(57)【要約】  ＩＬ２およびＩＬ２Ｒβ（例えば、ＣＩＲＢ）、ＩＬ２、ＩＬ２ＲβおよびＩＬ２１Ｒ（例えば、ＣＩＲＢ２１）を含む、および／またはＩＬ２、ＩＬ２ＲβおよびＣＤ２８（例えば、ＣＩＲＢ２８）を含む融合タンパク質；融合タンパク質を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および例えば癌を有する被験者を治療するためのそれらの使用方法；ＩＬ２、ＩＬ２ＲβおよびＣＤ２８を含む融合タンパク質を発現する制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）ならびに例えば自己免疫疾患もしくはＧＶＨＤを有する被験者を治療するためのそれらの使用方法。
2019519215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
介在性リンカーとともに、インターロイキン２受容体β（ＩＬ２Ｒβ）のＮ末端に融合したインターロイキン２（ＩＬ２）を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＩＬ２は配列番号３４を含む、および／または前記ＩＬ２Ｒβは、配列番号３５のアミノ酸２７〜５５１を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＩＬ２とＩＬ２Ｒβの前記Ｎ末端との間の前記介在性リンカーは、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＩＬ２Ｒαの前記細胞質ドメインは、配列番号２８を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
任意選択的にそれらの間の介在性リンカーとともに、ＩＬ２Ｒβの前記Ｃ末端でＩＬ２１Ｒの細胞質ドメインをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ＩＬ２１Ｒの前記細胞質ドメインは、配列番号３６のアミノ酸２５４〜５３８を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
任意選択的にそれらの間の介在性リンカーとともに、前記ＩＬ２Ｒβ部分の前記Ｃ末端でＣＤ２８の活性化ドメインをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＣＤ２８の前記活性化ドメインは、配列番号３８のアミノ酸１８０〜２２０を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の前記融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項１〜８の融合タンパク質を発現させるための１つ以上の調節領域を含む、請求項９に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１１】
好ましくは前記ＮＫ細胞は、さらにＣＤ１６ならびに任意選択的にＮＫＰ４４、ＮＫＰ４６およびＮＫＰ３０を発現する、請求項１〜８に記載の融合タンパク質を発現する単離ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項１２】
被験者、好ましくは癌を有するヒト被験者を治療する方法であって、それを必要とする被験者に請求項１〜８に記載の融合タンパク質を発現する治療有効量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与する工程を含む方法。
【請求項１３】
前記被験者は、固形腫瘍を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１種以上の抗腫瘍モノクローナル抗体もしくはチェックポイント阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＫ細胞は、静脈内投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＮＫ細胞は、投与される前に５００〜１０００ｃＧｙのγ線照射を受ける、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＶＨＤもしくは自己免疫疾患を有する被験者を治療する方法であって、それを必要とする被験者に請求項７または８に記載の融合タンパク質を発現する治療有効量の制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）を投与する工程を含む方法。
【請求項１８】
前記Ｔ−ｒｅｇ細胞は、静脈内投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮＫ細胞は、投与される前に５００〜１０００ｃＧｙのγ線照射を受ける、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
被験者、好ましくは癌を有するヒト被験者を治療する際に使用するための、請求項１〜８に記載の融合タンパク質を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項２１】
前記被験者は、固形腫瘍を有する、請求項２０に記載の使用のためのＮＫ細胞。
【請求項２２】
１種以上の抗腫瘍モノクローナル抗体もしくはチェックポイント阻害剤を投与する工程を含む方法において使用するための、請求項２０に記載の使用のためのＮＫ細胞。
【請求項２３】
前記ＮＫ細胞は、静脈内投与するために処方される、請求項２０に記載の使用のためのＮＫ細胞。
【請求項２４】
前記ＮＫ細胞は、投与される前に５００〜１０００ｃＧｙのγ線照射を受ける、請求項２０に記載の使用のためのＮＫ細胞。
【請求項２５】
ＧＶＨＤもしくは自己免疫疾患を有する被験者を治療する際に使用するための、請求項７または８の融合タンパク質を発現する制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）。
【請求項２６】
前記Ｔ−ｒｅｇ細胞は、静脈内投与するために処方される、請求項２５に記載の使用のためのＴ−ｒｅｇ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１６年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３３８，７５７号明細書および２０１７年３月１５日に出願された同第６２／４７１，４５６号明細書の利益を主張するものである。上記の出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書では、ＩＬ２、ＩＬ２ＲβおよびＩＬ２１Ｒ（例えば、ＣＩＲＢ２１）を含むキメラタンパク質；および／またはＩＬ２、ＩＬ２ＲβおよびＣＤ２８（例えば、ＣＩＲＢ２８）を含むキメラを発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ならびに例えば癌、ＧＶＨＤおよび自己免疫疾患を有する被験者を治療するためのそれらの使用方法が記載される。
【背景技術】
【０００３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、特異的抗原へ事前に曝露されなくても悪性細胞およびウイルス感染細胞を攻撃する先天的能力を備えているリンパ球である（１〜３）。数種のインターロイキンおよび特にＩＬ２は、例えばＴ細胞およびＮＫ細胞などの重要な免疫細胞を活性化して増殖させる（４）。このため全身性のＩＬ２補給は、癌からウイルス感染までの範囲に及ぶ様々な疾患において免疫を強化できよう。しかし、癌患者においては、腫瘍細胞およびそれらの微小環境（ＴＭＥ）は、多数の逃避機構を組織化することによってＮＫ細胞抗腫瘍活性を抑制することが多い（５）。
【０００４】
高用量ＩＬ２注入を使用した臨床試験は、敗血症に似た重篤な副作用が発生したために少しの成功しか得られなかったが（６〜８）、他方低用量ＩＬ２の有効性は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ２の短い半減期（１０分間未満）（９）ならびにＴ−ｒｅｇおよび他のリンパ球様細胞による低用量ＩＬ２の枯渇に起因して限定される（１０）。ＩＬ２をベースとする多数の戦略は、患者における傷害性を低減させながらＮＫ細胞傷害性を強化することを目的としていたが、有効性は限定された。培養した体外ＮＫ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏに移入する前のＩＬ２への曝露によって活性化させて増殖するように誘導することができる。体外活性化自家ＮＫ細胞は、自己クラスＩのＨＬＡシグナル伝達がＮＫ細胞傷害およびサイトカイン遊離を抑制するために（１３）、同種異系ドナー由来のＮＫ細胞（１２）よりも低い抗腫瘍有効性を示す（１１）。しかし、同種異系ドナーＮＫ細胞が効果的であるためには、成長因子およびサイトカインに対する競合を低減させるために、移入前のリンパ枯渇が必要とされる（１４，１５）。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ移入後のＮＫ細胞傷害性を維持するためには全身性のＩＬ２投与が必要とされるが、これは患者を全身性副作用に曝露させる。
【０００５】
ＮＫ細胞内の内因性ＩＬ２を発現させるこれまでの治療努力は、微小転移モデルにおいて限定された成功を示したが、外因性ＩＬ２を用いて刺激されたＮＫ細胞ほど効果的ではなかった（１６）。同様に、膜結合内因性ＩＬ２を発現させる努力は、親ＮＫ９２細胞を越える利点を全く示さなかった（１７）。ＮＫ細胞を使用する数種の免疫療法戦略の限定された成功は、活性化ＮＫ細胞が宿主におけるサイトカインに対するＴ−ｒｅｇおよび骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含むＴＭＥの免疫抑制作用を打ち負かす失敗によって説明できよう。ＭＤＳＣおよびＴ−ｒｅｇはどちらも、直接接触またはＴＧＦβ１の分泌のいずれかによってＮＫ細胞機能抑制を媒介する（１８，１９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
インターロイキン−２（ＩＬ２）は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む重要な免疫細胞にとっての免疫賦活性サイトカインである。このため全身性のＩＬ２補給は、腫瘍からウイルス感染までの範囲に及ぶ様々な疾患においてＮＫ媒介性免疫を強化できよう。しかし、その全身性使用は、その重篤な副作用によって制限され、その有効性は制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）の活性化によって限定され得る。ＩＬ２シグナル伝達は、ＩＬ２Ｒα、ＩＬ２ＲβおよびＩＬ２Ｒγを含有する高親和性マルチサブユニット受容体複合体との相互作用を通して媒介される。成人ＮＫ細胞は、ＩＬ２ＲβおよびＩＬ２Ｒγサブユニットしか発現することができないので、このためＩＬ２に対して相当に非感受性である。これらの限界を克服するために、本発明者らは、ＩＬ２の新規なキメラＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ（ＣＩＲＢ）融合タンパク質およびペプチドリンカーを介して結合されたその受容体ＩＬ２Ｒβを作製した。ＣＩＲＢ（ＮＫ９２ＣＩＲＢ）を発現するＮＫ９２細胞は高度に活性化され、外因性ＩＬ２なしで無限に増殖する。それらは高度に細胞傷害性であり、ＴＧＦ−β１およびデキサメタゾンに対して耐性であった。さらに、ＣＩＲＢは、天然細胞傷害性受容体ＮＫＰ４４、ＮＫＰ４６およびＮＫＰ３０ならびにＨＥＲ２陽性細胞に対する抗体依存性経路を介してトラスツズマブによるＮＫ細胞傷害性を強化したＣＤ１６の実質的な発現を誘導した。ＩＬ２を分泌するＮＫ９２細胞系（ＮＫ９２ＩＬ２）と比較した場合に、ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞は、マウスにおいて優れたｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍作用および生存性（少なくとも３週間）を示す。この新規なキメラは、ＩＬ２ＲαおよびＩＬ２Ｒβ両方の発現の必要を排除し、外因性ＩＬ２刺激への代替策を提供する。これらをまとめると、本研究のデータは、ＩＬ２をその受容体ＩＬ２Ｒβへ繋ぎ止めることが、免疫療法を選択的に活性化して強化する際に有用な可能性がある新規なプラットフォームを提供することを証明している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本明細書では、それらの間の介在性リンカーとともにインターロイキン２受容体β（ＩＬ２Ｒβ）のＮ末端に融合したインターロイキン２（ＩＬ２）を含む融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、ＩＬ２は配列番号３４を含む、および／またはＩＬ２Ｒβは配列番号３５のアミノ酸２７〜５５１を含む。一部の実施形態では、ＩＬ２とＩＬ２ＲβのＮ末端との間の介在性リンカーは、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインは、配列番号２８を含む。
【０００８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、任意選択的にそれらの間の介在性リンカーとともに、ＩＬ２ＲβのＣ末端でＩＬ２１Ｒの細胞質ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＩＬ２１Ｒの細胞質ドメインは、配列番号３６のアミノ酸２５４〜５３８を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、任意選択的にそれらの間の介在性リンカーとともに、ＩＬ２Ｒβ部分のＣ末端でＣＤ２８の活性化ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８の活性化ドメインは、配列番号３８のアミノ酸１８０〜２２０を含む。
【００１０】
さらに本明細書では、好ましくは本明細書に記載した融合タンパク質を発現させるための１つ以上の調節領域とともに、本明細書に記載した融合タンパク質をコードする核酸ならびにその核酸を含む発現ベクターが提供される。
【００１１】
さらに本明細書では、本明細書に記載した融合タンパク質を発現する単離ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（例えば、ＣＤ３−ＣＤ５６＋リンパ球）であって、好ましくはここでさらにＮＫ細胞はＣＤ３−ＣＤ５６＋リンパ球であり、さらにＣＤ１６および任意選択的にＮＫＰ４４、ＮＫＰ４６およびＮＫＰ３０を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ならびに癌を治療する際のそれらの使用が提供される。
【００１２】
さらに、それらの間に介在性リンカーを備える、インターロイキン２受容体β（ＩＬ２Ｒβ）のＮ末端に融合したインターロイキン２（ＩＬ２）を含む融合タンパク質を発現する制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）および任意選択的にそれらの間に介在性リンカーを備えるＩＬ２Ｒβ部分のＣ末端でＣＤ２８の活性化ドメインが提供される。好ましくは、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔｒｅｇ（例えば、アトピー性ＴｒｅｇについてはＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７−ＩＣＯＳ＋またはＧＶＨＤについてはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−ＣＤ６２Ｌ）、および任意選択的に同様にＦＯＸＰ３＋である。さらに、例えば、同種反応性Ｔ細胞を枯渇させるために、ＧＶＨＤおよび自己免疫疾患を治療する際にそれらの使用も提供される。
【００１３】
さらに、本明細書では、被験者、好ましくは癌を有する（例えば、癌を有すると診断されている）ヒト被験者を治療するための方法であって、本明細書に記載した融合タンパク質を発現する治療有効量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与する工程であって、好ましくはここでＮＫ細胞はＣＤ３−ＣＤ５６＋リンパ球であり、さらにＣＤ１６および任意選択的にＮＫＰ４４、ＮＫＰ４６およびＮＫＰ３０も発現する工程も含む方法が提供される。ＮＫ細胞は、例えば、本明細書に記載したように、静脈内投与すべく処方された生理学的に許容される組成物中で処方および／または投与することができる。
【００１４】
一部の実施形態では、被験者は、固形腫瘍を有する。
【００１５】
一部の実施形態では、本方法は、１種以上の抗腫瘍モノクローナル抗体もしくはチェックポイント阻害剤を投与する工程を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、静脈内投与される。
【００１７】
一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、投与される前に５００〜１，０００ｃＧｙのγ線照射を受ける。
【００１８】
さらに、本明細書ではＧＶＨＤもしくは自己免疫疾患を有する被験者を治療するための方法であって、それらの間の介在性リンカーとともにインターロイキン２受容体β（ＩＬ２Ｒβ）のＮ末端に融合したインターロイキン２（ＩＬ２）および任意選択的にそれらの間の介在性リンカーとともにＩＬ２Ｒβ部分のＣ末端でＣＤ２８の活性化ドメインを含む融合タンパク質を発現する治療有効量の制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）を投与する工程を含む方法が提供される。好ましくは、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔｒｅｇ（例えば、アトピー性ＴｒｅｇについてはＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７−ＩＣＯＳ＋またはＧＶＨＤについてはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−ＣＤ６２Ｌ）、および任意選択的に同様にＦＯＸＰ３＋である。
【００１９】
一部の実施形態では、Ｔ−ｒｅｇ細胞は、静脈内投与される。
【００２０】
一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、投与する前に５００〜１，０００ｃＧｙのγ線照射を受ける。
【００２１】
さらに、被験者、好ましくは癌、例えば固形腫瘍を有するヒト被験者を治療する際に使用するための、本明細書に記載した融合タンパク質を発現するＮＫ細胞が提供される。一部の実施形態では、被験者には、さらに１種以上の抗腫瘍モノクローナル抗体もしくはチェックポイント阻害剤が投与される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、静脈内投与されるために処方される。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、投与される前に５００〜１，０００ｃＧｙのγ線照射を受ける。
【００２２】
他に特に規定しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者であれば一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書では本発明において使用するための方法および材料が記載されている。当分野において公知である他の好適な方法および材料もまた使用できる。材料、方法および実施例は、例示することだけを意図しており、限定することは意図していない。本明細書で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース記入事項および他の参考文献は、参照により全体として組み込まれる。不一致が生じた場合は、用語の定義を含めて本明細書が優先されることになる。
【００２３】
本発明のその他の特徴および長所は、詳細な説明および図面ならびに特許請求項から明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ヒトＩＬ２およびレンチウイルス構築物中の受容体ＩＬ２Ｒβ（ＣＩＲＢ）と融合したキメラＩＬ２を示す図である。ｃＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）およびＩＬ２受容体αの細胞外ドメインの断片（ＥＭＥＴＳＱＦＰＧＥＥＫＰＱＡＳＰＥＧＲＰＥＳＥＴＳＣ）から構成されるリンカー（Ｌ）は、ＩＬ２とその受容体ＩＬ２Ｒβとを結合する。
【図２Ａ】キメラＣＩＲＢの表面検出および発現を示す図である。一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の表面でのＣＩＲＢ発現の抗ｃＭｙｃモノクローナル抗体による検出を示している。
【図２Ｂ】キメラＣＩＲＢの表面検出および発現を示す図である。レンチウイルス形質導入ＮＫ９２細胞内での一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の表面でのＣＩＲＢ発現の抗ｃＭｙｃモノクローナル抗体による検出を示している。
【図２Ｃ】キメラＣＩＲＢの表面検出および発現を示す図である。天然ＩＬ２Ｒβ（ＣＤ１２２）ならびにキメラを認識する、抗ＣＤ１２２モノクローナル抗体を使用して検出したＣＤ１２２発現を示す図である。ＣＣＤ１２２は、ＮＫ９２ＩＬ２細胞中に存在し、予想されたように、ＣＩＲＢの追加の発現に起因してＮＫ９２ＣＩＲＢ中でははるかに高い。発現は、抗体の非存在下（Ｎｅｇ）で検出されたバックグラウンドより高かった。
【図２Ｄ】キメラＣＩＲＢの表面検出および発現を示す図である。ＣＩＲＢはさらに、モノクローナル抗ヒトＩＬ２を使用するウエスタンブロットにより検出された。
【図３Ａ】共培養の前に２４時間にわたりプレーティングした多発性骨髄腫Ｕ２６６ＧＦＰ細胞に対するＮＫ９２ＩＬ２、ＮＫ９２ＣＩＲＢおよび親ＮＫ９２細胞系の細胞傷害アッセイを示す図である。ＮＫ細胞の増加したＥ／Ｔ比は、ＧＦＰ放射蛍光によって定量されたようにより多数のＵ２６６ＧＦＰ細胞死を誘導した。
【図３Ｂ】１つのパネルの５種のヒト癌細胞系に対する細胞傷害アッセイを示す図である。細胞は、２：１のＥ／Ｔ比でＮＫ細胞系を添加する前の２４時間にわたりプレーティングした。
【図３Ｃ】癌細胞は、Ｅ／Ｔ比を増加させながらＮＫ９２ＩＬ２（●）もしくはＮＫ９２ＣＩＲＢ（■）細胞に曝露させる前の５時間だけプレーティングした。この期間後に残留している細胞は、クリスタルバイオレット／アルコール抽出アッセイを使用して決定した。データは、ＮＫ細胞無含有コントロールと比較した細胞数を３例ずつのサンプルについての平均値＋ＳＥ値として提示した。
【図４Ａ】ＴＧＦβ１、ＩＬ−４およびデキサメタゾンがＮＫ細胞生存率に及ぼす影響を示す図である。６４×１０３個のＮＫ９２ＩＬ２細胞は、６日間の増殖期間にわたりＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）もしくはＤｅｘ（１μＭ）とともにプレーティングした。生存細胞は、トリパンブルーを使用して計数した。データは、最終細胞数（１０５個／ｍＬ）を３例ずつのサンプルについての平均値＋ＳＥ値として提示した。
【図４Ｂ】ＴＧＦβ１、ＩＬ−４およびデキサメタゾンがＮＫ細胞生存率に及ぼす影響を示す図である。ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞は、６日間の増殖期間にわたりＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）もしくはＤｅｘ（１μＭ）とともにプレーティングした。生存細胞は、トリパンブルーを使用して計数した。データは、最終細胞数（１０５個／ｍＬ）を３例ずつのサンプルについての平均値＋ＳＥ値として提示した。
【図４Ｃ】ＴＧＦβ１、ＩＬ−４およびデキサメタゾンがＮＫ細胞生存率に及ぼす影響を示す図である。ＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞系は、２４時間にわたりＴＧＦβ１（２０ｎｇ／ｍＬ■）、Ｄｅｘ（０．５μＭ▲）もしくは薬物なし（ＵＴ●）に曝露させた。親ＮＫ９２細胞は、２０ＩＵ／ｍＬでのＩＬ２とともにインキュベートした。癌細胞（細胞３２×１０３個）は次に２：１のＥ／Ｔ比でＮＫ細胞に添加し、その後に４日間インキュベートした。癌細胞生存率は、クリスタルバイオレット抽出アッセイを使用して決定した。データは、ＮＫ細胞無含有コントロール（ＵＴ）と比較した細胞数の平均パーセンテージとして提示した。
【図５Ａ】ＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞系の表現型を示す図である。フローサイトメトリーは、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ内でのＣＤ１６の増加した細胞表面密度およびＮＫ９２ＣＩＲＢ内でのＣＤ２５の低発現率を示している。データはＮＫ細胞無含有コントロールと比較した細胞数のパーセンテージとして提示した。３例ずつのサンプルについての平均値＋ＳＥ値として提示した。統計的有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ検定（＊Ｐ＜０．０５）によって決定した。
【図５Ｂ】ＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞系の表現型を示す図である。ＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢと比較したＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５およびＣＤ１６のヒト一次ＮＫ細胞（ｈＮＫ）表現型発現を示している。データはＮＫ細胞無含有コントロールと比較した細胞数のパーセンテージとして提示した。３例ずつのサンプルについての平均値＋ＳＥ値として提示した。統計的有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ検定（＊Ｐ＜０．０５）によって決定した。
【図５Ｃ】ＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞系の表現型を示す図である。トラスツズマブ（１μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした場合に２：１のＥ／Ｔ比でＨＥＲ２陽性ＢＴ４７４細胞系に対するエフェクターＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞によって媒介された直接細胞傷害性およびＡＤＣＣ活性を示している。データはＮＫ細胞無含有コントロールと比較した細胞数のパーセンテージとして提示した。３例ずつのサンプルについての平均値＋ＳＥ値として提示した。統計的有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ検定（＊Ｐ＜０．０５）によって決定した。
【図５Ｄ】ＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞系の表現型を示す図である。ＮＫ細胞系内でのＮＫＰ３０、ＮＫＰ４４、ＮＫＰ４６、グランザイム−Ｂ、パーフォリン−１、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γの発現プロファイルを示している。データは、３例ずつのサンプルについて平均値＋ＳＥ値として提示した。統計的有意差を評価するためには両側ｔ検定分析を使用した。
【図６Ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏでの非照射ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の評価を示す図である。Ｕ２５１腫瘍容積が約１６０ｍｍ３に達した時点に、非照射ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞（細胞１０７個）は、尾静脈を介してマウス（矢印）内に注射した。非照射ＮＫ細胞（細胞５×１０６個）の第２回注射は、４日後に実施した。腫瘍サイズについては、腫瘍移植３１日後まで監視した。
【図６Ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏでの非照射ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の評価を示す図である。最終ＮＫ細胞注射の１７日後、動物を犠死させ、各群３匹の動物から血液を採取した。血液サンプル（０．５ｍＬ）を処理し、各々ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ内でＩＬ２もしくはＣＩＲＢと共発現するヒト特異的マーカーＣＤ４５およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光マーカーを使用するフローサイトメトリーによって分析した。ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞（丸で囲まれている）が検出された。
【図７Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞生存率およびｉｎ  ｖｉｖｏでの照射ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の抗腫瘍有効性を示す図である。ＮＫ細胞は１０Ｇｙ（０．８３ｇｙ、１２分間）で照射し、その後、完全ＮＫ９２培地中でプレーティングし、２４時間毎にトリパンブルーを使用してそれらの生存率を決定した。ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の生存率の利点は、第１日および第２日で統計的有意であった（一元配置ＡＮＯＶＡ検定、＊Ｐ＜０．０５）。
【図７Ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞生存率およびｉｎ  ｖｉｖｏでの照射ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の抗腫瘍有効性を示す図である。ＰＣ−３腫瘍は、５週齢の雄性Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄマウス中で増殖させた。腫瘍が約２００ｍｍ３に達した時点に、ＮＫ細胞を５００ｃＧｙで照射し、尾静脈（矢印）を介してマウス１匹当たり２００μＬ中１５×１０６個の週１回の計４回の注射を投与した。最終ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の注射後、未処置群と比較して、１７日間の有意な腫瘍増殖遅延が記録された（＊＊Ｐ＜０．０１）。ＮＫ９２ＩＬ２処置群の腫瘍は、７日間の腫瘍遅延しか生じさせなかった（＊Ｐ＜０．０５）。統計的有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ検定によって決定した。
【図８】リンカーのヘリックス優勢予測構造はサーバーを使用して決定した（２０）。
【図９】ＮＫ９２ＩＬ２細胞系およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞系の細胞増殖を示す図である。ＮＫ９２ＩＬ２細胞系およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞系は、凍結後の迅速な回復ならびに複数回の凍結および組織培養中でのプレーティングを受けた後の優れた生存率を示した。ＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２、ＮＫ９２ＣＩＲＢおよびＩＬ２−活性化ＮＫ９２（１０ＩＵ／ｍＬ）の増殖は、６日後に類似であったが、４０ＩＵ／ｍＬではＮＫ９２についての方がわずかに高かった。ＮＫ９２−ＭＩ細胞は、同一期間中に最も緩徐な増殖を示した。
【図１０Ａ】ＮＫ９２−ＭＩおよびＮＫ９２内でのＣＤ１６の発現を示す図である。フローサイトメトリーはＮＫ９２およびＮＫ９２−ＭＩ内でのＣＤ１６の発現の欠如を確証している。
【図１０Ｂ】ＮＫ９２−ＭＩおよびＮＫ９２内でのＣＤ１６の発現を示す図である。１００もしくは１，０００ＩＵ／ｍのグリコシル化（Ｇ）および非グリコシル化ＩＬ２を用いて活性化したＮＫ９２内でのＣＤ１６の発現の欠如を示している。
【図１１】一般的シグナル伝達鎖ＩＬ２Ｒｇを使用したＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を通したシグナル伝達を示している略図である。
【図１２】ＩＬ２１もしくはＩＬ２を用いて刺激した場合の、１：１の比率でのＰＣ−３のＮＫ９２ＣＩＲＢ殺滅を示す図である。
【図１３】ＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＩＬ２１キメラ（ＣＩＲＢ２１）の典型的な略図を示す図である。
【図１４】１：１の比率でのＮＫ９２ＣＩＲＢおよびＮＫ９２ＣＩＲＢ２１対ＰＣ−３細胞の細胞傷害性を示すグラフである。
【図１５】ＮＫ９２に比較したＮＫ９２ＣＩＲＢおよびＮＫ９２ＣＩＲＢ２１中でのアクチベーターおよびサイトカインの発現倍率を示すグラフである。
【図１６】描出した活性化領域を備えるＩＬ２Ｒβ受容体細胞質ドメインを示す図である。Ｂｏｘ  １は、Ｓｏｃｓ  １阻害性モチーフとのＪＡＫ−ＳＴＡＴ相互作用のために必要とされる。Ｙ５３６は、ＳＴＡＴ５結合およびリン酸化のために必要とされる。
【図１７】描出した活性化領域を備えるＩＬ２１受容体細胞質ドメインを示す図である。Ｂｏｘ  １は、Ｂｏｘ  ２寄与とのＪＡＫ−ＳＴＡＴ相互作用のために必要とされる。Ｙ５１９は、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ１結合ならびにリン酸化のために必要とされる。
【図１８】ＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＣＤ２８キメラ（ＣＩＲＢ２８）の典型的な略図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本組成物および方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方においてＮＫ細胞傷害性および増殖を維持しながら、外因性ＩＬ２を使用せずに選択的にＮＫ細胞を活性化して増殖させ、ＮＫ細胞内でのＩＬ２Ｒαおよびその発現の欠如の要求を回避するので、そこでＴ−ｒｅｇのようなダウンレギュレーション性リンパ球様細胞のＩＬ２オフターゲット作用、サイトカイン競合および活性化を無効化する。
【００２６】
ＩＬ２は、共通ＩＬ２Ｒγ鎖（ＣＤ１３２）（２２，２３）とともに低親和性受容体ＩＬ２Ｒα（ＣＤ２５）（２１）もしくは中間親和性受容体ＩＬ２Ｒβ（ＣＤ１２２）のいずれかおよび全部に結合して、高親和性の４者複合体を形成するであろう（２４）。成人ＮＫ細胞は、ＩＬ２ＲβおよびＩＬ２Ｒγサブユニットしか発現できないので（２５）、このため、低用量のＩＬ２に対しては比較的に非感受性であるが、ＩＬ２Ｒα発現後には感受性を獲得する（２６）。ＩＬ２Ｒβに直接的に高親和性で結合することによってＩＬ２Ｒαを迂回する、近年開発されたＩＬ２「スーパーカイン（ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ）」（２７）は、マウスにおいて野生型ＩＬ２より優れた抗腫瘍作用を生成した。しかしそれでもなお、ＩＬ２「スーパーカイン」は、何らかの形態の肺水腫を誘発する。
【００２７】
本明細書に記載した新規なキメラＣＩＲＢは、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインに由来するペプチドリンカーによって結合されたＩＬ２およびその受容体ＩＬ２Ｒβを含む。このリンカーは、コンピューターを使用して、柔軟性とは一般に逆相関するキメラ安定性に有害な影響を及ぼすことなく合理的に柔軟性であると決定された（２８）。ＮＫ９２細胞中に導入されると、ＣＩＲＢは明確な細胞増殖を誘発し、ＩＬ２発現によって誘発された場合と類似もしくはより高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を付与した。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、中サイズの固形腫瘍に対するＮＫ９２ＣＩＲＢの抗癌活性は、ＮＫ９２ＩＬ２によって誘発された場合より実質的に優れていた。さらに、ＣＩＲＢは、ＩＬ２とは対照的に、ＴＧＦβ１、デキサメタゾンならびにＩＬ４に対する実質的な弾性を付与する。この利点は、ＴＧＦβ１が癌関連線維芽細胞を含む様々な細胞によって分泌され（２９）、およびＮＫ細胞のアネルギーを誘導するためにＴ−ｒｅｇ上の膜結合形で存在する（３０）、またはＮＫ細胞内でのＮＫＧ２Ｄ発現およびＩＦＮ−γ産生を阻害するためにＭＤＳＣによって分泌される（３１）ＴＭＥ内では極めて重要であろうと思われる。癌細胞はさらに、ＴＧＦβ１の膜結合形を含有する腫瘍由来エクソーム（ＴＤＥ）を定期的に取り除き、結果としてＮＫＧ２Ｄのダウンレギュレーション（３２）およびＩＬ２シグナル伝達の阻害（３３）を生じさせる。ＴＧＦβ１は、コアクチベーター／アダプターであるＤＡＰ１２の発現を抑制する誘導されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）−１８３によってＮＫ阻害を媒介するので、そこでＮＫ細胞内での数種の活性化シグナルを不安定化させる（３４）。ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞内でのＣＩＲＢ発現は、さらにｄｅｘに対する耐性を提供するが、その間にＮＫ９２ＩＬ２細胞が排除された。Ｄｅｘは、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ２産生を抑制し、ＮＫ細胞内での活性化受容体ＮＫＧ２ＤおよびＮｋｐ４６を低減させることによって、リンパ球の機能をある程度損傷させる（３５）。グルココルチコイドホルモンは、マクロファージ活性化および抗原提示を妨害し、数種の前炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞接着分子および炎症性反応に関係する他の酵素の転写を抑制することができる（３６）。ｄｅｘに対するＮＫ９２ＩＬ２の極度の感受性は、ＩＬ２  ＲＮＡの以前に報告された不安定化によって説明することができよう（３７）。このＲＮＡ不安定化は、ＮＫ９２ＩＬ２細胞内で潜在的に発生する可能性があろうが、ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞内のようにＩＬ２Ｒβ  ＲＮＡと融合した場合には発生しないであろう。
【００２８】
ＣＩＲＢおよびそれより少ない程度のＩＬ２の安定性発現は、ＮＫ９２細胞系内での実質的なＣＤ１６発現を許容した。しかし、外因性組換えＩＬ２は、そのような発現を媒介することができなかった。同様に、ＩＬ２を生成および分泌するＮＫ９２−ＭＩ細胞系は、以前に報告されたように（３８）、ＣＤ１６において欠損することが見いだされた。トラスツズマブと結合されると、ＣＤ１６発現はさらに、ＡＤＣＣによるＮＫ９２ＣＩＲＢおよびＮＫ９２ＩＬ２細胞傷害性を強化した。ＣＩＲＢは、ＮＣＲ（天然細胞傷害性受容体）であるＮＫＰ４４（９倍）、ＮＫＰ４６（１．４倍）およびＮＫＰ３０（１．７倍）の実質的な発現を誘導し、ならびにＩＮＦγにおいて中等度であるが有意な増加を誘導した。最後に、グランザイム−Ｂ発現は、ＮＫ９２ＩＬ２において実質的に低下した。興味深いことに、ＣＤ２５発現はＮＫ９２ＣＩＲＢにおいて劇的に低下したが、それはキメラＣＩＲＢの存在下では不要なためである（図５Ａ）。
【００２９】
ＮＫ細胞内にＣＤ１６を導入する最新の遺伝子改変は、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）と組み合わせた場合に多発性骨髄腫に対するＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣを増加させることが証明された（３９）。ＣＤ１６がＮＫ９２ＣＩＲＢおよびＮＫ９２ＩＬ２においてのみ誘導され、ＩＬ２を用いて刺激されたＮＫ９２−ＭＩもしくはＮＫ９２においては誘導されなかったという事実は、おそらく、ＮＫ９２ＣＩＲＢおよびＮＫ９２ＩＬ２のより強力な活性化および増殖に何らかの形で翻訳する持続性ＩＬ２シグナル伝達によって説明できよう。実際に、ＮＫ９２ＣＩＲＢおよびＮＫ９２ＩＬ２両方の増殖率はＮＫ９２−ＭＩの増殖率の２倍であったが（図９）、これはより高レベルの活性化を示唆している。ＮＫ９２ＣＩＲＢおよびＮＫ９２ＩＬ２のより高い活性化についてのまた別の指標は、４８時間にわたりＩＬ２を用いて刺激された親ＮＫ９２と比較したＮＫＰ４４の劇的な誘導である。
【００３０】
さらに、ＮＫ９２ＣＩＲＢはこのため、ＮＫ９２ＩＬ２細胞に比較して照射後にはｉｎ  ｖｉｖｏでははるかに長期間増殖でき、さらにより優れた生存率を有することができる。ＮＫ９２ＣＩＲＢの生存率はさらに、類似条件に曝露させた場合にもＮＫ９２−ＭＩの生存率を上回る（３８）。ＮＫ９２ＩＬ２細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、それらの活性化および増殖を維持するために十分なＩＬ２を分泌する。しかし、ＮＫ９２ＩＬ２細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性化および増殖を維持するために十分なＩＬ２細胞外濃度を生成することはできない可能性がある。これは、免疫競合動物ではＴ−ｒｅｇおよび他の免疫細胞によるＩＬ２に対する競合によって複雑化されるであろう。
【００３１】
そこで、ＣＩＲＢを含む本明細書に記載した新規なキメラは、癌の免疫療法および潜在的にウイルス感染を改善する極めて有用な属性をＮＫ９２細胞に授ける。
【００３２】
ドナーＮＫ細胞を使用する細胞免疫療法は、有意な抗癌作用を安全に、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を誘導するリスクを伴わずに達成できた先端分野である。この安全性の特徴ならびに標的抗原を有する正常組織への傷害性（ｏｆｆ  ｔｕｍｏｒ／ｏｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）は、現在はＣＡＲ−Ｔテクノロジーの成功を妨害している（４０）。数種のＮＫ細胞系（Ｋｈｙｇ−１、ＮＫＬ、ＮＫＧ、ＮＫ−ＹＳ、ＹＴ、ＹＴＳおよびＨＡＮＫ−１細胞）は、現在は前臨床試験において使用されている。しかし、臨床状況における安全性および有効性について広範に評価されてきたのはＮＫ９２細胞系だけであった（４１，４２）。ＮＫ９２細胞は、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−およびＣＤ１６−であり、増殖および活性化のためにはＩＬ２を必要とする（４３）。一次ＮＫ細胞とは異なって、ＮＫ９２細胞および他のＮＫ細胞系は、安定性で均質の集団を構成する。それらは、リンパ球についての良好な安全性プロファイルを示してきた遺伝子導入プラットフォームである（４４）、レンチウイルスによる遺伝子改変に対して適用できる。ＮＫ細胞に向けられた免疫療法において多数の有望な進歩が達成されてきた（４５）。しかし、体外でのＮＫ細胞増殖に対する需要の増加は、高度に活性化された細胞および細胞増殖の費用の減少の両方を必要とする。さらに、注入された細胞は、より高い活性化能力を有していなければならず、さらにＴＭＥにおいて見いだされる免疫抑制剤に対する好都合な特性を有していなければならない。
【００３３】
本戦略は、ＣＩＲＢ、ＣＩＲＢ２８においてそれらの受容体へインターロイキンを融合させる工程を含み、ＣＩＲＢ２１キメラは、特異性を伴って、および全身性傷害性もしくは免疫系の他の細胞成分による競合を伴わずにより良好なサイトカイン活性化を達成する。ＮＫ細胞の自己活性化は、例えばＴＧＦβ１もしくはグルココルチコイドホルモンへの弾性、ＣＤ１６の実質的発現、照射後のより高い生存率およびｉｎ  ｖｉｖｏでの優れた抗腫瘍活性などのいくつかの際立った特徴を提供する。
【００３４】
キメラタンパク質
本開示は、本明細書に記載したキメラ、例えば、ＩＬ２およびＩＬ２Ｒβ（例えば、ＣＩＲＢ）を含むキメラ；ＩＬ２、ＩＬ２ＲβおよびＩＬ２１Ｒ（例えば、ＣＩＲＢ２１）を含むキメラ；および／またはＩＬ２、ＩＬ２ＲβおよびＣＤ２８（例えば、ＣＩＲＢ２８）を含むキメラを提供する。本明細書に記載した融合タンパク質の全部は、例えば、組換えＤＮＡを操作および発現させるための標準的な分子生物学的手順を使用して生成することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９５）、およびＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｊｕｎｅ  １５，２０１２）およびそれらの補遺ならびに他の標準的な検査室マニュアルを参照されたい。キメラは、例えば、ＮＫ細胞内、例えば一次もしくは培養ＮＫ細胞内で発現させることができる、例えば安定性で発現させることができる。細胞は、次に被験者、例えば癌を有する（例えば、癌であると診断されていた）被験者に注入される。
【００３５】
以下に提供するのは、本明細書に記載したキメラを作り上げる様々なドメインのための典型的な配列である。一部の実施形態では、使用される配列は、本明細書に規定した典型的な配列と少なくとも８０％同一である。一部の実施形態では、配列は、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％もしくは１００％同一である。
【００３６】
２つの配列の同一性率（％）を決定するためには、配列が最適比較目的のためにアラインメントされる（最適アラインメントのために必要とされるように第１および第２のアミノ酸配列もしくは核酸配列の一方もしくは両方にギャップが導入され、比較目的のためには非相同配列を無視することができる）。比較目的でアラインメントされる参照配列の長さは、少なくとも８０％である（一部の実施形態では、参照配列の長さの約８５％、９０％、９５％もしくは１００％がアラインメントされる）。その後、対応する位置でのヌクレオチドもしくは残基が比較される。第１配列内の位置が第２配列内の対応する位置と同一のヌクレオチドもしくは残基によって占められている場合、その位置にある分子は同一である。２つの配列間の同一性率は、ギャップの数およびこれら２つの配列の最適アラインメントのために導入されることを必要とする各ギャップの長さを考慮に入れて、これらの配列が共有する同一位置の数の関数である。
【００３７】
２つの配列間の配列比較および同一性率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して実施できる。例えば、これら２つのアミノ酸配列間の同一性率は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４およびフレームシフトギャップペナルティ５を用いるＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスを使用して、ＧＣＧソフトウエアパッケージ内のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを使用して決定することができる。
【００３８】
ＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ（ＣＩＲＢ）
本明細書に記載した融合タンパク質には、特に、介在性リンカーと一緒に融合されたＩＬ２およびＩＬ２Ｒβが含まれる。ＩＬ２についての配列は、当分野において公知である。典型的なヒトＩＬ２前駆体配列は、配列番号３４に示した。
【化１】
2019519215.tif 000003
アミノ酸１〜２０は、シグナル配列であるので、所望であれば他のシグナル配列と置換することができる。ヒトＩＬ２に対する典型的な核酸配列は、
当分野において公知のリンカー配列は、融合タンパク質の様々なドメイン間で使用できる；例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上のＧＧＧＳ配列を使用できる。好ましい実施形態では、ＩＬ２とＩＬ２ＲβのＮ末端との間のリンカーは、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン（ＥＭＥＴＳＱＦＰＧＥＥＫＰＱＡＳＰＥＧＲＰＥＳＥＴＳＣ（配列番号２８））を含む。タグ、例えばｃＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２９））は、さらに例えばＩＬ２とリンカーとの間に追加することができる。ＩＬ２をコードする典型的な核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿０００５８６．３で入手できる。
【００３９】
ＩＬ２Ｒβについての配列もまた当分野において公知である；典型的なヒトＩＬ２Ｒβ前駆体配列は、配列番号３５に示した。
【化２】
2019519215.tif 000004
アミノ酸１〜２６はシグナル配列であり、好ましくは本構築物中では欠失しており、例えばこの配列は、配列番号３５のアミノ酸２７〜５５１を含む。ＩＬ２Ｒβをコードする典型的な核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿０００８７８．４（Ｖａｒ．１）、ＮＭ＿００１３４６２２２．１（Ｖａｒ．２）；およびＮＭ＿００１３４６２２３．１（Ｖａｒ．３）で入手できる。変異体１、２および３は、同一タンパク質をコードする。
【００４０】
ＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＩＬ−２１（ＣＩＲＢ２１）
インターロイキンＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５およびＩＬ２１は、ＩＬ２と同一ファミリーに属し、同一共通ＩＬ２Ｒｇを使用する。それらは、それらの固有のα受容体に加えてＩＬ２Ｒβを使用するＩＬ２およびＩＬ１５を除いて、全部がそれらの固有のプライベート受容体を有する（図１１）。可溶性ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７もしくはＩＬ２１がキメラＮＫ９２ＣＩＲＢを発現するＮＫ９２細胞に加えられると、ＩＬ２１だけがＰＣ−３細胞に対する細胞傷害性を劇的に強化する。そこで、ＩＬ２１Ｒの全細胞質ドメインをクローニングし、次にキメラＣＩＲＢ内のＩＬ２ＲβのＣ末端に頭−尾結合で加えた。これは、新規なＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＩＬ２１Ｒキメラ（図１３に例示した、いわゆるＣＩＲＢ２１）を生じさせた。本明細書に示すように、唯一のリガンドおよびハイブリッド受容体を使用することによって、様々な受容体を介してＮＫ細胞を活性化する複数のサイトカインから活性化シグナルを模倣することが可能であった。
【００４１】
一部の実施形態では、本構築物は、（任意選択的にそれらの間の介在性リンカーとともに）ＩＬ２ＲβのＣ末端でＩＬ２１Ｒの細胞質ドメインを含む。ＩＬ２１Ｒについての配列もまた当分野において公知である；典型的なヒトＩＬ２１Ｒ前駆体配列は、配列番号３６に示した。
【化３】
2019519215.tif 000005
好ましくは、これらの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来ドメインは、配列番号３６のアミノ酸２５４〜５３８を含む。ＩＬ２１Ｒをコードする典型的な核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿０２１７９８．３で入手できる。
【００４２】
ＮＫ細胞内のＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＣＤ２８（ＣＩＲＢ２８）
ＮＫ細胞（およびその他）は、ＭＨＣ−１分子の発現が形質転換細胞内（Ａｌｇａｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；６１（１）：６５−７３）およびウイルス感染中（Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；１８：８６１−９２）にダウンレギュレートされると、活性化される。しかし、腫瘍細胞による耐性表現型の獲得は、ＭＨＣ−１からの阻害性シグナルの発現によって頻回に誘発される（Ｋｏｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１３；２（１１）：ｅ２６４９１）。特にＨＬＡ−Ｇは、ＮＫ９２媒介性腫瘍細胞溶解を阻害することが公知である（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００７；１８（１１）：１８０４−９）。この問題に対する１つの可能性のある解決策は、これらの阻害性シグナルを相殺する複数の活性化シグナルの使用であろう。Ｔ細胞のために使用される最も効果的な共刺激性分子は、ＣＤ２８および４−１ＢＢである。ＣＤ２８活性化は、腫瘍細胞上でのＣＤ８０およびＣＤ８６刺激性リガンド発現を必要とする。結果として、腫瘍内でのＣＤ８０発現は、それらの拒絶をもたらすことが証明されているが（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３；２５９（５０９３）：３６８−７０）、これとは逆に、ＣＤ２８−／−マウスでは、細胞性およびＴ細胞依存性免疫が完全に欠如する（Ｓｈａｈｉｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３；２６１（５１２１）：６０９−１２）。このため、低レベルのＣＤ８０は、数種の癌における腫瘍にとっての逃避機構であると考えられる（Ｔｉｒａｐｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；６６（４）：２４４２−５０；Ｈｅｒｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９４；５８（４）：５２７−３２；Ｂｅｒｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３；８８（３）：４２４−３１）。例えば、抗ｅｒｂＢ２キメラ受容体内でのＣＤ２８活性化ドメインの使用は、ＭＨＣ−１＋リンパ腫のｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍進行の阻害を許容した（Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；１８１（５）：３４４９−５５）。ＣＤ２８はＮＫ９２細胞によって発現するが（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９４；８（４）：６５２−８）、その活性化は全ての癌によって媒介されない。
【００４３】
一部の実施形態では、本構築物は、（任意選択的にそれらの間の介在性リンカーとともに）ＩＬ２Ｒβ部分のＣ末端でＣＤ２８の活性化ドメインを含む。ＣＤ２８についての配列もまた当分野において公知である；典型的なヒトＣＤ２８前駆体配列は、配列番号３８に示した。
【化４】
2019519215.tif 000006
好ましくは、これらの実施形態では、ＣＤ２８由来ドメインは、細胞内ドメイン、例えば配列番号３８のアミノ酸１８０〜２２０、すなわち、ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号３９）を含む。ＣＤ２８をコードする典型的な核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿００６１３９．３で入手できる。
【００４４】
制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）内のＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＣＤ２８（ＣＩＲＢ２８）
血液学的悪性腫瘍を有する患者は、一般に同種造血幹細胞移植片（ＡＨＳＣＴ）から利益を得られる。この戦略では、ドナー免疫系は、移植片対腫瘍として公知の現象における治癒可能性を備えて患者の腫瘍細胞を攻撃するであろう。だが残念なことに、ドナー免疫細胞はさらに、直後またはその後の１００日間のいずれかにレシピエント患者の健常組織を攻撃し、ＧＶＨＤを誘発する可能性がある。これは、ＡＨＳＣＴの１５％においては死亡および／または４０〜６０％において罹患率を引き起こすであろう。免疫抑制は、現在、ＧＶＨＤを管理するための標準看護法である（Ｌｕｚｎｉｋ  ａｎｄ  Ｆｕｃｈｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１０；４７（１−３）：６５−７７；Ｓｔｏｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１０；１６（１  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１８−２７）。しかし、転写因子であるＦｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｐ３（ＦＯＸＰ３）を発現するＴ−ｒｅｇ細胞（Ｒｏｎｃａｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；３５（６）：１６８１−９１；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９０；１７１（１）：１４１−５７）は、ＡＨＳＣＴ中にＧＶＨＤを抑制もしくは軽減することが見いだされている（Ｂｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２；１８９（１）：４６４−７４；Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２０１１；１１７（３）：１０６１−７０）。ＦＯＸＰ３発現の持続は、その第１イントロン内に位置する保存された非コーディング配列２（ＣＮＳ２）内における１１ＣｐＧモチーフの後成的脱メチル化によって維持される。この脱メチル化パターンはＴ−ｒｅｇの寿命にわたって持続し、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる再メチル化からＣＮＳ２内のＣｐＧモチーフを保護するために、ＩＬ２シグナル伝達によって活性化されたＳＴＡＴ５によってＣＮＳ２に動員される（Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１６；３９（１２）：８８８−９７）Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ−Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ＤＮＡジオキシゲナーゼによって保護される。同様に、Ｔ細胞活性化の重要なダウンレギュレーターであるＣＴＬＡ−４は、Ｔ−ｒｅｇにおいてアップレギュレートされ、さらにＩＬ２によって制御される（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１；５４（５）：４５３−８；Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  ２０１５；５６：６６−８０；Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２；３：１７９）。Ｔ−ｒｅｇは、それらの大規模なＣＤ２５発現（Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００１；１９３（１１）：１３０３−１０）およびケモカイン受容体ＣＣＲ７によってそれらがＩＬ２源に達する能力（Ｓｍｉｇｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１４；２１１（１）：１２１−３６）に起因して、ＩＬ２に対して極度に応答性である。しかし、活性化Ｔ−ｒｅｇは、ＣＤ２５発現を低下させ、それらのＩＬ２シグナル伝達をＩＣＯＳシグナル伝達経路にとって好都合に変化させることが証明されている。これは活性化されたが最終的には分化されなかったＴ−ｒｅｇ（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１０；３３（６）：９４２−５４）から前炎症性Ｔ細胞エフェクターへの転位、またはＩＦＮ−γ−産生前炎症性Ｔｈ１エフェクター細胞（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１７；１９８（７）：２６１２−２５；Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１１；１４０（７）：２０３１−４３；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１１；２０８（１０）：２０５５−６７）もしくはＴｈ１７さえへの発達を可能にするＦＯＸＰ３発現の不安定性をもたらす（４６）。手短には、Ｔ−ｒｅｇの長期活性化およびＣＮＳ２の脱メチル化ならびに増殖は、ＩＬ２およびＣＤ２８両方の共刺激を必要とする（Ｔａｎｇ  ａｎｄ  Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２００６；２１２：２１７−３７；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１；１８６（１１）：６３２９−３７）。
【００４５】
そこで本明細書に記載したＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＣＤ２８キメラは、ＮＫ９２細胞がＭＨＣ−１＋癌細胞由来の阻害性シグナルを無効にするため、および個別に、ＧＶＨＤを治療する目的でＴ−ｒｅｇを活性化するための二重使用を有することができよう。本明細書に記載したように、理論によって拘束することを望まなくても、ＩＬ２およびＣＤ２８由来の共刺激性シグナルを結合する新規キメラであるＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＣＤ２８（図１８）内へのＣＤ２８の活性化ドメインの添加は、ＭＨＣ−１＋を介して腫瘍回避を無効にすることに役立つであろう優れたＮＫ９２活性化をもたらすであろう。このキメラは、さらに長期間ＦＯＸＰ３発現を伴うＴ−ｒｅｇ細胞の増殖ももたらすことができよう。この戦略は、人工的抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、樹状細胞もしくはＴ−ｒｅｇ活性化および増殖のために必要とされる抗ＣＤ３抗体の使用を迂回することができよう。
【００４６】
核酸および発現ベクター
本明細書に記載した組成物は、本明細書に記載したキメラをコードする核酸分子を含むことができる。発現ベクターを含む核酸分子は、例えば、本明細書に記載したＮＫ細胞もしくはＴ−ｒｅｇ細胞内でキメラを発現させるために使用できる。
【００４７】
選択されたキメラをコードする核酸は、発現構築物を作製するために、発現ベクター内に挿入することができる。多数の好適なベクター、例えば、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、アデノウイルス由来ベクターまたは組換え細菌プラスミドもしくは真核細胞プラスミドを含むウイルスベクターは、当分野において公知である。例えば、発現構築物は、キメラに対するコーディング領域および１つ以上の調節領域、例えばプロモーター配列、例えば選択された細胞タイプ、条件付きプロモーターもしくは強力な一般的プロモーターに発現を限定するプロモーター配列；エンハンサー配列；未翻訳調節配列、例えば５’未翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ；ポリアデニル化部位；および／またはキメラの発現を指示するインシュレーター配列を含むことができる。そのような配列は、当分野において公知であり、当業者であれば好適な配列を選択できるであろう。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９５）、およびＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｊｕｎｅ  １５，２０１２）およびそれらの補遺ならびに他の標準的な検査室マニュアルを参照されたい。
【００４８】
発現構築物は、任意の生物学的に有効な担体、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に成分遺伝子を効果的に送達することができる任意の製剤もしくは組成物中で投与することができる。ウイルスベクターは、細胞を直接的にトランスフェクトする；プラスミドＤＮＡは、例えば、カチオン性リポソーム（例えば、リポフェクチン）もしくは誘導体化（例えば、コンジュゲート化した抗体）、ポリリシンコンジュゲート、グラミシジンＳ、人工的ウイルスエンベロープもしくは他のそのような細胞内担体ならびに遺伝子構築物の直接的注射もしくはＣａＰＯ４沈降法を用いて送達することができる。一部の実施形態では、核酸は、「裸」で細胞に適用される、すなわち、取込みを強化するための任意の追加の作用物質を使用せずに単純バッファー中で適用される。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ９．１０−９．１４およびその他の標準的な検査室マニュアルを参照されたい。
【００４９】
ＮＫ細胞およびＴ−ｒｅｇ細胞
本方法には、安定性もしくは一過性のいずれかで本明細書に記載したキメラをＮＫ細胞内、例えば、ＣＤ３−ＣＤ５６＋リンパ球内で発現させる工程が含まれる；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１３）１０，２３０−２５２を参照されたい。ＮＫ細胞は、一次細胞であってよく、例えば、被験者の末梢血由来であってよい、および体外で増殖させることができる、または培養ＮＫ細胞であってよい。
【００５０】
一次細胞が使用される場合は、免疫抑制に曝露させられておらず、十分に活性であるはずなので、同種ＮＫ細胞が好ましい。好ましい実施形態では、細胞は末梢血白血球を収集するためにハプロタイプが同一の関連ドナー上でアフェレーシスを実施することによって得られ、得られた末梢血白血球は次に任意選択的な増殖および投与の前にＣＤ３＋細胞が枯渇させられる。例えば、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．２０１５  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；２１（６）：４８６−４９１を参照されたい。または、細胞は、末梢血もしくは臍帯血細胞、幹細胞もしくは誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）さえからも入手することができる；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１３）１０，２３０−２５２を参照されたい。
【００５１】
例えば、ＮＫ−９２、ＫＨＹＧ−１、ＮＫＬ、ＮＫＧ、ＮＫ−ＹＳ、ＹＴ、ＹＴＳおよびｈａＮＫ−１細胞を含む培養ＮＫ細胞系は、新規なＮＫ細胞系を作製する方法として当分野において公知である。ＮＫ−９２は、非ホジキンリンパ腫に罹患している被験者の血液由来のＮＫ細胞から体外で不死化された細胞溶解性癌細胞系である。ＮＫ−９２細胞は、大多数の活性化受容体および細胞溶解性シグナル伝達経路を維持しているが、正常ＮＫ細胞によって提示される主要な阻害性受容体は欠如しており、Ｆｃ受容体ＣＤ１６を発現しないので、そこで抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することはできない。ＮＫ−９２細胞は、ヒトにおいて腫瘍選択的および非免疫原性である。ＮＫ−９２細胞系は、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．８：６５２−８（１９９４）；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：２８５９−６８（１９９８）；国際公開第１９９８／４９２６８号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００２／００６８０４４号明細書に記載されている。ＮＫ−９２細胞は、血液学的悪性腫瘍を含む癌における潜在的治療使用について評価されてきた；例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｍｂｅｒｇ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ｍａｙ；７（５）：３２９−３９；Ｔｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２００１  Ａｕｇ；１０（４）：５３５−４４；Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２００５；７（１）：１６−２２；Ｍａｌｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８  Ｏｃｔ；５７（１０）：１５４１−５２を参照されたい。ｈａＮＫは、高親和性Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）を発現するＮＫ−９２変異細胞系であり、臨床開発においてＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と結合されている。ｔａＮＫは、所定の腫瘍抗原に対するキメラ抗原受容体を発現する遺伝子を用いてトランスフェクトされている標的ＮＫ−９２細胞である。ＫＨＹＧ−１細胞は、ＩＬ−２依存性であり、グランザイムＭを生成するアグレッシブＮＫ白血病（Ｙａｇｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０００）１４，９２２−９３０）を有する患者の血液（から）開発された。ＮＫＬ細胞は、ＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋大顆粒リンパ球性（ＬＧＬ）白血病を有する患者の末梢血から樹立された（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９６  Ｆｅｂ；２４（３）：４０６−１５）。ＮＫＧ細胞は、急速進行性非ホジキンリンパ腫を有する患者の末梢血から樹立された（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１１；２０（１１−１２）：１７３１−４６）。ＮＫ−ＹＳ細胞は、全身性皮膚浸潤を備える白血病状態の鼻血管中心ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞リンパ腫を有する患者から樹立された（Ｔｓｕｃｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９８  Ａｕｇ  １５；９２（４）：１３７４−８３）。ヒトＮＫ様白血病細胞系であるＹＴ細胞は、急性リンパ芽球性リンパ腫（ＡＬＬ）および胸腺腫を有する患者の心嚢液中の細胞から樹立された（Ｙｏｄｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３４：１６２３−１６３０（１９８５））；Ｈａｒｎａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（２）：４７５−４７９（２０１１））。ＹＴＳは、ＮＫ細胞白血病株ＹＴのサブクローンである。これらの細胞系の全部が市販で入手可能である。ＮＫ細胞系に関する追加の情報については、Ｋｌｉｎｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：９１（２０１６）；Ｄａｈｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：６０５（２０１５）を参照されたい。細胞は、そのままで、または改変して、例えば米国特許第７６１８８１７号明細書；同第８０３４３３２号明細書（ＩＬ２を含むサイトカインを分泌するＮＫ−９２細胞）；同第８３１３９４３号明細書（ＣＤ１６を発現するＮＫ−９２細胞）；国際公開第２０１５１９３４１１号パンフレット（ＣＡＲ発現性ｎｋ−９２細胞）；および同第２０１６１６０６０２号パンフレット（ＣＤ１６を含むＦｃＲを発現するＮＫ−９２細胞）に記載されたように遺伝子改変して使用することができる。培養ＮＫ細胞を生成および製造するための追加の方法は、当分野において公知である；例えば、特に、培地、サイトカインおよび培養系についての典型的なパラメーターを提供するＣｈａｂａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；７：５０４を参照されたい。
【００５２】
本方法には、さらに安定性もしくは一過性のいずれかで、本明細書に記載したキメラ（例えば、ＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＣＤ２８キメラ）をＴ−ｒｅｇ細胞、すなわち、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞内で発現させる工程が含まれる。Ｔ−ｒｅｇ細胞は、一次細胞であってよい、例えば、被験者の末梢血由来であってよい、および体外で増殖させることができる、または培養Ｔ−ｒｅｇ細胞であってよい。
【００５３】
一次Ｔ−ｒｅｇ細胞が使用される場合は、体外で増殖させたドナーＴ−ｒｅｇ細胞、例えば、末梢血由来の天然型制御性Ｔ細胞（ｎＴ−ｒｅｇ）が好ましい。好ましい実施形態では、細胞は、当分野において公知の方法を使用して、ドナー由来の末梢血から入手する、および体外で増殖させる；例えばＤｉｅｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３（１１）：１３０３−１３１０（２００１）Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９８（４）：５３３−５３７（２０１３）；Ｈｉｐｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１１  Ｍａｙ  １８；３（８３）：８３ｒａ４１；およびＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００２；９９：３４９３−３４９９を参照されたい。または、細胞は、臍帯血から入手できる（例えば、Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１１  Ｊａｎ  ２０；１１７（３）：１０６１−１０７０を参照されたい）。
【００５４】
ＮＫ細胞およびＴ−ｒｅｇ細胞は、ＧＭＰ（医薬品製造管理および品質管理基準）を順守してＧＭＰ施設において維持されなければならない。
【００５５】
一部の実施形態では、ＮＫ細胞もしくはＴ−ｒｅｇ細胞は、例えば、腫瘍形成に対して保護するための安全性手段として、特異的および選択的作用物質の導入によって遺伝子を発現する細胞が殺滅されることを許容する自殺遺伝子を含むように遺伝子操作される。シトシンデアミナーゼ遺伝子、水疱−帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｐｔ遺伝子、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｄｅｏ遺伝子（例えば、Ｙａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．２００２  Ｊｕｌｙ；２６（７）：７８３−９を参照されたい）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓ９）（Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５：１６７３−１６８３（２０１１）およびＭｏｒｇａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）；２０：１１−１３）、チトクロムＰ４５０または、野生型もしくは突然変異ＴＫ遺伝子（例えば、ｔｋ３０、ｔｋ７５、ｓｒ３９ｔｋ）であってよい単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を含む多数の自殺遺伝子系は、当分野において公知である。ＴＫタンパク質を発現する細胞は、グランシクロビルを使用して殺滅できる。例えば、国際公開第２０１６１６０６０２号パンフレットを参照されたい。
【００５６】
本明細書に記載したキメラを発現するＮＫ細胞もしくはＴ−ｒｅｇ細胞ならびに共投与のための任意の補助的活性剤は、医薬組成物中に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には細胞および医薬上許容される担体を含む。「医薬上許容される担体」には、医薬投与と適合するあらゆる溶媒、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤などが含まれる（Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００）。そのような担体もしくは希釈剤の好ましい例としては、水、食塩液、リンゲル液、デキストロース液および５％のヒト血清アルブミンが挙げられるがそれらに限定されない。リポソームおよび例えば不揮発性油などの非水性ビヒクルもまた使用できる。補助的な活性化合物もまた組成物中に組み込むことができる。
【００５７】
無菌注射液は、活性化合物（例えば、本明細書に記載したＮＫ細胞もしくはＴ−ｒｅｇ細胞）を必要な量で適切な溶媒中に必要とされる１種もしくは複数成分の組合わせとともに組み込むことによって調製できる；好ましくは、溶媒は既に滅菌されている、または製剤を後に滅菌することができる。一部の実施形態では、細胞は、低温保存される。
【００５８】
癌免疫療法
本明細書に記載した方法には、異常なアポトーシス性もしくは分化プロセスに関連する障害、例えば、細胞増殖障害もしくは細胞分化障害、例えば、固形腫瘍および血液学的癌の両方を含む癌を治療する方法が含まれる。一部の実施形態では、障害は、固形腫瘍、例えば、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、皮膚癌もしくは大腸癌である。一般に、本方法には、本明細書に記載したキメラを発現する治療有効量のＮＫ細胞を、そのような治療を必要とする、または必要とすると決定されている被験者に投与する工程が含まれる。
【００５９】
この状況で使用する「治療する」は、異常なアポトーシス性もしくは分化プロセスに関連する障害の少なくとも１つの症状を緩和することである。例えば、治療は、腫瘍サイズもしくは増殖率の減少を生じさせることができる。異常なアポトーシス性もしくは分化プロセスに関連する状態を治療するための本明細書に記載した治療有効量の化合物の投与は、特に、腫瘍サイズの減少もしくは増殖率の減少、再発のリスクもしくは頻度の減少、再発の遅延、転移の減少、生存率の増加および／または罹病率および死亡率の低下を生じさせるであろう。
【００６０】
細胞増殖障害および／または分化障害の例としては、癌、例えば癌腫、肉腫、転移性障害もしくは造血性腫瘍性障害、例えば白血病が挙げられる。転移性腫瘍は、前立腺、大腸、肺、乳房および肝臓起源のものが含まれるがそれらに限定されない複数の原発腫瘍タイプから発生する可能性がある。
【００６１】
本明細書で使用する用語「癌」、「高増殖性」および「腫瘍性」は、自立増殖のための能力、すなわち高増殖性細胞増殖を特徴とする異常な状態もしくは状況を有する細胞を意味する。高増殖性および腫瘍性疾患状態は、病理的である、すなわち疾患状態を特徴とする、もしくは構成すると分類することができる、または非病理的である、すなわち正常からは逸脱するが、疾患状態には関連していないと分類することができる。この用語は、組織病理学的タイプもしくは侵襲性の段階とは無関係に、あらゆるタイプの癌性増殖もしくは発癌性プロセス、転移性組織もしくは悪性に形質転換した細胞、組織もしくは器官を含むことが意図されている。「病理的高増殖性」細胞は、悪性腫瘍増殖を特徴とする疾患状態において発生する。非病理的高増殖性細胞の例としては、創傷修復に関連する細胞の増殖が挙げられる。
【００６２】
用語「癌」もしくは「腫瘍」には、例えば肺、乳房、甲状腺、リンパ組織、消化管および尿生殖路に影響を及ぼす様々な器官系の悪性腫瘍ならびに例えば大多数の大腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌および食道の癌を含む腺癌腫が含まれる。
【００６３】
用語「癌腫」は当分野において認識されており、呼吸器系癌腫、消化器系癌腫、尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫および黒色腫を含む上皮組織もしくは内分泌組織の悪性腫瘍を意味する。一部の実施形態では、疾患は、腎癌腫もしくは黒色腫である。典型的な癌腫には、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、大腸および卵巣の組織から形成される癌腫が含まれる。この用語には、さらに、例えば癌腫性および肉腫性組織から構成される悪性腫瘍を含む癌肉腫が含まれる。「腺癌腫」は、腺組織に由来する、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を意味する。
【００６４】
用語「肉腫」は、当分野において認識されており、間葉組織由来の悪性腫瘍を意味する。
【００６５】
増殖性障害の追加の例としては、造血性腫瘍性疾患が挙げられる。本明細書で使用する用語「造血性腫瘍性障害」には、例えば、骨髄、リンパ球もしくは赤血球系統の高増殖性／腫瘍性細胞またはそれらの前駆細胞に関係する疾患が含まれる。好ましくは、疾患は、低分化急性白血病、例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から発生する。追加の典型的な骨髄障害には、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７−９７において精査されている）が含まれるがそれらに限定されない；リンパ性悪性腫瘍には、Ｂ系統ＡＬＬおよびＴ系統Ａｌｌ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＬＬ）およびワルデンストレーム・マクログロブリン血症（ＷＭ）を含む急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）が含まれるがそれらに限定されない。悪性リンパ腫の追加の形態には、非ホジキンリンパ腫およびそれらの変形、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大型顆粒リンパ球白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード・シュテルンベルク病が含まれるがそれらに限定されない。
【００６６】
ＧＶＨＤおよび自己免疫疾患
本明細書に記載した方法には、異常な免疫応答に関連する障害、例えば、移植片対宿主病もしくはＧＶＨＤまたは自己免疫疾患を治療する方法が含まれる。本法は、それを必要とする被験者に本明細書に記載したＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＣＤ２８キメラを発現する制御性Ｔ細胞を投与する工程を含むことができる。
【００６７】
同種骨髄移植（ＢＭＴ）は、血液学的悪性腫瘍および一部の固形腫瘍においては有効であることが証明されてきたが、ＧＶＨＤの高い発生率がＢＭＴの有効性および使用を制限している。Ｔ−ｒｅｇ細胞は、ＧＶＨＤの抑制における有効性を証明してきた；例えば、Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１０  Ｍａｙ  ２７；１１５（２１）：４２９３−３０１；Ｓｕｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｏ，ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，２０１３；２：２５−３２；Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３（１１）：１３０３−１３１０（２００１）Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９８（４）：５３３−５３７（２０１３）；Ｈｉｐｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１１  Ｍａｙ  １８；３（８３）：８３ｒａ４１；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００２；９９：３４９３−３４９９；およびＢｒｕｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１７（３）：１０６１−１０７０）を参照されたい。
【００６８】
Ｔ−ｒｅｇ機能もしくはＴ−ｒｅｇに対するエフェクターＴ細胞の耐性の損傷は、例えば、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）（Ｂｒｕｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００５；５４（５）：１４０７−１４）、関節リウマチ（ｖａｎ  Ａｍｅｌｓｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４；５０（９）：２７７５−８５）、多発性硬化症（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９；１８３（１１）：７６０２−１０）、全身性紅斑性狼瘡（Ｌｙｓｓｕｋ  ｅｔ  ａｌ，．Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２００７；６０１：１１３−９）および乾癬（Ｓｕｇｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；１７４（１）：１６４−７３）ならびにアトピー性疾患（Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；５：４６）などの多数の自己免疫疾患において報告されてきた。Ｔ−ｒｅｇ内のＣＤ２５発現の上昇は、それらを特にＩＬ２に対して応答性にさせる。これは特に、例えば、低用量ＩＬ−２の投与がＴ−ｒｅｇ生存率を促進し、糖尿病に対してＮＯＤマウスを保護するＴ１Ｄの症例において利用されており（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００８；２８（５）：６８７−９；Ｇｒｉｎｂｅｒｇ−Ｂｌｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１０；２０７（９）：１８７１−８）、Ｔ−ｒｅｇの注入は小児の１型糖尿病におけるβ細胞機能を維持した（Ｍａｒｅｋ−Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ（２０１２）３５：１８１７−２０１０）。
【００６９】
Ｔ−ｒｅｇ、例えば、任意選択的に同様にＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＣＤ２８キメラを発現するＦＯＸＰ３＋であるＣＤ４＋ＣＤ２５＋、例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔｒｅｇ（例えば、アトピー性Ｔ−ｒｅｇのためのＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７−ＩＣＯＳ＋もしくはＧＶＨＤのためのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−ＣＤ６２Ｌ＋）は、ＧＶＨＤおよび自己免疫性を媒介して宿主組織を損傷させると考えられる同種反応性Ｔ細胞を減少させるために使用できる。これらの実施形態では、本明細書に記載したＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＣＤ２８キメラを発現するＴ−ｒｅｇの有効量は、自己応答性Ｔ細胞の数を減少させるため、および例えば、ドナーＴ細胞増殖の減少およびＴ細胞アポトーシスの増加によって自己免疫応答を減少させるために有効な量である。例えば、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；５：４６；Ｒｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００９  Ｍａｙ；３０（５）：６５６−６６５を参照されたい。
【００７０】
投与方法および容量
本方法は、好ましくは、本明細書に記載した治療有効量のＮＫ細胞の静脈内注入による投与を含む。治療有効量は、経験的に、例えば、動物実験および臨床試験に基づいて決定することができる。一部の実施形態では、本方法は、投与１回当たり端点を含めて少なくとも細胞１０４個〜１×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、３×１０８個、５×１０８個、１×１０９個もしくは５×１０９個、例えば細胞１０億個〜３０億個またはこれらの数の任意の２つの間の任意の範囲内の１回以上の注入を含む。細胞は、被験者に１回投与することができる、または複数回にわたり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３時間毎に１回、または１、２、３、４、５、６もしくは７日間毎に１回、または治療期間中、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間以上、または端点を含めてこれらの数の任意の２つの間の任意の範囲内に１回投与することができる。例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｍｂｅｒｇ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ｍａｙ；７（５）：３２９−３９；Ｔｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２００１  Ａｕｇ；１０（４）：５３５−４４；Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２００５；７（１）：１６−２２；Ｍａｌｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８  Ｏｃｔ；５７（１０）：１５４１−５２；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１３）１０，２３０−２５２を参照されたい。
【００７１】
好ましい実施形態では、被験者に注入される前に、細胞は、それらがもはや増幅することができないが、それでも細胞障害活性を維持するように処置される。この状態を達成する１つの方法は、例えば５００〜１，０００ｃＧｙまたは５００、１，０００、２，０００もしくは３，０００ｃＧｙを用いるγ照射による。約７５０〜１，０００グレイの間、例えば、７５０、８００、８５０、９００および９５０グレイの線量でのＮＫ−９２細胞のγ線照射は、この目的のために十分であると考えられる。例えば、紫外線を含む追加の照射の形態が使用され得る。このために使用するために好適な源には、例えば、１３７Ｃｓ源（Ｃｉｓ−ＵＳ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．；Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ４０，Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｔｄ．，Ｃａｎａｄａ）が含まれる。または、細胞は、上記の自殺遺伝子を含むことができる。
【００７２】
一部の実施形態では、ＮＫ細胞注入前、被験者は、予備的化学療法レジメン、例えば、高シクロホスファミドおよびフルダラビン（Ｈｉ−Ｃｙ［６０ｍｇ／ｋｇ×２日間］／Ｆｌｕ［２５ｍｇ／ｍ２×５日間］）、低シクロホスファミド（７５０ｍｇ／ｍ２）およびメチルプレドニゾン（１，０００ｍｇ／ｍ２）もしくはフルダラビン単独（２５ｍｇ／ｍ２×５日間）および／または全身照射、例えば２００〜５００の、例えば４００ｃＧｙの線量の照射を用いて処置することができる。
【００７３】
併用療法：チェックポイント阻害剤および抗腫瘍モノクローナルｍＡｂ
一部の実施形態では、本明細書に記載したキメラを発現するＮＫ細胞は、１種以上のチェックポイントブロック剤および／または抗腫瘍抗体を含む治療レジメンの一部として投与される。ＮＫ細胞は、チェックポイントブロック剤および／または抗腫瘍抗体と同時に、例えば、実質的に同時もしくは連続的に、例えばチェックポイントブロック剤および／または抗腫瘍抗体の投与の４８、２４、１２、６、５、４、３、２もしくは１時間以内、または４５、３０、２０もしくは１５分間以内に投与することができる。
【００７４】
本明細書で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子もしくはその免疫学的に活性部分、すなわち抗原結合部分を意味する。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、抗原に結合する能力を維持しているＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。そのような断片は、市販により、または当分野において公知の方法を使用して入手できる。例えば、Ｆ（ａｂ）２断片は、通常はＦｃ部分の１つのＦ（ａｂ）２断片および数多くの小ペプチドを生成する非特異的エンドペプチダーゼであるペプシンなどの酵素を用いて抗体を処置することによって生成することができる。結果として生じるＦ（ａｂ）２断片は、２つのジスルフィド結合Ｆａｂ単位から構成される。Ｆｃ断片は、広範に分解され、透析、ゲル濾過もしくはイオン交換クロマトグラフィーによってＦ（ａｂ）２から分離することができる。Ｆ（ａｂ）断片は、還元剤の存在下でＩｇＧ分子を類似サイズの３つの断片：２つのＦａｂ断片および１つのＦｃ断片に消化する非特異的チオール−エンドペプチダーゼであるパパインを使用して生成できる。Ｆｃ断片が関心対象である場合、パパインは、５０，００ダルトンのＦｃ断片を産生するために選択酵素である；Ｆ（ａｂ）断片を単離するためには、Ｆｃ断片は、例えば、タンパク質Ａ／Ｇを使用する親和性精製によって除去することができる。Ｆ（ａｂ）断片を生成するためには、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＩｇＧ１  ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２調製キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を含む、多数のキットを市販で入手することができる。さらに、抗原結合断片を生成するための市販で入手することができるサービス、例えば、Ｂｉｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨを使用できる。
【００７５】
抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、組換え、例えば、キメラ、脱免疫化もしくはヒト化、完全ヒト、非ヒト、例えば、マウスもしくは一本鎖抗体であってよい。一部の実施形態では、抗体は、エフェクター機能を有し、補体を固定することができる。一部の実施形態では、抗体は、Ｆｃ受容体に結合する減少した能力を有する、または結合する能力を有していない。例えば、抗体は、Ｆｃ受容体への結合を支持しないアイソタイプもしくはサブタイプ、断片もしくは他の突然変異体であってよい、例えば、突然変異もしくは欠失したＦｃ受容体結合領域を有する。抗体は、毒素もしくはイメージング剤に結合させることができる。
【００７６】
治療用抗腫瘍抗体もまた当分野において公知であり、腫瘍抗原に結合するヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体が含まれる。抗体は、典型的にはモノクローナルであり、例えば、裸、コンジュゲート化もしくは二重特異性であってよい。特定の例としては、アレムツズマブ、リツキスマブ（ｒｉｔｕｘｕｍａｂ）、トラスツズマブ、イブリツモマブ、ゲムツズマブ、ブレンツキシマブ、アドトランスツズマブ（ａｄｏｔｒａｎｓｔｕｚｕｍａｂ）、ブリナツノマブ（ｂｌｉｎａｔｕｎｏｍａｂ）、ダラツムマブおよびエロツズマブ；アブシキシマブ；アダリムマブ；アレファセプト；バシリキシマブ；ベリムマブ；ベズロトクスマブ；カナキヌマブ；セルトリズマブペゴル；セツキシマブ；ダクリズマブ；デノスマブ；エファリズマブ；エロツズマブ；ゴリムマブ；インフレクトラ；イピリムマブ；イキセキズマブ；ナタリズマブ；ニボルマブ；オビムツズマブ；オララツマブ；オマリズマブ；パリビズマブ；パニツムマブ；ペムブリリズマブ；トシリズマブ；セクキヌマブ；およびウステキヌマブが挙げられる。癌関連抗原に対する多数の抗体は公知である；典型的な抗体は、表２〜３に記載されている（Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １１９（４）：４７２−４８５，２００３）。本方法は、例えば、治療のための抗腫瘍抗体（例えば、乳癌を有する被験者に対してはトラスツズマブと組み合わせた、ホジキンリンパ腫を有する被験者においてはベルンツキシマブと組み合わせた、多発性骨髄腫を有する被験者においてはダラツムマブと組み合わせた、または多発性骨髄腫を有する被験者においてはエロツズマブと組み合わせたＮＫ細胞）が承認されている癌を有する被験者を治療するために使用できる。
【００７７】
チェックポイントブロック剤は、当分野において公知であり、ＣＴＬＡ−４（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ）；ＰＤ−１（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＢＧＢ−Ａ３１７）；ＰＤ−Ｌ１（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブ）に向けられた抗体が含まれる。
【実施例】
【００７８】
本発明について、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を制限するものではない下記の実施例においてさらに説明する。
【００７９】
材料および方法
下記の実施例では、下記の材料および方法を使用した。
【００８０】
試薬  −  デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、クロロキンおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（製品番号１２６−２．５）およびヒトグリコシル化ＩＬ２は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．製であった。ウマ血清（ＨＳ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、リポフェクタミン２０００およびＴＲＩｚｏｌは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製であった。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ製であった。ＲＰＭＩ  １６４０は、ＬＯＮＺＡ製であった。Ｓｍａｒｔｓｃｒｉｂｅ  ａｎｄ  Ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ  Ｏｎｅｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｔａｋａｒａキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製であった；Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製であり、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製であった。ヒトＴＧＦβ１は、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．製であった。ＩＬ２は、ＭＧＨ−ＤＦ／ＨＣＣ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｒｅ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）製であった。ヒトＩＬ−４は、Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．製であった。抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）ヒト化抗体は、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．製であった。
【００８１】
プラスミド  −  パッケージングプラスミドｐＶＳＶは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製であり、ｐＣＭＶ−ｄＲ８．２  ｄｖｐｒは、Ａｄｄｇｅｎｅ製であった（プラスミド第８４５５号）。レンチウイルスベクターＣＳＣＷ−ＧＦＰおよびＣＳＣＷ−ｍＣｈｅｒｒｙは、ＭＧＨ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）製であった。
【００８２】
細胞  −  ＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＫ９２、ＮＫ９２−ＭＩ  Ｕ２５１、ＰＣ−３、ＨｅｐＧ２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｐａｎｃ−１、Ｕ２５１、ＢＴ４７４およびＵ２６６細胞は、ＡＴＣＣからであった。Ｕ２６６−ＧＦＰ−ＬｕｃおよびＮＫ９２−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｌｕｃ細胞は、ＣＳＣＷ−ＧＦＰおよびＣＳＣＷ−ｍＣｈｅｒｒｙレンチウイルスベクター各々を使用するレンチウイルス形質導入によって生成した。腫瘍細胞系ＰＣ−３、Ｕ２５１、Ｕ２６６、Ｐａｎｃ−１、ＢＴ４７４およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ＨＥＫ２９３ＴおよびＨｅｐＧ２細胞は、完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。ＮＫ９２および由来細胞系は、１０％の熱不活化ＦＢＳと０．２ｍＭのＩ−イノシトール、０．０２ｍＭの葉酸、０．１ｍＭの２−βメルカプトエタノール、２ｍＭのＬ−グルタミンが補給された１０％の熱不活化ウマ血清とを含むＲＰＭＩ１６４０中で培養し、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を加える。全細胞系およびアッセイ培養は、３７℃および５％のＣＯ２で維持した。
【００８３】
キメラＣＩＲＢの構築  −  ＩＬ２  ｃＤＮＡは、ヒト脳全ＲＮＡから、フォワードプライマー５’−ＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＣＣ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５’−ＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号２）を使用するＲＴＰＣＲによって増幅させ、ｐＣＤＮＡ４−ＴＯ中のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ内でクローン化した。ＣＩＲＢキメラを構築するために、本発明者らは、最初にＩＬ２およびその受容体ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインからキメラを構築したが、これはＮＫ９２全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによってＩＬ２のＣ末端（停止コドンの前の１２アミノ酸）を架橋し、ＩＬ２Ｒαのアミノ酸１８７〜１９４の間の配列ならびにＩＬ２プラスミドの非コーディング３’アミノ酸配列であるｃＭｙｃ  Ｔａｇを含有するフォワードオリゴ
【化５】
2019519215.tif 000007
を使用して増幅させた。このプライマーは、リバースオリゴ
【化６】
2019519215.tif 000008
とともに使用した。増幅断片は、結果としてＩＬ２−ＩＬ２Ｒαキメラを生じさせるＩＬ２野生型を突然変異させるためのオリゴとして使用した。ＣＩＲＢ最終キメラ構築物を構築するために、ＩＬ２受容体αキメラを使用してＣ末端ｃＭｙｃタグ、その後にＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインのみ、次にフォワード５’−ＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＣＣ−３’（配列番号５）およびリバース５’−ＧＧＧＡＡＧＴＧＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＣＧＣＡＧＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＧＡ−３’（配列番号６）を使用するＩＬ２ＲβのＮ末端断片によってＩＬ２を増幅させた。これは後にＩＬ２ＲβのＮ末端を導入する。生成物は、次に同一フォワードプライマーおよびリバース
【化７】
2019519215.tif 000009
を使用して再増幅させた。ＩＬ２中のＸｂａＩ部位は、最初にフォワードプライマー５’−ＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣ−３’（配列番号８）およびリバースプライマー５’−ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号９）を使用する突然変異により除去した。ＩＬ２Ｒβは、次に、フォワードプライマー
【化８】
2019519215.tif 000010
およびリバースプライマー
【化９】
2019519215.tif 000011
を使用して増幅させた。次に断片ＩＬ２−ｃＭｙｃ−ＩＬ２Ｒαは開放Ｘｈｏ−ＸｂａＩであったが、ＩＬ２Ｒβは、最終キメラＣＩＲＢを形成するためのＳａｌＩ−ＸｂａＩ断片として加えた。ＩＬ２およびＣＩＲＢはどちらもｐｃＤＮＡ４−ＴＯからＳｐｅＩ（鈍端）およびＸｈｏＩを使用して、ＢａｍＨＩ（鈍端）およびＸｈｏＩにより消化されたＣＳＣＷ−ｍｃｈｅｒｒｙレンチウイルスベクターに移行させた。全構築物をシーケンシングし、レンチウイルス完全性について検証した。
【００８４】
レンチウイルスの生成および形質導入  −  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、リポフェクタミン２０００を、ｐＶＳＶ、ｐＣＭＶｄｒ８．２ｄｖｒｐの２．４μｇのＤＮＡおよびレンチウイルス構築物ＣＳＣＷ−ＧＦＰまたはＣＩＲＢもしくはＩＬ２構築物いずれかを発現するＣＳＣＷ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターとともに各々１：０．４：１の比率を使用して、２５μＭのクロロキンとともに用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、培地を取り替え、細胞を３６時間にわたりインキュベートし、その後にレンチウイルス上清を収集し、０．４５μｍのシリンジフィルターに通して濾過した。ウイルス力価は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を発現するｍＣｈｅｒｒｙの連続希釈および計数によって決定した。ＮＫ９２細胞は、２×１０５個の細胞を含有する２ｍＬのエッペンドルフ試験管中で細胞１個当たりレンチウイルス粒子４６個の最適感染多重度（ＭＯＩ）で４５分間にわたり１，８００ｇでのスピノキュレーションによって感染させた。感染した細胞は、次に１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２が補給された６ウエルプレート内でプレーティングした。２日後、培地を取り替えたが、ＩＬ２は含まれていなかった。ＩＬ２（ＮＫ９２ＩＬ２）もしくはＣＩＲＢ（ＮＫ９２ＣＩＲＢ）を発現するＮＫ９２細胞系は、その後は、外因性ＩＬ２から永久的に引き離された。
【００８５】
ＮＫ９２ＣＩＲＢの増殖をＮＫ９２ＩＬ２、親ＮＫ９２およびＩＬ２非依存性ＮＫ９２−ＭＩ細胞系と比較した。６０×１０３個の細胞を３日間にわたり６ウエルプレート内で培養し、その後に３ｍＬの新鮮培地をさらに３日間にわたり旧培地の上部に添加した。生存細胞は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＴＣ２０（商標）自動化細胞計数機を使用してトリパンブルー排除によって計数した。タンパク質の発現は、超音波処理によって得られた全細胞溶解物を対象とするウェスタンブロットによって検出した。
【００８６】
フローサイトメトリー  −  ＮＫ細胞マーカーの発現は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡから購入したＣＤ４５−ＡＰＣ−ＣＹ７、ＣＤ２５−ＦＩＴＣ、ＣＤ１６−ＰＥ、ＣＤ３−ＰＥＣＹ７、ＣＤ５６−ＰＡＣ  ＢＬＵＥおよびＣＤ１２２−ＰＥに対するマウス抗ヒト抗体を使用して検証した。ＮＫＧ２Ｄ−ＡＰＣに対する抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＤＡＰＩであったが、マウス抗ｃＭｙｃ：ｓｕｒｅＬｉｇｈｔ  ＡＰＣはＣｏｌｕｍｂｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製であった。細胞は、アルゴンイオンレーザー励起（励起のために６３３ｎｍおよび３５ｍＷ）を使用するＢＤ５レーザーＳＯＲＰ  ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ  Ｄｉｖａシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＭＧＨフローサイトメトリーコア施設に貯蔵された。無傷細胞は、４８８ｎｍでの励起および３２０ｍＷからの前方散乱光および側方散乱光を使用してゲーティングした。データ収集は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して１０５事象／サンプルを分析することによって実施した。ＦＡＣＳデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して分析した。ヒト一次ＮＫ細胞は、Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ（商標）ヒト濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者のプロトコールにしたがって使用して健常ドナーの末梢血から抽出した。
【００８７】
ＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の細胞傷害活性  −  親ＮＫ９２細胞系（ＩＬ２、１００ＩＵ／ｍＬを用いて２４時間にわたり予備刺激した）と比較してＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢの細胞溶解作用を評価するため。（確実な粘着のために選択された）８×１０３個のＵ２６６ＧＦＰ細胞を９６ウエルプレート内で３回ずつプレーティングした。２４時間後にＮＫ細胞系を１／８、１／４、１／２、１／１および２／１のエフェクター／標的細胞比（Ｅ／Ｔ）で加えた。２日間の共培養後のＮＫ細胞は、Ｕ２６６ＧＦＰ細胞のさらなる殺滅を可能にするために懸濁させた。計４日間の共培養後、Ｕ２６６ＧＦＰ細胞生存率は、４８５ｎｍでの励起および５１５ｎｍでの発光によりＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２マイクロプレート蛍光リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して評価した。
【００８８】
また別の実験セットでは、１つのパネルの５種の癌細胞系Ｕ２５１ＧＭ、ＰＣ−３、Ｐａｎｃ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｅｐＧ２細胞にＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢが及ぼす抗癌作用を評価した。各癌細胞系について３２×１０３個の細胞を最初に２４ウエルプレート内で（ＩＬ２、１００ＩＵ／ｍＬを用いて予備刺激した）ＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２もしくはＮＫ９２ＣＩＲＢを２／１のＥ／Ｔ比の標的癌細胞を添加する前の２４時間（図３Ｂ）、または各癌細胞系に対して０／１、１／１、２／１および３／１のＥ／Ｔ比でＮＫ９２ＩＬ２もしくはＮＫ９２ＣＩＲＢを添加する前に５時間のみ（図３Ｃ）のいずれかでプレーティングした。共培養した細胞は、次に４日間インキュベートした。この時間の後の癌細胞の細胞生存率は、１０％アルコール溶液中の０．１％のクリスタルバイオレットを用いて決定し、その後に７０％のエタノールを用いた抽出および５９５ｎｍでの吸光度を読み取った。
【００８９】
Ｈｅｒ２陽性乳癌細胞系ＢＴ４７４に対するＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢのＡＤＣＣ
標的乳癌ＢＴ４７４（細胞８×１０３個）は、９６ウエルプレート内でプレーティングした。２４時間後、細胞は、１μｇ／ｍＬのトラスツズマブとともに室温で２０分間インキュベートし、その後に２：１のＥ／Ｔ比でエフェクター細胞を添加した。３日間のインキュベーション後、癌細胞の生存率は、上記で説明したクリスタルバイオレット／アルコール抽出アッセイを使用して決定した。
【００９０】
免疫抑制剤への事前曝露がＮＫ細胞の細胞傷害性および生存率に及ぼす影響  −  ＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ（細胞６４×１０３個）をプレーティングし、２４時間にわたりＴＧＦβ１（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｉｌ−４（２０ｎｇ／ｍＬ）もしくはＤｅｘ（０．５μＭ）へ曝露させた。この時間中に、親ＮＫ９２細胞を２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ２とともにインキュベートした。癌細胞Ｕ２５１ＧＭ、ＰＣ−３、Ｐａｎｃ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｅｐＧ２細胞（細胞３２×１０３個）を次に２：１のＥ／Ｔ比でＮＫ細胞に添加した。共培養した細胞を次に４日間インキュベートした。この期間後の癌細胞の細胞生存率は、クリスタルバイオレット／アルコール抽出アッセイを使用して決定した。
【００９１】
免疫抑制剤ＴＧＦβ１、ＩＬ−４およびＤｅｘがＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ（細胞３０×１０３個）の増殖に及ぼす影響を決定するために、１２ウエルプレート内で３例ずつプレーティングし、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）もしくはＤｅｘ（１μＭ）下で３日間増殖させ、次に計６日間にわたり同一条件下でさらに３日間の増殖期間毎に取り替えた。その期間後、細胞生存率をトリパンブルーによって決定した。
【００９２】
腫瘍増殖遅延実験  −  ５週齢（２４〜２５ｇ）の雄性ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ免疫欠損マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、比較医学のためにＭＧＨセンターに収容した。これらの動物にはＢ細胞およびＴ細胞ならびにＮＫ細胞が欠如しているので、したがって改変ＮＫ細胞の治療有効性を評価するための好適なプラットフォームを提供する。Ｕ２５１細胞もしくはＰＣ−３細胞は、２０％のＭａｔｒｉｇｅｌを含有する無血清ＲＰＭＩ中に懸濁させ、０．５インチの２９ゲージニードルおよび１ｍＬのインスリンシリンジを使用して０．５ｍＬの用量で、ＰＣ−３については細胞４×１０６個またはＵ２５１については細胞３×１０６個として皮下注射した。腫瘍面積（長さ×幅）はバーニヤ付きカリパス（Ｍａｎｏｓｔａｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して週２回測定し、腫瘍容積は：容積＝π／６（長さ×幅）３／２に基づいて計算した。ＮＫ９２ＣＩＲＢもしくはＮＫ９２ＩＬ２を用いた処置は、平均腫瘍容積がＰＣ−３については約２００ｍｍ３またはＵ２５１については約１６０ｍｍ３に達した時点に開始した。ＰＣ−３腫瘍を有する動物については、新しく調製したＮＫ細胞を５００ｃＧｙで照射したＰＢＳ中に懸濁させ、尾静脈を介して４週間毎に注射した（マウス１匹当たり２００μＬ中に細胞１５×１０６個）。Ｕ２５１細胞を有する動物のためには、ＮＫ９２ＣＩＲＢもしくはＮＫ９２ＩＬ２は照射されなかった。
【００９３】
末梢血中のＮＫ９２ＣＩＲＢおよびＮＫ９２ＩＬ２の検出  −  Ｕ２５１ＭＧ腫瘍細胞をＮｏｄ／ｓｃｉｄマウスにおいて皮下増殖させた。腫瘍サイズが約１６０ｍｍ３に達した時点に非照射ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞（マウス１匹当たり２００μＬ中細胞１０７個）は、尾静脈を介して注射した。非照射ＮＫ細胞（細胞５×１０６個）の第２回注射は、４日後に実施した。１７日後、動物を殺滅し、各群３匹の動物から心血液を採取した。ヘパリン加血液を処理し、ヒト特異的抗ＣＤ４５および内部リボソーム刺入部位を介してＩＬ２もしくはＣＩＲＢとともに排他的に共発現させられているｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質を使用してフローサイトメトリーによって分析した。
【００９４】
照射ＮＫ９２ＣＩＲＢおよびＮＫ９２ＩＬ２細胞の生存率  −  １０Ｇｙ（０．８３Ｇｙで１２分間）での照射後、次にＮＫ９２ＣＩＲＢおよびＮＫ９２ＩＬ２を培養し、それらの生存率を３日間にわたり２４時間毎にトリパンブルーを使用して決定した。
【００９５】
ＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ内の細胞傷害性エフェクターの発現プロファイル  −  天然細胞傷害性受容体であるＮＫＰ３０、ＮＫＰ４４、ＮＫＰ４６、細胞溶解性酵素パーフォリン−１およびグランザイム−ＢならびにサイトカインＴＮＦαおよびＩＦＮ−γの発現プロファイルは、表１に列挙したプライマーを使用するｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。結果は、比較ＣＴ（ΔΔＣＴ）法を使用して分析し、各サンプルのＧＡＰＤＨ  ＲＮＡ含量に対して正規化した後にＮＫ９２親細胞系に比較したＲＮＡ倍率として表示した。
【００９６】
【表１】
2019519215.tif 000012
【００９７】
統計的分析  −  統計的有意差は、両側スチューデント検定、一元配置ＡＮＯＶＡ、一対テューキー多重比較検定によって決定した。全検定は、未処置サンプルとの比較または検定で指示されたような比較を含んでいた。統計的有意差は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１によって表示した。分析は、Ｐｒｉｓｍソフトウエアバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して実施した。
【００９８】
実施例１．ＣＩＲＢキメラの設計および構築
ＩＬ２およびその受容体複合体の四次結晶構造（２０）は、ＩＬ２のＣ末端およびＩＬ２ＲβのＮ末端残基が４１Åによって分離されることを示している。ＩＬ２とＩＬ２ＲβのＮ末端との間のリンカーのために、本発明者らは、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン（ＥＭＥＴＳＱＦＰＧＥＥＫＰＱＡＳＰＥＧＲＰＥＳＥＴＳＣ（配列番号２８））を選択する。ｃＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２９））は、ＩＬ２とリンカーとの間に添加した。完全成熟受容体ＩＬ２Ｒβタンパク質コーディング配列（シグナルペプチドを含まない）は、完全キメラＣＩＲＢを産生するためにリンカーの後に置いた（図１）。ＣＩＲＢおよびＩＬ２のどちらもｍＣｈｅｒｒｙを共発現するレンチウイルスベクター内でクローニングした。リンカーフォールドは、コンピューターを使用してヘリックス優勢構造であると予測された（図５Ａ〜Ｄ）。リンカー柔軟性は、Ｋａｒｐｌｕｓ  ａｎｄ  Ｓｈｕｌｔｚ法のコンピューターを使用する方法（４７）を用いて評価し、全ペプチド結合で平均より優れた柔軟性（０〜２のスケール上で１以上）が示された。
【００９９】
結果として生じた配列は、以下に示した。
【０１００】
ＩＬ２−ＩＬ２Ｒβのヌクレオチド配列：
【化１０】
2019519215.tif 000013
【０１０１】
ＩＬ２−ＩＬ２Ｒβのタンパク質配列
【化１１】
2019519215.tif 000014
【０１０２】
実施例２．キメラＣＩＲＢの細胞表面発現
４６の同一ＭＯＩを備えるレンチウイルス媒介性安定性発現後、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞系は、ＩＬ２非依存性を獲得し、無限に増殖する。どちらの細胞系も６日間の期間中に類似の、およびまた別のＩＬ２非依存性細胞系であるＮＫ９２−ＭＩより高速の増殖を示し（図６Ａ〜Ｂ）、親ＮＫ９２細胞系およびＮＫ９２−ＭＩと比較して、培養中での複数回の凍結およびプレーティングサイクルを受けた後に強固な生存率を示した。抗ｃＭｙｃモノクローナル抗体を使用して、本発明者らは、次に一過性でトレンスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（図２Ａ）および安定性ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞（図２Ｂ）の細胞表面でのＣＩＲＢの発現を試験した。本発明者らは、ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞内ではｃＭｙｃの表面発現の明確な証拠を見いだしたが、ＮＫ９２ＩＬ２細胞内では見いだせなかった。ＣＩＲＢ発現は、さらに天然ＩＬ２Ｒβを認識する抗ＣＤ１２２モノクローナル抗体を使用してさらに確証され、ならびにキメラは、内因性ＣＤ１２２が、ＩＬ２ＲβおよびＣＩＲＢの両方を発現するＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞系内より低いレベルであるが、ＮＫ９２ＩＬ２細胞内で予想通りに存在することを示している。全長キメラＣＩＲＢの発現は、モノクローナル抗ヒトＩＬ２を使用してウエスタンブロットによってさらに検出された。図２Ｄは、８０ｋＤａの予想サイズより高く、おそらくは翻訳後グリコシル化に起因すると思われる９５ｋＤａの全長サイズを示している。
【０１０３】
実施例３．親ＮＫ−９２細胞系および改変細胞系の細胞傷害性
本発明者らは、付着性の多発性骨髄腫細胞系Ｕ２６６ＧＦＰに対するＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の細胞傷害性を比較した。図３Ａは、親ＮＫ９２細胞系は、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を用いて予備刺激されたにもかかわらず、ＮＫ９２ＩＬ２もしくはＮＫ９２ＣＩＲＢよりもはるかに低細胞傷害性であったことを示す。注目すべきことに、ＩＬ２は、４日間の共培養中に存在しなかった。ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞は、Ｕ２６６ＧＦＰに向けての同等の細胞傷害性を示したが、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの匹敵するレベルの活性化を示唆していた。
【０１０４】
本発明者らは、１つのパネルの５種のヒト癌細胞系内でのＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の抗癌活性をさらに比較した。１つの実験では（図３Ｂ）、細胞を２４時間プレーティングし、その後にＮＫ細胞系を添加した。ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の細胞傷害性は、ＮＫ９２ＣＩＲＢの方がわずかに有意であるが一般には同等であった。ＮＫ９２細胞は、他の２種のＮＫ細胞系に比較して劣っていた。他の実験では、癌細胞は５時間のみプレーティングし、その後にＮＫ細胞を添加すると（図３Ｃ）、ＮＫ細胞系の細胞傷害性は、プレーティングの２４時間後よりはるかに顕著になった。これらの条件下では、全ＮＫ細胞系の細胞傷害性は２４時間にわたりプレーティングされた細胞中より大きく、ＮＫ９２ＣＩＲＢは大多数のＥ／Ｔ比でＮＫ９２ＩＬ２細胞より大きい細胞傷害性を示した。この差は、最も耐性の癌細胞系Ｕ２５１ＧＭおよびＰａｎｃ−１を用いるとより明白であった。
【０１０５】
実施例４．ＴＧＦβ１、ＩＬ４およびデキサメタゾン免疫抑制に対するＮＫ９２ＣＩＲＢの耐性
トランスフォーミング成長因子ＴＧＦβ１は、ＴＭＥ内で過剰発現した免疫抑制剤であり、ＮＫ細胞内の数種の活性化シグナルを脱安定化させることによってＮＫ細胞機能を阻害することが公知である（３４）。グルココルチコイドデキサメタゾンは、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ２産生を抑制することによってリンパ球の機能を部分的に弱める（３５）。ＩＬ−４は、ＮＫ細胞の増殖を阻害すると報告された（４８）。本発明者らは、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ４（１０ｎｇ／ｍＬ）もしくはｄｅｘ（１μＭ）の存在下で６日間にわたり細胞を培養することによってＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞療法におけるこれらの免疫抑制剤の作用を試験した。図４Ａは、ＮＫ９２ＩＬ２細胞がｄｅｘへの曝露に耐えられなかったが、それらの増殖がＴＧＦβ１によって強力に、およびある程度はＩＬ４によって阻害されたことを示している。対照的に、ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の増殖はＴＧＦβ１もしくはＩＬ４による有意な影響を受けなかったが、ｄｅｘによっては軽度にのみ阻害された（図４Ｂ）。
【０１０６】
ＮＫ細胞の細胞傷害性にＴＧＦβ１およびｄｅｘの前処置が及ぼす作用は、次に２：１のＥ／Ｔ比で５種の癌細胞系のパネルを使用して評価した（図４Ｃ）。ＮＫ細胞は、癌細胞が既にプレーティングされたＮＫ９２細胞に添加されたが、既に付着していなかった場合はより脆弱性であるので、これらの実験条件ではより多くの殺滅に影響を及ぼした。さらに、親ＮＫ９２細胞を培地（２０ＩＵ／ｍＬ）中でＩＬ２とともにプレーティングしたので、このため他の実験におけるより活性である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ−３およびＨｅｐＧ２に対するＮＫ９２ＣＩＲＢの細胞傷害性は影響を受けなかった。Ｄｅｘは、全癌細胞系に対するＮＫ９２ＩＬ２細胞の細胞傷害性を重度に減少させた。同様に、ＴＧＦβ１は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｅｐＧ２を除いて大多数の癌細胞系に対するＮＫ９２ＩＬ２の細胞傷害性を有意に減少させた。驚くべきことに、ＮＫ９２細胞はさらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｅｐＧ２におけるｄｅｘ阻害に対する耐性も示した。ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の全免疫抑制は、ＮＫ９２およびＮＫ９２ＩＬ２細胞系内におけるより弱く、さらに標的癌細胞系にも依存していた。
【０１０７】
実施例５．ＣＤ１６はキメラＣＩＲＢの内因性発現によって実質的に誘導される
ＮＫ９２細胞の最初の特性解析（４３）によると、ＮＫ９２細胞は、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ１６−、ＣＤ２５＋、ＣＤ４５＋およびＮＫｇ２Ｄ−である（図５Ａ）。これと比較して、ＮＫ９２ＩＬ２細胞、ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞および新しく単離したヒトＮＫ（ｈＮＫ）細胞は、様々なパターンのマーカー発現を提示する。ＮＫ９２とは異なり、細胞系ＮＫ９２ＩＬ２、ＮＫ９２ＣＩＲＢおよびｈＮＫ細胞は、全部がＣＤ１６＋であり、発現レベルはｈＮＫ＞ＮＫ９２ＣＩＲＢ＞ＮＫ９２ＩＬ２であった（図５Ｂ）。本発明者らは、ＩＬ２非依存性ＮＫ９２−ＭＩについて試験し、以前の報告書にしたがうと（３８）、ＣＤ１６の発現を全く見いださなかった（図１０Ａ）。本発明者らは、グリコシル化もしくは非グリコシル化ＩＬ２を用いて処置されたＮＫ９２細胞内でのＣＤ１６発現を全く見いださなかった（図１０Ｂ）。ヒトＮＫ（ｈＮＫ）細胞は、全ＮＫ９２細胞系よりもはるかに高レベルのＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄを発現し、実質的にＣＤ２５陰性であるが（図５Ｂ）、ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞は両方のＩＬ２刺激ＮＫ９２もしくはＮＫ９２ＩＬ２より低量のＣＤ２５を発現した。ＮＫ９２細胞系中、ＣＤ２５およびＣＤ１６に対するＮＫ９２ＣＩＲＢ発現はｈＮＫと最も類似であった。
【０１０８】
実施例６．ＨＥＲ２陽性乳癌細胞系ＢＴ４７４に対するＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢのＡＤＣＣ
本発明者らは、次にＨＥＲ２陽性乳癌細胞系ＢＴ４７４に対してトラスツズマブを使用してＣＤ１６発現がＡＤＣＣに及ぼす影響を試験した。図５Ｃは、トラスツズマブの非存在下において２：１のＥ／Ｔ比を使用した場合に、ＢＴ４７４細胞がＮＫ細胞の直接細胞傷害性による影響を受けなかったことを示している。しかし、１μｇ／ｍＬのトラスツズマブの存在下では、ＮＫ９２ＣＩＲＢおよびＮＫ９２ＩＬ２はどちらもそれぞれ約６０％および５０％の実質的な細胞傷害性を与えた。１μｇ／ｍＬでのトラスツズマブ単独は、ＢＴ４７４の生存率に有意には影響を及ぼさなかった。同様に、親ＮＫ９２は、トラスツズマブの存在下でＢＴ４７４に対する有意な細胞傷害性を全く誘発しなかった。
【０１０９】
実施例７．ＮＫ９２、ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ内の細胞傷害性エフェクターの発現プロファイル
ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞のｑＰＣＲ分析は、ＩＬ２を用いて４８時間にわたり刺激されたＮＫ９２ＩＬ２および親ＮＫ９２と比較して、天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）であるＮＫＰ３０（１．７倍）、ＮＫＰ４４（９倍）およびＮＫＰ４６（１．４倍）の劇的な増加を明らかにした。ＮＫ９２ＩＬ２内では、ＮＫＰ４４発現もまた増加した（３．３倍）。パーフォリン−１の発現は全細胞系内で類似であったが、ＮＫ９２ＩＬ２内ではグランザイム−Ｂ発現が低下してＴＮＦ−αは増加し、ＮＫ９２ＣＩＲＢ内ではどちらも辛うじて低下したが、ＩＦＮγは増加した。
【０１１０】
実施例８．循環中ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ検出
ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢのｉｎ  ｖｉｖｏの生存率および全身性循環を腫瘍担持動物の状況において評価した。Ｕ２５１ＭＧ腫瘍細胞は、Ｎｏｄ／ｓｃｉｄマウスにおいて皮下増殖させた。腫瘍サイズが平均１６０ｍｍ３に達した時点に、動物には４日間以内に尾静脈を介して２回の非照射ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の注射を受けさせた。図６Ａは、ＮＫ９２ＣＩＲＢ生存細胞の初回注射から２４時間以内に、迅速な４６％の腫瘍容積後退が観察されたが、ＮＫ９２ＩＬ２細胞は３５％減少を誘発したことを示す。これとは対照的に、腫瘍は未処置動物では増殖し続け、消退する前にはほぼ２００ｍｍ３の最大限度サイズに達した。このサイズ依存性の限定された増殖は、ＶＥＧＦ発現によって改善することのできる、これらの腫瘍の不良な血管形成に起因することが以前に証明された（４９）。ＮＫ９２ＣＩＲＢ処置群についての腫瘍消退は第２回注射後に持続したが、他方ＮＫ９２ＩＬ２処置動物における腫瘍は増殖を再開し、第１８日まで応答しなかった。３週間後、未処置およびＮＫ９２ＩＬ２群は、類似の腫瘍サイズを示した。これと比較して、ＮＫ９２ＣＩＲＢ処置群は、８６％の有意な腫瘍容積減少を提示した。ＮＫ細胞注射の１７日後、血液（０．５ｍＬ）を３群のマウスから採取し、ｍＣｈｅｒｒｙおよびヒトＣＤ４５の両方を発現する循環細胞に対してサイトメトリーにより分析した。図６Ｂは、循環中ＮＫ細胞がＮＫ９２ＣＩＲＢ処置群においてのみ検出できることを示している。この結果は、ＣＩＲＢ発現が腫瘍担持動物において存続する能力をＮＫ細胞に授けるが、ＩＬ２分泌は授けないことを示唆している。
【０１１１】
実施例９．照射されたＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の生存率
ＮＫ９２細胞系は、アグレッシブ非ホジキンリンパ腫患者から単離した（４３）。このため、ＦＤＡは、増殖を防止するための注入前の５〜１０ＧｙのＮＫ９２細胞照射を要求している。これらの条件下で、照射されたＮＫ９２細胞の生存率は、２日間以内に劇的に低下する。ＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢは、１０Ｇｙ（０．８３ｇｙ、１２分間）で照射し、その後、２４時間毎にトリパンブルーを使用してそれらの生存率を決定するために完全ＮＫ９２培地中でプレーティングした。図７Ａは、照射２４時間後、ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の５７％およびＮＫ９２ＩＬ２細胞の４５％が生存することを示している。ＮＫ９２ＣＩＲＢの生存率の利点は、第１日および第２日で統計的有意であった（＊Ｐ＜０．０５）。
【０１１２】
実施例１０．照射されたＮＫ９２ＩＬ２およびＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の抗腫瘍有効性
前立腺癌細胞系ＰＣ−３（５０）は、アンドロゲン受容体およびＰＳＡ陰性であり、Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄマウスにおいて増殖させると極めてアグレッシブな腫瘍を形成する。腫瘍容積が約２００ｍｍ３に達した時点に（第２８日）、照射されたＮＫ細胞（５００ｃＧｙ）を尾静脈を介して４週間毎の注射として投与した。図７Ｂは、ＮＫ９２ＣＩＲＢ処置群におけるＰＣ−３腫瘍の増殖が第１回注射後に緩徐化されたことを示している。最終ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の注射後、未処置群と比較して、約１７日間の有意な腫瘍増殖遅延が第１回〜第４回ＮＫ９２ＣＩＲＢ細胞の注射期間中に記録された（＊＊Ｐ＜０．０１）。これとは対照的に、ＮＫ９２ＩＬ２処置群の腫瘍は未処置腫瘍群と比較して７日間の腫瘍遅延しか生成しなかった（＊Ｐ＜０．０５）。
【０１１３】
実施例１１．ＣＩＲＢ２１キメラの設計、構築および試験
インターロイキンＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５およびＩＬ２１は、ＩＬ２と同一ファミリーに属し、同一の共通ＩＬ２Ｒｇを使用する。それらは、それらの固有のα受容体に加えてＩＬ２Ｒβを使用するＩＬ２およびＩＬ１５を除いて、全部がそれらの固有のプライベート受容体を有する（図１１）。本発明者らは、ＰＣ−３細胞に対して、キメラＮＫ９２ＣＩＲＢを発現するＮＫ９２細胞の細胞傷害性に添加されたサイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７およびＩＬ２１）が及ぼす影響について試験した。本発明者らは、細胞傷害性を劇的に増加させることができたのがＩＬ２１だけであることを見いだした（図１２は、ＩＬ２１およびＩＬ２の影響だけを示している）。これに鼓舞されて、本発明者らは、ＩＬ２およびＩＬ２１が同一ＩＬ２Ｒｇを使用する場合、１つのキメラサイトカイン受容体において両方のシグナル伝達を結び付けることが可能であるかどうかを調査した。それを解決するために、ＩＬ２１Ｒの全細胞質ドメインをクローニングし、次にキメラＣＩＲＢ内のＩＬ２ＲβのＣ末端に頭−尾結合で加えた。これは新規なＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＩＬ２１Ｒキメラ（図１３に例証した、いわゆるＣＩＲＢ２１）を生じさせ、これを次にＮＫ９２細胞内に導入するとＮＫ９２ＣＩＲＢ２１が産生した。
【０１１４】
ＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＩＬ２１Ｒ（ＣＩＲＢ２１）のヌクレオチド配列
【化１２】
2019519215.tif 000015
【化１３】
2019519215.tif 000016
【０１１５】
ＩＬ２−ＩＬ２Ｒβ−ＩＬ２１Ｒ（ＣＩＲＢ２１）のタンパク質配列
【化１４】
2019519215.tif 000017
【０１１６】
図１４は、新規なハイブリッド受容体が、ＰＣ−３癌細胞に対して原キメラＣＩＲＢより５倍優れている実質的な細胞傷害性を付与し、さらにＣＤ１６を生成することを示している。それらはさらに緩徐な増殖を有していたが、これは培地への外因性ＩＬ２の添加によって強化することができた。
【０１１７】
ＩＬ２は、主としてＳＴＡＴ５を活性化することが証明されているが（５１）、ＩＬ２１は優先的にＳＴＡＴ３（５２，５３）およびＳＴＡＴ１（５４）を活性化する。この活性化がインターフェロンγ（ＩＦＮ−ｇ）産生をもたらすことは証明されており（５５）、これは本発明者らが見た癌細胞殺滅における劇的な強化を説明できよう（図１４）。ｑＰＣＲによるＲＮＡ発現解析は、ＣＩＲＢと比較してハイブリッド受容体ＣＩＲＢ２１によって駆動された顕著な程度の活性化を解明した。図１５は、ＩＦＮ−ｇ、グランザイム−Ｂおよびパーフォリン−１が、ＣＩＲＢおよびＮＫ９２内のレベルを超えて、ＣＩＲＢ２１においてはそれぞれ５倍、６倍および３倍増加させられたことを示している。これらのデータは、ハイブリッド受容体を通したＩＬ２シグナル伝達のこの新規なプラットフォームが優れたＮＫ細胞活性化についての治療上の展望を有することを確証している。
【０１１８】
しかし、ＩＬ−２１シグナル伝達はさらに、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路をダウンレギュレートしてＩＬ２によるシグナル伝達を阻害する（５７，５８）、サイトカインシグナル伝達１（ＳＯＣＳ１）およびＳＯＣＳ３タンパク質の抑制剤を含む多数の他の遺伝子転写も誘発する（（５６）において論評されている）。この阻害は、キメラＣＩＲＢ２１を発現するＮＫ９２のより緩徐な増殖より遅れるであろう。
【０１１９】
最初は、キメラＣＩＲＢ２１においては、ＩＬ２１Ｒによって媒介されたＳＴＡＴ３の活性化は、結果としてより緩徐なＮＫ９２ＣＩＲＢ２１細胞増殖を生じさせる、ＩＬ２Ｒβによって媒介されたＳＴＡＴ５の活性化と矛盾する可能性があるとの仮説が立てられた。ＳＴＡＴ３は、ＩＬ２１Ｒシグナル伝達の主要な副生成物であり、その転写活性は、本発明者らの細胞系においてＩＬ２によって媒介されたＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達のダウンレギュレーションよりも遅れるであろう。特にＳＴＡＴ３の強力および選択的阻害剤である５，１５−ジフェニルポルフィリン（５，１５−ＤＰＰ）は、ナノモル範囲内で作用し、ＳＴＡＴ３核転座を防止する。しかし、本発明者らが特異的５，１５−ＤＰＰを使用してＳＴＡＴ３の二量体化を阻害した場合に、本発明者らは、ＮＫ９２ＣＩＲＢ２１細胞増殖を改良しなかった。この結果は、ＳＴＡＴ３ホモ二量体ならびにＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３の可能性のあるヘテロ二量体化の非存在もしくはＳＴＡＴ１ホモ二量体の優勢のいずれかを示唆している。ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３は、通常は対立する生物学的作用を有する。ＳＴＡＴ３は癌遺伝子であるが（５９，６０）、ＳＴＡＴ１は腫瘍抑制因子として作用する（６１，６２）。ＳＴＡＴ１リン酸化は、ＮＫ９２ＣＩＲＢ２１によって高度に生成されるＩＦＮｇによって媒介され得る（６３）。このため、ＮＫ９２ＣＩＲＢ２１細胞のより緩徐な増殖は、ＳＴＡＴ１腫瘍抑制因子活性によって誘発されることがあり得る。
【０１２０】
それらの現在の劇的な細胞傷害性に影響を及ぼすことなく、ＮＫ９２ＣＩＲＢ２１のより迅速な増殖を回復させるためには、３種の方法が使用される。第１に、ＣＩＲＢ２１の現在の立体配置は、典型的な構築物中のＩＬ２ＲβおよびＩＬ２１Ｒの２つの細胞質ドメイン間のスペーサーの欠如に起因してＩＬ２Ｒβにとっては立体的に不都合であると考えられる。このため、ＣＩＲＢ２１キメラは、ＩＬ２ＲβとＩＬ２１Ｒとの間に柔軟性リンカー、例えば、（ＧＧＧＳ）ｎリンカーを付加するために改変されている。これは、重複伸長法を用いて高忠実度ＰＣＲを使用して実施される。リンカーの及ぼす影響は、ＮＫ９２細胞内で結果として生じたキメラの安定性発現によって試験される。第２に、リンカーの添加がＮＫ９２細胞増殖を回復しない場合は、ＡＫ−ＳＴＡＴ経路をダウンレギュレートし、ＩＬ２によるシグナル伝達を阻害する（５７，５８）Ｓｏｃｓ１モチーフは、受容体ＩＬ２Ｒβから除去される（図１６）。これは、センスプライマー５’−ＧＣＡＧＣＡＡＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＴＴＴＡＣ−３’（配列番号３４）およびリバースプライマー５’−ＧＴＡＡＡＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＴＣＡＧＣＧＡＧＴＧＧ  ＴＴＧＣＴＧＣ−３’（配列番号３５）を使用して部位突然変異高忠実度ＰＣＲによって達成される。本発明者らは、さらにＩＬ２１Ｒ細胞質ドメインのＢｏｘ−２領域を欠失させることによってＩＬ２１Ｒのシグナル変換を弱める（図１７）。Ｂｏｘ−１およびより少ない程度のＢｏｘ−２は、どちらもＩＬ２１のシグナル変換に関係している（（６４））。これとは別に、本発明者らは、ＩＬ２シグナル伝達の全強度にわずかにしか寄与しないこと（５３）が証明されたチロシンＹ３１７とＹ３９９との間に含まれる領域と一緒にＢｏｘ−２もさらに除去する。第３に、これらの遺伝子改変がＮＫ９２の細胞増殖を回復させない場合、ＩＬ２ＲβおよびＩＬ２１Ｒの細胞質ドメインのＤＮＡシャッフリングは、次にＮＫ細胞のより迅速な増殖を可能にする新規なキメラを産生することができる。
【０１２１】
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３２．Ｃｌａｙｔｏｎ  Ａ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＪＰ，  Ｃｏｕｒｔ  Ｊ，  Ｌｉｎｎａｎｅ  Ｓ，  Ｍａｓｏｎ  ＭＤ，  Ｔａｂｉ  Ｚ．  Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅ  ＮＫＧ２Ｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；１８０（１１）：７２４９−５８．
３３．Ｃｌａｙｔｏｎ  Ａ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＪＰ，  Ｃｏｕｒｔ  Ｊ，  Ｍａｓｏｎ  ＭＤ，  Ｔａｂｉ  Ｚ．  Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｍｐａｉｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７（１５）：７４５８−６６．
３４．Ｄｏｎａｔｅｌｌｉ  ＳＳ，  Ｚｈｏｕ  ＪＭ，  Ｇｉｌｖａｒｙ  ＤＬ，  Ｅｋｓｉｏｇｌｕ  ＥＡ，  Ｃｈｅｎ  Ｘ，  Ｃｒｅｓｓ  ＷＤ，  ｅｔ  ａｌ．  ＴＧＦ−ｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１８３  ｓｉｌｅｎｃｅｓ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２０１４；１１１（１１）：４２０３−８．
３５．Ｈｓｕ  ＡＫ，  Ｑｕａｃｈ  Ｈ，  Ｔａｉ  Ｔ，  Ｐｒｉｎｃｅ  ＨＭ，  Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＳＪ，  Ｔｒａｐａｎｉ  ＪＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ  ｏｎ  ＮＫ−ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｐｒｏｆｏｕｎｄｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｂｌｏｏｄ  ２０１１；１１７（５）：１６０５−１３．
３６．Ｂａｒｎｅｓ  ＰＪ．  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ  （Ｌｏｎｄ）  １９９８；９４（６）：５５７−７２．
３７．Ｂｏｕｍｐａｓ  ＤＴ，  Ａｎａｓｔａｓｓｉｏｕ  ＥＤ，  Ｏｌｄｅｒ  ＳＡ，  Ｔｓｏｋｏｓ  ＧＣ，  Ｎｅｌｓｏｎ  ＤＬ，  Ｂａｌｏｗ  ＪＥ．  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｔ  ｔｈｅ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９１；８７（５）：１７３９−４７．
３８．Ｔａｍ  ＹＫ，  Ｍａｋｉ  Ｇ，  Ｍｉｙａｇａｗａ  Ｂ，  Ｈｅｎｎｅｍａｎｎ  Ｂ，  Ｔｏｎｎ  Ｔ，  Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ａｌｔｅｒｅｄ，  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９９；１０（８）：１３５９−７３．
３９．Ｔａｉ  ＹＴ，  Ｄｉｌｌｏｎ  Ｍ，  Ｓｏｎｇ  Ｗ，  Ｌｅｉｂａ  Ｍ，  Ｌｉ  ＸＦ，  Ｂｕｒｇｅｒ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉ−ＣＳ１  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＨｕＬｕｃ６３  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｉｌｉｅｕ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２（４）：１３２９−３７．
４０．Ｇｌｉｅｎｋｅ  Ｗ，  Ｅｓｓｅｒ  Ｒ，  Ｐｒｉｅｓｎｅｒ  Ｃ，  Ｓｕｅｒｔｈ  ＪＤ，  Ｓｃｈａｍｂａｃｈ  Ａ，  Ｗｅｌｓ  ＷＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＡＲ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０１５；６：２１．
４１．Ｔｏｎｎ  Ｔ，  Ｓｃｈｗａｂｅ  Ｄ，  Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓ，  Ｅｓｓｅｒ  Ｒ，  Ｋｏｅｈｌ  Ｕ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＮＫ−９２．  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１３；１５（１２）：１５６３−７０．
４２．Ａｒａｉ  Ｓ，  Ｍｅａｇｈｅｒ  Ｒ，  Ｓｗｅａｒｉｎｇｅｎ  Ｍ，  Ｍｙｉｎｔ  Ｈ，  Ｒｉｃｈ  Ｅ，  Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＮＫ−９２  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｏｒ  ｍｅｌａｎｏｍａ：  ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ．  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００８；１０（６）：６２５−３２．
４３．Ｇｏｎｇ  ＪＨ，  Ｍａｋｉ  Ｇ，  Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  （ＮＫ−９２）  ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９４；８（４）：６５２−８．
４４．Ｓｕｅｒｔｈ  ＪＤ，  Ｓｃｈａｍｂａｃｈ  Ａ，  Ｂａｕｍ  Ｃ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２；２４（５）：５９８−６０８．
４５．Ｔｅｒｍｅ  Ｍ，  Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ｅ，  Ｄｅｌａｈａｙｅ  ＮＦ，  Ｃｈａｐｕｔ  Ｎ，  Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  Ｌ．  Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：  ｍｏｖｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｔｏ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；９（５）：４８６−９４．
４６．Ｙａｎｇ  ＸＯ，  Ｎｕｒｉｅｖａ  Ｒ，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＧＪ，  Ｋａｎｇ  ＨＳ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｐａｐｐｕ  ＢＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００８；２９（１）：４４−５６．
４７．Ｖｉｈｉｎｅｎ  Ｍ，  Ｔｏｒｋｋｉｌａ  Ｅ，  Ｒｉｉｋｏｎｅｎ  Ｐ．  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９９４；１９（２）：１４１−９．
４８．Ｎａｇｌｅｒ  Ａ，  Ｌａｎｉｅｒ  ＬＬ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＪＨ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＩＬ−４  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ＩＬ−２  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８８；１４１（７）：２３４９−５１．
４９．Ｋｅ  ＬＤ，  Ｓｈｉ  ＹＸ，  Ｙｕｎｇ  ＷＫ．  ＶＥＧＦ（１２１），  ＶＥＧＦ（１６５）  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｕ２５１  ＭＧ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ＮＧ−１  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；６２（６）：１８５４−６１．
５０．Ｋａｉｇｈｎ  ＭＥ，  Ｎａｒａｙａｎ  ＫＳ，  Ｏｈｎｕｋｉ  Ｙ，  Ｌｅｃｈｎｅｒ  ＪＦ，  Ｊｏｎｅｓ  ＬＷ．  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  （ＰＣ−３）．  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｕｒｏｌ  １９７９；１７（１）：１６−２３．
５１．Ｆｕｊｉｉ  Ｈ，  Ｎａｋａｇａｗａ  Ｙ，  Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ  Ｕ，  Ｋａｗａｈａｒａ  Ａ，  Ｍｏｒｉ  Ｈ，  Ｇｏｕｉｌｌｅｕｘ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｔ５  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａ  ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｃｈａｉｎ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９５；９２（１２）：５４８２−６．
５２．Ａｓａｏ  Ｈ，  Ｏｋｕｙａｍａ  Ｃ，  Ｋｕｍａｋｉ  Ｓ，  Ｉｓｈｉｉ  Ｎ，  Ｔｓｕｃｈｉｙａ  Ｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｇａｍｍａ−ｃｈａｉｎ  ｉｓ  ａｎ  ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＬ−２１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１；１６７（１）：１−５．
５３．Ｓｔｒｅｎｇｅｌｌ  Ｍ，  Ｓａｒｅｎｅｖａ  Ｔ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｄ，  Ｊｕｌｋｕｎｅｎ  Ｉ，  Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎ  Ｓ．  ＩＬ−２１  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｔｈ１  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００２；１６９（７）：３６００−５．
５４．Ｚｅｎｇ  Ｒ，  Ｓｐｏｌｓｋｉ  Ｒ，  Ｃａｓａｓ  Ｅ，  Ｚｈｕ  Ｗ，  Ｌｅｖｙ  ＤＥ，  Ｌｅｏｎａｒｄ  ＷＪ．  Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ＩＬ−２１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１０９（１０）：４１３５−４２．
５５．Ｓｔｒｅｎｇｅｌｌ  Ｍ，  Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎ  Ｓ，  Ｓｉｒｅｎ  Ｊ，  Ｌｅｈｔｏｎｅｎ  Ａ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｄ，  Ｊｕｌｋｕｎｅｎ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．  ＩＬ−２１  ｉｎ  ｓｙｎｅｒｇｙ  ｗｉｔｈ  ＩＬ−１５  ｏｒ  ＩＬ−１８  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０（１１）：５４６４−９．
５６．Ｓｐｏｌｓｋｉ  Ｒ，  Ｌｅｏｎａｒｄ  ＷＪ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２１：  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｄｇｅｄ  ｓｗｏｒｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２０１４；１３（５）：３７９−９５．
５７．Ｅｎｄｏ  ＴＡ，  Ｍａｓｕｈａｒａ  Ｍ，  Ｙｏｋｏｕｃｈｉ  Ｍ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｒ，  Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｈ，  Ｍｉｔｓｕｉ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｎｅｗ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｎ  ＳＨ２  ｄｏｍａｉｎ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＪＡＫ  ｋｉｎａｓｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；３８７（６６３６）：９２１−４．
５８．Ｃｏｈｎｅｙ  ＳＪ，  Ｓａｎｄｅｎ  Ｄ，  Ｃａｃａｌａｎｏ  ＮＡ，  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ａ，  Ｍｕｉ  Ａ，  Ｍｉｇｏｎｅ  ＴＳ，  ｅｔ  ａｌ．  ＳＯＣＳ−３  ｉｓ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ＳＴＡＴ５  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９９；１９（７）：４９８０−８．
５９．Ｂｒｏｍｂｅｒｇ  ＪＦ，  Ｗｒｚｅｓｚｃｚｙｎｓｋａ  ＭＨ，  Ｄｅｖｇａｎ  Ｇ，  Ｚｈａｏ  Ｙ，  Ｐｅｓｔｅｌｌ  ＲＧ，  Ａｌｂａｎｅｓｅ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔａｔ３  ａｓ  ａｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  Ｃｅｌｌ  １９９９；９８（３）：２９５−３０３．
６０．Ｂｒｏｍｂｅｒｇ  Ｊ．  Ｓｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００２；１０９（９）：１１３９−４２．
６１．Ｃｈｉｎ  ＹＥ，  Ｋｉｔａｇａｗａ  Ｍ，  Ｓｕ  ＷＣ，  Ｙｏｕ  ＺＨ，  Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｙ，  Ｆｕ  ＸＹ．  Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐ２１  ＷＡＦ１／ＣＩＰ１  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＳＴＡＴ１．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６；２７２（５２６２）：７１９−２２．
６２．Ｋａｐｌａｎ  ＤＨ，  Ｓｈａｎｋａｒａｎ  Ｖ，  Ｄｉｇｈｅ  ＡＳ，  Ｓｔｏｃｋｅｒｔ  Ｅ，  Ａｇｕｅｔ  Ｍ，  Ｏｌｄ  ＬＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９８；９５（１３）：７５５６−６１．
６３．Ｑｉｎｇ  Ｙ，  Ｓｔａｒｋ  ＧＲ．  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＡＴ１  ａｎｄ  ＳＴＡＴ３  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４；２７９（４０）：４１６７９−８５．
６４．Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ  Ｊ，  Ｄｉｌｌｏｎ  ＳＲ，  Ｎｅｌｓｏｎ  Ａ，  Ｈａｍｍｏｎｄ  Ａ，  Ｓｐｒｅｃｈｅｒ  Ｃ，  Ｇｒｏｓｓ  ＪＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｒｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２０００；４０８（６８０８）：５７−６３．
【０１２２】
その他の実施形態
本発明をその詳細な説明と結び付けて記載してきたが、上記の説明は例示することを目的としており、添付の請求項の範囲によって規定される本発明の範囲を限定することは意図していない。例えば、ヒトの細胞および配列はヒト被験者を治療する際に使用するために本明細書に例示したが、例えば他の種由来の配列およびＮＫ細胞もまた使用できる。他の態様、利点および修飾は、以下の請求項の範囲内に含まれる。
【図１】
2019519215.tif 000018
【図２Ａ】
2019519215.tif 000019
【図２Ｂ】
2019519215.tif 000020
【図２Ｃ】
2019519215.tif 000021
【図２Ｄ】
2019519215.tif 000022
【図３Ａ】
2019519215.tif 000023
【図３Ｂ】
2019519215.tif 000024
【図３Ｃ】
2019519215.tif 000025
【図４Ａ】
2019519215.tif 000026
【図４Ｂ】
2019519215.tif 000027
【図４Ｃ】
2019519215.tif 000028
【図５Ａ】
2019519215.tif 000029
【図５Ｂ】
2019519215.tif 000030
【図５Ｃ】
2019519215.tif 000031
【図５Ｄ】
2019519215.tif 000032
【図６Ａ】
2019519215.tif 000033
【図６Ｂ】
2019519215.tif 000034
【図７Ａ】
2019519215.tif 000035
【図７Ｂ】
2019519215.tif 000036
【図８】
2019519215.tif 000037
【図９】
2019519215.tif 000038
【図１０Ａ】
2019519215.tif 000039
【図１０Ｂ】
2019519215.tif 000040
【図１１】
2019519215.tif 000041
【図１２】
2019519215.tif 000042
【図１３】
2019519215.tif 000043
【図１４】
2019519215.tif 000044
【図１５】
2019519215.tif 000045
【図１６】
2019519215.tif 000046
【図１７】
2019519215.tif 000047
【図１８】
2019519215.tif 000048
【国際調査報告】
2019519215.tif 000049
2019519215.tif 000050
2019519215.tif 000051
2019519215.tif 000052