(57)【要約】本発明は、立体規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの分野ならびにヌクレオシドモノマーおよびその合成法に関する。本明細書において開示するアシル保護L-LNA-Gモノマーは、溶解特性および安定特性が改善され、オリゴヌクレオチド合成の有効性に改善をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式1の化合物：
2019510021.tif 000054
式中、
Zは、グアニン核酸塩基基がグアニン環外窒素基上にアシル保護基を含むグアニンヌクレオシドであり、ここで式1の環外酸素はヌクレオシドZの3'炭素に共有結合されており；
R5およびR6は独立に、水素、アルキル、シクロ-アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換シクロ-アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールからなる群より選択されるか、またはR5およびR6は一緒に、式(1）のN原子と共に3〜16炭素原子を含む複素環を形成し；
R1は水素およびC1〜3アルキルからなる群より選択され；R9は水素であり；
かつRはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリール、ニトロ、ハロゲン、シアノ、シリル、置換シリル、スルホン、置換スルホン（アリール置換スルホン）、フルオレン、および置換フルオレンからなる群より選択される。
【請求項２】
Rがアリール、ヘテロアリール、置換アリール、および置換ヘテロアリールからなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
Rがフェニルなどのアリールである、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
R1が水素である、請求項1〜3のいずれか一項記載の化合物。
【請求項５】
R5およびR6が一緒に、式（1）のN原子と共に4炭素原子を含む複素環を形成する、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
【請求項６】
式2の化合物であり： 
2019510021.tif 000055
式中、Z、R、およびR1が、請求項1〜5のいずれか一項記載のとおりである、
請求項5記載の化合物。
【請求項７】
グアニン環外窒素基上のアシル保護基が-C(=O)-R7であり、ここでR7は置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、またはアリール基、好ましくは置換されていてもよいC1〜6-アルキル基、C2〜6-アルケニル基、C2〜6-アルキニル基、C3〜7-シクロアルキル基、またはフェニル基からなる群より選択され；ここで、置換されている場合、置換基は、例えば、ハロゲン、C1〜6-アルキル、C2〜6-アルケニル、C2〜6-アルキニル、C1〜6-アルコキシ、置換されていてもよいアリールオキシ、または置換されていてもよいアリールからなる群より選択される1つまたは複数の置換基で一置換または多置換されていてもよい、請求項1〜6のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８】
グアニン環外窒素基上のアシル保護基が、イソブツリル（iBu）、アセチル（Ac）、フェノキシアセチル（PAC）、p-イソプロピルフェノキシアセチル（iPrPAC）、フェニルアセチル、イソプロピルオキシアセチル、メトキシアセチル、ベンゾイル、p-メトキシフェニルアセチル、ジフェニルアセチル、シクロヘキシルカルボニル、1,1-ジメチルプロパノイル、およびp-tert-ブチル-フェノキシアセチルからなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９】
グアニン環外窒素基上のアシル保護基が、イソブツリル（iBu）、アセチル（Ac）、フェノキシアセチル（PAC）、およびp-イソプロピルフェノキシアセチル（iPrPAC）からなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１０】
グアニン環外窒素基上のアシル保護基がイソブツリル（iBu）である、請求項1〜6のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１】
式3の化合物であり：
2019510021.tif 000056
式中、
R、R1、R5、R6、およびR9が、請求項1〜8のいずれか一項記載のとおりであり；
Bが、グアニン環外窒素基上にアシル保護基を含むグアニン核酸塩基基であり；
R3＝が、CH2ODMTr、CH2-アルキル-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-アルキル-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb、およびCH-Ra-O-MMTrRbからなる群より選択され；かつR2およびR4が一緒に、架橋-C(RaRb)-O-、-C(RaRb)C(RaRb)-O-、-CH2-O-、-CH2CH2-O-、および-CH(CH3)-O-からなる群より選択される二価の架橋を示す、
請求項1〜10のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２】
R2およびR4が、二価の架橋-CH2-O-（メチレン-オキシ）または-CH(CH3)-O-（メチル-メチレン-オキシ）を示す、請求項11記載の化合物。
【請求項１３】
式16または17の化合物であり：
2019510021.tif 000057
式中、R、R1、R9、R3、R7、およびR8が、請求項1〜16のいずれか一項記載のとおりである、
請求項1〜12のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１４】
Rがフェニルであり、かつR1が水素またはメチルである、請求項13記載の化合物。
【請求項１５】
アシル保護基（-C(=O)-R7）がイソブツリルである、請求項13または14記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、立体規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの分野ならびにヌクレオシドモノマーおよびその合成法に関する。本明細書において開示するアシル保護L-LNA-Gモノマーは、溶解特性および安定特性が改善され、したがってオリゴヌクレオチド合成の効率改善をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
最近、本発明者らは、LNAオリゴヌクレオチドにおける立体規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間結合の使用がLNAオリゴヌクレオチドの薬理特性の最適化を可能にすることを発見した。立体規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの製造は、現在の所、立体規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比べてかなり非効率的である。したがって、立体規定されたオリゴヌクレオチドの合成の効率を改善する必要がある。
【０００３】
WO2014/010250（特許文献1）は、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、対応するホスホロチオエートヌクレオシド間結合の位置でキラルに規定された立体中心を提供する、ヌクレオシドモノマーを開示している。LNAモノマーが考慮されるが、作製されたものも試験もされたものもない。本発明は、グアニンモノマー（L-XNA-Gモノマーと呼ぶ）が多くの溶媒中で不溶性および/または不安定であるという驚くべき観察に基づく。本発明は、グアニン残基の環外窒素が標準のDMF保護基ではなくアシル保護基によって保護される、L-XNA-Gモノマーの提供に基づく。そのようなモノマーは溶液中で著しく可溶性および安定である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO2014/010250
【発明の概要】
【０００５】
発明の記載
本発明は、式1、1aまたは1bの化合物を提供する：
2019510021.tif 000002
式中、
Zは、グアニン核酸塩基基がグアニン環外窒素基上にアシル保護基を含む、グアニンヌクレオシドであり、ここで式Iの環外酸素はヌクレオシドZの3'炭素に共有結合されており；
R5およびR6は独立に、水素、アルキル、シクロ-アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換シクロ-アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールからなる群より選択されるか、またはR5およびR6は一緒に、式1のN原子と共に3〜16炭素原子を含む複素環を形成し；
R9は水素であり；
R1は水素およびC1〜3アルキルからなる群より選択され；かつ
Rはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリール、ニトロ、ハロゲン、シアノ、シリル、置換シリル、スルホン、置換スルホン（アリール置換スルホン）、フルオレン、および置換フルオレンからなる群より選択される。
【０００６】
置換されている場合、Rは、C1〜4アルキル基、C6〜14アリール基、C1〜4アルコキシ基、C7〜14アラルキル基、C1〜4アルキル、C6〜14アリール基、C1〜4アルコキシ、C6〜14アリール基、またはC6〜14アリールC1〜4アルキル基からなる群より選択される基で置換されていてもよい。複数の置換基は依存して、または独立に、C1〜4アルキル基、C6〜14アリール基、C1〜4アルコキシ基、C7〜14アラルキル基、C1〜4アルキル、C6〜14アリール基、C1〜4アルコキシ、C6〜14アリール基、またはC6〜14アリールC1〜4アルキル基からなる群より選択されてもよい。
【０００７】
式1の化合物は、式1aまたは式1bに示すとおり、いずれかのジアステレオ異性体であってもよく、またはいくつかの態様において、ジアステレオ異性体の混合物であってもよい。
【０００８】
いくつかの態様において、Zは下記である：
2019510021.tif 000003
式中、Bはグアニン環外窒素基上にアシル保護基を含むグアニン核酸塩基基であり、かつR2、R3およびR4は本明細書に記載のとおりである。いくつかの態様において、R4およびR2はビラジクル架橋を形成して、二環式ヌクレオシドを形成する（本明細書における以下のLNA参照）。点線は式1、1aまたは1bの化合物における非環酸素への結合を表す。代表的なヌクレオシド基Zを、3'OH基が式1、1aおよび1bに示す環外酸素基への結合で置き換えられていること以外は、本明細書に開示する式62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73および74のヌクレオシドにおいて例示する。いくつかの態様において、Rが置換アリールである場合、Rはヨウ化物、フッ化物、臭化物または塩化物などの、ハロゲン化物で置換されていてもよい。
【０００９】
本発明は、式1の化合物および溶媒を含む溶液（組成物）を提供する。本発明は、式1aの化合物および溶媒を含む溶液（組成物）を提供する。本発明は、式1bの化合物および溶媒を含む溶液（組成物）を提供する。溶液は安定な溶液であり得、すなわち、室温で少なくとも24時間安定である（例えば、実施例6に提供する検定を用いて）。いくつかの態様において、安定な溶液は24時間の間に溶液中の本発明の化合物のいくらかの分解をきたし得ることが理解されるべきであるが、例えば、化合物1の初期量の少なくとも20％（少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％または少なくとも70％、または少なくとも75％などの）が24時間後の溶液中に存在する。
【００１０】
本発明は、オリゴヌクレオチドの合成または製造における本発明の化合物または組成物の使用を提供する。
【００１１】
本発明は、式I（1a）の化合物の合成法を提供し、本方法は、3'-OH基を含むグアニンヌクレオシドを、式8の化合物：
2019510021.tif 000004
と反応させる段階を含む。ここでXは、ヨウ化物、臭化物、または塩化物などのハロゲン化物であり、かつグアニンヌクレオシド上のグアニン核酸塩基基はグアニン環外窒素基上にアシル保護基を含み、かつR、R1、R9、R5およびR6は本発明の化合物のとおりであり、かつグアニンヌクレオシド上のグアニン核酸塩基基はグアニン環外窒素基上にアシル保護基を含む。
【００１２】
本発明は、式1aおよび1bの化合物の混合物を提供する。本発明は、式1aの化合物を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、混合物はジアステレオマー混合物であってもよい。本明細書において示すとおり、LNAモノマーなどの本明細書に開示するモノマーのLおよびD立体異性体の溶解性は、異なる溶媒中で著しく異なる溶解性および安定性を示し得る。
【００１３】
本発明は、立体規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成法であって、本発明の化合物（本発明のグアニンヌクレオシドモノマー）を固体支持体に結合した-OH基へのヌクレオシドの5'-OH基にカップリングする段階と、続く硫化段階を含む方法を提供する。方法は、キャッピング段階をさらに含んでもよく、これは硫化段階の前または後に実施してもよい。続いて、鎖伸長の完了後、例えば、全体的脱保護およびオリゴヌクレオチドの固体支持体からの切断中に、アシル保護基を除去してもよい。したがって、本発明のモノマーをホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成において用いて、オリゴヌクレオチド内の立体規定されたキラル中心を導入してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、選択した溶媒中の様々なLおよびDヌクレオシドモノマーの溶解性を示す。
【図２】図2は、選択した溶媒中の様々なLおよびDヌクレオシドモノマーの安定性を示す。3＝比較的不安定、2＝中間の安定性、1＝比較的安定。
【図３】図3は、様々な溶媒中で24時間後に測定した、L-LNA-G-iBuモノマー（3a）およびL-LNA-G-DMFモノマーの安定性を示す（実施例6参照）。図3a−I-bu-対照はt＝0時間の出発原料（L-LNA G-I-bu）を意味する。図3b−DMF-対照はt＝0時間の出発原料（L-LNA G-DMF）を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
本明細書において用いられる「アリール」なる用語は、環を形成している原子がそれぞれ炭素原子である芳香環を意味する。アリール環は、5、6、7、8、9、または9以上の炭素原子によって形成される。アリール基は置換または無置換である。1つの局面において、アリールはフェニルまたはナフタレニルである。構造に応じて、アリール基はモノラジカルまたはジラジカル（すなわち、アリーレン基）であり得る。1つの局面において、アリールはC6〜10アリールである。いくつかの態様において、アリールはフェニルである。置換されている場合、アリールは、C1〜4アルキル基、C6〜14アリール基、C1〜4アルコキシ基、C7〜14アラルキル基、C1〜4アルキル、C6〜14アリール基、C1〜4アルコキシ、C6〜14アリール基、またはC6〜14アリールC1〜4アルキル基からなる群より選択される基で置換されていてもよい。複数の置換基は依存して、または独立に、C1〜4アルキル基、C6〜14アリール基、C1〜4アルコキシ基、C7〜14アラルキル基、C1〜4アルキル、C6〜14アリール基、C1〜4アルコキシ、C6〜14アリール基、もしくはC6〜14アリールC1〜4アルキル基からなる群より選択されてもよく；またはヨウ化物、フッ化物、臭化物、もしくは塩化物などのハロゲン化物からなる群より選択される基、例えば、ヨウ化物、フッ化物、臭化物、または塩化物などのハロゲン化物で置換されたフェニルであってもよい。
【００１６】
「アルキル」基は、脂肪族炭化水素基を意味する。アルキル部分は飽和アルキル基（いかなる不飽和の単位、例えば、炭素-炭素二重結合または炭素-炭素三重結合も含まないことを意味する）であってもよく、またはアルキル部分は不飽和アルキル基（少なくとも1つの不飽和の単位を含むことを意味する）であってもよい。アルキル部分は、飽和または不飽和のいずれであっても、分枝、直鎖であってもよく、または環式部分を含んでもよい。アルキルの結合点は、環の一部ではない炭素原子である。「アルキル」部分は、1〜10の炭素原子を有してもよい（本明細書において出現する場合はいつでも、「1〜10」などの数値の範囲は所与の範囲内の各整数を意味し、例えば、「1〜10の炭素原子」は、アルキル基が10を含む最大10炭素原子までの1炭素原子、2炭素原子、3炭素原子などからなり得ることを意味するが、本定義は数値の範囲が示されていない「アルキル」なる用語の出現も包含する）。アルキルには分枝および直鎖アルキル基の両方が含まれる。本明細書に記載の化合物のアルキル基は「C1〜6アルキル」または同様の名称で示してもよい。例にすぎないが、「C1〜6アルキル」は、アルキル鎖中に1、2、3、4、5、または6の炭素原子があることを示し、すなわち、アルキル鎖はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、およびtert-ブチルからなる群より選択される。典型的アルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、アリル、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチルなどが含まれるが、決してそれらに限定されない。1つの局面において、アルキルはC1〜6もしくはC1〜4アルキルまたはC1〜3アルキルである。C1〜3アルキル基は、1〜3の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル基を意味する。C1〜4アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルである。C1〜3アルキル基は、1〜4の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル基を意味する。C1〜3アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、およびtert-ブチルである。
【００１７】
「アルケニル」基は、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む直鎖、分枝鎖、および環式炭化水素基である。アルケニル基は置換されていてもよい。
【００１８】
「アルキニル」基は、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含む直鎖、分枝鎖、および環式炭化水素基である。アルキニル基は置換されていてもよい。
【００１９】
「アルコキシ」基は、酸素に結合されたアルキル基、すなわち(アルキル)-O-基を意味し、ここでアルキルは本明細書の定義のとおりである。例には、メトキシ（-OCH3）またはエトキシ（-OCH2CH3）基が含まれる。
【００２０】
「アルケニルオキシ」基は、酸素に結合されたアルケニル基、すなわち(アルケニル)-O-基を意味し、ここでアルケニルは本明細書の定義のとおりである。
【００２１】
「アルキニルオキシ」基は、酸素に結合されたアルキニル基、すなわち(アルキニル)-O-基を意味し、ここでアルキニルは本明細書の定義のとおりである。
【００２２】
「アリールオキシ」基は、酸素に結合されたアリール基、すなわち(アリール)-O-基を意味し、ここでアリールは本明細書の定義のとおりである。例にはフェノキシ（-OC6H5）基が含まれる。
【００２３】
「シリル」とは、H3Si-を意味する。本明細書において用いられる「置換シリル」は、シリルの1つまたは複数の水素が置換された部分を意味する。例には、TBDMS｛tert-ブチルジメチルシリル）、TBDPS（tert-ブチルジフェニルシリル）またはTMS｛triメチルシリル）基が含まれるが、それらに限定されない。
【００２４】
「ハロゲン」なる用語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含むことが意図される。「ハロゲン化物」なる用語には、フッ化物、臭化物、ヨウ化物および塩化物が含まれる。
【００２５】
「アシル保護基」は、アシル基-C(=O)-R7を含み、ここでR7は末端基、例えば、アルキル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、およびアリール基から選択される基；または無置換アルキル基、無置換アルケニル基、無置換アルキニル基、無置換シクロアルキル基、もしくは無置換アリール基から選択される基；または置換アルキル基、置換アルケニル基、置換アルキニル基、置換シクロアルキル基、もしくは置換アリール基から選択される基である。いくつかの態様において、R7は無置換C1〜6-アルキル基、無置換C2〜6-アルケニル基、無置換C2〜6-アルキニル基、無置換C3〜7-シクロアルキル基、もしくは無置換フェニル基、または置換C1〜6-アルキル基、置換C2〜6-アルケニル基、置換C2〜6-アルキニル基、置換C3〜7-シクロアルキル基、もしくは置換フェニル基からなる群より選択されてもよく；ここで置換されている場合、置換基は、例えば、ハロゲン、C1〜6-アルキル、C2〜6-アルケニル、C2〜6-アルキニル、C1〜6-アルコキシ、置換されていてもよいアリールオキシまたは置換されていてもよいアリールからなる群より選択される1つまたは複数の置換基によって一置換または多置換されていてもよい。いくつかの態様において、アシル保護基はイソブツリル（isobuturyl）（-C(O=)CH(CH3)2）（本明細書においてiBuとも呼ぶ）である。イソブツリルなる用語はイソブチリル（isobutyryl）とつづってもよい。
【００２６】
本発明は、式1aまたは1bなどの式1のヌクレオシドモノマー、およびヌクレオシドモノマーを含む溶媒組成物（溶液）、ならびにオリゴヌクレオチドの合成におけるそれらの使用を提供する。
【００２７】
式1aのヌクレオシドのRおよびR1（R/R1）基は立体中心（L）を提供し、これはオリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に、ヌクレオシドに対して3'のSp立体規定されたホスホロチオエート基の生成をもたらす。式1aに示すRおよびR1基によって作製された立体中心を含むモノマーは、本明細書においてLモノマーと呼び、これはSp立体中心の生成をもたらす。いくつかの態様において、本発明は、L-LNA-GモノマーなどのDMF保護グアニンLモノマーは多くの溶媒中で可溶化するのが難しく、可溶化した場合でも、非常に不安定で立体規定されたオリゴヌクレオチドを商業的に妥当な規模まで作製する能力が制限されるという驚くべき観察に基づく。二環式ヌクレオシド、例えばL-LNA-Gヌクレオシドなどの、糖修飾ヌクレオシドに比べて、L-DNA-Gモノマーでは問題は重大ではない。事実、DMF保護L-LNA-GおよびD-LNA-G（式1bに示すとおり、式1の立体中心R/R1およびR6/R9の立体化学が逆転している）の溶解性の並列比較は、DMF保護D-LNA-Gはほとんどの溶媒中で可溶性かつ安定性であるが、DMF保護L-LNA-Gは可溶化するのが非常に難しく、溶液中での安定性は24時間未満であることを示す。
【００２８】
式1bのヌクレオシドのRおよびR1（R/R1）基は立体中心（D）を提供し、これはオリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に、ヌクレオシドに対して3'のRp立体規定されたホスホロチオエート基の生成をもたらす。式1bに示すRおよびR1基によって作製された立体中心を含むモノマーは、本明細書においてDモノマーと呼び、これはRp立体中心の生成をもたらす。
【００２９】
ジアステレオ異性体の混合物
本発明は、式1aの化合物を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、前記組成物は式1bの化合物を含まない。いくつかの態様において、組成物は1％を超える式1bの化合物を含まない（式1aの化合物のモル比により測定して）。いくつかの態様において、組成物は2％を超える式1bの化合物を含まない（式1aの化合物のモル比により測定して）。いくつかの態様において、組成物は3％を超える式1bの化合物を含まない（式1aの化合物のモル比により測定して）。いくつかの態様において、組成物は4％を超える式1bの化合物を含まない（式1aの化合物のモル比により測定して）。いくつかの態様において、組成物は5％を超える式1bの化合物を含まない（式1aの化合物のモル比により測定して）。いくつかの態様において、組成物は10％を超える式1bの化合物を含まない（式1aの化合物のモル比により測定して）。いくつかの態様において、組成物は20％を超える式1bの化合物を含まない（式1aの化合物のモル比により測定して）。組成物は本明細書に記載の溶液（組成物）の形態であってもよい。
【００３０】
本発明は、式1bの化合物を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、前記組成物は式1aの化合物を含まない。いくつかの態様において、組成物は1％を超える式1aの化合物を含まない（式1bの化合物のモル比により測定して）。いくつかの態様において、組成物は2％を超える式1aの化合物を含まない（式1bの化合物のモル比により測定して）。いくつかの態様において、組成物は3％を超える式1aの化合物を含まない（式1bの化合物のモル比により測定して）。いくつかの態様において、組成物は4％を超える式1aの化合物を含まない（式1bの化合物のモル比により測定して）。いくつかの態様において、組成物は5％を超える式1aの化合物を含まない（式1bの化合物のモル比により測定して）。いくつかの態様において、組成物は10％を超える式1aの化合物を含まない（式1bの化合物のモル比により測定して）。いくつかの態様において、組成物は20％を超える式1aの化合物を含まない（式1bの化合物のモル比により測定して）。組成物は本明細書に記載の溶液（組成物）の形態であってもよい。
【００３１】
L-モノマー
いくつかの態様において、本発明は、式1aの化合物を提供する：
2019510021.tif 000005
式中、
Zは、グアニン核酸塩基基がグアニン環外窒素基上にアシル保護基を含む、グアニンヌクレオシドであり、ここで式1aの環外酸素はヌクレオシドZの3'炭素に共有結合されており；
R5およびR6は独立に、水素、アルキル、シクロ-アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換シクロ-アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールからなる群より選択されるか、またはR5およびR6は一緒に、式1aのN原子と共に3〜16炭素原子を含む複素環を形成し；
R9は水素であり；
R1は水素およびC1〜3アルキルからなる群より選択され；かつ
Rはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリール、ニトロ、ハロゲン、シアノ、シリル、置換シリル、スルホン、置換スルホン（アリール置換スルホン）、フルオレン、および置換フルオレンからなる群より選択される。
【００３２】
本明細書における基R、R1、R6、R9およびR5の記載は、一般には、LおよびD立体異性体の両方を含む、本明細書に記載の化合物に適用され得る。
【００３３】
置換されている場合、Rは、C1〜4アルキル基、C6〜14アリール基、C1〜4アルコキシ基、C7〜14アラルキル基、C1〜4アルキル、C6〜14アリール基、C1〜4アルコキシ、C6〜14アリール基、またはC6〜14アリールC1〜4アルキル基からなる群より選択される基で置換されていてもよい。複数の置換基は依存してまたは独立に、C1〜4アルキル基、C6〜14アリール基、C1〜4アルコキシ基、C7〜14アラルキル基、C1〜4アルキル、C6〜14アリール基、C1〜4アルコキシ、C6〜14アリール基、またはC6〜14アリールC1〜4アルキル基からなる群より選択されてもよい。
【００３４】
いくつかの態様において、Rはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリール、ニトロ、ハロゲン、シアノ、シリル、置換シリル、スルホン、置換スルホン（アリール置換スルホン）、フルオレン、および置換フルオレンからなる群より選択される。
【００３５】
いくつかの態様において、Rは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、および置換ヘテロアリールからなる群より選択される。
【００３６】
いくつかの態様において、Rはフェニルなどのアリールである。
【００３７】
いくつかの態様において、Rが置換アリールである場合、Rはヨウ化物、フッ化物、臭化物、または塩化物などのハロゲン化物で置換されていてもよく、例えば、ヨウ化物、フッ化物、臭化物、または塩化物などのハロゲン化物で置換されたフェニルであってもよい。
【００３８】
いくつかの態様において、R1は水素である。いくつかの態様において、R1はメチル、エチルまたはプロピルなどのC1〜3アルキルである。いくつかの態様において、R1はメチルである。
【００３９】
いくつかの態様において、Rはフェニルなどのアリールであり、かつR1は水素である。
【００４０】
いくつかの態様において、Rはフェニルなどのアリールであり、かつR1はメチル、エチルまたはプロピルなどのC1〜3アルキルである。
【００４１】
いくつかの態様において、Rは、
2019510021.tif 000006
であり、式中、G31、G32、およびG33は独立に、C1〜4アルキル、C6〜14アリールC1〜4アルコキシ、C7〜14アラルキル、C1〜4アルキルC6〜14アリール、C1〜4アルコキシC6〜14アリール、およびC6〜14アリールC1〜4アルキルからなる群より選択される。
【００４２】
いくつかの態様において、Rは、
2019510021.tif 000007
であり、式中、G21、G22、およびG23は、独立に水素、ニトロ、ハロゲン、シアノ、またはC1〜3アルキルである。
【００４３】
いくつかの態様において、Rは、
2019510021.tif 000008
であり、式中、G51、G52、およびG53は、独立に水素、ニトロ、ハロゲン、シアノ、またはC1〜3アルキルもしくはC1〜3アルキルオキシ基である。
【００４４】
いくつかの態様において、R5およびR6は一緒に複素環を形成する（式1に示す環窒素と共に）。複素環は、例えば、4炭素原子などの、3〜16炭素原子を含んでもよい。
【００４５】
いくつかの態様において、R5およびR6は一緒に4炭素原子を含む複素環を形成して（式Iに示す環窒素と共に）、複素環内の合計を5原子（式1に示す4炭素および窒素）とする。例えば、本発明の化合物は式2の化合物であってもよい：
2019510021.tif 000009
式中、R、R1、R9、およびZは、本発明の化合物のとおりである。
【００４６】
いくつかの態様において、R5およびR6は一緒に4炭素原子を含む複素環を形成して（式1に示す環窒素と共に）、複素環内の合計を5原子（式1に示す4炭素および窒素）とし、かつRはフェニルなどのアリールであり、R1は水素またはメチルである。R9は水素である。
【００４７】
前記Z基はヌクレオシドであり、ここでヌクレオシドの3'酸素は式1に示す環外酸素である。いくつかの態様において、Z基はLNAヌクレオシド部分である。いくつかの態様において、本発明の化合物は、したがって、式3の化合物として表してもよい：
2019510021.tif 000010
式中、R、R1、R5、R6、およびR9は本発明の化合物のとおりであり；
Bはグアニン環外窒素基上にアシル保護基を含むグアニン核酸塩基基であり；
R3＝は、CH2ODMTr、CH2-アルキル-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-アルキル-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb、およびCH-Ra-O-MMTrRbからなる群より選択され；
R2は、-Fなどのハロ、アミノ、アジド、-SH、-CN、-OCN、-CF3、-OCF3、-O(Rm)-アルキル、-S(Rm)-アルキル、-N(Rm)-アルキル、-O(Rm)-アルケニル、-S(Rm)-アルケニル、-N(Rm)-アルケニル；-O(Rm)-アルキニル、-S(Rm)-アルキニル、または-N(Rm)-アルキニル；O-アルキレニル-O-アルキル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリール、O-アラルキル、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)またはO-CH2C(=O)-N(Rm)(Rn)、-O-(CH2)2OCH3、および-O-CH3からなる群より選択され、ここで各RmおよびRnは独立に、H、アミノ保護基または置換もしくは無置換C1〜10アルキルであり；
R4＝は、アルキル、シクロ-アルキル、シクロ-ヘテロアルキル、O-アルキル、S-アルキル、NH-アルキル、および水素からなる群より選択され；
またはR2およびR4は一緒に、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=N、O、-Si(Ra)2-、S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zからなる群より選択される1、2、3の基/原子からなるなどの、二価の架橋を示し；
ここでRaおよび、存在する場合はRbは、それぞれ独立に水素、置換されていてもよいC1〜6-アルキル、置換されていてもよいC2〜6-アルケニル、置換されていてもよいC2〜6-アルキニル、ヒドロキシ、置換されていてもよいC1〜6-アルコキシ、C2〜6-アルコキシアルキル、C2〜6-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1〜6-アルコキシカルボニル、C1〜6-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリール-オキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロ-アリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1〜6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1〜6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1〜6-アルキル)アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、C1〜6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1〜6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1〜6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1〜6-アルキルチオ、ハロゲンから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基RaおよびRbは一緒に置換されていてもよいメチレン（=CH2）を示してもよく、ここですべてのキラル中心について、非対称の基はRまたはS配向のいずれで見いだされてもよい。
【００４８】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に、ヌクレオシド（Z）は同等のDNAヌクレオシドよりも相補的RNA標的に対して高い結合親和性を与える。そのようなヌクレオシドは高親和性ヌクレオシドと呼ぶ。高親和性ヌクレオシドの例には、2'-O-MOE、2'-フルオロ、2'-O-メチル、およびLNAヌクレオシドが含まれる。ヌクレオシドが高親和性ヌクレオシドである態様において、R3は、例えば、CH2-O-DMTrまたはCH2-O-MMTrであってもよい。
【００４９】
いくつかの態様において、R2はフルオロ（-F）、-O-(CH2)2OCH3、および-O-CH3などの-O-C1〜3アルキルからなる群より選択される。そのような態様において、任意にR4は水素である。
【００５０】
いくつかの態様において、ヌクレオシドは2'-4'架橋（ビラジクル）を含むLNAヌクレオシド（二環式ヌクレオシドとしても公知）である。
【００５１】
いくつかの態様において、R2およびR4は一緒に架橋-C(RaRb)-O-、-C(RaRb)C(RaRb)-O-、-CH2-O-、-CH2CH2-O-、-CH(CH3)-O-からなる群より選択される二価の架橋を示す。いくつかの態様において、R2およびR4は二価の架橋-CH2-O-（オキシ-LNAとしても公知のメチレン-オキシ）または-CH(CH3)-O-（メチル-メチレン-オキシ）を示す。-CH(CH3)-O-架橋は架橋内の炭素原子においてキラル中心を導入し、いくつかの態様において、これはS配置である（例えば、当技術分野において(S)cETとして公知のヌクレオシド-EP1984381参照））。いくつかの態様において、R2およびR4は架橋がベータ-D配置である二価の架橋-CH2-O-を示す（ベータ-D-オキシLNA）。いくつかの態様において、R2およびR4は架橋がアルファ-L配置である二価の架橋-CH2-O-を示す（アルファ-L-D-オキシLNA）。いくつかの態様において、R2およびR4は二価の架橋-CH2-S-（チオLNA）、または-CH2-NH2-（アミノLNA)を示す。R2およびR4が一緒に二価の架橋を示す態様において、R3は、例えば、CH2-O-DMTrまたはCH2-O-MMTrであってもよい。ヌクレオシド（Z）がベータ-D-オキシLNAなどの二環式ヌクレオチド（LNA）であるいくつかの態様において、Rはフェニルなどのアリールであり、かつR1は水素またはC1〜3アルキルである。そのような態様において、R5およびR6は一緒に、本明細書に記載の5員複素環などのヘテロサイリック環（heterocylic ring）を形成してもよい（例えば、式2参照）。
【００５２】
本発明の化合物はアシル保護グアニンヌクレオシド（Z）を含む。
【００５３】
本発明の化合物は、いくつかの態様において、式10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25の化合物によって表されてもよい：
2019510021.tif 000011
2019510021.tif 000012
2019510021.tif 000013
2019510021.tif 000014
2019510021.tif 000015
2019510021.tif 000016
2019510021.tif 000017
2019510021.tif 000018
式中、R、R1、R2、R3、R4、R5、R9、およびR6は本発明の化合物のとおりであり、かつ-C(=O)-R7はグアニン塩基の環外窒素上のアシル保護基であり、かつR8は、存在する場合は、グアニン環外酸素上の保護基である。いくつかの態様において、R8はシアノエチルである。いくつかの態様において、R9は水素である。
【００５４】
本発明の化合物のいくつかの態様において、R7は置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、またはアリール基、好ましくは置換されていてもよいC1〜6-アルキル基、C2〜6-アルケニル基、C2〜6-アルキニル基、C3〜7-シクロアルキル基、またはフェニル基からなる群より選択され；ここで、置換されている場合、置換基は、例えば、ハロゲン、C1〜6-アルキル、C2〜6-アルケニル、C2〜6-アルキニル、C1〜6-アルコキシ、置換されていてもよいアリールオキシまたは置換されていてもよいアリールからなる群より選択される1つまたは複数の置換基で一置換または多置換されていてもよい。いくつかの態様において、アルキルは、C3〜10またはC3〜6分枝アルキルなどの分枝アルキルである。
【００５５】
いくつかの態様において、R7は、イソプロピル、イソブチル、sec-ブチル、およびtert-ブチルなどの、置換または無置換分枝アルキルなどの、分枝アルキルである。いくつかの態様において、R7はイソプロピルである。
【００５６】
いくつかの態様において、グアニン環外窒素基上のアシル保護基（例えば、-C(=O)-R7）は、イソブツリル（iBu）、アセチル（Ac）、フェノキシアセチル（PAC）、p-イソプロピルフェノキシアセチル（iPrPAC）、フェニルアセチル、イソプロピルオキシアセチル、メトキシアセチル、ベンゾイル、p-メトキシフェニルアセチル、ジフェニルアセチル、シクロヘキシルカルボニル、1,1-ジメチルプロパノイル、およびp-tert-ブチル-フェノキシアセチルからなる群より選択される。
【００５７】
いくつかの態様において、グアニン環外窒素基上のアシル保護基は、イソブツリル（iBu）、アセチル（Ac）、フェノキシアセチル（PAC）、およびp-イソプロピルフェノキシアセチル（iPrPAC）からなる群より選択される。
【００５８】
いくつかの態様において、グアニン環外窒素基上のアシル保護基はイソブツリル（iBu）末端基である。
【００５９】
R2およびR4が一緒に二価の架橋を示す態様において、R3はCH2-O-DMTrまたはCH2-O-MMTrであってもよく、かつグアニン環外窒素基上のアシル保護基（例えば、-C(=O)-R7）はイソブツリル（iBu）であり、Rはフェニルであってもよく、かつR1は水素またはメチルのいずれかであってもよく、かつR5およびR6は一緒に式2に示すものなどの、5員複素環を形成する。
【００６０】
本発明の化合物は、いくつかの態様において、式50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、または61の化合物によって表されてもよい：
2019510021.tif 000019
2019510021.tif 000020
式中、R3およびR8（存在する場合）は本発明の化合物のとおりである。いくつかの態様において、R3はCH2ODMTr、CH2-アルキル-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-アルキル-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb、およびCH-Ra-O-MMTrRbからなる群より選択され、かつR8（存在する場合）はシアノエチルであってもよく；ここでRaおよびRbは本発明の化合物のとおりである。
【００６１】
いくつかの態様において、本発明は、式75、76、および77のいずれか1つの化合物を提供する：
2019510021.tif 000021
N-(9-((1S,3R,4R,6S,7S)-1-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-6-メチル-7-(((1R,3R,3aS)-3-フェニルテトラヒドロ-1H,3H-ピロロ[1,2-c][1,3,2]オキサザホスホル-1-イル)オキシ)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-3-イル)-6-オキソ-6,9-ジヒドロ-1H-プリン-2-イル)イソブチルアミド
2019510021.tif 000022
N-(9-((1R,3R,4R,7S)-1-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-7-(((1R,3R,3aS)-3-フェニルテトラヒドロ-1H,3H-ピロロ[1,2-c][1,3,2]オキサザホスホル-1-イル)オキシ)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-3-イル)-6-オキソ-6,9-ジヒドロ-1H-プリン-2-イル)イソブチルアミド
2019510021.tif 000023
N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-3-(2-メトキシエトキシ)-4-(((1R,3R,3aS)-3-フェニルテトラヒドロ-1H,3H-ピロロ[1,2-c][1,3,2]オキサザホスホル-1-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-オキソ-6,9-ジヒドロ-1H-プリン-2-イル)イソブチルアミド
いくつかの態様において、式75、76および77の化合物はメチルである（水素ではなく）R1基を有してもよいことが理解されるであろう。
【００６２】
溶媒組成物
本発明は、本発明の化合物および極性非プロトン性溶媒などの溶媒を含む溶媒組成物を提供する。適切には、本発明の化合物は溶媒に可溶性である。したがって、本発明は、本発明の化合物を含む溶液を提供する。溶液は安定な溶液であってもよい。安定な溶液、すなわち、本発明の化合物は溶媒に可溶性であり、かつ室温（例えば、20℃）で少なくとも24時間安定である。実施例は、本発明の化合物を含む溶液組成物の溶解性および安定性を判定する方法を提供する。
【００６３】
いくつかの態様において、本発明の化合物の溶液（例えば、溶液組成物）中での安定性は、実施例6に提供する安定性判定検定（典型的には20〜25℃などの室温で実施）を用いて24時間後に測定して、少なくとも約20％、例えば少なくとも約30％、例えば少なくとも約40％、例えば少なくとも約50％、例えば少なくとも約60％、例えば少なくとも約70％、例えば少なくとも約75％である。24時間後に安定性を示す（すなわち、実施例6の安定性判定検定を用いて測定した24時間後の残存化合物の量が少なくとも約20％、例えば少なくとも約30％、例えば少なくとも約40％、例えば少なくとも約50％、例えば少なくとも約60％、例えば少なくとも約70％、例えば少なくとも約75％である）、溶液中に溶解した本発明の化合物を含むそのような溶液は、本明細書において安定な溶液と呼ぶ。いくつかの態様において、本発明は、本明細書において言及するものなどの、本発明の化合物および溶媒を含む安定な溶液を提供する。
【００６４】
いくつかの態様において、溶媒は極性溶媒である。いくつかの態様において、溶媒は非プロトン性溶媒である。
【００６５】
いくつかの態様において、溶媒は、アセトニトリル、DMF、DMSO、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、およびジクロロエタンからなる群より選択される溶媒であるか、またはそれを含む。
【００６６】
いくつかの態様において、溶媒はアセトニトリルまたはジオキサンであるか、またはそれを含む。
【００６７】
いくつかの態様において、溶媒はアセトニトリルおよびアセトンを、例えば、約1：1の比で含む。
【００６８】
いくつかの態様において、溶媒はDMSOまたはDMFであるか、またはそれを含む。
【００６９】
いくつかの態様において、溶媒はテトラヒドロフランであるか、またはそれを含む。
【００７０】
いくつかの態様において、溶媒はジクロロメタンまたはジクロロエタンであるか、またはそれを含む。
【００７１】
いくつかの態様において、溶媒はトルエン以外である。いくつかの態様において、溶媒はトルエンを含まない。
【００７２】
いくつかの態様において、溶媒はDMSOまたはDMF以外である。いくつかの態様において、溶媒はDMSOまたはDMFを含まない。
【００７３】
本発明の化合物の合成法
本発明は、本発明の化合物の合成法であって、3'-OH基を含むグアニンヌクレオシド（Z）を；式4の化合物と反応させる段階を含む方法を提供する：
2019510021.tif 000024
式中、Xは臭化物、塩化物またはヨウ化物などのハロであり、かつR、R1、R5、R6、およびR9は本発明の化合物のとおりであり；
かつここでグアニンヌクレオシド上のグアニン核酸塩基基はグアニン環外窒素基上にアシル保護基-C(=O)-R7などのアシル保護基を含む。
【００７４】
いくつかの態様において、式4の化合物は式5、6、7、および8からなる群より選択される：
2019510021.tif 000025
式中、Xは塩化物、臭化物またはヨウ化物などのハロである。
【００７５】
いくつかの態様において、式4または5のXは塩化物である。下記は任意に式4、5、6、7および8の化合物に適用してもよい。
【００７６】
いくつかの態様において、Rはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリール、ニトロ、ハロゲン、シアノ、シリル、置換シリル、スルホン、置換スルホン（アリール置換スルホン）、フルオレン、および置換フルオレンからなる群より選択される。
【００７７】
いくつかの態様において、Rはアリール、ヘテロアリール、置換アリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択される。
【００７８】
いくつかの態様において、Rはフェニルなどのアリールである。
【００７９】
いくつかの態様において、Rが置換アリールである場合、Rはヨウ化物、フッ化物、臭化物または塩化物などのハロゲン化物で置換されていてもよく、例えば、ヨウ化物、フッ化物、臭化物または塩化物などのハロゲン化物で置換されたフェニルであってもよい。
【００８０】
いくつかの態様において、R1は水素である。いくつかの態様において、R1はメチル、エチルまたはプロピルなどのC1〜3アルキルである。いくつかの態様において、R1はメチルである。
【００８１】
いくつかの態様において、Rはフェニルなどのアリールであり、かつR1は水素である。
【００８２】
いくつかの態様において、Rはフェニルなどのアリールであり、かつR1はメチル、エチルまたはプロピルなどのC1〜3アルキルである。
【００８３】
いくつかの態様において、Rはフェニルであり、R1は水素であり、Xは臭素であり、かつR5およびR6は一緒に5員複素環を形成する。いくつかの態様において、Rはフェニルであり、R1はメチルであり、Xは臭素であり、かつR5およびR6は一緒に5員複素環を形成する。いくつかの態様において、Rはフェニルであり、R1は水素であり、Xは塩素であり、かつR5およびR6は一緒に5員複素環を形成する。いくつかの態様において、Rはフェニルであり、R1はメチルであり、Xは塩素であり、かつR5およびR6は一緒に5員複素環を形成する。
【００８４】
式4または式5、6、7もしくは8の化合物は、本発明の化合物の合成法において用い得る中間体化合物であり、したがって本発明は、式4、5、6、7、または8の化合物、およびヌクレオシドモノマー、例えば、アシル保護L-XNA-G、例えば、アシル保護L-LNA-Gモノマーの合成におけるその使用を提供する。
【００８５】
式4の中間体化合物（式5、6、7、および8の化合物などの）は、式9または式9aの化合物を、3ハロゲン化リン、例えばPCl3、PBr3、またはPI3、例えばPCl3と反応させることによる予備段階（段階A）において作製してもよい：
2019510021.tif 000026
式中、R、R1、R5、R9、およびR6は本発明の化合物のとおりである。
【００８６】
式9または9aの化合物と3ハロゲン化リンとの間の反応は、典型的にはN-メチルモルホリン（NMM）、トリエチルアミン、ピリジン、N-メチルイミダゾール、または1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタンなどの3級非求核塩基存在下で実施し、溶媒、例えば、トルエン、THF、ジオキサン、ジエチルエーテルまたはベンゼン、例えば、THFまたはトルエン中で実施してもよい。いくつかの態様において、3級非求核アミンはNMMであり、かつ溶媒はトルエンまたはTHFのいずれかである。
【００８７】
式9または9aのいくつかの態様において、Rはフェニルであり、かつR1は水素である。いくつかの態様において、Rはフェニルであり、かつR1はメチルである。
【００８８】
本発明は、式4、5、6、7、または8の化合物の合成法（これは本明細書に記載のいくつかの態様において段階Aと呼んでもよい）を提供し、本方法は、式9または9aの化合物を3ハロゲン化リン（式4および5*の化合物を作製するため）、例えば、3塩化リン（式6*の化合物を作製するため）、3ヨウ化リン（式7*の化合物を作製するため）、または3臭化リン（式8*の化合物を作製するため）の溶媒（例えば、トルエン）溶液と、0℃未満の温度で反応させて、式4、5、6、7、8、または9の化合物を生成する段階を含む。溶媒は、例えば、THFまたはトルエンなどの、トルエン、THF、ジオキサン、ジエチルエーテルまたはベンゼンからなる群より選択されてもよい。前駆体9aを用い、どの3ハロゲン化リンを用いるかに応じて、式5、6、7、8、または9の中間体（式5、6、7、および8に関して*によって示す）を作製し得ることが理解されるであろう。したがって、3ハロゲン化リンと式9または9aの化合物との反応は式4、5、6、7、または8の中間体化合物を生成する。
【００８９】
いくつかの態様において、化合物9（または9a）と3ハロゲン化リンとの反応は約-45℃〜約-65℃、例えば約50℃〜約-60℃の間、例えば約-55℃の温度で実施する。約なる用語は示した具体的な整数値を含む。
【００９０】
いくつかの態様において、PCl3などの3ハロゲン化リンを、式9または9aの化合物のもの以下のモル濃度で用いる。いくつかの態様において、段階Aで3ハロゲン化リンのモル量に比べて1モル過剰の式9または9aの化合物を用いる。いくつかの態様において、段階1における式9または9aの前駆体化合物の3ハロゲン化リンに対するモル比は、約1よりも大きい、例えば1.05またはそれより大きい。いくつかの態様において、段階1における式9または9aの前駆体化合物の3ハロゲン化リンに対するモル比は、1.5以下である。
【００９１】
合成後、式4、5、6、7、または8の化合物を、本明細書において段階Bと呼んでもよいその後の合成段階で用いるために、減圧下などで乾燥してもよく、任意に溶媒、例えば、トルエン、THF、ジオキサン、ジエチルエーテルまたはベンゼン、例えば、THFまたはトルエン中に再溶解してもよい。
【００９２】
本発明は、式3の化合物の合成法（これは本明細書に記載のいくつかの態様において段階Bと呼んでもよい）を提供し、本方法は、式4の化合物：
2019510021.tif 000027
（式中、Xは臭化物、ヨウ化物または塩化物などのハロであり（式5、6、7、または8の化合物などの）、かつR、R1、R5、R9、およびR6は本発明の化合物のとおりである）
を、式Xのヌクレオシド：
2019510021.tif 000028
（式中、R2、R3、およびR4は本発明の化合物のとおりである）
と、溶媒、例えばトルエン、THF、ジオキサン、ジエチルエーテル、またはベンゼン、例えばTHFまたはトルエン中、0℃未満の温度で反応させて、式3の化合物：
2019510021.tif 000029
を生成する段階を含む。いくつかの態様において、段階の反応を、有機塩基、例えば、3級非求核アミン塩基、例えば、n-メチルモルホリンおよびトリエチルアミン存在下で実施する。
【００９３】
いくつかの態様において、式4の（または式5、6、7、もしくは8の）化合物とヌクレオシドXとの反応を約-60℃〜約-80℃、例えば約65℃〜約-75℃の間、例えば約-77℃の温度で実施する。約なる用語は示した具体的な整数値を含む。
【００９４】
いくつかの態様において、段階Bで用いる式4の（または式5、6、7、もしくは8の）化合物とヌクレオシドXとのモル濃度比は、少なくとも2、例えば約2と約4、例えば約2と約3である。いくつかの態様において、式4の（または式5、6、7、もしくは8の）化合物を、式Xの化合物に比べて、1モル過剰で用いる。
【００９５】
いくつかの態様において、ヌクレオシドXの溶液を式4の（または式5、6、7、もしくは8の）化合物の溶液に徐々に、すなわち、1回の添加段階ではなく、例えば少なくとも15秒かけて、例えば少なくとも30秒、例えば少なくとも1分かけて、例えば少なくとも90秒、例えば少なくとも2分、例えば5〜30分の間、例えば10〜20分の間、例えば約15分で加える。
【００９６】
いくつかの態様において、ヌクレオシドは以下の式を有する：
2019510021.tif 000030
式中、B、R2、R3、R4は、本明細書の定義のとおりである。
【００９７】
いくつかの態様において、段階Bにおける反応は、塩基および溶媒存在下で起こる。いくつかの態様において、塩基は有機塩基、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、およびN-メチルモルホリンからなる群より選択される塩基である。いくつかの態様において、溶媒はトルエンまたはテトラヒドロフランであるか、またはそれを含み、任意にピリジンをさらに含む。いくつかの態様において、溶媒は極性非プロトン性溶媒であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、溶媒はアセトニトリル、DMF、DMSO、ジオキサン、テトラヒドロフラン、N-メチル-2-ピロリドン、ジクロロメタン、およびジクロロエタンからなる群より選択される溶媒であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、溶媒はテトラヒドロフラン（THF）であるか、またはそれを含み、塩基はトリメチルアミンである。いくつかの態様において、段階Bにおける反応は、0℃未満、例えば-10℃未満、例えば-20℃未満、例えば-30℃未満、例えば-40℃未満、例えば-50℃未満、例えば-60℃未満、例えば-70℃未満、例えば-75〜-80の間、例えば約-77℃の温度で起こる。約は言及した正確な整数を含む。
【００９８】
いくつかの態様において、式Xの化合物は、式62、63、64、65、66、67、68、69、70、および71の化合物から選択される：
2019510021.tif 000031
2019510021.tif 000032
式中、R2、R3、R4、R7およびR8は本発明の化合物のとおりである。
【００９９】
いくつかの態様において、式Xの化合物は、式72、73、または74の化合物であってもよい。
2019510021.tif 000033
N-(9-((1R,3R,4R,6S,7S)-1-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-7-ヒドロキシ-6-メチル-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-3-イル)-6-オキソ-6,9-ジヒドロ-1H-プリン-2-イル)イソブチルアミド
2019510021.tif 000034
N-(9-((1R,3R,4R,7S)-1-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-3-イル)-6-オキソ-6,9-ジヒドロ-1H-プリン-2-イル)イソブチルアミド
2019510021.tif 000035
N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシ-3-(2-メトキシエトキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-オキソ-6,9-ジヒドロ-1H-プリン-2-イル)イソブチルアミド
【０１００】
本発明は、式1の化合物（例えば、式3の化合物）の合成法を提供し、本方法は、その後の段階AおよびBを含む。方法段階Aおよび段階Bの一例を以下の反応図に示し、ここでRおよびR1は本発明の化合物のとおりであり、PX3はハロゲン化リンであり、Xはハロゲン化物、例えば、ヨウ化物、臭化物、または塩化物であり、かつBは本発明のアシル保護グアニン核酸塩基である。
2019510021.tif 000036
【０１０１】
オリゴヌクレオチド合成
本発明は、本発明の化合物、または本発明の化合物を含む溶媒組成物の、オリゴヌクレオチドの合成における使用を提供する。
【０１０２】
本発明のヌクレオシドモノマーは、オリゴヌクレオチド合成を介してオリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に、組み込まれたヌクレオシドに対して3'のSp立体規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間結合の生成をもたらす。
【０１０３】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはLNAオリゴヌクレオチドである。本発明のL-LNA-Gモノマーを、ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成などの、任意の適切なオリゴヌクレオチド合成法を介してオリゴヌクレオチドに組み込んでもよい。本発明のL-LNA-Gモノマーはホスホラミダイトである。いくつかの態様において、L-LNA-Gモノマーを、ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成中にオリゴヌクレオチドに組み込む。
【０１０４】
いくつかの態様において、本発明の方法によって作製したLNAオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのGモノマー、例えば少なくとも2つのGモノマー、例えば少なくとも3つのGモノマー、例えば少なくとも4つのGモノマーを含んでもよい。オリゴヌクレオチドの多くの設計が公知であり、本発明の方法を用いて、例えば、LNAギャップマー、ミックスマー、トータルマー、およびTINY LNAを作製してもよい。
【０１０５】
以下の図は、下に示す、ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成の方法において用い得る、酸化、キャッピングおよび脱保護の反復サイクルの概略図である。
2019510021.tif 000037
【０１０６】
オリゴヌクレオチドの調製法は、ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成などの、任意の適切なオリゴヌクレオチド合成法を用いてもよい。オリゴヌクレオチド合成は、unylinker支持体などの固体支持体上で実施してもよい。オリゴヌクレオチド合成は、カップリング、酸化、キャッピングおよび脱保護の連続段階によって実施してもよい。オリゴヌクレオチドが合成されれば、任意の残存保護基（例えば、-C(=O)-R7および存在する場合はR8）を除去してもよく、かつオリゴヌクレオチドを、例えば、60℃でNH4OHを用いて、固体支持体から遊離してもよい。
【０１０７】
立体規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
典型的には、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートはRpおよびSpホスホロチオエート結合の無作為混合物（ジアステレオマー混合物とも呼ぶ）として合成する。本発明の方法において、オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート結合の少なくとも1つが立体規定されている、すなわち、オリゴヌクレオチド試料中に存在するオリゴヌクレオチド分子の少なくとも75％、例えば少なくとも80％、または少なくとも85％、または少なくとも90％または少なくとも95％、または少なくとも97％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％、または（本質的に）すべてでRpまたはSpのいずれかである、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが提供される。立体規定されたオリゴヌクレオチドは、立体規定されている少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む。立体規定されたなる用語は、1つもしくは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間結合のRpもしくはSpのいずれかとして規定されたキラリティーを記載するために用いてもよく、またはそのような1つ（もしくは複数）のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記載するために用いてもよい。立体規定されたオリゴヌクレオチドは少量の任意の1つの位置の別の立体異性体を含み得ることが理解され、例えば、Wan et alはNAR、November 2014で報告したギャップマーについて98％の立体選択性を報告している。
【０１０８】
LNAオリゴヌクレオチド
LNAオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドである。LNAオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。本明細書において用いられるオリゴヌクレオチドなる用語は、それが当業者によって複数の共有結合されたヌクレオシドを含む分子と一般に理解されていると定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のために、オリゴヌクレオチドは典型的には長さ7〜30ヌクレオチドとして合成する。
【０１０９】
本明細書において用いられる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」なる用語は、標的核酸、特に標的核酸上の隣接配列にハイブリダイズすることにより、標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸に相補的であることによっても定義され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってsiRNAではない。アンチセンスオリゴは標的核酸に相補的な隣接ヌクレオチドを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的には1つまたは複数の修飾ヌクレオシド間結合を含み、かつ非限定例として、LNAギャップマーまたは混合ウィングギャップマーの形態であってもよい。他の態様において、オリゴヌクレオチドはLNAミックスマー（LNAおよび非LNAヌクレオチド、例えば、LNAおよびDNA（例えば、WO2007/112754を参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる）、またはLNAおよび2'-O-MOEヌクレオチド、またはLNA、DNAおよび2'O-MOEヌクレオチド）、またはLNAトータルマー（LNAだけのヌクレオチド、例えば、WO2009/043353を参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる）であってもよい。
【０１１０】
「修飾ヌクレオシド間結合」なる用語は、当業者によって、2つのヌクレオシドを一緒に共有結合する、ホスホジエステル（PO）結合以外の結合と一般に理解されていると定義される。修飾ヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチドをインビボでの使用のために安定化させる際に特に有用で、ヌクレアーゼ切断に対して保護するのに役立ち得る。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ抵抗性、有益な薬動力学、および製造の容易さゆえに、特に有用である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド、またはその隣接ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも70％、例えば少なくとも80％または例えば少なくとも90％はホスホロチオエートである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド、またはその隣接ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合はすべてホスホロチオエートであり、ここでホスホロチオエートヌクレオシド間結合の少なくとも1つは立体規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間結合（オリゴヌクレオチド合成中の本発明のアシル保護L-XNA-Gモノマーのオリゴヌクレオチドへの組み込みに由来する）である。さらなるヌクレオシド間結合はWO2009/124238（参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている。
【０１１１】
核酸塩基なる用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、およびシトシン）部分を含む。本発明の文脈において、核酸塩基なる用語は、天然の核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能する、修飾核酸塩基も含む。いくつかの態様において、核酸塩基部分は、核酸塩基を修飾または置き換えることにより修飾される。この文脈において、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンなどの天然核酸塩基、ならびに非天然変種の両方を意味する。そのような変種は、例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1.に記載されている。
【０１１２】
ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構築ブロックであり、本発明のために、天然および非天然ヌクレオチドの両方を含む。本質的に、DNAおよびRNAヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分および1つまたは複数のリン酸基（ヌクレオシドにはない）を含む。修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、同等のDNAまたはRNAヌクレオシド/ヌクレオチドに比べて、リボース糖部分、核酸塩基部分、または修飾ヌクレオチドの場合はヌクレオシド間結合への修飾の導入によって修飾される。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは交換可能に「単位」または「モノマー」と呼んでもよい。
【０１１３】
本明細書において用いられる「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」なる用語は、同等のDNAまたはRNAヌクレオシドに比べて、糖部分または（核酸）塩基部分の1つまたは複数の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを意味する。修飾ヌクレオシドなる用語は、本明細書において「ヌクレオシド類縁体」または修飾「単位」または修飾「モノマー」なる用語と交換可能に用いてもよい。修飾ヌクレオシドの例は別の項「オリゴマー修飾」およびその下位の項において記載する。
【０１１４】
アシル保護環外窒素
グアニンの環外窒素基を以下に例示する（囲み）。この基は本発明の化合物においてアシル基で保護する。酸素基も任意に保護してもよい。
2019510021.tif 000038
【０１１５】
L-XNA-Gモノマー
いくつかの態様において、本発明の化合物は、DNAまたはRNA以外のヌクレオシド部分（Z）を含み、そのようなモノマーはL-XNA-Gモノマーと呼ぶ。L-XNA-G（およびL-LNA-G）における「L」なる注釈は、式1、2および3に示す立体中心R/R1（およびR6/R9位などのR9位の立体中心）における立体化学を意味する。別の立体異性体、D型は、R/R1およびR9立体中心において逆の立体化学を有する。DNAおよびRNA以外のヌクレオシドはヌクレオシド類縁体と呼んでもよい。ヌクレオシドは高親和性ヌクレオシド（高親和性ヌクレオシド類縁体）であってもよい。そのようなモノマーには、LNAモノマー（L-LNA-Gモノマー）、ならびに2'O-MOE、2'-フルオロまたは2'Oメチルなどの2'置換ヌクレオシドが含まれるが、それらに限定されない。他の2'置換は当技術分野において公知で、いくつかを本明細書におけるR2の定義の下に挙げる。
【０１１６】
LNA Gモノマー
LNA-Gなる用語は、フランセ環およびグアニン核酸塩基に2'-4'ビラジカルを含むヌクレオシドを意味する。本発明は、非環式窒素基がアシル保護基を用いて保護されている、L-LNA-Gモノマーを提供する。任意に、G残基の酸素原子も保護されている。
【０１１７】
ロックド核酸ヌクレオシド（LNA）
LNAヌクレオシドは、ヌクレオチドのリボース糖環のC2'とC4'との間にリンカー基（ビラジクルまたは架橋と呼ぶ）を含む修飾ヌクレオシド（すなわち、R2およびR4が一緒に二価の架橋を示す態様）である。これらのヌクレオシドは、文献中では架橋核酸または二環式核酸（BNA）とも呼ばれる。
【０１１８】
いくつかの態様において、本発明のモノマーは、LNAヌクレオシドであるか、またはそれを含み、例えば、本発明の化合物は式IまたはIIのものであり得る。
2019510021.tif 000039
注釈Zは本発明の化合物のアシル保護グアニンヌクレオシド（Z）を表し、これは例示のために含まれる。
【０１１９】
Bはアシル保護グアニン核酸塩基を示し；R、R1、R6、R3、R9、R5は本発明の化合物のとおりである。
【０１２０】
Xは、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zからなるリストより選択される基を示す。
【０１２１】
いくつかの態様において、Xは、-O-、-S-、NH-、NRaRb、-CH2-、CRaRb、-C(=CH2)-、および-C(=CRaRb)-からなる群より選択される。
【０１２２】
いくつかの態様において、Xは-O-である。
【０１２３】
Yは、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zからなる群より選択される基を示す。
【０１２４】
いくつかの態様において、Yは、-CH2-、-C(RaRb)-、-CH2CH2-、-C(RaRb)-C(RaRb)-、-CH2CH2CH2-、-C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、および-C(Ra)=N-からなる群より選択される。
【０１２５】
いくつかの態様において、Yは、-CH2-、-CHRa-、-CHCH3-、CRaRb-からなる群より選択され、
または-X-Y-は一緒に、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zからなる群より選択される1、2、または3つの基/原子からなる二価のリンカー基（ラジクルとも呼ぶ）を示し、
いくつかの態様において、-X-Y-は、-X-CH2-、-X-CRaRb-、-X-CHRa-、-X-C(HCH3)-、-O-Y-、-O-CH2-、-S-CH2-、-NH-CH2-、-O-CHCH3-、-CH2-O-CH2、-O-CH(CH3CH3)-、-O-CH2-CH2-、OCH2-CH2-CH2-、-O-CH2OCH2-、-O-NCH2-、-C(=CH2)-CH2-、-NRa-CH2-、N-O-CH2、-S-CRaRb-および-S-CHRa-からなる群より選択されるビラジクルを示す。
【０１２６】
いくつかの態様において、-X-Y-は-O-CH2-または-O-CH(CH3)-を示す。
【０１２７】
かつRaおよび、存在する場合Rbは、それぞれ独立に水素、置換されていてもよいC1〜6-アルキル、置換されていてもよいC2〜6-アルケニル、置換されていてもよいC2〜6-アルキニル、ヒドロキシ、置換されていてもよいC1〜6-アルコキシ、C2〜6-アルコキシアルキル、C2〜6-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1〜6-アルコキシカルボニル、C1〜6-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1〜6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1〜6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1〜6-アルキル)アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、C1〜6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1〜6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1〜6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1〜6-アルキルチオ、ハロゲンから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基RaおよびRbは一緒に置換されていてもよいメチレン（=CH2）を示してもよく、ここですべてのキラル中心について、非対称の基はRまたはS配向のいずれで見いだされてもよい。
【０１２８】
R10は水素であってもよく、またはいくつかの態様において：置換されていてもよいC1〜6-アルキル、置換されていてもよいC2〜6-アルケニル、置換されていてもよいC2〜6-アルキニル、ヒドロキシ、C1〜6-アルコキシ、C2〜6-アルコキシアルキル、C2〜6-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1〜6-アルコキシカルボニル、C1〜6-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1〜6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1〜6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1〜6-アルキル)アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、C1〜6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1〜6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1〜6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1〜6-アルキルチオ、ハロゲンからなる群より選択されてもよく、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基は一緒にオキソ、チオキソ、イミノ、または置換されていてもよいメチレンを示してもよい。
【０１２９】
いくつかの態様において、R10はメチルなどのC1〜6アルキル、および水素から選択される。
【０１３０】
いくつかの態様において、R10は水素である。
【０１３１】
いくつかの態様において、Raは水素またはメチルのいずれかである。いくつかの態様において、存在する場合、Rbは水素またはメチルのいずれかである。
【０１３２】
いくつかの態様において、RaおよびRbの一方または両方は水素である。
【０１３３】
いくつかの態様において、RaおよびRbの一方は水素であり、他方は水素以外である。
【０１３４】
いくつかの態様において、RaおよびRbの一方はメチルであり、他方は水素である。
【０１３５】
いくつかの態様において、RaおよびRbの両方はメチルである。
【０１３６】
いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-O-CH2-であり、かつR10は水素である。いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-S-CH2-であり、かつR10は水素である。
【０１３７】
いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-NH-CH2-であり、かつR10は水素である。
【０１３８】
いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-O-CH2-CH2-または-O-CH2-CH2-CH2-であり、かつR10は水素である。
【０１３９】
いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-O-CH2-であり、かつR10はメチルなどのC1〜6アルキルである。
【０１４０】
いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-O-CRaRb-であり、ここでRaおよびRbの一方または両方はメチルなどの水素以外であり、かつR10はメチルなどのC1〜6アルキルである。
【０１４１】
いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は二価のリンカー基-O-CH(CH2OCH3)-（2'O-メトキシエチル二環式核酸−Seth at al., 2010, J. Org. Chem., 2010, 75 (5), pp 1569-1581）を示す。いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は二価のリンカー基-O-CH(CH2CH3)-（2'O-エチル二環式核酸−Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-O-CHRa-であり、かつR10は水素である。
【０１４２】
いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-O-CH(CH2OCH3)-であり、かつR10は水素である。そのようなLNAヌクレオシドは当技術分野において環式MOE（cMOE）としても公知で、WO07090071に開示されている。
【０１４３】
いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は、R-またはS-配置いずれかの二価のリンカー基-O-CH(CH3)-を示す。いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は一緒に二価のリンカー基-O-CH2-O-CH2-（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-O-CH(CH3)-であり、かつR10は水素である。そのような6'メチルLNAヌクレオシドは当技術分野においてcETヌクレオシドとしても公知で、WO07090071（ベータ-D）およびWO2010/036698（アルファ-L）に開示されるとおり、(S)cETまたは(R)cET立体異性体のいずれであってもよい。
【０１４４】
いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-O-CRaRb-であり、ここでRaまたはRbのいずれも水素ではなく、かつR10は水素である。いくつかの態様において、RaおよびRbは両方メチルである。
【０１４５】
いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-S-CHRa-であり、かつR10は水素である。
【０１４６】
いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-C(=CH2)-CH2-、または-C(=CH2)-CH(CH3)-などの-C(=CH2)-C(RaRb)-であり、かつR10は水素である。
【０１４７】
いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-N(-ORa)-であり、かつR10は水素である。いくつかの態様において、RaはメチルなどのC1〜6アルキルである。いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は一緒に二価のリンカー基-O-NRa-CH3-（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。いくつかの態様において、ビラジクル-X-Y-は-N(Ra)-であり、かつR10は水素である。いくつかの態様において、RaはメチルなどのC1〜6アルキルである。
【０１４８】
いくつかの態様において、かつR10はメチルなどのC1〜6アルキルである。そのような態様において、ビラジクル-X-Y-は-O-CH2-または-O-C(HCH3)-などの-O-C(HCRa)-から選択されてもよい。
【０１４９】
いくつかの態様において、ビラジクルはCH2-O-CH2-などの-CRaRb-O-CRaRb-であり、かつR10は水素である。いくつかの態様において、RaはメチルなどのC1〜6アルキルである。
【０１５０】
いくつかの態様において、ビラジクルはO-CH2-O-CH2-などの-O-CRaRb-O-CRaRb-であり、かつR10は水素である。いくつかの態様において、RaはメチルなどのC1〜6アルキルである。
【０１５１】
特に記載がないかぎり、LNAヌクレオシドはベータ-Dまたはアルファ-L立体異性体であり得ることが理解されるであろう。
【０１５２】
実施例において示すとおり、本発明のいくつかの態様において、LNAヌクレオシドは、2'-4'架橋が式Iのとおりであり、かつXが酸素であり、YがCH2であり、かつR10が水素であるなどの、ベータ-D-オキシ-LNAヌクレオシドであるか、またはそれを含む。
【０１５３】
ギャップマー
本明細書において用いられるギャップマーなる用語は、1つまたは複数の親和性増強修飾ヌクレオシド（フランク）によって5'および3'に隣接するRNアーゼH動員オリゴヌクレオチド（gap）の領域を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。様々なギャップマーの設計を本明細書において記載する。ヘッドマーおよびテールマーは、フランクの一方が欠損している、すなわち、オリゴヌクレオチドの末端の一方だけが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む、RNアーゼHを動員可能なオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーでは、3'フランクが欠損しており（すなわち、5'フランクは親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）、テールマーでは、5'フランクが欠損している（すなわち、3'フランクは親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）。
【０１５４】
LNAギャップマー
LNAギャップマーなる用語は、親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも1つがLNAヌクレオシドである、ギャップマーオリゴヌクレオチドである。
【０１５５】
混合ウィングギャップマー
混合ウィングギャップマーなる用語は、フランク領域が少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび少なくとも1つの非LNA修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも1つの2'置換修飾ヌクレオシド、例えば、2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA（MOE）、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸（ANA）、2'-フルオロ-ANAおよび2'-F-ANAヌクレオシドを含む、LNAギャップマーを意味する。いくつかの態様において、混合ウィングギャップマーはLNAヌクレオシドを含む1つのフランク（例えば、5'または3'）を有し、他のフランク（それぞれ3'または5'）は2'置換修飾ヌクレオシドを含む。
【０１５６】
長さ
本明細書において言及するヌクレオチド分子の長さに言及する場合、モノマー単位がヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体のいずれかに関わらず、長さはそれらのモノマー単位、すなわちヌクレオチドの数に対応する。ヌクレオチドに関して、モノマーおよび単位なる用語は本明細書において交換可能に用いられる。本発明のプロセスは、例えば、7〜30ヌクレオチド、例えば、7〜10、例えば、7、8、9、10または10〜20ヌクレオチド、例えば、12〜18ヌクレオチド、例えば、12、13、14、15、16、17もしくは18ヌクレオチドからなる短いオリゴヌクレオチドの精製に特に適している。
【０１５７】
本発明のさらなる態様
1.  式1の化合物：
2019510021.tif 000040
式中、
Zは、グアニン核酸塩基基がグアニン環外窒素基上にアシル保護基を含む、グアニンヌクレオシドであり、ここで式Iの環外酸素はヌクレオシドZの3'炭素に共有結合されており；
R5およびR6は独立に、水素、アルキル、シクロ-アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換シクロ-アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールからなる群より選択されるか、またはR5およびR6は一緒に、式1のN原子と共に3〜16炭素原子を含む複素環を形成し；
R1は水素およびC1〜3アルキルからなる群より選択され；R9は水素であり；
かつRはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリール、ニトロ、ハロゲン、シアノ、シリル、置換シリル、スルホン、置換スルホン（アリール置換スルホン）、フルオレン、および置換フルオレンからなる群より選択される。
【０１５８】
2.  Rがアリール、ヘテロアリール、置換アリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択される、態様1記載の化合物。
【０１５９】
3.  Rがフェニルなどのアリールである、態様1記載の化合物。
【０１６０】
4.  R1が水素である、態様1〜3のいずれか1つに記載の化合物。
【０１６１】
5.  R1がメチルなどのC1〜3アルキルである、態様1〜3のいずれか1つに記載の化合物。
【０１６２】
6.  R5およびR6が一緒に、式（I）のN原子と共に3〜16（例えば4）炭素原子を含む複素環を形成する、態様1〜5のいずれか1つに記載の化合物。
【０１６３】
7.  R5およびR6が一緒に、式（I）のN原子と共に4炭素原子を含む複素環を形成する、態様1〜5のいずれか1つに記載の化合物。
【０１６４】
8.  式2の化合物である、態様6または7記載の化合物：
2019510021.tif 000041
式中、Z、R、およびR1は態様1〜7のいずれか1つに記載のとおりである。
【０１６５】
9.  式3の化合物である、態様1〜8のいずれか1つに記載の化合物：
2019510021.tif 000042
式中、
R、R1、R5、R6およびR9は態様1〜8のいずれか1つに記載のとおりであり；
Bはグアニン環外窒素基上にアシル保護基を含むグアニン核酸塩基基であり；
R3＝CH2ODMTr、CH2-アルキル-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-アルキル-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb、およびCH-Ra-O-MMTrRbからなる群より選択され；
R2は-Fなどのハロ、アミノ、アジド、-SH、-CN、-OCN、-CF3、-OCF3、-O(Rm)-アルキル、-S(Rm)-アルキル、-N(Rm)-アルキル、-O(Rm)-アルケニル、-S(Rm)-アルケニル、-N(Rm)-アルケニル；-O(Rm)-アルキニル、-S(Rm)-アルキニルまたは-N(Rm)-アルキニル；O-アルキレニル-O-アルキル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリール、O-アラルキル、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)またはO-CH2C(=O)-N(Rm)(Rn)、-O-(CH2)2OCH3、および-O-CH3からなる群より選択され、ここで各RmおよびRnは独立に、H、アミノ保護基または置換もしくは無置換C1〜10アルキルであり；
R4＝アルキル、シクロ-アルキル、シクロ-ヘテロアルキル、O-アルキル、S-アルキル、NH-アルキル、および水素からなる群より選択され；
またはR2およびR4は一緒に、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=N、O、-Si(Ra)2-、S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zからなる群より選択される1、2、3の基/原子からなる二価の架橋を示し；
ここでRaおよび、存在する場合はRbは、それぞれ独立に水素、置換されていてもよいC1〜6-アルキル、置換されていてもよいC2〜6-アルケニル、置換されていてもよいC2〜6-アルキニル、ヒドロキシ、置換されていてもよいC1〜6-アルコキシ、C2〜6-アルコキシアルキル、C2〜6-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1〜6-アルコキシカルボニル、C1〜6-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリール-オキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロ-アリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1〜6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1〜6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1〜6-アルキル)アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、C1〜6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1〜6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1〜6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1〜6-アルキルチオ、ハロゲンから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基RaおよびRbは一緒に置換されていてもよいメチレン（=CH2）を示してもよく、ここですべてのキラル中心について、非対称の基はRまたはS配向のいずれで見いだされてもよい。
【０１６６】
10.  グアニン環外窒素基上のアシル保護基が-C(=O)-R7であり、ここでR7は置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、またはアリール基、好ましくは置換されていてもよいC1〜6-アルキル基、C2〜6-アルケニル基、C2〜6-アルキニル基、C3〜7-シクロアルキル基、またはフェニル基からなる群より選択され；ここで、置換されている場合、置換基は、例えば、ハロゲン、C1〜6-アルキル、C2〜6-アルケニル、C2〜6-アルキニル、C1〜6-アルコキシ、置換されていてもよいアリールオキシまたは置換されていてもよいアリールからなる群より選択される1つまたは複数の置換基で一置換または多置換されていてもよい、態様1〜9のいずれか1つに記載の化合物。
【０１６７】
11.  グアニン環外窒素基上のアシル保護基が、イソブツリル（iBu）、アセチル（Ac）、フェノキシアセチル（PAC）、p-イソプロピルフェノキシアセチル（iPrPAC）、フェニルアセチル、イソプロピルオキシアセチル、メトキシアセチル、ベンゾイル、p-メトキシフェニルアセチル、ジフェニルアセチル、シクロヘキシルカルボニル、1,1-ジメチルプロパノイル、およびp-tert-ブチル-フェノキシアセチルからなる群より選択される、態様1〜9のいずれか1つに記載の化合物。
【０１６８】
12.  グアニン環外窒素基上のアシル保護基が、イソブツリル（iBu）、アセチル（Ac）、フェノキシアセチル（PAC）、およびp-イソプロピルフェノキシアセチル（iPrPAC）からなる群より選択される、態様1〜9のいずれか1つに記載の化合物。
【０１６９】
13.  グアニン環外窒素基上のアシル保護基がイソブツリル（iBu）である、態様1〜9のいずれか1つに記載の化合物。
【０１７０】
14.  R2およびR4が一緒に架橋-C(RaRb)-O-、-C(RaRb)C(RaRb)-O-、-CH2-O-、-CH2CH2-O-、および-CH(CH3)-O-からなる群より選択される二価の架橋を示す、式IIIの、態様9〜13のいずれか1つに記載の化合物。
【０１７１】
15.  R2およびR4が二価の架橋-CH2-O-（メチレン-オキシ）または-CH(CH3)-O-（メチル-メチレン-オキシ）を示す、態様9〜13のいずれか1つに記載の化合物。
【０１７２】
16.  R3がCH2-O-DMTrまたはCH2-O-MMTrである、態様1〜15のいずれか1つに記載の化合物。
【０１７３】
17.  式16または17の化合物である、態様1〜16のいずれか1つに記載の化合物：
2019510021.tif 000043
式中、R、R1、R9、R3、R7およびR8は態様1〜16のいずれか1つに記載のとおりである。
【０１７４】
18.  Rがフェニルであり、かつR1が水素またはメチルである、態様17記載の化合物。
【０１７５】
19.  Rがフェニルであり、かつR1が水素である、態様17記載の化合物。
【０１７６】
20.  Rがフェニルであり、かつR1がメチルである、態様17記載の化合物。
【０１７７】
21.  アシル保護基（-C(=O)-R7）がイソブツリルである、態様17〜20のいずれか1つに記載の化合物。
【０１７８】
22.  態様1〜21のいずれか1つに記載の化合物および溶媒を含む溶液。
【０１７９】
23.  溶媒が極性非プロトン性溶媒であるか、またはそれを含む、態様22記載の溶液。
【０１８０】
24.  溶媒がアセトニトリル、DMF、DMSO、ジオキサン、テトラヒドロフラン、N-メチル-2-ピロリドン、ジクロロメタン、およびジクロロエタンからなる群より選択される、態様22または23記載の溶液。
【０１８１】
25.  態様1〜21のいずれか1つに記載の化合物、または態様22〜24に記載の溶液の、オリゴヌクレオチドの合成における使用。
【０１８２】
26.  態様1〜21のいずれか1つに記載の化合物の合成法であって、3'-OH基を含むグアニンヌクレオシドを、式4の化合物と反応させる段階を含む方法：
2019510021.tif 000044
式中、Xはヨウ化物、臭化物または塩化物などのハロゲン化物であり、かつR、R1、R5、R9およびR6は前記態様のいずれか1つに記載のとおりであり、かつここでグアニンヌクレオシド上のグアニン核酸塩基基はグアニン環外窒素基上に態様10〜13のいずれか1つに記載のアシル保護基などのアシル保護基を含む。
【０１８３】
27.  式4の化合物のXが塩化物である、態様26記載の方法。
【０１８４】
28.  式4の化合物が
2019510021.tif 000045
からなる群より選択される、態様26または27記載の方法。
【０１８５】
29.  R、R1、R5、R6およびR9が態様1〜25のいずれか1つに定義のとおりである、態様26〜28のいずれか1つに記載の方法。
【０１８６】
30.  ヌクレオシドが以下の式を有する、態様26〜29のいずれか1つに記載の方法：
2019510021.tif 000046
式中、B、R2、R3、R4は、態様9〜25のいずれか1つの定義のとおりである。
【０１８７】
31.  反応段階が塩基および溶媒存在下で起こる、態様26〜30のいずれか1つに記載の方法。
【０１８８】
32.  塩基が有機塩基、例えば、3級非求核有機塩基、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、およびN-メチルモルホリンからなる群より選択される塩基である、態様32記載の方法。
【０１８９】
33.  溶媒が態様22〜24のいずれか1つで定義したものからなる群より選択される、態様31または32記載の方法。
【０１９０】
34.  溶媒がテトラヒドロフラン（THF）またはトルエンであるか、またはそれを含み、任意に溶媒がピリジンをさらに含んでもよい、態様26〜33のいずれか1つに記載の方法。
【０１９１】
35.  反応が0℃未満、例えば-50℃未満の温度で起こる、態様26〜34のいずれか1つに記載の方法。
【実施例】
【０１９２】
実施例1
一般合成法：
トルエン（50mL）中のN-メチルモルホリンの溶液に、PCl3（2.93mL 33.4mmol）を-70℃で10分間で加えた。その後、トルエン（50mL）中のプロリン（P5-DまたはP5-L）補助剤（6.24g 35.2mmol）を30分間で加えた（P5-DおよびP5-Lの合成についてはJ. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 16031-16037参照）。得られた混合物を室温で1.5時間撹拌し、その後、溶媒および揮発性物質を減圧下（40℃および15mbar）で除去した。次いで、残りの残渣をTHF（50mL）に溶解し、その後、-70℃まで冷却し、続いてまずNEt3（17.8mL 128mmol）と、次いで、30分間で、5'-ODMT-DNA-ヌクレオシド（16mmol）をTHF（50mL）中の溶液として加えた。反応混合物を-77℃で30分間と、次いで室温で2時間撹拌した。その後、冷EtOAc（200mL）を加え、混合物を冷NaHCO3（150mL）、食塩水（150mL）で洗浄し、乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、蒸発乾固させた。粗生成物をアルゴン雰囲気下、シリカ上での分解を避けるために溶離剤中に含まれる7％NEt3を用いて、フラッシュカラムクロマトグラフィにより精製した。
【０１９３】
生成物を、例えば、EtOAc、THF、およびNEt3からの少量の残存溶媒を含む可能性がある、固体として得た。
【０１９４】
前述の手順を用いて、以下のモノマーを合成した。
2019510021.tif 000047
【０１９５】
実施例2
D-LNA-G-DMFの合成
5'-ODMT-LNA-G（3.51g 5.00mmol）をピリジンと、次いでトルエンと共に同時蒸発させて、任意の残存する水または他の溶媒を除去した。次いで、残渣をピリジン（10mL）およびTHF（10mL）に溶解した。この溶液をD-オキサザホスホリジン（3.51g 5.00mmol）、PCl3（0.88mL 10.0mmol）、およびNEt3（3.50mL 25.0mmol）の溶液に-77℃で加えた。次いで、得られた反応混合物を-77℃で15分間と、次いで室温で1.5時間撹拌した。その後、EtOAc（150mL）を加え、混合物を冷NaHCO3（100mL）および食塩水（100mL）で洗浄し、Na2SO4を用いて乾燥し、ろ過し、最後にトルエンと一緒に蒸発させた。
【０１９６】
得られた残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤EtOAc中のTHF、10％〜30％＋7％NEt3）により精製して、D-LNA-G-DMF（3.91g、推定収率84％）を得た。
2019510021.tif 000048
【０１９７】
実施例3
L-LNA-G-DMFの合成
5'-ODMT-LNA-G（4.91g 7.00mmol）をピリジンと、次いでトルエンと共に同時蒸発させて、任意の残存する水または他の溶媒を除去した。次いで、残渣をピリジン（10mL）およびTHF（15mL）に溶解した。この溶液をL-オキサザホスホリジン（2.48g 14.0mmol）、PCl3（1.22mL 14.0mmol）、およびNEt3（4.90mL 35.0mmol）の溶液に-77℃で加えた。次いで、得られた反応混合物を-77℃で15分間と、次いで室温で1.5時間撹拌した。その後、EtOAc（150mL）を加え、混合物を冷NaHCO3（100mL）および食塩水（100mL）で洗浄し、Na2SO4を用いて乾燥し、ろ過し、最後にトルエンと一緒に蒸発させた。
【０１９８】
得られた残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤EtOAc/DCM 1：1中のTHF、15％〜25％＋7％NEt3の勾配を用いて）により精製して、D-LNA-G-DMF（3.41g、推定収率84％）を得た。生成物を前述のカラムクロマトグラフィにより精製した。
2019510021.tif 000049
【０１９９】
実施例4
D-DNA G-DMFの合成
トルエン（50mL）中のN-メチルモルホリンの溶液に、PCl3（2.93mL 33.4mmol）を-70℃で10分間で加えた。その後、トルエン（50mL）中のP5-D（6.24g 35.2mmol）を30分間で加えた。得られた反応混合物を室温で1.5時間撹拌し、その後、溶媒および揮発性物質を減圧下（40℃および15mbar）で除去した。次いで、残りの残渣をTHF（50mL）に溶解し、その後、-70℃まで冷却し、続いてまずNEt3（17.8mL 128mmol）と、次いで、30分間で、5'-ODMT-DNA-G（9.99g 16.0mmol）をTHF（50mL）中の溶液として加えた。反応混合物を-77℃で30分間と、次いで室温で2時間撹拌した。その後、冷EtOAc（200mL）を加え、混合物を冷NaHCO3（150mL）、食塩水（150mL）で洗浄し、乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、蒸発乾固させた。粗生成物をアルゴン雰囲気下、フラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離剤DCM/EtOAc＝2/1＋7％NEt3）により精製した。D-DNA-G-DMFを、痕跡量の溶媒不純物（EtOAc、トルエン、およびNEt3）を含む白色泡状物（10.6g、72％）として単離した。
2019510021.tif 000050
【０２００】
実施例5
L-DNA G-DMFの合成
トルエン（25mL）中のN-メチルモルホリンの溶液に、PCl3（1.33mL 15.2mmol）を-55℃で5分間で加えた後、トルエン（25mL）中のP5-L（2.84g 16.00mmol）を15分間で加えた。得られた反応混合物を-55〜45℃で10分間と、次いで室温で1.5時間撹拌した。次いで、溶媒および他の揮発性物質を減圧下（40℃および6mbar）で除去した。次いで、残りの残渣をTHF（25mL）に溶解し、-77℃まで冷却した。その後、NEt3（8.92mL 64mmol）と、続いてTHF（25mL）中の5'-ODMT-DNA-G-DMF（4.5g 7.2mmol）の溶液を15分間で加えた。反応混合物を-77℃で15分間と、次いで室温で3時間撹拌した。その後、EtOAc（150mL）を加え、混合物を冷NaHCO3（100mL）、食塩水（50mL）で抽出し、乾燥（Na2SO4）し、ろ過し、蒸発させた。
【０２０１】
生成物をアルゴン雰囲気下、フラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離剤EtOAc/DCM＝1/2＋7％NEt3）により、痕跡量のEtOAcと共に白色泡状物（3.77g、63％）として単離した。
2019510021.tif 000051
【０２０２】
実施例6
L-LNA-G-Ibuモノマーの合成
5'-OAP-LNA-G-iBu誘導体の合成の手順
2019510021.tif 000052
【０２０３】
段階A：トルエン（15mL）中のN-メチルモルホリン（1.76mL 16.0mmol）の溶液に、PCl3（0.66mL 7.6mmol）を-55℃で5分間で加えた。その後、トルエン（12mL）中の(S)-フェニル-(R)-ピロリジン-2イル)メタノール（P5-D）（1.42g 8.00mmol）を次の15分間で加えた。次いで、反応混合物を-55〜-45℃の間で10分間と、次いで室温で1.5時間撹拌した。
溶媒および他の揮発性化合物を40℃および6mbarの減圧下で除去し、その後、THF（13mL）を加えた。
【０２０４】
段階B：これに続いて、反応混合物を-77℃まで冷却し、その後、トリエチルアミン（5.54mL 40mmol）と、続いてTHF（13mL）中の5'-ODMT-LNA-G-iBu（2.67g 4mmol）の溶液を15分間で加えた。得られた混合物を-77℃で15分間と、次いで室温で3時間撹拌した。その後、EtOAc（75mL）を加え、混合物を冷NaHCO3（50mL）および食塩水（50mL）で洗浄し、Na2SO4を用いて乾燥し、ろ過し、減圧下で蒸発させた。粗生成物をAr雰囲気下、フラッシュカラムクロマトグラフィ（EtOAc：ヘキサン、1：4＋7％NEt3）により精製した。
生成物を白色泡状物（1.95g、推定収率55％）として得た。
DMSO中の31P-NMR 148.8 ppm＋28.8 ppmに1％。
【０２０５】
D-LNA G-iBuおよびL-LNA G-iBu両方の合成のさらなる最適化
2019510021.tif 000053
【０２０６】
前駆体（例えばP5）よりもわずかに過剰のPCl3は生成物（例えばOAP-LNA-GiBu）の収率を著しく低下させる副生成物を生じさせることが判明した。したがって、少なくともモル当量の前駆体およびPCl3を用いることが望ましい。いくつかの態様において、段階1における前駆体のPCl3に対するモル比は、約1よりも大きい、例えば1.05またはそれより大きい。いくつかの態様において、段階1における前駆体のPCl3に対するモル比は1.5以下である。
【０２０７】
段階2における中間体の2倍を超えるモル当量の使用は、生成物の最も高い収率をもたらすことが判明した（表、項目3および5参照）。いくつかの態様において、中間体（例えば5'-ODMT-G/iBu）の前駆体およびPCl3に対するモル比は2よりも大きい。
【０２０８】
生成物の純度を31P-NMRスペクトルから判定した。
【０２０９】
実施例6
生成物の安定性および溶解性の判定
L-LNA G-DMFおよびL-LNA G-i-Buの安定性および溶解性を調査するために、以下の実験手順に従った：
1.5mLバイアルに0.013mmolのアミダイトを加え、その後、固体材料を0.13mLの溶媒に溶解した。その後、バイアルに栓をし、ボルテックスにかけ、最後に室温で24時間放置した。次いで、溶解した材料を、溶解性に関して目視検査した（図1）。溶液が混濁、またはそれ以外に非均質に見える場合、溶解性は「なし」とした。溶液が完全に均質に見えれば、溶解性は「あり」とした（検査を24時間後に繰り返した）。
【０２１０】
安定性判定法：分析を完了するために、アミダイトの安定性をAgilent 1100シリーズHPLC-MSを以下の仕様で用いて調査した：
カラム：Waters XTerra、MS C-18、5μm、2.1×100mm
温度：40℃
流速：0.3mL/分
検出：254nmのUV
分析時間：12分
溶離剤：A：H20中0.1％飽和NH4OH水溶液 B：CH3CN中20％A
時間（分）：B溶離剤％：
0.00：80
0.50：80
3.00：100
7.00：100
8.00：80
12.00：80
【０２１１】
親化合物の質量およびUVピークを、0時間および24時間で特定した。この後、他の副生成物と比べての相対的安定性を、UVクロマトグラム（254nm）を積算し、面積を0時間で記録されたクロマトグラムに対して規準化することにより報告した（図2）。
【０２１２】
3つのモノマーについての合成後0時間および24時間の溶解性データを図1に示す。様々な溶媒中で24時間後に測定した安定性データを図2ならびに図3a（L-LNA-G-iBu）および3b（L-LNA-G-DMF）に示す。
【０２１３】
モノマーL-LNA G-DMFはほとんどの溶媒（MeCN、MeCN：DCE、MeCN：Tol、MeCN：アセトン、ジオキサン、およびTHF）に不溶性である。モノマーが可溶性である溶媒（MeCN：DCM、DMF、DMSO、NMP、DCM、DCE、およびトルエン）は、非常な不安定性を示す。最良の溶媒はDCMで、24時間後にアミダイトの10％が残る。
【０２１４】
モノマーL-LNA G-i-Buは調査したすべての溶媒（異なる12の）に溶解性で、最もよく機能するのはMeCN、MeCN：アセトン、DCM、およびDCEである。L-LNA G-i-Buモノマーについて調査したすべての溶媒は、溶解性および安定性の有意な改善を示す。
【図１】
2019510021.tif 000058
【図２】
2019510021.tif 000059
【図３】
2019510021.tif 000060
【国際調査報告】
2019510021.tif 000061
2019510021.tif 000062
2019510021.tif 000063