(57)【要約】  水中油ナノエマルション（ＮＥ）薬物送達システム中に封入されたω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートの組成物。水中油ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、癌を処置することによる、癌の処置方法。水中油ＮＥ薬物送達システム中に封入されたω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物に多剤耐性細胞を暴露し、多剤耐性細胞の死を誘導することによる、多剤耐性の克服方法。癌幹細胞の排除方法。癌幹細胞の幹細胞性を低下させる方法、薬物を身体内で保持する方法、及びより緩慢な放出プロファイルを提供する方法。
2019523226.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中油ナノエマルション（ＮＥ）薬物送達システム中に封入されたω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートを含む組成物。
【請求項２】
前記ＰＵＦＡが、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びα−リノレン酸（ＬＮＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートが、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲート中のタキソイドが、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＢＴ−１２１３、ＳＢＴ−１２８５４、ＳＢＴ−１２１３０３、ＳＢＴ−１２１６、ＳＢＴ−１１０３３、ＳＢＴ−１２１３１３、ＳＢＴ−１２１６０２、カバジタキセル、ＳＢＴ−１２１２、ＳＢＴ−１２１７、ＳＢＴ−１１０２、ＳＢＴ−１１０３、ＳＢＴ−１１０４、ＳＢＴ−１１０６、ＳＢＴ−１１０７、ＳＢＴ−１２１３０１、ＳＢＴ−１２１３０２、ＳＢＴ−１２１３０４、ＳＢＴ−１２１４０３、ＳＢＴ−１１０３１、ＳＢＴ−１１０３２、ＳＢＴ−１１０３４、ＳＢＴ−１２８５１、ＳＢＴ−１２８５２、ＳＢＴ−１２８５３、ＳＢＴ−１２８５５、ＳＢＴ−１２８５１−１、ＳＢＴ−１２８５１−３、ＳＢＴ−１２８５２−１、ＳＢＴ−１２８５２−３、ＳＢＴ−１２８５３−１、ＳＢＴ−１２８５３−３、ＳＢＴ−１２８５４−１、ＳＢＴ−１２８５４−３、ＳＢＴ−１２８５５−１及びＳＢＴ−１２８５５−３からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートが、ＤＨＡ−パクリタキセル、ＤＨＡ−ドセタキセル、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１３、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１１０３、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１１０４、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１６、ＬＮＡ−ＳＢＴ−１２１３、ＬＮＡ−パクリタキセル、ＬＮＡ−ドセタキセル、ＤＨＡ−カバジタキセル及びＬＮＡ−カバジタキセルからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートが、請求項４に記載のタキソイドのＤＨＡ又はＬＮＡエステルである、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記水中油ＮＥが、５０〜１０００ｎｍの範囲の平均液滴径を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記水中油ＮＥが、２００ｎｍ未満の平均液滴径を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記水中油ＮＥ中の油が、魚油、松の実油、亜麻仁油、ベニバナ油、サクラソウ油、クロフサスグリ油、ルリジサ油、コムギ胚芽油、チア油、大麻油、エゴマ油、ブドウ油、スクアレン油及び真菌油からなる群から選択されるω−３脂肪酸に富んだ食用油である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記油が、界面活性剤、標的化剤、画像コントラスト剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される物質により修飾されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートが、ナノ粒子中に封入されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、４℃で６カ月間まで物理的に安定である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、６カ月間まで安定な粒子サイズを有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートの溶液形態よりも増大された、身体内における保持時間を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートの溶液形態よりも少なくとも３倍緩慢な、前記身体内での放出プロファイルを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
癌の処置方法であって：
水中油ＮＥ薬物送達システム中に封入されたω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を、処置を必要とする患者に投与するステップと；
癌を処置するステップと、を含む、方法。
【請求項１８】
前記ＰＵＦＡが、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びα−リノレン酸（ＬＮＡ）からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートがＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲート中のタキソイドが、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＢＴ−１２１３、ＳＢＴ−１２８５４、ＳＢＴ−１２１３０３、ＳＢＴ−１２１６、ＳＢＴ−１１０３３、ＳＢＴ−１２１３１３、ＳＢＴ−１２１６０２、カバジタキセル、ＳＢＴ−１２１２、ＳＢＴ−１２１７、ＳＢＴ−１１０２、ＳＢＴ−１１０３、ＳＢＴ−１１０４、ＳＢＴ−１１０６、ＳＢＴ−１１０７、ＳＢＴ−１２１３０１、ＳＢＴ−１２１３０２、ＳＢＴ−１２１３０４、ＳＢＴ−１２１４０３、ＳＢＴ−１１０３１、ＳＢＴ−１１０３２、ＳＢＴ−１１０３４、ＳＢＴ−１２８５１、ＳＢＴ−１２８５２、ＳＢＴ−１２８５３、ＳＢＴ−１２８５５、ＳＢＴ−１２８５１−１、ＳＢＴ−１２８５１−３、ＳＢＴ−１２８５２−１、ＳＢＴ−１２８５２−３、ＳＢＴ−１２８５３−１、ＳＢＴ−１２８５３−３、ＳＢＴ−１２８５４−１、ＳＢＴ−１２８５４−３、ＳＢＴ−１２８５５−１及びＳＢＴ−１２８５５−３からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートが、ＤＨＡ−パクリタキセル、ＤＨＡ−ドセタキセル、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１３、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１１０３、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１１０４、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１６、ＬＮＡ−ＳＢＴ−１２１３、ＬＮＡ−パクリタキセル、ＬＮＡ−ドセタキセル、ＤＨＡ−カバジタキセル及びＬＮＡ−カバジタキセルからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートが、請求項２０に記載のタキソイドのＤＨＡ又はＬＮＡエステルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌、頭部及び頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵癌、黒色腫、脳癌、前立腺癌、白血病、肉腫、甲状腺癌、非ホジキンリンパ腫、膀胱癌、グリア細胞腫、子宮内膜癌、並びに腎癌からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
癌幹細胞内の幹細胞性促進遺伝子及び転写因子の発現を低減するステップを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記幹細胞性促進遺伝子が、ＡＢＣＧ２、ＡＣＡＮ、ＡＣＴＢ、ＡＩＮ１、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＰＩ、ＡＳＣＬ２、ＢＭＰ１、ＢＭＰ３、ＣＣＮＤ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ８Ｂ１、ＣＤＨ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＴＮＮＡ１、ＤＨＨ、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＴＸ１、ＤＶＬ１、ＦＧＦ１、ＦＧＦ３、ＦＧＦＲ１、ＦＺＤ１、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＪＡ１、ＧＪＢ１、ＩＧＦ１、ＩＳＬ１、ＪＡＧ１、ＫＲＴ１５、ＭＭＥ、ＭＳＸ１、ＭＹＯＤ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＣＡＭ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＵＭＢ、ＰＡＲＤ６Ａ、ＰＰＡＲＤ、ＲＢ１、ＲＰＬ１３Ａ、Ｓ１００Ｂ、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記転写因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
腫瘍の癌幹細胞構成成分を低減又は排除し、前記腫瘍を治療法に対してより感受性とするステップを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
チューブリンを急速に重合させ、細胞死を誘導するステップを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドの非コンジュゲート化型を前記対象に投与するステップを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、パクリタキセル感受性又はパクリタキセル耐性腫瘍を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤＸ２、ＤＬＸ２、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＧＲ、ＦＯＸＰ３、ＧＬＩ２、ＨＯＸファミリーＴＦ、ＩＲＸ４、ＪＵＮ、ＫＬＦ２、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ２Ｆ２、ＰＣＮＡ、ＰＩＴＸ３、ＰＯＵ４Ｆ１、ＳＩＸ２、ＳＯＸ９、ＷＴ１、及びそれらの組み合わせの発現を下方調節するステップを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍成長を抑制し、腫瘍縮小を誘導し、接着ホロクローンの生成を防止し、腫瘍の血管新生を防止するステップを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記投与するステップが、ヒト血清アルブミンに対する前記組成物の親和性に起因して、ｇｐ６０仲介による経細胞質輸送を介した腫瘍間質内への組成物の腫瘍特異的蓄積を提供するステップを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記医薬組成物の溶液形態よりも長期間、前記医薬組成物を前記対象内に保持するステップを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記医薬組成物が、前記医薬組成物の溶液形態よりも長期間、前記対象内の腫瘍中に保持される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記医薬組成物の溶液形態の放出プロファイルよりも少なくとも３倍緩慢な、前記医薬組成物の放出プロファイルを提供するステップを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
多剤耐性の克服方法であって：
水中油ＮＥ薬物送達システム中に封入されたω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物に多剤耐性細胞を暴露するステップと；
前記多剤耐性細胞の死を誘導するステップと、を含む、方法。
【請求項３８】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートがＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
癌幹細胞内の幹細胞性促進遺伝子及び転写因子の発現を低減するステップを更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記幹細胞性促進遺伝子が、ＡＢＣＧ２、ＡＣＡＮ、ＡＣＴＢ、ＡＩＮ１、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＰＩ、ＡＳＣＬ２、ＢＭＰ１、ＢＭＰ３、ＣＣＮＤ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ８Ｂ１、ＣＤＨ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＴＮＮＡ１、ＤＨＨ、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＴＸ１、ＤＶＬ１、ＦＧＦ１、ＦＧＦ３、ＦＧＦＲ１、ＦＺＤ１、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＪＡ１、ＧＪＢ１、ＩＧＦ１、ＩＳＬ１、ＪＡＧ１、ＫＲＴ１５、ＭＭＥ、ＭＳＸ１、ＭＹＯＤ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＣＡＭ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＵＭＢ、ＰＡＲＤ６Ａ、ＰＰＡＲＤ、ＲＢ１、ＲＰＬ１３Ａ、Ｓ１００Ｂ、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記転写因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
腫瘍の癌幹細胞構成成分を低減又は排除し、前記腫瘍を治療法に対してより感受性とするステップを更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
チューブリンを急速に重合させ、細胞死を誘導するステップを更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が、パクリタキセル感受性又はパクリタキセル耐性腫瘍を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
ＣＤＸ２、ＤＬＸ２、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＧＲ、ＦＯＸＰ３、ＧＬＩ２、ＨＯＸファミリーＴＦ、ＩＲＸ４、ＪＵＮ、ＫＬＦ２、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ２Ｆ２、ＰＣＮＡ、ＰＩＴＸ３、ＰＯＵ４Ｆ１、ＳＩＸ２、ＳＯＸ９、ＷＴ１、及びそれらの組み合わせの発現を下方調節するステップを更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍成長を抑制し、腫瘍縮小を誘導し、接着ホロクローンの生成を防止し、腫瘍の血管新生を防止するステップを更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記投与するステップが、ヒト血清アルブミンに対する前記組成物の親和性に起因して、ｇｐ６０仲介による経細胞質輸送を介した腫瘍間質内への組成物の腫瘍特異的蓄積を提供するステップを更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
癌幹細胞の排除方法であって：
水中油ＮＥ薬物送達システム中に封入されたω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物に癌幹細胞を暴露するステップと；
前記癌幹細胞の死を誘導するステップと、を含む、方法。
【請求項４９】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートがＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
癌幹細胞の幹細胞性を低下させる方法であって：
水中油ＮＥ薬物送達システム中に封入されたω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物に癌幹細胞を暴露するステップと；
前記癌幹細胞内の幹細胞性促進遺伝子の発現を低減するステップと、を含む、方法。
【請求項５１】
前記ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートがＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
対象の身体内におけるω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートの保持時間を増大させる方法であって：
ＮＥ薬物送達システム中に封入されたω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を投与するステップと；
前記医薬組成物の溶液形態よりも長期間、前記医薬組成物を前記身体内に保持するステップと、を含む、方法。
【請求項５３】
前記保持するステップが、前記医薬組成物の溶液形態よりも長期間、血漿及び腫瘍からなる群から選択される前記身体の範囲内に前記医薬組成物を保持するステップとして更に定義される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
対象の身体内でω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートのより緩慢な放出プロファイルを提供する方法であって：
ＮＥ薬物送達システム中に封入されたω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を投与するステップと；
前記医薬組成物の溶液形態よりも少なくとも３倍緩慢に前記医薬組成物を前記身体内に放出するステップと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を処置するための、特に癌幹細胞における多剤耐性を含む多剤耐性を克服するための治療薬及び方法に関する。特に、本発明は、例えば第３世代タキソイド等のタキソイド薬物のナノエマルション製剤及び送達システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、米国で２番目に多い死因である。他のヒト癌とは対照的に、前立腺癌（ＰｒＣ）の発症率及び死亡率は、最近十年間で有意に増大している。ＰｒＣ患者の７０％超が処置後の再発及び不治状態への疾病の移行に直面する。ヒト腫瘍は階層的に組織化され、この階層の最上部は悪性幹細胞が占め、この悪性幹細胞は無制限の自己複製及び腫瘍開始能力を有することが広く受け入れられている。発癌の最近の概念によれば、癌幹細胞（ＣＳＣ）の特定の表現型亜集団のみが腫瘍発達、並びに転移性及び薬物耐性細胞を含む腫瘍塊を構成する分化した子孫の全範囲の生成に関与している。ＣＳＣは、結腸直腸癌、膵癌及び前立腺癌を含む全ての主要なヒト癌タイプから単離されている。多くの癌タイプに関する多数の研究は、共通のＣＳＣマーカー、特にＣＤ１３３及びＣＤ４４を発現している腫瘍原生細胞が、従来の抗癌剤（５−ＦＵ、オキサリプラチン、イリノテカン、ドセタキセル及びその他等）に対して例外的に耐性であることを示している。
【０００３】
従来の及び新規な化学治療薬に対する多物耐性（ＭＤＲ）は、臨床的癌治療法に対する大変な困難を示している。ＭＤＲは、排他的にＣＳＣの性質というわけではないが、多くの証拠は、ＭＤＲがＣＳＣの存在と密接に関連していることを示している。ＣＳＣは、多数の機構に起因して化学療法に対して天然で耐性であり、当該機構には、それらの相対的な静止状態、それらのＤＮＡ修復に関する高い能力、多くの標準的な抗癌剤を排出するＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体のそれらの活性化、及びアポトーシスに対するそれらの耐性が挙げられる。ＣＳＣの静止状態は、化学療法及び放射線療法に対するそれらの耐性も促進する。更に、大部分の標準的な抗癌剤は、実際に静止状態のＣＳＣを刺激して自己複製させ、腫瘍に薬物耐性細胞を再配置させる。ＣＳＣはまた、無制限の細胞複製、自給自足及び長期生存等の、腫瘍表現型に決定的な多数の表現型特性を示す。これらの特性は、なぜ多くの癌療法が成熟腫瘍細胞の塊を殺滅する一方で、多くの場合失敗であるかを説明することを助け、その理由は、それらはＣＳＣを根絶しないからである。現在の前立腺癌処置は、主として、腫瘍性の、急激に成長する癌細胞の塊を標的とするが、ＣＳＣ亜集団を標的とせず、このことは殆どの前立腺癌療法で見られる、限定された延命効果の理由を提供し得る。ＣＳＣの生存部分は、外科的切除並びに／又は放射線及び化学療法による明らかに成功した、病変の大部分の除去後の腫瘍再発を殆ど不可避なものとする。
【０００４】
殆どの癌薬物がＣＳＣ亜集団に対処しないという事実は、開発中の抗癌剤が、他の疾病と比較して最も高い減少率を有するという事実を説明する：前臨床開発において抗癌活性を有する薬剤の５％のみが規制当局の承認を通過し、それでも僅かな利益のみを有し得る。特に、開発中の前立腺癌用の現在の抗癌剤は、他の癌と比較して有意に低い成功率を有する。一方、候補抗癌剤の前臨床評価は、伝統的に、単層培養物として成長した非選択の、高継代の商業的癌細胞株の使用に基づいている。しかしながら、長期のインビトロ維持は、更なるゲノム及びエピゲノム変化の蓄積、並びにドミナント細胞亜集団の選択をもたらす。実際に、最も一般的に使用されている樹立癌細胞株は、元の臨床サンプルと全く相関がなく、又は相関が低いことが最近示された。このことは、樹立細胞株の使用が、インビボ腫瘍の複雑性及び病態生理と関係しないため、ゲノム変化の研究、臨床的に関連する分子標的の発見、及び抗癌剤開発のためのこれらの細胞株の使用に問題があることを示唆している。上記の留意事項の全ては、臨床的に意義のある分子標的の発見におけるＣＳＣの重大な役割を強調し、ＣＳＣ標的化薬物開発、生理学的及び臨床的により関連した癌細胞の供給源、並びにより関連したインビトロ及びインビボモデルの緊急な必要性をもたらす。
【０００５】
最近、本出願人らは、未熟な幹様細胞の特徴を安定的に保持する、患者由来の超低継代の前立腺癌細胞株（ＰＰＴ２細胞株）を樹立した。以前の研究では、前立腺癌細胞のＣＤ１３３ｈｉ／ＣＤ４４ｈｉ表現型が、高い腫瘍−及びスフェロイド開始能力、可塑性（多数の細胞表現型を生じる能力）、並びに標準的な薬物に対する高い耐性を含む、明らかな幹細胞関連の特徴を示したことが示されている。これらの細胞は、過剰活性化発達経路を発現し、高いレベルの、胚幹細胞多能性を決定する数個の重要な転写因子を発現する。加えて、ＰＰＴ２細胞は、抗アポトーシスシグナル伝達及び薬物耐性に関連した多くの遺伝子を発現し、このことは、それらをＣＳＣ標的化薬物開発研究のための適切なモデルとする。
【０００６】
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｌａｎｄｅｒ、及び他のグループによる最近の研究では、分化した腫瘍及び癌幹細胞（ＣＳＣ）表現型の間を相互変換する癌細胞の驚異的な可塑性が示されている。臨床的研究努力により、表現型−ＣＳＣマーカーを有する細胞が、伝統的な化学治療薬を用いた処置後に、より蔓延し、またそれらの分化した対応物と比較してより腫瘍原生であることが示されている。ＣＳＣは有意な可塑性を有する「メタ状態」で存在し、従ってこれらの細胞は、腫瘍原性（ｔｕｍｏｒｇｅｎｉｃ）であり、かつ化学感受性又はＭＤＲ耐性のいずれかである細胞に分化し得る。
【０００７】
この情報は、分化した腫瘍細胞及びＣＳＣ集団の両方から生じるＭＤＲ機構を緩和するために、多数の「メタ表現型」状態に対処し、マルチモーダルな治療法の必要性を示唆する。パクリタキセル（ＰＸ）及びドセタキセル等の第１世代タキソイド薬物は、この必要性を満たさない。タキソイド薬物は、微小管を安定化し、細胞周期の後期Ｇ２又はＭ相を阻害することにより、細胞死をもたらす。ＰＸ及びドセタキセルは、臨床的に非常に活性であるが、乏しい薬物溶解度、骨髄抑制、末梢性感覚ニューロパチー、アレルギー反応、及び最終的な薬物耐性の発生等の重大な用量制限毒性を含むいくつかの臨床的問題を有する。これらの副作用の多数は、これらの抗悪性腫瘍薬の希釈に使用される溶媒：パクリタキセルの場合、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、及びドセタキセルの場合、ポリソルベート８０に関連している。加えて、報告はこれらの溶媒をＰＸ及びドセタキセル薬物動態プロファイルの望ましくない変化に関連付けている。第１世代タキソイドの主な欠点は、ＭＤＲ細胞に対して有効ではないことである。これらの薬物は、薬物を細胞の外に能動的に揚送し、薬物耐性を誘導するＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）、有効なＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体の基質である。このことは、なぜＰＸ及びドセタキセルが当初、乳癌、卵巣癌及び肺癌に対して有効であるが、結腸癌、膵癌、黒色腫及び腎癌に対して効力を示さないかを説明することを助ける。例えば、ヒト結腸癌腫は、Ｐｇｐの過剰発現に起因して本質的に多剤耐性である。従って、ＰＸは、マウスにおけるヒト結腸癌異種移植片に対して、いずれの認識できる効力も示さない。
【０００８】
第２世代タキソイドは、ＭＤＲ及びＣＳＣの問題に対する改善された解決法を提供する。ＰＸとは著しく対照的に、ＳＢＴ−１２１４等の多数の第２世代タキソイドは、ＭＤＲ表現型を発現している薬物耐性癌細胞に対して卓越した活性（ＰＸよりも２〜３桁強力）を示す。結腸直腸及び前立腺癌モデルを使用したいくつかの研究では、ＳＢＴ−１２１４はインビトロ及び異種移植片モデルの両方でＣＳＣを効果的に殺滅することが示された。ＳＢＴ−１２１４はまた固有のＰｇｐ調節能力を有することも見出された。ＳＢＴ−１２１４は、ＳＣＩＤマウスにおける高い薬物耐性（Ｐｇｐ＋）のいくつかの結腸腫瘍異種移植片に対して顕著な有効性を示し、全ての生存マウスにおいて完全な退行を誘導し、腫瘍成長遅延は＞１８７日であった。ＳＢＴ−１２１４による腫瘍再発の、観察された総抑制は、このタキソイドがＣＳＣを殺滅又は調節できることを示し得る。それ故、本発明者らは、３Ｄ培養物における癌スフェロイドを使用して、ＨＣＴ１１６、ＨＴ−２９及びＤＬＤ−１細胞株からの結腸ＣＳＣに対するＳＢＴ−１２１４の活性を調べた。ＨＣＴ１１６、ＨＴ−２９及びＤＬＤ−１スフェロイドに対する１００ｎＭ  ＳＢＴ−１２１４の４８時間の投与は、全細胞における２次スフェロイドの成長の著しい抑制をもたらした。最も重要なことには、この処置レジメンを生き残った生細胞は、２次スフェロイドを形成する能力を有意に喪失し、このことは結腸ＣＳＣ集団が臨床的に影響を受けたことを示している。また、ＳＢＴ−１２１４によるＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１及びＨＴ−２９  ＣＳＣの処理は、多数の幹細胞関連遺伝子の下方調節、及び多能性の保持に関与する遺伝子の有意な阻害をもたらすことが見出された。ＳＢＴ−１２１４は、調べた全ての結腸ＣＳＣ内で大部分の幹細胞関連遺伝子を阻害した。これらの遺伝子の多くは、自己複製、対称性／非対称分割の調節及び多能性に関連することに留意することは価値のあることである。これらの結果は、ＰＰＴ２細胞及び腫瘍に対する、この研究の非常に強力な細胞毒性抗腫瘍剤構成成分としてのこの新世代タキソイド、ＳＢＴ−１２１４の使用を強く支持した。
【０００９】
タキソイド薬物送達の更なる改善は、天然脂肪酸（多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ））に対するタキソイドのコンジュゲーションであった。これは魅力的な戦略であり、これは主として、以下に起因する。（ａ）いくつかのＰＵＦＡは、様々な癌で過剰発現しているシグナル伝達経路を介した癌特異的毒性を有する、（ｂ）様々な細胞毒性薬物とＰＵＦＡＳは、多くの場合、様々な癌細胞株に対して相乗効果を示す、（ｃ）ＰＵＦＡは、薬物誘導アポトーシスを阻止することにより、健康な細胞に対する保護効果を有するように思われる、（ｄ）コンジュゲーションは、細胞毒性薬物の薬物動態特性を変化させることにより、全身毒性を低下させ得る、及び（ｅ）ＰＵＦＡは、ＦＤＡ承認の食品添加物である。ｎ−３  ＰＵＦＡは、様々な機構を介してｎ−６  ＰＵＦＡ由来の発癌性エイコサノイドの生成を阻害することが示されている。ｎ−３  ＰＵＦＡ由来のエイコサノイドは、一般に、炎症及び腫瘍成長に対する阻害効果を示す。最終的に、ｎ−３  ＰＵＦＡは、薬物耐性に関与するＥＲＫ１／２経路を阻害することが示されている。これらの因子の全ては、ｎ−３  ＰＵＦＡと様々な細胞毒性剤の間の、観察された相乗効果に寄与する可能性がある。
【００１０】
天然に存在するｎ−３  ＰＵＦＡの中でも、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、最も高い効能を有し、従って広範に研究されている。ＤＨＡは、生化学的前駆体及びエネルギー源使用のために、腫瘍細胞により容易にかつ選択的に吸収されることが示されている。この効果は、選択的な腫瘍標的化効果を生じるのみならず、ＤＨＡコンジュゲートは、Ｐｇｐによる排出の低減も示す。第１世代タキソイドＰＸのＤＨＡコンジュゲートが開発された（ＴＡＸＯＰＲＥＸＩＮ（登録商標）：Ｐｒｏｔａｒｇａ／Ｌｕｉｔｐｏｌｄ）。ＤＨＡコンジュゲートは、腫瘍細胞により貪欲に吸収され、内部移行され（おそらくＤＨＡ部分と癌細胞膜との強い脂質−脂質相互作用を介して）、癌細胞内のエステラーゼによってゆっくり加水分解されることが見出された。ＤＨＡはＰｇｐの良好な基質ではないように思われ、ＰＸの排出を低減することが見出された。
【００１１】
しかしながら、第１世代タキソイドに対するＤＨＡのコンジュゲーションは、ＣＳＣ及び他の癌細胞におけるＭＤＲを克服するための最適な戦略ではない。癌細胞がＰｇｐ及び／又は他のＡＢＣ輸送体を過剰発現している場合、ＰＸ分子は、ゆっくり放出されている場合であっても、排出ポンプによって捉えられ、癌細胞から排除されるであろう。
【００１２】
ＳＢＴ−１２１４のような第２世代タキソイドは、Ｐｇｐ仲介による排出に対する固有の耐性を既に有するため、ＨＡＳ−脂肪酸−タキソイド複合体のＥＰＲ効果を利用することにより、コンジュゲートをおそらく腫瘍標的化物とする戦略、及び、ＤＨＡをこれらのタキソイドにコンジュゲートすることにより、Ｇｐ６０によるＨＳＡ複合体の腫瘍選択的な経細胞質輸送を形成する戦略が開発された。結果はタキソイドの次世代であり、これは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４及びＬＮＡ−ＳＢＴ−１２１４によって例示されるタキソイド−脂肪酸コンジュゲートを含む。
【００１３】
ＳＢＴ−１２１４に対するＤＨＡコンジュゲーションは、プロドラッグ特性も提供し、コンジュゲート化薬物を遊離ＳＢＴ−１２１４よりも１０倍毒性の低いものとする。ＤＨＡ部分は、タキサンバックボーンを遮蔽し、チューブリン結合を防止する。コンジュゲートが細胞によって吸収され、ＤＨＡ部分が細胞内エステラーゼによって切断されるまで、化合物は活性ではない。
【００１４】
ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の合成は成功し、ＳＣＩＤマウスにおけるＰＸ感受性及びＰＸ耐性ヒト腫瘍異種移植片の両方に対するその抗腫瘍活性が評価された。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、ＰＸ耐性及び非耐性腫瘍の両方を完全に退行させることが見出された。
【００１５】
マウスモデルにおけるＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の結腸、卵巣、膵臓及びＮＳＣＬ腫瘍異種移植片に対する有効性が評価され、印象的な有効性が示された。しかしながら、これらの研究では、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４はｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ−１５（又はポリソルベート８０）／エタノール／生理食塩水中で処方され、賦形剤の使用は、賦形剤及びエタノールに起因する、文書で十分に裏付けられた有害効果、並びに、低濃度の賦形剤におけるいくつかの安定上の問題を課すことが見出された。従って、本出願人らは、製剤研究室にて開発されたナノエマルション製剤の有効性を研究した。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４で見られた強い前臨床効果にも関わらず、現在の製剤の使用には欠点が存在し、本出願人らは、安全性、ＰＫ、分布、保持及び診療所内での使用の容易さを潜在的に改善する方法を模索している。
【００１６】
タキサンは臨床的に活性であるが、数個の問題点を有する。その問題的としては、乏しい薬物溶解度、骨髄抑制、末梢性感覚ニューロパチー、アレルギー反応、及び最終的な薬物耐性の発生等の重大な用量制限毒性が挙げられる。これらの副作用の多数は、これらの抗悪性腫瘍薬の希釈に使用される溶媒：パクリタキセルの場合、ＣｒＥＬ、及びドセタキセルの場合、ポリソルベート８０に関連している。特にポリオキシエチル化ヒマシ油は、生物学的及び薬理学的に活性であり、標準的な静脈内（ｉ．ｖ．）チューブから可塑剤を浸出させ、ジ（２−エチルヘキシル）フタレート（ＤＥＨＰ）を放出させる。その注入はヒスタミン放出を生じ、その結果、アナフィラキシーを含む詳しく説明されている過敏症反応を生じる。早期第Ｉ相試験において、前投与されていない患者の２０％〜４０％は、これらの反応の影響を受けた。更に、これはまた、高脂血症、異常なリポ蛋白パターン、赤血球の凝集、及び遷延性の、時には不可逆的な感覚性ニューロパチー（脱髄及び軸索変性に関連し得る）に関連付けられている。ＣｒＥＬは、好中球減少症も引き起こし得る。加えて、報告は、これらの溶媒をパクリタキセル及びドセタキセル薬物動態プロファイルの変化と関連付けた。過敏症反応はポリソルベート８０によっても生じ得るが、ＣｒＥＬによるものと比較して低い程度である。ポリソルベート８０は、時には重度かつ不可逆的な感覚性及び運動ニューロパチーにも関連付けられている。更に、ポリソルベート８０は、膜流動性を変化させ、累積的流体保持をもたらす可能性がある。この独特のドセタキセル毒性は、予防的コルチコステロイドによって低減され得る。別の重要な点は、ＣｒＥＬ及びポリソルベート８０が腫瘍浸透を制限し得、これが有効性に負の影響を与えることである。特に、血漿コンパートメント中のＣｒＥＬ−パクリタキセルの大きい極性ミセルの形成は、薬物を捕捉し、薬物クリアランスの低下、及び分布容積の低下による非線形薬物動態をもたらし得る。これは、用量依存性抗腫瘍活性の欠如に寄与する。
【００１７】
ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は極度に疎水性であるため、ポリソルベート８０／エタノール／生理食塩水又はＳｏｌｕｔｏｌ  Ｈ−１５／エタノール／生理食塩水中で処方されて、静脈内に注入される必要がある。前述したように、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ及びポリソルベート８０等のビヒクルは、重大な副作用を生じ、薬物動態に対する望ましくない効果は、以前に言及した。
【００１８】
ナノスケール分子は、「向上された透過性及び保持（ＥＰＲ）」効果に起因して、抗癌剤用のビヒクルとしてのそれらの使用における独特の特性を有する。ナノスケール分子の蓄積は、特定の受容体を必要としないため、ＥＰＲ効果は本来受動的であるが、有効であることが証明されている。ナノエマルション処方プロトコルは、リン脂質及び魚油を含むため、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の使用はＳＢＴ−１２１４自体と比較して、魚油構成成分に対する高い親和性と、それによる封入における高い効率性（ミセル内で高濃度の薬物が達成される）との明らかな利点を有する。
【００１９】
去勢抵抗性の前立腺癌（ＣＲＰＳ）のための第１選択の治療法は、ドセタキセルとプレドニゾンであり、ドセタキセル処置に代わって又は当該処置に加えてカバジタキセルが２０１０年にＦＤＡにより承認されている。しかしながら、ＣＳＣに関与するＣＲＰＳは、アンドロゲンシグナル伝達を示さず、従ってこのタイプのＣＲＰＳは、ドセタキセル又はカバジタキセルとプレドニゾンとの組み合わせに応答しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
溶解度、ＭＤＲ耐性特性、及びＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４等のＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートのＣＳＣ標的化を向上させる送達システム、並びに前立腺癌の処置方法が高く必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、水中油ナノエマルション（ＮＥ）薬物送達システム中に封入されたω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートを含む組成物を提供する。
【００２２】
本発明は、水中油ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む医薬組成物も提供する。
【００２３】
本発明は、水中油ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、癌を処置することによる、癌の処置方法を更に提供する。
【００２４】
本発明はまた更に、水中油ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物に多剤耐性細胞を暴露し、多剤耐性細胞の死を誘導することによる、多剤耐性の克服方法を提供する。
【００２５】
本発明は、水中油ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物に癌幹細胞を暴露し、癌幹細胞の死を誘導することによる、癌幹細胞の排除方法も提供する。
【００２６】
本発明は、水中油ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物に癌幹細胞を暴露し、癌幹細胞内で幹細胞性促進遺伝子の発現を低減することによる、癌幹細胞の幹細胞性を低下させる方法を更に提供する。
【００２７】
本発明は、ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を投与し、医薬組成物の溶液形態よりも長期間、医薬組成物を身体内に保持することによる、対象の身体内でＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートの保持時間を増大させる方法を提供する。
【００２８】
本発明は、ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を投与するステップと、身体内で医薬組成物の溶液形態よりも少なくとも３倍緩慢に医薬組成物を放出するステップと、を含む、対象の身体内でＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートのより緩慢な放出プロファイルを提供する方法も提供する。
【００２９】
本発明の他の利点は、添付の図面と共に考慮した場合、以下の詳細な説明を参照してより深く理解されるため、容易に認識される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の化学構造を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明による典型的なＮＥの構造、及び典型的なＮＥのナノ粒子の構造（右側）を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＥＧＦＲ＋細胞を標的化するための表面ペプチドを含むＮＥナノ粒子の構造を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４及び他のタキソイドによる処置下のＳＣＩＤマウスにおけるＰｇｐ＋、ＰＸ耐性ＤＬＤ１結腸癌異種移植片の成長のグラフを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４及び他のタキソイドによる処置下のＳＣＩＤマウスにおけるＰＡＮＣ−１膵癌異種移植片の成長のグラフを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４及び他のタキソイドによる処置下のＳＣＩＤマウスにおけるＣＦＰＡＣ−１膵臓腺癌異種移植片の成長のグラフを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４及び他のタキソイドによる処置下のＳＣＩＤマウスにおけるＨ４６０非小細胞肺腫瘍異種移植片の成長のグラフを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＳＢＴ−１２１３の化学構造を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＳＢＴ−１２８５４の化学構造を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＳＢＴ−１２１３０３の化学構造を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＤＨＡ−パクリタキセルの化学構造を示す。
【図５】図５は、癌幹細胞に富んだ腫瘍スフェロイドに対するＳＢＴ−１２１４の細胞毒性効果を示す実験結果を示す。
【図６Ａ−Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、プラセボ（ＮＥ−プラセボ）（図６Ａ）、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルション製剤（ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４）（図６Ｂ）及びＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（図６Ｃ）の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）である。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａは、粒子サイズ決定（単位ｎｍ）のグラフであり、図７Ｂは、ゼータ電位決定（単位ｍＶ）のグラフである。
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａは、単層ＰＰＴ２細胞培養物へのローダミン封入ナノエマルション製剤の取込みの蛍光顕微鏡法画像であり、図８Ｂは、スフェロイドＰＰＴ２細胞培養物へのローダミン封入ナノエマルション製剤の取込みの蛍光顕微鏡法画像である。
【図９Ａ−Ｇ】図９Ａは、水性溶液中又はナノエマルション製剤中でＰＰＴ２細胞に投与された際の、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の関数としての最大応答の百分率のグラフであり、図９Ｂ〜９Ｇは、異なる濃度のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルションで処理され、顕微鏡下で毒性に関して観察したＰＰＴ２スフェロイドの写真である（対照（図９Ｂ））、１０ｎＭ（図９Ｃ）、１００ｎＭ（図９Ｄ）、１μＭ（図９Ｅ）、５μＭ（図９Ｆ）及び１０μＭ（図９Ｇ）。
【図１０Ａ−Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｄは、親ＰＰＴ２細胞株（ＣＤ１３３＋（図１０Ａ））及びＣＤ４４＋（図１０Ｂ）、並びにＰＰＴ２−誘導マウス腫瘍異種移植片（ＣＤ１３３＋（図１０Ｃ））及びＣＤ４４＋（図１０Ｄ）からの１次細胞縣濁液における細胞表面マーカー発現のフローサイトメトリー分析である。
【図１１Ａ−Ｆ】図１１Ａ〜１１Ｆは、マウス腫瘍の写真である。（図１１Ａは、ビヒクルで処置したマウスからの対照腫瘍を示し、図１１Ｂ及び１１Ｃは、Ａｂｒａｘａｎｅ処置マウスからの腫瘍を示し（各々、２５及び４０ｍｇ／ｋｇ）、図１１Ｄ、１１Ｅ及び１１Ｆは、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ処置マウスからの腫瘍を示し（各々、２５、３０及び４０ｍｇ／ｋｇ））、図１１Ｇは、異なる濃度のＮＥ−ＤＨＡ−５ＢＴを用いた処置により誘導された体重変化のグラフであり、図１１Ｈは、全ての処置様式を概略するグラフである。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａは、ＰＰＴ２誘導マウス腫瘍異種移植片に対するＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴのインビボ効力を用いた経時的な腫瘍体積変化のグラフであり、図１２Ｂは、異なる濃度のＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴによる処置により誘導された体重変化のグラフである。
【図１３Ａ−Ｌ】図１３Ａ〜１３Ｌは、対照及びＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ処置マウスから収集したＰＴ２−誘導腫瘍及び異なる器官組織の病理組織学的評価を示す写真である（ヘマトキシリン＆エオシン染色）。図１３Ａ−対照非処置腫瘍は、分化が乏しい腺癌を示す。図１３Ｂ〜１３Ｄ−３０ｍｇ／ｋｇのＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４処置腫瘍は、大量のヒアルリゼーション（ｈｙａｌｕｒｉｚａｔｉｏｎ）、空胞形成及び広範な壊死を示す。組織は、対照非処置マウスを形成する：図１３Ｅ−肝臓；図１３Ｇ−腸；図１３Ｉ−腎臓；図１３Ｋ−膵臓；４０ｍｇ／ｋｇのＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ処置マウスからの組織：図１３Ｆ−肝臓（挿入写真はｘ４０）；図１３Ｈ−腸；図１３Ｊ−腎臓；及び図１３Ｌ−膵臓。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａは、剥離スフェロイド下の浮遊スフェロイドと小型ホロクローンの写真であり、図１４Ｂは、対照非処置腫瘍からの１次細胞縣濁液により生成された浮遊スフェロイドの写真である。
【図１５Ａ−Ｂ】図１５Ａは、単一のスフェロイド及び接着コロニー又は生細胞の非存在の写真であり、図１５Ｂは、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４で処置した腫瘍細胞により誘導された培養物中の単一のスフェロイドの写真である。
【図１６】図１６は、スフェロイド中で培養後の、非処置対照スフェロイドにおける残留腫瘍中の処置後細胞生存率の分析のグラフである。
【図１７】図１７は、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４処置スフェロイドにおける処置後細胞生存率の分析のグラフである。
【図１８Ａ−Ｋ】図１８Ａ〜１８Ｋは、脳（図１８Ａ）、膵臓（図１８Ｂ）、腎臓（図１８Ｃ）、前立腺（図１８Ｄ）、結腸（図１８Ｅ）、心臓（図１８Ｆ）、肺（図１８Ｇ）、肝臓（図１８Ｈ）、脾臓（図１８Ｉ）、血漿（図１８Ｊ）及び腫瘍（図１８Ｋ）内のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４溶液及びナノエマルションの体内分布のグラフである。
【図１９Ａ−Ｄ】図１９Ａ〜１９Ｄは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４薬物溶液及びナノエマルションの時間及び温度に関する安定特性のグラフである。図１９Ａは、安定性のグラフであり、図１９Ｂは、粒子サイズのグラフであり、図１９Ｃは、多分散指数のグラフであり、図１９Ｄは、ゼータ電位のグラフである。
【図２０Ａ−Ｅ】図２０Ａ〜２０Ｅは、異なる処置グループによる腫瘍の写真である。対照（図２０Ａ）、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ  ３０ｍｇ／ｋｇ（図２０Ｂ）、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ  ４０ｍｇ／ｋｇ（図２０Ｃ）、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ  ５０ｍｇ／ｋｇ（図２０Ｄ）、及びＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ  ７０ｍｇ／ｋｇ（図２０Ｅ）。
【図２１】図２１は、溶液及びナノエマルション（ＮＥ）からのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４のインビトロ透析放出研究のグラフであり、溶液及びＮＥからの累積ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４放出（％）を時間（ｈ）に対してプロットする。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、水中油ナノエマルション（ＮＥ）薬物送達システム中で処方されたω−３多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートを含む。好ましい実施形態はＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４であり、ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートはＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４であり、その構造は図１に示されている。
【００３２】
用語「第２世代タキソイド」は、パクリタキセル（タキソール）及びドセタキセル（タキソイド）等の第１世代タキサンを指すように使用され、ここで（ｉ）Ｃ−３’−フェニル基がアルケニル又はアルキル基で置き換えられ、（ｉｉ）Ｃ−１０位が特定のアシル基で修飾され、Ｃ−３’Ｎ位がｔ−Ｂｏｃ基である。用語「ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲート」は、そのメタ位に修飾Ｃ２−ベンゾイル基を有する第２世代タキソイドを指すように使用される。ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートは、Ｐｇｐ仲介によるＭＤＲを実質的に回避するその能力により特徴付けられる（Ｏｊｉｍａ  Ｉ．ａｎｄ  Ｄａｓ  Ｍ．，Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔａｘｏｉｄ．Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．（２００９）７２（３）：５５４−５６５）。
【００３３】
用語「ナノエマルション」（ＮＥ）は、５０〜１０００ｎｍの範囲の平均液滴径を有する水中油エマルションを指すように使用され、＞２００ｎｍの直径が好ましい。好ましいＮＥ油相は、Ａｍｉｊｉ，ｅｔ  ａｌ．への米国特許出願公開第２００７０１４８１９４号明細書におけるように、魚油又は亜麻仁油等のω−３脂肪酸に富んだ食用油を使用して調製される。非限定的に、松の実油、ベニバナ油、サクラソウ油、クロフサスグリ油、ルリジサ油、コムギ胚芽油、チア油、大麻油、エゴマ油、ブドウ油、スクアレン油、及び真菌油等の他の油を使用することができる。油小滴は、リン脂質（例えば、ＬＩＰＯＩＤ（登録商標））及びポリ（エチレンオキシド）含有非イオン性界面活性剤（例えば、プルロニック又はツイーン）を含む界面活性剤で修飾される。油小滴の表面はまた、葉酸、ＥＧＦＲペプチド、及び他の既知の標的化リガンドの使用を含む、標的化剤による腫瘍細胞への選択的標的化のために修飾され得る。組成物は、フルオロフォア、ＭＲＩコントラスト剤、又は放射性化合物を含む画像コントラスト剤も含み得る。
【００３４】
コンジュゲート中のＰＵＦＡは、好ましくはＤＨＡ（Ｃ−２２）であるが、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、Ｃ−２０）、又はα−リノレン酸（ＬＮＡ、Ｃ−１８）であってもよい。
【００３５】
本発明は、Ａｍｉｊｉ，ｅｔ  ａｌ．への米国特許出願公開第２００７０１４８１９４号明細書（２００７）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているような、ＮＥにおけるナノ粒子内に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートの製剤を含む。典型的なＮＥの構造は、図２の左側に示され、典型的なＮＥのナノ粒子の構造は、図２の右側に示される。好ましいＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートはＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４であり、その構造は、図１に示される。代替的に、Ｏｊｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．への米国特許第７，８２０，８３９号明細書、並びにＯｊｉｍａ  Ｉ及びＤａｓ  Ｍ、（２００９）（それらの両方の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートのいずれかを含むがこれらに限定されない任意のタキソイド、又はタキソイドの組み合わせが、ＮＥ中に封入され得る。製剤の詳細は本明細書の実施例３に提供されている。
【００３６】
ＮＥ製剤として本発明に含まれ得る他のタキソイドには、非限定的に、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＢＴ−１２１３（図４Ａ）、ＳＢＴ−１２８５４（図４Ｂ）、及びＳＢＴ−１２１３０３（図４Ｃ）（Ｍａｔｅｓａｎｚ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）；ＳＢＴ−１２１６、ＳＢＴ−１１０３３、ＳＢＴ−１２１３１３、ＳＢＴ−１２１６０２（Ｏｊｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）、カバジタキセル、ＳＢＴ−１２１２、ＳＢＴ−１２１７、ＳＢＴ−１１０２、ＳＢＴ−１１０３、ＳＢＴ−１１０４、ＳＢＴ−１１０６、ＳＢＴ−１１０７、ＳＢＴ−１２１３０１、ＳＢＴ−１２１３０２、ＳＢＴ−１２１３０４、ＳＢＴ−１２１４０３、ＳＢＴ−１１０３１、ＳＢＴ−１１０３２、ＳＢＴ−１１０３４、ＳＢＴ−１２８５１、ＳＢＴ−１２８５２、ＳＢＴ−１２８５３、ＳＢＴ−１２８５５、ＳＢＴ−１２８５１−１、ＳＢＴ−１２８５１−３、ＳＢＴ−１２８５２−１、ＳＢＴ−１２８５２−３、ＳＢＴ−１２８５３−１、ＳＢＴ−１２８５３−３、ＳＢＴ−１２８５４−１、ＳＢＴ−１２８５４−３、ＳＢＴ−１２８５５−１及びＳＢＴ−１２８５５−３が挙げられる。ＰＵＦＡ−コンジュゲート化第２世代タキソイドも挙げられ、それには、非限定的に、ＤＨＡ−パクリタキセル（図４Ｄ）（Ｂｒａｄｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）；ＤＨＡ−ドセタキセル、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１３、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１１０３、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１１０４、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１６、ＬＮＡ−ＳＢＴ−１２１３、ＬＮＡ−パクリタキセル、ＬＮＡ−ドセタキセル、ＤＨＡ−カバジタキセル及びＬＮＡ−カバジタキセル（ＬＮＡ＝α−リノレン酸）が挙げられる。上記の第２世代トキソイド（ｔｏｘｏｉｄ）のいずれかのＤＨＡ又はＬＮＡエステルも使用することができる。当業者は、そのようなエステルを容易に作製することができる。それらの製剤及び有効性の作業実施例は、示した参考文献（それらの全体が本明細書に組み込まれる）に見出される。
【００３７】
例示的なＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の利点には、以前論じたように、ＣＳＣを含む癌細胞の標的化における有効性と、ＭＤＲの克服における有効性が挙げられる。薬物耐性の克服におけるＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の有効性のより詳細な証拠は、本明細書の実施例１に提供されている。これらの実験では、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、パクリタキセル（ＰＸ）耐性ヒト細胞株ＤＬＤ１（結腸癌）、ＰＡＮＣ−１及びＣＦＰＡＣ−１（膵癌）、並びにＨ４６０（非小細胞肺癌）のＳＣＩＤマウス異種移植片に対して有効であった。加えて、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４がＣＳＣに対して特別な作用を有する証拠が存在する。第１に、親薬物、ＳＢＴ−１２１４は、ＣＳＣの「幹細胞性」を低下させ、即ち、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４及びその他等の多能性に重要なものを含む幹細胞性促進遺伝子及び転写因子の発現を低減する（Ｂｏｔｃｈｋｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０＆２０１３、及び実施例２）。このことは、腫瘍のＣＳＣ構成成分を低減又は排除し、腫瘍を治療法に対してより感受性とする。実験の詳細は、本明細書の実施例２に提供されている。加えて、ＳＢＴ−１２１４は、ＰＸの数時間に対して、数分間でチューブリンを重合させることが示されている。この微小管生物学の急速な破壊は、静止状態のＣＳＣにおいてさえも細胞死を誘導し得る。
【００３８】
ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の主な欠点である、体液中での乏しい溶解性は、本発明によるＮＥ製剤中への封入により克服される。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４及び他のＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートは、本発明によるＮＥを用いた製剤により可溶化及び送達されることができる。これらのＮＥは、水中のω−３、−６、及び−９多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）に富んだ油の分散により形成され、両親媒性リン脂質単層で安定化された単純なコロイド状担体である。ＮＥは、＜２００ｎｍの流体力学直径を有し、相当の量の疎水性薬物を、油相の高体積部分中に組み込むことができ、水溶性が乏しい薬物の送達に好適である。ＮＥ’ｓは、一般に安全等級（ＧＲＡＳ）と見なされている材料から完全に構成され、当該材料は、非常に好適な安全性プロファイルを有する。このことは、臨床的採用にとって有意な利点である。
【００３９】
ＰＸを使用した以前の研究では、ＮＥのＰＸ封入効率は１００％であった。この高い薬物封入効率は、ＰＸの高い親油性に起因し、薬物はＮＥナノ粒子の油コア内に保持される。ＰＸのＮＥ製剤は、３カ月間の貯蔵期間の間、安定であり、相分離又は小滴サイズの変化は観察されなかった。
【００４０】
本発明のＮＥ組成物は、実施例６に記載されているように、４℃で６カ月間まで物理的に安定であることが見出された。粒子サイズは、この期間中、一貫していることが見出され、またＰＤＩ及びゼータ電位も分析された。ＮＥ組成物は、実施例５に詳細するように、ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートの溶液形態と比較して、身体内での保持時間が増大している。ＮＥ組成物はまた、実施例８に詳細するように、ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートの溶液形態よりも少なくとも３倍緩慢な、身体内での放出プロファイルを提供する。
【００４１】
加えて、ω−３  ＰＵＦＡに富んだ油から構成されるＮＥは、ＳＫＯＶ３細胞内でＰＸ蓄積を向上させることが見出された。松の実油又は亜麻仁油を含むＮＥは、各々、４０％又は４７％のω−３  ＰＵＦＡを有し、マウスにて評価して、ＰＸ製剤のバイオアベイラビリティ及び有効性を向上させることが示された。
【００４２】
ＮＥの別の利点は、それらの表面を標的化分子で修飾して、封入薬物の腫瘍特異的送達を増大させ得ることである。例えば、ＥＧＦＲ結合ペプチドを支持するＮＥナノ粒子は、非標的化ＮＥナノ粒子よりも急速に、ＥＧＦＲ＋ＳＫＯＶ細胞によって吸収された。それらはまた、６０分においてＮＥナノ粒子よりも高い蓄積を示した。例示的な標的化ＮＥナノ粒子の構造を、図２Ｂに示す。本発明は、ＮＥナノ粒子が、成長因子受容体結合ペプチド、モノクローナル抗体、及びその断片等の標的化分子を支持する任意の好適なＮＥタキソイド製剤を含む。
【００４３】
ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４製剤の特定の利点は、ＤＨＡ部分が油に富んだナノエマルションへの組み込みを促進することである。疎水性脂肪酸テールによって、これらのプロドラッグの長期循環標的化ＮＥの脂質コア内への封入が可能となる。
【００４４】
ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４製剤の別の利点は、注射用生理食塩水等の水性溶液中での溶解性である。従って、本発明による製剤は、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）等の毒性溶媒の必要性を排除する。従って、本発明は、水中油ナノエマルション薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを提供する。
【００４５】
ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の利点の全てを、処方されていない親化合物よりも有効かつ毒性の低い形態で提供する。前記に論じたように、これらのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の利点には、ＣＳＣを含むＭＤＲ耐性癌細胞を殺滅する能力、及びＣＳＣを標的化する能力が挙げられ、これらは両方とも、幹細胞性促進遺伝子の発現を低減し、微小管の急速重合を介して静止細胞を殺滅することによる。臨床的前例によれば、化学療法による腫瘍の病変の大部分の除去は、通常静止状態のＣＳＣ集団を「目覚め」させ、腫瘍細胞集団を再配置させる。従って、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の初期の処置は、標準的な微小管安定化機構を介した腫瘍の病変の大部分の除去を開始させ、また、ＣＳＣ集団における遺伝子発現プロファイルを変化させることが予測される。一旦ＣＳＣが腫瘍の再配置を開始させたら、それらは、微小管安定化効果に対してより感受性となる。加えて、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、ＣＳＣ遺伝子発現を下方調節し、ＣＳＣを分化させ、それによりＣＳＣはＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４誘導アポトーシスに対してより感受性となることが示されている。
【００４６】
従って、本発明は、ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、癌を処置することによる、癌の処置方法を提供する。本明細書の方法において処置される癌又はＣＳＣは、非限定的に、乳癌、卵巣癌、肺癌、頭部及び頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵癌、黒色腫、脳癌、前立腺癌、白血病、肉腫、甲状腺癌、非ホジキンリンパ腫、膀胱癌、グリア細胞腫、子宮内膜癌、並びに腎癌等の任意のタイプの癌であり得る。ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートは、本明細書に記載される任意のものであってよく、特にＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である。ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートはＮＥ中に封入されているため、身体によって能動的に吸収され、ＤＨＡは通常の送達方法におけるよりも効率的に切断される。本方法は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４等の多能性に重要なものを含む、ＣＳＣにおける幹細胞性促進遺伝子及び転写因子の発現を低減するステップを更に含み得る。下方調節される幹細胞性促進遺伝子は、非限定的に、ＡＢＣＧ２、ＡＣＡＮ、ＡＣＴＢ、ＡＩＮ１、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＰＩ、ＡＳＣＬ２、ＢＭＰ１、ＢＭＰ３、ＣＣＮＤ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ８Ｂ１、ＣＤＨ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＴＮＮＡ１、ＤＨＨ、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＴＸ１、ＤＶＬ１、ＦＧＦ１、ＦＧＦ３、ＦＧＦＲ１、ＦＺＤ１、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＪＡ１、ＧＪＢ１、ＩＧＦ１、ＩＳＬ１、ＪＡＧ１、ＫＲＴ１５、ＭＭＥ、ＭＳＸ１、ＭＹＯＤ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＣＡＭ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＵＭＢ、ＰＡＲＤ６Ａ、ＰＰＡＲＤ、ＲＢ１、ＲＰＬ１３Ａ、Ｓ１００Ｂ、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴ及びそれらの組み合わせであり得る。ＣＤＸ２、ＤＬＸ２、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＧＲ、ＦＯＸＰ３、ＧＬＩ２、ＨＯＸファミリーＴＦ、ＩＲＸ４、ＪＵＮ、ＫＬＦ２、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ２Ｆ２、ＰＣＮＡ、ＰＩＴＸ３、ＰＯＵ４Ｆ１、ＳＩＸ２、ＳＯＸ９及びＷＴ１の発現も下方調節され得る。本方法は、腫瘍のＣＳＣ構成成分を低減又は排除し、腫瘍を治療法に対してより感受性とするステップを更に含み得る。本方法は、チューブリンを急速に重合させ、細胞死を誘導するステップを更に含み得る。実施例４に示すように、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４コンジュゲートのナノエマルションは、前立腺癌モデルにおいて、優れた腫瘍退行及び腫瘍成長阻害を誘導する。本組成物及び方法は、パクリタキセル感受性及びパクリタキセル耐性腫瘍に対して特に有効であり得る。本組成物は、腫瘍成長を抑制し、腫瘍縮小を誘導し、接着ホロクローンの生成を防止し、腫瘍の血管新生を防止し得る。ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）に対するＤＨＡコンジュゲート化薬物のより高い親和性に起因して、ｇｐ６０仲介による経細胞質輸送を介した腫瘍間質内への組成物の腫瘍特異的蓄積が存在し、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）は、血流中でのＰＵＦＡの主要な担体である（実施例４に記載するように）。更に、実施例５により実証されるように、本方法は、医薬組成物の溶液形態と比較して、身体内で医薬組成物をより長期間保持する、特に腫瘍に医薬組成物をより長期間保持するステップを更に含み得る。
【００４７】
また、ＰＵＦＡ−タキソイドの非コンジュゲート化型を、本明細書の方法のいずれかで、コンジュゲートと共に投与することができる。ＤＨＡは身体内で活性となる前に切断される必要があるため、コンジュゲート化型が身体内で持続性の効果を提供できる一方、非コンジュゲート化型は即時効果を提供することができる。特に高悪性度の腫瘍では、それらを急速に処置することが望ましいが、癌幹細胞に対する持続的な、より長期の効果を有することも望ましい。組み合わせ処置を単回投与又は単回注射の負荷用量及び維持用量として投与することができる。
【００４８】
本発明は、ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物に多剤耐性細胞を暴露し、多剤耐性細胞の死を誘導することによる、多剤耐性の克服方法も提供する。ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートは、本明細書に記載される任意のものであってよく、特にＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である。例えば、実施例１では、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、マウスにおいて多剤耐性腫瘍の完全な退行をもたらした。本方法は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４等の多能性に重要なものを含む、ＣＳＣにおける幹細胞性促進遺伝子及び転写因子の発現を低減するステップを更に含み得る。本方法は、腫瘍のＣＳＣ構成成分を低減又は排除し、腫瘍を治療法に対してより感受性とするステップを更に含み得る。本方法は、チューブリンを急速に重合させ、細胞死を誘導するステップを更に含み得る。
【００４９】
本発明は、ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物に癌幹細胞を暴露し、癌幹細胞の死を誘導することによる、癌幹細胞の排除方法も提供する。ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートは、本明細書に記載される任意のものであってよく、特にＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である。本方法は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４等の多能性に重要なものを含む、ＣＳＣにおける幹細胞性促進遺伝子及び転写因子の発現を低減するステップを更に含み得る。本方法は、腫瘍のＣＳＣ構成成分を低減又は排除し、腫瘍を治療法に対してより感受性とするステップを更に含み得る。本方法は、チューブリンを急速に重合させ、細胞死を誘導するステップを更に含み得る。
【００５０】
ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物に癌幹細胞を暴露し、癌幹細胞における幹細胞性促進遺伝子の発現を低減することによる、癌幹細胞の幹細胞性を低下させる方法も本発明により提供される。ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートは、本明細書に記載される任意のものであってよく、特にＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である。本方法は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４等の多能性に重要なものを含む、ＣＳＣにおける幹細胞性促進遺伝子及び転写因子の発現を低減するステップを更に含み得る。本方法は、腫瘍のＣＳＣ構成成分を低減又は排除し、腫瘍を治療法に対してより感受性とするステップを更に含み得る。本方法は、チューブリンを急速に重合させ、細胞死を誘導するステップを更に含み得る。
【００５１】
本発明は、ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を投与し、医薬組成物の溶液形態よりも長期間、医薬組成物を身体内に保持することによる、対象の身体内でＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートの保持時間を増大させる方法を更に提供する。実施例５により実証されるように、ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートのためのＮＥ薬物送達システムは、身体内で、特に血漿及び腫瘍中で、溶液形態と比較してより長い保持時間を提供することが可能である。ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートは、本明細書に記載される任意のものであってよく、特にＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である。保持時間の増大に起因して、より低用量のＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを付与することができ、それにより副作用が低減される。
【００５２】
本発明は、対象の身体内でＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートのより緩慢な放出プロファイルを提供する方法も提供し、当該方法は、ＮＥ薬物送達システム中に封入されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を投与するステップと、医薬組成物の溶液形態よりも少なくとも３倍緩慢に医薬組成物を身体内で放出するステップとを含む。実施例８により実証されるように、ＮＥ組成物は、溶液形態よりも３倍緩慢な放出プロファイルを有する。ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートは、本明細書に記載される任意のものであってよく、特にＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である。より緩慢な放出プロファイルに起因して、より低用量のＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを付与することができ、それにより副作用が低減される。
【００５３】
本発明による医薬組成物は、好ましくは、通常の（０．９％）無菌の、発熱物質を含有しない生理食塩水等の水性溶液である。それよりは好ましくないが、代替的溶媒を使用することができ、又は担体を使用することができる。本発明は、薬学的に許容され得る適合性の賦形剤、緩衝液又は安定剤も含み得る。
【００５４】
「有効量」の医薬組成物は、責任がある製造業者及び／又は開業医により決定され、典型的には、処置される疾患、対象患者の状態、送達部位、投与方法及び他の因子を考慮に入れる。有効量を決定する技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ、Ａ．Ｒ．（ｅｄ．），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９８５に見出すことができる。一般に、「有効量」の組成物は、疾病状態の正の変更を有意に誘導するのに十分な量として定義される。この用語はまた、その量が重大な副作用を避けるのに十分少量であることを暗示する。これらの量の決定は、典型的には、感覚的な医学的判断の範囲内にある。「有効量」は、処置される特定の状態、並びに処置される患者の年齢及び健康状態、状態の重篤さ、処置の持続時間、付随する治療法の性質、使用される薬学的に許容され得る特定の担体、並びに同様の因子に従って変動するであろう。本発明による医薬組成物は、ヒト及び獣医学的目的の両方に使用することができる。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口的に、最も好ましくは静脈内経路により投与されるが、代替的に筋内、皮下、皮内、くも膜下腔内及び硬膜外経路により投与されてもよい。例えば腫瘍局在的処置等の特定の目的のために、投与は経口、舌下、局所、経皮、眼科用、経耳、経鼻、直腸及び経膣経路等の非経口ではない経路を介したものであってもよい。
【００５６】
本発明の様々な実施形態及び態様は、以前に描写した通り、以下の実施例にて実験的サポートが見出される。
【実施例】
【００５７】
実施例１：親ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲート、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、インビボでＰＸ感受性及びＰＸ耐性腫瘍の両方に対して有効である。
ＳＣＩＤマウスにおけるＰＸ耐性ヒト結腸癌異種移植片の成長に対するＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の効果。
ＳＣＩＤマウスにｓ．ｃ．インプラントしたパクリタキセル耐性、Ｐｇｐ（＋）ＤＬＤ１ヒト結腸腫瘍異種移植片を使用した実験において、パクリタキセル及びＴＡＸＯＰＲＥＸＩＮ（登録商標）は完全に無効であった。著しく対照的に、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、５、８、及び１１日目に投与された８０ｍｇ／ｋｇ用量で、５匹のマウス中５匹においてＤＬＤ−１腫瘍の完全な退行をもたらした（腫瘍成長遅延＞１８７日）（図３Ａ）。
【００５８】
ＳＣＩＤマウスにおけるヒト膵癌異種移植片の成長に対するＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の効果。
この実験は、ＲＰＣＩ  ＳＣＩＤマウスにおいてヒトＰＡＮＣ−１膵臓腫瘍異種移植片を使用して、ＰＸ及びＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４に関するｑ７ｄｘ３とｑ３ｄｘ３スケジュールを比較した。結果（図３Ｂ）は、両方のスケジュールがこのヒト膵臓腫瘍異種移植片において非常に有効であることを示した（腫瘍成長遅延＞９０日）。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｅｓ）（ＭＴＤ）は、２４０ｍｇ／ｋｇ総投与量（８０ｍｇ／ｋｇ  ｘ３  ｉｎｊ＝２４０ｍｇ／ｋｇ）であるように思われ、３００ｍｇ／ｋｇ総用量で、１つの有毒死が生じた。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を受容した全マウスは、完全な寛解を達成し、本質的に治癒された。対照的に、ＰＸは、僅かにのみ有効であり、ｑ７ｄｘ３スケジュールで１８日の腫瘍成長遅延、及びｑ３ｄｘ３スケジュールで１３日の腫瘍成長遅延を示し、完全な寛解は存在しなかった。
【００５９】
ＳＣＩＤマウスにおけるヒト膵臓腺癌異種移植片の成長に対するＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の効果。
この実験は、ヒトＣＦＰＡＣ−１膵管癌（ｄｕｃｔａｌ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）異種移植片を使用して、ＰＸ、ＤＨＡ−パクリタキセル及びＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の効力を比較した。２４０ｍｇ／ｋｇ又は３００ｍｇ／ｋｇ総用量のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は非常に有効であり、各々、５中５、又は４中４の完全な退行及び治癒をもたらした（図３Ｃ）。ＰＸ及びＤＨＡ−パクリタキセルは遥かに有効性が低く、ビヒクルと比較してマイナーな腫瘍成長遅延のみを有した。ＳＢＴ−１２１４（１２０ｍｇ／ｋｇ総用量）は、ＰＸに勝る結果を示し、６匹のマウス中６匹で腫瘍退行が存在したが、６匹のうち１匹のみが治癒し、薬物はＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４よりも有毒であるように思われた。ＳＢＴ−１２１４処理マウスは、２０日目までにマイナーな体重低下（＜４％）のみを示したが、２４０ｍｇ／ｋｇ又は３００ｍｇ／ｋｇ総用量のいずれでも、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４−処理マウスでは体重低下は無視できるものであった。
【００６０】
ＳＣＩＤマウスにおけるヒト非小細胞肺癌異種移植片の成長に対するＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の効果。
この実験は、非常に高悪性度のＨ４６０ヒト非小細胞肺腫瘍異種移植片に対するＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４、ＰＸ、ＤＨＡ−パクリタキセル及びＳＢＴ−１２１４を比較した。ＭＴＤ（７５ｍｇ／ｋｇ総用量）のＰＸ及びＭＴＤ（２４０ｍｇ／ｋｇ総用量）のＤＨＡ−パクリタキセルで、各々８及び３日目に、マイナーな腫瘍成長遅延のみが見られた。対照的に、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４及びＳＢＴ−１２１４は、ほぼＭＴＤ（各々、２４０ｍｇ／ｋｇ及び１２０ｍｇ／ｋｇ総用量）で、５５及び３４日の腫瘍成長遅延をもたらした。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、ＳＢＴ−１２１４よりも明らかに良好に許容された。
【００６１】
この実施例の結果は、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１５の親が、多様な標的細胞におけるＭＤＲの克服に有効であることを示す。これらの結果は、本発明によるＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４製剤が、処方されていない親化合物よりも可溶性かつ毒性の低い製剤において、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４のものと少なくとも等価な抗腫瘍効果を生じることを示す。
【００６２】
実施例２：親タキソイドＳＢＴ−１２１４は、癌幹細胞の幹細胞特性を低減する。
前立腺癌の患者由来癌幹細胞株、ＰＰＴ２を用いて実験を行った（Ｂｏｔｃｈｋｉｎａ  ２０１３，Ｒｏｗｅｈｌ  ２０１４）。細胞株ＰＰＴ２を患者由来前立腺癌腫瘍から生成した。これらの小細胞含有ホロクローンのサブクローニングにより、高いレベルのＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ１６６を発現している細胞の劇的な富化がもたらされた。ＰＰＴ２細胞株を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス腫瘍異種移植片、浮遊３Ｄスフェロイド及びタイプＩコラーゲン接着培養物として連続的に増殖させた。ＡＴＣＣ報告（ＩＤ番号００２８７２）によれば、ＰＰＴ２細胞は、いずれの既知の樹立細胞株によっても汚染されていない独特のヒト細胞であった。ＣＳＣ富化培養物の表現型は、ＣＳＣの二重性（即ち、自己複製の能力と、前駆細胞を生成する能力）に起因して動的であったが、ＰＰＴ２細胞は、ＭＡＣＳ−ＣＤ１３３＋細胞選別及び血清フリー培地中のタイプＩコラーゲン被覆表面上での培養から８週間後まででさえも、比較的安定な表現型を維持した。実質的に、ＰＰＴ２細胞の全集団が未分化のままであり（３〜５％のみが、分化細胞のマーカー、パンケラチンを発現している）、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ４４の標準的なアイソフォームに関して陽性であった（９８〜９９％）。７２％までが、バリアントアイソフォーム、ＣＤ４４ｖ６を発現した。＞２７継代後、約９０％のＰＰＴ２細胞が尚、中程度〜高レベルのＣＤ１３３を発現し、３Ｄ培養物中で非常に高いスフェア形成能力を有していた。圧倒的多数のＣＤ１３３＋ＰＰＴ２細胞は、高い細胞質レベルの、神経及び胚幹細胞に特徴的なビメンチン及びネスチンを発現した。ＰＰＴ２細胞の核及び細胞質部分の両方は、ｃ−Ｍｙｃを発現したが、他の多能性マーカー（Ｏｃｔ−４及びＳｏｘ−２）は、核部分中のみで検出された。重要なことには、ＰＰＴ２細胞はアポトーシス促進／腫瘍抑制タンパク質、ｐ５３及びｐ２１に関して陰性であり、標準的な抗癌剤に対して極度に耐性であった。
【００６３】
幹細胞性遺伝子発現における可能な薬物誘導変化を特徴付けるために、ＳＢＴ−１２１４及びＣＭＣ  ２．２４、化学修飾クルクミンの組み合わせによる処置の前後にＣＤ１３３＋ＰＰＴ２細胞を分析した。発現における１．５倍以上の変化のフィルタリング基準を用いたＰＣＲアレイアッセイ（ＰＡＨＳ  ５０１；ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、分析した８４の幹細胞関連の転写因子（ＴＦ）の約５０％が、分化したＰｒＣ細胞と比較して、ＣＤ１３３＋内で上方調節されることが見出された。その中に含まれるのは、ＣＤＸ２、ＤＬＸ２、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＧＲ、ＦＯＸＰ３、ＧＬＩ２、ＨＯＸファミリーＴＦ、ＩＲＸ４、ＪＵＮ、ＫＬＦ２、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ２Ｆ２、ＰＣＮＡ、ＰＩＴＸ３、ＰＯＵ４Ｆ１、ＳＩＸ２、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＴＥＲＴ、ＷＴ１及びその他であった。ＳＢ−１２１４（１μＭ）及びＣＭＣ２．２４による２４時間の単回処理は、これらの過剰発現遺伝子の有意な下方調節を誘導した。ウェスタンブロット分析は、ＳＢＴ−１２１４がＣＤ１３３＋及びバルクＰＰＴ２細胞の両方の核抽出物中のｃ−Ｍｙｃ及びＳｏｘ２の中程度の下方調節を誘導することを示した。重要なことには、ＣＤ１３３＋及びバルクＰＰＴ２細胞の両方の核部分は、アポトーシスの２つの腫瘍抑制因子／調節因子、ｐ５３及びｐ２１を発現せず、このことは抗癌剤に対するそれらの極度の耐性を部分的に説明することができる。ＳＢＴ−１２１４は、ｐ２１及びｐ５３の発現を誘導した。薬物を用いた前処理により誘導されるそのような「遺伝子の目覚め」は、第２の処理に対するこれらの高い薬物耐性の細胞の更なる感受性を劇的に増大させ、ＣＳＣ富化細胞の実質的に完全な死をもたらした。
【００６４】
別の例では、３つの浸潤性結腸癌細胞株、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９及びＤＬＤ−１から結腸癌細胞の幹細胞富化集団を選択した。この集団を３Ｄ多細胞スフェロイドとして成長させた。ＳＢＴ−１２１４は、スフェロイドの３つの全タイプにおいて細胞毒性を効果的に誘導することが見出された（図５Ａ）。更に、ＳＢＴ−１２１４処理は、３つの全腫瘍細胞タイプのスフェロイドにおいて、以下の幹細胞性関連遺伝子を下方調節した。
【００６５】
ＨＣＴ１１６：ＳＯＸ１、ＲＰＬ１３Ａ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ３、ＮＥＵＲＯＧ２、ＧＪＢ１、ＧＪＡ１、ＡＳＣＬ２、ＣＴＮＮＡ１、ＧＤＦ２、ＡＬＰＩ、Ｓ１００Ｂ、ＣＤ８Ｂ１、ＡＣＴＢ、ＣＣＮＤ１、ＦＧＦ１、ＰＡＲＤ６Ａ、ＤＶＬ１、ＧＤＦ３、ＩＳＬ１、ＣＤ３Ｄ、ＭＭＥ、ＦＧＦＲ１、ＲＢ１、ＡＩＮ１、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＣＤ８Ａ、ＰＰＡＲＤ、ＦＺＤ１、ＮＵＭＢ及びＡＢＣＧ２；
【００６６】
ＨＴ２９：ＡＣＡＮ、ＡＬＰＩ、ＢＭＰ３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤＨ２、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ９Ａ１、ＤＨＨ、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＴＸ１、ＦＧＦ１、ＦＧＦ３、ＦＺＤ１、ＧＤＦ２、ＩＧＦ１、ＭＭＥ、ＭＹＯＤ、ＮＣＡＭ１、ＮＥＵＲＯＧ２、Ｓ１００Ｂ、ＳＯＸ２及びＴＥＲＴ；
【００６７】
ＤＬＤ−１：ＣＤ４、ＣＤＨ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＤＬＬ１、ＤＴＸ１、ＩＧＦ１、ＦＧＦ３、ＦＺＤ１、ＪＡＧ１、ＫＲＴ１５、ＭＳＸ１、ＮＣＡＭ１及びＮＯＴＣＨ１（Ｂｏｔｃｈｋｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００６８】
これらの例示的な研究の結果により、ＳＢＴ−１２１４はＣＳＣにおける幹細胞特性を低減し、それらを効果的に排除することが示される。ＳＢＴ−１２１４は、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４として処方された際、幹細胞性遺伝子発現の同様の抑制を生じるが、親化合物と比較して溶解性が高く、より毒性の低い効果を有することを予測することができる。
【００６９】
実施例３：ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の製剤の調製。
本発明のＮＥは、水中のω−３−６＆−９多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）に富んだ油の分散により形成され、両親媒性リン脂質単層で安定化された単純なコロイド状担体である。これらのＮＥの組成物、及びそれらの作製方法の詳細な説明は、Ａｍｉｊｉ，ｅｔ  ａｌへの米国特許出願公開第２００７０１４８１９４号明細書（２００７）に見出され、ω−３  ＰＵＦＡに富んだ油から構成されたＮＥは、ＳＫＯＶ３細胞内でＰＸ蓄積を向上させることが見出されている。
【００７０】
手短に言えば、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を処方するために、水中油ＮＥ製剤を高エネルギー微小溶液操作法により調製する。最初に、卵ホスファチジルコリン及びペグ化剤（ＰＥＧ２０００ＤＳＰＥ）を脱イオン水に溶解することにより水性相を調製する。次いで、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４をＰＵＦＡに富んだ油に加えて油／脂質相を得る。混合物をＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）プロセッサーＭ−１１０ＥＨにより低圧で５サイクル、プレホモジナイズして、粗いエマルションを形成し、更に５サイクルの高圧ホモジナイゼーションにより小滴サイズ＜２００ｎｍのＮＥを形成する。ＳＢＴ−１２１４に対するＤＨＡの以前の結合は、ナノエマルションへのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の組み込みを促進する。
【００７１】
油は、少なくとも２％（ｗ／ｗ）の少なくとも１つのＰＵＦＡを含むことが好ましい。松の実油又は亜麻仁油を含むＮＥは、各々、４０％又は４７％のω−３  ＰＵＦＡを有し、好ましい形態のものであり、マウスにて評価されて、タキソイド製剤の有効性を向上されることが示されている（４１）。ＮＥ製剤に好ましい他の油には、非限定的に、ベニバナ、サクラソウ、クロフサスグリ、ルリジサ、コムギ胚芽、チア、大麻、エゴマ、ブドウ、スクアレン及び真菌油、並びにω−３に富んだ魚油が挙げられる。
【００７２】
タキソイド化合物の封入に有効であることが見出されている例示的な製剤（Ｇａｎｔａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）は、以下のようにＳＢＴ−１２１４に関して適合させることができる：クロロホルム中のＳＢＴ−１２１４（例えば、１０ｍｇ）をガラスバイアル内の１．０ｇの超純粋等級のω−３脂肪酸に富んだ亜麻仁油（Ｊｅｄｗａｒｄｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｑｕｉｎｃｙ，ＭＡ）に加える。窒素ガス流を吹き込むことによりクロロホルムを蒸発させる。１２０ｍｇの卵黄レシチン（Ｌｉｐｏｉｄ  Ｅ８０（登録商標）、Ｌｉｐｏｉｄ  ＧＭＢＨ，Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び４０ｍｇのデオキシコール酸（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ，ＮＪ）を４ｍＬの脱イオン蒸留水に加え、ＳＩＬＶＥＲＳＯＮ（登録商標）ホモジナイザーを使用して５０００ｒｐｍで３０分間撹拌して完全に溶解することにより、水性相を調製する。油相及び水性相を別々に７０〜７５℃に２分間加熱する。水性相を油相に徐々に加えた後、混合物をＶＩＢＲＡ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＶＣ  ５０５超音波機器（Ｓｏｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｎｅｗｔｏｗｎ，ＣＴ）を使用して２１％振幅及び５０％デューティーサイクルで１０分間超音波処理して、安定なナノエマルションを得る。ナノエマルション中の油小滴の粒子サイズを、動的光散乱法により、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの９０Ｐｌｕｓ粒子サイズアナライザー（Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して、９０°の固定角及び２５℃の温度で測定する。分析前に全てのサンプルを脱イオン蒸留水中で希釈し、平均油小滴流体力学直径を測定する。サンプル中の粒子サイズの分布の尺度である多分散指数（ＰＤＩ）も決定する。加えて、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔのＺｅｔａＰＡＬＳ方法を用いて、油小滴の電気泳動可動性に基づいて、油小滴表面電荷（ゼータ電位）値を決定する。
【００７３】
次に、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の特定の製剤を、サイズ、電荷及び形態に関して特徴付けて、その安定性、機能性及び能力を決定する。ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４製剤における封入効率（加えた量の関数としての、油相中に保持された薬物の百分率）の決定は、周知の遠心分離フィルター装置を使用した限外濾過法により決定される。薬物ペイロードの濃度は、ＩＣＰ−ＭＳ又はＬＣ−ＭＳにより決定される。これらの測定値のいずれかが、所望のパラメーターから有意に逸脱することが見出された場合、油／脂質混合物を簡単な実験によって最適化し得る。
【００７４】
実施例４
材料及び方法
新世代タキソイド、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を、ストーニーブルック大学（Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ，ＮＹ）のＤｒ．Ｏｊｉｍａの研究室又はＣｈｅｍＭａｓｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．（Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ，ＮＹ）により合成した。超純粋のω−３に富んだ魚油をＪｅｄｗａｒｄｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｑｕｉｎｃｙ，ＭＡ）から、Ｌｉｐｏｉｄ  Ｅ８０をＬｉｐｏｉｄ  ＧＭＢＨ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から、ＤＳＰＥ  ＰＥＧ２０００をＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から、ツイーン８０をＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  ｏｎｅ溶液細胞増殖アッセイキット（Ｇ３５８０）をＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から、間葉幹細胞成長培地（ＭＳＣＧＭ）をＬｏｎｚａ（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）から、ＬＡＬ発色性内毒素定量化キットをＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から、顕微鏡スライド（単一孔、凹所）をＡｍｓｃｏｐｅ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から、コラゲナーゼタイプＩＩ及びタイプＩＶをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から、抗ヒトＣＤ１３３／２−ＡＰＣ抗体（クローン２９３Ｃ３）をＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，ＣＡ，ＵＳＡから；ＣＤ１６６−ＰＥ抗体（クローン１０５９０２）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ，ＵＳＡから；ＣＤ４４−ＦＩＴＣ抗体（クローンＦ１０−４４−２）又はＣＤ４４−ＰＥ抗体（クローンＦ１０−４４−２）を；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅｓ，ＵＳＡから；ＣＤ４４ｖ６−ＦＩＴＣ抗体（クローン２Ｆ１０）を；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡから、ＥｐＣＡＭ−ＦＩＴＣ抗体をＢｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡから、パンケラチン（Ｃ１１）抗体−ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入し、全てのアイソタイプ対照抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎから購入した。ペニシリン、ストレプトマイシン及びＴｒｙｐＬＥをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から得た。全ての他の試薬は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを介して購入した。
【００７５】
ナノエマルション製剤の調製及び特徴付け
ナノエマルション製剤の調製は、最近報告されたようにして、また幾分かの修正を加えて行った。超音波処理法の代わりに、水中油ナノエマルションは以下のように微小溶液法により調製した。手短に言えば、魚油のみからなる（プラセボの場合）又はＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を有する予熱した油相（１０ｍｌ）を、卵ホスファチジルコリン（Ｌｉｐｏｉｄ  Ｅ８０（登録商標））（１２００ｍｇ）、ポリソルベート８０（ツイーン８０（登録商標））（０．５ｍｌ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（１，２−ジステアロイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］）（７５ｍｇ）を含む予熱した水相（４０ｍｌ）に徐々に加えた。得られた混合物をホモジナイズし、油−水縣濁液をＭ−１１０ＥＨ−３０高せん断流体プロセッサーのジルコニアプランジャーに１０，０００ｐｓｉで４サイクル通過させて、均一なナノエマルション製剤を達成した。
【００７６】
水中油ナノエマルション製剤を研究室内で、確立されたプロトコルにより特徴付けた。要約すると、水希釈ナノエマルションの粒子サイズ及び表面電荷を、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの９０Ｐｌｕｓ  ＺｅｔａＰＡＬＳ粒子サイズアナライザー（Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用することにより測定し、ナノエマルション製剤中の油小滴の形態を透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）で可視化した。薬物負荷、封入効率及び安定性を、ＨＰＬＣを使用して以前記載したように評価した。要するに、薬物負荷の場合、ナノエマルションを有機物（アセトニトリル）で十分に希釈し、２０μＬアリコートをＨＰＬＣ内に注入した。封入効率の場合、遠心分離フィルター装置（分子量カットオフ３，０００ダルトン；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用した限外濾過法を用いた。ナノエマルションの全バッチを、インビボ及びインビトロ研究の両方に適用する前に、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ溶解物（ＬＡＬ）アッセイにより製造業者の指示に従って内毒素レベルに関して試験した。
【００７７】
腫瘍開始細胞の細胞培養、単離、精製及び特徴付け
ヒト前立腺癌幹細胞（ＰＰＴ２）、前立腺腺癌ＣＳＣ富化細胞株をステージｐＴ２ｃ  ｐＮＸ  ｐＭＸ前立腺癌患者から最近樹立した。手短に言えば、ＰＰＴ２細胞をラットコラーゲンタイプ１被覆組織培養皿上で単層として培養し、浮遊３Ｄスフェロイド培養物を誘導するために、これらの細胞を超低接着（ＵＬＡ）プレート又はフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に５％  ＣＯ２雰囲気下で３７℃で播種した。ＣＳＣの信頼できる富化を確実にし及び調整するために、異なる蛍光染料をコンジュゲート化した数個のマーカーで細胞を標識した。これらの染色細胞を選別し、多パラメーターフローサイトメーターＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＡ）で分析し、又は分離した細胞を遠心分離し、強磁性粒を直接若しくは間接的にコンジュゲート化したＣＤ１３３  Ａｂｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，ＣＡ）で、製造業者の推奨の通り標識した。単離細胞を、非接着培養条件下で、円形コロニー（ホロクローン）及び３Ｄスフェロイドを誘導するそれらの能力に関して機能的に試験した。１次マウス腫瘍の細胞培養のために、腫瘍組織を機械的及び酵素的に脱凝集させて無菌状態で単一の細胞縣濁液とし、ハンクのバランス塩溶液で濯ぎ、２００単位／ｍｌコラゲナーゼタイプＩＩ及びタイプＩＶ、１２０μｇ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む血清フリーＲＰＭＩ培地１６４０中で３７℃で１．５時間インキュベートした。細胞をピペット操作及び細胞分離篩（サイズ４０及び８０メッシュ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を通した連続濾過により更に脱凝集させた。１次細胞縣濁液を単層として及びスフェロイドの両方で成長させた。
【００７８】
細胞取込み研究
これらの研究を行って、単層及びスフェロイド培養ＰＰＴ２細胞の両方へのローダミン封入ナノエマルション製剤の取込みを評価及び比較した。蛍光共焦点顕微鏡法研究を行って、ナノ粒子の定性的細胞内部移行を以前に記載したように評価した。手短に言えば、細胞を単層として及びスフェロイドの両方で培養した。単層及び最適直径のスフェロイドで細胞の獲得したコンフルエンシーを得た後、これらを異なる濃度の染料封入ナノエマルションと共に８時間インキュベートした。細胞及びスフェロイドを冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定化し、冷ＰＢＳで洗浄し、単層細胞培養物の場合、ＤＡＰＩと共に通常の清浄なスライドガラス上に載せ、スフェロイドの形状を無傷で保つために単一孔の凹所を有する顕微鏡スライド上に載せた。ＬＳＭ  ７００（登録商標）共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって６３ｘ倍率でデジタル画像を捕捉し、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ−Ｊソフトウエアを使用して分析した。蛍光検出及び画像の分析に関する全設定パラメーターを一定に保って、比較のためのサンプル画像化の一貫性を可能とした。
【００７９】
細胞生存率分析
異なる濃度のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を含む水性薬物溶液及びナノエマルション製剤の両方を用いて、細胞生存率研究を行った。これを目的として、ＰＰＴ２細胞を１００００細胞／ウェルの密度でコラーゲン被覆９６−ウェルプレート内に播種した。２４時間後、異なる濃度のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を、各々の対照と共に、水性溶液中又はナノエマルション製剤中の単層細胞に加えた。培地及びＤＭＳＯのみ（いずれの薬物も有さない）で処理した細胞を、負の対照として使用した。各試験条件につき８つの複製を作製した。４８時間のインキュベーション期間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒアッセイにより製造業者の指示に従って細胞生存率を決定した。ＢｉｏＴｅｋ−ＨＴ  ＵＶ−Ｖｉｓ／蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、プレートの吸光度を波長５７０ｎｍで読み取った。対照（培地のみ）細胞の吸光度と比較した薬物処理細胞の吸光度に基づいて、１００を乗算してパーセント細胞生存率を計算した。溶液又はナノエマルション製剤のいずれか中のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４により生じた細胞生存率の５０％阻害（ＩＣ５０）を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して計算した。
【００８０】
マウス腫瘍異種移植
動物使用を含む全実験は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の動物実験の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）の推奨に厳格に従って、以前記載したようにストーニーブルック大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）により承認された研究プロトコルにより行った。手短に言えば、十分な増殖後、高いレベルのＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１６６及びＥｐＣＡＭを発現しているクローン原性細胞を１：１  ＭＳＣＧＭ／マトリゲル中に再懸濁し、６週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの側腹部に注入した（マウス当たり１００万細胞まで；皮下に）。腫瘍発達を毎週監視した。１次腫瘍サイズを毎週、ノギスにより測定し、式０．５ａｂ２（ｂは、２つの直交直径のうち短い方）を使用しておよその腫瘍重量を決定した。
【００８１】
ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４及びＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）のインビボ効力と、１次腫瘍細胞のエクスビボ特徴付け
ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（１、３、１０、２５、３０、４０、５０及び７０ｍｇ／ｋｇ）及びＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（タンパク質結合パクリタキセル、Ｃｅｌｇｅｎｅ）（及び３０及び４０ｍｇ／ｋｇ）を；触知可能な腫瘍異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに３週間、毎週静脈内投与した。処置は、ＰＰＴ２細胞の移植から１週間後、腫瘍異種移植片がおよそ５０〜１５０ｍｍ３に達した際に開始した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける全身毒性を注意深く監視し、標準的な基準（運動活性、病的状態、食欲、姿勢及び外観）により評価し、マウスが瀕死であり、又は大きすぎる若しくは潰瘍化腫瘍を有した後に、人道的に安楽死させた。最終処置後、腫瘍発達を更に４週間監視した。全マウスは４週間の経過観察後に終了した。いくつかの対照又は処置後残留腫瘍を回収し、エクスビボクローン原性及びスフェア形成能力及び他のアッセイのために病理組織学的に分析した。処置後の特徴付けのために、マウス腫瘍異種移植片を回収し、機械的及び酵素的に脱凝集させて単一の細胞縣濁液とした。これらの１次細胞が円形コロニー（ホロクローン）及びスフェア形成を誘導する能力を、対照（非処置）及び薬物処置マウスの両方に関して決定した。ホロクローンの場合、細胞を計数し、３００細胞／ウェルの最終総数で４８−ウェルプレート上に蒔き、スフェア形成の場合、細胞を１：４マトリゲル／ＭＳＧＭ中に再懸濁し、既知の細胞数をＵＬＡプレート上に蒔いた。開始から１週間後、プレートを各々、コロニー成長及び浮遊スフェア成長に関して検査した。各ウェル内のコロニー及び浮遊スフェアを位相差顕微鏡法により観察した。処置した腫瘍異種移植片内の両方の非処置からいくつかの細胞を、細胞マーカーの発現における薬物誘導変化の、ＦＡＣＳ及びアレイを用いた分析に使用した。
【００８２】
統計的データ分析
薬物処置に対するインビボ応答を、薬物処置、対、非処置対照異種移植片の腫瘍体積の変化として評価した。データは、対照及び薬物処置腫瘍に関する平均±ＳＤとして表した。スチューデントのｔ検定を使用してＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて統計的有意差を決定した。使用したパラーターは、２テール分布及び対応のある検定（ｐａｉｒｅｄ  ｔｅｓｔ）であった。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると見なされた。
【００８３】
結果
ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルション製剤の特徴付け
ナノエマルションは、水中油又は油中水の順として作製され得る液体の不均一分散物であり、粒子サイズは１００〜１５０ｎｍスケール上にある。ナノエマルション製剤は、インビトロ及びインビボの両方でのそれらの効果的な治療能力に起因して、疎水性薬物送達用の最も一般的に使用されている担体である。多数の抗癌剤封入ナノエマルションは、腫瘍部位へのそれらの標的特異的全身送達に起因して、高い有効性が示されている。この送達手法はまた、本発明者らの以前の研究において高い治療可能性が示されている。
【００８４】
この現在の研究では、本出願人らは、ω−３及びω−６脂肪酸等のＰＵＦＡに富み、有意な量の親油性抗癌剤を可溶化する能力を有する魚油を使用した水中油ナノエマルションを開発した。ナノエマルション製剤を前立腺癌に対する独立した治療法としてのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４、第２世代タキソイドの封入に使用した。本出願人らは微小溶液技術を用いて均一な乳白色エマルション製剤を得た。全てのナノエマルションは、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）で観察して、構造が球状に近く、サイズ範囲は１００〜２２０ｎｍであった（図６Ａ〜６Ｃ）。ＴＥＭ画像では、ＮＥ−プラセボ及びＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の両方が６００００ｘ倍率で撮影されたが、Ａｂｒａｘａｎｅは４００００ｘ倍率で撮影された。ナノエマルションサンプルの油小滴は球状であり、それらのサイズは１００〜２２０ｎｍの範囲内であった。スケールバーは、１００ｎｍの距離を表す。粒子サイズ、多分散指数（ＰＤＩ）、及びゼータ電位（表面電荷）を、プラセボ、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４負荷ナノエマルション製剤及びＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）に関して決定した。全ての製剤は微小溶液技術を用いて作製し、０．２マイクロメートルフィルターを通して濾過し、小さいサイズ（＜２３０ｎｍ）及びＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）を除いて狭いＰＤＩ（＜０．３）を有した。ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）は０．３６１のＰＤＩを有し、負に帯電していた。表１は、本研究に使用した全製剤の平均粒子サイズ、ＰＤＩ及びゼータ電位を示す。
【００８５】
【表１】
2019523226.tif 000003
【００８６】
ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルション製剤のサイズ及びゼータ電位の代表的なグラフを、各々図７Ｂ及び７Ｃに示す。ブランクナノエマルション（いずれも薬物も有さない）の平均粒子サイズは、２２５±７ｎｍであった。ナノエマルションへのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の組み込みは、流体力学粒子サイズ及びサイズを有意に変化させず、およそ２２８±７ｎｍのままであった。ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）は、両方のナノエマルション製剤と比較して小さい粒子サイズを示した。ナノエマルション中の油小滴の平均表面電荷は、−２０．２〜−２７．０ｍＶの範囲内であった。全ての製剤の表面電荷は、油小滴中への薬物の最大封入を用いても有意に異ならなかった。ＨＰＬＣアッセイを用いてナノエマルション製剤中の薬物濃度を決定した。２０ｍｇ／ｍｌのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルションは、９７％の薬物負荷を有した。このナノエマルションの高い薬物封入効率は、これらの薬物がナノエマルションの油コア内に保持されたため、薬物の相対的な親油性によるものであった。加えて、全ての製剤は、貯蔵中にそれらの粒子サイズ及び表面電荷を保持し、薬物封入ナノエマルション製剤は、４℃での貯蔵により少なくとも６カ月間まで化学的に安定であった。全ての製剤は、貯蔵期間中にＬｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ溶解物（ＬＡＬ）アッセイにより確認して、最小レベルの内毒素を有した。
【００８７】
ＰＰＴ２  ＣＳＣにおけるＮＥ  ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４のインビトロ評価
ナノエマルションがＰＰＴ２細胞の単層内及びスフェロイド内に内部移行されたか否かを調べるために、ローダミンをナノエマルション中に封入し、共焦点顕微鏡法研究を行った。異なる濃度の染料製剤と共に８時間インキュベートした後、図８Ａ及び８Ｂに示すように、ローダミン封入ナノエマルション製剤の細胞及びスフェロイドへの最適な取込みを観察した。蛍光顕微鏡法画像は、青色（核）、赤色（ローダミン封入ナノエマルション）及び紫色のオーバーレイ画像を示す。画像は、６３ｘ倍率で撮影された。スケールバーは、１００μｍである。図８Ａ及び８Ｂの画像は、ナノエマルションが封入染料を細胞内に効率的に送達し、より高い濃度のローダミンナノエマルションで処理された細胞及びスフェロイドにおける増大された蛍光シグナルが、ＰＰＴ２細胞及びスフェロイドによるより高い細胞内取込みを示すことを明白に示す。ナノエマルション製剤の内部移行は、細胞取込み実験により確認されたため、ローダミンをナノエマルション製剤中でＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４と置き換え、細胞生存率に対するその効果を薬物溶液と比較した。水性溶液中及びナノエマルション製剤中のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の細胞殺滅効率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒアッセイを用いてＰＰＴ２細胞単層内で調べた。これらの研究に選択されたＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の最終濃度は、ＳＢＴ−１２１４の研究に基づいて１、１０、１００及び１０００ｎＭであった。ＰＰＴ２細胞内の単一薬剤としてのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４に対する用量応答研究を、表２にまとめ、図９Ａに示す。
【００８８】
【表２】
2019523226.tif 000004
【００８９】
結果は、３７℃で薬物に４８時間暴露した後の処理の関数としての、残留生細胞のパーセントとして示す。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４が１０及び１００ｎＭ濃度で投与された場合、水性溶液製剤と比較して、ナノエマルションでより高い細胞毒性が観察された。ＰＰＴ２細胞に関するＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４溶液のＩＣ５０は４８ｎＭであったが、同じ細胞に関するＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルション製剤によるＩＣ５０は、４ｎＭであった。このことは、同様のＩＣ５０を達成するためには、その対応物の薬物ナノエマルション製剤と比較して、ＰＰＴ２細胞は少なくとも約１２倍高い濃度のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４溶液が必要であることを明らかにし、薬物溶液を超えるナノエマルション製剤の優れた効力を示した。
【００９０】
ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルションがＰＰＴ２細胞スフェロイドも殺滅することを確認するために、等しい数のスフェロイドを０．０１〜１０μＭの範囲の異なる濃度のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルションで処理し、特定の時間後、それらの表現型を明視野顕微鏡で観察した。図９Ｂ〜９Ｇは、非処理サンプルにおける明るい健康なスフェロイドを示し、これは濃度の増大と共に暗茶色となり、薬物封入ナノエマルションの増大による細胞死の増大を示す。
【００９１】
ＰＰＴ２細胞株及びＣＳＣベースのインビボ異種移植片モデル
圧倒的多数の最近樹立したＰＰＴ２細胞は未分化のままであり（３〜５％のみが分化細胞のマーカーであるパンケラチンを発現する）、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１６６、ＣＤ４９ｆ及びＥｐＣＡＭ等の多くの共通の細胞表面マーカーの高いレベルの発現を含む、多くの幹細胞の特徴を有する。加えて、ＰＰＴ２細胞は、中でもｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ−４及びＳｏｘ−２を含む多能性のいくつかのマーカーを発現する。圧倒的多数のＣＤ１３３＋ＰＰＴ２細胞は、神経及び胚幹細胞の特徴である高い細胞質レベルのビメンチン及びネスチンを発現した。ＣＤ１３３及びＣＤ４４の最高の発現を有するＰＰＴ２細胞の総集団の約１０％は、最高レベルのＣＸＣＲ４を共発現し、ＣＸＣＲ４は数種の癌タイプにおける転移性活性に関連したケモカイン受容体である。重要なことには、ＰＰＴ２細胞は、アポトーシス促進／腫瘍抑制タンパク質、ｐ５３及びｐ２１に関して陰性であり、標準的な抗癌剤に極度に耐性である。ＰＰＴ２細胞は、非常に高いクローン原性（ホロクローン）、スフェア形成及び腫瘍原生能力を安定的に有する。加えて、これらの細胞は、薬物処理に極度に耐性である。上記の全ては、抗癌剤候補のＣＳＣ標的化効力の評価のためのＰＰＴ２細胞株の利用に関する確かな根拠を表す。数千のＰＰＴ２細胞がＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内で腫瘍を一様に誘導した場合でも、本出願人らは、比較的多数の細胞（マウス当たり１００万細胞まで）の皮下移植が、異常に高い割合の幹様細胞を有する腫瘍異種移植片を誘導することを見出した。このように、移植された細胞がＣＤ１３３＋細胞を９８％まで及びＣＤ４４＋細胞を８４％まで（図１０Ａ及び１０Ｂ）含んでいた場合、マウス腫瘍異種移植片から調製した１次細胞縣濁液は、ＣＤ１３３＋細胞を９１％まで及びＣＤ４４＋細胞を７８％まで（図１０Ｃ及び１０Ｄ）含んでいた。これらの特徴の全ては、ＰＰＴ２のインビボ及びインビトロモデルがＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４のＣＳＣ標的化活性の試験に好適であることを示す。
【００９２】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＰＰＴ２腫瘍の成長阻害
全ての動物手順は、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）のガイドライン及び承認の下で行った。ＰＰＴ２細胞の移植後、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを特定の数のグループに分割し、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（２５、３０、４０、５０及び７０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）［２５及び４０ｍｇ／ｋｇ；ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬフリーナノ粒子アルブミン結合パクリタキセルである）、及びビヒクル（非処置対照）の静脈内注射により毎週処置した。各用量グループは、４匹のマウス（ｎ＝４；２５ｍｇ／ｋｇのＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４で処置したグループは、ｎ＝６を有した）を含んでいた。処置は、腫瘍細胞の移植から１週間後、腫瘍異種移植片が触知可能となった際に開始した（腫瘍は、通常、５０〜１５０ｍｍ３に達した）。腫瘍発達を毎週監視した。３組の毎週注射の後、腫瘍成長を更に４週間監視した。全ての測定値及び形態を図１１Ａ〜１１Ｆに示す。ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（図１１Ｂ、１１Ｃ）とは対照的に、比較的低い濃度のＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４でも、未処置の腫瘍異種移植片（図１１Ａ）と比較して腫瘍成長の劇的な抑制を誘導し（図１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ）、また初期腫瘍サイズと比較して腫瘍体積の用量依存的低下（図１１Ｈ）を誘導することが見出された。このように、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の全ての試験濃度が腫瘍縮小を誘導した（最低用量（２５ｍｇ／ｋｇ）のＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４で処置した６匹のマウスのうちの１匹を除いて）。処置後の残留腫瘍の全ては、可視の血管新生を有することなく実質的に透明であった。最大腫瘍退行は、経過観察の４週目までに観察された。特に、２５ｍｇ／ｋｇは平均４５％縮小を誘導し、３０ｍｇ／ｋｇは６２％、４０ｍｇ／ｋｇは７４％及び５０ｍｇ／ｋｇは８８％（図１２Ａ）の腫瘍体積の低下を誘導した。注目すべきは、より高い用量のＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（７０ｍｇ／ｋｇ）（図１２Ａ）は、腫瘍低下を増大させなかった。ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４とは対照的に、最適用量のＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（２５ｍｇ／ｋｇ）及び４０ｍｇ／ｋｇでさえも、ＰＰＴ２−誘導腫瘍成長の僅かな抑制のみを約４週間もたらし、次いで非処置マウス異種移植片と同様の速度で成長が継続した（図１１Ｈ）。異なる濃度のＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４で処置した全マウスの腫瘍成長阻害及び腫瘍縮小は劇的であったが、全てのマウスが処置の３週目までに１７％まで体重が低下した（図１１Ｇ及び図１２Ｂ）。しかしながら、経過観察の２週目から、全てのマウスは体重の増加を開始した。Ａｂｒａｘａｎｅを用いた処置により有意な体重変化は誘導されなかった。最終処置から４週間後、異なる実験グループの残留腫瘍を回収し、病理組織学的、ゲノム及び機能的分析に供した。非処置対照腫瘍は、ＩＲＢ要件に従って、最大直径がおよそ２ｃｍに達した後に除去した。
【００９３】
組織の病理組織学的分析
非処置及びＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４処置ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからのヘマトキシリン及びエオシン染色腫瘍異種移植片組織切片と、肝臓、腎臓、腸及び膵臓を含む数個の主要な器官の組織切片とを分析した。対照の非処置腫瘍組織切片は、高い程度の核異型を有する、分化が乏しいヒト腺癌の古典的な組織学的特徴を示す（図１３Ａ）。ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（３０ｍｇ／ｋｇ）処置腫瘍組織は、有意な細胞異常、著しいヒアルリゼーション、空胞形成及び広範な壊死を示した（図１３Ｂ〜１３Ｄ）。肝臓（図１３Ｅ）、腎臓（図１３Ｉ）、腸（図１３Ｇ）、膵臓（図１３Ｋ）等の組織学的に評価した主要な器官の中でも、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４処置マウス（４０ｍｇ／ｋｇ）からの肝臓組織のみが、肝細胞の反応性核変化を示し、ある損傷が示唆された（図１３Ｆ）。他の器官は、いずれの診断的異常も示さなかった（図１３Ｈ、１３Ｊ及び１３Ｌ）。
【００９４】
腫瘍細胞のクローン原性及びスフェア形成能力における処置後の変化
ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を用いた処置が、ＣＳＣ富化マウス腫瘍異種移植片細胞のクローン原性の可能性、即ち、浮遊スフェロイド又は接着円形コロニー（ホロクローン）を誘導するそれらの能力に影響を与えるか否かを試験するために、対照及びＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４処置残留腫瘍（エクスビボ細胞培養物）からの総細胞縣濁液を、タイプＩコラーゲン被覆皿及びＵＬＡプレート上に播種した。非処置（ビヒクル処置）ＰＰＴ２−誘導腫瘍異種移植片は密に血管形成され（図１４Ａ及び１４Ｂ）、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４処置残留腫瘍は非常に小さく、透明であり、可視の毛細血管を欠き（図１５Ａ及び１５Ｂ）、接着ホロクローンを生成せず、３Ｄ培養物において単一スフェロイドの孤発性の外観のみ存在した。これらの１次腫瘍細胞は、１次腫瘍細胞懸濁液から成長した非処置スフェロイド（図１６）及びＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４処置スフェロイド（図１７）のパーセント生細胞データで示されるように、次の数日で培養物中で著しい細胞死を受けた。生存細胞のパーセントは、４分割の左下に示され、死細胞は４分割の右下に示される。
【００９５】
考察
腫瘍開始細胞、又はＣＳＣは、従来の治療的戦略に高い耐性を有するのみでなく、それらの自己複製における薬物誘導代償性増大に起因して、癌進行を実際に促進し得ることは広く記述されている。このことは、ＣＳＣを標的化する効果的な治療介入の必要性を強調する。研究は患者由来のＣＳＣ富化ＰＰＴ２細胞株に対して行われ、当該細胞株の幹細胞特性は、以前に記載され、研究室内で常に維持された。Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、ＥＧＦＲ、Ｗｎｔ／β−カテニン及びＮｏｔｃｈなどのＰＰＴ２細胞における数個の発生カスケードの、観察された過剰活性化は、前立腺幹細胞調節及び前立腺癌のアンドロゲン非依存及び転移への進行に関連付けられた。前立腺転移におけるＳＯＸ２及びＯＣＴ３／４の関与は、これらの遺伝子の標的化ノックダウンにより示され、これはインビトロで前立腺癌細胞の浸潤を顕著に抑制した。ビメンチン及びネスチンの両方は、アンドロゲン依存から去勢抵抗性の転移性前立腺癌への移行に関連していた。従って、最も高悪性度の腫瘍タイプ又は細胞株からのＣＳＣを標的化する薬物を開発することが有益であり、これは、そのような薬物が、より広い範囲の作用機構を有し、従って、より広い抗癌的意義を有する可能性があり得るためである。増大する証拠により、抗癌剤が、それらのバルク腫瘍対応物とは機能的及び形態的に異なる癌特異的腫瘍開始細胞を効果的に標的とする筈であることが示されている。上記の全ては、ＰＰＴ２細胞がＣＳＣ標的化薬物開発及び前立腺癌発達の基本的な機能的研究のための独特の前臨床モデルであることを示す。
【００９６】
Ｈｅｄｇｅｈｏｇ及びＮｏｔｃｈ等の主要な幹細胞シグナル伝達経路を標的化する薬物は、正常な幹細胞に重大な副作用を誘導することが最近示された。ＣＳＣの薬物耐性を調節する試みにおける薬物排出ポンプの阻害は、いずれの有意な臨床的利益も提供しなかった。臨床及び前臨床的証拠の蓄積により、癌患者の長期生存に対する抗血管新生薬の利益は取るに足らないことが示された。パクリタキセル（タキソール）及びドセタキセル等の微小管安定剤は、アンドロゲン非依存性前立腺癌の患者の処置に最初は効果的であり得るが、癌は、殆ど、より高悪性度の形態で常に再発する。パクリタキセルは、依然として、乳癌、卵巣癌及び非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）癌、並びにカポジ肉腫を含む多くの固形腫瘍徴候の第１線の処置である。パクリタキセルは、β−チューブリンに結合し、微小管を過剰安定化し、微小管フレームワークの動的不安定性を障害することを介して、その強力な細胞毒性を発揮する。これは、細胞周期を停止させ、Ｇ２／Ｍ期におけるアポトーシスを開始させる。その乏しい水溶性に対処するために、リポソーム、シクロデキストリン及びＨＳＡ結合ナノ粒子（「ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）」）製剤を含む、パクリタキセルの多数の製剤及びプロドラッグが開発されている。パクリタキセルは、パクリタキセルを排出するＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体であるＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）の過剰発現に起因して、前立腺及び結腸癌に対して有効ではない。従って、パクリタキセルは、マウスにおけるヒト結腸癌異種移植片に対してさえも、いずれの認識できる効力も示さない。
【００９７】
排出の問題を克服するために、パクリタキセルは、その癌特異的活性、健康な細胞に対する保護効果、及び腫瘍間質内へのｇｐ６０仲介による経細胞質輸送を介した薬物コンジュゲートの向上された腫瘍特異的蓄積に起因して、多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）とコンジュゲート化された。このコンジュゲート化は、血流中でのＰＵＦＡの主要な担体であるヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）に対するＤＨＡコンジュゲート化薬物のより高い親和性に起因する。ＤＨＡ−パクリタキセル（ＴＸＰ）は、腫瘍細胞により貪欲に吸収され、内部移行され、癌細胞内のエステラーゼによりゆっくり加水分解される。ＤＨＡパクリタキセルは、上述したように、パクリタキセルと比較して、Ｐｇｐの比較的弱い基質であることが見出された。しかしながら、癌細胞がＰｇｐ及び／又は他のＡＢＣ輸送体を過剰発現している場合、遊離パクリタキセル分子は、たとえゆっくり放出されている場合であっても、排出ポンプによって捉えられ、癌細胞から排除されるであろう。パクリタキセルとは対照的に、新世代タキソイド、ＳＢＴ−１２１４は、多剤耐性（ＭＤＲ）表現型を発現している薬物耐性癌細胞に対して卓越した活性（パクリタキセルよりも２〜３桁強力である）を示す。以前に本出願人らは、この新世代タキソイドＳＢＴ−１２１４が、薬物耐性結腸腫瘍異種移植片の長期（１６７日）退行及び腫瘍成長遅延を誘導することを示した。その後、この薬物分子は、幹細胞の調節、癌発生及び進行に関与する数個の重要な転写因子を含む、多数の幹細胞性関連遺伝子の有意な下方調節を誘導することが見出された。注目すべきは、ドセタキセル（去勢抵抗性の転移性前立腺癌における標準的な第１選択治療法）は、ＴＧＦ−β機構を介して前立腺癌細胞の薬物耐性及び脱分化（上皮から間葉系への移行）を促進し得る。血液循環及び最終的に治療法を更に改善するために、現在の研究においてＤＨＡがＳＢＴ−１２１４にコンジュゲート化された。
【００９８】
この疎水性薬物送達の送達を更に改善するために、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、水中油の熱力学的に安定化された分散物であるナノエマルション中に封入され、油小滴サイズは、高エネルギー超音波処理又は微少流体機器を使用して高せん断応力を適用することによってナノメートル長スケール（約２００）に低減される。親油性薬物がナノエマルションに組み込まれた場合、全身投与後の化合物の薬物動態及び体内分布パターンは、薬物分子の物理化学的特性ではなくナノエマルション製剤の特性による影響を受けるであろう。例えば、ＰＥＧ修飾は、血液循環中のナノエマルションの長寿命を向上さえ得る。これはひいては血液中の薬物分子の滞留時間を増大させ、またＥＰＲ効果を介して腫瘍部位における蓄積を向上させる。この研究では、本出願人らは、高濃度のＰＵＦＡを有する魚油を使用して、最適化された水中油ナノエマルション製剤を開発した。一般に、全てのナノエマルションは、２５０ｎｍ未満の油小滴サイズを示し、狭いサイズ分布を有する。ＴＥＭ画像は、油小滴が球状であり、均一に分布されていることも確認する。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を使用したナノエマルションのＰＥＧ表面修飾は、粒子サイズ及びサイズ分布に影響を与えなかった。ナノエマルションの表面電荷値は、−２３．３７〜−３４．５３ｍＶの範囲内であることが認められた。ナノエマルション油小滴上の表面電荷は、界面層を形成する構成成分のイオン化を表す。ＰＥＧ修飾ナノエマルションの場合、界面層は、卵レシチン及びＰＥＧ修飾リン脂質（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の結果として形成された。これらの製剤は、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４をＰＰＴ２細胞及びスフェロイドに対して送達するのに使用された。定性的細胞取込み分析は、ナノエマルション製剤がＰＰＴ２細胞及びスフェロイド内に効率的に内部移行されることを示した。このことは、ナノエマルションがペイロードを細胞内部位に効率的に送達することを示唆する。比較的低濃度のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（０．１〜１μＭ）のナノエマルションが、幹細胞性促進培養条件下で維持された高い腫瘍原生及び高い薬物耐性の前立腺ＣＤ１３３＋細胞の９０％までの死を誘導し、その薬物溶液よりも強力であることが見出された。この研究では、ナノエマルション製剤で送達された場合、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４はＰＰＴ２腫瘍を抑制することが見出された。これらの観察事項に加えて、フローサイトメトリー分析は、インプラントされた腫瘍細胞が皮下腫瘍内でそれらの幹細胞性を保持することも明らかにした。ナノエマルションで送達されるＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を用いた治療法は、ＰＰＴ２細胞及び腫瘍においてより高い治療的有効性を実際に示した。分析した処置グループのいずれにも、有意な体重低下は観察されなかった。組織の組織学的検査は、処置グループのいずれにも、肝臓、心臓又は腎臓におけるいずれの異常な所見も示さなかった。これらの試験は、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４が、ナノエマルションとして投与された場合、マウス内で良好な耐容性を有することを示す。結論として、本発明者らのデータは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４コンジュゲートのナノエマルションが優れた退行及び腫瘍成長阻害を誘導し、新規なＣＳＣ���的化抗癌剤候補としての高い可能性を有することを示す。
【００９９】
結論
現在の研究において、多不飽和脂肪酸ベースのナノエマルションシステムは、疎水性薬物、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を効果的に封入し、インビボ及びインビトロモデルの両方で治療的有効性を示した。この製剤はまた、マウス内で試験して良好な耐容性を示した。粒子サイズ及びゼータ電位データは、物理的に安定なナノエマルションの形成を示した。ナノエマルション製剤中で投与された場合、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４はＰＰＴ２細胞内に送達され、インビトロ細胞毒性の有意な向上をもたらした。結論として、データはＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４のナノエマルション製剤がその溶液と比較して抗癌有効性を向上させることを示す。従って、１次患者由来の、自発的に不死化された、低継代の、高い腫瘍原生及びクローン原性の前立腺癌細胞（ＣＤ１３３＋／高／ＣＤ４４＋／高表現型を有する）に対して多面的ＣＳＣ標的化活性を発揮する疎水性薬物は、臨床的に意義があり、抗癌剤の組み合わせとしての高い可能性を有する。
【０１００】
容易に調製することができ、疎水性分子に効果的及び効率的に組み込まれ、臨床的に安全であり、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の薬理を改善する送達システムが望ましい。結果は、新規なタキソイドＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４のナノエマルション製剤が、処置が困難な癌の新たな治療法を提供できることを示す。ナノエマルションは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４等の疎水性薬物の治療的有効性を向上させ得る有望な新規な製剤である。加えて、乏しい水溶性を有する実験薬物候補のスクリーニング及び評価のための最適な製剤として、これらのナノエマルションを使用することができる。そのような場合、ナノエマルションは容易に処方できるため、時間を要する及び高価な他の製剤研究が避けられる。ナノ送達システムは、ＰＸ等の疎水性薬物の溶解性を改善し、一般に毒性も低いため、薬物送達における有望なビヒクルである。ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）、粒子サイズ約１３０ｎｍのＰＸアルブミン結合ナノ粒子製剤は、転移性乳癌の処置に関して２００５年にＦＤＡにより承認された。この製剤は、タキソールと比較して低い毒性の観点から、いくつかの利点を示した。加えて、総用量は、前処置を有することなく、３０分以内で投与することができる。従って、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は強力な腫瘍標的化化学治療薬であり、パクリタキセル、ドセタキセル及びＴＡＸＯＰＲＥＸＩＮ（登録商標）の弱点を克服し、癌患者の生活の質を実質的に改善するというあらゆる徴候が存在する。タキソイドがチェックポイント阻害剤等の腫瘍免疫療法薬との組み合わせで利用され得る免疫学的効果を有するという、増大する証拠も存在する。タキサン処置は、腫瘍関連マクロファージ細胞毒性を刺激し、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、腫瘍特異的細胞毒性Ｔ細胞の活性化を誘導し、また調節性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇｓ」）を下方調節することが示されている。従って、ＰｇＰ輸送体の基質ではなく、ＭＤＲ腫瘍及び癌幹細胞（「ＣＳＣ’ｓ」）に対して有効であり、改善された安全性及び薬物送達プロファイルを有し、腫瘍を受動的に標的化する、新規な第２世代タキソイドのナノエマルション製剤は、未達成の明らかな医学的必要性に対する可能な解決法を提供する。
【０１０１】
実施例５
ＰＰＴ２皮下腫瘍支持マウスにおけるＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４溶液及びそのナノエマルションの薬物動態分析及び体内分布。
材料
雄のＣＤ−１（登録商標）マウス（４〜６週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入した。ヒト１次前立腺癌細胞（ＰＰＴ２）をこれらのマウスの右側腹部内に皮下移植して、腫瘍を形成した。全ての動物手順はノースイースタン大学（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の動物実験委員会により承認された。溶媒はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ）から購入した。
【０１０２】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析
２つのポンプ、オートサンプラー及びＵＶ−検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  ＬＣ（モデル２４８７、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ）を分析に使用した。機器の制御、データ獲得及び加工のためにＬＣシステムをＥｍｐｏｗｅｒソフトウエアとインターフェースした。（Ａ）水中０．１％  ＴＦＡ、及び（Ｂ）アセトニトリル中０．１％  ＴＦＡからなる移動相を、Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５４カラム（Ｃ１８、粒子サイズ５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）を通して流速１ｍＬ／分で揚送した。勾配は１５分で６０％Ｂ〜９５％Ｂであり、薬物溶出は波長２３０ｎｍで監視した。８０μＬアリコートをＨＰＬＣ内に注入した。
【０１０３】
ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４溶液及びナノエマルション製剤の血漿薬物動態分析
ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を溶液又はナノエマルション製剤として、尾静脈注射を介して１２０ｍｇ／ｋｇでマウスに静脈内投与した。血液を様々な時間間隔：投与後０．５、４、１０、２４及び４８時間でＥＤＴＡ処理チューブ内に収集し、氷上に保った。サンプルを１０，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離して血漿を分離した。血漿を−２０℃で貯蔵し、又は分析のために直ちに使用した。１００μｌの血漿を３００μｌのアセトニトリルで構成し、ボルテックス後、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を抽出及び分離した。上清にＨＰＬＣを行い、溶離液をＨＰＬＣにより分析した。
【０１０４】
異なる組織におけるＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４溶液及びナノエマルション製剤の体内分布
ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を溶液又はナノエマルション製剤として、尾静脈注射を介して１２０ｍｇ／ｋｇでマウスに静脈内投与した。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の静脈内投与後、マウスに麻酔をかけ、０．５、４、１０、２４及び４８時間の所定の時点で、心臓穿刺により血液を完全に取り除いた。動物をＰＢＳで灌流した後、頸部脱臼により屠殺し、心臓、前立腺、膵臓、脳、結腸、肺、脾臓、腎臓、肝臓及び腫瘍組織を含む様々な組織を回収し、秤量し、液体窒素中で急速凍結させ、−８０℃で貯蔵した。凍結組織を等価重量の通常の生理食塩水溶液中に懸濁し、組織ホモジナイザーを使用して５０００ｒｐｍで２分間ホモジナイズした。酢酸エチル：メタノール：アセトニトリル（５０：２５：２５）の４倍過剰混合物をホモジナイズした組織に加え、ボルテックス後、サンプルを１０，０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離して、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を抽出及び分離した。上清を窒素ガスで蒸発させ、サンプルを４００μｌのアセトニトリル中で再構成した。再構成サンプルにＨＰＬＣを行い、溶離液をＨＰＬＣにより分析した。
【０１０５】
薬物動態データ分析
非コンパートメント分析を用いて、Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ｖ．１．３ソフトウエアを使用してＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の薬物動態パラメーターを決定した。対数線形台形法を用いて、０から無限大（ＡＵＣ０〜∞）の血漿濃度−時間曲線下面積を計算した。定常状態の分布体積（Ｖｓｓ）、クリアランス（Ｃｌ）、最終消失相に関連した速度定数であるラムダｚ（λｚ）、対応する半減期（ｔ１／２）、及び平均滞留時間（ＭＲＴ）を含むＰＫパラメーターを概算した。
【０１０６】
結果
ＰＰＴ２細胞を５週齢の雄のＮＯＤ．ＳＣＩＤ／ＮＣｒマウスにインプラントした。腫瘍体積が平均１００ｍｍ３に達した際、マウスを２つのグループに無作為化した。異なる時点（０．５、４、１０、２４及び４８時間）で１２０ｍｇ／ｋｇマウスで静脈内投与することにより、マウスの一方のグループをＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４溶液で処置し、他方のグループを同じ薬物のナノエマルションで処置した。各処置に関して時点当たり２匹のマウスが存在した。各時点に関して４つの複製を有するように各器官を２つに分割した。腫瘍体積は１００〜１５０ｍｍ３であった。各時点が経過した後、動物を屠殺し、全ての主要な器官及び腫瘍を回収し、血液を収集した。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４薬物をアセトニトリルで全ての器官及び血漿から抽出し、ＨＰＬＣ方法により定量化した。図１８Ａ〜１８Ｋは、溶液及びナノエマルションの両方からの薬物の異なる器官内の体内分布を示す。ほぼ全ての器官内で、ナノエマルションからの薬物は、その溶液形態と比較して、より長時間保持された。異なる器官内での薬物のより高い保持（４８時間後でさえも）は、ナノエマルションが血液循環中の薬物をより長時間保ち、従ってナノエマルションは薬物に対する腫瘍血管のより高い暴露を提供して、現在使用されている薬物溶液と比較してより良好な治療効率を有し得ることを示す。
【０１０７】
実施例６
ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルション製剤の安定性
ナノエマルションを、異なる温度で貯蔵した後、６カ月間まで、その均一性（外観）、粒子サイズ及び表面電荷に関連した安定性を研究した。３つの異なるバッチからのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４溶液及びナノエマルションを異なる貯蔵条件、即ち、室温、４℃及び−２０℃で６カ月間までインキュベートし、貯蔵期間に亘って周期的に薬物の濃度をＨＰＬＣにより計算して、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４薬物の溶液及びナノエマルションの両方の貯蔵に最も好適な温度を見出した。図１９Ａに示すように、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４のナノエマルションは４℃及び−２０℃条件の両方で安定であるが、室温では安定でない。しかしながら、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の薬物溶液は、−２０℃の貯蔵条件のみで安定であり、室温及び４℃では安定でなかった。この貯蔵期間中、ナノエマルションの物理的特性も周期的に決定した。図１９Ｂは、４℃が理想的な貯蔵条件であることを示し、ここでナノエマルションの粒子サイズはほぼ一定に留まったが、−２０℃では徐々に増大し、室温では非常に大きい凝集を示した。この期間中、ＰＤＩ（多分散指数）も決定し、これを図１９Ｃに示し、またゼータ電位（表面電荷）を決定し、これを図１９Ｄに示し、４℃がナノエマルション製剤の長期間貯蔵に最良の貯蔵条件であると結論付けた。
【０１０８】
実施例７
更なるインビボ細胞毒性研究
これらのインビボ研究は、異なる用量のＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の細胞毒性の分析に焦点を当てた。動物を以下のグループに分割した（表３）。異なる用量のＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（３０、４０、５０及び７０ｍｇ／ｋｇ）を１回／週、３週間静脈内投与し、４週間の経過観察を行った。
【０１０９】
【表３】
2019523226.tif 000005
【０１１０】
全試験濃度のＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴにより誘導された腫瘍成長の劇的な抑制が認められ（図２０Ａ〜２０Ｅ）、それにより、その遥かに低い用量の更なる評価が動機づけられた。以前のように、全身毒性を注意深く監視し、標準的な基準（運動活性、病的状態、食欲、姿勢及び外観）により評価し、腫瘍成長を毎週測定した。各々マウス腫瘍異種移植片の一部をＲＮＡ−Ｌａｔｅｒで前処理し、ＣＳＣ関連遺伝子発現のＰＣＲアレイ分析（これは、インビボ研究の完了後に行われる）の前に−８０℃で保った。回収した各腫瘍の部分を、以前記載したように、機械的及び酵素的に脱凝集させて単一の細胞懸濁液とし、円形コロニー（ホロクローン）及び３Ｄスフェロイドを誘導する能力について試験した（ＣＳＣの生存に関する試験として）。
【０１１１】
インビボ及びインビトロ研究で常に使用したＰＰＴ２細胞の高いクローン原性及び腫瘍原生の集団の維持、精製及び増殖のために一定の労力を適用した。低用量のＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の細胞毒性の研究のために、別のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの組にＰＰＴ２細胞を移植した。
【０１１２】
実施例８
薬物溶液及びナノエマルション製剤からのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４のインビトロ放出
薬物溶液及びそのナノエマルション製剤からのインビトロ放出プロファイルを研究するために、５μｇのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルション又は薬物溶液を、透析緩衝液で調整し、ＰＢＳ＋ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）緩衝液中に懸濁した後、１００ｒｐｍで１２時間の回転の異なる地点で、３５００  ＭＷＣＯ  Ｓｌｉｄｅ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット内に注入した。毎時間後にビーカーから１ｍｌサンプルを取り、薬物をアセトニトリルで抽出し、ＨＰＬＣを行って、溶液及びナノエマルションの両方からの薬物放出量を定量化した。図２１に示すように、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の放出は、そのナノエマルション製剤と比較して、薬物溶液からは３倍超速かった。
【０１１３】
本発明を例示的に記載してきたが、使用された用語は、限定ではなく、記載の単語の本質の範囲内であることが意図されると理解される。本発明の多数の修正及び変更が上記の教示に照らして可能であることは明らかである。従って、本発明は、不随する特許請求の範囲内で、詳細に記載されたものとは異なるように実践できることが理解される。
【０１１４】
参考文献
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Ｇａｎｔａ  Ｓ，ＤｅｖａｌａｐａｌｌｙＨ，Ａｍｉｊｉ  Ｍ．Ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｏｒａｌ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｕｐｏｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．（２０１０）Ｎｏｖ；９９（１１）：４６３０−４１．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｐｓ．２２１５７．
Ｇａｎｔａ  Ｓ，Ｓｉｎｇｈ  Ａ，Ｐａｔｅｌ  ＮＲ，Ｃａｃａｃｃｉｏ  Ｊ，Ｒａｗａｌ  ＹＨ，Ｄａｖｉｓ  ＢＪ，Ａｍｉｊｉ  ＭＭ，Ｃｏｌｅｍａｎ  ＴＰ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＥＧＦＲ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．（２０１４）Ｓｅｐ；３１（９）：２４９０−５０２．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０９５−０１４−１３４５−ｚ．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｍａｒ  １９．
Ｍａｔｅｓａｎｚ  Ｒ，Ｔｒｉｇｉｌｉ  Ｃ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｓａｌａｒｉｃｈｓ  Ｊ，Ｚａｎａｒｄｉ  Ｉ，Ｐｅｒａ  Ｂ，Ｎｏｇａｌｅｓ  Ａ，Ｆａｎｇ  ＷＳ，Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｂａｒｂｅｒｏ  Ｊ，Ｃａｎａｌｅｓ  Ａ，Ｂａｒａｓｏａｉｎ  Ｉ，Ｏｊｉｍａ  Ｉ，Ｄｉａｚ  ＪＦ．Ｔａｘａｎｅｓ  ｗｉｔｈＨｉｇｈ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｔｕｂｕｌｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｔｕｍｏｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．（２０１４）Ｓｅｐ  １５；２２（１８）：５０７８−９０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｍｃ．２０１４．０５．０４８．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｊｕｎ  １９．
Ｏｊｉｍａ  Ｉ，Ｚｕｎｉｇａ  ＥＳ，Ｂｅｒｇｅｒ  ＷＴ，Ｓｅｉｔｚ  ＪＤ．Ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｅｗ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔａｘｏｉｄｓ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．（２０１２）Ｊａｎ；４（１）：３３−５０．ｄｏｉ：１０．４１５５／ｆｍｃ．１１．１６７．
“Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ”，Ｊ．Ｓｅｉｔｚ  ａｎｄ  Ｉ．Ｏｊｉｍａ，Ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｆｒｏｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｆ．Ｋｒａｔｚ，Ｐ．Ｓｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｔｅｉｎｈａｇｅｎ  Ｅｄ．）Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ．Ｖｏｌ．３．（２０１１）Ｃｈａｐｔｅｒ  ５．９：ｐｐ  １３２３−１３６０．
Ｔｉｗａｒｉ  ＳＢ，Ａｍｉｊｉ  ＭＭ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｎａｎｏｓｃｉ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６）Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；６（９−１０）：３２１５−２１．
Ｇｕｐｔａ  ＰＢ，Ｃｈａｆｆｅｒ  ＣＬ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ．Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｍｉｒａｇｅ  ｏｒ  ｒｅａｌｉｔｙ？  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００９；１５（９）：１０１０−２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ０９０９−１０１０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１９７３４８７７．
Ｇｕｐｔａ  ＰＢ，Ｆｉｌｌｍｏｒｅ  ＣＭ，Ｊｉａｎｇ  Ｇ，Ｓｈａｐｉｒａ  ＳＤ，Ｔａｏ  Ｋ，Ｋｕｐｅｒｗａｓｓｅｒ  Ｃ，Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ．Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｓｔａｔｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｇｉｖｅ  ｒｉｓｅ  ｔｏ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｉｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ．２０１１；１４６（４）：６３３−４４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０７．０２６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２１８５４９８７．
Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ．Ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．２０１１；１４４（５）：６４６−７４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０２．０１３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２１３７６２３０．
Ｆａｎａｌｉ  Ｃ，Ｌｕｃｃｈｅｔｔｉ  Ｄ，Ｆａｒｉｎａ  Ｍ，Ｃｏｒｂｉ  Ｍ，Ｃｕｆｉｎｏ  Ｖ，Ｃｉｔｔａｄｉｎｉ  Ａ，Ｓｇａｍｂａｔｏ  Ａ．Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｗｏｒｌｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ：ＷＪＧ．２０１４；２０（４）：９２３−４２．ｄｏｉ：１０．３７４８／ｗｊｇ．ｖ２０．ｉ４．９２３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４５７４７６６；ＰＭＣＩＤ：３９２１５４５．
Ｈｅｒｍａｎｎ  ＰＣ，Ｈｕｂｅｒ  ＳＬ，Ｈｅｒｒｌｅｒ  Ｔ，Ａｉｃｈｅｒ  Ａ，Ｅｌｌｗａｒｔ  ＪＷ，Ｇｕｂａ  Ｍ，Ｂｒｕｎｓ  ＣＪ，Ｈｅｅｓｃｈｅｎ  Ｃ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎＨｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ．２００７；１（３）：３１３−２３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２００７．０６．００２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８３７１３６５．
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＡＳ，Ｈｕａｎｇ  Ｊ，Ｇｕｏ  Ｃ，Ｇａｒｒａｗａｙ  ＩＰ，Ｗｉｔｔｅ  ＯＮ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌ  ｏｆ  ｏｒｉｇｉｎ  ｆｏｒＨｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０；３２９（５９９１）：５６８−７１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１８９９９２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２０６７１１８９；ＰＭＣＩＤ：２９１７９８２．
Ｍｉｋｉ  Ｊ，Ｆｕｒｕｓａｔｏ  Ｂ，ＬｉＨ，Ｇｕ  Ｙ，ＴａｋａｈａｓｈｉＨ，Ｅｇａｗａ  Ｓ，Ｓｅｓｔｅｒｈｅｎｎ  ＩＡ，ＭｃＬｅｏｄ  ＤＧ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｓ，Ｒｈｉｍ  ＪＳ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒｓ，ＣＤ１３３  ａｎｄ  ＣＸＣＲ４，ｉｎＨＴＥＲＴ−ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄＨｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００７；６７（７）：３１５３−６１．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−０６−４４２９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１７４０９４２２．
Ｄｉ  Ｃ，Ｚｈａｏ  Ｙ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ（Ｒｅｖｉｅｗ）．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５；９（２）：２８９−９３．ｄｏｉ：１０．３８９２／ｅｔｍ．２０１４．２１４１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：ＰＭＣ４２８０９５０．
Ｌａｔｈｉａ  ＪＤ．Ａｗａｋｅｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｅａｓｔ：Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５；７（２６９）：２６９ｅｃ３−ｅｃ３．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａａ３４７０．
ＧｅｌｄｅｒｂｌｏｍＨ，Ｖｅｒｗｅｉｊ  Ｊ，Ｎｏｏｔｅｒ  Ｋ，Ｓｐａｒｒｅｂｏｏｍ  Ａ．Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：ｔｈｅ  ｄｒａｗｂａｃｋｓ  ａｎｄ  ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．２００１；３７（１３）：１５９０−８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１１５２７６８３．
Ｇｉａｎｎｉ  Ｌ，Ｋｅａｒｎｓ  ＣＭ，Ｇｉａｎｉ  Ａ，Ｃａｐｒｉ  Ｇ，Ｖｉｇａｎｏ  Ｌ，Ｌａｃａｔｅｌｌｉ  Ａ，Ｂｏｎａｄｏｎｎａ  Ｇ，Ｅｇｏｒｉｎ  ＭＪ．Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ／ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎＨｕｍａｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．１９９５；１３（１）：１８０−９０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：７７９９０１８．
Ｎｏｏｔｅｒ  Ｋ，Ｓｔｏｔｅｒ  Ｇ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．１９９６；１９２（７）：７６８−８０．
Ｖｒｅｄｅｎｂｕｒｇ  ＭＲ，Ｏｊｉｍａ  Ｉ，Ｖｅｉｔｈ  Ｊ，Ｐｅｒａ  Ｐ，Ｋｅｅ  Ｋ，Ｃａｂｒａｌ  Ｆ，Ｓｈａｒｍａ  Ａ，Ｋａｎｔｅｒ  Ｐ，Ｂｅｒｎａｃｋｉ  ＲＪ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｒａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｔａｘａｎｅｓ  ｏｎ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ  Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００１；９３：１２３４−４５．
Ｏｊｉｍａ  Ｉ，Ｓｌａｔｅｒ  ＪＣ，Ｍｉｃｈａｕｄ  Ｅ，Ｋｕｄｕｋ  ＳＤ，Ｂｏｕｎａｕｄ  Ｐ−Ｙ，Ｖｒｉｇｎａｕｄ  Ｐ，Ｂｉｓｓｅｒｙ  Ｍ−Ｃ，Ｖｅｉｔｈ  Ｊ，Ｐｅｒａ  Ｐ，Ｂｅｒｎａｃｋｉ  ＲＪ．Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｔａｘｏｉｄｓ．Ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９６；３９：３８８９−９６．
Ｏｊｉｍａ  Ｉ，Ｓｌａｔｅｒ  ＪＳ，Ｋｕｄｕｋ  ＳＤ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ＣＳ，Ｇｉｍｉ  ＲＨ，Ｓｕｎ  Ｃ−Ｍ，Ｐａｒｋ  ＹＨ，Ｐｅｒａ  Ｐ，Ｖｅｉｔｈ  ＪＭ，Ｂｅｒｎａｃｋｉ  ＲＪ．Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  Ｔａｘｏｉｄｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  １４  −Ｈｙｄｒｏｘｙ−１０−ｄｅａｃｅｔｙｌｂａｃｃａｔｉｎ  ＩＩＩ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９７；４０：２６７−７８．
Ｏｊｉｍａ  Ｉ，Ｗａｎｇ  Ｔ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＭＬ，Ｌｉｎ  Ｓ，Ｂｏｒｅｌｌａ  Ｃ，Ｇｅｎｇ  Ｘ，Ｐｅｒａ  Ｐ，Ｂｅｒｎａｃｋｉ  ＲＪ．Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｔａｘｏｉｄｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１９９９；９：３４２３−８．
Ｂｏｔｃｈｋｉｎａ  ＧＩ，Ｚｕｎｉｇａ  ＥＳ，Ｄａｓ  Ｍ，Ｗａｎｇ  Ｙ，ＷａｎｇＨ，Ｚｈｕ  Ｓ，Ｓａｖｉｔｔ  ＡＧ，Ｒｏｗｅｈｌ  ＲＡ，Ｌｅｙｆｍａｎ  Ｙ，Ｊｕ  Ｊ，Ｓｈｒｏｙｅｒ  Ｋ，Ｏｊｉｍａ  Ｉ．Ｎｅｗ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔａｘｏｉｄ  ＳＢ−Ｔ−１２１４  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ３Ｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ．２０１０；９：１９２．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７６−４５９８−９−１９２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２０６３００６７；ＰＭＣＩＤ：２９１１４４８．
Ｂｏｔｃｈｋｉｎａ  ＧＩ，Ｚｕｎｉｇａ  ＥＳ，Ｒｏｗｅｈｌ  ＲＨ，Ｐａｒｋ  Ｒ，Ｂｈａｌｌａ  Ｒ，Ｂｉａｌｋｏｗｓｋａ  ＡＢ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｆ，Ｇｏｌｕｂ  ＬＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｏｊｉｍａ  Ｉ，Ｓｈｒｏｙｅｒ  ＫＲ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔａｘｏｉｄ，ＳＢＴ−１２１４  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｅｎｏｌｉｃ  ｚｉｎｃ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｕｒｃｕｍｉｎｏｉｄ，ＣＭＣ２．２４．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．２０１３；８（９）：ｅ６９８８４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８８４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４０８６２４５；ＰＭＣＩＤ：３７８２４７０．
Ｂｏｔｃｈｋｉｎａ  ＩＬ，Ｒｏｗｅｈｌ  ＲＡ，Ｒｉｖａｄｅｎｅｉｒａ  ＤＥ，Ｋａｒｐｅｈ  ＭＳ，Ｊｒ．，ＣｒａｗｆｏｒｄＨ，Ｄｕｆｏｕｒ  Ａ，Ｊｕ  Ｊ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｌｅｙｆｍａｎ  Ｙ，Ｂｏｔｃｈｋｉｎａ  ＧＩ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００９；６（１）：１９−２９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１９４５１０８７．
Ｆｅｒｌｉｎｉ  Ｃ，Ｄｉｓｔｅｆａｎｏ  Ｍ，Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉ  Ｆ，Ｌｉｎ  Ｓ，Ｒｉｖａ  Ａ，Ｂｏｍｂａｒｄｅｌｌｉ  Ｅ，Ｍａｎｃｕｓｏ  Ｓ，Ｏｊｉｍａ  Ｉ，Ｓｃａｍｂｉａ  Ｇ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔａｘａｎｅｓ  Ｔｈａｔ  Ａｃｔ  ａｓ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｐ−Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ  Ｔｉｍｅ．Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０００；８３：１７６２−８．
Ｇａｎｔａ  Ｓ，Ａｍｉｊｉ  Ｍ．Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｉｎ  ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２００９；６（３）：９２８−３９．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ８００２４０ｊ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１９２７８２２２．
Ｇａｎｔａ  Ｓ，ＤｅｖａｌａｐａｌｌｙＨ，Ａｍｉｊｉ  Ｍ．Ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｏｒａｌ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｕｐｏｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２０１０；９９（１１）：４６３０−４１．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｐｓ．２２１５７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２０８４５４６１．
ｖａｎ  Ｖｌｅｒｋｅｎ  ＬＥ，Ｄｕａｎ  Ｚ，Ｌｉｔｔｌｅ  ＳＲ，Ｓｅｉｄｅｎ  ＭＶ，Ａｍｉｊｉ  ＭＭ．Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  ｃｅｒａｍｉｄｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂｌｅｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２００８；５（４）：５１６−２６．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ８０００３０ｋ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８６１６２７８；ＰＭＣＩＤ：２６４６６６８．
Ｔｉｗａｒｉ  ＳＢ，Ａｍｉｊｉ  ＭＭ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００６；６（９−１０）：３２１５−２１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１７０４８５３９．
Ｇａｎｔａ  Ｓ，Ｓｉｎｇｈ  Ａ，Ｐａｔｅｌ  ＮＲ，Ｃａｃａｃｃｉｏ  Ｊ，Ｒａｗａｌ  ＹＨ，Ｄａｖｉｓ  ＢＪ，Ａｍｉｊｉ  ＭＭ，Ｃｏｌｅｍａｎ  ＴＰ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＥＧＦＲ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１４；３１（９）：２４９０−５０２．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０９５−０１４−１３４５−ｚ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４６４３９３２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４１６９３５５．
Ｃｈｅｎ  Ｊ，Ｌｉ  Ｙ，Ｙｕ  ＴＳ，ＭｃＫａｙ  ＲＭ，Ｂｕｒｎｓ  ＤＫ，Ｋｅｒｎｉｅ  ＳＧ，Ｐａｒａｄａ  ＬＦ．Ａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐａｇａｔｅｓ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｆｔｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２；４８８（７４１２）：５２２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１２８７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２２８５４７８１；ＰＭＣＩＤ：３４２７４００．
【図１】
2019523226.tif 000006
【図２Ａ】
2019523226.tif 000007
【図２Ｂ】
2019523226.tif 000008
【図３Ａ】
2019523226.tif 000009
【図３Ｂ】
2019523226.tif 000010
【図３Ｃ】
2019523226.tif 000011
【図３Ｄ】
2019523226.tif 000012
【図４Ａ】
2019523226.tif 000013
【図４Ｂ】
2019523226.tif 000014
【図４Ｃ】
2019523226.tif 000015
【図４Ｄ】
2019523226.tif 000016
【図５】
2019523226.tif 000017
【図６Ａ−Ｃ】
2019523226.tif 000018
【図７Ａ−Ｂ】
2019523226.tif 000019
【図８Ａ】
2019523226.tif 000020
【図８Ｂ】
2019523226.tif 000021
【図９Ａ】
2019523226.tif 000022
【図９Ｂ−Ｇ】
2019523226.tif 000023
【図１０Ａ−Ｂ】
2019523226.tif 000024
【図１０Ｃ−Ｄ】
2019523226.tif 000025
【図１１Ａ−Ｆ】
2019523226.tif 000026
【図１１Ｇ】
2019523226.tif 000027
【図１１Ｈ】
2019523226.tif 000028
【図１２Ａ】
2019523226.tif 000029
【図１２Ｂ】
2019523226.tif 000030
【図１３Ａ−Ｌ】
2019523226.tif 000031
【図１４Ａ−Ｂ】
2019523226.tif 000032
【図１５Ａ−Ｂ】
2019523226.tif 000033
【図１６】
2019523226.tif 000034
【図１７】
2019523226.tif 000035
【図１８Ａ−Ｄ】
2019523226.tif 000036
【図１８Ｅ−Ｈ】
2019523226.tif 000037
【図１８Ｉ−Ｋ】
2019523226.tif 000038
【図１９Ａ】
2019523226.tif 000039
【図１９Ｂ】
2019523226.tif 000040
【図１９Ｃ】
2019523226.tif 000041
【図１９Ｄ】
2019523226.tif 000042
【図２０Ａ−Ｅ】
2019523226.tif 000043
【図２１】
2019523226.tif 000044
【国際調査報告】
2019523226.tif 000045
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