(57)【要約】  前糖尿病対象を治療する方法が開示され、この対象は、５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする。本方法は、治療上有効な量の少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ（ＭＮＫ）阻害剤をこの対象に投与することを含み、該ＭＮＫ阻害剤は、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を低下させる。本方法は、前糖尿病の２型糖尿病への進行を予防及び／または遅延させ得る。本方法はまた、空腹時グルコース障害（ＩＦＧ）の段階にある前糖尿病のグルコース耐性障害（ＩＧＴ）の段階への進行を予防し得る。【選択図】【特許請求の範囲】
【請求項１】
５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療する方法であって、治療上有効な量の少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ（ＭＮＫ）阻害剤を前記対象に投与することを含み、前記ＭＮＫ阻害剤は、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を低下させる、方法。
【請求項２】
前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ２の生物活性を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＮＫ阻害剤が、ＭＮＫ２に対する選択性を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ１の生物活性を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の生物活性を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＮＫ阻害剤が、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体もしくはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、またはアプタマーから成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＮＫ阻害剤が、ＡＴＰ競合剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＮＫ阻害剤が、Ｎ３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−［３，４−ｄ］ピリミジン−３，４−ジアミン、または４−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニルアミノ）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、（９ａＳ）−８−アセチル−９，９ａ−ジヒドロ−１，３，７−トリヒドロキシ−９ａ−メチル−９−オキソ−４−ジベンゾフランカボキサミド（ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｃａｂｏｘａｍｉｄｅ）、４−［５−（４−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］ピリジンジヒロドクロリド、４−（２−（２−フルオロプロポキシ）−４−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−５−メチルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド、及び４−（２−イソプロポキシ）−４−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）−５−メチルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドから選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＮＫ阻害剤が、薬学的または獣医学的に許容される充填剤、担体、希釈剤、及び／または賦形剤と任意に組み合わせて薬学的組成物として製剤化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、空腹時グルコース障害の前糖尿病を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、グルコース耐性障害の前糖尿病を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、前糖尿病の２型糖尿病への進行を予防及び／または遅延させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、前記空腹時グルコース障害（ＩＦＧ）の段階にある前糖尿病の前記グルコース耐性障害（ＩＧＴ）の段階への進行を予防する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、６．１ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療するための、治療上有効な量の少なくとも１つのＭＮＫ阻害剤の使用であって、前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を低下させる、使用。
【請求項１６】
５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療するための医薬品の製造における、前記ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を低下させる少なくとも１つのＭＮＫ阻害剤の使用。
【請求項１７】
前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ２の生物活性を低下させる、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＭＮＫ阻害剤が、ＭＮＫ２に対する選択性を示す、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ１の生物活性を低下させる、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の生物活性を低下させる、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＭＮＫ阻害剤が、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体もしくはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、またはアプタマーから成る群から選択される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記ＭＮＫ阻害剤が、ＡＴＰ競合剤である、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
前記ＭＮＫ阻害剤が、Ｎ３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−［３，４−ｄ］ピリミジン−３，４−ジアミン、または４−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニルアミノ）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、（９ａＳ）−８−アセチル−９，９ａ−ジヒドロ−１，３，７−トリヒドロキシ−９ａ−メチル−９−オキソ−４−ジベンゾフランカボキサミド（ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｃａｂｏｘａｍｉｄｅ）、４−［５−（４−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］ピリジンジヒロドクロリド、４−（２−（２−フルオロプロポキシ）−４−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−５−メチルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド、及び４−（２−イソプロポキシ）−４−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）−５−メチルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドから選択される、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記ＭＮＫ阻害剤が、薬学的または獣医学的に許容される充填剤、担体、希釈剤、及び／または賦形剤と任意に組み合わせて薬学的組成物として製剤化される、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記対象が、空腹時グルコース障害の前糖尿病を有する、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記対象が、グルコース耐性障害の前糖尿病を有する、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記方法が、前糖尿病の２型糖尿病への進行を予防及び／または遅延させる、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記方法が、前記空腹時グルコース障害（ＩＦＧ）の段階にある前糖尿病の前記グルコース耐性障害（ＩＧＴ）の段階への進行を予防する、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記対象が、６．１ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を特徴とする、請求項１５〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、高脂肪食の作用、特に前糖尿病を阻害することに関する。特定の形態において、本開示は、ＭＡＰキナーゼ相互作用キナーゼの発現または機能を阻害することに関する。
【０００２】
優先権書類
本出願は、２０１６年３月３１日出願の「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」と題される豪州仮特許出願第２０１６／９０１１９２号の優先権を主張するものであり、この内容は、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
食物、特に飽和脂肪の過剰消費の結果、主要かつ急速に増加する健康問題が世界的に生じ、肥満、ならびに脂肪組織炎症、インスリン抵抗性、及び２型糖尿病などの関連疾患を引き起こす。西欧諸国の成人４人に１人近くが、糖尿病または前糖尿病のいずれかであり、肥満の有病率の増加のため、発生率が上昇している。前糖尿病は、異常に高いが、その人が糖尿病であると診断するのに十分な高さではない血中グルコース値に関連する疾患である。前糖尿病患者は、しばしば肥満であり、この疾患は、概して、高脂肪食などの不健康な食事と関連している。したがって、前糖尿病の管理には、低脂肪食を介した減量の勧告が頻繁に関与する。しかしながら、前糖尿病の多くの患者は、彼らの疾患を治療するための推奨された減量を達成及び維持するために必要な生活習慣の変化を遵守したくない、もしくはできない、または代替として、既存の療法が失敗した可能性がある。したがって、前糖尿病の代替治療及び／または管理の必要性が存在する。
【０００４】
マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ相互作用キナーゼ（ＭＮＫ）は、ＭＡＰＫシグナル伝達の下流エフェクターであるセリン／スレオニンキナーゼ群であり、発癌の形質転換及び進行に関与している。ネズミＭＮＫ１及びＭＮＫ２は、それぞれ、Ｍｋｎｋ１及びＭｋｎｋ２遺伝子によってコードされる。対応するタンパク質（ＭＮＫ１及びＭＮＫ２）は、ＭＡＰキナーゼ（例えば、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ））と、特にＭＮＫ１の場合は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼと相互作用する。ＭＮＫタンパク質は、ＭＡＰキナーゼによりリン酸化され、ＭＮＫ活性の刺激を引き起こす（Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚら、１９９７）。ＭＮＫタンパク質の最もよく知られた基質は、いくつかの更なる基質が記載されているが（Ｂｕｘａｄｅら、２００８に掲載される）、タンパク質合成機構の重要な成分である真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）である（Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚら、１９９７；Ｓｃｈｅｐｅｒら、２００１）。ＭＮＫがｅＩＦ４Ｅに作用する唯一のキナーゼであるため、ＭＮＫタンパク質の生物活性は、リン酸化されたｅＩＦ４Ｅ（Ｐ−ｅＩＦ４Ｅ）のレベルを測定することによって測定され得る。
【０００５】
それらの一次配列に関して非常に類似しているが、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２は、多数の重要な点で異なる。例えば、ネズミＭＮＫ１（ヒトＭＮＫ１ａに相当）は、主に細胞質であるが、ネズミＭＮＫ２（ヒトＭＮＫ２ａと類似）は、核及び細胞質で見られる。ＭＮＫ１は、ＥＲＫまたはｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路の刺激後に強く活性化されるが（Ｓｃｈｅｐｅｒら、２００１；Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚら、（１９９９）；Ｗａｎｇら、１９９９）、ＭＮＫ２は、これらの経路によってわずかに更に刺激されるのみである高い定常活性を示す。ＭＮＫ１及びＭＮＫ２  ｍＲＮＡは、肝臓、骨格筋、及び心臓で発現することが知られているが、しかしながら、異なるマウス組織におけるＭＮＫ１及びＭＮＫ２の発現パターンは、異なり、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２が違う役割を果たすことを示唆する。ノックアウトマウスにおけるＭＫＮＫ１及びＭＫＮＫ２遺伝子の一方または両方の破壊は、有害作用の報告がなく、ダブルＭＮＫ１／２ノックアウトマウスは、生存可能、かつ繁殖可能であり、異常は報告されなかった（Ｕｅｄａら、２００４）。
【０００６】
本発明者らは、ＭＮＫ活性が、肥満、脂肪生成及び脂質生成、ならびに関連疾患、例えば、脂肪組織炎症、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、前糖尿病、及び２型糖尿病を含む高脂肪食の作用と関連し得ることを認識した。本明細書に記載されるように、ＭＮＫ発現または生物活性を阻害することは、高脂肪食の作用を阻害し、前糖尿病などの高脂肪食関連疾患を治療及び／または管理することに対する新しい手段を提供し得る。
【発明の概要】
【０００７】
本開示の第１の態様によると、５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療する方法が提供され、治療上有効な量の少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ（ＭＮＫ）阻害剤を対象に投与することを含み、該ＭＮＫ阻害剤は、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を低下させる。
【０００８】
一実施形態において、ＭＮＫ阻害剤は、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体またはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、またはアプタマーである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＭＫＮＫ１及びＭＫＮＫ２  ｍＲＮＡ発現の分析を提供し、（Ａ）肝臓及び性腺脂肪組織（ｎ＝８）におけるｑＰＣＲによって決定されたＭＫＮＫ１（ＭＮＫ１）及びＭＫＮＫ２（ＭＮＫ２）の相対的発現、データは平均±ＳＥＭ（各組織についてＭＮＫ１とＭＮＫ２を比較した、両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）、（Ｂ）４つの独立した実験を代表する、肝臓、脂肪組織、心臓、及び骨格筋におけるＭＮＫ１タンパク質レベルの免疫ブロット分析、（Ｃ）分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞（ｎ＝３）におけるＰｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｓｒｅｂｐ１ｃ、Ｇｌｕｔ４、及びＣｄ３６の（Ｃ）ｍＲＮＡ発現、データは平均±ＳＥＭ、（Ｄ）分化３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（ｎ＝３）におけるＭｋｎｋ１（ＭＮＫ１）ｍＲＮＡ及びＭｋｎｋ２（ＭＮＫ２）ｍＲＮＡ発現、データは平均±ＳＥＭ（テューキーのポスト検定による一元配置分散分析）＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、（Ｅ）脂肪細胞分化の３Ｔ３−Ｌ１モデルにおけるＭｋｎｋ１、Ｍｋｎｋ２、及びＣｅｂｐβ  ｍＲＮＡ発現の経時的発現（分化カクテルの添加後）を示すグラフ結果、を伴う。
【図２】ＭＮＫ１ノックアウト（ＫＯ）及びＭＮＫ２  ＫＯマウスの高脂肪食に対する応答を提供し、（Ａ）飼料または高脂肪食（ＨＦＤ）のいずれかでの２０週間後の野生型（ＷＴ）、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯの体重、（ｎ＝６〜９）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、（Ｂ）体重のパーセンテージとして表される性腺脂肪組織重量（ｎ＝６〜９）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、（Ｃ）２０週間のＨＦＤ後のＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからの性腺脂肪沈着を示す代表的な画像、（Ｄ）飼料食またはＨＦＤのいずれかでの２０週間後のＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯの空腹時血糖、ｎ＝６〜９、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、（Ｅ）飼料食またはＨＦＤのいずれかでの２０週間後のＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯの空腹時血漿インスリン（ｎ＝３〜５）、を伴う。データは平均±ＳＥＭ、（Ｆ）インスリン抵抗性の「読み出し」としてのインスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）の恒常性モデル評価。
【図３】脂肪細胞に対するＭＮＫをノックアウトまたは阻害する効果を提供し、（Ａ）画像Ｊソフトウェアによって分析され、定量化されたＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスにおける脂肪細胞の平均サイズ（ＷＴ飼料、ｎ＝３、ＷＴ  ＨＦＤ  ｎ＝３、ＭＮＫ２−ＫＯ飼料食  ｎ＝３、ＭＮＫ２−ＫＯ  ＨＦＤ  ｎ＝３）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）、＊＊Ｐ＜０．０１、（Ｂ）次の条件に関する２つの視野における脂肪細胞の平均数（ＷＴ飼料食  ｎ＝３、ＷＴ  ＨＦＤ  ｎ＝３、ＭＮＫ２−ＫＯ飼料食  ｎ＝３、ＭＮＫ２−ＫＯ  ＨＦＤ  ｎ＝３）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）、＊Ｐ＜０．０５、（Ｃ）（ｉ）３回の独立した実験を代表する、指示された濃度のＣＧＰ５７３８０で７２時間処理した未分化３Ｔ３−Ｌ１細胞の溶解物の免疫ブロット分析、（ｉｉ）（ｉ）に示されたデータの定量化、データは平均±ＳＥＭ（テューキーのポスト検定による一元配置分散分析）＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、（Ｄ）２０μのＭＣＧＰ５７３８０の非存在下または存在下で９日間分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞のオイルレッドＯ染色、代表的な顕微鏡視野が示されている、（ｎ＝３）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）、（Ｅ）２０μＭのＣＧＰ５７３８０の存在下または非存在下で分化プロトコルに供された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰｐａｒγ、Ｃｂｐα、Ｓｒｅｂｐ１ｃ、Ｇｌｕｔ４、及びＣｄ３６のｍＲＮＡ発現（ｎ＝３）、データは平均±ＳＥＭ（テューキーのポスト検定による一元配置分散分析）、を伴う。
【図４】ＨＦＤ摂取ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯマウスの代謝研究のグラフ結果を提供し、（Ａ）飼料食またはＨＦＤのいずれかでの１５週間後のグルコース負荷試験（ｎ＝６〜２１）、データは平均±ＳＥＭ、（Ｂ）濃度曲線下面積計算（ＡＵＣ）（ｎ＝６〜２１）、データは平均±ＳＥＭ（テューキーのポスト検定による二元配置分散分析）、（Ｃ）飼料食またはＨＦＤマウスのいずれかでの２０週間後のインスリン抵抗性試験（ｎ＝３〜４）、データは平均±ＳＥＭ両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、を伴う。
【図５】飼料食摂取またはＨＦＤ摂取ＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯマウスの組織の総タンパク質溶解物の免疫ブロット分析を提供し、（Ａ）３つの独立した実験を代表する、性腺脂肪組織におけるＰ−ｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ４Ｅレベルの分析、（Ｂ）インスリン抵抗性試験後の性腺脂肪組織におけるＰＫＢ、リン酸化ＰＫＢ、及びアクチンのレベルの分析、（ｎ＝３）、（Ｃ）０．７５Ｕ／ｋｇのインスリンの腹腔内注射で処理され（示される場合）、３０分後に屠殺されたマウスの骨格筋におけるＰＫＢ、リン酸化ＰＫＢ、及びチューブリンのレベルの免疫ブロット分析であり、組織は、示される抗体を用いた免疫ブロット分析のために回収された分析、（Ｄ）アクチンに対して正規化されたＧＬＵＴ４として表される、個々の事例における３匹のマウスからの、上部パネル、ＧＬＵＴ４レベルの分析、下パネル、（Ｄ、上のパネル）のデータの定量化、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、（Ｅ）骨格筋におけるＰ−ｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ４Ｅレベルの分析（ｎ＝３）、（Ｆ）個々の事例における３匹のマウスからの骨格筋におけるＧＬＵＴ４タンパク質レベル（ｅＩＦ４Ｅに対して正規化された）のデータの定量化、を示す。
【図６】ＷＴ及びＭＮＫ−ＫＯマウスからの脂肪組織におけるマクロファージマーカーについて、飼料食摂取及びＨＦＤ摂取ＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからの性腺脂肪組織から単離された全ＲＮＡのｑＰＣＲ分析を提供し、（Ａ）一般的なマクロファージマーカーＣｄ６８、（Ｂ）一般的なマクロファージマーカーＦ４／８０、（Ｃ）Ｍ１極性化マクロファージマーカーＴｎｆα、（Ｄ）Ｍ１極性化マクロファージマーカーＣｄ１１ｃ、（Ｅ）Ｍ１極性化マクロファージマーカーＭｈｃＩＩ（ｎ＝３〜４）、に対するｍＲＮＡの相対発現を示し、データは、平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。
【図７】ＥＬＩＳＡによって測定された、飼料食摂取及びＨＦＤ摂取  ＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからの（Ａ）ＩＬ−５及び（Ｂ）ＩＬ−１０の血漿レベルの分析（ｎ＝６〜９）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、ならびにＭ２マーカーである（Ｃ）Ｉｌ−１０、（Ｄ）Ｃｄ２０６、（Ｅ）Ｐｐａｒγ、及び（Ｆ）Ｓｔａｔ６のｍＲＮＡ発現レベルについて、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）をＭ２表現型に分極させるためにＩＬ−４の存在下または非存在下で２４時間培養したＷＴまたはＭＮＫ２−ＫＯマウスから単離されたＢＭＤＭから単離された全ＲＮＡのｑＰＣＲ分析（ｎ＝６）を提供し、データは、平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）、＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【図８】（Ａ）Ｎｒｆ２及び（Ｂ）その下流標的ヘムオキシゲナーゼ１（Ｈｏ−１）に対するｍＲＮＡの相対発現について、飼料食摂取及びＨＦＤ摂取ＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスの肝組織から単離された全ＲＮＡのｑＰＣＲ分析（ｎ＝４）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、ならびにｄｅ  ｎｏｖａ脂質生成（Ｃ）Ｓｒｅｂｐ１ｃ、（Ｄ）Ｆａｓ、（Ｅ）Ａｃｃ１、及び（Ｆ）β−酸化（Ｃｐｔ１ａ）に関与する、飼料摂取及びＨＦＤ摂取ＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからの肝臓における遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析（ｎ＝４）を提供し、データは、平均±ＳＥＭ（両側、スーペリアスチューデントｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。
【図９】１００ｎＭのインスリン（１０及び６０分間）、及び示される場合は３μＭのＭＮＫ阻害剤、ＭＮＫ−Ｉ１で刺激する前に４ｍＭの脂肪酸パルミテートで１６時間処理されたＣ２Ｃ１２骨格筋細胞からの溶解物の免疫ブロット分析を提供する。パルミテートは、パルミテートで前処理された細胞において、重要な調節部位、Ｔｈｒ３０８でのＰＫＢのリン酸化を増加させるインスリンの能力の障害によって示されるように、これらの細胞におけるインスリン抵抗性を誘導する。マーカーＰ−３０８−ＰＫＢのレベルは、ＭＮＫ阻害剤が細胞のパルミテートへの曝露後にインスリンシグナル伝達を回復できることを示した。
【図１０】カロリー過負荷（すなわち、エネルギーが豊富な高脂肪食（ＨＦＤ）を生後４週〜１５週に摂取させることによる）に対するＭＮＫ１−ＫＯ、ＭＮＫ２−ＫＯ、及びＭＮＫ１＋ＭＮＫ２ダブルＫＯ（ＤＫＯ）動物の応答を示すグラフ結果を提供し、ＨＦＤ摂取動物の体重増加から飼料食摂取動物の体重増加を差し引いたデータが示される。６〜１６／グループ。＊、ｐ＜０．０５両側、対応のないｔ検定。
【図１１】飼料食（ＣＤ）またはＨＦＤを摂取したＷＴマウスと比較して、ＭＮＫ１−ＫＯ及びＤＫＯマウスにおける、血漿グルコース濃度として示されるグルコース負荷試験（ＧＴＴ）の結果を提供する。
【図１２】示された時間の間、「分化カクテル」で処理された３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞における経時的なＭＮＫ２発現（０〜２４時間）を示す棒グラフを提供し、細胞は、溶解され、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析がＭｎＫ２  ｍＲＮＡの発現のために行われた。データは、未処理の細胞＝１に対して表わされる。
【図１３】３Ｔ３−Ｌ１細胞（セルコスポラミド（１０μＭ））を処理するためのＭＮＫ阻害剤、セルコスポラミド（ＣＳＰＭ）を用いて行われた研究のグラフ結果を提供する。（Ａ）試料は、示されたｍＲＮＡについてのＲＴ−ｑＰＣＲによって分析された。データは、３回の反復実験からのものであり、β２−ミクログロブリンｍＲＮＡに対して正規化される。（Ｂ）試料は、脂質蓄積に関して分析された。
【図１４】以下の結果を示す：（Ａ）示された濃度で１時間、ＭＮＫ阻害剤、ＭＮＫ−Ｉ１及びＭＮＫ−Ｉ２で処理された３Ｔ３−Ｌ１細胞、次いで、リン酸化及び全ｅＩＦ４Ｅについての免疫ブロットによって分析された試料。３回の反復実験で得られた同様のデータ、（Ｂ）ＭＮＫ−Ｉ１及びＭＮＫ−Ｉ２のデータの定量化。（Ｃ）示された濃度で示された回数をＭＮＫ−Ｉ１及びＭＮＫ−Ｉ２で処理された３Ｔ３−Ｌ１細胞、次いで、試料は、リン酸化及び全ｅＩＦ４Ｅについての免疫ブロットによって分析された。
【図１５】研究のグラフ結果を示し、（Ａ）３Ｔ３−Ｌ１細胞は、ＭＮＫ−Ｉ１の非存在下または存在下で示された回数、分化カクテルで処理された。試料は、示されたｍＲＮＡについてＲＴ−ｑＰＣＲによって分析された。データは、３回の反復実験からのものであり、β２−ミクログロブリンに対して正規化される。０日目のデータは、１に設定される。（Ｂ）（Ａ）と同様であるが、細胞は、９日間分化させ、次いで溶解し、脂質（トリグリセリド）蓄積について分析された。
【図１６】マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＭＮＫ１−ＫＯ（Ａ）またはＭＮＫ２−ＫＯ（Ｂ）に対して実行した研究の結果を提供する。ＭＥＦは、示した濃度で１時間、ＭＮＫ−Ｉ１またはＭＮＫＩ２で処理され、次いで、試料は、Ｐ−ｅＩＦ４Ｅ及び全ｅＩＦ４Ｅについて分析された。グラフは、３つの実験からの組み合わされたデータを示す。＊、ｐ＜０．０５対未処理対照群、＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１対未処理対照群。３０μのＭＣＧＰ５７３８０で処理した陽性細胞。
【図１７】研究のグラフ結果を示し、（Ａ）３Ｔ３−Ｌ１細胞は、ＭＮＫ−Ｉ２の非存在下または存在下で示された回数、分化カクテルで処理された。試料は、示されたｍＲＮＡについてＲＴ−ｑＰＣＲによって分析された。データは、３回の反復実験からのものであり、β２−ミクログロブリンｍＲＮＡに対して正規化される。０日目のレベル＝１。（Ｂ）（Ａ）と同様であるが、細胞は、９日間分化させ、次いで溶解し、トリグリセリドについて分析された。
【発明を実行するための形態】
【００１０】
本開示は、ＭＮＫ１またはＭＮＫ２がノックアウトされたマウス（それぞれ、ＭＮＫ１−ＫＯ及びＭＮＫ２−ＫＯ）を用いて、脂肪細胞分化の細胞モデルにおいて、正常飼料食（ＣＤ）または高脂肪食（ＨＦＤ）を消費したマウスにおけるＭＮＫ１及びＭＮＫ２の役割の調査を記載する。ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の発現の阻害、またはＭＮＫ阻害剤を用いたＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性の低下が、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、及び脂質生成を含む高脂肪食の作用を阻害し得ることが見出された。
【００１１】
本明細書で提供されるデータは、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２が、インスリンによる身体代謝の調節に関与する脂肪組織で発現されることを実証する。ＭＮＫ２  ｍＲＮＡが、脂肪細胞分化の細胞モデルにおいて急速に誘導され、脂肪生成中のこのタンパク質の関与が示される。注目すべきことに、ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＷＴ／ＨＦＤマウスで観察されるＨＦＤ誘発性脂肪増加に対して保護されていた。ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスの脂肪細胞のサイズは、それらの飼料食摂取対応物よりも大きくないことが観察された。しかしながら、比較において、ＷＴ／ＨＦＤマウスの脂肪細胞のサイズは、飼料食（ＷＴ／ＣＤ）のＷＴマウスと比べて著しく増加した。ＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤ及びＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスの両方は、インスリン抵抗性の指標に対して保護され、ＷＴ／ＨＦＤマウスと比較して、減少した循環グルコース及びインスリンのレベル、及び減少したＨＯＭＡ−ＩＲ（インスリン抵抗性の指標）、より良好なグルコース耐性、及びＰＫＢシグナル伝達経路（ＰＫＢリン酸化）の強い応答によって示される減少したインスリン抵抗性を有した。更に、ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスは、脂肪組織における炎症の低下を示した。これらの結果は、高脂肪食の有害作用の媒介におけるＭＮＫ１、特にＭＮＫ２の関与を確認する。
【００１２】
ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の両方の小分子阻害剤、ＣＧＰ５７３８０（すなわち、Ｎ３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−［３，４−ｄ］ピリミジン−３，４−ジアミン、または４−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニルアミノ）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン）の存在下で、脂肪細胞の細胞モデルにおける脂質の蓄積が顕著に阻害された。更に、ＣＧＰ５７３８０は、脂肪細胞の分化に必要な多くの遺伝子の発現を阻害し、脂肪生成及び脂質貯蔵におけるＭＮＫ１及びＭＮＫ２の重要な役割を示す。これらの結果は、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物学的機能の低下が脂肪生成及び脂質貯蔵を阻害することを実証する。更に、ＣＧＰ５７３８０の存在下で分化された細胞では、より少ないグリセロールが、ＣＧＰ５７３８０の非存在下で分化された細胞と比較して、脂肪分解アッセイにおいて放出され、ＣＧＰ５７３８０処理細胞におけるトリグリセリドの貯蔵の低下が確認された。
【００１３】
ＭＮＫ１及びＭＮＫ２は、ｅＩＦ４Ｅをリン酸化することが知られている唯一のキナーゼである。ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、両方の食餌条件下で、ＷＴマウスと比較して、Ｐ−ｅＩＦ４Ｅの実質的な低下を示したが、ＭＮＫ１−ＫＯマウスは、飼料食でＰ−ｅＩＦ４Ｅの変化を示さず、ＷＴ動物と比較して、ＨＦＤでＰ−ｅＩＦ４Ｅのわずかな減少を示すのみであった。これは、ＭＮＫ２が脂肪組織におけるより活性なＭＮＫアイソフォームであることを示す。
【００１４】
したがって、第１の態様では、本開示は、５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療する方法を提供し、治療上有効な量の少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ（ＭＮＫ）阻害剤を対象に投与することを含み、該ＭＮＫ阻害剤は、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を低下させる。
【００１５】
前糖尿病対象は、グルコース代謝障害を有する。２つの段階が認められる：（１）空腹時グルコース障害（ＩＦＧ）の前糖尿病、及び（２）グルコース耐性障害（ＩＧＴ）の前糖尿病。本質的に、ヒト対象における標準的な経口グルコース負荷試験（ＧＴＴ）は、４つの診断のうちの１つを決定する結果を提供する。グルコース代謝を診断するために使用されるＧＴＴ及び「カットオフ」グルコース値の正確なプロトコルは、国によって異なるが、一般的に用いられる一例は、空腹時血中グルコース値を測定し、次いで、グルコース溶液の測定された用量（通常、７５ｇのグルコース）が５分以内に経口摂取され、次いで、血中グルコース値が、通常２時間後に再度測定される。診断は、典型的に、表１に示すように行われる。しかしながら、表１に示される数値のいくつかの小さな変化が一般的に引用されている。本開示の目的のために、本方法は、５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌ（すなわち、１００ｍｇ／ｄｌ〜１２５ｍｇ／ｄｌ）の空腹時血漿グルコース値を有する前糖尿病対象に対して使用され得る。
【００１６】
【表１】
2019510061.tif 000002
【００１７】
多くの前糖尿病対象は、症状のいかなる顕著な変化も伴わずに、例えば、３年から１５年の間、糖尿病前の状態のままであるが、他の症例では、症状は、より迅速に悪化し、２型糖尿病に進行する。重要なことに、前糖尿病の診断は、最終的に２型糖尿病を発症する高リスク因子と考慮されるが、前糖尿病の２つの段階は、互いに、かつ２型糖尿病とは区別され、それは、空腹時グルコース障害の前糖尿病と診断された全ての対象が、グルコース耐性障害の前糖尿病または２型糖尿病障害に進行するわけではないからである。同様に、グルコース耐性障害の前糖尿病を有する全ての対象が、２型糖尿病に進行するわけではない。
【００１８】
本開示の方法は、前糖尿病から２型糖尿病への進行を予防及び／または遅延させ得る。本方法はまた、空腹時グルコース障害（ＩＦＧ）の段階にある前糖尿病のグルコース耐性障害（ＩＧＴ）の段階への進行を予防し得る。本方法はまた、肥満、体重増加、脂肪組織重量の増加、脂肪組織炎症の増加、循環グルコース及び／またはグルコース耐性の増加、循環インスリン及び／またはインスリン抵抗性の増加などの前糖尿病に関連する症状及び／または作用を回避または軽減し得る。
【００１９】
上記のように、前糖尿病対象は、しばしば体重過剰であり、この状態は一般に、高脂肪食などの不健康な食事と関連する。「高脂肪食」という用語は、本明細書では、通常の食事と比較して、典型的に、カロリーの高い割合（食事中の脂肪から得られる）を有する食餌を指すために使用される。食餌中の脂肪は、動物性であろうと植物性であろうと、一価不飽和性、多価不飽和性、飽和性などであろうと、全ての種類の食物脂肪を含み得る。したがって、高脂肪食は、通常の食事より高いカロリー含量を有する。一実施形態では、開示された方法に従って治療される前糖尿病対象は、総エネルギーの３０％以上が脂肪からである食事を含む高脂肪食を有する。別の実施形態では、開示された方法に従って治療される前糖尿病対象は、総エネルギーの３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％以上が脂肪からである食事を含む高脂肪食を有する。加えて、または代替として、開示された方法に従って治療される前糖尿病対象は、通常の食事より高い総エネルギー値を特徴とする高脂肪食を有する。例えば、中年成人に対する通常の食事に関して推奨されるエネルギー摂取量が表２に示される。
【００２０】
【表２】
2019510061.tif 000003
【００２１】
当業者は、推奨されるエネルギー摂取量値が通常の食事エネルギー摂取レベルを示すことを理解するであろう。しかしながら、これらの値は、年齢、性別、身長、活動レベルによって異なる。したがって、高脂肪食は、通常の食事とほぼ同じエネルギー摂取量を有するか、そうでなければ、通常の食事よりも高い総エネルギー摂取量、例えば、通常の食事と比較して１０〜３０％、２０〜４０％、３０〜５０％、または３０〜６０％高い総エネルギー摂取量を有する。したがって、開示された方法に従って治療された前糖尿病対象は、通常の食事のエネルギー摂取値より少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、または２００％高いエネルギー摂取値を伴う高脂肪食を有し得る。
【００２２】
ＨＦＤ摂取雄マウスは、高脂肪食の作用を研究するために広く使用され、受け入れられているモデルである（Ｐａｎｃｈａｌら、２０１１）。これらの動物は、脂肪組織の増加、脂肪組織の炎症、及びインスリン応答の欠陥（例えば、グルコース耐性障害）に関して、ヒトの肥満関連メタボリックシンドロームに関連する応答と同じ応答の多くを示す（Ｈａｒｉｒｉ及びＴｈｉｂａｕｌｔ、２０１０）。例として、マウスの高脂肪食は、７％ｋｃａｌの脂肪、１８％ｋｃａｌのタンパク質、７５％ｋｃａｌの炭水化物を含む標準飼料食と比較して、４５％ｋｃａｌの脂肪、２０％ｋｃａｌのタンパク質、３５％ｋｃａｌの炭水化物を含み得る。しかしながら、当業者は、マウスの高脂肪食は、脂肪からのエネルギーが３２％〜６０％の範囲にあり得ることを理解するであろう。
【００２３】
本明細書に開示されるように、ＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤ及びＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスの両方は、ＷＴ／ＨＦＤ動物と比較してより高いグルコース耐性を有した。本試験では、動物は、２ｇ／ｋｇのグルコースの腹腔内注射を受ける前に動物を一晩絶食させ、グルコース投与前及び投与後２時間までのいくつかの時点で血液中のグルコースが測定された。ＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤ及びＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスの両方は、測定された各時点でＷＴ／ＨＦＤ動物と比較してより低いグルコース値を有した。これは、同じ高脂肪食で、減少したＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を有することは、グルコース耐性を増加させることを証明し、したがって、ＭＮＫ生物活性を減少させることは、前糖尿病の治療または予防を援助するであろうと示すため、特に関連がある。したがって、実施形態では、ＭＮＫ阻害剤によって治療または予防される疾患は、前糖尿病である。
【００２４】
ヒトＭＮＫは、選択的スプライシングによる２つの遺伝子（遺伝子記号：ＭＫＮＫ１及びＭＫＮＫ２）に由来する４つのタンパク質の群を含む。ＭＮＫ１ａ／１ｂは、ＭＮＫ２ａ／２ｂと同様にそれらのＣ末端で異なる。いずれの場合も、ａ型は、ＭＡＰキナーゼ結合領域を欠くｂ型よりも長いＣ末端領域を有する。全ての型のＮ末端は、インポーチンα及び翻訳因子スカフォールドタンパク質真核生物開始因子４Ｇ（ｅＩＦ４Ｇ）に結合する多塩基性領域を含有する。ＭＮＫ１ａ／ｂ及びＭＮＫ２ａ／ｂの触媒ドメインは、３つの珍しい特徴を共有する：２つの短いインサート、及び他のキナーゼがＤＦＧを有するＤＦＤ特徴。ＭＮＫアイソフォームは、それらの活性及び調節、ならびに細胞内局在において著しく異なる。最も特徴付けられたＭＮＫ基質は、ｅＩＦ４Ｅである。ｅＩＦ４Ｅリン酸化の細胞の役割は、不明であり、それは核から特定のｍＲＮＡの輸出を促進するかもしれない。他のＭＮＫ基質は、特異的ｍＲＮＡの安定性／翻訳を調節するＡＵが豊富な要素に結合する。ＭＮＫはまた、炎症メディエーターの産出、及びチロシンキナーゼ受容体からのシグナル伝達、ならびに細胞増殖または生存を制御し得る。
【００２５】
ヒトＭＮＫの配列は、以下のように見出され得る：ヒトＭＮＫ１  ｍＲＮＡ及びアミノ酸配列：Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０００４０９．１；ヒトＭＮＫ１アミノ酸配列変異体：Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ−００３６８４．２；ヒトＭＮＫ２ａ  ｍＲＮＡ配列：Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ２３７７７５；ヒトＭＮＫ２ｂ  ｍＲＮＡ及びアミノ酸配列：Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ２３７７７６、及びＮＭ−１７５７２．２と標識付けられた核酸配列の変異体。「ＧｅｎＢａｎｋ受入番号」という用語は、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））のＧｅｎＢａｎｋデータベースエントリ（Ｂｅｎｓｏｎら、２０００）に関連する。上記のＧｅｎＢａｎｋ受入番号の各々に開示される情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
本明細書で使用される「ＭＮＫ阻害剤」という用語は、ＭＮＫ１の生物活性を低下させる（スプライス変異体ＭＮＫ１ａ及びＭＮＫ１ｂの一方または両方の生物活性を低下させることを含む）及び／またはＭＮＫ２の生物活性を低下させる（スプライス変異体ＭＮＫ２ａ及びＭＮＫ２ｂの一方または両方の生物活性を低下させることを含む）、任意の化合物を指すように意図され、発現されるＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の量を減少させることを含む。例えば、ＭＮＫ阻害剤は、有機小分子（本明細書では「小分子」とも称される）、ペプチドアンタゴニスト、阻害性抗体もしくはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、アプタマー、または当業者に理解されるような発現または生物活性を阻害する他のＭＮＫ阻害剤であってもよい。ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の生物活性は、様々な方法、例えば、当業者に知られている任意の適切な方法を用いて、例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０７−８２３（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、マサチューセッツ州、ビルリカ）によって流通される抗リン酸化ｅＩＦ４Ｅ（Ｓｅｒ２０９）抗体などの、例えば、特異的抗Ｐ−ｅＩＦ４Ｅ抗体を使用する免疫ブロットまたはＥＬＩＳＡを行うことによって、その基質ｅＩＦ４ＥのＰ−ｅＩＦ４Ｅへのリン酸化を測定することによって測定され得る。したがって、ＭＮＫ阻害剤の非存在下における対応する試料と比較して、ＭＮＫ阻害剤を含有する試料中のＰ−ｅＩＦ４Ｅの量の相対的低下は、ＭＮＫの生物活性が低下したことを証明する。当業者は、Ｐ−ｅＩＦ４Ｅレベルを測定するとき、適切な対照群をどのように実行するかを知っているであろう。ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性は、そうでなければ、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性のレベルを検出することができる細胞アッセイを用いて測定され得る。リン酸化されたＭＮＫを特定的に検出する抗体もまた、使用され得、例えば、抗Ｐ−ＭＮＫ１（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｍｎｋ１（Ｔｈｒ１９７／２０２）抗体番号２１１１；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、米国、マサチューセッツ州、ダンバーズ）がある。更に、当業者は、ＭＮＫ阻害剤は、その意図された目的のための使用に対して安全であるべきであることを理解するであろう。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、好ましくは、ＭＮＫ２に対する選択性及び／または阻害能力の増加を示し得る。ＭＮＫ阻害剤の選択性を評価するための簡単な試験は、ＭＮＫ１またはＭＮＫ２のいずれかがノックアウトされた動物からの適切な細胞（例えば、ＭＮＫ１−ＫＯ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからのマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ））をＭＮＫ阻害剤で処理することによって実行され得る。ＭＮＫ１−ＫＯ  ＭＥＦにおいて、ｅＩＦ４Ｅリン酸化は、ＭＮＫ２に依存し、逆もまた同様であるため、ＭＮＫ−ＫＯ  ＭＥＦにおける、異なる濃度の対象とするＭＮＫ阻害剤のＰ−ｅＩＦ４Ｅレベルへの効果を監視することは、その化合物の、ＭＮＫ２（ＭＮＫ１−ＫＯ  ＭＥＦｓ）またはＭＮＫ１（ＭＮＫ２−ＫＯ  ＭＥＦｓ）を阻害する能力に関して報告する。したがって、２種類の細胞のデータを比較することにより、試験されたＭＮＫ阻害剤がＭＮＫ１またはＭＮＫ２に対して示す選択性の程度が決定され得る。
【００２８】
ＭＮＫ阻害剤は、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体またはその断片、干渉ＲＮＡ分子を含む阻害性ヌクレオチド分子、及びアプタマーから成る群から選択されてもよい。ＭＮＫ阻害剤は、当技術分野で既に知られているものを含んでもよい。実施形態では、ＭＮＫ阻害剤の組み合わせが使用されてもよい。
【００２９】
実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、有機小分子である。ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の適切な小分子阻害剤の多くの例を以下に記載する。
【００３０】
【化１】
2019510061.tif 000004
式Ｉ
式Ｉは、市販されているＣＧＰ５７３８０（Ｎ３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−［３，４−ｄ］ピリミジン−３，４−ジアミン；または４−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニルアミノ）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；ＷＯ０３／０３７３６２；Ｃｈｒｅｓｔｅｎｓｅｎら、２００７；Ｂｕｘａｄｅら、２００５；Ｗｏｒｃｈら、２００４、Ｒｏｗｌｅｔｔら、２００８）を示す。これは、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の両方の阻害剤である（Ｈｏｕら、２０１２）。
【００３１】
【化２】
2019510061.tif 000005
式ＩＩ
式ＩＩは、市販されているセラコスラミド（（９ａＳ）−８−アセチル−９，９ａ−ジヒドロ−１，３，７−トリヒドロキシ−９ａ−メチル−９−オキソ−４−ジベンゾフランカボキサミド；Ｓｕｓｓｍａｎら、２００４）を示す。
【００３２】
【化３】
2019510061.tif 000006
式ＩＩＩ
式ＩＩＩは、市販されているＥＴＰ４５８３５二塩酸塩（４−［５−（４−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］ピリジン二塩酸塩；Ｏｙａｒｚａｂａｌら、２０１０年）を示す。
【００３３】
【化４】
2019510061.tif 000007
式ＩＶ
式ＩＶは、スタウロスポリンの誘導体であるＣＧＰ０５２０８８（Ｔｓｃｈｏｐｐら、２０００）を示す。
【００３４】
【化５】
2019510061.tif 000008
式Ｖ
式Ｖは、ＭＮＫ−Ｉ１（４−（２−（２−フルオロプロポキシ）−４−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−５−メチルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドを示す。Ｂｅｇｇｓら、２０１５）を示す。
【００３５】
【化６】
2019510061.tif 000009
式ＶＩ
式ＶＩは、ＭＮＫ−Ｉ２（４−（２−イソプロポキシ）−４−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）−５−メチルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド）を示す。
【００３６】
これらの化合物のいくつかに関するＩＣ５０の詳細を表３に示す。
【００３７】
【表３】
2019510061.tif 000010
【００３８】
いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための有機小分子型ＭＮＫ阻害剤は、「ＡＴＰ競合剤」またはＭＮＫのＡＴＰ結合ドメイン（例えば、ＣＧｐ５７３８０及びセルコスポラミド；Ｈｏｕら、２０１２）と相互作用する「Ｉ型キナーゼ阻害剤」（Ｈｏｕら、２０１２、Ｌｉｕ及びＧｒａｙ、２００６）として知られている化合物の群から選択される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための有機小分子型ＭＮＫ阻害剤は、チエノピリミジン化合物の群から選択される。そのような化合物の例としては、ＷＯ０６／１３６４０２及びＷＯ２００７／１１５８２２に記載されるもの、Ｔｅｏら、２０１５に記載されるチエノピリミジニル誘導体（ＭＮＫ２選択的阻害剤を含む）、及びＷＯ２０１１／１０４３４０及びＵＳ８，６３３，２０１に記載されるものなどの置換アルキル基を含有するチエノピリミジニル誘導体が挙げられ、この段落で言及される全ての仕様の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。適切なチエノピリミジン化合物の好ましい例は、ＷＯ２０１１／１０４３４０に記載されるもの（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに上記の特定の化合物、ＭＮＫ−Ｉ１及びＭＮＫ−Ｉ２を含んでもよい。適切なチエノピリミジン化合物の特に好ましい例は、以下に示される一般式のものであってもよい。
【化７】
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式ＶＩＩ
式中、Ｘは、ＣＨ及びＮから選択され；Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン原子（Ｆなど）、ＣＮ、Ｃ１−６アルキル基（好ましくはＣ１−３アルキル基）、またはＣＯＮＨ２基であり；Ｒ２は、ハロゲン原子（複数可）（Ｆなど）または１つもしくは２つのトリハロゲン−メチル（例えば、トリフルオロメチル）で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝Ｃ１−６アルキル基（好ましくはＣ１−３アルキル基）、テトラヒドロピラニル、シクロプロピル、Ｈ２Ｎ−ＣＯ−、Ｒ５ＮＨＣＯ−、または（Ｒ５）２Ｎ−ＣＯ−基であり、ここで、シクロプロピル基は、１つもしくは２つのハロゲン原子（複数可）（Ｆなど）、または−ＣＨ２−ＣＮで置換されてもよく、ここで、化合物が（Ｒ５）２Ｎ−ＣＯ−基を含む場合、２つのＲ５基は、それらが付着されるＮ原子と一緒に、炭素原子がＯ、Ｓ、ＳＯ、もしくはＳＯ２によって置き換えられてもよく、及び／またはＯＨ、ＮＨ２、Ｎ（Ｃ１−３−アルキル）２、ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、ＣＦ３、Ｃ１−３−アルキル基で置換されてもよい４−〜８−員環を形成してもよく、またはＲ２は、２〜６位で１つもしくは２つのＯＨで独立して置換される直鎖もしくは分枝Ｃ２−６アルキル基、Ｃ１−３アルコキシ、アミノ、ＣＮ、Ｒ６ＮＨ−、（Ｒ６）２Ｎ−、Ｒ６ＯＣＯＮＨ−、Ｒ６ＣＯＮＨ−、Ｒ６ＳＯ２ＮＨ−、またはＲ６ＮＨＣＯＮＨ−基であり、ここで、Ｒ６は、Ｃ１−５アルキル基（好ましくはＣ１−４アルキル基、例えば、ＣＨ３、ｉ−Ｐｒ、及びＴ−ＢＵ）であり、各々、１つのＣＦ３、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２またはＣＨ３Ｏ−基で任意に置換され、上記のＮＨ部分のいずれかの水素原子は、ＣＨ３で置換されてもよく；Ｒ３は、ＨまたはＣ１−３アルキル基（好ましくはＣＨ３）であり；Ｒ４は、カルボキシ基、Ｃ１−３アルコキシ−カルボニル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ７、−ＣＯＮＨ−ＯＲ７、−ＣＯＮＨ−ＳＯ２Ｒ７、及び−ＣＯ−ＮＨ−Ｌ−Ｒ７基から選択され、
Ｌは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎが２、３、または４である場合）もしくはＣ３−６分枝鎖アルキル残基（例えば、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−）、−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−、または
2019510061.tif 000012
であり、Ｒ７は、ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ８、−Ｎ（Ｒ８）２、−ＮＨ−ＣＯ２Ｒ８、または３−〜６−員環（例えば、フェニルまたはモルホリン基）、または環状アミン（例えば、ピロリジンもしくはピペリジン）から選択され、Ｒ８は、Ｃ１−３アルキル（好ましくはＣＨ３）、またはその互変異性体、鏡像異性体、もしくは塩である。より具体的には、式（ＶＩＩ）の好ましい化合物は、Ｘが上記で定義されたもの（ただし、好ましくはＣＨ２）であり、Ｒ１がＨまたはより好ましくはＦであり、Ｒ２がハロゲン原子（複数可）（Ｆなど）または１つもしくは２つのトリハロゲン−メチル（例えば、トリフルオロメチル）で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝Ｃ１−６アルキル基、テトラヒドロピラニル、シクロプロピル、Ｈ２Ｎ−ＣＯ−、Ｒ５ＮＨＣＯ−、または（Ｒ５）２Ｎ−ＣＯ−基であり、Ｒ３がＣＨ３であり、Ｒ４がカルボキシ基、Ｃ１−３アルコキシ−カルボニル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ７、−ＣＯＮＨ−ＯＲ７、−ＣＯＮＨ−ＳＯ２Ｒ７、及び−ＣＯ−ＮＨ−Ｌ−Ｒ８基から選択され、ここで、Ｌは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎが２または３である場合）またはＣ３−６分岐鎖アルキル残基（例えば、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−）であり、Ｒ７がＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ８及びＮ（Ｒ８）２、−ＮＨ−ＣＯ２Ｒ８（Ｒ８がＣ１−３アルキル、好ましくはＣＨ３である場合）、ならびに環状アミン（好ましくはピロリジン）などの３−〜６−員環、またはそれらの互変異性体もしくは塩から選択される、ものである。式（ＶＩＩ）の更に好ましい化合物は、Ｘが上記で定義されたものであり（ただし、好ましくはＣＨ２）、Ｒ１がＦであり、Ｒ２がハロゲン原子（複数可）（Ｆなど）で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ３がＣＨ３であり、Ｒ４が−ＣＯＮＨＲ７または−ＣＯＮＨ−ＯＲ７であってもよいが、より好ましくは−ＣＯ−ＮＨ−ＬＲ８基であり、ここで、Ｌは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎが２または３である場合）またはＣ３−６分枝鎖アルキル残基（例えば−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−）であり、Ｒ７がＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ８及びＮ（Ｒ８）２、−ＮＨ−ＣＯ２Ｒ８（Ｒ８がＣ１−３アルキル、好ましくはＣＨ３である場合）、ならびに環状アミン（好ましくはピロリジン）などの３−〜６−員環、またはそれらの互変異性体もしくは塩から選択される、ものであってもよい。
【００４０】
ＭＮＫ１及び／またはＭＫＮ２の生物活性を低下させる他の小分子もまた、本明細書に記載される使用に適切であってもよい。そのような化合物の例としては、ＥＰ０８１９１２９に記載されるもの、ピリジン及びピラジン誘導体、例えば、ＷＯ２００７／１４７８７４に記載されるもの、ならびに８−ヘテロアリールプリン化合物、例えば、ＵＳ７９５１８０３に記載されるものが挙げられ、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、当業者は、他の小分子が、本明細書に記載されるようなＭＮＫの生物活性及び／または発現を阻害する場合、それらは、本開示の方法における使用に適切であり、それらの目的のために安全であると考えられる。ＭＮＫ阻害機能のための小化合物をスクリーニングするための方法は、ＵＳ８，６３３，２０１に記載されている。更に、追加の有機小分子ＭＮＫ阻害剤を設計するための考慮事項が、Ｈｏｕら（２０１２）に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４１】
実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、ペプチド阻害剤である。
【００４２】
ペプチド阻害剤は、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性が減少するような様式で、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２などの標的と結合することができるペプチドもしくはタンパク質またはその断片である。ペプチド阻害剤は、天然源由来、または人工的に合成されたものに関わらず、天然に存在するＭＮＫ結合パートナーであってもよい、または他のペプチドであってもよい。多数のペプチドライブラリーが知られており、そのようなライブラリーは、当業者に知られている多くの技術によってスクリーニングされ得る。ＭＮＫ１及び／またはＭＫＮ２の新規ペプチド阻害剤は、そのような方法を用いて同定され、当業者に周知の技術を用いて産出され得る。
【００４３】
実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、阻害性抗体またはその断片、例えば、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を阻害または拮抗するために直接使用されてもよいＭＮＫに特異的な抗体であってもよい。代替として、阻害抗体は、中和抗体として知られていてもよい。
【００４４】
適切な抗体は、当業者に周知の方法を用いて生成され、次いで、ＭＮＫ阻害特性を有する、すなわち、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を低下させる抗体を同定するためにスクリーニングされてもよい。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片、及びＦａｂ発現ライブラリーによって産生される断片が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＮＫ阻害特性を有する抗体を作製する方法は、当業者に周知である。
【００４５】
実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、阻害性アプタマー、例えば、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を阻害または拮抗するために直接使用されてもよいＭＮＫに特異的なアプタマーであってもよい。アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子であり、（通常は）短いオリゴヌクレオチド鎖から成るオリゴヌクレオチド分子及び典型的には短い可変ペプチドドメイン（またはループ）から成るペプチドアプタマーが、両端部でタンパク質の骨組に付着している。アプタマーは、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２などのタンパク質を高い親和性及び特異性で阻害することができる。アプタマーを産生し、所望の阻害作用についてそれらをスクリーニングする任意の適切な方法を使用してＭＮＫ阻害剤を産生してもよい。ヌクレオチドアプタマーのためのそのような方法の例は、ＵＳ７，９６０，１０２及びＷＯ９１／１９８１３に記載されるが、しかしながら、他の方法もまた適切であり得る。ペプチドアプタマーはまた、ファージディスプレイ、ならびにｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイ、及び酵母ディスプレイなどの他の表面ディスプレイ技術によって構築された組み合わせペプチドライブラリーから選択され得る。阻害性ペプチドアプタマーを産生するための方法の更なる例は、ＷＯ２０１２／０９６９７８に記載される。
【００４６】
実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、阻害性ヌクレオチド分子であってもよい。二本鎖または一本鎖干渉ＲＮＡ分子は、当業者に周知のように、所与の遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の配列特異的分解を誘発し、それにより、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害することができる。ＭＮＫをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子は、ｍＲＮＡの転写をブロックすることが望ましい状況で代替的に使用されてもよい。したがって、阻害性ヌクレオチド分子は、産生されるＭＮＫタンパク質の量を減少させることによって、ＭＮＫ生物活性を阻害するために使用されてもよい。そのような技術は現在、当業者に周知であり、センスもしくはアンチセンスオリゴマーまたはより大きな断片は、ＭＮＫをコードする配列のコードまたは制御領域に沿った様々な位置から設計され得る。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス、もしくはワクシニアウイルスから、または種々な細菌プラスミドから誘導された発現ベクターは、標的臓器、組織、または細胞集団へのヌクレオチド配列の送達のために使用されてもよい。当業者に周知の方法が、ＭＮＫをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築するために使用され得る。ＭＮＫをコードする遺伝子は、ＭＮＫをコードする高レベルのポリヌクレオチドまたはその断片を発現する発現ベクターで細胞または組織を形質転換することによってオフにされ得る。そのような構築物は、翻訳不可能なセンスまたはアンチセンス配列を細胞に導入するために使用されてもよい。ＤＮＡへの組み込みがない場合でも、そのようなベクターは、ＲＮＡ分子が内因性ヌクレアーゼによって無効にされるまでＲＮＡ分子を転写し続けることがある。一過性発現は、非複製ベクターで１ヶ月以上続き、更に適した複製要素がベクターシステムの一部である場合、更に長くことがある。阻害性ヌクレオチド分子は、核酸分子の合成のための、当業者に知られている任意の方法によって調製されてもよい。
【００４７】
ＭＮＫ阻害剤は、経口または直腸などの経腸投与のための許容される方法のいずれかによって、または皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内経路などの非経口投与によって、または鼻腔内経路などの他の適切な経路によって対象に投与されてもよい。注射は、ボーラス投与、または一定もしくは間欠的注入を介し得る。実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、経口投与される。したがって、ＭＮＫ阻害剤は、例えば、カプセル、錠剤、カプレット、顆粒、もしくは粉末（飲料を提供するために水中に懸濁または溶解されてもよい）などの経口剤形で、または補強食品として製剤化されてもよい。
【００４８】
ＭＮＫ阻害剤は、それを生体利用可能にする任意の形態または様式で投与され得る。製剤を調製する当業者は、選択されるＭＮＫ阻害剤の特定の特性、治療される疾患、治療される疾患の段階、及び他の関連状況に応じて、適切な投与形態及び様式を容易に選択することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（１９９５）を参照されたい）。実施形態では、製剤は、薬学的または獣医学的に許容される充填剤、担体、希釈剤、及び／または賦形剤と任意に組み合わせられてもよい。充填剤、担体、希釈剤、または賦形剤は、当業者に知られている任意の適切な物質、例えば、リン酸二カルシウム二塩基（ＤＣＰＤ）、第二リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、糖類、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、セルロース、セルロース誘導体または変性セルロース、例えば、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、キシリトール、ソルビトール、もしくはマルチトールのようなアルコール類、水、アルコール、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、及び／またはヒュームドシリカ吸収剤であってもよい。好ましくは、充填剤、担体、希釈剤、または賦形剤は、ステアリン酸マグネシウム、ＤＣＰＤ、デンプングリコール酸ナトリウム、ヒュームドシリカ吸収剤、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００４９】
ＭＮＫ阻害剤は、本明細書に記載される疾患の治療のために、１つ以上の追加の薬物（複数可）と併用または共に投与されてもよい。成分は、同じ製剤または別々の製剤で投与されえる。別々の製剤で投与される場合、ＭＮＫ阻害剤は、連続して（すなわち、例えば、数秒または数分または更に数時間（例えば２〜４８時間）以内に任意の順序で連続して）、または他の薬物（複数可）と同時に投与されてもよい。
【００５０】
１つ以上の追加の薬物と組み合わせて投与可能であることに加えて、ＭＮＫ阻害剤は、併用療法で使用されてもよい。これが行われるとき、ＭＮＫ阻害剤は、典型的には、互いに組み合わせて投与される。したがって、ＭＮＫ阻害剤の１つ以上は、所望の効果を達成するために、同時（組み合わされた調合剤として）、または連続（すなわち、例えば、数秒または数分または更に数時間（例えば２〜４８時間）以内に任意の順序で連続して）のいずれかで投与されてもよい。これは、２つの薬物の組み合わされた効果が、改善された治療結果を提供するように、各ＭＮＫ阻害剤の治療プロファイルが異なる場合に特に望ましい。
【００５１】
必要に応じて、より効果的な分布のために、ＭＮＫ阻害剤は、ポリマーマトリックス、リポソーム、及びマイクロスフェアなどの徐放性または標的送達系に組み込まれ得る。
【００５２】
「治療上有効な量」のＭＮＫ阻害剤は、例えば、特定の選択されたＭＮＫ阻害剤または使用されるＭＮＫ阻害剤の組み合わせ、投与方法、治療される特定の疾患、及び所望の転帰によって変動してもよい。それはまた、疾患の段階及び重症度、患者の年齢及び身体状態を含む治療される対象、もしある場合、同時療法の性質、及び医師に周知の同様の要因にもよる。防止的（予防的）な適用に関しては、それは、概して、予防されるように探される特定の疾患の発症を遅らせる、進行を阻害する、または共に停止させるのに十分なその量である。治療的適用に関しては、それは、概して、医学的に望ましい結果を達成するのに十分なその量である。
【００５３】
治療上有効な量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。いずれの化合物についても、治療上有効な量は、細胞培養アッセイ（例えば、前脂肪細胞株）、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、またはブタのいずれかで最初に推定され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用されてもよい。そのような情報は、その後、ヒトにおける投与のための有用な投与量及び経路を決定するために使用され得る。治療有効性及び任意の毒性は、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致命的である用量）の決定を通して、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定されてもよい。治療効果と毒性作用との間の用量比は、治療指数であり、それは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表され得る。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投与量の範囲を定式化するのに使用される。そのような組成物に含有される投与量は、好ましくは、毒性がほとんどない、または全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、使用される剤形、患者の感受性、及び投与経路によって、この範囲内で変化する。使用される正確な投薬量及び治療上有効な量は、処理を必要とする対象に関連する因子を考慮して、開業医によって決定される。投与量及び投与経路／頻度は、十分なレベルの活性部分を提供するために、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る因子としては、病状の重篤度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ（複数可）、反応感受性、ならびに療法に対する耐性／応答が挙げられる。薬学的組成物は、特定の製剤及び／または活性部分の半減期及びクリアランス速度によって、１日数回、１日１回、３〜４日ごと、毎週、または２週間に１回投与されてもよい。治療上有効な量は、投与経路によって、０．１〜１００，０００ｍｇ、最大約１ｇの総量まで変動してもよい。一例では、治療上有効な量は、概して、約１〜２０００ｍｇ／日、好ましくは約１０〜約１０００ｍｇ／日、最も好ましくは約１０〜約５００ｍｇ／日であってもよく、単回または複数回投与されてもよい。
【００５４】
本開示の方法の上記の実施形態のいずれかまたは全てが、以下を含む本開示の他の態様において容易に使用され得ることが意図される。
【００５５】
本開示の別の態様は、５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療するための、治療上有効な量の少なくとも１つのＭＮＫ阻害剤の使用を提供し、該ＭＮＫ阻害剤ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を低下させる。
【００５６】
本開示の更なる態様は、５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする前糖尿病対象を治療するための医薬品の製造における、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を低下させる少なくとも１つのＭＮＫ阻害剤の使用を提供する。
【実施例】
【００５７】
実施例１  ＭＮＫ１及びＭＮＫ２は、高脂肪食の有害作用を媒介し、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の生物学的機能を阻害することは、これらの作用を減少させる
材料及び方法
材料及び化学物質
全ての細胞培養液及びサプリメントは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国、カリフォルニア州、カールスバッド）から購入した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの試薬は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）から購入した。脂肪生成実験のために、インスリン、デキサメタゾン、ＩＢＭＸ、及びロシグリタゾンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国、ミズーリ州、セントルイス）から得た。マクロファージ分極化については、リポ多糖（ＬＰＳ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、インターロイキン（ＩＬ）−４及びインターフェロン（ＩＦＮ）γをＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（米国、ニュージャージー州、ロッキーヒル）から購入した。ＭＮＫ阻害剤ＣＧＰ５７３８０は、Ａｂｃａｍ  ＰＬＣ（英国、ケンブリッジ）から得た。
【００５８】
動物の使用及び食餌
ＭＮＫ１−ＫＯ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景で作製され、Ｒｉｋｉｒｏ  Ｆｕｋｕｎａｇａ博士（日本、大阪大学；Ｕｅｄａら、２００４）によって快く提供された。４週齢の雄野生型（ＷＴ）、ＭＮＫ１−ＫＯ、またはＭＮＫ２−ＫＯマウスを、１２時間の明／暗サイクル（０７：００に点灯）及び２２±２℃の一定温度で、食料と水は自由に入手可能な状態で保持した。それらを、２０週間の高脂肪食（ＨＦＤ；４５％ｋｃａｌの脂肪、２０％ｋｃａｌのタンパク質、３５％ｋｃａｌの炭水化物；Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、英国、エセックス）または標準飼料食（Ｃ；７％ｋｃａｌの脂肪、１８％ｋｃａｌのタンパク質、７５％ｋｃａｌの炭水化物；Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）のいずれかに割り当てた。食餌中の脂肪は、ラード（１７．８９％ｗ／ｗ）及び大豆油（４．３２％ｗ／ｗ）によって提供した。食餌の栄養価を表４に示す。
【００５９】
【表４】
2019510061.tif 000013
【００６０】
代謝研究
飼料食またはＨＦＤのいずれかで１５週間後、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）を一晩の絶食後に行った。空腹時グルコース濃度を、マウスがＤ−グルコース（２ｇ／マウス体重１ｋｇ；Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄ、豪州、アデレード）を腹腔内（ｉｐ）注射される前に尾静脈から得られた全血から測定し、血中グルコース濃度を、Ａｖｉｖａ  Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋグルコメ―ター（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、スイス、Ｒｉｓｃｈ−Ｒｏｔｋｒｅｕｚ）を用いて腹腔内注射の１５、３０、６０、及び１２０分後に尾静脈から測定した。
【００６１】
インスリン抵抗性を試験するために、マウスの別個のコホートを一晩絶食させ、腹腔内インスリン注射（０．７５Ｕ／マウス体重１ｋｇ；Ａｃｔｒａｐｉｄ、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク、バウスベア）の前に尾から得た全血中の絶食グルコース濃度を測定した。次いで、血液グルコース濃度を、腹腔内注射の１５及び３０分後に尾静脈から測定した。マウスは、腹腔内注射の３０分後にグルコース測定値を得た後、直ちに屠殺し、組織を、下流のインスリンシグナル伝達を測定するためのウェスタンブロッティングによる分析のために直ちに凍結した。
【００６２】
血漿インスリン、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０の測定は、英国、ケンブリッジのＣｏｒｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣＢＡＬ）によって実施された酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって行った。
【００６３】
ウェスタンブロッティング
組織を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、５０ｍＭのβ−グリセロールホスフェート、０．５ｍＭのＮａＶＯ３、０．１％２−メルカプトエタノール及びプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液中で採取した。溶解後、不溶性物質を４℃で、１２，０００ｇで１０分間遠心分離することによって除去した。タンパク質含量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって決定した。イムノブロッティングは、Ｌｉｕら（２０１４）に記載される通りに行った。ブロットは、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて視覚化した。表５に示される一次抗体は、抗Ｐ−ｅＩＦ４Ｅ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を除いて、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのものであった。二次抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（米国、マサチューセッツ州、ウォルサム）から入手し、１：２０，０００希釈で使用した。
【００６４】
【表５】
2019510061.tif 000014
【００６５】
遺伝子発現解析
全ＲＮＡは、メーカーの説明書に従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して組織から単離した（サンプリング時に凍結された）。ＲＮＡ濃度を２６０ｎｍでの吸光度によって決定すると同時に、品質及び完全性を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２６０／２３０及び２６０／２８０比で評価した。ＲＴリアルタイムＰＣＲ増幅を、製造業者のプロトコルに従ってランダムプライマーでＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａ３８００；Ｐｒｏｍｅｇａ、米国、ウィスコンシン州、マジソン）を使用して実行した。続いて、リアルタイム定量（ｑ）ＰＣＲを、Ｍｏｏｒｅ  ＣＥＪら、２０１６の補足表Ｓ１に記載されるプライマー配列を用いて行い、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。比較ＣＴ法を使用して、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ｍＲＮＡと比較して標的ｍＲＮＡレベルの増幅を測定した。図１Ａにおいて、各転写産物の相対量は、ｄＣｔ＝（Ｃｔ標的遺伝子−Ｃｔ  ｒｅｆ遺伝子）である式２−ｄＣｔ及びＣｔ＝サイクル閾値を用いて決定した。
【００６６】
ＢＭＤＭの単離
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、成体ＷＴまたはＭＮＫ２−ＫＯマウス（Ｗｅｉｓｃｈｅｎｆｅｌｄｔ及びＰｏｒｓｅ、２００８）から前述のように生成した。簡潔には、マウスの両側大腿骨及び脛骨を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有さない滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に２６ゲージの針を用いてフラッシュした。細胞クラスターをピペッティングし、懸濁液を４０μｍの細胞ストレーナーに通すことによって破壊した。得られた細胞懸濁液を遠心分離し（１０分、４００×ｇ）、細胞ペレットを、３０％Ｌ９２９細胞馴化培地（Ｌ９２９細胞は、マクロファージへの骨髄細胞の分化を促進するために必要とされるマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を分泌する）、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５０％ＤＭＥＭ（高グルコースダルベッコ変法イーグル培地、ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する完全マクロファージ培地（ＣＭＭ）に１％（重量／体積）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に再懸濁した。
【００６７】
マクロファージ極性化
ＢＭＤＭ細胞を、ＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４からのＬ２６３０−リポ多糖体）で２４時間処理して、Ｍ１マクロファージ表現型に分極するか、または細胞を、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）単独で２４時間処理して、Ｍ２表現型に分極した。
【００６８】
３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化及びオイルレッドＯ染色
３Ｔ３−Ｌ１（線維芽細胞）細胞分化の誘導のために、前脂肪細胞を、１０％ＦＢＳで補充されたＤＭＥＭ（０日目）でコンフルエンス後２日まで増殖させ、培地を、１０％ＦＢＳ、インスリン（１６７ｎＭ）、デキサメタゾン（０．５μＭ）、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（０．５ｍＭ）、及びロシグリタゾン（２μＭ）で補充されたＤＭＥＭに交換した。４８時間後、培地を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１６７ｎＭのインスリンで補充されたＤＭＥＭを含有する培地と置き換えた。４日目に、分化を誘導した後、そしてそれ以降、細胞を、１０％ＦＢＳを伴うＤＭＥＭ中で培養した。維持培地は、細胞が実験に利用されるまで（分化開始から９日）まで４８時間毎に交換した。２０μＭのＣＧＰ５７３８０を、０日目に細胞に添加し、分化プログラムを通じてその後の培地交換の間維持した。
【００６９】
細胞内トリグリセリドレベルの評価は、他の文献（Ｓｍｉｔｈら、１９８８）に記載されているようにオイルレッドＯ染色を用いて行った。簡潔には、３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化の９日目に、１０％ホルマリン中で１時間固定した。細胞を、新たに調製したオイルレッドＯ染色液で１０分間染色する前に、６０％イソプロパノールで洗浄した。定量のために、細胞を水で広範囲に洗浄して未結合の色素を除去し、１ｍｌのイソプロパノールを、染色された６ウェル培養プレートに添加した。５分後、５１０ｎｍでのオイルレッド抽出物の吸光度を測定し、吸光度の増加は、細胞内の脂質レベルの増加を示した。
【００７０】
組織学
脂肪組織切片を１０％中性緩衝ホルマリン中で６時間固定し、パラフィンワックスに包埋する前に標準物として脱水した。切片（４μｍ）を切断し、正に帯電したガラススライド上に載せ、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を標準物として行った。スライドを、Ｐａｎｏｒａｍｉｃ２５０Ｆｌａｓｈ  ＩＩスキャナー（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ、ハンガリー）を使用してスキャンした。画像を、脂肪細胞ツールマクロを有するＩｍａｇｅ  Ｊを用いて分析した。次いで、脂肪細胞を計数し、各被写体の絶対画素面積を計算し、μｍ２に変換した。
【００７１】
統計
分析は、図の説明文に示されるように、両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定、一元または二元配置分散分析によって行った。０．０５未満のＡＰ値は、有意であると考えられた。統計的検定は、統計的プログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン６；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）を用いて行った。
【００７２】
脂質分解アッセイ
３Ｔ３Ｌ１細胞を９日間上記のように分化させた。脂肪分解アッセイは、メーカーの説明書（Ａｂｃａｍ  Ｌｉｐｏｌｙｓｉｓアッセイキット、ａｂ１８５４３３、Ａｂｃａｍ）に従って行った。簡潔には、分化後、細胞を脂肪分解アッセイ緩衝液で２回洗浄した。脂質分解を、１００ｎＭイソプロテレノールを用いて３時間刺激した。放出されたグリセロールの量を、比色強度を用いて測定した。
【００７３】
トリグリセリド測定
組織放出トリグリセリド（ＴＡＧ）の量は、トリグリセリド定量キット（Ａｂｃａｍ、ａｂ６５３３６）を用いて測定した。
【００７４】
肝臓組織学
新鮮な低温切片（厚さ５μｍ）を用いて、オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ）で染色することにより脂質蓄積を検出した。低温切片を６０％イソプロパノール中で１０分間固定し、６０％イソプロパノール中の０．３％オイルレッドＯで３０分間染色し、続いて、６０％イソプロパノールで洗浄した。核をヘマトキシリンで２分間染色し、次いで、水道水で濯いだ。スライドをＰａｎｎｏｒａｍｉｃ２５０Ｆｌａｓｈ  ＩＩスキャナー（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ、ハンガリー）を用いてスキャンした。
【００７５】
結果と考察
ＭＮＫ１及び２は、インスリン調節代謝に関与する正常なマウス組織において発現される
以前に、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２  ｍＲＮＡが肝臓、骨格筋、及び心臓において発現されることが示されている。本発明者らは、肝臓での発現を確認することに加えて、ＭＫＮＫ１及びＭＫＮＫ２  ｍＲＮＡ分子が脂肪組織でも発現することを示している（図１Ａ参照）。免疫ブロット分析は、肝臓、骨格筋、及び心筋、ならびに脂肪組織におけるＭＮＫ１タンパク質の発現を明らかにした（図１Ｂ）。
【００７６】
脂肪細胞分化中のＭＮＫ２の発現を調べるために、広範に使用される脂肪細胞分化モデルである３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞を使用して、転写因子ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、及びＳＲＥＢＰ１ｃ、ならびにグルコース及び脂肪酸輸送体ＧＬＵＴ４及びＣＤ３６などの標準マーカーの発現を分析し、分化プロトコルの有効性を確認した（図１Ｃ）。ＭＮＫ２  ｍＲＮＡのレベルは、分化プロトコルの誘導後に急速に上昇し、１日で３倍のレベル（他のマーカーの最も早いものと少なくとも同じ速さ）であった（図１Ｄ）。この結果は、ＭＮＫ２が脂肪細胞分化の初期に役割を果たすことを示す。ＭＮＫ２  ｍＲＮＡレベルは、６日目までにほぼ分化前レベルまで低下した。対照的に、ＭＫＮＫ１  ｍＲＮＡレベルは、この期間にほんの少し増加した。更なる研究（図１Ｅ参照）では、脂肪生成に関与する主要遺伝子の大部分の出現の前に（Ｃ／ＥＢＰβ以外に）、ＭＮＫ１ではなくＭＮＫ２が３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の脂肪細胞への分化の間、非常に早く上方制御されることが見出された。
【００７７】
ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＨＦＤ誘発性脂肪増加及びインスリン抵抗性の指標に対して保護されている
野生型（ＷＴ）マウスと比較したＭＮＫ１ノックアウト（ＫＯ）またはＭＮＫ２−ＫＯマウスの、正常食（飼料食）と比較した高脂肪食（ＨＦＤ）に対する応答を調べて、ＭＮＫ−１及びＭＮＫ−２の役割を決定した。飼料食と比較して、野生型（ＷＴ）Ｃ５７Ｂｌ６／ＪマウスにＨＦＤを摂取させると、体重及び性腺脂肪の増加した（図２Ａ〜２Ｃ）。高脂肪摂取ＭＮＫ１−ＫＯマウスは、ＨＦＤのＷＴマウスと同様の身体及び性腺重量の増加を示した（図２Ａ〜２Ｃ）。対照的に、同型のＭＮＫ２−ＫＯマウスに同じＨＦＤを摂取させると、体重及び性腺脂肪の増加がより小さくなった。ＷＴマウスでは、ＨＦＤもまた、グルコース及びインスリンの循環レベルの顕著な増加を引き起こした（それぞれ図２Ｄ、２Ｅ）。そのような増加は、ＨＦＤのＭＮＫ１−ＫＯ動物及びＭＮＫ２−ＫＯ動物の両方において顕著に低下し、ＨＦＤの有害作用の減弱を示した。とりわけ、飼料食では、ＭＮＫ１−ＫＯ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＷＴマウスの体重、性腺脂肪重量、基礎グルコース及びインスリンレベルと同様のものを有した。野生型対照群と比較して、ＭＮＫ−ＫＯマウスの食物摂取量の差は観察されなかった。
【００７８】
インスリン抵抗性の恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）は、インスリン抵抗性の指標として広く使用され、それは、血中インスリン及びグルコース値から計算される（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９８５）。ＨＯＭＡ−ＩＲは、ＷＴ／ＨＦＤマウスにおいて上昇した（図２Ｆ）。しかしながら、ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスでは、飼料食摂取動物と比較して、ＨＯＭＡ−ＩＲのはるかに少ない増加が観察され、ＭＮＫ２−ＫＯ動物が、インスリン抵抗性などのＨＦＤの有害作用に対して大きく保護されていることを示した。ＭＮＫ１−ＫＯマウスは、ＨＦＤのＷＴマウスと同様の重量及び脂肪増加を示すが、それらは、より低い血中インスリン及びグルコース値、したがって、ＷＴ／ＨＦＤマウスよりも良好なＨＯＭＡ−ＩＲを示した（図２Ｄ〜２Ｆ）。
【００７９】
ＨＦＤのＷＴマウスでは、脂肪細胞のサイズは、細胞面積によって評価されるように、飼料食のものと比較して実質的に増加した（１．７倍；図３Ａ）。これらの細胞が大体球状であると仮定すると、これは、脂肪細胞体積の約３倍の増加になる。これと一致して、飼料食摂取マウスと比較して、ＨＦＤ摂取ＷＴの脂肪細胞の観察された数において対応する減少が存在した（図３Ｂ）。対照的に、飼料食摂取対照群と比較した場合、ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスにいて脂肪細胞のサイズの増加はなかった（図３Ａ、３Ｂ）。これは、これらの動物がＨＦＤに置かれるときに、脂肪細胞の脂質貯蔵における起こり得る欠陥を示唆する。興味深いことに、脂肪細胞のサイズは、ＷＴ対照群よりもＭＮＫ２／飼料食動物でより大きいことが見出され、理論に縛られることは望まないが、これは、ＭＮＫ２−ＫＯマウスにおける脂肪生成の欠損の存在を示し得るため、より少ない脂肪細胞が存在し、その結果、それぞれがより大きくなる。脂肪細胞サイズがＭＮＫ２−ＫＯマウスにおけるＨＦＤで増加しなかったという観察は、高脂肪摂食ＭＮＫ２−ＫＯマウスの体重増加の減少に寄与する可能性が高い。
【００８０】
ＭＮＫは、脂肪細胞の分化に必要とされる
ＷＴ／ＨＦＤ対照群と比較したＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスで観察された脂肪組織の少ない増加、及び脂肪細胞分化中のＭＮＫ２の発現増加（図１Ｃ）は、ＭＮＫ２が細胞の脂肪細胞への分化において役割を果たすか否かの試験を促した。この目的のために、３Ｔ３−Ｌ１細胞を、標準プロトコルを用いて脂肪細胞に分化させ、脂質含量を評価し、ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＧＬＵＴ４、及びＣＤ３６に対するｍＲＮＡなどの脂肪細胞マーカーを評価することによって分化を監視した。
【００８１】
ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の両方の活性の広く使用されている阻害剤、ＣＧＰ５７３８０（Ｔｓｃｈｏｐｐら、２０００）の、３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化に対する効果を調べた。用量応答試験を、真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）のリン酸化を読取りとして用いて評価するように、ＭＮＫ機能を遮断するために必要とされるＣＧＰ５７３８０の濃度を決定するために行った。ＭＮＫは、ｅＩＦ４Ｅをリン酸化することが知られている唯一のキナーゼであり、したがって、ｅＩＦ４Ｅ（Ｐ−ｅＩＦ４Ｅ）のリン酸化は、ＭＮＫ生物活性の直接の読み出しを提供する。結果は、２０μＭのＣＧＰ５７３８０が効果的であり、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＭＮＫ活性をほぼ完全に遮断することを示した（図３Ｃ）。更に、図３Ｄに示すように、２０μのＭＣＧＰ５７３８０は、分化プロトコルに供された３Ｔ３−Ｌ１細胞への脂質の蓄積を阻害した。
【００８２】
脂質蓄積の阻害が脂肪生成分化に関与する他の遺伝子の発現の変化を反映するかどうかを研究するために、ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＧＬＵＴ４、及びＣＤ３６に対するｍＲＮＡレベルを調べた。図３Ｅに示すように、ＣＧＰ５７３８０は、ＣＧＰ５７３８０の非存在下で分化された３Ｔ３−Ｌ１細胞と比較して、分化プロトコルの３日目及び６日目の両方でこれらの遺伝子の全ての誘導を実質的に遮断した。これらのデータは、ＭＮＫが３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化において役割を果たすこと、及びインビボでの脂肪細胞分化においても役割を果たす可能性があることを示し、図３Ａ及び３Ｂに示される脂肪細胞のサイズ及び数に対するＭＮＫの役割を確認する。
【００８３】
ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスは、肝臓脂質蓄積の増加を示さない
ＨＦＤのＷＴ動物と比較して、ＭＮＫ２−ＫＯマウスで観察された脂肪組織の増加の減弱を考慮して、食事からの余分な脂質負荷が肝臓に転用され、そこの脂肪蓄積に寄与する可能性があるかどうかを調べる調査を行った。ＨＦＤ  ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＨＦＤのＷＴマウスと同様の肝臓重量を示した（データ示さず）。ＨＦＤのＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスの総肝脂質レベルは、同様であった（データ示さず）。これらのデータは、ＨＦＤ中の余分な脂質がＭＮＫ２−ＫＯマウスの肝臓に転嫁されていないことを示している。
【００８４】
ＭＮＫ−ＫＯマウスは、ＨＦＤのＷＴマウスと比較してグルコース耐性の改善を示す
ＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯ動物におけるグルコース耐性に対するＨＦＤの作用を直接評価するために、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）を行った。飼料食摂取ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＧＴＴにおいて飼料食摂取ＷＴ動物と同様の応答を示し、ＭＮＫが正常（飼料食）条件下でグルコース耐性に影響しないことを示した。しかしながら、ＭＮＫ１−ＫＯ及びＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスは、ＷＴ／ＨＦＤマウスと比べて、グルコース投与後、常に著しく低い血中グルコース値を示し、グルコース処理を調節することにおけるＭＮＫ１及びＭＮＫ２の役割（図４Ａ、４Ｂ）、したがって、より高いグルコース耐性を示した。したがって、これらの結果から、ＭＮＫ１またはＭＮＫ２のいずれかのノックアウトは、ＨＦＤ誘導性のグルコース不耐性に対してマウスを保護するように思われる。
【００８５】
インスリンの作用を評価するために、飼料食またはＨＦＤのＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯマウスをインスリンで処理して、これらの動物の、血中グルコース値を低下させる能力を評価した。インスリンは、ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤ動物において、ＷＴ／ＨＦＤマウスよりも血中グルコースをより効果的に低下させ、インスリンがＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤ及びＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスにおいてより効率的に作用することを示した（図４Ｃ）。実際に、ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスにおけるインスリンによって引き起こされる血中グルコース値の低下率は、飼料食摂取動物で観察されたものと同様である。これらのデータは、ＭＮＫ１−ＫＯ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスがそれぞれ、ＨＦＤ誘発性のインスリン抵抗性に対してかなりの程度まで保護されていることを示している。
【００８６】
ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＨＦＤのＷＴマウスよりも良好なインスリンシグナル伝達を示す
脂肪組織におけるＭＮＫ１及びＭＮＫ２活性の相対レベルを評価するために、ｅＩＦ４Ｅ（ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の共通基質）のリン酸化を調べた。ＨＦＤは、ＷＴマウスの脂肪組織におけるリン酸化（Ｐ）−ｅＩＦ４Ｅのわずかな増加を引き起こした（図５Ａ）。ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、両方の食餌条件下でＰ−ｅＩＦ４Ｅの実質的な低下を示したが、ＭＮＫ１−ＫＯマウスは、飼料食のＷＴ動物と比較して、飼料食でＰ−ｅＩＦ４Ｅに変化を示さなかった。これは、ＭＮＫ２が脂肪組織における最も活性なＭＮＫアイソフォームであることを実証する。ＭＮＫ１−ＫＯマウスでは、Ｐ−ｅＩＦ４Ｅは、飼料食摂取マウスよりもＨＦＤ摂取の脂肪組織においてより低かった（図５Ａ）。
【００８７】
インスリンは、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４の、細胞膜への転座を介して、脂肪、特に筋肉などの組織へのグルコースの取り込みを刺激する。この効果は、インスリンの代謝作用の多くと同様に、ホスファチジルイノシトイド３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）の下流でリン酸化され、活性化されるタンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ、Ａｋｔとも呼ばれる）を介して媒介される。インスリンの、この経路を活性化する能力を評価するために、飼料食またはＨＦＤを摂取したＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスにインスリンを投与し、３０分後に屠殺してインスリン抵抗性を試験した。試料を血液から採取し、脂肪組織及び骨格筋（腓腹筋）も採取した。組織試料を、インスリンシグナル伝達の様々なパラメータについて免疫ブロットにより分析した。ＷＴマウスにおいて、インスリン投与は、脂肪組織（図５Ｂ）及び筋肉（図５Ｂ、５Ｃ）におけるその活性化に関与する主部位であるＳｅｒ４７３及びＴｈｒ３０８におけるＰＫＢのリン酸化の増加を引き起こした。これらの効果は、ＨＦＤを摂取したＷＴ動物で減少し、インスリンの効果に対する部分的な抵抗性を示した。飼料食のＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯマウスにおいて、インスリン誘発性ＰＫＢリン酸化は、飼料食のＷＴ動物と同様であったが、インスリン誘発性ＰＫＢリン酸化は、ＨＦＤ上のＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯマウスにおいて、ＷＴ／ＨＦＤ動物より高く、インスリン抵抗性がＭＮＫ−ＫＯ／ＨＦＤマウスの両方において減弱されたことを示した（図５Ｂ、５Ｃ）。
【００８８】
総ＧＬＵＴ４タンパク質の増加が、ＷＴまたは飼料食摂取ＭＮＫ２−ＫＯ動物のいずれかと比較して、ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスの脂肪組織で観察された（図５Ｄ）。ＧＬＵＴ４は、このホルモンに応答してグルコースのインスリン応答性組織への取り込みを媒介する、重要なインスリン調節されたグルコース輸送体である。インスリンは、ＰＫＢを含むシグナル伝達経路を介して細胞膜へのその転座を促進する。したがって、ＷＴ／ＨＦＤマウスと比較して、ＭＮＫ２  ＫＯ／ＨＦＤ動物の改善されたグルコース耐性は、改善されたインスリン感受性及び／またはシグナル伝達と、より高いレベルのＧＬＵＴ４タンパク質との組み合わせを含む可能性が高い。Ｇｌｕｔ４  ｍＲＮＡレベルは、ＷＴ動物と比較して、飼料食またはＨＦＤのＭＮＫ２−ＫＯ動物の脂肪組織においてわずかに低かった（データ示さず）。ＧＬＵＴ４タンパク質のレベルは、野生型動物と比較して、ＭＮＫ１−ＫＯ動物の脂肪においてより低い傾向があった（図５Ｄ）。骨格筋において、ｅＩＦ４Ｅリン酸化は、ＭＮＫ２−ＫＯマウスでは低下したが、ＭＮＫ１−ＫＯ動物では低下せず（図５Ｅ）、ＭＮＫ２がこの組織において最も活性なＭＮＫアイソフォームであるが、ＭＮＫ１も寄与することを示す。インスリン誘発性ＰＫＢリン酸化は、飼料食と比較してＨＦＤを摂取したＷＴマウスでは減少したが、それは、ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯ動物では損なわれなかった。ＧＬＵＴ４タンパク質のレベルは、ＭＮＫ２−ＫＯマウス、特にＨＦＤのマウスの筋肉においてより高い傾向があったが、その差は、有意性に達しなかった（図５Ｅ〜５Ｆ）。したがって、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２は両方とも、ＨＦＤ摂取マウスの脂肪組織及び筋肉におけるインスリンシグナル伝達を損なう役割を果たす。
【００８９】
ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＨＦＤ誘発性脂肪炎症に対して保護される
体重増加及びインスリン抵抗性に加えて、ＨＦＤを消費する結果として、炎症誘発性Ｍ１マクロファージで浸潤される、特に脂肪組織における炎症がある。飼料食またはＨＦＤのいずれかを摂取していたＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからの脂肪組織におけるマクロファージ及びＭ１−極性化マクロファージのマーカーを調べた。ＷＴ／ＨＦＤ及びＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤマウスは、ＷＴ／ＨＦＤ動物と比較して、Ｃｄ６８及びＦ４／８０などのマクロファージマーカーのためのｍＲＮＡレベルにおいて増加を示した（図６Ａ、６Ｂ）。ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスにおける変化したマクロファージマーカーを考慮して、炎症誘発性（Ｍ１マクロファージ）マーカーＣｄ１１ｃ及びＴｎｆα（図６Ｃ、６Ｄ）、ケモカイン受容体Ｃｃｒ２及びＣｃｒ５（マクロファージ輸送において重要；データ示さず）、ならびに細胞移動を可能にする細胞外マトリックスの消化に関与するＭｍｐ１２（マトリックスメタロプロテイナーゼ１２；データ示さず）及びＡｄａｍ８（データ示さず）。著しく対照的に、ＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤマウスではなくＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスは、飼料食での同じ動物と比較して、急減した炎症を示し、Ｃｄ６８、Ｆ４／８０、Ｔｎｆα、Ｃｄ１１ｃ、ＭｈｃＩＩ  ｍＲＮＡｓ（図６Ａ〜６Ｄ）、及びＣｃｒ２、Ｃｃｒ５、Ｍｍｐ１２、またはＡｄａｍ８  ｍＲＮＡ（データ示さず）の増加がほとんどない、またはまったくなかった。まとめると、これらのデータは、ＨＦＤでは、ＭＮＫ２−ＫＯマウスの脂肪組織は、（Ｃｄ６８及びＦ４／８０  ｍＲＮＡの正常な顕著な増加がないことに基づいて）マクロファージで大きく浸潤されることはない、またはＣｄ１１ｃ及びＴｎｆαのレベルの著しい鈍化によって示されるように、炎症誘発性Ｍ１マクロファージにおける増加を示す。脂肪細胞ＭＨＣＩＩは、免疫細胞をＨＦＤ摂食動物における脂肪組織に誘引する際に重要な役割を果たすことが報告されているため、ＭＮＫ２−ＫＯマウスにおけるＭｈｃＩＩの増加の欠如が興味深い。更に、飽和脂肪が多い食事は、ｃ−ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化を介してインスリン抵抗性を引き起こすことが報告されている。しかしながら、ＭＮＫは、ＪＮＫによって活性化されず、ＨＦＤ−ＭＮＫ２−ＫＯマウスで観察された表現型におけるＪＮＫの役割を排除する（Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚら、１９９７）。
【００９０】
したがって、結果は、ＨＦＤがＷＴマウスの脂肪組織において広範囲の炎症を誘発するが、ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＨＦＤの炎症誘発性の作用に対して保護されることを示す。興味深いことに、ＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤマウスは、インスリン抵抗性及びグルコース不耐性に対する部分的な保護を示すが、それらは、ＷＴ／ＨＦＤ動物と同様の脂肪組織炎症を依然として呈示する。これは、高脂肪摂食に応答するＭＮＫ１及びＭＮＫ２の異なる役割を明確に示す。しかしながら、保護の根拠が異なるように思われることは注目に値し、ＭＮＫ１−ＫＯマウスは、それらの保護と同時に、脂肪増加及び炎症の減少を示す一方、ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＷＴマウスと同様に、体重及び脂肪組織を増加させるが、それでもなお、インスリン抵抗性に対して保護されている。
【００９１】
マクロファージ生物学
ＭＮＫ２−ＫＯマウスからのマクロファージを、それらがＴＮＦα及びＩＬ−６などのサイトカインの産出において本質的に欠陥があるかどうかを判断するために評価した。ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の両方は、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）におけるｅＩＦ４Ｅリン酸化に寄与する（データ示さず）。それらの調節特徴と一致して、ＷＴ  ＢＭＤＭにおけるリポ多糖（ＬＰＳ）によって誘発されたｅＩＦ４Ｅの増加は、ＭＮＫ１−ＫＯ細胞において失われた（データ示さず）。野生型またはＭＮＫ２−ＫＯマウスからのＢＭＤＭを、リポ多糖（ＬＰＳ）によってインビトロで刺激し、サイトカインｍＲＮＡレベルを評価した。ＬＰＳは、野生型及びＭＮＫ２−ＫＯ  ＢＭＤＭのＴｎｆα及びＩＬ−６  ｍＲＮＡのレベルを同様の程度まで増加させた（データ示さず）。これらのデータは、ＭＮＫ２−ＫＯ  ＢＭＤＭの、ＬＰＳに応答し、サイトカインを産出する能力に本質的な欠陥がないことを示す。
【００９２】
ＬＰＳとＩＦＮγとの組み合わせによる長期間（２４時間）の効果を調べて、炎症誘発性Ｍ１表現型に対するＢＭＤＭの極性化を評価した。ＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯ  ＢＭＤＭは、同様に応答し、ＭＮＫ２が、ＢＭＤＭによるこれらの炎症誘発性サイトカインの産出に必要とされないことを示した（データ示さず）。
【００９３】
ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスの血漿において、２つの抗炎症マーカー、Ｉｌ−１０及びＩｌ−５のｍＲＮＡレベルの有意な増加が、ＷＴ／ＨＦＤマウスと比較して観察された（図７Ａ、７Ｂ）。ＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからのＢＭＤＭの、Ｍ２抗炎症性表現型に分極する固有の能力を調べた。興味深いことに、ＭＮＫ２−ＫＯマウスからのＢＭＤＭは、ＷＴ  ＢＭＤＭと比較して、制御条件下でＩＬ−１０及びＰｐａｒγレベルの上昇を示し、調べられたＭ２極性化の全てのマーカーは、ＩＬ−４での２４時間の刺激後に増加した（図７Ｃ−７Ｆ）。リン酸化されたｅＩＦ４Ｅに関するデータは、ＭＮＫ２がマクロファージにおける主アイソフォームであることを示す（データ示さず）。まとめると、このデータは、ＭＮＫ２−ＫＯマウスからのマクロファージが、抗炎症性表現型に対するより高い傾向を有することを示唆する。
【００９４】
高脂肪摂取は、野生型マウスではなくＭＮＫ２−ＫＯにおいてＮｒｆ２発現を誘導する
核因子赤血球２関連因子２（Ｎｒｆ２）は、広範な脂肪酸酸化から生じ得る酸化ストレスに対する保護において重要な役割を果たし、また、メタボリックシンドロームの発症を防ぐことも報告される。ＭＮＫ２−ＫＯマウスがメタボリックシンドロームの指標に対する保護を示すことを前提として、ＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスの肝臓におけるＮｒｆ２の発現を調べた。レベルは、飼料食を摂取したマウスにおいて同様であった。Ｎｒｆ２  ｍＲＮＡレベルは、ＨＦＤを摂取したＭＮＫ２−ＫＯマウスで顕著に増加したが、対応する対照動物では増加しなかった（図８Ａ）。肝Ｎｒｆ２タンパク質レベルも、ＭＮＫ２−ＫＯマウスにおいて増加を示したが、その変化は、有意に達しなかった。したがって、Ｎｒｆ２機能の増加を確認するために、よく特徴付けられたＮｒｆ２標的遺伝子であるハエムオキシゲナーゼ（ｈａｅｍ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）−１（ＨＯ−１）の発現も試験し、それは、Ｎｒｆ２自体のタンパク質発現と同様のパターンを示した（図８Ｂ）。興味深いことに、Ｎｒｆ２の活性化は、脂肪症を予防すると報告される。Ｎｒｆ２は、ＰＰＡＲαによって転写的に制御され得るが、しかしながら、ＨＦＤのＭＮＫ２−ＫＯまたはＷＴマウスの肝臓では、ＰＰＡＲαレベルの変化は観察されなかった（データ示さず）。
【００９５】
パルミテート誘発性のインスリン抵抗性の治療
インスリン抵抗性のＣ２Ｃ１２骨格筋モデルを使用して、パルミテート（レベル高脂肪食に血液中の増加遊離脂肪酸）処理がＰ−ｅＩＦ４Ｅを増加させることが観察され、したがって、パルミテートがＭＮＫ酵素を活性化することを示した。更なる実験を、１００ｍＭのインスリンで１０及び６０分間刺激する前に、４ｍＭのパルミテートで１６時間処理されたＣ２Ｃ１２細胞を用いて行った。細胞のいくつかを３μＭのＭＮＫ阻害剤、Ｍｎｋ−Ｉ１で更に処理した。結果（図９参照）は、阻害剤がＭＮＫ１及びＭＮＫ２を不活性化したことを示したが（処理された細胞におけるＰ−ｅＩＦ４Ｅのレベル低下を参照されたい）、インスリンシグナル伝達マーカー、Ｐ−ＰＫＢ３０８は、ＭＮＫ阻害剤がパルミテート暴露の間にインスリンシグナリングを回復させることができることを示した。
【００９６】
実施例２  ＭＮＫ１及びＭＮＫ２ダブルノックアウト動物の作製、及び高脂肪食（ＨＦＤ）を用いた研究
ＷＴ及びＭＮＫ−ＫＯマウスにおける研究
本実施例に記載される研究は、５〜６世代にわたるストックＣ５７Ｂｌ／６マウスに対して戻し交配した、実施例１に記載されているようなマウスを用いて行った。次いで、ヘテロ接合ＭＮＫ１−ＫＯ（Ｍｋｎｋ１＋／−）及びＭＮＫ２−ＫＯ（Ｍｋｎｋ２＋／−）マウスを交配して、ＷＴ及びＭＮＫ１＋ＭＮＫ２ダブルＫＯ（Ｍｋｎｋ１−／−；Ｍｋｎｋ２−／−；ＤＫＯ）動物、ならびにＭＮＫ１−ＫＯ（Ｍｋｎｋ１−／−）及びＭＮＫ−ＫＯ（Ｍｋｎ２−／−）動物を得た。ＭＮＫ１及びＭＮＫ２のノックアウトは、マウスの発達、生存能力、または生殖能に影響を及ぼさず（Ｕｅｄａら、２００４）、これと一致することが既に報告されており、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２のノックアウトの有害作用は、飼料食または高脂肪食を摂取したマウスにおいて観察されなかった。飼料食及びＨＦＤは、実施例１に記載したものと同様であった。この場合、飼料食製剤は、Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  １８％Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（Ｅｎｖｉｇｏ、米国、ウィスコンシン州、マジソン）であり、ＨＦＤ製剤は、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｆｅｅｄｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ（Ｄｉｅｔ  ＳＦ１５−０９５；豪州、西オーストラリア州、グレンフォレスト）から調達した。
【００９７】
ＨＦＤでの体重増加
飼料食では、ＷＴ及びＤＫＯマウスは、研究の１６週間の期間にわたって同様の程度まで体重を増加させたが（データは示されていない）、４週齢では、ＭＮＫ１−ＫＯは、ＭＮＫ２−ＫＯまたはＷＴマウスよりもわずかに重かった（データ示さず）。ＧＴＴは、１５〜１６週目に行われたため、その時点以降に得られたデータは、マウスが直面した騒乱のために完全に信頼できるものではない。
【００９８】
カロリー過負荷に対する動物の応答を試験するために、マウスは、離乳時（すなわち、４週齢から）から更に１６週間（２０週齢まで）、飼料食（対照群）または高エネルギー高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられた。ＨＦＤでは、ＷＴマウスは、大幅により多く体重が増加した（ＨＦＤで、１１週間または１５週間で２５または２８ｇ）。重要なことに、かつ実施例１に記載された観察と一致して、ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＨＦＤにおいてＷＴ対照群よりも実質的により少なく体重が増加し（図１０）、ＭＮＫ２の喪失がＨＦＤでの体重増加に対して保護することを確認した。しかしながら、実施例１に記載された結果とは対照的に、この場合のＭＮＫ１−ＫＯマウスは、実際に、ＷＴ対照群と同様に体重が増加し（図１０）、この差異の理由は、これらの動物が以前に使用された動物と遺伝的に同一でないという事実、使用されたＨＦＤの相違、または他の要因にあるかもしれない。ＤＫＯマウスでは、動物が１５週までにＭＮＫ２−ＫＯマウスよりもわずかに大きな体重増加を示したことが見出されたが、その増加は、ＷＴまたはＭＮＫ１−ＫＯ動物に関して見られるものよりもまだ少ない（図１０）。これは、両方のＭＮＫのノックアウトが、部分的な保護を提供する各ＭＮＫアイソフォーム単独のＫＯよりも、体重増加に対するより大きな保護を提供すると推測されたため、予想外であった。したがって、データは、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２を無効にすることが、ＭＮＫ２単独の損失よりも大きな利益をもたらさず、実際に、体重増加を防止することに関して、それほど有利でない可能性があることを示す。
【００９９】
ＧＴＴデータ
グルコース負荷試験を実施例１に記載したように行って、ＨＦＤ摂食動物がグルコース不耐性（この設定では一般にインスリン抵抗性によって引き起こされる）を発症したかどうかを評価した。飼料食またはＨＦＤのいずれかで１１週間後、６時間の絶食後にグルコース負荷試験（ＧＴＴ）を行った。空腹時グルコース濃度を、マウスに２５％Ｄ−グルコース溶液（２ｇ／ｋｇ体重；Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ、豪州）を腹腔内（ｉｐ）注射する前に、尾の先端から血液した出血から測定し、血中グルコース濃度をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｌｉｔｅグルコメーター（Ａｂｂｏｔｔ、豪州、ニューサウスウェールズ州、マッコリ―パーク）を使用して腹腔内注射後１５、３０、６０、及び１２０分に測定した。ＨＦＤを摂取したマウスは、グルコース耐性障害を示す。実施例１に記載の研究が、ＨＦＤ摂取ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯマウスが、対応するＷＴ動物よりも良好なグルコース耐性を示すということを示したことを前提として、ＭＮＫ１＋２−ＤＫＯマウスは、更に良好なグルコース耐性を示すであろうと予測された。しかしながら、図１１に示すように、これは、事実ではない。実際に、ＭＮＫ１−ＫＯマウスは、ＷＴ−ＨＦＤマウスより良好なグルコース耐性を示さないことが見出された。更に、グルコースのボーラス投与後、ＨＦＤ摂取ＭＮＫ−ＤＫＯマウスにおいて、血漿グルコース値は、これらの遺伝子型のいずれの飼料食摂取マウスの状況と同様に、１２０分までにほぼベースラインまで戻った。したがって、ＭＮＫ２−ＫＯマウス（実施例１参照）と同様に、ＤＫＯ動物は、これらのデータの曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって見られるように（データ示さず）、ＨＦＤを摂取したＷＴマウスより良好なグルコース耐性を示す。ＡＵＣの評価はまた、ＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤマウスが、実際に、ＷＴ／ＨＦＤ動物より劣り、ＭＮＫ−ＤＫＯ／ＨＦＤマウスよりはるかに劣るグルコース耐性を示し、グルコース濃度がＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤマウスにおいて著しく高いままであったことを明らかにした（図１１）。
【０１００】
したがって、ＭＮＫ１の喪失は、ＨＦＤ誘発性グルコース不耐性に対して一貫して保護しないと思われる。これは、なぜＭＮＫ１及びＭＮＫ２の喪失が、ＨＦＤ摂取マウスのＧＴＴにおけるそれらの能力に関して、ＭＮＫ２単独の喪失よりも更なる利益を与えないのかを説明するのに役立つかもしれない。
【０１０１】
まとめると、この実施例で提供されたデータは、ＭＮＫ２をノックアウトすることが、ＨＦＤでのグルコース耐性の改善（代謝の健康）に関して、一貫して有益であることを示す。対照的に、ＭＮＫ１の喪失の効果は、おそらく、正確な遺伝的背景及び／または食餌の正確な成分よって変化すると思われる。更に、両方のＭＮＫのノックアウトは、ＭＮＫ２単独の損失より優れた効果を提供しない。したがって、本開示に従って前糖尿病を治療する方法において、両方の酵素に影響を与える二重阻害剤ではなく、ＭＮＫ２の特異的阻害剤を使用する方が、はるかに信頼性が高く、有効であろう。
【０１０２】
実施例３  ３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるｅＩＦ４Ｅリン酸化に対するＭＮＫ２特異的阻害の効果
３Ｔ３−Ｌ１細胞における研究
実施例１で説明されたように、正常飼料食でのＭＮＫ２−ＫＯマウスは、同量の性腺脂肪組織の同じ量を含有するが、そのような組織は、より少なく、より大きい脂肪細胞（脂肪細胞）を有することが見出された。これは、脂肪細胞の産出（すなわち、脂肪細胞の分化）における欠陥を示唆する。ＨＦＤでは、脂肪細胞は、通常、より大きくなり、動物がより多くの脂肪を貯蔵し、より重くなることを可能にする。しかしながら、ＭＮＫ２−ＫＯマウスでは、脂肪細胞は、ＨＦＤで大きくならず、なぜこれらのマウスがＷＴ／ＨＦＤマウスほど重くならないのかを説明する可能性が高い。理論に縛られることを望まないが、この更なるサイズ増加の欠如は、（ｉ）ＭＮＫ２−ＫＯマウスにおけるより大きな脂肪細胞が貯蔵容量に達し、それらの脂肪含有量を増加させることができないという事実、及び／または（ｉｉ）そのような細胞の、脂肪を貯蔵する本来の能力が損なわれるということ、を反映し得る。
【０１０３】
脂肪細胞分化におけるＭＮＫ２の役割を研究するために、３Ｔ３−Ｌ１細胞を実施例１に記載したのと同様の方法で使用した。３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞は、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ、５００μＭ；ｃＡＭＰを上昇させる）、インスリン（３５０ｎＭ）、デキサメタゾン（０．５μＭ；ステロイド）、及びロシグリタゾン（２μＭ；転写因子ＰＰＡＲγを刺激する）の組み合わせでインキュベートされた時、脂肪細胞に分化する。この刺激の「カクテル」に応答して、これらの細胞は、まずクローン増殖を受け、続いて、転写因子のカスケードの誘導が後続し、脂肪生成に関与する遺伝子の発現を引き起こす。
2019510061.tif 000015
【０１０４】
結果（図１２に示される）は、Ｍｎｋ２  ｍＲＮＡが分化カクテルの添加後に非常に急速に誘導される（＞３倍×３時間、Ｍｎｋ２  ｍＲＮＡ発現が低下してから約６時間まで持続する）ことを明らかにし、それを脂肪生成において役割を果たすように位置付けた。実施例１では、ＭＮＫ阻害剤、ＣＧＰ５７３８０が、Ｃ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγ、及びＳＲＥＢＰ１ｃ（脂質貯蔵に関与する遺伝子の発現を促進する）などの重要な転写因子の誘導を損なうことが示された。また、ＣＧＰ５７３８０がグルコース、ならびに脂質トランスポーターＧＬＵＴ４及びＣＤ３６の発現を阻害することも見出され、なぜ脂肪貯蔵がインビボでＭＮＫ２−ＫＯ脂肪細胞において制限されるのかを少なくとも部分的に説明することができる。ここでは、ＭＮＫも阻害する別の、別の全く異なる化合物、すなわち、セルコスポラミドを試験するための研究を行った。図１３に示すように、セルコスポラミドは、ＰＰＡＲγなどの遺伝子の誘導（図１３Ａ）及び脂質蓄積の減少（図１３Ｂ）も損なう。
【０１０５】
しかしながら、ＣＧＰ５７３８０及びセルコスポラミドは、ＭＮＫに加えて他のタンパク質キナーゼを阻害し、非常に強力なＭＮＫ阻害剤ではなく（Ｂａｉｎら、２００７；Ｋｏｎｉｃｅｋら、２０１１）、例えば、Ｐ−ｅＩＦ４Ｅを強く阻害するためには≧２０μＭの濃度で使用されなければならない。その結果、更なる阻害化合物、ＭＮＫ−Ｉ１（Ｂｅｇｇｓら、２０１５）が研究された。ＭＮＫ−Ｉ１は、ＣＧＰ５７３８０及びセルコスポラミドとは構造的に異なり、はるかにより特異的であり、ＣＧＰ５７３８０によって影響を受け追加のキナーゼを阻害しない（Ｂｅｇｇｓら、２０１５）。それはまた、はるかにより強力であり、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＭＮＫ活性を、はるかに低い濃度（３μＭ；図１４Ａ、１４Ｂ参照；ＣＧＰ５７３８０と比較して、同程度のｐ−ｅＩＦ４Ｅの阻害を見るために５０μＭが必要とされた（図３ｃ参照））で強く阻害する。重要なことに、細胞が、分化を受けるために細胞を少なくとも３日間インキュベートされなければならないことを前提として、ＭＮＫ−Ｉ１のＰ−ｅＩＦ４Ｅに対する効果は、少なくともこの期間持続する。
【０１０６】
ＭＮＫ−Ｉ１は、転写因子Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、及びＰｐａｒγ、ならびに脂肪酸シンターゼ及びアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（Ｆａｓ及びＡｃｃ；脂質生成の重要な酵素）、ならびに脂質輸送体Ｃｄ３６を含む、研究された脂肪生成遺伝子の全ての誘導を損なうことが見出された（図１５Ａ参照）。それはまた、オイルレッドＯ染色（データ示さず）または直接トリグリセリドアッセイ（図１５Ｂ）によって判断されるように、脂質蓄積を遮断した。ＭＮＫ−Ｉ１の効果が完全ではない（すなわち、総阻害ではない）という事実は、脂肪細胞数がＭＮＫ２−ＫＯマウスにおいて減少したが、完全になくならないという観察と一致する。これはまた、ＭＮＫ−２  ＫＯマウスは、対照食餌において同様の総脂肪量を示すが、ＨＦＤを摂取した場合、それらの脂肪増加が大きく減少するという重要な知見と一致する。これは、患者の体重増加が減少または逆転することを意味するため、重要な臨床的意味を有するが、これは、脂肪組織の極度の喪失につながらない。
【０１０７】
更なる研究において、ＭＮＫ−Ｉ１と同様の一連の化合物を生成し、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＭＮＫを阻害するそれらの能力について試験した。化合物の構造を以下の表６に示す。ｅＩＦ４Ｅは、ＭＮＫのみによってリン酸化されるため、そのリン酸化状態は、細胞内ＭＮＫ活性の信頼できる読み出しである。新しい化合物のいくつかは、これらの細胞におけるｅＩＦ４Ｅリン酸化を阻害し、それらがＭＮＫに対して活性であることを示した（表６）。特に、ＭＮＫ−Ｉ２は、３Ｔ３−Ｌ１細胞においてＰ−ｅＩＦ４Ｅを強く阻害し（図１４Ａ参照）、それが強力なＭＮＫ阻害剤であることを示す。更に、ＭＮＫ１対ＭＮＫ２に対するＭＮＫ−Ｉ１及びＭＮＫ−Ｉ２の相対的効果を評価するために、ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯ動物からのマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用した。ＭＮＫ１−ＫＯ  ＭＥＦにおいて、ＭＮＫ−Ｉ２は、試験した全ての濃度でＰ−ｅＩＦ４Ｅレベルをほとんど完全に阻害した（最低０．１μＭ）。これは、ＭＮＫ−Ｉ１の効果と同様である（図１６Ａ）。対照的に、ｅＩＦ４Ｅリン酸化がＭＮＫ１に依存するＭＮＫ２−ＫＯ細胞では、ＭＮＫ−Ｉ２は、ＭＮＫ−Ｉ１よりも弱い阻害効果を有し、それがＭＮＫ−Ｉ１よりもＭＮＫ１に対する低い活性を有することを示す（図１６Ｂ）。したがって、これらの結果は、ＭＮＫ１よりもＭＮＫ２に対するＭＮＫ−Ｉ２阻害剤の選択性を示す。ＭＮＫ２は、３Ｔ３−Ｌ１細胞及び脂肪組織における主要なＭＮＫである（Ｍｏｏｒｅら、２０１６）。
【０１０８】
追加の研究では、３Ｔ３−Ｌ１細胞における分化マーカーの誘導に対するＭＮＫ−Ｉ２阻害剤の効果を評価するために試験を行った。ＭＮＫ−Ｉ２が、研究された脂肪生成プログラムにおける遺伝子の全ての誘導を損なうことが見出された（図１７Ａ）。ＭＮＫ−Ｉ２の効果の大きさは、ＭＮＫ−Ｉ１のそれと同様であるか、場合によっては、より大きかった（図１５Ａと１７Ａとを比較）。これらの結果は、それらが、ＭＮＫ２選択的阻害剤、例えば、ＭＮＫ１＋ＭＮＫ２阻害剤ＣＧＰ５７３８０及びＭＮＫ−Ｉ１もまた、脂肪生成を損なうことを示し、ＭＮＫ２が脂肪組織における重要なＭＮＫ２アイソフォームであるという結論を支持するという点において重要である。
【０１０９】
したがって、ＫＯマウス試験から得られたデータ（実施例２参照）及び３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いてインビトロで実施された実験に基づいて（実施例３参照）、ＭＮＫ−２選択的阻害剤は、かなり有望であり、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の阻害剤よりも、前糖尿病対象の治療において有益である可能性が高い。
【０１１０】
【表６】
2019510061.tif 000016
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【０１１１】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という語及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、任意の他の整数または整数の群の除外ではなく、記載された整数または整数の群の包括を暗示すると理解されるであろう。
【０１１２】
本明細書にある任意の先行技術への言及は、そのような先行技術が共通の一般知識の一部を形成するといういかなる形態の示唆の認知ではなく、そのように取られるべきではない。
【０１１３】
本発明は、その使用において、記載された特定の用途に限定されないということは、当業者によって理解されるであろう。また、本発明は、本明細書に記載もしくは図示される特定の要素及び／または特徴に関して、その好ましい実施形態において限定されない。本発明は、開示された１つまたは複数の実施形態に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲によって記載され、定義された本発明の範囲から逸脱することなく多数の再構成、修正、及び置換が可能であることが理解されるであろう。
参考文献
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Ｗｏｒｃｈ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３（５７）：９１６２−９１７２（２００４）．
【図１Ａ】
2019510061.tif 000020
【図１Ｂ】
2019510061.tif 000021
【図１Ｃ】
2019510061.tif 000022
【図１Ｄ】
2019510061.tif 000023
【図１Ｅ】
2019510061.tif 000024
【図２Ａ】
2019510061.tif 000025
【図２Ｂ】
2019510061.tif 000026
【図２Ｃ】
2019510061.tif 000027
【図２Ｄ】
2019510061.tif 000028
【図２Ｅ】
2019510061.tif 000029
【図２Ｆ】
2019510061.tif 000030
【図３Ａ】
2019510061.tif 000031
【図３Ｂ】
2019510061.tif 000032
【図３Ｃ（ｉ）】
2019510061.tif 000033
【図３Ｃ（ｉｉ）】
2019510061.tif 000034
【図３Ｄ（ｉ）】
2019510061.tif 000035
【図３Ｄ（ｉｉ）】
2019510061.tif 000036
【図３Ｄ（ｉｉｉ）】
2019510061.tif 000037
【図３Ｅ】
2019510061.tif 000038
【図４Ａ】
2019510061.tif 000039
【図４Ｂ】
2019510061.tif 000040
【図４Ｃ】
2019510061.tif 000041
【図５Ａ】
2019510061.tif 000042
【図５Ｂ】
2019510061.tif 000043
【図５Ｃ】
2019510061.tif 000044
【図５Ｄ（ｉ）】
2019510061.tif 000045
【図５Ｄ（ｉｉ）】
2019510061.tif 000046
【図５Ｅ】
2019510061.tif 000047
【図５Ｆ】
2019510061.tif 000048
【図６Ａ】
2019510061.tif 000049
【図６Ｂ】
2019510061.tif 000050
【図６Ｃ】
2019510061.tif 000051
【図６Ｄ】
2019510061.tif 000052
【図６Ｅ】
2019510061.tif 000053
【図７Ａ】
2019510061.tif 000054
【図７Ｂ】
2019510061.tif 000055
【図７Ｃ】
2019510061.tif 000056
【図７Ｄ】
2019510061.tif 000057
【図７Ｅ】
2019510061.tif 000058
【図７Ｆ】
2019510061.tif 000059
【図８Ａ】
2019510061.tif 000060
【図８Ｂ】
2019510061.tif 000061
【図８Ｃ】
2019510061.tif 000062
【図８Ｄ】
2019510061.tif 000063
【図８Ｅ】
2019510061.tif 000064
【図８Ｆ】
2019510061.tif 000065
【図９】
2019510061.tif 000066
【図１０】
2019510061.tif 000067
【図１１】
2019510061.tif 000068
【図１２】
2019510061.tif 000069
【図１３Ａ】
2019510061.tif 000070
【図１３Ｂ】
2019510061.tif 000071
【図１４Ａ】
2019510061.tif 000072
【図１４Ｂ】
2019510061.tif 000073
【図１４Ｃ】
2019510061.tif 000074
【図１５Ａ】
2019510061.tif 000075
【図１５Ｂ】
2019510061.tif 000076
【図１６Ａ】
2019510061.tif 000077
【図１６Ｂ】
2019510061.tif 000078
【図１７Ａ】
2019510061.tif 000079
【図１７Ｂ】
2019510061.tif 000080
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月26日(2018.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
空腹時グルコース障害の前糖尿病の２型糖尿病への進行を予防及び／または遅延させるために前記前糖尿病を有する対象を治療する方法であって、前記対象が、５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とし、前記方法が、治療上有効な量の少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ（ＭＮＫ）阻害剤を前記対象に投与することを含み、前記ＭＮＫ阻害剤は、ＭＮＫ２、及び任意に、ＭＮＫ１の生物活性を低下させる、方法。
【請求項２】
前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ２の生物活性を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＮＫ阻害剤が、ＭＮＫ２に対する選択性を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ１の生物活性を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の生物活性を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＮＫ阻害剤が、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体もしくはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、またはアプタマーから成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＮＫ阻害剤が、ＡＴＰ競合剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＮＫ阻害剤が、Ｎ３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−［３，４−ｄ］ピリミジン−３，４−ジアミン、（９ａＳ）−８−アセチル−９，９ａ−ジヒドロ−１，３，７−トリヒドロキシ−９ａ−メチル−９−オキソ−４−ジベンゾフランカボキサミド（ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｃａｂｏｘａｍｉｄｅ）、４−［５−（４−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］ピリジンジヒロドクロリド、４−（２−（２−フルオロプロポキシ）−４−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−５−メチルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド、及び４−（２−イソプロポキシ）−４−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）−５−メチルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＮＫ阻害剤が、薬学的または獣医学的に許容される充填剤、担体、希釈剤、及び／または賦形剤と任意に組み合わせて薬学的組成物として製剤化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記空腹時グルコース障害（ＩＦＧ）の段階にある前糖尿病の前記グルコース耐性障害（ＩＧＴ）の段階への進行を予防する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、６．１ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
空腹時グルコース障害の前糖尿病の２型糖尿病への進行を予防及び／または遅延させるために前記前糖尿病を有する対象を治療するための、治療上有効な量の少なくとも１つのＭＮＫ阻害剤の使用であって、前記対象が、５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とし、前記ＭＮＫ阻害剤が、ＭＮＫ２、及び任意に、ＭＮＫ１の生物活性を低下させる、使用。
【請求項１３】
空腹時グルコース障害の前糖尿病の２型糖尿病への進行を予防及び／または遅延させるために前記前糖尿病を有する対象を治療するための医薬品の製造における、ＭＮＫ２、及び任意に、ＭＮＫ１の生物活性を低下させる少なくとも１つのＭＮＫ阻害剤の使用であって、前記対象が、５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする、使用。
【請求項１４】
前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ２の生物活性を低下させる、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＭＮＫ阻害剤が、ＭＮＫ２に対する選択性を示す、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ１の生物活性を低下させる、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＭＮＫ阻害剤が、前記ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の生物活性を低下させる、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＭＮＫ阻害剤が、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体もしくはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、またはアプタマーから成る群から選択される、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＭＮＫ阻害剤が、ＡＴＰ競合剤である、請求項１２〜1８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＭＮＫ阻害剤が、Ｎ３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−［３，４−ｄ］ピリミジン−３，４−ジアミン、（９ａＳ）−８−アセチル−９，９ａ−ジヒドロ−１，３，７−トリヒドロキシ−９ａ−メチル−９−オキソ−４−ジベンゾフランカボキサミド（ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｃａｂｏｘａｍｉｄｅ）、４−［５−（４−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］ピリジンジヒロドクロリド、４−（２−（２−フルオロプロポキシ）−４−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−５−メチルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド、及び４−（２−イソプロポキシ）−４−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）−５−メチルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドから選択される、請求項１２〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＭＮＫ阻害剤が、薬学的または獣医学的に許容される充填剤、担体、希釈剤、及び／または賦形剤と任意に組み合わせて薬学的組成物として製剤化される、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記方法が、前記空腹時グルコース障害（ＩＦＧ）の段階にある前糖尿病の前記グルコース耐性障害（ＩＧＴ）の段階への進行を予防する、請求項１２〜２1のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
前記対象が、６．１ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を特徴とする、請求項１２〜２1のいずれか１項に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、高脂肪食の作用、特に前糖尿病を阻害することに関する。特定の形態において、本開示は、ＭＡＰキナーゼ相互作用キナーゼの発現または機能を阻害することに関する。
【０００２】
優先権書類
本出願は、２０１６年３月３１日出願の「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」と題される豪州仮特許出願第２０１６／９０１１９２号の優先権を主張するものであり、この内容は、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
食物、特に飽和脂肪の過剰消費の結果、主要かつ急速に増加する健康問題が世界的に生じ、肥満、ならびに脂肪組織炎症、インスリン抵抗性、及び２型糖尿病などの関連疾患を引き起こす。西欧諸国の成人４人に１人近くが、糖尿病または前糖尿病のいずれかであり、肥満の有病率の増加のため、発生率が上昇している。前糖尿病は、異常に高いが、その人が糖尿病であると診断するのに十分な高さではない血中グルコース値に関連する疾患である。前糖尿病患者は、しばしば肥満であり、この疾患は、概して、高脂肪食などの不健康な食事と関連している。したがって、前糖尿病の管理には、低脂肪食を介した減量の勧告が頻繁に関与する。しかしながら、前糖尿病の多くの患者は、彼らの疾患を治療するための推奨された減量を達成及び維持するために必要な生活習慣の変化を遵守したくない、もしくはできない、または代替として、既存の療法が失敗した可能性がある。したがって、前糖尿病の代替治療及び／または管理の必要性が存在する。
【０００４】
マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ相互作用キナーゼ（ＭＮＫ）は、ＭＡＰＫシグナル伝達の下流エフェクターであるセリン／スレオニンキナーゼ群であり、発癌の形質転換及び進行に関与している。ネズミＭＮＫ１及びＭＮＫ２は、それぞれ、Ｍｋｎｋ１及びＭｋｎｋ２遺伝子によってコードされる。対応するタンパク質（ＭＮＫ１及びＭＮＫ２）は、ＭＡＰキナーゼ（例えば、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ））と、特にＭＮＫ１の場合は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼと相互作用する。ＭＮＫタンパク質は、ＭＡＰキナーゼによりリン酸化され、ＭＮＫ活性の刺激を引き起こす（Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚら、１９９７）。ＭＮＫタンパク質の最もよく知られた基質は、いくつかの更なる基質が記載されているが（Ｂｕｘａｄｅら、２００８に掲載される）、タンパク質合成機構の重要な成分である真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）である（Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚら、１９９７；Ｓｃｈｅｐｅｒら、２００１）。ＭＮＫがｅＩＦ４Ｅに作用する唯一のキナーゼであるため、ＭＮＫタンパク質の生物活性は、リン酸化されたｅＩＦ４Ｅ（Ｐ−ｅＩＦ４Ｅ）のレベルを測定することによって測定され得る。
【０００５】
それらの一次配列に関して非常に類似しているが、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２は、多数の重要な点で異なる。例えば、ネズミＭＮＫ１（ヒトＭＮＫ１ａに相当）は、主に細胞質であるが、ネズミＭＮＫ２（ヒトＭＮＫ２ａと類似）は、核及び細胞質で見られる。ＭＮＫ１は、ＥＲＫまたはｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路の刺激後に強く活性化されるが（Ｓｃｈｅｐｅｒら、２００１；Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚら、（１９９９）；Ｗａｎｇら、１９９９）、ＭＮＫ２は、これらの経路によってわずかに更に刺激されるのみである高い定常活性を示す。ＭＮＫ１及びＭＮＫ２  ｍＲＮＡは、肝臓、骨格筋、及び心臓で発現することが知られているが、しかしながら、異なるマウス組織におけるＭＮＫ１及びＭＮＫ２の発現パターンは、異なり、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２が違う役割を果たすことを示唆する。ノックアウトマウスにおけるＭＫＮＫ１及びＭＫＮＫ２遺伝子の一方または両方の破壊は、有害作用の報告がなく、ダブルＭＮＫ１／２ノックアウトマウスは、生存可能、かつ繁殖可能であり、異常は報告されなかった（Ｕｅｄａら、２００４）。
【０００６】
本発明者らは、ＭＮＫ活性が、肥満、脂肪生成及び脂質生成、ならびに関連疾患、例えば、脂肪組織炎症、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、前糖尿病、及び２型糖尿病を含む高脂肪食の作用と関連し得ることを認識した。本明細書に記載されるように、ＭＮＫ発現または生物活性を阻害することは、高脂肪食の作用を阻害し、前糖尿病などの高脂肪食関連疾患を治療及び／または管理することに対する新しい手段を提供し得る。
【発明の概要】
【０００７】
本開示の第１の態様によると、前糖尿病の２型糖尿病への進行を予防及び／または遅延させるために空腹時グルコース障害の前糖尿病を有する対象を治療する方法が提供され、該対象は、５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とし、該方法は治療上有効な量の少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ（ＭＮＫ）阻害剤を対象に投与することを含み、該ＭＮＫ阻害剤は、ＭＮＫ２、及び任意に、ＭＮＫ１の生物活性を低下させる。
【０００８】
一実施形態において、ＭＮＫ阻害剤は、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体またはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、またはアプタマーである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＭＫＮＫ１及びＭＫＮＫ２  ｍＲＮＡ発現の分析を提供し、（Ａ）肝臓及び性腺脂肪組織（ｎ＝８）におけるｑＰＣＲによって決定されたＭＫＮＫ１（ＭＮＫ１）及びＭＫＮＫ２（ＭＮＫ２）の相対的発現、データは平均±ＳＥＭ（各組織についてＭＮＫ１とＭＮＫ２を比較した、両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）、（Ｂ）４つの独立した実験を代表する、肝臓、脂肪組織、心臓、及び骨格筋におけるＭＮＫ１タンパク質レベルの免疫ブロット分析、（Ｃ）分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞（ｎ＝３）におけるＰｐａｒγ、Ｃｅｂｐα、Ｓｒｅｂｐ１ｃ、Ｇｌｕｔ４、及びＣｄ３６の（Ｃ）ｍＲＮＡ発現、データは平均±ＳＥＭ、（Ｄ）分化３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（ｎ＝３）におけるＭｋｎｋ１（ＭＮＫ１）ｍＲＮＡ及びＭｋｎｋ２（ＭＮＫ２）ｍＲＮＡ発現、データは平均±ＳＥＭ（テューキーのポスト検定による一元配置分散分析）＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、（Ｅ）脂肪細胞分化の３Ｔ３−Ｌ１モデルにおけるＭｋｎｋ１、Ｍｋｎｋ２、及びＣｅｂｐβ  ｍＲＮＡ発現の経時的発現（分化カクテルの添加後）を示すグラフ結果、を伴う。
【図２】ＭＮＫ１ノックアウト（ＫＯ）及びＭＮＫ２  ＫＯマウスの高脂肪食に対する応答を提供し、（Ａ）飼料または高脂肪食（ＨＦＤ）のいずれかでの２０週間後の野生型（ＷＴ）、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯの体重、（ｎ＝６〜９）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、（Ｂ）体重のパーセンテージとして表される性腺脂肪組織重量（ｎ＝６〜９）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、（Ｃ）２０週間のＨＦＤ後のＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからの性腺脂肪沈着を示す代表的な画像、（Ｄ）飼料食またはＨＦＤのいずれかでの２０週間後のＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯの空腹時血糖、ｎ＝６〜９、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、（Ｅ）飼料食またはＨＦＤのいずれかでの２０週間後のＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯの空腹時血漿インスリン（ｎ＝３〜５）、を伴う。データは平均±ＳＥＭ、（Ｆ）インスリン抵抗性の「読み出し」としてのインスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）の恒常性モデル評価。
【図３】脂肪細胞に対するＭＮＫをノックアウトまたは阻害する効果を提供し、（Ａ）画像Ｊソフトウェアによって分析され、定量化されたＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスにおける脂肪細胞の平均サイズ（ＷＴ飼料、ｎ＝３、ＷＴ  ＨＦＤ  ｎ＝３、ＭＮＫ２−ＫＯ飼料食  ｎ＝３、ＭＮＫ２−ＫＯ  ＨＦＤ  ｎ＝３）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）、＊＊Ｐ＜０．０１、（Ｂ）次の条件に関する２つの視野における脂肪細胞の平均数（ＷＴ飼料食  ｎ＝３、ＷＴ  ＨＦＤ  ｎ＝３、ＭＮＫ２−ＫＯ飼料食  ｎ＝３、ＭＮＫ２−ＫＯ  ＨＦＤ  ｎ＝３）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）、＊Ｐ＜０．０５、（Ｃ）（ｉ）３回の独立した実験を代表する、指示された濃度のＣＧＰ５７３８０で７２時間処理した未分化３Ｔ３−Ｌ１細胞の溶解物の免疫ブロット分析、（ｉｉ）（ｉ）に示されたデータの定量化、データは平均±ＳＥＭ（テューキーのポスト検定による一元配置分散分析）＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、（Ｄ）２０μのＭＣＧＰ５７３８０の非存在下または存在下で９日間分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞のオイルレッドＯ染色、代表的な顕微鏡視野が示されている、（ｎ＝３）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）、（Ｅ）２０μＭのＣＧＰ５７３８０の存在下または非存在下で分化プロトコルに供された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＰｐａｒγ、Ｃｂｐα、Ｓｒｅｂｐ１ｃ、Ｇｌｕｔ４、及びＣｄ３６のｍＲＮＡ発現（ｎ＝３）、データは平均±ＳＥＭ（テューキーのポスト検定による一元配置分散分析）、を伴う。
【図４】ＨＦＤ摂取ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯマウスの代謝研究のグラフ結果を提供し、（Ａ）飼料食またはＨＦＤのいずれかでの１５週間後のグルコース負荷試験（ｎ＝６〜２１）、データは平均±ＳＥＭ、（Ｂ）濃度曲線下面積計算（ＡＵＣ）（ｎ＝６〜２１）、データは平均±ＳＥＭ（テューキーのポスト検定による二元配置分散分析）、（Ｃ）飼料食またはＨＦＤマウスのいずれかでの２０週間後のインスリン抵抗性試験（ｎ＝３〜４）、データは平均±ＳＥＭ両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、を伴う。
【図５】飼料食摂取またはＨＦＤ摂取ＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯマウスの組織の総タンパク質溶解物の免疫ブロット分析を提供し、（Ａ）３つの独立した実験を代表する、性腺脂肪組織におけるＰ−ｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ４Ｅレベルの分析、（Ｂ）インスリン抵抗性試験後の性腺脂肪組織におけるＰＫＢ、リン酸化ＰＫＢ、及びアクチンのレベルの分析、（ｎ＝３）、（Ｃ）０．７５Ｕ／ｋｇのインスリンの腹腔内注射で処理され（示される場合）、３０分後に屠殺されたマウスの骨格筋におけるＰＫＢ、リン酸化ＰＫＢ、及びチューブリンのレベルの免疫ブロット分析であり、組織は、示される抗体を用いた免疫ブロット分析のために回収された分析、（Ｄ）アクチンに対して正規化されたＧＬＵＴ４として表される、個々の事例における３匹のマウスからの、上部パネル、ＧＬＵＴ４レベルの分析、下パネル、（Ｄ、上のパネル）のデータの定量化、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、（Ｅ）骨格筋におけるＰ−ｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ４Ｅレベルの分析（ｎ＝３）、（Ｆ）個々の事例における３匹のマウスからの骨格筋におけるＧＬＵＴ４タンパク質レベル（ｅＩＦ４Ｅに対して正規化された）のデータの定量化、を示す。
【図６】ＷＴ及びＭＮＫ−ＫＯマウスからの脂肪組織におけるマクロファージマーカーについて、飼料食摂取及びＨＦＤ摂取ＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからの性腺脂肪組織から単離された全ＲＮＡのｑＰＣＲ分析を提供し、（Ａ）一般的なマクロファージマーカーＣｄ６８、（Ｂ）一般的なマクロファージマーカーＦ４／８０、（Ｃ）Ｍ１極性化マクロファージマーカーＴｎｆα、（Ｄ）Ｍ１極性化マクロファージマーカーＣｄ１１ｃ、（Ｅ）Ｍ１極性化マクロファージマーカーＭｈｃＩＩ（ｎ＝３〜４）、に対するｍＲＮＡの相対発現を示し、データは、平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。
【図７】ＥＬＩＳＡによって測定された、飼料食摂取及びＨＦＤ摂取  ＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからの（Ａ）ＩＬ−５及び（Ｂ）ＩＬ−１０の血漿レベルの分析（ｎ＝６〜９）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、ならびにＭ２マーカーである（Ｃ）Ｉｌ−１０、（Ｄ）Ｃｄ２０６、（Ｅ）Ｐｐａｒγ、及び（Ｆ）Ｓｔａｔ６のｍＲＮＡ発現レベルについて、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）をＭ２表現型に分極させるためにＩＬ−４の存在下または非存在下で２４時間培養したＷＴまたはＭＮＫ２−ＫＯマウスから単離されたＢＭＤＭから単離された全ＲＮＡのｑＰＣＲ分析（ｎ＝６）を提供し、データは、平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）、＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【図８】（Ａ）Ｎｒｆ２及び（Ｂ）その下流標的ヘムオキシゲナーゼ１（Ｈｏ−１）に対するｍＲＮＡの相対発現について、飼料食摂取及びＨＦＤ摂取ＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスの肝組織から単離された全ＲＮＡのｑＰＣＲ分析（ｎ＝４）、データは平均±ＳＥＭ（両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、ならびにｄｅ  ｎｏｖａ脂質生成（Ｃ）Ｓｒｅｂｐ１ｃ、（Ｄ）Ｆａｓ、（Ｅ）Ａｃｃ１、及び（Ｆ）β−酸化（Ｃｐｔ１ａ）に関与する、飼料摂取及びＨＦＤ摂取ＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからの肝臓における遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析（ｎ＝４）を提供し、データは、平均±ＳＥＭ（両側、スーペリアスチューデントｔ検定）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。
【図９】１００ｎＭのインスリン（１０及び６０分間）、及び示される場合は３μＭのＭＮＫ阻害剤、ＭＮＫ−Ｉ１で刺激する前に４ｍＭの脂肪酸パルミテートで１６時間処理されたＣ２Ｃ１２骨格筋細胞からの溶解物の免疫ブロット分析を提供する。パルミテートは、パルミテートで前処理された細胞において、重要な調節部位、Ｔｈｒ３０８でのＰＫＢのリン酸化を増加させるインスリンの能力の障害によって示されるように、これらの細胞におけるインスリン抵抗性を誘導する。マーカーＰ−３０８−ＰＫＢのレベルは、ＭＮＫ阻害剤が細胞のパルミテートへの曝露後にインスリンシグナル伝達を回復できることを示した。
【図１０】カロリー過負荷（すなわち、エネルギーが豊富な高脂肪食（ＨＦＤ）を生後４週〜１５週に摂取させることによる）に対するＭＮＫ１−ＫＯ、ＭＮＫ２−ＫＯ、及びＭＮＫ１＋ＭＮＫ２ダブルＫＯ（ＤＫＯ）動物の応答を示すグラフ結果を提供し、ＨＦＤ摂取動物の体重増加から飼料食摂取動物の体重増加を差し引いたデータが示される。６〜１６／グループ。＊、ｐ＜０．０５両側、対応のないｔ検定。
【図１１】飼料食（ＣＤ）またはＨＦＤを摂取したＷＴマウスと比較して、ＭＮＫ１−ＫＯ及びＤＫＯマウスにおける、血漿グルコース濃度として示されるグルコース負荷試験（ＧＴＴ）の結果を提供する。
【図１２】示された時間の間、「分化カクテル」で処理された３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞における経時的なＭＮＫ２発現（０〜２４時間）を示す棒グラフを提供し、細胞は、溶解され、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析がＭｎＫ２  ｍＲＮＡの発現のために行われた。データは、未処理の細胞＝１に対して表わされる。
【図１３】３Ｔ３−Ｌ１細胞（セルコスポラミド（１０μＭ））を処理するためのＭＮＫ阻害剤、セルコスポラミド（ＣＳＰＭ）を用いて行われた研究のグラフ結果を提供する。（Ａ）試料は、示されたｍＲＮＡについてのＲＴ−ｑＰＣＲによって分析された。データは、３回の反復実験からのものであり、β２−ミクログロブリンｍＲＮＡに対して正規化される。（Ｂ）試料は、脂質蓄積に関して分析された。
【図１４】以下の結果を示す：（Ａ）示された濃度で１時間、ＭＮＫ阻害剤、ＭＮＫ−Ｉ１及びＭＮＫ−Ｉ２で処理された３Ｔ３−Ｌ１細胞、次いで、リン酸化及び全ｅＩＦ４Ｅについての免疫ブロットによって分析された試料。３回の反復実験で得られた同様のデータ、（Ｂ）ＭＮＫ−Ｉ１及びＭＮＫ−Ｉ２のデータの定量化。（Ｃ）示された濃度で示された回数をＭＮＫ−Ｉ１及びＭＮＫ−Ｉ２で処理された３Ｔ３−Ｌ１細胞、次いで、試料は、リン酸化及び全ｅＩＦ４Ｅについての免疫ブロットによって分析された。
【図１５】研究のグラフ結果を示し、（Ａ）３Ｔ３−Ｌ１細胞は、ＭＮＫ−Ｉ１の非存在下または存在下で示された回数、分化カクテルで処理された。試料は、示されたｍＲＮＡについてＲＴ−ｑＰＣＲによって分析された。データは、３回の反復実験からのものであり、β２−ミクログロブリンに対して正規化される。０日目のデータは、１に設定される。（Ｂ）（Ａ）と同様であるが、細胞は、９日間分化させ、次いで溶解し、脂質（トリグリセリド）蓄積について分析された。
【図１６】マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＭＮＫ１−ＫＯ（Ａ）またはＭＮＫ２−ＫＯ（Ｂ）に対して実行した研究の結果を提供する。ＭＥＦは、示した濃度で１時間、ＭＮＫ−Ｉ１またはＭＮＫＩ２で処理され、次いで、試料は、Ｐ−ｅＩＦ４Ｅ及び全ｅＩＦ４Ｅについて分析された。グラフは、３つの実験からの組み合わされたデータを示す。＊、ｐ＜０．０５対未処理対照群、＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１対未処理対照群。３０μのＭＣＧＰ５７３８０で処理した陽性細胞。
【図１７】研究のグラフ結果を示し、（Ａ）３Ｔ３−Ｌ１細胞は、ＭＮＫ−Ｉ２の非存在下または存在下で示された回数、分化カクテルで処理された。試料は、示されたｍＲＮＡについてＲＴ−ｑＰＣＲによって分析された。データは、３回の反復実験からのものであり、β２−ミクログロブリンｍＲＮＡに対して正規化される。０日目のレベル＝１。（Ｂ）（Ａ）と同様であるが、細胞は、９日間分化させ、次いで溶解し、トリグリセリドについて分析された。
【発明を実行するための形態】
【００１０】
本開示は、ＭＮＫ１またはＭＮＫ２がノックアウトされたマウス（それぞれ、ＭＮＫ１−ＫＯ及びＭＮＫ２−ＫＯ）を用いて、脂肪細胞分化の細胞モデルにおいて、正常飼料食（ＣＤ）または高脂肪食（ＨＦＤ）を消費したマウスにおけるＭＮＫ１及びＭＮＫ２の役割の調査を記載する。ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の発現の阻害、またはＭＮＫ阻害剤を用いたＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性の低下が、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、及び脂質生成を含む高脂肪食の作用を阻害し得ることが見出された。
【００１１】
本明細書で提供されるデータは、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２が、インスリンによる身体代謝の調節に関与する脂肪組織で発現されることを実証する。ＭＮＫ２  ｍＲＮＡが、脂肪細胞分化の細胞モデルにおいて急速に誘導され、脂肪生成中のこのタンパク質の関与が示される。注目すべきことに、ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＷＴ／ＨＦＤマウスで観察されるＨＦＤ誘発性脂肪増加に対して保護されていた。ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスの脂肪細胞のサイズは、それらの飼料食摂取対応物よりも大きくないことが観察された。しかしながら、比較において、ＷＴ／ＨＦＤマウスの脂肪細胞のサイズは、飼料食（ＷＴ／ＣＤ）のＷＴマウスと比べて著しく増加した。ＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤ及びＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスの両方は、インスリン抵抗性の指標に対して保護され、ＷＴ／ＨＦＤマウスと比較して、減少した循環グルコース及びインスリンのレベル、及び減少したＨＯＭＡ−ＩＲ（インスリン抵抗性の指標）、より良好なグルコース耐性、及びＰＫＢシグナル伝達経路（ＰＫＢリン酸化）の強い応答によって示される減少したインスリン抵抗性を有した。更に、ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスは、脂肪組織における炎症の低下を示した。これらの結果は、高脂肪食の有害作用の媒介におけるＭＮＫ１、特にＭＮＫ２の関与を確認する。
【００１２】
ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の両方の小分子阻害剤、ＣＧＰ５７３８０（すなわち、Ｎ３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−［３，４−ｄ］ピリミジン−３，４−ジアミン、または４−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニルアミノ）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン）の存在下で、脂肪細胞の細胞モデルにおける脂質の蓄積が顕著に阻害された。更に、ＣＧＰ５７３８０は、脂肪細胞の分化に必要な多くの遺伝子の発現を阻害し、脂肪生成及び脂質貯蔵におけるＭＮＫ１及びＭＮＫ２の重要な役割を示す。これらの結果は、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物学的機能の低下が脂肪生成及び脂質貯蔵を阻害することを実証する。更に、ＣＧＰ５７３８０の存在下で分化された細胞では、より少ないグリセロールが、ＣＧＰ５７３８０の非存在下で分化された細胞と比較して、脂肪分解アッセイにおいて放出され、ＣＧＰ５７３８０処理細胞におけるトリグリセリドの貯蔵の低下が確認された。
【００１３】
ＭＮＫ１及びＭＮＫ２は、ｅＩＦ４Ｅをリン酸化することが知られている唯一のキナーゼである。ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、両方の食餌条件下で、ＷＴマウスと比較して、Ｐ−ｅＩＦ４Ｅの実質的な低下を示したが、ＭＮＫ１−ＫＯマウスは、飼料食でＰ−ｅＩＦ４Ｅの変化を示さず、ＷＴ動物と比較して、ＨＦＤでＰ−ｅＩＦ４Ｅのわずかな減少を示すのみであった。これは、ＭＮＫ２が脂肪組織におけるより活性なＭＮＫアイソフォームであることを示す。
【００１４】
前糖尿病対象は、グルコース代謝障害を有する。２つの段階が認められる：（１）空腹時グルコース障害（ＩＦＧ）の前糖尿病、及び（２）グルコース耐性障害（ＩＧＴ）の前糖尿病。本質的に、ヒト対象における標準的な経口グルコース負荷試験（ＧＴＴ）は、４つの診断のうちの１つを決定する結果を提供する。グルコース代謝を診断するために使用されるＧＴＴ及び「カットオフ」グルコース値の正確なプロトコルは、国によって異なるが、一般的に用いられる一例は、空腹時血中グルコース値を測定し、次いで、グルコース溶液の測定された用量（通常、７５ｇのグルコース）が５分以内に経口摂取され、次いで、血中グルコース値が、通常２時間後に再度測定される。診断は、典型的に、表１に示すように行われる。しかしながら、表１に示される数値のいくつかの小さな変化が一般的に引用されている。本開示の目的のために、本方法は、５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌ（すなわち、１００ｍｇ／ｄｌ〜１２５ｍｇ／ｄｌ）の空腹時血漿グルコース値を有する前糖尿病対象に対して使用され得る。
【００１５】
【表１】
2019510061.tif 000081
【００１６】
多くの前糖尿病対象は、症状のいかなる顕著な変化も伴わずに、例えば、３年から１５年の間、糖尿病前の状態のままであるが、他の症例では、症状は、より迅速に悪化し、２型糖尿病に進行する。重要なことに、前糖尿病の診断は、最終的に２型糖尿病を発症する高リスク因子と考慮されるが、前糖尿病の２つの段階は、互いに、かつ２型糖尿病とは区別され、それは、空腹時グルコース障害の前糖尿病と診断された全ての対象が、グルコース耐性障害の前糖尿病または２型糖尿病障害に進行するわけではないからである。同様に、グルコース耐性障害の前糖尿病を有する全ての対象が、２型糖尿病に進行するわけではない。
【００１７】
本開示の方法は、前糖尿病から２型糖尿病への進行を予防及び／または遅延させ得る。
【００１８】
したがって、第１の態様では、本開示は、前糖尿病の２型糖尿病への進行を予防及び／または遅延させるために空腹時グルコース障害の前糖尿病を有する対象を治療する方法を提供し、該対象は５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とし、該方法は治療上有効な量の少なくとも１つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ（ＭＮＫ）阻害剤を対象に投与することを含み、該ＭＮＫ阻害剤は、ＭＮＫ２、及び任意に、ＭＮＫ１の生物活性を低下させる。
【００１９】
本開示の方法はまた、空腹時グルコース障害（ＩＦＧ）の段階にある前糖尿病のグルコース耐性障害（ＩＧＴ）の段階への進行を予防し得る。加えて、本方法はまた、肥満、体重増加、脂肪組織重量の増加、脂肪組織炎症の増加、循環グルコース及び／またはグルコース耐性の増加、循環インスリン及び／またはインスリン抵抗性の増加などの前糖尿病に関連する症状及び／または作用を回避または軽減し得る。
【００２０】
上記のように、前糖尿病対象は、しばしば体重過剰であり、この状態は一般に、高脂肪食などの不健康な食事と関連する。「高脂肪食」という用語は、本明細書では、通常の食事と比較して、典型的に、カロリーの高い割合（食事中の脂肪から得られる）を有する食餌を指すために使用される。食餌中の脂肪は、動物性であろうと植物性であろうと、一価不飽和性、多価不飽和性、飽和性などであろうと、全ての種類の食物脂肪を含み得る。したがって、高脂肪食は、通常の食事より高いカロリー含量を有する。一実施形態では、開示された方法に従って治療される前糖尿病対象は、総エネルギーの３０％以上が脂肪からである食事を含む高脂肪食を有する。別の実施形態では、開示された方法に従って治療される前糖尿病対象は、総エネルギーの３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％以上が脂肪からである食事を含む高脂肪食を有する。加えて、または代替として、開示された方法に従って治療される前糖尿病対象は、通常の食事より高い総エネルギー値を特徴とする高脂肪食を有する。例えば、中年成人に対する通常の食事に関して推奨されるエネルギー摂取量が表２に示される。
【００２１】
【表２】
2019510061.tif 000082
【００２２】
当業者は、推奨されるエネルギー摂取量値が通常の食事エネルギー摂取レベルを示すことを理解するであろう。しかしながら、これらの値は、年齢、性別、身長、活動レベルによって異なる。したがって、高脂肪食は、通常の食事とほぼ同じエネルギー摂取量を有するか、そうでなければ、通常の食事よりも高い総エネルギー摂取量、例えば、通常の食事と比較して１０〜３０％、２０〜４０％、３０〜５０％、または３０〜６０％高い総エネルギー摂取量を有する。したがって、開示された方法に従って治療された前糖尿病対象は、通常の食事のエネルギー摂取値より少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、または２００％高いエネルギー摂取値を伴う高脂肪食を有し得る。
【００２３】
ＨＦＤ摂取雄マウスは、高脂肪食の作用を研究するために広く使用され、受け入れられているモデルである（Ｐａｎｃｈａｌら、２０１１）。これらの動物は、脂肪組織の増加、脂肪組織の炎症、及びインスリン応答の欠陥（例えば、グルコース耐性障害）に関して、ヒトの肥満関連メタボリックシンドロームに関連する応答と同じ応答の多くを示す（Ｈａｒｉｒｉ及びＴｈｉｂａｕｌｔ、２０１０）。例として、マウスの高脂肪食は、７％ｋｃａｌの脂肪、１８％ｋｃａｌのタンパク質、７５％ｋｃａｌの炭水化物を含む標準飼料食と比較して、４５％ｋｃａｌの脂肪、２０％ｋｃａｌのタンパク質、３５％ｋｃａｌの炭水化物を含み得る。しかしながら、当業者は、マウスの高脂肪食は、脂肪からのエネルギーが３２％〜６０％の範囲にあり得ることを理解するであろう。
【００２４】
本明細書に開示されるように、ＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤ及びＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスの両方は、ＷＴ／ＨＦＤ動物と比較してより高いグルコース耐性を有した。本試験では、動物は、２ｇ／ｋｇのグルコースの腹腔内注射を受ける前に動物を一晩絶食させ、グルコース投与前及び投与後２時間までのいくつかの時点で血液中のグルコースが測定された。ＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤ及びＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスの両方は、測定された各時点でＷＴ／ＨＦＤ動物と比較してより低いグルコース値を有した。これは、同じ高脂肪食で、減少したＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を有することは、グルコース耐性を増加させることを証明し、したがって、ＭＮＫ生物活性を減少させることは、前糖尿病の治療または予防を援助するであろうと示すため、特に関連がある。したがって、実施形態では、ＭＮＫ阻害剤によって治療または予防される疾患は、前糖尿病である。
【００２５】
ヒトＭＮＫは、選択的スプライシングによる２つの遺伝子（遺伝子記号：ＭＫＮＫ１及びＭＫＮＫ２）に由来する４つのタンパク質の群を含む。ＭＮＫ１ａ／１ｂは、ＭＮＫ２ａ／２ｂと同様にそれらのＣ末端で異なる。いずれの場合も、ａ型は、ＭＡＰキナーゼ結合領域を欠くｂ型よりも長いＣ末端領域を有する。全ての型のＮ末端は、インポーチンα及び翻訳因子スカフォールドタンパク質真核生物開始因子４Ｇ（ｅＩＦ４Ｇ）に結合する多塩基性領域を含有する。ＭＮＫ１ａ／ｂ及びＭＮＫ２ａ／ｂの触媒ドメインは、３つの珍しい特徴を共有する：２つの短いインサート、及び他のキナーゼがＤＦＧを有するＤＦＤ特徴。ＭＮＫアイソフォームは、それらの活性及び調節、ならびに細胞内局在において著しく異なる。最も特徴付けられたＭＮＫ基質は、ｅＩＦ４Ｅである。ｅＩＦ４Ｅリン酸化の細胞の役割は、不明であり、それは核から特定のｍＲＮＡの輸出を促進するかもしれない。他のＭＮＫ基質は、特異的ｍＲＮＡの安定性／翻訳を調節するＡＵが豊富な要素に結合する。ＭＮＫはまた、炎症メディエーターの産出、及びチロシンキナーゼ受容体からのシグナル伝達、ならびに細胞増殖または生存を制御し得る。
【００２６】
ヒトＭＮＫの配列は、以下のように見出され得る：ヒトＭＮＫ１  ｍＲＮＡ及びアミノ酸配列：Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０００４０９．１；ヒトＭＮＫ１アミノ酸配列変異体：Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ−００３６８４．２；ヒトＭＮＫ２ａ  ｍＲＮＡ配列：Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ２３７７７５；ヒトＭＮＫ２ｂ  ｍＲＮＡ及びアミノ酸配列：Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ２３７７７６、及びＮＭ−１７５７２．２と標識付けられた核酸配列の変異体。「ＧｅｎＢａｎｋ受入番号」という用語は、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））のＧｅｎＢａｎｋデータベースエントリ（Ｂｅｎｓｏｎら、２０００）に関連する。上記のＧｅｎＢａｎｋ受入番号の各々に開示される情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本明細書で使用される「ＭＮＫ阻害剤」という用語は、ＭＮＫ１の生物活性を低下させる（スプライス変異体ＭＮＫ１ａ及びＭＮＫ１ｂの一方または両方の生物活性を低下させることを含む）及び／またはＭＮＫ２の生物活性を低下させる（スプライス変異体ＭＮＫ２ａ及びＭＮＫ２ｂの一方または両方の生物活性を低下させることを含む）、任意の化合物を指すように意図され、発現されるＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の量を減少させることを含む。例えば、ＭＮＫ阻害剤は、有機小分子（本明細書では「小分子」とも称される）、ペプチドアンタゴニスト、阻害性抗体もしくはその断片、干渉性ヌクレオチド分子、アプタマー、または当業者に理解されるような発現または生物活性を阻害する他のＭＮＫ阻害剤であってもよい。ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の生物活性は、様々な方法、例えば、当業者に知られている任意の適切な方法を用いて、例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０７−８２３（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、マサチューセッツ州、ビルリカ）によって流通される抗リン酸化ｅＩＦ４Ｅ（Ｓｅｒ２０９）抗体などの、例えば、特異的抗Ｐ−ｅＩＦ４Ｅ抗体を使用する免疫ブロットまたはＥＬＩＳＡを行うことによって、その基質ｅＩＦ４ＥのＰ−ｅＩＦ４Ｅへのリン酸化を測定することによって測定され得る。したがって、ＭＮＫ阻害剤の非存在下における対応する試料と比較して、ＭＮＫ阻害剤を含有する試料中のＰ−ｅＩＦ４Ｅの量の相対的低下は、ＭＮＫの生物活性が低下したことを証明する。当業者は、Ｐ−ｅＩＦ４Ｅレベルを測定するとき、適切な対照群をどのように実行するかを知っているであろう。ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性は、そうでなければ、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性のレベルを検出することができる細胞アッセイを用いて測定され得る。リン酸化されたＭＮＫを特定的に検出する抗体もまた、使用され得、例えば、抗Ｐ−ＭＮＫ１（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｍｎｋ１（Ｔｈｒ１９７／２０２）抗体番号２１１１；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、米国、マサチューセッツ州、ダンバーズ）がある。更に、当業者は、ＭＮＫ阻害剤は、その意図された目的のための使用に対して安全であるべきであることを理解するであろう。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、好ましくは、ＭＮＫ２に対する選択性及び／または阻害能力の増加を示し得る。ＭＮＫ阻害剤の選択性を評価するための簡単な試験は、ＭＮＫ１またはＭＮＫ２のいずれかがノックアウトされた動物からの適切な細胞（例えば、ＭＮＫ１−ＫＯ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからのマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ））をＭＮＫ阻害剤で処理することによって実行され得る。ＭＮＫ１−ＫＯ  ＭＥＦにおいて、ｅＩＦ４Ｅリン酸化は、ＭＮＫ２に依存し、逆もまた同様であるため、ＭＮＫ−ＫＯ  ＭＥＦにおける、異なる濃度の対象とするＭＮＫ阻害剤のＰ−ｅＩＦ４Ｅレベルへの効果を監視することは、その化合物の、ＭＮＫ２（ＭＮＫ１−ＫＯ  ＭＥＦｓ）またはＭＮＫ１（ＭＮＫ２−ＫＯ  ＭＥＦｓ）を阻害する能力に関して報告する。したがって、２種類の細胞のデータを比較することにより、試験されたＭＮＫ阻害剤がＭＮＫ１またはＭＮＫ２に対して示す選択性の程度が決定され得る。
【００２９】
ＭＮＫ阻害剤は、有機小分子、ペプチド阻害剤、阻害性抗体またはその断片、干渉ＲＮＡ分子を含む阻害性ヌクレオチド分子、及びアプタマーから成る群から選択されてもよい。ＭＮＫ阻害剤は、当技術分野で既に知られているものを含んでもよい。実施形態では、ＭＮＫ阻害剤の組み合わせが使用されてもよい。
【００３０】
実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、有機小分子である。ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の適切な小分子阻害剤の多くの例を以下に記載する。
【００３１】
【化１】
2019510061.tif 000083
式Ｉ
式Ｉは、市販されているＣＧＰ５７３８０（Ｎ３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ−［３，４−ｄ］ピリミジン−３，４−ジアミン；または４−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニルアミノ）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；ＷＯ０３／０３７３６２；Ｃｈｒｅｓｔｅｎｓｅｎら、２００７；Ｂｕｘａｄｅら、２００５；Ｗｏｒｃｈら、２００４、Ｒｏｗｌｅｔｔら、２００８）を示す。これは、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の両方の阻害剤である（Ｈｏｕら、２０１２）。
【００３２】
【化２】
2019510061.tif 000084
式ＩＩ
式ＩＩは、市販されているセラコスラミド（（９ａＳ）−８−アセチル−９，９ａ−ジヒドロ−１，３，７−トリヒドロキシ−９ａ−メチル−９−オキソ−４−ジベンゾフランカボキサミド；Ｓｕｓｓｍａｎら、２００４）を示す。
【００３３】
【化３】
2019510061.tif 000085
式ＩＩＩ
式ＩＩＩは、市販されているＥＴＰ４５８３５二塩酸塩（４−［５−（４−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］ピリジン二塩酸塩；Ｏｙａｒｚａｂａｌら、２０１０年）を示す。
【００３４】
【化４】
2019510061.tif 000086
式ＩＶ
式ＩＶは、スタウロスポリンの誘導体であるＣＧＰ０５２０８８（Ｔｓｃｈｏｐｐら、２０００）を示す。
【００３５】
【化５】
2019510061.tif 000087
式Ｖ
式Ｖは、ＭＮＫ−Ｉ１（４−（２−（２−フルオロプロポキシ）−４−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−５−メチルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドを示す。Ｂｅｇｇｓら、２０１５）を示す。
【００３６】
【化６】
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式ＶＩ
式ＶＩは、ＭＮＫ−Ｉ２（４−（２−イソプロポキシ）−４−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）−５−メチルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド）を示す。
【００３７】
これらの化合物のいくつかに関するＩＣ５０の詳細を表３に示す。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための有機小分子型ＭＮＫ阻害剤は、「ＡＴＰ競合剤」またはＭＮＫのＡＴＰ結合ドメイン（例えば、ＣＧｐ５７３８０及びセルコスポラミド；Ｈｏｕら、２０１２）と相互作用する「Ｉ型キナーゼ阻害剤」（Ｈｏｕら、２０１２、Ｌｉｕ及びＧｒａｙ、２００６）として知られている化合物の群から選択される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための有機小分子型ＭＮＫ阻害剤は、チエノピリミジン化合物の群から選択される。そのような化合物の例としては、ＷＯ０６／１３６４０２及びＷＯ２００７／１１５８２２に記載されるもの、Ｔｅｏら、２０１５に記載されるチエノピリミジニル誘導体（ＭＮＫ２選択的阻害剤を含む）、及びＷＯ２０１１／１０４３４０及びＵＳ８，６３３，２０１に記載されるものなどの置換アルキル基を含有するチエノピリミジニル誘導体が挙げられ、この段落で言及される全ての仕様の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。適切なチエノピリミジン化合物の好ましい例は、ＷＯ２０１１／１０４３４０に記載されるもの（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに上記の特定の化合物、ＭＮＫ−Ｉ１及びＭＮＫ−Ｉ２を含んでもよい。適切なチエノピリミジン化合物の特に好ましい例は、以下に示される一般式のものであってもよい。
【化７】
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式ＶＩＩ
式中、Ｘは、ＣＨ及びＮから選択され；Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン原子（Ｆなど）、ＣＮ、Ｃ１−６アルキル基（好ましくはＣ１−３アルキル基）、またはＣＯＮＨ２基であり；Ｒ２は、ハロゲン原子（複数可）（Ｆなど）または１つもしくは２つのトリハロゲン−メチル（例えば、トリフルオロメチル）で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝Ｃ１−６アルキル基（好ましくはＣ１−３アルキル基）、テトラヒドロピラニル、シクロプロピル、Ｈ２Ｎ−ＣＯ−、Ｒ５ＮＨＣＯ−、または（Ｒ５）２Ｎ−ＣＯ−基であり、ここで、シクロプロピル基は、１つもしくは２つのハロゲン原子（複数可）（Ｆなど）、または−ＣＨ２−ＣＮで置換されてもよく、ここで、化合物が（Ｒ５）２Ｎ−ＣＯ−基を含む場合、２つのＲ５基は、それらが付着されるＮ原子と一緒に、炭素原子がＯ、Ｓ、ＳＯ、もしくはＳＯ２によって置き換えられてもよく、及び／またはＯＨ、ＮＨ２、Ｎ（Ｃ１−３−アルキル）２、ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、ＣＦ３、Ｃ１−３−アルキル基で置換されてもよい４−〜８−員環を形成してもよく、またはＲ２は、２〜６位で１つもしくは２つのＯＨで独立して置換される直鎖もしくは分枝Ｃ２−６アルキル基、Ｃ１−３アルコキシ、アミノ、ＣＮ、Ｒ６ＮＨ−、（Ｒ６）２Ｎ−、Ｒ６ＯＣＯＮＨ−、Ｒ６ＣＯＮＨ−、Ｒ６ＳＯ２ＮＨ−、またはＲ６ＮＨＣＯＮＨ−基であり、ここで、Ｒ６は、Ｃ１−５アルキル基（好ましくはＣ１−４アルキル基、例えば、ＣＨ３、ｉ−Ｐｒ、及びＴ−ＢＵ）であり、各々、１つのＣＦ３、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２またはＣＨ３Ｏ−基で任意に置換され、上記のＮＨ部分のいずれかの水素原子は、ＣＨ３で置換されてもよく；Ｒ３は、ＨまたはＣ１−３アルキル基（好ましくはＣＨ３）であり；Ｒ４は、カルボキシ基、Ｃ１−３アルコキシ−カルボニル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ７、−ＣＯＮＨ−ＯＲ７、−ＣＯＮＨ−ＳＯ２Ｒ７、及び−ＣＯ−ＮＨ−Ｌ−Ｒ７基から選択され、
Ｌは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎが２、３、または４である場合）もしくはＣ３−６分枝鎖アルキル残基（例えば、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−）、−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−、または
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であり、Ｒ７は、ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ８、−Ｎ（Ｒ８）２、−ＮＨ−ＣＯ２Ｒ８、または３−〜６−員環（例えば、フェニルまたはモルホリン基）、または環状アミン（例えば、ピロリジンもしくはピペリジン）から選択され、Ｒ８は、Ｃ１−３アルキル（好ましくはＣＨ３）、またはその互変異性体、鏡像異性体、もしくは塩である。より具体的には、式（ＶＩＩ）の好ましい化合物は、Ｘが上記で定義されたもの（ただし、好ましくはＣＨ２）であり、Ｒ１がＨまたはより好ましくはＦであり、Ｒ２がハロゲン原子（複数可）（Ｆなど）または１つもしくは２つのトリハロゲン−メチル（例えば、トリフルオロメチル）で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝Ｃ１−６アルキル基、テトラヒドロピラニル、シクロプロピル、Ｈ２Ｎ−ＣＯ−、Ｒ５ＮＨＣＯ−、または（Ｒ５）２Ｎ−ＣＯ−基であり、Ｒ３がＣＨ３であり、Ｒ４がカルボキシ基、Ｃ１−３アルコキシ−カルボニル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ７、−ＣＯＮＨ−ＯＲ７、−ＣＯＮＨ−ＳＯ２Ｒ７、及び−ＣＯ−ＮＨ−Ｌ−Ｒ８基から選択され、ここで、Ｌは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎが２または３である場合）またはＣ３−６分岐鎖アルキル残基（例えば、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−）であり、Ｒ７がＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ８及びＮ（Ｒ８）２、−ＮＨ−ＣＯ２Ｒ８（Ｒ８がＣ１−３アルキル、好ましくはＣＨ３である場合）、ならびに環状アミン（好ましくはピロリジン）などの３−〜６−員環、またはそれらの互変異性体もしくは塩から選択される、ものである。式（ＶＩＩ）の更に好ましい化合物は、Ｘが上記で定義されたものであり（ただし、好ましくはＣＨ２）、Ｒ１がＦであり、Ｒ２がハロゲン原子（複数可）（Ｆなど）で独立して置換されてもよい直鎖もしくは分枝Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ３がＣＨ３であり、Ｒ４が−ＣＯＮＨＲ７または−ＣＯＮＨ−ＯＲ７であってもよいが、より好ましくは−ＣＯ−ＮＨ−ＬＲ８基であり、ここで、Ｌは、−（ＣＨ２）ｎ−（ｎが２または３である場合）またはＣ３−６分枝鎖アルキル残基（例えば−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−）であり、Ｒ７がＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ８及びＮ（Ｒ８）２、−ＮＨ−ＣＯ２Ｒ８（Ｒ８がＣ１−３アルキル、好ましくはＣＨ３である場合）、ならびに環状アミン（好ましくはピロリジン）などの３−〜６−員環、またはそれらの互変異性体もしくは塩から選択される、ものであってもよい。
【００４１】
ＭＮＫ１及び／またはＭＫＮ２の生物活性を低下させる他の小分子もまた、本明細書に記載される使用に適切であってもよい。そのような化合物の例としては、ＥＰ０８１９１２９に記載されるもの、ピリジン及びピラジン誘導体、例えば、ＷＯ２００７／１４７８７４に記載されるもの、ならびに８−ヘテロアリールプリン化合物、例えば、ＵＳ７９５１８０３に記載されるものが挙げられ、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、当業者は、他の小分子が、本明細書に記載されるようなＭＮＫの生物活性及び／または発現を阻害する場合、それらは、本開示の方法における使用に適切であり、それらの目的のために安全であると考えられる。ＭＮＫ阻害機能のための小化合物をスクリーニングするための方法は、ＵＳ８，６３３，２０１に記載されている。更に、追加の有機小分子ＭＮＫ阻害剤を設計するための考慮事項が、Ｈｏｕら（２０１２）に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４２】
実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、ペプチド阻害剤である。
【００４３】
ペプチド阻害剤は、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性が減少するような様式で、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２などの標的と結合することができるペプチドもしくはタンパク質またはその断片である。ペプチド阻害剤は、天然源由来、または人工的に合成されたものに関わらず、天然に存在するＭＮＫ結合パートナーであってもよい、または他のペプチドであってもよい。多数のペプチドライブラリーが知られており、そのようなライブラリーは、当業者に知られている多くの技術によってスクリーニングされ得る。ＭＮＫ１及び／またはＭＫＮ２の新規ペプチド阻害剤は、そのような方法を用いて同定され、当業者に周知の技術を用いて産出され得る。
【００４４】
実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、阻害性抗体またはその断片、例えば、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を阻害または拮抗するために直接使用されてもよいＭＮＫに特異的な抗体であってもよい。代替として、阻害抗体は、中和抗体として知られていてもよい。
【００４５】
適切な抗体は、当業者に周知の方法を用いて生成され、次いで、ＭＮＫ阻害特性を有する、すなわち、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を低下させる抗体を同定するためにスクリーニングされてもよい。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片、及びＦａｂ発現ライブラリーによって産生される断片が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＮＫ阻害特性を有する抗体を作製する方法は、当業者に周知である。
【００４６】
実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、阻害性アプタマー、例えば、ＭＮＫ１及び／またはＭＮＫ２の生物活性を阻害または拮抗するために直接使用されてもよいＭＮＫに特異的なアプタマーであってもよい。アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子であり、（通常は）短いオリゴヌクレオチド鎖から成るオリゴヌクレオチド分子及び典型的には短い可変ペプチドドメイン（またはループ）から成るペプチドアプタマーが、両端部でタンパク質の骨組に付着している。アプタマーは、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２などのタンパク質を高い親和性及び特異性で阻害することができる。アプタマーを産生し、所望の阻害作用についてそれらをスクリーニングする任意の適切な方法を使用してＭＮＫ阻害剤を産生してもよい。ヌクレオチドアプタマーのためのそのような方法の例は、ＵＳ７，９６０，１０２及びＷＯ９１／１９８１３に記載されるが、しかしながら、他の方法もまた適切であり得る。ペプチドアプタマーはまた、ファージディスプレイ、ならびにｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイ、及び酵母ディスプレイなどの他の表面ディスプレイ技術によって構築された組み合わせペプチドライブラリーから選択され得る。阻害性ペプチドアプタマーを産生するための方法の更なる例は、ＷＯ２０１２／０９６９７８に記載される。
【００４７】
実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、阻害性ヌクレオチド分子であってもよい。二本鎖または一本鎖干渉ＲＮＡ分子は、当業者に周知のように、所与の遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の配列特異的分解を誘発し、それにより、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害することができる。ＭＮＫをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子は、ｍＲＮＡの転写をブロックすることが望ましい状況で代替的に使用されてもよい。したがって、阻害性ヌクレオチド分子は、産生されるＭＮＫタンパク質の量を減少させることによって、ＭＮＫ生物活性を阻害するために使用されてもよい。そのような技術は現在、当業者に周知であり、センスもしくはアンチセンスオリゴマーまたはより大きな断片は、ＭＮＫをコードする配列のコードまたは制御領域に沿った様々な位置から設計され得る。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス、もしくはワクシニアウイルスから、または種々な細菌プラスミドから誘導された発現ベクターは、標的臓器、組織、または細胞集団へのヌクレオチド配列の送達のために使用されてもよい。当業者に周知の方法が、ＭＮＫをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築するために使用され得る。ＭＮＫをコードする遺伝子は、ＭＮＫをコードする高レベルのポリヌクレオチドまたはその断片を発現する発現ベクターで細胞または組織を形質転換することによってオフにされ得る。そのような構築物は、翻訳不可能なセンスまたはアンチセンス配列を細胞に導入するために使用されてもよい。ＤＮＡへの組み込みがない場合でも、そのようなベクターは、ＲＮＡ分子が内因性ヌクレアーゼによって無効にされるまでＲＮＡ分子を転写し続けることがある。一過性発現は、非複製ベクターで１ヶ月以上続き、更に適した複製要素がベクターシステムの一部である場合、更に長くことがある。阻害性ヌクレオチド分子は、核酸分子の合成のための、当業者に知られている任意の方法によって調製されてもよい。
【００４８】
ＭＮＫ阻害剤は、経口または直腸などの経腸投与のための許容される方法のいずれかによって、または皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内経路などの非経口投与によって、または鼻腔内経路などの他の適切な経路によって対象に投与されてもよい。注射は、ボーラス投与、または一定もしくは間欠的注入を介し得る。実施形態では、ＭＮＫ阻害剤は、経口投与される。したがって、ＭＮＫ阻害剤は、例えば、カプセル、錠剤、カプレット、顆粒、もしくは粉末（飲料を提供するために水中に懸濁または溶解されてもよい）などの経口剤形で、または補強食品として製剤化されてもよい。
【００４９】
ＭＮＫ阻害剤は、それを生体利用可能にする任意の形態または様式で投与され得る。製剤を調製する当業者は、選択されるＭＮＫ阻害剤の特定の特性、治療される疾患、治療される疾患の段階、及び他の関連状況に応じて、適切な投与形態及び様式を容易に選択することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（１９９５）を参照されたい）。実施形態では、製剤は、薬学的または獣医学的に許容される充填剤、担体、希釈剤、及び／または賦形剤と任意に組み合わせられてもよい。充填剤、担体、希釈剤、または賦形剤は、当業者に知られている任意の適切な物質、例えば、リン酸二カルシウム二塩基（ＤＣＰＤ）、第二リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、糖類、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、セルロース、セルロース誘導体または変性セルロース、例えば、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、キシリトール、ソルビトール、もしくはマルチトールのようなアルコール類、水、アルコール、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、及び／またはヒュームドシリカ吸収剤であってもよい。好ましくは、充填剤、担体、希釈剤、または賦形剤は、ステアリン酸マグネシウム、ＤＣＰＤ、デンプングリコール酸ナトリウム、ヒュームドシリカ吸収剤、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００５０】
ＭＮＫ阻害剤は、本明細書に記載される疾患の治療のために、１つ以上の追加の薬物（複数可）と併用または共に投与されてもよい。成分は、同じ製剤または別々の製剤で投与されえる。別々の製剤で投与される場合、ＭＮＫ阻害剤は、連続して（すなわち、例えば、数秒または数分または更に数時間（例えば２〜４８時間）以内に任意の順序で連続して）、または他の薬物（複数可）と同時に投与されてもよい。
【００５１】
１つ以上の追加の薬物と組み合わせて投与可能であることに加えて、ＭＮＫ阻害剤は、併用療法で使用されてもよい。これが行われるとき、ＭＮＫ阻害剤は、典型的には、互いに組み合わせて投与される。したがって、ＭＮＫ阻害剤の１つ以上は、所望の効果を達成するために、同時（組み合わされた調合剤として）、または連続（すなわち、例えば、数秒または数分または更に数時間（例えば２〜４８時間）以内に任意の順序で連続して）のいずれかで投与されてもよい。これは、２つの薬物の組み合わされた効果が、改善された治療結果を提供するように、各ＭＮＫ阻害剤の治療プロファイルが異なる場合に特に望ましい。
【００５２】
必要に応じて、より効果的な分布のために、ＭＮＫ阻害剤は、ポリマーマトリックス、リポソーム、及びマイクロスフェアなどの徐放性または標的送達系に組み込まれ得る。
【００５３】
「治療上有効な量」のＭＮＫ阻害剤は、例えば、特定の選択されたＭＮＫ阻害剤または使用されるＭＮＫ阻害剤の組み合わせ、投与方法、治療される特定の疾患、及び所望の転帰によって変動してもよい。それはまた、疾患の段階及び重症度、患者の年齢及び身体状態を含む治療される対象、もしある場合、同時療法の性質、及び医師に周知の同様の要因にもよる。防止的（予防的）な適用に関しては、それは、概して、予防されるように探される特定の疾患の発症を遅らせる、進行を阻害する、または共に停止させるのに十分なその量である。治療的適用に関しては、それは、概して、医学的に望ましい結果を達成するのに十分なその量である。
【００５４】
治療上有効な量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。いずれの化合物についても、治療上有効な量は、細胞培養アッセイ（例えば、前脂肪細胞株）、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、またはブタのいずれかで最初に推定され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用されてもよい。そのような情報は、その後、ヒトにおける投与のための有用な投与量及び経路を決定するために使用され得る。治療有効性及び任意の毒性は、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致命的である用量）の決定を通して、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定されてもよい。治療効果と毒性作用との間の用量比は、治療指数であり、それは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表され得る。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投与量の範囲を定式化するのに使用される。そのような組成物に含有される投与量は、好ましくは、毒性がほとんどない、または全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、使用される剤形、患者の感受性、及び投与経路によって、この範囲内で変化する。使用される正確な投薬量及び治療上有効な量は、処理を必要とする対象に関連する因子を考慮して、開業医によって決定される。投与量及び投与経路／頻度は、十分なレベルの活性部分を提供するために、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る因子としては、病状の重篤度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ（複数可）、反応感受性、ならびに療法に対する耐性／応答が挙げられる。薬学的組成物は、特定の製剤及び／または活性部分の半減期及びクリアランス速度によって、１日数回、１日１回、３〜４日ごと、毎週、または２週間に１回投与されてもよい。治療上有効な量は、投与経路によって、０．１〜１００，０００ｍｇ、最大約１ｇの総量まで変動してもよい。一例では、治療上有効な量は、概して、約１〜２０００ｍｇ／日、好ましくは約１０〜約１０００ｍｇ／日、最も好ましくは約１０〜約５００ｍｇ／日であってもよく、単回または複数回投与されてもよい。
【００５５】
本開示の方法の上記の実施形態のいずれかまたは全てが、以下を含む本開示の他の態様において容易に使用され得ることが意図される。
【００５６】
本開示の別の態様は、前糖尿病の２型糖尿病への進行を予防及び／または遅延させるために空腹時グルコース障害の前糖尿病を有する対象を治療するための、治療上有効な量の少なくとも１つのＭＮＫ阻害剤の使用を提供し、該対象は５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とし、該ＭＮＫ阻害剤は、ＭＮＫ２、及び任意に、ＭＮＫ１の生物活性を低下させる。
【００５７】
本開示の更なる態様は、前糖尿病の２型糖尿病への進行を予防及び／または遅延させるために空腹時グルコース障害の前糖尿病を有する対象を治療するための、医薬品の製造における、ＭＮＫ２、及び任意に、ＭＮＫ１の生物活性を低下させる少なくとも１つのＭＮＫ阻害剤の使用を提供し、該対象は５．５ｍｍｏｌ／ｌ〜６．９ｍｍｏｌ／ｌの空腹時血漿グルコース値を有することを特徴とする。
【実施例】
【００５８】
実施例１  ＭＮＫ１及びＭＮＫ２は、高脂肪食の有害作用を媒介し、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の生物学的機能を阻害することは、これらの作用を減少させる
材料及び方法
材料及び化学物質
全ての細胞培養液及びサプリメントは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国、カリフォルニア州、カールスバッド）から購入した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの試薬は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）から購入した。脂肪生成実験のために、インスリン、デキサメタゾン、ＩＢＭＸ、及びロシグリタゾンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国、ミズーリ州、セントルイス）から得た。マクロファージ分極化については、リポ多糖（ＬＰＳ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、インターロイキン（ＩＬ）−４及びインターフェロン（ＩＦＮ）γをＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（米国、ニュージャージー州、ロッキーヒル）から購入した。ＭＮＫ阻害剤ＣＧＰ５７３８０は、Ａｂｃａｍ  ＰＬＣ（英国、ケンブリッジ）から得た。
【００５９】
動物の使用及び食餌
ＭＮＫ１−ＫＯ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景で作製され、Ｒｉｋｉｒｏ  Ｆｕｋｕｎａｇａ博士（日本、大阪大学；Ｕｅｄａら、２００４）によって快く提供された。４週齢の雄野生型（ＷＴ）、ＭＮＫ１−ＫＯ、またはＭＮＫ２−ＫＯマウスを、１２時間の明／暗サイクル（０７：００に点灯）及び２２±２℃の一定温度で、食料と水は自由に入手可能な状態で保持した。それらを、２０週間の高脂肪食（ＨＦＤ；４５％ｋｃａｌの脂肪、２０％ｋｃａｌのタンパク質、３５％ｋｃａｌの炭水化物；Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、英国、エセックス）または標準飼料食（Ｃ；７％ｋｃａｌの脂肪、１８％ｋｃａｌのタンパク質、７５％ｋｃａｌの炭水化物；Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）のいずれかに割り当てた。食餌中の脂肪は、ラード（１７．８９％ｗ／ｗ）及び大豆油（４．３２％ｗ／ｗ）によって提供した。食餌の栄養価を表４に示す。
【００６０】
【表４】
2019510061.tif 000092
【００６１】
代謝研究
飼料食またはＨＦＤのいずれかで１５週間後、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）を一晩の絶食後に行った。空腹時グルコース濃度を、マウスがＤ−グルコース（２ｇ／マウス体重１ｋｇ；Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄ、豪州、アデレード）を腹腔内（ｉｐ）注射される前に尾静脈から得られた全血から測定し、血中グルコース濃度を、Ａｖｉｖａ  Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋグルコメ―ター（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、スイス、Ｒｉｓｃｈ−Ｒｏｔｋｒｅｕｚ）を用いて腹腔内注射の１５、３０、６０、及び１２０分後に尾静脈から測定した。
【００６２】
インスリン抵抗性を試験するために、マウスの別個のコホートを一晩絶食させ、腹腔内インスリン注射（０．７５Ｕ／マウス体重１ｋｇ；Ａｃｔｒａｐｉｄ、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク、バウスベア）の前に尾から得た全血中の絶食グルコース濃度を測定した。次いで、血液グルコース濃度を、腹腔内注射の１５及び３０分後に尾静脈から測定した。マウスは、腹腔内注射の３０分後にグルコース測定値を得た後、直ちに屠殺し、組織を、下流のインスリンシグナル伝達を測定するためのウェスタンブロッティングによる分析のために直ちに凍結した。
【００６３】
血漿インスリン、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０の測定は、英国、ケンブリッジのＣｏｒｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣＢＡＬ）によって実施された酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって行った。
【００６４】
ウェスタンブロッティング
組織を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、５０ｍＭのβ−グリセロールホスフェート、０．５ｍＭのＮａＶＯ３、０．１％２−メルカプトエタノール及びプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液中で採取した。溶解後、不溶性物質を４℃で、１２，０００ｇで１０分間遠心分離することによって除去した。タンパク質含量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって決定した。イムノブロッティングは、Ｌｉｕら（２０１４）に記載される通りに行った。ブロットは、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて視覚化した。表５に示される一次抗体は、抗Ｐ−ｅＩＦ４Ｅ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を除いて、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのものであった。二次抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（米国、マサチューセッツ州、ウォルサム）から入手し、１：２０，０００希釈で使用した。
【００６５】
【表５】
2019510061.tif 000093
【００６６】
遺伝子発現解析
全ＲＮＡは、メーカーの説明書に従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して組織から単離した（サンプリング時に凍結された）。ＲＮＡ濃度を２６０ｎｍでの吸光度によって決定すると同時に、品質及び完全性を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２６０／２３０及び２６０／２８０比で評価した。ＲＴリアルタイムＰＣＲ増幅を、製造業者のプロトコルに従ってランダムプライマーでＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａ３８００；Ｐｒｏｍｅｇａ、米国、ウィスコンシン州、マジソン）を使用して実行した。続いて、リアルタイム定量（ｑ）ＰＣＲを、Ｍｏｏｒｅ  ＣＥＪら、２０１６の補足表Ｓ１に記載されるプライマー配列を用いて行い、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。比較ＣＴ法を使用して、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ｍＲＮＡと比較して標的ｍＲＮＡレベルの増幅を測定した。図１Ａにおいて、各転写産物の相対量は、ｄＣｔ＝（Ｃｔ標的遺伝子−Ｃｔ  ｒｅｆ遺伝子）である式２−ｄＣｔ及びＣｔ＝サイクル閾値を用いて決定した。
【００６７】
ＢＭＤＭの単離
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、成体ＷＴまたはＭＮＫ２−ＫＯマウス（Ｗｅｉｓｃｈｅｎｆｅｌｄｔ及びＰｏｒｓｅ、２００８）から前述のように生成した。簡潔には、マウスの両側大腿骨及び脛骨を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有さない滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に２６ゲージの針を用いてフラッシュした。細胞クラスターをピペッティングし、懸濁液を４０μｍの細胞ストレーナーに通すことによって破壊した。得られた細胞懸濁液を遠心分離し（１０分、４００×ｇ）、細胞ペレットを、３０％Ｌ９２９細胞馴化培地（Ｌ９２９細胞は、マクロファージへの骨髄細胞の分化を促進するために必要とされるマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を分泌する）、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５０％ＤＭＥＭ（高グルコースダルベッコ変法イーグル培地、ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する完全マクロファージ培地（ＣＭＭ）に１％（重量／体積）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に再懸濁した。
【００６８】
マクロファージ極性化
ＢＭＤＭ細胞を、ＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４からのＬ２６３０−リポ多糖体）で２４時間処理して、Ｍ１マクロファージ表現型に分極するか、または細胞を、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）単独で２４時間処理して、Ｍ２表現型に分極した。
【００６９】
３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化及びオイルレッドＯ染色
３Ｔ３−Ｌ１（線維芽細胞）細胞分化の誘導のために、前脂肪細胞を、１０％ＦＢＳで補充されたＤＭＥＭ（０日目）でコンフルエンス後２日まで増殖させ、培地を、１０％ＦＢＳ、インスリン（１６７ｎＭ）、デキサメタゾン（０．５μＭ）、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（０．５ｍＭ）、及びロシグリタゾン（２μＭ）で補充されたＤＭＥＭに交換した。４８時間後、培地を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１６７ｎＭのインスリンで補充されたＤＭＥＭを含有する培地と置き換えた。４日目に、分化を誘導した後、そしてそれ以降、細胞を、１０％ＦＢＳを伴うＤＭＥＭ中で培養した。維持培地は、細胞が実験に利用されるまで（分化開始から９日）まで４８時間毎に交換した。２０μＭのＣＧＰ５７３８０を、０日目に細胞に添加し、分化プログラムを通じてその後の培地交換の間維持した。
【００７０】
細胞内トリグリセリドレベルの評価は、他の文献（Ｓｍｉｔｈら、１９８８）に記載されているようにオイルレッドＯ染色を用いて行った。簡潔には、３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化の９日目に、１０％ホルマリン中で１時間固定した。細胞を、新たに調製したオイルレッドＯ染色液で１０分間染色する前に、６０％イソプロパノールで洗浄した。定量のために、細胞を水で広範囲に洗浄して未結合の色素を除去し、１ｍｌのイソプロパノールを、染色された６ウェル培養プレートに添加した。５分後、５１０ｎｍでのオイルレッド抽出物の吸光度を測定し、吸光度の増加は、細胞内の脂質レベルの増加を示した。
【００７１】
組織学
脂肪組織切片を１０％中性緩衝ホルマリン中で６時間固定し、パラフィンワックスに包埋する前に標準物として脱水した。切片（４μｍ）を切断し、正に帯電したガラススライド上に載せ、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を標準物として行った。スライドを、Ｐａｎｏｒａｍｉｃ２５０Ｆｌａｓｈ  ＩＩスキャナー（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ、ハンガリー）を使用してスキャンした。画像を、脂肪細胞ツールマクロを有するＩｍａｇｅ  Ｊを用いて分析した。次いで、脂肪細胞を計数し、各被写体の絶対画素面積を計算し、μｍ２に変換した。
【００７２】
統計
分析は、図の説明文に示されるように、両側かつ対応のないスチューデントのｔ検定、一元または二元配置分散分析によって行った。０．０５未満のＡＰ値は、有意であると考えられた。統計的検定は、統計的プログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン６；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）を用いて行った。
【００７３】
脂質分解アッセイ
３Ｔ３Ｌ１細胞を９日間上記のように分化させた。脂肪分解アッセイは、メーカーの説明書（Ａｂｃａｍ  Ｌｉｐｏｌｙｓｉｓアッセイキット、ａｂ１８５４３３、Ａｂｃａｍ）に従って行った。簡潔には、分化後、細胞を脂肪分解アッセイ緩衝液で２回洗浄した。脂質分解を、１００ｎＭイソプロテレノールを用いて３時間刺激した。放出されたグリセロールの量を、比色強度を用いて測定した。
【００７４】
トリグリセリド測定
組織放出トリグリセリド（ＴＡＧ）の量は、トリグリセリド定量キット（Ａｂｃａｍ、ａｂ６５３３６）を用いて測定した。
【００７５】
肝臓組織学
新鮮な低温切片（厚さ５μｍ）を用いて、オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ）で染色することにより脂質蓄積を検出した。低温切片を６０％イソプロパノール中で１０分間固定し、６０％イソプロパノール中の０．３％オイルレッドＯで３０分間染色し、続いて、６０％イソプロパノールで洗浄した。核をヘマトキシリンで２分間染色し、次いで、水道水で濯いだ。スライドをＰａｎｎｏｒａｍｉｃ２５０Ｆｌａｓｈ  ＩＩスキャナー（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ、ハンガリー）を用いてスキャンした。
【００７６】
結果と考察
ＭＮＫ１及び２は、インスリン調節代謝に関与する正常なマウス組織において発現される
以前に、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２  ｍＲＮＡが肝臓、骨格筋、及び心臓において発現されることが示されている。本発明者らは、肝臓での発現を確認することに加えて、ＭＫＮＫ１及びＭＫＮＫ２  ｍＲＮＡ分子が脂肪組織でも発現することを示している（図１Ａ参照）。免疫ブロット分析は、肝臓、骨格筋、及び心筋、ならびに脂肪組織におけるＭＮＫ１タンパク質の発現を明らかにした（図１Ｂ）。
【００７７】
脂肪細胞分化中のＭＮＫ２の発現を調べるために、広範に使用される脂肪細胞分化モデルである３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞を使用して、転写因子ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、及びＳＲＥＢＰ１ｃ、ならびにグルコース及び脂肪酸輸送体ＧＬＵＴ４及びＣＤ３６などの標準マーカーの発現を分析し、分化プロトコルの有効性を確認した（図１Ｃ）。ＭＮＫ２  ｍＲＮＡのレベルは、分化プロトコルの誘導後に急速に上昇し、１日で３倍のレベル（他のマーカーの最も早いものと少なくとも同じ速さ）であった（図１Ｄ）。この結果は、ＭＮＫ２が脂肪細胞分化の初期に役割を果たすことを示す。ＭＮＫ２  ｍＲＮＡレベルは、６日目までにほぼ分化前レベルまで低下した。対照的に、ＭＫＮＫ１  ｍＲＮＡレベルは、この期間にほんの少し増加した。更なる研究（図１Ｅ参照）では、脂肪生成に関与する主要遺伝子の大部分の出現の前に（Ｃ／ＥＢＰβ以外に）、ＭＮＫ１ではなくＭＮＫ２が３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の脂肪細胞への分化の間、非常に早く上方制御されることが見出された。
【００７８】
ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＨＦＤ誘発性脂肪増加及びインスリン抵抗性の指標に対して保護されている
野生型（ＷＴ）マウスと比較したＭＮＫ１ノックアウト（ＫＯ）またはＭＮＫ２−ＫＯマウスの、正常食（飼料食）と比較した高脂肪食（ＨＦＤ）に対する応答を調べて、ＭＮＫ−１及びＭＮＫ−２の役割を決定した。飼料食と比較して、野生型（ＷＴ）Ｃ５７Ｂｌ６／ＪマウスにＨＦＤを摂取させると、体重及び性腺脂肪の増加した（図２Ａ〜２Ｃ）。高脂肪摂取ＭＮＫ１−ＫＯマウスは、ＨＦＤのＷＴマウスと同様の身体及び性腺重量の増加を示した（図２Ａ〜２Ｃ）。対照的に、同型のＭＮＫ２−ＫＯマウスに同じＨＦＤを摂取させると、体重及び性腺脂肪の増加がより小さくなった。ＷＴマウスでは、ＨＦＤもまた、グルコース及びインスリンの循環レベルの顕著な増加を引き起こした（それぞれ図２Ｄ、２Ｅ）。そのような増加は、ＨＦＤのＭＮＫ１−ＫＯ動物及びＭＮＫ２−ＫＯ動物の両方において顕著に低下し、ＨＦＤの有害作用の減弱を示した。とりわけ、飼料食では、ＭＮＫ１−ＫＯ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＷＴマウスの体重、性腺脂肪重量、基礎グルコース及びインスリンレベルと同様のものを有した。野生型対照群と比較して、ＭＮＫ−ＫＯマウスの食物摂取量の差は観察されなかった。
【００７９】
インスリン抵抗性の恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）は、インスリン抵抗性の指標として広く使用され、それは、血中インスリン及びグルコース値から計算される（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９８５）。ＨＯＭＡ−ＩＲは、ＷＴ／ＨＦＤマウスにおいて上昇した（図２Ｆ）。しかしながら、ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスでは、飼料食摂取動物と比較して、ＨＯＭＡ−ＩＲのはるかに少ない増加が観察され、ＭＮＫ２−ＫＯ動物が、インスリン抵抗性などのＨＦＤの有害作用に対して大きく保護されていることを示した。ＭＮＫ１−ＫＯマウスは、ＨＦＤのＷＴマウスと同様の重量及び脂肪増加を示すが、それらは、より低い血中インスリン及びグルコース値、したがって、ＷＴ／ＨＦＤマウスよりも良好なＨＯＭＡ−ＩＲを示した（図２Ｄ〜２Ｆ）。
【００８０】
ＨＦＤのＷＴマウスでは、脂肪細胞のサイズは、細胞面積によって評価されるように、飼料食のものと比較して実質的に増加した（１．７倍；図３Ａ）。これらの細胞が大体球状であると仮定すると、これは、脂肪細胞体積の約３倍の増加になる。これと一致して、飼料食摂取マウスと比較して、ＨＦＤ摂取ＷＴの脂肪細胞の観察された数において対応する減少が存在した（図３Ｂ）。対照的に、飼料食摂取対照群と比較した場合、ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスにいて脂肪細胞のサイズの増加はなかった（図３Ａ、３Ｂ）。これは、これらの動物がＨＦＤに置かれるときに、脂肪細胞の脂質貯蔵における起こり得る欠陥を示唆する。興味深いことに、脂肪細胞のサイズは、ＷＴ対照群よりもＭＮＫ２／飼料食動物でより大きいことが見出され、理論に縛られることは望まないが、これは、ＭＮＫ２−ＫＯマウスにおける脂肪生成の欠損の存在を示し得るため、より少ない脂肪細胞が存在し、その結果、それぞれがより大きくなる。脂肪細胞サイズがＭＮＫ２−ＫＯマウスにおけるＨＦＤで増加しなかったという観察は、高脂肪摂食ＭＮＫ２−ＫＯマウスの体重増加の減少に寄与する可能性が高い。
【００８１】
ＭＮＫは、脂肪細胞の分化に必要とされる
ＷＴ／ＨＦＤ対照群と比較したＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスで観察された脂肪組織の少ない増加、及び脂肪細胞分化中のＭＮＫ２の発現増加（図１Ｃ）は、ＭＮＫ２が細胞の脂肪細胞への分化において役割を果たすか否かの試験を促した。この目的のために、３Ｔ３−Ｌ１細胞を、標準プロトコルを用いて脂肪細胞に分化させ、脂質含量を評価し、ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＧＬＵＴ４、及びＣＤ３６に対するｍＲＮＡなどの脂肪細胞マーカーを評価することによって分化を監視した。
【００８２】
ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の両方の活性の広く使用されている阻害剤、ＣＧＰ５７３８０（Ｔｓｃｈｏｐｐら、２０００）の、３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化に対する効果を調べた。用量応答試験を、真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）のリン酸化を読取りとして用いて評価するように、ＭＮＫ機能を遮断するために必要とされるＣＧＰ５７３８０の濃度を決定するために行った。ＭＮＫは、ｅＩＦ４Ｅをリン酸化することが知られている唯一のキナーゼであり、したがって、ｅＩＦ４Ｅ（Ｐ−ｅＩＦ４Ｅ）のリン酸化は、ＭＮＫ生物活性の直接の読み出しを提供する。結果は、２０μＭのＣＧＰ５７３８０が効果的であり、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＭＮＫ活性をほぼ完全に遮断することを示した（図３Ｃ）。更に、図３Ｄに示すように、２０μのＭＣＧＰ５７３８０は、分化プロトコルに供された３Ｔ３−Ｌ１細胞への脂質の蓄積を阻害した。
【００８３】
脂質蓄積の阻害が脂肪生成分化に関与する他の遺伝子の発現の変化を反映するかどうかを研究するために、ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＧＬＵＴ４、及びＣＤ３６に対するｍＲＮＡレベルを調べた。図３Ｅに示すように、ＣＧＰ５７３８０は、ＣＧＰ５７３８０の非存在下で分化された３Ｔ３−Ｌ１細胞と比較して、分化プロトコルの３日目及び６日目の両方でこれらの遺伝子の全ての誘導を実質的に遮断した。これらのデータは、ＭＮＫが３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化において役割を果たすこと、及びインビボでの脂肪細胞分化においても役割を果たす可能性があることを示し、図３Ａ及び３Ｂに示される脂肪細胞のサイズ及び数に対するＭＮＫの役割を確認する。
【００８４】
ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスは、肝臓脂質蓄積の増加を示さない
ＨＦＤのＷＴ動物と比較して、ＭＮＫ２−ＫＯマウスで観察された脂肪組織の増加の減弱を考慮して、食事からの余分な脂質負荷が肝臓に転用され、そこの脂肪蓄積に寄与する可能性があるかどうかを調べる調査を行った。ＨＦＤ  ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＨＦＤのＷＴマウスと同様の肝臓重量を示した（データ示さず）。ＨＦＤのＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスの総肝脂質レベルは、同様であった（データ示さず）。これらのデータは、ＨＦＤ中の余分な脂質がＭＮＫ２−ＫＯマウスの肝臓に転嫁されていないことを示している。
【００８５】
ＭＮＫ−ＫＯマウスは、ＨＦＤのＷＴマウスと比較してグルコース耐性の改善を示す
ＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯ動物におけるグルコース耐性に対するＨＦＤの作用を直接評価するために、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）を行った。飼料食摂取ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＧＴＴにおいて飼料食摂取ＷＴ動物と同様の応答を示し、ＭＮＫが正常（飼料食）条件下でグルコース耐性に影響しないことを示した。しかしながら、ＭＮＫ１−ＫＯ及びＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスは、ＷＴ／ＨＦＤマウスと比べて、グルコース投与後、常に著しく低い血中グルコース値を示し、グルコース処理を調節することにおけるＭＮＫ１及びＭＮＫ２の役割（図４Ａ、４Ｂ）、したがって、より高いグルコース耐性を示した。したがって、これらの結果から、ＭＮＫ１またはＭＮＫ２のいずれかのノックアウトは、ＨＦＤ誘導性のグルコース不耐性に対してマウスを保護するように思われる。
【００８６】
インスリンの作用を評価するために、飼料食またはＨＦＤのＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯマウスをインスリンで処理して、これらの動物の、血中グルコース値を低下させる能力を評価した。インスリンは、ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤ動物において、ＷＴ／ＨＦＤマウスよりも血中グルコースをより効果的に低下させ、インスリンがＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤ及びＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスにおいてより効率的に作用することを示した（図４Ｃ）。実際に、ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスにおけるインスリンによって引き起こされる血中グルコース値の低下率は、飼料食摂取動物で観察されたものと同様である。これらのデータは、ＭＮＫ１−ＫＯ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスがそれぞれ、ＨＦＤ誘発性のインスリン抵抗性に対してかなりの程度まで保護されていることを示している。
【００８７】
ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＨＦＤのＷＴマウスよりも良好なインスリンシグナル伝達を示す
脂肪組織におけるＭＮＫ１及びＭＮＫ２活性の相対レベルを評価するために、ｅＩＦ４Ｅ（ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の共通基質）のリン酸化を調べた。ＨＦＤは、ＷＴマウスの脂肪組織におけるリン酸化（Ｐ）−ｅＩＦ４Ｅのわずかな増加を引き起こした（図５Ａ）。ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、両方の食餌条件下でＰ−ｅＩＦ４Ｅの実質的な低下を示したが、ＭＮＫ１−ＫＯマウスは、飼料食のＷＴ動物と比較して、飼料食でＰ−ｅＩＦ４Ｅに変化を示さなかった。これは、ＭＮＫ２が脂肪組織における最も活性なＭＮＫアイソフォームであることを実証する。ＭＮＫ１−ＫＯマウスでは、Ｐ−ｅＩＦ４Ｅは、飼料食摂取マウスよりもＨＦＤ摂取の脂肪組織においてより低かった（図５Ａ）。
【００８８】
インスリンは、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４の、細胞膜への転座を介して、脂肪、特に筋肉などの組織へのグルコースの取り込みを刺激する。この効果は、インスリンの代謝作用の多くと同様に、ホスファチジルイノシトイド３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）の下流でリン酸化され、活性化されるタンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ、Ａｋｔとも呼ばれる）を介して媒介される。インスリンの、この経路を活性化する能力を評価するために、飼料食またはＨＦＤを摂取したＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスにインスリンを投与し、３０分後に屠殺してインスリン抵抗性を試験した。試料を血液から採取し、脂肪組織及び骨格筋（腓腹筋）も採取した。組織試料を、インスリンシグナル伝達の様々なパラメータについて免疫ブロットにより分析した。ＷＴマウスにおいて、インスリン投与は、脂肪組織（図５Ｂ）及び筋肉（図５Ｂ、５Ｃ）におけるその活性化に関与する主部位であるＳｅｒ４７３及びＴｈｒ３０８におけるＰＫＢのリン酸化の増加を引き起こした。これらの効果は、ＨＦＤを摂取したＷＴ動物で減少し、インスリンの効果に対する部分的な抵抗性を示した。飼料食のＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯマウスにおいて、インスリン誘発性ＰＫＢリン酸化は、飼料食のＷＴ動物と同様であったが、インスリン誘発性ＰＫＢリン酸化は、ＨＦＤ上のＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯマウスにおいて、ＷＴ／ＨＦＤ動物より高く、インスリン抵抗性がＭＮＫ−ＫＯ／ＨＦＤマウスの両方において減弱されたことを示した（図５Ｂ、５Ｃ）。
【００８９】
総ＧＬＵＴ４タンパク質の増加が、ＷＴまたは飼料食摂取ＭＮＫ２−ＫＯ動物のいずれかと比較して、ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスの脂肪組織で観察された（図５Ｄ）。ＧＬＵＴ４は、このホルモンに応答してグルコースのインスリン応答性組織への取り込みを媒介する、重要なインスリン調節されたグルコース輸送体である。インスリンは、ＰＫＢを含むシグナル伝達経路を介して細胞膜へのその転座を促進する。したがって、ＷＴ／ＨＦＤマウスと比較して、ＭＮＫ２  ＫＯ／ＨＦＤ動物の改善されたグルコース耐性は、改善されたインスリン感受性及び／またはシグナル伝達と、より高いレベルのＧＬＵＴ４タンパク質との組み合わせを含む可能性が高い。Ｇｌｕｔ４  ｍＲＮＡレベルは、ＷＴ動物と比較して、飼料食またはＨＦＤのＭＮＫ２−ＫＯ動物の脂肪組織においてわずかに低かった（データ示さず）。ＧＬＵＴ４タンパク質のレベルは、野生型動物と比較して、ＭＮＫ１−ＫＯ動物の脂肪においてより低い傾向があった（図５Ｄ）。骨格筋において、ｅＩＦ４Ｅリン酸化は、ＭＮＫ２−ＫＯマウスでは低下したが、ＭＮＫ１−ＫＯ動物では低下せず（図５Ｅ）、ＭＮＫ２がこの組織において最も活性なＭＮＫアイソフォームであるが、ＭＮＫ１も寄与することを示す。インスリン誘発性ＰＫＢリン酸化は、飼料食と比較してＨＦＤを摂取したＷＴマウスでは減少したが、それは、ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯ動物では損なわれなかった。ＧＬＵＴ４タンパク質のレベルは、ＭＮＫ２−ＫＯマウス、特にＨＦＤのマウスの筋肉においてより高い傾向があったが、その差は、有意性に達しなかった（図５Ｅ〜５Ｆ）。したがって、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２は両方とも、ＨＦＤ摂取マウスの脂肪組織及び筋肉におけるインスリンシグナル伝達を損なう役割を果たす。
【００９０】
ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＨＦＤ誘発性脂肪炎症に対して保護される
体重増加及びインスリン抵抗性に加えて、ＨＦＤを消費する結果として、炎症誘発性Ｍ１マクロファージで浸潤される、特に脂肪組織における炎症がある。飼料食またはＨＦＤのいずれかを摂取していたＷＴ、ＭＮＫ１−ＫＯ、及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからの脂肪組織におけるマクロファージ及びＭ１−極性化マクロファージのマーカーを調べた。ＷＴ／ＨＦＤ及びＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤマウスは、ＷＴ／ＨＦＤ動物と比較して、Ｃｄ６８及びＦ４／８０などのマクロファージマーカーのためのｍＲＮＡレベルにおいて増加を示した（図６Ａ、６Ｂ）。ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスにおける変化したマクロファージマーカーを考慮して、炎症誘発性（Ｍ１マクロファージ）マーカーＣｄ１１ｃ及びＴｎｆα（図６Ｃ、６Ｄ）、ケモカイン受容体Ｃｃｒ２及びＣｃｒ５（マクロファージ輸送において重要；データ示さず）、ならびに細胞移動を可能にする細胞外マトリックスの消化に関与するＭｍｐ１２（マトリックスメタロプロテイナーゼ１２；データ示さず）及びＡｄａｍ８（データ示さず）。著しく対照的に、ＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤマウスではなくＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスは、飼料食での同じ動物と比較して、急減した炎症を示し、Ｃｄ６８、Ｆ４／８０、Ｔｎｆα、Ｃｄ１１ｃ、ＭｈｃＩＩ  ｍＲＮＡｓ（図６Ａ〜６Ｄ）、及びＣｃｒ２、Ｃｃｒ５、Ｍｍｐ１２、またはＡｄａｍ８  ｍＲＮＡ（データ示さず）の増加がほとんどない、またはまったくなかった。まとめると、これらのデータは、ＨＦＤでは、ＭＮＫ２−ＫＯマウスの脂肪組織は、（Ｃｄ６８及びＦ４／８０  ｍＲＮＡの正常な顕著な増加がないことに基づいて）マクロファージで大きく浸潤されることはない、またはＣｄ１１ｃ及びＴｎｆαのレベルの著しい鈍化によって示されるように、炎症誘発性Ｍ１マクロファージにおける増加を示す。脂肪細胞ＭＨＣＩＩは、免疫細胞をＨＦＤ摂食動物における脂肪組織に誘引する際に重要な役割を果たすことが報告されているため、ＭＮＫ２−ＫＯマウスにおけるＭｈｃＩＩの増加の欠如が興味深い。更に、飽和脂肪が多い食事は、ｃ−ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化を介してインスリン抵抗性を引き起こすことが報告されている。しかしながら、ＭＮＫは、ＪＮＫによって活性化されず、ＨＦＤ−ＭＮＫ２−ＫＯマウスで観察された表現型におけるＪＮＫの役割を排除する（Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚら、１９９７）。
【００９１】
したがって、結果は、ＨＦＤがＷＴマウスの脂肪組織において広範囲の炎症を誘発するが、ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＨＦＤの炎症誘発性の作用に対して保護されることを示す。興味深いことに、ＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤマウスは、インスリン抵抗性及びグルコース不耐性に対する部分的な保護を示すが、それらは、ＷＴ／ＨＦＤ動物と同様の脂肪組織炎症を依然として呈示する。これは、高脂肪摂食に応答するＭＮＫ１及びＭＮＫ２の異なる役割を明確に示す。しかしながら、保護の根拠が異なるように思われることは注目に値し、ＭＮＫ１−ＫＯマウスは、それらの保護と同時に、脂肪増加及び炎症の減少を示す一方、ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＷＴマウスと同様に、体重及び脂肪組織を増加させるが、それでもなお、インスリン抵抗性に対して保護されている。
【００９２】
マクロファージ生物学
ＭＮＫ２−ＫＯマウスからのマクロファージを、それらがＴＮＦα及びＩＬ−６などのサイトカインの産出において本質的に欠陥があるかどうかを判断するために評価した。ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の両方は、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）におけるｅＩＦ４Ｅリン酸化に寄与する（データ示さず）。それらの調節特徴と一致して、ＷＴ  ＢＭＤＭにおけるリポ多糖（ＬＰＳ）によって誘発されたｅＩＦ４Ｅの増加は、ＭＮＫ１−ＫＯ細胞において失われた（データ示さず）。野生型またはＭＮＫ２−ＫＯマウスからのＢＭＤＭを、リポ多糖（ＬＰＳ）によってインビトロで刺激し、サイトカインｍＲＮＡレベルを評価した。ＬＰＳは、野生型及びＭＮＫ２−ＫＯ  ＢＭＤＭのＴｎｆα及びＩＬ−６  ｍＲＮＡのレベルを同様の程度まで増加させた（データ示さず）。これらのデータは、ＭＮＫ２−ＫＯ  ＢＭＤＭの、ＬＰＳに応答し、サイトカインを産出する能力に本質的な欠陥がないことを示す。
【００９３】
ＬＰＳとＩＦＮγとの組み合わせによる長期間（２４時間）の効果を調べて、炎症誘発性Ｍ１表現型に対するＢＭＤＭの極性化を評価した。ＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯ  ＢＭＤＭは、同様に応答し、ＭＮＫ２が、ＢＭＤＭによるこれらの炎症誘発性サイトカインの産出に必要とされないことを示した（データ示さず）。
【００９４】
ＭＮＫ２−ＫＯ／ＨＦＤマウスの血漿において、２つの抗炎症マーカー、Ｉｌ−１０及びＩｌ−５のｍＲＮＡレベルの有意な増加が、ＷＴ／ＨＦＤマウスと比較して観察された（図７Ａ、７Ｂ）。ＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスからのＢＭＤＭの、Ｍ２抗炎症性表現型に分極する固有の能力を調べた。興味深いことに、ＭＮＫ２−ＫＯマウスからのＢＭＤＭは、ＷＴ  ＢＭＤＭと比較して、制御条件下でＩＬ−１０及びＰｐａｒγレベルの上昇を示し、調べられたＭ２極性化の全てのマーカーは、ＩＬ−４での２４時間の刺激後に増加した（図７Ｃ−７Ｆ）。リン酸化されたｅＩＦ４Ｅに関するデータは、ＭＮＫ２がマクロファージにおける主アイソフォームであることを示す（データ示さず）。まとめると、このデータは、ＭＮＫ２−ＫＯマウスからのマクロファージが、抗炎症性表現型に対するより高い傾向を有することを示唆する。
【００９５】
高脂肪摂取は、野生型マウスではなくＭＮＫ２−ＫＯにおいてＮｒｆ２発現を誘導する
核因子赤血球２関連因子２（Ｎｒｆ２）は、広範な脂肪酸酸化から生じ得る酸化ストレスに対する保護において重要な役割を果たし、また、メタボリックシンドロームの発症を防ぐことも報告される。ＭＮＫ２−ＫＯマウスがメタボリックシンドロームの指標に対する保護を示すことを前提として、ＷＴ及びＭＮＫ２−ＫＯマウスの肝臓におけるＮｒｆ２の発現を調べた。レベルは、飼料食を摂取したマウスにおいて同様であった。Ｎｒｆ２  ｍＲＮＡレベルは、ＨＦＤを摂取したＭＮＫ２−ＫＯマウスで顕著に増加したが、対応する対照動物では増加しなかった（図８Ａ）。肝Ｎｒｆ２タンパク質レベルも、ＭＮＫ２−ＫＯマウスにおいて増加を示したが、その変化は、有意に達しなかった。したがって、Ｎｒｆ２機能の増加を確認するために、よく特徴付けられたＮｒｆ２標的遺伝子であるハエムオキシゲナーゼ（ｈａｅｍ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）−１（ＨＯ−１）の発現も試験し、それは、Ｎｒｆ２自体のタンパク質発現と同様のパターンを示した（図８Ｂ）。興味深いことに、Ｎｒｆ２の活性化は、脂肪症を予防すると報告される。Ｎｒｆ２は、ＰＰＡＲαによって転写的に制御され得るが、しかしながら、ＨＦＤのＭＮＫ２−ＫＯまたはＷＴマウスの肝臓では、ＰＰＡＲαレベルの変化は観察されなかった（データ示さず）。
【００９６】
パルミテート誘発性のインスリン抵抗性の治療
インスリン抵抗性のＣ２Ｃ１２骨格筋モデルを使用して、パルミテート（レベル高脂肪食に血液中の増加遊離脂肪酸）処理がＰ−ｅＩＦ４Ｅを増加させることが観察され、したがって、パルミテートがＭＮＫ酵素を活性化することを示した。更なる実験を、１００ｍＭのインスリンで１０及び６０分間刺激する前に、４ｍＭのパルミテートで１６時間処理されたＣ２Ｃ１２細胞を用いて行った。細胞のいくつかを３μＭのＭＮＫ阻害剤、Ｍｎｋ−Ｉ１で更に処理した。結果（図９参照）は、阻害剤がＭＮＫ１及びＭＮＫ２を不活性化したことを示したが（処理された細胞におけるＰ−ｅＩＦ４Ｅのレベル低下を参照されたい）、インスリンシグナル伝達マーカー、Ｐ−ＰＫＢ３０８は、ＭＮＫ阻害剤がパルミテート暴露の間にインスリンシグナリングを回復させることができることを示した。
【００９７】
実施例２  ＭＮＫ１及びＭＮＫ２ダブルノックアウト動物の作製、及び高脂肪食（ＨＦＤ）を用いた研究
ＷＴ及びＭＮＫ−ＫＯマウスにおける研究
本実施例に記載される研究は、５〜６世代にわたるストックＣ５７Ｂｌ／６マウスに対して戻し交配した、実施例１に記載されているようなマウスを用いて行った。次いで、ヘテロ接合ＭＮＫ１−ＫＯ（Ｍｋｎｋ１＋／−）及びＭＮＫ２−ＫＯ（Ｍｋｎｋ２＋／−）マウスを交配して、ＷＴ及びＭＮＫ１＋ＭＮＫ２ダブルＫＯ（Ｍｋｎｋ１−／−；Ｍｋｎｋ２−／−；ＤＫＯ）動物、ならびにＭＮＫ１−ＫＯ（Ｍｋｎｋ１−／−）及びＭＮＫ−ＫＯ（Ｍｋｎ２−／−）動物を得た。ＭＮＫ１及びＭＮＫ２のノックアウトは、マウスの発達、生存能力、または生殖能に影響を及ぼさず（Ｕｅｄａら、２００４）、これと一致することが既に報告されており、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２のノックアウトの有害作用は、飼料食または高脂肪食を摂取したマウスにおいて観察されなかった。飼料食及びＨＦＤは、実施例１に記載したものと同様であった。この場合、飼料食製剤は、Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  １８％Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（Ｅｎｖｉｇｏ、米国、ウィスコンシン州、マジソン）であり、ＨＦＤ製剤は、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｆｅｅｄｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ（Ｄｉｅｔ  ＳＦ１５−０９５；豪州、西オーストラリア州、グレンフォレスト）から調達した。
【００９８】
ＨＦＤでの体重増加
飼料食では、ＷＴ及びＤＫＯマウスは、研究の１６週間の期間にわたって同様の程度まで体重を増加させたが（データは示されていない）、４週齢では、ＭＮＫ１−ＫＯは、ＭＮＫ２−ＫＯまたはＷＴマウスよりもわずかに重かった（データ示さず）。ＧＴＴは、１５〜１６週目に行われたため、その時点以降に得られたデータは、マウスが直面した騒乱のために完全に信頼できるものではない。
【００９９】
カロリー過負荷に対する動物の応答を試験するために、マウスは、離乳時（すなわち、４週齢から）から更に１６週間（２０週齢まで）、飼料食（対照群）または高エネルギー高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられた。ＨＦＤでは、ＷＴマウスは、大幅により多く体重が増加した（ＨＦＤで、１１週間または１５週間で２５または２８ｇ）。重要なことに、かつ実施例１に記載された観察と一致して、ＭＮＫ２−ＫＯマウスは、ＨＦＤにおいてＷＴ対照群よりも実質的により少なく体重が増加し（図１０）、ＭＮＫ２の喪失がＨＦＤでの体重増加に対して保護することを確認した。しかしながら、実施例１に記載された結果とは対照的に、この場合のＭＮＫ１−ＫＯマウスは、実際に、ＷＴ対照群と同様に体重が増加し（図１０）、この差異の理由は、これらの動物が以前に使用された動物と遺伝的に同一でないという事実、使用されたＨＦＤの相違、または他の要因にあるかもしれない。ＤＫＯマウスでは、動物が１５週までにＭＮＫ２−ＫＯマウスよりもわずかに大きな体重増加を示したことが見出されたが、その増加は、ＷＴまたはＭＮＫ１−ＫＯ動物に関して見られるものよりもまだ少ない（図１０）。これは、両方のＭＮＫのノックアウトが、部分的な保護を提供する各ＭＮＫアイソフォーム単独のＫＯよりも、体重増加に対するより大きな保護を提供すると推測されたため、予想外であった。したがって、データは、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２を無効にすることが、ＭＮＫ２単独の損失よりも大きな利益をもたらさず、実際に、体重増加を防止することに関して、それほど有利でない可能性があることを示す。
【０１００】
ＧＴＴデータ
グルコース負荷試験を実施例１に記載したように行って、ＨＦＤ摂食動物がグルコース不耐性（この設定では一般にインスリン抵抗性によって引き起こされる）を発症したかどうかを評価した。飼料食またはＨＦＤのいずれかで１１週間後、６時間の絶食後にグルコース負荷試験（ＧＴＴ）を行った。空腹時グルコース濃度を、マウスに２５％Ｄ−グルコース溶液（２ｇ／ｋｇ体重；Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ、豪州）を腹腔内（ｉｐ）注射する前に、尾の先端から血液した出血から測定し、血中グルコース濃度をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｌｉｔｅグルコメーター（Ａｂｂｏｔｔ、豪州、ニューサウスウェールズ州、マッコリ―パーク）を使用して腹腔内注射後１５、３０、６０、及び１２０分に測定した。ＨＦＤを摂取したマウスは、グルコース耐性障害を示す。実施例１に記載の研究が、ＨＦＤ摂取ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯマウスが、対応するＷＴ動物よりも良好なグルコース耐性を示すということを示したことを前提として、ＭＮＫ１＋２−ＤＫＯマウスは、更に良好なグルコース耐性を示すであろうと予測された。しかしながら、図１１に示すように、これは、事実ではない。実際に、ＭＮＫ１−ＫＯマウスは、ＷＴ−ＨＦＤマウスより良好なグルコース耐性を示さないことが見出された。更に、グルコースのボーラス投与後、ＨＦＤ摂取ＭＮＫ−ＤＫＯマウスにおいて、血漿グルコース値は、これらの遺伝子型のいずれの飼料食摂取マウスの状況と同様に、１２０分までにほぼベースラインまで戻った。したがって、ＭＮＫ２−ＫＯマウス（実施例１参照）と同様に、ＤＫＯ動物は、これらのデータの曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって見られるように（データ示さず）、ＨＦＤを摂取したＷＴマウスより良好なグルコース耐性を示す。ＡＵＣの評価はまた、ＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤマウスが、実際に、ＷＴ／ＨＦＤ動物より劣り、ＭＮＫ−ＤＫＯ／ＨＦＤマウスよりはるかに劣るグルコース耐性を示し、グルコース濃度がＭＮＫ１−ＫＯ／ＨＦＤマウスにおいて著しく高いままであったことを明らかにした（図１１）。
【０１０１】
したがって、ＭＮＫ１の喪失は、ＨＦＤ誘発性グルコース不耐性に対して一貫して保護しないと思われる。これは、なぜＭＮＫ１及びＭＮＫ２の喪失が、ＨＦＤ摂取マウスのＧＴＴにおけるそれらの能力に関して、ＭＮＫ２単独の喪失よりも更なる利益を与えないのかを説明するのに役立つかもしれない。
【０１０２】
まとめると、この実施例で提供されたデータは、ＭＮＫ２をノックアウトすることが、ＨＦＤでのグルコース耐性の改善（代謝の健康）に関して、一貫して有益であることを示す。対照的に、ＭＮＫ１の喪失の効果は、おそらく、正確な遺伝的背景及び／または食餌の正確な成分よって変化すると思われる。更に、両方のＭＮＫのノックアウトは、ＭＮＫ２単独の損失より優れた効果を提供しない。したがって、本開示に従って前糖尿病を治療する方法において、両方の酵素に影響を与える二重阻害剤ではなく、ＭＮＫ２の特異的阻害剤を使用する方が、はるかに信頼性が高く、有効であろう。
【０１０３】
実施例３  ３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるｅＩＦ４Ｅリン酸化に対するＭＮＫ２特異的阻害の効果
３Ｔ３−Ｌ１細胞における研究
実施例１で説明されたように、正常飼料食でのＭＮＫ２−ＫＯマウスは、同量の性腺脂肪組織の同じ量を含有するが、そのような組織は、より少なく、より大きい脂肪細胞（脂肪細胞）を有することが見出された。これは、脂肪細胞の産出（すなわち、脂肪細胞の分化）における欠陥を示唆する。ＨＦＤでは、脂肪細胞は、通常、より大きくなり、動物がより多くの脂肪を貯蔵し、より重くなることを可能にする。しかしながら、ＭＮＫ２−ＫＯマウスでは、脂肪細胞は、ＨＦＤで大きくならず、なぜこれらのマウスがＷＴ／ＨＦＤマウスほど重くならないのかを説明する可能性が高い。理論に縛られることを望まないが、この更なるサイズ増加の欠如は、（ｉ）ＭＮＫ２−ＫＯマウスにおけるより大きな脂肪細胞が貯蔵容量に達し、それらの脂肪含有量を増加させることができないという事実、及び／または（ｉｉ）そのような細胞の、脂肪を貯蔵する本来の能力が損なわれるということ、を反映し得る。
【０１０４】
脂肪細胞分化におけるＭＮＫ２の役割を研究するために、３Ｔ３−Ｌ１細胞を実施例１に記載したのと同様の方法で使用した。３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞は、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ、５００μＭ；ｃＡＭＰを上昇させる）、インスリン（３５０ｎＭ）、デキサメタゾン（０．５μＭ；ステロイド）、及びロシグリタゾン（２μＭ；転写因子ＰＰＡＲγを刺激する）の組み合わせでインキュベートされた時、脂肪細胞に分化する。この刺激の「カクテル」に応答して、これらの細胞は、まずクローン増殖を受け、続いて、転写因子のカスケードの誘導が後続し、脂肪生成に関与する遺伝子の発現を引き起こす。
2019510061.tif 000094
【０１０５】
結果（図１２に示される）は、Ｍｎｋ２  ｍＲＮＡが分化カクテルの添加後に非常に急速に誘導される（＞３倍×３時間、Ｍｎｋ２  ｍＲＮＡ発現が低下してから約６時間まで持続する）ことを明らかにし、それを脂肪生成において役割を果たすように位置付けた。実施例１では、ＭＮＫ阻害剤、ＣＧＰ５７３８０が、Ｃ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγ、及びＳＲＥＢＰ１ｃ（脂質貯蔵に関与する遺伝子の発現を促進する）などの重要な転写因子の誘導を損なうことが示された。また、ＣＧＰ５７３８０がグルコース、ならびに脂質トランスポーターＧＬＵＴ４及びＣＤ３６の発現を阻害することも見出され、なぜ脂肪貯蔵がインビボでＭＮＫ２−ＫＯ脂肪細胞において制限されるのかを少なくとも部分的に説明することができる。ここでは、ＭＮＫも阻害する別の、別の全く異なる化合物、すなわち、セルコスポラミドを試験するための研究を行った。図１３に示すように、セルコスポラミドは、ＰＰＡＲγなどの遺伝子の誘導（図１３Ａ）及び脂質蓄積の減少（図１３Ｂ）も損なう。
【０１０６】
しかしながら、ＣＧＰ５７３８０及びセルコスポラミドは、ＭＮＫに加えて他のタンパク質キナーゼを阻害し、非常に強力なＭＮＫ阻害剤ではなく（Ｂａｉｎら、２００７；Ｋｏｎｉｃｅｋら、２０１１）、例えば、Ｐ−ｅＩＦ４Ｅを強く阻害するためには≧２０μＭの濃度で使用されなければならない。その結果、更なる阻害化合物、ＭＮＫ−Ｉ１（Ｂｅｇｇｓら、２０１５）が研究された。ＭＮＫ−Ｉ１は、ＣＧＰ５７３８０及びセルコスポラミドとは構造的に異なり、はるかにより特異的であり、ＣＧＰ５７３８０によって影響を受け追加のキナーゼを阻害しない（Ｂｅｇｇｓら、２０１５）。それはまた、はるかにより強力であり、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＭＮＫ活性を、はるかに低い濃度（３μＭ；図１４Ａ、１４Ｂ参照；ＣＧＰ５７３８０と比較して、同程度のｐ−ｅＩＦ４Ｅの阻害を見るために５０μＭが必要とされた（図３ｃ参照））で強く阻害する。重要なことに、細胞が、分化を受けるために細胞を少なくとも３日間インキュベートされなければならないことを前提として、ＭＮＫ−Ｉ１のＰ−ｅＩＦ４Ｅに対する効果は、少なくともこの期間持続する。
【０１０７】
ＭＮＫ−Ｉ１は、転写因子Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、及びＰｐａｒγ、ならびに脂肪酸シンターゼ及びアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（Ｆａｓ及びＡｃｃ；脂質生成の重要な酵素）、ならびに脂質輸送体Ｃｄ３６を含む、研究された脂肪生成遺伝子の全ての誘導を損なうことが見出された（図１５Ａ参照）。それはまた、オイルレッドＯ染色（データ示さず）または直接トリグリセリドアッセイ（図１５Ｂ）によって判断されるように、脂質蓄積を遮断した。ＭＮＫ−Ｉ１の効果が完全ではない（すなわち、総阻害ではない）という事実は、脂肪細胞数がＭＮＫ２−ＫＯマウスにおいて減少したが、完全になくならないという観察と一致する。これはまた、ＭＮＫ−２  ＫＯマウスは、対照食餌において同様の総脂肪量を示すが、ＨＦＤを摂取した場合、それらの脂肪増加が大きく減少するという重要な知見と一致する。これは、患者の体重増加が減少または逆転することを意味するため、重要な臨床的意味を有するが、これは、脂肪組織の極度の喪失につながらない。
【０１０８】
更なる研究において、ＭＮＫ−Ｉ１と同様の一連の化合物を生成し、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＭＮＫを阻害するそれらの能力について試験した。化合物の構造を以下の表６に示す。ｅＩＦ４Ｅは、ＭＮＫのみによってリン酸化されるため、そのリン酸化状態は、細胞内ＭＮＫ活性の信頼できる読み出しである。新しい化合物のいくつかは、これらの細胞におけるｅＩＦ４Ｅリン酸化を阻害し、それらがＭＮＫに対して活性であることを示した（表６）。特に、ＭＮＫ−Ｉ２は、３Ｔ３−Ｌ１細胞においてＰ−ｅＩＦ４Ｅを強く阻害し（図１４Ａ参照）、それが強力なＭＮＫ阻害剤であることを示す。更に、ＭＮＫ１対ＭＮＫ２に対するＭＮＫ−Ｉ１及びＭＮＫ−Ｉ２の相対的効果を評価するために、ＭＮＫ１−ＫＯまたはＭＮＫ２−ＫＯ動物からのマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用した。ＭＮＫ１−ＫＯ  ＭＥＦにおいて、ＭＮＫ−Ｉ２は、試験した全ての濃度でＰ−ｅＩＦ４Ｅレベルをほとんど完全に阻害した（最低０．１μＭ）。これは、ＭＮＫ−Ｉ１の効果と同様である（図１６Ａ）。対照的に、ｅＩＦ４Ｅリン酸化がＭＮＫ１に依存するＭＮＫ２−ＫＯ細胞では、ＭＮＫ−Ｉ２は、ＭＮＫ−Ｉ１よりも弱い阻害効果を有し、それがＭＮＫ−Ｉ１よりもＭＮＫ１に対する低い活性を有することを示す（図１６Ｂ）。したがって、これらの結果は、ＭＮＫ１よりもＭＮＫ２に対するＭＮＫ−Ｉ２阻害剤の選択性を示す。ＭＮＫ２は、３Ｔ３−Ｌ１細胞及び脂肪組織における主要なＭＮＫである（Ｍｏｏｒｅら、２０１６）。
【０１０９】
追加の研究では、３Ｔ３−Ｌ１細胞における分化マーカーの誘導に対するＭＮＫ−Ｉ２阻害剤の効果を評価するために試験を行った。ＭＮＫ−Ｉ２が、研究された脂肪生成プログラムにおける遺伝子の全ての誘導を損なうことが見出された（図１７Ａ）。ＭＮＫ−Ｉ２の効果の大きさは、ＭＮＫ−Ｉ１のそれと同様であるか、場合によっては、より大きかった（図１５Ａと１７Ａとを比較）。これらの結果は、それらが、ＭＮＫ２選択的阻害剤、例えば、ＭＮＫ１＋ＭＮＫ２阻害剤ＣＧＰ５７３８０及びＭＮＫ−Ｉ１もまた、脂肪生成を損なうことを示し、ＭＮＫ２が脂肪組織における重要なＭＮＫ２アイソフォームであるという結論を支持するという点において重要である。
【０１１０】
したがって、ＫＯマウス試験から得られたデータ（実施例２参照）及び３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いてインビトロで実施された実験に基づいて（実施例３参照）、ＭＮＫ−２選択的阻害剤は、かなり有望であり、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の阻害剤よりも、前糖尿病対象の治療において有益である可能性が高い。
【０１１１】
【表６】
2019510061.tif 000095
2019510061.tif 000096
2019510061.tif 000097
2019510061.tif 000098
【０１１２】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という語及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、任意の他の整数または整数の群の除外ではなく、記載された整数または整数の群の包括を暗示すると理解されるであろう。
【０１１３】
本明細書にある任意の先行技術への言及は、そのような先行技術が共通の一般知識の一部を形成するといういかなる形態の示唆の認知ではなく、そのように取られるべきではない。
【０１１４】
本発明は、その使用において、記載された特定の用途に限定されないということは、当業者によって理解されるであろう。また、本発明は、本明細書に記載もしくは図示される特定の要素及び／または特徴に関して、その好ましい実施形態において限定されない。本発明は、開示された１つまたは複数の実施形態に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲によって記載され、定義された本発明の範囲から逸脱することなく多数の再構成、修正、及び置換が可能であることが理解されるであろう。
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