(57)【要約】本開示の原理は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞への不透過性の外来性材料（例えば、低分子、タンパク質、抗体および遺伝子）の効率的で標的化された送達のための新規なデバイスおよび方法に関し、種々の治療用途のために薬物、ワクチン、遺伝子を送達するために非常に重要である。具体的には、本発明は、金ナノロッドおよびオプシンプラスミドの従来からある硝子体内または網膜下への注射、その後、眼底検査、ＯＣＴまたは走査検眼鏡によって決定される病変領域に合うように調整した、スキャンされ／空間的に調整されたレーザービームによる、網膜が光変性した患者における視力回復のために、オプシンの標的とするナノ強化型光学送達のためのデバイスおよび方法を提供する。
2019509995.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の細胞型に第１の薬剤を送達する方法であって、
ａ．細胞の集合に対し、第１の官能基化されたナノ粒子を与えることによって、前記第１のナノ粒子が第１の細胞型に結合することと；
ｂ．前記細胞の集合に第１の薬剤を与えることと；
ｃ．前記細胞の集合に、前記第１のナノ粒子の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に合うように調整した近赤外（ＮＩＲ）レーザービームを用いた第１の照射を与えることによって、前記第１のナノ粒子によって結合した前記第１の細胞型が、前記第１の細胞型の中に前記第１の薬剤が入り込むことを可能にすることとを含む、方法。
【請求項２】
前記第１の照射の後、第２の細胞型は、前記第１の薬剤が入り込むことができないままである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記第１の細胞型は、細胞の集合であり、前記方法は、さらに
ａ．前記細胞の集合に対し、第２の官能基化されたナノ粒子を与えることによって、前記第２のナノ粒子が第２の細胞型に結合することと；
ｂ．前記細胞の集合に第２の薬剤を与えることと；
ｃ．前記細胞の集合に、前記第２のナノ粒子のＳＰＲに合うように調整したレーザーを用いた第２の照射を与えることによって、前記第２のナノ粒子によって結合した前記第２の細胞型が、前記第２の細胞型の中に前記第２の薬剤が入り込むことを可能にすることとを含む、方法。
【請求項４】
前記第２の照射の後、第１の細胞型は、前記第２の薬剤が入り込むことができないままである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤が、細胞不透過性薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞不透過性薬剤が、低分子、核酸およびタンパク質からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、改変ｓｉＲＮＡ、改変ＤＮＡまたは改変ｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡが、治療タンパク質をコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療タンパク質が、サイトカイン、ホルモン、ワクチン、オプシンまたは抗体、またはこれらのフラグメントである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、金ナノロッドおよびオプシンプラスミドの従来からある硝子体内または網膜下への注射、その後、ＳＰＲに合わせた近赤外レーザービームの照射による、網膜が光変性した患者における視力回復のために、標的とする網膜の地図状萎縮領域へのオプシン遺伝子の光学送達のために使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療タンパク質が、ホルモン、サイトカイン、抗体、またはこれらのフラグメントである、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の細胞が、組織中の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
近赤外レーザービームが、不透過性分子の細胞内送達を必要とする組織の目的の領域全体をスキャンする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞／組織を全体的に加熱することなく、送達を最適化するために、レーザーは、パルス状態であってもよい（幅が数ピコ秒から数分まで変動する）、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＮＯＤによって標的化された分子送達によって、標的外の細胞および組織で望ましくない発現を引き起こさず、標的領域で有害反応または細胞毒性を生じさせない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
疾患進行中に病変部位の欠損または拡張があった場合には、細胞への分子の再注入およびトランスフェクションを行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、網膜細胞であり、ＯＮ型神経節細胞またはＯＮ型双極細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
ＮＯＤを行うためのデバイスであって、該デバイスは、ＮＯＤに基づく分子送達を必要とする網膜における目的の領域を特定するために、被験体の目の眼底検査のためのスリットランプまたは走査レーザー検眼鏡と一体化されている、ＮＯＤのためのＮＩＲレーザーを備えている、デバイス。
【請求項１９】
ＮＯＤのためのＮＩＲレーザーが、網膜の病変を特定し、ＮＯＤレーザービーム送達に対するフィードバックを与えるための光干渉断層撮影と一体化されている、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
ＮＯＤのためのＮＩＲレーザーが、スループットを高め、ＮＯＤによる標的化された分子送達を必要とする移動する器官の組織における目的の領域を形状に合わせるために、空間光変調器またはデジタルマイクロミラーデバイスによって空間的に整えられている、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２１】
ＮＯＤのためのＮＩＲレーザーの波面が、標的組織の散乱特性および目の不完全な光媒体に起因して生じる歪みを消すように補正される、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２２】
ＮＯＤが、注入される分子の安定化、またはその結合性または移動性の向上、内境界膜の透過性、または細胞損傷の最小化のための補助物の使用によってその場で作られる、請求項１８に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１６年２月１３日に出願された米国仮出願第６２／２９５，０３０号の利益を請求し、この出願は、本明細書に参考として組み込まれる。
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
【０００２】
本発明は、主に、ＮａｎｏＳｃｏｐｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣと米国の資金援助によりなされた。政府は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの補助金（１Ｒ４３ＥＹ０２６４８３−０１）の元で援助している。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本開示は、一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞への不透過性の外来性材料（例えば、低分子、核酸、タンパク質、抗体および遺伝子）の効率的で標的化された送達のためのデバイスおよび方法に関し、治療戦略のために薬物、ワクチン、遺伝子を送達するために非常に重要である。
【０００４】
本開示は、不透過性薬剤（例えば、限定されないが、標識または治療薬剤）の細胞特異的な空間的に標的化された送達のための新規な方法およびシステムに関する。さらに、本開示は、限定されないが、金ナノロッドおよびオプシンプラスミドなどのナノ粒子の従来からある硝子体内または網膜下への注射によって、網膜が光変性した患者における視力回復のためのオプシンの標的化された光学送達のためのデバイスおよび方法を提供する。
【背景技術】
【０００５】
細胞、器官および生物全体への外来ＤＮＡ（１）、低分子干渉ＲＮＡ（２）、低分子、タンパク質（３）および薬物の導入は、遺伝子学、細胞発生生物学、ワクチン接種（４）、遺伝子治療（５、６）および他の治療戦略における種々の用途にとって重要である。さらに、蛍光タンパク質をコードするプラスミドのトランスフェクション（７）は、細胞構造および細胞下構造を視覚化し、さらに、細胞発生生物学の種々の機能的な態様を学ぶために一般的に用いられる（８）。さらに、光感受性のオプシンをコードする遺伝子の標的化された送達によって、低出力の光によって、励起可能な細胞（神経、筋肉、心臓など）のうち選択された群が高い時間精度で特異的に刺激され、またはサイレンシングされる（９〜１２）。この光遺伝学的手法（１３〜１８）は、神経回路を詳細に分析することが可能になることにより、神経科学に大きな影響を与えており、いくつかの神経学的障害の治療に有益であり得ることがわかっている（１９〜２５）。しかし、遺伝子治療方法を臨床的な実施に置き換える際に、既存の送達システムの複雑さが、主な障害となっている（６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞および組織に対する不透過性分子の空間的に標的化された送達における課題を満たすために、本発明の原理は、視力回復を含めた異なる用途のために、低出力の近赤外レーザービームを用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞へ、ｉｎ  ｖｉｖｏで皮膚および網膜への標的化された送達を達成するために、ナノ強化型の光学的な方法を提供する。本発明は、ビームのスキャニング、ビームの成形、波面補正の達成を含め、標的化された送達のためのいくつかのデバイスも含む。
【０００７】
これに加えて、本発明は、いくつかの態様では、治療分子の送達を必要とする標的化された領域を特定するために、検査、スキャニングレーザー検眼鏡検査および光干渉断層撮影と一体化されたナノ強化型光学送達（ＮＯＤ）デバイスを提供する。
【０００８】
本発明は、最小限に侵襲的な様式で、ナノ強化型光熱手段によって、連続波（ｃｗ）近赤外（ＮＩＲ）レーザービームを用い、プラスミドおよび不透過性の物質を細胞に導入することができることを示す。このナノ強化型光学送達（ＮＯＤ）方法では、金ナノロッド（ＧＮＲ）によるＮＩＲ場の増強を利用し、細胞膜を一時的に穿孔し、ロッド末端にあるホットスポットを介し、外来性分子を細胞へと送達する。空間的に標的化されたｉｎ  ｓｉｔｕでの送達は、標的化された領域での連続波（ｃｗ）ＮＩＲレーザービームを光らせることによって達成される。ＮＯＤ方法は、不透過性のオプシン−プラスミドが、近ＩＲ（ＮＩＲ）の連続波レーザービームを用い、標的細胞へと送達されることを示す。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、開示される発明は、視力回復および他の用途のためにオプシンを送達するために、ＮＯＤ方法を使用するための方法を提供する。安全なＮＩＲスペクトルにおける、金ナノ構造による効率的な局在化された光熱変換（５２〜６０）によって、動物モデルにおける光変性した網膜の標的化された領域中の細胞へのオプシン−プラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏでのナノ強化型光学送達（ＮＯＤ）が可能になった。
【００１０】
この結果は、明らかに、提案したＮＯＤが、標的細胞への外来性分子の送達を遠隔で導くために実行可能であり、非侵襲性の手法であることを示している。金ナノ構造は、非常に細胞毒性が低く、種々の臨床試験に広く用いられてきているため、ＮＯＤ方法の臨床への置き換えのために理想的なナノ材料である。パルス状態のレーザーと比較して、ｃｗＮＩＲ（ダイオード）レーザーは、小型であり、使用が容易であるため、顕著な置き換え可能性を有している。例えば、安全な様式で近赤外レーザービームを用い、乾燥ＡＭＤ患者の変性した網膜領域へのオプシン遺伝子の標的化されたｉｎ  ｖｉｖｏでの光学送達によって、地図状萎縮領域において光感受性を回復することができる。
【００１１】
一態様では、本開示は、ＮＯＤ手法の機構を提供し、レーザー照射されたナノロッドが接続した細胞における温度上昇を、周囲の細胞と比較すると、プラスミドの部位特異的な送達を可能にするのに十分なほど顕著である。一実施形態では、本開示の原理は、目的の薬剤の細胞特異的な送達のための方法およびデバイスを提供する。この方法は、第１の細胞型への第１の薬剤の送達と、第２の細胞型への第２の薬剤の送達とを含む。いくつかの実施形態では、送達はｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こるが、他の実施形態では、送達はｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。
【００１２】
本開示は、光感受性を回復させるために、光変性した網膜にオプシン遺伝子を送達する方法を提供する。本明細書に提示される結果は、金ナノロッドおよびオプシン−プラスミドを硝子体内注射し、その後、ナノ強化型光学送達を行った後のマウス網膜内でのオプシンレポータータンパク質の効率的で安定なｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を示す。
【００１３】
さらに別の態様によれば、本開示は、網膜に地図状萎縮を有するヒトにおいて視力を回復する方法を提供する。この方法は、目におけるＮＯＤによる、ｉｎ  ｖｉｖｏでの空間的に標的化された網膜細胞へのオプシン遺伝子の送達、および／またはヒトの厚い内境界膜を横切る、標的化された網膜層に対する送達効率を高めるためのα−アミノアジピン酸（ＡＡＡ）と組み合わせたものを含む。安全なＮＯＤが介在するオプシン送達は、患者における多様な網膜変性の効果的な遺伝子治療の可能性を有する。
【００１４】
本開示は、細胞が、金ナノ構造およびオプシンをコードする核酸分子と接触するか、またはこれらを含む方法を提供する。好ましくは、網膜中の細胞は、ＯＮ型神経節細胞またはＯＮ型双極細胞である。
【００１５】
さらに広い態様では、本開示は、細胞および組織の機能を調整し、障害の診断および治療に使用するための診断分子および治療分子を送達するための方法を提供する。
【００１６】
本明細書に記載の方法または組成物の任意の実施形態を、本明細書に記載する任意の他の方法または組成物について実施することができることが想定される。
【００１７】
上およびその他の箇所に記載される実施形態と関連する詳細を以下に記載する。
【００１８】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかし、本発明の精神および範囲の中の種々の変更および改変は、この詳細な説明から当業者には明らかになるため、詳細な記載および具体的な実施例は、本発明の具体的な実施形態を示しているが、単なる実例によって与えられることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
以下の図面は、一例を示し、限定するものではない。簡潔さおよび明瞭さのために、所与の構造の全ての特徴が、その構造が現れる全ての図面に常に示されているわけではない。以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに説明するために含まれている。本発明は、本明細書に提示する具体的な実施形態の詳細な記載と組み合わせて、１つ以上のこれらの図面を参照することによって、よりよく理解されるだろう。
【００２０】
【図１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定の細胞群に対し、またはｉｎ  ｖｉｖｏで組織において、ナノ強化型光学送達の種々の工程を示す。  １００：標的細胞の集合を特定する  １１０：特定の細胞のために官能基化された金ナノロッドを添加する  １２０：官能基化された金ナノロッドを標的細胞に結合させる  １３０：送達される分子を媒体に添加する  １４０：ナノロッドのＳＰＲに合うように調整されたＣＷレーザーを照射する  １５０：分子が、ホットスポットに露出した膜を介して入り込む  １６０：レーザーをオフ状態に切り替えた直後に、ホットスポットに露出した膜を介して分子が入り込み続ける  １７０：注入された分子が、標的オルガネラに結合する  １８０：結合していないロッドと分子を洗浄する  １９０：次の細胞群のために、異なる形状の官能基化された金ナノロッドを添加する  ２００：官能基化されたナノロッドが、次の標的細胞群に結合する、２１０：送達される新しい分子を媒体に添加する  ２２０：新しいＳＰＲに合うように調整されたレーザービームを照射する  ２３０：新しい分子が、ホットスポットを介して次の細胞群に入り込む  ２４０：注入された新しい分子が、第２の細胞群の中の標的化されたオルガネラと結合する
【図２Ａ】金ナノロッドの末端でのレーザービームの光学的増強（ホットスポット）のために使用される金ナノロッドの高倍率顕微鏡画像を示す。これらのナノロッドは、異なる型の細胞に対して標的特異的に結合するために、ＰＥＧ、コンカナバリンＡまたは抗体で官能基化される。
【図２Ｂ】８００ｎｍでピークを示す１型金ナノロッドの測定された光学密度を示す。
【図２Ｃ】８５０ｎｍでピークを示す２型金ナノロッドの光学密度を示す。
【図３Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞へのナノ強化型光学送達のための設定の模式図を示す。４００＝ＣＷレーザー；４１０＝集束レンズ；４２０＝コンデンサレンズ；４３０＝白色光；４４０＝ダイクロイックミラー１；４５０＝サンプルチャンバ；４６０＝ＸＹステージ；４７０＝顕微鏡対物レンズ；４８０＝ダイクロイックミラー２；４９０＝蛍光励起；５００＝励起フィルタ；５１０＝吸収フィルタ；５２０＝レーザーカットオフフィルター；５３０＝カメラ。
【図３Ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞へのナノ強化型光学送達のためのレーザー型直立型蛍光顕微鏡の写真を示す。
【図４】外来性分子を送達するための金ナノ球と緑色レーザービーム（５３２ｎｍ）の使用を示す。４Ａ．ＨＥＫ細胞の明視野画像、４Ｂ．緑色レーザービーム照射前の蛍光画像、４Ｃ．細胞に局在化するように標的化された緑色レーザービーム、４Ｄ〜４Ｅ．外来性分子（ヨウ化プロピジウム、ＰＩ）の流入を示す蛍光の増加。４Ｆ．異なる細胞／領域への送達を可能にするためのサンプルステージのＸＹ移動後の明視野画像。４Ｇ．サンプル再配置後の落射蛍光画像、４Ｈ．近赤外ｃｗレーザー照射。４Ｉ〜４Ｊ．新しい標的細胞中の外来性分子（ＰＩ）の流入を示す蛍光の上昇。生体組織への緑色光の透過深さは小さいが、近赤外系の手法を必要とするＮＯＤのための網膜への緑色レーザーの使用には、重篤な問題（細胞損傷）がある。
【図５】ＨＥＫ細胞への外来性の不透過性抗体の送達のための金ナノロッドおよびＮＩＲレーザービーム（８００ｎｍ）の使用の一例を示す。５Ａ．官能基化された金ナノロッドに接続した細胞、５Ｂ．ＮＯＤ前の蛍光。５Ｃ〜５Ｅ．不透過性のアクチン染色分子（Ａｌｅｘａ  ４８８  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）存在下、ｃｗＮＩＲレーザービーム（８００ｎｍ）によって広い領域を照射した後に観察される、蛍光強度の増加および細胞分布。
【図６】ＨＥＫ細胞への外来性の不透過性抗体の送達のための金ナノロッドおよびＮＩＲレーザービーム（８００ｎｍ）の使用を示す。６Ａ．官能基化された金ナノロッドに接続したＨＥＫ細胞（８００ｎｍでＳＰＲピーク）、６Ｂ．ＮＯＤ前の蛍光。６Ｃから６Ｄから６Ｅ．細胞内蛍光強度の増加（抗体の送達を示唆する）が、ｃｗＮＩＲレーザービーム（８００ｎｍ）による広範囲にわたる照射の後に観察された。波長が合うように調整されていないレーザービーム（８５０ｎｍ）を使用すると、金ナノロッドに接続した細胞へのナノ強化型光学送達は生じなかった。
【図７】外植片中の網膜細胞への外来性の不透過性抗体の送達のための金ナノロッドおよびＮＩＲレーザービームの使用を示す。７Ａ．網膜外植片の明視野画像。蛍光画像；７Ｂ．ＧＮＲ存在下、レーザー露光（３０秒）の前、７Ｃ．ＧＮＲ存在下、レーザー露光（３０秒）の後。７Ｄ：ＧＮＲを用いずに、網膜外植片に３０秒間レーザー露光した後の蛍光の不存在。
【図８Ａ】ＮＯＤを用いた、皮膚におけるｉｎ−ｖｉｖｏでの遺伝子送達を示す。ヌードマウスの皮膚に注射したナノ粒子とＧＦＰプラスミドの混合物の一滴落下（矢印で示される）。
【図８Ｂ】ＮＯＤを用いた、皮膚におけるｉｎ−ｖｉｖｏでの遺伝子送達を示す。ＮＯＤのためのｃｗＮＩＲレーザービーム（８００ｎｍ）を用いた標的化された照射。
【図８Ｃ】ＮＯＤを用いた、皮膚におけるｉｎ−ｖｉｖｏでの遺伝子送達を示す。ＮＯＤ領域と、隣接するコントロール領域（白い線によって分離されている）におけるＧＦＰ発現。
【図９】網膜の丸で囲まれた領域における光受容体（桿体、錐体）の消失を示す網膜の模式図を表す。この標的化された光変性領域における網膜の異なる細胞層に、ＮＯＤに基づく制御された送達によって外来性治療分子を微量注入することができる。
【図１０】網膜の標的化された領域におけるＮＯＤに基づく制御された分子送達の模式図を示す。１０００：ＮＯＤのためのＮＩＲレーザー；１０１０：網膜（１０４０）で集束させるための、角膜（１０２０）およびレンズ（１０３０）によって歪んだビームを補正するための光学機器。１０５０：治療することが必要な領域；１０６０：金ナノロッドと注入される分子；１０７０：インジェクター。分子（例えば、遺伝子）は、強膜を介し、硝子体に注射した。近赤外（ＮＩＲ）レーザーが、網膜の標的化された領域（円形）に照射されると、適切なナノロッドと結合した網膜細胞の膜が、外来性の不透過性分子（例えば、遺伝子）について透過性になる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子送達システムは、網膜の空間的に標的化された領域の照射を外来性分子と共に送達することができるように、目の角膜およびレンズを通るビームの伝播を補正するための外部光学機器からなる。
【図１１Ａ】目の中でのＮＯＤのｉｎ  ｖｉｖｏ実験設定を示す。非特異的な結合を最小限にするために、金ナノロッドをＰＥＧ化する。ＰＥＧ化は、硝子体内の金ナノロッドの凝集も防ぐ。
【図１１Ｂ】レーザー走査型顕微鏡によって画像化された瞳孔拡張を示す。
【図１１Ｃ】近赤外レーザービームに対してレーザー露光している間の目の拡大された画像を示す。
【図１１Ｄ】標的化された領域内の網膜細胞におけるオプシンのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を示す。
【図１２】ＮＯＤと、蛍光および／または通常の眼底検査のためのイメージング検眼鏡とのための一体化されたデバイスの模式図を示す。１２００：可視光源（ＬＥＤ／ランプ／レーザー）；１２１０：レンズ−１；１２２０：励起バンドパスフィルター；１２３０：開口部；１２４０：ダイクロイックミラー；１２５０、ＮＩＲレーザーとコントローラ；１２６０：ビーム発散拡大のコントローラ；１２７０：レンズ−２；１２８０：ミラー−１；１２９０：穴；１３００：補正レンズ；１３１０：ミラー−２；１３２０：レンズ−３；１３３０：カメラとディスプレイ；１３４０：発光バンドパスフィルター。
【図１３】ＮＯＤおよびＯＣＴによるイメージングのために一体化されたデバイスの模式図を示す。１４００：ＮＩＲレーザー；１４１０：ファイバーカプラー；１４２０：コリメーティングレンズ−１；１４３０、１４４０：走査ミラー；１４５０、１４６０：レンズ対；１４７０：低コヒーレンス源；１４８０：サーキュレータ；１４９０：コリメーティングレンズ−２；１５００：参照ミラー；１５１０：コリメーティングレンズ−３；１５２０：格子；１５３０、１５４０：レンズ対；１５５０：カメラ；１５６０：コンピューター、ディスプレイ、コントローラ。
【図１４】ＯＣＴ／眼底検査によるフィードバックイメージングを用いた、地図状萎縮に対するＤＭＤ／ＳＬＭによってＮＯＤのためのレーザービームを成形するための模式的な設定を示す。１６００ＮＩＲレーザー；１６１０：二分の一波長板；１６２０：偏光板；１６３０：レンズ−１；１６４０：レンズ−２；１６５０：空間光変調器またはデジタルマイクロミラーデバイス；１６６０：レンズ−３；１６７０：非偏光ビーム；１６８０：ピンホール；１６９０：変調されたビーム；１７００：レンズ−４；１７１０：ダイクロイックミラー；１７２０：レンズ−５；１７３０：レンズ−６；１７４０：レンズ−７；１７５０：ＯＣＴまたは眼底検査計；１７６０：コンピューターとディスプレイ。
【図１５】網膜の地図状萎縮領域に対するＮＯＤのためのレーザービームを補正するための適応光学設定の模式図を示す。１８００：ＮＯＤ／イメージングレーザー；１８１０：ビームエキスパンダー／コリメーター；１８２０：ビームコントローラ（偏光／出力／露光）；１８３０：レンズ−１；１８４０：ピンホール１；１８５０：ダイクロイックミラー；１８６０：ミラー−１；１８７０：ミラー−２；１８８０：適応光学機器ミラー；１８９０：走査ミラー−１；１９００：走査ミラー−２；１９１０：レンズ−２；１９２０：レンズ−３；１９３０：ビームスプリッター；１９４０：ピンホール２；１９５０：レンズ−４；１９６０：波面センサ；１９７０：カメラ；１９８０：コンピューターとコントローラ；１９９０：光検出器。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
主な遺伝子送達方法は、高い形質導入効率を有するウイルストランスフェクションを使用する。しかし、ウイルスの使用によって、予想されない炎症応答、免疫反応、不適切な遺伝子組み込みが起き、封入され、送達され得るプラスミドの大きさが制限される場合がある（６、２９）。さらに、ウイルス法は、タンパク質、不透過性の薬物または低分子の送達に適用することができず、これらは、ワクチン接種および癌の治療にとって必要である。したがって、代替的な非ウイルス法、例えば、物理的な方法（微量注入（３０）、電気穿孔（３１、３２）、超音波（３３）など）および化学物質が介在する方法（例えば、リポソーム（３４）および生分解性ポリマー（３５））を開発することに顕著な努力がなされてきた。これらの方法には、１つ以上の欠点（例えば、侵襲性、効率が低い、空間的に標的化された送達ができない、および／またはトランスフェクションされた細胞に対するいくつかの有害な影響）がある（３１）。例えば、電気穿孔の間に大きな動物へとｉｎ  ｖｉｖｏで送達するのに必要な物理エネルギーは、組織に対し、物理的および機能的な損傷を引き起こすことがある。最も重要なことに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの電気穿孔、ウイルスベクタまたは化学物質が介在する方法を用い、遺伝子発現の領域を空間的に制御することは困難である。このことは、空間的に標的化された領域への遺伝子送達のための非侵襲的な方法の開発を必要とする。
【００２２】
密に集束するパルス状のレーザービームを使用することによって、標的細胞の膜は、最小限の侵襲的な様式で一時的に穿孔し、外来性分子を細胞の中に入り込ませることができる。過去数十年にわたって、非接触の非侵襲性の様式で高分子物質を単一の植物細胞および動物細胞に注入するために、レーザーを利用した穿孔が適用されてきた。最初に、ＵＶのレーザー（３６）および可視光を光穿孔に使用した。しかし、ＵＶ−可視光は、オルガネラと、細胞に移される外来性分子（例えば、ＤＮＡおよびタンパク質）に対する損傷が増える可能性がある。近年、近赤外領域（ＮＩＲ、７００〜１０００ｎｍ）でのレーザーが、この範囲での細胞構成要素による吸収および散乱に起因して顕著に低い光学損失のため、注目を集めるようになってきている。しかし、超高速レーザービームの高いピーク強度は、外来性物質を微量注入することを必要とする（４６）。これらのパルス状のレーザーは、単一細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの微量注入に適しているが、いくつかの理由のため、３Ｄ組織へのｉｎ  ｖｉｖｏでの分子の送達には困難が生じる。（ｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏ送達の効率およびスループットは、目的の領域へと分子を送達するためにスキャンされることが必要なレーザービームの高いピーク強度を必要とするために、低く、（ｉｉ）レーザービームの集束およびパルスは、組織内部を伝播する間に歪み、そのため、深さ方向に穿孔するのに必要な強度が失われ（レーザーエネルギーを上げると、さらに、標的組織に到達する前に、標的外の細胞および組織への重篤な損傷が起こる）、（ｉｉｉ）臨床での実施に固有の困難がある。装置の嵩高さおよび複雑さは、重大な操作上の困難となる。したがって、ｆｓレーザーに基づく送達の適用は、大部分が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび単層細胞培養物に限定されている。
【００２３】
標的細胞の内側に薬物を送達する現行法は、電気穿孔、トランスフェクションまたは他の厳しい方法を含む方法によって、目的の細胞を単離し、薬剤を細胞に挿入することに依存する。標的細胞の内側に薬剤をｉｎ  ｖｉｖｏで送達することは、さらにもっと複雑であり、細胞に特異的な細胞標的の特定と、薬剤の送達に適切に取り込むものに依存する。
【００２４】
乾燥加齢黄斑変性（乾燥ＡＭＤ）および網膜色素変性（ＲＰ）などの網膜の光変性疾患において、光から電気化学シグナルへの変換に関与する光受容体（例えば、桿体および錐体）が変性する。これにより、網膜内で光誘発性シグナルが生成するのを防ぐ。光受容体細胞の消失および／または光受容体細胞の機能の消失は、光感受性の低下および失明の主な原因である。
【００２５】
失明を治療するために現在の光遺伝学的手法を臨床に置き換えることは、変性していない網膜領域を乱すことなく、オプシンをコードする遺伝子を、変性した網膜の空間的に標的化された領域（乾燥ＡＭＤの黄斑）に送達する方法がないという問題がある。したがって、最小限の侵襲的な様式で網膜の空間的に標的化された領域にオプシン構築物を送達することができる、新規で効果的な非ウイルス法の開発および最適化が必要とされている。
【００２６】
本明細書に記載されるように、細胞、器官および生物全体への外来ＤＮＡ（１）、低分子干渉ＲＮＡ（２）、低分子、タンパク質（３）および薬物の導入は、遺伝子学、細胞発生生物学、ワクチン接種（４）、遺伝子治療（５、６）および他の治療戦略における種々の用途にとって重要である。
【００２７】
さらに、細胞プロセス、発現パターンおよび活性を視覚化し、制御するために、蛍光分子をコードする遺伝子（標識のためのタンパク質）、イオンチャンネル（光による活性化のため）、一般的にコードされる電圧指標（ＧＥＶＩ、活性を検出するため）、膜および細胞内オルガネラを標的とする抗体などの他の分子を送達する必要がある。主な遺伝子送達方法は、高い形質導入効率を有するウイルストランスフェクションを使用する（２６〜２８）。しかし、ウイルスの使用によって、予想されない炎症応答、免疫反応（６、２９）、不適切な遺伝子組み込みが起きる場合がある（２９、６１）。さらに、ウイルス法は、封入され、送達され得るプラスミドの大きさを制限し、ウイルス法は、タンパク質および抗体を送達することもできない。さらに、細胞回路を理解するために、標的化された分子の発現を、特定の細胞型においてだけではなく、制限される空間的な領域内の特定の細胞にも局在化することが有用であろう。したがって、代替的な非ウイルス法、例えば、物理的な方法（微量注入（３０）、電気穿孔（３１、３２）、超音波（３３）など）および化学物質が介在する方法（例えば、リポソーム（３４）および生分解性ポリマー（３５））を開発することに顕著な努力がなされてきた。これらの方法には、１つ以上の欠点（例えば、侵襲性、効率が低い、空間的に標的化された送達ができない、および／またはトランスフェクションされた細胞に対するいくつかの有害な影響）がある（３１）。最も重要なことに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの電気穿孔、ウイルスベクタまたは化学物質が介在する方法を用い、遺伝子発現の領域を空間的に制御することは困難である。このことは、組織の標的細胞への遺伝子送達のための非侵襲的な方法の開発を必要とする。
【００２８】
特定の細胞型に対し、選択の薬剤を送達する現行法は、ある程度効果的ではあるが、厳しい条件と、適切な標的薬剤の特定に依存する。さらに、現行の方法は、特異性、信頼性がなく、ｉｎ  ｖｉｖｏではほとんどが役に立たない。したがって、本開示は、特定の細胞型に、いくつかの実施形態では、特定の細胞型の内側に、薬剤を送達するための方法およびシステムを提供する。
【００２９】
密に集束するパルス状のレーザービームを使用することによって、標的細胞の膜を、最小限の侵襲的な様式で一時的に穿孔し、外来性分子を細胞の中に入り込ませることができる。過去数十年にわたって、非接触の非侵襲性の様式で高分子物質を単一の植物細胞および動物細胞に注入するために、レーザーを利用した穿孔が適用されてきた。最初に、ＵＶのレーザー（３６）および可視光（３７、３８）を光穿孔に使用した。しかし、ＵＶ−可視光は、オルガネラと、細胞に移される外来性分子（例えば、ＤＮＡおよびタンパク質）に対する損傷が増える可能性がある。近年、近赤外領域（ＮＩＲ、７００〜１０００ｎｍ）でのレーザーが、この範囲での細胞構成要素による吸収および散乱に起因して顕著に低い光学損失のため、注目を集めるようになってきている（３９〜４２）。しかし、超高速レーザービームの高いピーク強度（３９、４２〜４５）は、外来性物質を微量注入することを必要とする（４６）。これらのパルス状のレーザーは、単一細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの微量注入に適しているが、いくつかの理由のため、３Ｄ組織へのｉｎ  ｖｉｖｏでの分子の送達には困難が生じる。（ｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏ送達の効率およびスループットは、目的の領域へと分子を送達するためにスキャンされることが必要なレーザービームの高いピーク強度を必要とするために、低く、（ｉｉ）レーザービームの集束およびパルスは、組織内部を伝播する間に歪み、そのため、深さ方向に穿孔するのに必要な強度が失われ（レーザーエネルギーを上げると、さらに、標的組織に到達する前に、標的外の細胞および組織への重篤な損傷が起こる）、（ｉｉｉ）臨床での実施に固有の困難がある。装置の嵩高さおよび複雑さは、重大な操作上の困難となる。したがって、ｆｓレーザーに基づく送達の適用は、大部分が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび単層細胞培養物に限定されている。
【００３０】
細胞および組織への不透過性分子の空間的に標的化された送達における課題を軽減するために、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞への標的化された送達を達成するためのナノ強化型光学送達（ＮＯＤ）方法を提供する。ナノ強化型光学送達（ＮＯＤ）方法とは、ナノ粒子またはナノ構造、例えば、金、銀などの帰属から作られるナノロッド、ナノ楕円体、ナノ三角錐、ナノ星形、ナノ貝形、局所的な光場を増強させることができる半導体または絶縁体の使用を意味する。光学（ＮＩＲ）場の増強は、先端での金ナノロッド（ＧＮＲ）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の使用によって達成される。これにより、ＧＮＲに結合した細胞への不透過性の分子の送達を達成するために、低いレーザー出力を使用することができる。
【００３１】
「ナノ粒子」とは、本明細書で使用される場合、ナノ粒子またはナノ構造、例えば、金、銀などの帰属から作られるナノロッド、ナノ楕円体、ナノ三角錐、ナノ星形、ナノ貝形、局所的な光場を増強させることができる半導体または絶縁体の使用を意味する。一実施形態では、本明細書に開示する方法での用途が見つかるナノ粒子としては、限定されないが、金ナノロッドと、出力が１０〜１００ｍＷであり、約０．０１〜１ｍｍの範囲の大きさのスポットに集束するＮＩＲレーザービームが挙げられる。
【００３２】
一実施形態では、第１のナノ粒子は、当該技術分野で公知の方法を用い、第１の標的薬剤を用いて官能基化される。標的薬剤とは、標的細胞に特異的に結合する薬剤を意味する。標的薬剤が、第２の細胞型と比較して、ある細胞型に特異的に結合することができるものである限り、標的薬剤は、リガンド、抗体、抗体フラグメント、核酸、アプタマー、低分子などであってもよい。この様式で、ナノ粒子−標的薬剤複合体が細胞混合物に添加されたら、第１の細胞型のみがナノ粒子と会合するだろう。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、第２の細胞型に特異的な第２の標的薬剤で官能基化されている。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、３、４、５、１０、２０、５０、７５、１００、またはもっと多くの細胞型をそれぞれ標的化するために、３、４、５、１０、２０、５０、７５、１００、またはもっと多くの標的薬剤を用い、３、４、５、１０、２０、５０、７５、１００、またはもっと多くの別個の基で官能基化されている。
【００３４】
次いで、官能基化されたナノ粒子が、目的の細胞型または複数の細胞型と接触する。しかし、特に、ナノ粒子は、それぞれの標的薬剤に特異的な細胞型にしか結合しない。したがって、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで処理することができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、異なる形状を有し、したがって、異なるＳＰＲを有するナノ粒子を使用することができる。第１および第２の形状およびＳＰＲを有するナノ粒子は、異なる細胞を標的化するために、第１および第２の標的薬剤で官能基化されてもよく、または第１および第２の細胞型に第１および第２の薬剤を送達するために使用されてもよい。金ナノ粒子のアスペクト比（長軸に対する短軸の大きさの比率）は、可視光（約５３０ｎｍ）〜ＮＩＲ（約１１００ｎｍ）までのさまざまなＳＰＲを得るために、１：１〜１：５で変動してもよい。
【００３６】
それぞれの細胞の内側に投与される薬剤を、細胞の集合または混合物に添加してもよい。次いで、ナノ粒子の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のピークに適合する波長を有するレーザービームを細胞に照射する。ナノ粒子が、細胞表面に近接した状態にあるため、標的薬剤の結果として、ＳＰＲによって、細胞を殺すことなく、標的薬剤を細胞の内側に送達することができるように、細胞がわずかに破壊されると考えられる。いくつかの実施形態では、第２のナノ粒子−標的薬剤複合体を細胞混合物と接触させ、第２の薬剤は、この手順を繰り返すことにより、第２の細胞の集合の内側に投与される。
【００３７】
照射は、約１０〜２００ｍＷ（約０．０１〜約１ｍｍのスポットサイズに集束する）で継続してもよく、１秒〜約２分間続いてもよい。サンプルの照射が完了したら、サンプルを薬剤と共に種々の期間、例えば、０．５秒間〜５時間、または１秒間〜２時間、または２秒間〜１時間、または５秒間〜３０分間、または１０秒間〜１０分間〜ほぼ３０秒間〜５分間、インキュベートしてもよい。いくつかの実施形態では、インキュベートは、ほぼ０．５秒間、ほぼ１秒間、ほぼ５秒間、ほぼ１０秒間、ほぼ３０秒間、ほぼ６０秒間、ほぼ２分間、ほぼ５分間、ほぼ１０分間、ほぼ２０分間、ほぼ３０分間、ほぼ６０分間、ほぼ２時間、ほぼ５時間、ほぼ７時間、ほぼ１０時間またはほぼ２４時間継続する。
【００３８】
本開示は、膜の透過性を局所的に変化させる、膜のナノ強化型光熱または光化学または誘電破壊を含んでいてもよいが、必ずしもこれに限定されないナノ強化型光学送達（ＮＯＤ）によって、最小限の侵襲的な様式で、細胞不透過性の物質（例えば、限定されないが、プラスミドなど）を細胞内に導入することができることを示す。一実施形態では、ＮＯＤは、連続波（ｃｗ）ＮＩＲレーザービームを用いたナノ強化型光熱方法を包含する。このナノ強化型光学送達（ＮＯＤ）方法では、金ナノロッド（ＧＮＲ）による近赤外（ＮＩＲ）場の増強を利用し、細胞膜を一時的に穿孔し、ロッド末端にあるホットスポットを介し、外来性分子を細胞へと送達する。空間的に標的化されたｉｎ  ｓｉｔｕでの送達は、標的化された領域での連続波（ｃｗ）ＮＩＲレーザービームを光らせることによって達成される。
【００３９】
本明細書に記載の方法にしたがって細胞の内側に投与することができる薬剤としては、限定されないが、細胞不透過性薬剤、例えば、核酸、低分子、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、遺伝子、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、ｍＲＮＡ、改変核酸および改変ヌクレオチドを含む特定の種類の核酸、標識、イオン、細胞外流体、ワクチン、成長因子、ホルモンおよびアプタマーが挙げられる。
【００４０】
一実施形態では、送達される細胞透過性薬剤は、ナノ粒子に可逆的に接続する。この実施形態では、ナノ粒子に照射し、ナノ粒子に対する薬剤の結合を逆転させると、薬剤が、細胞の内側に送達される。任意の細胞型への送達は、本明細書に開示する方法によって達成することができる。
【００４１】
本明細書に記載の方法によれば、不透過性の分子（例えば、遺伝子）の皮膚へのＮＯＤは、近赤外レーザービームを用いて達成された。
【００４２】
一実施形態では、本開示は、目的の１つ以上の細胞に治療薬剤を投与することによって疾患を治療する方法を提供する。例示的な一実施形態では、開示される発明は、ＲＰおよび乾燥ＡＭＤなどの網膜の光変性疾患を有する患者において、視力回復用途のためにオプシンを送達するためにＮＯＤ方法を使用するための方法を提供する。ほとんどの現行の臨床的治療は、主に、疾患の進行を遅らせることに集中しており（６２）、変性を止めることができる治療がなく（６３）、変性に起因する視力喪失を回復させることができる網膜プロテーゼ以外の治療がない（６４）。より高次のニューロンは、光変性した網膜の中で無傷であるため、いくつかの刺激方法は、より高次のニューロン（例えば、双極細胞および網膜神経節細胞）を標的としており、これらは、視覚野に視覚情報を運ぶ。直接的な電気刺激手法は、網膜細胞に電極を機械的に接触させる必要があるが、間接的な刺激手法（例えば、光遺伝学的な刺激）は、このような物理的な接触の必要がない。光遺伝学的刺激は、光によって活性化可能なイオンチャンネルをコードするプラスミドを細胞へと送達することを含む。細胞膜上で発現したら、適切な波長の光を照射すると、イオンチャンネルが活性化し（アニオンまたはカチオンの内側／外側への流れが向上し）、そのため、細胞が脱分極するか、または過分極化する。したがって、間接的な方法は、非侵襲性であるという明確な利点を与える。これに加えて、光遺伝学的刺激を用いつつ、細胞特異性および高い（単一細胞）解像度を達成することができる。
【００４３】
現在、活性化／阻害と組み合わせた網膜細胞の光遺伝学的感作の使用によって、網膜インプラントの代わりとなり、高解像度のためにそれぞれの１つのニューロンの付近に電極を配置する必要性がなくなる可能性がある（６５）。光遺伝学的刺激は、光活性化可能な分子チャンネル（オプシン）を遺伝子標的によって細胞へと導入することによって、高い時間精度を与える（９、１０、１２、１３、６６、６７）。高い時間的および空間的な解像度に加え、光遺伝学は、細胞特異性（例えば、使われていない錐体、神経節または双極細胞）などの電気刺激および最小限の侵襲性といういくつかの利点を有する（６８）。非選択的なカチオンチャンネルであるＣｈＲ２の光誘発活性化は、ＣｈＲ２を発現するこれらの細胞のみを脱分極させる。ｍｓ−パルス状の青色光によるニューロンの選択的な活性化が、培養物（６７）、脳切片および小さな動物（６９〜７２）で示されている。この光遺伝学的活性化方法は、発光ダイオード（ＬＥＤ）またはレーザーから運ぶことが可能な中強度の光（＜０．１ｍＷ／ｍｍ２）のみを必要とするため、細胞活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで制御するのに非常に有望である（９、１０）。細胞の光感受性を高めるため、または異なる波長の可視光によって活性化されるように、種々の光によって活性化されるイオンチャンネル（オプシン）が開発されてきた。
【００４４】
網膜の非特異的な網膜（７３）またはＲＧＣのためのＴｈｙ１を含むプロモーター特異的な様式で（７４〜７８）、ＯＮ型双極細胞を標的とするｍＧｌｕＲ６で（２４、７９）によって、失明したマウスモデルにおける視力回復のために光遺伝学的方法が使用されてきた。メラノプシン（８０）または光化学遺伝学（８１）の使用によってＲＧＣを刺激するための企てもなされてきた。さらに、長時間続く錐体光受容体（８２）中で発現する、塩素チャンネルであるオプシン（ハロロドプシン）の活性な光刺激の使用は、視力回復のための治療介入の新しい可能性を示している（８３）。再感作された光受容体は、網膜回路の機能が働き、皮質回路を活性化させ、視覚によって導かれる挙動を媒介することが示されている。
【００４５】
光遺伝学的治療または他の遺伝子治療方法による視力回復が、ウイルス手段（例えば、組換えアデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルス）を介する目の硝子体へのオプシンまたは他の遺伝子の送達によって、ヒトにおいて提案されている。しかし、視力回復のためのこのような治療の臨床への置き換え（光遺伝学的活性化を用いる）は、ＭＣＯをコードする遺伝子を、変性した網膜の空間的に標的化された領域（すなわち、乾燥ＡＭＤの黄斑）へと送達するための手法がないため、患者の小さな集合（網膜全体にわたって完全に光変性がある）に限定されている。したがって、最小限の侵襲的な様式で網膜の空間的に標的化された領域に大きな構築物を送達することができる、新規で効果的な非ウイルス法の開発が必要とされている。
【００４６】
安全なＮＩＲスペクトルにおける、金ナノ構造による効率的な局在化された光熱変換（５２〜６０）によって、出力が５０〜２００ｍＷの外部ＮＩＲレーザービーム（８００ｎｍ）を５〜１５秒間露光させ、動物モデルにおける光変性した網膜の標的化された領域中の細胞へのオプシン−プラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏでのナノ強化型光学送達（ＮＯＤ）が可能になった。金ナノ粒子は、無視できる細胞毒性を有し、臨床的ＮＯＤに適したものである。すなわち、この例示的な実施形態では、ＧＮＰは、それを必要とする被験体の網膜に、オプシンをコードするプラスミドを送達するために使用される。当業者に理解されるように、多様な疾患を本明細書に記載する方法によって治療することができる。このような疾患を治療する方法は、細胞不透過性薬剤を他の方法で細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで投与することを含む。
【００４７】
この方法は、ウイルスベクタとは異なり、免疫応答の引き金となることなく、遺伝子強化治療および遺伝子阻害治療の両方に使用可能である。本明細書に記載する方法およびシステムの用途が見出される目の障害の非限定的な実施例としては、ＲＰ、ＡＭＤ、スターガルト病、ＬＣＡ、錐体−桿体ジストロフィー、アッシャー症候群を含む目の光変性疾患が挙げられる。本明細書に記載する方法およびシステムの用途が見出される他の障害の非限定的な実施例としては、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型およびベッカー型）、嚢胞性線維症（肺および消化器系が、濃い粘性の粘液で詰まる）、重篤な複合免疫不全を有する子供が挙げられる。
【００４８】
ＮＯＤ方法は、癌を含む多くの障害を治療するためのｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方での細胞（例えば、Ｔ細胞）へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９治療分子の送達を補助するだろう。いくつかの実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子移動は、本明細書に開示する方法を用いて見出される。ＮＯＤを用いた外来性遺伝子の送達による細菌の形質変換が有用である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精に使用される卵子、胚、精子への遺伝子および他の治療分子の送達は、生殖医療において有用であろう。さらに、植物の遺伝子改変を開発する際に使用するための遺伝子および他の低分子を送達するために、ＮＯＤ方法を使用することができる。さらに、ｅｘ−ｖｉｖｏでの使用は、進行した急性リンパ芽球性白血病を含む癌のためのキメラ抗原受容体Ｔ細胞を遺伝子改変するためのＮＯＤを用いた分子の送達を含む。ＮＯＤ方法は、幹細胞の移植時の多くの障害の治療を向上させるために幹細胞産生中のリプログラミングのために、細胞への分子（プラスミド、ＲＮＡ、タンパク質など）の送達を補助するだろう。
【００４９】
本開示は、ビームのスキャニング、ビームの成形、波面補正の達成を含め、標的化された送達のためのいくつかのデバイスの設計も含む。これに加えて、本発明は、いくつかの態様では、治療分子の送達を必要とする標的化された領域を特定するために、検査、スキャニングレーザー検眼鏡検査および光干渉断層撮影と一体化されたナノ強化型光学送達（ＮＯＤ）デバイスを提供する。
【００５０】
本発明は、いくつかの態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞内のオプシンの発現と、これらのオプシンによって細胞活性を調整するための方法を含む。本発明で示される結果は、オプシンとＮＯＤ薬剤（ＧＮＲ）とを硝子体内注入した後のマウス網膜におけるオプシン受容体タンパク質の効率的で安定なｉｎ  ｖｉｖｏ発現を示す。
【００５１】
本発明の別の態様によれば、ヒトにおいて視力を回復する方法が提供される。本方法は、網膜の標的化された領域にオプシン遺伝子を運ぶためのＮＯＤの使用と、および／またはＮＯＤビームスキャニング／成形デバイスに対するフィードバックを与えるための異なるイメージングモダリティとの組み合わせを含む。オプシンを発現する細胞は、光受容体細胞と同様に光によって誘発される内側の電流を作り出し、そのため、視力を回復することができる。
【００５２】
ここで、本開示は、添付の図面を参照しつつ、以下にさらに完全に記載し、本発明のいくつかの例示的な実施形態が示される。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具現化されてもよく、本明細書に記載する実施形態に限定されるものと解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が十分に完全であり、当業者に本発明の範囲を完全に伝えるように与えられる。
【００５３】
「１つの（a）」または「１つの（an）」という用語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書中で「〜を含む（comprising）」という用語と組み合わせて使用される場合、「１つ」を意味してもよいが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、「１つ、または１つより多い」の意味とも一致する。
【００５４】
特許請求の範囲において「または」という用語の使用は、特に明記されない限り、代替物のみを指すか、または代替物が相互に排他的であることを指すように、「および／または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替物と「および／または」のみを指す定義を支持する。
【００５５】
「１つ（a）」および「１つ（an）」という用語は、本開示が明示的に他の意味であることを必要としていない限り、１つ以上であると定義される。「実質的に」との用語は、当業者によって理解されるように、大部分が明記されるように定義されるが、必ずしも全体的ではなくてもよい（例えば、実質的に９０°と明記される場合、９０°を含み、実質的に平行とは、平行を含む）。任意の開示される実施形態では、「実質的に」、「おおよそ」、「約」という用語は、明記されているものの「〜［パーセント］以内に」と置き換えられてもよく、このパーセントは、０．１％、１％、５％、１０％を含む。
【００５６】
本出願全体で、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために使用されるデバイスまたは方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。
【００５７】
さらに、特定の様式で構成される分子または方法は、少なくともその様式で構成されるが、具体的に開示されるもの以外の様式で構成されてもよい。
【００５８】
「〜を含む（comprise）」（および含む（comprise）の任意の形態、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）、「〜を有する（have）」（および有する（have）の任意の形態、例えば、「ｈａｓ」および「ｈａｖｉｎｇ」）、「〜を含む（include）」（および含む（include）の任意の形態、例えば、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」）および「〜を含有する（contain）」（および含有する（contain）の任意の形態、例えば、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」）との用語は、包括的な接続動詞である。結果として、１つ以上の要素「〜を含む（comprises）」、「〜を有する（has）」、「〜を含む（includes）」または「〜を含有する（contains）」装置は、１つ以上の要素を含むが、１つ以上の要素のみを有することに限定されない。同様に、１つ以上の工程「〜を含む（comprises）」、「〜を有する（has）」、「〜を含む（includes）」または「〜を含有する（contains）」方法は、１つ以上の工程を含むが、１つ以上の工程のみを有することに限定されない。
【００５９】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「〜を含む（comprising）」（および含む（comprising）の任意の形態、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」）、「〜を有する（having）」（および有する（having）の任意の形態、例えば、「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」）、「〜を含む（including）」（および含む（including）の任意の形態、例えば、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄ」）または「〜を含有する（containing）」（および含有する（containing）の任意の形態、例えば、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」）との用語は、包含的または包括的であり、さらなる引用されていない構成要素または方法の工程を除外しない。
【００６０】
装置、システムおよび方法のいずれかの実施形態が、記載されている工程、構成要素および／または特徴のいずれかを含む（comprise）／含む（include）／含有する／有するのではなく、これらからなるか、または本質的にこれらからなっていてもよい。したがって、特許請求の範囲のいずれかにおいて、「〜からなる」または「本質的に〜からなる」は、その他の様式で包括的な接続動詞を用いる所与の特許請求の範囲を変えるために、上に引用した包括的な任意の接続動詞で置き換えることができる。
【００６１】
記載されておらず、示されていない場合であっても、本開示によって明示的に禁止されていない限り、または実施形態の性質から明示的に禁止されていない限り、ある実施形態の１つ以上の特徴を他の実施形態に適用してもよい。
【００６２】
上述の参考文献または他の文献の具体的な開示内容が、本発明の任意の一般的な態様を予測するために考慮され得る程度まで、本発明の開示は、既に開示したこのような任意の種を放棄するという条件で含まれることを理解すべきである。本発明の態様は、このような文献の開示内容によって予測されないが、本明細書に開示され、または主張された予想できない優れた結果の少なくとも一部分によって、これらの刊行物の開示内容から自明でもない。
【００６３】
いくつかの参考文献は、刊行物、特許および特許明細書を含んでいてもよく、本発明の記載に引用され、記載されている。このような参考文献の引用および／または説明は、単に、本発明の説明を明確にするために与えられており、このような任意の参考文献が、本明細書に記載する本発明の「従来技術」であることを認めたものではない。本明細書で引用され、記載される全ての参考文献は、その全体が本明細書に参考として組み込まれ、それぞれの参考文献が、個々に参考として組み込まれるのと同じ程度まで、組み込まれる。
【００６４】
以下、ここに開示する発明を、単なる説明のために与えられる実施例としてさらに記載するが、したがって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００６５】
実施例１−図１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定の細胞群に対する、またはｉｎ  ｖｉｖｏで組織におけるナノ強化型光学送達の種々の工程を示す。
工程１：特定の細胞に結合するように官能基化された金ナノロッドを、細胞外媒体に添加する。工程２：官能基化された金ナノロッドを、特定のインキュベート期間で標的細胞に結合させる。
工程３：プラスミドまたは抗体などの送達される分子を、細胞外媒体に添加する。
工程４：近赤外（ＮＩＲ）レーザービームの波長を、金ナノロッド（ＧＮＲ）の表面プラズモン共鳴ピーク（ＳＰＲ）に合わせて調整する。サンプルまたはビームは、標的領域を包含するように、スキャンされる（走査ミラーまたはステージによって）か、または空間的に調整される（例えば、空間光変調器またはデジタルマイクロミラーデバイスによって）。ＧＮＲのＮＩＲレーザー照射は、ロッドの先端にホットスポットを作り出し、細胞膜に結合している場合には、局所的に膜透過性を高める。工程５：したがって、他の様式で、不透過性の分子が、ホットスポットに露出した膜を介して入り込む。細胞への外来性分子の送達は、ＮＩＲレーザービームの全体的な露光と出力に依存する。さらに、送達効率は、ＧＮＲの濃度、細胞との結合性、ＧＮＲのＳＰＲピークとＮＩＲレーザービームとの適合性に依存し、これらは全て、当業者ならば決定することができる。ＮＩＲレーザービームに対する連続的な露光を使用し、このようなナノ強化型光学送達を達成することができるが、細胞／組織を全体的に加熱することなく、送達を最適化するために、レーザーは、パルス状態であってもよい（幅が数ピコ秒から数分まで変動する）。
工程６：レーザービームをオフ状態に切り替えた後、特定の期間（数秒間から数分間、または数時間の場合さえある）で、外来性分子を細胞に入り込ませ、標的とするオルガネラに結合させ、遺伝子発現などの細胞機能を活性し、この細胞機能によって活性化されてもよい。次いで、結合していないロッドと送達される分子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＮＯＤの場合には洗浄することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏの場合には、器官の排泄システムがこれを達成するだろう。
工程７：同じ異なる分子を別の細胞型に送達するために、異なる形状（すなわち、異なるＳＰＲピーク）の金ナノロッドが、新しい細胞型に結合するために、異なる部分で官能基化される。
工程８：官能基化されたＧＮＲを細胞外媒体に添加し、インキュベート期間で、標的細胞の次の群に結合させる。
工程９：新しい送達される分子を上述の媒体に添加する。添加される分子の濃度は（異なる形状のＧＮＲの濃度に加えて）、異なる細胞内送達を得るために変化する。
工程１０：近赤外（ＮＩＲ）レーザーを、新しく添加した金ナノロッド（ＧＮＲ）の表面プラズモン共鳴ピーク（ＳＰＲ）に合わせて調整する。細胞／組織の標的とする領域に、新しいＳＰＲに適合するＮＩＲレーザービームを照射する。
工程１１：新しい分子が、レーザー照射中に作られたホットスポットを介し、その後に細胞膜の透過性が乱されるまで、ＧＮＲに結合した次の細胞群の中に入り込む。
工程１２：注入された新しい分子が、第２の細胞群の中の標的化されたオルガネラと結合することが可能である。遺伝子または他の低分子の場合には、細胞機構は、遺伝子を発現するか、または所望な活性を抑制するように作用する。
【００６６】
実施例２−異なる細胞型への異なる分子の空間的に標的化された送達のために、異なる形状（短軸に対する長軸のアスペクト比）を有する金ナノロッドを作成した。図２Ａは、金ナノロッドの末端でのレーザービームの光学的増強（ホットスポット）のために使用される金ナノロッドの高倍率顕微鏡画像を示す。これらのナノロッドは、異なる型の細胞に対して標的特異的に結合するために、ＰＥＧ、コンカナバリンＡまたは抗体で官能基化された。これらの金ナノロッドの形状を変えることで、波長選択的な表面プラズモン増強が可能になった。図２Ｂは、８００ｎｍでＳＰＲピークを示す１型金ナノロッドの測定された光学密度を示す。８５０ｎｍにピークを有する２型金ナノロッドの光学密度を図２Ｃに示す。波長選択的な送達を評価するために、１型の官能基化された金ナノロッド（ＳＰＲピーク８００ｎｍ）に細胞を接続し、ＳＰＲが適合しない８５０ｎｍのレーザービームを照射した。ヨウ化プロピジウム（細胞不透過性分子）を細胞外媒体に添加した。ＳＰＲが適合しないレーザー照射の場合には、細胞内送達は観察されなかった。しかし、同じレーザー出力と露光で、８００ｎｍで照射すると、空間的に標的化された細胞への明らかな送達が起こった（１型ＧＮＲと結合した）。したがって、ＮＩＲレーザー波長を調整すると、標的となる細胞の集合に選択的に送達することができた。
【００６７】
実施例３−細胞へのナノ強化型光学送達を調べるために、複数のＮＩＲレーザーが顕微鏡プラットフォームに連結したプロトタイプを開発した。図３Ａは、細胞へのナノ強化型光学送達のための設定の模式図を示す。Ｃｗレーザー（４００）ビーム（８００ｎｍまたは８５０ｎｍ）は、拡大され、集束レンズ（４１０）の組み合わせを用いて平行にされ、ダイクロイックミラー１（４４０）を用いて顕微鏡に連結された。コンデンサレンズ（４２０）は、ＮＩＲビームをサンプル上に集束した。コンデンサレンズの垂直変換によって、サンプルチャンバ（４５０）内の照射スポットの大きさを制御した。分子の複数の送達またはパターン化された送達のために、ＸＹステージ（４６０）を変換した。イメージング白色光（４３０）は、ダイクロイックミラー１（４４０）を介して運ばれる。顕微鏡対物レンズ（４７０）は、サンプルを通った白色光を集め、伝える。サンプルの蛍光励起のために、蛍光励起ランプ（４９０）を使用した。励起バンドパスフィルター（５００）の選択は、観察中の分子の特徴的な蛍光に基づいてなされた。ダイクロイックミラー２（４８０）は、顕微鏡対物レンズを介し、サンプル表面で励起光を反射した。吸収フィルタ（５１０）は、観察中に分子からの特徴的な蛍光発光を伝えた。レーザーカットオフフィルター（５２０）は、ＮＩＲレーザービームがカメラ（５３０）に届くのを阻止した。細胞へのナノ強化型光学送達のためのレーザー型直立型蛍光顕微鏡の実際の写真を図３Ｂに示す。ＮＯＤの機構を示すためにこの設定を利用しているが、決して、提案する方法を実現することができる唯一の手段であると解釈すべきではない。他の手段は、空間光変調器またはデジタルマイクロミラーデバイスを用い、倒立顕微鏡の使用、単一のファイバーまたは光ファイバープローブ、ビームのスキャニングまたはビームの成形を含む。
【００６８】
実施例４−図４、外来性の不透過性分子を送達するための金ナノ球と緑色レーザービーム（５３２ｎｍ）の使用を示す。緑色レーザービームを照射する前のＨＥＫ細胞の明視野画像と蛍光画像をそれぞれ図４Ａおよび図４Ｂに示す。図４Ｃは、サンプルチャンバ内で細胞に対して空間的に標的化された緑色レーザービームを示す。外来性分子（ヨウ化プロピジウム、ＰＩ）の流入を示す蛍光の増加は、図４Ｄおよび図４Ｅで明らかである。図４Ｆは、異なる細胞／領域への送達を可能にするためのサンプルステージのＸＹ移動後の明視野画像を示す。図４Ｇは、サンプル再配置後の落射蛍光画像を示す。図４Ｈのパネルに示すように、近赤外ｃｗレーザー照射を再び実施する。図４Ｉ〜図４Ｊは、新しい標的細胞中の外来性分子（ＰＩ）の流入を示す蛍光の上昇を示す。生体組織への緑色光の透過深さは小さいが、近赤外系の手法を必要とするＮＯＤのためのｉｎ  ｖｉｖｏでの組織への緑色レーザーの使用には、重篤な問題（細胞損傷）がある。
【００６９】
実施例５−図５は、ＨＥＫ細胞への外来性の不透過性抗体の送達のための金ナノロッドおよびＮＩＲレーザービーム（８００ｎｍ）の使用を示す。８００ｎｍでの表面プラズモン吸収最大を有する金ナノロッド（直径：１０ｎｍ、長さ：４０ｎｍ）をＮＯＤに使用した。図５Ａは、官能基化された金ナノロッドに接続した細胞の明視野画像を示す。膜特異的な結合のために、これらのナノロッドは、細胞膜に排他的に結合することが示されているコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）分子で官能基化された。本願発明者らの初期のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＯＤ実験では、ＮＯＤ方法を最適化するために、ヨウ化プロピジウム（Ｐｌ）−不透過性のＤＮＡ結合分子がＨＥＫ細胞へと運ばれた。ＮＯＤ方法を最適化するために、異なるレーザー出力（２０、５０、１００ｍＷ）および露光（１、２、５、１０、２０、３０、６０、９０、１２０秒間）を使用した。細胞膜の上のＮＩＲを吸収するナノ粒子の光熱特性を向上させると、局所的な温度上昇が可能になり、ｃｗＮＩＲレーザーがオン状態にある間、細胞膜を介して不透過性分子の送達が可能になる。最適なレーザー線量について、カルセイン排除アッセイによって確認される場合、細胞生存能力は変わらないままであった。細胞の形態は変わらないままで、外来性分子の流入は、レーザービームをオフ状態に切り替えると停止した。
【００７０】
次いで、ＮＯＤを使用し、不透過性のアクチン染色分子（Ａｌｅｘａ  ４８８  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）を運んだ。ＮＯＤ前に細胞外媒体中でインキュベートしたＡｌｅｘａ  ４８８  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎの蛍光画像を図５Ｂに示す。細胞膜の上のＮＩＲを吸収する金ナノロッド（ＧＮＲ）の光学特性を向上させると、連続波（ＣＷ）レーザー照射のときに（ホットスポットで）局所的に温度が上昇し、細胞膜を介して不透過性分子を送達することができる。ｃｗＮＩＲレーザービーム（８００ｎｍ）による広範囲にわたる照射の後に観察されたＡｌｅｘａ  ４８８  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ蛍光強度の増加および細胞分布は、図５Ｃ、図５Ｄおよび図５Ｅに示されている。
【００７１】
今日まで、全ての抗体に基づく治療は、細胞外に基づいており、空間的に標的化されていない。組織の標的化された領域内の生きた細胞に対する抗体の送達は、細胞の構造および機能を視覚化するために、また、治療薬のために重要である。細胞内オルガネラへの抗体送達によって、染料による非特異的な結合とは対照的に、標的化された分子（オルガネラ上の）における高い特異性を与える。しかし、そのサイズが大きいことと、膜不透過性であることに起因して、ほとんどの研究は、固定化された細胞に限定されており、そのため、神経調整の際に変化を識別するために必要な時間分解能を与えない。ウイルス法は、抗体、染色分子、タンパク質または不透過性の薬物の送達に適用することはできない。したがって、代替的な非ウイルス法、例えば、物理的な方法（微量注入（３０）、電気穿孔（３１、３２）、超音波（３３）など）および化学物質が介在する方法（例えば、リポソーム（３４）および生分解性ポリマー（３５））を開発することに顕著な努力がなされてきた。抗体を細胞に運ぶために、高濃度の細胞外カリウムを利用した研究は非常に少ない（８４、８５）。このような研究は、シナプス小胞の力学に対する重要な研究を可能にする（８４）が、高濃度のカリウムが、細胞の生理学的環境と活性を乱す。さらに、選択した細胞に対して、空間的に標的化することができない。したがって、既存の方法には、１つ以上の欠点（例えば、侵襲性、効率が低い、空間的に標的化された送達ができない、および／または微量注入された細胞に対するいくつかの有害な影響）がある（３１）。
【００７２】
図６は、Ａｌｅｘａ  ４８８で標識された外来性の不透過性抗体の送達のための金ナノロッドおよびＮＩＲレーザービーム（８００ｎｍ）の使用を示す。図６Ａは、官能基化された金ナノロッド（８００ｎｍでＳＰＲピーク）に接続したＨＥＫ細胞の明視野画像を示す。ＮＯＤ前の蛍光画像を図６Ｂに示す。細胞内蛍光強度の増加（抗体の送達を示唆する）が、ｃｗＮＩＲレーザービーム（８００ｎｍ）による広範囲にわたる照射の後に観察されており、図６Ｃ、図６Ｄおよび図６Ｅに示されている。波長が合うように調整されていないレーザービーム（８５０ｎｍ）を同じ出力および露光で使用すると、金ナノロッドに接続した細胞へのナノ強化型光学送達は生じなかった。
【００７３】
実施例７−網膜細胞へのナノ強化型光学送達を示すために、マウスの網膜外植片を使用した。成体ｒｄ１０欠損成マウスを、ＣＯ２を用いて屠殺した。光変性した網膜を取り出し、組織切断器を用い、１ｍｍ×１ｍｍの正方形の外植片に切断した。外植片を、５μｇ／皿のポリ−Ｄ−リシンであらかじめコーティングしておいたカバースリップの上に置いた。図７Ａは、網膜外植片の明視野画像を示す。網膜外植片を、Ｃｏｎ  Ａと接合した金ナノロッドと共に３７℃で１時間インキュベートした。不透過性のＤＮＡ結合分子：ヨウ化プロピジウムを細胞外媒体に添加した。１０分間インキュベートした後、外植片を落射蛍光顕微鏡で観察し、レーザー露光前のベースラインを定量した（図７Ｂ）。次いで、それぞれの外植片において、直径０．５ｍｍの領域（領域：約０．２ｍｍ２）でＮＯＤを行った。網膜細胞へのＰＩの送達を、レーザー露光直後に落射蛍光顕微鏡を用いて監視した。ＧＮＲ存在下での近赤外レーザー露光（３０秒間）後の蛍光画像を図７Ｃに示す。３種類のレーザー曝露時間（３０秒、６０秒、１２０秒）を使用した。ＧＮＲ存在下でのＮＯＤ領域における蛍光（送達の指標）（図７Ｃ）を、金ナノロッドを用いずに網膜外植片のレーザー露光を行った条件（図７Ｄ）と定量的に比較した。ＧＮＲが存在しない状態では、網膜外植片の３０秒間のレーザー露光の後、蛍光の検出可能な増加は観察されなかった（図７Ｄ）。
【００７４】
実施例８−ＮＯＤを用いたｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子送達を確立するために、本願発明者らは、ＧＦＰプラスミドと、モデルとしてヌードマウスを使用した。ヌードマウスの皮膚に注射したナノ粒子とＧＦＰプラスミドの（１：２）混合物５μｌの落下（図８Ａに矢印で示される）。その部位に、ｃｗＮＩＲレーザービーム（８００ｎｍ）を２分間、ＮＯＤのために標的化された照射を行った（図８Ｂ）。標的化された細胞におけるＧＦＰ発現を、直立型蛍光顕微鏡を用いたＮＯＤから４８時間後に分析した。ＮＯＤ領域と、隣接するコントロール領域（白い点線によって分離されている）におけるＧＦＰ発現を図８Ｃに示す。したがって、組織へのプラスミドの標的化された送達は、ｃｗＮＩＲレーザービームに基づくＮＯＤを用いて実現することができる。
【００７５】
実施例９−オプシンが疾患の治療に使用される一例は、網膜の光変性疾患によって引き起こされる失明である。網膜色素変性（ＲＰ）および乾燥加齢黄斑変性（乾燥ＡＭＤ）は、目の光受容体の変性を特徴とする障害を指し、非機能性のニューロン活性および視覚野へのシグナルの伝播によって視力が損なわれる（８６〜９０）。（乾燥）ＡＭＤは、６５歳より上の約１５００万人において新しい視力喪失の主原因であり（９１）、ＲＰの有病率は、世界中で少なくとも１０００万人である（９２、９３）。ＲＰは、常染色体潜性遺伝として最も多くは遺伝しており、症例の大多数が、この遺伝的形質の形態である（８８、９２、９４）。さらに、視力喪失の程度は、加齢と共に上がっていき（９５）、高齢の集団への人口統計学上の変化の主な関心事である。
【００７６】
ｒｄ１０マウス網膜外植片において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＯＤ実験結果が成功した後、ｒｄ１０マウスの網膜細胞へのオプシンプラスミドのｉｎ  ｖｉｖｏでの形質導入が、ＮＯＤ技術を用いて行われた。ｒｄ１０マウス（網膜変性１０、Ｐｄｅ６ｂにおける自然発生的なミスセンス点変異）は、遅発型の進行性網膜変性を有しており、これはヒトの網膜光変性の表現型とよく似ている。図９では、網膜の丸で囲まれた領域における光受容体（桿体、錐体）の消失を示す網膜の模式図を表す。この標的化された光変性領域における網膜の異なる細胞層に、ＮＯＤに基づく制御された送達によって外来性治療分子を微量注入することができる。
【００７７】
図１０は、網膜の標的化された領域におけるＮＯＤに基づく制御された分子送達の模式的なプロセスを示す。分子（例えば、遺伝子）を、強膜を介し、硝子体に注射した。近赤外（ＮＩＲ）レーザーが、網膜の標的化された領域（円形）に照射されると、適切なナノロッドと結合した網膜細胞の膜が、外来性の不透過性分子（例えば、遺伝子）について透過性になる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子送達システムは、網膜の空間的に標的化された領域の照射を外来性分子と共に送達することができるように、目の角膜およびレンズを通るビームの伝播を補正するための外部光学機器（適応／スキャニング）からなる。遺伝子送達システムを、スキャニングレーザー検眼鏡検査、光干渉断層撮影および眼底検査を含む網膜イメージングモダリティと一体化する。
【００７８】
実施例１０−ＮＩＲレーザービームを用いたナノ強化型光学送達を、ｉｎ  ｖｉｖｏ設定で実施した（図１１Ａ）。８００ｎｍでの表面プラズモン吸収最大を有する金ナノロッド（直径：１０ｎｍ、長さ：４０ｎｍ）をＮＯＤに使用した。ｒｄ１０マウス（Ｎ＝６）を、ケタミン（６５ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（７．５ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）の混合物を用いて麻酔した。この動物の両目に、１滴の局所麻酔薬（０．５％塩酸プロパラカイン）を注入した。官能基化された金ナノロッドと、２μｌのオプシン−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミド（最終濃度：５０ｎｇ／μｌ）を、滅菌したＨａｍｉｌｔｏｎマイクロシリンジの３２−Ｇ針を強膜から硝子体の空洞部に挿入することによって片方の目に注射した。ネガティブコントロールとして、他方の目に、同じ容積のＰＢＳを硝子体内に注射した。１％のトロピカミド眼用溶液を、瞳孔を拡張させるために適用した。瞳孔の拡張は、共焦点レーザー走査反射顕微鏡画像からわかるだろう（図１１Ｂ）。全手技の間、緩衝化された塩溶液を用いて角膜を湿ったままの状態にした。ＣＷ  ＮＩＲレーザービームの露光を変えた。図１１Ｃは、目のＮＯＤレーザー露光中にＧＮＲとオプシンプラスミドを注射された、目の拡大された画像を示す。ＡＡＶ−ｍＧｌｕＲ６−ＭＣＯ−ｍＣｈｅｒｒｙを注射してから５週間後、マウスを屠殺し、網膜組織を切除した。共焦点蛍光画像（図１１Ｄ）は、網膜細胞中のオプシン−ｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す。ＰＢＳを注射したコントロールの目の網膜は、特徴的な（ｍＣｈｅｒｒｙ）蛍光を示さない。さらに、周辺網膜（ＮＩＲレーザを照射していない）は、内部ネガティブコントロールとして役立った。
【００７９】
ＮＯＤ方法は、マウス網膜への遺伝子送達の成功を示したが、ヒトへの治療遺伝子の送達の成功は、厚い内境界膜（ＩＬＭ）があり（９６）、ヒトの目の内境界膜を一時的に透過性にすることができる化学薬剤（例えば、ＡＡＡ）の使用が必要になる場合がある。
【００８０】
実施例１１−ヒト被験体におけるＮＯＤの使用のために、ＮＯＤのためのＮＩＲレーザーと、スリットランプ検眼鏡／眼底検査による標的網膜試験とを含む一体化されたシステムが示される。図１２は、ＮＯＤと、蛍光および／または通常の眼底検査のためのイメージング検眼鏡とのための一体化されたデバイスの模式図を示す。１２００（可視光源、例えば、ＬＥＤ、ランプまたはレーザー）から発せられる光は、レンズ（１２１０）を用いて拡大され／平行にされ／集束され、開口部（１２２０）を通って進み、ミラー１（１２８０）によって網膜へと向かう。励起バンドパスフィルター（１２２０）は、場合により、網膜の蛍光試験の場合に励起バンドを選択するために使用される。近赤外ＮＯＤレーザー（１２５０）ビームは、ビーム発散拡大のコントローラ（１２６０）によって拡大され、ダイクロイックミラー（１２４０）、レンズ（１２７０）およびミラー１（１２８０）を使用することによって、被験体の目に向かう。網膜から反射した光（または蛍光）は、ミラー２（１３１０）、レンズ３（１３２０）の組み合わせによって集められ、場合により、吸収フィルタ（１３４０）を通る。観察者が被験体の網膜を視覚化するために、補正レンズ（１３００）が使用される．病変領域を特定した後、被験体の目に、ＧＮＲと治療分子を注入する。次いで、観察者−操作者は、ＮＩＲレーザービームを病変領域に向かわせ、安全限界の範囲内で、臨床的／前臨床的に試験する線量（すなわち、出力および露光時間）でこれらの領域を曝露する。
【００８１】
実施例１２−さらに、ヒト被験体におけるＮＯＤの使用のために、ＮＯＤのためのＮＩＲレーザーと、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によるフィードバックを得るためのデバイスとを含む一体化されたシステムが示される。図１３は、ＮＯＤ（１４００）およびＯＣＴによるイメージングのために一体化されたデバイスの模式的な設定を示す。ＯＣＴシステムは、ＮＩＲ低コヒーレンス源（１４７０）からなり、サーキュレータ（１４８０）を通り、２ｘ２ファイバーカプラー（１４１０）へとつながっている。ＮＯＤのためのＮＩＲレーザー（１４００）は、ＯＣＴ源とはスペクトル的に分離される波長を有するように選択され、ファイバーカプラー（１４１０）の第２の流入チャンネルに接続する。ファイバーカプラーから出たところから発せられるＮＯＤレーザービームは、コリメーティングレンズ（１４２０）によって平行にされ、走査ミラー（１４３０、１４４０）および望遠レンズ対（１４５０、１４６０）によって、選択した網膜領域へと向かう。網膜の病変を特定している間、ＮＯＤのためのＮＩＲレーザービームは、オフ状態に切り替えられている。低コヒーレンス源からのビーム（ＯＣＴのため）は、ＦＣの出力終了時に、同じコリメーティングレンズ（１４２０）によって平行にされ、ミラー対（１４３０、１４４０）によってスキャンされる。ＯＣＴビームは、望遠レンズ（１４５０、１４６０）の使用によって、目に伝わる。ファイバーカプラーの他の部分から発生する参照ビームは、別のコリメーティングレンズ（１４９０）によって平行にされ、図１３に示されるように、参照ミラー（１５００）を使用することによって、同じポートを介して後方に反射する。目（および網膜）から後方に反射したサンプルビームと、参照ビームは、サーキュレータ（１４８０）を介して、格子（１５２０）とレンズ（１５３０、１５４０）とを備える分光計へと向かう。干渉図をカメラ（１５５０）で記録し、これを処理し、目および網膜の構造的な情報、特に、その病変状態を示す情報を得る。ＮＯＤのための目的の領域は、観察スクリーン（１５６０）上に示される画像の上に示されるだろう。
【００８２】
治療が必要な病変領域を特定した後、被験体の目にＧＮＲと治療分子を、標的とする網膜層に応じて、硝子体の空洞部または網膜下の空間に注射する。ＮＩＲレーザービームをオンに切り替え、目的の病変領域に向ける。治療分子を効率的に、最小限の侵襲性で送達するために、これらの領域を、臨床的に試験されるＮＩＲレーザー線量（すなわち、出力と露光時間）で露光する。
【００８３】
ナノ強化型光学送達の間、ＯＣＴビームは、目的の領域のイメージングを可能にするように、オン状態のまま維持され、ＮＯＤレーザービームによるスキャンを、目的の領域に適合するように動的に再調整することができるように、ＮＯＤレーザービーム送達プロセスに対して（目の移動に伴って）フィードバックを与える。スペクトルドメインＯＣＴと一体化されたＮＯＤをここに示したが、本発明は、網膜病変を特定し、ＮＯＤレーザービーム送達に対してフィードバックを与えるための他のＯＣＴモダリティの使用を除外しない。
【００８４】
実施例１３−器官（例えば、目）の迅速な移動の場合、ＮＯＤによる標的化された分子送達を必要とする組織中の目的の領域の形状に合うように空間的に整えられるＮＩＲビームを使用することが有利であろう。図１４は、治療分子（例えば、遺伝子）を高スループット様式で送達することができるように、標的領域（例えば、光変性疾患における網膜の地図状萎縮）に適合するようにＤＭＤ／ＳＬＭによってＮＯＤのためのＮＩＲレーザービームを成形するための設定の模式図を示す。この方法では、標的領域に対してＮＯＤレーザービームの正確な適合を確実にするために、ＯＣＴまたは眼底検査によるフィードバックイメージングを得ることができる。病変領域を特定した後、被験体の目に、ＧＮＲと治療分子を注入する。ＮＯＤに使用されるＮＩＲレーザービーム（１６００）の出力および／または偏光を制御するために、ビームを半波長板（１６１０）と偏光板（１６２０）に通す。ビームは、レンズ（１６３０、１６４０）によって拡大され、平行にされ、空間光変調器またはデジタルマイクロミラーデバイス（１６５０）を照射する。１６５０は、ＮＯＤレーザー分子送達を必要とする組織の領域に適合するように、（ＯＣＴまたは眼底検査によるフィードバックに基づき）レーザービームの形状を調整するようにプログラミングされている。１６５０からの歪んでいないビーム（１６７０）は、レンズ（１６６０）ピンホール（１６８０）アセンブリによって遮断される。空間的に調整されたビーム（１６９０）は、１６８０を通って進み、レンズ（１７００）によって平行にされ、ダイクロイックミラー（１７１０）を通って望遠レンズ対（１７２０、１７３０）へと進み、このビームを組織（例えば、網膜）に送達する。安全限界の範囲内で、ＮＩＲレーザービームの臨床的／前臨床的に試験する線量（すなわち、出力および露光時間）で、病変領域を曝露する。
【００８５】
実施例１４−動きアーチファクトに加え、目の散乱する組織と不完全な光学媒体に起因して、ＮＯＤのためのＮＩＲレーザーのマージンに完全に適合させるという課題が生じる場合がある。ＮＯＤレーザービーム（１８００）における波面の歪みを補正するために、図１５に示されるように、適応光学機器の使用が存在する。これは、ＮＯＤプロセスの性能を改善するためのものである。これは、変形可能な適応光学ミラー（１８８０）を用いることによって、目の角膜およびレンズに由来する高次元の収差を補正するために行われる。図１５は、網膜の地図状萎縮における細胞への分子のナノ強化型光学送達のためのレーザービームを補正するための適応光学機器を利用する設定の模式図を示す。ＮＯＤレーザービーム（１８００）は、ビームエキスパンダー（１８１０）によって拡大され、平行にされる。ビームコントローラ（１８２０）は、ＮＯＤレーザービームの偏光、出力、露光を制御する。レンズ（１８３０）およびピンホール（１８４０）を通過した後のビームは、ダイクロイックミラー１（１８５０）によって折り畳みミラー（１８６０、１８７０）へと反射し、このビームは、変形可能な適応光学ミラー（１８８０）へと向かう。最初に、ＮＯＤレーザービームは、低出力モードで操作され、１８８０をイニシャライズする。ビームは、走査ミラー対（１８９０、１９００）によって誘導され、ビーム（点線の矢印）は、望遠鏡レンズ対（１９１０、１９２０）を介して網膜へと送られる。歪んだ波面を有する、目から後方に反射したビーム（実線の矢印）は、ダイクロイックミラー１（１８５０）を介し、ビームスプリッター（１９３０）へと進む。ビームのうち（１９３０）から反射した部分は、ピンホール（１９４０）を通り、光検出器（１９９０）に向かい、（走査レーザー検眼鏡と同様に）目のイメージングを可能にする。（１９３０を介して）伝播されたビームは、ピンホールおよびレンズ（１９５０）を通過し、波面センサ（１９６０）、例えば、Ｓｈａｃｋ−Ｈａｒｔｍａｎｎ’ｓへと向かう。ほぼリアルタイムでマッピングされた波面の歪みを使用し、操作条件でＮＯＤレーザービームにおける歪みを補正するように、１８８０を制御する。病変領域を特定した後、被験体の目に、ＧＮＲと治療分子を注入する。次いで、網膜の空間的に標的化された領域の照射は、安全限界の範囲内で、臨床的／前臨床的に試験する線量（すなわち、出力および露光時間）で、波面が補正されたＮＩＲレーザービームによって行われる。
【００８６】
光遺伝学的な視力回復のために、網膜変性の空間的な分布における患者ごとの変動性および時間依存性の変化は、オプシンの部位特異的な発現を必要とする。例えば、オプシンをコードする遺伝子の空間的に標的化された送達は、乾燥ＡＭＤの場合に光受容体喪失に起因して光感受性を失った黄斑で必要とされる（９７〜９９）。ウイルス法または他の非ウイルス法（例えば、電気穿孔、リポフェクション）を用いると、オプシン構築物は、所かまわず運ばれ、網膜全体で制御されない発現が起こる。これにより、網膜回路の複数層における光によって誘発される活性の干渉によって、網膜の変性していない領域の機能発揮が複雑化する（１００）。したがって、変性した網膜におけるオプシンの空間的に標的化されたＮＯＤの適用によって、光受容体の変性領域において網膜細胞の光刺激が可能になり、視力が回復する。
【００８７】
本発明は、本明細書に記載の組成物を被験体に投与することを含む、視力を改善または回復する方法を提供する。本発明のＮＯＤ方法によって視力回復のために硝子体内または網膜下に注射される混合物溶液の組成物は、以下を含む。（ｉ）オプシンプラスミド、（ｉｉ）官能基化された金ナノロッドおよび（ｉｉｉ）分子の安定化、または損傷の最小化、またはその結合性または移動性の向上のための補助物。例えば、本発明の送達は、α−アミノアジピン酸（ＡＡＡ、ＩＬＭ（１０１、１０２）を可逆的に妨害することが知られているグルタメートの構造類似体）の最適化された配合をオプシン−プラスミドおよびＧＮＲと一緒に使用することによって、その場で作られ、ヒトの目の内境界膜を一時的に透過させる。さらに、ＲＧＣまたは双極細胞におけるＭＣＯのプロモーター特異的な発現を可能にするために、適切なプロモーター（すなわち、ＲＧＣのためのγ−シヌクレインおよび双極細胞のためのｍＧｌｕＲ６）を、オプシンプラスミドの上流で使用する。
【００８８】
視力を改善するための既存の複雑な網膜移植手技の手術リスクは、非常に高い。これは、慢性的な使用中のデバイスの損傷に起因してインプラントを交換する場合には、特に懸念される。さらに、ＲＰおよび乾燥ＡＭＤなどの疾患では、網膜の光変性は、１年に約２ｍｍ２進行する。このような進行性の喪失の間、ＮＯＤプロセスは、新しく光変性した網膜の領域でオプシンを容易に繰り返し発現させることができる。本願発明者らが提案したオプシン発現方法は、以下の現在の臨床的な実施に適用するのが容易である。（ｉ）官能基化された金ナノロッドの硝子体内／網膜下の注入およびインキュベート；（ｉｉ）オプシンをコードするプラスミドの硝子体内／網膜下の注入；および（ｉｉｉ）イメージングフィードバックに基づき、光変性した領域中の網膜細胞内へ、オプシン−プラスミドの標的化されたＮＯＤ。
【００８９】
ＮＩＲ光線（ＮＯＤのために使用される）は、実際に、ほとんどの組織および透明な目の層（例えば、角膜、レンズ、神経網膜）において、無視できる吸収効率を有する。さらに、近赤外（約８００〜９００ｎｍ）（ＮＯＤレーザービーム）での水の吸収は、最小である。しかし、ｃｗＮＩＲ光（ＮＯＤのために使用される）は、網膜の色素上皮によって吸収されてもよい。温度上昇（組織損傷を誘発し得る）を最小限にするために、ＮＯＤレーザービームは、パルス状態であってもよく、デューティサイクルを変え、最適な効果（すなわち、網膜の色素上皮を乱すことなく、網膜組織において最大の送達）を達成する。
【００９０】
本明細書および実施例は、実例となる実施形態の構造および使用の完全な説明を与える。特定の具体性をもって、または１つ以上の個々の実施形態を参照しつつ、特定の実施形態を記載してきたが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、開示された実施形態の多くの改変を行うことができる。このように、デバイスの種々の実例となる実施形態を、開示される特定の形態に限定することは意図していない。むしろ、特許請求の範囲に入る全ての改変および代替を含み、示されているもの以外の実施形態は、示されている実施形態の特徴の一部または全てを含んでいてもよい。例えば、構成要素は、省略されてもよく、または単一の構造として合わされてもよく、および／または接続が置換されてもよい。さらに、適切な場合、匹敵する特性または異なる特性を有し、同じ問題または異なる問題に対処するさらなる実施例を作り出すために、上に記載されるいずれかの実施例の態様を、記載される任意の他の実施例の態様と組み合わせてもよい。同様に、上に記載した長所および利点は、１つの実施形態に関連していてもよく、またはいくつかの実施形態に関連していてもよいことが理解されるだろう。
【００９１】
本発明の組成物および方法を、好ましい実施形態という観点で記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、この組成物および／または方法に、本明細書に記載する方法の工程に、または一連の工程に変更が適用されてもよいことは当業者には明らかであろう。さらに具体的には、化学的および生理学的に関連する特定の薬剤を、同じ結果または類似の結果が達成されつつ、本明細書に記載する薬剤と置き換えてもよいことが明らかであろう。当業者にとって明らかな全てのこのような同様の置換物および改変物は、本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【００９２】
さらに、特許請求の範囲は、「〜のための手段」または「〜のための工程」という句をそれぞれ用い、所与の特許請求の範囲にこのような限定が明示的に引用されていない限り、ミーンズプラスファンクションまたはステッププラスファンクションの限定を含むことを意図しておらず、また、含むと解釈すべきではない。
参考文献
【００９３】
以下の参考文献は、上述のものに対する補助的な例示的な手順または他の詳細を与える程度まで、具体的に参考として組み込まれる。
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１０．Ｂｏｙｄｅｎ  ＥＳ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｂａｍｂｅｒｇ  Ｅ，Ｎａｇｅｌ  Ｇ，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｋ．Ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ−ｔｉｍｅｓｃａｌｅ，ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００５；８（９）：１２６３〜８。
１１．Ｈａｎ  Ｘ，Ｂｏｙｄｅｎ  ＥＳ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ＣｏＩｏｒＯｐｔｉｃａＩ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｉｔｈ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｐｉｋｅ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．２００７；２（３）：ｅ２９９。
１２．Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ａｒａｖａｎｉｓ  ＡＭ，Ａｄａｍａｎｔｉｄｉｓ  Ａ，ｄｅ  Ｌｅｃｅａ  Ｌ，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｋ．Ｃｉｒｃｕｉｔ−ｂｒｅａｋｅｒｓ：ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｂｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７；８（８）：５７７〜８１。
１３．Ｍｏｈａｎｔｙ  ＳＫ，Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  ＲＫ，Ｌｉｕ  Ｘ，Ｏｋａｍｕｒａ  Ｎ，Ｋｒａｓｉｅｖａ  ＴＢ，Ｂｅｒｎｓ  ＭＷ．Ｉｎ−Ｄｅｐｔｈ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ２−Ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｓｐａｔｉａｌ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｗｏ−Ｐｈｏｔｏｎ  Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．２００８；９５（８）：３９１６〜２６。
１４．Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｒ  ２０１０．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ．２０１１；８（１）：１−。
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１７．Ｐａｓｔｒａｎａ  Ｅ．Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｇｈｔ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ．２０１１；８（１）：２４〜５。
１８．Ｓｈｉｖａｌｉｎｇａｉａｈ  Ｓ，Ｇｕ  Ｌ，Ｍｏｈａｎｔｙ  ＳＫ．Ｎｏｎ−Ｉｉｎｅａｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  ＳＰＩＥ  ２０１１；７８８３：７８８３５５。
１９．Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ＪＰ，Ｈａｍａｎａｋａ  Ｈ，Ｍｏｎｆｉｌｓ  ＭＨ，Ｂｅｈｎｉａ  Ｒ，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｋ，Ｂｌａｉｒ  ＨＴら、Ｏｐｔｉｃａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｔｅｒａｌ  ａｍｙｇｄａｌａ  ｐｙｒａｍｉｄａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  ｆｅａｒ  ｌｅａｒｎｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｅｉ．２０１０；１０７（２８）：１２６９２〜７。
２０．Ｔφｎｎｅｓｅｎ  Ｊ，Ｐａｒｉｓｈ  ＣＬ，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＡＴ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ａ，Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  Ｃ，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｋら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｒａｆｔｅｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  Ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ  ｂｙ  Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ａｎ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  Ｍｏｄｅｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．２０１１；６（３）：ｅ１７５６０。
２１．Ａｄａｍａｎｔｉｄｉｓ  ＡＲ，Ｔｓａｉ  ＨＣ，Ｂｏｕｔｒｅｌ  Ｂ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｓｔｕｂｅｒ  ＧＤ，Ｂｕｄｙｇｉｎ  ＥＡら、Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｈａｓｅｓ  ｏｆ  ｒｅｗａｒｄ−ｓｅｅｋｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１；３１（３０）：１０８２９〜３５。
２２．Ａｌｉｌａｉｎ  ＷＪ，Ｌｉ  Ｘ，Ｈｏｒｎ  ＫＰ，Ｄｈｉｎｇｒａ  Ｒ，Ｄｉｃｋ  ＴＥ，Ｈｅｒｌｉｔｚｅ  Ｓら、Ｌｉｇｈｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  Ｂｒｅａｔｈｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００８；２８（４６）：１１８６２〜７０。
２３．Ｉｖａｎｏｖａ  Ｅ，Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ，Ｂｉｓｓｉｇ  Ｄ，Ｐａｎ  Ｚ−Ｈ，Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ  ＢＡ．Ｒｅｔｉｎａｌ  ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２−  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｊ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ．２０１０；１６：１０５９〜６７。
２４．Ｌａｇａｌｉ  ＰＳ，Ｂａｌｙａ  Ｄ，Ａｗａｔｒａｍａｎｉ  ＧＢ，Ｍｕｎｃｈ  ＴＡ，Ｋｉｍ  ＤＳ，Ｂｕｓｓｋａｍｐ  Ｖら、Ｌｉｇｈｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ＯＮ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｔｏｒｅ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００８；１１（６）：６６７〜７５。
２５．Ｓｈｉｖａｌｉｎｇａｉａｈ  Ｓ，Ｇｕ  Ｌ，Ｍｏｈａｎｔｙ  ＳＫ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐａｔｉａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ  ｒｅａｃｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｓｉｏｎ  ｂｙ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  ＳＰＩＥ．２０１１；７８８５：７８８５１  Ｙ。
２６．Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  Ｒ，Ｎａｇｙ  Ｄ，Ｍａｎｄｅｌ  ＲＪ，Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ，Ｔｒｏｎｏ  Ｄ．Ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｉｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｃｈｉｅｖｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９７；１５（９）：８７１〜５。
２７．Ｒｕｉｔｅｎｂｅｒｇ  ＭＪ，Ｅｇｇｅｒｓ  Ｒ，Ｂｏｅｒ  ＧＪ，Ｖｅｒｈａａｇｅｎ  Ｊ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｓ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｒａｕｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００２；２８（２）：１８２〜９４。
２８．Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ，Ｂｌｏｍｅｒ  Ｕ，Ｇａｌｌａｙ  Ｐ，Ｏｒｙ  Ｄ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ  Ｒ，Ｇａｇｅ  ＦＨら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６；２７２（５２５９）：２６３〜７。
２９．Ｔｈｏｍａｓ  ＣＥ，Ｅｈｒｈａｒｄｔ  Ａ，Ｋａｙ  ＭＡ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２００３；４（５）：３４６〜５８。
３０．Ｋｉｎｇ  Ｒ．Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００４；２４５（２）：１６７〜７３。
３１．Ｌｉ  Ｓ，Ｈｕａｎｇ  Ｌ．Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｐｒｏｍｉｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００；７（１）：３１〜４。
３２．Ｆｅｒｂｅｒ  Ｄ．Ｓａｆｅｒ  ａｎｄ  Ｖｉｒｕｓ−Ｆｒｅｅ？Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１：２９４（５５４７）：１６３８〜４２。
３３．Ｎｅｗｍａｎ  ＣＭ，Ｌａｗｒｉｅ  Ａ，Ｂｒｉｓｋｅｎ  ＡＦ，Ｃｕｍｂｅｒｌａｎｄ  ＤＣ．Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｏｎ  ｔｈｅ  Ｒｏａｄ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｎｃｅｐｔｔｏ  Ｒｅａｌｉｔｙ．Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ．２００１；１８（４）：３３９〜４７。
３４．Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ  ＮＳ，Ｌａｓｉｃ  ＤＤ，Ｆｒｅｄｅｒｉｋ  ＰＭ，Ｓｔｒｅｙ  ＨＨ，Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＤＤ，Ｐａｖｌａｋｉｓ  ＧＮ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＤＮＡ：ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９７；１５（７）：６４７〜５２。
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４０．Ｈｏｓｏｋａｗａ  Ｙ，Ｉｇｕｃｈｉ  Ｓ，Ｙａｓｕｋｕｎｉ  Ｒ，Ｈｉｒａｋｉ  Ｙ，Ｓｈｕｋｕｎａｍｉ  Ｃ，Ｍａｓｕｈａｒａ  Ｈ．Ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ａｆｔｅｒ  ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄ  ｌａｓｅｒ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ  Ｓｕｒｆ  Ｓｅｉ．２００９；２５５（２４）：９８８０〜４。
４１．Ｓｔｒａｃｋｅ  Ｆ，Ｒｉｅｍａｎ  Ｉ，Ｋｏｎｉｇ  Ｋ．Ｏｐｔｉｃａｌ  ｎａｎｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｖｉｔａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００５；８１（３）：１３６〜４２。
４２．Ｓｃｈｉｎｋｅｌ  Ｈ，Ｊａｃｏｂｓ  Ｐ，Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇ  Ｓ，Ｗｅｈｎｅｒ  Ｍ．Ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｐｉｃｏｓｅｃｏｎｄ  Ｉａｓｅｒ  ｆｏｒ  ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２００８；９９（１）：２４４〜８。
４３．Ｔｉｒｌａｐｕｒ  ＵＫ，Ｋｏｎｉｇ  Ｋ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄ  ｌａｓｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２００２；４１８（６８９５）：２９０〜１。
４４．Ｔｉｒｌａｐｕｒ  ＵＫ，Ｋｏｎｉｇ  Ｋ．Ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄ  ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｐｕｌｓｅｓ  ａｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａ−ｔｉｓｓｕｅ  ｎａｎｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２００２；３１（３）：３６５〜７４。
４５．Ｇｕ  Ｌ，Ｍｏｈａｎｔｙ  ＳＫ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎａ  ｕｓｉｎｇ  ｏｐｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔ．２０１１；１６（１２）：１２８００３〜６。
４６．Ｄｈａｋａｌ  Ｋ，Ｂｌａｃｋ  Ｂ，Ｍｏｈａｎｔｙ  Ｓ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ａｃｔｉｎ−ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｏｐｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１４；４（６５５３）：１〜７。
４７．Ｇｒｕｎｗａｌｄ  ＪＥ，Ｐｉｓｔｉｌｌｉ  Ｍ，Ｙｉｎｇ  ＧＳ，Ｍａｇｕｉｒｅ  ＭＧ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｅ，Ｍａｒｔｉｎ  ＤＦ．Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  Ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍａｃｕｌａｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  Ｔｒｉａｌｓ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２０１４。
４８．Ｗｕ  Ｚ，Ａｙｔｏｎ  ＬＮ，Ｌｕｕ  ＣＤ，Ｇｕｙｍｅｒ  ＲＨ．Ｍｉｃｒｏｐｅｒｉｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０１５；５６（１）：１１５〜２１。
４９．Ｗａｌｌｓｈ  Ｊ，Ｇａｌｌｅｍｏｒｅ  Ｒ．Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｐｓ  ａｎｄ  ａｖｅｒａｇｅ  ｍａｃｕｌａｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｆｏｒ  ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ．Ｒｅｔｉｎ  Ｃａｓｅｓ  Ｂｒｉｅｆ  Ｒｅｐ．２０１５；９（１）：８８〜９１。
５０．Ｂｉａｒｎｅｓ  Ｍ，Ｍｏｎｅｓ  Ｊ，Ａｌｏｎｓｏ  Ｊ，Ａｒｉａｓ  Ｌ．Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｏｐｔｏｍ  Ｖｉｓ  Ｓｅｉ．２０１１；８８（７）：８８１〜９。
５１．Ｓｕｎｎｅｓｓ  ＪＳ，Ｍａｒｇａｌｉｔ  Ｅ，Ｓｒｉｋｕｍａｒａｎ  Ｄ，Ａｐｐｌｅｇａｔｅ  ＣＡ，Ｔｉａｎ  Ｙ，Ｐｅｒｒｙ  Ｄら、Ｔｈｅ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｆｒｏｍ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２００７；１１４（２）：２７１〜７。
５２．Ｗａｎｇ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  ＫＪ，Ｗｕ  ＴＨ，Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｌｉｎ  ＷＹ，Ｏｈａｓｈｉ  Ｍら、Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ．２０１０；１２２（２２）：３８６５〜９。
５３．Ｃｈｅｎｇ  Ｙ，Ｓａｒｎｉａ  ＡＣ，Ｌｉ  Ｊ，Ｋｅｎｎｅｙ  ＭＥ，Ｒｅｓｎｉｃｋ  Ａ，Ｂｕｒｄａ  Ｃ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１０；２６（４）：２２４８〜５５。
５４．Ｋｉｍ  Ｂ，Ｈａｎ  Ｇ，Ｔｏｌｅｙ  ＢＪ，Ｋｉｍ  Ｃ−ｋ，Ｒｏｔｅｌｌｏ  ＶＭ，Ｆｏｒｂｅｓ  ＮＳ．Ｔｕｎｉｎｇ  ｐａｙｌｏａｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏ．２０１０；５（６）：４６５〜７２。
５５．Ｔｏｎｇ  Ｌ，Ｚｈａｏ  Ｙ，Ｈｕｆｆ  Ｔ，Ｈａｎｓｅｎ  Ｍ，Ｗｅｉ  Ａ，Ｃｈｅｎｇ  ＪＸ．Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｒｏｄｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ｂｙ  Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００７；１９（２０）：３１３６〜４１。
５６．Ｈｕａｎｇ  Ｘ，Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ  ＩＨ，Ｑｉａｎ  Ｗ，Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ  ＭＡ．ＣａｎｃｅｒＣｅＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｒｏｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．２００６；１２８（６）：２１１５〜２０。
５７．Ｇｏｂｉｎ  ＡＭ，Ｌｅｅ  ＭＨ，Ｈａｌａｓ  ＮＪ，Ｊａｍｅｓ  ＷＤ，Ｄｒｅｚｅｋ  ＲＡ，Ｗｅｓｔ  ＪＬ．Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｎａｎｔ  Ｎａｎｏｓｈｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００７；７（７）：１９２９〜３４。
５８．Ｂｒｏｎｇｅｒｓｍａ  ＭＬ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ：Ｎａｎｏｓｈｅｌｌｓ：ｇｉｆｔｓ  ｉｎ  ａ  ｇｏｌｄ  ｗｒａｐｐｅｒ．Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．２００３；２（５）：２９６〜７。
５９．Ｃｈｅｎ  Ｊ，Ｗａｎｇ  Ｄ，Ｘｉ  Ｊ，Ａｕ  Ｌ，Ｓｉｅｋｋｉｎｅｎ  Ａ，Ｗａｒｓｅｎ  Ａら、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｃａｇｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００７；７（５）：１３１８〜２２。
６０．Ｃｈｅｎ  Ｊ，Ｓａｅｋｉ  Ｆ，Ｗｉｌｅｙ  ＢＪ，Ｃａｎｇ  Ｈ，Ｃｏｂｂ  ＭＪ，Ｌｉ  Ｚ−Ｙら、Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｃａｇｅｓ：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｕｓｅ  ａｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＣｏｎｔｒａｓｔＡｇｅｎｔｓ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５（３）：４７３〜７。
６１．Ｓｕｇａｎｏ  Ｅ，Ｉｓａｇｏ  Ｈ，Ｗａｎｇ  Ｚ，Ｍｕｒａｙａｍａ  Ｎ，Ｔａｍａｉ  Ｍ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｈ．Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  ｉｎ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｂｌｉｎｄ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１１；１８（３）：２６６〜７４。
６２．Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ  ＷＡ．Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．２０００；５４（５）：８１４〜２４。
６３．Ｓａｈａｂｏｇｌｕ  Ａ，Ｐａｑｕｅｔ−Ｄｕｒａｎｄ  Ｏ，Ｄｉｅｔｔｅｒ  Ｊ，Ｄｅｎｇｌｅｒ  Ｋ，Ｂｅｒｎｈａｒｄ−Ｋｕｒｚ  Ｓ，Ｅｋｓｔｒｏｍ  ＰＡら、Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ：ｒａｐｉｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｇｏｖｅｒｎｅｄ  ｂｙ  ｓｌｏｗ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．２０１３；４：ｅ４８８。
６４．Ｈａｍｅｌ  Ｃ．Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．ＯｒｐｈａｎｅｔＪ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．２００６；１：４０。
６５．Ｂｕｓｓｋａｍｐ  Ｖ，Ｐｉｃａｕｄ  Ｓ，Ｓａｈｅｌ  ＪＡ，Ｒｏｓｋａ  Ｂ．Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１２；１９（２）：１６９〜７５。
６６．Ｍｉｌｌｅｒ  Ｇ．Ｓｈｉｎｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｌｉｇｈｔ  ｏｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｉｒｃｕｉｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６；３１４（５８０６）：１６７４〜６。
６７．Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｗａｎｇ  ＬＰ，Ｂｏｙｄｅｎ  ＥＳ，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｋ．Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  ａｎｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６；３（１０）：７８５〜９２。
６８．Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ａｒａｖａｎｉｓ  ＡＭ，Ａｄａｍａｎｔｉｄｉｓ  Ａ，ｄｅ  Ｌｅｃｅａ  Ｌ，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｋ．Ｃｉｒｃｕｉｔ−ｂｒｅａｋｅｒｓ：ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｂｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７；８（８）：５７７〜８１。
６９．Ｎａｇｅｌ  Ｇ，Ｂｒａｕｎｅｒ  Ｍ，Ｌｉｅｗａｌｄ  ＪＦ，Ａｄｅｉｓｈｖｉｌｉ  Ｎ，Ｂａｍｂｅｒｇ  Ｅ，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  Ａ．Ｌｉｇｈｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  ｉｎ  ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｒａｐｉｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．２００５；１５（２４）：２２７９〜８４。
７０．Ｓｃｈｒｏｌｌ  Ｃ，Ｒｉｅｍｅｎｓｐｅｒｇｅｒ  Ｔ，Ｂｕｃｈｅｒ  Ｄ，Ｅｈｍｅｒ  Ｊ，Ｖｏｌｌｅｒ  Ｔ，Ｅｒｂｇｕｔｈ  Ｋら、Ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ａｐｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｏｒ  ａｖｅｒｓｉｖｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｌａｒｖａｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００６；１６（１７）：１７４１〜７。
７１．Ｃａｏ  Ｈ，Ｇｕ  Ｌ，Ｍｏｈａｎｔｙ  ＳＫ，Ｃｈｉａｏ  ＪＣ．Ａｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｕ  ＬＥＤ  Ｏｐｔｒｏｄｅ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ．Ｉｅｅｅ  Ｔ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄ  Ｅｎｇ．２０１３；６０（１）：２２５〜９。
７２．Ｄｈａｋａｌ  Ｋ，Ｇｕ  Ｌ，Ｓｈｉｖａｌｉｎｇａｉａｈ  Ｓ，Ｄｅｎｎｉｓ  Ｔ，Ｂｏｂｚｅａｎ  Ｓ，Ｐｅｒｒｏｔｔｉ  Ｌら、Ｎｏｎ−ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｉｂｅｒ−ｏｐｔｉｃ  ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｂｅａｍ  ｌｅｄ  ｔｏ  ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ．２０１４（印刷中）。
７３．Ｂｉ  ＡＤ，Ｃｕｉ  ＪＪ，Ｍａ  ＹＰ，Ｏｌｓｈｅｖｓｋａｙａ  Ｅ，Ｐｕ  ＭＬ，Ｄｉｚｈｏｏｒ  ＡＭら、Ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ−ｔｙｐｅ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｖｉｓｕａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｎ．２００６；５０（１）：２３〜３３。
７４．Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  Ｓ，ｖａｎ  Ｗｙｋ  Ｍ，Ｌｅｈｍａｎｎ  Ｋ，Ｌｏｗｅｌ  Ｓ，Ｆｅｎｇ  Ｇ，Ｗａｓｓｌｅ  Ｈ．Ｖｉｓｕａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ２  ｉｎ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１０；３０（２６）：８７４５〜５８。
７５．Ｂｉ  Ａ，Ｃｕｉ  Ｊ，Ｍａ  ＹＰ，Ｏｌｓｈｅｖｓｋａｙａ  Ｅ，Ｐｕ  Ｍ，Ｄｉｚｈｏｏｒ  ＡＭ１ら、Ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ−ｔｙｐｅ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｖｉｓｕａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｎ．２００６；５０（１）：２３〜３３。
７６．Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｉｖａｎｏｖａ  Ｅ，Ｂｉ  Ａ，Ｐａｎ  Ｚ−Ｈ．Ｅｃｔｏｐｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎｓ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ＯＮ  ａｎｄ  ＯＦＦ  Ｌｉｇｈｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００９；２９（２９）：９１８６〜９６。
７７．Ｔｏｍｉｔａ  Ｈ，Ｓｕｇａｎｏ  Ｅ，Ｉｓａｇｏ  Ｈ，Ｈｉｒｏｉ  Ｔ，Ｗａｎｇ  Ｚ，Ｏｈｔａ  Ｅら、Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｏ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖｉｓｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｂｌｉｎｄ  ｒａｔｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１０；９０（３）：４２９〜３６。
７８．Ｔｏｍｉｔａ  Ｈ，Ｓｕｇａｎｏ  Ｅ，Ｆｕｋａｚａｗａ  Ｙ，Ｉｓａｇｏ  Ｈ，Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｙ，Ｈｉｒｏｉ  Ｔら、Ｖｉｓｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒａｔｓ  Ｈａｒｂｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｈｙ−１．２  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００９；４（１１）。
７９．Ｄｏｒｏｕｄｃｈｉ  ＭＭ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＫＰ，Ｌｉｕ  Ｊ，Ｓｉｌｋａ  ＫＡ，Ｂｏｙｄｅｎ  ＥＳ，Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ  ＪＡら、Ｖｉｒａｌｌｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  Ｓａｆｅｌｙ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１１；１９（７）：１２２０〜９。
８０．Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ａ，Ｔａｎａｋａ  ＫＦ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ａ．Ｔｈｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｂｙ  ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．２０１３；７５（１）：３〜５。
８１．Ｆｅｈｒｅｎｔｚ  Ｔ，Ｓｃｈｏｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍ，Ｔｒａｕｎｅｒ  Ｄ．Ｏｐｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２０１１；５０（５１）：１２１５６〜８２。
８２．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｄｅ  Ｃａｓｔｒｏ  ＪＰ，Ｓｃｏｔｔ  ＰＡ，Ｆｒａｎｓｅｎ  ＪＷ，Ｄｅｍａｓ  Ｊ，ＤｅＭａｒｃｏ  ＰＪ，Ｋａｐｌａｎ  ＨＪら、Ｃｏｎｅ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｓｗｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｅｉ．２０１４；５５（４）：２４６０〜８。
８３．Ｂｕｓｓｋａｍｐ  Ｖ，Ｄｕｅｂｅｌ  Ｊ，Ｂａｌｙａ  Ｄ，Ｆｒａｄｏｔ  Ｍ，Ｖｉｎｅｙ  ＴＪ，Ｓｉｅｇｅｒｔ  Ｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｅ  Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０；３２９（５９９０）：４１３〜７。
８４．Ｋｒａｓｚｅｗｓｋｉ  Ｋ，Ｍｕｎｄｉｇｌ  Ｏ，Ｄａｎｉｅｌｌ  Ｌ，Ｖｅｒｄｅｒｉｏ  Ｃ，Ｍａｔｔｅｏｌｉ  Ｍ，Ｄｅ  Ｃａｍｉｌｌｉ  Ｐ．Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣＹ３−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｉｕｍｅｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９５；１５（６）：４３２８〜４２。
８５．Ｋａｖａｌａｌｉ  ＥＴ，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＥＭ．Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１４；１７（１）：１０〜６。
８６．Ｈａｒｔｏｎｇ  ＤＴ，Ｂｅｒｓｏｎ  ＥＬ，Ｄｒｙｊａ  ＴＰ．Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｌａｎｃｅｔ．２００６；３６８（９５４９）：１７９５〜８０９。
８７．Ｓｕｇａｗａｒａ  Ｔ，Ｈａｇｉｗａｒａ  Ａ，Ｈｉｒａｍａｔｓｕ  Ａ，Ｏｇａｔａ  Ｋ，Ｍｉｔａｍｕｒａ  Ｙ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｓ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｉｅｌｄ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ  ｖｉｓｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄ）．２０１０；２４（４）：５３５〜９。
８８．Ｄａｉｇｅｒ  ＳＰ，Ｂｏｗｎｅ  ＳＪ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＬＳ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００７；１２５（２）：１５１〜８。
８９．Ｍｅｚｅｒ  Ｅ，Ｂａｂｕｌ−Ｈｉｒｊｉ  Ｒ，Ｗｉｓｅ  Ｒ，Ｃｈｉｐｍａｎ  Ｍ，ＤａＳｉｌｖａ  Ｌ，Ｒｏｗｅｌｌ  Ｍら、Ａｔｔｉｔｕｄｅｓ  Ｒｅｇａｒｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００７；２８（１）：９〜１５。
９０．Ｆｌａｎｎｅｒｙ  ＪＧ，Ｆａｒｂｅｒ  ＤＢ，Ｂｉｒｄ  ＡＣ，Ｂｏｋ  Ｄ．Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａ  ｒｅｔｉｎａ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｅｉ．１９８９；３０（２）：１９１〜２１１。
９１．Ｃｕｒｃｉｏ  ＣＡ，Ｍｅｄｅｉｒｏｓ  ＮＥ，Ｍｉｌｌｉｃａｎ  ＣＬ．Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｅｉ．１９９６；３７（７）：１２３６〜４９。
９２．Ｈａｒｔｏｎｇ  ＤＴ，Ｂｅｒｓｏｎ  ＥＬ，Ｄｒｙｊａ  ＴＰ．Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｌａｎｃｅｔ．２００６；３６８（９５４９）：１７９５〜８０９。
９３．Ｃｈａｄｅｒ  ＧＪ．Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ：ｐａｓｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｈｏｐｅ．Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．２００２；４２（４）：３９３〜９。
９４．Ｌｉ  ＺＹ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＳＧ，Ｍｉｌａｍ  ＡＨ．Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−１７−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ：ｒｅｔｉｎａｌ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１９９４；５８（４）：３９７〜４０８。
９５．Ｇｒｏｖｅｒ  Ｓ，Ｆｉｓｈｍａｎ  ＧＡ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＲＪ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＫＲ，Ｄｅｒｌａｃｋｉ  ＤＪ．Ｒａｔｅ  ｏｆ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｉｅｌｄ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．１９９７；１０４（３）：４６０〜５。
９６．Ｄｉｃｈｔｌ  Ａ，Ｊｏｎａｓ  ＪＢ，Ｎａｕｍａｎｎ  ＧＯ．Ｒｅｔｉｎａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｆｉｂｅｒ  ｌａｙｅｒ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｙｅｓ．Ｇｒａｅｆｅ’ｓ  ａｒｃｈｉｖｅ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．１９９９；２３７（６）：４７４〜９。
９７．Ｋｌｅｉｎ  ＭＬ，Ｆｅｒｒｉｓ  ＦＬ，３ｒｄ，Ｆｒａｎｃｉｓ  ＰＪ，Ｌｉｎｄｂｌａｄ  ＡＳ，Ｃｈｅｗ  ＥＹ，Ｈａｍｏｎ  ＳＣら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２０１０；１１７（８）：１５５４〜９，９  ｅ１。
９８．Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ  Ｍ，Ｓｃｈｍｉｔｚ−Ｖａｌｃｋｅｎｂｅｒｇ  Ｓ，Ａｄｒｉｏｎ  Ｃ，Ｋｒａｍｅｒ  Ｉ，Ｅｔｅｒ  Ｎ，Ｈｅｌｂ  ＨＭら、Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｔｒａｌ−ｄｏｍａｉｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｅｉ．２０１０；５１（８）：３８４６〜５２。
９９．Ｓｕｎｎｅｓｓ  ＪＳ，Ａｐｐｌｅｇａｔｅ  ＣＡ，Ｂｒｅｓｓｌｅｒ  ＮＭ，Ｈａｗｋｉｎｓ  ＢＳ．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｃｕｌａ：ｅｎｒｏｌｌｍｅｎｔ  ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｓｔｕｄｙ．Ｒｅｔｉｎａ．２００７；２７（２）：２０４〜１０。
１００．Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＳＧ，Ｒｏｍａｎ  ＡＪ，Ａｌｅｍａｎ  ＴＳ，Ｓｕｍａｒｏｋａ  Ａ，Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｗ，Ｗｉｎｄｓｏｒ  ＥＡら、Ｎｏｒｍａｌ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｅｉ．２０１０；５１（２）：１０７９〜８５。
１０１．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ＯＯ，Ｋａｒｌｓｅｎ  ＲＬ．Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ，Ｌ−ａｌｐｈａ−ａｍｉｎｏａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ．Ａｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｓｔｕｄｙ．Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１９７９；２８（５）：５６９〜７５。
１０２．Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｙ，Ｍｉｎｅ  Ｓ．Ａｍｉｎｏａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｏｘｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇｌｉａｌ−Ｃｅｌｌｓ．Ｊｐｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９８３；２７（１）：１０７〜１８。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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