(57)【要約】  本発明は、対象における化学療法誘発性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療における使用のためのGPR132阻害剤に関する。GPR132阻害剤を含む医薬組成物、並びにGPR132阻害剤を特定するための方法もまた、本発明に包含される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における化学療法誘発性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療における使用のための、GPR132（Gタンパク質共役受容体132）阻害剤であって、前記対象には少なくとも1種の白金含有化学療法剤が投与されている、GPR132阻害剤。
【請求項２】
前記少なくとも1種の白金含有化学療法剤がオキサリプラチンである、請求項1に記載の使用のためのGPR132阻害剤。
【請求項３】
前記阻害剤が、化学療法依存的な感覚ニューロンの過剰興奮性を低減する、請求項1又は2に記載の使用のためのGPR132阻害剤。
【請求項４】
前記阻害剤が、化学療法依存的な一過性受容器電位（transient receptor potential、TRP）チャネルの感作を低減する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用のためのGPR132阻害剤。
【請求項５】
前記一過性受容器電位（TRP）チャネルは、TRPV1、TRPA1、TRPM8、TRPV4、TRPC3及びTRPC6から成る群から選択される、請求項4に記載の使用のためのGPR132阻害剤。
【請求項６】
前記化学療法依存的な一過性受容器電位（TRP）チャネルの感作が、酸化脂質により媒介される、請求項4又は5に記載の使用のためのGPR132阻害剤。
【請求項７】
前記酸化脂質が、ヒドロキシオクタデカジエン酸（HODE）、ジヒドロキシオクタデセン酸（DiHOME）、及びエポキシオクタデセン酸（EpOME）から成る群から選択される、請求項6に記載の使用のためのGPR132阻害剤。
【請求項８】
前記酸化脂質が、9-HODE、13-HODE、9,10-DiHOME、12,13-DiHOME、9,10-EpOME及び12,13-EpOMEから成る群から選択される、請求項6又は7に記載の使用のためのGPR132阻害剤。
【請求項９】
前記対象が、哺乳類、好ましくはヒトである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の使用のためのGPR132阻害剤。
【請求項１０】
前記阻害剤が、経口及び／又は非経口（parental）投与により前記対象に投与される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の使用のためのGPR132阻害剤。
【請求項１１】
前記阻害剤が、ペプチド若しくはタンパク質、リボザイム、抗体、小分子、阻害性RNA分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、モルフォリノ又は脂質、特にリゾホスファチジルコリン（LPC）である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の使用のためのGPR132阻害剤。
【請求項１２】
GPR132阻害剤を含む医薬組成物であって、前記阻害剤が、ペプチド若しくはタンパク質、リボザイム、抗体、小分子、阻害性RNA分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、モルフォリノ又は脂質、特にリゾホスファチジルコリン（LPC）である、医薬組成物。
【請求項１３】
医薬上許容される担体を更に含む、請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
以下の工程を含む、GPR132阻害剤を特定するための方法：
a) 酸化脂質の存在下で培養された、GPR132を発現する細胞を、GPR132阻害剤であると推測される化合物と接触させる工程、
b) 前記接触後、GPR132活性を決定する工程、及び
c) 決定されたGPR132活性を、対照細胞において決定されたGPR132活性と比較し、それによりGPR132阻害剤を特定する工程。
【請求項１５】
前記対照細胞が、GPR132阻害剤であると推測される化合物と接触させられていない、酸化脂質の存在下で培養された、GPR132を発現する細胞である、請求項14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象において化学療法誘発性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療における使用のためのGPR132阻害剤に関する。GPR132阻害剤を含む医薬組成物、並びにGPR132阻害剤を特定するための方法もまた、本発明に包含される。
【背景技術】
【０００２】
化学療法誘発性末梢神経障害（CIPN）とも称される、化学療法誘発性神経障害性疼痛は、癌治療中の細胞増殖抑制薬の重度の有害事象である。CIPNは、化学療法の延期又は中止の主要な理由の1つであり、従って化学療法の有効性の減少、生活の質の低下の原因となる(Sisignano等、2014) (Wang等、2012)。いくつかの化合物がCIPNの治療において有用であることが示唆されている（例えば、国際公開第2005/105135号、国際公開第2016/016178号）。しかしながら、現在、CIPNの予防又は効果的な治療のために承認された又は推奨される薬剤は存在しない（Hershman等、2014）。
【０００３】
シスプラチン又はオキサリプラチン等の白金ベースの化合物、ビンクリスチン及びビンブラスチン等のビンカアルカロイド、パクリタキセル及びドセタキセル等のタキサン、並びにボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤は、重度のCIPNを誘発し得る抗新生物薬である。オキサリプラチンは大腸癌の一次治療として広く用いられ、最大80％の患者においてCIPNを誘発する(Pachman等、2011)。症状は体の四肢に現れ、反復治療の間に手足に沿って進行し得る(Pachman等、2011)。CIPNは炎症プロセスを伴う可能性があるが、古典的な炎症性疼痛モデルと比較すると、重要な酵素及びシグナル伝達分子は異なると考えられる。オキサリプラチンでの治療はCOX2の発現の増大を誘導せず、プロスタグランジン合成をまったく増大させないため、酸化脂質合成及びシグナル伝達の異なるメカニズムが示唆される(Sisignano等、2014)。このため、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）はオキサリプラチン誘発性CIPNの治療において効果的でない（Park等、2013）。
【０００４】
オキサリプラチン誘発性末梢神経障害の背景にある分子メカニズムは今なお不明瞭である。一過性受容器電位（transient receptor potential、TRP）チャネルのような、リガンド依存性イオンチャネル（ligand-gated ion channel）が、CIPNの病理に寄与し得ることが示唆されている。生理学的条件下でTRPチャネルは、熱やチリ・ペパー由来のカプサイシン（TRPV1）、低ｐH又はワサビ由来のイソチオシアン酸アリル（TRPA1）、低温又はペパーミント由来のメントール（TRPM8）のような外部刺激、並びに浸透圧及び機械刺激（TRPA1、TRPV4、TRPC3及びTRPC6）（Moran等、2011）の知覚に役立つ。病態生理学的条件下では、TRPチャネルは感作され、それにより、活性化閾値の減少及びそれによる疼痛性の又は通常は非疼痛性の刺激に対する感度の増大（それぞれ痛覚過敏症、異痛症）がもたらされる(Julius、2013)。TRPチャネルに対するこれらの感作効果は、プロスタグランジンE2（PGE2）、他のエイコサノイド、又は酸化リノール酸代謝産物等の脂質メディエーターにより媒介され得る。これらの脂質は、感覚ニューロンにおいてGタンパク質共役受容体（GPCR）に結合し、様々なGタンパク質依存シグナル伝達経路の活性化を引き起こし、プロテインキナーゼA（PKA）及びPKCε媒介性のTRPチャネルのリン酸化をもたらし（Wang等、2008; Wang等、2015）、それらの活性化を引き起こす（Moriyama等、2005; Sisignano等、2014)。TRPV1、TRPA1及びTRPV4の感作の増大は、化学療法誘発性末梢神経障害において機械的過敏症（mechanical hypersensitivity）及び冷感異痛症に寄与し得る(Nassini等、2011; Li等、2015)。
【０００５】
Gタンパク質共役受容体G2A（G2A受容体）としても知られる、Gタンパク質共役受容体132（GPR132）は、プロトン感知性Gタンパク質共役受容体（GPR）サブファミリーの一員である。GPR132は最初、ストレス誘導性GPCRとして特定された（Weng等、1998）。GPR132は7回膜貫通型Gタンパク質共役受容体であり、細胞膜の表面に存在する。リゾホスファチジルコリン及びスフィンゴシルホスホリルコリンがGPR132に対する直接的なリガンドであることが最初に報告された。しかしながら、これらの研究は、これらのリン脂質が実際にGPR132に結合するという証拠を与えず、その結果当該論文は4年後に撤回された。さらに、特定のリノール酸及びアラキドン酸代謝産物がGPR132に対するリガンドとして機能することが示唆されている(Obinata等、2005)。
【０００６】
GPR132の発現は、主にマクロファージ、樹状細胞、好中球、Tリンパ球、Bリンパ球等の血液白血球において見られ、ストレス及び長期のマイトジェンシグナルにより上方調節され得る。さらに最近、GPR132は後根神経節（DRG）等の特定のニューロンの集団において発現されることもまた、記述された。GPR132（G2A）を欠くノックアウトマウスは自己免疫疾患を発症することが報告された。さらに、G2A欠損T細胞はTCR刺激に対し過反応性であることが示され、増殖の増進と活性化のための閾値の低下を見せた。
【０００７】
GPR132は免疫系の調節に関与しているため、治療標的としてのGPR132への焦点は、主にGPR132シグナル伝達を活性化させるという意味において、炎症性疾患にあった。国際公開第2003/080071号は好中球の蓄積、IL-8の過剰放出、又は微生物感染を伴う疾患又は障害を治療するための、G2A受容体特異的なアゴニストリガンドを開示する。国際公開第2008/156833は、高密度リポタンパク質（HDL）粒子レベルの減少、超低密度リポタンパク質（VLDL）粒子レベルの増大、又は低密度リポタンパク質（LDL）粒子レベルの増大を特徴とする疾患状態、例えば慢性炎症性自己免疫障害、アテローム性動脈硬化、高脂血症又は高コレステロール血症等、を治療及び予防するための治療標的としてG2A受容体を開示する。国際公開第2004/003567号は、ヒトG2Aの核酸配列及びアミノ酸配列、及び哺乳類における血液疾患、心血管疾患、末梢及び中枢神経系の障害、胃腸疾患並びに炎症の治療のためのその調節に関する。
【０００８】
化学療法誘発性神経障害性疼痛を予防及び／又は治療するための、特に白金含有化学療法剤、例えばオキサリプラチン、により誘発される神経障害性疼痛のための、GPR132阻害剤の使用は、先行技術に開示されておらず、予測もされていない。
【０００９】
CIPNは炎症プロセスを伴う可能性があるが、古典的な炎症性疼痛モデルと比較すると、重要な酵素及びシグナル伝達分子は異なると考えられる。オキサリプラチンでの治療はCOX2の発現の増大を誘導せず、プロスタグランジン合成をまったく増大させないため、酸化脂質合成及びシグナル伝達の異なるメカニズムが示唆される(Sisignano等、2014)。このため、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）はオキサリプラチン誘発性CIPNの治療において効果的ではない。
【００１０】
前述のように、化学療法誘発性神経障害性疼痛（CIPN）を有する患者、特にオキサリプラチン等の広く使用される白金含有化学療法剤により誘発される神経障害性疼痛を有する患者において、臨床用途に使用可能な、裏付けられた神経保護的利益を有する治療法は現在存在しない。
【００１１】
以上を考慮すると、化学療法誘発性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療における使用のための治療剤の開発について現在進行中の要求が存在する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の根底にある技術的課題は、上述の要求を満たすための手段及び方法の提供であると考えられ得る。当該技術的課題は、特許請求の範囲及び以下において特徴づけられる実施形態により解決される。
【００１３】
本発明は、対象において化学療法誘発性神経障害性疼痛を予防及び／又は治療することにおける使用のためのGPR132（Gタンパク質共役受容体132）阻害剤であって、前記対象には少なくとも1種の白金含有化学療法剤が投与されている、GPR132阻害剤に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】オキサリプラチンでの処理の10日後の坐骨神経及びDRGにおける9-HODE及び13-HODEの合成の増大。図1A: 10日間にわたりダイナミックプランターエステシオメーターを用い、ビヒクル（0.9% v/v DMSO）と比較した、オキサリプラチンのi.p.注入（3mg/kg）後のマウスの機械的疼痛閾値。1群当たりn=8のマウスの足引っ込め潜時（paw withdraw latency、PWL）の平均±SEMを示す；**p<0.01 ***p<0.001；Bonferroniのpost hoc試験を用いた二元配置ANOVA（two-way ANOVA）。図1B〜F:注入の10日後の、ビヒクル（黒色棒；0.9% v/v DMSO）又はオキサリプラチン（白色棒；3mg/kg）で処理したマウスの坐骨神経、DRG及び後角組織から得た9-HODE(B)、13-HODE(C) 、9,10-DiHOME(D)、12,13-DiHOME(E)、及び14, 15-EET(F)の濃度。データは、1群当たりn=5のマウスから得られた平均±SEMを表す；*p<0.05；対応のないスチューデントt検定。図1G:定量的RT-PCRを用い、ビヒクル（0.9% v/v DMSO）と比較した、オキサリプラチン（3mg/kg）での処理の10日後にマウスから得られた後根神経節（DRG）におけるCYP2J6、COX2及びLOXアイソフォームの相対的mRNA発現。データは、1群当たりn=3のマウスから得られた平均±SEMを表す。
【図２】9-HODEは、感覚ニューロンにおいてTRPV1を感作し、インビボで機械的疼痛閾値を低減する。図2A：カプサイシンでの2回の成体DRGニューロンのTRPV1の刺激（Cap; 200nM、30秒）。2回目の刺激の前に9-HODE(200nM、120秒)と共にインキュベーションすると、最初の刺激に比べたカルシウム流量（Δ比率）が増大した。ニューロンはKCl（40mM、10秒）への反応により特定した。代表的な波形を示す。図2B：9-HODEは、DRGニューロンのTRPV1チャネルを用量依存的に感作する。0〜1000nMの範囲の9-HODE濃度での最初及び2回目のカプサイシン刺激のΔ比率を示す。1濃度当たりn=44〜99のニューロンを用い、データを平均±SEMとして与える。図2C：13-HODE（200nM、120秒）により、DRGニューロン（n=30〜83）におけるTRPV1依存的カルシウム流量のΔ比率は増大しない。図2D：カプサイシン（1μM、15秒）で2回処理したDRGニューロンのホールセル電位固定測定のサンプル波形。2回目のcap-刺激の前に、9-HODE(200nM、3分)と共に細胞をインキュベートした。図2E：n=11のニューロンを用い平均±SEMとして示す、（D）に記載のように処理した細胞についての最初及び2回目のカプサイシン刺激に対する標準化された反応。図2F：メントール（100μM、30秒）で刺激したDRGニューロンのTRPM8に対する9-HODEの効果。図2G：イソチオシアン酸アリル（50μM、30秒）で刺激したDRGニューロンのTRPA1に対する9-HODEの効果。1条件当たりn=20〜33のニューロンを用い、ビヒクル（DMSO）と比べたΔ比率を示す。図2H：9-HODE(1μM、10分)、カプサイシン（400nM、10分）又は両方ともで刺激したDRGニューロンからのCGRP放出。データは、1条件当たりn=6〜8のマウスから得られた平均±SEMとして示す；*p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001；対応のないスチューデントt検定。図2I：8日間にわたりダイナミックプランターエステシオメーターを用いて得られた、オキサリプラチン（3mg/kg）での処理後のTRPV1欠損マウスと比較した野生型マウス（WT）の機械的疼痛閾値。1群当たりn=7のマウスの対側の足（未処理）のPWLの平均±SEMを示す；***p<0.001；2元配置ANOVA。図2J: オキサリプラチン（3mg/kg）での処理後のTRPV1欠損マウスと比較した野生型マウスの機械的疼痛閾値。8日目に、9-HODE(1μM)を同側の足にi.pl.（足底内）注入し、PWLをさらに0.5時間、1時間及び2時間後に測定した。1群当たりn=7のマウスの同側の足（9-HODE処理した）のPWLの平均±SEMを示す；***p<0.001；Bonferroniのpost hoc試験を用いた二元配置ANOVA。
【図３】9-HODEはG2A受容体（GPR132）を活性化させる。図3A〜B：9-HODE（1μM）で刺激した、G2Aベクター又はpcDNA3.1(空ベクター)でトランスフェクトしたHEK細胞のカルシウム濃度を示す。陽性対照としてタプシガルギンを用いた。図3Aは代表的な波形を示し、図3Bは1条件当たりn=32〜46の細胞を用い平均±SEMとして与える定量分析を示す。***p<0.001;対応のないスチューデントt検定。図3C：イクオリン-及びG2A-発現ベクター又はpcDNA3.1(空ベクター)で共トランスフェクトしたCOS-1細胞の用量反応分析。様々な9-HODE及び13-HODE濃度［10-9〜10-5M］での曲線下の面積（AUC）としてのカルシウム流量を示す。n=3の測定から得た平均±SEMとしてデータを与える。図3D：9-HODE(10μM)、13-HODE(10μM)、リノール酸（30μM）及びアラキドン酸（30μM）で刺激した、イクオリン-及びG2A-発現ベクターで共トランスフェクトしたCOS-1細胞。n=3の測定を行い、曲線下の面積（AUC）の平均±SEMとしてカルシウム流量を示した；***p<0.001；Bonferroniのpost hoc試験を用いた一元配置ANOVA；###p<0.001対応のないスチューデントt検定。図3E；野生型及びG2A欠損マウスにおけるG2A-mRNAの発現。n=4の測定を行い、平均±SEMとしてデータを与えた；***p<0.001；対応のないスチューデントt検定。図3F〜G：2回目のカプサイシン刺激（Cap;200nM、30秒）の前に9-HODE（200nM、120秒）と共に成体DRGニューロンをインキュベーションすると、野生型（WT）のDRGニューロンでは最初の刺激と比べたカルシウム流量（Δ比率）が増大したが、G2A欠損マウスでは増大しなかった。ニューロンは、KCl（40mM、10秒）への反応により特定した。図3Fは代表的な波形を示し、図3Gは1条件当たりn=46〜110の細胞を用い、平均±SEMとして与える定量分析を示す；***p<0.001；Bonferroniのpost hoc試験を用いた一元配置ANOVA。
【図４】9-HODEを介したTRPV1感作はPKAではなくPKCにより媒介される。図4A：成体DRGニューロンの9-HODE（200nM、120秒）を介したTRPV1の感作は、PKA阻害剤H89（10μM、測定前45分）による影響を受けなかった。PKA依存的なTRPV1感作のための対照として8-ブロモ-cAMP（40μM、120秒）を用いた。1条件当たりn=20〜69の細胞を用い、平均±SEMとしてデータを示す。図4B：PKC阻害剤GF109203X（1μM、測定前45分）は、9-HODE依存的なTRPV１感作を抑制する。PKC依存的なTRPV1感作の陽性対照としてブラジキニン（500nM、120秒）を用いた。1条件当たりn=45〜90の細胞を用い、平均±SEMとしてデータを示す; *p<0.05 **p<0.01;対応のないスチューデントt検定。
【図５】G2A欠損マウスのオキサリプラチン処理中の9-HODE依存的な機械的疼痛は低減していた。図5A：ハーグリーブス装置（Hargreaves Apparatus）を用いて得られた、左後足への9-HODE（1μM及び10μM）のi.pl.（足底内）注入後のナイーブ野生型マウスの熱疼痛閾値（thermal pain threshold）。1群当たりn=8のマウスのPWLの平均±SEMを示す。図5B：ダイナミックプランターエステシオメーターを用いて得られた、左後足への9-HODE（10μM）のi.pl.注入後のナイーブ野生型マウスの機械的疼痛閾値。1群当たりn=6のマウスのPWLの平均±SEMを示す。図5C：ビヒクル処理したマウスと比較した、10日間オキサリプラチン（3mg/kg）で処理したマウスのDRGにおけるG2A-mRNA発現。1群当たりn=4のマウスを用い、平均±SEMとしてデータを与えた；*p<0.05；対応のないスチューデントt検定。図5D:10日間にわたりダイナミックプランターエステシオメーターを用いて得られた、オキサリプラチン（3mg/kg）での処理後の、G2A欠損マウスと比べた野生型（WT）の機械的疼痛閾値。1群当たりn=8のマウスのPWLの平均±SEMを示す; ***p<0.001；二元配置ANOVA。図5E:8日間にわたるオキサリプラチン（3mg/kg）での処理後の、G2A欠損マウスと比べた野生型の機械的疼痛閾値。さらに、9-HODE（10μM）を左後足にi.pl.(足底内)注入し、PWLを0.5時間、1時間及び2時間についてさらに測定した。1群当たりn=7のマウスの9-HODE処理した足のPWLの平均±SEMを示す; ***p<0.001；Bonferroniのpost hoc試験を用いた二元配置ANOVA；##p<0.01、対応のないスチューデントt検定。
【図６】細胞ベースのアッセイにおけるGPR132活性の決定。図6A及びB：HEK-293細胞をGPR132で一過的にトランスフェクトした。9-HODE（1μM）によるGPR132の活性化はカルシウム放出をもたらした。カルシウムの測定値：FURA-2の蛍光強度。図6C及びD：COS-1細胞をGPR132で一過的にトランスフェクトし、イクオリンを発現するベクターで共トランスフェクトした。9-HODEによるGPR132の活性化は、濃度依存的に（10nM〜10μM）カルシウム放出をもたらした。カルシウムの測定値：イクオリンの生物発光。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
化学療法誘発性末梢神経障害（CIPN）とも称される、「化学療法誘発性神経障害性疼痛」との用語は、化学療法剤（細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤としても知られる）により誘発される神経障害性疼痛に関する。CIPNは、癌治療中に広く使用される細胞増殖抑制剤、例えばシスプラチン又はオキサリプラチン等の白金ベースの化合物、ビンクリスチン及びビンブラスチン等のビンカアルカロイド、パクリタキセル及びドセタキセル等のタキサン、並びにボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、の重度の衰弱させる副作用である。CIPNの典型的な症状には、疼痛、刺痛、無感覚、及び温度感受性が含まれる。時には、運動神経／中枢神経系及び／又は自律神経系もまた影響される。典型的には、手及び足の末端における神経終末が最初に対称的、長さ依存的に毒性の影響を受ける。大径感覚神経繊維が最も一般的に影響を受け、小径感覚繊維に対する損傷は極めて稀にしか発生しない。感覚性運動失調、疼痛、及び重度の無感覚等の症状を伴う感覚神経障害は、運動障害（motor involvement）よりも概して一般的である。しかし、運動神経障害及び自律神経障害の症状もまた発症し得る。現在、CIPNを有する患者において、臨床用途に使用可能な、裏付けられた神経保護的利益を有する治療法は存在しない。今日まで、CIPNは典型的には使用される化学療法剤の用量を減らすことにより緩和されているが、それは治療の有効性を弱め得る。CIPNの別の症状及び特徴は、当該技術分野において周知であり、例えば、Stedman又はPschyrembl等の標準的な医学の教科書に記載されている。
【００１６】
好ましくは、化学療法誘発性神経障害性疼痛は、白金含有化学療法剤の投与、より好ましくはオキサリプラチンの投与と関連する。本明細書で使用される「関連する」との用語は、好ましくは、神経障害性疼痛と白金含有化学療法剤の投与との間の時間的及び／又は因果関係を指す。当業者は、疼痛が白金含有化学療法剤の投与と関連すると考えられる場合、何が意味されるのかを理解する。好ましくは、疼痛が誘発される、即ち、直接的にせよ間接的にせよ、前記白金含有化学療法剤の投与により引き起こされる場合、疼痛は白金含有化学療法剤の投与と関連すると考えられるだろう。このような因果関係を指し示すものは、具体的には投与と疼痛との間の密接な時間的関係である。
【００１７】
本明細書で使用される「白金含有化学療法剤」との用語は、白金、好ましくは1種以上の白金の配位錯体を含む、癌を治療するための化学療法剤を指す。このような薬剤はまた、一般的には「プラチン（platin）」又は「白金ベースの抗新生物薬」と称される。白金含有化学療法剤は、当該技術分野において周知である。好ましくは、当該薬剤はシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン（triplatin tetranitrate）、フェナントリプラチン（phenanthriplatin）、ピコプラチン、サトラプラチン、及びこれらの変種、例えばリポプラチン（lipoplatin、リポソーム性シスプラチン）、から成る群から選択される。白金含有化学療法剤の投与及び投与量は、治療される癌の種類及び状態、及び患者の健康状態等の様々な要素に依存する。白金含有化学療法剤は通常、白金含有化学療法剤の使用経験がある有資格医師の監督の下で、投与される。白金含有化学療法剤の好ましい投与経路には、静脈内、髄腔内、及び腹腔内投与が含まれる。急性神経毒性及びCIPNを含め、いくつかの、投与量を限定する可能性のある、白金化合物の副作用が当該技術分野において知られている。
【００１８】
好ましくは、白金含有化学療法剤は、オキサリプラチンである。オキサリプラチンは、平面正方形の白金（II）中心を特徴とする第3世代白金類似体である。シスプラチン及びカルボプラチンとは対照的に、オキサリプラチンは、2つの単座アンミン配位子の代わりに二座リガンドである1,2-ジアミノシクロヘキサンを特徴とし、さらに2座のシュウ酸塩基を特徴とする。オキサリプラチンは、早期の大腸癌と進行した大腸癌の両方に対し活性であることが示されている。大腸癌の治療のために、オキサリプラチンはよくフォリン酸及び5-フルオロウラシルの組み合わせと共に使用される（FOLFOXとして知られる）。
【００１９】
本明細書で使用される「治療」との用語は、疾患またはそれに関連する少なくとも1つの症状を改善または治癒することを指す。好ましくは、前記疾患は、CIPN又はそれに関連する少なくとも1つの症状である。従って、疾患又はそれに関連する少なくとも1つの症状の改善又は治癒がある場合、その治療は有効であるとみなされるだろう。治療は全ての対象において有効であるわけではない可能性があることは理解されるだろう。しかし、本発明によれば、治療は、治療される対象の少なくとも統計的に有意な割合において有効であることが想定される。有効に治療され得る対象の統計的に有意な割合をどのようにして決定するかは当業者に周知である。
【００２０】
対象の割合又は本明細書で言及される任意の他の値が統計的に有意かどうかは、よく知られた種々の統計的評価手段、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントt検定、マンホイットニー検定などを用いて、更に手間をかけることなく当業者により決定されうる。詳細はDowdyおよびWearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に記載されている。好ましい信頼区間は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005または0.0001である。
【００２１】
好ましくは、本発明により想定される確率は、与えられたコホートまたは集団の対象の少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％または少なくとも90％に関して、有効な治療の所見が正確であることを可能にする。
【００２２】
本明細書中で使用される「予防」との用語は、疾患またはその少なくとも1つの症状の発症を回避することを指す。好ましくは、前記疾患はCIPNである。本明細書で用いるCIPNはまた、CIPNを有すると人を見なすのに必要な症状が1つ以上存在し、かつ、末梢神経の損傷がまだ発生していないが、対象においてCIPNの発症のリスクが存在する、症状がない又は極めて弱いCIPN前の状態（pre-CIPN state）を含むことは、当業者に理解されるだろう。本発明による使用のためのGPR132阻害剤の予防的投与は、CIPNを患うリスクが増大している患者、例えば糖尿病患者、遺伝性神経障害を有する患者、又は後天性免疫不全症候群（AIDS）に起因する神経障害性の症状を既に示している患者、において特に有用である。好ましくは、CIPNを予防するために、対象に最初の少なくとも1種の白金含有化学療法剤が投与された後、CIPNの1つ以上の症状が存在する前に、GPR132阻害剤が投与される。
【００２３】
Gタンパク質共役受容体G2A（G2A受容体）としても知られる、GPR132（Gタンパク質共役受容体132）は、細胞膜表面に存在する7回膜貫通型Gタンパク質共役受容体である。GPR132は最初、ストレス誘導性Gタンパク質共役受容体として特定された（Weng等、1998）。GPR132の核酸及びタンパク質配列は、公開データベースで取得され得る。例えばヒト及びマウスGPR132のタンパク質配列は、UniProtKBデータベースにおいてそれぞれアクセッション番号Q9UNW8 (GP132_HUMAN)及びQ9Z282 (GP132_MOUSE)で取得され得る。
【００２４】
「GPR132阻害剤」との用語は、GPR132の活性を減少させ、一部損なわせ、及び／又は完全に阻害することができる任意の物質を指す。GPR132活性とは、GPR132が下流のシグナル伝達分子、例えば、Gタンパク質、プロテインキナーゼ、及びホスホリパーゼを活性化する能力を指すことは理解されるだろう。典型的には、GPR132等のGタンパク質共役受容体は、リガンド又は他のシグナルメディエーターの形態の外部シグナルにより活性化される。これにより受容体において構造変化が生じ、Gタンパク質が活性化され、それによりさらにプロテインキナーゼの活性化、例えばプロテインキナーゼC（PKC）の活性化、などのGタンパク質依存性シグナル伝達が媒介され、それによりさらにPKC媒介のTRPチャネルのリン酸化、及び／又は、小胞体からのカルシウムの放出がもたらされる。従って、GPR132の活性を阻害することはまた、GPR132の下流過程を阻害すること、具体的には、小胞体からのカルシウムの放出を阻害することを意味し得る。GPR132活性の阻害は、GPR132活性を直接的又は間接的に損なわせることにより達成され得る。例えば、GPR132の直接阻害は、細胞膜に局在するGPR132タンパク質へのアンタゴニスト小分子又は抗体の結合により達成され得る。このような直接阻害剤は、GPR132に可逆的又は不可逆的に結合し得る。間接阻害は、GPR132活性化分子の阻害により、例えばGPR132を活性化することが知られている9-HODE等の酸化脂質の阻害により、達成され得る。GPR132阻害剤はまた、アロステリック阻害剤、例えば、活性化因子と異なる受容体の部位に結合するため、アロステリック阻害剤として働く分子、であり得ることは理解されるだろう。GPR132の活性の阻害は、DNA、RNA又はタンパク質レベルで起こり得ることもさらに、理解されるだろう。好ましくは、前記阻害は、DNA、RNA及び／又はタンパク質の発現を減少させることにより達成される。例えば、GPR132阻害剤は、GPR132 mRNAが生じ得ないよう、それぞれDNAのタイトなパッケージングをもたらす又は転写阻害剤である分子であり得る。例えば、特定の化学療法剤の投与後によく観察されるGPR132の転写の上方調節を妨げる分子もまた、GPR132阻害剤として含まれる。GPR132阻害剤はまた、転写後阻害剤であり得、それによりGPR132タンパク質は正しく翻訳、輸送、細胞膜へ挿入されず、それゆえGPR132は適切に機能しないということになる。好ましくは、本発明による使用のための前記GPR132阻害剤は、GPR132の直接阻害剤である。より好ましくは、GPR132の前記阻害剤は、ペプチド又はタンパク質、リボザイム、抗体、小分子、阻害性RNA分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、モルフォリノ、又は脂質、特にリゾホスファチジルコリン（LPC）である。
【００２５】
本明細書に記載されるペプチド又はタンパク質は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基から成る分子に関する。ペプチド結合により互いに共有結合している、数個の、典型的には少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、又は少なくとも60個のアミノ酸から成るペプチドは、一般的にポリペプチドと称される。ペプチド結合により共有結合している20個未満のアミノ酸から成る分子は通常、ペプチドとみなされる。好ましい実施形態では、ペプチド又はタンパク質は、GPR132の直接又は間接阻害剤であるだろう。より好ましくは、ペプチド又はタンパク質は、GPR132に直接結合し、それによりその活性を阻害するだろう。
【００２６】
本明細書に記載されるリボザイムは、RNA及びDNAの切断及び／又はライゲーション並びにペプチド結合の形成を含む、特定の生化学反応を触媒することができるRNA分子に関する。リボザイムを設計及び構築する方法は当該分野において既知であり、それには例えば、デノボ合理的設計、オリゴヌクレオチド合成及びインビトロ転写が含まれる。リボザイムは、プラスミド又はベクター等の組み換えDNAコンストラクトの一部として細胞に安定に統合され得る、又は一過的に導入され得ることもまた、当業者にとって既知である。このようなDNAコンストラクトは、エンハンサー、構成的若しくは誘導性プロモーター又はターミネーター等の追加の調節エレメントを含有し得ることは理解されるだろう。リボザイムはGPR132の直接又は間接阻害剤であるだろう。好ましい実施形態では、リボザイムが、GPR132をコードする遺伝子から転写されるGPR132 mRNAを特異的に標的とし、その後GPR132 mRNAがエンドヌクレアーゼ的に切断される。従って、前記切断されたmRNAから機能的なGPR132タンパク質は生じ得ないため、GPR132活性が阻害される。
【００２７】
本明細書に記載される抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方、並びに抗原又はハプテンに結合することができるそれらの断片、例えばFv、Fab、及びF(ab)2断片を含む。本発明はまた、一本鎖抗体、及び所望の抗原特異性を示す非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列がヒトアクセプター抗体の配列と組み合わされているヒト化ハイブリッド抗体を含む。ドナー配列は通常、少なくともドナーの抗原結合アミノ酸残基を含むだろうが、さらにドナー抗体の他の構造的及び／又は機能的に関連するアミノ酸残基を含み得る。このようなハイブリッドは、当該技術分野において周知のいくつかの方法により調製され得る。抗体は、例えばGPR132自体に直接結合することにより、又はGPR132と間接的に相互作用することにより、例えば9-HODE等のGPR132活性化因子に結合し、それによりGPR132の活性化を阻害することにより、GPR132の活性を阻害するだろう。好ましい実施形態では、抗体は、GPR132に特異的に結合し、それによりGPR132活性を阻害するアンタゴニスト抗体である。好ましくは、抗体は、GPR132の細胞外ドメインに含まれるエピトープに特異的に結合し、それによりGPR132活性を阻害する。より好ましくは、抗体は、ヒトGPR132（UniprotKB アクセッション番号 Q9UNW8）の最初の45アミノ酸に含まれる、又はマウスGPR132（UniprotKB アクセッション番号 Q9Z282）の最初の42アミノ酸に含まれるエピトープに結合し得る。本発明による特異的結合とは、リガンド又は薬剤が、分析される試料中に存在する他のペプチド、ポリペプチド、又は物質に実質的に結合（それらと「交差反応」）しないだろうことを意味する。好ましくは、特異的に結合したペプチド又はポリペプチドは、任意の他の関連するペプチド又はポリペプチドよりも少なくとも3倍高い、より好ましくは少なくとも10倍高い、さらにより好ましくは少なくとも50倍高い親和性で結合するだろう。例えば、ウェスタンブロット上のそのサイズにより、又は試料中の比較的高い存在量により、依然として明確に識別及び測定することができる場合には、非特異的結合は許容され得る。結合剤の結合は、当該分野において既知の任意の方法により測定され得る。好ましくは、前記方法は半定量的又は定量的である。
【００２８】
本明細書に記載される小分子は、低分子量を有する分子に関する。典型的には、小分子は、900ダルトン未満の分子量を有する有機化合物である。小分子には、例えば、小さい二次代謝産物、例えばアルカロイド、脂質、配糖体、テルペン、テトラピロール、フェナジン、オリゴヌクレオチド、及び小ペプチド又はペプチド様分子、が含まれる。小分子は、GPR132の直接又は間接阻害剤であるだろう。好ましい実施形態では、小分子はGPR132に直接結合し、それによりその活性を阻害する。
【００２９】
本明細書に記載される阻害性RNA分子は、配列特異的な方法で遺伝子発現を阻害するRNA分子である。阻害性RNA分子には、例えば、低分子干渉RNA（siRNA）、低分子ヘアピンRNA（small hairpin RNA、shRNA）、及びマイクロRNA（miRNA）が含まれる。阻害性RNA分子は典型的には、RNA干渉（RNAi）として知られる過程を誘導し、相補的な配列を有する標的mRNAの切断及び／又は翻訳阻害をもたらす。阻害性RNA分子は、相補的な標的配列に対し、完全な又は不完全な塩基対合を示し得る。siRNA及びshRNAは典型的には、完全に塩基対合し、単一の特定の標的のみにおいてmRNA切断を誘導する。miRNAは、典型的には、標的に対し不完全な塩基対合を示し、多くの場合、類似の配列を有する多数の様々なmRNAの翻訳を阻害する。阻害性RNA分子はまた、として知られる過程を誘導し得る。阻害性RNA分子を設計及び製造する手段及び方法は当該技術分野において周知である。阻害性RNA分子は、化学的に合成され得る、又は、例えば各組み換えDNAコンストラクトの導入により、細胞内で発現され得る。このようなDNAコンストラクトは、エンハンサー、構成的若しくは誘導性プロモーター又はターミネーター等の追加の調節エレメントを含有し得ることは理解されるだろう。阻害性RNA分子は、GPR132の直接又は間接阻害剤であるだろう。好ましい実施形態では、阻害性RNA分子はGPR132 mRNAに直接干渉する。それにより、GPR132 mRNAの機能的タンパク質への翻訳が妨げられ、GPR132シグナル伝達の阻害が達成される。さらに好ましい実施形態では、阻害性RNA分子はGPR132の活性化因子及び／又はリガンドのmRNAに干渉し、それにより活性化因子及び／又はリガンドによるGPR132の活性化を妨げる。
【００３０】
本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA及び／又はRNAプロセシングに干渉することができる一本鎖DNA及び／又はRNA分子に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のRNA又はDNA配列に相補的な核酸配列を含む。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列特異的な方法で各相補的オリゴヌクレオチド、DNA、又はRNAに結合し、それによりDNA及び／又はRNAプロセシングに干渉するだろう。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNase H媒介の分解、翻訳阻止、スプライシングの調節を介してmRNAプロセシングに干渉し得る、又はそれらはタンパク質の立体障害、例えば、エクソン内スプライシングエンハンサー部位へのセリン−アルギニン−リッチタンパク質の立体障害を介して作用し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計及び合成のための手段及び方法は、当該技術分野において周知であり、例えば合理的設計、ロックド核酸（locked nucleic acid、LNA）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計、及び固相化学合成を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得る、或いは、例えば各組み換えDNAコンストラクトの導入により、細胞内で発現され得る。このようなDNAコンストラクトは、エンハンサー、構成的若しくは誘導性プロモーター又はターミネーター等の追加の調節エレメントを含有し得ることは理解されるだろう。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、又はそれより多いヌクレオチド長を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又は双方の組み合わせを含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、GPR132の直接又は間接阻害剤であるだろう。好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、GPR132の発現及び／又は翻訳に干渉するDNA及び／又はRNA分子である。さらに好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、GPR132の活性化因子及び／又はリガンドの発現及び／又は翻訳に干渉し、それにより活性化因子及び／又はリガンドによるGPR132の活性化を妨げる、DNA及び／又はRNA分子である。
【００３１】
本明細書に記載のモルフォリノは、RNAの塩基対合面（base-pairing surface）の小さい特定の配列、典型的には約25塩基、への他の分子の接近を遮断する分子に関する。モルフォリノは通常、メチレンモルホリン環及びホスホロジアミデート結合の骨格を含む。モルフォリノはまた、一般的に、モルフォリノオリゴマー（MO核酸類似体）及びホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（PMO）として知られる。ホスホロチオエート又はsiRNA等の多数の他のアンチセンス構造の分子とは対照的に、モルフォリノは、その標的RNA分子を分解しない。その代わりに、モルフォリノは立体的に遮断することにより、即ち、RNA内の標的配列に結合し、単純にそうでなければRNAに干渉し得る分子の障害となることにより作用する。モルフォリノは、GPR132の直接又は間接阻害剤であるだろう。好ましい実施形態では、モルフォリノは、GPR132のpre-mRNA及び／又はmRNAに結合する。pre-mRNA及び／又はmRNAに結合することにより、モルフォリノがGPR132のスプライシング及び／又は翻訳に干渉し、それにより機能が弱い又は機能しないGPR132タンパク質が生産され、GPR132タンパク質生産が減少し、又はGPR132タンパク質が全く生産されず、それによりGPR132活性が阻害され得る。
【００３２】
本明細書に記載される脂質は、疎水性又は両親媒性の小分子に関する。脂質には、脂肪酸及びその誘導体、例えばトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、リゾホスファチジルコリン（LPC）等のリゾリン脂質、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質（saccharolipid）、ポリケチド、プレノール脂質、及びステロール脂質、が含まれる。脂質は、GPR132の直接又は間接阻害剤であるだろう。好ましい実施形態では、脂質はGPR132タンパク質に直接相互作用し、それによりその活性を阻害する。さらに好ましい実施形態では、脂質は、9-HODE等のGPR132の活性化因子及び／又はリガンドと相互作用し、それによりGPR132への活性化因子及び／又はリガンドの結合を阻害する、又はそれは9-HODE等の活性化因子とは異なる受容体の部位に結合してアロステリック阻害剤として作用する。
【００３３】
「リゾリン脂質」との用語は、1個又は両方のアシル誘導体が加水分解により取り除かれたリン脂質の任意の誘導体を指す。リゾリン脂質には、リゾホスファチジルコリン、リゾグリセロリン脂質、リゾグリコスフィンゴ脂質、リゾ脂質、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾセファリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリン、及びリゾスフィンゴミエリンが含まれる。好ましくは、リゾリン脂質は、リゾホスファチジルコリン（LPC）である。「リゾホスファチジルコリン（LPC）」との用語は、典型的にはホスファチジルコリンの部分加水分解から生じるリゾリン脂質に関する。加水分解は典型的には、ホスホリパーゼA2（PLA2）により行われ、ここでPLA2はホスファチジルコリンの脂肪酸基の1つを取り除く。in vivoで、LPCは、リゾホスホリパーゼ及びLPCアシルトランスフェラーゼにより早急に代謝され得るため、通常in vivoでは半減期が短い。G2A受容体（GPR132）は特定のリゾホスファチジルコリン種により拮抗され得ることが最近示された（Murakami等、2004）。リゾホスファチジルコリンとの用語にはまた、LPC類似体、例えば、代謝的安定性の増大をもたらす、アルキルリゾリン脂質（ALP）とも称される、LPC内のアシル基がアルキル基と置換されているLPC類似体が含まれることは理解されるだろう。LPC類似体は当該技術分野において既知であり、例えば、エデルフォシン、ミルテフォシン、及びペリフォシンを含む。好ましくは、LPCは、GPR132の活性を阻害する、即ちGPR132のアンタゴニストとして機能する。より好ましくは、前記LPCは、LPC (18:1)、LPC (18:0)、LPC (18:2)、LPC (16:0)又はLPC (20:4)である。
【００３４】
好ましくは、GPR132阻害剤は、化学療法依存的な感覚ニューロンの過剰興奮性を低減する。感覚ニューロンは、触感、視覚、又は音等の感覚情報を送達する神経細胞である。感覚ニューロンは、感覚入力により活性化され、神経系の他の要素に投影（projection）を送り、最終的に脳又は脊髄に感覚情報を伝達する。感覚ニューロンの過剰興奮性とは、感覚ニューロンを活性化させるための閾値が通常よりも低いことを意味する。従って、「正常な」シグナルが、刺激に対する過剰な反応をもたらし得る。感覚ニューロンの興奮性を決定するための手段及び方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、活動電位の生成、シナプス伝達及びイオンチャネル（即ちナトリウム、カルシウム）の開口の測定を含む。
【００３５】
感覚ニューロンの過剰興奮性は、化学療法を受ける癌患者においてよく観察される。本発明によると、化学療法依存的な感覚ニューロンの過剰興奮性は、好ましくは、白金含有化学療法剤、より好ましくはオキサリプラチンが投与された対象において観察される。
【００３６】
好ましくは、GPR132の阻害剤は、化学療法依存的な一過性受容器電位（TRP）チャネルの感作を低減する。TRPチャネルは、主に原形質膜に局在するイオンチャネルの群である。大抵のTRPチャネルは、細胞内のN及びC末端を有する6回膜貫通へリックスから構成される。哺乳類TRPチャネルは、多種多様な刺激により活性化及び調節されており、全身に発現されている。TRPチャネルは、疼痛、熱さ、暖かさ若しくは冷たさ、様々な種類の味、圧力、及び視覚という感覚のような、様々な感覚を媒介する。TRPチャネルは以下の7つのサブファミリーに分けることができる：(1) TRPC (カノニカル（canonical）)、(2) TRPV (バニロイド（vanilloid）)、(3) TRPA (アンキリン（ankyrin）)、(4) TRPM (メラスタチン（melastatin）)、(5) TRPP (ポリシスチン（polycystin）)、(6) TRPML (ムコリピン（mucolipin）)、及び(7) TRPN (NOMPC) (Islam MS（編）、2011年1月、Transient Receptor Potential Channels、Advances in Experimental Medicine and Biology、704、Berlin: Springer、p. 700)。
【００３７】
生理学的条件下でTRPチャネルは、熱やチリ・ペパー由来のカプサイシン（TRPV1）、低ｐH又はワサビ由来のイソチオシアン酸アリル（TRPA1）、低温又はペパーミント由来のメントール（TRPM8）のような外部刺激、並びに浸透圧及び機械刺激（TRPA1、TRPV4、TRPC3及びTRPC6）（Moran等、2011）の知覚に役立つ。病態生理学的条件下では、TRPチャネルは感作され、そのことはその活性化閾値が低下することを意味する。結果として、疼痛性の（痛覚過敏症)又は通常は非疼痛性の刺激(異痛症）に対する感度の増大が生じ得る(Julius、2013)。TRPチャネルの感作は、化学療法剤の投与後に生じ得る。従って、化学療法依存的なTRPチャネルの感作とは、少なくとも1種の化学療法剤、好ましくは少なくとも1種の白金含有化学療法剤、より好ましくはオキサリプラチンの投与後に少なくとも1種のTRPチャネルの感作が生じていることを意味する。化学療法依存的な感作が、TRPV1、TRPA1、TRPM8、TRPV4、TRPC3及びTRPC6から成る群から選択されるTRPチャネルに生じていることが、さらに好ましい。
【００３８】
TRPチャネルの化学療法依存的な感作は、プロスタグランジンE2（PGE2）、他のエイコサノイド、又は酸化リノール酸代謝産物等の脂質メディエーターにより媒介され得る。これらの脂質メディエーターは感覚ニューロンにおいてGタンパク質共役受容体（GPCR）に結合し、様々なGタンパク質依存シグナル伝達経路の活性化を引き起こし、プロテインキナーゼA（PKA）及びPKCε媒介のTRPチャネルのリン酸化をもたらし（Wang等、2008; Wang等、2015）、それらの活性化を引き起こす（Moriyama等、2005; Sisignano等、2014; Watanabe等、2003; Basora等、2003、Wen等、2012)。
【００３９】
本発明によると、化学療法依存的なTRPチャネルの感作は、好ましくは酸化脂質により媒介される。例えば、TRPV1の化学療法依存的な感作は、好ましくは9-HODEにより媒介され得、TRPA1の化学療法依存的な感作は、プロスタグランジンA2（PGA2）、15-デオキシ-デルタ-12,14-プロスタグランジンJ2（15-d-PGJ2）、5,6-エポキシエイコサトリエン酸（5,6-EET）、又は4-ヒドロキシノネナール（4-HNE）により媒介され得、TRPV4の化学療法依存的な感作は8,9-エポキシエイコサトリエン酸（8,9-EET）により媒介され得、TRPC6の化学療法依存的な感作は20-ヒドロキシエイコサテトラエン酸（20-HETE）により媒介され得る。より好ましくは、前記酸化脂質は、ヒドロキシオクタデカジエン酸（HODE）、ジヒドロキシオクタデセン酸（DiHOME）、及びエポキシオクタデセン酸（EpOME）から成る群から選択される。さらにより好ましくは、前記酸化脂質は、9-HODE、13-HODE、9,10-DiHOME、12,13-DiHOME、9,10-EpOME及び12,13-EpOMEから成る群から選択される。
【００４０】
本明細書で使用される「対象」との用語は、動物、好ましくはマウス、ラット、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、サル又はウシ等の哺乳類、より好ましくはヒトに関する。「対象」及び「患者」との用語は本明細書で同義に用いられる。
【００４１】
本明細書で用いられる対象とは、少なくとも1種の白金含有化学療法剤が投与されており、CIPNを患っていること又はCIPNを発症するリスクが増大していることが疑われ、従ってCIPNの予防及び／又は治療のための治療法を必要とする、対象を指す。好ましくは、対象は、CIPNを示唆する症状又は臨床兆候又はパラメータを示す。
【００４２】
本発明に従う対象は、過去に、即ちGPR132阻害剤の投与前に、少なくとも1種の白金含有化学療法剤、好ましくはオキサリプラチンが投与されているだろう。好ましくは、対象は、GPR132阻害剤の投与前1日、2日、4日、1週間、2週間、3週間、1か月、2か月、3か月、4か月、5か月又は6カ月以内に、前記阻害剤が投与されている。
【００４３】
好ましくは、対象は、少なくとも1種の白金含有化学療法剤、好ましくはオキサリプラチンが投与される必要のある患者である。例えば、特に当該薬剤がオキサリプラチンである場合、対象は大腸癌を患っていることが想定される。大腸癌を患う患者は、オキサリプラチン等の少なくとも1種の白金含有化学療法剤が投与される前、他の処置を受けていても良く、大腸癌に関連する症状、臨床兆候又は他のパラメータを示し得ることは理解される。大腸癌の典型的な症状には、排便習慣の変化、便秘、下痢、直腸出血又は血便、腹部膨満、痙攣（cramp）又は不快感、通常よりも薄い便、原因不明の体重減少、吐き気又は嘔吐、貧血、黄疸、及び衰弱又は倦怠感が含まれる。しかし、当該用語はまた、少なくとも1種の白金含有化学療法剤が投与されている一見健康な対象、即ち前述の症状、臨床兆候又はパラメータのどれも示さない対象に関する。特に、大腸癌の初期段階で診断された患者は、大抵健康に見え、前述の症状のどれも示さない。初期段階では、大腸癌は大抵、日常の健康管理、又は結腸鏡検査を用いた定期的なスクリーニングの際に検出される。好ましくは、前記一見健康な対象は、CIPNを発症するリスクが増大している対象、例えば、糖尿病患者又は遺伝性神経障害を有する患者である。
【００４４】
前記対象への治療剤の投与は、非経口（parental）及び／又は経口投与を含むいくつかの方法で行われ得る。治療剤の投与及び投与量は、対象の健康状態及び治療される疾患等の様々な要素に依存することは、当業者に知られている。好ましくは、前記白金含有化学療法剤は静脈内、髄腔内、及び腹腔内投与により投与され、一方、本発明による使用のための前記GPR132阻害剤は、好ましくは経口及び／又は非経口投与により前記対象に投与される。好ましくは、前記対象に投与される前記白金含有化学療法剤はオキサリプラチンである。前記対象に投与される前記GPR132阻害剤は、好ましくは、ペプチド若しくはタンパク質、リボザイム、抗体、小分子、阻害性RNA分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、モルフォリノ又は脂質、特にリゾホスファチジルコリン（LPC）である。
【００４５】
本発明による使用のためのGPR132阻害剤の治療有効性及び毒性は、細胞培養物又は実験動物において標準的な薬学的手順、例えばED50（集団の50％において治療上有効な量）、及びLD50（集団の50％に対し致死的な量）、により決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療指数であり、それはLD50/ED50なる比として表され得る。投与量レジメンは、主治医により及び臨床的要素により決定されるだろう。医学分野において周知であるように、任意の1人の患者のための投与量は、患者のサイズ、年齢、投与される医薬の特定の処方、性別、投与の時間及び経路、身体全体の健康、及び同時に投与される他の薬剤を含む、多数の要素に依存する。進行は定期的な評価により監視され得る。推奨投与量は、考慮される被投与者に応じて用量の調整を予想するために、処方者又は使用者の使用説明書に示されるだろう。
【００４６】
本発明はまた、GPR132阻害剤を含む医薬組成物であって、前記阻害剤が、ペプチド若しくはタンパク質、リボザイム、抗体、小分子、阻害性RNA分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、モルフォリノ又は脂質である、医薬組成物を包含する。
【００４７】
本明細書で使用される「医薬組成物」との用語は、GPR132阻害剤を含む混合物であって、前記阻害剤が、ペプチド若しくはタンパク質、リボザイム、抗体、小分子、阻害性RNA分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、モルフォリノ又は脂質、特にリゾホスファチジルコリン（LPC）である、混合物を指す。さらに、当該組成物は、更なる治療成分又は補助成分、及び／又は医薬上許容される担体、及び／又は希釈剤等の更なる構成要素をも含み得る。本発明の医薬組成物は、好ましくは、医薬として使用されるためのものである。前記医薬は、好ましくは、本明細書の他の箇所で詳細に記載されている化学療法誘発性神経障害性疼痛を治療及び／又は予防するために、適用される。
【００４８】
好ましくは、本発明の医薬組成物のそのような更なる成分は、安定化剤、湿潤剤、医薬担体、追加の薬学的活性剤、放出制御剤等であり得る。より好ましくは、本発明の医薬組成物は、医薬上許容される担体を含む。
【００４９】
好ましい希釈剤は、水、アルコール、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水等の緩衝液、シロップ、オイル、水、エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤等を包含する。本発明による医薬上許容される希釈剤は、組み合わせたものの生物学的活性に影響しないよう選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。さらに、医薬組成物又は製剤はまた、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤等を含み得る。
【００５０】
本発明による医薬上許容される担体は、製剤のその他の成分に適合性であり、その被投与者に有害でないという意味で許容され得るものでなければならない。使用される医薬担体には、固体、ゲル、又は液体が含まれ得る。固体担体の典型例としては、乳糖、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム（acacia）、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などが挙げられる。同様に、担体又は希釈剤は、当該技術分野でよく知られた時間遅延（time delay）物質、例えばグリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートを、単独で、またはワックスと共に含み得る。前記の適切な担体は前述のもの、および当技術分野でよく知られた他のものを含む。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaを参照されたい。
【００５１】
医薬組成物は、化学療法誘発性神経障害性疼痛の治療及び／又は予防における使用のために適応されるだろう。典型的には、所望の投与様式は、全身投与であるだろう。従って、本発明の組成物は好ましくは、全身適用のために製剤化される。好ましくは、例えば錠剤、溶液若しくは飲用アンプルの形態での経口適用、又は注射による適用が想定される。しかし、作用の性質及び様式に応じて、組成物はさらに、経皮、筋肉内、皮下、経口、静脈内、又は局所投与を含む他の経路により投与され得る。組成物は、ボーラス投与のために製剤化され得る、又は連続投与のために製造され得る。
【００５２】
本発明の組成物は、好ましくは、上記のGPR132阻害剤を治療上有効な量含むだろう。当該化合物の治療有効性及び毒性は、前述のように、細胞培養物又は実験動物において標準的な薬学的手順、例えばED50（集団の50％において治療上有効な量）、及びLD50（集団の50％に対し致死的な量）、により決定され得る。
【００５３】
医薬として製剤化するために、本発明の組成物は、医薬分野において周知の方法で調製され得る。例えば、医薬を製造するために、治療有効成分は通常混合され、好ましくは担体又は希釈剤と配合されるだろう。得られた製剤は投与様式に適応されるはずである。本明細書に記載の医薬を製剤化するための手順は、必要に応じて成分を混合すること、顆粒化すること、圧縮すること、又は溶解させて所望の組成物を形成することを含み得る。医薬上許容される担体または希釈剤の形態および性質は、それと配合される有効成分の量、投与経路および他のよく知られた変数によって決まると理解されるだろう。推奨投与量は、考慮される被投与者に応じて用量の調整を予想するために、処方者又は使用者の使用説明書に示されるだろう。最後に、医薬としての本発明による組成物の製剤化は、医薬の品質、薬学的安全性及び有効性を保証するために、GMP標準化条件等の下で行われることは理解されるべきである。
【００５４】
前記医薬は、好ましくは、本明細書の他の箇所で詳細に記載されている化学療法誘発性神経障害性疼痛を治療及び／又は予防するために、適用される。
【００５５】
上述の定義及び本明細書中の説明は、以下の本発明の方法に準用する。
【００５６】
さらに、以下の工程を含むGPR132阻害剤を特定するための方法、好ましくはインビトロの方法が、本発明により包含される：
a) 酸化脂質の存在下で培養された、GPR132を発現する細胞を、GPR132阻害剤であると推測される化合物と接触させる工程、
b) 前記接触後、GPR132活性を決定する工程、及び
c) 決定されたGPR132活性を、対照細胞において決定されたGPR132活性と比較し、それによりGPR132阻害剤を特定する工程。
【００５７】
好ましい実施形態では、上述の方法は、化学療法誘発性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療のための医薬を特定するために使用される。
【００５８】
従って、本発明はさらに、以下の工程を含む、化学療法誘発性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療のための医薬を特定するための方法、好ましくはインビトロの方法に関する：
a) 酸化脂質の存在下で培養された、GPR132を発現する細胞を、GPR132阻害剤であると推測される化合物と接触させる工程、
b) 前記接触後、GPR132活性を決定する工程、及び
c) 決定されたGPR132活性を、対照細胞において決定されたGPR132活性と比較し、それにより化学療法誘発性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療のための医薬を特定する工程。
【００５９】
さらに、本発明は、化学療法誘発性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療のための医薬を特定するためのGPR132ポリペプチドの使用に関する。好ましくは、前記使用はインビトロの使用である。
【００６０】
好ましくは、化合物はGPR132阻害剤とみなされ、従って化学療法誘発性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療のための医薬とみなされ、工程b)におけるGPR132活性は対照細胞において決定されるGPR132活性よりも低い。
【００６１】
GPR132を発現する細胞は、天然にGPR132を発現する細胞、又は特定のレベルまでGPR132を発現するよう改変された、即ち適切な発現コンストラクトの導入により改変された細胞であり得ることは理解されるべきである。このような発現コンストラクトは、例えば、GPR132を恒常的及び／又は誘導可能な方法で発現することができる、一過的に又は安定的に導入された組み換えDNAコンストラクトであり得る。好ましくは、前記GPR132を発現する細胞は、哺乳類細胞、より好ましくはマウス、サル又はヒト細胞である。好ましくは、前記細胞は不死細胞である。好ましくは、前記細胞はCOS-1又はHEK293細胞等のサル又はヒトの腎組織に由来する。好ましくは、前記細胞は安定的にGPR132を発現している。さらにより好ましくは、前記細胞はヒトGPR132 (NCBI Gene ID: 29933、Ensembl: ENSG00000183484 HPRD:06936) を安定的に発現するHEK293細胞である。
【００６２】
好ましくは、前記組み換えDNAコンストラクトは、GPR132をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドについての発現カセットを含むだろう。好ましい一実施形態では、組み換えDNAコンストラクトに存在する前記GPR132をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドは、哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。組み換えDNAコンストラクトの構築のための手段及び方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、制限酵素の使用、又はGatewayクローニングを含む。組み換えDNAコンストラクトを生成するための手順はまた、標準的な教科書、例えばSambrook等 (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley及びSons, N.Y. (1989及び毎年の改訂版)に見出され得る。本明細書に記載される組み換えDNAコンストラクトは、エンハンサー、構成的若しくは誘導性プロモーター又はターミネーター等の追加の調節エレメントを含有し得ることは理解されるだろう。好ましい実施形態では、前記組み換えDNAコンストラクトは、ベクターpcDNA3.1+ (Invitrogen)に基づく。好ましくは、ヒトGPR132のオープンリーディングフレームはヒトの肺のcDNAからPCRにより増幅される。さらにより好ましくは、ヒトGPR132は、制限部位EcoRI(5')及びXhoI(3')を用いてpcDNA3.1+ (Invitrogen)にクローニングされる。前記組み換えDNAコンストラクト中に含まれるGPR132ポリヌクレオチドは、野生型のポリヌクレオチド（Gene Bank登録番号: NM_013345）であり得る、又は1個以上の変異を含み得ることは理解されるだろう。好ましくは、前記1個以上の変異はサイレント変異、即ち翻訳された時にポリヌクレオチド配列に変化をもたらさないポリヌクレオチド配列における変異、である。nt138においてCからAへの1個のサイレント変異を有するGPR132ポリヌクレオチドを含む各DNAコンストラクトはまた、cDNA.org（カタログ番号 #GPR1320000）により市販されている。
【００６３】
前記組み換えDNAコンストラクトはまた、GPR132のバリアントをコードし得ることは理解されるだろう。このようなバリアントは、典型的には、少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加により、特定のアミノ酸配列、例えばUniProtKB アクセッション番号Q9UNW8によるヒトGPR132と異なる。それにも関わらず、このようなGPR132のバリアントは依然として生物学的活性を発揮すること、具体的には特定のリガンドに結合し、Gタンパク質を活性化する能力を保持することができるだろう。
【００６４】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」との用語は、デオキシリボ核酸又はリボ核酸、例えば、DNAポリヌクレオチドの一本鎖又は二本鎖DNAポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの長さは、塩基対（「bp」）又はヌクレオチド（「nt」）の数を特定することにより示される。さらに、ポリヌクレオチドはその各々のヌクレオチド配列により定義されるため、ヌクレオチド／ポリヌクレオチド及びヌクレオチド配列／ポリヌクレオチド配列との用語は同義に用いられ、従って、ある核酸配列への言及はまた、その核酸配列と同一の配列を有する核酸ストレッチを含む又はそれから成る核酸を定義することを意味する。好ましくは、本発明により使用されるポリヌクレオチドはGPR132、より好ましくはヒトGPR132（NCBI Gene ID: 29933、Ensembl: ENSG00000183484 HPRD:06936）をコードするだろう。
【００６５】
前記GPR132を発現する細胞は、少なくとも1種（即ち1以上）の酸化脂質の存在下で培養されるだろう。従って、細胞が培養される培地は少なくとも1種の酸化脂質を含むだろう。好ましくは、前記酸化脂質は、ヒドロキシオクタデカジエン酸（HODE）、ジヒドロキシオクタデセン酸（DiHOME）、及びエポキシオクタデセン酸（EpOME）から成る群から選択される。より好ましくは、前記酸化脂質は、9-HODE、13-HODE、9,10-DiHOME、12,13-DiHOME、9,10-EpOME及び12,13-EpOMEから成る群から選択される。最も好ましくは、前記脂質は9-HODEである。
【００６６】
好ましくは、細胞が培養される培地中の前記少なくとも1種の酸化脂質の濃度は、少なくとも100nMである。より好ましくは、当該濃度は100nM〜10μMの範囲である。さらにより好ましくは、細胞が培養される培地中の前記少なくとも1種の酸化脂質の濃度は、約5μM〜10μM、2μM〜5μM、100nM〜2μM、500nM〜2mM、500nM〜1μMの範囲である。最も好ましくは、当該濃度は約1μMである。
【００６７】
本明細書に記載の約は、±20％、±10％、±5%、±4%、±3%、±2%又は±1%の範囲内の任意の変動を含む、本明細書に記載の任意の特定の値、例えば培地中の酸化脂質の濃度を指す。
【００６８】
GPR132阻害剤であると推測される化合物は、GPR132の活性を部分的又は完全に損なわせることができると推測される任意の化合物であり得る。GPR132活性の阻害は、本明細書の他の箇所により詳細に記載のように、GPR132活性を直接的または間接的に損なわせることにより達成され得る。好ましくは、GPR132阻害剤であると推測される前記化合物は、ペプチド若しくはタンパク質、リボザイム、抗体、小分子、阻害性RNA分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、モルフォリノ、脂質、特にリゾホスファチジルコリン（LPC）である。
【００６９】
GPR132を発現する細胞を、GPR132阻害剤であると推測される化合物と接触させることは、化合物がGPR132の活性を部分的に又は完全に損なわせることができる可能性があるように行われる。例えば、GPR132阻害剤であると推測される化合物は、GPR132を発現する細胞の上清に適用され得る、或いは、GPR132を発現する細胞内で直接誘導又は発現される。
【００７０】
GPR132活性を決定することは、好ましくはGPR132活性を示すシグナルの測定を指す。上述のように、GPR132は、Gタンパク質と共役する受容体である。例えば9-HODEによりGPR132が活性化すると、活性化されたGタンパク質（GTPに結合している）が更なるシグナル伝達事象を誘導し、それによりPLC及び／又はPLK等のプロテインキナーゼの活性化及びそれに続く小胞体からのカルシウム放出がもたらされる。従って、GPR132活性を示すシグナルは、好ましくはカルシウム放出である。このため、GPR132の活性は、好ましくはGPR132ポリペプチドによりもたらされるカルシウム放出を評価することにより決定される。GPR132を含むGタンパク質共役受容体の活性を決定するための手段及び方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、上にも記載のようにGタンパク質共役受容体における構造変化及び／又はそれに続く下流シグナル伝達分子の活性化を測定することを含む。
【００７１】
好ましくは、GPR132活性は、カルシウム放出（即ちGPR132ポリペプチドによりもたらされる放出）を測定することにより決定される。前記カルシウム放出は、好ましくは、蛍光カルシウムイメージングにより測定される。より好ましくは、前記GPR132活性は、遊離の細胞内カルシウムに結合するレシオメトリック蛍光色素であるFura-2を用いることにより、及び／又はヒドロ虫網のオワンクラゲ（Aequorea victoria）から単離されたカルシウム活性化発光タンパク質であるイクオリン（aequorin）を用いることにより決定される。Fura-2は膜透過性の色素であり、Fura-2を用いてカルシウムを測定する手順は当該技術分野においてよく説明されている。典型的には、Fura-2の励起レシオメトリックイメージングは、340/26及び380/10励起フィルター、455nmダイクロイックミラー（約330nmまで優れた反射率を有する）、及び535/40エミッションフィルターを用いることにより行われる。イクオリンは、それ自体典型的には青色光を発生する生物発光タンパク質であり、放出された光は、例えば照度計を用いて容易に検出され得る。イクオリンは、緑色蛍光タンパク質（GFP）と共に使用され、共鳴エネルギー転移により緑色光を生じさせ得る。イクオリンを用いてGPR132活性を決定するために、イクオリンは好ましくは組み換えDNAコンストラクトを用いて細胞内で発現させられる。組み換えDNAコンストラクトを生成するための手段及び方法は当該技術分野において周知であり、さらに本明細書の他の箇所に記載されている。より好ましくは、イクオリンはGPR132を安定的に又は一過的に発現する細胞において共発現させられる。
【００７２】
本明細書で用いられる「比較すること」との用語は、GPR132阻害剤であると推測される化合物と接触させられた細胞におけるGPR132活性を、GPR132阻害剤であると推測される化合物と接触させられてない対照細胞と比較することを指す。本明細書で用いられる比較することとは、通常対応するパラメータ又は値を比較することを指し、例えば、絶対量は参照の絶対量と比較され、一方、濃度は参照の濃度と比較される、或いは、細胞においてGPR132の活性化から得られた強度シグナルは対照細胞から得られた同種の強度シグナルと比較されることは理解されるだろう。このような強度シグナルは、蛍光又は生物発光分子により放出される光、例えば本明細書の他の箇所に記載のFura-2及び／又はイクオリンにより放出される蛍光、の量であり得る。比較は手作業で又はコンピュータを用いて行われ得る。従って、比較は計算装置により行われ得る。例えば、細胞及び対照細胞各々においてGPR132の活性化から得られた強度シグナルは、例えば互いに比較され得、比較のためのアルゴリズムを実行するコンピュータプログラムにより前記比較は自動で行われ得る。前記評価を行うコンピュータプログラムは、適切な出力形式で所望の評価を与えるだろう。コンピュータを用いて比較するために、細胞及び対照細胞から得られた強度シグナルの値、又は2つの値の比の計算値はそれぞれコンピュータプログラムによりデータベースに保存される。コンピュータプログラムはさらに比較の結果を評価し得る、即ち適切な出力形式で所望の評定を自動で与え得る。GPR132の阻害剤であると推測される化合物が投与された細胞において、前記化合物が投与されていない対照細胞と比較して低いGPR132活性を示すシグナルをもたらす前記化合物は、GPR132の阻害剤と考えられる。好ましくは、GPR132阻害剤が投与された細胞におけるシグナルは、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらにより好ましくは少なくとも30％、最も好ましくは少なくとも40％減少する。
【００７３】
「対照細胞」との用語は、GPR132活性を示す細胞、好ましくは哺乳類、より好ましくはマウス又はヒトの細胞を指す。好ましくは、対照細胞は、GPR132阻害剤であると推測される化合物と接触させられていない、酸化脂質の存在下で培養された、GPR132を発現する細胞である。好ましくは、対照細胞並びにGPR132阻害剤であると推測される化合物と接触させられる細胞は、同じ細胞型に属する。
【００７４】
より一般的には、本発明はまた、対象における化学療法誘発性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療のための医薬の製造のためのGPR132阻害剤の使用であって、前記対象には少なくとも1種の白金含有化学療法剤が投与されている、使用を企図する。
【００７５】
本発明の他の一般的態様は、GPR132阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における化学療法誘発性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療のための方法であって、前記対象には少なくとも1種の白金含有化学療法剤が投与されている、方法に関する。好ましくは、前記阻害剤は医薬上有効な量で対象に投与される。
【００７６】
有利なことに、本発明の基礎をなす研究と一致して、Gタンパク質共役受容体G2A（G2A受容体）とも称されるGタンパク質共役受容体132（GPR132）を阻害すると、白金含有の化学療法剤、特にオキサリプラチンにより誘発される化学療法誘発性末梢神経障害性疼痛（CIPN）が著しく低減することが見出された。さらに、GPR132の脂質リガンドである9-HODE(9-ヒドロキシ-10E,12Z-オクタデカジエン酸)は、オキサリプラチン処理されたマウスの坐骨神経及び後根神経節において濃度が増大していることが見出された。この脂質は、GPR132及びPKCの活性化を介して感覚ニューロンにおけるイオンチャネルTPRV1を感作する。GPR132受容体が欠損しているマウスは、オキサリプラチン処理後温熱性（thermal）及び／又は機械的異痛症の減少を示す。GPR132阻害剤は、TRPV1感作及び感覚ニューロンの過剰興奮性を低減させるために、従って患者においてオキサリプラチン誘発性神経障害性疼痛を低減させるために使用され得る。
【００７７】
上述の用語の説明及び定義は、本明細書全体に適用する。さらに、以下では、本発明による組成物の典型的な実施形態が挙げられる。
【００７８】
使用のためのGPR132阻害剤の好ましい実施形態では、少なくとも1種の白金含有化学療法剤はオキサリプラチンである。
【００７９】
使用のためのGPR132阻害剤のさらに好ましい実施形態では、阻害剤は化学療法依存的な感覚ニューロンの過剰興奮性を低減する。
【００８０】
使用のためのGPR132阻害剤のさらに好ましい実施形態では、阻害剤は化学療法依存的な一過性受容器電位（TRP）チャネルの感作を低減する。
【００８１】
使用のためのGPR132阻害剤のさらに好ましい実施形態では、一過性受容器電位（TRP）チャネルは、TRPV1、TRPA1、TRPM8、TRPV4、TRPC3及びTRPC6から成る群から選択される。
【００８２】
使用のためのGPR132阻害剤のさらに好ましい実施形態では、化学療法依存的な一過性受容器電位（TRP）チャネルの感作は酸化脂質により媒介される。
【００８３】
使用のためのGPR132阻害剤のさらに好ましい実施形態では、酸化脂質は、ヒドロキシオクタデカジエン酸（HODE）、ジヒドロキシオクタデセン酸（DiHOME）、及びエポキシオクタデセン酸（EpOME）から成る群から選択される。
【００８４】
使用のためのGPR132阻害剤のさらに好ましい実施形態では、酸化脂質は、9-HODE、13-HODE、9,10-DiHOME、12,13-DiHOME、9,10-EpOME及び12,13-EpOMEから成る群から選択される。
【００８５】
使用のためのGPR132阻害剤のさらに好ましい実施形態では、対象は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００８６】
使用のためのGPR132阻害剤のさらに好ましい実施形態では、阻害剤は、経口及び／又は非経口（parental）投与により前記対象に投与される。
【００８７】
使用のためのGPR132阻害剤のさらに好ましい実施形態では、阻害剤は、ペプチド若しくはタンパク質、リボザイム、抗体、小分子、阻害性RNA分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、モルフォリノ又は脂質、特にリゾホスファチジルコリン（LPC）である。
【００８８】
本発明はまた、GPR132阻害剤を含む医薬組成物であって、前記阻害剤は、ペプチド若しくはタンパク質、リボザイム、抗体、小分子、阻害性RNA分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、モルフォリノ又は脂質、特にリゾホスファチジルコリン（LPC）である、医薬組成物を提供することは理解されるだろう。
【００８９】
本発明の医薬組成物の好ましい実施形態では、医薬組成物はさらに医薬上許容される担体を含む。
【００９０】
さらに、以下の工程を含む、GPR132阻害剤を特定するための方法もまた本発明により包含される：
a) 酸化脂質の存在下で培養された、GPR132を発現する細胞を、GPR132阻害剤であると推測される化合物と接触させる工程、
b) 前記接触後、GPR132活性を決定する工程、及び
c) 決定されたGPR132活性を、対照細胞において決定されたGPR132活性と比較し、それによりGPR132阻害剤を特定する工程。
【００９１】
当該方法の好ましい実施形態では、対照細胞は、GPR132阻害剤であると推測される化合物と接触させられていない、酸化脂質の存在下で培養された、GPR132を発現する細胞である。
【００９２】
本明細書において引用されるすべての文献は、それらの全体の開示内容及び本明細書において具体的に言及される開示内容について、参照により本明細書に組み込まれる。文献の完全な引用は本明細書の他の箇所に見出されるだろう。
【実施例】
【００９３】
本発明は、以下の実施例により単なる例示がなされる。前記実施例は、何であっても、本発明の範囲を限定するように解釈されてはならない。
【００９４】
＜実施例1：LC-MS/MSによる組織試料由来の脂質の決定＞
L4〜L6の脊髄、両方の坐骨神経及び20〜30個の後根神経節（DRG）を成体マウスから調製した。
【００９５】
脂質の抽出及び標準
2500ng/mlの分析物9-HODE、13-HODE、9,10-EpOME、12,13-EpOME、9,10-DiHOME、12,13-DiHOME、5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET及び14,15-EET、並びにそれらの内部標準（9-HODE-d4、13-HODE-d4、9,10-及び12,13-Ep0ME-d4、9,10-及び12, 13-DiHOME-d4、5,6-及び14,15-EET-d11、8,9-及び11,12-EET-d4）を有するストック溶液をメタノール中に調製した。分析物について0.25〜2500 ng/mlの濃度範囲でさらに希釈することにより、作業用標準（working standard）を得た。
【００９６】
液液抽出を用いて試料の前処理を行った。従って、ホモジネートした組織を600 〜Iの酢酸エチルで2回抽出した。有機相を合わせ、それを穏やかな窒素気流下45℃の温度で除去した。残留物を50 〜Iのメタノール／水／ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）（50:50:10〜3、v/v/v）で戻した後、10,000gで2分間遠心分離し、ガラス製の小瓶に移して分析を待った。
【００９７】
脂質測定のための器具類
LC-MS/MS系はネガティブなエレクトロスプレーイオン化モードで作動するTurbo-Vソースを備えるQTrap 5500 (Sciex、Darmstadt、Germany)、Agilent 1200バイナリHPLCポンプ及びデガッサ（Agilent、Waldbronn、Germany）、及びHTC Palオートサンプラー(CTC analytics、Zwingen、Switzerland)から構成した。質量分析計のための高純度の窒素は、NGM 22-LC-MS窒素発生装置（erne Instruments、Eschborn、Germany）により生産された。
【００９８】
酸化脂質のクロマトグラフ分離のために、Gemini NX C18カラム及びプレカラムを使用した（内径150×2mm、粒径5μm、孔径110A; Phenomenex、Aschaffenburg、Germany）。総稼働時間17.5分で0.5ml/分の流速で線形勾配を用いた。移動相Aは水：アンモニア（100:0.05、v/v）から成り、移動相Bはアセトニトリル：アンモニア（100:0.05、v/v）から成る。勾配を12分以内に85％Aから10％に変化させた。この状態を1分間保った。その後、移動相を0.5分以内に85％Aに戻し、それを4分間維持し、カラムを再平衡化させた。
【００９９】
20μlの抽出試料をLC-MSIMS系に注入した。定量化は、内部標準法を用いてMultiQuant 3.0 (Sciex、Darmstadt、Germany)で行った（同位体希釈質量分析）。分析物のピーク面積と内部標準の面積の比（y軸）を濃度（x軸）に対してプロットし、1/濃度２の重み付けをした最小二乗回帰により較正曲線を計算した。
【０１００】
＜実施例2：カルシウム測定、ニューロンのカルシトニン遺伝子関連ペプチド放出及び電気生理学的記録＞
DRG初代培養物
DRG初代培養物を以前記載されたように調製した（Brenneis等、2011 b）。簡潔に言えば、20〜30個のマウス後根神経節（DRG）を脊髄分節から切断し、CaCl2及びMgCl2を有する氷冷したハンクス平衡塩溶液に直接移した(lnvitrogen、Carlsbad、CA、USA)。その後、37℃で75分間、500U/mlコラゲナーゼ（Sigma、Deisenhofen、Germany）及び2.5U/mlディスパーゼII(Roche、Mannheim、Germany)を含有するNeurobasal培地（lnvitrogen、Carlsbad、CA、USA）でDRGをインキュベートした。コラゲナーゼ／ディスパーゼ溶液を取り除いた後、10%FCS、ペニシリン／ストレプトマイシン／ゲンタマイシン（lnvitrogen、Carlsbad、CA、USA）を含有する培地で細胞を3回洗浄し、37℃で10分間0.05%トリプシン中でインキュベートした。2回の洗浄工程の後、細胞を1mlピペットで機械的に解離させポリ-L-リジン(Sigma)コーティングされたカバースリップ上にプレーティングした。2時間37℃でのインキュベーションの後、グルタミン（2mm）、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、B-27及びゲンタマイシン（50μg/ml）を含有するNeurobasal培地を細胞に添加し、一晩インキュベートした。当該ニューロンは、翌日カルシウムイメージングのために用いた。
【０１０１】
カルシウムイメージング
DFC360 FX (CCD)カメラを備えるLeica DMI 4000 b倒立顕微鏡、Fura-2フィルター、及びN-Plan 10x/0.25 Ph1対物レンズ（すべてLeica製）から成るLeicaカルシウムイメージングセットアップを用いて、カルシウムイメージング実験を行った。2秒毎に画像を撮り、それをLAS AF-ソフトウェア(Leica)で処理した。各実験について、調製の24時間後に（DRG初代培養物を参照）細胞数が多い領域を選択し、40〜110細胞を同時に観察した。細胞に5μMのfura-2-AM-エステル(Biotium)を与え、37℃で45〜60分間インキュベートし、リンガー液（145mM NaCl、1.25mM CaCl2、1mM MgCl2、5mM KCl、10mM D-グルコース及び10mM HEPES、pH 7.3に調整される）で洗浄した。ベースラインの測定は、室温で1〜2ml/分の流速でリンガー液を用いて行った。リンガー液中に溶解させた、200nMのカプサイシン（Sigma）溶液をTRPV1の活性化のために、50μMのイソチオシアン酸アリル(AITC、Fluka Analytic)をTRPA1活性化のために、100μM L-メントール（Sigma）をTRPM8のために用いた。TRPチャネルを感作するために、様々な濃度（50nM〜1000ｎM）の(±) 9-HODE (Cayman)又は(±) 13-HODE (Cayman)で2分間細胞をインキュベートした後、2回目の刺激を行った。対照の刺激については対応する量のDMSO（Sigma）をリンガー液中に混合し、同じ流速で加えた。10μMのPKA阻害剤H89（Tocris）又は1μMのPKC阻害剤GF1 09203X（Tocris）を45分間fura-2と共にインキュベートした。陽性対照として、PKA活性化については40 iJM 8-ブロモ-cAMP (Cayman)を、PKC活性化については500nMのブラジキニン（Cayman）を用いた。各測定の終了時には、ニューロンを特定するために50mM KClを加えた。
【０１０２】
ニューロンのカルシトニン遺伝子関連ペプチドの放出
ニューロンのカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）放出の決定のために、後根神経節（DRG）ニューロンを以前記載されたように（Brenneis等、2011 a）マウスから単離した。簡潔に言えば、1μMの(±) 9-HODE (Cayman)単独で又は400nMカプサイシン（Sigma）と組み合わせてDRG培養物を10分間刺激した。カプサイシンを単独で加えた培養物は対照として機能した。ラットCGRP酵素免疫アッセイキット(SPI-Bio、Montigny、France)を製造業者の使用説明書に従って利用し、上清中のCGRP濃度を分析した。Spectra Max 250 (Molecular Devices、lsmaning、Germany)を用いて吸光を測定した。
【０１０３】
電気生理学
DRGニューロンのプレーティングから48時間以内に、室温ですべての記録を行った。ホールセル電位固定記録は、Axopatch 200A増幅器（Molecular Devices）及び2〜3MΩの抵抗を有するパッチピペットを用いて行った。ピペット溶液は、5mM NaCl、140mM KCl、0.5mM CaCl2、2mM MgCl2、5mM EGTA、10mM HEPES及び3mM Na2ATPであり、NaOHでpH 7.2に調整した。外液は、140mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2、10mM HEPES及び10mM D-グルコースであり、NaOHでpH 7.4に調整した(Sigma)。コマンドプロトコル(command protocol)を作成し、pCLAMP10ソフトウェアを有するDigidata 1440A A/Dインターフェイスでデータをデジタル化した。灌流ペンシル(AutoMate Scientific)と接続された重力灌流系を用い、細胞に9-HODE又はカプサイシンを外部から加えた。
【０１０４】
インビトロにおけるカルシウム測定
異種発現させたG2A受容体を研究するために、壁面が白く底が透明の96ウェルプレートにCOS-1細胞を播種し、製造業者の使用説明書に従ってFuGENE 6試薬(Promega)を用いることにより、50ng/ウェルの濃度で、G2AについてのcDNA又は対照DNA（空ベクター、mock）を含有するプラスミドと共に、イクオリンとGFPのカルシウム感受性生物発光融合タンパク質をコードするプラスミド(Baubet等、2000)でトランスフェクトした。
【０１０５】
48時間後、37℃で2時間、1.8mMのCaCl2及び10mMのグルコースを含有するHBSS中の5μMセレンテラジンh（Invitrogen）を細胞に与えた。発光プレートリーダー（Flexstation 3）を用いることにより、測定を行った。各カルシウム過渡応答（calcium transient）下の面積は、SoftMaxProソフトウェアを用いることにより計算し、曲線下の面積（AUC）として表現した。
【０１０６】
＜実施例3：マウスにおける行動試験＞
動物
すべての行動試験において、実験者は、マウスの処理及び遺伝子型を知らなかった。すべての行動試験について、繁殖業者（Charles River、Sulzfeld、Germany、Janvier、Le Geneset-Saint-lsle、FR）から購入した6〜12週齢のC57BU6Nマウスのみを用いた。G2A及びTRPV1ノックアウト系統は、Jackson研究室から入手した。すべての実験は、意識を有する動物における調査のための倫理指針に従い、手順は現地の倫理委員会により承認された。
【０１０７】
処理
9-HODE (1 0 (JM) (Cayman)での足底内（i.pl.）の処理については、10 (JIの量を後足の足底中央に注入した。腹腔内（i.p.）処理については、100 (JIのオキサリプラチン(3mg/kg、Tocris)を腹膜に注入した。対照群の動物は、対応する量の0.9%食塩水で処理した。
【０１０８】
行動試験−機械的疼痛
マウスの機械的閾値（mechanical threshold）を決定するためにダイナミックプランターエステシオメーター(Ugo Basile、Comerio、Italy)を用いた。測定の少なくとも2時間前に試験用ケージ内の高い格子上にマウスを乗せ、順応できるようにした。そして、ベースラインの測定を、オキサリプラチン又は9-HODEでの処理の前に行った。従って、足を素早く引っ込めるのが観察されるまで、線形的に強くなる力で（0.5 g/秒間隔で、10秒かけて0〜5g）後肢の足底側を鋼棒で押した。鋼棒が最初に接触してから足を引っ込めるまでの時間を秒単位で測定し（足引っ込め潜時（paw withdraw latency））、20秒のカットオフ時間（cut-off time）を設定した。
【０１０９】
行動試験−熱痛
熱閾値（thermal threshold）を決定するために、最初の日に少なくとも2時間、温めたガラス板上（32℃）の試験ケージ内にマウスを入れた状態を保ち、順応できるようにした。そして、引っ込みが起きるまで、足の足底中央領域を高強度の投光器ランプから成る放射熱装置で刺激した。注入していない足及び注入した足を5〜10分の間隔で交互に測定した。
【０１１０】
＜実施例4：リアルタイムRT-PCR、データ分析及び統計＞
リアルタイムRT-PCR
腰部DRG（L2〜L6）を切断し、液体窒素中で急速に冷凍させ、-80℃で保存した。製造業者の使用説明書に従いmirVana miRNA単離キット (Ambion)を用いて、RNaseフリーの条件下でDRGの全RNAを単離し、NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies)で定量化した。製造業者の使用説明書に従いFirst Strand cDNA合成キット(Thermo Scientific)を用いて、200ngのRNAからcDNAを合成した。Maxima SYBR Green qPCR マスターミックス ROX並びにCYP2C37 (Luo等、1998)、CYP2C38 (Zhang等、2003)、CYP2C39 (Luo等、1998)、CYP2J6 (Choudhary等、2003)及びCYP3A11 (Chavan等、2015)に対する適切なプライマーを用い、ABI Prism 7500配列検出システム（Applied Biosystems）を用い、リアルタイムRT-PCRを行った。
【０１１１】
GAPDH (Mm99999915_g1)、G2A (Mm02620285_s1)、5-LOX (Mm01182747 m1)、12-LOX (Mm00545833_m1)、15-LOX (Mm00507789_m1)及びCOX-2 (Mm03294838_g1)アッセイの分析のために、ThermoFisher Scientific製のプライマーを用いた。10分間95℃でインキュベートした後95℃15秒及び60℃1分を40サイクル行うことにより、反応（総量10μl）を三連で行った。特異性を保証するために水の対照を含めた。ΔΔCt法を用いて標的遺伝子の相対的発現レベルを決定した。ここで、Ctは、PCR産物のシグナルがPCRの指数関数的増幅期（exponential phase）内で設定した規定閾値を交差するサイクル数を示す。試料RNAの量は、GAPDHで標準化した。
【０１１２】
データ分析及び統計
すべてのデータは平均±SEMとして与えた。すべての行動実験において、統計的に有意な相違を決定するために、反復測定のための二元配置ANOVA（two-way ANOVA for repeated measures）を用いた後、GraphPad Prism 6を使用してBonferroniのpost hoc補正を行った。2つの群のみを比較するインビトロ実験については、スチューデントt検定を行った。0.05未満のp値は、統計的に有意であるとみなした。
【０１１３】
＜実施例5：オキサリプラチン処理したマウスの坐骨神経及びDRGにおける酸化脂質の合成の増大＞
オキサリプラチン誘発性神経障害性疼痛の際に酸化脂質の濃度変化が起きるか否か調べるために、C57BL/6Nマウスにおいて3mg/kgのオキサリプラチン（Nassini等、2011）をi.p.で注入し、ダイナミックプランターエステシオメーターを用いて、10日にわたり足引っ込め潜時を観察した。処理したマウスは、4日目に始まり8〜10日の間に効果が最大となる、機械的足引っ込め潜時の有意な減少を示した（図1A）。オキサリプラチン注入の10日後に坐骨神経、L1〜L6 DRG及び後角の対応する部位をマウスから切断し、LC-MS/MSにより酸化脂質の濃度を決定した。ヒドロキシオクタデカジエン酸（HODE）、ジヒドロキシオクタデセン酸（DiHOME）、エポキシオクタデセン酸（EpOME）、及びエポキシエイコサトリエン酸（EET）の濃度を測定した。9-HODE(図1B〜F)。酸化脂質を合成する酵素の発現調節を評価するために、腰部DRGにおいてシトクロムP450-（CYP）-エポキシゲナーゼCYP2J6、リポキシゲナーゼアイソフォーム（LOX）、5-LOX、12-LOX、15-LOX並びにシクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）のmRNAレベルを決定した（図1G）。オキサリプラチン処理後10日目では、これらの酵素のmRNA発現の相違は全く観察されなかった。
【０１１４】
＜実施例6：9-HODEは、感覚ニューロンにおいてTRPV1を感作し、インビボで機械的疼痛の閾値を低下させる＞
9-HODE又は13-HODEがTRPV1を感作し得るか否かを調べるために、マウス由来のDRGニューロンをカプサイシンで刺激し、2分間ビヒクル、9-HODE又は13-HODEと共にインキュベートした後、2回目のカプサイシン刺激を加えた（図2A）。最初と2回目のピークのΔ比率を計算し、カプサイシン刺激に対する感作が起きているか否かを判定した（図2B）。9-HODEは、100〜200nMの9-HODEの濃度で、TRPV1の感作を濃度依存的に誘導した（図2B）。対照的に、13-HODEは、カプサイシン誘導のTRPV1活性化に対し強い感作効果を有しなかった（図2C）。DRGニューロンのホールセル電位固定測定により、9-HODEはTRPV1感作を誘導することが裏付けられた。なぜなら、9-HODEで前処理した細胞のカプサイシン誘導の内向き電流は有意に増大したためである（図2D及び図2E）。それと適合して、9-HODEは、DRGニューロンにおいてカプサイシン依存のCGRP放出を有意に増大させた（図2H）。注目すべきことに、9-HODEによるTRPV1感作はTRPV1に特異的である。なぜなら、9-HODEはTRPM8（メントール[100μM]で活性化される；図2F）又はTRPA1（AITC[50μM]で活性化される；図2G）について感作効果を全く示さないためである。TRPV1欠損マウスは、野生型マウスに比べ、オキサリプラチンでの処理後8日の全期間にわたって機械的足引っ込め潜時の低減を示した（図2I）。さらに、オキサリプラチン処理したマウスの8日目に左後足（同側）に9-HODEを足底内注入すると、野生型マウスでは機械的足引っ込め潜時の強い低減が誘導されたが、TRPV1欠損マウスでは誘導されなかった（図2J）。
【０１１５】
＜実施例7：9-HODEはG2A受容体（GPR132）を活性化する＞
TRPV1の感作は一般的にGPCRシグナル伝達経路を介して媒介され(Moriyama等、2005) (Sisignano等、2014)、9-HODEがG2A受容体（GPR132）を活性化し得ることが異種発現系において過去に示された(Obinata等、2005)。それと一致して、G2Aを過剰発現させたHEK細胞は9-HODEでの刺激後に細胞内カルシウム濃度の増大を示すことが観察された（図3A及び3B）。G2AをトランスフェクトしたCOS-1細胞及びmock（空ベクター）をトランスフェクトしたCOS-1細胞についての濃度曲線（10-8〜10-5M）を（図3C）に示す。
【０１１６】
G2AノックアウトマウスにおいてG2Aの遺伝子欠損を確認するために、野生型及びG2Aノックアウトマウスにおいて腰部DRGにおけるG2A mRNA発現レベルを決定した。予想された通り、G2A-mRNAは、野生型由来のDRGでは検出されたが、G2Aノックアウトマウス由来のDRGでは検出されなかった（図3E）。TRPV1感作に対する9-HODEの効果がG2A依存的であるか否か判定するために、野生型及びG2A欠損マウスの初代DRG培養物を用いてカルシウムイメージング実験を行った。G2A欠損マウスのDRG培養物では、9-HODE誘導のTRPV1感作が欠けていた（図3F及び3G）。
【０１１７】
<実施例8：9-HODE誘導のTRPV1感作は、PKAではなくPKCにより媒介される>
TRPV1感作は、PKA又はPKCにより媒介され得る（Schnizler等、2008; Bhave等、2003）。DRGニューロンにおけるG2AとTRPV1との間のシグナル伝達経路を調べるために、どちらのプロテインキナーゼがTRPV1の感作に関与しているか判定した。従って、PKA（H89；図4A）及びPKC(GF-109203X；図4B)に対する阻害剤を用い、9-HODE誘導のTRPV1感作に対するそれらの効果を試験した。PKA阻害剤H89でDRGニューロンをインキュベーションすると、8-ブロモ-cAMPによりもたらされるPKA依存的なTRPV1感作が阻害されたが、9-HODE誘導のTRPV1感作は抑制されなかった（図4A）。しかしながら、PKC阻害剤GF109203Xにより、9-HODEによりもたらされるTRPV１感作が妨げられた（図4B）。PKC依存的なTRPV1感作の陽性対照としてブラジキニンを用いた。
【０１１８】
＜実施例9：オキサリプラチン処理に対する反応において、G2A欠損マウスの疼痛はより弱い＞
オキサリプラチン注入の10日後に、DRGにおけるG2A mRNAの発現レベルが増大した（図5A）。G2A欠損マウスでは、野生型マウスに比べ、オキサリプラチンでの処理後10日の期間にわたって機械的過敏症が低減することを観察することができた（図5B）。さらに、オキサリプラチン処理後8日目に左後足に9-HODEを足底内注入すると、野生型マウスでは機械的疼痛閾値の著しい低下が誘導されたが、G2A欠損マウスでは誘導されなかった（図5C）。
【０１１９】
参考文献
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2019529461.tif 000003
2019529461.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019529461.tif 000009
【図６】
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【国際調査報告】
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