(57)【要約】  設計された人工培地を使用し、最小限の処理で採取することができ、ここから、真菌産物（例えば、抗生物質、タンパク質、及び脂質）を単離することができる高密度糸状菌バイオマットを産生する、真菌を成長させる新規な方法が開示され、この方法により、エネルギー使用、酸素化、水の使用及び廃液の生成のための真菌栽培費用が安くなる。
2019510492.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌バイオマットを製造する方法であって、
（ａ）有効量の少なくとも１種類の糸状菌の浮遊細胞を人工成長培地に播種するステップ、
（ｂ）撹乱のない状態で、所定期間、前記播種済成長培地をインキュベートするステップ、
（ｃ）糸状菌バイオマットを製造するステップ、及び
（ｄ）場合により、前記糸状菌バイオマットを採取するステップを含む、上記方法。
【請求項２】
糸状菌バイオマットを製造する方法であって、
（ａ）人工成長培地に、７．５％（体積：体積）の少なくとも１種類の糸状菌の浮遊細胞を播種するステップ、
（ｂ）撹乱のない状態で、所定期間、前記播種済成長培地をインキュベートするステップ、
（ｃ）糸状菌バイオマットを製造するステップ、及び
（ｄ）場合により、前記糸状菌バイオマットを採取するステップを含む、上記方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種類の糸状菌が、ＭＫ７と命名された菌株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０６９８）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種及びクモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種類の糸状菌が、ＭＫ７と命名された菌株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０６９８）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）又はリゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１種類の糸状菌が、ＭＫ７と命名された菌株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０６９８）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記人工培地が約１８．６ａｔｍの浸透圧を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記人工培地が約０．３６８のイオン強度を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
バイオマット細胞密度が少なくとも２５ｇ／Ｌ（乾燥重量／培地（Ｌ））である少なくとも１つの細胞層を含む、糸状菌バイオマット。
【請求項９】
前記糸状菌が、ＭＫ７と命名された菌株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０６９８）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種及びクモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種からなる群から選択される、請求項８に記載の糸状バイオマット。
【請求項１０】
前記糸状菌が、ＭＫ７と命名された菌株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０６９８）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）又はリゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）である、請求項８又は９に記載の糸状バイオマット。
【請求項１１】
前記糸状菌が、ＭＫ７と命名された菌株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０６９８）である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の糸状バイオマット。
【請求項１２】
フィラメントが、空気：バイオマット界面及び／又はバイオマット：培地界面に対して平行に主に組織化されている、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の糸状バイオマット。
【請求項１３】
前記バイオマットが、少なくとも２つの構造的に異なる細胞層を含み、１つの細胞層は人工培地及び少なくとも１つのもう一方の細胞層と接触する、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の糸状バイオマット。
【請求項１４】
前記細胞層間の構造差が、層内の細胞の密度である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の糸状バイオマット。
【請求項１５】
前記１つの細胞層が、空気及び少なくとも１つのもう一方の細胞層と接触している、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の糸状バイオマット。
【請求項１６】
前記バイオマットが、３つの構造的に異なる細胞層を含む、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の糸状バイオマット。
【請求項１７】
前記バイオマットの引張強度が、少なくとも０．２ｋｇ／マット幅（ｃｍ）である、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の糸状バイオマット。
【請求項１８】
細胞密度が少なくとも５０ｇ／ｌ又は少なくとも７５ｇ／ｌである、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の糸状バイオマット。
【請求項１９】
前記バイオマットは、タンパク質含有量が少なくとも４０％である、請求項８〜１８のいずれか一項に記載の糸状バイオマット。
【請求項２０】
前記バイオマットは、脂質含有量が少なくとも３９％である、請求項８〜１９のいずれか一項に記載の糸状バイオマット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、グロムス門（Ｇｌｏｍｅｒｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の範囲内、例えば、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種を含むケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）の範囲内の種の単離された糸状真菌株、ＭＫ７と命名された好酸性糸状真菌及びその子孫、及び他種態様な有用な産物を産生するこのような真菌株から表面発酵を行い、糸状菌バイオマットを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの真菌の細胞は、菌糸と呼ばれる、管状の細長く糸状の構造として成長し、菌糸は、複数の核を含んでいる場合もあり、先端で成長することによって伸びていく。これは、細胞の鎖を用いて繰り返し細胞分裂することによって成長する糸状の緑藻類などの同様の外観をした生物とは対照的である。
【０００３】
真菌の栄養生長期を構成する菌糸の集合体は、菌糸体（ｍｙｃｅｌｉｕｍ）（複数形はｍｙｃｅｌｉａ）と呼ばれる。菌糸体は、真菌の主体又は主要形態と考えることができ、糸状であると記載されることが多い。成長は、菌糸の無性生殖によって起こり、菌糸は分岐鎖へと成長する。菌糸体が、土又は木材を通って移動し、その基質を食品として使用することができるため、菌糸体は、真菌にとって重要であり、真菌は、果実体（例えば、子実体）、例えば、キノコ、サルノコシカケ、トリュフ、チャワンタケ又はアミガサタケを産生する場合には必要とするだろう。
【０００４】
菌糸体は、外酵素を分泌し、外酵素は、生きている組織を殺し（死体栄養性）、次いで、死んだ材料を吸収することができ（腐栄養性）、これらは、単純に、既に死んだ材料を吸収し（これも腐栄養性）、又は生きている組織を食べる（生体栄養性）ことによる。
【０００５】
真菌界の全ての門は、糸状種を含んでいると考えられているが、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）及び接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）は、特に、多数の糸状種を含む。これらの門のメンバーは、多種多様な製品、例えば、タンパク質、アミノ酸、油類、医薬品（例えば、ペニシリン）、食品（例えばテンペ）、食品添加物、食品防腐剤（例えば、クエン酸）、工業用酵素、及びベーキング、チーズ、ビール及びワインの製造に使用されるものを製造する。
【０００６】
最先端の固体基質発酵（ＳＳＦ）には、多くの明白な欠点がある。例えば、最終生成物（すなわち生成されたバイオマス）は、固体基質と密に混合し、基本的に、一方を他方から分離することが困難である。典型的には、ＳＳＦは、真菌バイオマスを低濃度で産生し、変換率が非常に低く、最終的には、収率が低い。ＳＳＦは、効果的な発酵のために、特定の水分活性を必要とする。正しい量の水分活性を供給し、維持することは困難であり、実施に費用がかかる。ＳＳＦ系に空気を含ませることも、達成するのが困難であり、変換効率をさらに悪化させ、システム収率を制限してしまう。不適切な水分活性と換気不良は、物質移動と熱移動を制限し、その結果、過剰に加熱され、酸素の供給が不足する。得られたバイオマスは、無作為に配向したフィラメントを有するものとして特性付けられ、これは、特定の用途（すなわち食物及び／又は動物飼料）において有用性を大きく制限する。
【０００７】
Ｑｕｏｒｎ（商標）は、主にフザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）糸状菌のバイオマスで構成される製品であり、比較的栄養価の高いマイコプロテインを与える。Ｑｕｏｒｎ（商標）は、最先端の深部発酵系によって生産され、バッチ系連続プロセスで大量生産が可能である。商業的に実行可能ではあるものの、この生産方法論には、多くの明白な欠点がある。商業的な要求を満たすために、Ｑｕｏｒｎ（商標）は、それぞれ３，５００万〜４，０００万ドルのバイオリアクターを使用する。Ｑｕｏｒｎ（商標）システムは、真菌系が主要な指標を超えて成熟するまで、又は別の種によって汚染されるまで、単一のリアクター内で連続的に実行される。この時点で、生産は停止し、リアクターと、関連する全ての配管が空にされ、滅菌され、プロセスを終了するのに数週間がかかる場合もあり、市販製品の供給業者にとって多くの重大な問題が発生する。このような問題は、例えば、（１）生産サイクルを予測することが困難であること、（２）清掃及び生産の停止に要する費用、（３）在庫管理の困難さなどである。さらに、大型のバイオリアクターにおける深部発酵は、通気及び混合に多大な量のエネルギーを必要とする。バイオマスを発酵させる液体からバイオマスを分離するには、遠心分離が必要であり、遠心分離も、労働集約的であり、エネルギーを必要とするプロセスであることが知られている。このプロセスは、さらに、水を多く消費し、多量の廃水を取り扱う必要がある。生産されたバイオマスは、フィラメント長が短いことを特性とし、結合剤を導入することなく食品／飼料製品に直接的に変換する能力を制限し、その後の処理工程は、さらに、費用、困難さを付与し、効率的に管理するのに努力が必要である。
【０００８】
現在の糸状菌糸体成長の方法論には、多くの欠点がある。例えば、適切な通気を有する設備と、真菌の成長、その後の成長培地からの真菌の菌糸体の分離（例えば、遠心分離）に必要な装置は、特に、工業規模で真菌の成長を行うには、かなりの資本を必要とする。現行のプロセスは、大量のエネルギーと水の投入を必要とするだけでなく、大きな廃液の生成にもつながる。
【０００９】
結果として、糸状菌糸体の糸状菌バイオマット形成への合理化された手法が業界において必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本開示は、現在使用されているプロセスの限界を克服する。ここで、糸状菌バイオマットは、換気を必要としない新規な成長培地に所望な真菌株を播種した後に、表面発酵によって生成される。この表面発酵の方法は、様々な範囲の産業にわたって幅広い種類の製品を生産することができる多種多様な真菌種に適用可能である。開発された培地は、迅速な細胞成長を引き起こし、長いフィラメントを含む高密度の糸状菌バイオマットを生成し、少量の廃液を生成し、炭素源、炭素と窒素の比率（Ｃ：Ｎ）、処理パラメータの関数として生産される糸状真菌バイオマットの操作を可能にする。全体的な影響は、水使用量、エネルギー使用量、設備要件及び二酸化炭素排出量によって測定されるような環境影響を最小限にしつつ、高い生産速度が得られることである。
【００１１】
したがって、本開示は、糸状菌を培養し、糸状真菌バイオマットの生産を可能にするのに適した人工培地を提供する。人工培地は、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、炭素（Ｃ）、カリウム（Ｋ）、硫黄（Ｓ）、酸素（Ｏ）、水素（Ｈ）といった多量栄養素と、鉄（Ｆｅ）、ホウ素（Ｂ）、銅（Ｃｕ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、及び亜鉛（Ｚｎ）といった微量栄養素とを少なくとも含む。ある場合では、クロム（Ｃｒ）、セレン（Ｓｅ）、バナジウム（Ｖ）などのさらなる微量栄養素を用い、微量栄養素を強化する。人工培地は、高いタンパク質：脂質比又は高い脂質：タンパク質比のいずれかを有する糸状菌バイオマットの生成に望ましい様々なＣ：Ｎ比を有する。
【００１２】
糸状菌バイオマット生産のための種々の糸状真菌を培養する条件も提供され、そのいくつかは好酸性であり、例えば、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フシスポリウム（Ｆｕｓｉｓｐｏｒｉｕｍ）、プソイドフザリウム（Ｐｓｅｕｄｏｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、スポロトリチェラ（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｅｌｌａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｏｃｏｄｅｒｍａ）、ケカビ．ｓｐ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ  ｓｐ．）内の種（例えば、リゾプス  ｓｐ．（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．））の種及び／又は菌株、及びＭＫ７と命名される糸状真菌株である。種及び／又は菌株に応じて、培地のｐＨは、約０．６８〜約８．５の範囲、ある場合には、１０．５までである。この方法の一実施形態は、１つ以上の真菌種及び／又は菌株を人工培地に播種すること、及びこの真菌種及び／又は菌株を成長させ、１つ以上の有用な産物を含む糸状バイオマスを生産することを含む。
【００１３】
生産された糸状菌バイオマットは、表面発酵によって、嫌気性条件、微好気性条件、好気性条件、又はこれらの組み合わせから得られる。糸状菌バイオマットは、分生子、小分生子、大分生子、分生子殻（ｐｙｃｎｉｄｉａ）、厚膜胞子、菌糸、菌糸の一部、又はこれらの任意の組み合わせ及び全ての組み合わせの形態で、真菌種及び／又は菌株及び／又はそれらの子孫を含む。
【００１４】
また、糸状菌バイオマットを採取する方法、糸状菌によって産生された有用なタンパク質、アミノ酸及び／又は脂質の単離及び／又は精製も提供される。これらのタンパク質、アミノ酸及び／又は脂質は、食品、魚飼料、動物飼料、油、脂肪酸、医薬品、栄養補助食品、殺真菌剤、除草剤、殺酵母剤、殺虫剤、バイオ潤滑剤に、及び他の価値が付加された製品のための原料として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ａ、Ｂ：イエローストーン国立公園の温泉環境における天然のＭＫ７株。Ｃ、Ｄ：高い密度、高い引張強度、凝集性を有する純粋なバイオマスを示す、明確な人工的条件の下で製造されたＭＫ７株バイオマス。Ｅ：Ｃ、ＤのＭＫ７株バイオマスの断面。
【図２】播種材料を作成するために使用される例示的な１０Ｌバイオリアクター。
【図３】Ａ：第２世代の保管培養物から集められた白色菌糸体マットを示すループ。Ｂ：ＭＫ７株菌糸体マットを含むペトリ皿。
【図４】トレイリアクターに播種するために使用される１０Ｌバイオリアクター中でのＭＫ７株培養物の成長及びｐＨ。Ｃ：Ｎ比が７．５：１である７．５％グリセロール含有量でのＭＫ７−１液体培地。播種材料として使用するための最適な培地は、バイオマスが後期対数成長期にあるとき（矢印の間）、７２〜９０時間の間に作成される。
【図５】Ａ：バイオマットを製造するためのトレイリアクターとして使用されるトレイ。トレイ中のルーラーの長さは、３１．７５ｃｍ（１２．５インチ）長である。Ｂ：３９個のプラスチックトレイを保持するために使用されるトレイラックシステムからなるバイオリアクター。リアクター全体が、Ｓａｒａｎ（登録商標）などの透明プラスチックラップで包まれる。
【図６】窒素を制限した条件下（Ｃ：Ｎ比が４０：１）、１．５リットルのＭＫ７−１培地と１２５ｇ／Ｌのグリセロールが入った０．２５ｍ２トレイ中、８日間表面発酵した後に、高脂質生産のために栽培された採取したＭＫ７株バイオマット。
【図７】遅延期を示す、浅いトレイ中でのＭＫ７株の典型的な成長パターン。バイオマスの蓄積速度は、比較的遅く（０〜１．５日間）、対数成長が始まったときのバイオマット形成時間（矢印、１．５日間）である。７．５％グリセロールを含み、Ｃ：Ｎ比が３０：１のＭＫ７−１培地中で成長させたバイオマット。
【図８】３種類の大きさの範囲にあるトレイサイズにおいて、グリセロール上で成長させたＭＫ７株バイオマットの乾燥重量。
【図９】栽培期間及び温度の関数としてのＭＫ７株によるリノレン酸産生。４％グリセロール表面発酵、ｐＨ２．８及びＭＫ７−１培地。
【図１０】ＭＫ７−１培地＋グリセロールを用いて製造した５日齢のＭＫ７バイオマットの断面の透過光顕微鏡画像。Ａ、Ｂ：気中菌糸層、遷移領域層及び緻密底部層の３層を示す５０倍ズーム。Ｃ：２つの別個の層を示す５０倍ズーム。
【図１１】ＭＫ７−尿素培地を用いて製造した５日齢のＭＫ７バイオマットの断面顕微鏡写真。Ａ：緻密菌糸体層から外側に伸びる気中菌糸と菌糸体を表すＭＫ７株バイオマットの上部表面。倍率１００倍で透過光顕微鏡を用いて生成された画像。Ｂ：緻密菌糸体層から外側に伸びる気中菌糸と菌糸体を表すＭＫ７株バイオマットの上部表面。倍率４００倍で透過光顕微鏡を用いて生成された画像。Ｃ：菌糸と菌糸体を表すＭＫ７株バイオマットの底部表面。倍率４００倍で透過光顕微鏡を用いて生成された画像。Ｄ：絡み合った繊維組成を表すＭＫ７株バイオマットの緻密な内部。倍率４００倍で透過光顕微鏡を用いて生成された画像。
【図１２】Ａ、Ｂ：ｐＨ４．１、５％グリセロールを含むＭＫ−７培地を用い、０．２５ｍ２トレイで６日間成長させたリゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）のバイオマット。Ｃ：マットにおけるリゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）の菌糸の４００倍光学顕微鏡画像。
【図１３】Ａ：４日後、Ｂ：６日後の０．２５ｍ２トレイリアクターで成長させたフザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）の画像。ＭＫ７−１培地を用い、ｐＨ５．０、１２．５％グリセロールでバイオマットを成長させた。画像Ｃは、光学顕微鏡を用いて倍率４００倍で撮影したＦ．ベネナタム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）の菌糸形態を示す。これらの条件下で、Ｆ．ベネナタム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）は、２つのトレイについて、１トレイ当たり平均で７１ｇの乾燥バイオマスを産生した。
【図１４】Ａ：５ｇ未満のＭＫ７株乾燥重量バイオマス／Ｌ（培地：原料混合物）で、リグノセルロース中に完全に組み込まれたＭＫ７株を示す、固体状態発酵（ＳＳＦ）によって栽培されたＭＫ７株バイオマスの採取。Ｂ：小麦わらにランダムに組み込まれたフィラメントを示す、Ａの採取されたＭＫ７株バイオマスの顕微鏡画像。Ｃ：緻密な（１８０ｇ・Ｌ）凝集性の本質的に純粋なＭＫ７株バイオマスを示す、固体基質表面発酵（ＳＳＳＦ）によるＭＫ７株バイオマット。
【図１５】１２．７×１２．７ｃｍトレイ中で７日間、様々な処理をしたＭＫ７株の栽培。エラーバーは、３つのトレイの標準偏差である。
【図１６】左：１２．５％グリセロールと共にｐＨ２．７で８時間培養した後のＭＫ７株の光学顕微鏡画像。右：細胞面積の４０〜６０％と推定される高い割合の脂質を示す、ナイルレッド染色後の蛍光画像。
【図１７】ＭＫ７株によって産生された脂質プロファイル。（左パネル）培地のＣ：Ｎ比の関数としての、直接的なエステル交換における全脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）（全燃料能）及び抽出可能な脂質フラクションの平均（ｎ＝３）。抽出可能な脂質フラクションの棒グラフ内の棒グラフは、トリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド（ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ）及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）といった構成要素を表す。挿入図は、脂質フラクションの主成分であるＴＡＧ分子を含むＧＣ−ＦＩＤクロマトグラムを示す。（右パネル）全ての脂肪酸からＦＡＭＥへの直接的なエステル交換（直接（Ｄｉｒｅｃｔ））から作られた脂質のＦＡＭＥプロファイルと、抽出可能な脂質前駆体のみから誘導されるＦＡＭＥ（抽出可能（Ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅ））。挿入図は、Ｄｉｒｅｃｔフラクション及びＥｘｔｒａｃｔａｂｌｅフラクションのＧＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。
【図１８】初期ｐＨ４．８で、Ａｃｉｄ  Ｗｈｅｙ  Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ培地（ＡＷＳ）で７日間成長させた後のＭＫ７株バイオマット（Ａ、Ｂ、Ｃ）。材料の糸状性を示すバイオマット（Ｃ）の透過光顕微鏡画像（４００倍）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
本明細書で使用される場合、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」との動詞及びその活用形は、非限定的な意味で、この単語に続く項目を含むが、具体的に述べられていない項目を除外しないことを意味するように、本明細書及び特許請求の範囲で使用される。これに加え、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による、ある要素への言及は、文脈上、その要素が１つ存在し、１つのみであることを明確に要求する場合を除き、その要素が１つより多く存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「〜に由来する」という用語は、供給源を指し、天然に存在する分子、組換え分子、未精製分子又は精製分子を含んでいてもよい。特定の単離された真菌株及び／又はその子孫に由来する真菌は、特定の突然変異を含んでいてもよいが、その由来となる単離された真菌株又はその子孫の顕著な形態学的特性及び生理学的特性の１つ、２つ、もしくはそれより多く、又は全てを依然として保持している。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「好酸性」との用語は、最適な成長条件が酸性条件下である生物を指す。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「原料」との用語は、燃料として直接使用することができ、又は別の形態の燃料又はエネルギー生成物に変換することができる任意の再生可能な生物学的材料を指す。バイオマス原料は、エタノール、ブタノール、バイオディーゼル及び他の炭化水素燃料のような燃料を得るために使用される植物材料及び藻類材料である。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「リグノセルロース系原料」という句は、リグノセルロースを含有する原料を指す。リグノセルロース系原料の非限定的な例としては、農業作物残留物（例えば、小麦わら、大麦わら、稲わら、小粒穀物わら、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維（例えば、トウモロコシ繊維ガム（ＣＦＧ）、蒸留乾燥穀物（ＤＤＧ）、コーングルテンミール（ＣＧＭ））、目的をもって成長させた草作物、エネルギー作物、スイッチグラス、ヘイアルファルファ、サトウキビバガス）、コーンスティープリカー、ビートパルプ非農業バイオマス（例えば、藻類マット、都市樹木残留物）、コーンスティープリカー、ビートパルプ、森林産物及び工業残留物（例えば、軟木の一次／二次粉砕残留物、硬木軟木の一次／二次粉砕残留物、リサイクル紙、パルプスラッジ）、リグノセルロースを含有する廃棄物（例えば、新聞紙、廃棄紙、醸造穀物、都市有機廃棄物、庭塵芥、医療用有機廃棄物、バイオ燃料の生産中に作られる廃棄物（例えば、処理した藻類バイオマス、グリセロール、セルロースエタノールの生産からの残留物、バイオディーゼル生産からの固体残留物）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２１】
本明細書で使用される場合、特に明記されない限り、「炭水化物」との用語は、少なくとも２個のヒドロキシル基と組み合わせてアルデヒド基又はケトン基を含む、炭素、水素及び酸素の化合物を指す。本発明の炭水化物は、１つ以上の位置で場合により置換又は脱酸素されていてもよい。したがって、炭水化物は、置換及び非置換の単糖類、二糖類、オリゴ糖類及び多糖類を含む。糖は、アルドース又はケトースであってもよく、３個、４個、５個、６個又は７個の炭素を含んでいてもよい。一実施形態では、これらは、単糖類である。別の実施形態では、これらは、ピラノース糖及びフラノース糖であってもよい。これらは、場合により、任意の対応するＣ位置で脱酸素されていてもよく、及び／又は１つ以上の部分、例えば、水素、ハロ、ハロアルキル、カルボキシル、アシル、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、チオール、イミン、スルホニル、スルファニル、スルフィニル、スルファモイル、エステル、カルボン酸、アミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、チオエステル、チオエーテル、オキシム、ヒドラジン、カルバメートで置換されていてもよい。これらの糖単位は、任意の順序で並んでいてもよく、２つの糖単位間の架橋は、約１０の異なる様式のいずれかで生じてもよい。その結果、異なる可能な立体異性体オリゴ糖鎖の数は膨大である。一実施形態では、上述の炭水化物は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「単糖」という用語は、３炭素糖（トリオース）、４炭素糖（テトロース）、５炭素糖（ペントース）、６炭素糖（ヘキソース）など、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される糖モノマーを指す。一実施形態では、５炭素糖は、ケトペントース（例えば、リブロース、キシルロース）、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、リキソース）、デオキシ糖（デオキシリボース）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、６炭素糖は、アルドヘキソース（例えば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、イドース、ガラクトース、タロース）、環状ヘミアセタール、ケトヘキソース（例えば、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）からなる群から選択される。一実施形態では、上述の単糖類は、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトースなど、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２３】
一実施形態では、単糖類は、直鎖形態であり、別の実施形態では、単糖類は、環状形態である。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「発酵性糖」という句は、有用な付加価値が付けられた発酵産物に変換することが可能な糖化合物を指し、その非限定的な例としては、アミノ酸、タンパク質、糖類、炭水化物、脂質、核酸、ポリケチド、ビタミン、医薬品、動物飼料用補助物質、特殊化学品、化学原料、プラスチック、溶媒、燃料、又はその他の有機ポリマー、乳酸、エタノールが挙げられる。開示される方法によって生産され得る特定の付加価値が付けられた製品としては、限定されないが、β−グルカン、乳酸；特殊化学品；クエン酸、コハク酸及びマレイン酸を含む有機酸；溶媒；魚飼料及び動物飼料の補助物質；医薬品；ビタミン；アミノ酸、例えば、リシン、メチオニン、トリプトファン、トレオニン、カロテノイド、ヒト食品、栄養補助食品及びアスパラギン酸；工業的酵素、例えば、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ及びキシラナーゼ；及び化学原料が挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「真菌」又は「真菌類」との用語は、吸収性栄養素を含み、クロロフィルを欠く、真核生物の明確な一群を指す。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「酸性化物質」との用語は、溶媒（例えば水）に添加されると、水素イオン活性が純粋な溶媒（例えば、水）よりも大きな溶液を与える、任意の物質、化学化合物、薬剤及び／又は組成物を指す。この物質は、気体、液体又は固体の形態であってもよい。この物質は、有機物及び／又は無機物であってもよい。酸性化物質の非限定的な例としては、ハロゲン化水素を含む任意の物質及びその溶液（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、臭化水素酸（ＨＢｒ）及びヨウ化水素酸（ＨＩ））、ハロゲンオキソ酸（例えば、次亜塩素酸、塩素酸、過塩素酸、過ヨウ素酸、及び臭素及びヨウ素についての対応する化合物）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、フルオロスルホン酸、硝酸（ＨＮＯ３）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、フルオロアンチモン酸、フルオロホウ酸、ヘキサフルオロリン酸、クロム酸（Ｈ２ＣｒＯ４）、スルホン酸、メタンスルホン酸（別名メシル酸、ＭｅＳＯ３Ｈ）、エタンスルホン酸（別名エシル酸、ＥｔＳＯ３Ｈ）、ベンゼンスルホン酸（別名ベシル酸、Ｃ６Ｈ５ＳＯ３Ｈ）、ｐ−トルエンスルホン酸（別名トシル酸ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｈ）、トリフルオロメタンスルホン酸（別名トリフル酸、ＣＦ３ＳＯ３Ｈ）、カルボン酸（例えば、酢酸、クエン酸、ギ酸、グルコン酸、乳酸、シュウ酸、酒石酸）、ビニル性カルボン酸（例えば、アスコルビン酸、メルドラム酸）、酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、硫化水素ナトリウム（ＮａＨＳ）、重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）、リン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）及びリン酸二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４））が挙げられる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「中和する（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ）」、「中和する（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ）」及び「中和」との用語は、水溶液中での化学反応を指し、酸と塩基が反応して水と塩を生成し、この溶液のｐＨは、初期ｐＨに戻る。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「マンガン供与体」との用語は、水溶液中でマンガンイオン（例えば、マンガン（Ｉ）、マンガン（ＩＩ）及びマンガン（ＩＩＩ））を与えることができる組成物又は化合物を指す。マンガン供与体の非限定的な例としては、Ｍｎ２（ＣＯ）１０、Ｋ５Ｍｎ（ＣＮ）６ＮＯ、ＭｎＣｌ、ＭｎＦ２、ＭｎＢｒ２、ＭｎＯ、ＭｎＯ２、ＭｎＣｈ、ＭｎＦ３、ＭｎＢｒ３、ＭｎＣＯ３、Ｍｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、Ｃ６Ｈ９ＭｎＯ６、ＭｎＴｉＯ３、［ＣＨ３ＣＯＣＨ＝Ｃ（Ｏ）ＣＨ３］２Ｍｎ、［Ｃ６Ｈ１１（ＣＨ２）３ＣＯ２］２Ｍｎ、（ＨＣＯ２）２Ｍｎ、Ｍｎ（Ｃ５ＨＦ６Ｏ２）２、Ｍｎ（ＰＨ２Ｏ２）２、ＭｎＩ、（Ｃ３Ｈ５Ｏ３）２Ｍｎ、ＭｎＭｏＯ４、Ｍｎ（ＮＯ３）２、Ｍｎ（ＣｌＯ４）２、Ｃ３２Ｈ１６ＭｎＮ８、ＭｎＳＯ４、（ＣＨ３ＣＯＯ）３Ｍｎ、Ｃ３２Ｈ１６ＣｌＭｎＮ８、Ｃ４８Ｈ２８ＣｌＭｎＮ４Ｏ８、Ｃ５Ｈ４ＣＨ３Ｍｎ（ＣＯ３）、Ｍｎ（Ｃ５Ｈ４Ｃ２Ｈ５）２及びＣ１６Ｈ２２Ｍｎが挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ｐＨ緩衝物質」との用語は、液体混合物中に添加された場合に、この液体混合物のｐＨを維持することができる組成物を指し、ここで、ｐＨは、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０付近に維持される。例えば、液体混合物のｐＨは、約０．５〜約３．０の範囲内である。糸状好酸性ＭＫ７株の好ましいｐＨは、約２．２〜約３．０である。このような組成物は、酸、酸塩、塩基及び塩基塩、例えば、ＨＣｌ、Ｈ２ＮＯ３、Ｈ２ＳＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＨＳ、ＮａＨＳＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨＳＯ３、ＫＨＣＯ３、ＫＨＳ、ＫＨＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨＳＯ３、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、ＣａＣＯ３、ＭｇＣＯ３、Ｎａ２Ｓ、Ｋ２Ｓなどの化合物を含んでいてもよい。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「好気性条件」との用語は、十分な酸素が供給され、このような条件下で成長する微生物における嫌気呼吸が妨げられ、嫌気性代謝経路が阻害され、嫌気呼吸を妨げる条件を指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）」及び「微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ）」との用語は、相互に置き換え可能に使用され、酸素の供給が制限されるが、生物における細胞呼吸が主に好気呼吸である条件を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「脂肪酸」との用語は、一方の末端にメチル基を有し、他方の末端にカルボン酸基を有する長鎖分子を指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「単離された真菌」との用語は、天然源から得られる真菌集団を含む任意の組成物を指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「炭素源」との用語は、一般に、原核細胞又は真核細胞の成長のための炭素源として使用されるのに適した物質を指す。炭素源としては、限定されないが、バイオマス加水分解物、酸ホエイ、スイートホエイ、炭水化物（例えばデンプン、スクロース、多糖類及び単糖類）、セルロース、ヘミセルロース、キシロース及びリグニン、及びこれらの物質のモノマー構成要素及び／又はこれらの組み合わせが挙げられる。炭素源は、種々の形態での種々の有機化合物を含んでいてもよく、限定されないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含む。これらの炭素源としては、例えば、種々の単糖類、例えば、グルコース、デキストロース（Ｄ−グルコース）、マルトース、オリゴ糖類、多糖類、飽和又は不飽和の脂肪酸、サクシナート、ラクタート、アセタート、エタノールなど、又はこれらの混合物が挙げられる。炭素源は、原料又はリグノセルロース系原料、例えば、サトウダイコンパルプであってもよい。光合成生物は、光合成の産物としてさらに炭素源を産生することができる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「生体触媒」との用語は、反応の活性化エネルギーを下げることによって化学反応を加速させる任意の種類の生体系又は細胞を指し、プロセスで消費されたり、変化したりしない。生体触媒としては、限定されないが、酵母、真菌、細菌、古細菌などの微生物が挙げられるだろう。例えば、本発明の単離された真菌種及び／又は菌株は、タンパク質及び脂質の産生において、又はタンパク質及び脂質を産生するための炭素基質又は有機分子の分解において、生体触媒として使用することができる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「発酵」又は「発酵プロセス」との用語は、生物又は生体触媒が、原材料（例えば、炭素源及び栄養素）を含む培地中で栽培され、その生物又は生体触媒が、これらの原材料を産物に変換するプロセスを指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「バイオマス」との用語は、生きている生物又は最近まで生きていた生物（例えば、緑色植物の茎、葉及びデンプン含有部分、又は木材、廃棄物、森林残留物（死んだ樹木、枝及び切り株）、庭塵芥、木材チップ、又は藻類又は動物に由来する物質、及び／又は工業副産物及び廃液、食品廃棄物／スクラップ及び他の単純な糖類）に由来する生体材料を指す。ある場合には、バイオマスは、かなりの部分のタンパク質及び／又は脂質を含有する。他の場合には、バイオマスは、主に、デンプン、リグニン、ペクチン、セルロース、ヘミセルロース及び／又はペクチンで構成される。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「セルロース系バイオマス」との用語は、ヒトが食べることができないか、又はほとんど食べることができない植物繊維で主に構成され、顕著な構成要素としてセルロースを含むバイオマスを指す。これらの繊維は、加水分解され、微生物によって発酵され得る様々な糖類を生成し得る。セルロース系バイオマスの例としては、農業又は林産物産業から生じる草、木材、及びセルロースが豊富な残留物が含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「糸状バイオマット」及び「糸状菌バイオマット」との用語は、相互に置き換え可能に用いられ、糸状菌によって産生され、糸状菌を含むバイオマットを指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「デンプン」との用語は、消化酵素（例えば、アミラーゼ）によって容易に加水分解されるグルコースのポリマーを指す。デンプンは、通常、ジャガイモ、トウモロコシ穀粒、米穀、小麦穀物及びサトウキビ茎などの植物の特定の部分に濃縮されている。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「リグニン」との用語は、植物の構造的な剛性の基礎を形成し、多くは植物の木材部分と呼ばれる、主に架橋したフェノール系モノマー化合物（例えば、ｐ−クマリルアルコール、コニフェリルアルコール及びシナピルアルコール）で構成されるポリマー材料を指す。リグニンは、植物の細胞壁の非炭水化物部分であるとも考えられている。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「セルロース」との用語は、リグニン及び任意のヘミセルロースと組み合わせて、通常は植物細胞壁中に見出される、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎのβ−グルコースの長鎖ポリマー多糖炭水化物を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ヘミセルロース」との用語は、いくつかのヘテロポリマーのいずれかであってもよい、ある種の植物細胞壁の多糖類を指す。これらの多糖類としては、キシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、グルクロンオキシラン、ルコマンナン及びガラクトマンナンが挙げられる。ヘミセルロースのモノマー構成要素としては、限定されないが、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース及びＤ−グルクロン酸が挙げられる。この種の多糖類は、セルロースと共にほぼ全ての細胞壁に見出される。ヘミセルロースは、セルロースよりも重量が小さく、熱水又はキレート化剤によって抽出することができないが、アルカリ水溶液によって抽出することができる。ヘミセルロースのポリマー鎖は、架橋繊維の網目構造中のペクチン及びセルロースに結合し、ほとんどの植物細胞の細胞壁を形成する。
【００４４】
本明細書で使用される「ペクチン」との用語は、酸及びキレート化剤で処理することによって抽出することができる、ある種の食部細胞壁の不均一多糖類を指す。典型的には、ペクチンの７０〜８０％が、α−（１−４）結合したＤ−ガラクツロン酸モノマーの直鎖として見出される。ペクチンのより小さいＲＧ−１フラクションは、（１−４）結合したガラクツロン酸と（１−２）結合したＬ−ラムノースを交互に含み、かなりの量のアラビノガラクタン分岐がラムノース残基から生じている。他の単糖類、例えば、Ｄ−フコース、Ｄ−キシロース、アピオース、アセル酸、Ｋｄｏ、Ｄｈａ、２−Ｏ−メチル−Ｄ−フコース及び２−Ｏ−メチル−Ｄ−キシロースは、ＲＧ−ＩＩペクチンフラクション中に見出される（２％未満）か、又はＲＧ−Ｉフラクション中の微量構成成分として見出される。Ｄ−ガラクツロン酸に関連するそれぞれの単糖類の割合は、個々の植物及びその微小環境、種、成長周期中の時期に応じて変わる。同じ理由から、ホモガラクツロナン及びＲＧ−１フラクションは、ＧａｌＡ残基上のメチルエステル含量、ＧａｌＡ及び中性糖のＣ−２位及びＣ−３位におけるアセチル残基エステル含量が大きく異なる可能性がある。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「通性嫌気性生物」又は「通性嫌気性微生物」又は「通性嫌気性生体触媒」との用語は、酸素の存在下又は非存在下で成長することができる生物、例えば、本発明で単離される真菌株であると定義される。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「蒸留乾燥粒子」との用語は、ＤＤＧと略記され、発酵後に残留する固体を指し、通常、消費されていない原料固体、残留する栄養素、タンパク質、繊維及び油、及び生体触媒の細胞破片からなる。この用語は、発酵からの可溶性残留物質も含んでいてもよく、次いで、「蒸留乾燥粒子及び可溶物」（ＤＤＧＳ）と呼ばれる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「栄養素」との用語は、成長し、生存するために生物又は生体触媒によって使用される化学化合物であると定義される。一例として、栄養素は、炭水化物及びアミノ酸などの有機化合物又は金属塩などの無機化合物であってもよい。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「複合栄養素」との用語は、タンパク質、ＤＮＡ、脂質及び炭水化物の産生のために生物又は生体触媒によって使用される主としてモノマー有機化合物を含む栄養源と定義される。「豊富な栄養素」との用語は、複合栄養素との用語と、全体にわたって相互に置き換え可能に使用される。典型的には、複合栄養素又は豊富な栄養素は、屠殺場廃棄物、乳製品廃棄物又は農業残留物などの生体材料に由来する。複合栄養素又は豊富な栄養素としては、限定されないが、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、大豆抽出物、コーンスティープリカー、大豆タンパク質及びカゼインが挙げられる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「好気性代謝」との用語は、炭水化物からエネルギーを、典型的にはＡＴＰの形態でエネルギーを生成するために酸素が使用される生化学的プロセスを指す。典型的な好気性代謝は、解糖及びＴＣＡサイクルによって起こり、１個のグルコース分子は酸素の存在下で完全に二酸化炭素へと代謝される。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「嫌気性代謝」との句は、酸素が、ＮＡＤＨに含まれる電子の最終的な受容体ではない生化学的プロセスを指す。嫌気性代謝は、酸素以外の化合物が末端電子受容体として機能する嫌気呼吸と、ＮＡＤＨからの電子が「発酵経路」を介して還元生成物を生成するために利用される発酵とに分けることができる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「微生物発酵」との語は、有機物質を分解し、微生物によって製品に再び組み立てるプロセスを指す。この物質には、限定されないが、グルコース、スクロース、グリセロール、デンプン、マルトデキストリン、ラクトース、脂肪、炭化水素、タンパク質、アンモニア、硝酸塩及びリン源が含まれるだろう。製品としては、限定されないが、専門品（限定されないが、マイコプロテイン製品、大豆製品、テンペなどを含む）、従来からある商品（限定されないが、パン、ビール、ワイン、スピリッツ、チーズ、乳製品、発酵した肉及び野菜、キノコ類、醤油及び酢を含む）、農業製品（限定されないが、ジベレリン、殺真菌剤、殺虫剤、サイレージ、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アスパラギン酸（＋）、Ｌ−アリールグリシンなどのアミノ酸を含む）、酵素（限定されないが、炭水化物、セルロース、リパーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼを含む）、燃料及び化学原料（限定されないが、アセトン、ブタノール、ブタンジオール、イソプロパノール、エチルアルコール、グリセロール、メタン、グリセロール、酪酸、メタン、クエン酸、フマル酸、乳酸、プロピオン酸、コハク酸及びＬ−グルタル酸、又はこれらのいずれかの酸の塩を含む）、ヌクレオチド、有機酸、医薬及び関連する化合物（限定されないが、アルカロイド、抗生物質、ホルモン、免疫抑制剤、インターフェロン、ステロイド、ワクチン、ビタミンを含む）、ポリマー（限定されないが、アルギナート、デキストラン、ゲラン、ポリヒドロキシブチラート、セレログルカン、キサンタンを含む）が挙げられるだろう。発酵に使用される微生物は、原核微生物（細菌、シアノバクテリアを含む）及び真核微生物（酵母、真菌及び藻類を含む）の両方を含み得る。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「エネルギー作物」との句は、バイオ燃料を製造するために使用される低コストかつ低保守の採取物として栽培される植物、又はそのエネルギー含量のために直接的に利用される植物を指す。市販のエネルギー作物は、典型的には高密度に植えられ、高採取作物種であり、エネルギー作物を焼き、発電する。熱帯の草類、例えば、ミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）及びペニセタム・プルプレウム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファント・グラスとして知られる）と同様、木質作物、例えば、ウィロー又はポプラは、広く利用されている。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「表面発酵」との用語は、使用される微生物が、さらなる支えを必要とせずに発酵培地の表面上で成長する発酵を指す。培地は、典型的には、自由に流動する水性培地である。理論に束縛されないが、糸状バイオマットは、好気性代謝、微好気性代謝及び／又は嫌気性代謝のいくつかの組み合わせから生じると考えられている。例えば、バイオマットの表面は好気呼吸に頼っていると考えられるが、一方、バイオマットの底は、微好気性から非常に嫌気性であるかもしれない。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「固体基質表面発酵」との用語は、使用される微生物が、発酵培地に沈められた固体によって供給される炭素及び栄養素を用い、発酵培地の表面上で成長する発酵を指す。ある実施形態では、バイオマットの一部分が部分的に沈められてもよい。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「深部発酵」との用語は、使用される微生物が発酵培地内に沈んだ状態で成長する発酵を指す。ペニシリン深部発酵技術のように、このカテゴリーには多くの発酵が含まれる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「固体状態発酵」との用語は、目的のために選択された固体支持体上で成長させた微生物の培養物を指す。例えば、微生物を播種した後、平らな床の上に、米又は小麦ふすまのような固体培養基質を堆積させる。次いで、この基質を、温度制御された室内に数日間放置する。固体状態発酵は、水分レベルが低い（水分活性が低い）培養基質を使用する。培地（例えば、米又は小麦ふすま）は、水で飽和されているが、ほとんど自由に流動することはない。固体培地は、基質と、発酵が行われる固体支持体の両方を含む。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「栄養補助食品」との用語は、健康上の利点又は薬効を有する物質を指す。ある場合では、栄養補助食品は、食飼料を補うだけでなく、疾患及び／又は障害の予防及び／又は治療を助ける。「栄養補助食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）」との用語は、１９８９年に、「Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＦＩＭ）」の創設者兼会長であるＳｔｅｐｅｎ  ＤｅＦｅｌｉｃｅ（ＭＤ）によって、「栄養（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）」と「医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）」を合わせて作られた。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「子孫」とは、どのように、又はどこで生成するかによらず、ある菌株に由来する系統別の任意の子孫及び全ての子孫をいう。本明細書で使用される場合、「子孫」の定義に含まれるのは、単離／寄託された菌株及びその子孫の任意の突然変異体及び全ての突然変異体であり、このような突然変異体は、単離／寄託された菌株及びその子孫の生理学的特性及び／又は形態特性のうち少なくとも１つを有する。
【００５９】
糸状菌バイオマットの成長のための人工培地
糸状菌バイオマットを生産するために、人工培地が使用される。人工培地は、天然に見出されるものと比較して、細胞周期時間を増加させ（すなわち、成長速度を増加させ）、細胞密度を増加させるために必要な栄養素を与える。人工培地は、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、炭素（Ｃ）、カリウム（Ｋ）、硫黄（Ｓ）といった多量栄養素を少なくとも含む。炭素源を補うために、微量栄養素、例えば、鉄（Ｆｅ）、ホウ素（Ｂ）、クロム（Ｃｒ）、銅（Ｃｕ）、セレン（Ｓｅ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、バナジウム（Ｖ）、亜鉛（Ｚｎ）も、培地に添加することができる。炭素源、例えば、リグノセルロース系原料、スイートホエイ及び／又は酸ホエイは、典型的には、さらなる微量栄養素が必要とされないように、十分な微量栄養素を与える。
【００６０】
さらなる栄養素の添加を、人工培地に加えることができる。このような栄養素の例は、炭水化物（例えば、単糖類、多糖類）、アミノ酸供与体（例えば、アミノ酸、ポリペプチド）、及びこれらの組み合わせである。これに加えて、リグノセルロース系炭素源の前処理を容易にすることができる化合物を人工培地に添加することもできる。このような化合物としては、限定されないが、酸性化物質、マンガン供与体、栄養素及びｐＨ緩衝物質が挙げられる。
【００６１】
人工培地は、液体含浸固体、液体又はゲルの形態であってもよい。人工培地は、固体炭素基質（例えば、リグノセルロース原料又は他の固体炭素基質）を覆う液体の形態であってもよい。ここで、固体基質は、液体表面より下に沈められ、その結果、バイオマットは、沈められた固体に由来する炭素と、固体基質表面発酵（ＳＳＳＦ）として知られるプロセスとを用い、液体表面で成長する。真菌から分泌された細胞外酵素は、固体炭素基質を分解し、可溶性の炭素を放出し、バイオマット／水界面又はこの界面付近で、この可溶性の炭素をバイオマットが吸収することができる。得られたバイオマットは、沈められた固体基質の上にある液体層の上にマットを形成する。一般に、沈められた炭素源より上にある液体層は、深さが約０．０１〜１．０ｃｍであるべきである。液体が少なすぎると、マットが形成されず、固体状態発酵及び／又は深部発酵が起こる。液体が多すぎると、変換が非効率となり、バイオマットの成長周期が低下する。
【００６２】
人工培地の炭素源として使用可能な多種多様な物質が存在する。これらの物質としては、糖類（例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、トレハロース、スクロース、アラビノース、マンノース、キシロース、フルクトースなど）、グリセロール、デンプン、炭水化物、グリセロール、ホエイ、リグノセルロース系原料、廃液（例えば、酸ホエイ）及びこれらの組み合わせが挙げられる。適切なリグノセルロース系原料としては、例えば、スイッチグラス、エネルギー作物、森林硬木及び他の産物、醸造使用済穀物、小麦わら、草、葉、ＡＦＥＸ作物残留物、嫌気性消化物、農業作物残留物（例えば、大麦わら、稲わら、小粒穀物わら、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維（例えば、トウモロコシ繊維ガム（ＣＦＧ）、蒸留乾燥穀物（ＤＤＧ）、コーングルテンミール（ＣＧＭ））、ヘイアルファルファ、サトウキビバガス、非農業バイオマス（例えば、藻類マット、都市樹木残留物）、工業残留物（例えば、軟木の一次／二次粉砕残留物、硬木軟木、一次／二次粉砕残留物、リサイクル紙、パルプスラッジ）、リグノセルロースを含有する廃棄物（例えば、新聞紙、廃棄紙、醸造穀物、都市有機廃棄物、庭塵芥）、医療用有機廃棄物、バイオ燃料の生産中に作られる廃棄物（例えば、処理した藻類バイオマス、セルロースエタノールの生産からの残留物、バイオディーゼル生産からの固体残留物）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。適切な廃液としては、農業廃棄物、都市有機廃棄物、バイオ燃料の生産中に作られる廃棄物（例えば、セルロースエタノールの生産からの残留物）、藻類バイオマス、醸造使用済穀類及び／又は廃液（例えば、糖蜜、コーンシロップなど）、工業廃棄物（例えば、フェノール及び他の芳香族物質などの有機分子）、繊維、例えば、β−グルカン、セルロース、キチン、ヘミセルロース及びポリデキストロース、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。単糖類は、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトースなど、及びこれらの任意の組み合わせ及び全ての組み合わせを包含し、ペントースは、リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボース、及びこれらの任意の組み合わせ及び全ての組み合わせを包含し、一方、ヘキソースは、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グルコース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、及びこれらの任意の組み合わせ及び全ての組み合わせからなる群から選択される。二糖類は、スクロース、ラクトース、マルトース、及びこれらの任意の組み合わせ及び全ての組み合わせを包含し、一方、多糖類は、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、及びこれらの任意の組み合わせ及び全ての組み合わせを包含する。
【００６３】
単離された真菌株を成長させるために使用される炭素源は、炭素源の乾燥重量の約５重量％〜約１００重量％、約１０重量％〜約９５重量％、約２０重量％〜約９０重量％、約３０重量％〜約８５重量％、約４０重量％〜約８０重量％、約５０重量％〜約７５重量％、又は約６０重量％〜約７０重量％の量でセルロースを含んでいてもよい。又は、セルロース系炭素源は、炭素源の乾燥重量の少なくとも約５重量％、少なくとも約１０重量％、少なくとも約２０重量％、少なくとも約３０重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、又は少なくとも約７０重量％の量でセルロースを含む。他の場合には、単離された真菌株を成長させるために使用されるセルロース系炭素源は、リグニン、ヘミセルロース、又はこれらの組み合わせから選択される構成要素を約１重量％〜約５０重量％、約５重量％〜約４０重量％、又は約１０重量％〜約３０重量％含む。本発明のある実施形態では、微生物を成長させるために使用されるセルロース系炭素源は、リグニン、ヘミセルロース、又はこれらの組み合わせから選択される構成要素を少なくとも約１重量％、少なくとも約５重量％、少なくとも約１０重量％、少なくとも約２０重量％、又は少なくとも約３０重量％含む。
【００６４】
適切な窒素源としては、尿素、硝酸アンモニウム（ＮＨ４ＮＯ３）、硫酸アンモニウム（ＮＨ４ＳＯ４）、硝酸塩（例えばＫＮＯ３）、アンモニア塩（すなわちＮＨ４ＳＯ４）及び有機Ｎ（例えばタンパク質、ペプチド）、窒素を多く含む産業廃液、コーンスティープリカー、及びこれらの組み合わせが挙げられる。純粋な尿素窒素源を用いて調製された人工培地は、尿素と硝酸アンモニウムを組み合わせて調製した人工培地よりも糸状菌の成長が約２５％速い（すなわち、それぞれ、７０ｇ／ｍ２／日  対  ５２ｇ／ｍ２／日）。尿素と硝酸アンモニウムとの組み合わせも使用することができる。硫酸アンモニウムが唯一の窒素源として使用される場合、尿素単独又は尿素の組み合わせを用いて生産されるよりもはるかに遅いが、これも成長は起こる。硝酸アンモニウムのみを使用することもできるが、この窒素源も、尿素の組み合わせで見られるような激しい成長を引き起こさない。
【００６５】
人工培地中の炭素と窒素の比率（Ｃ：Ｎ）の操作は、真菌種及び／又は菌株によって産生されるバイオマットの組成に重要な影響を及ぼす。典型的には、７．５：１以下のＣ：Ｎ比などの低いＣ：Ｎ比は、脂質と比較してタンパク質及びアミノ酸の産生を助長する。一方、Ｃ：Ｎ比が７．５：１を超えると、タンパク質と比較して脂質の産生が促進される。多くは、人工培地が、少なくとも１０：１、１５：１、２０：１、２６：１、３０：１、４０：１又は５０：１のＣ：Ｎ比を有する場合に、脂質の形成が特に促進される。
【００６６】
人工培地のｐＨは、所望の生成物及び使用される真菌種及び／又は菌株に基づいて決定される。フシスポリウム（Ｆｕｓｉｓｐｏｒｉｕｍ）、プソイドフザリウム（Ｐｓｅｕｄｏｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、スポロトリチェラ（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｅｌｌａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｏｃｏｄｅｒｍａ）、ケカビ．ｓｐ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ  ｓｐ．）内の種（例えば、リゾプス  ｓｐ．（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．））、及びＭＫ７と命名される単離された糸状好酸性真菌株、及びこれらの組み合わせは、２．０〜７．０のｐＨ範囲、最適には、３．５未満のｐＨで高脂質産生が起こる。高タンパク質産生は、主にＣ：Ｎ比の関数として影響を受けるが、少なくとも２．７、好ましくは４．５〜５．５のｐＨを必要とする。
【００６７】
単離された真菌種及び／又は菌株を含む培養物及び組成物
本発明は、単離された真菌種及び／又は菌株の純粋な培養物、又は２種類の真菌種及び／又は菌株の純粋な共培養物を使用するか、又は３種類以上の真菌種及び／又は菌株の実質的に純粋な培養物から構成される。多数の単離された糸状真菌種及び／又は菌株、例えば、フシスポリウム（Ｆｕｓｉｓｐｏｒｉｕｍ）、プソイドフザリウム（Ｐｓｅｄｏｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、スポロトリチェラ（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｅｌｌａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｏｃｏｄｅｒｍａ）、ピチア  ｓｐｐ．（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ）、ケカビ．ｓｐ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ  ｓｐ．）内の種（例えば、リゾプス  ｓｐ．（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．））の種及び／又は菌株、及びこれらの組み合わせを使用することができる。生物学的に純粋な培養物／共培養物／実質的に純粋な培養物は、ＭＫ７と命名される単離された糸状好酸性真菌株（ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１０６９８として寄託されている）、又はその活性な突然変異体も含んでいてもよい。遺伝的に改変された糸状菌の生物学的に純粋な培養物も使用することができる。純粋な真菌種及び／又は菌株及び／又はその子孫は、典型的には、分生子、小分生子、大分生子、分生子殻（ｐｙｃｎｉｄｉａ）、厚膜胞子、菌糸、菌糸の一部、菌糸体、又はこれらの組み合わせの形態である。
【００６８】
糸状好酸性ＭＫ７真菌株は、好酸性真菌の新しい菌株であり、リグノセルロース系炭素源、炭水化物（例えば、酸ホエイ）及び藻類バイオマスなどの炭素源を、タンパク質及び脂質を含む糸状菌バイオマットに直接的に変換することができる。
【００６９】
人工培地及び単離された真菌株及び／又はその子孫を使用して有用な製品を生産する方法は、
（ａ）容器中、真菌種又は菌株及び／又はその子孫のうち１つ以上を、糖、グリセロール、リグノセルロース系原料、炭素を含有する農業、工業及び都市廃棄物、炭水化物、酵母抽出物、カサミノ酸、酸ホエイ、スイートホエイ及び／又はこれらの組み合わせからなる群から選択される炭素源を含む人工培地に播種することであって、人工培地が、表面発酵によって、上述の単離された真菌株の成長を補助することができる、播種すること、
（ｂ）上述の単離された真菌株を上述の人工培地中で成長させ、糸状菌バイオマットを生産すること、
（ｃ）上述の糸状菌バイオマットを採取すること、並びに
（ｄ）場合により、上述の糸状菌バイオマットからの産物を単離し、精製し、及び／又は生産することを含む。
【００７０】
成長は、好気性条件下で生ずる。別の実施形態では、成長は、微好気性条件下で生ずる。又は、好気性条件、微好気性条件及び嫌気性条件の任意の組み合わせの結果として、例えば、表面発酵によって、成長が生じる。
【００７１】
有用な製品は、タンパク質が豊富なバイオマス、バイオマット及び／又は糸状菌バイオマットである。例えば、開示した真菌及び方法を用いて産生された有用な産物としては、限定されないが、食品、魚飼料製品、動物飼料製品、バイオプラスチック及び／又はこれらの前駆体に使用するためのタンパク質バイオマットが挙げられる。ここでは、成長は、好気性条件、微好気性条件及び嫌気性条件、又はこれらの任意の組み合わせによって生じる。
【００７２】
多数の好酸性真菌種及び／又は菌株、例えば、フシスポリウム（Ｆｕｓｉｓｐｏｒｉｕｍ）、プソイドフザリウム（Ｐｓｅｕｄｏｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、スポロトリチェラ（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｅｌｌａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｏｃｏｄｅｒｍａ）、ケカビ．ｓｐ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ  ｓｐ．）内の種（例えば、リゾプス  ｓｐ．（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．））、ＭＫ７と命名された単離された糸状好酸性真菌株、及びこれらの組み合わせ、及び／又は子孫は、汚染がほとんどないか、又は全くない状態で、抗生物質が存在しない状態で培養することができる。典型的には、人工培地中の汚染は、細菌、他の望ましくない真菌（例えば、酵母、カビ）、藻類、植物、昆虫、及びこれらの混合物などの他の生物によって引き起こされる。
【００７３】
フシスポリウム（Ｆｕｓｉｓｐｏｒｉｕｍ）、プソイドフザリウム（Ｐｓｅｕｄｏｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、スポロトリチェラ（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｅｌｌａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｏｃｏｄｅｒｍａ）、ケカビ．ｓｐ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ  ｓｐ．）内の種（例えば、リゾプス  ｓｐ．（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．））、フィラメントを産生することができる酵母（すなわち、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ））、ＭＫ７と命名された単離された糸状好酸性真菌株、及びこれらの組み合わせの単離された真菌種及び／又は菌株を含む少なくとも１つの組成物も開示される。組成物は、さらに、真菌種及び／又は菌株の成長を補助する人工培地と、場合により、酸性化物質、マンガン供与体、栄養素の添加及び／又はこれらの混合物のうち１つ以上を含んでいてもよい。
【００７４】
表面発酵
本開示は、人工培地に、所望の糸状真菌種及び／又は菌株の浮遊細胞の懸濁物を播種することによって、表面発酵を開始する。播種材料リアクターからの播種材料培養物を、所望の期間内に成熟したバイオマットを産生する濃度で、人工培地に加える。理論的には、この培地に、１個の細胞を播種することができた。しかし、このような播種は、成熟したバイオマットを発達させるためには、非常に厳しい滅菌条件及び著しく長い期間を必要とする。典型的には、成長培地１リットル当たり、０．５〜１．０ｇの細胞を播種すると、３〜６日でバイオマットが産生されるだろう。例えば、使用する培地の７．５％（体積対体積）で、約１０ｇ／Ｌの細胞を含有する播種材料を加えると、３〜６日でバイオマットが産生されるだろう。人工培地にバブリング又は他の手段によって外部から酸素が導入されない場合、周囲条件又はほぼ周囲条件から十分な酸素を集めることができる。
【００７５】
理論に束縛されないが、酸素の存在下で細胞成長がはるかに迅速であるため、より多くの酸素が存在する人工培地表面に存在する分生子は、迅速に成長し、菌糸体バイオマットの形成が始まると考えられる。酸素濃度は、人工培地の表面よりわずか数マイクロメートル下でもかなり低く、その結果、この領域に位置する真菌細胞は、ストレス環境におかれると考えられる。ストレスは、細胞外多糖類の分泌を増加させることが知られており、これは「粘着性」表現型を有し、そのため、表面で増殖する細胞に付着することによって、糸状菌バイオマットの迅速な形成を補助するだろう。しかしながら、基質濃度も、有意な効果を有する。例えば、炭素基質濃度が４％未満である場合、糸状菌バイオマットは形成されない。マットを形成するための初期の環境ストレスによって、ストレスを受けたマット（すなわち、ストレスを受けた生物によって分泌される毒素を含有するマット）が作られると必ずしも推測するわけではないことに留意すべきである。
【００７６】
典型的には、人工培地を含む浅いトレイは、使用される真菌種及び／又は菌株に適した温度、湿度及び空気流が制御された条件下で表面発酵に使用される。最適な糸状菌バイオマットの成長のために、滅菌条件が維持される。十分な空気流が維持され、人工培地の表面を撹拌して真菌菌糸の成長を乱すことなく、微生物の呼吸から発生した熱及び二酸化炭素を除去し、酸素を供給する。
【００７７】
一般に、播種から２日後に、「スキン」が人工培地表面に形成し始める。この「スキン」は、初期の糸状菌バイオマットであり、多くは、気中菌糸と、人工培地と接触した菌糸を含み、成長し、細胞密度が増加し続ける。典型的には、播種してから３〜６日後に、得られた糸状菌バイオマットは、厚さが１〜３０ｍｍであり、引き裂かれることなく取り扱うのに十分な引張強度と構造一体性を有する。
【００７８】
産生された糸状菌バイオマットは、天然には見られない、上述のような構造を有する。第１に、天然に形成された糸状菌バイオマットは、純粋な培養物／共培養物／実質的に純粋な培養物から構成されたものではない。典型的には、天然に形成されるバイオマットは、少なくとも１つの糸状真菌種に加え、様々な種類の藻類及び／又は細菌を含み、人工マイクロエコシステムを形成する。天然に形成される真菌バイオマットの例は、菌根真菌マットであり、大部分は土壌に分散した形態で存在し、植物の根、地衣類（例えばトナカイ苔及び固着地衣）、及びキノコ（例えば、アルミラリア・オストヤエ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｏｓｔｏｙａｅ））と結合している。
【００７９】
第２に、本明細書に記載の方法及び技術を用いて形成されたバイオマットは、天然に形成されるバイオマット中に見られる複数の種を考慮しても、天然で発見されるバイオマットよりも顕著に大きな細胞密度を有する。産生された糸状菌バイオマットは、非常に緻密な傾向があり、典型的には、１リットル当たり５０〜２００グラムである。糸状菌の成長のための天然のプロセス及び深部でのプロセスは、一般に、１リットル当たり約１５グラムのバイオマス密度を生じる。固体状態発酵プロセスによって、基質と少量の真菌の混合物が得られる（すなわち、５％未満の真菌組成物）。固形分の割合という観点から、本明細書に開示する方法は、固形分が一般に５〜２０％の範囲の糸状菌バイオマットを生成した。これとは対照的に、糸状菌の成長のための天然のプロセス及び深部でのプロセスは、一般に、固形分の割合が１．５％未満である。達成された密度、糸状性、及びこれらの緻密なバイオマット中に見出される細胞外マトリックスの１つの結果は、乾燥時に凝集性のマットとして維持される能力である。このことは、他の乾燥糸状菌バイオマットで通常見られる粉末状及び／又は非凝集性の形態とは著しく対照的である。
【００８０】
第３に、本明細書に記載の方法及び技術を用いて形成されたバイオマットは、天然に存在するバイオマットと比較して高い引張強度を有し、それらを持ち上げて破損することなく移動させることができる。
【００８１】
第４に、本発明のバイオマットは、所定の構造を有し、ある場合では、この構造は、空気：バイオマット界面にほぼ平行に整列した長いフィラメントで構成される単一の緻密層を含む。ある糸状菌バイオマットでは、（ａ）緻密底部層と（ｂ）気中菌糸層の少なくとも２つの層が存在する。ある糸状菌バイオマットでは、（ａ）緻密底部層、（ｂ）気中菌糸層、（ｃ）遷移領域層の少なくとも３つの構造的に異なる層を見ることができる（図１０Ａ及びＢを参照）。気中菌糸を有する系と、３層を有する系では、気中菌糸層は、典型的には、最も顕著に支配的な層であり、その後に緻密底部層があり、存在する場合には遷移領域層が最も小さい。それぞれの層は、通常、他の層と比較して、これに関連する特徴的な細胞密度を有する。例えば、気中菌糸層は、バイオマットの底部層よりも著しく密度が低い（例えば、図１０Ａ参照）。気中菌糸が生成する場合、気中菌糸は、主にバイオマット：空気界面及び／又はバイオマット：培地界面に垂直に配向する。全てのバイオマスについて、緻密層は、バイオマット：空気界面及び／又はバイオマット：培地界面と平行に整列するようにあらかじめ配置された長いフィラメントで構成される。さらに、得られるバイオマットは、少なくとも大部分の真菌バイオマスで構成されており、好ましい実施形態では、本質的に残留原料が存在せず、本質的に純粋な真菌バイオマスである。
【００８２】
気中菌糸が作られる場合には、例えば、グリセロールを基質として使用する場合に、気中菌糸層と緻密底部層との間に多くの鍵となる識別因子も存在する。長さに関しては、気中菌糸は、緻密底部層中に見られるものよりも長くなる傾向がある。個々の気中菌糸の密度及び分布は、緻密層の菌糸体と結合しているものよりも少ない。気中菌糸は、大気に向かって並べられている末端で、垂直方向を向く傾向がある。すなわち、気中菌糸は、表面培地に対して相対的に垂直に成長する傾向がある。一方、緻密層の菌糸は、空気：バイオマット界面及び／又はバイオマット：培地界面に対して主に平行な方向に成長する傾向がある。気中菌糸の相対密度が低いことと、気中菌糸が長いこと、垂直方向を向いていることとを組み合わせると、酸素を最大限に取り入れることを示唆している。さらに、気中菌糸層には、余分な細胞マトリックスがほとんどないか、全くない。対照的に、緻密底部層には多くの細胞外マトリックスを見ることができる。
【００８３】
バイオマットの気中層は、形成されれば、バイオマットの成長を促進するようである。気中層が破壊された気中層破壊領域ができると、バイオマットの加速成長に悪影響を与える。破壊には、固体物体との接触、水滴との接触、バイオマットが成長する液体培地の撹拌により生じる亀裂又は裂け目が含まれる。典型的には、破壊されたバイオマット領域は、破壊の原因が取り除かれたとき、それ以上は成長しない。一般に、バイオマットの成長は、好気性条件、微好気性条件及び嫌気性条件、又はこれらの任意の組み合わせによって生じる。
【００８４】
バイオマットは、通常、使用される種／菌株と所望の生成物に応じて、播種してから３〜１２日間で採取されるが、もっと後の採取時期も可能である。糸状菌バイオマットは、多くの異なる方法論によって採取することができ、この方法論は、すすぎ、物理的な処理（サイズを小さくする、加圧処理、脱水など）、生存手順の不活性化、温度サイクリング、バイオマス構成要素の抽出及び／又は分離、変換及び／又は異なる系への導入が挙げられるだろう。ある実施形態では、糸状菌バイオマットは、採取され、水ですすがれ、次いで、温度制御されたオーブン中で乾燥され、多くの酵素を不活化し、バイオマット内の生化学的形質転換を制限するか、又は凍結させる。
【００８５】
糸状菌は、組換えタンパク質生産及び発現プラットフォームのための宿主細胞として非常に有用であると認識され、バイオマス及び／又は糸状菌バイオマット内で発現される有用な産物を生じる。このようなプロセスで現在使用されているか、又は使用することが提案されている糸状菌の例としては、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、トリポクラジウム・ゲオデス（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｇｅｏｄｅｓ）、ムーコル・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）が挙げられる。さらに、開示されたようにバイオマットを産生するために使用される微生物種は、転写を含めた遺伝子発現の操作によって、系を発現／抑制するように遺伝子改変することができ、その結果、天然の形態又は改変されていない形態に見出される化合物又は化学物質を過剰に発現するか、又は発現しない。既存の化学物質を過剰発現させ、天然に存在しない系を発現するか、又は天然形態に一般的に存在する系を抑制するための真菌系の使用及び操作は、当該技術分野で公知であり、すなわち、アスペルギルス  ｓｐｐ．（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ペニシリウム  ｓｐｐ．（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、リゾプス  ｓｐｐ．（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）、トリコデルマ  ｓｐｐ．（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）及び酵母、例えば、ピチア  ｓｐｐ．（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）である。開示されたバイオマット及び方法を使用して生産された有用な製品としては、限定されないが、医薬、栄養補助食品、工業用途のビルディングブロック化学物質、医薬品、酵素及び／又はそれらの前駆体を発現するために使用されるバイオマス及び／又はバイオマスバイオマットが挙げられる。
【００８６】
好酸性真菌種及び／又は菌株
本発明で使用される好酸性真菌種及び／又は菌株は、以下の識別する特性を少なくとも有する、リグノセルロースを分解する糸状真菌株及び／又はその子孫である。
（ａ）単離された菌株は、好酸性であり、約０．６８〜約８．５の範囲のｐＨで成長することができ、
（ｂ）人工培地から、好気性条件、微好気性条件、嫌気性条件、又はこれらの組み合わせで、表面発酵によって、タンパク質と脂質を含む糸状バイオマットを生成する。ここで、人工培地の炭素源には、炭水化物、リグノセルロース系原料、炭素含有廃棄物（例えば酸ホエイ）、又はこれらの組み合わせが含まれる。
【００８７】
単離された種及び／又は菌株は、さらに、典型的には、以下のさらなる識別する特性のうち１つ以上を少なくとも含む。
（ｃ）タンパク質、脂質アミノ酸、酵素、核酸（ヌクレオチド）、炭水化物、繊維（例えばβグルカン）、ポリケチド、アルカロイド、顔料及び抗生物質などを生産する能力。例としては、限定されないが、エステル、グルタミン酸、アスパラギン酸、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、核酸／ヌクレオチド：ＤＮＡ／ＲＮＡ、プリン、ピリミジン、オレイン酸、パルミトレイン酸、β−グルカン、キチン、β−カロテン、グリコシド、フェノール類、１８ページ、段落［８０］に記載される炭素源及び藻類原料からのテルペノイド、種々の嫌気性条件、好気性微好気性条件及び／又はこれらの任意の組み合わせでの、バイオ燃料の生産中に作られる廃棄物（例えば、処理した藻類バイオマス、グリセロール）からのものが挙げられる。
（ｄ）配列番号１に対して少なくとも９８％の同一性を共有する１８Ｓ  ｒＲＮＡ及びＩＴＳ領域ＤＮＡ配列を含む。
【００８８】
適切な糸状好酸性真菌種及び／又は菌株としては、フシスポリウム（Ｆｕｓｉｓｐｏｒｉｕｍ）、プソイドフザリウム（Ｐｓｅｕｄｏｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、スポロトリチェラ（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｅｌｌａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｏｃｏｄｅｒｍａ）、ケカビ．ｓｐ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ  ｓｐ．）内の種（例えば、リゾプス  ｓｐ．（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．））、及びＭＫ７と命名される単離された糸状好酸性真菌株、及びこれらの組み合わせ、及び／又はこれらの子孫が挙げられる。ＭＫ７と命名された菌株は、ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１０６９８として寄託されている。
【００８９】
好酸性真菌種及び／又は菌株及び／又はその子孫は、最大で約７．０、約６．５、約６．０、約５．５、約５．０、約４．５、約４．０、約３．５、約２．０、約１．８、約１．６、約１．４、約１．２、約１．０、約０．９、約０．８、又は約０．７、又は約０．６、又は約０．５の低ｐＨで成長することができる。例えば、真菌株は、約０．６８〜約２．０の範囲の低ｐＨで成長することができる。
【００９０】
使用される好酸性種及び／又は菌株は、上述の低ｐＨ範囲で成長した糸状菌バイオマット内で、高品質の脂質とタンパク質を産生することができる。例えば、単離された菌株は、上述の低ｐＨで、当該技術分野で既に報告されているものよりも速い速度で、炭素源を脂質に変換することができ、例えば、既に単離されたＦｕｓａｒｉｕｍ菌株が記載されている（Ｎａｉｒｎら、１９８５、Ｂｈａｔｉａら、２００６及びＮａｑｖｉら、１９９７参照）。使用される好酸性種及び／又は菌株は、ｐＨ２．５で１０日間インキュベートした後、少なくとも０．０４脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．０５脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．０６脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．０７脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．０８脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．１脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．１２脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．１４脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．１６脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．１８脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．２脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．２５脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．３脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、０．３５脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）、又は０．４脂質（ｇ）／炭素源（ｇ）の速度で、炭素源を脂質に変換することができる。
【００９１】
本発明の培養条件は、培養した真菌又は微細藻類から以前に産生されたバイオマスと比較すると、より好ましい脂質プロファイルを有する糸状バイオマスも産生する。例えば、使用される好酸性種及び／又は菌株は、より多くの飽和脂肪酸（例えば、パルミチン酸（１６：０）及びステアリン酸（１８：０））と一不飽和脂肪酸（例えば、オレイン酸（１８：１））を産生するが、酸化に対してより脆弱な多価不飽和脂肪酸は少ない。
【００９２】
これに加えて、好酸性真菌種及び／又は菌株及び／又はその子孫は、高い金属濃度で成長することができ、金属は、Ｍｎ、Ａｇ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ａｌ、Ｂｅ、Ｐｂ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｕ、Ｔｈ、Ｍｏ、Ｓｎ、Ｔｉ、Ａｓ、Ａｕ、Ｓｅ、Ｓｂ及びＨｇからなる群から選択される。
【００９３】
好酸性真菌種及び／又は菌株及び／又はその子孫は、この培養条件下で、迅速な高密度の細胞成長が可能である。ここで、微生物は、（乾燥重量／人工培地（Ｌ）として測定すると）少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約２５ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１２５ｇ／Ｌ、少なくとも約１３５ｇ／Ｌ、少なくとも約１４０ｇ／Ｌ、少なくとも約１４５ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌ、少なくとも約１６０ｇ／Ｌ、少なくとも約１７０ｇ／Ｌ、少なくとも約１８０ｇ／Ｌ、少なくとも約１９０ｇ／Ｌ、少なくとも約２００ｇ／Ｌ、少なくとも約２１０ｇ／Ｌ、少なくとも約２２０ｇ／Ｌ、少なくとも約２３０ｇ／Ｌ、少なくとも約２４０ｇ／Ｌ、少なくとも約２５０ｇ／Ｌの細胞密度を達成することができる。
【００９４】
例えば、好酸性真菌種及び／又は菌株は、約１０ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約７５ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約１２５ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約１７０ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約１３０ｇ／Ｌ〜約２９０ｇ／Ｌ、約１３５ｇ／Ｌ〜約２８０ｇ／Ｌ、約１４０ｇ／Ｌ〜約２７０ｇ／Ｌ、約１４５ｇ／Ｌ〜約２６０ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌ、約１７０ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ〜約２８０ｇ／Ｌの細胞密度を達成することができる。好酸性真菌種及び／又は菌株の高密度成長は、発酵条件（例えば、温度、ｐＨ、イオン濃度、インキュベート時間及び／又はガス濃度など）を調整することによって、さらに増加させることができる。
【００９５】
フザリウム種
好酸性フザリウム種に関する情報、同定し、単離し、培養する方法は、Ｎｅｌｓｏｎら（Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  Ｓｐｅｃｉｅｓ，１９９４，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，７（４）：４７９−５０４）、Ｔｏｕｓｓｏｕｎ及びＮｅｌｓｏｎ（１９７６，Ｆｕｓａｒｉｕｍ），Ｂｏｏｔｈ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ：ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ，１９７７，Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＩＳＢＮ  ０８５１９８３８３９，９７８０８５１９８３８３７）及びＬｅｓｌｉｅら（Ｔｈｅ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２００６，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ＩＳＢＮ  ０８１３８１９１９９，９７８０８１３８１９１９８）に記載されており、それぞれ、その全体が本明細書に援用により組み込まれる。
【００９６】
糸状真菌種及び／又は菌株によって産生されるタンパク質（例えば、特定の酵素を含む）は、生物によって産生される糸状バイオマスから精製することができる。タンパク質精製の方法は、当業者に公知である。詳細なタンパク質精製法は、Ｊａｎｓｏｎ及びＲｙｄｅｎ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９８，ＩＳＢＮ  ０４７１１８６２６０，９７８０４７１１８６２６７），Ｄｅｔｓｃｈｅｒ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８２  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｇｕｌｆ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０，ＩＳＢＮ  ０１２１８２０８３１，９７８０１２１８２０８３１）及びＣｕｔｌｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２４４  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４  ＩＳＢＮ  １５８８２９０６７０，９７８１５８８２９０６７０）に記載されており、あらゆる目的のために、その全体が援用により組み込まれている。
【００９７】
製品としての実用性及び有用性を見出すために、タンパク質をマットから精製する必要はない。すなわち、マットは精製せずに処理することができ、有用である。すなわち、タンパク質源として、食物として、及び／又は動物飼料として有用である。マットから製品を作成することができる。バイオマットから作られた製品を系中で混合することは、重要であり、価値がある。
【００９８】
真菌種及び／又は菌株の脂質
上述のように、高いＣ：Ｎ比を有する人工培地中で培養すると、藻類及び他の脂質を産生する生物と比較して、高い脂質含有量を有し、より望ましい脂質プロファイルを有する糸状菌バイオマットが産生される。脂質は、単離された糸状バイオマスから抽出することができる。ある場合には、脂質は、主に脂肪酸アシル基を有するトリアシルグリセリドである。ある場合では、脂肪酸は、本質的に不飽和脂肪酸及び／又は飽和脂肪酸である。不飽和脂肪酸としては、オレイン酸（１８：１）、α−リノレン酸（１８：３）、エイコセン酸（２０：１）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。飽和脂肪酸としては、パルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、アラキジン酸（２０：０）、ベヘン酸（２２：０）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。産生し得る他の種類の脂質としては、限定されないが、ステロール（例えばエルゴステロール、Ｄ２前駆体中のビタミン）、ジアシルグリセリド、カロテノイド、飽和脂肪（例えば、酪酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、ノナデカン酸、エイコサン酸、ドコサン酸、テトラコサン酸）、モノ不飽和脂肪（例えば、テトラデセン酸、ペンタデセン酸、ヘキサデセン酸、ヘプタデセン酸、オクタデセン酸、エイコセン酸、ドコセン酸、ｃｉｓ−テトラコセン酸）、多価不飽和脂肪（例えば、ヘキサデカジエン酸、リノール酸、リノレン酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、パリナリン酸、エイコサジエン酸、アラキドン酸、チモノドン酸、ブラシン酸、クルパノドン酸、ドコサヘキサエン酸）が挙げられる。
【００９９】
糸状真菌種及び／又は菌株及び／又はその子孫は、脂質の効率的な産生が可能である。ある場合では、産生される脂質の量は、少なくとも約１ｇ／Ｌ／日、５ｇ／Ｌ／日、少なくとも約１０ｇ／Ｌ／日、少なくとも約２０ｇ／Ｌ／日、少なくとも約３０ｇ／Ｌ／日、少なくとも約４０ｇ／Ｌ／日、少なくとも約５０ｇ／Ｌ／日、少なくとも約６０ｇ／Ｌ／日、少なくとも約７０ｇ／Ｌ／日、又はもっと多い。例えば、産生される生体油の量は、約１ｇ／Ｌ／日〜約５ｇ／Ｌ／日、約５ｇ／Ｌ／日〜約７０ｇ／Ｌ／日、約１０ｇ／Ｌ／日〜約７０ｇ／Ｌ／日、約２０ｇ／Ｌ／日〜約７０ｇ／Ｌ／日、又は約３０ｇ／Ｌ／日〜約７０ｇ／Ｌ／日である。これらの値は、文献で約１２ｇ／Ｌ／日である、報告されている最も高い値より、はるかに大きい（Ｄｅｙ，Ｐ．ら（２０１１）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ  ｆｕｎｇａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ−Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐ．  ｈａｖｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ  ａｓ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ．  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０２：５８１５−５８２３；Ｇｏｎｇ，Ｚ．ら（２０１３）。Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｉｎｔｏ  ｌｉｐｉｄｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ６：３６；Ｇｏｎｇ，Ｚ．ら（２０１４）、Ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｎ  ｓｔｏｖｅｒ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  ｙｅａｓｔ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ７：１５８；Ｈｕｉ，Ｌ．ら（２０１０）、Ｄｉｒｅｃｔ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｅａｔ  ｓｔｒａｗ  ｉｎｔｏ  ｌｉｐｉｄ  ｂｙ  ａ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ  ｆｕｎｇｕｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  Ａ−４  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０１：７５５６−７５６２；Ｌｉａｎｇ，Ｙ．ら（２０１４）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ  ｃｏｒｎ  ｆｉｂｅｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ３０：９４５−９５１；Ｌｉｕ，Ｃ．−Ｚ．ら（２０１２）Ｉｏｎｉｃ  ｌｉｑｕｉｄｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｆｕｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｅｒｇｙ  ９２：４０６−４１４；  Ｒｕａｎ，Ｚ．ら（２０１３）Ｃｏ−ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｉｐｉｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１０：１０３９−１０４９；Ｓｕｎｇ，Ｍ．ら（２０１４）Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉ��ｎ  ｆｒｏｍ  ｙｅａｓｔ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｕｓｉｎｇ  Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ  ａｒｔｉｃｈｏｋｅ．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５５：７７−８３；Ｘｉｅ，Ｈ．ら（２０１２）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ  ｏｆ  ｃｏｒｎ  ｓｔｏｖｅｒ  ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ−ｉｏｎｉｃ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ．１４：１２０２−１２１０を参照）。
【０１００】
様々な手順を用いて、糸状菌バイオマットから脂質を抽出することができる。脂質抽出の非限定的な例は、Ｋｉｎｇら（Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：Ｐｒｅｓｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，２００２，Ｇｒａｓａ  Ａｓｃｅｉｔｅｓ，５３，８−２１）、Ｆｏｌｃｈら（Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ，１９５７，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２６、４９７−５０９）、Ｂｌｉｇｈ及びＤｙｅｒ（Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．１９５９，Ｃａｎ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７，９１１−９１７）、Ｃａｂｒｉｎｉら（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｆｉｓｈ  ｔｉｓｓｕｅｓ−ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９２，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０１（３），３８３−３８６）、Ｈａｒａら（Ｌｉｐｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌｏｗ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｓｏｌｖｅｎｔ．１９７８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９０，４２０−４２６）、Ｌｉｎら（Ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ／ｅｔｈｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ａｓ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｆｏｌｃｈ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ａｎｉｍａｌ  ｌｉｐｉｄｓ．２００４，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，５２，４９８４−４９８６）、Ｗｈｉｔｅｌｅｙら（Ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｓｔｏｒｅｄ  ａｔ  ｓｕｂｚｅｒｏ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．１９９２，Ｃｒｙｏ−Ｌｅｔｔｅｒｓ，１３，８３−８６）、Ｋｒａｍｅｒら（Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔ．１９７８，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，１９，１０３−１０６）及びＳｏｍａｓｈｅｋａｒら（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｌｉｐｉｄ  ａｎｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｆｕｎｇａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ，２００１，Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７（３）：３１７−３２０）に記載されている。
【０１０１】
別の例では、ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ＧｍｂＨ、ドイツ）プロセスと同様の方法によって脂質を抽出することができ、これを使用し、微生物によって産生される生体油を抽出する。ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）は、水系の物理的な油抽出プロセスであり、これにより、従来の溶媒抽出方法を使用することなく、油を含有する原材料を、油を抽出するために直接的に使用することができる。このプロセスでは、水溶性有機溶媒を処理助剤として使用し、重力又は遠心力を用いた密度分離によって、原料ブロスから油を分離する。
【０１０２】
脂質が抽出された後、脂質は、当該分野で公知の任意の適切な手段によって、回収することができるか、又は非脂質構成要素から分離することができる。例えば、脂質含有組成物を非脂質組成物から分離するために、低コストの物理的技術及び／又は機械的技術が使用される。脂質を抽出するために使用される抽出方法によって複数の相又はフラクションが作られる場合、１つ以上の相又はフラクションが脂質を含む場合には、脂質含有相又はフラクションを回収するための方法は、脂質含有相又はフラクションを、非脂質相又はフラクションから、又はその逆に物理的に除去することを含んでいてもよい。ある場合には、ＦＲＩＯＬＥＸ（登録商標）型の方法を使用し、微生物によって産生された脂質を抽出し、次いで、脂質を豊富に含む相を、タンパク質を豊富に含む重い相から物理的に分離する（例えば、密度分離の後に、タンパク質を豊富に含む重い相の上にある、脂質を豊富に含む相を取り除くことによって）。
【０１０３】
糸状真菌種及び／又は菌株による脂質の産生には、（ａ）糸状菌バイオマットの蓄積段階と、（ｂ）脂質産生段階の少なくとも２つの段階がある。糸状菌バイオマットの蓄積段階は、真菌株の糸状菌バイオマット産生の合計の約１０％〜約９５％、約２０％〜約９５％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％又は約５０％〜約９５％が、糸状菌バイオマットの蓄積段階の間に達成されるように、真菌種及び／又は菌株の糸状バイオマスを産生する。他の場合には、微生物の糸状菌バイオマット産生の合計の約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、又は約８０％〜約９５％が、糸状菌バイオマットの蓄積段階の間に達成される。他の状況では、微生物の糸状菌バイオマット産生の合計の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は１００％が、糸状菌バイオマットの蓄積段階の間に達成されるように、糸状菌バイオマットの蓄積段階は、微生物の糸状菌バイオマットを産生する。例えば、微生物の糸状菌バイオマット産生の合計の約５０％〜約９５％が、糸状菌バイオマットの蓄積段階の間に達成される。
【０１０４】
脂質産生段階に関し、脂質は、細胞の成長及び増殖に必要なため、脂質は、全ての成長段階にわたって産生される。すなわち、脂質は、糸状菌バイオマットの蓄積段階中に産生される。理論に束縛されないが、貯蔵脂質のいくつかはバイオマット成長の後期に産生され、胃一方、他の貯蔵脂質は、バイオマット形成中の初期に産生されると考えられる。これに加え、低窒素条件下では、生物は、貯蔵脂質をより速い速度で蓄積するだろう。
【０１０５】
脂質蓄積段階は、微生物の全脂質産生の約１０％〜約９５％、約２０％〜約９５％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％、又は約５０％〜約９５％が、脂質蓄積段階中に達成されるように脂質を産生する。ある場合には、微生物の全脂質産生の約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、又は約８０％〜約９５％が、脂質蓄積段階中に達成される。他の状況では、脂質蓄積段階は、微生物の全脂質産生の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が、脂質蓄積段階中に達成されるように脂質を産生する。好ましくは、微生物の全脂質産生の約５０％〜約９５％が、脂質蓄積段階中に達成される。
【０１０６】
脂質が本発明に従って産生されると、当該分野で公知の様々な方法を使用して、食品又は医薬品の成分として使用するために生体油を脂肪酸エステルに変換することができる。脂肪酸エステルの製造は、微生物によって産生された生体油をエステル交換することを含むことができる。微生物からの脂質の抽出及び脂質のエステル交換は、ワンステップ法で同時に行うことができる。例えば、単離された真菌株を含む培養物は、脂質の抽出及び脂質のエステル交換の両方を促進する条件又は処理（又は条件又は処理の組み合わせ）にさらされてもよい。このような条件又は処理としては、限定されないが、ｐＨ、温度、圧力、溶媒の存在、水の存在、触媒又は酵素の存在、洗剤の存在及び物理的／機械的な力が挙げられる。脂質の抽出又はエステル交換のいずれかの効率を顕著に下げずに、２セットの条件又は処理を合わせることができる限り、２セットの条件又は処理を組み合わせ、脂質を抽出し、エステル交換する１ステップでの方法を作り出すことができ、ここで、１セットの条件又は処理は、脂質の抽出を有利に促進し、他のセットの条件又は処理は、脂質のエステル交換を有利に促進する。加水分解及びエステル交換は、全細胞の糸状バイオマスに対して直接行うことができる。
【０１０７】
又は、脂質の抽出は、脂質のエステル交換の工程とは別の工程として行われる。このようなエステル交換反応は、酸触媒又は塩基触媒を用いて行われる。食品又は医薬品の成分として使用するために生体脂質を脂肪酸エステルにエステル交換する方法は、トリグリセリドを含む生体油を、アルコールと塩基が存在する条件下で反応させ、トリグリセリド由来の脂肪酸残基のエステルを生成することを含む。
【０１０８】
エステル交換に使用するのに適したアルコールには、１〜６個の炭素原子を含む任意の低級アルキルアルコール（すなわち、メチル、エチル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルアルコール及びそれらの異性体などのＣ１−６アルキルアルコール）が含まれる。理論に束縛されないが、低級アルキルアルコールの使用は、脂肪酸残基の低級アルキルエステルを生成すると考えられる。例えば、エタノールを使用すると、エチルエステルが生成する。アルコールがメタノール又はエタノールである場合、生成される脂肪酸エステルはそれぞれ脂肪酸残基のメチルエステル及びエチルエステルである。典型的には、アルコールは、脂質組成物、アルコール、塩基の混合物の約５重量％〜約７０重量％、約５重量％〜約６０重量％、約５％〜約５０重量％、約７重量％〜約４０重量％、約９重量％〜約３０重量％、又は約１０重量％〜約２５重量％を含む。組成物及び塩基を、純粋なエタノール又は純粋なメタノールのいずれかに添加することができる。一般に、使用されるアルコールの量は、アルコール中のトリグリセリドを含む脂質又は組成物の溶解度によって変化し得る。
【０１０９】
トリグリセリド、アルコール及び塩基を含む組成物を、脂肪酸残基及びアルコールからのエステルの生成を可能にする温度及び時間で、一緒に反応させる。エステルを生成するのに適した反応時間及び温度は、当業者によって決定され得る。理論に束縛されないが、脂肪酸残基は、トリグリセリドのグリセロール主鎖から開裂し、各脂肪酸残基のエステルが反応段階中に形成されると考えられる。アルコール及び塩基の存在下で組成物を反応させる工程は、約２０℃〜約１４０℃、約２０℃〜約１２０℃、約２０℃〜約１１０℃、約２０℃〜約１００℃、又は約２０℃〜約９０℃の温度で行われる。又は、アルコール及び塩基の存在下で組成物を反応させる工程は、約２０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１０５℃又は１２０℃、又はそれ以上の温度で行われる。所望の生成物に依存して、アルコール及び塩基の存在下で組成物を反応させる工程は、約２時間〜約３６時間、約３時間〜約３６時間、約４時間〜約３６時間、約５時間〜約３６時間、又は約６時間〜約３６時間の時間、行われる。その代わりに、アルコール及び塩基の存在下で組成物を反応させる工程は、０．２５時間、０．５時間、１．０時間、２．０時間、４．０時間、５．０時間、５．５時間、６時間、６．５時間、７時間、７．５時間、８時間、８．５時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２８時間、３２時間又は３６時間行うことができる。
【０１１０】
脂質組成物、アルコール及び塩基を反応させる工程は、構成要素を環流させ、脂肪酸エステル、例えば、ＰＵＦＡエステルを生成することによって行われてもよい。脂質組成物を反応させる工程は、反応構成要素を環流させない温度で行うこともできる。例えば、大気圧よりも高い圧力下で脂質組成物を反応させる工程を実施することにより、反応混合物中に存在する溶媒の沸点を上昇させることができる。そのような条件下では、反応は、溶媒が大気圧で沸騰する温度で起こり得るが、反応構成要素が環流しない。一般に、反応は、約５〜約２０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）、約７〜約１５ｐｓｉ、又は約９から約１２ｐｓｉの圧力で行われる。いくつかの反応は、７ｐｓｉ、８ｐｓｉ、９ｐｓｉ、１０ｐｓｉ、１１ｐｓｉ又は１２ｐｓｉの圧力で行われる。加圧下で行われる反応は、上に列挙した反応温度で行われてもよい。加圧下で行われる反応は、約７０℃、７５℃、８０℃、８５℃又は９０℃以上の温度で行うことができる。
【０１１１】
組成物を蒸留し、脂肪酸エステルを含むフラクションを回収することにより、脂肪酸エステルを反応混合物から分離する。目的の脂肪酸エステルを含む反応混合物の標的フラクションを反応混合物から分離して回収することができる。蒸留は高減圧下で行うことができる。理論に束縛されないが、高減圧下での蒸留は、高減圧が存在しない状態よりも低い温度で蒸留を達成することができ、したがってエステルの分解を防止することができる。典型的な蒸留温度は、約１２０℃〜約１７０℃の範囲であり、例えば、約１８０℃未満、約１７５℃未満、約７０℃未満、約１６５℃未満、約１６０℃未満、約１５５℃未満、約１５０℃未満、約１４５℃未満、約１４０℃未満、約１３５℃未満、又は約１３０℃未満の温度で蒸留を行う。高減圧蒸留の典型的な圧力は、約０．１ｍｍＨｇ〜約１０ｍｍＨｇの範囲であり、例えば、約０．１ｍｍＨｇ、０．５ｍｍＨｇ、１ｍｍＨｇ、１．５ｍｍＨｇ、２ｍｍＨｇ、２．５ｍｍＨｇ、３ｍｍＨｇ、３．５ｍｍＨｇ又は４ｍｍＨｇ以上の高減圧蒸留圧力の範囲である。
【０１１２】
本発明の糸状真菌種又は菌株及び／又はその子孫から抽出された脂質は、バイオ潤滑剤を生成するために使用される。本明細書で使用される場合、「バイオ潤滑剤」との用語は、生きている生物又は最近まで生きていた生物に由来する物質を用いることによって作られる潤滑剤を指す。本明細書で使用される場合、「潤滑剤」との用語は、２つの移動表面の間の摩擦及び摩耗を低減するように、２つの移動表面の間に導入される物質（操作条件では通常は流体）を指す。モーターオイルとして使用されるベースオイルは、一般的にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって鉱油（グループＩ、ＩＩ及びＩＩＩ）又は合成油（グループＩＶ及びＶ）と分類される。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＡＰＩ）Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ０９を参照。モーターオイルの形態での潤滑剤の最大の用途の１つは、自動車及び動力装置の内燃機関を保護することである。典型的には、潤滑油は、９０％のベースオイル（鉱油と呼ばれることが、最も多い石油フラクションである）及び１０％未満の添加剤を含む。水素化ポリオレフィン、エステル、シリコーン、フルオロカーボン及び多くの他のものなどの植物油又は合成液体が、ベースオイルとして使用されることがある。これらは主に植物及び動物由来のトリグリセリドエステルである。潤滑剤ベースオイルの使用には、植物由来の物質が好ましい。一般的なものには、高オレイン酸キャノーラ油、ヒマシ油、パーム油、植物由来のヒマワリ種子油及び菜種油、及び動物源由来のトール油が含まれる。多くの植物油はしばしば加水分解され、酸を生成し、その後選択的に合成され、特殊な合成エステルを形成する。
【０１１３】
したがって、本発明の糸状真菌種及び／又は菌株及び／又はそれらの子孫によって形成された糸状菌バイオマットから抽出された脂質は、適切な添加剤を添加することによってエステル系バイオ潤滑剤組成物を製造するために使用することができる。エステル系潤滑剤組成物を製造する方法は、当業者に知られている。非限定的な例として、トリグリセリドを含むある量の生物学的に誘導された油が提供され、トリグリセリドの少なくともいくつかを加水分解し、遊離脂肪酸を形成するように処理され、ここで、脂肪酸は、飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される種類の脂肪酸である。脂肪酸は、種類によって分離され、その結果、少なくとも一価不飽和脂肪酸が、飽和脂肪酸及び多価不飽和脂肪酸から実質的に単離される。次に、一価不飽和脂肪酸の少なくとも一部を改質し、エステル生成物（例えば、トリエステルを含む）を生成させ、飽和脂肪酸及び／又は多価不飽和脂肪酸の少なくとも一部を水素処理し、アルカン（パラフィン）を得る。ある実施形態では、このようなエステル生成物は、モノエステル種、ジエステル種、トリエステル種、及びこれらのヒドロキシル化類似体のうち１つ以上を含んでいてもよいことにも留意されたい。
【０１１４】
糸状真菌種及び／又は菌株からの酸性ｐＨ耐性の酵素
フザリウム・オキシスポラム  ｆ．ｓｐ．リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）株４２８７のゲノムは、最近配列決定されており、リグニン、ヘミセルロース及びセルロースの分解に関与する様々な遺伝子を有することが示されている。さらに、これらの物質の分解に関与する酵素（例えば、セルラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、グルクロニダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アラビノガラクタナーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、グルコマンナーゼ、アミラーゼ、ラミナリナーゼ、キシログルカナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キチナーゼ、ｅｘｏ−［３−Ｄ−グルコサミニダーゼ、セロビオースデヒドロゲナーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、キシロシダーゼ、ａ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、フェルロイルエステラーゼ、エンドグルカナーゼ、［３−グルコシダーゼ、Ｍｎ−ペルオキシダーゼ及びラカーゼ）は、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  Ｆ３（Ｘｉｒｏｓら（２００９）Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｂｒｅｗｅｒ’ｓ  ｓｐｅｎｔ  ｇｒａｉｎ  ｂｙ  ａ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  １０：４）で広く研究されている。結果的に、好酸性糸状真菌種及び／又は菌株、例えば、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、及びＭＫ７と命名された好酸菌性糸状菌株は、リグノセルロース材料及び廃液（例えば酸ホエイ）などの複合炭素源を加水分解するために完全に装備されることが期待される）。これらの好酸性糸状真菌種及び／又は菌株は、他の糸状菌株（ｐＨ＞２、Ｓｔａｒｋｅｙ、１９７３）と比較して、かなり低いｐＨ（０．７〜７．５）で成長することができ、リグニン、ヘミセルロース及びセルロースの分解のための酵素は、低いｐＨでもっと高い活性を有するだろうということも期待される。酸性条件下で高活性を有する酵素は、低ｐＨで実施されるプロセスにおいて特に有用である。
【０１１５】
フザリウム種によって産生される毒素
しばしば、微生物に基づく生産は、汚染を防ぐために費用と時間のかかる方法の使用を必要とする。上述のように、糸状好酸性真菌種及び／又は菌株は、他の生物による汚染に対して非常に耐性である。例えば、フザリウム属のメンバーが強力な抗生物質、殺虫剤及び植物毒性を有する毒素（例えば、フモニシン）を生成することが知られている。同様に、糸状好酸性ＭＫ７真菌株は、糸状菌バイオマットの生産に使用される場合、外部抗生物質をほとんど必要としないか、又は全く必要としない。いくつかのフザリウム種は、９種類の異なる毒素を産生し得る。その生成は、異なる宿主植物との関係に依存する（Ｍａｒａｓａｓら、１９８４，Ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ，ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ＩＳＢＮ  ０２７１００３４８０）。毒素の産生も、発酵に使用される培地によって異なる。フザリウム種によって産生され、分泌される毒素としては、限定されないが、ビカベリン、エンニアチン、フザリン酸、リコマラスミン、モニリホルミン、オキシスポロン、トリコテセン、ゼエレロン（ｚｅａｒｅｌｏｎｅｓ）、種々のナフトキノン及びアントラキノン（例えば、ノナケチドナフタザリンキノン、ビカベリン及びノルビカベリン、ヘプタケチド、ネクタリアフロン、５−０−メチルジャバニシン、及びアンヒドロフサルビン（ａｎｈｙｄｒｏｆｕｓａｒｕｂｉｎ）ラクトール）が挙げられる。
【０１１６】
さらに、フザリウム種由来の毒素としては、４−アセトキシシルペンジオール（４−３−アセトキシ−３，１５−ジヒドロキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）を含み得る。同様の化合物、モノデアセチラングイジン  ４−又は１５−アセチルシルペントリオール）、３−アセチルデオキシニバレノール（デオキシニバレノールモノアセタート、３”−アセトキシ−７”、ｌ５−ジヒドロキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン−８−オン）、８−アセチルネオソラニオール（ネオソラニオールモノアセタート、４”，８”，１５−トリアセトキシ−３”−ヒドロキシ−１２、１３−エポキシトリコテック−９−エン）、４−又は１５−アセチルシルペントリオール（４−アセトキシシルペンジオール）、アセチル  Ｔ−２トキシン（３”，４”，１５−トリアセトキシ−８”−（３−メチルブチル（ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒｙ）（オキシ）−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、アングイジン（ジアセトキシシルペノール）、アベナセイン、ビューベリシン、ブテノリド（４−アセトアミド−４−ヒドロキシ−２−ブテン酸−ラクトン）、カロネクトリン（３”，１５−ジアセトキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、１５−デアセチルカロネクトリン（１５−デ−Ｏ−アセチルカロネクトリン、３”−アセトキシ−１５−ヒドロキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、デオキシニバレノール（Ｒｄトキシン、ボミトキシン、３”，Ｔ’，１５−トリヒドロキシ−１２、１３−エポキシトリコテック−９−エン−８−オン）、デオキシニバレノールジアセタート（ジアセチルデオキシニバレノール）、デオキシニバレノールモノアセタート（３−アセチルデオキシンジャバレノール）、ジアセトキシシルペンジオール（７”−ヒドロキシジアセトキシシルペノール）、ジアセトキシシルペノール（アングイジン、４，１５−ジアセトキシ−３’−ヒドロキシ  １２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、ジアセトキシセルペントリオール（７”、８”−ジヒドロキシジアセトキシシルペノール）、ジアセチルデオキシニバレノール（デオキシニバレノールジアセタート、３”、１５−ジアセトキシ−７−ヒドロキシ  １２，１３−エポキシトリコテック−９−エン−８−オン）、ジアセチルニバレノール（ニバレノールジアセタート、４，１５−ジアセトキシ−３’、７’−ジヒドロキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン−８−オン）、７”，８”−ジヒドロキシジアセトキシシルペノール（ジアセトキシシルペントリオール、４，１５−ジアセトキシ−３”，７”，８”−トリヒドロキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、エンニアチン、フルクチゲニン、フモニシンＢ１（１，２，３−プロパントリカルボン酸  １，１−［１−（１２−アミノ−４，９，１１−トリヒドロキシ−２−メチルトリデシル）−２−（１−メチルペンチル）−１，２−エタンジイル］エステル；マクロフシン）、フザレノン（フザレノン−Ｘ、フザレノン、モノアセチルニバレノール、ニバレノールモノアセタート、４−アセトキシ−３”，７”，１５−トリヒドロキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン−８−オン）��ザル酸（フザリン酸、５−ブチルピコリン酸）、フザリン酸（フザル酸）、Ｆ−２（ゼアラレノン）、ＨＴ−２トキシン＝１５−アセトキシ−３”，４−ジヒドロキシ−８”−（３−メチルブチリルオキシ）−１２−エポキシトリコテック−９−エン、７”−ヒドロキシ−ジアセトキシシルペノール（ジアセトキシシルペンジオール、４，１５−ジアセトキシ−３”，７”−ジヒドロキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、８”−ヒドロキシジアセトキシシルペノール（ネオソラニオール）、１，４−イポメアジオール（１−（３−フリル）−１，４−ペンタンジオール）、イポメアニン（１−（３−フリル）−１，４−ペンタンチオン）、１−イポメアノール（１−（３−フリル）−１−ヒドロキシ−４−ペンタノン）、４−イポメアノール（１−（３−フリル）−４−ヒドロキシ  ４  ペンタノン）、ラテリチン、リコマラスミン、モニリホルミン（１−ヒドロキシシクロブタ−１−エン−３，４−ジオンのカリウム塩又はナトリウム塩）、モノアセトキシシルペノール（１５−アセトキシ−３”，４”−ジヒドロキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、モノアセチルニバレノール（フザレノン−Ｘ）、モノデアセチルアングイジン（４−アセトキシシルペンジオール）、ネオソラニオール（８”−ヒドロキシジアセトキシシルペノール，４，１５−ジアセトキシ−３”８”−ジヒドロキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、ネオソラニオールアセタート（８−アセチルネオソラニオール）、ネオソラニオールモノアセタート（８−アセチルネオソラニオール）、ニバレノール（３”，４”，７”，１５”−テトラヒドロキシ−１２，１３−エポキシ−トリコテック−９−エン−８−オン）、ニバレノールジアセタート（ジアセチルニバレノール）、ニバレノールモノアセタート（フザレノン−Ｘ）、ＮＴ−１トキシン（Ｔ−１トキシン、４”，８”−ジアセトキシ−３”，１５−ジヒドロキシ−１２，１３−エポキシ−トリコテック−９−エン）、ＮＴ−２トキシン（４”−アセトキシ−３”，８”，１５−トリヒドロキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、Ｒｄトキシン（デオキシニバレノール）、サムブシニン、シルペントリオール（３”，４”，ｌ５”−トリヒドロキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、ソラニオール（ネオソラニオール）、Ｔ−１トキシン（ＮＴ−１トキシン）、Ｔ−２トキシン（４”，１５”−ジアセトキシ−３”−ヒドロキシ−８”−（３−メチルブチリルオキシ）−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、トリアセトキシ−シルペンジオール（４”，８”，１５”−トリアセトキシ−３”，７”−ジヒドロキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、トリアセトキシ−シルペノール（３”，４”，１５”−トリアセトキシ−１２，１３−エポキシトリコテック−９−エン）、ボミトキシン（デオキシニバレノール）、ヤバニシン、ゼアラレノール（２，４−ジヒドロキシ−６−（６，１０−ジヒドロキシ−ｔｒａｎｓ−１−ウンデセニル）−安息香酸−ラクトン）、ゼアラレノン（６−（１０−ヒドロキシ−６−オキソ−ｔｒａｎｓ−１−ウンデセニル）−レソルシル酸ラクトン）���Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）によって産生されるより詳細な毒素は、Ｔａｔｕｍら（Ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｉｔｒｕｓ．１９８５，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：４５７−４５９），Ｔａｔｕｍら（Ｎａｐｈｔｈｏｆｕｒａｎｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｉｔｒｕｓ．１９８７，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６：２４９９−２５００），Ｂａｋｅｒら（Ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ．１９９８，Ｊ  Ｆｅｒｍｅｎｔ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８５：３５９−３６１）．  Ｔｈｒａｎｅ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅｉｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，ｉｎ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ．Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ，ｔａｘｏｎｏｍｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，１９８９，Ｃｈｅｌｋｏｗｓｋｉ  Ｊ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒによって編集，ＮＹ，ＵＳＡ，ｐｐ１９９−２２５）；Ｂａｋｅｒら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｆｕｓａｒｉａ，Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ  １１１：９−１５，１９９０；Ｍａｒａｓａｓら（Ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１９８４，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ，ＰＡ，ＵＳＡ）に記載され、それぞれ、あらゆる目的のために、その全体が援用により組み込まれる。
【０１１７】
本発明は、以下の例によってさらに説明されるが、これらの例は限定的に解釈されるべきではない。本出願を通して引用された全ての参考文献、特許及び公開された特許出願ならびに図及び配列表の内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
例
例１：自然環境におけるＭＫ７株
自然発生株ＭＫ７は、自然界の藻類、古細菌及び細菌と常に関連しており、平均密度が０．５ｇ乾燥バイオマス／井戸水（Ｌ）未満であることを特徴とする（図１）。これに加え、ＭＫ７は、「ストリーマー」として自然界に存在する。Ｐｕｒｃｅｌｌらは、「ストリーマー」を以下のように定義している。「ストリーマーは、付着点から流水中に突出している糸状及び他の細胞形態を有する水中凝集物である」（Ｐｕｒｃｅｌｌら（２００７）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｅｃｏｌｏｇｙ７  ６０：４５６−４６６）。ＭＫ７株は、全ストリーマーバイオマスの割合として１０％未満である。さらに、ＭＫ７株バイオマスは、本質的に、大きな分生子細胞としてバイオマスの３０％を超えることを特徴とし、本開示の方法の概要によって作られる表面発酵バイオマット中には決して見出されない。
【０１１９】
例２：人工培地の調製
以下の手順で使用されるＭＫ７−１液体培地は、表１Ａに列挙される成分を、２２〜３０℃の脱イオン水（１８．２ＭΩ）に添加した後、１３Ｎ  ＨＣｌを用い、元より低いｐＨであるｐＨ２．８に調整することによって調製された。ｐＨは、Ｏａｋｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  １５０型のｐＨ計とプローブ（オレンジバーグ、ＮＹ）を用いて測定した。次いで、培地を２０分間沸騰させ、使用前に室温（約２３℃）まで冷却した。液体培地を添加する直前に、Ｏａｋｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  １５０のｐＨ計とプローブを用いてｐＨを再び調べ、必要に応じてｐＨ２．８に調整し直す。
【０１２０】
表１Ｂに列挙した成分を用い、ＭＫ７−３液体培地を同じ様式で調製した。
【０１２１】
ある実施形態では、使用される炭素源はグリセロールではないが、種々の他の炭素源、例えば、糖類、グリセロール、リグノセルロース系材料、リグノセルロース系材料の加水分解物、都市廃棄物又は農業廃棄物、食品加工廃棄物（例えば酸ホエイ）、工業用廃液生成物、ジャガイモ廃棄物（ジャガイモ皮、分解によるジャガイモ廃棄物、刻んだジャガイモ、傷ついたジャガイモ）、デンプン廃棄物、サトウダイコン廃棄物、サトウダイコンパルプ、トウモロコシ処理からの廃棄物（すなわち、コーンスティープリカー）、バイオ燃料製造からの廃棄物（セルロース系のエタノール生産、嫌気性消化物などからの残留物）から選択されてもよい。そのような場合には、培地は、使用される炭素源からの栄養素の寄与に対応するように調整される。例えば、炭素源が、糖蜜、酸ホエイ又はリグノセルロースである場合、必要とされる微量元素は、炭素源によって部分的又は完全に提供されると考えられ、培地には多量栄養素のみを加える必要があるだろう。他の実施形態では、炭素源は、「食品グレード」と分類されてもよい。これらの例では、炭素源に関連する微量元素と多量栄養素は期待されず、微量元素と多量栄養素を全て加えなければならない。
【０１２２】
【表１】
2019510492.tif 000003
【０１２３】
【表２】
2019510492.tif 000004
【０１２４】
例３：播種プロセス
トレイに播種するために使用される培養物を、ＭＫ７−１液体培地中、深部発酵条件下で１０Ｌバイオリアクター中で成長させた。他の大きさのバイオリアクターに修正可能であり、１０Ｌの大きさのリアクターの選択は、限定するものと解釈すべきではないことを注記しておくべきである。１０Ｌリアクターは、直径１０．１６ｃｍの透明なＰＶＣ管の長さ１．３ｍの部分から構成されており、底部にＰＶＣエンドキャップを有している。３ｍｍオリフィスを備えるプラスチック通気口／接続具を底部のエンドキャップと管に接続し、空気を供給するために通気口に接続した。プラスチックのサンプリング口／バルブを、底部エンドキャップの底から１５ｃｍの透明なＰＶＣ壁の側面に取り付けた。透明なＰＶＣリアクターの上部を滅菌ガーゼで覆い、リアクターから気体を逃がすことができるように、３ｍｍの穴を有するＰＶＣエンドキャップをゆるく取り付けることによって、所定位置に保持した。組み立てられたバイオリアクターを図２に示す。
【０１２５】
１０Ｌバイオリアクターのための播種材料は、糸状好酸性ＭＫ７真菌株の保管された培養ストック（ロット番号００３）から調製した。保管されたストック培養物は、ＭＫ７−１プレート培地のために表１に記載されたように、１．５％の寒天（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ顆粒寒天、ロット番号５２８７９９４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ウォルサム、ＭＡ）、グリセロール及び無機栄養素で構成された固体培地を含む滅菌ペトリ皿上で成長した糸状好酸性ＭＫ７真菌株菌糸体マットから構成されていた。寒天培地は、２０分間沸騰させ、培地を５０℃まで冷却し、次いで、この溶液２５ｍＬを滅菌ペトリ皿に注ぐことによって調製した。冷却して固化させた後、このプレートに第２世代の保管された凍結ストックを播種し、滅菌ループ（炎で赤くなるまで加熱し、冷却する）を用いることによって、保管されたストックからサンプルを集め、これをペトリ皿に筋状に播種した（図３Ａ）。
【０１２６】
５日間成長させた後、菌糸体マットは、寒天培地表面に完全に成長した（図３Ｂ）。次いで、培養物を−８０℃で凍結させた。１０Ｌリアクターに播種する５日前に、ペトリ皿ストックを冷凍庫から取り出し、室温（約２３℃）に２時間置き、平衡状態にした。次いで、寒天表面に成長した菌糸体マットを、滅菌鉗子（鉗子を炎で赤くなるまで加熱し、イソプロパノールを用いて冷却したもの）を用いて取り出し、滅菌ガーゼ布で覆った１Ｌの滅菌ガラス製バッフル付き振とうフラスコの中の滅菌ＭＫ７−１液体培地３５０ｍＬに入れた。１０Ｌバイオリアクターへの播種材料として使用する前に、このフラスコを、ＶＷＲ  ＯＳ−５００ラボラトリシェーカー（ＶＷＲ、ラドナー、ＰＡ）で、２００ｒｐｍで５日間回転させた。
【０１２７】
播種材料を受け入れる準備として、１０Ｌバイオリアクター中の飲料水道水１１Ｌに濃次亜塩素酸Ｎａ溶液（Ｃｈｌｏｒｏｘ（登録商標）ブリーチ＝８．２５％  次亜塩素酸Ｎａ）３３０ｍＬを添加し、平衡状態に２日間保つことによって、バイオリアクターを滅菌した。２日後、さらなる濃次亜塩素酸Ｎａ溶液３３０ｍＬをこのリアクターに添加した。１日後、希釈した次亜塩素酸Ｎａ溶液をリアクターから完全に排出させ、熱水２Ｌを加え、旋回させ、バイオリアクター内側表面の全てをすすぐことによって、リアクターを約８０℃の沸騰した水ですすいだ。次いで、洗浄水を排出させた。このバイオリアクターに滅菌ＭＫ７−１液体培地３．５Ｌを添加し、滅菌空気（０．２ｕｍ濾過したもの）を、リアクターの底部にある通気口から４００ｍＬ／分の速度でバブリングさせた。これらのバブリング条件によって、直径３〜３０ｍｍの範囲の気泡を生じ、成長中に、液体培地（浮遊細胞）全体に真菌細胞が混合し、均一に分布した。実験では、バブリング速度を大きくするか、又は気泡の大きさを小さくすると、バイオフィルムの成育特性が得られ、バイオマスの塊を生成し、バイオリアクター表面に粘着することが示された。したがって、トレイリアクターの播種のために細胞の均一な懸濁が望ましいため、バイオフィルムの成長特性は、望ましくない。次いで、１Ｌシェーカーフラスコ中で成長した播種材料を、無菌技術を用い、１０Ｌリアクターに添加した（バイオリアクターの上部を開ける前に、外側表面付近の全てに７０％イソプロパノール／３０％水を噴霧し、バイオリアクターの内表面には触れない）。１０Ｌリアクター中にさらなる培養体積を構築するために、培地が、６ｇ／Ｌの乾燥糸状バイオマス密度を得た後、滅菌の新鮮なＭＫ７−１液体培地を、上述のリアクターに加えた。新鮮なＭＫ７−１液体培地をリアクターに添加する場合、その体積は、リアクター中の液体培地の体積の９倍以下であるべきである。通気システムを操作させつつ、バイオリアクターの側面開口部を介してサンプルを集め、既知の体積を、高減圧濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＷＰ６１１１５６０、ＸＸ１００４７００、ＸＸ１００４７０５、ダルムシュタット、ドイツ）を用い、０．２２ｕｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＧＳＷＰ０４７００、ダルムシュタット、ドイツ）で濾過することによって、乾燥糸状バイオマスを測定した。あらかじめ秤量しておいたフィルターと、濡れた糸状バイオマスをＢｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃｕ−Ｓｈａｋｅｒ  Ｍｉｎｉ（エジソン、ＮＪ）中、５０℃で４時間乾燥させ、次いで、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ｓｃａｌｅ  ＭＳ３０３５型（コロンブス、ＯＨ）で計量した。
【０１２８】
糸状好酸性ＭＫ７真菌株は、１０Ｌリアクター中、比成長速度が約０．０２４ｈ−１であり（図４）、対数期中の成長は、以下の式に従うだろう。
【数１】
2019510492.tif 000005
式中、ｘは最終バイオマスであり、ｘ０は初期バイオマスであり、μは比成長速度であり、ｔは時間である。トレイリアクター中の播種材料として使用する場合、１０Ｌリアクター中の培地の細胞密度は、後期対数成長期には、６ｇ／乾燥重量（Ｌ）を上回るべきである（図４：対数成長は、細胞数が連続的に２倍になっている、培養物中の成長期間であり、後期対数成長は、細胞成長速度が減り始める、対数成長が止まる直前の期間である）。細胞密度が低い培地を播種材料に使用すると、バイオマット形成が顕著に遅くなる（２日より長い遅延期）ため、望ましくない。
【０１２９】
播種材料は、本質的に、浮遊細胞で構成されると本明細書では定義されており、浮遊細胞は、塊になっておらず、又は凝集しておらず、幅が約４ミクロン、長さが５〜２０ミクロンの単一細胞であると定義される。
【０１３０】
表面発酵又は固体基質表面発酵のために表面トレイリアクターに播種するために、バブリングによって連続的に混合しつつ、リアクター底部付近の開口部を介して１０Ｌリアクターから液体培地を取り出した。開口部の内側に７０％イソプロパノール／３０％脱イオン水混合物を噴霧し、次いで、バルブを開け、培養物約２５ｍＬを外に出し、バルブをすすぐことによって、播種材料のために使用する培養物を無菌様式で取り出した。この廃棄播種材料培養物を廃棄した。例３に記載したように、播種材料培養物をトレイリアクターの培地に直接添加する。
【０１３１】
例４：表面発酵によるトレイリアクター中でのＭＫ７株の成長
糸状好酸性ＭＫ７真菌株を、浅いトレイリアクターで成長させた。この革新的な考えの教示から、異なるトレイの大きさに修正可能であることを注記しておくべきである。この例では、ポリエチレントレイの内寸は、幅が４１．２７ｃｍ、長さが６１．２８ｃｍであり、高さが２．５４ｃｍの側壁を有する（マットの成長に利用可能な全表面積＝０．２５３ｍ２、図５、Ｗｉｎｃｏ、アイダホフォールズ、ＩＤ）。トレイは、汚染の可能性を最小限に抑えるために、使用前に屑片及び化学物質をきれいに取り除き、滅菌しておくことが望ましい。その結果、使用前に、トレイを石鹸及び温かい飲料水道水（５０〜７０℃）で十分に洗浄し、温かい水道水で１分間十分に洗浄し、全ての石鹸残留物が除去されたことを確認した。その後、トレイの全ての表面が７０％イソプロパノール／３０％脱イオン水（１８．２ＭΩ）溶液で濡れるまで、トレイ全表面に噴霧し、上述のアルコール混合物に浸した紙タオルを用い、手袋を付けた手でトレイを拭いた。その後、漏れたり乾燥したりせずにトレイが液体培地（以下に記載）を受け入れ、保持することができるように、トレイをラックシステム内に配置した。
【０１３２】
本明細書に記載の表面発酵プロセスに使用されるトレイ及びラックシステムは、バイオマットを形成し、バイオマットの急速な成長を可能にするために必要な全ての構成要素を与える。リアクタートレイを保持するために使用されるラックシステムは、Ｇｌｏｂａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（シカゴ、イリノイ州、図５Ａ、Ｂ）から購入したクロム被覆された鋼鉄製の３９トレイ用ラックであった。透明なプラスチックであるＳａｒａｎ（登録商標）などの１６インチ幅のラップ（Ｃｏｓｔｃｏ、ボーズマン、モンタナ州）を使用し、ラックシステムを包み、囲み込み、トレイを周囲の部屋から隔離した。これにより、環境条件（湿度、空気流量）の制御が可能になり、汚染が最小限に抑えられた（図５Ａ、Ｂ）。加湿された滅菌空気を、８００ｍＬ／分の速度で、（空気を加湿するための）水温２２〜３０℃、オートクレーブ処理した０．２ｕｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＬＦＧ８５０００、ダルムシュタット、ドイツ）に通し、微生物を除去するために２００ｍＬの脱イオン水（１８．２ＭΩ）に通すバブリングによって、閉じたラックに吹き込んだ。理想的には、空気流の速度は、ラックシステムにわずかな正の圧力（＞０．１ｐｓｉ）が生じるような速度であり、それによって、バイオマットが所望の密度及び／又は稠度に達するまで、閉じられたトレイ及びラック系に、空気に含まれる汚染物質が入り込む量を最低限にする。
【０１３３】
微生物マットが活動している間、細胞は呼吸している。すなわち、二酸化炭素と熱を生成し、酸素を消費する。二酸化炭素が蓄積すると、酸素の利用可能性を減らす可能性があり、これは制限されるべきである。したがって、空気流は、微生物の呼吸中に生成され、蓄積される二酸化炭素を流し出すようなものでなければならない。さらに、空気流は、微生物の呼吸中に生成する過剰な熱を取り除き、呼吸している細胞に十分な酸素を供給するようなものでなければならない。空気流は、これらの必要性を満たすように調整すべきである。例えば、さらに多くのトレイを使用する場合に必要性が増すにつれて、空気流は、上昇する温度及び大気の必要性を満たすように増加させるべきである。空気流は、真菌の菌糸を乱し、その成長と機能を阻害するのに十分なほど強いものであってはならない。理想的には、トレイシステムでは、空気流によって、トレイを横切る空気の流れを作り出す。一実施形態では、空気流は、空気を０．２ｕｍフィルターに通し、マットを横切って空気を通過させるファンによって作り出すことができる。ファンの速度及び得られる空気流は、ラック内に配置された温度、二酸化炭素及び酸素のセンサに基づき、スマートセンサ／アクチュエーションシステムによって制御することができる。
【０１３４】
トレイシステムの温度は、成長中に２５℃±２℃の範囲であった。ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅｓｙｓ  １０Ｓ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｂｉｏｍａｔ  ３Ｓ、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ６０Ｓソフトウェア及びセンサシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ．ウォルサム、ＭＡ）を用い、温度を測定した。熱電対センサは、トレイラックシステムの内側の中程の高さ２０ｍｍのところと、トレイラックシステムの上部に配置した。
【０１３５】
例２に記載するように、ＭＫ７−１培地を調製した［栄養素の添加、ｐＨ調整、沸騰及び室温（約２３℃）への冷却］。培地を調製した後、播種材料リアクターから播種材料培養物を得て（例３を参照）、ＭＫ７−１培地の７．５％（体積対体積）の割合でポットに加えた。例えば、このポットに入った培地１．５Ｌに播種材料１１３ｍＬを加えた。培地に対する播種材料のこの比率は、細胞を迅速に成長させ、マットを形成するのに十分な条件を与える。この実施形態では、新鮮な培地を播種した後の所望な乾燥細胞糸状バイオマスは、０．４５〜０．７５ｇ／Ｌである。しかし、０．０１〜１００ｇ／Ｌの範囲の密度は、現在のトレイシステムにおいてバイオマットを首尾よく生成するために潜在的に使用される可能性がある。培地に対する播種材料の比率を小さくすると、例３に記載したように、成長が遅くなる。
【０１３６】
培地の体積に対する炭素基質の体積は、得られるバイオマスの生成速度に影響を与える。一般に、上述の比率が小さすぎると、利用可能な炭素が不足するため、成長速度が遅くなる。すなわち、成長速度は、炭素によって制限されるようになる。上述の比率が大きすぎると、得られる浸透圧が大きくなりすぎ、バイオマスの成長速度が低下する。さらに、炭素が限られている場合、得られるバイオマスの密度及びバイオマス凝集性は小さく、これによって、表面発酵プロセスによって与えられる処理及び取り扱いの利点が低くなる。例えば、ＭＫ７と命名された糸状真菌株は、上述の比率が８〜１５％であるときに、最適な成長条件を有する。
【０１３７】
培地／細胞懸濁物を、滅菌した大きなプラスチックスプーン（長さ３０ｃｍ、上述のアルコール混合物で洗浄することによって滅菌）で混合し、得られた混合物１．５Ｌを、滅菌した（上述のアルコール混合物で洗浄した）メスシリンダーを用い、各トレイに加えた。全てのトレイがラックシステムに装填された後、ラックシステムを透明プラスチックで包んだ。
【０１３８】
６日間インキュベートした後、得られたバイオマットは、厚さが３〜１０ｍｍであり、破損することなく取り扱うことができるほど、十分な引張強度及び構造一体性を有している（図６）。まず、ラックシステムの周りの透明プラスチックラップを取り除き、ラックからトレイを取り出すことによって、バイオマットを採取した。バイオマットを手でトレイから取り出し、１２．７×２３ｃｍのＰｙｒｅｘガラストレイに入れ、飲料水道水で２分間、穏やかにすすいだ。すすいだバイオマットをガラストレイ上に置き、乾燥させるか、又は３．７リットルのプラスチック袋に入れて凍結させた。乾燥させるために、バイオマットを温度制御されたオーブンに入れ、バイオマットを４５分間、６０℃±１℃で加熱して酵素の多くを不活化し、マット内の生化学的変換を制御し、その後、乾燥重量が変化しなくなるまで５０℃±１℃で加熱した（約４８〜７２時間）。上述の条件で生成したバイオマットの平均乾燥重量は、糸状好酸性ＭＫ７真菌株についてトレイ当たり乾燥糸状バイオマス８１ｇであった。これは、５４ｇ／Ｌ、３２４ｇ／表面積（ｍ２）、生産性０．３７ｇ／Ｌ／時間に相当する。乾燥していないバイオマットの平均含水量は、０．１７乾燥糸状バイオマス／ｇ、又は８３％液体であった。
【０１３９】
トレイにおける細胞成長は、典型的には、図７に示す成長曲線に従って起こる。細胞は、成長約４８時間までは、プランクトン様の状態（培地全体に均質／均一に分布した細胞）で成長する。４８時間後、培地表面で細胞が凝集し、バイオフィルム（言い換えると、細胞が絡み合い、互いに付着している微生物マット）を形成し始める。マットは、最初は非常に薄いスキン状態だが、炭素基質又は他の栄養素が不足するなどの制約要因が成長を抑制するまで、迅速に成長し続ける。
【０１４０】
バイオマットが撹乱に敏感な結果、成長が低下するため、トレイが撹乱されないまま維持され、全成長期間の間、バイオマットの一体性が維持されることが重要である。バイオマットに影響を与える撹乱としては、トレイの過剰な振動、マットに圧力をかけること、バイオマットの表面に液体をかけること、バイオマットを横切る急速な空気流、菌糸の乱れ、破壊又は圧縮、又はマット自体の物理的破壊が挙げられる。これらの種類の撹乱によって、迅速な成長速度、液体の体積及び表面積当たりの高い糸状バイオマス蓄積といった、バイオマットが成長する際の利点が失われる。
【０１４１】
気中菌糸及び菌糸体は、バイオマット全体に細胞が呼吸するための酸素を供給する際に重要な役割を果たすとの仮説が立てられている。したがって、気中菌糸／菌糸体の形成、成長及び機能は、バイオマットの迅速な成長にとって重要である。その結果、これらの菌糸／菌糸体の形成又は成長に影響を及ぼす撹乱は、バイオマットの成長を低下させる。
【０１４２】
上述の表面発酵方法及び培地は、バイオマットを形成させ、迅速な成長を可能にするために必要な構成要素を全て与える。多種多様なトレイシステムを、上述の概念を用いて試験し、単位面積当たりほぼ同等の生産性が得られた。例えば、７．５％グリセロール及びＣ：Ｎ比１０：１を用い、バイオリアクターの表面積を０．０２ｍ２から１ｍ２まで増やしたとき、生産性は成長期に約４４ｇ／ｍ２／日で一定のままであった。
【０１４３】
例５：糸状菌バイオマットの成長及び生産性にトレイサイズが及ぼす影響
バイオマットの成長及び生産性に対するトレイサイズの影響を試験するために、０．０２ｍ２Ｐｙｒｅｘ（登録商標）ガラストレイ、０．２５ｍ２ポリプロピレントレイ、１．７７ｍ２プラスチックライナー付きトレイ中、７．５％グリセロールを含むＭＫ７−１培地上でＭＫ７株糸状菌バイオマットを成長させた。表面積に対する液体培地の体積の比率は、全ての処理について６Ｌ／ｍ２であった。成長速度は、トレイサイズによって最小限しか影響を受けず、６日後に、線形の成長速度が観察された（図８）。乾燥バイオマスの生産性は、それぞれ０．０２、０．２５、１．７７ｍ２のトレイで、１．３２、１．５４及び１．５７／ｍ２／ｈであった。
【０１４４】
例６：異なる培地上でのＭＫ７株の成長
糸状好酸性ＭＫ７真菌株の成長特性（すなわち、成長速度、細胞密度、基質変換効率、マット形成）の成長特性は、成長培地の選択の関数として顕著に変動し、培養物は、ＳＳＦ／深部発酵条件又はＳＳＳＦ／表面発酵条件で成長する。糸状好酸性ＭＫ７真菌株を、イエローストーン国立公園の微生物の自然環境中に見出される化学物質を模倣するために最初に設計されたが、他の糸状真菌にとって有益であることがわかっている栄養源に適合するように窒素、リン、カルシウム及びマグネシウムの濃度を高めた、従来の（２００９年５月から２０１２年１１月まで）ＭＫ７Ａ培地上で栽培した（表２、ＭＫ７Ａ）。ＭＫ７−１培地は、糸状好酸性ＭＫ７真菌株の成長特性を、特に、表面発酵によるマット形成に関して向上させ、改善するために開発された（表２）。具体的には、リン、カルシウム、マグネシウム、窒素を増やし、さらなる窒素源（尿素）を加えた。カルシウム、マグネシウムを増やし、尿素を加えると、具体的には、成長速度が増加し、マット形成が向上した。
【０１４５】
【表３】
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【０１４６】
ＭＫ７Ａ培地を用いた最初の実験は、シェーカーフラスコ中の深部発酵条件下でのみ行われた。これらの条件下で、最大成長速度、変換効率（糸状バイオマスに変換される炭素基質のｇ数）、生成した最大糸状バイオマスは、それぞれ、０．０７２ｇ／Ｌ／ｈ、２２％、８．６ｇ／Ｌであった（表３）。
【０１４７】
【表４】
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【０１４８】
細胞密度を高めるために、ＭＫ７Ａ培地を表面発酵条件と組み合わせて利用した。バイオマットは、４〜１５％の炭素濃度、グルコース又はスクロース４〜３０％とグリセロールを含む状態で生成した。尿素は、表面発酵条件下で生成速度を高めることが見出され、ＮＨ４ＮＯ３、ＮＨ４ＰＯ４、ＮＨ４ＳＯ４は、ＮＨ４の代替源である。尿素の添加は、他のＮＨ４源と比較して、市場価格が安価であるという利点を有する。糸状バイオマスの密度を１８０ｇ／Ｌまで高め（トレイからバイオマットを取り出した後の密度）、成長速度を最適化するには、炭素基質１２．５％が理想的であることがわかった。
【０１４９】
表面発酵及びＭＫ７−１培地を用いて生産された高密度のバイオマットは、深部発酵条件（いずれかの培地を用いる）と比較して、以下を含む多くの利点を有する。（１）深部発酵の場合には最大で２４．１ｇ／Ｌであるのと比較して（表３）、糸状バイオマスの密度が１８０ｇ／Ｌまで増加する（トレイからバイオマットを取り出した後の密度）、（２）深部条件では最大速度が０．２８ｇ／Ｌ／ｈｒであるのと比較して、成長速度が０．４６ｇ／Ｌ／ｈｒまで増加、（３）最大成長速度のために、炭素原料の密度が７．５％から１２．５％まで増加、（４）特に、高密度糸状バイオマスが産生されたとき、糸状バイオマスの採取条件がかなり容易である（例えば、遠心分離を必要としない）、（５）深部発酵のための大きく複雑な通気バイオリアクターと比較して、糸状バイオマスを通気する必要がない、（６）非常に大きな市販の深部発酵機と比較して、表面トレイシステムを使用するようにかなりスケールアップし、拡張することが可能である、（７）液体の廃棄物が少ない。
【０１５０】
Ｃ：Ｎ比を１０：１未満に下げることも、糸状バイオマス生産にとって非常に有益であり、脂質に対するタンパク質のレベルが増加した。歴史的に、ＭＫ７Ａ培地は、特に３０超：１のＣ：Ｎ比で、糸状好酸性ＭＫ７真菌株によって脂質を産生するように設計された。様々なＣ：Ｎ比と、培養条件とを合わせ、糸状好酸性ＭＫ７真菌株バイオマス中の脂質濃度を、バイオマスの５〜６０重量％に調整することができた。糸状バイオマスの脂肪酸プロファイルは、ＭＫ７Ａ培地及びＭＫ７−１培地と非常によく似ており、種々の単純な炭素基質（例えば、グリセロール、グルコース、スクロース）を含むが、温度は、多価不飽和脂肪酸の濃度を上げることがわかり、ω−３リノレン酸は、相対的にもっと低い温度で、時間経過に伴って増加していく（図９）。
【０１５１】
例７．ＭＫ７Ａ培地及びＭＫ７−１培地でのＭＫ７株の成長
ＭＫ７株の糸状菌バイオマットは、ＭＫ７Ａ培地及びＭＫ７−１培地を用い、炭素源（原料）としてスクロース又はグリセロールを用いた表面発酵条件下で生産された。ＭＫ７Ａ培地及びＭＫ７−１培地から生産される糸状菌バイオマットを評価するために、５種類の異なる培地配合物を調製した。（１）ＭＫ７Ａ培地中、４％のスクロース、（２）ＭＫ７−１培地中、４％のスクロース、（３）ＭＫ７Ａ培地中、４％のグリセロール、（４）ＭＫ７−１培地中、１０％のグリセロール、（５）ＭＫ７−１培地中、１２．５％のグリセロール。５種類全ての培地配合物のｐＨを、濃ＨＣｌを適切に添加して２．７に調整し、その後、１０分間沸騰させた。室温（約２３℃）まで冷却した後、７．５％（体積／体積）の対数成長期にあるＭＫ７株播種材料を各培地に添加した。ｐＨを２．７に再び調整し、播種した培地を２５０ｍＬずつに小分けし、これを消毒した０．０２３ｍ２のＰｙｒｅｘ（登録商標）ガラストレイに添加した。次いで、トレイをトレイラックシステムに入れ、培地と播種材料の混合物を２３℃±１℃でインキュベートした。
【０１５２】
以前の実験結果に基づき、全ての培地の組み合わせでバイオマスが形成されると予想される。ＭＫ７−１培地と比較して、ＭＫ７Ａ培地の方がバイオマスを迅速に生成することも予想される。これは、成長（例えば、より低いイオン強度／浸透圧、より低いアンモニウム濃度）のためのＭＫ７Ａ培地のより快適な化学的条件に起因する。しかし、時間の経過と共に、ＭＫ７−１培地表面に生育する糸状菌バイオマットは、ＭＫ７Ａ培地上で成長するバイオマスよりも速い成長速度で成長する。すなわち、両方の系は異なる増殖速度曲線を有しており、ＭＫ７−１培地は、初期段階で急速な成長を示し、後期段階では成長速度が減少する。逆に、ＭＫ７−１培地上で成長した糸状菌バイオマットは、まず、初期成長段階では比較的遅い成長速度を示し、その後、バイオマス成長の後期段階で非常に急速な成長速度を示した。最終的に、ＭＫ７−１培地上で成長した糸状菌バイオマットは、ＭＫ７Ａ培地上で成長したバイオマットよりも厚くなり、より大きな引張強度を有する。ＭＫ７Ａ培地中の栄養素（例えば、Ｎ、Ｐ、Ｋ）の濃度が顕著に低いと、早期に栄養素の制限が起こり、ＭＫ７−１培地上で産生されるバイオマットほど厚くなく、又は強くないバイオマットでは、成長阻害を引き起こすことが予想される。
【０１５３】
例８：ＭＫ７株によって産生されたバイオマットの構造
バイオマットの構造は、透過型光学顕微鏡によって決定した。ここで、７．５％グリセロールを含むＭＫ７−１培地上で５日間成長させたＭＫ７株からバイオマットを生産した。バイオマットを採取し、凍結させ（−２０℃）、１ｃｍ×１ｃｍの正方形試験片に切除した後、クリオモルド（ＶＷＲ  ２５６０８−９１６、ラドナー、ＰＡ）中の１０％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ  Ｇ２５００−３０００  Ｂｌｏｏｍゼラチン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）で包み込んだ。液体窒素浴の蒸気相にクリオモルドをさらすことによって、ゼラチン／組織サンプルをすばやく凍結させた後、−２０℃に一晩置いた。
【０１５４】
凍結切除は、Ｌｅｉｃａ  ３９４７５２１４型  Ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｅｒ（Ｌｅｉｃａ、ヴェッツラー、ドイツ）を用いて行った。クリオモルドからサンプルを取り出し、ＯＴＣ組織凍結培地（Ｌｅｉｃａ  １４０２０１０８９２６）でコーティングした後、凍結切断して厚さ１０〜５０μｍの切片にした。透過光顕微鏡法（顕微鏡：Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ；カメラ：Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、ドイツ）を用い、サンプル切片を可視化し、画像化した。
【０１５５】
グリセロールマットでは、（ａ）緻密底部層と（ｂ）気中菌糸層の少なくとも２つの別個の層が観察された。あるサンプルでは、（ａ）緻密底部層、（ｂ）気中菌糸層、（ｃ）遷移領域層の少なくとも３つの構造的に異なる層を見ることができた（図１０Ａ及びＢを参照）。典型的には、気中菌糸層は、最も顕著に支配的な層であり、その後に緻密底部層があり、存在する場合及び／又は見ることができる場合には遷移領域層が最も小さい。ある場合では、例えば、図１０Ａに示すバイオマットでは、（ａ）緻密底部層と（ｂ）気中菌糸層と（ｃ）遷移領域層との目に見える比率は、約３．８６対約９．４３対約１であった。別のサンプルでは、例えば、図１８Ｂに示すバイオマットでは、この比率は、約１．７対約３．７対約１であった。図１８Ｃには、目に見えて明らかな遷移領域層は見られなかった。
【０１５６】
ＭＫ７−３で成長したバイオマットのさらなる光学画像は、緻密底部層と比較して、上部の気中菌糸層には脂質又は顔料の存在が示されなかった（図１１Ａ及び１１Ｂ）。気中菌糸は、マットから伸びていることがわかり、それぞれが大気にさらされており、菌糸間に液体は存在しない。このことにより、液体及び／又は細胞外多糖／タンパク質マトリックスによって分離されているマットの他の層の菌糸／菌糸体とは区別される。気中菌糸は、酸素の移動とＣＯ２の移動を担う。酸素の利用可能性によって、上部の気中菌糸層に酸素を吸収する菌糸が得られる。これらの気中菌糸は、下部のマット層に見られる菌糸／菌糸体よりも長いように見える（図１１Ｂと図１１Ｃを比較）。上部層の気中菌糸は、垂直配向の優位性も有する傾向があり、すなわち、これらの気中菌糸は、糸状菌バイオマットと空気の界面に対して垂直に配向する傾向がある。
【０１５７】
緻密底部層の菌糸では、垂直配向は支配的ではなかった（図１１Ｃ）。ここで、菌糸は絡み合い、配向が混在し、水平配向が優勢な傾向がある。底部層の菌糸は紫色顔料も含んでいるように見えたが、上部の気中層では明白ではなかった。予備実験では、底部層が約３０％の脂質を含み、菌糸が、タンパク質及び／又は多糖のマトリックスに埋め込まれていることを示した。底部層の菌糸は、顔料、脂質、炭水化物及びタンパク質の主な貯蔵領域でもある。
【０１５８】
（１）ＭＫ７−１培地及び（２）ＭＫ７−３培地で成長させたＭＫ７株から製造したバイオマットを５日後に採取し、２０℃で凍結させた。両バイオマットの厚さは、２〜４ｍｍの範囲であった。１ｃｍ２の正方形切片を、上述の２種類の凍結させたバイオマットから３個ずつ切断し、次いで、横方向に半分に切断し、それぞれの厚さが１．５ｍｍの上部及び底部の半分の切片を作成した。
【０１５９】
ＭＫ７−１培地で成長させたバイオマットの平均密度は、上部の横方向の切片では０．１３１ｇ／ｃｍ３（標準偏差＝０．０６８）であり、底部の横方向の切片では０．３１１ｇ／ｃｍ３（標準偏差＝０．０３２）であった。上部密度と底部密度の比は、０．４２であった。
【０１６０】
ＭＫ７−３培地で成長させたバイオマットでは、上部の横方向の切片の平均密度は、０．１０２ｇ／ｃｍ３（標準偏差＝０．０４８）であり、一方、底部の横方向の切片の平均密度は、０．２５６ｇ／ｃｍ３（標準偏差＝０．０１０）であった。上部密度と底部密度の比は、０．４０であった。
【０１６１】
例９：ＭＫ７株によって産生されたバイオマットの引張強度
ＭＫ７−３培地で５日間成長させたＭＫ７バイオマットの引張強度を評価した。ここでは、幅２５．４ｃｍ、長さ４６ｃｍ、厚さ３．５ｍｍのマットを使用した。マットの含水率は約８５％であり、乾燥重量の約１５％に相当する。総乾燥重量は、７０ｇ／０．２５ｍ２トレイ又は２８０ｇ／ｍ２であった。このマットの密度は０．０８ｇ／ｃｍ３であった。
【０１６２】
引張強度を測定するために、マットの一方の端部を静止位置にクランプ止めし、他方の端部を自由移動する装置にクランプ止めした。自由移動する装置自体は、加えられた張力を測定するスケールに取り付けられていた。マットが壊れるまで数秒間かけてスケールを引っ張り、安定してゆっくりとした張力をマットに加えた。マットの破断／裂き／引き裂きに必要な測定された張力は、０．２８ｋｇ／マット幅２．５４ｃｍ〜０．５８ｋｇ／マット幅２．５４ｃｍの範囲であり、これは、０．１１ｋｇ／マット幅１ｃｍ〜０．２３ｋｇ／マット幅１ｃｍに相当する。その平均は、０．５ｋｇ／マット幅２．５４ｃｍ、又は０．２ｋｇ／マット幅１ｃｍであった。
【０１６３】
例１０：粗グリセリン上でのＭＫ７株バイオマットの成長
粗グリセリンを炭素源及び栄養源（原料）として使用し、緻密なＭＫ７株バイオマットを８日間で製造した。粗グリセリンは、バイオディーゼル生産の副産物であり、Ｗ−２  Ｆｕｅｌｓ（製品コードＧＬ３２０００、バッチ４３００、カタログ番号５６−８１−５、エイドリアン、ＭＩ）から得た。粗グリセリンは、７５〜８５％のグリセリン、２〜１０％の水、２〜５％の塩、１〜２％の脂肪、油又はエステル、１％未満のメタノールで構成されていた。
【０１６４】
全強度又は１／２強度のＭＫ７−１培地塩に、７．５％濃度の粗グリセリンの飲料水道水溶液（重量：体積）を追加し、全強度又は１／２強度のＭＫ７−１培地１１Ｌを作成した。これらの溶液のｐＨを４．８に調整し、その後、１０分間沸騰させた。室温（約２３℃）まで冷却した後、例３に記載のように調製した５％体積：体積のＭＫ７株播種材料を上述の培地に添加した。ｐＨを再び４．８に調整し、播種した粗グリセリン培地を１．５Ｌずつに小分けし、トレイをラックシステムに配置する前に、これを消毒したポリプロピレン０．２５ｍ２トレイに加えた。
【０１６５】
この混合物を２３℃±１℃でインキュベートし、８日後に厚さ約４ｍｍの可撓性で比較的緻密なバイオマットを得て、この時点で、バイオマットを採取した。バイオマットを５０℃で７２時間乾燥させ、平均乾燥重量±標準偏差は、全強度培地処理の場合には３０．３±３．１ｇ（ｎ＝６）、１／２強度培地処理の場合には３０．２±２．８ｇ（ｎ＝８）であった。グリセリンから乾燥バイオマットへの平均変換率は３４％であり、乾燥バイオマスの重量を基準とした、湿ったマットの密度は、両処理で０．０３ｇ／ｃｍ２であった。
【０１６６】
例１１：小麦蒸留可溶物上で成長させたＭＫ７株バイオマットの菌糸／菌糸体の構造
連結されたＭＫ７株の糸状菌バイオマットは、炭素源及び栄養源（原料）として乾燥小麦蒸留可溶物（ｄｓ）を用いて７日間で生産された。小麦ｄｓは、タンパク質３１．５％、油８．６％、デンプン２．８％、砂糖１３．５％、繊維２．７％、灰分８．５％、カルシウム０．１９％、マグネシウム０．２９％、カリウム１．７％、リン０．７８％、硫酸３．５％から構成されていた。２種類の成長培地処理を調製した。処理１は、水中５％のｄｓ乾燥重量を使用し、処理２は、１／２強度のＭＫ７−１塩培地中５％ｄｓ乾燥重量を使用した。混合物のｐＨを３．４に調整した。混合物に、７．５％（体積：体積）の例３に記載したように調製したＭＫ７株播種材料を播種し、その培地１７５ｍｌをアルコール滅菌した１２．７×１２．７ｃｍのプラスチックトレイに添加した。糸状菌バイオマットを室温（約２３℃）で７日間インキュベートした後に採取した。唯一の炭素源及び栄養源としての５％ｄｓ上で成長させたバイオマット（処理１、ＭＫ７−１塩を含まない）は、厚さが平均２．７ｍｍであり（ｎ＝３トレイ）、明確な層化を示さず、平均乾燥重量は０．８３ｇであり、平均密度は０．０１９ｇ／ｃｍ３であり、変換効率は約１０％であった。気中菌糸は観察されず、マットは、全体的に液体で飽和されていた。すなわち、マットの上部表面は、液体の表面にあった。
【０１６７】
ＭＫ７−１塩を追加した５％ｄｓで成長させたバイオマット（処理２）は、厚さが平均６．４ｍｍであり、平均乾燥重量は３．１１ｇであり、平均密度は０．０３０ｇ／ｃｍ３であり、変換効率は約４０％であった。これらのマットは、厚さ約０．９ｍｍの別個の緻密層のすぐ上に、厚さが約４〜７ｍｍの広範でふわふわした白い気中菌糸系を発達させた。上部層の密度は０．０１１ｇ／ｃｍ３であり、下部層の密度は０．１４８ｇ／ｃｍ３であった。
【０１６８】
例１２：炭素源及び栄養源としてのコーンスティープリカー及びコーンスティープリカー／デンプン上でのＭＫ７株の糸状菌バイオマットの成長
緻密なＭＫ７株の糸状菌バイオマットは、唯一の炭素源及び栄養源（原料）としてコーンスティープリカーを用い、わずか４日間で生産された。さらに、デンプンを５％添加したコーンスティープリカーも、緻密な糸状菌バイオマットを生成することができることが示された。コーンスティープリカーは、トウモロコシ湿式粉砕の粘性のある副生成物であり、アミノ酸、ビタミン、及びミネラルの組成を有し、微生物発酵の補助剤として適している。この例で使用したコーンスティープリカーは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ダラス、ＴＸ；ロット番号Ｂ０１１６）から購入した。これらの実験は、ＭＫ７−１栄養素の代替物としてのコーンスティープリカーの使用を示した。処理は、唯一の炭素源及び栄養源として１０％及び２０％のコーンスティープリカー、（それぞれ）５％デンプンを含む１０％及び２０％のコーンスティープリカーを含んでおり、デンプンは、糸状菌バイオマットの成長のためのさらなる炭素を与える。
【０１６９】
０ｇ又は５０ｇの乾燥デンプンを含む体積１Ｌに対し、１０％又は２０％のコーンスティープリカーを添加することによって、４バッチの培地を調製した。適切な量のＨＣｌを添加することによって培地をｐＨ３．６に調整し、適切な容器中で１５分間沸騰させた。室温まで冷却後、混合物のｐＨを３．６に再び調整し、混合物に、例３で調製した７．５％ＭＫ７株播種材料を播種した。培地を１７５ｍｌに小分けし、これを５つの四角トレイ（０．０１６ｍ２表面積／トレイ）に添加し、ラックシステム中、２３℃±１℃でインキュベートした。６日後に糸状菌バイオマットを採取した。１０％、２０％、１０％＋デンプン及び２０％＋デンプンにおけるコーンスティープリカー処理の平均最終ｐＨは、それぞれ３．９７、３．６９、４．２３及び４．１５であった。これらの処理の平均バイオマス重量±標準偏差は、それぞれ１．１±０．２、０．１±０．１、２．３±０．１及び２．１±０．２ｇであった。
【０１７０】
例１３：牛の肥育池水から糸状菌バイオマットへの変換
成長実験は、唯一の炭素源及び栄養源として牛の肥育池水を用いて実施した。水の初期溶存有機炭素含有量は４ｇ／Ｌであり、初期総溶存窒素含有量は０．８ｇ／Ｌであった。
【０１７１】
肥育池水を濃ＨＣｌでｐＨ２．６に調整し、例３で調製した７％ＭＫ７株播種材料を播種した。消毒した０．２５ｍ２のポリプロピレントレイを１．５Ｌの播種した廃水で満たし、２４℃±１℃でインキュベートするために、トレイラックシステムに入れた。播種から２日後に糸状菌バイオマットが液体表面に形成され始めた。１０日後、糸状菌バイオマット及び残った液体を１つの容器に集め、乾燥させた後、Ｃｏｓｔｅｃｈ  ｔｏｔａｌ  Ｃ  ａｎｄ  Ｎ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＥＣＳ  ４０１０，Ｃｏｓｔｅｃｈ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，バレンシア、ＣＡ）を用い、総Ｃ及びＮを分析した。トレイ当たりの平均乾燥バイオマスは、６．５３１ｇ（ｎ＝２）であった。マットと残留液の分析により、炭素の約７７％と窒素の９９〜１００％が、マットによって肥育池廃水から除去されたことが明らかになった（この方法検出限界は約１％）。このシステムの炭素及び窒素の除去率は、１０日間にわたって平均した場合、６．８ｍｇ／Ｌ／ｈ及び１．２ｍｇ／Ｌ／ｈであった。現在の理解によれば、肥育池水をＨＣｌでｐＨ２．６に酸性化し、ＭＫ７株を播種することによって、Ｃの大部分と、Ｎのほぼ全てを肥育池水から除去することが可能である。さらに、直接肥育池水を処理することが可能であり、現場の肥育池水上に浮遊する糸状菌バイオマットを生じ、その後使用するために採取することができる。
【０１７２】
例１４：酸ホエイ代用培地上でのＭＫ７株バイオマットの成長
緻密なＭＫ７株バイオマットは、Ａｃｉｄ  Ｗｈｅｙ  Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＷＳ）から７日間で製造された。ＡＷＳ培地の組成は、Ｔｓａｋａｌｉら（２０１０）に記載されている酸ホエイの典型的な組成に基づいていた。この例で使用したＴｓａｋａｌｉ培地及びＡＷＳ培地の組成を表４に記載する。
【０１７３】
ｐＨ４．８のＡＷＳ培地８７ｍＬを使用して、滅菌した１２．７×１２．７ｃｍ（０．０１６ｍ２）のポリプロピレントレイでバイオマットを生産した。この培地は、１Ｌ三角フラスコ中で表４に記載の成分を混合し、ｐＨを４．８に調整し、次いで１０分間沸騰させることによって調製した。培地が約２３℃まで冷却された後、７．５体積％（体積／体積）の対数成長期の播種材料を上述のフラスコに添加した。この播種材料を、例３に記載したように作成した。播種した培地を８７ｍＬに小分けし、これをイソプロピルスワブドトレイ（例３）に添加し、このトレイを、例３に記載したトレイラックシステムに取り付けた、これより大きな（０．２５ｍ２）トレイに置いた。培養物を２５±１℃でインキュベートし、比較的緻密なバイオマットを得て、これを７日後に採取した（図１８）。７日後の残留液の平均ｐＨ値は、６．９±０．１であった。このように、成長プロセスは、ＡＷＳのｐＨを、酸ホエイに典型的な４．８から中性付近（約７）に中和した。透過型光学顕微鏡法は、ＡＷＳ培地上に生成されたバイオマットの糸状性を明らかにした（図１８）。湿ったバイオマットの平均厚さは４±０．５ｍｍであった。バイオマットを５０℃で３０時間乾燥し、得られた平均乾燥重量は、１．８８±０．２ｇであった。湿ったバイオマットの平均密度は、０．２９ｇ／ｃｍ３であった。乾燥原料（ラクトース及び総タンパク質）の乾燥バイオマットへの平均変換率は４２．２％であった。
【０１７４】
【表５】
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【０１７５】
例１５：酸ホエイ上でのＭＫ７株バイオマットの成長
主な炭素源及び栄養源として酸ホエイを用い、ＭＫ７株バイオマットを６日間成長させた。バイオマットは、種々の処理を行った１２５ｍＬの原料酸ホエイを使用し、滅菌済みの１２．７×１２．７ｃｍ（０．０１６ｍ２）のポリプロピレントレイで生産された。この処理は、ｐＨを調整し、選択した栄養素を加え、及び／又は競合する微生物の存在を最小限にするために加熱した後、成長速度とバイオマスの生産性を評価するために行われる。
【０１７６】
あらかじめ滅菌しておいた１リットルの三角フラスコ（１２５℃で１０分間加熱した）に、体積５００ｍＬの酸ホエイを加え、液体培地に、表５に概説するような選択した処理（１〜１２）を行う。ｐＨを調整しない（酸ホエイの平均ｐＨは４．８）か、又は濃ＨＣｌでｐＨ２．７に調整する。栄養素添加処理は、添加しない、窒素源として２．５ｇ／Ｌの尿素、又は例１に記載したように酸ホエイ液中で調製した完全に適した栄養素として１／２強度のＭＫ７−１、グリセロールを引いたものを含む。加熱殺菌は、他の処理（ｐＨ及び／又は栄養素添加）が行われた後、酸ホエイ液体培地を１５分間沸騰させることによって行われる。培地が約２３℃まで冷却された後、７．５体積％（体積／体積）の対数成長期の播種材料を上述のフラスコに添加する。この播種材料を、例３に記載したように作成する。播種した培地を１２５ｍＬに小分けし、これをイソプロピルスワブドトレイ（滅菌手順について例３を参照）に添加し、このトレイを、例３に記載したトレイラックシステムに取り付けた、これより大きな（０．２５ｍ２）トレイに置く。培養物を２５±１℃で少なくとも６日間インキュベートする。
【０１７７】
【表６】
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【０１７８】
例１６：嫌気性消化物上でのＭＫ７株の糸状菌バイオマットの成長
嫌気性消化物を唯一の炭素源及び栄養源（原料）として使用し、緻密なＭＫ７株バイオマットを７日間で製造した。嫌気性消化物は、酸素制限条件下で、リグノセルロース富化バイオマス（例えば、トウモロコシ茎葉、小麦わら、牛肥料）の微生物発酵後に残るリグニンに富む固形残留物である。嫌気性消化物は、微生物によるさらなる分解に抵抗性があると考えられており、この理由から、土壌改質として一般に使用されているか、燃焼され、電気の生成のために蒸気発生器に動力を供給している。
【０１７９】
２Ｌの飲料水道水に湿った嫌気性消化物（５００ｇ）を加え、混合物を作成した。この混合物の天然ｐＨは、５．５であった。混合物に、７．５％（体積：体積）の例３に記載したように調製したＭＫ７株播種材料を播種し、得られた混合物２００ｍｌを、四角形の１２．７×１２．７ｃｍトレイに添加した。連結されたバイオマットが表面に形成され、室温（約２３℃）で７日間インキュベートした後に採取した。バイオマットの平均厚さは２．６ｍｍであり、平均乾燥重量は０．６２ｇ（ｎ＝３、標準偏差＝０．０３ｇ）であり、対応する密度は０．０１５ｇ／ｃｍ３であった。平均変換効率は２．３％であった。
【０１８０】
嫌気性消化物から微生物バイオマスへの変換率を高めるために、嫌気性消化物に大麦培地を追加することによって、強化された成長培地を効果的に用い、さらなる実験を行った。大麦培地を用いて成長を刺激し、嫌気性消化物から真菌バイオマスへのさらなる分解及び変換のためにＭＫ７株による系中での酵素産生を誘導した。１Ｌの水道水、５０ｇの大麦の花、１ｇの酵母抽出物、０．１ｍＬのグルコアミラーゼ（Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ  ＶＨＰ、Ｄｕｐｏｎｔ）、０．１ｍＬのα−アミラーゼ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＡＬＰＨＡ、１３，７７５ＡＡＵ／ｇ、Ｄｕｐｏｎｔ）及び０．１ｍＬのβ−グルコナーゼ（Ｏｐｔｉｍａｓｈ  ＴＢＧ、Ｄｕｐｏｎｔ）を合わせることによって、強化された大麦培地を調製した。混合物を６５℃まで加熱し、６５℃で１５分間撹拌した。その後、混合物を１５分間沸騰させ、酵素を不活化した。次いで、混合物を室温まで冷却した。
【０１８１】
嫌気性消化物の実験のための上述のプロトコルを、ただし、水道水を、強化された大麦培地で置き換え、使用する各構成要素の全体積を半分に減らした以外は、繰り返した。嫌気性消化物からバイオマットへの平均変換率は、嫌気性消化物を添加しないコントロール処理で生成したバイオマスを差し引いた後に、６±２％であった。
【０１８２】
例１７：トレイリアクター中の他の糸状菌の成長
リゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）及びフザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）の成長を、ＭＫ７株について例１、２及び３に記載の表面発酵技術を用いて評価した。
【０１８３】
リゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）は、世界中のテンペ（ヒトの食品）生産に広く用いられている。リゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）株ＡＴＣＣ  ２２５９５は、２０１５年１０月１日にＡＴＣＣから入手した。ＡＴＣＣから入手したＲ．オリゴスポラス（Ｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）の純粋培養サンプルを、例２に記載したように、ペトリ皿中のＭＫ７−１寒天培地上に置いた。
【０１８４】
Ｑｕｏｒｎ（商標）食品製造で使用されているフザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）は、ボーズマン（モンタナ州）のＡｌｂｅｒｔｓｏｎスーパーマーケットから２０１６年１月１６日に購入したＱｕｏｒｎチキンナゲットパッケージ（ＵＰＣコード：３３７３５−００００６）から取り出した。Ｆ．ベネナタム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）を単離するために、Ｆ．ベネナタム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）が入ったＱｕｏｒｎ（商標）チキンナゲットサンプル（約０．２５ｃｍ２）を、２５０ｍｌのバッフル付きシェーカーフラスコ中の１００ｍＬの滅菌ＭＫ７−１培地（ｐＨ５）に入れた。培地及びフラスコを、フラスコ内の培地を２０分間沸騰させることによって滅菌した。Ｑｕｏｒｎ（商標）サンプルを添加する前に、培地を２３℃まで冷却した。２３±１℃、２００ｒｐｍで回転させつつ、３日間インキュベートした後、１ｍＬの培養物を取り出し、別の同一のフラスコ及び培地に播種するために使用した。同じ方法でさらに３日間インキュベートした後、培養物を小分けした５０μＬを取り出し、無菌ペトリ皿中の滅菌ＭＫ７−１寒天培地（ｐＨ４．８）上に播種した。
【０１８５】
Ｒ．オリゴスポラス（Ｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）及びＦ．ベネナタム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）プレート上で発育した菌糸体マットを使用し、例３に記載したように滅菌した１Ｌのバッフル付きシェーカーフラスコ中の３５０ｍＬのＭＫ７−１培地に播種した。例３に記載のシェーカーフラスコ中で５日間成長させた後、トレイリアクターのための播種材料として培養物を使用した。トレイリアクターのための望ましい播種材料は、対数期後期に６ｇ／Ｌを超える細胞密度を有する微生物学的に純粋な培養物からなる（例３を参照）。例３に記載したように、１．５Ｌの播種したＭＫ７−１培地を含む２つのトレイを、２種類の生物のそれぞれについて調製した。培地のｐＨは、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）については４．１に、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）については５．０に調整した。得られた培養物及びマットの画像を図１２及び１３に示す。
【０１８６】
例１８：固体基質表面発酵（ＳＳＳＦ）によって産生されたバイオマスと比較した、固体状態発酵（ＳＳＦ）によって産生された糸状菌バイオマットの比較
ＳＳＦ手順
ここでいう固体状態発酵（ＳＳＦ）とは、含水量が低い、通常５０％未満の固形分で起こる微生物発酵プロセスを意味する。
【０１８７】
ＭＫ７  ＳＳＦ播種材料は、２Ｌガラス容器中、２０ｇのグルコースを１ＬのＭａｎｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅｅｓｅ培地に加えることによって調製し、ｐＨ４．５、１２１℃で４５分間、オートクレーブ処理した。得られた培地１００ｍＬを、２５０ｍｌの三角フラスコに加え、−８０℃グリセロールストックからＭＫ７株０．２５ｇを播種した。培養物を３０℃、１８０ｒｐｍで１４日間インキュベートした後、ＳＳＦの播種材料として使用した。
【０１８８】
ＳＳＦプロセスの一例は、ＷＯ２０１６／００４３８０号及びＵＳ２０１６／０００２６８０号のバイオマットの製造に使用されたものである。具体的には、小麦わら１００グラムを市販のブレンダーで細かくし、２リットルのガラス瓶に入れた。３００ｍｌのＭａｎｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅｅｓｅ培地及び３ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４を加えた。得られたスラリーを１２１℃で４５分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理したスラリーのｐＨをＮａＯＨで３．０に調整し、室温まで冷却し、次いで、２５０ｍｌの三角フラスコ４本に等分して移した。１０ｍｌのＭＫ７株播種材料を添加し、フラスコを３０℃、１８０ｒｐｍで４日間振とうし、その後、全てのフラスコの内容物を９×９インチのＰｙｒｅｘ（登録商標）皿に移した。得られた培養物をＳａｒａｎ（登録商標）ラップで覆い、採取前に３０℃で７日間インキュベートした。
【０１８９】
ＳＳＳＦ手順
ＳＳＳＦ播種材料は例３に記載されており、手順は以下の例に記載されている（すなわち、液体層の上に浮遊するサトウダイコンパルプ及び他のリグノセルロース系材料の変換）。具体的には、本明細書で言及するＳＳＳＦは、固形基質が液体表面より下に沈められたときに起きる発酵を意味し、糸状菌バイオマットは、沈められた固体由来の炭素及び栄養素を用い、液体表面上で成長する。産生された糸状菌バイオマスは凝集性であり、高密度であり、原料を含まない（図１４Ｃ）。
【０１９０】
バイオマス生産と、得られた生成したバイオマットは、ＳＳＳＦ手順とＳＳＦ手順との間でかなり異なる。培地構成要素、イオン強度、浸透圧、原料濃度、播種材料の品質、培養時間（表６及び７）は、全て、ＳＳＳＦとＳＳＦ方法論との間の重要なパラメータの相違である。これらのプロセスの差は、バイオマス特性（例えば、密度、連結マットの形成、微生物の純度、フィラメントの長さ、フィラメントの組織化など）が大きく異なる結果である。
【０１９１】
ＳＳＳＦによって生産されたバイオマスは、液体層の上部に浮遊し、固体の原料層から物理的に分離した糸状菌バイオマットの生産をもたらす。得られた糸状菌バイオマットは、凝集し稠密なマットに組織化された、本質的に純粋な真菌バイオマスである。マットは、高い引張強度を有し、（図１Ｃ、１１及び１２に示すように）数ミリメートルから数センチメートルにわたる平均長さを有する長いフィラメントで構成される。フィラメントは、主にバイオマットの表面に平行に組織化され、非常に高密度の真菌の塊で結合している。バイオマットの表面は、バイオマットの表面に対して垂直に配向された気中菌糸を示してもいてもよく、又は示していなくてもよい。糸状菌バイオマットは、液体又は固体基質から物理的に分離しているため、成長環境から容易に取り出され、比較的純粋な糸状菌バイオマットを迅速に、容易に採取することができる。
【０１９２】
対照的に、ＳＳＦによって成長したバイオマスは、ランダムな構成で固体基質と不均質に一体化したバイオマスを生成する。産生されたバイオマスのフィラメントは、一般に、長さが１００μｍ未満である（図１４Ｂ）。さらに、ＳＳＦによって生成したバイオマスは、凝集性はなく、単一の単位で拾い上げることができないほど、低い引張強度が問題となる（図１４Ａを参照）。得られたバイオマス／固体基質混合物は、特にＳＳＳＦによって生産された糸状菌バイオマットと比較した場合、密度が低い傾向がある。
【０１９３】
【表７】
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【０１９４】
例１９：ＭＫ７株によるサトウダイコンパルプのＳＳＦ及びＳＳＳＦ
ＭＫ７株バイオマスは、ＳＳＦ法及びＳＳＳＦ法を用い、主な炭素源としてサトウダイコンパルプを用いて生産された。サトウダイコンパルプは、処理工場でサトウダイコンパルプから砂糖を除去した後に残る、サトウダイコンの野菜部分である。サトウダイコンパルプは、ビリングス、モンタナのＷｅｓｔｅｒｎ  Ｓｕｇａｒ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ製造工場から得て、約２４％の乾燥物質、９．１％の粗タンパク質、０．６％の粗脂質、２３．１％の粗繊維、４％の灰分、０．５６％のカルシウムで構成されていた。
【０１９５】
ＳＳＦ実験のために、乾燥サトウダイコンパルプ５０ｇを２５０ｍｌの水と混合した。混合物を２０分間オートクレーブ処理して無菌性を確保した。室温（約２３℃）まで冷却した後、トウモロコシ茎葉／水混合物の表面上にバイオマットとして成長させた２５０ｍｇの湿ったＭＫ７株バイオマットを混合物に播種した。ＭＫ７株バイオマットを、滅菌スパチュラを用いてサトウダイコンパルプ混合物に混合し、得られた播種された混合物を室温で４、５及び７日間インキュベートした。
【０１９６】
ＳＳＳＦ実験のために、サトウダイコンパルプを、１／２強度のＭＫ７−１培地に対して７％の濃度で加え（パルプ重量：液体体積）、３００ｍｌの培地を作成した。適当な量のＨＣｌを添加することにより培地のｐＨを４．８に調整し、続いて２０分間沸騰させた。室温まで冷却した後、例Ｃに記載のトウモロコシ茎葉／水混合物の表面上に糸状菌バイオマットとして成長させた約１００ｍｇのＭＫ７バイオマットを、滅菌したスパチュラを用いて培地に混合した。適切な量のＨＣｌを添加することによってｐＨを４．８に再び調整し、トレイラックシステムにトレイを入れる前に、滅菌した０．０２３ｍ２のパイレックス（登録商標）ガラストレイに、播種したパルプ培地を小分けした１００ｍｌを添加した。播種した混合物を２３℃±１℃でインキュベートした結果、それぞれ４、５及び７日後に、約２．９、３．４及び４．１ｍｍの厚さの柔軟で緻密なバイオマットが得られた。バイオマットを採取し、５０℃で４８時間乾燥し、乾燥重量は、１．８５ｇ（４日間）、２．２５ｇ（５日間）及び２．８５ｇ（７日間）であった。サトウダイコンパルプから乾燥バイオマットへの変換率は、それぞれ４、５及び７日のマットで２６．４％、３２．１％及び４０．７％であった。ほとんどのバイオマットの体積の乾燥重量に基づくバイオマット密度は、それぞれ４、５及び７日間のマットについて、０．０２８、０．０２９及び０．０３０ｇ／ｃｍ３であった。
【０１９７】
ＳＳＦ対ＳＳＳＦを使用した成長から、著しく異なるバイオマス形態が生じた。ＳＳＦは、バイオマスと基質の両方の密接した混合物であるバイオマス構造を生成した。これらの混合物は、サトウダイコンパルプ基質の断片の周り及びその中に絡み合った低密度の真菌バイオマスを含んでいた。これらの密接した混合物は、主として少量の真菌バイオマスが散在した基質から構成されていた。バイオマスを基質から分離することは、かなりの追加のプロセスを必要とし、技術的に達成するのが困難であるため、行わなかった。
【０１９８】
対照的に、ＳＳＳＦは、サトウダイコンパルプ基質と物理的に分離した別個の糸状菌バイオマットを生じ、バイオマットの直接的かつ簡単な採取を可能にした。さらに、得られた糸状菌バイオマットは、緻密であり、本質的に純粋であり、長く整列したフィラメントから構成されていた。
【０１９９】
例２０：ニンジン及びブロッコリーの廃棄物上でのＭＫ７株の糸状菌バイオマットの成長
緻密なＭＫ７株バイオマットは、ホモジナイズされたブロッコリー又はホモジナイズされたニンジンを原料として使用して、６日間で生産された。ブロッコリーとニンジンは、ボーズマン、モンタナ州のＣｏｓｔｃｏ  Ｗｈｏｌｅｓａｌｅから購入した。１００グラムの各原料を、市販のフードプロセッサーで、金属ブレードを用い、高速で個別に５分間ホモジナイズし、９０００ｍｌの水道水を用い、２リットルのビーカーに入れた。中程度の塩を以下のように加えて混合物を形成した。
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【０２００】
１．３ｍｌの濃ＨＣｌを添加することにより、混合物のｐＨを３．５に調整した。培地をアルミニウム箔で覆い、次いで、３０分間沸騰させた。室温（約２３℃）まで冷却した後、例３に記載のように調製した播種材料５０ｍｌ（７．５％体積：体積）を各供給原料の培地に添加し、均質な混合物が形成されるまで撹拌した。２５０ｍｌの混合物を４つの別個の５×７インチ（０．０２ｍ２）のトレイに注ぎ、Ｓａｒａｎ（登録商標）ラップで覆った。採取前にトレイを２３℃±１℃で７日間栽培した。得られたバイオマスは、残っているブロッコリー原料又はニンジン原料を含まない、可撓性で緻密な糸状菌バイオマットであった。すなわち、原料残留物を含まず、本質的に純粋なＭＫ７バイオマスからなる糸状菌バイオマットが生産された。採取後の残留液の平均ｐＨ値は、６．２であった。湿ったバイオマットの平均厚さは３±１ｍｍであった。糸状菌バイオマットを５０℃で７２時間乾燥させ、平均乾燥重量±標準偏差は、ブロッコリーで１．７±０．２ｇ、ニンジンで１．７±０．２ｇであった。ブロッコリーの乾燥重量に対する平均変換率は、５２±５ｇ  ＭＫ７株乾燥重量／ブロッコリーの乾燥重量１００ｇであった。ニンジンの乾燥重量に対する平均変換率は、５５±７ｇ  ＭＫ７株乾燥重量／ニンジンの乾燥重量１００ｇであった。
【０２０１】
例２１：都市有機廃棄物代用物（前処理の機能としての草刈り及び葉）上でのＭＫ７株栽培
都市有機廃棄物に対する酸及び塩基の前処理の影響は、原料から糸状菌バイオマットへの変換率の関数として評価した。ケンタッキー・ブルーグラスの切り抜きとトネリコの木の葉は、含水量が８％未満になるまで６０℃で別々に乾燥させた。各原料は、市販のブレンダーで細かい粉末に粉砕した。
【０２０２】
ＨＣｌ酸の前処理
・１００ｍｌ水道水中、ｐＨ２．５で（３３％ＨＣｌで調整）、１０ｇの草／葉（乾燥重量で５０：５０）の３個組を、１０分間沸騰させることによって前処理した。
・１００ｍｌ水道水中、ｐＨ２．５で（３３％ＨＣｌで調整）、１０ｍＭのＭｎＳＯ４を含み、１０ｇの草／葉（乾燥重量で５０：５０）の３個組を、１０分間沸騰させることによって前処理した。
・１００ｍｌのＭＫ７−１培地中、ｐＨ２．５で（３３％ＨＣｌで調整）、１０ｇの草／葉（乾燥重量で５０：５０）の３個組を、１０分間沸騰させることによって前処理した。
・１００ｍｌのＭＫ７−１培地中、ｐＨ２．５で（３３％ＨＣｌで調整）、１０ｇの草／葉（乾燥重量で５０：５０）の３個組を、１０ｍＭのＭｎＳＯ４と共に１０分間沸騰させることによって前処理した。
【０２０３】
ＮａＯＨ系の前処理
・１００ｍｌ水道水中、ｐＨ１０．７５で（１％ＮａＯＨで調整）、１０ｇの草／葉（乾燥重量で５０：５０）の３個組を、１０分間沸騰させることによって前処理した。ＨＣｌを用い、最終ｐＨを２．５に調整した。
・１００ｍｌ水道水中、ｐＨ１０．７５で（１％ＮａＯＨで調整）、１０ｍＭのＭｎＳＯ４を含み、１０ｇの草／葉（乾燥重量で５０：５０）の３個組を、１０分間沸騰させることによって前処理した。ＨＣｌを用い、最終ｐＨを２．５に調整した。
・１００ｍｌのＭＫ７−１培地中、ｐＨ１０．７５で（１％ＮａＯＨで調整）、１０ｇの草／葉（乾燥重量で５０：５０）の３個組を、１０分間沸騰させることによって前処理した。ＨＣｌを用い、最終ｐＨを２．５に調整した。
・１００ｍｌのＭＫ７−１培地中、ｐＨ１０．７５で（１％ＮａＯＨで調整）、１０ｇの草／葉（乾燥重量で５０：５０）の３個組を、１０ｍＭのＭｎＳＯ４と共に１０分間沸騰させることによって前処理した。ＨＣｌを用い、最終ｐＨを２．５に調整した。
【０２０４】
コントロールの前処理
・１００ｍｌの水道水中、１０ｇの草／葉（乾燥重量で５０：５０）を３個組。最終ｐＨ５．５。
・１００ｍｌの水道水、１０ｍＭのＭｎＳＯ４中、１０ｇの草／葉（乾燥重量で５０：５０）を３個組。最終ｐＨ５．５。
・１００ｍｌのＭＫ７−１培地中、１０ｇの草／葉（乾燥重量で５０：５０）を３個組。最終ｐＨ５．５。
・１００ｍｌのＭＫ７−１培地、１０ｍＭのＭｎＳＯ４中、１０ｇの草／葉（乾燥重量で５０：５０）を３個組。最終ｐＨ５．５。
サンプルを１２．７×１２．７ｃｍのトレイに入れ、カバーし、次いで７日間インキュベートした。結果を図１５に示す。それぞれの場合に、前処理を適用すると、得られた変換率が増えた。すなわち、酸又は塩基による前処理を適用することによって、また、マンガンの添加によって、得られた糸状菌バイオマットに対する原料の変換量が増えた。
【０２０５】
例２２：デンプン上でのＭＫ７株バイオマットの成長
緻密なＭＫ株及び糸状菌バイオマットは、炭素源及び栄養源（原料）としてデンプンを用い、わずか４日間で生産された。これらの具体的な実験で使用されたデンプンは、Ａｒｇｏ  Ｆｏｏｄ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ（メンフィス、ＴＮ）によって製造された１００％  Ａｒｇｏ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔａｒｃｈであり、ボーズマン、ＭＨのＡｌｂｅｒｔｓｏｎスーパーマーケットから購入した。
【０２０６】
鋼鉄製の１０Ｌポット中、６Ｌ容積の飲料水道水に、６％、８％及び１０％の乾燥デンプン粉末を添加することによって、３バッチのデンプン培地を調製した。この混合物にＭＫ７−１塩を追加し、１０分間沸騰させた後、室温（約２３℃）まで冷却した。混合物を加熱すると、融合したデンプンの塊が得られ、次いで、これを物理的に小さな塊へと分解した。混合物のｐＨを２．７に調整し、例３に記載したようにして調製した７．５％（体積：体積）のＭＫ７播種材料を播種した。
【０２０７】
播種された培地を１．５Ｌに小分けし、これを４つの消毒したポリプロピレン０．２５ｍ２トレイに加え、トレイラックシステムに入れ、２３℃±１℃でインキュベートした。成長させてちょうど２日後に、緻密な糸状菌バイオマットを観察し、バイオマットを６日後に採取した。採取後のトレイに残っている残留液体の平均ｐＨ値は、それぞれ、６％、８％、１０％での処理の場合に、６．０５、６．１１、５．８８であった。バイオマットの平均厚さは、３回の処理でそれぞれ２．９ｍｍ、３．１ｍｍ、３．３ｍｍであった。糸状菌バイオマットを５０℃で７２時間乾燥させ、平均乾燥重量±標準偏差は、それぞれ６％、８％、１０％のデンプンを含む４個ずつのトレイについて、２９．０±１．３、３４．４±１．５、３８．２±１．９ｇであった。これは、糸状菌バイオマット乾燥重量に対して、３２％、２９％、及び２５％のデンプンの変換率に相当する。湿った糸状菌バイオマットについての乾燥重量を基準とした平均密度は、上述の３種類の処理についてそれぞれ０．０４、０．０４及び０．０５ｇ／ｃｍ２であった。
【０２０８】
例２３：ジャガイモ処理廃液上でのＭＫ７株の糸状菌バイオマットの成長
緻密なＭＫ７株の糸状菌バイオマットは、炭素源及び栄養源（原料）としてジャガイモ処理廃棄物を用い、７日間で生産された。ジャガイモ処理廃棄物は、一般に、ジャガイモの処理中に生成し、洗浄、皮むき、切断操作（すなわち、フライドポテト、ポテトキューブ、フレークなど）からの廃液を含む。ジャガイモ処理廃液は、ひとかたまりの複数のジャガイモ処理廃液のピリンで構成される廃棄堆積物も含み、覆いのない自然環境にさらされる。この例では、複数の様々なジャガイモの処理廃棄物で構成されるジャガイモ処理廃液を、２０１６年９月２１日にホワイトホール、モンタナ州のＢａｕｃｈ  Ｆａｒｍｓから入手し、ＭＫ７株バイオマットを成長させるための炭素源及び栄養源として４８時間以内に使用した。
【０２０９】
ジャガイモ切れ端は、フライドポテトをジャガイモ全体から切り取った後に残るジャガイモ片である。ジャガイモ切れ端は、大きさ及び寸法が様々であり、非限定的な例として、薄い細長片から、長さが６インチ、厚さが０．５インチ以上のジャガイモ片までがある。大部分の場合には、新鮮な廃棄物は、傷、傷みなどのためにジャガイモから除去されたジャガイモ片を記述する。ある場合には、ジャガイモ全体が廃棄サンプルとして含まれる。皮は、主にジャガイモから表皮を剥がしたものである。
【０２１０】
ジャガイモ切れ端、廃棄物及び表皮は、フードプロセッサー（高に設定したＦａｒｂａｒｗａｒｅ  １０３７４２型フードプロセッサー）によって均一な稠度を有するようになるまで、体積約５００ｍｌのバッチで１分間処理された。食品加工されたサンプルは、この例の説明では、混合物と呼ばれる。
【０２１１】
混合したジャガイモ切れ端と新鮮な廃棄物を、１５Ｌのエポキシコーティングした鋼製調理用ポット２個に、ＭＫ７−１培地の体積に対して湿潤時の重量ブレンド１０％の比率で、４．５Ｌの液体ＭＫ７−１培地に対してブレンド５００ｇの比率で加え、混合物を作成する。混合物のｐＨを、濃ＨＣｌを用いて２．４５に調整した。例３に記載したように調製したＭＫ７株播種材料を、７．５％体積：体積（すなわち、４６２５ｍｌの混合物に対して３７５ｍｌの播種材料）の比率で添加した。播種した懸濁物を小分けした１．５Ｌを、個々の０．２５ｍ２の滅菌したポリプロピレントレイに３個ずつ加え、トレイラックシステムに入れた。培養物を２３℃±１℃でインキュベートし、７日後にｎ個の可撓性で緻密なバイオマットを採取した。採取後のトレイに残っている残留液体の平均ｐＨ値は、それぞれ、切れ端では７．１、新鮮な廃棄物処理では６．９であった。採取したバイオマットを水道水７Ｌで、１０分間穏やかに撹拌しながらすすぎ、５０℃で７２時間乾燥させた。
【０２１２】
湿ったバイオマットの平均厚さは、切れ端の場合３．８±０．９ｍｍ、廃棄物の場合３．９±１．０ｍｍであった。各トレイにおけるバイオマスの平均乾燥重量±標準偏差は、切れ端からは３３．６±０．６ｇであり、新鮮廃棄物からは４０．２±２．７ｇであった。乾燥重量に基づくバイオマットの平均密度は、切れ端では０．０３５ｇ／ｃｍ３であり、廃棄物では０．０４１ｇ／ｃｍ３であった。元のジャガイモ副生成物中の全固形物から乾燥バイオマットへの平均変換率は、切れ端で３６％、新鮮な廃棄物で４３％であった。ＭＫ７株によって使用される炭素の約５０％が二酸化炭素として大気に放出されるという事実を考慮すると、５０％近くの変換率が、炭素の１００％変換効率になると考えられる。
【０２１３】
ブレンドしたジャガイモの皮を、成長実験に先立って前処理し、ＭＫ７株に対するジャガイモの皮の栄養素の接近を増加させた。ブレンドしたジャガイモの皮（１７５ｇ）を、それぞれの９個の１２．７×１７．８ｃｍ（０．０２３ｃｍ２）のＰｙｒｅｘ（登録商標）ガラストレイに加え、それぞれ３個ずつ、３回の処理の実験マトリックスを作成した。処理１には、５０ｍｌの飲用水道水が与えられた。処理２は、トウモロコシ茎葉上で成長させたときにＭＫ７株によって分泌された一連のＭＫ７株加水分解酵素を含むＭＫ７株加水分解物を小分けした４５ｍｌが与えられた。処理３は、５０ｍｌの水道水と、０．０５ｇのセルラーゼＹ−Ｃ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カタログ番号３２０９５１、ロット番号Ｍ４１５６）、２．５ｍｌのグルコアミラーゼ（Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ  ＶＨＰ、Ｄｕｐｏｎｔ）、２．５ｍｌのα−アミラーゼ（ＡＰＥＺＹＭＥ  ＡＬＰＨＡ、１３，７７５ＡＡＵ／ｇ、Ｄｕｐｏｎｔ）、２．５ｍｌのβ−グルコナーゼ（Ｏｐｔｉｍａｓｈ  ＴＢＧ、Ｄｕｐｏｎｔ）から構成される一連の市販の酵素が与えられた。処理３のトレイを５０℃で３０分間インキュベートして酵素加水分解を刺激し、その後、５分間沸騰させ、酵素を不活化した。処理のｐＨを、濃ＨＣｌを用いて３．０に調整し、例２に記載したように調製した１０ｍｌのＭＫ７株を全てのトレイに播種した。７日後、バイオマットを液体表面から取り出し、水道水で１０秒間すすぎ、６０℃で４８時間乾燥させた。ジャガイモ皮の乾燥重量から乾燥バイオマットへの変換率は、コントロール（Ｈ２Ｏのみ）平均＝５．９％（５．５％、６．５％、５．８％）、ＭＫ７株酵素＝９．０％（７．２％、１０．１％、９．８％）、市販の酵素＝９．９％（１０．２％、８．４％、１１％）であった。
【０２１４】
例２４：ＳＳＳＦによって生産されたバイオマットに対する、ＳＳＦによって生産されたバイオマスの栄養分析
栄養分析は、ＳＳＳＦ方法論に対し、ＳＳＦ法から得られたバイオマットと比較し、Ｅｕｒｏｆｉｎｓによって実施された。ＳＳＦサンプルは、Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのアンモニア繊維拡張（ＡＦＥＸ）で前処理したトウモロコシ茎葉上で培養したＭＫ７株から得た。１５０ｇのＡＦＥＸを５００ｍｌの水道水に添加し、濃ＨＣＬでｐＨを３．５に調整した後、１２１℃でオートクレーブ処理した。得られた混合物に、例１８に従って２５ｍｌのＭＫ７株播種材料を播種した。スラリーを２３×２３ｃｍのＰｙｒｅｘ（登録商標）ガラストレイに移し、室温で１１日間インキュベートした。統合したＭＫ７株バイオマスとトウモロコシ茎葉を採取し、６０℃で４８時間乾燥させた。Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＵＳＡ（デモインズ、アイオワ州）では、総タンパク質、総繊維、総炭水化物、灰分及び総脂肪についてサンプルを分析した。
【０２１５】
ＳＳＳＦサンプルは、５％ＡＦＥＸトウモロコシ茎葉で産生されたマットから得た。ＡＦＥＸトウモロコシ茎葉５０ｇを水道水１Ｌに添加し、濃ＨＣｌでｐＨを３．５に調整した後、１２１℃でオートクレーブ処理した。得られた混合物に、例３に記載したように調製した５０ｍｌのＭＫ７株播種材料を播種した。スラリーを２つの２３×２３ｃｍのＰｙｒｅｘ（登録商標）ガラストレイに移し、室温で１１日間インキュベートした。マットを採取し、３０秒間水道水ですすぎ、続いて６０℃で２４時間乾燥させた。Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＵＳＡ（デモインズ、アイオワ州）では、総タンパク質、総繊維、総炭水化物、灰分及び総脂肪についてサンプルを分析した。
【０２１６】
【表８】
2019510492.tif 000012
【０２１７】
例２５：糸状好酸性ＭＫ７真菌株のアミノ酸プロファイル
糸状好酸性ＭＫ７真菌株バイオマットは、ＭＫ７−１培地において例２及び３に記載の方法を使用し、トレイリアクター中で産生された。６つのトレイからの糸状バイオマスを合わせた後、６０℃で４５分間、５０℃で７２時間乾燥させた。この糸状バイオマス４００ｇを、栄養分析のために、デモイン、アイオワ州のＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．のＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒに送った。アミノ酸は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（ＡＯＡＣ）Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓで公開された国際的に認められた、以下のような方法を用いて分析した。トリプトファンについてはＡＯＡＣ  ９８８．１５、シスチン及びメチオニンについてはＡＯＡＣ  ９９４．１２改変法、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、総リシン、チロシン及びバリンについてはＡＯＡＣ  ９８２．３０改変法。Ｅｕｒｏｆｉｎｓによって報告された糸状好酸性ＭＫ７真菌株サンプルのアミノ酸組成を、魚飼料について使用したフザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）のアミノ酸組成と比較する（Ａｌｒｉｋｓｓｏｎ，Ｂ．ら、（２０１４）Ｆｉｓｈ  ｆｅｅｄ  ｆｒｏｍ  ｗｏｏｄ．Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４８：９−１０（２０１４），Ｑｕｏｒｎ（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  Ｑｕｏｒｎ  Ｍｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，２００９），ｅｇｇ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄａｔａ  ｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｕｄｙ  ＃２４．Ｒｏｍｅ（１９７０）．ＵＮＩＰＵＢ，Ｉｎｃ．，４６１１−Ｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｄｒｉｖｅ，Ｌａｎｈａｍ，ＭＤ  ２０７０６）ａｎｄ  Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ（Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．Ｃ．，Ｓｔｅｉｎｋｒａｕｓ，Ｋ．Ｈ．  ＆  Ｈａｃｋｌｅｒ，Ｌ．Ｒ．（１９７６）Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｄ  ｍｙｃｅｌｉｕｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｄｉａ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３２：３８１−３８７）ｉｎ  Ｔａｂｌｅ  ８。総タンパク質含有量は、４．５％の含水量のバイオマスの４１．５％として測定された。注目すべきことに、糸状好酸性ＭＫ７真菌株は、４種類の他のタンパク質源の全てと比較して、より高い濃度の必須アミノ酸を含むことが示され、糸状好酸性ＭＫ７真菌株は、食品及び飼料にとって非常に望ましいタンパク質源となった。
【０２１８】
【表９】
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【０２１９】
例２６：食品グレードのグリセロールからの糸状好酸性ＭＫ７真菌株による、Ｃ１８を豊富に含む脂質の産生
培地調製：１２５ｇ／Ｌのグリセロール（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｔｏｒｅ−Ｋｏｓｈｅｒ  Ｆｏｏｄ  Ｇｒａｄｅ  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ＞９９．７％、ＡＳＩＮ：Ｂ００ＫＮ１ＬＲＷＱ、インターネット上で入手可能）（５６２．５ｇ）と、Ｃ：Ｎ比を４０：１に変更するＮＨ４ＮＯ３及び尿素窒素濃度（Ｃ源中の炭素のモル数：窒素化合物中のＮのモル数）を用い、４．５リットルのＭＫ７−１培地を調製した。
【０２２０】
【表１０】
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【０２２１】
混合物のｐＨを２．７に調整し、フラスコの上部をアルミ箔で覆った２リットルの三角フラスコ中で３０分間沸騰させることにより加熱滅菌した。混合物を２時間かけて２５℃まで冷却した。
【０２２２】
播種：播種材料（対数成長期（例３を参照）の乾燥重量として１５ｇ／Ｌの浮遊細胞）を、最終的な乾燥重量濃度が１ｇ／Ｌになるように、冷却したフラスコに加えた。播種材料を均一に分布させるために、フラスコを十分に混合した。浮遊状態の細胞は、マット形成にとって重要であり、細胞のクラスター化（すなわち、１ｍｍを超えるバイオフィルム）が最小限になることが望ましい。理想的には、２．５ｍｍより大きい細胞クラスターは、分配する前に播種物から濾過されるべきである。
【０２２３】
インキュベート及び採取：播種材料を含む混合物を、体積１．５リットル／トレイ又は６リットル／平方メートルで３個の０．２５ｍ２トレイに均一に分配し、２５℃、湿度９０〜１００％で８日間インキュベートした。連結されたバイオマットバイオマスは、細胞密度が３０ｇ／Ｌを超えるように生産され、バイオマスは、１つの凝集マットとして採取することができる。一実施形態では、マットはトレイから単に引き出される（図６）。流水を用いてマットを３０秒間すすぎ、５〜１０分間かけて滴を落として乾燥させる。タンパク質及び他の真菌の栄養素が、過剰な水の除去により失われるので、マットを絞ることは避けた。滴を落として乾燥させた後の糸状バイオマスは、湿潤時の重量が４１０グラムであった（又は１６２０グラム／ｍ２）。乾燥重量７３．８ｇ／トレイ又は２９５ｇ／ｍ２に対応する８２％（すなわち、１８％の乾燥重量）で含水量を測定した。１８％の乾燥重量の糸状バイオマスは、典型的な乾燥重量１．５％の深部培養で成長した他の真菌バイオマスの処理と比較して優れている。これとは対照的に、最先端の技術プロセスは、所望の真菌バイオマス密度を達成するために遠心分離（エネルギー及び資本の集約的なプロセス）を利用する。本明細書に記載のプロセスは、これらの高価な方法と比較して、必要な処理、設備及びエネルギー投入量がはるかに少ない。
【０２２４】
脂質分析：全脂質の推定は、ナイルレッド染色（Ｃｏｏｋｓｅｙら、１９８７；図１６）を用いたＵＶ−Ｖｉｓ顕微鏡検査によって行われ、全脂質は４０〜５０％と推定された。Ｌｏｈｍａｎら（２０１３）に記載されているＧＣ−ＭＳ分析と組み合わせた直接エステル交換を用い、総細胞内脂質の定量値を決定したところ、３９％であることがわかった。この値は、８日間で１１５ｇ／ｍ２（１４ｇ／ｍ２／日）の脂質産生、又は０．３９ｇ／リットル／時間の平均生産速度に相当する。これらの速度は、８％グリセロール（０．２４５ｇ／Ｌ／ｈｒ）を含む糸状好酸性ＭＫ７真菌株を用いた深部培養で見出されるものよりかなり速く、酵母及び藻類を含む文献に見出される他の生物と非常に競合するものである。さらに、糸状好酸性ＭＫ７真菌株は、これらの競争的な速度で、ほとんどの生物が耐えることができない非常に高いグリセロール濃度で、脂質を産生し、この酸性ｐＨ範囲に耐えることができる唯一の生物であり（我々の知る限り）、汚染を制限するための顕著な利点である。さらに、脂質係数（脂質（ｇ）／基質（ｇ））は、０．２１脂質（ｇ）／グリセロール（ｇ）（別表参照）で他の菌株と非常に競合する。増加した脂質生産速度及び１８０ｇ／Ｌの細胞密度は、現在開発中又は商業的に使用されている多種多様な微生物による微生物油の生産を変えてしまう直接的な影響を有する。
【０２２５】
糸状好酸性ＭＫ７真菌株の脂質プロファイルは、異なる種類の処理（すなわち、ｐＨ、温度、成長基質、培養期間、含水量）間で著しく一致しており、Ｃ１６：０及びＣ１８：０、Ｃ１８：１及びＣ１８：２のトリアシルグリセリドが多数を占める（全脂質の９５％を超える、以下の表１０、図１７）。脂肪酸プロファイルは、ω−７バクセン酸（１１−オクタデセン酸メチル）、ω−７パルミトレイン酸（メチルヘキサデカ−９−エノエート、商品名Ｐｒｏｖｉｎａｌ（商標））及びテトラコサン酸メチルエステルを含む多くの高価値産物も示す。これらは、植物油には通常見られない珍しい脂肪酸であり、バイオディーゼル単独よりも原料１トン当たりの収入が大幅に増加する可能性がある。
【０２２６】
【表１１】
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【０２２７】
例２７：ＭＫ７株の毒性分析
異なる条件下で成長させたＭＫ７株の５つのサンプルを、マイコトキシンの存在についてアッセイした。サンプル１のバイオマスは、Ｃ：Ｎ比が３０：１であったことを除いて、例１に記載した播種材料を生成するために使用したのと同じ条件下で、１０Ｌのバイオリアクターで生産された。バイオマスサンプルを、例１に記載した高減圧濾過装置を用い、０．２ｕｍのフィルターに通して濾過することによって集めた。
【０２２８】
滅菌した１２．７×１７．８ｃｍ（０．０２ｍ２）のＰｙｒｅｘ（登録商標）ガラストレイ中、培地に１２％グリセロール及び０．２％ペプトン（重量／体積、顆粒状態のペプトン、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロット番号１４３２４１、サマービル、ニュージャージー州）を追加した以外は例１に記載のように調製したｐＨ２．８のＭＫ７−１培地５０ｍＬを使用し、サンプル２のバイオマットを生産した。サンプル２は、例３に関連して０．２５ｍ２のトレイに使用したのと同じ手順を滅菌に使用した。
【０２２９】
サンプル３は、ｐＨを４．５に調整し、培地にペプトンを追加しなかった以外は、サンプル２と同じ条件で成長させた。
【０２３０】
サンプル４は、培地に４％グリセロールを追加したことを除き、サンプル２と同一の条件で成長させた。
【０２３１】
サンプル５は、ｐＨを２．２に調整し、培地にペプトンを追加しなかった以外は、サンプル２と同じ条件で成長させた。サンプル２〜５の培地に、サンプル１に用いた液体培地を７．５％（体積／体積）播種した。湿ったバイオマスサンプルを、成長８日後に収集し、マイコトキシンの抽出前に−２０℃で保存した。
【０２３２】
マイコトキシンは、Ｍｙｃｏ６ｉｎ１＋アッセイキットマニュアルに記載される標準プロトコルに従って、Ｖｉｃａｍから提供されるＭｙｃｏ６ｉｎ１＋マイコトキシンアッセイキット（ロット番号１０００００１７６：ニクサ、ミズーリ州）を用い、湿ったバイオマスから抽出した。Ｍｙｃｏ６ｉｎ１＋ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌに記載されているプロトコルを使用して、ＬＣ−Ｑ−ＴＯＦにより１２種類の異なるマイコトキシンを分析した。Ｍｏｎｔａｎａ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙに収容されたＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  ＨＰＬＣに連結されたＡｇｉｌｅｎｔ  ６５３８  Ｑ−ＴＯＦを、トキシンの同定及び定量に使用した。フモニシンＢ１及びフモニシンＢ２を確実な標準として使用した。
【０２３３】
試験した全てのトキシンの測定値は、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって設定されたヒトの消費レベルの規制値を下回っていた（表１１）。測定レベルは、規制レベルよりも少なくとも１桁低かったが、例外的に、規制レベル２０ｎｇ／ｇと比較して、サンプル４に見られる総アフラトキシンは８．７６ｎｇ／ｇであった。しかし、アフラトキシン生産の遺伝子はＭＫ７株には存在しないので、このトキシンの供給源はペプトン及び培地中で使用される他の成分からの汚染であり、ＭＫ７の産物ではないと予想される。
【０２３４】
【表１２】
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【０２３５】
ＭＫ７培地及びバイオマスの非毒特性を、毒性アッセイに一般的に使用される高感度大型無脊椎動物であるダフニア・マグナ（Ｄａｐｈｎｉａ  ｍａｇｎａ）を用いたバイオアッセイによってさらに確認した（ＥＰＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、１９８７；Ｇｕｉｌｈｅｒｍｉｎｏら、２０００）。生きたＤ．マグナ（Ｄ．ｍａｇｎａ）をＣａｒｏｌｉｎａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ（バーリントン、ノースカロライナ州）から購入し、供給業者によって提供されるマニュアルに記載の条件下で成長させた。成長及び観察の２４時間後、オオミジンコを、毒性実験に使用した。３つのペトリ皿を、例３に記載のように播種材料リアクターで６日間成長させたＭＫ７培地（ＭＫ７培地及びＭＫ７−１培地）３０％と、Ｄ．マグナ（Ｄ．ｍａｇｎａ）を運搬してきた水７０％とを合わせたもの３０ｍＬで満たした。実験コントロールのために、３つのさらなるペトリ皿を３０ｍＬの運搬用水で満たした。元気なように見える７匹のＤ．マグナ（Ｄ．ｍａｇｎａ）を、上述の６つのペトリ皿それぞれに加え、３日間、毎日観察した。Ｄ．マグナ（Ｄ．ｍａｇｎａ）の死亡は、１分後に目に見える動きがないことと定義された。ＭＫ７培地及びバイオマスで３日間処理したＤ．マグナ（Ｄ．ｍａｇｎａ）と、実験コントロールとの間に、生存率に有意な差は観察されなかった（各処理について、３日後にペトリ皿当たり平均で１．２匹が死亡）。
【０２３６】
ＭＫ７株バイオマスの毒性は、金魚（カラシウス・オーラタス（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ））でも試験した。２つの同一の５．７Ｌの魚用タンク、ポンプ及びフィルターをボーズマン、モンタナ州のＰｅｔｃｏ（Ａｑｕｅｏｎ  Ｅ４１４Ｗ型、フランクリン、ウィスコンシン州）から購入した。このタンクに、Ａｌｂｅｒｔｓｏｎスーパーマーケット（ボーズマン、モンタナ州）から購入したポーランドの湧き水５．７Ｌを満たした。６匹の金魚（長さは約３ｃｍ）をＰｅｔｃｏ（ボーズマン、モンタナ州）から購入し、各タンクに３匹を入れた。タンクの１つに、約０．０５ｇの乾燥ＴｅｔｒａＦｉｎ  Ｇｏｌｄｆｉｓｈ  Ｆｌａｋｅｓ  Ｐｌｕｓ（ブラックスバーグ、ＶＡ）の魚の飼料を１日に一回入れた（Ｐｅｔｃｏ、ボーズマン、モンタナ州から購入）。他方のタンクには、約０．０．０５ｇの乾燥したＭＫ７株バイオマスを毎日入れた。湿ったＭＫ７バイオマスは、例３に記載のプロトコルに従って製造されたトレイリアクターの１つから得た。トレイから４０ｇのＭＫ７を取り出し（例３を参照）、このバイオマスを２５０ｍＬのビーカーに入れることによって、ＭＫ７バイオマスを調製した。次いで、湿ったバイオマスを、ＧＥ  ｍｉｃｒｏｗａｖｅ（ＷＥＳ１４５２ＳＳ１ＳＳ型）を３０秒間用い、マイクロ波を照射した。乾燥したバイオマスの含水量は、０．５％未満であった。次いで、バイオマスをステンレス鋼のスパチュラで粉砕し、ＴｅｔｒａＦｉｎ  Ｇｏｌｄｆｉｓｈ  Ｆｌａｋｅｓと同様のサイズの小さなフレークを得た。飼料を与えてから６０日後に、全ての魚は生存しており、健康なように見え（激しく泳いでいる）、ＭＫ７が産生したバイオマスマットを食べることに対し、顕著な熱中が見られた。実験は６０日後に終了した。
【０２３７】
配列番号１  ＭＫ７株と命名された好酸性糸状真菌種の１８Ｓ  ｒＲＮＡ及びＩＴＳ領域のＤＮＡ配列
2019510492.tif 000017
2019510492.tif 000018
【０２３８】
配列番号２  翻訳伸長因子１α（Ｔｅｆ１）
2019510492.tif 000019
【０２３９】
配列番号３  チューブリンβ鎖（Ｔｕｂ１）：部分配列
2019510492.tif 000020
2019510492.tif 000021
【０２４０】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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