量は通常、水1 mL中で与えられた。
【００６４】
試験は28日間継続し、試験の28日目に空腹時血糖データの収集後に全ての動物をイソフルラン過量投与および開胸術によって安楽死させた。下行大静脈から採血した。肝臓および腹部脂肪を回収し秤量し、一部分の左側肝葉および腹部脂肪を個々の組織像カセットに入れ、液体窒素中で急速冷凍した。一般的な病理学的観察を記録した。
【００６５】
RNA単離
ラット組織サンプルから抽出した全RNAを、RNeasyミニキット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて単離および精製した。組織約100 mgをRLT溶解緩衝液(Qiagen) 1.8 mLに再懸濁し、ポリトロンホモジナイザーで30秒間ホモジナイズした。PAX RNAキット(Qiagen)を用いて血液RNAを単離した。
【００６６】
DNAマイクロアレイ分析
Agilentが提供するシステムを用いてDNAマイクロアレイ分析を行った。アレイは1チップあたり4つのアレイを含んでいた(Agilent 4X44Kチップ)。全RNAを、T7プライマーを用いて逆転写し(1000 ng)、シアニン-3色素を用いて標識および転写した。各アレイを標識cRNA少なくとも1.65 μgとともに65℃で18時間ハイブリダイズさせた。Agilentアレイスキャナーを用いてアレイをスキャンした。マイクロアレイプラットフォームは、遺伝子発現の最小1.5倍の変化を測定することができる。4つの試験群間で発現された遺伝子の比較変化倍率を測定し、統計的に分析した: キシログルカンを28日間給餌したホモ接合型ZDFラット(群2) vs 等量の媒体を給餌したホモ接合型ZDFラット(群1) vs キシログルカンを28日間給餌したヘテロ接合型ZLC非肥満ラット(群4) vs 等量の媒体を28日間給餌したヘテロ接合型ZLC非肥満ラット(群3)。%遺伝子修復計算は、キシログルカンを給餌したZDFラットの、キシログルカンを給餌したZLC健常ラットに対する変化倍率に基づいた。
【００６７】
ミトコンドリア活性の評価
70%コンフルエンスで増殖させたHTB-11細胞をキシログルカン(65 μg/mL)または媒体で24時間処理し、続いて2 μMの終濃度でのローダミン6Gとの30分間のインキュベーションを行った。リン酸緩衝生理食塩水での徹底的な洗浄の後、ローダミン6Gの、広範かつ選択的なミトコンドリアによる取り込みおよび保持を示す蛍光画像を、FITC、GFP、およびRFP用のフィルタセットを含む、高輝度LED照明システムを備えたNikon Ti Epi蛍光モジュールを用いて20 msの露光で捕捉した。
【００６８】
全血からの機能的に適格なミトコンドリアの精製
ミトコンドリア調製物を2×107個の白血球(WBC)から得た。ヘパリン処理した全血サンプル(ドナーあたり50 mL)を得て、1-Step Polymorphs (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY)勾配媒質を用いて直ちに分離した。血液5 mLを14 mLの丸底チューブ中の多形体(polymorphs) 5 mLの上に重層し、次に18℃でスイングバケットローター中500×gで35分間遠心分離した。遠心分離後、多形核細胞(PMN)および単核細胞(MN)を含有するバンドを、ガラスピペットを用いて採取し、15 mLの遠心分離管に移し、次に10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA)で洗浄した。細胞を400×gで10分間の遠心分離後に回収した。細胞を、10%ウシ胎児血清(Invitrogen)を補充したRPMI-1640培地中37℃でインキュベートし、60分間回復させた。
【００６９】
ミトコンドリアの単離の前に、WBCを洗浄し、そして冷(4℃) PBSでペレット化した。培養細胞用ミトコンドリア単離キット(MITOISO2; Sigma-Aldrich)を用いてミトコンドリアを単離した。この方法により、細胞から濃縮されたインタクトなミトコンドリア画分が得られた。界面活性剤溶解法を用い、溶解緩衝液650 μLを要した。溶解した細胞を700gで10分間遠心分離し、得られた上清を3000gで15分間遠心分離した。この次の上清は細胞質ゾル画分を含有し、別のチューブに移された。ミトコンドリアペレットを提供された洗浄試薬500 μLで洗浄した。洗浄したミトコンドリアを12000gで5分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを保存緩衝液1 mLに再懸濁した。
【００７０】
タンパク質定量のため、ミトコンドリアを、トリス緩衝生理食塩水(25 mM Tris, 0.15 M NaCl; pH 7.2)中2%のCHAPS 100 μL中で1分間ボルテックスで攪拌することによって溶解し、12000gで2分間遠心分離した。上清を、Bio-Radプロテインアッセイおよびマイクロプレートリーダー(Microplate Manager(登録商標) 4.0)を用いて分析した。
【００７１】
ミトコンドリア純度の検証
ウエスタンブロットのため、精製タンパク質(調製物あたりおよそ1.4 μg)をBolt(商標) LDSサンプル緩衝液(4×) 10 μLおよび脱イオン水30 μLと混ぜ合わせた。サンプルを90℃で10分間変性させ、28分間165 VにてNuPAGE(登録商標) Novex(登録商標) 4-12% Bis-Tris Mini-gel上でのタンパク質電気泳動によって分離した。電気泳動後、iBlot(登録商標) Gel Transfer Deviceシステム(Invitrogen)を用いてサンプルをニトロセルロース膜上に転写した。その後、ウエスタン検出(Western Detection)用iBlot(登録商標) Gel Device (Invitrogen)を用いて、ブロッキング段階、一次抗体段階、および二次抗体段階からなる3段階プログラムに膜を供した。一次抗体、マウス抗シトクロムCモノクローナル抗体は、Life Technologies (Invitrogenカタログ番号33-8500)から入手し、ブロッキング緩衝液で1000分の1に希釈した。二次抗体はブロッキング緩衝液で2000分の1に希釈した。次いで、膜を1×洗浄液中で3回連続して洗浄し、室温でのインキュベーション前に脱イオン水中ですすいだ。最後に、室温で穏やかに揺り動かしながら、発色基質としてChromogen (BCIP/NBT)を用いてブロットを発色させた。
【００７２】
顕微鏡法およびリアルタイムPCRによるミトコンドリア移入効率の検証
ドナー細胞からレシピエント細胞への単離ミトコンドリアの移入は、単離直後に行った。ミトコンドリアを、1×105個のレシピエント細胞を含む6ウェルプレート中、培地2 mLとともに24時間インキュベートした。生存性および機能アッセイのため、細胞を96ウェルプレート中でインキュベートした。
【００７３】
ミトコンドリアDNA (mtDNA)含有量および核DNA含有量を、リアルタイムPCRを用いて比較した。QIAamp DNAミニキット(Qiagen)を用いてDNAを単離および精製した。mtDNA用のヒトNADHデヒドロゲナーゼサブユニット1 (ND1)検出セット(Hs02596873_s1)およびチロシン3-モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5-モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、核DNA用のゼータポリペプチド(YWHAZ)検出セット(Hs03044281_g1) (ThermoFisher Scientific)を用いてリアルタイムPCRを行った。反応あたりDNA 1 μLを用いて、全てのサンプルを三つ組で分析した。リアルタイムPCRマスターミックスは、2×ユニバーサルマスターミックス25 μL、20×検出セット(プライマーおよびプローブを含む)2.5 μL、ならびに水21.5 μLを含んでいた。PCRはApplied Biosystems Quant Studio 7 Flexシステムを用いて行った。サーモサイクラー条件は、60℃で60秒間のアニーリングおよび伸長の組み合わせとともに95℃で15秒間の変性を含んだ。40サイクルのPCRの前に95℃で10分間置いた。移植後のレシピエント細胞中の核DNAに対するmtDNAの比率と比較した、移植前のドナー細胞およびレシピエント細胞中の核DNAに対するmtDNAの平均比率を用いてmtDNAの相対量を評価した。レシピエント細胞中のGFPまたはDsRed2FP標識ミトコンドリアの可視化は、共焦点顕微鏡法を用いて行った。
【００７４】
細胞生存性およびミトコンドリア機能のアッセイ
レシピエント細胞の生存性は、他所(Kitani et al., J. Cell. Mol. Med., 18(8):1694-703 (2014))に記述されているようにレサズリンに基づくアッセイキットを用いて測定し、酸素消費速度、細胞外酸性化速度、およびATP産生を、Seahorse XF器具を用いて定量した。計測により、酸素消費速度(OCR)および細胞外酸性化速度(ECAR)の両方を同時に測定するように固体センサによって生細胞におけるミトコンドリア呼吸および解糖の迅速な分析が提供される。全ての計測プラットフォームは、複数のウェルに含まれる生細胞への薬理学的および代謝的作用物質の複数回投与を支援する。
【００７５】
結果
ZDFラット(n=7) vs 媒体給餌対照ZDFラット(n=7)への精製キシログルカンのインビボ投与は、ミトコンドリア複合体1活性の相乗的増強に関与する13個の高プロファイル候補遺伝子の統計的に有意な発現増強を生じた(表1)。劇的な様式で、インビボキシログルカン処置は、ホモ接合型ZDFラットの異常な遺伝子発現を、高度の統計的有意性で、健常ZLCラットにおいて観察された正常に近い発現レベルに回復させた(標準的な遺伝子機能の80〜110%の回復)。
【００７６】
（表１）キシログルカンで処置したZDFラットの血液サンプル中で測定し、媒体給餌ZDFラットと比較した場合の、核にコードされるミトコンドリア複合体1遺伝子の発現増強
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【００７７】
ZDFラット(n=7) vs 媒体対照ZDFラット(n=7)への精製キシログルカンのインビボ投与は、ZDFラット vs 媒体給餌対照ZDFラットの血液サンプルにおいてモニターした場合に、統計的に有意な高プロファイルミトコンドリア輸送遺伝子の発現増強およびTrak1の顕著な低減を生じた(表2)。
【００７８】
（表２）血液サンプルにおいて測定した場合の、核にコードされたミトコンドリア輸送遺伝子の発現増強およびTrak1発現の顕著な低減
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【００７９】
複合体1遺伝子発現の観察された変化は、十分に特徴付けられたカチオン性色素ローダミン6Gによる機能的に活性なミトコンドリアの半定量的標識と併せてHTB-11細胞を用いるインビトロ細胞モデルを利用して検証された。古典的な生化学的研究により、単離された呼吸しているラット肝臓ミトコンドリアにおけるミトコンドリア複合体1プロトンポンプ活性およびF1F0 ATPase媒介ATP生合成に及ぼすローダミン6G投与の阻害効果が実証された(Higuti et al., Biochim. Biophys. Acta, 593(2):463-7 (1980)およびBunting, Biophys. Chem., 42(2):163-75 (1992))。ローダミン6Gはまた、インビトロで生細胞中のミトコンドリア活性の高信頼性かつ高選択性の半定量的蛍光プローブとして確立され(Dietzmann et al., Exp. Pathol., 31(1):47-51 (1987))、心血管系内のヒトミトコンドリアのインビボ画像化のための潜在的に非常に重要なPETリガンドとして確立された(Bartholoma et al., Nucl. Med. Biol., 42(10):796-803 (2015))。
【００８０】
媒体処理対照細胞と比較して、24時間培養物中に維持されたキシログルカン処理HTB-11細胞において、蛍光ミトコンドリアの強度の劇的な6.4倍の増強が観察された(図1)。独立して行われた3つの実験に基づいて、媒体対照培養物と比較して、キシログルカンで処理された培養物において蛍光強度の6.4の平均変化倍率が観察された。対照用視野内で計数された細胞(n=138)は細胞あたり7.5単位の平均強度を有し、一方で視野内のキシログルカン処理細胞(n=192)は細胞あたり50.5単位の平均強度を有した。対照細胞の平均細胞面積は89 μm2であり、キシログルカン処理細胞の平均細胞面積は70 μm2であった。
【００８１】
さらに、ミトコンドリア含有トンネルナノチューブの発現の増強が、24時間培養物中に維持されたキシログルカン処理HTB-11細胞において観察された(図2)。矢印はトンネルナノチューブ内の蛍光ミトコンドリアの存在を示す。
【００８２】
まとめると、これらの結果は、キシログルカンを用いて、ミトコンドリア輸送タンパク質およびミトコンドリア呼吸複合体1の重要なサブユニットの著しく増強された協調的遺伝子発現を介して哺乳動物の血液から最適に機能するミトコンドリア調製物を得ることができることを実証する。特に、これらの結果は、血中白血球において必須のミトコンドリア輸送/アダプタータンパク質と協調して複合体1の15個のサブユニットの協調的増強を同期させる本明細書において提供されるキシログルカンのインビボ投与の能力を実証する。これらの方法を用いて、末梢血からの非常に豊富で、容易に精製可能な、最適に機能するミトコンドリアのプールの発現を促進することができる。これらの増強されたミトコンドリアは、複数の医学的適応症のミトコンドリア補充療法に用いることができる。
【００８３】
他の態様
本開示をその詳細な説明と併せて記述してきたが、先の記述は例示するものであると意図され、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定するものではないと意図されることが理解されるべきである。他の局面、利点、および変更は以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
2019529434.tif 000006
【図２】
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【国際調査報告】
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