(57)【要約】  静脈切開後であるが分析前の血液サンプルを安定化するための安定化組成物は、代謝阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、バッファー系、抗凝固剤、及び溶媒を含む。安定化組成物は、後の分析のために血液サンプルの生理学的状況を保存するために静脈切開後の血液サンプルを安定化する。安定化された血液サンプルに対して実施される分析によって、診断のために血液サンプル中の分析物の状況が決定されうる。安定化組成物は、静脈切開後の血液サンプルを少なくとも６時間、６７２時間まで安定化することができる。安定化組成物は、静脈切開後の血液サンプルとの接触前に、検出不能なレベルのホルムアルデヒドを有することがより好ましく、その結果、静脈切開後の血液サンプル中のタンパク質同士の架橋及び核酸に対するタンパク質の架橋が最小限となる。安定化組成物は、６７２時間まで試験感度率１を有する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析前に静脈切開後の血液サンプルを安定化するための血液安定化組成物であって、
ジアミド、アゾエステル、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、及びその組合せからなる群から選択される代謝阻害剤、
６−アミノヘキサン酸、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、Ｎ−エチルマレイミド、エチレンジアミン四酢酸、アプロチニン、ベンズアミジンＨＣｌ、及びその組合せからなる群から選択されるプロテアーゼ阻害剤、
ｐＨを３．０から６．５又はそれ未満に維持することができる酸性バッファー、
抗凝固剤、並びに
溶媒
を含む安定化組成物。
【請求項２】
代謝阻害剤が、ジアミド、アゾエステル、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、及びその組合せからなる群から選択され、
プロテアーゼ阻害剤が、６−アミノヘキサン酸、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、Ｎ−エチルマレイミド、エチレンジアミン四酢酸、アプロチニン、ベンズアミジンＨＣｌ、及びその組合せからなる群から選択され、
バッファーが、トリス−塩酸、ビス−トリス−塩酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド、ジメチル尿素、イミダゾリジニル尿素、グリシン、リシン、２−メルカプトエタノール及びその組合せからなる群から選択され、
抗凝固剤が、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸三カリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム、クエン酸、シュウ酸、及びその組合せからなる群から選択され、
溶媒が、滅菌蒸留水、滅菌濾過水、及び濾過オゾン化水からなる群から選択される、
請求項１に記載の安定化組成物。
【請求項３】
代謝阻害剤が、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオールであり、
プロテアーゼ阻害剤が、６−アミノヘキサン酸であり、
酸性バッファーが、トリス−塩酸、ジメチル尿素、２−メルカプトエタノール、及びイミダゾリジニル尿素であり、
抗凝固剤が、エチレンジアミン四酢酸であり、
溶媒が、滅菌濾過水である、
請求項１に記載の安定化組成物。
【請求項４】
分析前に静脈切開後の血液サンプルを安定化するための血液安定化組成物であって、
１デシリットル当たり３．３から６．６グラムの代謝阻害剤、
１デシリットル当たり３．３から６．６グラムのプロテアーゼ阻害剤、
トリス−塩酸、ジメチル尿素、２−メルカプトエタノール及びイミダゾリジニル尿素、並びにその組合せからなる群から選択される、１デシリットル当たり１から２グラムの酸性バッファー、
１デシリットル当たり４．９から６．０グラムの抗凝固剤、並びに
溶媒
を含む安定化組成物。
【請求項５】
３から６．５のｐＨを有する、請求項４に記載の安定化組成物。
【請求項６】
１８から２５摂氏度で、重水中の炭素１３核磁気共鳴画像化によって分析された場合に、検出不能な量のホルムアルデヒドを有する、請求項４に記載の安定化組成物。
【請求項７】
静脈切開後の血液サンプルを安定化するための方法であって、
静脈切開後の血液サンプルを安定化組成物と接触させることであって、
安定化組成物が、代謝阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ｐＨを３．０から６．５又はそれ未満に維持することができる酸性バッファー、抗凝固剤、及び溶媒を含む、接触させることと、
安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルを分析前に少なくとも６時間貯蔵することと
を含む方法。
【請求項８】
貯蔵することが、１０から３０摂氏度の温度で、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルを貯蔵することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
貯蔵することが、少なくとも７２時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
貯蔵することが、少なくとも１６８時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
貯蔵することが、少なくとも３３６時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
貯蔵することが、少なくとも６７２時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
静脈切開後の血液サンプルを分析して目的の状態の有無を決定する方法であって、
静脈切開後の血液サンプルを安定化することであって、
静脈切開後の血液サンプルを安定化組成物と接触させることを含み、
安定化組成物が、代謝阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ｐＨを３．０から６．５又はそれ未満に維持することができるバッファー、抗凝固剤、及び溶媒を含む、安定化することと、
安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルを少なくとも６時間貯蔵することと、
分析物及び標的細胞外小胞を含む血漿を安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルから分離することと、
分析物を分析して目的の状態の有無を決定することと
を含む方法。
【請求項１４】
分離することが、分析物及び標的細胞外小胞を含む血漿を、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルの細胞及び細胞デブリから分離することを含み、分離することが２段階の遠心分離を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
分析物が、標的細胞外小胞の内部と関連する分析物及び標的細胞外小胞の外部と関連する分析物である場合、分離することが、分析物及び標的細胞外小胞を有する血漿を細胞外小胞単離試薬と接触させることをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
分析物が標的細胞外小胞の内部と関連する場合、分離することが、分析物に結合するためのシリカベースの膜で溶出することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
分析物が標的細胞外小胞の内部と関連する場合、分離することが、分析物を溶解バッファーで可溶化することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
標的分析物が標的細胞外小胞の外部と関連する場合、分離することが、標的分析物に特異的な抗体に結合させることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
疾患の診断方法であって、
分析物を有する静脈切開後の血液サンプルを安定化することであって、
静脈切開後の血液サンプルを安定化組成物と接触させることを含む、安定化することと、
安定化組成物と接触した分析物を有する静脈切開後の血液サンプルを少なくとも６時間貯蔵することと、
少なくとも６時間貯蔵された静脈切開後の血液サンプルを分析することであって、分析物が、試験感度率１で維持される、分析することと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのリファレンス
この出願は、その全体が出典明示により援用される、２０１６年６月８日に出願された表題「Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」の米国仮出願第６２／３４７４４１号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの疾患を含む目的の状態の早期検出が望まれる。例えば、妊娠、胎児の染色体異常、又は癌の早期検出は、介入型の治療を使用できるため、患者により良好な予後をもたらす可能性がある。しかし、目的の状態を単にスクリーニングするだけでなく、診断をもたらすのに利用可能な早期検出機序は、典型的には、侵襲的手段（例えば、羊水穿刺、腫瘍生検、絨毛検査）を必要とする。診断を提供する侵襲的手順によって、例えば、感染、疾患の伝染、手順の間に投与される麻酔に対する反応などの有害反応のリスクが増大する。さらに、これらの侵襲的手順は、技術的に高度であり、普及した使用には適合しない。侵襲的手順に関するリスクの増大と複雑化により、目的の状態を試験するための非侵襲的診断試験（例えば、採血により採取したサンプルからの診断）を有することが望ましい。
【０００３】
目的の状態の診断は、分析物、例えば、細胞外小胞に存在するタンパク質、脂質、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びマイクロＲＮＡを含む抗体又はバイオマーカーの分析によって、血液サンプルに対して実施される非侵襲的診断試験を介して可能である。血液サンプル中の分析物の非侵襲的検出に対する現在の臨床プロトコルは、正確且つ一貫した診断結果を得るために、血液サンプルの即時処理を必要とする。診断は、分析物の分析によって行われてもよい。分析物の分析は、細胞外小胞の内部と関連する分析物の分析、細胞外小胞の外部と関連する分析物の分析、又は細胞外小胞と関連しない分析物の分析であってもよい。血液サンプルの処理を遅らせることによって、血液サンプル中の血液細胞が血液サンプル中に細胞外小胞を放出することが可能となり、目的の状態に応答性でない非標的細胞外小胞（例えば、バックグラウンド細胞外小胞）の不自然な増加を引き起こす。バックグラウンド細胞外小胞の増加は、静脈切開後の血液サンプル中の分析物の濃度（例えば、割合）を不自然に低下させる。
【０００４】
図１は、血液サンプルの処理が、血液サンプルの即時処理（例えば、採血の３時間以内の処理）に対して６時間を超えて遅れる場合に起こる細胞外小胞の増加の実例である。このバックグラウンド細胞外小胞の放出の増加は、細胞が代謝を続ける一方で、血液サンプル中の細胞をグルコース除去及び低酸素に曝露することによって誘発されると考えられる。この細胞外小胞の「バックグラウンド」の増加は、目的の状態に反応性である血液サンプル内の目的の分析物の検出を著しく妨害する可能性があり、したがって、分析が診断に対する十分な正確性と再現性を有することを妨げる。
【０００５】
例えば、分析実験室からの距離、分析のためのサンプルの体積などの実用上の制限は、血液サンプルの即時処理を阻害する。例えば、多くの血液採取場所、特にへき地の血液採取場所は、診断用分析物を分析するための血液サンプルを処理できるよう装備していない。代わりに、典型的には、血液サンプルは、分析物の処理及び分析のために、へき地の血液採取場所から中央の分析実験室まで輸送される。サンプル採取場所から中央実験室までサンプルを輸送することは、現在の臨床分析プロトコルにおける現在時刻の制約を考慮すると実用的又は実行可能ではない。さらに、より規模の大きな臨床研究では、血液サンプルの即時処理は実用的ではない。
【０００６】
血液サンプル用の現在の血液採取管は、ホルムアルデヒド又はホルムアルデヒド放出薬として作用する化学物質を含有する。ホルムアルデヒドは、タンパク質と核酸の架橋及びタンパク質とタンパク質の架橋を形成させることによって、採血された血液中の核酸及びタンパク質（分析物である核酸及びタンパク質を含む）に重大な損傷を引き起こす。サンプルの採取と分析の間の時間が増加すると、ホルムアルデヒドが核酸及びタンパク質に及ぼす有害な作用も増大する。
【０００７】
静脈切開後（採血後）の血液サンプルを室温（１８から２５摂氏度）で少なくとも６時間安定化する組成物及び方法を有することが望ましく、その結果、目的の分析物は、目的の状態の診断に対して十分な正確性と再現性を伴って分析されうる。ホルムアルデヒドは架橋を介して核酸及びタンパク質に重大な損傷を引き起こすため、これらの組成物は、静脈切開後の血液サンプルと組み合わせる前のホルムアルデヒドが検出不能なレベルであり、静脈切開後の血液サンプルと接触後、６７２時間までホルムアルデヒドが検出不能なレベルであることがさらに望ましい。
【発明の概要】
【０００８】
組成物を安定化すること及び組成物の安定化を使用する方法が記載されている。
本発明の一態様では、分析前に静脈切開後の血液サンプルを安定化するための血液安定化組成物は、ジアミド、アゾエステル、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、及びその組合せからなる群から選択される代謝阻害剤、６−アミノヘキサン酸（アミノカプロン酸）、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、Ｎ−エチルマレイミド、エチレンジアミン四酢酸、アプロチニン、ベンズアミジンＨＣｌ、及びその組合せからなる群から選択されるプロテアーゼ阻害剤、ｐＨを３．０から６．５又はそれ未満に維持することができる酸性バッファー、抗凝固剤、並びに溶媒を含む。
【０００９】
本発明の別の態様では、分析前に静脈切開後の血液サンプルを安定化するための血液安定化組成物は、１デシリットル当たり３．３から６．６グラムの代謝阻害剤、１デシリットル当たり３．３から６．６グラムのプロテアーゼ阻害剤、１デシリットル当たり１から２グラムのバッファー、１デシリットル当たり４．９５から６．０グラムの抗凝固剤、及び溶媒を含む。
【００１０】
本発明の別の態様では、静脈切開後の血液サンプルを安定化するための方法は、静脈切開後の血液サンプルを安定化組成物と接触させることであって、安定化組成物が、代謝阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、バッファー、抗凝固剤、及び溶媒を含む、接触させることと、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルを分析前に少なくとも６時間貯蔵することとを含む。
【００１１】
本発明の別の態様では、静脈切開後の血液サンプルを分析して目的の状態の有無を決定する方法であって、静脈切開後の血液サンプルを安定化することであって、静脈切開後の血液サンプルを安定化組成物と接触させることを含み、安定化組成物が、代謝阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、バッファー、抗凝固剤、及び溶媒を含む、安定化することと、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルを少なくとも６時間貯蔵することと、分析物及び標的細胞外小胞を含む血漿を安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルから分離することと、分析物を分析して目的の状態の有無を決定することとを含む方法。
【００１２】
本発明の別の態様では、疾患の診断方法であって、分析物を有する静脈切開後の血液サンプルを安定化することであって、静脈切開後の血液サンプルを安定化組成物と接触させることを含む、安定化することと、安定化組成物と接触した分析物を有する静脈切開後の血液サンプルを少なくとも６時間貯蔵することと、少なくとも６時間貯蔵された静脈切開後の血液サンプルを分析することであって、分析物が、試験感度率１で維持される、分析することとを含む方法。
【００１３】
本明細書で援用され、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の実施態様を例証し、詳細な説明と一緒に、本発明の原理を説明する役目を果たす。
【００１４】
本発明の多数の利点は、以下の添付の図面を参照して、当業者により十分に理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】血液サンプルの処理が、血液サンプルの即時処理（例えば、採血の３時間以内の処理）に対して６時間を超えて遅れた場合に生じる細胞外小胞の増加の実例を表す図である。
【図２】安定化組成物管２００を表す図である。
【図３】安定化組成物中のホルムアルデヒドの検出不能なレベルを表すグラフである。
【図４】安定化組成物管と共に静脈切開後の血液サンプルを安定化する方法４００を表すフロー図である。
【図５】診断するのに十分な目的の状態の状況を決定するために静脈切開後の血液サンプルを分析する方法５００を表すフロー図である。
【図６】（１）Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルと（２）安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルから決定した血液サンプルのグルコース濃度の比較を表すグラフである。
【図７】（１）安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプル及び（２）Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルから決定した静脈切開後の血液サンプルのｒａｓ関連ドメイン含有タンパク質１（すなわち、ＲＡＳＳＦ１Ａ）ＤＮＡの比較を表すグラフである。
【図８】（１）安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルと（２）Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルの間の溶血の比較を表す写真である。
【図９】（１）安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルと（２）Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルの間の標的細胞外小胞とバックグラウンド細胞外小胞（例えば、細胞外小胞）の血漿濃度の比較を表すグラフである。
【図１０】（１）安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルと（２）Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルから決定したタンパク質濃度、ＲＮＡ濃度、及びＤＮＡ濃度の比較を表すグラフである。
【図１１】（１）安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルと（２）Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルの感度試験の比較を表す表である。
【図１２】静脈切開後の血液サンプルのプロテアーゼ活性を低減する安定化組成物の能力を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
静脈切開後であるが分析前の血液サンプルを安定化するための安定化組成物は、代謝阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、バッファー系、抗凝固剤、及び溶媒を含む。安定化組成物は、後の分析のために血液サンプルの生理学的状況を保存するために静脈切開後の血液サンプルを安定化する。安定化された血液サンプルに対して実施される分析によって、診断のために血液サンプル中の分析物の状況が決定されうる。
【００１７】
安定化組成物は、静脈切開後の血液サンプルを少なくとも６時間、６７２時間まで安定化することができる。安定化組成物は、静脈切開後の血液サンプルとの接触前に、０．００５％（体積当たりの重量）又はそれ未満のホルムアルデヒドレベルを有することが好ましい。安定化組成物は、静脈切開後の血液サンプルとの接触前に、検出不能なレベルのホルムアルデヒドを有することがより好ましく、その結果、静脈切開後の血液サンプル中のタンパク質同士の架橋及び核酸に対するタンパク質の架橋が最小限となる。
【００１８】
図２は、安定化組成物管２００を表す。安定化組成物管２００は、管２０１、蓋２０２、及び安定化組成物２０３を含む。安定化組成物管２００の管２０１は、安定化組成物２０３及び静脈切開後の血液サンプルと相溶性である液体を保持するために構成される任意のサイズの試験管であってよい。管２０１は、ガラス、プラスチック、金属、ポリプロピレン、又はセラミックなどの非反応性材料製であってよい。
【００１９】
安定化組成物管２００の蓋２０２は、管２０１を密封して、反転させた際に管２０１中の液体を保ち、風媒性などである夾雑物を管２０１の外側に保つために、管２０１に接して配置するよう構成される蓋である。蓋２０２は、プラスチック、ゴム、テフロン、金属、及びその組合せを含む非反応性材料からなるものであってよい。蓋２０２は、管２０１の内側に真空を形成し、管２０１の内側の滅菌環境を維持するよう構成されるのが最も好ましい。
【００２０】
安定化組成物管２００の安定化組成物２０３は、代謝阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、バッファー系、抗凝固剤、及び溶媒を含む。安定化組成物２０３は、静脈切開後の血液サンプルを少なくとも６時間安定化する。静脈切開後の血液サンプルを安定化することによって、安定化組成物管２００において１８から２５の間の摂氏度で少なくとも６時間貯蔵後、診断をもたらす静脈切開後の血液サンプル中の分析物の分析が行われてよいことを意味する。
【００２１】
安定化組成物は、静脈切開後の血液サンプルとの接触前に、０．００５％（体積当たりの重量）又はそれ未満のホルムアルデヒドレベルを有する。安定化組成物は、静脈切開後の血液サンプルとの接触前に、検出不能なレベルのホルムアルデヒドを有することがより好ましく、その結果、静脈切開後の血液サンプル中のタンパク質同士の架橋及び核酸に対するタンパク質の架橋が最小限となる。
【００２２】
静脈切開後の血液サンプル（図示せず）は、静脈穿刺又は他の採血方法によってヒトから採取されてよい。静脈切開後の血液サンプルは、分析用の分析物を含有してもよい。分析物は、細胞外小胞の内部と関連する分析物、細胞外小胞の外部と関連する分析物、又は細胞外小胞と関連しない分析物であってよい。
【００２３】
安定化組成物２０３の代謝阻害剤は、静脈切開後の血液サンプル中の細胞の代謝を阻害する。静脈切開後の血液サンプル中の細胞の代謝を阻害することにより、静脈切開後の血液サンプル中の細胞に由来するバックグラウンド細胞外小胞の放出が制限される。代謝阻害剤は、ジアミド、アゾエステル、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール（ブロノポール）、マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、及びその組合せからなる群から選択される。好ましい代謝阻害剤は、ブロノポール及びマレイミドである。代謝阻害剤は、安定化組成物２０３を静脈切開後の血液サンプルと接触させる前に、安定化組成物の３．３から６．６ｇ／ｄＬを構成する。代謝阻害剤がなければ、分析は、不自然に高い濃度（例えば、割合）のバックグラウンド細胞外小胞を示すことになる。
【００２４】
安定化組成物２０３のプロテアーゼ阻害剤は、静脈切開後の血液サンプルにおけるプロテアーゼ酵素によるタンパク質分解を阻害する。静脈切開後の血液サンプルにおいてプロテアーゼを阻害することにより、分析物の分解が低減され、したがって、分析のための分析物が安定化される。プロテアーゼ阻害剤は、アミノカプロン酸、ブロノポール、Ｎ−エチルマレイミド、エチレンジアミン四酢酸、アプロチニン、ベンズアミジンＨＣｌ、及びその組合せからなる群から選択される。好ましいプロテアーゼ阻害剤は、アミノカプロン酸である。プロテアーゼ阻害剤は、安定化組成物２０３を静脈切開後の血液サンプルと接触させる前に、安定化組成物の３．３から６．６ｇ／ｄＬを構成する。プロテアーゼ阻害剤がなければ、分析は、不自然に低い濃度の分析物を示すことになる。
【００２５】
安定化組成物２０３のバッファー系は、静脈切開後の血液サンプルの細胞の溶血を低減する。静脈切開後の血液サンプルの細胞の溶血を低減することにより、静脈切開後の血液サンプル中の分析物の分解が低減される。バッファー系は、酸性であり、３から６．５のｐＨを維持することができ、トリス−塩酸（トリス−ＨＣｌ）、ビス−トリス−塩酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド、ジメチル尿素、イミダゾリジニル尿素、グリシン、リシン、２−メルカプトエタノール及びその組合せからなる群から選択される。好ましいバッファー系は、静脈切開後の血液サンプルと接触させる前に、安定化組成物２０３の１ｇ／ｄＬから２ｇ／ｄＬを構成するトリス−ＨＣｌ、安定化組成物２０３の３．３ｇ／ｄＬから１３．２ｇ／ｄＬを構成するジメチル尿素、安定化組成物２０３の０．１３２ｇ／ｄＬから０．２６４ｇ／ｄＬを構成する２−メルカプトエタノール、及び安定化組成物２０３の０．１６５ｇ／ｄＬから３．３ｇ／ｄＬを構成するイミダゾリジニル尿素を含んでもよい。バッファー系がなければ、分析は、不自然に低い濃度の分析物を示すことになる。
【００２６】
安定化組成物２０３の抗凝固剤は、静脈切開後の血液サンプルの凝固を低減する。静脈切開後の血液サンプルの凝固を低減することにより、静脈切開後の血液サンプル中の分析物を安定化する。抗凝固剤は、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸三カリウム（Ｋ３ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸二カリウム（Ｋ２ＥＤＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、及びその組合せからなる群から選択される。好ましい抗凝固剤は、Ｋ３ＥＤＴＡ及びＫ２ＥＤＴＡである。抗凝固剤は、静脈切開後の血液サンプルと接触させる前に、安定化組成物２０３の４．９５ｇ／ｄＬから６．０ｇ／ｄＬを構成する。抗凝固剤がなければ、分析は、不自然に低い濃度の分析物を示すことになる。
【００２７】
安定化組成物２０３の溶媒は、代謝阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、抗凝固剤、及びバッファー系を保有する。溶媒は、滅菌蒸留水、滅菌濾過水、及び濾過オゾン化水からなる群から選択される。好ましい溶媒は、滅菌濾過水である。
【００２８】
安定化組成物２０３は、静脈切開後の血液サンプルと接触させる前に、０．００５％（重量／体積）又はそれ未満のホルムアルデヒドレベルを有することが好ましい。０．００５％及びそれ未満のホルムアルデヒドは、静脈切開後の血液サンプル中のタンパク質及び核酸への損傷を低減する。安定化組成物は、静脈切開後の血液サンプルと接触させる前に、炭素１３核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）で測定したホルムアルデヒドレベルが検出不能であることが最も好ましい。
【００２９】
図３は、安定化組成物中のホルムアルデヒドの検出不能なレベルを例証する。図３は、安定化組成物の溶媒として重水を有する炭素１３（Ｃ−１３）ＮＭＲ画像３００を示す。重水中の水和されたホルムアルデヒド（メチレングリコール）の化学シフト（δ）３０１は、テトラヒドロフラン−ｄ８（ＴＨＦ）のピークに対して８２．５９百万分率（ｐｐｍ）を表すはずである。３０１におけるδ＝８２．５９ｐｐｍのピークの非存在により、安定化組成物中の水和したホルムアルデヒドが検出不能であることが確立される。
【００３０】
図４は、安定化組成物管と共に静脈切開後の血液サンプルを安定化する方法４００を例証する。４０１において、静脈切開後の血液サンプルは、安定化組成物管中の安定化組成物と接触する。接触させることは、静脈切開後の血液サンプルを安定化組成物管に引き込むことを含んでもよい。接触させることは、血液採取管を一又は複数回反転させることをさらに含んでもよい。
【００３１】
４０２では、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルは、分析前に少なくとも６時間貯蔵される。静脈切開後の血液サンプルは、６７２時間までの任意の時間貯蔵されてもよい。静脈切開後の血液サンプルは、室温で貯蔵されてもよい。静脈切開後の血液サンプルを貯蔵することは、室温で静脈切開後の血液サンプルを輸送することを含んでもよい。
【００３２】
図５は、診断するのに十分な目的の状態の状況を決定するために静脈切開後の血液サンプルを分析する方法５００を例証する。５０１では、静脈切開後の血液サンプルが安定化される。安定化することは、静脈切開後の血液サンプルを安定化組成物管中の安定化組成物と接触させることを含んでもよい。接触させることは、静脈切開後の血液サンプルを安定化組成物管へと導入することを含んでもよい。接触させることは、安定化組成物管を一又は複数回反転させることをさらに含んでもよい。
【００３３】
５０２では、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルは、少なくとも６時間貯蔵される。安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルは、６７２時間までの任意の時間貯蔵されてもよい。静脈切開後の血液サンプルは、室温で貯蔵されてもよい。静脈切開後の血液サンプルを貯蔵することは、室温で静脈切開後の血液サンプルを輸送することを含んでもよい。
【００３４】
５０３では、分析物は、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルから分離される。分離させることは、２段階の遠心分離により、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルの細胞及び細胞デブリから、分析物、標的細胞外小胞及びバックグラウンド細胞外小胞を含む血漿を分離することを含んでもよい。２段階の遠心分離は、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルの１６００（１．１１８×１０−５）（例えば、×ｇ）での１０分間の遠心分離と、血漿を第１の遠心分離管に移すことと、移した血漿を１６，０００ｇで１０分間遠心分離して、細胞及び細胞デブリを含有するペレットから血漿を分離することと、ペレットを乱さず、２段階の遠心分離後に実質的に細胞を含まない血漿を第２の遠心分離管に移すこととを含んでもよい。分離した血漿は、分析物、標的細胞外小胞、及びバックグラウンド細胞外小胞を含む。
【００３５】
分析物が細胞外小胞の内部と関連する場合及び分析物が細胞外小胞の外部と関連する場合、５０３は、分析物、標的細胞外小胞及びバックグラウンド細胞外小胞を有する血漿をアジ化ナトリウムなどの細胞外小胞単離試薬と接触させることをさらに含んでもよい。次いで、分析物、標的細胞外小胞、及びバックグラウンド細胞外小胞を有する血漿を４摂氏度で３０分間インキュベートし、それに続いて、４摂氏度において１０，０００ｇで５分間遠心分離する。遠心分離後、分析物、標的細胞外小胞、及びバックグラウンド細胞外小胞は、第２の遠心分離管の底に細胞外小胞のペレットで存在する。分析物、標的細胞外小胞及びバックグラウンド細胞外小胞を実質的に含まない血漿は、第２の遠心分離管の上部にある。
【００３６】
分析物が細胞外小胞の内部と関連する場合及び分析物が細胞外小胞の外部と関連する場合、５０３は、分析物、標的及びバックグラウンド細胞外小胞を有する細胞外小胞のペレットを分析物単離試薬と接触させて分析物を単離することをさらに含んでもよい。分析物は、標的細胞外小胞の内部と関連するＤＮＡ又はＲＮＡであり、接触させることは、分析物をカラム中のシリカベースの膜で溶出することを含む。分析物が、標的細胞外小胞の内部と関連するタンパク質である場合、接触させることは、標的細胞外小胞の内部と関連するタンパク質を溶解バッファーで可溶化することを含む。分析物が、標的細胞外小胞の外側と関連するタンパク質である場合、細胞外小胞のペレットは、タンパク質と結合するのに特異的な抗体と接触する。
【００３７】
５０４では、分析物が分析されて、目的の状態と関連する診断が決定される。例えば、目的の状態が、結腸癌などの遺伝子突然変異である場合、決定は、静脈切開後の血液サンプル中の変異した遺伝子の存在を分析することになる。染色体異数性、例えば、トリソミー２１が目的の状態である場合、決定は、静脈切開後の血液サンプル中の２１番染色体の付加的コピーの存在を分析することになる。目的の状態が胎児の性別である場合、決定は、静脈切開後の血液サンプル中のＹ染色体ＤＮＡの有無を分析することになる。目的の状態が高血糖又は糖尿病である場合、決定は、静脈切開後の血液サンプルのグルコース濃度を分析することになる。
【００３８】
図６は、（１）Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプル、及び（２）以前に記載した安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルから決定した静脈切開後の血液サンプルのグルコース濃度を比較する。グルコースは、静脈切開後の血液サンプル中の標的細胞外小胞と関連しない分析物である。
【００３９】
静脈切開後の血液サンプルと接触させる前に、１デシリットル（ｄＬ）当たり３．３グラム（ｇ）のブロノポール、３．３ｇ／ｄＬのアミノカプロン酸、１ｇ／ｄＬのトリス−ＨＣｌを含むバッファー系、６．６ｇ／ｄＬのジメチル尿素、０．１３２ｇ／ｄＬの２−メルカプトエタノール、１．６５ｇ／ｄＬのイミダゾリジニル尿素、５．６１ｇ／ｄＬのＫ３ＥＤＴＡ、及び３，３０１．６ｇ／ｄＬの滅菌濾過水を含む安定化組成物が選択された。
【００４０】
この安定化組成物を静脈切開後の血液サンプルと組み合わせた後、混合物は、１デシリットル（ｄＬ）当たり０．１グラム（ｇ）のブロノポール、０．１ｇ／ｄＬの６−アミノヘキサン酸（アミノカプロン酸）、０．０３ｇ／ｄＬのトリス−ＨＣｌを含むバッファー系、０．２ｇ／ｄＬのジメチル尿素、０．００４ｇ／ｄＬの２−メルカプトエタノール、及び０．０５ｇ／ｄＬのイミダゾリジニル尿素、０．１７ｇ／ｄＬのＫ３ＥＤＴＡ、及び９９．１４６ｇ／ｄＬの滅菌濾過水を含んだ。この例では特定の安定化組成物を使用した一方、他の安定化組成物も使用することができた。
【００４１】
Ｋ３ＥＤＴＡと接触した静脈切開後の血液サンプルは、噴霧乾燥形態の１．２から２ｍｇのＫ３ＥＤＴＡから構成する採取管（例えば、Ｋ３ＥＤＴＡのみの管）中で静脈切開後の血液サンプルを接触させることによって調製した。Ｋ３ＥＤＴＡのみの管と接触した静脈切開後の血液サンプルは、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルである。
【００４２】
グルコース濃度は、各静脈切開後の血液サンプルについて、各サンプルから単離した実質的に細胞を含まない血漿層における１デシリットル当たりのグルコースのグラム数を測定するために血糖値測定器を使用して、６７２時間の期間にわたって決定した。
【００４３】
Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルのグルコース濃度は、６時間目から７２時間目に８４％のグルコース濃度の低下を示した。６時間目から１６８時間目に、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルは１００％のグルコース濃度の低下を示した。１６８時間目から６７２時間目に、グルコースは０％の濃度で一定のままであった。このことは、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルの細胞が、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプル中のグルコースの実質的にすべてが細胞によって消費されるまで細胞代謝を続けたことを示唆する。
【００４４】
安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルのグルコース濃度は、６時間目から７２時間目に５．７％の低下、７２時間目から１６８時間目に１５．６％の低下、１６８時間目から３３６時間目に８．４％の低下、及び３３６時間目から６７２時間目に７．７％の低下を示した。まとめると、６時間目から６７２時間目におよそ９．３５％の低下が観察された。したがって、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触したサンプルと比較して、代謝は、安定化組成物によっておよそ９３％阻害された。安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルは、採血後少なくとも６７２時間までに正確なグルコースの決定を提供することができた。
【００４５】
図７は、（１）以前に記載した安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプル及び（２）Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルから決定した静脈切開後の血液サンプルのｒａｓ関連ドメイン含有タンパク質１（すなわち、ＲＡＳＳＦ１Ａ）ＤＮＡを比較する。低メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａは、バックグラウンド細胞外小胞において関連する。高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａは、標的細胞外小胞の内部と関連する分析物である。静脈切開後の血液サンプル中の細胞はバックグラウンド細胞外小胞を放出し、したがって、この例は、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触したサンプルに対してバックグラウンド細胞外小胞の放出を抑制する所望の安定化組成物の能力を実証する。この例では、図６の安定化組成物を使用して、静脈切開後の血液サンプルを安定化したが、他の安定化組成物を使用してもよい。
【００４６】
安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルは、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後のサンプルに対して、７２時間後に３８０％、１６８時間にわたって４，５２５％、３３６時間にわたって１７，４３０％、及び６７２時間にわたって３６，４３１５％のＲＡＳＳＦ１Ａ  ＤＮＡの低減を示した。したがって、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルは、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルに対して、静脈切開後の血液サンプル由来の不自然に低い決定レベルの高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａを有意に低減する。Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルと異なり、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルは、高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａの正確な決定をもたらす場合がある。
【００４７】
図８は、（１）安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルと（２）Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルの間の溶血を比較する。この例では、図６の安定化組成物を使用して静脈切開後の血液サンプルを安定化したが、他の安定化組成物を使用してもよい。
【００４８】
Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルは、１６８時間目に溶血の兆候を示し、このような兆候は６７２時間を通して増加した。安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルは、３３５時間及び６７２時間後に、溶血のわずかな兆候を示した。安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルとＫ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルとを比較すると、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルは、３３６時間でわずかな溶血を示した安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルと比較して、３３６時間でかなりの溶血を示した。したがって、安定化組成物は、静脈切開後の血液サンプルにおいて溶血を阻害する。
【００４９】
図９は、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルとＫ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルの間の標的細胞外小胞とバックグラウンド細胞外小胞（例えば、細胞外小胞）の間の血漿濃度を比較する。この場合には、図６の安定化組成物を使用して静脈切開後の血液サンプルを安定化したが、他の安定化組成物を使用してもよい。
【００５０】
Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルは、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルと比較して、７２時間目に、細胞外小胞の４５％の増加を示した。Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルは、安定化組成物と接触した静脈切開後のサンプルと比較して、１６８時間目に、細胞外小胞の１７３％の増加を示した。Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルは、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルと比較して、３３６時間目に、細胞外小胞の６２７％の増加を示した。Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルは、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルと比較して、６７２時間目に、細胞外小胞の４０４％の増加を示した。したがって、安定化組成物は、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルに対して、静脈切開後の血液サンプルにおけるバックグラウンド細胞外小胞の量を低減した。安定化組成物と接触した血液サンプルは、標的細胞外小胞の内部と関連する分析物又は標的細胞外小胞の外部と関連する分析物の正確な決定をもたらす場合がある。
【００５１】
図１０は、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプル及びＫ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルから決定したタンパク質濃度、ＲＮＡ濃度、及びＤＮＡ濃度を比較する。この例では、図６の安定化組成物を使用して静脈切開後の血液サンプルと接触したが、他の安定化組成物を使用してもよい。
【００５２】
図１０に関して使用したパーセンテージは、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した血液サンプルがベースライン測定値である文脈で表現され、ここで、安定化組成物は、ベースライン測定値未満のタンパク質、ＲＮＡ、又はＤＮＡの濃度をもたらす。安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルは、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した第２の静脈切開後の血液サンプルと比較して、７２時間後に２２％、１６８時間後に４８％、３３６時間後に１４９％、及び６７２時間後に２１３％のタンパク質濃度の低減を示した。比較すると、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルは、Ｋ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルと比較して、７２時間後に５４％、１６８時間後に１３５％、３３６時間後に１００％、及び６７２時間後に７６％のＲＮＡ濃度の低減を示した。比較すると、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルは、Ｋ３ＥＤＴＡのみの静脈切開後の血液サンプルと比較して、７２時間後に１１８％、１６８時間後に４３８％、３３６時間後に４１６４％、及び６７２時間後に５３３９％のＤＮＡ濃度の低減を示した。したがって、安定化組成物は、静脈切開後の血液サンプルにおけるバックグラウンド細胞外小胞の放出を阻害し、静脈切開後の血液サンプル中の細胞分解を低減する。
【００５３】
図１１は、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルとＫ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルの感度試験を比較する。静脈切開後の血液サンプルは、２００コピー／ｍＬの濃度で添加したヘテロ接合性変異（例えば、ＫＲＡＳ変異）を有するカーステン（ｋｉｒｓｔｏｎ）ラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）エクソン２Ｇ１３Ｄを保有するヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６由来の同体積の細胞外小胞を有した。この例では、図６の安定化組成物を使用して静脈切開後の血液サンプルと接触させたが、他の安定化組成物を使用してもよい。
【００５４】
ＫＲＡＳ変異細胞外小胞を添加した安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルを、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検出を使用してＫＲＡＳ変異に対する感度について試験した。ＫＲＡＳ変異細胞外小胞を添加した安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルは、６、７２、１６８、３３６、及び６７２時間後に１の試験感度を示した。ＫＲＡＳ変異細胞外小胞を添加したＫ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルを、リアルタイムＰＣＲ検出を使用してＫＲＡＳ変異に対する感度について試験した。ＫＲＡＳ変異細胞外小胞を添加したＫ３ＥＤＴＡのみと接触した静脈切開後の血液サンプルは、６時間後のみ１の試験感度を示した。６時間後までに１の試験感度をもたらしただけのＫ３ＥＤＴＡのみと比較して、安定化組成物は６７２まで１の試験感度を延長した。
【００５５】
図１２は、静脈切開後の血液サンプル中のプロテアーゼ活性を低減する安定化組成物の能力を実証する。プロテアーゼ活性に対する安定化組成物の効果を、安定化組成物と接触した精製トリプシンサンプル、安定化組成物と接触した精製プロテイナーゼＫサンプル、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と接触した精製トリプシンサンプル、及びＰＢＳと接触した精製プロテイナーゼＫ組成物サンプルにおけるプロテアーゼであるトリプシン及びプロテイナーゼＫの酵素活性を決定することによって測定した。この例では、図６の安定化組成物を使用したが、他の安定化組成物を使用してもよい。さらに、ＰＢＳと接触したトリプシン及びプロテイナーゼＫサンプルは、図１２において「コントロール」と標識する。
【００５６】
安定化組成物と接触した精製トリプシンサンプルは、トリプシン活性において９５％の低減を示す。安定化組成物と接触した精製プロテイナーゼＫサンプルは、安定化組成物との接触及びインキュベーション後のプロテイナーゼＫ活性において９５％の低減を示す。ＰＢＳと接触した精製トリプシン及びＰＢＳと接触した精製プロテイナーゼＫサンプルは、トリプシン又はプロテイナーゼＫ活性のいずれにおいても統計的に有意な低減を示さない。このことは、トリプシン及びプロテイナーゼＫ活性が、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプル中で実質的に阻害されることを実証する。プロテアーゼ活性の実質的な阻害は、分析物の分解を制限する。
【００５７】
以下の定義は、本明細書及び特許請求の範囲の矛盾のない理解を補助するために提供される。
【００５８】
分析物は、抗体、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ  マイクロＲＮＡ、ｃｆＤＮＡ、膜受容体、接着分子、サイトカイン、ケモカイン、及び増殖因子であってもよい。分析物は、標的細胞外小胞の内部と関連していてもよい。分析物は、標的細胞外小胞の外部と関連していてもよく、又は分析物は、細胞外小胞と関連していなくてもよい。
【００５９】
標的細胞外小胞は、目的の状態と関連する細胞によって生成される細胞外小胞（例えば、マイクロ小胞及びエキソソーム）である。標的細胞外小胞は、目的の状態を示す細胞によって生成される。標的細胞外小胞は、細胞起源及び分析物の起源である細胞の生理学的状態を反映する分析物と関連していてもよい。
【００６０】
サンプル中のバックグラウンド細胞外小胞は、目的の状態と関連しない細胞（例えば、母親細胞、又は正常で健康なヒト細胞）によって生成される細胞外小胞であり、サンプルが採取された時点でサンプル中に存在するバックグラウンド細胞外小胞と、サンプルの採取とサンプルの分析の時点間に生成されるバックグラウンド細胞外小胞とを含む。
【００６１】
診断は、目的の状態の状況の決定を生じる静脈切開後の血液サンプルの分析であり、ここで静脈切開後の血液サンプルは少なくとも６時間貯蔵され、分析物の試験感度率は１で維持され、試験感度は、真の陽性結果と偽の陰性結果の合計で除した真の陽性結果の比率である。目的の状態の状況は、目的の状態の有無であってよい。
【図１】
2019527363.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019527363.tif 000010
【図９】
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【図１０】
2019527363.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月5日(2018.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析前に静脈切開後の血液サンプルを安定化するための血液安定化組成物であって、
ジアミド、アゾエステル、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、及びその組合せからなる群からの、安定化組成物１デシリットル当たり３．３から６．６グラムの化合物、
６−アミノヘキサン酸、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、Ｎ−エチルマレイミド、エチレンジアミン四酢酸、アプロチニン、ベンズアミジンＨＣｌ、及びその組合せからなる群から選択されるプロテアーゼ阻害剤、
ｐＨを３．０から６．５又はそれ未満に維持することができる酸性バッファー、
抗凝固剤、並びに
溶媒
を含む安定化組成物。
【請求項２】
プロテアーゼ阻害剤が、６−アミノヘキサン酸、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、Ｎ−エチルマレイミド、エチレンジアミン四酢酸、アプロチニン、ベンズアミジンＨＣｌ、及びその組合せからなる群から選択され、
バッファーが、トリス−塩酸、ビス−トリス−塩酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド、ジメチル尿素、イミダゾリジニル尿素、グリシン、リシン、２−メルカプトエタノール及びその組合せからなる群から選択され、
抗凝固剤が、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸三カリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム、クエン酸、シュウ酸、及びその組合せからなる群から選択され、
溶媒が、滅菌蒸留水、滅菌濾過水、及び濾過オゾン化水からなる群から選択される、
請求項１に記載の安定化組成物。
【請求項３】
化合物が、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオールであり、
プロテアーゼ阻害剤が、６−アミノヘキサン酸であり、
酸性バッファーが、トリス−塩酸、ジメチル尿素、２−メルカプトエタノール、及びイミダゾリジニル尿素であり、
抗凝固剤が、エチレンジアミン四酢酸であり、
溶媒が、滅菌濾過水である、
請求項１に記載の安定化組成物。
【請求項４】
分析前に静脈切開後の血液サンプルを安定化するための血液安定化組成物であって、
安定化組成物１デシリットル当たり３．３から６．６グラムの、ジアミド、アゾエステル、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、及びその組合せからなる群のうちの一又は複数、
安定化組成物１デシリットル当たり３．３から６．６グラムのプロテアーゼ阻害剤、
安定化組成物１デシリットル当たり１から２グラムの、ｐＨを３．０から６．５又はそれ未満に維持することができる酸性バッファーであって、トリス−塩酸、ジメチル尿素、２−メルカプトエタノール、及びイミダゾリジニル尿素、並びにその組合せからなる群から選択される、酸性バッファー、
安定化組成物１デシリットル当たり４．９から６．０グラムの抗凝固剤、並びに
溶媒
を含む安定化組成物。
【請求項５】
３から６．５のｐＨを有する、請求項４に記載の安定化組成物。
【請求項６】
１８から２５摂氏度で、重水中の炭素１３核磁気共鳴画像化によって分析された場合に、検出不能な量のホルムアルデヒドを有する、請求項４に記載の安定化組成物。
【請求項７】
静脈切開後の血液サンプルを安定化するための方法であって、
静脈切開後の血液サンプルを安定化組成物と接触させることであって、
安定化組成物が、安定化組成物１デシリットル当たり３．３から６．６グラムの、ジアミド、アゾエステル、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、及びその組合せからなる群のうちの一又は複数、プロテアーゼ阻害剤、ｐＨを３．０から６．５又はそれ未満に維持することができる酸性バッファー、抗凝固剤、並びに溶媒を含む、接触させることと、
安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルを分析前に少なくとも６時間貯蔵することと
を含む方法。
【請求項８】
貯蔵することが、１０から３０摂氏度の温度で、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルを貯蔵することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
貯蔵することが、少なくとも７２時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
貯蔵することが、少なくとも１６８時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
貯蔵することが、少なくとも３３６時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
貯蔵することが、少なくとも６７２時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
静脈切開後の血液サンプルを分析して目的の状態の有無を決定する方法であって、
静脈切開後の血液サンプルを安定化することであって、
静脈切開後の血液サンプルを安定化組成物と接触させることを含み、
安定化組成物が、安定化組成物１デシリットル当たり３．３から６．６グラムの、ジアミド、アゾエステル、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、及びその組合せからなる群のうちの一又は複数、プロテアーゼ阻害剤、ｐＨを３．０から６．５又はそれ未満に維持することができるバッファー、並びに溶媒を含む、安定化することと、
安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルを少なくとも６時間貯蔵することと、
分析物及び標的細胞外小胞を含む血漿を安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルから分離することと、
分析物を分析して目的の状態の有無を決定することと
を含む方法。
【請求項１４】
分離することが、分析物及び標的細胞外小胞を含む血漿を、安定化組成物と接触した静脈切開後の血液サンプルの細胞及び細胞デブリから分離することを含み、分離することが２段階の遠心分離を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
分析物が、標的細胞外小胞の内部と関連する分析物及び標的細胞外小胞の外部と関連する分析物である場合、分離することが、分析物及び標的細胞外小胞を有する血漿を細胞外小胞単離試薬と接触させることをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
分析物が標的細胞外小胞の内部と関連する場合、分離することが、分析物に結合するためのシリカベースの膜で溶出することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
分析物が標的細胞外小胞の内部と関連する場合、分離することが、分析物を溶解バッファーで可溶化することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
標的分析物が標的細胞外小胞の外部と関連する場合、分離することが、標的分析物に特異的な抗体に結合させることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
疾患の診断方法であって、
分析物を有する静脈切開後の血液サンプルを安定化することであって、
静脈切開後の血液サンプルを安定化組成物と接触させることを含み、
安定化組成物が、安定化組成物１デシリットル当たり３．３から６．６グラムの、ジアミド、アゾエステル、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、マレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、及びその組合せからなる群のうちの一又は複数、プロテアーゼ阻害剤、ｐＨを３．０から６．５又はそれ未満に維持することができるバッファー、並びに溶媒を含む、安定化することと、
安定化組成物と接触した分析物を有する静脈切開後の血液サンプルを少なくとも６時間貯蔵することと、
少なくとも６時間貯蔵された静脈切開後の血液サンプルを分析することであって、分析物が、試験感度率１で維持される、分析することと
を含む方法。
【国際調査報告】
2019527363.tif 000015