(57)【要約】  本発明は、１つまたは多数の非孔増加結合ドメインを含むトランス−スプライシングＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）分子；前記ｔｓＲＮＡを含む細胞またはベクター；および前記ｔｓＲＮＡを使用する細胞を殺すためのまたは疾患を治療するための方法に関する。
2019509756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療すべき疾患に関連するかまたは治療すべき疾患のためのバイオマーカーである遺伝子の少なくとも一部分に特異的な少なくとも１つの結合ドメイン；
少なくとも１つの発現可能な自殺タンパク質または自殺系の成分であるタンパク質をコードする核酸；および
少なくとも１つのスプライスシグナル、
を含むトランス−スプライシングＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）分子であって、
前記結合ドメインは、内部結合および／または自己相補的配列を有しない少なくとも２５個の連続的な非構造化されたヌクレオチド（ｎｔ）を含む結合部位を含み、そして前記結合部位内にまたは当該部位の外に、前記結合ドメインは、４４ｎｔまたはそれより長い場合、少なくとも１つのまたは複数の、前記遺伝子に対するミスマッチヌクレオチドを有する、
トランス−スプライシングＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）分子。
【請求項２】
前記結合部位が、次の個数のヌクレオチドを含むかまたは次の個数のヌクレオチドからなるリストから選択されるヌクレオチドの配列を含む、請求項１に記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子：２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、６９，７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００個またはそれを超えるヌクレオチド。
【請求項３】
前記結合ドメインが、治療すべき疾患に関連するかまたは治療すべき疾患のためのバイオマーカーである遺伝子の前記一部分に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％または１００％相補的であるヌクレオチドの配列を含む、請求項１または２に記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記結合ドメインにおけるミスマッチが、前記結合部位を含めるかまたは当該結合部位を除いて、標的に対して完全に相補的な４５ｎｔのまたはそれより長い区間を回避するように位置する、請求項１〜３のいずれか１つに記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記ミスマッチが、５’または３’末端から少なくとも５ヌクレオチドである、請求項４に記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記の少なくとも１つの発現可能な自殺タンパク質が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）である、請求項１〜５のいずれか１つに記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記核酸が複数の発現可能な自殺タンパク質または自殺系の成分である複数のタンパク質をコードする、請求項１〜６のいずれか１つに記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記ｔｓＲＮＡが３’ＥＲを誘発する、請求項７に記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記ｔｓＲＮＡが前記結合ドメインに隣接するスペーサー配列も含む、請求項１〜８のいずれか１つに記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記のトランス−スプライシングＲＮＡ分子が、治療すべき疾患に関連するかまたは治療すべき疾患のためのバイオマーカーである遺伝子の同一のもしくは異なる部分に対して相補的である前記結合ドメインを複数含む、請求項１〜９のいずれか１つに記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記結合ドメインが、治療すべき疾患に関連するかまたは治療すべき疾患のためのバイオマーカーである異なる遺伝子に相補的である、請求項１〜９のいずれか１つに記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記ｔｓＲＮＡが、結合ドメインの外側に、少なくとも１つのシス結合もしくは自己結合ドメインを含む、請求項１〜１１のいずれか１つに記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記ｔｓＲＮＡが、結合ドメインの外側かつ前記分子の３’に、自己相補的な配列の存在のために折りたたまれるかまたは自身と対を形成するＲＮＡの高度に構造化された配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項１４】
高度に構造化されたＲＮＡが、それとポリＡ部位の間に位置したスペーサーに隣接する、請求項１３に記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項１５】
高度に構造化されたＲＮＡが、活性もしくは不活性リボザイムである、請求項１４に記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記ｔｓＲＮＡが５’ＥＲを誘発する、請求項１４または１５に記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記ｔｓＲＮＡが５’または３’ＥＲを誘発する、請求項１〜７または９〜１５のいずれか１つに記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記疾患が、癌またはウイルス感染または細菌感染または転位因子、放射線、化学物質もしくは未知の誘因により誘発された突然変異により引き起こされる後天性遺伝疾患である、請求項１〜１７のいずれか１つに記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記癌が、肝細胞がん（ＨＣＣ）、子宮頸がん、膣癌、外陰癌、陰茎癌、皮膚癌、悪性黒色腫を含む黒色腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、メルケル細胞癌、肺癌、細胞膀胱癌（ｃｅｌｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、乳癌、結腸または直腸癌、肛門癌、子宮内膜癌、腎癌、白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｐ−ＴＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、リンパ腫、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、鼻咽頭癌、口腔または咽頭癌、口腔咽頭癌、胃癌、脳腫瘍、骨の癌および幹細胞の癌である、請求項１８に記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記ウイルス感染が、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）を含むレトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型および２型（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）を含むレンチウイルス、１６型および１８型（ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８）を含むヒトパピローマウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶおよびＨＥＶを含む肝炎ウイルス、単純ヘルペス（ＨＳＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を含むヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、インフルエンザウイルスまたは他の任意の組み込みウイルスによる感染である、請求項１８に記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項２１】
前記細菌感染が、細菌、例えばバントネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ種、サルモネラ・チフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ブルセラ種、レジオネラ種、マイコバクテリア種、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｎｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ノカルジア種、ロドコッカス種、エルシニア種、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）等による感染である、請求項１８に記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項２２】
前記の後天性遺伝疾患が、神経線維腫症１型および２型、マッキューン・オルブライト、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、表皮水疱症、ファンコニＡおよびＣ、フィラデルフィア染色体、血友病ＡおよびＢ、嚢胞性線維症、マックル・ウェルズ症候群、リポタンパク質リパーゼ欠損症、Ｂ−サラセミア、ピルビン酸脱水素酵素複合体欠損症等である、請求項１８に記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１つに記載の前記ｔｓＲＮＡを含む細胞。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１つに記載の前記ｔｓＲＮＡを含むベクター。
【請求項２５】
前記ベクターが、裸の核酸をベースとするベクター、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２６】
前記の裸の核酸をベースとするベクターが、ＲＮＡ分子、プラスミド、ＤＮＡミニサークルまたはダンベル型ＤＮＡ最小ベクターを含む、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
前記の非ウイルスベクターが、リポソーム小胞、ナノ粒子、ポリマーコンジュゲート、抗体コンジュゲート、細胞貫通ペプチドまたはポリマーカプセルを含む、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２８】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、キメラウイルスベクター、シンドビス・ウイルスベクターまたはアルファウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクターおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２９】
異常細胞を標的化する方法であって、請求項１〜２２のいずれか１つに記載のｔｓＲＮＡまたは前記ｔｓＲＮＡを含むベクターでの、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、腫瘍中への、局所適用；経鼻適用；肺胞適用；全身適用；経口適用；静脈内適用；筋肉適用；皮下適用；皮膚適用；腹腔内適用または注射、および、任意選択的に、前記細胞を、前記細胞を殺すために有効な前記自殺系の他の成分（単数または複数）に曝露することを含む方法。
【請求項３０】
細胞を殺す方法であって、前記細胞を、請求項１〜２２のいずれか１つに記載のｔｓＲＮＡまたは前記ｔｓＲＮＡを含むベクターで、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、トランスフェクション、リポフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクションまたは形質転換すること、および任意選択的に、前記細胞を殺すために有効な前記自殺系の他の成分（単数または複数）に前記細胞を曝露することを含む方法。
【請求項３１】
疾患を治療する方法であって、異常細胞を、請求項１〜２２のいずれか１つに記載のｔｓＲＮＡまたは前記ｔｓＲＮＡを含むベクターで、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、トランスフェクション、リポフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクションまたは形質転換すること、および任意選択的に、前記細胞を殺すために有効な前記自殺系の他の成分（単数または複数）に前記細胞を曝露することを含む方法。
【請求項３２】
前記自殺系の前記成分（単数または複数）が、ガンシクロビル、シトシンデアミナーゼ−５−フルオロシトシン、シトクロムＰ４５０−イホスファミド、シトクロムＰ４５０−シクロホスファミドおよびニトロレダクダーゼ−５−［アジリジン−１−イル］−２，４−ジニトロベンズアミドを含むかまたはこれらからなる群から選択される、請求項２９〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が哺乳類である、請求項１９〜２２のいずれか１つに記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子または請求項２３に記載の細胞または請求項２９〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞がヒトである、請求項１９〜２２のいずれか１つに記載のトランス−スプライシングＲＮＡ分子または請求項２３に記載の細胞または請求項２９〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜２２のいずれか１つに記載の前記ｔｓＲＮＡまたは請求項２４〜２８のいずれか１つに記載のベクターおよび、任意選択的に、前記トランス−スプライスされたＲＮＡを発現する細胞の死を誘発するために有効な前記自殺系の少なくとも１つのさらに別の成分を含む薬剤。
【請求項３６】
請求項１〜２２のいずれか１つに記載の前記ｔｓＲＮＡまたは請求項２４〜２８のいずれか１つに記載のベクター；任意選択的に、前記トランス−スプライスされたＲＮＡを発現する細胞の死を誘発するために有効な前記自殺系の少なくとも１つのさらに別の成分；およびヒトまたは獣医学的用途に適したキャリアーを含む医薬組成物。
【請求項３７】
前記自殺系の前記１つのさらに別の成分が、ガンシクロビル、シトシンデアミナーゼ−５−フルオロシトシン、シトクロムＰ４５０−イホスファミド、シトクロムＰ４５０−シクロホスファミドおよびニトロレダクダーゼ−５−［アジリジン−１−イル］−２，４−ジニトロベンズアミドを含むかまたはこれらからなる群から選択される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つまたは複数の非構造化結合ドメインを含むトランス−スプライシングＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）分子；前記ｔｓＲＮＡを含む細胞またはベクター；および前記ｔｓＲＮＡを使用する細胞を殺すためのまたは疾患を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スプライソソームが介在するＲＮＡトランス−スプライシング（ＳＭａＲＴ）は、それによって２つの別個の前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）または他のスプライシング可能なＲＮＡがトランスで連結して核においてキメラＲＮＡを生成するプロセスであり、該キメラＲＮＡは核輸出後に、細胞質においてキメラタンパク質の形成を誘発する。この技術は、例えば突然変異を有するものを、無傷のエキソンで置き換えることにより欠損のあるＲＮＡを修復するために、または内因性のメッセージを機能性配列で標識するために、使用することができる。  
【０００３】
しかしながら、トランス−スプライシングをベースとする修復は達成するのが困難であり、なぜならば、永続的な修復のためにはトランス−スプライシングＲＮＡが継続的に送達されるか、またはゲノムへの組み込み後に内因的に発現される必要があり、また、標的内の意図されるスプライス部位への正確なスプライシングが必要であり、そして、それは通常のシス−スプライシングとの激しい競争にもかかわらずに治療的な表現型を誘発するのに十分に効率的でなければならないからである。  
【０００４】
トランス−スプライシングをベースとする機能性配列での標識は、例えば、生細胞における遺伝子の発現、または自殺遺伝子治療アプローチにおける異常転写物を発現する細胞の死を選択的に誘発するための死シグナルをモニターするための蛍光タンパク質をコードするＲＮＡに関する。異常転写物、異常細胞のためのバイオマーカーであり得、例えば癌に特異的ながん遺伝子の転写物またはウイルス転写物である。上記の死シグナルは、ａ）毒素のような直接的なシグナル、例えばジフテリアまたはコレラ毒素、ｂ）アポトーシス遺伝子、例えばカスパーゼ、またはｃ）酵素、例えばガンシクロビル（ＧＣＶ）のような薬物の共送達において死シグナルを誘発する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、によって誘発され得る。直接的な毒素ａ）またはアポトーシスシグナルｂ）は、即座に細胞死を誘発することができるが、残念ながらこれらは、非特異的なターゲッティングまたはオフターゲッティングに伴うリスクを増加させる。これは、上記の技術の規制承認を問題のあるものにしてしまう。対照的に、それら自体は細胞に対して毒性でない２つの成分ｃ）の組み合わせの使用は、はるかに安全なアプローチを示す。  
【０００５】
治療として、トランス−スプライシング誘発性の細胞死は、トランス−スプライシングをベースとする修復よりも達成するのが容易であり、なぜならばトランス−スプライシングコンストラクトを、一度だけ標的細胞中に送達する必要があり、従って長期の発現は不要だからである。さらに、選択的オンターゲット・トランス−スプライシング、すなわち正確な標的に向けられ、そのような標的のいずれのスプライス部位にも関与しないトランス−スプライシングは不利ではなく、むしろ標的特異的な死シグナルに寄与し、トランス−スプライシングは、標的細胞を殺すために十分に強力なシグナルを誘発するために高度に効率的である必要はない。
【０００６】
ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ系に基づいて、我々は、有効なトランス−スプライシングをベースとする自殺遺伝子治療アプローチを開発した。我々は、５’および３’エキソン置換（ＥＲ）両方のための、すなわち、自殺遺伝子または自殺遺伝子系の構成要素、例えばＨＳＶｔｋを、標的メッセージの５’または３’末端のいずれかに加えるための、新規のトランス−スプライシングＲＮＡを設計した。トランス−スプライシングＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）のオンターゲット活性および特異性の両方を改善するために、ＲＮＡ構造設計を研究した。
【発明の概要】
【０００７】
第１の態様によると、以下を含むトランス−スプライシングＲＮＡが提供される：
治療すべき疾患に関連するかまたは治療すべき疾患のためのバイオマーカーである遺伝子の少なくとも一部分に特異的な少なくとも１つの結合ドメイン；
少なくとも１つの自殺タンパク質または自殺系の成分であるタンパク質をコードする核酸；および
少なくとも１つのスプライスシグナル；
ここで、前記結合ドメインは、内部結合および／または自己相補的配列を有しない少なくとも２５個、より好ましくは３５個、より一層好ましくは４５個、最も好ましくは５５個またはそれ以上の連続的な非構造化ヌクレオチド（ｎｔ）を含む結合部位を含み、そして；前記結合ドメインが４４ｎｔまたはそれより長い場合、前記結合ドメインは、前記結合部位内にまたは当該部位の外に、少なくとも１つの、または複数の、前記遺伝子に対するミスマッチヌクレオチド（単数または複数）を有する。
【０００８】
治療すべき疾患に関連するかまたは治療すべき疾患のためのバイオマーカーである遺伝子に対する本明細書における言及は、前記疾患の特徴であり、したがって前記疾患が生じた場合に専らまたは優先的に存在するかまたは発現される遺伝子に対する言及である。
【０００９】
自殺系の成分であるタンパク質に対する本明細書における言及は、少なくとも１つの他の分子と相互作用するタンパク質であって、当該相互作用により前記タンパク質を発現する細胞の死を誘発するかまたはもたらすタンパク質に対する言及である。
【００１０】
当業者には、ｔｓＲＮＡが、ｔｓＲＮＡが結合すべき遺伝子と相補的なヌクレオチドを有すること、およびｔｓＲＮＡはＲＮＡなので、ヌクレオチド、すなわちアデノシン、グアノシン、シチジンまたはウリジンおよび各塩基、すなわちアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル、またはこれらの公知の化学修飾を含むことが理解されるであろう。
【００１１】
当業者に知られているように、ＲＮＡはヌクレオチドの鎖であるがＤＮＡとは異なっており、それは多くの場合に天然において、自己相補配列（これによりＲＮＡの一部分を折りたたむことができ、それ自身と対をなして高度に構造化された分子を形成することができる）の存在のために自身上で折り畳まれた一本鎖として見られる。従って、非構造化状態に対する本明細書における言及は、ＲＮＡヌクレオチドの配列が折り畳まれていない鎖で存在する前記結合部位内の状態に対する言及である。この鎖は、曲がっているかまたは湾曲していてもよいが、折り畳まれていない；従って、内部結合または自己相補性配列は存在しない。
【００１２】
代替として、非構造化状態を説明する別の方法は、前記結合部位が、安定な最小自由エネルギー二次構造に折りたたまれないと予測された配列を含むか（ＲＮＡ二次構造形成のＧｉｂｂｓの自由エネルギー  ΔＧ≧０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、または少なくとも、可能性のある結合ドメインの平均より構造化されていない（ΔＧ＞ΔＧ平均）、ということである。ＲＮＡｆｏｌｄは、そのような構造を白丸として示す一方で、ｍｆｏｌｄは、ΔＧ≧０ｋｃａｌ／ｍｏｌの構造に関しては結果を与えないであろう。
【００１３】
好ましい実施態様において、前記結合ドメインは、標的遺伝子またはｐｒｅ−ｍＲＮＡに対して完全に相補性ではなく、従って、前記結合ドメインは、標的遺伝子と完全な二重構造を形成せず、通常は、２００ｂｐ以下、最も通常は１００ｂｐ以下である。
【００１４】
本発明の特定の実施態様において、前記結合ドメインは、前記結合部位を含めて、以下を含むかまたは以下からなるリストから選択されるヌクレオチドの配列を含む：２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００個またはそれを超えるヌクレオチド。
【００１５】
本発明のさらに別の特定の実施態様において、前記結合ドメインは、治療すべき疾患に関連するかまたは治療すべき疾患のためのバイオマーカーである前記遺伝子の前記一部分に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補的であるヌクレオチドの配列を含む。理想的には、前記結合ドメインにおけるミスマッチは、標的に対して完全に相補的な４５ｎｔまたはそれ以上の区間（前記結合部位を含めるか、または当該部位を除く）を回避するように位置しており、理想的には、５’または３’末端から少なくとも５ヌクレオチドである。我々は、これらの特徴は、核中での長い二本鎖ＲＮＡの形成から得られるかもしれないＡ−ｔｏ−Ｉ編集を含むアンチセンス効果を抑制することにより作用する可能性が最も高いと考える。これらの特徴は、３’ＥＲにおいて特に有益であると考えられる。
【００１６】
特定の実施態様において、結合ドメインは、特にそれが短い場合、すなわち結合部位を含めて１００ヌクレオチド未満である場合、結合ドメインの非構造化された性質を維持するのを助けるスペーサー配列に隣接して位置し、従って、ｔｓＲＮＡも当業者に公知のスペーサー配列を、前記結合ドメインに隣接して含む。
【００１７】
前記の結合ドメインを、任意の疾患の任意のバイオマーカーに結合するように設計でき、それが上記の特徴を有するならば、効果的なトランスースプライシングが起こることを当業者は理解するであろう。従って、本明細書に記載される自殺遺伝子治療コンストラクトまたは配列は、容易に再プログラム化して、単純に標的結合ドメインを交換することにより代わりの疾患または罹患組織を標的にすることができる。
【００１８】
本発明のさらに別の特定の実施態様において、前記のトランス−スプライシングＲＮＡ分子は、治療すべき疾患に関連するかまたは治療すべき疾患のためのバイオマーカーである遺伝子の同一のもしくは異なる部分に対して相補的である前記結合ドメインを複数含む。さらに別の結合ドメインが、遺伝子の同一部分のためのものである場合、我々は、それが特異的なオンターゲットトランス−スプライシングを改善することを見出した。さらに別の結合ドメインが、遺伝子の異なる部分のためのものまたはさらには異なる遺伝子のためのものである場合、我々は、それがトランス−スプライシング活性を増強し、トランス−スプライシング表現型を改善することを見出した。
【００１９】
まさに我々は、マルチプルターゲット結合ドメインを含むトランス−スプライシングＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）を設計することにより、意図した標的スプライス部位でのトランス−スプライシングの特異性が６倍改善することを見出した。さらに、または上記の代替として、我々は、ｔｓＲＮＡにおいて、結合ドメインの外側に、少なくとも１つのシス結合もしくは自己結合ドメインを包含することが、標的ＤＮＡ非存在下でトランス−スプライス部位を保護することも見出した。マルチプルターゲット結合ドメインおよび少なくとも１つの前記シス結合ドメインの両者を包含することは、トランス−スプライシングの特異性を１０倍改善し、トランス−スプライシング活性を２倍を超えて改善した。従って、特定の実施態様において、前記ｔｓＲＮＡは、前記結合ドメインの外側に位置する少なくとも１つのシス−結合ドメインをさらに含む。
【００２０】
特定のさらなる実施態様において、前記ｔｓＲＮＡは５’または３’ｔｓＲＮＡのいずれかである。
【００２１】
非構造化されミスマッチ化された標的結合ドメインが５’または３’エキソン置換の両方を改善する一方で、ｔｓＲＮＡ  ３’末端の熱力学的安定性を増加させることにより、３’ＥＲまたは５’ＥＲのいずれかが改善された。これは、高度に構造化された３’末端を、自己相補的な配列の存在によって折りたたまれるかまたは、それ自身と対になるヌクレオチドのＲＮＡ鎖をそこに挿入することにより作製して、高度に構造化された分子を形成することによって行われる。ｔｓＲＮＡ中への挿入のための高度に構造化されたＲＮＡ鎖の例は、ハンマーヘッド型リボザイム配列、ヘアピンループ形成配列またはｙ型構造形成配列であるが、しかしながら、そのような他の構造が当業者に知られており、従ってこの目的に使用することができる。従って、他の特定の実施態様は、３’が高度に構造化されたＲＮＡ配列を少なくとも１つ含む。我々は、この特徴が、トランス−スプライシングＲＮＡを安定化し、それをリボ核酸分解的分解から保護することにより作用する可能性が最も高いと考えている。この特徴は、５’ＥＲにおいて特に有益であると考えられる。活性リボザイム、ヘアピンループまたはＹ型構造のさらなる形成は、リボザイムとポリＡ部位の間にスペーサーを挿入することにより支持された。
【００２２】
シス切断三次構造安定化（第二世代）ハンマーヘッド型リボザイムを、結合ドメインとポリアデニル化部位の間に、または他の高度に安定なＲＮＡ鎖を使用した場合には、これらの安定なＲＮＡ鎖とポリアデニル化部位との間に挿入することにより、５’ＥＲを改善した。この特徴は、トランス−スプライシングＲＮＡのポリＡ尾部を除去し、これはその後もう、細胞質中に輸出することができず、その核濃度およびトランス−スプライシング活性が増加する。この特徴はまた、５’ＥＲ用のトランス−スプライシングＲＮＡが、トランス−スプライシングの非存在下で輸出され得、翻訳され得、表現型を誘発し得ることを回避する。
【００２３】
我々の研究は、これらの最適化したｔｓＲＮＡが効果的にＨＰＶ−１６またはＡＦＰ−陽性細胞の死を誘発したことを示す。従って、スプライソソームが介在するＲＮＡトランス−スプライシングは、自殺遺伝子治療アプローチにおける細胞死を誘発するための有望な治療ストラテジーを示す。
【００２４】
他の実施態様において、前記疾患は、癌またはウイルス感染または細菌感染または転位因子、放射線、化学物質または未知の誘因により誘発された突然変異により引き起こされる後天性遺伝疾患である。
【００２５】
第１の例において、前記の癌は以下を含む群から選択される：肝細胞がん（ＨＣＣ）、子宮頸がん、膣癌、外陰癌、陰茎癌、皮膚癌、悪性黒色腫を含む黒色腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、メルケル細胞癌、肺癌、細胞膀胱癌（ｃｅｌｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、乳癌、結腸または直腸癌、肛門癌、子宮内膜癌、腎癌、白血病、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｏｒ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｏｒ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｐ−ＴＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、リンパ腫、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、鼻咽頭癌、口腔または咽頭癌、口腔咽頭癌、胃癌、脳腫瘍、骨の癌および幹細胞の癌、ならびに本明細書に開示される治療から利益を享受するであろう他の癌。
【００２６】
第２の例において、前記のウイルス感染は以下を含む群から選択される：パピローマウイルス、ヒトパピローマウイルス１６型、ヒトパピローマウイルス１８型、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）およびヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）等。
【００２７】
第３の例において、前記の細菌感染は以下を含む群から選択される：バントネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ種、サルモネラ・チフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ブルセラ種、レジオネラ種。マイコバクテリア種、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｎｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ノカルジア種、ロドコッカス種、エルシニア種、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）等。
【００２８】
最後の例において、前記の後天性遺伝疾患は以下を含む群から選択される：神経線維腫症１型および２型、マッキューン・オルブライト、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、表皮水疱症、ファンコニＡおよびＣ、フィラデルフィア染色体、血友病ＡおよびＢ、嚢胞性線維症、マックル・ウェルズ症候群、リポタンパク質リパーゼ欠損症、Ｂ−サラセミア、ピルビン酸脱水素酵素複合体欠損症等。
【００２９】
代替の態様において、本発明による上記ｔｓＲＮＡおよび任意選択的に、上記トランス−スプライスされたＲＮＡを発現する細胞の死を誘発するために有効な上記自殺系の少なくとも１つのさらに別の成分を含む薬剤が提供される。
【００３０】
代替の態様において、本発明による上記ｔｓＲＮＡ；任意選択的に、上記トランス−スプライスされたＲＮＡを発現する細胞の死を誘発するために有効な上記自殺系の少なくとも１つのさらに別の成分；およびヒトまたは獣医学的用途に適したキャリアーを含む医薬組成物が提供される。
【００３１】
上記の任意の例において、上記のさらに別の成分は、例えばガンシクロビルであることができるが、他の公知の細胞死のための共成分自殺系を使用してもよい。例としては、シトシンデアミナーゼ−５−フルオロシトシン、シトクロムＰ４５０−イホスファミド、シトクロムＰ４５０−シクロホスファミド、およびニトロレダクダーゼ−５−［アジリジン−１−イル］−２，４−ジニトロベンズアミドが挙げられる。
【００３２】
代替的な態様において、前記ｔｓＲＮＡを含有する細胞または前記ｔｓＲＮＡを含有するベクターが提供される。
【００３３】
さらなる態様において、細胞を殺す方法であって、上記細胞を、ｔｓＲＮＡ、または本発明による上記ｔｓＲＮＡを含むベクターでトランスフェクション、リポフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクションまたは形質転換すること、および任意選択的に、上記細胞を、上記トランス−スプライスされたＲＮＡを発現する細胞の死を誘発するために有効な上記自殺系の少なくとも１つの他の成分に曝露することを含む方法が提供される。
【００３４】
この実施態様において、本発明は、通常ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【００３５】
さらなる態様において、疾患を治療する方法であって、異常細胞を、ｔｓＲＮＡ、または本発明による上記ｔｓＲＮＡを含むベクターで、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、トランスフェクション、リポフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクションまたは形質転換すること、および任意選択的に、上記細胞を、上記トランス−スプライスされたＲＮＡを発現する細胞の死を誘発するために有効な上記自殺系の少なくとも１つの他の成分に曝露することを含む方法が提供される。
【００３６】
さらなる態様において、異常細胞を標的化する方法であって、ｔｓＲＮＡ、または本発明による上記ｔｓＲＮＡを含むベクターでの、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、腫瘍中への、局所適用（クリーム、ゲル、フォーム、ローション、軟膏またはエアロゾル）、経鼻適用、肺胞適用（ａｌｖｅｏｌａｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、全身適用、経口適用、静脈内適用、筋肉適用、皮下適用、皮膚適用、腹腔内適用または注射、および、任意選択的に、上記細胞を、上記細胞を殺すために有効な上記自殺系の他の成分に曝露することを含む方法が提供される。
【００３７】
本発明の特定の方法において、前記細胞は、ウイルスで形質転換された細胞である。典型的には、細胞は以下を含む群から選択されるウイルスで形質転換される：パピローマウイルス、ヒトパピローマウイルス１６型、ヒトパピローマウイルス１８型、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）およびヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）。
【００３８】
本発明のさらに別の方法において、上記細胞は、癌細胞、例えば肝細胞がん（ＨＣＣ）細胞、子宮頸がん細胞、膣癌細胞、外陰癌細胞、陰茎癌細胞、皮膚癌細胞、悪性黒色腫細胞を含む黒色腫細胞、扁平上皮癌細胞、基底細胞癌細胞、メルケル細胞癌細胞、肺癌細胞、細胞膀胱癌（ｃｅｌｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）細胞、乳癌細胞、結腸または直腸癌細胞、肛門癌細胞、子宮内膜癌細胞、腎癌細胞、白血病細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞、慢性リンパ性白血病（ＣＭＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）細胞、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｐ−ＴＬＬ）細胞、大顆粒リンパ球性白血病細胞、成人Ｔ細胞白血病細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、非ホジキンリンパ腫細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、鼻咽頭癌細胞、口腔または咽頭癌細胞、口腔咽頭癌細胞、胃癌細胞、脳腫瘍細胞、骨の癌細胞および幹細胞の癌細胞。理想的には、前記細胞は哺乳類であり、最も典型的にはヒトである。
【００３９】
後に続く特許請求の範囲において、および本発明の前述の説明において、特定の言葉または必要な意味合いのために文脈が別段必要とする場合を除いて、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のバリエーションは、包含的な意味で、すなわち示された特徴の存在を特定するために使用されるが、本発明の種々の実施態様においけるさらなる特徴の存在または付加を排除するためではなく使用される。
【００４０】
本明細書で引用される特許または特許出願を含む全ての参考文献は、引用により本明細書に組み込まれる。任意の参考文献が先行技術を構成するとは認められない。さらに、先行技術のいずれかが当技術分野の技術常識の一部を構成するとは認められない。
【００４１】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかと関連して記載されるとおりであってもよい。
【００４２】
本発明の他の特徴は、以下の例から明らかとなるであろう。概して、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲および図を含む）に開示される特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせに拡張される。従って、本発明の特定の態様、実施態様または例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物または化学的部分は、本明細書で記載されるいずれの態様、実施態様または例にも、相容性がない場合を除き、適用可能であると理解されるべきである。
【００４３】
さらに、別段の記載がない限り、本明細書に開示される特徴はいずれも、同一または類似の目的にかなう代替的な特徴と置き換えてもよい。
【００４４】
この明細書の記載および特許請求の範囲を通して、別段文脈が必要としない限り、単数は複数を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、別段文脈が必要としない限り、明細書は複数ならびに単一を考慮していると理解されるべきである。
【００４５】
ここで、以下を参照しながら、本発明の実施態様を例示だけを目的として説明する：
図１  ＨｅｐＧ２組織培養細胞における標的ＡＦＰへの５’ＥＲおよび３’ＥＲによる細胞死シグナルのトランス−スプライシングの検出。（ａ）５’エキソン置換（５’ＥＲ）または３’エキソン置換（３’ＥＲ）のいずれかによる、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）へのＨＳＶｔｋ死シグナルでのエキソン置換のために設計された２種のトランス−スプライシング分子を示す図。５’ＥＲコンストラクトは、コーディングドメインＨＳＶｔｋ遺伝子、それに続く５’ドナースプライス部位を有する５’スプライシングドメイン、およびＡＦＰ遺伝子のイントロン３を認識する５０塩基対の結合ドメインを含む。自己切断ＨＨ  Ｒｚが、ポリＡシグナルからＢＤを切り離すために取り付けられる。３’ＥＲコンストラクトは、ＡＦＰイントロン５を標的にする５０塩基対のＢＤ、それに続く３’スプライスシグナル、Ｐ２ＡおよびＨＳＶｔｋコーディング領域を含む。タンパク質分解的切断部位Ｐ２Ａが、トランス−スプライシングの成功後にＡＦＰ−ＨＳＶｔｋ融合タンパク質からのＨＳＶｔｋの切断のために取り付けられる。ＨＳＶｔｋ，単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ；ＩＳＥ，イントロニック・スプライス・エンハンサー；ＢＤ，結合ドメイン；ＨＨ  Ｒｚ，ハンマーヘッド型リボザイム；ＢＰ，分岐点；Ｐｐｙ，ポリピリミジントラクト。（ｂ）５’ＥＲ（上のパネル）および３’ＥＲ（下のパネル）を用いた、過剰発現されたＡＦＰ＿Ｅ３−Ｅ６ミニ遺伝子の状況においてトランス−スプライシングコンストラクトを導入した際のシス−スプライシングおよびトランス−スプライシングの生の閾値サイクル（Ｃｔ）を示す定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。ＡＦＰ（５’ＥＲに関してはエキソン４、３’ＥＲに関してはエキソン６に結合、左のパネル）およびＨＳＶｔｋ（５’ＥＲに関しては遠位部で、３’ＥＲについては近位部で結合、右のパネル）の２セットのＴａｑＭａｎプローブを検出のために使用した。ベータ−アクチンを内部コントロールとして使用した。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ。（ｃ）慣用の３０＋３０サイクルの２ステップＰＣＲを実施して、過剰発現させたＡＦＰとの５’（上）および３’（下）スプライシング事象を１％アガロースゲル上で観察し、スプライスジャンクションを配列決定により確認した。Ｃ，シス；  Ｔ，トランス。（ｂ）および（ｃ）Ｍｏｃｋ＿ＨｅｐＧ２は、ＡＦＰシス−スプライシング検出の内因性レベルを示す（ｂ，左のパネル、およびｃ，上および下の最後のレーン）。（ｄ）および（ｅ）は、活性な５’（ｄ）および３’（ｅ）トランス−スプライシングコンストラクトをＡＦＰミニ遺伝子とともに導入した場合の、シス−スプライシングレベルの低下を示す。シスおよびトランス−スプライシングの生Ｃｔ値は、スプライシング事象の二分子反応の結果を表す。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ。（ｆ）Ｃｔ値として表された内因性標的ＡＦＰにおけるスプライシング事象。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ。（ｇ）活性３’ＥＲ（上のパネル）および５’ＥＲ（下）における内因性ＣおよびＴのレベルを示す、３５＋３５サイクルの慣用のＰＣＲ。
【００４６】
図２  スプライス部位活性、ＢＤ配列選択および二次構造の観点から有効なトランスースプライシング分子。（ａ）３’ＥＲ（一番上の左パネル）および（ｂ）５’ＥＲ（一番上の右パネル）用に設計したＢＤは、標的に対して完全な相補性を有する現行の配列設計ＢＤ（緑色でハイライト）と比較して、２つの標的（青色）ミスマッチΔＢＤ（赤色でハイライト）を有する５０塩基長であった。３’ＥＲ（左パネル）に関して、スプライス部位に、Δｓｓ１においては、ＢＰモチーフおよび３’アクセプターを変えることにより突然変異を導入し、Δｓｓ２においてはＢＰ配列にさらに突然変異を導入し、５’ＥＲ（右パネル）に関して、Δｓｓ１において５’ドナーｓｓを隣接領域を変えることによりそのまま維持し、Δｓｓ２においてドナー部位を変えることによりさらに突然変異を導入した。３’ΔＢＤおよび５’ΔＢＤ活性コンストラクトの相対的なトランス−スプライシング活性を、活性なミスマッチなしＢＤコンストラクト、ならびにΔＢＤおよびＢＤ配列設計の両方を有するｓｓ突然変異体に対して試験した。コンピューターにより選択された２つの標的ミスマッチを有する構造化ＢＤ設計（赤色でハイライト）ならびにΔＢＤおよびＢＤ設計両方を有する３’ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ−ｉｎｖ、５’ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ−ｉｎｖ＿ＨＨと比較した、標的ミスマッチを有するか、または有しない、（ｃ）３’ＥＲ（左上のパネル）および（ｄ）５’ＥＲ（右上のパネル）活性ＢＤのＲＮＡ二次構造予測（ｍｆｏｌｄ）。下のパネルは、配列および構造の観点からのコンピューターによる解析を伴わない技術水準の既存のＢＤ設計と比較した、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ（左）およびｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ（右）の改善されたＢＤ設計の間の相対的なトランス−スプライシング活性を示す。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、使用した有意検定は一元であった。
【００４７】
図３  ＲＮＡの３’末端の改善された安定性は、ハンマーヘッド型リボザイムの切断との相関において５’トランス−スプライシングを改善する。（ａ）特異的なステムループプライマー、フォワードプライマーおよびユニバーサルＴａｑＭａｎプローブおよびリバースプライマーを用いる、不活性ＡＣＣモチーフと比較した、活性ＧＵＣモチーフを有するＨＨ  Ｒｚの切断効率の検出。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ。（ｂ）５’トランス−スプライシングコンストラクトの５’末端でΔＢＤおよび３’末端でポリＡに付いた三次モチーフトランス切断ＨＨ  ＲｚのＲＮＡ二次構造予測（ｍｆｏｌｄ）。ステムＩａ、ＩｂおよびＩＩの保存されたモチーフをボックスでハイライトし、ステムＩＩＩをΔＢＤの３’末端への完全な相補物として設計して、ＨＨ  Ｒｚ構造を作製した。切断モチーフＧＵＣをはさみの図で示す。（ｃ）３’末端においてＢＤの後に活性な切断性ＨＨ  Ｒｚかまたは不活性な非切断性ＨＨ  Ｒｚモチーフが続くかまたはＨＨ  Ｒｚ構造が続かないかのいずれかである、種々の程度のＲＮＡ二次構造を有するトランス−スプライシングＲＮＡの修飾された３’末端を有する設計された５’トランス−スプライシングコンストラクトの概略図。（ｄ）修飾した３’末端ＲＮＡトランス−スプライシングコンストラクトと比較した、活性なＨＨ  Ｒｚを有する親ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ＿ＨＨ（黒）の相対的なトランス−スプライス活性。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、有意検定はＴｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃを伴う一元ＡＮＯＶＡであった。（ｅ）自己切断およびポリＡ切断が可能な／可能でない、活性ＨＨ  ＲＺを有する／不活性ＨＨ  ＲＺを有する／ＨＨ  ＲＺを有しない５’コンストラクトのトランス−スプライシング活性と全折りたたみエネルギー（ΔＧ）との間の相関。Ｒ２、相関係数。ｎ＝３、直線回帰分析。
【００４８】
図４  ＡＦＰ遺伝子へのＨＳＶ−ｔｋの特異的および選択的オンターゲットトランス−スプライシングの研究。（ａ）５’ＥＲおよび３’ＥＲ事象とともに、ＡＦＰ標的（ＡＦＰ＿Ｅ３−Ｅ６ミニ遺伝子）を示す概念図。実線矢印は、特異的なオン・ターゲットトランス−スプライシングを示し、破線の矢印は、選択的オン・ターゲットトランス−スプライシング事象を示す。これらの両方の事象を、ＨＳＶｔｋプローブを用いるＴａｑＭａｎ定量化を用いて実証した。赤色のフォントの数は、Ｓｐｌｉｃｅ  Ｓｉｔｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎアルゴリズムを用いたドナーおよびアクセプタースプライス部位の強さを表す。（ｂ）そのＨＨ突然変異体を有し（ｐ５ＥＲに関してのみ）、それらのＢＤコンストラクトを有しない親ｐ５ＥＲコンストラクト（左）およびｐ３ＥＲコンストラクト（右）の相対的な特異的および選択的オン・ターゲットトランス−スプライシング活性。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、使用した有意検定はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃを伴う二元ＡＮＯＶＡであった。（ｃ）３’ＥＲコンストラクトにおける選択的オン・ターゲットトランス−スプライシングの発生を減少させるための、オリジナルの３’ＥＲΔＢＤ（明るい青色）とともに追加的なＢＤの設計を示す概念図。ＢＤ  Ｅ（ダークブルー）はエキソン５の５’ｓｓの４６塩基下流に結合し、ＢＤ  Ｆ（ピンク）はエキソン３の５’ｓｓに結合し、ＢＤ  Ｄ（グリーン）はｐ３ＥＲトランス−スプライシング分子のＰｐｙトラクトに結合する。（ｄ）オリジナルのΔＢＤを補完するために設計された追加的なＢＤと比較した、単一のΔＢＤを有する親ｐ３ＥＲの相対的な特異的および選択的オンターゲットトランス−スプライシング活性。各コンストラクトの特異性係数を、（特異的ｔｓ／選択的ｔｓ）ｘ１００％として決定した。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、使用した有意検定はＴｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃを伴う二元ＡＮＯＶＡであった。（ｅ）結合ドメインの特異性なしのトランス−スプライシングを防ぐためにＢＤを持たず追加的なＢＤ  Ｄを有するコンストラクトを示す概念図。
【００４９】
図５  過剰発現されたＡＦＰ標的または内因性ＡＰＦ標的のいずれかでのトランス−スプライシングの成功におけるＨＳＶｔｋ陽性細胞の選択的殺害。過剰発現ＡＦＰ（左）および内因性ＡＦＰ（右）で１００μＭ用量のＧＣＶを６日間用いて、選択した（ａ）３’ＥＲコンストラクトおよび（ｂ）５’ＥＲコンストラクトにおいて行われたＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイ。（ｃ）トランスースプライシング遺伝子およびフローサイトメトリーでのアポトーシスの解析のために使用されるＧＦＰ遺伝子の両方を有するｐＶＡＸ１におけるコントロールおよびトランス−スプライシング単一プラスミド系のクローニング設計。（ｄ）トランス−スプライシング後のアネキシンＶ陽性初期および後期アポトーシス細胞を検出するためのゲーティングストラテジーを示す代表的なフローサイトメトリーデータ画像。示したサンプルは、１００μＭ  ＧＣＶで処理するかまたは薬物で処理していないポジティブＨＳＶｔｋ＿ＧＦＰコントロールである。（ｅ）１００μＭ  ＧＣＶ処理の４８時間後に過剰発現および内因性ＡＦＰ標的レベルの両方で、選択した３’ＥＲおよび５’ＥＲコンストラクトにおいて検出されたアポトーシス。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、使用した有意検定はＴｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃを伴う二元ＡＮＯＶＡであった。図において示した有意性の他に、過剰発現させた標的セットにおいて、ネガティブコントロールＡＦＰ＿Ｅ３−Ｅ６＿ＧＦＰと比較して、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ＿Δｓｓ１＿ＧＦＰを除く全てのサンプルが有意であった（ｐ＝  ０．０００８〜＜０．０００１）。内因性標的セットにおいて、全てのサンプルがポジティブＨＳＶｔｋ＿ＧＦＰコントロールと比較して有意であった（ｐ＝  ０．０４〜＜０．０００１）。（ｆ）１００μＭ  ＧＣＶ処理の２４時間後の個々のＨｅｐＧ２細胞におけるＤＮＡ損傷を検出するために行った単細胞ゲル電気泳動。選択したコンストラクトを、ＧＣＶ投与あり／なしで１５０個のコメットに関して分析し、テイルモーメントとして記録した。右のパネルは、１０Ｘ倍率で撮った代表的なコメット像を示す。Ｑ３＋１．５（ＩＱＲ）超に該当するコメットをドット（アウトライアー）として示す。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、使用した有意検定はＴｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃを伴う一元ＡＮＯＶＡであった。（ｇ）ＡＦＰに加えてＨＣＣＡ２、ＣＤ２４およびＶＥＧＦを含む２以上のＨＣＣマーカーを標的とするために２つのＢＤを用いる３’ＥＲにおける多重トランス−スプライシング技術。当該概略図は、ＡＦＰ標的のイントロン５および追加的な標的のイントロン１を同時に標的とするためのＢＤ１およびＢＤ２の配置を示す。（ｈ）Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイは、標的の内因性状況下でより低い用量である１０μＭ  ＧＣＶで処理した場合の、単一のＢＤ系と比較した、２つのＢＤを有するコンストラクトにおけるトランス−スプライシングが誘発する細胞死の効果を示す。（ａ）（ｂ）（ｈ）ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、使用した有意検定は、ｍｏｃｋ＿ＨｅｐＧ２と比較した、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃを伴う二元ＡＮＯＶＡであった。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１���
【００５０】
図６  ３’ＥＲおよび５’ＥＲを用いるＨＰＶ１６陽性細胞へのトランス−スプライシングによるＨＳＶｔｋ死シグナルの標識。（ａ）ウイルス細胞が選択的スプライシングのために利用する利用可能なスプライスアクセプター（Ａ）およびスプライスドナー（Ｄ）を示す、６つの初期（Ｅ）および２つの後期（Ｌ）遺伝子を含むＨＰＶ１６ゲノムの概略マップ。全部で６つのトランス−スプライシングＲＮＡを設計した（５’ＥＲに関して５’Ｅ６および５’Ｅ１ｂ）および（３’ＥＲに関して３’Ｅ６、３’Ｅ１ａ、３’Ｅ２および３’Ｅ５）。赤の矢印はマルチプルトランス−スプライシング事象の検出のために使用したＲＰ（５’ＥＲ）およびＦＰ（３’ＥＲ）の位置を示し、青の矢印はトランス−スプライシングコンストラクトのＨＳＶｔｋ領域におけるプライマーの位置を示す。（ｂ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用し、３’ＥＲ（左パネル）および５’ＥＲ（右パネル）の両方に関してＨＰＶ１６陽性マウス細胞株Ｃ３（上のパネル）およびヒト細胞株ＳｉＨａ（下のパネル）におけるベータ−アクチンで標準化したΔＣｔ値として示した、内因性ＨＰＶ１６標的を用いたトランス−スプライシング事象の定量化。一部のＳＤおよびＳＡに関するグラフ中のバーの不在は、トランス−スプライシングを測定していないことを示す。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ。（ｃ）１００μＭ  ＧＣＶで６日間処理した場合の、内因性ＨＰＶ１６陽性細胞株ＳｉＨａ（左上）、Ｃ３（右上）およびＨＰＶ１８陽性ヒト細胞株ＨｅＬａ（左下）およびＨＰＶ１６／１８陰性細胞株ＨｅｐＧ２（右下）において、選択したトランス−スプライシングコンストラクトについて行ったＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイ。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、使用した有意検定はｍｏｃｋと比較した、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃを伴う二元ＡＮＯＶＡであった。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【００５１】
図Ｓ１  ３’ＥＲコンストラクトのＢＤを示すＲＮＡ二次構造。（ａ）ＢＤの上流または下流いずれかへの、それを構造化させるためのスペーサー配列の導入。（ｂ）親３’ＥＲ最適化および非構造化結合ドメイン（青色でハイライトされた「オープン」）を、ＡＦＰ標的に対する２つのミスマッチを用いて設計し（ΔＢＤ）、現行のＢＤ設計（標的ミスマッチを有さない）と比較した。ボックスは２つのコンストラクト間の変化領域を示し、ＲＮＡ折りたたみは同一を維持する。（ｃ）（ｄ）選択した３’ＥＲ＿ΔＢＤ  ｓｔｒｕｃ１（非構造化３’ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔと３塩基重複）および３’ＥＲ＿ΔＢＤ  ｓｔｒｕｃ２  （３’ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔの６７塩基上流および３’ＥＲ＿ΔＢＤ  ｓｔｒｕｃ１の２７塩基上流）は、標的結合のためにあまり最適でない閉じたＲＮＡ二次構造を示す。（ｅ）ΔＢＤまたはＢＤのいずれかを有するｐ３ＥＲ＿ｏｐｔ−ｉｎｖコンストラクトを、それぞれオリジナルΔＢＤまたはＢＤを保持し、スペーサーをいくつかのミスマッチを有する逆方向反復中に変えて設計することにより、トランス−スプライシング活性の低い完全に構造化された長いステム構造を得た。
【００５２】
図Ｓ２  ５’ＥＲコンストラクトのＢＤを示すＲＮＡ二次構造。（ａ）標的に２つのミスマッチを有するように設計した最適化および非構造化ＢＤ（赤色のボックスでハイライト）を有する親５’ＥＲコンストラクト。（ｂ）標的にミスマッチを有しないように設計した最適化および非構造化ＢＤ（緑色のボックスでハイライト）を有する親５’ＥＲコンストラクト。（ｃ）ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｓｔｒｕｃ１＿ＨＨ  （非構造化５’ＥＲ＿  ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨと９塩基重複）は、最適な結合にあまり適切でない閉じたＢＤを示す。（ｄ）（ｅ）減少したトランス−スプライシングを有するステムループ構造形成のために親ＢＤに逆相補体としてのスペーサーを有する（ｄ）ΔＢＤまたは（ｅ）ＢＤのいずれかを有するｐ５ＥＲ＿ｏｐｔ−ｉｎｖ＿ＨＨコンストラクト。
【００５３】
図Ｓ３  過剰発現ＡＦＰ標的または内因性ＡＰＦ標的のいずれかでのトランス−スプライシングの成功におけるＨＳＶｔｋ陽性細胞の選択的殺害。過剰発現ＡＦＰ（左上）および内因性ＡＦＰ（右上）で１０μＭ用量のＧＣＶを６日間用いて、選択した（ａ）３’ＥＲコンストラクトおよび（ｂ）５’ＥＲコンストラクトにおいて行われたＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイ。過剰発現（左下）および内因性（右下）ＡＦＰレベルの両方に関して、全てのコンストラクトにおいて薬物なしコントロールをした。ｍｏｃｋ＿ＨｅｐＧ２に対して算出された有意性。
【００５４】
図Ｓ４  トランス−スプライシング誘発アポトーシスを示すフローサイトメトリー解析  （ａ）ＦＡＣＳにおいて細胞死を解析するためのＨｅｐＧ２細胞におけるコトランスフェクションのための、ＡＦＰミニ遺伝子、ｔｓＲＮＡコンストラクトをｐＶＡＸ１プラスミド中に有するベクター、およびＧＦＰ遺伝子をｐＥＧＦＰ．Ｃ２プラスミド中に有するベクターの概略図。トランス−スプライシングは、選択した（ｂ）３’ＥＲおよび（ｃ）５’ＥＲコンストラクトにおいて、１００μＭ用量のＧＣＶの４８時間後にアポトーシスを誘発した。ネガティブＡＦＰミニ遺伝子、ネガティブＧＦＰコントロールおよびポジティブＨＳＶｔｋコントロールを、活性のｔｓプラスミドの代わりに等量のｐＳＵＰＥＲ空プラスミドとコトランスフェクトした。（ｂ）ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔおよび（ｃ）ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ親コンストラクトに対して算出された有意性。（ｄ）トランス−スプライシング後のアネキシンＶ陽性アポトーシス細胞とＧＦＰ陽性細胞を区別するためのゲーティングストラテジーを示す代表的なフローサイトメトリーデータ画像。示したサンプルは、１００μＭ  ＧＣＶで処理するかまたは薬物で処理していないポジティブＨＳＶｔｋコントロールである。ｔｓＲＮＡおよびｅＧＦＰプラスミドのコトランスフェクトは、単一の陽性細胞の示差的なポピュレーションを示し、従って、コトランスフェクションは、トランス−スプライシング誘発細胞死を受けるトランスフェクション陽性細胞を選択するための最適でない選択肢であると結論付けられる。
【００５５】
図Ｓ５  内因性レベルで２つの標的を有するトランス−スプライシング。（ａ）形質転換された細胞ＨＣＣ陽性および陰性細胞株、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）およびＨＣＣに関して陰性の初代脂肪細胞を含む種々の細胞タイプにおけるＨＣＣマーカー遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ発現レベルを示すヒートマップ。（ｂ）１００μＭ用量のＧＣＶを伴う（左）およびＧＣＶを伴わない（右）、内因性遺伝子レベルで２つのターゲットを有するトランス−スプライシングを示すためのＡｌａｍａｒアッセイ。
【００５６】
図Ｓ６  １０μＭ、１００μＭ  ＧＣＶで処理した場合またはＧＣＶで処理しなかった場合の、ＨＰＶ１６陽性および陰性細胞株におけるＨＳＶｔｋ誘発細胞死を示す、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイ。通常の補充用量の薬物を用いた６日間のＧＣＶ誘導細胞死に関して、Ｅ１ｂおよびＥ６を標的とする２つの５’ＥＲ  ｔｓＲＮＡコンストラクトならびにＥ１ａ、Ｅ２、Ｅ５およびＥ６を標的とする４つの３’ＥＲ  ｔｓＲＮＡコンストラクトを次の細胞株：（ａ）ＨＰＶ１６陽性ヒト細胞株ＳｉＨａ、（ｂ）ＨＰＶ１６陽性マウス細胞株Ｃ３、（ｃ）ＨＰＶ１８陽性ヒト細胞株ＨｅＬａ、（ｄ）ＨＰＶ１６および１８陰性ヒト細胞株ＨｅｐＧ２において試験した。
【００５７】
図Ｓ７  ダンベル型ＤＮＡ最小ベクターを用いたＲＮＡトランス−スプライシングの送達。（ａ）ＥＬＡＮ法によるｔｓＲＮＡプラスミドからのダンベルの合成。記載のサイズを有するプラスミドおよびダンベルベクターの両方の概略図。ＡＦＰ  ＴａｑＭａｎ  ｒｔＲＴ−ＰＣＲ検出系を用いたプラスミドｔｓＲＮＡコンストラクトに対する等質量および等モルの両方で試験した（ｂ）３’ＥＲおよび（ｃ）５’ＥＲダンベルの効率。全てのデータは、３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭを表す。使用した有意検定はＴｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃを伴う二元ＡＮＯＶＡであった。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１ａ】ＨｅｐＧ２組織培養細胞における標的ＡＦＰへの５’ＥＲおよび３’ＥＲによる細胞死シグナルのトランス−スプライシングの検出。（ａ）５’エキソン置換（５’ＥＲ）または３’エキソン置換（３’ＥＲ）のいずれかによる、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）へのＨＳＶｔｋ死シグナルでのエキソン置換のために設計された２種のトランス−スプライシング分子を示す図。
【図１ｂ】ＨｅｐＧ２組織培養細胞における標的ＡＦＰへの５’ＥＲおよび３’ＥＲによる細胞死シグナルのトランス−スプライシングの検出。（ｂ）５’ＥＲ（上のパネル）および３’ＥＲ（下のパネル）を用いた、過剰発現されたＡＦＰ＿Ｅ３−Ｅ６ミニ遺伝子の状況においてトランス−スプライシングコンストラクトを導入した際のシス−スプライシングおよびトランス−スプライシングの生の閾値サイクル（Ｃｔ）を示す定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。
【図１ｃ】ＨｅｐＧ２組織培養細胞における標的ＡＦＰへの５’ＥＲおよび３’ＥＲによる細胞死シグナルのトランス−スプライシングの検出。（ｃ）慣用の３０＋３０サイクルの２ステップＰＣＲを実施して、過剰発現させたＡＦＰとの５’（上）および３’（下）スプライシング事象を１％アガロースゲル上で観察し、スプライスジャンクションを配列決定により確認した。
【図１ｄ】ＨｅｐＧ２組織培養細胞における標的ＡＦＰへの５’ＥＲおよび３’ＥＲによる細胞死シグナルのトランス−スプライシングの検出。活性な５’トランス−スプライシングコンストラクトをＡＦＰミニ遺伝子とともに導入した場合の、シス−スプライシングレベルの低下を示す。
【図１ｅ】ＨｅｐＧ２組織培養細胞における標的ＡＦＰへの５’ＥＲおよび３’ＥＲによる細胞死シグナルのトランス−スプライシングの検出。活性な３’トランス−スプライシングコンストラクトをＡＦＰミニ遺伝子とともに導入した場合の、シス−スプライシングレベルの低下を示す。
【図１ｆ】ＨｅｐＧ２組織培養細胞における標的ＡＦＰへの５’ＥＲおよび３’ＥＲによる細胞死シグナルのトランス−スプライシングの検出。（ｆ）Ｃｔ値として表された内因性標的ＡＦＰにおけるスプライシング事象。
【図１ｇ】ＨｅｐＧ２組織培養細胞における標的ＡＦＰへの５’ＥＲおよび３’ＥＲによる細胞死シグナルのトランス−スプライシングの検出。（ｇ）活性３’ＥＲ（上のパネル）および５’ＥＲ（下）における内因性ＣおよびＴのレベルを示す、３５＋３５サイクルの慣用のＰＣＲ。
【図２ａ】スプライス部位活性、ＢＤ配列選択および二次構造の観点から有効なトランスースプライシング分子。（ａ）３’ＥＲ（一番上の左パネル）用に設計したＢＤは、標的に対して完全な相補性を有する現行の配列設計ＢＤ（緑色でハイライト）と比較して、２つの標的（青色）ミスマッチΔＢＤ（赤色でハイライト）を有する５０塩基長であった。
【図２ｂ】スプライス部位活性、ＢＤ配列選択および二次構造の観点から有効なトランスースプライシング分子。（ｂ）５’ＥＲ（一番上の右パネル）用に設計したＢＤは、標的に対して完全な相補性を有する現行の配列設計ＢＤ（緑色でハイライト）と比較して、２つの標的（青色）ミスマッチΔＢＤ（赤色でハイライト）を有する５０塩基長であった。
【図２ｃ】スプライス部位活性、ＢＤ配列選択および二次構造の観点から有効なトランスースプライシング分子。（ｃ）３’ＥＲ（左上のパネル）活性ＢＤのＲＮＡ二次構造予測（ｍｆｏｌｄ）。下のパネルは、配列および構造の観点からのコンピューターによる解析を伴わない技術水準の既存のＢＤ設計と比較した、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ（左）の改善されたＢＤ設計の間の相対的なトランス−スプライシング活性を示す。
【図２ｄ】スプライス部位活性、ＢＤ配列選択および二次構造の観点から有効なトランスースプライシング分子。（（ｄ）５’ＥＲ（右上のパネル）活性ＢＤのＲＮＡ二次構造予測（ｍｆｏｌｄ）。下のパネルは、配列および構造の観点からのコンピューターによる解析を伴わない技術水準の既存のＢＤ設計と比較した、ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ（右）の改善されたＢＤ設計の間の相対的なトランス−スプライシング活性を示す。
【図３ａ】ＲＮＡの３’末端の改善された安定性は、ハンマーヘッド型リボザイムの切断との相関において５’トランス−スプライシングを改善する。（ａ）特異的なステムループプライマー、フォワードプライマーおよびユニバーサルＴａｑＭａｎプローブおよびリバースプライマーを用いる、不活性ＡＣＣモチーフと比較した、活性ＧＵＣモチーフを有するＨＨ  Ｒｚの切断効率の検出。
【図３ｂ】ＲＮＡの３’末端の改善された安定性は、ハンマーヘッド型リボザイムの切断との相関において５’トランス−スプライシングを改善する。（ｂ）５’トランス−スプライシングコンストラクトの５’末端でΔＢＤおよび３’末端でポリＡに付いた三次モチーフトランス切断ＨＨ  ＲｚのＲＮＡ二次構造予測（ｍｆｏｌｄ）。
【図３ｃ】ＲＮＡの３’末端の改善された安定性は、ハンマーヘッド型リボザイムの切断との相関において５’トランス−スプライシングを改善する。（ｃ）３’末端においてＢＤの後に活性な切断性ＨＨ  Ｒｚかまたは不活性な非切断性ＨＨ  Ｒｚモチーフが続くかまたはＨＨ  Ｒｚ構造が続かないかのいずれかである、種々の程度のＲＮＡ二次構造を有するトランス−スプライシングＲＮＡの修飾された３’末端を有する設計された５’トランス−スプライシングコンストラクトの概略図。
【図３ｄ】ＲＮＡの３’末端の改善された安定性は、ハンマーヘッド型リボザイムの切断との相関において５’トランス−スプライシングを改善する。（ｄ）修飾した３’末端ＲＮＡトランス−スプライシングコンストラクトと比較した、活性なＨＨ  Ｒｚを有する親ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ＿ＨＨ（黒）の相対的なトランス−スプライス活性。
【図３ｅ】ＲＮＡの３’末端の改善された安定性は、ハンマーヘッド型リボザイムの切断との相関において５’トランス−スプライシングを改善する。（ｅ）自己切断およびポリＡ切断が可能な／可能でない、活性ＨＨ  ＲＺを有する／不活性ＨＨ  ＲＺを有する／ＨＨ  ＲＺを有しない５’コンストラクトのトランス−スプライシング活性と全折りたたみエネルギー（ΔＧ）との間の相関。
【図４ａ】ＡＦＰ遺伝子へのＨＳＶ−ｔｋの特異的および選択的オンターゲットトランス−スプライシングの研究。（ａ）５’ＥＲおよび３’ＥＲ事象とともに、ＡＦＰ標的（ＡＦＰ＿Ｅ３−Ｅ６ミニ遺伝子）を示す概念図。
【図４ｂ】ＡＦＰ遺伝子へのＨＳＶ−ｔｋの特異的および選択的オンターゲットトランス−スプライシングの研究。（ｂ）そのＨＨ突然変異体を有し（ｐ５ＥＲに関してのみ）、それらのＢＤコンストラクトを有しない親ｐ５ＥＲコンストラクト（左）およびｐ３ＥＲコンストラクト（右）の相対的な特異的および選択的オン・ターゲットトランス−スプライシング活性。
【図４ｃ】ＡＦＰ遺伝子へのＨＳＶ−ｔｋの特異的および選択的オンターゲットトランス−スプライシングの研究。（ｃ）３’ＥＲコンストラクトにおける選択的オン・ターゲットトランス−スプライシングの発生を減少させるための、オリジナルの３’ＥＲΔＢＤ（明るい青色）とともに追加的なＢＤの設計を示す概念図。
【図４ｄ】ＡＦＰ遺伝子へのＨＳＶ−ｔｋの特異的および選択的オンターゲットトランス−スプライシングの研究。（ｄ）オリジナルのΔＢＤを補完するために設計された追加的なＢＤと比較した、単一のΔＢＤを有する親ｐ３ＥＲの相対的な特異的および選択的オンターゲットトランス−スプライシング活性。
【図４ｅ】ＡＦＰ遺伝子へのＨＳＶ−ｔｋの特異的および選択的オンターゲットトランス−スプライシングの研究。（ｅ）結合ドメインの特異性なしのトランス−スプライシングを防ぐためにＢＤを持たず追加的なＢＤ  Ｄを有するコンストラクトを示す概念図。
【図５ａ】過剰発現されたＡＦＰ標的または内因性ＡＰＦ標的のいずれかでのトランス−スプライシングの成功におけるＨＳＶｔｋ陽性細胞の選択的殺害。過剰発現ＡＦＰ（左）および内因性ＡＦＰ（右）で１００μＭ用量のＧＣＶを６日間用いて、選択した（ａ）３’ＥＲコンストラクトにおいて行われたＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイ。
【図５ｂ】過剰発現されたＡＦＰ標的または内因性ＡＰＦ標的のいずれかでのトランス−スプライシングの成功におけるＨＳＶｔｋ陽性細胞の選択的殺害。過剰発現ＡＦＰ（左）および内因性ＡＦＰ（右）で１００μＭ用量のＧＣＶを６日間用いて、選択した（ｂ）５’ＥＲコンストラクトにおいて行われたＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイ。
【図５ｃ】過剰発現されたＡＦＰ標的または内因性ＡＰＦ標的のいずれかでのトランス−スプライシングの成功におけるＨＳＶｔｋ陽性細胞の選択的殺害。（ｃ）トランスースプライシング遺伝子およびフローサイトメトリーでのアポトーシスの解析のために使用されるＧＦＰ遺伝子の両方を有するｐＶＡＸ１におけるコントロールおよびトランス−スプライシング単一プラスミド系のクローニング設計。
【図５ｄ】過剰発現されたＡＦＰ標的または内因性ＡＰＦ標的のいずれかでのトランス−スプライシングの成功におけるＨＳＶｔｋ陽性細胞の選択的殺害。（ｄ）トランス−スプライシング後のアネキシンＶ陽性初期および後期アポトーシス細胞を検出するためのゲーティングストラテジーを示す代表的なフローサイトメトリーデータ画像。
【図５ｅ】過剰発現されたＡＦＰ標的または内因性ＡＰＦ標的のいずれかでのトランス−スプライシングの成功におけるＨＳＶｔｋ陽性細胞の選択的殺害。（ｅ）１００μＭ  ＧＣＶ処理の４８時間後に過剰発現および内因性ＡＦＰ標的レベルの両方で、選択した３’ＥＲおよび５’ＥＲコンストラクトにおいて検出されたアポトーシス。
【図５ｆ】過剰発現されたＡＦＰ標的または内因性ＡＰＦ標的のいずれかでのトランス−スプライシングの成功におけるＨＳＶｔｋ陽性細胞の選択的殺害。（ｆ）１００μＭ  ＧＣＶ処理の２４時間後の個々のＨｅｐＧ２細胞におけるＤＮＡ損傷を検出するために行った単細胞ゲル電気泳動。
【図５ｇ】過剰発現されたＡＦＰ標的または内因性ＡＰＦ標的のいずれかでのトランス−スプライシングの成功におけるＨＳＶｔｋ陽性細胞の選択的殺害。（ｇ）ＡＦＰに加えてＨＣＣＡ２、ＣＤ２４およびＶＥＧＦを含む２以上のＨＣＣマーカーを標的とするために２つのＢＤを用いる３’ＥＲにおける多重トランス−スプライシング技術。
【図５ｈ】過剰発現されたＡＦＰ標的または内因性ＡＰＦ標的のいずれかでのトランス−スプライシングの成功におけるＨＳＶｔｋ陽性細胞の選択的殺害。（ｈ）Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイは、標的の内因性状況下でより低い用量である１０μＭ  ＧＣＶで処理した場合の、単一のＢＤ系と比較した、２つのＢＤを有するコンストラクトにおけるトランス−スプライシングが誘発する細胞死の効果を示す。
【図６ａ】３’ＥＲおよび５’ＥＲを用いるＨＰＶ１６陽性細胞へのトランス−スプライシングによるＨＳＶｔｋ死シグナルの標識。（ａ）ウイルス細胞が選択的スプライシングのために利用する利用可能なスプライスアクセプター（Ａ）およびスプライスドナー（Ｄ）を示す、６つの初期（Ｅ）および２つの後期（Ｌ）遺伝子を含むＨＰＶ１６ゲノムの概略マップ。
【図６ｂ】３’ＥＲおよび５’ＥＲを用いるＨＰＶ１６陽性細胞へのトランス−スプライシングによるＨＳＶｔｋ死シグナルの標識。（ｂ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用し、３’ＥＲ（左パネル）および５’ＥＲ（右パネル）の両方に関してＨＰＶ１６陽性マウス細胞株Ｃ３（上のパネル）およびヒト細胞株ＳｉＨａ（下のパネル）におけるベータ−アクチンで標準化したΔＣｔ値として示した、内因性ＨＰＶ１６標的を用いたトランス−スプライシング事象の定量化。
【図６ｃ】３’ＥＲおよび５’ＥＲを用いるＨＰＶ１６陽性細胞へのトランス−スプライシングによるＨＳＶｔｋ死シグナルの標識。（ｃ）１００μＭ  ＧＣＶで６日間処理した場合の、内因性ＨＰＶ１６陽性細胞株ＳｉＨａ（左上）、Ｃ３（右上）およびＨＰＶ１８陽性ヒト細胞株ＨｅＬａ（左下）およびＨＰＶ１６／１８陰性細胞株ＨｅｐＧ２（右下）において、選択したトランス−スプライシングコンストラクトについて行ったＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイ。
【図Ｓ１ａ】３’ＥＲコンストラクトのＢＤを示すＲＮＡ二次構造。（ａ）ＢＤの上流または下流いずれかへの、それを構造化させるためのスペーサー配列の導入。
【図Ｓ１ｂ】３’ＥＲコンストラクトのＢＤを示すＲＮＡ二次構造。（ｂ）親３’ＥＲ最適化および非構造化結合ドメイン（青色でハイライトされた「オープン」）を、ＡＦＰ標的に対する２つのミスマッチを用いて設計し（ΔＢＤ）、現行のＢＤ設計（標的ミスマッチを有さない）と比較した。
【図Ｓ１ｃ】３’ＥＲコンストラクトのＢＤを示すＲＮＡ二次構造。（ｃ）選択した３’ＥＲ＿ΔＢＤ  ｓｔｒｕｃ１（非構造化３’ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔと３塩基重複）は、標的結合のためにあまり最適でない閉じたＲＮＡ二次構造を示す。
【図Ｓ１ｄ】３’ＥＲコンストラクトのＢＤを示すＲＮＡ二次構造。（ｄ）選択した３’ＥＲ＿ΔＢＤ  ｓｔｒｕｃ２  （３’ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔの６７塩基上流および３’ＥＲ＿ΔＢＤ  ｓｔｒｕｃ１の２７塩基上流）は、標的結合のためにあまり最適でない閉じたＲＮＡ二次構造を示す。
【図Ｓ１ｅ】３’ＥＲコンストラクトのＢＤを示すＲＮＡ二次構造。（ｅ）ΔＢＤまたはＢＤのいずれかを有するｐ３ＥＲ＿ｏｐｔ−ｉｎｖコンストラクトを、それぞれオリジナルΔＢＤまたはＢＤを保持し、スペーサーをいくつかのミスマッチを有する逆方向反復中に変えて設計することにより、トランス−スプライシング活性の低い完全に構造化された長いステム構造を得た。
【図Ｓ２ａ】５’ＥＲコンストラクトのＢＤを示すＲＮＡ二次構造。（ａ）標的に２つのミスマッチを有するように設計した最適化および非構造化ＢＤ（赤色のボックスでハイライト）を有する親５’ＥＲコンストラクト。
【図Ｓ２ｂ】５’ＥＲコンストラクトのＢＤを示すＲＮＡ二次構造。（ｂ）標的にミスマッチを有しないように設計した最適化および非構造化ＢＤ（緑色のボックスでハイライト）を有する親５’ＥＲコンストラクト。
【図Ｓ２ｃ】５’ＥＲコンストラクトのＢＤを示すＲＮＡ二次構造。（ｃ）ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｓｔｒｕｃ１＿ＨＨ  （非構造化５’ＥＲ＿  ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨと９塩基重複）は、最適な結合にあまり適切でない閉じたＢＤを示す。
【図Ｓ２ｄ】５’ＥＲコンストラクトのＢＤを示すＲＮＡ二次構造。（ｄ）減少したトランス−スプライシングを有するステムループ構造形成のために親ＢＤに逆相補体としてのスペーサーを有する（ｄ）ΔＢＤを有するｐ５ＥＲ＿ｏｐｔ−ｉｎｖ＿ＨＨコンストラクト。
【図Ｓ２ｅ】５’ＥＲコンストラクトのＢＤを示すＲＮＡ二次構造。（ｅ）減少したトランス−スプライシングを有するステムループ構造形成のために親ＢＤに逆相補体としてのスペーサーを有する（ｅ）ＢＤを有するｐ５ＥＲ＿ｏｐｔ−ｉｎｖ＿ＨＨコンストラクト。
【図Ｓ３ａ】過剰発現ＡＦＰ標的または内因性ＡＰＦ標的のいずれかでのトランス−スプライシングの成功におけるＨＳＶｔｋ陽性細胞の選択的殺害。過剰発現ＡＦＰ（左上）および内因性ＡＦＰ（右上）で１０μＭ用量のＧＣＶを６日間用いて、選択した（ａ）３’ＥＲコンストラクトにおいて行われたＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイ。
【図Ｓ３ｂ】過剰発現ＡＦＰ標的または内因性ＡＰＦ標的のいずれかでのトランス−スプライシングの成功におけるＨＳＶｔｋ陽性細胞の選択的殺害。過剰発現ＡＦＰ（左上）および内因性ＡＦＰ（右上）で１０μＭ用量のＧＣＶを６日間用いて、選択した（ｂ）５’ＥＲコンストラクトにおいて行われたＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイ。
【図Ｓ４ａ】トランス−スプライシング誘発アポトーシスを示すフローサイトメトリー解析。（ａ）ＦＡＣＳにおいて細胞死を解析するためのＨｅｐＧ２細胞におけるコトランスフェクションのための、ＡＦＰミニ遺伝子、ｔｓＲＮＡコンストラクトをｐＶＡＸ１プラスミド中に有するベクター、およびＧＦＰ遺伝子をｐＥＧＦＰ．Ｃ２プラスミド中に有するベクターの概略図。
【図Ｓ４ｂ】トランス−スプライシング誘発アポトーシスを示すフローサイトメトリー解析。トランス−スプライシングは、選択した（ｂ）３’ＥＲコンストラクトにおいて、１００μＭ用量のＧＣＶの４８時間後にアポトーシスを誘発した。
【図Ｓ４ｃ】トランス−スプライシング誘発アポトーシスを示すフローサイトメトリー解析。トランス−スプライシングは、選択した（ｃ）５’ＥＲコンストラクトにおいて、１００μＭ用量のＧＣＶの４８時間後にアポトーシスを誘発した。
【図Ｓ４ｄ】トランス−スプライシング誘発アポトーシスを示すフローサイトメトリー解析。（ｄ）トランス−スプライシング後のアネキシンＶ陽性アポトーシス細胞とＧＦＰ陽性細胞を区別するためのゲーティングストラテジーを示す代表的なフローサイトメトリーデータ画像。
【図Ｓ５ａ】内因性レベルで２つの標的を有するトランス−スプライシング。（ａ）形質転換された細胞ＨＣＣ陽性および陰性細胞株、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）およびＨＣＣに関して陰性の初代脂肪細胞を含む種々の細胞タイプにおけるＨＣＣマーカー遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ発現レベルを示すヒートマップ。
【図Ｓ５ｂ】内因性レベルで２つの標的を有するトランス−スプライシング。（ｂ）１００μＭ用量のＧＣＶを伴う（左）およびＧＣＶを伴わない（右）、内因性遺伝子レベルで２つのターゲットを有するトランス−スプライシングを示すためのＡｌａｍａｒアッセイ。
【図Ｓ６ａ】１０μＭ、１００μＭ  ＧＣＶで処理した場合またはＧＣＶで処理しなかった場合の、ＨＰＶ１６陽性および陰性細胞株におけるＨＳＶｔｋ誘発細胞死を示す、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイ。通常の補充用量の薬物を用いた６日間のＧＣＶ誘導細胞死に関して、Ｅ１ｂおよびＥ６を標的とする２つの５’ＥＲ  ｔｓＲＮＡコンストラクトならびにＥ１ａ、Ｅ２、Ｅ５およびＥ６を標的とする４つの３’ＥＲ  ｔｓＲＮＡコンストラクトを次の細胞株：（ａ）ＨＰＶ１６陽性ヒト細胞株ＳｉＨａにおいて試験した。
【図Ｓ６ｂ】１０μＭ、１００μＭ  ＧＣＶで処理した場合またはＧＣＶで処理しなかった場合の、ＨＰＶ１６陽性および陰性細胞株におけるＨＳＶｔｋ誘発細胞死を示す、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイ。通常の補充用量の薬物を用いた６日間のＧＣＶ誘導細胞死に関して、Ｅ１ｂおよびＥ６を標的とする２つの５’ＥＲ  ｔｓＲＮＡコンストラクトならびにＥ１ａ、Ｅ２、Ｅ５およびＥ６を標的とする４つの３’ＥＲ  ｔｓＲＮＡコンストラクトを次の細胞株：（ｂ）ＨＰＶ１６陽性マウス細胞株Ｃ３において試験した。
【図Ｓ６ｃ】１０μＭ、１００μＭ  ＧＣＶで処理した場合またはＧＣＶで処理しなかった場合の、ＨＰＶ１６陽性および陰性細胞株におけるＨＳＶｔｋ誘発細胞死を示す、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイ。通常の補充用量の薬物を用いた６日間のＧＣＶ誘導細胞死に関して、Ｅ１ｂおよびＥ６を標的とする２つの５’ＥＲ  ｔｓＲＮＡコンストラクトならびにＥ１ａ、Ｅ２、Ｅ５およびＥ６を標的とする４つの３’ＥＲ  ｔｓＲＮＡコンストラクトを次の細胞株：（ｃ）ＨＰＶ１８陽性ヒト細胞株ＨｅＬａにおいて試験した。
【図Ｓ６ｄ】１０μＭ、１００μＭ  ＧＣＶで処理した場合またはＧＣＶで処理しなかった場合の、ＨＰＶ１６陽性および陰性細胞株におけるＨＳＶｔｋ誘発細胞死を示す、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイ。通常の補充用量の薬物を用いた６日間のＧＣＶ誘導細胞死に関して、Ｅ１ｂおよびＥ６を標的とする２つの５’ＥＲ  ｔｓＲＮＡコンストラクトならびにＥ１ａ、Ｅ２、Ｅ５およびＥ６を標的とする４つの３’ＥＲ  ｔｓＲＮＡコンストラクトを次の細胞株：（ｄ）ＨＰＶ１６および１８陰性ヒト細胞株ＨｅｐＧ２において試験した。
【図Ｓ７ａ】ダンベル型ＤＮＡ最小ベクターを用いたＲＮＡトランス−スプライシングの送達。（ａ）ＥＬＡＮ法によるｔｓＲＮＡプラスミドからのダンベルの合成。記載のサイズを有するプラスミドおよびダンベルベクターの両方の概略図。
【図Ｓ７ｂ】ダンベル型ＤＮＡ最小ベクターを用いたＲＮＡトランス−スプライシングの送達。ＡＦＰ  ＴａｑＭａｎ  ｒｔＲＴ−ＰＣＲ検出系を用いたプラスミドｔｓＲＮＡコンストラクトに対する等質量および等モルの両方で試験した（ｂ）３’ＥＲダンベルの効率。
【図Ｓ７ｃ】ダンベル型ＤＮＡ最小ベクターを用いたＲＮＡトランス−スプライシングの送達。ＡＦＰ  ＴａｑＭａｎ  ｒｔＲＴ−ＰＣＲ検出系を用いたプラスミドｔｓＲＮＡコンストラクトに対する等質量および等モルの両方で試験した（ｃ）５’ＥＲダンベルの効率。
【実施例】
【００５９】
方法および材料
ＲＮＡ設計：活性および標的特異性を改善するために種々の報告されたおよび新規の分子の特徴を組み合わせて、トランス−スプライシングコンストラクトを設計した。３’ＥＲ  ｔｓコンストラクトは、ＣＭＶプロモーター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ａｃｃ  ｎｏ．Ｕ５５７６２）、それに続く標的ＡＦＰイントロン５に相補的な５０塩基の結合ドメイン（ＢＤ）からなっていた。前記ＢＤは、細胞の核内においてより長いｄｓＲＮＡによって誘発され得る潜在的なアンチセンス（ａｓ）効果を抑制するために、１８番目および１９番目に２つのミスマッチを含んでいた。ＡＦＰイントロン５に指向され得る完全なアンチセンスＲＮＡ構造スペース内の短い非構造化ＢＤを選択するために、ソフトウェア「ｆｏｌｄａｎａｌｙｚｅ」（ＨＵＳＡＲ，ＤＫＦＺ）を使用した。選択したＢＤの構造を、ソフトウェアツールｍｆｏｌｄおよびＲＮＡｆｏｌｄを用いるＲＮＡ  ２°構造（最小自由エネルギーおよびセントロイド）予測により確認した。そのような選択されたＢＤをその後、トランス−スプライシングＲＮＡの残部と融合し、ＢＤが融合時に非構造化されたままであってトランスースプライシングまたはコーディングドメインの塩基対形成に関与しないことを確実にし、これは適切なスペーサーを付与することにより達成された。選択された３’スプライスシグナル（３’ｓｓ）は、機能的に細胞のシス−スプライス部位と競合するように設計され、イントロニック・スプライス・エンハンサー（ｉｎｔｒｏｎｉｃ  ｓｐｌｉｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ：ＩＳＥ）（ＭｃＣａｒｔｈｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｋｏｎｃｚａｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｙｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）、分岐点（ＢＰ）（Ｅｕｌ，  ２００６）およびポリピリミジントラクト（Ｐｐｔ）（Ｎｏｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｔａｇｇａｒｔ，  ｅｔ  ａｌ，  ２０１２）によって支持された。トランス−スプライシングプロセスから最初に得られるＡＦＰ−ＨＳＶｔｋ融合タンパク質からの天然のＨＳＶ−ｔｋの内因性の切り離しを保証するために、タンパク質分解的切断部位Ｐ２Ａ（Ｋｉｍ，  ｅｔ  ａｌ，  ２０１１）をコードする配列をＨＳＶｔｋ  ｃｄｓの前に置いた。前記ＨＳＶｔｋ遺伝子は開始コドンを欠いており、トランス−スプライシング後にのみ、標的メッセージの翻訳開始を用いて翻訳され得る。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は、ＨＳＶ−ｔｋアミノ酸配列を変化させない縮重した選択的コドンを使用することにより生成したＡ／Ｇリッチ・エキソニック・スプライス・エンハンサー（ＥＳＥ）を備えていた（Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ，  ２００２；  Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）  （補助図１ａ）。１３３塩基のベータ−グロビン・ミニイントロン（（ｐＣＭＶＴＮＴＴＭ，  ａｃｃ  ｎｕｍ．  ＡＦ４７７２００．１）をＨＳＶｔｋ遺伝子に、スプライス部位コンセンサスモチーフ（３’ｓｓ  ＣＡＧ／Ｇおよび５’ｓｓ  ＭＡＧ）で導入した。転写終結のために、ＳＶ４０ポリＡ配列（ｐｃＤＮＡ３．１，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。
【００６０】
５’ＥＲ  ｔｓコンストラクトを、ｐ３ＥＲと同一の分子特徴を有するが、ＣＭＶプロモーターとともに転写シグナルモチーフを含む方向が異なるように設計した。真核ｍＲＮＡの翻訳に重要な全ての構造要素が含まれていた：ＡＦＰのオリジナルキャップ部位（Ｇｉｂｂｓ，  ｅｔ  ａｌ．  １９８７）、それに続くコンセンサスＫｏｚａｋ配列ＧＣＣＲＧＣＣＡＵＧＧ（Ｋｏｚａｋ，  １９９５，  １９９９，  ２００５）。翻訳直後、開始シグナルは  ＥＳＥおよびミニイントロン、それに続く５’ｓｓシグナルを含めたコーティングドメインＨＳＶｔｋであった（Ｆｒｅｕｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。５’  ＢＤは、ａｓ効果を避けるために、２４および２５番目にミスマッチを有する同様の方法で設計した。ＢＤに続いて、ハンマーヘッド型リボザイム（ＨＨＲｚ）（Ｓａｋｓｍｅｒｐｒｏｍｅ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４）を、核中への送達後のＢＤの切断増強のために導入した。ＳＶ４０ポリＡが続くリボザイムからＳＶ４０ポリＡを単離するために、ＨＨ  ＲＺの後に長いスペーサーを続けた。
【００６１】
突然変異設計：２つの点突然変異を有する完全長不活性化ＨＳＶｔｋタンパク質を産生するために、３’／５’ΔＨＳＶｔｋを設計した：１１５番目のＡからＧへの突然変異（グリシンからグルタミン酸へ）、６４９番目のＧからＡへの突然変異（ヒスチジンからアルギニンへ）（Ｓａｓａｄｅｕｓｚ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９７）。３／５’Δｓｓを活性なスプライスシグナルを有することの重要性をチェックするために設計した。ｓｓにおける突然変異は、ｔｓの減少をもたらすはずである。３’Δｓｓ１は、ＡからＣへ変化させた保存されたＢＰを有しており、３’Δｓｓ２は、ＢＰを含む変化させた６／８ヌクレオチドを有し、両ｓｓは、ＡＧからＴＣへ突然変異させたアクセプターｓｓを有している。５’Δｓｓ１は、完全なコンセンサスドナーｓｓＧＴに対して変化させた７／１１塩基を有し、５’Δｓｓ２は、変化させた１０／１１塩基を有しており、ＧＴからＡＣへのドナーｓｓの突然変異を含んでいた。５’ΔＨＨ  Ｒｚは、リボザイムの切断効率を除去するかまたは大きく低下させるために保存された切断モチーフＧＵＣがＡＣＡに変えられた。
【００６２】
プラスミドコンストラクション：それぞれｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔおよびｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨと名付けた３’および５’親エキソン置換（ＥＲ）コンストラクトを、遺伝子合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ，  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）、マスターベクターとして使用すべきｐＶＡＸ１（ＡｄｄＧｅｎｅ）にＳｐｅＩおよびＢｂｓＩを用いてクローニングし、トランス−スプライシングコンストラクトの残部をサブクローニングした。ＮＣＢＩ（ａｃｃ  ｎｕｍ  Ｍ１６１１０）に由来するエキソン３−６およびイントロン３および５からなるＡＦＰミニ遺伝子（ＡＦＰ＿Ｅ３−Ｅ６）を遺伝子合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ，  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩを用いてｐＶＡＸ１にクローニングした。ＨＳＶｔｋポジティブコントロールを、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐ３ＥＬおよびｐ５ＥＬ発現プラスミドからサブクローニングした。ＨＳＶｔｋ遺伝子（ＮＣＢＩ  ａｃｃ  ｎｕｍ  ＡＦ０５７３１０）の完全１１３６塩基ｃｄｓを、トランス−スプライシングコンストラクトの一部として遺伝子合成した。
【００６３】
全部で８０個のコンストラクトを設計し、変化の領域は遺伝子合成するかまたはＰＣＲ増幅し、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔおよびｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ親またはマスターベクターにサブクローニングした。ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Δｓｓ１およびｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Δｓｓ２は、野生型ｓｓを置き換えるためにそれぞれＢｂｖＣＩおよびＳａｃＩ、ＮｈｅＩおよびＰｖｕＩを用いてｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ内にサブクローニングした３’スプライス部位突然変異である。同様に、ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ＿Δｓｓ１を、ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ内にＢｓｓＨＩＩおよびＢｂｓＩを用いてクローニングした。ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ＿Δｓｓ２をｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いて合成して所望の５’ｓｓ突然変異を生成し、マスターベクター中にＢｓｓＨＩＩおよびＫｐｎＩを用いてクローニングした。より弱いＨＳＶｔｋタンパク質を生成するための３’および５’置換突然変異、すなわちｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ΔＨＳＶｔｋおよびｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ＿ΔＨＳＶｔｋを、それぞれＰｖｕＩおよびＰｓｔＩ、ＰｓｔＩおよびＮｈｅＩを用いてそれらの親ベクターにクローニングした。５’ＨＨ  Ｒｚ突然変異、すなわちｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ΔＨＨをｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いて生成し、親ベクター中にＫｐｎＩおよびＢｂｖＣＩを用いてクローニングした。ＮｈｅＩおよびＢｂｖＣＩを用いてｐ３ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔを、ＫｐｎＩおよびＢｂｖＣＩを用いてｐ５ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨをサブクローニングし、標的に対してミスマッチを持たないＢＤ（技術水準のＢＤ）を生成した。ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔからＢＤをＮｈｅＩおよびＢｂｖＣＩを用いて除去し、小さいオリゴを同一ＲＥのオーバーハングを用いて置き換えることにより、ｐ３ＥＲ＿ＢＤ（−）を生成した。ただし、ｐ５ＥＲ＿ＢＤ（−）＿ＨＨおよびｐ５ＥＲ＿ＢＤ（−）＿ΔＨＨは、５’ＢＤをＨＨ  ＲｚのステムＩＩＩと結合するためにランダムな８ｍｅｒと置き換えることにより生成し、親ベクター中にＫｐｎＩおよびＢｂｖＣＩを用いてサブクローニングした。ＨＨを有しないｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ（−）をＫｐｎＩおよびＢｂｖＣＩを用いてサブクローニングした。３’構造化ＢＤ、すなわちｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｓｔｒｕｃ１、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｓｔｒｕｃ２およびｐ３ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ−ｉｎｖを、ＮｈｅＩおよびＢｂｖＣＩを用いてサブクローニングした。５’構造化ＢＤ、すなわち５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｓｔｒｕｃ１＿ＨＨおよびｐ５ＥＲ  ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ−ｉｎｖ＿ＨＨを、ＫｐｎＩおよびＢｂｓＩを用いてサブクローニングした。さらに、ＲＮＡの３’末端の安定性を見るための５’ＥＲコンストラクト（ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ｈｐ＿ＨＨおよびｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Ｙ＿ＨＨのような）を、ＫｐｎＩおよびＢｂｓＩを用いて親の中にクローニングした。３’ＥＲにおけるオンターゲットおよび選択的トランス−スプライシングの特異性を研究するための追加的なＢＤ、すなわちｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Ｄ、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Ｅ、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Ｆ、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＥＦ、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＤＥＦお���びｐ３ＥＲ＿ＢＤ（−）＿Ｄを、ＮｈｅＩおよびＢｂｖＣＩを用いて親の中にクローニングした。スプライス突然変異体の状況においてこれらの準最適なトランス−スプライシングコンストラクトの効果をさらに研究するために、これらを３’セットに関してはｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Δｓｓ１およびｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Δｓｓ２に、５’セットに関してはｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ＿Δｓｓ１およびｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ＿Δｓｓ２中にクローニングした。３’構造化ＢＤ（６個の異なるコンストラクト：ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｓｔｒｕｃ１／２／ｏｐｔ−ｉｎｖ＿Δｓｓ１／２）、３’ミスマッチなしＢＤ（２個のコンストラクト：ｐ３ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ＿Δｓｓ１／２）および３’ＢＤなし（２個のコンストラクト：ｐ３ＥＲ＿ＢＤ（−）＿Δｓｓ１／２）をＮｈｅＩおよびＢｂｖＣＩを用いてクローニングした。５’構造化ＢＤ（４個の異なるコンストラクト：ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｓｔｒｕｃ１／ｏｐｔ−ｉｎｖ＿ＨＨ＿Δｓｓ１／２）、５’ミスマッチなしＢＤ（２個のコンストラクト：ｐ５ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ＿Δｓｓ１／２）、５’ＢＤなし＿ｗｔ  ＨＨ（２個のコンストラクト：ｐ５ＥＲ＿ＢＤ（−）＿ＨＨ＿Δｓｓ１／２）および５’ｎｏ  ＢＤ＿ｍｕｔ  ＨＨ  （２個のコンストラクト：ｐ５ＥＲ＿ＢＤ（−）＿ΔＨＨ＿Δｓｓ１／２）をＫｐｎＩおよびＢｂｖＣＩを用いてクローニングした。ミスマッチなしまたは技術水準ＢＤの状況において準最適なトランス−スプライシングコンストラクトの効果を研究するために、構造化ＢＤを標的に対して完全に相補性にし、ＮｈｅＩおよびＢｂｖＣＩを用いてｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ中にクローニングし（全部で３個のコンストラクト：ｐ３ＥＲ＿ＢＤ−ｓｔｒｕｃ１／２／ｏｐｔ−ｉｎｖ）、ＫｐｎＩおよびＢｂｓＩを用いてｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ中にクローニングした（全部で２個のコンストラクト：ｐ５ＥＲ＿ＢＤ−ｓｔｒｕｃ１／ｏｐｔ−ｉｎｖ＿ＨＨ）。
【００６４】
全体のトランス−スプライシングを改善するために、３’ＥＲコンテキストにおいて同時に２つのｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的とするためのコンストラクトを設計し（一方はＡＦＰに対し、他方はＨＣＣＡ２、ＣＤ２４またはＶＥＧＦの何れかに対する）、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＡＦＰ＋ＨＣＣＡ２およびｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＣＣＡ２＋ＡＦＰをＮｈｅＩおよびＢｂｖＣＩを用いてｐ３ＥＲ親ベクター中にサブクローニングした。他の標的、すなわちｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＡＦＰ＋ＣＤ２４およびｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＡＦＰ＋ＶＥＧＦを、ＥｃｏＲＩおよびＢｂｖＣＩを用いて、第２のＢＤとしての役割を果たすＨＣＣＡ２を置き換えることにより、３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＡＦＰ＋ＨＣＣＡ２ベクター中にさらにサブクローニングした。同様にｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＣＤ２４＋ＡＦＰおよびｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＥＧＦ＋ＡＦＰをＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩを用いて第１のＢＤとして役割を果たすＨＣＣＡ２  ＢＤを置き換えることによりｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＣＣＡ２＋ＡＦＰベクター中にサブクローニングした。フローサイトメトリー分析のために、ＧＦＰ遺伝子（ｐＥＧＦＰ．Ｃ２から増幅）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いてｐＧＬ３−コントロール中にクローニングし、ｐＧＬ３プラスミドからのＳＶ４０プロモーター−ＧＦＰ−ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ−ＳＶ４０エンハンサーカセットを、ｐＶＡＸ１−トランス−スプライシングベクターにおける自己生成ＭＣＳ部位にＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩを用いてクローニングした。ｐＶＡＸ１−ＡＦＰネガティブコントロールベクターにおけるＧＦＰカセットを、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩを用いて直接クローニングした。ＨＰＶ１６遺伝子を標的とするトランス−スプライシングコンストラクトを生成するために、親ベクターｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔからＢａｍ  ＨＩおよびＸｈｏＩ用いて上記ＢＤを切断し、ＢＤ  Ｅ１ａおよびＥ５で置き換えることにより、それぞれｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Ｅ１ａおよびｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Ｅ５を生成した。同様にＢＤ  Ｅ２およびＥ６をＸｈｏＩおよびＸｂａＩを用いてＡＦＰ  ＢＤを置き換えることによりｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ中にクローニングして、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Ｅ２およびｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Ｅ６を生成した。５’ＥＲに関して、ＡＦＰ  ＢＤを含む親ベクターｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨを、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いてＨＰＶ１６  ＢＤ  Ｅ１ｂで置き換え、ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Ｅ１ｂ＿ＨＨを生成し、ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ（−）ベクターのＡＦＰ  ＢＤをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いてＥ６  ＢＤで置き換えて、ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Ｅ６＿ＨＨ（−）を形成した。
【００６５】
ダンベル（ｄｂ）構造：プラスミドベクターからのトランス−スプライシング用ダンベルの生成は、ｄｂ製造のＥＬＡＮ法を用いて行った。Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｂｙ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＥＬＡＮ）は、プラスミドからの転写カセットの切断、いずれかの側での閉ループのライゲーション、それに続く閉じていないｄｂプラスミドを除去するためのエキソヌクレアーゼ処理を含む３ステッププロセスである。
（ａ）ステムループプライマーのリン酸化
個別のＲＥ部位からなるステムループはＡＩＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（シンガポール）によって合成し、それを表１に示す以下の反応を用いてリン酸化した：
【００６６】
【表１】
2019509756.tif 000003
【００６７】
ステムループプライマーは、Ｓｔｅｍ  ｌｏｏｐ−ＳｐｅＩおよびＳｔｅｍ−ｌｏｏｐ−ＢａｍＨＩであった。
（ｂ）  ＥＬＡＮ法
ＥＬＡＮループ−ライゲーション法において、遺伝子発現カセットを、親プラスミドから直接切り出した。遺伝子発現カセットの大部分がキャップされることを確実にするために、５０倍のさらなるステムループをライゲーション反応に添加した。ループダイマーのような副生成物を制限酵素により切断し、エクソヌクレアーゼ処理の間に破壊した。反応の詳細なセットアップを表２に示す。
【００６８】
【表２】
2019509756.tif 000004
【００６９】
表２：ＥＬＡＮループ−ライゲーションストラテジーを用いる、トランス−スプライシングダンベルの生成のための反応のセットアップ
生成したダンベルを、それらの完全性を確認するために１％アガロースゲルで泳動した。
【００７０】
細胞培養：ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、ヒト子宮頸癌細胞株（Ｓｉｈａ，ＨｅＬａ）およびマウス子宮頸癌細胞株（Ｃ３）を５％ＣＯ２を有する加湿したインキュベーターにおいて３７℃で、１０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において維持した。細胞を所望の密度で３〜４日毎に継代した。
【００７１】
プラスミドＤＮＡのトランスフェクション：ＨｅｐＧ２細胞のトランスフェクションを、約７０〜９０％コンフルエントで、ウエスタンブロッティング用には６ウェルプレートにおいて、ＦＡＣＳ分析のためには１２ウェルプレートにおいて、および他の全ての分析のためには２４ウェルプレートにおいて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ＦＡＣＳ研究用のみ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを用いて、製造業者のプロトコールに従って行った。過剰発現研究では、全体で１μｇのＤＮＡで、２４ウェルプレートのフォーマットにおいて（５００ｎｇ：５００ｎｇのｔｓコンストラクト：ＡＦＰ＿Ｅ３＿Ｅ６ミニ遺伝子）、そして内因性研究においてのみ１μｇのｔｓコンストラクトで、コトランスフェクションまたはトランスフェクションを行った。１２ウェルおよび６ウェルのフォーマットに関しては、全ＤＮＡの量をそれぞれ２μｇおよび４μｇに増やした。ＦＡＣＳ実験のために、５００ｎｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ２プラスミドを、ｔｓおよびＡＦＰミニ遺伝子ベクターとともにコトランスフェクトし、いくつかの３’ＥＲおよび５’ＥＲプラスミドおよびダンベルを用いて実験を行うか、またはＧＦＰ融合ｔｓベクターをＡＦＰミニ遺伝子とともに／ＡＦＰミニ遺伝子なしで、それぞれ過剰発現および内因性試験のために使用した。トータルＲＮＡの単離：トランスフェクションの２４時間後に、ＲＮｅａｓｙ  ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを単離した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００を用いて測定した。
【００７２】
ｃＤＮＡ変換およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：全サンプルからの５００ｎｇ  ＲＮＡを、２００ｎｇのランダムヘキサマーおよび１０ｕＭのｄＮＴＰｓとともにＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを用いて、ｃＤＮＡに変換した。反応条件は、２５℃で５分間、続いて５０℃で２時間、および７０℃で１５分間の熱失活であった。２０ｎｇのｃＤＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲのための鋳型として使用した。ｃＤＮＡのＴａｑＭａｎ定量化をＡＢＩ  ７９００ＨＴにおいて、各シス−およびトランス−スプライシング検出用の特異的プローブおよびプライマーセットを設計することにより行った。１セットのプローブをＡＦＰ領域において設計した；すなわち、それぞれ３’ＥＲおよび５’ＥＲ  シスおよびトランス−スプライシングを検出するためのＡＦＰ  ｐｒｏｂｅ  ｅｘｏｎ  ５およびＡＦＰ  ｐｒｏｂｅ  ｅｘｏｎ  ４。ＡＦＰプローブとともに３’ＥＲシス−スプライシングを検出するためのプライマーはＦＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ５（ｓｅｔ１）およびＲＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ６であり、３’ＥＲトランス−スプライシングについてはＦＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ５（ｓｅｔ１）およびＲＰ  ＨＳＶｔｋであった。ＡＦＰプローブとともに５’ＥＲシス−スプライシングを検出するためのプライマーはＦＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ３およびＲＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ４（ｓｅｔ１）であり、５’ＥＲトランス−スプライシングについてはＦＰ  ＨＳＶｔｋ（ｓｅｔ１）およびＲＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ４（ｓｅｔ１）であった。３’ＥＲを検出するための遠位ＨＳＶｔｋ領域におけるプローブの別のセット（ＨＳＶｔｋ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ３’ＥＲと名付けた）および５’ＥＲを検出するための近位ＨＳＶｔｋ領域における別のセット（ＨＳＶｔｋ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ５’ＥＲ  ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｌｏｎｅ）を設計した。ＨＳＶｔｋプローブとともに３’ＥＲトランス−スプライシングを検出するためのプライマーはＦＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ５（ｓｅｔ２）およびＲＰ  ＨＳＶｔｋであった。ＨＳＶｔｋプローブとともに５’ＥＲトランス−スプライシングを検出するためのプライマーはＦＰ  ＨＳＶｔｋ（ｓｅｔ２）およびＲＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ４（ｓｅｔ２）であった。過剰発現試験および内因性試験におけるサイクル数は、それぞれ４０および５０であった。ＲＴ−ＰＣＲ：３’および５’シスおよびトランス−スプライシングを検出するために、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて６０サイクルの２ステップＰＣＲ（３０＋３０サイクルまたは３５＋３５サイクル）でｃＤＮＡサンプルについて逆転写ＰＣＲを実施し、バンドを１％アガロースゲル上で可視化した。３’ＥＲシスースプライシングおよびｍｏｃｋを検出するために使用したプライマーは、ＦＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ５（ｓｅｔ１）およびＲＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ６であり、３’ＥＲトランス−スプライシングを検出するためのプライマーは、ＦＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ５（ｓｅｔ１）およびＲＰ  ＨＳＶｔｋであった。５’ＥＲシス−スプライシングおよびｍｏｃｋを検出するためには、プライマーＦＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ３およびＲＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ��（ｓｅｔ１）、５’ＥＲトランス−スプライシングを検出するためには、プライマーＦＰ  ＨＳＶｔｋ（ｓｅｔ１）およびＲＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ４（ｓｅｔ１）であった。特異的対選択的オンターゲットトランス−スプライシングを可視化するために、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤおよびｐ３ＥＲ＿ＢＤ（−）  ｃＤＮＡを、特異的ｔｓのためにプライマーＦＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ５（ｓｅｔ２）およびＲＰ  ＨＳＶｔｋを用いて、選択的オンターゲットｔｓのためにプライマーＦＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ３およびＲＰ  ＨＳＶｔｋを用いて増幅した。ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ＿ＨＨおよびｐ５ＥＲ＿ＢＤ（−）＿ＨＨ  ｃＤＮＡを、特異的ｔｓのためにプライマーＦＰ  ＨＳＶｔｋ（ｓｅｔ２）およびＲＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ４（ｓｅｔ２）を用いて、選択的オンターゲットｔｓのためにプライマーＦＰ  ＨＳＶｔｋ（ｓｅｔ２）およびＲＰ  ａｆｐ  ｅｘｏｎ  ６を用いて増幅した。
【００７３】
Ａｌａｍａｒアッセイ：トランス−スプライシングの機能的活性を調べるために、トランスフェクションの２４時間後に薬剤ガンシクロビル（ＧＣＶ）（Ｓｉｇｍａ）を細胞に１０μＭ、１００μＭの濃度で添加し、およびＧＣＶを添加せず（内部ネガティブコントロール）、引き続き薬剤の２４時間後にａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、６日間、それぞれａｌａｍａｒの記録後に、毎日フレッシュな培地および薬剤で置き換えた。３７℃でのインキュベーションの９０分後に２３０／２９０ｎｍで蛍光を測定した。当該アッセイ用のポジティブおよびネガティブコントロールを、製造者のプロトコールに記載されるように設計した。
【００７４】
単細胞ゲル電気泳動：コメットアッセイとしても知られ、それは、トランスフェクションの２４時間後に１０μＭ  ＧＣＶを投与し、アルカリ溶解法（Ｏｌｉｖｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００６）を用いて薬物処理の２４時間後に回収した細胞での二本鎖ＤＮＡ破壊を調べるために実施した。コメットをヨウ化プロピジウム１０μｇ／ｍｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、蛍光顕微鏡で１０Ｘおよび２０Ｘ倍率で解析した。サンプルあたり約１５０〜２００個のコメットをスコア化した。
【００７５】
フローサイトメトリー：アポトーシスを調べるために、１００μＭ  ＧＣＶ処理の４８時間後に回収し、製造者のプロトコールに従ってアネキシン−結合バッファーにおいてヨウ化プロピジウムおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて染色した。ＧＦＰ陽性である単一の生細胞ポピュレーションに基づいてサンプルをゲーティングした。最終のアポトーシスの値％を、（初期および後期アポトーシス＋ＧＣＶ）−（初期および後期アポトーシス−ＧＣＶ）として示す。
【００７６】
ウエスタンブロッティング：ＡＦＰおよびＨＳＶｔｋタンパク質の両方を検出するために、細胞をトランスフェクションの２４時間後に回収し、全体で５０μｇのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでローディングし、ＰＶＤＦ膜に転写し、５％ミルク（ｗ／ｖ）でブロッキングを行った。各々の一次抗体（ＨＳＶ−ｔｋ  ｖＬ−２０ヤギポリクローナル  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｃａｔ  ｎｏ．  ｓｃ−２８０３８、ＡＦＰヤギポリクローナル  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｃａｔ  ｎｏ．  ｓｃ−８１０８およびベータアクチン（内部コントロール）ウサギポリクローナル  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｃａｔ  ｎｏ．ｓｃ−１３０６５６）を５％ミルク中で一晩４℃でインキュベートし、続いて二次抗体（ＨＳＶｔｋおよびＡＦＰ抗ヤギ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｃａｔ  ｎｏ．  ｓｃ−２０２０およびベータアクチン抗ウサギ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｃａｔ  ｎｏ．  ｓｃ−２３５７）と２時間インキュベートした。ブロットをＰｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる化学発光に付し、撮像装置（ＢｉｏＲａｄ）において現像した。
【００７７】
スプライス部位の予測：スプライス部位の強さおよび性質は、ソフトウェアＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｓｐｌｉｃｅ  Ｓｉｔｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  （ＡＳＳＰ）  （Ｗａｎｇ，  ２００６）    ｈｔｔｐ：／／ｗａｎｇｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．ｃｏｍ／ａｓｓｐ／ｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍｌおよびＢｅｒｋｅｌｅｙ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｓｐｌｉｃｅ  Ｓｉｔｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  （ＢＤＧＰ  ＳＳＰ）  （Ｒｅｅｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑｔｏｏｌｓ／ｓｐｌｉｃｅ．ｈｔｍｌを用いて予測し、スプライス部位予測のためのデフォルトのカットオフ値を用いた。ＨＰＶ１６ゲノムにおけるスプライス部位の性質を予測するために、ＡＳＳＰを使用して、ソフトウェアによって生成される全体スコアおよび信頼度に基づいて、構成的なまたは微弱なスプライスアクセプターおよびドナーを示した。信頼度＞０．８９およびスコア＞５．５を有する選択的スプライス部位、および信頼度＞０．１およびスコア＞７．７を有する構成的スプライス部位を、文献に記載されたスプライス部位（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  ２０１３およびＳｃｈｍｉｔｔ，  ｅｔ  ａｌ，  ２０１１）の他にトランス−スプライシング解析のために選択した。
【００７８】
結果および議論
５’および３’エキソン置換（ＥＲ）のために新規に設計したトランス−スプライシングＲＮＡは、過剰発現されたまたは内因性ｐｒｅ−ｍＲＮＡ標的に対して標的化されたトランス−スプライシングを誘発する
この発明は、より高いトランス−スプライシング活性および特異性を達成するために設計された新規の最適化されたＲＮＡ配列および構造に向けられている。我々は、下記の分子的特徴を含む、５’ＥＲまたは３’ＥＲ両方のための親トランス−スプライシングＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）分子を設計した（図１ａ）：第１に、ＡＦＰのｐｒｅ−ｍＲＮＡのイントロン３または５に相補的なコンピューターにより選択された約５０ｎｔの長さの非構造化結合ドメイン（ＢＤ）およびｔｓＲＮＡ分子の状況下で選択されたＢＤ構造を保存するスペーサー；第２に、５’ＥＲに関して、イントロニック・スプライス・エンハンサー（ＩＳＥ）およびコンセンサス・スプライスドナー（ＳＤ）部位（ＣＡＧ／ＧＴ）から、または３’ＥＲに関して、ＩＳＥ、コンセンサスＹＮＹＵＲＡＣ  （Ｒ  プリン，  Ｙ  ピリミジン，  Ｎ  任意のヌクレオチド）分岐点（ＢＰ）配列、広範囲のポリピリミジントラクト（ＰＰＴ）およびコンセンサススプライスアクセプター（ＳＡ）部位（ＡＧ／Ｇ）から構成されるスプライシングドメイン；および第３に、新規の強化されたエキソニック・スプライス・エンハンサー（ＥＳＥ）ならびにα−グロビンミニイントロンを有する、最適化ＨＳＶｔｋ遺伝子を含むコーディングドメイン。
【００７９】
さらに我々は、核ＲＮＡ保持を誘発するためおよびトランス−スプライシング非依拠ＨＳＶｔｋ発現を避けるために、５’ＥＲのための前記ｔｓＲＮＡに、ＢＤの下流に位置する三次構造安定化ハンマーヘッド型リボザイム（ＨＨＲｚ）（Ｓａｋｓｍｅｒｐｒｏｍｅ，  ｅｔ  ａｌ．２００４）を、それ自身をＳＶ４０ポリＡ部位と一緒に切り取るために取り付けた。活性リボザイム構造の形成は、リボザイムとポリＡ部位の間にスペーサーを挿入することにより支持された。一方、３’ＥＲのためのｔｓＲＮＡは、トランス−スプライシング反応から得られるキメラ融合タンパク質からのＨＳＶｔｋのタンパク質分解的切り離しを誘発するために、スプライスアクセプターＳＡ部位のすぐ下流に位置するＰ２Ａタンパク質分解的切断部位（Ｋｉｍ  ＪＨ，  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）を備えていた。これらのコンストラクトは、活性の最大化のために設計した。
【００８０】
標的結合が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によるＡ−ｔｏ−Ｉ編集を含むアンチセンス効果を誘発するかもしれない（これはトランス−スプライス・ストラテジーを損ない得る）長い二本鎖核ＲＮＡを生成するのを避けるために、中央の２ｎｔ標的ミスマッチが結合ドメイン中に含まれた（ΔＢＤ）。３’または５’ＥＲのためにこのような方法で最適化されたＢＤを、ｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔまたはｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨと呼ぶ。コントロールとして、我々は、５’および３’ＥＲのために各々、２つのスプライス部位突然変異（Δｓｓ１およびΔｓｓ２）、部分的に不活性なＨＳＶｔｋ突然変異（ＨＳＶｔｋ遺伝子の１１５番目のＡからＧへの突然変異、および６４９番目のＧからＡへの突然変異）、ならびに５’ＥＲのために、不活性ＨＨＲｚ切断部位を有するコントロール（図３ａ）を設計した。ｔｓＲＮＡを試験するために、我々は、イントロン３（Ｉ３）および５（Ｉ５）を含むがイントロン４（Ｉ４）を欠くエキソン３〜エキソン６（Ｅ３〜Ｅ６）の配列を包含するＡＦＰミニ遺伝子の過剰発現のためのベクターを設計した（図１ａ）。内因性のＡＦＰ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ５、ＳＮＵ４９５およびＣＬ４８、および非肝臓細胞株ＨＥＫ２９３Ｔを含むいくつかの癌細胞株で検出した。ＨｅｐＧ２細胞を５００ｎｇ  ｔｓＲＮＡ  ＋  ５００ｎｇ  ＡＦＰミニ遺伝子でトランスフェクトし、細胞のトータルＲＮＡをトランスフェクションの２４時間後に単離し、トランス−スプライスおよびシス−スプライスされたＲＮＡの両方をＡＦＰ特異的ＴａｑＭａｎプローブを用いるリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔＲＴ−ＰＣＲ）により定量化した。ＨＳＶｔｋ特異的プローブを用いてトランス−スプライシングを追加的に検出した（図１ｂ）。シス−スプライシングが、トランス−スプライシングより高頻度に見られ、スプライス部位突然変異により、親コンストラクトおよびＨＳＶｔｋまたはＨＨＲｚ切断部位突然変異体と比較して減少したトランス−スプライス活性が明らかとなった。ＰＣＲ増幅したｃＤＮＡ内のスプライスジャンクションの配列決定により、親コンストラクトにより誘発されたトランス−スプライシングならびにＡＦＰミニ遺伝子および内因性転写物の両方のシス−スプライシングの正確性を確認した（図１ｃ）。ＡＦＰミニ遺伝子転写物または内因性ＡＦＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ内またはこれらに向けたシス−およびトランス−スプライシングの競合により、シス−スプライシングをトランス−スプライシングにより阻害できることが示された（図１ｄ，ｅ）。我々は、内因性ＡＦＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡに向けられたトランス−スプライシングの成功も検出でき（図１ｆ）、その正確性をｃＤＮＡ配列決定により確認した（図１ｇ）。トランス−スプライシングで誘発されたＨＳＶｔｋタンパク質発現をウエスタンブロット解析によってモニタリングし、トランス−スプライスＲＮＡのレベルとよく相関することが見出された（補助図１ｄ，ｅ）。キメラＡＦＰ−ＨＳＶｔｋ融合タンパク質は３’ＥＲコンストラクトで検出できず、これは効率的なＰ２Ａ−タンパク質分解的切断を示していた。５’ＥＲの場合、スプライス部位突然変異体は、親コンストラクトと比較して明確に減少したレベルのＨＳＶｔｋ発現を誘発し、これは大部分のＨＳＶｔｋタンパク質がトランス−スプライシングに由来し、リークしたスプライシング非依拠性の発現からではないことを示していた。３’ＥＲの後には、４２  ｋＤａ  ＨＳＶｔｋアイソフォームのみが形成されたが、一方で５’ＥＲおよびポジティブコントロールは２つの４２ｋＤａおよび４４ｋＤａ  ＨＳＶｔｋアイソフォームの発現をもたらす。
【００８１】
結合ドメイン配列および構造の設計は、３’エキソン置換を大幅に改善するが５’エキソン置換は改善しない
我々は、ＲＮＡトランス−スプライシングにおけるＢＤ  ＲＮＡ二次の役割を調べた。我々の以前に記載したソフトウェアツール（Ｓｅｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）を用いて、我々は、ＡＦＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡに対して標的化できる約５０ｎｔの長さの最も構造化されていないＢＤを同定した：それぞれイントロン５またはイントロン３に結合する３’または５’ＥＲのための３ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔまたは５ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ（図２、補助図１ｂ，２ａ）。コントロールとして、我々は同等の長さの高度に構造化したドメイン（３ＥＲ＿ＢＤ−ｓｔｒｕｃ１、３ＥＲ＿ＢＤ−ｓｔｒｕｃ２および５ＥＲ＿ＢＤ−ｓｔｒｕｃ１）（これらの各々は非構造化ドメインと重複していた）を同定した（補助図１，２）。最後に我々は、有利なＢＤ、すなわち３ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔおよび５ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔを完全に包含する内部逆方向反復を使用し、それらを構造化された不利なＢＤに変えるが、標的スプライス部位への距離を維持することにより、別の２つのＢＤ、すなわち３ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ−ｉｎｖおよび５ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ−ｉｎｖを設計した。選択された結合ドメインを、リンカーまたはスペーサー配列を介してｔｓＲＮＡの他のドメインと融合し、これにより選択されたＢＤ構造が融合の際に変化しないことが確保された（補助図１ａ）。ＲＮＡ編集を抑制するために、これらの全てのＢＤは、中央に２ｎｔの標的ミスマッチを有する不完全な標的結合ドメイン（ΔＢＤ）として生成した。これらのミスマッチによって生じる効果を調べるために、我々はまた、それぞれ非構造化ＢＤもしくは最も構造化されたＢＤの完全に相補的なアナログ、３ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔおよび５ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ、または３ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ−ｉｎｖおよび５ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ−ｉｎｖを生成した（図２ａ，２ｂ）。全てのＢＤおよびΔＢＤを、親のトランス−スプライシングベクター中にクローニングした。ＨｅｐＧ２細胞を、トランス−スプライシングプラスミドおよびＡＦＰミニ遺伝子ベクターでコトランスフェクトし、トランス−スプライシング活性をトランスフェクションの２４時間後にモニタリングした。３’ＥＲの場合、３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔを有するｔｓＲＮＡは、３ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ、３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ−ｉｎｖまたは３ＥＲ＿ＢＤ−ｏｐｔ−ｉｎｖを有するそのアナログと比較して、４倍（ｐ＝０，０４）、３倍または３０倍（ｐ＝０．０４）強いトランス−スプライシングを誘発した（図２ｃ）。さらに、３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔは、４倍または６倍（ｐ＝０．０４）、３ＥＲ＿ＢＤ−ｓｔｒｕｃ１または３ＥＲ＿ＢＤ−ｓｔｒｕｃ２より強力であった。これらのデータは、（ｉ）ミスマッチΔＢＤが相補的なＢＤよりも強力であること、および（ｉｉ）非構造化ＢＤまたはΔＢＤが構造化されたものより効果的であることを示す。反対に、結合ドメイン内のＲＮＡ二次構造形成および標的相補性の程度は、５’ＥＲ活性に影響を与えなかった（図２ｄ）。しかしながら、スプライス部位突然変異は、全てのコンストラクトの３’および５’ＥＲ活性を低下させた（図２ａ，ｂ）。５’エキソン置換は、ｔｓＲＮＡ  ３’末端の熱力学的安定性と相関する。
【００８２】
図１ｂにより、不活性なＨＨＲｚ切断モチーフを有するコンストラクトｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ΔＨＨが、その切断可能アナログｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨと比較して強力なトランス−スプライス活性を誘発したことが示された。切断されていないＲＮＡは、ポリＡ尾部を有し、細胞質に輸出され、その結果その核濃度およびトランス−スプライシングの率を低下させると考えられるので、このことは驚くべきことであった。我々は、ステムループ・プライマーをベースとするｒｔ−ＲＴ−ＰＣＲを用いて、切断されたＲＮＡ３’末端を定量化することにより、ＨＨＲｚ切断を調べた（図３ａ）。この方法は、完全なプライマーマッチングと伸長ＲＮＡ  ３’末端を効果的に区別することが証明された。観察された６．２サイクルの差により、非構造化３’末端ＢＤを有するトランス−スプライシングＲＮＡを産生する９０％超のリボザイム切断率が示された（図３ａ）。アンチセンスＲＮＡの非構造化末端は、速い標的結合と分解の両方と関連することが報告されている。リボザイム切断後に５’ＥＲのためのトランス−スプライシングＲＮＡの３’末端を安定化するために、我々は、ＢＤの下流であるがＨＨＲｚ切断部位の上流にステムループ（ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ｈｐ＿ＨＨ）またはＹ字型（ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿Ｙ＿ＨＨ）構造を有するコンストラクト、ならびにＢＤにポリＡ部位が続くが、リボザイムおよびスペーサーを欠いているコントロール（ｐ５ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＨＨ（−））を設計した（図３ｃ）。リボザイム切断の前後のＲＮＡ二次構造をｍｆｏｌｄを用いて予測した。全ての５’ＥＲコンストラクトの実験的研究により、ＲＮＡ３’末端の熱力学的安定性、すなわち二次構造形成のＧｉｂｂｓの自由エネルギーΔＧと、トランス−スプライシング活性との間の正の相関が明らかとなった（図３ｄ，ｅ）。最も強力なトランス−スプライシングは、突然変異を有するＨＨＲｚ切断部位を有しスペーサーおよびＳＶ４０ポリＡ部位によって形成される安定な二次構造を有するコンストラクトにおいて観察され、末端にＹ字型およびステムループ構造を有するコンストラクト、および３’末端ＢＤを有する親コンストラクトが続く。しかしながら、群を抜いて最も低いトランス−スプライス活性は、ポリＡ部位を含むが３’末端に安定な構造を欠いているコンストラクトにおいて測定された。
【００８３】
マルチプル結合ドメインは、標的化されたトランス−スプライシングを増強し、選択的オンターゲットトランス−スプライシングを抑制し、従って３’ＥＲの特異性を増加させる
選択的オンターゲットトランス−スプライシングを抑制するため、およびトランス−スプライシング特異性を改善するために、我々は、複数の標的および／または自己結合ドメインを有する３’ＥＲのための新規ＲＮＡを設計した（図４ｃ）。迅速な標的への結合のために最適化されたＢＤ−ｏｐｔを補足して、我々は、  （ｉ）ＢＤ−Ｅに、意図するトランス−スプライス部位Ｄ２およびＡを互いにより近接させ、（ｉｉ）ＢＤ−Ｆを結合させ、機能的に選択的ドナースプライス部位Ｄ１をブロックし、（ｉｉｉ）ＢＤ−ｏｐｔのすぐ上流に位置していた自己結合ドメインＢＤ−Ｄに、標的結合不在下でトランス−スプライシングＲＮＡのアクセプタースプライス部位ＡのＰＰＴを保護させた。さらに我々は、ＢＤ−ｏｐに加えそれぞれＢＤ  ＥおよびＦまたはＢＤ  Ｄ、ＥおよびＦを有する、マルチプルＢＤ、すなわちｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＥＦまたはｐ３ＥＲ＿ΔＢＤ−ｏｐｔ＿ＤＥＦを生成した。全てのコンストラクトに関して、我々は、特異的（ＴＳｓｐｅｃ）および選択的オンターゲットトランス−スプライシング（ＴＳａｌｔ）の相対活性を測定し、式（１）を用いて特異性係数Ｓを計算した（図４ｄ）：
Ｓ  ＝  ＴＳｓｐｅｃ／ＴＳａｌｔ＊１００％            （１）
全ての二次ＢＤは、特異性係数の増加に反映されるように、トランス−スプライシングの特異性を増加させた。ＢＤ−Ｆおよびより顕著なＢＤ−Ｄは、特異的および選択的オンターゲットトランス−スプライシングの両方を抑制した一方で、ＢＤ−ＥならびにＢＤ−Ｅおよび−Ｆの組み合わせは、特異的なトランス−スプライシングは増加させたが、選択的オンターゲットトランス−スプライシングは抑制した。しかしながら、最も成功したのは３つ全ての追加的なＢＤ、すなわちＤ、ＥおよびＦの組み合わせであり、これは、特異的なトランス−スプライシングを約２倍増加させ、選択的スプライシングを約５倍減少させ、従って、親コンストラクトと比較して、１０倍高いトランス−スプライシングの特異性を示した。標的結合ドメインのないコンストラクトにおいて、内部ＢＤ−Ｄは  強力なスプライスドナーＤ１またはやや強力なドナーＤ２に向けたトランス−スプライシングを２０倍または１３０倍抑制し、他の細胞のオフターゲットに対するトランス−スプライシングが同程度抑制されたと考えられる。特に、トランス−スプライシングの同等の減少が、突然変異誘発により弱められたスプライス部位を有するＢＤ（−）コンストラクトで観察された。
【００８４】
過剰発現させたまたは内因性ＡＦＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡに向けたトランス−スプライシングは、ヒト肝がん細胞株において死を誘発する
自殺遺伝子系として、我々は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）およびプロドラッグのガンシクロビル（ＧＣＶ）を選択した。トランス−スプライシングは、標的ＲＮＡに依存する様式でＨＳＶｔｋ発現を誘発し、これはその後  ＧＣＶのそのモノホスフェートへのリン酸化に触媒作用を及ぼし、それは引き続きそのジ−およびトリ−ホスフェート誘導体に細胞キナーゼにより変換される。毒性のＧＣＶ−トリホスフェートはその後、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）アナログとして作用し、従って、複製の間にＤＮＡ鎖上に留まり、鎖の終結および細胞死を引き起こす。我々は、過剰発現させたまたは内因性ＡＦＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡに向けられた５’または３’ＥＲによって誘発されたヒト肝がん細胞ＨｅｐＧ２の死を３つの異なるアッセイを用いて調べた。第１に、ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイ。細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に１０もしくは１００μＭ  ＧＣＶを培地に添加し、薬剤処理の２４時間後にａｌａｍａｒ色素を添加し、９０分のインキュベーション時間後に蛍光を測定した。ａｌａｍａｒ測定後に、培地および薬剤を補充し、６日間連続でプロセスを繰り返した。ポジティブコントロールのレベルに達する、最も高いレベルの細胞死、すなわち、１００μＭ  ＧＣＶで最大８０％（図５ａ，ｂ）または１０μＭ  ＧＣＶで６０〜７０％（補助図３）が、過剰発現ＡＦＰメッセージに対する親コンストラクトのトランス−スプライシングにより処理の６日目に誘発された。同様に、高レベルの細胞死が、４つ全てのＢＤを含む３’ＥＲコンストラクトで、および突然変異を有するＨＨＲｚ切断モチーフを有する５’ＥＲに関して観察された。内因性ＡＦＰ  ＲＮＡでの３’ＥＲは、わずかに効果が低かった。予測されたように、より低いレベルの細胞死が、部分的に不活性なＨＳＶｔｋ突然変異体、スプライス部位突然変異体およびＡＦＰ特異的ＢＤを欠くＲＮＡにより誘発された。ＧＣＶの非存在下においてＡＦＰミニ遺伝子またはトランス−スプライシングコンストラクトにより細胞毒性は誘発されなかった。第２に、我々の系によって誘発される細胞死の特定の様式をモニターするために、我々は、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アポトーシスアッセイを利用した。従って、ＨｅｐＧ２細胞をトランスフェクトし、１００μＭ  ＧＣＶで４８時間処理し、フローサイトメトリーを用いて解析した。トランスフェクトした細胞のみを分析するために、我々は最初にトランス−スプライシングベクターおよびＡＦＰミニ遺伝子と一緒にＥＧＦＰ発現ベクターをコトランスフェクトした（補助図４）。活性なトランス−スプライシングコンストラクトが、部分的に不活性なコンストラクトまたはコントロールと比較して高いレベルのアポトーシス（最大５０％）を誘発することが見出されたが、相当の割合（３０％）のアポトーシス細胞がＥＧＦＰ陽性であった（補助図８ｄ）。複数のプラスミドのコトランスフェクトに伴う欠点を回避するために、我々は、ＳＶ４０プロモーター駆動性のＥＧＦＰ遺伝子を、トランス−スプライシングベクター、ＡＦＰミニ遺伝子ベクターおよびＨＳＶｔｋベクターに挿入し、その結果、細胞を１つのプラスミドだけ（内因性標的）または２つのプラスミド（過剰発現標的）でトランスフェクトすることができた（図５ｃ，ｄ，ｅ）。最適化されたＢＤまたはマルチプルＢＤを有する最も活性な３’ＥＲコンストラクト、および活性もしくは不活性切断モチーフを有するＨＨＲｚを持つ最良の５’ＥＲコンストラクトは、ＡＦＰ過剰発現細胞の４０％超でアポトーシスを誘発した。半分のアポトーシス細胞は、内因性ＡＦＰのみを発現する細胞で検出された。例外は、突然変異を有するＨＨＲｚ切断部位を有する５’ＥＲコンストラクトであり、これは、内因性および過剰発現ＡＦＰの両方と同等の高レベルのアポトーシスを誘発した。このｔｓＲＮＡは、標的に対するトランス−スプライシングを受けなくとも、５’キャップおよび３’ポリＡ尾部を有する完全に損傷されていない安定なｍＲＮＡを示す。従って、このｔｓＲＮＡの高い細胞死活性は、トランス−スプライシングの非存在下での核輸出およびＨＳＶｔｋ翻訳のどちらかによるものであるか、および／または代替として高い内因性の安定性および後続の高率のトランス−スプライシング（これらはまさにこのＲＮＡに関して測定された）によるものであるかもしれない（図３ｄ）。ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ誘発細胞死の様式は、主に、ＤＮＡ二本鎖破壊を伴うアポトーシスとして報告されてきた。大部分の割合の細胞がアポトーシスにより殺されたことを確認するために、我々は第３に、単細胞ゲル電気泳動後に部分的に分解したＤＮＡを可視化できるコメットアッセイを実施した。従って、ＨｅｐＧ２細胞を、トランス−スプライシングコンストラクトおよびＡＦＰミニ遺伝子でコトランスフェクトし、１００μＭ  ＧＣＶでインキュベートし、２４時間後にＤＮＡ破壊をテイルモーメントとして記録した。結果は、ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅおよびアネキシンＶ／ＰＩアッセイで得られたものと一致し：大部分のＤＮＡの破壊が、マルチプルＢＤまたは親３’ＥＲ  ＲＮＡにより、５’ＥＲの場合は突然変異を有するＨＨＲｚ切断部位および親配列を持つＲＮＡにより誘発された（図５ｆ）。
【００８５】
２つの内因性肝がんマーカーを同時に標的とするトランス−スプライシングＲＮＡは、１０倍低いガンシクロビル用量で細胞死の増加を誘発した
他の多くのヒト疾患のように、肝細胞がん（ＨＣＣ）の発がんは、多因子性の、多段階の複雑なプロセスであり、単一のバイオマーカーは疾患およびそのステージを正確に示さない。我々のアプローチのＨＣＣ特異性および感受性の両方を増加させるために、我々は、別個のＢＤを用いて２つのＨＣＣバイオマーカーを同時に標的化する二重特異性（二重標的化）ｔｓＲＮＡを調べた。マルチプルＨＣＣバイオマーカーは文献に報告されており、我々は、１０種の異なる細胞株または細胞において１２個の対応するｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの量を測定した（補助図５ａ）。我々の試験細胞株における量、ＨＣＣ特異性および臨床的意義に基づいて、我々は３つの遺伝子を選択した：第１にＨＣＣＡ２（ＹＹ１ＡＰ１）であり、肝がん患者においてアップレギュレートされているＨＣＣ関連タンパク質；第２にＣＤ２４であり、表面マーカー糖タンパク質であって、末期ＨＣＣにおける細胞の高い侵襲性および転移可能性に関するマーカー；および第３にＶＥＧＦであって、腫瘍の血管新生に重要な役割を果たすサイトカインであり、ＨＣＣにおけるリンパ節転移のバイオマーカーである。我々は、ＡＦＰおよびＢＤをスペーサー配列で分離する１つの二次標的ＢＤの６つ全ての組み合わせを考慮して二重標的化トランス−スプライシングＲＮＡを設計し、ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイを用いて、内因性のｐｒｅ−ｍＲＮＡのみを標的とするＨｅｐＧ２細胞のトランス−スプライシング介在性死を調べた（図５ｇ，ｈ）。１０μＭ  ＧＣＶで、全ての二重標的化コンストラクトは、ＡＦＰのみを標的とするコンストラクトと比較して有意に高いレベルの細胞死を誘発したが（図５ｈ）；１００μＭ  ＧＣＶでは、単一および二重標的化コンストラクトは同等の効果を示した（補助図５ｂ）。
【００８６】
ＨＰＶ−１６−標的化自殺ＲＮＡは、特異的にＨＰＶ−１６−形質転換組織培養細胞を殺した
我々のｔｓＲＮＡの普遍的な設計は、関心のある任意のｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的とするための、スペーサーと一緒のＢＤの置換を促進する。第２の臨床的に関連する標的として、我々はヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ−１６）を選択した。ＨＰＶは、皮膚および粘膜のケラチノサイトにおいて増殖的に感染し、良性の乳頭腫、前がん病変および癌を引き起こす。ＨＰＶ感染は、世界中で最も高頻度な性感染疾患であり、２つの高リスク型ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８は、子宮頸がん全症例の約７０％を引き起こす。細胞形質転換の前に、ＨＰＶ−１６ゲノムが宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルスＤＮＡを感染した個体から排除する方法はない。しかしながら、自殺遺伝子治療による感染細胞の選択的な破壊は、この問題を解決するためのアプローチを提示し得る。ＨＰＶ感染において、選択的スプライシングは、ウイルスｍＲＮＡの多様なアイソフォームを生成する。我々は、コンピューターにより５つの最も有利な非構造化アンチセンスＢＤ（ｏｐｔ＿Ｅ６、＿Ｅ１ａ、＿Ｅ１ｂ、＿Ｅ２および＿Ｅ５）を選択し、これらは初期ウイルス遺伝子Ｅ６、Ｅ１、Ｅ２およびＥ５を標的としてＨＰＶ−１６転写物に対して向けられることができる（図６ａ）。４６〜８２ｎｔの長さの選択したＢＤを適切な構造保存スペーサーと一緒に親トランス−スプライシングベクターにクローニングして、３’ＥＲのために４つのコンストラクトおよび５’ＥＲに関して２つのコンストラクトを生成した。得られた５’ＥＲまたは３’ＥＲ  ｔｓＲＮＡの各々は、多様な選択的ウイルススプライスアクセプターまたはドナー部位を採用することができ、これらは、発表されているか、またはスプライス部位予測者アルゴリズムＡＳＳＰを用いて我々により予測された。我々は、ＨＰＶ−１６形質転換細胞株ＳｉＨａ（ヒト、２つのウイルスゲノムコピー）およびＣ３（マウス、多重切断および完全ウイルスゲノムコピー）におけるトランス−スプライシング用のこれらのスプライス部位の使用を、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを用いてモニターした（図６ｂ）。両細胞株において、ＨＰＶ−１６転写物は非常に多量であった。５’ＥＲベクターおよび２つの最も活性な３’ＥＲコンストラクトＥ１およびＥ６をその後、ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイおよび１００μＭのＧＣＶ濃度を用いて、ＨＳＶｔｋ発現ベクター（ポジティブコントロール）と比較して、細胞死を誘発するためのそれらの可能性に関して試験した。ＨＰＶ−１６形質転換細胞株ＳｉＨａおよびＣ３において細胞死が選択的に誘発されたが、ＨＰＶ−１８形質転換ＨｅＬａ細胞においてまたはＨＰＶ陰性細胞株ＨｅｐＧ２においては誘発されなかった（図６ｃ、補助図６）。ＳｉＨａ細胞では、全てのｔｓＲＮＡはポジティブコントロールと同程度に細胞死を誘発し；Ｃ３細胞では３’ＥＲが５’ＥＲより効率的であった。
【００８７】
トランス−スプライシング分子の細胞送達のための最小限のダンベル型ＤＮＡベクター
ダンベル型ＤＮＡ最小ベクター、またはダンベルベクターは、従来のプラスミドベクターまたはウイルスベクターに対していくつかの利点を有する。多くのウイルスベクターは安全リスクを伴うが、より大きなプラスミドは、免疫毒性を含む副作用を誘発し得、初代細胞における導入遺伝子サイレンシングを患い得る。ダンベル類はこれらの欠点を有さず、プラスミドと比較して、細胞送達、核拡散および遺伝子発現の観点からより有効である。我々が初めて、ＲＮＡトランス−スプライシングを送達するためのダンベルベクターを生成した。それは、トランス−スプライシングカセットをプラスミドから切り出し、続いてヘアピンループ構造のライゲーションにより末端を閉じることによって達成された（図Ｓ７ａ）。この方法は、ＥＬＡＮ法として知られている。ＨｅｐＧ２細胞をＡＦＰミニ遺伝子プラスミドでコトランスフェクトし、等モルまたは等質量のいずれかのダンベルを投与した。３’ＥＲの場合、等モルまたは等質量のダンベルは、プラスミドと比較して、より高いレベルのトランス−スプライシングを誘発した（図Ｓ７ｂ）。５’ＥＲの場合、等質量のダンベルＤＮＡは、より高いレベルのトランス−スプライシングを示した（図Ｓ７ｃ）。
【００８８】
オリゴヌクレオチド、プローブおよびプライマーのリスト
【００８９】
【表３】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図５ｇ】
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【図５ｈ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図Ｓ１ａ】
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【図Ｓ１ｂ】
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【図Ｓ１ｃ】
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【図Ｓ１ｄ】
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【図Ｓ１ｅ】
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【図Ｓ２ａ】
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【図Ｓ２ｂ】
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【図Ｓ２ｃ】
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【図Ｓ２ｄ】
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【図Ｓ２ｅ】
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【図Ｓ３ａ】
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【図Ｓ３ｂ】
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【図Ｓ４ａ】
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【図Ｓ４ｂ】
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【図Ｓ４ｃ】
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【図Ｓ４ｄ】
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【図Ｓ５ａ】
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【図Ｓ５ｂ】
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【図Ｓ６ａ】
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【図Ｓ６ｂ】
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【図Ｓ６ｃ】
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【図Ｓ６ｄ】
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【図Ｓ７ａ】
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【図Ｓ７ｂ】
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【図Ｓ７ｃ】
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【国際調査報告】
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