(57)【要約】  本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、該抗体又は断片をコードしているポリヌクレオチド、並びに前述のものを作製及び使用する方法に関する。
2019502698.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片であって、ＨＬＡ−ＤＲに対する結合に関して、
ｉ）配列番号５８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号６１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
ｊ）配列番号５６のＶＨ及び配列番号６０のＶＬ、
ｋ）配列番号５７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
ｌ）配列番号１３７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
ｍ）配列番号１３８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
ｎ）配列番号１３９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
ｏ）配列番号１４０のＶＨ及び配列番号１４２のＶＬ、又は
ｐ）配列番号１４１のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ
を含む抗体と競合する、前記抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
ＨＬＡ−ＤＲのアンタゴニストである、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体又はその抗原結合断が、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びヒトＨＬＡ−ＤＲ４を発現しているトランスジェニック動物から単離された樹状細胞の共培養下において、１μｇ／ｍＬの抗体濃度でＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を少なくとも３０％阻害する、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体又はその抗原結合断片が、ＨＬＡ−ＤＲの同種Ｔ細胞受容体との相互作用をブロックしない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記ＨＬＡ−ＤＲが、配列番号７の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲα鎖及び配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲ  β鎖を含むＨＬＡ−ＤＲ４である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体又はその抗原結合断片が、
ａ）配列番号７の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲα鎖と配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲβ鎖とを含むＨＬＡ−ＤＲ４に、平衡解離定数（ＫＤ）５×１０−８Ｍ以下で結合し、ここでＫＤは、ＤＰＢＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０（ＰＳ−２０）及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する緩衝液中、２５℃で、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いて測定される、
ｂ）配列番号７の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲα鎖と配列番号１５のＨＬＡ−ＤＲβ鎖とを含むＨＬＡ−ＤＲ１に、平衡解離定数（ＫＤ）５×１０−８Ｍ以下で結合し、ここでＫＤは、ＤＰＢＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＰＳ−２０及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する緩衝液中、２５℃で、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いて測定される、
ｃ）Ｂ細胞のアポトーシスを誘導する能力を有さず、ここでアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）のサンプル中のＣＤ３−ＣＤ２０＋アネキシンＶ＋ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ−Ｂ細胞の頻度を測定することによって求められる、
ｄ）Ｂ細胞の死を誘導する能力を有さず、ここでＢ細胞の死は、フローサイトメトリーを用いて前記ヒトＰＢＭＣのサンプル中のＣＤ３−ＣＤ２０＋アネキシンＶ＋ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ＋Ｂ細胞の頻度を測定することによって求められる、又は
ｅ）ＨＬＡ−ＤＲのＣＤ４に対する結合を阻害する
との特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
ＨＬＡ−ＤＲが、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ１０、又はＨＬＡ−ＤＲ１５である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
ＨＬＡ−ＤＲα鎖及びＨＬＡ−ＤＲβが、
ａ）それぞれ配列番号１３及び１４、
ｂ）それぞれ配列番号１３及び１５、
ｃ）それぞれ配列番号１３及び１０６、
ｄ）それぞれ配列番号１３及び１０５、
ｅ）それぞれ配列番号１３及び１０７、又は
ｆ）それぞれ配列番号１３及び１０８
のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体又はその抗原結合断片が、約５×１０−８Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）でＨＬＡ−ＤＲ４に結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
ＨＬＡ−ＤＲが、アミノ酸配列ＱＫＲＡＡ（配列番号６６）、ＱＲＲＡＡ（配列番号６７）、又はＲＲＲＡＡ（配列番号６８）からなる共有エピトープを含有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
ＨＬＡ−ＤＲが、ペプチドとの複合体中として存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記ペプチドが、配列番号７、８、９、７１、７２、１０４、又は１２２のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記ペプチドが、配列番号７、８、９、７１、７２、１０４、又は１２２のアミノ酸配列からなる、請求項１２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗体が、アミノ酸残基Ｅ３、Ｆ１０８、Ｄ１１０、及びＲ１４０において配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２に、アミノ酸残基Ｖ１４３及びＱ１４９において配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１に結合する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記抗体が、アミノ酸残基Ｋ２、Ｅ３、Ｖ６、Ｅ８８、Ｖ８９、Ｔ９０、Ｆ１０８、Ｄ１１０、Ｋ１１１、Ｒ１４０、Ｌ１４４、Ｒ１４６、及びＫ１７６において配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２に、アミノ酸残基Ｌ１１４、Ｋ１３９、Ｖ１４２、Ｖ１４３、Ｓ１４４、Ｔ１４５、Ｌ１４７、Ｉ１４８、Ｑ１４９、及びＥ１６２において配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１に結合する、請求項１４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
前記抗体が、アミノ酸残基Ｋ２において配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２に、アミノ酸残基Ｄ４１、Ｓ１２６、Ｒ１３０、Ｖ１４２、及びＱ１４９において配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１に結合する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１７】
前記抗体が、アミノ酸残基Ｉ１、Ｋ２、Ｅ３、Ｄ２７、Ｒ１４０、Ｅ１４１、Ｄ１４２、及びＨ１４３において配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２に、アミノ酸残基Ｈ１６、Ｆ１７、Ｒ２３、Ｒ２５、Ｒ２９、Ｒ３９、Ｄ４１、Ｄ４３、Ｖ４４、Ｖ５０、Ｇ１２５、Ｓ１２６、Ｅ１２８、Ｖ１２９、Ｒ１３０、Ｖ１４２、Ｇ１４６、Ｌ１４７、Ｑ１４９、及びＶ１５９において配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１に結合する、請求項１６に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
ａ）それぞれ配列番号７３、７４、及び７５の重鎖相補性決定領域１、２、及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）配列、並びにそれぞれ配列番号７６、７７、及び７８の軽鎖相補性決定領域１、２、及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）、
ｂ）それぞれ配列番号３９、４２、４６、５０、５２、及び５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｃ）それぞれ配列番号４０、４３、４７、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｄ）それぞれ配列番号４１、４４、４８、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｅ）それぞれ配列番号４１、４５、４９、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｆ）それぞれ配列番号１２３、１２６、１２９、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｇ）それぞれ配列番号１２３、１２６、１３０、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｈ）それぞれ配列番号１２３、１２６、１３１、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｉ）それぞれ配列番号１２４、１２７、１３２、１３４、１３５、及び１３６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｊ）それぞれ配列番号１２５、１２８、１３３、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３
を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１９】
前記抗体が、ＩＧＨＶ１−６９（配列番号６２）、ＩＧＨＶ５−５１（配列番号６３）、又はＩＧＨＶ３＿３−２３（配列番号１６１）に由来する重鎖フレームワークを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２０】
前記抗体が、ＩＧＫＶ３−２０（配列番号６４）、ＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）、又はＩＧＫＶ１−３９（配列番号１６２）に由来する軽鎖フレームワークを含む、請求項１９に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２１】
前記重鎖フレームワーク及び前記軽鎖フレームワークが、
ａ）それぞれＩＧＨＶ１−６９（配列番号６２）及びＩＧＫＶ３−２０（配列番号６４）、
ｂ）それぞれＩＧＨＶ５−５１（配列番号６３）及びＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）、
ｃ）それぞれＩＧＨＶ１−６９（配列番号６２）及びＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）、
ｄ）それぞれＩＧＨＶ３＿３−２３（配列番号１６１）及びＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）、又は
ｅ）それぞれＩＧＨＶ５−５１（配列番号６３）及びＩＧＫＶ１−３９（配列番号１６２）
に由来する、請求項２０に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２２】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号５６、５７、５８、５９、１３７、１３８、１３９、１４０、又は１４１のアミノ酸配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるＶＨを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２３】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号６０、６１、又は１４２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるＶＬを含む、請求項２２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２４】
前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号５６、５７、５８、５９、１３７、１３８、１３９、１４０又は１４１のＶＨ及び配列番号６０又は６１又は１４２のＶＬを含み、前記ＶＨ及び前記ＶＬが、任意追加的に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８個のアミノ酸置換を有する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２５】
ａ）それぞれ配列番号５６及び６０、
ｂ）それぞれ配列番号５７及び６１、
ｃ）それぞれ配列番号５８及び６１、
ｄ）それぞれ配列番号５９及び６１、
ｅ）それぞれ配列番号１３７及び６１、
ｆ）それぞれ配列番号１３８及び６１、
ｇ）それぞれ配列番号１３９及び６１、
ｈ）それぞれ配列番号１４０及び１４２、又は
ｉ）それぞれ配列番号１４１及び６１
のＶＨ及びＶＬを含む、請求項２４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２６】
前記ＶＨ及び前記ＶＬが、
ａ）それぞれ配列番号７９及び８０、
ｂ）それぞれ配列番号８１及び８２、
ｃ）それぞれ配列番号８３及び８２、
ｄ）それぞれ配列番号１２１及び８２、
ｅ）それぞれ配列番号１４３及び８２、
ｆ）それぞれ配列番号１４４及び８２、
ｇ）それぞれ配列番号１４５及び８２、
ｈ）それぞれ配列番号１４６及び１４８、又は
ｉ）それぞれ配列番号１４７及び８２
を含むポリヌクレオチドによってコードされている、請求項２５に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２７】
前記抗体が、
ａ）ＩｇＧ１アイソタイプである、
ｂ）ＩｇＧ２アイソタイプである、
ｃ）ＩｇＧ３アイソタイプである、
ｄ）ＩｇＧ４アイソタイプである、
ｅ）前記抗体のＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの結合を調節する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換を含む、
ｆ）野生型ＩｇＧ２と比較したとき、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ２アイソタイプである、
ｇ）野生型ＩｇＧ１と比較したとき、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ１アイソタイプである、
ｈ）野生型ＩｇＧ１と比較したとき、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含むＩｇＧ１アイソタイプである、又は
ｉ）野生型ＩｇＧ４と比較したとき、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を含むＩｇＧ４アイソタイプである、
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２８】
ａ）それぞれ配列番号８４及び８８、
ｂ）それぞれ配列番号８５及び８９、
ｃ）それぞれ配列番号８６及び８９、
ｄ）それぞれ配列番号８７及び８９、
ｅ）それぞれ配列番号９６及び８８、
ｆ）それぞれ配列番号９７及び８９、
ｇ）それぞれ配列番号９８及び８９、
ｈ）それぞれ配列番号９９及び８９、
ｉ）それぞれ配列番号１４９及び８９、
ｊ）それぞれ配列番号１５０及び８９、
ｋ）それぞれ配列番号１５１及び８９、
ｌ）それぞれ配列番号１５２及び１５４、又は
ｍ）それぞれ配列番号１５３及び８９
の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
前記ＨＣ及び前記ＬＣが、
ａ）それぞれ配列番号９０及び９４、
ｂ）それぞれ配列番号９１及び９５、
ｃ）それぞれ配列番号９２及び９５、
ｄ）それぞれ配列番号９３及び９５、
ｅ）それぞれ配列番号１００及び９４、
ｆ）それぞれ配列番号１０１及び９５、
ｇ）それぞれ配列番号１０２及び９５、
ｈ）それぞれ配列番号１０３及び９５、
ｉ）それぞれ配列番号１５５及び９５、
ｊ）それぞれ配列番号１５６及び９５、
ｋ）それぞれ配列番号１５７及び９５、
ｌ）それぞれ配列番号１５８及び１６０、又は
ｍ）それぞれ配列番号１５９及び９５
のポリヌクレオチドによってコードされている、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
ａ）それぞれ配列番号３９、４２、４６、５０、５２、及び５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号５６のＶＨ及び配列番号６０のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号８４若しくは９６のＨＣ及び配列番号８８のＬＣ
を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３１】
ａ）それぞれ配列番号４０、４３、４７、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号５７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号８５若しくは９７のＨＣ及び配列番号８９のＬＣ
を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３２】
ａ）それぞれ配列番号４１、４４、４８、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号８６若しくは９８のＨＣ及び配列番号８９のＬＣ
を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３３】
ａ）それぞれ配列番号４１、４５、４９、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号５９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号８７若しくは９９のＨＣ及び配列番号８９のＬＣ
を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３４】
前記抗体が、異種分子にコンジュゲートしている、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３５】
前記異種分子が、検出可能な標識又は細胞毒性剤である、請求項３４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３６】
前記抗体が、多重特異的又は二重特異的抗体である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項３８】
ａ）配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、８４、８５、８６、８７、９６、９７、９８、９９、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、若しくは１５４のＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、ＨＣ、ＬＣ、若しくはＨＣ及びＬＣをコードしている、又は
ｂ）配列番号７９、８０、８１、８２、８３、９０、９１、９２、９３、９４、９５、１００、１０１、１０２、１０３、１２１、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、若しくは１６０のポリヌクレオチド配列を含む、
ポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項３８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４０】
請求項３９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４１】
請求項２５に記載の抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、前記抗体が発現する条件で請求項４０に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収することとを含む、前記方法。
【請求項４２】
ＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患を治療又は予防する方法であって、前記ＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項３７に記載の医薬組成物を、前記治療を必要としている対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４３】
前記ＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患が、自己免疫疾患である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記自己免疫疾患が、ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は１型糖尿病である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体又はその抗原結合断片が、第２の治療薬と組み合わせて投与される、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第２の治療薬が、コルチコステロイド又は免疫抑制剤である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
自己抗原に対する免疫応答を抑制する方法であって、前記自己抗原に対する免疫応答を抑制するのに十分な時間、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項３７に記載の医薬組成物を、前記抑制を必要としている対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４８】
前記自己抗原が、自己免疫疾患の患者に存在する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は１型糖尿病である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍を治療する方法であって、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍を治療するのに十分な時間、細胞毒性剤にコンジュゲートしている請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項３７に記載の医薬組成物を治療的に有効な量、前記治療を必要としている対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】
ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍が、血液悪性腫瘍である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記血液悪性腫瘍が、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄性白血病、又は急性単芽球性白血病（ＡＭｏＬ）である、請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍が、神経膠腫、卵巣癌、結腸直腸癌、骨肉腫、子宮頸癌、胃癌、又は結腸、喉頭、骨格筋、乳房、若しくは肺における腫瘍である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項２５に記載の抗体又はその抗原結合断片に結合する抗イディオタイプ抗体。
【請求項５５】
請求項２５に記載の抗体又はその抗原結合断片を含むキット。
【請求項５６】
治療において使用するための、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗体又は請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
ＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患、自己免疫疾患、又は癌の治療において使用するための、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗体又は請求項３７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、その内容全体が参照により本明細書に援用される。２０１６年１２月１５日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイルは、ＪＢＩ５０７８ＷＯＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、サイズは２５４キロバイトである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体及び抗原結合断片、抗体又は断片をコードしているポリヌクレオチド、並びに前述のものを作製及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）のクラスＩＩ分子は、抗原由来ペプチドをＣＤ４＋Ｔ細胞に提示するために用いられる。ヒトは、それぞれ細胞内のペプチドに結合し、かかるペプチドを提示のため細胞表面に輸送する、アルファ／ベータ（α／β）鎖ヘテロ二量体からなる３種のＭＨＣクラスＩＩ分子：ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＲを有する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、Ｂ細胞、マクロファージ、及び樹状細胞を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現する。
【０００４】
ＨＬＡ−ＤＲＡ１によってコードされているＨＬＡ−ＤＲα鎖は、高度に保存されている。ＨＬＡ−ＤＲＢ１又はそのパラログであるＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、又はＨＬＡ−ＤＲＢ５のうちの１つによってコードされているＨＬＡ−ＤＲβ鎖は、超多型性である。すべての個体由来の抗原提示細胞は、ＨＬＡ−ＤＲＡ１によってコードされているアルファ鎖及びＨＬＡ−ＤＲＢ１によってコードされているベータ鎖を発現するが、更に、１本又は２本のＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、及びＨＬＡ−ＤＲＢ５によってコードされている鎖と対合するアルファ鎖を発現し得る。したがって、個体は、遺伝した母方及び父方の対立遺伝子に応じて２〜４つのＨＬＡ−ＤＲアイソフォームを発現し得る。
【０００５】
特にＨＬＡ−ＤＲＢ１は、多くのヒト自己免疫疾患と関連している。ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子における変異は、ＨＬＡ−ＤＲによって提示される特異的ペプチドに影響を与える場合があり、これにより、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞がどのＨＬＡ−ＤＲ／ペプチド複合体を認識し、応答するかに影響が生じ得る。ＨＬＡ−ＤＲＢ１と自己免疫疾患との遺伝的関連は、疾患の発症及び／又は進行においてヘルパーＴ細胞にペプチドが提示されていることを意味する。Ｔ細胞が、活性化により自己ペプチドを外来分子として最初に認識することが、自己免疫疾患の早期段階であるものと考えられる。病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、組織の損傷を直接引き起こし得るだけでなく、自己抗体の産生につながるＢ細胞の活性化をトリガーすることもある。
【０００６】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１における多型は、関節リウマチ（ＲＡ）、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、及び１型糖尿病を含む疾患に関連していることが見出されている（Ｇｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００７；８（７）：４５３〜４６５及びＳｈｉｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００９；５４：１５〜１９によって概説されている）。ベータ鎖のペプチド結合ポケット側のアミノ酸７０〜７４は、「共有エピトープ」と呼ばれており、正に帯電している残基（ＱＫＲＡＡ、ＱＲＲＡＡ、又はＲＲＲＡＡ）を含む。共有エピトープは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子であるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０１、＊０１：０２、＊０４：０１、＊０４：０４、＊０４：０５、＊０４：０８、及び＊１０：０１に存在し、これらは、アミノ酸アルギニンがシトルリンに改変されているシトルリン化ペプチドを優先的に提供すると考えられる。ＲＡ患者の約３分の２は、「共有エピトープ」ＨＬＡ−ＤＲ分子による提示後にシトルリン化ペプチドが認識される結果として生じると仮定されている、血清中に存在しＡＣＰＡ（抗シトルリン化タンパク質抗体）と呼称される自己抗体を有する。
【０００７】
ＨＬＡ−ＤＲは、様々な血液悪性腫瘍及び固形腫瘍でも発現し、これら適応症における抗体に基づく療法について研究が続けられているものの（Ｓｃｈｗｅｉｇｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐ  ６１（１２）２３６７〜７３，２０１２；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ  １０８：２７３６〜４４；Ａｌｔａｍｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００３  ２２：６５６４〜６５６９）、このアプローチには安全上の懸念が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、自己免疫疾患及びＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍などのＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患を治療するための治療法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片であって、ＨＬＡ−ＤＲに対する結合に関して、
配列番号５８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号６１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号６０のＶＬ、
配列番号５７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号１３７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号１３８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号１３９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号１４０のＶＨ及び配列番号１４２のＶＬ、又は
配列番号１４１のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む抗体と競合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１０】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号７３、７４、及び７５の重鎖相補性決定領域１、２、及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）、並びにそれぞれ配列番号７６、７７、及び７８の軽鎖相補性決定領域１、２、及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）、
それぞれ配列番号３９、４２、４６、５０、５２、及び５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号４０、４３、４７、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号４１、４４、４８、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号４１、４５、４９、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号１２３、１２６、１２９、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号１２３、１２６、１３０、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号１２３、１２６、１３１、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号１２４、１２７、１３２、１３４、１３５、及び１３６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
それぞれ配列番号１２５、１２８、１３３、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１１】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片であって、本明細書に記載される特定のＶＨ、ＶＬ、ＨＣ、及びＬＣアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１２】
また、本発明は、以下
それぞれ配列番号３９、４２、４６、５０、５２、及び５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号６０のＶＬ、並びに／又は
配列番号８４若しくは９６のＨＣ及び配列番号８８のＬＣを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１３】
また、本発明は、以下
それぞれ配列番号４０、４３、４７、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、並びに／又は
配列番号８５若しくは９７のＨＣ及び配列番号８９のＬＣを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１４】
また、本発明は、以下
それぞれ配列番号４１、４４、４８、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、並びに／又は
配列番号８６若しくは９８のＨＣ及び配列番号８９のＬＣを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１５】
また、本発明は、以下
それぞれ配列番号４１、４５、４９、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号５９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、並びに／又は
配列番号８７若しくは９９のＨＣ及び配列番号８９のＬＣを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１６】
また、本発明の抗体は、異種分子にコンジュゲートしている、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１７】
また、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
また、本発明は、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、８４、８５、８６、８７、９６、９７、９８、９９、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４９、１５０、１５１、１５２、１５４、１５４のＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、ＨＣ、ＬＣ、若しくはＨＣ及びＬＣをコードしている、又は配列番号７９、８０、８１、８２、８３、９０、９１、９２、９３、９４、９５、１００、１０１、１０２、１０３、１２１、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、若しくは１６０のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２０】
また、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２１】
また、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、該抗体が発現する条件で本発明の宿主細胞を培養することと、該宿主細胞によって産生された抗体を回収することとを含む方法を提供する。
【００２２】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患を治療又は予防する方法であって、ＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の本発明の抗体又はその抗原結合断片を、かかる治療又は予防を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００２３】
また、本発明の方法は、自己抗原に対する免疫応答を抑制する方法であって、自己抗原に対する免疫応答を抑制するのに十分な時間、本発明の抗体又はその抗原結合断片を、かかる抑制を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍を治療する方法であって、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍を治療するのに十分な時間、細胞毒性剤にコンジュゲートしている本発明の抗体又はその抗原結合断片を、かかる治療を必要としている対象に治療的に有効な量で投与することを含む、方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【００２６】
また、本発明は、本発明の抗体又は抗原結合断片を含むキットを提供する。
【００２７】
また、本発明の抗体は、治療において使用するための本発明の抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】選択抗体のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列及びＨＣＤＲ１属の配列（HCDR1 genus sequence）を示す。属の配列（genus sequence）は、抗体モデリングのためのデフォルトプロトコールを用いてＭＯＥ（ＣＣＧ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）においてすべてのＦｖ（ＶＨ／ＶＬ対）について分子モデルを作成することによって決定した。異なる長さを有するＣＤＲについては、構造的に保存されている領域に基づいてこれら構造モデルをアラインメントし、構造的に等価なＣＤＲ位置を同定した。
【図２】選択抗体のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列及びＨＣＤＲ２属の配列を示す。ＨＣＤＲ２属の配列は図１に記載のとおり作成した。
【図３】選択抗体のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列及びＨＣＤＲ３属の配列を示す。ＨＣＤＲ３属の配列は図１に記載のとおり作成した。
【図４】選択抗体のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列及びＬＣＤＲ１属の配列を示す。ＬＣＤＲ１属の配列は図１に記載のとおり作成した。
【図５】選択抗体のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列及びＬＣＤＲ２属の配列を示す。ＬＣＤＲ２属の配列は図１に記載のとおり作成した。
【図６】選択抗体のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列及びＬＣＤＲ３属の配列を示す。ＬＣＤＲ３属の配列は図１に記載のとおり作成した。
【図７】ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する選択抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。ＶＨドメインは、各行の先頭の配列番号によって特定される。ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔにより定義）には下線を付している。
【図８】ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する選択抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。ＶＬドメインは、各行の先頭の配列番号によって特定される。ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔにより定義）には下線を付している。
【図９】Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）技術を用いて測定されたＤＲ４Ｇ８９（ＨＬＡ−ＤＲ４と血球凝集素ペプチドＨＡ＿３０４−３１８との複合体）に対する指定の抗体の結合を示す。ＥＣＬ：電気化学発光シグナル。
【図１０】ＭＳＤ技術を用いて測定されたＤＲ４Ｇ９３（ＨＬＡ−ＤＲ１と血球凝集素ペプチドＨＡ＿３０４−３１８との複合体）に対する指定の抗体の結合を示す。ＥＣＬ：電気化学発光シグナル。
【図１１】ＭＳＤ技術を用いて測定されたＤＲ４Ｇ９０（ＨＬＡ−ＤＲ４とＩＩ型コラーゲンペプチドＣＩＩ＿１２３６−１２４９との複合体）に対する指定の抗体の結合を示す。ＥＣＬ：電気化学発光シグナル。
【図１２】ＭＳＤ技術を用いて測定されたＤＲ４Ｇ９９（ＨＬＡ−ＤＲ１とＩＩ型コラーゲンペプチドＣＩＩ＿１２３６−１２４９との複合体）に対する指定の抗体の結合を示す。ＥＣＬ：電気化学発光シグナル。
【図１３】２μｇ／ｍＬ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を用い２０時間培養した後のヒトＰＢＭＣにおける、細胞死を起こしたＢ細胞（％アネキシンＶ＋Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ＋ＣＤ３−ＣＤ２０＋）の頻度を、アイソタイプ対照と比較して示す。
【図１４】２μｇ／ｍＬ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を用い２０時間培養した後のヒトＰＢＭＣにおける、アポトーシスＢ細胞（％アネキシンＶ＋Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ−ＣＤ３−ＣＤ２０＋）の頻度を、アイソタイプ対照と比較して示す。
【図１５Ａ】ＤＲ４Ｂ１１７と複合体を形成しているＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲ４Ｇ８６）の構造を示す。
【図１５Ｂ】ＤＲ４Ｂ１２７と複合体を形成しているＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲ４Ｇ８６）の構造を示す。
【図１５Ｃ】Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と複合体を形成しているＨＬＡ−ＤＲ４の構造を示す。
【図１６Ａ】ＤＲ４Ｂ１１７及びＤＲ４Ｂ１２７は、ＨＬＡ−ＤＲの同種（cognate）ＴＣＲとの相互作用をブロックしないが、ＤＲ４Ｂ４、ＤＲ４Ｂ５、及びＤＲ４Ｂ６はブロックすることを示す。
【図１６Ｂ】ＤＲ４Ｂ２２、ＤＲ４Ｂ３０、及びＤＲ４Ｂ３３は、ＨＬＡ−ＤＲの同種ＴＣＲとの相互作用をブロックしないが、ＤＲ４Ｂ６はブロックすることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）すべての刊行物は、参照によりそれらの全体が記載されているのと同様に、本明細書に援用される。
【００３０】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００３１】
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用できるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が用いられる。
【００３２】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどを含む。
【００３３】
「特異的結合」、「特異的に結合する」、「特異的に結合」、又は「結合する」とは、抗体が抗原又は該抗原内部のエピトープに、他の抗原に対するよりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、抗体は、約１×１０−７Ｍ以下、例えば、約５×１０−８Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、又は約１×１０−１２Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原又は該抗原内部のエピトープに結合し、典型的には、該ＫＤは、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合に関してのＫＤの少なくとも１／１００以下である。解離定数は標準的手法を用いて測定することができる。しかし、抗原又は抗原内部のエピトープに特異的に結合する抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ（コモンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合がある。単一特異性抗体は、１つの抗原又は１つのエピトープに特異的に結合するのに対し、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原又は２つの異なるエピトープに特異的に結合する。「ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体」又は「抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体」とは、少なくとも、それぞれ配列番号１３及び１４に示すアミノ酸配列を有するＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２α鎖及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１β鎖で構成されるＨＬＡ−ＤＲ４に特異的に結合する抗体を指す。様々なＨＬＡ−ＤＲタンパク質は、ＨＬＡ−ＤＲα及びＨＬＡ−ＤＲβ鎖をコードしている遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされているので、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、他のＨＬＡ−ＤＲタンパク質、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ１０、及びＨＬＡ−ＤＲ１５にも特異的に結合し得る。
【００３４】
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性又は多重特異性抗体、二量体、四量体又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、及び必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された形態を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体分子」は、ジスルフィド結合によって相互に接続されている２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメインで構成され、該重鎖定常ドメインは、サブドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）で構成される。ＶＨ及びＶＬは、フレームワーク領域（ＦＲ）に散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に区分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。
【００３５】
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体における「抗原結合部位」である。ＣＤＲは、様々な用語を用いて定義され得る：（ｉ）ＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列多様性に基づく（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，（１９７０）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２：２１１−５０；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）存在する「超可変性領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋによって定義されているとおり、構造が超可変性である抗体可変ドメインの領域を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，（１９８７）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１〜１７）。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位についての標準化付番及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴの表記間の対応関係については、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐａｒａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５〜７７に記載されている。本明細書で使用されている「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、本明細書において別途記載のない限り、上掲のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより記載されている方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
【００３６】
免疫グロブリンは、重鎖定常領域アミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
【００３７】
「抗原結合断片」は、元の完全長抗体の抗原結合特性を保持している免疫グロブリン分子の部分を指す。代表的な抗原結合断片は、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２及び／又は３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２及び／又は３、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びＦｖ断片、並びに１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインのいずれかからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）である。ＶＨ及びＶＬドメインは、合成リンカーを介して互いに連結されて、ＶＨ／ＶＬドメインが、分子内で、又はＶＨ及びＶＬドメインが別々の鎖によって発現される場合には分子間で対形成して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの一価の抗原結合部位又はダイアボディを形成する様々な種類の一本鎖抗体の設計を形成することができる。例えば、国際公開第１９９８／４４００１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号、同第１９９２／０１０４７号に記載されている。
【００３８】
「モノクローナル抗体」は、抗体重鎖からＣ末端リジンを除去するなどの可能な周知の変更を除き、各重鎖及び各軽鎖において単一のアミノ酸組成を有する抗体集団を指す。モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原エピトープに結合する二重特異性のモノクローナル抗体を除き、典型的には１つの抗原エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団中に不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性若しくは多重特異性、又は一価、二価、若しくは多価であり得る。二価抗体は、モノクローナル抗体という用語に含まれる。
【００３９】
「単離された」とは、組み換え細胞などの分子が産生されるシステムに関係する他の成分から実質的に分離及び／又は精製されている、分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又は抗体などのタンパク質）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体」とは、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない抗体を指し、より高純度、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度に単離された抗体を包含する。
【００４０】
「ヒト化抗体」とは、抗原結合部位が非ヒト種に由来し、可変領域フレームワークがヒト由来の免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワーク内に置換を含む可能性があることから、該フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子の配列の正確なコピーでなくてもよい。
【００４１】
「ヒト抗体」とは、フレームワーク及び抗原結合部位の両方がヒト由来の配列に由来する重鎖及び軽鎖可変ドメインを有する抗体を指す。抗体が定常ドメイン又は定常ドメインの一部を含む場合、定常ドメインもヒト由来の配列に由来する。
【００４２】
ヒト抗体は、抗体の可変ドメインがヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト由来の配列に「由来する」重鎖又は軽鎖可変ドメインを含む。このような代表的な系は、ファージ又は哺乳類細胞に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及び本明細書に記載されているヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するマウス又はラットなどの非ヒトトランスジェニック動物である。「ヒト抗体」は、例えば天然に存在する体細胞突然変異、あるいはフレームワーク若しくは抗原結合部位、又はこれらの両方への意図的な置換の導入により、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子と比較したときにアミノ酸の相違を含み得る。典型的には、ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。一部の場合では、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７〜８６に記載されている、ヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載されている、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含み得る。
【００４３】
ヒト免疫グロブリン配列に由来するヒト抗体は、ファージディスプレイ組み込み合成ＣＤＲ及び／又は合成フレームワークなどの系を用いて作製することもでき、インビトロ突然変異誘発に供して抗体特性を改善した結果、インビボにおけるヒト抗体生殖系列レパートリーでは発現されない抗体を得ることもできる。
【００４４】
抗原結合部位が非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
【００４５】
「組み換え体」とは、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離された抗体及びその他のタンパク質を指す。「組み換え抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック若しくはトランスクロモソーマルである動物（例えばマウス）又はそれから調製されたハイブリドーマ（以下で更に説明する）から単離された抗体、該抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、組み換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、並びにヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライスすることを伴う任意の他の手段により調製、発現、作製、又は単離された抗体、あるいは二重特異的抗体などのＦａｂアーム交換を用いてインビトロで生成される抗体などの、組み換え手段により調製、発現、作製、又は単離されるすべての抗体を含む。
【００４６】
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原の部分を指す。エピトープは典型的には、化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）部分の表面集団、例えばアミノ酸又は多糖側鎖などの部分の表面集団からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、立体配座上の空間単位を形成する連続的な及び／又は不連続なアミノ酸によって構成され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分にあるアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するようになる。
【００４７】
「パラトープ」は、抗原に特異的に結合する抗体の部分を指す。パラトープは元々一つながりのものであってもよく、又は一つながりの連続するアミノ酸ではなく抗体のアミノ酸のうち隣接していないもの同士が空間的に関係することによって形成される非連続なものであってもよい。「軽鎖パラトープ」及び「重鎖パラトープ」又は「軽鎖パラトープのアミノ酸残基」及び「重鎖パラトープのアミノ酸残基」はそれぞれ、抗原と接触する抗体の軽鎖残基及び重鎖残基を指し、あるいは概して「抗体パラトープ残基」は、抗原と接触するこれらの抗体アミノ酸を指す。
【００４８】
「二重特異性」は、２つの異なる抗原、又は同じ抗原中の２つの異なるエピトープと特異的に結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、他の関連する抗原に対して交差反応性を有し得るか、又は２つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合することができる。
【００４９】
「多重特異性」とは、少なくとも２種の異なる抗原と特異的に結合する抗体、又は同じ抗原内の少なくとも２箇所の異なるエピトープと結合する抗体を指す。多重特異性抗体は、例えば、２種、３種、４種、若しくは５種の異なる抗原、又は同じ抗原内の異なるエピトープに結合し得る。
【００５０】
「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の等価な共有結合化学によって共有結合したヌクレオチド鎖を含む合成分子を指す。ｃＤＮＡは、合成ポリヌクレオチドの典型例である。
【００５１】
「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されポリペプチドを形成している少なくとも２つのアミノ酸残基を含んでなる分子を指す。
【００５２】
「ペプチド」とは、３０アミノ酸長以下の短いポリペプチドを指す。
【００５３】
「変異体」は、１つ以上の改変、例えば、１つ以上の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
【００５４】
「ベクター」は、生物系内で複製可能な、又はそのような系間を移動することができる、ポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、ベクターを複製することができる生物学的要素を利用して生物系（例えば、細胞、ウイルス、動物、植物）及び再構成された生物系におけるこれらポリヌクレオチドの複製又は維持を促進する機能を有する、複製起点、ポリアデニル化シグナル、又は選択マーカーなどの要素を含有する。ベクターポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又はこれらのハイブリッドであり得る。
【００５５】
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指令するために、生物系又は再構成された生物系において利用できるベクターを指す。
【００５６】
「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は明細書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に従う１つの標準偏差又は５％までの範囲のいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
【００５７】
「サンプル」とは、対象から単離された類似の流体、細胞、又は組織に加えて、対象の体内に存在する流体、細胞、又は組織の収集物を指す。代表的なサンプルは、血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ液、尿、唾液、嚢胞液、涙液、糞便、喀痰などの体液、分泌組織及び器官の粘膜からの分泌液、膣分泌液、腹水、胸膜腔、心膜腔、腹膜腔、腹腔、及び他の体腔の流体、気管支洗浄液によって回収された流体、滑液、対象又は生物源、例えば、細胞及び器官の培養培地（細胞又は器官の培養上清を含む）、洗浄液などと接触した液体溶液、組織生検、穿刺吸引、外科的に切除された組織、器官の培養物又は細胞の培養物である。
【００５８】
「〜と組み合わせて」は、２つ以上の治療薬を、混合物の状態で一緒に、単剤として同時に又、は単剤として任意の順序で逐次、対象に投与することを意味する。
【００５９】
「アンタゴニスト」とは、細胞タンパク質に結合したとき、該タンパク質の天然のリガンドによって誘導される少なくとも１つの反応又は活性を抑制する分子を指す。分子は、該少なくとも１つの反応若しくは活性が、アンタゴニストの非存在下（例えば、陰性対照）で抑制される少なくとも１つの反応若しくは活性よりも少なくとも約３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％多く抑制されるとき、又はアンタゴニストの非存在下における抑制と比較して抑制が統計的に有意であるとき、アンタゴニストである。代表的なアンタゴニストは、Ｔ細胞の活性化、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を阻害する、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体である。
【００６０】
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」は、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物などのすべての脊椎動物を含む。「患者」及び「対象」は、本明細書では互換的に使用される。
【００６１】
「ヒト白血球抗原ＨＬＡ−ＤＲ」又は「ＨＬＡ−ＤＲ」とは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ細胞表面受容体を指す。ＨＬＡ−ＤＲは、各サブユニットが膜を１回貫通するα及びβ鎖のヘテロ二量体である。ＨＬＡ−ＤＲα鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＡ１によってコードされており、ＨＬＡ−ＤＲβ鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、又はそのパラログであるＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、若しくはＨＬＡ−ＤＲＢ５のうちの１つによってコードされている。ＨＬＡ−ＤＲＢ１は、周知であるとおり、超多型性である。様々なＨＬＡ−ＤＲα及びＨＬＡ−ＤＲβ鎖の命名法、ｃＤＮＡ、及びアミノ酸配列は、周知である。例えば、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標））データベースは、ＨＬＡ−ＤＲＡ１及びＨＬＡ−ＤＲＢによってコードされているタンパク質のアミノ酸配列、並びにそのアミノ酸アラインメントを提供する。ＨＬＡの命名法は、ＨＬＡ遺伝子及びタンパク質の配列、並びにＨｔｔｐ：＿／＿ｈｌａ＿ａｌｌｅｌｅｓ＿ｏｒｇに見出すことができ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）４３：Ｄ４２３−４３１及びＭａｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ（２０１０）７５：２９１〜４５５に引用されているＨＬＡ対立遺伝子番号についての統計値を提供する。
【００６２】
「ＨＬＡ−ＤＲ４」又は「ＤＲ４」とは、血清学的グループ４に含まれる特定のＨＬＡ抗原を指す。ＨＬＡ−ＤＲ４α鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１によってコードされており、ＨＬＡ−ＤＲ４β鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４によってコードされている。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４は、多型性であり、当該技術分野において周知であるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５などを含む様々な変異体をコードしている。
【００６３】
「ＨＬＡ−ＤＲ１」又は「ＤＲ１」とは、血清学的グループ１に含まれる特定のＨＬＡ抗原を指す。ＨＬＡ−ＤＲ１α鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１によってコードされており、ＨＬＡ−ＤＲ１β鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１遺伝子によってコードされている。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１は、多型性であり、当該技術分野において周知であるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０５などを含む様々な変異体をコードしている。
【００６４】
「ＨＬＡ−ＤＲ３」又は「ＤＲ３」とは、血清学的グループ３に含まれる特定のＨＬＡ抗原を指す。ＨＬＡ−ＤＲ３α鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１によってコードされており、ＨＬＡ−ＤＲ３β鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３遺伝子によってコードされている。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３は、多型性であり、当該技術分野において周知であるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３：０５などを含む様々な変異体をコードしている。
【００６５】
「ＨＬＡ−ＤＲ１０」又は「ＤＲ１０」とは、血清学的グループ１０に含まれる特定のＨＬＡ抗原を指す。ＨＬＡ−ＤＲ１０α鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１によってコードされており、ＨＬＡ−ＤＲ１０β鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０遺伝子によってコードされている。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０は、多型性であり、当該技術分野において周知であるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０：０５などを含む様々な変異体をコードしている。
【００６６】
「ＨＬＡ−ＤＲ１５」又は「ＤＲ１５」とは、血清学的グループ１５に含まれる特定のＨＬＡ抗原を指す。ＨＬＡ−ＤＲ１５α鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１によってコードされており、ＨＬＡ−ＤＲ１５β鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５遺伝子によってコードされている。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５は、多型性であり、当該技術分野において周知であるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０５などを含む様々なＨＬＡ−ＤＲＢ１タンパク質をコードしている（ecodes）。
【００６７】
「共有エピトープ」とは、そのβ鎖の第３の超可変領域における特定のＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子によって共有されている共通の構造モチーフを指す。この共通のモチーフは、ペプチド結合ポケット（残基７０〜７４）の側に５つのアミノ酸が延出しており、ＱＫＲＡＡ（配列番号６６）、ＱＲＲＡＡ（配列番号６７）、又はＲＲＲＡＡ（配列番号６８）のアミノ酸配列を有する。共有エピトープは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子であるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０１、＊０１：０２、＊０４：０１、＊０４：０４、＊０４：０５、＊０４：０８、及び＊１０：０１に存在する。
【００６８】
本明細書で使用するとき、「アポトーシス」とは、細胞内で生じ得るプログラム細胞死（ＰＣＤ）のプロセスを指す。
【００６９】
「Ｂ細胞の死」とは、急性の組織損傷から生じ、炎症応答、アポトーシスによる細胞死を引き起こす、又は任意の他の手段による細胞死の形態である、偶発的なＢ細胞死（壊死）を指す。
【００７０】
「複合体における／複合体として」又は「複合体化された」とは、ＨＬＡ−ＤＲα鎖、ＨＬＡ−ＤＲβ鎖、及びＨＬＡ−ＤＲ分子における周知のペプチド結合溝に存在する１つのペプチドに関する複合体を指す。インビボにおいて、ペプチド／ＨＬＡ−ＤＲ相互作用は、非共有結合性である。インビトロにおいて、ペプチドは、例えば、β鎖のＮ末端に共有結合し得る。したがって、「複合体における／複合体として」は、ＨＬＡ−ＤＲと非共有結合的に及び共有結合的に結合しているペプチドとの複合体のいずれをも包含する。
【００７１】
「Ｔ細胞活性化」とは、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞の１つ以上の細胞応答、例えば、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞毒性エフェクター分子の放出、細胞毒性活性、及び活性化マーカーの発現を指す。
【００７２】
「ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患」とは、特定のＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子又はハプロタイプとの遺伝的関連が既に同定されているか又は同定されるであろう自己免疫疾患を指す。
【００７３】
「ＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患」とは、ＨＬＡ−ＤＲのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）への結合によって少なくとも部分的に介在される疾患を指す。
【００７４】
本明細書全体を通して、抗体の定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、特に明示的に指定しない限り、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のとおりＥＵインデックスに従っている。
【００７５】
表１に示す従来の１文字及び３文字アミノ酸コードが本明細書で使用される。
【００７６】
【表１】
2019502698.tif 000003
【００７７】
組成物
本発明は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を阻害するＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、所望により、枯渇せず、ＨＬＡ−ＤＰにもＨＬＡ−ＤＱにも結合を示さず、したがって、感染中に免疫応答を生じさせるために必要な、ＨＬＡ−ＤＰ又はＨＬＡ−ＤＱにおける他のペプチドの提示に対しては効果を有しないものの、自己免疫疾患に関連する自己ペプチドの提示にのみ干渉することによって、改善された安全性プロファイルを提供し得る。本発明は、本発明の抗体をコードしているポリペプチド及びポリヌクレオチド、又はその相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにこれらを作製及び使用する方法を提供する。
【００７８】
本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、ＨＬＡ−ＤＲに対する結合に関して、
ａ）配列番号５８の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号６１の軽鎖可変領域（ＶＬ）、
ｂ）配列番号５６のＶＨ及び配列番号６０のＶＬ、
ｃ）配列番号５７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
ｄ）配列番号１３７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
ｅ）配列番号１３８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
ｆ）配列番号１３９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
ｇ）配列番号１４０のＶＨ及び配列番号１４２のＶＬ、又は
ｈ）配列番号１４１のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む抗体と競合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００７９】
それぞれ配列番号５８及び６１（ｍＡｂ  ＤＲ４Ｂ１２７）又は５６及び６０（ｍＡｂ  ＤＲ４Ｂ１１７）のＶＨ及びＶＬを含む抗体は、固有の機序によってＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を阻害すると同定された。ＤＲ４Ｂ１２７及びＤＲ４Ｂ１１７は、ＨＬＡ−ＤＲの同種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）との相互作用に干渉するのではなく、ＣＤ４結合部位においてＨＬＡ−ＤＲに結合した。特定の理論によって束縛されるものではないが、ＤＲ４Ｂ１２７及びＤＲ４Ｂ１１７は、ＨＬＡ−ＤＲ分子における高次構造の変化及び／又は空間的な変化を誘導可能であることから、ＨＬＡ−ＤＲ及び同種Ｔ細胞受容体間又はＨＬＡ−ＤＲ及びＴ細胞共受容体ＣＤ４間の相互作用を防ぐ。したがって、ＤＲ４Ｂ１２７及びＤＲ４Ｂ１１７は、Ｔ細胞のシグナル伝達を急性的に混乱させ得るが、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性Ｔ細胞の長期にわたる抑制も誘導し得る。抗体の存在に起因して記憶Ｔ細胞とＨＬＡ−ＤＲとが長期にわたって接触しないことから、Ｔ細胞プールからの喪失が引き起こされた。ＨＬＡ−ＤＲに結合し、ＣＤ４の結合に干渉する抗体は、ＣＤ４を結合させずに非生産的なＨＬＡ−ＤＲ／ＴＣＲ会合を継続させることができ、同時刺激を抑制し、その結果、アネルギーが生じる。したがって、非ＴＣＲ部位においてＨＬＡ−ＤＲをブロッキングすることによってＴ細胞の活性化を防ぐ抗体（例えば、ＤＲ４Ｂ１２７及びＤＲ４Ｂ１１７、並びにＨＬＡ−ＤＲへの結合に関してＤＲ４Ｂ１２７及びＤＲ４Ｂ１１７と交差競合する抗体）は、自己免疫疾患の治療だけでなく、予防にも有益であり得る。ＨＬＡ−ＤＲへの結合に関して交差競合する代表的な抗体は、抗体ＤＲ４Ｂ３０、ＤＲ４Ｂ１１７、ＤＲ４Ｂ１２７、ＤＲ４Ｂ７８、ＤＲ４Ｂ３８、ＤＲ４Ｂ７０、ＤＲ４Ｂ２２、及びＤＲ４Ｂ３３である。本明細書で示されたとおり、対照抗体ＤＲ４Ｂ４、ＤＲ４Ｂ５、及びＤＲ４Ｂ６は、ＨＬＡ−ＤＲのＴＣＲへの結合をブロックした。
【００８０】
ＨＬＡ−ＤＲへの結合に関しての、特定のＶＨ及びＶＬ配列を含む本発明の抗体又はその抗原結合断片との競合は、周知の方法を用いてインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識抗体の存在下でのＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏタグ（商標）ＮＨＳ−エステル標識抗体の可溶性組み換えＨＬＡ−ＤＲへの結合は、ＥＬＩＳＡによって評価することもでき、又はＢｉａｃｏｒｅ分析法若しくはフローサイトメトリーを用いて本発明の抗体との競合を示すこともできる。代表的なアッセイでは、１０μｇ／ｍＬの可溶性ＨＬＡ−ＤＲ分子ＤＲ４Ｇ８９又はＤＲ４Ｇ９９（本明細書に記載）５μＬをＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に２時間吸収させ、次いで、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  １５０μＬで３回洗浄する。プレートを４℃で一晩５％  ＢＳＡ緩衝液でブロッキングする。翌日、プレートを０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４で３回洗浄し、続いて、ルテニウム（Ｒｕ）で標識し１ｍＭ試験ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂと共に３０分間室温で予めインキュベートしておいた参照ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂの混合物を添加する。穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした後、プレートを０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄する。ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔを蒸留水で希釈し（４倍）、各ウェルに分注し、次いで、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で分析する。試験抗体が参照抗体のＨＬＡ−ＤＲへの結合を８０％以上、例えば、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上阻害するとき、試験抗体は、ＨＬＡ−ＤＲへの結合に関して参照抗体と競合する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＨＬＡ−ＤＲのアンタゴニストである。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、Ｔ細胞の活性化を阻害する。
【００８３】
Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞の増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞毒性エフェクター分子の放出、細胞毒性活性、又は活性化マーカーの発現であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞の活性化を阻害する代表的な抗体は、本明細書に記載される抗体ＤＲ４Ｂ３０、ＤＲ４Ｂ１１７、ＤＲ４Ｂ１２７、ＤＲ４Ｂ７８、ＤＲ４Ｂ３８、ＤＲ４Ｂ７０、ＤＲ４Ｂ２２、ＤＲ４Ｂ９８、及びＤＲ４Ｂ３３である。
【００８４】
Ｔ細胞の活性化は、樹状細胞又は他の抗原提示細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養する混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いて決定することができ、該細胞の増殖は、３Ｈ−チミジンの取り込みによって及び本明細書に記載される方法を用いることによって決定される。抗体は、アイソタイプ対照と比較して、Ｔ細胞の活性の少なくとも１つの特徴（例えば、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞毒性エフェクター分子の放出、細胞毒性活性、又は活性化マーカーの発現）を３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％阻害するとき、又はアイソタイプ対照の存在下における阻害と比較して、統計的に有意に阻害するとき、「Ｔ細胞の活性化を阻害する」。「アイソタイプ対照」は、周知である。あるいは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、増加したインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）又はＴＮＦ−αの分泌をＭＬＲアッセイにおいて測定することによってアッセイすることもできる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びヒトＨＬＡ−ＤＲ４を発現しているトランスジェニック動物から単離された樹状細胞の共培養下において、１μｇ／ｍＬの抗体濃度でＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を少なくとも３０％阻害する。
【００８６】
ヒトＨＬＡ−ＤＲ４を発現する代表的なトランスジェニック動物は、マウス系統４１４９、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓである。これらのマウスは、マウスＩ−Ｅ（Ｈ２−Ｅ）の膜近位ドメインを遺伝子操作したヒトＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１を発現する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＨＬＡ−ＤＲの同種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）への結合を阻害しない。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲα鎖と配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲβ鎖とを含むＨＬＡ−ＤＲ４の、同種ＴＣＲへの結合を阻害しない。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＨＬＡ−ＤＲのＣＤ４への結合を阻害する。
【００９０】
「結合を阻害する」とは、アイソタイプ対照と比較したときの、該抗体の存在下でのＨＬＡ−ＤＲのＣＤ４又は同種ＴＣＲへの結合における測定可能な減少を指す。阻害は、アイソタイプ対照と比較したときの、結合の例えば３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の減少、又はアイソタイプ対照の存在下での阻害と比較して、統計的に有意な阻害であり得る。したがって、該抗体は、アイソタイプ対照と比較して、阻害が２９％未満であるか又は統計的に有意ではないとき、ＨＬＡ−ＤＲの同種ＴＣＲへの結合を阻害しない。
【００９１】
ＨＬＡ−ＤＲのＴＣＲへの結合の阻害は、標準的なＥＬＩＳＡ実験を用いて実施され得る。代表的なアッセイでは、５μｇ／ｍＬのＨＬＡ−ＤＲ抗原ＤＲ４Ｇ１３４（本明細書に記載）５０μＬをＭＤＳプレートにコーティングし、該プレートを室温で１０分間振盪し、４℃で一晩インキュベートする。該プレートをアッセイ緩衝液（１×ＤＰＢＳ、１％  ＢＳＡ、０．０５％  ｔｗｅｅｎ  ２０）でブロッキングし、１０−２〜１０２ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の混合物又は試験抗体、５μｇ／ｍＬの組み換えＴＣＲ（ＤＲＧ７９、本明細書に記載）、１０μｇ／ｍＬ抗ヒスチジン抗体、及び２μｇ／ｍＬ  ＳｕｌｆｏＴａｇ−ＳＡをウェルに添加する。該プレートを１時間インキュベートし、洗浄し、１５０μＬのＭＳＤリード緩衝液を添加した後、ＭＳＤで読み取った。
【００９２】
いくつかの実施形態では、該抗体又はその抗原結合断片は、
ａ）配列番号７の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲα鎖と配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲβ鎖とを含むＨＬＡ−ＤＲ４に、平衡解離定数（ＫＤ）５×１０−８Ｍ以下で結合し、ここでＫＤは、ＤＰＢＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０（ＰＳ−２０）、及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する緩衝液中、２５℃で、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いて測定される、
ｂ）配列番号７の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲα鎖と配列番号１５のＨＬＡ−ＤＲβ鎖とを含むＨＬＡ−ＤＲ１に、平衡解離定数（ＫＤ）５×１０−８Ｍ以下で結合し、ここでＫＤは、ＤＰＢＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＰＳ−２０、及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する緩衝液中、２５℃で、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いて測定される、
ｃ）Ｂ細胞のアポトーシスを誘導する能力を有さず、ここでアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）のサンプル中のＣＤ３−ＣＤ２０＋アネキシンＶ＋ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ−Ｂ細胞の頻度を測定することによって求められる、
ｄ）Ｂ細胞の死を誘導する能力を有さず、ここでＢ細胞の死は、フローサイトメトリーを用いてヒトＰＢＭＣのサンプル中のＣＤ３−ＣＤ２０＋アネキシンＶ＋ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ＋Ｂ細胞の頻度を測定することによって求められる、又は
ｅ）ＨＬＡ−ＤＲのＣＤ４に対する結合を阻害する。
【００９３】
Ｂ細胞のアポトーシスを誘導する能力を有しない代表的な抗体は、本明細書に記載の抗体ＤＲ４Ｂ１１７、ＤＲ４Ｂ３０、ＤＲ４Ｂ１２７、ＤＲ４Ｂ９８、及びＤＲ４Ｂ３３である、の特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを有する。これらの抗体は、対照抗体ＤＲ４Ｂ４、ＤＲ４Ｂ５、及びＤＲ４Ｂ６などのＢ細胞の死を誘導する抗体と比較したとき、改善された安全性プロファイルを有し得る。
【００９４】
Ｂ細胞のアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いて、サンプル、例えば、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のサンプル中のＣＤ３−ＣＤ２０＋アネキシンＶ＋ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ−Ｂ細胞としてアポトーシスＢ細胞を同定して、測定することができる。本発明の抗体は、アイソタイプ対照で処理されたサンプルと比較して、試験抗体で処理されたサンプル中のＢ細胞のアポトーシスが統計的に有意に増加したとき、「Ｂ細胞のアポトーシスを誘導する能力を有しない」。「Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ」とは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製のｅＦ６６０など、細胞死の機序にかかわらず、生細胞と死細胞とを識別する蛍光染料を指す。
【００９５】
Ｂ細胞の死を誘導する能力を有しない代表的な抗体は、本明細書に記載の抗体ＤＲ４Ｂ１１７、ＤＲ４Ｂ３０、ＤＲ４Ｂ１２７、及びＤＲ４Ｂ９８、及びＤＲ４Ｂ３３である。これらの抗体は、対照抗体ＤＲ４Ｂ４、ＤＲ４Ｂ５、及びＤＲ４Ｂ６などのＢ細胞の死を誘導する抗体と比較して、改善された安全性プロファイルを有し得る。
【００９６】
Ｂ細胞の死は、フローサイトメトリーを用いて、サンプル、例えば、ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）のサンプル中のＣＤ３−ＣＤ２０＋アネキシンＶ＋ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ−Ｂ細胞として死Ｂ細胞を同定して、測定することができる。本発明の抗体は、アイソタイプ対照で処理されたサンプルと比較して、試験抗体で処理されたサンプル中のＢ細胞の死が統計的に有意に増加したとき、「Ｂ細胞の死を誘導する能力を有しない」。
【００９７】
ＨＬＡ−ＤＲのＣＤ４への結合の阻害は、公知のプロトコール及び本明細書に記載のＨＬＡ−ＤＲ抗原を用いて、ＥＬＩＳＡを用いて測定することができる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲは、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ１０、又はＨＬＡ−ＤＲ１５である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲ４は、配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１：０２及び配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲ１は、配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２及び配列番号１５のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０１を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲ４は、配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２及び配列番号１０６のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０２を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲ３は、配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２及び配列番号１０５のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３：０１を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲ１０は、配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２及び配列番号１０７のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０：０１を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲ１５は、配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２及び配列番号１０８のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１を含む。
【０１０５】
様々なＨＬＡ−ＤＲα及びβ鎖の命名法及びアミノ酸配列は、周知である。本発明の抗体は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１が超多型性であることを考慮すると、複数のＨＬＡ−ＤＲ分子に特異的に結合し得る。
【０１０６】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲ４に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、約５×１０−８Ｍ以下未満の平衡解離定数（ＫＤ）でＨＬＡ−ＤＲ４に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１０７】
抗体又はその抗原結合断片のＨＬＡ−ＤＲ４又は他のＨＬＡ−ＤＲ分子に対する親和性は、任意の好適な方法を用いて実験により決定することができる。このような方法では、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００、若しくはＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡ、又は当業者に公知の競合的結合アッセイを利用することができる。特定の抗体／ＨＬＡ−ＤＲの相互作用の親和性の測定値は、異なる条件下（例えば、浸透圧、ｐＨ）で測定した場合には異なり得る。したがって、親和性及び他の結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、典型的には、標準的な条件及び本明細書に記載される緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。例えばＢｉａｃｏｒｅ  ３０００又はＰｒｏｔｅＯｎを用いた親和性測定での内部誤差（標準偏差ＳＤとして測定される）は、典型的には、典型的な検出限界内で測定した場合、５〜３３％の範囲内であり得る。したがって、ＫＤに関して用語「約」は、アッセイにおける一般的な標準偏差を反映する。例えば、ＫＤが１×１０−９Ｍの場合の典型的なＳＤは、±０．３３×１０−９Ｍ以下である。
【０１０８】
本明細書に記載される実験で用いられるＨＬＡ−ＤＲ分子は、可溶性Ｆｃ−融合タンパク質として発現され得る。ＨＬＡ−ＤＲに提示されるペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲβ鎖のＮ末端に共有結合して、発現を促進し得る。ヘキサヒスチジン（配列番号３）又はＳｔｒｅｐＩＩタグ（配列番号６）などのタグは、α及び／若しくはβ鎖又はＦｃに共有結合して、発現したタンパク質の精製を容易にし得る。提示されたペプチド、α及び／又はβ鎖、Ｆｃ部分、及び／又は様々なタグの間にリンカーを挿入してもよい。好適なリンカーは、グリシン／セリンリンカー（配列番号１又は４）、タバコエッチ病ウイルスＮｉａプロテアーゼ切断部位（配列番号２）、又はヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位（配列番号５）であり得る。ＨＬＡ−ＤＲに提示され得る好適なペプチドは、赤血球凝集素ペプチドＨＡ＿３０４−３１８（配列番号７）、ＩＩ型コラーゲンペプチドＣＩＩ＿１２３６−１２４９若しくはＣＩＩ＿２５７−２７３（それぞれ配列番号８及び配列番号９）、ビメンチンペプチド（配列番号７１）、アグリカンペプチド（配列番号７２）、ＣＬＩＰペプチド（配列番号１０４）、又はＩＩ型コラーゲンペプチドＣＩＩ＿２５９−２７３（配列番号１２２）であり得る。発現し得る代表的なＨＬＡ−ＤＲ分子は、：
α鎖：細胞外ドメイン又は特定のα鎖、配列番号１のリンカー、配列番号２のリンカー、配列番号１のリンカー、Ｆｃドメイン、配列番号３のタグ
β鎖：配列番号７のペプチド、配列番号４のリンカー、配列番号５のリンカー、特定のβ鎖の細胞外ドメイン、配列番号４のリンカー、配列番号２のリンカー、配列番号４のリンカー、Ｆｃドメイン、配列番号６のタグの構成を有し得る。α及びβ鎖は共発現し、得られるヘテロ二量体は、標準的な方法を用いて、例えば、Ｈｉｓ６及びＳｔｒｅｐＩＩタグを用いて精製され得る。ＨＬＡ−ＤＰ及びＨＬＡ−ＤＱ分子は、同様に発現し得る。
【０１０９】
また、本発明は、アミノ酸配列ＱＫＲＡＡ（配列番号６６）、ＱＲＲＡＡ（配列番号６７）、又はＲＲＲＡＡ（配列番号６８）からなる共有エピトープを含有するＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１１０】
ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子であるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０１、＊０１：０２、＊０４：０１、＊０４０４、＊０４：０５、＊０４：０８、及び＊１０：０１における共有エピトープは、ＨＬＡ−ＤＲβ鎖における残基位置７０〜７４における５アミノ酸残基のモチーフＱＫＲＡＡ（配列番号６６）、ＱＲＲＡＡ（配列番号６７）又はＲＲＲＡＡ（配列番号６８）である。
【０１１１】
共有エピトープを有するＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子は、ＲＡなどの自己免疫疾患と関連しており、高親和性でＴ細胞によって非自己として認識されるシトルリン化ペプチドを提示することが示されている。例えば、ＲＡでは、シトルリン化タンパク質（ＡＣＰＡ）を認識する自己抗体は、疾患の発症前（最長で疾患の１４年前）に血清中に存在しており、ＲＡと診断される２年前には顕著な増加を示す（Ｒａｎｔａｐａａ−Ｄａｈｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００３；４８（１０）：２７４１〜９；Ｎｉｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４；５０（２）：３８０〜６；Ｖａｎ  ｄｅ  Ｓｔａｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２０１１；６３（１１）：３２２６〜３３）。ＨＬＡ−ＤＲＢ１は、健常ＡＣＰＡ＋個体からＲＡのＡＣＰＡ＋個体に進行するリスクに関連することが判明している（Ｈｅｎｓｖｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ２０１５；７４（２）：３７５〜８０）。したがって、ＲＡの発症前のＡＣＰＡの検出は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体による処理でＴ細胞の活性化を抑止し、血清の自己抗体レベルが更に上昇するのを防ぎ、ＲＡの診断につながる炎症の増加を弱めることができる機会を提示する。共有エピトープを含有するＨＬＡ−ＤＲ分子と同種Ｔ細胞受容体との相互作用をブロッキングすることによって、又はＨＬＡ−ＤＲ分子における高次構造（及び／又は空間変化）を誘導してＨＬＡ−ＤＲと同種Ｔ細胞受容体との相互作用を防ぐことによって、Ｔ細胞の活性化を阻害する抗体は、自己免疫疾患の治療だけでなく、予防においても有益であり得る。
【０１１２】
共有エピトープを含有するＨＬＡ−ＤＲに結合する代表的な抗体は、本明細書に記載される抗体ＤＲ４Ｂ１１７、ＤＲ４Ｂ３０、ＤＲ４Ｂ１２７、ＤＲ４Ｂ９８、ＤＲ４Ｂ７８、ＤＲ４Ｂ３８、ＤＲ４Ｂ７０、ＤＲ４Ｂ２２、及びＤＲ４Ｂ３３である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲは、ペプチドとの複合体として存在する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号７、８、又は９、７１、７２、１０４、又は１２２のアミノ酸配列を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号７、８、又は９、７１、７２、１０４、又は１２２のアミノ酸配列からなる。
【０１１６】
また、本発明は、それぞれ配列番号７３、７４、及び７５の重鎖相補性決定領域１、２、及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１１７】
配列番号７３、７４、及び７５は、それぞれ、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合するその抗原結合断片の抗体のＨＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３属のアミノ酸配列を表す。属内の抗体は、Ｔ細胞の活性化を阻害し、かつＢ細胞の死を誘導する能力は有しない。代表的なこのような抗体は、本明細書に記載の抗体ＤＲ４Ｂ１２７及びＤＲ４Ｂ９８である。
【０１１８】
図１は、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列及びＨＣＤＲ１属の配列のアラインメントを示す。
【０１１９】
図２は、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列及びＨＣＤＲ２属の配列のアラインメントを示す。
【０１２０】
図３は、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列及びＨＣＤＲ３属の配列のアラインメントを示す。
【０１２１】
配列番号７３
ＳＸ１Ｘ２ＩＸ３；（式中、
Ｘ１は、Ｙ又はＤであり、
Ｘ２は、Ｓ、Ｗ、又はＹであり、
Ｘ３は、Ｈ又はＧである）。
【０１２２】
配列番号７４
ＧＩＸ１ＰＩＸ２ＧＸ３ＡＸ４ＹＡＱＫＦＱＧ；（式中、
Ｘ１は、Ｒ又はＡであり、
Ｘ２は、Ｓ又はＹであり、
Ｘ３は、Ｎ又はＴであり、又は
Ｘ４は、Ｅ又はＹである）。
【０１２３】
配列番号７５
ＤＡＳＸ１Ｘ２ＲＸ３ＹＧＦＤＹ；（式中、
Ｘ１は、Ｙ又はＷであり、
Ｘ２は、Ｙ又はＡであるか、又は
Ｘ３は、Ｎ又はＡである）。
【０１２４】
また、本発明は、それぞれ配列番号７６、７７、及び７８の軽鎖相補性決定領域１、２、及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１２５】
配列番号７６、７７、及び７８は、それぞれ、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３属のアミノ酸配列を表す。属内の抗体は、Ｔ細胞の活性化を阻害し、Ｂ細胞のアポトーシス及び／又は死を誘導する能力を有しない。代表的なこのような抗体は、本明細書に記載の抗体ＤＲ４Ｂ１１７、ＤＲ４Ｂ３０、ＤＲ４Ｂ１２７、及びＤＲ４Ｂ９８である。
【０１２６】
図４は、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列及びＬＣＤＲ１属の配列のアラインメントを示す。
【０１２７】
図５は、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列及びＬＣＤＲ２属の配列のアラインメントを示す。
【０１２８】
図６は、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列及びＬＣＤＲ３属の配列のアラインメントを示す。
【０１２９】
配列番号７６
ＲＡＳＱＳＶＳＳＸ１ＹＬＡ；（式中、
Ｘ１は、Ｓ又は欠失している）。
【０１３０】
配列番号７７
Ｘ１ＡＳＸ２ＲＡＴ；（式中、
Ｘ１は、Ｇ又はＤであり，
Ｘ２は、Ｓ又はＮである）。
【０１３１】
配列番号７８
ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＰＬＴ；（式中、
Ｘ１は、Ｙ又はＲであり、
Ｘ２は、Ｇ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｓ又はＮであり、
Ｘ４は、Ｓ又はＷである）。
【０１３２】
また、本発明は、それぞれ配列番号７３、７４、及び７５の重鎖相補性決定領域１、２、及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）、並びにそれぞれ配列番号７６、７７、及び７８の軽鎖相補性決定領域１、２、及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１３３】
また、本発明は、配列番号５６、５７、５８、５９、１３７、１３８、１３９、１４０、又は１４１の重鎖可変領域（ＶＨ）に含有されているＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供し、該ＨＣＤＲ１、該ＨＣＤＲ２、及び該ＨＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、又はＣｈｏｔｈｉａによって定義される。
【０１３４】
また、本発明は、配列番号６０、６１、又は１４２の軽鎖可変領域（ＶＬ）に含有されているＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供し、該ＬＣＤＲ１、該ＬＣＤＲ２、及び該ＬＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、又はＣｈｏｔｈｉａによって定義される。
【０１３５】
また、本発明は、配列番号３９、４０、４１、１２３、１２４、又は１２５のＨＣＤＲ１を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１３６】
また、本発明は、配列番号４２、４３、４４、４５、１２６、１２７、又は１２８のＨＣＤＲ２を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１３７】
また、本発明は、配列番号４６、４７、４８、４９、１２９、１３９、１３１、１３２、又は１３３のＨＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１３８】
また、本発明は、配列番号５０、５１、又は１３４のＬＣＤＲ１を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１３９】
また、本発明は、配列番号５２、５３、又は１３５のＬＣＤＲ２を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１４０】
また、本発明は、配列番号５４、５５、又は１３６のＬＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、
それぞれ配列番号３９、４２、４６、５０、５２、及び５４、
それぞれ配列番号４０、４３、４７、５１、５３、及び５５、
それぞれ配列番号４１、４４、４８、５１、５３、及び５５、
それぞれ配列番号４１、４５、４９、５１、５３、及び５５、
それぞれ配列番号１２３、１２６、１２９、５１、５３、及び５５、
それぞれ配列番号１２３、１２６、１３０、５１、５３、及び５５、
それぞれ配列番号１２３、１２６、１３１、５１、５３、及び５５、
それぞれ配列番号１２４、１２７、１３２、１３４、１３５、及び１３６、又は
それぞれ配列番号１２５、１２８、１３３、５１、５３、及び５５、のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、抗体は、
それぞれ配列番号５６及び６０、
それぞれ配列番号５７及び６１、
それぞれ配列番号５８及び６１、
それぞれ配列番号５９及び６１、
それぞれ配列番号１３７及び６１、
それぞれ配列番号１３８及び６１、
それぞれ配列番号１３９及び６１、
それぞれ配列番号１４０及び１４２、又は
それぞれ配列番号１４１及び６１、のＶＨ及びＶＬを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、
それぞれ配列番号７９及び８０、
それぞれ配列番号８１及び８２、
それぞれ配列番号８３及び８２、
それぞれ配列番号１２１及び８２、
それぞれ配列番号１４３及び８２、
それぞれ配列番号１４４及び８２、
それぞれ配列番号１４５及び８２、
それぞれ配列番号１４６及び１４８、又は
それぞれ配列番号１４７及び８２のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされている。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、抗体は、
それぞれ配列番号８４及び８８、
それぞれ配列番号８５及び８９、
それぞれ配列番号８６及び８９、
それぞれ配列番号８７及び８９、
それぞれ配列番号９６及び８８、
それぞれ配列番号９７及び８９、
それぞれ配列番号９８及び８９、
それぞれ配列番号９９及び８９、
それぞれ配列番号１４９及び８９、
それぞれ配列番号１５０及び８９、
それぞれ配列番号１５１及び８９、
それぞれ配列番号１５２及び１５４、又は
それぞれ配列番号１５３及び８９、のＨＣ及びＬＣを含む。
【０１４５】
また、本発明は、それぞれ配列番号３９、４２、４６、５０、５２、及び５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、抗体重鎖フレームワークは、ＩＧＨＶ１−６９（配列番号６２）に由来し、抗体軽鎖フレームワークは、ＩＧＫＶ３−２０（配列番号６４）に由来する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸残基Ｅ３、Ｆ１０８、Ｄ１１０、及びＲ１４０において配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２に、アミノ酸残基Ｖ１４３及びＱ１４９において配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１に結合する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸残基Ｋ２、Ｅ３、Ｖ６、Ｅ８８、Ｖ８９、Ｔ９０、Ｆ１０８、Ｄ１１０、Ｋ１１１、Ｒ１４０、Ｌ１４４、Ｒ１４６、及びＫ１７６において配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２に、アミノ酸残基Ｌ１１４、Ｋ１３９、Ｖ１４２、Ｖ１４３、Ｓ１４４、Ｔ１４５、Ｌ１４７、Ｉ１４８、Ｑ１４９、及びＥ１６２において配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１に結合する。
【０１４９】
これらアミノ酸残基でＨＬＡ−ＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ４結合部位においてＨＬＡ−ＤＲに結合し、ＨＬＡ−ＤＲの同種ＴＣＲへの結合をブロックしない。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５６の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号６０の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、抗体ＶＨは、配列番号７９のポリヌクレオチドによってコードされており、ＶＬは、配列番号８０のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの結合を調節する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、又はＦｃγＲＩＩＩｂへの結合を減少させる、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ２と比較したとき、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ２アイソタイプである。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較したとき、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較したとき、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含むＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ４と比較したとき、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を含むＩｇＧ４アイソタイプである。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８４のＨＣ及び配列番号８８のＬＣを含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９６のＨＣ及び配列番号８８のＬＣを含む。
【０１６４】
また、本発明は、
ａ）
ｉ）それぞれ配列番号４０、４３、及び４７、
ｉｉ）それぞれ配列番号４１、４４、及び４８、又は
ｉｉｉ）それぞれ配列番号４１、４５、及び４９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、並びに
ｂ）それぞれ配列番号５１、５３、及び５５のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１６５】
また、本発明は、それぞれ配列番号４０、４３、４７、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、抗体重鎖フレームワークは、ＩＧＨＶ５−５１（配列番号６３）に由来し、抗体軽鎖フレームワークは、ＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）に由来する。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号６１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８１のポリヌクレオチドによってコードされており、ＶＬは、配列番号８２のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの結合を調節する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ又はＦｃγＲＩＩＩｂへの結合を減少させる、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換を含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ２と比較したとき、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ２アイソタイプである。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較したとき、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較したとき、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含むＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ４と比較したとき、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を含むＩｇＧ４アイソタイプである。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８５のＨＣ及び配列番号８９のＬＣを含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９７のＨＣ及び配列番号８９のＬＣを含む。
【０１８１】
また、本発明は、それぞれ配列番号４１、４４、４８、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、抗体重鎖フレームワークは、ＩＧＨＶ１−６９（配列番号６２）に由来し、抗体軽鎖フレームワークは、ＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）に由来する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸残基Ｋ２において配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２に、アミノ酸残基Ｄ４１、Ｓ１２６、Ｒ１３０、Ｖ１４２、及びＱ１４９において配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１に結合する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸残基Ｉ１、Ｋ２、Ｅ３、Ｄ２７、Ｒ１４０、Ｅ１４１、Ｄ１４２、及びＨ１４３において配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２に、アミノ酸残基Ｈ１６、Ｆ１７、Ｒ２３、Ｒ２５、Ｒ２９、Ｒ３９、Ｄ４１、Ｄ４３、Ｖ４４、Ｖ５０、Ｇ１２５、Ｓ１２６、Ｅ１２８、Ｖ１２９、Ｒ１３０、Ｖ１４２、Ｇ１４６、Ｌ１４７、Ｑ１４９、及びＶ１５９において配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１に結合する。
【０１８５】
これらアミノ酸残基でＨＬＡ−ＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ４結合部位においてＨＬＡ−ＤＲに結合し、ＨＬＡ−ＤＲの同種ＴＣＲへの結合をブロックしない。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号６１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８３のポリヌクレオチドによってコードされており、ＶＬは、配列番号８２のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの結合を調節する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換を含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ又はＦｃγＲＩＩＩｂへの結合を減少させる、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換を含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ２と比較したとき、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ２アイソタイプである。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較したとき、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較したとき、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含むＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ４と比較したとき、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を含むＩｇＧ４アイソタイプである。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８６の重鎖（ＨＣ）及び配列番号８９の軽鎖（ＬＣ）を含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９８の重鎖（ＨＣ）及び配列番号８９の軽鎖（ＬＣ）を含む。
【０２００】
また、本発明は、それぞれ配列番号４１、４５、４９、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、抗体重鎖フレームワークは、ＩＧＨＶ１−６９（配列番号６２）に由来し、抗体軽鎖フレームワークは、ＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）に由来する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５９の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号６１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１２１のポリヌクレオチドによってコードされており、ＶＬは、配列番号８２のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの結合を調節する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換を含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ又はＦｃγＲＩＩＩｂへの結合を減少させる、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換を含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ２と比較したとき、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ２アイソタイプである。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較したとき、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ１アイソタイプである。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較したとき、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含むＩｇＧ１アイソタイプである。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ４と比較したとき、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を含むＩｇＧ４アイソタイプである。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８７の重鎖（ＨＣ）及び配列番号８９の軽鎖（ＬＣ）を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９９の重鎖（ＨＣ）及び配列番号８９の軽鎖（ＬＣ）を含む。
【０２１６】
表２は、選択ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＫａｂａｔ  ＣＤＲアミノ酸配列の配列番号を示す。
【０２１７】
【表２】
2019502698.tif 000004
【０２１８】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体が、ＩＧＨＶ１−６９（配列番号６２）、ＩＧＨＶ５−５１（配列番号６３）、又はＩＧＨＶ３＿３−２３（配列番号１６１）に由来する重鎖フレームワークを含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２１９】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体が、ＩＧＫＶ３−２０（配列番号６４）、ＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）、又はＩＧＫＶ１−３９（配列番号１６２）に由来する軽鎖フレームワークを含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２２０】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖フレームワークが、ＩＧＨＶ１−６９（配列番号６２）に由来し、軽鎖フレームワークがＩＧＫＶ３−２０（配列番号６４）に由来する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２２１】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖フレームワークが、ＩＧＨＶ５−５１（配列番号６３）に由来し、軽鎖フレームワークがＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）に由来する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２２２】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖フレームワークが、ＩＧＨＶ１−６９（配列番号６２）に由来し、軽鎖フレームワークがＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）に由来する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２２３】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖フレームワークが、ＩＧＨＶ３−２３（配列番号１６１）に由来し、軽鎖フレームワークがＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）に由来する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２２４】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖フレームワークが、ＩＧＨＶ５−５１（配列番号６３）に由来し、軽鎖フレームワークがＩＧＫＶ１−３９（配列番号１６２）に由来する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２２５】
特定のフレームワーク又は生殖系列配列「に由来する」重鎖又は軽鎖可変領域を含む本発明の抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から、例えば、本明細書で論じられるトランスジェニックマウス又はファージディスプレイライブラリなどから得られる抗体を指す。特定のフレームワーク又は生殖系列配列「に由来する」抗体は、例えば自然に生じる体細胞突然変異又は意図的な置換のために、由来とする配列と比較したときにアミノ酸の違いを含み得る。特定のＶＨ及びＶＬフレームワーク配列を有し、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する、代表的な抗体を表１７に示す。
【０２２６】
また、本発明は、配列番号５６、５７、５８、５９、１３７、１３８、１３９、１４０、又は１４１のＶＨを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２２７】
また、本発明は、配列番号６０、６１、又は１４２のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２２８】
また、本発明は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６０のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２２９】
また、本発明は、配列番号５７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２３０】
また、本発明は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２３１】
また、本発明は、配列番号５９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体を提供する。
【０２３２】
また、本発明は、配列番号５７、５８、又は５９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２３３】
ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する代表的な抗体又はその抗原結合断片のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を表１４、表１５、及び表１６に示す。
【０２３４】
実施例で説明する実施形態は、一方が重鎖に由来し、一方が軽鎖に由来する可変ドメインの対を含むが、当業者であれば、代替的な実施形態が単一の重鎖又は軽鎖可変ドメインを含み得ることを認識するであろう。単一の可変ドメインを用いて、例えばＨＬＡ−ＤＲに結合することができる２ドメイン特異的抗原結合断片を形成することができる可変ドメインについてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、国際公開第１９９２／０１０４７号に開示されている階層的二重コンビナトリアルアプローチ（hierarchical dual combinatorial approach）を用いたファージディスプレイスクリーニング法によって行うことができる。このアプローチでは、ＶＨ鎖又はＶＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて、他方の鎖（ＶＬ又はＶＨ）をコードしているクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた二本鎖特異的抗原結合ドメインを公知の方法及び本明細書に記載されるものを用いてファージディスプレイ技術に従って選択する。したがって、個別のＶＨ及びＶＬポリペプチド鎖は、国際特許公開第１９９２／０１０４７号に開示されている方法を用いて、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する更なる抗体を同定するのに有用である。
【０２３５】
相同抗体
表１４、表１５、及び表１６に示すＶＨ又はＶＬアミノ酸配列を含む本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の変異体は、本発明の範囲内である。例えば、変異体は、親抗体と比較したとき、相同抗体が機能特性を保持しているか又は改善された機能特性を有しているという条件で、ＶＨ及び／又はＶＬに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、配列同一性は、本発明のＶＨ又はＶＬアミノ酸配列に対して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であり得る。
【０２３６】
ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する相同抗体又はその抗原結合断片は、アンタゴニストであり、
ａ）配列番号７の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲα鎖と配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲβ鎖とを含むＨＬＡ−ＤＲ４に、平衡解離定数（ＫＤ）５×１０−８Ｍ以下で結合し、ここでＫＤは、ＤＰＢＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０（ＰＳ−２０）、及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する緩衝液中、２５℃で、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いて測定される、
ｂ）配列番号７の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲα鎖と配列番号１５のＨＬＡ−ＤＲβ鎖とを含むＨＬＡ−ＤＲ１に、平衡解離定数（ＫＤ）５×１０−８Ｍ以下で結合し、ここでＫＤは、ＤＰＢＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＰＳ−２０、及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する緩衝液中、２５℃で、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いて測定される、
ｃ）Ｂ細胞のアポトーシスを誘導する能力を有さず、ここでアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）のサンプル中のＣＤ３−ＣＤ２０＋アネキシンＶ＋ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ−Ｂ細胞の頻度を測定することによって求められる、
ｄ）Ｂ細胞の死を誘導する能力を有さず、ここでＢ細胞の死は、フローサイトメトリーを用いてヒトＰＢＭＣのサンプル中のＣＤ３−ＣＤ２０＋アネキシンＶ＋ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ＋Ｂ細胞の頻度を測定することによって求められる、又は
ｅ）ＨＬＡ−ＤＲのＣＤ４に対する結合を阻害する。
【０２３７】
また、本発明は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６０のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該ＶＨ、該ＶＬ、又は該ＶＨ及び該ＶＬの両方が、任意追加的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する、の特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを有する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０２３８】
また、本発明は、配列番号５７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該ＶＨ、該ＶＬ、又は該ＶＨ及び該ＶＬの両方が、任意に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０２３９】
また、本発明は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該ＶＨ、該ＶＬ、又は該ＶＨ及び該ＶＬの両方が、任意に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０２４０】
また、本発明は、配列番号５９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該ＶＨ、該ＶＬ、又は該ＶＨ及び該ＶＬの両方が、任意に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０２４１】
また、本発明は、配列番号１３７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該ＶＨ、該ＶＬ、又は該ＶＨ及び該ＶＬの両方が、任意に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０２４２】
また、本発明は、配列番号１３８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該ＶＨ、該ＶＬ、又は該ＶＨ及び該ＶＬの両方が、任意に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０２４３】
また、本発明は、配列番号１３９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該ＶＨ、該ＶＬ、又は該ＶＨ及び該ＶＬの両方が、任意に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０２４４】
また、本発明は、配列番号１４０のＶＨ及び配列番号１４２のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該ＶＨ、該ＶＬ、又は該ＶＨ及び該ＶＬの両方が、任意に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０２４５】
また、本発明は、配列番号１４１のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該ＶＨ、該ＶＬ、又は該ＶＨ及び該ＶＬの両方が、任意に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０２４６】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号５６、５７、５８、５９、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１のＶＨと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有するＶＨを含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に上記配列番号の配列の変異は全く存在しない。
【０２４７】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号６０、６１、又は１４２のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に上記配列番号の配列の変異は全く存在しない。
【０２４８】
ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する選択抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列のアラインメントを図７に示し、選択抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列のアラインメントを図８に示す。ＶＨ及びＶＬ鎖は、各行の先頭の配列番号によって特定される。抗体間で異なる残基位置が、ＶＨ及び／又はＶＬにおいて置換可能な部位である。例えば、置換は、配列番号５６、５７、５８、又は５９のＶＨにおける残基位置１、１６、１８、２０、２４、２７、２８、３０、４０、４３、６７、７１、７４、７６、８１、８２、８３、８７、８８、８９において行われ得る。行われ得る代表的な置換は、保存的アミノ酸置換、又はＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する各抗体における対応する残基位置に存在するアミノ酸残基による置換であり得る。例えば、配列番号５８のＶＨでは、アミノ酸残基位置１、１６、１８、２０、２４、２７、２８、３０、４０、４３、６７、７１、７４、７６、８１、８２、８３、８７、８８、８９は、配列番号５６、５７又は５９のＶＨに存在する対応する残基で、又は本明細書に記載される保存的改変が生じるアミノ酸で置換され得る。例えば、配列番号６１のＶＬでは、アミノ酸残基位置９、６１、７８は、配列番号６０のＶＬに存在する対応する残基で、又は本明細書に記載される保存的改変が生じるアミノ酸で置換され得る。
【０２４９】
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。
【０２５０】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ  ４：１１〜１７（１９８８））を使用して、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して決定することができる。更に、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｇｃｇ＿ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３（１９７０））を使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクス、ギャップ重み付け（gap weight）１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、長さ重み付け（length weight）１、２、３、４、５、又は６を使用して決定することもできる。
【０２５１】
保存的改変を有する抗体
また、本発明は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列を含むＶＨと、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含むＶＬとを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲ配列のうちの１つ以上が、本明細書に記載の抗体（例えば、表１２若しくは表１４に示す抗体）に基づく指定のアミノ酸配列又はその保存的改変を含み、該抗体が、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する親抗体の所望の機能特性を保持している抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２５２】
保存的改変を有する、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、アンタゴニストであり、
ａ）配列番号７の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲα鎖と配列番号１４のＨＬＡ−ＤＲβ鎖とを含むＨＬＡ−ＤＲ４に、平衡解離定数（ＫＤ）５×１０−８Ｍ以下で結合し、ここでＫＤは、ＤＰＢＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０（ＰＳ−２０）、及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する緩衝液中、２５℃で、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いて測定される、
ｂ）配列番号７の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号１３のＨＬＡ−ＤＲα鎖と、配列番号１５のＨＬＡ−ＤＲβ鎖とを含むＨＬＡ−ＤＲ１に、平衡解離定数（ＫＤ）５×１０−８Ｍ以下で結合し、ここでＫＤは、ＤＰＢＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＰＳ−２０、及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する緩衝液中、２５℃で、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いて測定される、
ｃ）Ｂ細胞のアポトーシスを誘導する能力を有さず、ここでアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）のサンプル中のＣＤ３−ＣＤ２０＋アネキシンＶ＋ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ−Ｂ細胞の頻度を測定することによって求められる、
ｄ）Ｂ細胞の死を誘導する能力を有さず、ここでＢ細胞の死は、フローサイトメトリーを用いてヒトＰＢＭＣのサンプル中のＣＤ３−ＣＤ２０＋アネキシンＶ＋ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ＋Ｂ細胞の頻度を測定することによって求められる、又は
ｅ）ＨＬＡ−ＤＲのＣＤ４に対する結合を阻害する、の特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを有する。
【０２５３】
また、本発明は、それぞれ配列番号３９、４２、及び４６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号５０、５２、及び５４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２５４】
また、本発明は、それぞれ配列番号４０、４３、４７、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２５５】
また、本発明は、それぞれ配列番号４１、４４、４８、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２５６】
また、本発明は、それぞれ配列番号４１、４５、４９、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２５７】
また、本発明は、それぞれ配列番号１２３、１２６、１２９、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２５８】
また、本発明は、それぞれ配列番号１２３、１２６、１３０、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２５９】
また、本発明は、それぞれ配列番号１２３、１２６、１３１、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２６０】
また、本発明は、それぞれ配列番号１２４、１２７、１３２、１３４、１３５、及び１３６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２６１】
また、本発明は、それぞれ配列番号１２５、１２８、１３３、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２６２】
また、本発明は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６０のＶＬ、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２６３】
また、本発明は、配列番号５７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２６４】
また、本発明は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片、及びこれらの保存的改変を提供する。
【０２６５】
また、本発明は、配列番号５９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２６６】
また、本発明は、配列番号１３７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２６７】
また、本発明は、配列番号１３８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２６８】
また、本発明は、配列番号１３９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２６９】
また、本発明は、配列番号１４０のＶＨ及び配列番号１４２のＶＬ、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２７０】
また、本発明は、配列番号１４１のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、並びにこれらの保存的改変を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２７１】
「保存的改変」とは、アミノ酸改変を含有する抗体の結合特性に著しく影響を与えることも変化させることもないアミノ酸改変を指す。保存的改変は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、アラニンスキャニング突然変異誘発について既に記載されているように（ＭａｃＬｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ  Ｓｕｐｐｌ  ６４３：５５〜６７；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３５：１〜２４）、ポリペプチド中の任意のネイティブ残基をアラニンで置換してもよい。本発明の抗体に対するアミノ酸置換は、例えばＰＣＲ変異導入法（米国特許第４，６８３，１９５号）などの周知の方法によって行うことができる。あるいは、変異体のライブラリは、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン（例えば１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコードするＤＶＫコドン）を用いて生成することもできる。結果として生じる抗体変異体は、それらの特性に関して、本明細書に記載のアッセイを用いて試験することができる。
【０２７２】
遺伝子操作及び改変された抗体
本発明の抗体又はその抗原結合断片を更に遺伝子操作して、親抗体と比較して類似の特性又は変化した特性を有する改変抗体を作製することができる。本発明の抗体では、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、定常領域、重鎖フレームワーク、軽鎖フレームワーク、又は６つのＣＤＲのうちのいずれか若しくはすべてが遺伝子操作されていてもよい。
【０２７３】
本発明の抗体は、ＣＤＲグラフト化により遺伝子操作されてもよい。本発明の抗体の１つ以上のＣＤＲ配列を、異なるフレームワーク配列にグラフト化してもよい。ＣＤＲグラフト化は、公知の方法及び本明細書に記載の方法を使用して行うことができる。
【０２７４】
使用され得るフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベース又は刊行されている参照文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変ドメイン遺伝子に関する生殖系列ＤＮＡ及びコードタンパク質配列は、ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ−ｉｍｇｔ＿ｏｒｇに見出すことができる。本発明の抗体の既存のフレームワーク配列を置き換えるために用いることができるフレームワーク配列は、ＶＨ若しくはＶＬの全長、又はＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４の長さにわたって親可変ドメインに対して最も高い同一性パーセント（％）を示すものであってよい。更に、好適なフレームワークは、更に、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ１及びＣＤＲ２の長さ、又は同一のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、及びＨＣＤＲ２の標準構造に基づいて選択され得る。好適なフレームワークは、公知の方法、例えば、米国特許第８，７４８，３５６号に記載のヒトフレームワーク適応又は米国特許第７，７０９，２２６号に記載の超ヒト化を用いて選択され得る。
【０２７５】
親抗体及び遺伝子操作を受けた抗体のフレームワーク配列を、更に、例えば米国特許第６，１８０，３７０号に記載のとおり、復帰突然変異によって更に改変して、生成される抗体の抗原への結合を回復及び／又は改善させることができる。親抗体又は遺伝子操作を受けた抗体のフレームワーク配列を、更に、フレームワーク領域内の（あるいは１つ以上のＣＤＲ領域内の）１つ以上の残基を変異させることによって改変して、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低減することもできる。このアプローチは「脱免疫」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００７００１４７９６号に更に詳述されている。
【０２７６】
本発明の抗体のＣＤＲ残基を変異させて、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体の親和性を改善することができる。
【０２７７】
本発明の抗体のＣＤＲ残基を変異させて、翻訳後修飾のリスクを最小化することができる。脱アミノ化（ＮＳ）、酸触媒加水分解（ＤＰ）、異性化（ＤＳ）、又は酸化（Ｗ）についての推定モチーフのアミノ酸残基を天然のアミノ酸のいずれかで置換して、該モチーフの突然変異を誘発することができ、得られた抗体を、本明細書に記載の方法を用いて、その機能及び安定性について試験することができる。
【０２７８】
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は他の望ましい生物学的若しくは生物物理学的特性を改善するために改変され得る本発明の抗体は、本発明の範囲内である。抗体の安定性は、分子内力及び分子間力の中でも特に、（１）固有の安定性に影響を及ぼす個々のドメインのコアパッキング、（２）ＨＣとＬＣとの対合に影響するタンパク質／タンパク質界面相互作用、（３）極性残基及び帯電残基の埋没、（４）極性残基及び帯電残基の水素（Ｈ）結合ネットワーク、並びに（５）表面電荷及び極性残基の分布、を含む、多くの要因によって影響を受ける（Ｗｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０５：９８９〜１０１０）。構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構造に基づいて、又は場合によっては分子モデリングによって同定することができ、また、抗体の安定性に対する該残基の効果は、同定された残基において変異を保有する変異体を作製及び評価することによって試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つには、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって測定したときの熱転移中点温度（Ｔｍ）を高くするというものがある。一般に、タンパク質のＴｍは、その安定性と相関しており、溶液中でのアンフォールディング及び変性のし易さ、並びにそのタンパク質がアンフォールディングする傾向に応じた分解プロセスとは逆相関する（Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｂｉｏｐｈａｒｍ  １３：３６〜４６）。多数の研究で、ＤＳＣによって熱安定性として測定された配合物（formulations）の物理的安定性のランク付けと他の方法によって測定された物理的安定性との間に相関が見出されている（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ  ５Ｅ８；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：３０７６〜８９；Ｍａａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  １４０：１５５〜６８；Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２１：１３５３〜６１；Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １５：２００〜８）。配合物の研究により、ＦａｂのＴｍは、対応するｍＡｂの長期物理的安定性と密接な関係があることが示唆されている。
【０２７９】
Ｃ末端リジン（ＣＴＬ）は、注入された抗体から、血流中の内因性循環カルボキシペプチダーゼによって除去され得る（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０８：４０４〜４１２）。製造中、米国特許出願公開第２０１４０２７３０９２号に記載のとおり、細胞外Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ、又はＥＤＴＡ−Ｆｅ３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御することができる。抗体のＣＴＬ含量は、公知の方法を用いて測定することができる。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約４０％〜約７０％、約５５％〜約７０％、又は約６０％のＣ末端リジン含量を有する。
【０２８１】
本発明の抗体に対してＦｃ置換を行って、抗体エフェクター機能及び／又は薬物動態特性を調節することができる。従来の免疫機能では、抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用の結果、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞障害、マスト細胞の脱顆粒、及び食作用から免疫調整性シグナル、例えば、リンパ球の増殖及び抗体の分泌の制御に及ぶ広範な応答が生じる。これら相互作用のすべてが、抗体又は免疫複合体のＦｃドメインの、細胞上の特殊な細胞表面受容体への結合を通して開始される。抗体及び免疫複合体によって誘発される細胞応答の多様性は、Ｆｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）の異種性から生じ、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、Ｆｃγ受容体を活性化し（すなわち、免疫系の増強）、一方、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２Ｂ）は、阻害性Ｆｃγ受容体である（すなわち、免疫系の減弱）。ＦｃＲｎ受容体への結合は、抗体の半減期を調節する。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｆｃ領域に少なくとも１つの置換を含む。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｆｃ領域に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の置換を含む。
【０２８４】
抗体の半減期を調節するために置換され得るＦｃ位置は、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：２３５１４〜２４０、Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８：１５７〜１５９、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９（８）：６２１３〜６２１６、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：３４６〜３５６、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１〜６６０７、Ｐｅｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：１７５９〜１７６９、Ｄａｔｔａ−Ｍａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ，３５：８６〜９４，２００７、Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１２８３〜１２８８、Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，７０：３２６９〜３２７７、及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：２８１９に記載されているものであり、２５０、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４、及び４３５位を含む。単独で又は組み合わせて行うことができる代表的な置換は、置換Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ、及びＨ４３５Ｒである。抗体の半減期を延長するために行うことができる代表的な単独又は組み合わせの置換は、置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａである。抗体の半減期を短縮するために行うことができる代表的な単独又は組み合わせの置換は、置換Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒである。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、アミノ酸位置２５０、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４、又は４３５において、抗体Ｆｃに少なくとも１つの置換を含む。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択される、抗体Ｆｃにおける少なくとも１つの置換を含む。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択される、抗体Ｆｃにおける少なくとも１つの置換を含む。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、抗体の活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）への結合を減少させる及び／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、若しくは貪食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低下させる、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換を含む。
【０２８９】
抗体の活性化ＦｃγＲへの結合を減少させ、続いて、エフェクター機能を低下させるために置換され得るＦｃ位置は、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１〜６６０４、国際公開第２０１１／０６６５０１号、米国特許第６，７３７，０５６号及び同第５，６２４，８２１号、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００：１６〜２６、Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７：１５３７〜１５４３、Ｂｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：４０３〜４１１、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６８：５６３〜５７１、Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：１２５６〜１２６４、Ｇｈｅｖａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８：２９２９〜２９３８、Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）ｍＡｂｓ，１：５７２〜５７９）に記載されているものであり、２１４、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、及び３６５位を含む。単独で又は組み合わせて行うことができる代表的な置換は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４における置換Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓである。ＡＤＣＣの少ない抗体が得られる代表的な組み合わせ置換は、ＩｇＧ１における置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、すべてのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６−欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６−欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓである。ＩｇＧ２由来の残基１１７〜２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１〜４４７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４  Ｆｃドメインを使用してもよい。
【０２９０】
ＩｇＧ４の安定性を高めるために、周知のＳ２２８Ｐ置換をＩｇＧ４抗体に行うことができる。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、少なくとも１つの残基位置２１４、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、又は３６５に置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、少なくとも１つの残基位置２２８、２３４、２３５、２３７、２３８、２６８、３３０、又は３３１に置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｓ２２８Ｐ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｖ２３４Ａ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｆ２３４Ａ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｇ２３７Ａ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｐ２３８Ｓ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｈ２６８Ａ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０３００】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｑ２６８Ａ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ａ３３０Ｓ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｐ３３１Ｓ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、及びＱ２６８Ａ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、又はＦ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｓ２２８Ｐ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０３１０】
相同抗体、保存的改変を有する抗体、及び遺伝子操作及び改変されている抗体の生成方法
親抗体と比較してアミノ酸配列が変化している本発明の抗体は、標準的なクローニング及び発現技術を用いて生成され得る。例えば、部位特異的変異導入又はＰＣＲを介在させることによる変異導入を実施して変異を導入することができ、抗体結合又は他の所望の特性に対する影響を、周知の方法及び本明細書において実施例に記載されている方法を用いて評価することができる。
【０３１１】
抗体のアイソタイプ及びアロタイプ
本発明の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプであり得る。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０３１６】
治療用抗体の免疫原性は、注入反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮に関連している（Ｂａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：６０２〜０８）。宿主において治療用抗体が免疫応答を誘導する程度は、抗体のアロタイプによって部分的に決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３〜２１）。抗体のアロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列の変異に関連する。表３は、選択ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アロタイプを示す。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｇ２ｍ（ｎ）アロタイプである。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｇ２ｍ（ｎ−）アロタイプである。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｇ２ｍ（ｎ）／（ｎ−）アロタイプである。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、ｎＧ４ｍ（ａ）アロタイプである。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｇ１ｍ（１７）アロタイプである。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体は、Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプである。
【０３２３】
【表３】
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【０３２４】
抗イディオタイプ抗体
また、本発明は、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０３２５】
また、本発明は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６０のＶＬを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０３２６】
また、本発明は、配列番号５７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０３２７】
また、本発明は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０３２８】
また、本発明は、配列番号５９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０３２９】
また、本発明は、配列番号１３７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０３３０】
また、本発明は、配列番号１３８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０３３１】
また、本発明は、配列番号１３９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０３３２】
また、本発明は、配列番号１４０のＶＨ及び配列番号１４２のＶＬを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０３３３】
また、本発明は、配列番号１４１のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
【０３３４】
抗イディオタイプ（Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原決定基（例えば、パラトープ又はＣＤＲ）を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗原をブロッキングするものであっても、しないものであってもよい。抗原をブロッキングするＩｄを使用して、サンプル中の遊離抗体（例えば、本明細書に記載される本発明の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体）を検出することができる。ブロッキングしないＩｄを使用して、サンプル中の全抗体（遊離しているもの、抗原に一部結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの）を検出することができる。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されている抗体で動物を免疫することによって調製することができる。
【０３３５】
また、更に別の動物で免疫応答を誘導する免疫原として抗Ｉｄ抗体を使用して、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を生成することもできる。抗−抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元のｍＡｂとエピトープが同一であり得る。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。抗Ｉｄ抗体は様々であってよく（これにより抗Ｉｄ抗体変異体が産生される）、及び／又はＨＬＡ−ＤＲ抗体に特異的に結合する抗体に関して本明細書の他の箇所に記載されているものなどの任意の好適な技術によって誘導体化してもよい。
【０３３６】
本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体のコンジュゲート
また、本発明は、異種分子にコンジュゲートしている、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、異種分子は、検出可能な標識又は細胞毒性剤である。
【０３３８】
また、本発明は、検出可能な標識にコンジュゲートしている、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３３９】
また、本発明の抗体は、細胞毒性剤にコンジュゲートしている、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３４０】
ＨＬＡ−ＤＲに結合する抗体又はその抗原結合断片は、ＨＬＡ−ＤＲ発現細胞に治療薬を導くために用いることができる。ＨＬＡ−ＤＲを過剰発現する腫瘍細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ抗体の取り込み時に、細胞を殺傷する細胞毒性剤をコンジュゲートされている、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体の標的となり得る。あるいは、ＨＬＡ−ＤＲを発現している悪性細胞は、取り込まれることにより細胞機能を改変することを意図する治療薬（例えば、転写因子阻害剤）とカップリングされているＨＬＡ−ＤＲ抗体の標的となり得る。血液癌細胞及び組織癌細胞は、ＨＬＡ−ＤＲを発現することが報告されている（Ｃａｂｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５；４１：３９８〜４０６；Ａｌｔｏｍｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００３；２２：６５６４〜６５６９）ので、これら細胞を標的とする抗体の使用は、治療効果を提供し得る。
【０３４１】
本発明の抗体は、細胞によって取り込まれるが、所望により、Ｂ細胞のアポトーシス及び／又は死を誘導しない。これらの抗体は、細胞毒性剤にコンジュゲートし得、血液悪性腫瘍などのＨＬＡ−ＤＲ陽性腫瘍を治療するために用いられ得る。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は細胞毒性剤でもある。
【０３４３】
検出可能な標識にコンジュゲートしており本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片は、様々なサンプルにおけるＨＬＡ−ＤＲの発現を評価するために用いられ得る。
【０３４４】
検出可能な標識は、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートしたときに、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的な手段を介して後者を検出可能なものとする組成物を含む。
【０３４５】
代表的な検出可能な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えば、一般的にＥＬＩＳＡにおいて使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンシレート（scintillates）、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体又はその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、及び比色基質が挙げられる。
【０３４６】
検出可能な標識は、例えば、検出可能な標識が放射性同位体であるときなど、自発的にシグナルを発し得る。他の場合、検出可能な標識は、外部場によって刺激された結果として、シグナルを発する。
【０３４７】
代表的な放射性同位体は、γ放出、オージェ放出、β放出、アルファ放出、又はポジトロン放出性の放射性同位体であり得る。代表的な放射性同位体としては、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１９Ｆ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１５Ｉｎ、１２３１、１２４１、１２５Ｉ、１３１１、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２６Ｒａ、２２５Ａｃ、及び２２７Ａｃが挙げられる。
【０３４８】
代表的な金属原子は、２０超の原子番号を有する金属、例えば、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユウロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バーケリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、又はローレンシウム原子である。
【０３４９】
いくつかの実施形態では、金属原子は、２０超の原子番号を有するアルカリ土類金属であり得る。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、金属原子は、ランタニドであり得る。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、金属原子は、アクチニドであり得る。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、金属原子は、遷移金属であり得る。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、金属原子は、卑金属であり得る。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、及びガドリニウム原子であり得る。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、金属原子は、５３（すなわち、ヨウ素）〜８３（すなわち、ビスマス）の原子番号を有する金属であり得る。
【０３５６】
いくつかの実施形態では、金属原子は、磁気共鳴映像法に好適な原子であり得る。
【０３５７】
金属原子は、＋１、＋２、又は＋３の酸化状態の形態の金属イオン、例えば、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３＋、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、及びＺｎ２＋であり得る。金属原子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄、酸化マンガン、又は酸化ガドリニウムを含み得る。
【０３５８】
好適な色素としては、例えば、５（６）−カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ  ６８０ＲＤマレイミド、又はＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル色素などの任意の市販の色素が挙げられる。
【０３５９】
好適な蛍光色素分子は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、テキサスレッド、ＣｙＤｙｅ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４；Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外線（ＮＩＲ）（７００〜９００ｎｍ）蛍光染料、並びにカルボシアニン及びアミノスチリル染料である。
【０３６０】
検出可能な標識にコンジュゲートしている本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片は、腫瘍の分布、ＨＬＡ−ＤＲ発現細胞の存在の診断を評価するために造影剤として用いられ得る。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片は、細胞毒性剤にコンジュゲートしている。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素活性を有する毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち、放射性複合体）である。
【０３６３】
細胞毒性剤にコンジュゲートしている本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片は、例えば、ＡＭＬ、ＡＬＬ、又はＭＭ細胞、及びその細胞内蓄積部への細胞毒性剤の標的化送達に使用することができ、これらコンジュゲートしていない細胞毒性剤の全身投与は、正常細胞に許容されないレベルの毒性をもたらし得る。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、マイタンシノイド、又はカリケアマイシンである。細胞毒性剤は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってその細胞毒性又は細胞増殖抑制作用を引き起こし得る。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、アレウリテス・フォルディ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンなどの酵素活性を有する毒素である。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅなどの放射性核種である。
【０３６７】
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、ドラスタチン又はドラスタチンのペプチド類似体及び誘導体、アウリスタチン又はモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。代表的な分子は、米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号に開示されている。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰの加水分解、並びに核及び細胞分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０〜３５８４））、抗癌及び抗真菌活性を有することが示されている。ドラスタチン及びアウリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端若しくはＣ（カルボキシル）末端を介して（国際公開第０２／０８８１７２号）、又はＦＮ３ドメインに組み込まれた任意のシステインを介して、本発明のＦＮ３ドメインに結合することができる。
【０３６８】
本発明の本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片は、公知の方法を用いて検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。
【０３６９】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、キレート剤と複合体を形成している。
【０３７０】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、リンカーを介して本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされている。
【０３７１】
検出可能な標識又は細胞毒性剤は、公知の方法を用いて、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片に直接又は間接的に結合し得る。好適なリンカーは、当該技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ−スクシミジル（succimidyl）−ベンゾアートの誘導体；ドデカボラート）、大環状及び非環式の両キレート剤のキレート部分、例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアナート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）、並びに他のキレート部分が挙げられる。好適なペプチドリンカーは周知である。
【０３７２】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、腎クリアランスによって血液から除去される。
【０３７３】
本発明の抗体の作製
ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する本発明の抗体又はその抗原結合断片は、様々な技術を用いて作製され得る。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５のハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えばハムスター、ラット、又はサルを、本明細書に記載のとおりＦｃ融合タンパク質として発現しペプチドと複合体を形成しているヒト又はカニクイザルのＨＬＡ−ＤＲ抗原で免疫し、続いて、標準的な方法を使用して、免疫した動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から生じたコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、及び抗原に対する親和性などの所望の特性を有する抗体の産生についてスクリーニングしてよい。
【０３７４】
ヒト受容体フレームワークの選別を含む代表的なヒト化技術としては、ＣＤＲグラフト化（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲグラフト化（米国特許第６，８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ，（１９９１）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：４８９〜４９９）、特異性決定残基のリサーフェシング（米国特許出願公開第２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適応（米国特許第８，７４８，３５６）、又は超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）が挙げられる。これらの方法では、ＣＤＲの長さの類似性若しくは標準構造の同一性、又はこれらの組み合わせに基づいて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づいて選択され得るヒトフレームワークに親抗体のＣＤＲを移植する。
【０３７５】
ヒト化抗体は、国際公開第１０９０／００７８６１号及び同第１９９２／２２６５３号に記載されているものなどの技術によって、結合親和性を保存するように変化させたフレームワーク支持残基を組み込むことによって（復帰突然変異）、又は任意のＣＤＲに変異を導入して、例えば抗体の親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択性又は親和性を改善するように更に最適化させてもよい。
【０３７６】
トランスジェニック動物、例えば、ゲノム中にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を有するマウス又はラットは、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質に対するヒト抗体を作製するために使用することができ、例えば、米国特許第６，１５０，５８４号、国際公開第９９／４５９６２号、国際公開第２００２／０６６６３０号、国際公開第２００２／４３４７８号、国際公開第２００２／０４３４７８号、及び国際公開第１９９０／０４０３６号、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜９；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３〜２１；Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３〜９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５〜９３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３〜１３２６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４５〜８５１；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：１４６〜１５６；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１〜２３；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：１２３６〜１２４３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｔａｕｓｓｉｇ（１９９７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８：４５５〜４５８に記載されている。このような動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組み換えを用いて、導入染色体（transchromosome）を用いて、又はミニ遺伝子を用いて、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を該動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｏｍｔｉｎｃ＿ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を用いて、選択抗原に対するヒト抗体の提供に従事し得る。
【０３７７】
ヒト抗体は、ファージがヒト免疫グロブリン又はその一部（例えば、Ｆａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は非対合若しくは対合抗体可変領域）を発現するように遺伝子操作を受けたファージディスプレイライブラリから選択され得る（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７〜８６；Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２５４：６７〜８４；Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９〜３１４；Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）ＰＩＴＡＳ（ＵＳＡ）９５：６１５７〜６１６２；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１）。本発明の抗体は、例えば、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６及び国際公開第０９／０８５４６２号）に記載されているバクテリオファージｐＩＸコートタンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリから単離され得る。ライブラリを、ヒト及び／又はカニクイザルＨＬＡ−ＤＲに結合するファージについてスクリーニングし、得られた陽性クローンを更に特性評価し、クローン溶解物からＦａｂを単離し、完全長ＩｇＧとして発現させることができる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，９６９，１０８号、同第６，１７２，１９７号、同第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、及び同第６，５９３，０８１号に記載されている。
【０３７８】
ＨＬＡ−ＤＲへの結合に関して参照抗体と競合する抗体は、ファージディスプレイライブラリを用いてヒトＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体を単離し、ＨＬＡ−ＤＲへの結合に関して参照抗体と競合する能力について、生成された抗体をスクリーニングすることによって生成され得る。
【０３７９】
免疫原性抗原の調製及びモノクローナル抗体の生成は、組み換えタンパク質生成などの任意の好適な技術を用いて実施することができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あるいは細胞全体又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、抗原は、該抗原又はその一部をコードしている核酸から動物の体内で新規に（de novo）形成されてもよい。
【０３８０】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、二重特異性抗体である。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、多重特異性抗体である。
【０３８２】
本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単一特異性抗体は、遺伝子操作して二重特異性抗体にすることもでき、これも本発明の範囲内に包含される。本発明の抗体のＶＬ及び／又はＶＨ領域は、公開されている方法を用いて遺伝子操作して、ＴａｎｄＡｂ（登録商標）設計などの構造として一本鎖二重特異性抗体に（国際公開第１９９９／５７１５０号、米国公開第２０１１／０２０６６７２号）、又は米国特許第５，８６９，６２０号、国際公開第１９９５／１５３８８号、同第１９９７／１４７１９号、若しくは同第２０１１／０３６４６０号に開示されているものなどの構造として二重特異性ｓｃＦｖにすることもできる。
【０３８３】
本発明の抗体のＶＬ及び／又はＶＨ領域を遺伝子操作して二重特異性の完全長の抗体にすることもでき、この場合、各抗体のアームは、別個の抗原又はエピトープに結合する。このような二重特異性抗体は、米国特許第７，６９５，９３６号、国際公開第２００４／１１１２３３号、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００７／０２８７１７０号、国際公開第２００８／１１９３５３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７４号、米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号、国際公開第２０１１／１３１７４６号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、又は米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号に記載されているものなどの技術を用いて、２本の抗体重鎖間のＣＨ３相互作用を調節して二重特異性抗体を形成することによって作製することもできる。
【０３８４】
例えば、二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載の方法に従って、２つの単一特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域中に非対称な変異を導入し、還元条件下において２つの親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成してジスルフィド結合を異性化させることによって、無細胞環境でインビトロにおいて作製することができる。この方法では、ヘテロ二量体の安定性を促進する特定の置換をＣＨ３ドメインに有するように、２つの単一特異性二価抗体を遺伝子操作する。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合の異性化を受けるのに十分な還元条件下において共にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が作製される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る代表的な還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン、及びβ−メルカプトエタノールであり、好ましくは、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオトレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えば、ｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。
【０３８５】
二重特異性抗体の第１の重鎖及び第２の重鎖に使用され得る代表的なＣＨ３突然変異は、Ｋ４０９Ｒ及びＦ４０５Ｌである。
【０３８６】
本発明の抗体のＶＬ及び／又はＶＨ領域が組み込まれ得る更なる多重特異性構造は、例えば、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ）（国際公開第２００９／１３４７７６号）、あるいはロイシンジッパー又はコラーゲン二量体化ドメインなどの異なる特異性を有する２本の抗体アームに接続するために様々な二量体化ドメインを含む構造（国際公開第２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号）である。ＤＶＤは、ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２−ＣＨ構造を有する重鎖と、ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２−ＣＬ構造を有する軽鎖とを含む完全長抗体であり、リンカーは任意のものである。
【０３８７】
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
また、本発明は、特定のＶＨ及びＶＬ配列を有する、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体のＶＨが第１のポリヌクレオチドによってコードされ、該抗体のＶＬが第２のポリヌクレオチドによってコードされている抗体又はその抗原結合断片を提供する。ポリヌクレオチドは、相補的デオキシ核酸（ｃＤＮＡ）であってよく、好適な宿主において発現するためにコドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、周知の技術である。
【０３８８】
また、本発明は、本発明の抗体のＶＨ、本発明の抗体のＶＬ、本発明の抗体の重鎖、又は本発明の抗体の軽鎖をコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０３８９】
また、本発明は、配列番号５６、５７、５８、５９、１３７、１３８、１３９、１４０、又は１４１のＶＬをコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０３９０】
また、本発明は、配列番号６０、６１、又は１４２のＶＬをコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０３９１】
また、本発明は、配列番号５６、５７、５８、５９、１３７、１３８、１３９、１４０、又は１４１のＶＨと配列番号６０、６１、又は１４２のＶＬとをコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０３９２】
また、本発明は、配列番号８４、８５、８６、８７、９６、９７、９８、９９、１４９、１５０、１５１、１５２、又は１５３の重鎖をコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０３９３】
また、本発明は、配列番号８８、８９、又は１５４の軽鎖をコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０３９４】
また、本発明は、配列番号８４、８５、８６、８７、９６、９７、９８、９９、１４９、１５０、１５１、１５２、又は１５３の重鎖と配列番号８８、８９、又は１５４の軽鎖とをコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０３９５】
また、本発明は、配列番号７９、８０、８１、８２、８３、９０、９１、９２、９３、９４、９５、１００、１０１、１０２、１０３、１２１、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９又は１６０のポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０３９６】
本発明の抗体のＶＨ及び／若しくはＶＬ又はこれらの抗原結合断片、あるいは本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードしているポリヌクレオチド配列は、意図される宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を可能にする、プロモーター又はエンハンサーなどの１つ以上の制御エレメントに操作可能に連結され得る。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであってもよい。
【０３９７】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。このようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明の合成ポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターであってよい。例えば、所望により定常領域に連結されている本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入する。軽鎖及び／又は重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードしているＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター中のコントロール配列に操作可能に連結することができる。このようなコントロール配列としては、シグナル配列、プロモーター（例えば、天然に付随する又は異種のプロモーター）、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列が挙げられ、抗体を発現するように選択された宿主細胞と適合するように選択される。ベクターを適切な宿主に組み込んだら、組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされているタンパク質を高レベルで発現させるのに好適な条件下で宿主を維持する。
【０３９８】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号７９のポリヌクレオチド及び配列番号８０のポリヌクレオチドを含む。
【０３９９】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８１のポリヌクレオチド及び配列番号８２のポリヌクレオチドを含む。
【０４００】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８３のポリヌクレオチド及び配列番号８２のポリヌクレオチドを含む。
【０４０１】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１２１のポリヌクレオチド及び配列番号８２のポリヌクレオチドを含む。
【０４０２】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１４３のポリヌクレオチド及び配列番号８２のポリヌクレオチドを含む。
【０４０３】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１４４のポリヌクレオチド及び配列番号８２のポリヌクレオチドを含む。
【０４０４】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１４５のポリヌクレオチド及び配列番号８２のポリヌクレオチドを含む。
【０４０５】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１４６のポリヌクレオチド及び配列番号１４８のポリヌクレオチドを含む。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１４７のポリヌクレオチド及び配列番号８２のポリヌクレオチドを含む。
【０４０７】
好適な発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするため、アンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、又はネオマイシン耐性などの選択マーカーを含む。
【０４０８】
好適なプロモーター及びエンハンサーエレメントは、当該技術分野において既知である。真核細胞での発現に関して、代表的なプロモーターとしては、軽鎖及び／又は重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス前初期プロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター；初期及び後期ＳＶ４０プロモーター；レトロウイルス由来の末端反復配列に存在するプロモーター；マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター；並びに様々な既知の組織特異的プロモーターが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内である。
【０４０９】
使用され得る代表的なベクターは、細菌：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ）並びにｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）である。
【０４１０】
また、本発明は、本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞を提供する。「宿主細胞」は、ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代、また特定の対象細胞から生成された安定な細胞株も指すことを意図すると理解される。変異又は環境による影響のいずれかにより、後続世代においてある特定の改変が生じる可能性があるため、そのような後代は親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内には依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってよい。原核宿主細胞の例は、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）などの桿菌、並びにサルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、及び様々なシュードモナス属（Pseudomonas）の種などの他の腸内細菌科のものである。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス属（Saccharomyces）（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae））及びピキア属（Pichia）である。代表的な真核宿主細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであり得る。哺乳動物真核宿主細胞としては、ハイブリドーマ又は骨髄腫細胞株などの不死化細胞株、例えば、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）、及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株などが挙げられる。代表的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するもの、例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ２ＳＶ（Ｌｏｎｚａ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４が挙げられる。
【０４１１】
また、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、該抗体が発現する条件で本発明の宿主細胞を培養することと、該宿主細胞によって産生された抗体を回収することとを含む方法を提供する。抗体を作製し、それを精製する方法は、当該技術分野において周知である。合成されたら（化学的に又は組み換えによって）、抗体全体、その二量体、個々の軽鎖及び／若しくは重鎖、又はＶＨ及び／若しくはＶＬなどの他の抗体断片を、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動などの標準的な手順（概して、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照）に従って精製することができる。対象抗体は、実質的に純粋、例えば、少なくとも純度約８０％〜８５％、少なくとも純度約８５％〜９０％、少なくとも純度約９０％〜９５％、又は少なくとも約９８％〜９９％、又はそれ以上の純度であり得、例えば、対象抗体以外の細胞残屑、巨大分子などの夾雑物を含まない。
【０４１２】
また、本発明は、
該抗体のＶＨをコードしている第１のポリヌクレオチド及び該抗体のＶＬをコードしている第２のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことと、
宿主細胞を該発現ベクターで形質転換することと、
該ＶＬ及び該ＶＨが発現し、抗体を形成する条件下で、培養培地中で該宿主細胞を培養することと、
該宿主細胞又は該培養培地から抗体を回収することと、を含む、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を作製する方法を提供する。
【０４１３】
本発明の特定のＶＨ又はＶＬ配列をコードしているポリヌクレオチドを、標準的な分子生物学的方法を用いてベクターに組み込むことができる。宿主細胞の形質転換、培養、抗体発現、及び精製は、周知の方法を用いて行われる。
【０４１４】
医薬組成物／投与
本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。治療用途では、本発明の抗体は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」とは、本発明の抗体と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いてもよい。これらの溶液は滅菌されており、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌法（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有し得る。このような医薬製剤中の本発明の抗体又はその抗原結合断片の濃度は、約０．５重量％未満から、通常は少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される具体的な投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ  ６９１〜１０９２に記載されており、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。
【０４１５】
本発明の抗体又はその抗原結合断片の治療的使用における投与方法は、錠剤、カプセル剤、液剤、粉剤、ゲル、粒子として、注射器、埋め込み式装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、又は当該技術分野において周知の、当業者が理解する他の手段に入れられた製剤を用いた、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、若しくは皮下、肺内、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）投与などの、抗体を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。部位特異的投与は、例えば、腫瘍内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸内、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。
【０４１６】
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）注入又はボーラス注射により非経口的に、筋肉内又は皮下又は腹腔内になど任意の好適な経路によって対象に投与することができる。ｉ．ｖ．注入は、例えば、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、若しくは２４０分間にわたって、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２時間にわたって行ってよい。
【０４１７】
対象に投与される用量は、治療されている疾患を軽減する、少なくとも部分的に停止させる、又は予防するのに十分（「治療的に有効な量」）なものであり、時に、０．００５ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０５ｍｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ若しくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、又は約４ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ若しくは約２４ｍｇ／ｋｇ、又は例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｍｇ／ｋｇであり得るが、更に多量、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０４１８】
例えば、５０、１００、２００、５００、若しくは１０００ｍｇの固定単位用量を与えてもよく、又は患者の表面積に基づいて、例えば、５００、４００、３００、２５０、２００、若しくは１００ｍｇ／ｍ２の用量を与えてもよい。通常、１〜８用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８）が患者を治療するために投与されるが、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれよりも多い用量を与えてもよい。
【０４１９】
本発明の抗体又はその抗原結合断片の投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月又はそれ以上後に反復してもよい。治療コースの反復も可能であり、長期にわたる投与も同様に可能である。反復投与は、同一用量であってもよく、又は異なる用量であってもよい。例えば、本明細書に記載される本発明の抗体又はその抗原結合断片は、静脈内注入により、８週間にわたって１週間間隔で８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与し、続いて、更に１６週間にわたって２週間ごとに８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与し、続いて、４週間ごとに８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
【０４２０】
例えば、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、１日当たり約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇの量の１日投薬量として、治療開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０日目のうちの少なくとも１日に、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週目のうちの少なくとも１週に、又はこれらの任意の組み合わせで、２４、１２、８、６、４、又は２時間ごとの単一用量又は分割用量を使用して、又はこれらの任意の組み合わせで提供され得る。
【０４２１】
また、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、自己免疫疾患の発現のリスクを低減する及び／又は症状の発症を遅延させるために、予防的に投与してもよい。
【０４２２】
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、保管のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体で再構成し得る。この技術は、従来のタンパク質調製物に関して有効であることが示されており、周知の凍結乾燥及び再構成技術を用いることができる。
【０４２３】
方法及び使用
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、インビトロ及びインビボで、診断上、並びに治療及び予防上の有用性を有する。例えば、本発明の抗体は、自己免疫疾患などのＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患又はＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍などの様々な障害を処置、予防及び／又は診断するために、培養中の細胞にインビトロ若しくはエクスビボで、又は対象に投与することができる。
【０４２４】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患を治療又は予防する方法であって、ＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を、かかる治療又は予防を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０４２５】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患を予防する方法であって、ＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する本発明の抗体又はその抗原結合断片を、かかる予防を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０４２６】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲ介在性疾患は、自己免疫疾患である。
【０４２７】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、関節炎である。
【０４２８】
いくつかの実施形態では、関節炎は、若年性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、又は痛風性関節炎である。
【０４２９】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、全身型若年性特発性関節炎である。
【０４３０】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、グレーブス病である。
【０４３１】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、橋本甲状腺炎である。
【０４３２】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、重症筋無力症である。
【０４３３】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症である。
【０４３４】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、ループスである。
【０４３５】
いくつかの実施形態では、ループスは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は皮膚エリテマトーデス（ＣＬＥ）である。
【０４３６】
いくつかの実施形態では、対象は、ループス腎炎を有する。
【０４３７】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、１型糖尿病である。
【０４３８】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、炎症性腸疾患である。
【０４３９】
いくつかの実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病である。
【０４４０】
いくつかの実施形態では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎である。
【０４４１】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患を治療する方法であって、該自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。
【０４４２】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患を予防する方法であって、該自己免疫疾患を予防するのに十分な時間、治療的に有効な量の、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を、かかる予防を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０４４３】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、ループス、又は１型糖尿病である。
【０４４４】
また、本発明は、自己抗原に対する免疫応答を抑制する方法であって、自己抗原に対する免疫応答を抑制するのに十分な時間、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を、かかる抑制を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０４４５】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患を治療する方法であって、該ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、それぞれ配列番号３９、４２、４６、５０、５２、及び５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を治療的に有効な量、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０４４６】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６０のＶＬを含む。
【０４４７】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患を治療する方法であって、該ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、それぞれ配列番号４０、４３、４７、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を治療的に有効な量、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０４４８】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
【０４４９】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患を治療する方法であって、該ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、それぞれ配列番号４１、４４、４８、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を治療的に有効な量、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０４５０】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
【０４５１】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患を治療する方法であって、該ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、それぞれ配列番号４１、４５、４９、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を治療的に有効な量、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０４５２】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
【０４５３】
また、本発明は、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍を治療する方法であって、ＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍を治療するのに十分な時間、細胞毒性剤にコンジュゲートしている本発明の抗体又はその抗原結合断片を、治療的に有効な量、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０４５４】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現腫瘍は、血液悪性腫瘍である。
【０４５５】
いくつかの実施形態では、血液悪性腫瘍は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄性白血病、又は急性単芽球性白血病（ＡＭｏＬ）である。
【０４５６】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現腫瘍は、神経膠腫である。
【０４５７】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現腫瘍は、卵巣癌である。
【０４５８】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現腫瘍は、結腸直腸癌である。
【０４５９】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現腫瘍は、骨肉腫である。
【０４６０】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現腫瘍は、子宮頸癌である。
【０４６１】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現腫瘍は、胃癌である。
【０４６２】
いくつかの実施形態では、対象は、結腸、喉頭、骨格筋、乳房、又は肺に腫瘍を有する。
【０４６３】
ＨＬＡ−ＤＲの発現は、これらの癌において同定されている（例えば、Ｄｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１５；８（５）：５４８３〜９０；Ｒａｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  ｔｈｅｒ  ２００４；３（１０）：１０２１〜７；Ｃａｂｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５；４１：３９８〜４０６；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２００５；９７（１）：５７〜６３；Ｔｒｉｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌ  ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  １９９８；１９４：６７９〜６８４を参照）。
【０４６４】
ＨＬＡ介在性疾患、自己免疫疾患、及び／又は癌の治療において有効な本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の「治療的に有効な量」は、標準的な研究技術によって決定され得る。例えば、インビトロアッセイを使用して、最適用量範囲を特定する手立てとすることもできる。所望により、関節炎若しくは関節リウマチなどの自己免疫疾患又は癌の治療において有効であり得る本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の投与量は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体を当該技術分野において公知の関連する動物モデルに投与することによって決定され得る。具体的な有効量の選択は、幾つかの要因を考慮して当業者によって（例えば、臨床試験を通して）決定され得る。このような要因としては、治療又は予防しようとする疾患、疾患症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者に公知のその他の要因が挙げられる。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路及び疾患の重篤度に応じて決まり、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されなければならない。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導かれる用量反応曲線から推定することができる。本明細書に記載されるモデルのいずれかを用いて、本発明の抗体をその有効性及び有効量について試験することができる。
【０４６５】
併用療法
本発明の方法において、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、第２の治療薬と同時に、逐次、又は別々に併用投与してよい。
【０４６６】
本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、自己免疫疾患を治療するために有用であることが知られているか、又は用いられたことがあるか若しくは現在用いられている任意の剤又は剤の組み合わせを含む、自己免疫疾患のための任意の公知の療法と組み合わせて投与してよい。このような療法及び治療薬としては、手術又は外科手技（例えば、脾摘出、リンパ節郭清、甲状腺摘除術、プラズマフェレーシス、白血球アフェレーシス（leukophoresis）、細胞、組織又は臓器の移植、消化器外科手術（intestinal procedures）、及び臓器潅流など）、放射線療法、例えば、ステロイド療法及び非ステロイド療法、ホルモン療法、サイトカイン療法、皮膚病薬による治療（例えば、アレルギー、接触性皮膚炎、及び乾癬などの皮膚の状態を治療するために使用される局所薬）、免疫抑制療法、並びに他の抗炎症性モノクローナル抗体療法などの療法が挙げられる。
【０４６７】
第２の治療薬は、コルチコステロイド、抗マラリア薬、免疫抑制剤、細胞毒性剤、又はＢ細胞調節因子であり得る。
【０４６８】
いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、ミコフェノール酸ナトリウム、シクロスポリン、レフルノミド、タクロリムス、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、又はベリムマブ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標））である。
【０４６９】
いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、サリチル酸塩、スルファサラジン、細胞毒性薬、免疫抑制薬、ミゾリビン、クロラムブシル、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６；ＰｒｏＧｒａｆｒＭ）、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス（ラパマイシン）、デオキシスパガリン、レフルノミド及びそのマロノニトリルアミドアナログ、クロベタゾール、ハロベタゾール、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、フルオシノール（fluocinole）、フルオシノニド、メサラミンを含有する医薬（５−ＡＳＡ剤として公知）、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェンプロフェン（fenprofen）、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸塩、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、サリチル酸塩、スリンダク、トルメチン；ホスホジエステラーゼ−４阻害剤、抗ＴＮＦα抗体インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標））、及びアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、サリドマイド、又はレナリドミドなどのそのアナログである。
【０４７０】
治療効果又はＲＡは、米国リウマチ学会による基準、欧州リウマチ学会による診断基準、又は任意の他の基準によって定義される臨床応答によって測定されるとおりの有効性を用いて評価することができる。例えば、Ｆｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３８：７２７〜３５及びｖａｎ  Ｇｅｓｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３９：３４〜４０を参照。
【０４７１】
本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片、又は細胞毒性剤にコンジュゲートしておりＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片は、血液悪性腫瘍を治療するために用いられる療法などの任意の公知の癌療法と組み合わせて投与してよい。
【０４７２】
診断的使用及びキット
キット
また、本発明は、本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含むキットを提供する。
【０４７３】
キットは、治療的使用のために、及び診断キットとして使用することができる。
【０４７４】
キットは、サンプル中のＨＬＡ−ＤＲの存在を検出するために使用することができる。
【０４７５】
いくつかの実施形態では、キットは、本発明の抗体又はその抗原結合断片と、該抗体を検出するための試薬とを含む。キットは、使用説明書；他の試薬、例えば、標識、治療薬、又はキレート化ないしは別の方法のカップリングに有用な剤、標識若しくは治療薬に対する抗体、又は放射線防護組成物；投与するために該抗体を調製するための装置又は他の材料；医薬的に許容される担体；及び対象に投与するための装置又は他の材料を含む、１つ以上の他の構成要素を含み得る。
【０４７６】
いくつかの実施形態では、キットは、容器内の本発明の抗体又はその抗原結合断片と、キットの使用説明書とを含む。
【０４７７】
いくつかの実施形態では、キットにおける抗体は標識されている。
【０４７８】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６０のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【０４７９】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号５７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【０４８０】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【０４８１】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号５９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【０４８２】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号１３７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【０４８３】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号１３８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【０４８４】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号１３９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【０４８５】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号１４０のＶＨ及び配列番号１４２のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【０４８６】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号１４１のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、ＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
【０４８７】
ＨＬＡ−ＤＲの検出方法
また、本発明は、サンプル中のＨＬＡ−ＤＲを検出する方法であって、該サンプルを入手することと、該サンプルを本発明のＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、該サンプル中のＨＬＡ−ＤＲに結合している抗体を検出することと、を含む、方法を提供する。
【０４８８】
いくつかの実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に結合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科的に切除された腫瘍組織、穿刺吸引を含む生検材料）、組織プレパラートなどから得ることができる。
【０４８９】
ＨＬＡ−ＤＲに結合している本発明の抗体又はその抗原結合断片は、公知の方法を用いて検出され得る。代表的な方法としては、蛍光若しくは化学発光標識、又は放射線標識を使用して抗体を直接標識すること、あるいは本発明の抗体に、ビオチン、酵素、又はエピトープタグなどの容易に検出可能な部分を結合させることが挙げられる。代表的な標識及び部分は、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びベータガラクトシダーゼ、ポリ−ヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料である。
【０４９０】
本発明の抗体は、サンプル中のＨＬＡ−ＤＲを検出するための様々なアッセイにおいて使用することができる。代表的なアッセイは、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイ、免疫組織化学的検査、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、又はＥＬＩＳＡアッセイである。
【０４９１】
本発明の更なる実施形態
本明細書の他の箇所の開示に従う、本発明の特定の更なる実施形態を以下に記載する。本明細書に開示される本発明に関連するものとして上述された本発明の実施形態の特徴は、これらの番号付けされた更なる実施形態のうちの１つ１つにもまた関係する。
１）ＨＬＡ−ＤＲα鎖及びＨＬＡ−ＤＲβ鎖を含むＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する単離抗体。
２）ＨＬＡ−ＤＲがＨＬＡ−ＤＲ４である、請求項１に記載の抗体。
３）該ＨＬＡ−ＤＲα鎖が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、該ＨＬＡ−ＤＲβ鎖が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体。
４）ＨＬＡ−ＤＲがＨＬＡ−ＤＲ１である、請求項１に記載の抗体。
５）該ＨＬＡ−ＤＲα鎖が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、該ＨＬＡ−ＤＲβ鎖が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体。
６）該抗体がＢ細胞のアポトーシスを誘導する能力を有していない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
７）アポトーシスが、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）のサンプル中のＣＤ３−ＣＤ２０＋アネキシンＶ＋ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ−Ｂ細胞の頻度を測定することによって求められる、請求項６に記載の抗体。
８）該抗体がＢ細胞の死を誘導する能力を有していない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
９）該Ｂ細胞の死が、フローサイトメトリーを用いてヒトＰＢＭＣのサンプル中のＣＤ３−ＣＤ２０＋アネキシンＶ＋ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ＋Ｂ細胞の頻度を測定することによって求められる、請求項７に記載の抗体。
１０）ＨＬＡ−ＤＲが共有エピトープを含有する、請求項１に記載の抗体。
１１）該共有エピトープが、アミノ酸配列ＱＫＲＡＡ（配列番号６６）、ＱＲＲＡＡ（配列番号６７）、又はＲＲＲＡＡ（配列番号６８）を含む、請求項１０に記載の抗体。
１２）該共有エピトープが、アミノ酸配列ＱＫＲＡＡ（配列番号６６）、ＱＲＲＡＡ（配列番号６７）、又はＲＲＲＡＡ（配列番号６８）からなる、請求項１０又は１１に記載の抗体。
１３）ＨＬＡ−ＤＲが、ペプチドとの複合体として存在する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
１４）該ペプチドが、ＩＩ型コラーゲン（配列番号６９）、赤血球凝集素（配列番号７０）、ＮＹ−ＥＳＯ１（配列番号７１）、又はインスリン（配列番号７２）のペプチド断片である、請求項１３に記載の抗体。
１５）該ペプチドが、配列番号７、８、９、１０、又は１１のアミノ酸配列を含む、請求項１３又は１４に記載の抗体。
１６）該ペプチドが、配列番号７、８、９、１０、又は１１のアミノ酸配列からなる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の抗体。
１７）該抗体がＴ細胞の活性化を阻害する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
１８）実施例４に記載のアッセイを用いて、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びヒトＨＬＡ−ＤＲ４を発現しているトランスジェニック動物から単離された樹状細胞の共培養下において、１μｇ／ｍＬの濃度でＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を少なくとも３０％阻害する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体。
１９）それぞれ配列番号７３、７４、及び７５の重鎖相補性決定領域１、２、及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
２０）それぞれ配列番号７６、７７、及び７８の軽鎖相補性決定領域１、２、及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
２１）配列番号５６、５７、５８、又は５９の重鎖可変領域（ＶＨ）に含有されているＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、該ＨＣＤＲ１、該ＨＣＤＲ２、及び該ＨＣＤＲ３が、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、又はＣｈｏｔｈｉａによって定義される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体。
２２）配列番号６０又は６１の軽鎖可変領域（ＶＬ）に含有されているＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、該ＬＣＤＲ１、該ＬＣＤＲ２、及び該ＬＣＤＲ３が、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、又はＣｈｏｔｈｉａによって定義される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体。
２３）配列番号３９、４０、又は４１のＨＣＤＲ１を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体。
２４）配列番号４２、４３、４４、又は４５のＨＣＤＲ２を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体。
２５）配列番号４６、４７、４８、又は４９のＨＣＤＲ３を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
２６）配列番号５０又は５１のＬＣＤＲ１を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体。
２７）配列番号５２又は５３のＬＣＤＲ２を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体。
２８）配列番号５４又は５５のＬＣＤＲ３を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体。
２９）それぞれ配列番号３９、４２、及び４６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号５０、５２、及び５４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３とを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体。
３０）
ａ）
ｉ）それぞれ配列番号４０、４３、及び４７、
ｉｉ）それぞれ配列番号４１、４４、及び４８、又は
ｉｉｉ）それぞれ配列番号４１、４５、及び４９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、並びに
ｂ）それぞれ配列番号５１、５３、及び５５のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体。
３１）それぞれ配列番号４０、４３、４７、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項３０に記載の抗体。
３２）それぞれ配列番号４１、４４、４８、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項３０に記載の抗体。
３３）それぞれ配列番号４１、４５、４９、５１、５３、及び５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項３０に記載の抗体。
３４）該抗体が、ＩＧＨＶ１−６９（配列番号６２）又はＩＧＨＶ５−５１（配列番号６３）に由来する重鎖フレームワークを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体。
３５）該抗体が、ＩＧＫＶ３−２０（配列番号６４）又はＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）に由来する軽鎖フレームワークを含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体。
３６）該重鎖フレームワークがＩＧＨＶ１−６９（配列番号６２）に由来し、該軽鎖フレームワークがＩＧＫＶ３−２０（配列番号６４）に由来する、請求項３４又は３５に記載の抗体。
３７）該重鎖フレームワークがＩＧＨＶ５−５１（配列番号６３）に由来し、該軽鎖フレームワークがＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）に由来する、請求項３４又は３５に記載の抗体。
３８）該重鎖フレームワークがＩＧＨＶ１−６９（配列番号６２）に由来し、該軽鎖フレームワークはＩＧＫＶ３−１１（配列番号６５）に由来する、請求項３４又は３５に記載の抗体。
３９）配列番号５６、５７、５８、又は５９のアミノ酸配列と少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるＶＨを含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗体。
４０）配列番号６０又は６１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるＶＬを含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗体。
４１）配列番号５６、５７、５８、又は５９のＶＨを含み、該ＶＨが、任意追加的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個のアミノ酸置換を有する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の抗体。
４２）配列番号６０又は６１のＶＬを含み、該ＶＬが、任意追加的に、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸置換を有する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体。
４３）配列番号５６のＶＨ及び配列番号６０のＶＬを含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の抗体。
４４）配列番号５７のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の抗体。
４５）配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の抗体。
４６）配列番号５９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の抗体。
４７）配列番号５７、５８、又は５９のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の抗体。
４８）ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の抗体。
４９）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプの抗体である、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体。
５０）該抗体のＦＣに１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の置換を含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の抗体。
５１）該１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の置換の結果、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する該抗体の結合が減少する、請求項５０に記載の抗体。
５２）該活性化ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、又はＦｃγＲＩＩＩｂである、請求項５１に記載の抗体。
５３）
ａ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換、
ｂ）Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ置換、
ｃ）Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、及びＱ２６８Ａ置換、
ｄ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、若しくはＬ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換、
ｅ）Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、若しくはＦ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換、又は
ｆ）Ｖ２３４Ａ置換（残基の付番は、ＥＵインデックスに従う）を含む、請求項５２に記載の抗体。
５４）Ｓ２２８Ｐ置換（残基の付番は、ＥＵインデックスに従う）を含む、請求項５３に記載の抗体。
５５）請求項１〜５４のいずれか一項に記載の抗体と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
５６）請求項１９〜５４のいずれかに記載の抗体ＶＨ、抗体ＶＬ、又は抗体ＶＨ及び抗体ＶＬをコードしているポリヌクレオチド。
５７）請求項５６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
５８）請求項５７に記載のベクターを含む宿主細胞。
５９）請求項１９〜５４のいずれかに記載の抗体を作製する方法であって、該抗体が発現する条件で請求項５８に記載の宿主細胞を培養することと、該宿主細胞によって産生された前記抗体を回収することと、を含む方法。
６０）ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患を有する対象を治療する方法であって、該ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の請求項１〜５４のいずれかに記載の抗体を、かかる治療を必要としている対象に投与すること、を含む方法。
６１）該ＨＬＡ−ＤＲＢ１関連自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は１型糖尿病である、請求項６０に記載の方法。
６２）自己抗原に対する免疫応答を抑制する方法であって、自己抗原に対する免疫応答を抑制するのに十分な時間、請求項１〜５４のいずれかに記載の抗体を、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む方法。
６３）該自己抗原が、自己免疫疾患の患者に存在する、請求項６２に記載の方法。
６４）該自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は１型糖尿病である、請求項６３に記載の方法。
６５）請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の抗体に結合する抗イディオタイプ抗体。
６６）請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の抗体を含むキット。
６７）該抗体を検出するための試薬と、使用説明書とを更に含む、請求項６６に記載のキット。
【０４９２】
以上、本発明を一般論として説明したが、本発明の各実施形態を、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例において更に開示する。
【実施例】
【０４９３】
実施例１．抗原及び対照抗体の生成
切断可能なリンカーを介してＨＬＡβ鎖のＮ末端に結合している、共有結合している赤血球凝集素、コラーゲン、インスリン、又はＮＹ−ＥＳＯペプチドとのＦｃ融合タンパク質として、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＬＡ−ＤＰヘテロ二量体抗原を発現させた。α及びβ鎖を、以下のとおりのフォーマットで発現させた。
α鎖：ＥＣＤ−Ｇ４Ｓ−ＴＥＶ−Ｇ４Ｓ−Ｆｃ−Ｈｉｓ６
β鎖：ペプチド−３ｘＧＳ−ＨＲＶ３Ｃ−ＥＣＤ−Ｇ４Ｓ−ＴＥＶ−Ｇ４Ｓ−Ｆｃ−ＳｔｒｅｐＩＩ
ＥＣＤ：発現しているＨＬＡ鎖の細胞外ドメイン
Ｇ４Ｓ：ＧＧＧＧＳ（配列番号１）
ＴＥＶ：ＥＤＬＹＦＱ（配列番号２）；タバコエッチ病ウイルスのＮｉａプロテアーゼ切断部位
Ｈｉｓ６：ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３）
３ｘＧＳ：ＧＳＧＳＧＳ（配列番号４）
ＨＲＶ３Ｃ：ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号５）；ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位
ＳｔｒｅｐＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号６）；ＳｔｒｅｐＩＩタグ
赤血球凝集素ペプチドＨＡ＿３０４〜３１８：ＡＣＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号７）
ＩＩ型コラーゲンペプチドＣＩＩ＿１２３６〜１２４９：ＬＱＹＭＲＡＤＱＡＡＧＧＬＲ（配列番号８）
ＩＩ型コラーゲンペプチドＣＩＩ＿２５７〜２７３：ＥＰＧＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰ（配列番号９）
インスリンペプチドＩＮＳ＿１〜１５：ＦＶＮＱＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬ（配列番号１０）
ＮＹ−ＥＳＯペプチドＮＹ−ＥＳＯ＿１５７〜１６９：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶ（配列番号１１）
ＰＬＰペプチドＰＬＰ＿１７８〜１８６：ＮＴＷＴＴＣＱＳＩ（配列番号３７）
【０４９４】
Ｆｃ：改変ＩｇＧ４（配列番号１２）
ＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬ
【０４９５】
ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２（配列番号１３）
ＩＫＥＥＨＶＩＩＱＡＥＦＹＬＮＰＤＱＳＧＥＦＭＦＤＦＤＧＤＥＩＦＨＶＤＭＡＫＫＥＴＶＷＲＬＥＥＦＧＲＦＡＳＦＥＡＱＧＡＬＡＮＩＡＶＤＫＡＮＬＥＩＭＴＫＲＳＮＹＴＰＩＴＮＶＰＰＥＶＴＶＬＴＮＳＰＶＥＬＲＥＰＮＶＬＩＣＦＩＤＫＦＴＰＰＶＶＮＶＴＷＬＲＮＧＫＰＶＴＴＧＶＳＥＴＶＦＬＰＲＥＤＨＬＦＲＫＦＨＹＬＰＦＬＰＳＴＥＤＶＹＤＣＲＶＥＨＷＧＬＤＥＰＬＬＫＨＷＥＦＤＡＰＳＰＬＰＥＴＴＥ
【０４９６】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１（配列番号１４）
ＧＤＴＲＰＲＦＬＥＱＶＫＨＥＣＨＦＦＮＧＴＥＲＶＲＦＬＤＲＹＦＹＨＱＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲＰＤＡＥＹＷＮＳＱＫＤＬＬＥＱＫＲＡＡＶＤＴＹＣＲＨＮＹＧＶＧＥＳＦＴＶＱＲＲＶＹＰＥＶＴＶＹＰＡＫＴＱＰＬＱＨＨＮＬＬＶＣＳＶＮＧＦＹＰＧＳＩＥＶＲＷＦＲＮＧＱＥＥＫＴＧＶＶＳＴＧＬＩＱＮＧＤＷＴＦＱＴＬＶＭＬＥＴＶＰＲＳＧＥＶＹＴＣＱＶＥＨＰＳＬＴＳＰＬＴＶＥＷＲＡＲＳＥＳＡＱＳＫ
【０４９７】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０１（配列番号１５）
ＧＤＴＲＰＲＦＬＷＱＬＫＦＥＣＨＦＦＮＧＴＥＲＶＲＬＬＥＲＣＩＹＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲＰＤＡＥＹＷＮＳＱＫＤＬＬＥＱＲＲＡＡＶＤＴＹＣＲＨＮＹＧＶＧＥＳＦＴＶＱＲＲＶＥＰＫＶＴＶＹＰＳＫＴＱＰＬＱＨＨＮＬＬＶＣＳＶＳＧＦＹＰＧＳＩＥＶＲＷＦＲＮＧＱＥＥＫＡＧＶＶＳＴＧＬＩＱＮＧＤＷＴＦＱＴＬＶＭＬＥＴＶＰＲＳＧＥＶＹＴＣＱＶＥＨＰＳＶＴＳＰＬＴＶＥＷＲＡＲＳＥＳＡＱＳＫ
【０４９８】
ＨＬＡ−ＤＱＡ１（配列番号１６）
ＥＤＩＶＡＤＨＶＡＳＣＧＶＮＬＹＱＦＹＧＰＳＧＱＹＴＨＥＦＤＧＤＥＱＦＹＶＤＬＥＲＫＥＴＡＷＲＷＰＥＦＳＫＦＧＧＦＤＰＱＧＡＬＲＮＭＡＶＡＫＨＮＬＮＩＭＩＫＲＹＮＳＴＡＡＴＮＥＶＰＥＶＴＶＦＳＫＳＰＶＴＬＧＱＰＮＴＬＩＣＬＶＤＮＩＦＰＰＶＶＮＩＴＷＬＳＮＧＱＳＶＴＥＧＶＳＥＴＳＦＬＳＫＳＤＨＳＦＦＫＩＳＹＬＴＦＬＰＳＡＤＥＩＹＤＣＫＶＥＨＷＧＬＤＱＰＬＬＫＨＷＥＰＥＩＰＡＰＭＳＥＬＴＥ
【０４９９】
ＨＬＡ＿ＤＱＢ１＊０６：０２（配列番号１７）
ＲＤＳＰＥＤＦＶＦＱＦＫＧＭＣＹＦＴＮＧＴＥＲＶＲＬＶＴＲＹＩＹＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＶＹＲＡＶＴＰＱＧＲＰＤＡＥＹＷＮＳＱＫＥＶＬＥＧＴＲＡＥＬＤＴＶＣＲＨＮＹＥＶＡＦＲＧＩＬＱＲＲＶＥＰＴＶＴＩＳＰＳＲＴＥＡＬＮＨＨＮＬＬＶＣＳＶＴＤＦＹＰＧＱＩＫＶＲＷＦＲＮＤＱＥＥＴＡＧＶＶＳＴＰＬＩＲＮＧＤＷＴＦＱＩＬＶＭＬＥＭＴＰＱＲＧＤＶＹＴＣＨＶＥＨＰＳＬＱＳＰＩＴＶＥＷＲＡＱＳＥＳＡＱＳＫ
【０５００】
ＨＬＡ−ＤＰＡ１（配列番号１８）
ＡＧＡＩＫＡＤＨＶＳＴＹＡＡＦＶＱＴＨＲＰＴＧＥＦＭＦＥＦＤＥＤＥＭＦＹＶＤＬＤＫＫＥＴＶＷＨＬＥＥＦＧＱＡＦＳＦＥＡＱＧＧＬＡＮＩＡＩＬＮＮＮＬＮＴＬＩＱＲＳＮＨＴＱＡＴＮＤＰＰＥＶＴＶＦＰＫＥＰＶＥＬＧＱＰＮＴＬＩＣＨＩＤＫＦＦＰＰＶＬＮＶＴＷＬＣＮＧＥＬＶＴＥＧＶＡＥＳＬＦＬＰＲＴＤＹＳＦＨＫＦＨＹＬＴＦＶＰＳＡＥＤＦＹＤＣＲＶＥＨＷＧＬＤＱＰＬＬＫＨＷＥＡＱＥＰＩＱＭＰＥＴＴＥ
【０５０１】
ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４：０１（配列番号１９）
ＲＡＴＰＥＮＹＬＦＱＧＲＱＥＣＹＡＦＮＧＴＱＲＦＬＥＲＹＩＹＮＲＥＥＦＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲＡＶＴＥＬＧＲＰＡＡＥＹＷＮＳＱＫＤＩＬＥＥＫＲＡＶＰＤＲＭＣＲＨＮＹＥＬＧＧＰＭＴＬＱＲＲＶＱＰＲＶＮＶＳＰＳＫＫＧＰＬＱＨＨＮＬＬＶＣＨＶＴＤＦＹＰＧＳＩＱＶＲＷＦＬＮＧＱＥＥＴＡＧＶＶＳＴＮＬＩＲＮＧＤＷＴＦＱＩＬＶＭＬＥＭＴＰＱＱＧＤＶＹＴＣＱＶＥＨＴＳＬＤＳＰＶＴＶＥＷＫＡＱＳＤＳＡＲＳＫ
【０５０２】
表４は、発現しているＨＬＡ融合タンパク質のフォーマットを示す。表５は、α及びβ鎖の両方のアミノ酸配列を示す。発現及び精製のために、ＨＬＡα及びβＥＣＤ−Ｆｃ融合物をＨＥＫ２９３Ｅｘｐｉ細胞にコトランスフェクトし、可溶性ＨＬＡ−ＥＣＤ  Ｆｃ融合タンパク質をプロテインＡ／ＳＥＣを介して精製した。ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと、標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２１３２７）を用いて、すべてのＨＬＡ−ＤＲ抗原をビオチンにコンジュゲートした。ＨＡＢＡ−アビジンアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号４６６１０）及びＯｃｔｅｔによって、ビオチニル化の成功を分析した。
【０５０３】
【表４】
2019502698.tif 000006
【０５０４】
【表５−１】
2019502698.tif 000007
【０５０５】
【表５−２】
2019502698.tif 000008
【０５０６】
【表５−３】
2019502698.tif 000009
【０５０７】
ＩｇＧ２シグマアイソタイプとして定常ドメインを再度遺伝子操作した後、対照抗体として抗体Ｌｙｍ−１、アポリズマブ（１Ｄ１０）、及びＬ２４３を使用した。遺伝子操作を受けたＩｇＧ２シグマｍＡｂを、ＤＲ４Ｂ４（Ｌｙｍ−１）、ＤＲ４Ｂ５（アポリズマブ）、及びＤＲ４Ｂ６（Ｌ２４３）と再命名した。ＩｇＧ２σは、エフェクター機能を欠失させたＦｃ（silent Fc）であり、野生型ＩｇＧ２と比較して置換Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを有する。ＩｇＧ２シグマは、米国特許第８，９６１，９６７号に記載されている。
【０５０８】
Ｌｙｍ−１  ＶＨ（配列番号３１）
ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＩＳＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＶＶＩＷＳＤＧＳＴＴＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＳＨＹＧＳＴＬＡＦＡＳＷＧＨＧＴＬＶＴＶＳＡ
【０５０９】
Ｌｙｍ−１  ＶＬ（配列番号３２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＩＣＲＡＳＶＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＮＡＫＩＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＮＳＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＨＹＧＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
【０５１０】
アポリズマブＶＨ（配列番号３３）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＫＷＳＧＧＳＴＥＹＮＡＡＦＩＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＳＬＫＬＮＳＬＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＤＲＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０５１１】
アポリズマブＶＬ（配列番号３４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＮＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＫＱＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＨＹＧＮＳＹＰＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【０５１２】
Ｌ２４３  ＶＨ（配列番号３５）
ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＫＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＹＴＲＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＦＡＦＳＬＥＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＮＥＤＴＡＫＹＦＣＡＲＤＩＴＡＶＶＰＴＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
【０５１３】
Ｌ２４３  Ｖｌ（配列番号３６）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＶＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡＷＹＲＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＦＡＡＳＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＬＫＩＮＳＬＱＳＥＤＦＧＤＹＹＣＱＨＦＷＴＴＰＷＡＦＧＧＧＴＮＬＥＩＫ
【０５１４】
実施例２．ＨＬＡ−ＤＲに結合する抗体のファージディスプレイライブラリからの単離
Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６，２０１０、国際公開第２００９／０８５４６２号）に記載の２セットのデノボｐＩＸファージディスプレイライブラリから、ＨＬＡ−ＤＲ結合性のＦａｂを選択した。簡潔に言えば、Ｖ３．０及びＶ５．０と呼ばれる２セットのライブラリは、ヒトスカフォールドを多様化させることによって作製されたものであり、生殖系列ＶＨ遺伝子ＩＧＨＶ１−６９＊０１、ＩＧＨＶ３−２３＊０１及びＩＧＨＶ５−５１＊０１を、Ｈ３ループを介してヒトＩＧＨＪ−４ミニ遺伝子で組み換え（Ｖ５．０ではＩＧＨＪ−６ミニ遺伝子も用いた）、そして、ヒト生殖系列ＶＬカッパ遺伝子Ｏ１２（ＩＧＫＶ１−３９＊０１）、Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１＊０１）、Ａ２７（ＩＧＫＶ３−２０＊０１）及びＢ３（ＩＧＫＶ４−１＊０１）をＩＧＫＪ−１ミニ遺伝子で組み換えて、完全なＶＨ及びＶＬドメインを構築した。多様化のために、タンパク質及びペプチド抗原と高頻度で接触すると特定された位置に対応するＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３ループ周辺の重鎖及び軽鎖可変領域内の位置を選択した。選択した位置における配列多様性は、それぞれのＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ遺伝子のＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ生殖系列遺伝子ファミリーにおいてそれぞれの位置に存在する残基に制限した。Ｈ３ループにおける多様性は、Ｖ３．０ライブラリについては７〜１４アミノ酸長、Ｖ５．０ライブラリについては６〜１９アミノ酸長の短鎖〜中鎖の合成ループを使用して作製した。Ｈ３におけるアミノ酸分布は、ヒト抗体において観察されるアミノ酸の変動を模倣するよう設計された。ライブラリを作製するために利用したスカフォールドは、そのヒトＶＨ及びＶＬ生殖系列遺伝子の由来に従って命名した。Ｖ３．０及びＶ５．０セットの両方について、ＨＬＡ−ＤＲを発現する組み換え細胞株又はＦｃ断片に融合しており、特定のペプチドをディスプレイするＨＬＡ−ＤＲの細胞外ドメインに対する選択実験に用いられる各ライブラリセットについて、３つの重鎖ライブラリのそれぞれを、４個の生殖系列軽鎖又は生殖系列軽鎖ライブラリと組み合わせて１２の固有のＶＨ：ＶＬ組み合わせを作製した。
【０５１５】
「細胞に基づく」選別では、不要のエピトープ又はネイティブ細胞（親細胞株Ｕ９３７）に対する初期枯渇工程、それに続く標的エピトープ又はトランスフェクトされた細胞（組み換え細胞株）の選別工程、に基づくサブトラクティブストラテジを使用した。Ｕ９３７細胞における安定的トランスフェクションによって、ＨＬＡ−ＤＲ１５を発現する組み換え細胞株（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１９１１）を作製した。このサブトラクティブストラテジでは、所望のもの他の過剰な細胞表面受容体に結合しているファージの選別を回避した。精製された組み換え抗原を用いるファージ選別では、ＨＡペプチドＨＡ＿３０４〜３１８を有するビオチン化ＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲ４Ｇ８９）又はＩＩ型コラーゲンペプチドＣＩＩ＿２５７〜２７３を有するＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲ４Ｇ９２）をベイト（bait）として用いて、ファージバインダを捕捉及び固定化した。数回の選別ラウンド後、精製抗原を用いるポリクローナルファージＥＬＩＳＡを実施して、個々のパニング実験の特異的富化（enrichment）を検出した。個々のＦａｂクローンから発現したＦａｂタンパク質を、いくつかの異なるビオチン化ＨＬＡ−ＤＲ抗原（ＤＲ４Ｇ８９、ＤＲ４Ｇ９０、ＤＲ４Ｇ９２、ＤＲ４Ｇ１０２）並びにビオチン化ＨＬＡ−ＤＰ（ＤＲ４Ｇ１１３）及びＨＬＡ−ＤＱ（ＤＲ４Ｇ１１１及びＤＲ４Ｇ１１２）に対するバインダとして使用したモノクローナルＦａｂ  ＥＬＩＳＡで、ＨＬＡ−ＤＲに対するバインダの富化が立証されたこれらパニング実験から回収されたファージを更にスクリーニングした。陰性対照ＦａｂよりもＨＬＡ−ＤＲに対する結合シグナルが５倍高く、及び陰性対照ＦａｂよりもＨＬＡ−ＤＰ又はＨＬＡ−ＤＱに対する結合シグナルが５倍未満で高いＦａｂクローンを、更なる分析のために選択した。選択されたＦａｂをＩｇＧ２シグマ／κａｐｐａとしてクローニングし、ＭＳＤアッセイを用いて更に特性評価した。
【０５１６】
実施例３．抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、提示されるペプチドに関係なく可溶性ＨＬＡ−ＤＲ抗原に結合する
選択された生成抗体を、ベータ鎖のＮ末端に結合している様々なペプチドを有する可溶性ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、又はＨＬＡ−ＤＰ抗原に対する結合について特性評価した。更に、対照抗体ＤＲ４Ｂ４、ＤＲ４Ｂ５、及びＤＲ４Ｂ６についても試験した。ＤＲ、ＤＰ、及びＤＱの可溶性抗原を、４℃で一晩、５μｇ／ｍＬでＭＳＤ標準プレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｌ１５ＸＡ−３）にコーティングした。翌日、プレートを自動プレート洗浄機（Ｂｉｏ  Ｔｅｋ）でＰＢＳＴにより３回洗浄し、３０分間ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３７５４３）でブロッキングし、抗体と共に１時間インキュベートした。０．０４〜５μｇ／ｍＬの範囲の４つの抗体濃度を用いてＤＲ抗原に対する結合を試験した。５μｇ／ｍＬの１つの濃度を用いてＤＰ及びＤＱ抗原に対する結合を試験した。３回洗浄した後、ＳｕｌｆｏＴａｇ抗ヒト／ＮＨＰ  Ｋａｐｐａ二次抗体（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｄ２０ＴＦ−６）を添加し、１時間インキュベートした。更に３回洗浄した後、ＭＳＤリーダー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）でプレートを読み取り、電気化学発光（ＥＣＬ）を測定した。ＭＳＤアッセイは高い再現性を有するので、各データ点のためデュープリケートで実施した。ＤＰ及びＤＱに対する結合に関しては５μｇ／ｍＬ、ＤＲ対立遺伝子に対する結合に関しては０．２μｇ／ｍＬの抗体濃度における、抗体のＤＲ、ＤＰ、又はＤＱ抗原に対する結合の結果（ＥＣＬシグナルとして表す）を表６に示し、デュープリケートで取った各データ点（the two replicates）の平均として報告する。ＤＲ４Ｇ８９（ＨＡ＿３０４−３１８ペプチドを有するＨＬＡ−ＤＲ４）に対する抗体の結合についての用量反応曲線を図９に示す。ＤＲ４Ｇ９３（ＨＡ＿３０４−３１８ペプチドを有するＨＬＡ−ＤＲ１）に対する抗体の結合についての用量反応曲線を図１０に示す。ＤＲ４Ｇ９０（ＣＩＩ＿１２３６−１２４９ペプチドを有するＨＬＡ−ＤＲ４）に対する抗体の結合についての用量反応曲線を図１１に示す。ＤＲ４Ｇ９９（ＣＩＩ＿１２３６−１２４９ペプチドを有するＨＬＡ−ＤＲ１）に対する抗体の結合についての用量反応曲線を図１２に示す。
【０５１７】
ＤＲ４Ｂ９８が、ＣＩＩ＿１２３６−１２４９ペプチドを有するＨＬＡ−ＤＲに対する結合の減少を示したことを除いて、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたペプチドに関係なく、生成された抗体はＨＬＡ−ＤＲ４及びＨＬＡ−ＤＲ１に結合した。抗体がＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰに対して示した結合は最小限のものであった。
【０５１８】
【表６】
2019502698.tif 000010
【０５１９】
実施例４．抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の特性評価
生成された抗体を、その抗原特異的Ｔ細胞活性化を阻害する能力、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニック動物から単離された樹状細胞及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対する結合、並びにＢ細胞の生存に対する効果について試験した。
【０５２０】
方法
抗原特異的Ｔ細胞の阻害：ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウス樹状細胞の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（「ＨＬＡ−ＤＲ４  ＤＣ  ＭＬＲ」）
ＭＬＲアッセイを使用して、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞とヒトＨＬＡ−ＤＲ４を発現しているトランスジェニック動物から単離された樹状細胞との共培養下における細胞増殖の阻害を測定して、生成された抗体のＴ細胞の活性化を阻害する能力を評価した。
【０５２１】
樹状細胞は、Ａｂｂノックアウト／トランスジェニックＨＬＡ−ＤＲ４マウス骨髄（系統４１４９、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に由来していた。これらマウスは、マウスＩ−Ｅ（Ｈ２−Ｅ）の膜近位ドメインが遺伝子操作されたヒトＨＬＡ−ＤＲＡ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１を発現する。骨髄は、マウスから調製し、−８０℃で凍結した。骨髄を解凍し、１０ｍＬの樹状細胞（ＤＣ）培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％最小必須培地（ＭＥＭ）非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）溶液、１０％熱不活化ウシ胎児血清（すべてＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）、及び５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０／Ｇｌｕｔａｍａｘ）に再懸濁させた。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次いで、１０ｍＬのＤＣ培地に再懸濁させ、カウントし、再度１２００ｒｐｍで８分間スピンした。２０ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＤＣ培地で細胞を０．３×１０６細胞／ｍＬに希釈した。６ｍＬの希釈した細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに移し、次いで、プレートを３７℃／５％  ＣＯ２で９６時間インキュベートした。３ｍＬの培地を各ウェルから除去し、３ｍＬの新鮮ＤＣ培地＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦと交換した。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で更に４８時間インキュベートした。３ｍＬの培地を各ウェルから除去し、３ｍＬの新鮮ＤＣ培地＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ＋２μｇ／ｍＬ  ＬＰＳ（最終濃度１μｇ／ｍＬ  ＬＰＳ）（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と交換した。次いで、プレートを３７℃／５％  ＣＯ２で１８時間インキュベートした。
【０５２２】
ＭＬＲアッセイにおいて用いられるヒトＣ４＋Ｔ細胞を、凍結させたヒトＰＢＭＣ（Ｈｅｍａｃａｒｅ）から単離した。細胞を解凍し、５０ｍＬのコニカルに移し、４０ｍＬの完全培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％加熱不活化ウシ胎児血清（すべてＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）、及び５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０／Ｇｌｕｔａｍａｘ）で洗浄した。細胞を１０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、上清を吸引除去し、細胞を４０ｍＬのＥａｓｙＳｅｐ緩衝液（ＰＢＳ＋２％熱不活化ウシ胎児血清＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。細胞を１２００ｒｐｍで８分間遠心分離し、５×１０７個／ｍＬの濃度でＥａｓｙＳｅｐ緩衝液に再懸濁させ、１５ｍＬのポリスチレン丸底チューブに移した。製造業者の指示書（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。単離した細胞を、１×１０６個／ｍＬの濃度で完全培地に再懸濁させた。
【０５２３】
ＬＰＳ成熟マウス骨髄由来樹状細胞をプレートから回収し、５０ｍのコニカルチューブ内で合わせた。プレートを２ｍＬのＰＢＳで洗浄し、次いで、２ｍＬのＰＢＳ＋３ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３７℃／５％  ＣＯ２で１０分間各ウェルに添加して、残りの樹状細胞を回収した。細胞をプレートから回収し、５０ｍＬのコニカルに移した。細胞を４０ｍＬの完全培地で３回洗浄した（１２００ｒｐｍで８分間遠心分離）。このＤＣを、２．５×１０５個／ｍＬの濃度になるように完全培地に再懸濁させた。５０μＬの細胞を９６ウェル丸底プレートの各ウェルに添加した。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を、１０μｇ／ｍＬの単一用量で添加した、又は４×最終濃度の完全培地で連続希釈し、５０μＬの抗体希釈物を各ウェルに添加した。対照ウェルには５０μＬの培地を加えた。Ｔ細胞を各ウェルに添加し（１００μＬ／ウェルで、Ｔ細胞を１×１０６個／ｍＬ）、その結果、合計体積は２００μＬ／ウェルになった。プレートを３７℃／５％  ＣＯ２で５日間インキュベートした。インキュベート後、１．０ｍＣｉ／ウェル３Ｈ−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含有する完全培地２５μＬをすべてのウェルに添加し、３７℃／５％  ＣＯ２で６時間インキュベートした。細胞をＵｎｉｆｉｌｔｅｒ−９６、ＧＦ／Ｃプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に収集し、ＲＴで一晩乾燥させた。５０μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を各ウェルに添加し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてカウントした。
【０５２４】
ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスに由来する樹状細胞に結合する抗体
ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスに由来する樹状細胞に対する抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の結合を評価した。ＨＬＡ−ＤＲ４  ＤＣは、上記のように由来していた。ＤＣ（５×１０５個／ウェル）を、９６ウェル丸底プレートの完全培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０／Ｇｌｕｔａｍａｘ−すべてＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）にプレーティングした。細胞を、ＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有する完全培地５０μＬに再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートした。抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂ及びアイソタイプ対照ｍＡｂを、試験する最終濃度（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）の２倍になるように完全培地で希釈した。希釈したｍＡｂ５０μＬをウェルに添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を、アジド−及び血清／タンパク質フリーのＰＢＳ２００μＬで２回洗浄し、４℃で５分間１４００ｒｐｍで遠心分離した。細胞を、１：４０００希釈したＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有するＰＢＳ又はＰＢＳのみ１００μＬに再懸濁させた。プレートを、光から保護した状態で２〜８℃にて３０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、４℃で５分間１４００ｒｐｍで遠心分離した。ハムスター抗マウスＣＤ１１ｃ−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；１：２０、５μＬ／試験）及びＡＦ６４７  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；１：２０００希釈）を含有するＦＡＣＳ緩衝液５０μＬを各ウェルに添加し、プレートを暗条件下、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、１ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、４℃で５分間１４００ｒｐｍで遠心分離した。細胞は、４％パラホルムアルデヒド溶液（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）２００μＬに再懸濁させた細胞であり、１５分間氷上でインキュベートした。細胞を１８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でイベントを回収した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ−ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞について平均蛍光強度（ＭＦＩ、ＧｅｏＭｅａｎ）を決定した。抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂの結合レベルをアイソタイプ対照と比較した。
【０５２５】
ヒトＢ細胞生存アッセイ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：ＮＯＣＯＭＰＯＵＮＤＮＡＰ１００１「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」を使用して、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎの従業員のドナーから血液を回収した。血液を、ヘパリンナトリウムを含有するＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒに回収した。血液をＰＢＳで１：１〜１：３希釈した。１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を５０ｍＬのコニカルに添加し、３０ｍＬの希釈血液を、傾けたチューブの側面にゆっくりとピペットで落とすことによってＦｉｃｏｌｌ上に慎重に層状に重ねた。コニカルを、ＲＴでブレーキなしに４Ｎ（４００ｇ）で３０分間遠心分離した。ＰＢＭＣ層を５０ｍＬのコニカルチューブに回収し、次いで、これにＰＢＳを充填し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞をＰＢＳで更なる時間洗浄した。細胞を、完全培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％  ＮＥＡＡ、１％  ＨＥＰＥＳ、及び１０％熱不活化ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０／Ｇｌｕｔａｍａｘ、すべてＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）に再懸濁させ、カウントした。細胞を、８００，０００個／ウェルの濃度で９６ウェル丸底プレートにプレーティングした。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を、０．２μｇ／ｍＬ及び２μｇ／ｍＬの濃度でウェルに添加した。プレートを３７℃／５％  ＣＯ２で２０時間インキュベートした。次いで、細胞を、ＲＴで１５分間、１００μｇ／ｍＬヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％熱不活化ウシ胎児血清、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１００μＬに再懸濁させた。細胞を遠心分離によってペレット化させ、氷上で２０分間５０μＬ抗体カクテルに再懸濁させた。抗体カクテルは、以下：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ３−ＰＥ  Ｃｙ７クローンＯＫＴ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ２０−ＡＰＣ  Ｃｙ７クローン２Ｈ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５クローン３Ｇ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及び抗ＣＤ１４−ＢＶ７８５クローンＭ５Ｅ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有していた。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｓｔａｉｎ−ｅＦ６６０（Ｌ／Ｄ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；ＰＢＳ１ｍＬ当たり１μＬ）に再懸濁させ、氷上で２０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで、アネキシンＶ結合緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で１回洗浄した。細胞を、ＲＴで２０分間、１００μＬのアネキシンＶ結合緩衝液＋５μＬのアネキシンＶ−パシフィックブルー（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に再懸濁させた。細胞をアネキシンＶ結合緩衝液で１回洗浄し、氷上で１０分間、１００μＬのＣｙｔｏＦｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁させた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、次いで、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。ＬＳＲ  ＩＩフローサ��トメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でイベントを回収した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（ｅＢｉｓｏｃｉｅｎｃｅ）を使用して、単色補償（single-color compensations）を設定する。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用してＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ（Ｌ／Ｄ）及びアネキシンＶ＋／−Ｂ細胞の頻度を決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６でグラフ化した。死Ｂ細胞の頻度を、ｅＦ６６０＋及びアネキシンＶ＋でもあるＣＤ３−ＣＤ２０＋細胞の百分率として計算した。アポトーシスＢ細胞の頻度を、ｅＦ６６０−及びアネキシンＶ＋でもあるＣＤ３−ＣＤ２０＋細胞の百分率として計算した。ｔ検定を用いて統計的有意性を判定した。
【０５２６】
ヒトＰＢＭＣに結合する抗体
ヒトＰＢＭＣに対する抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の結合を評価した。ヒトＰＢＭＣを、上記のとおり単離した。各ドナー由来のＰＢＭＣを、５００，０００個／ウェルで９６ウェル丸底プレートにプレーティングした。細胞を、ＲＴで１５分間、１００μｇ／ｍＬヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％熱不活化ウシ胎児血清）１００μＬに再懸濁させた。２５μＬのＢｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中１μｇの抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂをウェルに添加し、次いで、２５μＬの抗体カクテルをウェルに添加した。抗体カクテルは、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び２μＬ／試験で以下：抗ＣＤ３−ＰＥ  Ｃｙ７クローンＯＫＴ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ２０−ＡＰＣ  Ｃｙ７クローン２Ｈ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５クローン３Ｇ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及び抗ＣＤ１４−ＢＶ７８５クローンＭ５Ｅ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、のそれぞれを含有していた。細胞を氷上で２０分間インキュベートし、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、細胞を、氷上で２０分間、Ｆｃγ断片特異的なものであり、ＡＦ４８８で標識されたＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ）’２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の１：２００希釈物５０μＬに再懸濁させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷上で３０分間１００μＬのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｓｔａｉｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；ＰＢＳ１ｍＬ当たり０．５μＬ）に再懸濁させた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、氷上で１０分間、１００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ）に再懸濁させ、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、次いで、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でイベントを回収した。ドナー１由来の細胞を使用して、単色補償を設定した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ、ＧｅｏＭｅａｎ）を決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６でグラフ化した。抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂの結合レベルをアイソタイプ対照と比較した。
【０５２７】
結果
試験した抗体はすべて、１０μｇ／ｍＬの単一用量濃度で、ＭＬＲアッセイにおいてＴ細胞の活性化を阻害した。抗体は、ＭＬＲアッセイにおいて、０．１１〜５．３６μｇ／ｍＬの範囲のＩＣ５０値で細胞の増殖を阻害した。対照抗体ＤＲ４Ｂ６は、用量依存的にＭＬＲを阻害したが、対照抗体ＤＲ４Ｂ４及びＤＲ４Ｂ５は、試験した最高濃度１０μｇ／ｍＬで１００％阻害に達しなかったので、これらの抗体についてＩＣ５０値を計算することはできなかった。
【０５２８】
試験した抗体はすべて、ヒトＰＢＭＣに結合し、また、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニック動物由来のＤＣにも結合した。１つの対照抗体ＤＲ４Ｂ５は、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックＤＣに対して低い結合を示した。
【０５２９】
生成された抗体は、Ｂ細胞の死又はアポトーシスを誘導することができないという点で試験抗体とは異なっていた。図１３は、生成された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、アイソタイプ対照と比べて３人の別々のドナーにおいて死Ｂ細胞の頻度に対して効果を有しなかったが、対照抗体ＤＲ４Ｂ６は、死Ｂ細胞の頻度の統計的に有意な増加を示したことを示す。同様に、図１４は、生成された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、３人の別々のドナーに由来するＢ細胞においてアポトーシスを誘導しなかったが、対照抗体ＤＲ４Ｂ６は誘導したことを示す。
【０５３０】
表７は、選択された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の特徴を示す。
【０５３１】
ＤＲ４Ｂ４（Ｌｙｍ−１）及びＤＲ４Ｂ５（アポリズマブ）は、Ｂ細胞のアポトーシス及び死を誘導することが示されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  ２２：３４２〜５６，２００７；Ｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０３：１８４６〜５４，２００４）。
【０５３２】
【表７】
2019502698.tif 000011
【０５３３】
実施例５．抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の構造的特徴
標準的な技術を用いて、抗体のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳物を得た。ポリペプチド配列の決定後、可変領域又は完全長抗体をコードしているいくつかの抗体ｃＤＮＡを、発現をスケールアップするための標準的な方法を用いてコドンを最適化した。
【０５３４】
表８は、選択抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【０５３５】
表９は、選択抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【０５３６】
表１０は、選択抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【０５３７】
表１１は、選択抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
【０５３８】
表１２は、選択抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＬＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
【０５３９】
表１３は、選択抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【０５４０】
表１４は、選択抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＶＨ、ＶＬ、ＨＣ、及びＬＣ対についてのタンパク質配列番号を示す。
【０５４１】
表１５は、選択抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＶＨ、ＶＬ、ＨＣ、及びＬＣをコードしているポリヌクレオチド配列番号を示す。
【０５４２】
表１６は、選択抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＶＨ、ＶＬ、ＨＣ、及びＬＣのアミノ酸配列、並びにこれらをコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
【０５４３】
表１７は、選択抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のフレームワークを示す。
【０５４４】
【表８】
2019502698.tif 000012
【０５４５】
【表９】
2019502698.tif 000013
【０５４６】
【表１０】
2019502698.tif 000014
【０５４７】
【表１１】
2019502698.tif 000015
【０５４８】
【表１２】
2019502698.tif 000016
【０５４９】
【表１３】
2019502698.tif 000017
【０５５０】
【表１４】
2019502698.tif 000018
【０５５１】
【表１５】
2019502698.tif 000019
【０５５２】
【表１６−１】
2019502698.tif 000020
【０５５３】
【表１６−２】
2019502698.tif 000021
【０５５４】
【表１６−３】
2019502698.tif 000022
【０５５５】
【表１６−４】
2019502698.tif 000023
【０５５６】
【表１６−５】
2019502698.tif 000024
【０５５７】
【表１６−６】
2019502698.tif 000025
【０５５８】
【表１６−７】
2019502698.tif 000026
【０５５９】
【表１６−８】
2019502698.tif 000027
【０５６０】
【表１６−９】
2019502698.tif 000028
【０５６１】
【表１７】
2019502698.tif 000029
【０５６２】
ＩＧＨＶ１−６９配列番号６２
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳ  ＳＹＡＩＳ  ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ  ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ  ＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
【０５６３】
ＩＧＨＶ５−５１配列番号６３
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲ
【０５６４】
ＩＧＫＶ３−２０（Ａ２７）配列番号６４
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ  ＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰ
【０５６５】
ＩＧＫＶ３−１１（Ｌ６）配列番号６５
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰ
【０５６６】
ＩＧＨＶ３＿３−２３配列番号１６１
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０５６７】
ＩＧＫＶ１−３９配列番号１６２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰ
【０５６８】
実施例６．ＨＬＡ−ＤＲに対する抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の親和性
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体と、ＩＩ型コラーゲン又は赤血球凝集素ペプチドのいずれかを含有するＨＬＡ−ＤＲ１複合体及びＨＬＡ−ＤＲ４複合体との相互作用について、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験した。アミンカップリング化学についての製造業者の取扱説明書を使用して、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体をＧＬＣセンサチップの表面に直接カップリングさせることによって、バイオセンサ表面を調製した。カップリング緩衝液、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で希釈した１５μｇ／ｍＬのｍＡｂで、約１３０〜５００ＲＵ（反応単位）のｍＡｂを固定化した。ランニング緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．０１％  Ｐ２０＋１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）中にて２５℃で速度実験を実施した。速度実験を実施するために、アナライト（ＨＬＡ−ＤＲ１及びＨＬＡ−ＤＲ４複合体）を、３．７ｎＭ〜３００ｎＭ（３倍連続希釈）の範囲の濃度で、カップリングした抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂセンサ上に水平配向で注入した。５０μＬ／分で６分間、会合相をモニタリングし、続いて、３０分間緩衝液を流した（解離相）。１００μＬ／分で１００ｍＭリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を１８秒間ずつ２回流してチップ表面を再生した。回収したデータをＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを用いて処理した。まず、インタースポットを用いてバックグラウンドについてデータを補正した。次いで、分析物注入用の緩衝液注入を使用して、データのダブルリファレンスサブトラクション（double reference subtraction）を行った。ラングミュア型の１：１結合モデルを用い、データの速度論的分析を実施した。各ｍＡｂの結果を、Ｋａ（結合速度（Ｏｎ−ｒａｔｅ））、Ｋｄ（解離速度（Ｏｆｆ−ｒａｔｅ））、及びＫＤ（平衡解離定数）の形式で報告した。
【０５６９】
表１８は、ＨＬＡ−ＤＲ４／赤血球凝集素ペプチド複合体（ＤＲ４Ｇ８９）に対する結合に関してＤＲ４Ｂ１１７及びＤＲ４Ｂ１２７の親和性パラメータを示す。表１９は、ＨＬＡ−ＤＲ４／コラーゲンペプチド複合体（ＤＲ４Ｇ９０）に対する結合に関してＤＲ４Ｂ１１７及びＤＲ４Ｂ１２７の親和性パラメータを示す。表２０は、ＨＬＡ−ＤＲ１／赤血球凝集素ペプチド複合体（ＤＲ４Ｇ９３）に対する結合に関してＤＲ４Ｂ１１７及びＤＲ４Ｂ１２７の親和性パラメータを示す。表２１は、ＨＬＡ−ＤＲ１／コラーゲンペプチド複合体（ＤＲ４Ｇ９９）に対する結合に関してＤＲ４Ｂ１１７及びＤＲ４Ｂ１２７の親和性パラメータを示す。
【０５７０】
【表１８】
2019502698.tif 000030
【０５７１】
【表１９】
2019502698.tif 000031
【０５７２】
【表２０】
2019502698.tif 000032
【０５７３】
【表２１】
2019502698.tif 000033
【０５７４】
実施例７．抗体機能に対するアイソタイプの効果
ＩｇＧ２シグマ／κ抗体ＤＲ４Ｂ１１７、ＤＲ４Ｂ３０、ＤＲ４Ｂ１２７、ＤＲ４Ｂ９８、及びＤＲ４Ｂ６の可変領域を野性型ＩｇＧ１としてクローニングして、可能性のある機能差を評価した。
【０５７５】
ＩｇＧ１／κ抗体を、ＤＲ４Ｂ３９１（野性型ＩｇＧ１におけるＤＲ４Ｂ１１７  ＶＨ／ＶＬ）、ＤＲ４Ｂ３９６（野性型ＩｇＧ１におけるＤＲ４Ｂ３０  ＶＨ／ＶＬ）、ＤＲ４Ｂ３９２（野性型ＩｇＧ１におけるＤＲ４Ｂ１２７  ＶＨ／ＶＬ）、ＤＲ４Ｂ４０１（ＩｇＧ１におけるＤＲ４Ｂ９８  ＶＨ／ＶＬ）、及びＤＲ４Ｂ３９７（ＩｇＧ１におけるＤＲ４Ｂ６  ＶＨ／ＶＬ）と命名した。抗体の重鎖配列を表２２に示す。軽鎖配列は親抗体と同一であった。
【０５７６】
【表２２−１】
2019502698.tif 000034
【０５７７】
【表２２−２】
2019502698.tif 000035
【０５７８】
【表２２−３】
2019502698.tif 000036
【０５７９】
実施例４に記載のアッセイに加えて、ＨＬＡ−ＤＲ４によって提示されるＩＩ型コラーゲンペプチド（アミノ酸２５９〜２７３；ＧＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰ、配列番号１２２）を特異的に認識するＴ細胞ハイブリドーマを用いて、抗原特異的Ｔ細胞を阻害する能力について抗体を試験した（ＨＬＡ−ＤＲ４／ＩＩ型コラーゲンペプチド拘束性Ｔ細胞ハイブリドーマアッセイ（「ＨＬＡ−ＤＲ４／ＣｏｌＩＩ−Ｔｃｅｌｌ」アッセイ））。
【０５８０】
４名の個々のＰＢＭＣドナーにわたるＨＬＡ−ＤＲ４  ＤＣ  ＭＬＲアッセイの結果を表２３に要約する。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウス由来の樹状細胞へのｍＡｂの結合（（「ＨＬＡ−ＤＲ４  ＤＣ結合」アッセイ）又はヒトＰＢＭＣへのｍＡｂの結合を評価した結果、ヒトＢ細胞の生存に対するｍＡｂの効果、及びＨＬＡ−ＤＲ４／ＣＩＩペプチド拘束性Ｔ細胞ハイブリドーマの阻害を表２４に示す。
【０５８１】
エフェクター機能を欠失させたＩｇＧ２シグマから野性型ＩｇＧ１へのアイソタイプの切り換えは、抗体機能に対して効果を有していた。例えば、ＤＲ４Ｂ１１７の野性型ＩｇＧ１へのアイソタイプの切り換えの結果、ｍＡｂの阻害活性が改善されたが、ＤＲ４Ｂ１２７の野性型ＩｇＧ１へのアイソタイプの切り換えの結果、ｍＡｂの阻害活性が低下した。ＰＢＣＭへの結合又はＢ細胞の生存においてアイソタイプによる影響は存在しなかった。
【０５８２】
ＤＲ４Ｂ３０及びＤＲ４Ｂ１２７は、１０μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬの抗体濃度で、ＨＬＡ−ＤＲ４／ＣＩＩペプチド拘束性Ｔ細胞ハイブリドーマによるＩＬ−２生成を阻害した。ＤＲ４Ｂ１１７は、このアッセイにおいて阻害性ではなく、抗体は、試験したすべての用量においてＩＬ−２の生成を増強した。対照抗体ＤＲ４Ｂ６は、１０μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬの抗体濃度では阻害性であったが、０．１μｇ／ｍＬ未満の濃度ではＩＬ−２の生成を増強した（表２３）。
【０５８３】
（ＨＬＡ−ＤＲ４／ＩＩ型コラーゲンペプチド拘束性Ｔ細胞ハイブリドーマアッセイ（「ＨＬＡ−ＤＲ４／ＣｏｌＩＩ−Ｔ細胞」アッセイ））。
Ｂｏｌｅｔｈ  Ｂ細胞株（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１についてホモ接合型）は、国際組織適合性ワーキンググループから入手した。Ｂｏｌｅｔｈ細胞を洗浄し、１．２５×１０５個／ｍＬで完全培地（ＤＭＥＭ／Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１０％ウシ胎児血清＋５０μＭ  ２−メルカプトエタノール）に再懸濁させ、５０μＬの細胞を９６ウェル丸底プレートの各ウェルに添加した。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を、１０μｇ／ｍＬの濃度で始めて、４×最終濃度、５０μＬ／ウェルで添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。
【０５８４】
Ｔ細胞ハイブリドーマラインＤＲ４．ＣＩＩ．３６．８は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＣｅｎｔｅｒのＥｄｗａｒｄ  Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃ博士から入手した。これら細胞を完全培地で洗浄し、２×１０６個／ｍＬの濃度で完全培地に再懸濁させ、Ｂｏｌｅｔｈ細胞を含有するプレートに添加した（５０μＬ／ウェル）。ＣＩＩペプチド（ＧＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥＰ、配列番号１２１）を完全培地で８μＭ（最終濃度２μＭの４倍）に希釈し、５０μＬ／ウェルでプレートに添加した。すべてのウェルの合計体積を、完全培地を用いて２００μＬにした。プレートを３７℃で１８〜２１時間インキュベートした。製造業者の指示書に従ってｍＩＬ−２  ＡｌｐｈａＬＩＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、分析のために上清を回収した。
【０５８５】
【表２３】
2019502698.tif 000037
【０５８６】
【表２４】
2019502698.tif 000038
【０５８７】
実施例８．抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、様々なペプチドと複合体を形成している一連のＨＬＡ−ＤＲ抗原（a spectrum of HLA-DA antigens）のスペクトルに対する結合を保持する
選択抗体を、ベータ鎖のＮ末端に共有結合した様々なペプチドを有する複合体における可溶性ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＰ抗原に対する結合について更に特性評価した。実施例３に記載のプロトコールを用いて結合をアッセイした。ヘテロ二量体抗原を実施例１に記載のとおり発現させた。表２５は、更に発現させたＨＬＡ融合タンパク質のフォーマットを示し、表２６は、α鎖及びβ鎖のアミノ酸配列を示す。すべての更なるＨＬＡタンパク質は、配列番号２０の共通α鎖を有していた。ＣＬＩＰ、ＬＣＡＰ、又はＰＬＰペプチドと複合体を形成している、被験ＤＰ抗原及び被験ＤＱ抗原に結合した抗体は存在しなかった。ＤＲ４Ｂ１１７及びＤＲ４Ｂ１２７は、共有エピトープを含有していない、ＤＲＢ１＊０４：０２、ＤＲＢ１＊１５：０１、及びＤＲＢ１＊０３：０１を含む、すべての被験ＨＬＡ抗原に対し結合を示した。対照抗体ＤＲ４Ｂ４及びＤＲ４Ｂ５は、ＤＲ４Ｂ１１７及びＤＲ４Ｂ１２７と比較したとき、ＤＲＢ１＊０４：０１、ＤＲＢ１＊０１：０１、及びＤＲＢ１＊１０：０１に対して全体的な結合の減少を示し、ＤＲＢ１＊１５：０１及びＤＲＢ１＊０４：０２には結合しなかった。ＤＲ４Ｂ６は、試験したＨＬＡペプチド複合体すべてに対して結合を示した。表２７、表２８、表２９、及び表３０は、ＨＬＡ分子に対する抗体の結合の結果を示す。
【０５８８】
配列番号７１  ビメンチンＬ７０Ａ突然変異体６６〜７８ペプチド（ＶｉｔＬ７０Ａ）ＳＡＶＲＡＲＳＳＶＰＧＶＲ
配列番号７２  アグリカンペプチドＮ１（アグリカン）ＥＶＶＬＬＶＡＴＥＧＲＶＲＶＮＳＡＹＱＤＫ
配列番号１０４；ＣＬＩＰ  ＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡＬＰＭ
【０５８９】
配列番号１０５  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３：０１＿Ｐ０１９１２
ＧＤＴＲＰＲＦＬＥＹＳＴＳＥＣＨＦＦＮＧＴＥＲＶＲＹＬＤＲＹＦＨＮＱＥＥＮＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲＡＶＴＥＬＧＲＰＤＡＥＹＷＮＳＱＫＤＬＬＥＱＫＲＧＲＶＤＮＹＣＲＨＮＹＧＶＶＥＳＦＴＶＱＲＲＶＨＰＫＶＴＶＹＰＳＫＴＱＰＬＱＨＨＮＬＬＶＣＳＶＳＧＦＹＰＧＳＩＥＶＲＷＦＲＮＧＱＥＥＫＴＧＶＶＳＴＧＬＩＨＮＧＤＷＴＦＱＴＬＶＭＬＥＴＶＰＲＳＧＥＶＹＴＣＱＶＥＨＰＳＶＴＳＰＬＴＶＥＷＲＡＲＳＥＳＡＱＳＫ
【０５９０】
配列番号１０６  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０２＿ＨＬＡ００６８７  ＥＣＤ
ＧＤＴＲＰＲＦＬＥＱＶＫＨＥＣＨＦＦＮＧＴＥＲＶＲＦＬＤＲＹＦＹＨＱＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲＰＤＡＥＹＷＮＳＱＫＤＩＬＥＤＥＲＡＡＶＤＴＹＣＲＨＮＹＧＶＶＥＳＦＴＶＱＲＲＶＹＰＥＶＴＶＹＰＡＫＴＱＰＬＱＨＨＮＬＬＶＣＳＶＮＧＦＹＰＧＳＩＥＶＲＷＦＲＮＧＱＥＥＫＴＧＶＶＳＴＧＬＩＱＮＧＤＷＴＦＱＴＬＶＭＬＥＴＶＰＲＳＧＥＶＹＴＣＱＶＥＨＰＳＬＴＳＰＬＴＶＥＷＲＡＲＳＥＳＡＱＳＫ
【０５９１】
配列番号１０７  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０：０１＿Ｑ３０１６７＿ＥＣＤ  ３０−２２７
ＧＤＴＲＰＲＦＬＥＥＶＫＦＥＣＨＦＦＮＧＴＥＲＶＲＬＬＥＲＲＶＨＮＱＥＥＹＡＲＹＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲＰＤＡＥＹＷＮＳＱＫＤＬＬＥＲＲＲＡＡＶＤＴＹＣＲＨＮＹＧＶＧＥＳＦＴＶＱＲＲＶＱＰＫＶＴＶＹＰＳＫＴＱＰＬＱＨＨＮＬＬＶＣＳＶＮＧＦＹＰＧＳＩＥＶＲＷＦＲＮＧＱＥＥＫＴＧＶＶＳＴＧＬＩＱＮＧＤＷＴＦＱＴＬＶＭＬＥＴＶＰＱＳＧＥＶＹＴＣＱＶＥＨＰＳＶＭＳＰＬＴＶＥＷＲＡＲＳＥＳＡＱＳＫ
【０５９２】
配列番号１０８  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１＿Ｐ０１９１１＿ＥＣＤ  ３０−２７７
ＧＤＴＲＰＲＦＬＷＱＰＫＲＥＣＨＦＦＮＧＴＥＲＶＲＦＬＤＲＹＦＹＮＱＥＥＳＶＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲＡＶＴＥＬＧＲＰＤＡＥＹＷＮＳＱＫＤＩＬＥＱＡＲＡＡＶＤＴＹＣＲＨＮＹＧＶＶＥＳＦＴＶＱＲＲＶＱＰＫＶＴＶＹＰＳＫＴＱＰＬＱＨＨＮＬＬＶＣＳＶＳＧＦＹＰＧＳＩＥＶＲＷＦＬＮＧＱＥＥＫＡＧＭＶＳＴＧＬＩＱＮＧＤＷＴＦＱＴＬＶＭＬＥＴＶＰＲＳＧＥＶＹＴＣＱＶＥＨＰＳＶＴＳＰＬＴＶＥＷＲＡＲＳＥＳＡＱＳＫ
【０５９３】
【表２５】
2019502698.tif 000039
【０５９４】
【表２６−１】
2019502698.tif 000040
【０５９５】
【表２６−２】
2019502698.tif 000041
【０５９６】
【表２７】
2019502698.tif 000042
【０５９７】
【表２８】
2019502698.tif 000043
【０５９８】
【表２９】
2019502698.tif 000044
【０５９９】
【表３０】
2019502698.tif 000045
【０６００】
実施例９．ＤＲ４Ｂ１１７  Ｆａｂと複合体を形成しているＨＬＡ−ＤＲ４  ＥＣＤの結晶構造
構造研究のために用いたＨＬＡ−ＤＲ４コンストラクトは、ＤＲ４Ｇ８６であった。一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ  ２９３Ｓ−ＧｎＴｉ細胞でタンパク質を発現させた。清澄化し、濃縮した上清を、２本のタンデムな５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１１−００３４−９５）にロードし、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５で溶出し、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２で透析した。ｍＡｂ  ＤＲ４Ｂ１１７のＦａｂ断片を、２００ｍＬのＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞において一過的に発現させた。清澄化した上清を、５ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７−５２４８−０２）にロードし、漸増するイミダゾール濃度の段階勾配を用いて溶出した。タンパク質を、ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号２８−９８９３−３６）を用い２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で実行したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって更に精製した。
【０６０１】
抗体−抗原複合体を作製するために、２４ｍｇのＤＰＢＳ中ＤＲ４Ｇ８６、ｐＨ７．２と、１１ｍｇの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び５０ｍＭ  ＮａＣｌ中ＤＲ４Ｂ１１７、ｐＨ７．４と、を１：１のモル比で静かに混合し、室温で１日間インキュベートした。次いで、混合物を、全タンパク質３μｇ当たり酵素１単位を用い、ＴＥＶ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１２５７５−０２３）中ＴＥＶプロテアーゼによって処理し、３０℃で一晩インキュベートした。Ｆｃから複合体を分離するために、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２中で予め平衡化しておいた１ｍＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１１−００３４−９３）に切断した材料をロードした。主にＤＲ４：Ｆａｂ複合体を含有するフロースルーを１ｍＬの画分に回収し、プールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中ＳＥＣカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−１０７１−０１）にロードして、残留Ｆａｂ及びＴＥＶプロテアーゼなどの他の夾雑物を除去した。ＤＲ４Ｂ１１７：Ｆａｂ複合体を含有するＳＥＣプールを１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。サンプルをＳＤＳ  ＰＡＧＥ、Ａ２８０、ＳＥ  ＨＰＬＣ、及びＳＥＣ  ＭＡＬＳによって分析した。ＳＥＣ  ＭＡＬＳ分析は、複合体の分子量が配列から計算されたものと一致していることを示した。
【０６０２】
結晶化のために、ＤＲ４：Ｆａｂ複合体を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １０ｋＤａ  ＭＷＣＯデバイスを使用して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中１４ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。Ｍｏｓｑｕｉｔｏ  ｒｏｂｏｔ（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ）及びＭＲＣ  ２ウェル結晶化プレート（Ｓｗｉｓｓｃｉ）を用いて、２０℃のシッティングドロップフォーマットにおいて気相拡散法によって、複合体の結晶化を実施した。ＰＥＧスクリーン（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１３０９０４）、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ＨＴ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号ＨＲ２−１３０）、及びインハウススクリーン（Ｏｂｍｏｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｆ７０：１１０７〜１１１５）を用いて結晶化条件のスクリーニングを行った。１８％  ＰＥＧ  ３３５０、１．０Ｍ  ＬｉＣｌ、０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５から、最適化後に、回折品質の結晶が得られた。２０％グリセロールを添加した母液に結晶を回収し、液体窒素で急速冷凍させた。Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｂｅａｍｌｉｎｅ  １７−ＩＤ）においてＸ線回折データを回収し、ＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，（２０１０）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ６６：１２５〜１３２）を用いて処理して分解能を１．７５Åにした。Ｘ線データの詳細を表３１に与える。
【０６０３】
プログラムＰｈａｓｅｒ（Ｒｅａｄ，（２００１）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５７：１３７３〜１３８２）を用いて分子置換によってＤＲ４：Ｆａｂの構造を決定した。Ｆａｂについてはタンパク質データバンク３ｎａ９、ＤＲ４ついては４ｍｃｚから得られた結晶構造をサーチモデルとして用いた。構造をＰｈｅｎｉｘ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔ．１１：５３〜５５）を用いて精密化し、ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃｏｗｔａｎ，（２００４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ６０：２１２６〜２１３２）を用いてモデルフィッティングを行った。精密化統計値を表３１に示す。Ｐｙｍｏｌ（ｗｗｗ．ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ）を用いてすべてのグラフィックを作成した。ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ  ４（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５３：２４０〜２５５）を用いてすべての他の計算を行った。
【０６０４】
【表３１】
2019502698.tif 000046
＊括弧内の数字は、最高解像シェルを指す。
【０６０５】
複合体の構造を図１５Ａに示す。構造から、ＤＲ４Ｂ１１７の結合エピトープがＤＲ４のα及びβサブユニットの両方に由来する残基で構成されていることが明らかになった。エピトープは、ＣＬＩＰペプチド及びＴＣＲ結合表面に対して遠位であった。したがって、ＤＲ４Ｂ１１７は、ＴＣＲがＤＲ４に結合するのを直接はブロックしなかった。抗体−抗原界面は、溶媒のアクセス可能な表面のうちの２５００Å２を被覆し、そのうち１３００Å２は抗体上であり、１２００Å２はＤＲ４上であった（７００Å２はα上、５００Å２はβ上）。ＤＲ４Ｂ１１７の６つのＣＤＲすべてが抗原に対する接触を提供した。４−Åカットオフを用いて同定されたエピトープ及びパラトープ残基を表３２に与える。接触の数に基づき、エピトープにおける最も重要な残基は、鎖α中Ｅ３、Ｆ１０８、Ｄ１１０、Ｒ１４０（配列番号１３に従って残基を付番）、並びに鎖β中Ｖ１４３及びＱ１４９（配列番号１４に従って残基を付番）であった。
【０６０６】
【表３２】
2019502698.tif 000047
＊配列番号１３（ＤＲ４α）、配列番号１４（ＤＲ４β）、配列番号５６（ＶＨ）、配列番号６０（ＶＬ）に従って残基を付番。
【０６０７】
実施例１０．ＤＲ４Ｂ１２７  Ｆａｂとの複合体におけるＨＬＡ−ＤＲ４  ＥＣＤの結晶構造
タンパク質発現、複合体の調製、結晶化、Ｘ線のデータ収集、及び構造決定を、以下を除いて実施例９に記載のとおり実施した。２７ｍｇのＤＰＢＳ中ＤＲ４Ｗ１７６、ｐＨ７．２と、１３ｍｇの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び５０ｍＭ  ＮａＣｌ中Ｆａｂ  ＤＲ４Ｂ１２７、ｐＨ７．４と、を１：１のモル比で混合することによって、複合体を形成した。１８％  ＰＥＧ  ３３５０、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、０．２Ｍギ酸ナトリウムから複合体の結晶を得た。２．７５Åの解像度で構造を決定した。Ｘ線データ及び精密化統計値を表３３に与える。
【０６０８】
【表３３】
2019502698.tif 000048
＊括弧内の数字は、最高解像シェルを指す。
【０６０９】
複合体の構造を図１５Ｂに示す。構造から、ＤＲ４Ｂ１２７の結合エピトープがＤＲ４のαサブユニット及びβサブユニットの両方に由来する残基で構成されていることが明らかになった。エピトープは、ＣＬＩＰペプチド及びＴＣＲ結合表面に対して遠位であった。したがって、ＤＲ４Ｂ１２７は、ＴＣＲがＤＲ４に結合するのを直接はブロックしなかった。抗体−抗原界面は、溶媒のアクセス可能な表面のうちの３２００Å２を被覆し、そのうち１５００Å２は抗体上であり、１７００Å２はＤＲ４上であった。６つのＣＤＲのうちの４つ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、及びＣＤＲ−Ｌ２）だけが、抗原に対する接触を提供した。４−Åカットオフを用いて同定されたエピトープ及びパラトープ残基を表３４に与える。接触の数に基づき、エピトープにおける最も重要な残基は、鎖α中Ｋ２（配列番号１３に従って残基を付番）、並びに鎖β中Ｄ４１、Ｓ１２６、Ｒ１３０、Ｖ１４２、及びＱ１４９（配列番号１４に従って残基を付番）であった。
【０６１０】
【表３４】
2019502698.tif 000049
＊配列番号１３（ＤＲ４α）、配列番号１４（ＤＲ４β）、配列番号５８（ＶＨ）、配列番号６１（ＶＬ）に従って残基を付番。
【０６１１】
ＴＣＲ（ＰＤＢ  ｅｎｔｒｙ  １ｊ８ｈ；Ｈｅｎｎｅｃｋｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ，（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：５７１〜５８１）（図１５Ｃ）、Ｆａｂ  ＤＲ４Ｂ１１７（図１５Ａ）、及びＦａｂ  ＤＲ４Ｂ１２７（図１５Ｂ）と複合体を形成しているＤＲ４の結晶構造の比較は、両抗体がＴＣＲエピトープから遠位の部位においてＤＲ４に結合するので、ＴＣＲ結合に直接は干渉しなかったことを示した。ＤＲ４Ｂ１１７及びＤＲ４Ｂ１２７は、細胞表面に近接するＤＲ４に結合し、恐らく、ＤＲ４のＥＣＤをｍＡｂから離れる方向に傾斜させて、ＤＲ４分子と膜との間の嵩高いＦｃ部分に空間を与え、その結果、ＴＣＲはＤＲ４に結合できなくなった。両抗体ＤＲ４Ｂ１１７及びＤＲ４Ｂ１２７のＦａｂ断片は、ＴＣＲ結合を阻害しなかった。ＤＲ４Ｂ１１７及びＤＲ４Ｂ１２７は、ＣＲ４のＨＬＡ−ＤＲへの結合をブロックする。
【０６１２】
実施例１１．エピトープのビニング
ＭＤＳ又はＩＢＩＳを用いて、抗原としてのＤＲＧ８９（ＩＩ型コラーゲン＿１２３６ペプチドとの複合体におけるＨＬＡ−ＤＲ１＊０４：０１）又はＤＲ４Ｇ９９（赤血球凝集素ペプチドとの複合体におけるＨＬＡ−ＤＲ１：０１）を利用して３１個のＨＬＡ−ＤＲ抗体の初期マトリクス交差競合実験において３つの競合群を同定した。ＤＲ４Ｂ４及びＤＲ４Ｂ５はあまりＤＲ４Ｇ８９に結合しなかったので、アッセイで用いることができなかった。
【０６１３】
ＤＲＧ８９に対する交差競合について以下の競合群を同定した：
グループ１：ＤＲ４Ｂ３０、ＤＲ４Ｂ９８、ＤＲ４Ｂ１１７、ＤＲ４Ｂ１２７、ＤＲ４Ｂ７８、ＤＲ４Ｂ３８、ＤＲ４Ｂ７０、ＤＲ４Ｂ２２、及びＤＲ４Ｂ３３。グループ２：ＤＲ４Ｂ６。
【０６１４】
ＤＲＧ９９に対する交差競合について以下の競合群を同定した：
グループ１：ＤＲ４Ｂ３０、ＤＲ４Ｂ１１７、ＤＲ４Ｂ１２７、ＤＲ４Ｂ７８、ＤＲ４Ｂ３８、ＤＲ４Ｂ７０、ＤＲ４Ｂ２２、及びＤＲ４Ｂ３３。グループ２：ＤＲ４Ｂ６。グループ３：ＤＲ４Ｂ９８。ＤＲ４Ｂ９８は、ＤＲ４Ｇ９９に対する結合が最低であったことから、グループ１にはマッピングしなかった。
【０６１５】
サンプル及び試薬：
抗原：
ＤＲ４Ｇ８９  １．２６４ｍｇ／ｍＬ
ＤＲ４Ｇ９９  ０．９９ｍｇ／ｍＬ
ＩＢＩＳシステム用のランニング緩衝液：ＰＢＳＴ、脱気。
【０６１６】
ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡによる交差競合：
Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に、１０μｇ／ｍＬのＤＲ４Ｇ８９又はＤＲ４Ｇ９９  ５μＬを、２時間吸収させ、次いで、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  １５０μＬで３回洗浄した。プレートを４℃で一晩５％ＢＳＡ緩衝液でブロッキングした。翌日、プレートを０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４で３回洗浄し、続いて、１ｍＭの他の抗ＤＲ４  ｍＡｂと共に３０分間室温で予めインキュベートしておいた、ルテニウム（Ｒｕ）で標識された抗ＤＲ４  ｍＡｂの混合物を添加した。穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした後、プレートを０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔを蒸留水で希釈し（４倍）、各ウェルに分注し、次いで、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で分析した。
【０６１７】
ＩＢＩＳによるエピトープビニング（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ＭｕｌｔｉｐｌｅＸ  ９６，ＩＢＩＳ−ＭＸ９６，Ｗａｓａｔｃｈ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｉｎｃ．）：
プロトコールは、文献（Ａｂｄｉｃｈｅ，Ｙ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４），ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｆｅ９２４５１）に従ったが、下記のとおりいくつかの改変を行った：
【０６１８】
チップの調製
ＣＦＭ２（Ｗａｓａｔｃｈ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を用いて９６個のｍＡｂのマイクロアレイを作製した。９６ウェルマイクロプレートから４８個の７０μＬプラグのサンプルを流体マニホールドに引き出し、これによって、ＳＰＲ基材（Ｇ−ＣＯＯＨでコーティングされたプリズム、Ｓｓｅｎｓ  ｂｖ，ＮＬ製）の表面上の４８個のマイクロフローセルの４×１２アレイに溶液を集中させ、該溶液を６０μＬ／分で前後に循環させる。ＭＥＳカップリング緩衝液ｐＨ４．５中３０μｇ／ｍＬの各ｍＡｂ１００μＬを用いて９６ウェルマイクロプレートを調製し、ＣＦＭのベイ２にロードした。新たに混合した活性化試薬（合計５ｍＬのＭＥＳカップリング緩衝液ｐＨ４．５中０．４Ｍ  ＥＣＤ  １５０μＬ及び０．１Ｍスルホ−ＮＨＳ  １５０μＬ）の第２のプレートをベイ１にロードした。次いで、ＣＦＭをシステム緩衝液（ＰＢＳ＋０．０１％  Ｔ２０）でプライミングした。抗ＤＲ４  ｍＡｂのプレートのセットは、トリプリケートで配列された４２個のｍＡｂを含有していた。ドッキングさせた時点で、活性化試薬を７分間表面全体に循環させ、直後に、このセットのｍＡｂを１５分間循環させた。
【０６１９】
次いで、プリントされたチップを、シングルフローセルと、分析物当たり８０ｍＬの注入物を前後に循環させるアレイに対処するようになっているオートサンプラーとを使用する、ＩＢＩＳ  ＳＰＲリーダー（ＭＸ９６，ＩＢＩＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｂｖ）にロードした。ロードしたら、１Ｍエタノールアミンをチップを通して１５分間かけて注入し、過剰の反応性エステルをクエンチした。次いで、システム緩衝液でチップを洗浄し、チップ画像を用いて反応スポット（すなわち、９６リガンドアレイ）及び介在する参照スポット（反応スポット当たり２つのローカル参照スポット）を規定した。古典的ビニングでは、両抗原（ＤＲ４Ｇ８９又はＤＲ４Ｇ９９のいずれか）及びｍＡｂ分析物を平行にフローセルに輸送し、再生を継続する前に互いの直後に注入する共注入を使用した。実験では、抗原を３分間注入し、続いて、更に３分間２０μｇ／ｍＬ  ｍＡｂを注入し、次いで、表面を再生した。すべてのＳＰＲｉ実験を、９６×９６アナライト・オン・リガンドフォーマットで実施した。
【０６２０】
マイクロアレイデータ解析
データをＳＰＲｉｎｔソフトウェアｖ．６．１５．２．１で処理し（対象の結合工程前に較正、局所的に参照、及びＹ軸はゼロに合わせる）、ヒートマップを作成し、ソートし、ノードプロッティングするためにＷａｓａｔｃｈ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓビニングソフトウェアで解析した。階層クラスタリングを使用して、ヒートマップにおいて群様の挙動を示すｍＡｂを一緒にした。ヒートマップ及びノードプロットは、エピトープビン及びビン間の関係を可視化する代替方法である。
【０６２１】
実施例１２．ＨＬＡ−ＤＲ抗体は、ＨＬＡ−ＤＲの同種ＴＣＲ  ＥＣＤとの相互作用をブロックしない。
結晶構造試験によって、ＤＲ４Ｂ１１７及びＤＲ１Ｂ１２７はＨＬＡ−ＤＲの同種ＴＣＲとの相互作用をブロックしなかったことが確認された。ＭＤＳを用いて、いくつかの更なる抗体を、組み換えＴＣＲをブロックする効果について試験した。
【０６２２】
抗体ＤＲ４Ｂ１１７、ＤＲ４Ｂ１２７、ＤＲ４Ｂ３０、ＤＲ４Ｂ７０、ＤＲ４Ｂ２２、ＤＲ４Ｂ３３、ＤＲ４Ｂ３８、及びＤＲ４Ｂ７８は、ＨＬＡ−ＤＲの同種ＴＣＲとの相互作用を阻害しなかったが、ＤＲ４Ｂ９８は、該相互作用を部分的に阻害した。ＤＲ４Ｂ４、ＤＲ４Ｂ５、及びＤＲ４Ｂ６は、ＨＬＡ−ＤＲ／ＴＣＲ相互作用を阻害した。
【０６２３】
図１６Ａは、ＤＲ４Ｂ１１７、ＤＲ４Ｂ１２７、ＤＲ４Ｂ４、ＤＲ４Ｂ５、及びＤＲ４Ｂ６についてＨＬＡ−ＤＲ／ＴＣＲ相互作用の阻害の用量応答曲線を示す。
【０６２４】
図１６Ｂは、ＤＲ４Ｂ２２、ＤＲ４Ｂ３０、及びＤＲ４Ｂ３３についてＨＬＡ−ＤＲ／ＴＣＲ相互作用の阻害の用量応答曲線を示す。
【０６２５】
材料
・ＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＃Ｌ１５ＸＡ−３）
・ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ、＃１４１９０−１３６）
・ウシアルブミン画分Ｖ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号８２０４５１）
・Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ１３７９）
・ＨｉｓＴａｇ  Ａｂ−ビオチン（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，＃Ａ００６１３）
・Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇストレプトアビジン（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｒ３２ＡＤ−５０）
・ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ９２ＴＣ−１）
・ＨＬＡ−ＤＲ抗原：ＤＲ４Ｇ１３４（ヘキサヒスチジンタグを有しないＤＲＧ８９）；以下のフォーマットの、赤血球凝集素ペプチドＨＡ＿３０４−３１８（ＨＡ）を有するヒトＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１：０２／ＤＲＢ１＊０４：０１  ＥＣＤアルファ鎖：ＥＣＤ＿Ｇ４Ｓ＋ＴＥＶ＋Ｇ４Ｓ＋ＭＭＢ＋６ｘＨｉｓＴａｇ；ベータ鎖：ＨＡ＋３ＸＧＳ＋ＨＲＶ３Ｃ＋ＥＣＤ＋Ｇ４Ｓ＋ＴＥＶ＋Ｇ４Ｓ＋ＭＭＢ＋ＳｔｒｅｐＩＩ
・ＤＲ４Ｇ７９：ＴＣＲ受容体ＥＣＤ；以下のフォーマットの、ヒトＨＡ  １．７  ＴＣＲ  ＥＣＤ：アルファ鎖ＥＣＤ＋ＴＥＶ＋ＭＭＢ＋ＨｉｓＴａｇ；ベータ鎖ＥＣＤ＋ＴＥＶ＋ｈｕＩｇＧ４ＭＭＢ＋Ｆｌａｇ＋ＳｔｒｅｐＩＩ（ＤＲ４Ｇ７９  ＨＣ：配列番号６９；ＬＣ配列番号７０
【０６２６】
＞ＤＲ４Ｇ７９  ＨＣ配列番号６９
ＱＳＶＴＱＬＧＳＨＶＳＶＳＥＧＡＬＶＬＬＲＣＮＹＳＳＳＶＰＰＹＬＦＷＹＶＱＹＰＮＱＧＬＱＬＬＬＫＹＴＳＡＡＴＬＶＫＧＩＮＧＦＥＡＥＦＫＫＳＥＴＳＦＨＬＴＫＰＳＡＨＭＳＤＡＡＥＹＦＣＡＶＳＥＳＰＦＧＮＥＫＬＴＦＧＴＧＴＲＬＴＩＩＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＧＧＧＧＳＥＤＬＹＦＱＳＧＧＧＧＳＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ
【０６２７】
＞ＤＲ４Ｇ７９  ＬＣ配列番号７０
ＧＳＶＫＶＴＱＳＳＲＹＬＶＫＲＴＧＥＫＶＦＬＥＣＶＱＤＭＤＨＥＮＭＦＷＹＲＱＤＰＧＬＧＬＲＬＩＹＦＳＹＤＶＫＭＫＥＫＧＤＩＰＥＧＹＳＶＳＲＥＫＫＥＲＦＳＬＩＬＥＳＡＳＴＮＱＴＳＭＹＬＣＡＳＳＳＴＧＬＰＹＧＹＴＦＧＳＧＴＲＬＴＶＶＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＳＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＧＧＧＧＳＥＤＬＹＦＱＳＧＧＧＧＳＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＧＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫＷＳＨＰＱＦＥＫ
【０６２８】
プロトコール
アッセイ緩衝液：１ＸＤＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ＋０．０５％  ｔｗｅｅｎ  ２０
１．ＭＳＤプレートを５０μＬのＤＲ４Ｇ１３４抗原（５μｇ／ｍＬ）でコーティングし、ＲＴで１０分間振盪する。４℃で一晩インキュベートする。
２．プレートを空にし、穏やかに振盪しながら１５０μＬのアッセイ緩衝液で１時間ブロッキングし、その間に、ＤＲＧ７９、ＤＲ４  ｍＡｂ、抗Ｈｉｓ  Ａｂ、Ｓｕｌｆｏ  Ｔａｇ−ＳＡ（最終濃度はそれぞれ５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、及び２μｇ／ｍＬ）をプレミックスする。
３．プレートを空にし、プレミックスを添加し、１時間インキュベートする。
４．３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄する。
５．ＭＳＤプレート用ＭＳＤリード緩衝液１５０μＬを添加する。
６．ＭＳＤで読み取る。
【０６２９】
実施例１３．ＤＲ４Ｂ７０、ＤＲ４Ｂ２２、ＤＲ４Ｂ３３、ＤＲ４Ｂ３８、及びＤＲ４Ｂ７８の機能的特徴
ＤＲ４Ｂ７０、ＤＲ４Ｂ２２、ＤＲ４Ｂ３３、ＤＲ４Ｂ３８、及びＤＲ４Ｂ７８を、上記アッセイを用いて特性評価した。すべての抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ４又はＨＬＡ−ＤＲ１に結合し、ＤＱ又はＤＰに結合した抗体は存在しなかった。表３５は、様々なＨＬＡに対する抗体の結合結果を示す。
【０６３０】
【表３５】
2019502698.tif 000050
【０６３１】
表３６は、機能アッセイにおける抗体の特徴を示す。すべての抗体は、アンタゴニストＤＲ４Ｂ７８、ＤＲ４Ｂ３８、ＤＲ４Ｂ７０、及びＤＲ４Ｂ２２であり、Ｂ細胞のアポトーシス及び／又は死を誘導した。ＤＲ４Ｂ３０は誘導しなかった。
【０６３２】
【表３６】
2019502698.tif 000051
【図１】
2019502698.tif 000052
【図２】
2019502698.tif 000053
【図３】
2019502698.tif 000054
【図４】
2019502698.tif 000055
【図５】
2019502698.tif 000056
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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