(57)【要約】  本発明は、静電場、磁場または電磁場を印加することにより、ビーズを正確且つ迅速に、そして容易に操作できる装置および方法に関するものである。この方法は、ビーズと流体に存在する残りの上清液の分離を行うのに特に有用であり、液体ハンドリング用チップにおける捕集および精製効率を最大化する。【選択図】図４
2019510225.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーズを含む液体をチップに吸引するステップと、
チップの体積の少なくとも一部に静電場、磁場または電磁場を印加するステップと、
経時によってチップの体積に印加される場を変化させるステップと、
前記変化した場の勾配の作用によって、液体から磁性ビーズを分離するステップと、
ビーズを排出することなく、チップから液体を分注するステップとを含む、液体ハンドラーのチップ内のビーズを分離する方法。
【請求項２】
ビーズを含む液体をチップに吸引するステップと、
チップの体積の少なくとも一部に静電場、磁場または電磁場を印加するステップと、
経時によってチップの体積に印加される場を変化させるステップと、
前記変化した場の勾配の作用によって、液体中に磁性ビーズを再懸濁するステップとを含む、液体ハンドラーのチップに含まれる磁性ビーズを再懸濁する方法。
【請求項３】
チップの外部に磁石または電磁石を含み、液体からビーズを分離する目的で、前記チップの体積に可変磁場が印加されるように、前記チップを移動させるか前記磁場を変調させる、液体ハンドラーのチップ内部の液体中に懸濁したビーズを分離する装置。
【請求項４】
チップの外部に磁石または電磁石を含み、液体中にビーズを再懸濁させる目的で、前記チップの体積に可変磁場が印加されるように、前記チップを移動させるか前記磁場を変調させる、液体ハンドラーのチップ内部の液体中にビーズを再懸濁する装置。
【請求項５】
前記磁石または前記電磁石は、特に、局在化した高勾配の磁場を達成するように設計されている、請求項３または４に記載の装置。
【請求項６】
局在化した高勾配の磁場領域は、前記チップの移動、前記磁石の移動または前記電磁石の変調によって、前記チップの体積内で掃引される、請求項３または４に記載の装置。
【請求項７】
前記ビーズは、事前に分離されたビーズクラスター上にビーズを蓄積することによって、前記チップ内部の液体から累積的に分離される、請求項５または６に記載の装置。
【請求項８】
前記ビーズは、事前に分離されたビーズクラスター上にビーズを蓄積することによって、前記チップ内部の液体から分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記チップは、ビーズおよび異なる流体の層で満たされ、ビーズを流体から別の流体に移動させることによって、１つ以上の物質の混合または濃度の変化が前記チップ内で達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記チップ自体からの流体の排出時に、チップ内部に前記クラスターを保持するために、前記ビーズクラスターに外力が加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記チップは、流体の排出時に、ビーズクラスターが前記チップを離れることを防止するように構成されている、請求項３または４に記載の装置。
【請求項１２】
前記ビーズが一旦ペレット化されると、前記ビーズクラスターの凝集力よりも大きいせん断力を有する流体力学の乱流の発生を防止するために、制御された流速で流体が排出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビーズは、液体ハンドラーの作用と、同時、逐次、独立または配位のいずれか１つの外力によって移動し、電磁気、音響、熱、重力および磁気を含む群から選ばれた前記外力によって流体を形成するビーズを分離することを可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料を含むビーズは、ディスペンサーのチップ内に吸引された後分離され、前記ディスペンサーのディスペンサーモードへの切り替えが、洗浄ステップまたは前記ビーズの溶離あるいは染色を行うことを可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ビーズは、前記ビーズのペレット化の原因となる前記外力の変化によって移動する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記層間拡散を最小化するために、流体、油、ゲルまたは溶液のさらなる層が付加され、前記ビーズは、前記流体の密度、極性、混和性、ならびに他の化学的および物理的特性の差により生成される前記流体溶液からの分離中に通過しなければならない、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記チップは、磁性または非磁性であり得るビーズで予め充填される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記流体力学の乱流は、試料溶液を排出する若しくは排出せず、または新たな流体でチップを満たすことなく、ビーズクラスターを再懸濁するために、チップの内部で発生する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
洗浄作用は、前記ビーズクラスター内の不要な物質の起こり得る残留物を除去するために、チップの内部で直接行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
溶離ステップは、前記ビーズに付着した分析物の除去を可能にするために、チップの内部で達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ビーズは、前記ビーズの洗浄または溶離に用いられる溶離液、溶媒または任意の種類の流体を除去するために、前記チップの内部で乾燥する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学的、生物学的および生化学的工程または反応の自動化分野に関する。より具体的に、本発明は、液体ハンドリングシステムのチップまたはオリフィスにおける磁性粒子および非磁性粒子を分離する装置および方法を開示している。
【背景技術】
【０００２】
マイクロおよびナノ粒子の使用は、バイオセンシング用途、医学的治療中の薬物送達の変形、抗体とタンパク質の生体分離、精製およびスクリーニングなどの医療ならびに生物学的用途など、多くの技術的用途として非常に注目されている。
【０００３】
一般に、本明細書では、外力の影響下で１つ以上の特定の成分を選択的に輸送することができる、数オングストロームから数ミリメートルの任意のタグ、バーコード、分子ビーコン、スポンジまたは粒子を「ビーズ」と定義する。
【０００４】
特に、磁気分離技術は、ＤＮＡシーケンシングの基本的な部分となっている。実際に、磁気分離技術は、比較的安価で高度に拡張可能な方法であるだけでなく、試料に非常に小さな機械的応力が加えられ、試料の高い回収効率および精製などの同様の方法に比べて、多くの利点を提供する。
【０００５】
磁性ビーズは、粒子の外面の適切なコーティングによって、タンパク質、細胞、抗体、抗原および核酸の担体として使用される。実際に、所望のターゲット分析物を結合及び捕捉できるようにするためには、磁性ビーズを前記ターゲットに特異的に結合するリガンドでコーティングしなければならない。リガンドの類型の選択は、捕捉しなければならないターゲット分子に完全に依存するであろう。
【０００６】
前記ビーズの中心核は磁性であり、外部磁場に反応する能力を担う。金属酸化物は、通常、純金属に対する酸化にさらに安定であるため好ましい。前記ビーズは、前記磁性コアの大きさによって、シングルドメインまたはマルチドメイン構造を有し得る。ビーズの大きさは、主に保磁力に影響し、ビーズが小さいほど、保磁力はさらに小さくなる。特に、５〜１５ｎｍ程度のナノ粒子は超常磁性であるのに対し、マイクロ粒子は強磁性である。
【０００７】
前記ビーズの磁性および物理的特性は、磁性粒子を使用しなければならない用途に応じて選択される。ナノ粒子は、磁場が除去されるときに残留磁化が起こらないという利点があると共に、磁力が非常に小さいため、粘性力が支配的であるが、これは、前記粒子の分離および移動がより困難であることを意味する。
【０００８】
一般に、磁性分離は、磁石の極との結合が非常に弱いビーズ（常磁性）、磁化に対して高い感受性を示すビーズ（強磁性）、印加磁場に対して１８０°の方向に磁化するビーズ（反磁性）または超常磁性挙動を示す強磁性ナノ粒子により行われ得る。
【０００９】
磁性ビーズの分離において、第１のステップは、前記試料を前記ビーズの外面のコーティングに結合させることである。前記ターゲット分析物を含有する溶液を磁性ビーズ緩衝液に分注する。一般に、液体の混合は、磁性ビーズと分析物との結合の効率を高めるために行われる。
【００１０】
前記分析物の分離は、下式に従って力を発生する外部磁場を印加して、ビーズを移動させることにより達成される。
【００１１】
【数１】
2019510225.tif 000003
【００１２】
【数２】
2019510225.tif 000004
【００１３】
磁場が印加されると、前記磁性ビーズは磁化し、磁場勾配の方向に沿って移動するクラスターを形成し始める。前記ビーズの量および寸法、磁場勾配の強度ならびに前記溶液の粘度によって一定時間が経過した後、前記磁性ビーズは前記磁場の線に依存する規定領域でペレット化される。
【００１４】
この時点で、前記試料の分離は、残りの溶液から前記ビーズを分離することによって達成される。一般に、残りの溶液を排出するか、または前記磁性ビーズのクラスターを別の容器に移動させる。
【００１５】
次いで、前記磁性ビーズから分析物を分離するために、溶液中に前記磁性ビーズを浸漬させる。前記ビーズからの前記試料の捕集を最適化するために、ビーズを再懸濁することが求められることもあり、これは磁性ビーズ間の分離力を克服することを意味する。結局のところ、前記磁性ビーズは、この場合においてはターゲット分析物を含有する上清液を捕集するために、再度分離される。
【００１６】
前記磁性ビーズの分離の効率は、主に工程の終了時に捕集される開始試料の量（捕集効率）と、分離技術を行う際に除去すべきであった不要な物質の存在（精製効率）に依存する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、正確且つ迅速に、そして容易に使用できるビーズの操作のための装置および方法に関するものである。この方法は、ビーズと流体に存在する残りの上清液の分離を行うのに特に有用であり、液体ハンドリング用チップにおける捕集および精製効率を最大化する。
【００１８】
液体ハンドリング用チップは、一般に、流体と液体ハンドリングシステム（「液体ハンドラー」または「ピペット」）との間の除去可能なまたは永続的なインターフェースとして意図される。特定の実施形態において、前記チップは、液体ハンドラーによって吸引および分注される液体を含むことを意味し得る。本開示において、前記チップは、液体ハンドリングおよび生物学的または化学的反応の分野で通常使用される、他のマイクロプレート、チューブ、針、注射器、真空採血管、フィルター、容器、毛細管および流体チャネルを含む。チップは、単回使用する際（通常の汚染防止）の使い捨てチップと、複数回再使用する際の永久的なチップと見なすことができる。
【００１９】
液体ハンドラーは、選択された量の試薬、試料または他の流体を分注することができる手動付属品または自動システムである。液体ハンドラーは、液体ハンドリングおよび生物学的または化学的反応の分野で通常使用される、他の手動ピペット、注射器、ポンプ、弁、ワークステーション、毛細管、マイクロ流体チャネルおよび液体分注装置を含む。
【００２０】
液体ハンドラーのうち、本明細書では試料を吸引および分注することができる装置（ピペッターとも呼ばれる）と、規定の量で貯留槽から流体を小分け分注する装置（ディスペンサーとも呼ばれる）とを含む。本明細書では、同じチップを介して、前記チップに試料を捕集することから、１つ以上の流体をフラッシングすることまで、ピペッターとディスペンサーとの間の作業方式を切り替えることができるディスペンサーと呼ばれる、ディスペンサーとピペッターの中間の特定クラスの液体ハンドラーを開示している。
【００２１】
本明細書では、分離を、流体内に均一に分散させるか、または流体の内部または外部の特定の位置にビーズを凝集させることができる、ビーズに行う工程として定義する。
【００２２】
従って、本発明の一態様において、液体ハンドラーのチップ内でビーズを分離する方法が提供される。前記方法は、分離を引き起こすビーズに力を加え得る静電気、電気力学、電磁気、音響、機械的、重力、核、磁気または熱のソースを含む。一旦、ビーズクラスターが形成されると、チップから残りの流体のみ排出することによって分離が達成される。
【００２３】
本発明のまた別の態様において、チップ自体から流体を排出する間、前記チップの内部にビーズクラスターが留まるように、ビーズクラスターに外力が加えられる。
【００２４】
本発明のまた別の態様において、チップは、流体を排出する間、ビーズクラスターが前記チップを離れないように設計される。
【００２５】
本発明のまた別の態様において、一旦、ビーズがペレット化されると、せん断力がビーズクラスターの凝集力よりも大きい流体力学の乱流の発生を防止するために、流体が制御された流速で排出される。
【００２６】
本発明のまた別の態様において、ビーズは、液体ハンドラーの作用と、同時、逐次、独立または配位のいずれか１つの外力によって移動し、流体を形成するビーズを分離することを可能にする。前記分離は、液体ハンドラー、または一般的な吸引あるいは分注装置に連結された容器内で発生し得る。前記連結は、永久的または除去可能であり、電磁性、音響、熱、重力または磁力などの外力による機械的接触または非接触によって達成され得る。
【００２７】
本発明のまた別の態様において、試料を含有するビーズは、ディスペンサーのチップ内へ吸引された後分離され、前記ディスペンサーのディスペンサーモードへの切り替えは、ビーズの洗浄工程または溶離若しくは染色を行うことを可能にする。
【００２８】
本発明のまた別の態様において、ビーズは、ビーズのペレット化の原因となる外力の変化によって移動する。かかる変化は、単純に、外力場に対するチップの相対変位または外力場の変化によって達成され得る。
【００２９】
本発明のまた別の態様において、チップは、ビーズおよび異なる流体の層で満たされる。前記ビーズを流体から別の流体に移動させることによって、１つ以上の物質の混合または濃度の変化がチップ内で達成される。
【００３０】
本発明のまた別の態様において、層間拡散を最小化するために、流体、油、ゲルまたは溶液のさらなる層が付加され、前記ビーズは、流体の密度、極性、混和性、ならびに他の化学的および物理的特性の差により生成される流体溶液から分離する間通過しなければならない。
【００３１】
本発明のまた別の態様において、チップは、磁性または非磁性であり得るビーズで予め充填されていてもよい。空間的分離は、流体に対して透過性であるが、ビーズに対しては不透過性の膜によって達成される。
【００３２】
本発明のまた別の態様において、流体力学の乱流は、試料溶液を排出する若しくは排出せず、または新たな流体でチップを満たすことなく、ビーズクラスターを再懸濁するために、チップの内部で発生する。
【００３３】
本発明のまた別の態様において、洗浄作用は、ビーズクラスター内の不要な残留物を除去するために、チップの内部で直接行われる。
【００３４】
本発明のまた別の態様において、溶離ステップは、ビーズに付着された分析物の除去を可能にするために、チップの内部で達成される。
【００３５】
本発明のまた別の態様において、ビーズは、ビーズの洗浄または溶離に用いられる溶離液、溶媒または任意の種類の流体の存在を除去するために、チップの内部で乾燥される。前記乾燥は、流体の移動またはチップの外部環境あるいは内部環境の温度変化によって達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】液体ハンドラーまたはピペットチップを用いた磁性ビーズの分離の可能な形状を実施する概略的なシナリオを示す。
【図２】液体ハンドラーのチップの内部における磁性ビーズの分離の概略的なシナリオを示す。
【図３】チップから流体を排出する間、ビーズクラスターを保持するように最適化されたチップの設計例を示す。
【図４】チップの内部におけるビーズクラスターの変位を示す。前記クラスターは、チップの内部に存在する流体から取り出される。
【図５】液体ハンドラーのチップの内部における洗浄ステップの実施例を示す。
【図６】チップの内部に予め充填されたビーズおよび膜を用いたビーズの分離を示す。
【図７】ピペットチップから洗浄緩衝液の残留物を除去する概略的なシナリオを示す。
【図８】ビーズを捕集する間、動的掃引を具現する概略的なシナリオを示す。
【図９】ビーズの捕集および起こり得る最適の磁場構成に対して、起こり得る最適の磁性プロファイルのグラフを示す。
【図１０】ビーズクラスターと接触して液体を移動させるエアギャップの使用に関する概略図を示す。
【図１１】ピペットチップの内部で起こり得る反復ビーズ捕集の概略的なシナリオを示す。
【図１２】本開示による装置で精製されたＰＣＲ生成物からのプライマー汚染物質の完全な除去を示す。
【図１３】本開示による装置で洗浄された最終ＰＣＲ生成物内で、ビーズ汚染がないことを示す。
【図１４】本開示によって行われた試料の回収効率を示す。
【図１５】本開示による磁気分離のワークフローを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、このような多数の用途だけでなく、ビーズの操作に関するものである。例示の目的のために、図面および説明は、一般に、液体ハンドラーのピペットチップ内における磁性ビーズの操作の解法を扱う装置および方法に関する。しかし、本発明に開示されている手段は、分離の分野においてより一般的な実施形態に同様に適用可能である。
【００３８】
液体ハンドラーのチップにおける磁性ビーズの変位およびペレット化に関する一般的な説明
図１は、液体ハンドラーを用いて、磁性ビーズと液体溶液とを分離するために通常使用される実施例を示す。ビーズ１０１は、容器１０２の底部でペレット化され、ピペットチップ１０３は、試料を含まない液体１０４を吸引する。ピペットチップの位置は、高い捕集効率および精製効率を維持するために非常に重要である。前記ピペットチップが、吸引中に磁性ビーズクラスターと近すぎると、試料を含むビーズの一部がピペットチップによって吸引され得るので、捕集効率の低下を引き起こす。前記ピペットチップが、ビーズクラスターと十分近くないと、不要な物資が試料から適切に分離しないので、精製効率の低下を引き起こす。
【００３９】
磁性ビーズの操作は、均質または非均質の磁場によって達成される。次いで、液体ハンドラーのチップの内部および外部にクラスターの形態で特定数のビーズを分離して移動させることができる。図２は、液体ハンドラーのチップにおいて、磁性ビーズの操作のための可能な方法および装置を示す。図２ａにおいて、試料および磁性ビーズ２０１は、容器２０２内にホストされる。この容器は、液体ハンドラー２０３のチップによって液体の吸引を最適化するために最適化され得る。最初に、図２ｂおよび２ｃに示すように、前記チップは試料中に浸漬され、前記流体は液体ハンドラーによって吸引されて、前記チップを部分的または完全に満たす。その後、図２ｄに示すように、前記チップにより含まれる液体に、永久磁石、電磁石または任意の磁場源２０４によって磁力が印加される。前記磁力の影響下で、前記磁性ビーズは、磁場に沿って移動し始め、分析物を含むクラスター２０５が形成される。この時点で、図２ｅに示すように、前記チップから流体のみ排出される。
【００４０】
一実施形態において、ビーズクラスターは、チップから流体が排出する際、外部磁場によってペレット化され、静止状態を保持する。
【００４１】
他の実施形態において、チップの形状、寸法、材料または他の化学的あるいは物理的特性は、分離後の不要な流体の分注時に、ビーズクラスターの排出を防止するために、適正化することができる。この場合、磁場がビーズクラスターに印加されてもよく、印加されなくてもよい。図３ａは、ビーズクラスター３０３用のトラップ３０２を有するように設計されたチップ３０１の例を示しているのに対し、図３ｂは、クラスタービーズ３０６がチップから離れることを遮断するが、前記流体が前記チップに出入りすることを可能にするように設計されたボア３０５を有するチップ３０４を示す。
【００４２】
また別の実施形態において、ビーズは、それらの保磁力および凝集力が、チップから流体が排出することにより生成される乱流よりも大きくなるように、外力を使用する、または使用しないことにより、適切に設計または選択される。
【００４３】
流体の多層を有する液体ハンドラーのチップにおける磁性ビーズの変位およびペレット化に関する一般的な説明
本発明の一態様において、ビーズクラスターは、液体ハンドラーの作用および外力によって流体から取り出される。図４において、連続的なイメージは、磁力源４０１とチップ４０２との間の相対的な変位が、チップ内部のクラスタービーズ４０３をどのように移動できるかを示す。かかる移動によって、前記ビーズクラスターは、流体４０４から完全に抜け出すことができる。このシナリオでは、前記チップから流体が排出することにより生成される乱流は、前記ビーズクラスターの位置および従来の状態に影響を与えない。
【００４４】
別の実施形態において、ビーズまたは分析物を含有する溶液を吸引する前に、一定量の１つ以上の流体、ゲルまたは溶液がチップの内部に吸引される。かかる層は、流体溶液から分離する際に、ビーズが通過しなければならないポテンシャル障壁を最小化するために、目的に応じて選択され得る。
【００４５】
また別の実施形態において、液体ハンドラーが吸引または分注することができる体積の量を正確に制御することによって、流体、ゲルまたは溶液からなる層の排出または形成は、前記ビーズの吸引前・後、または吸引中にチップに追加されるか、チップから除去され得る。
【００４６】
また別の実施形態において、エアクッションは、特定の流体の吸引前または吸引後にチップに付加される。かかるエアクッションの目的は、チップ内において連続する流体層間に起こり得る拡散、混合または汚染を最小化することである。
【００４７】
液体ハンドラーのチップにおけるビーズの洗浄ステップに関する一般的な説明
分離の精製効率を向上させるために、流体の排出後に依然として存在する不要な物質または流体の存在を除去するために、１回または複数回の洗浄ステップを行うことが可能である。図５は、チップにおいて、磁性ビーズを洗浄するための可能な方法および装置を示す。図５ａでは、液体ハンドラーのチップ５０１を示しており、予めペレット化したビーズ５０２のクラスターを含む。図５ｂは、吸引時にチップに入る洗浄緩衝液５０３を示し、前記ビーズクラスターは洗浄緩衝液に浸漬されている。
【００４８】
一実施形態において、ビーズは、洗浄ステップ時にペレット化が保持され、洗浄緩衝液は、簡単に１回または数回吸引および分注される。
【００４９】
別の実施形態において、図５ｃに示すように、ビーズクラスターの内部にトラップされ得る不要な物質の除去を促進するために再懸濁され、クラスター５０４内のビーズが流体５０５中に分散され、チップの表面から分離される。この場合、図５ｄに示すように、ビーズクラスター５０６は再生成されなければならず、不要な物質５０７を含有する洗浄緩衝液はチップから排出される（図５ｅ）。
【００５０】
液体ハンドラーのチップにおける予め充填された緩衝液を有するビーズの洗浄ステップに関する一般的な説明
一実施形態において、洗浄緩衝液は、流体の排出後に使用する準備ができた流体層の形態で、チップの内部に予め充填（例えば、予め吸引）され得る。
【００５１】
別の実施形態において、洗浄および溶離緩衝液は、ディスペンサーが分注モードに切り替えられることによって、チップを介してフラッシングされる。
【００５２】
液体ハンドラーのチップにおけるビーズの乾燥に関する一般的な説明
一実施形態において、分析物を汚染させ得る残りの洗浄緩衝液、または不要な物質の任意の存在を除去するために、ビーズが乾燥される。
【００５３】
別の実施形態において、ビーズを含むチップは、ビーズの乾燥を促進するために加熱される。また別の実施形態において、ガスは、液体を排出するために、チップを介してフラッシングされる。前記ガスは、適用要件に応じて、冷気、暖気、熱気または室温であり得る。
【００５４】
チップの内部における磁性ビーズの再懸濁に関する一般的な説明
一実施形態において、磁性ビーズの再懸濁は、液体ハンドラーのチップに出入りする流体により発生する乱流によって行われる。前記流体の流速は、せん断力の効果を高め、ビーズクラスターの凝集力を圧倒するために最適化することができる。
【００５５】
また別の実施形態において、チップは、チップの内部を移動する流体により発生するせん断力の効果を向上および増加させるために適切に設計される。
【００５６】
また別の実施形態において、ビーズを再懸濁するために、外部磁気、音響、電磁気、機械的または熱的な力が、チップまたはビーズクラスターに直接加えられる。
【００５７】
チップの内部におけるビーズの溶離に関する一般的な説明
本発明の一態様において、ビーズに結合した分析物の溶離は、ビーズを濡らさなければならない必要な溶離緩衝液を吸引することによって、チップの内部で直接行われる。
【００５８】
別の実施形態において、ビーズクラスターの再懸濁は、ビーズを溶離緩衝液と接触させた後に行われる。前記ビーズの再懸濁は、液体ハンドラーのチップ内部または別の容器の内部で起こり得る。
【００５９】
予め充填されたチップを用いたビーズの分離に関する一般的な説明
本発明のまた別の態様において、図６ａに示すように、チップは、磁性または非磁性であり得るビーズで予め充填される。前記チップは、試料溶液６０２に対して透過性であるが、ビーズ６０３に対しては不透過性の膜６０１を含む。図６ｂは、試料溶液を吸引した後のチップを示す。分析物は、選択性のある膜の上部でビーズと結合している。前記試料６０５を含有するビーズを残りの流体溶液６０６から分離するために、液体ハンドラーは前記チップから流体を簡単に排出させる。前記膜は、選択的にビーズに対する障壁を生成するのに対し、前記溶液は、前記チップから排出され得る。
【００６０】
ビーズから前記試料を捕集するために、ビーズから分析物を分離する役割を行う溶液を吸引する必要がある。連続的な分注時に、ビーズを除いた分析物は、膜がそれらに対して透過性であるので、チップから排出される。
【００６１】
磁場に出入りする最適の軌跡に関する一般的な説明
一般に、ビーズの移動は、ビーズに作用する外力の変化によって達成される。例えば、かかる力の変化は、電磁石の活性化によって達成され得る。
【００６２】
別の実施例において、ビーズに加えられる力の変化は、チップを変位させる単純な工程によって達成される。外部静電場に対するチップの軌跡は、前記ビーズが流体内に捕集および分散される方式に影響を与え得る。
【００６３】
本発明の一態様において、ビーズクラスターの非局在化またはビーズの不要な再懸濁を防止するために、磁場に出入りする軌跡が最適化されている。磁力源に接近する軌跡は、磁場の線に従うように設計されている。同様に、ビーズクラスターの摂動を防止するために、離脱軌跡は、磁場の線に沿うように、または直交する方向に移動するように設計されている。
【００６４】
例えば、前記ビーズが外力によってクラスターをチップの壁に押し付けている静的状態にあるとき、前記外力が、強度は変化するが、同じ方向に維持する方法でチップを移動させることは、チップの壁に対する凝集体の持続性に有利に働く反面、外力が方向を変えてビーズを壁から押し出す移動は、再懸濁に有利に働き得る。さらに、場が急速に収束している領域は、クラスターの凝集に有利に働き得る反面、発散領域は、クラスターの再懸濁に有利に働き得る。
【００６５】
洗浄緩衝液の残留物の最適な除去に関する一般的な説明
一般に、溶離ステップ前の磁性ビーズは、洗浄緩衝液があってはならない。実際に、洗浄緩衝液のわずかな汚染も、分析物のその後の分析を妨害する可能性がある。前記磁性ビーズの乾燥では十分ではない可能性があり、特に相対的に長い工程であり得る。ビーズの分離工程の後、汚染されていない分析物を保証するために、ピペットチップの内部および外部の洗浄緩衝液の残留物を溶離ステップ前に除去する。
【００６６】
図７において、連続的なイメージは、ピペットチップ７０１が、チップの内部７０３およびチップの外表面７０４に存在する洗浄緩衝液の残留物から、ビーズ７０２をどのように洗浄できるかを示す。前記ピペットチップの内部および外部の洗浄緩衝液における残留物の除去は、事前に定義された体積のワイピング液７０６を吸引することにより達成される。
【００６７】
一般に、体積の量は、チップの内部におけるワイピング液のカラムの高さが、ビーズがペレット化される高さよりも短くなるように選択される。
【００６８】
それにもかかわらず、特に、ビーズとワイピング液との間の不活性が確認された場合には、任意の量のワイピング液の体積が使用され得る。ピペットチップ７０７からワイピング液をパージすることによって、洗浄緩衝液が除去される。
【００６９】
一実施例において、チップの外表面から洗浄緩衝液の残留物を除去するために、ピペットチップをワイピング液７０５に浸漬する。また別の実施形態において、溶液内のピペットチップを移動させることによって、洗浄緩衝液の残留物の除去が最適化される。また別の実施例において、チップはワイピング液に浸漬され、洗浄緩衝液の残留物の除去は、撹拌機、ミキサー、超音波粉砕機、アジテータ、またはピペットチップの周りの流体の乱流あるいは層流を発生させる任意の装置により最適化される。
【００７０】
ビーズクラスターを含有するピペットチップの保管に関する一般的な説明
別の実施例において、ペレット化されたビーズを含むチップは、ピペットから除去され、分析物の後続または並行処理のために、適切なラック（ｒａｃｋ）に保存する。チップを含むラックは、ビーズのペレット化を保持するために、固定されるか可変的な磁場を備えることができる。
【００７１】
また別の実施例において、ペレット化されたビーズを含む保存されたチップは、洗浄ステップ後に洗浄緩衝液を乾燥させる工程を経る。前記ビーズの乾燥は、流体の移動、チップの外部または内部の温度変化、または電磁照射によって達成され得る。
【００７２】
試料間の交差汚染を防止するためのビーズの移動に関する一般的な説明
一般に、磁力は、磁石からの距離に依存する。このため、捕集の効率を最大化するためには、ピペットチップができるだけ磁石に近接しなければならない。それにもかかわらず、試料間の交差汚染を防止しなければならない場合には、磁石とチップとの接触が不可能かもしれない。一般に、チップの一部は、吸引および分注時に分析物を含む流体に浸漬され、これは吸引する液体の量に依存し得る。このような理由で、溶液に浸漬されるチップの部分の外表面は、磁石の表面を汚染する可能性のある液体の残留物を運ぶことができる。捕集の効率を最大化するために、前記チップを磁石に接触させると、試料間の交差汚染が起こり得る。液体ハンドリングを操作する際に、液体に浸漬されていないチップの一部のみを磁石と接触させると、試料間の交差汚染を防止することができるという簡単な解決策がある。
【００７３】
一実施例において、ペレット化されたビーズは、汚染問題が発生することなく、捕集の効率を最大化するために、液体中に浸漬されず、磁石と安全に接触することができるチップの一部に到達するために、外部磁場を使用してピペットチップに沿って掃引される。
【００７４】
別の実施例において、ビーズを含む液体は、液体ハンドリングを操作する際に、液体に浸漬されていないチップの位置に達するために、ピペットチップの内部に吸引される。続いて、ビーズのペレット化は、チップ内部の同じ位置で発生する。
【００７５】
別の実施例において、ピペットと接触して配置される磁石の表面は、汚染の可能性のある存在を除去するために洗浄される。
【００７６】
ビーズ捕集中のピペットチップの動的掃引に関する一般的な説明
別の実施例において、ビーズの捕集は、磁石の位置に対するピペットチップの相対的な動的掃引によって行われる。実際に、磁性ビーズ間の協力的な相互作用は、チップ全体でそれらの捕集を向上させるために用いられる。図８において、連続的なイメージは、ビーズクラスター８０３を用いて、試料溶液の内部に残留する浮動的なビーズ８０４を捕集するために、磁石８０２に対するピペットチップ８０１の動的掃引を示す。
【００７７】
磁場の最適化された勾配に関する一般的な説明
他の実施例において、磁場の勾配は、磁場の異なるプロファイルの組み合わせを利用することによって、磁性ビーズの捕集効率を最適化するように設計される。特に、コンパクトなクラスターが形成されるように、小領域にビーズを集中させるために、磁場プロファイルの１つまたは組合せが使用され得るのに対し、磁場プロファイルの１つまたは組合せは、ピペットチップ全体に存在するビーズを捕集し、全体の磁場勾配が最大になる領域でそれらを移動させるのに使用され得る。
【００７８】
図９において、ピペットチップの垂直軸に沿った磁場の最適化された勾配の実現可能な実施例を示す。
【００７９】
ピペットチップの内部におけるビーズの再懸濁及び混合に関する一般的な説明
一般に、磁性ビーズの再懸濁および混合は、容器とピペットチップとの間で液体および磁性材料の混合物を繰り返し移動させることによってピペットチップの外部で行われる。それにもかかわらず、このような方法は、起こり得るビーズの損失または外部要因による汚染を発生させる可能性がある。特に、自動液体ハンドラーの場合、少量の液体は、容器の内部のピペットチップの位置、容器の幾何学的構造、及び容器を構成する材料の特性（例えば、親水性）によって吸引できない。起こり得るビーズの損失および汚染を最小化するために、磁性ビーズを再懸濁し、ピペットチップの内部で直接混合する。
【００８０】
一実施例において、ビーズの再懸濁は、ビーズクラスターのせん断を引き起こす外部磁場を動的に印加することによって行われる。別の実施例において、結合緩衝液、洗浄緩衝液および溶離緩衝液と、ビーズとの混合は、液体の内部でビーズの移動を引き起こす外部磁場を動的に印加することによって行われる。
【００８１】
また別の実施例において、前記外部磁気プロファイルは、ピペットチップの内部でビーズを再懸濁および混合する間、チップの内壁を利用するように設計される。
【００８２】
液体ハンドラーのチップにおけるビーズの乾燥に関する一般的な説明
また別の実施形態において、ピペットチップは、ビーズを乾燥させるために、ガスを繰り返し吸引および分配する。このような過程中に、ピペットは、洗浄緩衝液の蒸気またはエアゾールを含む事前に排出されたガスの起こり得る吸引を防止するために移動する。
【００８３】
前記チップの内部におけるビーズクラスターと液体との混合に関する一般的な説明
一般に、分離過程の後、分析物の相対的に高い最終濃度を有するために、溶離緩衝液に使用される体積は小さい。このような理由で、前記ビーズクラスターは、溶離緩衝液の液体カラムの高さよりも高いピペットチップ内部の垂直位置に生成され得る。実現可能な方法は、前記ビーズクラスターと接触させるために、前記チップの底部にあるエアギャップを用いて、液体を垂直に移動させることである。
【００８４】
図１０において、液体をビーズのクラスターと接触させるために、ピペットチップの内部でエアギャップを使用できる実現可能な実施例を示している。ピペットチップ１００２の内部に存在する液体１００１の量は、ビーズクラスター１００３を湿潤させるのに十分ではない。前記ピペットチップの底部にエアギャップ１００４を生成することによって、前もって吸引された液体は、ビーズクラスターに向かって移動させられる。
【００８５】
別の実施形態において、外部磁場を印加することによって、ビーズクラスターは、前記チップに存在する液体に向かって移動させられる。
【００８６】
ビーズを分離する際の洗剤の使用に関する一般的な説明
ピペットチップおよびビーズクラスターに存在する液体の相対的な移動は、ビーズの凝集を攪乱し、特定数のビーズの起こり得る分離を引き起こす可能性がある。このようなビーズの損失は、溶離ステップ時に捕集効率の低下またはビーズの汚染を引き起こし得る。洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）（ＴｗｅｅｎおよびＴｒｉｔｏｎはいずれも登録商標）の使用は、液体の排出または吸引中に生じる流体力学的乱流を最小化する。
【００８７】
反復ビーズ捕集に関する一般的な説明
磁場飽和および非常に局在化した磁場勾配は、磁性ビーズの捕集のために制限され得る。例えば、磁場勾配が適用される領域よりもビーズクラスターの体積が高い場合、チップの内部における液体の相対的な移動の流体力学的な乱流によって、一部のビーズの起こり得る損失を引き起こす可能性がある。一実施例において、ビーズクラスターの形成工程および前記液体から離れる移動工程は、図１１に示すように、繰り返し行われる。磁石１１０１は、ビーズ１１０３を有する溶液を含むピペットチップ１１０２に近接して配置される。最初のビーズクラスターが生成され１１０４、残りのビーズは溶液にそのまま残っている１１０５。次いで、ビーズのクラスター１１０６が液体から除去される。その後、液体から除去された新たなビーズクラスター１１０７を生成することにより工程が繰り返され、以前のクラスターと併合して、新たなより大きなビーズクラスター１１０８が生成される。
【００８８】
ビーズ捕集のためのフィードバックシステムに関する一般的な説明
一実施例において、捕集効率時に、効率を最適化し検証するために、フィードバックシステムが生成される。センサーは、磁性ビーズのペレット化および再懸濁時に、ピペットチップに相対的に近接して配置される。
【００８９】
一実施形態において、センサーは、画像処理によってビーズクラスターの生成または再懸濁を検出するビジョンベースのシステムである。また別の実施形態において、ピペットチップに存在する液体の光学密度は、ビーズのペレット化および再懸濁を確認するために測定される。
【００９０】
特定の細胞および器官だけでなく、生体分子（２本鎖および１本鎖ＤＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、タンパク質）の分離および精製は、遺伝子およびタンパク質の発現の研究、クローニング、トランスフェクション、タンパク質−タンパク質の相互作用、免疫学、臨床診断、ｃＤＮＡライブラリー合成、ＰＣＲとｑＰＣＲ、サンガーシーケンシングとＮＧＳシーケンシングなどの広範囲なその後の適用を容易にする。その単純性、回収効率および純度によって、磁気分離はこの生分解分野でその位置を見出し、広範囲な遠心分離または真空濾過を必要とし、自動化に適用されていない従来の液相および固相分離法に徐々に取って代わっている。
【００９１】
しかしながら、いくつかの要因は、予想の通り、磁気分離が主流の方法になることを妨げる。第一に、精製用試料は、３８４−ウェルプレート、９６−ウェルプレートおよび２４−ウェルプレートから、小型チューブ、中型チューブおよび大型チューブに至るまで様々な容器に集められ、異なる形態および容積を有する全てのものは、数マイクロリットルからミリリットルに至る範囲を有する。従来は、磁気分離器の領域は、異なる容器を収容するように、全ての形状及び大きさで開発された。それぞれの用途に応じて、特定の磁気分離器を購入することにより、コストがすぐに高くなる。第二に、良好な回収効率は、分離および洗浄ステップ時のビーズの損失を防止し、最終溶離時のビーズの汚染を防止するために、ビーズペレットを妨げない丁寧なピペッティング技術を必要とし、これは時間がかかり、再現性よく達成できない。第三に、最終ステップにおけるビーズの清浄度または生体分子の高い回収を確保するために、集中的に繰り返したピペッティングによって、ペレット化後に均質な磁性ビーズの再懸濁が達成される。この作業は、科学者および技術者に、反復性のストレス障害という筋骨格系障害の危険性を増加させるだけでなく、磁性分離プロトコルを手作業で行うのに必要な時間の損失もまたかなり増加させる。
【００９２】
これら全ての障壁は、本開示による自動磁性ビーズ分離技術の革新的な設計により除去することができる。このプラットフォームには、卓上ピペッティングロボットであるＡｎｄｒｅｗが、液体の吸引、試料とビーズとの混合、ビーズの洗浄、ビーズのペレット化、インキュベーション、乾燥および試料の溶離を含むピペットチップ内の全てのビーズ操作ステップを実行するＯｎｅ−Ｓｉｚｅ−Ｆｉｔ−Ａｌｌ磁気分離器を含む。試料を入れる容器から完全に独立しており、全ての通常の体積範囲の生物学的適用のために拡張可能であり、全てのプロトコルとそれぞれのプロトコルに適したビーズの操作のために調整および最適化が可能なパラメータを使用しているので、本開示による装置は、８４％以上９９％以下の試料を回収し、汚染物質がなく、その後の適用のための準備を常に達成することができる。
【００９３】
実施例
ＢｅａｄＴｅｎｄｅｒによる効率的な自動ＰＣＲ精製
クローニング、トランスフェクション、またはサンガーシーケンシングに使用する前に、汚染物質（捕獲されていないｄＮＴＰ、残存プライマー、１００ｂｐ未満のプライマーダイマー、塩および酵素）を除去するために、ＰＣＲ生成物を度々精製する必要がある。本明細書では、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ）で生成されたＰＣＲ生成物のＢｅａｄＴｅｎｄｅｒによる精製効率を試験した。多数の反応をプーリングし、６つの２０μＬまたは５０μＬの試料に分割した。ピペットロボットであるＡｎｄｒｅｗ  Ａｌｌｉａｎｃｅモデル１０００Ｒは、０．２ｍＬのＰＣＲチューブで２０μＬの試料を処理し、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブで５０μＬの試料をそれぞれ処理するために、ＸＴｉｐｓ  ２５０μＬ（Ｂｉｏｔｉｘ）、Ｌ１００およびＬ２００ピペットを使用した。３６μＬまたは９０μＬのＲＸＮ純粋磁性ビーズ（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｋ）を、Ａｎｄｒｅｗによって２０μＬまたは５０μＬの試料と混合した。ビーズペレットを１００μＬまたは１５０μＬの８０％のＥｔＯＨで２回、１００μＬまたは１５０μＬの水で１回洗浄し、精製されたＰＣＲ生成物を６つの複製物Ｐ１〜Ｐ６として２０μＬまたは５０μＬの１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）で溶離させた（いずれもＡｎｄｒｅｗによって自動的に行われる）。
【００９４】
精製の定性および定量の評価は、ＢｅａｄＴｅｎｄｅｒが優れた収率（表１、図１４）で汚染物質のない全ての試料を効果的に捕集することを示している（図１２〜１３）。精製前後の試料のμＬを、Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でキャピラリー電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により分析した。参考のために、全ての試料で下部ゲルマーカーをロードした。精製されたＰＣＲ生成物のうち、２０μＬ及び５０μＬの試料のいずれについても、＜１００  ｂｐ（プライマーおよびプライマーダイマー）の汚染物質のみ残っていた。精製前後の各試料のμＬを、分光光度計Ｄｒｏｐｓｅｎｓｅ１６（Ｔｒｉｎｅａｎ）を用いて、ビーズおよび他の不純物について測定した。洗浄された試料にはビーズ汚染の兆候は見られなかった。
【００９５】
【表１】
2019510225.tif 000005
【００９６】
精製前後の各試料の１μＬを、ＨＳ  ＤＮＡ定量キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ）を用いて、蛍光光度計Ｑｕｂｉｔで測定した。精製前のプーリングされたＰＣＲの濃度に対し、２０μＬおよび５０μＬの試料用の６つの精製された複製物（Ｐ１〜Ｐ６）から捕集されたＰＣＲ生成物の割合を計算した（表１）。全ての試料は、８４％〜９９％で一貫して捕集された。図１５に示すように、ＢｅａｄＴｅｎｄｅｒによる磁気分離のワークフローは、単一のピペットチップ内に完全に含まれており、適用によって、最小５μＬおよび最大５ｍＬの試料を収容する。この工程は、試料が目的の生体分子を捕獲するために、適切な磁性ビーズの類型と混合される、使用者が選択した任意の容器から始めた（図１５Ａ）。前記試料−ビーズの混合物がピペットチップ内に吸引され、ＢｅａｄＴｅｎｄｅｒの磁石に移動して、ビーズをペレット化した（図１５Ｂ）。上清液がビーズから除去され、廃棄された後、同じチップがエタノールを引き入れ、ＢｅａｄＴｅｎｄｅｒの２つの磁石の間を移動して、ビーズペレットを洗浄した（図１５Ｃ）。次いで、エタノールを廃棄し、ビーズペレット下のチップ内に水が吸引され、エタノールの痕跡を取り除き、前記チップ内部のペレットは、ピペットの親指（ｐｉｐｅｔｔｅ  ｔｈｕｍｂ）の周期的な垂直移動によって乾燥した（図１５Ｄ）。次に、溶離緩衝液は、チップの底部でエアクッションにより引き入れられ、ビーズペレットを効果的に覆い、生体分子はＢｅａｄＴｅｎｄｅｒの２つの磁石の間でチップを移動させることにより達成されたペレットの再懸濁によって、ビーズから放出された（図１５Ｅ）。洗浄されたビーズをペレット化し、生体分子を含む溶離液から分離され（図１５Ｆ）、最終的に新たな容器に移された（図１５Ｇ）。工程の完了は、ピペットロボットＡｎｄｒｅｗにより行われた。使用者は、試料、ビーズ、洗浄緩衝液、溶離緩衝液の選択と、最終的に精製された生成物のためのクリーンな容器を供給するだけである。
【００９７】
ビーズの再懸濁および持続時間だけでなく、ペレット化の時間は、ビーズの類型、試料の粘度、ならびに緩衝液のイオン力およびｐＨに応じて、グラフィックソフトウェアＡｎｄｒｅｗ  Ｌａｂで完全に調整可能であり、使用者に完全な柔軟性及び制御を提供して、最高の再現可能な試料の回収効率と純度のために、任意のプロトコルを最適化することができる。
【００９８】
本明細書は、明細書に引用される参考文献の教示を考慮して、最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の実例を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明に含まれることを容易に認識できる。当業者は、本明細書で説明された発明の特定の実施形態と同じ多数の等価物を、通常の実験のみを用いて認識または確認できる。かかる等価物は、添付の請求の範囲に含まれることが意図されている。
【図１】
2019510225.tif 000006
【図２】
2019510225.tif 000007
【図３】
2019510225.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2019510225.tif 000014
【図１０】
2019510225.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2019510225.tif 000018
【図１４】
2019510225.tif 000019
【図１５】
2019510225.tif 000020
【国際調査報告】
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