(57)【要約】  試料を調製するための方法であって、試料が、支持構造体上の薄い薄膜として提供され、支持構造体の温度が、膜厚を減少させるために環境の露点温度よりも上の値に調整され、光が支持構造体に向けられ、透過光の強度値が測定され、支持構造体が測定強度値に応じて、液体寒剤中に自動的に挿入される、方法。本出願は、支持構造体と、支持構造体を事前に定義された温度に維持するための温度制御ステージと、支持構造体を液体寒剤を含む容器内に移動させるための移送機構と、光源と、透過光の強度値を測定するための光検出器と、測定強度値に応じて移送機構を作動させるための制御デバイスとを備えるシステムにさらに関する。
2019537709.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持構造体（２０）上の試料を調製するための方法であって、
前記試料が、膜厚を有する薄い薄膜として支持構造体（２０）上に提供され、
前記支持構造体（２０）の温度が、環境の露点温度よりも上の値に調整され、したがって、前記膜厚が減少し、
光が前記支持構造体（２０）に向けられ、
前記支持構造体（２０）によって透過された前記光の少なくとも１つの強度値が測定され、
前記支持構造体（２０）が、前記少なくとも１つの測定強度値に応じて液体寒剤（８０）中に自動的に挿入され、したがって、前記試料が、無定形固体まで冷却される、
方法。
【請求項２】
前記支持構造体（２０）が、前記少なくとも１つの測定強度値が所定の閾値を超えたとき、前記液体寒剤（８０）中に自動的に挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記支持構造体（２０）の温度が、環境の露点温度よりも２°から８°上の値に調整される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記膜厚が、温度を環境の露点温度よりも上の値に調整する前にブロッティング又は再吸引によって減少する、請求項１から３までの一項に記載の方法。
【請求項５】
前記光の波長が、近赤外範囲にあり、詳細には波長が７８０ｎｍ以上である、請求項１から４までの一項に記載の方法。
【請求項６】
前記光が、前記支持構造体（２０）の表面に垂直である光経路（Ｌ）に沿って前記支持構造体（２０）に向けられる、請求項１から５までの一項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、事前に定義された量の前記試料を毛細管内に吸引することによって、及び前記試料を前記毛細管を用いて前記支持構造体（２０）上に分配することによって前記支持構造体（２０）上に提供される、請求項１から６までの一項に記載の方法。
【請求項８】
追加の較正ステップが実施され、前記光が、前記試料から自由になっている基準支持構造体（２０）に向けられ、前記基準支持構造体（２０）によって透過された前記光の少なくとも１つの基準強度値が、測定され、前記試料を支える前記支持構造体（２０）が、前記少なくとも１つの測定強度値と、前記少なくとも１つの基準強度値との比率に応じて前記液体寒剤（８０）中に自動的に挿入される、請求項１から７までの一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料に向けた前記光が、少なくとも第１の波長の、詳細には６００ｎｍから９００ｎｍの間の範囲の、より詳細には７８０ｎｍから８８０ｎｍの間の範囲の、又は６３０ｎｍから６７０ｎｍの間の範囲の光と、第２の波長の、詳細には３５０ｎｍから５００ｎｍの間の範囲の、より詳細には４０５ｎｍから４５０ｎｍの間の範囲の光とを含む、請求項１から８までの一項に記載の方法。
【請求項１０】
支持構造体（２０）上の試料を調製するためのシステム（１００）であって、
試料を収容するように構成される支持構造体（２０）と、
前記支持構造体（２０）が温度制御ステージ（１）上に配置されたとき、前記支持構造体（２０）を事前に定義された温度に維持するように構成される温度制御ステージ（１）と、
前記支持構造体（８０）上の前記試料が寒剤（８０）に接触するように、前記支持構造体（２０）を前記温度制御ステージ（１）から前記液体寒剤（８０）を含む容器（１２）内に移動させるように構成される移送機構（６０）と
を備え、
前記支持構造体（２０）に向ける光を提供するように構成される光源（１３）と、
前記支持構造体（２０）によって透過された前記光の少なくとも１つの強度値を測定するように構成される光検出器（１４）と、
前記測定強度値を前記光検出器（１４）から受け取り、前記液体寒剤（８０）を含む前記容器（１２）中に前記支持構造体（２０）が挿入されるように前記移送機構（６０）を前記少なくとも１つの測定強度値に応じて作動させるように構成される制御デバイス（３０）と
を備えることを特徴とするシステム（１００）。
【請求項１１】
前記光源（１３）が、光経路（Ｌ）に沿って前記光を放射するように適合され、前記支持構造体（２０）及び前記光検出器（１４）が、前記光経路（Ｌ）に沿って配置され、したがって、少なくとも前記光の一部が、前記支持構造体（２０）を介して前記光源（１３）から前記光経路（Ｌ）に沿って前記光検出器（１４）に進み、詳細には、前記支持構造体（２０）が、前記光経路（Ｌ）に対して垂直に配置されることを特徴とする、請求項１０に記載のシステム（１００）。
【請求項１２】
前記システム（１００）が、前記支持構造体（２０）を保持するように構成された第１のアダプタ（３）を備え、前記移送機構（６０）が、前記支持構造体（２０）を保持する前記第１のアダプタ（３）に接続されるよう構成され、前記移送機構（６０）が、前記支持構造体（２０）上の前記試料が前記容器（８）内の前記寒剤（８０）に接触するように、前記支持構造体（２０）とともに前記第１のアダプタ（３）を旋回させて、前記容器（１２）よりも上の垂直位置に入れ、前記第１のアダプタ（３）及び前記支持構造体（２０）を前記旋回運動後、下方に移動させるように構成されることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のシステム（１００）。
【請求項１３】
前記システム（１００）が、調整可能なやり方で前記温度制御ステージ（１）に対して前記第１のアダプタ（３）を保持するように構成された調整手段（５）を備え、前記調整手段（５）が保持手段（５０）を、詳細には電磁石（５０）の形態で備え、前記保持手段（５０）が、第１のアダプタ（３）を解放可能に保持し、前記試料が前記支持構造体（２０）上に位置決めされたとき前記第１のアダプタ（３）を自動的に解放するように構成されることを特徴とする、請求項１０から１２までの一項に記載のシステム（１００）。
【請求項１４】
前記移送機構（６０）が、第２のアダプタ（７）を備え、前記第１のアダプタ（３）と前記第２のアダプタ（７）とが、前記保持手段（５０）が前記第１のアダプタ（３）を解放したとき、互いに係合するように設計され、前記移送機構（６０）が、前記第１のアダプタ（３）が前記第２のアダプタ（７）と係合され前記保持手段（５０）から解放されたとき、前記第２のアダプタ（７）を前記容器（１２）よりも上に旋回させるように設計されることを特徴とする、請求項１０から１３までの一項に記載のシステム（１００）。
【請求項１５】
前記システム（１００）が、分配ヘッド（１１）を備える液体処理システムを備え、前記液体処理システムが、前記分配ヘッド（１１）を介してある容量の試料を吸引し、分配し、前記システム（１００）が、第１のタンクをさらに備え、前記第１のタンク内に、ナノリットル容量の試料を含む前記分配ヘッド（１１）が、例えば、前記支持構造体（２０）上の堆積の前の緩衝液の脱塩又は交換のための拡散制御試料調整を可能にするように浸漬することができることを特徴とする、請求項１０から１４までの一項に記載のシステム（１００）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子顕微鏡法の試料を調製するための調製方法、及び対応するシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ガラス化標本の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）（ｃｒｙｏ−ＥＭ；非特許文献１）が、生体物質の高分解能構造解析の強力な技法となっており（非特許文献２）、今や生物学において主流のツールとして次第に認識されている（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。いくつかの技術成果により、この進展が可能となっており、最も顕著なのは最近の電子直接検出（ＤＥＤ）カメラの導入と改善されたデータ処理アルゴリズムの利用可能性である（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。
【０００３】
超低温試料グリッド（クライオＥＭグリッド）調製及び撮像方法により、生体標本が、電子顕微鏡内の超高真空に耐え、放射線障害の影響を低減し、生体分子の構造配列を保存する生理学的状態に捕捉されながらそれらの調査をすることを可能にすることが確実になる（非特許文献９；非特許文献１；非特許文献１０）。
【０００４】
しかし、これらの調製方法は、ここ２０年にわたって顕著に改善されておらず、いくつかの大きな欠陥を有する。具体的には、２〜４μｌの試料容量が必要であるが、ろ紙を用いて行われる幅広いブロッティング・ステップによりグリッド調製中に試料容量の９９．９％が失われる（非特許文献１１）。
【０００５】
さらに、ろ紙を用いるブロッティングは、タンパク質の凝集又は変性をもたらすことがある。技術試料調製方法の現状は、クライオＥＭにおける最も顕著な限界のうちの１つと認識されている（Glaeser, R.M., 2016. How good can cryo-EM become ? Nat Methods 13, 28-32）。
【０００６】
試料消費を低減する、改善されたクライオＥＭグリッド調製戦略は、今や必須条件である。インクジェット・ピコリットル分配をプランジ凍結装置と組み合わせるデバイスが２０１２年に提示され（非特許文献１２）、インクジェット・スポッティングと組み合わせたクライオ・グリッド調製を可能とする自己ブロッティング・グリッドの使用によって最近改良された（非特許文献１３）。
【０００７】
具体的には、先行技術のクライオ・グリッド試料調製方法は、しばしば、結果として様々な厚さ及び品質のガラス化試料薄膜となり、それにより、非制御水分蒸発による画質の低下又は塩アーチファクトがもたらされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J.J., Homo, J.C., Lepault, J., McDowall, A.W., Schultz, P., 1988. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228
【非特許文献２】Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y., 2013. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature 504, 107-112
【非特許文献３】Callaway, E., 2015. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature 525, 172-174
【非特許文献４】Kuhlbrandt, W., 2014. Biochemistry. The resolution revolution. Science 343, 1443-1444
【非特許文献５】Nogales, E., 2015. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat. Methods 13, 24-27
【非特許文献６】Grigorieff, N., 2007. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. J. Struct. Biol. 157, 117-125
【非特許文献７】Lyumkis, D., Brilot, A.F., Theobald, D.L., Grigorieff, N., 2013. Likelihood-based classification of cryo-EM images using FREALIGN. J. Struct. Biol. 183, 377-388
【非特許文献８】Scheres, S.H.W., Chen, S., 2012. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nat. Methods 9, 853-854
【非特許文献９】Baker, L.A., Rubinstein, J.L., 2010. Chapter Fifteen-Radiation Damage in Electron Cryomicroscopy. Methods Enzymol
【非特許文献１０】Lepault, J., Booy, F.P., Dubochet, J., 1983. Electron microscopy of frozen biological suspensions. J. Microsc. 129, 89-102
【非特許文献１１】Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S.A., Giss, D., Muller, S.A., Ringler, P., Goldie, K.N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T., 2012. Connecting μ-fluidics to electron microscopy. J. Struct. Biol. 177, 128-134
【非特許文献１２】Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C.S., 2012. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. J. Struct. Biol. 179, 68-75)
【非特許文献１３】Razinkov, I., Dandey, V.P., Wei, H., Zhang, Z., Melnekoff, D., Rice, W.J., Wigge, C., Potter, C.S., Carragher, B., 2016. A new method for vitrifying samples for cryoEM. J. Struct. Biol. 195, 190-198
【非特許文献１４】Arnold, S.A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T., 2016. Total Sample Conditioning and Preparation of Nanoliter Volumes for Electron Microscopy. ACS nano 10, 4981-4988
【非特許文献１５】Kemmerling, S., Arnold, S.A., Bircher, B.A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T., 2013. Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy. J. Struct. Biol. 183, 467-473
【非特許文献１６】(Rohou, A., Grigorieff, N., 2015. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. J. Struct. Biol. 192, 216-221
【非特許文献１７】McLeod, R.A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. submitted 2016. Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy
【非特許文献１８】Tang, G., Peng, L., Baldwin, P.R., Mann, D.S., Jiang, W., Rees, I., Ludtke, S.J., 2007. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. J. Struct. Biol. 157, 38-46
【非特許文献１９】Scheres, S.H., 2012. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J. Struct. Biol. 180, 519-530
【非特許文献２０】Pettersen, E.F., Goddard, T.D., Huang, C.C., Couch, G.S., Greenblatt, D.M., Meng, E.C., Ferrin, T.E., 2004. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J. Comput. Chem. 25, 1605-1612
【非特許文献２１】Elliott, C., Vijayakumar, V., Zink, W., Hansen, R., 2007. National Instruments LabVIEW: A Programming Environment for Laboratory Automation and Measurement. JALA 12, 17-24
【非特許文献２２】Tivol, W.F., Briegel, A., Jensen, G.J., 2008. An improved cryogen for plunge freezing. Microsc. Microanal. 14, 375-379
【非特許文献２３】Engel, A., 2010. Assessing Biological Samples with Scanning Probes, p. 417-431, Springer Berlin Heidelberg
【非特許文献２４】Bircher, B.A., Lang, H.-P., Duempelmann, L., Gerber, C., Braun, T., 2013. Photothermal excitation of microcantilevers in liquid: effect of the excitation laser position on temperature and vibrational amplitude. Micro Nano Lett. 8, 770-774)
【非特許文献２５】Hale, G.M., Querry, M.R., 1973. Optical Constants of Water in the 200-nm to 200-μm Wavelength Region. Appl. Opt. 12, 555-563
【非特許文献２６】Henderson, R., Sali, A., Baker, M.L., Carragher, B., Devkota, B., Downing, K.H., Egelman, E.H., Feng, Z., Frank, J., Grigorieff, N., Jiang, W., Ludtke, S.J., Medalia, O., Penczek, P.A., Rosenthal, P.B., Rossmann, M.G., Schmid, M.F., Schroder, G.F., Steven, A.C., Stokes, D.L., Westbrook, J.D., Wriggers, W., Yang, H., Young, J., Berman, H.M., Chiu, W., Kleywegt, G.J., Lawson, C.L. 2012. Outcome of the first electron microscopy validation task force meeting., pp. 205-214 Structure (London, England : 1993), Vol. 20
【非特許文献２７】Lee, J., Saha, A., Pancera, S.M., Kempter, A., Rieger, J., Bose, A., Tripathi, A., 2012. Shear free and blotless cryo-TEM imaging: a new method for probing early evolution of nanostructures. Langmuir 28, 4043-4046
【非特許文献２８】Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T., 2014. Exploring the interactome: Microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy. Anal. Chem. 86, 4680-4687
【非特許文献２９】Elliott, C., Vijayakumar, V., Zink, W., Hansen, R., 2007. National Instruments LabVIEW: A Programming Environment for Laboratory Automation and Measurement. JALA 12, 17-24
【非特許文献３０】Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Muller, S.A., Goldie, K.N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T., 2014. openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements. BMC Bioinf. 15, 84
【非特許文献３１】Alduchov, O.A., Eskridge, R.E., 1996. Improved magnus form approximation of saturation vapor pressure. Journal of Applied Meteorology 35, 601-609
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、上述の先行技術の不利点に対して改善されている試料を調製するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、独立方法請求項１及び独立システム請求項１０の主題によって達成される。従属請求項２から９までは、方法の実施例を表し、従属請求項１１から１５までは、システムの実施例を表す。本発明を以下に詳細に説明する。
【００１１】
本発明の第１の態様は、支持構造体上の試料を調製するための方法に関し、
−  試料が、支持構造体上の膜厚を有する薄膜として提供され、
−  支持構造体の温度が、環境の露点温度よりも上の値に調整され、したがって、膜厚が減少し、
−  光が支持構造体に向けられ、
−  支持構造体によって透過された光の少なくとも１つの強度値が測定され、
−  支持構造体が、少なくとも１つの測定強度値に応じて液体寒剤中に自動的に挿入され、したがって、試料が無定形固体まで冷却される。
【００１２】
これは、グリッド上の試料薄膜の薄化が、紙ブロッティング及びスポッティングなしで実現することができ、特に、たった数ナノリットル（例えば、３〜２０ｎＬ）の総試料容量しか必要としないという利点を有する。具体的には、それは、例えば、穴あきカーボンＥＭグリッド上に微小毛細管によって試料を直接「書き込み」、その後、堆積した液体をガラス化し、ガラス化した標本の薄層をカーボン薄膜の穴部に生成する方法を用いることによって可能である。
【００１３】
有利には、制御温度における試料の蒸発と膜厚測定による蒸発監視との組合せにより、定義された及び再現可能な膜厚を用いて自動的に試料を調製することが可能になり、それにより、電子顕微鏡写真の画質が改善され、非制御水分蒸発による塩アーチファクトが回避される。
【００１４】
支持構造体は、穴あきカーボン薄膜又は任意の他の適切な構造を有する、周知の電子顕微鏡法（ＥＭ：ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）グリッドでもよく、又はそれを備えることができる。
【００１５】
支持構造体上への試料移送は、試料の物理的及び化学的特性により多くのやり方で実施することができる。（ｉ）表面張力効果による支持面上へのナノリットル容量の液滴の直接堆積及びその後の拡散、（ｉｉ）支持面上へのナノリットル容量の液滴の堆積、それに続く最初に堆積した容量よりも小さい容量を有する試料の再吸引、（ｉｉｉ）支持構造体表面へのナノリットル容量の液滴の堆積、それに続く支持構造体と液体処理システムとの間の相対運動、その間支持構造体上の堆積した試料を拡散させるために２つの間に液体架橋が依然として確立されている。（ｉｖ）支持構造体上の堆積した試料を拡散させるために堆積中に支持構造体と液体処理システムとの相対運動を組み合わせた支持構造体表面へのナノリットル容量の液滴の堆積。
【００１６】
本明細書において、ｎｌ（ナノリットル）量又は容量とは、詳細には１ｎｌから１００ｎｌの範囲の容量、より詳細には１ｎｌから２０ｎｌである。
【００１７】
ある実施例において、支持構造体は、温度制御ステージ上に提供される。
【００１８】
ある実施例において、支持構造体の温度は、第１のステップにおいて環境の露点温度に調整され、支持構造体の温度は、第１のステップに続く第２のステップにおいて環境の露点温度よりも上の温度に調整される。
【００１９】
ある実施例において、支持構造体は、少なくとも１つの測定強度値が所定の閾値を超えたとき、液体寒剤中に自動的に挿入される。
【００２０】
ある実施例において、支持構造体の温度は、環境の露点温度よりも２°から８°上の値に調整される。
【００２１】
具体的には、支持構造体の温度を増加させることは、目標温度を露点温度よりも上に、詳細には露点温度よりも２°から８°上に設定することを表し、支持構造体の温度が、遅延時間の間、初期温度から目標温度に増加する。
【００２２】
ある実施例において、膜厚は、温度を環境の露点温度よりも上の値に調整する前にブロッティング又は再吸引によって減少する。
【００２３】
そのような事前薄化ステップは、試料薄膜が制御蒸発の前にすでに薄い場合、試料の制御蒸発中に、試料がわずかに濃縮されるだけであるという利点を有する。
【００２４】
ある実施例において、光の波長は近赤外範囲にあり、詳細には、波長は７８０ｎｍ以上である。
【００２５】
試料薄膜の厚さ決定に７８０ｎｍの赤外光を使用することは、光が水又は生物材料によって顕著に吸収されないという利点を有する。
【００２６】
代替案として、例えば、４０５ｎｍの波長を使用することもできる。
【００２７】
ある実施例において、試料に向けた光は、少なくとも、第１の波長の、詳細には６００ｎｍから９００ｎｍの間の範囲の、より詳細には７８０ｎｍから８８０ｎｍの間の範囲の、又は６３０ｎｍから６７０の間の範囲の光と、第２の波長の、詳細には３５０ｎｍから５００ｎｍの間の範囲の、より詳細には４０５ｎｍから４５０ｎｍの間の範囲の光とを含む。
【００２８】
言い換えれば、２つの波長の組合せ（例えば、４０５ｎｍと７８０ｎｍ）を使用して、試料を同時に照射することができる。２つの干渉ピークの時間間隔から、特定の試料蒸発率を較正することができる。
【００２９】
例えば、第１の波長は７８０ｎｍでもよい。例えば、第２の波長は４０５ｎｍ、４４５ｎｍ、又は４５０ｎｍでもよい。
【００３０】
ある実施例において、第１の波長から第２の波長の間の距離は、３００ｎｍから４００ｎｍである。
【００３１】
ある実施例において、第１の波長を含む第１の光ビーム及び第２の波長を含む第２の光ビームが、試料に向けられ、試料によって透過された第１の光ビームの強度及び試料によって透過された第２の光ビームの強度が、別々に検出される。
【００３２】
ある実施例において、第１の光ビームと第２の光ビームは統合され、統合された光ビームが、支持構造体に向けられる。
【００３３】
ある実施例において、試料によって透過された光は、光強度の検出の前に第１の透過光ビームと第２の透過光ビームとに分割される。
【００３４】
ある実施例において、光は、支持構造体の表面に対して垂直である光経路（Ｌ）に沿って支持構造体に向けられる。
【００３５】
具体的には、そのような垂直設定は、光が、その後の電子顕微鏡写真に撮像される支持構造体（例えば、ＥＭグリッド）の位置を照射するという利点を有する。
【００３６】
さらに、測定された光強度信号の一部を構成する干渉パターンの明瞭度は、垂直設定を使用したときが最高である。
【００３７】
ある実施例において、事前に定義された量の試料を毛細管内に吸引し、毛細管を用いて支持構造体上に試料を分配することによって、試料は支持構造体上に提供される。
【００３８】
ある実施例において、支持構造体は、液体寒剤中への挿入の前に、詳細には旋回運動によって垂直位置にされる。
【００３９】
ある実施例において、追加の較正ステップが実施され、光が、試料から自由になっている基準支持構造体に向けられ、基準支持構造体によって透過された光の少なくとも１つの基準強度値が、測定され、試料を支える支持構造体が、少なくとも１つの測定強度値及び少なくとも１つの基準強度値、詳細には少なくとも１つの測定強度値と少なくとも１つの基準強度値との比率に応じて、液体寒剤中に自動的に挿入される。さらに、２つの波長を混合するシステムにより、層厚さの絶対較正が可能になる。
【００４０】
「ドライ信号」とも称するそのような基準信号は（したがって、グリッド上の試料薄膜による信号も）、グリッド・タイプ及びメッシュ・サイズに左右される。したがって、説明する実施例の利点は、基準信号を用いて、試料薄膜の厚さ測定をグリッド・タイプ及びメッシュ・サイズから独立して実施できることである。
【００４１】
ある実施例において、支持構造体は、ガラス化試料とともに液体寒剤から取り除かれる。
【００４２】
ある実施例において、試料は、支持構造体上に試料を提供する前に調整緩衝液に浸漬される。これにより、例えば、支持構造体上の堆積の前の緩衝液の脱塩又は交換のための拡散制御試料調整が可能になる。
【００４３】
試料調製の前の拡散制御試料調整は、試料の塩濃度が蒸発中に増加するので、制御試料蒸発との組合せにおいて特に有利である。
【００４４】
本発明の第２の態様は、支持構造体上の試料を調製するための、詳細には本発明の第１の態様による方法を適用するためのシステムであって、
−  試料を収容するように構成される支持構造体と、
−  支持構造体が温度制御ステージ上に配置されるとき、支持構造体を事前に定義された温度に維持するように構成される温度制御ステージと、
−  支持構造体上の試料が寒剤に接触するように、支持構造体を温度制御ステージから液体寒剤を含む容器内に移動させるように構成される移送機構とを備え、
システムが、
−  支持構造体に向ける光を提供するように構成される光源と、
−  支持構造体によって透過された光の少なくとも１つの強度値を測定するように構成される光検出器と、
−  測定強度値を光検出器から受け取り、液体寒剤を含む容器内に支持構造体が挿入されるように少なくとも１つの測定強度値に応じて移送機構を作動させるように構成される、制御デバイスとを備える、システムに関する。
【００４５】
温度制御ステージと、光源及び光検出器からなる光学測定デバイスとの組合せにより、有利には、定義された及び再現可能な膜厚におけるクライオ・グリッドの制御試料蒸発及び調製が可能になる。これにより、電子顕微鏡写真の画質が改善され、非制御水分蒸発による塩アーチファクトが回避される。
【００４６】
ある実施例において、光源は、光経路に沿って光を放射するように適合され、支持構造体及び光検出器が光経路に沿って配置され、したがって、少なくとも光の一部が支持構造体を介して光源から光経路に沿って光検出器まで進み、詳細には、支持構造体が、光経路に対して垂直に配置される。
【００４７】
ある実施例において、システムは、支持構造体を保持するように構成された第１のアダプタを備え、支持構造体上の試料が寒剤に接触するように、移送機構が、支持構造体を保持する第１のアダプタに接続されるように、及び液体寒剤を含む容器内に支持構造体を移動させるように構成される。
【００４８】
ある実施例において、第１のアダプタは、支持構造体を保持するためのピンセットを備える。
【００４９】
ある実施例において、移送機構は、支持構造体上の試料が容器内の寒剤に接触するように、支持構造体とともに第１のアダプタを容器よりも上の垂直位置に旋回させるように、及び第１のアダプタ及び支持構造体を旋回運動後に下方に移動させるように構成される。
【００５０】
ある実施例において、システムは、支持構造体を保持するように構成された第１のアダプタを備え、移送機構が、支持構造体を保持する第１のアダプタに接続されるように構成され、移送機構が、支持構造体上の試料が容器内の寒剤に接触するように、支持構造体とともに第１のアダプタを容器よりも上の垂直位置に旋回させるように、及び第１のアダプタ及び支持構造体を旋回運動後に下方に移動させるように構成される。
【００５１】
ある実施例において、システムは、分配ヘッドを備える液体処理システムを備え、液体処理システムが、分配ヘッドを介して、ある容量の試料を吸引し、分配するように構成される。
【００５２】
ある実施例において、システムは、液体処理システムに対して温度制御ステージを移動させ、したがって、分配ヘッドと支持構造体とが、試料を液体処理システムから支持構造体に移送させるために互いに近接することができるように構成される並進ステージ組立品を備える。
【００５３】
ある実施例において、並進ステージ組立品は、２つの別々の並進ステージを備えることができ、一方は、温度制御ステージ又は支持構造体をＸ及びＹ方向（例えば、水平面）に移動させるように構成されるが、他方は、分配ヘッド（例えば、毛細管又は微小毛細管）をＺ方向（垂直方向）に位置決めするように構成される。
【００５４】
代替案として、実施例において、並進ステージ組立品は、すべての次元（Ｘ、Ｙ及びＺ）において分配ヘッド（例えば、毛細管又は微小毛細管）に対して温度制御ステージ及び支持構造体を位置決めするように構成される、ＸＹＺステージ組立品でもよい。
【００５５】
ある実施例において、システムは、温度制御ステージに対して第１のアダプタを調整可能なやり方で保持するように構成された調整手段を備える。
【００５６】
ある実施例において、調整手段は、第１のアダプタを解放可能に保持するように、及び試料が支持構造体上に位置決めされ、及び詳細には事前に定義された温度を有するとき、詳細には第１のアダプタを自動的に解放するように構成される詳細には保持手段を電磁石の形態で備える。
【００５７】
ある実施例において、システムは、温度制御ステージに対して第１のアダプタを調整可能なやり方で保持するように構成された調整手段を備え、調整手段が、第１のアダプタを解放可能に保持し、試料が支持構造体上に位置決めされたとき第１のアダプタを自動的に解放するように構成される詳細には保持手段を電磁石の形態で備える。
【００５８】
ある実施例において、移送機構は、第２のアダプタを備え、第１のアダプタと第２のアダプタは、保持手段が第１のアダプタを解放したとき互いに係合するように設計される。
【００５９】
ある実施例において、移送機構は、第１のアダプタが第２のアダプタと係合し、保持手段から解放されたとき、第２のアダプタを容器よりも上に旋回させるように設計される。
【００６０】
ある実施例において、移送機構は、第２のアダプタを備え、第１のアダプタと第２のアダプタが、保持手段が第１のアダプタを解放したとき、互いに係合するように設計され、移送機構が、第１のアダプタが第２のアダプタと係合し、保持手段から解放されたとき、第２のアダプタを容器よりも上に旋回させるように設計される。
【００６１】
ある実施例において、移送機構は、運動発生手段を備え、詳細には、第１のアダプタ及び支持構造体が、垂直位置において容器よりも上に位置決めされたとき、第２のアダプタを下方に移動させ、したがって、支持構造体上の試料が容器内の寒剤に接触するように構成される、ソレノイドを備える。
【００６２】
ある実施例において、分配ヘッドは、液体処理システムの端部における毛細管、詳細には微小毛細管によって形成され、その毛細管は、吸引試料を収容するための先端を備える。
【００６３】
具体的には、微小毛細管の内径は、１マイクロメートルから９００マイクロメートルの範囲内、より詳細には、１マイクロメートルから１００マイクロメートルの範囲内でもよい。
【００６４】
ある実施例において、システムは、拡散制御試料調整が可能になるようにナノリットル容量の試料を含む分配ヘッドを浸漬することができる第１のタンクを備える。
【００６５】
ある実施例において、システムは、分配ヘッドを備える液体処理システムを備え、液体処理システムが、分配ヘッドを介してある容量の試料を吸引し、分配し、システムが、例えば、支持構造体上の堆積の前の緩衝液の脱塩又は交換のための拡散制御試料調整が可能になるようにナノリットル容量の試料を含む分配ヘッドを浸漬することができる第１のタンクをさらに備える。
【００６６】
試料調製の前の拡散制御試料調整は、試料の塩濃度が蒸発中に増加するので、制御試料蒸発との組合せにおいて特に有利である。
【００６７】
ある実施例において、システムは、第２のタンクを備え、第２のタンクから、ナノリットル容量の試料を含む分配ヘッドが、認知分子を含む少量を吸引することができる。
【００６８】
ある実施例において、光源は、少なくとも、第１の波長の、詳細には６００ｎｍから９００ｎｍの間の範囲の、より詳細には７８０ｎｍから８８０ｎｍの間の範囲の、又は６３０ｎｍから６７０の間の範囲の光と、第２の波長の、詳細には３５０ｎｍから５００ｎｍの間の範囲の、より詳細には４０５ｎｍから４５０ｎｍの間の範囲の光とを含む光を生成するように適合される。
【００６９】
例えば、第１の波長は７８０ｎｍでもよい。例えば、第２の波長は４０５ｎｍ、４４５ｎｍ、又は４５０ｎｍでもよい。
【００７０】
ある実施例において、第１の波長から第２の波長の間の距離は、３００ｎｍから４００ｎｍである。
【００７１】
ある実施例において、システムは、第１の波長の、詳細には６００ｎｍから９００ｎｍの間の範囲の、より詳細には７８０ｎｍから８８０ｎｍの間の範囲の、又は６３０ｎｍから６７０ｎｍの間の範囲の光を生成するように適合された第１の光源と、第２の波長の、詳細には３５０ｎｍから５００ｎｍの間の範囲の、より詳細には４０５ｎｍから４５０ｎｍの間の範囲の光を生成するように適合された第２の光源とを備える。
【００７２】
ある実施例において、システムは、第１の光源から放射され、支持構造体によって（詳細には支持構造体上の試料によって）透過された光を第１の光検出器によって検出できるように位置決めされる第１の光検出器と、第２の光源から放射され、支持構造体によって透過された光を第２の光検出器によって検出できるように位置決めされる第２の光検出器とを備える。
【００７３】
ある実施例において、システムは、第１の波長の光を通過させ、第２の波長の光を反射するように適合される第１のダイクロイック・ミラーを備え、第１のダイクロイック・ミラーが、第１の光源によって放射された光と第２の光源によって放射された光が第１のダイクロイック・ミラーによって統合され、支持構造体に、詳細には支持構造体の表面に対して垂直に向けられるように、位置決めされる。
【００７４】
ある実施例において、システムは、第１の波長の光を通過させ、第２の波長の光を反射するように適合される第２のダイクロイック・ミラーを備え、第２のダイクロイック・ミラーが、支持構造体によって（詳細には支持構造体上の試料によって）透過された光が第１の透過光ビームと第２の透過光ビームとに分割されるように位置決めされ、第１の透過光ビームが、第１の光検出器に向けられ、第２の光ビームが、第２の光検出器に向けられる。
【００７５】
ある実施例において、システムは、第１の波長の、詳細には６００ｎｍから９００ｎｍの間の範囲の、より詳細には７８０ｎｍから８８０ｎｍの間の範囲の、又は６３０ｎｍから６７０ｎｍの間の範囲の光を生成するように適合された第１の光源と、第２の波長の、詳細には３５０ｎｍから５００ｎｍの間の範囲の、より詳細には４０５ｎｍから４５０ｎｍの間の範囲の光を生成するように適合された第２の光源と、第１の光検出器と、第２の光検出器と、第１のダイクロイック・ミラーと、第２のダイクロイック・ミラーとを備え、第１及び第２のダイクロイック・ミラーが、第１の波長の光を通過させ、第２の波長の光を反射するように適合され、第１のダイクロイック・ミラーが、第１の光源によって放射された光と第２の光源によって放射された光が第１のダイクロイック・ミラーによって統合され、支持構造体に向けられるように位置決めされ、第２のダイクロイック・ミラーが、支持構造体によって（詳細には支持構造体上の試料によって）透過された光が第１の透過光ビームと第２の透過光ビームとに分割されるように位置決めされ、第１の透過光ビームが、第１の光検出器に向けられ、第２の光ビームが、第２の光検出器に向けられる。
【００７６】
本発明の他の特徴及び利点を、図を参照して、実施例の詳細な説明を用いて説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明によるクライオ・グリッド調製システムの斜視図である。
【図２】本発明によるシステム及び方法の動作原理を示す図である。
【図３】ガラス質氷層の厚さを制御するために試料からの水分蒸発の実時間監視データを示すグラフである。
【図４】本発明によるシステム及び方法を使用するクライオ・グリッド調製の概念実証データを示す図である（堆積プロトコル１）。
【図５】本発明によるシステムを使用するクライオ・グリッド調製の概念実証データを示す図である（堆積プロトコル２）。
【図６】高分解能構造分析のために試料を調製するための本発明によるシステムの使用を示す図である。
【図７】制御ソフトウェアのスクリーンショットである。
【図８】温度制御ステージ（露点ステージ）の温度／湿度データを示すグラフである。
【図９】塩効果を示す電子顕微鏡写真である。
【図１０】アンフィポールで再構成された２００ｋＤａ膜たんぱく質の電子顕微鏡写真である。
【図１１】堆積プロトコル２を用いて堆積させた単一細胞溶解物の電子顕微鏡写真である。
【図１２】補正されたフーリエ・シェル相関（ＦＳＣ：Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｓｈｅｌｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）曲線を示すグラフである。
【図１３】試料膜厚を測定するための設定の概略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
図１は、本発明によるシステム１００の実施例を示す。システム１００は、例えば、微小毛細管１１ａによって形成された分配ヘッド１１とは別に、温度制御ステージ１と、支持構造体２０（例えば、ＥＭグリッド）を保持するピンセット２と、ピンセット２を保持する電磁石４と、例えば、温度制御ステージ１上の支持構造体２０の平らな位置決めを確実にするための、ｘｙｚ手動アラインメント５（「運動ステージ」とも称する）の形態の調整手段５であって、温度制御ステージ１上に装着される調整手段５と、ギャップＧによって移送機構６０（インジェクタ組立品としても示す）上の第２のアダプタ７から分離された、第１のアダプタ３のピンセット２を開閉するためにねじをもってピンセット２上に装着された第１のアダプタ３とを備える。具体的には、２つの引き合う永久磁石、詳細にはＮｄ磁石が、アダプタ３、７の端部に挿入され、第３の永久磁石９、詳細にはＮｄ磁石が、第２のアダプタ７を水平位置に保持している。
【００７９】
システム１００は、温度制御ステージ１よりも上に位置決めされる、光源１３、詳細にはレーザ・ダイオード、より詳細には７８０ｎｍ赤外レーザ・ダイオードをさらに備える。光源１３は、光経路Ｌに沿って光ビームを放射するように構成され、支持構造体２０の表面が、光経路Ｌと交差し、したがって、光源１３からの光が支持構造体に向けられる。具体的には、光源１３及び温度制御ステージ１は、支持構造体２０の表面が光経路Ｌに対して垂直となるように位置決めされる。
【００８０】
さらに、システム１００は、光経路Ｌにおいて温度制御ステージ１よりも下に位置決めされ、したがって、温度制御ステージ１上の支持構造体２０を通って進む、すなわち、支持構造体２０によって透過される光が光検出器１４に向けられる光検出器１４を備え、電気信号が、光検出器１４によって検出された光の強度により、光検出器１４によって発生される。光検出器１４によって発生された信号は、システム１００の制御デバイス３０に伝送される。制御デバイス３０は、試料とともに支持構造体２０を液体寒剤８０中に移動させるために指定の光強度値で移送機構６０を作動させ、それによりガラス化試料を発生させるように適合される。具体的には、移送機構６０は、以下に指定したように、電磁石５０を非活性化することによって制御デバイス３０によって間接的に作動させることができる。
【００８１】
支持構造体２０が穴あきカーボン薄膜を有するＥＭグリッドであるとき、光源１３によって放射された光ビームは、薄い試料薄膜も収容するＥＭグリッドのギャップを通して部分的に透過される。具体的には、透過光の光強度は、液体試料による吸収、並びに詳細には空気／液体界面における反射から生じる光散乱及び干渉現象に依存する。したがって、具体的には、光検出器１４において発生される信号は、支持構造体２０の試料薄膜の膜厚に左右される。
【００８２】
具体的には、信号は、個々の支持構造体２０の異なる特性を補正するために、試料堆積の前に、乾性支持構造体２０上で測定された基準信号を用いて正規化することができる。
【００８３】
一般に、すべての実施例において、温度制御ステージ１は、ペルチェ・コントローラによって制御される水冷式ペルチェ素子を備えることができる。ペルチェ・コントローラは、ステージ１上に装着された温度センサからのステージ温度を得る。実際の露点温度は、実験室の内側の周囲温度及び相対湿度の両方を測定し、露点温度を連続的に計算する露点センサによって提供することができ、それは制御ソフトウェアを介してペルチェ・コントローラにフィードバックされる。
【００８４】
本発明による方法において、支持構造体２０の温度は、制御されたやり方で試料薄膜を部分的に蒸発させるために温度制御ステージ１を用いて露点温度よりも上に設定される。蒸発中、試料層の膜厚は、光源１３及び光検出器１４を用いて監視することができ、したがって、試料ガラス化を指定の膜厚において作動させることができる。
【００８５】
以下において、移送機構６０の機能を詳細に記述する。
【００８６】
システム／移送機構６０は、例えば、３０ｍｍハブを有するソレノイド８と、ピンセット２がスイッチに当たっているとき閉じており、それにより、ソレノイド８が作動し、支持構造体２０が容器１２に含まれる寒剤８０中に下方移動する、二次電気回路１０とをさらに備える。
【００８７】
支持構造体２０は、アダプタ３の小さなピンセット２によって保持される。ピンセット２は、例えば、２つのねじによって前記第１のアダプタ３にしっかりと装着される。例えば、第３のねじにより、ピンセット２の開閉が、それらに圧力を印加することによって可能になる。この第１のアダプタ３の後端は、永久磁石、詳細には挿入されたネオジウム磁石を有する。
【００８８】
支持構造体２０、ピンセット２、及び第１のアダプタ３は、組立品を形成する。この組立品は、例えば、ピンセット２に接触している前記電磁石５０の形態の保持手段５０によって水平位置に保持される。電磁石５０自体は、支持構造体／グリッド２０を温度制御ステージ１と位置合せするために、すべての次元において手動位置合せを可能にする前記調整手段５に装着され、その場合、グリッド２０は、良好な熱的接触及び効果的な試料堆積のために平らにならなければならない。
【００８９】
例えば、複数の電動リニア・ステージの組合せを備える並進ステージ組立品６は、温度制御ステージ１上の支持構造体２０の表面よりも上の微小毛細管先端１１の精密な位置決めを可能にする。分配ヘッド１１及びグリッド２０の表面は、試料を分配ヘッド１１から支持構造体（例えば、グリッド）２０に移送するために近接される。
【００９０】
詳細には、調整手段５は、温度制御ステージ１上に装着されるが、分配ヘッド１１は、図１に示さない適切な保持手段によって保持することができる分配ヘッド１１に対して温度制御ステージ１がステージ組立品６によって移動させることができるように、温度制御ステージ１に接続されない。詳細には、前記微小毛細管先端（分配ヘッド）１１は、支持構造体２０に対して微小毛細管の垂直位置の調整を可能にする、別個のＺ軸ステージ上に装着される。詳細には、ステージ組立品６は、温度制御ステージをＸＹ平面において自動的に移動させることを可能にし、ＸＹ平面に沿ってステージ６が延びる。
【００９１】
前記試料移送は、試料の物理的及び化学的特性により多くのやり方で実施することができる。（ｉ）表面張力効果による支持構造体２０（例えば、ＥＭグリッド）上へのナノリットル容量の液滴の直接堆積及びその後の拡散、（ｉｉ）支持構造体２０（例えば、ＥＭグリッド）上へのナノリットル容量の液滴の堆積、それに続く最初に堆積した容量よりも小さい容量を有する試料の再吸引、（ｉｉｉ）支持構造体２０（例えば、ＥＭグリッド）上へのナノリットル容量の液滴の堆積、それに続くＥＭグリッドと微小毛細管先端１１との間の相対運動、その間支持構造体２０（例えば、ＥＭグリッド）上の堆積した試料を拡散させるために２つの間に液体架橋が依然として確立されている。（ｉｖ）支持構造体２０上の堆積した試料を拡散させるために堆積中に支持構造体２０（例えば、ＥＭグリッド）及び微小毛細管先端１１の相対運動と組み合わせた支持構造体２０（例えば、ＥＭグリッド）上へのナノリットル容量の液滴の堆積。
【００９２】
移送機構（受け渡し機構）６０は、一方の端部において挿入された永久磁石、詳細にはネオジウム磁石も有し、他方の端部において回転ヒンジ６１を介して大きなソレノイド６と接続される第２のアダプタ７を備える。この第２のアダプタ７を水平位置に維持するために、第３の永久磁石、詳細にはネオジウム磁石が、それに応じて配置される。第１及び第２のアダプタ３、７は、小さなギャップＧによって分離される。２つの挿入磁石は、互いに引き合うが、しかし、２つの結合は、組立品２０、２、３（例えば、ピンセット２）をしっかり保持する電磁石５０によって妨げられる。
【００９３】
試料堆積後、超低温液体８０、通常、エタン又はエタン／プロパン（４０／６０）の混合物中への支持構造体（例えば、ＥＭグリッド）２０の急速注入が、支持構造体２０上の試料薄膜の所望の厚さにおいて行われなければならない。これは、光検出器１４によって測定された、支持構造体２０によって透過された光の指定の光強度値における制御デバイス３０からの制御信号を用いて電磁石５０をオフにすることによって実施される。
【００９４】
電磁石５０をオフにすることにより、２つのアダプタ３、７が、互いにかみ合い、新たな、より重い組立品を形成することが可能になる。この新たな組立品は、あまりに重すぎて、第３の永久（例えば、ネオジウム）磁石によって元の位置に保持されない。組立品は垂直位置（第２のアダプタ７の反対側のヒンジ６１）に素早くはまる。組立品が垂直位置に達した場合、それは、前後に跳ねるのを防止するために別の磁石によって所定位置に保持される。同時に、電気回路が、落下する組立品（例えば、スイッチ）の金属部分を通して閉じる。これにより、ソレノイド・コントローラを制御する二次電気回路１０が作動する。結果として、ソレノイド８が始動され、３０ｍｍハブが下方に発射され、最後に支持構造体（例えば、ＥＭグリッド）２０を容器１２内の寒剤８０中に注入する。ソレノイド８をオンにすることから支持構造体２０が寒剤８０中に発射されるまでのプロセス全体は、第２の時間の３分の１以内に行われ、堆積した液体薄膜のガラス化が可能になる。
【００９５】
図２は、本発明によるシステム及び方法の動作原理を示す。図２Ａに示すように、標準穴あきカーボン薄膜ＥＭグリッド（支持構造体）２０が、ピンセット２の先端の間に装着され、温度制御ステージ１（露点ステージとも称する）におけるスロットに平ら（水平）に位置決めされる。ステージ温度は、露点温度に近接して設定され、ＰＩＤペルチェ・コントローラを使用して調節することができる。ＥＭグリッド２０は、ステージ１と良好な熱的接触をしている。露点ステージ１は、電動ｘｙ軸に装着されて、微小毛細管（分配ヘッド）１１に対してグリッド２０を移動させ、それは、グリッド２０よりも数マイクロメートル上まで下げることができる。この微小毛細管１１は、数ナノリットルの試料を堆積させるが、ステージ１は、波状パターンで移動しており、約０．５ｍｍ２の面積に及ぶ。
【００９６】
図２Ｂに示すように、試料堆積後、微小毛細管１１は引き込まれ、ステージ１は、ＩＲレーザ（光源）１３（λ＝７８０ｎｍ）とフォトダイオード（光検出器）１４との間でグリッド２０を位置決めするように移動する。グリッド上の薄い水性試料薄膜からの光散乱及び干渉効果は、水分が蒸発するにつれて変化する（図３及び８参照）。
【００９７】
図２Ｃに示すように、フォトダイオード１４の信号が定義された閾値レベルに達したとき、作動により、プランジ凍結が自動的に開始する。ピンセット２及びグリッド２０は、９０度だけ垂直位置にはじかれ、寒剤８中に突入されて、ステージ１から急速に引き込まれる。このピック・アンド・プランジ・プロセス全体は数百ミリ秒かかる。
【００９８】
図３は、ガラス質氷層の厚さを制御するための試料からの水分蒸発の実時間監視データを示す。７８０ｎｍレーザの透過光は、水−層の厚さの変化を登録するのに使用される（図２Ｂ参照）。紫色（静止）線は、乾性グリッド（ドライ信号）を用いて得た信号である。赤色線は、水分蒸発中の試料堆積後に記録されたセンサ信号である（ステージ温度は露点よりも２°Ｃ高い）。経験的に、センサ信号がドライ信号の約９５％（青色線）であるとき、有効なグリッドが得られることが分かった。ピック・アンド・プランジ機構は、この閾値に達したとき（矢印で示す）作動され、クライオ・グリッドの急速なガラス化（数百ミリ秒以内）及び光レーザ経路からグリッドが取り除かれたときの信号の急増をもたらす。図表は試料が蒸発するのに伴う時間に対する信号の特徴的な進展を示していることに留意されたい。このグラフは、露点からの小さなオフセット（２°Ｃ）において長時間にわたって蒸発する大きな容量（２０ｎＬ）を示すので、明確にするために選択された。実際には、より少ない試料が堆積し（又はあらかじめ再吸引され）、最後の数秒の図表しか記録することができない。
【００９９】
図４は、本発明によるシステム及び方法を使用するクライオ・グリッド調製の概念実証データを示す（堆積プロトコル１、以下の実例参照）。２０ｎＬの全試料容量がＱｕａｎｔｉｆｏｉｌ  Ｃｕ  ２００メッシュＲ２／１グリッドに適用された。過剰液体は、可能な限り多くの試料を回収するために再吸引された。露点ステージ温度は、常に露点よりも８°Ｃ上であり、それは結果として急速な試料薄化となった。グリッド・ピック・アンド・プランジ機構は、過剰試料の再吸引直後に自動的に作動された。
【０１００】
図４Ａは、ガラス質の氷の薄い薄膜を示す調製グリッドの典型的な概観を示す。黄色の矢印は、試料の境界を示す。差し込み図：可視性を改善するための、コントラスト調整後の境界領域の４倍拡大。ガラス質試料の均質層に留意されたい。スケール・バー：１００μｍ。
【０１０１】
図４Ｂは、穴部における均質試料層を示すより高倍率の概観画像を示す。スケール・バー：２μｍ。
【０１０２】
図４Ｃは、この方法によって調製され、高倍率で、及びコントラストを上げるために焦点をぼかして撮像された、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中のアポフェリチン粒子及びバクテリオファージを示す。差し込み図：バクテリオファージ・テール及び少数の環形状アポフェリチン複合体を示す指示領域の２倍拡大。スケール・バー：８０ｎｍ。
【０１０３】
図５は、本発明によるシステムを使用するクライオ・グリッド調製の概念実証データ及び堆積プロトコル２を示す（以下の実例参照）。それぞれの場合において、３ｎＬ試料容量がグリッドに直接適用された。試料は再吸引されなかった。グリッドは、制御水分蒸発による試料薄化後にガラス化された。
【０１０４】
図５Ａは、Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ  Ｃｕ  ４００メッシュＲ２／２グリッドの中央の３ｎＬ試料容量（ＰＢＳ緩衝液中のウレアーゼ）の概観画像を示す。図４に関しては、層厚さは、ある領域において勾配を有することに留意されたい。ガラス質の氷の周辺は黄色の矢印で示す。スケール・バー：１００μｍ。
【０１０５】
図５Ｂは、アンフィポールで再構成された繊細な２００ｋＤａ膜たんぱく質の画像を示す。差し込み図：たんぱく粒子を明確に示す指示領域の２倍拡大。スケール・バー：８０ｎｍ。
【０１０６】
図５Ｃは、単一付着真核細胞からの溶解物の無損失クライオ・グリッド調製の実例を示す。機能性ＩＴＯ光学顕微鏡スライド上で成長する個々のＨＥＫ細胞がエレクトロポレーションによって溶解され、３ｎＬの全容量が迅速に吸引された。その後、溶解物は、プロトコル２を使用してグリッド上で分配され、ガラス化された。スケール・バー：８０ｎｍ。
【０１０７】
図６は、高分解能構造分析の試料を調製するための本発明によるシステムの使用を示す。ＰＢＳ緩衝液中の２０ｎＬ容量のウレアーゼが、堆積プロトコル１を使用してＱｕａｎｔｉｆｏｉｌ  Ｃｕ  ２００メッシュＲ１．２／１．３グリッド上に堆積された（以下の実例参照）。
【０１０８】
図６Ａは、ガラス質の氷に埋め込まれたウレアーゼ粒子の、ドリフト補正されたクライオＥＭ画像を示す。差し込み図：高コントラストによる粒子。スケール・バー、５０ｎｍ。
【０１０９】
図６Ｂは、最初に選択された１０，０００粒子のうちの〜３，４００を含む２Ｄクラス平均を示す。スケール・バー、５ｎｍ。
【０１１０】
図６Ｃは、さらに処理するために識別された８７００粒子のうちの〜５，３７０を含む３Ｄクラス平均を示す。スケール・バー、５ｎｍ。
【０１１１】
図６Ｄは、３回軸に対して垂直に見た、５．０３Å分解能におけるウレアーゼ密度地図を示す。組み込まれたＸ線モデルのバックボーンを示す（ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ４ｚ４２／ｐｄｂ）。
【０１１２】
図７は、液体処理制御プラグイン（右上）、試料堆積中の微小毛細管及びＥＭグリッドの監視カメラ写真（右下）、及び自動化のためのマクロパネル（左）を示す制御ソフトウェアのスクリーンショットを示す。
【０１１３】
図８Ａは、２３°Ｃの室温における８つの異なる部屋のｒＨに対して作図された、露点ステージ（ＤＰステージ：ｄｅｗ  ｐｏｉｎｔ  ｓｔａｇｅ）温度対ステージ／グリッド微環境の相対湿度（ｒＨ：ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｕｍｉｄｉｔｙ）のデータを示す。露点温度からの小さな正のオフセット（例えば、＋２°Ｃ）に対して、図表は、ほぼ直線であり、すべての８つのシナリオに対して同様の傾きを有する。
【０１１４】
図８Ｂは、２３°Ｃにおける部屋のｒＨに対する、３つの異なるｒＨ微環境をＤＰステージ上に作り出す必要がある露点温度からのオフセットの依存関係を示す。９０％ｒＨ微環境をＤＰステージ上に作り出す必要があるオフセットは、部屋のｒＨが２０％〜９０％変化したとき、０．３度未満だけ変動する。
【０１１５】
図８Ｃは、水の層に対して垂直に入射する理想的なコヒーレント青色（４０５ｎｍ）又は赤外（７８０ｎｍ）レーザ光の透過率の簡単なシミュレーションを示す。透過率は、水層の厚さに対して作図される（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｍａｃｌｅｏｄソフトウェア、Ｔｈｉｎ  Ｆｉｌｍ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）。
【０１１６】
図８Ｄは、赤外（赤色線、λ＝７８０ｎｍ）又は青色レーザ（青色線、λ＝４０５ｎｍ）を用いて測定された、グロー放電されたＥＭグリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ  Ｃｕ  ２００メッシュ、Ｒ２／１）上に堆積した２０ｎｌのウォーター・スポットの完全蒸発に対する正規化振幅対時間データを示す。グリッドは、露点よりも３°Ｃ上に維持された。いくつかの独立した実験が、両方の波長に対して異なるグリッド上で実行され（ｎ＝５、点線）、平均結果が計算された（実線）。干渉パターンの明瞭度は、（ｉ）使用されたレーザ・ダイオードの好ましくないコヒーレンス長、（ｉｉ）グリッドに対するレーザの不正確な傾斜配置、及び（ｉｉｉ）照射領域上の不均一な膜厚により、悪化することに留意されたい。
【０１１７】
図９は、過剰な水が試料薄化中に蒸発したときに起こる塩効果の実演を示す。０．１％のデシル−３−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭ）を含むＰＢＳ中のタバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ：Ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）試料が、本発明によるシステム及び堆積プロトコル２を使用してクライオＥＭ用に調製された（以下の実例参照）。
【０１１８】
図９Ａは間違った試料薄化を示し、過剰な試料がグリッド上に残され、及び／又は薄化の前に十分に広く拡散しなかった。結果として、小さな塩結晶（高コントラスト）が背景に見え、ＴＭＶの反復構造の分解能が減少している。
【０１１９】
図９Ｂは、正しい試料薄化を示す。ＴＭＶの２３Å反復が、生の画像に明確に見え、ガラス化した氷の背景は、低コントラストを有する。図９Ａ及び図９Ｂの差し込み図：指示領域の２倍拡大。スケール・バー：８０ｎｍ。
【０１２０】
図１０は、アンフィポールで再構成された２００ｋＤａ膜たんぱく質の電子顕微鏡写真を示す。試料は、異なるやり方で顕微鏡使用のために調製された。クライオＥＭグリッドは、同じ日に調製された。５μＭのアジ化ナトリウムを用いて補完されたＨＥＰＥＳ緩衝液中の再構成たんぱく質の同じ試料ストックが全体を通して使用された。
【０１２１】
図１０Ａは、ネガティブ染色されたグリッド（２％酢酸ウラニル）の電子顕微鏡写真を示す。
【０１２２】
図１０Ｂは、代表的なＶｉｔｒｏｂｏｔ  ｐｌｕｎｇｅ−ｆｒｅｅｚｅｒを使用して調製されたクライオＥＭグリッドからの電子顕微鏡写真を示す。Ｖｉｔｒｏｂｏｔに使用されたプロトコルは以下の通りであった：３００メッシュのレース状銅製グリッドが６０秒間グロー放電され、液体エタンにおけるプランジ凍結のためにＶｉｔｒｏｂｏｔに供給された。装荷されたたんぱく質試料の量、２．５μＬ；待機時間、５秒；ブロッティング力、１；ブロッティング時間、３秒；ブロッティング・ペーパー、Ｗｈａｔｍａｎ  ＃１  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ；湿度１００％、チャンバは１０°Ｃで平衡化。
【０１２３】
図１０Ｃは、本発明によるデバイスを使用して調製されたクライオ・グリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ  ２００メッシュ、Ｒ２／２）からの電子顕微鏡写真を示す（プロトコル２、以下の実例参照）。３ｎＬ試料容量。差し込み図：指示領域の２倍拡大。スケール・バー：８０ｎｍ。
【０１２４】
図１１は、プロトコル２を用いて堆積させた単一細胞溶解物の電子顕微鏡写真を示す（以下の実例参照）。
【０１２５】
図１１Ａは、連続カーボンの追加の層を有する穴あきカーボン・グリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ  ２００メッシュＲ２／２）からの電子顕微鏡写真を示す。連続カーボン層のわずかなしわ及びそれ以外の場合の均質氷層に留意されたい。
【０１２６】
図１１Ｂは、連続カーボン薄膜なしの穴あきカーボン・グリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ  ２００メッシュＲ２／１）からの電子顕微鏡写真を示す。穴部内の勾配に留意されたい。差し込み図は、単一細胞試料に見出される典型的な膜パッチを示す。スケール・バーは、概観には２μｍ及び差し込み図には８０ｎｍを表す。
【０１２７】
図１２は、ウレアーゼ地図の最終仕上げ後の補正されたフーリエ・シェル相関（ＦＳＣ）曲線を示す。「至適基準」によれば、ＦＳＣ＝０．１４３である周波数は、３Ｄ再構成の分解能を示す。ここで、対応する空間周波数は、０．１９９Ａ−１であり、５．０３Ａの予測分解能を得る。
【０１２８】
図１３は、試料膜厚を測定するための設定の概略を示し、それは、本発明による、支持構造体２０上の試料を調製するためのシステム１００の一部である。設定は、第１の波長の第１の光ビームＬ１を光経路Ｌに沿って支持構造体２０上に放射するように構成される第１の光源１３ａと、光経路Ｌに対して垂直の第２の波長の第２の光ビームＬ２を放射するように構成される第２の光源１３ｂとを備える。
【０１２９】
具体的には、第１の波長及び第２の波長は、３００ｎｍから４００ｎｍの距離を有する。例えば、第１の光ビームＬ１は、７８０ｎｍの波長の光を含むことができ、第２の光ビームは、４０５ｎｍの波長の光を含むことができる。
【０１３０】
第１の光ビームＬ１及び第２の光ビームＬ２は、第１の光ビームＬ１が第１のダイクロイック・ミラー１５ａを通過するように構成される第１のダイクロイック・ミラー１５ａに向けられ、第２の光ビームＬ２は、第１のダイクロイック・ミラー１５ａによって反射される。第１の光ビームＬ１及び第２の光ビームＬ２は、第１のダイクロイック・ミラー１５ａを用いて統合され、詳細には支持構造体２０の表面に対して垂直である光経路Ｌに沿って、支持構造体２０に向けられる。少なくとも統合された光ビームの一部は、試料を含む支持構造体２０によって透過され、透過光ビームＴが、発生される。
【０１３１】
例えば、第１の光ビームＬ１は、第２の光ビームＬ２よりも長い波長の光を含むことができ、第１のダイクロイック・ミラー１５ａは、第１の光ビームＬ１の光を通過させるように適合されたロング・パス・ダイクロイック・ミラー（ロング・パス・フィルタとして働く）でもよく、第２の光ビームＬ２の光は、通過することが可能ではないが、第１のダイクロイック・ミラー１５ａによって反射される。代替案として、第１の光ビームＬ１が、第２の光ビームＬ２よりも短い波長の光を含む場合、第１のダイクロイック・ミラー１５ａは、ショート・パス・ダイクロイック・ミラー（ショート・パス・フィルタとして働く）でもよい。
【０１３２】
設定は、透過光ビームＴを第１の透過光ビームＴ１と第２の透過光ビームＴ２とに分割するように適合される第２のダイクロイック・ミラー１５ｂをさらに備える。第２のダイクロイック・ミラー１５ｂは、第１の透過光ビームＴ１の光を通過させ、第２の透過光ビームＴ２を反射し、したがって、第１の透過光ビームＴ１が第１の光検出器１４ａに向けられ、第２の透過光ビームＴ２が第２の光検出器１４ｂに向けられるように構成される。第１の光検出器１４ａは、第１の開口部１６ａを用いて入射光から保護され、第２の光検出器１４ｂは、第２の開口部１６ｂを用いて入射光から保護される。
【０１３３】
第１のダイクロイック・ミラー１５ａと同様に、第２のダイクロイック・ミラー１５ｂは、ロング・パス・ダイクロイック・ミラー又はショート・パス・ダイクロイック・ミラーでもよい。
【０１３４】
第１及び第２の光検出器１４ａ、１４ｂは、検出された光（それぞれ、第１又は第２の透過光ビームＴ１、Ｔ２）の強度による信号を発生するように適合される。第１及び第２の光ビームＬ１、Ｌ２が別々の波長の光を含むとき、支持構造体２０上の試料薄膜の厚さは、第１及び第２の光検出器１４ａ、１４ｂによって発生された２つの信号を用いて決定することができる。
【０１３５】
本発明は、以下の実例によってさらに説明する。
【０１３６】
実例−ナノリットル・サイズのたんぱく質試料及び単一細胞抽出液からのブロッティング・フリー及び無損失クライオ電子顕微鏡法グリッド調製
材料及び方法
ここに提示する器具は、本明細書において説明されているか、又は前に公表されたものである（非特許文献１４；非特許文献１５）。図１は、パーツ・リスト及び方法の詳細を含めて、設定の詳細な説明を提供する。図７は、制御ソフトウェアを示す。
【０１３７】
化学薬品及び緩衝液
すべての化学薬品は、特に他の指示がない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄに発注された。以下の緩衝液が使用された。ＰＢＳ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３６．９ｍＭ  ＮａＣｌ、８．９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ  ７．４；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．４）；ＨＥＰＥＳ緩衝液、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ８．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ。
【０１３８】
試験試料
試験試料は、（ｉ）０．１％デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭ、Ａｎａｔｒａｃｅ）を含むＰＢＳ中のタバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）、（ｉｉ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の大腸菌（ｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＣＢＡ１２０）に対してアポフェリチン及びファージを含む混合物、及び（ｉｉｉ）アンフィポールで再構成された、精製２００ｋＤａ膜たんぱく質（名称開示せず）であった。この場合、バルク膜たんぱく質試料が、５μＭアジ化ナトリウムで補完されたＨＥＰＥＳ緩衝液により平衡化されたＳ２００  １０／３００ＧＬサイズ排除クロマトグラフィ・カラムに適用された。大きなＡ２８０ピークの中心に対応する単一３００μｌ部分が、ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒを使用することによって、及びＶｉｔｒｏｂｏｔ  ｐｌｕｎｇｅ−ｆｒｅｅｚｅｒ（ＦＥＩ）を使用することによってクライオ・グリッドを調製するのに使用された。この部分のたんぱく濃度は、ＵＶ−Ｖｉｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を使用して、及びＡｂｓ（０．１％）＝１と仮定して吸光測定によって決定されたとき、０．３５  ｍｇ／ｍＬであった。（ｉｖ）ＰＢＳ緩衝液中の０．３５ｍｇ／ｍｌの濃度におけるエルシニア・エンテロコリチカ・バクテリアからのウレアーゼ。
【０１３９】
ＥＭグリッド
穴あきカーボン薄膜を有する２００メッシュ銅製グリッド（Ｒ２／２、Ｒ２／１、及びＲ１．２／１．３、Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、並びに連続カーボンの追加の層を有する穴あきカーボン・グリッド、及びレース状カーボン・グリッドなどの様々なＥＭグリッドが、ＣｒｙｏＷｒｉｔｅｒを用いて使用された。ＥＭグリッドは、使用直前に空気プラズマにおいて３０秒間グロー放電された。グリッドの平坦性は、グリッドが温度制御された露点ステージ（ＤＰステージ）上にあるとき、機械的書込みステップ及び効率的な熱伝達の両方にとって重要な態様であることに留意されたい。
【０１４０】
クライオ・グリッド調製
ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒの設定に使用された２つの堆積プロトコルは、以下の節及び図１に詳述する。
【０１４１】
電子顕微鏡法及び単一粒子分析
特に指定しない限り、試験試料を有するＥＭグリッドが、Ｇａｔａｎ−６２６クライオ・ホルダに配置され、２００ｋＶで動作させた、ＴＶＩＰＳ  Ｆ４１６  ４ｋ  ＣＭＯＳカメラ（ＴＶＩＰＳ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を装備するＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ２００（ＦＥＧ）ＴＥＭで撮像された。
【０１４２】
単一粒子分析用のウレアーゼの画像が、３００ｋＶで動作させた、Ｇａｔａｎ  Ｑｕａｎｔｕｍ−ＬＳ（２０ｅＶのゼロ損失スリット幅）及びＧａｔａｎ  Ｋ２  Ｓｕｍｍｉｔ  ＤＥＤを装備する、ＦＥＩ  Ｔｉｔａｎ  Ｋｒｉｏｓを使用して取得された。低線量条件が、動画モードで得た大量４０の画像に対して５−６  ｅ７ｐｈｙｓｉｃａｌ−ｐｉｘｅｌ／ｓｅｃの線量率において−５０  ｅ−／Ａ２総電子線量を用いて適用された。ドリフト及びコントラスト伝達関数（ＣＴＦ）補正が、ＣＴＦＦＩＮＤ４を使用して（非特許文献１６）、Ｚｏｒｒｏソフトウェアを用いてウレアーゼ・データに適用された（非特許文献１７）。ほぼ１０，０００の粒子が、ＥＭＡＮ２を使用して記録された５１の顕微鏡写真から手動で選択され（非特許文献１８）、その後、ＲＥＬＩＯＮ−１．４において処理された（非特許文献１９）。粒子配列後、およそ８７００の粒子が、その後３Ｄ分類に使用された、良好な２Ｄクラス平均を生じた。２つの最良３Ｄクラス（〜７，８００の粒子を含む）が選択され、反復して改善された。次いで、地図の最終仕上げが、実施され、ウレアーゼ複合体の最終３Ｄ再構成を生じた。原子モデル（ＰＤＢ：１０．２２１０／ｐｄｂ４ｚ４２／ｐｄｂ）が、ＵＣＳＦキメラ・ソフトウェアを使用して３Ｄ地図に組み込まれた（非特許文献２０）。
【０１４３】
結果
原理及び設定
ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒ（本発明によるシステム）の設定及び方法の原理を図２に示す。さらなる詳細は、図１及び７に見出すことができる。ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒは、ネガティブ染色及びトレハロース包埋用のナノリットル容量の試料調整及びＥＭグリッド調製のために前に開発された液体処理及び移送システムに統合される（非特許文献１４）。方法は、微小毛細管による液体吸収及び分配を制御する高精度ピペット操作システム、ＥＭグリッドの環境を制御する温度制御された露点ステージ（ＤＰステージ）、試料層の厚さを制御する実時間監視システム、及び試料ガラス化用のピック・アンド・プランジ機構を使用する。設定自体は、湿度制御環境に含まれない。プロセス全体は、ＬａｂＶＩＥＷ（非特許文献２１）において開発されたｏｐｅｎＢＥＢ（Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Muller, S.a., Goldie, K.N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T., 2014. openBEB: open）プラグインによって制御され、マクロを使用して自動化することができる（図７参照）。
【０１４４】
クライオ・グリッド調製の設定及び基本手順（図２）は、以下の通りである。（ｉ）グリッド冷却：ピンセットによって保持された、グロー放電された標準穴あきカーボン薄膜ＴＥＭグリッドが、低温ＤＰステージ上に位置決めされる。（ｉｉ）試料吸収；微小毛細管及び高精度ポンプ・システムが、前に説明したように、電解直後に単一細胞の試料ストック又は溶解物から液体プラグを吸引するのに使用される（非特許文献１４；非特許文献１５）。
【０１４５】
（ｉｉｉ）試料堆積（図２Ａ）、微小毛細管先端が、グリッド表面に近接される。次いで、試料が、微小毛細管から分配されて、微小毛細管先端とＥＭグリッドの親水性（グロー放電された）穴あきカーボン表面との間のギャップにわたる小さな液滴を形成する。同時に、グリッドは、正弦波又は円形パターンにおけるノズルに対して移動される。液体試料は、カーボン薄膜の穴部を埋める表面上に拡散される。（ｉｖ）制御水分蒸発による試料安定化及び薄化（図２Ｂ及び以下の専用の節）；ＤＰステージの温度は、全体を通して、ＥＭグリッド及び懸濁した試料の両方を部屋の露点温度に近接した指定の温度に維持するように設定される。グリッドは、直ちにはガラス化されないが、短時間（選択されたオフセット温度により、＜１から１０秒の間）ステージ上に維持することができ、したがって、ある量の試料水は蒸発できることに留意されたい。グリッド及び適用された水性試料と７８０ｎｍレーザ・ビームとの相互作用による干渉／散乱効果は、蒸発を監視するのに使用することができる（図３）。いくらかの水の制御損失は、薄い水薄膜がカーボン層の穴部にわたることを確実にするために重要である。（ｉｖ）クライオ・グリッド・ピック・アンド・プランジ凍結（図２Ｃ）；機構は、ガラス化のために、監視システムによって作動され、又はあらかじめ設定された時間の後に、グリッド（及びピンセット先端）を液体エタン／プロパン（４０：６０）槽内に急速に突入させる（非特許文献２２）（図１も参照）。
【０１４６】
２つの堆積プロトコルは、実験及び試料により、この基本手順に使用することができる。プロトコル１において、相対的に大きな容量（２０ｎＬ）が、グリッド上に堆積し、過剰試料が、取り除かれ、分配微小毛細管を用いて再吸引によって回収される。このプロトコルは、単一粒子分析及び高分解能構造決定に対する精製たんぱく質複合体の大きなＥＭ撮像領域の調製に理想的である。プロトコル２において、〜３ｎＬの容量の試料が、直接グリッド上に堆積し、再吸引ステップの必要を回避する。このプロトコルは、微小量、例えば、単一細胞視覚プロテオミクスに制限される適用例により適切である（非特許文献１４；非特許文献２３；非特許文献１１）。
【０１４７】
これらのプロトコルを以下に詳細に説明する。
【０１４８】
プロトコル１：過剰試料の回収を有する堆積
微小毛細管及び高精度ポンプ・システムは、数十ナノリットルを試料ストックから吸引するのに使用される。次いで、微小毛細管先端が、グロー放電されたグリッド表面まで下げられ（分離−１０μｍ）、試料の２０ｎＬ滴下がそれから分配される。滴下は、微小毛細管先端とＥＭグリッドとの間のギャップにわたり、微小毛細管に対してグリッドを移動させることによって−０．５ｍｍ２の面積を覆うようにさらに拡散させることができる（図２Ａ）。その後、微小毛細管先端は、この面積内のグリッド表面に接触するまで下げられ、可能な限り多くの過剰試料を再吸引し、これを今後の使用のために再回収する。ＤＰステージ（及びグリッド）の温度は、これらのステップのすべてに対して部屋の露点温度よりも上に維持されて、最小量の水分が蒸発することを可能にする。過剰試料の再吸引直後のプランジ凍結と組み合わされた露点から＋８°Ｃだけの温度オフセットは、典型的には、結果として高分解能構造分析のための良好な試料厚さとなる。より精度が必要な場合、試料薄膜の厚さは、以下に説明する実時間監視システムを使用して、制御水分蒸発によって最適化することができる。試料薄化プロセスのより広範な説明は、専用の節に見出すことができる。
【０１４９】
プロトコル２：再吸引なしの直接試料堆積
このプロトコルにより、〜３ｎＬの試料が、グリッド上に直接堆積し、試料の再吸引を回避する。グリッド温度は、水分蒸発を回避するために露点に維持され、わずかな試料液滴が、ほぼ０．５ｍｍ２の面積を覆う正弦波又は円形パターンで微小毛細管先端の下のＥＭグリッドを移動させることによって拡散される。その後、試料薄化ステップは、プランジ凍結の前に、制御水分蒸発によって実施されなければならない。蒸発は、ＤＰステージ温度を部屋の露点よりもわずかに上の値（例えば、＋２°Ｃ）まで増加させることによって誘導される。これらの小さな容量を用いて再現可能な結果を得るために、試料薄化プロセスは、監視システムによって監視されなければならない（専用の節参照）。
【０１５０】
制御水分蒸発による試料安定化及び薄化
表面張力効果により、極めて小さな試料アリコートでも、グリッドをクライオＥＭに使用可能にするために薄化しなければならない。最近、インクジェット・スポッティングと組み合わせた「自己ブロッティング」グリッドを使用する興味ある方法が示された（非特許文献１３）。
【０１５１】
ここで、薄い試料層を作り出すための試料水の制御蒸発に基づく方法を提案する。試料膜厚は、ＤＰステージの温度を調整することによって調節することができ、ピック・アンド・プランジ凍結前の時間帯が開始される。試料は水分蒸発によってわずかに濃縮される。これは、たんぱく質には望ましい可能性があるが、塩濃度も増加し、それにより、たんぱく質複合体が潜在的に害を受けることがある。したがって、このような薄化は、すでに薄い試料薄膜に限定され、堆積プロトコル１によって調製された試料の再吸引を絶対不可欠にする。必要に応じ、ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒを支持する液体処理及び移送システムにより、クライオ・グリッド調製前に、試料調整、例えば、拡散駆動プロセスによる塩交換が可能となることに留意されたい（非特許文献１４）。
【０１５２】
ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒ設定は、実時間におけるグリッドからの試料液体の蒸発を追跡するためにレーザ・ダイオード（７８０ｎｍ、図２Ｂ）と光検出器とを含む。７８０ｎｍの波長において、光は、水又は生物材料によって顕著に吸収されず、試料中への伝熱の量を無視できるほどにする（非特許文献２４）。それにもかかわらず、蒸発による水の膜厚の変化は、光検出器によって記録された信号の振幅に対する検出可能な効果を有する。光散乱の変化の他に、透過光信号は、薄い薄膜の表面において反射された光波の間の干渉によっても影響される（図３）。水分が蒸発するにつれて、信号はほぼ直線的に増加し、ついには特定の層厚さに達し、そこで信号は急激に増加し始める。この正のピークを波長λ＝７８０ｎｍ及びｎ７８ｏ＝１−３２９に対する層厚さｄ−Ａ／（２ｎ）におけるほとんど垂直のビームの建設的干渉に起因すると考える（非特許文献２５）。相殺的干渉から予測されるように、負のピークが正のピークにすぐ続く。放射ピークが７８０ｎｍにおける代わりに４０５ｎｍあたりにおけるレーザ・ダイオードが、観察された信号挙動（図３）が主に干渉効果によることを確認するのに使用された。乾性グリッドを用いて得た絶対信号に対する特定のユーザ定義された信号の閾値（説明については図３参照）に達すると、ピック・アンド・プランジ機構が監視システムによって作動され、それにより、クライオ・グリッドが急速にガラス化される。
【０１５３】
「ドライ信号」はグリッド・タイプ及びメッシュ・サイズに依存することに留意されたい。差が顕著であるとき、常に「空」測定を試料堆積前に行う必要がある（図３）。対照的に、信号は、特定のグリッド・タイプ／メッシュ上に堆積した試料のタイプに依存せず、緩衝液だけ（試料なし）を使用してスクリーニング・ランを実施して、実験にとって理想的な凍結状態を決定することを可能にする。
【０１５４】
異なる試料からの概念実証クライオ・グリッド調製
この及び以下の節における実例は、単一粒子分析（以下に示す）又はヘリカル分析による構造決定、及び単一細胞視覚プロテオミクスなどの様々な目的にｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒ設定を使用して、異なる生体試料（例えば、可溶性又は膜たんぱく質粒子、糸状体、ウイルス、細胞溶解物）の高品質クライオ・グリッドを調製することができることを示す（非特許文献２３）。実際には、特定の試料に使用される堆積プロトコルの選択は、その特性及び実験の目的による。方法は、採用される緩衝液システムに対して感受性がない。
【０１５５】
グロー放電された穴あきカーボン薄膜上に２０ｎＬの試料容量を拡散させるためのｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒ及び堆積プロトコル１の使用は、図４に示す。すべての調製ステップに対して、ＤＰステージ温度は、露点よりも８°Ｃ上に維持された。その後、過剰試料が再吸引され、試料薄化がプランジ凍結前１秒の間実施された。図４Ａによって文書化されているように、再吸引後に残った試料は、クライオ・グリッドの一部を覆う均質ガラス質氷層を形成した。領域の周辺は見ることができ、矢印で示す。層の均質性は図４Ｂによって確認され、それは、試料層がカーボン支持体の穴部にわたることを示す、より高倍率における穴あきカーボン薄膜を示す。図４Ｃは、この方法によって調製されたアポフェリチン粒子（環状外観）及びバクテリオファージの高品質を示す。バクテリオファージ・テールの構造を示す（差し込み図）。結晶性氷構造の不在は、グリッドが実際にガラス化したことを示すことに留意されたい。他の実例は単一粒子処理節に示す。
【０１５６】
３ｎＬの試料をグロー放電された穴あきカーボン薄膜上に配分するためのｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒ及び堆積プロトコル２の使用を図５に示す。試料薄化が、上記の専用の節に詳述したように、監視された水分蒸発によって実施された。図５Ａは、典型的なグリッドの概観を示す。ガラス質試料によって覆われた面積は、一般に、堆積プロトコル１が使用されたときに覆われた面積よりも小さい。さらに、ガラス化試料層の厚さは、（図５Ａと図４Ａ及びＢとを比較して）それほど均質ではない。プロトコル２によって堆積したパターン化液体領域が親水性グリッド上に拡散したが、厚さ勾配は、表面張力により、及びぬれ面積の周辺において水分がより早く蒸発するので、依然としてそのままである。試料領域の中心における、より低い蒸発率は、恐らく、液滴周辺における、より大きな表面／容量比の結果、蒸発した水分によりグリッドよりも上の一時的により高い湿度、及び液滴中心におけるグリッドからの熱流によってあまり効率的に補償されない蒸発プロセスの冷却効果である。
【０１５７】
プロトコル２が穴あきカーボン薄膜に適用されたときに観察された厚さ勾配は欠点である。それらは、ある試料には、少量の界面活性剤を使用することによって、又は、比較的程度は低いが、薄い連続カーボン薄膜で覆われたＥＭグリッドを使用することによって最小限に抑えることができる。それにもかかわらず、クライオＥＭは、図５Ｂ及びＣで示すように、わずかに一様でない氷厚さを有する試料に対して実施することができる。ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒ及びプロトコル２を使用して調製された穴あきカーボン・クライオ・グリッドから記録されたアンフィポールを用いて安定化された２００ｋＤａ膜たんぱく質の画像を図５Ｂに示す。ネガティブ染色ＴＥＭには薄いカーボン薄膜上で、及びクライオＥＭにはレース状及び穴あきカーボン上で、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ  ｐｌｕｎｇｅ−ｆｒｅｅｚｅｒ又はｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒのいずれかを使用して調製された同じたんぱく質の画像を図１０に示す。ネガティブ染色画像は無傷単一粒子を示すが、劣化粒子が、潜在的にブロッティング・ステップにより、代表的なプランジ凍結方式によってクライオＥＭに対して調製されたグリッド上に通常は見出される。対照的に、ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒを用いて調製されたクライオＥＭグリッドは、代表的なプランジ凍結方式を使用して調製されたときよりも高い濃度でより多くの均質たんぱく粒子を有するように思われる。
【０１５８】
堆積プロトコル２が使用されたとき消費される微小容量は、それ以外の場合到達できない試料からのクライオ・グリッド調製を可能にする。例えば、単一真核細胞の溶解物を試験することができる。これを示すために、付着ＨＥＫ２９３細胞が導電ガラス・スライド上で培養され、個々の標的細胞が、前に説明したように、光学顕微鏡で識別され、電気穿孔され、微小毛細管を使用して吸引された（非特許文献１４；非特許文献１５）。同じプラチナ被覆微小毛細管が、エレクトロポレーション、細胞溶解物吸引及び分配に使用され、したがって、微量の生物材料の表面への露出及び結果として生じる細胞成分の損失を最小限に抑えた。プロトコル２を使用する溶解物堆積により、図５Ｃで示したように、高品質クライオ・グリッドが得られ、付随たんぱく質を有する典型的な膜構造が見える。試料堆積プロトコル２を使用して調製された単一細胞溶解物のより多くの実例を図１１に示す。
【０１５９】
単一粒子分析
高分解能構造分析のためのｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒ方法の有用性を示すために、エルシニア・エンテロコリチカ・バクテリアからのウレアーゼが、堆積プロトコル１を使用してクライオＥＭのために調製され、直接電子検出器を装備したＴｉｔａｎ  Ｋｒｉｏｓ顕微鏡を用いて撮像された（材料及び方法参照）。図６Ａは、試料グリッドの高品質を文書化している。初期２Ｄ分類から選択されたクラス平均を図６Ｂに示す。粒子のサブセットが、生成されたクラスから選択され、最終処理ステップに使用された（図６Ｃ）。「至適基準」による改良により（非特許文献２６；非特許文献８）、フーリエ・シェル相関による５．０３Ａの分解能における四量体錯体の３Ｄ再構成が生じた（ＦＳＣ＝０．１４３、図１２）。
【０１６０】
考察
本発明は、クライオＥＭのための試料グリッド調製方法を改善し、最小量の試料（ナノリットル）を使用してそのようなグリッドを調製する問題を解決する。本明細書に説明したクライオＥＭ試料堆積及びガラス化ツールは、１つのグリッド当たり３から２０ｎＬの試料しか消費せず、異なるタイプの試料、例えば、可溶性及び膜たんぱく質、ウイルス及びバクテリオファージの単一粒子調製又は細胞溶解物全体に一緒に使用することができる。設定は、定義された閾値に達すると、試料薄膜の制御された薄化及びピック・アンド・プランジ機構の自動始動を可能にするための監視システムを含む。重要なことには、凍結条件及びこの閾値は、実際の試料の代わりに緩衝液だけを用いて調製されたグリッドを使用して決定することができる。
【０１６１】
他の重要な態様は、ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒ方法が最小の試料損失で動作し、任意の紙ブロッティング・ステップが関与しないことである。クライオ・グリッド調製を頼りにする多くの実験室の経験により、代表的な調製方法が繊細なたんぱく質複合体の保存に害を及ぼすことがあることが分かっている。これは、しばしば、試料の緩衝液特性を急速に変化させることがあり（塩、ｐＨ変化、ろ紙から浸出したイオン）、長いたんぱく質集合を阻害するせん断力をもたらすことがある紙ブロッティング・ステップ（非特許文献２７）、又はより多くのたんぱく質をブロッティング中及びその後の苛酷な空気−水界面に露出させる、ブロッティング後の試料薄膜の大きな表面対容量比率のいずれかに帰される。本明細書に提示した試料堆積プロトコルは、紙ブロッティングを完全に回避する。堆積プロトコル１は、試料再吸引後にグリッド上に残るたんぱく質の空気−水界面への露出時間も最小限に抑える。ＤＰステージ・オフセットが＋８°Ｃである場合、堆積直後に試料をガラス化することができる。空気−水界面への露出は、堆積プロトコル２が使用されるとき、より長い。試料堆積、拡散、及び薄化は、グリッドが寒剤で終了するまでに、最大１０秒までかかることがある。両方の堆積プロトコルは、空気−水界面において濃縮する微量の洗剤などの添加物の使用も可能にし、それにより、たんぱく質は表面効果から保護される可能性がある。拡散駆動プロセスによる試料調整（非特許文献１４）は、ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒ設定に含めることができ、洗剤が小さな試料容量（＜５ｎＬ）に急速に導入されること及びプロトコル２による均質グリッドの調製を可能にする（非特許文献１４）。
【０１６２】
方法は、適切な凍結条件を決定するのに必要な時間及び労力を大幅に短縮する見込みがある。達成されたほとんど無損失の調製及び低試料消費により、クライオＥＭは、わずかに利用可能なたんぱく質／たんぱく質複合体及び単一細胞の内容の構造分析に適用可能となる。これは、クライオＥＭの技術の進歩が今やわずか数千から数百万のたんぱく質複合体の単一粒子の撮像及び分析によって３から６Ａの間の分解能に到達することを可能にし（非特許文献２）、構造分析のためのマイクロ流体試料調製方法を実現可能にするので、特に興味深い（非特許文献２８）。
【０１６３】
ＣｒｙｏＷｒｉｔｅｒ：詳細な設定の説明及び試料のガラス化
ＣｒｙｏＷｒｉｔｅｒ設定を図１に示す。ＣｒｙｏＷｒｉｔｅｒ設定は、露点（ＤＰステージ）に近接して維持される温度制御ステージ１を有する。温度センサと湿度センサとの組合せ（ＵＦＴ７５−ＡＴ、Ｓｅｎｓｏｒ−Ｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が、部屋の露点を連続して決定し、ペルチェ・コントローラによって調節される水冷式ペルチェ素子（Ｃｏｏｌｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が、それに応じてＤＰステージ１の温度を調整するのに使用される。電子顕微鏡法（ＥＭ）グリッド２０（前に空気プラズマにおいて３０秒間グロー放電された）が、第１のアダプタ３に固定されるピンセット２によって保持される。第１のアダプタ３上のつまみねじの回転により、ピンセット２が開閉し、グリッド２０を把持し、保持することが可能になる。電磁石（ＭＭＴ  Ｍａｇｎｅｔｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）４がピンセット２を水平位置に保持し、ピンセット２が、その上に装着された２つの小さなペルチェ素子を介して冷却される。電磁石は、精密キネマティック・マウント５（ＫＳ０５Ｋ／Ｍ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に固定され、精密キネマティック・マウント５自体は、手動ｚ軸ステージ上に装着される。したがって、ピンセット２によって保持されたグリッド２０は、穴あきカーボン面を上にして、ＤＰステージ１におけるスロットに位置合せされ、平らに（水平に）配置することができる。スロットは、その中央にレーザ・ビームの通過を可能にするための小さな穴部（直径２ｍｍ）を有する（以下を参照）。この領域を除いて、グリッド２０の外縁及び下面は、ステージ材料と直接接触している。ＤＰステージ１自体は、電動ステージ（Ｐｒｉｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）６上に装着され、位置決めされたグリッド及びピンセットは水平面上を移動することが可能になる。別の永久磁石が挿入された第２のアダプタ７は、旋回軸を介して大きなソレノイド８（ＨＤ８２８６−Ｒ−Ｆ、Ｋｕｈｎｋｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続される。この第２のアダプタ７は、その旋回軸を中心にして自由に回転することができるが、小さな永久磁石９によって水平の向きに保持される。大きなソレノイド８は、３０ｍｍのハブ長さを有し、二次回路１０が閉じたときにソレノイドが始動するようにソレノイド・コントローラ（ＭＳＴ−１６３０．００１／００２、Ｔｒｅｍｂａ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって制御される。
【０１６４】
リニア・ステージの組立品（Ｍ−４０４．２ＰＤ及びＭ−４１４．３ＰＤ、Ｐｈｙｓｉｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上に装着された溶融石英微小毛細管（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、ＵＳＡ）１１が、高精度注射器ポンプ（Ｃｅｔｏｎｉ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続される（図示せず）。微小毛細管は、試料を貯蔵容器、例えば、ＰＣＲチューブ、ウエル・プレートなどから、又は溶解単一細胞から吸引するのに使用され（非特許文献１４）、それをＤＰステージ１上のグリッド上に分配する。ＤＰステージ１は電動ステージ上に装着されるので、試料を分配しながらグリッド２０を移動させることができ、必要に応じ、グリッド２０のより広い面積にわたってそれを配分することが可能になる。２つのＣＣＤカメラ（図示せず）により、試料堆積及び拡散の直接観察が可能になる（側面図及び傾斜上面図、図７参照）。微小毛細管はこれが完了すると引き込まれる。
【０１６５】
試料堆積後、液体の蒸発は、ＤＰステージ１の温度によって制御され、レーザ・ダイオード（λ＝７８０ｎｍ、ＣＰＳ１９２、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１３及び光検出器（フォトダイオードＰＤＡ１００Ａ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１４を手動開口部（ＳＭ１Ｄ１２ＳＺ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に使用して監視することができる。レーザ・ダイオード１３は、ＤＰステージ１よりも上に装着され、試料が堆積したグリッド２０の面積を照射する。光検出器１４は、レーザ・ダイオード１３の光学経路におけるＤＰステージ１の下に位置決めされる。
【０１６６】
試料ガラス化は、監視システムによって登録されたレーザ信号が定義された閾値に達したとき、又はユーザによって定義された、あらかじめ設定された時間の後、自動的に進む。グリッドの寒剤中への注入は、電磁石４がオフにされ、アダプタ３及び７内の２つの磁石がかみ合い、ピンセット２及びグリッド２０をＤＰステージ１から引き抜いたとき、作動される。新たに形成された組立品は、その増加した重量により垂直位置にはまる。組立品が垂直位置に達したとき、それは自動的に二次回路１０を閉じ、それにより、大きなソレノイドが作動する。３０ｍｍソレノイド・ハブは、ＥＭグリッド及びピンセット２の先端を寒剤１２（プランジ凍結中の氷汚染を最小限に抑えるために特注の発泡スチロールのふたを用いてＶｉｔｒｏｂｏｔ、ＦＥＩ、ＵＳＡからの標準寒剤容器内に液化されたエタンとプロパンとの混合物（４０：６０））中に発射する。電磁石４がオフにされた瞬間からグリッドが寒剤中に浸漬されるまでわずか数百ミリ秒しか経過しない。ピンセット２は、ここで容易に組立品から手で取り除くことができ（磁石接続）、グリッド２０は、液体窒素中に浸漬されたグリッド貯蔵箱内に配置することができ、その後、貯蔵デュワに又は観察のために直接クライオ装備の電子顕微鏡に移送される。
【０１６７】
ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒ：制御ソフトウェア
すべての器具は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＬａｂＶＩＥＷソフトウェアを介して制御される（非特許文献２９）。ｏｐｅｎＢＥＢ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ（ｗｗｗ．ｏｐｅｎｂｅｂ．ｏｒｇ）が、各器具プログラムを独立したプラグインとしてロードするのに使用される（非特許文献３０）。試料装荷、堆積、及びクライオ注入などの多くの実験ステップが、ｏｐｅｎＢＥＢのマクロ言語を使用して自動化された。図７は、プロセス・オートメーション用のマクロ・ウィンドウを含めて、制御ソフトウェアのスクリーンショットを示す。
【０１６８】
７８０ｎｍレーザ・ダイオードによる水の厚さの実時間監視
グリッド及びステージが露点温度に維持された場合、グリッドに近接した微環境の相対湿度（ｒＨ）は１００％である。水分凝縮を防止し、グリッド表面からの試水の制御蒸発を可能にするために、ステージ温度は、露点温度よりもわずかに上にある必要があり、例えば、温度オフセットは、グリッド表面において９０％ｒＨを示すように選択される。
【０１６９】
（Ｉ）ＤＰステージ／グリッド微環境のｒＨ及び部屋のｒＨへの感受性
計算により、露点温度からの小さなオフセット（例えば、＋２°Ｃ）の場合、ＤＰステージ微環境のｒＨは、２３°Ｃの室温において２０％から９０％の範囲の部屋のｒＨにわたって直線的にステージ温度に依存することが分かる（図８Ａ）。さらに、ステージ上に９０％ｒＨの微環境を作り出す必要がある温度オフセットは、２３°Ｃにおいて２０％から９０％の範囲の部屋のｒＨに対して０．３度未満だけ変動する（図８Ｂ）。したがって、ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒ手順は室内のｒＨ変化に感受性がなく、システムは、必ずしも湿度制御されたチャンバを必要としないが、しかし、これは今後の適用例に望ましい可能性がある。
【０１７０】
温度ＴにおけるｒＨ、ｒＨ（Ｔ）は、以下のように計算された。
【数１】
2019537709.tif 000003
【数２】
2019537709.tif 000004
【０１７１】
ここで、Ｅ（ＲＴ）及びＥＳ（Ｔ）は、Ｍａｇｎｕｓ公式によって記載されるように、それぞれ、室温ＲＴにおける実際の蒸気圧（単位パスカル）及び温度Ｔにおける最大（飽和）蒸気圧である（非特許文献３１）。
【０１７２】
上記の結論に一致して、より大きな試料容量がプロトコル１によって堆積したとき、それは、一般に、緩衝液アリコートを使用して試料堆積とピック・アンド・プランジ凍結との間に必要な時間のずれを決定するのに十分であったし、薄化の程度は実験的に監視する必要はなかった。
【０１７３】
（ＩＩ）レーザ透過の試料層厚さへの依存
ｃｒｙｏＷｒｉｔｅｒ設定により、水分蒸発を７８０ｎｍレーザ・ダイオードと光検出器とからなる光学系によって実験的に監視することが可能となる。これは上記に対する任意選択であり、堆積プロトコル２には特に重要である。グリッドを通るほとんど垂直のレーザ・ビームの透過は、測定される（図１及び２参照）。蒸発による膜厚の変化は、光検出器によって記録される信号の振幅に影響する（図３）。これらの信号の変化が干渉効果によって支配されることを確認するために、透過信号は、異なる波長（７８０ｎｍ及び４０５ｎｍ）で放射するレーザ・ダイオードに対して測定された。干渉理論から予測されるように（図８Ｃ）、２つのパターンは、質的に同じであったし、青色レーザ信号の正のピークは、より薄い水の層に向かってシフトされた（図８ｄ）。
【符号の説明】
【０１７４】
１００  システム
１      温度制御ステージ
２      ピンセット
３      第１のアダプタ
４      電磁石
５      調整手段
６      並進ステージ組立品
７      第２のアダプタ
８      運動発生手段、詳細にはソレノイド
９      永久磁石
１０    二次電気回路
１１    分配ヘッド、詳細には微小毛細管先端
１２    容器
１３    光源
１３ａ  第１の光源
１３ｂ  第２の光源
１４    光検出器
１４ａ  第１の光検出器
１４ｂ  第２の光検出器
１５ａ  第１のダイクロイック・ミラー
１５ｂ  第２のダイクロイック・ミラー
１６ａ  第１の開口部
１６ｂ  第２の開口部
２０    支持構造体
３０    制御デバイス
５０    保持手段
６０    移送機構
６１    回転ヒンジ
８０    寒剤
Ｇ      ギャップ
Ｌ      光経路
Ｌ１    第１の光ビーム
Ｌ２    第２の光ビーム
Ｔ      透過光ビーム
Ｔ１    第１の透過光ビーム
Ｔ２    第２の透過光ビーム
【図１】
2019537709.tif 000005
【図２ａ】
2019537709.tif 000006
【図２ｂ】
2019537709.tif 000007
【図２ｃ】
2019537709.tif 000008
【図３】
2019537709.tif 000009
【図４ａ】
2019537709.tif 000010
【図４ｂ】
2019537709.tif 000011
【図４ｃ】
2019537709.tif 000012
【図５ａ】
2019537709.tif 000013
【図５ｂ】
2019537709.tif 000014
【図５ｃ】
2019537709.tif 000015
【図６ａ】
2019537709.tif 000016
【図６ｂ】
2019537709.tif 000017
【図６ｃ】
2019537709.tif 000018
【図６ｄ】
2019537709.tif 000019
【図７】
2019537709.tif 000020
【図８】
2019537709.tif 000021
【図９ａ】
2019537709.tif 000022
【図９ｂ】
2019537709.tif 000023
【図１０ａ】
2019537709.tif 000024
【図１０ｂ】
2019537709.tif 000025
【図１０ｃ】
2019537709.tif 000026
【図１１ａ】
2019537709.tif 000027
【図１１ｂ】
2019537709.tif 000028
【図１２】
2019537709.tif 000029
【図１３】
2019537709.tif 000030
【国際調査報告】
2019537709.tif 000031
2019537709.tif 000032
2019537709.tif 000033