(57)【要約】  本発明は、一般式(I)の化合物:【化１】2019519616.tif 000206（式中、R1、R2、R3、R10、及びX-は本明細書に定義される通りである）に関する。該化合物は、上皮型ナトリウムチャネル(ENaC)の阻害剤であり、呼吸器の疾患及び病態の治療又は予防に有用である。
2019519616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その全互変異性形態、全エナンチオマー、及び同位体変種を含む一般式(I)の化合物:
【化１】
2019519616.tif 000190
（式中:
X-はアニオンであり;
R1は:
i.  H、ハロ;又は
ii.  C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、-O(C1-6アルキル)、-O(C2-6アルケニル)、若しくは-O(C2-6アルキニル)（そのいずれも1つ以上のハロ置換基により任意に置換されている）;又は
iii  -L1R11、-O-L1R11、-OR5、-SO2R5、-C(O)OR5、-C(O)NR5R6、若しくは-C(=NR7)NR5R6;
L1は、C1-6アルキレン、C2-6アルケニレン、又はC2-6アルキニレンであり;
R11は、H、-NR7R8、-NR7-C(=NR9)N(R8)2、-NR7-C(O)O-R8、-NR7-C(O)-(C1-3アルキレン)-N+(R8)3、又は-N+(R8)3であり;
各R7、R8、及びR9は、H又はC1-4アルキルから独立に選択され;
各R5及びR6は、独立に、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-8シクロアルキル、又はC3-8ヘテロシクリルである（そのいずれも、ハロ、OR7、C(O)OR7、-NR7R8、C(O)NR7R8又は、シクロアルキル若しくはヘテロシクリル基の場合、オキソから選択される1つ以上の置換基により任意に置換されている）;又は
iv.  -L2-R12（式中
L2は:
結合;
-Z12-、-アリール-、-ヘテロアリール-、-カルボシクリル-、-ヘテロシクリル-、-Z6-カルボシクリル-、-Z6-ヘテロシクリル-、-Z6-アリール-、-Z6-ヘテロアリール-;
-カルボシクリル-Z6-、-ヘテロシクリル-Z6-、-アリール-Z6-、-ヘテロアリール-Z6-;
-Z6-NR7-Z6-;
-OZ12-、-O-アリール-、-O-ヘテロアリール-、-O-カルボシクリル-、-O-ヘテロシクリル-、
-OZ6-カルボシクリル-、-OZ6-ヘテロシクリル-、-OZ6-アリール-、-OZ6-ヘテロアリール-;
-O-カルボシクリル-Z6-、-O-ヘテロシクリル-Z6-、-O-アリール-Z6-、-O-ヘテロアリール-Z6-;
-OZ6-NR7-Z6-、
-C(O)Z12-、-C(O)-カルボシクリル-、-C(O)-ヘテロシクリル-、-C(O)-カルボシクリル-Z6-、-C(O)-ヘテロシクリル-Z6-、-C(O)-Z6-カルボシクリル-、C(O)-Z6-ヘテロシクリル-、-C(O)-Z6-カルボシクリル-Z6-、C(O)-Z6-ヘテロシクリル-Z6-、
-C(O)NR7-、-C(O)NR7-Z12-、-C(O)NR7-カルボシクリル-、C(O)NR7-ヘテロシクリル-、C(O)NR7-アリール-、C(O)NR7-ヘテロアリール-、-C(O)NR7-カルボシクリル-Z6-、-C(O)NH-ヘテロシクリル-Z6-、-C(O)NR7-Z6-カルボシクリル-、-C(O)NR7-Z6-ヘテロシクリル-、-C(O)NR7-Z6-カルボシクリル-Z6-、-C(O)NR7-Z6-ヘテロシクリル-Z6-;
-Z6-C(O)NR7-Z6-、-Z6-C(O)NR7-アリール-、-Z6-C(O)NR7-ヘテロアリール-、-Z6-C(O)NR7-カルボシクリル-、-Z6-C(O)NR7-ヘテロシクリル-、-Z6-C(O)NR7-アリール-Z6-、-Z6-C(O)NR7-ヘテロアリール-Z6-、-Z6-C(O)NR7-カルボシクリル-Z6-、若しくは-Z6-C(O)NR7-ヘテロシクリル-Z6-;
-C(O)Z12-、-C(O)-カルボシクリル-、-C(O)-ヘテロシクリル-、-C(O)-カルボシクリル-Z6-、-C(O)-ヘテロシクリル-Z6-、-C(O)-Z6-カルボシクリル-、C(O)-Z6-ヘテロシクリル-、-C(O)-Z6-カルボシクリル-Z6-、C(O)-Z6-ヘテロシクリル-Z6-、
-C(=N)NR7-Z12-、-C(=N)NR7-カルボシクリル-、C(=N)NR7-ヘテロシクリル-、-C(=N)NR7-カルボシクリル-Z6-、-C(=N)NH-ヘテロシクリル-Z6-、-C(=N)NR7-Z6-カルボシクリル-、-C(=N)NR7-Z6-ヘテロシクリル-、-C(=N)NR7-Z6-カルボシクリル-Z6-、-C(=N)NR7-Z6-ヘテロシクリル-Z6-;
（式中、Z12は、C1-12アルキレン、C2-12アルケニレン、又はC2-12アルキニレンであり;
Z6は、C1-6アルキレン、C2-6アルケニレン、又はC2-6アルキニレンであり、アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレン基は、NR8R9、C(O)NR8R9、OH、又はハロ（式中、R7、R8、及びR9は先に定義された通りである）から選択される1つ以上の置換基により任意に置換されており;
R12は-NR14R15又は-G-R14であり;
R14と及びR15のそれぞれは、独立に、1つ以上のOH基により任意に置換されているC1-8アルキルであり;且つGは、1つ以上のOH基により任意に置換されており、共有結合により基R14に接続している少なくとも1つの窒素原子を含む5員〜10員の複素環である）;
v.  -L3-R13であり（式中
L3は、１つの環式基又は互いに直接結合している2つの環式基であって、各環式基が、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、及びヘテロシクリル（式中、シクロアルキル及びヘテロシクリル基は1つ以上のオキソ置換基を有してよい）から選択される環式基を含み;且つ
R13は、H、-OR5、-SO2R5、-C(O)OR5、-C(O)NR5R6、又は-C(=NR7)NR5R6であり;式中、R5、R6及びR7は、先に定義された通りである）;
R2は、1つ以上の-CH2-基が任意に-O-に置き換わっており、ハロ、アリール、ヘテロアリール、-OR7、及び-NR7R8（式中、R7及びR8は先に定義された通りである）から選択される1つ以上の置換基により任意に置換されているC1-10アルキルであり;
R3は、H、ハロ、シアノ、C1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、又は-S(C1-3アルキル)であり;
R10は、ハロ、-OR7、及び-NR7R8（式中、R7及びR8は先に定義された通りである）から選択される1つ以上の置換基により任意に置換されているC1-6アルキルであり;
但し
R2がエチルであり;R3がクロロであり、且つR10がエチルである場合:
R1が、R5とR6の少なくとも一方が、OH及びNR7R8（式中、R7及びR8は、それぞれ独立にH又はメチルである）から選択される1つ以上の置換基により置換されたC1-6アルキルであるC(O)NR5R6ではないことを条件とし;且つ
R1が、L2がC(O)ヘテロシクリルであり、R12がN(CH3)2であるL2R12ではないことを条件とする）。
【請求項２】
一般式(IC)の化合物:
【化２】
2019519616.tif 000191
（式中、R1、R2、R3、R10、及びX-は一般式(I)に関して定義された通りである）;
又は一般式(ID)の化合物:
【化３】
2019519616.tif 000192
（式中、R1、R2、R3、R10、及びX-は一般式(I)に関して定義される通りである）
である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
R1が、H、ハロ;又はC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、-O(C1-6アルキル)、-O(C2-6アルケニル)、若しくは-O(C2-6アルキニル)（そのいずれも1つ以上のハロ置換基により任意に置換されている）である、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項４】
R1が、H、クロロ、メチル、トリフルオロメチル、メトキシ、又はトリフルオロメトキシである、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
R1が、-L1R11、-O-L1R11、-OR5、-SO2R5、-C(O)OR5、-C(O)NR5R6、又は-C(=NR7)NR5R6であり;式中、L1、R11、R5、R6及びR7が請求項１に定義された通りである、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項６】
L1が、C1-6アルキレン、より好適にはC1-4アルキレンである、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
R1が-L1R11であり、L1が、nが1〜6である-(CH2)n-であるか;或いは
R1が-O-L1-R11であり、L1が、mが1〜5である-(CH2)m-である、請求項５又は請求項６記載の化合物。
【請求項８】
R11が、H、-NR7R8、-NR7-C(=NR9)N(R8)2、-NR7-C(O)O-R8、-NR7-C(O)-(C1-3アルキレン)-N+(R8)3、又は-N+(R8)3（式中、各R7、R8、及びR9は、H及びC1-4アルキルから選択される）である、請求項５〜７のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９】
R11が、-NH2、-NH-C(=NH)NH2、-NH-C(O)O-C(CH3)3、-NH-C(O)-CH2-N+(CH3)3、及び-N+(CH3)3である、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
R1が、-OR5、-C(O)OR5、-C(O)NR5R6、又は-C(=NR7)NR5R6であり、R5及びR6がH及びC1-6アルキルから選択されるか;或いは
R1が-SO2R5であり、R5がC1-6アルキルであるか;或いは
R1が、-OR5、-C(O)OR5、-C(O)NR5R6、又は-C(=NR7)NR5R6、又は-SO2R5であり;R6(存在する場合)がHであり、R5がオキソにより任意に置換されている5員又は6員の炭素環又は複素環基である、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１】
R1が、-OCH3、-OCF3、-C(O)OCH3、-C(O)OH、-NH-C(O)O-C(CH3)3、-C(=NH)NH2、-SO2-CH3、-C(O)N(CH3)2、又は:
【化４】
2019519616.tif 000193
である、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
R1が、L2及びR12が請求項１に定義された通りである-L2-R12であり、式中、該リンカー基L2において、独立に又は任意の組み合わせで:
R7(存在する場合)がHであり;
ヘテロシクリル基がピペリジニル基であり;
該ヘテロアリール基が:
【化５】
2019519616.tif 000194
（式中、aは前記分子の残りの部分への結合であり、bはR12への結合である）であり;
Z12及びZ6基が、-NH2、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)N(CH3)2、OH、及びハロにより任意に置換されている、請求項１〜４のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１３】
L2が:
結合;
-Z12-、-アリール-、-ヘテロアリール-、-カルボシクリル-、-ヘテロシクリル-、
-Z6-カルボシクリル-、-Z6-ヘテロシクリル-、-Z6-アリール-、-Z6-ヘテロアリール-;
-カルボシクリル-Z6-、-ヘテロシクリル-Z6-、-アリール-Z6-、-ヘテロアリール-Z6-;
-Z6-NR7-Z6-;
-OZ12-、-O-アリール-、-O-ヘテロアリール-、-O-カルボシクリル-、-O-ヘテロシクリル-、
-OZ6-カルボシクリル-、-OZ6-ヘテロシクリル-、-OZ6-アリール-、-OZ6-ヘテロアリール-;
-O-カルボシクリル-Z6-、-O-ヘテロシクリル-Z6-、-O-アリール-Z6-、-O-ヘテロアリール-Z6-;
-OZ6-NR7-Z6-、
-C(O)-ヘテロシクリル-、-C(O)-ヘテロシクリル-Z6-、
-C(O)NR7-、-C(O)NR7-Z12-、-C(O)NR7-Z6-ヘテロシクリル-、-C(O)NR7-Z6-カルボシクリル-Z6-、-C(O)NR7-Z6-ヘテロシクリル-Z6-;
-Z6-C(O)NR7-Z6-、-Z6-C(O)NR7-アリール-、-Z6-C(O)NR7-ヘテロアリール-、-Z6-C(O)NR7- -Z6-C(O)NR7-アリール-Z6-、-Z6-C(O)NR7-ヘテロアリール-Z6-であり;
式中、Z12及びZ6基が上述の通り任意に置換されている、請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
L2が:
結合
-OCH2CH2-
-CH2CH2CH2-
【化６】
2019519616.tif 000195
である、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
R12が-NR14R15又は-G-R14であり;式中、独立に又は組み合わせで:
Gがピペリジニル、例えば:
【化７】
2019519616.tif 000196
であり、該ピペリジニル基がL2にaで結合しており;
R14及びR15のそれぞれが、独立に、1つ以上のOH基により任意に置換されているC4-8アルキルである、請求項１２〜１４のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１６】
R14及び任意にR15が:
3つのOH置換基を有するC4アルキル;又は
4つのOH置換基を有するC5アルキル;又は
5つのOH置換基を有するC6アルキル;又は
6つのOH置換基を有するC7アルキル;又は
7つのOH置換基を有するC8アルキルである、請求項１５記載の化合物。
【請求項１７】
R1が-L3-R13であり、式中、R13が請求項１に定義された通りであり、L3が、アリール又はヘテロアリール基に任意に結合している炭素環又は複素環基を含み、該炭素環又は複素環基と該アリール又はヘテロアリール基が両方とも5員又は6員環である、請求項１〜４のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１８】
L3がピペリジン又はピペラジンであり、前記R13基が1位で窒素に結合しており、該ピペリジン又はピペラジン環が、4位で、前記分子の残りの部分又は(存在する場合)該L3リンカーの残りの部分を構成する前記アリール基に結合している、請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
L3が:
【化８】
2019519616.tif 000197
（式中、aは前記分子の残りの部分への結合であり、bはR13への結合である）の1つである、請求項１８記載の化合物。
【請求項２０】
R13が、H、-OR5、-SO2R5、-C(O)OR5、-C(O)NR5R6、又は-C(=NR7)NR5R6であり;式中、R5、R6及びR7が請求項１に定義された通りである、請求項１７〜１９のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２１】
R13が、-OCH3、-OCF3、-C(O)OCH3、-C(O)OH、-NH-C(O)O-C(CH3)3、-C(=NH)NH2、-SO2-CH3、-C(O)N(CH3)2、又は:
【化９】
2019519616.tif 000198
である、請求項２０記載の化合物。
【請求項２２】
R2が、-(CH2)sCH3又は(CH2CH2O)t-Hであり、そのいずれも請求項１に定義された通り任意に置換されており;sが、0〜9、より好適には0〜6であり;tが、1〜3、特に2又は3である、請求項１〜２１のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２３】
R3が、ハロ、シアノ、又はメチル、エチル、チオメチル、若しくはチオエチル（そのいずれも1つ以上のハロ置換基により任意に置換されている）である、請求項１〜２２のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２４】
R10が、H又はハロ、-OR6、及び-NR6R7（式中、R6及びR7は請求項１に定義された通りである）から選択される1つ以上の置換基により任意に置換されているC1-6アルキルである、請求項１〜２３のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２５】
下記から選択される請求項１記載の化合物:
【表１】
2019519616.tif 000199
2019519616.tif 000200
2019519616.tif 000201
2019519616.tif 000202
2019519616.tif 000203
又はこれらの化合物の代替塩（式中、該アニオンは、請求項１に定義される代替のアニオンX-に置き換えられている）。
【請求項２６】
請求項１に定義される一般式(I)の化合物の調製の方法であって、一般式(II)の化合物又はその塩を:
【化１０】
2019519616.tif 000204
（式中、R3は請求項１に定義された通りである）
一般式(III)の塩と:
【化１１】
2019519616.tif 000205
（式中、R1、R2、Q1、Q2、及びX-は請求項１に定義された通りである）;
カップリング試薬の存在下で反応させることを含む方法。
【請求項２７】
医薬に使用するための請求項１〜２５のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２８】
呼吸器の疾患及び病態、皮膚の病態、又は眼の病態の治療又は予防に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２９】
呼吸器の疾患及び病態、皮膚の病態、又は眼の病態の治療又は予防のための薬剤の調製における、請求項１〜２５のいずれか一項記載の化合物の使用。
【請求項３０】
呼吸器の疾患及び病態、皮膚の病態、又は眼の病態の治療又は予防の方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の請求項１〜２５のいずれか一項記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項３１】
請求項１〜２５のいずれか一項記載の化合物及び医薬として許容し得る賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３２】
経口、鼻腔内、気管支(吸入)、又は局所投与のために製剤された、請求項３１記載の医薬組成物。
【請求項３３】
請求項３１又は３２記載の医薬組成物の調製の方法であって、請求項１〜２５のいずれか一項記載の化合物を医薬として許容し得る賦形剤と混合することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮型ナトリウムチャネル(ENaC)の阻害剤としての活性を有する新規化合物に関する。本発明は、ENaCにより調節される疾患及び病態、特に、呼吸器の疾患及び病態、ドライアイ疾患、アトピー性皮膚炎、及び乾癬の治療におけるこれらの化合物の使用にも関する。本発明は、該化合物及びそれらを含む医薬組成物を調製する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトは１日に最大12,000Lの空気を吸い込むことができ、それと共に空気で運ばれる病原体(細菌、ウイルス、真菌胞子)の可能性も来る。これらの空気で運ばれる病原体から保護するために、肺は、気道の感染及び定着の可能性を最小限にする先天的防御機構を進化させてきた。そのような機構の１つは粘液クリアランス系であり、分泌された粘液は、咳クリアランスと共に線毛の連携された打ち付けにより気道を上行し追い出される。この継続する肺の「洗浄」は、吸い込まれた粒子及び微生物を絶え間なく除去し、それにより感染の危険性を低下させる。
【０００３】
近年、粘液ゲルの水分保持量(hydration)が粘液クリアランスを可能にするために重要であることが明らかになった(Boucherの文献2007年;Matsuiらの文献1998年)。正常で健康な気道では、粘液ゲルは典型的には97%水及び3%の固形分であり、その状態では粘液は粘液線毛作用により除かれる。気道粘膜の水分保持量は、いくつかのイオンチャネルと輸送体の連携された活動により制御される。嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)及びカルシウム活性化クロライドコンダクタンス(CaCC;TMEM16A)により媒介されるアニオン(Cl-/HCO3-)分泌と、上皮型Na+チャネル(ENaC)によるNa+吸収のバランスが、気道粘膜の保水状態を決定する。イオンは上皮を越えて輸送されるので、水は浸透圧により強制的に追従し、このようにして流体が分泌又は吸収される。
【０００４】
慢性気管支炎及び嚢胞性線維症などの呼吸器の疾患においては、水分保持量が低下し、粘液クリアランスが低下するために、粘液ゲルの固形分割合(%)が増加する(Boucherの文献、2007年)。嚢胞性線維症において、CFTRの機能喪失型変異が流体を分泌する気道の能力を弱め、固形分割合(%)は15%に増加することがあり、それは小気道の詰まり及び粘液クリアランスの不全の一因であると考えられている。さらに、嚢胞性線維症において、ENaC活性の増加がいくつかのグループにより報告され(Knowlesらの文献、1983年;Middletonらの文献、1993年)、ENaC機能のこの上昇が疾患の重症度と相関することが示された(Fajacらの文献、2004年;Lealらの文献、2008年)。気道粘液の水分保持量を増加させる戦略には、アニオンの刺激とそれによる流体分泌か、又はNa+吸収の阻害がある。この目的のために、ENaCの活性の遮断はNa+吸収を阻害し、したがって気道粘膜中の流体貯留を増加させ、粘液に水分を与え、粘液クリアランス機構を増強するだろう。
【０００５】
ENaCは、腎臓、結腸、角膜、汗管、及び呼吸器の上皮に発現され、Na+に対する選択性がK+に対するよりもおよそ10倍である低コンダクタンスチャネル(〜4pS)を形成する(Kellenbergerの文献、2002年)。該チャネルの機能喪失型変異及び機能獲得型変異は、塩類喪失疾患である偽性低アルドステロン症1型(PHA1) (Changらの文献、1996年)、並びに塩類貯留及び高血圧と関連する疾患であるリドル症候群(Botero-Velezらの文献、1994年)を含むヒトの疾患を起こし得る。肺生理機能にとって特に注目すべきことは、PHA1 ENaCの機能喪失型変異を有する患者が、正常な健康な集団と比べて、典型的には3〜4倍速い気道粘液線毛クリアランス(MCC)の増大した速度を有するという観察である(Keremらの文献、1999年)。さらに、これらの患者の上気道は、「湿って」いるように見え、正常と比べて余分な水分保持量を有する。これらの観察結果は、水分保持量の制御におけるENaCがヒト気道中で果たす際立った役割並びに気道におけるENaCの遮断がMCC及び先天的防御の増大の点でもたらし得る治療効果をさらに支持する。
【０００６】
ENaCの低分子化合物ブロッカーであるアミロライドは、健康な対照とCFの患者の両方でMCCを増加させることが示され、この機構の生理学的な重要性をさらに支持する(Appらの文献、1990年)。しかし、吸入されたアミロライドの臨床的エンドポイントに対する確固とした効果が無いこと(Bowlerらの文献、1995年;Grahamらの文献、1993年;Knowlesらの文献、1990年;Ponsらの文献、2000年)は、肺の中でのこの化合物の短い作用持続時間によるものとされた(Nooneらの文献、1997年)。したがって、気道での長い作用持続時間のために特に設計された新規なENaCブロッカーは、短期的にはMCCの拡大増強を与え、長期的にはその結果として生じる臨床的有益性を与えると予測される。
【０００７】
呼吸器疾患の治療のための吸入されたENaCブロッカーの設計に伴う問題は、高カリウム血症による腎臓系副作用の可能性であった(Perazelaらの文献、2000年)。ENaCは腎臓上皮の皮質集合管中で発現され、ここでの該チャネルの遮断はK+の全身蓄積につながり得る。この理由のため、吸入されたENaCブロッカーが、肺からの吸収後に腎曝露を避けることが望ましい。これは、ENaCブロッカーの高い肺貯留により低い投与量のみが投与されることを可能にするか、又は腎臓に到達する前に迅速に分解する化合物の設計により達成され得る。
【０００８】
ENaCは、眼の上皮によっても発現され、眼の保水状態の制御にも関与している。呼吸器の上皮におけるその機能と同様に、ENaCは、角膜/結膜上皮中の吸収経路として提案されている。そのため、ENaCの阻害は、涙の体積及び眼の水分保持量の増加をもたらすことが期待される。ドライアイ(乾性角結膜炎（keratoconjunctivitus sicca）)は、シェーグレン症候群、狼瘡、及びアレルギー性結膜炎を含む多くの病状と関連するよく見られる疾患であり、不十分な量又は質の涙の産生を特徴とする。前臨床モデルでの試験は、ENaCブロッカーが慢性ドライアイの治療への新規な薬理学的アプローチであることを示唆している(Thelinらの文献、2012年)。
【０００９】
ENaCは、皮膚の水分保持量及びバリア機能の制御にも関連しており、これらが損なわれたアトピー性皮膚炎及び乾癬などの疾病の治療への新規なアプローチを提供している(Fratechiらの文献、2010年）。
いくつかのENaCブロッカーが公知である。例えば、WO 2011/079087は、式:
【化１】
2019519616.tif 000003
の化合物に関する。WO 2015/007516、WO 2015/007517、及びWO 2015/007519は全て、式:
【化２】
2019519616.tif 000004
の化合物に関する。
【００１０】
これらの文書に記載の化合物は全て3,5-ジアミノピラジン基を含み、この基は、WO2013/0664450、WO2013/092674、WO2014/044849、WO 2014/177469、WO 2015/003958、WO2015/018754、WO 2011/028740、WO 2007/071396、WO 2007/071400、WO 2008/135557、WO 2009/074575、WO 2009/138378、WO 2009/150137、及びWO 2012/035158を含む多くの他の文書に開示されているENaC阻害剤の構造的な特徴でもある。いくつかの他の従来技術文書は、ピラジン環の5位での代替置換基の可能性を言及している。これらには、WO 2015/003083、WO 2004/073629、WO 03/070184、WO 03/070182、WO 2006/022935、WO 2007/018640、WO 2008/124491、WO 2009/139948、WO 2005/044180、WO 2005/016879、WO 2005/018644、WO 2005/025496、WO 2005/034847、及びWO 2013/181232がある。しかし、これらの文書で例示されているどの化合物も3,5-ジアミノピラジン基を含み、したがって、3位及び5位でアミノ置換基を有するピラジン環がENaC遮断活性に必須であると考えられていることは明らかである。
【００１１】
WO 2011/113894は、気道の炎症性若しくは閉塞性の疾病を治療するのに、又は粘膜の水分保持量の促進に役に立つと言われている化合物に関する。該化合物は、式:
【化３】
2019519616.tif 000005
のものである（式中、AはN又はCR4aであり、R2はハロアルキルである）。この文書に例示されている化合物はいずれもベンゾジアゾール部分を含まない。
【００１２】
WO 2017/028926は、式:
【化４】
2019519616.tif 000006
のENaC阻害化合物に関し、WO 2017/028927は、式:
【化５】
2019519616.tif 000007
のENaC阻害化合物に関する。
【００１３】
これらの化合物は、ピラジン部分の5位にアミノ置換基がないにもかかわらずENaC阻害活性を示すと言われている。
【発明の概要】
【００１４】
驚くべきことに、本発明者らは、ピラジン環の5位にアミノ置換基がないが、ENaC遮断活性を保持しているさらなる化合物を有する。さらに、これらの化合物のいくつかは、相当する3,5-ジアミノピラジン化合物よりも迅速な代謝という利点を有し、気道及び肺に直接投与される場合、実質的にそれらが腎臓又は結腸に到達する前に代謝されて、該療法の副作用を最小限にし得ることを意味する。
【００１５】
本発明において、その全互変異性形態、全エナンチオマー、及び同位体変種を含む一般式(I)の化合物が提供される:
【化６】
2019519616.tif 000008
（式中:
X-はアニオンであり;
R1は:
i.  H、ハロ;又は
ii.  C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、-O(C1-6アルキル)、-O(C2-6アルケニル)、若しくは-O(C2-6アルキニル)（そのいずれも1つ以上のハロ置換基により任意に置換されている）;又は
iii  -L1R11、-O-L1R11、-OR5、-SO2R5、-C(O)OR5、-C(O)NR5R6、若しくは-C(=NR7)NR5R6;
L1は、C1-6アルキレン、C2-6アルケニレン、又はC2-6アルキニレンであり;
R11は、H、-NR7R8、-NR7-C(=NR9)N(R8)2、-NR7-C(O)O-R8、-NR7-C(O)-(C1-3アルキレン)-N+(R8)3、若しくは-N+(R8)3であり;
各R7、R8、及びR9は、H又はC1-4アルキルから独立に選択され;
各R5及びR6は、独立に、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-8シクロアルキル、若しくはC3-8ヘテロシクリルである（そのいずれも、ハロ、OR7、C(O)OR7、-NR7R8、C(O)NR7R8、又は、シクロアルキル若しくはヘテロシクリル基の場合、オキソから選択される1つ以上の置換基により任意に置換されている）;又は
iv.  -L2-R12（式中
L2は:
結合;
-Z12-、-アリール-、-ヘテロアリール-、-カルボシクリル-、-ヘテロシクリル-、-Z6-カルボシクリル-、-Z6-ヘテロシクリル-、-Z6-アリール-、-Z6-ヘテロアリール-;
-カルボシクリル-Z6-、-ヘテロシクリル-Z6-、-アリール-Z6-、-ヘテロアリール-Z6-;
-Z6-NR7-Z6-;
-OZ12-、-O-アリール-、-O-ヘテロアリール-、-O-カルボシクリル-、-O-ヘテロシクリル-、-OZ6-カルボシクリル-、-OZ6-ヘテロシクリル-、-OZ6-アリール-、-OZ6-ヘテロアリール-;
-O-カルボシクリル-Z6-、-O-ヘテロシクリル-Z6-、-O-アリール-Z6-、-O-ヘテロアリール-Z6-;
-OZ6-NR7-Z6-、
-C(O)Z12-、-C(O)-カルボシクリル-、-C(O)-ヘテロシクリル-、-C(O)-カルボシクリル-Z6-、-C(O)-ヘテロシクリル-Z6-、-C(O)-Z6-カルボシクリル-、C(O)-Z6-ヘテロシクリル-、-C(O)-Z6-カルボシクリル-Z6-、C(O)-Z6-ヘテロシクリル-Z6-、
-C(O)NR7-、-C(O)NR7-Z12-、-C(O)NR7-カルボシクリル-、C(O)NR7-ヘテロシクリル-、C(O)NR7-アリール-、C(O)NR7-ヘテロアリール-、-C(O)NR7-カルボシクリル-Z6-、-C(O)NH-ヘテロシクリル-Z6-、-C(O)NR7-Z6-カルボシクリル-、-C(O)NR7-Z6-ヘテロシクリル-、-C(O)NR7-Z6-カルボシクリル-Z6-、-C(O)NR7-Z6-ヘテロシクリル-Z6-;
-Z6-C(O)NR7-Z6-、-Z6-C(O)NR7-アリール-、-Z6-C(O)NR7-ヘテロアリール-、-Z6-C(O)NR7-カルボシクリル-、-Z6-C(O)NR7-ヘテロシクリル-、-Z6-C(O)NR7-アリール-Z6-、-Z6-C(O)NR7-ヘテロアリール-Z6-、-Z6-C(O)NR7-カルボシクリル-Z6-、若しくは-Z6-C(O)NR7-ヘテロシクリル-Z6-;
-C(O)Z12-、-C(O)-カルボシクリル-、-C(O)-ヘテロシクリル-、-C(O)-カルボシクリル-Z6-、-C(O)-ヘテロシクリル-Z6-、-C(O)-Z6-カルボシクリル-、C(O)-Z6-ヘテロシクリル-、-C(O)-Z6-カルボシクリル-Z6-、C(O)-Z6-ヘテロシクリル-Z6-、
-C(=N)NR7-Z12-、-C(=N)NR7-カルボシクリル-、C(=N)NR7-ヘテロシクリル-、-C(=N)NR7-カルボシクリル-Z6-、-C(=N)NH-ヘテロシクリル-Z6-、-C(=N)NR7-Z6-カルボシクリル-、-C(=N)NR7-Z6-ヘテロシクリル-、-C(=N)NR7-Z6-カルボシクリル-Z6-、-C(=N)NR7-Z6-ヘテロシクリル-Z6-であり;
式中、Z12は、C1-12アルキレン、C2-12アルケニレン、又はC2-12アルキニレンであり;
Z6は、C1-6アルキレン、C2-6アルケニレン、又はC2-6アルキニレンであり、アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレン基は、NR8R9、C(O)NR8R9、OH、又はハロ（式中、R7、R8、及びR9は先に定義された通りである）から選択される1つ以上の置換基により任意に置換されており;
R12は、-NR14R15又は-G-R14であり;
R14と及びR15のそれぞれは、独立に、1つ以上のOH基により任意に置換されているC1-8アルキルであり;且つ、Gは、1つ以上のOH基により任意に置換されており、共有結合により基R14に接続している少なくとも1つの窒素原子を含む5員〜10員の複素環である）;
v.  -L3-R13であり（式中
L3は、1つの環式基又は互いに直接結合している2つの環式基であって、各環式基がアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、及びヘテロシクリル（式中、シクロアルキル及びヘテロシクリル基は、1つ以上のオキソ置換基を有してよい）から選択される環式基を含み;且つ
R13は、H、-OR5、-SO2R5、-C(O)OR5、-C(O)NR5R6、又は-C(=NR7)NR5R6であり;式中、R5、R6及びR7は、先に定義された通りである）;
R2は、1つ以上の-CH2-基が任意に-O-に置き換わっており、ハロ、アリール、ヘテロアリール、-OR7、及び-NR7R8（式中、R7及びR8は先に定義された通りである）から選択される1つ以上の置換基により任意に置換されているC1-10アルキルであり;
R3は、H、ハロ、シアノ、C1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、又は-S(C1-3アルキル)であり;
R10は、ハロ、-OR7、及び-NR7R8（式中、R7及びR8は先に定義された通りである）から選択される1つ以上の置換基により任意に置換されているC1-6アルキルであり;
但し、
R2がエチルであり;R3がクロロであり、且つR10がエチルである場合:
R1が、R5とR6の少なくとも一方が、OH及びNR7R8（式中、R7及びR8は、それぞれ独立にH又はメチルである）から選択される1つ以上の置換基により置換されたC1-6アルキルであるC(O)NR5R6ではないことを条件とし;且つ
R1が、L2がC(O)ヘテロシクリルであり、R12がN(CH3)2であるL2R12ではないことを条件とする）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、文脈が特殊な言語又は必要な意味合いにより別な意味を要求する場合を除き、言葉「を含む(comprises)」又は「を含む（comprises）」若しくは「を含んでいる(comprising)」などのその変形体は、包括的な意味で、すなわち述べられる特徴の存在を明示するが、本発明の種々の実施態様におけるさらなる特徴の存在又は追加を排除しないように使用される。
【００１７】
アニオンX-は任意の負の電荷を有し得て、適切な数のカチオンにより釣り合いがとれる。そのため、例えば、X-が単一の負の電荷を有するアニオンである一般式(I)の化合物は、カチオン:アニオンの1:1の比を有するだろうが、アニオンX-が-2の電荷を有する場合、一般式(I)の化合物中のカチオン:アニオンの比は2:1だろう。アニオンX-は好適には薬理学的に許容し得るアニオンであるが、他のアニオンも、特に一般式(I)の化合物の合成前駆体において有用になり得る。好適なアニオン、X-には、ハライド、ヒドロキシド、スルフェート、ニトレート、ホスフェート、ホルメート、アセテート、トリフルオロアセテート、フマレート、シトレート、タータレート、オキサレート、スクシネート、マンデレート、メタンスルホネート、及びp-トルエンスルホネートがある。
【００１８】
本明細書において、用語「C1-6」アルキルは、1〜6個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖の完全飽和炭化水素基を指す。該用語は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、及びt-ブチルを包含する。他のアルキル基、例えばC1-4アルキルは先に定義された通りであるが、異なる数の炭素原子を含む。
【００１９】
用語「C2-6アルケニル」は、2〜6個の炭素原子及び少なくとも１個の炭素-炭素二重結合を有する直鎖又は分岐鎖の炭化水素基を指す。例には、エテニル、プロパ-1-エニル、ヘキサ-2-エニルなどがある。他のアルキレン基、例えばC1-3アルキレンは、明示された数の(例えば、1〜3)炭素原子を含む以外、先に定義された通りである。
【００２０】
用語「C2-6アルキニル」は、2〜6個の炭素原子及び少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を有する直鎖又は分岐鎖の炭化水素基を指す。例には、エチニル、プロパ-1-イニル、ヘキサ-2-イニルなどがある。他のアルケニレン基、例えばC2-3アルキレンは、明示された数の(例えば、2〜3)炭素原子を含む以外、先に定義された通りである。
【００２１】
用語「C1-6アルキレン」は、1〜6個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖の完全飽和炭化水素鎖を指す。アルキレン基の例には、-CH2-、-CH2CH2-、CH(CH3)-CH2-、CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH2CH3)-、及び-CH2CH(CH2CH3)CH2-がある。他のアルキレン基、例えばC1-3アルキレンは、明示された数の(例えば、1〜3)炭素原子を含む以外、先に定義された通りである。
【００２２】
用語「C2-6アルケニレン」は、2〜6個の炭素原子及び少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を含む直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を指す。アルケニレン基の例には、-CH=CH-、-CH=C(CH3)-、-CH2CH=CH-、-CH=CHCH2-、CH2CH2CH=CH-、CH2CH=C(CH3)-、及び-CH2CH=C(CH2CH3)-がある。他のアルケニレン基、例えばC2-3アルケニレンは、明示された数の(例えば、2〜3)炭素原子を含む以外、先に定義された通りである。
【００２３】
用語「C2-6アルキニレン」は、2〜6個の炭素原子及び少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を含む直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を指す。アルケニレン基の例には、-C≡C-、-CH2C≡C-、-C≡C-CH2-、CH2CH2C≡C-、CH2C≡CCH2-、及び-CH2CH≡C-CH2CH2-がある。他のアルキニレン基、例えばC2-3アルキニレンは、明示された数の(例えば、2〜3)炭素原子を含む以外、先に定義された通りである。
【００２４】
用語「炭素環式」及び「カルボシクリル」は、特記されない限り、3〜10個の環炭素原子及び任意に1個以上の二重結合を含む非芳香族炭化水素環系を指す。炭素環基は単環であり得るか、縮合又は架橋していてよい2又は3個の環を含み得る。例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンテニル、及びシクロヘキセニルがある。
【００２５】
本明細書の文脈において、用語「複素環式」及び「ヘテロシクリル」は、N、O、及びSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子を含む3〜10個の環原子を含む非芳香環系を指す。複素環基は単環であり得るか、縮合又は架橋していてよい2又は3個の環を含み得る。例には、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイプラニル（tetrahydroypranyl）、ピロリジン、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、及びチオモルホリニルがある。
【００２６】
本明細書の文脈における用語「アリール」及び「芳香族」は、5〜14個の環炭素原子を有し、3個までの環を含む芳香族性を有する環系を指す。アリール基が2個以上の環を含む場合、全ての環が完全な芳香族性を有していなくてはならないということはない。芳香族部分の例は、ベンゼン、ナフタレン、フルオレン、インダン、及びインデンである。
【００２７】
本明細書の文脈における用語「ヘテロアリール」及び「ヘテロ芳香族」は、5〜14個の環原子を有し、その少なくとも1個がN、O、及びSから選択されるヘテロ原子であり、3個までの環を含む芳香族性を有する環系を指す。ヘテロアリール基が2個以上の環を含む場合、全ての環が完全な芳香族性を有していなくてはならないということはない。ヘテロアリール基の例には、ピリジン、ピリミジン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、及びインドレンがある。
【００２８】
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素を指し、用語「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード基を指す。同様に、「ハライド」は、フルオリド、クロリド、ブロミド、又はヨージドを指す。
【００２９】
本明細書で使用される用語「C1-6ハロアルキル」は、水素原子の1つ以上がハロ基に置き換えられている先に定義されたC1-6アルキル基を指す。ペルハロ置換まで、任意の数の水素原子が置き換えられ得る。例には、トリフルオロメチル、クロロエチル、及び1,1-ジフルオロエチルがある。
【００３０】
用語「オキソ」は、カルボニル部分を形成するように、二重結合が、オキソ置換基により置換されている環又は鎖中の炭素原子へのものである置換基=Oを指す。
【００３１】
用語「同位体変種」は、1つ以上の原子が、最も普通に天然にみられる原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する原子に置き換えられている事実以外は式(I)に詳述された化合物と同一であるか、又は天然にあまり見られない原子質量又は質量数を有する原子の比率が高められた同位体標識された化合物を指す(後者の概念は「同位体濃縮」と称される)。本発明の化合物に組み込むことができる同位元素の例には、2H(重水素)、3H、11C、13C、14C、18F、123I、又は125I(例えば、3H、11C、14C、18F、123I、又は125I)など、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素、ヨウ素、及び塩素の同位元素があり、これらは、天然に存在する同位元素でも、天然に存在しない同位元素でもあり得る。
【００３２】
標準形（canonical forms）の概念は当業者により充分に理解される。そのため、一般式(I)の化合物は、以下の標準形として表すことができ:
【化７】
2019519616.tif 000009
その両方が本発明の範囲内に含まれる。
【００３３】
本発明のいくつかの好適な化合物において、R2がエチルであり、R3がクロロであり、R10がエチルである場合:
R1は、C(O)NR5R6でも、L2がC(O)ヘテロシクリルでありR12がN(CH3)2であるL2R12でもない。
【００３４】
本発明の化合物において、R1置換基は、好適には5位又は6位にあり、そのため一般式(I)の化合物は、一般式(IC)の化合物:
【化８】
2019519616.tif 000010
（式中、R1、R2、R3、R10、及びX-は一般式(I)に関して定義される通りである）;
又は一般式(ID)の化合物:
【化９】
2019519616.tif 000011
（式中、R1、R2、R3、R10、及びX-は一般式(I)に関して定義される通りである）
であり得る。
【００３５】
一般式(IC)の化合物が特に好適である。
一般式(I)のいくつかの好適な化合物において、R1は:
H、ハロ;又はC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、-O(C1-6アルキル)、-O(C2-6アルケニル)、若しくは-O(C2-6アルキニル)（そのいずれも1つ以上のハロ置換基により任意に置換されている）である。
これらの化合物においてより好適には、R1は、H、ハロ、C1-6アルキル、C1-6ハロアルキル、C1-6アルコキシ、又はC1-6ハロアルコキシである。
【００３６】
そのようなR1基の例には、H、クロロ、メチル、トリフルオロメチル、メトキシ、及びトリフルオロメトキシがある。
一般式(I)の他の好適な化合物において、R1は、-L1R11、-O-L1R11、-OR5、-SO2R5、-C(O)OR5、-C(O)NR5R6、又は-C(=NR7)NR5R6であり;式中、L1、R11、R5、R6、及びR7は、先に定義された通りである。
好適には、L1は、C1-6アルキレンであり、より好適にはC1-4アルキレンである。
R1が-L1R11であるいくつかの好適な化合物において、L1はnが1〜6である-(CH2)n-である。
【００３７】
R1が-O-L1-R11であるいくつかの好適な化合物において、L1は、mが1〜5である-(CH2)m-である。
さらにより好適には、nは1〜4であり、mは1〜3である。L1及びOL1基の例には、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-O-CH2-CH2-、及び-O-CH2-CH2-CH2-がある。
【００３８】
好適には、R11は、H、-NR7R8、-NR7-C(=NR9)N(R8)2、-NR7-C(O)O-R8、-NR7-C(O)-(C1-3アルキレン)-N+(R8)3、又は-N+(R8)3（式中、各R7、R8、及びR9は、H及びC1-4アルキルから選択される）である。
より好適には、R7はHであり、各R8は、独立に、H又はC1-4アルキルであり、R9はHである。
R11が-NR7-C(O)-(C1-3アルキレン)-N+(R8)3である場合、該C1-3アルキレン基は、好適には、-CH2-又は-CH2-CH2-、特に-CH2-である。
【００３９】
そのようなR11基の例には、-NH2、-NH-C(=NH)NH2、-NH-C(O)O-C(CH3)3、-NH-C(O)-CH2-N+(CH3)3、及び-N+(CH3)3がある。
R1が、-OR5、-C(O)OR5、-C(O)NR5R6、又は-C(=NR7)NR5R6である場合、好適なR5及びR6基には、H及びC1-6アルキルがある。
R1が-SO2R5である場合、これらの化合物は不安定であり得るので、R5がHでないことが好ましい。したがって、R1が-SO2R5である場合、好適には、R5はC1-6アルキルである。
【００４０】
或いは、R6(存在する場合)はHであり得て、R5は、環式基、例えば、オキソにより任意に置換されている5員又は6員の炭素環又は複素環基、例えば、γ-ブチロラクトンなどのラクトン、テトラヒドロフラン、ピロリジン、ピペリジン、又はピペラジン基であり得る。
このタイプのR1基の例には、-OCH3、-OCF3、-C(O)OCH3、-C(O)OH、-NH-C(O)O-C(CH3)3、-C(=NH)NH2、-SO2-CH3、-C(O)N(CH3)2、及び:
【化１０】
2019519616.tif 000012
がある。
【００４１】
一般式(I)の他の化合物において、R1は、L2及びR12が先に定義された通りである-L2-R12である。好適には、リンカー基L2において、独立に又は任意の組み合わせで:
R7はHであり;
カルボシクリル及びヘテロシクリル基は、5員又は6員環、好適には6員環であり;
アリール基はフェニルであり;
ヘテロアリール基は、5員又は6員の窒素含有ヘテロアリール基であり;
Z12及びZ6は、上述の通り任意に置換されているアルキレン基である。
【００４２】
より好適には、リンカーL2において、独立に又は任意の組み合わせで:
R7はHであり;
ヘテロシクリル基はピペリジニル基であり;
ヘテロアリール基は:
【化１１】
2019519616.tif 000013
である（式中、aは該分子の残りの部分への結合であり、bはR12への結合である）。
【００４３】
Z12及びZ6基が上述の通り置換されている場合、より好適な置換基には、-NH2、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)N(CH3)2、OH、及びハロがある。
より好適な置換基には、-NH2、-C(O)NH2、OH、及びハロがある。
【００４４】
リンカーL2は、好適には
結合;
-Z12-、-アリール-、-ヘテロアリール-、-カルボシクリル-、-ヘテロシクリル-、-Z6-カルボシクリル-、-Z6-ヘテロシクリル-、-Z6-アリール-、-Z6-ヘテロアリール-;
-カルボシクリル-Z6-、-ヘテロシクリル-Z6-、-アリール-Z6-、-ヘテロアリール-Z6-;
-Z6-NR7-Z6-;
-OZ12-、-O-アリール-、-O-ヘテロアリール-、-O-カルボシクリル-、-O-ヘテロシクリル-、-OZ6-カルボシクリル-、-OZ6-ヘテロシクリル-、-OZ6-アリール-、-OZ6-ヘテロアリール-;
-O-カルボシクリル-Z6-、-O-ヘテロシクリル-Z6-、-O-アリール-Z6-、-O-ヘテロアリール-Z6-;
-OZ6-NR7-Z6-、
-C(O)-ヘテロシクリル-、-C(O)-ヘテロシクリル-Z6-、
-C(O)NR7-、-C(O)NR7-Z12-、-C(O)NR7-Z6-ヘテロシクリル-、-C(O)NR7-Z6-カルボシクリル-Z6-、-C(O)NR7-Z6-ヘテロシクリル-Z6-;
-Z6-C(O)NR7-Z6-、-Z6-C(O)NR7-アリール-、-Z6-C(O)NR7-ヘテロアリール-、-Z6-C(O)NR7-、-Z6-C(O)NR7-アリール-Z6-、-Z6-C(O)NR7-ヘテロアリール-Z6-であり;
式中、Z12及びZ6基は上述の通り任意に置換されている。
【００４５】
より好適には、リンカーL2は:
結合;
-Z12-、-アリール-、-ヘテロアリール-、
-Z6-NR7-Z6-;
-OZ12-、
-OZ6-NR7-Z6-、
-C(O)-ヘテロシクリル-、-C(O)-ヘテロシクリル-Z6-、
-C(O)NR7-、-C(O)NR7-Z12-、-C(O)NR7-Z6-ヘテロシクリル-、-C(O)NR7-Z6-ヘテロシクリル-Z6-;
-Z6-C(O)NR7-、-Z6-C(O)NR7-アリール-Z6-、-Z6-C(O)NR7-ヘテロアリール-Z6-であり;
式中、Z12及びZ6基は上述の通り任意に置換されている。
【００４６】
これらのL2基において、好適なR7、Z12、Z6、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリール基は、先に定義された通りである。
L2リンカーの例には:
結合
-OCH2CH2-
-CH2CH2CH2-
【化１２】
2019519616.tif 000014
がある。
【００４７】
一般式(I)の化合物において、R12は、-NR14R15又は-G-R14であり、式中、Gは、1つ以上のOH基により任意に置換されており、共有結合により基R14に接続している少なくとも1つの窒素原子を含む5員〜10員の複素環である。
【００４８】
好適には、Gは、5員又は6員の複素環、より好適にはピペリジニル、例えば:
【化１３】
2019519616.tif 000015
であり、ここで、該ピペリジニル基はaでL2に結合している。
【００４９】
好適には、R14と及びR15のそれぞれは、独立に、1つ以上のOH基により任意に置換されているC4-8アルキルである。
好適には、R14及び任意にR15は、2つ以上のOH基又は3つ以上のOH基を含む。典型的には、この場合、R14及び／又はR15がC4アルキルである場合、それは3つのOH置換基を有するだろう;R14及び／又はR15がC5アルキルである場合、それは4つのOH置換基を有するだろう;R14及び／又はR15がC6アルキルである場合、それは5つのOH置換基を有するだろう;R14及び／又はR15がC7アルキルである場合、それは6つのOH置換基を有するだろう;R14及び／又はR15がC8アルキルである場合、それは7つのOH置換基を有するだろう。
【００５０】
いくつかの化合物において、R12が-NR14R15である場合、R14とR15はどちらも、先に議論された通り複数のOH基を含む。
いくつかの他の化合物において、R12が-NR14R15である場合、R14とR15の一方は、1つ以上のOH置換基、好適には2つ以上のOH基を有し、R14とR15の他方は非置換である。他の化合物において、R14とR15はどちらも1つ以上のOH置換基を含む。
【００５１】
一般式(I)の他の化合物において、R1は-L3-R13であり、ここで、L3及びR13は先に定義された通りである。
好適には、L3は、任意にアリール又はヘテロアリール基に結合している炭素環基又は複素環基を含む。典型的には、該炭素環又は複素環基と該アリール又はヘテロアリール基はどちらも5員又は6員環だろう。
より好適には、L3は、複素環基、特に任意にアリール又はヘテロアリール基に結合している窒素含有複素環基を含む。
好適な窒素含有複素環基の例には、ピペリジン、ピペラジン、及びピロリジン、より好適にはピペラジン及びピペリジン、特にピペリジンがある。
【００５２】
該窒素含有複素環基がピペリジン又はピペラジンである場合、R13基は、好適には1位で窒素に結合しており、該ピペリジン又はピペラジン環は、4位により該分子の残りの部分へ、又は(存在する場合)L3リンカーの残りの部分を構成するアリール基に結合している。複素環（heterocylic）基が4位によりヘテロアリール基に結合しているピペラジンである場合、それは、該ヘテロアリール基の炭素原子に結合するだろう。該複素環基が、ヘテロアリール基に結合しているピペリジンである場合、それは、該ヘテロアリール基の炭素原子にも窒素原子にも結合できる。
【００５３】
好適には、L3リンカーの一部を形成するアリール又はヘテロアリール基は、ヘテロアリール基、典型的には、窒素含有ヘテロアリール基、例えばピラゾール、イミダゾール、ピロール、ピリジン、又はピラジンである。
L3リンカーの例には、
【化１４】
2019519616.tif 000016
（式中、aは該分子の残りの部分への結合であり、bはR13への結合である）がある。
【００５４】
基R13は、H、-OR5、-SO2R5、-C(O)OR5、-C(O)NR5R6、又は-C(=NR7)NR5R6であり;ここで、R5、R6及びR7は、先に定義された通りである;
いくつかの好適な化合物において、R13はHである。
このタイプの他の化合物において、R13は、-OR5、-C(O)OR5、-C(O)NR5R6、又は-C(=NR7)NR5R6であり、ここで、好適には、各R5、R6、及びR7基は、H及びC1-6アルキルから独立に選択される。
【００５５】
R13が-SO2R5である場合、これらの化合物が不安定であり得るので、R5がHでないことが好ましい。したがって、R13が-SO2R5である場合、好適にはR5はC1-6アルキルである。
或いは、R6(存在する場合)はHであり得て、R5は、環式基、例えば、オキソにより任意に置換されている5員又は6員の炭素環又は複素環基、例えばγ-ブチロラクトンなどのラクトン、テトラヒドロフラン、ピロリジン、ピペリジン、又はピペラジン基であり得る。
【００５６】
このタイプのR13基の例には、-OCH3、-OCF3、-C(O)OCH3、-C(O)OH、-NH-C(O)O-C(CH3)3、-C(=NH)NH2、-SO2-CH3、-C(O)N(CH3)2、及び:
【化１５】
2019519616.tif 000017
がある。
上述の通り、R2は、1つ以上の-CH2-基が任意に-O-に置き換わっており、先に定義の通り任意に置換されているC1-10アルキルである。
好適には、R2は、-(CH2)sCH3又は(CH2CH2O)t-Hであり、そのいずれも先に定義の通り任意に置換されており;且つsが、0〜9、より好適には0〜6であり;tが、1〜3、特に2又は3である。
【００５７】
R2のより好適な置換基には、OR6、ハロ、NR6R7、フェニル、又はピリジルがあり、ここで、R6及びR7は先に定義された通りである。R2の特に好適な置換基には、OH、メトキシ、エトキシ、ハロ、NH2、フェニル、又はピリジル、特にOH、フェニル、又はピリジルがある。
一般式(I)のいくつかの化合物において、R2は-(CH2)sCH3であり、先に定義された単一の置換基により任意に置換されている。
一般式(I)のいくつかのそのような化合物において、R2は、メチル、エチル、ベンジル、ピリジルメチル、-CH2OH、-CH2NH2、-CH2CH2OH、又はCH2CH2NH2である。
他の特に好適な化合物において、R2は、-CH2CH2OCH2CH2OH又は-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OHである。
【００５８】
一般式(I)のいくつかの好適な化合物において、R3は、ハロ、シアノ又はメチル、エチル、チオメチル、若しくはチオエチル（そのいずれも1つ以上のハロ置換基により任意に置換されている）である。
より好適には、R3は、フルオロ、クロロ、ブロモ、シアノ、メチル、トリフルオロメチル、又はチオメチルである。
特に好適な化合物において、R3は、クロロ、ブロモ、メチル、又はチオメチルである。
一般式(I)の化合物において、R10は、好適には、H又はハロ、-OR6、及び-NR6R7（式中、R6及びR7は先に定義された通りである）から選択される1つ以上の置換基により任意に置換されているC1-6アルキルである。
【００５９】
より好適には、R10は、H、C1-4アルキル、又はより好適にはH、先に定義された通り任意に置換されているメチル、又はエチルである。
より好適には、R10は、ハロ、-OR6、及び-NR6R7（式中、R6及びR7は先に定義された通りである）から選択される単一の置換基により任意に置換されている。
一般式(I)の特に好適な化合物において、R10は、メチル、エチル、-CH2OH、-CH2NH2、-CH2CH2OH、又はCH2CH2NH2である。
いくつかの特に好適な本発明の化合物には、以下の表1（表中、番号は以下の実施例の番号を指す）に示されるもの
【表１】
2019519616.tif 000018
2019519616.tif 000019
2019519616.tif 000020
2019519616.tif 000021
2019519616.tif 000022
又はアニオンが先に定義された代替アニオンX-に置き換えられている、上記化合物の代替塩がある。
【００６０】
一般式(I)の化合物は、一般式(II)の化合物又はその塩を:
【化１６】
2019519616.tif 000023
（式中、R3は一般式(I)に関して定義された通りである）;
一般式(III)の塩と:
【化１７】
2019519616.tif 000024
（式中、R1、R2、Q1、Q2、及びX-は、一般式(I)に関して定義された通りである）反応させることにより調製できる。
【００６１】
好適には、該反応は、カップリング試薬の存在下で塩基性条件下で実施される。塩基性条件は、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)又はトリエチルアミンなどの非求核塩基により供給され得る。好適なカップリング試薬には、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU)、O-（ベンゾトリアゾール-1-イル）-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート(TBTU)、N,N,N',N'-テトラメチル-O-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、又は1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)と1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)又はヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)との組み合わせがある。
該反応は、約10〜50℃、より一般的には15〜30℃の温度で、又は室温で、N,N-ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒中で実施され得る。
【００６２】
一般式(II)の化合物は、一般式(V)の化合物の:
【化１８】
2019519616.tif 000025
（式中、R3は一般式(I)に関して定義された通りであり、R21はC1-6アルキル又はベンジルである）加水分解により調製できる。
好適には、加水分解は、一般式(V)の化合物が、塩基と、好適には水酸化リチウム、水酸化カリウム、又は水酸化ナトリウムなどの水溶性強塩基と反応するような塩基加水分解である。
【００６３】
一般式(V)の化合物は公知であり、容易に利用可能である。或いは、一般式(V)の化合物は、別の一般式(V)の化合物から調製できる。
例えば、R3がC1-3アルキルである一般式(V)の化合物は、R3がハロ、例えばブロモである一般式(V)の化合物から、触媒存在下での好適なアルキルボラン誘導体との反応により調製できる。好適なアルキルボラン誘導体には、要求されるR3基がメチルである場合トリメチルボロキシン、又は要求されるR3基がエチル若しくはプロピルである場合エチルボロン酸若しくはプロピルボロン酸がある。
【００６４】
好適な触媒には、[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)がある。反応は、好適には、不活性雰囲気下で、例えば窒素下で、高温、例えば約70〜110℃で、高圧で(例えば、プレッシャーチューブ（pressure tube）中)実施される。好適な溶媒には、ジメチルエーテルなどのエーテルがある。
R3が-CNである一般式(V)の化合物は、R3がハロ、例えばブロモである一般式(V)の化合物から、好適なシアニド塩との反応により調製できる。反応は、銅(I)塩、例えばヨウ化銅(I)の存在下で起こり、該シアニド塩は、好適にはシアン化銅(I)である。反応は、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)などのパラジウム触媒により触媒され得て、高圧で、例えばプレッシャーチューブ中で、約50〜100℃、より一般的には70〜90℃、典型的には約80℃の温度で起こり得る。
【００６５】
いくつかの場合に、一般式(V)の化合物は、異なるR3基を有する一般式(II)の化合物に直接転化できる。例えば、R3がハロ、例えばブロモである一般式(V)の化合物は、R3が-S(C1-3アルキル)である一般式(II)の化合物に、一般式(VI)の化合物:
R22-S- Z+(VI)
（式中、R22はC1-3アルキルであり、Z+は、好適なカチオン、例えばNa+又はK+である）との反応により転化できる。
【００６６】
該反応は、好適には、例えば、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)などのパラジウム触媒により触媒され、高圧で、例えばプレッシャーチューブ中で、約30〜80℃、より一般的には40〜60℃、典型的には約50℃の温度で起こり得る。
【００６７】
或いは、一般式(I)の化合物は、先に定義された一般式(III)の塩を、一般式(IV)の化合物:
【化１９】
2019519616.tif 000026
（式中、R3は一般式(I)に関して定義された通りである）と反応させることにより調製できる。
好適には、該反応は、約10〜50℃、より一般的には15〜30℃の温度、又は室温で、N,N-ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒中で実施される。
【００６８】
一般式(IV)の化合物は、先に定義された一般式(V)の化合物をカルボニルジイミダゾール(CDI)と反応させることにより調製できる。好適には、該反応は、N,N-ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒中で、約10〜30℃、より一般的には15〜25℃の温度、又は室温で起こる。
一般式(I)の化合物は、他の一般式(I)の化合物から、例えば、以下の実施例7、18、21、22、及び25に記載されている方法を利用しても合成できる。
【００６９】
一般式(III)の化合物は、一般式(VII)の化合物
【化２０】
2019519616.tif 000027
(式中、R1、R2及びR10は一般式(I)に関して定義された通りであり;
R23は、アリールにより任意に置換されているO(C1-6)アルキル、又はC(O)OHにより任意に置換されているアリールであり;且つR24はHであるか;或いは
R23とR24は、それらが結合している炭素原子及び窒素原子と共に、アリール又はヘテロアリール環に任意に縮合し、さらなる=O置換基を任意に含む複素環を形成する）から調製できる。
【００７０】
R23がアリールにより任意に置換されているO(C1-6)アルキル、又はC(O)OHにより任意に置換されているアリールであり;且つR24がHである場合、一般式(III)の化合物への転化は、酸により、例えば塩化水素溶液により、水酸化ナトリウムなどの無機塩基により、又はピペリジン若しくはモルホリンなどの有機塩基との反応により実施され得る。該反応は、好適には、約10〜30℃、より一般的には15〜25℃、又は室温で実施される。酸又は塩基の選択は、R23基の性質による。
【００７１】
個々のR23基の例には、メトキシ、エトキシ、nプロピルオキシ、iプロピルオキシ、nブチルオキシ、sブチルオキシ、tブチルオキシ、ベンジルオキシ、及びフルオレニルメトキシがある。R23がアルコキシである場合、一般式(III)の化合物への転化は、酸性条件下で実施され得る。他のR23基、特にフルオレニルメトキシに関しては、塩基性条件がより適切である。
環式N(R24)C(O)R23基の例は、1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イル(フタルイミジル)である。
【００７２】
R23とR24が、それらが結合している炭素原子及び窒素原子と共にこのタイプの複素環を形成する場合、一般式(III)の化合物は、一般式(VII)の化合物を抱水ヒドラジンと反応させることにより合成できる。好適には、この反応は、メタノールなどのアルコール性溶媒中で、高温、例えば約60〜90℃、典型的には約75℃で実施される。
【００７３】
一般式(VII)の化合物は、一般式(VIII)の化合物から:
【化２１】
2019519616.tif 000028
（式中、R1及びR10は一般式(I)に関して定義された通りであり、R23及びR24は一般式(VII)に関して定義された通りである）;
一般式(IX)の化合物との反応により:
R2-X1(IX)
（式中、R2は一般式(I)に関して定義された通りであり、X1はハロなどの脱離基である）;又は一般式(IXA)の化合物との反応により:
R2a-X1(IXA)
（式中、X1は一般式(IX)に関して先に定義された通りであり、R2aは保護されたR2基である）調製できる。例えば、所望のR2基が1つ以上のOH部分を含む場合、これらは、標準的な保護基、例えばトリメチルシリル(TMS)、tブチルジメチルシリル(TBDMS)などのシリル保護基を使用して保護できる。
【００７４】
一般式(IXA)の化合物を経る経路が利用される場合、一般式(VIII)の化合物は、好適には、R23がアリールにより任意に置換されているO(C1-6)アルキル又はC(O)OHにより任意に置換されているアリールであり;R24がHであるものであるが、その理由は、この場合、シリル及びカルボニルオキシ保護基が、塩化水素溶液などの酸の使用により除去できるからである。
【００７５】
いくつかの場合、一般式(IX)の化合物が、N(R24)C(O)R23が1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イルなどの環式基である一般式(VIII)の化合物と反応する場合、該反応は開環を伴い得る。そのため、N(R24)C(O)R23が1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イルである一般式(VIII)の化合物は、N(R24)C(O)R23が:
【化２２】
2019519616.tif 000029
である一般式(VII)の生成物をもたらし得る。
いくつかの一般式(VIII)の化合物は公知である。例えば、中間体2(以下の実施例参照)は、US 2015/0018314 A1に述べられている経路により合成できる。
【００７６】
いくつかの一般式(VIII)の化合物は、他の一般式(VIII)の化合物から合成できる。例えば、R1がC(O)OR5である(式中、R5はH以外である）一般式(VIII)の化合物は、例えば塩基による、好適には水酸化リチウムなどのアルカリ金属水酸化物による加水分解により、R1がC(O)OHである一般式(VIII)の化合物に転化され得る。次いで、R1がC(O)OHである化合物は、R1がC(O)OR5である（式中、R5はH以外である）化合物に、一般式(X)の化合物:
R52-CH-NHR252 X
（式中、R5は、Hではないという点以外一般式(I)に関して定義された通りであり、R25はC1-4アルキルである）との反応により転化され得る。
【００７７】
一般式(VIII)の化合物は、異なるR23及び／又はR24基を有する他の一般式(VIII)の化合物にも転化され得る。例えば、R23が、アリールにより任意に置換されているO(C1-6)アルキル又はC(O)OHにより任意に置換されているアリールであり;R24がHである場合、一般式(VIII)の化合物は、例えばジオキサンなどの溶媒中でのHClとの反応により加水分解されて、一般式(XI)の化合物:
【化２３】
2019519616.tif 000030
（式中、R1及びR10は一般式(I)に定義された通りである）を与え得る。
【００７８】
一般式(X)の化合物は再び保護されて、例えば一般式(XII)の化合物:
【化２４】
2019519616.tif 000031
（式中、R23は一般式(VII)に関して先に定義された通りである）との反応により、新たな一般式(VIII)の化合物が得られる。該反応は、トリメチルアミンなどの塩基の存在下で、極性有機溶媒、例えばジクロロメタン中で、10〜30℃、より一般的には15〜25℃の温度、典型的には室温で実施され得る。
【００７９】
R23がアリールにより任意に置換されているO(C1-6)アルキル又はC(O)OHにより任意に置換されているアリールであり;R24がHである一般式(VIII)の化合物は、一般式(XIII)の化合物から:
【化２５】
2019519616.tif 000032
（式中、R1及びR10は一般式(I)に関して定義された通りである）;
一般式(XIV)の化合物:
【化２６】
2019519616.tif 000033
（式中、R23は一般式(VII)に関して先に定義の通りである）との反応によっても調製できる。
【００８０】
該反応は、好適には、塩基、典型的には非求核塩基、例えばN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)又はトリエチルアミンなどのアミン及びペプチドカップリング剤、例えばHATU、TBTU、HBTU、又はEDCとHOAt若しくはHOBtとの組み合わせの存在下で起こる。該反応は、好適には、約10〜30℃、通常15〜25℃の温度、例えば室温で実施される。好適な反応溶媒には、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)などの有機溶媒がある。
【００８１】
一般式(XIII)及び(XIV)の化合物は公知であり、容易に利用可能であるか、当業者に公知である方法により調製できる。
或いは、一般式(XIII)の化合物は、一般式(XV)の化合物から:
【化２７】
2019519616.tif 000034
（式中、R1及びR10は一般式(I)に関して定義された通りである）;
接触水素化により、好適にはパラジウム触媒を使用して調製できる。
【００８２】
該水素化は、好適には、1気圧で、約10〜30℃、通常15〜25℃の温度で、例えば室温で実施される。
一般式(XIII)の生成物は、さらなる単離又は精製工程なしに、上述の一般式(XIV)の化合物と直接反応させることができる。
【００８３】
一般式(XV)の化合物は、一般式(XVI)の化合物から:
【化２８】
2019519616.tif 000035
（式中、R1は一般式(I)に関して定義された通りであり、X2は、脱離基、特にクロロなどのハロ基である）;
一般式(XVII)の化合物:
R10-NH2(XVII)
(式中、R10は一般式(I)に関して定義された通りである）との反応により調製できる。
【００８４】
該反応は、好適には、加圧下で、約30〜70℃、より一般的には約40〜60℃、典型的には約50℃の温度で、テトラヒドロフランなどの有機溶媒中で実施される。
一般式(XVI)及び(XVII)の化合物は公知であり、容易に利用可能であるか、又は当業者に公知である方法により調製できる。
【００８５】
一般式(I)の化合物はENaCブロッカーであり、したがって、呼吸器の疾患及び病態の治療又は予防に有用である。
したがって、本発明のさらなる態様において、医薬に使用するための一般式(I)の化合物が提供される。
好適には、一般式(I)の化合物は、ENaCにより媒介される疾患又は病態の治療又は予防に使用するためのものである。
【００８６】
下記も提供される：
・呼吸器の疾患及び病態の治療又は予防に使用するための一般式(I)の化合物
・皮膚の病態又は眼の病態の治療又は予防に使用するための一般式(I)の化合物。
本発明は下記をさらに提供する:
・呼吸器の疾患及び病態の治療又は予防のための薬剤の調製における一般式(I)の化合物の使用
・皮膚の病態又は眼の病態の治療又は予防のための薬剤の調製における一般式(I)の化合物の使用。
【００８７】
下記も提供される:
・呼吸器の疾患及び病態の治療又は予防の方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の一般式(I)の化合物を投与することを含む方法
・皮膚の病態及び眼の病態の治療又は予防の方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の一般式(I)の化合物を投与することを含む方法。
【００８８】
一般式(I)の化合物により治療され得る呼吸器の疾患及び病態には、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、慢性気管支炎、肺気腫、非嚢胞性線維症性気管支拡張症を含む気管支拡張症、及び喘息がある。
本発明の化合物により治療され得る皮膚の病態には、乾癬、アトピー性皮膚炎、及び魚鱗癬がある。
本発明の化合物により治療され得る眼の病態には、ドライアイ疾患(乾性角結膜炎)がある。
【００８９】
治療すべき患者は、好適には哺乳動物、より好適にはヒトである。
一般式(I)の化合物は医薬組成物中で投与でき、したがって、本発明のさらなる態様において、一般式(I)の化合物及び医薬として許容し得る賦形剤を含む医薬組成物が提供される。治療又は予防されている疾患又は病態に適切な又は賢明であると考えられる通り、他の薬理活性のある物質も存在してよい。
【００９０】
担体、又は2種以上が存在する場合担体のそれぞれは、製剤の他の成分と適合性があり、受容者にとって有害でないという意味で許容し得るものでなくてはいけない。
【００９１】
製剤は、経口、直腸、鼻腔内、気管支(吸入)、局所(皮膚、経皮、点眼、頬側、及び舌下を含む)、膣内、又は非経口(皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内を含む)投与に好適なものを含み、調剤の技術分野に周知である任意の方法により調製され得る。
投与経路は、治療すべき病態に依存するが、好ましい組成物は、経口、鼻腔内、気管支(吸入)又は局所投与用に製剤される。
【００９２】
吸入による気管支投与用の組成物は、呼吸器の病態の治療に特に好適であるために好ましい。
点眼剤としての投与のための局所製剤も好ましく、ドライアイ疾患の治療に特に好適である。
皮膚への適用のための局所製剤も好ましく、乾癬、アトピー性皮膚炎、及び魚鱗癬などの皮膚の病態の治療に特に好適である。
【００９３】
組成物は、先に定義された活性薬剤を賦形剤と混合することにより調製され得る。一般に、製剤は、活性薬剤を液体の担体若しくは微粉砕された固体担体又は両方と均一且つ完全に混合し、次いで、必要な場合、生成物を付形することにより調製される。本発明は、一般式(I)の化合物を、医薬として又は獣医学的に許容し得る担体又はビヒクルと結合し、又は混合することを含む、医薬組成物を調製する方法に及ぶ。
【００９４】
本発明における経口投与用の製剤は、所定量の活性薬剤をそれぞれ含むカプセル、分包、若しくは錠剤などの別個の単位として;散剤若しくは顆粒剤として;水性液体若しくは非水性液体中の活性薬剤の液剤若しくは懸濁剤として;又は水中油型液体エマルション若しくは油中水型液体エマルションとして;又はボーラス剤などとして呈され得る。
【００９５】
経口投与用の組成物(例えば、錠剤及びカプセル)に関して、用語「許容し得る担体」は、通常の賦形剤、例えば、結合剤、例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン(ポビドン)、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、及びスターチ;充填剤及び担体、例えばコーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム、及びアルギン酸;並びにステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム及び他のステアリン酸金属塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコーン流体、タルク、蝋、油、及びコロイダルシリカなど滑沢剤などのビヒクルを含む。ペパーミント、ウィンターグリーンのオイル、チェリー香味料などの着香料も使用できる。剤形を容易に特定可能にするために着色剤を加えることが望ましいことがある。錠剤は、当技術分野に周知である方法により被覆されていてもよい。
【００９６】
錠剤は、任意に1種以上の副成分と共に圧縮又は成形により製造できる。打錠剤は、好適な機械中で、結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、保存剤、界面活性剤、又は分散化剤と任意に混合された粉末又は顆粒などの自由流動形態の活性薬剤を圧縮することにより調製できる。湿製錠は、好適な機械中で、不活性な液体希釈剤により湿らされた粉末化された化合物の混合物を成形することにより製造できる。錠剤は、任意に被覆されていても、割線が入っていてもよく、活性薬剤の緩徐又は徐放性放出を与えるように製剤されることがある。
【００９７】
経口投与に好適な他の製剤には、風味がついた基剤、通常スクロース及びアラビアゴム又はトラガカント中の活性薬剤を含むロゼンジ剤;ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアラビアゴムなどの不活性な基剤中に活性薬剤を含む香錠;並びに好適な液体担体中に活性薬剤を含む洗口液がある。
【００９８】
皮膚への局所適用には、一般式(I)の化合物は、クリーム、軟膏、ゼリー、液剤、又は懸濁剤などに作り上げられ得る。薬物に使用できるクリーム又は軟膏製剤は、例えば、英国薬局方などの薬剤の標準的な教科書に記載の通り、当技術分野に周知である従来の製剤である。
【００９９】
一般式(I)の化合物は、薬理学的有効成分を粉末の形態で、又は液剤若しくは懸濁剤の液滴の形態で分散できる、例えば、エアゾール剤又はスプレー剤の鼻腔内、気管支、又は頬側投与により、呼吸器の治療に使用され得る。粉末分散性を有する医薬組成物は、通常、有効成分の他に、沸点が室温未満である液体噴射剤並びに、所望の場合、液体若しくは固体の非イオン性若しくはアニオン性界面活性剤及び／又は希釈剤などの添加物を含む。薬理学的有効成分が溶解状態にある医薬組成物は、これに加え、好適な噴射剤、並びにさらに、必要な場合、追加の溶媒及び／又は安定剤を含む。噴射剤の代わりに、圧縮空気を使用でき、圧縮空気は好適な圧縮膨張装置により適宜製造されることが可能である。
非経口製剤は一般に滅菌されている。
【０１００】
一般式(I)の化合物は、呼吸器の疾患及び病態の治療又は予防に有用である1種以上の他の活性薬剤と組み合わせて使用され得る。
このタイプの追加の活性薬剤は、上述の医薬組成物に含められ得るが、或いは、それは、一般式(I)の化合物と同時に、又はより早い若しくは遅い時間に、別に投与され得る。
【０１０１】
したがって、本発明のさらなる態様において、ENaCにより媒介される疾患又は病態及び特に呼吸器の疾患又は病態、例えば上述の疾患及び病態のいずれかの治療における同時、連続的、又は別々な使用のための複合製剤（combined preparation）としての、一般式(I)の化合物及び呼吸器の病態の治療又は予防に有用な追加の薬剤を含む製品が提供される。
【０１０２】
一般式(I)の化合物と共に医薬組成物又は複合製剤に含められ得る好適な追加の活性薬剤には下記がある:
メタプロテレノール、イソプロテレノール、イソプレナリン、アルブテロール、サルブタモール、ホルモテロール、サルメテロール、インダカテロール、テルブタリン、オルシプレナリン、メシル酸ビトルテロール、及びピルブテロールなどのβ2アドレナリン受容体アゴニスト;
抗ヒスタミン剤、例えば、ロラタジン、セチリジン、デスロラタジン、レボセチリジン、フェキソフェナジン、アステミゾール、アゼラスチン、及びクロルフェニラミンなどのヒスタミンH1受容体アンタゴニスト又はH4受容体アンタゴニスト;
ドルナーゼアルファ;
プレドニゾン、プレドニゾロン、フルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾンプロピオン酸エステル、ブデソニド、フルチカゾンプロピオン酸エステル、モメタゾンフランカルボン酸エステル及び、フルチカゾンフランカルボン酸エステルなどのコルチコステロイド;
モンテルカスト及びザフィルルカストなどのロイコトリエンアンタゴニスト;
抗生物質。
【実施例】
【０１０３】
（実施例）
（A.中間体の合成）
感湿性試薬を含む全反応は、標準的な真空ライン技法及びオーブンで乾燥させたガラス器具を使用して窒素雰囲気下で実施した。市販の無水溶媒を反応に使用し、HPLCグレードの溶媒を後処理及びクロマトグラフィーに利用した。Elix UV-5システムを使用して水を精製した。他の全試薬を事前の精製なしに供給されたまま使用した。マイクロ波実験を、Biotage Initiator+を使用して実施した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、Biotage SNAPカラムを使用するBiotage Isolera 4を使用して実施した。NMRスペクトルは、溶媒を内部重水素ロックとして使用してBruker Avance III HD 500MHz又はBruker Avance III HD 250MHzで記録した。スペクトルは特記されない限り室温で記録した。分析LCMSを以下のシステムで実施した:システムA:固定相:Kinetex Core-Shell C18 2.1×50 mm、5μm、40℃;検出UV 215 nm-ELS-MS;移動相:A、水+0.1%ギ酸;B、MeCN+0.1%ギ酸;勾配(A:B比、時間):95:5-0:100、1.20分;100:0、0.10分;100:0-5:95、0.01分;システムB:固定相:Phenomenex Gemini-NX C18 2.0×50 mm、3μm、40℃;検出UV 215 nm-ELS-MS;移動相:A、2mM NH4HCO3 pH 10;B、MeCN;勾配(A:B比、時間):99:1-0:100、1.80分;100:0、0.30分;100:0-1:99、0.20分;1:99、1.20分;システムC:固定相:Phenomenex Kinetix-XB C18 2.1×100 mm、1.7μm、40℃;検出UV 215 nm-ELS-MS;移動相:A、水+0.1%ギ酸;B、MeCN+0.1%ギ酸;勾配(A:B比、時間):95:5-0:100、5.30分;100:0、0.50分;100:0-5:95、0.02分;5:95、1.18分。分取HPLC精製は以下の条件を利用して実施した:固定相:Waters Sunfire 30×100 mm、10μm;検出UV 215及び254 nm;移動相A:水+0.1%ギ酸;B:MeCN+0.1%ギ酸;勾配:14分かけて5-95%溶媒B;流量:40ml/分。
【０１０４】
以下の略語及び用語は全体にわたって示される意味を有する:
【表２】
2019519616.tif 000036
【０１０５】
（リチウム3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボキシレート:中間体1の合成）
【化２９】
2019519616.tif 000037
2M LiOH水溶液(65ml、130mmol)を、5分かけて、室温のMeOH(75ml)中のメチル3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボキシレート(15.0g、64.7mmol)の懸濁液に加えた。該反応物を50℃で3時間加熱した。該反応溶液を真空中で濃縮してMeOHのほとんどを除いた。生じた水性懸濁剤を真空下でろ過し、次いで生じた茶色の固体を、最低限の水、それに続いて最低限のMeCNで洗浄し、次いで、真空下で40℃で一定重量になるまで乾燥させると、生成物を茶色の固体として与えた(10.3g)。ろ液を蒸発乾固させ、次いで最低限の水(〜30ml)に懸濁させた。沈殿した固体を真空下でろ過し、次いで、最低限の水及びMeCNで洗浄し、次いで生じた茶色の固体を真空下で一定重量まで乾燥させると、追加バッチの生成物を茶色の固体として与えた(2.00g)。該2つのバッチをMeCN懸濁液として合わせ、次いで蒸発させ、真空下で乾燥させると、生成物を茶色の固体として与えた(12.3g、85%)。
【化３０】
2019519616.tif 000038
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=218 [M(79Br)H+]、220 [M(81Br)H+])、Rt=0.69分、UV純度=100%。
【０１０６】
（5-ブロモ-3-(1H-イミダゾール-1-カルボニル)ピラジン-2-アミン:中間体2の合成）
【化３１】
2019519616.tif 000039
CDI(2.23g、13.8mmol)を、DMF(20ml)中の市販の3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボン酸(2.00g、9.17mmol)の懸濁液に加えた。該反応物を室温で16時間撹拌した。該反応混合物を冷却し(0℃)、次いで水(20ml)で希釈した。固体をろ過により回収し、次いで、最低限の体積の水及び冷却した(0℃)MeCNで洗浄し、次いで真空下で乾燥させると、生成物を黄色の固体として与えた(2.23g、86%)。
【化３２】
2019519616.tif 000040
LC/MS(システムA、MeOHクエンチ):m/z(ESI+)=232 [メチルエステルM(79Br)H+]、234 [メチルエステルM(81Br)H+])、Rt=0.87分、UV純度=95%。
【０１０７】
（リチウム3-アミノ-6-ヨードピラジン-2-カルボキシレート:中間体3の合成）
【化３３】
2019519616.tif 000041
LiOH水溶液(2.0M、0.72ml、1.4mmol)を、室温のMeOH(3.5ml)中のメチル3-アミノ-6-ヨードピラジン-2-カルボキシレート(200mg、0.72mmol)の懸濁液に滴加した。該反応物を50℃で1.5時間加熱し、次いで室温に放冷した。該反応混合物を真空中で濃縮してMeOHのほとんどを除いた。生じた懸濁液をろ過し、このようにして得られた固体を最低限の体積の水(0.5ml)で洗浄し、真空下で乾燥させると、生成物を茶色の固体として与えた(40mg、20%)。
【化３４】
2019519616.tif 000042
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=265 [MH+]、Rt=0.78分、UV純度=97%。
【０１０８】
（メチル3-アミノ-6-メチルピラジン-2-カルボキシレート:中間体4の合成）
【化３５】
2019519616.tif 000043
K2CO3(0.89g、6.46mmol)を、プレッシャーチューブ中で、メチル3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボキシレート(0.75g、3.23mmol)の無水DME(15ml)溶液に加えた。トリメチルボロキシン(0.99ml、3.56mmol)を加え、次いで生じた茶色の懸濁液を、窒素流を反応混合物に5分間バブリングすることにより脱気した。Pd(dppf)2Cl2(0.13g、0.16mmol)を加え、次いで該プレッシャーチューブに窒素を流し、密封した。該反応物を100℃で16時間撹拌し、次いで室温に放冷した。生じた懸濁液をろ過し、次いでこのようにして得られた固体をEtOAc(20ml)で洗浄した。合わせたろ液を真空中で濃縮した。粗製の物質を、シリカカラム(50g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、10カラム体積にわたり勾配を0:100から50:50に直線的に増加させながらEtOAc:ヘプタンで溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を薄黄色の固体として与えた(470mg、87%)。
【化３６】
2019519616.tif 000044
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=168 [MH+]、Rt=0.68分、UV純度=100%。
【０１０９】
（リチウム3-アミノ-6-メチルピラジン-2-カルボキシレート:中間体5の合成）
【化３７】
2019519616.tif 000045
LiOH水溶液(2.0M、4.3ml、8.6mmol)を、室温のMeOH(5ml)中のメチル3-アミノ-6-メチルピラジン-2-カルボキシレート、中間体4(464mg、2.78mmol)の懸濁液に滴加した。該反応物を50℃で1時間加熱し、次いで室温に放冷した。該反応混合物を真空中で濃縮してMeOHのほとんどを除いた。生じた懸濁液をろ過し、このようにして得られた固体を最低限の体積の水(1ml)で洗浄し、真空下で乾燥させると生成物を黄色の固体として与えた(395mg、89%)。
【化３８】
2019519616.tif 000046
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=154 [MH+]、Rt=0.33分。
【０１１０】
（メチル3-アミノ-6-エチルピラジン-2-カルボキシレート:中間体6の合成）
【化３９】
2019519616.tif 000047
Pd(dppf)Cl2(158mg、0.215mmol)を、DME(20ml)中のメチル3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボキシレート(1.00g、4.31mmol)、エチルボロン酸(0.637g、8.62mmol)、及びK2CO3(1.79g、12.9mmol)の懸濁液に加えた。生じた懸濁液を、窒素流を反応混合物に1分間バブリングすることにより脱気した。該反応混合物を90℃で17時間加熱し、次いで室温に放冷した。該反応物に、エチルボロン酸(318mg、4.31mmol)及びPd(dppf)Cl2(79mg、0.11mmol)を再び加え、次いで90℃で2時間加熱した。該反応混合物を室温に放冷し、次いで、飽和NaHCO3水溶液(40ml)に加えた。生じた混合物をEtOAc(2×40ml)で抽出し、次いで、合わせた有機抽出物をブライン(40ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、真空中で濃縮した。粗製の物質をシリカカラム(50g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、10カラム体積にわたり勾配を6:94から50:50に直線的に増加させながらEtOAc:ヘプタンで溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると生成物を黄色の固体として与えた(322mg、41%)。
【化４０】
2019519616.tif 000048
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=182 [MH+]、Rt=0.81分、UV純度=100%。
【０１１１】
（リチウム3-アミノ-6-エチルピラジン-2-カルボキシレート:中間体7の合成）
【化４１】
2019519616.tif 000049
LiOH水溶液(2.0M、1.8ml、3.6mmol)を、室温のMeOH(5ml)中のメチル3-アミノ-6-エチルピラジン-2-カルボキシレート、中間体6(322mg、1.78mmol)の懸濁液に滴加した。該反応物を50℃で2時間加熱し、次いで室温に放冷した。該反応混合物を真空中で濃縮してMeOHのほとんどを除いた。生じた懸濁液をろ過し、このようにして得られた固体を最低限の体積の水(0.5ml)で洗浄し、真空下で乾燥させると、生成物を黄色の固体として与えた(306mg、99%)。
【化４２】
2019519616.tif 000050
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=168 [MH+]、Rt=0.68分、UV純度=100%。
【０１１２】
（3-アミノ-6-(メチルスルファニル)ピラジン-2-カルボン酸:中間体8の合成）
【化４３】
2019519616.tif 000051
メチル3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボキシレート(500mg、2.16mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(124mg、0.108mmol)、及びナトリウムメタンチオラート(306mg、4.31mmol)のDMF(10ml)溶液を、窒素を流したプレッシャーチューブ中に密封した。該プレッシャーチューブを50℃で2時間加熱し、次いで室温に放冷した。該反応混合物をEtOAc(30ml)で希釈し、次いで塩化水素酸(1M、2×25ml)で洗浄した。沈殿物が生じ、それをろ過により除いた。ろ液をMgSO4で乾燥させ、蒸発させた。このようにして得られた粗製の物質をC18(60g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-100%、20CV;100%、2CVを利用して、MeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を濃い黄色の固体として与えた(77mg、19%)。
【化４４】
2019519616.tif 000052
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=186 [MH+]、Rt=0.72分、UV純度=98%。
【０１１３】
（メチル3-アミノ-6-シアノピラジン-2-カルボキシレート:中間体9の合成）
【化４５】
2019519616.tif 000053
テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(176mg、0.152mmol)を、プレッシャーチューブ中でメチル3-アミノ-6-ヨードピラジン-2-カルボキシレート(350mg、1.25mmol)及びCuI(167mg、0.878mmol)のDMF(8ml)溶液に加えた。該反応チューブに窒素を流し、次いでCuCN(225mg、2.51mmol)を加えた。該チューブを密封し、次いで80℃で4時間加熱した。該反応混合物を室温に放冷し、次いで飽和NaHCO3水溶液(25ml)に加え、EtOAc(3×25ml)で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン(25ml)で洗浄し、次いでMgSO4で乾燥させ、ろ過し、次いで真空中で濃縮して、薄黄色の油にした。該粗製の物質をC18 Samplet（登録商標）上に移し、真空下で乾燥させ、次いでシリカ(25g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、10カラム体積にわたり勾配を12:88から100:0に直線的に増加させながらEtOAc:ヘプタンで溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を白色の固体として与えた(23mg、10%)。
【化４６】
2019519616.tif 000054
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=179 [MH+]、Rt=0.75分、UV純度=100%。
【０１１４】
（3-アミノ-6-シアノピラジン-2-カルボン酸:中間体10の合成）
【化４７】
2019519616.tif 000055
LiOH水溶液(2.0M、0.13ml、0.16mmol)を、メチル3-アミノ-6-シアノピラジン-2-カルボキシレート、中間体9(25mg、0.14mmol)のTHF(1ml)溶液に加えた。該反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いでHCl水溶液(2M、5ml)に加えた。生じた混合物をEtOAc(2×10ml)で抽出し、次いで合わせた有機相をMgSO4で乾燥させ、真空中で濃縮すると、生成物を薄黄色の固体として与えた(21mg、91%)。
【化４８】
2019519616.tif 000056
LC/MS(システムA):m/z(ESI-)=163 [(M-H)-]、Rt=0.29分。
【０１１５】
（2-[(1-エチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル)メチル]-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-1,3-ジオン:中間体11の合成）
【化４９】
2019519616.tif 000057
中間体11を文献(US 2015/0018314 A1)の手順に従って合成した。
【０１１６】
（2-[(1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イル)メチル]-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体12の合成）
【化５０】
2019519616.tif 000058
ヨードメタン(590μl、9.47mmol)を、プレッシャーチューブ中で、MeCN(13ml)中の2-[(1-エチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル)メチル]-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-1,3-ジオン、中間体11(1.59g、4.74mmol)の懸濁液に加えた。該混合物を80℃で4時間加熱し、次いで室温に放冷した。生じた懸濁液を窒素気流下で元の体積のおよそ半分に減らした。固体をろ過により回収し、次いでさらなるMeCN(3ml)で洗浄すると生成物を白色の固体として与えた(1.99g、87%)。
【化５１】
2019519616.tif 000059
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=350 [M+]、Rt=0.87分、UV純度=99%。
【０１１７】
（2-(アミノメチル)-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体13の合成）
【化５２】
2019519616.tif 000060
抱水ヒドラジン(1.17ml、24.0mmol)を、MeOH(25ml)中の2-[(1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イル)メチル]-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体12(2.29g、4.80mmol)の懸濁液に加えた。該混合物を75℃で1時間加熱した。該反応物を濃縮乾固させ、生じた固体をCH2Cl2:MeOH(10:1)に懸濁させた。固体をろ過により回収し、CH2Cl2で洗浄した。ろ液を濃縮乾固させると、生成物を薄茶色の固体として与えた(1.60g、96%)。
【化５３】
2019519616.tif 000061
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=220 [M+]、Rt=0.14分、ELS純度=100%。
【０１１８】
（2-[(1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イル)メチル]-1,3-ジエチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体14の合成）
【化５４】
2019519616.tif 000062
ヨードエタン(715μl、8.95mmol)を、MeCN(20ml)中の2-[(1-エチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル)メチル]-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-1,3-ジオン、中間体11(3.00g、8.95mmol)の懸濁液に加えた。該混合物を80℃で4時間加熱した。ヨードエタン(715μl、8.95mmol)を加え、混合物を80℃で16時間撹拌した。ヨードエタン(715μl、8.95mmol)を加え、混合物を80℃でさらに24時間撹拌し、室温に放冷した。該混合物を真空中で元の体積のおよそ3分の1に濃縮した。沈殿物をろ過により回収し、次いでMeCNで洗浄すると、灰色の固体を与えた(2.6g)。ろ液を濃縮すると濃い灰色の固体を与えた。このようにして得られた2バッチの固体を合わせ、MeCN(20ml)に懸濁させた。ヨードエタン(715μl、8.95mmol)を加え、次いで該反応混合物を80℃で18時間撹拌し、次いで100℃で4時間撹拌した。該反応混合物をプレッシャーチューブ中に二等分した。ヨードエタン(300μl、3.75mmol)を両反応混合物に加え、次いで該プレッシャーチューブを密封し、100℃で16時間加熱したままにした。該反応混合物を室温に放冷し、次いで合わせた。生じた混合物を真空中で〜5mlに濃縮し、次いでろ過した。回収した固体を最低限のMeCN(0.5ml)で洗浄すると、生成物を灰色の固体として与えた(2.37g)。ろ液を減圧下で濃縮すると茶褐色の固体を与え、それをEtOAc(〜10ml)によりトリチュレートし、ろ過した。ろ液を一晩静置し、次いでそれを再びろ過した。EtOAcろ過から得られた固体を合わせ、乾燥させると、追加のバッチの生成物を灰色の固体として与えた(1.24g)。得られた2つのバッチの生成物をEtOAc懸濁液として合わせ、次いで蒸発させ、真空下で乾燥させると、生成物を灰色の固体として与えた(3.61g、81%)。
【化５５】
2019519616.tif 000063
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=365 [M+]、Rt=0.93分、UV純度=99%。
【０１１９】
（2-(アミノメチル)-1,3-ジエチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体15の合成）
【化５６】
2019519616.tif 000064
抱水ヒドラジン(1.18ml、24.1mmol)を、MeOH(25ml)中の2-[(1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イル)メチル]-1,3-ジエチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体14(2.37g、4.82mmol)の懸濁液に加えた。次いで、該混合物を75℃で2.5時間加熱し、次いで16時間かけて室温に放冷した。該反応混合物を濃縮乾固させ、生じた固体をCH2Cl2:MeOH(10:1)に懸濁させ、次いでろ過した。回収した固体をCH2Cl2で洗浄した。ろ液を濃縮乾固させると、生成物を灰色の固体として与えた(1.89g、＞99%)。
【化５７】
2019519616.tif 000065
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=234 [M+]、Rt=0.16分、ELS純度=92%。
【０１２０】
（tert-ブチルN-[(1-エチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル)メチル]カルバマート:中間体16の合成）
【化５８】
2019519616.tif 000066
HATU(8.53g、22.3mmol)及びDIPEA(7.1ml、41mmol)を、N-(tert-ブトキシカルボニル)グリシン(3.93g、22.4mmol)のDMF(40ml)溶液に加えた。生じた溶液を室温で0.5時間撹拌し、次いで1-N-エチル-5-メトキシベンゼン-1,2-ジアミン(3.39g、20.4mmol)のTHF(20ml)溶液を加えた。該反応物を室温で80分間撹拌したままにし、次いで該反応混合物をEtOAc(200ml)及び水(150ml)で希釈した。相を分離し、次いで有機相を水(3×150ml)及びブライン(150ml)で洗浄した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥させ、次いで真空中で濃縮すると、粗製中間体を暗赤色の粘性のある油として与えた。該中間体をAcOH(40ml)に吸収させ、生じた溶液を60℃で18時間撹拌した。該反応混合物を放冷し、次いで真空中で濃縮した。次いで、残渣をEtOAc(200ml)に溶解させ、次いで、飽和NaHCO3水溶液の添加によりpHを9に調整した。相を分離し、有機相を水(2×150ml)及びブライン(150ml)で洗浄し、次いでNa2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮すると、粗生成物を暗赤色の油として与えた。粗製の物質をシリカカラム(340g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、10カラム体積にわたり勾配を100:0から92:8に直線的に増加させながらCH2Cl2:MeOHにより溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると粘性のある暗赤色の油になり、それは放置されると凝固して、生成物を暗赤色の固体として与えた(5.02g、77%)。
【化５９】
2019519616.tif 000067
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=306 [MH+]、Rt=0.88分、UV純度=96%。
【０１２１】
（2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-3-(2-ヒドロキシエチル)-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムブロミド:中間体17の合成）
【化６０】
2019519616.tif 000068
(2-ブロモエトキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン(1.66g、6.96mmol)を、プレッシャーチューブ中で、MeCN(5ml)中のtert-ブチルN-[(1-エチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル)メチル]カルバマート、中間体16(85%、500mg、1.39mmol)の懸濁液に加えた。該チューブを密封し、次いで該反応混合物を80℃で0.5時間撹拌し、次いで100℃で16時間撹拌した。該反応物を室温に放冷し、次いで追加の(2-ブロモエトキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン(1.00g、4.18mmol)を加えた。該チューブを密封し、次いで該反応物を100℃でさらに24時間撹拌したままにした。該反応混合物を放冷し、次いで真空中で赤色の油に濃縮した。該粗製の物質を、シリカカラム(25g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、10カラム体積にわたり勾配を100:0から90:10に直線的に増加させながらCH2Cl2:MeOHにより溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、粘性のある暗赤色の油を与えた(615mg)。該物質をC18(30g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-36%;36%、2CV;36-50%、4CV;50-100%、3CV;100%、3CVを利用して、MeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を粘性のある暗赤色の油として与えた(278mg、43%)。
【化６１】
2019519616.tif 000069
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=350 [M+]、Rt=0.88分、UV純度=92%。
【０１２２】
（2-(アミノメチル)-1-エチル-3-(2-ヒドロキシエチル)-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩クロリド:中間体18の合成）
【化６２】
2019519616.tif 000070
塩化水素のジオキサン溶液(4.0M、1.2ml、4.8mmol)を、2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-3-(2-ヒドロキシエチル)-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムブロミド、中間体17(90%、227mg、0.47mmol)のMeCN(3ml)溶液に加えた。生じた混合物を室温で1時間撹拌した。該反応混合物を真空中で濃縮すると、生成物を濃い紫色の固体として与えた(153mg、99%)。
【化６３】
2019519616.tif 000071
LC/MS(システムB):m/z(ESI+)=250 [M+]、Rt=1.58分、UV純度=99%。
【０１２３】
（2-{[(2-カルボキシフェニル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-3-{2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エチル}-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体19の合成）
【化６４】
2019519616.tif 000072
MeCN(15ml)中の2-[(1-エチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル)メチル]-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-1,3-ジオン、中間体11(2.00g、5.96mmol)と2-[2-(2-ヨードエトキシ)エトキシ]エタン-1-オール(90%、8.62g、29.8mmol)の混合物を、130℃で、密封したチューブ中で16時間加熱し、次いで室温に放冷した。該反応混合物を真空中で濃縮し、次いで粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-14%、2CV;14-18%、1CV;18-27%、2CV;27-31CV、0.5CV;31-60%、0.5CV;60-100%、1CV;100%、1CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を黄色の非晶質の固体として与えた(1.72g、47%)。
【化６５】
2019519616.tif 000073
NMR純度 = 92%
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=486 [M+]、Rt=0.80分、UV純度=100%。
【０１２４】
（2-(アミノメチル)-1-エチル-3-{2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エチル}-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体20の合成）
【化６６】
2019519616.tif 000074
抱水ヒドラジン(639μl、13.2mmol)を、プレッシャーチューブ中で、2-{[(2-カルボキシフェニル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-3-{2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エチル}-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体19(92%、1.52g、2.28mmol)のMeOH(12ml)溶液に加えた。該チューブを密封し、該反応溶液を75℃で3.5時間加熱した。該反応物を室温に放冷し、次いで室温で64時間撹拌した。追加の抱水ヒドラジン(639μl、13.2mmol)を加え、該反応物を75℃でさらに18時間加熱し、次いで80℃でさらに24時間加熱した。該反応混合物を室温に放冷し、次いで真空中で濃縮して橙色の固体にした。このようにして得られた固体をCH2Cl2:MeOH(9:1、30ml)に懸濁させ、次いでろ過した。ろ液を真空中で濃縮すると、生成物を粘性のある橙色の油として与えた(1.21g、83%)。
LC/MS(システムB):m/z(ESI+)=338 [M+]、Rt=1.41分、UV純度=84%。
【０１２５】
（2-[(6-クロロ-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル)メチル]-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-1,3-ジオン:中間体21の合成）
【化６７】
2019519616.tif 000075
無水DMF(30ml)中のN-フタロイルグリシン(2.15g、10.5mmol)と、TBTU(3.52g、11.0mmol)と、NEt3(2.31ml、13.0mmol)の混合物を室温で45分間撹拌した。5-クロロ-1-N-エチルベンゼン-1,2-ジアミン(1.70g、9.96mmol)の無水THF(20ml)溶液を加え、生じた混合物を室温で18時間撹拌した。該反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(100ml)に加えると、薄茶色の固体が溶液から沈殿した。該固体をろ過し、水で洗浄し、真空下で乾燥させた。このようにして得られた固体をMeCN中でトリチュレートし、次いでろ過し、真空下で乾燥させると、中間体を薄桃色の固体として与えた(5.4g)。このようにして得られた固体を少量ずつ酢酸(30ml)に加えた。生じた懸濁液を100℃で45分間加熱し、次いで16時間かけて室温に放冷した。生じた懸濁液をろ過し、EtOAcで洗浄し、次いで真空下で乾燥させると、生成物を薄桃色の固体として与えた(585mg)。該固体をMeCN(5ml)に懸濁させ、次いでMeCN:水(1:1、1ml)を加えた。生じた懸濁液をろ過し、次いで固体を真空下で乾燥させると生成物を薄桃色の固体として与えた(430mg、13%)。ろ液を再びろ過し、次いで固体をEtOAcで洗浄し、真空下で乾燥させると、第2のバッチの生成物を薄桃色の固体として与えた(2.00g)。該固体をMeCN(20ml)に懸濁させ、次いでMeCN:水(1:1、5ml)を加えた。生じた懸濁液をろ過し、次いで該固体を真空下で乾燥させると、第2のバッチの生成物を薄桃色の固体として与えた(1.33g、38%)。2つのバッチの生成物をMeCN中の懸濁液として合わせ、次いで濃縮し、真空下で乾燥させると、生成物を薄桃色の固体として与えた(1.76g、51%)。
【化６８】
2019519616.tif 000076
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=340 [M(35Cl)H+]、342 [M(37Cl)H+]、Rt=1.12分、UV純度=99%。
【０１２６】
（6-クロロ-2-[(1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イル)メチル]-1-エチル-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体22の合成）
【化６９】
2019519616.tif 000077
MeCN(6ml)中の2-[(6-クロロ-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル)メチル]-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-1,3-ジオン、中間体21(600mg、1.77mmol)とヨードメタン(330μl、5.30mmol)の混合物を、75℃で、密封したチューブ中で1.5時間加熱し、次いで室温に放冷した。ヨードメタン(165μl、2.65mmol)を加え、次いで該反応物を80℃で5時間加熱した。該反応物を室温に放冷し、次いでろ過すると固体を与え、それをMeCNで洗浄し、真空下で乾燥させると、生成物を黄色の固体として与えた(644mg、73%)。
【化７０】
2019519616.tif 000078
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=354 [M(35Cl)+]、356 [M(37Cl)+]、Rt=0.90分、UV純度=97%。
【０１２７】
（2-(アミノメチル)-6-クロロ-1-エチル-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体23の合成）
【化７１】
2019519616.tif 000079
抱水ヒドラジン(446μl、9.17mmol)を、プレッシャーチューブ中で、MeOH(8ml)中の6-クロロ-2-[(1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イル)メチル]-1-エチル-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体22(640mg、1.33mmol)の懸濁液に加えた。該チューブを密封し、75℃で3時間加熱し、次いで室温に放冷した。生じた懸濁液をろ過し、固体をMeOH(10ml)で洗浄した。ろ液を蒸発乾固させると橙色の固体を与え、それをCH2Cl2(10ml)に懸濁させ、次いでろ過し、CH2Cl2で洗浄した。このようにして得られた固体をCH2Cl2(10ml)に懸濁させた。数滴のMeOHを加え、該懸濁液を超音波処理した。生じた懸濁液をろ過し、次いで該固体を真空下で乾燥させると、生成物を灰白色の固体として与えた(360mg、77%)。
【化７２】
2019519616.tif 000080
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=224 [M(35Cl)+]、226 [M(37Cl)+]、Rt=0.16分、ELS純度=100%。
【０１２８】
（tert-ブチルN-[(1-エチル-6-フルオロ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル)メチル]カルバマート:中間体24の合成）
【化７３】
2019519616.tif 000081
2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}酢酸(1.70g、9.73mmol)、HATU(4.07g、10.7mmol)及びDIPEA(3.39ml、19.5mmol)の無水DMF(20ml)溶液を室温で20分間撹拌した。1-N-エチル-5-フルオロベンゼン-1,2-ジアミン(1.05g、9.73mmol)の無水THF(10ml)溶液を加え、生じた混合物を室温で16時間撹拌した。該反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(80ml)に注いだ。EtOAc(100ml)及び水(50ml)を加え、次いで相を分離した。水相をEtOAc(2×50ml)で抽出し、次いで合わせた有機相を水(4×50ml)及びブライン(50ml)で洗浄し、次いでNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させると、中間体を黒色の油として与えた(4g)。該中間体を酢酸(30ml)に溶解させ、次いで60℃で4時間加熱した。該反応混合物を室温に放冷し、次いで室温で16時間撹拌した。生じた混合物を蒸発させ、次いで生じた残渣を、EtOAc(150ml)と水(100ml)の間で分配した。水相をEtOAc(50ml)で抽出し、次いで合わせた有機相を水(4×50ml)及びブライン(50ml)で洗浄し、次いでNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させて、黒色の固体にした(4g)。該固体を最低限のCH2Cl2/MeOHに溶解させ、次いでシリカ(9g)上で蒸発させた。粗製の物質をシリカカラム(120g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、10カラム体積にわたり勾配を100:0から95:5に直線的に増加させながらCH2Cl2:MeOHにより溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させて黒色の固体にした(2.9g)。このようにして得られた固体をEtOAc(100ml)に溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(3×50ml)及び水(50ml)で抽出し、次いでNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させて黒色の固体にした(2.5g)。該固体を最低限のCH2Cl2/MeOHに溶解させ、次いでシリカ(10g)上で蒸発させた。該物質を、シリカカラム(120g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。該カラムを、10カラム体積にわたり勾配を0:100から100:0に直線的に増加させながらEtOAc:ヘプタンで溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を桃色の固体として与えた(1.78g、62%)。
【化７４】
2019519616.tif 000082
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=294 [MH+]、Rt=0.92分、UV純度=100%。
【０１２９】
（2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-6-フルオロ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体25の合成）
【化７５】
2019519616.tif 000083
ヨードメタン(497μl、7.98mmol)を、プレッシャーチューブ中で、無水MeCN(12ml)中のtert-ブチルN-[(1-エチル-6-フルオロ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル)メチル]カルバマート、中間体24(0.78g、2.66mmol)の懸濁液に加えた。該チューブを密封し、次いで75℃で4時間加熱した。該反応混合物を室温に放冷し、次いで真空中で濃縮すると、生成物を薄黄色の固体として与えた(1.16g、99%)。
【化７６】
2019519616.tif 000084
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=308 [M+]、Rt=0.87分、UV純度=99%。
【０１３０】
（2-(アミノメチル)-1-エチル-6-フルオロ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ヨージド:中間体26の合成）
【化７７】
2019519616.tif 000085
HClのジオキサン溶液(4.0M、3.3ml、13.2mmol)を、2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-6-フルオロ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体25(1.16g、2.66mmol)のMeCN(5ml)溶液に加えた。該反応物を室温で0.5時間撹拌し、次いで真空中で濃縮した。該固体をMeCN(10ml)と共沸させ、次いで真空下で乾燥させると、生成物を黄色/緑色固体として与えた(870mg、88%)。
【化７８】
2019519616.tif 000086
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=208 [M+]、Rt=0.14分、ELS純度=100%。
【０１３１】
（tert-ブチルN-{[1-エチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル]メチル}カルバマート:中間体27の合成）
【化７９】
2019519616.tif 000087
中間体27は文献(WO 2009019506 A1)の手順に従って合成した。
【０１３２】
（2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-3-メチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体28の合成）
【化８０】
2019519616.tif 000088
ヨードメタン(381μl、6.12mmol)を、プレッシャーチューブ中で、無水MeCN(10ml)中のtert-ブチルN-{[1-エチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル]メチル}カルバマート、中間体27(700mg、2.04mmol)の懸濁液に加えた。該チューブを密封し、75℃で8時間加熱し、次いで室温に放冷した。該反応混合物を真空中で濃縮すると、生成物を薄黄色の固体として与えた(1.01g、＞99%)。
【化８１】
2019519616.tif 000089
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=358 [M+]、Rt=0.91分、UV純度=98%。
【０１３３】
（2-(アミノメチル)-1-エチル-3-メチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ヨージド:中間体29の合成）
【化８２】
2019519616.tif 000090
HClのジオキサン溶液(4.0M、2.8ml、11mmol)を、2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-3-メチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体28(1.07g、2.21mmol)のMeCN(5ml)溶液に加えた。該反応物を室温で16時間撹拌し、次いで真空中で濃縮すると、生成物を灰白色の固体として与えた(875mg、94%)。
【化８３】
2019519616.tif 000091
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=258 [M+]、Rt=0.17分、ELS純度=100%。
【０１３４】
（N-エチル-2-ニトロ-5-(トリフルオロメトキシ)アニリン:中間体30の合成）
【化８４】
2019519616.tif 000092
2つの同一な反応を、下記の通り並行して実施し、次いで後処理のために合わせた。エチルアミンのTHF溶液(2.0M、4.1ml、8.2mmol)を、プレッシャーチューブ中で、THF(12ml)中の2-クロロ-1-ニトロ-4-(トリフルオロメトキシ)ベンゼン(1.00g、4.14mmol)及びK2CO3(0.86g、6.21mmol)の懸濁液に加えた。該チューブを密封し、次いで50℃で16時間加熱し、次いで室温に放冷した。追加のエチルアミンのTHF溶液(2.0M、2.1ml、4.2mmol)を加え、次いで該反応物を50℃で24時間加熱した。合わせた反応物をろ過し、次いでこのようにして得られた固体をEtOAc(100ml)ですすいだ。合わせたろ液を、飽和NaHCO3水溶液(2×100ml)、水(50ml)、及びブライン(50ml)で抽出し、次いでNa2SO4で乾燥させ、次いでろ過し、蒸発させて橙色の油にした。粗製の物質を、C18(120g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2Oにより溶離した。所望のフラクションを合わせ、真空中で濃縮してMeCNのほとんどを除いた。残存する水性混合物をEtOAc(100ml)で抽出した。有機相を分離し、次いでNa2SO4で乾燥させ、蒸発させると、生成物を明るい橙色の油として与えた(1.42g、69%)。
【化８５】
2019519616.tif 000093
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=251 [MH+]、Rt=1.32分、UV純度=100%。
【０１３５】
（tert-ブチルN-{[1-エチル-6-(トリフルオロメトキシ)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル]メチル}カルバマート:中間体31の合成）
【化８６】
2019519616.tif 000094
EtOH(40ml)中のパラジウムカーボン(10重量%、0.3g)及びN-エチル-2-ニトロ-5-(トリフルオロメトキシ)アニリン、中間体30(1.42g、5.68mmol)の懸濁液を水素雰囲気下で(1気圧)室温で16時間撹拌した。該反応混合物をガラス繊維ろ紙によりろ過し、EtOAcにより洗浄した。ろ液を、真空中で濃縮してほぼ乾固させ、次いで無水THF(10ml)で希釈した。生じた溶液を、無水DMF(20ml)中の2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}酢酸(994mg、5.68mmol)、HATU(2.37g、6.24mmol)、及びDIPEA(1.98ml、11.4mmol)の事前に混合した溶液に加えた。該反応混合物を室温で68時間撹拌し、次いで飽和NaHCO3水溶液(80ml)に注いだ。EtOAc(50ml)及び水(50ml)を加え、相を分離した。水相をEtOAc(2×50ml)で抽出し、次いで合わせた有機相を水(4×50ml)及びブライン(50ml)で洗浄し、次いでNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させて黒色の油にした。このようにして得られた油を酢酸(10ml)に溶解させ、生じた溶液を70℃で1.5時間加熱した。該反応溶液を真空中で濃縮し、次いで残渣をEtOAc(50ml)と飽和NaHCO3水溶液(50ml)の間で分配した。有機相を、飽和NaHCO3水溶液(4×50ml)、水(50ml)、及びブライン(10ml)で洗浄し、次いでNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させて茶色の固体にした(1.95g)。該粗製の物質をCH2Cl2/MeOHに溶解させ、次いでシリカ(10g)上で蒸発させて、シリカカラム(120g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、10カラム体積にわたり勾配を0:100から100:0に直線的に増加させながらEtOAc:ヘプタンで溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を桃色の固体として与えた(1.04g、47%)。
【化８７】
2019519616.tif 000095
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=360 [MH+]、Rt=1.11分、UV純度=92%。
【０１３６】
（2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-3-メチル-6-(トリフルオロメトキシ)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体32の合成）
【化８８】
2019519616.tif 000096
ヨードメタン(208μl、3.34mmol)を、プレッシャーチューブ中で、無水MeCN(5ml)中のtert-ブチルN-{[1-エチル-6-(トリフルオロメトキシ)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル]メチル}カルバマート、中間体31(400mg、1.11mmol)の懸濁液に加えた。該チューブを密封し、次いで75℃で5時間加熱し、次いで室温に放冷した。該反応混合物を真空中で濃縮すると、生成物を濃緑色の固体として与えた(567mg、95%)。
【化８９】
2019519616.tif 000097
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=374 [M+]、Rt=0.96分、UV純度=93%。
【０１３７】
（2-(アミノメチル)-1-エチル-3-メチル-6-(トリフルオロメトキシ)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ヨージド:中間体33の合成）
【化９０】
2019519616.tif 000098
HClのジオキサン溶液(4.0M、1.4ml、5.6mmol)を、2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-3-メチル-6-(トリフルオロメトキシ)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体32(570mg、1.14mmol)のMeCN(5ml)溶液に加えた。該反応物を室温で16時間撹拌したままにし、次いで真空中で濃縮した。該固体をMeCN(10ml)と共沸させ、次いで真空下で乾燥させると、生成物を茶色の固体として与えた(480mg、84%)。
【化９１】
2019519616.tif 000099
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=274 [M+]、Rt=0.37分、ELS純度=87%。
【０１３８】
（メチル2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-カルボキシレート:中間体34の合成）
【化９２】
2019519616.tif 000100
DMF(200ml)中の2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}酢酸(8.57g、48.9mmol)と、HATU(20.5g、53.8mmol)と、DIPEA(17.0ml、97.8mmol)の混合物を室温で1時間撹拌した。メチル4-アミノ-3-(エチルアミノ)ベンゾエート(8.57g、48.9mmol)を少量ずつ加え、次いで無水THF(20ml)を該反応物中に加えてすすいだ。該反応混合物を室温で18時間撹拌した。2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}酢酸(0.857g、4.89mmol)、HATU(1.86g、4.89mmol)及びDIPEA(1.70ml、9.78mmol)のDMF(3ml)溶液を室温で15分間撹拌し、次いで主要な反応物に加えた。生じた溶液を室温で3時間撹拌した。2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}酢酸(0.857g、4.89mmol)、HATU(1.86g、4.89mmol)、及びDIPEA(1.70ml、9.78mmol)のDMF(3ml)溶液及び室温で15分間撹拌し、次いで主要な反応物に加えた。生じた溶液を室温で64時間撹拌した。該反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(200ml)に注いだ。EtOAc(150ml)及び水(100ml)を加え、次いで相を分離した。水相をEtOAc(2×150ml)で抽出し、次いで合わせた有機相を水(4×100ml)及びブライン(50ml)で洗浄し、次いでNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させると、粗製の中間体を黒色の油として与えた(18g)。このようにして得られた油を酢酸(80ml)に溶解させ、70℃で1時間撹拌した。該反応物を室温に放冷し、次いで蒸発させると、茶色の固体を与えた。該固体をEtOAc(200ml)に懸濁させ、次いでろ過し、EtOAcで洗浄し、次いで真空下で乾燥させると、薄桃色の固体を与えた(6.5g)。このようにして得られた固体をEtOAc(200ml)に懸濁させた。生じた懸濁液を50℃で15分間加熱し、次いで室温に放冷した。固体をろ過により回収すると、生成物を白色の固体として与えた(2.43g)。ろ液を再びろ過し、固体をろ過により回収し、EtOAc:ヘプタンで洗浄し、次いで真空下で乾燥させると、第2のバッチの生成物を白色の固体として与えた(1.34g)。ろ液を分液漏斗に移し、次いで、飽和NaHCO3水溶液(3×100ml)、水(100ml)、及びブライン(50ml)で抽出し、次いでNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させて黄色の固体にし、それを最低限の体積のEtOAc:ヘプタン(1:4)に懸濁させ、ろ過し、次いで真空下で乾燥させると、第3のバッチの生成物を白色の固体として与えた(1.77g)。最初のろ過から得られたろ液を分液漏斗に移し、次いで飽和NaHCO3水溶液(3×100ml)、水(100ml)、及びブライン(50ml)で抽出し、次いでNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させて茶褐色の固体にした。該固体をEtOAc(50ml)に懸濁させ、次いでろ過した。該固体を真空下で乾燥させると、第4のバッチの生成物を白色の固体として与えた(3.4g)。ろ液を蒸発させると、黒い固体を与えた(8g)。このようにして得られた固体をCH2Cl2/MeOHに溶解させ、次いでシリカ(16g)上に蒸発させた。該粗製の物質をシリカカラム(100g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、10カラム体積にわたり勾配を0:100から100:0に直線的に増加させながらEtOAc:ヘプタンで溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させて、茶色の固体にした。このようにして得られた固体をEtOAc:ヘプタン(1:4、20ml)に懸濁させ、次いでろ過した。該固体をEtOAc:ヘプタンで洗浄し、次いで真空下で乾燥させると、第5のバッチの生成物を白色の固体として与えた(1.45g)。ろ液を真空中で濃縮し、次いで残渣をEtOAcに懸濁させ、ろ過し、真空下で乾燥させると、第6のバッチの生成物を灰白色の固体として与えた(0.32g)。6つのバッチの固体をEtOAc懸濁液として合わせ、次いで蒸発させ、真空下で乾燥させると、生成物を灰白色の固体として与えた(10.71g、66%)。
【化９３】
2019519616.tif 000101
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=334 [MH+]、Rt=0.98分、UV純度=100%。
【０１３９】
（2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1,3-ジエチル-6-(メトキシカルボニル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体35の合成）
【化９４】
2019519616.tif 000102
ヨードエタン(969μl、12.1mmol)を、プレッシャーチューブ中で、無水MeCN(15ml)中のメチル2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-カルボキシレート、中間体34(1.34g、4.02mmol)の懸濁液に加えた。該チューブを密封し、次いで80℃で21時間加熱し、次いで室温に放冷した。ヨードエタン(323μl、4.02mmol)を加え、次いで該反応物を80℃で5時間加熱し、次いで室温に放冷した。ヨードエタン(646μl、8.04mmol)を加え、次いで該反応物を80℃で16時間加熱した。該反応物を室温に放冷し、次いで蒸発させると、生成物を桃色の泡として与えた(1.97g、＞99%)。
【化９５】
2019519616.tif 000103
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=362 [M+]、Rt=0.92分、UV純度=100%。
【０１４０】
（2-(アミノメチル)-1,3-ジエチル-6-(メトキシカルボニル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ヨージド:中間体36の合成）
【化９６】
2019519616.tif 000104
HClのジオキサン溶液(4.0M、5.1ml、20.4mmol)を、2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1,3-ジエチル-6-(メトキシカルボニル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体35(1.98g、4.05mmol)のMeCN(10ml)溶液に加えた。該反応物を室温で1.5時間撹拌し、次いで真空中で濃縮すると、生成物を黄色の固体として与えた(1.60g、93%)。
【化９７】
2019519616.tif 000105
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=262 [M+]、Rt=0.16分、ELS純度=100%。
【０１４１】
（メチル2-(アミノメチル)-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-カルボキシレート二塩酸塩:中間体37の合成）
【化９８】
2019519616.tif 000106
HClのジオキサン溶液(4.0M、5.4ml、21.6mmol)を、メチル2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-カルボキシレート、中間体34(1.45g、4.35mmol)のMeCN(10ml)溶液に加えた。該反応物を室温で45分間撹拌したままにし、次いでろ過した。該固体をMeCNで洗浄し、次いで真空下で乾燥させると、生成物を白色の固体として与えた(1.29g、97%)。
【化９９】
2019519616.tif 000107
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=234 [MH+]、Rt=0.67分、UV純度=100%。
【０１４２】
（メチル2-({[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-カルボキシレート:中間体38の合成）
【化１００】
2019519616.tif 000108
トリエチルアミン(2.04ml、14.6mmol)を、CH2Cl2(22ml)中のメチル2-(アミノメチル)-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-カルボキシレート二塩酸塩中間体37(1.29g、4.21mmol)の懸濁液に加えた。ベンジル2,5-ジオキソピロリジン-1-イルカーボネート(1.15g、4.63mmol)のCH2Cl2(10ml)溶液を滴加し、次いで該反応混合物を室温で15分間撹拌した。該反応混合物を、水(20ml)、飽和NaHCO3水溶液(2×10ml)、水(20ml)、及びブライン(10ml)で抽出し、次いでNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させると、生成物を白色の固体として与えた(1.65g、92%)。
【化１０１】
2019519616.tif 000109
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=368 [MH+]、Rt=1.02分、UV純度=86%。
【０１４３】
（2-({[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-カルボン酸:中間体39の合成）
【化１０２】
2019519616.tif 000110
LiOH水溶液(2.0M、2.4ml、4.8mmol)を、MeOH(20ml)中のメチル2-({[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-カルボキシレート、中間体38(1.33g、3.62mmol)の懸濁液に加えた。該反応混合物を50℃で17時間撹拌し、次いで室温に放冷した。該反応混合物をろ過し、次いでろ液を真空中で濃縮してMeOHのほとんどを除いた。生じた水溶液の4分の3を、C18(60g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):5%、5CV;5-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。フラクションをLCMSにより分析し、次いで最も純度の高いフラクションを合わせ、ろ過すると、生成物を白色の固体として与えた(92mg)。ろ液を真空中で濃縮すると、第2のバッチの生成物を灰白色の固体として与えた(48mg)。純度の低い生成物を含むフラクションを合わせ、蒸発させると灰白色の固体を与え、それをEtOAcに懸濁させ、次いでろ過し、真空下で乾燥させると、第3のバッチの生成物を灰白色の固体として与えた(96mg)。EtOAc(10ml)を、残った水性反応混合物に加えた。相を分離し、次いで水相をEtOAc(10ml)でさらに抽出した。水相を、HCl水溶液(2M)の滴加により中和した。固体をろ過により回収し、次いで真空下で乾燥させると、第4のバッチの生成物を白色の固体として与えた(134mg)。ろ液を、HCl水溶液(2M)の添加によりpH 4にさらに酸性化し、次いでEtOAc(4×20ml)で抽出した。合わせた有機液をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させると、第5のバッチの生成物を灰白色の固体として与えた(100mg)。5つのバッチの生成物をEtOAc中の懸濁液として合わせ、次いで蒸発させると、生成物を灰白色の固体として与えた(470mg、37%)。
【化１０３】
2019519616.tif 000111
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=354 [MH+]、Rt=0.87分、UV純度=100%。
【０１４４】
（tert-ブチル2-({[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-カルボキシレート:中間体40の合成）
【化１０４】
2019519616.tif 000112
1,1-ジ-tert-ブトキシ-N,N-ジメチルメタンアミン(1.03ml、4.30mmol)を、トルエン(10ml)中の2-({[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-カルボン酸、中間体39(380mg、1.08mmol)の懸濁液に加えた。該反応物を80℃で2時間加熱し、次いで室温に放冷した。1,1-ジ-tert-ブトキシ-N,N-ジメチルメタンアミン(1.03ml、4.30mmol)を加え、次いで該反応物を80℃で3時間加熱し、次いで室温に放冷した。1,1-ジ-tert-ブトキシ-N,N-ジメチルメタンアミン(1.03ml、4.30mmol)を加え、次いで該反応物を110℃で1時間加熱し、次いで室温に放冷した。該反応混合物をEtOAc(20ml)で希釈し、次いで水(2×20ml)、飽和NaHCO3水溶液(2×20ml)、及びブライン(10ml)で洗浄し、次いでNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させると、橙色の固体を与えた(510mg)。該粗製の物質を、シリカカラム(25g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、10カラム体積にわたり勾配を0:100から50:50に直線的に増加させながらEtOAc:ヘプタンで溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を白色の固体として与えた(320mg、72%)。
【化１０５】
2019519616.tif 000113
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=410 [MH+]、Rt=1.17分、UV純度=99%。
【０１４５】
（2-({[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-6-[(tert-ブトキシ)カルボニル]-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体41の合成）
【化１０６】
2019519616.tif 000114
ヨードエタン(251μl、3.13mmol)を、無水MeCN(4ml)中のtert-ブチル2-({[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-カルボキシレート、中間体40(320mg、0.78mmol)の懸濁液に加えた。該反応混合物を120℃で2時間マイクロ波照射下で加熱した。ヨードエタン(63μl、0.78mmol)を加え、次いで該反応混合物を120℃で2時間マイクロ波照射下で加熱した。該反応物を蒸発させると、生成物を橙色の泡として与えた(420mg、90%)。
【化１０７】
2019519616.tif 000115
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=438 [M+]、Rt=0.99分、UV純度=95%。
【０１４６】
（2-(アミノメチル)-6-カルボキシ-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム臭化水素酸塩ブロミド:中間体42の合成）
【化１０８】
2019519616.tif 000116
HBrのAcOH溶液(33重量%、0.9ml)を、2-({[(ベンジルオキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-6-[(tert-ブトキシ)カルボニル]-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体41(220mg、0.39mmol)のAcOH(0.5ml)溶液に加えた。該反応物を室温で40分間撹拌した。該反応物を真空中で濃縮し、次いでMeCN(×4)と共沸させた。残渣を最低限の体積のMeCNに懸濁させた。固体をろ過により回収し、次いで真空下で乾燥させると、生成物を灰白色の固体として与えた(144mg、90%)。
【化１０９】
2019519616.tif 000117
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=248 [M+]、Rt=0.15分、ELS純度=100%。
【０１４７】
（3-ベンジル-2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムブロミド:中間体43の合成）
【化１１０】
2019519616.tif 000118
臭化ベンジル(173μl、1.46mmol)を、プレッシャーチューブ中で、無水MeCN(3ml)中のtert-ブチルN-{[1-エチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル]メチル}カルバマート、中間体27(250mg、0.73mmol)の懸濁液に加えた。該チューブを密封し、80℃で16時間加熱し、次いで真空中で濃縮すると橙色の油を与え、それは放置すると凝固した。生じた固体をMeCN(2ml)に懸濁させた。固体をろ過により回収し、次いで真空下で乾燥させると生成物を白色の固体として与えた(160mg)。ろ液を真空中で濃縮した。残渣を最低限の体積のMeCNに懸濁させ、次いでろ過した。このようにして得られた固体を真空下で乾燥させると、第2のバッチの生成物を灰白色の固体として与えた(90mg)。2バッチの生成物をMeCN中で合わせ、次いで蒸発させると、生成物を灰白色の固体として与えた(250mg、64%)。
【化１１１】
2019519616.tif 000119
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=434 [M+]、Rt=1.05分、UV純度=96%。
【０１４８】
（2-(アミノメチル)-3-ベンジル-1-エチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ブロミド:中間体44の合成）
【化１１２】
2019519616.tif 000120
HClのジオキサン溶液(4.0M、0.61ml、2.4mmol)を、3-ベンジル-2-({[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}メチル)-1-エチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムブロミド、中間体43(250mg、0.49mmol)のMeCN(2.5ml)溶液に加えた。該反応物を室温で18時間撹拌し、次いで真空中で濃縮した。残渣をMeCNと共沸させ、次いで真空下で乾燥させると、生成物を薄黄色の固体として与えた(209mg、95%)。
【化１１３】
2019519616.tif 000121
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=334 [M+]、Rt=0.86分、UV純度=100%。
【０１４９】
（2-[(6-ブロモ-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル)メチル]-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-1,3-ジオン:中間体45の合成）
【化１１４】
2019519616.tif 000122
無水DMF(150ml)中のN-フタロイルグリシン(13.1g、63.8mmol)と、TBTU(21.5g、67.0mmol)と、NEt3(14.1ml、79.1mmol)の混合物を室温で45分間撹拌した。5-ブロモ-1-N-エチルベンゼン-1,2-ジアミン(13.1g、60.9mmol)の無水THF(50ml)溶液を加え、生じた混合物を室温で18時間撹拌した。該反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(400ml)に加えた。生じた沈殿物をろ過により回収し、次いで水で洗浄し、真空下で乾燥させると、中間体を薄い灰色の固体として与えた。このようにして得られた固体を少量ずつ酢酸(150ml)に加えた。生じた懸濁液を100℃で2.5時間加熱し、次いで室温に放冷した。該反応混合物を真空中で濃縮し、次いで残渣をEtOAc(300ml)と水(300ml)との間で分配した。生じた沈殿物をろ過により回収し、EtOAc(200ml)及び水(200ml)で洗浄し、次いで真空下で乾燥させると、生成物を桃色の固体として与えた(17.9g、76%)。
【化１１５】
2019519616.tif 000123
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=384 [M(79Br)H+]、386 [M(81Br)H+]、Rt=1.12分、UV純度=100%。
【０１５０】
（tert-ブチル4-(4-{2-[(1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イル)メチル]-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-イル}-1H-ピラゾール-1-イル)ピペリジン-1-カルボキシレート:中間体46の合成）
【化１１６】
2019519616.tif 000124
tert-ブチル4-[4-(テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)-1H-ピラゾール-1-イル]ピペリジン-1-カルボキシレート(540mg、1.43mmol)を、プレッシャーチューブ中で、ジオキサン(10ml)及び水(0.5ml)中の2-[(6-ブロモ-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-2-イル)メチル]-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-1,3-ジオン、中間体45(500mg、1.30mmol)の溶液に加えた。Cs2CO3(848mg、2.60mmol)を加え、次いで生じた懸濁液を、窒素流を反応混合物に10分間バブリングすることにより脱気した。XPhos-Pd-G2(61mg、0.078mmol)を加え、次いで窒素バブリングをさらに5分間続けた。該チューブを密封し、次いで100℃で16時間加熱した。該反応混合物を真空中で濃縮し、次いでEtOAc(100ml)と水(100ml)との間で分配した。相を分離し、次いで有機相を水(50ml)及びブライン(2×50ml)で洗浄し、次いでMgSO4で乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。粗製の物質をシリカカラム(50g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、10カラム体積にわたり勾配を0:100から100:0に直線的に増加させながらEtOAc:ヘプタンで溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると生成物を薄黄色の泡として与えた(226mg、31%)。
【化１１７】
2019519616.tif 000125
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=555 [MH+]、Rt=1.13分、UV純度=100%。
【０１５１】
(6-(1-{1-[(tert-ブトキシ)カルボニル]ピペリジン-4-イル}-1H-ピラゾール-4-イル)-2-[(1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イル)メチル]-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体47の合成）
【化１１８】
2019519616.tif 000126
ヨードエタン(159μl、1.98mmol)を、tert-ブチル4-(4-{2-[(1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イル)メチル]-1-エチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-6-イル}-1H-ピラゾール-1-イル)ピペリジン-1-カルボキシレート、中間体46(220mg、0.397mmol)の無水MeCN(5ml)溶液に加えた。該反応混合物を、マイクロ波照射下で2時間120℃で加熱した。ヨードエタン(130μl、1.62mmol)を加え、次いで該反応混合物を、マイクロ波照射下で1時間120℃で加熱した。該反応混合物を真空中で濃縮し、次いでジエチルエーテルと共沸させた。残渣を真空下で乾燥させると、生成物を薄黄色の固体として与えた(280mg、80%)。
【化１１９】
2019519616.tif 000127
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=583 [M+]、Rt=1.13分、UV純度=81%。
【０１５２】
(2-(アミノメチル)-6-(1-{1-[(tert-ブトキシ)カルボニル]ピペリジン-4-イル}-1H-ピラゾール-4-イル)-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体48の合成）
【化１２０】
2019519616.tif 000128
抱水ヒドラジン(96μl、2.0mmol)を、プレッシャーチューブ中で、6-(1-{1-[(tert-ブトキシ)カルボニル]ピペリジン-4-イル}-1H-ピラゾール-4-イル)-2-[(1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イル)メチル]-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体47(280mg、0.39mmol)のメタノール(5ml)溶液に加えた。該チューブを密封し、次いで75℃で1時間加熱した。該反応混合物を室温に放冷し、次いで真空中で濃縮した。残渣をCH2Cl2(9:1、20ml)に懸濁させ、次いでろ過した。このようにして得られた固体をさらなるCH2Cl2(20ml)で洗浄した。ろ液を合わせ、蒸発乾固させると、生成物を薄黄色の固体として与えた(225mg、82%)。
【化１２１】
2019519616.tif 000129
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=453 [M+]、Rt=0.91分、UV純度=83%。
【０１５３】
(6-(2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)-1,3-ジエチル-2-[({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)メチル]-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体49の合成）
【化１２２】
2019519616.tif 000130
中間体49を、文献(US 2015/0018313 A1)の手順に従って合成した。
【０１５４】
（2-(アミノメチル)-6-(2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド:中間体50の合成）
【化１２３】
2019519616.tif 000131
モルホリン(3.46ml、40.0mmol)を、6-(2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)-1,3-ジエチル-2-[({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)メチル]-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体49(95%、3.00g、4.00mmol)のTHF(50ml)溶液に加えた。該反応混合物を室温で25分間撹拌し、次いでジエチルエーテル(150ml)で希釈した。生じた混合物を激しく撹拌し、次いで上清をデカンテーションにより除いた。残ったゴムをエーテル(2×60ml)でさらに洗浄し、次いで真空下で乾燥させた。残渣をTHFに溶解させ、次いで真空中で濃縮すると、生成物を薄い橙色の固体として与えた(1.99g、83%)。
【化１２４】
2019519616.tif 000132
LC/MS(システムA):m/z(ESI+)=363 [M+]、Rt=0.76分、UV純度=82%。
【０１５５】
(B.実施例化合物の合成）
(実施例1―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージドの合成:）
【化１２５】
2019519616.tif 000133
DIPEA(500μl、2.86mmol)を、リチウム3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボキシレート、中間体1(160mg、0.714mmol)、2-(アミノメチル)-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体13(248mg、0.714mmol)、及びHBTU(352mg、0.929mmol)の無水DMF(8ml)溶液に加えた。生じた混合物を周囲温度で1.5時間撹拌した。該反応混合物を水(40ml)で希釈し、0.5時間撹拌し、次いで室温で一晩静置した。生じた茶色/橙色の沈殿物をろ過し、水(20ml)で洗浄し、最低限の水/MeCNに溶解させ、次いで凍結乾燥させた。生じた固体をTBME(8ml)に懸濁させ、超音波処理し、ろ過により回収し、真空下で乾燥させた。生じた固体をEtOAc(40ml)に溶解させ、次いで水(30ml)で洗浄し、次いでブライン(30ml)で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮すると、ガラス状の油を与え、それはひっかくと同時に固体を与えた。生じた固体を最低限の水/MeCNに溶解させ、次いで凍結乾燥させると、生成物を黄色の固体として与えた(275mg、70%)。
【化１２６】
2019519616.tif 000134
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=419 [M(79Br)+]、421 [M(81Br)+])、Rt=1.90分、UV純度=100%。
【０１５６】
(実施例2―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1,3-ジエチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムホルメートの合成:)
【化１２７】
2019519616.tif 000135
5-ブロモ-3-(1H-イミダゾール-1-カルボニル)ピラジン-2-アミン、中間体2(80mg、0.30mmol)及び2-(アミノメチル)-1,3-ジエチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体15(108mg、0.30mmol)のDMF(0.7ml)溶液を室温で16時間撹拌した。該反応混合物をC18 Samplet（登録商標）に移し、真空下で乾燥させた。粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を薄黄色の固体として与えた(54mg、37%)。
【化１２８】
2019519616.tif 000136
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=433 [M(79Br)+]、435 [M(81Br)+])、Rt=1.91分、UV純度=98%。
【０１５７】
(実施例3―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-3-(2-ヒドロキシエチル)-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムホルメートの合成:)
【化１２９】
2019519616.tif 000137
DMF(2ml)中の2-(アミノメチル)-1-エチル-3-(2-ヒドロキシエチル)-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムクロリド塩酸塩、中間体18(80%、125mg、0.31mmol)と5-ブロモ-3-(1H-イミダゾール-1-カルボニル)ピラジン-2-アミン、中間体2(83mg、0.31mmol)の混合物を、室温で0.5時間撹拌した。該反応混合物を真空中で濃縮すると、赤色の油を与えた。粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-30%、15CV;30-100%、3CV;100%、3CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させた。このようにして得られた物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-46%、18CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を薄い橙色の固体として与えた(11mg、7%)。
【化１３０】
2019519616.tif 000138
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=449 [M(79Br)+]、451 [M(81Br)+])、Rt=1.73分、UV純度=97%。
【０１５８】
(実施例4―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-3-{2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エチル}-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムホルメートの合成:)
【化１３１】
2019519616.tif 000139
DIPEA(156μl、0.893mmol)を、リチウム3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボキシレート、中間体1(50mg、0.22mmol)、2-(アミノメチル)-1-エチル-3-{2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エチル}-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体20(104mg、0.22mmol)、及びHBTU(110mg、0.29mmol)のDMF(1ml)溶液に加えた。生じた混合物を周囲温度で2.5時間撹拌した。該反応物を窒素流の下で濃縮すると、粗生成物を油として与えた。粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を茶色の固体として与えた(25mg)。このようにして得られた物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を薄茶色の固体として与えた(16mg、12%)。
【化１３２】
2019519616.tif 000140
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=537 [M(79Br)+]、539 [M(81Br)+])、Rt=1.89分、UV純度=97%。
【０１５９】
(実施例5―2-{[(3-アミノ-6-クロロピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージドの合成:)
【化１３３】
2019519616.tif 000141
DIPEA(200μl、1.15mmol)を、3-アミノ-6-クロロピラジン-2-カルボン酸(50mg、0.29mmol)、2-(アミノメチル)-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体13(100mg、0.29mmol)、及びHBTU(142mg、0.37mmol)の無水DMF(1ml)溶液に加えた。生じた混合物を周囲温度で18時間撹拌した。該反応混合物を窒素流の下で濃縮すると、粗生成物を油として与えた。該粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を灰白色の固体として与えた(84mg、58%)。
【化１３４】
2019519616.tif 000142
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=375 [M(35Cl)+]、377 [M(37Cl)+])、Rt=1.83分、UV純度=100%。
【０１６０】
(実施例6―2-{[(3-アミノ-6-ヨードピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージドの合成:）
【化１３５】
2019519616.tif 000143
DIPEA(129μl、0.74mmol)を、リチウム3-アミノ-6-ヨードピラジン-2-カルボキシレート、中間体3(50mg、0.19mmol)、2-(アミノメチル)-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体13(64mg、0.19mmol)、及びHBTU(91mg、0.24mmol)の無水DMF(1ml)溶液に加えた。生じた混合物を周囲温度で2時間撹拌した。水(7ml)を加え、生じた混合物を室温で1時間撹拌した。生じた懸濁液をろ過し、固体を水で洗浄し、次いで真空下で乾燥させた。該固体を超音波処理によりTBME(5ml)に懸濁させ、次いで生じた懸濁液をろ過し、このようにして得られた固体を真空下で乾燥させた。該固体をEtOAc(30ml)に溶解させ、次いで水(30ml)及びブライン(30ml)で抽出した。有機相をMgSO4で乾燥させ、次いでろ過し、真空中で濃縮した。このようにして得られた残渣を真空下で乾燥させると、生成物を黄色の固体として与えた(59mg、52%)。
【化１３６】
2019519616.tif 000144
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=467 [M+])、Rt=2.00分、UV純度=96%。
【０１６１】
(実施例7―2-{[(3-アミノ-6-メチルピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージドの合成:)
【化１３７】
2019519616.tif 000145
HBTU(155mg、0.41mmol)を、リチウム3-アミノ-6-メチルピラジン-2-カルボキシレート、中間体5(50mg、0.31mmol)及び2-(アミノメチル)-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体13(109mg、0.31mmol)の無水DMF(1ml)溶液に加えた。DIPEA(218μl、1.26mmol)を加え、次いで生じた混合物を周囲温度で3時間撹拌した。該反応物を窒素流の下で濃縮すると、粗生成物を油として与えた。粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を灰白色の固体として与えた(67mg、41%)。
【化１３８】
2019519616.tif 000146
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=355 [M+])、Rt=1.64分、UV純度=93%。
【０１６２】
(実施例8―2-{[(3-アミノ-6-エチルピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージドの合成:)
【化１３９】
2019519616.tif 000147
HBTU(142mg、0.38mmol)を、リチウム3-アミノ-6-エチルピラジン-2-カルボキシレート、中間体7(50mg、0.29mmol)及び2-(アミノメチル)-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体13(100mg、0.29mmol)の無水DMF(1ml)溶液に加えた。DIPEA(200μl、1.16mmol)を加え、次いで生じた混合物を周囲温度で5時間撹拌した。該反応混合物を窒素流の下で濃縮すると、粗生成物を油として与えた。該粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を灰白色の固体として与えた(28mg、19%)。
【化１４０】
2019519616.tif 000148
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=369 [M+])、Rt=1.89分、UV純度=98%。
【０１６３】
(実施例9―2-({[3-アミノ-6-(メチルスルファニル)ピラジン-2-イル]ホルムアミド}メチル)-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージドの合成:)
【化１４１】
2019519616.tif 000149
HBTU(106mg、0.28mmol)を、3-アミノ-6-(メチルスルファニル)ピラジン-2-カルボン酸、中間体8(40mg、0.22mmol)及び2-(アミノメチル)-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体13(75mg、0.22mmol)の無水DMF(1ml)溶液に加えた。DIPEA(151μl、0.86mmol)を加え、次いで生じた混合物を周囲温度で1.5時間撹拌した。該反応混合物を窒素流の下で濃縮すると、粗生成物を油として与えた。粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を灰白色の固体として与えた(31mg、27%)。
【化１４２】
2019519616.tif 000150
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=387 [M+])、Rt=1.93分、UV純度=98%。
【０１６４】
（実施例10―システムC 2-{[(3-アミノピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージドの合成:）
【化１４３】
2019519616.tif 000151
DIPEA(200μl、1.15mmol)を、3-アミノピラジン-2-カルボン酸(40mg、0.29mmol)、2-(アミノメチル)-1-エチル-6-メトキシ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体13(100mg、0.29mmol)、及びHBTU(142mg、0.37mmol)の無水DMF(1ml)溶液に加えた。生じた混合物を周囲温度で2.5時間撹拌した。該反応混合物を窒素流の下で濃縮すると、粗生成物を油として与えた。粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を白色の固体として与えた(95mg、69%)。
【化１４４】
2019519616.tif 000152
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=341 [M+])、Rt=1.46分、UV純度=98%。
【０１６５】
（実施例11―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-6-クロロ-1-エチル-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムギ酸ホルメートの合成:）
【化１４５】
2019519616.tif 000153
無水DMF(2ml)中のリチウム3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボキシレート、中間体1(70mg、0.31mmol)、2-(アミノメチル)-6-クロロ-1-エチル-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体23(0.11g、0.31mmol)、EDC.HCl(0.12g、0.63mmol)、及びHOAt(0.04g、0.31mmol)の懸濁液を室温で16時間撹拌した。該反応物を蒸発させ、次いで粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):5%、5CV;5-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を橙色の固体として与えた(70mg、43%)。
【化１４６】
2019519616.tif 000154
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=423 [M(79Br 35Cl)+]、425 [M(79Br37Cl+81Br35Cl)+])、427 [M(81Br 37Cl)+] Rt=1.93分、UV純度=99%。
【０１６６】
（実施例12―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-6-フルオロ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムホルメートの合成:）
【化１４７】
2019519616.tif 000155
2-(アミノメチル)-1-エチル-6-フルオロ-3-メチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ヨージド、中間体26(83mg、0.22mmol)及びDIPEA(39μl、0.22mmol)の無水DMF(1ml)溶液を、リチウム3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボキシレート、中間体1(50mg、0.22mmol)、EDC.HCl(86mg、0.45mmol)、及びHOAt(30mg、0.22mmol)のDMF(1ml)溶液に加えた。該反応物を室温で64時間撹拌し、次いで真空中で濃縮した。粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):5%、5CV;5-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させて、橙色の固体にした(28mg)。このようにして得られた固体をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):5%、5CV;5-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を橙色の固体として与えた(20mg、20%)。
【化１４８】
2019519616.tif 000156
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=407 [M(79Br)+]、409 [M(81Br)+] Rt=1.71分、UV純度=99%。
【０１６７】
（実施例13―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-3-メチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージドの合成:）
【化１４９】
2019519616.tif 000157
リチウム3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボキシレート、中間体1(90mg、0.40mmol)、HBTU(168mg、0.442mmol)、及びDIPEA(140μl、0.804mmol)の無水DMF(0.5ml)溶液を室温で15分間撹拌した。2-(アミノメチル)-1-エチル-3-メチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ヨージド、中間体29(169mg、0.402mmol)、及びDIPEA(140μl、0.804mmol)のDMF(1.5ml)溶液を加え、次いで該反応物を室温で16時間撹拌した。該反応物を蒸発させ、次いで粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):0%、2CV;0-40%、16CV;40-100%、4CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させ、次いで残渣をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-50%、25CV;50-100%、5CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、真空中で濃縮して、MeCNのほとんどを除いた。生じた懸濁液をろ過し、次いで該固体を真空下で乾燥させると、生成物を黄色の固体として与えた(38mg、16%)。
【化１５０】
2019519616.tif 000158
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=457 [M(79Br)+]、459 [M(81Br)+] Rt=2.11分、UV純度=100%。
【０１６８】
（実施例14―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1-エチル-3-メチル-6-(トリフルオロメトキシ)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムホルメートの合成:）
【化１５１】
2019519616.tif 000159
リチウム3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボキシレート、中間体1(90mg、0.40mmol)、HBTU(168mg、0.44mmol)、及びDIPEA(140μl、0.804mmol)のDMF(0.5ml)溶液を室温で15分間撹拌した。2-(アミノメチル)-1-エチル-3-メチル-6-(トリフルオロメトキシ)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ヨージド、中間体33(176mg、0.402mmol)、及びDIPEA(0.14ml、0.804mmol)のDMF(1.5ml)溶液を加え、次いで該反応物を室温で16時間撹拌した。該反応混合物を真空中で濃縮し、次いで粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):0%、2CV;0-40%、16CV;40-100%、4CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させ、次いで残渣をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-50%、25CV;50-100%、5CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、真空中で濃縮した。このようにして得られた物質を、以下の方法を利用して分取HPLCによりさらに精製した:溶媒A:水+0.1%ギ酸;溶媒B:MeCN+0.1%ギ酸;カラム:Waters Sunfire 30mm×100mm、5ミクロン;流量=40ml/分;勾配(時間、溶媒B):0分、5%;1.9分、5%;2分、30%;16分、40%;16.1分、95%;19分、95%;19.1分、5%;20分、5%。所望のフラクションを合わせ、真空中で濃縮すると、生成物を橙色の固体として与えた(40mg、19%)。
【化１５２】
2019519616.tif 000160
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=473 [M(79Br)+]、475 [M(81Br)+] Rt=2.17分、UV純度=100%。
【０１６９】
（実施例15―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1,3-ジエチル-6-(メトキシカルボニル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージドの合成:）
【化１５３】
2019519616.tif 000161
リチウム3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-カルボキシレート、中間体1(850mg、3.80mmol)、HBTU(1.58g、4.18mmol)、及びDIPEA(1.32ml、7.59mmol)の無水DMF(3ml)溶液を室温で15分間撹拌した。2-(アミノメチル)-1,3-ジエチル-6-(メトキシカルボニル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ヨージド、中間体36(1.62g、3.8mmol)及びDIPEA(1.32ml、7.59mmol)のDMF(3ml)溶液を加え、次いで該反応物を室温で64時間撹拌した。該反応混合物を真空中で濃縮し、次いで粗製の物質をC18(120g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):5%、2CV;5-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2Oにより溶離した。最もきれいなフラクションを蒸発させると、生成物を茶褐色の固体として与えた(80mg)。さらなる高純度フラクションを合わせ、蒸発させると、第2のバッチの生成物を茶褐色の固体として与えた(340mg)。残りの生成物を含有するフラクションを合わせ、蒸発させ、次いでこのようにして得られた物質をC18(120g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):5%、2CV;5-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2Oにより溶離した。所望のフラクションを合わせ、真空中で濃縮して、MeCNのほとんどを除いた。生じた水性懸濁剤をろ過し、次いで該固体を真空下で乾燥させると、第3のバッチの生成物を橙色の固体として与えた(44mg)。ろ液を真空中で濃縮すると、第4のバッチの生成物を茶色のゴムとして与えた(113mg)。第2のカラムからのさらなる生成物含有フラクションを合わせ、蒸発させると、第5のバッチの生成物を茶色の固体として与えた(28mg)。5つのバッチをMeCN中で合わせ、次いで蒸発させると、生成物を茶色の固体として与えた(605mg、27%)。
【化１５４】
2019519616.tif 000162
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=461 [M(79Br)+]、463 [M(81Br)+] Rt=1.96分、UV純度=99%。
【０１７０】
（実施例16―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-6-カルボキシ-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムブロミドの合成:）
【化１５５】
2019519616.tif 000163
5-ブロモ-3-(1H-イミダゾール-1-カルボニル)ピラジン-2-アミン、中間体2(40mg、0.15mmol)及び2-(アミノメチル)-6-カルボキシ-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム臭化水素酸塩ブロミド、中間体42(61mg、0.15mmol)のDMF(1ml)溶液を室温で17時間撹拌した。該反応物をろ過し、次いで回収した固体をMeCNで洗浄し、真空下で乾燥させると、生成物を灰白色の固体として与えた(31mg、37%)。
【化１５６】
2019519616.tif 000164
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=447 [M(79Br)+]、449 [M(81Br)+] Rt=1.29分、UV純度=94%。
【０１７１】
（実施例17―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1,3-ジエチル-6-{[(3R)-2-オキソオキソラン-3-イル]カルバモイル}-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムホルメートの合成:）
【化１５７】
2019519616.tif 000165
2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-6-カルボキシ-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムブロミド、実施例16(60mg、0.11mmol)、HBTU(47mg、0.13mmol)、及び4-メチルモルホリン(29μl、0.23mmol)の無水DMF(0.5ml)溶液を室温で5分間撹拌した。(3R)-3-アミノオキソラン-2-オン塩酸塩(16mg、0.11mmol)を加え、次いで該反応物を室温で4時間撹拌した。該反応混合物を真空中で濃縮し、次いで粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):5%、2CV;5-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を灰白色の固体として与えた(22mg、32%)。
【化１５８】
2019519616.tif 000166
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=530 [M(79Br)+]、532 [M(81Br)+] Rt=1.62分、UV純度=97%。
【０１７２】
（実施例18―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1,3-ジエチル-6-{[(3S)-2-オキソオキソラン-3-イル]カルバモイル}-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムホルメートの合成:）
【化１５９】
2019519616.tif 000167
2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-6-カルボキシ-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムブロミド、実施例16(70mg、0.13mmol)、HBTU(55mg、0.13mmol)、及び4-メチルモルホリン(34μl、0.27mmol)の無水DMF(0.5ml)溶液を室温で5分間撹拌した。(3S)-3-アミノオキソラン-2-オン塩酸塩(18mg、0.13mmol)を加え、次いで該反応物を室温で16時間撹拌した。該反応混合物を真空中で濃縮し、次いで粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):5%、2CV;5-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を灰白色の固体として与えた(17mg、21%)。
【化１６０】
2019519616.tif 000168
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=530 [M(79Br)+]、532 [M(81Br)+] Rt=1.61分、UV純度=93%。
【０１７３】
（実施例19―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-3-ベンジル-1-エチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムホルメートの合成:）
【化１６１】
2019519616.tif 000169
5-ブロモ-3-(1H-イミダゾール-1-カルボニル)ピラジン-2-アミン、中間体2(55mg、0.21mmol)及び2-(アミノメチル)-3-ベンジル-1-エチル-6-(トリフルオロメチル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ブロミド、中間体44(102mg、0.226mmol)のDMF(1ml)溶液を室温で64時間撹拌し、次いで真空中で濃縮した。粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):5%、2CV;5-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を白色の固体として与えた(68mg、57%)。
【化１６２】
2019519616.tif 000170
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=533 [M(79Br)+]、535 [M(81Br)+] Rt=2.55分、UV純度=100%。
【０１７４】
（実施例20―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-6-(1-{1-[(tert-ブトキシ)カルボニル]ピペリジン-4-イル}-1H-ピラゾール-4-イル)-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージドの合成:）
【化１６３】
2019519616.tif 000171
5-ブロモ-3-(1H-イミダゾール-1-カルボニル)ピラジン-2-アミン、中間体2(112mg、0.42mmol)を、2-(アミノメチル)-6-(1-{1-[(tert-ブトキシ)カルボニル]ピペリジン-4-イル}-1H-ピラゾール-4-イル)-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体48(220mg、0.38mmol)の無水DMF(5ml)溶液に加えた。生じた溶液を周囲温度で3時間撹拌した。該反応混合物を真空中で濃縮して、茶色の油にした。粗製の物質をC18(30g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):5%、2CV;5-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、蒸発させると、生成物を薄黄色の固体として与えた(146mg、49%)。
【化１６４】
2019519616.tif 000172
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=652 [M(79Br)+]、654 [M(81Br)+] Rt=2.84分、UV純度=100%。
【０１７５】
（実施例21―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1,3-ジエチル-6-[1-(ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ヨージドの合成:）
【化１６５】
2019519616.tif 000173
HClのジオキサン溶液(4.0M、100μl、0.4mmol)を、2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-6-(1-{1-[(tert-ブトキシ)カルボニル]ピペリジン-4-イル}-1H-ピラゾール-4-イル)-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、実施例20(128mg、0.164mmol)の無水MeCN(3ml)溶液に加えた。生じた溶液を周囲温度で17時間撹拌した。RMを真空中で濃縮し、次いでMeCNと共沸させ、真空下で乾燥させると、生成物を黄色の固体として与えた(115mg、97%)。
【化１６６】
2019519616.tif 000174
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=552 [M(79Br)+]、554 [M(81Br)+] Rt=1.40分、UV純度=99%。
【０１７６】
（実施例22―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-6-[1-(1-カルバミミドイルピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムギ酸ホルメートの合成:）
【化１６７】
2019519616.tif 000175
1H-1,2,4-トリアゾール-1-カルボキシイミドアミド塩酸塩(21mg、0.14mmol)を、2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1,3-ジエチル-6-[1-(ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ヨージド、実施例21(50mg、0.070mmol)の無水DMF(2ml)溶液に加えた。DIPEA(30μl、0.17mmol)を加え、次いで該反応混合物を室温で88時間撹拌した。該反応混合物を真空中で濃縮し、次いで分取HPLCにより精製した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を薄黄色の固体として与えた(21mg、44%)。
【化１６８】
2019519616.tif 000176
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=297 [M(79Br)++H+]、298 [M(81Br)++H+] Rt=1.51分、UV純度=100%。
【０１７７】
（実施例23―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1,3-ジエチル-6-(1-{1-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-ペンタヒドロキシヘキシル]ピペリジン-4-イル}-1H-ピラゾール-4-イル)-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムギ酸クロリドの合成:）
【化１６９】
2019519616.tif 000177
AcOH(7μl、0.1mmol)を、2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1,3-ジエチル-6-[1-(ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩ヨージド、実施例21(60mg、0.083mmol)及び4,6-O-ベンジリデン-D-グルコピラノース(62mg、0.22mmol)の無水メタノール(1.5ml)溶液に加えた。生じた溶液を室温で0.5時間撹拌し、次いでシアノ水素化ホウ素ナトリウム(22mg、0.34mmol)を加えた。RMを室温で4時間撹拌した。さらにシアノ水素化ホウ素ナトリウム(22mg、0.34mmol)及び4,6-O-ベンジリデン-D-グルコピラノース(62mg、0.22mmol)を加え、次いで該反応物を室温で16時間撹拌した。該反応物を飽和NaHCO3水溶液(15ml)に滴加し、次いでCH2Cl2(25ml)で希釈した。CH2Cl2:MeOH(2:1、10ml)を加え、次いで相を分離した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮すると、中間体を薄黄色の固体として与えた(54mg)。このようにして得られた物質の一部(50mg、0.057mmol)をHCl水溶液(2M、4ml)に溶解させた。該反応物を室温で3.5時間撹拌し、次いで真空中で濃縮した。粗製の物質をC18(12g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):5%、2CV;5-100%、20CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を白色の固体として与えた(7mg、15%)。
【化１７０】
2019519616.tif 000178
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=716 [M(79Br)+]、718 [M(81Br)+] Rt=1.35分、UV純度=100%。
【０１７８】
（実施例24―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-6-(2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムホルメートの合成:）
【化１７１】
2019519616.tif 000179
DMF(8ml)中の5-ブロモ-3-(1H-イミダゾール-1-カルボニル)ピラジン-2-アミン、中間体2(98%、300mg、1.10mmol)と2-(アミノメチル)-6-(2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体50(90%、598mg、1.10mmol)の混合物を室温で2.5時間撹拌した。該反応混合物を真空中で濃縮し、次いで粗製の物質をC18(60g)のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。該カラムを、以下の勾配(%MeCN、カラム体積):10%、2CV;10-34%、12CV;34-100%、6CV;100%、2CVを利用してMeCN:H2O+0.1%ギ酸により溶離した。所望のフラクションを合わせ、真空中で濃縮すると、生成物を橙色のゴムとして与えた(407mg、61%)。
【化１７２】
2019519616.tif 000180
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=562 [M(79Br)+]、564 [M(81Br)+] Rt=2.53分、UV純度=100%。
【０１７９】
（実施例25―2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-6-(2-アミノエトキシ)-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウム塩酸塩クロリドの合成:）
【化１７３】
2019519616.tif 000181
ジオキサン中のHCl(4.0M、1.5ml、6.0mmol)を、MeCN(10ml)中の2-{[(3-アミノ-6-ブロモピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-6-(2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)-1,3-ジエチル-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムホルメート、実施例24(407mg、0.67mmol)の懸濁液に加えた。該反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いで真空中で濃縮した。残渣をMeCN(5ml)に懸濁させた。生じた懸濁液をろ過し、次いで回収した固体をMeCNで洗浄し、真空下で乾燥させた。ろ過した物質を高真空下でさらに乾燥させると、生成物を橙色の泡として与えた(169mg、47%)。
【化１７４】
2019519616.tif 000182
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=462 [M(79Br)+]、464 [M(81Br)+] Rt=1.09分、UV純度=99%。
【０１８０】
（実施例26―2-{[(3-アミノ-6-シアノピラジン-2-イル)ホルムアミド]メチル}-1,3-ジエチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムホルメートの合成:）
【化１７５】
2019519616.tif 000183
DIPEA(191μL、1.10mmol)を、3-アミノ-6-シアノピラジン-2-カルボン酸、中間体10(45mg、0.27mmol)、2-(アミノメチル)-1,3-ジエチル-6-メトキシ-1H-1,3-ベンゾジアゾール-3-イウムヨージド、中間体15(104mg、0.288mmol)、及びHBTU(135mg、0.356mmol)の無水DMF(2ml)の溶液に加えた。生じた混合物を室温で1.5時間撹拌し、次いで水(15ml)を加えた。生じた懸濁液を室温で0.5時間撹拌し、次いで沈殿物をろ過により回収した。該固体を水で洗浄し、次いで真空下で乾燥させた。このようにして得られた粗製の物質を分取HPLCにより精製した。所望のフラクションを合わせ、凍結乾燥させると、生成物を灰白色の固体として与えた(8mg、7%)。
【化１７６】
2019519616.tif 000184
LC/MS(システムC):m/z(ESI+)=380 [M+])、Rt=1.80分、UV純度=95%。
【０１８１】
（C.生物学的実施例）
（実施例27―ヒト気管支上皮細胞におけるENaCブロッカー効力を決定する短絡電流アッセイ）
（細胞培養）
ヒト気管支上皮細胞(HBEC)(Lonza社製、英国)を、Cooteらの文献(2008年)に記載の方法を改良したものを利用して培養した。細胞をプラスチックT-75フラスコに播種し、ウシ下垂体抽出物(52ng/mL)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/mL)、ヒト組換え型上皮成長因子(0.5ng/mL)、エピネフリン(0.5ng/mL)、トランスフェリン(10ng/mL)、インスリン(5ng/mL)、レチノイン酸(0.1ng/mL)、トリヨードサイロニン(6.5ng/mL)、ゲンタマイシン(50μg/mL)、及びアムホテリシン-B(50ng/mL)を補った気管支上皮細胞増殖培地(BEGM)(Lonza社製、英国)中で増殖させた。細胞が90%コンフルエントになるまで培地を48時間ごとに交換した。次いで、細胞を継代し、ポリカーボネートSnapwell（商標）インサート(Costar社製、英国)上で、BGEM中に50%DMEMを含みトリヨードサイロニン以外の上記のものと同じ補足物を含み最終レチノイン酸濃度が50nMである(全トランスレチノイン酸;Sigma-Aldrich社製、英国)分化培地中に播種した(8.25×105細胞/インサート)。細胞を培養中に最初の7日間浸した状態に保ち、その後、細胞を、残りの培養期間の間、頂端空気界面(apical air interface)に曝した。ALI確立の最初の日から、HBECに、ゲンタマイシン(50μg/mL)及びアムホテリシンB(50ng/mL)と共に2% Ultroser G(Pall BioSepra社製、フランス)を含むDMEM:HAMS F-12(1:1)培地を与えた。細胞を、ALIの確立後14〜21日に、短絡電流アッセイに使用した。培養の全段階で、細胞を、エアインキュベーター中で5%CO2中37℃に保った。
【０１８２】
（短絡電流(ISC)測定）
SnapwellインサートをCostar Vertical Diffusion Chamber(Costar社製、英国)に載せ、(mMで):120 NaCl、25 NaHCO3、3.3 KH2PO4、0.8 K2HPO4、1.2 CaCl2、1.2MgCl2及び10グルコースを含み37℃に維持された連続的にガス処理されているリンゲル液(O2中5%CO2;pH 7.4)に浸した。溶液の容量オスモル濃度は、使用した全生理学的塩溶液に関して常に280〜300 mOsm/kg H2Oであった。細胞を0mVに電位固定した(EVC4000型、WPI)。経上皮抵抗(RT)は、2mVパルスを30秒の間隔で印加し、オームの法則によりRTを計算することにより測定した。PowerLabワークステーション(ADInstruments社製、英国)を使用してデータを記録した。
【０１８３】
ENaCブロッカー化合物を、1000倍ストック溶液(DMSO中に調製)から頂端チャンバー(apical chamber)に加えて、基底部ISCの阻害の点での累積濃度反応を得た。濃度反応の完了時に、最大上（supramaximal）濃度のアミロライド(10μM)を加えた。全アミロライド感受性ISCの50%阻害を誘導した試験化合物の濃度(IC50)を、GraphPad Prism v6.05を利用して計算した。
【０１８４】
（実施例28―ミクロソーム安定性）
ミクロソーム(ラット及びヒト)をBioreclamation社から得た。DMSO中の試験化合物ストック溶液(10mM)をDMSOで希釈して2mMにした。さらに希釈して、100μMストック(最終濃度;91.5%アセトニトリル:8.5%DMSO)を得た。インキュベーション時の最終試験化合物濃度は1μM(＜0.1%DMSO)であった。以下のプローブ基質を使用した:1μMの最終インキュベーション濃度でのベラパミル、プロプラノロール、メトプロロール、及びフェナセチン(ラット)。アッセイ緩衝液-溶液1:1L脱イオン水に溶解させた17.4g無水リン酸水素二カリウム(K2HPO4、0.1M)。溶液2:1L脱イオン水に溶解させた13.6g無水リン酸二水素カリウム(KH2PO4、0.1M)。リン酸カリウム溶液1と2を合わせて、37℃でpH 7.42溶液を形成した。2mM塩化マグネシウムを含むpH 7.4。NADPH(10mM)-脱イオン水に希釈。凍結ミクロソームを37℃で解凍した。ミクロソームをアッセイ緩衝液に希釈して、最終タンパク質濃度0.5mg/mL及び1mM NADPHを得た。以下の手順を、96ウェルフォーマットでPerkin Elmer Janusロボットプラットフォームで完了した:ミクロソームインキュベーションプレートを300 rpmのヒーターシェーカーに移し、溶液を10分間予備加温して37℃に熱した。0及び45分での補因子のない対照並びに各試験化合物の1つの反復実験を全アッセイに含めた。ミクロソームを、アッセイ全体を通して300 rpmに設定したシェーカー上で37℃でインキュベートした。各時点で(0、5、15、30、45分)50μLの試料を96ウェルから除き、200μLのクエンチ溶液(0.1%ギ酸及びイミプラミン/ラベタロール、200nMを含むアセトニトリル)に加えた。Janus Robotを使用して試料を1:1で水により希釈し、LC-MS/MSにより分析した。
【０１８５】
（実施例29―肝臓安定性）
凍結保存された肝細胞(ラット及びヒト)をBioreclamation社から得た。DMSO中の試験化合物ストック溶液(10mM)をDMSOで希釈して4mMにした。さらに希釈して、100μMストック(195μLの50:50 DMSO:肝細胞緩衝液中の4mMの5μL)を得た。インキュベーション時の最終試験化合物濃度は1μMであった。以下のプローブ基質を使用した:1μMの最終インキュベーション濃度でのテストステロン及びカルバマゼピン。肝細胞緩衝液を調製した(フェノールレッド及びGlutamax（商標）、15mM HEPESを含み、37℃に加温され、NaOHによりpH7.4であるウィリアムE培地)。細胞を液体窒素から取りだし、水浴中で解凍し、デカンテーションにより50mLの事前加温されたCryopreserved Hepatocyte Recovery Media(LifeTechnologies社製)に入れ、遠心分離した。上清フラクションを除き、細胞を肝細胞緩衝液中で再懸濁させ、トリパンブルー排除により計数した。80%超の細胞生存率が全アッセイで必要とされた。細胞を1×106/mLに再懸濁させ、198μL細胞懸濁液を各96ウェルに加えた。2μLの100μM化合物ストック溶液を、関連するウェルに加えて、インキュベーションを開始した。細胞のない対照及び各試験化合物の2つの反復実験も全アッセイに含めた。細胞を、300rpmに設定したシェーカー上で37℃でインキュベートした。各時点で(0、15、30、45、60、90分)、20μLの試料を96ウェルから除き、80μLのクエンチ溶液(0.1%ギ酸及びイミプラミン/ラベタロール、200nMを含むアセトニトリル)にくわえた。Janus Robotを使用して試料を1:1で水により希釈し、LC-MS/MSにより分析した。実施例28〜30の結果を表2に表す。
表2
【表３】
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【０１８６】
（参考文献）
【化１７７】
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2019519616.tif 000188
2019519616.tif 000189
【国際調査報告】
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2019519616.tif 000208
2019519616.tif 000209