(57)【要約】  本発明は、免疫賦活特性、抗炎症特性及び抗酸化特性を有するビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)に関する。更に、本発明は、免疫賦活特性、抗炎症特性及び抗酸化特性を有する前記ビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)を含むか又はそれらからなる混合物を含む組成物に関する。最後に、本発明は、(i)炎症性疾患、(ii)ウイルス、細菌、真菌又は原虫疾患、(iii)感染症、及び(iv)インフルエンザ、風邪又は発熱の予防的及び/又は治療的処置に使用するための前記組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)炎症性疾患、(ii)ウイルス、細菌、真菌又は原虫疾患、(iii)感染症、及び(iv)インフルエンザ、風邪又は発熱の予防的及び/又は治療的処置に使用するための、免疫賦活特性、抗炎症特性及び抗酸化特性を有するビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)。
【請求項２】
前記株が、ビフィドバクテリウム属に属する以下の種:ビフィドバクテリウム・ロンガム(B. longum)、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(B. breve)、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス(B. animalis susp. Lactis)及びビフィドバクテリウム・ビフィダム(B. bifidum)に属する細菌株の群から選択される、請求項1に記載の使用するための細菌株。
【請求項３】
前記株が、ビフィドバクテリウムであるビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBS01(LMG P-21384)、ビフィドバクテリウム・ブレーベBR03(DSM16604)及びビフィドバクテリウム・ロンガムBL03(DSM16603)から選択される、請求項1又は2に記載の使用するための細菌株。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス及びビフィドバクテリウム・ビフィダム種から選択されるビフィドバクテリウム属に属するビフィドバクテリウムのプロバイオティクス細胞抽出物であって、前記抽出物がペプチドグリカンを含むか又はペプチドグリカンからなる、抽出物。
【請求項５】
前記菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガムBL03(DSM16603)、ビフィドバクテリウム・ブレーベBR03(DSM16604)及びビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBS01(LMG P-21384)菌株から選択される、請求項4に記載の抽出物。
【請求項６】
請求項1から5のいずれか一項に記載の免疫賦活特性、抗炎症特性及び抗酸化特性を有するビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)と、場合により食品又は薬理学的に許容される添加剤又は賦形剤又は成分とを含むか又はそれらからなる混合物を含む組成物であって、(i)炎症性疾患、(ii)ウイルス、細菌、真菌又は原虫疾患、(iii)感染症、及び(iv)インフルエンザ、風邪又は発熱の予防的及び/又は治療的処置に使用するためのものである、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活特性、抗炎症特性及び抗酸化特性を有するビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)に関する。更に、本発明は、免疫賦活特性、抗炎症特性及び抗酸化特性を有する前記ビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)を含むか又はそれらからなる混合物を含む組成物に関する。最後に、本発明は、(i)炎症性疾患、(ii)ウイルス、細菌、真菌又は原虫疾患、(iii)感染症、及び(iv)インフルエンザ、風邪又は発熱の予防的及び/又は治療的処置に使用するための前記組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
身体が受ける外部環境(微生物、細菌、ウイルス等)に起因するものと体内で産生されるもの(過剰に産生されるメディエーター、フリーラジカル、異化誘導体等)の両方の恒常的な無数の攻撃が、時間とともに、通常はこれらの攻撃に抵抗するのを可能にする免疫防御の破壊でないとしても弱化を引き起こすことを示すことは周知である。
【０００３】
前記攻撃に対する先天的/炎症性防御反応は、外部病原体又は損傷を受けた組織からのシグナルに応じて活性化される。
【０００４】
炎症が身体の免疫応答の必須の部分であることは周知である。炎症は外部傷害後に自身を治そうとするものであり、よって、ウイルス、細菌若しくは外部作用物質から自身を防御しようとする又は損傷を受けた組織を回復しようとするものである。
【０００５】
炎症がなければ、創傷が持続し、感染症が致死的になると予想される。
【０００６】
しかしながら、炎症は、回復させるのが困難な問題となる過程を誘引し、いくつかの慢性疾患で基本的役割を果たし得る。
【０００７】
このため、研究を行い、炎症を回復及び予防することができる製品を開発することが必要である:炎症過程を予防する及び/又は治療するとは、身体に感染症をもたらす外部病原性作用物質によって誘引される全ての機構を回復させることを意味する。
【０００８】
単球/マクロファージは、異なる活性化プログラムを介して炎症の開始及び回復において重要な役割を果たす。末梢血単球は、実際には、均一集団ではなく、むしろその表現型及び機能が異なり、更に、いったんマクロファージに分化すると、組織微小環境の変化に応じた種々の異なる表現型をインビボで採用して、異なる機能的状態の連続体を示すことができる。
【０００９】
循環血単球は、「パトロール単球(patrolling monocytes)」(CX3CR1highCD14dimCD16+)及び「炎症性単球」(CCR2highCD14highCD16-)の2つの大きな亜集団に分けることができる。
【００１０】
CD16+単球は、恒常的に組織に到達し、組織が炎症を起こした時にのみ移動するCD16-単球と比較して異なる表現型特性を有しており、実際、CD16-単球は先天的炎症応答に関与しているように見える。対照的に、CD16+集団に由来する細胞は組織恒常性に関与しており、クッパー細胞、破骨細胞及びミクログリア等の専門化された在住マクロファージに分化する。
【００１１】
これらの明らかな生理学的-機能的差異に照らして、これらの亜集団の1つ又は複数の欠如は明らかに種々のタイプの病理における様々な応答を誘発すると予想される。
【００１２】
よって、ウイルス、細菌、真菌若しくは原虫等の病原性作用物質及び組織病変に由来する異なる微小環境に存在するシグナル、又は適応免疫に由来するエフェクターが、様々な分極の機能的状態に従って、単球をマクロファージに分化させる様々な遺伝プログラムを誘引する。
【００１３】
現状のパラダイムは、古典的様式で活性化されるマクロファージであるM1マクロファージ及び代替様式で活性化されるM2マクロファージの2つの機能的サブセットを説明するものであり、これらの機能的表現型が、広範囲の分化状態の両極端を表すことを考慮すべきである。
【００１４】
そのため、当分野の専門家は、感染症、例えばウイルス及び細菌感染症に対する防御の第一線を有利に形成するために、単球/マクロファージ亜集団の活性に、有用かつ有効な様式で、介入し、よってこれを調節することができるようになることに大いに関心を持ち続けている。実際面で、ウイルス、細菌、真菌又は原虫疾患を迅速かつ有効に予防及び/又は治療する、並びに身体に感染症をもたらす外部病原性作用物質によって誘引される炎症過程を予防及び/又は治療することを可能にする療法/治療を有することができる必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】イタリア特許出願番号第MI2012A001355号
【特許文献２】国際特許出願PCT/IB2015/058747号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
長期にわたる精力的な研究及び開発活動の後、本出願人は、炎症性疾患におけるその機能を調節する方法でCD16-及びCD16+単球の亜集団の活性を調節することができる、プロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)に基づく有効な組成物、並びにそれを調製するための関連する方法を考え出した。
【００１７】
本発明は、添付の独立請求項に定義される特徴を有する、免疫賦活特性、抗炎症特性及び抗酸化特性を有するビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)に関する。
【００１８】
本発明は、添付の独立請求項に定義される特徴を有する、免疫賦活特性、抗炎症特性及び抗酸化特性を有するビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)を含むか又はそれらからなる混合物を含む組成物に関する。
【００１９】
本発明は、添付の独立請求項に定義される特徴を有する、免疫賦活特性、抗炎症特性及び抗酸化特性を有するビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)を含むか又はそれらからなる混合物を含む組成物であって、(i)炎症性疾患、(ii)ウイルス、細菌、真菌又は原虫疾患、及び(iii)感染症の予防的及び/又は治療的処置に使用するための組成物に関する。
【００２０】
本発明は、添付の独立請求項に定義される特徴を有する、免疫賦活特性、抗炎症特性及び抗酸化特性を有するビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)を調製する方法(又は手順)に関する。
【００２１】
本発明は、添付の独立請求項に定義される特徴を有する、免疫賦活特性、抗炎症特性及び抗酸化特性を有するビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)を含むか又はそれらからなる混合物を調製する方法(又は手順)であって、前記組成物が(i)炎症性疾患、(ii)ウイルス、細菌、真菌又は原虫疾患、及び(iii)感染症の予防的及び/又は治療的処置に使用するためのものである方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図1は、BCWEによる刺激の最適濃度を示した図である。
【図２】図2は、5日間の刺激後の単球/マクロファージ集団に関する調節の結果を示した図である。
【図３】図3は、2つの単球/マクロファージ集団(CD16+/CD16-)間の活性化比に関する結果を示した図である。
【図４】図4は、24時間後のROS産生の結果を示した図である。
【図５】図5は、TEER測定値を、対照ウェルの値(基礎値)と比較した各個々の実験ウェルについてのTEER値の百分率として表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の好ましい実施形態を、本発明の範囲を限定することなく、例として以下に記載する。
本発明の文脈において、「プロバイオティクス細胞抽出物又はプロバイオティクス細菌細胞抽出物(PCEと略される)」は、限定されないが、使用されるプロバイオティクス細菌の細胞壁抽出物(BCWE)及び/又は細胞壁の構成成分であるペプチドグリカンも含むことを意図している。細菌株はビフィドバクテリウム属に属し、以下の種:ビフィドバクテリウム・ロンガム(B. longum)、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(B. breve)、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス(B. animalis susp. Lactis)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(B. bifidum)等から選択される。
【００２４】
本発明の組成物は、混合物と、場合により添加剤及び/又は賦形剤及び/又は他の成分とを含み、上記の全てが医薬品又は食品グレードである。
【００２５】
本発明の前記組成物中に含有される前記混合物は、ビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)若しくは細菌細胞壁抽出物(BCWE)を含むか又はそれらからなる。前記混合物中に含有される前記抽出物は、ペプチドグリカンを含むか又はペプチドグリカンからなる。
【００２６】
本発明の前記組成物中に含有される前記混合物(ペプチドグリカンを含むか又はペプチドグリカンからなる、ビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)若しくは細菌細胞壁抽出物(BCWE)を含む)は、ウイルス、細菌、真菌又は原虫によって誘発される炎症過程を予防及び/又は治療することができるようにするために、外部作用物質(ウイルス、細菌、真菌又は原虫)が炎症を誘発した場合に前記組成物を使用することができるようにする免疫賦活作用、抗炎症作用及び/又は抗酸化作用を示す。
【００２７】
本発明の前記混合物、そのため前記組成物(ペプチドグリカンを含むか又はペプチドグリカンからなる、ビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)若しくは細菌細胞壁抽出物(BCWE)を含む)も、身体に感染症をもたらす外部病原性作用物質(ウイルス、細菌、真菌又は原虫)によって誘引される炎症過程を予防及び/又は治療することができる。
【００２８】
一実施形態では、前記混合物、そのため前記組成物が、ビフィドバクテリウム・ロンガム、若しくはビフィドバクテリウム・ブレーベ、若しくはビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス、若しくはビフィドバクテリウム・ビフィダム種に属する少なくとも1種のプロバイオティクス細菌株、又は対応するプロバイオティクス細胞の抽出物(PCE)を含むか又はそれらからなる。
【００２９】
一実施形態では、前記混合物、そのため前記組成物が、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBS01(LMG P-21384)、ビフィドバクテリウム・ブレーベBR03(DSM 16604)及びビフィドバクテリウム・ロンガムBL03(DSM 16603)菌株から選択されるビフィドバクテリウム・ロンガム、若しくはビフィドバクテリウム・ブレーベ、若しくはビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス、若しくはビフィドバクテリウム・ビフィダム種に属する少なくとも1種のプロバイオティクス細菌株、又は対応するプロバイオティクス細胞の抽出物(PCE)を含むか又はそれらからなる。
【００３０】
本出願人は、全てビフィドバクテリウム属に属する極めて広大な群の細菌株の免疫賦活特性を、徹底的かつ詳細な様式で、研究及び分析した。特に、ビフィドバクテリウム属に属する以下の種:ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム等に属する細菌株を分析及び研究した。
【００３１】
細菌株を、(i)指数増殖段階で生存可能、(ii)チンダル化(プロバイオティック)及び(iii)超音波処理によって破壊されているという様々な生存性の状態で使用した。更に、調査中のプロバイオティクスビフィドバクテリウムの同じ菌株について、以下で更に詳述する具体的な抽出プロトコル(プロバイオティクス細胞抽出物(PCE)の抽出のためのプロトコルP1)を通して得られたそれぞれのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)も研究及び分析した。
【００３２】
本発明者等は、例として、(i)指数増殖段階で生存可能、(ii)チンダル化されている(プロバイオティック)及び(iii)超音波処理によって破壊されているという様々な生存性の状態で使用されたビフィドバクテリウム属の3つの異なる菌株(ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBS01(LMG P-21384)、ビフィドバクテリウム・ブレーベBR03(DSM 16604)及びビフィドバクテリウム・ロンガムBL03(DSM 16603))、並びに抽出プロトコルP1を通して得られたそれぞれのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)又は細菌細胞壁抽出物(BCWE)の研究のみを具体的に記載する。
【００３３】
本出願人によって発明された、本発明の主題である方法(又は手順)を以下に記載する。
【００３４】
本出願人によって適用された手順は、一連の分析及び評価の方法又はプロトコルの適用を含む。本出願人によって適用された手順を以下に記載し、これは、以下を含むか又は以下からなる:
・様々な菌株の上記プロバイオティクス細菌株のプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)の抽出(プロトコルP1)。
・標準的なプロトコルP2による健康な対象の末梢血からの単核細胞(PBMC)の単離(プロトコルP2)。
・24時間及び5日間(120時間)の調査中の菌株及びBCWE(10mg/ml)によるPBMCの刺激-(刺激法)。
・ROS産生の評価。
・単球/マクロファージ分化マーカーの評価。
・対応のあるデータT検定によって行われるデータ分析及び統計学的評価;p<0.05の値についてデータを有意とみなす。
【００３５】
プロトコルP1:ビフィドバクテリウム属の様々な菌株からのPCEの抽出
ISO19344:2015の方法に従って、市販のキット「BD液体計数ビーズを用いるBDTM細胞生存率キット」を使用して、出発凍結乾燥物の細胞濃度を評価するために、細胞蛍光測定分析を行う。
出発細菌細胞数の結果は2.8±0.3MLD/mg(平均±標準偏差)である。
【００３６】
材料
-  分析したビフィドバクテリウムの菌株:ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBS01(LMG P-21384)、ビフィドバクテリウム・ブレーベBR03(DSM 16604)及びビフィドバクテリウム・ロンガムBL03(DSM 16603)。
-  T20℃の硫酸アンモニウムの飽和溶液。
-  天秤、ビーカー、メスシリンダー、ミニブレンダー、スパチュラ、ガラス管、マグネチックスターラー、磁気攪拌棒、ピペット、ボルテックス、遠心分離機900〜10000g。
-  蒸留又は再蒸留水。
【００３７】
プロトコルP1
-  凍結乾燥ビフィドバクテリウム30gを蒸留又は再蒸留水H2O 120mlに懸濁する(H2O 4ml中凍結乾燥細菌1g、希釈1:4)。
-  均質な懸濁液が得られるまで、マグネチックスターラー及び攪拌棒で攪拌する。
-  均質な細菌懸濁液をブレンダーのジャーに移し、確実に液体がブレンダーブレードのレベルを超えないようにする。細菌壁を粉砕するために、液体をブレンダーブレードのレベルに維持することが重要である。Philipsブレンダーの場合、一度に懸濁液40mlが推奨される。
-  間に1分間の休止を入れて、それぞれ1分間の2回の粉砕サイクルを行う。調製物の温度を低下させるために、小さじ1杯の砕氷をブレンダーに添加する。
-  元の懸濁液の全ての細菌が粉砕されるまで、懸濁液をビーカーに回収し、操作を繰り返す。
-  まだ無傷の細菌を分離するために、混合物を900×gで5分間遠心分離し、これにより、上清中に残っている壁断片から、沈降物(ペレット)が形成される。
-  上清をビーカーに回収し、確実に沈降物を除去するようにし、10000×gで15分間(又は6000×gで20分間)再び遠心分離する。上清を回収し、更なる適用のために好ましくは凍結して保存する。エンドマス(endomass)と呼ぶこの部分は、細菌細胞の細胞質成分の全てを含有している。ペプチドグリカン画分は沈降物に含有される。
-  ペレット(目的の画分を含有する)をH2Oに再懸濁し、約90mlの体積にする。
-  次いで、攪拌下で、40%飽和まで硫酸アンモニウム[(NH4)2SO4]の飽和溶液を添加することによって、ペプチドグリカン画分を沈殿させる。
【００３８】
【数１】
2019526608.tif 000002
【００３９】
(式中、
X=使用しなければならない硫酸アンモニウムの量;
V=沈殿させる溶液の体積)。
-  そのため、V=90mlの場合、飽和硫酸アンモニウム60mlを添加しなければならない。
-  懸濁液をマグネチックスターラー上に置き、硫酸アンモニウムの飽和溶液(60ml)を滴加する。
-  ペプチドグリカンの沈殿が生じるように、溶液を4℃で一晩置く。
-  沈殿を回収するために、溶液を10000×gで15分間(又は6000×gで20分間)遠心分離する。
-  硫酸アンモニウムを含有する上清を除去し、洗浄を5回繰り返す[10000×gで15分間(又は6000×gで20分間)]。ペプチドグリカン懸濁液中にまだ存在する全ての硫酸アンモニウムを除去する。
-  沈殿を水に再懸濁し、得られたペプチドグリカンの凍結乾燥に進む。
【００４０】
平均収量(ペプチドグリカン/凍結乾燥物)0.12g(標準偏差0.06)及びヘキソサミンレベル10.19%(標準偏差1.14)が得られた。収量はペプチドグリカンの最終グラム(実験に使用した最終生成物)/出発凍結乾燥物のグラムとして表されるペプチドグリカン画分である。実験に使用した凍結乾燥物のバッチの全てを平均することによってデータを得た。一方で、ペプチドグリカン画分中に存在するヘキソサミンレベルは、得られた最終生成物の組成物の純度の指標となる。実験に使用した、最大生物学的活性を有すると実証されたペプチドグリカンの最終濃度は10mg/mlに等しい。
【００４１】
プロトコルP2:末梢血単核細胞の分離
末梢血単核細胞(PBMC)を密度勾配遠心分離によって分離した。このために、各実験で、Immunotransfusion Centre of the Hospital of Borgomaneroに入院している健康なドナーからのバフィーコート20mlを使用した;平均収量200×106個のPBMC/バフィーが得られた。分離した細胞の量をチュルク液を使用してビルケルチャンバー内の細胞数によって決定し、単核細胞と多形核細胞の区別を可能にした。細胞を、熱不活性化した10%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco社)、1%グルタミン及び25mM Hepesを補足したRPMI-1640増殖培地(Invitrogen社)中2×106個細胞/mlの濃度にした。
【００４２】
刺激法:ビフィドバクテリウムによるPBMCの刺激
分離後、PBMCを細菌株(生存、チンダル化及び超音波処理並びにそれぞれのBCWE)で24時間及び5日間刺激した。使用した試験は以下の通りであった:
-  単球/マクロファージ集団の特異的表面マーカーを評価するための細胞蛍光測定試験。
-  高ホモシステイン血症のインビトロモデルにおいてROS(酸素フリーラジカル)の産生を評価するための試験。
【００４３】
各単一実験についての内部標準は以下によって表された:
-  単球/マクロファージ亜集団を評価するためのLPS(リポ多糖)1mg/ml。
細胞を5日間刺激し、細胞蛍光測定分析を通して各個々の亜集団について特異的な細胞表面マーカーを評価した。最終値は、LPSによって活性化された陽性対照に対する集団の増加倍数の表現である。
-  ROS産生の試験のためのホモシステイン5mM。分光光度計の読み取りを24時間+2時間の刺激後に550nmでとった。読み取った絶対値は、上清中へのフリーラジカルの放出に正比例する。
【００４４】
BCWEによる刺激の最適濃度(図1、基礎(100%)に対する調節)を決定した。得られた結果から、10mg/mlの濃度が炎症過程における重要な調節性サイトカインであるインターロイキンIL4を調節するための最適ペプチドグリカン濃度を表すことが分かる。
【００４５】
図2は、5日間の刺激後の単球/マクロファージ集団に関する調節の結果を示す。細胞蛍光測定評価は表面マーカーを考慮する。
【００４６】
図3は、2つの単球/マクロファージ集団(CD16+/CD16-)間の活性化比に関する結果を示す。
【００４７】
図4は、24時間後のROS産生の結果を示す。図4に関連して、以下に留意すべきである:
CTR=ROS放出の基礎値:8.9nmol;
HYC=陽性基準値、ホモシステイン5mMで刺激した細胞:42.1nmol;
その他の点=プロバイオティクスによる24時間の予備刺激、引き続いてホモシステインによる2時間の刺激。
【００４８】
実験(24時間+2時間)に引き続いてチトクロムC(1mg/ml)と30分間インキュベーションし、酸素フリーラジカルの産生を間接的に定量化するために、550nmで分光光度計を読み取った。
【００４９】
細菌超音波処理:新鮮な培養液3ml(約1×109個細菌/mlの濃度)を、滅菌試験管内の滅菌水27mlに添加する;こうして調製した試料を15分間超音波処理する。ISO19344:2015の方法に従って、市販のキット「BD液体計数ビーズを用いるBDTM細胞生存率キット」を使用して、残留細胞濃度を評価するために、細胞蛍光測定分析を行う。
【００５０】
細菌チンダル化:ISO19344:2015の方法に従って、市販のキット「BD液体計数ビーズを用いるBDTM細胞生存率キット」を使用して、無傷であるが、生存可能でない細胞の総濃度を定量化するために、細胞蛍光測定分析を行う。チンダル化に適用した手順は、イタリア特許出願番号第MI2012A001355号及び国際特許出願PCT/IB2015/058747号に記載されている。
全てビフィドバクテリウム属に属する、試験した3つの菌株によって産生されたプロバイオティクス細胞抽出物(PCE、ペプチドグリカンを含むか又はペプチドグリカンからなる)は、「パトロール亜集団」と「炎症性亜集団」の両方の2つのヒト単球/マクロファージ亜集団を、有意な程度に、調節することができることを実証し、よって強力な免疫賦活効果を示した。
【００５１】
単球/マクロファージは、ウイルス及び細菌感染症における防御の第一線を構成する。更に、これらの細胞は、免疫応答を調節することができ、炎症過程の誘発及び維持において主要な役割を果たす。末梢血流中を循環している単球は様々な組織に流入し、そこで様々な微小環境因子に暴露した結果として専門化された細胞に分化する。こうして分化したマクロファージが種々の器官に存在し、そこで免疫及び炎症応答、組織損傷及び修復、アポトーシス細胞のクリアランス並びに抗悪性腫瘍監視において重要な役割を果たす。
【００５２】
図3から分かるように、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBS01(LMG P-21384)菌株からのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE、ペプチドグリカンを含むか又はペプチドグリカンからなる)は、2つの集団間の比:これはこれらの2つの集団に固有の抗炎症及び免疫賦活活性の重要な指標である、の約13倍の増加(基礎値は1に等しい)をもたらす。実際、2つの亜集団を有意な程度に調節することによって、PCEは、微生物を貪食する能力(自然免疫における重要な役割)、抗原を処理し、それらをTリンパ球に提示する能力(獲得免疫における重要な役割)並びに炎症反応を開始及び/又は増幅又は終了し、炎症細胞の動員を促進し、リンパ球応答を調節することができる多数のサイトカイン及びケモカインを合成する能力を含む、単球/マクロファージの特異的な機能的免疫特性を刺激する。
【００５３】
プロバイオティクス細胞抽出物(PCE、ペプチドグリカンを含むか又はペプチドグリカンからなる)は、2つの亜集団を刺激することによって、感染部位で炎症と戦うのを助け、病原性細菌、ウイルス及び真菌に対する適応応答を活性化することができる。
有利なことに、前記混合物、そのため前記組成物は、プロバイオティクス菌株ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBS01(LMG P-21384)及び/又はプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)を含むか又はそれらからなる。
【００５４】
更に、PCEは、ホモシステインによって誘発される酸化ストレス(高ホモシステイン血症のインビトロモデル)を有意に減少させることができる。
【００５５】
PCEの作用は、BR03、BS01及びBL03の生存可能、チンダル化又は超音波処理菌株の作用よりも優れており、PCEの重要な抗酸化及び抗炎症効果を表す。
【００５６】
有利なことに、プロバイオティクス細胞抽出物(PCEを含むか又はそれからなる)を、その三重効果のおかげで感染症の予防的又は治療的処置に有効に適用することができる:
-  (a)ペプチドグリカンは炎症反応に直接関与する2つの単球/マクロファージ集団の活性化を調節することができるので、免疫賦活;
-  (b)ペプチドグリカンは、例えばウイルス、細菌、真菌又は原虫等の外部病原性作用物質の存在によって誘発される炎症状態の退行を誘導することができるので、抗炎症;
-  (c)ペプチドグリカンは更に、炎症に直接関与する免疫系の集団によって誘引される酸化ストレスを減少させることにおいて直接的作用を有するので、抗酸化。
【００５７】
本発明は、インフルエンザ、発熱又は風邪の予防的及び/又は治療的処置に使用するため、或いは抗インフルエンザワクチンとして使用するための、免疫賦活特性、抗炎症特性及び抗酸化特性を有するビフィドバクテリウム属に属するプロバイオティクス細菌株及び/又はそのプロバイオティクス細胞抽出物(PCE)に関する。
【００５８】
有利なことに、前記ワクチンは、ビフィドバクテリウム属に属する以下の種:ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに属する細菌の少なくとも1つの菌株を含むか又はそれらからなる;前記菌株はビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBS01(LMG P-21384)、ビフィドバクテリウム・ブレーベBR03(DSM16604)及びビフィドバクテリウム・ロンガムBL03(DSM16603)菌株から選択される。
【００５９】
本発明の前記混合物、そのため前記組成物は、同じプロバイオティクス菌株の生存、溶解、チンダル化又は超音波処理細胞と比較して免疫系を強化し、炎症影響を減少させることを実証した。実際面で、これらは、(i)予防の手段(ワクチン)として、病気になる、例えばインフルエンザ、風邪又は発熱を有する個体の数を減少させる;及び/又は(ii)症状の強度(少ない病気の日数)及びその重症度(例えば、より低い熱)を減少させることができる。このために、本発明の組成物は、市場に出ているワクチンの有効な代替となる。
【００６０】
PCEは、対応する生存可能な菌株の能力と比較すると、単球/マクロファージ亜集団の活性化の場合、更に優れていると言わないまでも、匹敵する免疫賦活活性を有する。PCEの使用は、特に例えば、局所使用のための製剤(ゲル、クリーム、軟膏及びローション)又は経口使用のため若しくはエアゾール療法に使用するための製剤等の製剤において、生存可能な菌株、又は溶解菌株、又はチンダル化菌株、又は超音波処理菌株の使用の有効な代替であるということになる。前記製剤は生存プロバイオティクス細菌株に不適切な気候帯で市販することもできる。
【００６１】
本出願人は更なるインビトロ試験を行った。
この試験では、プロバイオティクス菌株ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBS01(LMG P-21384)及び本特許出願に記載される抽出法を通して得られたそのそれぞれの細胞壁抽出物(PCE)が、損傷を受けた腸管上皮のモデルにおいて膜の完全性を回復させる能力を分析した。
【００６２】
以下を行った:
1.調査中の様々な菌株からの細胞壁の抽出。
2.経上皮電気抵抗(TEER)アッセイ。
3.データ分析及び統計学的評価を対応のあるデータt検定によって行った;p<0.05の値の場合にデータを有意とみなした。
【００６３】
材料及び方法
プロバイオティクス菌株ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBS01(LMG P-21384)を、選択培地(MRS)中37℃で培養し、FACSCaliburフローサイトメーター(BD社により製造)を使用して計数した。標準的な手順に従って、BD社のCell Viability Kitを使用して、生理溶液中10〜3倍希釈で菌株を計数した。
実験のために、CACO-2細胞を3×106個細菌及び10mg/mlのPCEで処理した。
実験では24ウェルトランスウェルプレートを使用し、その上でコンフルエントな細胞層、ARETA International社、Gerenzano(Va)により製造された腸管上皮組織のインビトロモデルを形成するまで21日間、CACO-2細胞を培養した。
全ての実験をDMEM10%FBS(ウシ胎仔血清)培地(GIBCO)で行った。
バリア機能の回復を評価するためのプロトコルは、各ウェルの初期抵抗を読み取った後、上皮損傷を誘発する最終濃度10ng/mlの炎症促進性刺激:TNFα及びIL-1β(Immunotools社により製造)と1時間、CACO-2細胞をプレインキュベートし、引き続いてプロバイオティクス菌株(3×106個細胞/ウェル)及びそのそれぞれのPCE(10mg/ml)と1時間インキュベートすることを想起する。
2時間刺激した後、頂端チャンバー及び側底チャンバーの培地を交換する。刺激の24時間後、頂端チャンバーと側底チャンバーとの間の電気抵抗の正確な測定を行うことができる、EVOM2-細胞組織の経上皮抵抗を測定するよう特別に設計された機器を使用して、実験細胞モデルでTEER(経上皮電気抵抗)を決定する。
TEER測定値を、対照ウェルの値(基礎値)と比較した各個々の実験ウェルについてのTEER値の百分率として表す。結果をTable 1(表1)及び図5に示す。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
考察及び結論
腸管の完全性を維持することは腸の基本的な生理学的過程にとって重要である。
バリアの完全性は経上皮電気抵抗、すなわちTEERを通して測定することができる。TEERは、傍細胞経路を通したイオンの通過のインビトロ測定である。
そのため、TEER値の減少は、細胞損傷の早期発現を表し、バリアが損なわれていることを示し得る。
プロバイオティクス菌株ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBS01(LMG P-21384)が、TEER値を85%にもっていくことによって、それ自体、腸管上皮細胞モデル(CACO-2)において損傷を受けた膜の完全性を回復することができることが既に実証されている。
この試験では、BS01菌株が、本特許出願に記載される細胞壁抽出法の後でさえ、この能力を維持することを実証することが目的であった。
データにより、BS01菌株のPCEが、元の菌株に完全に匹敵する様式で、膜の完全性を76%に回復させることが確認される。
この証拠に照らして、BS01菌株のPCEが、細菌又はウイルス感染症による腸管壁損傷の予防及び治療に使用するための優れた候補であると断言することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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