(57)【要約】  本発明は、サイトカイン融合タンパク質、および斯かるサイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明は、さらに、サイトカイン融合タンパク質またはこれをコードする核酸分子を含む、細胞、非ヒト生物、医薬組成物およびキットに関し、また、医薬としてのこれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのリガンドの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントと、（ｉｉ）インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントとを含む、サイトカイン融合タンパク質であって、リガンドの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントと、インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントとが、共有結合により連結されている、サイトカイン融合タンパク質。
【請求項２】
共有結合により連結されたリガンドの３個の細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントを含むブロックを含み、ブロックとインターロイキンまたはその断片もしくはバリアントとが、共有結合により連結されている、請求項１に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項３】
３個の細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントが、リガンドの受容体に結合することができるホモ三量体を形成する、請求項２に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項４】
３個の細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントおよび／またはブロックと、インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントとが、ペプチドリンカーを介して共有結合により連結されている、請求項２または３に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項５】
次の一般式を有する分子／構造を含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質。
Ｎ’−Ａ−ＬA−Ａ−ＬA−Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｃ’（式Ｉ）または
Ｎ’−Ｂ−Ｌ−Ａ−ＬA−Ａ−ＬA−Ａ−Ｃ’（式ＩＩ）
（式中、Ａは、リガンドの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントを含み、Ｂは、インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントを含み、
Ｌは、ペプチドリンカーを含み、
ＬAは、出現毎に、共有結合およびペプチドリンカーから独立して選択される）
【請求項６】
Ｌが、サイトカイン融合タンパク質の多量体形成、好ましくは、二量体形成を可能にする、多量体形成ドメイン、好ましくは、二量体形成ドメインをさらに含む、請求項５に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項７】
二量体形成ドメインが、ＩｇＥ重鎖ドメイン２（ＥＨＤ２）、ＩｇＭ重鎖ドメイン２（ＭＨＤ２）、ＩｇＧ重鎖ドメイン３（ＧＨＤ３）、ＩｇＡ重鎖ドメイン３（ＡＨＤ２）、ＩｇＤ重鎖ドメイン３（ＤＨＤ３）、ＩｇＥ重鎖ドメイン４（ＥＨＤ４）、ＩｇＭ重鎖ドメイン４（ＭＨＤ４）、Ｆｃドメイン、ウテログロビン二量体形成ドメインおよび前述のいずれか１種の機能的バリアントからなる群から選択される、請求項６に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項８】
多量体、好ましくは二量体複合体として存在する、請求項６または７に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項９】
リガンドの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントと、インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントとが、ペプチドリンカーを介して共有結合により連結されている、請求項１に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項１０】
次の一般式を有する分子／構造を含む、請求項１または９に記載のサイトカイン融合タンパク質。
Ｎ’−Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｃ’（式ＩＩＩ）または
Ｎ’−Ｂ−Ｌ−Ａ−Ｃ’（式ＩＶ）
（式中、Ａは、リガンドの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントを含み、Ｂは、インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントを含み、
Ｌは、ペプチドリンカーを含む）
【請求項１１】
三量体複合体として存在し、リガンドの３個の細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントが、リガンドの受容体に結合することができるホモ三量体を形成する、請求項１、９および１０のいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項１２】
リガンドが、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ−アルファ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬおよびＴＷＥＡＫからなる群から、好ましくは、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０Ｌからなる群から選択される、請求項１から１１までのいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項１３】
ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインが、配列番号１のアミノ酸残基５１〜２６１もしくは１１６〜２６１を含むもしくはこれからなる、ＣＤ２７Ｌの細胞外ドメインが、配列番号２のアミノ酸残基５２〜１９３を含むもしくはこれからなる、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインが、配列番号３のアミノ酸残基７１〜２５４を含むもしくはこれからなる、および／またはＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインが、配列番号４のアミノ酸残基５１〜１８３を含むもしくはこれからなる、請求項１２に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項１４】
インターロイキンが、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ２１、ＩＬ２７、ＩＬ１−アルファ、ＩＬ１−ベータ、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ９、ＩＬ２３、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ３１およびＩＬ３３からなる群から選択される、請求項１から１３までのいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項１５】
インターロイキンが、単一のポリペプチドとして存在するヘテロ二量体インターロイキンである、請求項１４に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項１６】
サイトカイン融合タンパク質の検出および／または単離を可能にする少なくとも１個の標識またはタグをさらに含む、請求項１から１５までのいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項１７】
サイトカイン融合タンパク質の安定性を増加させる１個または複数の修飾をさらに含む、請求項１から１６までのいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項１８】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＴ細胞、好ましくは、ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を増強する、請求項１から１７までのいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１から１８までのいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２０】
発現制御配列に操作可能に連結された、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
ベクターに含有されている、請求項１９または２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
ＲＮＡ分子、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ＲＮＡ分子である、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２３】
請求項１９から２２までのいずれか１項に記載の核酸分子により形質転換またはトランスフェクトされた細胞。
【請求項２４】
原核細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
真核細胞、好ましくは、哺乳類細胞、より好ましくは、ヒト細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２６】
請求項１９から２２までのいずれか１項に記載の核酸分子により形質転換またはトランスフェクトされた非ヒト生物。
【請求項２７】
活性剤として、請求項１から１８までのいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質、請求項１９から２２までのいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項２３から２５までのいずれか１項に記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項２８】
薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１から１８までのいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質、請求項１９から２２までのいずれか１項に記載の核酸分子、請求項２３から２５までのいずれか１項に記載の細胞、または請求項２７もしくは２８に記載の医薬組成物を含むキット。
【請求項３０】
医薬としての使用のための、請求項１から１８までのいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質、請求項１９から２２までのいずれか１項に記載の核酸分子、請求項２３から２５までのいずれか１項に記載の細胞、または請求項２７もしくは２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
がん、感染性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫性障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患および移植片拒絶からなる群から選択される疾患の処置における使用のための、請求項１から１８までのいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質、請求項１９から２２までのいずれか１項に記載の核酸分子、請求項２３から２５までのいずれか１項に記載の細胞、または請求項２７もしくは２８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカイン融合タンパク質、および斯かるサイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明は、さらに、サイトカイン融合タンパク質またはこれをコードする核酸分子を含む、細胞、非ヒト生物、医薬組成物およびキットに関し、また、医薬としてのこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのリガンドは、アポトーシス、免疫細胞機能の調節および他の細胞型特異的応答を含む、正常な発生過程における重要な役割を有する。これは、がんおよび自己免疫性疾患を含む、様々な後天的および遺伝的疾患における重大な役割も果たす。
ＴＮＦリガンドスーパーファミリーは、ＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）と称される、保存された細胞外Ｃ末端ドメインによって特徴づけられる（Bodmer, J.L. et al. (2002), TRENDS in Biochemical Sciences, 27(1):19-26）。実質的に同一の三次フォールドを共有し、ファミリーメンバー間でおよそ２０〜３０％の配列同一性を示すＴＨＤは、受容体結合の原因となり、非共有結合的に相互作用して（ホモ）三量体複合体を形成し、これは次いで、その特異的受容体によって認識される。大部分のリガンドは、膜結合型タンパク質、より具体的には、ＩＩ型（すなわち、細胞内Ｎ末端および細胞外Ｃ末端）膜貫通タンパク質として合成されるが、可溶性サイトカインが、ＴＨＤを含む細胞外ドメインのタンパク質分解性切断によって生成され得る（Bodmer, J.L. et al. (2002), TRENDS in Biochemical Sciences, 27(1):19-26）。
用語「インターロイキン（ＩＬ）」は、細胞増殖、成熟、遊走および接着を含む、複雑な免疫調節機能を有するサイトカインの群を指す。インターロイキンは、免疫細胞分化および活性化における重要な役割も果たす（Brocker, C. et al. (2010), Human Genomics, 5:30-55）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、多機能性、特に、二機能性または二重作用性（ｄｕａｌ−ａｃｔｉｎｇ）である、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドおよびインターロイキンのサイトカイン融合タンパク質を提供することであった。本発明のさらに別の目的は、斯かるサイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子、特に、ＲＮＡ分子を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、本発明は、（ｉ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのリガンドの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントと、（ｉｉ）インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントとを含む、サイトカイン融合タンパク質であって、リガンドの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントと、インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントとが、共有結合により連結されている、サイトカイン融合タンパク質に関する。
一実施形態では、サイトカイン融合タンパク質は、共有結合により連結された、リガンドの３個の細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントを含む、ブロックを含み、ブロックとインターロイキンまたはその断片もしくはバリアントとは、共有結合により連結されている。
一実施形態では、３個の細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントは、リガンドの受容体に結合することができるホモ三量体を形成する。
一実施形態では、３個の細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントおよび／またはブロックと、インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントとは、ペプチドリンカーを介して共有結合により連結される。
【０００５】
一実施形態では、サイトカイン融合タンパク質は、次の一般式を有する分子／構造を含む。
Ｎ’−Ａ−ＬA−Ａ−ＬA−Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｃ’（式Ｉ）または
Ｎ’−Ｂ−Ｌ−Ａ−ＬA−Ａ−ＬA−Ａ−Ｃ’（式ＩＩ）
（式中、Ａは、リガンドの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントを含み、Ｂは、インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントを含み、
Ｌは、ペプチドリンカーを含み、
ＬAは、出現毎に、共有結合およびペプチドリンカーから独立して選択される）
一実施形態では、Ｌは、サイトカイン融合タンパク質の多量体形成、好ましくは、二量体形成を可能にする、多量体形成ドメイン、好ましくは、二量体形成ドメインをさらに含む。
【０００６】
一実施形態では、二量体形成ドメインは、ＩｇＥ重鎖ドメイン２（ＥＨＤ２）、ＩｇＭ重鎖ドメイン２（ＭＨＤ２）、ＩｇＧ重鎖ドメイン３（ＧＨＤ３）、ＩｇＡ重鎖ドメイン３（ＡＨＤ２）、ＩｇＤ重鎖ドメイン３（ＤＨＤ３）、ＩｇＥ重鎖ドメイン４（ＥＨＤ４）、ＩｇＭ重鎖ドメイン４（ＭＨＤ４）、Ｆｃドメイン、ウテログロビン二量体形成ドメインおよび前述のいずれか１種の機能的バリアントからなる群から選択される。
一実施形態では、サイトカイン融合タンパク質は、多量体、好ましくは、二量体複合体として存在する。
一実施形態では、リガンドの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントと、インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントとは、ペプチドリンカーを介して共有結合により連結される。
【０００７】
一実施形態では、サイトカイン融合タンパク質は、次の一般式を有する分子／構造を含む。
Ｎ’−Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｃ’（式ＩＩＩ）または
Ｎ’−Ｂ−Ｌ−Ａ−Ｃ’（式ＩＶ）
（式中、Ａは、リガンドの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントを含み、Ｂは、インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントを含み、
Ｌは、ペプチドリンカーを含む）
一実施形態では、サイトカイン融合タンパク質は、リガンドの３個の細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントが、リガンドの受容体に結合することができるホモ三量体を形成する、三量体複合体として存在する。
【０００８】
一実施形態では、リガンドは、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ−アルファ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬおよびＴＷＥＡＫからなる群から、好ましくは、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０Ｌからなる群から選択される。
一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基５１〜２６１もしくは１１６〜２６１を含むもしくはこれからなる、ＣＤ２７Ｌの細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸残基５２〜１９３を含むもしくはこれからなる、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸残基７１〜２５４を含むもしくはこれからなる、および／またはＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインは、配列番号４のアミノ酸残基５１〜１８３を含むもしくはこれからなる。
一実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ２１、ＩＬ２７、ＩＬ１−アルファ、ＩＬ１−ベータ、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ９、ＩＬ２３、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ３１およびＩＬ３３からなる群から選択される。
【０００９】
一実施形態では、インターロイキンは、単一のポリペプチドとして存在するヘテロ二量体インターロイキンである。
一実施形態では、サイトカイン融合タンパク質は、サイトカイン融合タンパク質の検出および／または単離を可能にする、少なくとも１個の標識またはタグをさらに含む。
一実施形態では、サイトカイン融合タンパク質は、サイトカイン融合タンパク質の安定性を増加させる、１個または複数の修飾をさらに含む。
一実施形態では、サイトカイン融合タンパク質は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＴ細胞、好ましくは、ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を増強する。
別の態様では、本発明は、上に規定されているサイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。
一実施形態では、核酸分子は、発現制御配列に操作可能に連結される。
一実施形態では、核酸分子は、ベクターに含有される。
一実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ＲＮＡ分子である。
別の態様では、本発明は、上に規定されている核酸分子により形質転換またはトランスフェクトされた細胞に関する。
一実施形態では、細胞は、原核細胞である。
一実施形態では、細胞は、真核細胞、好ましくは、哺乳類細胞、より好ましくは、ヒト細胞である。
別の態様では、本発明は、上に規定されている核酸分子により形質転換またはトランスフェクトされた非ヒト生物に関する。
別の態様では、本発明は、活性剤として、上に規定されているサイトカイン融合タンパク質、上に規定されている核酸分子、または上に規定されている細胞を含む医薬組成物に関する。
一実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む。
【００１０】
別の態様では、本発明は、上に規定されているサイトカイン融合タンパク質、上に規定されている核酸分子、上に規定されている細胞、または上に規定されている医薬組成物を含むキットに関する。
別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、上に規定されているサイトカイン融合タンパク質、上に規定されている核酸分子、上に規定されている細胞、または上に規定されている医薬組成物に関する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、がん、感染性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫性障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患および移植片拒絶からなる群から選択される疾患の処置における使用のための、上に規定されているサイトカイン融合タンパク質、上に規定されている核酸分子、上に規定されている細胞、または上に規定されている医薬組成物に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明（ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ）は、がん、感染性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫性障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患および移植片拒絶からなる群から選択される疾患の処置のための医薬の製造における、上に規定されているサイトカイン融合タンパク質、上に規定されている核酸分子、上に規定されている細胞、または医薬組成物の使用に関する。
別の態様では、本発明（ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ）は、がん、感染性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫性障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患および移植片拒絶からなる群から選択される疾患の処置方法であって、上に規定されているサイトカイン融合タンパク質、上に規定されている核酸分子、上に規定されている細胞、または上に規定されている医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、インターロイキン、ＴＮＦＲリガンドの細胞外ドメインおよびこれらの融合タンパク質をコードするｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のためのベクター設計を示す。ヒトインターロイキン（ｈＩＬ（ｘ））、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）リガンドおよびこれらの融合タンパク質をコードするＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として、プラスミドコンストラクトｐＳＴ１−ｈＡｇ−コザック−ｓｅｃ（ｏｐｔ）−インサート−２ｈＢｇＵＴＲ−Ａ３０ＬＡ７０を使用した。ＴＮＦＲリガンドは、ホモ三量体として機能的に活性である  −  したがって、インサートが、短いリンカードメイン（コードされるアミノ酸：Ｇ3ＳＧ3）によって分離された３コピーの細胞外ヒトドメインを含んだ、よって、共有結合した三量体をコードする、単鎖コンストラクトをクローニングした。このようなコンストラクトは、「ｈ３＿ＴＮＦＲ−Ｌ」として示される。インターロイキン配列およびＴＮＦＲリガンドの融合タンパク質を生成するために、両者は、リンカーによって接続された。コンストラクトは、「ｓｅｃ」として示される分泌シグナル配列を含んだ。
【図２】図２は、ＩＶＴ−ＲＮＡエレクトロポレーション後の融合タンパク質の細胞内発現を示す。インターロイキンＴＮＦＲリガンド融合タンパク質をコードするＩＶＴ−ＲＮＡにより、Ｋ５６２細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション６時間後に、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇおよびＧｏｌｇｉＳＴＯＰによりタンパク質排出を遮断し、１２時間のインキュベーション後に、それぞれ示されているインターロイキンおよびＣＤ４０Ｌに関して細胞を細胞内染色した。
【図３】図３は、インターロイキンＣＤ４０Ｌ融合コンストラクトをコードするＩＶＴ−ＲＮＡのエレクトロポレーション後に発現されたタンパク質の受容体活性化特性を示す。（Ａ）ＨＴ１０８０の安定したヒトＣＤ４０トランスフェクタントを抗ＣＤ４０−ＦＩＴＣで染色した。（Ｂ）示されているｈ３＿ＣＤ４０Ｌ融合タンパク質をコードするＩＶＴ−ＲＮＡによりエレクトロポレーションされたＫ５６２由来の上清とのインキュベーション後の、ＨＴ１０８０＿ｈＣＤ４０の活性化によるＩＬ−８放出。ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ単一のタンパク質および融合タンパク質は、対応するＲＮＡ（エレクトロポレーション当たり７，５μｇ  ＲＮＡ）のエレクトロポレーション後にＩＬ−８分泌をもたらした。組換えタンパク質ＭｅｇａＣＤ４０Ｌ（Ｅｎｚｏ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および組換えＴＮＦ−アルファは、匹敵する量までＩＬ８分泌を誘導した。
【図４Ａ】図４は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞増殖における、ＩＶＴ−ＲＮＡコードされたｈＩＬ２−ｈ３＿ＴＮＦＲＬ融合タンパク質の効果を示す。ヒトＩＬ−２および可溶性ＴＮＦＲリガンドドメインからなる融合タンパク質をコードするＩＶＴ−ＲＮＡ（ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ、ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ、ｈ３＿ＯＸ４０Ｌまたはｈ３＿４−１ＢＢＬ）を、非特異的ＣＦＳＥ増殖アッセイによって、ＰＢＭＣ増殖におけるその機能に関して検査した。この目的のため、マルチウェルエレクトロポレーションプレート（９６ウェル）において、インターロイキン、ＴＮＦＲリガンドの細胞外ドメインまたはこれらの融合タンパク質をコードするＩＶＴ−ＲＮＡにより、Ｋ５６２細胞をエレクトロポレーションした。他に指定がなければ、対応するコードされたタンパク質を参照して、２０ｐｍｏｌのＲＮＡを使用した。２４時間のインキュベーション後に、上清を、抗ＣＤ３によって最適以下に活性化された、ＣＦＥＳ標識されたＰＢＭＣに移した。フローサイトメトリーによって５日間のインキュベーション後にＣＦＳＥ読み取りを行った；ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞およびＣＤ５６+ＮＫ細胞を、それぞれ抗ヒトＣＤ４−ＰＥ、ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７およびＣＤ５６−ＡＰＣで染色した。細胞分裂を示すピークに基づく増殖の詳細な解析をＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって行った。この手段によって、「分裂した細胞％」によって示される、分裂状態になったＴ細胞のパーセンテージと、「増殖指数」によって示される、分裂状態になった細胞の平均分裂回数を計算した（Ａ〜Ｄ）。単一のサイトカインコードＲＮＡと比較したｈＩＬ２融合タンパク質の効果を、ＴＮＦＲリガンドｈ３＿ＣＤ２７Ｌ（Ａ）との融合に関して解析した。
【図４Ｂ】単一のサイトカインコードＲＮＡと比較したｈＩＬ２融合タンパク質の効果を、ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ（Ｂ）との融合に関して解析した。
【図４Ｃ】単一のサイトカインコードＲＮＡと比較したｈＩＬ２融合タンパク質の効果を、ｈ３＿４−１ＢＢＬ（Ｃ）との融合に関して解析した。
【図４Ｄ】単一のサイトカインコードＲＮＡと比較したｈＩＬ２融合タンパク質の効果を、ｈ３＿ＯＸ４０Ｌ（Ｄ）との融合に関して解析した。
【図４Ｅ−Ｆ】代表的ヒストグラムをＥおよびＦに示す。単一のサイトカインコードＲＮＡと比較したｈＩＬ２融合タンパク質の効果を、ｈ３＿４−１ＢＢＬ（Ｅ）およびｈ３＿ＯＸ４０Ｌ（Ｆ）との融合に関して解析した。
【図５】図５は、Ｔ細胞増殖におけるＩＶＴ−ＲＮＡコードされたｈｓｃＩＬ１２−ｈ３＿ＴＮＦＲＬ融合タンパク質の効果を示す。単一のサイトカインコードＲＮＡと比較したｈｓｃＩＬ１２融合タンパク質の効果を、ＴＮＦＲリガンドｈ３＿ＣＤ２７Ｌ（Ａ）、ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ（Ｂ）、ｈ３＿４−１ＢＢＬ（Ｃ）およびｈ３＿ＯＸ４０Ｌ（Ｄ）とのｈｓｃＩｌ１２融合に関して解析した。図４（例４）に記載されている通りにアッセイを行った。
【図６】図６は、抗原特異的Ｔ細胞増殖におけるＩＶＴ−ＲＮＡコードされたｈＩＬ２−ｈ３＿ＴＮＦＲＬ融合タンパク質の効果を示す。クローディン−６  ＩＶＴ−ＲＮＡによりｉＤＣをエレクトロポレーションした。クローディン−６特異的ＣＤ８+Ｔ細胞受容体をコードするＩＶＴ−ＲＮＡによりＣＤ８+Ｔ細胞（ＨＬＡ−Ａ２+ドナー）をエレクトロポレーションし、後に、ＣＦＳＥで染色した。エレクトロポレーション１日後に、ｉＤＣおよびＣＤ８+Ｔ細胞を１：１０の比で４日間共培養した；２４時間のインキュベーション後のエレクトロポレーションされたＫ５６２細胞由来の上清を、共培養物に添加した。Ｋ５６２細胞は、マルチウェルエレクトロポレーションプレート（９６ウェル）において、示されているインターロイキン、ＴＮＦＲリガンドの細胞外ドメインまたはこれらの融合タンパク質をコードするＩＶＴ−ＲＮＡ（翻訳されたタンパク質を参照して２０ｐｍｏｌ）によりエレクトロポレーションされていた。ＣＤ８+Ｔ細胞増殖をＦＡＣＳによって解析した。細胞分裂を示すピークに基づく増殖の詳細な解析をＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって行った。この手段によって、「分裂した細胞％」によって示される、分裂状態になったＴ細胞のパーセンテージと、「増殖指数」によって示される、分裂状態になった細胞の平均分裂回数を計算し、両者をそれぞれ（Ａ）および（Ｂ）に示す。ｈＩＬ２−ｈ３＿ＴＮＦＲＬ融合タンパク質は、対応する単一のＲＮＡの混合物よりも高い程度まで増殖を増強した。より正確には、全ｈＩＬ２−ｈ３＿ＴＮＦＲＬ融合体は、より多い回数の細胞分裂をもたらし（Ｂ）、その上、ｈＩＬ２−ｈ３＿ＣＤ２７ＬおよびｈＩＬ２−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ融合コンストラクトの適用により、より多くの細胞が分裂状態になった（Ａ）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明について下に詳細に記載するが、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬は変動し得るため、本発明が、これらに限定されないことを理解されたい。本明細書に使用されている用語法が、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、本発明の範囲の限定を意図せず、本発明は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるであろうことも理解されたい。他に規定がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。
【００１５】
次に、本発明のある特定の要素を記載する。これらの要素は、特異的な実施形態により収載され得るが、これらの要素を、いずれかの様式およびいずれかの数で組み合わせて、追加的な実施形態を作り出してよいことを理解されたい。様々に記載された例および好ましい実施形態は、明確に記載された実施形態のみに本発明を限定するものと解釈するべきではない。この記載は、明確に記載された実施形態をいずれかの数の開示されたおよび／または好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持および包含するものと理解されたい。さらに、文脈がそれ以外を示さない限り、本願におけるあらゆる記載された要素のいずれかの順列および組合せは、本願の記載によって開示されていると考慮されたい。
【００１６】
好ましくは、本明細書に使用されている用語は、“A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)に記載の通りに規定されている。
本発明の実施は、他に断りがなければ、当該分野の文献において説明される化学、生化学、細胞生物学、免疫学および組換えＤＮＡ技法の従来方法を用いるであろう（Sambrook, J. et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。
【００１７】
本明細書およびこれに続く特許請求の範囲を通して、文脈がそれ以外を要求しない限り、単語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびに「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のその変種は、記述されたメンバー、整数もしくはステップ、またはメンバー、整数もしくはステップの群の包接を暗示するが、他のいかなるメンバー、整数もしくはステップ、またはメンバー、整数もしくはステップの群も排除しない、ただし、一部の実施形態では、斯かる他のメンバー、整数もしくはステップ、またはメンバー、整数もしくはステップの群は排除される場合がある、すなわち、主題は、記述されたメンバー、整数もしくはステップ、またはメンバー、整数もしくはステップの群の包接に存すると理解されるであろう。用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」、ならびに本発明を記載する文脈（特に、特許請求の範囲の文脈）で使用される同様の参照は、本明細書において他に断りがなければ、または文脈と明らかに矛盾しなければ、単数形および複数形の両方を網羅するものと解釈されたい。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲内に収まるそれぞれ別々の値を個々に参照する簡略された方法として機能することが意図される。本明細書において他に断りがなければ、それぞれ個々の値は、本明細書に個々に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているあらゆる方法は、本明細書において他に断りがなければ、または文脈と他に明らかに矛盾しなければ、いずれか適した順序で実行することができる。本明細書に提示されているありとあらゆる例、または例示的な言葉（例えば、「等」）の使用は、単に、本発明をより良く例証することを意図し、本来請求されている本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる言葉も、本発明の実施に本質的ないずれか請求されていない要素を示すものと解釈するべきではない。
【００１８】
いくつかの文書が、本明細書の文章を通して引用されている。上記であれ下記であれ、本明細書に引用されている文書のそれぞれ（あらゆる特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の明細、説明書等を含む）は、これにより、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。本明細書におけるいずれも、本発明が、先行発明に基づいて斯かる開示に先行する権利がないことの承認として解釈するべきではない。
用語「サイトカイン」は一般に、細胞シグナル伝達において重要であり、受容体を介して作用するタンパク質を指す。本発明の文脈において、この用語は、特に、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンド、より具体的には、可溶性活性ホモ三量体を形成するこのようなリガンドの細胞外ドメインや、インターロイキンを指す。
【００１９】
用語「ＴＮＦスーパーファミリーのリガンド」（本明細書において、「ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）リガンド」または「ＴＮＦＲリガンド」または「ＴＮＦＲＬ」または「ＴＮＦＲ−Ｌ」とも称される）は、ＴＮＦスーパーファミリーの所与のリガンドのバリアントも含む、ただし、このようなバリアントが機能的であること、より具体的には、リガンドの受容体に結合することができるホモ三量体を形成することができる細胞外ドメインを有することを条件とする。
本発明に係る用語「ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドのバリアント」は、特に、突然変異体、スプライスバリアント、立体構造バリアント、アイソフォーム、アレルバリアント、種バリアントおよび種ホモログ、特に、天然に存在するこれらを指す。アレルバリアントは、その重要性が不明であることが多い、遺伝子の正常配列の変更に関する。完全遺伝子配列決定は、多くの場合、所与の遺伝子の多数のアレルバリアントを同定する。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列とは起源の異なる種による核酸またはアミノ酸配列である。用語「ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドのバリアント」は、いずれかの翻訳後修飾されたバリアントおよび立体構造バリアントを包含するものとする。
【００２０】
一実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドは、ＴＮＦスーパーファミリーのヒトリガンドである。本発明において、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドは、好ましくは、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ−アルファ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬおよびＴＷＥＡＫからなる群から、より好ましくは、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０Ｌからなる群から選択される。
上述および他のリガンドの核酸配列およびアミノ酸配列は、当業者に知られており、ＮＣＢＩデータベース、ＧｅｎｅＣａｒｄｓまたはＵｎｉＰｒｏｔ等、公共のデータベースから得ることができる。
【００２１】
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、ＣＤ１５４、ＴＮＦＳＦ５、ＴＲＡＰまたはｇｐ３９の別名でも知られており、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。一実施形態では、用語、ＣＤ４０Ｌは、本明細書において、ヒトＣＤ４０Ｌを指す。例えば、ヒトＣＤ４０ＬのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ２９９６５である。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）は、ＣＤ７０またはＴＮＦＳＦ７の別名でも知られており、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。一実施形態では、用語、ＣＤ２７Ｌは、本明細書において、ヒトＣＤ２７Ｌを指す。例えば、ヒトＣＤ２７ＬのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ３２９７０である。一実施形態では、ＣＤ２７Ｌは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、ＴＮＦＳＦ９とも称される。一実施形態では、用語、４−１ＢＢＬは、本明細書において、ヒト４−１ＢＢＬを指す。例えば、ヒト４−１ＢＢＬのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ４１２７３である。一実施形態では、４−１ＢＢＬは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。
ｇｐ３４またはＴＮＦＳＦ４の別名でも知られるＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。一実施形態では、用語、ＯＸ４０Ｌは、本明細書において、ヒトＯＸ４０Ｌを指す。例えば、ヒトＯＸ４０ＬのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ２３５１０である。一実施形態では、ＯＸ４０Ｌは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。
【００２３】
ＴＡＬＬ−２、ＴＲＤＬ−１またはＴＮＦＳＦ１３の別名でも知られる増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）は、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーのＩＩ型膜貫通タンパク質である。一実施形態では、用語、ＡＰＲＩＬは、本明細書において、ヒトＡＰＲＩＬを指す。例えば、ヒトＡＰＲＩＬのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｏ７５８８８である。
ＴＮＦＳＦ８の別名でも知られるＣＤ３０リガンド（ＣＤ３０Ｌ）は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜タンパク質である。一実施形態では、用語、ＣＤ３０Ｌは、本明細書において、ヒトＣＤ３０Ｌを指す。例えば、ヒトＣＤ３０ＬのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ３２９７１である。
エクトジスプラシン−Ａ１（ＥＤＡ−Ａ１）は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。これは、エクトジスプラシン−Ａ（ＥＤＡ）のスプライスバリアントである。一実施形態では、用語、ＥＤＡ−Ａ１は、本明細書において、ヒトＥＤＡ−Ａ１を指す。例えば、ヒトＥＤＡ−Ａ１のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｑ９２８３８−１である。
【００２４】
エクトジスプラシン−Ａ２（ＥＤＡ−Ａ２）は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。これは、エクトジスプラシン−Ａ（ＥＤＡ）のスプライスバリアントである。一実施形態では、用語、ＥＤＡ−Ａ２は、本明細書において、ヒトＥＤＡ−Ａ２を指す。例えば、ヒトＥＤＡ−Ａ２のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｑ９２８３８−３である。
Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）は、ＣＤ９５ＬまたはＴＮＦＳＦ６の別名でも知られており、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。一実施形態では、用語、ＦａｓＬは、本明細書において、ヒトＦａｓＬを指す。例えば、ヒトＦａｓＬのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ４８０２３である。
【００２５】
ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦＳＦ１８と命名された。一実施形態では、用語、ＧＩＴＲＬは、本明細書において、ヒトＧＩＴＲＬを指す。例えば、ヒトＧＩＴＲＬのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｑ９ＵＮＧ２である。
ＬＩＧＨＴは、ＨＶＥＭＬまたはＴＮＦＳＦ１４の別名でも知られており、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。一実施形態では、用語、ＬＩＧＨＴは、本明細書において、ヒトＬＩＧＨＴを指す。例えば、ヒトＬＩＧＨＴのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｏ４３５５７である。
【００２６】
リンホトキシン−アルファ（ＬＴ−アルファ）は、ＴＮＦ−ベータまたはＴＮＦＳＦ１の別名でも知られており、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである。一実施形態では、用語、ＬＴ−アルファは、本明細書において、ヒトＬＴ−アルファを指す。例えば、ヒトＬＴ−アルファのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ０１３７４である。
ＴＬ１Ａは、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１５（ＴＮＦＳＦ１５）と命名された。一実施形態では、用語、ＴＬ１Ａは、本明細書において、ヒトＴＬ１Ａを指す。例えば、ヒトＴＬ１ＡのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｏ９５１５０−１である。
カケクチンまたはＴＮＦＳＦ２の別名でも知られる腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。一実施形態では、用語、ＴＮＦ−アルファは、本明細書において、ヒトＴＮＦ−アルファを指す。例えば、ヒトＴＮＦ−アルファのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ０１３７５である。
【００２７】
Ａｐｏ−２リガンドまたはＴＮＦＳＦ１０の別名でも知られるＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。一実施形態では、用語、ＴＲＡＩＬは、本明細書において、ヒトＴＲＡＩＬを指す。例えば、ヒトＴＲＡＩＬのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ５０５９１である。
ＴＲＡＮＣＥ、ＯＤＦ、ＯＰＧＬまたはＴＮＦＳＦ１１とも称されるＮＦ−ｋＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）リガンド（ＲＡＮＫＬ）は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。一実施形態では、用語、ＲＡＮＫＬは、本明細書において、ヒトＲＡＮＫＬを指す。例えば、ヒトＲＡＮＫＬのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｏ１４７８８である。
ＴＷＥＡＫは、ＴＮＦスーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＡＰＯ３リガンドまたはＴＮＦＳＦ１２とも称される。一実施形態では、用語、ＴＷＥＡＫは、本明細書において、ヒトＴＷＥＡＫを指す。例えば、ヒトＴＷＥＡＫのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｏ４３５０８である。
【００２８】
用語「細胞外ドメイン」は、本明細書において、ＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）を含むＴＮＦスーパーファミリーのリガンドの細胞外Ｃ末端部分を指す。細胞外ドメインは、リガンドの受容体に結合することができる（ホモ）三量体を形成するその能力によって特徴づけられ、「受容体結合ドメイン」と称されることもある。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基５１〜２６１もしくは１１６〜２６１、好ましくは、１１６〜２６１を含むもしくはこれからなる、ＣＤ２７Ｌの細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸残基５２〜１９３を含むもしくはこれからなる、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸残基７１〜２５４を含むもしくはこれからなる、および／またはＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインは、配列番号４のアミノ酸残基５１〜１８３を含むもしくはこれからなる。
好ましくは、本発明に従って使用することができる細胞外ドメインの「断片またはバリアント」は、好ましくは、リガンドの受容体に結合することができる（ホモ）三量体を形成する能力を有する、細胞外ドメインの機能的断片またはバリアントである。よって、斯かる断片またはバリアントは、少なくとも機能的ＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）を含む。
【００２９】
本発明において、インターロイキンは、好ましくは、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ２１、ＩＬ２７、ＩＬ１−アルファ、ＩＬ１−ベータ、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ９、ＩＬ２３、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ３１およびＩＬ３３からなる群から選択される。特定の実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ２１、ＩＬ２７、ＩＬ１−アルファ、ＩＬ１−ベータ、ＩＬ７、ＩＬ１５およびＩＬ１８からなる群から選択される。一実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ２である。別の実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ１２である。
【００３０】
上述および他のインターロイキンの核酸配列およびアミノ酸配列は、当業者に知られており、ＮＣＢＩデータベース、ＧｅｎｅＣａｒｄｓまたはＵｎｉＰｒｏｔ等、公共のデータベースから得ることができる。
一実施形態では、インターロイキンは、ヒトインターロイキン（ｈＩＬ）である。
【００３１】
例えば、ヒトＩＬ２のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ６０５６８である、ヒトＩＬ１２のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ２９４５９（ＩＬ１２サブユニットアルファ、これは、ＩＬ１２Ａまたはｐ３５とも称される）およびＰ２９４６０（ＩＬ１２サブユニットベータ、これは、ＩＬ１２Ｂまたはｐ４０とも称される）である、ヒトＩＬ２１のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｑ９ＨＢＥ４である、ヒトＩＬ２７のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｑ８ＮＥＶ９（ＩＬ２７サブユニットアルファ、これは、ＩＬ２７ＡまたはＩＬ３０とも称される）およびＱ１４２１３（ＩＬ２７サブユニットベータ、これは、ＩＬ２７ＢまたはＥＢＩ３とも称される）である、ヒトＩＬ１−アルファのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ０１５８３である、ヒトＩＬ１−ベータのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ０１５８４である、ヒトＩＬ７のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ１３２３２である、ヒトＩＬ１５のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ４０９３３である、ヒトＩＬ１８のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｑ１４１１６である、ヒトＩＬ９のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ１５２４８である、ヒトＩＬ２３のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｑ９ＮＰＦ７（ＩＬ２３サブユニットアルファ、これは、ＩＬ２３Ａとも称される）およびＰ２９４６０（ＩＬ１２サブユニットベータ、これは、ＩＬ１２Ｂまたはｐ４０とも称される）である、ヒトＩＬ４のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ０５１１２である、ヒトＩＬ６のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ０５２３１である、ヒトＩＬ１０のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｐ２２３０１である、ヒトＩＬ３１のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｑ６ＥＢＣ２である、および／またはヒトＩＬ３３のＵｎｉＰｒｏｔ受託番号は、Ｏ９５７６０である。
一実施形態では、インターロイキンは、ヘテロ二量体インターロイキンである。一般に、用語「ヘテロ二量体インターロイキン」は、１個または複数のジスルフィド架橋を介して共有結合により連結されていてもされていなくてもよい、２個の異なるインターロイキンまたはインターロイキンサブユニットの会合によって形成されるインターロイキンを指す。一実施形態では、ヘテロ二量体インターロイキンは、ＩＬ１２（ＩＬ１２Ａ／ｐ３５およびＩＬ１２Ｂ／ｐ４０によって形成される）、ＩＬ２３（ＩＬ２３ＡおよびＩＬ１２Ｂ／ｐ４０によって形成される）およびＩＬ２７（ＩＬ２７Ａ／ＩＬ３０およびＩＬ２７Ｂ／ＥＢＩ３によって形成される）からなる群から選択される。
【００３２】
一実施形態では、ヘテロ二量体インターロイキンは、単一のポリペプチドとして存在する、例えば、ヘテロ二量体インターロイキン（単鎖（ｓｃ）ヘテロ二量体インターロイキンとも称される）を形成する、２個の異なるインターロイキンまたはインターロイキンサブユニットを含む融合タンパク質の形態である。一実施形態では、２個の異なるインターロイキンまたはインターロイキンサブユニットは、ペプチドリンカーを介して連結される。
好ましくは、本発明に従って使用することができる、インターロイキンの「断片またはバリアント」は、インターロイキンの機能的断片またはバリアントである。
【００３３】
一実施形態では、インターロイキンは、分泌シグナル配列、特に、天然の分泌シグナル配列を欠く。所与のタンパク質の分泌シグナル配列（「シグナルペプチド」とも称される）を同定するための手段および方法は、当業者に知られている。所与のタンパク質の分泌シグナル配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ等、公共のデータベースから入手することもできる。天然の分泌シグナル配列を欠くインターロイキンは、前記インターロイキンの断片と称されることがある。別の実施形態では、インターロイキンは、天然の（または内在性）分泌シグナル配列を含む。
本発明に従った他の適したインターロイキン断片は、ＩＬ１２Ａ／ｐ３５、ＩＬ１２Ｂ／ｐ４０、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２７Ａ／ＩＬ３０およびＩＬ２７Ｂ／ＥＢＩ３等、（ヘテロ）二量体インターロイキンのサブユニットを含む。
一実施形態では、インターロイキンまたはその断片は、配列番号９〜１２および２４〜２９のうち１種に従ったアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。
【００３４】
本発明に係る用語「インターロイキンのバリアント」は、特に、突然変異体、スプライスバリアント、立体構造バリアント、アイソフォーム、アレルバリアント、種バリアントおよび種ホモログ、特に、天然に存在するこれらを指す。アレルバリアントは、その重要性が不明であることが多い、遺伝子の正常配列の変更に関する。完全遺伝子配列決定は、多くの場合、所与の遺伝子の多数のアレルバリアントを同定する。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列とは起源の異なる種による核酸またはアミノ酸配列である。用語「インターロイキンのバリアント」は、いずれかの翻訳後修飾されたバリアントおよび立体構造バリアントを包含するものとする。これは、前記インターロイキンを含む融合タンパク質も包含する。
【００３５】
特に、用語「インターロイキンのバリアント」は、増加した安定性、またはその受容体に対する増加した親和性等、それぞれの野生型インターロイキンと比較して改善された特性を有する天然または非天然インターロイキンタンパク質を含む。特定の例として、ＩＬ２−スーパーカイン（ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ）（Levin, A.M. et al. (2012), Nature, 484:529-533）およびＩＬ１５Ｒ−アルファ−ＩＬ１５融合タンパク質（例えば、Mortier, E. et al. (2006), J. Biol. Chem., 281(3):1612-9を参照）が挙げられる。
一般に、用語「部分」または「断片」は、本明細書において互換的に使用されており、連続した要素を指す。例えば、アミノ酸配列またはタンパク質等、ある構造の部分は、前記構造の連続した要素を指す。タンパク質配列の部分または断片は、好ましくは、該タンパク質配列の少なくとも６、特に、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０または少なくとも２００個の連続的なアミノ酸の配列を含む。
【００３６】
一般に、（例えば、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドの細胞外ドメインのまたはインターロイキンの）アミノ酸配列の「バリアント」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアントおよび／またはアミノ酸置換バリアントを含む。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端側の端に欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、Ｎ末端および／またはＣ末端トランケーションバリアントとも呼ばれる。
【００３７】
アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列における単一のまたは２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、１個または複数のアミノ酸残基が、アミノ酸配列における特定の部位に挿入されるが、得られた産物の適切なスクリーニングによるランダム挿入も可能である。
アミノ酸付加バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個以上のアミノ酸等、１個または複数のアミノ酸のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合を含む。
アミノ酸欠失バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個以上のアミノ酸の除去による等、配列からの１個または複数のアミノ酸の除去によって特徴づけられる。欠失は、タンパク質のいかなる位置で為されてもよい。
【００３８】
アミノ酸置換バリアントは、配列における除去された少なくとも１個の残基と、その場所に挿入された別の残基によって特徴づけられる。相同タンパク質もしくはペプチドの間で保存されないアミノ酸配列中の位置における修飾、および／または同様の特性を有する他のアミノ酸によるアミノ酸置き換えが、好ましい。好ましくは、タンパク質バリアントにおけるアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸の、同じアミノ酸ファミリーの別のアミノ酸、すなわち、その側鎖が関係するアミノ酸（例えば、電荷および／またはサイズの観点から）による置換が関与する。天然起源のアミノ酸は一般に、４種のファミリーに分けられる：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）および無電荷極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類される場合もある。
【００３９】
好ましくは、所与のアミノ酸配列と、前記所与のアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは、同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％となるであろう。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域に対して付与される。例えば、参照アミノ酸配列が、２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００個のアミノ酸、好ましくは、連続したアミノ酸に対して付与される。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長に対して付与される。配列類似性、好ましくは、配列同一性を決定するためのアライメントは、本技術分野で公知のツールにより、好ましくは、最良の配列アライメントを使用して、例えば、標準設定を使用したＡｌｉｇｎ、好ましくは、ＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を使用して行うことができる。
「配列類似性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換を表す、アミノ酸のパーセンテージを示す。２種のアミノ酸配列の間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
【００４０】
用語「パーセンテージ同一性」は、最良のアライメント後に得られた、比較されるべき２配列の間で同一であるアミノ酸残基のパーセンテージを表示することが意図され、このパーセンテージは、純粋に統計学的であり、２配列間の差は、ランダムに、その全長にわたって分布する。２種のアミノ酸配列の間の配列比較は、従来、最適に整列した後にこれらの配列を比較することにより行われ、前記比較は、配列類似性の局所的領域を同定および比較するために、セグメントまたは「比較ウィンドウ」によって行われる。比較のための配列の最適アライメントは、手作業に加えて、Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482の局所的相同性アルゴリズムによって、Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443の局所的相同性アルゴリズムによって、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444の類似性検索方法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラムによって（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ内、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）作成することができる。
パーセンテージ同一性は、比較されている２配列の間の同一位置の数を決定し、この数を比較される位置の数で割り、得られた結果に１００を掛けて、これら２配列の間のパーセンテージ同一性を得ることにより計算される。
【００４１】
用語「融合タンパク質」は一般に、２個以上の別個の（ポリ）ペプチドまたはタンパク質を、好ましくは、ヘッドトゥーテールで（すなわち、Ｎ末端からＣ末端へと、または逆もまた同じで）接合し、本来のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性を有する単一のタンパク質をもたらすことにより作製されたタンパク質を指す。本発明において、用語「サイトカイン融合タンパク質」は、サイトカイン融合タンパク質の「サブユニット」と称されることがある、別個の融合タンパク質の多量体、例えば、二量体または三量体複合体も包含する。好ましくは、斯かるサブユニットは、非共有結合または共有結合により（例えば、ジスルフィド結合を介して）会合して、サイトカイン融合タンパク質を形成する。
【００４２】
本発明に従った好ましいサブユニットは、次の一般式を有する。
Ｎ’−Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｃ’（式ＩＩＩ）または
Ｎ’−Ｂ−Ｌ−Ａ−Ｃ’（式ＩＶ）
（本明細書に規定されている通り、式中、好ましくは、これらのサブユニットのうち３個は、リガンドの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントを介して非共有結合により会合して、サイトカイン融合タンパク質を形成する）
【００４３】
本発明に従った別の好ましいサブユニットは、次の一般式を有する。
Ｎ’−Ａ−ＬA−Ａ−ＬA−Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｃ’（式Ｉ）または
Ｎ’−Ｂ−Ｌ−Ａ−ＬA−Ａ−ＬA−Ａ−Ｃ’（式ＩＩ）
（本明細書に規定されている通り、式中、Ｌは、多量体、好ましくは、二量体サイトカイン融合タンパク質の形成を可能にする、多量体形成ドメイン、好ましくは、二量体形成ドメインをさらに含む）
用語「ブロック」は、本明細書において、３個の共有結合により連結された、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントを含む分子単位／実体を指す。一実施形態では、ブロックは、一般式Ａ−ＬA−Ａ−ＬA−Ａ（式中、ＡおよびＬAは、本明細書に規定されている通りである）を有する。一実施形態では、ブロックは、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のうち１種に従ったアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。
【００４４】
用語「共有結合により連結された」は、本明細書において、共有結合を介した、またはペプチドリンカー等の共有結合リンカー分子を介した連結を指す。
【００４５】
用語「ペプチドリンカー」は、本明細書において、タンパク質部分、例えば、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドの細胞外ドメイン、またはそのブロックおよびインターロイキンを接続／連結するように適応されたペプチドを指す。本発明に従ったペプチドリンカーは、いかなる長さを有することもできる、すなわち、いかなる数のアミノ酸残基も含む。しかし、これは、好ましくは、接続／連結された部分が、例えば、立体障害によって、互いの活性  −  例えば、リガンドの受容体に結合することができるホモ三量体を形成するＴＮＦスーパーファミリーのリガンドの細胞外ドメインの能力、および／または同じ細胞（「シス」）もしくは異なる細胞（「トランス」）における２種の異なる受容体に結合する斯かるホモ三量体およびこれに融合されたインターロイキンの能力  −  に干渉することを防止するのに妥当な程度の可動性をもたらすために、また、適したタンパク質フォールディングを可能にするために、十分に長い；さらに、これは、好ましくは、細胞における安定性（例えば、タンパク質分解性安定性）をもたらすために、十分に短い。
【００４６】
好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、１〜３０個のアミノ酸の長さを有する。よって、本発明において、ペプチドリンカーは、単一のアミノ酸残基で構成され得る。好ましくは、長いペプチドリンカーは、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドの３個の細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントを含むブロックを、インターロイキンまたはその断片もしくはバリアントと接続する一方、一般に、短いペプチドリンカーは、リガンドの２個の細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントを接続するために使用される。リガンド４−１ＢＢＬの場合、長いペプチドリンカーは、その細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントのうち２個を接続するために使用することができる。短いペプチドリンカーは、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のアミノ酸、好ましくは、１〜７個のアミノ酸等、１２個以下からなる場合がある。長いペプチドリンカーは、１２〜３０または１２〜２５または１２〜２０個のアミノ酸、例えば、１５個のアミノ酸等、１２個以上からなる場合がある。ペプチドリンカーのアミノ酸は、あらゆる天然または非天然起源のアミノ酸から選択することができ、アミノ酸のグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）およびスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）が好ましい。一実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン−セリン−スレオニン−リッチリンカーまたはグリシン−セリン−リッチリンカーであり、アミノ酸の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％が、それぞれグリシンもしくはセリンもしくはスレオニン残基またはグリシンもしくはセリン残基である。別の実施形態では、アミノ酸は、グリシン、セリンおよびスレオニンから選択される、即ち、ペプチドリンカーは、グリシン、セリンおよびスレオニン残基で排他的に構成される（グリシン−セリン−スレオニンリンカーと称される）。さらに別の実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシンおよびセリン残基で排他的に構成される（グリシン−セリンリンカーと称される）。
【００４７】
本発明に従った好ましいペプチドリンカーは、一般式（ＧＧＧＧＸ）n（式中、Ｘは、出現毎に、ＳおよびＴから独立して選択され、ｎは、１〜６、好ましくは、１〜５から選択される整数である）；またはＧＸＧ、ＧＧＸＧＧおよびＧＧＧＸＧＧＧ（式中、Ｘは、ＳまたはＴである）からなる群から選択される一般式を有する。
好ましい短いペプチドリンカーは、ＧＸＧ、ＧＧＸＧＧ、ＧＧＧＸＧＧＧおよびＧＧＧＧＸＧＧＧＧ（式中、Ｘは、ＳまたはＴ、好ましくはＳである）からなる群から選択される一般式を有する。特に好ましい短いペプチドリンカーは、ＧＧＧＸＧＧＧ（式中、Ｘは、ＳまたはＴ、好ましくはＳである）である。
【００４８】
好ましい長いペプチドリンカーは、一般式（ＧＧＧＧＸ）n（式中、Ｘは、出現毎に、ＳおよびＴから独立して選択され、ｎは、３〜６、好ましくは３〜５、より好ましくは３および４から選択される整数である）を有する。特に好ましい長いペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）3（配列番号１９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号２０）および（ＧＧＧＧＳ）4（配列番号２１）からなる群から選択される。別の好ましい長いリンカーは、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱ（配列番号２２）である。
あるいは、エラスチンまたはエラスチン様ペプチドリンカーを使用することができる。好ましくは、前記エラスチンまたはエラスチン様ペプチドリンカーは、モチーフ（ＶＰＧＸＧ）nの反復（式中、Ｘは、プロリン以外のいずれかのアミノ酸であり、ｎは、ペンタペプチド反復の数を表す）からなる。一実施形態では、ｎは、１〜６、好ましくは、１〜５から選択される整数である。
【００４９】
好ましくは、サイトカイン融合タンパク質が、本明細書に規定される通りの式ＩまたはＩＩの一般式を有する分子／構造を含む場合、
Ｌは、本明細書に規定される通りの長いペプチドリンカーを含む、および／または
ＬAは、出現毎に、共有結合（例えば、ペプチド結合）、本明細書に規定される通りの短いペプチドリンカーおよび本明細書に規定される通りの長いペプチドリンカーから独立して選択される。
好ましくは、Ａが、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインまたはその断片もしくはバリアントを含む場合、ＬAは、出現毎に、本明細書に規定される通りの長いペプチドリンカーから独立して選択される。
本発明において、サイトカイン融合タンパク質が、本明細書に規定される通りの式ＩまたはＩＩの一般式を有する分子／構造を含む場合、
Ｌは、サイトカイン融合タンパク質の多量体形成を可能にする多量体形成ドメインをさらに含むことができる。
【００５０】
このような場合、Ｌは、多量体形成ドメインが挿入された、本明細書に規定される通りのペプチドリンカーを含むことができる。代替的な実施形態では、Ｌは、多量体形成ドメインを挟む、本明細書に規定される通りの２個のペプチドリンカーを含むことができ、この２個のペプチドリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。一実施形態では、２個のペプチドリンカーは、本明細書に規定される通りの短いペプチドリンカーから選択される。さらに別の実施形態では、多量体形成ドメインは、Ｌによって含まれるペプチドリンカーを表す。
多量体形成は、特に、複数（例えば、２、３または４、好ましくは２または３、より好ましくは２個）の多量体形成ドメインの間の１個または複数のジスルフィド結合を介して、非共有結合相互作用および／または共有結合相互作用によって起こり得る。
【００５１】
適した多量体形成ドメインは、当業者に知られており、例えば、テネイシン三量体形成モチーフ、コレクチン三量体形成ドメインおよびストレプトアビジン等の三量体形成ドメイン、ならびにＩｇＥ重鎖ドメイン２（ＥＨＤ２）、ＩｇＭ重鎖ドメイン２（ＭＨＤ２）、ＩｇＧ重鎖ドメイン３（ＧＨＤ３）、ＩｇＡ重鎖ドメイン３（ＡＨＤ２）、ＩｇＤ重鎖ドメイン３（ＤＨＤ３）、ＩｇＥ重鎖ドメイン４（ＥＨＤ４）、ＩｇＭ重鎖ドメイン４（ＭＨＤ４）、Ｆｃドメインおよびウテログロビン二量体形成ドメイン等の二量体形成ドメインを含む。一実施形態では、多量体形成ドメインは、二量体形成ドメインである。一実施形態では、二量体形成ドメインは、例えば、ＷＯ  ２０１３／１５６１４８  Ａ１に記載されている通り、ＥＨＤ２ドメインまたはＭＨＤ２ドメインである。一実施形態では、二量体形成ドメインは、ヒトＥＨＤ２ドメインである。前述のドメインのうちいずれか１種、例えば、その半減期を延長するおよび／またはその効率を増加させるように修飾されたドメインの機能的バリアントも含まれる。適した修飾は、当業者に知られており、例えば、Zalevsky, J. et al. (2010), Nature Biotechnology, 28(2):157-9に記載されている通り、ＦｃＲｎに対するその親和性を増加させるＦｃドメインの修飾が挙げられるがこれらに限定されない。
サイトカイン融合タンパク質が、本明細書に規定される通りの式ＩＩＩまたはＩＶの一般式を有する分子／構造を含む場合、
Ｌは、好ましくは、本明細書に規定される通りの長いペプチドリンカーを含む。
【００５２】
一実施形態では、単一のポリペプチドとして存在するヘテロ二量体インターロイキンを形成する２個の異なるインターロイキンまたはインターロイキンサブユニットを連結するペプチドリンカーは、５〜１５個のアミノ酸、好ましくは８〜１２個のアミノ酸の長さを有する。一実施形態では、ペプチドリンカーは、エラスチンまたはエラスチン様リンカーである。一実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧ（配列番号２３）を含むまたはこれからなる。
本明細書に記載されているペプチドリンカーは、適した長さの非ペプチド性分子、例えば、非ペプチド性オリゴマーおよびポリマー（例えば、ＰＥＧ分子）により置き換えることができる。斯かる均等な実施形態は、本発明に明確に含まれる。
【００５３】
「サイトカイン融合タンパク質の検出および／または単離を可能にする標識またはタグ」は、これらの目的のための本技術分野で知られたいずれかの標識／タグを含むことを意味する。キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびヒスチジン−リッチ配列またはポリ（Ｈｉｓ）（例えば、Ｈｉｓ6）等のＨｉｓ−タグ等、親和性タグ；チオレドキシン（ＴＲＸ）およびポリ（ＮＡＮＰ）等、可溶化タグ；ＦＬＡＧ−タグ等、クロマトグラフィータグ；Ｖ５−タグ、ｍｙｃ−タグおよびＨＡ−タグ等、エピトープタグ；ならびに蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等）、蛍光色素およびルシフェラーゼ等、蛍光または発光標識またはタグが特に好ましい。一実施形態では、標識／タグは、ＦＬＡＧ−タグである。
【００５４】
（ポリ）ペプチド標識またはタグのアミノ酸配列は、サイトカイン融合タンパク質のアミノ酸配列内のいずれかの位置において導入することができ、例えば、コードされたタンパク質構造内（例えば、本明細書に記載されている（ペプチド）リンカーのいずれかの内、またはさらには、標識／タグが、これらの機能に干渉しないのであれば、リガンドの細胞外ドメイン内もしくはインターロイキン内）のループの形状をとることができる、またはＮ末端もしくはＣ末端に融合されてよい。標識またはタグは、サイトカイン融合タンパク質からの標識またはタグの除去を可能にする切断部位（例えば、ＴＥＶ切断部位）をさらに含有することができる。同様に、非ペプチド性標識またはタグ、例えば、蛍光色素は、いずれか適した部位においてサイトカイン融合タンパク質にコンジュゲートすることができる。
【００５５】
本発明に係るサイトカイン融合タンパク質は、Ｎ末端分泌シグナル配列等、分子の分泌を容易にするためのアミノ酸配列を含むこともできる。好ましくは、分泌シグナル配列は、分泌経路の十分な通過および／または細胞外環境への分泌を可能にするシグナル配列である。好ましくは、分泌シグナル配列は、切断可能であり、成熟サイトカイン融合タンパク質から除去される。分泌シグナル配列は、好ましくは、サイトカイン融合タンパク質が産生される細胞または生物に関して選ばれる。一実施形態では、分泌シグナル配列は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。一実施形態では、分泌シグナル配列は、サイトカイン融合タンパク質によって含まれるタンパク質、例えば、インターロイキンのうちの１種の天然（または内在性）分泌シグナル配列である。
本発明のサイトカイン融合タンパク質は、例えば、特異的細胞型に対する選択性を増強するように機能する結合ドメインをさらに含むことができる。これは、例えば、前記細胞型の表面に発現された特異的抗原に結合する結合ドメインを配置することにより達成することができる。
【００５６】
本発明に係るサイトカイン融合タンパク質は、サイトカイン融合タンパク質の安定性を増加させる１個または複数の修飾をさらに含むことができる。用語、サイトカイン融合タンパク質の「安定性」は、例えばｉｎ  ｖｉｖｏでの、サイトカイン融合タンパク質の「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量または数の半分を除くために必要とされる期間に関する。
サイトカイン融合タンパク質は、例えば、半減期延長モジュールにコンジュゲートすることができる。斯かるモジュールは、当業者に知られており、例えば、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、免疫グロブリンのＦｃ領域／ドメイン、免疫グロブリン結合ドメイン、ＦｃＲｎ結合モチーフ、構造不定（ポリ）ペプチド鎖およびポリマーを含む。特に好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸およびヒアルロン酸を含む。
【００５７】
用語「構造不定（ポリ）ペプチド鎖」は、本明細書において、固定されたまたは規則正しい三次元構造を欠く（ポリ）ペプチド鎖を指し、好ましくは、親水性である。自身が融合されたペプチドおよびタンパク質の（ｉｎ  ｖｉｖｏ）半減期を延長する構造不定（ポリ）ペプチド鎖は、当業者に知られており、例えば、ＸＴＥＮ（Schellenberger, V. et al. (2009), Nat Biotechnol., 27(12):1186-90）およびＰＡＳ配列（Schlapschy, M. et al. (2013), Protein Eng Des Sel., 26(8):489-501）を含む。
本発明に係る用語「結合」は、好ましくは、特異的結合に関する。本発明に従ったサイトカイン融合タンパク質等、結合剤は、既定の標的に結合することができるが、他の標的に結合できない場合、前記既定の標的に特異的である。
【００５８】
「核酸分子」は、本発明において、好ましくは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、より好ましくは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、最も好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ  ＲＮＡ）または合成ＲＮＡである。核酸分子は、本発明において、一本鎖または二本鎖であり、直鎖状または共有結合により閉環して環を形成した、分子の形態となることができる。
【００５９】
本発明の文脈において、用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチド残基を含み、好ましくは、デオキシリボヌクレオチド残基で全体的にまたは実質的に構成された分子に関する。「デオキシリボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を欠くヌクレオチドに関する。用語「ＤＮＡ」は、部分的にまたは完全に精製されたＤＮＡ、基本的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび組換えにより生成されたＤＮＡ等、単離されたＤＮＡを含み、１個または複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更によって、天然起源のＤＮＡとは異なる修飾されたＤＮＡを含む。斯かる変更は、ＤＮＡの端へのまたは内部への、例えば、ＤＮＡの１個または複数のヌクレオチドにおける等、非ヌクレオチド材料の付加を含むことができる。ＤＮＡ分子におけるヌクレオチドは、非天然起源のヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチド等、非標準ヌクレオチドを含むこともできる。これらの変更されたＤＮＡは、アナログまたは天然起源のＤＮＡのアナログと称されることがある。
本発明の文脈において、用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは、リボヌクレオチド残基で全体的にまたは実質的に構成された分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。用語「ＲＮＡ」は、部分的にまたは完全に精製されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡおよび組換えにより生成されたＲＮＡ等、単離されたＲＮＡを含み、１個または複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更によって、天然起源のＲＮＡとは異なる修飾されたＲＮＡを含む。斯かる変更は、ＲＮＡの端へのまたは内部への、例えば、ＲＮＡの１個または複数のヌクレオチドにおける等、非ヌクレオチド材料の付加を含むことができる。ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドは、非天然起源のヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド等、非標準ヌクレオチドを含むこともできる。これらの変更されたＲＮＡは、アナログまたは天然起源のＲＮＡのアナログと称されることがある。本発明において、「ＲＮＡ」は、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡを指す。
【００６０】
本発明において、用語「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、ＤＮＡ鋳型を使用することにより生成され得、ペプチドまたはタンパク質をコードし得る、「転写物」に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域、タンパク質コード領域および３’非翻訳領域を含む。本発明の文脈において、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写方法論は、当業者に知られている。例えば、種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写キットが市販されている。
本発明において、ＲＮＡは、修飾されていてよい。例えば、ＲＮＡは、ＲＮＡにおける安定化効果を有する１個または複数の修飾によって安定化されていてよい。
本発明に従って使用されるＲＮＡの文脈における用語「修飾」は、ＲＮＡにおいて天然に存在しない前記ＲＮＡのいずれかの修飾を含む。
【００６１】
本発明の一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡは、無キャップ５’−三リン酸塩を持たない。斯かる無キャップ５’−三リン酸塩の除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することにより達成することができる。
【００６２】
本発明に係るＲＮＡは、その安定性を増加させるために、および／または細胞傷害性を減少させるために、および／またはその免疫賦活性潜在力をモジュレートするために、修飾された天然起源または非天然起源の（合成）リボヌクレオチドを有することができる。例えば、一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡにおいて、ウリジンは、シュードウリジンによって部分的にまたは完全に、好ましくは完全に置換される。
【００６３】
一実施形態では、用語「修飾」は、ＲＮＡに５’キャップまたは５’キャップアナログを配置することに関する。用語「５’キャップ」は、ｍＲＮＡ分子の５’端に見出されるキャップ構造を指し、一般に、珍しい５’から５’への三リン酸塩連結を介してｍＲＮＡに接続されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは、７位がメチル化されている。用語「従来の５’キャップ」は、天然起源のＲＮＡ  ５’キャップ、好ましくは、７−メチルグアノシンキャップ（ｍ7Ｇ）を指す。本発明の文脈において、用語「５’キャップ」は、ＲＮＡキャップ構造に似ている５’キャップアナログを含み、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／または細胞において、そこに取り付けられた場合、ＲＮＡを安定化する能力を保有するように修飾される。一実施形態では、５’キャップアナログβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）が使用される。ＲＮＡに５’−キャップまたは５’キャップアナログを配置することは、前記５’キャップまたは５’キャップアナログの存在下でＤＮＡ鋳型をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写することによって達成することができ、この場合、前記５’キャップは、同時転写により、生成されたＲＮＡストランドに取り込まれる、あるいはＲＮＡを、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成し、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して、５’キャップを転写後に生成することができる。
ＲＮＡは、さらに別の修飾を含むことができる。例えば、本発明において使用されるｍＲＮＡの修飾は、天然起源のポリ（Ａ）テイルの延長またはトランケーションとなり得る。
【００６４】
用語、ＲＮＡの「安定性」は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量または数の半分を除くために必要とされる期間に関する。本発明の文脈において、ＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性を示す。
本発明において、ＲＮＡの安定性を減少させることが望まれる場合、ＲＮＡの安定性を増加させる上述の要素の機能に干渉するようにＲＮＡを修飾することも可能である。
【００６５】
本発明において、ＲＮＡは、化学合成によって、または適切なＤＮＡ鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって得ることができる。本発明の文脈において、用語「転写」は、ＤＮＡ配列における遺伝暗号が、ＲＮＡへと転写される過程に関する。その後、ＲＮＡは、タンパク質へと翻訳され得る。本発明において、用語「転写」は、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写」を含み、この用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写」は、無細胞系において、好ましくは、適切な細胞抽出物を使用して、ＲＮＡ、特に、ｍＲＮＡが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成される過程に関する。好ましくは、クローニングベクターが、転写物の生成に適用される。このようなクローニングベクターは一般に、転写ベクターと命名され、本発明において、用語「ベクター」によって包含される。転写を制御するためのプロモーターは、いずれかのＲＮＡポリメラーゼのためのいずれかのプロモーターとなることができる。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特に、ｃＤＮＡをクローニングし、これをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための適切なベクターに導入することによって得ることができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得ることができる。好ましくは、転写物を産生するためにクローニングベクターが使用され、これは一般に、転写ベクターと命名される。
【００６６】
本発明に係る用語「翻訳」は、細胞のリボソームにおける過程に関し、これにより、メッセンジャーＲＮＡのストランドは、アミノ酸の配列のアセンブリを方向づけて、ペプチドまたはタンパク質を作製する。
本発明に係る用語「ペプチド」は、オリゴおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって共有結合により接合された、２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは９個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２１個以上の、かつ最大で好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０、特に１００個のアミノ酸を含む物質を指す。用語「タンパク質」は、大型のペプチド、好ましくは、１００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に、用語「ペプチド」および「タンパク質」は、同義語であり、本明細書において互換的に使用されている。
用語「発現制御配列」は、本明細書において、所望の宿主細胞におけるまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ設定での操作可能に連結された核酸分子の発現を可能にする核酸配列を指すことを意味する。適した発現制御配列は、当業者に知られており、プロモーター、例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーター等、ＲＮＡプロモーターを含む。
【００６７】
本発明に係る核酸分子は、ベクターに含有されてよい／含まれてよい。用語「ベクター」は、本明細書において、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージ等のファージベクター、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体ベクターを含む、当業者に知られたいずれかのベクターを含む。前記ベクターは、発現およびクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターを含み、一般に、所望のコード配列、および特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫または哺乳類）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を含有する。クローニングベクターは一般に、ある特定の所望のＤＮＡ断片を操作および増幅するように使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要とされる機能的配列を欠いてもよい。
【００６８】
用語「細胞」または「宿主細胞」は、好ましくは、インタクトな細胞、すなわち、酵素、オルガネラまたは遺伝的材料等、その正常な細胞内構成成分を放出したことがないインタクトな膜を有する細胞に関する。インタクトな細胞は、好ましくは、生細胞、すなわち、その正常な代謝機能を実行することができる生きている細胞である。好ましくは、前記用語は、本発明において、外因的核酸によりトランスフェクトまたは形質転換することができるいずれかの細胞に関する。好ましくは、細胞は、外因的核酸によりトランスフェクトまたは形質転換されて、レシピエントに移入されると、レシピエントにおいて核酸を発現することができる。用語「細胞」は、細菌細胞等の原核細胞、および酵母細胞、真菌細胞または哺乳類細胞等の真核細胞を含む。適した細菌細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の株等のグラム陰性細菌株、ならびにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）およびラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の株等のグラム陽性細菌株に由来する細胞を含む。適した真菌細胞は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種に由来する細胞を含む。適した酵母細胞は、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ））およびハンゼヌラの種に由来する細胞を含む。適した哺乳類細胞は、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３ＨＥＫその他を含む。しかし、異種タンパク質の発現のために本技術分野で使用される両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞および他のいずれかの細胞を同様に使用することもできる。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギおよび霊長類に由来する細胞等、哺乳類細胞が、養子移入に特に好ましい。細胞は、多数の組織型に由来することができ、免疫系の細胞、特に、樹状細胞およびＴ細胞等の抗原提示細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞等の幹細胞ならびに他の細胞型等、初代細胞および細胞株を含む。抗原提示細胞は、主要組織適合抗原複合体の文脈において、その表面に抗原を表示する細胞である。Ｔ細胞は、自身のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して、この複合体を認識することができる。
【００６９】
用語「非ヒト生物」は、本明細書において、非ヒト霊長類または他の動物、特に、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、またはマウス、ラット、モルモットおよびハムスター等の齧歯類等、哺乳類を含むことを意味する。
本発明に従った医薬組成物は、好ましくは、所望の反応または所望の効果を生じるための、本明細書に記載されているサイトカイン融合タンパク質、核酸分子または細胞（本明細書において、「薬剤」とも称される）の有効量を含有する。
【００７０】
本発明に従った医薬組成物は、好ましくは、無菌である。医薬組成物は通常、均一な剤形で提供され、それ自体を知られた様式で調製することができる。医薬組成物は、例えば、溶液または懸濁液の形態となることができる。
【００７１】
医薬組成物は、１種または複数の担体および／または賦形剤をさらに含むことができ、これらの全ては、好ましくは、薬学的に許容される。用語「薬学的に許容される」は、本明細書において、好ましくは、医薬組成物の活性剤の作用と相互作用しない、材料の無毒性を指す。
用語「担体」は、活性構成成分が、応用を容易にするため、増強するためまたは可能にするために組み合わされた、天然または合成性質の有機または無機構成成分を指す。本発明において、用語「担体」は、対象への投与に適した、１種または複数の適合性固体または液体フィラー、希釈剤または被包物質も含む。
【００７２】
非経口的投与のための可能な担体物質は、例えば、滅菌水、リンゲル溶液、乳酸リンゲル溶液、生理的食塩水、静菌的生理食塩水（例えば、０．９％ベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、および特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシ−プロピレンコポリマーである。
用語「賦形剤」は、本明細書において、塩、バインダー（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール）、潤滑剤、増粘剤、表面活性剤、保存料、乳化剤、緩衝物質、調味料または着色料等、医薬組成物中に存在し得る、活性成分ではない、あらゆる物質を含むことが意図される。
【００７３】
薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するために使用することができ、本発明に含まれる。この種類の薬学的に許容される塩は、非限定的な仕方で、次の酸から調製された塩を含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸その他。薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩等、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩として調製することもできる。塩は、イオン強度または浸透圧を調整するために加えることができる。
【００７４】
医薬組成物における使用のための適した保存料は、抗酸化剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、システイン、メチオニン、パラベンおよびチメロサールを含む。
医薬組成物における使用のための適した緩衝物質は、塩形態の酢酸、塩形態のクエン酸、塩形態のホウ酸および塩形態のリン酸を含む。
医薬組成物は、安定した凍結乾燥した産物として製剤化することもでき、これは、上に規定されている１種または複数の賦形剤を含んでいてもよい、適切な希釈剤により再構成される。
本明細書に記載されている薬剤および組成物は、いずれかの従来の経路により、例えば、注射または注入を含む、経口、肺、吸入または非経口的に投与することができる。一実施形態では、非経口的投与、例えば、静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内投与が使用される。本明細書に記載されている薬剤および組成物は、徐放投与により投与することもできる。
【００７５】
非経口的投与に適した医薬組成物は通常、好ましくは、レシピエントの血液と等張性である、活性化合物の無菌水性または非水性調製物を含む。適合性担体／溶媒／希釈剤の例は、滅菌水、リンゲル溶液、乳酸リンゲル溶液、生理的食塩水、静菌的生理食塩水（例えば、０．９％ベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびハンクス溶液である。加えて、通常、無菌の固定油を溶液または懸濁液培地として使用することができる。
本明細書に記載されている薬剤および組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態の処置の場合、所望の反応は、好ましくは、疾患経過の阻害に関する。これは、疾患進行の減速、特に、疾患進行の中断または反転を含む。疾患または状態の処置における所望の反応は、前記疾患または前記状態の発病の遅延または発病の防止となることもできる。本明細書に記載されている薬剤または組成物の有効量は、処置するべき状態、疾患の重症度（ｓｅｖｅｒｅｎｅｓｓ）、年齢、生理的状態、サイズおよび体重を含む対象の個々のパラメータ、処置の持続時間、付随する治療法（存在するのであれば）の種類、特異的な投与経路、ならびに同様の因子に依存するであろう。したがって、本明細書に記載されている薬剤の投与される用量は、様々な斯かるパラメータに依存することができる。対象における反応が、初回用量により不十分である場合、より高い用量（または異なるより局在化された投与経路によって達成される、有効により高い用量）を使用することができる。
【００７６】
本明細書において、用語「キットオブパーツ（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）（すなわち：キット）」は、１個または複数の容器を含み、データキャリアを含んでいてもよい、製造品を指す。前記１個または複数の容器に、上述の手段または試薬のうち１種または複数を充填することができる。例えば、希釈剤、バッファーおよびさらに別の試薬を含有する、追加的な容器がキットに含まれてよい。前記データキャリアは、情報リーフレット、情報シート、バーコードもしくはアクセスコード等の非電子的データキャリア、例えば、グラフィカルデータキャリア、またはフロッピーディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、マイクロチップもしくは別の半導体ベースの電子的データキャリア等の電子的データキャリアとなることができる。アクセスコードは、データベース、例えば、インターネットデータベース、集中型または分散型データベースへのアクセスを可能にすることができる。前記データキャリアは、本発明のサイトカイン融合タンパク質、核酸分子、細胞および／または医薬組成物の使用説明書を含むことができる。
本明細書に記載されている薬剤および組成物は、本明細書に記載されている障害等、種々の障害を処置または防止するために、対象に、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与することができる。
【００７７】
本発明において、用語「疾患」は、いずれかの病理的状態、特に、がん、感染性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫性障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患および移植片拒絶を指す。
【００７８】
本明細書において、用語「がん」は、異常に調節された細胞成長、増殖、分化、接着および／または遊走によって特徴づけられる疾患を含む。「がん細胞」とは、急速な制御されない細胞増殖によって成長し、新たな成長を惹起した刺激が止まった後に成長し続ける、異常細胞を意味する。本発明に係る用語「がん」は、白血病、セミノーマ、メラノーマ、テラトーマ、リンパ腫、神経芽細胞腫、グリオーマ、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、副腎がん、甲状腺がん、血液がん、皮膚がん、脳のがん、子宮頸部がん、腸管がん、肝臓がん、結腸がん、胃がん、腸がん、頭頸部がん、胃腸がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵臓がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、乳がん、前立腺がん、子宮のがん、卵巣がんおよび肺がん、ならびにこれらの転移を含む。これらの例は、肺癌、乳房（ｍａｍｍａ）癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、子宮頸部癌、または上述のがん型もしくは腫瘍の転移である。
【００７９】
本発明に係る用語「がん」は、がん転移も含む。「転移」とは、その本来の身体部位から別の部分へのがん細胞の伝播を意味する。転移の形成は、非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の脱離、細胞外マトリックスへの浸入、内皮基底膜に浸透して体腔および血管に進入すること、次いで、血液によって輸送された後の、標的臓器への浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍、すなわち、続発性腫瘍または転移性腫瘍の成長は、血管新生に依存する。腫瘍細胞または構成成分が残存し、転移性潜在力を発達し得るため、腫瘍転移は、原発性腫瘍の除去後であっても起こることが多い。一実施形態では、本発明に係る用語「転移」は、原発性腫瘍および領域性リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。
用語「感染性疾患」は、個体間でまたは生物間で伝染し得る、微生物病原体（例えば、感冒）に起因する、いずれかの疾患を指す。感染性疾患の例として、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ）、Ａ、ＢもしくはＣ型肝炎、ヘルペス、帯状疱疹（水疱）、風疹（風しんウイルス）、黄熱、デング熱等、フラビウイルス、インフルエンザウイルス、出血性感染性疾患（マールブルグまたはエボラウイルス）および重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）等のウイルス感染性疾患、レジオネラ症（レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ））、性的伝染性疾患（例えば、クラミジアまたは淋病）、胃潰瘍（ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ））、コレラ（ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ））、結核、ジフテリア、大腸菌、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）もしくは連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）（破傷風）による感染等の細菌感染性疾患；マラリア、睡眠病、リーシュマニア症等の原生動物病原体による感染；トキソプラズマ症、すなわち、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）およびトキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）による感染；または例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）もしくはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）に起因する、真菌感染が挙げられる。
【００８０】
用語「炎症性疾患」は、組織、特に、結合組織における高レベルの炎症、またはこれらの組織の変性によって特徴づけられる、またはこれらに関連する、いずれかの疾患を指す。慢性炎症性疾患は、持続性炎症によって特徴づけられる医学的状態である。（慢性）炎症性疾患の例として、セリアック病、血管炎、ループス、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、過敏性腸疾患、粥状動脈硬化、関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、結腸炎、慢性活動性肝炎、皮膚炎および乾癬が挙げられる。
【００８１】
用語「代謝性疾患」は、正常な代謝を破壊するいずれかの疾患または障害を指す。例として、シスチン症、糖尿病、脂質異常症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、低脂血症、ガラクトース血症、ゴーシェ病、肥満およびフェニルケトン尿症が挙げられる。
【００８２】
用語「自己免疫性障害」は、身体が、自分自身の組織の一部の構成物に対する免疫原性（すなわち、免疫系）応答を生じる、いずれかの疾患／障害を指す。換言すると、免疫系は、体内の一部の組織または系を自己として認識するその能力を失い、これを異物であるかのように標的とし、攻撃する。自己免疫性疾患は、主に１種の臓器が罹患した疾患（例えば、溶血性貧血および抗免疫甲状腺炎）と、自己免疫性疾患過程が多くの組織にわたって拡散した疾患（例えば、全身性エリテマトーデス）に分類することができる。例えば、多発性硬化症は、脳および脊髄の神経線維を囲む鞘を攻撃するＴ細胞に起因すると考えられる。これは、協調の喪失、脱力および霧視をもたらす。自己免疫性疾患は、本技術分野で知られており、例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ループス、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、結腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬その他を含む。
【００８３】
用語「変性疾患」は、罹患した組織または臓器の機能または構造が、時間と共に次第に悪化することになる、いずれかの疾患を指す。例として、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、黄斑変性症、多発性硬化症、筋ジストロフィー、ニーマン・ピック病、骨粗鬆症および関節リウマチが挙げられる。
用語「アポトーシス関連疾患」は、アポトーシスの変更が関与する、いずれかの疾患を指す。例として、がん、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および脳卒中等の神経学的障害、虚血再灌流および慢性心不全等の心疾患、感染性疾患ならびに自己免疫性疾患が挙げられる。
用語「移植片拒絶」は、レシピエントの免疫系による移植された組織または臓器の拒絶を指し、これは最終的に、移植された組織または臓器を破壊し得る。
用語「医薬」は、本明細書において、治療法、すなわち、疾患の処置において使用される物質／組成物を指す。
【００８４】
「処置」とは、対象における腫瘍のサイズもしくは腫瘍の数の低下；対象における疾患の抑止もしくは緩徐化；対象における新たな疾患の発症の阻害もしくは緩徐化；症状の頻度もしくは重症度および／または疾患を現在有するもしくは以前に有した対象における再発の減少；および／または対象の寿命を延ばすこと、すなわち、増加させることを含む、疾患を防止または排除するための、対象への化合物もしくは組成物または化合物もしくは組成物の組合せの投与を意味する。
特に、用語「疾患の処置」は、疾患またはその症状の治癒、持続時間の短縮、寛解、防止、減速または進行もしくは悪化の阻害、または発病の防止もしくは遅延を含む。
【００８５】
用語「対象」は、本発明において、人間、非ヒト霊長類または他の動物、特に、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、またはマウス、ラット、モルモットおよびハムスター等の齧歯類等の哺乳類を含む、処置のための対象、特に、罹病した対象（「患者」とも称される）を意味する。一実施形態では、対象／患者は、人間である。
【実施例】
【００８６】
（例１）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）  −  ｍＲＮＡコードされたサイトカイン融合タンパク質のベクター設計、クローニングおよび産生
インターロイキン、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）リガンドおよびこれらの融合タンパク質をコードするＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として使用された、プラスミドコンストラクト（ｐＳＴ１−ｈＡｇ−コザック−ｓｅｃ−２ｈＢｇＵＴＲ−Ａ３０ＬＡ７０）は、ｐＳＴ１−２ｈＢｇＵＴＲ−Ａ１２０に基づいた（Holtkamp S. et al. (2006), Blood, 108(13):4009-17）。プラスミド骨格は、Ｔ７プロモーター、５’−ヒトアルファ−グロブリンＵＴＲ、コザック配列、ＭＨＣクラスＩ分子に由来する７８ｂｐシグナルペプチド（Ｓｅｃ；分泌シグナル配列）、２コピーのヒト３’−ベータ−グロブリンＵＴＲ、Ａ３０ＬＡ７０ポリ（Ａ）テイル（Ｌ：リンカー配列）およびカナマイシン抵抗性遺伝子を導入することにより、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ／ＣＡ、ＵＳＡ）から得た。インターロイキン、ＴＮＦＲリガンドまたはこれらの融合タンパク質をコードするインサートは、ＰＣＲ産物によるｃｏｌｄ融合反応によって導入された（Ｃｏｌｄ融合キット、Ｂｉｏｃａｔ）。関連するタンパク質をコードするセクションのＤＮＡ配列は、表１に収載されている。
【００８７】
表１．本発明に従って使用されるｐＳＴ１−ｈＡｇ−コザック−ｓｅｃ−インサート−２ｈＢｇＵＴＲ−Ａ３０ＬＡ７０および他のプラスミドの特定のセクションのＤＮＡ／アミノ酸配列
【表１】
2019502693.tif 000002
最適化された分泌シグナル配列（ｓｅｃ）を、全コンストラクトにおけるコード配列の前にクローニングした；ヒトインターロイキンのコード配列は、天然分泌シグナル配列なしで導入した。三量体ヒトＴＮＦＲリガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＯＸ４０Ｌおよび４−１ＢＢＬ）のコード配列は、次の通りに導入した：一列に接続され、ＧＳ−リンカーによって分離された、示されているヒトＴＮＦＲリガンドの細胞外配列を３コピー；斯かるヒトインサートは、ｈ３＿ＴＮＦＲ−Ｌ（ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ、ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ、ｈ３＿ＯＸ４０Ｌまたはｈ３＿４１ＢＢＬ）として指定される。インターロイキンＴＮＦＲリガンド融合タンパク質のコード配列を得るために、インターロイキン配列およびｈ３＿ＴＮＦＲ−Ｌ配列を、それぞれ１５アミノ酸リンカー（（Ｇ4Ｓ）3−リンカー）によって接続した（表１および図１）。ＲＮＡ転写物は、それぞれｈＩＬ（ｘ）−ｈ３＿ＴＮＦＲ−Ｌまたはｈ３＿ＴＮＦＲ−Ｌ−ｈＩＬ（ｘ）として示されている。単一のｈ３＿ＴＮＦＲ−Ｌおよび単一のインターロイキンのタンパク質配列は、表２および表３に収載されている。
【００８８】
表２．ｐＳＴ１−ｈＡｇ−コザック−ｓｅｃ−インサート−２ｈＢｇＵＴＲ−Ａ３０ＬＡ７０およびＴＮＦＲリガンドの細胞外ドメインをコードするプラスミドの可変的インサートのアミノ酸配列（リンカー配列に下線を引く）
【表２】
2019502693.tif 000003
表３．ｐＳＴ１−ｈＡｇ−コザック−ｓｅｃ−インサート−２ｈＢｇＵＴＲ−Ａ３０ＬＡ７０およびインターロイキンをコードするプラスミドの可変的インサートのアミノ酸配列（リンカー配列に下線を引く）
【表３−１】
2019502693.tif 000004
【表３−２】
2019502693.tif 000005
【００８９】
ＩＶＴ−ＲＮＡの生成のため、クラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して、プラスミドをポリ（Ａ）テイルの下流で直鎖化した。直鎖化されたプラスミドを、製造業者の説明書に従って、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって精製し、分光光度的に定量化し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に付した。その上、キャップアナログβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）を取り込み、最後に、ＭＥＧＡキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＲＮＡを精製した。
【００９０】
（例２）
ＩＶＴ−ＲＮＡエレクトロポレーション後のインターロイキンＴＮＦＲリガンド融合タンパク質の細胞内発現
融合タンパク質の発現をチェックするために、対応するＩＶＴ−ＲＮＡをＫ５６２細胞へとエレクトロポレーションした。慢性骨髄性白血病に由来するヒト細胞株であるＫ５６２（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡから得る）を、５％ＦＣＳ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養した。９６ウェルプレートシステムにおけるＫ５６２のエレクトロポレーションのため、収集された細胞をＸ−Ｖｉｖｏ１５培地（Ｌｏｎｚａ）において１回洗浄し、最終濃度５００．０００細胞／１５０μｌとなるよう再度Ｘ−Ｖｉｖｏ１５に再懸濁した。１５０μｌの細胞懸濁液をピペッティングして、マルチウェルエレクトロポレーション（Ｂｉｏｒａｄ）のために要求されたＩＶＴ−ＲＮＡを既に含有する９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。混合した後に、Ｂｉｏｒａｄ製のＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＭＸｃｅｌｌエレクトロポレーションシステム（２５０Ｖ、１×３０ｍｓパルス）、９６ウェルエレクトロポレーションデバイスにおいてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの直後に、抗生物質を含まない新鮮培地を含有する新たな培養プレートに細胞を移し、インキュベーター内で約６時間休ませた。Ｋ５６２の細胞内染色のため、次いで細胞を、製造業者のプロトコールに従って、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇおよびＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）と共に１６時間インキュベートした。翌日に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘバッファー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において室温で２０分間固定した。その後に、細胞を再度ＰＢＳにおいて洗浄し、細胞を洗浄し、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移すことにより透過処理した。１０分間のインキュベーション後に、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーに希釈した抗インターロイキン抗体および抗ＣＤ４０抗体で細胞を３０分間、室温で暗所にて染色し、続いて、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで３回洗浄ステップを行った。次に、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリーによって細胞を直接的に解析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）を使用して解析を行った。
【００９１】
インターロイキンとＴＮＦＲリガンドの融合タンパク質をコードするｍＲＮＡのエレクトロポレーションは、細胞内タンパク質発現をもたらし、これは、細胞内抗体染色によって検出することができた。図２は、ｈＩＬ（ｘ）−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ融合コンストラクトの例を示す：インターロイキン部分およびＣＤ４０Ｌ部分の両方が、対応する抗体によって検出された。
【００９２】
（例３）
インターロイキンＣＤ４０Ｌ融合コンストラクトをコードするＩＶＴ−ＲＮＡのエレクトロポレーションにより発現されたタンパク質の受容体活性化特性
融合タンパク質のタンパク質機能をチェックするために、５％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸにおいて培養されたＨＴ１０８０＿ＣＤ４０細胞を使用して、そのリガンドによりＣＤ４０活性化を測定するレポーターアッセイを行った。ＨＴ１０８０−トランスフェクタントにおけるＴＮＦ受容体の細胞表面発現をＦＡＣＳによって解析した。この目的のため、抗ヒトＣＤ４０−ＦＩＴＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用してＨＴ０１８０＿ＣＤ４０を染色した（図３Ａ）。上述の通りの（例２を参照）Ｋ５６２のエレクトロポレーションによって、ヒトインターロイキンＴＮＦＲリガンド融合タンパク質を産生した。エレクトロポレーションの直後に、１００μｌの新鮮培地を添加することにより、細胞を新たな培養プレートに移し、インキュベーター内で約３時間休ませた。次に、細胞を遠心分離し、一晩インキュベーション（約１６時間）のため、０，５％ＦＣＳを有する５００μｌのＲＰＭＩ  １６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸに細胞ペレットを再懸濁した。翌日に、分泌された融合タンパク質を含有する１００μｌの上清を、ＨＴ１０８０＿ＣＤ４０トランスフェクタントのコンフルエント層に移した。ＣＤ４０受容体活性化は、ＨＴ１０８０＿ＣＤ４０細胞によるＩＬ−８放出後にＮＦ−カッパーＢ経路活性化をもたらした。６〜８時間のインキュベーション後に、無細胞上清を捕集し、製造業者のプロトコールに従ってＩＬ−８  ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によってＩＬ８濃度を測定した。
【００９３】
ＣＤ４０−受容体と独立して細胞を活性化する組換えＣＤ４０（ＭｅｇａＣＤ４０Ｌ、ｅｎｚｏ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および組換えＴＮＦ−アルファと匹敵する程度で、全被験ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ融合タンパク質のエレクトロポレーションにより、ＨＴ１０８０＿ＣＤ４０におけるＣＤ４０受容体の活性化を検出した。単一のｈ３＿ＣＤ４０Ｌコンストラクトおよびｈ３＿ＣＤ４０Ｌ融合コンストラクトの適用は、匹敵する活性化をもたらし、融合タンパク質内でのＣＤ４０Ｌの機能性を確認した（図３Ｂ）。
【００９４】
（例４）
Ｔ細胞およびＮＫ細胞増殖におけるＩＶＴ−ＲＮＡコードしたｈＩＬ２−ｈ３＿ＴＮＦＲリガンド融合タンパク質の効果
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるインターロイキンＴＮＦＲリガンド融合コンストラクト（ＩＶＴ−ＲＮＡ）によって媒介される効果を解析するために、ＣＦＳＥ増殖アッセイを行った。インターロイキンＴＮＦＲリガンド融合タンパク質の産生のためにＫ５６２細胞を使用した。この目的のため、９６ウェルプレートシステムにおいてＫ５６２をエレクトロポレーションした。細胞をＸ−Ｖｉｖｏ１５培地において１回洗浄し、５００．０００細胞／１５０μｌとなるよう再度Ｘ−Ｖｉｖｏ１５において再懸濁した。１５０μｌの細胞懸濁液をピペッティングして、マルチウェルエレクトロポレーションのために要求されたＩＶＴ−ＲＮＡ（２０ｐｍｏｌ／ウェル、対応する翻訳されたタンパク質を参照）を既に含有する９６ウェルプレートに入れた。混合した後に、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＭＸｃｅｌｌエレクトロポレーションシステム（２５０Ｖ、１×３０ｍｓパルス）においてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの直後に、１００μｌの新鮮培地を添加することにより、細胞を新たな培養プレートに移し、インキュベーター内で約１〜３時間休ませた。次に、細胞を遠心分離し、２４時間のインキュベーションのために、０，５％ＦＣＳを有する５００μｌのＲＰＭＩ  １６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸに細胞ペレットを再懸濁した。
ＣＦＳＥ増殖アッセイのため、ドイツ、マインツにおけるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＨｏｓｐｉｔａｌにおけるＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓｚｅｎｔｒａｌｅ由来の献血からＰＢＭＣを得た。製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってカルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）でＰＢＭＣを染色し、５％ヒトＡＢ血清を補充したＩＭＤＭ培地に移した。ＰＢＭＣドナー特異的予備検査で決定された最終濃度となるように、抗ＣＤ３抗体（クローン：ＵＣＨＴ１）を細胞懸濁液に添加して、ＰＢＭＣの最適以下刺激をもたらした。ウェル当たり１５０μｌ培地における５０．０００細胞で９６ウェルプレートにＰＢＭＣを蒔いた。それぞれＲＮＡコード融合タンパク質または単一のタンパク質を含有する、５０μｌのＫ５６２上清（２４時間のインキュベーション後、上述を参照）を添加した。インキュベーションを５日間行い、Ｔ細胞増殖をフローサイトメトリーによって測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって解析した。ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞およびＣＤ５６+ＮＫ細胞の細胞懸濁液は、抗体染色によって鑑別した。
【００９５】
ｈＩＬ２  ＲＮＡ単独は、ＣＤ４+、ＣＤ８+Ｔ細胞およびＮＫ細胞の中等度増殖を誘導した。可溶性ＴＮＦＲリガンドをコードする単一のＲＮＡとｈＩＬ２  ＲＮＡの混合物は、ｈＩＬ２  ＲＮＡ単独と同様の効果を媒介した。対照的に、ｈＩＬ２とＴＮＦＲリガンドの融合タンパク質をコードするＲＮＡは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞増殖を強く増強した、あるいはより正確には、より多くのＴ細胞が分裂状態になり、より頻繁に分裂した（図４）。ｈＩＬ−２融合タンパク質の効果は、全４種の被験ＴＮＦリガンド、ＣＤ２７Ｌ（図４Ａ）、ＣＤ４０Ｌ（図４Ｂ）、４−１ＢＢＬ（図４Ｃ）およびＯＸ４０Ｌ（図４Ｄ）との融合について示された。ＣＦＳＥ解析によって可視化された細胞分裂の代表的ヒストグラムは、図４Ｅ（ｈＩＬ２−ｈ３＿４−１ＢＢＬ融合）および図４Ｆ（ｈＩＬ２−ｈ３＿ＯＸ４０Ｌ融合）に示す。
【００９６】
（例５）
Ｔ細胞増殖におけるＩＶＴ−ＲＮＡコードｈｓｃＩＬ１２−ｈ３＿ＴＮＦＲリガンド融合タンパク質の効果
ヒトｓｃＩＬ１２および可溶性ＴＮＦＲリガンドドメインからなる融合タンパク質をコードするＩＶＴ−ＲＮＡ（ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ、ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ、ｈ３＿ＯＸ４０Ｌまたはｈ３＿４−１ＢＢＬ）を、上述の通りに（例４）ＣＦＳＥ増殖アッセイによって、ＰＢＭＣ増殖におけるその効果について検査した。ｈｓｃＩＬ１２融合タンパク質の優れた効果は、全４種の被験ＴＮＦリガンド、ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ、ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ、ｈ３＿４−１ＢＢＬおよびｈ３＿ＯＸ４０Ｌとの融合について示された（図５）。最も強い効果は、ＣＤ８+Ｔ細胞に観察された（図５Ｂおよび図５Ｄ）。ｈｓｃＩＬ１２融合タンパク質は特に、増殖速度を増強した（細胞分裂回数）（図５Ｃおよび図５Ｄ）。
【００９７】
（例６）
抗原特異的Ｔ細胞増殖におけるＩＶＴ−ＲＮＡコードｈＩＬ２−ｈ３＿ＴＮＦＲリガンド融合タンパク質の効果
抗原特異的Ｔ細胞増殖におけるサイトカイン融合コンストラクトの効果を解析するために、ＣＦＳＥ  ＣＤ８+Ｔ細胞増殖アッセイを次の通りに設定した。ＨＬＡ−Ａ２+ＰＢＭＣは、ドイツ、マインツにおけるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＨｏｓｐｉｔａｌにおけるＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓｚｅｎｔｒａｌｅ由来の献血から得た。抗ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術によってＰＢＭＣから単球を単離した；将来的なＴ細胞単離のために末梢血リンパ球（ＰＢＬ、ＣＤ１４−画分）を凍結した。未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）へと分化するため、５％ヒトＡＢ−血清（Ｇｉｂｃｏ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、非必須アミノ酸、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０００ＩＵ／ｍＬ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子および１０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−４（両者共にＭｉｌｔｅｎｙｉ製）を含有するＲＰＭＩ  ＧｌｕｔａＭＡＸにおいて単球を４〜５日間培養した。この４〜５日の間に、培地の半分を新鮮培地に１回置き換えた。ｉＤＣを収集し、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地において１回洗浄し、その後、エレクトロポレーションし、再度Ｘ−Ｖｉｖｏ１５において１×１０6〜５×１０6細胞／２５０μｌとなるよう再懸濁し、エレクトロポレーションキュベットに移した。抗原クローディン−６をコードするＲＮＡを添加し、次いで細胞懸濁液を混合した。ＢＴＸ  ＥＣＭ（登録商標）８３０エレクトロポレーションシステムデバイス（３００Ｖ、１×１２ｍｓパルス）を使用して、４ｍｍエレクトロポレーションキュベット内の２５０μｌのＸ−Ｖｉｖｏ１５においてｉＤＣエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの直後に、５％ヒトＡＢ血清を補充したＩＭＤＭ培地を含有する６ウェルプレートに細胞を移し、インキュベーター内で一晩休ませた。
【００９８】
ヒトインターロイキンＴＮＦＲリガンド融合タンパク質を含有する上清を生成するために、Ｋ５６２マルチエレクトロポレーションを上述の通りに行った。ＣＤ１４+ＭＡＣＳ単離後に凍結した残っているＨＬＡ−Ａ２+末梢血リンパ球から、抗ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用したＭＡＣＳ技術によってＣＤ８+Ｔ細胞を分離した。Ｘ−ｖｉｖｏ１５培地においてＣＤ８+Ｔ細胞を１回洗浄し、最終濃度１０〜１５×１０6細胞／２５０μｌとなるよう再度Ｘ−Ｖｉｖｏ１５に再懸濁した。クローディン−６−ＴＣＲのアルファ鎖をコードする１０μｇのＩＶＴ−ＲＮＡ、プラス、ベータ鎖をコードする１０μｇのＩＶＴ−ＲＮＡ（ＨＬＡ−Ａ２+に制限）を有する２５０μｌの培地において、１０〜１５×１０6個のＣＤ８+Ｔ細胞をエレクトロポレーションした。ＢＴＸデバイス（５００Ｖ、１×３ｍｓパルス）を使用して、４ｍｍエレクトロポレーションキュベット内の２５０μｌのＸ−Ｖｉｖｏ１５においてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの直後に、５％ヒトＡＢ血清を補充した新鮮ＩＭＤＭ培地に細胞を移し、インキュベーター内で少なくとも１時間休ませた。次に、ＣＦＳＥでＴ細胞を染色し、インキュベーター内で一晩休ませた。
【００９９】
エレクトロポレーション１日後に、クローディン−６  ＲＮＡをエレクトロポレーションした総計５．０００個のＤＣおよびＣＬＤ６−ＴＣＲをコードするＲＮＡをエレクトロポレーションした５０．０００個のＴ細胞を、９６ウェル丸底プレートのウェル当たり５％ヒトＡＢ血清、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充した１００μｌの容量のＲＰＭＩ  １６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸにおいて混合した。ウェル当たり分泌されたインターロイキンＴＮＦＲリガンド融合体を含有する５０μｌのＫ５６２上清（マルチウェルエレクトロポレーション後に２４時間のインキュベーション）をＤＣ：Ｔ細胞懸濁液に添加した。インキュベーションを行い、５日間のインキュベーション後に、フローサイトメトリーによってＴ細胞増殖を測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって解析した。
【０１００】
ヒトＩＬ２および可溶性ＴＮＦリガンドドメインからなる融合タンパク質をコードするＩＶＴ−ＲＮＡ（ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌまたは４−１ＢＢＬ）を、抗原特異的設定でのＣＤ８+Ｔ細胞増殖におけるその効果について検査した（図６）。ＩＬ２  ＲＮＡ単独は、ＣＤ８+Ｔ細胞の中等度増殖を誘導した。可溶性ＴＮＦリガンドをコードする単一のＲＮＡとＩＬ２  ＲＮＡの混合物は、ＩＬ２  ＲＮＡ単独と同様の効果を媒介した。対照的に、ＩＬ２とＴＮＦＲリガンドの融合タンパク質をコードするＲＮＡは、Ｔ細胞増殖を強く増強した。より詳細な解析は、全４種のｈＩＬ２融合タンパク質が、増殖指数（細胞分裂回数）を増強したことを明らかにした（図６Ｂ）。加えて、ｈＩＬ−２−ＣＤ２７ＬおよびｈＩＬ２−ＣＤ４０Ｌ融合体は、分裂した細胞（分裂状態になった細胞）のパーセンテージを増強した（図６Ａ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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