(57)【要約】  本発明は、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ翼果からの抽出物、そのような抽出物を提供するためのプロセス、ならびに得られた抽出物の方法および使用に関する。具体的には、本発明は、肥満関連および／またはメタボリックシンドローム関連の腸内細菌叢ディスバイオシス治療を回復させること、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を治療または予防すること、ならびに腸内細菌叢を調節および／または調整することにおける、そのような抽出物の使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）肥満関連および／もしくはメタボリックシンドローム関連の腸内細菌叢ディスバイオシスを回復させること、
（ｂ）脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／もしくは非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を治療もしくは予防すること、
（ｃ）腸管壁浸漏および／もしくは腸管透過性亢進を治療もしくは予防すること、
（ｄ）腸内細菌叢ディスバイオシスに起因する心血管疾患および／もしくは心血管代謝疾患を治療もしくは予防すること、
（ｅ）軽度の炎症を治療もしくは予防すること、
（ｆ）アテローム性動脈硬化症を治療もしくは予防すること、
（ｇ）肥満を治療もしくは予防すること、ならびに／または
（ｈ）インスリン抵抗性、耐糖能異常、前糖尿病、および／もしくは糖尿病を治療もしくは予防すること、に使用するためのＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物。
【請求項２】
（ａ）肥満関連および／もしくはメタボリックシンドローム関連の腸内細菌叢ディスバイオシスを回復させること、
（ｂ）脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／もしくは非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を治療もしくは予防すること、
（ｃ）腸管壁浸漏および／もしくは腸管透過性亢進を治療もしくは予防すること、
（ｄ）腸内細菌叢ディスバイオシスに起因する心血管疾患および／もしくは心血管代謝疾患を治療もしくは予防すること、
（ｅ）軽度の炎症を治療もしくは予防すること、
（ｆ）アテローム性動脈硬化症、
（ｇ）肥満を治療もしくは予防すること、ならびに／または
（ｈ）インスリン抵抗性、耐糖能異常、前糖尿病、および／もしくは糖尿病を治療もしくは予防すること、のための薬剤の製造における、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の使用。
【請求項３】
（ａ）肥満関連および／もしくはメタボリックシンドローム関連の腸内細菌叢ディスバイオシスを回復させること、
（ｂ）脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／もしくは非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を治療もしくは予防すること、
（ｃ）腸管壁浸漏および／もしくは腸管透過性亢進を治療もしくは予防すること、
（ｄ）腸内細菌叢ディスバイオシスに起因する心血管疾患および／もしくは心血管代謝疾患を治療もしくは予防すること、
（ｅ）軽度の炎症を治療もしくは予防すること、
（ｆ）アテローム性動脈硬化症を治療もしくは予防すること、
（ｇ）肥満を治療もしくは予防すること、ならびに／または
（ｈ）インスリン抵抗性、耐糖能異常、前糖尿病、および／もしくは糖尿病を治療もしくは予防すること、のための方法であって、
それを必要とする対象に、治療有効量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物を投与することを含む、方法。
【請求項４】
回復、治療もしくは予防される、前記疾患または障害が、
肥満関連の腸内細菌叢ディスバイオシスおよびメタボリックシンドローム関連の腸内細菌叢ディスバイオシス、ならびに／または
脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、使用するための抽出物、使用または方法。
【請求項５】
（ｉ）腸内細菌叢を調節もしくは調整し、
（ｉｉ）体脂肪を減少させ、かつ／または
（ｉｉｉ）血糖濃度を減少させること、におけるＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の使用。
【請求項６】
（ｉ）腸内細菌叢を調節もしくは調整し、
（ｉｉ）体脂肪を減少させ、かつ／または
（ｉｉｉ）血糖濃度を減少させる方法であって、
それを必要とする対象に、有効量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物を投与することを含む、方法。
【請求項７】
前記調節または調整が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａｃａｅ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、ＢｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＥｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓからなる属から選択される細菌群を増加させる、請求項１に記載の使用のための抽出物、請求項２に記載の使用もしくは請求項３に記載の方法、または請求項５もしくは６に記載の使用もしくは方法。
【請求項８】
前記調節または調整が、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＩＶおよびＢｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓからなる属から選択される細菌群を増加させる、請求項１に記載の使用のための抽出物、請求項２に記載の使用もしくは請求項３に記載の方法、または請求項５もしくは６に記載の使用もしくは方法。
【請求項９】
前記調節または調整が、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅおよびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅを含む科から選択される細菌群を増加させる、請求項１に記載の使用のための抽出物、請求項２に記載の使用もしくは請求項３に記載の方法、または請求項５もしくは６に記載の使用もしくは方法。
【請求項１０】
前記抽出物が、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ翼果から得られる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の、使用のための抽出物、使用または方法。
【請求項１１】
前記抽出物が、
（ｉ）約１重量％〜約１５重量％のヌゼニドと、
（ｉｉ）約１重量％〜約１７重量％のＧＬ３と、
（ｉｉｉ）約０．５重量％〜約１重量％のオレオシドメチルエステルと、
（ｉｖ）約０．０３重量％〜約０．１２重量％のエクセルシドＢと、
（ｖ）約０．１重量％〜約１．７重量％のＧＬ５と、
（ｖｉ）約０．０８重量％〜約０．７重量％のサリドロシドと、を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の、使用のための抽出物、使用または方法。
【請求項１２】
前記抽出物が、約１０重量％のヌゼニドと約１０重量％のＧＬ３とを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の、使用のための抽出物、使用または方法。
【請求項１３】
前記抽出物が、水−エタノール抽出物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の、使用のための抽出物、使用または方法。
【請求項１４】
前記水−エタノール抽出物が、約３０％〜約７５％のエタノールを含有する溶媒を使用して得られる、請求項１３に記載の、使用のための抽出物、使用または方法。
【請求項１５】
前記抽出物が、
（ａ）請求項１〜１４のいずれか一項もしくは複数項に記載のＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物と任意で薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物、または
（ｂ）請求項１〜１４のいずれか一項もしくは複数項に記載のＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物と任意で食品許容原料とを含む食品組成物、の形態で投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の、使用のための抽出物、使用または方法。
【請求項１６】
前記組成物が、経口投与用である、請求項１５に記載の、使用のための抽出物、使用または方法。
【請求項１７】
前記使用または方法が、ヒト対象に対して実施される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、使用のための抽出物、使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａからの（特に、その翼果からの）抽出物、そのような抽出物を提供するためのプロセス、ならびにそのような抽出物に関連する方法および使用に関する。具体的には、本発明は、肥満関連および／またはメタボリックシンドローム関連の腸内細菌叢ディスバイオシス治療を回復させること、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）などの状態を治療または予防すること、ならびに腸内細菌叢を調節および／または調整すること、の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書内の明らかに以前に発行された文書の列挙または考察は、必ずしも、その文書が、先端技術の一部であるか、または一般共通の知識であると認識されるべきではない。
【０００３】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、肝臓におけるトリグリセリドの形での過度の脂肪蓄積（脂肪症）として定義される（組織学的に肝細胞の５％超の蓄積として指定される）状態である。それは、先進国において、最も一般的な肝障害であり、例えば、米国の成人の約３０％が罹患している。未治療のまま放置すると、状態が次第に悪化し、最終的に肝硬変に至ることがある。ＮＡＦＬＤは、肥満特許において特に一般的であり、約８０％がこの疾患を有すると考えられる。
【０００４】
ＮＡＦＬＤ患者のサブグループは、過剰な脂肪蓄積に加えて、肝細胞傷害および炎症を示す。非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）と指定されるこの状態は、アルコール性脂肪肝炎（ＡＳＨ）と組織学的にはほとんど区別できない（Ｗｏｒｌｄ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  （ＷＧＯ）  ｉｎ  ＷＧＯ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：  Ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ  （２０１２）に記載）。ＮＡＦＬＤに見られる単純な脂肪症は、短期間の罹患率または死亡率の増加と直接的には相関しないが、この状態がＮＡＳＨに進行すると、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌（ＨＣＣ）のリスクが劇的に増加する。
【０００５】
肝臓病による罹患率および死亡率は、ＮＡＳＨの患者において大幅に増加するが、彼らは心血管疾患による罹患率および死亡率とさらにより強く相関する。ＮＡＳＨは、２型真性糖尿病、インスリン抵抗性、中枢（虚血）肥満、高脂血症、低高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、高トリグリセリド血症、および高血圧に関連する疾患を含む、一般にメタボリックシンドロームと呼ばれる状態（例えば、Ｗｉｅｒｎｓｐｅｒｇｅｒ，Ｎ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｓｙｎｄｒ  Ｏｂｅｓ，６，３７９−３８８（２０１３）を参照）の肝臓の発現であると広く考えられている。
【０００６】
現在、糖尿病と肥満が世界的に流行になっている。少なくとも１４億６０００万人の成人が過体重または肥満であり、２００８年時、約１億７０００万人の世界の児童が、過体重または肥満であると指定された。これらの数値は上昇を続けており、ＮＡＳＨが、裕福な国と途上国の両方においてますます一般的な肝臓の問題になることを示しており、肝臓疾患の世界的負担が増大し、世界的に公衆衛生および医療費に影響を及ぼす。
【０００７】
２０１２年に、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨは、５年間の直接的および間接的な医療費を約２６％増加させるということが推定された。上記のように、現在、先進国の全ての成人の約３０％が、ＮＡＦＬＤを有するという推定もなされており、そのような成人の約２〜６％が、ＮＡＳＨを有すると考えられている。具体的には、ＮＡＦＬＤは、肥満個体の最大７０〜８０％が罹患していると考えられている（例えば、Ｙｏｕｎｏｓｓｉ，Ｚ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ，９，５２４−５３０  （２０１１）を参照）。
【０００８】
ＮＡＳＨの正確な原因は解明されておらず、全ての患者において、ほぼ確実に同じではない。それは、インスリン抵抗性、肥満、およびメタボリックシンドロームと最も密接に関連しているが、これらの状態の患者の全てが、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨを有するわけではなく、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの患者の全てが、これらの状態のうちの１つに罹患しているわけではない。それでも、ＮＡＳＨが、肝硬変、肝不全、およびＨＣＣをもたらす潜在的に致命的な状態であることを考えると、効果的な治療が緊急に求められている。
【０００９】
現時点では、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨのための根拠に基づく承認された薬物療法はない。生活習慣の変化は、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの過程を逆戻りさせるいかなる試みにおいても重要であり、治療の標的はインスリン抵抗性および酸化ストレスである。いくつかの治療の選択肢が評価されているが、ほとんどの治療の価値は依然として不明であるか、またはその効果はそれらが中止されるときに逆戻りする。ＮＡＳＨのための治療目標は、組織学的特徴を減少させ、かつインスリン抵抗性および肝酵素レベルを改善することである。
【００１０】
ヒトの腸内細菌叢は、数兆の微生物で構成されており、その大部分は、非病原性であると考えられる細菌およびウイルスのものである。細菌叢は、宿主の防御および免疫系と並行して機能し、病原体の定着および侵入から保護する。また、それは、必須の代謝機能を果たし、必須の栄養素およびビタミンの供給源として働き、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）およびアミノ酸などのエネルギーおよび栄養素を食物から抽出するのに役立つ（例えば、Ｃａｒｄｉｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｅｃｏｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｓ，２６，２６１９１（２０１５）を参照）。
【００１１】
微生物培養試験では、少数の腸内細菌種しか検出されない。今日では、腸内細菌叢の組成および多様性は、培養に依存しない遺伝的およびメタゲノム的技術によって明らかにされている。メタゲノム解析および１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列決定は、門レベルで、ＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓおよびＢａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ  が支配的であり、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ  およびＬｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅもまた存在するということを示している（同上）。支配的な門は、個体間で比較的一定であるが、多様性は、それぞれの個体が１００種を超える固有の種を抱える分類系統に沿って増加する。
【００１２】
腸内細菌叢は、ヒトと共に相互作用的パートナーとして進化してきたが、腸内細菌叢の組成の変化、すなわち腸内細菌叢の生態学的構成の変化（一般にディスバイオシスとして知られている）は、肥満、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アレルギー性疾患、胃腸疾患、自己免疫疾患および癌などのいくつかの臨床状態（例えば、Ｓｅｒｉｎｏ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｃａｒｄｉｏｌ  Ｒｅｐ，１６（１１），５４０  （２０１４）を参照）に関連し、またＮＡＦＬＤ（例えば、Ｂｏｕｒｓｉｅｒ，Ｊ．ａｎｄ  Ｄｉｅｈｌ，Ａ．Ｍ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ，１１（１），ｅ１００４５５９  （２０１５）を参照）にも関連することが見出されている。事実、腸内細菌叢ディスバイオシスは、腸防御の変化、細菌転位の増加をもたらし、次に組織炎症および脂肪肝を誘因し得ると考えられている。
【００１３】
脂肪肝進行における腸内細菌叢の可能性がある役割としては、いくつかの潜在的作用機序：消化不能食物多糖類からのエネルギー収穫による肥満の誘発、腸の透過性の調節および軽度の炎症の刺激、食餌性コリン代謝の調節、  ならびに腸内細菌による内因性エタノール生成の刺激が挙げられる（Ａｒｓｌａｎ，Ｎ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０（４４），１６４５２−１６４６３  （２０１４）を参照）。
【００１４】
さらに、肥満の原因となる細菌叢は、肝性トリグリセリドを刺激することによって、また肝臓中の脂肪酸の貯蔵に間接的に影響を与え得る、全身性の脂質代謝を調節することによって、肝機能を変更させ得ると考えられている。したがって、最適な腸内細菌叢系の回復は、脂肪症の進行を防止し、かつ、特に、ＮＡＦＬＤのＮＡＳＨへの進行を阻止するための有望な戦略であり得る。
【発明の概要】
【００１５】
本発明者らは、現在驚くべきことに、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ（本明細書ではＦＡと称する）翼果または種子から（特に、翼果から）得られる抽出物は、腸内細菌叢を調節または調整することによって腸内細菌叢ディスバイオシスを回復させることにおいて強力な活性を有することを見出している。これらの効果は、そのような  Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物が、数多くの治療的および非治療的（例えば、美容）用途、ならびに医学的状態の予防における用途を有し得ることを示唆している。  
【００１６】
Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物
本発明によれば、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ（ＦＡ）抽出物（特に、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ翼果種子（特に、翼果）抽出物）が提供され、それは以下では「本発明の抽出物」と称され得る。
【００１７】
典型的には、本発明の抽出物は、本明細書に記載のプロセスを使用して、ＦＡ（特に、ＦＡの翼果または種子）から得られる抽出物であってもよい。
【００１８】
疑念を回避するために、本明細書においてＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ（ＦＡ）抽出物への全ての言及は、具体的には、ＦＡ翼果または種子（なお特に、翼果）抽出物から得られる抽出物について言及することにする。さらに、ＦＡ翼果はＦＡ種子を含有するので、ＦＡ翼果からの抽出物は、ＦＡ種子（翼果）からの抽出物を含む（またはこれらから本質的になる／これらからなる）ことが理解されるであろう。
【００１９】
本発明の抽出物は、水抽出物、アルコール抽出物または水−アルコール抽出物であってもよい。好ましくは、本発明の抽出物は、水−メタノール抽出物または水−エタノール抽出物などの水−アルコール抽出物である。例えば、本発明の抽出物は、水中約１％〜約９９％のエタノール、例えば水中約３０％〜約７５％のエタノール、または水中約３０％〜約５０％のエタノール、例えば水中約３５％〜約４０％のエタノールを含む抽出溶媒を使用して得られる水−エタノール抽出物であってもよい。
【００２０】
本明細書で使用する用語「水抽出物」は、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ（ＦＡ）から得られる抽出物を指し、水のみの溶媒を使用して、植物（特に、翼果）からの抽出を行っている。
【００２１】
本明細書で使用する用語「アルコール抽出物」は、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ（ＦＡ）から得られる抽出物を指し、アルコールのみの溶媒を使用して、植物（特に、翼果）からの抽出を行っている。例えば、１００％メタノールおよび／または１００％エタノールである。
【００２２】
本明細書で使用する用語「水−アルコール抽出物」は、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ（ＦＡ）から得られる抽出物を指し、水とアルコールの混合物を使用して、植物からの抽出を行っている。例えば、水中約１％〜約９９％のアルコール（例えば、エタノール）では、そのような抽出物を水−エタノール抽出物と称する。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明の抽出物は、以下の化合物（セコイリドイド類）：
（ｉ）約１重量％〜約１６重量％、例えば約１重量％〜約１５重量％のヌゼニド、
（ｉｉ）約１重量％〜約１８重量％、例えば約１重量％〜約１７重量％のＧＬ３、
（ｉｉｉ）約０．５重量％〜約１重量％のオレオシドメチルエステル、
（ｉｖ）約０．０３重量％〜約０．１２重量％のエクセルシドＢ、
（ｖ）約０．１重量％〜約１．７重量％のＧＬ５、および／または（例えばおよび）
（ｖｉ）約０．０８重量％〜約０．８重量％、例えば約０．０８重量％〜約０．７重量％のサリドロシドを含み得る（またはこれらから本質的になり得る／これらからなり得る）。
【００２４】
本明細書において特に明記しない限り、列挙した重量パーセントは、得られた（乾燥）抽出物の総重量を基準とする。
【００２５】
疑念を回避するために、本発明の所与の態様、特徴、またはパラメータについて示される嗜好性、選択肢、および具体的な特徴などは、別段文脈が示さない限り、同じまたは他の本発明の態様、特徴、またはパラメータについて示されるあらゆる全ての嗜好性、選択肢、および具体的な特徴と組み合わせて開示されているものとみなされるべきである。
【００２６】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語を使用する場合、記載されている抽出物または組成物が、列挙された成分（複数可）を含有しなければならないが、任意で追加の成分を含有してもよいことを意味する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語を使用する場合、記載されている抽出物または組成物が、列挙された成分（複数可）を含有しなければならず、かつ少量（例えば、最大５重量％、または最大１重量％もしくは０．１重量％）の他の成分を含有してもよいが、但し、いかなる追加の成分も抽出物または組成物の本質的な特性に影響を与えないことを条件とすることを意味する。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」という用語を使用する場合、記載されている抽出物または組成物が、列挙された成分（複数可）のみを含有しなければならないことを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、測定可能な値（反応混合物中の特定の構成成分の量または重量など）を指す場合、±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または特に±０．１％の特定量の変動を指す。
【００２８】
例えば、特定の実施形態では、本発明の抽出物は、約１０重量％のヌゼニドおよび／または（例えば、および）約１０重量％のＧＬ３を含み得る（またはこれらから本質的になり得る／これらからなり得る）。
【００２９】
疑念を回避するために、上記の化合物の構造を以下に示す。
【００３０】
【化１】
2019523257.tif 000003
【００３１】
【化２】
2019523257.tif 000004
【００３２】
【化３】
2019523257.tif 000005
【００３３】
さらに、他の化合物もまた本発明の抽出物中に存在し得る。特定の実施形態では、存在し得る他の化合物としては、フラキシン、フラキセチン、エスクリン、エスクレチン、スコポリン、７−メチルエクリンおよびフラキシジングルコシドなどのクマリン類が挙げられるが、これに限定されない。
【００３４】
例えば、特定の実施形態では、本発明の抽出物は、さらに、
フラキシン（約０．０９５％）、
フラキセチン（約０．１１７％）、
エスクリン（約０．０１７％）、
エスクレチン（約０．０１７％）、
スコポリン（約０．０３８％）、
７−メチルエクリン（約０．０４０％）、および／または（例えば、および）
フラキシジングルコシド（約０．０６１％）を含み得る（またはこれらから本質的になり得る／これらからなり得る）。
【００３５】
特定の実施形態では、総クマリン類（フラキシンとして検出されたクマリン類を基準にして推定）は約０．３９％であった。さらに、他のクマリン類は、少なすぎて定量化できないレベル（それらの存在が５ｐｐｍ未満であるため）で、同定され得る（例えば、ＬＣ／ＭＳによって）が、シコリン、スコポレチン、カルシノサゾン、マンドシュリン、フラキシジン、イソフラキシジンおよびフラキシノールを含み得る。
【００３６】
当業者には、本発明の抽出物が、固体形態で提供され得ることが理解されるであろう。固体形態には、化合物が、非晶質固体、または結晶性固体もしくは部分結晶性固体として提供され得ることが含まれる。
【００３７】
組成物および投与
本発明によれば、本発明の抽出物は、薬学的組成物または（機能性食品組成物または食物組成物と称され得る）食品組成物などの（適切な）組成物の形態で提供され得る。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明の抽出物は、本発明の抽出物と適切な場合には任意で薬学的に許容される賦形剤とを含む（薬学的製剤とも称され得る）薬学的組成物または本発明の抽出物と適切な場合には任意で（機能性）食品許容原料とを含む機能性食品組成物の形態で提供され得る。
【００３９】
本明細書で使用する場合、薬学的に許容される賦形剤への言及は、当業者にとって既知である薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、および／または担体を指し得る。
【００４０】
食品許容原料としては、当該技術分野において既知であるもの（本明細書において薬学的に許容される賦形剤とも称されるものを含む）が挙げられ、それは天然であっても非天然であってもよく、すなわち、それらの構造は、天然で生じたものであっても、そうでなくてもよい。特定の場合には、それらは、天然化合物に由来し、後に修飾されたものであってもよい（例えば、マルトデキストリン）。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明の抽出物は、非天然担体もしくはマルトデキストリンなどの修飾天然担体をさらに含む、薬学的組成物または機能性食品組成物の形態で提供され得る。
【００４２】
「薬学的に許容される」とは、組成物の追加の成分が、無菌であり、かつ発熱物質を含まないことを意味する。そのような成分は、本発明の抽出物と適合性があり、そのレシピエントに対して有害でないという意味において「許容される」ものでなければならない。したがって、「薬学的に許容される」は、単に賦形剤として作用することを意図した、すなわち、それ自体生物学的活性を有することを意図しない、製剤の一部を形成するのに使用される任意の化合物（複数可）を含む。したがって、薬学的に許容される賦形剤は、一般的に安全であり、非毒性であり、生物学的にも他の点でも望ましくないものではない。
【００４３】
当業者には、（例えば、本明細書に記載したものなどの、当業者に既知の薬学的組成物などの組成物の形態である）本発明の抽出物は、経口、直腸、経鼻、肺、口腔、舌下、経皮、嚢内、腹腔内、ならびに（皮下、筋肉内、くも膜下腔内、静脈内および皮内を含む）非経口などの任意の適切な経路によって、患者または対象（例えば、ヒトもしくは動物の患者または対象）に投与され得ることが理解されるであろう。
【００４４】
特に、本発明の抽出物は、経口投与されてもよい。そのような場合、本発明による薬学的組成物は、経口経路による投与のために特別に製剤化されてもよい。
【００４５】
経口投与のための薬学的組成物としては、硬質または軟質カプセル剤、錠剤、トローチ剤、糖衣錠、丸剤、ロゼンジ剤、散剤および顆粒剤などの固体剤形が挙げられる。適切な場合には、それらは、腸溶性コーティングなどのコーティングで調製することができ、またはそれらは、当該技術分野において既知の方法に従って、持続放出または延長放出などの、有効成分の制御放出を提供するように製剤化することができる。
【００４６】
経口投与のための液体剤形としては、溶液、エマルジョン、水性または油性懸濁液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。
【００４７】
経口投与を意図したものなどの、本明細書に記載の組成物（例えば、薬学的組成物または食品組成物）は、組成物の成分を混合物にもたらすなどの、当業者に既知の方法に従って調製されてもよい。
【００４８】
本明細書に記載のそのような組成物は、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤などの食品原料からなる群から選択される１つ以上の追加の成分を含有してもよい。錠剤は、有効成分（複数可）を、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤（または成分）と混合して含有してもよい。例えば、これらの賦形剤（または成分）は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性な希釈剤、コーンスターチ、マルトデキストリンまたはアルギン酸などの顆粒化剤および崩壊剤、デンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、ならびにステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの滑沢剤であってもよい。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、それにより長期間にわたって持続的な作用を提供するために既知の技術でコーティングされていてもよい。例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートなどの時間遅延材料を使用してもよい。
【００４９】
適切な薬学的担体としては、不活性な固体希釈剤または充填剤、滅菌水溶液および様々な有機溶媒が挙げられる。固体担体の例は、乳糖、白土、スクロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、アラビアゴム、加工デンプンおよびセルロースの低級アルキルエーテルである。液体担体の例は、シロップ、落花生油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレンおよび水である。さらに、担体または希釈剤は、単独またはワックスと混合されたモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの、当該技術分野において既知である任意の徐放性材料を含んでもよい。
【００５０】
治療される障害および患者、ならびに投与経路に応じて、本発明の抽出物は、様々な用量（すなわち、それを必要とする患者に投与される場合の治療上有効な用量）で投与されてもよい。これに関して、当業者には、本発明の文脈における、哺乳動物、特にヒトに投与される用量は、妥当な時間枠にわたって哺乳動物において治療応答に影響を与えるのに十分であるべきであることが理解されるであろう。当業者であれば、正確な用量および組成物の選択ならびに最も適切な送達レジメンはまた、とりわけ  、製剤の薬理学的特性、治療される状態の性質および重症度、ならびにレシピエントの身体的状態および精神的明瞭性、ならびに特定の化合物の効力、治療される患者の年齢、状態、体重、性別および応答、ならびに疾患の段階／重症度に影響されることを認識するであろう。
【００５１】
典型的には、本明細書に記載の本発明の使用または方法において、抽出物または抽出物を含む組成物は、約１００ｍｇ／日〜約２０００ｍｇ／日、または約５００ｍｇ／日〜約１５００ｍｇ／日もしくは約１０００ｍｇ／日の量で投与される。
【００５２】
いずれにしても、医師または他の熟練者は、個々の患者に最も適した実際の投与量を日常的に決定することができるであろう。上記投薬量は、平均の場合の例であり、当然のことながら、より高いまたはより低い投薬量範囲が妥当である個々の事例があり得、それらも本発明の範囲内である。
【００５３】
本明細書に記載の組成物（例えば、薬学的組成物）中に含まれる場合、抽出物は、典型的には、約１重量％〜約１００重量％、例えば、約１０重量％〜約９０重量％または約２０重量％〜約８０重量％または約３０重量％〜約７０重量％または約４０重量％〜約６０重量％の量で存在する。
【００５４】
抽出物を得るためのプロセス
本発明の抽出物は、当業者によって決定されてもよい、必要な抽出物を選択する分離技術を使用して、ＦＡ種子または翼果（特に、ＦＡ翼果）から単離されてもよい。
【００５５】
典型的には、本発明の抽出物は、一般に以下に記載された抽出プロセスおよび単離プロセス、またはそれらを慣習的に修正したものによって得られ得る。
【００５６】
例えば、本発明の抽出物の抽出および単離のためのプロセスは、次のステップ：
（ｉ）適切な溶媒による、（粉砕され得る）ＦＡ翼果の抽出と、
（ｉｉ）溶媒の蒸発と、必要に応じて
（ｉｉｉ）抽出物の精製（例えば、クロマトグラフィーによる）と、を含み得る（またはこれらから本質的になり得る／これらからなり得る）。
【００５７】
典型的には、ＦＡ翼果を、約０．１ｍｍ〜約３０ｍｍの範囲の粒径を有する顆粒に粉砕して、溶媒が接触する表面積を増大させ、抽出効率を高める。
【００５８】
抽出プロセスにおいて使用してもよい特定の溶媒としては、メタノールなどのアルコール、および（メタノールと水の混合物などの）アルコール／水混合物が挙げられる。例えば、抽出溶媒は、水、水−アルコール混合物（水中に約１％〜約９９％のアルコール。例えば、水中に約３０％〜約７５％のアルコール、または水中に約３０％〜約５０％のアルコール、例えば水中に約３５％〜約４０％のアルコール）、またはアルコールであり得る。挙げることができる特定のアルコールとしては、エタノール（ＥｔＯＨ）およびメタノール（ＭｅＯＨ）が挙げられる。
【００５９】
特定の実施形態では、抽出溶媒は、水中に約３０％〜約７５％のエタノール、または水中に約３０％〜約５０％のエタノールなどのエタノール−水混合物であってもよい。例えば、水中に約３５％〜約４０％のエタノール。
【００６０】
一実施形態では、抽出温度は、約２０℃〜約１００℃の範囲である。特定の実施形態では、抽出のための温度は、約５０℃〜約７０℃の範囲である。
【００６１】
典型的には、植物材料と抽出プロセスで使用される溶媒混合物との比は、グラム対ミリリットル単位で、約１：１〜約１：１０まで、例えば約１：３〜約１：８まで変化する。
【００６２】
インキュベーション時間（すなわち、植物材料を溶媒と接触させる時間）は、典型的には、約２時間〜約２４時間である。
【００６３】
植物材料および溶媒をインキュベートした後、溶媒を残留植物材料から分離し、抽出組成物が固体成分を有するまで抽出組成物を濃縮する（すなわち、溶媒を除去する）。典型的には、固体成分は、約１％〜約３５％のＦＡセコイリドイド類を含み（または、から本質的になる／からなる）得る。他の成分としては、フェノール化合物類、サリドロシド、クマリン類およびフラボノイド類が挙げられる。
【００６４】
抽出プロセスの完了後、セコイリドイド類は、ＦＡ抽出物から、必要に応じてクロマトグラフィープロセスを使用して（すなわち精製して）それ自体単離することができる。
【００６５】
典型的には、本発明の抽出物は、以下のプロセスを使用して得ることができる。
−ＦＡ抽出粉末（すなわち、粉砕された翼果を調製することによって得られる）をアルコールに溶解し、セコイリドイド類をアルコールによって粉末から抽出する。次いで、アルコールを蒸発させ、セコイリドイド類を含む残りの残渣を、逆相Ｃ−１８樹脂を充填したクロマトグラフィーカラムに入れる。
−種々の化合物を含有する数個の分画が、一連の水および１０％のＭｅＯＨ／９０％の水、ならびにＭｅＯＨ系を用いて溶出される。分画は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって比較され、同様のＨＰＬＣパターンを有する溶出物がまとめられる。
−まとめられた分画は、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離され、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、９０％、８０％のＣＨＣｌ３から始めて１００％のＭｅＯＨまでに至るＣＨＣｌ３−メタノール混合物で溶出して、数個の亜分画を得る。亜分画はＨＰＬＣによって比較され、エクセルシドＡを含有する分画、およびエクセルシドＢを含有する分画が、それぞれまとめられる。まとめられた分画は、Ｃ−１８樹脂、ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＨＰ−２０Ｐ樹脂および／またはＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０樹脂によるカラムクロマトグラフィーの組合せによってさらに精製されて、純粋なエクセルシドＡおよびエクセルシドＢを得る。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」および「精製された」は、抽出物またはセコイリドイド類と共にその天然源に存在する少なくとも１つの他の成分（例えば、ポリペプチドまたはセルロース誘導体）から分離されている抽出物またはセコイリドイド類を指す。一実施形態では、抽出物またはセコイリドイド類は、純粋な形態で、または溶媒、緩衝液、イオン、またはその溶液中に通常存在する他の成分の存在下で提供される。
【００６７】
したがって、用語「単離された」および「精製された」は、天然源に存在する抽出物またはセコイリドイド類を指さない。同様に、抽出物という用語は、天然源（例えば、ＦＡ種子）に存在する成分ではなく、抽出プロセスによって得られた天然材料の成分を指す。
【００６８】
特定の実施形態では、そのようなプロセスから得られる本発明の抽出物は、
−他の植物材料を実質的に含まず（例えば、植物セルロースを含まない）、
−植物細胞を実質的に含まず、かつ／または
−植物細胞物質を実質的に含まなくてもよい。
【００６９】
本明細書で使用される場合、別の材料の「実質的に含まない」材料への言及は、１重量％未満（例えば、０．１重量％未満、例えば、０．０１重量％未満または０．００１重量％未満）のその他の材料からなる材料を指してもよい。
【００７０】
代替実施形態では、ＦＡ抽出物をＦＡ種子から抽出および単離する方法は、
（ａ）ＦＡ種子を粒子に粉砕する工程と、
（ｂ）粒子を溶媒混合物に含有させる工程と、
（ｃ）粉砕された粒子を溶媒混合物から分離する工程と、
（ｄ）溶媒混合物を蒸発させる工程と、を含む（またはこれらから本質的になる／これらからなる）ものとして記載されてもよい。
【００７１】
さらなるそのような実施形態では、プロセスはまた、
（ｅ）（ｄ）の生成物をアルコールに溶解させる工程と、
（ｆ）アルコールを蒸発させる工程と、を含み得る（またはこれらから本質的になり得る／これらからなり得る）。
【００７２】
典型的には、ＦＡ種子からのＦＡ抽出物の抽出（すなわち、上記の工程（ａ）〜（ｄ））において、粉砕粒子は、約０．１ｍｍ〜３０ｍｍの直径を有し、かつ／または温度は、約２０℃〜約１００℃であり、かつ／または粉砕粒子と溶媒混合物との比は、約１ｇ対１ｍｌ〜約１ｇ対８ｍｌであり、かつ／または粉砕粒子を溶媒混合物と約２時間〜約２４時間接触させ、かつ／または溶媒混合物は、水、水−アルコール混合物またはアルコールである。
【００７３】
特定の実施形態では、本明細書に記載された本発明の抽出物は、本明細書に記載されたプロセスから得られた（またはそのプロセスによって得られる）抽出物であってもよい。
【００７４】
治療的および非治療的用途
本明細書に記載されているとおり、本発明の抽出物は、特定の生物学的効果を有してもよく、それは医学的状態の治療において有用であってもよい。したがって、本発明によれば、医薬における（または医薬品としての）本発明の抽出物の使用が提供される。
【００７５】
さらに、本明細書に記載されているとおり、本発明の抽出物は、脂肪肝（肝臓における脂肪症）などの本明細書に記載したものなどの疾患の治療に特に有用であってもよい。
【００７６】
本発明の抽出物はまた、患者が体重増加を減少または制限するのを支援し得る。例えば、本発明の抽出物は、高脂肪食をとっている対象において体重増加を減少させ得る（図１に示すとおり）。
【００７７】
本発明の抽出物はまた、耐糖能異常を減少させ得る。典型的には、本発明の抽出物は、高脂肪食をとっている対象において耐糖能異常を減少させ得る（図２に示すとおり）。
【００７８】
本発明の抽出物はまた、肝臓に蓄積される脂肪（脂肪肝）のレベルを減少させ得る。典型的には、本発明の抽出物は、高脂肪食をとっている対象において肝臓に蓄積される脂肪のレベルを減少させ得る（図３に示すとおり）。
【００７９】
したがって、本発明の一態様では、
（ａ）肥満関連および／もしくはメタボリックシンドローム関連の腸内細菌叢ディスバイオシスを回復させること、
（ｂ）脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／もしくは非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を治療もしくは予防すること、
（ｃ）腸管壁浸漏および／もしくは腸管透過性亢進を治療もしくは予防すること、
（ｄ）腸内細菌叢ディスバイオシスに起因する心血管疾患および／もしくは心血管代謝疾患を治療もしくは予防すること、
（ｅ）軽度の炎症を治療もしくは予防すること、
（ｆ）アテローム性動脈硬化症を治療もしくは予防すること、
（ｇ）肥満を治療もしくは予防すること、ならびに／または
（ｈ）インスリン抵抗性、耐糖能異常、前糖尿病、および／もしくは糖尿病（例えば、２型糖尿病）を治療もしくは予防すること、に使用するためのＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物（すなわち、本発明の抽出物）が提供される。
【００８０】
本発明の代替態様では、
（ａ）肥満関連および／もしくはメタボリックシンドローム関連の腸内細菌叢ディスバイオシスを回復させること、
（ｂ）脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／もしくは非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を治療もしくは予防すること、
（ｃ）腸管壁浸漏および／もしくは腸管透過性亢進を治療もしくは予防すること、
（ｄ）腸内細菌叢ディスバイオシスに起因する心血管疾患および／もしくは心血管代謝疾患を治療もしくは予防すること、
（ｅ）軽度の炎症を治療もしくは予防すること、
（ｆ）アテローム性動脈硬化症を治療もしくは予防すること、
（ｇ）肥満を治療もしくは予防すること、ならびに／または
（ｈ）インスリン抵抗性、耐糖能異常、前糖尿病、および／もしくは糖尿病（例えば、２型糖尿病）を治療もしくは予防すること、のための薬剤の製造における、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の使用が提供される。
【００８１】
本発明のさらなる代替態様では、
（ａ）肥満関連および／もしくはメタボリックシンドローム関連の腸内細菌叢ディスバイオシスを回復させること、
（ｂ）脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／もしくは非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を治療もしくは予防すること、
（ｃ）腸管壁浸漏および／もしくは腸管透過性亢進を治療もしくは予防すること、
（ｄ）腸内細菌叢ディスバイオシスに起因する心血管疾患および／もしくは心血管代謝疾患を治療もしくは予防すること、
（ｅ）軽度の炎症を治療もしくは予防すること、
（ｆ）アテローム性動脈硬化症を治療もしくは予防すること、
（ｇ）肥満を治療もしくは予防すること、ならびに／または
インスリン抵抗性、耐糖能異常、前糖尿病、および／もしくは糖尿病（例えば、２型糖尿病）を治療もしくは予防すること、のための方法であって、
それを必要とする対象に、治療有効量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物を投与することを含む、方法が提供される。
【００８２】
特定の実施形態では、回復、治療もしくは予防される疾患または障害は、
−肥満関連の腸内細菌叢ディスバイオシス、メタボリックシンドローム関連の腸内細菌叢ディスバイオシス、ならびに／または
−脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）からなる群から選択される。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「治療」（および同様に、「治療する」）という用語は、医学の分野における通常の意味である。具体的には、この用語は、当業者（例えば、医師）にとって既知の技術を使用して決定され得る疾患または障害（例えば、真菌症）に関連した１つ以上の臨床症状の重症度を減少させるのを達成すること、および／または疾患または障害の進行を緩徐化する（すなわち、例えば、そのように治療されていない患者においてかかることが予想される時間と比較して、疾患または障害がより重度の状態へと進行するのにかかる時間を増加させる）ことを指し得る。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「予防」（および同様に「予防する」）という用語は、疾患または障害の予防への言及（およびその逆）を含む。特に、この用語は、患者（または健康な対象者）がその病態を発症する可能性の低減（例えば、少なくとも１０％の低減（少なくとも２０％、３０％、または４０％の低減など）、例えば、少なくとも５０％の低減）を指し得る。
【００８５】
疑念を回避するために、本発明の文脈において、「治療する」および「予防する」という用語は、治療を必要とする対象／患者の治療的または対症的な治療、ならびに関連疾患状態になりやすい患者の予防的治療および／または診断を含む。
【００８６】
医学的状態に関連して本明細書で使用する場合、「減少させる（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」という用語は、観察される量をより小さくするか、またはサイズを減少させることを指し得る。
【００８７】
医学的状態に関連して本明細書で使用する場合、「回復させる」という用語は、当業者に知られているとおり、関連する特徴を通常の状態に戻すことを指し得る。例えば、様々な種類の腸内細菌叢ディスバイオシスを回復させることは、腸内細菌叢のレベルおよび／または性質を、当業者が健康な対象において観察するのを期待するものと同じか、より類似したレベルおよび／または性質に変えることを指し得る。
【００８８】
疑念を回避するために、特定の実施形態では、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物は、
（ｉ）約１重量％〜約１５重量％のヌゼニドと、
（ｉｉ）約１重量％〜約１７重量％のＧＬ３と、
（ｉｉｉ）約０．５重量％〜約１重量％のオレオシドメチルエステルと、
（ｉｖ）約０．０３重量％〜約０．１２重量％のエクセルシドＢと、
（ｖ）約０．１重量％〜約１．７重量％のＧＬ５と、
（ｖｉ）約０．０８重量％〜約０．７重量％のサリドロシドと、を含む（またはこれらから本質的になる／これらからなる）。
【００８９】
特に、ＦＡ抽出物は、約１０重量％のヌゼニドおよび約１０重量％のＧＩ３を含み得る（またはこれらから本質的になり得る／これらからなり得る）。
【００９０】
さらに、疑念を回避するために、  Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物は、本明細書に記載の組成物（例えば、薬学的組成物または食品組成物）の形態であってもよい。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「対象」および「患者」という用語は、互換的に使用され得、哺乳動物種（特にヒト）を含み得る。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」という用語は、治療される患者に治療効果を与える、本発明の抽出物、または本発明のＬＡ抽出物を含む組成物の量（例えば、疾患を治療または予防するのに十分な量）を指し得る。この効果は、客観的（すなわち、いくつかの試験またはマーカーによって測定可能）または主観的（すなわち、対象が効果の指標を与えるか、または効果を感じる）なものであってもよい。
【００９３】
本明細書に記載されているとおり、腸内細菌叢の典型的な生態学的構成の変化（ディスバイオシス）などの、腸内細菌叢の組成の変化は、肥満、インスリン抵抗性、耐糖能異常、前糖尿病、糖尿病、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患、軽度の炎症、腸管壁浸漏、腸管透過性亢進、腸内細菌叢ディスバイオシスに起因する、心血管疾患、心血管代謝疾患、ならびにアテローム性動脈硬化症などの状態に関連している。したがって、最適な腸内細菌叢系に回復させる可能性は、脂肪症の進行およびＮＡＦＬＤのＮＡＳＨへの進行を防止するための戦略を提供する。さらに、この効果は、特定の医学的な疾患または障害に罹患していない患者における一般的な健康の促進にも有用であり得る。
【００９４】
したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載の使用（使用のための抽出物を含む）または方法は、脂肪症の進行を遅延または阻止する（後の用語は、停止する、または防止すると称され得る）こと、特にＮＡＦＬＤのＮＡＳＨへの進行を遅延または阻止すること（例えば、遅延させること）を含み（または、からなり）得る。
【００９５】
本明細書で使用する場合、疾患状態の進行を阻止することへの言及は、そのような治療の開始後の期間中および／またはそのような治療が提供されている期間中にその疾患のいかなる重大な悪化も当業者が観察することができないように、その疾患を治療することを指す。同様に、ある（第１の）疾患状態から別の（第２の）疾患状態への進行を阻止することへの言及は、そのような治療の開始後の期間中および／またはそのような治療が提供されている期間中に第２の疾患状態の開始を当業者が観察することができないように、その第１の疾患を治療することを指す。
【００９６】
本明細書で使用する場合、疾患状態の進行を遅延させることへの言及は、そのような治療の開始後の期間中および／またはそのような治療が提供されている期間中には疾患状態が悪化するのに要する時間が、そのような治療が行われなかった場合に予想される時間よりも長くなる（すなわち、医学的に有意な期間、例えば少なくとも１週間、または特に少なくとも４週間もしくは８週間）ことを当業者が観察することができるように、その疾患を治療することを指す。同様に、ある（第１の）疾患状態から別の（第２の）疾患状態への進行を遅延させることへの言及は、そのような治療の開始後の期間中および／またはそのような治療が提供されている期間中には第１の疾患状態が第２の疾患状態に進行するのに要する時間が、そのような治療が行われなかった場合に予想される時間よりも長くなることを当業者が観察することができるように、その第１の疾患を治療することを指す。
【００９７】
さらに、本発明の別の態様では、
（ｉ）腸内細菌叢を調節もしくは調整し、
（ｉｉ）体脂肪を減少させ、かつ／または
（ｉｉｉ）血糖濃度を減少させることにおける、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物（すなわち、本発明の抽出物）の使用（例えば、非治療的用途）が提供される。
【００９８】
本発明の代替態様では、
（ｉ）腸内細菌叢を調節もしくは調整し、
（ｉｉ）体脂肪を減少させ、かつ／または
（ｉｉｉ）血糖濃度を減少させる、方法（例えば、非治療的方法）であって、
それを必要とする対象に、有効量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物を投与することを含む、方法が提供される。
【００９９】
本明細書で使用する場合、「調節」（もしくは「調節する」）または「調整」（もしくは「調整する」）という用語は、腸内に存在する特定の分類群（門、部類、集団、科、および属）を増加（濃縮）および／または減少させることを指し得る。例えば、調節または調整への言及は、腸内に存在する特定の操作的分類単位（ＯＴＵ）を増加および／または減少させる効果を指し得る。
【０１００】
「有効量」という用語は、本発明の抽出物、または本発明の抽出物を含む組成物の量であって、その抽出物または組成物が投与された対象に効果を与える量（例えば、腸内に存在する特定の分類群（門、部類、集団、科、および属）を増加および／または減少させるなどの所望の効果をもたらすのに十分な量）を指す。この効果は、客観的（すなわち、いくつかの試験またはマーカーによって測定可能）または主観的（すなわち、対象が効果の指標を与えるか、または効果を感じる）なものであってもよい。
【０１０１】
本明細書に記載されているとおり、使用または方法は、腸内に存在する特定の操作的分類単位（ＯＴＵ）の増加（濃縮）および／または減少などの、腸内に存在する特定の分類群（門、部類、集団、科、および属）の増加および／または減少をもたらす結果になり得る。
【０１０２】
特定の実施形態では、調節または調整は、
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａｃａｅ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、ＢｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＥｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓからなる属から選択される細菌群のレベルを増加させ、かつ／または
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＩＶおよびＢｕｔｙｒｉｃｏｃｃｕｓからなる属から選択される細菌群のレベルを減少させることを指す。
【０１０３】
さらに特定の実施形態では、調節または調整は、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅおよびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅからなる科から選択される細菌群のレベルを増加させることを指す。
【０１０４】
またさらに特定の実施形態では、調節または調整は、
−Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ  ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ  Ａｌｉｓｔｉｐｅｓからなる属から選択される細菌群のレベルを増加させ、かつ／または
−Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ  Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓのレベルを減少させることを指す。
【０１０５】
特定の細菌分類群の存在は肝臓における高レベルの脂肪症と関連しているので、本発明の抽出物、または本発明の抽出物を含む組成物による調節または調整によって生じる特定の細菌分類群の濃縮は、肝臓における脂肪症の発達もしくは進行および／もしくはＮＡＦＬＤのＮＡＳＨへの進行を減少または防止し得る。
【０１０６】
したがって、特定の実施形態では、腸内細菌叢の調節または調整は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を予防もしくは治療し、かつ／またはＮＡＦＬＤの非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）への進行を遅延させる（もしくは阻止する）ことに使用するためにある（すなわち、そのことをもたらす結果になるか、またはその効果を有する）。
【０１０７】
本発明のさらなる態様では、ＮＡＦＬＤを予防もしくは治療し、かつ／またはＮＡＦＬＤのＮＡＳＨへの進行を遅延させる（もしくは阻止する）ために腸内細菌叢を調節または調整する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物を投与することを含む、方法が提供される。
【０１０８】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を予防もしくは治療し、かつ／またはＮＡＦＬＤの非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）への進行を遅延させる（もしくは阻止する）ことは、
−Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａｃａｅ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、ＢｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＥｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓからなる属から選択される細菌群のレベルを増加させ、かつ／または
−Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＩＶおよびＢｕｔｙｒｉｃｏｃｃｕｓからなる属から選択される細菌群のレベルを減少させることによって、かつ／または
−Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅおよびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅからなる科から選択される細菌群のレベルを増加させることによって、かつ／または
−Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ  ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ  Ａｌｉｓｔｉｐｅｓからなる属から選択される細菌群のレベルを増加させ、かつ／または
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ  Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓのレベルを減少させることによって達成され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】（Ａ）体重であり、（Ｂ）２００ｍｇ／ｋｇ体重のＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物が有りまたは無しの、高脂肪食（６０％）の１２週間の消費におけるマウスの体重増加であり、（Ｃ）１２週間の処置後のマウスの体組成である。＊は、結果が対照とは統計的に異なること、ｐ＜０．０５を示す。
【図２】（Ａ）経口胃管栄養法による経口グルコース投与の前ならびに１５分、３０分、６０分、９０分および１２０分後の血糖であり、（Ｂ）２００ｍｇ／ｋｇ体重のＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物が有りまたは無しの、高脂肪食（６０％）の１２週間の消費の終了時のマウスの各曲線下面積（ＡＵＣ）値である。＊は、結果が対照とは統計的に異なること、ｐ＜０．０５を示す。
【図３】（Ａ）対照およびＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ処置マウスの、凍結肝臓から調製し、オイルレッドＯで染色した肝臓切片（倍率×２０）であり、（Ｂ）面積による脂肪の割合であり、オイルレッドＯで染色されたスライドをＩｍａｇｅＪ解析ソフトウェアで分析して、脂肪症の定量的組織学的測定を得、画像から画素強度のヒストグラムを生成し、その面積を測定し、その結果を面積による脂肪の割合として表した。データは、中央値、第１四分位数、第３四分位数、最小値および最大値を示すボックスプロットによって表されている。＊＊は、結果が対照とは統計的に異なること、ｐ＝０．００４を示す（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）
【図４】グループごとの各試料タイプ：１ヶ月（＿Ｔ１）もしくは３ヶ月（＿Ｔ３）の高脂肪食処置マウス（ＨＦＤ６０）または１ヶ月（＿Ｔ１）もしくは３ヶ月（＿Ｔ３）の高脂肪食およびＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物処置マウス（ＨＦＤ６０＋Ｆ．ａｎｇｕｓｔ）についての個々の試験試料が示す、部類レベルでの分類群の相対的割合である。
【図５】グループごとの各試料タイプ：１ヶ月（＿Ｔ１）もしくは３ヶ月（＿Ｔ３）の高脂肪食処置マウス（ＨＦＤ６０）または１ヶ月（＿Ｔ１）もしくは３ヶ月（＿Ｔ３）の高脂肪食およびＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物処置マウス（ＨＦＤ６０＋Ｆ．ａｎｇｕｓｔ）についての平均が示す、部類レベルでの分類群の相対的割合である。
【図６】グループごとの各試料タイプ：１ヶ月（＿Ｔ１）もしくは３ヶ月（＿Ｔ３）の高脂肪食処置マウス（ＨＦＤ６０）または１ヶ月（＿Ｔ１）もしくは３ヶ月（＿Ｔ３）の高脂肪食およびＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物処置マウス（ＨＦＤ６０＋Ｆ．ａｎｇｕｓｔ）についての個々の試験試料が示す、科レベルでの分類群の相対的割合である。
【図７】グループごとの各試料タイプ：１ヶ月（＿Ｔ１）もしくは３ヶ月（＿Ｔ３）の高脂肪食処置マウス（ＨＦＤ６０）または１ヶ月（＿Ｔ１）もしくは３ヶ月（＿Ｔ３）の高脂肪食およびＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物処置マウス（ＨＦＤ６０＋Ｆ．ａｎｇｕｓｔ）についての平均が示す、科レベルでの分類群の相対的割合である。
【図８】Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離測定基準に基づいて、マウスの異なるグループからの試料（１ヶ月（＿Ｔ１）もしくは３ヶ月（＿Ｔ３）の高脂肪食処置マウス（ＨＦＤ６０）または１ヶ月（＿Ｔ１）もしくは３ヶ月（＿Ｔ３）の高脂肪食およびＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物処置マウス（ＨＦＤ６０＋Ｆ．ａｎｇｕｓｔ））を比較するためのＰｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣｏＡ）である。０と１のアルファ値を有する両方のＰＣｏＡプロットが示されている。
【図９】Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離測定基準に基づいて、マウスの異なるグループからの試料（１ヶ月（＿Ｔ１）もしくは３ヶ月（＿Ｔ３）の高脂肪食処置マウス（ＨＦＤ６０）または１ヶ月（＿Ｔ１）もしくは３ヶ月（＿Ｔ３）の高脂肪食およびＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物処置マウス（ＨＦＤ６０＋Ｆ．ａｎｇｕｓｔ））を比較するためのＰｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣｏＡ）である。０と１のアルファ値を有する両方のＰＣｏＡプロットが示されている。
【図１０】Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の補給なしで高脂肪食を与えたマウスと  Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の補給ありで高脂肪食を与えたマウスとの３ヶ月間での比較である。線形判別分析効果サイズは、デフォルト値（部類間の階乗Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定とサブクラス間のペアワイズＷｉｌｃｏｘｏｎ検定の両方でアルファ値０．５、識別機能の対数ＬＤＡスコアで閾値２．０）および「ａｌｌ−ａｇａｉｎｓｔ−ａｌｌ」に設定されたマルチクラス分析のための戦略を使用して決定された。（Ｂ）ＬＤＳ効果サイズデータからのＬＥｆＳｅクラドグラムは、６つの属の最大分類レベルの樹木根としての細菌で生成された。ハイライト（緑または赤）は、対応する群において示された分類群の濃縮を表す。
【図１１】Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の補給なしで高脂肪食を与えたマウスと  Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の補給ありで高脂肪食を与えたマウスとの３ヶ月間での比較である。ＬＤＳ効果サイズデータからのＬＥｆＳｅクラドグラムは、６つの属の最大分類レベルの樹木根としての細菌で生成された。ハイライト（緑または赤）は、対応する群において示された分類群の濃縮を表す。
【図１２】同定された科分類群および脂肪症の重症度としてのオイルレッドＯ肝臓染色率のＲａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔ回帰分析である。
【図１３】同定された科分類群および脂肪症の重症度としてのオイルレッドＯ肝臓染色率のＲａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔ回帰分析である。
【図１４】同定された科分類群および脂肪症の重症度としてのオイルレッドＯ肝臓染色率のＲａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔ回帰分析である。
【０１１０】
本発明を以下の非限定的な実施例を参照してさらに説明することにする。
【実施例】
【０１１１】
実施例１−水を用いたＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａの抽出
Ｆ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａの翼果の合計２．５ｋｇを空気中で乾燥させ、次いで粒度が約１〜２ｍｍの粗粉末に粉砕した。粗粉末を８０〜９０℃のパーコレーターで５時間水に浸し、水抽出物をパーコレーターから排出した。抽出プロセスを３回繰り返した。全ての水抽出物を合わせて、回転式真空蒸発器で濃縮した。水を蒸発させた後、合計５５０グラムの乾燥粉末抽出物を得た。ＨＰＬＣ分析は、この粉末抽出物が２つの主要なセコイリドイド、１１．４％（重量／重量）のヌゼニドおよび６．２％のＧＢを含有することを示す。組成物はまた、リグストロシド、オレオシドジメチルエステル、およびエクセルシドＡを含むいくつかの非主要なセコイリドイドと共に、０．１９％のオレオシド−１，１−メチルエステル、０．４１％のエクセルシドＢ、０．６３％のＧＩ５、０．２％のサリドロシドも含有する。
【０１１２】
実施例２−水、水−ＥｔＯＨ、およびＥｔＯＨを用いたＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａの抽出
５個の試料を調製し、各試料は、５グラムのＦ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ翼果を含有した。各試料を粉末に粉砕し、それぞれ２００ｍＬの、水、２５％ＥｔＯＨ／７５％水、５０％ＥｔＯＨ／５０％水、７５％ＥｔＯＨ／２５％水、およびＥｔＯＨで溶媒抽出にかけた。室温（２２〜２４℃）で２４時間抽出した後、溶媒を蒸発させ、残留固体をＨＰＬＣで分析した。セコイリドイド内容物およびサリドロシドを表１に列挙する。
【０１１３】
【表１】
2019523257.tif 000006
【０１１４】
実施例３−Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａからのセコイリドイドの単離
３．５Ｌのメタノールを添加し、実施例１に示した手順から得られた粉末抽出物５００グラムと室温で３時間混合した。メタノール溶液をろ過プロセスにより粉末から分離した。同じプロセスを１回繰り返し、２つのメタノール抽出物を合わせ、減圧下で濃縮して、合計５４グラムの乾燥メタノール抽出物を得た。メタノール抽出物を水に再溶解し、ろ過して非水溶性物質を除去した。ろ液にはさらに、水、および水中に１０％のＭｅＯＨから１００％のＭｅＯＨまでの勾配のあるＭｅＯＨ−水溶媒系を加えたＣ−１８樹脂による逆相カラムクロマトグラフィー分離を実施した。合計７つの分画を採取した。カラムから溶出した各分画を真空下で蒸発させ、ＨＰＬＣ分析によってまとめた。分画２、３および７をシリカゲル樹脂で充填したクロマトグラフィーカラムに入れ、ＣＨＣｌ３から始めて、１０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３、２０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３、１００％のＭｅＯＨに至るまでのクロロホルム−メタノール系で溶出した。シリカゲルカラムから採取した分画をＨＰＬＣ分析で比較し、分離した各溶出液にＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＨＰ−２０Ｐ樹脂および／またはＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０樹脂によるカラムクロマトグラフィーを繰り返し実施し、１つの純粋な化合物が得られるまで水−メタノール系で溶出した。化合物エクセルシドＡ、エクセルシドＢ、ヌゼニド、ＧＩ３、ＧＩ５、リグストロシド、オレオシドジメチルエステル、オレオシド−１，１−メチルエステル、およびサリドロシドが同定された。全ての化学構造は分光法によって解明された。
【０１１５】
実施例４−マウスにおける脂肪肝に対するＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の効果の試験
９週齢の成体オスＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  （Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｒｈoｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、一定の室温および湿度で飼育し、ＳＰＦ条件で１２時間／１２時間の明／暗サイクルに維持した。これらには、ＳＡＦＥ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｏｏｄ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａｕｇｙ、Ｆｒａｎｃｅ）によって得られた脂肪由来の６０％エネルギーの高脂肪食（ＨＦＤ）が１２週間与えられ、水は自由に与えられた。表２および表３は、それぞれＨＦＤの成分リストおよび栄養価を示す。
【０１１６】
【表２】
2019523257.tif 000007
【０１１７】
【表３】
2019523257.tif 000008
【０１１８】
処置群において、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ（Ｖａｈｌ）抽出物を直接食物に混合し、２００ｍｇ／ｋｇ／日で経口経路により投与したが、これは、ＦＤＡによる式（２００５年）：ヒト等価用量ＨＥＤ（ｍｇ／ｋｇ）＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物体重（ｋｇ）／ヒト体重（ｋｇ））に従うと、１ｇ／日のヒト等価用量を表す。Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ翼果の乾燥抽出物は、本明細書に記載の水中３０％（ｖ／ｖ）エタノールで抽出することによって得た。抽出物は、好ましくは、その植物の抽出物の総乾燥重量を基準として、約１０％（％ｗ／ｗ）のヌゼニドおよび約１０％（％ｗ／ｗ）のＧＬ３を含有し得る。ＨＦＤのみ消費するラット（対照群）とＨＦＤおよび抽出物の両方を消費するラット（Ｆ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ群）において異なるパラメータを比較することにより、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ（Ｖａｈｌ）抽出物消費の効果を分析した。
【０１１９】
体重および体重増加を１２週間にわたって追跡し、体組成（体脂肪量、除脂肪体重および水の割合）を処置の終了時にＮＭＲによって評価した。２ｇ／ｋｇ体重のグルコースを絶食マウスに投与し、グルコース投与後２時間にわたって血糖値を追跡することにより、１２週間の処置後の経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を行った。
【０１２０】
犠牲にして、肝臓を慎重に取り出し、両方の組織学的分析のために秤量し、調整した。肝臓における脂質沈着を検出するために、凍結肝臓から肝臓切片を調製し、以前に報告されているオイルレッドＯ（Ｆｏｗｌｅｒ，Ｓ．Ｄ．，Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，Ｐ．，Ｏ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，３３，８３３−８３６  （１９８５））で染色した。オイルレッドＯで染色したスライドをＩｍａｇｅＪ解析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）で分析して、脂肪症の定量的組織学的測定を得た。それぞれの肝臓生検について、ｘ２０倍率での５枚のランダム画像を採取して、各検体について代表的な試料を確保した。画像から画素強度のヒストグラムを生成し、その面積を測定し、結果を面積による脂肪の割合として表した。
【０１２１】
図１に示すとおり、高脂肪食の１２週間の消費は、かなりの体重増加を誘導し、それはＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の同時消費によって中和された。具体的には、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物は、ＨＦＤを１２週間与えたマウスの脂肪量を減少させることができた。
【０１２２】
図２に示すとおり、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の消費はまた、血糖負荷の３０分後および６０分後の血糖濃度の有意な減少（ｐ＜０．０５）および（血糖値対時間）曲線下面積（ＡＵＣ）の有意な減少（ｐ  ＝  ０．０７）によって示されるとおり、ＨＦＤを与えたマウスの耐糖能異常を有意に減少させることもできた。
【０１２３】
図３に示すとおり、高脂肪食の１２週間の消費は、対照群において肝臓への高レベルの脂肪沈着、すなわち脂肪症（３５．２％）を誘発し、この種の食事は肥満、糖尿病および脂肪肝を誘発する食事モデルとして典型的である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｙ，Ｓｏｅｊｉｍａ  Ｙ，Ｆｕｋｕｓａｔｏ  Ｔ，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，１８（１９），２３００−２３０８  （２０１２）；  ａｎｄ  Ｚｈｏｕ，Ｙ．ａｎｄ  Ｘｉｅ，Ｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｄｉｓ，２（１），６０−６７（２０１５）を参照）。Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物を用いた１２週間の処置は、抽出物を用いて処理したマウスの肝臓においてわずか２２．８パーセントの脂肪だけが検出され、これは脂肪症の３５％の減少に相当するので、脂肪症の重症度を有意に減少させることができた（ｐ＝０．００４）。脂肪含量に従って脂肪症の重症度を分類する（グレード０：＜５％、グレード１：５〜３３％、グレード２：３４〜６６％、グレード３：＞６７％）、Ｗｏｒｌｄ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（２０１２）と、ＫｌｅｉｎｅｒおよびＢｒｕｎｔによる分類（Ｋｌｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ  Ｂｒｕｎｔ，Ｅ．Ｍ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ，３２，３−１３  （２０１２））とにより、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａを用いた処置は、脂肪症の重症度をグレード２からグレード１に減少させることを保証した。
【０１２４】
実施例５−マウスにおける腸内細菌叢ディスバイオシスに対するＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の効果の試験
高脂肪食を与えられたマウスにおけるＦｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の消費によって誘導される腸内細菌叢の改変を評価するために、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物を用いて、または用いずに、ＨＦＤ消費の開始時（４週間）および１２週間後のマウス糞便試料（グループにつきマウス１０匹、総数４０匹のマウス）に対して１６Ｓ  ｒＤＮＡメタゲノム研究を行った。試料に含まれる細菌集団は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ細菌遺伝子の可変領域（Ｖ３−Ｖ４）の次世代ハイスループット配列決定を使用して決定された。
【０１２５】
メタゲノミクスワークフローは、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の特定の領域を増幅することによって、メタゲノムサンプルから生物を分類するために使用される。このメタゲノミクスワークフローは、細菌にのみ適用される。主な成果は、いくつかの分類レベル：門、部類、集団、科および属での読み取りの分類である。試料中に存在する細菌叢集団は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ細菌遺伝子の可変領域の次世代ハイスループット配列決定を使用して決定されている。ワークフローには次のステップが含まれる。
【０１２６】
（１）ライブラリー構築および配列決定
細菌１６Ｓリボソーム遺伝子のＶ３−Ｖ４領域を標的とする１６Ｓユニバーサルプライマーを使用してＰＣＲ増幅を行った。ジョイントの対の長さは、２×３００ペアエンドのＭｉＳｅｑキットＶ３のおかげで、４７６塩基対アンプリコンを含むように設定された。各試料について、配列決定アダプターの追加によって配列決定ライブラリーを生成した。配列決定断片の検出は、ＭｉＳｅｑ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）技術を使用して行われた。
【０１２７】
（２）バイオインフォマティクスパイプライン
細菌叢からの標的化メタゲノム配列を、以下のバイオインフォマティクスパイプラインを使用して分析した。簡単に述べると、バーコード化されたイルミナの対の読み取りを逆多重化した後、単一の読み取り配列をきれいにし、各試料について独立してより長い断片に対にした。品質フィルタリングおよび１６Ｓ参照データベースとの整列の後、９７％の同一性閾値を有する操作的分類単位（ＯＴＵ）へのクラスタリング、および分類割り当てを行って、コミュニティプロファイルを決定した。
【０１２８】
これらの結果に基づいて、１）個々の研究試料および２）各試料タイプ／群の平均に存在する分類群（門、部類、集団、科、および属）の相対的な割合をグラフで表した。
【０１２９】
図４、図５、図６および図７に示したとおり、ＨＦＤと同時に抽出物を消費しなかったマウスと比較して、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物を消費したマウスでは、腸内細菌叢プロファイルは高脂肪食消費開始時（Ｔ１）には類似していたが、若干の差異が部類で見られ、科レベルでより激しく見られた。
【０１３０】
Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離測定基準（Ｌｏｚｕｐｏｎｅ  Ｃ、Ｌｌａｄｓｅｒ  ＭＥ、Ｋｎｉｇｈｔｓ  Ｄ、Ｓｔｏｍｂａｕｇｈ  Ｊ、Ｋｎｉｇｈｔ  Ｒ（２０１１）ＵｎｉＦｒａｃ：ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｔｒｉｃ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．ＩＳＭＥ  Ｊ．５（２）：１６９−１７２）に基づいて試料を比較してマウスのグループの違いを説明するために、Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣｏＡ）を行った。
【０１３１】
図８および図９に示したとおり、個体の分布の積み重ね可能なプロファイルによって示されるように、高脂肪食消費の開始時（Ｔ１）にはマウスの腸内細菌叢組成は類似していたが、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物で３ヶ月の処置後、処置された個体は、それらの腸内細菌叢の組成により未処理の個体と異なることが見られた。
【０１３２】
次いで、メタゲノミクスデータの高次元クラス比較を分析するために、Ｌｉｎｅａｒ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＬＤＡ）Ｅｆｆｅｃｔ  Ｓｉｚｅ（ＬＥｆＳｅ）（Ｓｅｇａｔａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，１２（６），Ｒ６０（２０１１））法を使用した。ＬｅｆＳｅは、２つ以上の生物学的条件の差異を特徴付ける分類群を同定することができる、高次元のバイオマーカー発見および説明のためのアルゴリズムである。それは、統計的有意性と生物学的関連性の両方を強調し、生物学的に意味のあるカテゴリー（サブクラス）とも矛盾しない、異なる豊富な特徴を研究者が同定できるようにする。ＬＥｆＳｅは、最初に、生物学的部類間で統計的に異なる特徴を確実に同定する。次いで、それは、これらの差異が、期待される生物学的挙動に関して一貫しているかどうかを評価するために追加の試験を実施する。線形判別分析効果サイズは、デフォルト値（部類間の階乗Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定とサブクラス間のペアワイズＷｉｌｃｏｘｏｎ検定の両方でアルファ値０．５、識別機能の対数ＬＤＡスコアで閾値２．０）および「ａｌｌ−ａｇａｉｎｓｔ−ａｌｌ」に設定されたマルチクラス分析のための戦略を使用して決定された。
【０１３３】
図１０および図１１に示したとおり、ＬｅｆＳｅ分析は、  ＨＦＤを与えられた未処理マウスと比較して、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物で処理されたマウスでは、属またはＯＴＵレベルで、異なる分類群（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａｃａｅ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓおよび他のＯＴＵ）の濃縮があることを明らかにした。逆に、  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ＿ＩＶ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓおよび他の分類群は、ＨＦＤを与えられた未処理マウスと比較して、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物で処理されたマウスでは、あまり現れなかった。これらの結果は、  Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物の補給によって誘導される腸内細菌叢の改変を強調している。
【０１３４】
細菌叢分析と脂肪症の重症度との相関は、Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ法（Ｔｏｕｗ，Ｗ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｅｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ，１４（３），３１５−２６  （２０１３））を使用して分析された。図１２、図１３および図１４に示したとおり、それぞれ科または属レベルでのいくつかの分類群の相対的な存在量は、高脂肪食を与えたマウスにおける脂肪症の重症度と相関しており、Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ抽出物が、腸内細菌叢を改変することができ、特にいくつかの科または属（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）の相対的な存在量を改変できること、およびこれらの改変により脂肪症の発達を減少させられることが明確に示されている。分類群の存在量（科および属による）と脂肪症の重症度との相関の分析結果を以下の表４および表５に示す。
【０１３５】
【表４】
2019523257.tif 000009
【０１３６】
【表５−１】
2019523257.tif 000010
【０１３７】
【表５−２】
2019523257.tif 000011
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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