(57)【要約】  心筋細胞成熟培地は、基礎培地、パルミチン酸等の1つ又は複数の脂肪酸、グルコース及びアルブミンを含む。1つ又は複数の脂肪酸及びグルコースは、理想的には、約1:10の濃度比で存在する。典型的に、培地は、TGFもインスリンも含まないか、又は最小限のTGF及び/若しくはインスリンを含む。発生しつつある心筋の力の測定を容易とする対向ポールを含む、細胞培養容器が提供される。
2019526255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基礎培地、1つ又は複数の脂肪酸、グルコース及びアルブミンを含む、心臓細胞成熟培地。
【請求項２】
心筋細胞の成熟に適している、請求項1に記載の心臓細胞成熟培地。
【請求項３】
ゲル化培地を含む、請求項1に記載の心臓細胞成熟培地。
【請求項４】
1つ又は複数の細胞外マトリックス(ECM)分子又はこれらの成分を含む、請求項3に記載の心臓細胞成熟培地。
【請求項５】
(ECM)分子又はこれらの成分が、コラーゲンI及びMatrigel(商標)を含む、請求項4に記載の心臓細胞成熟培地。
【請求項６】
1つ又は複数の脂肪酸及びグルコースが、約1:10の濃度比で存在する、請求項1から5のいずれか一項に記載の心臓細胞成熟培地。
【請求項７】
グルコースが、約1mMの濃度である、請求項1から6のいずれか一項に記載の心臓細胞成熟培地。
【請求項８】
1つ又は複数の脂肪酸が、約100μMの濃度である、請求項1から7のいずれか一項に記載の心臓細胞成熟培地。
【請求項９】
1つ又は複数の脂肪酸が、C12〜C20の飽和脂肪酸であるか、又はこれを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の心臓細胞成熟培地。
【請求項１０】
1つ又は複数の脂肪酸が、パルミチン酸であるか、又はこれを含む、請求項9に記載の心臓細胞成熟培地。
【請求項１１】
TGFもインスリンも含まないか、又は最小限のTGF及び/若しくはインスリンを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の心臓細胞成熟培地。
【請求項１２】
無血清培地である、請求項1から11のいずれか一項に記載の心臓細胞成熟培地。
【請求項１３】
各々が、ウェルの基底面から、実質的に垂直に伸びる対向ポールを含む、複数のウェルを含む、心臓細胞培養容器。
【請求項１４】
ウェル内の筋束により引き起こされる対向ポールの変位が、収縮力の測定を容易とする、請求項13に記載の心臓細胞培養容器。
【請求項１５】
対向ポールが、矩形の断面を有する、請求項14に記載の心臓細胞培養容器。
【請求項１６】
ウェルが、卵形を有する、請求項13、請求項14、又は請求項15に記載の心臓細胞培養容器。
【請求項１７】
約3mmの長軸と、約2mmの短軸とを有するウェル;各々の矩形の断面が、約0.2mm×約0.5mmの大きさを有する対向ポール;及び/又はウェルの長軸に沿って、それぞれのポールの中心から、約1.0mm離れて対称的に隔てられた対向ポールを含む、少なくとも1つの大きさを含む、請求項13から16のいずれか一項に記載の心臓細胞培養容器。
【請求項１８】
(i)請求項1から12のいずれか一項に記載の心臓細胞成熟培地と;
(ii)請求項13から17のいずれか一項に記載の心臓細胞培養容器と
を含む、心臓細胞培養システム。
【請求項１９】
心臓細胞培養容器が、各々がウェルの基底面から実質的に垂直に伸びる対向ポールを含む、複数のウェルを含む、請求項18に記載の心臓細胞培養システム。
【請求項２０】
心臓動力計であるか、又はこの構成要素である、請求項19に記載の心臓細胞培養システム。
【請求項２１】
心臓細胞を培養する方法であって、1つ又は複数の心筋細胞の成熟を誘導又は促進するのに十分な時間にわたり、これに適する条件下で、1つ又は複数の心筋細胞を、請求項13から17のいずれか一項に記載の細胞培養容器内、又は請求項18から21のいずれか一項に記載の細胞培養システム内の、請求項1から12のいずれか一項に記載の心臓細胞成熟培地と接触させる工程を含む方法。
【請求項２２】
1つ又は複数の心筋細胞を、ECM成分又は分子及びアルブミンの存在下で最初にゲル化する、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
グルコース及び1つ又は複数の脂肪酸を、その後、インスリンの非存在下で、ゲル化した心筋細胞へと添加する、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
1つ又は複数の心筋細胞が、1つ又は複数の始原細胞から分化している、請求項21から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
始原細胞が、ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞であるか、又はこれらを含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
アスコルビン酸-2-リン酸塩、BMP-4、アクチビンA、FGF-2、及びCHIR99021等のGSK-3阻害剤のうちの1つ又は複数を使用して、始原細胞を培養する、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
請求項21から26のいずれか一項に記載の方法により作製される、心臓細胞、オルガノイド、又は操作心臓組織。
【請求項２８】
心臓細胞成熟をモジュレートする1つ又は複数の分子を同定する方法であって、1つ又は複数の心筋細胞を、請求項13から17のいずれか一項に記載の細胞培養容器、又は請求項18から20のいずれか一項に記載の細胞培養システム内の、1つ又は複数の候補分子と接触させる工程を含み、1つ又は複数の心筋細胞の成熟の修飾が、候補分子が心臓細胞成熟のモジュレーターであることを指し示す方法。
【請求項２９】
モジュレーターが、少なくとも部分的に、心臓細胞成熟を阻害又は抑制する、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
モジュレーターが、少なくとも部分的に、心臓細胞成熟を増強又は促進する、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
心臓細胞、組織、又はオルガノイドに対する1つ又は複数の分子の効果を決定、評価、又はモニタリングする方法であって、心臓細胞、オルガノイド、若しくは操作心臓組織を、請求項21から26のいずれか一項に記載の方法に従い作製し、心臓細胞、オルガノイド、若しくは操作心臓組織を、1つ若しくは複数の分子と接触させる工程;又は請求項27に記載の心臓細胞、オルガノイド、若しくは操作心臓組織を、1つ若しくは複数の分子と接触させる工程;及び心臓細胞、オルガノイド、又は操作心臓組織に対する1つ又は複数の分子の効果を決定、評価、又はモニタリングする工程を含む方法。
【請求項３２】
1つ又は複数の分子の毒性又は安全性を決定する、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
1つ又は複数の分子の治療有効性を決定する、請求項31に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞に関する。より詳細には、本発明は、in vitroにおける心筋細胞の成熟を促進する培養培地、システム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋細胞の成熟は、出生後生命の早期において生じ、電気生理学的変化、構造的変化、及び代謝的変化を含む、多数の適応を課する(1)が、これらは、増殖能及び再生力の喪失と軌を一にして生じる(2、3)。心筋細胞の成熟及び細胞周期停止の、鍵となる、上流の駆動因子の発見は、心臓生物学において答えられていない、最も重要な問題のうちの1つであり続けている。これらの駆動因子の発見は、薬物発見のために、in vitroにおける心筋細胞の成熟を促進し、再生薬のために、in vivoにおいて、成人心筋細胞を脱分化させる、最新の試みを容易とする。
【０００３】
出生後の生命早期には、代謝基質の供給が、大きく変化する。哺乳動物の心臓は、子宮内では、高濃度の炭水化物及びインスリンの存在に依拠するが、その後、生誕後における、乳中に存在する、脂肪酸を主とする基質、及び低インスリンレベルへと切り替わる(4)。これらの基質の変化に適応するために、心筋細胞は、生誕後において、脂肪酸の酸化に要請される遺伝子を上方調節する(5)。in vivoにおける、遺伝子の、脂肪酸酸化成分の破壊は、健康上、広範にわたる負の影響を及ぼしうるため、心筋細胞の成熟への、これらの代謝的適応の重要性について研究することは困難であった(6)。したがって、心筋細胞代謝の、成熟過程に対する影響について研究するための、代替的な手法を開発することが必要である。
【０００４】
hPSCは、いまや、心筋細胞を含む、規定されたヒト体細胞型を作出するために、広く使用されている。hPSC-CMは、発生の研究、薬物のスクリーニング、疾患のモデル化、及び心臓の修復のために、広範に使用されている。しかし、成熟の欠如及び薬理学的薬剤への不適切な応答が、2Dベース又は胚様体ベースの分化戦略における限界として同定されている(7)。心筋の構造及び機能を、よりよく刺激しようとする取組みにおいて、3D操作心筋を形成するための心臓組織操作が使用されている(8〜12)。ヒト心臓組織操作における、これらの近年の進歩は、hPSC-CMの、構造的かつ機能的な成熟を、大幅に増強している。しかし、代謝、転写、及び増殖の成熟は、いまだ達成されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、広く、心筋細胞の成熟を促進又は増強する、規定された構成成分を有する培地を対象とする。本発明はまた、広く、心筋細胞及び/又は心筋細胞を含む心臓オルガノイドの、前述の培地中の形成を容易とする、1つ又は複数のウェルを含む培養システムも対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第1の態様は、基礎培地、1つ又は複数の脂肪酸、グルコース及びアルブミンを含む、心臓細胞成熟培地を提供する。
【０００７】
適切には、心臓細胞成熟培地は、心筋細胞の成熟に適している。
【０００８】
心臓細胞成熟培地は、1つ又は複数の細胞外マトリックス(ECM)分子又はこれらの成分を含むゲル化培地を更に含みうる。1つ又は複数の細胞外マトリックス(ECM)分子又は成分は、Matrigel(商標)である場合もあり、これを含む場合もある。好ましくは、1つ又は複数の細胞外マトリックス(ECM)分子又は成分は、コラーゲンを含む。
【０００９】
好ましくは、1つ又は複数の脂肪酸及びグルコースは、約1:10の濃度比で存在する。
【００１０】
好ましくは、1つ又は複数の脂肪酸は、パルミチン酸であるか、又はこれを含む。
【００１１】
心臓細胞成熟培地は、TGFもインスリンも含まないか、又は最小限のTGF若しくはインスリンを含むことが適切である。
【００１２】
典型的に、心臓細胞成熟培地は、無血清培地である。
【００１３】
本発明の第2の態様は、各々がウェルの基底面から実質的に垂直に伸びる対向ポールを含む、複数のウェルを含む、心臓細胞培養容器を提供する。
【００１４】
本発明の第3の態様は、
(i)第1の態様の心臓細胞成熟培地と;
(ii)第2の態様の心臓細胞培養容器と
を含む、心臓細胞成熟システムを提供する。
【００１５】
特定の実施形態では、心臓細胞培養システムは、心臓動力計である場合もあり、又はこの構成要素である場合もある。
【００１６】
本発明の第4の態様は、心臓細胞を培養する方法であって、1つ又は複数の心筋細胞の成熟を誘導又は促進するのに十分な時間にわたり、これに適する条件下で、1つ又は複数の心筋細胞を、第1の態様の心臓細胞成熟培地と接触させる工程を含む方法を提供する。
【００１７】
一部の実施形態では、1つ又は複数の心筋細胞は、1つ又は複数の始原細胞から分化している。始原細胞は、ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である場合もあり、これらを含む場合もある。
【００１８】
好ましい実施形態では、少なくとも部分的に、第3の態様の心臓細胞成熟システムを使用して、方法を実施する。
【００１９】
また、この態様の方法により作製される、心臓細胞、オルガノイド、又は操作心臓組織も提供される。
【００２０】
本発明の第5の態様は、心臓細胞成熟をモジュレートする1つ又は複数の分子を同定する方法であって、1つ又は複数の心筋細胞を、第2の態様の心臓細胞成熟システム内の1つ又は複数の候補分子と接触させる工程を含み、1つ又は複数の心筋細胞の成熟の修飾が、候補分子が心臓細胞成熟のモジュレーターであることを指し示す方法を提供する。
【００２１】
一実施形態では、モジュレーターは、少なくとも部分的に、心筋細胞の成熟を阻害又は抑制する。
【００２２】
別の実施形態では、モジュレーターは、少なくとも部分的に、心筋細胞の成熟を増強又は促進する。
【００２３】
本発明の第6の態様は、心臓細胞、組織、又はオルガノイドに対する1つ又は複数の分子の効果を決定、評価、又はモニタリングする方法であって、第3の態様の方法に従い作製された心臓細胞、オルガノイド、又は操作心臓組織を、1つ又は複数の分子に接触させる工程、及び心臓細胞、オルガノイド、又は操作心臓組織に対する1つ又は複数の分子の効果を決定、評価、又はモニタリングする工程を含む方法を提供する。
【００２４】
特定の実施形態では、方法は、1つ又は複数の分子の、治療有効性、安全性、又は毒性を決定、評価、又はモニタリングする。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ヒト心臓オルガノイドの自動化された形成、機械によるローディング、及び解析を容易とする、Heart-Dyno  マイクロ組織プラットフォームを示す図である。  a)96ウェルプレートであるHeart-Dynoについての概略表示である。各ウェルは、2本のエラストマー製のポストを含有する、楕円形の播種ウェルを含有する、培養インサートを有する。  b)Heart-Dyno内の自動式組織形成を示す図である。hPSC-CM及び線維芽細胞を、ECM内に播種し、37℃で、30分間にわたりゲル化する。その後、細胞は、2本のエラストマー製のポールの周囲に凝集する結果として、hCOの自動化された形成をもたらす。  c)ポールトラッキングを使用して、収縮力を近似しうることを示す図である。左:ポールのたわみについての概略図を、力についての近似式(SI付録の方法を参照されたい)と共に示す図である。本発明者らのシステムのパラメータに基づくと、これは、たわみの後における、1μm当たり14μNと等しい力を結果としてもたらす。右:心臓マイクロ組織の位相差画像を示す図であり、左ポール上の×印は、自動化された収縮解析ソフトウェアにより選択されたトラッキング点を指し示す。  d)各hCOについてのバッチビデオ解析を実施して、収縮特性を得うることを示す図である。左:代表的な力についての出力曲線を示す図である。右:対照培地中で7日間にわたり培養された、n=31例の組織からの全収縮パラメータ±標準偏差を示す図である。Ta:50%活性化から、ピークまでの時間である。Tr:ピークから、50%弛緩までの時間である。  e)スクリーニングのために、全載免疫染色を使用して、hCOマーカーの発現を評価しうることを示す図である。MLC2V、Ki-67、及びα-アクチニンの免疫染色についての、共焦点近接撮影による代表的な画像である。  f)スクリーニングが、hCOの収縮力に最適なグルコース濃度及びパルミチン酸濃度を同定することを示す図である。完全実施要因グルコース(0、0.5、1、及び5.5mM)及びパルミチン酸(0、1、10、及び100μM)スクリーンに応答する、力についてのヒートマップである。力は、CTRL培地中の、2日間にわたるhCO形成の後における、5日間にわたる無血清培養の後で評価した。3回の実験による、HES3に由来するhCOのn=7〜13例である。CTRL=CTRL培地及び後続のパネル(SI付録の方法を参照されたい)である。  g)パルミチン酸が、MLC2Vの発現を誘導することを示す図である。完全実施要因グルコース(0、0.5、1、及び5.5mM)及びパルミチン酸(0、1、10、及び100μM)スクリーンに応答する、MLC2vについてのヒートマップである。MLC2Vの発現は、CTRL培地中の、2日間にわたるhCO形成の後における、5日間にわたる無血清培養の後で評価した。3回の実験による、HES3に由来するhCOのn=7〜13例である。MLC2Vの発現は、対照の無血清条件(5.5mMグルコース、パルミチン酸を伴わない)と比べた発現である。  h)KI67の発現が、インスリンにより誘導されることを示す図である。組織は、CTRL培地中の、5日間にわたるhCO形成の後における、11日間にわたる無血清培養の後で評価した。2回の実験による、HES3に由来するhCOのn=6〜7例である。Ki-67の発現は、CTRLと比べた発現である。  i)スクリーニングが、インスリンの非存在下における、最適のグルコースレベル及びパルミチン酸レベルを同定することを示す図である。インスリンの存在を伴わない、完全実施要因グルコース(0、0.5、1、及び5.5mM)及びパ��ミチン酸(0、1、10、及び100μM)スクリーンに応答する、力についてのヒートマップである。力は、CTRL培地中の、5日間にわたるhCO形成の後における、11日間にわたる無血清培養の後で評価した。3回の実験による、HES3に由来するhCOのn=6〜15例である。  j)パルミチン酸が、MLC2Vの発現を誘導することを示す図である。インスリンの非存在下における、完全実施要因グルコース(0、0.5、1、及び5.5mM)及びパルミチン酸(0、1、10、及び100μM)スクリーンに応答する、MLC2vについてのヒートマップである。MLC2Vの発現は、CTRL培地中の、5日間にわたるhCO形成の後における、11日間にわたる無血清培養の後で評価した。3回の実験による、HES3に由来するhCOのn=6〜9例である。MLC2Vの発現は、対照の無血清条件(5.5mMグルコース、パルミチン酸を伴わない)と比べた発現である。  k)KI67の発現が、インスリンを伴わずに、1mMのグルコース及び100μMのパルミチン酸を含有する無血清培地(ここでは、成熟培地(MM)と称する)中で低減されることを示す図である。組織は、CTRL培地中の、5日間にわたるhCO形成の後における、11日間にわたる無血清培養の後で評価し、KI67の発現は、CTRL培地と比べた発現である。2回の実験による、HES3に由来するhCOのn=6〜8例である。  l)hCOの培養物が、CTRL培地中の、5日間にわたるhCO形成の後における、11日間にわたる培養の後で、CTRL培地中又はMM中で、高い組織生存率を維持することを示す図である。組織733及び組織717のそれぞれについての、n=16回の実験であり、HES3に由来するhCOである。  m)hPSCの拡大、心臓の分化、及びhCO形成、並びにCTRL培地中又はMM培地中の培養のタイミング及び持続時間を指し示す、最終的な心臓成熟プロトコールによる培養の概略を示す図である。  データは、ヒートマップについての平均値±s.e.m.である(f、g、i、j)。一元ANOVAを、テューキーの事後検定(h)、5.5mMグルコース及びパルミチン酸なしと比べたダネットの事後検定(f、g、i、j)、又はt検定(k)と共に使用する、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****p<0.0001である。#は、一元ANOVAと共に、5.5mMグルコース及びパルミチン酸なしと比べたダネットの事後検定(j)を使用する、p=0.07を指し示す。
【図２】Heart-Dynoの開発、最適化、及び特徴付けを示す図である。  a)96ウェルプレート内にhCOを伴う、Heart-Dyno培養インサートの光学顕微鏡写真を示す図である。  b)公知の収縮力抑制因子/収縮力活性化因子に応答する収縮力(n=5)を示す図である。  c)予測される通り、催不整脈性化合物が、hCO内で、弛緩時間の延長を引き起こすこと(n=5)を示す図である。  d)全載免疫染色、2回の実験によるn=5〜7を使用する、Ki-67マーカーの活性化についての検証を示す図である。0.05%のDMSO及び5μmのCHIRで処理されたhCOである。  e)インスリンの存在下において、完全実施要因グルコース(0、0.5、1及び5.5mM)及びパルミチン酸(0、1、10及び100μM)スクリーンに応答する、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)レベルを示す図である。LDHレベルは、CTRL培地中の、2日間にわたるhCO形成の後における、5日間にわたる無血清培養の後で評価した。3回の実験による、HES3に由来するhCOのn=8〜9例である。+ve:陽性対照であり、-ve:陰性対照である。  f)無血清条件について、心臓トロポニン(CTNI)レベルを示す図である。CTNIレベルは、CTRL培地中の、2日間にわたるhCO形成の後における、5日間にわたる無血清培養の後で評価した。1回の実験によるn=2〜3であり、HES3 ESC系である。+ve:陽性対照であり、-ve:陰性対照である。  g)α-アクチニンで染色されたhCOであって、CTRL培地中の、2日間にわたるhCO形成の後における、5日間にわたる無血清培養の後で、「アーム」の破断問題(上)及びネッキング問題(下)により機械的に破損したhCOについての全載画像を示す図である。スケールバー=200μmである。  h)完全実施要因グルコース(0、0.5、1、及び5.5mM)及びパルミチン酸(0、1、10、及び100μM)スクリーンに応答する、力についてのヒートマップを示す図である。力は、CTRL培地中の、2日間にわたるhCO形成の後における、5日間にわたる無血清培養の後で評価した。3回の実験による、H9に由来するhCOのn=8〜12例である。  i)完全実施要因グルコース(0、0.5、1、及び5.5mM)及びパルミチン酸(0、1、10、及び100μM)スクリーンに応答する、全載MLC2V発現を示す図である。MLC2Vの発現は、CTRL培地中の、2日間にわたるhCO形成の後における、5日間にわたる無血清培養の後で評価した。3回の実験による、H9に由来するhCOのn=8〜12例である。MLC2Vの発現は、対照の無血清条件(5.5mMグルコース、パルミチン酸を伴わない)と比べた発現である。  j)TGF-β1が、hCO機能に対して有害であることを示す図である。TGF-β1濃度(0、1、3、及び10ng/ml)及び持続時間(2〜5、2〜7、及び2〜9日目)に応答する、力についてのヒートマップである。力は、CTRL培地中の、2日間にわたるhCO形成の後における、10日間にわたる無血清培養の後で評価した。3回の実験による、H9に由来するhCOのn=13〜16例である。  k)コラーゲンIの増大及びMatrigelが、組織の生存率を改善することを示す図である。組織の生存率は、CTRL培地中の、2日間にわたるhCO形成の後における、10日間にわたる無血清培養の後で評価した。3回の実験によるn=18であり、H9に由来するhCOである。低Col=1.6mg/mlのコラーゲンマトリックスであり、高Col=3.2mg/mlのコラーゲンマトリックスであり、高Col+MG=2.6mg/mlのコラーゲン+9%(v/v)のMatrigelマトリックスである。CTRL=対照培地であり、SF=無血清培地(インスリンを伴う、1mMのグルコース、10μMのパルミチン酸)である。  l)細胞外マトリックスの量及び組成の、hCOの力に対する影響を���す図である。組織の生存率は、CTRL培地中の、2日間にわたるhCO形成の後における、10日間にわたる無血清培養の後で評価した。3回の実験による、H9に由来するhCOのn=6〜15例である。低Col=1.6mg/mlのコラーゲンマトリックスであり、高Col=3.2mg/mlのコラーゲンマトリックスであり、高Col+MG=2.6mg/mlのコラーゲン+9%(v/v)のMatrigelマトリックスである。CTRL=対照培地であり、SF=無血清培地(インスリンを伴う、1mMのグルコース、10μMのパルミチン酸)である。  データは、平均値±s.e.m.である。ベースライン又は0.2mMのCa2+と比べた、一元ANOVA+ダネットの事後検定(b、c)、t検定(d)、TGF-β1なしと比べた、ダネットの事後検定を伴うt検定(j)、テューキーの事後検定だけを伴い、ANOVAを使用して、CTRL培地群又はSF群を比較する(l)、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****p<0.0001。
【図３】MM中のhCOの培養が、細胞組成を変更しないことを示す図である。  a)hCO内のDNA強度が、MM中の細胞が少数であることを指し示す図である。14回の実験によるn=70〜74である。  b)hCOから解離させた、単一のhPSC-CMを示す図である(バー=10μm)。  c)hCOから解離させたhPSC-CMについての、フローサイトメトリープロファイリング(α-アクチニン)が、CTRL培地中及びMM中の両方における、同様の純度(非有意)を明らかにすることを示す図である。  d)hCOから解離させた間質細胞(CD90+)についてのフローサイトメトリープロファイリングが、MM中で培養されたhCO内のCD90+細胞の、CTRL培地中と対比した、極めて微細な減少(p<0.05)(n=5)を明らかにすることを示す図である。  e)CTRL培地中のhCOが、hPSC-CM(MLC2v)を介して、内皮管状構造(CD31)及び間質細胞(CD90)を存在させていることを示す図である。hCOの外面上にはまた、心外膜細胞(WT-1)も存在する。全hCOについての低拡大率の画像を、各染色について、左側(バー=200μm)に示し、高拡大率の画像を、右側(バー=20μm)に示す。  f)MM中のhCOが、hPSC-CM(MLC2v)を介して、内皮管状構造(CD31)及び間質細胞(CD90)を存在させていることを示す図である。hCOの外面上にはまた、心外膜細胞(WT-1)も存在する。全hCOについての低拡大率の画像を、各染色について、左側(バー=200μm)に示し、高拡大率の画像を、右側(バー=20μm)に示す。  データは、平均値±S.E.M.として提示する。t検定(a)、t検定を使用して解析された統計(c、d)を使用する、***P<0.001。
【図４】電気生理学的特性及び収縮特性の成熟が、組織操作環境により決定されることを示す図である。  a)CTRL培地中又はMM中のhCOについての、代表的な個別の収縮曲線及び収縮パラメータを示す図である。  b)イソプレナリンによる刺激が、hCO内の収縮速度の増大を誘導すること(n=5〜6)を示す図である。  c)イソプレナリンが、MM中で培養されたhCO内の収縮力を増大させることを示す図である。2回の実験によるn=5〜7である。  d)MM中で培養されたhCOが、カルシウム感受性を低下させていることを示す図である。イソプレナリンによる刺激実験は、培養培地(Ca2+=1.8mM)中で実施したので、イソプレナリンの効果は、カルシウム濃度が低濃度である場合に、より顕著でありうる。2回の実験によるn=4〜7である。  e)カルシウムをEC50濃度とする、ペーシング条件(1Hz)下で、イソプレナリンが、収縮力を増大させ、収縮の持続時間を減少させること(CTRL=0.3mM、MM=l.0mM)(n=7)を示す図である。  f)CTRL培地中又はMM中で培養され、37℃、1HzでペーシングされたhCOから解離させた、個別のhPSC-CMからの、代表的な、個別の、カルシウム指示薬(Fluo-4)記録及びパラメータを示す図である。  g)CTRL培地中又はMM中で培養され、37℃、1HzでペーシングされたhCOから解離させた、個別のhPSC-CMからの、代表的な、個別の、活動電位記録及びパラメータを示す図である。APD:活動電位の持続時間、RMP:静止膜電位、CMP:固定膜電位である。  データは、平均値±s.e.m.である。t検定(a、e)、ベースラインと比べた差違を指し示す二元ANOVA(b、c)、テューキーの事後検定を伴うANOVA(f、g)を使用する、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001である。二元ANOVAを使用すると、CTRL培地中及びMM中のhCOのカルシウムに対する応答曲線は、統計学的に有意である(p<0.05)(d)。
【図５】図4に提示した機能的解析についての実証データを示す図である。  a)H9に由来するhCO及びiPSCに由来するhCOが、MM中で培養されたHES3 hCOと同様の収縮特性を有することを示す図である。CTRL培地中又はMM中の、H9に由来するhCO又はiPSCに由来するhCOについての、代表的な収縮曲線及びパラメータである。  b)Fluo-4AMを伴うCTRL培地中及びMM中で培養され、37℃、1Hzでペーシングされた、2D培養物及びhCOから単離された、hPSC-CMから記録された、代表的なカルシウム出力についての生データ及び処理データを示す図である。  c)パッチクランプ(更なる詳細については、「材料及び方法」を参照されたい)を使用する、hPSC-CM亜型についての特徴付けを示す図である。  d)穿刺電極を使用する電気生理学記録を示す図である。AP:活動電位、APD:活動電位の持続時間、RMP:静止膜電位である。  データは、平均値±s.e.m.である。t検定(d)を使用する、*P<0.05である。
【図６】MM中の培養が、hCOの転写及びプロテオーム成熟を誘導することを示す図である。  a)Delaughterら(27)により同定された遺伝子のサブセットを使用して、成熟度(表S6(27)の遺伝子)をプロファイリングする、RNA-seqデータについての主成分分析を示す図である。CTRL培地中又はMM中で培養されたhCO(n=4回の実験であり、各々20例ずつのhCOをプールした)、及び本発明者らのヒト成人心臓試料(n=1回であり、心臓3例をプールした)に由来するRNA-seqデータであって、GSE62913(25)からのRNA-seqデータであり、20日後(n=3)、1年後(n=3)における2D hPSC-CM、ヒト胎児心室(n=2)、及びヒト成人心臓(n=2)を含有するRNA-seqデータと組み合わされたRNA-seqデータである。全ての遺伝子は、少なくとも1例の試料について、100万個当たり>10カウントであった。上方のバーは、成熟と相関する成分である、PC1の投影である。  b)MM中で培養されたhCOが、ヒト成人心臓組織と、有意に相関することを指し示す、ピアソン相関共係数を示す図である。グラフは、ヒト成人心臓(n=1回であり、心臓3例をプールした)又はMM中で培養されたhCO(n=4)の平均遺伝子発現についてのlog2(CPM)グラフである。  c)MM中で培養されたhCOが、ヒト成人心臓組織と、著明に相関することを指し示す、ピアソン相関共係数を示す図である。グラフは、ヒト成人心臓(n=1)又はMM中で培養されたプールhCO(n=3回であり、各々9例ずつのhCOをプールした)についてのlog2(iBAQ)グラフである。  d)CTRL培地中で培養されたhCOと、MM中で培養されたhCOとの間における、調節された遺伝子についてのクラスター化ヒートマップ(FDR<0.05)を示す図である。  e)CTRL中で培養されたhCOと、MM中で培養されたhCOとの間における、調節されたタンパク質についてのクラスター化ヒートマップ(q値<0.05)を示す図である。  f)RNA-seqについてのGOターム解析は、複数の過程が、MM中で培養されたhCO内で、CTRL培地中で培養されたhCO内と対比して、減少又は増大することを明らかにすることを示す図である。これらは、出生後における心臓成熟時に生じる過程(5)と符合する。バー内の数は、この特定の過程内で同定される遺伝子の数を指し示す。  g)プロテオミクスについてのGOターム解析は、複数の過程が、MM中で培養されたhCO内で、CTRL培地中で培養されたhCO内と対比して、減少及び増大することを明らかにすることを示す図である。これらは、出生後における心臓成熟時に生じる過程(5)と符合する。バー内の数は、この特定の過程内で同定される遺伝子の数を指し示す。  h)成熟についてのRNA-seqマーカー:「心臓の発生」GOターム内の遺伝子であって、RNA-seqデータ内でもまた、上方調節される遺伝子を示す図である。  i)成熟についてのプロテオミクスマーカー:「心臓の発生」GOターム内の遺伝子であって、プロテオミクスデータ内でもまた、上方調節される遺伝子を示す図である。  データは、平均値±s.e.m.である。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、FDR(h)又はq値(i)であり、統計学的解析については、「材料及び方法」を参照されたい。
【図７】CTRL培地中及びMM中のいずれで培養されたhCOも、in vivo様構造を呈示することを示す図である。  a)概観(スケールバー=2μm)及びサルコメアについての高倍率の拡大(スケールバー=1μm)のための、CTRL培地中及びMM中のhCOについての透過電子顕微鏡写真を示す図である。それぞれ、Z帯、I-Z帯、及びI帯である。  b)MLC2v及びα-アクチニンの全載免疫染色が、CTRL培地中及びMM中のいずれにおいても、hCO内で良好に発生したサルコメアの存在を明らかにする(バー=20μm)ことを示す図である。MLC2v/α-アクチニン共染色が、Z帯内のα-アクチニン及びサルコメアの残余部分内だけのMLC2Vを明らかにする、5倍の挿入図及び強度プロファイルに注目されたい。  c)チチン及びα-アクチニンの全載免疫染色が、Z帯内のα-アクチニン及びI帯内のチチンについての明確な描出を明らかにする(スケールバー=20μm)ことを示す図である。チチン/α-アクチニン共染色が、Z帯内のα-アクチニン及びI帯内だけのチチンを明らかにする、5倍の挿入図及び強度プロファイルに注目されたい。  d)α-アクチニン染色を使用する、サルコメア長の定量化を示す図である。2回の実験による細胞のn=20である。データは、平均値±s.e.m.であり、NS:t検定を使用した非有意(P<0.05)である。  e)CTRL培地中及びMM中のhCO内のミトコンドリア(M)についての、透過電子顕微鏡写真を示す図である。M:ミトコンドリアである(スケールバー=0.5μm)。  f)CTRL培地中及びMM中のhCO内のT管(T)についての、透過電子顕微鏡写真(スケールバー=0.5μm)を示す図である。  g)CAV3の全載免疫染色が、CTRL培地中及びMM中のhCO内の、T管構造を確認する(スケールバー=10μm)ことを示す図である。  h)CTRL培地中及びMM中のhCO内の介在板(ID)についての、透過電子顕微鏡写真(スケールバー=0.5μm)を示す図である。  i)汎カドヘリンの全載免疫染色が、CTRL培地中及びMM中のhCO内の、介在板の存在を確認する(スケールバー=10μm)ことを示す図である。  j)コネキシン43の全載免疫染色が、CTRL培地中及びMM中のhCO内の、介在板の存在を確認する(スケールバー=10μm)ことを示す図である。
【図８】図6に提示した、RNA-seq及びプロテオミクスによる、hCOの発現解析についての実証データを示す図である。  a)潜在的な夾雑細胞型についてのマーカーのRNA-seq発現(n=4回の実験)を示す図である。  b)異なる心臓細胞集団内で発現するマーカーのRNA-seq発現(n=4回の実験)を示す図である。  c)GSE62913(25)からのRNA-seqデータであって、20日後(n=3)、1年後(n=3)における、hPSCに由来する2D hPSC-CM、ヒト胎児心室(n=2)、及びヒト成人心臓(n=2)を含有するRNA-seqデータと組み合わされた、本発明者らのRNA-seqデータについての主成分分析を示す図である。全ての遺伝子は、少なくとも1例の試料について、100万個当たり>10カウントであった。  d)MM中のhCOと、ヒト成人心臓内のhCOとの間の発現差が最も大きい1000の遺伝子であって、ヒト成人心臓内の存在度が大きい遺伝子について、上位25のGOタームを示す図である。  e)RNA-seqデータ(n=4回の実験)についての示差的解析を例示するボルカノプロットを示す図である。  f)プロテオミクスデータ(n=3例の試料)についての示差的解析を例示するボルカノプロットを示す図である。  g)成熟と共に切り替わる/増大することが公知のサルコメア遺伝子(TTN N2B、MYH7/6、TNNI3/1、及びMYL2/7)についてのqPCR(n=4回の実験)を示す図である。  データは、平均値(a、b)又は平均値±s.e.m.である(f)。マン-ホイットニーを使用する、*P<0.05である(f)。
【図９】図4に提示したデータを実証する、代謝遺伝子についてのRNA-seqデータ及びプロテオミクスデータのヒートマップを示す図である。  a)GOターム「解糖」についてのRNA-seqデータ中又はプロテオミクスデータ中で、有意に調節された標的(CTRL培地対MM)に由来するヒートマップデータを示す図である。  b)GOターム「酸化還元」についてのRNA-seqデータ中又はプロテオミクスデータ中で、有意に調節された標的(CTRL培地対MM)に由来するヒートマップデータを示す図である。  c)GOターム「脂肪酸の酸化」についてのRNA-seqデータ中又はプロテオミクスデータ中で、有意に調節された標的(CTRL培地対MM)に由来するヒートマップデータを示す図である。  データは、全ての条件について、平均値と比べたlog2表示として(RNA-seqについて、n=4回の実験であり、プロテオミクスについて、n=3回の実験である)提示する。
【図１０】MM中で培養されたhCO内で、代謝が、解糖から、脂肪酸の酸化へと切り替わることを示す図である。  a)Seahorseミトコンドリアストレス試験を示す図である。A:オリゴマイシン、B:FCCP、C:エトモキシル、D:アンチマイシンA/ロテノンである。Seahorseストレス試験は、CTRL培地中又はMM中で、9日間にわたり培養されたhCOからの記録1件当たり、n=8例のプールhCOに由来する、n=6件の独立の記録について行った(パネルb〜d)。  b)最大のOCRが、MM中で培養されたhCO内で高度であることを示す図である。  c)代謝予備能が、MM中で培養されたhCO内で高度であることを示す図である。  d)脂肪酸の酸化が、MM中で培養されたhCO内で高度であることを示す図である。  e)mtDNAが、MM中で培養されたhCO内で高度であることを示す図である(ND1及びRNA18S5を、内因性ゲノム対照として使用するqPCR)(n=4回の実験)。  f)炭素代謝物の測定(n=2、各々、12〜14例ずつのhCOをプールした)は、MM中で培養されたhCO内の代謝が、解糖から、脂肪酸の酸化へと切り替わることを確認することを示す図である。カッコ内の赤字の値は、CTRL培地中と対比した、MM中の倍数を指し示す。メタボロミクス値は、CTRL培地中で培養されたhCO内と対比した、MM中で培養されたhCO内のDNA強度に照らして正規化する。  データは、平均値±s.e.m.である。t検定(b〜d)、又は比の対応のあるt検定(e)による、*P<0.05、**P<0.01である。
【図１１】hPSC-CMの増殖及びWNT-β-カテニンシグナル伝達が、MM中で培養されたhCO内で抑制されることを示す図である。  a)MM中のhCOの培養(のべ11日間)が、hPSC-CM(α-アクチニン)の増殖(Ki-67)を低減することを示す図である。3〜4回の実験によるn=11〜14例のhCOである。4396のhPSC-CMは、手作業によりカウントした。スケールバー=20μmである。  b)MM中のhCOの培養(のべ11日間)が、hPSC-CM(α-アクチニン)の有糸分裂を低減する(pH3)ことを示す図である。5回の実験によるn=10である。7838のhPSC-CMは、手作業によりカウントした。  c)48時間後における、異なる代謝の条件下で培養されたhCO内の、活性化β-カテニンの強度が、インスリンの欠如は、活性化β-カテニンの減少の一因であることを明らかにすることを示す図である。3回の実験によるn=6〜13である。  d)インスリンを伴うMM中のhCO内、及びインスリンを伴わないMM中のhCO内の、活性化β-カテニンの代表的な免疫染色を示す図である。スケールバー=200μmである。カラー画像上方の挿入図は、白色の活性化β-カテニン単独である。  e)48時間後における、異なる代謝の条件下で培養されたhCO内の、Ki-67強度が、インスリンの欠如は、細胞周期活性の初期の降下の一因であることを明らかにすることを示す図である。3回の実験によるn=6〜13である。スケールバー=20μmである。  f)細胞周期活性(Ki-67)と、活性化β-カテニンとが、異なる代謝の条件下で培養されたhCO内で、高度に相関したことを示す図である。3回の実験によるn=146である。  g)長期間の培養(MM中で9日間にわたる)の後、48時間にわたるインスリンの再導入が、hPSC-CM(α-アクチニン)の増殖(Ki-67)を回復させえなかったこと(代表的な免疫染色)を示す図である。  h)長期間の培養(MM中で9日間にわたる)の後、48時間にわたるインスリンの再導入後におけるhCO内のKi-67強度が、増殖を回復させえなかったことを示す図である。2回の実験によるn=10〜11例のhCOである。  i)増殖する(Ki-67)hPSC-CM(α-アクチニン)の定量化が、長期間の培養(MM中で9日間にわたる)の後、48時間にわたるインスリンの再導入は、増殖を回復させえなかったことを明らかにすることを示す図である。2回の実験によるn=3〜4例のhCOである。2441のhPSC-CMは、手作業によりカウントした。  スケールバー=20μmである。データは、平均値±s.e.mであり、t検定(a)を使用する、**P<0.01である。P値は、t検定(b、h、i)、ピアソン相関(r)及びp値(f)を使用して計算した。二元ANOVAを使用して、INS -が、INS +と統計学的に異なる場合のP<0.0001である(c、e)。
【図１２】図5に提示したデータを実証する、異なる細胞系に由来するhCO内のKi-67強度、及び異なる代謝条件下における収縮力を示す図である。  a)H9に由来するhCO(n=10)内のKi-67強度を示す図である。  b)hIPSCに由来するhCO(n=4)内のKi-67強度を示す図である。  c)48時間後における、異なる代謝条件下で培養された、HES3に由来するhCO内の収縮力を示す図である。3回の実験によるn=11〜15である。  データは、平均値±s.e.m.である。t検定(a、b)を使用する、**P<0.01である。
【図１３】MM中のhCOの培養が、DDRを誘導することを示す図である。  a)CTRL培地中と対比したMM中で有意に調節されたタンパク質を示すヒートマップであって、GOターム「DNA損傷刺激に対する細胞応答」についてのプロテオミクスデータに由来するヒートマップを示す図である。データは、全ての条件について、平均値と比べたlog2表示として(n=3回の実験)提示する。  b)MM中で培養されたhPSC-CM(MLC2v)の増大を示すDNA内の酸化による塩基修飾である、8-オキソ-7,8-ジヒドログアニン(8-OxoG)についての核内強度を示す図である。n=120〜180のhPSC-CM核である。挿入図は、白色の8-OxoG単独である。  c)MM中で培養されたhPSC-CM(MLC2v)の増大を示すリン酸化(Serl987)ATM(pATM)についての核内強度を示す図である。n=120〜240のhPSC-CM核である。挿入図は、白色pATM単独である。  スケールバー=20μmである。データは、平均値±s.e.m.である。t検定(b、c)を使用する、****P<0.0001である。
【図１４】Heart-Dynoデバイスのウェルについての好ましい実施形態を示す図である。
【図１５】収縮力を測定するためのシステムについての概略描示である。
【図１６】成熟培地中で成熟させた心臓オルガノイドの、非増殖性状態を示す図である。  a)5μMのCHIR99021及び0.05%のDMSO(対照)に応答して、2Dゼラチンでコーティングされたプレート内のCTRL培地中で培養された、増殖する(Ki-67)hPSC-CM(α-アクチニン)の定量化を示す図である。データは、4回の独立の実験である。これらの実験では、3160個の心筋細胞を、手作業によりカウントした。  b)増殖する(Ki-67)hPSC-CM(α-アクチニン)の定量化が、MM中で培養されたhCOは、CHIR99021(24時間にわたる処理)に対する増殖性応答を鈍らせたことを確認することを示す図である。2回の実験によるn=7〜8である。10,609のhPSC-CMは、手作業によりカウントした。  スケールバー=20μmである。データは、平均値±s.e.m.である。ダネットの事後検定(a)又はテューキーの事後検定(b)を伴うANOVAを使用する、*P<0.05、**P<0.01、****P<0.0001である。
【図１７】成熟hCOを使用する毒性スクリーニングを示す図である。  a)ヒト心筋細胞が、収縮のための、全ての主要なイオンチャネル、カルシウムハンドリングタンパク質、及びサルコメアタンパク質を発現させることから、毒性スクリーニングのための良好なモデルとなっている(図6のRNA-seqからのデータ)ことを示す図である。  b)不整脈作用の危険性が高度である、公知の分子に対する、成熟hCO内の50%弛緩時間(Tr)についての濃度反応曲線を示す図である。  c)不整脈作用の危険性が中等度である、公知の分子に対する、成熟hCO内の50%弛緩時間(Tr)についての濃度反応曲線を示す図である。  d)不整脈作用の危険性が低度である、公知の分子に対する、成熟hCO内の50%弛緩時間(Tr)についての濃度反応曲線を示す図である。  データは、平均値±S.E.M.として提示する。被験分子1個当たりのn=4〜6hCOである。hAH:ヒト成人心臓である。
【図１８】糖尿病性条件が、心臓機能の、駆出率が保持された心不全(HFpEF)様変更を促進することを示す図である。  a)収縮力を、グルコース/インスリンの供給量の変更と共に示す図である。  b)弛緩時間(拡張機能)を、グルコース/インスリンの供給量の変更と共に示す図である。n=8であり、テューキーの事後検定を伴うANOVAを使用する、ベースラインの成熟培地(1mMグルコース、インスリンを伴わない)からの**p<0.01である。
【図１９】成熟培地(MM)がまた、2D心筋細胞培養物中の細胞周期活性も低減することを示す図である。  異なる培地組成中の、3日間にわたる培養の後における、増殖する(Ki-67+)心筋細胞(α-アクチニン+)の定量化である(n=8〜12のウェル)。データは、平均値±S.E.M.として提示し、テューキーの事後検定を伴うANOVAを使用する、**P<0.01、****P<0.0001である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、心臓の成熟に対する代謝の影響についてスクリーニングすることを目的とする作業から生じた。この作業の1つの側面は、バイオ工学処理されたヒト心臓組織におけるハイスループットスクリーニングのための96ウェルデバイスの開発であった。心臓動力計(又は「Heart-Dyno」)は、組織サイズを制限することにより、稠密な筋束を形成するようにデザインされ、デバイスの形状は、自動化された組織の形成、培養、組織ハンドリングを伴わない収縮力の解析を可能とする。Heart-Dynoを使用して、hPSCに由来する心筋細胞及び心臓オルガノイドの、構造、電気生理学、代謝、及び増殖における成熟を促進する、完全に無血清の3D培養物条件が規定された。したがって、本発明は、幹細胞に由来する心臓組織であって、心臓オルガノイドの形態等の心臓組織の、構造、電気生理学、代謝、及び/又は増殖における成熟を容易とするための、方法、培養培地、及び/又はシステムを対象とする。
【００２７】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施又は試行では、本明細書で記載される方法及び材料と同様又は同等な、任意の方法及び材料を使用しうるが、好ましい方法及び材料について記載する。
【００２８】
本明細書で使用された、文脈がそうでないことを要請する場合を除き、「〜を含む(comprise)」という用語、並びに「〜を含むこと(comprising)」、「〜を含む(comprises)」、及び「含まれた(comprised)」等、この用語の変化形は、更なる添加物、成分、整数、又は工程を除外することを意図しない。
【００２９】
不定冠詞である「ある(a)」及び「ある(an)」とは、単数形の不定冠詞として、又は、他の形で、不定冠詞が言及する、1つの対象を超える対象、若しくは単一の対象を超える対象を除外するものとしては読まれないものとすることが察知されるであろう。例えば、「ある(a)」細胞は、1つの細胞、1つ又は複数の細胞、及び複数の細胞を含む。
【００３０】
本明細書で使用される「約」という用語は、言明された値が、言明された値を上回る値又はこれを下回る値を包摂するものとみなす。好ましくは、この文脈では、範囲は言明された値を、2、5、又は10%上回る場合もあり、これを下回る場合もある。例だけを目的として述べると、「約100μM」とは、90〜110μMの場合もあり、95〜105μMの場合もあり、98〜102μMの場合もある。
【００３１】
本発明の目的では、「単離された」とは、その天然状態から取り出されているか、又は、他の形で、人間の操作下に置かれた材料を意味する。単離された材料(例えば、細胞)は、それが、その天然状態において、通常伴う成分を、実質的に、又は本質的に含まない場合もあり、それが、その天然状態において、通常伴う成分と併せて、人工状態にあるように操られている場合もある。
【００３２】
「濃縮された」又は「精製された」とは、特定の状態(例えば、濃縮又は精製された状態)における発生、表示、又は頻度が、濃縮又は精製の前の、事前の状態と比較して大きいことを意味する。
【００３３】
ある特定の態様では、本発明は、広く、心筋細胞等の心臓細胞を、ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞等の始原細胞から分化させるのに適している、細胞培養培地、システム、及び/又は方法を対象とする。
【００３４】
本発明の態様は、基礎培地、1つ又は複数の脂肪酸、グルコース及びアルブミンを含む、心臓細胞成熟培地を提供する。
【００３５】
本発明の別の態様は、
(i)第1の態様の心臓細胞成熟培地と;
(ii)各々がウェルの基底面から実質的に垂直に伸びる対向ポールを含む、複数のウェルを含む、心臓細胞培養容器と
を含む、心臓細胞培養システムを提供する。
【００３６】
本発明の更に別の態様は、心臓細胞を培養する方法であって、1つ又は複数の始原細胞を、1つ又は複数の始原細胞の、心筋細胞への成熟を誘導又は促進するのに十分な時間にわたり、これに適する条件下で、第1の態様の心臓細胞成熟培地と接触させる工程を含む方法を提供する。
【００３７】
「始原細胞」とは、自己再生を伴うか又は伴わずに、1つ又は複数の発生経路に沿って分化させることが可能な細胞である。典型的に、始原細胞は、単能性又は少能性であり、少なくとも限定的な自己再生が可能である。
【００３８】
「ヒト胚性幹細胞」、「hES細胞」、及び「hESC」という用語は、ヒトの胚又は胚盤胞から導出されるか、得ることができるか、又はこれらに由来する細胞であって、自己再生性及び多能性又は全能性であり、成熟動物において存在する細胞型の全てをもたらす能力を有する細胞を指す。ヒト胚性幹細胞(hESC)は、例えば、ヒトin vivo着床前胚、in vitro受精胚、又は胚盤胞段階へと拡大されたヒト単細胞胚から得られたヒト胚盤胞から単離することができる。
【００３９】
「人工多能性幹細胞」及び「iPSC」という用語は、OCT4、SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、及びSOX18、KLF4、LIN28、Glis1、並びにc-MYCを含むがこれらに限定されない転写因子等の外因性遺伝子の発現を介して、多能性状態へとリプログラミングされた、任意の種類のヒト成人体細胞から導出可能であるか、得ることができるか、又はこれらに由来する細胞を指す。
【００４０】
「〜を分化させる」、「〜を分化させること」、及び「分化した」という用語は、細胞の、発生経路の早期段階又は初期段階から、発生経路の後の段階、又はより成熟した段階への発育又は成熟に関する。この文脈では、「分化した」とは、細胞が、完全に分化し、多能性、又は発生経路に沿って、若しくは他の発生経路に沿って、更に発育する能力を喪失したことを意味又は含意しないことが察知されるであろう。分化は、細胞分裂を伴いうる。
【００４１】
本明細書で使用される「心筋細胞(cardiomyocyte)」とは、心筋細胞(myocardiocyte)又は心筋細胞(cardiac myocyte)としてもまた公知である、心筋細胞(cardiac muscle cell)であって、心臓の心房及び心室において見出されるような心筋である。各心筋細胞(myocardial cell)は、心筋細胞(cardiac muscle cell)の基本的な収縮単位である筋原線維を含有する。心筋細胞(cardiomyocyte)は、典型的に、1つ又は2つの核を含有するが、最大で4つの核及び比較的大きなミトコンドリア密度を有する場合があり、これは、筋肉収縮のための、アデノシン三リン酸(ATP)の産生を容易とする。心筋梗塞は、心筋細胞(cardiomyocyte)の死を引き起こす。成人では、これらの喪失した心筋細胞を再生する心臓の能力が限定的であることから、心機能の障害並びに高度な罹患率及び死亡率がもたらされる。
【００４２】
当技術分野でよく理解される通り、細胞の分化の段階又は状態は、複数のマーカーのうちの1つの発現及び/又は非発現を特徴としうる。この文脈では、「マーカー」とは、細胞、細胞集団、系列、細胞のコンパートメント又はサブセットのゲノムによりコードされる核酸又はタンパク質であって、それらの発現又は発現パターンが、発生を通して変化する核酸又はタンパク質を意味する。核酸マーカーの発現は、当技術分野で公知の、任意の技法であって、核酸配列の増幅(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応)及び核酸ハイブリダイゼーション(例えば、マイクロアレイ、ノーザンハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション)を含むがこれらに限定されない技法により検出又は測定することができる。タンパク質マーカーの発現は、当技術分野で公知の、任意の技法であって、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫ブロット法、タンパク質アレイ、タンパク質プロファイリング(例えば、2Dゲル電気泳動)を含むがこれらに限定されない技法により検出又は測定することができる。好ましくは、タンパク質マーカーは、タンパク質マーカーに結合する抗体又は抗体断片(ポリクローナルの場合もあり、モノクローナルの場合もある)により検出される。抗体は、放射性標識、フルオロフォア(例えば、Alexa色素)、ジゴキシゲニン、又は酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ)等であるがこれらに限定されない標識により標識化することが適切である。Table 1(表1)及びTable 2(表2)は、本発明に従うマーカーの検出に有用な、マーカー、抗体、及びフルオロフォアの、特定の非限定的な例を提示する。マーカーは、代替的に、分化又は発生の結果としての細胞の変化を伴う代謝過程の産物である、「代謝物」でもありうる。
【００４３】
本明細書で一般に使用される「血清」という用語は、動物(例えば、ウシ胎仔血清)から得られるか、又は得ることができる、実質的に無細胞のタンパク質性血液画分を指し、アルブミン等の精製血清成分も組換え合成血清成分も含まない。この文脈では、無血清培地としての「無血清」とは、血清の完全な非存在を意味するか、又は、約1%、0.5%、0.2%、又は0.1%(v/v)を超えない血清を指す場合がある。
【００４４】
本明細書で開示される心臓細胞培養培地の特定の特徴は、心筋細胞の成熟、並びに操作心臓組織(EHT)及び心臓オルガノイドの形成を最適化する成分(component)又は構成成分(constituent)の選択である。
【００４５】
方法の初期工程は、hESC又はiPSC等の始原細胞を、心臓中胚葉へと分化させ、次いで、心筋細胞へと分化させる。まず、始原細胞を、RPMI等の無血清基礎培地を、インスリンの非存在下、約2%(v/v)の好ましい濃度で、B27等の補充物質と併せて含む培養培地中で、心臓中胚葉へと分化させる。培養培地は、アスコルビン酸-2-リン酸塩、BMP-4、アクチビンA、FGF-2、及びCHIR99021等のGSK-3阻害剤を更に含みうる。その後、細胞を、IWP-4等のWnt阻害剤の存在下に続き、補充培地(例えば、RPMI+2%のB27)中に、インスリン及びアスコルビン酸-2-リン酸塩を添加して、約15日後におけるコラゲナーゼ消化まで、心筋細胞へと分化させる。
【００４６】
次いで、コラゲナーゼで消化された心筋細胞を、心臓細胞成熟培地中で培養することができる。心臓の成熟培地は、αMEM、DMEM、イスコフ培地、又はRPMI1640等、任意の無血清培地でありうる「基礎培地」を含むことが適切である。一部の実施形態では、基礎培地は、α-MEM GlutaMAXである。心臓細胞成熟培地は、無血清であることが適切である。心臓細胞成熟培地は、B27等であるがこれらに限定されない補充物質を更に含みうる。好ましい実施形態では、心臓細胞成熟培地は、精製ウシ血清アルブミン若しくは組換えウシ血清アルブミン、又はヒト血清アルブミン等のアルブミンを含む。アルブミンは、B27等の補充物質中に存在する場合もあり、培地の別個の成分として含まれる場合もある。アルブミンの濃度は、好ましくは、約2mg/mL以上、1mg/mL以上、0.5mg/mL以上、0.2mg/mL以上、又は最少で、0.1若しくは0.05mg/mLであることが適切である。心臓細胞成熟培地は、L-アスコルビン酸-2-リン酸塩を更に含みうる。
【００４７】
心臓細胞成熟培地は、心臓細胞懸濁液、図20に示されたもの等、単層又は二次元「2D」培養物を作製するのに適しうる。
【００４８】
三次元「3D」心臓組織又はオルガノイドを作製する、他の実施形態では、上記で言及した、心臓細胞成熟培地中の培養の前に、細胞を、無血清基礎培地と、上記で記載したB27等の補充物質(アルブミンは含むが、インスリンは含まない)と、細胞外マトリックス(ECM)又はこれらの成分とを含むゲル化培地中で培養する。本明細書で広く使用される「ECM」とは、細胞の外側又は外部に位置する、分子のマトリックス又は網状組織であって、細胞間コミュニケーション、細胞のシグナル伝達、細胞の接着、間隔、位置、及び/又は配向性であるがこれらに限定されないものを調節するマトリックス又は網状組織を指す。ECMの分子成分は、プロテオグリカン、硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチン、ケラチン、コラーゲン(例えば、I〜XIV型)、エラスチン、ラミニン、及びフィブロネクチンであるがこれらに限定されない分子成分を含みうる。
【００４９】
一部の実施形態では、ECMは、Matrigel(商標)の形態で存在しうる。Matrigel(商標)の濃度は、ゲル化培地のうちの、約2〜20%(v/v)、好ましくは約5〜15%(v/v)、より好ましくは約7〜12%(v/v)、若しくは8〜10%(v/v)の場合もあり、約9%.(v/v)であると有利な場合もある。コラーゲンはまた、ゲル化培地のうちの、約2mg/mLを超える濃度で存在することが適切な場合もあり、約2.6mg/mLで存在すると有利な場合もある。これは、細胞1.5×106個当たり約0.23mgである。心筋細胞は、Matrigel(商標)及びコラーゲンを含むゲル化培地中、典型的に、約37℃で、約30分間にわたりゲル化することが適切である。特に、9%等の高濃度における、Matrigel(商標)の存在は、Heart Dynoにおいて作製された3D心臓組織の、長期にわたる構造的完全性であって、心臓組織塊が、Heart Dynoの対向ポールから剥離する「ネッキング」を引き起こす細胞張力により損なわれうる構造的完全性に有利である。
【００５０】
ゲル化の後、心筋細胞を、1つ又は複数の脂肪酸、アルブミン、及びグルコースを含む、心臓成熟培地中で成熟させる。同様に、「2D」単層として培養された心筋細胞を、1つ又は複数の脂肪酸、アルブミン、及びグルコースを含む、心臓成熟培地中で成熟させる。1つ又は複数の脂肪酸及びグルコースは、約1:5〜約1:60、約1:7〜1:20の濃度比で存在しうる。好ましくは、1つ又は複数の脂肪酸及びグルコースは、約1:10の濃度比で存在する。脂肪酸は、哺乳動物細胞内の、酸化による脂肪酸代謝のための基質として作用することが可能な、飽和脂肪族鎖又はモノ不飽和脂肪族鎖若しくはポリ不飽和脂肪族鎖を伴う、任意のカルボン酸でありうる。好ましくは、脂肪酸は、12〜20個の炭素原子を含む脂肪族鎖(すなわち、C12〜C20脂肪酸)を有する。好ましくは、脂肪酸は、16又は18個の炭素原子を含む脂肪族鎖(すなわち、C16又はC18脂肪酸)を有する。脂肪酸は、リノレン酸、パルミチン酸、リノール酸、又はオレイン酸であるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、脂肪酸は、パルミチン酸であるか、又はこれを含む。パルミチン酸等の脂肪酸は、1〜1000μM、5〜500μM、10〜200μM、又は50〜150μMの範囲の濃度で存在しうる。パルミチン酸等の脂肪酸の好ましい濃度は、約100μMである。
【００５１】
グルコースの好ましい濃度は、約0.5〜5.5mMであるか、又は約1mMであると有利である。
【００５２】
グルコースが、D-グルコース、並びに哺乳動物細胞内の解糖のための基質として作用しうる、D-グルコースの、任意の開鎖異性体、キラル異性体、及び/又は環状異性体を含むこともまた理解されるであろう。
【００５３】
典型的に、心臓細胞成熟培地は、インスリンを含まないか、又はインスリンの最小濃度を含む。インスリンの最小濃度は、心筋細胞の増殖(KI67の発現により測定される増殖等)及び/又はWnt/β-カテニンの活性化であって、インスリンの完全な非存在下で見られる活性化を、5〜10%を超えずに上回る活性化を刺激する濃度であることが適切である。
【００５４】
必ずしも理論に束縛されることを望まないが、心臓は、発生の早期段階における、優先的な解糖代謝から、成熟状態における、ほぼ専一的な酸化代謝へとシフトすることが提起されている。こうして、発生のこの段階は、血中の低レベルの脂肪酸及び高レベルの乳酸塩を特徴とするので、基質の循環レベルが、胎児の心臓において見られる解糖代謝の確立において主要な役割を果たす。出生前代謝は、炭水化物の主な使用を特徴とし、脂肪酸の酸化は、全エネルギー産生のうちの約15%に寄与するに過ぎない。成人の心筋細胞による代謝は、ほぼ専一的な酸化(全エネルギー産生のうちの約90%)である。実施例において提示されるデータは、心臓細胞成熟培地が、エネルギー代謝を、インスリン依存性かつグルコース依存性の解糖代謝から、Wnt/β-カテニンによるシグナル伝達及び細胞周期の進行の阻害と相関する脂肪酸代謝へと切り替えることを示唆する。これらの条件は、心筋細胞の成熟を優先すると考えられる。しかし、グルコースの完全な非存在は、好ましくなく、この場合、本明細書の前出記載される通り、特定の脂肪酸:グルコース比が好ましい。
【００５５】
心臓細胞成熟培地は、TGF-β1を含まないか、又はTGF-β1の最小濃度若しくは最小量を含むことが適切である。最小濃度のTGFβは、約2ng/mL未満であるか、又は、好ましくは、約1ng/mLを超えないことが適切である。TGF-β1の最小濃度は、存在する場合、5日未満の培養、好ましくは、最初の5日間の培養のための濃度であることが適切である。実施例で、より詳細に記載される通り、成熟培地中のTGF-β1の存在の延長は、著明な細胞死を引き起こし、EHTの収縮機能を損なった。
【００５６】
心臓細胞成熟培地は、FGF2等の線維芽細胞増殖因子(FGF)を含まないか、又は最小濃度若しくは最小量のFGF2を含むことが適切である。
【００５７】
本発明の別の態様は、各々がウェルの基底面から実質的に垂直に伸びる対向ポールを含む、複数のウェルを含む、心臓細胞培養容器を含む、心臓細胞成熟システムを提供する。ウェル及び対向ポールは、対向ポールに係合し、これらを取り囲む、稠密な筋束を含む、心臓オルガノイドの形成を最大化する大きさ、形状であり、このように方向付けられていることが適切である。実施例において、図15を参照して、より詳細に記載される通り、筋束により引き起こされる対向ポールの変位は、収縮力の測定を容易とする。
【００５８】
典型的に、ウェル、又はウェルの、少なくとも上部外周は、実質的に卵形である。ウェルは、ウェルの長軸に沿って、離れて、隔てられた、対向ポールを含むことが適切である。ポールは、長軸に沿って、離れて、対称的に隔てられていることが適切である。ポールは、ウェルの基部に対して、実質的に垂直でありうるが、ウェルの上部外周より上部へは突出しない。ウェルの、特定の、非限定的な大きさは、3mmの長軸と、2mmの短軸とを含む。対向ポールは、方形又は矩形の断面を有するブロック形でありうる。特定の形態では、対向ポールは、断面が、0.2mm×0.5mmの大きさを有する矩形でありうる。特定の形態では、対向ポールは、長軸に沿って、ポールの中心から約1.0mm離れて、対称的に隔てられている。ウェルの特定の例を、図14に示し、また、図1にも示す。心臓成熟容器は、当技術分野で公知の、24、48、96、384ウェルフォーマット、又は他のマルチウェルフォーマット等、本明細書で開示される複数のウェルを含みうる。
【００５９】
心臓成熟容器は、稠密な筋細胞束を形成する心臓動力計(又は「Heart-Dyno」)デバイスであって、自動化された心臓組織の形成、培養、及び収縮力の解析のための心臓動力計デバイスでありうるか、又はこの構成要素でありうる。Heart-Dynoデバイスの利点は、形成、培養、及び収縮力の解析における組織ハンドリングを、最小化するか、又はなくすことである。実施例から理解される通り、「Heart-Dyno」デバイスは、特に、本明細書の前出で記載された細胞培養培地を開発するのに有利な、収縮力の測定をもたらした。収縮力の測定の実施についての詳細な記載を、本明細書の後出の実施例で行い、概略を、図15に示す。加えて、心筋細胞の増殖(例えば、Ki67の発現による)及び成熟(例えば、心室ミオシン軽鎖2の発現による)を評価すること等のために、心筋細胞についての免疫組織化学も、たやすく実施することができる。
【００６０】
本発明の関連する態様は、心臓細胞成熟をモジュレートする1つ又は複数の分子を同定する方法であって、1つ又は複数の心筋細胞を、本明細書で開示される心臓細胞培養システム内の1つ又は複数の候補分子と接触させる工程を含み、1つ又は複数の心筋細胞の成熟の修飾が、候補分子が心臓細胞成熟のモジュレーターであることを指し示す方法を提供する。
【００６１】
一実施形態では、モジュレーターは、少なくとも部分的に、心臓細胞成熟を増強又は促進する。前出から察知される通り、このようなモジュレーターは、特に、特定の比で存在する場合に、グルコース及びパルミチン酸等の脂肪酸を含む。少なくとも部分的に、心臓細胞成熟を増強又は促進する、他のモジュレーターは、この方法に従い同定しうることが察知されるであろう。
【００６２】
別の実施形態では、モジュレーターは、少なくとも部分的に、心臓細胞成熟を阻害又は抑制する。前出から察知される通り、このようなモジュレーターは、長時間にわたる、インスリン及び比較的高濃度のTGF-β1を含む。心臓細胞成熟を、少なくとも部分的に阻害又は抑制する、他のモジュレーターは、この方法に従い同定しうることが察知されるであろう。「心臓細胞成熟を、少なくとも部分的に阻害又は抑制する」とは、心筋細胞に対して毒性であり、かつ/又は細胞死をもたらすモジュレーター(例えば、心筋細胞アポトーシスの誘導剤)を含むことが理解されるであろう。
【００６３】
一部の実施形態では、心筋細胞は、始原細胞から分化している。始原細胞は、ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である場合もあり、これを含む場合もある。
【００６４】
本発明のこの態様は、心筋細胞の成熟をモジュレートしうる候補分子を同定、アッセイ、又はスクリーニングするための方法又はシステムを提供することが察知されるであろう。候補分子は、コンビナトリアルライブラリー、天然産物ライブラリー、合成化学物質ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、リード化合物ライブラリー、及びスクリーニングに適する分子の、他の任意のライブラリー又はコレクションの中に存在しうる。
【００６５】
本発明の更なる態様は、本明細書で開示される方法により作製される、1つ又は複数の心筋細胞又は心臓組織又は心臓組織を含むオルガノイドを提供する。
【００６６】
既に記載した通り、心臓細胞成熟培地、成熟システム及び方法は、心臓細胞懸濁液、単層培養物又は「2D培養物」を作製するのに適しうる。
【００６７】
他の特定の実施形態では、心臓細胞成熟培地、成熟システム及び方法は、EHT又は心臓「オルガノイド」等の三次元(3D)構造内で、心筋組織を作製するのに適しうる。オルガノイドは、操作心臓組織又は人工心臓組織を作製するために使用することができる。例えば、心臓オルガノイドを、脱細胞化ヒト心臓、ポリエステルフリース、又は生体分解性のポリマー足場等の足場内に組み込んで、これにより、心臓3D構造を作製することができる。また、「バイオプリンティングされた」3D心臓構造も想定される。
【００６８】
例だけを目的として述べると、ハイドロゲル足場を使用して、ヒト細胞を、所望の配向性で配置して、ヒト臓器を複製する、臓器プリンティングマシンが開発されている。
【００６９】
本明細書で記載される心筋細胞及び/又は心臓オルガノイドは、心臓の細胞療法のための、精製され分化した心筋細胞の潜在的な供給源をもたらしうることもまた察知されるであろう。特定の実施形態では、遺伝的な心臓欠損又は心疾患を伴う患者から導出されるか、得られるか、又はこれらに由来するiPSC系は、in vitroにおける遺伝子突然変異の修復のために使用することができる。このような心臓細胞、EHT、又はオルガノイドは、本発明の方法に従い使用し、次いで、自家細胞療法のために、患者へと投与することができるであろう。一部の実施形態では、本発明に従い作製された心臓細胞、EHT、又はオルガノイドは、心臓へと、組織パッチ、組織マット、組織プラグ、組織ボーラスの形態、又は他の植込み可能な形態で、直接投与することができる。
【００７０】
本明細書で記載される心筋細胞及び/又は心臓オルガノイドは、心疾患のモデル化のための、精製され分化した心筋細胞の潜在的な供給源をもたらしうることもまた察知されるであろう。例を目的として述べると、遺伝子欠損を有する、心筋細胞を含む心臓オルガノイドの収縮特性を決定すること等により、心機能に対する遺伝子欠損の効果を探索することができる。更なる実施形態では、遺伝子欠損の処置又は是正における、薬物又は他の分子の有効性も、本明細書で記載される心筋細胞及び/又は心臓オルガノイドにより評価することができる。
【００７１】
他の実施形態では、本明細書で記載される心筋細胞及び/又は心臓オルガノイドは、遺伝子発現をモジュレートすること(例えば、遺伝子の「ノックアウト」、「ノックダウン」、又は過剰発現)の効果についての、モデル化、探索、又は予測等、患者特異的な心疾患のモデル化及び心臓生物学等の適用において使用することができる。
【００７２】
したがって、本発明の特定の態様は、心臓細胞、組織、又はオルガノイドに対する1つ又は複数の分子の効果を決定、評価、又はモニタリングする方法であって、本明細書で開示される方法に従い作製された心臓細胞、オルガノイド、又は操作心臓組織を、1つ又は複数の分子と接触させる工程、及び心臓細胞、オルガノイド、又は操作心臓組織に対する1つ又は複数の分子の効果を決定、評価、又はモニタリングする工程を含む方法を提供する。
【００７３】
本発明のこの態様は、心臓細胞、組織、又はオルガノイドに対する1つ又は複数の分子の効果を決定、評価、又はモニタリングするための方法を提供することが察知されるであろう。効果は、心臓の疾患又は障害の処置における治療有効性、薬物の投与量の決定、毒性及び/又は安全性(例えば、薬物の副作用の評価)、並びに心臓細胞、組織、又はオルガノイドの収縮特性でありうるか、又はこれに関しうるが、これらに限定されない。
【００７４】
1つ又は複数の分子は、公知の薬物又は既存の薬物の場合もあり、コンビナトリアルライブラリー、天然産物ライブラリー、合成化学物質ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、リード化合物ライブラリー、及び方法に適する分子の、他の任意のライブラリー又はコレクションの中に存在する場合もある。
【００７５】
方法についての特定の実施形態では、心筋細胞及び/又は心臓オルガノイドは、毒性スクリーニング又はin vitroにおける薬物安全性試験に有用でありうる。心毒性であり、特に、心不整脈、心筋症、及び/又は急性冠動脈症候群を引き起こす、いくつかの薬物及び他の分子が存在する。これらは、シサプリド、Ca2+チャネルブロッカー、K+チャネルブロッカー、及びNa+チャネルブロッカー、βブロッカー、及びアントラサイクリン等の化学療法剤を含む。薬物を、心筋細胞及び/又は心臓オルガノイドに照らしてスクリーニングして、一般的な心毒性を決定することもでき、特定の個体の始原細胞から得られた心筋細胞又はオルガノイドが、潜在的に心毒性の薬物又は他の分子若しくは化合物に対して、感受性を提示するのかどうかを決定することもできる。
【００７６】
既に記載した通り、一部の実施形態では、心臓細胞、組織、又はオルガノイドは、1つ又は複数の特定の遺伝子欠損を有する個体の始原細胞から得ることができる。例を目的として述べると、本発明は、候補薬物又は他の分子を、異なる遺伝子的バックグラウンドを有する、本明細書で開示される心筋細胞及び/又は心臓オルガノイドに照らして調べて、特定の遺伝子的バックグラウンドと相関する、示差的な薬物有効性及び/又は副作用が存在するのかどうかを決定する、「遺伝子バックグラウンド試験」を想定する。これは、特定の遺伝子的バックグラウンドを伴う患者に適切な薬物療法の選択を可能としうる。
【００７７】
本発明をたやすく理解し、実行しうるように、以下の非限定的な実施例を参照する。
【実施例】
【００７８】
序説
哺乳動物の心臓は、成人の機能的な要請の増大を満たすように、出生後における発育時に成熟を経る。しかし、この過程の鍵となる駆動因子は、依然としてほとんど規定されないままである。現在のところ、ヒト多能性幹細胞に由来する心筋細胞(hPSC-CM)内の、出生後における成熟を再現することは不可能であることから、再生用治療剤を発見するための、モデルシステムとしてのそれらの可能性は制約されている。本実施例では、本発明者らは、本発明者らの研究の概要を提示するが、研究では、本発明者らは、ヒト多能性幹細胞に由来する心臓オルガノイド(hCO)による機能的なスクリーニングのための、96ウェルデバイスを開発した。>10,000例のオルガノイドの精査により、本発明者らは、細胞外マトリックス、代謝の基質、及び増殖因子の条件を含むパラメータであって、心臓組織の生存率、機能、及び成熟を増強するパラメータを、系統的に最適化する。最適化された成熟条件下で、機能的特徴付け及び分子的特徴付けは、脂肪酸代謝への切替えが、心臓成熟の中心的な駆動因子であることを明らかにした。これらの条件下で、hPSC-CMは、分裂促進性刺激に対して不応性となり、本発明者らは、β-カテニン及びYAP1を含む、鍵となる増殖経路が抑制されることを見出した。
【００７９】
方法
ヒト多能性幹細胞
ヒト胚性幹細胞(hESC)の使用についての倫理的承認は、University of Queensland's Medical Research Ethics Committee(2014000801)から得られ、National Health and Medical Research Council of Australia(NHMRC)による法規に従いなされた。HES3(女性)及びH9(女性)hESC(WiCell)又はhiPSC(女性の、センダイウイルスによりリプログラミングされたCD34+細胞である、ATCC-BXS0116、ATCC)は、mTeSR-1(Stem Cell Technologies社)/Matrigel(Millipore社)を使用して、TrypLE(ThermoFisher Scientific社)により継代培養された培養物として維持した。核型解析及びDNAフィンガープリンティングは、品質管理として実施した。
【００８０】
ヒトRNA試料
成人ヒト心臓試料は、Clontech社から得た。成人試料は、外傷で死亡した、30〜39歳の白人男性に由来する、3つの心臓からプールした。
【００８１】
ヒトプロテオミクス試料
ヒト成人心臓試料を、健常な49歳の女性から得、University of Sydney(2012/2814)による倫理的承認下で瞬時凍結させたが、これは、National Health and Medical Research Council of Australia(NHMRC)による法規に従いなされた。
【００８２】
新生仔ラットの心室心筋細胞
心筋細胞は、既に記載されている(60)通り、PI Sprague-Dawley新生仔ラットに由来した。1〜2日齢の新生仔ラット(Sprague Dawley)を、心筋細胞の単離のために使用し、University of Queensland Ethics Committeeによる倫理承認下で、科学的目的のために、動物の管理及び使用についての、オーストラリア国内の実施規則に従い取り扱った。略述すると、新生仔ラットを、屠殺し、心臓を、切り出し、ADS緩衝液中で洗浄し、心房を摘出した。コラゲナーゼIIを使用して、筋肉細胞を単離し、Percoll勾配により分離した。Percoll勾配は、15mlのFalconチューブ内で、1:1.2のPercoll:ADS層を、1:0.5のPercoll:ADS層上に層状化させることにより構築した。単離された筋肉細胞を、ゼラチンでコーティングされたガラスカバースリップ上のCTRL培地(下記を参照されたい)中に、1cm2当たりの細胞1×105個で播種し、実験の前に、一晩にわたり回収した。
【００８３】
Heart-Dynoの加工
Heart-Dyno培養インサートは、標準的なSU-8フォトリソグラフィー及びPDMS成形法(16)を使用して加工した。微細加工カンチレバーアレイデザインは、DraftSight(Dassault Systems社)により作成し、多数の異なるデザインを、まず、実現可能性について調べた。次いで、デザインのフォトマスクを、MIVAフォトプロッターにより、7インチのHY2ガラスプレート(Konica Minolta社)へとプロットした。6インチのシリコンウェハー基板上の、SU-8フォトリソグラフィーは、-700μmの深さまで、構造を形成した。略述すると、シリコンウェハーを、アセトン、イソプロパノール、及びN2で清浄化し、次いで、150℃で、30分間にわたり脱気した。SU-8 2150フォトレジスト(Microchem社)を、スピンコーティングし、4時間にわたりソフトベーキングして、SU-8を、要請された厚さへとビルドアップした。次いで、ウェハーを、フォトマスク下で、1082mJ/cm2の総線量にわたり、UV光へと曝露した。次いで、曝露されたウェハーを、曝露後ベーキングし(65℃で、5分間;95℃で、40分間;65℃で、4分間)、超音波洗浄機内、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート中、45分間にわたり現像した。最終的なフィーチャーの高さは、光学表面プロファイラー(Veeco社)で測定した。Heart-Dynoは、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS;Sylgard 184、Dow Corning社;単量体:触媒比10:1で混合された)を伴うソフトリソグラフィーで成形し、65℃で、35分間にわたり硬化させた。6mmの穿孔機を使用して、型抜きし、96ウェルプレートに入れ、次いで、その後、これらを、70%エタノール及びUV光で滅菌し、PBSで洗浄し、ウェルの底部への細胞の付着を防止するように、3%のBSA(Sigma社)でコーティングした。
【００８４】
心臓の分化
近年開発されたプロトコール(13、56、58)を使用して、心臓細胞を作製した。hPSCを、Matrigelでコーティングしたフラスコ内、1cm2当たりの細胞2×104個で播種し、mTeSR-1を使用して、4日間にわたり培養した。次いで、5ng/mlのBMP-4(RnD Systems社)、9ng/mlのアクチビンA(RnD Systems社)、5ng/mlのFGF-2(RnD Systems社)、及び1μMのCHIR99021(Stem Cell Technologies社)を含有するRPMI B27培地(RPMI 1640 GlutaMAX+インスリンを伴わない2%のB27補充物質、200μMのL-アスコルビン酸-2-リン酸塩セスキマグネシウム塩水和物(Sigma社)、及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン(そうでないことが指し示されない限りにおいて、全て、ThermoFisher Scientific社))を使用して、毎日培地交換しながら、3日間にわたり、これらを、心臓中胚葉へと分化させた。その後、これらを、5μMのIWP-4(Stem Cell Technologies社)を含有するRPMI B27-に続く、更に、7日間にわたるRPMI B27+ (RPMI 1640 GlutaMAX+インスリンを伴う2%のB27補充物質、200μMのL-アスコルビン酸-2-リン酸塩セスキマグネシウム塩水和物、及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン)を使用して、2〜3日ごとに培地交換しながら、hPSC-CM/間質細胞混合物へと特殊化させた。次いで、分化細胞を、15日後における、37℃で、60分間にわたる、PBS(Ca2+及びMg2+を伴う)中に20%のウシ胎仔血清(FBS)中に0.2%のI型コラゲナーゼ(Sigma社)、に続く、10分間にわたる、0.25%のトリプシン-EDTAを使用する消化まで、RPMIB27+中で培養した。100μmメッシュ細胞ストレーナー(BD Biosciences社)を使用して、細胞を濾過し、300×gで、3分間にわたり遠心分離し、CTRL培地:α-MEMGlutaMAX、10%のFBS、200μMのL-アスコルビン酸-2-リン酸塩セスキマグネシウム塩水和物、及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン中に、要請される密度で再懸濁させた。フローサイトメトリーに基づき、組織操作のために作出及び使用された細胞は、約70%のα-アクチニン+/CTNT+ hPSC-CMであり、残余は主に、CD90+間質細胞であった(13)。
【００８５】
hCOの加工
CTRL培地:α-MEM GlutaMAX(ThermoFisher Scientific社)、10%  ウシ胎仔血清(FBS)(ThermoFisher Scientific社)、200μMのL-アスコルビン酸-2-リン酸塩セスキマグネシウム塩水和物(Sigma社)、及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン(ThermoFisher Scientific社)である。各hCOのために、CTRL培地中に5×104個の心臓細胞を、コラーゲンIと混合して、2.6mg/mlのコラーゲンI及び9%のMatrigelを含有する、3.5μlの最終溶液を作り出した。Matrigel及び細胞と混合する前に、10倍濃度のDMEM及び0.1MのNaOHのそれぞれを使用して、ウシ酸可溶化コラーゲンI(Devro社)を、まず、塩について平衡させ、pHについて中和した。混合物を、氷上で調製し、Heart-Dynoへとピペッティングした。次いで、Heart-Dynoを、100×gで、10秒間にわたり遠心分離して、hCOが、ポストの中程まで形成されることを確保した。次いで、混合物を、37℃で30分間にわたりゲル化させてから、組織を覆うように、CTRL培地を添加した(hCO 1つ当たり150μl)。Heart-Dynoのデザインは、ビルトイン型のPDMS製エクササイズポール(1μN当たり約0.07μm変形するようにデザインされた)の周囲における組織の自己形成を容易とする。培地は、2〜3日ごとに(hCO 1つ当たり150μl)交換した。
【００８６】
hCOを、形成のために、CTRL培地中で培養し、次いで、実験に適応の無血清培地と交換した。全てのスクリーニング実験のために、hCO形成の後で、hCOを、グルコースを伴わないDMEM、グルタミン、及びフェノールレッドを含む無血清条件(ThermoFisher Scientific社)であって、4%のB27(インスリンを伴うか又は伴わない)(ThermoFisher Scientific社)、1%のGlutaMAX(ThermoFisher Scientific社)、200μMのL-アスコルビン酸-2-リン酸塩セスキマグネシウム塩水和物、及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン(ThermoFisher Scientific社)を補充した無血清条件下で培養した。培地への添加物は、グルコース、パルミチン酸(37℃で、2時間にわたりインキュベートし、B27中のウシ血清アルブミンへとコンジュゲートさせた;Sigma社)、又はTGFβ-1(Peprotech社)を含んだ。hCOの最終加工、培養、及び成熟のためのプロトコールの時程表は、図1mに見出すことができる。
【００８７】
Heart-Dynoにおける、hCOについての力の解析
ポールのたわみを使用して、収縮力を近似した。Leica DMi8 inverted high content Imagerを使用して、37℃で、リアルタイムにおける、各hCOの収縮の、10秒間にわたる時間経過を捕捉した。スタッキングされたTIFFファイルを、AVIへと変換し、ポールの動きを追跡し(vision.PointTrackerを使用して)、収縮のパラメータを決定し、力-時間図を作製し、バッチデータを、Excel(Microsoft社)のスプレッドシートへとエクスポートするように、Matlab R2013a(Mathworks社)により、カスタムのバッチ処理ファイルを記述した。
【００８８】
スタッキングされたTIFFファイルを、AVIへと変換し、ポールの動きを追跡し(vision.PointTrackerを使用して)、収縮のパラメータを決定し、力-時間図を作製し、バッチデータを、Excel(Microsoft社)のスプレッドシートへとエクスポートするように、Matlab R2013a(Mathworks社)により、カスタムのバッチ処理ファイルを記述した。以下の式を使用して、各時点における収縮力を決定した。
【００８９】
指定された距離において適用された力:
【００９０】
【数１】
2019526255.tif 000003
【００９１】
による、1つの端部に固定された、矩形のカンチレバーの端部における、最大のたわみである。
【００９２】
式1及び式2を組み合わせて、
【００９３】
【数２】
2019526255.tif 000004
【００９４】
[式中、F=力、I=慣性のモーメント、E=ヤング率、b=ポールの長さ、h=ポールの幅(曲げの方向)、L=ポールの高さ、x=ポール上z方向の組織の位置、及びδ=ポールのたわみである]
【００９５】
本発明者らのシステムのパラメータに基づくと、E=1500kPa、b=0.5mm、h=0.2mm、L=0.7mm、及びx=0.35mm(hCOポールの中程)、k=14μN/μmとなる。
F=kS[式4](ポール1本当たり)
【００９６】
本発明者らは、高感度等尺性力変換器(ADInstruments社)を使用して、これらのパラメータを検証し、k=14.2±2.4μN/μm(n=10)と測定した。
【００９７】
全載免疫染色
hCOは、1%パラホルムアルデヒド(Sigma社)により、室温で、60分間にわたり固定し、PBSで、3回にわたり洗浄し、その後、これらを、PBS中に5%のFBS及び0.2%のTriton-X-100(Sigma社)であるブロッキング緩衝液中の一次抗体(Table 1(表1))と共に、4℃で、一晩にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、ブロッキング緩衝液中、2時間ずつ、2回にわたり洗浄し、その後、二次抗体(Table 1(表1))及びHoescht(1:1000)と共に、4℃で、一晩にわたりインキュベートした。これらを、ブロッキング緩衝液中、2時間ずつ、2回にわたり洗浄し、in situにおいて、又はFluoromount-G(Southern Biotech社)を使用して、顕微鏡スライド上にマウントしてイメージングした。
【００９８】
免疫染色解析
スクリーニングには、Leica DMi8 high content imaging顕微鏡を、in situイメージングのために使用して、hCOをイメージングした。バックグラウンドを削除し、画像強度を計算し、バッチデータを、Excel(Microsoft社)のスプレッドシートへとエクスポートするように、Matlab R2013a(Mathworks社)により、カスタムのバッチ処理ファイルを記述した。
【００９９】
より詳細な画像には、マウントイメージングのためにOlympus IX81共焦点顕微鏡又はNikon Diskovery Spinning Disk共焦点顕微鏡を使用した。細胞周期解析実験のために、3つのランダムな視野をイメージングし、増殖について、手作業により定量化した。これらを足し併せて、各hCO内のhPSC-CMの増殖百分率を計算した。
【０１００】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのために、細胞を、単一細胞へと解離させた。hCOを、まず、37℃の灌流緩衝液(130mMのNaCl、1mMのMgCl2、5mMのKC1、0.5mMのNaH2P04、10mMのHEPES、10mMのタウリン、10mMのグルコース、10μMの2,3-ブタンジオンモノキシム、pH7.4)中で、2回にわたり洗浄した。hCOを、37℃のEDTA緩衝液(130mMのNaCl、5mMのKC1、0.5mMのNaH2P04、10mMのHEPES、10mMのタウリン、10mMのグルコース、5mMのEDTA、10μMの2,3-ブタンジオンモノキシム、pH7.4)中で、5分間にわたりインキュベートした。hCOを、灌流緩衝液中で、2回にわたり洗浄し、次いで、750rpmのシェーカー上、37℃の灌流緩衝液+1mg/mlコラゲナーゼB(Roche社)中、30分間にわたりインキュベートした。次いで、hCOを、1000×gで、3分間にわたり遠心分離し、コラゲナーゼを除去し、750rpmのシェーカー上、37℃、0.25%のトリプシン-EDTA中、15分間にわたりインキュベートした。次いで、5%のFBSを伴う灌流緩衝液を添加し、1000×gで、3分間にわたり遠心分離することにより、単一細胞をペレット化させる。次いで、フローサイトメトリーのために、生細胞の細胞生存率を維持するように、PBSを、灌流緩衝液で置きかえることを除き、公開されているプロトコールを使用して、細胞を染色した。フローサイトメトリーは、Becton Dickinson LSR Fortessa X-20 cytometer上で実施し、Cyflogic 1.2.1(Cyflo Ltd社)を使用して解析した。
【０１０１】
単一細胞電気生理学及びカルシウムイメージングのための、hPSC-CMの解離
hPSC-CMを、2D hPSC-CMのために、hCOの加工の場合と同じプロトコールを使用して解離させ、ゼラチンでコーティングしたカバースリップ上の、CTRL培地中に播種した。細胞は、翌日解析した。
【０１０２】
MMへの切替えの9日後、10μMの2,3-ブタンジオンモノキシム(解離緩衝液)を伴うカルシウム非含有タイロード緩衝液(120mMのNaCl、1mMのMgCl2、5.4mMのKC1、22.6mMのNaHCO3、0.42mMのNaH2PO4、5.5mMのグルコース、pH7.4)中で3回洗浄することにより、hPSC-CMを、hCOから解離させた。解離緩衝液中に1mg/mlのコラゲナーゼBを使用して、37℃で、30〜60分間にわたり、細胞を解離させた。解離させた細胞を、解離緩衝液中で洗浄し、100×gで、3分間にわたり遠心分離した。解離させた細胞を、解離緩衝液中に再懸濁させ、10μMの2,3-ブタンジオンモノキシムを伴うCTRL培地又はMMを使用して、カルシウム濃度を、10、50、250μMへと徐々に上昇させ、最終的に1250μMへと上昇させた。細胞を、100×gで、3分間にわたり遠心分離し、10μMの2,3-ブタンジオンモノキシムを伴うCTRL培地中又はMM中に再懸濁させ、増殖因子低減Matrigel又はラミニン(Sigma社)でコーティングしたカバースリップ上に播種した。付着の4時間後、培地を、10μMの2,3-ブタンジオンモノキシムを伴わないCTRL培地又はMMへと交換し、細胞は、翌日解析した。
【０１０３】
電気生理学
電気生理学記録は、OlympusIX-51倒立顕微鏡の載物台へとマウントされた、TC-124A温度制御装置(Warner Instruments社)を使用して、37℃で得た。データは、Axoクランプ  200B amplifier(Axon Instruments社)へと接続された16ビットのAD/DAインターフェース(Digidata 1322A、Axon Instruments社)を介して、pClamp 9ソフトウェア(Axon Instruments社)により収集した。記録は、10kHzでサンプリングし、5kHzのローパスベッセルでフィルタリングし(約3dBのカットオフ)、Clampfit 10及びGraphPad Prism 6により、オフラインで査定した。ピペットは、P-87 horizontal puller(Sutter Instruments社)上で、ホウケイ酸塩ガラス製標準壁面型キャピラリー(BF120-69-10、Sutter Instruments社)から調製した。
【０１０４】
hCO単一hPSC-CMの活動電位(AP)は、140mMのNaCl、4mMのKC1、2mMのCaCl2、2mMのMgCl2、5mMのHEPES、5mMのグルコース、pH=7.4中に浸漬した解離細胞から記録した。ピペットオフセット電位及びピペットキャパシタンスを中和させてから、電流固定モードによる、全細胞のパッチクランプ測定を行った。パッチピペットは、内部溶液(10mMのNaCl、140mMのKC1、2mMのEGTA、1mMのMgCl2、0.1mMのNa-GTP、5mMのMg-ATP、10mMのHEPES、pH=7.2)によるバックフィリング時に、1〜3MΩの抵抗を有した。hPSC-CMは、連続電流注入により、-80mVの膜電位へと「固定」された。APは、方形電流パルスを、125%の閾値レベルで、4ミリ秒間にわたり加えることにより、1Hzで誘発された。以下の基準に従い、hPSC-CMを、心室様hPSC-CM、心房様hPSC-CM、及び房室結節様hPSC-CMへと分類した:心室様APは、明確なプラトー(膜電位の降下を20mV未満として、持続時間が少なくとも50ミリ秒間である持続相)を有し、立ち上がりが速く(>50V/秒)、APの振幅が大きく(>85mV)、90%再分極時におけるAPの持続時間の、50%再分極時におけるAPの持続時間に対する比が小さかった(APD90/APD50<2.3)。心房様APは、明確なプラトーを有さないが、他の全ての心室様基準を共有した。最後に、房室結節様APは、プラトー相を欠き、再分極相の緩慢さ(APD90/APD50>2.3)を特徴とした。
【０１０５】
膜電位及び自発電気信号を、収縮を阻害する、7μMのブレビスタチンを伴う、CTRL培地又はMMに浸漬された無傷のhCOから記録した。組織に穿刺する前に、ピペットオフセット電位及びピペットキャパシタンスを中和した。鋭利形状の電極は、3MのKClによるバックフィリング時に、30〜50MΩの直列抵抗を有した。先端部電位及び液体接合部電位は、合計数mVに達したので、補正にはかけなかった。
【０１０６】
カルシウムイメージング
細胞に、37℃で、30分間にわたり、培養培地へと直接添加された、2.5μMのFluo-4 AM(ThermoFisher Scientific社)をロードした。培地を交換し(CTRL又はMM)、37℃で、30分間にわたり放置してから、記録した。記録のために、ラインスキャニング(ライン1本当たり約1ミリ秒間で、約10秒間にわたる)を使用して、Olympus IX81共焦点顕微鏡上、37℃、1Hz(Panlab/Harvard Apparatus Digital Stimulatorを使用する)で、細胞を刺激した。生データを処理し、ピークを同定し、パラメータを、記録中の各カルシウムトランジェントについて計算し、この特定の細胞について平均した。これは、精度を改善し、バイアスをなくすように、Matlab R2013a(Mathworks社)により、カスタムで書き下ろされたプログラムを使用して実施した。
【０１０７】
RNAの抽出
RNAは、Trizol(ThermoFisher Scientific社)を使用して抽出し、DNAse(Qiagen社)により処理し、RNeasy Minielute Cleanup Kit(Qiagen社)を使用して精製した。
【０１０８】
RNA-seq
hCO及び成人ヒト心臓試料のために、リボソームRNAを、Ribo Zero Goldにより枯渇させ、SuperScript II Reverse Transcriptase(ThermoFisher Scientific社)により、cDNAを作出した。TruSeq Stranded Total RNAキット(Illumina社)により、RNA-seqライブラリーを創出し、HiSeq 2500シーケンサー上のHiSeq SR Cluster v4キット(Illumina社)で読み取った。試料の読取り品質は、FASTQCにより決定し、Trimmomatic(61)を使用して、品質不良配列(<25フレッドスコア)及びアダプター配列をトリミングした。STAR(62)により、各試料を、hg38へとマッピングした。次いで、マッピングされたリードを、ユニオンモード上のhtseq-countでカウントし、EdgeR(v3.2.4)により、示差的発現解析を実施した。
【０１０９】
プロテオミクス試料の調製
CTRL培地条件又はMM条件に由来する、1連当たり9例ずつのhCOをプールし、PBS中で、2回にわたり洗浄した。組織を、6Mの塩化グアニジウム、100mMのトリス、pH 8.0、10mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、40mMの2-クロロアセトアミド中の、プローブチップ型超音波処理により溶解させ、5分間にわたり、95℃へと加熱した。試料を、4℃へと冷却し、20,000×gで、10分間にわたり遠心分離した。上清を、水で、1:1に希釈するのに続き、4倍容量のアセトンにより、タンパク質を沈殿させた。タンパク質のペレットを、80%のアセトンで洗浄し、10%のトリフルオロエタノール、100mMのトリス  pH 8.0中に再懸濁させた。タンパク質を、BCAで定量化し、50μgを、1μgのLysC(和光純薬株式会社)により、37℃で、2時間にわたり消化するのに続き、1μgのトリプシン(Sigma社)により、37℃で、16時間にわたり消化した。消化物を、4倍容量の0.5%トリフルオロ酢酸(TFA)で希釈し、POROS Oligo R2/R3逆相粒子(20μm、ThermoFisher Scientific社)を充填したCI8マイクロカラムで脱塩させた。ペプチドを、50%のアセトニトリル、0.1%のTFA中で溶出させ、真空遠心分離により乾燥させた。ペプチドを、Qubit fluorescenceにより定量化し、LC-MS/MSによる、直接的な解析のために、1μgのアリコートを取り出した。ペプチドの第2のアリコートを、hCO試料(合計30μg)の各々から取り出し、分画するためにプールした。Agilent 1200 HPLCを使用して、プールされたhCO及び心筋組織に由来するペプチドを、320μm×30 cmの、社内で充填されたC18マイクロHPLCカラム(3μmのBEH、Waters社)上で分画した。勾配は、60分間にわたる、0〜40%の緩衝液Bであり、2分間ずつの画分を回収するのに続き、LC-MS/MSによる解析のために、12画分へと連結した(緩衝液A=10mMの重炭酸アンモニウム、pH7.9、緩衝液B=90%のアセトニトリル)。
【０１１０】
LC-MS/MS及びデータ解析
ペプチドは、正の極性モードのQ-Exactive Plus with Tune v2.4.1824へとカップリングさせた、Dionex 3500RS上で解析した。ペプチドは、0.1%のFAを含有する、2〜30%のアセトニトリルによる勾配を伴う、社内で充填された75μm×50cmのプルドカラム(1.9μmの粒子サイズ、C18AQ;DrMaisch社製)を使用して、55℃、250nl/分で、120分間にわたり分離した。MS1スキャンを、300〜1500のm/zにわたり収集する(70,000の分解能、3×106のAGC、100ミリ秒間の注入時間)のに続き、HCDによる、20の最も強度の大きなイオンの、MS/MSデータ依存型収集(17,500の分解能、1×105のAGC、60ミリ秒間の注入時間、27のNCE、1.2m/zの単離幅)を行った。ペプチドスペクトルマッチ、及び1%へと設定したタンパク質偽発見率(FDR)を伴う、全てのデフォルト設定を使用して、生データを、ヒトUniProtデータベース(2016年1月)に照らしたMaxQuant v 1.5.3.30(64)内のAndromeda(63)により検索した。単連のhCOを、プールされた分画試料へとマッチさせる、「試行間マッチ」オプションを含む、無標識型定量化(65)を可能とした。統計学的解析は、Perseus(66)で実施し、Benjamini-Hochberg FDRを使用して、複数の試験について補正された、二標本t検定を含んだ。全ての生物学的反復により定量化されたタンパク質だけを、最終解析に組み入れ、q<0.05に基づき、有意性を計算した。
【０１１１】
バイオインフォマティクス
主成分分析(PCA)は、EdgeR(v3.2.4)(67)から出力されたデータ100万例当たりの、log2変換による正規化カウントを使用するMatlab R2013a(Mathworks社)を使用して実施した。PCAは、1年間又は20日間にわたり培養されたhPSC-CM、並びに成人及び胎児のヒト心臓組織(25)のRNA-seqを組み入れた。これらの100塩基対のペアドエンドリードデータは、Gene Expression Omnibus(GSE62913)から得、ペアドエンドシーケンシング設定を使用して、Trimmomatic(61)及びSTAR(62)を実行したことを除き、上記の通りに解析した。遺伝子オントロジー解析は、DAVID(68)により実施し、ヒートマップ及び階層的クラスタリングは、GENE-E(Broad Institute社)を使用して実施した。
【０１１２】
qPCR
Superscript III(ランダムプライマー)を使用して、cDNAを逆転写し、SYBR Mastermix(ThermoFisher Scientific社)を、Applied Biosystems Step One Plus上で使用して、qPCRを実施した。18Sを、内因性対照として使用して、遺伝子発現変化を決定するのに、2-ΔΔCt法を使用した。プライマー配列を、Table 2(表2)に列挙し、200nMで使用した。
【０１１３】
透過電子顕微鏡
試料は、既に記載されている通り(69)、電子顕微鏡のために処理した。切片は、染色せずに、Jeol1011透過電子顕微鏡により解析した。
【０１１４】
代謝物の抽出
細胞の代謝物を抽出するために、CTRL培地中又はMM中のそれぞれにおいて(9日間にわたり)培養されたhCOについて、hCOを、n=12又は14へとプールした。hCOを、0.9%の氷冷NaCl 3ml中で、3回にわたり洗浄し、10分間ずつにわたる、複数ラウンドのボルテクシングを伴う、氷冷の50%水性アセトニトリル1mlを使用して、代謝物を抽出した(70)。試料は、処理及び解析まで、-80℃で瞬時凍結させた。抽出溶液は、試料1例当たり50nMのアジドチミジンを、HPLC-MS/MS解析の抽出効率をモニタリングするための内部標準物質として含有した。
【０１１５】
中心炭素代謝物についての解析
中心炭素代謝(CCM)の中間体は、(71)に記載されている方法に従い、以下の改変を伴って解析した。試料抽出物は、存在度が小さな代謝物を検出するほか、存在度が大きな代謝物を、範囲内に希釈する可能性を増強するように、2つの濃度で解析した。こうして、V-AQプログラムを使用して、200μlの試料抽出物を、真空遠心分離機(Eppendorf Concentrator Plus、Eppendorf社)内で、約60分間にわたり、加熱せずに(すなわち、室温で)乾燥させた。試料を、95:5の水:アセトニトリル50μl中に再懸濁させて、4倍濃縮試料をもたらし、このうちの5μlを、未使用のバイアルへと取り出し、95:5の水:アセトニトリル95μlで希釈した、元の抽出物の、有効5倍希釈液をもたらした。CCM解析のために、既に記載されている通り(71)、試料を、HPLC-MS/MSシステムへの注入により、HPLCバイアルへと移した。
【０１１６】
Seahorse代謝プロファイリング
細胞バイオエナジェティックス(酸素消費速度[OCR]及び細胞外酸性化速度[ECAR]を含む)を、Seahorse XF24 Extracellular Flux Bioanalyser(Seahorse Bioscience社)上で決定した。略述すると、hCOを、グルコース(5.5mM、Sigma社)、ピルビン酸ナトリウム(1.0mM、ThermoFisher Scientific社)、及びGlutaMAX(2.0mM、ThermoFisher Scientific社)を補充した非緩衝アッセイ培地(pH=7.4、Seahorse Bioscience社)中で洗浄した。2回にわたる洗浄後、6つ〜8つのhCOを、24ウェルXF24細胞培養マイクロプレート(Seahorse Bioscience社)内に(アッセイ培地中に)播種した。非緩衝アッセイ培地単独を含有する8つのウェルを、バックグラウンド対照として使用した。ミトコンドリアバイオエナジェティックス及び解糖バイオエナジェティックスの具体的な側面は、既に記載されている通り(72)、オリゴマイシン(2μM)、FCCP(1.5μM)、エトモキシル(4μM)、及びロテノン/アンチマイシンA(2μM)の連続投与を使用する、ミトコンドリアストレス試験時に解析した。
【０１１７】
マイトジェンスクリーニング
新生仔ラットの心筋細胞のためには、低分子/増殖因子を、CTRL培地へと添加し、細胞へと、DMSO(Sigma社)、CHIR99021、及びNRG-1(RnD Systems社)を、24又は48時間にわたり施した。トランスフェクション実験のために、24ウェル当たり500μlずつのOptiMEM中のLipofectamine RNAiMax(24ウェル当たり3μlずつ)を使用して、細胞に、8時間にわたりトランスフェクトするのに続き、培地を、CTRL培地へと交換した。細胞を、50nMの、スクランブルmiR対照(All Stars Negative Control、Qiagen社)、miR模倣体であるhsa-miR-199a-3p(Qiagen社)、又はmiR模倣体であるhsa-miR-590-3p(Qiagen社)と共にトランスフェクトした。活性Yap 1を、構成的に過剰発現させるために、CTRL培地中で、細胞に、マウスYap 1の突然変異形である、CMV-YAP(S112A)を含有するアデノウイルスを、10のMOIで感染させた。
【０１１８】
処理の前に、hCOを、Heart-Dyno内のCTRL培地中に播種した後で、6日間にわたり培養した。低分子を添加し、細胞へと、48時間にわたり、DMSO、CHIR99021、及びNRG-1を施した。トランスフェクション実験のために、hCO 1つ当たり150μlのOptiMEM中のLipofectamine RNAiMax(hCO 1つ当たり3μl)を使用して、細胞に、4時間にわたりトランスフェクトするのに続き、培地を、CTRL培地へと交換した。細胞を、50nMの、スクランブルmiR対照、miR模倣体であるhsa-miR-199a-3p、又はmiR模倣体であるhsa-miR-590-3pと共にトランスフェクトした。活性Yap 1を、構成的に過剰発現させるために、hCOに、ヒトYap 1の突然変異形である、CMV-YAP(S127A)(Vector Biolabs社)を含有するAAV6を、hCO 1つ当たり1.25〜2.5×1010vgで感染させた。活性β-カテニンを、構成的に過剰発現させるために、hCOに、アミノ酸2〜90を伴わないヒトCTNNB 1の突然変異形である、AAV6-ΔN90βCAT(Vector Biolabs社)を含有するAAV6を、hCO1つ当たり1.25〜2.5×1010vgで感染させた。これらの実験では、AAV6-MCS対照又はAAV6-GFP(Vector Biolabs社)対照を、同じ力価で使用した。
【０１１９】
定量化及び統計学的解析
全ての鍵となるhCO実験は、再現性を確保するように、複数の実験において、条件1つ当たり、複数のhCOにより実施した。複数の群について解析する、スクリーニング又は実験では、結果が、異なる実験にわたり、条件を比較することのアーチファクトではないことを確保するように、各実験には、対照を含む全ての群が存在した。
【０１２０】
そうでないことが注記されない限りにおいて、データは、平均値±S.E.M.として提示する。統計学は、Microsoft Excel(Microsoft社)又はGraphPAD Prism 6(Graphpad Software Inc社)を使用して解析した。試料数、実験の反復、統計学的解析、及びp値は、各図のキャプションに報告する。
【０１２１】
データセットの利用可能性
RNA-seqデータは、GEOに、GSE93841として委託されており、CTRL培地のプロテオミクスデータと対比させた、MM hCOのプロテオミクスデータは、PRIDEに、PXD005736下で委託されている。
【０１２２】
結果
Heart-Dyno:ミニチュア化された96ウェルヒト心臓オルガノイドスクリーニングプラットフォーム
稠密な筋束を含む心臓オルガノイドの、自動化された形成及び解析を容易とするために、本発明者らは、SU-8フォトリソグラフィー及びポリジメチルシロキサン(PDMS)キャスティングを使用して、培養インサートを含有する96ウェルプレートを加工した(図1a)。本発明者らは、50,000個の心臓細胞を含有する3.5μlの容量が、2日間にわたり、2本の弾性ポストの周囲に、自動的に凝集し、1mmの長さのhCOを形成するように、楕円形の形状をデザインした(図1b、図2a)。hPSCに由来する心臓細胞は、約70%α-アクチニン+/CTNT+ hPSC-CMから構成され、残余は主に、CD90+間質細胞であった(13)。hPSC-CMの、間質細胞に対するこの比は、機能的なhCOを形成するのに、不可欠かつ最適である(13、14)。弾性ポストは、hCOの収縮に対する機械抵抗であって、機能を増強するのに要請される機械抵抗をもたらす(15)。このデザインはまた、ポールの動きをトラッキングすることにより、収縮力を近似することも可能とするが(図1c)、本発明者らは、力変換器を使用して、これを検証した。加えて、各ウェルから、各hCOについての、10秒間のビデオを、高速(1秒間当たり50フレーム)で捕捉するように、カスタムデザインのハイコンテントイメージングシステムを開発した。その後、カスタムで書き下ろされたMatlabプログラムを使用して、ビデオファイルをバッチ解析して、各hCOについての、力の出力波形及び収縮データをもたらした(図1d)。本発明者らは、収縮力を変更し(図2b)、弛緩時間を延長する(図2c)刺激に対するhCOの応答を評価することにより、本発明者らの3D組織培養物及び収縮解析パイプラインを、更に検証した。Heart-Dynoが、hERG毒性を伴う化合物であって、臨床に導入されたが、その後、不整脈性副作用のために撤退した化合物(シサプリド)を含む、公知の薬理学的薬剤に対する生理学的応答を予測することが可能であった(図2c)ことは、重要である。
【０１２３】
収縮力についての半自動化解析に加えて、本発明者らはまた、全載免疫染色を、ハイコンテント画像解析と組み合わせて使用して、異なるマーカーの発現について、hCOを事後解析するためのプロトコールも開発した(図1e)。本発明者らは、α-アクチニン染色と、CHIR99021を使用して、GSK3阻害の増殖促進性効果を検出する、Ki-67染色とを使用して、この手法を検証した(16)(図2d)。これらの初期研究は、Heart-Dynoを、長期刺激のほか、収縮特性及びマーカー発現の解析を容易とする、ハイスループットの、ハイコンテントスクリーニングプラットフォームとして検証した。
【０１２４】
hCO成熟に最適な代謝基質についてのスクリーニング
本発明者らは、次に、解糖から、脂肪酸の酸化への代謝の切替えが、hCO成熟を誘導しうるのかどうかを決定した。本発明者らは、無血清培地中の心臓の成熟に対する、グルコースとパルミチン酸との完全実施要因相互作用をスクリーニングした。パルミチン酸は、新生児期において循環する、最も存在度の大きな脂肪酸のうちの1つであり、全ての長鎖遊離脂肪酸のうちの36%を表す(17)ので、本発明者らは、パルミチン酸を、脂肪酸基質として使用することを選んだ。心臓の成熟は、3つの主要なリードアウト:心機能(収縮力により評価される)、未成熟のマーカーとしての、hPSC-CMの増殖(Ki-67の発現により評価される)、及び成熟マーカーとしての、心室ミオシン軽鎖2(MLC2v)の発現(18)を介して評価した。
【０１２５】
hCOの収縮力は、無血清条件下における、10μM及び100μMのパルミチン酸の添加と共に増大する傾向を示した(各パルミチン酸濃度について、全てのグルコース濃度をプールし、それぞれ、0μMのパルミチン酸と比較した、p=0.007及びp=0.07)。最大の力は、1mMのグルコースと、10μM又は100μMのパルミチン酸とを含有する培地中でもたらされた(図1f)。同時に、MLC2vの発現もまた、パルミチン酸の添加と共に増大した(図1g)。10μMのパルミチン酸を伴う、1mMのグルコース中で培養されたhCOに加えて、100μMのパルミチン酸中で培養された、全てのhCOも、MLC2vの発現を、無血清対照(パルミチン酸を伴わない、5.5mMのグルコース)と比べて増大させた。これらの無血清条件が、細胞生存率に対して、いずれかの有害効果を及ぼしたのかどうかを評価するために、本発明者らは、乳酸デヒドロゲナーゼ及び心臓トロポニンIについてのELISAを実施し、それらのレベルが、パルミチン酸の添加の影響を受けなかったことから、hCO内の、本発明者らの無血清培養条件が、明白な形では、細胞死を引き起こさなかったことが指し示される(図2e、図2f)ことを見出した。初期グルコース-パルミチン酸スクリーニングは、生存及び機能を改善するように、大半の無血清培地補充物質中で、一般に使用されている、インスリンの存在下で実施した。しかし、インスリンは、解糖を誘導し、PI3K/GSK3シグナル伝達に対するその活性を介して、増殖を潜在的に促進しうる(19)ので、また、心筋細胞の成熟を妨げうるであろう。本発明者らは、インスリンが、無血清条件(1mMのグルコース及び10μMのパルミチン酸)下で、hPSC-CMの増殖を誘導している(図1h)ことを見出した。インスリンの除去は、細胞周期活性を低減したが、この条件は、1mMのグルコース及び10μMのパルミチン酸を伴う無血清条件下で、細胞の代謝に対して、潜在的に影響を及ぼしうるであろう。したがって、本発明者らは、次に、インスリンの非存在下における、グルコースとパルミチン酸との完全実施要因相互作用をスクリーニングした。本発明者らは、ここでもまた、多様な濃度のグルコース(0.5、1、及び5.5mMのグルコース;図1i)の存在下であってもなお、100μMのパルミチン酸中で培養された組織内でもたらされる著しく高い力により、パルミチン酸の存在下における力の増大を見た。パルミチン酸は、ここでもまた、MLC2v発現を増大させる傾向を促進した(図1j)。無血清培地(100μMのパルミチン酸を伴うが、インスリンを伴わない、1mMのグルコース)中のhCOの培養はまた、細胞周期活性も、CTRL培地中で得られる結果と比べて、4分の1に低減した(図1k)。これらの条件は、複数のhPSC系に由来する、hCOの頑健な作出及び培養を可能とし、生存可能で、無傷、かつ、機能的な組織を、90%を超える確率でもたらした(図11)。その後、本発明者らは、この培地を、「成熟培地」(MM)と名付け、この成熟プロトコールを使用して、hCOについての広範な表現型解析を実施した(図1m)。
【０１２６】
MMは、hCO内の細胞組成を変更しない
本発明者らが、DNA強度解析に基づき、MM中で培養されたhCOは、CTRL培地と比較して、細胞数が低減される(図3a)ことを見出したことは、Ki-67の降下と符合する。hCOを解離させた後で、本発明者らは、CTRL培地条件下及びMM条件下のいずれにおいても、同様の百分率のhPSC-CM(α-アクチニン)が存在する(図3b、図3c)ことを決定した。本発明者らはまた、MM中で培養されたCD90+細胞の、わずかではあるが有意な減少(CTRLにおける13%に対する、MMにおける10%、p<0.05)(図3d)も見出した。加えて、本発明者らは、全載免疫染色を使用して、hCO内の、複数の心臓細胞集団についても検討し、hPSC-CM(α-アクチニン又はMLC2v)、間質細胞(CD90)、内皮細胞が、管(CD31)へと組織化し、心外膜細胞(WT-1)が、CTRL培地中又はMM中で培養された組織全ての中に存在する(図3e、図3f)ことを見出した。発明者らによる近年の公開物(13)等、大型の組織フォーマットとは対照的に、これは、内皮構造が、本発明者らの稠密なミニチュア化hCOフォーマットにおいて、より良好に支援されることを示唆する。
【０１２７】
MMは、hCO内のhPSC-CM機能を、更に増強するわけではない
本発明者らは、CTRL培地中及びMM中の両方で培養されたhCOの収縮特性を詳細に解析した。本発明者らは、MM中で培養されたhCOが、同様の収縮力を有するが、CTRL培地中で培養されたhCOと比べて、興奮伝導時間(Ta)が短縮され、弛緩時間(Tr)も短縮された(図4a)ことから、ヒト心筋細胞発生における機能的な成熟時に生じる変化(20)が反映されることを見出した。これらの知見を確認するために、本発明者らはまた、hESC系であるH9及び市販のヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)系という、2つの更なる細胞系から導出される、hCOの収縮動態もプロファイリングした。HES3に由来するhCO及びhiPSCに由来するhCOのいずれも、CTRL培地中と対比したMM中の、収縮速度の増大及びTaの短縮を提示した。しかし、H9に由来するhCOは、CTRL培地中と対比したMM中の、収縮速度も、Taも、増大させなかった(図5a)。これは、Taの変化が、速度依存性であることを指し示す。これに対し、MM中の全ての被験細胞系は、速度に関わらず、CTRL培地中で培養された細胞系と比較して、Trが短縮された(図4a、図5a)。ECMの産生はまた、心疾患を伴う患者における弛緩時間の延長とも相関する(21)ので、これは、内因性ECM合成の低減(図6f、図6g)に起因しうる。
【０１２８】
本発明者らはまた、CTRL培地中及びMM中の両方において培養されたhCO内の、イソプレナリンに対する変時応答及び変力応答についても評価した。イソプレナリンは、いずれの培地中でも、収縮速度を増大させた(図4b)。しかし、イソプレナリンが、収縮力の増大を誘導したのは、MM中で培養されたhCO内だけであり(図4c)、これは、被験培養条件下における、大きな収縮予備能を示す。本発明者らは、MM中で培養されたhCOは、収縮力についてのカルシウムのEC50が、CTRL培地中で培養されたhCO(0.3mMのCa2+)より大きい(1.0mMのCa2+)(図4d)ことを見出した。イソプレナリン応答は、収縮予備能に依存する(22)ので、カルシウムEC50が低値であることは、1.8mMのCa2+を含有する、本発明者らのhCO培養物条件下における、イソプレナリン誘導性の変力応答の鈍化を結果としてもたらしうる。これについて探索するため、本発明者らは、カルシウムを、CTRL培地中のhCOについてのEC50(0.3mM)及びMM中のhCOについてのEC50(1.0mM)として、高度に制御されたペーシング条件(1Hz)下における、イソプレナリンの効果について評価した。これらの条件下で、CTRL培地及びMMのいずれも、収縮力を同様に増大させ、50%収縮時間を短縮した(図4e)。MM中で培養されたhCO内の、カルシウムのEC50の増大は、成人心筋への成熟を示す(成人におけるEC50=2.6〜6.0mM(23))。
【０１２９】
収縮時におけるカルシウム動態についてもまた、1Hzペーシング(37℃)時の、hCOから解離させた単一細胞上で、Fluo-4 AMカルシウムイメージングを使用して評価した。単一細胞のカルシウム記録は、参照としてのSP hPSC-CMと、CTRL培地中及びMM中のhCOから解離させたhPSC-CMとから得た(図5b)。これらの実験は、hCOにおける、ピーク振幅、上り勾配、及び減衰の、SPと比べた増大が見られ、これは、より成熟したカルシウムハンドリングシステムを示すことを明らかにしたが、異なる培地中で培養されたhCOの間では、差違が観察されなかった(図4f)。CTRL hCOと、MM hCOとの間で、カルシウムハンドリング動態の差違が欠如すること(図4f)はまた、MM中で培養されたhCO内の収縮Trの低減が、hPSC-CMのカルシウムハンドリング特性の変化より、ECM産生の低減に起因するという考えも支持する。
【０１３０】
次に、本発明者らは、CTRL培地中又はMM中で培養されたhCO及び参照としてのSP hPSC-CMから解離させた単一細胞に由来する全細胞パッチクランプ記録を使用して、hPSC-CMの電気生理学的特性を決定した。本発明者らは、CTRL培地中及びMM中のいずれのhCOに由来するhPSC-CMにおける活動電位プロファイルも、成人心室心筋細胞の活動電位プロファイル(図4g、図5cで定量化された心室hPSC-CM)に相似することを見出した。しかし、本発明者らは、CTRL培地中のhCOに由来するhPSC-CM、又はMM中のhCOに由来するhPSC-CMの間では、差違を見出さなかった(図4g)。hCOから解離させたhPSC-CMの静止膜電位は、比較的脱分極よりであった(図4g)ので、本発明者らまた、穿刺電極を使用して、in situのhCOにおける電気生理学的パラメータも記録した(図5d)。この手法を使用して、本発明者らは、in situにおけるhPSC-CMが、約-60mVの静止膜電位を有する(図5d)ことを見出した。酵素的に解離させたhPSC-CM上で実施された初期パッチクランプ実験における、膜電位の脱分極(図4g)は、解離過程により引き起こされた可能性が高い。in situにおいて穿刺電極を使用する活動電位記録がまた、CTRL培地中及びMM中の両方における、hCO内のhPSC-CMは、成人様心室活動電位を有することも確認した(図5d)ことは、重要である。まとめると、これらの結果は、組織操作培養環境が、既に報告されている(10、14)通り、in vivo様の機能的な成熟の発生を支援することを示唆する。
【０１３１】
MMは、hCOの培養により支援される構造的組織化を、更に増強するわけではない
MM内に、サルコメアに関連する他の変化が存在するのかどうかを決定するために、本発明者らは、hCO内のhPSC-CMの構造的組織化をプロファイリングした。透過電子顕微鏡(TEM)を使用して、CTRL中及びMM中のいずれのhCO内においても、明確なZ帯及びI帯の存在を確認した(図7a)。これは、α-アクチニンを、CTRL培地中又はMM中で培養されたhCO内のZ帯へと局在化させ、MLC2Vを、hCO内のI帯及びA帯へと局在化させる、高度に組織化された発現パターンを明らかにする、MLC2V及びα-アクチニンの染色を使用して確認された(図7b)。チチン及びα-アクチニンの染色もまた、Z帯内のα-アクチニンの発現、並びにI帯内及びA帯内のチチン発現の明確な描出を明らかにした(図7c)。サルコメア長は、いずれの培地中でも、約2.3μmであった(図7d)が、これは、未成熟心筋細胞ではなく、成人心筋細胞と符合する(24)。本発明者らはまた、TEMを使用して、サルコメアに隣接して、十分に発達したミトコンドリア(図7e)及びT管(図7f)も観察した。本発明者らは、カベオリン3についての免疫染色を使用して、T管の存在を確認した(図7g)。
【０１３２】
TEMを使用して、本発明者らは、高度に組織化された介在板もまた存在することを見出し(図7h)、汎カドヘリン(図7i)染色及びコネキシン43染色(図7j)を使用して、細胞間結合の形成を確認した。まとめると、これらの結果は、既に報告されている通り(10、14)、組織操作培養環境が、in vivo様構造の発生を支援することを更に示唆する。
【０１３３】
MMは、心臓発生因子、代謝、及び細胞周期の成熟の増強を誘導する
MMの、hCOに対する効果について、より広い視野を得るために、本発明者らは、次に、CTRL培地中又はMM中で培養されたhCO、及び市販の成人心臓試料(プールされた3例の男性心臓、30〜39歳)についてのRNA-seqを実施した。hCO内には、極めて少数の、他の系統に由来する夾雑細胞型が存在するが、hCO内及びヒト成人心臓組織内では、潜在的な夾雑系統についての大半のマーカーは、同様のレベルで発現した(図8a)。心臓内で最も顕著な細胞型についてのマーカーについて検討したところ、本発明者らは、本発明者らのプロトコールが、hPSC-CM、心外膜細胞、及び線維芽細胞を、hCO内及びヒト成人心臓組織内に存在する、これらの系統についての転写物と同様の存在度で作出する(図8b)ことを見出した。内皮転写物もまた、存在したが、低存在度であり、白血球転写物は、hCO内では、ヒト成人心臓組織内と比べて、低存在度であるか、又は非存在であった(図8b)。これらの結果は、本発明者らのフローサイトメトリー及び免疫染色と符合する(図3)。
【０１３４】
主成分分析(PCA)を実施して、本発明者らの試料間の差違を決定した。これらの解析のために、本発明者らまた、20日目及び1歳のhPSC-CM、ヒト胎児心室、並びにヒト成人心臓を含む(25)、更なる公開の参照データ(GSE62913)も組み入れた。全ての転写物(100万個当たり>10カウント)を使用したところ、本発明者らは、hCOが、他の試料と顕著に異なる形でクラスタリングし、実験間で良好な再現性を指し示す(図8c)ことを見出した。しかし、いかなる2つの条件も、一致してはクラスタリングしなかったが、これは、異なる細胞集団が、各異なる試料中に存在することの影響(すなわち、Kuppusamyら(25)に由来するhPSC-CM試料が純粋であるのに対し、本発明者らのhCO試料及び心臓組織は、複数の細胞型を含有する)に起因する可能性が極めて高い。実際、hCOは、内皮細胞をほとんど有さず、白血球を欠くが(図8b)、これらは、天然心臓組織内では豊富である(26)。この考えを支持するように、ヒト成人心臓組織内で、MM中で培養されたhCOと比べて高度に発現した、上位1000の遺伝子についての、上位25の遺伝子オントロジー(GO)タームは、大半が、免疫過程と関連していた(図8d)。にもかかわらず、本発明者らは、Delaughterら(27)と同様の手法を使用して、心筋細胞内で発現する転写物((27)における表S6;795の転写物が、100万個当たり>10カウントである)に対してPCAを実施することにより、本発明者らのhCOの発生段階をプロファイリングした。本発明者らは、この手法を使用したところ、CTRL培地条件及びMM条件の両方に由来するhCO、1歳のhPSC-CM、及びヒト胎児心室が、PC1にクラスタリングし、20日齢のhPSC-CMより成熟していた(図6a)ことから、Delaughterら(27)において提示された成熟プロファイリングと符合することを見出した。PCAにより強調されるこれらの差違にもかかわらず、本発明者らは、RNA-seqデータに基づき、MM中で培養されたhCOが、成人ヒト心臓組織と、高度に相関する(図6b)ことを見出した。本発明者らはまた、CTRL培地中又はMM中で培養されたhCO及び成人ヒト心臓組織に対して、プロテオミクスも実施し、プロテオミクスデータに基づいてもまた、MM中で培養されたhCOが、ヒト成人心臓組織に酷似する(図6c)ことを見出した。
【０１３５】
本発明者らは、CTRL培地中のhCO又はMM中のhCOの間で示差的に調節される、3856の転写物と、855のタンパク質とを同定した(それぞれ、FDR<0.05及びq値<0.05;図8e、図8f)。示差的に発現した遺伝子(図6d)又はタンパク質(図6e)を使用して、本発明者らは、GOターム解析を、RNA-seq(図6f)及びプロテオミクスデータセット(図6g)に対して、独立に実施した。いずれの場合にも、MM中で培養されたhCO内では、解糖の低減、細胞外マトリックスの組織化、及びアクチン細胞骨格の組織化が同定された(図6f、図6g)。2つのデータセットの間で一致して増強された過程は、RNAプロセシング/RNA代謝過程の調節、及び転写の調節/染色体の組織化を含んだ(図6f、図6g)。興味深いことに、「酸化還元」、「脂肪酸の酸化」、及び「DNA損傷刺激に対する細胞の応答」は、プロテオミクスデータセット内だけで上方調節された(図6f、図6g)。これらの生物学的過程は、哺乳動物の出生後のin vivoにおける心筋細胞の成熟を強く示し(5、28、29)、トランスクリプトミクスに加えて、プロテオミクス解析を実施することの重要性を、加えて強調する。GOターム「細胞周期の調節」が、MMにより、RNA-seqデータセット内で、特異的に低減されたことは、CTRL培地中であってもなお、細胞周期に関与するタンパク質の存在度が小さいことに起因する可能性が高く、出生後における成熟と符合する(図6f、図6g)。GOターム「心臓の発生」はまた、MM中で培養されたhCOの、RNA-seqデータセット内でも上方調節され(図6f)、このGOターム内で心臓の成熟に関与する、鍵となる因子(MYH7、IRX4、及びMYBPC3)はまた、プロテオミクス解析でも上方調節された(図6h、図6i)。MYH7は、ヒト心臓の成熟時に増大することが公知であり(30)、IRX4核内転座は、出生後における心臓の成熟時に増大し(31)、心機能を維持するために極めて重要であり(32)、MYBPC3ノックアウトマウスでは、心筋細胞は、出生後における細胞周期停止の前に、更なる分裂のラウンドを経る(33)。本発明者らはまた、qPCRを使用して、TTN N2B、MYH7/6、及びTNNI3/1等、成熟時に、切り替わる/増大することが公知である、サルコメアのアイソフォーム(24)が、MM中で培養されたhCO内で増大することも検証した(図8g)。まとめると、これらの結果は、MM中で培養されたhCOが、心臓の発生因子、代謝の切替え、DNAの損傷、及び細胞周期活性の低減の誘導を含む、出生後における複数の成熟過程を経ることを裏付ける。しかし、本発明者らの知見はまた、MM中のhCOの培養が、これらの過程を特異的に成熟させる一方で、成熟と関連する、他の構造的かつ機能的な特性が、MM中の培養により、更には増強されないことも強調する(図4、図5、図6、図7において見出される)。
【０１３６】
MMは、解糖から、脂肪酸の酸化への、代謝の切替えを誘導する
本発明者らのRNA-seq解析及びプロテオミクス解析(図6)は、MM中のhCOの培養が、hCO内の、多くの解糖成分を抑制し、多くの脂肪酸の酸化成分を活性化させることを明らかにした(図9)。本発明者らは、次に、エトモキシルを使用して、内因性脂肪酸の酸化を測定する更なる工程と共に、Seahorse XF Bioanalyzerによるミトコンドリアストレス試験を使用して、hCOの代謝をプロファイリングした(図10a)。MMに由来するhCOは、Seahorse試験条件下で、最大のOCRが大きく(図10b)、OCR予備能を有し(図10c)、脂肪酸の酸化を増大させ(図10d)、脂肪酸の酸化への切替えを支持した。これらの酸化能の変化は、ミトコンドリア含量(mtDNA)の増大と関連した(図10e)。カルボニルシアニド-4(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)を使用するATP脱共役は、グルコースの非存在下であってもなお、成熟心筋細胞内の細胞外酸性化速度(ECAR)の大幅な増大をもたらしうる(34)ので、本発明者らは、CTRL培地条件下及びMM条件下のhCO内の解糖性経路及び分枝経路である代謝フラックスを更にプロファイリングするのに、メタボロミクスを使用することを選んだ。解糖経路のほか、解糖経路から分枝する経路であって、ヘキソサミン経路、五炭糖リン酸経路、及びグリコーゲン経路を含む経路内の代謝物は全て、CTRL培地内と比較して、MM内で低減された(図10f)。まとめると、本発明者らのRNA-seqデータ、プロテオミクスデータ、Seahorseデータ、及びメタボロミクスは、解糖から、脂肪酸の酸化への、代謝の切替えを確認する。
【０１３７】
MMは、細胞周期を阻害し、β-カテニンの抑制及びDNA損傷応答(DDR)の誘導と関連する
本発明者らはまず、MMが、複数のhPSC細胞系(H9及びhiPSC、図12a、図12b)内で、Ki-67強度の低下を誘導することを確認した。加えて、本発明者らは、高分解能共焦点顕微鏡による染色及びhPSC-CMの細胞周期活性の定量化を使用して、本発明者らの初期全載蛍光強度スクリーニングデータ(図1k)を確認した。本発明者らは、一般的な細胞周期マーカーであるKi-67(図11a)と、有糸分裂特異的なマーカーであるpH3(図11b)とを使用して、MM中のhCOの培養が、細胞周期にあるhPSC-CMの百分率の低減を引き起こすことを見出した。MM中で培養されたhCO内では、hPSC-CMの増殖は、顕著に低減され、hPSC-CMの総有糸分裂率は、大きく低下した(約0.2%のpH3+ hPSC-CM)が、これは、出生後におけるヒト心臓(35)と同様であった。
【０１３８】
本発明者らは、次に、代謝基質が、どのようにして、心臓細胞周期に影響を及ぼしたのかを評価しようとした。本発明者らは、hCOの形成期後において、グルコース、インスリン、及びパルミチン酸による因子実験を実施した。培養の最初の48時間では、全ての条件が、同様の収縮力を有した(図12c)ことから、この早期段階では、hCOが、グルコース及びパルミチン酸の非存在下であってもなお、同様の機能的な特性及び生存率を有する(長期間の培養と対照される;図1i)ことが指し示されることは、重要である。本発明者らは、CHIR99021(16)を、ヒト心筋細胞の増殖の、最も強力な活性化因子のうちの1つとして、既に同定し、また、この経路が、出生後における成熟時において、転写的に抑制されることも見出していた(5)ので、これらの研究では、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路について、具体的に検討した。本発明者らのスクリーンにおけるβ-カテニン活性のリードアウトとして、本発明者らは、活性化し、核内に局在化したβ-カテニンだけに結合する抗体を使用して、活性化β-カテニンの定量化を実施した(36)。活性化β-カテニンは、グルコース又はパルミチン酸の存在(図11c、図11d)に関わらず、増殖(図11e)と同様、インスリンに高度に依存し、活性化β-カテニンと、Ki-67強度との間には、高度に有意な相関が見られた(図11f;全ての条件における、全てのhCOについて)。MM中の培養の2日後における、増殖のためのインスリンシグナル伝達への、この依存にもかかわらず、MM中で11日後におけるインスリンの添加は、hPSC-CMの増殖を再活性化させるのに十分ではなかった(図11g、図11h、図11i)。これは、長期間にわたるMM中の培養が、hPSC-CMの、インスリン増殖活性に対する脱感作を誘導することを指し示す。
【０１３９】
in vivoの心筋細胞内の、高度に酸化的な出生後環境は、心筋細胞の終末分化を駆動する中心的な機構として提起されている(29)DDRを誘導する。本発明者らがまた、MM中で培養されたhCO内では、DDRタンパク質の発現の増大が見られる(図6g、図13a)ことも見出したことは、これらのin vivoにおける知見と符合する。MM中で培養されたhCO内のDDRの誘導の証拠であって、DNA内の酸化による塩基修飾のマーカーである8-オキソ-7,8-ジヒドログアニン(8-OxoG)の発現の増大(図13b)、及びSer1987リン酸化ATM(pATM)の増大(図13c)を含む証拠が見られた。したがって、DDRがまた、MM中で培養されたhCO内の増殖の停止とも関連することは、in vivoの出生後における成熟と符合する。
【０１４０】
成熟心筋細胞及びオルガノイドの更なる使用
本発明に従い作製されたオルガノイドは、心臓生物学、疾患モデル化、及び毒性への、より信頼できる洞察を可能とするであろう。
【０１４１】
成熟培地(MM)中で作製されたhCO内の心筋細胞は、他の2D心筋細胞及び3D心筋細胞と比較して、増殖レベルの低減を提示する(図16a、図16b)。加えて、MM中で培養されたhCO内の心筋細胞は、分裂促進性刺激(この場合の例は、CHIR99021(GSK3阻害剤)である)に対して不応性である(図16a、図16b)。これは、成人心筋細胞が、もはや、分裂促進性刺激に応答して、細胞周期に入ることがない、in vivoの出生後における心臓の成熟と符合する。
【０１４２】
MM中で作製されたhCOは、極めて重要なイオンチャネル、カルシウムハンドリングタンパク質、及び収縮周期のための収縮タンパク質を発現させるので、薬物の毒性をモデル化するのに使用することができる(図17a)。MM中で作製されたhCOは、弛緩時間の延長に基づき、ヒトether-a-go-goチャネル(hERG)と相互作用する、危険性が高度、中等度、又は低度の化合物を正確に予測した(図17b、図17c、図17d)。
【０１４３】
ここで、MM中で作製されたhCOの代謝的成熟は、hCO内で、代謝性疾患をモデル化することを可能とする。糖尿病状態(低インスリン、高グルコース)で培養されたhCOは、一貫した収縮力を呈示するが、弛緩時間も延長した(図18a、図18b)。この「拡張機能不全」は、駆出率が保持された心不全(HFpEF)を伴う患者において生じる機能的変化と符合する。したがって、MM中で作製されたhCOは、代謝性障害の、心機能に対する影響をモデル化するために極めて重要であり、糖尿病を伴う患者は、心筋症及びHFpEFを発症する危険性がより大きいことが公知である。
【０１４４】
一部の遺伝子疾患は、2D培養物によりモデル化しうるが、成熟サルコメアのアイソフォーム又はECMに関連する任意の遺伝子疾患は、3Dオルガノイドを要請する。ALPK3欠損成熟心筋細胞は、心筋症を結果としてもたらす可能性があり、正常心筋細胞と比較した収縮力の低減を示す。同様に、収縮力の低減は、NKX2-5欠損心筋細胞内でも測定することができる。これらのような突然変異体遺伝子の効果についての解析は、本明細書で開示される成熟培地を使用して作製された、成熟心筋細胞内及び/又はオルガノイド内で企図されるであろう。
【０１４５】
成熟培地の更なる使用
多くの適用は、hCO内の培養より、2D心筋細胞の培養を要請しうる。MMが、また、2Dにおいても働くのかどうかを決定するために、本発明者らは、異なる培地組成、及び細胞周期活性を低減するそれらの能力を比較した(図19)。本発明者らは、同じMM又はB27を、ヒト血清アルブミンで置きかえたMMが、2D培養物中でもまた、短い時間枠にわたる場合であってもなお、細胞周期活動を低減するのに十分であることを見出した。
【０１４６】
考察
hPSC-CMは、ヒトの心臓生物学、発生、及び生理学について研究するのに、広く使用されるようになった。しかし、それらは、典型的に、未成熟であり、これは、成人心臓生物学を正確にモデル化するそれらの能力を限定する。操作心筋は、構造及び機能の点で、hPSC-CMの成熟を改善しうる(10、14)が、代謝的成熟及び細胞周期停止の、鍵となる上流の駆動因子は、大部分が知られていない。
【０１４７】
hPSC-CMの成熟及び細胞周期からの脱出の、中心的な調節因子を同定するために、本発明者らは、スクリーニングを容易とするように、ミニチュア化半自動化心臓オルガノイド培養プラットフォーム(Heart-Dyno)を開発した。体系的かつ反復的なスクリーニングにより、本発明者らは、成熟過程の、顕著に異なる生理学的特徴が、異なるキューにより駆動されることを裏付けることができた。例えば、本発明者らは、構造的パラメータ、電気生理学的パラメータ、カルシウムハンドリングのほか、アドレナリン作動性刺激に対する応答等、多くのパラメータの成熟が、3D操作心臓組織環境により支援されることを見出した。本発明者らのhCOにおけるこれらのパラメータは、他の心臓組織操作プラットフォームを使用して報告されたパラメータと同様であった(8〜12)。しかし、本発明者らは、代謝の、脂肪酸の酸化への切替えが、代謝遺伝子の発現のシフト、ミトコンドリア新生、及び脂肪酸の酸化にとってだけでなく、また、成人サルコメアタンパク質アイソフォームの発現の増大、及び細胞周期からの脱出にとっても鍵となる駆動因子であることを見出した。したがって、成人心筋細胞の表現型の異なる側面は、成熟hPSC-CMを作出するために、注意深く制御することが必要な、顕著に異なるキューにより統御されている。
【０１４８】
出生後第1週の間に、in vivoにおける代謝は、脂肪酸の酸化へと切り替わり、心臓では、解糖性基質から、脂肪酸への血清組成の変化に呼応して、細胞周期からの脱出が生じる(4)。本研究では、本発明者らは、代謝基質の供給におけるこれらの変化の模倣が、代謝的成熟の主要な駆動因子であるだけでなく、また、ヒト心筋細胞内の転写及び細胞周期の成熟の主要な駆動因子でもあることを見出した。具体的に、本発明者らは、一般に使用される、高インスリン、炭水化物ベースの培地から、低炭水化物、低インスリン、パルミチン酸ベースの培地への切替えが、hCOの成熟を増強することを見出した。これらの成熟条件は、グルコース、インスリン、及び血清を一般に含み、細胞の増殖を増大させるようにデザインされた、典型的な細胞増殖環境と対照的である。代謝環境の変更は、hCO内の成熟を促進するのに極めて重要であり、また、他の細胞型の分化及び機能的な成熟を促進するための、実行可能な手法も表しうる。
【０１４９】
近年の研究は、酸素圧が、心筋細胞の増殖と連関することを示唆しており(28、29、49)、高酸素環境が、出生後における心筋細胞の、細胞周期からの脱出のための、鍵となる誘因であることを明らかにしている(29)。しかし、大気中の酸素(約21%のO2)下の、in vitroにおけるhPSC-CMの培養は、細胞周期からの脱出を駆動するのに十分ではない(16、50)。本発明者らの研究は、高酸素環境下における、代謝基質の活用の変更を介する、脂肪酸の酸化への切替えが、hPSC-CMの、細胞周期停止の駆動因子であることを裏付ける。これは、高酸素環境が、生誕後において、代謝基質の利用可能性の変化に呼応して働いて、心筋細胞の細胞周期停止を統御することを示唆する。これはまた、成人の心臓における、酸素濃度の低減と、心筋細胞の増殖の再活性化及び心臓の再生との連関であって、解糖への代謝の切替えと関連した連関(28)を裏付ける近年の研究によって、in vivoにおいても実証される。まとめると、これらの研究は、出生後における代謝的適応、酸素圧、及び心筋細胞の増殖の間の因果連関を確立する。
【０１５０】
本発明者らの知見は、hPSC-CMの代謝の、脂肪酸の酸化への切替えが、β-カテニン及びYAP1によるシグナル伝達の長期持続的な変化のほか、hPSC-CMの細胞周期中断を結果としてもたらすDDRを誘導することを示す。それらが心臓の発生時における心筋細胞の増殖を制御するように相互作用する胎児心臓では、β-カテニンシグナル伝達と、YAPシグナル伝達との協同性が報告されている(41)。更に、新生児期における、心臓の再生能の中心的な調節因子として、Hippo/Yapシグナル伝達も出現している(51、52)。本発明者らの研究は、出生後における心筋細胞代謝の変更が、生誕後におけるβ-カテニン及びYAPによるシグナル伝達の抑制を介して、心筋細胞の細胞周期遮断をもたらす、鍵となる切替えとして作用しうることを示唆する。同様に、代謝の変更は、他の細胞型における、β-カテニン及びYAPの活性にも影響を及ぼすことが公知である(53、54)。したがって、これらの知見は、β-カテニン、YAP1、代謝、及びDDRが、緊密に連関し、心臓の細胞周期及び成熟を調節するように協同作用するモデルを指示する。
【０１５１】
ヒトオルガノイドの作製は、過去数年間にわたり、急速に発展した。Heart-Dyno等のハイスループットスクリーニングプラットフォームとカップリングさせて、オルガノイド実験は、ヒト生物学についての我々の知識を急速に拡大し、多くの疾患のための、新規の治療戦略を、潜在的に解き明かす可能性を有する。
【０１５２】
本明細書を通して、目的は、本発明を、いかなる1つの実施形態にも、具体的な特徴の集合にも限定せずに、本発明の好ましい実施形態について記載することであった。したがって、当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、例示される特定の実施形態では、多様な改変及び変化を施しうることを察知するであろう。
【０１５３】
本明細書で言及される、全てのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許、及び学術文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
【表１】
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【０１５５】
【表２】
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【０１５６】
参考文献
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図１ｈ】
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【図１ｉ】
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【図１ｊ】
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【図１ｋ】
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【図１ｌ】
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【図１ｍ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図２ｉ】
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【図２ｊ】
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【図２ｋ】
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【図２ｌ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
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【図６ｈ】
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【図６ｉ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図７ｇ】
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【図７ｈ】
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【図７ｉ】
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【図７ｊ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図８ｇ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１０ｆ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｆ】
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【図１１ｇ】
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【図１１ｈ】
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【図１１ｉ】
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【図１２ａ】
2019526255.tif 000097
【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
2019526255.tif 000101
【図１３ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
2019526255.tif 000106
【図１７ｂ】
2019526255.tif 000107
【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
2019526255.tif 000109
【図１８ａ】
2019526255.tif 000110
【図１８ｂ】
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【図１９】
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【国際調査報告】
2019526255.tif 000113
2019526255.tif 000114
2019526255.tif 000115
2019526255.tif 000116
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