(57)【要約】  本開示は、免疫刺激のための新規のベクターと、これを、免疫療法、特に、がん免疫療法において使用する方法とを提示する。新規のベクターは、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７リガンド）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含み、ベクターは、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇をもたらす。具体的には、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を、５’〜３’方向に、１、２、３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が、１位にはないことを条件としてベクター内に構成する。本開示の実施形態は、新規のベクターを含むウイルス粒子、ならびに新規のベクターを形質導入またはトランスフェクトされたがん細胞または免疫細胞を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含み、少なくとも１つの調節核酸配列、好ましくは、プロモーター配列をさらに含み、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇をもたらすベクター。
【請求項２】
前記４−１ＢＢＬの発現レベルが、ベクターＩｍ０１の発現構築物（図２０）により得られる４−１ＢＢＬの発現レベルと比較して上昇している、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
ベクターＩｍ０１の発現構築物（図２０）により得られるｓｃＩＬ−１２および／またはＩＬ−２の発現レベルと比較して、前記ｓｃＩＬ−１２の発現レベルが低下し、かつ／または前記ＩＬ−２の発現レベルが上昇している、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする前記核酸配列を、５’〜３’方向に、１、２、３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする前記配列が、１位にはないことを条件として構成した、請求項１から３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５】
アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、ナノ粒子ベクター、およびネイキッドＤＮＡのうちのいずれか１つである、請求項１から４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６】
４−１ＢＢＬをコードする前記核酸配列が、ヒトｃＤＮＡであり、ｓｃＩＬ−１２をコードする前記核酸配列が、ヒトｃＤＮＡであり、かつ／またはＩＬ−２をコードする前記核酸配列が、ヒトｃＤＮＡである、請求項１から５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７】
４−１ＢＢＬをコードする前記核酸配列が、配列番号１の核酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を示し、前記変異体の核酸配列が、活性化Ｔ細胞に特異的に結合することが可能な、４−１ＢＢＬタンパク質をコードする、請求項１から６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
ＩＬ−２をコードする前記核酸配列が、配列番号３の核酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を示し、前記変異体の核酸配列が、免疫刺激活性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、請求項１から６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
ｓｃＩＬ−１２をコードする前記核酸配列が、配列番号５の核酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を示し、前記変異体の核酸配列が、免疫刺激活性を有するｓｃＩＬ−１２タンパク質をコードする、請求項１から６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０】
ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２をコードする前記核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする前記核酸配列の下流に配置する、請求項１から９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
ＩＬ−２をコードする前記核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする前記核酸配列の下流に配置し、ｓｃＩＬ−１２をコードする前記核酸配列を、ＩＬ−２をコードする前記核酸配列の下流に配置する、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
プロモーターを、４−１ＢＢＬをコードする前記核酸配列の上流に配置するが、ｓｃＩＬ−１２および／またはＩＬ−２をコードする前記核酸配列の上流には配置しない、請求項１０または１１に記載のベクター。
【請求項１３】
４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする前記核酸配列を、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により連結した、請求項１から１２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のベクターを形質導入またはトランスフェクトされたがん細胞または免疫細胞。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１４に記載のがん細胞もしくは免疫細胞を含む医薬。
【請求項１６】
がん、ウイルス感染、および／または免疫系障害を処置する方法における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のベクター、請求項１４に記載のがん細胞もしくは免疫細胞、または請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
前記がんが、膀胱がん、乳がん、前立腺がん、リンパ腫、皮膚がん、膵臓がん、結腸がん、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣がん、脳がん、原発性脳癌、頭頸部がん、神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓がん、非小細胞肺がん、頭部または頸部癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、前立腺癌、尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵臓膵島細胞腫、悪性カルチノイド癌、絨毛癌、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血症、子宮頸過形成、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、中皮腫、骨肉腫、原発マクログロブリン血症、および網膜芽細胞腫のうちのいずれか１つである、請求項１６に記載の使用のためのベクター、または請求項１６に記載の使用のためのがん細胞もしくは免疫細胞、または請求項１６に記載の使用のための医薬。
【請求項１８】
がんの転移を防止または処置する方法における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１４に記載のがん細胞もしくは免疫細胞、または請求項１５に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は一般に、免疫学の分野に関し、より具体的には、免疫療法の分野に関する。特に、本開示は、免疫刺激のための新規のベクター系と、これを、免疫療法において使用する方法とに関する。新規のベクター系は、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７リガンド）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含む、１または複数のベクターを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、細菌またはウイルスなど、外来の侵入者のほか、がん細胞を含む、体内の損傷細胞、疾患細胞、または異常な細胞を認識し、破壊するための手段をもたらす。免疫系応答における主要な応答細胞は、一般レベルまたは非特異的レベルの免疫保護をもたらす、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞を含む。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＢリンパ球を含む他の細胞型は、特異的標的に対して作用する。免疫応答は、Ｂ細胞が抗原特異的抗体を産生する体液性応答と、抗原または抗原保有細胞が、様々な異なる機構を使用することにより、多様な種類のＴ細胞により認識され、破壊される細胞媒介性応答とを含む。ＣＴＬ応答を含む細胞媒介性免疫応答は、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の消失への鍵であると考えられる。
【０００３】
一般に、異常な細胞を検出し、破壊する免疫系の自然の能力は、多くのがんの発生を防止すると考えられる。そうであるにもかかわらず、一部のがん細胞は、免疫系による破壊を回避する戦略を発達させている。例えば、がん細胞が免疫応答を抑制するのに使用しうる、いくつかの異なる機構が存在する。がん細胞はまた、がん関連抗原の喪失をもたらし、それらを免疫系に対して「見え」にくくする遺伝子的変化も経る場合がある。同様の考察は、免疫逃避戦略もまた採用し、宿主の免疫系によるウイルス感染コントロールの失敗をもたらす、異なるウイルスに関しても当てはまる。
【０００４】
免疫療法の目標は、有効な免疫応答に対するこれらの障壁を克服することである。免疫療法ベースの生物学的療法は、特異的な免疫系構成要素の活性を回復するかもしくは増大させるか、またはがん細胞により、もしくはウイルス感染性疾患時にもたらされる免疫抑制性シグナルに対抗する。腫瘍細胞は、とりわけ、ＣＴＬにより、抗原特異的に殺滅される。したがって、Ｔ細胞の活性化を促進し、強力な細胞溶解性および炎症性特性を付与する薬剤は、腫瘍特異的免疫を増強するための、理想的な候補物質である。
【０００５】
治療の新たな形態が必要とされ続けており、免疫療法剤の１つの主要な道筋は、遺伝子導入技術に基づく。免疫療法を送達する方策としての遺伝子治療が確立されている。非複製型ウイルスおよびウイルスベクターは元来、２０年前に、とりわけ、免疫活性化（例えば、ＩＬ−２）モダリティーを使用する抗がん剤として提起された（例えば、Crofts and Krimsky, 2005, Hum Gene Ther. 16: 169-177を参照されたい）。国際公開第２００４／０３５７９９号パンフレットは、感染性疾患およびがんの処置における遺伝子治療のために、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、共刺激性タンパク質である４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターについて記載している。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、不活性の免疫微小環境を、活性の免疫微小環境へと転換し、これにより、がんおよびウイルス感染を処置するために有効な、既存の遺伝子治療手法を上回る改善を表す、新規のベクターベースの免疫療法に関する。
【０００７】
本開示は、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、およびＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列を含むベクターであって、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現の増大をもたらすベクターを提示する。具体的には、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を、５’〜３’方向に、１、２、３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成する。本開示はまた、不活性の免疫微小環境を、活性の免疫微小環境へと転換し、これにより、がんまたは感染性疾患を処置する方法、およびこのための新規のベクターの使用も提示する。本開示の方法および組成物は、特許請求されるウイルスベクターであって、がん細胞およびウイルス感染に対する免疫応答を誘発して、がんおよびウイルス感染に対する免疫を増強および／または刺激するウイルスベクターの構築および検証を含む。
【０００８】
本開示の態様は、以下を含む。
１．４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含み、少なくとも１つの調節核酸配列、好ましくは、プロモーター配列をさらに含み、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇をもたらすベクター。
２．４−１ＢＢＬの発現レベルが、ベクターＩｍ０１の発現構築物（図２０）により得られる４−１ＢＢＬの発現レベルと比較して上昇している、項目１のベクター。
３．ベクターＩｍ０１の発現構築物（図２０）により得られるｓｃＩＬ−１２および／またはＩＬ−２の発現レベルと比較して、ｓｃＩＬ−１２の発現レベルが低下し、かつ／またはＩＬ−２の発現レベルが上昇している、項目１または２のベクター。
４．４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を、５’〜３’方向に、１、２、３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列が、１位にはないことを条件として構成した、項目１〜３のうちのいずれか１つのベクター。
５．アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、ナノ粒子ベクター、およびネイキッドＤＮＡのうちのいずれか１つである、項目１〜４のうちのいずれか１つのベクター。
６．４−１ＢＢＬをコードする核酸配列が、ヒトｃＤＮＡであり、ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列が、ヒトｃＤＮＡであり、かつ／またはＩＬ−２をコードする核酸配列が、ヒトｃＤＮＡである、項目１〜５のうちのいずれか１つのベクター。
７．４−１ＢＢＬをコードする核酸配列が、配列番号１の核酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を示し、変異体の核酸配列が、活性化Ｔ細胞に特異的に結合することが可能な、４−１ＢＢＬタンパク質をコードする、項目１〜６のうちのいずれか１つのベクター。
８．ＩＬ−２をコードする核酸配列が、配列番号３の核酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を示し、変異体の核酸配列が、免疫刺激活性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、項目１〜６のうちのいずれか１つのベクター。
９．ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列が、配列番号５の核酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を示し、変異体の核酸配列が、免疫刺激活性を有するｓｃＩＬ−１２タンパク質をコードする、項目１〜６のうちのいずれか１つのベクター。
１０．ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２をコードする核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列の下流に配置する、項目１〜９のうちのいずれか１つのベクター。
１１．ＩＬ−２をコードする核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列の下流に配置し、ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列を、ＩＬ−２をコードする核酸配列の下流に配置する、項目１０のベクター。
１２．プロモーターを、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列の上流に配置するが、ｓｃＩＬ−１２および／またはＩＬ−２をコードする核酸配列の上流には配置しない、項目１０または１１のベクター。
１３．４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により連結した、項目１〜１２のうちのいずれか１つのベクター。
１４．項目１〜１３のうちのいずれか１つのベクターを形質導入またはトランスフェクトされたがん細胞または免疫細胞。
１５．項目１〜１３のうちのいずれか１つのベクター、または項目１４のがん細胞もしくは免疫細胞を含む医薬。
１６．がん、ウイルス感染、および／または免疫系障害を処置する方法における使用のための、項目１〜１３のうちのいずれか１つのベクター、項目１４のがん細胞もしくは免疫細胞、または項目１５の医薬。
１７．がんが、膀胱がん、乳がん、前立腺がん、リンパ腫、皮膚がん、膵臓がん、結腸がん、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣がん、脳がん、原発性脳癌、頭頸部がん、神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓がん、非小細胞肺がん、頭部または頸部癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、前立腺癌、尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵臓膵島細胞腫、悪性カルチノイド癌、絨毛癌、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血症、子宮頸過形成、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、中皮腫、骨肉腫、原発マクログロブリン血症、および網膜芽細胞腫のうちのいずれか１つである、項目１６による使用のためのベクター、または項目１６による使用のためのがん細胞もしくは免疫細胞、または項目１６による使用のための医薬。
１８．がんの転移を防止または処置する方法における使用のための、項目１〜１３のうちのいずれか１つのベクター、または項目１４のがん細胞もしくは免疫細胞、または項目１５の医薬。
【０００９】
本開示の１または複数の実施形態の詳細について、付属の図面および下記の記載に明示する。他の特徴、目的、および利点は、記載および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マウスＩｍ０１およびヒトＩｍ０１による、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、および４−１ＢＢＬのトランス遺伝子の発現、ならびにＩＦＮ−γ応答の比較を示す図である。ＭＯＩ（感染多重度）：［カッコ］内に表示の数字；「ｍ」＝マウス；「ｈｕ」＝ヒト。
【図２】シャトルプラスミドであるｐＥ１．１  Ｉｍ０２についての、概略的遺伝子マップを示す図である。ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２の遺伝子による３つの治療剤のｃＤＮＡを、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により連結され、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより駆動される、トリシストロニックの構築物内に構成する。転写物のポリアデニル化は、ＳＶ４０由来のシグナルにより誘導する。Ｉｍ０２の発現カセットを、例えば、アデノウイルスのベクターＤＮＡを保有するプラスミドへのサブクローニングに適する、プラスミドｐＥ１．１に基づく先駆的導入プラスミドとして例示する。
【図３】Ｉｍ０２および早期ベクターＩｍ０１による、トランス遺伝子の発現、およびＩＦＮ−γ応答の比較を示す図である。ＭＯＩ（感染多重度）：［カッコ］内に表示の数字。表示のデータ点は、各例４連とする、４例の個々のドナーの平均値である。
【図４】膀胱組織ベースのモデルにおける、Ｉｍ０２およびＩｍ０１の比較を示す図である。「Ｔ」＝膀胱腫瘍組織；「Ｂ」＝正常膀胱組織。
【図５】異なる用量レベルにおける、Ｉｍ０２およびＩｍ０１の比較を示す図である。ｉｖｐという用量は、感染性ウイルス粒子の用量を意味する。「Ｔ」＝膀胱腫瘍組織；「Ｂ」＝正常膀胱組織。
【図６】ＲＴ−４ヒト膀胱がん細胞の、ヒトＰＢＭＣとの共培養における、免疫細胞型の活性化を例示する熱プロットを示す図である。後続の行は、基本免疫細胞型および活性化（「ａｃｔ」）免疫細胞型を示す。ベクターを伴わないＲＴ−４細胞（「対照」）、および空アデノウイルスベクターを形質導入した細胞（「Ａｄ０」）を、対照として使用した。Ｔｈ＝ヘルパーＴ細胞；Ｔｃ＝細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋  Ｔ細胞）；ＰＣ＝形質細胞；ＮＫ＝ナチュラルキラー細胞；ｍｏｎｏ＝単球；ＤＣ＝樹状細胞；ｎｅｕｔｒｏ＝好中球。
【図７−１】図７は、Ｉｍ０２、または対照としてのＡｄ０もしくは非処置で刺激した試料の、ヘマトキシリン／エオシン染色の後における組織学的検討を示す図である。Ａ：培養を伴わない膀胱腫瘍組織；Ｂ：１０８ｉｖｐのＡｄ０による、６日間にわたる処置後における、膀胱腫瘍組織。
【図７−２】図７は、Ｉｍ０２、または対照としてのＡｄ０もしくは非処置で刺激した試料の、ヘマトキシリン／エオシン染色の後における組織学的検討を示す図である。Ｃ：１０８ｉｖｐのＩｍ０２による、６日間にわたる処置後における、膀胱腫瘍組織。
【図８】Ｉｍ０２を伴うかまたは伴わずに刺激した試料の、ヘマトキシリン／エオシン染色の後における組織学的検討を示す図である。上パネル：培養を伴わない尿路上皮腫瘍組織、下パネル：１０８ｉｖｐのＩｍ０２で刺激された、６日間にわたる処置後における、膀胱腫瘍組織。
【図９−１】図９は、透過電子顕微鏡法による、標的細胞の解析および取込み機構を示す図である。パネル１：概観（右画像）および詳細（Ａ）：未知の細胞型による、小胞を伴わない粒子の取込み。詳細（Ｂ）；白色：ランゲルハンス細胞形状／マクロファージ形状／樹状細胞形状の細胞による、小胞への粒子の取込み。パネル２：概観（Ｂ）および詳細（Ａ）：ランゲルハンス細胞形状／マクロファージ形状／樹状細胞形状の細胞による、小胞へのアデノウイルス粒子の取込み。
【図９−２】図９は、透過電子顕微鏡法による、標的細胞の解析および取込み機構を示す図である。パネル３：概観（Ｂ）および詳細（Ａ）：リンパ球形状の細胞の、強力な小胞構造による、アデノウイルス粒子の取込み。パネル４：概観（Ｂ）および詳細（Ａ）：線維芽細胞形状の細胞による、小胞を伴わない、アデノウイルス粒子の取込み。パネル５：概観（Ｂ）および詳細（Ａ）：未知の標的細胞型により取り込まれた、小胞を伴わないアデノウイルス粒子の大型の群。
【図９−３】図９は、透過電子顕微鏡法による、標的細胞の解析および取込み機構を示す図である。パネル６：概観：上皮細胞または腫瘍細胞の形状特徴を伴う標的細胞内の、夥多な小胞構造間の小胞コーティング（白色矢印）を伴わないアデノウイルス粒子。詳細（Ａ）：細胞膜へと接合したアデノウイルス粒子の、早期エンドサイトーシスの外観。詳細（Ｂ）：他の非ウイルス構造もまた含有する大型の小胞による、アデノウイルス粒子に対する飲作用。
【図１０】正常膀胱試料中および膀胱腫瘍試料中の、示差的発現の比較を示す図である。Ｉｍ０２は、実施例２で記載されるアデノウイルスベクターを意味する。Ａｄ０は、対照として使用される空アデノウイルスベクターを意味する。ｎ＝膀胱／腫瘍試料の例数。
【図１１】細胞培養物中の異なるトランスフェクタントについての検討を示す図である。ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質。ＣＡＲ＝コックサッキー−アデノウイルス受容体。ＭＯＩ＝感染多重度（標的細胞１個当たりの感染性ウイルス粒子）。
【図１２】トランス遺伝子の発現およびＩＦＮ−γの誘導に対するプロタミン硫酸塩の効果を示す図である。Ｉｍ０２とは、実施例２で記載されるアデノウイルスベクターを意味する。Ａｄ０＝対照として使用される空アデノウイルスベクター。ｉｖｐ＝感染性ウイルス粒子。「Ｔ」＝膀胱腫瘍組織；「Ｂ」＝正常膀胱組織。
【図１３】ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１４】ヒトＩＬ−２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１５−１】図１５は、リンカーで連結された、ヒトＩＬ−１２の、ｐ４０サブユニットおよびｐ３５サブユニットを含むヒト単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。リンカー配列を、配列番号５および６のそれぞれに、太字で、かつ、下線を付して示す。
【図１５−２】上記と同様である。
【図１６−１】図１６は、ヒトＩＬ−１２の、３５ｋＤａのサブユニットおよび４０ｋＤａのサブユニットのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１６−２】上記と同様である。
【図１７−１】図１７は、図２に描示される、シャトルベクターであるｈｕ  ｐＥ１．１  Ｉｍ０２のヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す図である。ヌクレオチド配列は、合計７，８４５ｂｐを有する。ＣＭＶプロモーター、ヒト４−１ＢＢＬ、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ−２、ＰＶ  ＩＲＥＳ、ヒトｓｃＩＬ−１２、およびＳＶ４０ポリＡは、配列番号１１のヌクレオチド配列内で、以下：ＣＭＶプロモーター：ｂｐ  ４８４〜１，０５９；ヒト４−１ＢＢＬ：ｂｐ  １，０８０〜１，８４４；ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ：ｂｐ  １，８８５〜２，３８８；ヒトＩＬ−２：ｂｐ  ２，４０９〜２，８７０；ＰＶ  ＩＲＥＳ：ｂｐ  ２，９１４〜３，５４５；ヒトｓｃＩＬ−１２：ｐ４０サブユニット：ｂｐ  ３，５８１〜４，５６４、リンカー：ｂｐ  ４，５６５〜４，６０９、ｐ３５サブユニット：ｂｐ  ４，６１０〜５，２０３；およびＳＶ４０ポリＡ：ｂｐ  ５，２７１〜５，５１０の通りに同定することができる。
【図１７−２】上記と同様である。
【図１７−３】上記と同様である。
【図１７−４】上記と同様である。
【図１８−１】図１８は、図２内および配列番号１１（図１７）内のそれぞれに描示されるシャトルプラスミドである、ｈｕ  ｐＥ１．１  Ｉｍ０２内に含有されるＣＭＶ、ヒト４−１ＢＢＬ、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ−２、ＰＶ  ＩＲＥＳ、ヒトｓｃＩＬ−１２、およびＳＶ４０ポリＡを含む発現カセットの概略的概観およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図１８−２】上記と同様である。
【図１８−３】上記と同様である。
【図１８−４】上記と同様である。
【図１９】異なるＭＯＩの、Ｉｍ０２および単一遺伝子発現ベクターによる、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２のトランス遺伝子の発現、ならびにＩＦＮ−γ応答を示す図である。下方の、「４−１ＢＢＬ＋細胞の％」と称する軸は、４−１ＢＢＬの発現について陽性である細胞を意味する。左側のバーは、各々、ＭＯＩを［５］とするＩＬ−１２およびＩＬ−２の、異なるＭＯＩの４−１ＢＢＬ（［１０］、［２５］、［５０］、および［１００］）との組合せを指し示す。Ｉｍ０２は、実施例２で記載されるアデノウイルスベクターを意味する。ＭＯＩ＝感染多重度（すなわち、標的細胞１個当たりの感染性ウイルス粒子）。Ｉｍ０２と、単一遺伝子発現ベクターの組合せとによる、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２のトランス遺伝子の発現、ならびにＩＦＮ−γ応答は、ＩＦＮ−γの発現が、４−１ＢＢＬレベルの上昇に依存することを明らかにする。
【図２０】シャトルプラスミドである、ｐＥ１．１  Ｉｍ０１についての概略的遺伝子マップを示す図である。ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２の遺伝子による３つの治療剤のｃＤＮＡを、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により連結され、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより駆動される、トリシストロニックの構築物内に構成する。転写物のポリアデニル化は、ＳＶ４０由来のシグナルにより誘導する。Ｉｍ０１の発現カセットを、例えば、アデノウイルスのベクターＤＮＡを保有するプラスミドへのサブクローニングに適する、プラスミドｐＥ１．１に基づく先駆的導入プラスミドとして例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書および付属の特許請求の範囲で使用される、単数形の「ある（a）」、「ある（an）」、および「その」は、文脈により、そうでないことが明らかに指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ある（an）抗原」への言及は、複数のこのような抗原を含み、「ある（a）細胞」または「その細胞」への言及は、１または複数の細胞、および、当業者に公知である、これらの同等物（例えば、複数の細胞）への言及を含む。同様に、「ある（a）化合物」または「ある（a）組成物」への言及は、複数のこのような化合物または組成物を含み、文脈により、そうでないことが明らかに指示されない限りにおいて、それぞれ、１または複数の化合物または組成物を指す。数または数値範囲を指す場合の「約」という用語は、言及される数または数値範囲が、実験のばらつき内（または統計学的実験の誤差内）の近似であり、したがって、数または数値範囲は、言明された数または数値範囲に対する、１％〜１５％の間で変動しうることを意味する。ある特定の他の実施形態では、「〜を含むこと（comprising）」という用語（および「〜を含む（comprise）」または「〜を含む（comprises）」または「〜を有すること」または「〜を含むこと（including）」など、関連する用語）は、例えば、本明細書で記載される、任意の、物質の組成物、組成物、方法、または過程などについての実施形態が、記載される特徴「からなる」か、またはこれら「から本質的になる」ことを除外することを意図するものではない。
【００１２】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および学術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で記載される方法および材料と同様または同等な方法および材料を、開示される方法の実施および組成物において使用しうるが、本明細書では、例示的な方法、デバイス、および材料について記載する。
【００１３】
「コドン最適化配列」という用語は一般に、使用頻度が約２０％未満である任意のコドンを置きかえることにより、特定の宿主種に最適化されたヌクレオチド配列を指す。本明細書では、コドン最適化に加えて、疑似ポリアデニル化配列の消失、エクソン／イントロンスプライシングシグナルの消失、トランスポゾン様リピートの消失、および／またはＧＣ含量の最適化により、表示の宿主種における発現について最適化されたヌクレオチド配列を、「発現増強配列」と称する。
【００１４】
本明細書では、「プロモーター領域」という用語を、その通常の意味で、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すように使用し、この場合、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することが可能な遺伝子に由来する。調節配列は、所望の遺伝子配列に対して、相同な場合もあり、異種の場合もある。例えば、本明細書で記載されるウイルスプロモーターまたは哺乳動物プロモーターを含む、広範なプロモーターを用いることができる。プロモーターは、ＤＮＡ配列に対して、前記ＤＮＡ配列の転写を開始することが可能であるような向きにする。
【００１５】
「調節核酸配列」という用語は、レシピエント細胞内のコード配列の複製、転写、および翻訳を集合的にもたらす、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流の調節ドメイン、複製起点、エンハンサーなどを集合的に指す。選択したコード配列を、適切な宿主細胞内で、複製、転写、および翻訳することが可能である限りにおいて、これらの制御配列の全てが、常に存在する必要はない。当業者は、公開のデータベースおよび材料から、調節核酸配列を、たやすく同定することができる。さらに、当業者は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて意図される使用に適用可能な調節配列も同定しうる。好ましくは、「調節核酸配列」という用語は、プロモーターまたはプロモーター配列を指す。
【００１６】
多様な実施形態では、「調節核酸配列」という用語はまた、ＩＲＥＳ配列（内部リボソーム侵入部位）も指す。これは特に、「調節核酸配列」という用語が、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含有する、トリシストロニックの発現カセット／ベクター１つ当たり、１つのプロモーターを包含し、プロモーターのすぐ下流に局在化させない各シストロンのためのＩＲＥＳ配列をさらに包含する、多様な好ましい実施形態に当てはまる。プロモーター配列およびＩＲＥＳ配列の組合せが検討されており、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列（この順序で）を、４−１ＢＢＬのためのプロモーター、ならびにＩＬ−２およびｓｃＩＬ−１２のためのＩＲＥＳ配列と共に含有するトリシストロニックの発現カセット／ベクター内で、ＩＬ−２およびｓｃＩＬ−１２の発現レベルまたは発現率と比較して改善された、４−１ＢＢＬの発現レベルまたは発現率をもたらすことが裏付けられている。
【００１７】
「作動的に配置された」、「作動的に連結された」、「制御下に」、および「転写制御下に」という語句は、プロモーターが、核酸配列との関係で、この配列の転写の開始および／または発現を制御するのに、適正な機能的な位置および／または方向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写の活性化に関与するシス作用型調節配列を指す、「エンハンサー」と共に使用する場合もあり、使用しない場合もある。
【００１８】
国際公開第２００４／０３５７９９号パンフレットは、マウス／ヒトの単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、およびＩＬ−２の遺伝子を、この順序で、５’〜３’方向に含む、すなわち、ｓｃＩＬ−１２を１位でコードする遺伝子、４−１ＢＢＬを２位でコードする遺伝子、およびＩＬ−２を３位でコードする遺伝子を含む発現構築物を含むアデノウイルスベクターについて記載している。この発現構築物は、国際公開第２００４／０３５７９９号パンフレットの図１に示されており、対応するベクターは、「Ａｄ−３」と名付けられた。本開示では、前記早期ベクターである「Ａｄ−３」の内部ベクターコードは、「Ｉｍ０１」であり、また、本開示の実施例１も参照されたい。
【００１９】
マウスＩｍ０１およびヒトＩｍ０１の、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２のトランス遺伝子の発現は、本開示の実施例１および図１で示される通り、トランス遺伝子の発現レベルが、マウス種とヒト種との間で明らかに変化することを明らかにした。とりわけ、ヒトｓｃＩＬ−１２、ヒト４−１ＢＢＬ、およびヒトＩＬ−２の遺伝子を保有するＩｍ０１（「ヒトＩｍ０１」または「ｈｕ  Ｉｍ０１」）の発現は、マウスｓｃＩＬ−１２、マウス４−１ＢＢＬ、およびマウスＩＬ−２の遺伝子を保有するＩｍ０１（「マウスＩｍ０１」または「ｍ  Ｉｍ０１」）の発現と比較して、ＩＬ−１２の顕著な増大を結果としてもたらした。したがって、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２の遺伝子の順序の構成に関して、マウスＩｍ０１と、ヒトＩｍ０１とは、同じベクターアーキテクチャーであるにも関わらず、トランス遺伝子の発現レベルの顕著な差違が観察された。マウスＩｍ０１と、ヒトＩｍ０１との間の、トランス遺伝子の発現のこれらの差違のうちの少なくとも一部は、完全に予測外であった。
【００２０】
本開示により提示されるベクターは、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子に関する、新たなアーキテクチャーを含む。新規のベクターは、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現の増大をもたらす。特に、本開示により提示されるベクターは、発現カセットを含み、この場合、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２をコードする３つの核酸配列（または３つの遺伝子）は、５’〜３’方向に、１、２、および３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成されている。この新規のベクターアーキテクチャーは、とりわけ、ヒトＩｍ０１内の同じ遺伝子の配置と比較した、４−１ＢＢＬの発現の上昇であって、ＩＬ−１２の減少と共時的である上昇をもたらす。驚くべきことに、この新規のベクターアーキテクチャーは、ＩＦＮ−γ応答の増大をもたらすことが見出されている（本開示の実施例３および図３、ならびに実施例１１および図１９を参照されたい）。本開示の新規のベクターによりもたらされる、驚くべき効果は、このような治療を必要とする患者の免疫療法に特に有益であることが実証されている。具体的には、本開示のベクターは、不活性の免疫微小環境を、活性の免疫微小環境へと転換し、これにより、がんまたはウイルス感染を処置するために特に有効であることが示されている。したがって、本開示のベクターは、がん免疫療法における使用に特に適する。例えば、本開示の図４および５は、対応する実施例４および５で説明される通り、本開示のベクターが、早期ベクターＩｍ０１と比較した、腫瘍微小環境内の免疫刺激効果の改善を呈することを裏付ける。さらに、トランスクリプトーム解析は、本開示のベクターについての、治療用遺伝子の発現プロファイルが、固有であり、優れており、特に、早期ベクターＩｍ０１の発現プロファイルより優れている（実施例６、ならびに表１および２を参照されたい）ことを示している。加えて、図６に示す通り、主要な免疫細胞型の活性化についての遺伝子発現解析は、本開示のベクターによるヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋  Ｔ細胞）の活性化が、早期ベクターＩｍ０１による同じ免疫細胞の活性化より優れている（実施例７を参照されたい）ことを示している。
【００２１】
本開示の新規のベクターは、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃ−ＩＬ１２）、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子を含み、この場合、前記遺伝子は、５’〜３’方向に、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が、前記３つの遺伝子のうちの最上流位にはないように構成されている。したがって、本開示の新規のベクターは、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃ−ＩＬ１２）、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子を含み、この場合、前記遺伝子は、５’〜３’方向に、１、２、および３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成されている。より具体的には、ベクターは、４−１ＢＢＬ、ｓｃ−ＩＬ１２、およびＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列を含み、前記遺伝子は、５’〜３’方向に、１、２、および３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成されている。より具体的には、ベクターは、４−１ＢＢＬ、ｓｃ−ＩＬ１２、およびＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列を含み、前記遺伝子の前記核酸配列は、５’〜３’方向に、１、２、および３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子の核酸配列が、１位にはないことを条件として構成されている。
【００２２】
本開示の多様な実施形態では、新規のベクターは、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃ−ＩＬ１２）、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子（より具体的には、３つの遺伝子の核酸配列）を含む発現構築物（または発現カセット）を含み、前記遺伝子は、発現カセット内に、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が発現カセットの最上流位にはないように構成されている。発現カセットの最上流位は、より具体的には、発現カセットの５’末端の位置として記載することができる。発現カセットの最上流位はまた、より具体的には、発現カセットの３つの遺伝子の転写を調節するプロモーターのすぐ下流の位置としても記載することができる。プロモーターは、発現カセットの一部であるプロモーターの場合もあり、発現カセットの上流のプロモーターの場合もある。３つのトランス遺伝子（すなわち、４−１ＢＢＬ、ｓｃ−ＩＬ１２、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子）の、発現カセット内の構成は、より具体的には、前記３つの遺伝子の核酸配列が、５’〜３’方向に、１、２、および３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子の核酸配列が、発現カセットの３つの遺伝子の１位にはないことを条件として構成されているという趣旨で記載することができる。
【００２３】
本開示の多様な実施形態では、本開示の新規のベクターは、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃ−ＩＬ１２）、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子を含む発現構築物（または発現カセット）を含み、この場合、前記遺伝子は、５’〜３’方向に、１、２、および３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成されている。より具体的には、ベクターは、４−１ＢＢＬ、ｓｃ−ＩＬ１２、およびＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列を含む発現構築物（または発現カセット）を含み、前記遺伝子は、５’〜３’方向に、１、２、および３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成されている。より具体的には、ベクターは、４−１ＢＢＬ、ｓｃ−ＩＬ１２、およびＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列を含む発現構築物（または発現カセット）を含み、前記遺伝子の前記核酸配列は、５’〜３’方向に、１、２、および３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子の核酸配列が、１位にはないことを条件として構成されている。多様な実施形態では、本開示の発現カセットまたは発現構築物は、プロモーターを含む。プロモーターは、より具体的には、発現カセット（または発現構築物）の転写を調節するプロモーターとして記載することができる。多様な実施形態では、発現カセットは、発現カセットの上流（または発現カセットの５’末端）（または発現カセットの５’末端の上流）に配置される、１つのプロモーターを含む。
【００２４】
本明細書で記載される通り、上記で言及された条件節の「１位」とは、より具体的には、前記１、２、および３の順序の１位として記載することができる。
【００２５】
多様な実施形態では、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子の、５’〜３’方向の構成とは、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃ−ＩＬ１２）、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子を含む、本開示の発現カセットまたは発現構築物と比べた、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子の、５’〜３’方向の構成を意味する。したがって、５’〜３’方向とは、発現カセット（または発現構築物）または発現カセットのプロモーターの５’〜３’方向を指す。本開示の他の多様な実施形態では、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子の、５’〜３’方向の構成とは、本開示の発現カセット（または発現構築物）の一部ではないが、発現カセット（または発現構築物）の上流、すなわち、発現カセット（または発現構築物）の５’末端の上流に配置されるプロモーターと比べた、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子の、５’〜３’方向の構成を意味する。本明細書では、５’〜３’方向とは、発現カセット（または発現構築物）の５’末端の上流のプロモーターによる５’〜３’方向を指す。発現カセットの上流（または発現カセットの５’末端の上流）に配置されたプロモーターは、より具体的には、発現カセット（または発現構築物）の転写を調節するプロモーターとして記載することができる。
【００２６】
５’〜３’方向はまた、本開示の３つのトランス遺伝子（すなわち、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２をコードする）のうちの遺伝子であって、前記３つのトランス遺伝子のうちの最上流位にある遺伝子の上流のプロモーターによる５’〜３’方向も指す場合がある。
【００２７】
本開示により提示されるベクターは、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子に関する、新たなアーキテクチャーであって、前記３つの遺伝子が、５’〜３’方向に、１、２、および３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成されているという趣旨でもまた記載されうるアーキテクチャーを含み、この場合、前記１位は、プロモーターの下流、特に、前記３つの遺伝子を発現させるためのプロモーターの下流である。したがって、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃ−ＩＬ１２）、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子を含む、本開示の発現カセット（または発現構築物）に関して、前記３つの遺伝子は、５’〜３’方向に、１、２、および３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成されており、この場合、前記１位は、プロモーターの下流、特に、前記発現カセット（または発現構築物）を転写／発現させるためのプロモーターの下流である。
【００２８】
本明細書で記載される「上流に配置された」は、より具体的には、「すぐ上流に配置された」と記載することができる。さらに、「５’末端に配置された」または「５’末端の上流に配置された」は、より具体的には、「転写開始部位の５’末端に配置された」または「転写開始部位の５’末端の上流に配置された」と記載することができる。
【００２９】
本開示の新規のベクターは、４−１ＢＢＬ、ｓｃ−ＩＬ１２、およびＩＬ−２をコードする遺伝子（または遺伝子の核酸配列）を発現させることが可能である。したがって、より具体的には、本開示の新規のベクターは、発現ベクター、なおより具体的には、組換え発現ベクターである。
【００３０】
本明細書で記載される通り、多様な実施形態では、「４−１ＢＢＬ、ｓｃ−ＩＬ１２、およびＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列」という用語は、「４−１ＢＢＬ、ｓｃ−ＩＬ１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列」を意味し、この逆も成り立つ。したがって、多様な実施形態では、「４−１ＢＢＬをコードする遺伝子の核酸配列」という用語は、「４−１ＢＢＬをコードする核酸配列」を意味し、この逆も成り立つ。したがって、多様な実施形態では、「ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子の核酸配列」という用語は、「ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列」を意味し、この逆も成り立ち、「ＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列」は、「ＩＬ−２をコードする核酸配列」を意味し、この逆も成り立つ。同様に、多様な実施形態では、「ｓｃ−ＩＬ１２およびＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列」という用語は、「ｓｃ−ＩＬ１２およびＩＬ−２をコードする核酸配列」を意味し、この逆も成り立つ。本明細書でさらに記載される通り、多様な実施形態では、「４−１ＢＢＬ、ｓｃ−ＩＬ１２、およびＩＬ−２をコードする遺伝子」という用語は、「４−１ＢＢＬ、ｓｃ−ＩＬ１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列」を意味し、この逆も成り立つ。したがって、多様な実施形態では、「４−１ＢＢＬをコードする遺伝子」という用語は、「４−１ＢＢＬをコードする核酸配列」を意味し、この逆も成り立つ。同様に、多様な実施形態では、「ｓｃ−ＩＬ１２およびＩＬ−２をコードする遺伝子」という用語は、「ｓｃ−ＩＬ１２およびＩＬ−２をコードする核酸配列」を意味し、この逆も成り立つ。
【００３１】
本開示の新規のベクターは、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現と比較して高度な４−１ＢＢＬの発現をもたらす。したがって、本開示ではまた、少なくとも４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含む、１または複数のベクターを含むベクター系も提示され、この場合、ベクター系は、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現と比較して高度な４−１ＢＢＬの発現をもたらす。より高度な４−１ＢＢＬの発現は、３つのトランス遺伝子の転写を調節するプロモーターの、異なるプロモーター強度により調節される。前記１または複数のベクターは、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を発現させることが可能な発現ベクターである。より具体的には、発現ベクターは、組換え発現ベクターである。多様な実施形態では、１または複数のベクターを含むベクター系は、ＩＬ−１２およびＩＬ−２を一定レベルとするときの、より高度な４−１ＢＢＬレベルまたは４−１ＢＢＬレベルの上昇の実現をもたらす。多様な実施形態では、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を形質導入またはトランスフェクトされたがん細胞または免疫細胞のうちの少なくとも５％が、４−１ＢＢＬを発現していることを達成するために、１または複数のベクターを含むベクター系を、医療環境において使用することができる。
【００３２】
一態様では、本開示は、少なくとも、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含む、１または複数のベクターを含むベクター系を提示するが、この場合、ベクター系は、ＩＬ−１２およびＩＬ−２を一定レベルとするときの、より高度な４−１ＢＢＬレベルまたは４−１ＢＢＬレベルの上昇の実現をもたらす。これは、図１９に示される、ＩＦＮ−γの発現が、４−１ＢＢＬレベルの上昇に依存するという知見を反映する。図１９に示す通り、いずれもＭＯＩ［５］の、レベルを一定とするＩＬ−１２およびＩＬ−２の、ＭＯＩ［１００］まで漸増するレベルの４−１ＢＢＬとの組合せは、中程度のＩＬ−１２レベルで、ＩＦＮ−γの漸増する誘導をもたらす。多様な実施形態では、本開示のベクター系を、医療環境、好ましくは、ＩＬ−１２およびＩＬ−２を一定レベルとするときの、４−１ＢＢＬレベルの上昇によるがんの処置において使用することができる。具体的には、ＭＯＩ［１０］の、４−１ＢＢＬをコードするベクターと、ＭＯＩ［５］の、ＩＬ−２およびＩＬ−１２をコードするベクターとを伴うベクター系を、医療環境において使用することができる。また、ＭＯＩ［１０］の、４−１ＢＢＬをコードするベクターと、ＭＯＩ［５］の、ＩＬ−２およびＩＬ−１２をそれぞれコードする２つのベクターとを伴うベクター系も、医療環境において使用することができる。多様な実施形態では、ＭＯＩ［２５］の、４−１ＢＢＬをコードするベクターと、ＭＯＩ［５］の、ＩＬ−２およびＩＬ−１２をコードする、１つまたは２つのベクターとを伴うベクター系を、医療環境において使用することができる。他の多様な実施形態では、ＭＯＩ［５０］の、４−１ＢＢＬをコードするベクターと、ＭＯＩ［５］の、ＩＬ−２およびＩＬ−１２をコードする、１つまたは２つのベクターとを伴うベクター系を、医療環境において使用することができる。さらなる多様な実施形態では、ＭＯＩ［１００］の、４−１ＢＢＬをコードするベクターと、ＭＯＩ［５］の、ＩＬ−２およびＩＬ−１２をコードする、１つまたは２つのベクターとを伴うベクター系を、医療環境において使用することができる。好ましくは、４−１ＢＢＬをコードするベクターに適用されるＭＯＩは、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を形質導入またはトランスフェクトされたがん細胞または免疫細胞のうちの少なくとも５％が、４−１ＢＢＬを発現していることを達成する。
【００３３】
上記で言及した医療環境は、これに限定せずに述べると、がんまたはウイルス感染の処置を包含する。好ましくは、医療環境は、がんの処置、より好ましくは、固形がんまたは充実性腫瘍の処置を意味する。
【００３４】
本開示の新規のベクター系は、４−１ＢＢＬ、ｓｃ−ＩＬ１２、およびＩＬ−２をコードする遺伝子（または遺伝子の核酸配列）を発現させることが可能である。したがって、より具体的には、本開示の新規のベクター系は、１または複数の発現ベクターを含む発現ベクター系、なおより具体的には、１または複数の組換え発現ベクターを含む組換え発現ベクター系である。多様な好ましい実施形態では、少なくとも、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含む、１または複数のベクターのベクター型は、ベクター系の全てのベクターについて同じである。ベクターは、典型的に、少なくとも、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を保有することが可能な種類のものである。したがって、ベクターは、少なくとも、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を取り込む能力を有する種類のものである。好ましくは、少なくとも、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含む、１または複数のベクターの各々は、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、好ましくは、ＭＶＡ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、および麻疹ウイルスベクターのうちのいずれか１つである。より好ましくは、少なくとも、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含む、１または複数のベクターの各々は、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、好ましくは、ＭＶＡ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである。さらにより好ましくは、少なくとも、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含む、１または複数のベクターの各々は、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはワクシニアウイルスベクター、好ましくは、ＭＶＡである。
【００３５】
本開示は、少なくとも、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含む、１または複数のベクターに基づく免疫刺激性ベクター系の文脈における、ＩＦＮ−γの発現と、４−１ＢＢＬレベルの上昇との関係を裏付ける。実施例１１に記載され、図１９に示される通り、Ｉｍ０２と、単一遺伝子発現ベクターの組合せとによる、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２のトランス遺伝子の発現、ならびにＩＦＮ−γ応答は、ＩＦＮ−γの発現が、４−１ＢＢＬレベルの上昇に依存することを明らかにする。図１９に示す通り、いずれもＭＯＩ［５］の、レベルを一定とするＩＬ−１２およびＩＬ−２の、ＭＯＩ［１００］まで漸増するレベルの４−１ＢＢＬとの組合せは、中程度のＩＬ−１２レベルで、ＩＦＮ−γの漸増する誘導をもたらす。本開示の重要な知見は、ＩＦＮ−γの最大の誘導、および関連する免疫の活性化を、ベクターＩｍ０２内で描示される、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列の特異的配置によるだけではなく、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現と比較して、上昇するかまたは高度な４−１ＢＢＬの発現をもたらす、代替的な実施形態によってもまた達成しうることである。したがって、本開示は、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含むベクターであって、ＩＬ−１２およびＩＬ−２を一定レベルとするときの、より高度な４−１ＢＢＬレベルまたは４−１ＢＢＬレベルの上昇の実現をもたらすベクターを提示する。より具体的には、本開示はまた、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含み、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇、またはこれと比較して高度な４−１ＢＢＬの発現レベルをもたらす、少なくとも１つの調節核酸配列をさらに含むベクターも提示する。この態様は、ベクターＩｍ０２は、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現と比較して高度な４−１ＢＢＬの発現をもたらすことが示されており、上記で論じた通り、いずれもＭＯＩ［５］の、レベルを一定とするＩＬ−１２およびＩＬ−２の、ＭＯＩ［１００］まで漸増するレベルの４−１ＢＢＬとの組合せが、中程度のＩＬ−１２レベルで、ＩＦＮ−γの漸増する誘導をもたらすという知見を反映する。
【００３６】
図３および１９は、本開示のベクターまたはベクター系により得られる４−１ＢＢＬの発現レベルが、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる４−１ＢＢＬの発現レベルと比較して上昇することを示す。したがって、好ましい実施形態では、４−１ＢＢＬの発現レベルは、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる４−１ＢＢＬの発現レベルと比較して上昇する。
【００３７】
図３および１９はまた、ｓｃＩＬ−１２の発現レベルが、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるｓｃＩＬ−１２の発現レベルと比較して低下することも示す。したがって、好ましい実施形態では、ｓｃＩＬ−１２の発現レベルは、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるｓｃＩＬ−１２の発現レベルと比較して低下する。
【００３８】
図３および１９はさらに、ＩＬ−２の発現レベルが、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるＩＬ−２の発現レベルと比較して上昇することも示す。したがって、好ましい実施形態では、ＩＬ−２の発現レベルは、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるＩＬ−２の発現レベルと比較して上昇する。
【００３９】
本開示は、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含み、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる４−１ＢＢＬの発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇、またはこれと比較して高度な４−１ＢＢＬの発現レベルをもたらす、少なくとも１つの調節核酸配列をさらに含むベクターを包含する。好ましくは、ｓｃＩＬ−１２の発現レベルは、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるｓｃＩＬ−１２の発現レベルと比較して低下し、かつ／またはＩＬ−２の発現レベルは、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるＩＬ−２の発現レベルと比較して上昇する。より具体的には、少なくとも１つの調節核酸配列は、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるｓｃＩＬ−１２の発現レベルと比較した、ｓｃＩＬ−１２の発現レベルの低下をもたらし、かつ／または少なくとも１つの調節核酸配列は、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるＩＬ−２の発現レベルと比較した、ＩＬ−２の発現レベルの上昇をもたらす。
【００４０】
ベクターＩｍ０１の発現構築物は、実施例１に描示されており、５’〜３’方向に、以下の順序：５’−ＣＭＶ−ｓｃＩＬ−１２−ＩＲＥＳ−４−１ＢＢＬ−ＩＲＥＳ−ＩＬ−２−ポリＡシグナル−３’で構成された、ＣＭＶプロモーター、２つのＩＲＥＳエレメント、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびポリＡシグナルを含む。
【００４１】
より具体的には、ベクターＩｍ０１の発現構築物は、国際公開第２００４／０３５７９９Ａ２号パンフレットの図１に示された、「Ａｄ−３」と称するベクターの発現構築物に対応する。ベクター「Ａｄ−３」の発現構築物は、参照により本開示に組み込まれる。国際公開第２００４／０３５７９９Ａ２号パンフレットの図１では、「Ａｄ−３」という呼称は、前記図１に示される、対応する発現構築物または発現カセットを保有する、完全なベクターを意味する。したがって、ベクター「Ａｄ−３」の発現構築物とは、国際公開第２００４／０３５７９９Ａ２号パンフレットの図１の基本線で描示された発現構築物を意味する。本開示では、ベクターＩｍ０１の発現構築物は、好ましくは、国際公開第２００４／０３５７９９Ａ２号パンフレットの図１において示される通りであり、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２をコードする核酸配列のヒトｃＤＮＡを含む、ベクター「Ａｄ−３」の発現構築物に対応する。したがって、本開示で言及される、ベクターＩｍ０１の発現構築物は、５’〜３’方向に、以下の順序：５’−ＣＭＶ−ヒトｓｃＩＬ−１２−ＰＶ−ＩＲＥＳ−ヒト４−１ＢＢＬ−ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ−ヒトＩＬ−２−ＳＶ−４０ポリＡ−３’で構成されたエレメントを含む。
【００４２】
本開示の多様な実施形態では、「ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる発現レベル」への言及は、「ベクターＩｍ０１により得られる発現レベル」を意味する。ベクターＩｍ０１は、アデノウイルスベクターである。したがって、本開示の多様な実施形態では、「ベクターＩｍ０１により得られる発現レベル」への言及は、国際公開第２００４／０３５７９９Ａ２号パンフレットの図１において示される、ベクター「Ａｄ−３」の発現構築物であって、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２をコードする核酸配列のヒトｃＤＮＡを伴う発現構築物を含むアデノウイルスベクターを含む。より具体的には、「ベクターＩｍ０１により得られる発現レベル」への言及は、５’〜３’方向に、以下の順序：５’−ＣＭＶ−ヒトｓｃＩＬ−１２−ＰＶ−ＩＲＥＳ−ヒト４−１ＢＢＬ−ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ−ヒトＩＬ−２−ＳＶ−４０ポリＡ−３’で構成されたエレメントを含むアデノウイルスベクターにより得られる発現レベルを意味する。したがって、好ましい実施形態では、「ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる発現レベル」への言及は、図２０に示される、「ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる発現レベル」を意味する。したがって、図２０を参照すると、ベクターＩｍ０１とは、シャトルベクターである、ｈｕ  ｐＥ１．１  Ｉｍ０１を意味する。図２０に示される、ベクターＩｍ０１の発現構築物は、ＣＭＶプロモーター、ヒトｓｃＩＬ−１２、ＰＶ  ＩＲＥＳ、ヒト４−１ＢＢＬ、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ−２、およびＳＶ４０ポリＡを包含する。図２０に描示されるシャトルベクターである、ｈｕ  ｐＥ１．１  Ｉｍ０１のヌクレオチド配列は、合計７，８４５ｂｐを有する。ＣＭＶプロモーター、ヒトｓｃＩＬ−１２、ＰＶ  ＩＲＥＳ、ヒト４−１ＢＢＬ、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ−２、およびＳＶ４０ポリＡのヌクレオチド配列は、図２に描示されるシャトルベクターであるｈｕ  ｐＥ１．１  Ｉｍ０２のヌクレオチド配列を示す、配列番号１１（図１７）のヌクレオチド配列内で同定することができる。シャトルベクターである、ｈｕ  ｐＥ１．１  Ｉｍ０１の、ＣＭＶプロモーター、ヒトｓｃＩＬ−１２、ＰＶ  ＩＲＥＳ、ヒト４−１ＢＢＬ、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ−２、およびＳＶ４０ポリＡのヌクレオチド配列は、シャトルベクターであるｈｕ  ｐＥ１．１  Ｉｍ０２の、ＣＭＶプロモーター、ヒト４−１ＢＢＬ、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ−２、ＰＶ  ＩＲＥＳ、ヒトｓｃＩＬ−１２、およびＳＶ４０ポリＡの、それぞれのヌクレオチド配列に対応する。
【００４３】
多様な好ましい実施形態では、「ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる発現レベル」への言及は、例えば、アデノウイルスのベクターＤＮＡを保有するプラスミドまたはベクターへとクローニングまたはサブクローニングされた、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる発現レベルを意味する。より好ましくは、「ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる発現レベル」への言及は、アデノウイルスベクターへとクローニングまたはサブクローニングされた、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる発現レベルを意味する。
【００４４】
多様な実施形態では、ベクター型は、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含むベクターと、ベクターＩｍ０１の発現構築物を含むベクターとについて同じである。ベクターは、典型的に、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を保有することが可能な種類のものである。したがって、ベクターは、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を取り込む能力を有する種類のものである。好ましくは、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含む、１または複数のベクターの各々は、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、好ましくは、ＭＶＡ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、および麻疹ウイルスベクターのうちのいずれか１つである。より好ましくは、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含む、１または複数のベクターの各々は、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、好ましくは、ＭＶＡ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである。さらにより好ましくは、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含む、１または複数のベクターの各々は、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはワクシニアウイルスベクター、好ましくは、ＭＶＡである。
【００４５】
本開示の多様な実施形態では、「ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる発現レベル」への言及または「ベクターＩｍ０１により得られる発現レベル」は、ベクター（すなわち、本開示のベクターもしくはベクター系、またはベクターＩｍ０１、もしくはベクターＩｍ０１の発現構築物を含むベクター、好ましくは、アデノウイルスベクター）を形質導入される腫瘍細胞株、好ましくは、ヒトＡ５４９細胞と、標的細胞としてのヒト血中免疫細胞の、その後のオーバーレイとを含む、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系の適用により得られる発現レベルを意味する。
【００４６】
したがって、本開示は、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含み、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇をもたらす、少なくとも１つの調節核酸配列をさらに含み、発現レベルが、ベクター、好ましくは、ベクターＩｍ０１の発現構築物を含むアデノウイルスベクターを形質導入された腫瘍細胞株、好ましくは、ヒトＡ５４９細胞株と、ヒト血中免疫細胞、好ましくは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系（または発現アッセイ）で決定されるベクターを提示する。
【００４７】
本開示では、発現レベル、またはトランス遺伝子の発現レベルおよび発現率、またはトランス遺伝子の発現率という用語を、互換的に使用することができる。
【００４８】
本開示のベクターまたはベクター系によりもたらされる、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２の発現レベルは、トランス遺伝子特異的、すなわち、本開示のベクターまたはベクター系によりもたらされる、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２の発現レベルに特異的な免疫応答を誘導する。本開示のベクターまたはベクター系によりもたらされる発現レベルは、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇に特に特異的な免疫応答を誘導する。好ましくは、本開示のベクターまたはベクター系によりもたらされる、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２の発現レベルは、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇に特に特異的な免疫応答を誘導し、この場合、４−１ＢＢＬの発現レベルが、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる４−１ＢＢＬの発現レベルと比較して上昇している。より好ましくは、本開示のベクターまたはベクター系によりもたらされる、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２の発現レベルは、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇に特に特異的な免疫応答を誘導し、この場合、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるｓｃＩＬ−１２および／またはＩＬ−２の発現レベルと比較して、ｓｃＩＬ−１２の発現レベルが低下し、かつ／またはＩＬ−２の発現レベルが上昇している。さらにより好ましくは、本開示のベクターまたはベクター系によりもたらされる、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２の発現レベルは、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇に特に特異的な免疫応答を誘導し、この場合、４−１ＢＢＬの発現レベルが、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる４−１ＢＢＬの発現レベルと比較して上昇し、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるｓｃＩＬ−１２および／またはＩＬ−２の発現レベルと比較して、ｓｃＩＬ−１２の発現レベルが低下し、かつ／またはＩＬ−２の発現レベルが上昇している。
【００４９】
トランス遺伝子特異的免疫応答とは、好ましくは、トランス遺伝子特異的ＩＦＮ−γ応答、またはＩＦＮ−γの、トランス遺伝子特異的な発現もしくは産生を意味する。ＩＦＮ−γレベルを含むサイトカインレベルは、ＥＬＩＳＡにより、常套的にアッセイすることができる。
【００５０】
好ましい実施形態では、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２の発現レベルにより誘導される、トランス遺伝子特異的免疫応答を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、好ましくは、ＥＬＩＳＡにより検出または決定する。
【００５１】
本開示の多様な実施形態では、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列を、１つのベクターにより、２つの個別の調節核酸配列から発現させるが、この場合、１つの調節核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列の上流に配置し、他の調節核酸配列を、ＩＬ−２およびｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列を含む発現カセットの上流に配置する。好ましくは、前記発現カセットは、ＩＬ−２およびｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列を、５’〜３’方向に、５’−ＩＬ−２−ｓｃＩＬ−１２−３’の順序で含む。本開示に従い、２つの調節核酸配列は、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇、もしくはこれと比較して高度な４−１ＢＢＬの発現レベルをもたらし、かつ／または、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる４−１ＢＢＬの発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇、またはこれと比較して高度な４−１ＢＢＬの発現レベルをもたらす。好ましくは、２つの調節核酸配列はまた、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるｓｃＩＬ−１２の発現レベルと比較した、ｓｃＩＬ−１２の発現レベルの低下、および／またはベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるＩＬ−２の発現レベルと比較した、ＩＬ−２の発現レベルの上昇ももたらすか、またはさらに、これらももたらす。好ましくは、調節核酸配列は、プロモーター配列である。
【００５２】
本開示の多様な実施形態では、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列を、１つのベクターにより、３つの個別の調節核酸配列から発現させるが、この場合、１つの調節核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列の上流に配置し、１つの調節核酸配列を、ＩＬ−２をコードする核酸配列の上流に配置し、１つの調節核酸配列を、ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列の上流に配置する。本開示に従い、３つの調節核酸配列は、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇、もしくはこれと比較して高度な４−１ＢＢＬの発現レベルをもたらし、かつ／または、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られる４−１ＢＢＬの発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇、またはこれと比較して高度な４−１ＢＢＬの発現レベルをもたらす。好ましくは、３つの調節核酸配列はまた、ベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるｓｃＩＬ−１２の発現レベルと比較した、ｓｃＩＬ−１２の発現レベルの低下、および／またはベクターＩｍ０１の発現構築物により得られるＩＬ−２の発現レベルと比較した、ＩＬ−２の発現レベルの上昇ももたらすか、またはさらに、これらももたらす。好ましくは、調節核酸配列は、プロモーター配列である。
【００５３】
本明細書で記載される通り、調節核酸配列とは、好ましくは、プロモーター（配列）または、より具体的には、発現プロモーター配列を意味する。意図される上昇したまたは高い、４−１ＢＢＬの発現レベルのために使用されうる強力なプロモーターは、それらに限定せずに述べると、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファ（ＥＦ１Ａ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）のうちのいずれか１つを含む。ＣＭＶは、特に好ましいプロモーターである。これらのプロモーターは、本開示の多様な実施形態で使用することができ、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルと比較した、４−１ＢＢＬの発現レベルの上昇をもたらしうる、好ましいプロモーターを表す。これは特に、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２をコードする３つの核酸配列を、トリシストロニックのカセット内に、５’〜３’方向に、１、２、３の順序で、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列を、ＩＬ−２およびｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列の上流に配置して構成する実施形態であって、好ましくは、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２をコードする３つの核酸配列を、５’〜３’へと、以下の順序：５’−４−１ＢＢＬ−ＩＬ−２−ｓｃＩＬ−１２−３’で構成する実施形態に当てはまる。
【００５４】
ＩＬ−２および／またはＩＬ−１２の、意図される発現のために使用されうるプロモーターは、それらに限定せずに述べると、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびユビキチンＣ（ＵＢＣ）を含む。これらのプロモーターは、本開示の多様な実施形態で使用することができ、意図されるＩＬ−２およびＩＬ−１２の発現レベルをもたらしうる、好ましいプロモーターを表す。特に、これらのプロモーターを、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列を、１つのベクターにより、２つの個別の調節核酸配列から発現させるが、この場合、１つの調節核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列の上流に配置し、他の調節核酸配列を、ＩＬ−２およびｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列を含む発現カセットの上流に配置する実施形態において使用することができる。これらのプロモーターはさらに、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列を、１つのベクターにより、３つの個別の調節核酸配列から発現させるが、この場合、１つの調節核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列の上流に配置し、１つの調節核酸配列を、ＩＬ−２をコードする核酸配列の上流に配置し、１つの調節核酸配列を、ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列の上流に配置する実施形態においても使用することができる。
【００５５】
多様な実施形態では、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を含むベクターの、少なくとも１つの調節核酸配列は、ベクターＩｍ０２により得られるのと同じ発現レベルまたは発現比の、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をもたらす。
【００５６】
本開示の新規のベクター／ベクター系の、１または複数のベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、ナノ粒子ベクター、およびネイキッドＤＮＡのうちのいずれか、またはこれらの組合せでありうる。
【００５７】
本開示の多様な実施形態では、新規のベクター／ベクター系の、１または複数のベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、生ベクターの場合もあり、弱毒化ベクターの場合もあり、複製条件化ベクターの場合もあり、複製欠損（deficient）ベクターの場合もあり、また、非病原性（欠損（defective））ウイルスベクターの場合もあり、複製コンピテントウイルスベクターの場合もある。
【００５８】
本開示のある特定の実施形態では、本開示の新規のベクター／ベクター系のうちの、１または複数のベクターは、レトロウイルスベクターのゲノム、レンチウイルスベクターのゲノム、ポックスウイルスベクターのゲノム、ワクシニアウイルスベクターのゲノム、アデノウイルスベクターのゲノム、アデノ随伴ウイルスベクターのゲノム、ヘルペスウイルスベクターのゲノム、アルファウイルスベクターのゲノム、プラスミドＤＮＡ、およびプラスミドＲＮＡから選択される。
【００５９】
ウイルスベクターの安全性特徴、例えば、組込み（integration）の欠損性を組み込む（incorporated）ことが所望される。ある特定の実施形態では、組込み（integration）の欠損性は、ベクターゲノムのエレメントにより付与される場合もあり、また、パッケージング系（例えば、ベクターゲノムの一部でありうるが、トランスで供給される、非機能的なインテグラーゼタンパク質）のエレメントに由来する場合もある。
【００６０】
多様な実施形態では、本開示の新規のベクター／ベクター系のうちの、１または複数のベクターは、複製性ベクターである。好ましくは、複製性ベクターは、複製型ウイルスベクター、より好ましくは、複製型アデノウイルスベクターである。他の多様な実施形態では、本開示の新規のベクター／ベクター系のうちの、１または複数のベクターは、非複製性ベクター、好ましくは、非複製コンピテントウイルスベクター、より好ましくは、非複製コンピテントアデノウイルスベクターである。
【００６１】
本開示の新規のベクター／ベクター系のうちの、１または複数のベクターが、ＲＮＡベクターである場合、これらは、挿入された修飾リボヌクレオチドを含みうる。
【００６２】
本開示の例示的なウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。好ましくは、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。
【００６３】
ある特定の実施形態では、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターを、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、およびＩＬ−２の、３つの遺伝子を発現させるために使用することができる。いくつかのアデノウイルスベクター系と、ベクターを投与するための方法とについては記載されている（例えば、Mercier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101 :6188-93を参照されたい）。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、エコトロピックレトロウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組合せに基づくベクターを含みうる。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本開示の新規のベクター／ベクター系のうちの、１または複数のベクターは、レトロウイルスベクター、好ましくは、レンチウイルスベクターである。ヒト遺伝子治療に適するゲノムベースのレンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に基づくベクターを含む。
【００６５】
多様な実施形態では、ベクターは、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡである。本明細書で記載される、少なくとも、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする、１または複数のポリヌクレオチドを含有するプラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡは、当技術分野で周知の標準的な技法を使用して、たやすく構築される。ベクターは、典型的に、プラスミド形態で構築することができ、次いで、パッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株へとトランスフェクトすることができる。プラスミドは一般に、細菌内のプラスミドの複製に有用な配列を含む。当技術分野では、このようなプラスミドが周知である。加えて、原核生物の複製起点を含むベクターはまた、その発現が、薬物耐性など、検出用マーカーまたは選択用マーカーを付与する遺伝子も含みうる。
【００６６】
一実施形態では、少なくとも、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードするポリヌクレオチド配列であって、感染性疾患環境またはがん環境において、免疫応答を誘導するポリヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクターが提供される。４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２の発現を導くために、各ベクター内のコードポリヌクレオチド配列は、コードポリヌクレオチド配列に作動的に連結された、少なくとも１つの適切な発現制御配列（また、調節発現配列または調節発現特徴とも呼ばれる）を含むべきである。当技術分野では、コードされるポリペプチドの発現を調節するために使用されうる発現制御エレメントが公知であり、誘導可能なプロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、リーダー、および他の調節配列を含むがこれらに限定されない。
【００６７】
本明細書で記載される通り、発現ベクターは、少なくとも１つの調節発現配列（発現制御配列）を含みうる。ある特定の実施形態では、発現ベクターが、ウイルスベクターのゲノムを含む場合、特定の標的細胞内では、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２の発現が所望される。典型的に、例えば、ウイルスベクター内では、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２をコードするポリヌクレオチド配列を、５’ＬＴＲ配列と、３’ＬＴＲ配列との間に配置する。さらに、コードヌクレオチド配列を、好ましくは、他の遺伝子配列もしくは遺伝子特徴、または調節配列もしくは調節特徴、例えば、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする遺伝子の発現を、特定の方式で調節する、プロモーターまたはエンハンサーを含む転写調節配列と機能的な関係で、作動的に連結する。ウイルスベクター構築物に関して、「内部」プロモーター／エンハンサーとは、ウイルスベクター内の５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に配置され、目的のコードポリヌクレオチド配列へと作動的に連結されたプロモーター／エンハンサーである。内部プロモーター／エンハンサーは、それが機能的関係にある遺伝子の発現を増大させることが公知である、任意のプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーの組合せでありうる。「機能的関係」および「作動的に連結された」とは、限定せずに述べると、プロモーターおよび／またはエンハンサーを、適切な分子と接触させると、目的の配列が、発現するように、配列が、プロモーターおよび／またはエンハンサーに照らして、適正な位置および方向にあることを意味する。ある特定の場合には、有用な転写調節配列とは、活性に関して、時間および空間の両面において、高度に調節された転写調節配列である。内部プロモーター／エンハンサーの選出は、３つの遺伝子である、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２の所望の発現パターン、ならびに公知のプロモーター／エンハンサーの特異的特性に基づく。したがって、内部プロモーターは、構成的に活性でありうる。使用されうる構成的プロモーターの非限定的例は、ＣＭＶプロモーターを含む。本開示の多様な実施形態では、新規のベクター／ベクター系は、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２と比較して、高度な４−１ＢＢＬの発現をもたらす、内部プロモーター／エンハンサーを含む。ウイルスゲノム内および哺乳動物ゲノム内の多くのエンハンサーが同定され、特徴づけられている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋなど、一般に利用可能なデータベースを参照されたい）。
【００６８】
エンハンサーは、典型的に、通例、約１０〜３００ｂｐの長さである、ＤＮＡのシス作用型エレメントであって、プロモーターに対して、その転写を増大させるように作用するエレメントである。今日では、哺乳動物遺伝子および真核細胞ウイルスに由来する、多くのエンハンサー配列が公知である。例は、複製起点の後期側（ｂｐ：１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。エンハンサーは、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列に対する５’位または３’位において、ベクターへとスプライシングしうるが、好ましくは、プロモーターから５’側の部位に配置される。エンハンサーは、異種プロモーターと組み合わせて使用することができる。当業者は、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２の、所望される発現パターンに基づき、適切なエンハンサーを選択することが可能であろう。
【００６９】
多様な実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターでありうる。一部の実施形態では、プロモーターは、標的細胞特異的プロモーターである。加えて、プロモーターは、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２の誘導可能な発現を可能とするように選択することができる。当技術分野では、誘導可能な発現のための多数の系であって、テトラサイクリン応答系、ｌａｃオペレーター−リプレッサー系のほか、熱ショック、金属イオン、インターフェロン、低酸素状態、ステロイド、および放射線を含む、様々な環境的変化または生理学的変化に対して応答性であるプロモーターを含む系が公知である。プロモーターの組合せはまた、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子の各々の所望の発現を得るのにも使用することができる。当業者は、目的の生物または標的組織または標的細胞における、ポリヌクレオチド配列の所望の発現パターンに基づき、プロモーターを選択することが可能であろう。
【００７０】
本明細書で記載される通り、ウイルスベクターのゲノムを含む発現ベクターは、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ応答性プロモーターを含みうる。このプロモーターは、少なくとも４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２をコードするポリヌクレオチド配列に作動的に連結することができ、また、終結配列へも連結することができる。加えて、１つを超えるＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩプロモーターも組み込むことができる。当業者には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩプロモーターが周知である。
【００７１】
細胞媒介性免疫応答を誘導するために、ウイルスベクターのゲノムを含む組換え発現ベクターの送達を、特定の標的細胞または標的組織へとターゲティングする場合、ベクターゲノムは通例、標的細胞または標的組織により認識され、目的の配列に作動的に連結されたプロモーター、ウイルスの構成要素（ベクターが、ウイルスベクターである場合）、および本明細書で論じられる他の配列を含有するであろう。
【００７２】
プロモーターは、誘導可能なプロモーターの場合もあり、構成的プロモーターの場合もあり、時間活性プロモーターの場合もあり、組織特異的プロモーターの場合もある。誘導可能なプロモーターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を、例えば、特定の組織内でオンまたはオフにしうるため、遺伝子操作における有用なツールである。誘導可能なプロモーターは、化学的調節プロモーターおよび物理的調節プロモーターとして群分けすることができる。典型的な化学的調節プロモーターは、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体（ＧＲ）ベースのプロモーター、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）ベースのプロモーター）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子ベースのプロモーター）、および病理機序関連プロモーター（例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis）属およびトウモロコシの病原体関連（ＰＲ）タンパク質ベースのプロモーター）を含むがこれらに限定されない。典型的な物理的調節プロモーターは、温度調節プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）および光調節プロモーター（例えば、ダイズＳＳＵプロモーター）を含むがこれらに限定されない。当業者には、他の例示的なプロモーターが周知である。
【００７３】
多様な実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）を使用することができる。ポリヌクレオチドの発現を達成することが、当技術分野で周知である、他のウイルス細胞または哺乳動物細胞または細菌ファージのプロモーターの使用もまた想定される。当業者は、特異的状況に基づき、適切なプロモーターを選択することが可能であろう。当技術分野では、プロモーターを、発現させるポリヌクレオチド配列に作動的に連結するための方法と同様、多くの異なるプロモーターも記載されている。パッケージング細胞および標的細胞または標的組織における発現を導くのに、天然プロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用することができる。異種プロモーターは典型的に、それらが一般に、天然プロモーターと比較して、所望のタンパク質の転写の増大および高収量を可能とするために使用される。プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得ることができる。プロモーターはまた、このようなプロモーターが、標的細胞または標的組織と適合性であることを条件として、例えば、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、または通常天然配列と関連するプロモーターでもありうる。一実施形態では、プロモーターは、ウイルス発現系内の、天然におけるウイルスプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、腫瘍細胞特異的プロモーターである。
【００７４】
発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有しうる。これらの配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの、５’側の非翻訳領域内でしばしば見出され、場合によって、３’側の非翻訳領域内で見出され、当技術分野でも周知である。
【００７５】
本開示の新規のベクター／ベクター系はさらに、発がん性ウイルス（例えば、ＥＢＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ、およびＫＳＨＶ）および腫瘍関連抗原に由来する免疫原を含むがこれらに限定されない、１または複数の免疫原もコードしうる。好ましくは、腫瘍関連抗原は、膀胱がん、肝臓がん、メルケル細胞癌、腎細胞癌、前立腺がん、中皮腫、膵臓がん、黒色腫、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、卵巣がんに由来する腫瘍関連抗原である。より好ましくは、腫瘍関連抗原は、膀胱がんに由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ−Ｍｙｃ、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＣＴ７、ＣＴ１０、ＧＡＧＥ、ＩＭＰ３、ＢＫ  Ｔ抗原、ＭＡＲＴ−１、ＤＡＭ−６、ＮＡ８８−Ａ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＴＲＫ受容体、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＲＡＧＥ、７０７−ＡＰ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達因子１（ＴＡＣＳＴＤ１）、ＴＡＣＳＴＤ２、受容体チロシンキナーゼ、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、細胞質チロシンキナーゼ、ｓｒｃ−ファミリー、核因子カッパＢ（ＮＦ−κΒ）、Ｎｏｔｃｈ受容体、ｃ−Ｍｅｔ、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、ＰＭＳＡ、ＰＲ−３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞癌５Ｔ４、ＳＭ２２アルファ、ＳＴＥＡＤ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐＣＡＭ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＢＯＲＩＳ、精子タンパク質１７、ＳＳＸ２、Ｂ７Ｈ３、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、およびｆｏｓ関連抗原１のうちのいずれか１つである。別の実施形態では、本明細書では、腫瘍関連抗原を、膀胱がん抗原から選択する方法が提示される。一実施形態では、膀胱がん抗原は、ＣＴＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＣＴ７、ＣＴ１０、ＧＡＧＥ、ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、ＳＡＧＥ、ＨＡＧＥ、ＭＰＨＯＳＰＨ１、ＤＥＰＤＣＩ、ＩＭＰ３およびＭＡＧＥ−Ａ、ならびにＢＫ  Ｔ−抗原のうちのいずれか１つである。
【００７６】
発現ベクターが、ウイルスベクターのゲノムである場合、ウイルスベクターのゲノムは典型的に、ウイルスベクターのゲノム構築物を作製するための、パッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株へとトランスフェクトされうる、プラスミド形態で構築することができる。プラスミドは一般に、細菌内のプラスミドの複製に有用な配列を含む。当技術分野では、このようなプラスミドが周知である。加えて、原核生物の複製起点を含むベクターはまた、その発現が、薬物耐性など、検出用マーカーまたは選択用マーカーを付与する遺伝子も含みうる。当業者が理解する通り、特定の宿主内のその発現を増強するように、コード配列を修飾することが有利でありうる。遺伝子コードは、６４の可能なコドンを伴い、冗長であるが、大半の生物は、これらのコドンのサブセットを優先的に使用する。種において最もしばしば用いられるコドンは、最適コドンと呼ばれ、それほどしばしば用いられないコドンは、希少コドンまたは低使用度コドンと分類される。コドンは、宿主の好ましいコドン使用を反映するように置換することができ、過程は、場合によって、「コドン最適化」または「種についてコドンバイアスを制御すること」とも呼ばれる。特定の原核宿主または真核宿主に好ましいコドンを含有する、最適化コード配列を調製して、例えば翻訳の速度を増大させることもでき、非最適化配列から作製された転写物と比較した、半減期の延長など、所望の特性を有する組換えＲＮＡ転写物を作製することもできる。多様な実施形態では、少なくとも４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２をコードする核酸配列を、ヒトにおける発現のためにコドン最適化する。本開示の好ましい実施形態では、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列は、ヒトｃＤＮＡ（４−１ＢＢＬのヒト遺伝子）であり、ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列は、ヒトｃＤＮＡ（ｓｃＩＬ−１２のヒト遺伝子）であり、かつ／またはＩＬ−２をコードする核酸配列は、ヒトｃＤＮＡ（ヒトＩＬ−２の遺伝子）である。
【００７７】
多様な実施形態では、本開示の新規のベクター／ベクター系の核酸配列は、ｃＤＮＡ配列である。本開示の新規のベクター／ベクター系内に含有される、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２の遺伝子の核酸配列は、異種核酸配列と考えることができる。本明細書では、核酸配列およびポリヌクレオチドという用語を互換的に使用することができる。本明細書で記載される「核酸配列」という用語は、一本鎖核酸配列および二本鎖核酸配列の両方を包含しうる。多様な実施形態では、核酸配列は、ＤＮＡ配列である。
【００７８】
多様な実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクターである。多様な実施形態では、ベクターは、ＲＮＡベクターである。本開示の新規のベクターは、より具体的には、環状ベクター、なおより具体的には、環状発現ベクターとして記載することができる。本明細書で記載される「ベクター」という用語は、一本鎖ＤＮＡベクターおよび二本鎖ＤＮＡベクターを含むがこれらに限定されない、一本鎖ベクターおよび二本鎖ベクターの両方を包含しうる。
【００７９】
本明細書で記載される通り、４−１ＢＢＬをコードする遺伝子の核酸配列は、核酸配列をコードする、４−１ＢＢＬの変異体、特に、配列番号２（図１３）に示されるアミノ酸配列を有する、４−１ＢＢＬの変異体を包含する。このような変異体の配列については、本明細書の下記で、さらに詳細に記載する。同様に、ＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列は、核酸配列をコードする、ＩＬ−２の変異体、特に、配列番号４（図１４）に示されるアミノ酸配列を有する、ＩＬ−２の変異体を包含する。このような変異体の配列については、本明細書の下記で、さらに詳細に記載する。ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子の核酸配列もまた、核酸配列をコードする、ｓｃＩＬ−１２の変異体、特に、配列番号６（図１５）に示されるアミノ酸配列を有する、ｓｃＩＬ−１２の変異体を包含する。このような変異体の配列については、本明細書の下記で、さらに詳細に記載する。
【００８０】
本開示の多様な実施形態では、（ｉ）４−１ＢＢＬをコードする（遺伝子の）核酸配列は、配列番号１の核酸配列を含み、この核酸配列はヒトにおける発現についてコドンを最適化されており、（ｉｉ）ＩＬ−２をコードする（遺伝子の）核酸配列は、配列番号３の核酸配列を含み、この核酸配列はヒトにおける発現についてコドンを最適化されており、かつ／または（ｉｉｉ）ｓｃＩＬ−１２をコードする（遺伝子の）核酸配列は、配列番号５の核酸配列を含み、この核酸配列はヒトにおける発現についてコドンを最適化されている。４−１ＢＢは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。ＣＤ１３７は、ＣＤ表記法に従う４−１ＢＢの呼称である。本開示では、ＣＤ１３７および４−１ＢＢという用語は、互換的に使用することができる。したがって、本開示では、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）およびＣＤ１３７リガンドという用語もまた、互換的に使用することができる。本開示の多様な実施形態では、４−１ＢＢＬ（またはＣＤ１３７リガンド）をコードする核酸配列は、配列番号１（図１３）の核酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列は、活性化Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ４＋ヘルパー細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に特異的に結合することが可能な、４−１ＢＢＬタンパク質をコードする。好ましくは、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列は、配列番号１（図１３）の核酸配列に対する、少なくとも８０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列は、活性化Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ４＋ヘルパー細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に特異的に結合することが可能な、４−１ＢＢＬタンパク質をコードする。より好ましくは、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列は、配列番号１（図１３）の核酸配列に対する、少なくとも９０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列は、活性化Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ４＋ヘルパー細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に特異的に結合することが可能な、４−１ＢＢＬタンパク質をコードする。なおより好ましくは、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列は、配列番号１（図１３）の核酸配列に対する、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列は、活性化Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ４＋ヘルパー細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に特異的に結合することが可能な、４−１ＢＢＬタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、上記の４−１ＢＢＬの変異体は、配列番号１（図１３）の配列によりコードされる天然４−１ＢＢＬと同じ、Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ４＋ヘルパー細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に対する結合特異性を呈する。特に好ましい実施形態では、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列は、配列番号１（図１３）の配列を含む（またはこれからなる）。多様な好ましい実施形態では、本明細書で記載される、ヒト４−１ＢＢＬの核酸配列の変異体配列は、マウス４−１ＢＢＬをコードするヌクレオチド配列ではない。したがって、多様な好ましい実施形態では、本開示の新規のベクター／ベクター系は、マウス由来の４−１ＢＢＬをコードする核酸配列を含まない。
【００８１】
本開示の多様な実施形態では、ＩＬ−２をコードする核酸配列は、配列番号３（図１４）の核酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする。好ましくは、ＩＬ−２をコードする核酸配列は、配列番号３（図１４）の核酸配列に対する、少なくとも８０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする。より好ましくは、ＩＬ−２をコードする核酸配列は、配列番号３（図１４）の核酸配列に対する、少なくとも９０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする。なおより好ましくは、ＩＬ−２をコードする核酸配列は、配列番号３（図１４）の核酸配列に対する、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、上記で記載したＩＬ−２の変異体は、配列番号３（図１４）の配列によりコードされる天然ＩＬ−２と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を呈する。特に好ましい実施形態では、ＩＬ−２をコードする核酸配列は、配列番号３（図１４）の配列を含む（またはこれからなる）。多様な好ましい実施形態では、本明細書で記載される、ヒトＩＬ−２の核酸配列の変異体配列は、マウスＩＬ−２をコードするヌクレオチド配列ではない。したがって、多様な好ましい実施形態では、本開示の新規のベクター／ベクター系は、マウス由来のＩＬ−２をコードする核酸配列を含まない。
【００８２】
本開示の多様な実施形態では、ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列は、配列番号５（図１５）の核酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有するｓｃＩＬ−１２タンパク質をコードする。好ましくは、ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列は、配列番号５（図１５）の核酸配列に対する、少なくとも８０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有するｓｃＩＬ−１２タンパク質をコードする。より好ましくは、ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列は、配列番号５（図１５）の核酸配列に対する、少なくとも９０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有するｓｃＩＬ−１２タンパク質をコードする。なおより好ましくは、ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列は、配列番号５（図１５）の核酸配列に対する、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有するｓｃＩＬ−１２タンパク質をコードする。本明細書で記載される通り、タンパク質は、それが、天然ＩＬ−１２タンパク質の２つのサブユニットを、融合タンパク質として含むアミノ酸配列を含む場合、ｓｃＩＬ−１２タンパク質と考えられる。配列番号５（図１５）の配列は、リンカーにより連結された、ヒトＩＬ−１２の、４０ｋＤａのサブユニットと３５ｋＤａサブユニットとをコードする遺伝子の配列を示す。図１５に描示される配列番号５のヌクレオチド配列内では、リンカー配列を、太字で示す。ある特定の実施形態では、上記で記載したｓｃＩＬ−１２の変異体は、配列番号５（図１５）の配列によりコードされる天然ｓｃＩＬ−１２と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を呈する。特に好ましい実施形態では、ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列は、配列番号５（図１５）の配列を含む（またはこれからなる）。多様な好ましい実施形態では、本明細書で記載される、ヒトｓｃＩＬ−１２の核酸配列の変異体配列は、マウスｓｃＩＬ−１２をコードするヌクレオチド配列ではない。したがって、多様な好ましい実施形態では、本開示の新規のベクター／ベクター系は、マウス由来のｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列を含まない。
【００８３】
本開示の多様な実施形態では、４−１ＢＢＬ（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号２（図１３）のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬポリペプチドをコードし、この場合、４−１ＢＢＬポリペプチドは、活性化Ｔ細胞、好ましくは、活性化したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に特異的に結合することが可能である。好ましくは、４−１ＢＢＬ（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号２（図１３）のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬポリペプチドをコードし、この場合、４−１ＢＢＬポリペプチドは、Ｔ細胞、好ましくは、活性化したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に特異的に結合することが可能である。より好ましくは、４−１ＢＢＬ（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号２（図１３）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬポリペプチドをコードし、この場合、４−１ＢＢＬポリペプチドは、活性化Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に特異的に結合することが可能である。なおより好ましくは、４−１ＢＢＬ（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号２（図１３）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬポリペプチドをコードし、この場合、４−１ＢＢＬポリペプチドは、活性化Ｔ細胞、好ましくは、活性化したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に特異的に結合することが可能である。ある特定の実施形態では、上記で記載した、４−１ＢＢＬ（の遺伝子）の変異体の核酸配列は、配列番号２（図１３）のアミノ酸配列を有する、天然の４−１ＢＢＬと同じ、Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に対する結合特異性を呈する、４−１ＢＢＬポリペプチドをコードする。好ましい実施形態では、４−１ＢＢＬ（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号２（図１３）のアミノ酸配列を含む（またはこれからなる）ポリペプチドをコードする。
【００８４】
本開示の多様な実施形態では、ＩＬ−２（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号４（図１４）のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ−２ポリペプチドをコードし、この場合、ＩＬ−２ポリペプチドは、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。好ましくは、ＩＬ−２（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号４（図１４）のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ−２ポリペプチドをコードし、この場合、ＩＬ−２ポリペプチドは、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。より好ましくは、ＩＬ−２（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号４（図１４）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ−２ポリペプチドをコードし、この場合、ＩＬ−２ポリペプチドは、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。なおより好ましくは、ＩＬ−２（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号４（図１４）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ−２ポリペプチドをコードし、この場合、ＩＬ−２ポリペプチドは、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。ある特定の実施形態では、上記で記載した、ＩＬ−２の変異体の核酸配列は、配列番号４（図１４）のアミノ酸配列を有する、天然のＩＬ−２と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を呈する、ＩＬ−２ポリペプチドをコードする。好ましい実施形態では、ＩＬ−２（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号４（図１４）のアミノ酸配列を含む（またはこれからなる）ポリペプチドをコードする。
【００８５】
本開示の多様な実施形態では、ｓｃＩＬ−１２（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号６（図１５）のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードし、この場合、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドは、免疫刺激活性、好ましくは、単球、ヘルパーＴ細胞、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。好ましくは、ｓｃＩＬ−１２（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号６（図１５）のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードし、この場合、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドは、免疫刺激活性、好ましくは、単球、ヘルパーＴ細胞、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。より好ましくは、ｓｃＩＬ−１２（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号６（図１５）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードし、この場合、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドは、免疫刺激活性、好ましくは、単球、ヘルパーＴ細胞、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。なおより好ましくは、ｓｃＩＬ−１２（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号６（図１５）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードし、この場合、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドは、免疫刺激活性、好ましくは、単球、ヘルパーＴ細胞、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。ある特定の実施形態では、上記で記載した、ｓｃＩＬ−１２の変異体の核酸配列は、配列番号６（図１５）のアミノ酸配列を有する、天然のｓｃＩＬ−１２と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を呈する、ｓｃＩＬ−１２ポリペプチドをコードする。好ましい実施形態では、ｓｃＩＬ−１２（の遺伝子）の核酸配列は、配列番号６（図１５）のアミノ酸配列を含む（またはこれからなる）ポリペプチドをコードする。
【００８６】
本明細書で記載される通り、１または複数のポリシストロニックまたはマルチシストロニックの発現単位であって、２つまたは３つ全てのタンパク質をコードする、２つまたは３つのポリヌクレオチド配列、すなわち、各々が、少なくとも（ｉ）４−１ＢＢＬもしくはｓｃＩＬ−１２、または（ｉｉ）４−１ＢＢＬもしくはＩＬ−２、または（ｉｉｉ）ｓｃＩＬ−１２もしくはＩＬ−２をコードする、２つのポリヌクレオチド配列；あるいは各々が、少なくとも４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、または４−１ＢＢＬのそれぞれをコードする、３つのポリヌクレオチド配列を含む発現単位を使用することができる。マルチシストロニックのベクター（または発現単位）の使用は、要求される核酸分子の総数を低減し、したがって、複数のベクターゲノムからの発現の協調と関連する、可能な困難を回避しうる。マルチシストロニックのベクター内では、発現させる多様なエレメントを、１または複数のプロモーター（および、必要に応じて、他の発現制御エレメント）に作動的に連結することができる。
【００８７】
いくつかのプロモーターを使用する場合、プロモーターの相互的阻害を観察することができる。少なくともトリシストロニックであり、それらが、発現カセット１つ当たり１つだけのプロモーターを含有し、プロモーターのすぐ下流に局在化させない各シストロンのためのＩＲＥＳ配列をさらに含むことをさらに特徴とするベクターを使用して、特に高度な発現率を達成することができる。プロモーター配列と、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列との組合せは、タンパク質発現の改善をもたらすと考えられる。異なるＩＲＥＳ配列の使用は、これらの配列間の組換え頻度を最小化しうるという、さらなる利点をもたらしうる。本開示の多様な実施形態では、ＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ（脳心筋炎ウイルス）に由来する。本開示の多様な実施形態では、ＩＲＥＳは、ＰＶ（ポリオウイルス）に由来する。本開示の多様な実施形態では、新規のベクター／ベクター系は、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２の、３つのトランス遺伝子の間に、２つのＩＲＥＳを含み、この場合、１つのＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳであることが可能であり、他のＩＲＥＳは、ＰＶ  ＩＲＥＳでありうる。本開示の多様な実施形態では、新規のベクター／ベクター系は、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２の、３つのトランス遺伝子の間に、２つのＩＲＥＳを含み、この場合、いずれのＩＲＥＳも、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの場合もあり、いずれのＩＲＥＳも、ＰＶ  ＩＲＥＳの場合もある。テトラシストロニックのベクターを使用する場合、それらを、異なる発現カセットへと分割することが有用でありうる。この場合、発現カセット１つ当たり１つずつのプロモーターが存在することが好ましい。互いからの可能な最大距離を示すことが好ましい、２つの発現カセット内の分離は、プロモーターの空間的な分離をもたらし、これにより、相互的阻害を低減する。
【００８８】
本開示の多様な実施形態では新規のベクター／ベクター系は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により連結された、トリシストロニックの構築物内に、この順序（すなわち、５’〜３’に、４−１ＢＢＬをコードする遺伝子の下流に配置された、ＩＬ−２をコードする遺伝子と、ＩＬ−２をコードする遺伝子の下流に配置された、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子とを伴う）で構成された、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２の、３つの遺伝子を含む。好ましくは、３つの遺伝子は、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ヒトＩＬ−２、およびヒト単鎖ＩＬ−１２の遺伝子である。より好ましくは、３つの遺伝子は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより駆動される、すなわち、ベクター系は、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ヒトＩＬ−２、およびヒト単鎖ＩＬ−１２の３つの遺伝子を含む、トリシストロニックの構築物の上流において、ＣＭＶプロモーターを含む。さらにより好ましくは、転写物のポリアデニル化は、ＳＶ４０由来のシグナルにより誘導される、すなわち、新規のベクター／ベクター系は、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ヒトＩＬ−２、およびヒト単鎖ＩＬ−１２の３つの遺伝子 （ヒトｓｃＩＬ−１２）を含む、トリシストロニックの構築物の下流において、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を含む。なおより好ましくは、ベクターＤＮＡは、アデノウイルスのベクターＤＮＡである。
【００８９】
したがって、１つの好ましい実施形態では、本開示の新規のベクター／ベクター系は、（ｉ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により連結された、トリシストロニックの構築物内に、この順序（すなわち、５’〜３’に、４−１ＢＢＬをコードする遺伝子の下流に配置された、ＩＬ−２をコードする遺伝子と、ＩＬ−２をコードする遺伝子の下流に配置された、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子とを伴う）で構成された、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ヒトＩＬ−２、およびヒト単鎖ＩＬ−１２の３つの遺伝子、（ｉｉ）ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ヒトＩＬ−２、およびヒト単鎖ＩＬ−１２の３つの遺伝子を含む、トリシストロニックの構築物の上流におけるＣＭＶプロモーター、ならびに（ｉｉｉ）前記トリシストロニックの構築物の下流における、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を含む発現カセットを含み、この場合、ベクターは、アデノウイルスベクターである。多様な実施形態では、本開示の新規のベクター／ベクター系は、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２の、３つの遺伝子を、下記の（ａ）〜（ｆ）（Ｐｒｏｍ．＝プロモーター）のうちのいずれか１つに描示される通りに構成した発現構築物を含む。
【００９０】
【表１】
2019509760.tif 000002
【００９１】
本開示の多様な実施形態では新規のベクターは、本明細書の別の箇所で記載した順序で構成された４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２の、３つの遺伝子（を含む発現構築物）の上流において、プロモーターを含む。好ましくは、ヒト４−１ＢＢＬの遺伝子は、新規のベクターの３つの遺伝子の１位、より具体的には、前記３つの遺伝子を含む発現構築物の１位にある。
【００９２】
本開示の多様な実施形態では新規のベクターは、配列番号１２（図１８）の核酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含む発現カセットを含み、この場合、変異体の核酸配列の発現は、配列番号１２の発現カセットの発現と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性をもたらす。好ましくは、発現カセットは、配列番号１２（図１８）の核酸配列に対する、少なくとも８０％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含み、この場合、変異体の核酸配列の発現は、配列番号１２の発現カセットの発現と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性をもたらす。より好ましくは、発現カセットは、配列番号１２（図１８）の核酸配列に対する、少なくとも９０％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含み、この場合、変異体の核酸配列の発現は、配列番号１２の発現カセットの発現と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性をもたらす。なおより好ましくは、発現カセットは、配列番号１２（図１８）の核酸配列に対する、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含み、この場合、変異体の核酸配列の発現は、配列番号１２の発現カセットの発現と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性をもたらす。好ましい実施形態では、本開示の新規のベクターは、配列番号１２（図１８）の核酸配列を含む（またはからなる）発現カセットを含む。
【００９３】
本開示の多様な実施形態では新規のベクターは、以下の、配列番号１１（図１７）の核酸配列：（ｉ）ｂｐ  １，０８０〜１，８４４にわたる核酸配列（ヒト４−１ＢＢＬ）、（ｉｉ）ｂｐ  １，８８５〜２，３８８にわたる核酸配列（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）、（ｉｉｉ）ｂｐ  ２，４０９〜２，８７０にわたる核酸配列（ヒトＩＬ−２）、（ｉｖ）ｂｐ  ２，９１４〜３，５４５にわたる核酸配列（ＰＶ  ＩＲＥＳ）、および（ｖ）ｂｐ  ３，５８１〜５，２０３にわたる核酸配列（リンカーにより連結された、ヒトＩＬ−１２のｐ４０のサブユニットとｐ３５のサブユニットとを含むヒトｓｃＩＬ−１２）を含む基準発現カセットに対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含む発現カセットを含み、この場合、変異体の発現カセットの発現は、前記基準発現カセットの発現と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性をもたらす。好ましくは、発現カセットは、前記基準発現カセットに対する、少なくとも８０％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含み、この場合、変異体の発現カセットの発現は、前記基準発現カセットの発現と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性をもたらす。より好ましくは、発現カセットは、前記基準発現カセットに対する、少なくとも９０％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含み、この場合、変異体の発現カセットの発現は、前記基準発現カセットの発現と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性をもたらす。なおより好ましくは、発現カセットは、前記基準発現カセットに対する、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含み、この場合、変異体の発現カセットの発現は、前記基準発現カセットの発現と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性をもたらす。好ましい実施形態では、本開示の新規のベクターは、以下の、配列番号１１（図１７）の核酸配列：（ｉ）ｂｐ  １，０８０〜１，８４４にわたる核酸配列（ヒト４−１ＢＢＬ）、（ｉｉ）ｂｐ  １，８８５〜２，３８８にわたる核酸配列（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）、（ｉｉｉ）ｂｐ  ２，４０９〜２，８７０にわたる核酸配列（ヒトＩＬ−２）、（ｉｖ）ｂｐ  ２，９１４〜３，５４５にわたる核酸配列（ＰＶ  ＩＲＥＳ）、および（ｖ）ｂｐ  ３，５８１〜５，２０３にわたる核酸配列（リンカーにより連結された、ヒトＩＬ−１２のｐ４０のサブユニットとｐ３５のサブユニットとを含むヒトｓｃＩＬ−１２）を含む（またはからなる）発現カセットを含む。
【００９４】
本開示の多様な実施形態では新規のベクターは、以下の、配列番号１１（図１７）の核酸配列：（ｉ）ｂｐ  ４８４〜１，０５９にわたる核酸配列（ＣＭＶプロモーター）、（ｉｉ）ｂｐ  １，０８０〜１，８４４にわたる核酸配列（ヒト４−１ＢＢＬ）、（ｉｉｉ）ｂｐ  １，８８５〜２，３８８にわたる核酸配列（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）、（ｉｖ）ｂｐ  ２，４０９〜２，８７０にわたる核酸配列（ヒトＩＬ−２）、（ｖ）ｂｐ  ２，９１４〜３，５４５にわたる核酸配列（ＰＶ  ＩＲＥＳ）、（ｖｉ）ｂｐ  ３，５８１〜５，２０３にわたる核酸配列（リンカーにより連結された、ヒトＩＬ−１２のｐ４０のサブユニットとｐ３５のサブユニットとを含むヒトｓｃＩＬ−１２）、および（ｖｉｉ）ｂｐ  ５，２７１〜５，５１０にわたる核酸配列（ＳＶポリＡ）を含む基準発現カセットに対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含む発現カセットを含み、この場合、変異体の発現カセットの発現は、前記基準発現カセットの発現と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性をもたらす。好ましくは、発現カセットは、前記基準発現カセットに対する、少なくとも８０％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含み、この場合、変異体の発現カセットの発現は、前記基準発現カセットの発現と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性をもたらす。より好ましくは、発現カセットは、前記基準発現カセットに対する、少なくとも９０％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含み、この場合、変異体の発現カセットの発現は、前記基準発現カセットの発現と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性をもたらす。なおより好ましくは、発現カセットは、前記基準発現カセットに対する、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含み、この場合、変異体の発現カセットの発現は、前記基準発現カセットの発現と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性をもたらす。好ましい実施形態では、本開示の新規のベクターは、以下の、配列番号１１（図１７）の核酸配列：（ｉ）ｂｐ  ４８４〜１，０５９にわたる核酸配列（ＣＭＶプロモーター）、（ｉｉ）ｂｐ  １，０８０〜１，８４４にわたる核酸配列（ヒト４−１ＢＢＬ）、（ｉｉｉ）ｂｐ  １，８８５〜２，３８８にわたる核酸配列（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）、（ｉｖ）ｂｐ  ２，４０９〜２，８７０にわたる核酸配列（ヒトＩＬ−２）、（ｖ）ｂｐ  ２，９１４〜３，５４５にわたる核酸配列（ＰＶ  ＩＲＥＳ）、（ｖｉ）ｂｐ  ３，５８１〜５，２０３にわたる核酸配列（リンカーにより連結された、ヒトＩＬ−１２のｐ４０のサブユニットとｐ３５のサブユニットとを含むヒトｓｃＩＬ−１２）、および（ｖｉｉ）ｂｐ  ５，２７１〜５，５１０にわたる核酸配列（ＳＶポリＡ）を含む（またはからなる）発現カセットを含む。
【００９５】
多様な実施形態では、ベクター系は、３つの個別のベクター内に構成される、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２の３つの遺伝子を含む。好ましくは、３つの遺伝子は、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２のヒト遺伝子である。より好ましくは、３つの遺伝子は、各々、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより駆動される、すなわち、各ベクターは、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ヒトＩＬ−２、およびヒト単鎖ＩＬ−１２のそれぞれの遺伝子の上流のＣＭＶプロモーターを含む。さらにより好ましくは、転写物のポリアデニル化は、ＳＶ４０由来のシグナルにより誘導される、すなわち、各ベクター系は、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ヒトＩＬ−２、およびヒト単鎖ＩＬ−１２（ヒトｓｃＩＬ−１２）のそれぞれの遺伝子の下流のＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を含む。なおより好ましくは、各個別のベクターのベクターＤＮＡは、アデノウイルスのベクターＤＮＡである。
【００９６】
したがって、１つの好ましい実施形態では、ベクター系は、各々が（ｉ）ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ヒトＩＬ−２、またはヒト単鎖ＩＬ−１２の遺伝子、（ｉｉ）ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ヒトＩＬ−２、およびヒト単鎖ＩＬ−１２のそれぞれの遺伝子の上流のＣＭＶプロモーター、ならびに（ｉｉｉ）ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ヒトＩＬ−２、およびヒト単鎖ＩＬ−１２のそれぞれの遺伝子の下流のＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列を含む、３つのアデノウイルスベクターを含む。
【００９７】
多様な態様では、ベクター系は、２つの個別のベクター内に構成される、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２の３つの遺伝子を含む。具体的には、多様な実施形態では、２つのベクターのうちの１つは、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）およびＩＬ−２の遺伝子を含み、他のベクターは、単鎖ＩＬ−１２の遺伝子を含む。好ましくは、遺伝子は、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２のヒト遺伝子である。より好ましくは、遺伝子は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより駆動される、すなわち、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）およびヒトＩＬ−２の遺伝子を含むベクターは、ＣＭＶプロモーターを、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流に含むか、またはヒトＩＬ−２の遺伝子を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流に含み、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含むベクターは、ＣＭＶプロモーターを、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流に含む。さらにより好ましくは、転写物のポリアデニル化は、ＳＶ４０由来のシグナルにより誘導される、すなわち、２つのベクターの各々は、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列を含む、すなわち、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）およびヒトＩＬ−２の遺伝子を含むベクターは、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトＩＬ−２の遺伝子の下流に含むか、またはＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を、ヒトＩＬ−２の遺伝子を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の下流に含み、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含むベクターは、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列を、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の下流に含む。なおより好ましくは、各個別のベクターのベクターＤＮＡは、アデノウイルスのベクターＤＮＡである。
【００９８】
したがって、１つの好ましい実施形態では、ベクター系は、一方がヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）およびヒトＩＬ−２の遺伝子を含み、他方がヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含む、２つのアデノウイルスベクターを含み、この場合、（ｉ）ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）およびヒトＩＬ−２の遺伝子を含むベクターは、ＣＭＶプロモーターを、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流にさらに含むか、またはヒトＩＬ−２の遺伝子を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流にさらに含み、この場合、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含むベクターは、ＣＭＶプロモーターを、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流に含み、（ｉｉ）ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）およびヒトＩＬ−２の遺伝子を含むベクターはなお、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の核酸配列を、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトＩＬ−２の遺伝子の下流にさらに含むか、またはＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を、ヒトＩＬ−２の遺伝子を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の下流にさらに含み、この場合、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含むベクターは、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の下流に含む。
【００９９】
他の多様な実施形態では、ベクター系は、２つの個別のベクターを含み、この場合、２つのベクターのうちの１つは、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）および単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）の遺伝子を含み、他のベクターは、ＩＬ−２の遺伝子を含む。好ましくは、遺伝子は、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２のヒト遺伝子である。より好ましくは、遺伝子は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより駆動される、すなわち、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）およびヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含むベクターは、ＣＭＶプロモーターを、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流に含むか、またはヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流に含み、ヒトＩＬ−２の遺伝子を含むベクターは、ＣＭＶプロモーターを、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流に含む。さらにより好ましくは、転写物のポリアデニル化は、ＳＶ４０由来のシグナルにより誘導される、すなわち、２つのベクターの各々は、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列を含む、すなわち、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）およびヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含むベクターは、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の下流に含むか、またはＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の下流に含み、ヒトＩＬ−２の遺伝子を含むベクターは、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列を、ヒトＩＬ−２の遺伝子の下流に含む。なおより好ましくは、各個別のベクターのベクターＤＮＡは、アデノウイルスのベクターＤＮＡである。
【０１００】
したがって、１つの好ましい実施形態では、ベクター系は、一方がヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）およびヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含み、他方がヒトＩＬ−２の遺伝子を含む、２つのアデノウイルスベクターを含み、この場合、（ｉ）ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）およびヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含むベクターは、ＣＭＶプロモーターを、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流にさらに含むか、またはヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流にさらに含み、この場合、ヒトＩＬ−２の遺伝子を含むベクターは、ＣＭＶプロモーターを、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流に含み、（ｉｉ）ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）およびヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含むベクターはなお、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の下流にさらに含むか、またはＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列を、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の下流にさらに含み、この場合、ヒトＩＬ−２の遺伝子を含むベクターは、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列を、ヒトＩＬ−２の遺伝子の下流に含む。
【０１０１】
他の多様な実施形態では、ベクター系は、２つの個別のベクターを含み、この場合、２つのベクターのうちの１つは、ＩＬ−２および単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）の遺伝子を含み、他のベクターは、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を含む。好ましくは、遺伝子は、ＩＬ−２、ｓｃＩＬ−１２、および４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）のヒト遺伝子である。より好ましくは、遺伝子は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより駆動される、すなわち、ヒトＩＬ−２およびヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含むベクターは、ＣＭＶプロモーターを、ヒトＩＬ−２の遺伝子を、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流に含むか、またはヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流に含み、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を含むベクターは、ＣＭＶプロモーターを、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流に含む。さらにより好ましくは、転写物のポリアデニル化は、ＳＶ４０由来のシグナルにより誘導される、すなわち、２つのベクターの各々は、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列を含む、すなわち、ヒトＩＬ−２およびヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含むベクターは、ヒトＩＬ−２の遺伝子をヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流に配置する場合は、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列をヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の下流に含むか、またはヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子をヒトＩＬ−２の遺伝子の上流に配置する場合は、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列をヒトＩＬ−２の遺伝子の下流に含み、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を含むベクターは、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の下流に含む。なおより好ましくは、各個別のベクターのベクターＤＮＡは、アデノウイルスのベクターＤＮＡである。
【０１０２】
したがって、１つの好ましい実施形態では、ベクター系は、一方がヒトＩＬ−２およびヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含み、他方がヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を含む、２つのアデノウイルスベクターを含み、この場合、（ｉ）ヒトＩＬ−２およびヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含むベクターは、ＣＭＶプロモーターを、ヒトＩＬ−２の遺伝子を、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流にさらに含むか、またはヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流にさらに含み、この場合、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を含むベクターは、ＣＭＶプロモーターを、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の上流に含み、（ｉｉ）ヒトＩＬ−２およびヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を含むベクターはなお、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を、ヒトＩＬ−２の遺伝子を、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子の下流にさらに含むか、またはＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列を、ヒトｓｃＩＬ−１２の遺伝子を、ヒトＩＬ−２の遺伝子の上流に配置する場合は、ヒトＩＬ−２の遺伝子の下流にさらに含み、この場合、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子を含むベクターは、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルをコードする核酸配列を、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）の遺伝子の下流に含む。
【０１０３】
本開示のウイルス粒子では、発現単位はさらに、パッケージング細胞内の、所望のベクター粒子の作製に必要なエンベロープ／カプシド分子または１もしくは複数の成熟因子をコードする配列を含む。
【０１０４】
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを使用して、多重遺伝子メッセージ、またはマルチシストロニックメッセージもしくはポリシストロニックメッセージを創出する。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存性翻訳のリボソーム走査モデルをバイパスし、内部部位において翻訳を開始することが可能である。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームへと連結することができる。各々がＩＲＥＳにより隔てられた、複数のオープンリーディングフレームを、併せて転写し、マルチシストロニックもしくはポリシストロニックのメッセージを創出することができる。マルチシストロニックの発現ベクター内で発現させる各構成要素を、ＩＲＥＳエレメントで隔てて、同じプロモーターからの、多様なタンパク質の個別の発現を可能とすることができる。当技術分野では、マルチシストロニックのベクター内の遺伝子エレメント、特に、ＩＲＥＳエレメントを分離するのに使用しうるツールが公知である。特定のマルチシストロニックのベクターの有効性は、標準的なプロトコールを使用して、遺伝子の各々の発現を検出することにより、たやすく調べることができる。
【０１０５】
本開示の多様な実施形態では、少なくとも、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする核酸配列を、１つのベクター内に構成し、この場合、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２をコードする核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列の下流に配置する。このようなベクターは、マルチシストロニックの発現ベクターであると考えられる。ある特定の実施形態では、マルチシストロニックの発現ベクターは、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする（遺伝子の）核酸配列を含有する、トリシストロニックの発現ベクターであって、遺伝子を、５’〜３’方向に、１、２、３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成した、発現ベクターである。多様な実施形態では、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２をコードする核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列の下流に配置する。好ましくは、マルチシストロニックまたはトリシストロニックの発現ベクター内に、ＩＬ−２をコードする核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列の下流に配置し、ｓｃＩＬ−１２をコードする核酸配列を、ＩＬ−２をコードする核酸配列の下流に配置する。マルチシストロニックまたはトリシストロニックの発現についての多様な実施形態では、プロモーターを、４−１ＢＢＬをコードする核酸配列の上流に配置するが、ｓｃＩＬ−１２および／またはＩＬ−２をコードする核酸配列の上流には配置しない。
【０１０６】
マルチシストロニックまたはトリシストロニックの発現ベクターについての、ある特定の実施形態では、少なくとも４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２をコードする核酸配列を、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により連結する。
【０１０７】
具体的例示では、ウイルスベクターのゲノムは、エンハンサー／プロモーター配列、好ましくは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター配列；ウイルス５’ＬＴＲに由来する、Ｒ配列およびＵ５配列；任意選択のパッケージング配列；内部エンハンサー；内部プロモーター；少なくとも４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、および／またはＩＬ−１２をコードする、１または複数のポリヌクレオチド；そのエンハンサー配列を欠失させたＵ３エレメント；ならびにウイルス３’ＬＴＲのＲ配列およびＵ５配列を含む。ベクターゲノムの構築は、当技術分野で公知の、任意の適切な遺伝子操作法であって、限定せずに述べると、例えば、Sambrook et al. （1989 and 2001 editions; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY）において記載されている、例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡシーケンシングの標準的技法を含む遺伝子操作法を使用して達することができる。
【０１０８】
哺乳動物細胞内の一過性発現のために構築されるベクターもまた、使用することができる。一過性発現は、宿主細胞が、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、これが、発現ベクター内のポリヌクレオチドによりコードされる、高レベルのポリペプチドを合成するように、宿主細胞内で効率的に複製することが可能な発現ベクターの使用を伴う。Sambrook et al., supra, pp. 16.17-16.22, 1989を参照されたい。当技術分野では、ポリペプチドの発現への適応に適する、他のベクターおよび方法が周知であり、具体的状況へと、たやすく適応させることができる。
【０１０９】
本明細書で提示される教示および当技術分野における知見を使用することにより、当業者は、パッケージング細胞に、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターをトランスフェクトし、適切な技法を使用して、発現を測定すること、例えば、緑色蛍光タンパク質コンジュゲートからの蛍光を測定することにより、特定の発現系の有効性を調べうることを認識するであろう。当技術分野では、他の適切なレポーター遺伝子が周知である。
【０１１０】
本開示ではまた、ある特定の実施形態では、本開示により提示される新規のベクター／ベクター系が、ｓｃＩＬ−１２ではなく、天然ＩＬ−１２を含みうる、すなわち、天然ＩＬ−１２をコードする（遺伝子の）核酸配列を含みうることも想定される。ＩＬ−１２は、２つの個別にコードされるｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットから構成される、ジスルフィド連結されたヘテロ二量体のサイトカインである。多様な実施形態では、（遺伝子の）核酸配列は、天然ヒトＩＬ−１２をコードしうる。したがって、多様な実施形態では、本開示により提示される新規のベクター／ベクター系は、（ｉ）４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、（ｉｉ）ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットおよびｐ３５サブユニット、ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ−２をコードする３つの遺伝子であって、５’〜３’方向に、１、２、３の順序で、ＩＬ−１２  ｐ３５サブユニットおよびＩＬ−１２  ｐ４０サブユニットをコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成した遺伝子を含みうる。
【０１１１】
本開示の多様な実施形態では新規のベクター／ベクター系は、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、天然ＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする３つの遺伝子であって、５’〜３’方向に、１、２、３の順序で、ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットをコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成した遺伝子を含むことが可能であり、この場合、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ４０およびｐ３５をコードする遺伝子は、配列番号７および９の核酸配列（図１６）に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含むことが可能であり、この場合、変異体の核酸配列は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有するＩＬ−１２タンパク質をコードする。好ましくは、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ３５およびｐ４０をコードする遺伝子は、配列番号７および９の核酸配列（図１６）に対する、少なくとも８０％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含むことが可能であり、この場合、変異体の核酸配列は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有するＩＬ−１２タンパク質をコードする。より好ましくは、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ４０およびｐ３５をコードする遺伝子は、配列番号７および９の核酸配列（図１６）に対する、少なくとも９０％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含むことが可能であり、この場合、変異体の核酸配列は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有するＩＬ−１２タンパク質をコードする。なおより好ましくは、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ４０およびｐ３５をコードする遺伝子は、配列番号７および９の核酸配列（図１６）に対する、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または配列同一性を有する核酸配列を含むことが可能であり、この場合、変異体の核酸配列は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有するＩＬ−１２タンパク質をコードする。特に好ましい実施形態では、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ４０およびｐ３５をコードする遺伝子は、配列番号７および９の核酸配列（図１６）を含みうる。ある特定の実施形態では、上記で記載したＩＬ−１２のサブユニットであるｐ３５およびｐ４０の変異体は、配列番号７および９の配列によりコードされる、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ３５およびｐ４０と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を呈する。
【０１１２】
多様な実施形態では、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ４０およびｐ３５の遺伝子は、配列番号８および１０（図１６）のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を有するポリペプチドをコードし、この場合、ポリペプチドは、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。好ましくは、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ４０およびｐ３５の遺伝子は、配列番号８および１０（図１６）のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を有するポリペプチドをコードし、この場合、ポリペプチドは、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。より好ましくは、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ４０およびｐ３５の遺伝子は、配列番号８および１０（図１６）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％または９５％の相同性または配列同一性を有するポリペプチドをコードし、この場合、ポリペプチドは、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。なおより好ましくは、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ４０およびｐ３５の遺伝子は、配列番号８および１０（図１６）のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【０１１３】
好ましくは、本明細書で記載される、ヒトＩＬ−１２のサブユニットであるｐ３５およびｐ４０の核酸配列の変異体配列は、マウスＩＬ−１２のサブユニットであるｐ３５およびｐ４０をコードするヌクレオチド配列ではない。したがって、好ましくは、上記で記載した、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ３５およびｐ４０、ならびにＩＬ−２をコードする、３つの遺伝子（すなわち、この場合、前記遺伝子は、５’〜３’方向に、１、２、３の順序で、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ３５およびｐ４０をコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成されている）を含む、本開示の新規のベクター／ベクター系は、マウス由来のＩＬ−１２のサブユニットであるｐ３５およびｐ４０をコードする核酸配列を含まない。
【０１１４】
別の実施形態では、ベクター粒子が提供される。本開示は、本開示のベクター系を含むウイルス粒子を提示する。ベクター粒子は、本明細書で記載される、少なくとも４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１または複数のベクターを含む新規ベクター／ベクター系のうちのいずれか１つを含む。本明細書ではまた、少なくとも４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２（本明細書で記載される）をコードする、本開示のベクター系を、標的細胞へと送達するための方法も提示される。このような方法は、標的細胞の、本開示のベクター系を送達する媒体との接触（すなわち、相互作用を可能とすること）を含む。特定の実施形態では、新規のベクター／ベクター系を送達するための方法は、対象へと少なくとも４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１または複数のベクターを含む、本開示の新規のベクター／ベクター系を含むベクター粒子を投与することにより、細胞に接触させることを含む。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、ベクター粒子は、ウイルスベクターの粒子であり、新規のベクター／ベクター系の、１または複数のベクターは、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、ナノ粒子ベクター、およびネイキッドＤＮＡのうちのいずれかである。他のある特定の実施形態では、ベクター粒子は、例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、サルモネラ（Salmonella）属種、牛型結核菌（Mycobacterium bovis）、大腸菌（Escherichia coli）、赤痢菌（Shigella）属種、およびエルシニア（Yersinia）属種などの細菌に由来する粒子であり、ベクター系の、１または複数のベクターは、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、ナノ粒子ベクター、およびネイキッドＤＮＡのうちのいずれかである。
【０１１６】
例示的なウイルスベクターの粒子は、レンチウイルスベクターのゲノムを含む、レンチウイルスベクターの粒子；ポックスウイルスベクターのゲノムを含む、ポックスウイルスベクターの粒子；ワクシニアウイルスベクターのゲノムを含む、ワクシニアウイルスベクターの粒子；アデノウイルスベクターのゲノムを含む、アデノウイルスベクターの粒子；アデノ随伴ウイルスベクターのゲノムを含む、アデノ随伴ウイルスベクターの粒子；ヘルペスウイルス（例えば、Ｉ型単純ヘルペスウイルスまたはＩＩ型単純ヘルペスウイルス）ベクターのゲノムを含む、ヘルペスウイルスベクターの粒子；またはアルファウイルスベクターのゲノムを含む、アルファウイルスベクターの粒子を含む。
【０１１７】
ベクター粒子（例えば、本明細書で記載されるウイルスベクターの粒子）を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、特に、腫瘍へと注射することができ、この場合、粒子は、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２の発現により、免疫刺激効果をもたらす。ウイルス粒子の量は、少なくとも３×１０６ｉｖｐ（感染性ウイルス粒子）であり、少なくとも１×１０７ｉｖｐ、少なくとも３×１０７ｉｖｐ、少なくとも１×１０８ｉｖｐ、少なくとも３×１０８ｉｖｐ、少なくとも１×１０９ｉｖｐ、または少なくとも３×１０９ｉｖｐでありうる。選択された間隔で、レシピエントの悪性（腫瘍）組織または標的病原体感染組織に由来する細胞を使用して、例えば、ベクター粒子内に含まれる、ベクター系内に存在するポリヌクレオチド配列により共発現させる場合、ＧＦＰまたはルシフェラーゼなど、マーカーの発現を観察することにより、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２の発現を測定することができる。特に、ベクター粒子で処置されたレシピエントの、悪性（腫瘍）組織または標的病原体感染組織に由来するＴ細胞を、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２の発現について測定することができる。
【０１１８】
「複製コンピテントアデノウイルスベクター」という用語は、特異的細胞内または特異的組織内のウイルスの複製に要求される任意の遺伝子機能が欠損していない、任意のアデノウイルスベクターを指す。ベクターは、複製およびパッケージングすることが可能でなければならないが、特異的細胞内または特異的組織内で、条件的に複製されうるに過ぎないであろう。
【０１１９】
アデノウイルス（Ａｄ）とは、ヒトにも感染するが、広範な宿主範囲を提示する、大型の（約３６ｋｂ）ＤＮＡウイルスである。ヒトアデノウイルスには、約５０の血清型が存在し、これらは、分子的基準、免疫学的基準、および機能的基準に基づき、６つのファミリーへと分けられる。成人期までに、事実上大半のヒトは、より一般的なアデノウイルス血清型に感染し、主要な影響は、かぜ様症状である。宿主細胞のアデノウイルス感染は、エピソーム内に維持されるアデノウイルスＤＮＡを結果としてもたらし、これは、ベクターの組込みと関連する、潜在的遺伝子毒性を低減する。アデノウイルスはまた、構造的に安定でもあり、広範な増幅の後でも、ゲノム再配列は検出されていない。
【０１２０】
本開示で使用されるアデノウイルスベクターは、ヒトまたは動物を処置する方法における使用に適する、任意のアデノウイルスベクターでありうる。代替的に、本開示に従い、多様な種類のアデノウイルスベクターを使用することができる。ベクターはまた、当技術分野で公知の任意の方式で、例えば、任意のウイルス領域を、欠失させるか、挿入するか、突然変異させるか、または修飾することにより修飾することもできる。ベクターは、複製に関して、腫瘍特異的とすることができる。例えば、アデノウイルスベクターは、腫瘍特異的プロモーターの挿入、領域の欠失、およびトランス遺伝子の挿入など、Ｅ１内、Ｅ３内、および／またはＥ４内の修飾を含みうる。
【０１２１】
ヒトＡｄ−５は、遺伝子的および生化学的に十分に特徴づけられた、ヒトアデノウイルス血清型（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ７３２６０；ＡＣ＿０００００８）である。したがって、好ましい実施形態では、アデノウイルスは、複製コンピテントＡｄ５血清型、またはＡｄ５構成要素を含む、ハイブリッド血清型である。アデノウイルスは、野生型株の場合もあり、例えば、腫瘍細胞内で複製されるウイルスの能力に影響を及ぼさずに、正常休眠細胞内で複製されるウイルスの能力を弱めることにより、腫瘍選択性を増強するように、遺伝子修飾することもできる。本開示により包含されるアデノウイルスの非限定的例は、デルタ２４、デルタ２４−ＲＧＤ、ＩＣＯＶＩＲ−５、ＩＣＯＶＩＲ−７、ＯＮＹＸ−０１５、ＣｏｌｏＡｄ１、およびＨ１０１を含む。特定の一実施形態では、アデノウイルスは、デルタ２４またはデルタ２４−ＲＧＤである。デルタ２４アデノウイルスは、５型アデノウイルス（Ａｄ−５）に由来し、Ｅ１  Ａ遺伝子のＣＲ２部分内に、２４塩基対の欠失を含有する。デルタ２４−ＲＧＤは、ＲＧＤ−４Ｃ配列の挿入をさらに含む。Ｅ１  Ａの欠失は、がん細胞に対するウイルスの選択性を増大させ、ＲＧＤ−４Ｃ配列は、神経膠腫内のウイルスの感染性を増大させる。
【０１２２】
さらに、アデノウイルスベクターの骨格は、いかなる血清型のものでもありうる。なおさらに、ベクターは、キメラベクター、例えば、Ａｄ５／３ベクターでありうる。例として述べると、「Ａｄ５／３ベクター」は、Ａｄ５ベクターおよびＡｄ３ベクターの両方の一部を有するキメラベクターを指す。
【０１２３】
アデノウイルスは、魅力的な送達系であり、いくつかの治療適用での遺伝子導入における使用のために、十分に確立されている。アデノウイルスは、細胞表面受容体を介して、許容性の宿主細胞に侵入し、次いで、内部化される。
【０１２４】
腫瘍型上の、低レベルのコックサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の非存在、または存在は、アデノウイルスの有効性を限定しうる。カプシドの修飾は、ＣＡＲ非依存性の標的細胞の感染を可能とする。アデノウイルスの、標的組織への取込みもまた、トランスフェクタント様ポリカチオン性化合物の添加により改善することができる。本明細書（実施例１０を参照されたい）では、アデノウイルスの取込みが、トランスフェクタント剤であるプロタミン硫酸塩を使用して、特に改善されることが裏付けられている。したがって、多様な実施形態では、プロタミン硫酸塩を、本開示のベクター系のトランスフェクション、好ましくは、本開示のアデノウイルスベクター系のトランスフェクションのために使用する。
【０１２５】
発現では、転写物の適正なポリアデニル化を行うように、ポリアデニル化シグナルを含めることが典型的である。ポリアデニル化シグナルの性質は、本開示の実施の成功に極めて重要であるとは考えられず、任意のこのような配列を利用することができる。好ましい実施形態は、多様な標的細胞内で好都合であり、および／またはよく機能することが公知である、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナル、および／またはウシ増殖ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む。本明細書ではまた、転写終結部位も、発現構築物のエレメントとして想定される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強し、かつ／またはカセットから、他の配列へのリードスルーを最小化するのにも用いられうる。
【０１２６】
本開示のある特定の実施形態では、本開示の新規のベクター／ベクター系によって感染させられる細胞は、ベクター系内に、レポーター遺伝子を含めることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて同定することができる。一般に、選択用レポーターとは、選択を可能とする特性を付与するレポーターである。陽性選択用レポーターが、レポーター遺伝子の存在がその選択を可能とするレポーターであるのに対し、陰性選択用レポーターは、その存在がその選択を妨げるレポーターである。陽性選択用マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。他の種類のレポーターは、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）など、スクリーニング用レポーターを含む。本開示の実施形態は、ワクチンまたは遺伝子治療用構築物を創出するようにデザインされた、最新のウイルスベクタープラットフォーム技術を使用しうる。ウイルスベクター構築についての態様は、遺伝子素材を、ウイルスベクター内に挿入することと、構築物を、特徴付けにより確認することと、核酸、ウイルス、およびウイルス産物のシーケンシングとを含む。次いで、ウイルスベクターを、スケーラビリティーについて評価するようにデザインされた、一連の実行可能性研究にかける。
【０１２７】
本開示は、本開示の新規のベクター／ベクター系をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提示する。
【０１２８】
さらに、本開示は、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を含む組成物を提示する。本開示はまた、本明細書で開示されるポリヌクレオチド、すなわち、本開示の新規のベクター／ベクター系をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物も提示する。
【０１２９】
理論に束縛されることなく述べると、４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２を発現させる、新規のベクター／ベクター系の使用は、腫瘍内または腫瘍周囲における、サイトカインの局所的産生を結果としてもたらし、これは、全身的または局所的に誘導された、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を、がんの部位へと導くであろう。この機構によりもたらされる免疫刺激効果を介して、がん、ウイルス感染、および免疫系障害に対する免疫療法の有効性は、大幅に増強されるであろう。実施例では、本開示の新規のベクター／ベクター系によりもたらされる免疫刺激効果を裏付けている。
【０１３０】
本開示は、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を、医薬としての使用のために含む組成物を包含する。本開示は、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を含む医薬を提示する。本開示はまた、本明細書で開示されたポリヌクレオチド、すなわち、本開示の新規のベクター／ベクター系をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬も提示する。
【０１３１】
本開示は、治療用ワクチンとしての使用、より具体的には、がんまたはウイルス感染の処置のための治療用ワクチンとしての使用のための、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を包含する。
【０１３２】
本開示はまた、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を形質導入またはトランスフェクトされた免疫細胞またはがん細胞も提示する。このような形質導入細胞またはトランスフェクト細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏ療法、特に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるがん治療のために使用することができる。このような治療についての多様な実施形態では、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を形質導入またはトランスフェクトされたがん細胞のうちの少なくとも５％は、４−１ＢＢＬを発現している。
【０１３３】
本開示では、がん細胞は、好ましくは、腫瘍の細胞、すなわち、腫瘍細胞、より具体的には、充実性腫瘍の細胞である。
【０１３４】
さらに、本開示は、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を形質導入またはトランスフェクトされたこのような免疫細胞またはがん細胞を含む組成物を提示する。なおさらに、本開示は、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を形質導入またはトランスフェクトされたこのような免疫細胞またはがん細胞を含む医薬を提示する。多様な実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球系統の細胞型（マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マスト細胞）、線維芽細胞である。多様な実施形態では、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を形質導入またはトランスフェクトされたがん細胞のうちの少なくとも５％は、４−１ＢＢＬを発現している。
【０１３５】
本開示の新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を、がん、ウイルス感染、および／または免疫系障害を、処置または改善するための方法において使用することができる。また、本開示のポリヌクレオチドも、がん、ウイルス感染、および／または免疫系障害の処置において使用することができる。また、上記の記載された、本開示の組成物または医薬も、がん、ウイルス感染、および／または免疫系障害の処置において使用することができる。多様な実施形態では、本開示の新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子は、活性薬剤と考えることができる。多様な実施形態ではまた、本開示のポリヌクレオチド、すなわち、本開示の新規のベクター／ベクター系をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、および本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を形質導入またはトランスフェクトされたがん細胞も、活性薬剤と考えることができる。これは特に、本明細書で開示される医療処置の文脈で当てはまる。
【０１３６】
本開示は、がん、ウイルス感染性疾患（ウイルス感染）、または免疫系障害を、処置または改善するための方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、本開示の新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を投与するステップを含む方法を提示する。本開示はまた、がん、ウイルス感染性疾患（ウイルス感染）、または免疫系障害を、処置または改善するための方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、本開示のポリヌクレオチド、すなわち、本開示の新規のベクター／ベクター系をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを投与するステップを含む方法も提示する。本開示はまた、がん、ウイルス感染性疾患（ウイルス感染）、または免疫系障害を、処置または改善するための方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、本開示の免疫細胞またはがん細胞、すなわち、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を形質導入またはトランスフェクトされた免疫細胞またはがん細胞を投与するステップを含む方法も提示する。多様な実施形態では、がんを処置または改善する方法を、がん細胞を、患者から得るステップと、自家がん細胞に、本明細書で開示されるベクター系またはウイルス粒子を、形質導入またはトランスフェクトするステップと、本明細書で開示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を形質導入またはトランスフェクトされた自家がん細胞を、患者へと投与するステップとを含むｅｘ  ｖｉｖｏ療法として実施する。本開示はまた、がん、ウイルス感染性疾患（ウイルス感染）、または免疫系障害を、処置または改善するための方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、上記で記載した、本開示の医薬または組成物を投与するステップを含む方法も提示する。
【０１３７】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、本明細書で開示される活性薬剤、組成物、または医薬の量であって、それにより、疾患または障害（例えば、がんまたは感染性疾患）の有害な影響が、少なくとも、改善される量を指す。好ましい実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、リンパ腫、皮膚がん、膵臓がん、結腸がん、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣がん、脳がん、原発脳癌、頭頸部がん、神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、頭部または頸部癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、前立腺癌、尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵臓膵島細胞腫、悪性カルチノイド癌、絨毛癌、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血症、子宮頸過形成、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、中皮腫、骨肉腫、原発マクログロブリン血症、および網膜芽細胞腫のうちのいずれか１つである。
【０１３８】
他の好ましい実施形態では、がんは、黒色腫、がん転移、腺がん、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、結腸がん、ホジキンリンパ腫、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎臓がん、および膵臓がんのうちのいずれか１つである。特に好ましい実施形態では、がんは、泌尿器がん、好ましくは、膀胱がんである。他の特に好ましい実施形態では、がんは、肝臓がんである。さらに他の特に好ましい実施形態では、がんは、皮膚がんである。本開示で提示される手段および方法はまた、がん転移を処置または防止するための方法においても、特に有用である。
【０１３９】
多様な実施形態では、がんは、腫瘍への、または腫瘍の周囲への、本開示の活性薬剤（例えば、ベクター系またはウイルス粒子）、組成物、または医薬の、直接的な注射を可能とするようにアクセス可能な、１または複数の腫瘍を含む。特に好ましい実施形態では、がんは、充実性腫瘍を含むか、または充実性腫瘍である。ある特定の実施形態では、充実性腫瘍は、癌、肉腫、またはリンパ腫である。この点で、リンパ腫は一般に、液性腫瘍と考えられるが、リンパ節内では、アクセス可能な「充実性」腫瘍が形成される場合があり、したがって、本明細書で開示される方法および使用に従い処置することができる。多様な実施形態では、感染性疾患は、病原性細菌により引き起こされる感染性疾患である。他の実施形態では、感染性疾患は、ウイルスにより引き起こされる感染性疾患である。さらに他の実施形態では、感染性疾患は、病原性寄生虫、原虫、または真菌により引き起こされる感染性疾患である。
【０１４０】
本開示に従い、処置し、それに対して防御し、かつ／または管理しうるウイルス性疾患は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルス）、水痘ウイルス、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−Ｉ）、ＩＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−ＩＩ）、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、ＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コックサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｉ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ）、ＩＩ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−ＩＩ）、エボラウイルス、ジカウイルス、およびウイルス性髄膜炎、脳炎、デング熱、または天然痘など、ウイルス性疾患の病原物質により引き起こされるウイルス性疾患を含むがこれらに限定されない。
【０１４１】
細菌により引き起こされる細菌疾患であって、本開示に従い、処置し、それに対して防御し、かつ／または管理しうる細菌疾患は、ライム病、炭疽、破傷風、コレラ、ペスト、ジフテリア、クラミジア感染症、および百日咳を含むがこれらに限定されない。
【０１４２】
原虫により引き起こされる原虫疾患であって、本開示に従い、処置し、それに対して防御し、かつ／または管理しうる原虫疾患は、リーシュマニア感染症およびマラリアを含むがこれらに限定されない。寄生虫により引き起こされる寄生虫疾患であって、本開示に従い、処置し、それに対して防御し、かつ／または管理しうる寄生虫疾患は、クラミジア感染症およびリケッチア症を含むがこれらに限定されない。
【０１４３】
本開示では、免疫系障害は、免疫系の下方調節、特に、免疫応答の下方調節を特徴とする。本開示の新規のベクター／ベクター系は、不活性の免疫微小環境を、活性の免疫微小環境へと転換し、これにより、免疫系障害を処置することにより、このような免疫系障害のコントロールを可能とする。
【０１４４】
同様に、本開示では、がんは、免疫系の下方調節、特に、免疫応答の下方調節を特徴としうる。したがって、本開示の新規のベクター／ベクター系は、不活性の腫瘍微小環境を、活性の腫瘍微小環境へと転換し、これにより、がんを処置またはコントロールすることにより、がんのコントロールまたは処置を可能とする。
【０１４５】
本開示ではまた、感染性疾患は、免疫系の下方調節、特に、免疫応答の下方調節も特徴としうる。したがって、本開示の新規のベクター／ベクター系は、不活性の免疫微小環境を、活性の免疫微小環境へと転換し、これにより、感染性疾患を処置またはコントロールすることにより、感染性疾患のコントロールまたは処置を可能とする。
【０１４６】
本開示の多様な実施形態では、ベクター系は、１用量単位当たり１×１０１１ｉｖｐを超えないか、好ましくは、１×１０１０ｉｖｐを超えないか、より好ましくは、１×１０９ｉｖｐを超えないか、なおより好ましくは、１×１０７ｉｖｐまたは１×１０６ｉｖｐを超えない濃度で存在する。これは特に、本明細書で開示される医療処置に当てはまるが、これらに限定されない。
【０１４７】
さらに、本開示の多様な実施形態では ウイルス粒子は、１用量単位当たり１×１０１１ｉｖｐを超えないか、好ましくは、１×１０１０ｉｖｐを超えないか、より好ましくは、１×１０９ｉｖｐを超えないか、なおより好ましくは、１×１０７ｉｖｐまたは１×１０６ｉｖｐを超えない濃度で存在する。これは特に、本明細書で開示される医療処置に当てはまるが、これらに限定されない。
【０１４８】
多様な実施形態では、５×１０６ｉｖｐ（感染性ウイルス粒子）の、本開示の新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を、それを必要とする患者へと投与する。他の多様な実施形態では、５×１０７ｉｖｐの、本開示の新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を、それを必要とする患者へと投与する。他の多様な実施形態では、５×１０８ｉｖｐの、本開示の新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子を、それを必要とする患者へと投与する。
【０１４９】
本開示では、「医薬」または「医薬組成物」という用語を、互換的に使用することができる。医薬または医薬組成物は、固体形態、半固体形態、または液体形態など、投与に適する任意の形態でありうる。製剤は、溶液、エマルジョン、または懸濁液のうちのいずれか１つであるがこれらに限定されないものでありうる。当業者には、本医薬調製物を製剤化するための手段および方法が公知であり、それ自体公知の方式で製造することができる。医薬（または医薬組成物）は、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせて投与することができる。当技術分野では、薬学的に許容される担体が周知であり、生理食塩液、緩衝生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、アミノ酸、滅菌等張性水性緩衝液、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０１５０】
本開示の活性薬剤（例えば、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子）、組成物、および医薬は、非経口投与することができる。これらの活性化合物の溶液または懸濁液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの油中の混合物中でも調製することができる。例示的な油は、石油由来、動物由来、植物由来、または合成由来、例えば、ラッカセイ油由来、ダイズ油由来、または鉱物油由来の油である。一般に、水、生理食塩液、デキストロース水溶液、および関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射用溶液に好ましい液体担体である。通常の保存条件下および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。当技術分野では、非経口薬物送達および経口（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）薬物送達のための製剤が公知であり、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing (1995)において明示されている。
【０１５１】
注射使用に適する医薬形態は、滅菌水性溶液または滅菌分散液、および滅菌注射用溶液または滅菌分散液を即席で調製するための滅菌粉末を含む。全ての場合に、形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジャビリティーが存在する程度に、流体でなければならない。形態は、製造条件下および保存条件下で安定的でなければならず、細菌および真菌など、微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、これらの適切な混合物、および植物油を含有する、溶媒または分散媒でありうる。
【０１５２】
本開示に従い処置される対象は、がん、感染性疾患、もしくは免疫系障害を発症する危険性があるか、またはこれらを発症した対象である。このような対象は、ヒトおよび非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物または鳥類種を含む。例示的な哺乳動物対象は、限定せずに述べると、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、齧歯動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、およびブタを含む。例示的な鳥類対象は、限定せずに述べると、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、アヒル、またはカモを含む。
【０１５３】
本開示の、治療または予防のための、活性薬剤、組成物、または医薬の有効量は、意図される目標、例えば、腫瘍または感染性疾患に対する免疫応答の刺激に基づき決定される。当業者は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、どのようにして遺伝子送達を適用するのかについて、十分に承知している。ウイルスベクターでは一般に、ウイルスベクター原液を調製する。ウイルスの種類および達成可能な力価に応じて、少なくとも約１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、または１×１０１２個の感染性ウイルス粒子、最大で約これらの数、もしくは約これらの数の感染性ウイルス粒子、またはこれらの間の任意の値もしくは範囲の数の感染性ウイルス粒子を、対象へと送達する。他の態様では、本開示に従うウイルスベクターは、単回投与で投与することもでき、複数回投与で投与することもできる。ウイルスベクターは、１×１０５個の感染性ウイルス粒子（ｉｖｐ）、５×１０５ｉｖｐ、少なくとも１×１０６ｉｖｐ、５×１０６または約５×１０６ｉｖｐ、１×１０７、少なくとも１×１０７ｉｖｐ、１×１０８または約１×１０８ｉｖｐ、少なくとも１×１０８ｉｖｐ、約５×１０８ｉｖｐまたは少なくとも５×１０８ｉｖｐ、１×１０９または少なくとも１×１０９ｉｖｐ、５×１０９または少なくとも５×１０９ｉｖｐ、１×１０１０ｉｖｐまたは少なくとも１×１０１０ｉｖｐ、５×１０１０または少なくとも５×１０１０ｉｖｐ、１×１０１１または少なくとも１×１０１１、１×１０１２または少なくとも１×１０１２、１×１０１３または少なくとも１×１０１３ｉｖｐの投与量で投与することができる。例えば、ウイルスベクターは、約１０７〜１０１３ｉｖｐの間、約１０８〜１０１３ｉｖｐの間、約１０８〜１０１２ｉｖｐの間、または約１０９〜１０１２ｉｖｐの間の投与量で投与することができる。
【０１５４】
治療効果は、本開示の活性薬剤（例えば、ベクター系またはウイルス粒子）、組成物、または医薬の、１回の投与だけにより達成することができる。他方、処置は、複数回投与を含有しうる。
【０１５５】
ベクターの有効用量は、少なくとも、処置を必要とする対象、疾患の種類、および疾患の病期に依存する。用量は、例えば、約１×１０８ｉｖｐ（感染性ウイルス粒子）〜約１×１０１４ｉｖｐ、具体的には、約１×１０９ｉｖｐ〜約１×１０１３ｉｖｐで変動する場合があり、より具体的には、約５×１０９ｉｖｐ〜約１×１０１２ｉｖｐで変動する場合がある。
【０１５６】
本開示の活性薬剤（例えば、ベクター系またはウイルス粒子）、組成物、または医薬の投与は、当業者に公知の、任意の適切な方法により行うことができる。本開示の一実施形態では、投与を、腫瘍内注射、動脈内注射、静脈内注射、胸膜内注射、膀胱内注射、腔内注射もしくは腹腔内注射、または経口投与により行う。本開示の別の実施形態では、投与を、筋内、皮内、皮下、非経口、鼻腔内、髄腔内、経皮、脊髄内、眼内、または頭蓋内で行う。また、異なる投与経路を組み合わせることも可能である。好ましい実施形態では、投与を、腫瘍内投与、すなわち、本開示の活性薬剤（例えば、ベクター系またはウイルス粒子）、組成物、または医薬の、腫瘍への投与により行う。
【０１５７】
本開示の活性薬剤（例えば、ベクター系またはウイルス粒子）、組成物、または医薬はまた、他の治療剤もしくは治療法または処置の組合せと併せて（同時に、逐次的に、または共時的に）使用することもできる。例えば、本開示の治療法または使用はさらに、放射線治療、化学療法、他の薬物、例えば、腫瘍増殖機構に対処する抗体の投与、免疫細胞チェックポイント標的、がんワクチン、または任意の臨床操作も含みうる。
【０１５８】
本明細書で記載される通り、免疫刺激（すなわち、特に、目的の部位への（例えば、腫瘍、または感染の粘膜部位への）免疫刺激により誘導され、活性化され、かつ／または刺激された細胞を引き込むか、または動員するために、がん、感染性疾患、または免疫系障害の処置の文脈で、免疫応答機構を誘導し、制御し、かつ／または活性化させ、かつ／または刺激すること）のための方法および使用がもたらされる。免疫応答に関与する免疫系の細胞を一般に、免疫細胞と称し、リンパ球と、アクセサリー細胞などの非リンパ系細胞とを含む。リンパ球は、外来抗原を特異的に認識し、これに応答する細胞である。リンパ球の主要なクラスは、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）と、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）と、大型の顆粒状リンパ球である、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とを含む。Ｂ細胞は、抗体を産生することが可能である。Ｔリンパ球はさらに細分され、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋  Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋  Ｔ細胞）を含む。ヘルパー細胞は、サイトカインを分泌し、Ｔ細胞、ならびにＢ細胞およびマクロファージを含む他の細胞の増殖および分化を促進し、炎症性白血球を動員し、活性化させる。調節性Ｔ細胞またはサプレッサーＴ細胞と呼ばれる、Ｔ細胞の別の亜群は、免疫系の活性化を、能動的に抑制し、病理学的な自己反応性、すなわち、自己免疫疾患を防止する。
【０１５９】
本明細書で記載される免疫刺激法は、多様な種類のＴ細胞を伴う細胞媒介性免疫応答を誘導すると考えられる。細胞媒介性応答では、多様な種類のＴリンパ球が、多数の機構により、抗原を消失させるように作用する。例えば、特異的抗原を認識することが可能なヘルパーＴ細胞は、サイトカインなどの可溶性メディエーターを放出することにより応答して、さらなる免疫系の細胞を、免疫応答に参与するように動員しうる。細胞傷害性Ｔ細胞もまた、抗原を特異的に認識することが可能であり、抗原保有細胞または抗原保有粒子に結合し、これらを破壊または損傷することにより応答しうる。
【０１６０】
宿主または対象における免疫応答は、当業者が精通している、任意の数の周知の免疫学的方法により決定することができる。本明細書で記載される通り、免疫応答の存在およびレベルを決定するための方法および技法は、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光分極、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動、シンチレーション近接アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、蛍光消光型酵素基質、発色型酵素基質、および電気化学発光、イムノアッセイ（酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロット法、免疫組織化学など）、表面プラズモン共鳴、レポーター遺伝子を使用するアッセイなど、細胞ベースのアッセイ、機能的アッセイ（例えば、免疫機能および免疫応答性を測定するアッセイ）を含む。
【０１６１】
このようなアッセイは、可溶性抗体、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−ａ、およびＴＧＦ−β）、リンホカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子などのほか、他の可溶性の小型ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド、および／または脂質メディエーターなどの可溶性メディエーターの存在およびレベルの、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける決定を含むがこれらに限定する必要はない。サイトカインのレベルは、当技術分野で記載および実施されている方法であって、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色、およびフローサイトメトリー、ならびにこれらの組合せ（例えば、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー）を含む方法に従い決定することができる。
【０１６２】
イムノアッセイはまた、免疫系の細胞の機能的特性または構造的特性の変更、例えば、細胞の増殖、運動性の変更、特異的遺伝子の発現または細胞溶解性挙動など、特化した活性の誘導；刺激に応答した樹状細胞の成熟など、細胞の成熟；Ｔｈ１応答と、Ｔｈ２応答との間の関係の変更；表面抗原発現プロファイルの変更またはアポトーシス（プログラム細胞死）の開始を含む、免疫系の細胞による細胞の分化を解析することにより、細胞の活性化状態の変化を決定することも含む。他の方法もまた、抗原特異性ＣＤ４＋  Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）、および／または組織常在性メモリーＴ細胞（Ｔｒｍ）などであるがこれらに限定されない、多様な免疫細胞集団を同定する細胞表面マーカーを測定するために利用可能である。これらのアッセイおよび同様のアッセイを実施するための手順は、文献に記載されている。ＣＴＬ活性（またはＣＤ８＋  Ｔ細胞活性）を決定するための細胞傷害作用アッセイは、当技術分野で常套的に実施されるいくつかの技法および方法のうちのいずれか１つを使用して実施することができる。
【０１６３】
特定の実施形態では、本明細書で開示される方法および使用の後に、局所浸潤性抗原特異的Ｔ細胞の２〜５０倍の増大が観察される。ある特定の実施形態では、局所浸潤性（例えば、腫瘍−浸潤性）抗原特異的Ｔ細胞の、２〜４０倍の増大、２〜３０倍の増大、２〜２０倍の増大、２〜１０倍の増大、３〜８倍の増大、４〜７倍の増大、または５〜６倍の増大が観察される。一般に、局所浸潤性抗原特異的Ｔ細胞の増大を、投与の非存在下で存在する局所浸潤性抗原特異的Ｔ細胞の数と比較するか、または適切な対照投与と比較する。本明細書で開示される方法および使用は、本開示の活性薬剤、組成物、または医薬の投与の非存在下における適切な対照と比較した、局所浸潤性抗原特異的Ｔ細胞の増大を、統計学的、生物学的、および／または臨床的に有意な形でもたらすと考えられる。
【０１６４】
本明細書で開示される方法に従う、本開示の活性薬剤（例えば、ベクター系またはウイルス粒子）、組成物、または医薬による処置を施された対象における免疫応答の存在およびレベルを決定するために、生物学的試料を、対象から得ることができる。本明細書で使用される「生物学的試料」とは、血液試料（そこから、血清または血漿を調製しうる）、アフェレーシス試料、生検検体、腫瘍生検検体、体液（例えば、肺洗浄液、腹水、粘膜洗浄液、滑液）、骨髄、リンパ節、組織移植片、臓器培養物、または対象もしくは生物学的供給源に由来する、他の任意の組織調製物もしくは細胞調製物でありうる。
【０１６５】
免疫応答を決定するための、本明細書で記載される、全てのイムノアッセイおよび方法に関して、当業者はまた、これらの方法を実施する場合に、どの対照を含めると適切であるのかもたやすく察知し、理解するであろう。反応成分の相互作用を可能とするのに十分な、反応成分の濃度、緩衝液、温度、および時間は、当業者が精通する方法に従い、決定および／または調整することができる。
【０１６６】
本開示の別の態様は、腫瘍微小環境内のＴ細胞を増大させる方法であって、腫瘍を有する対象へと、本明細書で開示される方法に従う、本開示の活性薬剤（例えば、ベクター系またはウイルス粒子）、組成物、または医薬を投与し、これにより、腫瘍に対する免疫応答を誘導するステップを含む方法を提示する。医療技術分野の当業者により理解される通り、「〜を処置する」および「処置」という用語は、対象（すなわち、患者）の疾患、障害、または状態の医学的管理を指す。一般に、適切な投与レジメンおよび処置レジメンは、本開示の活性薬剤（例えば、ベクター系またはウイルス粒子）、組成物、または医薬を、治療および／または予防利益をもたらすのに十分な量で施す。治療および／または予防利益は、例えば、臨床転帰の改善、治療処置および予防措置または防止措置の両方を含み、この場合、目的は、所望されない生理学的変化もしくは障害を、防止するか、もしくは緩徐化するか、もしくは遅延させる（減じる）か、またはこのような疾患もしくは障害の拡大もしくは重症度を、防止するか、もしくは緩徐化するか、もしくは遅らせる（減じる）ことである。対象を処置することによる、有益な臨床結果または所望される臨床結果は、処置される疾患または障害から生じるか、またはこれらと関連する症状の、除去、軽減、または緩和；症状の発生の低下；生活の質の改善；無病状態の長期化（すなわち、それに基づき疾患の診断がなされる症状を、対象が提示する可能性または傾向の減少）、疾患の程度の減弱；疾患状態の安定化（すなわち、非悪化）；疾患進行の遅延または緩徐化；疾患状態の改善または抑制；および検出可能であれ、検出不能であれ、寛解（部分寛解であれ、完全寛解であれ）；ならびに／または全生存を含むがこれらに限定されない。「処置」とはまた、対象が処置を施されなかった場合に予測される生存と比較して、生存を延長することも意味する。処置を必要とする対象は、疾患または障害を既に有する対象、ならびに疾患または障害を有する傾向があるか、またはこれを発症する危険性がある対象を含む。本開示に従うベクター系を含む核酸分子を、細胞へと、当技術分野で記載されるいくつかの方法のうちのいずれか１つに従い送達することができる。当業者に公知のこのような送達法は、リポソームへの封入、イオントフォレーシスによるもの、または生体分解性ポリマー；ハイドロゲル；シクロデキストリン；ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡマイクロスフェア；生体分解性ナノカプセル；および生体接着性マイクロスフェアなど、他の媒体への組込みによるもの、またはタンパク質性ベクターによるものを含むがこれらに制約されない。
【０１６７】
本開示は、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）を含むタンパク質の組合せであって、４−１ＢＢＬの量が、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の量より高量である組合せを提示する。
【０１６８】
多様な実施形態では、４−１ＢＢリガンドは、配列番号２（図１３）のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含み、この場合、４−１ＢＢリガンドは、Ｔ細胞、好ましくは、活性化したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に特異的に結合することが可能である。好ましくは、４−１ＢＢリガンドは、配列番号２（図１３）のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含み、この場合、４−１ＢＢリガンドは、Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に特異的に結合することが可能である。より好ましくは、４−１ＢＢリガンドは、配列番号２（図１３）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含み、この場合、４−１ＢＢリガンドは、Ｔ細胞、好ましくは、活性化したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に特異的に結合することが可能である。なおより好ましくは、４−１ＢＢリガンドは、配列番号２（図１３）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９５％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含み、この場合、４−１ＢＢリガンドは、Ｔ細胞、好ましくは、活性化したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に特異的に結合することが可能である。ある特定の実施形態では、上記で記載した４−１ＢＢＬの変異体は、配列番号２（図１３）のアミノ酸配列を有する、天然の４−１ＢＢＬと同じ、Ｔ細胞、好ましくは、活性化したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に対する結合特異性を呈する。
【０１６９】
本開示の多様な実施形態では、ＩＬ−２タンパク質は、配列番号４（図１４）のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、ＩＬ−２タンパク質は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。好ましくは、ＩＬ−２タンパク質は、配列番号４（図１４）のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、ＩＬ−２タンパク質は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。より好ましくは、ＩＬ−２タンパク質は、配列番号４（図１４）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、ＩＬ−２タンパク質は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。なおより好ましくは、ＩＬ−２タンパク質は、配列番号４（図１４）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９５％の相同性または配列同一性を示し、この場合、ＩＬ−２タンパク質は、免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。ある特定の実施形態では、上記で記載したＩＬ−２の変異体は、配列番号４（図１４）のアミノ酸配列を有する、天然のＩＬ−２と同じ免疫刺激活性、好ましくは、ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を呈する。
【０１７０】
本開示の多様な実施形態では、ｓｃＩＬ−１２タンパク質は、配列番号６（図１５）のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この場合、ｓｃＩＬ−１２タンパク質は、免疫刺激活性、好ましくは、単球、ヘルパーＴ細胞、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。好ましくは、ｓｃＩＬ−１２タンパク質は、配列番号６（図１５）のアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この場合、ｓｃＩＬ−１２タンパク質は、免疫刺激活性、好ましくは、単球、ヘルパーＴ細胞、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。より好ましくは、ｓｃＩＬ−１２タンパク質は、配列番号６（図１５）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この場合、ｓｃＩＬ−１２タンパク質は、免疫刺激活性、好ましくは、単球、ヘルパーＴ細胞、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。なおより好ましくは、ｓｃＩＬ−１２タンパク質は、配列番号６（図１５）のアミノ酸配列に対する、少なくとも９５％の相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この場合、ｓｃＩＬ−１２タンパク質は、免疫刺激活性、好ましくは、単球、ヘルパーＴ細胞、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を有する。ある特定の実施形態では、上記で記載したｓｃＩＬ−２の変異体は、配列番号６（図１５）のアミノ酸配列を有する、天然のｓｃＩＬ−２と同じ免疫刺激活性、好ましくは、単球、ヘルパーＴ細胞、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激する活性を呈する。
【０１７１】
本明細書で開示される通り、タンパク質は、それが、天然ＩＬ−１２タンパク質の２つのサブユニットであるｐ３５およびｐ４０を、融合タンパク質として含むアミノ酸配列を含む場合、ｓｃＩＬ−１２タンパク質と考えられる。配列番号８および１０の配列は、ヒトＩＬ−１２の、４０ｋＤａのサブユニットおよび３５ｋＤａのサブユニットのアミノ酸配列を示す。ある特定の実施形態では、上記で記載したｓｃＩＬ−１２の変異体は、配列番号８および１０のアミノ酸配列によりコードされる天然ｓｃＩＬ−１２と同じ免疫刺激活性を呈する。好ましくは、本開示のｓｃＩＬ−１２のリンカーは、ペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーである。本開示は、本明細書で記載される、ｓｃＩＬ−１２の変異体であって、特に、図１５（配列番号５および６）に太字で示されるリンカー配列を、リンカー配列の長さに関して、特異的に修飾した変異体を包含する。リンカーのアミノ酸配列の長さは、経験的に選択することもでき、構造情報による誘導により選択することもでき、２つの手法の組合せを使用して選択することもできる。当業者は、長さまたは組成が変動する、多くのこのような配列であって、それらが長過ぎも短過ぎもしないことを主要な検討事項とするリンカーとして用いられうる配列が存在することを認識するであろう。
【０１７２】
本開示により提示される、新規のベクター／ベクター系またはウイルス粒子は、キットとしてパッケージングすることができる。キットは、任意選択で、使用および投与のための指示書、デバイス（例えば、１または複数の組成物を、対象へと投与するための）、ならびにさらなる試薬、ならびに方法の実施および使用のための構成要素であって、試験管、容器、例えば、バイアルおよびシリンジなどの構成要素など、１または複数の構成要素を含みうる。本明細書ではまた、本開示のベクター系をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むキットも想定される。本明細書ではまた、本開示のベクター系またはウイルス粒子を形質導入またはトランスフェクトされたがん細胞を含むキットも想定される。本明細書ではまた、本開示の活性薬剤、組成物、または医薬を含むキットも想定される。本明細書ではまた、本開示の新規のウイルスベクター／ベクター系と、任意選択で、成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列とを含むキットも想定される。
【０１７３】
本開示に照らして、本明細書の別の箇所で記載される態様および実施形態の文脈にあると考えられる以下の項目も、これらに限定せずに述べると、本明細書に包含される。
１．４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、およびＩＬ−２をコードする遺伝子であって、５’〜３’方向に、１、２、３の順序で、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子が、１位にはないことを条件として構成した、遺伝子の核酸配列を含むベクター。
２．アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、ナノ粒子ベクター、およびネイキッドＤＮＡのうちのいずれか１つである、項目１のベクター。
３．ＲＮＡベクターが、修飾リボヌクレオチドの挿入を含む、項目２のベクター。
４．４−１ＢＢＬをコードする遺伝子の核酸配列が、ヒトｃＤＮＡであり、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子の核酸配列が、ヒトｃＤＮＡであり、かつ／またはＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列が、ヒトｃＤＮＡである、項目１〜３のうちのいずれか１つのベクター。
５．４−１ＢＢＬをコードする遺伝子の核酸配列が、配列番号１（図１３）の核酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列が、Ｔ細胞、好ましくは、活性化Ｔ細胞に特異的に結合することが可能な、４−１ＢＢＬタンパク質をコードする、項目１〜４のうちのいずれか１つのベクター。
６．ＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列が、配列番号３（図１４）の核酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列が、免疫刺激活性を有するＩＬ−２タンパク質をコードする、項目１〜４のうちのいずれか１つのベクター。
７．ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子の核酸配列が、配列番号５（図１５）の核酸配列に対する、少なくとも７０％の相同性または配列同一性を示し、この場合、変異体の核酸配列が、免疫刺激活性を有するｓｃＩＬ−１２タンパク質をコードする、項目１〜４のうちのいずれか１つのベクター。
８．ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする遺伝子の核酸配列の下流に配置する、項目１〜７のうちのいずれか１つのベクター。
９．ＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列を、４−１ＢＢＬをコードする遺伝子の核酸配列の下流に配置し、ｓｃＩＬ−１２をコードする遺伝子の核酸配列を、ＩＬ−２をコードする核酸配列の下流に配置する、項目８のベクター。
１０．プロモーターを、４−１ＢＢＬをコードする遺伝子の核酸配列の上流に配置するが、ｓｃＩＬ−１２および／またはＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列の上流には配置しない、項目８または９のベクター。
１１．４−１ＢＢＬ、ｓｃＩＬ−１２、およびＩＬ−２をコードする遺伝子の核酸配列を、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により連結した、項目８〜１０のうちのいずれか１つのベクター。
１２．項目１〜１１のうちのいずれか１つのベクターを含むウイルス粒子。
１３．項目１〜１１のうちのいずれか１つのベクターをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
１４．項目１〜１１のうちのいずれか１つのベクター、または項目１２のウイルス粒子を形質導入またはトランスフェクトされたがん細胞または免疫細胞。
１５．項目１〜１１のうちのいずれか１つのベクター、項目１２のウイルス粒子、項目１３のポリヌクレオチド、または項目１４のがん細胞もしくは免疫細胞を含む組成物。
１６．項目１〜１１のうちのいずれか１つのベクター、項目１２のウイルス粒子、項目１３のポリヌクレオチド、または項目１４のがん細胞もしくは免疫細胞を含む医薬。
１７．がん、ウイルス感染、および／または免疫系障害を処置する方法における使用のための、項目１〜１１のうちのいずれか１つのベクター、項目１２のウイルス粒子、項目１３のポリヌクレオチド、項目１４のがん細胞もしくは免疫細胞、項目１５の組成物、または項目１６の医薬。
１８．がんが、乳がん、前立腺がん、リンパ腫、皮膚がん、膵臓がん、結腸がん、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣がん、脳がん、原発脳癌、頭頸部がん、神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、頭部または頸部癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、前立腺癌、尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵臓膵島細胞腫、悪性カルチノイド癌、絨毛癌、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血症、子宮頸過形成、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、中皮腫、骨肉腫、原発マクログロブリン血症、および網膜芽細胞腫のうちのいずれか１つである、項目１７による使用のためのベクター、項目１７による使用のためのウイルス粒子、項目１７による使用のためのポリヌクレオチド、項目１７による使用のためのがん細胞もしくは免疫細胞、項目１７による使用のための組成物、または項目１７による使用のための医薬。
１９．がんの転移を防止または処置する方法における使用のための、項目１〜１１のうちのいずれか１つのベクター、項目１２のウイルス粒子、項目１３の組成物、または項目１４の医薬。
２０．ベクター系が、１用量単位当たり１×１０１１ｉｖｐ（感染性ウイルス粒子）を超えないか、好ましくは、１×１０１０ｉｖｐを超えないか、より好ましくは、１×１０９ｉｖｐを超えないか、なおより好ましくは、１×１０７ｉｖｐまたは１×１０６ｉｖｐを超えない濃度で存在することを特徴とする、項目１７〜１９のうちのいずれか１つの使用のためのベクター。
２１．ウイルス粒子が、１用量単位当たり１×１０１１ｉｖｐを超えないか、好ましくは、１×１０１０ｉｖｐを超えないか、より好ましくは、１×１０９ｉｖｐを超えないか、なおより好ましくは、１×１０７ｉｖｐまたは１×１０６ｉｖｐを超えない濃度で存在することを特徴とする、項目１７〜１９のうちのいずれか１つの使用のためのウイルス粒子。
２２．４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）を含むタンパク質の組合せであって、４−１ＢＢＬの量が、ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の量より高量である組合せ。
【０１７４】
本開示は、それらは、変動しうるので、本明細書で記載される特定の方法、プロトコール、細胞株、属、および試薬に限定されるものでないことを認められたい。また、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態について記載することだけを目的とするものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではないことも認められたい。
【０１７５】
以下の実施例は、例示を目的として示されるものであり、限定を目的として示されるものではない。
【０１７６】
当業者には、本開示に照らし、他の実施形態および使用も明らかとなるであろう。以下の例は、多様な実施形態についての例示的な例だけとして提示されるものであり、いかなる形であれ、本開示を限定するものとは見なされないものとする。
【実施例】
【０１７７】
[実施例１]
マウスＩｍ０１およびヒトＩｍ０１による、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、および４−１ＢＢＬのトランス遺伝子の発現、ならびにＩＦＮ−γ応答
Ｉｍ０１は、以下のスキーム：
【０１７８】
【表２】
2019509760.tif 000003
において示される順序で、単鎖ＩＬ−１２、４−１ＢＢＬ、およびＩＬ−２のヒト遺伝子を含む発現構築物を含むアデノウイルスベクターである。
【０１７９】
ベクターＩｍ０１の構築については、国際公開第２００４／０３５７９９号パンフレットの図１に描示されている上記のスキームと共に、国際公開第２００４／０３５７９９号パンフレットに記載されている。国際公開第２００４／０３６７９９号パンフレットにおけるベクター名は、「Ａｄ−３」である。本開示では、早期ベクターの内部ベクターコードは、Ｉｍ０１である。
【０１８０】
ヒトＡ５４９細胞およびマウスＨｅｐａ１−６細胞に、３つのヒト遺伝子またはマウス遺伝子を、それぞれ、表示の感染多重度（ＭＯＩ；［カッコ］内に示された数字）で保有するＩｍ０１を、１時間にわたり形質導入した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはマウスリンパ球を、形質導入の４時間後に添加し、上清を、共培養の３４時間後に、サイトカインアッセイのために回収した。サイトカインレベルを、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により検出した。腫瘍細胞を解離し、フローサイトメトリーにより、４−１ＢＢＬの発現についてアッセイした。結果として、マウスベクターおよびヒトベクターのアーキテクチャーは同一であるが、トランス遺伝子の発現レベルは、ヒトＩｍ０１が、マウスのＩｍ０１の、最大１５倍のＩＬ−１２発現を示すという点で、明らかに、マウス種とヒト種との間で変化する。臨床状況では、このようなＩＬ−１２レベルの上昇は、毒性の危険性および治療への適用可能性の制限をもたらす。
【０１８１】
[実施例２]
ベクターのデザインおよび研究の概観
Ｉｍ０２
本開示に従うベクターは、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける治療シミュレーション研究のために、デザインされ、作製されている。ベクターは、アデノウイルスベクターに基づき、Ｉｍ０２（内部ベクターコード：「Ｉｍ０２」）と名付けられている。Ｉｍ０２は、以下のスキーム：
【０１８２】
【表３】
2019509760.tif 000004
において示される順序で、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、および単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）のヒト遺伝子を含む発現構築物を含む。
【０１８３】
図２は、シャトルプラスミドであるｐＥ１．１  Ｉｍ０２についての、概略的遺伝子マップを示す。Ｉｍ０２の発現カセットを、例えば、アデノウイルスのベクターＤＮＡを保有するプラスミドへのサブクローニングに適する、プラスミドｐＥ１．１に基づく先駆的導入プラスミドとして例示する。より具体的には、アデノウイルスベクターＩｍ０２内に含有される発現カセットは、図１８に示される発現カセットであって、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む発現カセットである。本開示のベクターは、腫瘍内免疫微小環境の多価修飾により、膀胱がん内の腫瘍細胞に対する免疫防御機構を誘導することが同定されている。
【０１８４】
患者コホートの概観
ヒト腫瘍生検試料のｅｘ  ｖｉｖｏ培養物を、新規のベクター系のための研究モデルとして選び出した。試料は、Ｃｌｉｎｉｃ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、Ａｓｋｌｅｐｉｏｓ  ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｈａｍｂｕｒｇ−Ｂａｒｍｂｅｋにより提供された。合計で、４３人の患者に由来する、２４４例の腫瘍試料と、２７０例の正常膀胱組織対照生検とについて解析した。試料は、８例の患者から、経尿道的切除術（ＴＵＲ）時に回収し研究組入れ試料の大部分は、膀胱切除術に由来した。本研究では、腫瘍組織および膀胱組織を、早期〜後期と変化する広範な病期にわたり解析した。１６人の女性および２７人の男性に由来する試料を解析した。前立腺癌の共時的診断のために、この患者コホートにおける前処置は、連続ＴＵＲ、化学療法、または抗アンドロゲン療法であった。
【０１８５】
[実施例３]
Ｉｍ０２および早期ベクターＩｍ０１による、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２のトランス遺伝子の発現、ならびにＩＦＮ−γ応答
Ｉｍ０２（実施例２を参照されたい）および早期ベクターＩｍ０１（実施例１を参照されたい）による、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２のトランス遺伝子の発現、ならびにＩＦＮ−γ応答を比較した。
【０１８６】
ヒトＡ５４９細胞に、Ｉｍ０１またはＩｍ０２を、図３に表示のＭＯＩ（感染多重度、すなわち、標的細胞１個当たりの感染性ウイルス粒子数）（ＭＯＩ；カッコ内の数字）で、１時間にわたり形質導入した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、形質導入の４時間後に添加し、上清を、共培養の３４時間後に、サイトカインアッセイのために回収した。サイトカインレベルを、ＥＬＩＳＡにより検出した。腫瘍細胞を解離し、４−１ＢＢＬについて陽性の細胞を、フローサイトメトリーにより検出した。表示のデータ点は、各例４連とする、４例の個々のドナーの平均値である。
【０１８７】
図３に示す通り、Ｉｍ０２内の４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２の遺伝子の配置は、Ｉｍ０１内の同じ遺伝子の配置と比較した、４−１ＢＢＬの発現の上昇であって、ＩＬ−１２の減少と共時的であり、ＩＦＮ−γ応答の増大をもたらす上昇をもたらす。
【０１８８】
特に、Ｉｍ０２内の、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２の遺伝子の配置は、早期ベクターＩｍ０１内の遺伝子の配置と比較して、平均値で、４−１ＢＢＬの発現の１．７倍の増大、およびＩＬ−２の発現の１．５倍の増大をもたらす。これは、ＩＬ−１２の発現レベルの２．６分の１の低下と組み合わされている。Ｉｍ０２内の遺伝子の配置により、ＩＬ−２／ＩＬ−１２のモル比は、平均で２．５％から、９．１％へと増大した。さらに、ＩＬ−２および４−１ＢＢＬの発現の増大は、ＭＯＩ２．５、５、１０、および５０の全ての用量範囲で検出される、１．４倍のＩＦＮ−γの誘導をもたらす。
【０１８９】
Ｉｍ０２は、Ｉｍ０１によるＩＦＮ−γ応答より優れたＩＦＮ−γ応答をもたらす。結果として、Ｉｍ０２は、早期ベクターＩｍ０１と比較した、免疫刺激効果の改善を示す。
【０１９０】
[実施例４]
組織ベースのモデルにおける、単一のベクターならびにＩｍ０２およびＩｍ０１の比較
ｓｃＩＬ−１２、ＩＬ−２、または４−１ＢＢＬを発現させるアデノウイルスベクターを使用する単回投与による処置単独、ならびにＩｍ０２およびＩｍ０１（後者のさらなる詳細については、実施例１を参照されたい）について検討した。
【０１９１】
Ｉｍ０２の、腫瘍微小環境に対する効果について研究するために、非解離腫瘍組織試料に基づく治療シミュレーションモデルを確立した。経尿道的切除術または膀胱切除術に由来する組織試料を使用した。
【０１９２】
膀胱腫瘍（「Ｔ」）組織および正常膀胱（「Ｂ」）組織に、１０８ｉｖｐ（感染性ウイルス粒子）のＩｍ０２またはＩｍ０１を形質導入した。酵素的ＬＤＨ放出アッセイを使用して、腫瘍組織試料および膀胱組織試料の生存率を、培養培地上清中でモニタリングした。トランス遺伝子の発現およびＩＦＮ−γ応答を、形質導入後６日目に、培養物上清中で、ＥＬＩＳＡにより測定した。結果を、図４に示す。ｓｃＩＬ−１２およびＩＬ−２の発現レベルが、単独で高度であってもなお、ＩＦＮ−γ応答は、バックグラウンドに近い。この結果は、膀胱組織および腫瘍組織の文脈における、３つの遺伝子の協同的作用を示唆する。さらに、Ｉｍ０２は、ＩＬ−２応答およびＩＦＮ−γ応答の、Ｉｍ０１と比較した増大をもたらす。図４は、早期ベクターＩｍ０１と比較した、Ｉｍ０２の、腫瘍微小環境内の免疫刺激効果の改善を示す。
【０１９３】
[実施例５]
異なる用量レベルにおける、Ｉｍ０２およびＩｍ０１の比較
Ｉｍ０２およびＩｍ０１（これらのベクターのさらなる詳細については、実施例２および３を参照されたい）を、漸増用量で、腫瘍微小環境内のトランス遺伝子の発現およびＩＦＮ−γ応答について比較した。
【０１９４】
腫瘍試料は、個々の患者に由来し、膀胱腫瘍（「Ｔ」）組織および正常膀胱（「Ｂ」）組織のマッチさせた対を、１０７〜１０８ｉｖｐ（感染性ウイルス粒子）の用量レベルについて検討した。発現を、ＥＬＩＳＡにより、６日目に測定した。結果を、図５に示す。異なる用量レベルで、Ｉｍ０２は、Ｉｍ０１のＩＦＮ−γ応答より優れたＩＦＮ−γ応答をもたらす。結果として、異なる用量レベルで、Ｉｍ０２は、早期ベクターＩｍ０１と比較した、腫瘍微小環境内の免疫刺激効果の改善を示す。
【０１９５】
[実施例６]
Ｉｍ０２およびＩｍ０１についての遺伝子発現プロファイリング
Ｉｍ０２についての治療用遺伝子発現プロファイルを示すために、トランスクリプトーム解析を実施した。特に、Ｉｍ０２およびＩｍ０１による、白血球活性化についての包括的プロファイルを得るために、腫瘍細胞およびＰＢＭＣによる共培養物実験の腫瘍細胞に、Ｉｍ０２、Ｉｍ０１、およびＡｄ０（空ベクター）を形質導入し、白血球についてのｍＲＮＡ遺伝子活性解析（ｌｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｈｉｐ  ＨＴ１２全ゲノム発現解析）を実施した。この目的で、形質導入の後で、末梢白血球を、共培養物へと添加した。非形質導入腫瘍細胞に対する白血球を、対照として使用した。４、２４、３２、４８、７２、および９６時間後に、白血球を回収し、ＲＮＡを単離および精製した。品質チェックの後、ＲＮＡを、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと逆転写し、ビーズチップのプロトコールに従い標識し、ビーズチップであるＨＴ１２へとロードし、走査を実施した（Ｌｉｆｅ  ＆  Ｂｒａｉｎ、ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｏｎｎ）。得られたデータを、ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｌｌｌｕｍｉｎａ）へと転送した。その後、ＩＰＡ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ）を使用して、データを査定した。示差的に調節された過程を示す、コア解析を実施した。調節された過程についての概観を得、それらの重要性と、関与する分子数とを例示するために、ＩＰＡ（登録商標）過程解析を実施した。表１および２を参照されたい。
【０１９６】
【表４】
2019509760.tif 000005
【０１９７】
【表５】
2019509760.tif 000006
【０１９８】
結果として、Ｉｍ０２は、生理学的発生および機能のうちで、最も強く調節される５つの過程（関与する分子の重要性および数により）の中の、調節される６１の遺伝子（表１の下方を参照されたい）を伴う、「細胞媒介性免疫応答」を特徴とする免疫刺激をもたらす。Ｉｍ０１（表２の下方を参照されたい）では、この場合、示差的に調節される分子が、合計２８だけであるため、この機能（すなわち、「細胞媒介性免疫応答」）は、生理学的発生および機能のうちで、最も強く調節される５つの過程の中に現れない。表中で言及されている他の系（血液系、免疫細胞のトラフィッキング、組織の形状、および一般的な組織発生のような）は、多価免疫療法剤により引き起こされる広範な変化を示唆する。トランスクリプトーム解析から明らかとなることは、Ｉｍ０２についての、治療用遺伝子の発現プロファイルは、固有であり、優れており、特に、早期ベクターＩｍ０１の発現プロファイルより優れていることである。
【０１９９】
調節される過程は、ＩＰＡ（登録商標）ソフトウェア（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、特異的に調節される（細胞）機能へと割り当てられている。これは、生物学的過程の活性化／不活化に関する、より正確な情報を可能とする。
【０２００】
結果として（データは示さない）、最も強く誘導される５つの機能は、リンパ球の活性化、単核白血球の活性化、白血球の細胞傷害作用、単核白血球の分化、およびＴリンパ球（Ｔ細胞）の活性化である。
【０２０１】
[実施例７]
主要な免疫細胞型の活性化についての遺伝子発現解析
全ての主要な免疫細胞型の存在および活性化状態について、遺伝子発現データの解析を可能とするＣＥＬＬＭＩＸソフトウェアを使用して、９６時間の時間経過にわたる、主要な免疫細胞型の活性化について解析した。図６の熱プロットは、ＲＴ−４ヒト膀胱がん細胞と共培養される、４日間（９６時間）の時間経過にわたる、Ｂ細胞（末梢血単核細胞、ＰＢＭＣ）を除く、全ての主要な血中免疫細胞亜型の活性化を例示する。図６に示す通り、Ｉｍ０２によるヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、Ｉｍ０１による同じ免疫細胞の活性化より優れている。
【０２０２】
[実施例８]
ｅｘ  ｖｉｖｏ組織についての研究結果
組織学による組織プロファイリング
組織の品質および細胞の組成のばらつきについて、ホルマリン固定およびパラフィン包埋の後、または組織の凍結および固定の後における組織切片内でモニタリングした。全般的な品質は、ヘマトキシリン−エオシン染色（ＨＥ）の後で査定した。
【０２０３】
図７に示す通り、Ｉｍ０２は、Ａｄ０対照ベクター（Ｂ）または単一遺伝子ベクター（データは示さない）では見られなかった、組織学的再配置（Ｃ）を誘導した。Ｉｍ０２により誘導される形状の変更であって、腫瘍組織（図７、パネルＣ）内で観察される変更は、対照Ａｄ０／ＡｄＮｕｌｌ（パネルＢ）または単一遺伝子ベクター（データは示さない）で処置された組織に照らした、免疫細胞浸潤物の数および分布を含む。
【０２０４】
さらに、図８は、Ｉｍ０２が、白血球浸潤物の分布および頻度の、明らかな組織学的再配置を誘導することを示す。図８の下パネル中の矢印は、細胞死の徴候を伴う腫瘍領域を指し示す。これらの形状の変化は、Ｉｍ０２により誘導される免疫応答についての組織学的証拠をもたらす。
【０２０５】
標的細胞型の同定
Ｉｍ０２を形質導入した組織についての透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を実施して、とりわけ、小胞膜の存在および形状、ならびに細胞１個当たりの粒子の存在度により判定される、アデノウイルス粒子の取込みの標的細胞型、取込みの経路を同定した。
【０２０６】
膀胱切除術による腫瘍組織を切除し、試料を、１０８ｉｖｐのＩｍ０２を含有する５００μｌの培養培地に３７℃で１時間にわたり浸漬することにより形質導入し、２％のグルタルアルデヒドを含有する氷冷固定液による培地の置きかえにより、取込みを停止させた。次いで、標準的な手順により、組織試料を加工し、Ｖｉｒｏｎｏｖａ  ＳＡ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎにより提供されている透過電子顕微鏡法により、画像を撮影した。
【０２０７】
陽性染色透過電子顕微鏡法では、アデノウイルス粒子を、約８０ｎｍのそれらのサイズおよび粒子形状により同定した。結果を、図９に示す。形質導入の１時間後、Ｉｍ０２アデノウイルス粒子は、微細構造的形状解析により同定される通り、様々な細胞型内で検出可能である。アデノウイルス粒子周囲の小胞構造の存在および形状は、取込み機構を指し示す。
【０２０８】
それらの個々の形状により、異なる細胞型を、膀胱癌試料中の標的細胞であって、腫瘍細胞（図示しない）、腫瘍間質の結合組織細胞（線維芽細胞、パネル４）、および免疫細胞を含む標的細胞として見出した。アデノウイルス粒子を、リンパ球形状（パネル３）および単球形状（パネル２）の細胞内で検出した。膀胱癌内では、単球形状は、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、または樹状細胞の存在を指し示す。
【０２０９】
重要なことには、同定されたこれらの標的免疫細胞の全ては、サイトカインを形質導入した後で、エフェクター細胞型への活性化および分化を経ることが記載されており、一方、４−１ＢＢＬの発現は、抗原提示細胞内およびリンパ球において発現する場合に、逆シグナル伝達により、過程の活性化を支援することが示されている（Ju et al., 2009, International Immunology, 21 (10), 1135-1144）ので、この知見は、作用方式について特に有用である。
【０２１０】
取込みの経路および存在度：アデノウイルス粒子は、標的細胞の細胞質内の、異なる位置において、異なる環境と共に見出された。古典的な取込みは、コックサッキーおよびアデノウイルス受容体への結合に続く、エンドサイトーシス小胞のシャトリングの後で媒介される。
【０２１１】
粒子を小胞形成の過程中にイメージングしたパネル６Ａでは、この経路が活性であることが示唆される。パネル６Ｂでは、アデノウイルス粒子は、他の未規定の構造もまた含有する、大型の小胞内に位置することから、取込みの飲作用的方式が示唆される。パネル３Ａでは、アデノウイルス粒子は、円形の膜構造内に捕捉されていることから、エンドサイトーシスによる取込みの進展が示唆された。
【０２１２】
組織試料の、Ｉｍ０２への、１時間に限る曝露を、将来の膀胱内点滴プロトコールに合致するものとして選び出した。本発明者による組織モデルでは、粒子は、数細胞層の深さの領域に達する。通常、細胞１個当たりのアデノウイルス粒子、最大で３０の群を同定した（パネル５Ａ）。
【０２１３】
[実施例９]
正常膀胱試料中および膀胱腫瘍試料中の、示差的発現の比較
正常膀胱組織および腫瘍組織に、１０８ｉｖｐのＩｍ０２を形質導入した。培養は、６日目まで継続した。示差的発現は、対照としてのＡｄ０（空アデノウイルスベクター）で処置された試料と比較して決定した。図１０は、９例の膀胱組織試料および１０例の腫瘍組織試料のプールについての結果を示す。全体的な刺激（すなわち、免疫応答過程の誘導）は、正常膀胱組織内より、腫瘍組織内で高度である（図１０を参照されたい）。この効果は、正常組織と腫瘍組織との、微小環境の差違、例えば、免疫細胞の浸潤物の数、または腫瘍細胞の近傍における抑制のレベルの差違を指示する。
【０２１４】
[実施例１０]
アデノウイルスを取り込むためのトランスフェクタントの検討
トランスフェクタント様ポリカチオン性化合物を添加することにより、無傷の膀胱組織へのアデノウイルスの取込みを改善することができる。Ｉｍ０２による、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける組織試料の灌流のために、細胞株のセット内の、候補化合物のスクリーンにおいて、プロタミン硫酸塩（１０μｇ／ｍｌ）が、コックサッキー−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の発現に依存しない、アデノウイルス生成物の取込みを可能とすることを同定した（図１１を参照されたい）。ヒト膀胱がん細胞株であるＲＴ−４が、ＣＡＲを発現するのに対し、マウス結腸がん細胞株であるＣＴ−２６は、ＣＡＲを発現しないことが報告されている。図１１のキャプション中に表示の通り、アデノウイルス生成物を、緩衝液中で製剤化した。ヒト膀胱がん細胞株であるＲＴ−４、およびＣＡＲ陰性マウス結腸がん細胞株であるＣＴ−２６に、標的細胞１個当たり、異なる多重度（ＭＯＩ：感染多重度）で、Ａｄ−ＧＦＰ（ＧＦＰを保有するアデノウイルスベクター）を形質導入した。結果を、形質導入の４８時間後における、ＧＦＰ陽性細胞の百分率であって、フローサイトメトリーにより測定される百分率として例示する。結果として、いずれの細胞株でも、１０μｇ／ｍｌのプロタミン硫酸塩は、最高の形質導入効率を可能とした。
【０２１５】
略号：Ｍｅｒｃｋ緩衝液：ｐＨ８．０の５ｍＭトリス、７５ｍＭのＮａＣｌ、５％のスクロース、０．００５％のポリソルベート８０、１ｍＭのＭｇＣｌ２；全てのさらなる添加物も、Ｍｅｒｃｋ緩衝液中で製剤化する；キトサン：１％、マンニトール：１Ｍ；プロタミン：１０μｇ／ｍｌのプロタミン硫酸塩、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８：０．００１％；ブレンド：スクロース、マンニトール、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８のブレンド。Ｍｅｒｃｋ緩衝液とは、トランスフェクタント添加剤の支援を伴わない基礎製剤を指し示す。ＣＡＲの存在は、低感染多重度（ＭＯＩ；標的細胞１個当たりの感染性ウイルス粒子）における、十分な形質導入により指し示される。ＣＡＲの非存在下では、取込みは、インテグリン媒介性の取込みを介する、低アフィニティーの取込みだけにより達成される。添加剤を伴わない効果を、ＣＴ−２６内（ＭＯＩを５０００とする場合の、＜５％の形質導入）と対比したＲＴ−４内（ＭＯＩを１００とする場合の、約２５％の形質導入）で例示する。１０μｇ／ｍｌのプロタミン硫酸塩の添加は、ＲＴ−４内の形質導入を倍加させ、ＣＴ−２６内の形質導入を３倍加させる。
【０２１６】
ｅｘ  ｖｉｖｏの組織培養物中ではまた、プロタミン硫酸塩の協同的アジュバント効果も見出された（図１２を参照されたい）。１０μｇ／ｍｌプロタミン硫酸塩の添加を伴うかまたは伴わずに、腫瘍組織および膀胱組織に、１０８ｉｖｐのＩｍ０２またはＡｄ０（空アデノウイルスベクター）を形質導入した。トランス遺伝子の発現と、応答サイトカインとしてのＩＦＮ−γの発現とを、形質導入後６日目の、培養物上清中で、ＥＬＩＳＡにより測定した。１０μｇ／ｍｌのプロタミン硫酸塩の存在下では、トランス遺伝子の発現が低度の場合であってもなお、応答サイトカインであるＩＦＮ−γの発現が高度であることから、プロタミン硫酸塩の存在下のＩｍ０２が、より多くの免疫細胞を刺激することが示唆される。
【０２１７】
細胞株のパネルについての結果と、標的細胞の状態についての査定とに基づき、この製剤を、ｅｘ  ｖｉｖｏの治療シミュレーション研究に適用した。
【０２１８】
[実施例１１]
異なるＭＯＩの、Ｉｍ０２および単一遺伝子発現ベクターによる、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２のトランス遺伝子の発現、ならびにＩＦＮ−γ応答
Ｉｍ０２と、単一遺伝子発現ベクターの組合せとによる、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびｓｃＩＬ−１２のトランス遺伝子の発現、ならびにＩＦＮ−γ応答は、ＩＦＮ−γの発現が、４−１ＢＢＬレベルの上昇に依存することを明らかにする。
【０２１９】
ヒトＡ５４９細胞に、カッコ内の数字で指し示される感染多重度（ＭＯＩ、すなわち、標的細胞１個当たりの感染性ウイルス粒子）の、Ｉｍ０２、またはｓｃＩＬ−１２、ＩＬ−２、および４−１ＢＢＬのそれぞれを発現させる、単一遺伝子アデノウイルスベクターの組合せを、１時間にわたり形質導入した（図１９を参照されたい）。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、形質導入の４時間後に添加し、上清を、共培養の３４時間後に、サイトカインアッセイのために回収した。サイトカインレベルを、ＥＬＩＳＡにより検出した。腫瘍細胞を解離し、４−１ＢＢＬについて陽性の細胞を、フローサイトメトリーにより検出した。表示のデータ点は、各例４連とする、４例の個々のドナーの平均値である。
【０２２０】
図１９に示す通り、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、および４−１ＢＢＬを単独で発現させる、ＭＯＩ［５］の単一遺伝子ベクターは、最大で４．２ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γの基礎レベルの誘導をもたらす。ＩＬ−１２およびＩＬ−２の組合せは、このレベルをそれほど上昇させない。いずれもＭＯＩ［５］の、レベルを一定とするＩＬ−１２およびＩＬ−２の、ＭＯＩ［１００］まで漸増するレベルの４−１ＢＢＬとの組合せは、中程度のＩＬ−１２レベルで、ＩＦＮ−γの誘導をもたらす。
【０２２１】
実施例３（図３を参照されたい）で記載したベクターＩｍ０１による発現のように、ＩＬ−１２の発現を、無際限に上昇させてはならないことに注意することが重要である。高度なＩＬ−１２発現は、免疫活性化の下方調節を誘導し、毒性を引き起こすと考えられる。この、高度なＩＦＮ−γ発現および中程度のＩＬ−１２発現の状態は、本開示のベクター、特に、ベクターＩｍ０２で示される、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２の配置により実現される。
【図１】
2019509760.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
2019509760.tif 000013
【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
2019509760.tif 000029
【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８−１】
2019509760.tif 000032
【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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