(57)【要約】  本発明は、ＣＡＴ１関連疾患を診断するための方法であって、ＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体または断片により細胞中のＣＡＴ１を検出する工程を含む方法に関する。本発明はさらに、ＣＡＴ１関連疾患および／またはＢＬＶ感染の治療で使用するためのＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体または断片に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中のカチオン性アミノ酸トランスポーター−１（ＣＡＴ１）を検出および／または定量化するためのインビトロ方法であって、
ａ．前記細胞を少なくとも１種のウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片と接触させる工程と、
ｂ．前記少なくとも１種のリガンド、その変異体および／または断片のＣＡＴ１への結合を決定および／または定量化する工程と
を含む方法。
【請求項２】
工程ｂで決定および／または定量化された結合レベルを基準値と比較する工程をさらに含む、請求項１に記載のインビトロ方法。
【請求項３】
対象におけるＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を診断または監視するための方法である、請求項１または２に記載のインビトロ方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片は、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８および４９、その変異体および断片を含む群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインビトロ方法。
【請求項５】
少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片と薬学的に許容される賦形剤とを含む診断用組成物。
【請求項６】
好ましくは医用画像診断によるＣＡＴ１関連疾患のインビボ診断における使用のためのＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片。
【請求項７】
ＣＡＴ１関連疾患の治療で使用するためのＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片。
【請求項８】
前記ＣＡＴ１関連疾患は、アルギニン関連疾患、リジン関連疾患、ヒスチジン関連疾患、オルニチン関連疾患、一酸化窒素関連疾患および炎症性疾患を含む群から選択される、請求項６または７に記載の使用のためのＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片。
【請求項９】
ＢＬＶ感染の治療で使用するためのＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の使用のための少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の使用のための少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を含む薬。
【請求項１２】
前記ＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体または断片は、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８および／または４９、その変異体および／または断片を含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の使用のためのＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、請求項５に記載の診断用組成物、請求項１０に記載の医薬組成物、請求項１１に記載の薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばＣＡＴ１関連疾患などのカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患の診断または治療に関する。特に本発明は、カチオン性アミノ酸トランスポーターＣＡＴ１／ＳＬＣ７Ａ１とウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）エンベロープ糖タンパク質に由来する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）との結合の検出を含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルギニン、リジン、ヒスチジンおよびオルニチンは多様な代謝経路に関与するアミノ酸である。これらの経路は脂肪酸、グルコース、アミノ酸およびタンパク質の代謝を制御するが、窒素の輸送、処理および排泄、尿素の合成、クレアチンおよび一酸化窒素の合成にも関与する。
【０００３】
これらの経路のうちの１つの調節不全は、そのような調節不全によって冒された細胞、組織または臓器へのアルギニン、リジン、ヒスチジンおよびオルニチンの取込みの増加または減少を特徴とする癌（特に、癌腫、肉腫および白血病など）、糖尿病、肥満症、心血管疾患および炎症性疾患などの多様な疾患の顕著な特徴のうちの１つである。従って、これらのアミノ酸に関連する経路を標的化することへの関心が高まっている。例えば、アルギニン関連経路の調節不全を特徴とする多くの種類の癌が存在する。アルギニン欠乏はこれらの癌と戦うための戦略のうちの１つである。しかし、望ましくない副作用に加えてこれらの治療に対する耐性が現れたため（Ｆｅｕｎら，２０１５．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｃａｒｅ．１８（１）：７８−８２；Ｑｉｕら，２０１５．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．３６４（１）：１−７）、新しい戦略および代替療法を開発することが求められている。
【０００４】
最先端技術では、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーターＣＡＴ１がアルギニン（Ｃｌｏｓｓら，２００４．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３４（１０  Ｓｕｐｐｌ）：２７５２Ｓ−２７５９Ｓ）またはリジン、ヒスチジンおよびオルニチン流入のための主要トランスポーターであると教示されている。これまでのところ、マウスのＣ型エコトロピックレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質がマウスまたはラットＣＡＴ１に結合することがよく知られている（Ａｌｂｒｉｔｔｏｎら，１９９３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（４）：２０９１−２０９６）。しかし、他の哺乳類のＣＡＴ１、特にヒト、ウシおよび鳥類（ｆｌｏｃｋ）のＣＡＴ１を標的化する正確なリガンドが不足している。
【０００５】
本発明者らは、ヒトを含む異なる哺乳類のＣＡＴ１に特異的に結合するウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）エンベロープ糖タンパク質に由来するリガンドを発見した。驚くべきことに、本発明者らは、このリガンドが細胞内へのアルギニン流入を阻止し、それによりこれらの細胞内でのアルギニン蓄積を防止することを実証する。
【０００６】
従って、本発明は、ＣＡＴ１関連疾患の診断または治療のためのＢＬＶ．ＲＢＤの使用に関する。
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明は、細胞中のカチオン性アミノ酸トランスポーター−１（ＣＡＴ１）を検出および／または定量化するためのインビトロ方法であって、
ａ．前記細胞を少なくとも１種のウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片と接触させる工程と、
ｂ．前記少なくとも１種のリガンド、その変異体および／または断片のＣＡＴ１への結合を決定および／または定量化する工程と
を含む方法に関する。
【０００８】
一実施形態では、前記方法は、工程ｂで決定および／または定量化された結合レベルを基準値と比較する工程をさらに含む。
【０００９】
一実施形態では、前記方法は対象におけるＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を診断または監視するためのものである。
【００１０】
一実施形態では、前記少なくとも１種のウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片は、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８および４９、その変異体および断片を含む群から選択される。
【００１１】
本発明はさらに、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片と薬学的に許容される賦形剤とを含む診断用組成物に関する。
【００１２】
本発明はさらに、好ましくは医用画像診断法によるＣＡＴ１関連疾患のインビボ診断における使用のためのＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片に関する。
【００１３】
本発明はさらに、ＣＡＴ１関連疾患の治療で使用するためのＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片に関する。
【００１４】
一実施形態では、前記ＣＡＴ１関連疾患は、アルギニン関連疾患、リジン関連疾患、ヒスチジン関連疾患、オルニチン関連疾患および炎症性疾患を含む群から選択される。
【００１５】
本発明の別の目的は、ＢＬＶ感染の治療で使用するためのＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片である。
【００１６】
本発明の別の目的は、本明細書の上に記載されている使用のための少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物である。
【００１７】
本発明はさらに、本明細書の上に記載されている使用のための少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を含む薬に関する。
【００１８】
一実施形態では、ＢＬＶ．ＲＢＤリガンドは、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８および／または４９、その変異体および／または断片を含む。
【００１９】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２０】
「細胞表面栄養（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ）トランスポーター」という用語は栄養トランスポーターＣＡＴ１を指す。ＣＡＴ１は細胞の細胞膜または細胞内に固定されていてもよい。
【００２１】
「ＣＡＴ１／ＳＬＣ７Ａ１」は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーターを指す。ＣＡＴ１は、アルギニン、オルニチン、リジンおよびヒスチジンを含むアミノ酸のナトリウム非依存性およびｐＨ非感受性輸送を媒介する。ＣＡＴ１は肝臓細胞および涙腺細胞には存在しないと考えられているが、遍在的に発現される。ＣＡＴ１は本明細書ではＢＬＶ．ＲＢＤのための特異的受容体として同定される。一実施形態では、ＣＡＴ１は配列番号２（受入番号：ＫＪ８９２１５２）によってコードされるヒトＣＡＴ１（受入番号：ＡＩＣ４９７３８、配列番号１）である。一実施形態では、ＣＡＴ１は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは配列番号１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むかそれからなる。一実施形態では、ＣＡＴ１は配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは配列番号２と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すヌクレオチド配列によってコードされる。一実施形態では、ＣＡＴ１は、配列番号１の断片、好ましくは少なくとも約１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００個のアミノ酸の断片を含むかそれからなる。一実施形態では、ＣＡＴ１はマウスＣＡＴ１（受入番号：Ｑ０９１４３、配列番号２３）ではない。一実施形態では、ＣＡＴはラットＣＡＴ１（受入番号：Ｐ３０８２３、配列番号２４）ではない。
【００２２】
「診断用組成物」という用語は、診断、特にインビボ診断を行うために対象に投与される組成物を指す。一実施形態では、診断用組成物は、好ましくは対象の体内においてカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター、好ましくはＣＡＴ１の機能が調節不全である細胞を検出するためのものである。別の実施形態では、本発明は、好ましくは対象の体内においてＢＬＶに感染しているかまだ感染していない細胞を検出するための診断用組成物に関する。
【００２３】
「有効量」という用語は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター、好ましくはＣＡＴ１の機能が調節不全である対象またはＢＬＶに感染した対象に対して有意な悪影響または有害な副作用を引き起こすことのない、ＣＡＴ１への結合を目的としたリガンド、好ましくは少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドのレベルまたは量を指す。
【００２４】
「治療的有効量」という用語は、標的に対して有意な悪影響または有害な副作用を引き起こすことなく、（１）ＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染の発症を遅らせるか予防する、（２）ＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染の１つ以上の症状の進行、増悪または悪化を減速または停止する、（３）ＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染の症状の寛解をもたらす、（４）ＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染の重症度または発生率を低下させる、または（５）ＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を治癒させることを目的とした薬剤のレベルまたは量を意味する。予防処置のために、ＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染の発症前に治療的有効量を投与してもよい。代わりまたは追加として、治療処置のためにＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染の開始後に治療的有効量を投与してもよい。
【００２５】
「治療」という用語は治療処置および予防処置の両方を指し、その目的はＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を予防するか遅らせる（和らげる）ことである。治療を必要とするものとしては、ＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を既に罹患しているものならびにＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染に罹患しやすいものまたはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染が予防されるべきものが挙げられる。対象または哺乳類は、治療量の本発明に係るリガンドが投与された後に、その患者が病原性細胞数の減少、総病原性細胞の割合の減少および／または特定の疾患または病気に付随する１つ以上の症状のある程度の緩和、罹患率および死亡率の低下ならびに生活の質の問題の改善のうちの１つ以上の観察可能および／または測定可能な減少または不存在を示す場合に、疾患の「治療」が成功となる。治療の成功をおよび疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師が精通している通常の手順によって容易に測定可能である。
【００２６】
「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、動物、好ましくはヒトに投与した場合に副作用、アレルギー反応または他の有害反応を生じさせない賦形剤を指す。これは、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などを含む。ヒトへの投与のために、製剤は例えばＦＤＡ局またはＥＭＡなどの規制当局によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度基準を満たすものでなければならない。
【００２７】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸（好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸）の直鎖状ポリマーを指す。
【００２８】
「タンパク質」という用語は特に、１種以上のポリペプチドと任意に非ポリペプチド共同因子とから形成される機能的実体を指す。
【００２９】
「同一性」という用語は、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のＤＮＡ配列間の関係において使用される場合、それぞれ２つ以上のアミノ酸残基または２つ以上のヌクレオチド残基からなる配列間の一致数によって決定される（それぞれ）ポリペプチドまたはＤＮＡ配列間の配列関連性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）の程度を指す。「同一性」とは、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって扱われるギャップアラインメント（存在すれば）を有する２つ以上の配列のより短い配列間の一致率の尺度である。関連するポリペプチドまたはＤＮＡ配列の同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法としては、Ａｒｔｈｕｒ  Ｍ．Ｌｅｓｋ，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（コンピューターを使用した分子生物学：配列分析のための供給源および方法）（Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）；Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｗ．Ｓｍｉｔｈ，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト）（Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｈｕｇｈ  Ｇ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＡｎｎｅｔｔｅ  Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １（配列データのコンピューター解析、パート１）（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｇｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｒｅａｓｕｒｅ  Ｔｒｏｖｅ  ｏｒ  Ｔｒｉｖｉａｌ  Ｐｕｒｓｕｉｔ（分子生物学における配列分析：貴重な発見または小さな追及）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７）；Ｍｉｃｈａｅｌ  ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪｏｈｎ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列解析プライマー）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）およびＣａｒｉｌｌｏら，１９８８．ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．４８（５）：１０７３−１０８２に記載されているものが挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるように設計されている。同一性の決定方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記述されている。好ましいコンピュータプログラムによる２つの配列間の同一性の決定方法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２（１  Ｐｔ  １）：３８７−３９５；遺伝学コンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ），ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター，ウィスコンシン州マディソン）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０）などのＧＣＧプログラムパッケ��ジが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の提供源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ，メリーランド州ベセズダ，２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０）から公的に入手可能である。また、周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して同一性を決定してもよい。
【００３０】
「対象」という用語は、哺乳類、好ましくはヒト、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、子ウシ、若雌ウシ）、鳥類、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、子ヒツジ、雌ヒツジ）、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）（ヤギ（ｇｏａｔ）、雄ヤギ、子ヤギ）、より好ましくはヒトまたはウシを指す。一実施形態では、対象は、医療的ケアを受けるのを待っているか受けている、あるいは過去に医療処置の対象であったか現在対象であるか今後対象になる、あるいは疾患の発現について観察される「患者」、すなわち哺乳類、温血動物、より好ましくはヒトまたはウシであってもよい。
【００３１】
数字の前の「約」は前記数字の値の±１０％を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、細胞中の細胞表面栄養トランスポーターＣＡＴ１を検出および／または定量化するためのインビトロまたはインビボ方法であって、
ａ．前記細胞を少なくとも１種のリガンド、好ましくは少なくとも１種のウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）．ＲＢＤリガンドまたはその変異体および／または断片と接触させる工程と、
ｂ．前記少なくとも１種のリガンド、その変異体および／または断片のＣＡＴ１への結合を決定および／または定量化する工程と
を含む方法に関する。
【００３３】
一実施形態では、本発明の方法は、工程ｂで決定および／または定量化された結合を基準結合値と比較する工程を含む。
【００３４】
本明細書で使用される「細胞に存在するＣＡＴ１」という用語は、細胞の表面または細胞内に存在するＣＡＴ１を指してもよい。
【００３５】
一実施形態では、本発明の方法は細胞表面に存在するＣＡＴ１の発現レベルを評価するためのものである。別の実施形態では、本発明の方法は細胞内に存在するＣＡＴ１の発現レベルを評価するためのものである。
【００３６】
一実施形態では、本発明の方法は試料中のＣＡＴ１を検出および／または定量化するためのものある。
【００３７】
一実施形態では、当該試料は本発明の方法の実施前に対象から得たものである。一実施形態では、本発明の方法は対象から試料を得る工程を含まず、すなわち本発明の方法は非侵襲的である。
【００３８】
一実施形態では、本発明の方法を実施するために対象から得られた試料は生体試料である。
【００３９】
一実施形態では、前記生体試料は体液試料である。体液の例としてはとしては限定されるものではないが、血液、血漿、血清、リンパ、尿、脳脊髄液または汗が挙げられる。
【００４０】
別の実施形態では、前記生体試料は細胞試料である。細胞試料の例としては限定されるものではないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢白血球、リンパ節生検、腸もしくは滑液生検などの組織生検から得られた細胞試料、気管支肺胞洗浄から得られた細胞試料または脳脊髄液が挙げられる。
【００４１】
別の実施形態では、前記生体試料は組織試料である。組織試料の例としては、限定されるものではないが生検試料が挙げられる。
【００４２】
一実施形態では、本発明の方法を実施するために対象から得られた試料は血液試料である。一実施形態では、本発明の方法を実施するために対象から得られた試料は全血試料または血漿試料である。
【００４３】
一実施形態では、本発明の方法は顆粒球中のＣＡＴ１を検出および／または定量化するためのものではない。「顆粒球」とは、好中球、好酸球、好塩基球および肥満細胞などの骨髄球系または単球系に属する細胞を意味する。
【００４４】
試料中のタンパク質レベルを決定および／または定量化するためのインビトロ方法は当該技術分野で周知である。そのような方法の例としては、限定されるものではないが、免疫組織化学、マルチプレックス法（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光結合免疫吸着法（ＦＬＩＳＡ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。
【００４５】
タンパク質レベルを決定および／または定量化するためのインビボ方法は当該技術分野で周知である。そのような方法の例としては、限定されるものではないが、コンピューター断層撮影法（ＣＴスキャン）、超音波内視鏡（ＥＵＳ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴胆道膵管造影法、蛍光定量法、蛍光および近赤外線（ＮＩＲ）蛍光イメージングが挙げられる。
【００４６】
細胞表面または細胞、試料、組織または臓器中のタンパク質の存在を分析するための方法は当業者に周知であり、限定されるものではないが、ＦＡＣＳ分析、免疫組織化学、細胞分画を伴うウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、固相蛍光免疫測定法（ＦＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、画像分析、例えばハイコンテント分析、コンピューター断層撮影法（ＣＴスキャン）、超音波内視鏡（ＥＵＳ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴胆道膵管造影法、蛍光定量法、蛍光および近赤外線（ＮＩＲ）蛍光イメージングなどが挙げられる。
【００４７】
一実施形態では、細胞表面あるいは細胞、試料、組織または臓器中のタンパク質を検出するために、本明細書の上に列挙されている方法のうちの１つを実施する前に、前記細胞、試料、組織または臓器の固定工程が必要となる場合がある。細胞、試料、組織または臓器の固定法は当業者に周知であり、限定されるものではないが、灌流、ホルムアルデヒドまたはメタノール／エタノール浸漬が挙げられる。
【００４８】
細胞表面のタンパク質の存在を分析するための方法は当業者に周知であり、限定されるものではないが、ＦＡＣＳ分析、イメージングフローサイトメトリー（例えばＡＭＮＩＳ）、免疫組織化学、細胞分画を伴うウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、固相蛍光免疫測定法（ＦＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、画像分析、例えばハイコンテント分析、コンピューター断層撮影法（ＣＴスキャン）、超音波内視鏡（ＥＵＳ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、蛍光光度計、蛍光および近赤外線（ＮＩＲ）蛍光イメージングなどが挙げられる。
【００４９】
少なくとも１種のリガンド（好ましくは少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド）、その変異体および／または断片の「結合を決定および／または定量化する工程」という表現は、細胞表面栄養トランスポーターＣＡＴ１が存在する場合に、ＣＡＴ１と本発明のリガンド、その変異体および／または断片との間で複合体が形成され、それを検出し、かつ任意に定量化できることを意味する。
【００５０】
一実施形態では、上記複合体は、本リガンド、その変異体および／または断片が、例えば限定されるものではないが、抗体定常断片（Ｆｃ）または蛍光化合物（例えばシアニン色素、Ａｌｅｘａ色素、量子色素など）などの検出可能な分子と共有結合的に結合されている場合に検出することができる。上記複合体は本リガンドが当業者に周知の異なる手段でタグ付けされている場合にも検出することができる。例えば限定されるものではないが、本発明で使用されるタグは、赤血球凝集素タグ、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓ−タグ、ＨＡＴタグ、３×Ｆｌａｇタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、ＳＢＰタグ、キチン結合ドメインタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ、Ｔ７タグ、Ｖ５タグおよびＸ−プレスタグを含むからそれらからなる群から選択されるタグであってもよい。これらのタンパク質タグは、本発明のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドのＮ末端、Ｃ末端および／または内部に位置していてもよい。
【００５１】
従って、本リガンドの使用により一方では同定や検出が可能となり、他方では形成された複合体の定量化が可能になる。一実施形態では、結合を検出および／または定量化する工程は、フローサイトメトリー、免疫蛍光法または画像分析、例えばハイコンテント分析によって行う。
【００５２】
別の実施形態では、その複合体は本リガンドが例えば限定されるものではないが少なくとも１種の造影剤と共有結合的に結合されている場合に検出することができる。一実施形態では、結合を検出および／または定量化する工程を医用画像診断法で行う。
【００５３】
本明細書で使用される「造影剤」という用語は、限定されるものではないが、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）などのＸ線を用いる画像診断法、Ｘ線撮影法、超音波内視鏡（ＥＵＳ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、蛍光透視法、蛍光定量法、蛍光および近赤外線（ＮＩＲ）蛍光イメージングなどの医用画像診断法で体内構造の可視性を向上させるために使用される薬剤を指す。
【００５４】
一実施形態では、本リガンドを少なくとも１種の造影剤に結合させるが、前記造影剤は放射性標識薬剤または蛍光剤であってもよい。
【００５５】
一実施形態では、本発明の放射性標識薬剤は、非金属放射性同位体、非金属もしくは金属色素、常磁性金属または放射性金属を含む群から選択される。
【００５６】
非金属放射性同位体の例は、限定されるものではないが、Ｉ−１２５、Ｉ−１２３、Ｉ−１３１、Ｃ−１１、Ｆ−１８、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｂｒ−７７、Ｂｒ−８０およびＡｔ−２１１を含む。非金属放射性同位体は、本リガンドの末端すなわちアミノ酸側鎖の官能基のいずれかに共有結合的に結合されていてもよく、例えばフッ素、臭素またはヨウ素を有するアミノ酸フェニルアラニンまたはチロシン中のさらなる置換基として、あるいはさらなるカルボキシまたはメチル置換基として、あるいは本リガンド中の任意の規則炭素原子の代わりとして直鎖状安定化ペプチドの一部であってもよい。好ましくは、本リガンドをＩ−１２５に結合させる。これらの放射性同位体は陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）プローブまたは単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）プローブとしてリガンドにおいて有用である。
【００５７】
非金属もしくは金属色素の例は、限定されるものではないが有機分子、例えば市販のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、フルオレセイン、ローダミンまたはＣｙ（登録商標）色素（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７およびＣｙ７．５など）、遷移金属の複合体、例えばＥｕ３＋、Ｔｂ３＋のキレートあるいは可視域または近赤外線の光を吸収および／または放出するナノ粒子（量子ドット）を含む。有機色素およびキレート系はキレート剤のために上に記載されているようなリガンドに結合される。本リガンドと量子ドットとの結合は当業者に公知の手順によって行われる。色素を有するこれらのリガンドは光学イメージングプローブとして有用である。
【００５８】
常磁性金属の例は、限定されるものではないが、Ｇｄ、Ｆｅ、Ｍｎを含む。金属を本リガンドに結合させる。これらのリガンドは核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）プローブとして有用である。
【００５９】
放射性金属の例は、限定されるものではないが、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｚｒ−８９、Ｙ−９０、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｔｂ−１６１、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８およびＢｉ−２１３を含む。放射性金属（および上記常磁性金属）は、上に列挙されているようなキレート剤を介して本発明のリガンドに結合させ、本リガンドに直接またはスペーサーを介して接続されている。
【００６０】
蛍光剤の例としては、限定されるものではないが、ＧＦＰ、ｍＰｌｕｍｇ、ｍＣｈｅｒｒｙｇ、ｔｄＴｏｍａｔｏｇ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙｇ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤＳ−Ｒｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒｈ、ｍＯｒａｎｇｅｇ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅｉ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔｇ、ＥＹＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄｇ、ＥＧＦＰ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎｇ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅｇｇ、インドシアニングリーン、ＺＷ８００−１、Ｃｙ５．５およびＩＲＤｙｅ８００ＣＷが挙げられる。
【００６１】
一実施形態では、造影剤はＩ−１２５である。
【００６２】
典型的なリガンドとしては、限定されるものではないが、ポリペプチドおよびタンパク質が挙げられる。
【００６３】
一実施形態では、本リガンドはＣＡＴ１に特異的な抗体であり、かつ本発明の方法は、前記抗体とＣＡＴ１との間で形成される複合体を検出および／または定量化する工程を含む。
【００６４】
従って、一実施形態では、本発明は、細胞に存在する細胞表面栄養トランスポーターＣＡＴ１を検出および／または定量化するためのインビトロまたはインビボ方法であって、
ａ．前記細胞をＣＡＴ１に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させる工程と、
ｂ．前記少なくとも１種の抗体のＣＡＴ１への結合を決定および／または定量化する工程と
を含む方法に関する。
【００６５】
一実施形態では、本発明の方法は、工程ｂで決定および／または定量化された結合を基準結合値と比較する工程を含む。
【００６６】
一実施形態では、本リガンドは受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）リガンドであり、かつ本発明の方法は、前記ＲＢＤリガンドとＣＡＴ１との間で形成された複合体を検出および／または定量化する工程を含む。
【００６７】
本発明の一態様では、本リガンドは受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）リガンド、好ましくはＢＬＶ−ＲＢＤリガンドであり、前記ＲＢＤリガンドは、ＣＡＴ１と相互作用するエンベロープウイルスの糖タンパク質の可溶性部分に由来する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の一部または全体を含む。
【００６８】
「ＣＡＴ１と相互作用するもの」という表現は、それがその細胞に存在するＣＡＴ１受容体を認識しやすいことを意味する。従って、一実施形態では、ＣＡＴ１と相互作用するリガンドはＣＡＴ１と複合体を形成し、その複合体は本明細書の上に記載されている方法によって検出することができる。
【００６９】
「エンベロープウイルスの糖タンパク質の可溶性部分に由来する」という表現は、本リガンドがウイルスのエンベロープに含まれる糖タンパク質の断片または一部であり、かつ例えばクローニングによって得ることができることを意味する。
【００７０】
「糖タンパク質」という用語は、エンベロープ糖タンパク質、コート糖タンパク質または融合糖タンパク質を意味するものとして理解されるべきであり、ここで「糖タンパク質」という用語は、ポリペプチド側鎖に共有結合的に結合されたオリゴ糖鎖を含むタンパク質を指す。
【００７１】
ＲＢＤは特にウイルスのエンベロープの糖タンパク質中に存在し、従って受容体結合ドメインリガンドは、ＲＢＤ全体またはＲＢＤの断片すなわち一部を含む。
【００７２】
一実施形態では、本発明のリガンドは、例えばＢＬＶ．ＲＢＤなどのウイルスの糖タンパク質エンベロープの細胞表面（ＳＵ）ドメインまたはＳＵドメインの断片を含む。別の実施形態では、本発明のリガンドはウイルスの糖タンパク質エンベロープの膜貫通（ＴＭ）ドメインを含まない。従って、本発明の一実施形態では、本発明のリガンドは可溶性ペプチド、特に可溶性ＢＬＶ．ＲＢＤである。本明細書で使用される「可溶性ペプチド」という用語は、例えば膜貫通またはＧＰＩアンカードメインなどによって膜内に固定されていないペプチドを指す。
【００７３】
一実施形態では、ＲＢＤリガンドはマウスのＣ型エコトロピックレトロウイルスの糖タンパク質の可溶性部分に由来していない。一実施形態では、ＲＢＤリガンドはモロニーマウスの白血病ウイルス、Ｓｈｉｎｎｉｃｋ単離株（受入番号：Ｐ０３３８５、配列番号２５）の糖タンパク質の可溶性部分に由来していない。一実施形態では、ＲＢＤリガンドはフレンドマウス白血病ウイルス、５７系（受入番号：Ｐ０３３９０、配列番号２６）の糖タンパク質の可溶性部分に由来していない。
【００７４】
一実施形態では、ＲＢＤリガンドはデルタレトロウイルスの糖タンパク質の可溶性部分に由来している。
【００７５】
デルタレトロウイルス属は、ヒト、各種サル種およびウシに感染するウイルスを含む。デルタレトロウイルスとしては、限定されるものではないが、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１〜４（ＨＴＬＶ１〜４）およびサルのＴ細胞白血病ウイルス１〜４（ＳＴＬＶ１〜４）が挙げられる。
【００７６】
デルタレトロウイルスは、成熟したレトロウイルスウイルス粒子中に存在する糖タンパク質のエンベロープをコードする。エンベロープタンパク質はプロペプチドの形態で合成され、このプロペプチドがフューリンペプチダーゼによってゴルジ装置において切断され、２種類のポリペプチド、すなわち膜貫通（ＴＭ）および細胞表面（ＳＵ）成分が生じる。ＳＵドメインは２つの主要なサブドメイン、すなわちＴＭドメインおよびアミノ端末ＲＢＤと相互作用するドメインを含み、後者は宿主細胞膜受容体と相互作用しやすい。
【００７７】
一実施形態では、受容体結合ドメインリガンドはウシ白血病ウイルスのエンベロープ糖タンパク質から単離されたものであり、これを本明細書ではＢＬＶ．ＲＢＤと呼ぶ。
【００７８】
従って、一実施形態では、本発明のリガンドは、例えばＢＬＶ．ＲＢＤなどのウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）の糖タンパク質エンベロープの細胞表面（ＳＵ）ドメインまたはＳＵドメインの断片を含む。別の実施形態では、本発明のリガンドはウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）の糖タンパク質エンベロープの膜貫通（ＴＭ）ドメインを含まない。従って、本発明の一実施形態では、本発明のリガンドは可溶性ペプチド、特に可溶性ＢＬＶ．ＲＢＤである。
【００７９】
従って、一実施形態では、本発明は、細胞に存在する細胞表面栄養トランスポーターＣＡＴ１を検出および／または定量化するためのインビトロまたはインビボ方法であって、
ａ．前記細胞を少なくとも１種のウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片と接触させる工程と、
ｂ．前記少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体または断片のＣＡＴ１への結合を決定および／または定量化する工程と
を含む方法に関する。
【００８０】
一実施形態では、本発明の方法は、工程ｂで決定および／または定量化された結合を基準結合値と比較する工程を含む。
【００８１】
本発明の一態様では、本リガンドはＢＬＶ．ＲＢＤリガンドであり、前記ＢＬＶ．ＲＢＤリガンドは、ＣＡＴ１と相互作用するＢＬＶエンベロープウイルスの糖タンパク質の可溶性部分に由来する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の一部または全体を含む。
【００８２】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号２１のアミノ酸配列（配列番号２２または配列番号５によってコードされる）、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【００８３】
一実施形態では、前記断片は、配列番号２１のアミノ酸３４〜１８１を含むかそれからなる。
【００８４】
一実施形態では、前記断片は、配列番号２１のアミノ酸１〜１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９または１８０を含むかそれからなる。
【００８５】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号２１のアミノ酸３４〜１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９または１８０を含むかそれからなる。
【００８６】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号２８のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【００８７】
一実施形態では、前記断片は、配列番号２８のアミノ酸３４〜１８１を含むかそれからなる。
【００８８】
一実施形態では、前記断片は、配列番号２８のアミノ酸１〜１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９または１８０を含むかそれからなる。
【００８９】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号２８のアミノ酸３４〜１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９または１８０を含むかそれからなる。
【００９０】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号２９のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【００９１】
一実施形態では、前記断片は、配列番号２９のアミノ酸３４〜１８１を含むかそれからなる。
【００９２】
一実施形態では、前記断片は、配列番号２９のアミノ酸１〜１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９または１８０を含むかそれからなる。
【００９３】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号２９のアミノ酸３４〜１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９または１８０を含むかそれからなる。
【００９４】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号４のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【００９５】
一実施形態では、前記断片は、配列番号４のアミノ酸３４〜１８１を含むかそれからなる。
【００９６】
一実施形態では、前記断片は、配列番号４のアミノ酸１〜１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９または１８０を含むかそれからなる。
【００９７】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号４のアミノ酸３４〜１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９または１８０を含むかそれからなる。
【００９８】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【００９９】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３のアミノ酸３４〜２１５を含むかそれからなる。
【０１００】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３のアミノ酸１〜１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４を含むかそれからなる。
【０１０１】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３のアミノ酸３４〜１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４を含むかそれからなる。
【０１０２】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３０のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１０３】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３０のアミノ酸３４〜２１５を含むかそれからなる。
【０１０４】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３０のアミノ酸１〜１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４を含むかそれからなる。
【０１０５】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３０のアミノ酸３４〜１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４を含むかそれからなる。
【０１０６】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３１のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１０７】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３１のアミノ酸３４〜２１５を含むかそれからなる。
【０１０８】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３１のアミノ酸１〜１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４を含むかそれからなる。
【０１０９】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３１のアミノ酸３４〜１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４を含むかそれからなる。
【０１１０】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３２のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１１１】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３２のアミノ酸３４〜２１５を含むかそれからなる。
【０１１２】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３２のアミノ酸１〜１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４を含むかそれからなる。
【０１１３】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３２のアミノ酸３４〜１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３または２１４を含むかそれからなる。
【０１１４】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号１３のアミノ酸配列（配列番号１４によってコードされる）、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１１５】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号１５のアミノ酸配列（配列番号１６によってコードされる）、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１１６】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号１７のアミノ酸配列（配列番号１８によってコードされる）、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１１７】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号１９のアミノ酸配列（配列番号２０によってコードされる）、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１１８】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３３のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１１９】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３４のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１２０】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３５のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１２１】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３６のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１２２】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３７のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１２３】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３８のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１２４】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３９のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１２５】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号４０のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１２６】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号４１のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１２７】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号４２のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１２８】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号４３のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１２９】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号４４のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１３０】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号４５のアミノ酸配列（配列番号４６によってコードされる）、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１３１】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号４７のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１３２】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号４８のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１３３】
一実施形態では、前記ＢＬＶ．ＲＢＤは、配列番号４９のアミノ酸配列、その変異体または断片を含むかそれからなる。
【０１３４】
本明細書で使用される「アミノ酸」は、それらの名前全体あるいは当該技術分野で周知のそれらの３文字コードまたはそれらの１文字コードによって表されている。ペプチド内のアミノ酸残基は以下のように省略されている。すなわち、フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦ、ロイシンはＬｅｕまたはＬ、イソロイシンはＩｌｅまたはＩ、メチオニンはＭｅｔまたはＭ、バリンはＶａｌまたはＶ、セリンはＳｅｒまたはＳ、プロリンはＰｒｏまたはＰ、トレオニンはＴｈｒまたはＴ、アラニンはＡｌａまたはＡ、チロシンはＴｙｒまたはＹ、ヒスチジンはＨｉｓまたはＨ、グルタミンはＧｌｎまたはＱ、アスパラギンはＡｓｎまたはＮ、リジンはＬｙｓまたはＫ、アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤ、グルタミン酸はＧｌｕまたはＥ、システインはＣｙｓまたはＣ、トリプトファンはＴｒｐまたはＷ、アルギニンはＡｒｇまたはＲ、グリシンはＧｌｙまたはＧである。
【０１３５】
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸の両方ならびにＤおよびＬアミノ酸の両方を含む。「標準アミノ酸」または「天然に生じるアミノ酸」は、一般に天然に生じるペプチド中に存在する２０種の標準Ｌ−アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸残基」は、合成により調製されたか天然源に由来するかに関わらず標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。例えば、ナフチルアラニンをトリプトファンの代わりに使用して合成を容易にすることができる。置換することができる他の合成アミノ酸としては、限定されるものではないが、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル、Ｌ−α−ヒドロキシルリル（ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｙｌ）およびＤ−α−メチルアラニル、Ｌ−α−メチルアラニルなどのα−アミノ酸、β−アミノ酸およびイソキノリルが挙げられる。
【０１３６】
本明細書で使用される「アミノ酸」は、限定されるものではないが、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）および置換体などの化学的に修正されたアミノ酸も包含する。本発明のポリペプチド内、特にカルボキシまたはアミノ末端に含まれるアミノ酸は、それらの活性に悪影響を与えることなくポリペプチドの循環半減期を変えることができるメチル化、アミド化、アセチル化または他の化学基による置換によって修飾されていてもよい。さらに、本発明のポリペプチド内にジスルフィド結合が存在していても存在していなくてもよい。
【０１３７】
本発明のＲＢＤリガンドは標準アミノ酸または非標準アミノ酸を含んでいてもよい。ポリペプチド模倣体としては、以下の修飾を有するポリペプチド、すなわち、ｉ）１つ以上のペプチジル−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−結合が−ＣＨ２−カルバメート結合（−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−）、ホスホネート結合、−ＣＨ２−スルホンアミド（−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−）結合、尿素（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）結合、−ＣＨ２−第二級アミン結合またはアルキル化ペプチジル結合（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−）（式中、ＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである）などの非ペプチジル結合で置換されているポリペプチド、ｉｉ）Ｎ末端が−ＮＲＲ１基、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、−ＮＲＣ（Ｏ）基または−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基（式中、ＲおよびＲ１がどちらも水素でないという条件でＲおよびＲ１は水素またはＣ１〜Ｃ４アルキルである）に誘導体化されているポリペプチド、ｉｉｉ）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２（式中、Ｒ２はＣ１〜Ｃ４アルコキシおよび−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３およびＲ４は独立して水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される）に誘導体化されているポリペプチドが挙げられる。
【０１３８】
好ましい実施形態によれば、本ＢＬＶ．ＲＢＤリガンドは、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８および４９の配列、その断片および変異体を含む群から選択され、より好ましくは配列番号２１および４の配列、その断片および変異体を含む群から選択され、さらにより好ましくは配列番号２１の配列、その断片および変異体を含む群から選択される。別の実施形態によれば、受容体結合ドメインリガンドは配列番号２２、５、１４、１６、１８、２０および４６の配列、その変異体および断片を含む群から選択されるＤＮＡ配列によってコードされる。
【０１３９】
一実施形態では、本ＢＬＶ．ＲＢＤリガンドは、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８または４９の配列のうちの１つとと少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８または４９の配列のうちの１つと少なくとも約７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含むかそれからなる。
【０１４０】
別の実施形態では、本発明のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドは、配列番号２２、５、１４、１６、１８、２０または４６の配列と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは配列番号２２、５、１４、１６、１８、２０または４６の配列と少なくとも約７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すＤＮＡ配列によってコードされる。
【０１４１】
一実施形態では、本発明のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドは、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８および４９の配列を有するポリペプチドのうちの１つの変異体である。
【０１４２】
本明細書で使用されるポリペプチド「変異体」という用語は、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入の点で本明細書に具体的に開示されているポリペプチドとは典型的に異なるポリペプチドである。そのような変異体は、天然に生じたものであってもよく、あるいは、例えば、１つ以上の上記ポリペプチド配列を修飾し、本明細書に記載されているようにそのポリペプチドの１つ以上の生物活性を評価し、かつ／または当該技術分野で周知の複数の技術のいずれかを用いて合成により産生されたものであってもよい。修飾は、ポリペプチドの構造において行ってもよく、望ましい特性を有するポリペプチド変異体または誘導体をコードする機能性分子がなお得られる。
【０１４３】
ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させて、同等またはさらに改良された本発明のリガンドの変異体または一部を生成したい場合、当業者は典型的に、コード化ＤＮＡ配列のコドンの１つ以上を変化させる。例えば、細胞表面受容体、好ましくは細胞表面栄養トランスポーターに結合するその能力を大きく損失することなく、特定のアミノ酸をタンパク質構造中の他のアミノ酸で置換してもよい。タンパク質の生物学的機能活性を定めるのはタンパク質の結合能力および性質であるため、特定のアミノ酸配列の置換は、タンパク質配列および当然ながらその基礎をなすＤＮＡコード配列において行うことができ、それにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が得られる。従って、ペプチド配列または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列において、それらの生物学的有用性または活性を大きく損失することなく様々な変化をなし得ることが想定される。多くの例では、ポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的置換を含む。「保存的置換」とは、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造および親水性／疎水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｎａｔｕｒｅ）が実質的に変化されないことを期待するような、あるアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸で置き換える置換である。従って、上に概説したように、アミノ酸置換は一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいている。上記特性の様々なものを考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、セリンとトレオニン、グルタミンとアスパラギン、バリンとロイシンとイソロイシンが挙げられる。さらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいてアミノ酸置換を行ってもよい。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としてはヒスチジン、リジンおよびアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する荷電していない極性の頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンとフェニルアラニンとチロシンが挙げられる。保存的変化を表し得るアミノ酸の他の群としては、（１）Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、（２）Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、（３）Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、（４）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、および（５）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓが挙げられる。
【０１４４】
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」という用語は、以下の５つの群：
Ｉ．小さい脂肪族の非極性または僅かに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
ＩＩ．極性の負に荷電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、
ＩＩＩ．極性の正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
ＩＶ．大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
Ｖ．大きい芳香族の残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
のうちの１つの中でのアミノ酸交換としてさらに定義してもよい。
【０１４５】
変異体は、追加または代わりとして、非保存的変化を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチド変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の置換、欠失または付加によって天然配列とは異なる。変異体は、追加（または代わりとして）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および親水性／疎水性に対して最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって修飾されていてもよい。
【０１４６】
一実施形態では、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８または４９の変異体はそれぞれ、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８または４９のうちの１つと少なくとも同等の親和性でＣＡＴ１に結合することができる。
【０１４７】
一実施形態では、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８または４９の変異体はそれぞれ、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８または４９の配列と比較した場合に、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の保存的アミノ酸置換などの保存的アミノ酸置換を含む。
【０１４８】
別の実施形態では、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８または４９の変異体はそれぞれ、配列番号２１、３、４、１３、１５、１７、１９、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７、４８または４９の配列からの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸が存在しないか任意のアミノ酸で置換されているポリペプチド、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸（隣接していても隣接していなくてもよい）が付加されているポリペプチドである。
【０１４９】
本発明の一実施形態では、本明細書の上に記載されているＲＢＤリガンドは、当該技術分野で周知の手段、例えばリン酸、酢酸、脂質または炭水化物基などの１つ以上の官能基の付加および／または１つ以上の保護基の付加によって修飾されている。例えば、本ＲＢＤリガンドは、リン酸、酢酸または各種脂質および炭水化物などの１つ以上の官能基の付加によって修飾されていてもよい。本発明のＲＢＤリガンドはポリペプチド誘導体として存在していてもよい。「ポリペプチド誘導体」という用語は、アミノ基（−ＮＨ−）、より詳細にはペプチド結合を有する化合物を指す。ポリペプチドは置換アミドとしてみなしてもよい。アミド基のようにペプチド結合は高度の共鳴安定化を示す。ペプチド結合内のＣ−Ｎ単結合は典型的には約４０％の二重結合の性質を有し、かつＣ＝Ｏ二重結合は約４０％の単結合の性質を有する。「保護基」は保護されていない官能基に関与する望ましくない反応（タンパク質分解など）を防止する基である。アミノ保護基の具体例としては、ホルミル、トリフルオロアセチル、ベンジルオキシカルボニル、（オルト−またはパラ−）クロロベンジルオキシカルボニルや（オルト−またはパラ−）ブロモベンジルオキシカルボニルなどの置換ベンジルオキシカルボニル、およびｔ−ブトキシカルボニルやｔ−アミルオキシカルボニル（ｔ−ａｍｉｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）などの脂肪族オキシカルボニルが挙げられる。アミノ酸のカルボキシル基は、エステル基への変換によって保護することができる。エステル基としては、ベンジルエステル、メトキシベンジルエステルなどの置換ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、シクロヘプチルエステルまたはｔ−ブチルエステルなどのアルキルエステルが挙げられる。グアニジノ部分は保護基を必要としないが、ニトロまたはトシル、メトキシベンゼンスルホニルもしくはメシチレンスルホニルなどのアリールスルホニルによって保護されていてもよい。イミダゾールの保護基としては、トシル、ベンジルおよびジニトロフェニルが挙げられる。トリプトファンのインドール基はホルミルによって保護されていても保護されていてもよい。
【０１５０】
本ＲＢＤリガンドの修飾は、特にインビボでのそれらの寿命を引き延ばすことを目的としている。修飾の一種は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のＲＢＤリガンドのＮ末端またはＣ末端への付加である。ＰＥＧは、それを高い水溶解性、溶液中での高い移動性および低い免疫原性などのポリペプチドのための理想的な担体にさせる多くの特性を有していることが当業者によって知られている。この修飾によりポリペプチドがエキソペプチダーゼから保護され、従ってそれらのインビボでの全体的安定性も高まる。
【０１５１】
エンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼによるポリペプチドの分解を防止するために使用される他の修飾としては、アセチル化またはグリコシル化などのＮ端末修飾、アミド化などのＣ端末修飾、およびポリペプチド内の特定の部位における非天然アミノ酸（β−アミノおよびα−トリフルオロメチルアミノ酸）の使用が挙げられる。一実施形態では、本発明のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドはグリコシル化されている。別の実施形態では、本発明のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドはグリコシル化されていない。
【０１５２】
ポリペプチド分子のサイズを大きくするための別の代替法は、ポリペプチドのヒト免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧなど）のＦｃドメインへの遺伝子融合またはポリペプチドのアルブミンへの融合である。
【０１５３】
一実施形態では、本明細書の上に記載されているＢＬＶ．ＲＢＤリガンドは、例えばＦｃ断片またはＧＦＰなどの検出タグに融合されたＲＢＤの一部または全体を含む融合タンパク質である。Ｆｃ断片の例としては、限定されるものではないが、ウサギＦｃ断片（配列番号９によってコードされる配列番号８のアミノ酸配列）、マウスＦｃ断片（配列番号１１によってコードされる配列番号１０のアミノ酸配列）が挙げられる。
【０１５４】
一実施形態では、受容体結合ドメインリガンドは、ウサギＦｃ断片に融合されたＢＬＶ．ＲＢＤである（例えば配列番号１２のＤＮＡ配列によってコードされてもよい）。
【０１５５】
一実施形態では、本発明の受容体結合リガンドは少なくとも１種の造影剤に結合されている。造影剤の非限定的な例は本明細書の上に列挙されている。好ましい造影剤はＩ−１２５である。
【０１５６】
本明細書に記載されている本発明のＲＢＤリガンドは、当該技術分野で周知の化学合成または酵素的合成によって合成により生成することができる。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をタンパク質発現ベクターに導入し、好適な宿主生物（例えば、細菌、昆虫細胞など）において産生させ、次いで精製することができる。一実施形態では、受容体結合ドメインリガンドは、例えば、大腸菌、酵母、バキュロウイルス−昆虫細胞またはＨＥＫもしくはＣＨＯなどの哺乳類細胞発現系などの例えば当該技術分野で知られている任意の産生系を用いるクローニング法によって得られる。
【０１５７】
本発明の別の目的は、少なくとも１種の造影剤に結合させた本明細書の上に記載されているＢＬＶ．ＲＢＤリガンドである。一実施形態では、少なくとも１種の造影剤は放射性標識薬剤または蛍光剤である。一実施形態では、少なくとも１種の造影剤はＩ−１２５である。
【０１５８】
一実施形態では、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドを医用画像診断用プローブとして使用してもよい。
【０１５９】
少なくとも１種の造影剤をＲＢＤリガンドに結合させるための方法は最先端技術において周知である。例えば、少なくとも１種の造影剤は共有結合的または非共有結合的に結合させてもよい。
【０１６０】
例えば、ポリペプチドをＩ−１２５に結合させるための技術は最先端技術において周知である。そのような方法の非限定的な例は、還元された形態で存在するヨウ素（ＮａＩ）をチロシンのフェノール基またはヒスチジン残基の側鎖と反応させることである。これらの基を酸化剤（ヨードゲン）で予め酸化させる。次いで、ペプチド製剤（１ｍｃｉ＝３７ＭＢｑに対して１００μｇ）をヨードゲン溶液に添加し、４℃で１０分間インキュベートする。例えば標識ごとにアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ２００μＬを含む停止液を用いて反応を停止させる。同時に、マウス血清をＰＤ１０カラムに添加する。次いで、反応溶液をＰＤ１０カラムに添加し、ヨウ素に結合させたペプチドを回収する。
【０１６１】
本発明の一実施形態では、少なくとも１種の造影剤に結合させた本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片は、トレーサーとして使用するためのものである。本明細書で使用される「トレーサー」という用語は、術前、術中および術後においてＣＡＴ１関連疾患の位置、進行および／または構造の洞察を与える認識剤を指す。
【０１６２】
従って、本発明はさらに、それを必要とする対象におけるＢＬＶに感染しているかまだ感染していない細胞、またはカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター機能、好ましくはＣＡＴ１機能が調節不全である細胞を追跡するためのインビボ方法であって、
ａ．少なくとも１種の造影剤に結合させた有効量の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を対象に投与する工程と、
ｂ．医用画像診断法を用いて前記少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片の前記細胞への結合を検出および／または定量化する工程と
を含む方法に関する。
【０１６３】
一実施形態では、前記方法は術前、術中および術後のためのものである。別の実施形態では、前記方法は蛍光ガイド手術において使用するためのものである。
【０１６４】
使用することができる特定の医用画像診断法の例は当業者に周知であり、限定されるものではないが、例えばコンピューターＸ線体軸断層撮影法（ＣＡＴ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）または単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）が挙げられ、Ｂｏｏｎｓｔｒａら（２０１５．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．６（１６）：１４２６０−７３）に記載されている。
【０１６５】
一実施形態では、上記ＢＬＶ．ＲＢＤリガンドを本明細書に記載されている放射性標識薬剤または蛍光剤に結合させる。標的化のために使用することができる放射性標識薬剤または蛍光剤の例としては、限定されるものではないが、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｆ−１８（すなわち、１８−Ｆ−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース、１８−Ｆ−フルオロ−１７−エストラジオール）、１１−Ｃ−酢酸、Ｔｃ−９９ｍ、Ｏ−１５、Ｎ−１３、Ｂｒ−７６、Ｉｎ−１１１、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８、Ｚｒ−８９、ＺＷ８００−１、Ｃｙ５．５、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷが挙げられる。
【０１６６】
本明細書で使用される「カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患」という用語は、アルギニン、リジン、オルニチンまたはヒスチジンの恒常性および／または代謝に関与する経路が調節不全である疾患を指す。
【０１６７】
カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患の例、としては、限定されるものではないが、アルギニン関連疾患、リジン関連疾患、ヒスチジン関連疾患、オルニチン関連疾患、一酸化窒素関連疾患および炎症性疾患が挙げられる。
【０１６８】
アルギニン関連疾患の例としては、限定されるものではないが、アルギニン関連の癌、アルギニノコハク酸分解酵素関連疾患、アルギニノコハク酸合成酵素関連疾患、心筋線維化および筋肉線維症が挙げられる。
【０１６９】
アルギニン関連の癌の例としては、限定されるものではないが、アルギニン関連の腫瘍、アルギニン関連の肉腫、アルギニン関連の白血病、アルギニン関連の癌腫、アルギニン関連のリンパ腫、アルギニン関連の転移およびアルギニン関連の黒色腫、アルギニノコハク酸合成酵素関連の癌、アルギニノコハク酸分解酵素関連の癌、アルギニン栄養要求性腫瘍および急性骨髄性白血病が挙げられる。
【０１７０】
アルギニノコハク酸合成酵素関連の癌の例としては、限定されるものではないが、結腸直腸癌、膀胱癌、膵臓癌、肝臓癌、黒色腫、鼻咽腔癌、肝細胞癌、粘液線維肉腫、脳腫瘍、神経膠芽腫、ブドウ膜黒色腫、肺癌、小細胞肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、肝癌、腎細胞癌、前立腺癌、乳癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、膵臓癌、悪性黒色腫、骨肉腫、悪性胸膜中皮腫、食道腺癌、肺転移、卵巣癌、急性骨髄性白血病、中皮癌、泌尿器癌およびバーキット・リンパ腫が挙げられる。
【０１７１】
アルギニノコハク酸分解酵素関連疾患の例としては、限定されるものではないが、肝臓癌、肝線維症、結腸直腸癌、アルギニノコハク酸分解酵素欠損症、アルギニノコハク酸尿症、尿素サイクル異常症、高アンモニア血症、発達遅滞、急性感染症または認知機能障害に対するストレス、行動異常および／または学習障害、肝腫、進行性脳症、嗜眠、発作、注意欠陥多動性障害、肝炎、肝硬変、全身性高血圧症、低カリウム血症および神経膠芽腫が挙げられる。
【０１７２】
アルギニノコハク酸合成酵素関連疾患の例としては、限定されるものではないが、シトルリン血症１型、高アンモニア血症、尿素サイクル異常症およびアルギニノコハク酸合成酵素関連の癌が挙げられる。
【０１７３】
リジン関連疾患の例としては、限定されるものではないが、高リジン血症、グルタル酸尿症１型、Ｌ−２ヒドロキシグルタル酸尿症、Ｄ−２ヒドロキシグルタル酸尿症および単純ヘルペス感染が挙げられる。
【０１７４】
ヒスチジン関連疾患の例としては、限定されるものではないが、ヒスチジン血症およびヒスチジンアンモニアリアーゼ欠損症が挙げられる。
【０１７５】
オルニチン関連疾患の例としては、限定されるものではないが、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、肝硬変および発癌が挙げられる。
【０１７６】
一酸化窒素関連疾患の例としては、限定されるものではないが、慢性腎不全、慢性心不全、鬱血性心不全、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中および血栓症が挙げられる。
【０１７７】
代謝性疾患の例としては、限定されるものではないが、肥満症、糖尿病、心血管系死亡、腎障害および虚血が挙げられる。
【０１７８】
炎症性疾患の例としては、限定されるものではないが、多発性関節炎、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫疾患および多発性硬化症が挙げられる。
【０１７９】
ウシ白血病ウイルスは乳製品およびウシまたはヒツジの血液細胞および乳房組織に感染する。レトロウイルスは最初に直接接触、感染した血液および乳、場合により刺咬昆虫によってウシの間で容易に伝染する。さらに、最近の研究ではＢＬＶに曝露された女性が乳癌を発症するリスクが高まることが実証されている。
【０１８０】
ＢＬＶ感染の例としては、限定されるものではないが、白血病、持続性リンパ球増加症、リンパ球増殖、リンパ系腫瘍、悪性Ｂ細胞リンパ腫、（ウシにおける）地方病性ウシ白血病および乳癌が挙げられる。
【０１８１】
一実施形態では、本発明の方法はカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を診断するためのものである。一実施形態では、本発明の方法は炎症状態を診断するためのものではない。
【０１８２】
従って、本出願は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染の診断のための方法であって、
ａ．有効量の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を細胞、試料、組織および／または臓器に接触させる工程と、
ｂ．少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片の前記細胞、試料、組織および／または臓器中のＣＡＴ１への結合を検出および／または定量化する工程と
を含む方法に関する。
【０１８３】
一実施形態では、本発明の方法は、工程ｂで決定および／または定量化された結合を基準結合値と比較する工程を含む。
【０１８４】
本明細書で使用される「基準」という用語は、決定された結合に関する比較のための基準として使用することができるあらゆる好適な基準結合レベルを広く包含する。一実施形態では、この基準は、統計学的および階層的な分類のアルゴリズムおよび／または他の方法を用いて構築される。別の態様では、この基準結合レベルは、格納された結合レベルを提供するためにデータベースに格納されており、格納された結合レベルは結合レベルにおける差を決定するために使用される。このデータベースは例えばコンピューターまたはサーバに格納されていてもよい。
【０１８５】
一実施形態では、基準結合レベルは指標値であるか、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター機能、好ましくはＣＡＴ１機能が調節不全である細胞またはＢＬＶに感染しているかまだ感染していない細胞の存在についての１つ以上のリスク予測アルゴリズムまたはコンピューターで計算された指標に由来している。基準結合レベルは、限定されるものではないが、同様の年齢層である対象の集団、同じまたは同様の民族群である対象などの集団研究に由来する数または値に相対的なものであってもよい。
【０１８６】
本明細書で使用される「カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター、好ましくはＣＡＴ１機能が調節不全である細胞」という用語は、アルギニンまたはリジンまたはヒスチジンまたはオルニチン代謝または流入が異常に増加または減少している細胞を指す。
【０１８７】
アルギニンまたはリジンまたはヒスチジンまたはオルニチン代謝は、それらの合成、異化作用だけでなく食物摂取も含む。アルギニンは、多様な病態において不十分または異常な活性を示し、これらの病態に冒されているか冒されていないいくつかの臓器、組織、試料または細胞においてアルギニン蓄積を生じさせる２種類の鍵となる酵素すなわちアルギニノコハク酸合成酵素およびアルギニノコハク酸分解酵素によって合成される。リジンおよびヒスチジンは必須アミノ酸であり、従って動物の体内では合成されない。オルニチンは、Ｌ−アルギニンに対する酵素であるアルギナーゼの作用による尿素の生成に関与している。
【０１８８】
本発明の一実施形態では、当該基準結合レベルは、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染と診断された患者集団において測定された結合レベルである。
【０１８９】
本実施形態によれば、決定された結合レベルと当該基準結合レベルとの間の同等性（すなわち、差がないこと）、または当該基準結合レベルよりも高い決定された結合レベルは、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶによる感染の存在を示してもよい。
【０１９０】
本発明の一実施形態では、当該基準結合レベルは、実質的に健康な対象の集団、すなわちカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染と診断されていない対象の集団において決定された結合レベルである。本実施形態によれば、当該基準結合レベルよりも高い決定された結合レベルは、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染の存在を示してもよい。
【０１９１】
本発明では、２種類の数値、特に２種類の結合レベルは、第１の数値が第２の数値よりも高い（例えば、第１の数値が第２の数値よりも約２０％高い、好ましくは第２の数値よりも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％またはそれ以上高いなど）または第２の数値よりも低い（例えば、第２の数値が第２の数値よりも約２０％低い、好ましくは第２の数値よりも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％またはそれ以上低いなど）場合に異なるものとみなされる。
【０１９２】
一実施形態では、当該基準値は、同じ対象において事前（例えば、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染の治療を受ける前など）に決定された個別化された基準である。
【０１９３】
一実施形態では、少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片は、本明細書の上に記載されている少なくとも１種の造影剤に結合させたＢＬＶ．ＲＢＤリガンドである。
【０１９４】
一実施形態では、本発明の診断方法はインビボ診断方法である。好ましくは、前記診断方法は医用画像診断法に基づいている。
【０１９５】
別の実施形態では、本発明の診断方法はインビトロまたはエクスビボ方法であり、すなわち、本発明の方法は、本発明の方法の実施前に患者から得られた細胞、試料、組織および／または臓器に対して行う。従って、一実施形態では、本発明の方法は患者から試料を得る工程を含まず、すなわち本発明の方法は非侵襲的である。
【０１９６】
一実施形態では、本発明の方法は対象におけるカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患を監視するためのものである。一実施形態では、本発明の方法は対象におけるＢＬＶ感染を監視するためのものである。本明細書で使用される「監視する」という用語は、例えばカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染に対する治療の前、間および後などの時間の関数として対象の体内におけるアルギニン、リジン、ヒスチジンまたはオルニチン代謝が調節不全である細胞の量の決定を指す。
【０１９７】
本明細書で使用される「カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染に対する治療法」という用語は、アルギニン欠乏、化学療法、放射線、外科手術、免疫療法およびカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター疾患（ＣＡＴ１関連疾患を含む）またはＢＬＶ感染を治療するための薬物として当業者に公知の薬物を指してもよい。
【０１９８】
一実施形態では、本発明の監視方法は、２種類の結合レベル、例えば治療前に決定された結合と治療後に決定された結合レベルとを比較する工程を含む。
【０１９９】
一実施形態では、治療後の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドの結合レベルの減少は治療の有効性を示す。
【０２００】
一実施形態では、治療前に決定されたものと同等であるかより高い治療後の結合レベルは、治療の有効性がないことを示す。
【０２０１】
本出願は、対象におけるカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を監視するための方法であって、
ａ．好ましくは少なくとも１種の造影剤に結合させた有効量の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を前記対象の細胞、試料、組織および／または臓器に接触させる工程と、
ｂ．好ましくは医用画像診断法により、少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片の前記細胞、試料、組織および／または臓器中のＣＡＴ１への結合を検出および／または定量化する工程と、
ｃ．当該対象をカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染に対する治療法で治療する工程と、
ｄ．好ましくは少なくとも１種の造影剤に結合させた有効量の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を前記対象の細胞、試料、組織および／または臓器に接触させる工程と、
ｅ．少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片の前記細胞、試料、組織および／または臓器中のＣＡＴ１への結合を検出および／または定量化する工程と
を含む方法にも関する。
【０２０２】
一実施形態では、本発明の方法は、工程ｅ）で決定された結合を工程ｂ）で決定された結合と比較し、それにより当該対象におけるカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を監視する工程をさらに含む。
【０２０３】
一実施形態では、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患（ＣＡＴ１関連疾患を含む）またはＢＬＶ感染に対する治療後の細胞、試料、組織および／または臓器中のＣＡＴ１が検出されないことまたはその減少は寛解を示す。特に、そのような疾患としては、例えば一酸化窒素関連疾患、好ましくは慢性腎不全および慢性心不全を挙げることができる。
【０２０４】
別の実施形態では、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患（ＣＡＴ１関連疾患を含む）に対する治療後の細胞、試料、組織および／または臓器中のＣＡＴ１が検出されることまたはその増加は寛解を示す。特に、そのような疾患としては、例えば、肥満症、糖尿病、心血管系死亡、腎障害または虚血などの代謝性疾患を挙げることができる。
【０２０５】
本出願はさらに、本明細書の上に記載されている少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を含むかそれからなるか本質的にそれからなる組成物に関する。
【０２０６】
本出願はさらに、本明細書の上に記載されている少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含むかそれからなるか本質的にそれからなる医薬組成物に関する。
【０２０７】
本出願はさらに、本明細書の上に記載されている少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を含むかそれからなるか本質的にそれからなる薬に関する。
【０２０８】
医薬組成物または薬に関して本明細書で使用される「本質的に〜からなる」という用語は、本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドが前記医薬組成物または薬における唯一の治療薬または生物活性を有する薬剤であることを意味する。
【０２０９】
本出願は、本明細書の上に記載されている少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含むかそれからなるか本質的にそれからなる診断用組成物にも関する。
【０２１０】
一実施形態では、本発明の診断用組成物は、本明細書の上に記載されている本発明の方法に従って、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患を診断するためのもの、またはカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患を監視するためのものである。別の実施形態では、本発明の診断用組成物は、本明細書の上に記載されている本発明の方法に従ってＢＬＶ感染を診断するためのもの、またはＢＬＶ感染を監視するためのものである。一実施形態では、本発明の診断用組成物は炎症状態を診断するためのではない。
【０２１１】
薬学的に許容される賦形剤としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびエタノール、グルコース、スクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩および酢酸塩の溶液、ゼラチン、コラーゲン、カーボポール（登録商標）、植物油などが挙げられる。賦形剤は、好適な防腐剤、安定化剤、抗酸化剤、抗菌剤および緩衝剤、例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリンなどをさらに含んでもよい。
【０２１２】
本発明の組成物中に使用することができる薬学的に許容される賦形剤の他の例としては、限定されるものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒトの血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【０２１３】
さらに、薬学的に許容される賦形剤は、例えば、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）、好適な担体（例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含有する例えば溶媒および分散媒、好適なそれらの混合物および例えば落花生油および胡麻油などの植物油など）、等張剤（例えば、糖類または塩化ナトリウムなど）、被覆剤（例えば、レシチンなど）、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、チメロサールなど）、緩衝液（例えば、ホウ酸、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、等張化剤（例えば、デキストロース、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなど）、抗酸化剤および安定化剤（例えば、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、チオ尿素など）、非イオン性浸潤剤または清澄剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２およびチロキサポールなど）、粘度調整剤（例えば、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ペトロラタム、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなど）などのいくつかの賦形剤を含んでもよい。
【０２１４】
本出願は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を治療するため、またはそれらを治療する際に使用するための本明細書の上に記載されている少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、医薬組成物または薬にも関する。
【０２１５】
一実施形態では、本明細書の上に記載されている少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、医薬組成物または薬は炎症状態を治療するためのもの、またはそれを治療する際に使用するためのものではない。
【０２１６】
一実施形態では、本明細書の上に記載されている少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、医薬組成物または薬はワクチンではない。従って、一実施形態では、本明細書の上に記載されている少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、医薬組成物または薬は、抗体、特にＢＬＶに対する抗体を産生するためのもの、それを産生する際に使用するためのものではない。
【０２１７】
本出願は、当該対象に本明細書の上に記載されている治療的有効量の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドを投与する工程を含む、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を治療するための方法にも関する。
【０２１８】
本出願は、対象に少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を投与する工程を含む、ＢＬＶに感染しているかまだ感染していない細胞、試料、組織および／または臓器またはカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター機能、好ましくはＣＡＴ１機能が調節不全である細胞、試料、組織および／または臓器を標的化するための方法にも関する。そのような方法を使用して、例えば治療薬をＢＬＶに感染しているかまだ感染していない細胞、試料、組織および／または臓器またはカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター機能、好ましくはＣＡＴ１機能が調節不全である細胞、試料、組織および／または臓器に標的化してもよい。一実施形態では、本発明の方法は対象を既にＢＬＶに感染している他の対象から保護するため、またはＢＬＶ感染を防止するため、特にＢＬＶ感染の伝播を防止するためのものである。
【０２１９】
一実施形態では、前記少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドは、好ましくは少なくとも１種の造影剤に結合させる場合にはカプセル化されている。少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドのカプセル化により、あらゆる分解を回避してもよい。カプセル化法は最先端技術において周知である。
【０２２０】
カプセルの例としては、限定されるものではないが、リン脂質、ポリマー、リポソームおよび量子ドットが挙げられる。
【０２２１】
一実施形態では、少なくとも１種の本ＢＬＶ．ＲＢＤリガンドは、当該対象の体内のＢＬＶに感染しているかまだ感染していない細胞、試料、組織または臓器またはカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター機能、好ましくはＣＡＴ１機能が調節不全である細胞、試料、組織または臓器に特異的に投与するための治療薬と共にカプセル化されている。
【０２２２】
一実施形態では、本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、診断用組成物、医薬組成物または薬は、当業者によって決定され、かつ各対象に個々に適合させた用量で投与することができる。
【０２２３】
一実施形態では、本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、診断用組成物、医薬組成物または薬は、有効量で投与することができる。
【０２２４】
当然のことながら、本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、診断用組成物、医薬組成物または薬の使用は、適切な医学的判断の範囲内で担当医によって決定される。あらゆる特定の患者のための具体的な有効量は、用いられる具体的な組成物、当該対象の年齢、体重、健康状態、性別および食事ならびに投与時間、投与経路および医療分野で周知の同様の因子などの様々な因子によって決まる。
【０２２５】
一実施形態では、本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、診断用組成物、医薬組成物または薬は、注射、経口、局所、経鼻、口腔内、直腸内、膣内、気管内、内視鏡、経粘膜または経皮投与によって投与することができる。
【０２２６】
一実施形態では、本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、診断用組成物、医薬組成物または薬は注射によって投与することができ、好ましくは全身注射することができる。全身注射に適した製剤の例としては、限定されるものではないが、液体溶液または懸濁液、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態が挙げられる。全身注射の例としては、限定されるものではないが、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、硝子体内および腹膜内注射または灌流が挙げられる。別の実施形態では、本発明の組成物、診断用組成物、医薬組成物または薬は注射の際に無菌である。無菌組成物、診断用組成物、医薬組成物または薬を得るための方法としては、限定されるものではないが、ＧＭＰ合成（ＧＭＰは「優良医薬品製造基準」を表す）が挙げられる。
【０２２７】
一実施形態では、本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、診断用組成物、医薬組成物または薬は経口で投与することができる。経口投与に適した製剤の例としては、限定されるものではないが、固体形態、液体形態およびゲルが挙げられる。経口投与に適した固体形態の例としては、限定されるものではないが、丸剤、錠剤、カプセル、軟ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、カプレット、圧縮錠剤、カシェ剤、ウェーハ、糖被覆丸剤、糖被覆錠剤、または分散錠／崩壊錠、粉末、経口投与前の液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態、および発泡錠が挙げられる。経口投与に適した液体形態の例としては、限定されるものではないが、溶液、懸濁液、飲用に適した溶液、エリキシル剤、密閉アンプル、頓服水剤、飲薬、シロップおよび水薬が挙げられる。
【０２２８】
別の実施形態では、本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、診断用組成物、医薬組成物または薬は局所投与することができる。局所投与に適した製剤の例としては、限定されるものではないが、スティック、ワックス、クリーム、ローション、軟膏、香膏、ゲル、マスク、洗い流さない洗浄剤（ｌｅａｖｅ−ｏｎ  ｗａｓｈ）などが挙げられる。
【０２２９】
標的化される細胞、試料、組織および／または臓器に応じて、当業者は少なくとも１種の本ＢＬＶ．ＲＢＤリガンドを標的化される細胞、試料、組織および／または臓器に導入するのに必要な技術を決定することができる。
【０２３０】
一実施形態では、本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、診断用組成物、医薬組成物または薬は持続放出投与することができる。別の実施形態では、本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、診断用組成物、医薬組成物または薬は、当該薬剤の放出を制御する送達システムを含む。
【０２３１】
本明細書で使用される「標的化される細胞、試料、組織および／または臓器」は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染に冒されているか冒されている疑いがある細胞、試料、組織および／または臓器を指してもよい。
【０２３２】
一実施形態では、治療的有効量の本発明のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させたＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、医薬組成物または薬は少なくとも１日１回、１日２回または少なくとも１日３回投与される。
【０２３３】
別の実施形態では、治療的有効量の本発明のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させたＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、医薬組成物または薬は２日、３日、４日、５日または６日ごとに投与される。
【０２３４】
別の実施形態では、治療的有効量の本発明のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させたＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、医薬組成物または薬は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回投与される。
【０２３５】
別の実施形態では、治療的有効量の本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、医薬組成物または薬は、少なくとも２、３、４、５または６ヶ月の期間にわたって１ヶ月に１回投与される。
【０２３６】
別の実施形態では、本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、医薬組成物または薬の治療的有効量は約１μｇ〜５ｇの範囲である。
【０２３７】
別の実施形態では、治療的有効量の本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、医薬組成物または薬は、約０．１μｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
【０２３８】
別の実施形態では、本明細書の上に記載されている本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、医薬組成物または薬は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染のための別の治療と組みわせて投与することができる。
【０２３９】
カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を治療するための薬剤の例としては、限定されるものではないが、アルギニン欠乏、化学療法、放射線、外科手術、タンパク質キナーゼ阻害剤、微小管阻害剤、代謝拮抗剤、腫瘍ワクチンまたは免疫刺激抗体が挙げられる。
【０２４０】
本発明の一実施形態では、それを必要とする対象におけるカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を治療するための方法は、当該対象に本発明の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、組成物、医薬組成物または薬を、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染に対する別の治療の前、それと同時および／またはその後に投与する工程を含む。
【０２４１】
一実施形態では、当該対象は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染に冒されている、好ましくそれらの疾患と診断されている。別の実施形態では、本発明の対象は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を発症するリスクがある。カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患を発症するためのリスク因子の例としては、限定されるものではないが、遺伝因子、喫煙、肥満症、糖尿病、アルコールおよび環境条件が挙げられる。ＢＬＶ感染を発現するためのリスク因子の例としては、限定されるものではないが、例えば、ＢＬＶに感染している他の対象への曝露などの環境条件が挙げられる。
【０２４２】
別の実施形態では、本発明の対象は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患後、好ましくはＣＡＴ１関連疾患後の寛解段階にある。
【０２４３】
本発明の別の目的は、細胞、試料、組織および／または臓器中のＣＡＴ１を検出および／または定量化するため、特に少なくとも１種の本ＢＬＶ．ＲＢＤリガンドのＣＡＴ１への結合を決定するための手段を含む、本発明の方法を実施するためのキットである。
【０２４４】
一実施形態では、本発明のキットは、本明細書の上に記載されている少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドを含む。
【０２４５】
「キット」とは、ＣＡＴ１を特異的に検出および／または定量化するための少なくとも１種の試薬（例えば、少なくとも１種の造影剤に結合させたＢＬＶ．ＲＢＤリガンドなど）を含む任意の製造品（例えば、パッケージまたは容器）を意図している。本キットは、本発明の方法を行うための単位として宣伝、流通または販売されてもよい。さらに、本キットの試薬のいずれかまたは全ては、密封された滅菌容器などのそれらを外部環境から保護する容器に入れて提供されてもよい。本キットは本キットおよびその使用方法について記載した添付文書も含んでいてもよい。
【０２４６】
本発明の別の目的は、細胞におけるＣＡＴ１機能を調節する化合物を検出および／または定量化するためのスクリーニング方法であって、
ａ．前記化合物の存在下で細胞において発現される本明細書の上に記載されているＢＬＶ．ＲＢＤリガンドのＣＡＴ１への結合を決定および／または定量化する工程と、
ｂ．先の工程で測定された結合を前記化合物の非存在下で前記細胞において発現された本明細書の上に記載されているＢＬＶ．ＲＢＤリガンドのＣＡＴ１への結合と比較する工程と
を含む方法である。
【０２４７】
従って、本明細書で使用される「調節する」および「調節」という用語は、細胞におけるＣＡＴ１の存在の増加または減少を指してもよい。
【０２４８】
本出願は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染のインビトロまたはエクスビボまたはインビボ診断のための方法であって、
ａ．少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を細胞、試料、組織または臓器と接触させる工程と、
ｂ．前記対象の体内の細胞、試料、組織または臓器中に存在するＣＡＴ１に結合した少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドを検出および／または定量化する工程と
を含む方法にも関する。
【０２４９】
本出願は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染のインビボ診断のための方法であって、
ａ．それを必要とする対象に有効量の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を投与する工程と、
ｂ．前記対象の体内で少なくとも１種の本ＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を検出および／または定量化する工程と
を含む方法にも関する。
【０２５０】
本発明の一実施形態では、本ＢＬＶ．ＲＢＤリガンドを少なくとも１種の造影剤に結合させ、医用画像診断法によるインビボ診断のために使用してもよい。
【０２５１】
本出願は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を治療するための方法であって、
ａ．本発明の方法に従ってそれを必要とする対象におけるカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を診断する工程と、
ｂ．工程（ａ）でカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染と診断された前記対象に、治療的有効量のカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染に対する治療薬を投与する工程と
を含む方法にも関する。
【０２５２】
従って、一実施形態では、本発明のカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を治療するための方法は、
ａ．それを必要とする対象におけるカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター機能、好ましくはＣＡＴ１機能が調節不全である細胞またはＢＬＶに感染した（もしくはＢＬＶにまだ感染していない）細胞の存在を、
ｉ．少なくとも１種の造影剤に結合させた有効量の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を対象に投与すること、および
ｉｉ．医用画像診断法を用いて少なくとも１種の本ＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片を検出および／または定量化すること
によって決定する工程と、
ｂ．治療的有効量のカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染に対する治療薬を工程ａでカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染と診断された対象に投与する工程と
を含む。
【０２５３】
本出願は、治療的有効量の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤ、その変異体および／または断片をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を治療するための方法にも関する。
【０２５４】
本出願は、カチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を治療するための方法であって、
ａ．本発明の方法に従ってそれを必要とする対象におけるカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染を診断する工程と、
ｂ．治療的有効量の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤ、その変異体および／または断片を、工程ａでカチオン性Ｌ−アミノ酸トランスポーター関連疾患、好ましくはＣＡＴ１関連疾患またはＢＬＶ感染と診断された前記対象に投与する工程と
を含む方法にも関する。
【０２５５】
本出願は、細胞中のＣＡＴ１を検出および／または定量化するためのインビボ方法であって、
ａ．少なくとも１種の造影剤に結合させた少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片または本発明の診断用組成物を体、臓器、組織または細胞に投与する工程と、
ｂ．医用画像診断法を用いて前記体、臓器、組織または細胞における少なくとも１種の本ＢＬＶ．ＲＢＤリガンド、その変異体および／または断片のＣＡＴ１への結合を検出および／または定量化する工程と
を含む方法にも関する。
【０２５６】
一実施形態では、本発明の方法は、工程ｂで決定された結合を基準結合と比較する工程をさらに含む。
【０２５７】
本出願は、それを必要とする対象におけるＣＡＴ１活性を阻害するための方法であって、治療的有効量の少なくとも１種のＢＬＶ．ＲＢＤリガンドを前記対象に投与することを特徴とする方法にも関する。
【０２５８】
本明細書で使用される「ＣＡＴ１活性を阻害する」という用語は、ＣＡＴ１による細胞内へのアルギニン、ヒスチジン、リジンおよび／またはオルニチン輸送の流入の阻害を指してもよい。
【図面の簡単な説明】
【０２５９】
【図１】ＣＡＴ１をＢＬＶ．ＲＢＤ同族受容体として同定するＢＬＶ．ＲＢＤ自動化スクリーニングを示すグラフである。１７２種のＳＬＣメンバーに対するＢＬＶ．ＲＢＤ結合のスクリーニングは、ＴｅｃａｎロボットおよびＣｅｌｌｏｍｉｃｓ顕微鏡を用いて行った。結合は各ウェルの総蛍光強度として表されている。
【図２】ＢＬＶ．ＲＢＤのＣＡＴ１／ＳＬＣ７Ａ１への特異的結合を示すグラフのセットである。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｓｉＬＵＣ、ｓｉＣＡＴ１、ＣＡＴ１発現ベクターと組み合わせたｓｉＣＡＴ１（レスキューアッセイ）、空ベクター（ｐｃｈｉｘ）またはＣＡＴ１発現ベクターのみのいずれかでトランスフェクトした。ＣＡＴ１発現レベルはＢＬＶ．ＲＢＤリガンドを用いて監視した。
【図３】ウシ白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質の受容体結合ドメイン（ＢＬＶ．ＲＢＤ）によるアルギニン取込みの特異的阻害を示す２つのヒストグラムのセットである。ｐＣＳＩｍＦｃ空ベクター（「空ベクター」）、ｐＣＳＩ発現ベクターにおいてｒＦｃタグに融合されたＢＬＶ．ＲＢＤ（「ＢＬＶ−ＲＢＤ」、配列番号１２）、またはｐＣＳＩ発現ベクターにおいてｒＦｃタグに融合されたＨＴＬＶ２．ＲＢＤ（「ＨＴＬＶ２−ＲＢＤ」、配列番号７）のいずれかでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞による放射性標識したアルギニンおよびグルタミンの取込み。Ｎ＝３、対応のないデータに対する両側スチューデント検定（＊＊、ｐ＜０．０１；全ての他の差は統計的に有意でない）。
【図４】ＣＨＯ細胞を用いた感染性試験を示すヒストグラムである。陰性対照としての空のｐＬＸＳＮ発現ベクター（ＬＸＳＮ）あるいはヒトＣＡＴ１（Ｈｕ−ＣＡＴ１）、ウシＣＡＴ１（Ｂ−ＣＡＴ１）またはヒトＣＡＴ２（Ｈｕ−ＣＡＴ２）を発現するｐＬＸＳＮベクターでトランスフェクトした細胞におけるＢＬＶ（左のパネル）およびＨＴＬＶ（右のパネル）の感染性を試験した。結果は感染粒子数／ｍＬとして示されている。
【実施例】
【０２６０】
次に本発明を以下の実施例によってさらに例示するが、決してそれらに限定されるものではない。
【０２６１】
実施例１：ＢＬＶ．ＲＢＤのＣＡＴ１への特異的結合
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
全ての細胞株を１０％補体除去ウシ胎児血清（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、非必須アミノ酸（１１１４０−０３５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、グルタミン（２５０３０−０８１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）および抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含むＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社によって提供されたＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）（参照番号：１１９６５−０９２）中に維持した。全てを５％ＣＯ２−９５％空気雰囲気中３７℃でインキュベートした。
【０２６２】
２００００個のＱＴ６細胞を９６ウェルプレートに播種した。ＪｅｔＰｒｉｍｅトランスフェクションプロトコルを用いて細胞を１００ｎｇのＤＮＡでトランスフェクトした。ＢＬＶ．ＲＢＤとの結合のための条件を自動化条件のために最適化した。
【０２６３】
ＴｅｃａｎロボットおよびＣｅｌｌｏｍｉｃｓ顕微鏡のための染色
トランスフェクションから４８時間後にＢＬＶ．ＲＢＤ−ｍＦｃリガンド（配列番号２７）を用いて染色を行った。この目的のために、ＲＢＤリガンドを１／１０（ｖ：ｖ）希釈で試験し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８に結合させた抗マウスＩｇＧ１を使用した（１〜５００の希釈）。
【０２６４】
ＲＢＤリガンドのインキュベーションを振盪させずに３７℃で行い、二次抗マウスＩｇＧ１−Ａｌｅｘａを室温でインキュベートする（先のプロトコルにおける４℃とは対照的）。次いで、細胞を４％ＰＦＡで固定し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎ  ＸＴＩ  ＨＣＳ  リーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社；ＣＮＲＳ  ＭＲＩプラットフォームにおいて利用可能）を用いて蛍光強度を測定した。
【０２６５】
ハイスループットスクリーニングで検出されたＳＬＣ候補をＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡおよび過剰発現の両方によって確認した（データは示さず）。
【０２６６】
２９３Ｔ細胞表面でのＢＬＶ受容体の天然の発現およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞単層のプラスチックへのより緩い付着を理由に、本発明者らはウズラＱＴ６細胞を使用すること選択し、それらは本発明らのＳＬＣライブラリーの自動化スクリーニングに適合可能な本発明らのＢＬＶ．ＲＢＤリガンドの最も低い天然の結合および単層のプラスチックへの付着を有していた。本発明者らは、ＢＬＶ．ＲＢＤ同族受容体の発現からの蛍光性が非常に高いウズラＱＴ６細胞単層から単離され得る病巣を検出および定量化することができるＣｅｌｌｏｍｉｃｓ系蛍光自動化アッセイを準備することを選択する。
【０２６７】
結果
本発明らの研究室で得られた構築物により完成したヒトＯＲＦｅｏｍｅ（ＭＧＣプラットフォーム）から得られた４００種に近い上記メンバーのうち１７２種を含むＳＬＣライブラリーを確立した。続けて、本発明者らはＢＬＶ受容体を検出および単離するために、ウズラＱＴ６細胞株における一過性の過剰発現の自動化プロトコルおよびマウス免疫グロブリン（ｍＦｃ）の定常断片によりフレーム内でタグ付けされたＢＬＶ．ＲＢＤとの結合を準備する。
【０２６８】
その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＣＡＴ１  ｍＲＮＡを標的化するように特異的に設計されたｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ＢＬＶ．ＲＢＤ結合はフローサイトメトリーで測定した場合に３．５倍減少していた（ｎ＝３）。対照的に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＣＡＴ１／ＳＬＣ７Ａ１発現ベクターでトランスフェクトした場合、これらの細胞におけるＣＡＴ１過剰発現は、空ベクター対照でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較した場合にＢＬＶ．ＲＢＤ結合の３倍の増加を伴っていた（ｎ＝３）。
【０２６９】
本発明らのスクリーニング方法により、ＣＡＴ１（ＳＬＣ７Ａ１）がＢＬＶ．ＲＢＤおよびＢＬＶ  Ｅｎｖ受容体であるという証拠が得られる（図１）。図１に示されている結果から、本発明者らはＢＬＶ．ＲＢＤリガンドの推定上の受容体としてのＣＡＴ１（ＳＬＣ７Ａ１）に本発明らの注意を集中させた。その結果、特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＡＴ１、５’−ＵＡＡＵＵＧＣＡＣＣＵＵＵＧＧＣＵＧＣＴＴ−３’−配列番号６）によるＣＡＴ１  ｍＲＮＡの下方調節により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するＢＬＶ．ＲＢＤによる結合の非常に有意な減少が生じた（１３５対４９、図２）。本発明者らはレスキューアッセイ（ｓｉＣＡＴ１およびＣＡＴ１発現プラスミドの同時トランスフェクション）を行い、ＢＬＶ．ＲＢＤリガンドにより監視されるＣＡＴ１発現を回復させることができた（４９対２１８、図２）。さらに、ＢＬＶ．ＲＢＤを使用して、ｐＣＨＩＸ対照空ベクターまたはヒトＣＡＴ１発現ベクターのいずれかでトランスフェクトした細胞と比較した場合のＣＡＴ１の特異的増加発現を監視することができる（９２対３３５、図２）。
【０２７０】
実施例２：ＢＬＶ．ＲＢＤに誘導される細胞へのアルギニン取込み阻害
材料および方法
取込みアッセイ
１つのウェル当たり３．５×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞をポリ−Ｄ−リジンで被覆した６ウェルプレートに播種した。翌日、この細胞をリン酸カルシウムを用いて、ｐＣＳＩウサギＦｃ（ｒＦｃ）、ｐＣＳＩ  ＢＬＶ．ＲＢＤ  ｒＦｃ（配列番号１２）およびｐＣＳＩ  ＨＴＬＶ２．ＲＢＤ  ｒＦｃ（配列番号７）ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションから１６時間後に、細胞培地を交換し、２４時間後に細胞を放射性標識したＬ−アルギニンまたはＬ−グルタミンの取込みのために２４ウェルプレート（５×１０４細胞／ウェル）に播種するか６ウェルプレート（３×１０５細胞／ウェル）に播種して細胞を溶解し、免疫ブロット法によりＲＢＤの発現を確認した。
【０２７１】
取込みのために、古典的なＤＭＥＭで希釈した５μＣｉ／ｍＬのＬ−アルギニンモノ塩酸塩［２，３，４−３Ｈ］（ＮＥＴ１１２３２５０ＵＣ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）またはＬ−グルタミン［３，４−３Ｈ（Ｎ）］（ＮＥＴ５５１００１ＭＣ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）と共に細胞を２５０μＬの体積中３７℃で３０分間インキュベートした。冷たいＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を５００μＬのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１％）で溶解し、２ｍＬの液体シンチレーションカクテル（ＵＬＴＩＭＡ  ＧＯＬＤ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）と混合した後、放射活性を測定した。
【０２７２】
同化作用の値は放射性標識したアルギニンまたはグルタミンの捕捉量（ｐｍｏｌ）と各ウェル中のタンパク質量（ｍｇ）との比に相応する。その結果を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を用いて報告する。対応のないデータに対する両側スチューデント統計検定を使用した。
【０２７３】
結果
ＢＬＶ．ＲＢＤが結合時に同族受容体を機能的に変更させるその能力を試験した。この目的のために取込みアッセイを行い、これにより本発明者らは放射性標識したアルギニンを用いてマウスＦｃ（ｍＦｃ）（データは示さず）またはウサギＦｃ（ｒＦｃ）でタグ付けされたＢＬＶ．ＲＢＤがトランスポーター機能を阻止することができるか否かを監視することができた。
【０２７４】
ＣＡＴ１は、肝臓および涙腺以外の全ての細胞型において遍在的に発現され、かつアルギニン、リジン、オルニチンおよびヒスチジンを含むカチオン性Ｌ−アミノ酸のナトリウム非依存性輸送を媒介すると言われている。
【０２７５】
放射性標識したアルギニンモノ塩酸塩を用いて、Ｌ−［２，３，４−３Ｈ］によりＢＬＶ．ＲＢＤのＣＡＴ１／ＳＬＣ７Ａ１への結合のさらなる証拠が得られる。従って、ＣＡＴ１により媒介されるアルギニン輸送はＢＬＶ．ＲＢＤの導入時に阻害され、データからＢＬＶ．ＲＢＤがＣＡＴ１輸送機能を阻止することができることが分かる（図３）。
【０２７６】
これらの結果は、ＢＬＶ．ＲＢＤリガンドを使用してＣＡＴ１細胞表面発現を監視することができ、かつ多種多様な生体試料において適用することができることを実証している。従って、ＢＬＶ．ＲＢＤリガンドをフローサイトメトリー、免疫組織化学（図示せず）および免疫蛍光法によりインビトロで、あるいはＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージングによりインビボで使用することができる。
【０２７７】
実施例３：ＢＬＶ感染に対するＢＬＶ．ＲＢＤの効果のインビトロ試験
材料および方法
材料
異なる哺乳類種（Ａ２３−ＬＸＳＮ：空ベクター、Ａ２３−ヒトＣＡＴ１、Ａ２３−ウシＣＡＴ１、Ａ２３−マウスＣＡＴ１マウスおよびＡ２３−ハムスターＣＡＴ１）からＣＡＴ１を安定的に発現するＡ２３細胞株の感染。
【０２７８】
培地：１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸および抗生物質（ペニシリンストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭにおいてＨＥＫ２９３細胞を増殖させる。産生細胞（ＨＥＫ２９３）および感染Ａ２３細胞はＧＦＰをコードする。
【０２７９】
方法
０日目（Ｄ０）：４つのペトリ皿（直径１０ｃｍ）にＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）を３×１０６細胞／皿で播種する。
【０２８０】
Ｄ１（夕方）：以下のエンベロープ（ＨＴＬＶ２、ＢＬＶ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）またはエンベロープなし）をコードする偽型ウイルスを産生するために、ＨＥＫ２９３をトランスフェクトする。以下のベクター：
ＬＮＣＧ（ＧＦＰのコード）：１０μｇ、
ＢＥＢ．ＧＰ５７（ｇａｇ−ｐｏｌ）：５μｇ、
エンベロープ糖タンパク質：５μｇ
を用いて同時トランスフェクトする。
【０２８１】
リン酸カルシウムトランスフェクション（５００μＬのＨｅＢＳおよび３３μＬのＣａＣｌ２）。
【０２８２】
Ｄ２（朝）：ＨＥＫ２９３細胞の培地を交換する。
【０２８３】
Ｄ３：ＨＥＫ２９３細胞の上澄みを回収して濾過し（上澄みによる感染を維持するため）、産生細胞を剥がして計数する（細胞から細胞への感染のため）。
【０２８４】
上澄みによる感染
Ａ２３細胞（ＬＸＳＮ、ｈＣＡＴ１、ウシＣＡＴ１、マウスＣＡＴ１およびハムスターＣＡＴ１）を５０００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種する（５０μＬの培地中に５０００個の細胞を有するようにする）。等体積（５０μＬ）のウイルスの上澄みを添加する。Ｎ＝４。
【０２８５】
細胞から細胞への感染
異なる指標細胞（Ａ２３）を産生細胞（ＨＥＫ２９３）と同時培養する。各条件で２５００細胞／ウェルのＡ２３を２５００細胞の偽型産生細胞（例えば、偽型を産生するＨＥＫ２９３を含むＡ２３−ＬＸＳＮ）と共に播種する。Ｎ＝４。
【０２８６】
Ｄ５：（細胞から細胞へに感染のためのみ）。選択剤（２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８）を添加する。このようにして本発明者らは感受性の高い製造者の細胞を除外するが、Ａ２３は耐性を有する。
【０２８７】
Ｄ８：画像（１０倍）および蛍光強度をハイコンテントＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎにより得る（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ  Ｒｉｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ：ＭＲＩにおいて利用可能）。
【０２８８】
実施例４：ＣＡＴ１結合を介したＢＬＶ．ＲＢＤを有するＢＬＶ  ｅｎｖ糖タンパク質によるレトロウイルス感染のインビトロ試験
ウイルス感染
空のｐＬＸＳＮ発現ベクターまたはヒト（Ｈｕ−）またはウシ（Ｂ−）ＣＡＴ１のいずれかを発現するｐＬＸＳＮ構築物で安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞またはヒトＣＡＴ２イソ型を６ウェルプレートに播種し、翌日、ＢＬＶまたはＨＴＬＶ  Ｅｎｖ糖タンパク質で偽型化された複製欠損のｐＬＫＯ−１−ｐｕｒｏレンチウイルスベクターの連続希釈物で感染させた。ウイルス攻撃から１日後に、細胞を１０日間の間に３ｕｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて選択し、耐性細胞を計数してＢＬＶまたはＨＴＬＶ  Ｅｎｖを用いて侵入によるウイルス価を決定した。
【０２８９】
結果
ＨＴＬＶ  Ｅｎｖ媒介感染に対するＣＨＯ細胞感受性はＣＡＴ１またはＣＡＴ２発現とは無関係である（図４、右のパネル）が、対照的にＢＬＶ  Ｅｎｖ媒介感染に対して天然に耐性を有するＣＨＯ細胞（図４、左のパネル、黒色のヒストグラム）は、ヒト（図４、左のパネル、濃い灰色のヒストグラム）またはウシ（図４、左のパネル、灰色のヒストグラム）ＣＡＴ１のいずれかを発現する場合にＢＬＶ  Ｅｎｖ媒介感染に対して特に感受性が高くなるが、ヒトＣＡＴ２イソ型の発現時には耐性のままである（図４、左のパネル、淡い灰色のヒストグラム）。
【０２９０】
これらの結果から、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）エンベロープ糖タンパク質はウシおよびヒトなどの異なる哺乳類のＣＡＴ１に特異的に結合するがＣＡＴ２には結合しないことが確認される。
【図１】
2019502101.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2019502101000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月26日(2018.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019502101000001.app
【国際調査報告】
2019502101.tif 000006
2019502101.tif 000007
2019502101.tif 000008
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2019502101.tif 000010
2019502101.tif 000011
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