(57)【要約】  本開示は、ＨＩＶに対する特異性を有する結合剤と、ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳを処置、予防および／または改善するためのその使用方法とに関する。
2019509046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロＨＩＶ中和アッセイおよび／またはインビボでＨＩＶを中和する結合剤において、配列番号１〜３２からなる群から選択されかつ／または表１に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする結合剤。
【請求項２】
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の結合剤。
【請求項３】
配列番号１〜６もしくはＧＮＴ、またはその保存的置換バリアント；
配列番号１〜８、またはその保存的置換バリアント；
配列番号９および１０、またはその保存的置換バリアント；
配列番号１１および１２、またはその保存的置換バリアント；
配列番号１３および１４、またはその保存的置換バリアント；
配列番号１５および１６、またはその保存的置換バリアント；
配列番号１７および１８、またはその保存的置換バリアント；
配列番号１９および２０、またはその保存的置換バリアント；
配列番号２１および２２、またはその保存的置換バリアント；および
配列番号２３および２４、またはその保存的置換バリアント
の少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の結合剤。
【請求項４】
配列番号７０または７１を含む可変重鎖領域；
配列番号７０のアミノ酸２２に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）；
配列番号７１のアミノ酸２３に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）；
配列番号７２〜７８のいずれかのＣＤＲＨ３アミノ酸配列；
配列番号７２のアミノ酸８に対応するアミノ酸におけるアラニン（Ａ）；
配列番号７３のアミノ酸９に対応するアミノ酸におけるアラニン（Ａ）；
配列番号７４のアミノ酸１０に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）；
配列番号７５のアミノ酸１１に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）；
配列番号７６のアミノ酸１２に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）；
配列番号７７のアミノ酸１４に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）；
配列番号７８のアミノ酸１５に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）；
配列番号７９または８０を含む可変軽鎖領域；
配列番号７９のアミノ酸５に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）；および／または
配列番号８０のアミノ酸６に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）
を含まないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項５】
配列番号６８のアミノ酸残基Ｌ６７９、Ｗ６８０およびＫ６８３、ならびに／または配列番号６９のアミノ酸残基Ｌ１６８、Ｗ１６９およびＫ１７２に対する結合特異性を示すことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項６】
ＩＴＫＷＬＷＹＩＫ（配列番号６６）に対する結合特異性を示すことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項７】
ＩＴＫＷＬＷＹＩＫ（配列番号６６）に対する結合特異性を示すが、ＬＡＳＷＶＫＹＩＱ（配列番号６５）および／またはＩＴＫＷＩＫＹＩＱ（配列番号６７）に対する結合特異性を示さないことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項８】
１０２〜１００μｇ／ｍｌまたは１００〜１０１μｇ／ｍｌの濃度において、ＨＩＶ−１偽型ウイルスＢＪＯＸ（ＣＲＦ０７＿ＢＣ）、ＣＥ１１７６、ＴＲＯ．１１（Ｂ）、Ｘ１６３２（Ｇ）、ＣＨ１１９（ＣＲＦ０７＿ＢＣ）、ＣＮＥ５５（ＣＲＦ０１＿ＡＥ）、２５７１０（Ｃ）、ＣＤ０２１７（Ｃ）の中和を示すが、対照ウイルスＳＶＡ−ＭＬＶの中和を示さないことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項９】
中和パーセントは、少なくとも約５０％であることを特徴とする、請求項８に記載の結合剤。
【請求項１０】
２５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０において、図４に記載される１１８のＨＩＶ−１偽型ウイルスの大部分を中和することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項１１】
単離モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の結合剤。
【請求項１３】
前記抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３であることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の結合剤。
【請求項１４】
配列番号１〜３からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の結合剤。
【請求項１５】
配列番号４〜６またはＧＮＴからなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の結合剤。
【請求項１６】
配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖可変アミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の結合剤。
【請求項１７】
配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖可変アミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の結合剤。
【請求項１８】
配列番号１〜３２のいずれか１つまたは複数のアミノ酸残基の保存的置換を含むことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項１９】
ヒト抗体、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ２ａ、ヒトＩｇＧ２ｂ、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＡ１、ヒトＩｇＡ２、ヒトＩｇＤ、ヒトＩｇＥ、イヌ抗体、イヌＩｇＧＡ、イヌＩｇＧＢ、イヌＩｇＧＣ、イヌＩｇＧＤ、ニワトリ抗体、ニワトリＩｇＡ、ニワトリＩｇＤ、ニワトリＩｇＥ、ニワトリＩｇＧ、ニワトリＩｇＭ、ニワトリＩｇＹ、ヤギ抗体、ヤギＩｇＧ、マウス抗体、マウスＩｇＧ、ブタ抗体、およびラット抗体に由来することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項２０】
誘導体において、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の結合剤のものであることを特徴とする誘導体。
【請求項２１】
Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’単鎖抗体、Ｆｖ、単鎖、単一特異性抗体、二特異性抗体、三量体抗体、多特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ−ヒトキメラ抗体、イヌ−マウスキメラ抗体、イヌＦｃを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化抗体、ＣＤＲ移植抗体、サメ抗体、ナノボディ、およびラクダ科抗体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２１に記載の誘導体。
【請求項２２】
少なくとも第１および第２の特異性を含み、前記第１の特異性は、ｇｐ４１に対するものであり、および前記第２の特異性は、異なる抗原に対するものであることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合剤または誘導体。
【請求項２３】
固定可能に取り付けられた検出可能な標識を含むことを特徴とする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の結合剤またはその誘導体。
【請求項２４】
前記検出可能な標識は、フルオレセイン、ＤｙＬｉｇｈｔ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−ＦＡＭ、ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＡＴ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、ＦＩＴＣ、６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（６−ＪＯＥ）、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹフルオロフォア、ＢＯＤＩＰＹ  ４９２／５１５、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５００／５１０、ＢＯＤＩＰＹ  ５０５／５１５、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５４２／５６３、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ  ６６５／６７６、ＦＬ、ＦＬ  ＡＴＰ、ＦＩ−セラミド、Ｒ６Ｇ  ＳＥ、ＴＭＲ、ＴＭＲ−Ｘコンジュゲート、ＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、ＴＲ、ＴＲ  ＡＴＰ、ＴＲ−Ｘ  ＳＥ、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１２３、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＢエクストラ、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５ＧＬＤ、６−カルボキシローダミン６Ｇ、リサミン、リサミンローダミンＢ、ファリシジン、ファロイジン、ローダミンレッド、Ｒｈｏｄ−２、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、スルホローダミンＢ  ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＧエクストラ、６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ローダミンＷＴ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の結合剤。
【請求項２５】
固定可能に取り付けられたエフェクター部分を含むことを特徴とする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の結合剤またはその誘導体。
【請求項２６】
前記エフェクター部分は、細胞毒性薬、毒素、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、および放射化学物質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の結合剤または誘導体。
【請求項２７】
単離ポリヌクレオチドにおいて、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の結合剤をコードすることを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
配列番号３７〜７２の少なくとも１つの核酸配列を含むことを特徴とする、請求項２７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
発現ベクターにおいて、請求項２７または２８に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項３０】
宿主細胞において、請求項２７もしくは２８に記載の単離ポリヌクレオチドおよび／または請求項２９に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項３１】
組成物において、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの結合剤もしくは誘導体；請求項２７もしくは２８に記載の少なくとも１つの単離ポリヌクレオチド；または請求項２９に記載の少なくとも１つの発現ベクター；および／または請求項３０に記載の少なくとも１つの宿主細胞；あるいはこれらの組合せと、薬学的に許容可能な担体とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項３２】
細胞上のＨＩＶを検出するための方法において、試験生体サンプルを、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の結合剤または誘導体と接触させるステップと、前記生体サンプルまたはその成分に結合された前記結合剤を検出するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
前記試験生体サンプルまたはその成分への結合量を、対照生体サンプルまたはその成分への結合量と比較するステップをさらに含み、前記対照生体サンプルまたはその成分と比べて増大した前記試験生体サンプルまたはその成分への結合は、前記試験生体サンプル中におけるＨＩＶ発現細胞の存在を示すことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試験生体サンプルは、哺乳類の血液であることを特徴とする、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
インビボ方法であることを特徴とする、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
インビトロ方法であることを特徴とする、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
哺乳類のＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳを処置、予防および／または改善するための方法において、少なくとも１回の有効用量の、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の結合剤または誘導体を含む医薬組成物を前記哺乳類へ投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
前記動物に複数回の投与が行われることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記結合剤は、約１〜５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与されることを特徴とする、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
細胞内または細胞上のＨＩＶの発現を検出するためのキットにおいて、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の結合剤または誘導体と、使用説明書とを含むことを特徴とするキット。
【請求項４１】
前記結合剤、抗体、または誘導体は、凍結乾燥形態であることを特徴とする、請求項４０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１５年１２月５日に出願された米国特許出願第６２／２６３，６１８号に対する優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する特異性を有する結合剤と、その製造方法と、ＨＩＶ感染を処置および／または予防するためのその使用方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＩＶが流行して３０〜４０年が経つにつれて、ＨＩＶ病因の理解および強力かつ安全な抗ウイルス薬の開発において著しい進歩が遂げられている。３０を超える抗ウイルス薬が登録されており、抗レトロウイルス併用療法（ＡＲＴ）が罹患率および死亡率の両方に与える影響は注目に値するものであった。しかしながら、ＡＲＴを最適に順守する患者ではＨＩＶ複製の長期間の抑制が達成されているにもかかわらず、治療の中断後にＨＩＶは常に元に戻る。さらに、成功した治療は、ＡＲＴがないと、ＨＩＶ複製を制御することができるウイルス特異的免疫応答を誘発せず、またはその回復／発生を可能にしない。従って、ＨＩＶ感染対象の大多数において、ＨＩＶ複製および関連の疾患を制御するには、生涯にわたるＡＲＴが必要とされる。
【０００４】
持続的な抗ウイルス療法がなくてもウイルス複製が抑制されるいくつかの免疫学的介入がこれまでに研究されており、現在、ＨＩＶの機能的治癒を達成することを目標としてさらに開発されている。治療的ワクチン戦略は、これまで研究された主要な介入戦略であったが、結果は、実験動物モデルおよび患者において、ＣＭＶベースのベクターＨＩＶワクチン（ＮＨＰモデルにおいて５０％の効力）を除いてわずかな効力のみを示している。最近の研究は、ＨＩＶ感染における治療薬として抗エンベロープ広域中和抗体（ｂＮａｂ）を用いる可能性について興味深い結果をもたらしている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
当該技術分野において、ＨＩＶを標的にするための付加的な試薬、特に中和抗体と、その使用方法とが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、ＨＩＶ、ならびにＨＩＶに感染しておりかつ／またはＨＩＶを保有している細胞および／もしくは組織を標的にするために使用され得る試薬および方法を提供することにより、これらの必要性に対処する。
【０００７】
以下において、添付図面の簡単な説明が提供される。図面は、本発明をより詳細に説明することが意図される。しかしながら、それらは、本発明の主題を限定することは全く意図されない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】図１Ａ〜Ｂは、抗レトロウイルス療法を受けていない慢性感染患者からの７０の血漿サンプルによる、ＨＩＶ−１参照株の包括的パネルからの９個のＨＩＶ−１偽型ウイルスのパネルの中和の結果を示す。ＭＬＶ偽型ウイルスは、負の対照として使用される。強力な広域中和抗体を単離するためにリンパ節の採取に選択された７人のドナーがボックスで囲われている。矢印で強調されているのは、本発明で記載される広域中和抗体の単離のために選択されたドナーＳＡ００３である。ＩＤ５０値は、ウイルス感染の５０％を中和することができる血漿の希釈を示す。
【図１−２】図１Ｃ〜Ｄは、抗レトロウイルス療法を受けていない慢性感染患者からの７０の血漿サンプルによる、ＨＩＶ−１参照株の包括的パネルからの９個のＨＩＶ−１偽型ウイルスのパネルの中和の結果を示す。ＭＬＶ偽型ウイルスは、負の対照として使用される。強力な広域中和抗体を単離するためにリンパ節の採取に選択された７人のドナーがボックスで囲われている。ＩＤ５０値は、ウイルス感染の５０％を中和することができる血漿の希釈を示す。
【図２】図２は、リンパ節サンプルから記憶および胚中心ＩｇＧ  Ｂ細胞を精製するために使用されるゲーティングおよびソーティング戦略を示す。Ｂ細胞を表面マーカーＣＤ１９の発現について選択し、ＩｇＧ  Ｂ細胞をＩｇＡおよびＩｇＭ  Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の発現の欠乏について陰性選択した。胚中心Ｂ細胞をＣＤ３８マーカー（記憶Ｂ細胞上に存在しない）の発現についてさらに選択した。
【図３】図３Ａ−Ｂは、異なる濃度（μｇ／ｍｌ）のモノクローナル抗体ＬＮ０１による、ＨＩＶ−１参照株の包括的パネルからの９個のＨＩＶ−１偽型ウイルスのパネル（および負の対照としてのＭＬＶ）の中和の結果を示す。ＩＣ５０値は、ウイルス感染の５０％を中和することができるモノクローナル抗体の濃度を示す。エラーバーは、２度の繰返しの標準偏差を示す。
【図４】図４は、モノクローナル抗体ＬＮ０１による、１１８個のＨＩＶ−１偽型ウイルスのマルチクレードパネルの中和の結果を示す。ＩＣ５０値は、ウイルス感染の５０％を中和することができるモノクローナル抗体の濃度を示す。
【図５−１】図５Ａ〜Ｆは、図４に記載される１１８個のウイルスのパネル全体と、個々のクレードまたは循環組換え形態とにおけるＩＣ５０値の分布を示す。
【図５−２】図５Ｇ〜Ｊは、図４に記載される個々のクレードまたは循環組換え形態とにおけるＩＣ５０値の分布を示す。
【図６】図６は、ＴＺＭ−ｂｌまたはＦｃガンマ受容体Ｉを発現するＴＺＭ−ｂｌを標的細胞として用いたときに、モノクローナル抗体ＬＮ０１による、ＨＩＶ−１参照株の包括的パネルからの９個のＨＩＶ−１偽型ウイルスのパネルの中和の結果を示す。
【図７】図７は、７個のＨＩＶ−２／ＨＩＶ−１キメラ偽型ウイルスのパネルの中和の結果を示し、ここで、ＨＩＶ−２（株７３１２Ａ）ＭＰＥＲ領域は、クレードＢまたはクレードＣ（バリアント７３１２Ａ．Ｃ１Ｃの場合）ＨＩＶ−１株のＭＰＥＲコンセンサス配列から対応する残基を導入することにより変異誘発されている。
【図８−１】図８Ａ〜Ｂは、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、グループＭ、ＣＲＦ０１＿ＡＥおよびＣＲＦ０２＿ＡＧのコンセンサスＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｇｐ１６０配列の全長をカバーする、１２個のアミノ酸により重複する１４２３の１５−ｍｅｒペプチドのアレイに対するＬＮ０１または７Ｂ２モノクローナル抗体の結合を示す。２．０Ｅ＋４よりも低いシグナルは、陰性であるとスコア化される。予想通り、７Ｂ２は、ｇｐ４１免疫優性領域（ｇｐ４１ＩＤ）と反応する。
【図８−２】図８Ｃ〜Ｄは、図Ａ〜Ｂの続きである。
【図９−１】図９Ａ〜Ｂは、表面プラズモン共鳴で評価したときの、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）の存在下または非存在下で広域中和のために複数のエピトープを発現する切断型および可溶性ＨＩＶ−１  ＥｎｖトリマーＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０に対するＬＮ０１、ＰＧＴ１４５、ＰＧＴ１５１および１７Ｂモノクローナル抗体の結合を示す。予想通り、ＰＧＴ１４５（Ｖ１−Ｖ２グリカン特異的）およびＰＧＴ１５１（ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の界面の部位へ結合する）は、ｓＣＤ４の非存在下および存在下でＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０に対して高親和性で結合したが、１７ｂ（ＣＤ４結合誘導部位へ結合する）は、ｓＣＤ４の存在下においてのみ結合した。
【図９−２】図９Ｃ〜Ｄは、図Ａ〜Ｂの続きである。
【図１０】図１０Ａ−Ｂは、ＥＬＩＳＡで測定したときの、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ抗原および負の対照（Ｃｔｒ）抗原のセットに対するＬＮ０１および１０Ｅ８（ＭＰＥＲ特異的広域中和抗体）抗体の結合を示す。１０Ｅ８抗体は、ＭＰＥＲ領域を含有するｇｐ４１の組換え細胞外ドメインに反応した。
【図１１】図１１Ａ−Ｂは、ＥＬＩＳＡで測定したときの、融合中間体ｇｐ４１（ｇｐ４１ｉｎｔ）または負の対照としての非コートプレート（ＰＢＳ）に対するＬＮ０１および１０Ｅ８モノクローナル抗体の結合を示す。１０Ｅ８抗体は、ＭＰＥＲ領域を含有するｇｐ４１に反応した。
【図１２】図１２は、ｇｐ４１ペプチドＲＲＲ−ＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬＷＹＩＲＲＲＲ（配列番号８９）に対するｍＡｂ  １０Ｅ８の結合を示す。
【図１３−１】図１３Ａは、ＬＮ０１抗体点突然変異バリアントの効力を示す。Ａ．ＬＮ０１  ＶＨおよびＶＬバリアント。
【図１３−２】図１３Ｂ〜Ｃは、ＬＮ０１抗体点突然変異バリアントの効力を示す。Ｂ．ＬＮ０１バリアントのＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）。Ｃ．ＩＣ５０比（ＩＣ５０  ＬＮ０１ｗｔ／ＩＣ５０  ＬＮ０１バリアント（「ｖａｒ．」））。
【図１４−１】図１４Ａ−Ｄは、４つのウイルスのマルチクレードパネルに対する親ＬＮ０１抗体の試験を示す。Ａ〜Ｄ．中和パーセント（％）。
【図１４−２】図１４Ｅ−Ｈは、４つのウイルスのマルチクレードパネルに対する親ＬＮ０１抗体の試験を示す。Ｅ〜Ｈ．中和パーセント（％）。
【図１４−３】図１４Ｉ−Ｋは、ＬＮ０１バリアント７、８および３８の試験を示す。Ｉ．中和パーセント（％）。Ｊ．ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）。Ｋ．ＩＣ５０比（ＩＣ５０  ＬＮ０１ｗｔ／ＩＣ５０  ＬＮ０１バリアント（「ｖａｒ．」））。
【図１５】図１５Ａ−Ｂは、７つのウイルスのマルチクレードパネルに対して、ＬＮ０１バリアント４１、４２、４３、４４、４８および５０の試験を示す。Ａ．ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）。Ｂ．ＩＣ５０比（ＩＣ５０  ＬＮ０１ｗｔ／ＩＣ５０  ＬＮ０１バリアント（「ｖａｒ．」））。
【図１６】図１６Ａ−Ｂは、７つのウイルスのパネルに対して、ＬＮ０１バリアント４９の試験を示す。Ａ．ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）。Ｂ．ＩＣ５０比（ＩＣ５０  ＬＮ０１ｗｔ／ＩＣ５０  ＬＮ０１バリアント（「ｖａｒ．」））。
【図１７】図１７は、ＬＮ０１バリアント８２の試験を示す（ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ））。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する特異性を有する結合剤と、このような結合剤の製造方法と、ＨＩＶ感染を処置、予防および／または改善するためのこのような結合剤の使用方法とに関する。
【００１０】
本開示は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する結合親和性を有する結合剤に関する。いくつかの実施形態では、結合剤は、インビトロおよび／またはインビボでウイルス粒子自体の上または細胞表面上のＨＩＶ抗原に結合することができる。また、結合剤は、通常、インビトロで単離ＨＩＶ抗原ならびに／またはその断片および／もしくは誘導体にも結合し得る。また、ＨＩＶに関連する１つまたは複数の疾患を診断、処置、予防および／または改善するためのこのような結合剤の使用方法も提供される。例えば、結合剤は、ＨＩＶのエピトープまたはそのポリペプチドと反応および／または結合し得る抗体（例えば、モノクローナル抗体）であり得る。結合剤は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などのＨＩＶにより引き起こされる疾患を処置するために有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される結合剤は、ＨＩＶ、および／またはＨＩＶ（例えば、複製可能なＨＩＶ）を含有しかつ／またはそのタンパク質を発現するＨＩＶ感染細胞を選択的に標的にしかつ／または除去し得る。いくつかの実施形態では、このような細胞は、複製可能なＨＩＶのリザーバーであり得る。いくつかの実施形態では、例えば、異なる特異性を有する（例えば、異なるエピトープを認識する）結合剤は、感染、複製および／または他の細胞への伝播などのＨＩＶ活性に対して組み合わせられ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される結合剤は、ＨＩＶまたはＨＩＶ発現細胞の選択的な除去および／または抑制も提供し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される結合剤は、ＨＩＶおよび／またはＨＩＶ発現細胞を抑制および／または除去して、例えば、ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳを処置するために使用され得る。他の実施形態、使用などは以下に記載される。
【００１１】
結合剤は、モノクローナル抗体などの抗体であり得る。本明細書中の実施例に示されるように、以下で議論される技術は、本明細書に記載されかつ実施例に示される特定の特徴を有する、「ＬＮ０１」と呼ばれる完全ヒトｍＡｂを同定するために使用されている。ＬＮ０１抗体を単離し、前記抗体の可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）ドメインのアミノ酸配列を決定した。ＬＮ０１などの結合剤は、その可変性および／または相補性決定領域（「ＣＤＲ」）に対応するアミノ酸および／または核酸配列を参照することにより同定され得る。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の蓄積、ＡｂＭ、接触の定義、および／もしくは立体構造の定義、または当技術分野において周知の任意のＣＤＲ決定方法、抗体モデリングソフトウェア（現Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））、あるいはＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２−７４５により記載される、観察された抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」に従って同定される可変領域内のアミノ酸残基を含む。ＣＤＲの「立体構造の定義」において、ＣＤＲの位置は、抗原結合へのエンタルピー寄与を行う残基として同定され得る（Ｍａｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１１５６−１１６６）。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記のアプローチの１つに厳密に従わないことがあり得るが、それでも、特定の残基もしくは残基群またはさらにＣＤＲ全体が抗原結合に有意に影響を与えないという予測または実験的知見を踏まえて、これらは、短くまたは長くなり得るものの、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲの少なくとも一部とオーバーラップし得る。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、当該技術分野で知られている任意のアプローチ（アプローチの組合せを含む）により定義されるＣＤＲを指すことができる。本明細書において使用される方法は、これらのアプローチのいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用し得る。２つ以上のＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態について、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、接触、および／または立体構造の定義のいずれかに従って定義され得る。
【００１２】
ＬＮ０１およびその特定の例示的なバリアントの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）、軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２（およびＣＤＲＬ２長鎖）、ＣＤＲＬ３）、ＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列は、以下の表１に示される。
【００１３】
【表１−１】
2019509046.tif 000003
【００１４】
【表１−２】
2019509046.tif 000004
【００１５】
【表１−３】
2019509046.tif 000005
【００１６】
本開示の結合剤は、例えば、表１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つまたは複数（すなわち、配列番号１〜３２またはＧＴＹ（ＬＮ０１  ＣＤＲＬ２）のいずれか１つまたは複数）を含み得る。これらの断片および／または誘導体（例えば、保存的置換などの置換アミノ酸を含む）も開示される。ＬＮ０１抗体（ＩｇＧ３抗体）の例示的な誘導体は、例えば「ＩｇＧ１  ＬＮ０１」と呼ばれており、ＬＮ０１の可変領域がＩｇＧ１骨格にクローン化されたものである。いくつかの実施形態では、次に、本開示の結合剤は、配列番号１〜３２の１つまたは複数（すなわち１、２、３、４、５、６または７つ）を含み得る。いくつかの実施形態では、結合剤は、配列番号１〜６およびまたはＧＴＹ（ＬＮ０１  ＣＤＲＬ２）のそれぞれを含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、このような結合剤は、配列番号７および／もしくは配列番号８；配列番号９および／もしくは１０；配列番号１１および／もしくは１２；配列番号１３および／もしくは１４；配列番号１５および／もしくは１６；配列番号１７および／もしくは１８；配列番号１９および／もしくは２０；配列番号２１および／もしくは２２；または配列番号２３および／もしくは２４；あるいはこれらの保存的置換バリアントを含み得る。好ましい実施形態では、結合剤は、配列番号７および配列番号８；配列番号９および１０；配列番号１１および１２；配列番号１３および１４；配列番号１５および１６；配列番号１７および１８；配列番号１９および２０；配列番号２１および２２；もしくは配列番号２３および２４；またはこれらの保存的置換バリアントを含む。いくつかの実施形態では、結合剤は、１つまたは複数のアミノ酸置換、特に保存的置換（例えば、表２を参照されたい）を含む配列番号１〜３２のいずれかを含み得る。配列番号１（ＬＮ０１  ＣＤＲＨ１）の例示的なバリアントには、例えば、配列番号２５〜３２のいずれかが含まれる。いくつかの実施形態では、結合剤は、モノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、結合剤は、このようなモノクローナル抗体のＨＩＶ結合断片であり得る。このような実施形態は、通常、配列番号１〜３２の少なくとも１つまたは複数を含むことができ、好ましくは、配列番号１〜６（またはＧＴＹ（ＬＮ０１  ＣＤＲＬ２）のそれぞれを含み、例えば、配列番号７〜８；配列番号２５（ＬＮ０１バリアント７および４８  ＣＤＲＨ１）；配列番号２６（ＬＮ０１バリアント８  ＣＤＲＨ１）；配列番号２７（ＬＮ０１バリアント４１  ＣＤＲＨ１）；配列番号２８（ＬＮ０１バリアント４２  ＣＤＲＨ１）；配列番号２９（ＬＮ０１バリアント４３  ＣＤＲＨ１）；配列番号３０（ＬＮ０１バリアント４４  ＣＤＲＨ１）；配列番号３１（ＬＮ０１バリアント４９、ＬＮ０１バリアント７  ＣＤＲＨ１およびＬＮ０１バリアント８  ＣＤＲＨ１の組合せ）；または配列番号３２（ＬＮ０１バリアント８２  ＣＤＲＨ１）などである。いくつかの実施形態では、配列番号７０または７１を含む可変重鎖領域（それぞれＬＮ０１バリアント１３および１４）；配列番号７０のアミノ酸２２に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）（ＬＮ０１バリアント１３）��配列番号７１のアミノ酸２３に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）（ＬＮ０１バリアント１４）；配列番号７２〜７８のいずれかのＣＤＲＨ３アミノ酸配列（それぞれＬＮ０１バリアント１８〜２４）；配列番号７２のアミノ酸８に対応するアミノ酸におけるアラニン（Ａ）（ＬＮ０１バリアント１８）；配列番号７３のアミノ酸９に対応するアミノ酸におけるアラニン（Ａ）（ＬＮ０１バリアント１９）；配列番号７４のアミノ酸１０に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）（ＬＮ０１バリアント２０）；配列番号７５のアミノ酸１１に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）（ＬＮ０１バリアント２１）；配列番号７６のアミノ酸１２に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）（ＬＮ０１バリアント２２）；配列番号７７のアミノ酸１４に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）（ＬＮ０１バリアント２３）；配列番号７８のアミノ酸１５に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）（ＬＮ０１バリアント２４）；配列番号７９または８０を含む可変軽鎖領域（それぞれＬＮ０１バリアント３２および３３）；配列番号７９のアミノ酸５に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）（ＬＮ０１バリアント３２）；および／または配列番号８０のアミノ酸６に対応するアミノ酸におけるトリプトファン（Ｗ）（ＬＮ０１バリアント３３）を含むバリアントは、適切なＨＩＶ中和活性を提供し得ないため、これらを回避することが有益であり得る。従って、いくつかの実施形態では、結合剤は、配列番号１〜３２のいずれかを含み得るが、配列番号７０〜８０のいずれか１つまたは複数を有するものではない。他の適切な実施形態は、当業者により、本開示から誘導され得る。
【００１７】
結合剤（例えば、抗体、またはその抗原結合性断片）は、配列番号１〜３２（すなわち、表１に示されるＣＤＲ配列、ＶＨ配列および／またはＶＬ配列）の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、１つまたは複数のアミノ酸配列を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、その同一性パーセントは、少なくとも３個のアミノ酸（例えば、ＬＮ０１  ＣＤＲＬ２のＧＴＹの場合など）、６個のアミノ酸（例えば、ＬＮ０１  ＣＤＲＬ１（配列番号４）の場合など）、７個のアミノ酸（例えば、ＬＮ０１  ＣＤＲＨ２（配列番号２）の場合など）、９個のアミノ酸（例えば、ＬＮ０１  ＣＤＲＬ２（長鎖）（配列番号５）、ＬＮ０１  ＣＤＲＬ３（配列番号６）、ＬＮ０１バリアント８２  ＣＤＲＨ１（配列番号３２）の場合など）、１０個のアミノ酸（例えば、ＬＮ０１  ＣＤＲＨ１（配列番号１）または配列番号２５〜３１のいずれかの場合など）、または２０個のアミノ酸（例えば、ＬＮ０１  ＣＤＲＨ３（配列番号３）の場合など）のアミノ酸配列に関するものである。以下で議論されるように、１００％未満の同一性は、保存的置換の場合のように、別のアミノ酸による１つまたは複数のアミノ酸の天然または合成置換に起因し得る（例えば、表２を参照されたい）。配列番号１〜３２の種々の組合せは、当業者により本明細書に記載される技術を用いて確認され得るため、または他の方法で当業者が利用可能であり得るために有用であり得る。好ましい実施形態では、結合剤は、ＨＩＶ、および／またはＨＩＶに感染しておりかつ／もしくはＨＩＶタンパク質を発現する細胞に結合する。いくつかの特に好ましい実施形態では、結合剤は、本明細書に記載されるようにＨＩＶを中和する。好ましい実施形態では、結合剤は、ＨＩＶ、および／またはＨＩＶに感染しておりかつ／もしくはＨＩＶタンパク質を発現する細胞に結合すると共にＨＩＶを中和する。
【００１８】
可変領域および／またはＣＤＲ配列（例えば、表１）は、当業者に利用可能な１つまたは複数の他の可変領域／ＣＤＲアミノ酸配列と組み合わせて使用されてもよい。このような可変領域／ＣＤＲアミノ酸配列は、代替的および／または同様に、抗体分子の１つまたは複数のタイプの定常領域ポリペプチドに隣接され得る。例えば、表１に示されるＣＤＲアミノ酸配列は、同じまたは異なる種（例えば、ヒト、ヤギ、ラット、ヒツジ、ニワトリ）の任意の抗体分子、および／またはＣＤＲアミノ酸配列が由来するものの抗体サブタイプの定常領域に隣接または関連され得る。例えば、例示的な結合剤は、表１に示されるアミノ酸配列（例えば、ＬＮ０１およびＩｇＧ１  ＬＮ０１）の１つまたは複数を含む別の結合剤とほぼ同一の中和活性を有するもの、および／または同一または類似のエピトープに結合するもの、および／またはほぼ同一の親和性を示すものであってもよく、またはこれらに由来してもよい。結合剤は、１つまたは複数の定常領域および／または可変領域をそれぞれ含む抗体重鎖および／または軽鎖を含み得る。また、本明細書に記載されるアミノ酸配列（例えば、表１に示される）のいずれか、ならびに／またはこれらの任意の断片および／もしくは誘導体は、任意の順序および／または組合せで任意の他の可変領域および／またはＣＤＲと組み合わせられて、新しい結合剤、例えば、ハイブリッドおよび／または融合結合剤を形成してもよく、かつ／または標準的な技術を用いて他の重鎖および／または軽鎖可変領域に挿入されてもよい。
【００１９】
また、本開示は、ＨＩＶ、および／またはＨＩＶを保有しており、かつ／もしくはＨＩＶに感染しており、かつ／もしくはＨＩＶ抗原を発現する細胞を単離し、同定し、かつ／または標的にするためのこのような結合剤の使用も提供する。特定の実施形態では、このような結合剤は、細胞の表面で発現されるタンパク質などのＨＩＶ抗原に対して反応性であり得る。いくつかの実施形態では、結合剤は抗体である。「抗体」という用語は、非精製もしくは部分精製形態（例えば、ハイブリドーマ上清、腹水、ポリクローナル抗血清）または精製形態の抗体全体または断片化抗体を指すことができる。抗体は、例えば、マウスを含む任意の適切な起源または形態を有していてもよく（例えば、マウスハイブリドーマ細胞により産生される）、またはヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体などとして発現されてもよい。例えば、抗体は、例としてヒト（例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、Ｉｇ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）、イヌ（例えば、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ、ＩｇＧＤ）、ニワトリ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ）、ヤギ（例えば、ＩｇＧ）、マウス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、ブタ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、および／またはラット（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）抗体に完全または部分的に由来し得る。種々のタイプの抗体の調製、利用および貯蔵方法は当業者によく知られており、本発明の実施において適切であり得る（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．１，１９９８；Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）；ならびに米国特許第４，８１６，５６７号明細書；米国特許第５，５４５，８０７号明細書；米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，５６９，８２５号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；および米国特許第５，６６１，０１６号明細書を参照されたい）。特定の応用では、抗体は、ハイブリドーマ上清または腹水内に含有され、それ自体で直接または標準的な技術を用いて濃縮した後に利用され得る。他の応用では、抗体は、例えば、塩分別およびイオン交換クロマトグラフィー、またはアガロースビーズなどの固相担体に共有結合されたタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ、および／もしくはタンパク質Ｌリガンドを用いる親和性クロマトグラフィー、あるいはこれらの技術の組合せを使用してさらに精製され得る。抗体は、任意の適切なフォーマット、例えば、凍結調製物（例えば、−２０℃または−７０℃）として、凍結乾燥形態で、または通常の冷蔵条件（例えば、４℃）下で貯蔵され得る。例えば、液体形態で貯蔵される場合、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの適切な緩衝剤が利用されることが好ましい。いくつかの実施形態では、結合剤は、非経口的に許容できる無毒性の希釈剤または溶媒中の懸濁液などの注射用調製物として調製され得る。利用され得る適切な媒体および溶媒には、特に水、リンゲル溶液、ならびに等張性の塩化ナトリウム溶液、ＴＢＳおよび／またはＰＢＳが含まれる。このような調製物は、インビトロまたはインビボでの使用に適しており、当該技術分野において知られているように調製することができ、かつ正確な調製物は特定の応用に依存し得る。
【００２０】
しかしながら、本明細書に記載される結合剤は、決して抗体（すなわち全抗体）に限定されない。例えば、結合剤は、別のもの（例えば、模倣物）のように類似の結合特性を示す任意の化合物であり得る。例えば、例示的な結合剤は、ＨＩＶに結合し、かつ／またはＨＩＶに対する特異性を有する別の結合剤（例えば、ＬＮ０１などのモノクローナル抗体）と競合し得るものであり得る。いくつかの実施形態では、模倣物は、結合アッセイにおいて、比較されている結合剤（例えば、モノクローナル抗体）と実質的に同一の親和性を示すことができる。特定の結合剤の親和性は、細胞表面ＨＩＶ抗原（例えば、ポリペプチド）のＦＡＣＳ染色を含むがこれらに限定されない任意の適切なアッセイによって測定され得る。測定値（例えば、ｎｍ）が互いにほぼ１〜２０、１〜５、５〜１０、１０〜１５、または１５〜２０パーセントのいずれかの範囲内にある場合、１つの結合剤は別の結合剤と「実質的に同一の親和性」を有すると言うことができる。例示的な模倣物は、例えば、ＨＩＶに特異的に結合する有機化合物、またはアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）（Ｎｙｇｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５（１１）：２６６８−７６（２００８））、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２（１）：１７２−８５（２００７））、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８３（５）：１０５８−６８（２００８））、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５（１１）：２６７７−８３（２００８））、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１２）：１５５６−６１（２００５））、ＤＡＲＰｉｎ（Ｓｔｕｍｐｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  １３（１５−１６）：６９５−７０１（２００８））、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（５）：３１９６−３２０４（２００７））、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインペプチド（Ｎｉｘｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．９（２）：２６１−８（２００６））、および／もしくはモノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）（Ｋｏｉｄｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２：９５−１０９（２００７））を含むことができる。他の模倣物は、例えば、抗体の誘導体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’単鎖抗体、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、単一特異性抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ−ヒトキメラ抗体、イヌ−マウスキメラ抗体、イヌＦｃを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化、ＣＤＲ移植抗体（すなわち、表１に示される配列番号１〜３２のいずれかを含む）、サメ抗体、ナノボディ、ラクダ科抗体、ミクロボディ、および／もしくはイントラボディ、またはこれらの誘導体などを含むことができる。その他の結合剤も、当業者により理解されるように本明細書において提供される。
【００２１】
当業者に知られている任意の方法を使用して、ＨＩＶに対する特異性を有する（例えば、ＨＩＶに結合する）結合剤を作製することができる。例えば、モノクローナル抗体を作製および単離するために、マウスなどの動物は、１つまたは複数のＨＩＶタンパク質を投与（例えば、免疫化）され得る。活性化ヒトＴリンパ球上で発現されたＨＩＶに対して血清反応性を示す（例えば、フローサイトメトリーおよび／または顕微鏡法で決定したときに）動物は、次に抗ＨＩＶハイブリドーマ細胞株の生成について選択され得る。これは、複数回繰り返すことができる。また、スクリーニングは、例えば、結合剤がＨＩＶに対して特異的であると同定するための親和性結合および／または機能的特徴付けを含むこともできる。いくつかの実施形態、例えば、本明細書中の実施例では、ＨＩＶに対する抗体の発現についてヒトがスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ抗体、特に中和抗体を発現する人を同定するために、ＨＩＶに感染したヒトの血漿サンプルがスクリーニングされ得る。次に、このような人の中和抗体産生細胞を単離した後、それにより産生された抗体の単離および特徴付けを行うことができる（例えば、本明細書中の実施例のように）。中和抗体は、ＨＩＶによる細胞の感染を中和または阻害する能力を示すものであり得る。一般に、中和アッセイは、通常、ウイルスと特異的抗体との反応によるウイルスの感染力の損失を測定する。通常、感染力の損失は、標的細胞への結合、侵入、および／またはウイルス放出を含むが、これらに限定されないウイルス複製ステップのいずれかとの結合抗体による干渉によって引き起こされる。非中和ウイルスの存在は、当業者に利用可能なシステムのいずれか（例えば、ルシフェラーゼに基づくシステム）を用いて標的細胞の感染を測定することにより、所定の時間後、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２または１４日後に検出される。中和アッセイの非限定的な例は、所与の量のウイルスまたは偽型ウイルス（以下を参照されたい）を組み合わせることを含み得、種々の濃度の試験または対照（通常、正および負の対照が別々にアッセイされる）抗体が適切な条件（例えば、室温で１時間）下で混合され、次に適切な標的細胞培養物（例えば、ＴＺＭ−ｂｌ細胞）に接種される。例えば、結合剤産生細胞（例えば、Ｂ細胞産生抗体）は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）（記憶Ｂ細胞もポリクローナルに刺激する）、成長因子の混合物（例えば、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ−２００６、ＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍｌ）、および抗Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）ヤギ抗体（ＢＣＲを誘発する）の存在下において、ヒトフィーダー細胞における単一細胞ミクロ培養（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｍｉｃｒｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）としてこのような細胞を別々のプレートに播種することにより、ＨＩＶ−１中和抗体の産生についてアッセイされ得る。適切な時間後（例えば、１４日後）、このような培養物の上清は、このような細胞を生産的に感染させる２つ以上の代表的なＨＩＶ−１ウイルスまたは偽型ウイルスを用いて、ルシフェラーゼに基づく一次スクリーニングシステム��おいて試験され得る。偽型ウイルスはＢ細胞培養物の上清と共に適切な時間および温度（例えば、３７％（５％ＣＯ２）で１時間）でインキュベートされた後、宿主細胞（例えば、３０００のＴＺＭ−ｂｌ細胞）が添加され得る。その後、適切な時間（例えば、７２時間）のインキュベーションが行われた後、上清が除去され、Ｓｔｅａｄｙｌｉｔｅ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）が添加され得る（例えば、１５μｌ）。次に、Ｓｙｎｅｒｇｙマイクロプレートルミノメーター（ＢｉｏＴｅｋ）においてルシフェラーゼ活性が決定され得る（例えば、５分後）。負の対照に対して低下したルシフェラーゼ活性は、通常、ウイルスの中和を示す。本開示の結合剤を分析するのに適したこれらのような中和アッセイは、当該技術分野において知られている（例えば、Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，Ｄ．Ｃ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １２，Ｕｎｉｔ  １２．１１（２００５）；Ｅｄｍｏｎｄｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４０８（１）：１−１３（２０１０）；Ｓｅａｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４（３）：１４３９−１４５２（２０１０）；Ｐａｃｅ，ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１１０（３３）：１３５４０−１３５４５（２０１３）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、試験サンプルは、ＨＩＶ偽型ウイルスのパネル（例えば、本明細書中の実施例で実行されるように、ＨＩＶ−１参照株の包括的パネルからの９個のＨＩＶ−１偽型ウイルス（これらの偽型ウイルスは、ＢＪＯＸ（ＣＲＦ００７＿ＢＣ）、ＣＥ１１７６（Ｃ）、ＴＲＯ．１１（Ｂ）、Ｘ１６３２（Ｇ）、ＣＨ１１９（ＣＲＦ０７＿ＢＣ）、ＣＮＥ５５（ＣＲＦ０１＿ＡＥ）、２５７１０（Ｃ）、２４６Ｆ３（ＡＣ）、ＣＥ０２１７（Ｃ）である）；ＤｅＣａｍｐ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｆｏｒ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８８，２４８９−２５０７（２０１４））を中和することができる抗体の存在についてスクリーニングされ得る。また、より大きい偽型ウイルスのパネルの中和も試験することができ、例えば、ｄｅ  Ｃａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．は、１２個の偽型ウイルス（ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ参照株としても知られている）：３９８Ｆ１、２５７１０、ＣＮＥ８、ＴＲＯ１１、Ｘ２２７８、ＢＪＯＸ２０００、Ｘ１６３２、ＣＥ１１７６、２４６Ｆ３、ＣＨ１１９、ＣＥ０２１７、およびＣＮＥ５５のグループを記載している。いくつかの実施形態では、１０個のＨＩＶ単離物のパネルを試験することができ、９個の偽型ウイルスのパネルの６、７、８、９個のメンバー；または１２個の偽型ウイルスのパネルの６、７、８、９、１０、１１もしくは１２個のメンバーを中和するものとしてＢＮＡが同定され得る。また、このような偽型ウイルスのより大きいパネル（例えば、本明細書中の実施例のように、１１８個の偽型ウイルスのパネル）のスクリーニングも実行され得る。実施例で使用される、試験サンプルが中和抗体について試験され得る１１８個の偽型ウイルスの例示的なパネルは、例えば、図４に示されるもの（クレードＡ、クレードＢ、クレードＣ、クレードＤ、クレードＧ、循環組換え形態ＣＲＦ１０＿ＣＤ、ＣＲＦ０１＿ＡＥ、ＣＲＦ０２＿ＡＧおよびＣＲＦ０７＿ＢＣ、ならびに非循環組換え体ＡＣおよびＡＣＤ株を含む）を含むことができる。いくつかの実施形態では、中和は、ウイルス感染の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のいずれかを中和することができるモノクローナル抗体の濃度（例えば、μｇ／ｍｌ）の尺度として決定され得る（「ＩＣ５０」値）。いくつかの実施形態では、結合剤は、例えば、約１０−５、１０−４、１０−３、１０−２、１０−１、１００、１０１、１０２、または１０３μｇ／ｍｌのいずれかの濃度でウイルス感染の５０％を中和することができる場合、中和性であると考えることができる（図３に示されるようなＩＣ５０値）。いくつかの実施形態では、本明細書中の実施例のように、このＩＣ５０値は２５μｇ／ｍｌよりも低く、さらにより好ましくは、約１５、１０、５、２、１、０．５、０．２５、０．１、０．０５、または０．０１μｇ／ｍｌのいずれかよりも低いことが好ましい。好ましい実施形態では、本明細書に記載されるＬＮ０１抗体のように、ＩＣ５０値は０．０１１未満であり得る（例えば、図７）。いくつかの実施形態では、中和抗体がウイルス感染を中和する能力は、中和パーセント（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％（例えば、図３のように））として表すこともできる。また、当業者により決定され得るように、他の中和の尺度も適切であり得る。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される結合剤は、ＨＩＶに感染した人から得られる生体サンプル（例えば、血漿）中で同定された広域中和抗体（ＢＮＡ）であり得る。上記のようにかつ本明細書中の実施例に示されるように、このようなＢＮＡは、マルチクレードＨＩＶ単離物を中和する能力について、慢性的にＨＩＶに感染した患者（好ましくは、抗レトロウイルス療法を受けていない）の血漿サンプルを試験することによって同定され得る（例えば、最初に偽型ウイルスの９個または１２個のメンバーからなるパネルを用い、次により大きいパネル（例えば、１１８個のメンバー）を用いる））。いくつかの実施形態では、サンプルは、血漿１ｍｌ当たり５０未満のＨＩＶ  ＲＮＡコピーのウイルス血症を有する「エリートコントローラー」であることが分かっている患者から得ることができる。これらのようなスクリーニング手順の結果、患者の同定が得られ、これらの患者は、その後、ＢＮＡを産生するＢ細胞の単離および特徴付けのためのリンパ節ドナーとしての機能を果たし得る。このようなスクリーニングアッセイの実行において、中和活性は、通常、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）偽型ウイルスなどの負の対照と比較される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、中和結合剤（例えば、抗体）を発現する患者の胚中心および記憶ＩｇＧ  Ｂ細胞が単離され、さらに研究され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＡおよびＩｇＭ陰性細胞）、ＣＤ１９、およびＣＤ３８発現（胚中心Ｂ細胞はＣＤ３８陽性）に従って別々に選別され（例えば、図２を参照されたい）、ＨＩＶ−１中和抗体の産生について調べられる。例えば、高純度のＩｇＧ記憶Ｂ細胞およびＩｇＧ胚細胞は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）（記憶Ｂ細胞もポリクローナルに刺激する）および成長因子などの混合物（例えば、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ−２００６、ＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍｌ）、および抗ＢＣＲヤギ抗体（Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を誘発）で構成される）の存在下において、ヒトフィーダー細胞における単一細胞ミクロ培養として別々のプレートに播種され得る。このような培養物（例えば、１４日目の培養物から）の上清は、次に一次スクリーニング（例えば、本明細書中の実施例に示されるように、クレードＣおよびＣＲＦ０７の代表である２つの株、ＣＥ１１７６およびＢＪＯＸ２０００を並行して使用して、３８４ウェルベースのＨＩＶ−１偽型ウイルス中和アッセイを用いる）において試験され得る。中和アッセイは、任意の適切な宿主細胞（例えば、ＴＺＭ−ｂｌ細胞（Ｓｅａｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４（３）：１４３９−５２（２０１０）；ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ  ８１２９））を用いて実行され得る。著しい出力の相対光単位（ＲＬＵ）（例えば、５０〜１００×１０４ＲＬＵ）（すなわち細胞の増殖性感染を示す）をもたらすＨＩＶ−１偽型ウイルスは、次にＢ細胞培養物の上清と共に適切な時間および温度（例えば、３７％（５％ＣＯ２）で１時間）でインキュベートされた後、宿主細胞（例えば、３０００のＴＺＭ−ｂｌ細胞））が添加され得る。その後、通常、適切な時間（例えば、７２時間）のインキュベーションが行われた後、上清が除去され、Ｓｔｅａｄｙｌｉｔｅ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）が添加され得る（例えば、１５μｌ）。次に、Ｓｙｎｅｒｇｙマイクロプレートルミノメーター（ＢｉｏＴｅｋ）においてルシフェラーゼ活性が検出され得る（例えば、５分後）。ルシフェラーゼ活性の低下は、より少ない量のウイルスが細胞により放出されることおよびウイルスの中和を示す。例えば、特定の偽型ウイルスの基礎ＲＬＵが５０〜１００×１０４ＲＬＵであれば、中和抗体は、その偽型ウイルスのＲＬＵを、２５〜５０×１０４ＲＬＵまで低下させ（すなわち５０％の低下）、またはそれよりも低い値まで低下させることが決定され得る。このような系を用いて、株を交差中和させることができる上清が同定され、さらに収集され、他の偽型ウイルスを中和するその能力について試験され得る。
【００２４】
このような中和抗体含有培養物から得られる抗体は、次に抗体可変領域および相補性決定領域（ＣＤＲ）領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列を決定することによってさらに特徴付けされ得る。これらの技術を用いて、「ＬＮ０１」と呼ばれるＨＩＶ中和結合剤を、表１に示されるＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬ配列（配列番号１〜７および／またはＧＴＹ）を有するＩｇＧ３型完全ヒトモノクローナル抗体として同定した。ＬＮ０１はＩＧＨＶ４−３９＊０７およびＩＧＫＶ１−３９＊０１生殖系列遺伝子に由来し、生殖系列と比較して重鎖（２８％）およびカッパ軽鎖（２７％）の両方の可変遺伝子において体細胞性に高度に突然変異されていることが決定された。また、ＬＮ０１は、２０個のアミノ酸で構成される長い重鎖相補性決定３領域（「ＣＤＲＨ３」）ループを有することも見出された。いくつかの実施形態では、結合剤の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）遺伝子は、次に同一または異なるアイソタイプのＩｇＧ発現ベクターにクローン化され得る。実施例に示されるように、例えば、ＬＮ０１  ＣＤＲをコードする核酸（表３）をＩｇＧ１骨格にクローン化し、適切な宿主細胞（例えば、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞）をトランスフェクトすることにより、組換えのＩｇＧ１ベースの抗体（ＩｇＧ１  ＬＮ０１）を作製した。抗体全長ＩｇＧ１ベースの抗体は、次に標準的な技術を用いて精製され得る（例えば、全長ＩｇＧ１ベースの抗体は、組換えプロテインＡカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製され得る）。組換えで産生されたＩｇＧ１抗体は、次に適切な宿主細胞（例えば、ＴＺＭ−ｂｌ細胞）において、本明細書に記載されるもののいずれかなどの偽型ウイルスのパネルのいずれか（例えば、実施例で使用される９個のＨＩＶ−１参照偽型ウイルスの包括的パネル）に対して試験され得る。好ましい実施形態では、結合剤は、負の対照ウイルス（例えば、ＭＬＶ偽型ウイルス）を中和することなく、偽型ウイルスパネルメンバー（例えば、９、１２または１１８個のメンバーを含む）の大部分（すなわち、少なくとも約５０％以上）を中和する能力を示す。結合剤は、中和と考えられるＩＣ５０値（以下を参照されたい）でこのようなウイルスの大部分を中和する能力（例えば、約５０％よりも多くの中和、例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％のいずれかの中和）を示すことが好ましい。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、約１００μｇ／ｍｌ以下において、ＨＩＶ−１偽型ウイルスＢＪＯＸ（ＣＲＦ０７＿ＢＣ）、ＣＥ１１７６、ＴＲＯ．１１（Ｂ）、Ｘ１６３２（Ｇ）、ＣＨ１１９（ＣＲＦ０７＿ＢＣ）、ＣＮＥ５５（ＣＲＦ０１＿ＡＥ）、２５７１０（Ｃ）、ＣＤ０２１７（Ｃ）の中和を示すことができるが、対照ウイルスＳＶＡ−ＭＬＶの中和を示さない（図３）。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ−１偽型ウイルスの中和は、抗体濃度が１０２〜１００μｇ／ｍｌ、または１００〜１０１μｇ／ｍｌである場合に観察され得る（図３）。いくつかのこのような実施形態では、結合剤による中和パーセントは、少なくとも約５０％である（図３）。いくつかの実施形態では、１つのＨＩＶ−１単離物の感染は、この単離物��少なくとも１つの単離物の感染が２５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で中和される場合、２５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で結合剤（例えば、抗体）により中和されると考えられる。いくつかの実施形態では、図４に記載される１１８個のＨＩＶ−１偽型ウイルスの大部分が、２５μｇ／ｍｌ未満、例えば、約１０μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０９μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０７μｇ／ｍｌ、０．０６μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ、０．０３μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、または０．０１μｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和されると考えられる場合、結合剤は中和性であると考えることができる。好ましい実施形態では、結合剤は、ＩＤ６５３５．３、ＱＨ０６９２．４２、ＳＣ４２２６６１．８、ＰＶＯ．４、ＴＲＯ．１１、ＰＥＪＯ４５４１．６７、ＷＩＴＯ４１６０．３３、１００６＿１１＿Ｃ３＿１６０１、１０５４＿０７＿ＴＣ４＿１４９９、１０５６＿ＴＡ１１＿１８２６、１０１２＿１１＿ＴＣ２１＿３２５７、６２４４＿１３＿Ｂ５＿４５７６、ＳＣ０５＿８Ｃ１１＿２３４４、Ｄｕ１５６．１２、Ｄｕ１７２．１７、Ｄｕ４２２．１、ＺＭ１９７Ｍ．ＰＢ７、ＺＭ２１４Ｍ．ＰＬ１５、ＺＭ２３３Ｍ．ＰＢ６、ＺＭ２４９Ｍ．ＰＬ１、ＺＭ１０９Ｆ．ＰＢ４、ＺＭ１３５Ｍ．ＰＬ１０ａ、ＨＩＶ−００１３０９５−２．１１、ＨＩＶ−１６０５５−２．３、ＨＩＶ−１６８４５−２．２２、Ｃｅ１０８６＿Ｂ２、Ｃｅ１１７６＿Ａ３、Ｃｅ０６８２＿Ｅ４、Ｃｅ１１７２＿Ｈ１、ＺＭ２４７ｖ１（Ｒｅｖ−）、３０１６．ｖ５．ｃ４５、Ａ０７４１２Ｍ１．ｖｒｃ１２、２３１９６６．ｃ０２、ＣＮＥ２０、ＣＮＥ２１、ＣＮＥ１７、ＣＮＥ３０、ＣＮＥ５３、ＣＮＥ５８、９００４ＳＳ＿Ａ３＿４、９２８−２８、２６３−８、Ｔ２５５−３４、２１１−９、２３５−４７、ＣＮＥ８、Ｃ１０８０．ｃ０３、Ｒ２１８４．ｃ０４、Ｒ１１６６．ｃ０１、Ｃ２１０１．ｃ０１、Ｃ３３４７．ｃ１１、ＢＪＯＸ０１５０００．１１．５、ＢＪＯＸ０１００００．０６．２、ＢＪＯＸ０２５０００．０１．１、ＢＪＯＸ０２８０００．１０．３、Ｘ１１９３＿ｃ１、Ｘ２１３１＿Ｃ１＿Ｂ５、Ｐ１９８１＿Ｃ５＿３、６９５２．ｖ１．ｃ２０、および０８１５．ｖ３．ｃ３のＨＩＶ−１偽型ウイルス株を約１μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で中和することができる（図４）。いくつかの好ましい実施形態では、結合剤は、ＩＤ  ＱＨ０６９２．４２、ＳＣ４２２６６１．８、ＰＶＯ．４、ＴＲＯ．１１、ＰＥＪＯ４５４１．６７、ＷＩＴＯ４１６０．３３、１００６＿１１＿Ｃ３＿１６０１、１０５４＿０７＿ＴＣ４＿１４９９、１０５６＿ＴＡ１１＿１８２６、６２４４＿１３＿Ｂ５＿４５７６、ＳＣ０５＿８Ｃ１１＿２３４４、Ｄｕ１５６．１２、Ｄｕ１７２．１７、ＺＭ１９７Ｍ．ＰＢ７、ＨＩＶ−００１３０９５−２．１１、ＨＩＶ−１６０５５−２．３、ＨＩＶ−１６８４５−２．２２、Ｃｅ１��８６＿Ｂ２、Ｃｅ１１７２＿Ｈ１、ＺＭ２４７ｖ１（Ｒｅｖ−）、３０１６．ｖ５．ｃ４５、Ａ０７４１２Ｍ１．ｖｒｃ１２、ＣＮＥ２０、ＣＮＥ２１、ＣＮＥ５３、ＣＮＥ５８、９００４ＳＳ＿Ａ３＿４、９２８−２８、２６３−８、Ｔ２５５−３４、ＣＮＥ８、Ｃ１０８０．ｃ０３、ＢＪＯＸ０１５０００．１１．５、ＢＪＯＸ０１００００．０６．２、ＢＪＯＸ０２５０００．０１．１、ＢＪＯＸ０２８０００．１０．３、Ｘ２１３１＿Ｃ１＿Ｂ５、Ｐ１９８１＿Ｃ５＿３、６９５２．ｖ１．ｃ２０、および０８１５．ｖ３．ｃ３のＨＩＶ−１偽型ウイルス株を約０．５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で中和することができる（図４）。いくつかの好ましい実施形態では、結合剤は、ＩＤ１０５４＿０７＿ＴＣ４＿１４９９、１０５６＿ＴＡ１１＿１８２６、６２４４＿１３＿Ｂ５＿４５７６、Ｄｕ１７２．１７、ＨＩＶ−００１３０９５−２．１１、ＨＩＶ−１６８４５−２．２２、Ｃｅ１１７２＿Ｈ１、ＣＮＥ２０、ＣＮＥ２１、９２８−２８、ＣＮＥ８、Ｐ１９８１＿Ｃ５＿３のＨＩＶ−１偽型ウイルス株を約０．１μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で中和することができる（図４）。結合剤は、クレード依存性を示さないことがさらに好ましい。例えば、いくつかの実施形態では、結合剤は、ＨＩＶ−１クレードＢ、Ｂ（Ｔ／Ｆ）、Ｃ、Ｃ（Ｔ／Ｆ）、Ｄ、Ｄ（Ｔ／Ｆ）、ＢＣ、Ａ、Ａ（Ｔ／Ｆ）、ＣＲＦ０２＿ＡＧ、ＣＲＦ０１＿Ａｅ、ＣＲＦ０１＿ＡＥ（Ｔ／Ｆ）、Ｇ、ＣＤ、ＡＣおよびＡＣＤの偽型ウイルスを中和する能力を示し得る（図４）。いくつかの好ましい実施形態では、結合剤は、クレードＢ、Ｂ（Ｔ／Ｆ）、Ｃ、Ｃ（Ｔ／Ｆ）、Ｄ、ＢＣ、Ａ、Ａ（Ｔ／Ｆ）、ＣＲＦ０２＿ＡＧ、ＣＲＦ０１＿Ａｅ、ＣＲＦ０１＿ＡＥ（Ｔ／Ｆ）、Ｇ、ＣＤ、およびＡＣＤのそれぞれの中の少なくとも１つの偽型ウイルスを約１μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で中和し得る（図４）。いくつかの好ましい実施形態では、結合剤は、クレードＢ、Ｂ（Ｔ／Ｆ）、Ｃ、Ｃ（Ｔ／Ｆ）、Ｄ、ＢＣ、Ａ（Ｔ／Ｆ）、ＣＲＦ０２＿ＡＧ、ＣＲＦ０１＿Ａｅ、ＣＲＦ０１＿ＡＥ（Ｔ／Ｆ）、Ｇ、ＣＤ、およびＡＣＤのそれぞれの中の少なくとも１つの偽型ウイルスを約０．５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で中和し得る（図４）。いくつかの好ましい実施形態では、結合剤は、クレードＢ（Ｔ／Ｆ）、Ｃ、Ｃ（Ｔ／Ｆ）、ＢＣ、Ａ（Ｔ／Ｆ）、ＣＲＦ０２＿ＡＧ、ＣＲＦ０１＿ＡＥ、ＣＲＦ０１＿ＡＥ（Ｔ／Ｆ）、Ｇ、およびＣＤのそれぞれの中の少なくとも１つの偽型ウイルスを約０．１μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で中和し得る（図４）。いくつかの実施形態では、結合剤は、これらの特性のいずれか１つもしくは複数、および配列番号１〜３２の１つもしくは複数、好ましくは配列番号１〜７のそれぞれおよび／もしくは配列番号８〜９、ならびに／またはこれらの断片および／もしくは誘導体を含む。これらは、図４に示されるようにＩｇＧ１  ＬＮ０１などのＬＮ０１タイプの結合剤の特徴である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、結合剤は、１つまたは複数のタイプのＦｃ受容体を発現する細胞または発現しない細胞（例えば、実施例の場合のように、親ＴＺＭ−ｂｌ細胞、およびＦｃ−ガンマ受容体Ｉ（ＣＤ６４）を発現するＴＺＭ−ｂｌ細胞；例えば、Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １：ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｇｐ４１．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３，７３９７−７４１０（２００９）；ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１１７９８を参照されたい）を用いて、ＨＩＶ参照偽型ウイルス（例えば、上記の９個のＨＩＶ−１参照偽型ウイルスの包括的パネル）に対する中和能について試験され得る。Ｆｃ受容体を発現する細胞における中和活性の増強は、抗体にウイルス阻害のための動力学的利点を提供し得る。この動力学的利点は、抗体に特有である可能性があり、そのエピトープは、アクセスすることが困難であるか、または融合の初期段階中にＥｎｖタンパク質の中間構造においてごく短時間暴露されると考えられる。また、Ｆｃ−ガンマ受容体は、ＨＩＶ−１中和を潜在的に促進する可能性もあり、それは食作用であり、それにより抗体の中和能が増大される。今までのところ、ＴＺＭ−ｂｌ細胞株を構築したＨｅＬａ細胞は、ノンプロフェッショナルな食細胞の特性を示すことが知られている。従って、その表面にＦｃ−ガンマ受容体を導入することにより、ＴＺＭ−ｂｌ細胞がプロフェッショナルな食細胞に変換された可能性がある。ＨＩＶ−１中和抗体に対する任意のＦｃ−ガンマ受容体媒介性抗ウイルス薬の効果は、侵入阻害によるか食作用によるかにかかわらず、ＨＩＶの処置およびワクチンの投与計画において有益であり得る。Ｆｃ−ガンマ受容体は、ＣＤ４＋リンパ球上でめったに発現されないが、いくつかの他のＨＩＶ−１感受性細胞型は、複数のＦｃ−ガンマ受容体を発現し、性感染と、長寿命のウイルスリザーバーの早期確立とに関与する。特に、マクロファージは、粘膜暴露後にウイルスが遭遇する最初の感染感受性細胞の１つであり、慢性感染において、長寿命のウイルスリザーバーとしての機能を果たすと考えられる。マクロファージならびに単球および樹状細胞の特定のサブセットは、複数のＦｃ−ガンマ受容体を発現することが知られている。また、Ｆｃ−ガンマ受容体が、抗原取込み、抗原提示、細胞活性化およびＢ細胞寛容を促進することにより、適応免疫および末梢寛容の調節に関与することに言及することも重要である。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される結合剤は、Ｆｃ受容体の発現を誘発および／または増強する薬剤と併せて使用することができ、本明細書に記載される結合剤による処置と共に、または併せて１つまたは複数のＦｃ受容体をコードする核酸の導入することが含まれる。
【００２６】
本明細書に記載される結合剤の特異性は、当業者に利用可能な多数の技術のいずれかを用いて決定され得る。例えば、本明細書中の実施例に示されるように、特定のエピトープに関する結合剤（例えば、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体）の特異性は、中和能について試験するためにキメラ偽型ウイルスのパネル（例えば、親ＨＩＶ−２／７３１２Ａ内にＨＩＶ−１  ＭＰＥＲの種々のセグメントを含有するＨＩＶ−２／ＨＩＶ−１キメラ）を用いて確認され得る。例えば、本明細書中の実施例は、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体が親ＨＩＶ−２  ７３１２Ａ株を中和しないことを実証する。しかしながら、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は、ＨＩＶ−２  ＭＰＥＲ（ＬＡＳＷＶＫＹＩＱ（配列番号６５））の６個の残基がＨＩＶ−１  ＭＰＥＲ領域の残基で置換された（ＩＴＫＷＬＷＹＩＫ（配列番号６６））キメラウイルス７３１２Ａ．Ｃ４を強力に中和することが見出された。また、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は、同じ領域内の３個の残基のみが置換された（ＩＴＳＷＩＫＹＩＱ（配列番号６７））キメラウイルス７３１２Ａ．Ｃ６を中和しないことも見出された（例えば、図７を参照されたい）。キメラウイルス７３１２Ａ．Ｃ４と同じ６個の変化が、Ｎ末端領域における付加的な７個の突然変異と組み合わせられたキメラウイルス７３１２Ａ．Ｃ１Ｃを用いて同様の知見が得られた。これらの結果は、ｇｐ４１  ＭＰＥＲのＣ末端領域のアミノ酸残基Ｌ６７９、Ｗ６８０およびＫ６８３が、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体の結合に関与することを示す。従って、いくつかの実施形態では、結合剤は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｋ０３４５５（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＡＡＢ５０２６２）のＨＩＶ−１エンベロープアミノ酸配列、例えば、配列番号６８（Ｌ６７９、Ｗ６８０およびＫ６８３に下線）：
2019509046.tif 000006
【００２７】
または当業者に理解され得るようなこれらの均等物において見出されるように、アミノ酸残基Ｌ６７９、Ｗ６８０およびＫ６８３を含むｇｐ４１を発現するＨＩＶを結合および／または中和する能力を示す。例示的なｇｐ４１ポリペプチドは、以下に示される：
2019509046.tif 000007
【００２８】
別の例示的なｇｐ４１ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号１１０３２９９Ｂを有する（Ｍｅｕｓｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１３（６００２），４５０−４５８（１９８５））。アミノ酸残基Ｌ６７９、Ｗ６８０およびＫ６８３の例示的な均等物は、配列番号１４（およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号１１０３２９９Ｂ）の下線を引いたアミノ酸残基Ｌ１６８、Ｗ１６９およびＫ１７２である。いくつかの実施形態では、結合剤は、アミノ酸配列ＩＴＫＷＬＷＹＩＫ（配列番号６６）を発現するＨＩＶを結合および／または中和する能力を示す。いくつかの実施形態では、結合剤は、アミノ酸配列ＩＴＫＷＬＷＹＩＫ（配列番号６６）を発現するＨＩＶを結合および／または中和するが、ＬＡＳＷＶＫＹＩＱ（配列番号６５）および／またはＩＴＫＷＩＫＹＩＱ（配列番号６７）を発現するＨＩＶを結合および／または中和しない能力を示す。いくつかの実施形態では、結合剤が結合する（すなわち、特異性を有する）エピトープは、ＨＩＶｅｎｖ（例えば、配列番号６８）のアミノ酸残基Ｌ６７９、Ｗ６８０およびＫ６８３、またはこれらの均等物を含む。ｇｐ４１に関して、好ましい実施形態では、結合剤が結合する（すなわち、特異性を有する）エピトープは、配列番号６９のアミノ酸残基Ｌ１６８、Ｗ１６９およびＫ１７２、またはこれらの均等物を含む。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、上記の中和特徴（すなわち、１０２〜１００μｇ／ｍｌ、または１００〜１０１μｇ／ｍｌの濃度で少なくとも約５０％までＨＩＶ−１偽型ウイルスＢＪＯＸ（ＣＲＦ０７＿ＢＣ）、ＣＥ１１７６、ＴＲＯ．１１（Ｂ）、Ｘ１６３２（Ｇ）、ＣＨ１１９（ＣＲＦ０７＿ＢＣ）、ＣＮＥ５５（ＣＲＦ０１＿ＡＥ）、２５７１０（Ｃ）、ＣＤ０２１７（Ｃ）を中和するが、対照ウイルスＳＶＡ−ＭＬＶを中和せず（図３）、および２５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で、図４に記載される１１８個のＨＩＶ−１偽型ウイルスの大部分を中和する）と共に、これらの結合特異性を含み得る。
【００２９】
ペプチドマイクロアレイも、本明細書に記載される結合剤の結合特異性を決定するために代替的および／または同様に使用され得る。１つまたは複数のペプチドマイクロアレイは、重複ペプチドがＨＩＶポリペプチドアミノ酸配列全体を包含するように設計され得る。例えば、本明細書中の実施例に示されるように、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、グループＭ、ＣＲＦ０１＿ＡＥおよびＣＲＦ０２＿ＡＧのコンセンサスＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｇｐ１６０配列をカバーする１４２３の重複（１２個のアミノ酸による）１５−ｍｅｒペプチドによって形成されるペプチドマイクロアレイを利用して、結合剤ＩｇＧ１  ＬＮ０１の特異性を試験した。本明細書中の実施例では、ペプチドを３Ｄ−エポキシガラススライド上に印刷し、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナーを用いて分析した（Ｔｏｍａｒａｓ，Ｇ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５，１１５０２−１１５１９（２０１１））が、当業者に利用可能な任意の適切なシステムを利用することができる。結合剤は、対照結合剤と共に試験され得る（例えば、本明細書中の実施例では、ｇｐ４１の免疫優性領域に対する特異性を有する７Ｂ２と呼ばれる対照抗体と並行して、ＩｇＧ０１  ＬＮ０１を２０μｇ／ｍｌで試験した）。マイクロアレイ内のペプチドへの結合剤の結合は、任意の適切なプロセスにより、例えば、本明細書中の実施例ではＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧとのインキュベーションにより検出され得る。蛍光強度は、任意の適切なシステムにより、例えば、本明細書中の実施例のようにＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナー／ＧｅｎｅＰｉｘソフトウェアにより測定され得る（例えば、図８を参照されたい）。本明細書中の実施例に示されるように、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は、そのライブラリー内のペプチドのいずれとも明白に反応しなかったが、対称抗体（７Ｂ２）は、ｇｐ４１免疫優性領域にわたる１９０〜１９５のペプチドと強力に反応し、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体はＨＩＶ−１  Ｅｎｖの直鎖エピトープを認識しないことが示された。また、本明細書で企図される結合剤のいずれかにおいて同様の試験が実施され得る。
【００３０】
また、結合剤の特異性は、ＨＩＶタンパク質を示す可溶性トリマー（例えば、本明細書中の実施例で使用されるように、サブタイプＡ伝達（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ）／創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）株、ＢＧ５０５に基づく可溶性の切断型ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０トリマー）への結合についても試験され得る。好ましいトリマー（例えば、本明細書中の実施例で使用されるもの）は、高度に安定し、同種であり、かつネガティブ染色電子顕微鏡法（ＥＭ）により可視化したときに天然のウイルススパイクによく類似しているものである（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｃｌｅａｖｅｄ，ｓｏｌｕｂｌｅ  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｔｒｉｍｅｒ，ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０，ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｏｒ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｎｏｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．９，ｅ１００３６１８（２０１３））。通常、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ上の複数の中和エピトープに対する広域中和抗体は、このようなトリマー（例えば、４エピトープ抗体（ＣＨ０１、ＰＧ９、ＰＧ１６およびＰＧＴ１４５）を含む、ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０トリマー）と非常によく反応するであろう。反対に、ＣＤ４結合部位、ＣＤ４誘発性エピトープまたはｇｐ４１外部ドメインに対する非中和抗体（ＮＡｂ）は、そのエピトープがＥｎｖのより簡単な形態（例えば、ｇｐ１２０モノマーまたは解離ｇｐ４１サブユニット）上に存在する場合でもトリマーと反応しないであろう（および実施例において反応しなかった）。また、実施例は、トリマーの可溶性を改善し、凝集体の形成を低減するためにＭＰＥＲを欠失させた、本明細書に記載される結合剤のいずれかを試験する際に使用することができる試験も含む。また、結合剤は、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）の存在下または非存在下において、このようなトリマーへの結合について試験され得る。本明細書中の実施例には、ｓＣＤ４の存在下または非存在下において、ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０トリマーへの結合についての、ＩｇＧ１  ＬＮ０１、ＰＧＴ１４５（Ｖ１−Ｖ２グリカン特異的）、ＰＧＴ１５１（ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の界面の部位に結合）および１７ｂ（ＣＤ４結合誘発部位に結合）抗体の試験（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される）が記載される。そこに示されるように、ＰＧＴ１４５およびＰＧＴ１５１抗体は、ｓＣＤ４の存在下または非存在下において、ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０トリマーに強く反応し；１７ｂは、ｓＣＤ４の存在下においてのみＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０トリマーに反応し；およびＩｇＧ１  ＬＮ０１は、ｓＣＤ４の存在下でも非存在下でもＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０トリマーと反応しなかった（例えば、図９を参照されたい）。また、本明細書で企図される結合剤のいずれかにおいて同様の試験が実施され得る。
【００３１】
ＥＬＩＳＡなどの他のアッセイシステムも、本明細書で企図される結合剤を試験するために使用され得る。例えば、実施例に示されるように、ＭＰＥＲ特異的１０Ｅ８抗体（Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｏａｄ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｂｙ  ａ  ｇｐ４１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９１，４０６−４１２（２０１２））と並行して、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体を、ＨＩＶ−１抗原のパネル（ＣｏｎｓＢ、コンセンサスクレードＢ  ｇｐ１４０、４２６ｃ、クレードＣ  ｇｐ１４０、４２６ｃ−ＮＬＧＳ、４２６ｃ  ｇｐ１４０（Ｎ結合グリコシル化部位が除去された）、４２６ｃコア、ｇｐ１４０（Ｖループが除去された）、ＵＧ３７  ｇｐ１４０、クレードＡおよびｇｐ４１、ｇｐ４１の組換え細胞外ドメイン、ＨｘＢ２株からのアミノ酸５４１〜６８２、Ｖｙｂｉｏｎ）に対してＥＬＩＳＡにより試験した。ＥＬＩＳＡにより、試験抗原は、いずれもＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体により認識されなかった（例えば、図１０を参照されたい）。反対に、１０Ｅ８抗体は、ｇｐ４１の組換え細胞外ドメインに反応した。従って、実施例で示された結果は、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体が、１０Ｅ８と異なってｇｐ４１のＭＰＥＲのエピトープを認識し得ることを示す。また、本明細書中の実施例は、ＥＬＩＳＡを用いて、ｇｐ４１ｉｎｔと呼ばれる融合中間体ｇｐ４１および非コートプレート（ＰＢＳ）に対するＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体の試験も実証する（Ｌａｉ，Ｒ．Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｇｐ４１  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ＨＩＶ−１．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８９，２９９１２−２９９２６（２０１４））。ｇｐ４１ｉｎｔ抗原は、ＭＰＥＲ抗体４Ｅ１０、２Ｆ５および１０Ｅ８により、高親和性で認識される。１０Ｅ８はＥＬＩＳＡによりｇｐ４１ｉｎｔに反応したが、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は反応しなかった（例えば、図１１を参照されたい）。これらの結果は、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体が、恐らくＭＰＥＲ領域において、試験される抗原のいずれにおいても容易に提示されない保存エピトープを認識することを示す。本明細書で企図される結合剤のいずれかにおいて同様の試験が実施され得る。
【００３２】
「結合親和性」および／またはＫＤという用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指す。ＫＤは、結合速度（「オンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ｋａ））に対する解離の速度（「オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ｋｄ）」）の比率である。従って、ＫＤはｋｄ／ｋａに等しく、モル濃度（Ｍ）で表される。従って、ＫＤが小さいほど、結合の親和性は強力になる。例えば、１ｍＭのＫＤは、１ｎＭのＫＤと比べて弱い結合を示す。抗体のＫＤ値は、当該技術分野において十分に確立された方法を用いて、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される結合剤は、それぞれの各ＫＤ値に関して別の結合剤と比較され得る。これらの特性は、結合剤を互いに比較するために、中和能および／またはエピトープ特異性などの他の特徴と組み合わせることができる。従って、本明細書に記載されるものと同様のＫＤを有し、恐らく本明細書に記載される中和能およびエピトープ特異性（例えば、ＬＮ０１に示されるような）を有する結合剤も本開示の一部として企図される。
【００３３】
また、表１のアミノ酸配列（および／またはこれらの任意の１つまたは複数の断片および／または誘導体）のいずれも、当業者によって必要とされる通りに任意の他のアミノ酸によって置換され得る。例えば、当業者は、以下の表２に示されるように特定のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することにより、保存的置換を行うことができる。選択される特異的なアミノ酸置換は、選択される部位の場所に依存し得る。置換されているアミノ酸の周囲のアミノ酸配列間に当業者が相当量の類似性を確認し得る場合、アミノ酸置換は「対応する」と言うことができる。例えば、比較されているポリペプチドにおいて、置換されているアミノ酸の周囲の２個、３個、４個またはそれを超えるＮ末端およびＣ末端アミノ酸が同一または同様である（例えば、表２に記載されるように）場合、特定のアミノ酸配列は別のアミノ酸配列に対応し得る。保存的アミノ酸置換は、その位置のアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性、または親水性に対する影響がわずかであるかまたは全くなく、特に、例えば、ＨＩＶ中和能の低下および／または異なるエピトープ特異性をもたらさないような、非天然残基による天然アミノ酸残基の置換を含み得る。
【００３４】
【表２】
2019509046.tif 000008
【００３５】
特定の実施形態では、本明細書に記載される１つまたは複数の結合剤をコードする核酸分子は、以下でより詳細に議論されるように、１つまたは複数の発現ベクターに挿入され得る。このような実施形態では、結合剤は、アミノ酸配列に対応するヌクレオチドによってコードされ得る。種々のアミノ酸（ＡＡ）をコードするヌクレオチドの特定の組合せ（コドン）は、当業者により使用される種々の参考文献（例えば、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）に記載されるように、当該技術分野においてよく知られている。前記結合剤のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、例えば、表３を参照して確認され得る。核酸バリアントは、結合剤をコードするヌクレオチドの任意の組合せを使用し得る。
【００３６】
【表３】
2019509046.tif 000009
【００３７】
当業者は、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列および表４に示される情報から、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を容易に導き出せることを理解する。例えば、アミノ酸配列ＧＤＳＶＳＮＤＮＹＹ（配列番号１）および表４に示される情報から、アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列ＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＡＡＴＧＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＴ（配列番号３３）によってコードされ得ることが推定され得る。当業者は、配列番号２〜３２および３４〜３６をコードするヌクレオチド配列が同じようにして推定され得ること、およびこのようなヌクレオチド配列が本明細書で企図されることを理解するであろう。表４は、表１に示されるアミノ酸配列（配列番号１〜３２）をコードする例示的な核酸配列を提供する。
【００３８】
【表４−１】
2019509046.tif 000010
【００３９】
【表４−２】
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【００４０】
【表４−３】
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【００４１】
【表４−４】
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【００４２】
【表４−５】
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【００４３】
【表４−６】
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【００４４】
【表４−７】
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【００４５】
従って、本開示の結合剤をコードする核酸は、配列番号１〜３２のいずれかまたはＧＴＹ（ＬＮ０１  ＣＤＲＬ２）および／またはこれらの誘導体をコードする、１つまたは複数の配列番号３３〜６４またはＧＧＧＡＣＴＴＡＴ、またはこれらの誘導体（例えば、表４に記載されるものを含むがこれらに限定されない、例えば表３に記載されるように標準的な技術を用いて決定されるヌクレオチド配列によりコードされる、表２に記載されるように保存的に置換された配列番号１〜３２のいずれか）を含み得る。このような核酸配列を含む発現ベクターも本開示により企図される。結合剤が抗体である場合、その可変領域をコードするヌクレオチド配列は、発現ベクターにクローン化されたそれを発現するファージおよび／またはハイブリドーマ細胞から単離されてもよい。このような調製物を作るための方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００４６】
１つまたは複数のＨＩＶ結合剤をコードする核酸分子は、ウイルスおよび／または非ウイルスベクター内に含有されてもよい。一実施形態では、１つまたは複数のＨＩＶ結合剤をコードする核酸を患者に送達するためにＤＮＡベクターが利用される。その際、例えば、自己複製ウイルスレプリコンの使用（Ｃａｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｖａｃｃｉｎｅ，１７：３１２４−２１３５；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：７２３−７３２；Ｌｅｉｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：５１−５５）、コドン最適化（Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１：４９７−５００；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，上記；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：４９４７−４９５１）、インビボエレクトロポレーション（Ｗｉｄｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４６３５−３６４０）、共刺激性分子、サイトカインおよび／またはケモカインをコードする核酸の取込み（Ｘｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２：１２９−１３５；Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：１０８９−１１０３；Ｉｗａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：４５９１−３２０１；Ｓｈｅｅｒｌｉｎｃｋ，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９：２６４７−２６５６）、ＣｐＧなどの刺激性モチーフの取込み（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，上記；Ｌｅｉｔｎｅｒ，上記）、エンドサイトーシスまたはユビキチンプロセシング経路のターゲティングのための配列（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２４６−２２５２；Ｖｅｌｄｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５３６６−５３７３）、プライムブーストレジメン（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，上記；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｎａｔｕｒｅ，４０８：６０５−６０９；Ｈａｎｋｅ，ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ，１６：４３９−４４５；Ａｍａｒａ，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４）、プロテアソーム感受性切断部位、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）などの粘膜投与ベクターの使用（Ｄａｒｊｉ，ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｃｅｌｌ，９１：７６５−７７５；Ｗｏｏ，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９：２９４５−２９５４）を含む、種々の戦略を利用してこのようなメカニズムの効率を改善することができる。当該技術分野において他の方法が知られており、そのいくつかは以下に記載される。宿主に核酸を導入するために良好に利用されている種々のウイルスベクターには、特にレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスが含まれる。ベクターは、当業者に広く利用可能な標準組換え技術を用いて構築され得る。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（���ｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編、１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｃａ）などの一般的な分子生物学の参考文献において見出すことができる。「非ウイルス」プラスミドベクターも特定の実施形態において適切であり得る。好ましいプラスミドベクターは、細菌、昆虫、および／または哺乳類宿主細胞と適合性である。このようなベクターには、例えば、ＰＣＲ−ｉｉ、ＰＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳｉｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐｅｔ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦｐ−ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴｌ（Ｂｌｕｅｂａｃｉｉ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−ａｌｐｈａ（国際公開第９０／１４３６３号）およびｐＦＡＳＴＢＡＣｄｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、ならびにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数のＣＯＬｅ１ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ＴＡＱ増幅ＰＣＲ産物をクローン化するために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。細菌ベクターも使用され得る。これらのベクターには、例えば、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）が含まれる（例えば、国際公開第８８／６６２６号；国際公開第９０／０５９４号；国際公開第９１／１３１５７号；国際公開第９２／１７９６号；および国際公開第９２／２１３７６号を参照されたい）。多数の他の非ウイルスプラスミド発現ベクターおよびシステムが当該技術分野で知られており、使用することができる。例えば、ＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接注入、ＣａＰＯ４沈殿、遺伝子銃技術、エレクトロポレーション、およびコロイド分散系を含む他の送達技術も十分であり得る。コロイド分散系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系、例えば、水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む。好ましいコロイド系はリポソームであり、これは、インビトロおよびインビボでの送達媒体として有用な人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンは、水性内部に封入��れ、生物学的に活性な形態で細胞へ送達されることが可能である（Ｆｒａｌｅｙ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７）。通常、リポソームの組成は、通常、ステロイド、特にコレステロールと組み合わせた、リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質が使用されてもよい。リポソームの物理特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価のカチオンの存在に依存する。リポソームの製造において有用な脂質の例としては、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドが挙げられる。特に有用なものはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここで、脂質部分は、１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を含有し、かつ飽和されている。実例となるリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。
【００４７】
ベクターを含む培養細胞も提供される。培養細胞は、細胞が免疫原性ポリペプチドを発現する、ベクターまたは細胞の子孫がトランスフェクトされた培養細胞であり得る。適切な細胞株は当業者に知られており、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）により市販されている。トランスフェクト細胞は、免疫原性ポリペプチドの製造方法で使用することができる。方法は、免疫原性ポリペプチドの発現を可能にする条件下において、任意選択的に発現配列の制御下でベクターを含む細胞を培養するステップを含む。免疫原性ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製方法を用いて、細胞または培地から単離することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される結合剤は、ＨＩＶポリペプチドを発現し、かつ／またはＨＩＶ（および／もしくは複数の特異性を有する結合剤の場合には別の抗原）を保有している細胞集団を標的にし、かつ機能を阻害し、かつ／または除去するために活性剤に結合され得る。例えば、複製可能なＨＩＶを含有するＣＤ４＋Ｔ細胞集団は、結合剤／薬物コンジュゲート（例えば、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ））を用いて標的にされ、かつ除去され得る。単一特異性および／または二特異性候補結合剤は、１つまたは複数のタイプの薬物（例えば、ＤＮＡを損傷する薬物、マイクロチューブルを標的にする薬物）と結合され得る。また、本明細書に記載される結合剤および／またはその誘導体は、インビトロおよび／またはインビボで使用するための機能性薬剤に接合および／または結合され得る。例えば、結合剤は、細胞毒性薬または毒素、および／またはこれらの活性断片、例えば、特にジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどの機能性部分に接合および／または結合され得る。また、適切な機能性部分は放射化学物質も含み得る。抗体などの結合剤は、当該技術分野で標準的な技術を用いて、１つまたは複数の機能性薬剤に接合および／または結合され得る。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＮ０１（例えば、ＩＴＫＷＬＷＹＩＫ（配列番号７２）であるが、ＬＡＳＷＶＫＹＩＱ（配列番号７１）および／またはＩＴＫＷＩＫＹＩＱ（配列番号７３）ではない）により結合されるエピトープと、少なくとも１つの他の二次抗原（例えば、細胞表面タンパク質）とが単一の結合剤により結合され得るように、多特異性を有する結合剤を提供する。いくつかの実施形態では、二次抗原は、感染性病原体に感染した細胞により発現されるものであり得る。例えば、例示的な二次抗原は、ｇｐ４１以外のＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原であり得る。本明細書に記載されるアッセイを用いて決定され得るように、このような結合剤は二次抗原に結合することができ、かつ／または感染性病原体を中和する役割を果たし得る。結合剤、例えば本明細書に記載される１つまたは複数と、当業者に利用可能な別のものとの組合せも本明細書で企図される。例えば、いくつかの実施形態では、組合せは、１つまたは複数の結合剤のみを使用し、他のものを使用しない場合に得られる結果（例えば、中和アッセイ）との統計的に有意な違いを提供するように同定され得る。いくつかの実施形態では、組合せは、例えば、ＨＩＶの相乗的な中和を示す。いくつかの実施形態では、組合せは、ＬＮ０１（例えば、ＩｇＧ１  ＬＮ０１など）の特徴を有し、かつ／あるいは配列番号１〜３２のいずれか１つもしくは複数（および／もしくは表１に記載されるもの）、ならびに／またはこれらの誘導体を含む第１の結合剤と、米国特許第５，０８７，５５７号明細書；米国特許第５，２９８，４１９号明細書；米国特許第５，４５９，０６０号明細書；米国特許第５，６９３，７５２号明細書；米国特許第５，７３１，１８９号明細書；米国特許第５，７５３，５０３号明細書；米国特許第５，７５６，６７４号明細書；米国特許第５，７７７，０７４号明細書；米国特許第５，８０４，４４０号明細書；米国特許第５，８３１，０３４号明細書；米国特許第６，００８，０４４号明細書；米国特許第７，７７４，８８７Ｂ２号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１１８９８５Ａ１号明細書、同第２００７／０２９２３９０Ａ１号明細書、または同第２０１４／０２０５６１２Ａ１号明細書；国際公開第２００２／０３２４５２Ａ１号（例えば、ｇｐ４１エピトープＥＬＤＫＷＡ、ＥＬＥＫＷＡ、ＥＬＮＫＷＡ、ＥＬＤＥＷＡを結合）；欧州特許第０３３５１３４Ｂ１号明細書ＵＳ１７６０７７（例えば、そこに記載されるマウスｍＡｂのヒト化バージョン）；独国特許出願公開第３９３２４６１Ａ１号明細書（エピトープＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｒｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒに対するｍＡｂ）；Ｅｖａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０（３）：９４１−３（１９８８）；Ｇｏｒｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１６２４−２８（１９８９）；Ｔｅｅｕｗｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６，３８１−３９２；Ｅａｒｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（４）：２６７��−２６８４（１９９７）；Ｊｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１２）：１０２１３−１７（１９９８）；Ｚｗｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２２）：１０８９２−１０９０５（２００１）；Ｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９８（２０）：１１１８７−１１１９２（２００１）；Ｌｏｕｉｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２２）：２０２７８−２０２８５（２００３）；および／またはＰｉｅｔｚｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４（１０）：５０３２−４２（２０１０）（これらは全て、その全体が本明細書に援用される）のいずれか１つまたは複数に記載される抗体のいずれか１つまたは複数とを含み得る。例えば、本明細書に記載される結合剤のいずれかは、特に２Ｆ５、４Ｅ１０および／またはＺ１３ｅ１、および／またはこれらの誘導体として一般的に知られている１つまたは複数の抗体と組み合わせることができる（すなわち、単一の組成物としておよび／またはこれらと共に使用される）。このような組成物の結合剤は、異なる実体、例えば２つ以上の異なるモノクローナル抗体もしくはその誘導体であってもよく、または二機能性抗体（複数の結合特異性を含む単一の抗体もしくはその誘導体）などの同一の実体上に見出されてもよい。本明細書に記載されるような組合せは、免疫細胞機能をもたらし得る１つまたは複数の他の薬剤、例えばＣＴＬＡ−４に対する抗体などと組み合わせることもできる。当業者は、多数のこのような組合せが本明細書に記載されるような使用に適し得ることを認識するであろう。
【００４９】
上記のように、本明細書に記載されるＨＩＶ結合剤は、ＨＩＶによる感染の症状を処置、および／または予防、および／または改善するために使用され得る。当該技術分野で周知であるように、ＨＩＶ単離物は、現在、別個の遺伝的サブタイプに分類されている。ＨＩＶ−１は、少なくとも１０のサブタイプ（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ、Ｈ、ＪおよびＫ）を含むことが知られている（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，ＮＥＪＭ，３５９（１８）：１９６５−１９６６（２００８））。ＨＩＶ−２は、少なくとも５つのサブタイプ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）を含むことが知られている。サブタイプＢは、世界中で男性同性愛者および静注薬物使用者におけるＨＩＶの流行に関連している。大部分のＨＩＶ−１免疫原、実験室適応単離物、試薬およびマッピングされたエピトープは、サブタイプＢに属する。新しいＨＩＶ感染の発生率が高い地域であるサハラ以南のアフリカ、インドおよび中国では、ＨＩＶ−１サブタイプＢは感染のごく少数を占めるのみであり、サブタイプＨＩＶ−１  Ｃが最も一般的な感染性サブタイプであると思われる。これらのタイプの単離物のいずれも、本明細書に記載される結合剤を用いて対処され得る。また、１つまたは複数の結合剤は、例えば、プロテアーゼ阻害薬、ＨＩＶ侵入阻害薬、逆転写酵素阻害薬、および／または抗レトロウイルスヌクレオシド類似体など、ＨＩＶを予防、処置および／または改善するために使用される１つまたは複数の薬剤と共にまたは併せて投与されてもよい。適切な化合物は、例えば、Ａｇｅｎｅｒａｓｅ（アンプレナビル）、Ｃｏｍｂｉｖｉｒ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒ／Ｅｐｉｖｉｒ）、Ｃｒｉｘｉｖａｎ（インジナビル）、Ｅｍｔｒｉｖａ（エムトリシタビン）、Ｅｐｉｖｉｒ（３ｔｃ／ラミブジン）、Ｅｐｚｉｃｏｍ、Ｆｏｒｔｏｖａｓｅ／Ｉｎｖｉｒａｓｅ（サキナビル）、Ｆｕｚｅｏｎ（エンフビルチド）、Ｈｉｖｉｄ（ｄｄｃ／ザルシタビン）、Ｋａｌｅｔｒａ（ロピナビル）、Ｌｅｘｉｖａ（ホスアンプレナビル）、Ｎｏｒｖｉｒ（リトナビル）、Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ（デラビルジン）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒ／ＡＺＴ（ジドブジン）、Ｒｅｙａｔａｘ（アタザナビル、ＢＭＳ−２３２６３２）、Ｓｕｓｔｉｖａ（エファビレンツ）、Ｔｒｉｚｉｖｉｒ（アバカビル／ジドブジン／ラミブジン）、Ｔｒｕｖａｄａ（エムトリシタビン／テノホビルＤＦ）、Ｖｉｄｅｘ（ｄｄＩ／ジダノシン）、Ｖｉｄｅｘ  ＥＣ（ｄｄＩ、ジダノシン）、Ｖｉｒａｃｅｐｔ（ネビラピン）、Ｖｉｒｅａｄ（フマル酸テノホビルジソプロキシル）、Ｚｅｒｉｔ（ｄ４Ｔ／スタブジン）、およびＺｉａｇｅｎ（アバカビル）を含み、これらが利用され得る。他の適切な薬剤は当業者に知られており、本明細書に記載されるような使用に適し得る。このような薬剤は、本明細書に記載される結合剤の投与および／または方法の使用前、その間、その後のいずれかで使用され得る。
【００５０】
当業者は、本明細書に記載される結合剤（例えば、抗体）を使用して、それに結合するタンパク質を含有する生体サンプルを同定するための多数の適切な技術を有する。例えば、抗体は、例えば、免疫沈降または他の捕獲型アッセイを用いて、ＨＩＶ、またはＨＩＶを含有し、かつ／またはＨＩＶ抗原を発現する細胞を単離するために利用され得る。この周知の技術は、抗体を固相担体またはクロマトグラフィー材料（例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ｌでコートされたビーズ）に取り付けることにより実施される。結合した抗体は、次に、ＨＩＶ抗原（例えば、ＨＩＶ感染細胞）を含有するか、または含有すると考えられる溶液中に導入される。ＨＩＶ抗原は、次に抗体に結合することができ、非結合材料は、ＨＩＶ抗原が抗体に結合したままである条件下で洗い流される。結合タンパク質は、次に抗体から分離され、必要に応じて分析され得る。抗体を用いてタンパク質を単離するための同様の方法は、当該技術分野で周知である。また、結合剤（例えば、抗体）は、生体サンプル内のＨＩＶまたはＨＩＶ抗原を検出するためにも利用され得る。例えば、抗体は、例えば、フローサイトメトリー分析、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（例えば、ウエスタンブロット）、その場検出、免疫細胞化学、および／または免疫組織化学などのアッセイで使用され得る。このようなアッセイの実行方法は、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、結合剤は、１つまたは複数の検出可能な標識に接合および／または結合され得る。例えば、適切な検出可能な標識は、例えば、フルオレセイン（例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン；５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）；５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）；５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）；６−ＪＯＥ；６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）；ＦＩＴＣ；６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）；６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）；６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’、７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒｓ（例えば、３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０）；ＢＯＤＩＰＹフルオロフォア（例えば、４９２／５１５、４９３／５０３、５００／５１０、５０５／５１５、５３０／５５０、５４２／５６３、５５８／５６８、５６４／５７０、５７６／５８９、５８１／５９１、６３０／６５０−Ｘ、６５０／６６５−Ｘ、６６５／６７６、ＦＬ、ＦＬ  ＡＴＰ、ＦＩ−セラミド、Ｒ６Ｇ  ＳＥ、ＴＭＲ、ＴＭＲ−Ｘコンジュゲート、ＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、ＴＲ、ＴＲ  ＡＴＰ、ＴＲ−Ｘ  ＳＥ））、ローダミン（例えば、１１０、１２３、Ｂ、Ｂ２００、ＢＢ、ＢＧ、Ｂエクストラ、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５ＧＬＤ、６−カルボキシローダミン６Ｇ、リサミン、リサミンローダミンＢ、ファリシジン（Ｐｈａｌｌｉｃｉｄｉｎｅ）、ファロイジン、レッド、Ｒｈｏｄ−２、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、スルホローダミンＢ  ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＧエクストラ、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ＷＴ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、および／またはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘを含み得る。また、当該技術分野で知られている他の検出可能な標識も使用に適し得る。抗体などの結合剤は、当該技術分野において標準的な技術を用いて、１つまたは複数の検出可能な標識に接合および／または結合され得る。
【００５１】
また、本明細書に記載される結合剤は、患者の病状の存在を決定するため、予後を予測するため、または化学療法的もしくは他の処置計画の有効性を決定するためにも使用され得る。本明細書に記載されるように、または他に当該技術分野において知られているように実施される発現プロファイルアッセイは、例えば、細胞内のＨＩＶの発現の相対レベルを決定するために使用され得る。発現のレベルは、次に、特定の疾患が患者に存在するかどうか、患者の予後、または特定の処置計画が有効であるかどうかを決定するために、基準（例えば、対照）レベルと相関され得る。例えば、患者が特定の抗感染計画で処置されている場合、患者の組織（例えば、血漿）中のＨＩＶの発現レベルの上昇または低下は、その計画がその宿主におけるＨＩＶの負荷を悪化または改善していることを示すことができる。発現の上昇または低下は、その計画が所望の効果を有するかまたは有さず、従って別の治療方法が選択され得ることを示すことができる。
【００５２】
また、例えば、新しい薬物候補を試験するための薬物スクリーニングアッセイにおける試薬として、本明細書に記載される結合剤を使用することも可能である。試薬は、細胞株、または患者の細胞もしくは組織における免疫原性標的の発現に対する薬物候補の効果を確認するために使用され得る。発現プロファイリング技術は、有用な化合物の迅速な同定を可能にし、薬物候補による処置の有効性をモニターするために、高処理のスクリーニング技術と組み合わせることができる（例えば、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，８４−８（１９９８）を参照されたい）。薬物候補は、天然に存在するかまたは合成的に誘導されるかにかかわらず、化学化合物、核酸、タンパク質、抗体、またはこれらの誘導体であり得る。このようにして同定された薬物候補は、特に患者に投与するための医薬組成物として、またはさらなるスクリーニングアッセイでの使用のために利用され得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、結合剤は、精製された形態である。「精製」結合剤（例えば、抗体）は、（例えば、モノクローナル抗体の場合、ハイブリドーマ上清または腹水調製物の一部として）最初に見出されたタンパク質および／または他の成分の少なくとも約５０％から分離されたものであり得る。精製結合剤（例えば、抗体）は、最初に見出されたタンパク質および／または他の成分の少なくとも約５０％、６０％、７５％、９０％、または９５％から分離されたものであり得る。
【００５４】
また、本明細書に記載されるポリペプチドおよび核酸は、宿主への投与前に１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体と組み合わせることもできる。薬学的に許容可能な担体は、生物学的または他の点で好ましい材料であり、例えば、材料は、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用をすることなく対象に投与され得る。担体は、当然ながら、当業者に周知であるように、活性成分の分解を最小限にし、対象における任意の有害な副作用を最小限にするように選択されるであろう。適切な医薬担体およびその製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。通常、製剤を等張性にするために、適切な量の薬学的に許容可能な塩が製剤において使用される。薬学的に許容可能な担体の例としては、滅菌水、生理食塩水、リンゲル溶液のような緩衝溶液、およびデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、一般に、約５〜約８または約７〜約７．５である。他の担体には、ポリペプチドまたはその断片を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの持続放出調製物が含まれる。マトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、リポソームまたは微小粒子の形態であり得る。例えば、投与の経路および投与される組成物の濃度に応じて、特定の担体がより好ましいことがあり得ることは当業者に明らかであろう。担体は、ポリペプチドおよび／またはその断片をヒトまたは他の対象に投与するのに適したものである。また、医薬組成物は、免疫原性ポリペプチドに加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、補助剤、免疫賦活薬も含み得る。また、医薬組成物は、抗菌薬、抗炎症薬および麻酔薬などの１つまたは複数の活性成分も含み得る。医薬組成物は、従来の薬学的に許容可能な担体、補助剤、および媒体を含有する投与単位製剤において、経口的に、非経口的に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）、吸入噴霧により、経直腸的に、結節内に（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）、または局所的に投与され得る。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」または「生理学的に許容可能な担体」という用語は、核酸、ポリペプチド、またはペプチドの医薬組成物としての送達を達成または増強するのに適した１つまたは複数の製剤材料を指す。「医薬組成物」は、治療的に有効な量の核酸またはポリペプチドを含む組成物である。「有効量」および「治療的に有効な量」という用語は、それぞれ所望の治療効果（例えば、ＨＩＶの除去）を観察するために使用される結合剤、核酸などの量を指す。
【００５５】
少なくとも１回または複数回の有効用量の、本明細書に記載される１つまたは複数の結合剤（および／またはその誘導体）を哺乳類に投与するステップを含む、哺乳類宿主の１つまたは複数の疾患状態（例えば、ＨＩＶまたは癌）を処置するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、結合剤は、配列番号１〜３２および／または表１に示される配列の１つまたは複数を含むモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体である。１つまたは複数の結合剤は、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、または４０ｍｇ／ｋｇのいずれか）の投与量で投与され得る。特定の実施形態では、１つまたは複数の結合剤は、約１０ｍｇ／ｋｇで１回または複数回、哺乳類に（例えば、皮内に、静脈内に、経口的に、経直腸的に）投与され得る。複数回の投与が行われる場合、投与は、各投与においてほぼ同一または異なる量の結合剤を含み得る。また、投与は、同一または異なる間隔で互いに時間的に隔てられていてもよい。例えば、投与は、約６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、または９６時間、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１．５年、２年、３年、４年、５年のいずれか、またはこれらの期間のいずれかの前、後、および／または間の任意の期間だけ隔てられ得る。いくつかの実施形態では、結合剤は、他の薬剤（例えば、抗感染症薬および／または化学療法剤）と共に投与され得る。このような他の薬剤は、結合剤とほぼ同時にまたは異なる時点および／もしくは頻度で投与され得る。当業者により容易に決定され得るように、このような方法の他の実施形態も適切であり得る。
【００５６】
当業者が本明細書に記載される抗体などの結合剤を使用することを促進するために、結合剤は、キット形式で提供されてもよい。このような結合剤の１つまたは複数と、任意選択的に、それを用いてＨＩＶを発現する細胞を検出するために必要な他の成分とを含むキットも提供される。キットの結合剤は、凍結、凍結乾燥を含む任意の適切な形態で、またはＴＢＳもしくはＰＢＳなどの薬学的に許容可能な緩衝剤中で提供され得る。また、キットは、インビトロまたはインビボでの結合剤の利用に必要とされる他の試薬、例えば、緩衝剤（例えば、ＴＢＳ、ＰＢＳ）、遮断薬（脱脂粉乳、正常な血清、Ｔｗｅｅｎ−２０洗浄剤、ＢＳＡ、またはカゼインを含む溶液）、および／または検出試薬（例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧビオチン、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート、アロフィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ペルオキシダーゼ、検出可能な標識、ならびに他の標識および／または染色キット（例えば、ＡＢＣ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ，Ｐｉｅｒｃｅ））も含み得る。また、キットは、例えば、フローサイトメトリー分析、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（例えば、ウエスタンブロット）、その場検出、免疫細胞化学、免疫組織化学などの上記の一般的に利用されるアッセイにおいて抗体を使用するための他の試薬および／または説明書も含み得る。一実施形態では、キットは、精製形態の結合剤を提供する。別の実施形態では、結合剤は、単独でまたはアビジン結合検出試薬（例えば、抗体）と共にビオチン化形態で提供され得る。別の実施形態では、キットは、ＨＩＶを直接検出するために使用され得る１つまたは複数の検出可能な標識を含む結合剤を含む。これらの系のいずれかを使用するために必要とされる緩衝剤などは、当該技術分野で周知であり、かつ／もしくは最終使用者により調製されてもよく、またはキットの成分として提供されてもよい。また、キットは、正および負の対照タンパク質および／または組織サンプルを含有する固相担体を含むこともできる。例えば、スポッティングまたはウエスタンブロットタイプのアッセイを実施するためのキットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用するための対照細胞または組織ライセート、または実験サンプルのための付加的な空間と共に前固定された対照サンプルを含有するナイロンもしくは他の膜を含むこともできる。スライド上の細胞内のＨＩＶの可視化のためのキットは、実験サンプルのための付加的な空間と共に対照細胞または組織サンプルを含有するフォーマット済のスライドを含み得る。当業者により理解され得るように、キットの他の実施形態も本明細書で企図される。
【００５７】
従って、本開示は、ＨＩＶに対する特異性を有するＬＮ０１抗体などの結合剤を提供する。いくつかの実施形態では、結合剤は、配列番号１〜３２からなる群から選択されかつ／または表１に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、結合剤は、配列番号１〜３２の１つまたは複数の組合せを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、結合剤は抗体である。いくつかの実施形態では、結合剤は、配列番号１〜３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む抗体などのポリペプチドである。いくつかの実施形態では、結合剤は、配列番号４〜７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む抗体などのポリペプチドである。いくつかの実施形態では、結合剤は、配列番号７（ＬＮ０１）、配列番号９（ＬＮ０１バリアント７）、配列番号１１（ＬＮ０１バリアント８）、配列番号１３（ＬＮ０１バリアント３８）、配列番号１５（ＬＮ０１バリアント４１）、配列番号１７（ＬＮ０１バリアント４２）、配列番号１９（ＬＮ０１バリアント４８）、配列番号２１（ＬＮ０１バリアント４９）、または配列番号２３（ＬＮ０１バリアント８２）のＶＨアミノ酸配列を含む抗体などのポリペプチドである。いくつかの実施形態では、結合剤は、配列番号８（ＬＮ０１）、配列番号１０（ＬＮ０１バリアント７）、配列番号１２（ＬＮ０１バリアント８）、配列番号１４（ＬＮ０１バリアント３８）、配列番号１６（ＬＮ０１バリアント４１）、配列番号１８（ＬＮ０１バリアント４２）、配列番号２０（ＬＮ０１バリアント４８）、配列番号２２（ＬＮ０１バリアント４９）、または配列番号２８（ＬＮ０１バリアント２４）のＶＬアミノ酸配列を含む抗体などのポリペプチドである。いくつかの実施形態では、結合剤は、表１に示されるＣＤＲ（配列番号１〜６またはＧＮＴ（ＬＮ０１  ＣＤＲＬ１））および／または可変領域（配列番号７および８；配列番号９および１０；配列番号１１および１２；配列番号１３および１４；配列番号１５および１６；配列番号１７および１８；配列番号１９および２０；配列番号２１および２２；もしくは配列番号２３および２４；またはこれらの保存的置換バリアント）の組合せを含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、結合剤は、配列番号６８のアミノ酸残基Ｌ６７９、Ｗ６８０およびＫ６８３、ならびに／または配列番号６９のアミノ酸残基Ｌ１６８、Ｗ１６９およびＫ１７２を含むエピトープに対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、結合剤は、アミノ酸配列ＩＴＫＷＬＷＹＩＫ（配列番号６６）を発現するＨＩＶに結合しかつ／または中和する能力を示す。いくつかの実施形態では、結合剤は、アミノ酸配列ＩＴＫＷＬＷＹＩＫ（配列番号６６）を発現するが、ＬＡＳＷＶＫＹＩＱ（配列番号６５）および／またはＩＴＫＷＩＫＹＩＱ（配列番号６７）を発現しないＨＩＶに結合しかつ／または中和する能力を示す。いくつかの実施形態では、本開示の結合剤は、上記の中和特徴（すなわち、１０２〜１００μｇ／ｍｌまたは１００〜１０１μｇ／ｍｌの濃度で少なくとも約５０％までＨＩＶ−１偽型ウイルスＢＪＯＸ（ＣＲＦ０７＿ＢＣ）、ＣＥ１１７６、ＴＲＯ．１１（Ｂ）、Ｘ１６３２（Ｇ）、ＣＨ１１９（ＣＲＦ０７＿ＢＣ）、ＣＮＥ５５（ＣＲＦ０１＿ＡＥ）、２５７１０（Ｃ）、ＣＤ０２１７（Ｃ）を中和するが、対照ウイルスＳＶＡ−ＭＬＶを中和しないこと、および／または２５未満のＩＣ５０で図４に記載される１１８個のＨＩＶ−１偽型ウイルスの大部分を中和できること）と共に、これらの結合特異性のいずれか１つまたは複数を含み得る。いくつかの実施形態では、このような結合剤をコードする核酸はまた、表４のように提供される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、結合剤は、ヒト抗体、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ２ａ、ヒトＩｇＧ２ｂ、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＡ１、ヒトＩｇＡ２、ヒトＩｇＤ、ヒトＩｇＥ、イヌ抗体、イヌＩｇＧＡ、イヌＩｇＧＢ、イヌＩｇＧＣ、イヌＩｇＧＤ、ニワトリ抗体、ニワトリＩｇＡ、ニワトリＩｇＤ、ニワトリＩｇＥ、ニワトリＩｇＧ、ニワトリＩｇＭ、ニワトリＩｇＹ、ヤギ抗体、ヤギＩｇＧ、マウス抗体、マウスＩｇＧ、ブタ抗体、および／もしくはラット抗体、ならびに／またはこれらの誘導体に（例えば、配列または誘導によって）由来するかまたは関連する。いくつかの実施形態では、誘導体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’単鎖抗体、Ｆｖ、単鎖、単一特異性抗体、二特異性抗体、三量体抗体、多特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ−ヒトキメラ抗体、イヌ−マウスキメラ抗体、イヌＦｃを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化抗体、ＣＤＲ移植抗体、サメ抗体、ナノボディ、および／またはラクダ科抗体からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、結合剤は、少なくとも第１および第２の特異性を含み、第１の特異性は、ＨＩＶ  ｇｐ４１に対するものであり、および第２の特異性は、異なる抗原（例えば、ＨＩＶ（例えば、ｅｎｖ）などの感染性病原体の抗原、および／または腫瘍抗原）に対するものである。いくつかの実施形態では、結合剤および／またはその誘導体は、固定可能に取り付けられた検出可能な標識を含み得る。いくつかの実施形態では、いずれか１つの結合剤および／またはその誘導体は、固定可能に取り付けられたエフェクター部分（例えば、細胞毒性薬、毒素、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、および放射化学物質）を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の結合剤をコードするポリヌクレオチドも提供される（例えば、発現ベクターとして）。このようなポリヌクレオチドのポリペプチド産物を含みかつ／または発現する宿主細胞も提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの結合剤もしくは誘導体；少なくとも１つの単離ポリヌクレオチド；少なくとも１つの発現ベクター；および／または少なくとも１つの宿主細胞；あるいはこれらの組合せと、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物も提供される。
【００６０】
また、本開示は、細胞上のＨＩＶを検出するための方法も提供し、本方法は、試験生体サンプルを、本明細書に記載される結合剤または誘導体と接触させるステップと、生体サンプルまたはその成分に結合された結合剤を検出するステップとを含む。このような方法は、インビボ方法またはインビトロ方法であり得る。いくつかの実施形態では、本方法は、試験生体サンプルまたはその成分への結合量を、対照生体サンプルまたはその成分への結合量と比較するステップを含むことができ、ここで、対照生体サンプルまたはその成分と比べて増大した試験生体サンプルまたはその成分への結合は、試験生体サンプル（例えば、哺乳類血液）中におけるＨＩＶポリペプチドを発現する細胞の存在を示す。いくつかの実施形態では、細胞内または細胞上のＨＩＶの発現を検出するためのキットであり、本キットは、結合剤またはその誘導体および使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、結合剤および／またはその誘導体は、凍結乾燥形態である。いくつかの実施形態では、本開示は、哺乳類の感染症、癌および／または自己免疫を処置、予防および／または改善するための方法を提供し、本方法は、少なくとも１回の有効用量の、結合剤またはその誘導体を含む医薬組成物を哺乳類へ投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、感染症はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。いくつかの実施形態では、動物に複数回の投与が行われる。いくつかの実施形態では、結合剤および／またはその誘導体は、約１〜５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与され得る。
【００６１】
「約」、「およそ」などの用語は、数値のリストまたは範囲に先行される場合、そのリストまたは範囲内の個々の値がその用語によってそれぞれ直接先行されるかのように、そのリストまたは範囲内の個々の値を独立して指す。これらの用語は、それが示す値が、正確にその値であるか、その値に近いか、またはその値と同様であることを意味する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、対象または宿主は、個体であることを意味する。対象は、ネコおよびイヌ、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、およびヤギ）などの飼育動物、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）、ならびに鳥類を含むことができる。１つの態様では、対象は、霊長類またはヒトなどの哺乳類である。
【００６３】
任意選択なまたは任意選択的にとは、その後に記載される事象または状況が起こり得るかまたは起こり得ないこと、およびその記載が、その事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。例えば、「任意選択的に組成物が組合せを含み得る」という語句は、その組成物が異なる分子の組合せを含み得るかまたは組合せを含み得ないことを意味し、従って、その記載は、その組合せおよびその組合せ（すなわちその組合せの個々のメンバー）の非存在の両方を含む。
【００６４】
範囲は、本明細書では、およその１つの特定の値から、および／またはおよその別の特定の値までとして表され得る。このような範囲が表される場合、別の態様は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞の約またはおよその使用によって値が近似値として表される場合、特定の値が別の態様を形成することが理解されるであろう。範囲の各端点は、他の端点と関連しても、かつ他の端点から独立しても有意であることがさらに理解されるであろう。範囲（例えば、９０〜１００％）は、各値が個々に記載されたかのように、その範囲自体およびその範囲内の個々の値のそれぞれを含むことを意味する。
【００６５】
「組み合わせられる」、または「組み合わせて」、または「併せて」という用語は、特定の疾患を処置、予防および／または改善するための計画（例えば、別々に、物理的に、および／または時間内に投与される）において、一緒に投与される薬剤の物理的な組合せまたは２つ以上の薬剤の使用を指すことができる。
【００６６】
処置、予防、および／もしくは改善という用語またはその派生語が、所与の状態のための所与の処置（例えば、ＨＩＶによる癌感染の予防）に関連して本明細書で使用される場合、それは、処置された患者が臨床的に観察可能なレベルのその状態を全く発症しないか、またはその患者が処置を受けなかった場合よりも緩慢におよび／または低い程度で発症することを伝えることを意味する。これらの用語は、患者がその状態のいかなる態様も全く経験しない状況のみに限定されない。例えば、処置は、その状態の所与の兆候を生じることが予想され得る刺激への患者の暴露中に与えられ、そうでない場合に予想されるよりも少ないおよび／または軽いその状態の症状を患者が経験するという結果をもたらす場合、その状態を予防したと言われるであろう。例えば、処置は、患者が感染の明らかな症状を軽度にのみ示すという結果をもたらすことにより感染を「予防する」ことができ、これは、感染微生物による任意の細胞への侵入が全く存在してはならないことを意味するものではない。
【００６７】
同様に、低減する、低減している、および低減は、特定の処置による所与の状態の予防、処置および／または改善に関連して本明細書で使用される場合、対象が、処置（例えば、１つまたは複数のＨＩＶ結合剤の投与）を受けない場合に感染を発症する対照または基準レベルと比べてより緩慢にまたはより低い程度で感染を発症することを指す。感染のリスクの低減は、患者が感染の明らかな症状を軽度にのみ示すか、または感染の症状の遅延を示すという結果をもたらすことができ、これは、感染微生物による任意の細胞への侵入が全く存在してはならないことを意味するものではない。
【００６８】
本開示において引用される全ての参考文献は、参照によってその全体が本明細書に援用される。特定の実施形態は、以下の実施例においてさらに記載される。これらの実施形態は、単に例として提供されるのみであり、特許請求の範囲を限定することは決して意図されない。
【実施例】
【００６９】
実施例１
リンパ節ドナー
広域中和抗体の単離のためのＨＩＶ−１リンパ節ドナーの選択
マルチクレードＨＩＶ−１単離物を広域に中和することができる広域中和抗体を単離するために、抗レトロウイルス療法を受けていない慢性感染患者からの７０の血漿サンプルを、ＨＩＶ−１参照株の包括的パネルからの９個のＨＩＶ−１偽型ウイルスのパネルを中和することができる高力価の抗体の存在についてスクリーニングした（ＤｅＣａｍｐ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｆｏｒ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８８，２４８９−２５０７（２０１４））。この分析は、その後の強力な広域中和抗体の単離および特徴付けのためのリンパ節ドナーとして、７人の患者の同定をもたらした（図１）。特に、試験した９個の単離物のうちの８個を中和することが見出された高レベルの抗体の存在（負の対照ＭＬＶ偽型ウイルスに対するバックグラウンド活性の欠乏）についてドナーＳＡ００３を選択した。注目すべきことに、ＳＡ００３ドナーは、血漿１ｍｌ当たり５０未満のＨＩＶ  ＲＮＡコピーのウイルス血症を有するエリートコントローラーである（クレードＢ  ＨＩＶ−１に感染）。
実施例２
強力なＨＩＶ−１広域中和抗体の単離および特徴付け
ドナーＳＡ００３からの胚中心および記憶ＩｇＧ  Ｂ細胞をＩｇＧ（すなわちＩｇＡおよびＩｇＭ陰性細胞）、ＣＤ１９およびＣＤ３８発現（胚中心Ｂ細胞はＣＤ３８陽性）に従って別々に選別し（図２）、ＨＩＶ−１中和抗体の産生について調べた。特に、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）（記憶Ｂ細胞もポリクローナルに刺激する）と、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ−２００６、ＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍｌ）、および抗ＢＣＲヤギ抗体（ＢＣＲを誘発）で構成される混合物との存在下において、高純度のＩｇＧ記憶Ｂ細胞およびＩｇＧ胚細胞をヒトフィーダー細胞における単一細胞ミクロ培養として別々のプレートに播種した。次に、３８４ウェルベースのＨＩＶ−１偽型ウイルス中和アッセイ（クレードＣおよびＣＲＦ０７の代表である２つの株、ＣＥ１１７６およびＢＪＯＸ２０００を並行して使用）を用いて、１４日目の培養物からの上清を一次スクリーニングにおいて試験した。中和アッセイは、ＴＺＭ−ｂｌ細胞において行った。３８４ウェルプレートにおいて、５０〜１００×１０４相対光単位（ＲＬＵ）の出力をもたらすＨＩＶ−１偽型ウイルスをＢ細胞培養物の上清と共に３７％（５％ＣＯ２）で１時間インキュベートした後、３０００のＴＺＭ−ｂｌ細胞を添加した。これらをさらに７２時間インキュベートし、その後、上清を除去し、１５μｌのＳｔｅａｄｙｌｉｔｅ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を添加した。Ｓｙｎｅｒｇｙマイクロプレートルミノメーター（ＢｉｏＴｅｋ）においてプレートを読み取ることにより、５分後にルシフェラーゼ活性を検出した。胚中心Ｂ細胞の２つの培養物から得られた上清は、ＣＥ１１７６およびＢＪＯＸ２０００株の両方を交差中和できることが見出された。これらの２つの培養物からの上清をさらに収集し、４個の偽型ウイルス（ＣＥ１１７６、ＢＪＯＸ２０００、Ｘ１６３２および２５７１０）を中和するその能力について試験した。注目すべきことに、２つの上清の１つは、４つの偽型ウイルスを全て中和した。その可変領域（表１および５）およびその中の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸およびヌクレオチド配列を決定することにより、中和培養物から得られた抗体を特徴付けし、「ＬＮ０１」と名付けた。従って、「ＬＮ０１」と呼ばれる結合剤は、表１および２において上記で示されるようなＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬ配列を有するＩｇＧ３型完全ヒトモノクローナル抗体である。この抗体は、ＩＧＨＶ４−３９＊０７およびＩＧＫＶ１−３９＊０１生殖系列遺伝子に由来し、生殖系列と比較して重鎖（２８％）およびカッパ軽鎖（２７％）の両方の可変遺伝子において体細胞性に高度に突然変異されていた。また、ＬＮ０１抗体は、２０個のアミノ酸で構成される長い重鎖相補性決定３領域（ＣＤＲＨ３）ループも有した。ＬＮ０１  ＶＨおよびＶＬ遺伝子をＩｇＧ１発現ベクターにクローン化し、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をトランスフェクトすることにより組換えＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体を作製した。次に、組換えプロテインＡカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、全長ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体を精製した。
【００７０】
次に、組換えで産生されたＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体を、ＴＺＭ−ｂｌ細胞において９個のＨＩＶ−１参照偽型ウイルスの包括的パネルに対して試験した。顕著に、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は、０．０３〜１．６μｇ／ｍｌの範囲のＩＣ５０値で、９個のうちの８個のＨＩＶ−１偽型ウイルスを中和し（図３）、負の対照ＭＬＶ偽型ウイルスを中和しなかった。続いて、クレードＡ、クレードＢ、クレードＣ、クレードＤ、クレードＧ、循環組換え形態ＣＲＦ１０＿ＣＤ、ＣＲＦ０１＿ＡＥ、ＣＲＦ０２＿ＡＧおよびＣＲＦ０７＿ＢＣ、ならびに非循環組換え体ＡＣおよびＡＣＤ株を含む１１８個のＨＩＶ−１偽型ウイルスの拡張パネルにおいてＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体を試験した。ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は、２５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で１１８個のうちの１０９個のウイルス（すなわち試験したウイルスの９２％）を広域に中和し、ＩＣ５０の中央値は１．１μｇ／ｍｌであった（図４および５）。中和されたウイルスの分析により、ＬＮ０１の中和活性はクレードに依存しないことが示された。
実施例３
ＬＮ０１中和活性に対するＦｃ受容体の効果
ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体を、親ＴＺＭ−ｂｌ細胞、およびＦｃ−ガンマ受容体Ｉ（ＣＤ６４）を発現するＴＺＭ−ｂｌ細胞において、９個のＨＩＶ−１参照偽型ウイルスの包括的パネルに対して試験した（Ｐｅｒｅｚ，Ｌ．Ｇ．，Ｃｏｓｔａ，Ｍ．Ｒ．，Ｔｏｄｄ，Ｃ．Ａ．，Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．＆Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，Ｄ．Ｃ．Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １：ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｇｐ４１．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３，７３９７−７４１０（２００９））。注目すべきことに、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体の中和活性は、Ｆｃ−ガンマ受容体Ｉを発現するＴＺＭ−ｂｌ細胞において１００倍増強された（図６）。加えて、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は、Ｆｃ−ガンマ受容体Ｉを発現するＴＺＭ−ｂｌ細胞を用いて、ＴＺＭ−ｂｌ細胞においてＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体により中和されなかった株ＣＥ０２１７に対して強力な中和を示した（ＩＣ５０＞２５μｇ／ｍｌ））。これらの結果は、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体を細胞表面に予め配置することにより、Ｆｃ−ガンマ受容体がＡｂにウイルス阻害のための動力学的利点を与え得ることを示唆する。この動力学的利点は、抗体に特有である可能性があり、そのエピトープは、アクセスすることが困難であるか、または融合の初期段階中にＥｎｖタンパク質の中間構造においてごく短時間暴露されると考えられる。Ｆｃ−ガンマ受容体が潜在的にＨＩＶ−１中和を促進し得る別のメカニズムは食作用である。ＴＺＭ−ｂｌ細胞株を構築したＨｅＬａ細胞は、ノンプロフェッショナルな食細胞の特性を示すことが知られている。従って、その表面にＦｃ−ガンマ受容体を導入することにより、ＴＺＭ−ｂｌ細胞がプロフェッショナルな食細胞に変換された可能性がある。ＨＩＶ−１中和抗体に対する任意のＦｃ−ガンマ受容体媒介性抗ウイルス薬の効果は、侵入阻害によるか食作用によるかにかかわらず、ワクチン設定においていくつかの細胞型に有益であり得る。Ｆｃ−ガンマ受容体はＣＤ４＋リンパ球上でめったに発現されず、いくつかの付加的なＨＩＶ−１感受性細胞型は複数のＦｃ−ガンマ受容体を発現し、性感染と、長寿命のウイルスリザーバーの早期確立とに関与する。特に、マクロファージは、粘膜暴露後にウイルスが遭遇する最初の感染感受性細胞の１つであり、これらは、慢性感染において、長寿命のウイルスリザーバーとしての機能を果たすと考えられる。マクロファージは、単球および樹状細胞の特定のサブセットと同様に、複数のＦｃ−ガンマ受容体を発現することがよく知られている。また、Ｆｃ−ガンマ受容体が、抗原取込み、抗原提示、細胞活性化およびＢ細胞寛容を促進することにより、適応免疫および末梢寛容の調節に関与することに言及することも重要である。
実施例４
ＬＮ０１の特異性
ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体の特異性をよりよく定義するために、本発明者らは、親ＨＩＶ−２／７３１２Ａ内にＨＩＶ−１  ＭＰＥＲの種々のセグメントを含有するＨＩＶ−２／ＨＩＶ−１キメラ偽型ウイルスのパネルを使用した。ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は、親ＨＩＶ−２  ７３１２Ａ株を中和しなかった。注目すべきことに、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は、ＨＩＶ−１からの６個の残基のみをＨＩＶ−２  ＭＰＥＲ領域において置換した（ＬＡＳＷＶＫＹＩＱ（配列番号６５）をＩＴＫＷＬＷＹＩＫ（配列番号６６）に置換した）キメラウイルス７３１２Ａ．Ｃ４を強力に中和するが、同じ領域の３個の残基のみを置換した（ＬＡＳＷＶＫＹＩＱ（配列番号６５）をＩＴＫＷＩＫＹＩＱ（配列番号６７）に置換した）キメラウイルス７３１２Ａ．Ｃ６を中和しないことが見出された（図７）。７３１２Ａ．Ｃ４と同じ６個の突然変異を、Ｎ末端領域における付加的な７個の突然変異と組み合わせたキメラウイルス７３１２Ａ．Ｃ１Ｃを用いて同様の知見が得られた。これらの結果は、ｇｐ４１  ＭＰＥＲＣ末端領域の残基（Ｌ６７９、Ｗ６８０およびＫ６８３）がＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体の結合に関与することを示す。
【００７１】
ＬＮ０１の特異性をよりよく定義するために、本発明者らは、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、グループＭ、ＣＲＦ０１＿ＡＥおよびＣＲＦ０２＿ＡＧのコンセンサスＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｇｐ１６０配列の全長をカバーする、１２個のアミノ酸により重複する１４２３の１５−ｍｅｒペプチドによって形成されるペプチドマイクロアレイを使用した。ペプチドを３Ｄ−エポキシガラススライド上に印刷し、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナーを用いて分析した（Ｔｏｍａｒａｓ，Ｇ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５，１１５０２−１１５１９（２０１１））。７Ｂ２と呼ばれる対照抗体（ｇｐ４１の免疫優性領域に特異的である）と並行して、ペプチドマイクロアレイへの結合についてＬＮ０１を２０μｇ／ｍｌで試験した。ＬＮ０１および７Ｂ２の結合は、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧとのインキュベーションにより検出した。蛍光強度は、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナーを用いて測定し、ＧｅｎｅＰｉｘソフトウェアにより分析した（図８）。注目すべきことに、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は、このライブラリー内のペプチドのいずれとも明白に反応しなかったが、７Ｂ２は、ｇｐ４１免疫優性領域にわたる１９０〜１９５のペプチドと強力に反応した。これらの結果は、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体がＨＩＶ−１  Ｅｎｖの直鎖エピトープを認識しないことを示す。
【００７２】
また、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は、サブタイプＡ伝達（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ）／創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）株、ＢＧ５０５に基づく可溶性の切断型ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０トリマーへの結合についても試験した。これらのトリマーは非常に安定し、同種であり、かつネガティブ染色電子顕微鏡法（ＥＭ）により可視化したときに天然のウイルススパイクによく類似している（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｃｌｅａｖｅｄ，ｓｏｌｕｂｌｅ  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｔｒｉｍｅｒ，ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０，ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｏｒ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｎｏｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．９，ｅ１００３６１８（２０１３））。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ上の複数の中和エピトープに対する全ての広域中和抗体は、４エピトープ抗体（ＣＨ０１、ＰＧ９、ＰＧ１６およびＰＧＴ１４５）を含む、ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０トリマーと非常によく反応した。反対に、ＣＤ４結合部位、ＣＤ４誘発性エピトープまたはｇｐ４１外部ドメインに対する非ＮＡｂは、そのエピトープがＥｎｖのより簡単な形態（例えば、ｇｐ１２０モノマーまたは解離ｇｐ４１サブユニット）上に存在する場合でもトリマーと反応しなかった。また、トリマーの可溶性を改善し、凝集体の形成を低減するために、ＭＰＥＲを欠失させた。ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体、ＰＧＴ１４５（Ｖ１−Ｖ２グリカン特異的）、ＰＧＴ１５１（ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の界面の部位に結合）および１７ｂ（ＣＤ４結合誘発部位に結合）抗体を、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）の存在下または非存在下において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０トリマーへの結合について試験した。ＰＧＴ１４５およびＰＧＴ１５１抗体は、ｓＣＤ４の存在下または非存在下において、ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０トリマーに強く反応し；１７ｂは、ｓＣＤ４の存在下においてのみＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０トリマーに反応した。ＬＮ０１は、ｓＣＤ４の存在下でも非存在下でもＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０トリマーと反応しなかった（図９）。
【００７３】
ＭＰＥＲ特異的１０Ｅ８抗体（Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｏａｄ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｂｙ  ａ  ｇｐ４１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９１，４０６−４１２（２０１２））と並行して、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体を、ＥＬＩＳＡにより、ＨＩＶ−１抗原のパネル（ＣｏｎｓＢ、コンセンサスクレードＢ  ｇｐ１４０、４２６ｃ、クレードＣ  ｇｐ１４０、４２６ｃ−ＮＬＧＳ、４２６ｃ  ｇｐ１４０（Ｎ結合グリコシル化部位が除去された）、４２６ｃコア、ｇｐ１４０（Ｖループが除去された）、ＵＧ３７  ｇｐ１４０、クレードＡおよびｇｐ４１、ｇｐ４１の組換え細胞外ドメイン、ＨｘＢ２株からのアミノ酸５４１〜６８２、Ｖｙｂｉｏｎ）に対しても試験した。ＥＬＩＳＡにより、試験抗原のいずれもＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体により認識されなかった（図１０）。反対に、１０Ｅ８抗体はｇｐ４１の組換え細胞外ドメインに反応した。これらの結果は、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体が、１０Ｅ８と異なってｇｐ４１のＭＰＥＲのエピトープを認識し得ることを示す。
【００７４】
最後に、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体を、ｇｐ４１ｉｎｔと呼ばれる融合中間体ｇｐ４１および非コートプレート（ＰＢＳ）に対して試験した（Ｌａｉ，Ｒ．Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｇｐ４１  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ＨＩＶ−１．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８９，２９９１２−２９９２６（２０１４））。ｇｐ４１ｉｎｔ抗原は、ＭＰＥＲ抗体４Ｅ１０、２Ｆ５および１０Ｅ８により高親和性で認識される。１０Ｅ８はＥＬＩＳＡによりｇｐ４１ｉｎｔに反応したが、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は反応しなかった（図１１）。これらの結果は、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体が、恐らくＭＰＥＲ領域において、試験される抗原のいずれにおいても容易に提示されない保存エピトープを認識することを示す。本発明者らは、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体が、融合前（ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ）天然Ｅｎｖ立体構造において提示される場合、ＭＰＥＲ領域のＣ末端領域においてその同族立体構造エピトープを認識すると仮定し得る。
実施例５
ＬＮ０１のＭＰＥペプチドへの高親和性結合の欠乏
ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体の特異性をよりよく定義するために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡにより、ＭＰＥＲ特異的抗体１０Ｅ８を共結晶化するために使用された２８アミノ酸長さのペプチドに対するその結合を試験した（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１２）。このペプチドは、全２８残基のｇｐ４１  ＭＰＥＲ（残基６５６〜６８３）（配列ＲＲＲ−ＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬＷＹＩＲＲＲＲ（配列番号８１）を包含する。１０Ｅ８は、このＭＰＥＲペプチドに貪欲に反応するが、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体は非常にわずかにのみ反応する（図１２）。これらの結果は、ＩｇＧ１  ＬＮ０１抗体が、恐らくＭＰＥＲ領域において、ＭＰＥＲ  ｇｐ４１領域全体を包含する直鎖ペプチドにおいて容易に提示されない保存エピトープを認識することを示す。
実施例６
改善された中和活性を有するＬＮ０１バリアント
ＬＮ０１抗体の効力を改善するために、本発明者らは、点突然変異がＬＮ０１ＶＨ（２５のバリアント）またはＶＬ（１５のバリアント）に導入されたバリアントのセットを作製した（図１３Ａ）。これらの置換は、元の残基をＷまたはＡで置換することにより予測される表面暴露に基づいて選択した。変異ＶＨまたはＶＬをそれぞれ親のＶＬまたはＶＨと組み合わせることにより、４０のＬＮ０１バリアントを組換えで作製した。これらのバリアントを、３つのＨＩＶ−１株（ＣＨ１１９、Ｘ１６３２；ＢＪＯＸおよび対照ウイルスＳＶＡ−ＭＬＶ）の最初のパネルに対して試験した。いくつかのＬＮ０１バリアントは部分的または完全に中和活性を失い（バリアント１３、１４、２１、１８、１９、２０、２２、２３、２４、３２および３３）、これは、抗原認識における元の残基の重要な役割を示す（特にＶＨのＦＲ３、ＶＨのＣＤＲ３内の残基、およびＶＬのＣＤＲ１の残基）。注目すべきことに、３つのバリアントは、３倍（３×）を超える中和効力の増大を示した：バリアント７（Ｄ３２Ｗ、ＶＨのＣＤＲ１における突然変異）、バリアント８（ＶＨのＣＤＲ１におけるＮ３３Ｗ）およびバリアント３８（ＶＬのＦＲ３におけるＳ６７Ｗ）（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。顕著に、ＬＮ０１バリアント７は、親ＬＮ０１抗体と比較して３９倍の効力の増大を示した。これらの結果は、ＬＮ０１バリアント７、８および３８を、親ＬＮ０１抗体と並行して、８個のウイルスのマルチクレードパネルに対して試験したときに確認された（図１４Ａ〜Ｋ）。この第２の試験において、ＬＮ０１バリアント７、８および３８について観察された効力の増大は、それぞれ平均して４７、２．３および２．７倍であった。
【００７５】
これらの結果に基づいて、付加的なＬＮ０１バリアント（バリアント４１、４２、４３、４４、４８および５０）を合成し、７個のＨＩＶ−１株のパネルに対して試験した（図１５Ａ〜Ｂ）。バリアント（ｖ）４１、４２、４３および４４では、ＶＨのＣＤＲ１のＤ３２残基をＦ（ｖ４１）、Ｙ（ｖ４２）、Ｌ（ｖ４３）またはＩ（ｖ４４）のいずれかに変異させた。興味深いことに、これらの４つの突然変異のいずれも、バリアント７におけるＷの導入で観察されたものと同じ効力の増大を付与しなかった。加えて、芳香族残基（すなわちＦまたはＹ）の導入のみがＬＮ０１活性を改善し、Ｙ（Ｖ４２）は、平均して３．７倍の最も著しい改善を付与した（図１５Ｂ）。同じ位置における疎水性残基の導入は、中和活性に関する利益を一切付与しなかった。バリアント７で使用したＤ３２Ｗ突然変異の存在下（バリアント４８）または非存在下（バリアント５０）において、ＦＲ１およびＦＲ４における体細胞突然変異を生殖系列配置に戻した２つのバリアントも試験した。ＶＨのフレームワーク（ＦＲ）１およびＦＲ４における体細胞突然変異の除去は、ＬＮ０１中和活性を有意に変更しなかった。バリアント５０の骨格におけるＤ３２Ｗの導入は、より強力な中和活性（親ＬＮ０１抗体よりも平均して４．７倍良好）を付与した。しかしながら、ＶＨの生殖系列ＦＲとの関連でのＤ３２Ｗが、完全変異された親ＬＮ０１抗体（すなわちバリアント７）の骨格上の同じ突然変異で観察されるものと同じレベルの効力の改善を達成しなかったことは注目に値する。
【００７６】
バリアント７および８に導入された突然変異（Ｄ３２ＷおよびＮ３３Ｗ）の組合せも、４９と呼ばれる新しいバリアントにおいて、７ウイルスのパネルに対して試験し、これは、親ＬＮ０１抗体と比較して平均８１倍の高い効力を示した（図１６Ａ〜Ｂ）。この結果は、ＬＮ０１バリアント４９が非常に強力なＬＮ０１バリアント７抗体と同等であるか、それよりも優れていることを示す。
【００７７】
最後に、本発明者らは、５つのＣＤＲ１体細胞突然変異を生殖系列配置に戻した別のＬＮ０１バリアントを試験した。突然変異ＣＤＲ１配列ＤＳＶＳＮＤＮＹＹ（配列番号８２；下線を引いた５つのＣＤＲ１体細胞突然変異を含む）を、ＧＳＩＳＳＳＳＹＹ（配列番号３２；生殖系列ＣＤＲ１）に戻して、ＬＮ０１バリアント８２を作製した。驚くべきことに、ＬＮ０１バリアント８２は、親ＬＮ０１抗体よりも２．９倍高い効力を示した（図１７）。この結果は、ＶＨ  ＣＤＲ１がＬＮ０１中和活性において重要な役割を果たすことを示す。
【００７８】
好ましい実施形態に関して特定の実施形態が記載されたが、変更形態および修正形態が当業者に想到されるであろうことは理解される。従って、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるこのような均等な変更形態の全ては、特許請求の範囲により包含されることが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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