(57)【要約】  本発明は、皮膚の化粧用途のためにモモの花（peach flower extract(Prunus persica L.)）から抽出物を得る方法、その方法によって得られるモモの花抽出物および前記抽出物を含有する化粧品組成物を提供する。本発明は更に、SIRT2発現を調節する方法、皮膚および角質付属器の老化および光老化の兆候を減少および／または修正すること、ならびに紫外線による攻撃から皮膚を保護することを目的とした処置方法を提供する。【選択図】  図１
2019529535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モモの花（Prunus persica L.）から抽出物を得るための方法であって、下記のステップ：
（i）モモの花に水を加えて混合物を作るステップ、
（ii）室温（RT）〜70℃未満（below）の温度を維持することによって、前記混合物を2時間撹拌するステップ、
（iii）固形の花部分を除去するために混合物をろ過して、抽出物を得るステップ、
（iv）抽出物を70℃未満の温度で一晩低温殺菌するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記のモモの花がピンク色である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ii）がRT〜50℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ii）が50℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記のモモ抽出物が乾燥したモモの花から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抽出物を得るために、ステップ（iv）の前記抽出物が、約50μm〜約20μmの多孔性から約0.5μm〜約0.2μmまでの一連のろ過によって更に清澄化される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記のステップ（iv）のモモの花抽出物が、その後、水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化もしくはプロポキシル化グリコール、環状ポリオールまたはこれらの溶媒の任意の混合物より選択された溶媒中に希釈される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法によって得られるモモの花抽出物。
【請求項９】
10kDa未満の分子量を有する化合物を含有している、請求項８に記載のモモの花抽出物。
【請求項１０】
DPPHフリーラジカル捕捉活性が80 mg/L未満である、請求項８に記載のモモの花抽出物。
【請求項１１】
前記のモモの花抽出物が8〜15 g/kgの乾燥物質、2〜8g/Lのタンパク質、2〜8g/Lの糖質、0.2〜2g/Lのアミノ酸；および0.2〜2g/Lのフェノール化合物を含有する、請求項８に記載のモモの花抽出物。
【請求項１２】
フェノール化合物が、カフェ酸、カテキン、ロスマリン酸、没食子酸、クマル酸およびヒドロキシ安息香酸を含む、請求項８に記載のモモの花抽出物。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法によって得られるモモの花抽出物を含有する化粧品組成物であって、前記のモモの花抽出物が10kDa未満の分子量を有する化合物および生理学的に許容されうる溶媒を含有する、化粧品組成物。
【請求項１４】
前記のモモの花抽出物が、組成物の総重量の約0.0001〜約20重量％の濃度で使用される、請求項１３に記載の化粧品組成物。
【請求項１５】
前記のモモの花抽出物が、組成物の総重量の約0.0005〜約5重量％の濃度で使用される、請求項１３に記載の化粧品組成物。
【請求項１６】
前記組成物が局所適用に適した形態である、請求項１３に記載の化粧品組成物。
【請求項１７】
前記組成物がゲル、クリーム、バーム、乳液またはフォーム（foaming）製品の形態である、請求項１３に記載の化粧品組成物。
【請求項１８】
少なくとも１種の他の活性物質を更に含有する、請求項１３に記載の化粧品組成物。
【請求項１９】
抗酸化物質、植物の加水分解物、合成ペプチド化合物、日焼け止めおよび抗しわ物質より選択される少なくとも１種の他の活性物質を更に含有する、請求項１３に記載の化粧品組成物。
【請求項２０】
皮膚、粘膜および／もしくは表在性の皮膚付属器に、請求項１に記載の方法によって得られるモモの花抽出物を含有する化粧品組成物を局所適用することを含む、皮膚および角質付属器の老化および光老化の兆候を減少ならびに／または修正する方法であって、モモの花抽出物が生理学的に許容されうる溶媒中に10kDa未満の分子量を有する化合物を含有する、上記方法。
【請求項２１】
紫外線による攻撃から皮膚を保護するための請求項２０に記載の方法であって、処置されるべき皮膚に化粧品組成物を局所適用することを含む、上記方法。
【請求項２２】
皮膚、粘膜および／または表在性の皮膚付属器に、請求項１に記載の方法によって得られるモモの花抽出物を含有する化粧品組成物を局所適用することを含む、SIRT2発現を調節する方法であって、モモの花抽出物が生理学的に許容されうる溶媒中に10kDa未満の分子量を有する化合物を含有する、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品分野であり、より詳細にはスキンケアの分野である。本発明は、水性抽出によるモモの花（Prunus Persica）抽出物の調製方法、その方法によって得られるモモの花抽出物、およびモモの花抽出物を含有する化粧品組成物に関する。
【０００２】
本発明はまた、SIRT2発現を調節する方法に関連し、皮膚および角質付属器の老化および光老化の兆候を減少および／または修正すること、ならびに紫外線による攻撃から皮膚を保護することを目的とした美容的処置方法に関する。
モモの花抽出物は、単独で、または他の活性物質と併用して使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
皮膚は、いくつかの層（真皮、増殖層および角質層）から成る重要な器官であり、体の表面全体を覆い、保護機能、感覚機能、免疫機能、代謝機能、または体温調節機能を確保している。皮膚は、他の器官と同様に老化する。
【０００４】
例えば、皮膚の外観は、様々な種類の内部（疾患および妊娠などのホルモン変化）または外部からの攻撃（環境要因、例えば、汚染、日光、病原体など）によって変化する。その結果、しわおよび小じわ、色素過剰または色素減少、しみ（blemishes）、皮膚の乾燥または脱水、表皮の菲薄化、弾性線維症、欠陥、年齢によるしみなどが現れうる。これらの変化のすべては、皮膚だけでなく爪および髪などの角質付属器にも影響を及ぼす。
【０００５】
フリーラジカル、すなわち、細胞内代謝または外部からの攻撃によって生成される化学的に不安定で非常に反応性の高い分子種は、老化過程、より具体的には、酸化された損傷タンパク質の形成において重要な役割を果たすことが知られている（Harmanら“Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry” J. Gerontol., 11, 298-300）。これらの外部からの攻撃には、紫外線、毒素、大気汚染物質、食物性酸化剤が含まれ得る。紫外線の皮膚への曝露は、多くの活性酸素種（ROS）の生成を引き起こす。これらは、DNA、タンパク質、脂肪酸および糖質と反応して、酸化的損傷を引き起こし得る。
【０００６】
皮膚では、紫外線に曝露された領域で起こる早期老化が観察され、特に、エラスチン、コラーゲンまたはフィブロネクチンに影響を及ぼす、高分子の変化（脂質の過酸化、タンパク質のカルボニル化）の現象を特徴とする。
【０００７】
酸化的損傷の蓄積の重大な結果の１つは、細胞のATPを生成する能力の低下である（Porteousら、Eur J Biochem 1998, 257(1):192-201）。従って、細胞の老化現象は、細胞が受ける酸化的損傷に関連するが、また細胞が生存するために必要なエネルギー生産の過程にも関連する。
【０００８】
ヒトサーチュインファミリーは、進化を通じて高度に保存されているSIRT1〜SIRT7と名付けられた７つのタンパク質を含む。「SIRT2タンパク質」は主に細胞質に位置し、酸化ストレス応答、炎症、有糸分裂進行、微小管動態、細胞遊走、寿命に関与する。細胞質において、SIRT2は微小管とともに局在し、微小管を脱アセチル化する。有糸分裂の間、それは核に移行し、そこでそれはヒストンを脱アセチル化して、染色体凝集を調節する（Serrano L.ら、“The tumor suppressor SirT2 regulates cell cycle progression and genome stability by modulating the mitotic deposition of H4K20 methylation”, Genes & Dev. 2013. 27: 639-653）。それによって、SIRT2は有糸分裂チェックポイントの役割を果たし、それは有糸分裂進行および有糸分裂終了を調節する（Bosch-Presegue L.およびVaquero A., “Sirtuins in stress response: guardians of the genome”, Oncogene (2014) 33, 3764-3775）。更に、紡錘体形成チェックポイントタンパク質BubR1の安定性はSIRT2の制御下にあり、経時的なBubR1の減少は哺乳動物の老化と関連している（North B.J.ら、“SIRT2 induces the checkpoint kinase BubR1 to increase lifespan”, The EMBO Journal, 2014, 33, Issue 13, 1438-1453）。従って、SIRT2は、BubR1経路の維持を介して細胞寿命の増加に関連し得る。
【０００９】
SIRT2によるBubR1のLys668の脱アセチル化は、BubR1のユビキチン化およびそのプロテアソームへの指定を阻害する。BubR1存在量を減少させる生殖細胞変異は異数性の原因となる。
【００１０】
当技術分野の状況から、油または抽出物の形態で植物性原料を何らかの形で含有する多数の化粧品が知られている。ほとんどの場合、個々の植物の既知の有益な効果が、対応する全般的な効果を達成するために使用される。
【００１１】
本発明の目的は、SIRT2発現の活性化を示す新規植物抽出物を開発することであった。特許EP1868632は、サーチュイン（SIRT1）タンパク質の内因性合成を活性化することができる合成ペプチドを開示し、本発明者らによってSIRT 2を活性化できることが確認されている。この知見に基づき、本発明者らは、それらの同定されたSIRT2活性化ペプチドに対して配列相同性を有する植物物質（botanicals）を検索した。相同配列を同定するための配列類似性検索は、BLASTのような包括的タンパク質配列データベースを用いて、標準的な手順に従って行われた（William Pearson, “An Introduction to Sequence Similarity (“Homology”) searching”, Curr Protoc Bioinformatics. June 2013）。この検索は、本発明者らが有力な候補としてモモ（Prunus persica）を選択することを可能にした。
本発明のモモの花抽出物は、皮膚においてサーチュインSIRT2タンパク質の発現の増加を示した。
【００１２】
種名プルヌス・ペルシカ（Prunus persica）は、ペルシャでのその広範囲に及ぶ栽培を指し、そこからヨーロッパに移植された。それは、バラ科の中でサクラおよびプラムを含むサクラ（Prunus）属に属する。遺伝学的研究では、モモは中国原産であることが示唆され、それらは中国文明の初期、約2000 BCから栽培されている。
【００１３】
モモ（Prunus persica）は、中国医学において皮膚疾患の治療のために長い間使用されている。朝鮮では、花はいつも文学者（women and men of letters）にとって格好のインスピレーションの源であった。この詩神の資質（quality of muse）に加えて、花は、食品の装飾または浸出液として日々の生活に使用されている。
【００１４】
モモの花は、朝鮮の女性の美の象徴である。モモの花の浸出液は、かつてその肌の調子への有益な特性を知っていた上流階級の女性の間で非常に人気があった。一般にお茶として消費されるモモの花は、健康で若く見える肌を促進すると信じられている。モモの花に関する薬理学的研究を報告している文献は非常に限られている。
【００１５】
モモの花は、フェノール酸およびフラボノイドなどのポリフェノール化合物に非常に富んでいることが知られている。これらの分子は、スーパーオキシドアニオン、一重項酸素、ヒドロキシルラジカル、および脂質ペルオキシルラジカルの捕捉剤として作用し得る。ケルセチン、ルテオリンおよびカテキンなどの多くのフラボノイドは、栄養素ビタミンCおよびβ-カロテンより優れた抗酸化物質である（Svobodovaら、“Natural phenolics in the prevention of UV-induced skin damage. A Review” Biomed. Papers 147(2), 137-145 (2003)）。制御された加水分解は、これらの化合物の放出を可能にする。モモの葉は、伝統医学で駆虫薬および鎮静薬として使用される（Nadkarni, 1976）。Cevallos-Casalsらは、フェノールおよびアントシアニンに富むモモの果実が優れた抗酸化活性および抗菌活性を有することを報告した（Cevallos-Casalsら、“Selecting new peach and plum genotypes rich in phenolic compounds and enhanced functional properties”, Food Chemistry 96 (2006) 273-280）。一般にお茶として消費されるピンク色のモモの花は、下剤であり、健康で若く見える肌を促進すると信じられている。モモの花は、朝鮮の女性の美の象徴である。モモの花の浸出液は、かつてその肌の調子への有益な特性を知っていた上流階級の女性の間で非常に人気があった。
【００１６】
例えば、ケンペロールグルコシド誘導体ムルチフロリンB、トリフォリン、アフゼリン、およびアストラガリンなどの、いくつかのフラボノイドがモモの花において同定されている。加えて、ムルチフロリンBについて、皮膚保護効果が実証されている（Young ha Kimら、“The extract of the flowers of Prunus persica, a new cosmetic ingredient, protects against solar ultraviolet-induced skin damage in vivo”, j. Cosmet. Sci., 53, 27-34 (January/February 2002)）。
【００１７】
ピンク色のモモの花は、抽出物を得るために使用されている。花はポリフェノール化合物およびフラボノイドにも富み、特にピンク色の花はまた、白い花と比較して、特にフラボノイド、花にピンク色を与えるアントシアニンに富む。
アントシアニンは、幅広い生物学的機能を有することが実証されており、フラボノイドファミリーの他のメンバーと同様に優れた抗酸化物質として機能しうる。
【００１８】
抗酸化物質は、健康保護因子として重要な役割を果たす。天然の抗酸化物質の主な起源は、全粒穀物、果実、花および野菜である。植物の抗酸化物質は、ビタミンC、ビタミンE、カロテン、フェノール酸、フラボノイドである。それらは、疾患リスクを低下させる潜在能力、アンチエイジング効果を有すると認識されている。ピンク色のモモの花抽出物の抗酸化作用は、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（DPPH）の方法に従って調べられている。
【００１９】
化粧品組成物におけるモモ抽出物の使用は、先行技術において知られている。ほとんどの抽出物は、全抽出物または水-アルコール抽出物である。例えば、日本特許出願公開JP-A-2001302439は、高温抽出法によって得られる白いモモ（Punus Persia Batsh）からの抽出物を含むことによって、皮膚の老化の予防のため、エラスターゼおよびコラゲナーゼへの阻害作用を有する化粧品を開示している。韓国特許、KR-526637は、フェルラ酸およびモモの花抽出物を含有す皮膚の老化予防のための抗紫外線化粧品組成物を開示しており、その中には、活性成分中0.1〜20.0重量％のモモの花由来の抽出物および0.1〜20.0重量％のフェルラ酸が含まれ、皮膚の安定性が改善される。日本特許出願公開JP-A-2016053008は、活性酸素除去能力を有するモモ抽出物の製造方法を開示しており、それは、得られた抽出物の更なるヘキサン／水による分配抽出（partition extraction）を実施しており、スフィンゴ糖脂質（セラミド成分）を含有する。韓国特許、KR-1429117は、モモの花から花（fuse）を取り除いてがくだけを使用するステップ、サンプルを乾燥させるステップ、サンプルを粉砕するステップ、ホモジナイザーにかけるステップによって得られる、モモの花抽出物を含有する肌の美白のための組成物を開示している。水、C3〜6の低級アルコールおよびC3〜6の低級有機酸からなる群より選択される溶媒中で抽出するステップを含む。得られた抽出物は、ろ紙でろ過した後、凍結乾燥される。先行技術とは異なり、本出願は、高いポリフェノール含量を有し、セラミドを含まないモモの花抽出物の効果的な抽出方法を提供する。
【００２０】
肌のトリートメント市場において様々なアンチエイジング化粧品があるにもかかわらず、活性物質として天然成分を用いた、皮膚、髪および／もしくは爪にアンチエイジングまたは若返りの効用をもたらす、効果的な局所適用される化粧品組成物の必要性が残っている。非天然の、化学的に合成された製品は、環境面または個人的に安全ではないと認識されうる。一方、天然製品は、純粋で、穏やかで、化学的に合成された製品より優れていると認識される。植物またはハーブから抽出された多数の天然由来の生成物は、フリーラジカルによる損傷の影響を中和できる抗酸化／フリーラジカル捕捉物質を含有することが知られている。加えて、それらは、真皮において損傷を受けた結合組織構造、ならびに表皮でのバリア機能の合成および復元を促進する物質を含有し得る。
【００２１】
老化の兆候、具体的には、しわ、小じわおよびたるみの出現に対処する化粧品組成物の必要性が残っている。従って、本発明の目的は、老化したもしくは老化しつつある皮膚の兆候を処置、改善、および／または予防する新規組成物ならびに方法を提供することである。本発明の更なる目的は、老化しつつあるまたは老化した皮膚の全体的な外観を改善することである。
【００２２】
上述の序論は、単に当技術分野が直面している問題の本質のより良い理解を提供するために示され、決して先行技術として自認したと解釈されるべきではなく、また、本明細書における任意の文献の引用は、このような文献が本出願に対する「先行技術」に当たるとの自認と解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【００２３】
本発明の主要な態様は、モモ（Prunus persica L.）の花を含む抽出物を得るための方法を提供し、それは下記のステップ：
（i）モモの花に水を加えて混合物を作るステップ、
（ii）室温（RT）〜70℃より高い（above）温度を維持することによって、前記混合物を撹拌するステップ、
（iii）固形の花部分を除去するために混合物をろ過して、抽出物を得るステップ
を含む。
【００２４】
別の態様では、本発明は、水性抽出によって得られたモモの花抽出物を含有する化粧品組成物を提供し、ここで、モモの花抽出物は生理学的に許容されうる溶媒中に10kDa未満の分子量を有する化合物を含有する。
【００２５】
更に別の態様では、本発明は、皮膚、粘膜および／もしくは表在性の皮膚付属器に、水性抽出によって得られたモモの花抽出物を含有する化粧品組成物を局所適用することを含む、皮膚および角質付属器の老化および光老化の兆候を減少ならびに／または修正する方法を提供し、ここで、モモの花抽出物は生理学的に許容されうる溶媒中に10kDa未満の分子量を有する化合物を含有する。
【００２６】
更に別の態様では、本発明は、皮膚、粘膜および／または表在性の皮膚付属器に、水性抽出によって得られたモモの花抽出物を含有する化粧品組成物を局所適用することを含む、SIRT2発現を調節する方法を提供し、ここで、モモの花抽出物は生理学的に許容されうる溶媒中に10kDa未満の分子量を有する化合物を含有する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明の更なる実施形態は、添付の図面とともに理解され得る。
【図１】図１は、ケラチン生成細胞におけるSIRT2 mRNAの定量研究の図である。
【図２】図２は、線維芽細胞におけるSIRT2 mRNAの定量研究の図である。
【図３】図３は、ケラチン生成細胞におけるBubR1 mRNAの定量研究の図である。
【図４】図４は、線維芽細胞における老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA beta-gal）活性研究の図である。
【図５】図５は、線維芽細胞におけるBubR1染色の顕微鏡観察の図である。
【図６】図６は、線維芽細胞におけるβ-ガラクトシダーゼ老化マーカーの活性の図である。
【図７】図７は、蛍光マーカーシステムによる線維芽細胞の定量の図である。
【図８】図８は、570nmでの吸光度によって測定された平均細胞数の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本発明の詳細な実施形態は本明細書に開示されるが、開示された実施形態は単に本発明の実例であり、様々な形態で実施されうることを理解すべきである。従って、本明細書において開示される特定の構造および機能的詳細は、限定として解釈されるべきではなく、単に当業者が本発明を様々な形で使用するための教示の代表的な基盤として解釈されるべきである。
【００２９】
用語が範囲への言及によって特定されている場合は常に、範囲は、そのあらゆる要素を明示的に開示すると理解される。非限定的な例として、1〜10％の範囲は、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、および10％、ならびに1〜10％の間のすべての値を含むと理解される。
【００３０】
２つ以上の代替物（substituents）が、列挙された選択肢の群「より選択される」と言われる場合、それぞれの代替物は、他の代替物の固有性とは無関係に、その群の任意の要素であり得る。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、他に規定されない限り、「％」は重量％を指し、それは組成物（すなわち、任意の担体、ベヒクル、溶媒、増量剤、または皮膚に適用される前に添加される他の成分など）の総重量に対する成分の重量パーセントである。
【００３２】
本明細書において用いられるすべての用語は、他に規定されない限り、それらの一般的な意味を持つことが意図される。本発明の記載および特許請求のために、下記の用語が定義される。
【００３３】
「抽出物」は、抽出方法または成分に関わらず、天然源から抽出された任意の物質または分離された調製物であると理解される。この用語は、広い意味で用いられ、例えば、水もしくは有機溶媒に可溶性の、溶媒を用いて天然物質から抽出された成分、または天然物質の特定の成分を含んでいる。
「水性抽出物」は、水を用いた抽出によって得られた化合物の混合物であると理解される。
【００３４】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって結合している２個または数個のアミノ酸の配列を指し；ポリペプチドは、より大きなサイズのペプチドを指す。「ペプチド」という用語は、上述のような本発明の天然もしくは合成ペプチド、または少なくともその配列が以前に記載された配列によって全体もしくは部分的に構成される任意の天然もしくは合成ペプチドを指す。
【００３５】
「生理学的に許容されうる」によって、本発明の活性物質またはその物質を含有する組成物が、毒性もしくは不耐性反応を引き起こすことなく皮膚または粘膜と接触するのに適していることが理解される。
【００３６】
「老化および光老化の皮膚兆候」とは、例えば、皮膚の菲薄化、たるみ、水和の低下およびアトニー（atonia）、深いしわおよび小じわ、硬さおよび色調の低下、皮膚の萎縮または紫外線への曝露による他の任意の皮膚の内部劣化、肝斑および年齢によるしみなどの、老化による皮膚および皮膚付属物の外観の変化すべてを指す。「日光黒子（Solar lentigo）」、「老年性黒子（Lentigo senilis）」、「老齢性のしみ（Old age spot）」、「老年性のそばかす（Senile freckle）」としても知られる肝斑は、老化および太陽からの紫外線への曝露による光老化と関連した皮膚上のしみである。それらは、薄茶色から赤または黒色に及び、最もよく太陽に曝される部分、特に手、顔、肩、腕および額、はげている場合は頭皮に位置する。
【００３７】
「アンチエイジング効果」アンチエイジング効果は、（a）小じわもしくはしわの治療、減少、および／または予防、（b）皮膚の毛穴サイズの減少、（c）皮膚の厚さ、膨らみ、および／またははりの改善、（d）皮膚の柔軟性および／または柔らかさの改善、（e）皮膚の色調、輝き、および／または透明感の改善、（f）プロコラーゲンおよび／またはコラーゲン産生の改善、（g）皮膚の質感の改善および／または再組織化（retexturization）の促進、（h）皮膚バリアの修復および／または機能の改善、（i）皮膚のたるみもしくは萎縮の治療および／または予防、（j）皮膚輪郭の外観の改善、（k）皮膚のつや、および／または明るさの回復、（l）皮膚への必須栄養素および／または構成成分の補給、（m）閉経により低下する皮膚外観の改善、（n）皮膚の保湿および／または水和の改善、ならびに（o）皮膚の弾性および／または弾力性の改善、のうち１つ以上を含むが、それらに限定されない。
【００３８】
本発明における種名「プルヌス・ペルシカ（Prunus persica）」は、ペルシャでのその広範囲に及ぶ栽培を指し、そこからヨーロッパに移植された。それは、バラ科の中でサクラおよびプラムを含むサクラ属に属する。遺伝学的研究では、モモは中国原産であることが示唆され、それらは中国文明の初期、約2000 BCから栽培されている。モモ（Prunus persica）は、中国医学において皮膚疾患の治療のために長い間使用されている（Young ha Kimら、“The extract of the flowers of Prunus persica, a new cosmetic ingredient, protects against solar ultraviolet-induced skin damage in vivo”, j. Cosmet. Sci., 53, 27-34, January-February 2002）。
【００３９】
本明細書において用いられる場合、「皮膚」とは、皮膚、粘膜ならびに髪、まつ毛およびまゆ毛を含む皮膚付属器を構成するすべての被覆組織を指す。
「局所適用」は、前記のモモの花抽出物を含有する組成物の、皮膚もしくは粘膜の表面への適用または塗布であると理解される。
【００４０】
本明細書に記載されることは、乾燥させたモモの花から抽出物を得る方法、その抽出物を含有する化粧品組成物、モモの花抽出物を含有する組成物を皮膚に局所適用することによって皮膚および角質付属器の老化および光老化の兆候を減少および／または修正する方法、ならびにSIRT2発現を調節する方法である。
【００４１】
抗酸化物質は、健康保護因子として重要な役割を果たす。化学的根拠は、抗酸化物質ががんおよび心疾患を含む慢性疾患のリスクを低下させることを示唆する。天然の抗酸化物質の主な起源は、全粒穀物、果実、花および野菜である。植物の抗酸化物質は、ビタミンC、ビタミンE、カロテン、フェノール酸、フラボノイドである。
【００４２】
本発明のモモの花抽出物は、皮膚においてサーチュインSIRT2タンパク質の発現の増加を示した。「SIRTタンパク質」はNAD+依存性脱アセチル化酵素であり、Sir2サーチュインファミリーに属する。サーチュインの脱アセチル化酵素活性またはモノADPリボシルトランスフェラーゼ活性は、それらがいくつかのヒストンのアセチル化レベルを調節することを可能にする。従って、それらはしばしばクロマチンに影響を与えることによってそれらの機能を発揮し、遺伝子サイレンシング、DNA損傷シグナル伝達、DNA修復および細胞周期の調節を誘導する。実際に、サーチュインは、代謝的、酸化的または遺伝毒性ストレスに応答する重要な因子である。
【００４３】
本発明のモモの花抽出物は、フェノール酸およびフラボノイドなどのポリフェノール化合物に富むことが知られている。それらの抗酸化活性で知られているこれらの水溶性分子はすべて、本発明のモモの花抽出物の抗酸化能の提供に寄与する。抽出物中のフラボノイド含量は、塩化アルミニウム比色法によって測定された。塩化アルミニウム（AlCl3）比色法に関わる原理は、AlCl3が、抽出物のフラボンおよびフラボノールのC-4ケト基およびC-3またはC-5ヒドロキシル基のいずれかと酸に安定な複合体を形成することである。サンプルの吸光度は410 nmの分光光度計で測定される。フラボノイド含量は、ルチン標準曲線を用いてルチン当量として測定される。測定された総フラボノイド含量は200mg/kg抽出物である。
【００４４】
これらの分子は、スーパーオキシドアニオン、一重項酸素、ヒドロキシルラジカル、および脂質ペルオキシルラジカルの捕捉剤として作用し得る。ケルセチン、ルテオリンおよびカテキンなどの多くのフラボノイドは、栄養素ビタミンC、ビタミンEおよびβ-カロテンより優れた抗酸化物質である（Svobodovaら、“NATURAL PHENOLICS IN THE PREVENTION OF UV-INDUCED SKIN DAMAGE.A REVIEW” Biomed. Papers 147(2), 137-145 (2003)）。特に、ピンク色の花は、白い花と比較して特にフラボノイド、花をピンク色にさせるアントシアニンに富むことが見出されている。
好ましい実施形態では、本発明の抽出物を得るためにピンク色の花が使用されている。
【００４５】
ポリフェノール化合物は、強力な抗酸化分子であると認識されている。「ポリフェノール化合物」は、抗酸化特性を有する天然植物食物源に豊富に見られる化合物である。それらはすべての種類のポリフェノールを指し、少なくとも１つのジフェノール芳香環を含む化合物を意味し、フェノール基は任意選択でエーテル化またはエステル化され得る。それらは、単に「ポリフェノール」とも呼ばれ得る。ポリフェノールは、健康と活力の維持に重要な役割を果たす。集団として抗酸化物質は、体内の細胞をフリーラジカルによる損傷から保護するために役立ち、それによって老化する速度を制御する。抗酸化物質は、３つの主要なグループ：カロテノイド、ニンニクおよびタマネギにおいて見られる硫化アリル、ポリフェノール（フェノール類としても知られる）に分類され得る。
【００４６】
ポリフェノールは更に４つのカテゴリーに分類され得る：フェノール酸、フラボノイド、リグナン、およびスチルベンであり、それらが含むフェノール環の数に基づき、またこれらの環を互いに結合させる構造要素に基づいて、更なるサブグループ化を伴う。
【００４７】
フェノール酸は、様々な植物性食品において見出される、ポリフェノールと呼ばれるフィトケミカル（phytochemical）の一種であり、種子および果皮および野菜の葉は最も高い濃度を含有する。フェノール酸は、腸管壁から容易に吸収され、それらがフリーラジカル酸化反応による細胞の損傷を防ぐ抗酸化物質として働くため、健康にとって有益であり得る。天然に見出される多くの異なるフェノール酸があり、それらは２つのカテゴリー：没食子酸などの安息香酸誘導体、ならびにカフェ酸およびフェルラ酸などの桂皮酸誘導体に分類され得る。桂皮酸は安息香酸類より多く見られる。
【００４８】
フラボノイドは、ポリフェノール化合物の中で最大のファミリーであり、それらは酸素複素環（C環）を形成する3つの炭素原子によって結び付けられている２つの芳香環（AおよびB）からなる構造を有する。フラボノイドは、含まれる複素環の種類に応じて更に６つのサブクラスに分類される：フラボノール、フラボン、イソフラボン、フラバノン、アントシアニジン、ならびにフラバノール（カテキンおよびプロアントシアニジン）。植物は、寄生生物、酸化的傷害および厳しい気候条件に対する防御としてフラボノイドを生成する。
【００４９】
植物フラボノイドの３つの主要なクラス（アントシアニン、プロアントシアニン、およびフラボノール）があり、これらは分岐したフラボノイド生合成経路によって合成される。最も重要なフラボノイドクラスであるアントシアニンは、花および果実の主要な色素であり、これらの色素は、受粉および種子散布に必要な昆虫の誘引に不可欠である（Winkel-Shirley, “Flavonoid Biosynthesis. A Colorful Model for Genetics, Biochemistry, Cell Biology, and Biotechnology”, Plant Physiol. Vol. 126, 2001）。基本的なアントシアニンは、主にペラルゴニジン、シアニジン、およびデルフィニンで構成され、花の色の多様性に貢献している、グリコシル化、アシル化、およびメチル化などの、これらの化合物の様々な修飾が起こりうる（Morataら、“Formation of the highly stable pyranoanthocyanins (vitamins A and B) in red wines by the addition of pyruvic acid and acetaldehyde” , Food Chemistry 100 (2007) 1144-1152）。アントシアニンはまた、幅広い生物学的機能を有することが実証されており、フラボノイドファミリーの他のメンバーと同様に優れた抗酸化物質として機能しうる。
【００５０】
花の色素形成は、複雑な多酵素による生合成経路を含み、その中でいくつかの酵素反応は、フラボノイド化合物の生成および蓄積を引き起こす。フラボノイドは、UVからの保護（Liら、“Arabidopsis Flavonoid Mutants Are Hypersensitive to UV-6 lrradiation”, The Plant Cell, Vol. 5, 171-179, February 1993）、病原体防御（Treutter, “Significance of Flavonoids in Plant Resistance and Enhancement of Their Biosynthesis”, Plant Biology 7 (2005) 581-591）、ならびに花粉生存率（Taylor, LPおよびJorgensen R (1992). “Conditional male fertility in chalcone synthase-deficient petunia”. J. Hered. 83: 11-17.）などの多くの生物学的過程において重要な役割を果たす。モモの花は、特有のフラボノイド、４つのケンペロールグリコシド誘導体（ムルチフロリンB、トリフォリン、アフゼリン、およびアストラガリン）を含有し、ムルチフロリンBで皮膚の保護効果が実証されている（Young ha Kimら、“The extract of the flowers of Prunus persica, a new cosmetic ingredient, protects against solar ultraviolet-induced skin damage in vivo”, j. Cosmet. Sci., 53, 27-34 (January/February 2002)）。
【００５１】
本発明において使用される「フラボノイド」の中で、特に、タキシフォリン、カテキン、エピカテキン、エリオジクチオール、ナリンゲニン、ルチン、トロキセルチン、クリシン、タンゲレチン、ルテオリン、没食子酸エピガロカテキンおよびエピガロカテキン、ケルセチン、フィセチン、ケンペロール、ガランギン、ガロカテキン、没食子酸エピカテキンが言及されうる。
【００５２】
（Hassaniら、(2015), “Analysis of biochemical compounds and differentially expressed genes of the anthocyanin biosynthetic pathway in variegated peach flower”, Genetic Mol Res. 14(4):13425-36）は、著しい斑入りのモモの木に由来する異なる色（白およびピンク）の花弁で生成された化合物のLC-MS分析による比較研究を提供する。いくつかのシアニジンのグリコシル化誘導体（シアニジン-3-グルコシド、シアニジン-3-（6”-マロニルグルコシド）、シアニジン-3-（6”-エチルマロニルグルコシド））、同様にペラルゴニジンのグリコシル化誘導体（ペラルゴニジン-3-グルコシド、ペラルゴニジン-3-（6”-エチルマロニルグルコシド））ならびにペオニジンのグリコシル化誘導体（ペオニジン-3-グルコシドおよびペオニジン-3-（6”-エチルマロニルグルコシド））は、ピンクの花弁において検出されたが、これらの化合物のいずれも白の抽出物では検出されなかった。これらの化合物、特にシアニジンは、2014年に発表されたJungらの研究において記載されたように、それらの抗酸化作用および抗炎症作用について記載されている。それらは、疾患リスクを低下させる潜在能力、アンチエイジング効果を有すると認識されている。ピンク色のモモの花抽出物の抗酸化作用は、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（DPPH）の方法に従って調べられている。
【００５３】
本発明のピンク色のモモの花抽出物の抗酸化作用は、DPPHの方法に従って調べられた。DPPHアッセイは、抗酸化能を測定するための迅速で簡単な方法であり、フリーラジカル捕捉剤または水素供与体として機能する化合物の能力を試験するため、および抗酸化活性を評価するために広く用いられているフリーラジカル、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（DPPH）の使用を含んでいる。
【００５４】
DPPHアッセイ法は、安定なフリーラジカルであるDPPHの還元に基づく。奇数電子を有するフリーラジカルDPPHは、515 nmに極大吸収を示す（紫色）。DPPHの溶液が水素原子を供与できる物質と混合されると、これは還元型（ジフェニルピクリルヒドラジン；非ラジカル）を生じ、この紫色を失って、まだ存在しているピクリル基由来の残りの淡黄色を呈する（Prieto P, Pineda M,およびAguilar M (1999), “Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex: Specific application to the determination of vitamin E”, Anal Biochem 269, 337-341）。
【００５５】
本発明の利点の１つは、ピンク色のモモの花が、葉、果実、根または植物の他のあらゆる部分と比べて、目的とする種々の化合物に非常に富んでいることである。
【００５６】
本発明は、プルヌス・ペルシカ（Prunus persica）種から得られるモモの花抽出物を提供し、より好ましくは、モモの花抽出物は花全体から得られる。
【００５７】
本発明では、「花全体」または「モモの花」は、花弁とがく片との両方を含む。花は、生または乾燥のどちらでもよい。好ましくは、花は、自然の日陰での風乾によって、または熱風オーブン中45℃で48時間もしくは15℃で72時間乾燥される。
本発明のモモの花抽出物は、水性抽出によって得ることができる。モモ抽出物に見られる多くの化合物は、生物学的活性を有すると思われ、水溶性である。
【００５８】
好ましい実施形態では、本発明は、モモの花（Prunus persica L.）から抽出物を得るための方法を提供し、その方法は、
（i）モモの花に水を加えて混合物を作るステップ、
（ii）RT〜70℃未満（below）の温度を維持することによって、前記混合物を2時間撹拌するステップ、
（iii）固形の花部分を除去するために混合物をろ過して、抽出物を得るステップ、
（iv）混合物を70℃未満の温度で一晩低温殺菌するステップ
を含んでいる。
【００５９】
花は、生または乾燥のどちらでもよい。好ましい実施形態では、花は乾燥され、水は混合物を作るために乾燥した花に加えられる。自然の日陰またはオーブン乾燥など、任意の周知の乾燥方法が実施され得る。最も好ましい実施形態では、花は、15℃〜45℃の温度で48時間〜72時間、オーブン内で乾燥される。
【００６０】
好ましい実施形態では、モモの花材料は水に漬け込まれる。溶液は、RT〜70℃未満の温度で2時間、短時間の穏やかな浸軟を受ける。最も好ましくは、温度は、フラボノイドおよびフェノール酸などの目的の分子の完全性を保つため、そして抗酸化物質として機能するそれらの能力を保つために、RT〜50℃に維持される。
【００６１】
抽出温度の選択は、抽出されるべき所望の化合物の種類、植物源（花、果実、茎、種子、葉、根）の構造上の特性、抽出物に必要とされる品質および収量、ならびに工程のスケールアップのための経済的実現可能性に左右される。植物材料からのフェノール化合物の抽出は、抽出の温度および時間によって影響を受け、それは可溶化および酸化によるアナライトの分解の相反する作用を反映する。しかし、多くのフェノール化合物は加水分解されやすく、酸化されやすい。長時間の抽出および高温は、フェノール類の酸化の可能性を増加させ、抽出物中のフェノール類の収量を減少させる。様々な温度で分析が行われ、高温がこれらの種類の分子を分解させることを示した。抽出物は複雑な構造を有し、熱によってそれらの構造が破壊され、それらの潜在的な生物学的活性を失う。高温は、急速なアントシアニン分解を引き起こすことが示されている。実際に、長時間の抽出および高温（70℃以上）は、抽出物中のポリフェノール化合物の収量を減少させる酸化の可能性を増加させ、また、約4〜5のpHはポリフェノール化合物の安定に適している。従って、フェノール化合物の安定性を得て維持するために、効果的な抽出温度を選択することは、極めて重要である。
【００６２】
水抽出は、撹拌しながら、室温で、または70℃以下に加熱した水を用いて行われ得る。好ましくは、抽出は、50℃に加熱した水の中での2時間の浸軟によって行われる。その後、原液をグリッドろ過（grid filtering）にかけて、不溶性物質を除去する。グリッドろ過の後、水性すなわち液体の画分を回収する。水性抽出物のより小さい残渣を除去するために、当業者にとって周知の任意の方法によるろ過が行われてもよい。
【００６３】
好ましい実施形態では、精製工程は、抽出物を得るために50〜20μmから0.5〜0.2μmまで減少していく多孔性を有するフィルターを用いた一連のろ過から始まる。別の好ましい実施形態では、得られる抽出物は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって実証されるように、10 kDa未満の分子量を有するタンパク質断片およびペプチドを含む。得られる抽出物は、澄んだ鮮明な溶液である。
【００６４】
別の好ましい実施形態では、抽出物は、その後、水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化もしくはプロポキシル化グリコール、環状ポリオールまたはこれらの溶媒の任意の混合物、例えば30％グリセロールおよび0.85％のフェノキシエタノールなどの溶媒を用いて、4.0〜4.5のpHを維持することによって、8 g/Kg〜13g/Kg、好ましくは11 g/Kgの乾燥物質の濃度に希釈される。
その後、希釈された活性物質は滅菌ろ過によって滅菌される。その後、溶液は、低温殺菌を行うために65℃で一晩加熱される。
【００６５】
更に、本発明に従って希釈された活性物質は、定性的および定量的に分析され得る。その特性は下記のとおりである：
−タンパク質：3〜6 g/kg、
−糖質：3〜6 g/kg、
−アミノ酸：0.5〜1.5 g/kg、
−フェノール化合物：0.5〜1.5 g/kg、
−フラボノイド：0.1〜0.4 g/kg。
−抽出物は、いずれのセラミドまたはスフィンゴ脂質も含有しない。
【００６６】
モモの花抽出物のタンパク質含量は、抽出物の総タンパク質含量を定量するために用いられているローリータンパク質アッセイ（Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951). “Protein measurement with the Folin phenol reagent”, J. Biol. Chem. 193 (1): 265-75）によって測定した。ローリーアッセイは、溶液中の総タンパク質レベルを測定するための生化学的アッセイである。ローリー法は、ペプチド結合の酸化によって生じるCu+の、フォリン-チオカルトー試薬との反応に基づく。サンプルの吸光度は分光光度計において550nmで読み取られる。タンパク質含量はBSA標準曲線を用いて測定される。
【００６７】
モモの花抽出物のアミノ酸含量は、Mooreらによって発表された手順（Mooreら、“Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids”, Journal of Biological Chemistry 1948 Vol. 176 pp. 367-388）で測定した。抽出物の遊離アミノ酸含量は、試薬ニンヒドリンによるアミンおよびカルボン酸官能基の開裂に続く、有色複合体の形成によって評価した。複合体の吸光度は分光光度計において570nmで読み取られる。総アミノ酸含量はアミノ酸プールの標準曲線を用いて測定される。
【００６８】
モモの花抽出物の総糖質含量は、Duboisらによって記載されたアッセイ(“Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances”, Anal. Chem., 1956, 28 (3), 350-356）の改変による比色分析によって測定した。この分析は、フェノールと反応して有色複合体を形成する濃硫酸で構成される。複合体の吸光度は分光光度計において490nmで読み取られる。糖質含量はグルコース標準曲線を用いて測定される。
【００６９】
モモの花抽出物のポリフェノール含量は、フォリン-チオカルトーアッセイ（Singletonら(1999). “Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent”, 299: 152）を用いて測定した。サンプル中のポリフェノール化合物はフォリン-チオカルトー試薬と反応し、試薬の酸化は青色を呈する。サンプルの吸光度は分光光度計において760nmで読み取られる。含量は、没食子酸標準曲線を用いて没食子酸当量として表された。
【００７０】
SDS PAGE電気泳動は、抽出物中のタンパク質の分子量を評価するために行われた。モモの花抽出物は、変性サンプルバッファー中の還元的変性条件において70℃で10分間加熱される。還元されたタンパク質が電気泳動の間に再び酸化しないように、抗酸化溶液が内部チャンバー（陰極）に加えられる。タンパク質の泳動は、MES泳動バッファーを用い、分子量のマーカーとしてスタンダードNovex（登録商標）Sharpを用いて行われる。タンパク質染色は、銀染色を用いて行われる。
本発明の抽出物の利点は、低分子化合物が、アレルギー性を有することなく、より安定で再現性を持つことである。
【００７１】
別の態様では、本出願は、水性抽出によって得られたモモの花抽出物を含有する化粧品組成物を提供し、ここで、モモの花抽出物は10kDa未満の分子量を有する化合物および生理学的に許容されうる溶媒を含有する。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、モモの花抽出物は、組成物の総重量の約0.0001〜約20重量％、好ましくは0.0005〜約5重量％の濃度範囲で存在する。
別の実施形態では、モモの花抽出物は、化粧品用途、より好ましくは局所適用のために使用される。
【００７３】
別の好ましい実施形態では、本発明は、特に化粧品組成物もしくは皮膚用組成物のために、当業者によって改変された経口、非経口または局所製剤を提供する。本発明の組成物は、局所投与されるために好都合に設計される。これらの組成物は、従って、生理学的に許容されうる溶媒を含有しなければならず、すなわち、皮膚および上皮付属器に適合し、すべての化粧品形態または皮膚用形態を対象にする。
【００７４】
更に、本組成物は好ましくは、皮膚、粘膜、唇および／もしくは上皮付属器への適用に適した、水溶液、含水アルコール溶液または油性溶液；水中油型エマルション、油中水型エマルションまたは多重エマルション；クリーム、懸濁液、粉末の形態である。これらの組成物はまた、ほぼ流体であり、クリーム、ローション、乳液、セラム、ポマード、ゲル、ペーストまたはムースの外観を持ち得る。それらはまた、スティックのような固形でも存在でき、またはエアロゾルのように皮膚に適用され得る。それらはまた、スキンケア製品および／またはメイクアップ製品としても使用され得る
【００７５】
別の実施形態では、組成物は、通常使用される適用の範囲で想定される添加剤ならびにそれらの製剤に必要な添加剤、例えば、共溶媒（エタノール、グリセロール、ベンジルアルコール、ダンパー（damper）…）、増粘剤、希釈剤、乳化剤、抗酸化剤、着色剤、太陽光フィルター（solar filters）、色素、増量剤、保存料、香料、臭気吸収剤、精油、微量元素（oligo element）、必須脂肪酸、界面活性剤、膜形成ポリマー、化学物質フィルター（chemical filter）またはミネラル、保湿剤または温泉水などを含有する。水溶性の、好ましくは天然のポリマー、例えば、多糖類またはポリペプチド、メチルセルロース型もしくはヒドロキシプロピルセルロース型のセルロース誘導体、あるいは更に合成ポリマー、ポロキサマー、カルボマー、シロキサン、PVAもしくはPVP、および特にAshland社から販売されているポリマーが、例として挙げられる。
本発明の活性物質が、それだけで、または他の活性成分と併用して使用され得ることは、よく理解される。
【００７６】
更に、本発明に従って使用され得る組成物は、有利には少なくとも１種の他の活性物質を含有する。下記の種類の成分が非限定的に挙げられる：他のペプチド活性物質、植物抽出物、治療薬（healing agent）、アンチエイジング物質、抗しわ物質、鎮静薬（soothing agents）、抗フリーラジカル物質、抗紫外線物質、真皮の高分子合成またはエネルギー代謝を促進する物質、保湿剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗炎症剤、麻酔剤、皮膚の分化、色素沈着または脱色素を調節する物質、および爪や髪の成長を促進する物質。
抗フリーラジカル物質もしくは抗酸化物質、または真皮の高分子合成もしくはエネルギー代謝を促進する物質が用いられることが好ましい。
【００７７】
より具体的な実施形態では、本発明の組成物は、下記を含有するであろう：
−日焼け止め、紫外線および赤外線遮断剤、
−抗フリーラジカル物質、
−DHEA（デヒドロエピアンドロステロン）
−少なくとも１種のシトクロム共活性化化合物（cytochrome co-activating compound）、および／または、
−１種（以上の）アクアポリン活性化化合物および／または、
−１種（以上の）サーチュイン活性化化合物および／または、
−１種（以上の）細胞接着を増加させる化合物および／または、
−１種（以上の）コラーゲンもしくはラミニン型のマトリックスタンパク質などの産生を増加させる化合物、
−１種（以上の）HSPタンパク質調節化合物、
−１種（以上の）細胞エネルギーを増加させる化合物、
−１種（以上の）色素沈着調節化合物、例えば、酵母、アマランス、亜麻仁、豆、カカオ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、菜種またはエンドウマメペプチド抽出物など、
−１種（以上の）皮膚バリア機能を改善する化合物、
−１種（以上の）ミトコンドリア保護化合物、
−ビタミンA、特にレチノイン酸、レチノール、プロピオン酸レチノール、パルミチン酸レチノール、
−ビタミンB3、特にナイアシンアミド、トコフェロールニコチン酸エステル（niconitate）、
−ビタミンB5、ビタミンB6、ビタミンB12、パンテノール、
−ビタミンC、特にアスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、テトラパルミチン酸アスコルビル、リン酸アスコルビルマグネシウムおよびリン酸アスコルビルナトリウム、
−ビタミンE、F、H、K、PP、およびコエンザイムQ10、メタロプロテイナーゼ阻害剤、組織メタロプロテアーゼ阻害物質（TIMP）の活性化因子、
−アミノ酸、特にアルギニン、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ジパルミトイルヒドロキシプロリン、パルミトイルグリシン、ヒドロキシリシン、メチオニンおよびその誘導体、N-アシル化アミノ酸、
−天然または合成ペプチド、例えばジ-、トリ-、テトラ-、ペンタ-およびヘキサペプチドならびにそれらの親油性誘導体、異性体および金属イオン（すなわち銅、亜鉛、マンガン、マグネシウムなど）のような他の分子との複合体、MATRIXYL（登録商標）、ARGIRELINE（登録商標）、CHRONOGEN（商標）、LAMINIXYL IS（商標）、PEPTIDE Q10（商標）、COLLAXYL（商標）（特許FR2827170、ASHLAND（登録商標））、PEPTIDE VINCI 01（商標）（特許FR2837098、ASHLAND（登録商標））、PEPTIDE VINCI 02（商標）（特許FR2841781、ASHLAND（登録商標））、 ATPeptide（商標）（特許FR2846883、ASHLAND（登録商標））の商品名で販売されているペプチド、もしくはASHLAND（登録商標）によってATPeptide（商標）の商品名で販売されている配列Arg-Gly-Ser-NH2の合成ペプチド、
−GP4G（商標）（FR2817748、ASHLAND（登録商標））の商品名で販売されている、アルテミア（Artemia salina）の抽出物、
−植物ペプチド抽出物、例えば亜麻仁抽出物（Lipigenine(商標)、特許FR2956818、ASHLAND（登録商標））、ダイズ抽出物、ヒトツブコムギ、ブドウの木、菜種、コメ、トウモロコシまたはエンドウマメ、
−酵母抽出物、例えばDynagen(商標)、（特許FR2951946、ASHLAND（登録商標））またはActopontine(商標)（特許FR2944526、ASHLAND（登録商標））；デヒドロ酢酸（DHA）、
−天然または合成の植物ステロール、
−α-およびβ-ヒドロキシ酸、シラノール、
−糖アミン、グルコサミン、D-グルコサミン、N-アセチル-グルコサミン、N-アセチル-D-グルコサミン、マンノサミン、N-アセチルマンノサミン、ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、
−ブドウ抽出物、マツ抽出物、オリーブ抽出物などの、ポリフェノール、イソフラボン、フラボノイド、
−セラミドまたはリン脂質などの脂質、
−スクアレンまたはスクアランなどの動物油、
−アーモンド油、ココナッツ油、ヒマシ油、ホホバ油、オリーブ油、菜種油、ピーナッツ油、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、トウモロコシ胚芽油、大豆油、綿実油、アルファルファ油、ケシ油、カボチャ種子油、月見草油、キビ油、オオムギ油、ライムギ油、ベニバナ油、パッション油（passion oil）、ヘーゼルナッツ油、パーム油、杏仁油、アボカド油、カレンデュラ油、エトキシル化植物油、またはシアバターなどの植物油であり、上記の化合物は、天然、例えば植物のペプチド加水分解物など、あるいは合成、例えばペプチド化合物などであり得る。
【００７８】
更に別の実施形態では、本出願は、皮膚、粘膜および／もしくは皮膚付属器に、本出願のモモの花抽出物を含有する組成物を局所適用することを含む、皮膚および角質付属器の老化および光老化の兆候を減少ならびに／または修正する美容的方法を提供する。
【００７９】
本発明が、哺乳動物全般に対して、より具体的にはヒトに対して設計されていることは明白である。本発明者等は、皮膚および角質付属器の老化および光老化の皮膚兆候を減少ならびに／または修正し、紫外線による攻撃から皮膚を保護するために有用な、生物学的活性を実際に確認した。
【００８０】
「老化および光老化の皮膚兆候」とは、例えば、皮膚の菲薄化、たるみ、水和の低下およびアトニー（atonia）、深いしわおよび小じわ、硬さおよび色調の低下、皮膚の萎縮または紫外線への曝露による他の任意の皮膚の内部劣化、肝斑および年齢によるしみなどの、老化による皮膚および皮膚付属物の外観の変化すべてを指す。
【００８１】
更に別の態様では、本出願は、紫外線による攻撃から皮膚を保護する美容的方法を提供し、ここで、本発明のモモの花抽出物を含有する化粧品組成物は、処置されるべき皮膚に局所適用される。
【００８２】
更に別の実施形態では、本出願は、皮膚細胞においてSIRT2発現を調節する美容的方法を提供し、ここで、本発明のモモの花抽出物を含有する化粧品組成物は、処置されるべき皮膚に局所適用される。
この美容的方法に特有の実施形態はまた、上記の記載から生じる。
本発明の更なる利点および特徴は、実例となる、非限定的な添付の実施例を読むことによって、より詳細に理解され得る。
【実施例】
【００８３】
[実施例１]
モモの花抽出物（Prunus persica L.）の調製
大韓民国、全羅南道、潭陽郡（Damyang, South Jeolla, South Korea）から、ピンク色のモモの花を入手した。自然の日陰での風乾によって、または熱風オーブン中45℃で48時間もしくは15℃で72時間、花を乾燥させた。50 gの乾燥したモモの花（Prunus persica）を1リットルの蒸留水に入れた。溶液を50℃の温度で2時間加熱した。その後、フィルターグリッドを用いて、固形の花残渣を液体部分から分離した。精製工程は、澄んだ鮮明な溶液を得るために、減少していく多孔性（0.5〜0.2μm）のフィルターを用いた一連のろ過から始まる。その後、ろ液を希釈して、30％グリセロールおよび0.85％フェノキシエタノールとともに10〜12 g/Kg乾燥物質を有する抽出物を得た。抽出物の安定性を増加させるために、溶液のpHを4〜5に調整した。清澄化および希釈の後、0.2μmのフィルター多孔性を用いて、無菌状態のもとで、ろ液をフィルター滅菌した。その後、低温殺菌を行うために、溶液を65℃で一晩加熱した。モモの花抽出物は、標準的な手順を用いて分析された。得られたモモの花抽出物の特性は下記の通りである：乾燥物質：11 g/kg - タンパク質：4.5 g/kg - 糖質：4.5 g/kg - アミノ酸：0.7 g/kgおよびポリフェノール化合物：1.1 g/kg。モモの花抽出物中の様々な化合物の量を測定するために分光光度分析に用いられる方法：モモの花抽出物のタンパク質含量は、抽出物の総タンパク質含量を定量するために、ローリータンパク質アッセイ（Lowryら、1951）によって測定された。ローリーアッセイは、溶液中の総タンパク質レベルを測定するための生化学的アッセイである。ローリー法は、ペプチド結合の酸化によって生じるCu+の、フォリン-チオカルトー試薬との反応に基づく。サンプルの吸光度は分光光度計において550nmで読み取られる。タンパク質含量はBSA標準曲線を用いて測定される。抽出物のアミノ酸含量は、Mooreら（1948）によって発表された手順から測定され、抽出物の遊離アミノ酸含量は、試薬ニンヒドリンによるアミンおよびカルボン酸官能基の開裂に続く、有色複合体の形成によって評価された。複合体の吸光度は分光光度計において570nmで読み取られる。総アミノ酸含量はアミノ酸プールの標準曲線を用いて測定された。
【００８４】
抽出物の総糖質含量は、Duboisら（1956）によって記載されたアッセイ(Duboisら、“Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances”, Anal. Chem., 1956, 28 (3), 350-356）の改変による比色分析によって測定した。この分析は、原料の濃硫酸への溶解、およびその後の、有色複合体を形成するためのフェノールとの反応で構成される。複合体の吸光度は分光光度計において490nmで読み取られる。糖質含量はグルコース標準曲線を用いて測定する。
【００８５】
モモの花抽出物のポリフェノール含量は、フォリン-チオカルトーアッセイ（Singletonら、“Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent”, 1999, 299: 152）を用いて測定した。サンプル中のポリフェノール化合物はフォリン-チオカルトー試薬と反応し、試薬の酸化は青色を呈する。サンプルの吸光度は分光光度計において760nmで読み取られる。含量は、没食子酸標準曲線を用いた没食子酸当量として表した。
【００８６】
SDS PAGE電気泳動は、抽出物中のタンパク質の分子量を評価するために行われた。モモの花抽出物は、変性サンプルバッファー中の還元的変性条件において70℃で10分間加熱される。還元されたタンパク質が電気泳動の間に再び酸化しないように、抗酸化溶液が内部チャンバー（陰極）に加えられる。タンパク質の泳動は、MES泳動バッファーを用い、分子量のマーカーとしてスタンダードNovex（登録商標）Sharpを用いて行われる。タンパク質染色は、銀染色を用いて行われる。
得られた抽出物は、10 kDa未満の分子量を有するペプチドを含む。
【００８７】
HPLC手順：
フェノール酸のクロマトグラフィー分析：すべてのサンプルを、カラムUptisphere CS evolution 100mm×4.6mm×2.6μm（ref Interchim: UE2.6AQ-100/046）で、Agilent 1260 HPLCシステム（Agilent Technologies, CA, USA）によって分離した。流速は0.8 ml min-1であった。移動相は0.1％TFA（トリフルオロ酢酸）水溶液（A）およびメタノール（B）で構成した。溶出は、下記のような勾配プログラムによって促進した（表を参照）：
【００８８】
【表１】
2019529535.tif 000003
【００８９】
カラム温度は25℃に維持した。注入量は20μLであり、検出波長はUV検出器を用いて280 nmに設定した。アミノ酸標準品はSigma-Aldrichから購入した。アミノ酸の同定は、サンプルの保持時間およびUVスペクトルピークを信頼できる標準品と比較することによって行った。サンプル濃度および標準品のピーク面積に基づいて、フェノール酸の定量を行った。
【００９０】
アミノ酸のクロマトグラフィー分析：すべてのサンプルを、カラムUptisphere Strategy C18-2 5μm（250×4.6mm）US5C182-250/046 （ref Interchim: UE2.6AQ-100/046）で、Agilent 1260 HPLCシステム（Agilent Technologies, CA, USA）によって分離した。流速は1 ml/minであった。移動相はリン酸（H3PO4）0.1％溶液（A）およびアセトニトリル（B）で構成された。溶出は、下記のような勾配プログラムによって促進した（表を参照）：
【００９１】
【表２】
2019529535.tif 000004
【００９２】
カラム温度は25℃に維持した。注入量は5μLであり、検出波長はUV検出器を用いて254 nmに設定した。アミノ酸標準品はSigma-Aldrichから購入した。標準品およびサンプルは、注入前に、フェニルイソチオシアネート（PITC）で誘導体化した。アミノ酸の同定は、サンプルの保持時間およびUVスペクトルピークを信頼できる標準品と比較することによって行った。サンプル濃度および標準品のピーク面積に基づいて、アミノ酸の定量を行った。
【００９３】
HPLC分析
【表３】
2019529535.tif 000005
【００９４】
【表４】
2019529535.tif 000006
【００９５】
カテキン含量は70℃では50℃と比較して非常に低いことが観察された。カテキンは、フラボノールのグループに属し、天然のフェノール類の一種であり強力な抗酸化分子であるフラボノイドの化学物質ファミリーの一部である。温度の上昇に伴ってこの分子の含量が減少することは、70℃で得られた抽出物が、より低い温度で得られた抽出物より抗酸化作用が低いという事実を説明し得る。
結論として、50℃で行われる抽出は、特にカテキン分子を保護することが示された。
【００９６】
[実施例２]
実施例１のモモの花抽出物で処理されたケラチン生成細胞および線維芽細胞における、qPCR によるSIRT2 mRNA試験
本試験の目的は、ヒト細胞のサーチュイン2 mRNAレベルに対する実施例１のモモの花抽出物の影響をqPCRによって究明することである。
【００９７】
手順：100 ppm（「ppm」とは100万分率を指す）のストック溶液を細胞の培地で0.5％vol/volに希釈することによって、合成SIRT2ペプチドの処理溶液を調製した。
実施例１のモモの花抽出物を細胞の培地で0.1％vol/volまたは0.5％vol/volに希釈することによって、モモの花抽出物の処理溶液を調製した。
【００９８】
正常ヒトケラチン生成細胞または正常ヒト線維芽細胞を、2回、合成SIRT2活性化ペプチドの0.5％vol/volの溶液、または実施例１のモモの花抽出物の0.1％vol/volもしくは0.5％vol/volの溶液で24時間処理した。最初にRNeasy Mini Kit（74106, Qiagen）を用いて全RNAを抽出し、その後、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（4374966, Life technologies）を用いて全RNAを逆転写した。最後に、TaqMan Gene Expression Master Mix（4369514, Life technologies）ならびに、２つのプライマーおよび１つの配列特異的プローブで構成されるTaqMan Gene Expression Assays（Hs00247263_m1, Life technologies）を用いてサーモサイクラー（Applied Biosystems）上でリアルタイムPCRを行った。18S TaqMan Gene Expression Assay（Hs99999901_s1, Life technologies）を内在性コントロールとして用い、ターゲットの発現の相対定量のために比較Ct法を用いた。
【００９９】
結果：SIRT2 mRNAレベルは、ケラチン生成細胞および線維芽細胞の両方において、未処理の細胞と比較して、モモの花抽出物による処理後に増加した。そのレベルは高く、ケラチン生成細胞および線維芽細胞においてそれぞれ、0.1％処理後に64％および56％、0.5％処理後に88％および91％、有意に（スチューデントのt検定）増加した。
結論：SIRT2 mRNAのレベルは、モモの花抽出物で24時間処理された細胞において量的に増加した。結果は、図１および図２に示される。
【０１００】
【表５】
2019529535.tif 000007
【０１０１】
[実施例３]
実施例１のモモの花抽出物で処理されたケラチン生成細胞における、SIRT2タンパク質発現試験
本試験の目的は、細胞でのサーチュイン2 タンパク質発現に対する実施例１のモモの花抽出物の影響を究明することである。これを行うために、正常ヒトケラチン生成細胞に対して免疫蛍光による特異的標識を行った。
【０１０２】
手順：モモの花抽出物の処理溶液を実施例２のように調製した。
正常ヒトケラチン生成細胞を、2回、合成SIRT2活性化ペプチドの0.5％の溶液、または0.1％vol/volもしくは0.5％vol/volの実施例１のモモの花抽出物で24時間処理した。抗SIRT2抗体による免疫標識のために、細胞を洗浄し、3.7％パラホルムアルデヒドで10分間固定した。その後、細胞を、特異的な抗SIRT2抗体（Abcam, ref. ab19388、ウサギポリクローナル）の存在下でインキュベートし、その後、蛍光色素と結合した適切な二次抗体の存在下でインキュベートした。特定の媒質中に載せた後、落射蛍光顕微鏡（Nikon Eclipse 80i microscope）によってスライドを観察した。
【０１０３】
結果：顕微鏡観察は、モモの花抽出物での処理後、ケラチン生成細胞においてSIRT2染色の増加を示した。
結論：SIRT2タンパク質の発現は、モモの花抽出物で24時間処理された細胞において視覚的に増加した。
【０１０４】
[実施例４]
実施例１のモモの花抽出物で処理されたex vivoでのヒト皮膚生検における、SIRT2タンパク質発現試験
本試験の目的は、皮膚でのサーチュイン2 タンパク質発現に対する実施例１のモモの花抽出物の影響を究明することである。これを行うために、正常ヒト皮膚生検に対して免疫蛍光による特異的標識を行った。
【０１０５】
手順：モモの花抽出物の処理溶液を実施例２のように調製した。
正常ヒト皮膚生検を、2回、実施例１のモモの花抽出物の0.1％vol/volまたは0.5％vol/volの溶液で24時間処理した。抗SIRT2抗体による免疫標識のために、組織を固定し、パラフィンに包埋した。その後、包埋された皮膚生検を切り、切片を脱パラフィン、再水和した。その後、特異的な抗SIRT2抗体（Abcam, ref. ab19388, ウサギポリクローナル）および次に、蛍光色素と結合した適切な二次抗体を使用する前に、脱マスキング手順を行った。特定の媒質中に載せた後、落射蛍光顕微鏡（Nikon Eclipse 80i microscope）によってスライドを観察した。
【０１０６】
結果：皮膚切片でのSIRT2免疫蛍光染色の顕微鏡観察は、表５に示されるように、モモの花抽出物での処理後、用量依存的なSIRT2発現の増加を示した。その増加は用量依存的であり、合成ペプチドでの処理と比較して、より高かった。
結論：SIRT2タンパク質の発現は、モモの花抽出物で24時間処理された皮膚生検において視覚的に増加した。
【０１０７】
[実施例５]
実施例１のモモの花抽出物で処理されたケラチン生成細胞における、qPCR によるBubR1 mRNA試験
BubR1タンパク質はSIRT2の制御下にあり、哺乳動物の老化と関連しているので、本試験の目的は、ヒト細胞のBubR1 mRNAレベルに対する実施例１のモモの花抽出物の影響をqPCRによって究明することである。
【０１０８】
手順：モモの花抽出物の処理溶液を実施例２のように調製した。
正常ヒトケラチン生成細胞を、1日2回、実施例１のモモの花抽出物の0.1％vol/volまたは0.5％vol/volの溶液で24時間処理した。最初にRNeasy Mini Kit（74106, Qiagen）を用いて全RNAを抽出し、その後、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（4374966, Life technologies）を用いて全RNAを逆転写した。最後に、TaqMan Gene Expression Master Mix（4369514, Life technologies）ならびに、２つのプライマーおよび１つの配列特異的プローブで構成されるTaqMan Gene Expression Assays（Hs01084828_m1, Life technologies）を用いてサーモサイクラー（Applied Biosystems）上でリアルタイムPCRを行った。18S TaqMan Gene Expression Assay（Hs99999901_s1, Life technologies）を内在性コントロールとして用い、ターゲットの発現の相対定量のために比較Ct法を用いた。
【０１０９】
結果：BubR1 mRNAレベルは、ケラチン生成細胞において、未処理の細胞と比較して、モモの花抽出物による処理後に増加した。そのレベルは、ケラチン生成細胞において、0.1％処理後に46％、0.5％処理後に42％、極めて有意に（スチューデントのt検定）増加した。結果を図３に示す。
結論：BubR1 mRNAのレベルは、モモの花抽出物で24時間処理されたケラチン生成細胞において増加した。
【０１１０】
[実施例６]
実施例１のモモの花抽出物で処理されたケラチン生成細胞および線維芽細胞における、BubR1タンパク質発現試験
本試験の目的は、細胞でのBubR1タンパク質発現に対する実施例１のモモの花抽出物の影響を究明することである。これを行うために、正常ヒトケラチン生成細胞および線維芽細胞に対して免疫蛍光による特異的標識を行った。
【０１１１】
手順：モモの花抽出物の処理溶液を実施例２のように調製した。
正常ヒトケラチン生成細胞または正常ヒト線維芽細胞を、2回、実施例１のモモの花抽出物の0.1％vol/volまたは0.5％vol/volの溶液で24時間処理した。抗BubR1抗体による免疫標識のために、細胞を洗浄し、3.7％パラホルムアルデヒドで10分間固定した。その後、細胞を、特異的な抗BubR1抗体（Abcam, ref. ab4639、マウスモノクローナル）の存在下でインキュベートし、その後、蛍光色素と結合した適切な二次抗体の存在下でインキュベートした。特定の媒質中に載せた後、落射蛍光顕微鏡（Nikon Eclipse 80i microscope）によってスライドを観察した。Volocity 6.3.ソフトウェアを用いて画像を解析することによって、蛍光強度を定量化した。
【０１１２】
結果：顕微鏡観察は、モモの花抽出物での処理後、ケラチン生成細胞および線維芽細胞においてBubR1染色の有意に高い（スチューデントのt検定）増加を示した。結果は、それぞれ図４および５に示す。
【０１１３】
【表６】
2019529535.tif 000008
結論：BubR1タンパク質の発現は、モモの花抽出物で24時間処理された細胞において増加した。
【０１１４】
[実施例７]
実施例１のモモの花抽出物で処理された線維芽細胞における、老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA beta-gal）活性試験
本試験の目的は、細胞でのβ-ガラクトシダーゼ老化マーカーに対する実施例１のモモの花抽出物のより長い適用時間後の影響を究明することである。
【０１１５】
手順：モモの花抽出物の処理溶液を実施例２のように調製した。
正常ヒト線維芽細胞を、1日2回、実施例１のモモの花抽出物の0.1％vol/volまたは0.5％vol/volの溶液で、12継代培養の間（P3〜P15）処理し、P5の未処理の線維芽細胞と比較した。SA beta-gal活性染色のために、最初に細胞を洗浄し、固定した。その後、それらをSA beta-gal染色液とともに一晩インキュベートした。特定の媒質中に載せた後、光学顕微鏡法（Nikon Eclipse E600 microscope）によってスライドを観察した。Volocity 6.3.ソフトウェアを用いて画像を解析することによって、青色強度を定量化した。細胞数による正規化（normalization）を行った。
【０１１６】
結果：予想される通り、青色染色は、未処理の「若い」線維芽細胞（P5）から未処理の老化した線維芽細胞（P15）の間で増加した。この増加は、線維芽細胞がそれぞれ0.1％および0.5％のモモの花抽出物で処理された場合、統計的に有意に（スチューデントのt検定）17％および21％減少した。
【０１１７】
結論：β-ガラクトシダーゼ老化マーカーの活性は、長期間モモの花抽出物で処理された線維芽細胞において低下した。結果を図６に示す。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して詳細に記載されているが、本発明はそれらの詳細な実施形態に限定されるものではないことが理解されるべきである。むしろ、発明を実施するための現在の最良の形態を記載する本開示を考慮すれば、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、多くの変更形態および変形形態が当業者に思い浮かぶであろう。
【０１１８】
[実施例８]
実施例１のモモの花抽出物で処理された皮膚線維芽細胞における、SIRT2活性化試験
本試験の目的は、ヒト皮膚線維芽細胞でのサーチュイン2細胞遊走に対する、モモの花抽出物の影響を究明することであり、試験は実施例１の抽出物を用いて行われた。
【０１１９】
手順：実施例１のモモの花抽出物を0.2％vol/vol、0.5％vol/volまたは1％vol/volに希釈することによって、モモの花抽出物の処理溶液を調製した。
【０１２０】
Oris遊走アッセイ：
材料：
・コラーゲンIコートされたOris 96ウェル細胞遊走アッセイシステム（1パック）、Cat# CMACC1.101
・細胞染料：
○CellTracker Green Life Technologies 1mg, Cat# C2925
・トリプシン：
○トリプシンEDTA 1×Corning, Cat#25-053-CI
・洗浄液：
○ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）1×, Cat# 25-055-CV
・培地：
○ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）Life Technologies, Cat# 11965092
・補充あり、なし
・補充された培地では、培地は:
・10％のHycloneウシ胎児血清（FBS）, Cat# SH30071.03を補充された
【０１２１】
試験サンプル：
1．対照：
○培地のみ
2．遊走陽性対照：
○10ng/mlのPDGF Sigma Cat# P8147 Lot# SLBN0763V
3．保存料を含まないCR14031「モモ抽出物」（実施例１から得られたモモの花抽出物を指す）
○製造：Ashland Vincience
○コード：865810
○以前のコード：CR14031
○バッチ#RM15048
・0.2％（v/v）
・0.5％（v/v）
・1％（v/v）
【０１２２】
方法
1日目：Oris遊走プレートの細胞播種および活性物質による前処理
プレートを室温にするために、Oris細胞遊走アッセイを播種の前に4℃の冷蔵から取り出した。
無菌細胞培養条件下で、Oris遊走プレートに、ウェルあたり50μl培地中20,000個の細胞密度で、Zen Bio Lot# DFM110210Bからの62歳の11継代の正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF’s）を播種した。
【０１２３】
その後、ウェル中に結果として1×処理を含む100μlの最終容量になるように、培地中に等量（50μl）の2倍濃縮された処理を、下記のプレートレイアウト（n=10）に従って指定されたウェルに添加した。プレートを24時間、95％湿度、5％CO2 および37℃の標準的な細胞培養条件下でインキュベートした。
斜線のウェルは利用されず、余分であった。
【０１２４】
【表７】
2019529535.tif 000009
【０１２５】
2日目：細胞の染色、活性物質による再添加処理、遊走アッセイ時点の開始
翌日、培地および処理をプレートから除去し、接着細胞を37℃に温めたダルベッコPBSで2回洗浄することによって、染色前に細胞を洗浄した。
無血清培地中10mMのCell Tracker Green溶液を用いて細胞を染色し、標準的な細胞培養条件下で30分間インキュベートした。
30分の染色後、付属の道具を用いてOris遊走アッセイ中の特殊なウェルインサートを取り出し、CellTracker Green染色液を除去した。
【０１２６】
細胞を37℃に温めたダルベッコPBSで2回洗浄することによって、すべての障害のある細胞（disturbed cells）および残りの色素を洗い流した。
1×調製した処理を、示されたプレートレイアウトに従ってプレートに再添加し、蛍光プレートリーダーを用いて次の設定：492nm ex/517nm emで、t＝0で表されるアッセイの開始時に、直ちにプレートを読み取った。更なる1、2、3、4、6、8、および24時間の時点を取り、データを記録した。
【０１２７】
結果：結果は、モモの花抽出物による処理が、62歳のヒト皮膚線維芽細胞において細胞遊走を増加させ、それが濃度依存的であったことを示す。結果は下記の表に報告する：
【０１２８】
【表８】
2019529535.tif 000010
【０１２９】
結論：モモの花抽出物によるSirt2の支持によって、発明者らは、成熟した皮膚細胞において細胞が細胞遊走活性を取り戻すのを促進することができた。
結果を図７に示す。
【０１３０】
[実施例９]
実施例１のモモの花抽出物による処理後の平均細胞数の測定
本試験の目的は、平均細胞数に対するモモの花抽出物の影響を究明することであり、試験は実施例１の抽出物を用いて行われた。
【０１３１】
手順：実施例１のモモの花抽出物を0.2％vol/vol、0.5％vol/volまたは1％vol/volに希釈することによって、モモの花抽出物の処理溶液を調製した。
【０１３２】
Alamar Blue法 - 細胞増殖測定のためのアッセイ：
材料：
・96ウェルプレート
・Alamar Blue Solution Invitrogen, Cat# DAL1100
・ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）Life Technologies, Cat# 11965092
○下記を補充された：
・10％のHycloneウシ胎児血清（FBS）, Cat# SH30071.03
【０１３３】
方法：
96ウェルプレートに、ウェルあたり20,000個の細胞のZen Bio Lot# DFM110210Bからの62歳の11継代の正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF’s）を、示されたプレートレイアウトのとおりの処理とともに播種し、通常の細胞培養条件下で48時間培養した。
48時間後、培地および処理を除去し、培地中10％のAlamar Blue溶液を調製して、100μlのこの溶液をプレートのすべてのウェルにピペットで加えた。
【０１３４】
その後、標準的な細胞培養条件下のインキュベーターに1時間、プレートを戻した。1時間のインキュベート後、プレートリーダーで570nmでの吸光度を測定した。
試験されたサンプルに対する570nmでのO.D.をグラフにすることによって、結果を分析した。
【０１３５】
結果：Alamar blue測定値は、プレート中で生きている細胞の数と比例する。Sirt2を支持するモモの花抽出物で処理することによって、本発明者らは、成熟したヒト皮膚線維芽細胞（62歳）での細胞数の増加を測定した。
結論：成熟した皮膚細胞におけるSIRT2の支持はそれらの増殖を促進しており、SIRT2は細胞が分裂するために不可欠な微小管での細胞骨格に関連しているので、これは理にかなっている。
結果を図８に示す。
【０１３６】
【表９】
2019529535.tif 000011
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019529535.tif 000018
【図８】
2019529535.tif 000019
【国際調査報告】
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2019529535.tif 000021
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