(57)【要約】バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを用いて、潜在的な毒性剤による腎損傷を逆転、軽減または予防するための候補治療剤の能力を評価する方法が開示される。剤が腎機能に及ぼす影響を評価する方法も開示され、この方法は、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを剤と接触させる段階を含む。腎障害のモデルも開示される。一実施形態では、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを含む腎線維症のモデルが開示される。腎障害のモデルを作製する方法も開示される。一実施形態では、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルと間質線維性組織形成を誘導することができる剤とを接触させる段階を含む、腎線維症のモデルを製造する方法が開示される。2019537729.tif 000017
2019537729.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
潜在的な毒性剤による腎損傷を逆転、軽減または予防する候補治療剤の能力を評価する方法であって、以下の段階を含む、方法：
(a)人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成するための、
(i)腎間質組織の層であって、該腎間質組織が腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、層と、
(ii)腎上皮組織の層であって、該腎上皮組織が腎尿細管上皮細胞を含む、層と
を含むバイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを、潜在的な毒性剤と接触させる段階であって、
但し、該間質組織が間質バイオインクを含み、該上皮組織が上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する、段階；
(b)該腎尿細管モデルを候補治療剤と接触させる段階；
(c)該腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性を決定する段階；ならびに
(d)該候補治療剤と接触させていない対照腎尿細管モデルと比較した、該腎尿細管上皮細胞の決定された生存能力または機能性に基づいて、潜在的な毒性剤による腎損傷を逆転、軽減または予防するための候補治療剤の能力を評価する段階。
【請求項２】
前記腎尿細管上皮細胞が極性化している、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記腎間質組織の層が、頂端面および側底面を有する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記モデルが、前記腎間質組織層と前記腎上皮組織層との間に基底膜の層をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記腎上皮組織の層が、基底膜の層と連続的に接触しており、かつ該基底膜の層が、腎間質組織の層と連続的に接触している、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記腎上皮組織の層が、実質的に単層である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記腎上皮組織の層に存在する細胞が、腎尿細管上皮細胞のみである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記腎間質組織の層に存在する細胞が、線維芽細胞および内皮細胞のみである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記腎間質組織の層が、間質線維性組織をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記線維芽細胞および内皮細胞が、約50：50の線維芽細胞対内皮細胞比で腎間質組織の層に存在する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記腎間質組織の層または腎上皮組織の層が、体積で70％〜100％生細胞である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記腎間質組織の層が、間質線維性組織をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記腎尿細管モデルが、生体適合性膜をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記腎尿細管モデルが、均一な厚さである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記腎尿細管モデルが、2からの細胞層の厚さである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記線維芽細胞および内皮細胞が、プリントの6日後および潜在的な毒性剤と接触する前に、腎尿細管モデルが平面的である比率で存在する、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
複数の腎尿細管モデルが、アレイを形成するように構成されている、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アレイが、マイクロタイタープレートのウェル内に存在する、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記潜在的な毒性剤が、毒素、治療剤、抗菌剤、金属、または環境作用物質である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記潜在的な毒性剤が、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗鬱剤、利尿剤、またはプロトンポンプ阻害剤である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記潜在的な毒性剤が、サイトカイン、ケモカイン、小分子薬、大分子薬、タンパク質またはペプチドである、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記潜在的な毒性剤が、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、ゴナドレリンアゴニスト、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、レチノイド、カロテノイド、またはトコフェロール、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、MMP阻害剤、mTOR阻害剤、代謝拮抗剤、白金化合物、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、抗増殖抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、Ras発癌性アイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、血液悪性腫瘍の治療に用いる化合物、Flt-3阻害剤、Hsp90阻害剤、キネシンスピンドルタンパク質阻害剤、MEK阻害剤、抗腫瘍抗生物質、ニトロソウレア、タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性を標的とする／減少させる化合物、タンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／減少させる化合物、または抗血管新生化合物である化学療法剤である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記潜在的な毒性剤が、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ara-C、VP-16、テニポシド、ミトキサントロン、イダルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、PKC412、6-メルカプトプリン(6-MP)、リン酸フルダラビン、オクトレオチド、SOM230、FTY720、6-チオグアニン、クラドリビン、6-メルカプトプリン、ペントスタチン、ヒドロキシウレア、2-ヒドロキシ-1H-イソインドール-1，3-ジオン誘導体、1-(4-)クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジン、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジンスクシネート、アンジオスタチン、エンドスタチン、アントラニル酸アミド、ZD4190、ZD6474、SU5416、SU6668、ベバシズマブ、rhuMAB、rhuFab、マクゴン(macugon)、FLT-4阻害剤、FLT-3阻害剤、VEGFR-2 IgG1抗体、RPI 4610、ベバシズマブ、ポルフィマーナトリウム、アネコルタブ、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、11-α-エピヒドロコルチゾン、コルテキソロン、17a-ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デスオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロン、デキサメタゾン、フルオシノロン、植物アルカロイド、ホルモン化合物および／もしくはアンタゴニスト、生物学的応答調節剤、たとえば、リンホカインもしくはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド誘導体、shRNA、siRNA、またはそれらの薬学的に許容される塩である化学療法剤である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記潜在的な毒性剤が、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンB、およびアミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記潜在的な毒性剤が放射線である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、代謝活性の指標を測定することにより決定される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記代謝活性の指標が、対照と比較した、腎尿細管モードにおけるレサズリンの減少またはテトラゾリウム塩の減少である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ(GGT)活性、プロテアーゼ活性、ATP利用、グルコース取り込み活性、ナトリウム-グルコース共輸送体-2(SGLT2)活性またはRNA発現を測定することにより決定される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した前記モデル中の腎輸送分子活性を測定することにより決定される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記輸送分子活性が、少なくとも1つの高分子の排出および／または取り込みである、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記高分子がアルブミンである、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した腎尿細管上皮細胞の再生を同定することにより決定される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した腎尿細管モデルの経上皮電気抵抗または受動的透過性を測定することにより決定される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した、ビタミンD産生の変化、アンジオテンシン変換の変化、イオン交換の変化、pHの変化、酸／塩基バランスの変化、腎尿細管バリア機能の変化、もしくは腎臓内レニン／アンジオテンシンシステム(RAS)の変化、生理学の変化、病理学の変化、分子の輸送の変化、ナトリウム-グルコース共輸送体-2(SGLT2)活性の変化、間質線維性組織の量、または腎尿細管モデルの再生を測定することにより決定される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した間質線維性組織の量を測定することにより決定される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、経時的に測定される、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
潜在的な毒性剤による損傷を逆転または軽減する方法であり、前記腎尿細管モデルを最初に潜在的な毒性剤と接触させ、次に、候補治療剤と接触させる、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
潜在的な毒性剤による損傷を軽減または予防する方法であり、前記腎尿細管モデルを最初に候補治療剤と接触させ、次に、潜在的な毒性剤と接触させる、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記腎尿細管モデルが、候補治療剤および潜在的な毒性剤と接触させる前に、細胞培養培地中で培養されている、請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記腎尿細管モデルが、細胞培養培地中で少なくとも3日間培養されている、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
腎機能への剤の効果を評価する方法であって、以下の段階を含む、方法：
(a)人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成するための、
(i)腎間質組織の層であって、該腎間質組織が腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、層と、
(ii)腎上皮組織の層であって、該腎上皮組織が腎尿細管上皮細胞を含む、層と
を含むバイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを、該剤と接触させる段階であって、
但し、該間質組織が間質バイオインクを含み、該上皮組織が上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する、段階；ならびに
(b)該腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性への剤の効果を測定する段階。
【請求項４２】
プリントの6日後に前記腎尿細管モデルが平面になる線維芽細胞対内皮細胞比で、前記線維芽細胞および内皮細胞が存在する、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記腎尿細管上皮細胞が極性化している、請求項41または42に記載の方法。
【請求項４４】
前記腎間質組織の層が頂端面および側底面を有する、請求項41〜43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記モデルが、前記腎間質組織層と前記腎上皮組織層との間に基底膜の層をさらに含む、請求項41〜44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記腎上皮組織の層が、基底膜の層と連続的に接触しており、かつ該基底膜の層が、腎間質組織の層と連続的に接触している、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記腎上皮組織の層が、実質的に単層である、請求項41〜46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記腎上皮組織の層に存在する細胞が、腎尿細管上皮細胞のみである、請求項41〜45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記腎間質組織の層に存在する細胞が、線維芽細胞および内皮細胞のみである、請求項41〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記腎間質組織の層が、間質線維性組織をさらに含む、請求項41〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記線維芽細胞および内皮細胞が、約50：50の線維芽細胞対内皮細胞比で腎間質組織の層に存在する、請求項41〜50のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記腎間質組織の層または腎上皮組織の層のいずれかが、体積で70％〜100％生細胞である、請求項41〜51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記腎尿細管モデルが、生体適合性膜をさらに含む、請求項41〜52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記腎尿細管モデルが、均一な厚さである、請求項41〜53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記腎尿細管モデルが、少なくとも2細胞層の厚さである、請求項41〜54のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
複数の腎尿細管モデルが、アレイを形成するように構成されている、請求項41〜55のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記アレイが、マイクロタイタープレートのウェル内に存在する、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
前記剤が、毒素、治療剤、抗菌剤、金属、または環境作用物質である、請求項41〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記剤が、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗うつ剤、利尿剤、またはプロトンポンプ阻害剤である、請求項41〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記剤が、サイトカイン、ケモカイン、小分子薬、大分子薬、タンパク質またはペプチドである、請求項41〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記剤が、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、ゴナドレリンアゴニスト、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、レチノイド、カロテノイド、もしくはトコフェロール、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、MMP阻害剤、mTOR阻害剤、代謝拮抗剤、白金化合物、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、抗増殖抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、Ras発癌性アイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、血液悪性腫瘍の治療に用いられる化合物、Flt-3阻害剤、Hsp90阻害剤、キネシンスピンドルタンパク質阻害剤、MEK阻害剤、抗腫瘍抗生物質、ニトロソウレア、タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性を標的とする／減少させる化合物、タンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／減少させる化合物、または抗血管新生化合物である化学療法剤である、請求項41〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記剤が、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ara-C、VP-16、テニポシド、ミトキサントロン、イダルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、PKC412、6-メルカプトプリン(6-MP)、フルダラビンホスフェート、オクトレオチド、SOM230、FTY720、6-チオグアニン、クラドリビン、6-メルカプトプリン、ペントスタチン、ヒドロキシウレア、2-ヒドロキシ-1H-イソインドール-1，3-ジオン誘導体、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジン、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジンスクシネート、アンジオスタチン、エンドスタチン、アントラニル酸アミド、ZD4190、ZD6474、SU5416、SU6668、ベバシズマブ、rhuMAb、rhuFab、マクゴン、FLT-4阻害剤、FLT-3阻害剤、VEGFR-2 IgG1抗体、RPI 4610、ベバシズマブ、ポルフィマーナトリウム、アネコルタブ、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、11-α-エピヒドロコルチゾン、コルテキソロン、17a-ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デスオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロン、デキサメタゾン、フルオシノロン、植物アルカロイド、ホルモン化合物および／もしくはアンタゴニスト、生物学的応答調節剤、たとえば、リンホカインもしくはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド誘導体、shRNA、siRNA、またはそれらの薬学的に許容される塩である化学療法剤である、請求項41〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記剤が、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンB、アミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである、請求項41〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記剤が放射線である、請求項41〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、代謝活性の指標を測定することにより決定される、請求項41〜64のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記代謝活性の指標が、対照と比較した、腎尿細管モードにおけるレサズリンの減少またはテトラゾリウム塩の減少である、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ(GGT)活性、プロテアーゼ活性、ATP利用、SGLT2活性、グルコース取り込み活性またはRNA発現を測定することにより決定される、請求項41〜64のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した前記モデル中の腎輸送分子活性を測定することにより決定される、請求項41〜64のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記輸送分子活性が、少なくとも1つの高分子の排出および／または取り込みである、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
前記高分子がアルブミンである、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した腎尿細管上皮細胞の再生を同定することにより決定される、請求項41〜64のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した腎尿細管モデルの経上皮電気抵抗または受動的透過性を測定することにより決定される、請求項41〜64のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した、ビタミンD産生の変化、アンジオテンシン変換の変化、イオン交換の変化、pHの変化、酸／塩基バランスの変化、腎尿細管バリア機能の変化、腎臓内レニン／アンジオテンシンシステム(RAS)の変化、生理学の変化、病理学の変化、分子の輸送の変化、ナトリウム-グルコース共輸送体-2(SGLT2)活性の変化、間質線維性組織の量、または腎尿細管モデルの再生を測定することにより決定される、請求項41〜64のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が、経時的に測定される、請求項41〜73のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記腎尿細管モデルが、前記剤と接触させる前に、細胞培養培地中で培養されている、請求項41〜74のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記腎尿細管モデルが、細胞培養培地中で少なくとも3日間培養されている、請求項74に記載の方法。
【請求項７７】
(c)前記剤を除去する段階；および
(d)該剤の欠如が腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性の改善をもたらすか否かを評価する段階
をさらに含む、請求項41〜76のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
以下を含む、腎線維症のモデル：
人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成するための、
(i)腎間質組織の層であって、該腎間質組織が、腎線維芽細胞、内皮細胞、および線維性組織を含む、層と、
(ii)腎上皮組織の層であって、該腎上皮組織が、腎尿細管上皮細胞を含む、層と
を含み、
但し、該間質組織が間質バイオインクを含み、該上皮組織が上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する、
バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデル。
【請求項７９】
前記モデルに線維症が存在する場合、該モデルが、収縮、カーリング、組織の拡張、または他の線維症表現型を示す、請求項78に記載のモデル。
【請求項８０】
前記腎尿細管上皮細胞が極性化している、請求項78または79に記載のモデル。
【請求項８１】
前記腎間質組織の層が、頂端面および側底面を有する、請求項78または80のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項８２】
前記モデルが、前記腎間質組織層と前記腎上皮組織層との間に基底膜の層をさらに含む、請求項78〜81のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項８３】
前記腎上皮組織の層が、基底膜の層と連続的に接触しており、かつ該基底膜の層が、腎間質組織の層と連続的に接触している、請求項82に記載のモデル。
【請求項８４】
前記腎上皮組織の層が、実質的に単層である、請求項78〜83のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項８５】
前記腎上皮組織の層に存在する細胞が、腎尿細管上皮細胞のみである、請求項78〜84のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項８６】
前記腎間質組織の層に存在する細胞が、線維芽細胞および内皮細胞のみである、請求項78〜85のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項８７】
前記線維芽細胞および内皮細胞が、約50：50の線維芽細胞対内皮細胞比で腎間質組織の層に存在する、請求項78〜86のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項８８】
前記腎間質組織の層または腎上皮組織の層が、体積で70％〜100％生細胞である、請求項78〜87のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項８９】
前記腎尿細管モデルが、生体適合性膜をさらに含む、請求項78〜88のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項９０】
前記腎尿細管モデルが、平面組織構造の変形および過剰な細胞外マトリックス沈着を示す、請求項78〜89のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項９１】
前記腎尿細管モデルが、少なくとも2細胞層の厚さである、請求項78〜90のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項９２】
複数の前記腎尿細管モデルが、アレイを形成するように構成されている、請求項78〜91のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記アレイが、マイクロタイタープレートのウェル内に存在する、請求項92に記載のモデル。
【請求項９４】
前記線維芽細胞および内皮細胞が、プリントの6日後に腎尿細管モデルが平面である比率で存在する、請求項78〜93のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項９５】
請求項78〜94のいずれか一項に記載の腎線維症のモデルを作製する方法であって、以下の段階を含む、方法：
(a)バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを、間質線維性組織形成を誘導することができる剤と接触させる段階であって、
該腎尿細管モデルが、
人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成するための、
(i)腎間質組織の層であって、該腎間質組織が腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、層と、
(ii)腎上皮組織の層であって、該腎上皮組織が腎尿細管上皮細胞を含む、層と
を含み、
但し、該間質組織が間質バイオインクを含み、該上皮組織が上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する、段階。
【請求項９６】
プリントの6日後および前記剤と接触する前に腎尿細管モデルが平面である線維芽細胞対内皮細胞比で、前記線維芽細胞および内皮細胞が存在する、請求項95に記載の方法。
【請求項９７】
前記間質線維性組織沈着を誘導することができる剤が、シクロスポリンA、アリストロキア酸、タクロリムス、TGFベータ、シスプラチン、アシクロビル、アロプリノール、ベータラクタム系抗生物質、インジナビル、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラゾール、フェニトイン、ラニチジン、またはバンコマイシンである、請求項95または96に記載の方法。
【請求項９８】
以下を含む、腎障害のモデル：
人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成するための、
(a)腎間質組織の層であって、該腎間質組織が腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、層と、
(b)腎上皮組織の層であって、該腎上皮組織が腎尿細管上皮細胞を含む、層と
を含み、
但し、該腎間質組織が間質バイオインクを含み、該腎上皮組織が上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルであって、
ここで、該モデルが、腎尿細管における腎障害に特徴的な表現型を含む、該生体腎尿細管モデル。
【請求項９９】
前記表現型が、収縮、カーリング、拡張、壊死、アポトーシス、尿細管再生、代償性増殖、上皮間葉転換、炎症、虚血、虚血／再灌流、活性酸素種、ミトコンドリアの変化、細胞形態への変化、核形態への変化、過剰増殖、遺伝子発現の変化、バイオマーカーの分泌、エピジェネティック修飾、結晶沈着、嚢胞形成、細胞機能の変化、血管新生、低酸素、細胞外マトリックス沈着、または 周囲組織の死のうちの少なくとも1つを含む、請求項98に記載のモデル。
【請求項１００】
前記腎尿細管上皮細胞が極性化している、請求項98または99に記載のモデル。
【請求項１０１】
前記腎間質組織の層が、頂端面および側底面を有する、請求項98または100のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１０２】
前記モデルが、腎間質組織の層と腎上皮組織の層との間に基底膜の層をさらに含む、請求項98〜101のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１０３】
前記腎上皮組織の層が、基底膜の層と連続的に接触しており、かつ該基底膜の層が、腎間質組織の層と連続的に接触している、請求項102に記載のモデル。
【請求項１０４】
前記腎上皮組織の層が、実質的に単層である、請求項98〜103のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１０５】
前記腎上皮組織の層に存在する細胞が、腎尿細管上皮細胞のみである、請求項98〜104のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１０６】
前記腎間質組織の層に存在する細胞が、線維芽細胞および内皮細胞のみである、請求項98〜105のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１０７】
前記線維芽細胞および内皮細胞が、約50：50の線維芽細胞対内皮細胞比で腎間質組織の層に存在する、請求項98〜106のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１０８】
前記腎間質組織の層または腎上皮組織の層が、70〜100体積％の生細胞である、請求項98〜107のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１０９】
前記腎尿細管モデルが、生体適合性膜をさらに含む、請求項98〜108のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１１０】
前記腎尿細管モデルが、平面組織構造の変形および過剰な細胞外マトリックス沈着を示す、請求項98〜109のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１１１】
前記腎尿細管モデルが、少なくとも2細胞層の厚さである、請求項98〜110のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１１２】
複数の腎尿細管モデルが、アレイを形成するように構成されている、請求項98〜111のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記アレイが、マイクロタイタープレートのウェル内に存在する、請求項112に記載のモデル。
【請求項１１４】
前記線維芽細胞および内皮細胞が、プリントの6日後に腎尿細管モデルが平面になる比率で存在する、請求項98〜113のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１１５】
前記腎障害が、先天性異常、糖尿病、免疫複合体病、血管硬化症、腎アブレーション、腎線維症、高血圧症、動脈腎硬化症(arterionephrosclerosis)、ループス腎炎、血管疾患、炎症、溶血性尿毒症症候群、閉塞性腎症、異常リポタンパク血症、再発性脱水症、逆流性腎症、放射線腎症、アテローム塞栓性腎疾患、強皮症、鎌状赤血球貧血、脂質の滞留、中毒性曝露、感染症、虚血、虚血／再灌流、輸送欠損、結晶沈着、遺伝的障害、慢性システム障害、腎臓癌、またはそれらの組み合わせに関連する、請求項98〜114のいずれか一項に記載のモデル。 
【請求項１１６】
前記表現型が、該表現型を生じさせる処置、化合物、または感染性剤と前記腎尿細管モデルとを接触させることにより誘導される、請求項98〜115のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１１７】
前記表現型が、前記腎尿細管モデルにおける腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞の存在である、請求項98〜116のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１１８】
前記腎尿細管モデルの線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、またはそれらの組み合わせが、罹患ドナーから得られた初代細胞である、請求項98〜117のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１１９】
遺伝子改変された細胞をさらに含み、該遺伝子改変された細胞により前記表現型が誘導される、請求項98〜118のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１２０】
前記表現型を生じさせる処置、化合物、または感染性剤が、毒素、潜在的な毒性剤、抗菌剤、金属、または環境作用物質である、請求項116〜119のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１２１】
前記潜在的な毒性剤が、抗感染剤、鎮痛剤、抗うつ剤、利尿剤、またはプロトンポンプ阻害剤である、請求項120に記載のモデル。
【請求項１２２】
前記潜在的な毒性剤が、サイトカイン、ケモカイン、小分子薬、大分子薬、タンパク質、またはペプチドである、請求項120に記載のモデル。
【請求項１２３】
前記潜在的な毒性剤が、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン、ゴナドレリンアゴニスト、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、レチノイド、カロテノイド、もしくはトコフェロール、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、MMP阻害剤、mTOR阻害剤、代謝拮抗剤、白金化合物、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、抗増殖抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、 Ras発癌性アイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、血液悪性腫瘍の治療に用いられる化合物、Flt-3阻害剤、Hsp90阻害剤、キネシンスピンドルタンパク質阻害剤、MEK阻害剤、抗腫瘍抗生物質、ニトロソウレア、タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性を標的とする／減少させる化合物、タンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／減少させる化合物、または抗血管新生化合物である化学療法剤である、請求項120に記載のモデル。
【請求項１２４】
前記潜在的な毒性剤が、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ara-C、VP-16、テニポシド、ミトキサントロン、イダルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、PKC412、6-メルカプトプリン(6-MP)、フルダラビンホスフェート、オクトレオチド、SOM230、FTY720、6-チオグアニン、クラドリビン、6-メルカプトプリン、ペントスタチン、ヒドロキシウレア、2-ヒドロキシ-1H-イソインドール-1，3-ジオン誘導体、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジン、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジンスクシネート、アンギオスタチン、エンドスタチン、アントラニル酸アミド、ZD4190、ZD6474、SU5416、SU6668、ベバシズマブ、rhuMAb、rhuFab、マクゴン、FLT -4阻害剤、FLT-3阻害剤、VEGFR-2 IgG1抗体、RPI 4610、ベバシズマブ、ポルフィマーナトリウム、アネコルタブ、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、11-α-エピヒドロコルチゾン、コルテキソロン、17a-ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デスオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロン、デキサメタゾン、フルオシノロン、植物アルカロイド、ホルモン化合物および／もしくはアンタゴニスト、生物学的応答調節剤、たとえば、リンホカインもしくはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド誘導体、shRNA、siRNA、またはそれらの薬学的に許容される塩である化学療法剤である、請求項120に記載のモデル。
【請求項１２５】
前記腎障害が、急性腎障害、慢性腎障害、または腎臓癌である、請求項98〜124のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項１２６】
前記潜在的な毒性剤が、放射線である、請求項120に記載のモデル。
【請求項１２７】
候補治療剤が腎障害を逆転、軽減、誘発、または予防する能力を評価する方法であって、以下の段階を含む、方法：
(a)請求項98〜126のいずれか一項に記載の腎尿細管モデルを、候補治療剤と接触させる段階；
(b)腎組織細胞の生存能力または機能性を決定する段階；および
(c)候補治療剤と接触していない対照腎尿細管モデルと比較した、決定された腎組織細胞の生存能力または機能性に基づいて、候補治療剤が腎障害を逆転、軽減、誘発、または予防する能力を評価する段階。
【請求項１２８】
(d)候補治療剤を除去する段階；および
(e)該剤の欠如が腎組織細胞の生存能力または機能性の改善をもたらすか否かを評価する段階
をさらに含む、請求項127に記載の方法。
【請求項１２９】
前記表現型が、腎尿細管モデルにおける腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞の存在である、請求項127または128に記載の方法。
【請求項１３０】
前記腎尿細管モデルの線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、またはそれらの組み合わせが、罹患ドナーから得られた初代細胞である、請求項127〜129のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記候補治療剤が、抗感染薬、鎮痛剤、抗うつ剤、利尿剤、またはプロトンポンプ阻害剤である、請求項127〜130のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記候補治療剤が、サイトカイン、ケモカイン、小分子薬、大分子薬、タンパク質、またはペプチドである、請求項127〜130のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記候補治療剤が、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン、ゴナドレリンアゴニスト、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、レチノイド、カロテノイド、もしくはトコフェロール、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、MMP阻害剤、mTOR阻害剤、代謝拮抗剤、白金化合物、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、抗増殖抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、 Ras発癌性アイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、血液悪性腫瘍の治療に用いられる化合物、Flt-3阻害剤、Hsp90阻害剤、キネシンスピンドルタンパク質阻害剤、MEK阻害剤、抗腫瘍抗生物質、ニトロソウレア、タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性を標的とする／減少させる化合物、タンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／減少させる化合物、または抗血管新生化合物である化学療法剤である、請求項127〜130のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記候補治療剤が、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ara-C、VP-16、テニポシド、ミトキサントロン、イダルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、PKC412、6-メルカプトプリン(6-MP)、リン酸フルダラビン、オクトレオチド、SOM230、FTY720、6-チオグアニン、クラドリビン、6-メルカプトプリン、ペントスタチン、ヒドロキシウレア、2-ヒドロキシ-1H-イソインドール-1，3-ジオン誘導体、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジン、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジンスクシネート、アンジオスタチン、エンドスタチン、アントラニル酸アミド、ZD4190、ZD6474、SU5416、SU6668、ベバシズマブ、rhuMAb、rhuFab、マクゴン、FLT-4阻害剤、FLT-3阻害剤、VEGFR-2 IgG1抗体、RPI 4610、ベバシズマブ、ポルフィマーナトリウム、アネコルタブ、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、11-α-エピヒドロコルチゾン、コルテキソロン、17a-ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デスオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロン、デキサメタゾン、フルオシノロン、植物アルカロイド、ホルモン化合物および／もしくはアンタゴニスト、生物学的応答調節剤、たとえば、リンホカインもしくはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド誘導体、shRNA、siRNA、またはそれらの薬学的に許容される塩である化学療法剤である、請求項127〜130のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記候補治療剤が、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンB、アミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである、請求項127〜130のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記候補治療剤が、放射線である、請求項127〜130のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記腎組織細胞の生存能力または機能性が、代謝活性の指標を測定することにより決定される、請求項127〜136のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記代謝活性の指標が、対照と比較した、腎尿細管モードにおけるレサズリンの減少またはテトラゾリウム塩の減少である、請求項137に記載の方法。
【請求項１３９】
前記腎組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ(GGT)活性、プロテアーゼ活性、ATP利用、SGLT2活性、グルコース取り込み活性またはRNA発現を測定することにより決定される、請求項127〜136のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記腎組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した前記モデル中の腎輸送分子活性を測定することにより決定される、請求項127〜136のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記輸送分子活性が、少なくとも1つの高分子の排出および／または取り込みである、請求項140に記載の方法。
【請求項１４２】
前記高分子がタンパク質である、請求項141に記載の方法。
【請求項１４３】
前記腎組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した腎尿細管上皮細胞の再生を同定することにより決定される、請求項127〜136のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記腎組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した腎尿細管モデルの経上皮電気抵抗または受動的透過性を測定することにより決定される、請求項127〜136のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記腎組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した、ビタミンD産生の変化、アンジオテンシン変換の変化、イオン交換の変化、pHの変化、酸／塩基バランスの変化、腎尿細管バリア機能の変化、腎臓内レニン／アンジオテンシンシステム(RAS)の変化、生理学の変化、病理学の変化、分子の輸送の変化、ナトリウム-グルコース共輸送体-2(SGLT2)活性の変化、間質線維性組織の量、または腎尿細管モデルの再生を測定することにより決定される、請求項127〜136のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記腎組織細胞の生存能力または機能性が、対照と比較した、細胞質プロリンリッチチロシンキナーゼ-2(Pyk2)発現、チアジド感受性共輸送体(TSC)発現、上皮成長因子(EGF)発現、トランスフォーミング成長因子アルファ(TGF-α)発現、幹細胞因子(SCF)発現、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-β)発現、結合成長組織因子(CTGF)発現、補体因子B発現、トール様受容体2(TLR2)発現、トール様受容体4(TLR4)発現、インターロイキン6(IL-6)発現、クラスII主要組織適合遺伝子複合体(MHC)発現、細胞間接着分子-1(ICAM-1)発現、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)発現、またはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1(PAI-1)の、変化を測定することにより決定される、請求項127〜136のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記腎組織細胞の生存能力または機能性が、アポトーシス経路の誘導、細胞もしくは核の形態の変化、ミトコンドリアの数もしくは形態の変化、ミトコンドリア機能の変化、ケモカインの分泌、サイトカインの分泌、細胞外マトリックスの沈着の量もしくはパターンの変化、タンパク質結晶もしくは塩の結晶の沈着、腎尿細管再生、上皮間葉転換、炎症、虚血、過剰増殖、遺伝子発現の変化、バイオマーカーの分泌、またはエピジェネティック修飾を測定することにより決定される、請求項127〜136のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記腎組織細胞の生存能力または機能性が、経時的に測定される、請求項127〜147のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記腎尿細管モデルが、前記候補治療剤と接触させる前に細胞培養培地中で培養されている、請求項127〜148のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記腎尿細管モデルが、細胞培養培地中で少なくとも3日間培養されている、請求項127〜149のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５１】
前記罹患ドナーが、先天性異常、糖尿病、免疫複合疾患、血管硬化症、腎アブレーション、腎線維症、高血圧、動脈腎硬化症、ループス腎炎、血管疾患、炎症、溶血性尿毒症症候群、閉塞性腎症、異常リポタンパク血症、再発性脱水症、逆流性腎症、放射線腎症、アテローム塞栓性腎疾患、強皮症、鎌状赤血球貧血、脂質の保持、感染、虚血、虚血／再灌流、輸送欠損、結晶沈着、遺伝障害、慢性システム障害、腎臓癌、またはそれらの組み合わせを有する、請求項130〜150のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
遺伝子改変細胞をさらに含み、該遺伝子改変細胞により前記表現型が誘導される、請求項127〜151のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
候補治療剤の有効な投与濃度および投与スケジュールを予測する方法であって、以下の段階を含む、方法：
請求項98〜125のいずれか一項に記載のバイオプリントされた人工の三次元生体腎組織モデルと、様々な濃度または量の該剤とを接触させる段階；および
(a)該腎組織細胞の生存能力または機能性に対する該剤の効果を経時的に測定する段階。
【請求項１５４】
効能をもたらす最短の用量間タイミングを決定するために、経時的に腎組織細胞の回復を測定する段階
をさらに含む、請求項153に記載の方法。
【請求項１５５】
腎尿細管障害モデルを作製する方法であって、以下の段階を含む、方法：
腎組織の第1の層を腎組織の第2の層と接触させることにより、人工の三次元生体腎尿細管障害モデルを形成する段階であって、
但し、該腎組織の第1の層が腎間質組織を含み、該腎組織の第2の層が上皮組織を含み、少なくとも1つの腎組織層が、罹患細胞を有するバイオインクを含む、段階。
【請求項１５６】
前記バイオインクの罹患細胞が、疾患に特異的な遺伝子改変細胞を含む、請求項155に記載の方法。
【請求項１５７】
前記遺伝子改変細胞が、遺伝子改変幹細胞である、請求項156に記載の方法。
【請求項１５８】
前記遺伝子改変細胞が、遺伝子改変線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項156に記載の方法。
【請求項１５９】
前記遺伝子改変細胞が、トランスポーター、レトロウイルス、CRISPR、ウイルス導入、化学的突然変異誘発、またはそれらの任意の組み合わせにおける多嚢胞性突然変異(polycystic mutation)を含む、請求項156に記載の方法。
【請求項１６０】
前記バイオインクの罹患細胞が、特定の疾患を有するドナーから単離された細胞を含む、請求項155に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ドナーが、前記特定の疾患に対応する遺伝的機能障害を有する、請求項160に記載の方法。
【請求項１６２】
前記ドナーから単離された細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項160に記載の方法。
【請求項１６３】
少なくとも第2の腎組織層が、罹患細胞を有するバイオインクを含む、請求項155に記載の方法。
【請求項１６４】
前記腎間質組織が、腎線維芽細胞および内皮細胞を含み、かつ前記腎上皮組織が、腎尿細管上皮細胞を含む、請求項155に記載の方法。
【請求項１６５】
腎尿細管障害モデルを作製する方法であって、以下の段階を含む、方法：
所望の腎尿細管障害に特徴的な表現型を生成するために、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルをコンディショニングする段階であって、
該腎尿細管モデルが、
腎間質組織の層であって、該腎間質組織が、腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、腎間質組織の層と、
腎上皮組織の層であって、該腎上皮組織が、腎尿細管上皮細胞を含む、腎上皮組織の層と
を含み、
但し、該間質組織が間質バイオインクを含み、該上皮組織が上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する、段階。
【請求項１６６】
前記コンディショニングする段階が、所望の腎尿細管障害に特徴的な表現型を生じるように細胞を遺伝的に改変する、請求項165に記載の方法。
【請求項１６７】
前記細胞が、トランスポーター、レトロウイルス、CRISPR、ウイルス形質導入、化学的突然変異誘発、またはそれらの任意の組み合わせにおける多嚢胞性突然変異により遺伝的に修飾されている、請求項166に記載の方法。
【請求項１６８】
前記コンディショニングする段階が、人工の三次元生体腎尿細管モデルを、所望の腎尿細管障害に特徴的な表現型を誘導することができる剤と接触させることを含む、請求項165に記載の方法。
【請求項１６９】
前記剤が毒物である、請求項168に記載の方法。
【請求項１７０】
前記毒物が、抗感染剤、抗生物質、抗細菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンB、アミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラクソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、ゾレドロネート、またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つまたは複数を含む、請求項169に記載の方法。
【請求項１７１】
前記剤がグルコースである、請求項168記載の方法。
【請求項１７２】
前記剤が微生物である、請求項168に記載の方法。
【請求項１７３】
前記微生物が、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、または蠕虫である、請求項172に記載の方法。
【請求項１７４】
前記剤が炎症刺激剤である、請求項168に記載の方法。
【請求項１７５】
前記コンディショニングする段階が、前記人工の三次元生体腎尿細管モデルに対して酸素を減少させる、請求項165に記載の方法。
【請求項１７６】
前記コンディショニングする段階が、前記人工の三次元生体腎尿細管モデルに放射線を適用する、請求項165に記載の方法。
【請求項１７７】
前記コンディショニングする段階が、糖尿病状態によって引き起こされる、請求項165に記載の方法。
【請求項１７８】
前記糖尿病状態が、2型糖尿病である、請求項177に記載の方法。
【請求項１７９】
前記コンディショニングする段階が、高濃度のグルコース、高血圧、またはそれらの任意の組み合わせを適用する、請求項165に記載の方法。
【請求項１８０】
前記コンディショニングする段階が、腎臓病変を引き起こす、請求項165に記載の方法。
【請求項１８１】
前記コンディショニングする段階が、発癌物質を適用する、請求項165に記載の方法。
【請求項１８２】
前記コンディショニングする段階が、炎症を引き起こす、請求項165に記載の方法。
【請求項１８３】
前記コンディショニングする段階が、前記人工の三次元生体腎尿細管モデルへの血液供給を減少させる、請求項165に記載の方法。
【請求項１８４】
前記コンディショニングする段階が、ミトコンドリアに変化を適用する、請求項165に記載の方法。
【請求項１８５】
前記コンディショニングする段階が、細胞形態を変化させる、請求項165に記載の方法。
【請求項１８６】
前記コンディショニングする段階が、過剰増殖である、請求項165に記載の方法。
【請求項１８７】
前記コンディショニングする段階が、エピジェネティック修飾である、請求項165に記載の方法。
【請求項１８８】
前記コンディショニングする段階が、結晶を沈着させる、請求項165に記載の方法。
【請求項１８９】
前記結晶が、コレステロール結晶、コレステロール一ナトリウム尿酸塩、シュウ酸カルシウム、リン酸カルシウムヒドロキシアパタイト、2，8-ジヒドロキシアデニン、ウロモジュリン、ミオグロビン-ウロモジュリン、インジナビル、アシクロビル、ポリミキシン(たとえば、ポリスポリン、ネオスポリン、ポリミキシンB、またはポリミキシンE)、スルファジアジン、システイン、尿酸、またはリン酸マグネシウムアンモニウムのうちの1つまたは複数である、請求項188に記載の方法。 
【請求項１９０】
前記コンディショニングする段階が、タンパク質、塩、または他の沈殿物質(precipitous matter)の蓄積である、請求項165に記載の方法。
【請求項１９１】
前記所望の腎尿細管障害が急性腎障害である、請求項165に記載の方法。
【請求項１９２】
前記所望の腎尿細管障害が慢性腎障害である、請求項165に記載の方法。
【請求項１９３】
前記所望の腎尿細管障害が腎臓癌である、請求項165に記載の方法。
【請求項１９４】
前記急性腎障害が慢性腎障害から生じる、請求項191に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、腎尿細管モデルおよびアッセイにおけるそれらの使用の分野にある。バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを用いて、潜在的な毒性剤による腎損傷を逆転、軽減または予防する候補治療剤の能力を評価する方法が開示される。剤が腎機能に及ぼす影響を評価する方法も開示され、この方法は、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルと剤とを接触させることを含む。腎障害のモデルも開示される。一実施形態では、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを含む腎線維症のモデルが開示される。腎障害のモデルを作製する方法も開示される。一実施形態では、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを、間質性線維症組織形成を誘導することができる剤と接触させることを含む、腎線維症モデルを製造する方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、様々な薬物の代謝および排除において中心的な役割を果たし、近位尿細管(PT)は、糸球体での血漿の濾過後の内腔表面と、尿細管周囲毛細血管からの吸収後の基底外側表面と、の両方において高濃度の反応性親水性代謝産物に曝露される。PT上皮において発現される腎臓異物輸送体の作用のために、薬学的化合物はPTに蓄積して濃縮され、次に、シトクロムP450酵素およびUDP-グルクロニルトランスフェラーゼによるさらなる代謝を受け得る(Lohr et al., 1998)。これは、これらの化合物を解毒して、尿中に分泌されるより親水性の分子を生成する役割を果たすが、高い毒性の中間代謝物が蓄積し、尿細管上皮および周囲の細胞に損傷を与える可能性がある(Choudhury and Ahmed, 2006)。そのため、新薬を市場に投入する上での大きな課題は腎毒性のリスクであり、それは、しばしば薬剤開発の後期に検出され、腎毒性による開発中止(attrition)は、前臨床薬の開発中止の2％を占めるが、より費用のかかる第3相臨床試験中の開発中止の19％を占める(Redfern, 2010)。承認後の薬物誘発性腎毒性は急性腎損傷(AKI)の18〜27％を占め(Loghman-Adham et al., 2012)、これらの障害の最大36％が一般的に使用される抗生物質、たとえばアミノグリコシドに関連している(Kleinknecht et al., 1987)。これらのAKI症例の多くは可逆的であるが、いくつかの薬物は尿細管壊死、尿細管間質性炎症、および線維症をもたらす慢性腎損傷を誘発し得る(Kleinknecht et al., 1987; Choudhury and Ahmed, 2006)。現在、AKIまたは腎不全の診断はクレアチニンまたは血中尿素窒素レベルの上昇に依存しており、これらは損傷が深刻になるまで臨床的に有意にならない(Rahman et al., 2012)。AKIの持続的作用は重要であり、13％の患者が継続的な透析を必要とし、41％の患者が腎不全のために腎臓移植を必要とする(Vaidya et al., 2008)。そのため、医薬品開発過程で腎毒性薬を同定するためのより優れた予測ツールは、新薬の市場投入およびAKIの下流効果の治療に関連するコストを削減し、患者の生活を改善するであろう。
【０００３】
現在、腎毒性化合物のために広く使用されているスクリーニングツールは、主として、ヒトおよび動物の腎臓近位尿細管上皮細胞(RPTEC)または小動物モデルのパネルからなる。しかしながら、これらのシステムは、種特異的な違い、または生体異物輸送および生体内変化後の毒性を含む腎臓生理学の関連する側面を再現できないことのいずれかの結果として、器官特異的毒性を正確に予測できないことが多い(Lin and Will, 2012)。新たに単離された初代ヒトRPTECは種特異性の違いを未然に防ぐが、細胞は単離されて培養されると急速に脱分化して老化し、重要な輸送体および代謝酵素の発現を失う(Wieser et al., 2008; Vesey et al., 2009)。ヒト腎臓では、RPTECは、細胞を含む皮質細管、細胞外マトリックス、プロテオグリカン、糖タンパク質、および間質液の間の空間として定義される腎間質と密接に関連して存在する(Lemley and Kriz, 1991)。皮質間質に見られる細胞型は、線維芽細胞様細胞および免疫細胞を含み、それらは細管周囲毛細血管の微小血管系が散在している(Brenner, 2008)。初代RPTECと内皮細胞との共培養はRPTECの増殖および分化を改善する頑強なパラクリンシグナル伝達ネットワークをもたらすので、これらの支持細胞型はRPTECの継続的な機能を維持するのに重要な役割を果たす可能性がある(Tasnim and Zink, 2012)。したがって、よりネイティブな三次元(3D)アーキテクチャで間質細胞を支持しながら初代RPTECを配置することは、経時的にそれらの機能を維持するのを助け、線維症などの、上皮細胞のみを用いてモデル化することが困難なさらなる型の腎損傷の評価を可能にし得る(Subramanian et al., 2010)。
【０００４】
組織工学の主な目的の1つは、生細胞および生体材料を用いて、ネイティブの組織または器官の構造および機能の重要な態様を要約する3D組織を生成することである。適切なインビトロまたはインビボのコンディショニングにより、これらの構造内の細胞は、ネイティブの組織の特定の態様を模倣する細胞-細胞相互作用および細胞-マトリックス相互作用を確立することによって、可溶性および機械的合図に応答することができる(Griffith et al., 2014)。スフェロイドまたはコラーゲンゲルなどの3D配置で培養された細胞は、2D培養と機能的なアッセイにおいて異なった動作をし、3Dにおける細胞の生理学的反応はインビボで観察された反応により近いことが十分に確立されている(Godoy et al., 2013)。これらの3D構造を製造するためのそのような手段の1つはバイオプリンティングである。このアプローチでは、細胞材料から構成されるバイオインクが、研究者によって作製された再現可能な幾何学的に規定されたパターンで押し出される(Ozbolat and Hospodiuk, 2016)。バイオインクは、沈着後に互いに接着し、複雑でパターン化された組織の形成をもたらす、自己組織化多細胞凝集体から構成される(Jakab et al., 2008; Jakab et al., 2010)。自己組織化多細胞凝集体の使用をコンピューター制御バイオプリンティングと組み合わせることにより、直接的な細胞間接触を妨害し得る外因性細胞外マトリックスの欠如下で形成および成熟する、再現性の高い、足場のない組織の作製が可能になる(Norotte et al., 2009)。
【発明の概要】
【０００５】
腎臓の線維芽細胞、内皮細胞、および上皮細胞の間の細胞-細胞相互作用およびパラクリンシグナル伝達の両方を促進するためにRPTECを支持する重要な間質細胞型を組み込んだヒトPTの層状組織モデルを設計および作製するためにバイオプリンティング技術が利用された。得られた組織は、培養中少なくとも30日間、上皮の形態および機能を支持し、生化学的、転写的、および組織学的な評価項目の組み合わせを用いて、シスプラチンに対する腎毒性応答における有機カチオントランスポーターOCT2の役割をモデル化するために効果的に用いられた。したがって、このシステムは、医薬品開発プロセスの早い段階で薬学的化合物の腎毒性を予測するのに役立つ。
【０００６】
本明細書に記載の人工組織は、ヒト腎間質組織がヒト腎臓近位尿細管上皮細胞を支持して、それらの最適な形態および機能を促進する、尿細管間質界面のモデルを表現する。三次元の尿細管間質界面の作製は、小分子、化学物質、汚染物質、または生物製剤がどのように腎臓近位尿細管に影響を及ぼすかを正確に研究するために、代謝に必要な薬物輸送体および受容体の正確な局在化を容易にする。これは、ヒトまたはイヌの腎上皮細胞の二次元単層に対する生理学的により関連のある代替物を表現し、腎機能における種の差が結果の解釈を妨げる動物研究の補助として、または場合によっては代用として役立つ。
【０００７】
本明細書に記載の人工組織は、化合物がどのように腎臓近位尿細管に影響を及ぼすか、ならびに尿細管輸送、細胞間相互作用、および慢性腎臓疾患、多発性嚢胞腎、もしくはII型糖尿病において起こり得るような腎障害の発症に関連する病原性プロセスのモデリングを正確に研究する機会を提供する。
【０００８】
本明細書に記載の人工組織は、化合物がどのように腎臓近位尿細管に影響を及ぼすか、ならびに尿細管輸送、細胞間相互作用、および慢性腎臓疾患、多発性嚢胞腎、もしくはII型糖尿病において起こり得るような腎障害の発症に関連する病原性プロセスのモデリングを正確に研究する機会を提供する。
【０００９】
本明細書に記載の人工組織は、化合物がどのように腎臓近位尿細管に影響を及ぼすか、ならびに尿細管輸送、細胞間相互作用、および慢性腎臓疾患、多発性嚢胞腎、もしくはII型糖尿病において起こり得るような尿細管間質性線維症の発症に関連する病原性プロセスのモデリングを正確に研究する機会を提供する。
【００１０】
潜在的な毒性剤による腎損傷を逆転、軽減、または予防する候補治療剤の能力を評価する方法であって、バイオプリンティングされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを潜在的な毒性剤と接触させる段階と、腎尿細管モデルを候補治療剤と接触させる段階と、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性を決定する段階と、候補治療剤と接触していない対照腎尿細管モデルと比較して、腎尿細管上皮細胞の決定された生存能力または機能性に基づいて、潜在的な毒性剤による腎損傷を逆転、軽減、または予防する候補治療剤の能力を評価する段階と、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルは、腎間質組織の層であって、腎間質組織が腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、層、ならびに、腎上皮組織の層であって、腎上皮組織の層が腎尿細管上皮細胞を含む、層を含み、ここで、間質組織は間質バイオインクを含み、上皮組織は上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、腎尿細管上皮細胞は極性化している。いくつかの実施形態では、腎間質組織の層は、頂端面および側底面を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、モデルは、腎間質組織層と腎上皮組織層との間に基底膜の層をさらに含む。いくつかの実施形態では、腎上皮組織層は基底膜の層と連続的に接触しており、基底膜の層は腎間質組織の層と連続的に接触している。
【００１３】
いくつかの実施形態において、腎上皮組織の層は実質的に単層である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、腎上皮組織の層に存在する細胞は腎尿細管上皮細胞のみである。他の実施形態において、腎間質組織の層に存在する細胞は線維芽細胞および内皮細胞のみである。 他の実施形態において、腎間質組織の層は、間質線維性組織をさらに含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、線維芽細胞および内皮細胞は、約50：50の線維芽細胞対内皮細胞比で腎間質組織の層に存在する。いくつかの実施形態では、腎間質組織の層または腎上皮組織の層は、体積で70％〜100％生細胞である。他の実施形態において、腎間質組織層は、間質線維性組織をさらに含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルはさらに生体適合性膜を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは均一な厚さのものである。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは少なくとも2細胞層の厚さである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、線維芽細胞および内皮細胞は、腎尿細管モデルがプリントの6日後に平面になる比率で存在する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、複数の腎尿細管モデルが、アレイを形成するように構成される。いくつかの実施形態において、アレイはマイクロタイタープレートのウェルに存在する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は、毒素、治療剤、抗菌剤、金属、または環境作用物質である。
【００２１】
他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗うつ剤、利尿剤、またはプロトンポンプ阻害剤である。
【００２２】
他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、サイトカイン、ケモカイン、小分子薬、大分子薬、タンパク質またはペプチドである。
【００２３】
他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン、ゴナドレリンアゴニスト、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、レチノイド、カロテノイド、もしくはトコフェロール、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、MMP阻害剤、mTOR阻害剤、代謝拮抗剤、白金化合物、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、抗増殖抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、Ras発癌性アイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、血液悪性腫瘍の治療に使用される化合物、Flt-3阻害剤、Hsp90阻害剤、キネシンスピンドルタンパク質阻害剤、MEK阻害剤、抗腫瘍抗生物質、ニトロソ尿素、タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性を標的とする／減少させる化合物、タンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／減少させる化合物、または抗血管新生化合物である化学療法剤である。
【００２４】
他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ara-C、VP-16、テニポシド、ミトキサントロン、イダルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、PKC412、6-メルカプトプリン(6-MP)、フルダラビンホスフェート、オクトレオチド、SOM230、FTY720、6-チオグアニン、クラドリビン、6-メルカプトプリン、ペントスタチン、ヒドロキシ尿素、2-ヒドロキシ-1H-イソインドール-1,3-ジオン誘導体、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジン、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジンスクシネート、アンジオスタチン、エンドスタチン、アントラニル酸アミド、ZD4190、ZD6474、SU5416、SU6668、ベバシズマブ、rhuMAb、rhuFab、マクゴン(macugon)、FLT-4阻害剤、FLT-3阻害剤、VEGFR-2 IgG1抗体、RPI 4610、ベバシズマブ、ポルフィマーナトリウム、アネコルタブ、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、11-α-エピヒドロコルチゾン、コルテキソロン、17a-ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デスオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロン、デキサメタゾン、フルオシノロン、植物アルカロイド、ホルモン化合物および／またはアンタゴニスト、生物学的応答調節剤、たとえば、リンホカインもしくはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド誘導体、shRNA、siRNA、またはそれらの薬学的に許容される塩である化学療法剤である。
【００２５】
他の実施形態において、潜在的な毒性剤は、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンB、およびアミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである。
【００２６】
他の実施形態では、潜在的な毒性剤は放射線である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、代謝活性の指標を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、代謝活性の指標は、対照と比較した腎尿細管モードにおけるレサズリンの減少またはテトラゾリウム塩の減少である。
【００２８】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ(GGT)活性、プロテアーゼ活性、ATP利用、グルコース取り込み活性、ナトリウム-グルコース共輸送体-2(SGLT2)活性またはRNA発現を測定することによって決定される。
【００２９】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較したモデル中の腎輸送分子活性を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、輸送分子活性は、少なくとも1つの高分子の排出および／または取り込みである。いくつかの実施形態では、高分子はアルブミンである。
【００３０】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した腎尿細管上皮細胞の再生を同定することによって決定される。
【００３１】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した腎尿細管モデルの経上皮電気抵抗または受動的透過性を測定することによって決定される。
【００３２】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、ビタミンD産生の変化、アンジオテンシン変換の変化、イオン交換の変化、pHの変化、酸／塩基バランスの変化、腎尿細管バリア機能の変化、もしくは腎臓内レニン／アンジオテンシン系(RAS)の変化、生理学の変化、病理学の変化、分子の輸送の変化、ナトリウム-グルコース共輸送体-2(SGLT2)活性の変化、間質線維性組織の量、または腎尿細管モデルの再生を測定することによって決定される。
【００３３】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した間質線維性組織の量を測定することによって決定される。
【００３４】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は経時的に測定される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、最初に潜在的な毒性剤と、次に候補治療剤と接触させられる。他の実施形態では、腎尿細管モデルは、最初に候補治療剤と、次に潜在的な毒性剤と接触させられる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、候補治療剤および潜在的な毒性剤と接触させる前に細胞培養培地中で培養されている。
【００３７】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、細胞培養培地中で3日またはそれより長い日数、培養されている。
【００３８】
薬剤が腎機能に及ぼす影響を評価する方法も提供される。この方法は、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを剤と接触させる段階と、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性に対する剤の効果を測定する段階と、を含む。いくつかの実施形態では、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルは、腎間質組織の層であって、腎間質組織が腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、層と、腎上皮組織の層であって、腎上皮組織が腎尿細管上皮細胞を含む、層と、を含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する。ここで、間質組織は間質バイオインクを含み、上皮組織は上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、線維芽細胞および内皮細胞は、腎尿細管モデルがプリントの6日後に平面になる線維芽細胞対内皮細胞の比で存在する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、腎尿細管上皮細胞は極性化している。いくつかの実施形態において、腎間質組織の層は、頂端面および側底面を有する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、モデルは、腎間質組織層と腎上皮組織層との間に基底膜の層をさらに含む。いくつかの実施形態において、腎上皮組織の層は基底膜の層と連続的に接触しており、基底膜の層は腎間質組織の層と連続的に接触している。
【００４２】
いくつかの実施形態において、腎上皮組織の層は実質的に単層である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、腎上皮組織の層に存在する細胞は腎尿細管上皮細胞のみである。他の実施形態では、腎間質組織の層に存在する細胞は線維芽細胞および内皮細胞のみである。いくつかの実施形態において、腎間質組織の層は、間質線維性組織をさらに含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、線維芽細胞および内皮細胞は、約50：50の線維芽細胞対内皮細胞比で腎間質組織の層に存在する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、腎間質組織の層または腎上皮組織の層のいずれかは、体積で70％〜100％生細胞である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルはさらに生体適合性膜を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは一様な厚さのものである。他の実施形態では、腎尿細管モデルは2細胞層以上の厚さである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、複数の腎尿細管モデルが、アレイを形成するように構成される。いくつかの態様において、アレイはマイクロタイタープレートのウェルに存在する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、剤は、毒素、治療剤、抗微生物剤、金属、または環境作用物質である。
【００５０】
他の実施形態では、剤は、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗うつ剤、利尿剤、またはプロトンポンプ阻害剤である。
【００５１】
他の実施形態では、剤は、サイトカイン、ケモカイン、小分子薬、大分子薬、タンパク質またはペプチドである。
【００５２】
他の実施形態では、剤は、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン、ゴナドレリンアゴニスト、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、レチノイド、カロテノイド、もしくはトコフェロール、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、MMP阻害剤、mTOR阻害剤、代謝拮抗剤、白金化合物、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、抗増殖抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、Ras発癌性アイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、血液悪性腫瘍の治療に使用される化合物、Flt-3阻害剤、Hsp90阻害剤、キネシンスピンドルタンパク質阻害剤、MEK阻害剤、抗腫瘍抗生物質、ニトロソ尿素、タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性を標的とする／減少させる化合物、タンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／減少させる化合物、または抗血管新生化合物である化学療法剤である。
【００５３】
他の実施形態では、剤は、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ara-C、VP-16、テニポシド、ミトキサントロン、イダルビシン、シスプラチン、カルボプラチナ、PKC412、6-メルカプトプリン(6-MP)、リン酸フルダラビン、オクトレオチド、SOM230、FTY720、6-チオグアニン、クラドリビン、6-メルカプトプリン、ペントスタチン、ヒドロキシ尿素、2-ヒドロキシ-1H-イソインドール-1，3-ジオン誘導体、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジン、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジンスクシネート、アンジオスタチン、エンドスタチン、アントラニル酸アミド、ZD4190、ZD6474、SU5416、SU6668、ベバシズマブ、rhuMAb、rhuFab、マクゴン、FLT-4阻害剤。FLT-3阻害剤、VEGFR-2 IgG1抗体、RPI 4610、ベバシズマブ、ポルフィマーナトリウム、アネコルタブ、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、11-α-エピヒドロコルチゾン、コルテキソロン、17a-ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デスオキシコルチコステロン、テストステロン、エステロン、デキサメタゾン、フルオシノロン、植物アルカロイド、ホルモン化合物および／またはアンタゴニスト、生物学的応答調節剤、たとえば、リンホカインまたはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体、shRNA、siRNA、またはそれらの薬学的に許容される塩である化学療法剤である。
【００５４】
他の実施形態において、剤は、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンB、アミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデフォビル、インジナビル、ジノホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである。
【００５５】
他の実施形態では、剤は放射線である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、代謝活性の指標を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、代謝活性の指標は、対照と比較した腎尿細管モードにおけるレサズリンの減少またはテトラゾリウム塩の減少である。
【００５７】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ(GGT)活性、プロテアーゼ活性、ATP利用率、SGLT2活性、グルコース取り込み活性またはRNA発現を測定することによって決定される。
【００５８】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較したモデル中の腎輸送分子活性を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、輸送分子活性は少なくとも1つの高分子の排出および／または取り込みである。いくつかの実施形態では、高分子はアルブミンである。
【００５９】
他の実施形態において、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した腎尿細管上皮細胞の再生を同定することによって決定される。
【００６０】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した腎尿細管モデルの経上皮電気抵抗または受動的透過性を測定することによって決定される。
【００６１】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、ビタミンD産生の変化、アンジオテンシン変換の変化、イオン交換の変化、pHの変化、酸／塩基バランスの変化、腎尿細管バリア機能の変化、腎臓内レニン／アンジオテンシン系(RAS)の変化、生理学の変化、病理学の変化、分子の輸送の変化、ナトリウム-グルコース共輸送体-2(SGLT2)活性の変化、間質線維性組織の量、または腎尿細管モデルの再生を測定することによって決定される。
【００６２】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、経時的に測定される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルは、剤と接触させる前に細胞培養培地中で培養されている。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、細胞培養培地中で3日またはそれより長い日数、培養されている。
【００６４】
いくつかの実施形態では、剤が除去され、腎尿細管モデルは、剤の欠如により腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性が改善されるか否かを判定するために評価される。
【００６５】
バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを含む腎線維症のモデルも提供される。バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルは、腎間質組織の層であって、腎間質組織は腎線維芽細胞、内皮細胞および線維性組織を含む、層と、腎上皮組織の層であって、腎上皮組織は腎尿細管上皮細胞を含む、層と、を含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する。ただし、間質組織は間質バイオインクを含み、上皮組織は上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する。いくつかの実施形態において、線維症がモデルに存在する場合、モデルは、収縮、カーリング、組織の拡大、または他の線維症表現型を示す。
【００６６】
いくつかの実施形態では、腎尿細管上皮細胞は極性化している。 いくつかの実施形態において、腎間質組織の層は、頂端面および側底面を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、モデルは、腎間質組織層と腎上皮組織層との間に基底膜の層をさらに含む。いくつかの実施形態では、腎上皮組織の層は基底膜の層と連続的に接触しており、基底膜の層は腎間質組織の層と連続的に接触している。
【００６８】
いくつかの実施形態において、腎上皮組織の層は実質的に単層である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、腎上皮組織の層に存在する細胞は腎尿細管上皮細胞のみである。いくつかの実施形態において、腎間質組織の層に存在する細胞は線維芽細胞および内皮細胞のみである。
【００７０】
いくつかの実施形態において、線維芽細胞および内皮細胞は、約50：50の線維芽細胞対内皮細胞比で腎間質組織の層に存在する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、腎間質組織の層または腎上皮組織の層は、体積で70％〜100％生細胞である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは生体適合性膜をさらに含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルは、平面組織構造の変形および過剰な細胞外マトリックス沈着を示す。
【００７４】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルは、2細胞層以上の厚さである。
【００７５】
いくつかの実施形態において、複数の腎尿細管モデルが、アレイを形成するように構成される。いくつかの態様において、アレイはマイクロタイタープレートのウェルに存在する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、線維芽細胞および内皮細胞は、腎尿細管モデルがプリントの6日後に平面になる比率で存在する。
【００７７】
腎線維症のモデルを作製する方法も提供され、この方法は、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを、間質線維性組織形成を誘導し得る剤と接触させることを含む。ここで、腎尿細管モデルは、腎間質組織の層であって、腎間質組織が腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、層と、腎上皮組織の層であって、腎上皮組織が腎尿細管上皮細胞を含む、層と、を含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する。ただし、間質組織は、間質バイオインクを含み、上皮組織は上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、線維芽細胞および内皮細胞は、腎尿細管モデルがプリントの6日後に平面になる線維芽細胞対内皮細胞比で存在する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、間質線維性組織沈着を誘導することができる剤は、シクロスポリンA、アリストロキア酸、タクロリムス、TGFベータ、シスプラチン、アシクロビル、アロプリノール、ベータラクタム系抗生物質、インジナビル、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラゾール、フェニトイン、ラニチジン、またはバンコマイシンである。
【００８０】
また、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを含む、腎障害のモデルであって、
(a)腎間質組織の層であって、該腎間質組織が腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、層と、
(b)腎上皮組織の層であって、該腎上皮組織が腎尿細管上皮細胞を含む、層と
を含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成し、ただし、該間質組織が間質バイオインクを含み、該上皮組織が上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成し、ここで、該モデルは腎尿細管において腎障害に特徴的な表現型を含む、モデルも提供される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、表現型は、収縮、カーリング、拡大、壊死、アポトーシス、腎尿細管再生、代償性増殖、上皮間葉転換、炎症、虚血、虚血／再かん流、活性酸素種、ミトコンドリアの変化、細胞形態の変化、核形態の変化、過剰増殖、遺伝子発現の変化、バイオマーカーの分泌、エピジェネティック修飾、結晶析出、嚢胞形成、細胞機能の変化、血管新生、低酸素、細胞外マトリックス沈着、または周辺組織の死の少なくとも一つを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、腎尿細管上皮細胞は極性化している。
【００８３】
いくつかの実施形態では、腎間質組織の層は、頂端面および側底面を有する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、モデルは、腎間質組織層と腎上皮組織層との間に基底膜の層をさらに含む。
【００８５】
いくつかの実施形態において、腎上皮組織の層は基底膜の層と連続的に接触しており、基底膜の層は腎間質組織の層と連続的に接触している。
【００８６】
いくつかの実施形態では、腎上皮組織の層は実質的に単層である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、腎上皮組織の層に存在する細胞は腎尿細管上皮細胞のみである。
【００８８】
いくつかの実施形態において、腎間質組織の層に存在する細胞は線維芽細胞および内皮細胞のみである。
【００８９】
いくつかの実施形態において、線維芽細胞および内皮細胞は、約50：50の線維芽細胞対内皮細胞比で腎間質組織の層に存在する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、腎間質組織の層または腎上皮組織の層は、体積で70％〜100％生細胞である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルはさらに生体適合性膜を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルは、平面組織構造の変形および過剰な細胞外マトリックス沈着を示す。
【００９３】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、少なくとも2細胞層の厚さである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、複数の腎尿細管モデルが、アレイを形成するように構成される。
【００９５】
いくつかの実施形態において、アレイはマイクロタイタープレートのウェルに存在する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、線維芽細胞および内皮細胞は、腎尿細管モデルがプリントの6日後に平面になる比率で存在する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、腎障害は、先天性異常、糖尿病、免疫複合体病、血管硬化症、腎臓切除、腎線維症、高血圧、動脈腎硬化症、ループス腎炎、血管疾患、炎症、溶血性尿毒症症候群、閉塞性腎症、異常リポタンパク血症、再発性脱水症、逆流性腎症、放射線腎症、アテローム塞栓性腎疾患、強皮症、鎌状赤血球貧血、脂質貯留、感染症、虚血、虚血／再灌流、輸送欠損、結晶沈着、遺伝的障害、慢性システム障害、腎臓癌、またはそれらの組み合わせに関連する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、表現型を生じさせる処置、化合物、または感染性剤と腎尿細管モデルとを接触させることによって表現型が誘導される。
【００９９】
いくつかの実施形態において、表現型は、腎尿細管モデルにおける腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞の存在である。
【０１００】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、またはそれらの組み合わせは、罹患ドナーから得られた初代細胞である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞によって表現型が誘導される、遺伝子改変細胞をさらに含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、表現型を生じさせる処置、化合物、または感染性剤は、毒素、潜在的な毒性剤、抗菌剤、金属、または環境作用物質である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は、抗感染剤、鎮痛剤、抗うつ剤、利尿剤、またはプロトンポンプ阻害剤である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は、サイトカイン、ケモカイン、小分子薬、大分子薬、タンパク質、またはペプチドである。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン、ゴナドレリンアゴニスト、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、レチノイド、カロテノイド、もしくはトコフェロール、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、MMP阻害剤、mTOR阻害剤、代謝拮抗剤、白金化合物、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、抗増殖抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、Ras発癌性アイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、血液悪性腫瘍の治療に用いられる化合物、Flt-3阻害剤、Hsp90阻害剤、キネシンスピンドルタンパク質阻害剤、MEK阻害剤、抗腫瘍抗生物質、ニトロソ尿素、タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性を標的とする／減少させる化合物、タンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／減少させる化合物、または抗血管新生化合物である化学療法剤である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ara-C、VP-16、テニポシド、ミトキサントロン、イダルビシン、シスプラチン、カルボプラチナ、PKC412、6-メルカプトプリン(6-MP)、フルダラビンホスフェート、オクトレオチド、SOM230、FTY720、6-チオグアニン、クラドリビン、6-メルカプトプリン、ペントスタチン、ヒドロキシ尿素、2-ヒドロキシ-1H-イソインドール-1,3-ジオン誘導体、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジン、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジンコハク酸塩、アンジオスタチン、エンドスタチン、アントラニル酸アミド、ZD4190、ZD6474、SU5416、SU6668、ベバシズマブ、rhuMAb、rhuFab、マクゴン、FLT-4阻害剤、FLT-3阻害剤、VEGFR-2 IgG1抗体、RPI 4610、ベバシズマブ、ポルフィマーナトリウム、アネコルタブ、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、11-α-エピヒドロコルチゾン、コルテキソロン、17a-ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デスオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロン、デキサメタゾン、フルオシノロン、植物アルカロイド、ホルモン化合物および／またはアンタゴニスト、生物学的応答調節剤、たとえば、リンホカインもしくはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド誘導体、shRNA、siRNA、またはそれらの製薬上許容される塩である化学療法剤である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アムホテリシンB、アミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は放射線である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、腎障害は、急性腎障害、慢性腎障害、または腎臓癌である。
【０１１０】
候補治療剤が腎障害を逆転、軽減、誘発、または予防する能力を評価する方法も提供され、この方法は、
(a)腎尿細管モデルを候補治療薬と接触させる段階；
(b)腎組織細胞の生存能力または機能性を決定する段階；および
(c)候補治療剤と接触させていない対照腎尿細管モデルと比較した、腎組織細胞の決定された生存能力または機能性に基づいて、候補治療剤が腎障害を逆転、軽減、誘発、または予防する能力を評価する段階
を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、候補治療剤を評価する方法は、
(d)候補治療剤を除去する段階；および
(e)剤の欠如が腎組織細胞の生存能力または機能性の改善をもたらすか否かを評価する段階
をさらに含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、表現型は、腎尿細管モデルにおける腫瘍、腫瘍断片、腫瘍細胞、または不死化細胞の存在である。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、またはそれらの組み合わせは、罹患ドナーから得られた初代細胞である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、候補治療剤は、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗うつ剤、利尿剤、またはプロトンポンプ阻害剤である。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、候補治療剤は、サイトカイン、ケモカイン、小分子薬、大分子薬、タンパク質、またはペプチドである。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、候補治療剤は、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、ゴナドレリンアゴニスト、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、レチノイド、カロテノイド、もしくはトコフェロール、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、MMP阻害剤、mTOR阻害剤、代謝拮抗剤、白金化合物、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、抗増殖抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、Ras発癌性アイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、血液悪性腫瘍の治療に使用される化合物、Flt-3阻害剤、Hsp90阻害剤、キネシンスピンドルタンパク質阻害剤、MEK阻害剤、抗腫瘍抗生物質、ニトロソ尿素、タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性を標的とする／減少させる化合物、タンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／減少させる化合物、または抗血管新生化合物である化学療法薬である。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、候補治療剤は、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ara-C、VP-16、テニポシド、ミトキサントロン、イダルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、PKC412、6-メルカプトプリン(6-MP)、フルダラビンホスフェート、オクトレオチド、SOM230、FTY720、6-チオグアニン、クラドリビン、6-メルカプトプリン、ペントスタチン、ヒドロキシ尿素、2-ヒドロキシ-1H-イソインドール-1,3-ジオン誘導体、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-(ピリジルメチル)フタラジン、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジンコハク酸塩、アンジオスタチン、エンドスタチン、アントラニル酸アミド、ZD4190、ZD6474、SU5416、SU6668、ベバシズマブ、rhuMAb、rhuFab、マクゴン、FLT-4阻害剤、FLT-3阻害剤、VEGFR-2 IgG1抗体、RPI 4610、ベバシズマブ、ポルフィマーナトリウム、アネコルタブ、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、11-α-エピヒドロコルチゾン、コルテキソロン、17a-ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デスオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロン、デキサメタゾン、フルオシノロン、植物アルカロイド、ホルモン化合物および／またはアンタゴニスト、生物応答調節剤、たとえば、リンホカインもしくはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド誘導体、shRNA、siRNA、またはそれらの薬学的に許容される塩である化学療法剤である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、候補治療剤は、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンB、アミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、候補治療剤は放射線である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、腎組織細胞の生存能力または機能性は、代謝活性の指標を測定することによって決定される。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、代謝活性の指標は、対照と比較した腎尿細管モードにおけるレサズリンの減少またはテトラゾリウム塩の減少である。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、腎組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、乳酸脱水素酵素(LDH)活性、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ(GGT)活性、プロテアーゼ活性、ATP利用、SGLT2活性、グルコース取り込み活性またはRNA発現を測定することによって決定される。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、腎組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較したモデルにおける腎輸送分子活性を測定することによって決定される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、輸送分子活性は、少なくとも1つの高分子の排出および／または取り込みである。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、高分子はタンパク質である。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、腎組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した腎尿細管上皮細胞の再生を同定することによって決定される。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、腎組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、腎尿細管モデルの経上皮電気抵抗または受動的透過性を測定することによって決定される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、腎組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、ビタミンD産生の変化、アンジオテンシン変換の変化、イオン交換の変化、pHの変化、酸／塩基バランスの変化、腎尿細管バリア機能の変化、腎臓内レニン／アンジオテンシン系(RAS)の変化、生理学の変化、病理学の変化、分子の輸送の変化、ナトリウム-グルコース共輸送体-2(SGLT2)活性の変化、間質線維性組織の量、または腎尿細管モデルの再生を測定することによって決定される。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、腎組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、細胞質プロリンリッチチロシンキナーゼ-2(Pyk2)発現、チアジド感受性共輸送体(TSC)発現、上皮成長因子(EGF)発現、トランスフォーミング増殖因子α(TGF-α)発現、幹細胞因子(SCF)発現、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)発現、結合増殖組織因子(CTGF)発現、補体因子B発現、トール様受容体2(TLR2)発現、トール様受容体4(TLR4)発現、インターロイキン6(IL-6)発現、クラスII主要組織適合遺伝子複合体(MHC)発現、細胞間接着分子-1(ICAM-1)発現、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)発現、またはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1(PAI-1)の、変化を測定することによって決定される。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、腎組織細胞の生存能力または機能性は、アポトーシス経路の誘導、細胞もしくは核の形態の変化、ミトコンドリアの数もしくは形態の変化、ミトコンドリア機能の変化、ケモカインの分泌、サイトカインの分泌、細胞外マトリックスの沈着の量もしくはパターンの変化、タンパク質結晶もしくは塩結晶の沈着、腎尿細管再生、上皮間葉転換、炎症、虚血、虚血／再灌流、過剰増殖、遺伝子発現の変化、バイオマーカーの分泌、またはエピジェネティック修飾を測定することによって決定される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、腎組織細胞の生存能力または機能性は経時的に測定される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、候補治療剤と接触させる前に細胞培養培地中で培養されている。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、細胞培養培地中で少なくとも3日間培養されている。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、罹患ドナーは、先天性異常、糖尿病、免疫複合疾患、血管硬化症、腎臓除去、腎線維症、高血圧、動脈腎硬化症、ループス腎炎、血管疾患、炎症、溶血性尿毒症症候群、閉塞性腎症、リポタンパク質異常血症、再発性脱水症、逆流性腎症、放射線性腎症、アテロー閉塞性腎疾患、強皮症、鎌状赤血球貧血、脂質の保持、感染、虚血、輸送欠損、結晶沈着、遺伝性疾患、慢性システム障害、または腎臓癌を有する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞をさらに含み、ここで、遺伝子改変細胞によって表現型が誘導される。
【０１３６】
候補治療剤の有効投与濃度および投与スケジュールを予測する方法も提供される。この方法は、様々な濃度または量の剤を、バイオプリントされた人工の三次元生体腎組織モデルと接触させる段階と、腎組織細胞の生存能力または機能性に対する剤の効果を経時的に測定する段階と、を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、その方法は、効能をもたらす最短の用量間タイミングを決定するために、経時的に腎組織細胞の回復を測定することをさらに含む。
【０１３８】
本発明はまた、腎尿細管障害モデルを作製する方法も提供し、この方法は、腎組織の第1の層を腎組織の第2の層と接触させることによって、人工の三次元生体腎尿細管障害モデルを形成することを含む。ただし、腎組織の第1の層が腎間質組織を含み、腎組織の第2の層が上皮組織を含み、少なくとも1つの腎組織層が罹患細胞を有するバイオインクを含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、バイオインクの罹患細胞は、疾患に特異的な遺伝子改変細胞を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は遺伝子改変幹細胞である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、トランスポーター、レトロウイルス、CRISPR、ウイルストランスダクション、化学的突然変異誘発、またはそれらの任意の組み合わせにおける多嚢胞性突然変異(polycystic mutation)を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、バイオインクの罹患細胞は、特定の疾患を有するドナーから単離された細胞を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ドナーは、特定の疾患に対応する遺伝的機能障害を有する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ドナーから単離された細胞は人工多能性幹細胞である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、少なくとも第2の腎組織層は、罹患細胞を有するバイオインクを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、腎間質組織は、腎線維芽細胞および内皮細胞を含み、腎上皮組織は、腎尿細管上皮細胞を含む。
【０１４７】
本発明はまた、腎尿細管障害モデルを作製する方法を提供し、この方法は、所望の腎尿細管障害に特徴的な表現型を生成するために、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルをコンディショニングすることを含む。ここで、腎尿細管モデルは、腎間質組織の層であって、腎間質組織が腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、層と、腎上皮組織の層であって、腎上皮組織が腎尿細管上皮細胞を含む、層と、を含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する。ただし、間質組織は間質バイオインクを含み、上皮組織は上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、所望の腎尿細管障害に特徴的な表現型を生じるように細胞を遺伝的に修飾することである。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、細胞は、トランスポーター、レトロウイルス、CRISPR、ウイルス形質導入、化学的突然変異誘発、またはそれらの任意の組み合わせにおける多嚢胞性突然変異誘発によって遺伝的に改変されている。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、人工の三次元生体腎尿細管モデルを、所望の腎尿細管障害に特徴的な表現型を誘導することができる剤と接触させることを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、剤は毒物である。いくつかの実施形態では、毒物は、以下：抗感染剤、抗生物質、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンB、アミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、ゾレドロネート、またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つまたは複数を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、剤はグルコースである。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、剤は微生物である。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、微生物は、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、または蠕虫である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、剤は炎症刺激剤である。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、人工の三次元生体腎尿細管モデルに対して酸素を減少させることである。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、人工の三次元生体腎尿細管モデルに放射線を照射することである。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は糖尿病状態によって引き起こされる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、糖尿病状態は2型糖尿病である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、高濃度のグルコース、高血圧、またはそれらの任意の組み合わせを適用することである。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、腎障害を引き起こすことである。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、発癌物質を適用することである。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、炎症を引き起こすことである。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、人工の三次元生体腎尿細管モデルへの血液供給を減少させることである。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、ミトコンドリアに変化を適用することである。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、細胞形態を変化させることである。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、過剰増殖である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、エピジェネティック修飾である。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、結晶を析出させることである。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、結晶は、以下：コレステロール結晶、コレステロール尿酸一ナトリウム、シュウ酸カルシウム、リン酸カルシウムヒドロキシアパタイト、2，8-ジヒドロキシアデニン、ウロモジュリン、ミオグロビン-ウロモジュリン、インジナビル、アシクロビル、ポリミキシン(たとえば、ポリスポリン、ネオスポリン、ポリミキシンB、またはポリミキシンE)、スルファジアジン、システイン、尿酸、またはリン酸アンモニウムマグネシウムのうちの1つまたは複数である。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、コンディショニング段階は、タンパク質、塩、または他の沈殿物質(precipitous matter)の蓄積である。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、所望の腎尿細管障害は急性腎障害である。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、所望の腎尿細管障害は慢性腎障害である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、所望の腎尿細管障害は腎臓癌である。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、急性腎障害は慢性腎障害から生じる。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図1A〜1Bは、NovoGen  Bioprinter(登録商標)装置でプリントされたPT尿細管間質界面の3Dモデルを示す。図1Aは、上皮単層を支持する基底膜の下にある多細胞間質層を示す概略図である。図1Bは、24ウェルプレートにおけるTranswellインサート上に配置された3D PT組織の巨視的図である。
【図２】図2A〜2Fは、3D PT組織の組織学的特徴付けを示す顕微鏡写真である。14日間培養した組織の代表的な画像を示す。図2Aは、間質層および上皮層の完全に細胞の組織および組織化を示すH＆E染色の顕微鏡写真を示す。図2Bは、組織全体へのコラーゲンの沈着を示すゴモリ(Gomori)のトリクローム染色の顕微鏡写真を示す。図2Cは、広範囲の内皮細胞系のネットワークを示す間質層を示す顕微鏡写真を示す(赤、CD31)。図2Dは、腎臓近位尿細管上皮細胞(RPTEC)が単層を形成し、サイトケラチン18を発現することを示す顕微鏡写真を示す(赤)。図2Eは、コラーゲンIVに富む基底膜が上皮細胞の下にあり、E-カドヘリンが細胞間のタイトな結合に局在化することを示す顕微鏡写真を示す(赤色、コラーゲンIV；緑色、E-カドヘリン)。図2Fは、Na＋K＋ATPアーゼがRPTECの側底膜に局在することを示す顕微鏡写真を示す。
【図３】図3A〜3Bは、3D PT組織の生存能力および代謝活性を経時的に示すグラフである。図3Aは、alamarBlueの減少によって評価された3D組織の代謝活性を示すグラフである。示したデータは、経時的な相対蛍光を表す。図3Bは、3D PT組織(青色)または3D間質のみの組織(黒色)におけるGGT機能を示すグラフである。示したデータは、標準曲線から計算されたmIU／mlでの平均GGT活性の標準偏差を表す。示したデータは、少なくとも9つの独立した組織サンプルからの二重の測定の平均±平均の標準誤差である。
【図４】図4A〜図4Bは、3D PT組織におけるRAS経路成分活性を示す棒グラフである。図4Aは、4日間または14日間培養した3D PT組織からの上清および溶解物中のACEの発現レベルを示す棒グラフである。図4Bは、外因性アンジオテンシンIのACE媒介変換後のアンジオテンシンIIの検出を示す棒グラフである。示されるデータは、3つの独立した組織試料からの二重の測定の平均±平均の標準誤差である。
【図５】図5A〜5Bは、SGLT2トランスポーターの局在化および機能をそれぞれ示す顕微鏡写真および棒グラフである。図5Aは、培養14日後にSGLT2に対する抗体(緑色)で染色した3D PT組織を示す。図5Bは、グルコース取り込み誘導剤インスリンまたはSGLT2阻害剤カナルグリフロジン(Cana)の存在下または非存在下で、比色アッセイにおいて組織を非代謝性グルコースアナログ2-DGの保持について評価したときの結果を示す。飢餓状態の組織は、バーの青いファミリーにより示される。示されるデータは、6つの独立した組織サンプルにわたる三重の測定の平均±平均の標準誤差である。＊は、一元配置分散分析(one-way ANOVA)によって比較したグループ間のp＜0.05を示す。
【図６】図6A〜6Eは、P-gp輸送体の局在および機能を示す顕微鏡写真およびグラフ(図6E)である。図6Aは、培養14日後にP-gpに対する抗体(緑色)で染色された3D PT組織を示す。組織を、5μMゾスキダル単独(図6B)、10μMローダミン123(図6C)、またはローダミン123＋ゾスキダルに2時間曝露もした(図6D)。組織をスナップ固定し、凍結切片化し、そして全ての組織を同じ曝露時間で画像化した。図6Eは、図6B〜6Dで定量された蛍光強度を示すグラフである。示されるデータは、少なくとも6つの独立した組織サンプルからの二重の測定値の平均±平均の標準誤差を表す。＊は、一元配置分散分析によるグループ間のp＜0.05を示す。
【図７】図7Aおよび7Bは、シスプラチンが3D PT組織における全体的な生存能力および上皮機能を低下させることを示すグラフである。組織を漸増用量のシスプラチンで7日間、毎日処置した。図7Aは、alamarBlue代謝によって測定された全体的な組織生存能力を示すグラフである。示されるデータは、3つの個々の組織からの二連の測定値を示している。＊は、一元配置分散分析およびダネットの事後検定(Dunnett's post-test)によるビヒクル対照と比較したp＜0.05を示す。図7Bは、GGT活性によって評価された上皮生存能力を示すグラフである。示されるデータは、3つの独立した組織サンプルからの二重測定の平均±平均の標準誤差である。＊は、一元配置分散分析およびダネットの事後検定によるビヒクル対照と比較したp＜0.05を示す。
【図８】図8A〜8Cは、OCT2阻害によるシスプラチン誘発毒性の救出を示すグラフである。3D PT組織に、ビヒクル、シメチジン単独、5μMシスプラチン、またはシメチジンを伴うシスプラチンを7日間毎日投与した。図8Aは、全体的な組織代謝活性のalamarBlue分析を示す。図8Bは、上皮特異的機能の尺度としてのGGT活性を示す。図8Cは、毒性の尺度としての毎日のLDH放出を示す。各グラフについて、示されるデータは、3つの独立した組織サンプルからの二重測定の平均±平均の標準誤差を表す。＊は、一元配置または二元配置分散分析(one-way or two-way ANOVA)による評価で比較した、群間のp＜0.05を示す。図8Cにおいて、黒＊は、比較する群間と比較したp＜0.05を示す。色付きの星は、ビヒクルと比較した状態についてp＜0.05を示す。
【図９】図9A〜9Dは、シスプラチン毒性の組織学的分析を示す顕微鏡写真である。代表的なH＆E画像は、ビヒクル(図9A)、1mMシメチジン(図9B)、5μMシスプラチン(図9C)、または5μMシスプラチン＋1mMシメチジン(図9D)を7日間毎日投与した組織について示す。
【図１０】図10A〜10Dは、損傷に対する応答におけるRPTECの増殖を示す顕微鏡写真である。組織に、ビヒクル(図10A)、2.5μMシスプラチン(図10B)、5μMシスプラチン(図10C)、または5μMシスプラチン＋1mMシメチジン(図10D)を7日間、毎日投与し、そして、増殖細胞核抗原(PCNA)に対する抗体で染色した。増殖中の細胞は白い矢印でマークされる。
【図１１】図11A〜11Eは、2D初代ヒトRPTECについてのトランスポーター遺伝子発現および細胞形態を示す棒グラフ(図11A)および顕微鏡写真である。図11Aは、初代RPTECの4つの異なる市販のソースについてのP-gp、BCRP、メガリン、キュビリン、SGLT2、OAT1、OAT3、OCT2およびMATE1の相対的発現レベルを示す。図11B〜11Eは、市販の初代RPTECの代表的な顕微鏡写真を示す。
【図１２】図12A〜12Dは、ExVive(商標)腎組織の組織学的特徴付けを示す顕微鏡写真である。図12Aは、28日後の20倍の倍率での未処理組織の細胞形態を示す。図12Bは、20倍の倍率での28日後(培養14日および処理14日)に10g／Lのグルコースで処理した組織の細胞形態を示す。図12Cは、28日後の40倍の倍率での未処理組織の細胞形態を示す。図12Dは、40倍の倍率での28日後に10g／Lのグルコースで処理した組織の細胞形態を示す。上皮層中のグリコーゲン化核(glycogenated nuclei)は、図12Bおよび12Dに矢印で示される。図12Dの挿入図は、図中の最も右の矢印で示される細胞の拡大図である。
【図１３】図13A〜13Cは、ExVive(商標)腎組織の組織学的特徴付けを示す顕微鏡写真である。図13Aは未処理組織の細胞形態を示す。図13Bは、腎毒性剤で処理した組織の細胞形態を低倍率で示す。図13Cは、腎毒性剤で処理した組織の細胞形態をより高い倍率で示す。図13Bおよび13C中の矢印は、組織内のシュウ酸カルシウム沈着を示す。
【図１４】図14A〜14Bは、TGFβで処置した腎線維症誘発ExVive(商標)ヒト腎組織における生存能力および上皮細胞機能を示すグラフである。図14Aは、TGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織の生存能力を示す。図14Bは、TGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織における上皮細胞機能を示す。
【図１５】図15は、TGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織において、TGFβが線維症関連遺伝子発現を誘導することを示す棒グラフである。
【図１６Ａ】図16A〜図16Eは、TGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織において、TGFβが組織の肥厚化および細胞外マトリックス沈着の増加を誘導することを示す顕微鏡写真である。図16Aは、対照ビヒクルの顕微鏡写真である。
【図１６Ｂ】図16A〜図16Eは、TGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織において、TGFβが組織の肥厚化および細胞外マトリックス沈着の増加を誘導することを示す顕微鏡写真である。図16Bは、0.37ng／mLのTGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織の顕微鏡写真である。
【図１６Ｃ】図16A〜図16Eは、TGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織において、TGFβが組織の肥厚化および細胞外マトリックス沈着の増加を誘導することを示す顕微鏡写真である。図16Cは、1.1ng／mLのTGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織の顕微鏡写真である。
【図１６Ｄ】図16A〜図16Eは、TGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織において、TGFβが組織の肥厚化および細胞外マトリックス沈着の増加を誘導することを示す顕微鏡写真である。図16Dは、3.3ng／mLのTGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織の顕微鏡写真である。
【図１６Ｅ】図16A〜図16Eは、TGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織において、TGFβが組織の肥厚化および細胞外マトリックス沈着の増加を誘導することを示す顕微鏡写真である。図16Eは、10ng／mLのTGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織の顕微鏡写真である。
【図１６Ｆ】図16A〜図16Eは、TGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織において、TGFβが組織の肥厚化および細胞外マトリックス沈着の増加を誘導することを示す顕微鏡写真である。図16Fは、TGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織において、TGFβが組織肥厚および細胞外マトリックス沈着の増加を誘導することを示す棒グラフである。
【図１７】図17は、ExVive(商標)ヒト腎組織によるシスプラチン処置後の可溶性サイトケラチン18(CK18)の増加を示す顕微鏡写真である。
【図１８Ａ】P-gp発現について、LC-MS／MSによりトランスポーター発現について分析されたヒト腎皮質サンプル(KT1およびKT2)、ExVive(商標)ヒト腎組織(3D-1および3D-2)、およびプレーティングされた2D  RPTEC細胞(2D  RPTEC  lot1105)を示すグラフである。
【図１８Ｂ】MATE1発現について、LC-MS／MSによりトランスポーター発現について分析されたヒト腎皮質サンプル(KT1およびKT2)、ExVive(商標)ヒト腎組織(3D-1および3D-2)、およびプレーティングされた2D  RPTEC細胞(2D  RPTEC  lot1105)を示すグラフである。
【図１８Ｃ】OAT2発現について、LC-MS／MSによりトランスポーター発現について分析されたヒト腎皮質サンプル(KT1およびKT2)、ExVive(商標)ヒト腎組織(3D-1および3D-2)、およびプレーティングされた2D  RPTEC細胞(2D  RPTEC  lot1105)を示すグラフである。
【図１８Ｄ】OAT1発現について、LC-MS／MSによりトランスポーター発現について分析されたヒト腎皮質サンプル(KT1およびKT2)、ExVive(商標)ヒト腎組織(3D-1および3D-2)、およびプレーティングされた2D  RPTEC細胞(2D  RPTEC  lot1105)を示すグラフである。
【図１８Ｅ】MATE2発現について、LC-MS／MSによりトランスポーター発現について分析されたヒト腎皮質サンプル(KT1およびKT2)、ExVive(商標)ヒト腎組織(3D-1および3D-2)、およびプレーティングされた2D  RPTEC細胞(2D  RPTEC  lot1105)を示すグラフである。
【図１８Ｆ】OAT4発現について、LC-MS／MSによりトランスポーター発現について分析されたヒト腎皮質サンプル(KT1およびKT2)、ExVive(商標)ヒト腎組織(3D-1および3D-2)、およびプレーティングされた2D  RPTEC細胞(2D  RPTEC  lot1105)を示すグラフである。
【図１８Ｇ】OAT3発現について、LC-MS／MSによりトランスポーター発現について分析されたヒト腎皮質サンプル(KT1およびKT2)、ExVive(商標)ヒト腎組織(3D-1および3D-2)、およびプレーティングされた2D  RPTEC細胞(2D  RPTEC  lot1105)を示すグラフである。
【図１８Ｈ】OCT2発現について、LC-MS／MSによりトランスポーター発現について分析されたヒト腎皮質サンプル(KT1およびKT2)、ExVive(商標)ヒト腎組織(3D-1および3D-2)、およびプレーティングされた2D  RPTEC細胞(2D  RPTEC  lot1105)を示すグラフである。
【図１８Ｉ】BCRP発現について、LC-MS／MSによりトランスポーター発現について分析されたヒト腎皮質サンプル(KT1およびKT2)、ExVive(商標)ヒト腎組織(3D-1および3D-2)、およびプレーティングされた2D  RPTEC細胞(2D  RPTEC  lot1105)を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１７７】
発明の詳細な説明
特定の定義
他に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。 本明細書における「または」へのいかなる言及も、特に明記しない限り「および／または」を包含することを意図する。
【０１７８】
本明細書で用いる場合、「約」は示される値の±10％を意味する。たとえば、約10は9〜11を含む。
【０１７９】
本明細書に用いる場合、「アレイ」は、1つの試料に対して複数の試験を実施すること、複数の試料に対して1つもしくはそれより多い試験を実施すること、またはそれら両方、を許容するように空間的に配置された複数の要素の連合を含む科学的ツールを意味する。いくつかの実施形態では、複数の腎尿細管モデルが、アレイを形成するように構成される。いくつかの実施形態では、アレイは、中または高スループットスクリーニングに関連するものを含む、スクリーニング方法および装置に適合しているか、またはそれと適合性がある。さらなる実施形態では、アレイによって、複数の試験を同時に実施することが可能になる。さらなる実施形態では、アレイによって、複数の試料を同時に試験することが可能になる。いくつかの態様において、アレイは細胞のマイクロアレイである。さらなる実施形態では、細胞のマイクロアレイは、固体支持体の表面上の生細胞の多重検査を可能にするラボラトリーツールである。他の実施形態では、アレイは組織マイクロアレイである。さらなる実施形態において、組織マイクロアレイは、複数の生化学的分析、代謝的分析、分子的分析、または組織学的分析の実行を可能にするためにアレイにアセンブルされた複数の別々の組織または組織サンプルを含む(Murphy et al., 2013)。いくつかの実施形態において、アレイはマイクロタイタープレートのウェルに存在する。
【０１８０】
本明細書に用いる場合、「アッセイ」は、有機または生物学的サンプル(たとえば、細胞凝集体、組織、器官、生物など)中の物質(たとえば、化学物質、分子、生化学物質、タンパク質、ホルモン、または薬物など)の存在または活性を試験または測定するための手順を意味する。
【０１８１】
本明細書に用いる場合、「基底膜」とは、コラーゲンIV、ラミニン-エンタクチン／ニドジェン複合体、およびプロテオグリカンを含み得る細胞外マトリックスを意味する(Paulsson, 1992)。
【０１８２】
本明細書に用いる場合、「生体適合性膜」は、組織に対して毒性でない膜を意味する。
【０１８３】
本明細書で使用する「バイオインク」とは、バイオプリンティングにおいて使用するための液体、半固体、または固体の組成物を意味する。一部の態様において、バイオインクは、細胞溶液、細胞凝集物、細胞を含むゲル、多細胞体、または組織を含む。一部の態様において、バイオインクは、バイオプリンティングを可能にする特定の生化学的特性を提供する非細胞材料をさらに含む。一部の態様において、バイオインクは押出材料を含む。場合によっては、押出材料はバイオプリンティングプロセス後に取り除かれるように操作される。他の態様において、プリント後に、押出材料の少なくとも、ある部分は細胞と一緒に混入されたままであり、取り除かれない。間質バイオインクは、間質に由来する少なくとも1種類の細胞、例えば、線維芽細胞、間葉系細胞、または間質特徴をもつように誘導された多能性細胞を含む。上皮バイオインクは、近位尿細管細胞を含む少なくとも1種類の上皮細胞タイプを含む。
【０１８４】
本明細書で使用する「バイオプリンティング」とは、自動または半自動のコンピュータ支援三次元プロトタイピング装置(例えば、バイオプリンター)と適合する方法を介した、細胞(例えば、細胞溶液、細胞含有ゲル、細胞懸濁液、細胞濃縮物、多細胞凝集物、多細胞体など)の三次元の正確な付着を利用することを意味する。適切なバイオプリンターには、Organovo, Inc.(San Diego, CA)のNovogen Bioprinter(登録商標)、ならびに米国特許第9,149,952号および米国特許出願公開第2015/0093932、2015/0004273、2015/0037445が含まれる。
【０１８５】
本明細書中に用いる場合、「線維性組織」とは、線維症を起こしている腎間質組織をいう(Farris and Colvin, 2012)。線維症は、腎間質に対する量的および質的変化の両方を含み得、複数の細胞外成分、ならびに種々の細胞型、たとえば、これらに限らないが、線維芽細胞、線維細胞、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、内皮細胞、および尿細管上皮細胞(Zeisberg and Kalluri, 2015; Farris and Colvin, 2012)。
【０１８６】
本明細書に用いる場合、「層」は、1つまたは複数の細胞の厚さである、XおよびY平面における細胞の会合を意味する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腎尿細管は一層を含む。他の実施形態では、本明細書に記載の腎尿細管は複数の層を含む。様々な実施形態において、層は、細胞の、近接する、実質的に近接する、または近接していないシートを形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腎尿細管の各層は、X、Y、およびZ軸に複数の細胞を含む。
【０１８７】
本明細書に用いる場合、「極性化(された)」は、空間的に非対称であることを意味する(Bryant and Mostov, 2008)。
【０１８８】
本明細書で使用する「スキャフォールド」とは、合成スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲル、非合成スキャフォールド、例えば、前もって形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および脱細胞化組織、ならびに人工の組織の物理構造に不可欠であり、かつ組織を損傷/破壊することなく組織から除去することができない他の任意のタイプの前もって形成されたスキャフォールドを指す。さらなる態様において、脱細胞化組織スキャフォールドには、脱細胞化天然組織、または任意の手法で培養細胞によって生成された脱細胞化細胞材料、例えば、生きている間に細胞層が産生した細胞外マトリックス(ECM)を残しながら、死滅させた、または脱細胞化した細胞層が含まれる。従って、「スキャフォールドレス(scaffoldless)」という用語は、前もって形成されたスキャフォールドが、使用時に、除去されているか、または人工の組織の不活性成分として残っているので、人工の組織の不可欠な部分ではないことを意味することが意図される。「スキャフォールドレス」は「スキャフォールドフリー」および「前もって形成されたスキャフォールドを伴わない」と同義に用いられる。
【０１８９】
本明細書で使用する「対象」とは、ヒト、霊長類、類人猿、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウマなどを含むが、これに限定されない任意の哺乳動物種の生物である。対象は、生きている任意の哺乳動物種でもよく、死んでいる任意の哺乳動物種でもよい。対象には、最近死んだ対象、または生きている対象から採取した生検試料が含まれる。
【０１９０】
本明細書で使用する「治療用物質」とは、疾患を治療するために認可されたか、疾患を治療するために研究されているか、または生物学的応答、例えば、DNA、RNA、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質の変化を誘発する、任意の分子、生物製剤、化合物、または組成物を意味する。
【０１９１】
本明細書に用いる場合、「組織」は細胞の凝集体を意味する。
【０１９２】
本明細書に用いる場合、「生存(可能)」とは、細胞の少なくとも50％が生存していることを意味する。他の実施形態では、生存可能な細胞は、少なくとも1つの生存能力の試験によって決定して、バイオインクまたは組織層中の少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、97％、またはそれを超える細胞である。生存能力についての試験は当技術分野において公知であり、製造元のプロトコルに従って行われるalamarBlue(商標)アッセイを含む(Thermo Fisher, Carlsbad, CA)。
【０１９３】
腎尿細管モデルの組成
一部の態様において、組織内の細胞は、尿細管間質組織界面の層構造を再現するように空間的に組織化される。極性化した尿細管上皮は、内皮細胞をベースとする微小血管網を含む腎間質組織の層の上に存在する。任意で、EPO産生細胞などの専門化した細胞が管周囲空間内に含まれる。一部の態様において、上皮は刷子縁を有するか、または発生する。
【０１９４】
特定の非限定的な態様において、本明細書に記載の人工の腎組織は、2つの主要な部分:1)成人腎線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)で構成される間質層と、2)正常ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞(RPTEC)、メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞(MDCK)、ラット初代RPTEC細胞、および/または不死化RPTEC細胞のいずれかで構成される極性化した上皮単層を含み、不死化は、任意で、hTERT不死化RPTEC細胞を形成するようにhTERTを遺伝子操作することによって成し遂げられる。前記細胞は、上皮層が間質層の頂端側にあるようにNovogen MMX Bioprinterを用いて付着される(図1Aを参照されたい)。時間が経つにつれて分解する温度応答性ヒドロゲル(Novogel(登録商標)2.0)と混合した細胞の空間的に制御された付着と、圧縮ガス推進(インクジェットスプレー)によるエアロゾル化細胞材料の付着を組み合わせることによって、構造が作り出される。この態様では、2つの層は一緒になって腎臓遠位尿細管の壁をモデル化する。この構成は、インビボ組織をモデル化し、天然の組織応答を予測するのに重大な意味をもつ。上皮層の応答は薬物、化学物質、または生物学的薬剤に対する天然の組織応答を予測し、毒性または効力に関する情報を提供する可能性がある。間質層は、上皮が正しく機能するのに重大な意味をもち、天然の組織線維症、特に、腎臓尿細管間質線維症のモデルとして役立つ。
【０１９５】
特定の態様では、連続付着法を用いて間質層がバイオプリントされる。この態様では、インクジェット付着法を用いて上皮層が間質層上にバイオプリントされる。実質的に連続した上皮層はインビボ組織と一致しており、生理学的な関連性のある構造を複製するのに欠くことができない。インクジェット付着法によって、1つまたは複数の薄い上皮細胞層を、間質層の潜在的に不規則な表面に付着させる能力が得られる。このような態様において、上皮層のインクジェット付着は、任意で、間質層をバイオプリントした直後に、または間質層が成熟した後に行われる。
【０１９６】
一部の態様において、前記細胞はバイオプリントされる。さらなる態様において、バイオプリントされた細胞は密着されて、人工の腎尿細管モデルを形成する。なおさらなる態様において、人工の腎尿細管モデルは、製作時または使用時に、前もって形成されたスキャフォールドを伴わないか、または実質的に伴わない。場合によっては、バイオプリンティングを用いると、天然組織の適切な細胞充実性を模倣する組織を製作することが可能になる。
【０１９７】
一部の態様において、本明細書に記載の人工の三次元腎尿細管モデルは、三次元である、前もって形成されたスキャフォールドを伴わない、細胞から本質的になる、および/または細胞密度が高い(例えば、細胞が30％超、細胞が40％超、細胞が50％超、細胞が60％超、細胞が70％超、細胞が80％超、細胞が90％超、もしくは細胞が95％超)という事実があるために、以前の技術によって製作された組織とは区別される。
【０１９８】
一部の態様において、本明細書に記載の人工の三次元腎尿細管モデルは、神経支配されていない(例えば、神経組織を実質的に伴わない)、成熟した脈管構造を実質的に伴わない、および/または血液成分を実質的に伴わないという事実があるために、天然(例えば、操作されていない)組織と区別される。例えば、様々な態様において、人工の三次元腎尿細管モデルは、血漿、赤血球、血小板など、および/または内因的に生じた血漿、赤血球、血小板などを伴わない。ある特定の態様において、人工の腎尿細管モデルには、免疫細胞、例えば、T細胞、B細胞、マクロファージ、樹状細胞、好塩基球、マスト細胞、または好酸球を伴わない。一部の態様において、前記モデルは、天然の腎臓近位尿細管のように管の形をしておらず、平ら、またはシート状である。これにより、都合良く、インビトロアッセイおよび分析をすることが可能になる。一部の態様において、線維芽細胞は腎臓由来でない。一部の態様において、内皮細胞は腎臓由来でない。一部の態様において、上皮細胞はヒト由来でない。ある特定の態様において、人工の腎尿細管モデルは未分化細胞を伴わない。ある特定の態様において、人工の腎尿細管モデルは未分化腎臓細胞を伴わない。一部の態様において、本明細書に記載の人工の三次元腎尿細管モデルは平らであるか、または実質的に平らである点で天然腎尿細管組織と区別される。ある特定の態様において、本明細書に記載の人工の三次元腎尿細管モデルは天然腎尿細管組織より優れた機能的改善を有する。一例は、培養が長期間続いた後に、培養状態で少なくとも7日間、10日間、または27日間たつまで生存能力が高いことである。一部の態様において、腎尿細管モデルにおいて用いられる細胞は形質転換されているか、または不死化されている。一部の態様において、腎尿細管モデルにおいて用いられる細胞はトランスジェニックであり、EGFP、GFP、RFP、YFP、またはCFPのような蛍光タンパク質とのタンパク質融合を含有する。一部の態様において、腎尿細管モデルにおいて用いられる細胞はトランスジェニックであり、EGFP、GFP、RFP、YFP、GFPのような蛍光タンパク質、またはホタルルシフェラーゼもしくはウミシイタケ(renilla)ルシフェラーゼのような発光タンパク質を用いたレポーター構築物を含有する。ある特定の態様において、前記細胞はいずれも、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個の遺伝子、またはそれより多くの遺伝子の欠失または挿入を含有する。一部の態様において、3D腎尿細管モデルはキメラであり、少なくとも1つの細胞は、3D腎尿細管モデルの他の細胞とは異なる哺乳動物種に由来する。一部の態様において、3D腎尿細管モデルはキメラであり、少なくとも1つの細胞は。3D腎尿細管モデルの他の細胞とは異なるヒトドナーに由来する。
【０１９９】
細胞インプット
一部の態様において、本明細書に記載の人工の組織、アレイ、および方法は複数の細胞タイプを含む。一部の態様において、腎尿細管モデルは、哺乳動物線維芽細胞および哺乳動物内皮細胞を含む間質組織の層を含む。様々な態様において、適切な内皮細胞はヒト臍帯静脈(HUVEC)、ヒト初代、ヒト腎臓に由来するか、または人工多能性幹細胞(iPS)もしくはヒト胚性幹細胞(hES)の方向付けられた分化に由来する。一部の態様において、線維芽細胞は腎間質線維芽細胞である。様々な態様において、適切な腎間質線維芽細胞は、ヒト腎臓から単離された初代細胞に由来する。一部の態様において、線維芽細胞は起源が真皮または血管である。一部の態様において、細胞成分の1つまたは複数は非ヒト哺乳動物に由来する。一部の態様において、間質組織は腫瘍細胞または癌細胞を含む。一部の態様において、間質組織の層は実質的に単層である。一部の態様において、間質組織の層は、その表面積の95％を覆う単層を含む。一部の態様において、間質組織の層は、その表面積の90％を覆う単層を含む。一部の態様において、間質組織の層は、その表面積の80％を覆う単層を含む。一部の態様において、間質組織の層は1個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は2個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は3個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は4個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は5個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は10個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は20個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は50個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は100個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層の厚さは2〜100個の細胞である。一部の態様において、間質組織の層は20μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は30μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は40μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は50μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は100μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は200μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は500μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は600μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は1000μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は20μm〜1000μm厚である。一部の態様において、間質組織の層は20μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は30μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は40μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は50μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は100μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は200μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は500μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は600μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は1000μm厚未満である。
【０２００】
一部の態様において、腎尿細管モデルは、哺乳動物上皮細胞を含む上皮組織の層を含む。さらなる態様において、上皮細胞は腎尿細管上皮細胞(例えば、近位尿細管上皮細胞)である。なおさらなる態様において、適切な腎尿細管上皮細胞は初代分離細胞であるか、または幹細胞の方向付けられた分化から得られた(人工多能性幹細胞(iPS)由来および/もしくはヒト胚性幹細胞(hES)由来)細胞である。一部の態様において、腎尿細管上皮細胞はメイディン・ダービー・イヌ腎臓(MDCK)細胞である。一部の態様において、腎尿細管上皮細胞は不死化ヒト細胞である。他の態様において、腎尿細管上皮細胞は、hTERT-RPTEC細胞、HK-2細胞、LLC-PK1細胞、またはOK細胞などの不死化細胞である。一部の態様において、上皮細胞は、例えば、ラット、マウス、ブタ、または霊長類などの非ヒト哺乳動物に由来する。一部の態様において、上皮組織の層は腎尿細管上皮細胞から本質的になる。一部の態様において、上皮組織の層は初代腎尿細管上皮細胞から本質的になる。一部の態様において、上皮組織の層は腎臓近位尿細管上皮細胞から本質的になる。一部の態様において、上皮組織の層は初代腎臓近位尿細管上皮細胞から本質的になる。一部の態様において、腎上皮組織の層は実質的に単層である。一部の態様において、腎上皮組織の層に存在する細胞は腎尿細管上皮細胞のみである。一部の態様において、上皮組織の層は腫瘍細胞を含む。一部の態様において、上皮組織の層は腎細胞癌細胞を含む。一部の態様において、上皮組織の層は、その表面積の95％を覆う単層を含む。一部の態様において、上皮組織の層は、その表面積の90％を覆う単層を含む。一部の態様において、上皮組織の層は、その表面積の80％を覆う単層を含む。一部の態様において、上皮組織の層は1個の細胞より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は2個の細胞より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は3個の細胞より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は4個の細胞より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は5個の細胞より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は10個の細胞より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は20個の細胞より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は50個の細胞より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は100個の細胞より厚い。一部の態様において、上皮組織の層の厚さは2〜100個の細胞である。一部の態様において、上皮組織の層は20μm厚より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は30μm厚より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は40μm厚より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は50μm厚より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は100μm厚より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は200μm厚より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は500μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は600μm厚より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は1000μm厚より厚い。一部の態様において、上皮組織の層は20〜1000μm厚である。一部の態様において、上皮組織の層は1000μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は600μm厚未満である。一部の態様において、上皮組織の層は500μm厚未満である。一部の態様において、上皮組織の層は200μm厚未満である。一部の態様において、上皮組織の層は100μm厚未満である。一部の態様において、上皮組織の層は50μm厚未満である。一部の態様において、上皮組織の層は40μm厚未満である。一部の態様において、上皮組織の層は30μm厚未満である。一部の態様において、上皮組織の層は20μm厚未満である。
【０２０１】
任意で、腎尿細管モデルは他の細胞タイプ(例えば、EPO産生細胞、免疫細胞など)を含む。一部の態様において、免疫細胞はT細胞である。一部の態様において、免疫細胞はB細胞である。一部の態様において、免疫細胞はNK細胞である。一部の態様において、免疫細胞は樹状細胞である。一部の態様において、免疫細胞はマクロファージ細胞である。
【０２０２】
広範囲の細胞比が適している。一部の態様において、上皮層は近位尿細管上皮細胞を含むか、近位尿細管上皮細胞からなるか、または近位尿細管上皮細胞から本質的になる。一部の態様において、腎間質層に存在する細胞は線維芽細胞および内皮細胞のみである。一部の態様において、腎間質層は線維性組織をさらに含む。一部の態様において、間質層は、特定の比の線維芽細胞および内皮細胞を含むか、特定の比の線維芽細胞および内皮細胞からなるか、または特定の比の線維芽細胞および内皮細胞から本質的になる。適切な割合の線維芽細胞は、非限定的な例として、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、および95％の線維芽細胞を含み、その中の増加分を含む。適切な割合の内皮細胞は、非限定的な例として、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、および95％の内皮細胞を含み、その中の増加分を含む。ある特定の態様において、間質層は、指定された線維芽細胞:内皮細胞比を含むか、指定された線維芽細胞:内皮細胞比から本質的になるか、または指定された線維芽細胞:内皮細胞比からなる。ある特定の態様において、線維芽細胞:内皮細胞比は、少なくとも5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:65、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、または95:5であり、その中の増加分を含む。ある特定の態様において、線維芽細胞:内皮細胞比は、5:95〜95:5である。ある特定の態様において、線維芽細胞:内皮細胞比は、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:65、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、または95:5を超えないものであり、その中の増加分を含む。ある特定の態様において、線維芽細胞:内皮細胞比は約50:50である。ある特定の態様において、線維芽細胞:内皮細胞比は約60:40〜約40:60である。
【０２０３】
広範囲の細胞濃度がバイオインクに適している。バイオインクは、非限定的な例として、バイオインク1ミリリットルあたり、約100万個、200万個、300万個、400万個、500万個、600万個、700万個、800万個、900万個、1000万個、2000万個、3000万個、4000万個、5000万個、6000万個、7000万個、8000万個、9000万個、1億個、1億1000万個、1億2000個、1億3000万個、1億4000万個、1億5000万個、1億6000万個、1億7000万個、1億8000万個、1億9000万個、2億個、2億2500万個、2億5000万個、2億7500万個、3億個、またはそれより多い細胞を含む細胞濃度を用いて、連続付着バイオプリンティング法のために適切に調製される。特定の態様において、連続付着バイオプリンティングのために調製されたバイオインクは約100万〜2億個の細胞/mLを含む。バイオインクは、非限定的な例として、バイオインク1ミリリットルあたり、約25万個、50万個、100万個、200万個、300万個、500万個、1000万個、1500万個、またはそれより多い細胞を含む細胞濃度を用いて、インクジェット付着バイオプリンティング法のために適切に調製される。特定の態様において、インクジェット付着バイオプリンティングのために調製されたバイオインクは約100万個〜500万個の細胞/mLを含む。特定の態様において、インクジェット付着バイオプリンティングのために調製されたバイオインクは約100万〜400万個の細胞/mLを含む。特定の態様において、インクジェット付着バイオプリンティングのために調製されたバイオインクは約100万〜300万個の細胞/mLを含む。特定の態様において、インクジェット付着バイオプリンティングのために調製されたバイオインクは約100万〜200万個の細胞/mLを含む。
【０２０４】
ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり5000万〜10億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり5000万〜9億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり5000万〜8億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり5000万〜7億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり5000万〜6億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり5000万〜5億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり5000万〜4億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり5000万〜3億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり5000万〜2億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり7500万〜6億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり1億〜6億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり1億〜5億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり1億〜4億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり1億〜3億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり1億〜2億個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは1ミリリットルあたり1億〜1億5000万個の細胞を含む。
【０２０５】
ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり25万〜500万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり25万〜400万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり25万〜300万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり25万〜200万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり25万〜100万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり50万〜500万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり50万〜400万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり50万〜300万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり50万〜200万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり50万〜100万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり100万〜500万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり100万個〜400万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり100万個〜300万個の細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは1ミリリットルあたり100万個〜200万個の細胞を含む。
【０２０６】
ある特定の態様において、上皮バイオインクの密度は間質バイオインクの密度より小さい。ある特定の態様において、間質バイオインクの密度と上皮バイオインクの密度の比は、約300:1;約275:1;約250:1;約225:1;約200:1;約175:1;約150:1、約125:1;約100:1、約75:1、または約50:1である。ある特定の態様において、間質バイオインクの密度と上皮バイオインクの密度の比は約300:1〜約50:1である。ある特定の態様において、間質バイオインクの密度と上皮バイオインクの密度の比は約250:1〜約75:1である。ある特定の態様において、間質バイオインクの密度と上皮バイオインクの密度の比は約200:1〜約75:1である。ある特定の態様において、間質バイオインクの密度と上皮バイオインクの密度の比は約150:1〜約75:1である。ある特定の態様において、間質バイオインクの密度と上皮バイオインクの密度の比は約125:1〜約75:1である。
【０２０７】
ある特定の態様において、バイオインクは粘性液体である。ある特定の態様において、バイオインクは半固体である。ある特定の態様において、バイオインクは固体である。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は100センチポアズより大きい。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は200センチポアズより大きい。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は500センチポアズより大きい。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は1,000センチポアズより大きい。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は2,000センチポアズより大きい。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は5,000センチポアズより大きい。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は10,000センチポアズより大きい。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は20,000センチポアズより大きい。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は50,000センチポアズより大きい。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は100,000センチポアズより大きい。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は100センチポアズ未満である。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は200センチポアズ未満である。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は500センチポアズ未満である。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は1,000センチポアズ未満である。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は2,000センチポアズ未満である。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は5,000センチポアズ未満である。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は10,000センチポアズ未満である。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は20,000センチポアズ未満である。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は50,000センチポアズ未満である。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は100,000センチポアズ未満である。ある特定の態様において、バイオインクの粘度は100〜100,000センチポアズである。
【０２０８】
腎尿細管モデルの構造特徴
本開示の腎尿細管モデルは数多くの構成で構造的に配置することができる。ある特定の態様において、上皮組織層および間質組織層は、直接接触している別々の構造的に異なる層であるか、または1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm分だけ、もしくはそれより長く、この中の増加分を含めて分離されている別々の構造的に異なる層である。ある特定の態様において、この分離は、2つの層の間に細胞外マトリックスが分泌および付着されたことによるものであり、本開示の目的では接触しているとみなされる。正常な生理学的組織では、細胞および細胞層は頂端(内腔に面する)面と、他の細胞または組織マトリックスに面する側底面を有するように極性化している。本明細書において開示された腎尿細管モデルの目的では、側底面とは、別の細胞、細胞外マトリックス、または生体適合膜もしくは培養容器の表面に面している面を指す。本明細書において開示された腎尿細管モデルの目的では、頂端面とは、生体適合膜もしくは培養容器の表面から離れた所に面している面を指す。ある特定の態様において、腎尿細管上皮細胞は極性化している。ある特定の態様において、腎間質組織の層は、頂端面と側底面とを有する。
【０２０９】
ある特定の態様において、腎尿細管モデルは、生体適合膜をさらに含む。ある特定の態様において、間質組織層の側底面は、生体適合膜もしくは培養容器に取り付けられた面であり、間質組織層の頂端面は、生体適合膜にも培養容器にも取り付けられていない面である。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面に付着されるか、または間質組織層の頂端面に層を形成し、従って、2つの構造的に異なる層が形成される。ある特定の態様において、上皮組織層および間質組織層は途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の99％〜100％は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の95％〜100％は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の90％〜100％は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の50〜99％は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の80％〜100％は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の70％〜100％は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の60％〜100％は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の50％〜100％は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の99％未満は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の98％未満は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の97％未満は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の95％未満は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の90％未満は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の80％未満は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面を完全に覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の99％〜100％を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の95％〜100％を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の90％〜100％を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の80％〜100％を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の70％〜100％を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の60％〜100％を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の50％〜100％を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の99％未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の98％未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の97％未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の95％未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の90％未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の80％未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の70％未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の50〜99％を覆う。
【０２１０】
上皮組織層の構造
通常、上皮組織細胞は、隣接する細胞と密着結合を形成する。密着結合は、膜貫通タンパク質ファミリーであるカドヘリンを特徴とする。これらの1つであるE-カドヘリンは腎組織にある密着結合において特に顕著であり、密着結合の形成を特徴とする。ある特定の態様において、上皮組織層は、密着結合を形成する細胞からなる。ある特定の態様において、上皮組織層にある実質的に全ての細胞が、少なくとも1つの隣接する細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の99％〜100％が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の95％〜100％が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の90％〜100％が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の80％〜100％が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の70％〜100％が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の60％〜100％が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の50％〜100％が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の50％〜99％が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。
【０２１１】
細胞層の生存能力および密度
本開示の方法によるバイオプリンティングの利点は高い密度および高い生存能力で細胞をプリントできることである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は1x106細胞/mLを上回る。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも5x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも10x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも20x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも50x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも100x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも200x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも500x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は約100x106細胞/mL〜約900x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は約100x106細胞/mL〜約700x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は約100x106細胞/mL〜約600x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は約100x106細胞/mL〜約500x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は約100x106細胞/mL〜約300x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は約100x106細胞/mL〜約200x106細胞/mLである。ある特定の態様において、腎間質組織層または腎上皮組織層は生細胞の70〜100体積％である。ある特定の態様において、間質組織層の生存能力は99体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存能力は95体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存能力は90体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存能力は80体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存能力は70体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存能力は60体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存能力は50体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存能力は50〜99体積％生細胞である。ある特定の態様において、この生存能力は、プリンティング後、少なくとも8時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、またはそれより長く維持される。ある特定の態様において、この生存能力は、プリンティング後、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、21日、またはそれより長く維持される。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも1x105細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも2x105細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも5x105/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも1x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも5x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも10x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも20x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも50x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも100x106細胞/mLである。ある特定の態様に��いて、上皮細胞層の密度は少なくとも200x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも500x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は1x105/mL未満である。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は2x105/mL未満である。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は5x105/mL未満である。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は1x106細胞/mL未満である。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は5x106細胞/mL未満である。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は10x106細胞/mL未満である。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は10x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮組織層の生存能力は99体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存能力は95体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存能力は90体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存能力は80体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存能力は70体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存能力は60体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存能力は50体積％生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存能力は50〜99体積％生細胞である。ある特定の態様において、この生存能力は、プリンティング後、少なくとも8時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間にわたって維持される。ある特定の態様において、この生存能力は、プリンティング後、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日にわたって維持される。
【０２１２】
組織構造の均一性
本開示の方法を用いるバイオプリンティングの1つの利点は、対応する組織において反映されるプロセスによって達成される高度の均一性である。特定の実施形態では、腎尿細管モデルの厚さは実質的に均一である。特定の実施形態では、腎尿細管モデルの99％〜100％が、腎尿細管モデルの全体の平均の厚さの±10％の範囲内である。特定の実施形態において、腎尿細管モデルの95％〜100％は、腎尿細管モデルの全体の平均の厚さの±10％の範囲内にある。特定の実施形態において、腎尿細管モデルの90％〜100％は、腎尿細管モデルの全体の平均厚さの±10％の範囲内である。特定の実施形態では、腎尿細管モデルの80％〜100％が、腎尿細管モデルの全体の平均の厚さの±10％の範囲内である。特定の実施形態において、腎尿細管モデルの70％〜100％は、腎尿細管モデルの全体の平均の厚さの±10％の範囲内にある。特定の実施形態では、腎尿細管モデルの99％〜100％が、腎尿細管モデルの全平均の厚さの20％±の範囲内にある。特定の実施形態において、腎尿細管モデルの95％〜100％は、腎尿細管モデルの全体の平均厚の±20％の範囲内である。特定の実施形態において、腎尿細管モデルの90％〜100％は、腎尿細管モデルの全体の平均の厚さの±20％の範囲内にある。特定の実施形態において、腎尿細管モデルの80％〜100％は、腎尿細管モデルの全体の平均厚の±20％の範囲内である。特定の実施形態において、腎尿細管モデルの70％〜100％は、腎尿細管モデルの全平均厚の±20％以内にある。潜在的な毒性剤での処置後、腎尿細管モデルは均一性が低下し得る。
【０２１３】
バイオインクおよび細胞層の非細胞成分
多くの場合、バイオプリントされる細胞またはバイオインクは、バイオプリンティングに対する適性を改善する賦形剤または押出材料を含有する。押出材料の例には、ゲル、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸ベースのゲル、界面活性剤ポリオール(例えば、Pluronic F-127またはPF-127)、温度応答性ポリマー、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、細胞外マトリックス成分(およびその誘導体)、コラーゲン、ゼラチン、他の生体適合性の天然ポリマーまたは合成ポリマー、ナノファイバー、ならびに自己組織化ナノファイバーが含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、押出材料は合成ポリマーを含有する。一部の態様において、押出材料は、哺乳動物組織に通常、関連しない非合成ポリマーを含有する。一部の態様において、押出材料は、バイオプリンティング後に、物理的手段、化学的手段、または酵素的手段によって除去される。一部の態様において、本開示のバイオインクは1重量％以上の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示の腎尿細管モデルは1重量％超の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示のバイオインクは5重量％未満の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示のバイオインクは0〜2重量％の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示のバイオインクは1重量％未満の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示の腎尿細管モデルは0〜5重量％の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示の腎尿細管モデルは2重量％未満の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示の腎尿細管モデルは1重量％未満の押出材料を含有する。一部の態様において、上皮バイオインクはヒドロゲルを伴わない。一部の態様において、上皮バイオインクは押出材料を伴わない。一部の態様において、上皮バイオインクは、賦形剤または押出材料として用いられる合成ポリマーを伴わない。一部の態様において、腎尿細管モデルは、賦形剤または押出材料として用いられる合成ポリマーを伴わない。一部の態様において、上皮細胞層は、賦形剤または押出材料として用いられる合成ポリマーを伴わない。一部の態様において、間質細胞層は、賦形剤または押出材料として用いられる合成ポリマーを伴わない。
【０２１４】
プリント表面
生体適合面に取り付けられた腎尿細管モデルが本明細書において提供される。ある特定の態様において、間質組織層は生体適合面にプリントされる。ある特定の態様において、生体適合面は、孔径が0.4μm〜10μmの膜である。ある特定の態様において、生体適合面の孔径は約1μmである。ある特定の態様において、生体適合面は、細胞付着または生存能力を改善する組成物でコーティングされる。ある特定の態様において、腎尿細管モジュールは6ウェルプレート、12ウェルプレート、24ウェルプレート、48ウェルプレート、96ウェルプレート、または384ウェルプレートの中にプリントされる。ある特定の態様において、腎尿細管モジュールは、直径が60mm、100mm、もしくは150mm、またはそれより大きい組織培養プレートの中にプリントされる。ある特定の態様において、腎尿細管モジュールは組織培養フラスコの中に、またはマイクロ流体チップ上にプリントされる。ある特定の態様において、腎尿細管モデルはTranswellインサートの中/上にプリントされる。
【０２１５】
腎尿細管モデルを作製するためのプロセス
本開示は、腎尿細管モデルを製作するための方法およびプロセスを助ける。ある特定の態様において、人工の三次元生体腎尿細管モデルの製品はバイオプリンティングのプロセスによって作製される。ある特定の態様において、人工の三次元生体腎尿細管モデルの製品の少なくとも1つの構成要素はバイオプリンティングのプロセスによって作製される。ある特定の態様において、人工の三次元生体尿細管モデルを製作するプロセスは、腎臓間質バイオインクを調製する工程であって、間質バイオインクが複数の間質細胞タイプを含み、間質細胞タイプが腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、工程;腎臓上皮バイオインクを調製する工程であって、上皮バイオインクが腎尿細管上皮細胞を含む、工程;腎臓間質バイオインクの層の少なくとも1つの表面に腎臓上皮バイオインクが層を形成するように腎臓間質バイオインクおよび腎臓上皮バイオインクを付着させる工程;ならびに、細胞を密着させて、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成するように、付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程を含む。ある特定の態様において、腎間質組織バイオインクは頂端面および側底面を有する腎間質組織の層を形成する。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは腎間質組織の層の頂端面と接触して付着される。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは腎尿細管上皮細胞から本質的になる。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは初代腎尿細管上皮細胞から本質的になる。ある特定の態様において、初代腎尿細管上皮細胞は、腎機能に影響を及ぼす疾患をもつ対象から単離されている。ある特定の態様において、初代腎尿細管上皮細胞は、多発性嚢胞腎をもつ対象から単離されている。ある特定の態様において、初代腎尿細管上皮細胞は、II型糖尿病をもつ対象から単離されている。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは腎細胞癌細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは単層で付着される。ある特定の態様において、腎間質組織バイオインクは単層で付着される。ある特定の態様において、腎上皮組織の層は腎間質組織の層と途切れることなく接触して付着される。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは、腎間質組織の層の頂端面を50％〜100％覆う層を形成する。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは、腎間質組織の層の頂端面を70％〜100％覆う層を形成する。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは、腎間質組織の層の頂端面を90％〜100％覆う層を形成する。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは、腎間質組織の層の頂端面を50％〜90％覆う層を形成する。ある特定の態様において、腎上皮層の腎上皮細胞の少なくとも50％は他の腎上皮細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、腎上皮層の腎上皮細胞の少なくとも70％は他の腎上皮細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、腎上皮層の腎上皮細胞の少なくとも90％は他の腎上皮細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、腎上皮層の腎上皮細胞の50〜90％は他の腎上皮細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、腎尿細管モデルは50〜500μm厚である。ある特定の態様において、腎尿細管モデルは約100μm厚である。あ���特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは押出材料をさらに含む。ある特定の態様において、線維芽細胞および内皮細胞は約95:5〜約5:95の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質バイオインクに存在する。ある特定の態様において、線維芽細胞および内皮細胞は約75:25〜約25:75の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質バイオインクに存在する。ある特定の態様において、線維芽細胞および内皮細胞は約60:40〜約40:60の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質バイオインクに存在する。ある特定の態様において、線維芽細胞および内皮細胞は、約50:50の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質バイオインクに存在する。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは分泌細胞をさらに含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは免疫細胞をさらに含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは押出材料をさらに含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは糸球体細胞を含む。ある特定の態様において、前記モデルは、前もって形成されたスキャフォールドを実質的に伴わずに製作される。ある特定の態様において、腎線維芽細胞、内皮細胞、および腎尿細管上皮細胞は哺乳動物細胞である。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクまたは腎臓上皮バイオインクのいずれかが、付着後に平らな層を形成する。ある特定の態様において、腎尿細管モデルは均一な厚さの腎尿細管モデルである。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは生体適合膜上に付着される。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは、孔径が0.4μm超の生体適合膜上に付着される。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは、孔径が約1μmの生体適合膜上に付着される。ある特定の態様において、人工の三次元生体腎尿細管モデルはアレイを形成するように付着される。ある特定の態様において、人工の三次元生体腎尿細管モデルは、それぞれの腎尿細管モデルの間に約20μm〜約100μmのスペースをとるように構成されているアレイを形成するように付着される。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは30〜100体積％生細胞である。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは70〜100体積％生細胞である。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは90〜100体積％生細胞である。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは押出しバイオプリンティングによって付着される。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクはインクジェットバイオプリンティングによって付着される。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクはインクジェットバイオプリンティングによって付着されない。ある特定の態様において、腎尿細管モデルのどの層もインビトロ培養で培養状態で3日後に生存可能である。ある特定の態様において、腎尿細管モデルのどの層もインビトロ培養で10日後に生存可能である。
【０２１６】
ある特定の態様において、本明細書において開示された3D腎尿細管モデルは付加的な製造プロセスによって作製される。本明細書における3D腎尿細管モデルのための付加的な製造プロセスは、インビトロ用途の3D腎尿細管モデルのカスタマイズされた製作を可能にする。このことは、ユーザーによって設定された設計によって組織が製作されるので重要な意味をもつ。ある特定の態様において、3D腎尿細管モデルは、ユーザーが設定した細胞しか含有しない。ある特定の態様において、3D腎尿細管モデルは、ユーザーが設定した細胞タイプしか含有しない。ある特定の態様において、3D腎尿細管モデルは、ユーザーが設定した数の細胞または濃度の細胞しか含有しない。ある特定の態様において、3D腎尿細管モデルは、製作前または制作中に、低分子、治療用分子、または治療用物質で処理された細胞を含有する。治療用分子または治療用物質は、疾患を治療するか、または生物学的応答を誘発することを目的とする任意の分子である。ある特定の態様において、3D腎尿細管モデルは、生体適合性プラスチックまたは組織培養プラスチック、生体適合性合成ポリマー、架橋性ゲル、可逆的に架橋したゲル、および他の非細胞構成要素を含有する。
【０２１７】
腎尿細管モデルの成熟
ある特定の態様において、本開示の腎尿細管モデルは、バイオプリンティング後に、ある一定の時間にわたって成熟される。ある特定の態様において、前記モデルは、使用前に1〜24時間、例えば、使用前に少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、16時間、18時間、24時間、またはそれより長く成熟される。ある特定の態様において、前記モデルは、使用前に1〜30日間、例えば、使用前に少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日間、またはそれより長く成熟される。一部の態様において、組織の出荷または移送は、一つの用途である。ある特定の態様において、本開示の腎尿細管モデルの間質層は、バイオプリンティング後に、上皮層が加えられる前に、ある一定の時間にわたって成熟される。ある特定の態様において、間質層は、使用前に1〜24時間、例えば、使用前に少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、16時間、18時間、24時間、またはそれより長く成熟される。ある特定の態様において、間質層は、使用前に1〜30日間、例えば、使用前に少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日間、またはそれより長く成熟される。一部の態様において、組織の出荷または移送は、一つの用途である。一部の態様において、上皮層は、間質層のバイオプリンティング後、1〜24時間、例えば、1時間以内、2時間以内、3時間以内、4時間以内、5時間以内、6時間以内、7時間以内、8時間以内、9時間以内、10時間以内、11時間以内、12時間以内、16時間以内、18時間以内、24時間以内に間質層上にバイオプリントされる。一部の態様において、組織の出荷または移送は、一つの用途である。一部の態様において、上皮層は、間質層のバイオプリンティング後、1〜30日間、例えば、1日以内、2日以内、3日以内、4日以内、5日以内、6日以内、7日以内、8日以内、9日以内、10日以内、11日以内、12日以内、13日以内、14日以内、15日以内、16日以内、17日以内、18日以内、19日以内、20日以内、21日以内、22日以内、23日以内、24日以内、25日以内、26日以内、27日以内、28日以内、29日以内、30日以内に間質層上にバイオプリントされる。
【０２１８】
腎尿細管モデルの使用
本明細書に記載の腎尿細管モデルは複数の用途に利用することができる。一実施形態では、組織障壁は、毒物学およびADME用途に利用することができる。一実施形態では、腎尿細管モデルの機能的特徴は、バリアの確立、および(TEERおよびルシファーイエロー透過性によって実証されるような)透過性／吸収の実証を含む。これらの特徴は、透過速度論(Papp)および流入／流出(ab、ba)研究を可能にする。別の実施形態では、キートランスポーターおよび代謝酵素をそれぞれ介する能動輸送および代謝の研究を、ウェルベースのアッセイを介して、または質量分析による基質およびそれらの代謝物の検出を介して、行うことができる。これらの同じ技術は、様々な薬物および適用される化合物の能動輸送および代謝のメカニズムを評価するのに用いることができる。試験物質の輸送速度論、流出速度および透過係数は、それゆえ、FDAが推奨する基準薬との相関のために利用することができる。バリア機能および透過速度論を通じて、腎尿細管は、ネイティブ組織と同様に腎トランスポーターを介した化合物の能動輸送が存在するか否かを予測し、化合物が腎バリアを破壊しおよび／または腎臓炎症を誘発する能力を予測し、および／または炎症を調節する化合物の有効性を予測するのに用いることができる。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、免疫細胞を含む本明細書に開示される腎尿細管モデルは、炎症および炎症性疾患、ならびに癌に対する免疫調節の影響のモデリングに用いることができる。一実施形態では、免疫細胞は骨髄性細胞またはリンパ性細胞である。別の実施形態では、疾患モデルは、正常組織モデル、例えば、免疫細胞を含まない腎尿細管モデル、免疫細胞を含むが免疫細胞を活性化するように刺激されていない(静止)腎尿細管モデル、または免疫応答を模倣するために免疫細胞を欠如してサイトカインで刺激された腎尿細管モデル、と並べて比較される。この実施形態では、腎尿細管モデルは炎症および免疫応答の評価に有用である。免疫細胞を含む組織構築物も急性応答を研究するために用いることができる。免疫細胞を含む腎尿細管モデルはまた、候補の薬学的化合物または治療法の、急性、亜慢性、または慢性の投与を含む、損傷および回復をモデル化するために用いることができる。別の実施形態において、免疫細胞を含む腎尿細管モデルは、創傷治癒および線維症を評価するために用いられる。さらに、免疫細胞を含む組織構築物は、微生物／マイクロバイオーム相互作用をモデル化するために用いることができる。腎尿細管モデルの3Dの性質は、病原体の侵襲性と転座の強化された観察を可能にする。一実施形態では、腎尿細管モデルは、その後、炎症効果を逆転または制御するための候補の薬学的な剤または処置で処置される。検出され得る炎症シグナルには、サイトカイン(例えば、IL-8、TNF-α、IL-4、IL-19、IL-13、IL-17、および／またはIFN-ガンマ)、抗菌ペプチド(例えば、ベータデフェンシン、リゾチーム、および/またはsIgA)、内分泌物質、たとえば、ソマトスタチンの放出、炎症経路(たとえば、JAK/STAT、および／またはNFκB)の活性化、炎症に応答するバリア破壊の評価(組織学、TEER、Lucifer yellow、Ussingチャンバー、および／または他のウェルベースのアッセイ)、増殖、細胞傷害性、組織損傷、またはアポトーシス(カスパーゼ8またはTunel)または創傷領域の自食作用もしくは再上皮化の測定、および刺激に応答してアップレギュレートされる重要なマーカーおよび受容体の発現、が含まれる。記載される表現型のいずれについても、腎尿細管モデルは、発症の動態および程度ならびに摂動からの回復を実証するのに用いることができる。たとえば、腎尿細管モデルに治療剤を投与し、組織損傷の発症の動態と並行して吸収の動態を測定し、次いで試験剤を除去し、腎尿細管内の分子のクリアランスおよび損傷からの回復の動態を測定することができる。これらのパラメータの分析は、クリニックに入る化合物についての適切な投薬レベルおよび投薬スケジュールの予測を可能にし得る。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは腎疾患のモデルで使用される。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、腎疾患のモデルに用いることができ、その腎尿細管モデルは、
(a)腎間質組織の層であって、該腎間質組織が、腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、腎間質組織の層；ならびに、
(b)腎上皮組織の層であって、該腎上皮組織が、腎尿細管上皮細胞を含む、腎上皮組織の層、を含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する。ただし、間質組織は間質バイオインクを含み、上皮組織は上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成し、ここでそのモデルは腎尿細管に関連する障害に特徴的な表現型を表す。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、腎障害を逆転、軽減、誘発、または予防するための治療剤の能力を評価する方法において用いることができる。
【０２２３】
候補治療剤が腎障害を逆転、軽減、誘発、または予防する能力を評価する方法も提供され、その方法は、
(a)腎尿細管モデルを候補治療剤と接触させる段階；
(b)腎組織細胞の生存能力または機能性を決定する段階；および
(c)候補治療剤と接触させていない対照腎尿細管モデルと比較した、腎組織細胞の決定された生存能力または機能性に基づいて、候補治療剤が腎疾患を逆転、軽減、誘発または予防する能力を評価する段階
を含む。
【０２２４】
一部の態様において、本明細書において開示された腎尿細管およびアレイはインビトロアッセイにおいて使用するためのものである。一部の態様において、「アッセイ」とは、有機試料または生物試料(例えば、細胞凝集物、組織、臓器、生物など)の中の物質(例えば、化学物質、分子、生化学物質、薬物など)の存在または活性を試験または測定するための手順である。さらなる態様において、アッセイには定性アッセイおよび定量アッセイが含まれる。なおさらなる態様において、定量アッセイは、試料中の物質、例えば、化学物質または生体分子の量を測定する。
【０２２５】
様々な態様において、腎尿細管およびアレイは、非限定的な例として、画像をベースとするアッセイ、分泌タンパク質の測定、マーカーの発現、およびタンパク質またはmRNAの産生において使用するためのものである。様々なさらなる態様において、腎尿細管およびアレイは、以下:分子結合(放射性リガンド結合を含む)、分子取り込み、活性(例えば、酵素活性および受容体活性など)、遺伝子発現、タンパク質発現、タンパク質修飾(非限定的な例には、リン酸化、ユビキチン結合、アセチル化、グリコシル化、脂質修飾(lipidation)などが含まれる)、受容体アゴニズム、受容体アンタゴニズム、細胞シグナル伝達、アポトーシス、化学受容性、トランスフェクション、細胞遊走、走化性、細胞生存能力、細胞増殖、安全性、効力、代謝、毒性、感染性、ならびに乱用傾向の1つまたは複数を検出または測定するアッセイにおいて使用するためのものである。様々な態様において、腎尿細管は毒物学試験、製剤試験、または毒性試験のためのものである。
【０２２６】
一部の態様において、腎尿細管およびアレイはイムノアッセイにおいて使用するためのものである。イムノアッセイには、例えば、フローサイトメトリー、ハイスループット画像分析またはロースループット画像分析、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫測定法(ELISA)、ウエスタンブロット、ホモジニアスアッセイ(homogenous assay)、例えば、AlphaLISA(商標)、および時間分解蛍光または蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)に頼る関連技術が含まれる。さらなる態様において、イムノアッセイは競合イムノアッセイまたは非競合イムノアッセイである。競合イムノアッセイでは、例えば、試料中の抗原が、抗体と結合する標識抗原と競合し、次いで、抗体部位に結合した標識抗原の量が測定される。非競合イムノアッセイ(「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる)では、例えば、試料中の抗原が抗体部位に結合し、その後に、標識抗体が抗原に結合し、次いで、その部位にある標識抗体の量が測定される。
【０２２７】
一部の態様において、腎尿細管およびアレイはELISAにおいて使用するためのものである。さらなる態様において、ELISAは、試料における抗体または抗原の存在を検出するのに用いられる生化学的技法である。ELISAでは、例えば、特定の抗原に対する特異性をもつ少なくとも1種類の抗体が利用される。さらなる例として、未知量の抗原を含む試料は、非特異的に(表面への吸着を介して)、または特異的に(「サンドイッチ」ELISAでは、同じ抗原に特異的な別の抗体による捕捉を介して)、固体支持体(例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレート)上に固定化される。なおさらなる例として、抗原が固定化された後に、検出抗体は添加されて、抗原と複合体を形成する。検出用抗体は、例えば、酵素に共有結合的に連結されているか、または生体共役反応(bioconjugation)によって酵素に連結された二次抗体によって、そのものが検出される。
【０２２８】
例えば、一部の態様において、薬物スクリーニングまたは創薬のために細胞、多細胞凝集物、または組織のアレイ、マイクロアレイ、またはチップが用いられる。さらなる態様において、薬物スクリーニング用または創薬用のキットの一部として組織のアレイ、マイクロアレイ、またはチップが用いられる。一部の態様において、それぞれの腎尿細管は生体適合性マルチウェル容器のウェル内に存在し、この容器は1つまたは複数の自動薬物スクリーニング手順および/または装置と適合する。さらなる態様において、自動薬物スクリーニング手順および/または装置は、コンピュータまたはロボットの支援を受けた任意の適切な手順または装置を含む。
【０２２９】
さらなる態様において、任意の治療分野において潜在的に有用な薬物を研究または開発するために薬物スクリーニングアッセイ用または創薬アッセイ用のアレイが用いられる。なおさらなる態様において、適切な治療分野には、非限定的な例として、感染症、血液学、腫瘍学、小児科学、心臓病学、中枢神経系疾患、神経学、胃腸病学、肝臓学、泌尿器科学、不妊、眼科学、腎臓病学、整形外科学、疼痛管理、精神医学、肺学、ワクチン、創傷治癒、生理学、薬理学、皮膚科学、遺伝子療法、毒物学、毒性、および免疫学が含まれる。
【０２３０】
一部の態様において、前記腎尿細管およびアレイは細胞ベースのスクリーニングにおいて使用するためのものである。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングは、1種類または複数種の感染症、例えば、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、または寄生生物感染症を対象としている。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングは、腎細胞癌、傍糸球体細胞腫瘍(レニノーマ)、血管筋脂肪腫、腎オンコサイトーマ、ベリーニ管癌、腎臓明細胞肉腫、中胚葉腎腫、ウィルムス腫瘍、混合型上皮間質腫瘍(mixed epithelial stromal tumor)、および腎盂の移行上皮癌を含む腎臓癌を対象としている。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングは、糸球体腎炎、間質性腎炎または尿細管間質性腎炎、腎盂腎炎、ループス腎炎、およびスポーツ性腎炎(athletic nephritis)を含む腎炎を対象としている。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングは高血圧を対象としている。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングは糖尿病、I型、II型、およびMODYを対象としている。さらなる態様において、細胞ベースのスクリーニングは、IgA腎症、鎮痛薬腎症、または腫瘍腎症(onconephropathy)を含む腎症を対象としている。一部の態様において、細胞ベースのスクリーニングは多発性嚢胞腎またはキサンチンオキシダーゼ欠損症を対象としている。他の態様において、腎尿細管およびアレイは、癌の開始、進行、または転移の研究において使用するためのものである。なおさらなる態様において、腎尿細管およびアレイは、他の細胞タイプ、例えば、癌細胞、病原体を有する細胞、病原性細胞、免疫細胞、血液由来細胞、または幹細胞/前駆細胞の相互作用の研究において使用するためのものである。
【０２３１】
一部の態様において、前記構築物またはそのアレイは、抗体、哺乳動物細胞、細菌、生物学的に活性なタンパク質、ホルモンなどを含む生物製剤の性能の評価において使用するためのものである。他の態様において、前記腎尿細管またはそのアレイは、前記構築物を含む哺乳動物腎尿細管と、病原体を有する細胞、生きている病原性細胞、癌細胞、免疫細胞、血球、幹細胞/前駆細胞、または遺伝操作された細胞を含むが、これに限定されない1種類または複数種のさらなる細胞タイプとの間での細胞間相互作用および細胞-組織相互作用の研究において有用である。
【０２３２】
一部の態様において、前記アレイは腎尿細管と、さらなる組織構築物を含む。さらなる態様において、腎尿細管構築物は、1つまたは複数の面で、さらなる組織構築物と直接接触している。なおさらなる態様において、腎尿細管は、流体経路または共通の流体リザーバーを介して1つまたは複数のさらなる組織構築物または細胞に接続される。なおさらなる態様において、人工の腎尿細管構築物と接触する液体培地は、哺乳動物生細胞、例えば、免疫細胞、血液由来細胞、または腫瘍由来細胞を含有する。他の態様において、腎尿細管と接触する液体培地は、細菌、菌類、ウイルス、寄生生物、または他の病原体を含有する。
【０２３３】
候補治療剤が潜在的な毒性剤による腎損傷を逆転、軽減または予防する能力を評価する方法であって、該潜在的な毒性剤を、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルと接触させる段階と、腎尿細管モデルを候補治療剤と接触させる段階と、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性を決定する段階と、候補治療剤と接触していない対照腎尿細管モデルと比較した、腎尿細管上皮細胞の決定された生存能力または機能性に基づいて、潜在的な毒性剤による腎損傷を逆転、軽減または予防する候補治療剤の能力を評価する段階と、を含む方法が提供される。特定の実施形態では、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルは、腎間質組織の層および腎上皮組織の層を含む。他の実施形態では、腎間質組織は腎線維芽細胞および内皮細胞を含み、腎上皮組織は腎尿細管上皮細胞を含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する。ただし、間質組織は間質バイオインクを含み、上皮組織は上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成することを条件とする。
【０２３４】
一実施形態では、線維芽細胞および内皮細胞は、腎尿細管モデルがプリントの6日後に平面になる、内皮細胞に対する線維芽細胞の比で存在する。いくつかの実施形態では、線維芽細胞および内皮細胞は、内皮細胞に対して約50：50の線維芽細胞の比で腎間質組織の層に存在する。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、モデルは、腎間質組織層と腎上皮組織層との間に基底膜の層をさらに含む。いくつかの実施形態では、腎上皮組織の層は基底膜の層と連続的に接触しており、基底膜の層は腎間質組織の層と連続的に接触している。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは少なくとも3細胞層の厚さである。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは2またはそれより大きい細胞層の厚さである。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの平均の厚さは少なくとも50μmである。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの平均の厚さは少なくとも100μmである。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの平均の厚さは少なくとも200μmである。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの平均の厚さは少なくとも300μmである。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの平均の厚さは少なくとも400μmである。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの平均の厚さは少なくとも500μmである。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの平均の厚さは少なくとも600μmである。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの平均の厚さは少なくとも700μmである。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの平均の厚さは少なくとも800μmである。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの平均の厚さは少なくとも900μmである。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの平均の厚さは少なくとも1000μmである。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの平均の厚さは、50μm〜1000μmである。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの平均の厚さは75μm〜1000μmである。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの平均の厚さは100μm〜1000μmの間である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの平均の厚さは200μm〜1000μmの間である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの平均の厚さは500μm〜1000μmの間である。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの平均の厚さは、50μm〜500μmの間である。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの平均の厚さは、50μm〜300μmの間である。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの平均の厚さは、50μm〜200μmの間である。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの平均の厚さは、50μm〜150μmの間である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの平均の厚さは、50μm〜125μmの間である。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの平均の厚さは、75μm〜100μmの間である。
【０２３７】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの表面積は、0.01cm2〜0.1cm2の間である。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの表面積は少なくとも0.01cm2である。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの表面積は少なくとも0.02cm2である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの表面積は少なくとも0.03cm2である。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの表面積は少なくとも0.04cm2である。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの表面積は少なくとも0.05cm2である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの表面積は少なくとも0.06cm2である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの表面積は少なくとも0.07cm2である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの表面積は少なくとも0.08cm2である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの表面積は少なくとも0.09cm2である。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの表面積は少なくとも0.10cm2である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの表面積は少なくとも0.11cm2である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの表面積は少なくとも0.12cm2である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの表面積は0.5cm2未満である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの表面積は0.4cm2未満である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの表面積は0.3cm2未満である。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの表面積は0.2cm2未満である。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの表面積は0.1cm2未満である。
【０２３８】
潜在的な毒性剤は、腎組織の構造または機能に影響を及ぼし得るいずれかのものである。いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は、毒素、治療剤、抗菌剤、金属、または環境作用物質である。他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗うつ剤、利尿剤、またはプロトンポンプ阻害剤である。
【０２３９】
他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、サイトカイン、ケモカイン、小分子薬、大分子薬、タンパク質またはペプチドである。
【０２４０】
他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、アロマターゼ阻害剤、抗エストロゲン、抗アンドロゲン。ゴナドレリンアゴニスト、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、微小管活性剤、アルキル化剤、レチノイド、カロテノイド、もしくはトコフェロール、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、MMP阻害剤、mTOR阻害剤、代謝拮抗剤、白金化合物、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤、ビスホスホネート、抗増殖抗体、ヘパラナーゼ阻害剤、Ras発癌性アイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、血液悪性腫瘍の治療に用いられる化合物、Flt-3阻害剤、Hsp90阻害剤、キネシンスピンドルタンパク質阻害剤、MEK阻害剤、抗腫瘍抗生物質、ニトロソ尿素、タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性を標的とする／減少させる化合物、タンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的とする／減少させる化合物、または抗血管新生化合物である化学療法剤である。他の実施形態では、潜在的な毒性剤は、ダウノルビシン、アドリアマイシン、Ara-C、VP-16、テニポシド、ミトキサントロン、イダルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、PKC412、6-メルカプトプリン(6-MP)、フルダラビンホスフェート、オクトレオチド、SOM230、FTY720、6-チオグアニン、クラドリビン、6-メルカプトプリン、ペントスタチン、ヒドロキシウレア、2-ヒドロキシ-1H-イソインドール-1，3-ジオン誘導体、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジン、1-(4-クロロアニリノ)-4-(4-ピリジルメチル)フタラジンコハク酸塩、アンジオスタチン、エンドスタチン、アントラニル酸アミド、ZD4190、ZD6474、SU5416、SU6668、ベバシズマブ、rhuMAb、rhuFab、マクゴン、FLT-4阻害剤。FLT-3阻害剤、VEGFR-2 IgG1抗体、RPI 4610、ベバシズマブ、ポルフィマーナトリウム、アネコルタブ、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、11-α-エピヒドロコルチゾン、コルテキソロン、17a-ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デスオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロン、デキサメタゾン、フルオシノロン、植物アルカロイド、ホルモン化合物および／またはアンタゴニスト、生物学的応答調節剤、たとえば、リンホカインもしくはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド誘導体、shRNA、siRNA、またはそれらの薬学的に許容される塩である化学療法剤である。
【０２４１】
他の実施形態において、潜在的な毒性剤は、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンB、およびアミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、潜在的な毒性剤は放射線である。いくつかの実施形態では、放射線は、X線、ガンマ線、UV等を含み得る。いくつかの実施形態では、放射線は単独で、または他の1つまたは複数の毒性剤と組み合わせて用いられる。いくつかの実施形態では、放射線は、光子放射線療法、粒子線放射線療法、他のタイプの放射線療法、およびそれらの組み合わせを含み得る。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、毒性剤は、生体適合性溶媒に溶解される。潜在的な毒性剤が水不溶性である場合、潜在的な毒性剤は、極性の非プロトン性の有機溶媒、たとえば、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはジメチルホルムアミド(DMF)で溶解し、次に、蒸留水、水性Tween、培地、または他の生体適合性溶媒中で、水溶液、たとえば、9g／Lの塩化ナトリウム(塩類溶液)で希釈することができる。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、代謝活性の指標を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、代謝活性は、alamarBlue(商標)アッセイ(Thermo Fisher, Carslbad, CA)、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性アッセイ、または別のアッセイによって測定することができる。いくつかの実施形態において、代謝活性の指標は、対照と比較した、腎尿細管モードにおけるレサズリンの減少またはテトラゾリウム塩の減少である。いくつかの実施形態において、レサズリンの減少は、alamar  blueアッセイを用いて測定される(Rampersad, 2012)。いくつかの実施形態において、テトラゾリウム塩は、3-(4，5-ジメチルチアゾール(dimethyethiazol)-2-イル)-2，5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)、ナトリウム3’-［1-フェニルアミノ)-カルボニル］-3，4-テトラゾリウム］-ビス(4-メトキシ-6-ニトロベンゼン)スルホン酸水和物(XTT)、4-［3-(4-ヨードフェニル)-2-(4-ニトロフェニル)-2H-5-テトラゾリオ］-1，3-ベンゼンジスルホネート、水溶性テトラゾリウム塩(WST-1)などを含む(Rampersad, 2012)。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性(実施例2参照)、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ(GGT)活性(実施例2参照)、プロテアーゼ活性、ATP利用、グルコース取り込み活性(実施例7参照)、ナトリウム-グルコース共輸送体-2(SGLT2)活性(実施例12参照)、またはRNA発現(実施例6参照)を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ活性は、合成ペプチド基質を用いてカスパーゼ活性を測定することによって測定される(Kumar, 2004)。いくつかの実施形態において、細胞内ATPは、ATPアッセイキットを用いて測定される(Weng, 2015)。
【０２４６】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較したモデル中の腎輸送分子活性を測定することによって決定される。他の実施形態では、輸送分子活性は、少なくとも1つの高分子の排出および／または取り込みである。他の実施形態では、高分子はアルブミンである。いくつかの実施形態において、アルブミン取り込みは、蛍光顕微鏡および細胞溶解物蛍光を用いて測定される(Ferrell, 2012)。
【０２４７】
他の実施形態において、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した腎尿細管上皮細胞の再生を同定することによって決定される。一実施形態では、腎尿細管上皮細胞を視覚的に検査し、生存細胞の数の増加を同定することによって再生が同定される。
【０２４８】
他の実施形態において、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した腎尿細管モデルの経上皮電気抵抗(実施例2参照)、または受動的透過性(実施例2参照)を測定することによって決定される。
【０２４９】
他の実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、ビタミンD産生の変化、アンジオテンシン変換の変化(実施例3参照)、イオン交換の変化、pHの変化、酸／塩基バランスの変化、腎尿細管バリア機能の変化(実施例10参照)、もしくは腎臓内レニン／アンジオテンシンシステム(RAS)の変化(実施例11参照)、生理学の変化、病理学の変化(実施例5参照)、分子の輸送の変化(実施例12参照)、ナトリウム-グルコース共輸送体-2(SGLT2)活性の変化(実施例12参照)、間質線維性組織の量、または腎尿細管モデルの再生を測定することによって決定される。
【０２５０】
他の実施形態において、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した間質線維性組織の量を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、間質線維性組織は、トリクローム-PAS線維症測定、コラーゲンIII免疫組織化学、シリウスレッド(Sirius Red)染色、または他の型のアッセイを用いて測定される(Farris et al., 2011)。いくつかの実施形態では、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性は、経時的に測定される。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、最初に潜在的な毒性剤と、次に候補治療剤と接触させられる。他の実施形態では、腎尿細管モデルは、最初に候補治療剤と、次に潜在的な毒性剤と接触させられる。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、候補治療剤および潜在的な毒性剤と接触させる前に細胞培養培地中で培養されている。いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、細胞培養培地中で少なくとも3日間培養されている。
【０２５２】
腎機能に対する剤の効果を評価する方法も提供され、その方法は、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを剤と接触させる段階と、腎尿細管上皮細胞の生存能力または機能性を、腎機能に対する剤の効果を測定する段階と、を含む。いくつかの実施形態では、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルは、腎間質組織の層であって、腎間質組織が腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、層と、腎上皮組織の層であって、腎上皮組織が腎尿細管上皮細胞を含む、層と、を含む。ただし、間質組織は間質バイオインクを含み、上皮組織は上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成することを条件とする。一実施形態では、線維芽細胞および内皮細胞は、腎尿細管モデルがプリントの6日後に平面になる線維芽細胞対内皮細胞比で存在する。
【０２５３】
腎障害のモデル
バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを含む、腎障害のモデルが提供される。いくつかの実施形態では、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルは、腎間質組織の層であって、腎間質組織が腎線維芽細胞および／または内皮細胞を含む、層と、腎上皮組織の層であって、腎上皮組織が腎尿細管上皮細胞を含む、層と、を含む。ただし、間質組織は間質バイオインクを含み、上皮組織は上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体な腎尿細管モデルを形成することを条件とする。
【０２５４】
いくつかの実施形態において、腎障害は腎臓モデル内の脂質の保持と関連する。脂肪蓄積は、脂肪細胞の取り込みによってモデルに誘発することができる。いくつかの実施形態では、腎障害は、先天性異常、糖尿病、免疫複合体疾患、血管硬化症、腎線維症、高血圧、動脈腎硬化症、ループス腎炎、血管疾患、炎症、溶血性尿毒症症候群、閉塞性腎症、異常リポタンパク血症、再発性脱水症、逆流性腎症、放射線腎症、アテローム塞栓性腎症、強皮症、鎌状赤血球貧血、脂質の保持、毒物曝露、感染、虚血、虚血／再灌流、輸送欠損、嚢胞性疾患、結晶障害(crystallopathy)、またはそれらの組み合わせに関連する。いくつかの実施形態では、腎障害は環境の曝露の後に起こり得る。他の実施形態では、腎障害は遺伝的またはエピジェネティック修飾の結果として起こり得る。いくつかの実施形態では、腎障害は、細胞の局在性またはトランスポーター、酵素、もしくは他のタンパク質の活性における欠陥の後に起こり得る。
【０２５５】
急性腎障害
いくつかの実施形態において、腎障害は急性腎障害である。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、急性腎障害は急性尿細管壊死症である。 急性尿細管壊死は腎臓の腎尿細管を形成する尿細管上皮細胞の死に関連する。急性尿細管壊死は、生命を脅かす可能性がある急性腎損傷の一形態である。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、急性腎障害は急性間質性腎炎である。急性間質性腎炎は、腎機能の低下を引き起こす腎病変であり、腎間質における炎症細胞の浸潤および局在化を特徴とする。急性間質性腎炎は急性腎損傷の一形態である。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、急性腎障害は急性腎損傷である。急性腎損傷は急性腎不全(renal failure)または急性腎臓不全(kidney failure)とも呼ばれる。急性腎損傷は、腎臓の濾過の急激なまたは急速な低下である。腎臓が突然に血液から老廃物をろ過することができなくなり、危険なレベルの老廃物の蓄積を生じ得る場合に、急性腎損傷が発生する。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、急性腎損傷は、毒物曝露、糖尿病、感染症、炎症、虚血、または虚血／再灌流によって引き起こされる。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷は毒物曝露によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、毒物は抗感染剤である。 抗感染剤には、抗生物質、抗菌剤、抗真菌剤、および抗ウイルス剤が含まれる。いくつかの実施形態では、毒物は、抗生物質、抗菌剤、抗真菌剤、または抗ウイルス剤である。いくつかの実施形態では、毒物は、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンB、アミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ジドホビル、テノホビル、メトトレキセート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷は糖尿病によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、糖尿病は2型糖尿病である。いくつかの実施形態において、糖尿病は1型糖尿病である。いくつかの実施形態において、糖尿病は、高血糖および／または高血圧への曝露によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、糖尿病に起因する近位尿細管損傷は、糸球体の完全性および機能の低下に続発し、それがグルコース、タンパク質、たとえば、アルブミン、または濾液中の他の血液成分の上昇をもたらす。いくつかの実施形態では、糖尿病に起因する腎臓損傷は、部分的には、上昇したレベルのグルコース、タンパク質、および濾液中の他の血液成分への腎尿細管の曝露によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、急性腎損傷は糖尿病性ケトアシドーシスによって引き起こされる。糖尿病性ケトアシドーシス(DKA)は、高血糖症、高ケトン血症、および代謝性アシドーシスを特徴とする、糖尿病(通常、1型糖尿病)の生命を脅かす合併症である。DKAは、通常、急性感染症、心筋梗塞、脳卒中、膵炎、または外傷などの重大な生理的ストレスを伴うインスリン欠乏および高血糖症によって引き起こされる。それはまた、コルチコステロイド、チアジド系利尿薬、および交感神経刺激剤によっても引き起こされ得る。いくつかの実施形態では、腎尿細管損傷は、微小血管系の喪失または低下およびその結果としての低酸素症によってさらに損なわれる。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷は感染によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、感染は微生物(microorganism)または微生物(microbe)によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、感染を引き起こす微生物は、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、または蠕虫である。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷は炎症によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、炎症はパターン認識受容体によって引き起こされる。パターン認識受容体には、トール様受容体(TLR)、レチノイン酸誘導性遺伝子(RIG)-I様受容体、NOD様受容体、およびC型レクチン受容体が含まれる。いくつかの実施形態において、炎症は、TLR、RIG-I様受容体、NOD様受容体、またはC型レクチン受容体によって引き起こされる。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、急性腎損傷は虚血によって引き起こされる。虚血は器官や体の一部への不適切な血液供給である。いくつかの実施形態では、急性腎損傷は再灌流によって引き起こされる。再灌流は、虚血の期間の後に血液供給が腎臓に戻るときに引き起こされる腎臓の損傷である。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷は、他の疾患に対する二次的状態である。いくつかの実施形態では、急性腎損傷は、急性間質性腎炎、嚢胞性疾患、腎症、結晶症(crystallopathy)／腎結石症、感染性疾患、毒物への曝露、腎臓癌、または潜在的な毒性剤によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、急性腎損傷は、狼瘡、腎盂腎炎、または腫瘍性腎炎(onconephritis)から生じる腎炎によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、急性腎損傷は、多嚢胞性疾患などの遺伝的障害によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、急性腎損傷は、糖尿病性腎症などの腎症によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷は、感染性疾患によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、急性腎損傷は、毒物への曝露によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷は腎臓癌によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、急性腎損傷は潜在的な毒性剤によって引き起こされる。
【０２６６】
いくつかの実施形態において、急性腎臓損傷の結果は、壊死、アポトーシス、腎炎、尿細管再生、代償性増殖、上皮-間葉転換(EMT)、炎症、虚血、活性酸素種、ミトコンドリアの変化、細胞形態の変化、核形態の変化、過剰増殖、遺伝子発現の変化、バイオマーカーの分泌、またはエピジェネティック修飾である。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷の結果は壊死である。 いくつかの実施形態において、毒物への曝露によって引き起こされる急性腎臓損傷は壊死をもたらす。
【０２６８】
いくつかの実施形態において、急性腎臓損傷の結果はアポトーシスである。アポトーシスは、生物の成長または発達の正常な制御された部分として起こる細胞の死である。いくつかの実施形態において、急性腎臓損傷は、アポトーシスをもたらす毒物への曝露によって引き起こされる。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、急性腎臓損傷の結果は尿細管再生である。尿細管再生の間、腎上皮細胞は形態学的変化を受け、遊走し、そして増殖して失われた細胞を置換し、最終的に腎上皮の生理学的および機能的回復をもたらす。ビメンチン、Pax-2、および神経細胞接着分子などの分子は、急性腎損傷からの回復中に腎上皮細胞で再発現され得る(Tang et al., 2015)。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷の結果は、細胞が損傷および細胞死のために喪失した場合に増殖して細管を再配置させる既存の尿細管細胞の代償的増殖である。
【０２７１】
いくつかの実施形態において、急性腎臓損傷の結果はEMTである。EMTは、上皮細胞がそれらの細胞極性および細胞間接着を喪失し、そして、間葉性のままであるかまたは上皮細胞に分化して戻り得る、間葉系幹細胞になる移動特性および浸潤特性を獲得するプロセスである。EMTは、創傷治癒、組織線維症、および癌進行のための転移の開始において起こり得る。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷の結果は炎症である。いくつかの実施形態において、急性腎臓損傷は炎症によって引き起こされ得る。いくつかの実施形態では、急性腎損傷を引き起こすかまたはそれから生じる炎症は、パターン認識受容体の活性化によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、急性腎損傷を引き起こすかまたはそれから生じる炎症は、サイトカインによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、急性腎損傷を引き起こすかまたはそれから生じる炎症は、ケモカインによって引き起こされる。
【０２７３】
いくつかの実施形態において、急性腎臓損傷の結果は虚血である。いくつかの実施形態では、低酸素症-誘導性転写因子(HIF)の活性化は、虚血に対して保護する。HIFは、低酸素(低酸素症)への細胞適応の重要なメカニズムとして同定されている。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷の結果はミトコンドリアの変化である。急性腎損傷によって引き起こされるミトコンドリアの変化には、ミトコンドリアのグルタチオンレベルの変化、反応性酸素種の変化、およびミトコンドリアの形態の変化が含まれる。いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷の結果はミトコンドリアの機能障害である。ミトコンドリアの機能障害には、ミトコンドリア膜電位の喪失、ミトコンドリア生合成の減少、およびATP産生の低下が含まれる(Granata et al., 2015)。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷の結果は細胞形態の変化である。急性腎損傷によって引き起こされる細胞形態の変化には、細胞質の量の変化および細胞の形状の変化が含まれる。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、高血糖症などに伴う、近位尿細管細胞傷害の結果は、核形態の変化によって証明される。いくつかの実施形態では、細胞損傷はグリコーゲンの蓄積として現れる。いくつかの実施形態では、グリコーゲンは核内に蓄積し、その結果、核は、H＆Eおよび過ヨウ素酸シッフなどの標準的な組織学的染色において明瞭で空胞化したように見える。他の実施形態において、細胞の損傷は、細胞質におけるグリコーゲンの蓄積によって証明される。
【０２７７】
いくつかの実施形態において、急性腎臓損傷の結果は過剰増殖である。過剰増殖は、急速な分裂による細胞による増殖の異常に高い速度である。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷の結果は遺伝子発現の変化である。いくつかの実施形態において、遺伝子発現の変化は、タンパク質発現および／または機能における下流の変化をもたらし得る。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、急性腎損傷の結果はバイオマーカーの分泌である。急性腎臓損傷のバイオマーカーは、血清もしくは尿の成分であり得るか、または画像研究であり得る。いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷のバイオマーカーは、N-アセチル-β-グルコサミド、β2-ミクログロブリン、α1-ミクログロブリン、レチノール結合タンパク質、シスタチン-C、ミクロアルブミン、腎臓損傷分子-1、クラステリン、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、インターロイキン-18、システインリッチタンパク質、オステオポンチン、脂肪酸結合タンパク質、ナトリウム／水素交換体アイソフォーム、またはフェチュイン-Aを含む(Vaidya et al., 2008)。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、急性腎臓損傷の結果はエピジェネティック修飾である。エピジェネティクスとは、DNAに関連するが、DNA配列を変化させないタンパク質複合体の翻訳後修飾、たとえば、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、SUMO化、カルボニル化、グリコシル化、およびマイクロRNAの発現、による遺伝子発現の調節をいう(Tang et al., 2015)。いくつかの実施形態では、エピジェネティック修飾は、タンパク質発現および／または機能における下流の変化をもたらし得る。
【０２８１】
慢性腎障害
いくつかの実施形態において、腎障害は慢性腎障害である。慢性腎疾患は、慢性腎臓病または慢性腎不全とも呼ばれる。 いくつかの実施形態では、慢性腎障害は慢性腎損傷である。 慢性腎損傷は腎機能の進行的な悪化である。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、尿細管流は、慢性腎障害に特徴的な関連する表現型を発達させるのに必要とされる。
【０２８３】
いくつかの実施形態において、慢性腎障害は、急性腎障害と同じメカニズムによって引き起こされるが、より長期間にわたる曝露を伴う。いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷は、毒物曝露、糖尿病、感染、炎症、虚血、結晶沈着、遺伝的障害、嚢胞性疾患、慢性システム障害、または輸送欠損によって引き起こされる。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷は、毒物曝露によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、毒物は抗感染剤である。抗感染薬には、抗生物質、抗菌剤、抗真菌剤、および抗ウイルス剤が含まれる。いくつかの実施形態では、毒物は、抗生物質、抗菌剤、抗真菌剤、または抗ウイルス剤である。いくつかの実施形態では、毒性剤は、アセトアミノフェン、リチウム、アシクロビル、アンホテリシンB、アミノグリコシド、ベータラクタム、フォスカビル、ガンシクロビル、ペンタミジン、キノロン、スルホンアミド、バンコマイシン、リファンピン、アデホビル、インジナビル、ドドホビル、テノホビル、メトトレキサート、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラキソール、アロプリノール、フェニトイン、イホスファミド、ゲンタマイシン、またはゾレドロネートである。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷は、糖尿病に続発する。いくつかの実施形態では、糖尿病は2型糖尿病である。いくつかの実施形態において、糖尿病は1型糖尿病である。いくつかの実施形態では、慢性腎臓疾患は、高血圧および血管／糸球体損傷に続発する。いくつかの実施形態では、近位尿細管損傷は、糸球体の完全性および機能の低下に続発し、それがグルコース、アルブミンなどのタンパク質、または濾液中の他の血液成分の上昇をもたらす。いくつかの実施形態では、糖尿病に起因する腎臓損傷は、部分的には、上昇したレベルのグルコース、タンパク質、および濾液中の他の血液成分への腎尿細管の曝露によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、急性腎損傷はDKAによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、腎尿細管損傷は、微小血管系の喪失または低下およびその結果としての低酸素症によってさらに損なわれる。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷は感染症によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、感染症は微生物(microorganism)または微生物(microbe)によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、感染を引き起こす微生物は、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、または蠕虫である。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、慢性腎損傷は炎症によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、炎症はパターン認識受容体によって引き起こされる。パターン認識受容体には、トール様受容体(TLR)、レチノイン酸誘導性遺伝子(RIG)-I様受容体、NOD様受容体、またはC型レクチン受容体が含まれる。いくつかの実施形態において、炎症は、TLR、RIG-I様受容体、NOD様受容体、またはC型レクチン受容体によって引き起こされる。いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷を引き起こす炎症はサイトカインによって引き起こされる。いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷を引き起こす炎症はケモカインによって引き起こされる。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷は持続性虚血によって引き起こされる。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷は結晶沈着によって引き起こされる。腎臓への結晶沈着は、以下を含む異なるメカニズムから生じ得る：(1)大動脈のアテローム性動脈硬化の病変に由来するコレステロール結晶によって主に引き起こされる結晶塞栓症。これらの結晶は、より小さな動脈および細動脈を閉塞し、虚血性腎損傷を導き得る。(2)遠位尿細管の閉塞をもたらす管内キャスト形成。(3)シュウ酸腎症またはシスチン症のように、管腔プラグならびに管内およびイントラスティシャル(intrastitial)結晶を伴うびまん性(diffuse)結晶化。(4)乳頭での骨盤結石形成。それは、リン酸カルシウムからなり、ヘンレの細いループにおいて間質に沈殿する。結果として生じる病変(Randallのプラーク)は、石に成長し得る他の尿中結晶の沈殿のための付着部位になる(Mulay et al., 2014)。いくつかの実施形態では、結晶または粒子は、コレステロール尿酸一ナトリウム、シュウ酸カルシウム、リン酸カルシウムヒドロキシアパタイト、2，8-ジヒドロキシアデニン、ウロモジュリン、ミオグロビン-ウロモジュリン、インジナビル、アシクロビル、ポリミキシン(例えば、ポリスポリン、ネオスポリン、ポリミキシンB、またはポリミキシンE)、スルファジアジン、システイン、尿酸、またはリン酸マグネシウムアンモニウムである。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷は遺伝性障害によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、遺伝性障害は、嚢胞性腎臓疾患、アルポート症候群、バーター症候群、シスチン症、シスチン尿症、高シュウ酸尿症、先天性ネフローゼ症候群、爪膝蓋骨症候群、一次免疫性糸球体腎炎、逆流性腎症、または溶血性尿毒症症候群である。いくつかの実施形態では、遺伝性障害は、嚢胞腎疾患、たとえば、常染色体優性多発性嚢胞腎、常染色体劣性多発性嚢胞腎、若年性ネフロン癆、成人性ネフロン癆、海綿腎、多発性奇形症候群に関連する嚢胞腎疾患(たとえば、結節性硬化症、ロウ症候群、またはフォン・ヒッペル・リンダウ病)である。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷は、慢性システム障害、たとえば、糖尿病、自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデスまたはグッドパスチャー症候群)、または痛風によって引き起こされる。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、慢性腎損傷は輸送欠損によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷はグルコース輸送欠損によって引き起こされる。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷は、タンパク質、塩、または他の沈殿物質の蓄積によって引き起こされる。
【０２９４】
いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷の結果は、壊死、アポトーシス、腎炎、尿細管再生、EMT、炎症、虚血、ミトコンドリアの変化、細胞形態の変化、核形態の変化、過剰増殖、遺伝子発現の変化、バイオマーカーの分泌、エピジェネティック修飾、または結晶沈着である。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷の結果は壊死である。いくつかの実施形態では、毒物への曝露によって引き起こされる慢性腎臓損傷は壊死をもたらす。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷の結果はアポトーシスである。いくつかの実施形態において、毒物への曝露によって引き起こされる慢性腎臓損傷はアポトーシスをもたらす。
【０２９７】
いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷の結果は尿細管再生である。
【０２９８】
いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷の結果は代償性増殖である。
【０２９９】
いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷の結果はEMTである。
【０３００】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷の結果は炎症である。いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷は炎症によって引き起こされ得る。いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷から生じる炎症は、パターン認識受容体の活性化によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷から生じる炎症はサイトカインによって引き起こされる。いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷に起因する炎症はケモカインによって引き起こされる。
【０３０１】
いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷の結果は虚血である。 いくつかの実施形態では、低酸素誘導転写因子(HIF)の活性化は虚血から保護する。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷の結果はミトコンドリアの変化である。慢性腎損傷により引き起こされるミトコンドリアの変化には、ミトコンドリアのグルタチオンレベルの変化、活性酸素種の変化、およびミトコンドリアの形態の変化が含まれる。いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷の結果はミトコンドリア障害である。ミトコンドリア障害には、ミトコンドリア膜電位の喪失、ミトコンドリア生合成の減少、およびATP産生の低下が含まれる(Granata et al., 2015)。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷の結果は細胞形態の変化である。慢性腎損傷によって引き起こされる細胞形態の変化には、細胞質の量の変化、細胞の形状の変化および嚢胞(シスト)形成が含まれる。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、近位尿細管細胞損傷の結果は、核形態の変化によって証明される。いくつかの実施形態では、細胞の損傷はグリコーゲンの蓄積として現れる。いくつかの実施形態では、グリコーゲンは核内に蓄積し、その結果、核は、H＆Eおよび過ヨウ素酸シッフ(Periodic Acid Shiff)などの標準的な組織学的染色で明確に空胞化して見える。他の実施形態において、細胞の損傷は、細胞質におけるグリコーゲンの蓄積によって証明される。
【０３０５】
いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷の結果は過剰増殖である。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷の結果は遺伝子発現の変化である。いくつかの実施形態において、遺伝子発現の変化は、タンパク質発現および／または機能における下流の変化をもたらし得る。
【０３０７】
いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷の結果はバイオマーカーの分泌である。慢性腎臓損傷のバイオマーカーは、血清または尿の成分であり得るか、または画像研究であり得る。いくつかの実施形態において、慢性腎臓損傷のバイオマーカーは、N-アセチル-β-グルコサミド、β2-ミクログロブリン、α1-ミクログロブリン、レチノール結合タンパク質、シスタチン-C、ミクロアルブミン、腎臓損傷分子-1、クラステリン、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、インターロイキン-18、システインリッチタンパク質、オステオポンチン、脂肪酸結合タンパク質、ナトリウム／水素交換体アイソフォーム、またはフェチュイン-Aを含む(Vaidya et al., 2008)。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷の結果はエピジェネティック修飾である。エピジェネティック修飾には、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、SUMO化、カルボニル化、グリコシル化、またはマイクロRNAの発現によるヌクレオチドまたはDNA骨格の修飾が含まれる。いくつかの実施形態では、エピジェネティック修飾は、タンパク質発現および／または機能における下流の変化をもたらし得る。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、慢性腎臓損傷の結果は、結晶または粒子の存在である。いくつかの実施形態では、結晶または粒子は、コレステロール尿酸ナトリウム、シュウ酸カルシウム、リン酸カルシウムヒドロキシアパタイト、2，8-ジヒドロキシアデニン、ウロモジュリン、ミオグロビン-ウロモジュリン、インジナビル、アシクロビル、ポリミキシン(たとえば、ポリスポリン、ネオスポリン、ポリミキシンB、またはポリミキシンE)、スルファジアジン、システイン、尿酸、またはリン酸マグネシウムアンモニウムである。
【０３１０】
腎臓癌
いくつかの実施形態では、腎障害は腎臓癌である。
【０３１１】
いくつかの実施形態において、腎臓癌は、腎細胞癌、移行上皮癌、ウィルムス腫瘍、または腎肉腫である。いくつかの実施形態では、腎臓癌は、腎細胞癌、たとえば、腎明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、嫌色素性腎細胞癌、集合管腎細胞癌、多嚢胞性腎細胞癌、髄様癌、粘液性尿細管および紡錘細胞癌、または神経芽細胞腫に関連する腎細胞癌である。
【０３１２】
いくつかの実施形態において、腎臓癌は、タンパク質修飾、遺伝子突然変異、遺伝子転座、化学物質曝露、遺伝的機能不全、またはエピジェネティック修飾によって引き起こされる。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、腎臓癌はタンパク質修飾によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、タンパク質修飾は、タンパク質のリン酸化またはタンパク質のトランケーションである。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、腎臓癌は遺伝子変異によって引き起こされる。いくつかの実施形態において、遺伝子変異は癌遺伝子をオンにするか、または腫瘍抑制遺伝子をオフにする。いくつかの実施形態では、遺伝子変異は、VHL遺伝子における変異、FH遺伝子における変異、FLCN遺伝子における変異、SDHB遺伝子における変異、SDHD遺伝子における変異、またはMET癌遺伝子における変異などの遺伝性の遺伝子変異である。いくつかの実施形態において、遺伝子突然変異は、癌を引き起こす化学物質によって引き起こされる腫瘍抑制遺伝子および／または癌遺伝子における突然変異などの後天的遺伝子突然変異である。いくつかの実施形態では、遺伝子変異は、VHL遺伝子への変異によって引き起こされる後天的遺伝子変異である。いくつかの実施形態において、遺伝子発現の変化は、タンパク質発現および／または機能における下流の変化をもたらし得る。
【０３１５】
いくつかの実施形態において、腎臓癌は遺伝子転座によって引き起こされる。遺伝子転座は、機能が変化したタンパク質をもたらす2つの異なる遺伝子間の融合(すなわち、BCR-ABL遺伝子融合)を導き得る。
【０３１６】
いくつかの実施形態において、腎臓癌は、腎臓癌を引き起こす化学物質への曝露によって引き起こされる。
【０３１７】
いくつかの実施形態において、腎臓癌は遺伝的機能障害によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、遺伝的機能障害はヌクレオチドに突然変異を引き起こす。いくつかの態様において、突然変異はタンパク質発現および／または機能における下流の変化をもたらしうる。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、腎臓癌はエピジェネティック修飾によって引き起こされる。エピジェネティック修飾には、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、SUMO化、カルボニル化、グリコシル化、またはマイクロRNAの発現によるヌクレオチドまたはDNA骨格の修飾が含まれる。いくつかの実施形態では、エピジェネティック修飾は、タンパク質発現および／または機能における下流の変化をもたらし得る。
【０３１９】
いくつかの実施形態において、腎臓癌の結果は、過剰増殖、血管新生、低酸素症、または周囲組織の死である。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、腎臓癌の結果は過剰増殖である。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、腎臓癌の結果は血管新生である。
【０３２２】
いくつかの実施形態において、腎臓癌の結果は低酸素症である。腫瘍低酸素症は、腫瘍細胞から酸素が奪われている状況である。腫瘍が成長するにつれて、それは急速にその血液供給を上回り、酸素濃度が健康な組織におけるよりも有意に低い領域を有する腫瘍の部分を残す。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、腎臓癌の結果は周囲組織の死である。
【０３２４】
腎尿細管モデルにおいて腎障害を作り出す方法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の腎障害は、モデルを有毒物質または高レベルのグルコースなどの分子と接触させて、腎障害に特徴的な腎尿細管表現型を生じさせることによって本明細書に記載の腎尿細管モデルにおいて形成される。
【０３２５】
いくつかの実施形態において、腎障害は、モデルにおける遺伝的に改変された細胞によって腎尿細管モデルにおいて作られる。いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、モデルが形成される前に改変される。いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、モデルが形成された後に改変される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変はトランスポーター中の多嚢胞性変異(polycystic mutation)である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、レトロウイルス、CRISPR、ウイルス形質導入、または化学的突然変異誘発を用いることによって行われる。いくつかの実施形態では、遺伝的改変は幹細胞内で行われ、次いでこれを用いて腎尿細管障害モデルを製造する。いくつかの実施形態において、バイオインクは、遺伝子改変を有する幹細胞を含み、バイオインクは、腎尿細管障害モデルを作製するために使用される。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、腎障害は、罹患したドナーからの細胞を用い、それらを細胞インプットとして用いることによって、腎尿細管モデルにおいて作られる。いくつかの実施形態において、細胞は、特定の疾患を有するドナーから単離され得、腎尿細管障害モデルを作製するために使用され得る。いくつかの実施形態では、バイオインクは、特定の疾患を有するドナーから単離された細胞を含み、ここで、バイオインクは、腎尿細管障害モデルを製造するために使用される。他の実施形態では、人工多能性幹細胞は、遺伝的機能障害を有する成人から採取され得、腎尿細管障害モデルを作製するために使用され得る。いくつかの実施形態では、バイオインクは、遺伝的機能障害を有する成人から採取された人工多能性幹細胞を含み、ここで、バイオインクは腎尿細管障害モデルを構築するために使用される。
【０３２７】
いくつかの実施形態において、線維芽細胞、内皮細胞、および／または上皮細胞は、疾患表現型を誘導するために、組織への組み込みの前または組織形成の後に遺伝的に改変され得る。いくつかの実施形態では、バイオインクは、遺伝子改変された線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、または他の腎臓細胞を含み、ここで、バイオインクは腎尿細管障害モデルを作製するために使用される。
【０３２８】
腎尿細管モデルの生存能力または機能性の試験
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、アポトーシス経路の誘導を測定することによって決定される。 いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、カスパーゼ活性化によって決定される。いくつかの実施形態において、カスパーゼ活性は合成ペプチド基質を用いて測定される(Kumar, 2004)。他の実施形態では、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、クロマチン凝縮、核断片化、またはミトコンドリア放出またはチトクロムcなどのアポトーシスの顕著な特徴を測定することによって決定される。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、細胞または核の形態学的変化を測定することによって決定される。細胞形態または核形態の変化を測定する方法は、組織学または顕微鏡検査による検査を含む。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、ミトコンドリアの数または形態の変化を測定することによって決定される。ミトコンドリアの数および形態は、組織学または顕微鏡検査を用いて測定することができる。いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、ミトコンドリアの下流機能を測定することによって決定される。ミトコンドリアの下流機能は、ミトコンドリア呼吸を測定するための市販のキットを用いて測定することができる。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、サイトカインまたはケモカインの分泌を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、サイトカインおよびケモカインの分泌は、組織学、ELISA、質量分析、臨床化学分析装置、またはイムノアッセイ分析装置によって測定することができる。
【０３３２】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、細胞外マトリックスの沈着の量および／またはパターンを測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、細胞外マトリックスの沈着の量および／またはパターンは、組織学またはイムノアッセイによって測定することができる。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、組織内のタンパク質結晶または塩結晶の沈着を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、組織内のタンパク質結晶または塩結晶の沈着は、組織学または顕微鏡検査法を用いて測定することができる。
【０３３４】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、尿細管再生または代償性増殖を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、尿細管再生または代償性増殖は、組織学を使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、組織学的染色は増殖細胞核抗原(PCNA)またはKi-67に対するものである。
【０３３５】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、上皮間葉転換(EMT)を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、EMTは組織学または顕微鏡検査を用いて測定することができる。
【０３３６】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、炎症を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、炎症は、組織学、ELISA、質量分析、臨床化学分析装置、イムノアッセイ分析装置を用いて、または分子診断分析装置を用いた遺伝子発現によって測定することができる。
【０３３７】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、虚血を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、虚血は、低酸素誘導因子の証拠を探すことによって測定することができる。低酸素誘導因子の証拠は、組織学を用いて、または分子診断分析装置を用いた遺伝子発現によって測定することができる。
【０３３８】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、過剰増殖を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、過剰増殖は、組織学または顕微鏡検査法を用いて測定することができる。
【０３３９】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、遺伝子発現の変化を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、遺伝子発現の変化は分子診断分析装置(例えば、マイクロアレイ、RNA配列決定、またはqPCR)を用いて測定することができる。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、タンパク質発現の変化および／または翻訳後修飾によって決定される。 いくつかの実施形態では、タンパク質の発現レベルおよびタンパク質の翻訳後修飾は、組織学、顕微鏡検査、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ELISA、イムノアッセイ、または分子診断分析機を用いて測定することができる。
【０３４１】
いくつかの実施形態において、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、バイオマーカーの分泌を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの分泌は、ELISA、タンパク質活性アッセイ、イムノアッセイ、または分子診断分析機を用いて測定することができる。他の実施形態では、マイクロRNAなどの核バイオマーカーの分泌は、分子診断分析装置(例えば、マイクロアレイ、RNA配列決定、またはqPCR)を用いて測定することができる。他の実施形態では、他の化学バイオマーカーの分泌は、質量分析法または臨床化学分析装置を用いて測定することができる。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルの生存能力または機能性は、エピジェネティック修飾を測定することによって決定される。いくつかの実施形態において、エピジェネティック修飾は、分子診断分析機(例えば、DNAメチル化キット)を用いて測定することができる。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、腎組織細胞の生存能力または機能性は、対照と比較した、細胞質プロリンリッチチロシンキナーゼ-2(Pyk2)発現、チアジド感受性共輸送体(TSC)発現、上皮増殖因子(EGF)発現、トランスフォーミング増殖因子アルファ(TGF-α)発現、幹細胞因子(SCF)発現、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF-β)発現、結合増殖組織因子(CTGF)発現、補体因子B発現、トール様受容体2(TLR2)発現、トール様受容体4(TLR4)発現、インターロイキン-6(IL-6)発現、クラスII主要組織適合遺伝子複合体(MHC)発現、細胞間接着分子-1(ICAM-1)発現、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)発現、またはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1(PAI-1)発現、の発現および／または濃度の、変化を測定することによって決定される。これらの因子の発現および／または濃度の変化は、抗体ベースのアッセイを含む当技術分野において周知の方法に従って測定することができる。
【０３４４】
細胞質プロリンリッチチロシンキナーゼ-2(Pyk2)は、管状上皮細胞において豊富に発現されることが見出されており、それは、Gタンパク質共役受容体に対するアゴニスト、細胞内カルシウム濃度、炎症性サイトカイン、ストレスシグナル、およびインテグリン媒介性細胞接着、を含むいくつかの刺激によって活性化される。(Sonomura et al., 2012)。Pyk2は腎線維症における重要な開始因子であり得ると考えられている。
【０３４５】
チアジド感受性共輸送体(TSC)は、インサイツハイブリダイゼーション研究により、逆転写において、および顕微解剖ネフロンセグメントとのポリメラーゼ連鎖反応において、腎臓の遠位回旋状細管に局在化することが示されている(Taniyama et al., 2001)。ヒトTSC遺伝子の機能喪失を導き得る突然変異は、脱水症、低カリウム代謝性アルカローシス、低マグネシウム血症、および低カルシウム尿症を特徴とするギテルマン症候群を引き起こすことが示されている。
【０３４６】
ErbBシグナル伝達は、腎臓電解質ホメオスタシスおよび腎臓の完全性の維持に関与していることが見出されている(Melenhorst et al., 2008)。ErbB受容体ファミリーは、受容体型チロシンキナーゼスーパーファミリーのサブクラスIに属し、上皮成長因子(EGF)受容体(EGFR、HER1、およびErbB1)、HER2/neu(ErbB2)、HER3(ErbB3)、およびHER4(ErbB4)を組み込む。EGFR発現は、ほとんどの正常なヒト腎臓の細管において検出されている。さらに、EGFの増加は腎機能の減少およびアポトーシスの重症度と相関する尿細管間質性EGF発現の減少と関連していた。
【０３４７】
トランスフォーミング増殖因子-アルファ(TGF-α)は、ヒト腎臓異形成症の原始尿細管において検出されている(Melenhorst et al., 2008)。
【０３４８】
サイトカイン幹細胞因子(SCF)は、尿細管上皮をアポトーシスから保護することが示されている(Stokman, G., 2010)。尿細管上皮の生存は、腎虚血後の腎組織の再生に成功するために重要である。
【０３４９】
トランスフォーミング増殖因子ベータ1(TGF-β1)は、オートクリンまたはパラクリン機序を介した急性損傷後の組織再生を促進することが見出されている(Basile et al., 1996)。TGF-β1の発現の上昇は、外側髄質の再生細管内の細胞に主に局在することが見出された。TGF-β1発現はまた、ペルオキシソーム増殖因子-活性化受容体-γ(PPAR-γ)によって阻害されることも見出された(Wang et al., 2009)。PPAR-γは腎臓病において抗炎症効果を有することが見出されている。
【０３５０】
結合組織増殖因子(CTGF)は、remant腎臓におけるTGF-β1の線維化促進効果のための下流メディエータとして作用することが見出されており、TGF-β1依存性間質性線維症を治療するようにデザインされた抗線維化剤の標的であり得る(Okada et al., 2005)。グルココルチコイドデキサメタゾンでの処置後に、微小変化腎炎症候群の患者からの腎尿細管上皮細胞がCTGFを産生することも見出された(Okada et al., 2006)。
【０３５１】
補体因子Bの発現は、Toll様受容体4(リポ多糖)またはToll様受容体3(ポリイノシン・ポリシチジン酸)での刺激後、ヒト近位尿細管細胞およびマウス尿細管上皮細胞において増加することが示されている(Li et al., 2016)。
【０３５２】
腎尿細管上皮細胞の腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)およびトリプトライドへの曝露、およびそれに続くフローサイトメトリー分析によるB7-H1およびB7-DCの発現の検査は、B7-DCではなくB7-H1が、腎尿細管上皮細胞上で構成的に発現されることを示した(Chen et al., 2006)。そして、B7-H1は、TNF-αの刺激によって顕著に上方制御され、トリプトライドによって下方制御されることが示された。トール様受容体(TLR)の明確な発現パターンがマウスの初代腎尿細管上皮細胞において見られ、上皮細胞が直接刺激に応答してC-Cケモカインを分泌することが見いだされた(Tsuboi et al., 2002)。特に、マウス初代腎尿細管上皮細胞において発現されるTLR2およびTLR4は、細菌成分に対する直接応答を媒介することが示された。
【０３５３】
腎尿細管上皮細胞におけるインターロイキン-6(IL-6)の発現は、免疫抑制剤ミコフェノール酸の投与によって阻害されることが見出されている(Baer et al., 2004)。IL-6は、さまざまな形態の免疫介在性腎疾患における腎尿細管損傷の発達に関与している。
【０３５４】
腎尿細管上皮細胞におけるクラスII主要組織適合遺伝子複合体(MHC)およびB7-1発現は、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)およびリポサッカライドによって媒介されることが見出された(Banu et al., 1999)。
【０３５５】
細胞間接着分子-1(ICAM-1)の発現は、サイトカインであるインターフェロン-γ、TNF-α、およびIL-1によって腎尿細管上皮細胞においてアップレギュレートされることが見出された(Ishikura et al., 1991)。
【０３５６】
単球／マクロファージおよびTリンパ球に対する強力な走化性活性を有するケモカインである単球走化性タンパク質-1(MCP- 1)は、タンパク質過負荷で攻撃された近位尿細管細胞において上方制御されることが見出されている(Zoja et al., 2003)。そして、ケモカインフラクタルカインは、近位尿細管細胞のアルブミン刺激により過剰発現されることも見出された。
【０３５７】
アンジオテンシンIIおよびアンジオテンシンIVは、正常な成人ヒト腎臓由来の近位尿細管上皮細胞系においてプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1(PAI-1)発現の増加を誘導することが示された(Gesualdo et al., 1999)。PAI-1は、尿細管間質性線維症の一因となる強力なECM分解酵素であるメタロプロテイナーゼの変換を防ぐことが見いだされている。
【０３５８】
腎線維症のモデル
バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを含む、腎線維症のモデルが提供される。いくつかの実施形態では、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルは、腎間質組織の層であって、腎間質組織が、腎線維芽細胞、内皮細胞および／または線維性組織を含む、層と、腎上皮組織の層であって、腎上皮組織が、腎尿細管上皮細胞を含む、層と、含む。ただし、間質組織は間質バイオインクを含み、上皮組織は上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成することを条件とする。一実施形態において、腎線維症のモデルは、線維症がモデル中に存在する場合、収縮、カーリング、組織の拡大、または他の線維症表現型を示す。
【０３５９】
いくつかの実施形態において、モデルは、腎間質組織層と腎上皮組織層との間に基底膜の層をさらに含む。いくつかの実施形態では、腎上皮組織の層は基底膜の層と連続的に接触しており、基底膜の層は腎間質組織の層と連続的に接触している。
【０３６０】
いくつかの実施形態において、線維芽細胞および内皮細胞は、約50：50の線維芽細胞対内皮細胞比で腎間質組織の層に存在する。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、腎尿細管モデルは、平面組織構造の変形および過剰な細胞外マトリックス沈着を示す。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、線維芽細胞および内皮細胞は、腎尿細管モデルがプリントの6日後に平面になる比率で存在する。
【０３６３】
腎線維症のモデルを作製する方法もまた提供され、その方法は、バイオプリントされた人工の三次元生体腎尿細管モデルを、間質線維性組織形成を誘導し得る剤と接触させることを含む。ここで、腎尿細管モデルは、腎間質組織の層であって、腎間質組織が腎線維芽細胞および内皮細胞を含む、層と、腎上皮組織の層であって、腎上皮組織が腎尿細管上皮細胞を含む、層と、を含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成する。ただし、間質組織は間質バイオインクを含み、上皮組織は上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体腎尿細管モデルを形成することを条件とする。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、間質線維性組織沈着を誘導することができる剤は、シクロスポリンA、アリストロキア酸、タクロリムス、TGF-β、シスプラチン、アシクロビル、アロプリノール、ベータラクタム系抗生物質、インジナビル、ランソプラゾール、オメプラゾール、パントプラゾール、フェニトキシン、ラニチジン、またはバンコマイシンである。
【０３６５】
本明細書における開示はビジネス方法を含む。一部の態様において、インビトロアッセイなどの研究・開発用の細胞ベースツールにおいて使用するための腎尿細管モデルを作製するための産業用施設および/または商業用施設を設計、建設、および運転するために、本明細書において開示された技法および方法のスピードおよび拡張性が利用される。さらなる態様において、前記腎尿細管モデルおよびそのアレイは、例えば、細胞アレイ(例えば、マイクロアレイまたはチップ)、組織アレイ(例えば、マイクロアレイまたはチップ)、ならびに生物学的アッセイ用およびハイスループット薬物スクリーニング用のキットとして生産、保管、配布、市販、宣伝、および販売される。他の態様において、人工の腎尿細管モデルおよびそのアレイは、生物学的アッセイおよび/または薬物スクリーニングをサービスとして行うために生産および利用される。
【０３６６】
検証
理想的な人工の腎組織は完全にヒトであり、かつ腎尿細管上皮細胞、腎間質線維芽細胞、および内皮細胞を含む多細胞である。さらに、理想的な人工の腎組織は、CYP1A2、CYP2C9、およびCYP3A4活性、アルブミン輸送、ならびにビタミンDヒドロキシル化、γ-グルタミル-トランスフェラーゼ活性を含むが、これに限定されない特定の機能を示す。さらに、理想的な人工の腎組織は密着結合、カドヘリン、輸送体の極性、およびCD31発現でも特徴付けられ、アルブミン輸送、CYP450活性、組織学、および生存能力を含む特定のアッセイによって検証される。一部の態様において、本開示の腎尿細管モデルは、1日より長く、2日より長く、3日より長く、4日より長く、5日より長く、6日より長く、7日より長く、8日より長く、9日より長く、10日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して増加した特定の機能を示す。一部の態様において、本開示の腎尿細管モデルは、1日より長く、2日より長く、3日より長く、4日より長く、5日より長く、6日より長く、7日より長く、8日より長く、9日より長く、10日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して2倍増加した特定の機能を示す。一部の態様において、本開示の腎尿細管モデルは、1日より長く、2日より長く、3日より長く、4日より長く、5日より長く、6日より長く、7日より長く、8日より長く、9日より長く、10日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して5倍以上増加した特定の機能を示す。一部の態様において、本開示の腎尿細管モデルは、21日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して2倍以上増加した特定の機能を示す。一部の態様において、本開示の腎尿細管モデルは、27日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して5倍以上増加した特定の機能を示す。一部の態様において、本開示の腎尿細管モデルは、27日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して2倍以上増加した特定の機能を示す。一部の態様において、本開示の腎尿細管モデルは、21日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して5倍以上増加した特定の機能を示す。ある特定の態様において、特定の機能はγ-グルタミル-トランスフェラーゼ活性である。ある特定の態様において、特定の機能はビタミンDヒドロキシル化である。
【０３６７】
一部の態様において、本明細書に記載の人工の組織は、以下:
●細胞内密着結合(E-Cad、ZO-1、およびクローディン)の形成ならびに輸送体(頂端:OAT4、URAT1)およびインテグリン(側底)の正しい細胞内局在化を有する腎尿細管上皮細胞の極性化
●尿細管細胞層と、その下にある間質との間での基底膜の発達
●組織様尿細管細胞の発達を含む広範囲にわたる間質内微小血管網:微小血管空間関係の確立
●尿細管上皮輸送体(キュビリン、メガリン、アクアポリン)、OAT、URAT)、血管マーカー(CD31、vWF)を含む区画(compartment)特異的マーカーの発現、EPOタンパク質産生の証明(該当する場合)
●25-(OH)1ヒドロキシラーゼ(1OHアーゼ)を介したビタミンD合成
●アンジオテンシンIIの産生
●キュビリンを介した尿細管内腔からのアルブミン能動輸送
●側底面からのシメチジン輸送/蓄積
●代謝に関与するCYP450発現およびUGT発現(それぞれ、例えば、CYP2B6、3A5、4A11と、UGT1A9、2B7)
を含むが、これに限定されない組織学的特徴および腎尿細管特異的機能を含む、インビボヒト腎組織に関連する重要な構造的特性および機能的特性を有する。
【実施例】
【０３６８】
以下の例示的な実施例は、本明細書に記載のソフトウェアアプリケーション、システム、および方法を代表するものであり、限定することは全く意図されていない。
【０３６９】
実施例1-バイオプリントされた三次元腎尿細管細胞モデル
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ)から購入し、ゲンタマイシンまたはアンホテリシンBを含まないEBM-2サプリメントを含むEGM-2(Lonza, Basel, Switzerland)で培養した。成人腎線維芽細胞は、DV Biologics(Yorba Linda, CA)から購入し、Fibroblast Cellutionsサプリメントを含むFibroblast Cellutions Medium(DV Biologics, Yorba Linda, CA)中で増殖させた。初代ヒトRPTECは、4つの異なる販売業者(Lonza, Sciencell(Carlsbad, CA), Zen-Bio(Research Triangle Park, NC), Lifeline Cell Technology(Frederick, MD)から購入し、製造元の指示に従って培養した。
【０３７０】
全ての腎臓は、National Disease Research Interchange(Philadelphia, PA)を通じて倫理的に調達された。RPTEC細胞を以前に記載されたように単離した(Vesey et al., 2009)。手短に言えば、受け取り次第、腎臓を無菌的に開梱し、残存する脂肪体、尿管、血管または他の組織を除去するために洗浄した。皮質組織の切片を細かく刻み、コラゲナーゼで消化し、そして収集した細胞を、イオジキサノール勾配(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)にわたる遠心分離により上皮について富化した。RPTECはGBG(商標)上皮培地(Samsara Sciences, San Diego, CA)で培養した。
【０３７１】
実施例2-バイオプリントされた三次元腎尿細管細胞モデル
3D PT NovoView(商標)組織を、記載されるように作製した(Nguyen et al, 2016)。簡単に説明すると、培養した腎線維芽細胞およびHUVECを50：50の比で組み合わせ、NovoGel(登録商標)Bio-Inkに再懸濁し、次に、以前に確立されたプロトコル(Forgacs et al., 2012; Murphy et al., 2015; Nguyen et al., 2016)にしたがって、NovoGen Bioprinter(登録商標) Instrument (Organovo Inc., San Diego, CA)を用いて、24ウェルプレート(Corning Costar, Corning, NY)中の0.4μm Transwell透明ポリエステルメンブレンインサート上にバイオプリンティングした。バイオプリンティングに続いて、NovoView(商標)組織をNovoView(商標)Kidney Media(Organovo, San Diego, CA)で培養した。培養3日目に、初代RPTEC細胞をRPTEC培地中の1.25×106細胞／mlの懸濁液中の組織に添加した。次いで、1日おきに培地交換しながら、組織をNovoView(商標)Kidney Media(Organovo, San Diego, CA)中で30日間まで維持した。毒性試験のために、培養14日目に始めて、組織を頂端側区画および側底側区画に毎日投与した。シスプラチン投与試験のために、Transwellインサートの頂端側および側底側区画に対し、最終濃度2.5％のFBS(v／v)を培養培地に補充した。
【０３７２】
実施例3-バイオプリントされた組織に対する代謝アッセイおよび生存能力アッセイ
組織の生存能力および健康状態の代用物としての代謝活性の評価は、製造業者のプロトコル(Thermo Fisher, Carlsbad, CA)に従ってalamarBlue(商標)アッセイによって実施した。手短に言えば、組織をダルベッコリン酸緩衝塩類溶液(DPBS)で2回洗浄し、10％v/vのalamarBlue試薬を補充したRPTEC培地を各組織に添加した。すべての組織を、95％の相対湿度および5％のCO2で、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、alamarBlue溶液を除去し、560nmの励起フィルターおよび590nmの発光フィルターを備えたBMG Labtech POLARstar Omegaプレートリーダー(Cary, NC)で蛍光を測定した。グラフ化されたデータは、経時的な代謝活性についてブランクと比較した相対蛍光単位(RFU)のパーセント、または毒性試験についてビヒクル対照と比較したRFUのパーセントを表す。
【０３７３】
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性アッセイは、製造元のプロトコル(Abcam, Cambridge, MA)に従って実施した。馴化培地を3D PT組織から収集し、新鮮な培地でさらに希釈して、サンプルのLDH活性がアッセイの直線範囲内にあることを確認した。サンプルをマイクロプレートリーダー(BMG Labtech, Cary, NC)で測定した。GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad, San Diego, CA)を用いて、用量および期間について正規化した吸光度の標準曲線積分によってLDH活性を決定した。示されるデータは、サンプリングの各日についてのビヒクル対照に対するLDH活性の倍数変化を表す。
【０３７４】
製造元のプロトコル(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)に従って、GGT活性を測定した。組織をDPBSで2回洗浄し、Precellys溶解チューブ(Precellys, Rockville, MD)中のGGTアッセイ緩衝液中で溶解した。GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad, San Diego, CA)を用いて、37℃でのインキュベーション期間の用量および持続時間について正規化した吸光度の標準曲線積分と比較することによって、溶解物をGGT活性について評価した。示されるデータは、経時的なGGT機能の分析についてのmIU／mlでの平均GGT活性、または毒性試験についてのビヒクルに対するパーセントを表す。
【０３７５】
TEERを測定するために、21日間培養した個々の3D PT組織をTranswellインサートから取り出し、Ussingチャンバー(Physiologic Instruments, San Diego, CA)に入れた。研究は本質的に以前に記載されているようにして行った(Clarke, 2009)。グルコースを含むクレブス重炭酸リンガー溶液に組織を入れ(115 mM NaCl, 2.4 mM K2HPO4, 0.4 mM KH2PO4, 1.2 mM CaCl2 二水和物, 1.2 mM MgCl2 六水和物, 25 mM NaHCO3-, 10 mM グルコース; すべてSigma-Aldrich, St. Louis, MOからの試薬)、緩衝液をカルボゲン(carbogen)ガス(95% O2/5% CO2)で連続的に通気した。電極オフセット電位および液体抵抗を補正した後、組織を横切る抵抗を1時間連続して測定した。
【０３７６】
受動透過性(Papp)測定のために、組織をDPBSで3回洗浄し、37℃で10分間アッセイ緩衝液(10mMのHEPESを含むDPBS、pH7.4)で平衡化した。次いで、頂端側区画に250μMのルシファーイエロー(Lucifer yellow: Thermo Fisher, Carlsbad, CA)および側底側(受容体)区画に新鮮なアッセイ緩衝液を、組織に投与した。37℃で1時間インキュベートした後、頂端部と側底部の両方のコンパートメントからサンプルを採取した。各サンプル中の蛍光を、490nmの励起フィルターおよび540nmの発光フィルターを有するBMGプレートリーダー(BMG Labtech, Cary, NC)で測定し、定量のために標準曲線に対して正規化した。 Pappは等式1で計算した。ここで、Vはルシファーイエロー溶液の体積を表し、Tはインキュベーションの持続時間であり、D0は細胞に適用したルシファーイエローの濃度であり、そしてAはトランスウェル(Transwell)インサートの増殖面積である。
2019537729.tif 000003
【０３７７】
実施例4-アンジオテンシン変換酵素(ACE)およびアンジオテンシンIIについてのELISAアッセイ
組織溶解物および馴化培地の両方におけるACEタンパク質レベルを、製造元の説明書(Abcam, Cambridge, MA)を用いてELISAによって検出した。停止溶液を添加してから30分以内にプレートを450nMで読み取った(BMG Labtech, Cary, NC)。GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad, San Diego, CA)を用いて標準曲線と比較することにより試験試料の濃度を決定した。
【０３７８】
ACE酵素機能を評価するために、3D PT組織を5ng／mlのヒトアンジオテンシンI(Abcam, Cambridge, MA)で24時間処理し、次いで、アンジオテンシンIIを、製造元(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)の指示にしたがってSigmaからの競合ELISAキットを用いて検出した。停止溶液の添加後30分以内にプレートを450nMで読み取った(BMG Labtech, Cary, NC)。試験試料中のアンジオテンシンIIの濃度は、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad, San Diego, CA)を用いて標準曲線と比較することにより決定した。
【０３７９】
実施例5-異なる腎線維芽細胞対内皮細胞比でバイオプリントされた三次元腎尿細管モデル
組織形態に対する線維芽細胞対内皮細胞の比の効果を決定するために実験を行った。腎尿細管モデルは、腎線維芽細胞およびHUVEC細胞を90：10、75：25、および50：50(線維芽細胞対内皮細胞)の比で含むバイオインクを用いてバイオプリントした。 
【０３８０】
実施例6-組織学
3D PTを2％パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)中で一晩固定した。組織を、HistoGel(Thermo Fisher, Carlsbad, CA)に予め包埋することによって横断切片化のために配向させ、次いでTissueTek VIP組織プロセッシングシステム(Sakura Finetek USA, Torrance, CA)での自動プロセッシングによって脱水してパラフィンを浸透させた。組織をJung Histocutミクロトーム(Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL)で5μMに切片化した。ヘマトキシリンおよびエオシン(H＆E)またはゴモリのトリクローム(TCM)染色は、製造元の指示に従ってLeica Autostainer XL (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL)を用いて生成した。免疫組織化学は、表1の一次抗体を用いて、以前に記載されたように(King et al., 2013)実施した。一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした後、切片を、1：200の希釈でAlexaFluor-結合二次抗体(Thermo Fisher, Carlsbad, CA)で染色した。P-gpおよびSGLT2検出のために、製造元の指示(Thermo Fisher, Carlsbad, CA)に従ってチラミドシグナル増幅を行った。スライドを対比染色し、DAPIを含むFluoroGel II(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)でマウントした。H&EおよびTCM画像は、Zeiss Zenソフトウェア(Zeiss Microscopy, Thornwood、NY)を備えたZeiss Axioskopで取得した。免疫蛍光画像は、Zeiss Zenソフトウェアを備えたZeiss AxioImager A2で取得した。
【０３８１】
【表１】
2019537729.tif 000004
【０３８２】
実施例7-RNAの単離および定量的RT-PCR
3D PT組織からのRNA抽出は、製造元の指示(Zymo Research, Irvine, CA)に従って、Zymo Direct-zol RNAキットを用いて行った。RNAを、NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, Carlsbad, CA)を用いて分光光度法によって定量し、製造業者の指示(Thermo Fisher, Carlsbad, CA)にしたがって、SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMixを用いて、cDNAに変換した。内因性ハウスキーピング対照遺伝子としてGAPDH増幅を伴うTaqMan Gene Expression Array Cardカード(Thermo Fisher, Carlsbad, CA)を用いて200ngのcDNAで増幅反応を行った。TaqManプローブ／プライマーセットを表2に記載する。増幅は、ViiA7リアルタイムPCRシステム(Thermo Fisher, Carlsbad, CA)で検出した。個々の組織からの二つ組みの試料を評価した。GAPDHと比較した目的の遺伝子についての相対定量(RQ)値は、式：RQ = (2-ΔCt)*10000を用いて計算した。GAPDHと比較した目的の遺伝子についてのRQを、GAPDHと比較したKRT18についてのRQで割ることによって、各試料についてのRQ値をKRT18について正規化した。実験日のKRT18正規化RQを、3日目(またはSGLT2について12日目)のKRT18正規化RQで割ることによって、倍率変化を計算した。
【０３８３】
【表２】
2019537729.tif 000005
【０３８４】
実施例8-グルコース取り込み比色アッセイ
製造元のプロトコル(Abcam, Cambridge, MA)に従って、3D PT組織中のグルコース取り込みを検出および定量した。インスリン-トランスフェリン-セレン(Gibco, Carlsbad, CA)を用いてグルコース取り込みを刺激し、カナグリフロジン(Santa Cruz Biotech, Dallas, TX)を用いてSGLT2機能を阻害した。アッセイ前に、組織をDPBS/HEPES、pH 7.4中で一晩飢餓状態にした。次に、組織を1×インスリンまたは500μMカナグリフロジンで20分間前処理し、続いて1mMの2-デオキシグルコースを添加した。組織をPBSで十分に洗浄し、Precellys溶解チューブ(Precellys, Rockville, MD)中の抽出緩衝液中で溶解した。2-デオキシグルコース取り込みをマイクロプレートリーダー(BMG Labtech, Cary, NC)でOD412nmで測定し、結果を、GraphPad Prism Software (GraphPad, San Diego)を用いて、対照に対する倍率変化としてグラフ化した。
【０３８５】
実施例9-ローダミン123のベクトル輸送
3D PT組織をDPBSで3回洗浄し、37℃で10分間、アッセイ緩衝液(10mM  HEPESを補充したDPBS、pH7.4)に対し平衡化した。次いで、5μMゾスキダル(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)の存在下または非存在下で、組織の頂端側および側底側の両方をアッセイ緩衝液中37℃で20分間、プレインキュベートした。前処理後、組織に、5μMゾスキダルを含むまたは含まない1μMローダミン123(Molecular Probes, Eugene, OR)を側底側に37℃で2時間、投与した。インキュベーション後、組織を冷アッセイ緩衝液で洗浄し、2％PFAで固定し、そして凍結切片にした。全ての条件にわたって同じ露光時間で画像を撮影した。バックグラウンドおよび相対面積について補正した蛍光強度をImage J(National Institutes of Health, Bethesda, MD)で計算し、GraphPad Prism Software(GraphPad, San Diego)を用いて対照に対する倍率変化としてグラフ化した。
【０３８６】
GraphPad Prismソフトウェア(La Jolla, CA)を用いて統計値を計算した。示されるデータは平均±SEMである。統計的有意性(P <0.05)は、必要に応じて、Dunnetの事後検定、一元配置分散分析、または二元配置分散分析を用いるt検定によって計算した。
【０３８７】
実施例10-結果-ヒトPTの尿細管間質界面の3Dモデルの開発および特徴付け
培養した初代ヒトRPTECは、上皮間葉転換または老化を経験する前に、培養において有限の寿命を有し、形態および機能の喪失を伴う(Wieser et al., 2008)。豊富な証拠は、3Dアーキテクチャおよび支持細胞型を含む適切な微小環境が、極性化上皮の継続的な健康および機能の維持および支持を助けることができるという考えを裏付ける(Kunz-Schughart et al., 2006; Bryant and Mostov, 2008; Nagle et al., 2011: Li et al., 2014)。腎毒性を研究するための3Dヒトシステムを開発するために、Organovo NovoGen Bioprinterシステムを用いて、PT尿細管間質界面のモデル(NovoView組織)を作製した。図1Aの概略図に示すように、初代ヒト腎線維芽細胞およびHUVECから構成される基底多細胞間質層、ならびに基底膜によって支持された極性化初代ヒトRPTECの頂端単層を用いて組織をデザインした。バイオプリンターの使用は、標準的なマルチウェルTranswellインサート上に作製された空間的に規定された組織の再現可能な生成を可能にした(図1B)。
【０３８８】
14日間培養した後、PT組織を組織の組織化、細胞形態学、ならびに内皮および上皮マーカーの保持について分析した。3D組織のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色は、スピンドル形状の線維芽細胞と、内皮細胞内張ネットワークを形成するためのリモデリングを受けているHUVECの領域とから構成される低細胞密度の間質層を示した(図2A)。RPTEC細胞の単層が、間質の直上に、柱状形態および基底方向に配向した核と共に観察された。間質細胞自体は、ゴモリのトリクローム染色によって示されるように、豊富なECMを分泌し、組織の中央および上皮層の下にある内皮細胞ネットワーク(赤色)の周囲にフィブリル構造が見える(図2B)。H＆Eおよびトリクロームによって観察された推定される内皮細胞ネットワークはCD31を発現し、そしてHUVECが内皮細胞によって裏打ちされたオープンスペースを形成するように組織化されていることを実証した(図2C)。上皮から間質を分離すると、上皮細胞の基底側にすぐ隣接したコラーゲンIVに富む基底膜があった(図2D)。3D PTモデルにおけるRPTEC細胞は、隣接する細胞間に側方に局在するE-カドヘリンを伴って(図2E)、単層にわたって均一にサイトケラチン18を発現した(図2E)。RPTECの側底膜へのNa＋／K＋  ATPアーゼの偏光分布もまた観察された(図2F)。
【０３８９】
全体的な組織代謝活性および寿命を評価するために、alamarBlueアッセイにおいて、培養中の4週間にわたってレサズリンを減少させる能力について組織を評価した(図3A)。3日目から7日目までの代謝活性の最初の減少の後、3D PT組織の代謝活性は10日目〜30日目まで増加し続けた。RPTEC機能の寿命をより詳細に評価するために、3D PT組織または上皮を欠如している組織(間質のみ)を、培養中の時間の関数として、GGT活性について評価した。3D PT組織は、7日目の5mIU／mlから30日目の30mIU／mlへ、GGT活性の増加を示した(図3B)。予想通り、RPTECを欠く間質のみの組織は、30日間の培養期間を通して無視できるほどのGGT活性を示した(図3B)。まとめると、これらの知見は、少なくとも4週間、RPTEC形態、生存能力および機能を支持することができる腎尿細管間質界面の頑強な3Dモデルの形成を実証する。
【０３９０】
実施例11-バリア機能の特徴付け
3D PT組織のバリア機能を測定するために、培養21日後にUssingチャンバーを用いて経上皮電気抵抗(TEER)測定を行った。表3は、平均18.1Ω＊cm2の3D PT組織に対する平均面積補正抵抗値を示す。受動的透過性(Papp)もまた、Transwellの頂端側または側底側区画へのルシファーイエローの添加、および時間の関数として反対側区画における発蛍光団の検出によって、3D PT組織において測定した。3D PT組織は、2.97×10-6cm／sの平均Papp値を示し、これは、3D PT組織がルシファーイエローを有する上皮単層について観察されたものよりも透過性のバリアを示したことを示す(Tran et al., 2004)。まとめると、これらの値は、3D PT組織中にRPTEC細胞によって形成されたバリアが、単離された上皮単層より漏れやすいが、インビボでPTについて観察されるバリアの特徴であることを実証する(Boulpaep and Seely, 1971; Liang et al., 1999)。
【０３９１】
【表３】
2019537729.tif 000006
【０３９２】
実施例12-腎臓内レニン-アンジオテンシン系(RAS)の評価
3D PT組織が生存RASを保持しているか否かを決定するために、経路のいくつかのメンバーの遺伝子発現を最初に測定した。培養中の30日間にわたる組織の遺伝子発現分析は、検出可能なレベルのACE、アンジオテンシノーゲン(AGT)、アンジオテンシン受容体I(AGTR1)、およびレニンを示した(表1および4)。遺伝子発現データと一致して、ACEタンパク質は馴化培地および組織溶解物の両方において検出され、組織溶解物においてより高い検出を伴った(図4A)。これは、PTの刷子縁において観察されたACEの発現と相関し得る(Kobori et al., 2007)。ACEの機能を評価するために、3D PT組織に5ng／mlのヒトアンジオテンシンIを24時間投与し、アンジオテンシンIをアンジオテンシンIIに変換する能力について評価した。刺激後、アンジオテンシンIIは3D PT組織において0.4 pg/mlで検出された(図4B)。したがって、3D PT組織は、バリア機能の発達およびアンジオテンシンIのアンジオテンシンIIへの変換を含む、インビボPTと生理学的に関連のある特徴を示した。
【０３９３】
【表４】
2019537729.tif 000007
【０３９４】
実施例13-3D PT組織中の腎臓トランスポーターの分析
腎毒性に対する感受性に関連するPTの重要な特徴は、PTを取り囲む毛細血管または尿細管の内腔中の糸球体濾液から化合物を取り込むまたはそれから排出する腎臓トランスポーターの発現および機能である。初代ヒトRPTECは、2Dで培養すると急速に脱分化し、培養の時間および方法に依存してさまざまなレベルの腎臓トランスポーターおよび一連の細胞形態を示す(図11A〜11EおよびWieser et al., 2008; Vesey et al., 2009)。関連性のある腎間質で低継代数の初代ヒトRPTECを培養するとトランスポーターの発現および機能が維持されると本発明者らは仮定した。トランスポーター依存性毒性研究のための3D PTモデルの使用を検証するために、qPCRにより最初に、重要な腎臓トランスポーター遺伝子の相対的発現レベルについて組織を分析した(表1および5)。この研究において3D PT組織に組み込まれた個々のドナー細胞について、評価されたほとんどすべての腎臓トランスポーターが、培養中4週間を超えて安定した検出可能な遺伝子発現を示した(表5)。生体異物輸送体OCT2は、培養中28日を通して比較的高レベルで検出され、3日目と比較して30日目では発現が1.8倍増加した(表1および5)。キュビリン、メガリン、AQP1、およびSGLT2を含む内因性基質のための管腔内再吸収トランスポーターは、培養中30日間にわたって検出可能な発現を示した。メガリン発現は培養18日後にわずかに減少したが、SGLT2発現は経時的に増加した(表1および5)。分析された排出トランスポーターのうち、P-gpは最も高い発現レベルを示し、培養中18〜30日の間にピーク発現を示した(表1および5)。
【０３９５】
【表５】
2019537729.tif 000008
【０３９６】
(OAT3)、SLC47A1(MATE1)、SLC47A2(MATE2K)、およびSLC5A2(SGLT2)の発現をGAPDHと比較し、培養3日目と30日目の間にKRT18に対して正規化した。示したデータは、GAPDHと比較しKRT18に対して正規化した平均相対定量化(RQ)、および時点あたり2つの組織について3日目と比較した倍数変化である。SGLT2については、示される倍数変化は12日目に対するものである。NDは未検出。
【０３９７】
3D PTモデルにおける取り込みおよび排出トランスポーター機能の両方をさらに評価するために、グルコース取り込みトランスポーターSGLT2および生体異物排出トランスポーターP-gpを機能分析のために選択した。図5Aに示すように、SGLT2タンパク質発現は、3D PT組織上のRPTECの頂端面で主に検出された(3D組織はSGLT2に対する抗体で染色した(緑色))。このパターンは、ヒトPTにおいてインビボで見られるものと一致する(Brenner, 2008)。SGLT2トランスポーター機能を評価するために、組織を通常の組織維持培地中に24時間保持するか、またはグルコースを飢餓状態にし、続いてSGLT2輸送阻害剤カナグリフロジンの存在下または非存在下でインスリンによるグルコース取り込みの刺激を行った(図5B)。正常組織培地中に維持された組織において、インスリンによる処理は細胞内2-DGの4倍の増加を誘導し、それはSGLT2阻害剤カナグリフロジンの同時投与により50％まで減少した(図5B、黒および灰色のバー)。これは、組織内に機能的なSGLT2輸送が存在すること、および他の輸送メカニズムもまた全体的なグルコース取り込みに寄与していることを示唆する。組織を一晩飢餓状態にすると、インスリンはグルコース取り込みの8倍の増加を誘導し、それはカナグリフロジンによって対照組織と区別がつかないレベルまで有意に減少した(図5B、青いバー)。予想通り、組織はグルコースの非存在下で培養中に失われたグルコース恒常性を再確立しようとするので、飢餓は、通常の培地で培養された組織で観察されたものを超えて、3D PT組織によるグルコース取り込みを増加させた。SGLT2はこの過程において役割を果たすように思われる。
【０３９８】
3D PT組織においてP-gpが媒介する排出能力を評価するため、本発明者らは最初に、輸送タンパク質の局在化を決定することを望んだ。ネイティブの近位尿細管について予想されたように、P-gpタンパク質発現は、3D PTモデルのRPTEC細胞の頂端面で検出された。培養14日後、3D PT組織をP-gpに対する抗体で染色した(緑色)(図6Aおよび(Brenner, 2008))。P-gp機能を評価するために、P-gp阻害剤であるゾスキダルの存在下または非存在下で3D PT組織にローダミン123(R123)を負荷した。取り込み後、組織を洗浄し、凍結切片化して、PTモデルのRPTEC中のR123の存在を検出した(緑色)。緩衝液単独で処理した組織は緑色蛍光を示さず(対照)、一方、R123で処理した組織はRPTECの細胞質において点状の蛍光発現を示した。ゾスキダルでP-gp媒介排出を遮断すると、RPTEC単層が細胞質全体にわたって均一に蛍光を発することで、蓄積蛍光の増加が上皮において観察された(図6B)。画像定量化は、R123に曝露された組織が対照組織に対して4倍の増加を示す一方、R123＋ゾスキダルでの処置が対照組織に対して6倍の蛍光の増加およびR123処置単独と比較して有意な増加をもたらすことを示した(図6C)。したがって、3D PT組織は経時的に安定した腎臓トランスポーターの発現を示し、内因性基質トランスポーターSGLT2および生体異物トランスポーターP-gpの機能活性が確認された。
【０３９９】
実施例14-3D PT組織を用いるシスプラチン腎毒性の評価
シスプラチンは、OCT2を含む腎臓取り込みトランスポーターによるRPTEC中の分子の濃縮後の活性酸素種の生成および毒性グルタチオンコンジュゲートの形成を含む、腎毒性をもたらす複数の作用機序を有する化学療法剤である(Hanigan and Devarajan, 2003; Yonezawa et al., 2005)。さらに、シスプラチンは尿細管間質性線維症を引き起こすことが報告されている(Guinee et al., 1993)。3D PT組織がシスプラチン毒性を表し得るか否かを評価するために、組織をシスプラチンに毎日曝露した後、全体的な生存能力、GGT活性のレベル、LDHの放出、および組織学的分析の測定を行った。シスプラチンで処理した組織は、1μMほどの低い用量で、alamarBlue代謝の有意な減少を示し、5.72μMのLD50値および10μMでの生存能力の完全な喪失を示した(図7A)。シスプラチンに応答するGGT活性についても同様のパターンが観察され、5μMのシスプラチンはGGT活性のほぼ50％の減少を引き起こし、3D PTモデルのRPTECに対する有意な効果を示した(図7B)。
【０４００】
シスプラチン誘導毒性におけるOCT2媒介輸送の役割を評価するために、組織を、OCT2阻害剤であるシメチジンの存在下でシスプラチンで処理した。図8Aに示すように、ビヒクル対照と比較してシメチジン単独で処理した組織では生存能力の喪失は観察されなかった。 5μMシスプラチンで処理した組織は生存能力のほぼ50％の減少を示し(図7Aおよび図8A)、シスプラチンおよびシメチジンの組合せで処理した組織はビヒクルまたはシメチジンのみの対照と区別できない生存能力レベルを示した。このシメチジンの保護的効果は、シスプラチンまたはシスプラチンとシメチジンとの組み合わせで処理された組織からのGGT活性レベルにおいても観察された(図8B)。毒性を示すLDH放出は、5μMシスプラチン単独で処置した組織において処置5日目にピークに達し、ビヒクル対照に対して3倍の増加が観察された(図8C)。シスプラチン＋シメチジンで処理した組織は同じ損傷応答を示さず、5日目にビヒクルと比較してわずかに上昇したレベルのLDH放出を示し、7日目までに対照で処置した組織と区別できないレベルを示した(図8C)。
【０４０１】
H＆E染色による組織学的分析により、シスプラチンに応答した上皮の生存能力の喪失が確認された(図9A〜9D)。ビヒクルまたはシメチジンのみの組織は、丸い核を有する健康な円柱状のRPTECを示し(図9AおよびB)、5μMのシスプラチンで処理した組織はより扁平な形態および核の喪失を示した(図9C)。シスプラチン＋シメチジンで処理した組織は、シスプラチン単独と比較して上皮形態の実質的な改善を示し、核局在化および柱状RPTECの部分的回復を示した(図9D)。シスプラチンによって誘導された損傷に応答したRPTEC増殖を評価するために、組織を増殖細胞核抗原(PCNA)について染色した。ビヒクルまたはシメチジン処理した対照組織は低レベルのRPTEC増殖を示した。しかしながら、シスプラチンで処理した組織では用量依存的な増殖反応が観察された(図10A〜10D)。3D PT組織のRPTECにおけるこの増加した増殖は、シメチジンの同時投与によって減少した。したがって、3D PT組織は、臨床的に関連する用量のシスプラチンに曝露した後に腎毒性を再現することができ、腎毒性誘導のメカニズムとしてのOCT2トランスポーターの役割を確認することができた。
【０４０２】
実施例15-糖尿病の合併症の評価
ExVive(商標)ヒト腎組織(Organovo, San Diego, CA)は、初代腎線維芽細胞および内皮細胞のコラーゲンIVが豊富な尿細管間質界面により支持された極性化初代腎近位尿細管上皮細胞(RPTEC)の頂端層から構成される完全ヒト3Dバイオプリント組織である。14日間培養した後、健康なExVive(商標)腎組織は、未処理(対照)か、さらに14日間高濃度のグルコース(1000 mg/dL = 10 g/L)に曝露され、糖尿病患者に見られる高レベルの尿中グルコースを模倣した。
【０４０３】
次いで、組織をホルマリン固定し、包埋し、切片にし、そしてヘモトキシリンおよびエオシン(H＆E)で染色して、細胞および核の形態の変化を調べた。図12Bおよび12Dに示すように、高グルコース処理は(矢印で示すように)上皮細胞層内にグリコーゲン化核の生成を導く。グリコーゲン化核は、グリコーゲンの貯蔵に起因する「空洞化された」外観を有する核を特徴とし、核膜の周りのクロマチンの凝縮および顕著な核小体の存在を伴う(図12Dの挿入を参照)。グリコーゲン化核の存在は、糖尿病患者およびげっ歯類動物モデルにおいて観察されている。
【０４０４】
実施例15は、単離された3Dプリント近位尿細管障害モデルが、所望の表現型を誘導する通常の近位尿細管支持系なしで、所望の表現型を示すように上手く誘導され得ることを示す。近位尿細管の通常の支持系は、例として、糸球体、ボーマン嚢、および近位尿細管のための周囲の灌流系を含むであろう。糖尿病患者では、高濃度のグルコースが糸球体に蓄積する可能性があり、これは糸球体の機能不全に徐々に寄与し得る。糸球体のこの漸進的な機能不全は、最終的に、近位尿細管への過剰なグルコースの漏出をもたらす。そのため、近位尿細管は、グリコーゲン化核の存在を示す急性または慢性の糖尿病性障害を発症し始める可能性がある。実施例15はグリコーゲン化核の存在も示しており、それは、単離された3Dバイオプリント近位尿細管障害モデルが、所望の表現型を誘導する通常の近位尿細管支持系なしで、所望の疾患表現型を示すように上手く誘導することができることを示す。
【０４０５】
実施例16-結晶性沈着物の評価
健康なExVive(商標)腎組織を、未処理(対照)としたかまたは腎毒性剤に曝露した。
【０４０６】
次いで、組織をホルマリン固定し、包埋し、切片化し、次いで染色してシュウ酸カルシウム沈着物を探した。シュウ酸カルシウムは腎臓結石の成分として知られている。図13Bおよび13Cに示すように、腎組織を腎毒性剤に曝露すると、(矢印で示すように)処置依存性の沈着物が生じる。
【０４０７】
実施例17-腎線維症-TGFβで処理したExVive(商標)ヒト腎組織
本開示に記載されているように、ExVive(商標)ヒト腎組織(Organovo, San Diego, CA)は、初代腎線維芽細胞および内皮細胞のコラーゲンIVが豊富な尿細管間質界面によって支持される極性化された初代腎臓近位尿細管上皮細胞(RPTEC)の頂端層から構成される完全なヒト三次元(3D)バイオプリント組織である。腎線維症は薬物誘導性損傷の共通の下流効果であるので、尿細管間質性線維症を評価する目的で、ExVive(商標)ヒト腎組織を線維化反応の重要な役割を担うトランスフォーミング増殖因子β(TGFβまたはTGFベータ)で処理した。したがって、腎線維症を誘発するために、健康なExVive(商標)ヒト腎組織を、線維化反応に重要な役割を果たすTGFβで処理した。具体的には、各健康なExVive(商標)ヒト腎組織に7日間毎日、ビヒクル対照、0.37ng／mlのTGFβ、1.1ng／mlのTGFβ、3.3ng／mlのTGFβ、または10ng／mlのTGFβをそれぞれ投与した。続いて、ExVive(商標)ヒト腎組織をTGFβで処理した後、このExVive(商標)ヒト腎組織の生存能力および上皮細胞機能の評価を実施した。図14Aは、全体的な組織代謝活性および細胞の健康状態の尺度としてのレサズリン変換の分析を示す。処置群間で統計的に有意な差は検出されなかった。図14Bは、上皮細胞機能の尺度としてのガンマグルタミル転移(GGT)活性の分析を示す。RPTEC機能の統計的に有意な減少は、高用量のTGFβで検出された。示されるデータは、条件あたり3つの組織サンプルの平均であり、ビヒクル対照に対する倍率変化として表される。＊p＜0.05；＊＊＊ビヒクル対照と比較して各条件についてp＜0.001。
【０４０８】
線維症関連遺伝子発現もまた、TGFβで処理したこのExVive(商標)ヒト腎組織で評価した。図15は、半定量的RTPCRによる遺伝子発現分析を示し、線維性マーカーコラーゲンI(COL1A1)、結合組織成長因子(CTGF)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、または血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFRB)の誘導を示した。示されるデータは、条件あたり3つの組織サンプルの平均である。＊ビヒクル対照と比較して各条件についてp＜0.0001。
【０４０９】
TGFβで処置したExVive(商標)ヒト腎組織において、TGFβが組織肥厚および細胞外マトリックス沈着の増加を誘導することも示された。図16Aは、ECM沈着に対する代表的なゴモリのトリクローム染色を示す。図16Aに示すように、TGFβの増加は細胞外マトリックス沈着の増加を誘導した。図16Bは、組織切片中のシリウスレッド染色コラーゲンの定量化を示す。データは、組織あたり4つの技術的な複製、条件あたり3つの組織の平均を表し、ファストグリーン染色によって測定される、総タンパク質含有量に対する正規化後のビヒクル対照に対する倍率変化として表される。＊ビヒクル対照と比較した各条件についてp＜0.05。
【０４１０】
実施例17(図14〜16)は、TGFβで処理することによってExVive(商標)ヒト腎組織において腎間質性線維症が誘発され得ることを示す。TGFβで7日間ExVive(商標)ヒト腎組織を処理した後、線維症関連遺伝子の発現の増加(図15)、間質における広範なECM沈着(図16A)、および最高用量における上皮細胞機能の喪失(図14B)が示された。これらの結果は、寿命が限られている上皮細胞単層培養の伝統的なシステムでは達成できない疾患表現型である、腎傷害および間質性線維症と一致する生化学的、転写的、および組織学的レベルでの測定可能な応答を高めるというExVive(商標)ヒト腎組織の拡張された能力を実証するため、これは最先端技術における重要な技術的進歩である。したがって、ExVive(商標)ヒト腎組織は、疾患進行のメカニズムの理解、薬物誘発性腎線維症の評価、および新規抗線維症薬の開発に向けた介入戦略の調査を目的とした適用を可能にする。
【０４１１】
実施例18-シスプラチンで処理したExVive(商標)ヒト腎組織
腎毒性を誘発するのにシスプラチンを用いた。図7〜10で前述したように、シスプラチンは腎毒性を誘導することができる。各健康なExVive(商標)ヒト腎組織に毎日5、10、または25μMのシスプラチンを投与した。本開示に記載されるように、ExVive(商標)ヒト腎組織(Organovo, San Diego, CA)は、初代腎線維芽細胞および内皮細胞のコラーゲンIVの豊富な尿細管間質界面により支持される、極性化された初代腎近位尿細管上皮細胞(RPTEC)の頂端層から構成される完全なヒト三次元(3D)バイオプリント組織である。
【０４１２】
処理(Tx)3および5の後、培地上清を回収し、図17に示すように、サイトケラチン18フラグメントM30およびM65について分析した。図17に示すように、ExVive(商標)ヒト腎組織のシスプラチン処理の後、可溶性CK18は増加した。サイトケラチン18(CK18)は、上皮細胞において産生される表面マーカーである。CK18からの分泌切断産物は、細胞死のメカニズムに基づいて異なり、固相サンドイッチ酵素ELISA(Diapharma, West Chester, OH)で使用済み培地サンプルから測定することができる。M30  CK18フラグメントはアポトーシスから生じる酵素的カスパーゼ活性によって産生され、一方、M65  CK18フラグメントは死んだ細胞から放出される(アポトーシス性および壊死性)。このELISAアッセイは、複数の細胞型から構成される組織内の上皮特異的損傷の大きさを区別する能力を提供する。並行して、M30およびM65は上皮細胞死のメカニズムを決定するのを助ける。
【０４１３】
実施例19-ExVive(商標)ヒト腎組織におけるトランスポータータンパク質発現の検出
図18A〜Iは、ヒト腎皮質サンプル(KT1およびKT2)、ExVive(商標)ヒト腎組織(3D-1および3D-2)、およびプレーティングした2D  RPTEC細胞(2D  RPTECロット1105)を、LC-MS／MSによりトランスポーター発現について分析したことを示す。本開示に記載されるように、ExVive(商標)ヒト腎組織(Organovo, San Diego, CA)は、初代腎線維芽細胞および内皮細胞のコラーゲンIVの豊富な尿細管間質界面により支持される極性化された初代腎近位尿細管上皮細胞(RPTEC)の頂端層から構成される完全なヒト三次元(3D)バイオプリント組織である。各トランスポーターに固有のペプチドをインシリコ選択基準に基づいて選択した。分析前に組織／細胞試料に対して全膜単離を行った。それぞれのバーは、総試料タンパク質およびスパイクしたヒト血清アルブミン内部標準に対して正規化されたトランスポーターペプチドピークエリアを表す。図18A〜Iは、トランスポーターのタンパク質発現を記述し、図11は、トランスポーターの遺伝子発現を記述する。
【０４１４】
分析した全てのトランスポーターは、腎皮質サンプル、ExVive(商標)ヒト腎組織、およびプレーティングした2D  RPTECにおいて検出可能であった。測定されたトランスポーターはヒト腎臓内の薬物動態のために重要である。結果として、これらの輸送体は、米国食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁(EMA)などの規制承認機関によって、ヒト腎臓における薬物の安全性を評価するための重要なトランスポーターとして同定されている。
【０４１５】
考察
今日まで、インビトロでヒト尿細管間質界面を研究するために極めて少ないシステムしか開発されていない。マトリゲル中での細胞の培養、ヒアルロン酸またはシルクのような様々な足場上でのオルガノイドとしての細胞の培養、およびマイクロ流体デバイス中でのRPTECの培養(「チップ上の腎臓」)を含む、分離したRPTECの3D培養のための多様なシステムが開発されている(Joraku et al., 2009; Subramanian et al., 2010; Astashkina et al., 2012; Jang et al., 2013)。しかしながら、これらのシステムは、上皮と、上皮の配向において構造的役割を果たし、かつ上皮の継続的な健康および組織化にとって重要な成長因子の供給源を提供する、線維芽細胞および内皮細胞を含む、関連する間質細胞型との間の直接的な接触を欠如している(Lemley and Kriz, 1991; Kaissling and Le Hir, 2008; Meran and Steadman, 2011)。これらの支持細胞型がないと、RPTECは培養中にそれらのネイティブの表現型を急速に失うので、臨床において分子がどのように行動するかを予測するために必要な継続的な低用量の曝露研究を行う能力を妨げる。本研究の目的は、腎間質が健康な上皮の継続的な成長および維持を支持するモデルを構築し、特徴付けるために、3Dバイオプリンティングを用いることにある。腎線維芽細胞および内皮細胞は、外因性の足場を使用せずに組織形成を可能にし、間質層内の内皮細胞および上皮の下にあるコラーゲンが豊富な基底膜のオープンネットワークの形成を支持する、内因的に産生される細胞外マトリックスの強力な供給源を提供した。内皮のネットワークは、間質内に開放空間を形成し、それが組織全体への培地および栄養素のより良好なアクセスを可能にし得る。間質層はネイティブのヒト腎間質よりも厚いが、腎線維芽細胞と内皮細胞との組み合わせは、上皮にすぐ隣接した線維芽細胞様細胞を含む、インビボ組織をより連想させる細胞密度を可能にする(Lemley and Kriz, 1991)。
【０４１６】
腎臓内RASの再構成およびバリア機能を含む、インビボの近位尿細管の生理学的に関連する態様を再現する、3D PT組織の能力について評価した。ヒトPTは、アンジオテンシンIをアンジオテンシンIIに変換するためにRPTECの頂端面でACEを発現し(Schulz et al., 1988; Ichihara et al., 2004)、それは次にナトリウム輸送を調節して、腎微小血管系および糸球体へのフィードバックを介して高血圧に影響を与えるのに重要な役割を果たす(Kobori et al., 2007)。 3D PTモデルは、アンジオテンシンI刺激に応答したアンジオテンシンII変換を実証することができた(図4B)。3D PTモデルにおけるRASを探索する将来の実験は、新しい高血圧療法の糸球体に対する効果とPTに対する効果とを、特に高血圧の結果としての腎毒性の軽減に関して、分離するために、使用される潜在性がある。PTの他の重要な機能は、単層を横切る特定の型の分子の動きを制御する上皮バリアとして働くことである。PTは、糸球体濾過後の水および溶質の再吸収の主要部位であり、それ自体、ネフロンにおいてより遠位で観察されるものよりもより透過性のバリアを形成しなければならない(Ussing et al., 1974; Greger, 1996)。LLC-PK1およびMDCK細胞などの腎上皮の単層培養物は、100〜200Ω*cm2のより高いTEER値を示すことが示されているが、インビボ細管は6.6〜11.6Ω*cm2の値を示す(Boulpaep and Seely., 1971; Liang et al., 1999)。この研究において、3D PT組織は、18.1Ω*cm2のTEER値を示し(表3)、これはPTバリア形成についてインビボで測定された値とより厳密に一致する。タイトなバリア機能と高いTEER値(＞100Ω＊cm2)を有する単層上皮培養物は、ルシファーイエローについて0.5〜1×10-6cm／sのPappを示す(Tran et al., 2004)。3D PT組織におけるルシファーイエローの平均Papp値は2.97×10-6cm/sであり、これは組織を通る経細胞または傍細胞輸送を示し、TEER測定によって記録された漏れやすいバリア機能を確認する(表3)。これに対する1つの考えられる原因は、RPTECの基礎となる細胞外マトリックスに富む間質の存在であり、これは生理学的に関連のある基底膜構造の形成を通して漏れやすいバリアの形成を支持し得る。
【０４１７】
初代ヒトRPTECは、薬物誘発性腎損傷において役割を果たすことが知られている種々の輸送体を発現する利点を提供する。しかしながら、これらの細胞は、老化または上皮間葉転換ならびに腎トランスポーター発現および機能の付随的喪失を受ける前に、限られた時間(＜14日間)培養することができる(図11A〜11E)。対照的に、これらの細胞を間質層上で3Dの構成で培養すると、キュビリンおよびメガリン、MATE1およびMATE2K、OCT2、BCRP、およびP-gpのような多くの腎臓トランスポーターの遺伝子発現を保持しながら、少なくとも30日間の培養における上皮細胞生存および機能の保持を可能にした、(表1および5)。さらに、P-gpおよびSGLT2の極性化分布および機能的活性は、グルコースアナログおよびR123の輸送によってそれぞれ3D PT組織において確認された(図5A〜Bおよび図6A〜6E)。3D PT組織における腎臓トランスポーターの継続的な発現および機能により、分子の作用機序の詳細な分析と併せてヒト腎毒性を評価するための慢性投与試験を実施することが可能になる。
【０４１８】
区別できる上皮細胞および間質細胞の区画から構成されるヒト3D多細胞腎組織は、潜在的な腎毒性について新規の薬物実体を評価するための独自の試験プラットフォームを提供し、エクスビボにおいて複数の細胞型および解剖学的位置にわたる生化学的、転写的、および組織学的評価項目の評価を可能にする。このモデルが腎毒性試験に使用できるという最初の概念実証データを提供するために、3D PT組織を古典的な腎毒性シスプラチンに曝露した。3D PT組織は5.72μMのLD50値を示し(図7A)、これはインビトロおよびエクスビボのシスプラチン毒性について以前に報告された値と一致する(Tay et al., 1988; Katsuda et al., 2010)。いくつかのメカニズムが、活性酸素種の生成およびグルタチオン抱合による毒性中間体の生成を含む、シスプラチン媒介腎毒性において役割を果たす可能性があるが、これらのメカニズムはシスプラチンがRPTECによって取り込まれた後に起こる(Hanigan and Devarajan, 2003)。銅トランスポーター(CTR1および2)のような他の輸送体も同様に役割を果たし得るが、この取り込みは主にOCT2腎輸送体の作用を通して起こると考えられている(Ciarimboli et al., 2005)。現在の研究では、シメチジンによるOCT2トランスポーターの阻害は、シスプラチン誘発性の生存能力および上皮機能の喪失を上手く防ぐ(図8A〜8Cおよび図9A〜9D)。その機能に影響するOCT2の多型はシスプラチン誘導性AKIを予測するものであり、OCT2発現を欠く動物モデルはシスプラチンに対する感受性の低下を示すので、このメカニズムは臨床的に関連している(Ciarimboli et al., 2005年; Ciarimboli et al., 2010年)。AKIに応答して、PT上皮はインビボで代償増殖および再増殖(repopulation)のための高い能力を実証している(Nadasdy et al., 1994)。同様に、本発明者らは、シスプラチンに曝露された3D PT組織においてRPTECを増殖させることにおいて用量依存的な増加を観察したが、これはシメチジンで処置された組織において減少した(図10A〜10D)。ヒトにおいて、シメチジン療法またはOCT2における機能喪失変異の存在は、シスプラチン投与後の尿中シスタチンCの減少と相関しており、化学療法中の寛解法としてのこの療法の可能性のある有用性を実証する(Zhang and Zhou, 2012)。
【０４１９】
要約すると、本発明者らは、培養物中で長期間にわたってRPTEC機能を維持することができ、かつ、特定のメカニズムによって発生するPT腎毒性の定量的検出を可能にする、新しいインビトロのヒト3D組織モデルをデザインし検証した。これらのデータは、3D PT組織が臨床前の創薬パイプラインにポジティブな影響を与え、後期臨床試験において費用のかかる失敗を防ぐのに役立ち得ることを示唆する。急性または慢性腎臓病の患者からのものを含む、複数のドナーからの初代ヒトRPTECの使用は、薬物が特定の患者集団にわたって臨床的にどのように機能するかについてのより良い理解を可能にし得る。作用機序が異なる腎毒性化合物のパネルを対象とした追加的研究は、新しい化学物質をスクリーニングするためのシステムの価値をさらに解明する助けになろう。モデルにおける尿細管間質界面の包含は、線維症のような複雑な多因子の疾患過程の探査を可能にし、ならびに薬物誘発性損傷の間または後に再増殖および再生するためのRPTECの能力の評価を可能にする。さらに、このシステムは、早期の腎臓損傷を非侵襲的に検出するのに有用であり得るバイオマーカーの並行した調査を可能にし得る。
【０４２０】
略語
3D、3次元；ACE、アンジオテンシン変換酵素；AGT、アンジオテンシノーゲン；AGTR1、アンジオテンシン受容体I型；AKI、急性腎臓損傷；DPBS、ダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液；H＆E、ヘマトキシリンおよびエオシン；HUVEC、ヒト臍静脈内皮細胞；LDH、乳酸デヒドロゲナーゼ；OCT、有機カチオントランスポーター；Papp、受動透過性；PCNA、増殖細胞核抗原；PT、近位尿細管；R123、ローダミン123；RAS、レニン-アンジオテンシン系；RFU、相対蛍光単位；RPTEC、腎近位尿細管上皮細胞；TEER、経上皮電気抵抗。
【０４２１】
文献引用
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【０４２２】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態は例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換を思い付くであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替物が本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるはずである。
【０４２３】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願および刊行物は、引用により本明細書に完全に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【国際調査報告】
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