(57)【要約】  試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５ａ補体タンパク質（Ｃ５ａ）を定量化する方法であって、該方法が、ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体をストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）被覆粒子に結合させることと、試料中で遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することと、捕捉された遊離Ｃ５ａを検出することと、捕捉された遊離Ｃ５をレーザー誘導蛍光検出を用いて定量化することとを含むものであって、この方法が、Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内のＧｙｒｏｓ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００  ＣＤ中で実施されて、はじめにヒトＣ５が試料から除去されるものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５ａ補体タンパク質（Ｃ５ａ）を定量化する方法であって、前記方法が、
ａ．前記試料からヒトＣ５を除去することであって、前記試料を、磁気ビーズに連結したＣ５特異的ビオチン化抗体と共にインキュベートし、ヒトＣ５に結合したＣ５特異的ビオチン化抗体に連結した前記磁気ビーズを磁石で捕捉することと、
ｂ．ストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体を結合させることであって、前記ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体は、前記ストレパビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００  ＣＤに毛細管作用によって添加されて、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体が、前記カラム中の前記ストレパビジン被覆粒子へと動かされることと、
ｃ．前記試料中の前記遊離（非結合）Ｃ５ａを前記捕捉抗体上で捕捉することであって、工程ａの後の前記試料が毛細管作用によって前記ＣＤに添加されて、
前記ＣＤが前記Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記工程ａの後の前記試料が、前記カラム中の前記ストレパビジン被覆粒子上に結合した前記ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体へと動かされることと、
ｄ．捕捉された遊離Ｃ５ａを検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５ａ検出抗体が、毛細管作用によって前記ＣＤに添加されて、前記抗Ｃ５ａ検出抗体が、前記捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５ａに結合し、前記ＣＤが前記Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記検出抗体が、前記カラム中の前記ストレパビジン被覆粒子に結合した前記捕捉抗体に結合した前記遊離Ｃ５ａへと動かされることと、
ｅ．レーザー誘発蛍光検出を使用して前記捕捉された遊離Ｃ５ａを定量化することと、を含む、方法。
【請求項２】
工程ｃから得た値を、請求項１の方法を使用してＣ５ａ枯渇試料に添加した既知の量のＣ５ａから作成した標準曲線と比較することによって、遊離Ｃ５ａ抗体の濃度または量を計算することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｇｙｒｏｓ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアを用いて遊離Ｃ５抗体の濃度を計算することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料がヒト患者から得られる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が血清試料または血漿試料である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
患者が抗Ｃ５ａ抗体で治療されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記患者がＡＬＸＮ１００７で治療されている、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記磁気ビーズがＤｙｎａｂｅａｄ磁気ビーズである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃ５特異的抗体が、ビオチン化Ｎ１９／８である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビオチン化捕捉抗体がＡＬＸＮ１００７である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗Ｃ５ａ検出抗体がクローン２９４２である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
試料の希釈に、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮ緩衝液または１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液が使用され、前記検出抗体の希釈に、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆ緩衝液が使用される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｇｙｒｏｓ機器を、Ｂｉｏａｆｆｙ  ｗａｓｈ  １およびｐＨ１１緩衝液を用いて別個に二回プライミングすることをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の組み込み
本出願は配列表を含んでおり、該配列表はＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されたものであり、かつその全体が参照により本明細書に援用される。このＡＳＣＩＩコピーは２０１７年１０月１８日に作成され、１９００−４２７ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは２２，６０７バイトである。
【０００２】
本発明は、免疫関連疾患および遊離（非結合）薬剤標的の定量化アッセイの分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
補体タンパク質Ｃ５ａは、代替的な補体カスケードの重要な成分であり、アレクシオン社の薬物、ＡＬＸＮ１００７の標的である。この標的が適切に定量化されることは、疾患状態のモニタリング、モデリング、投薬量選択、ラベル・クレームなどの複数の理由にとって不可欠である。ＡＬＸＮ１００７は、ヒトＣ５ａに対して６０ｐＭの親和性を有するが、ヒトＣ５に対しては５ｎＭの親和性でもある。Ｃ５に対する親和性は、Ｃ５転換酵素がＣ５をＣ５ａおよびＣ５ｂに切断する場合のネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）アベイラビリティに基づくものであり、また時間の関数である。Ｃ５に対するこの低いレベルの親和性により、バイオアッセイにおいてＣ５ａの定量化に対して相加効果を有することができるものであるが、これはＡＬＸＮ１００７のように、Ｃ５ａに対してのみ特異的である二次抗体が存在せず、それらもまたより低い親和性でＣ５に結合するという理由によるものである。薬剤がリガンド結合アッセイフォーマットにおいて捕捉抗体として使用されるとき、Ｃ５がＡＬＸＮ１００７によって結合される場合、タンパク質の一部が、抗Ｃ５ａ抗体によって認識および結合されることとなり、それによって真のＣ５ａであるものを過大評価することにつながる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５ａ補体タンパク質（Ｃ５ａ）を定量化する方法を提供するものであって、該方法が、
ａ．試料からヒトＣ５を除去することであって、試料を、磁気ビーズに結合したＣ５特異的ビオチン化抗体と共にインキュベートし、ヒトＣ５に結合したＣ５特異的ビオチン化抗体に結合した該磁気ビーズを磁石で捕捉することと、
ｂ．ストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体を結合させることであって、前記ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体は、ストレパビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００  ＣＤに毛細管作用によって付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体が、カラム中のストレパビジン被覆粒子へと動かされることと、
ｃ．試料中の遊離（非結合）Ｃ５ａを捕捉抗体上で捕捉することであって、工程ａの後の試料が毛細管作用によってＣＤに付着して、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、工程ａの後の試料が、カラム中のストレパビジン被覆粒子上に結合したビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体へと動かされることと、
ｄ．捕捉された遊離Ｃ５ａを検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５ａ検出抗体が、毛細管作用によってＣＤに付着して、前記抗Ｃ５ａ検出抗体が、捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５ａに結合し、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、検出抗体が、カラム中のストレパビジン被覆粒子に結合された捕捉抗体に結合された遊離Ｃ５ａへと動かされることと、
ｅ．レーザー誘発蛍光検出を使用して捕捉された遊離Ｃ５ａを定量化することと、を含む。
【０００５】
本開示を制限することなく、本開示の多数の実施形態を説明の目的で以下に記載する。
【０００６】
項１  試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５ａ補体タンパク質（Ｃ５ａ）を定量化する方法であって、該方法が、
ａ．試料からヒトＣ５を除去することであって、試料を、磁気ビーズに結合したＣ５特異的ビオチン化抗体と共にインキュベートし、ヒトＣ５に結合したＣ５特異的ビオチン化抗体に結合した該磁気ビーズを磁石で捕捉することと、
ｂ．ストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体を結合させることであって、前記ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体は、ストレパビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００  ＣＤに毛細管作用によって付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体が、カラム中のストレパビジン被覆粒子へと動かされることと、
ｃ．試料中の遊離（非結合）Ｃ５ａを捕捉抗体上で捕捉することであって、工程ａの後の試料が毛細管作用によってＣＤに付着して、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、工程ａの後の試料が、カラム中のストレパビジン被覆粒子に結合したビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体へと動かされることと、
ｄ．捕捉された遊離Ｃ５ａを検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５ａ検出抗体が、毛細管作用によってＣＤに付着して、前記抗Ｃ５ａ検出抗体が、捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５ａに結合し、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、検出抗体が、カラム中のストレパビジン被覆粒子に結合された捕捉抗体に結合された遊離Ｃ５ａへと動かされることと、
ｅ．レーザー誘発蛍光検出を使用して捕捉された遊離Ｃ５ａを定量化することと、を含む。
【０００７】
項２  工程ｃから得た値を、請求項１の方法（少なくとも工程ｂ〜ｅであり、工程ａは任意である）を使用してＣ５ａ枯渇試料に添加した既知の量のＣ５ａから作成した標準曲線と比較することによって、遊離Ｃ５ａ抗体の濃度または量を計算することをさらに含む、項１記載の方法。
【０００８】
項３  Ｇｙｒｏｓ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアを用いて遊離Ｃ５抗体の濃度を計算することをさらに含む、項１または項２に記載の方法。
【０００９】
項４  試料がヒト患者から獲得される、先行する項のいずれか一つに記載の方法。
【００１０】
項５  前記試料が血清試料である、項４に記載の方法。
【００１１】
項６  患者を抗Ｃ５ａ抗体で治療している、先行する項のいずれか一つに記載の方法。
【００１２】
項７  患者をＡＬＸＮ１００７で治療している、項６に記載の方法。
【００１３】
項８  磁気ビーズがＤｙｎａｂｅａｄ磁気ビーズである、先行する項のいずれか一つに記載の方法。
【００１４】
項９  Ｃ５特異的抗体が、ビオチン化Ｎ１９／８である、先行する項のいずれか一つに記載の方法。
【００１５】
項１０  ビオチン化捕捉抗体がＡＬＸＮ１００７である、先行する項のいずれか一つに記載の方法。
【００１６】
項１１  抗Ｃ５ａ検出抗体がクローン２９４２である、先行する項のいずれか一つに記載の方法。
【００１７】
項１２  試料の希釈に、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮ緩衝液または１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液が使用され、検出抗体の希釈に、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆ緩衝液が使用される、先行する項のいずれか一つに記載の方法。
【００１８】
項１３  Ｇｙｒｏｓ機器を、Ｂｉｏａｆｆｙ  ｗａｓｈ  １およびｐＨ１１緩衝液を用いて別個に二回プライミングすることをさらに含む、先行する項のいずれか一つに記載の方法。
【００１９】
本発明のこれらおよびその他の態様に従って、多数のその他の態様が提供される。本発明のその他の特徴および態様は、以下の発明を実施するための形態および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、遊離Ｃ５ａビーズ処理の平行性を示すグラフである。
【００２１】
【図２】図２は、三つ組でなされた標準曲線の例である。
【００２２】
【図３】図３は、Ｃ５ａおよびＣ５に対するビーズの効果を示す。
【００２３】
【図４】図４は、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮ対１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０でビーズの効果を示す。
【００２４】
【図５】図５は、遊離Ｃ５ａの早期のビーズ処理の選択性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書で使用される場合、名詞の前の「ａ」または「複数の」という語は、特定の名詞のうちの一つ以上を表す。例えば、「哺乳動物細胞」という語句は、「一つ以上の哺乳動物細胞」を表す。
【００２６】
「哺乳動物細胞」という語は当技術分野で公知であり、例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシ、ハムスター、またはウサギを含む、任意の哺乳動物からのまたは由来の任意の細胞を指すことができる。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、不死化細胞、分化細胞、未分化細胞、幹細胞などであり得る。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「患者」という語は区別せずに使用される。患者または対象は、ヒト患者またはヒト対象でありうる。
【００２８】
「組換えタンパク質」という語は当技術分野で公知である。簡潔に述べると、「組換えタンパク質」という語は、細胞培養系を使用して製造することができるタンパク質を指すことができる。細胞培養系の細胞は、例えば、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または細菌細胞に由来することができる。一般的に、細胞培養中の細胞は、関心の組換えタンパク質をコードする導入核酸を含有する（この核酸は、プラスミドベクターなどのベクター上で生じ得る）。組換えタンパク質をコードする核酸は、タンパク質をコードする核酸に動作可能に連結された異種プロモーターを含むこともできる。
【００２９】
「免疫グロブリン」という語は当技術分野で公知である。簡潔に述べると、「免疫グロブリン」という語は、免疫グロブリンタンパク（例えば、可変ドメイン配列、フレームワーク配列、または定常ドメイン配列）の少なくとも１５個のアミノ酸（例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアミノ酸、または１００個以上のアミノ酸）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指すことができる。例えば、免疫グロブリンは、例えば、軽鎖免疫グロブリンの少なくとも１５個のアミノ酸、例えば、ＣＤＲ  Ｈ３などの重鎖免疫グロブリンの少なくとも１５個のアミノ酸を含むことができる。免疫グロブリンは、単離された抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ）であってもよい。免疫グロブリンは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のサブクラスであってもよい。免疫グロブリンは、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはｓｃＦｖとすることができる。免疫グロブリンはまた、少なくとも一つの免疫グロブリンドメインを含む改変タンパク質とすることができる（例えば、融合タンパク質）。改変タンパク質または免疫グロブリン様タンパク質はまた、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または二量体、三量体もしくは多量体の抗体、またはダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣＯＤＶ−Ｉｇ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）とすることができる。免疫グロブリンの非限定的な例が本明細書に記載されており、免疫グロブリンのさらなる例は当技術分野で公知である。
【００３０】
「改変タンパク質（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という語は当技術分野で公知である。簡潔に述べると、「改変タンパク質」という語は、生物体（例えば、哺乳動物）内に存在する内因性核酸によって自然にコードされないポリペプチドを指すことができる。改変タンパク質の例には、改変酵素であって、該改変酵素の安定性および／もしくは触媒活性の増加をもたらす一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を伴う改変酵素、融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二価抗体、三価抗体、四結合ドメイン抗体、ダイアボディ、ならびに、少なくとも一つの組換えｓｃａｆｆｏｌｄ配列を含有する抗体結合タンパク質が挙げられる。
【００３１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という語は区別なく使用され、当技術分野で公知であり、長さまたは翻訳後修飾に関わらず、アミノ酸の任意のペプチド結合連結鎖を意味することができる。
【００３２】
「抗体」という語は当技術分野で公知である。「抗体」という語は、「免疫グロブリン」という語と区別なく使用されうる。簡潔に述べると、それは、二つの軽鎖ポリペプチドと二つの重鎖ポリペプチドとを含む全抗体を指しうる。全抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体を含む異なる抗体アイソタイプが含まれる。「抗体」という語は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化抗体またはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、脱免疫化抗体、および完全ヒト抗体を含む。抗体は、例えば、ヒトなどの哺乳動物、非ヒト霊長類（例えば、オランウータン、ヒヒ、またはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ（ｇｅｒｂｉｌ）、ハムスター、ラット、およびマウスなどの種々の種のいずれかにおいて作られるか、またはそれらに由来しうる。抗体は、精製抗体または組換え抗体とすることができる。
【００３３】
抗体はまた、少なくとも一つの免疫グロブリンドメインを含む改変タンパク質または抗体様タンパク質とすることができる（例えば、融合タンパク質）。改変タンパク質または抗体様タンパク質はまた、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または二量体、三量体もしくは多量体の抗体、またはダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣＯＤＶ−Ｉｇ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）とすることができる。
【００３４】
「抗体断片」、「抗原結合断片」という語、または類似の語は、当技術分野で公知であり、例えば、標的抗原（例えば、ヒトＣ５）に結合して該標的抗原の活性を阻害する能力を保持する抗体の断片を指す。かかる断片としては、例えば、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。ｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖの由来となる抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との両方を含む一本鎖ポリペプチドである。さらに、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、およびダイアボディもまた、抗体の定義内に含まれ、本明細書に記載の方法での使用に適合する。例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１）：４７−６６；Ｈｕｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｒｔｔ（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１（１）：１７７−１８９；Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２（１２）：１１２１−１１２３；Ｒｏｎｄｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒａｓｃｏ（１９９７）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５１：２５７−２８３を参照されたい。抗原結合断片は、重鎖ポリペプチドの可変領域、および軽鎖ポリペプチドの可変領域も含みうる。従って、抗原結合断片は、抗体の軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドのＣＤＲを含むことができる。
【００３５】
「抗体断片」という語はまた、例えば、ラクダ化された（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）単一ドメイン抗体等である単一ドメイン抗体を含み得る。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２６：２３０−２３５；Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １：２５３−２６３；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２３１：２５−３８；ＰＣＴ出願国際公開第９４／０４６７８および第９４／２５５９１号、ならびに米国特許第６，００５，０７９号を参照されたい。「抗体断片」という語はまた、単一ドメイン抗体が形成されるように修飾を有する二つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を含む。
【００３６】
「抗体」という語はまた、「抗原結合断片」および「抗体断片」を含む。
【００３７】
「ｋａ」という語は、当技術分野で周知であり、抗原に対する抗体の会合に関する速度定数を指すことができる。「ｋｄ」という語もまた、当技術分野で周知であり、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関する速度定数を指すことができる。そして「ＫＤ」という語は、当技術分野で公知であり、抗体抗原相互作用の平衡解離定数を指すことができる。平衡解離定数は、運動速度定数ＫＤ＝ｋａ／ｋｄの比から推定される。こうした決定は、典型的には、２５℃または３７℃で測定される。例えば、ヒトＣ５に結合する抗体の動態は、抗体を固定する抗Ｆｃ抗体捕捉法を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器上の表面プラズモン共鳴（「ＳＰＲ」）を介して、ｐＨ８．０、７．４、７．０、６．５および６．０で決定することができる。
【００３８】
「例えば」および「（例えば）〜など（等）の」という語およびそれらと文法的に同等なものに関して、「限定されない」という語句は、別段の明示がない限り、以下に従うことが理解される。本明細書で使用される場合、「約」という語は、実験誤差による変動を考慮することを意味する。本明細書に報告されるすべての測定値は、別段の明示がない限り、「約」という語が明文で用いられていても用いられていなくても、「約」という語によって変形されるものと理解される。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。
【００３９】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本発明で使用するための方法および材料が本明細書に記載されており、当技術分野で公知のその他の適切な方法および材料も使用できる。材料、方法、および実施例は単に例示的なものであり、限定することを意図していない。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が考慮される。
【００４０】
捕体系
【００４１】
周知のように、補体系は、体の他の免疫学系と共に作用することで、細胞病原体およびウイルス病原体の侵入に対して防御する。少なくとも２５個の補体タンパク質がある。補体成分は、複雑だが正確な一連の酵素的切断および膜結合イベントにおいて相互作用することにより、それらの免疫防御機能を達成する。その結果である補体カスケードが、オプソニン作用、免疫調節作用および溶解作用を有する産物の産生を導く。
【００４２】
補体カスケードは、古典経路（「ＣＰ」）、レクチン経路（「ＬＰ」）、または副経路（「ＡＰ」）を経て進行することができる。レクチン経路は典型的には、高マンノースである基質にマンノース結合レクチン（「ＭＢＬ」）が結合することにより開始される。ＡＰは抗体と独立であることができ、病原体表面上の特定の分子によって開始されうる。ＣＰは、典型的には、標的細胞上の抗原部位の抗体認識および該抗原部位への結合によって開始される。これらの経路は、Ｃ３転換酵素に収束するが、これは補体成分Ｃ３が活性プロテアーゼによって切断されてＣ３ａおよびＣ３ｂが得られる点である。
【００４３】
ＡＰのＣ３転換酵素は、補体成分Ｃ３の自発的な加水分解によって始動されるが、これは血液中の血漿内に豊富である。このプロセスはまた、「ｔｉｃｋｏｖｅｒ」としても知られており、Ｃ３におけるチオエステル結合の自発的な開裂を経て生じ、Ｃ３ｉまたはＣ３（Ｈ２Ｏ）を形成する。ｔｉｃｋｏｖｅｒは、活性化されたＣ３の結合をサポートする、および／または中性もしくは陽性の電荷特性を持つ表面（例えば、細菌細胞表面）の存在によって促進される。このＣ３（Ｈ２Ｏ）の形成が、血漿タンパク質因子Ｂの結合を可能にし、これは次に因子Ｄにより因子ＢがＢａおよびＢｂに切断される。Ｂｂ断片はＣ３に結合したままであり、Ｃ３（Ｈ２Ｏ）Ｂｂ−「液相（ｆｌｕｉｄ−ｐｈａｓｅ）」または「開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）」のＣ３転換酵素、を含有する複合体を形成する。少量で生成されるのみであるが、液相Ｃ３転換酵素は、複数のＣ３タンパク質をＣ３ａおよびＣ３ｂに切断することができ、Ｃ３ｂの生成とその後のある表面（例えば、細菌表面）へのＣ３ｂの共有結合とが結果として生じる。表面結合性Ｃ３ｂに結合した因子Ｂは、因子Ｄによって切断されて、それによってＣ３ｂ、Ｂｂを含有する表面結合性ＡＰ  Ｃ３転換酵素複合体を形成する。例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ（１９８８）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５７：３２１−３４７を参照されたい。
【００４４】
ＡＰのＣ５転換酵素−（Ｃ３ｂ）２，Ｂｂ−は、第二のＣ３ｂモノマーがＡＰ  Ｃ３転換酵素に付加すると形成される。例えば、Ｍｅｄｉｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １４４：１０７６−１０９３およびＦｅａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １４２：８５６−８６３を参照されたい。第二のＣ３ｂ分子の役割は、Ｃ５に結合して、Ｂｂでの切断のためにそれを提示することである。例えば、Ｉｓｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２４：３２６−３３１を参照されたい。ＡＰのＣ３転換酵素およびＣ５転換酵素は、例えば、上記したＭｅｄｉｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）に記載されるような、三量体タンパク質プロパージンの付加によって安定化される。しかしながら、プロパージンの結合は、機能的な副経路のＣ３転換酵素またはＣ５転換酵素の形成には不用である。例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７５：  ３９４８−３９５２、およびＳｉｓｓｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：５５９−５６２を参照されたい。
【００４５】
ＣＰのＣ３転換酵素は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、およびＣ１ｓの複合体である補体成分Ｃ１が、標的抗原（例えば、微生物抗原）に結合している抗体と相互作用することによって形成される。Ｃ１のＣ１ｑ部分が抗体抗原複合体に結合することで、Ｃｌｒを活性化させるものであるＣ１の構造変化が生じる。活性Ｃ１ｒは次に、Ｃ１に会合したＣ１ｓを切断し、それによって活性型セリンプロテアーゼが生成する。活性Ｃ１ｓは、補体成分Ｃ４をＣ４ｂおよびＣ４ａに切断する。Ｃ３ｂと同様に、新たに生成されたＣ４ｂ断片は、標的表面（例えば、微生物細胞表面）上の適切な分子とのアミド結合またはエステル結合を容易に形成する非常に反応性の高いチオールを含有する。Ｃ１ｓはまた、補体成分Ｃ２をＣ２ｂおよびＣ２ａに切断する。Ｃ４ｂおよびＣ２ａによって形成される複合体は、ＣＰのＣ３転換酵素であり、これはＣ３をＣ３ａおよびＣ３ｂに処理する能力を有する。ＣＰのＣ５転換酵素−Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ、Ｃ３ｂ−は、Ｃ３ｂモノマーがＣＰのＣ３転換酵素に付加すると形成される。例えば、上記したＭｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ（１９８８）、およびＣｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２：７７５−７９３を参照されたい。
【００４６】
Ｃ３ｂはまた、Ｃ３転換酵素およびＣ５転換酵素におけるその役割に加えて、マクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞の表面上に存在する補体受容体とのその相互作用を通してオプソニンとして機能する。Ｃ３ｂのオプソニン作用は、概して、補体系の最も重要な抗感染機能の一つであると考えられている。Ｃ３ｂの作用を阻害する遺伝子病変を有する患者は、多種多様な病原性生物体に感染しやすく、一方、補体カスケードシーケンス下流の病変を有する患者、すなわち、Ｃ５の作用を阻害する病変を有する患者は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）感染のみに対してより感染しやすいため、いくらか感染しやすいのみであることが判明している。
【００４７】
ＡＰおよびＣＰのＣ５転換酵素は、Ｃ５を切断するが、これは正常なヒト血清中において約７５μｇ／ｍｌ（０．４μＭ）で見られる１９０ｋＤａのベータグロブリンである。Ｃ５はグリコシル化されており、その質量の約１．５〜３パーセントが炭水化物に起因する。成熟Ｃ５は、６５５アミノ酸の７５ｋＤａのベータ鎖にジスルフィド結合している、９９９アミノ酸の１１５ｋＤａのアルファ鎖のヘテロ二量体である。Ｃ５は、単一コピー遺伝子の一本鎖前駆体タンパク質産物として合成される（Ｈａｖｉｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３６２−３６８）。このヒト遺伝子の転写物のｃＤＮＡ配列が、１８アミノ酸リーダー配列に加えて１６５８個のアミノ酸のうちの分泌されたプロＣ５前駆体を予測する。例えば、米国特許第６，３５５，２４５号を参照されたい。
【００４８】
プロＣ５前駆体は、６５５アミノ酸および６５９アミノ酸の後で切断されて、アミノ末端断片（上記配列のアミノ酸残基＋１〜６５５）としてのベータ鎖と、カルボキシル末端断片（上記配列のアミノ酸残基６６０〜１６５８）としてのアルファ鎖とが得られ、この二つの間にある四個のアミノ酸（上記配列のアミノ酸残基６５６〜６５９）は欠失している。
【００４９】
Ｃ５ａは、アルファ鎖のうちの最初の７４個のアミノ酸（すなわち、上記配列のアミノ酸残基６６０〜７３３）を含むアミノ末端断片として、副経路または古典経路のいずれかのＣ５転換酵素によってＣ５のアルファ鎖から切断される。１１ｋＤａ質量のＣ５ａの約２０パーセントは、炭水化物に起因する。転換酵素作用（ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ａｃｔｉｏｎ）の切断部位は、アミノ酸残基７３３においてであるかまたはそれに直接隣接している。この切断部位にまたは隣接して結合することとなる化合物は、Ｃ５コンバターゼ酵素が切断部位に接近するのを阻害し、それによって補体阻害剤として作用する可能性がある。切断部位の遠位部位でＣ５に結合する化合物は、例えば、Ｃ５とＣ５転換酵素との相互作用の立体障害介在性阻害によってＣ５切断を阻害する可能性もある。化合物はまた、マダニ唾液（ｔｉｃｋ  ｓａｌｉｖａ）の補体阻害剤であるＯｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａ  Ｃ阻害剤（ＯｍＣＩ）の作用機序と一致する作用機序において、Ｃ５転換酵素のＣ５切断部位への接近を減少させる、Ｃ５のアルファ鎖のＣ３４５Ｃドメインの柔軟性を低下させることによってＣ５切断を防止しうる。例えば、Ｆｒｅｄｓｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９（７）：７５３−７６０を参照されたい。
【００５０】
Ｃ５はＣ５転換酵素活性以外の手段によって活性化することもできる。制限されたトリプシン消化（例えば、Ｍｉｎｔａ  ａｎｄ  Ｍａｎ（１９９７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１９：１５９７−１６０２およびＷｅｔｓｅｌ  ａｎｄ  Ｋｏｌｂ（１９８２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２８：２２０９−２２１６）および酸処理（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｇｅｗｕｒｚ（１９７８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２０：２００８およびＤａｍｅｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６：１１３３−１１４２）により、Ｃ５を切断して活性Ｃ５ｂを産生することもできる。
【００５１】
Ｃ５の切断により、強力なアナフィラトキシンおよび走化性因子であるＣ５ａが放出され、溶解性終末補体複合体Ｃ５ｂ−９の形成がもたらされる。Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９はまた、加水分解酵素、活性酸素種、アラキドン酸代謝産物、および様々なサイトカインなどの下流炎症因子の放出を増幅することによって、多面発現的な細胞活性化特性も有する。
【００５２】
終末補体複合体の形成の第一工程は、Ｃ５ｂをＣ６、Ｃ７、およびＣ８と組み合わせることを含み、Ｃ５ｂ−８複合体を標的細胞表面で形成する。Ｃ５ｂ−８複合体がいくつかのＣ９分子と結合すると、膜傷害複合体（「ＭＡＣ」、終末補体複合体「ＴＣＣ」であるＣ５ｂ−９）が形成される。標的細胞膜に十分な数のＭＡＣを挿入すると、それらが作り出す開口（ＭＡＣポア）が、赤血球などの標的細胞の急速な浸透圧溶解に介在する。非溶解（ｎｏｎ−ｌｙｔｉｃ）性の濃度の低いＭＡＣは、その他の影響を生じうる。特に、内皮細胞および血小板への少数のＣ５ｂ−９複合体の膜内挿入は、有害な細胞活性化を引き起こす可能性がある。一部の事例では、活性化が細胞溶解に先行しうる。
【００５３】
Ｃ３ａおよびＣ５ａはアナフィラトキシンである。これらの活性化された補体成分は、好塩基球および肥満細胞からのヒスタミン、ならびに、平滑筋収縮、血管透過性亢進、白血球活性化、および、細胞過形成をもたらす細胞増殖を含めた他の炎症性の現象をもたらす他の炎症の介在物質が放出される、肥満細胞の脱顆粒を誘発することがある。Ｃ５ａはまた、炎症促進性顆粒球を補体活性化部位に引き付ける働きをする走化性ペプチドとして機能する。
【００５４】
Ｃ５ａ受容体は、気管支および肺胞の上皮細胞ならびに気管支の平滑筋細胞の表面上で発見される。Ｃ５ａ受容体は、好酸球、肥満細胞、単球、好中球、および活性化リンパ球上でも発見されている。
【００５５】
補体系が適切に機能することで、微生物に感染することに対して頑強な防御がもたらされる一方、補体の不適切な制御または活性化が、例えば、関節リウマチ；ループス腎炎；喘息；虚血再灌流障害；非典型溶血性尿毒症症候群（「ａＨＵＳ」）；デンスデポジット病；発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）；黄斑変性症（例えば、加齢性黄斑変性；溶血、肝酵素上昇および血小板低下の症候群（ＨＥＬＬＰ症候群）；血小板減少性血栓性紫斑病（ＴＴＰ）；自然死産；Ｐａｕｃｉ−ｉｍｍｕｎｅ型血管炎；表皮水疱症；習慣性流産；多発性硬化症（ＭＳ）；外傷性脳損傷；ならびに、心筋梗塞、心肺バイパスおよび血液透析から生じた損傷を含む、様々な障害の発症に関与してきた。例えば、Ｈｏｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２２３：３００−３１６を参照されたい。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「Ｃ５ａ」という用語は、プロテアーゼＣ５転換酵素によるヒト補体成分Ｃ５のＣ５ａおよびＣ５ｂ断片への切断により放出されるタンパク質断片を指す。ヒトＣ５のプロフォーム（ｐｒｏｆｏｒｍ）、１６７６アミノ酸残基前駆体タンパク質は、一連のタンパク質切断事象によって処理される。最初の１８個のペプチド（−１８〜−１で番号付けられた）は、前駆体タンパク質から切断されるシグナルペプチドを構成する。残りの１６５８アミノ酸タンパク質は、二箇所で切断されてアルファ鎖およびベータ鎖を形成する。第一の切断事象は、アミノ酸残基６５５と６５６との間で発生する。第二の切断は、アミノ酸残基６５９と６６０との間で発生する。二つの切断事象が、以下の三つの独立のポリペプチド断片の形成をもたらす：（ｉ）アミノ酸１〜６５５を含む断片、ベータ鎖と称する；（ｉｉ）アミノ酸６６０〜１６５８を含む断片、アルファ鎖と称する；および（ｉｉｉ）アミノ酸６５６〜６５９からなるテトラペプチド断片。このアルファ鎖およびベータ鎖のポリペプチド断片は、ジスルフィド結合を介して相互に接続され、成熟Ｃ５タンパク質を構成する。ＣＰまたはＡＰのＣ５転換酵素は、アルファ鎖の残基７３３と７３４との間を切断することによって成熟Ｃ５を活性化し、結果としてこれがＣ５ａ断片（アミノ酸６６０〜７３３）の遊離をもたらす。成熟Ｃ５の残りの部分は断片Ｃ５ｂであり、これはベータ鎖にジスルフィド結合したアルファ鎖の残基７３４〜１６５８を含有する。生体内では、Ｃ５ａは血清酵素、カルボキシペプチダーゼＢによって、カルボキシル末端のアルギニン残基を欠いているものである「Ｃ５ａ  ｄｅｓａｒｇ」と称される７３アミノ酸形態に急速に代謝される。
【００５７】
抗Ｃ５ａ抗体
【００５８】
本明細書で開示されている方法での使用に適した抗Ｃ５ａ抗体（またはそれから誘導されるＶＨ／ＶＬドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは、当技術分野で認識されている抗Ｃ５ａ抗体を使用できる。Ｃ５ａに結合する、これら当技術分野で認識されている抗体のいずれかと競合する抗体もまた使用できる。
【００５９】
例示的な抗Ｃ５ａ抗体は、それぞれ配列番号１０および２で示す配列を有する重鎖および軽鎖を含むＢＮＪ３８３（「ＡＬＸＮ１００７」としても知られる）であるか、またはその抗原結合断片および変異体である。ＢＮＪ３８３は、国際特許出願国際公開第２０１１／１３７３９５号（例えば、表２）および米国特許第９，０１１，８５２号に記載されており、これらの教示は参照により本明細書に援用される。ＢＮＪ３８３は、補体成分Ｃ５ａおよびその代謝産物Ｃ５ａ  ｄｅｓＡｒｇに結合する組換えヒト化モノクローナル抗体である。生体外および生体内での非臨床データおよび進行中の第Ｉ相臨床試験からのデータが、ＢＮＪ３８３は、忍容性良好であり、そのエピトープに対して非常に特異的であり、Ｃ５ａ媒介性のシグナル伝達の強力なアンタゴニストであり、また循環からのＣ５ａ／Ｃ５ａ  ｄｅｓＡｒｇを枯渇させるということを実証している。
【００６０】
他の実施形態では、抗体は、ＢＮＪ３８３の重鎖および軽鎖のＣＤＲまたは可変領域を含む。一実施形態では、抗体は、配列番号１２に記載された配列を有するＢＮＪ３８３のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインと、配列番号４に記載された配列を有するＢＮＪ３８３のＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインとを含む。別の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１３、１４および１５に記載された配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインと、それぞれ配列番号５、６、および７に記載された配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とをそれぞれ含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１２および配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有するＶＨおよびＶＬ領域を含む。
【００６１】
ＣＤＲの正確な境界は、異なる方法に従って様々に定義されている。一部の実施形態では、軽鎖もしくは重鎖の可変ドメイン内のＣＤＲまたはフレームワーク領域の位置は、Ｋａｂａｔらによって規定されているとおり［（１９９１）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．”ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ］とすることができる。このような場合には、ＣＤＲは、「Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ（カバットＣＤＲ）」（例えば、「Ｋａｂａｔ  ＬＣＤＲ２」または「Ｋａｂａｔ  ＨＣＤＲ１」など）と称することができる。一部の実施形態では、軽鎖可変領域または重鎖可変領域のＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３によって規定されているとおりとすることができる。したがって、これらの領域は、「Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ」（例えば、「Ｃｈｏｔｈｉａ  ＬＣＤＲ２」または「Ｃｈｏｔｈｉａ  ＨＣＲ３」）と称することができる。一部の実施形態では、軽鎖可変領域および重鎖可変領域のＣＤＲの位置は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとを（Ｋａｂａｔ−Ｃｈｏｔｈｉａ）組み合わせた定義によって規定されているとおりとすることができる。このような実施形態では、これらの領域を「Ｋａｂａｔ−ＣｈｏｔｈｉａコンビＣＤＲ」と称することがある。Ｔｈｏｍａｓら［（１９９６）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３３（１７／１８）：１３８９−１４０１］は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの定義に従ってＣＤＲ境界の特定を例示する。
【００６２】
抗体がタンパク質抗原に結合しているか否か、および／または、タンパク質抗原に対する抗体の親和性を決定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、タンパク質抗原への抗体の結合は、ウェスタンブロット、ドットブロット、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ社、スウェーデン、ウプサラおよびニュージャージー州ピスカタウェイ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの様々な技術を使用して検出および／または定量化することができる。例えば、Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．Ｌｏ（２００４）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ：１５８８２９０９２１）；Ｊｏｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  １６０：１９１−１９８；Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ  Ｂｉｏｌ  Ｃｌｉｎ  ５１：１９−２６、およびＪｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７を参照されたい。
【００６３】
一実施形態では、抗Ｃ５ａ抗体またはその抗原結合断片は、哺乳動物（例えば、ヒト）Ｃ５ａタンパク質に結合する。例えば、抗Ｃ５ａ抗体またはその抗原結合断片は、以下のアミノ酸配列：ＴＬＱＫＫＩＥＥＩＡＡＫＹＫＨＳＶＶＫＫＣＣＹＤＧＡＣＶＮＮＤＥＴＣＥＱＲＡＡＲＩＳＬＧＰＲＣＩ
ＫＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧＲ（配列番号１７）を有するヒトＣ５ａタンパク質に結合することができる。別の実施形態では、抗Ｃ５ａ抗体またはその抗原結合断片は、以下のアミノ酸配列：ＴＬＱＫＫＩＥＥＩＡＡＫＹＫＨＳＶＶＫＫＣＣＹＤＧＡＣＶＮＮＤＥＴＣＥＱＲＡＡＲＩＳＬＧＰＲＣＩＫＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲＡＮＩＳＨＫＤＭＱＬＧ（配列番号１８）を有する脱アルギニン化（ｄｅｓａｒｇｉｎａｔｅｄ）したヒトＣ５ａタンパク質に結合する。本明細書に記載される抗Ｃ５ａ抗体、またはその抗原結合断片は、完全長ヒトＣ５ａおよび脱アルギニン化ヒトＣ５ａの両方に結合することができる。
【００６４】
一実施形態では、抗Ｃ５ａ抗体またはその抗原結合断片は、遊離ヒトＣ５ａ（ｈＣ５ａ、例えば、配列番号１７で示すアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるヒトＣ５ａタンパク質））に結合する。別の実施形態では、抗Ｃ５ａ抗体、またはその抗原結合断片は、例えば配列番号１８で示すアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるヒトＣ５ａの脱アルギニン化形態である、遊離Ｃ５ａの脱アルギニン化形態に結合する。抗体は遊離Ｃ５ａのネオエピトープに結合することができるが、このエピトープは、切断されていないＣ５上には存在しないか、または切断されていない全体のＣ５のうちの小フラクション上のみに存在する。
【００６５】
一実施形態では、抗体は、本明細書に記載される抗体とＣ５ａ上の同じエピトープとの結合に競合するか、および／または本明細書に記載される抗体とＣ５ａ上の同じエピトープに結合する。二つ以上の抗体に言及して「同じエピトープに結合する」という語は、所与の方法によって決定されるように、抗体がアミノ酸残基のうちの同一セグメントに結合することを意味する。抗体が、本明細書に記載される抗体と「Ｃ５ａ上の同じエピトープ」に結合しているか否かを決定する技術としては、例えば、エピトープの原子解析が提供される抗原抗体複合体の結晶のＸ線解析などのエピトープマッピング法、および水素／重水素交換質量分析法（ＨＤＸ−ＭＳ）が挙げられる。その他の方法には、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾に起因する結合の喪失が、エピトープ成分の表れとしばしばみなされるものである、ペプチド抗原断片または抗原の突然変異型のバリエーションに対する抗体の結合を監視することがある。さらに、エピトープマッピングのための計算的なコンビナトリアル法も使用することができる。これらの方法は、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリから特定の短いペプチドをアフィニティ単離する、関心の抗体の能力に依存している。同じＶＨおよびＶＬまたは同じＣＤＲ１、２および３配列を有する抗体は、同じエピトープに結合することが予想される。
【００６６】
「標的との結合に別の抗体と競合する」抗体は、他の抗体の該標的への結合を阻害（一部または完全に）する抗体を指す。二つの抗体が、標的への結合に関して相互に競合するか否か、すなわち、一方の抗体が、もう一方の抗体の標的への結合を阻害するかどうか、そしてどの程度まで阻害するかを、公知の競合実験を使用して決定することができる。特定の実施形態では、抗体は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％だけ、別の抗体と競合して、該別の抗体の標的への結合を阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が「阻害している抗体」（すなわち、最初に標的と共にインキュベートされた低温抗体）であるかによって、異なるものでありうる。競合抗体は、同じエピトープ、オーバーラップするエピトープ、または隣接し合うエピトープ（例えば、立体障害から明らかなように）に結合する。
【００６７】
本明細書に記載され、本明細書に記載される方法で使用される抗Ｃ５ａ抗体、またはその抗原結合断片は、当技術分野において認識される様々な技術を使用して生成することができる。
【００６８】
モノクローナル抗体は、当業者によく知られている様々な技術によって得られ得る。簡潔に述べると、所望の抗原で免疫化された動物由来の脾臓細胞は、通常、骨髄腫細胞との融合によって不死化される（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）を参照されたい）。代替的な不死化法としては、エプスタイン・バーウイルス、癌遺伝子、またはレトロウイルス、または当技術分野で周知の他の方法を用いた形質転換が挙げられる。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、抗原に対して所望の特異性および親和性をもつ抗体の産生のためにスクリーニングされ、かかる細胞によって産生されるモノクローナル抗体の産生量は、脊椎動物宿主の腹膜腔への注射を含めた様々な技術によって増強されてもよい。あるいは、Ｈｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）により概説される一般的なプロトコルに従って、ヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合断片をコードするＤＮＡ配列を単離してもよい。
【００６９】
抗Ｃ５ａ抗体は、モノクローナル抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体などとすることができる。抗Ｃ５ａ抗体は、融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質は、融合タンパク質が融合タンパク質をコードする核酸から発現されるように、組換えによって構築されうる。融合タンパク質は、一つ以上のＣ５ａ結合ポリペプチドのセグメントを含むことができる。
【００７０】
一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、ターゲティング部分と融合する。例えば、構築物は、Ｃ５結合ポリペプチドと、ポリペプチドを補体活性化部位に向かわせるターゲティング部分とを含むことができる。かかるターゲティング部分には、例えば、補体受容体１（ＣＲ１）の可溶形態、補体受容体２（ＣＲ２）の可溶形態、またはＣ３ｂおよび／もしくはＣ３ｄに結合する抗体（またはその抗原結合断片）が含まれ得る。
【００７１】
組換えＤＮＡ技術を含めて、融合タンパク質（例えば、Ｃ５ａ結合ポリペプチドと、ヒトＣＲ１またはヒトＣＲ２の可溶形態とを含有する融合タンパク質）を生成する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，８９７，２９０号；米国特許出願公開第２００５２６５９９５号、およびＳｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１（１２）：１８７５−１８８５に記載されている。
【００７２】
特定の実施形態では、抗Ｃ５ａ抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体（例えば、抗Ｃ５ａ抗体と、Ｃ３ｂおよび／またはＣ３ｄに結合する抗体とを含む二重特異性抗体）を製造する方法も当技術分野で公知である。Ｃ５結合抗体およびその他の抗体を含む二重特異性抗体を意図している。
【００７３】
多種多様な二重特異性抗体の形態は、抗体工学分野で公知であり、二重特異性抗体（例えば、抗Ｃ５ａ抗体［すなわち、Ｃ５ａ結合抗体］と、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄ、または組織特異的抗原に結合する抗体とを含む二重特異性抗体）の製造方法は、当業者の範囲において周知である。例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０；ＰＣＴ出願国際公開第９６／２７０１１号を参照されたい。
【００７４】
二重特異性抗体はまた、架橋されたまたは異種結合（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の抗体も含む。異種結合抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製されうる。好適な架橋剤は当技術分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に、多数の架橋技術と共に開示されている。米国特許第５，５３４，２５４号には、例えば、ペプチドカプラー（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｕｐｌｅｒ）、キレート剤、または化学的結合もしくはジスルフィド結合によって共に連結された一本鎖Ｆｖ断片を含む、いくつかの異なるタイプの二重特異性抗体が記載されている。別の例では、Ｓｅｇａｌ  ａｎｄ  Ｂａｓｔ［（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｓｕｐｐｌ．１４：２．１３．１−２．１３．１６］には、二つの単一特異性抗体を化学的に架橋結合して、それにより二重特異性抗体を形成する方法が記載されている。二重特異性抗体は、例えば、Ｃ５結合抗体、および、例えばＣ３ｂ、Ｃ３ｄ、または肺特異的抗原、眼特異的抗原、腎特異的抗原などに結合する抗体から選択される二つの一本鎖抗体を複合化することによって形成することができる。
【００７５】
二重特異性抗体は、リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）によって共有結合した二つの異なるｓｃＦｖ断片を含有する、タンデム一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ断片とすることができる。例えば、Ｒｅｎ−Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  １００：１０９５−１１０３およびＫｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ６：６４２−６５１を参照されたい。
【００７６】
二重特異性抗体はダイアボディとすることもできる。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８に記載のダイアボディ技術では、二重特異性抗体断片を作製するための代替機構が提供されている。この断片は、短すぎて同じ鎖上では二つのドメイン間を結合することができないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続されている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、一つの断片のＶＨおよびＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬおよびＶＨドメインと強制的に結合されて、それによって二つの抗原結合部位を形成する。Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１９２−１９６およびＨｅｌｆｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７６：２３２−２３９もまた参照されたい。二重特異性一本鎖ダイアボディ（「ｓｃＤｂ」）と、ｓｃＤｂを生成するための方法とが、例えば、Ｂｒｕｓｓｅｌｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ４：１１５−１２３；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：４１−５６、およびＮｅｔｔｌｅｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ３：８８２−８９１に記載されている。
【００７７】
Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５（１１）：１２９０−１２９７に記載の四価（ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ）の二重可変領域免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）分子等である二重特異性抗体の異型も本発明の方法で使用することができる。ＤＶＤ−Ｉｇ分子は、二つの異なる親抗体からの二つの異なる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、直接に、または組換えＤＮＡ技術による短鎖のリンカーを介して、それに続いて短鎖定常ドメインが、タンデム型に連結されるように設計されている。二つの親抗体からＤＶＤ−Ｉｇ分子を生成するための方法は、例えば、ＰＣＴ国際公開第０８／０２４１８８号および第０７／０２４７１５号にさらに記載されている。また、例えば、米国特許出願公開第２００７０００４９０９号に記載されている二重特異性の形態も包含される。使用できる別の二重特異性の形態は、国際公開第２０１２／１３５３４５号に記載された四つのドメイン抗体様分子を改変した形態である、交差二重Ｖ領域（Ｃｒｏｓｓ−Ｏｖｅｒ  Ｄｕａｌ  Ｖ  Ｒｅｇｉｏｎ）（ＣＯＤＶ−Ｉｇ）である。ＣＯＤＶ−Ｉｇは、改変二重特異性抗体様分子に有用であることが証明されており、Ｃ末端Ｖドメイン（内部）での立体障害がＤＶＤ−Ｉｇの構築を防止できるものである。
【００７８】
二重特異性抗体分子を形成するために使用されるＣ５ａ結合抗体および／またはターゲティング部分は、例えば、キメラ、ヒト化、再ヒト化、脱免疫化、または完全ヒトとすることができ、その全てが当技術分野で周知である。
【００７９】
抗Ｃ５ａ抗体は、組換えＤＮＡ技術によって産生されてもよい。例えば、Ｃ５ａ結合ポリペプチドをコードする核酸は、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終止配列、翻訳開始配列および翻訳終止配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサー配列または活性化因子配列を含む、転写調節配列ならびに翻訳調節配列を含有する発現ベクターに挿入することができる。調節配列は、プロモーターならびに転写開始および終止配列を含む。さらに、発現ベクターは、例えば、発現のための哺乳動物または昆虫細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のための原核宿主において、二つの異なる生物体中で維持され得るように、二つ以上の複製系を含むことができる。
【００８０】
哺乳動物細胞中を含む、多くの細胞中の核酸からの抗Ｃ５抗体の発現に関して、当技術分野で周知のいくつかの可能性のあるベクター系（プラスミドベクター系など）が利用可能である。
【００８１】
発現ベクターは、核酸のその後の発現に適した方法で、当技術分野で周知の方法によって細胞内に導入され得る。
【００８２】
抗Ｃ５ａ抗体は、任意の適切な宿主細胞中で発現してもよい。適切な宿主細胞としては、例えば酵母、細菌、昆虫、植物体、および哺乳動物の細胞が挙げられ、これには、大腸菌などの細菌、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピシア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの真菌、ＳＦ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞株（例えば、ヒト細胞株）、初代細胞株（例えば、初代哺乳動物細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ならびにＮＳＯなどの適切な骨髄腫細胞株が含まれる。
【００８３】
一部の実施形態では、抗Ｃ５ａ抗体は、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）内で発現され、それらから精製されてもよい。例えば、抗Ｃ５ａ抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、げっ歯類、ヒツジまたはヤギ）内で産生され、例えばＨｏｕｄｅｂｉｎｅ（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３（６）：６２５−６２９；ｖａｎ  Ｋｕｉｋ−Ｒｏｍｅｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ９（２）：１５５−１５９、およびＰｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１（１−２）：１４７−１５７に記載されるように乳から単離してもよい。
【００８４】
抗Ｃ５ａ抗体は、タンパク質を発現させるのに十分な条件下および時間の間、ポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することによって細胞から産生してもよい。タンパク質発現のためのこのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変動し、またルーチンな実験を通して当業者によって容易に確認されることとなる。例えば、組換えＤＮＡ技術の包括的開示を有する、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  −−３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）を参照されたい。
【００８５】
発現後、抗Ｃ５ａ抗体は、当業者に公知の様々な方法で単離または精製されてもよい。
【００８６】
抗Ｃ５ａ抗体は治療剤として使用されてもよく、任意の適切な剤形／組成物として、また任意の適切な経路によって（例えば、ＩＶ注射によって）、それを必要とする患者に投与される。抗Ｃ５ａ抗体はまた、本明細書に開示される方法において捕捉抗体または検出抗体としても使用されうる。
【００８７】
逆分離（Ｂａｃｋ  Ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）ＥＬＳＩＡアッセイモデリング
【００８８】
標的バイオマーカー／有効性バイオマーカーを定量化する場合、従来のプレートベースのリガンド結合アッセイでは、遊離分析物を過大評価する可能性がある。このような状況での遊離分析物の過大評価は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での真のものよりも有効性の欠如がより低く示唆される。エクリズマブは、２つの極めて稀な疾患の適応症に認可されたｍＡｂ治療薬であり、補体因子Ｃ５（１９０ｋＤ）を標的とする。薬剤の存在下での遊離Ｃ５の適切な定量化が重要である。
【００８９】
実験的証拠は、ＥＬＳＩＡプレートに結合している抗原が、溶液およびプレートに対して平衡に到達するのに少なくとも３０時間が必要であることを示す。
【００９０】
臨界パラメータは、インキュベーション時間、希釈時間、希釈温度、および試料対アッセイ範囲である。プレートインキュベーション時間が短いと、解離が減少する場合がある。二つの希釈工程中に冷却することで、速度ｋｄを遅くし、抗原−ｍＡｂおよび抗原−ｍＡｂ−抗原が解離しないようにさせることができる。希釈時間を短くすると、解離が減少する場合がある。希釈の不足が解離を減少させうる。可能であれば、純粋な試料を測定する。
【００９１】
抗原濃度及びｍＡｂ濃度（ＰＫ）のデータの不一致は、以下に原因がある：アッセイの希釈液および時間が異なること；測定された抗原濃度が、遊離抗原の過大評価であること；および測定されたｍＡｂ（ＰＫ）が、希釈による解離に起因した真の遊離ｍＡｂの過大評価であること、および溶液抗原（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）に起因した総ｍＡｂの過小評価であること。
【００９２】
溶血モデリング（Ｃ５を含有するヒト血清試料についての溶血アッセイを使用する）が、抗原、ＰＫ、および溶血（ＰＤ）データの不一致は以下に原因があるということを示唆している：アッセイの希釈および時間が異なること；測定された抗原濃度が、溶血アッセイにおける遊離抗原の過大評価であること；および測定されたｍＡｂ−エクリズマブ（Ｅｃｕｌｚｕｍａｂ）−（ＰＫ）が、希釈による解離に起因した真の遊離ｍＡｂの過大評価であること、および溶液抗原に起因した総ｍＡｂの過小評価であること；ならびに、測定された溶血が、希釈による解離に起因した真の遊離抗原の過大評価であること。
【００９３】
平衡方程式
【００９４】
【数１】
2019537711.tif 000002
【００９５】
ｍＡｂ＋Ｌ＝ｍＡｂ＊Ｌ
【００９６】
【数２】
2019537711.tif 000003
【００９７】
Ｋｄ＝１／ｋａ＝［Ｍａｂ］遊離ｘ［Ｌ］遊離／［Ｍａｂ＊Ｌ］結合
【００９８】
【数３】
2019537711.tif 000004
【００９９】
Ｋｄ＝解離定数、Ｋａ＝会合定数
【０１００】
Ｋオフ＝解離速度、ｋオン＝会合速度
【０１０１】
投与後は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の可溶性Ｌ（リガンド）に対するｍＡｂの結合は、質量作用の法則に従うものと仮定した。試料採取、保存などの生体外での条件は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）とは異なる条件に平衡が移行しうる。
【０１０２】
ｋオフの値は多くの場合、温度と緩衝液への感度が高い。平衡時間は、３０℃の場合と比較して、０℃で約３０倍増加する。解離速度定数は、常にアッセイの条件下で決定する必要がある。
【０１０３】
Ｌ遊離の測定
【０１０４】
薬物開発において決定を下すために次第に使用されてきており、用量とスケジュールの選択に有用である。Ｌの動態を理解することが、有効なｍＡｂ遊離レベルの規定の助けとなり得る。
【０１０５】
遊離Ｃ５Ａを定量化する方法の特定の実施形態
【０１０６】
標的バイオマーカー／有効性バイオマーカーを定量化する場合、従来のプレートベースのリガンド結合アッセイでは、遊離分析物を過大評価する可能性がある。このような状況での遊離分析物の過大評価は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での真のものよりも有効性の欠如がより低く示唆される。ＡＬＸＮ１００７は、移植片対宿主病に罹患しているヒト患者を治療するための臨床試験を受けている治療的なｍＡｂであり、相補因子Ｃ５ａを標的とする。薬剤の存在下での遊離Ｃ５ａの適切な定量化が重要である。
【０１０７】
Ｃ５ａに特異的に結合し、かつ、Ｃ５に特異的に結合しないという抗体は知られていない。したがって、Ｇｙｒｏｓシステムにおいて遊離Ｃ５ａを捕捉および検出する前に、はじめにＣ５を試料から除去する。試料を、磁気ビーズに結合したＣ５特異的抗体と共にインキュベートして、Ｃ５特異的抗体およびＣ５が結合した磁気ビーズを捕捉することによってＣ５を除去することによって、Ｃ５を除去することができ、磁石によりＣ５ａを含む上清が得られる。
【０１０８】
本明細書に開示される方法において、Ｇｙｒｏｓシステム（スウェーデン、ウプサラのＧｙｒｏｓ  ＡＢ社；ｗｗｗ．ｇｙｒｏｓ．ｃｏｍ）を使用する。Ｇｙｒｏｓアッセイは、秒単位で微細構造に沿って試料を通過させるため、逆向きである解離が生じる機会はあり得ない。Ｇｙｒｏｓシステムは、アフィニティ流動フォーマットを使用し、インキュベーションを省き、実行時間が短縮される。Ｇｙｒｏｓプラットフォームは、Ｇｙｒｏｌａｂプラットフォームに統合される高再現性のナノリットルマイクロ流体工学により設計されたＧｙｒｏｓ専有ＣＤ技術を使用するが、それがレーザー誘導蛍光検出を使用した平行性プロセッシングを伴う免疫アッセイを自動化する。このことは、ＣＤ内に含まれるナノリットルスケールのマイクロ流体構造を通る液体の流れを導く、遠心力および毛細管力の正確で自動化された制御を通して可能となる。
【０１０９】
円形のＢｉｏａｆｆｙコンパクトディスク（ＣＤ）を使用する。ＰＣＲプレートは、試料および試薬のために使用しうる。多くの利用可能なＰＣＲプレートを使用してよい。プレートは箔で封止され、蒸発を防止する。捕捉試薬（ビオチン化抗Ｃ５ａ抗体など）は、毛細管作用によってＣＤに入る。疎水性部が液体の流れを停止させる。このＣＤは、Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰなどのアッセイ専用の機器の内部で遠心力を受ける。この遠心力により、試薬が、ＣＤ内部のカラムの中へと動かされる。捕捉試薬は、カラム内のストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）被覆粒子に結合する。その後試料が、毛細管作用によってＣＤに入り、活性化されたカラムに試料が付着する。その後検出試薬（例えば、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５ａ抗体；捕捉試薬として使用される抗Ｃ５ａ抗体と異なるエピトープに結合するもの）が、毛細管作用によってカラムに入り、カラムに付着する。その後、カラムをレーザーでスキャンする（９０秒以内に１１２カラム）。Ｒｅｘｘｉｐ  Ａは、標準試料、ＱＣ、試料に用いられ得、またＲｅｘｘｉｐ  Ｆは、検出Ａｂに用いられ得る。次いで、レーザー誘導蛍光を使用して、試料（例えば、Ｃ５ａ）の濃度または量を測定する。
【０１１０】
Ｇｙｒｏｓアッセイは、使用するサンプル量が非常に少なく（４μｌなど）、所要時間が非常に短い（１．５時間など）。較正範囲は０．７８ｐＭ〜３００ｐＭである。
【０１１１】
本開示は、試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５ａ補体タンパク質（Ｃ５ａ）を定量化する方法を提供するものであって、該方法が、
ａ．試料からヒトＣ５を除去することであって、試料を、磁気ビーズに結合したＣ５特異的ビオチン化抗体と共にインキュベートし、ヒトＣ５に結合したＣ５特異的ビオチン化抗体に結合した該磁気ビーズを磁石で捕捉することと、
ｂ．ストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体を結合させることであって、前記ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体は、ストレパビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００  ＣＤに毛細管作用によって付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、ビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体が、カラム中のストレパビジン被覆粒子へと動かされることと、
ｃ．試料中の遊離（非結合）Ｃ５ａを捕捉抗体上で捕捉することであって、工程ａの後の試料が毛細管作用によってＣＤに付着して、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、工程ａの後の試料が、カラム中のストレパビジン被覆粒子上に結合したビオチン化抗Ｃ５ａ捕捉抗体へと動かされることと、
ｄ．捕捉された遊離Ｃ５ａを検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５ａ検出抗体が、毛細管作用によってＣＤに付着して、該抗Ｃ５ａ検出抗体が、捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５ａに結合し、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、検出抗体が、カラム中のストレパビジン被覆粒子に結合された捕捉抗体に結合された遊離Ｃ５ａへと動かされることと、
ｅ．レーザー誘発蛍光検出を使用して捕捉された遊離Ｃ５ａを定量化することとを含む。
【０１１２】
ＡＬＸＮ１００７で治療された患者からの血清試料などである試料中のＣ５ａは、遊離（非結合）していてもよく、またはＡＬＸＮ１００７に結合していてもよい。
【０１１３】
Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂ  ＸＰなどのＧｙｒｏアッセイを使用するために適切な任意の機器を使用してもよい。
【０１１４】
特定の実施形態では、この方法が、工程ｅから得た値をＣ５ａ枯渇試料に添加した既知の量のＣ５ａから作成した標準曲線と比較することによって、遊離Ｃ５ａ抗体の濃度または量を計算することをさらに含む。コントロールを含む試料は、患者の試料と同じ方法で処理される。特定の実施形態では、この方法は、Ｇｙｒｏｓ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアまたは別の好適なソフトウェアを用いて遊離Ｃ５ａ抗体の濃度を計算することをさらに含む。
【０１１５】
特定の実施形態では、試料はヒト患者から獲得される。特定のさらなる実施形態では、試料は血清試料である。さらに他の実施形態では、試料は、ＡＬＸＮ１００７などの抗Ｃ５ａ抗体で治療を受けている患者からのものである。特定の実施形態では、試料はＡＬＸＮ１００７での治療前に採取される。他の実施形態では、試料はＡＬＸＮ１００７での治療後に採取される。試料は、Ｃ５ａを含みうる任意の適切な試料であってもよく、血清、血漿、血液、尿、固体試料などであってもよい。試料は、当技術分野で公知の方法に従って、使用のために取得されて調製されてもよい。
【０１１６】
特定の実施形態では、磁気ビーズはＤｙｎａｂｅａｄ磁気ビーズである。任意の適切な磁気ビーズおよび磁石が使用されてもよい。
【０１１７】
特定の実施形態では、Ｃ５特異的抗体はビオチン化Ｎ１９／８である。任意の適切なＣ５特異的抗体を使用してもよい。
【０１１８】
特定の実施形態では、ビオチン化捕捉抗体はＡＬＸＮ１００７である。ビオチン化捕捉抗体は、任意の抗Ｃ５ａ抗体であってもよい。
【０１１９】
特定の実施形態では、抗Ｃ５ａ検出抗体はクローン２９４２である。抗Ｃ５ａ検出抗体は、任意の抗Ｃ５ａ抗体であってもよい。任意の所与のアッセイにおける抗Ｃ５ａ検出抗体は、そのアッセイで使用される捕捉抗体と比較してＣ５ａ上の異なるエピトープを認識するものであり；そのため、Ｃ５ａへの結合は、捕捉抗体と競合しない。
【０１２０】
特定の実施形態では、試料の希釈に、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮ緩衝液または１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液が使用され、検出抗体の希釈に、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆ緩衝液が使用される。Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮ緩衝液、１Ｍ  Ｎａｃｌ／０，５％Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液、またはＲｅｘｘｉｐ  Ｆ緩衝液をわずかに変化させたものを含めて、任意の適切な緩衝液を用いることができる。
【０１２１】
特定の実施形態では、Ｇｙｒｏｓ機器が、Ｂｉｏａｆｆｙ  ｗａｓｈ  １およびｐＨ１１緩衝液を用いて別個に二回プライミングされる。任意の適切な緩衝液を使用してもよく、プライミングは省いてもよく、また任意の適切な回数でなされてもよい。
【０１２２】
抗体をビオチンまたはアレクサフルオールと複合化する方法は当技術分野で公知である。
【０１２３】
例示的な使用
【０１２４】
本明細書に開示される方法は、試料中の遊離（非結合）Ｃ５ａの濃度または量を定量化する必要がある任意の目的に使用されうる。この方法は、例えば、ＡＬＸＮ１００７療法によって治療されている患者からのヒト血清試料中の遊離（非結合）Ｃ５ａの濃度または量を検出するために使用することができる。こうした試料の遊離（非結合）Ｃ５ａの濃度または量は、患者の疾患状態のモニタリングを可能にする。このアッセイは、治療法として使用されるエクリズマブに結合したＣ５ａ分子ではなく、遊離（非結合）Ｃ５ａを定量化するような例において有利である。ＡＬＸＮ１００７は、移植片対宿主病に罹患しているヒト患者を治療するための臨床試験を受けている。
【０１２５】
遊離Ｃ５ａが適切に定量化されることは、疾患状態のモニタリング、モデリング、投薬量選択、ラベル・クレームなどの複数の理由にとって不可欠である。
【実施例】
【０１２６】
実施例
【０１２７】
本発明についてよりよく理解するために、以下の実施例を説明する。これらの実施例は、説明のみを目的としており、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
【０１２８】
実施例１  ヒト血漿中の遊離Ｃ５ａの定量化のためのＧｙｒｏｓアッセイ
【０１２９】
補体タンパク質Ｃ５ａは、代替的な補体カスケードの重要な成分であり、アレクシオン社の薬物、ＡＬＸＮ１００７の標的である。この標的を適切に定量化することは、モデリングおよびラベル・クレームの両方にとって不可欠である。ＡＬＸＮ１００７は、Ｃ５ａに対して６０ｐＭの親和性を有するが、Ｃ５に対しては５ｎＭの親和性も有する。Ｃ５に対する親和性は、Ｃ５転換酵素がＣ５をＣ５ａおよびＣ５ｂに切断する場合のネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）アベイラビリティに基づくものであり、また時間の関数である。Ｃ５に対するこの低いレベルの親和性により、バイオアッセイにおいてＣ５ａの定量化において相加効果を有することができるものであるが、これはＡＬＸＮ１００７のように、Ｃ５ａに対してのみ特異的である二次抗体が存在しないものであり、また同様にそれらも低い親和性でＣ５に結合するという理由によるものである。薬剤がリガンド結合アッセイフォーマットにおいて捕捉抗体として使用されるとき、Ｃ５がＡＬＸＮ１００７によって結合される場合、タンパク質の一部が、抗Ｃ５ａ抗体によって認識および結合されることとなり、それによって真のＣ５ａであるものを過大評価することにつながる。
【０１３０】
Ｇｙｒｏｌａｂ技術は、アッセイ洗浄液、試薬、およびプロスクライブド（ｐｒｏｓｃｒｉｂｅｄ）間隔でディスク上の微細構造の全体にわたってスピンされる試料に基づく。捕捉試薬が固定化された微細構造の全体にわたって、試料がスピンされるのに必要な時間は、約六秒であるため、理論的には、ＡＬＸＮ１００７が捕捉抗体である場合に、Ｃ５が低い親和性で結合する機会はほとんどないだろう。さらに、Ｃ５が結合する可能性をさらに低下させて、アッセイにおいて相加効果をもたせるために、ヒト血漿試料を、Ｃ５特異的抗体が結合している磁気ビーズにより前処理し、したがって、アッセイプレートおよびディスクにロードされる前にほとんどのＣ５が除去される。ビーズ緩衝液は、低い親和性の結合を減少させる塩および洗浄剤を多く含む。
【０１３１】
材料および方法
【０１３２】
材料：
【０１３３】
Ｂｉｏａｆｆｙ  １０００ディスク、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮ緩衝液、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆ緩衝液、ｐＨ１１緩衝液、プレート箔（ニュージャージー州ウォレンのＧｙｒｏｓ  ＵＳ社）
【０１３４】
精製したヒトＣ５ａ（テキサス州タイラーのＣｏｍｐＴｅｃｈ社）
【０１３５】
ビオチン化ＡＬＸＮ１００７、ビオチン化Ｎ１９／８抗体（コネチカット州ニューヘイブン、Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）
【０１３６】
アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識クローン２９４２（ペンシルベニア州プリマス・ミーティング、Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）
【０１３７】
９６ウェルＰＣＲプレート、Ｂｉｏａｆｆｙ  ｗａｓｈ  １（０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０、０．０２％のアジ化ナトリウム（洗浄液成分）を含むＰＢＳ）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ、１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（緩衝液成分）（マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャー社）
【０１３８】
機器：
【０１３９】
Ｇｙｒｏｓ  ｘＰｌｏｒｅまたはＸＰワークステーション機器（ニュージャージー州ウォレンのＧｙｒｏｓ  ＵＳ社）
【０１４０】
方法：
【０１４１】
Ｇｙｒｏｓ機器は、各緩衝液自身のステーションをもつ、Ｂｉｏａｆｆｙ  ｗａｓｈ  １およびｐＨ１１緩衝液を用いて別個に二回プライミングされる。これらのプライミングサイクル中（それぞれ約２０分間）に、アッセイ試薬、洗浄液および試料を以下に記載するとおり調製する。実行に必要な数のＢｉｏａｆｆｙ  １０００ディスク（Ｇｙｒｏｓ  ｘＰｌｏｒｅの場合一枚、Ｇｙｒｏｓ  ＸＰワークステーションの場合最大五枚）を、冷蔵庫から取り出して、周囲室温にさせる。
【０１４２】
未知のヒト血漿試料は、ビオチン化抗体Ｎ１９／８と結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ中で希釈する。希釈は、ビーズ部２に対して血漿部１の比で行う。この希釈は、激しく振とうしながら室温で一時間、丸底ポリプロピレンプレート中で行う。この一時間のインキュベーション後、プレートを磁石に置き、二分後に、ピペットで希釈血漿試料をビーズペレットと分けて、該試料をＰＣＲプレート上のそれぞれの位置に、必要な量で移す。未知の血漿試料のさらなる希釈は不要である。
【０１４３】
アッセイの標準曲線は、精製されたヒトＣ５ａタンパク質から作成し、該精製したヒトＣ５ａタンパク質は、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮ緩衝液中に６０ｎｇ／ｍＬでスパイク（添加）され、その後６０（初期スパイク）、３０、１５、７．５、３．７５、１．８８、０．９３８、０．４６９、０．２３４、０．１１７、および０．０５８ｎｇ／ｍＬのとおりに２倍希釈される。０．０５８および６０ｎｇ／ｍＬの標準試料が、アンカーポイントである。Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮ緩衝液中で調製される場合、曲線は１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で１：２希釈され、混合される。希釈した標準試料を、それぞれの位置にそれぞれの必要量でＰＣＲプレートに移す。
【０１４４】
品質管理（ＱＣ）試料は、標準試料と同じ方法で調製される。精製ヒトＣ５ａは、２５、５、及び０．５ｎｇ／ｍＬでＲｅｘｘｉｐ  ＡＮ緩衝液中にスパイクされる。次いで、これらの試料は、標準曲線用試料について説明したように、１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中で１：２希釈した。必要に応じて、検出限界における試料（検出上限（ＵＬＯＱ）は４５ｎｇ／ｍＬ、また検出下限（ＬＬＯＱ）は０．１２０ｎｇ／ｍＬ）を、同様に調製する。希釈されたＱＣを、それぞれの位置にそれぞれの必要量でＰＣＲプレートに移す。
【０１４５】
ビオチン化捕捉試薬（ＡＬＸＮ１００７）は、Ｂｉｏａｆｆｙ  ｗａｓｈ  １中で作用濃度１００μｇ／ｍＬに調製されて、アレクサフルオール標識されたクローン２９４２は、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆ中で作用濃度４μｇ／ｍＬに調製される。これら試薬の両方を、必要な量でＰＣＲプレート上のそれぞれの所定位置に移す。Ｂｉｏａｆｆｙ  ｗａｓｈ  １はアッセイ緩衝液として使用され、ＰＣＲプレート上のそれぞれの所定位置に搭載される。
【０１４６】
標準試料、ＱＣ、任意の未知の血漿試料、アッセイ試薬、およびアッセイ洗浄液を搭載したＰＣＲプレートを、箔で封止し、その後Ｇｙｒｏｓ機器に搭載する。必要数のＢｉｏａｆｆｙ  １０００ディスクもまた当該機器に搭載する。
【０１４７】
Ｇｙｒｏｓクライアントソフトウェアを使用して、Ｇｙｒｏｓシステムでアッセイを行う。これは三工程のアッセイ（捕捉、分析物、検出）であり、捕捉抗体、試料、および検出抗体がプログラムされた間隔で、間欠的な洗浄工程の合間に添加される。アッセイ実行時間は一ディスク当たり約一時間である。データはＧｙｒｏｓ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアによって処理されるか、またはＷａｔｓｏｎなどのラボ情報システム（ＬＩＭＳ（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ））へのインポートのためにエクスポート可能である。このアッセイでは、応答の重み付けおよび１％のＰＭＴセッティングを伴う５ＰＬの曲線フィッティングを使用する。標準曲線用試料および血漿試料の希釈の差異（標準試料は１：１、血漿試料は１：２）のために、任意の血漿の結果に、希釈係数１．５が適用される。
【０１４８】
結果
【０１４９】
ヒト血漿中の遊離Ｃ５ａの定量化のためのＧｙｒｏｓアッセイは、０．１２０〜４５ｎｇ／ｍＬのダイナミックレンジを持ち、これは希釈係数補正後は血漿中０．１８０〜６７．５ｎｇ／ｍＬに変換される。血漿試料に対するビーズ処理の効果は、以下の三つのように確認される：第一が、遊離Ｃ５の定量化のためのＧｙｒｏｓアッセイにおいて、捕捉試薬としてエクリズマブ（その試験方法で禁止したように（ａｓ  ｐｒｏｓｃｒｉｂｅｄ））を使用することで、測定される使用可能なＣ５が減少することとして、第二が、同じアッセイフォーマットでエクリズマブの代わりに捕捉抗体としてＡＬＸＮ１００７を用いる場合に、ＡＬＸＮ１００７が結合するＣ５が減少することとして、および第三に、Ｇｙｒｏｓ遊離Ｃ５ａアッセイによる結合されたＣ５ａの量においてである。二つのビーズ緩衝液（Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮまたは１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）間の相違は、遊離Ｃ５ａ測定の点では最小であるが、遊離Ｃ５測定の点では明らかな違いがある。この理由から、１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液は、血漿試料のビーズ処理用に選択される希釈液であり、標準試料およびＱＣ試料の両方にはアッセイ希釈液を用いる。
【０１５０】
表１  ビーズ緩衝液としてＲｅｘｘｉｐ  ＡＮ緩衝液または１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いた、遊離Ｃ５（エクリズマブ捕捉およびＡＬＸＮ１００７捕捉）および遊離Ｃ５ａにおけるビーズ処理の効果
【０１５１】
【表１】
2019537711.tif 000005
【０１５２】
標的バイオマーカーアッセイの選択性は、重要なアッセイパラメータである。表２は、それぞれの試料中に既にある内因性Ｃ５ａのレベルの測定において相加効果を有する、５ｎｇ／ｍＬの精製されたＣ５ａの参照物質でスパイクされたドナー血漿に関するデータを示す。Ｇｙｒｏｓアッセイでは、この内因性の結合相手を含む試料中にスパイクさせた精製されたＣ５ａを、試験される小量のサンプルサイズのうちの８０％について１％および５％のＰＭＴセッティング両方で、正確に測定した。
【０１５３】
表２  ヒト血漿中の遊離Ｃ５ａのＧｙｒｏｓ選択性（ｎｇ／ｍＬ）
【表２】
2019537711.tif 000006
【０１５４】
平行性は、それが代替マトリックス（ここでは、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮ緩衝液）の標準曲線およびその精製された参照物質（ここでは、精製されたヒトＣ５ａ）の適合度を決定しうるものとなるため、バイオマーカーアッセイで決定される重要な要素である。プロスクライブド（ｐｒｏｓｃｒｉｂｅｄ）のビーズ処理の前に追加希釈でマトリックス試料を事前処理することによって、平行性が、代替の曲線とそれから測定された未知試料との間におけるアッセイ応答についての相違を表すことができる。図１は、五人のドナーの血漿についての平行性の結果を示す。これらのデータは、アッセイが平行性を持ち、代替の曲線が適切であることを示唆する。
【０１５５】
考察
【０１５６】
ヒト血漿中の遊離Ｃ５ａの定量化のためのＧｙｒｏｓアッセイは、０．１２０〜４５ｎｇ／ｍＬのダイナミックレンジを有し、これは希釈係数補正後は血漿中０．１８０〜６７．５ｎｇ／ｍＬに変換される。
【０１５７】
アッセイの選択性および平行性が、代替のマトリックスおよび参照物質が、ヒト血漿中で測定される内因性の結合相手に適切であるということを示している。
【０１５８】
ビーズ処理ありおよびビーズ処理なしでＧｙｒｏｓアッセイを実行した内因性血漿試料からのデータは、Ｇｙｒｏｓアッセイが、結果に対して相加効果を有することができるような、結合する低い親和性のＣ５の量を減少させるということを示唆している。このビーズ処理によれば、既に非常に短い試料インキュベーション時間であるＧｙｒｏｓ技術とあわせて、他の方法よりも特異的である遊離Ｃ５ａの定量化アッセイが得られる。
【０１５９】
実施例２  ヒト血漿中の遊離Ｃ５ａの定量化のためのＧｙｒｏｓアッセイ
【０１６０】
ＡＬＸＮ１００７は、ヒト化ｍＡｂターゲティングＣ５ａ／Ｃ５ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ（１０．４ｋＤ、副経路）である。これは、ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）の適応型第ＩＩ／ＩＩＩ臨床試験にスケジュールされている。
【０１６１】
適切なモデリング／有効性のために、バイオマーカー（ヒトＣ５ａ）の正確かつ高感度の定量化が必要である。この課題はまた、Ｃ５がＣ５ａよりも数桁小さいにもかかわらず（５ｎＭ対６０ｐＭ）、ＡＬＸＮ１００７がＣ５に結合することであり、このＣ５の結合は、時間の関数であり、ネオエピトープアベイラビリティである。Ｃ５ａのみに結合するが、ある程度までＣ５に結合しないという抗体は実際には存在しない。相加効果はアッセイの感度に影響を与える。
【０１６２】
典型的なＧｙｒｏｓアッセイは、秒単位で微細構造に沿って試料を通過させるため、ＡＬＸＮ１００７がＣ５に結合する機会はあり得ない。
【０１６３】
図２および表３は、三つ組の重要性を示す。
【０１６４】
表３
【表３】
2019537711.tif 000007
【０１６５】
Ｇｙｒｏｓアッセイパラメータ
【０１６６】
１００μｇ／ｍＬの捕捉Ａｂ
【０１６７】
４μｇ／ｍＬの検出Ａｂ
【０１６８】
参照物質としての精製されたヒトＣ５ａ
【０１６９】
標準試料およびＱＣの調製のためのＲｅｘｘｉｐ  ＡＮ
【０１７０】
Ｂｉｏａｆｆｙ  １０００ｎＬ  ディスク
【０１７１】
標準試料、ＱＣ、試料（試料希釈２）の希釈のためのＲｅｘｘｉｐ  ＡＮ
【０１７２】
検出ＡｂのためのＲｅｘｘｉｐ  Ｆ
【０１７３】
洗浄液１：Ｂｉｏａｆｆｙ  ｗａｓｈ  １
【０１７４】
洗浄液２：ｐＨ１１緩衝液
【０１７５】
３工程アッセイ（Ｃ−Ａ−Ｄ）
【０１７６】
ＰＭＴ  １％
【０１７７】
通例のプレートベースのＥＣＬアッセイフォーマットは、０．２８０〜４０．０ｎｇ／ｍＬのダイナミックレンジを持つ。
【０１７８】
試料希釈１：４
【０１７９】
提案される曲線範囲  ０．１１７〜６０．０ｎｇ／ｍＬ
【０１８０】
Ｃ５への結合をさらに減少させるために、試料由来のＣ５タンパク質分子を、ビオチン化抗Ｃ５抗体に結合したＤｙｎａｂｅａｄｓで除去する。結合ビーズの最終希釈液は、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮである。Ｃ５枯渇のためのマトリックス試料との結合ビーズの事前インキュベーション。
【０１８１】
図３は、Ｃ５ａおよびＣ５に対するビーズの効果を示す。図４は、Ｒｅｘｘｉｐ  ＡＮ対１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０でビーズの効果を示しているが、Ｃ５ａ結合に対する効果はずっと少ないが、Ｃ５の薬物結合が影響を受けているように見える。
【０１８２】
更新した遊離Ｃ５ａアッセイパラメータ
【０１８３】
１００μｇ／ｍＬの捕捉Ａｂ
【０１８４】
４μｇ／ｍＬの検出Ａｂ
【０１８５】
参照物質としての精製されたヒトＣ５ａ
【０１８６】
標準試料およびＱＣの調製のためのＲｅｘｘｉｐ  ＡＮ
【０１８７】
Ｂｉｏａｆｆｙ  １０００ｎＬ  ディスク
【０１８８】
標準試料とＱＣの希釈（ＭＲＤ２）のための１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０
【０１８９】
マトリックス試料の希釈のための１Ｍ  ＮａＣｌ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中で結合されたＤｙｎａｂｅａｄｓ（２０μｇ／ｍＬ  Ａｂ）、比２：１、室温で一時間、振とうしながらインキュベーション
【０１９０】
検出ＡｂのためのＲｅｘｘｉｐ  Ｆ
【０１９１】
洗浄液１：Ｂｉｏａｆｆｙ  ｗａｓｈ  １
【０１９２】
洗浄液２：ｐＨ１１緩衝液
【０１９３】
３工程アッセイ（Ｃ−Ａ−Ｄ）
【０１９４】
ＰＭＴ  １％
【０１９５】
提案される曲線範囲  ０．１１７〜６０．０ｎｇ／ｍＬ
【０１９６】
マトリックスでは、ＬＬＯＱ  ０．１７６
【０１９７】
図５は、遊離Ｃ５ａの早期ビーズ処理での選択性を示し、図１は、遊離Ｃ５ａの早期ビーズ処理での平行性を示す。
【０１９８】
遊離標的を捕捉するために薬剤を使用するアッセイのほとんどでは、真に遊離であるものを過大評価する可能性がある。Ｇｙｒｏｓでは、試料のインキュベーションを切り詰めることにより、標的バイオマーカーのより正確な定量化を可能にする。同じ理由から、Ｇｙｒｏｓ（単独で、または試料処理と組み合わせて）は、非特異的または低い親和性での結合を減少させることの助けにもなりうる。
【０１９９】
その他の実施形態
【０２００】
前述の説明は、本発明の例示的な実施形態のみを開示している。
【０２０１】
本発明についてその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は説明を意図しているものであって、添付の特許請求の範囲によって規定されている本発明の範囲を限定するものではないということを理解されたい。その他の態様、利点、および変形は、添付の請求項の範囲内にあるものである。したがって、本発明の特定の特徴のみが図示され、記述されているが、当業者にとっては多くの変形および変更が生じるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨内に収まるものとしてこうした変形および変更のすべてを網羅することが意図されているということを理解されたい。
【０２０２】
表４  配列の要約
【表４−１】
2019537711.tif 000008
【表４−２】
2019537711.tif 000009
【表４−３】
2019537711.tif 000010
【図１】
2019537711.tif 000011
【図２】
2019537711.tif 000012
【図３】
2019537711.tif 000013
【図４】
2019537711.tif 000014
【図５】
2019537711.tif 000015
【配列表】
2019537711000001.app
【国際調査報告】
2019537711.tif 000016
2019537711.tif 000017
2019537711.tif 000018