(57)【要約】  本発明は、ａ）ペルフルオロカーボンおよび任意選択で金属化合物を極性溶媒中の生体適合性疎水性ポリマーの溶液に加え、第１の液体混合物を提供するステップ、ｂ）第１の液体混合物を、ポリビニルアルコールを含む生体適合性界面活性剤の水溶液に超音波処理下で加え、第２の液体混合物を得るステップ、ｃ）冷却しながら第２の液体混合物の超音波処理を維持するステップ、ｄ）第２の液体混合物から極性溶媒を蒸発させ、生体適合性疎水性ポリマー、ペルフルオロカーボンおよび任意選択で金属化合物を含むビーズの懸濁液を得るステップ、ｅ）懸濁液からビーズを分離し、ビーズの水懸濁液を調製するステップ、およびｆ）水懸濁液を凍結乾燥し、ビーズを得るステップを含む、生体適合性疎水性ポリマー、ペルフルオロカーボン、ポリビニルアルコールおよび任意選択で金属化合物を含むビーズの調製のための方法に関し、ステップｂ）における生体適合性界面活性剤への第１の液体混合物の添加は、最大で１０秒の期間以内で行われ、ステップｂ）における超音波処理およびステップｃ）における超音波処理は、例えば、プローブまたはフロー型超音波処理器によって少なくとも１２０μｍの振幅で０．０１〜１０分間、液体混合物中へと直接行われ、生体適合性疎水性ポリマーに対する生体適合性界面活性剤の重量比は、少なくとも３：１である。本発明はさらに、イメージング目的に適した密接なＦ−Ｈ２Ｏ相互作用を有するビーズに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性疎水性ポリマー、ペルフルオロカーボン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）および任意選択で金属化合物を含むビーズの調製のための方法であって、
ａ）前記ペルフルオロカーボンおよび任意選択で前記金属化合物を極性溶媒中の前記生体適合性疎水性ポリマーの溶液に加え、第１の液体混合物を提供するステップ、
ｂ）前記第１の液体混合物をＰＶＡの水溶液および任意選択で生体適合性界面活性剤に超音波処理下で加え、第２の液体混合物を得るステップ、
ｃ）冷却しながら前記第２の液体混合物の前記超音波処理を維持するステップ、
ｄ）前記第２の液体混合物から前記極性溶媒を蒸発させ、前記生体適合性疎水性ポリマー、前記ペルフルオロカーボンおよび任意選択で前記金属化合物を含むビーズの懸濁液を得るステップ、
ｅ）前記懸濁液から前記ビーズを分離し、前記ビーズの水懸濁液を調製するステップ、および
ｆ）前記水懸濁液を凍結乾燥し、前記ビーズを得るステップ
を含み、
ステップｂ）における前記生体適合性界面活性剤への前記第１の液体混合物の前記添加は、最大で１０秒の期間以内で行われ、
ステップｂ）における前記超音波処理およびステップｃ）における前記超音波処理は、少なくとも１２０μｍの振幅で０．０１〜１０分間、前記液体混合物へと直接行われ、
前記生体適合性界面活性剤と前記生体適合性疎水性ポリマーの重量比は、少なくとも３：１である、方法。
【請求項２】
ステップａ）が、前記ペルフルオロカーボンおよび前記金属化合物を前記生体適合性疎水性ポリマーの前記溶液に加えることが関与し、前記金属化合物が、従前の希釈を伴わずに、または１ｍＬの前記溶液当たり少なくとも１００ｍｇの前記金属化合物を含む溶液として加えられ、得られた前記第１の液体混合物が、エマルジョンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）が、好ましくは、プローブまたはフロー型超音波処理器を使用して、直接の超音波処理下で行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体適合性疎水性ポリマーが、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体、ポリ（乳酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリジメチルシロキサンおよびこれらの組合せ、好ましくは、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体からなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記極性溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルおよびこれらの組合せ、好ましくは、ジクロロメタンからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ペルフルオロカーボンが、ペルフルオロクラウンエーテル、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロポリエーテル、ならびにその組合せおよび修飾からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記金属化合物が、ガドリニウムを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生体適合性界面活性剤として、ＰＶＡが存在し、任意選択で、ポリソルベートおよびポリビニルピロリドンからなる群から選択される界面活性剤が存在し、好ましくは、前記界面活性剤が、ポリビニルアルコールである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の液体混合物中の前記生体適合性疎水性ポリマーに対する前記第１の液体混合物中の前記ペルフルオロカーボンの重量比が、１０：１〜２５：１、例えば、１２：１〜２０：１、例えば、１４：１〜１８：１である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の液体混合物中の前記生体適合性疎水性ポリマーに対する前記第１の液体混合物中の前記金属化合物の重量比が、１：１０００〜１：１００、例えば、１：５００〜１：１５０、例えば、１：３００〜１：１８０である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体適合性疎水性ポリマーに対する前記生体適合性界面活性剤の重量比が、４：１〜１０：１、例えば、４．５：１〜８：１または４．８：１〜６：１である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるか、または得られるビーズ。
【請求項１３】
生体適合性疎水性ポリマー、ペルフルオロカーボン、少なくとも１０重量％のＰＶＡおよび任意選択で金属化合物を含むビーズであって、８５０ＭＨｚ分光計で測定した乾燥状態でのＴ１Ｄおよび水膨潤状態でのＴ１Ｗの、１０ｋＨｚ  ＭＡＳでの固体核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって測定するようなスピン格子緩和時間を示し、
２５℃でのＴ１Ｄ−Ｔ１Ｗは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
１５℃でのＴ１Ｄ−Ｔ１Ｗは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
５℃でのＴ１Ｄ−Ｔ１Ｗは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
−５℃でのＴ１Ｄ−Ｔ１Ｗは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
−１５℃でのＴ１Ｄ−Ｔ１Ｗは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
−２５℃でのＴ１Ｄ−Ｔ１Ｗは、少なくとも０．０５秒である、ビーズ。
【請求項１４】
生体適合性疎水性ポリマー、ペルフルオロカーボン、ポリビニルアルコール、および任意選択で、ガドリニウムキレート化合物を含むビーズであって、最大で２００ｎｍのピーク半径（ＤＬＳで測定）、最大で０．２のＰＤＩ、および少なくとも１５重量％、好ましくは、少なくとも２０重量％のペルフルオロカーボン含量を有する、ビーズ。
【請求項１５】
前記生体適合性疎水性ポリマーが、２〜１０重量％の量でＰＬＧＡを含み、前記ペルフルオロカーボンが、少なくとも２０重量％の量でＰＦＣＥを含み、ポリビニルアルコールの量が、少なくとも８重量％であり、前記重量％が、前記ビーズの重量に対するものである、請求項１４に記載のビーズ。
【請求項１６】
音響イメージング；光音響イメージング；超音波イメージング；内視鏡または術中イメージング；ラマン分光法を含めた分光技術；磁気共鳴イメージングまたは分光法技術、例えば、１Ｈまたは１９ＦのＭＲＩまたはＮＭＲまたはＭＲＳ；Ｔ１、Ｔ２およびＴ２*強調イメージング；プロトンまたは１９Ｆ密度強調イメージング；ＳＰＥＣＴ；ＰＥＴ；シンチグラフィー；バイオルミネセンスイメージングおよび蛍光イメージング断層撮影からなる群から選択される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのイメージングのための、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のビーズの使用。
【請求項１７】
音響イメージング；光音響イメージング；超音波イメージング；内視鏡または術中イメージング；ラマン分光法を含めた分光技術；磁気共鳴イメージングまたは分光法技術、例えば、１Ｈまたは１９ＦのＭＲＩまたはＮＭＲまたはＭＲＳ；Ｔ１、Ｔ２およびＴ２*強調イメージング；プロトンまたは１９Ｆ密度強調イメージング；ＳＰＥＣＴ；ＰＥＴ；シンチグラフィー；バイオルミネセンスイメージングおよび蛍光イメージング断層撮影からなる群から選択される、ｉｎ  ｖｉｖｏでのイメージングにおける使用のための、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のビーズ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医用イメージングにおけるコントラスト剤として有用なビーズの調製のための方法に関する。本発明はさらに、このような方法によって得ることができるビーズ、およびこのようなビーズの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでのイメージング技術は、個別化医療、および細胞治療を含めた治療にとって必要不可欠である。ある形態の細胞治療が関与する概ね１０，０００件の進行中の臨床治験が現在存在する（ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）。細胞治療の発展および最適化における重要な障害は、一旦細胞が非侵襲的様式で患者中にある場合、細胞をモニターする十分な手段が存在しないことである。イメージングが必要不可欠である他の領域は、埋込体／マトリックス／スカフォールド、薬物送達、標的療法の最適化およびモニタリング；ならびに例えば、炎症、心血管プラークまたは腫瘍の領域における疾患状態または治療への応答をモニターすることを含む。
【０００３】
いくつかの臨床イメージングモダリティーが利用可能であるが、どれも最適でない。このように、２つ以上のイメージングモダリティー（マルチモーダル造影剤）で視認することができる薬剤が望ましい。イメージング技術、例えば、１Ｈ  ＭＲＩ、１９Ｆ  ＭＲＩ、蛍光イメージング、ならびに超音波および光音響イメージングを含めた音響イメージング技術の組合せを使用して可視化することができるような、薬剤を開発することが試みられてきた。
【０００４】
医用イメージング手順における超音波の使用は、当技術分野で周知である。これは、最も頻繁に使用される臨床イメージングモダリティーである。超音波は、確立された安全記録を伴う経済的で非侵襲的なリアルタイム技術として公知である。これは縦断的研究のために使用することができ、反復使用は体に有害ではない。
【０００５】
超音波装置は電離放射線を生じさせず、これらの操作は、放射標識の使用が関与しない。超音波イメージングを行うための装置は携帯式であり、既に広範に使用されている。超音波イメージングは潜在的に定量的であり、これは全身イメージングモダリティーではなく、したがって、標的器官に限定される。超音波イメージングは、イメージングの深さに関して限定される。
【０００６】
典型的には、気体充填微小気泡が、超音波イメージングにおいてコントラスト剤として用いられる。これらは通常、相対的に大きなサイズ（１０００〜１００００ｎｍの直径）を有し、これは一般に細胞標識などの用途に適さない。さらに、これらはまた、血流外のイメージング、例えば、腫瘍イメージングに適さない。このような気体充填微小気泡は典型的には、ほぼ数秒から数分程度の短い寿命を有する。これらはまた、気泡が破裂すると、血管に対するものを含めた細胞傷害が起こり得るというさらなる不都合に苦しむ。さらに、気体充填微小気泡は不安定であり得、その結果、これらはかなりの時間貯蔵することができない。これらは典型的には、水和の後すぐに使用しなければならない。最終的に、このような大きな薬剤は、循環から離脱することができず、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのターゲティングまたは薬物送達用途のための非常に限定された機会を提示する。これらの大きなサイズはまた、腎臓による素早いクリアランスを促進し、これはさらにｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらの有用な寿命を制限する。
【０００７】
超音波コントラスト剤およびこれらの使用は、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔｓ：  ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｒａｄｉｏｌ．  １９９８  Ｍａｙ；２７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１５７−６０およびＫｉｅｓｓｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ２０１  １，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  １２７−１３４において概説されている。
【０００８】
米国特許出願第２０１００１５８８１５号明細書は、細胞の超音波視認性を改善するために、細胞中に内部移行されるコントラスト剤の使用について記載している。しかし、これは、薬剤が気体状であり、数時間を超える細胞トラッキングのために不安定であるという固有の不都合を有する。さらに、気体状薬剤は、例えば、膜または細胞骨格に対する細胞傷害をもたらし得る。
【０００９】
米国特許出願第２０１１００２０２３９号明細書は、イメージング用途のために細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで標識するための方法を提供し、任意の特定のコントラスト剤を詳細に記載していない。
【００１０】
国際公開第２０１２／１１３７３３号は、肝疾患、より特定すると、肝細胞癌（ＨＣＣ）の磁気共鳴断層撮影（ＭＲＴ）支援による診断におけるコントラスト媒体として使用するための、ガドリニウム化合物および／または組み込まれたペルフルオロオクチルブロミドを含むナノ粒子を開示している。
【００１１】
国際公開第２０１４／０４１１５０号は、ペルフルオロクラウンエーテルおよびガドリニウムキレートを含むポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ）粒子、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏでのイメージングおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのイメージングのためのその使用について開示している。国際公開第２０１４／０４１１５０号において、粒子は、ＰＬＧＡの溶液、ペルフルオロ−１５−クラウン−５−エーテル、およびガドテリドールの溶液を混合し、カップホーンを使用した超音波処理下でポリビニルアルコールの溶液中への混合物の滴下の添加、それに続く蒸発および凍結乾燥によって調製される。国際公開第２０１４／０４１１５０号は、細胞イメージング、例えば、超音波および光音響イメージング技術に適した安定的で入手可能および有効なコントラスト剤であるＰＬＧＡ粒子について開示している一方、方法、例えば、方法によって得ることができる粒子の収量をさらに改善することが当技術分野で求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
さらに、狭いサイズ分布、およびイメージングにおける高い応答を有する粒子が求められている。
【００１３】
本発明の目的は、上記および／または他の必要性を満たす、イメージングに有用であるビーズを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明は、
ａ）ペルフルオロカーボンおよび任意選択で金属化合物を極性溶媒中の生体適合性疎水性ポリマーの溶液に加え、第１の液体混合物を提供するステップ、
ｂ）第１の液体混合物を、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含有する水溶液に超音波処理下で加え、第２の液体混合物を得るステップ、
ｃ）冷却しながら第２の液体混合物の超音波処理を維持するステップ、
ｄ）第２の液体混合物から極性溶媒を蒸発させ、生体適合性疎水性ポリマー、ペルフルオロカーボン、ＰＶＡおよび任意選択で金属化合物を含むビーズの懸濁液を得るステップ、
ｅ）懸濁液からビーズを分離し、ビーズの水懸濁液を調製するステップ、および
ｆ）水懸濁液を凍結乾燥し、ビーズを得るステップ
を含む、生体適合性疎水性ポリマー、ポリビニルアルコール、ペルフルオロカーボンおよび任意選択で金属化合物を含むビーズの調製のための方法を提供し、
ステップｂ）における生体適合性界面活性剤への第１の液体混合物の添加は、最大で１０秒の期間以内で行われ、
ステップｂ）における超音波処理およびステップｃ）における超音波処理は、少なくとも１２０μｍの振幅で０．０１〜１０分間、液体混合物へと直接行われ、
生体適合性界面活性剤と生体適合性疎水性ポリマーの重量比は、少なくとも３：１である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】国際公開第２０１４／０４１１５０号の方法（左）および新規な（右）方法によって生成された粒子の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル。内部参照としてレソルシノール（４．１ｍｇ）を伴いスペクトルを測定した；４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ、緩和減衰＝２０ｓ。右のスペクトルにおける差し込み図：ＰＶＡの化学構造、加水分解されていないＯＨ基は単純化のために示さない。
【図２】ＰＬＧＡ、ＰＦＣＥおよび本発明によるガドテリドールを含むビーズについて測定したＤＳＣ曲線を示す。−１７℃でのＰＦＣＥの融解なしおよび−１９℃での結晶化なしを検出することができ、これはＰＦＣＥ相が明確な融点を有さないことを示す。加熱速度２Ｋ／分、試料の最初の重量１０．３ｍｇ、試料の最終重量５．６ｍｇ。
【図３】本発明によるガドテリドールを有さないＰＬＧＡおよびＰＦＣＥを含むビーズ上で測定した異核オーバーハウザー増進分光法（ＨＯＥＳＹ）ＮＭＲを示す。水−プロトンおよびフッ素の間のＨＯＥＳＹを検出することができる。これは、ポリマーマトリックス中に分布した小さなサイズのペルフルオロカーボンドメインを有する均一な構造を示す。Ｄ2Ｏ中のナノ粒子、５００ＭＨｚ（1Ｈ）、４７１ＭＨｚ（19Ｆ）。
【図４】乾燥状態および水膨潤状態である、ＰＬＧＡ、ＰＦＣＥおよび本発明によるガドテリドールを含むビーズ上で測定した固体ＮＭＲを示す。図４は、固体ＮＭＲ（１０ｋＨｚ  ＭＡＳ）によって測定したスピン格子緩和時間Ｔ１を示す。円で示す乾燥ナノ粒子、および四角で示す水で膨潤したナノ粒子の間のスピン格子緩和時間における差異が存在する。これは、水が全構造に自由に入ることができることを示し、ポリマー鎖の間に分布している小さなサイズのペルフルオロカーボンドメインを含有する均一な構造を再び示す。
【図５】乾燥状態および水膨潤状態である、ＰＬＧＡ、ＰＦＣＥおよび本発明によるガドテリドールを含むビーズ上で測定した固体ＮＭＲを示す。図５は、固体ＮＭＲ（１０ｋＨｚ  ＭＡＳ）で測定したスピン−スピン緩和時間Ｔ２を示す。緑色の円によって示される乾燥ナノ粒子、および青色の四角によって示される水で膨潤したナノ粒子の間のスピン格子緩和時間において差異が存在する。
【図６】ＰＬＧＡ、ＰＦＣＥおよびガドテリドールを含むビーズ（より高い強度を有するライン）、ならびにＰＦＣＥおよびガドテリドールを有さないＰＬＧＡを含むビーズ（より低い強度を有するライン）のＸ線小角散乱の結果を示す。結果は同様であり、これは粒子が均一な全球、または多分散のＰＦＣＥ充填ポアを有する粒子であることを示唆し得る。
【図７】ＰＬＧＡ、ＰＦＣＥおよびガドテリドールを含むビーズ（より低い強度を有するライン）、ならびにＰＦＣＥおよびガドテリドールを有さないＰＬＧＡを含むビーズ（より高い強度を有するライン）のＸ線回折の結果を示す。結果は同様である。
【図８】ＰＬＧＡ、ＰＦＣＥおよび本発明によるガドテリドール、ＰＬＧＡおよびＰＧＡを含むビーズの熱重量（ＴＧＡ）分析の結果を示す。本発明によるビーズの結果における４００℃での肩は、ビーズにおけるＰＶＡの存在を示す。
【図９】実験１５（比較）のＨＯＥＳＹ測定を示す。Ｄ２Ｏ中のＰＦＣＥを装填したコア−シェルカプセルのＨＯＥＳＹ  ＮＭＲ。水およびＰＦＣＥの間のクロスピーク（概ね−９２ｐｐｍのｙ軸、４．８ｐｐｍのｘ軸）は殆ど存在せず、フッ素が水と相互作用しないことを示す。残留シグナルは、ＰＦＣＥコアがシェルと接触している領域から来る。４００ＭＨｚ（1Ｈ）、３７７ＭＨｚ（19Ｆ）。
【図１０】異なるマイクロチップを有する超音波処理器における振幅および力の間の関係を示す。３．２ｍｍのマイクロチップは、特定の振幅設定における最も高い振幅を与え、それに続いてそれぞれ、４．８ｍｍおよび６．５ｍｍのマイクロチップである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
好ましくは、振幅は、少なくとも２４０μｍである。
【００１７】
高エネルギー超音波処理と組み合わせた、生体適合性界面活性剤の溶液への生体適合性ポリマー、ペルフルオロカーボンおよび任意選択の金属化合物の液体混合物の急速な添加は、ビーズの収量の改善をもたらしたことが驚いたことに見出された。さらに、ビーズは、ＰＶＡを含有し、驚くべきＦ−Ｈ2Ｏ相互作用を示す。
【００１８】
生体適合性界面活性剤の溶液への第１の液体混合物の急速な添加によって、最初または最後に加えられる第１の液体混合物に適用される超音波処理の持続時間において本質的に差異は存在しない。比較して、生体適合性界面活性剤の溶液への第１の液体混合物のゆっくりとした添加は、より後に加えられる混合物の部分が、より短い時間、超音波処理に曝露されることをもたらす。ステップｂ）およびｃ）における直接の超音波処理は好ましくは、プローブを使用することによって、またはフロー型超音波処理器を使用することによって行われる。例えば、カップホーンによる間接の超音波処理とは対照的に、プローブまたはフロー型超音波処理器の使用を伴う直接の超音波処理は、改善されたエネルギー移動をもたらす。プローブまたはフロー型超音波処理器を使用したこの均一な高エネルギー超音波処理は、ビーズの良好な収量をもたらした。さらに、方法は、狭い粒径分布および小さな平均粒径を有するビーズをもたらした。プローブ／フロー型超音波処理器と対照的に、例えば、国際公開第２０１４０４１１５０号において使用されているカップホーンは、冷却液が充填された浴型超音波処理器であり、その温度は、冷却循環器によって制御される。このように、超音波処理の間に、超音波は水浴の充填液体およびフラスコのガラス製の壁を通過しなければならない。これらの要因は、エネルギーの損失をもたらし、さらなるパラメーター、例えば、フラスコ壁の不均一性、または冷却液の動きもしくは冷却液の高さの偏りの可能性に対して、超音波処理を敏感なものとする。理論に束縛されるものではないが、これらの要因は、得られるビーズの収量および特性における差異をもたらすと考えられる。
【００１９】
本発明によって得られるビーズは、いくつかのイメージングモダリティーにおいて良好な視認性を有する。このようなビーズは、定性的または定量的イメージング、例えば、光音響および超音波イメージングを含めた音響イメージング、ＭＲＩイメージング、例えば、１９Ｆイメージング、Ｔ１およびＴ２強調イメージングを含めた１Ｈイメージング、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、シンチグラフィーおよび蛍光イメージング（蛍光色素または放射性リガンドの添加による）において有利に用いてもよい。次いで、これは、細胞標識、顕微鏡観察、組織学的検査、標的用途、薬物送達において、またはｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、異常な血管系から正常なものを区別することを含めた、血管系もしくは灌流をイメージングするために用いてもよい。蛍光色素またはルシフェラーゼ（またはルシフェラーゼをコードする核酸）が粒子に組み込まれた場合、ビーズはまた、蛍光イメージングまたはバイオルミネセンスを使用して検出し得る［Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２００４；  ２１：３５４−３６４］。
【００２０】
用語「ビーズ」は、本明細書において、室温にて乾燥しているとき固体であり、かつ沈殿および凍結乾燥によってゾル（液体連続相に分散している固体の分散物）から回収することができる物質を意味すると理解される。本発明によるビーズはまた、反復される凍結／解凍および凍結乾燥サイクルに対して安定的である。
【００２１】
リポソーム、ミセルおよびエマルジョン液滴は、本明細書において使用する場合、このように用語「ビーズ」には含まれない。分散相が気体である微小気泡の場合を除いて、これらは、またイメージング用途のための液体である分散相上の液体界面活性剤コーティング（典型的には、脂質）からなる。
【００２２】
したがって、公開資料、例えば、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｒａｄｉｏｌ．  ２００６  Ｍａｒ；４１  （３）：３０５−１２、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ．  ２０１３  Ａｕｇ；２６８（２）：４７０−８０において記述されている「ペルフルオロカーボンナノ粒子」は、「ペルフルオロカーボンエマルジョン液滴」であり、本明細書で使用されているような「ビーズ」ではない。エマルジョン液滴は、凍結乾燥によって未変化で回収することができず、エマルジョンは、凝結、クリーミング、合体および／またはオストワルド熱成に供される。これらの効果は、本明細書において使用する場合、ビーズに当てはまらない。
【００２３】
生体適合性疎水性ポリマー
ステップａ）において、極性溶媒中の生体適合性疎水性ポリマーの溶液を使用する。生体適合性疎水性ポリマーおよび極性溶媒の組合せは、極性溶媒に溶解するように生体適合性疎水性ポリマーを選択しなければならないことを認識されたい。
【００２４】
用語「生体適合性」は、本明細書において使用する場合、対象に導入されたとき、対象に実質的に有害な応答をもたらさない材料の特性を指す。例えば、対象に対して外来性である材料または装置が使用されるとき、これらが実質的に有害な反応、例えば、炎症反応および／または免疫反応を誘発しないことをこれは意味する。本開示のために使用し得る生体適合性材料は、生分解性またはバイオセイフティー材料を含む。
【００２５】
本明細書において使用する場合、ポリマーは、１００ｍｇのポリマーが室温にて１ａｔｍで１００ｍＬの水に溶解しないとき、疎水性であると決定される。
【００２６】
好ましくは、生体適合性疎水性ポリマーは、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリジメチルシロキサンおよびこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーを含む。疎水性ポリマーは、例えば、その末端基において修飾し、結合部位もしくは活性部位（例えば、「クリック」基）を組み込むか、または活性剤（例えば、蛍光色素）、もしくはさらなるポリマー、例えば、ＰＥＧを組込み得る。特に好ましくは、生体適合性疎水性ポリマーは、ＰＬＧＡである。
【００２７】
用語「ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体」またはＰＬＧＡは、当技術分野で認識されている用語であり、可変の長さおよび組成の乳酸およびグリコール酸モノマーの生分解性ポリマーを意味する。ＰＬＧＡビーズはまた、付加重合体、例えば、ポリ−エチレングリコール（ＰＥＧ，  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ２００４  Ｏｃｔ；１  （４）：３２１−３３）を含み得る。ＰＬＧＡビーズ／粒子は当技術分野において公知であり、イメージングにおける使用について記載されてきた（例えば、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１０  Ｓｅｐ；３１  （２７）：７０７０−７）。ＰＬＧＡの構造を、式１において示す（ｘおよびｙは、それぞれ、乳酸およびグリコール酸の単位の数を示す）。
化学式１
【化１】
2019510759.tif 000003
【００２８】
気体充填ＰＬＧＡ粒子はまた、超音波における使用について示唆されてきた。中国特許出願第１０１５７４５３０Ａ号明細書は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡマルチポリマー微小気泡超音波コントラスト剤の使用について記載しており、ここで、微小気泡は、気体、例えば、ペルフルオロプロパン、デカフルオロブタンまたは六フッ化硫黄を含む。
【００２９】
ペルフルオロカーボン
ペルフルオロカーボンを、液体として生体適合性疎水性ポリマーの溶液に加える。用語「液体」は、本明細書において使用する場合、体温（３７摂氏温度）および標準的大気圧（概ね１０００ヘクトパスカル）で単離した形態にあるとき、化合物の液体の物理的状態を指す。
【００３０】
用語「ペルフルオロカーボン」は、本質的に全ての、または全ての炭素−水素結合が炭素−フッ素結合によって置き換えられている、炭素化合物またはポリマーを指す。ペルフルオロカーボンは、他の元素、例えば、酸素を含むことができる。好ましいペルフルオロカーボンは、ペルフルオロポリエーテル、ペルフルオロクラウンエーテル、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロオクチルブロミドおよびペルフルオロポリエーテル、ならびにその組合せおよび修飾を含む。特に、好ましいペルフルオロカーボンは、ペルフルオロクラウンエーテルである。
【００３１】
用語「ペルフルオロクラウンエーテル」（ＰＦＣＥ）は、安定的な環構造において共有結合をしている炭素、酸素およびフッ素を含有する環状ペルフルオロカーボンとして解釈される。
【００３２】
特に有用なペルフルオロクラウンエーテルは、その構造を式２に示すペルフルオロ−１５−クラウン−５−エーテルである。
化学式２
【化２】
2019510759.tif 000004
【００３３】
金属化合物
金属化合物は１Ｈ  ＭＲＩにおけるコントラストの可能性を加え、すなわち、金属化合物は、ＭＲＩコントラスト剤としての役割を果たし得る。
【００３４】
用語「金属化合物」は、金属それ自体、および金属を含む化合物、例えば、金属キレートを指す。金属は、遷移金属、アルカリ金属および希土類金属を含めた、元素の周期律表において金属として定義されている元素である。
【００３５】
特定の好ましい金属化合物は、ランタニド、例えば、ガドリニウム（Ｇｄ）を含む。ガドリニウムキレートは、ガドテリドールを含む、例えば、「Ｐｒｏｈａｎｃｅ（登録商標）」と称される組成物として市販されている。ガドテリドールの構造を式３において示す。
化学式３
【化３】
2019510759.tif 000005
【００３６】
ステップａ）
ステップａ）は、ペルフルオロカーボンおよび任意選択で金属化合物を極性溶媒中の生体適合性疎水性ポリマーの溶液に加え、第１の液体混合物を提供することが関与する。ペルフルオロカーボンは、液体として加えられる。
【００３７】
ステップａ）が、生体適合性疎水性ポリマーの溶液に金属化合物を加えることが関与するとき、ステップａ）は、第１の液体混合物がエマルジョンとして得られるように、例えば、プローブまたはフロー型超音波処理器を使用した直接の超音波処理下で行われる。これは、より狭いサイズ分布およびより小さな平均サイズをもたらす。当業者はエマルジョンが得られたかどうかを容易に視覚的に決定することができ、したがって、ステップａ）において適用されるエネルギー（超音波処理の振幅および持続時間）を調節することができる。
【００３８】
好ましくは、金属化合物は、相対的に多量の金属化合物を含む溶液として、例えば、１ｍＬの溶液当たり少なくとも１００ｍｇ、１ｍＬの溶液当たり少なくとも２００ｍｇ、または１ｍＬの溶液当たり少なくとも２５０ｍｇが加えられる。例えば、市販の薬剤であるＰｒｏｈａｎｃｅ（登録商標）は、１ｍＬの溶液当たり２７９．３ｍｇのガドテリドールを含む溶液である。このような溶液は、希釈を伴わずに加えることができる。生体適合性疎水性ポリマーと混合される高濃度の金属化合物は、安定的なエマルジョン液滴をもたらし、これはより高い収量および／またはより良好なサイズ分布をもたらす。
【００３９】
ステップａ）が金属化合物を生体適合性疎水性ポリマーの溶液に加えることが関与しないとき、得られた第１の液体混合物は、ペルフルオロカーボンの相および生体適合性疎水性ポリマーの溶液の相を含む多相系である。
【００４０】
好ましくは、生体適合性疎水性ポリマーの溶液の極性溶媒は、有機溶媒であり、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルム、酢酸エチルおよびこれらの組合せからなる群から選択される。室温での蒸発を可能とするその低い沸点によって、ＤＣＭの使用が好ましい。
【００４１】
好ましくは、第１の液体混合物中の生体適合性疎水性ポリマーに対する第１の液体混合物中のペルフルオロカーボンの重量比は、１０：１〜２５：１、例えば、１２：１〜２０：１、例えば、１４：１〜１８：１である。
【００４２】
好ましくは、第１の液体混合物中の生体適合性疎水性ポリマーに対する第１の液体混合物中の金属化合物の重量比は、１：１０００〜１：１００、例えば、１：５００〜１：１５０、例えば、１：３００〜１：１８０である。
【００４３】
ステップｂ）
ステップｂ）は、第１の液体混合物をＰＶＡの水溶液および任意選択で他の生体適合性界面活性剤に超音波処理下で加え、第２の液体混合物を得ることが関与する。第２の液体混合物は、エマルジョンである。
【００４４】
ＰＶＡは、生体適合性界面活性剤として適用される。第２の液体混合物はまた、例えば、ポリソルベートおよびポリビニルピロリドンおよびこれらの組合せからなる群から選択される他の界面活性剤を含有し得る。ポリソルベートは、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０であり得る。特に好ましくは、生体適合性界面活性剤は、ＰＶＡである。
【００４５】
ステップｂ）における生体適合性界面活性剤溶液への第１の液体混合物の添加は、最大で１０秒、例えば、１〜８秒または３〜６秒の期間以内で行われる。
【００４６】
直接の超音波処理は、本発明によるビーズを作製するための成分を含有する混合物中で直接行われる。好ましくは、プローブまたはフロー型超音波処理器が、成分の混合物に対して超音波処理を適用するために使用されている。適用時間は、使用する系によって変化させることができ、一般に、０．０１分〜１０分である。プローブが使用されているとき、時間は典型的には１〜１０分である。フロー型超音波処理器が使用されているとき、時間は、より短く、例えば、０．０１〜５分でよい。
【００４７】
プローブを超音波処理のために混合物中に挿入し、例えば、カップホーンまたはマイクロプレートホーンによって提供される間接の超音波処理とは対照的に、混合物に対して直接の超音波処理を実現する。プローブはまた、マイクロチップまたはマイクロチッププローブと称してもよく、相対的に小さな直径、例えば、３〜７ｍｍ、例えば、３ｍｍ、３．２ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍおよび６．５ｍｍを有する。最も好ましくは、プローブは、その非常に高い強度のために、３ｍｍまたは３．２ｍｍ（１／８インチ）の直径を有する。
代わりに、この直接の超音波処理はまた、液体とまた直接接触しているフロー型超音波処理セル中で行うことができた。
【００４８】
ステップｂ）に適したプローブは、ステップａ）およびステップｃ）に適している。同じタイプのプローブを、ステップｂ）およびｃ）、またはｂ）、ｃ）およびａ）のために使用し得る。ステップｂ）、ｃ）およびａ）の間に異なるタイプのプローブを使用することがまた可能である。実際的な観点から、同じプローブを、ステップｂ）およびｃ）のために使用する。
【００４９】
ステップｂ）における超音波処理およびステップｃ）における超音波処理は、例えば、０．０１〜１０分間の少なくとも１２０μｍ、好ましくは、少なくとも２４０μｍの振幅でのプローブによって行う。振幅は、超音波処理の間のピークからピークまでのプローブの１つの動きの距離であり、超音波処理の強度の尺度である。所望の振幅は、プローブ直径によって設定の百分率を調節することによって達成し得る。例えば、２４０μｍの振幅は、３．２ｍｍの直径を有するプローブについて、例えば、超音波処理器を約３０％に設定することによって達成し得る。このような設定において、ステップｂ）およびｃ）において第２の液体混合物に適用される総エネルギーは、３分で約２７００Ｊであり得る。３００μｍの振幅は、３．２ｍｍの直径を有するプローブについて、例えば、超音波処理器を約４０％に設定することによって達成し得る。このような設定において、ステップｂ）およびｃ）において第２の液体混合物に適用される総エネルギーは、３分で約４１４０Ｊであり得る。プローブがより大きな直径を有するとき、超音波処理器の設定は、同じ振幅を達成するためにより高い百分率に設定し得る。超音波処理は典型的には、１６〜２４ｋＨｚ、例えば、２０ｋＨｚの周波数で行われる。
【００５０】
好ましくは、ステップｂ）およびステップｃ）における超音波処理の持続時間は、２〜６分、例えば、２．５〜５分である。
【００５１】
好ましくは、ステップｂ）およびステップｃ）における超音波処理の振幅は、２５０〜５００μｍ、例えば、２７０〜４００μｍ、例えば、２９０〜３５０μｍである。
【００５２】
特に好ましくは、ステップｂ）における超音波処理およびステップｃ）における超音波処理は、２９０〜３５０μｍの振幅で２．５〜５分間プローブによって行われる。
【００５３】
好ましくは、生体適合性界面活性剤の水溶液は、０．５〜３．０重量％、例えば、１〜２．５重量％、例えば、１．５〜２．０重量％の濃度を有する。
【００５４】
生体適合性疎水性ポリマーに対する生体適合性界面活性剤の重量比は、３：１〜１０：１、例えば、４：１〜８：１または５：１〜６：１である。生体適合性疎水性ポリマーに対する生体適合性界面活性剤の重量比が、少なくとも４：１であることが特に好ましく、これは、より小さな粒径およびより狭い粒径分布をもたらす。
【００５５】
ステップｃ）
ステップｃ）は、例えば、氷水浴中に第２の液体混合物を含有する容器を置くことによって、冷却しながら第２の液体混合物の超音波処理を維持することが関与する。
【００５６】
ステップｄ）
ステップｄ）は、極性溶媒をステップｃ）によって得られる第２の液体混合物から蒸発させ、ビーズの懸濁液を得ることが関与する。
【００５７】
これは、例えば、３℃から室温以内の温度にて、好ましくは、撹拌させながら行い得る。蒸発の持続時間は、例えば、６〜２４時間でよい。極性溶媒の蒸発の後、ＰＬＧＡ、ＰＦＣＥおよび任意選択で金属化合物を含むビーズは沈殿し、ビーズの懸濁液が得られる。
【００５８】
ステップｅ）
ステップｅ）は、ステップｄ）によって懸濁液から得たビーズを分離し、ビーズの水懸濁液を調製することが関与する。
【００５９】
分離は、例えば、遠心分離によって行い得る。遠心分離の加速および持続時間は、当業者が適切に選択し得る。例えば、遠心分離は、例えば、１５〜６０分間（例えば、３０〜４０分間）、例えば、１５０００〜３００００ｇ（例えば、１６０８７ｇまたは２７２００ｇ）で行い得る。
【００６０】
分離したビーズを、適切な量の水に再懸濁する。ステップｄ）によって得たビーズをこのように洗浄する。再懸濁は、浴型超音波処理または他の技術を含めた超音波処理によって行い得る。
【００６１】
分離および再懸濁ステップは、所望の通り繰り返し得る。
【００６２】
ステップｆ）
ステップｆ）は、ステップｅ）によって得た水懸濁液を凍結乾燥し、本発明によるビーズを得ることが関与する。凍結乾燥は、液体Ｎ２、または凍結相の間に−５０℃の最大温度を有する別の凍結系を使用して、当技術分野において周知のように行い得る。
【００６３】
好ましくは、本発明による方法は、ステップａ）において使用される１ｍｇの生体適合性疎水性ポリマー当たり少なくとも１ｍｇのビーズをもたらす。より好ましくは、本発明による方法は、ステップａ）において使用される１ｍｇの生体適合性疎水性ポリマー当たり少なくとも１．２ｍｇ、少なくとも１．５ｍｇまたは少なくとも１．８ｍｇのビーズをもたらす。
【００６４】
一部の好ましい実施形態では、本発明は、
ａ）ペルフルオロカーボンおよび任意選択で金属化合物を極性溶媒中のポリマー（好ましくは、ＰＬＧＡ）の溶液に加え、第１の液体混合物を提供するステップ、
ｂ）第１の液体混合物を、生体適合性界面活性剤であるポリビニルアルコールの水溶液、および任意選択で、ポリソルベートまたはポリビニルピロリドンからなる群から選択されるさらなる界面活性剤に超音波処理下で加え、第２の液体混合物を得るステップ、
ｃ）冷却しながら第２の液体混合物の超音波処理を維持するステップ、
ｄ）第２の液体混合物から極性溶媒を蒸発させ、ポリマー（好ましくは、ＰＬＧＡ）、ペルフルオロカーボンおよび任意選択で金属化合物を含むビーズの懸濁液を得るステップ、
ｅ）懸濁液からビーズを分離し、ビーズの水懸濁液を調製するステップ、および
ｆ）水懸濁液を凍結乾燥し、ビーズを得るステップ
を含む、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体、ポリ（乳酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリジメチルシロキサンおよびこれらの組合せからなる群から選択されるポリマー、ペルフルオロカーボン、ならびに任意選択で金属化合物を含むビーズの調製のための方法を提供し、
ステップｂ）における生体適合性界面活性剤への第１の液体混合物の添加は、最大で１０秒の期間以内で行われ、
ステップｂ）における超音波処理およびステップｃ）における超音波処理は、プローブによって少なくとも１２０μｍの振幅で１〜１０分間、液体混合物中で直接行われ、
ポリマー（好ましくは、ＰＬＧＡ）に対する生体適合性界面活性剤の重量比は、少なくとも３：１である。
超音波処理は好ましくは、少なくとも２４０μｍの振幅で行われる。
【００６５】
本発明による方法は、バッチ式で行い得る。代わりに、本発明による方法は、連続（微小）流プロセスにおいて行い得る。連続プロセスにおいて、直接の超音波処理は、フロー型超音波処理器セルにおいて行うことができる。
【００６６】
ビーズ
本発明はまた、本発明による方法によって得ることができるか、または得られるビーズに関する。
【００６７】
本発明はまた、均一な多ドメイン構造を有するビーズを調製するための本発明による方法の使用を提供し、ビーズは、生体適合性疎水性ポリマー、ペルフルオロカーボン、少なくとも１０重量％のポリビニルアルコールおよび任意選択で金属化合物を含む。
【００６８】
本発明はまた、均一な多ドメイン構造を有するビーズを提供し、ビーズは、生体適合性疎水性ポリマー、ペルフルオロカーボンおよび任意選択で金属化合物を含む。
【００６９】
別の態様によれば、本発明は、生体適合性疎水性ポリマー、ペルフルオロカーボン、ＰＶＡおよび任意選択で金属化合物を含むビーズを提供し、ビーズは、８５０ＭＨｚ分光計での乾燥状態でのＴ１Ｄおよび水膨潤状態でのＴ１Ｗの、１０ｋＨｚ  ＭＡＳでの固体核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって測定するようなスピン格子緩和時間を示し、
２５℃でのＴ１Ｄ−Ｔ１Ｗは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
１５℃でのＴ１Ｄ−Ｔ１Ｗは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
５℃でのＴ１Ｄ−Ｔ１Ｗは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
−５℃でのＴ１Ｄ−Ｔ１Ｗは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
−１５℃でのＴ１Ｄ−Ｔ１Ｗは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
−２５℃でのＴ１Ｄ−Ｔ１Ｗは、少なくとも０．０５秒である。
【００７０】
乾燥状態のビーズは、ステップｆ）の後に得た凍結乾燥したビーズとして理解される。水膨潤状態のビーズは、水に１０分間浸漬し、２１０００ｇの遠心分離に供したビーズとして理解される。
【００７１】
本発明によるビーズは、８５０ＭＨｚ分光計での乾燥状態でのＴ２Ｄおよび水膨潤状態でのＴ２Ｗの、１０ｋＨｚ  ＭＡＳでの固体核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって測定するようなスピン−スピン緩和時間を示し得、
２５℃でのＴ２Ｗ−Ｔ２Ｄは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
２０℃でのＴ２Ｗ−Ｔ２Ｄは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
１５℃でのＴ２Ｗ−Ｔ２Ｄは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
５℃でのＴ２Ｗ−Ｔ２Ｄは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
−５℃でのＴ２Ｗ−Ｔ２Ｄは、少なくとも０．０３秒であり、かつ／または
−１５℃でのＴ２Ｗ−Ｔ２Ｄは、少なくとも０．０５秒であり、かつ／または
−２５℃でのＴ２Ｗ−Ｔ２Ｄは、少なくとも０．０１秒である。
【００７２】
好ましくは、二次元異核１Ｈ−１９Ｆ  ＮＭＲ測定において、金属化合物を含まない本発明によるビーズは、１Ｈの４．７ｐｐｍでのピークおよび１９Ｆの−９２ｐｐｍでのピークの間の異核オーバーハウザー増進を示す。
【００７３】
本発明によるビーズは、好ましくは、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリジメチルシロキサンおよびこれらの組合せからなる群から選択される生体適合性疎水性ポリマーを含む。
最も好ましくは、生体適合性ポリマーは、ＰＬＧＡを含む。
【００７４】
生体適合性ポリマーの量は、ビーズの重量に対して、好ましくは、２〜１０重量％、より好ましくは、３〜８重量％の範囲である。
【００７５】
本発明によるビーズは、生体適合性界面活性剤としてポリビニルアルコールを含む。ビーズにおける生体適合性界面活性剤の存在は、例えば、熱重量分析または１Ｈ−ＮＭＲによって決定し得る。本発明によるビーズにおけるＰＶＡの量は、ビーズの重量に対して８〜４０重量％、好ましくは、１０〜３５重量％、または１１〜３０重量％であり得る。ビーズにおける生体適合性界面活性剤の量は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８２  （２００２）  １０５−１１４に記載されているように、例えば、比色法によって決定し得る。
【００７６】
好ましくは、ＰＶＡの量は、１Ｈ−ＮＭＲによって決定される。
【００７７】
ＰＶＡは、異なる分子量を有することができる。例えば、Ｍｗは、５０００〜５０００００の範囲であることができる。好ましくは、Ｍｗは、６０００〜２００００、または７０００〜１５０００ダルトンの範囲である。
【００７８】
ＰＶＡは、加水分解の程度６０〜９９％、好ましくは、７０〜９０％を有することができる。
【００７９】
好ましくは、本発明によるビーズは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定するように、最大で２００ｎｍのピーク半径および最大で０．２のＰＤＩを有する。
【００８０】
好ましくは、本発明によるビーズは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定するように、最大で１５０ｎｍ、または１４０ｎｍ、より好ましくは、９０〜１３０ｎｍのピーク半径を有する。
【００８１】
好ましくは、本発明によるビーズは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定するように、最大で０．１５または０．１４、より好ましくは、最大で０．１３、より好ましくは、最大で０．１０のＰＤＩを有する。
【００８２】
好ましくは、本発明によるビーズにおけるペルフルオロカーボン（好ましくは、ＰＦＣＥ）の量は、ビーズに対して、少なくとも１５重量％、より好ましくは、少なくとも２０重量％、例えば、２５〜５０重量％である。より高いペルフルオロカーボン含量は、イメージングの感受性のためにより有益である。
【００８３】
本発明によるビーズは、ＰＬＧＡ−ペルフルオロカーボンナノカプセルに対する従来技術を含めた、文献（ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｕｌｔｒａｓｏｎ  Ｆｅｒｒｏｅｌｅｃｔｒ  Ｆｒｅｑ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．２０１４  Ｊａｎ；６１（１）：５−１５，  Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  （２０  ｔｏ  ４０  ＭＨｚ）  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｌｉｑｕｉｄ−ｆｉｌｌｅｄ  ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ）において他の薬剤について記載されてきたようなコア−シェル構造、またはペルフルオロカーボンエマルジョン液滴、またはそれどころか相変化ペルフルオロカーボン液滴および微小気泡とは対照的に均一な構造（図１〜５を参照されたい）を有する。ポリマーマトリックス中に分布している複数のペルフルオロカーボンドメインを伴うこの独特の構造は、特に、超音波イメージング、光音響イメージングおよびさらなる用途、例えば、送達剤または治療剤に関してはっきりとした可能性につながる。
【００８４】
ビーズ中のさらなる成分
本発明によるビーズは、所望のイメージング目的のためのビーズの使用を可能とするためのさらなる成分を含み得る。
【００８５】
例えば、本発明によるビーズは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの用途のためにまたは細胞標識を増強するためにターゲティング剤を含み得る。用語「ターゲティング剤」は本明細書において、ビーズを関連性のある部位、または特定の細胞もしくは細胞型にｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで方向付ける薬剤を指す。特に有利なターゲティング剤は、抗体、ナノボディおよび受容体リガンドを含む。
【００８６】
本発明によるビーズは、蛍光剤、例えば、蛍光色素、量子ドット、炭素ドット、グラフェンドットまたは蛍光タンパク質、または蛍光剤をコードする核酸を含み得る。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、および組織学的または他の顕微鏡分析を含めた、ビーズの蛍光イメージングを可能とする。
【００８７】
本発明によるビーズは、放射性核種を含み得る。これは、オートラジオグラフィー、シンチグラフィー、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、または放射活性化合物を検出することができる他の検出方法を可能とする。また、ルシフェラーゼ酵素、またはルシフェラーゼ（もしくは関連する酵素）をコードする核酸ベクターを組み込むことによって、バイオルミネセンスを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの検出のために使用することができる。
【００８８】
ビーズはまた、生体適合性を修飾するさらなる薬剤、例えば、ＰＥＧまたは修飾されたＰＥＧコーティングでコーティングし得る。
【００８９】
特定のイメージング目的のための本発明によるビーズの使用に必要な成分は公知である。
【００９０】
これらの成分は、第１の液体混合物が所望のさらなる成分を含有するようにステップａ）において、または第２の液体混合物が所望のさらなる成分を含有するようにステップｂ）において、適切な形態で加えてもよい。例えば、ターゲティング目的のために、少しの薬剤をコーティングとしてビーズに加えてもよい。
【００９１】
ビーズの使用
本発明は、音響イメージング；光音響イメージング；超音波イメージング；内視鏡または術中イメージング；ラマン分光法を含めた分光技術；磁気共鳴イメージングまたは分光法技術、例えば、１Ｈまたは１９ＦのＭＲＩまたはＮＭＲまたはＭＲＳ；Ｔ１、Ｔ２およびＴ２*強調イメージング；プロトンまたは１９Ｆ密度強調イメージング；ＳＰＥＣＴ；ＰＥＴ；シンチグラフィー；バイオルミネセンスイメージングおよび蛍光イメージング断層撮影からなる群から選択される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのイメージングのための本発明によるビーズの使用に関する。
【００９２】
本発明はさらに、音響イメージング；光音響イメージング；超音波イメージング；内視鏡または術中イメージング；ラマン分光法を含めた分光技術；磁気共鳴イメージングまたは分光法技術、例えば、１Ｈまたは１９ＦのＭＲＩまたはＮＭＲまたはＭＲＳ；Ｔ１、Ｔ２およびＴ２*強調イメージング；プロトンまたは１９Ｆ密度強調イメージング；ＳＰＥＣＴ；ＰＥＴ；シンチグラフィー；バイオルミネセンスイメージングおよび蛍光イメージング断層撮影からなる群から選択される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのイメージングにおいて使用するための本発明によるビーズに関する。
【００９３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのイメージングは、診断イメージング、解剖学的イメージング、転移および血管系のイメージング、定量的イメージング、定性的イメージング、治療イメージング、細胞移植片のイメージング、細胞療法のイメージング、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞標識、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの顕微鏡観察またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組織学的検査の目的のためであり得る。
【００９４】
本発明は、音響イメージング；光音響イメージング；超音波イメージング；内視鏡または術中イメージング；ラマン分光法を含めた分光技術；磁気共鳴イメージングまたは分光法技術、例えば、１Ｈまたは１９ＦのＭＲＩまたはＮＭＲまたはＭＲＳ；Ｔ１、Ｔ２およびＴ２*強調イメージング；プロトンまたは１９Ｆ密度強調イメージング；ＳＰＥＣＴ；ＰＥＴ；シンチグラフィー；バイオルミネセンスイメージングおよび蛍光イメージング断層撮影からなる群から選択される、ｉｎ  ｖｉｖｏでのイメージングのための本発明によるビーズの使用に関する。
【００９５】
本発明はさらに、音響イメージング；光音響イメージング；超音波イメージング；内視鏡または術中イメージング；ラマン分光法を含めた分光技術；磁気共鳴イメージングまたは分光法技術、例えば、１Ｈまたは１９ＦのＭＲＩまたはＮＭＲまたはＭＲＳ；Ｔ１、Ｔ２およびＴ２*強調イメージング；プロトンまたは１９Ｆ密度強調イメージング；ＳＰＥＣＴ；ＰＥＴ；シンチグラフィー；バイオルミネセンスイメージングおよび蛍光イメージング断層撮影からなる群から選択される、ｉｎ  ｖｉｖｏでのイメージングにおける使用のための本発明によるビーズに関する。
【００９６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのイメージングは、診断イメージング、解剖学的イメージング、転移および血管系のイメージング、定量的イメージング、定性的イメージング、治療イメージング、細胞移植片のイメージング、細胞療法のイメージング、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞標識、ｉｎ  ｖｉｖｏでの顕微鏡観察またはｉｎ  ｖｉｖｏでの組織学的検査の目的のためであり得る。
【００９７】
本発明は、本明細書に記載されているフィーチャの全ての可能な組合せに関することが留意され、特に好ましいのは、特許請求の範囲において存在するフィーチャのこれらの組合せである。したがって、本発明による組成物に関するフィーチャの全ての組合せ；本発明による方法に関するフィーチャの全ての組合せ、および本発明による組成物に関するフィーチャの全ての組合せ、および本発明による方法に関するフィーチャは、本明細書に記載されていることが認識される。
【００９８】
用語「含む」は、他の要素の存在を除外しないことがさらに留意される。しかし、特定の成分を含む生成物／組成物についての説明はまた、これらの成分からなる生成物／組成物を開示することをまた理解すべきである。これらの成分からなる生成物／組成物は、生成物／組成物の調製のためのより単純でより経済的な方法を提供するという点で有利であり得る。同様に、特定のステップを含む方法についての記載はまた、これらのステップからなる方法について説明することをまた理解すべきである。これらのステップからなる方法は、より単純でより経済的な方法を提供するという点で有利であり得る。
【００９９】
本発明を、下記の実施例によってこれから明らかにするが、しかし、これらに限定されない。
【実施例】
【０１００】
実験１〜６：金属化合物を含むビーズの調製
ＰＬＧＡ（１００ｍｇ、ｒｅｓｏｍｅｒ５０２Ｈ）を、３ｍＬのジクロロメタンに溶解した。ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル（９００μＬ、１６００ｍｇ）およびＰｒｏｈａｎｃｅ（１．７８ｍＬ、４９７ｍｇのガドテリドール）をＰＬＧＡの溶液に加え、３ｍｍのチップ直径を有するマイクロチップを４０％の振幅で１５秒間使用して、第１のエマルジョンを超音波処理によって形成した（ＢｒａｎｓｏｎからのＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ｓ２５０）。この第１のエマルジョンを、丸底フラスコ中のポリ（ビニルアルコール）の溶液（９０００〜１００００ＤａのＭｗおよび８０％加水分解）（２５ｇの水および１００〜５００ｍｇのＰＶＡ）に急速に（１０秒以内で）加え、その間に、ＰＶＡ含有フラスコの超音波処理を開始した。全混合物は、３ｍｍのチップ直径を有するマイクロチップを２０％または４０％の振幅で使用して氷水浴において超音波処理し、第２のエマルジョンを得た。２０％の超音波処理の設定は、約１６０μｍの振幅を指し、一方、４０％の超音波処理の設定は、約３００μｍの振幅を指す。
第１のエマルジョンの添加から超音波処理の終わりまでの期間の持続時間は３分であった（ＢｒａｎｓｏｎからのＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ｓ２５０）。
【０１０１】
超音波処理の後、ジクロロメタンを撹拌しながら４℃または室温にて一晩蒸発させ、ビーズの凝固を達成した。ビーズを５０ｍＬの遠心分離管において２０分間の２７２００ｇでの遠心分離によって単離し、２５ｇの水に再懸濁した。洗浄ステップをさらに２回繰り返し、第２の洗浄の後に超音波処理による再懸濁（超音波処理浴、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ  Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ）を伴った。洗浄後、ビーズを４ｍＬの水に再懸濁させ、液体Ｎ2で凍結し、凍結乾燥した。このように得られた生成物は、白色の粉末であった。
【０１０２】
異なる成分の量および超音波処理振幅を、ビーズの特性および収量と一緒に表１において示す。
【０１０３】
【表１】
2019510759.tif 000006
【０１０４】
狭い粒径分布を有する小さなビーズは、本発明による方法によって得た（実験４、５および６）。高い振幅（４０％）および多量のＰＶＡ（２００ｍｇ（８．３重量％）、３５０ｍｇ（１３．７重量％）または５００ｍｇ（１８．５重量％））は、小さな半径、低いＰＤＩ、高いＰＦＣＥ含量および高収率の望ましい組合せをもたらしたことを観察することができる。
【０１０５】
実験７〜９：金属化合物を有さないビーズの調製
ＰＬＧＡ（１００ｍｇ、ｒｅｓｏｍｅｒ５０２Ｈ）を、３ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、それに続いてペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル（９００μＬ）を加えた。このように得られた二重相液体を、丸底フラスコ中のポリ（ビニルアルコール）の溶液（２５ｇの水および１００〜５００ｍｇのＰＶＡ）にガラス製ピペットで急速に加え、その間に、超音波処理を開始した。ＰＬＧＡ／ＤＣＭの相およびＰＦＣＥの相を、一定の比で同時に加えるように気をつけた。全混合物は、３ｍｍのチップ直径を有するマイクロチップを２０％または４０％の振幅で使用して氷水浴において超音波処理し、エマルジョンを得た。二重相液体の添加から超音波処理の終わりまでの期間の持続時間は３分であった（ＢｒａｎｓｏｎからのＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ｓ２５０）。
【０１０６】
超音波処理の後、ジクロロメタンを撹拌しながら４℃または室温にて一晩蒸発させ、ビーズの凝固を達成した。ビーズを５０ｍＬの遠心分離管において３５分間の２７２００ｇでの遠心分離によって単離し、２５ｇの水に再懸濁した。洗浄ステップをさらに２回繰り返し、第２の洗浄の後に超音波処理による再懸濁（超音波処理浴、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ  Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ）を伴った。洗浄後、ビーズを４ｍＬの水に再懸濁させ、液体Ｎ2で凍結し、凍結乾燥した。このように得られた生成物は、少なくとも１００ｍｇの収量を伴って白色の粉末であった。
【０１０７】
【表２】
2019510759.tif 000007
【０１０８】
狭い粒径分布および高いＰＦＣＥ含量を有する小さなビーズは、本発明の方法によって高収率で得た（実験９）。
【０１０９】
実験１０〜１２（比較）
ＰＬＧＡを表３において示す溶媒に溶解したことを除いては、実験６を繰り返した。
【０１１０】
【表３】
2019510759.tif 000008
【０１１１】
得られたビーズはより大きく、溶媒がジクロロメタンであった実験より広範なサイズ分布を有する。
【０１１２】
実施例１〜１２によって調製したビーズの直径は、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１０  Ｓｅｐ；  ３１  （２７）：７０７０−７に記載されているように、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して決定した。
【０１１３】
実験１３（比較）：カップホーンを使用したビーズの調製
ＰＬＧＡ（９０ｍｇ、ｒｅｓｏｍｅｒ５０２Ｈ）を、３ｍＬのジクロロメタンに溶解した。ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル（８９０μＬ）をＰＬＧＡの溶液に加えた。３ｍｇ／ｍＬの濃度を有するＰｒｏｈａｎｃｅを含む５０ｍＬの水溶液をさらに加えた。この混合物を、ガラス管においてポリ（ビニルアルコール）（２０ｇ／Ｌ）の溶液に滴下で添加し、その間に、ＰＶＡ含有フラスコの超音波処理を開始した。全混合物を、６０ｓのオンおよび１０ｓのオフサイクルを伴う、３０％の振幅で３分間カップホーンにおいて超音波処理し（ＢｒａｎｓｏｎからのＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ｓ２５０）、第２のエマルジョンを得た。超音波処理の間に、冷却水の温度は、冷却循環器によって４℃にて維持した。
【０１１４】
超音波処理の後、ジクロロメタンを撹拌しながら４℃にて一晩蒸発させ、ビーズの凝固を達成した。ビーズを２ｍＬの遠心分離管において３０分間の２１０００ｇでの遠心分離によって単離し、２５ｇの水に再懸濁した。ペレットを水で２回洗浄し、次いで、水に再懸濁させ、−８０℃にて凍結し、凍結乾燥した。このように得られた生成物は、５０ｍｇの収量を伴って白色の粉末であった。
【０１１５】
本発明による実施例（実験５、６、９）は、実験１３と比較して非常により高い収量をもたらした。
【０１１６】
実験１４（比較）；他の界面活性剤の使用（ＰＶＡなし）
ＰＶＡが本発明の粒子の形成に必要であるかどうかを研究するために、本発明者らは、ペルフルオロカーボンを有さない空のＰＬＧＡ粒子の生成のために、一般に使用される他の界面活性剤による生成を試験した（表４）。しかし、全てのこれらの界面活性剤によって、本発明者らは、ナノ粒子のサイズおよび多分散性において強い増加を観察した。特に、０．５より全てより高いＰＤＩ値は、試料の非常に広範なサイズ分布を示す。さらに、ＰＦＣＥのカプセル化は、有意により低いか、またはそれどころかＮＭＲで測定可能でなかった。要約すれば、ナノ粒子の合成は、他の界面活性剤では可能でなかった。したがって、本発明者らは、ＰＶＡが、ナノ粒子の安定化のために、およびＰＦＣＥのカプセル化のために必要不可欠であると結論付ける。
【０１１７】
【表４】
2019510759.tif 000009
【０１１８】
試験方法
ＰＦＣＥの定量化
ＰＦＣＥ含量は、溶媒としてＤ２Ｏ（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）および内部参照としてトリフルオロ酢酸を使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ４００ＭＨｚ分光計において１９Ｆ  ＮＭＲで測定した。緩和遅延Ｄ１は、２０ｓに設定した。データ評価は、ＭｅｓｔｒｅｌａｂからのＭｅｓｔｒｅＮｏｖａ１０．０で行った。
【０１１９】
２Ｄ異核オーバーハウザー増進分光法
ＰＦＣＥ−粒子のＨＯＥＳＹを、緩和遅延Ｄ１＝２．０ｓおよびクロス緩和遅延Ｄ８＝０．２５ｓ、４７１ＭＨｚ（19Ｆ）、５００ＭＨｚ（1Ｈ）を伴う、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＭＸ  ５００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計で溶媒としてＤ２Ｏ中で測定した。ＰＦＣＥを装填したコア−シェルカプセルのＨＯＥＳＹは、Ｄ１＝２．０ｓおよびＤ８＝０．１５ｓ、３７７ＭＨｚ（19Ｆ）、４００ＭＨｚ（1Ｈ）を伴う、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ４００ＭＨｚ分光計で行った。データ評価は、ＭｅｓｔｒｅｌａｂからのＭｅｓｔｒｅＮｏｖａ１０．０で行った。
【０１２０】
ＰＶＡの定量化
ＰＶＡの濃度は、溶媒としてＤ２Ｏを伴うＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ４００ＭＨｚ分光計において、内部参照としてレソルシノールを使用して１Ｈ  ＮＭＲで測定した。緩和遅延Ｄ１＝３０ｓ。データ評価は、ＭｅｓｔｒｅｌａｂからのＭｅｓｔｒｅＮｏｖａ  １０．０で行った。
【０１２１】
固体ＮＭＲ
固体ＮＭＲは、１０ｋＨｚ  ＭＡＳでのＶａｒｉａｎ  ＶＮＭＲＳ  ８５０ＭＨｚ分光計で測定した。乾燥状態の粒子を測定するために、本発明者らは、本特許において記載されている方法によって得た凍結乾燥したナノ粒子粉末を使用した。水で膨潤したナノ粒子を得るために、凍結乾燥した粉末を過剰な水と共に５分間インキュベートし、次いで、ｈｅｔｔｉｃｈ  ｍｉｃｒｏ２００Ｒ遠心機を使用して１５０００ｒｐｍで遠心した。次いで、固体ＮＭＲ測定のために、遠心分離からのペレットをローター中に直ちに充填した。データ評価は、ＭａｔＮＭＲで行った。
【０１２２】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＤＳＣは、測定およびデータ分析のためのＳＴＡＲｅソフトウェア１１．０を使用して、加熱速度２Ｋ／分で窒素雰囲気下にて、ＦＲＳ５センサー、Ｊｕｌａｂｏ  ＦＴ９００浸漬クーラー、ＴＳＯ  ８０１ＲＯ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｒｏｂｏｔを備えたＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＳＣ８２２ｅ熱量計で測定した。
【０１２３】
熱重量分析（ＴＧＡ）
ＴＧＡは、２０Ｋ／分の加熱速度を伴う、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＴＧＡ／ＳＤＴＡ８５１ｅ機器で窒素雰囲気下にて測定した。
【０１２４】
動的光散乱（ＤＬＳ）
ＤＬＳは、０．１ｍｇ／ｍＬの試料濃度で脱イオン水中、Ｍａｌｖｅｒｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳ  ｎａｎｏにおいて行った。
【０１２５】
Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ）
ＳＡＸＳ測定は、ＧｅｎｉＸ−Ｃｕ超低発散源（ｌ＝１．５４Å、１×１０８ｐｈ／ｓの流速）、Ｐｉｌａｔｕｓ３００Ｋシリコンピクセル検出器（４８７×６１９ピクセルの１７２×１７２μｍ２）、Ｌｉｎｋａｍ温度調節器（−８０〜２５０℃）、Ｊｕｌａｂｏ温度調節器（−５〜８０℃）、ｑ範囲０．００３〜３Å-1を備えたＧａｎｅｓｈａＸ線機器で行った。
【０１２６】
Ｘ線回折（ＸＲＤ）
ディフラクトグラムは、ＣｕＫα放射線を使用して、高精度焦点シールド管、およびＰＩＸｃｅｌ３Ｄ検出器を伴う、反射モードでのＰａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｅｍｐｙｒｅａｎ上で測定した。スキャン範囲は、０．０１３度のステップサイズを伴う２〜５０度の２シータであった。
【０１２７】
特徴づけ
本発明の方法によって得たビーズを、様々な方法によって特徴づけした。
【０１２８】
国際公開第２０１４／０４１１５０号からの実験である実験１３において調製した粒子は、ＰＬＧＡ、ＰＦＣＥおよびＧｄ−キレートからなる。これらの粒子と対照的に、新規なビーズ（実験１〜６を参照されたい）は、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を含有し、これは安定的および単分散の粒子の形成を促進する乳化プロセスの間に安定剤として使用した。
【０１２９】
このように、本発明による方法は、国際公開第２０１４／０４１１５０号による方法と異なる組成を有する粒子をもたらす。粒子組成のこの変化は、1Ｈ  ＮＭＲ測定によって示すことができる。図１は、古い特許からの粒子、および内部参照としてレソルシノールを有する新規な粒子の定量的1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。粒子形成の後のＰＬＧＡ鎖の移動度の低減によって、ＰＬＧＡは、ＮＭＲによって検出することができず、レソルシノールおよびＰＶＡのシグナルのみは、両方のスペクトル上で可視である。
【０１３０】
国際公開第２０１４／０４１１５０号の方法（左）および新規な方法（右）によって生成される粒子の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを測定した（図１を参照されたい）。内部参照としてレソルシノール（４．１ｍｇ）；４００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ、緩和減衰＝２０ｓを伴って、スペクトルを測定した。右のスペクトルにおける差し込み図：ＰＶＡの化学構造、加水分解されていないＯＨ基は単純化のために示さない。
【０１３１】
４．０６ｐｐｍでのピークは、図１の右の差し込み図に示されるように、モノマー繰り返し単位のＨ−ＣＯＨ基のプロトンに相当する。７．１８でのレソルシノールの三重項シグナルの積分、４．０６ｐｐｍでのＰＶＡピークの積分、およびＰＶＡの平均分子量９５００ｇ／ｍｏｌ（メーカーによる分子量９０００〜１００００ｇ／ｍｏｌ）は、計算することができ、下記のＰＶＡ含量がもたらされる。
・国際公開第２０１４／０４１１５０号の方法からの粒子：７重量％
・新規な方法からの粒子：２３重量％
【０１３２】
説明において示される固体ＮＭＲ測定および２Ｄ溶液ＮＭＲは、ＰＦＣＥが水と相互作用することを示した。ＰＶＡは親水性ポリマーである一方、ＰＬＧＡは水に可溶性ではない疎水性ポリマーであるため、新規な粒子中に存在するＰＶＡは、ＰＦＣＥおよび水の間のこの相互作用を促進し、独特の構造をもたらしたことを本発明者らは想定する。ＰＦＣＥは、水とは通常混合しない超疎水性化合物である。このように、文献においてこれまで報告された粒子またはエマルジョンは典型的には、コア−シェル構造を有する。
【０１３３】
実験１５（比較）
本発明者らの粒子の独特の構造を立証するために、本発明者らは、さらなる対照としてコア−シェルカプセルを調製した。これらのコア−シェルカプセルを作製するために、本発明者らは、Ｐｉｓａｎｉらによって従前に記載された、界面活性剤としてコール酸ナトリウムを有するＰＦＯＢを装填したカプセルの合成のための手順を使用した（Ａｄｖ．  Ｆｕｎｃｔ．  Ｍａｔｅｒ．  ２００８，  １８，  ２９６３−２９７１）。この手順において、本発明者らは、ＰＦＯＢを０．９ｍＬのＰＦＣＥと置き換え、ＰＦＣＥカプセルを作製したが、次いで、これを本発明者らのＰＦＣＥビーズと直接比較することができる。
【０１３４】
ＰＬＧＡ（１００ｍｇ、ｒｅｓｏｍｅｒ５０２Ｈ）を３ｍＬのジクロロメタンに溶解し、ガラス製ピペットで上下することによってペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル（９００μＬ）またはペルフルオロオクチルブロミド（ＰＦＯＢ、２７５μＬ）と混合した。このように得られた一次エマルジョンを、コール酸ナトリウムの１．５重量％溶液に加え、４０％の振幅で氷上にて３分間超音波処理した（ｂｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ｓ２５０）。超音波処理の後、ジクロロメタンを撹拌しながら室温にて一晩蒸発させた。界面活性剤を交換するために、ＰＶＡ溶液（１０ｇの１．９６重量％）を懸濁液に加え、混合物を４℃にて５日間撹拌した。エマルジョンを１６０００ｇにて水で２回洗浄し、振盪機上で４℃にて４ｍＬの水に再懸濁し、液体Ｎ２で凍結し、凍結乾燥した。
【０１３５】
合成によって、Ｒh＝６２ｎｍおよびＰＤＩ０．０９を有する凍結乾燥したカプセルを生じさせた。
【０１３６】
本発明者らの粒子と対照的に、このナノ−カプセルは、ＮＭＲにおいて、ＰＦＣＥ中のＦ原子、および水の間のＨＯＥＳＹを殆ど示さない（図９）。これらのカプセルのコア−シェル構造によって、水は、超疎水性ＰＦＣＥコアの中を浸透することができない。したがって、水およびＰＦＣＥの間の相互作用は殆ど存在しない。僅かな残留ＨＯＥＳＹシグナルは、コアとシェルとの接触域、すなわち、ＰＦＣＥ充填物とＰＬＧＡシェルとのインターフェースからもたらされ得る。対照的に、本発明者らの粒子は、ＰＦＣＥ中の水のプロトンおよびフッ素原子の間の広範なＨＯＥＳＹを示す（図３）。親水性ＰＶＡによって安定化される本発明者らの粒子の均一な多ドメイン構造によって、水およびＰＦＣＥの間の接触域は非常により多く、より強いＨＯＥＳＹをもたらす。
【０１３７】
所見：
Ｇｄは常磁性であるため、ＨＯＥＳＹはＧｄ含有粒子では測定することができない。従来技術（Ｐｉｓａｎｉ）は、実験をどのように行うかについての必要不可欠な詳細を見逃した。その発明者らは、これらのカプセルを作製するためのその発明者らの超音波処理器を使用し、そのように文献からの正確な超音波処理の設定を使用することができなかった。その発明者らは、カプセルを得るためにこれが重要であるとは考えない。
【０１３８】
その発明者らが使用した方法は、その発明者らの博士論文の１つと組み合わせたそのグループからのいくつかの論文に基づいた。問題は、その発明者らが完成していない方法（例えば、界面活性剤の容量をスキップすること）をしばしば発表したことであった。
【０１３９】
膨潤したカプセルのｓｓＮＭＲは、濃縮された水溶液中でこれらがそれほど安定的ではないため測定することができなかったが、ｓｓＮＭＲは数時間かかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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