(57)【要約】本開示は、核酸標的の直接シーケンシングのための方法およびキットを提供する。このような方法は、１つまたは複数の核酸標的が試料中に存在するかどうかを決定するのに使用することができる。この方法は、多重化できるか（例えば、単一の試料中の複数の標的を検出すること）もしくはハイスループットに適しており（例えば、複数の試料中の標的を検出すること）、または多重化かつハイスループットである（例えば、複数の試料中の複数の標的を検出すること）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸分子の配列を決定する方法であって、
前記試料を、フランキング配列を含む少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）と、前記ＮＰＰＦが前記標的核酸分子に特異的に結合するのに十分な条件下で接触させるステップであって、
前記ＮＰＰＦは、
５’末端および３’末端と、
前記ＮＰＰＦと前記標的核酸分子との特異的な結合を許容する前記標的核酸分子の領域に相補的な配列と
を含み、
前記フランキング配列は、前記標的核酸分子に相補的な前記配列の５’、３’、または両方に配置され、５’−フランキング配列は、前記標的核酸分子に相補的な前記配列の５’であり、３’−フランキング配列は、前記標的核酸分子に相補的な前記配列の３’であり、
前記フランキング配列は、前記試料中に存在する核酸分子中に認められない少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む、ステップ；
前記ＮＰＰＦが５’−フランキング配列を含む場合、前記試料を、前記５’−フランキング配列に相補的な配列（５ＣＦＳ）、５’末端リン酸を含む核酸分子と、前記５’−フランキング配列が前記５ＣＦＳに特異的にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ、
前記ＮＰＰＦが３’−フランキング配列を含む場合、前記試料を、前記３’−フランキング配列に相補的な配列（３ＣＦＳ）を含む核酸分子と、前記３’−フランキング配列が前記３ＣＦＳに特異的にハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップであって、
前記３ＣＦＳおよび前記５ＣＦＳの少なくとも１つは、捕獲部分を含み、
少なくともＮＰＰＦ中のヌクレオチドは、前記標的核酸分子中の対応するヌクレオチドに対する相補性を有さないか、または前記５ＣＦＳまたは前記３ＣＦＳ中の対応するヌクレオチドに対する相補性を有さない、ステップ；
前記標的核酸分子にハイブリダイズした、前記３ＣＦＳにハイブリダイズした、前記５ＣＦＳにハイブリダイズした、または前記３ＣＦＳと前記５ＣＦＳの両方にハイブリダイズしたＮＰＰＦを生成するステップ；
前記試料を、一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼと、未結合の核酸分子を除去するのに十分な条件下で接触させるステップであって、それによって、前記標的核酸分子にハイブリダイズした、前記３ＣＦＳにハイブリダイズした、前記５ＣＦＳにハイブリダイズした、または前記３ＣＦＳと前記５ＣＦＳの両方にハイブリダイズしたＮＰＰＦを含む消化された試料を生成するステップ；
前記標的核酸分子にハイブリダイズした、前記３ＣＦＳにハイブリダイズした、前記５ＣＦＳにハイブリダイズした、または前記３ＣＦＳと前記５ＣＦＳの両方にハイブリダイズした前記ＮＰＰＦを捕獲するステップ；
前記３ＣＦＳの５’−リン酸を前記標的核酸分子の３’末端にライゲートし、そして前記５ＣＦＳの３’末端を前記標的核酸分子の５’末端にライゲートするステップであって、それによって、ライゲートした標的核酸分子を生成するステップ；
前記ライゲートした標的核酸分子から前記ＮＰＰＦを分離ステップであって、それによって一本鎖ＮＰＰＦおよび一本鎖のライゲートした標的核酸分子を含む混合物を生成するステップ；ならびに
前記一本鎖のライゲートした標的核酸分子の少なくとも一部をシーケンシングするステップであって、それによって前記試料中の少なくとも１つの前記標的核酸分子の配列を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＮＰＰＦが、少なくとも１つのｄＵＴＰを含み、前記方法が、変性の後および前記シーケンシングの前に、一本鎖ＮＰＰＦおよび一本鎖のライゲートした標的核酸分子を含む前記混合物を、ウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）と、前記一本鎖ＮＰＰＦを分解するのに十分な条件下で接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのｄＵＴＰが、前記標的核酸分子の領域に相補的な前記配列の５塩基対以内に配置されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＰＰＦが、５’−フランキング配列と３’−フランキング配列の両方を含み、前記方法が、前記変性の後および前記シーケンシングの前に、
前記一本鎖のライゲートした標的核酸分子を、前記３ＣＦＳに相補的な領域を含む第１の増幅プライマーおよび前記５ＣＦＳに相補的な領域を含む第２の増幅プライマーと接触させるステップ；ならびに
前記一本鎖のライゲートした標的核酸分子を、前記第１および第２の増幅プライマーを用いて増幅するステップ
をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＰＰＦが、５’−フランキング配列と３’−フランキング配列の両方を含み、少なくとも一方のフランキング配列は、少なくとも１つのｄＵＴＰを含み、前記方法が、前記変性の後および前記シーケンシングの前に、
一本鎖ＮＰＰＦおよび一本鎖のライゲートした標的核酸分子を含む前記混合物を洗浄するステップ；
一本鎖ＮＰＰＦおよび一本鎖のライゲートした標的核酸分子を含む前記混合物を、ウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）と、前記一本鎖ＮＰＰＦを分解するのに十分な条件下で接触させるステップ；
前記一本鎖のライゲートした標的核酸分子を、前記３ＣＦＳに相補的な領域を含む第１の増幅プライマーおよび前記５ＣＦＳに相補的な領域を含む第２の増幅プライマーと接触させるステップ；ならびに
前記ライゲートした標的核酸分子を、前記第１および第２の増幅プライマーを用いて増幅するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの標的核酸分子が、ＤＮＡであり、前記５ＣＦＳおよび前記３ＣＦＳが、ＤＮＡである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの標的核酸分子が、ＤＮＡであり、前記５ＣＦＳが、ＤＮＡであり、前記３ＣＦＳが、ＲＮＡである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの標的核酸分子が、ＲＮＡであり、前記５ＣＦＳが、ＤＮＡであり、前記３ＣＦＳが、ＲＮＡである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの標的核酸分子が、ＲＮＡであり、前記５ＣＦＳが、ＲＮＡであり、前記３ＣＦＳが、ＲＮＡである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＰＰＦが、ＤＮＡ分子を含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＰＰＦが、３５〜１５０ヌクレオチドを含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記標的核酸分子の領域に相補的な前記配列が、１０〜６０ヌクレオチドの長さである、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記フランキング配列が、１２から５０ヌクレオチドの長さである、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＰＰＦが、前記５’末端および前記３’末端にフランキング配列を含み、前記５’末端における前記フランキング配列は、前記３’末端における前記フランキング配列とは異なる、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記捕獲部分が、固体支持体または標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記固体支持体が、ビーズである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ビーズが、磁気ビーズである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標識が、ビオチンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの標的核酸分子が、固定されているか、架橋されているか、または不溶性である、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が、固定されている、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が、ホルマリン固定されている、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＰＰＦが、ＤＮＡであり、前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組合せを含む、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
一本鎖核酸分子に特異的な前記ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼを含む、請求項１から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記ライゲートするステップが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、またはＴａｑリガーゼを用いて実行される、請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
複数の試料中の１つまたは複数の標的核酸分子を同時にシーケンシングまたは検出する、請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも２つの標的核酸分子をシーケンシングまたは検出し、前記試料が、少なくとも２つの異なるＮＰＰＦと接触し、各ＮＰＰＦが、異なる標的核酸分子に特異的である、請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも２つの異なる標的核酸分子をシーケンシングまたは検出し、前記試料が、前記少なくとも２つの異なる標的核酸分子に特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦと接触する、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも２つの異なる標的核酸分子が、野生型遺伝子配列および前記遺伝子配列中の少なくとも１つの突然変異を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
複数の試料で実行され、少なくとも２つの異なる標的核酸分子が、前記複数の試料のそれぞれで検出される、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つのＮＰＰＦが、ｍｉＲＮＡ標的核酸分子に特異的であり、少なくとも１つのＮＰＰＦが、ｍＲＮＡ標的核酸分子に特異的である、請求項１から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのＮＰＰＦが、少なくとも１０個の異なるＮＰＰＦを含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料を溶解するステップをさらに含む、請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
シーケンシングが、次世代シーケンシングを含む、請求項１から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
シーケンシングが、単一分子シーケンシングを含む、請求項１から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記標的核酸分子の配列を決定するステップが、前記標的核酸分子が点突然変異を含むかどうかを決定する、請求項１から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
一本鎖ＮＰＰＦおよび一本鎖のライゲートした標的核酸分子を含む前記混合物を洗浄するステップが、前記混合物を、前記捕獲部分に結合することができる表面と接触させることを含む、請求項５から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記表面が、磁石、マルチウェルプレート、ビーズ、またはカラムを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記表面が、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１および／または前記第２の増幅プライマーが、増幅ステップ中における、前記一本鎖のライゲートした標的核酸分子への、実験的タグまたはシーケンシングアダプターの付着を許容する配列をさらに含む、請求項４から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の増幅プライマーが、増幅ステップ中における、前記一本鎖のライゲートした標的核酸分子の前記５’末端への、第１の実験タグおよび／または第１のシーケンシングアダプターの付着を許容する配列をさらに含み、前記第２の増幅プライマーが、増幅ステップ中における、前記一本鎖のライゲートした標的核酸分子の前記３’末端への、第２の実験タグおよび／または第２のシーケンシングアダプターの付着を許容する配列をさらに含む、請求項４から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記増幅の後および前記シーケンシングの前に、前記第１および第２の増幅プライマーを除去するステップをさらに含む、請求項４から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記実験タグが、試料、対象、処理または標的核酸配列の同定を許容する核酸配列を含む、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記シーケンシングアダプターが、シーケンシングプラットフォーム上への捕獲を許容する核酸配列を含む、請求項４０から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記実験タグまたはシーケンシングアダプターが、前記一本鎖のライゲートした標的核酸分子の前記５’末端または３’末端に存在する、請求項４０から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記ライゲーションステップと同時に、または前記ライゲーションステップの前に、捕獲された標的核酸分子を重合するステップをさらに含む、請求項１から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）標的核酸分子に特異的なフランキング配列を含む少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）であって、
５’末端および３’末端と、
前記ＮＰＰＦと前記標的核酸分子との特異的な結合を許容する前記標的核酸分子の領域に相補的な配列と
を含み、
フランキング配列は、前記標的核酸分子に相補的な前記配列の５’、３’、または両方に配置され、５’−フランキング配列は、前記標的核酸分子に相補的な前記配列の５’であり、３’−フランキング配列は、前記標的核酸分子に相補的な前記配列の３’であり、
前記フランキング配列は、少なくとも１２ヌクレオチドを含む、プローブ、
（ｂ）前記ＮＰＰＦが３’−フランキング配列を含む場合、前記３’−フランキング配列に相補的な配列（３ＣＦＳ）、５’末端リン酸、および捕獲部分を含む核酸分子；および／または
（ｃ）前記ＮＰＰＦが５’−フランキング配列を含む場合、前記５’−フランキング配列に相補的な配列（５ＣＦＳ）を含む核酸分子
を含むキットであって、
少なくともＮＰＰＦ中のヌクレオチドは、前記標的核酸分子中の対応するヌクレオチドに対する相補性を有さないか、または前記５ＣＦＳまたは前記３ＣＦＳ中の対応するヌクレオチドに対する相補性を有さない、キット。
【請求項４７】
リガーゼ；
一本鎖核酸分子に特異的なヌクレアーゼ；
ウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）；
溶解緩衝液；
ライゲーション緩衝液；
変性緩衝液；
洗浄緩衝液；
ＰＣＲ増幅のための１つまたは複数の試薬；
プロテイナーゼＫ；
変性油；
ＣＦＳを含むアンプリコンに特異的に結合できるビーズ；
溶出緩衝液；
ＤＮＡポリメラーゼ；
ＲＮＡポリメラーゼ；
ＤＮアーゼ；
ＲＮアーゼ；および
核酸シーケンシングのための１つまたは複数の試薬
の１つまたは複数をさらに含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記５ＣＦＳに相補的な領域を含む第１の増幅プライマー；および
前記３ＣＦＳに相補的な領域を含む第２の増幅プライマー
をさらに含む、請求項４７または４８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年２月１１日に出願された米国仮出願番号第６２／２９４，１４３号および２０１６年１２月１６日に出願された米国仮出願番号第６２／４３５，４５９号に基づく優先権を主張しており、両者は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
分野
本開示は、核酸標的の直接シーケンシングを可能にする、定量的なヌクレアーゼ保護シーケンシング（ｑＮＰＳ）方法、およびキットを提供する。このような方法は、１つまたは複数の核酸標的が試料中に存在するかどうかを決定するのに使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
背景
核酸分子をシーケンシングする方法が公知であるが、それでもなお複数の試料または複数の配列を同時または同時発生的に直接シーケンシング分析を許容する方法への必要性がある。直接の多重化核酸分子シーケンシング反応の方法は、最も望ましい性能または簡単さのレベルで理解されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
先行の定量的なヌクレアーゼ保護シーケンシング（ｑＮＰＳ）方法（例えば米国出願公開第２０１１−０１０４６９３号および米国特許第８，７４１，５６４号で開示されたものなど）を改善し、現在の核酸シーケンシング方法への改善をもたらす方法が提供される。一部の例において、開示された方法は、フランキング配列（ＮＰＰＦ）を含む複数のヌクレアーゼ保護プローブを使用して、試料中の数種の異なる標的核酸分子をシーケンシングするのに使用され、各ＮＰＰＦは、１つまたは複数の特定の標的核酸分子に特異的に結合する。一部の例において、開示された方法は、複数の試料中の少なくとも１つの標的核酸分子を同時にシーケンシングするのに使用される。
【０００５】
試料中の少なくとも１つの標的核酸分子の配列を決定する開示された方法は、試料を、少なくとも１つのＮＰＰＦと、ＮＰＰＦが標的核酸分子に特異的に結合するのに十分な条件下で接触させることを含んでいてもよい。ＮＰＰＦは、標的核酸分子の全てまたは一部に相補的な配列を含み、したがって標的核酸分子とＮＰＰＦとの特異的な結合またはハイブリダイゼーションが許容される。例えば、標的核酸分子の領域に相補的なＮＰＰＦの領域は、高い特異性で、標的核酸分子のその領域に結合するかまたはハイブリダイズする。ＮＰＰＦは、ＮＰＰＦの５’末端および／または３’末端に１つまたは複数のフランキング配列をさらに含む。したがって、１つまたは複数のフランキング配列は、標的核酸分子に相補的な配列の５’、３’、または両方に配置される。ＮＰＰＦが５’末端および３’末端の両方にフランキング配列を含む場合、一部の例において、各ＮＰＰＦの配列は異なり、相補的ではない。フランキング配列は、試料中に存在する核酸分子中に認められない配列を有する数個の連続したヌクレオチド（例えば少なくとも１２ヌクレオチドの配列など）を含む。一部の例において、ＮＰＰＦ（例えば、一方もしくは両方のフランキング配列、および／または標的核酸分子の全てもしくは一部に相補的な領域の配列中の）は、後のＮＰＰＦ分解（例えばウラシルＤＮＡデグリコシラーゼを使用して）を許容するために、１つまたは複数のｄＵＴＰを含む。一例において、ＮＰＰＦ（例えば、一方もしくは両方のフランキング配列、および／または標的核酸分子の全てもしくは一部に相補的な領域の配列中の）は、そうでなければｄＴＴＰとなる位置にｄＵＴＰを含んでいてもよい。
【０００６】
一部の例において、ＮＰＰＦ（例えばフランキング配列または標的核酸分子の領域に相補的なＮＰＰＦの領域など）は、単一ヌクレオチドミスマッチを含み（例えば、Ａ：Ｔ塩基対がＧ：Ｔ塩基対になるか、またはＣ：Ｇ塩基対がＴ：Ｇ塩基対になるように、ＡをＧ、またはＣをＴで置き換えること；または標的核酸がＲＮＡである場合、Ａ：ｒＵ塩基対はＧ：ｒＵ塩基対になるか、またはＣ：ｒＧ塩基対はＴ：ｒＧ塩基対になる）、これは、高い特異性で標的核酸分子にハイブリダイズするＮＰＰＦの能力に有害作用を与えず、典型的にはＳ１ヌクレアーゼなどの一本鎖ヌクレアーゼによって認識または切断されない。したがって、標的核酸分子の領域に相補的なＮＰＰＦの領域は固有であり、試料中の標的核酸配列と区別することができる。例えば、ミスマッチしたヌクレオチドの存在は、検出されるもの（例えば、シーケンシングされるもの）がＮＰＰＦなのか、または標的核酸分子なのかを決定することを可能にする。一部の例において、ミスマッチしたヌクレオチドは、ＮＰＰＦの５’末端の最も端または３’末端の最も端に存在せず、例えばＮＰＰＦの５’末端または３’末端の２塩基以内に存在しない。一部の例において、ミスマッチしたヌクレオチドは、フランキング配列と標的核酸分子の領域に相補的なＮＰＰＦの領域との間のジャンクションに存在せず、例えば、このようなジャンクションから約１０から１５塩基である。一部の例において、ミスマッチしたヌクレオチドは、標的に相補的な領域内にあり、例えば、フランキング配列とＮＰＰＦ内の標的に相補的な配列との間のジャンクションの２塩基以内ではない。一例において、ミスマッチしたヌクレオチドは、標的に相補的な配列内の約１０〜１５ヌクレオチド、例えば標的に相補的な領域内の１２ヌクレオチドなどである。
【０００７】
本方法はまた、試料を、ＮＰＰＦのフランキング配列（ＣＦＳ）に対する相補性を有する核酸分子と接触させることも含む。例えば、ＮＰＰＦが５’−フランキング配列を有する場合、試料は、５’−フランキング配列に相補的な配列（５ＣＦＳ）および５’末端リン酸を有する核酸分子と、５’−フランキング配列が５ＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下で接触する。同様に、ＮＰＰＦが３’−フランキング配列を有する場合、試料は、３’−フランキング配列に相補的な配列（３ＣＦＳ）を有する核酸分子と、３’−フランキング配列が３ＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下で接触する。一部の例において、３ＣＦＳおよび５ＣＦＳの少なくとも１つは、標的核酸分子の捕獲または単離を許容する捕獲部分を含む。一部の例において、ＮＰＰＦは、標的核酸分子の捕獲または単離を許容する捕獲部分を含む。このハイブリダイゼーションは、標的核酸分子ならびに５ＣＦＳおよび／または３ＣＦＳにハイブリダイズしたＮＰＰＦとの二本鎖（ｄｓ）核酸分子の生成をもたらす。
【０００８】
本方法はまた、試料を、一本鎖（ｓｓ）核酸分子に特異的なヌクレアーゼと、反応中に未結合のｓｓ核酸分子を分解または除去するのに十分な条件下で接触させることも含む。したがって、例えば、標的核酸分子またはＣＦＳと結合していないＮＰＰＦに加えて、未結合の標的核酸分子または標的核酸分子の未結合部分、試料中の他のｓｓ核酸分子、および未結合のＣＦＳが分解される。これにより、その標的核酸分子にハイブリダイズした、その対応する３ＣＦＳにハイブリダイズした、その対応する５ＣＦＳにハイブリダイズした、またはその対応する３ＣＦＳとその対応する５ＣＦＳの両方にハイブリダイズしたＮＰＰＦを含む、消化された試料が生じる。このｄｓ核酸分子は、捕獲される（例えば捕獲部分の使用によって、例えばｄｓ核酸分子を固体支持体に固着して試料の残りを洗い流すことによって、例えば試料中の他の核酸分子から分離される）。標的核酸分子の捕獲は、ライゲーション前のあらゆるときに（例えば、あらゆるステップで）行うことができる（例えば、標的およびＣＦＳにハイブリダイズしたＮＰＰＦを含む複合体は、ハイブリダイゼーション中に、ハイブリダイゼーションに続いて、またはヌクレアーゼ消化の後に、捕獲または回収することができる、）。
【０００９】
その後、ＣＦＳを標的核酸にライゲートし、例えば５ＣＦＳの５’−リン酸を標的核酸分子の３’末端にライゲートし、３ＣＦＳの３’末端を標的核酸分子の５’末端にライゲートし、それによって、ライゲートした標的核酸分子（本明細書ではライゲートした標的と称される）が生成される。一部の例において、ライゲーションに加えて、重合ステップが実行される（例えばライゲーションと同時に、またはライゲーション後に）。例えば、ポリメラーゼは、ヌクレアーゼによって（すなわち、二本鎖核酸の露出した末端における「ニブル（ｎｉｂｂｌｅ）」塩基に対するｓｓ特異的ヌクレアーゼの性質を介して）偶発的に除去されたＣＦＳまたは標的のヌクレオチドを置き換えるのに使用することができる。二本鎖ＮＰＰＦ：ライゲートした標的核酸分子を、その対応するｓｓ核酸分子に分離し、それによってｓｓＮＰＰＦおよびｓｓのライゲートした標的核酸分子の混合物が生成される。一部の例において、二本鎖ＮＰＰＦ：ライゲートした標的のその対応するｓｓ核酸分子への分離は、例えば標的分子がＲＮＡであり、ＮＰＰＦがＤＮＡであり、３ＣＦＳおよび５ＣＦＳがＲＮＡである場合、ＤＮアーゼでの処理を含む。このような例において、ｓｓＮＰＰＦは、ｓｓのライゲートしたＲＮＡ標的分子から分解されるか、消化されるか、分離されるか、またはそれらの組合せである。一部の例において、ｓｓのライゲートしたＲＮＡ標的分子は、逆転写酵素の使用によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換される。一例において、ＮＰＰＦ：ライゲートした標的のＲＮＡ鎖は、ＲＮアーゼＨで複合体を処理することによって選択的に除去することができ、ここでＲＮアーゼＨは、ＤＮＡ：ＲＮＡ複合体のＲＮＡ部分を選択的に除去するものである（例えば、標的分子がＤＮＡであり、ＮＰＰＦがＲＮＡであり、３ＣＦＳおよび５ＣＦＳがＤＮＡである場合）。ＲＮＡからＤＮＡを個々に分解するか、またはＤＮＡからＲＮＡを個々に分解するためには、代替のヌクレアーゼを使用することができる。ライゲートした標的核酸分子は、任意選択で捕獲されるか（例えば捕獲部分の使用によって、例えば管の底部にライゲートした標的核酸分子を固着させ望ましくない他の分子洗い流すことによって、他の核酸分子から分離される）、またはそれ以外の方法で、例えばＮＰＰＦ、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳ上の捕獲部分の使用によって、ｓｓＮＰＰＦから分離される。ライゲートした標的核酸分子は、任意選択で増幅される（例えば実験タグおよび／または配列アダプターを付加するために）。ｓｓのライゲートした標的核酸分子（またはそのアンプリコン）の少なくとも一部をシーケンシングし、それによって試料中の少なくとも１つの標的核酸分子の配列を決定する。
【００１０】
また、１つまたは複数の標的核酸分子を直接シーケンシングするのに使用できるキットも本明細書に記載される。
【００１１】
本開示の前述のおよび他の目的および特徴は、添付の図面を参照しながら進められる以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、例示的なフランキング配列を有するヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）１００を示す模式図である。ＮＰＰＦ  １００は、標的核酸配列に特異的に結合し／それにハイブリダイズする配列を有する領域１０２を含む。ＮＰＰＦはまた、５’−フランキング配列１０４、３’−フランキング配列１０６、または両方を含む（両方を有する実施形態が示される）。
【００１３】
【図１Ｂ】図１Ｂは、例示的なフランキング配列を有するヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）１２０を示す模式図である。この例では、ＮＰＰＦ  １２０は、図１Ａに示すような単一核酸分子の代わりに、２個の別々の核酸分子１２８、１３０で構成される。ＮＰＰＦ  １２０は、標的核酸配列に特異的に結合し／それにハイブリダイズする配列を有する領域１２２を含む。ＮＰＰＦはまた、５’−フランキング配列１２４、３’−フランキング配列１２６、または両方を含む（両方を有する実施形態が示される）。
【００１４】
【図２−１】図２Ａは、１個または複数の標的核酸分子の直接的なシーケンシングに関する実例的な方法のステップの概要を示す模式図である。（ステップ１）試料（細胞またはＦＦＰＥ組織などの）を、試料崩壊緩衝液（例えば、試料中の細胞および組織の溶解を可能にするため）と接触させて、少なくとも１個のＮＰＰＦ  ２０２、およびその相補的な５ＣＦＳ  ２０８および３ＣＦＳ  ２１０とともに、ＮＰＰＦ  ２０２の、標的２００へのおよびＣＦＳ  ２０８、２１０への特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートする。（ステップ２）未結合（例えば、一本鎖）核酸を、ｓｓ核酸分子に特異的なヌクレアーゼ（Ｓ１ヌクレアーゼなどの）で消化する。（ステップ３）二本鎖ＮＰＰＦ／標的二重鎖２１４を、任意選択で捕獲するか、または他の場合では、ヌクレアーゼ反応混合物から除去する（例えば、捕獲部分２１２を使用する捕獲方法によって）。しかしながら、図２Ｂ〜図２Ｄに示すように、標的を含む核酸分子の捕獲は、より初期のステップで達成することができる。ＣＦＳ  ２０８、２１０を、例えばリガーゼの添加によって、標的２００にライゲートして、それにより、ライゲートした標的２１６を生成する。任意選択で、ライゲーション反応は、ヌクレアーゼによって除去される任意のヌクレオチドを置き換えるフィルイン反応を実行するためにポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼなどの）を含んでもよく、ポリメラーゼおよびリガーゼは、同時にまたは段階的に添加されてもよい。（ステップ４）ＮＰＰＦ／ライゲートした標的二重鎖２１４を、ｓｓＮＰＰＦ  ２０２およびｓｓのライゲートした標的２１６へと分離する。幾つかの例では、ＮＰＰＦ／ライゲートした標的二重鎖２１４を分離するために、二重鎖のＮＰＰＦを、ヌクレアーゼで、例えばＤＮアーゼで処理する。（ステップ５）ライゲートした標的２１６を、例えば、適切なプライマーを用いたＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを使用することによって、任意選択で増幅および重合して（図５）、続いてシーケンシングする。
【００１５】
【図２−２】図２Ｂ〜図２Ｄは、標的の捕獲または回収を、ライゲーション前にどこで行うことができるかについての特定の注記とともに、１個または複数の標的核酸分子の直接的なシーケンシングに関する実例的な方法のステップの概要を示す模式図である。図２Ｂは、１個または複数の標的核酸分子（例えば、図２Ａにおける２１４などの図２Ａにおける２００）の捕獲３２０を、ハイブリダイゼーション３１０中に行うことができることを示す。図２Ｃは、標的の捕獲４２０を、ヌクレアーゼ消化４３０後に行うことができることを示す。図２Ｄは、標的の捕獲５２０を、ハイブリダイゼーション５１０後に行うことができることを示す。
【００１６】
【図３】図３は、ライゲーション前の実例的な５ＣＦＳ  ２０８、標的２００、および３ＣＦＳ  ２１０の配置の詳細を示す模式図である。捕獲部分２１２は、５ＣＦＳ  ２０８上に示されるが、あるいはそれは、３ＣＦＳ  ２１０またはＮＰＰＦ  ２０２上に存在し得る。他の実施形態（図示していない）は、５ＣＦＳ  ２０８および標的２００、または標的２００および３ＣＦＳ  ２１０を含む。
【００１７】
【図４】図４は、５ＣＦＳ  ２０８および３ＣＦＳ  ２１０が、適切な５’リン酸基によってどのようにして標的２００にライゲートすることができるかどうかを示す模式図である。
【００１８】
【図５】図５は、幾つかの実施形態では、ライゲートした標的を、プライマー（矢印）および分解されたＮＰＰＦ  ２００を使用して増幅することができ、ライゲートした標的アンプリコン２２６を生じることを示す模式図である。プライマーは、シーケンシングアダプター２１８、２２０および／または実験タグ２２２、２２４が、ライゲートした標的アンプリコン２２６に付加することを可能にする配列を含み得る。
【００１９】
【図６】図６Ａ〜図６Ｆは、（ＡおよびＢ）ライゲートした標的の一方の末端上にのみＣＦＳを有するか、または（Ｃ〜Ｆ）ライゲートした標的の両方の末端上にＣＦＳを有する実施形態を含む、ライゲートした標的分子の例示的な実施形態を示す概略図である。
【００２０】
【図７Ａ】図７Ａは、開示された方法を使用して、７個の異なる標的のシーケンシングの結果を示す棒グラフである。
【００２１】
【図７Ｂ】図７Ｂは、開示された方法を使用して、７個の異なる標的のシーケンシングの用量設定の結果を示す棒グラフである。
【００２２】
【図８】図８は、開示された方法の、単一ヌクレオチドバリエーションを識別する能力を示す棒グラフである。
【００２３】
【図９】図９は、開示された方法を用いて検出することができる（例えば、同時にまたは同じ反応で）、それぞれが多数の異なる突然変異を有する遺伝子の例を提供する。幾つかの例では、遺伝子の野生型バージョン、および遺伝子の少なくとも２個の異なる突然変異（２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の異なる突然変異などの）が、単一ＮＰＰＦを用いて検出される（例えば、図１０を参照）。
【００２４】
【図１０】図１０は、それぞれが複数の異なる点突然変異（赤色のヌクレオチドを参照）ならびに野生型遺伝子を検出することができる例示的なプローブ（標的核酸分子の領域に相補的であるＮＰＰＦの領域が示される、即ち、フランキング配列は図示されない）（配列番号１、配列番号８および配列番号１７）を提供する。ＮＰＰＦ配列の下に示す標的配列は、ＮＰＰＦがハイブリダイズする鎖ではなく、代わりに逆の鎖であり、その結果、同定されるべき標的に対してＮＰＰＦ配列に成された変更が例示される。ＮＰＰＦ配列は特有であり、それは、野生型または突然変異体配列のいずれかに対して１００％配列同一性を共有しないことに留意されたい。上部から下部まで配列番号１〜配列番号２３。各ＮＰＰＦ中のミスマッチヌクレオチドは、イタリック体である（青色）。
【００２５】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｂは、開示された方法の、２個の異なるプローブ設計を使用して、（Ａ）ＫＲＡＳまたは（Ｂ）ＢＲＡＦの単一ヌクレオチドバリエーションを識別する能力を示す棒グラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜図１１Ｂは、開示された方法の、２個の異なるプローブ設計を使用して、（Ａ）ＫＲＡＳまたは（Ｂ）ＢＲＡＦの単一ヌクレオチドバリエーションを識別する能力を示す棒グラフである。
【００２６】
【図１２】図１２は、開示された方法の、ゲノム突然変異ステータスがわかっている細胞株内の予想される標的ヌクレオチドバリエーションを識別する能力を示す棒グラフである。
【００２７】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｂは、開示された方法の、多重的にインプット濃度範囲にわたるヌクレオチドバリエーションを識別する能力を示すグラフである。（Ａ）２０個のアンプリコンまたは（Ｂ）２個のアンプリコンの検出および線形性をより詳細に示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｂは、開示された方法の、多重的にインプット濃度範囲にわたるヌクレオチドバリエーションを識別する能力を示すグラフである。（Ａ）２０個のアンプリコンまたは（Ｂ）２個のアンプリコンの検出および線形性をより詳細に示す。
【００２８】
【図１４】図１４は、開示された方法の、希釈系列における単一ヌクレオチドバリエーションを識別する能力を示す表であり、４個の検出された標的それぞれに関する平均値、標準偏差、および％ＣＶを表示する。
【００２９】
【図１５】図１５は、開示された方法の、ＢＲＡＦ突然変異ステータスがわかっている臨床ＦＦＰＥ試料内のヌクレオチドバリエーションを識別する能力を示す棒グラフである。上部の配列は、ＢＲＡＦ標的配列を示す（配列番号６２、配列番号６３、および配列番号６４）。
【００３０】
【図１６−１】図１６Ａ〜図１６Ｄは、開示された方法を使用したＲＮＡ標的のシーケンシングからの結果を示すグラフである。生シーケンシング計数をプロットする。（Ａ）特異的なＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する試料からのシーケンシング計数。（Ｂ）種々の濃度（用量設定）での特異的なＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する試料のセットからのシーケンシング計数。（Ｃ）組織溶解産物を含有する試料中に存在する３個のＲＮＡ標的のシーケンシング計数。４個の異なる試料インプット用量設定を試験した。（Ｄ）試料中に存在する６個の異なるＲＮＡ標的のシーケンシング計数。
【図１６−２】図１６Ａ〜図１６Ｄは、開示された方法を使用したＲＮＡ標的のシーケンシングからの結果を示すグラフである。生シーケンシング計数をプロットする。（Ａ）特異的なＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する試料からのシーケンシング計数。（Ｂ）種々の濃度（用量設定）での特異的なＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する試料のセットからのシーケンシング計数。（Ｃ）組織溶解産物を含有する試料中に存在する３個のＲＮＡ標的のシーケンシング計数。４個の異なる試料インプット用量設定を試験した。（Ｄ）試料中に存在する６個の異なるＲＮＡ標的のシーケンシング計数。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
配列表
核酸およびタンパク質配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  １．８２２で定義されている通り、ヌクレオチド塩基に関する標準的な文字の略語を使用して示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、表示された鎖に言及される場合はいつでも相補鎖が含まれるものと理解される。２０１７年２月９日に作成されサイズが１６ＫＢの「ｓｅｑ  ｌｉｓｔｉｎｇ」と命名されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００３２】
配列番号１は、アミノ酸６００で複数のＢＲＡＦコード配列を検出することができるＮＰＰＦ核酸配列を示す。
【００３３】
配列番号２は、野生型ヒトＢＲＡＦ配列の一部を示す。
【００３４】
配列番号３は、Ｖ６００Ｅ突然変異をコードするＢＲＡＦ配列の一部を示す。
【００３５】
配列番号４は、Ｖ６００Ｋ突然変異をコードするＢＲＡＦ配列の一部を示す。
【００３６】
配列番号５は、Ｖ６００Ｒ突然変異をコードするＢＲＡＦ配列の一部を示す。
【００３７】
配列番号６は、Ｖ６００Ｅ２突然変異をコードするＢＲＡＦ配列の一部を示す。
【００３８】
配列番号７は、Ｖ６００Ｄ突然変異をコードするＢＲＡＦ配列の一部を示す。
【００３９】
配列番号８は、アミノ酸１２で複数のＫＲＡＳコード配列を検出することができるＮＰＰＦ核酸配列を示す。
【００４０】
配列番号９は、野生型ヒトＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００４１】
配列番号１０は、Ｇ１２Ｄ突然変異をコードするＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００４２】
配列番号１１は、Ｇ１２Ｖ突然変異をコードするＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００４３】
配列番号１２は、Ｇ１２Ａ突然変異をコードするＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００４４】
配列番号１３は、Ｇ１２Ｃ突然変異をコードするＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００４５】
配列番号１４は、Ｇ１２Ｓ突然変異をコードするＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００４６】
配列番号１５は、Ｇ１２Ｒ突然変異をコードするＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００４７】
配列番号１６は、Ｇ１３Ｄ突然変異をコードするＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００４８】
配列番号１７は、アミノ酸６１で複数のＫＲＡＳコード配列を検出することができるＮＰＰＦ核酸配列を示す。
【００４９】
配列番号１８は、野生型ヒトＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００５０】
配列番号１９は、Ｑ６１Ｅ突然変異をコードするＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００５１】
配列番号２０は、Ｑ６１Ｒ突然変異をコードするＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００５２】
配列番号２１は、Ｑ６１Ｌ突然変異をコードするＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００５３】
配列番号２２は、Ｑ６１Ｈ−Ｃ突然変異をコードするＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００５４】
配列番号２３は、Ｑ６１Ｈ−Ｔ突然変異をコードするＫＲＡＳ配列の一部を示す。
【００５５】
配列番号２４は、ＮＰＰＦの５’−フランキング配列を示す。
【００５６】
配列番号２５は、ＮＰＰＦの３’−フランキング配列を示す。
【００５７】
配列番号２６は、実験的タグ（例えば配列番号２８、２９、３６、３７、３８、３９、４０、５０、５１、または５４など）を含めるのに使用することができる８ヌクレオチドの領域を有するフォワードプライマー配列を示す。
【００５８】
配列番号２７は、実験的タグ（例えば配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０または６１など）を含めるのに使用することができる６ヌクレオチドの領域を有するリバースプライマー配列を示す。
【００５９】
配列番号２８から６１は、例示的な実験的タグ配列を示す。
【００６０】
配列番号６２は、標的野生型ヒトＢＲＡＦ配列の一部を示す。
【００６１】
配列番号６３は、Ｖ６００Ｅ突然変異をコードする標的ＢＲＡＦ配列の一部を示す。
【００６２】
配列番号６４は、Ｖ６００Ｅ２突然変異をコードする標的ＢＲＡＦ配列の一部を示す。
詳細な説明
【００６３】
別段の規定がない限り、専門用語は慣例的用法に従って使用される。分子生物学における共通用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ出版、２０００年（ＩＳＢＮ０１９８７９２７６Ｘ）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ出版、１９９４年（ＩＳＢＮ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．出版、１９９５年（ＩＳＢＮ０４７１１８６３４１）；およびＧｅｏｒｇｅ  Ｐ．  Ｒｅｄｅｉ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、第２版、２００３年（ＩＳＢＮ：０−４７１−２６８２１−６）に見出すことができる。
【００６４】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、１つまたは１つより多くを指す。例えば、用語「ＮＰＰＦを含む」は、単数または複数形のＮＰＰＦを含み、成句「少なくとも１つのＮＰＰＦを含む」と同等とみなされる。用語「または」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、述べられた選択的な要素の単一の要素または２つもしくはそれより多くの要素の組合せを指す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し、追加の要素は排除されない。
【００６５】
さらに、核酸またはポリペプチドに関して記載される全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子量の値は近似値であり、説明のために提供されることが理解されるものとする。本明細書に記載されたものに類似した、または同等な方法および材料が本開示の実施または試験で使用できるが、好適な方法および材料は、後述される。本明細書で述べられた全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれら全体が開示に組み入れられ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号（２０１６年２月１１日に存在する配列の場合）も同様である。矛盾がある場合、本明細書が用語の説明も含めて優先されることになる。加えて、材料、方法、および実施例は単なる例示にすぎず、限定することを意図しない。
【００６６】
別段の指示がある場合を除き、本開示の方法および技術は、一般的に、当技術分野において周知の従来の方法に従って、さらに本明細書にわたり引用され論じられた様々な総合的でより具体的な参考文献に記載されたように実行される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９９２年（および２０００年までの別冊）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９９年；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年を参照されたい。
Ｉ．概説
【００６７】
本開示は、標的核酸分子の直接シーケンシングを可能にする方法であって、さらに、多重化できるか（例えば、単一の試料中の複数の標的を検出すること）もしくはハイスループットに適しており（例えば、複数の試料中の標的を検出すること）、または多重化かつハイスループットである（例えば、複数の試料中の複数の標的を検出すること）方法を提供する。開示された方法は、現在利用可能なシーケンシング方法を超える数々の改善を提供する。例えば、本方法は、サロゲートを使用する代わりに目的の標的核酸分子（またはそのアンプリコン）を直接シーケンシングすることから、標的（例えば点突然変異など）の検出をより正確にすることが可能である。加えて、開示された方法は標的化されるため、データ分析は簡易化され、例えば、シーケンサーアウトプットを適用可能なＮＰＰＦ配列（または適用可能なＮＰＰＦ配列の相補物）の相対的に小さいデータベースに対してアラインできることから、複雑な核酸データベース（例えば全ゲノムなど）に対してシーケンサーアウトプットをアラインする必要性と、標的を同定するためのシーケンシングした断片のアセンブリが回避される。またヌクレオチドの長いリードも必要ではなく、これはなぜなら、例えば、シーケンシングされるライゲートした標的は、相対的に少数のヌクレオチドからなり（例えば同じ標的をコードするインタクトなｍＲＮＡと比較して）、ライゲートした標的の十分な数のヌクレオチドだけを読み取ればよいためであり（多くの場合、完全なライゲートした標的配列より少ない）、相対的に単純な参照データベース（上記で論じられた）に対するアライメントの成功を可能にする。さらに、一部のシーケンサーは、１回のシーケンシング試行で「読み取り」可能なヌクレオチドの数を制限するが、目的の標的を同定するために読み取らなければならないヌクレオチドの数を低減することによって、より有用なデータを各シーケンシング試行から得ることができる。加えて、結果は、複雑なバイオインフォマティクス分析を必要とすることなく単に計数することができる。加えて、本方法が必要とする標的核酸分子の加工がより少ないため、このような加工によって導入されるバイアスを低減するかまたはなくすことができる。例えば、一部の現行方法では、例えば標的がＲＮＡ（例えばｍＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡなど）である場合、方法は、典型的には、試料からＲＮＡを単離または抽出するステップ、それをＲＴ−ＰＣＲに供するステップ、ＲＮＡをライゲートするステップ、またはそれらの組合せを採用する。従来の方法はまた、望ましくない核酸分子、例えばｔＲＮＡおよび／またはｒＲＮＡなどを除去するために枯渇または分離ステップを必要とする場合もある。開示された方法の一部の実施形態では、このようなステップは必要ではない。結果として、本方法は、別の状況では検出シーケンシングに適さない様々な試料タイプを分析することを許容する。加えて、これにより試料からのＲＮＡの損失がより少なくなることから、より正確な結果が提供される。
【００６８】
本方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば１つまたは複数の遺伝子の融合、挿入または欠失などの突然変異、タンデムリピート、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）、単一ヌクレオチドバリアント、およびＤＮＡメチル化のステータスを検出するのに使用することができる。一例において、本方法は、標的核酸分子中の点突然変異を検出するのに使用される。このような突然変異は、公知の突然変異であってもよいし、または開示された方法を使用して新たに発見された突然変異であってもよい。例えば、本方法は、単一の標的核酸分子中の、または複数の標的核酸分子中の、１つまたは複数の点突然変異（例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０個またはそれより多くの点突然変異、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の異なる点突然変異）を検出するのに使用することができる。一部の例において、それぞれの異なる点突然変異は、異なる標的核酸分子とみなされる（例えば、図１０は、配列番号１が、野生型ＢＲＡＦ遺伝子と５つの異なるその突然変異体とを含む６つの異なる標的核酸分子（配列番号２〜７）を検出するのに使用できることを示す）。一部の例において、本方法は、２つまたはそれより多くの異なる標的核酸分子中の１つまたは複数の点突然変異を検出するのに使用することができる。本方法は、核酸プローブを使用し、この核酸プローブは、本明細書では、フランキング配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）、同様に相補的フランキング配列（ＣＦＳ）と称される。ＮＰＰＦおよびＣＦＳの使用は、多重性を許容し、一部の例において、シーケンシングされた標的核酸分子の化学量論を大まかに保存するが、これはなぜなら、ＣＦＳは、化学量論を有意に変更することなく、増幅のための万能なプライマー結合部位を許容し、シーケンシングアダプターおよび実験的タグの付加（例えば多重性を増加させるために、３’または５’末端のいずれか、または両方の末端に）を許容するためである。ＣＦＳは万能であり得るため、ＣＦＳがライゲートされるいずれの標的核酸分子を増幅するのに同じプライマーを使用することができ、したがって多重性がもたらされ、一部の例において化学量論が大まかに保存される。
【００６９】
加えて、プライマー（これは、ＣＦＳにハイブリダイズする）は、ＣＦＳが最終的にライゲートされる標的核酸分子へのタグ（例えば多重性を増加させるための、３’または５’末端のいずれかにおける、または両方の末端における、標的そのものの全体をシーケンシングすることなく標的の同定を許容するための、または異なる患者もしくは異なる実験またはそれ以外からの試料を、１回のシーケンシング試行に合わせることを許容するための実験タグ、加えて、特定のシーケンシングプラットフォームに必要な配列の付着、および一部のシーケンシングプラットフォームのためのコロニー形成を許容するためのシーケンシングアダプター）の付加を許容する。シーケンシングライブラリーは、標的全体（または標的全体の多数の断片）というよりも目的の標的（またはライゲートした標的アンプリコン）の公知部分を含有するため、ＮＰＰＦおよびＣＦＳの使用はまた、分析される（例えば、シーケンシングされる）シーケンサーインプット（シーケンシングライブラリーとも称される）の複雑さも簡易化する。ＮＰＰＦは、最終的にライゲートした標的から解離される（例えば、消化する、切断される、分離する、またはそれらの任意の組合せ）ため、最終的にシーケンシングされるのは、サロゲートとしてのＮＰＰＦではなくライゲートした標的（またはそのアンプリコン）である。ライゲートした標的（またはライゲートした標的のアンプリコン）のシーケンシングは、他のシーケンシング方法に必要となるものと比較してデータ分析を簡易化し、配列をゲノムに適合させ、標準的なシーケンシング方法から得られる複数の配列／遺伝子をデコンボリューションしなければならないのではなく、アルゴリズムを単にシーケンシングされたライゲートした標的を計数することのみに限定する。
【００７０】
一例において、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的核酸分子（例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、または少なくとも３０００個の標的核酸分子など）をシーケンシングするための方法を提供する。一部の例において、試料中の核酸分子を変性させるため、例えば、それに続く試料中のＮＰＰＦと標的核酸分子とのハイブリダイゼーション、加えてＮＰＰＦとその対応するＣＦＳとのハイブリダイゼーションを許容するために、試料、例えば核酸（例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）などの試料は加熱される。一部の例において、試料は、溶解した試料である（したがって、一部の例において、本方法は、試料を溶解することを含む）。一部の例において、試料は、固定された試料（例えばパラフィン包埋ホルマリン固定（ＦＦＰＥ）試料、ヘマトキシリンおよびエオシン染色された組織、またはグルタルアルデヒド固定組織など）である。例えば、標的核酸分子は、固定されていてもよいし、架橋されていてもよいし、または不溶性であってもよい。
【００７１】
一部の例において、開示された方法は、複数の試料中の少なくとも１つの標的核酸分子（例えば少なくとも２つの異なる標的核酸分子など）を同時または同時発生的にシーケンシングする。同時のシーケンシングは、同時に、または実質的に同じ時間に行われるシーケンシング、および／または同じシーケンシングライブラリーまたは同じシーケンシング反応で行われるシーケンシング、もしくは同じシーケンシングフローセルまたは半導体チップで実行される（例えば、同時発生の）シーケンシングを指す。一部の例において、事象は、互いに１マイクロ秒から１２０秒以内（例えば０．５から１２０秒以内、１から６０秒以内、または１から３０秒以内、または１から１０秒以内）に起こる。一部の例において、開示された方法は、例えば（ｉ）それぞれ異なる標的核酸分子に特異的な、少なくとも２つの異なるＮＰＰＦを使用して、（ｉｉ）複数の異なる標的核酸分子に特異的な１つのＮＰＰＦ（例えば、図１０は、配列番号１（これは、標的核酸分子の領域に相補的なＮＰＰＦの部分である）は、野生型ＢＲＡＦ遺伝子と５つの異なるＢＲＡＦ突然変異体とを含む６つの異なる標的核酸分子（配列番号２〜７）を検出するのに使用できることを示す；ＫＲＡＳについても類似の例が示される）を使用することによって、または（ｉｉｉ）それらの組合せによって、試料中の２またはそれより多くの標的核酸分子をシーケンシングする（例えば同時または同時発生的に）。一例において、試料は、複数のＮＰＰＦ（例えば少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、またはそれより多く）と接触し、各ＮＰＰＦは、特定の標的核酸分子に特異的に結合する。例えば、１０個の標的核酸分子がある場合、試料は、それぞれ１０個の標的のうち１つに特異的な１０個の異なるＮＰＰＦと接触させることができる。しかしながら、一部の例において、試料は、少なくとも１つのＮＰＰＦ（例えば少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００個、またはそれより多く）と接触し、各ＮＰＰＦは、少なくとも２つの（例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くの）異なる標的核酸分子（例えば野生型遺伝子および野生型遺伝子の１つまたは複数の突然変異など）に特異的に結合する。一部の例において、試料は、それぞれ特定の標的核酸分子に特異的に結合する１つまたは複数のＮＰＰＦと接触し、さらに、それぞれ少なくとも２つの異なる標的核酸分子（例えば野生型遺伝子および野生型遺伝子の１つまたは複数の突然変異など、例えば図１０を参照）に特異的に結合する１つまたは複数のＮＰＰＦと接触する。一例において、少なくとも１つのＮＰＰＦは、ｍｉＲＮＡ標的核酸分子に特異的であり、少なくとも１つのＮＰＰＦは、ｍＲＮＡ標的核酸分子に特異的である。一部の例において、少なくとも１０個の異なるＮＰＰＦは、試料と共にインキュベートされる。しかしながら、一部の例において、単一の標的核酸分子に特異的な１つより多くのＮＰＰＦ（例えば２、３、４、５、１０、２０個、またはそれより多く）、例えば同じ標的核酸の異なる領域に特異的なＮＰＰＦの集団、または標的核酸およびそれらのバリエーション（例えば突然変異または多形を有するものなど）に結合できるＮＰＰＦの集団などが使用できることが認識されている。例えば、低く発現される核酸標的は、より高いレベルで発現される核酸標的に比べてより多くのそれにハイブリダイズするＮＰＰＦを有する場合があり、例えば、４つのＮＰＰＦが低く発現される核酸標的にハイブリダイズし、単一のＮＰＰＦが高く発現される核酸標的にハイブリダイズする。したがって、ＮＰＰＦの集団は、少なくとも２つの異なるＮＰＰＦ集団（例えば２、３、４、５、１０、２０、または５０個の異なるＮＰＰＦ配列など）を含んでいてもよく、各ＮＰＰＦ集団（または配列）は、異なる標的核酸分子に特異的に結合する。
【００７２】
本方法は、試料を、フランキング配列を含む少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）と、ＮＰＰＦが標的核酸分子に特異的に結合するかまたはハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップを含む。ハイブリダイゼーションは、第１の核酸分子（例えば、ＮＰＰＦ）と第２の核酸分子（例えば、核酸標的およびＣＦＳ）との間に安定で特異的な結合（例えば、塩基対合）が起こるように、２つの核酸分子間に十分な程度の相補性が存在する場合に起こるプロセスである。ＮＰＰＦ分子は、５’末端および３’末端に加えて、その間の標的核酸分子の全てまたは一部に相補的な配列を含む。核酸配列の５’末端は、末端残基の５’の位置がヌクレオチドと結合していないところである。核酸分子の３’末端は、末端残基の３’においてそれに結合したヌクレオチドがない末端である。これは、ＮＰＰＦと標的核酸分子との特異的な結合またはハイブリダイゼーションを許容する。例えば、標的核酸分子の領域に相補的なＮＰＰＦの領域は、高い特異性で、標的核酸分子のその領域に結合するかまたはハイブリダイズする。ＮＰＰＦ分子はさらに、１つまたは複数のフランキング配列を含み、このフランキング配列は、ＮＰＰＦの５’末端および／または３’末端にある。したがって、１つまたは複数のフランキング配列は、標的核酸分子に相補的な配列の５’、３’、または両方に配置される。各フランキング配列は、数個の連続したヌクレオチドを含み、核酸分子中に認められないが他の様式で試料中に存在する配列（例えば少なくとも１２個の連続したヌクレオチドの配列など）が生成される。ＮＰＰＦが５’末端および３’末端の両方にフランキング配列を含む場合、一部の例において、各ＮＰＰＦの配列は、異なっており、互いに相補的ではない。一例において、ＮＰＰＦ（例えば一方もしくは両方のフランキング配列中、および／または標的核酸分子の全てもしくは一部に相補的な領域の配列中の）は、少なくとも１つのｄＵＴＰ、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのｄＵＴＰ（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のｄＵＴＰ）を含む。一例において、ＮＰＰＦ中の「Ｔ」の全てが、「Ｕ」で置き換えられている。このような塩基の存在は、一本鎖ＮＰＰＦを、後のステップで（例えば、ライゲートした標的からのＮＰＰＦの変性の後、ただしシーケンシングの前、例えばライゲートした標的の増幅の前またはその間に）ウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で分解または破壊することを可能にする。一例において、ＮＰＰＦ（例えば標的核酸分子の全てまたは一部に相補的な領域の配列中の、またはフランキング領域の配列中の）は、少なくとも１ヌクレオチドのミスマッチを含み、例えば、標的核酸分子に相補的ではないヌクレオチドを含む。例えば、図１０で示されるように、配列番号１は、１２位に「Ａ」の代わりに「Ｇ」を含有し、配列番号８は、１５位に「Ａ」の代わりに「Ｇ」を含有し、配列番号１７は、１３位に「Ｃ」の代わりに「Ｔ」を含有する。一部の例において、ミスマッチは、フランキング配列中に存在しない。一部の例において、ミスマッチは、フランキング配列の２塩基以内に存在しない（すなわち、ＮＰＰＦの標的核酸分子の全てまたは一部に相補的な領域の５’末端または３’末端の２塩基以内ではない）。一部の例において、ミスマッチしたヌクレオチドは、フランキング配列と標的核酸分子の領域に相補的なＮＰＰＦの領域との間のジャンクションに存在せず、例えば、このようなジャンクションから１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドである。一部の例において、ミスマッチの存在は、ＮＰＰＦを標的核酸分子と区別することを可能にする。
【００７３】
フランキング配列は、相補的フランキング配列（ＣＦＳ）に相補的である。ＣＦＳは、増幅プライマーの少なくとも一部に相補的な万能なハイブリダイゼーション／増幅配列を提供する。一部の例において、ＣＦＳは、実験的タグ、シーケンシングアダプター、またはそれらの組合せを含んでいてもよい（またはそれらの付加を許容する）。一部の例において、少なくとも一方のフランキング配列は、少なくとも１つのｄＵＴＰを含む。一部の例において、ＮＰＰＦは、それぞれ少なくとも１つのｄＵＴＰを有する２つのフランキング配列を含む。一部の例において、ＮＰＰＦは、２つのフランキング配列を含むが、１つのみが少なくとも１つのｄＵＴＰを有する。一部の例において、ＮＰＰＦは、少なくとも１つのｄＵＴＰを有する単一のフランキング配列を含む。一部の例において、ｄＵＴＰの配置は、標的核酸分子の領域に相補的な配列に近接しており、例えば、標的核酸分子の領域に相補的な配列から１、２、３、４、５塩基離れている（例えば、上記配列の１、２、３、４、５塩基以内である）。一部の例において、ｄＵＴＰの配置は、標的核酸分子の領域に相補的な配列から少なくとも２塩基（例えば少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５塩基）離れている。
【００７４】
本方法は、試料を、フランキング配列（ＣＦＳ）に対する相補性を有する少なくとも１つの核酸分子と、ＣＦＳがＮＰＰＦのフランキング配列に特異的に結合するかまたはハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップをさらに含む。例えば、ＮＰＰＦが５’−フランキング配列を有する場合、試料を、５’−フランキング配列に相補的な配列（５ＣＦＳ）および５’末端リン酸を有する核酸分子と、５’−フランキング配列が５ＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下で接触させる。同様に、ＮＰＰＦが３’−フランキング配列を有する場合、試料を、３’−フランキング配列に相補的な配列（３ＣＦＳ）を有する核酸分子と、３’−フランキング配列が３ＣＦＳに特異的に結合するのに十分な条件下で接触させる。一例において、３ＣＦＳおよび５ＣＦＳの少なくとも１つは、標的配列の捕獲、分離、回収、または単離を許容する捕獲部分を含む。当業者は、フランキング配列を保護するのに単一のＣＦＳを使用する代わりに、複数のＣＦＳを使用してフランキング配列を保護することができる（例えば、５’−フランキング配列を保護するのに複数の５ＣＦＳを使用することができる）ことを理解するであろう。一部の例において、標的核酸分子は、ＤＮＡであり、５ＣＦＳおよび３ＣＦＳは、ＤＮＡであるか、または５ＣＦＳは、ＤＮＡであり、３ＣＦＳは、ＲＮＡである。一部の例において、標的核酸分子は、ＲＮＡであり、５ＣＦＳは、ＤＮＡであり、３ＣＦＳは、ＲＮＡであるか、または５ＣＦＳは、ＲＮＡであり、３ＣＦＳは、ＲＮＡである。一部の例において、標的核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、５ＣＦＳおよび／または３ＣＦＳは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴであり、例えば５’塩基または５ＣＦＳの塩基および／または３’塩基または３ＣＦＳの塩基は、ＲＮＡであり、５ＣＦＳおよび３ＣＦＳの残りは、ＤＮＡである。一部の例において、１つまたは複数のＣＦＳは、塩基への改変、またはＣＦＳの３’もしくは５’末端への改変、例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｒａｔｅ）結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）をもたらすヌクレオチド（例えば、２’酸素および４’炭素を接続する余分な架橋で改変されたリボース）、または鎖ターミネーター（例えば、ｄｄＣＴＰまたは転位したＴ塩基）などを含有する。
【００７５】
これにより、標的核酸分子（またはその一部）に加えてＣＦＳに結合したＮＰＰＦ分子が生成され、それによってハイブリダイゼーションで標的およびＣＦＳ上の相補的塩基に係合したＮＰＰＦの塩基を含む二本鎖分子が生成される。ＣＦＳは、それに続くステップで、ヌクレアーゼでの消化物からのその対応するフランキング配列にハイブリダイズし、したがってそれを保護する。一部の例において、各ＣＦＳは、その対応するフランキング配列の正確な長さを有する。一部の例において、ＣＦＳは、その対応するフランキング配列に完全に相補的である。しかしながら、当業者は、５’末端フランキング配列を保護する５ＣＦＳの３’末端または３’末端フランキング配列を保護する３ＣＦＳの５’末端は、これらの位置のそれぞれにおいて、例えばヌクレオチドミスマッチ、上記で論じられた改変、またはそれらの組合せなどの差を有していてもよいことを理解するであろう。
【００７６】
標的核酸分子およびＣＦＳをＮＰＰＦに結合させた後、本方法はさらに、試料を、一本鎖（ｓｓ）核酸分子または核酸分子のｓｓ領域に特異的なヌクレアーゼ、例えばＳ１ヌクレアーゼなどと、相補的塩基にハイブリダイズしない核酸塩基を除去するのに十分な条件下で接触させるステップを含む。したがって、例えば、標的核酸分子またはＣＦＳに結合していないＮＰＰＦ、加えて未結合の一本鎖標的核酸分子、試料中の他のｓｓ核酸分子、および未結合のＣＦＳが分解される。これにより、５ＣＦＳ、３ＣＦＳ、または両方、および標的核酸の一部にハイブリダイズした二本鎖付加物として存在するインタクトなＮＰＰＦを含む消化された試料が生成される。一部の例において、例えばＮＰＰＦがＤＮＡで構成される場合、ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組合せを含み得る。
【００７７】
その後、ＣＦＳを、標的核酸にライゲートすることができ、例えば５ＣＦＳの５’−リン酸を標的核酸分子の３’末端にライゲートし、３ＣＦＳの３’末端を標的核酸分子の５’末端にライゲートし、それによってライゲートした標的核酸分子（本明細書ではライゲートした標的またはｃＮＰＰＦと称される）が生成される。一部の例において、ライゲーションに加えて、ＣＦＳを、ポリメラーゼ処理（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）に供し、例えば、ヌクレアーゼ処理中に除去された可能性があるヌクレオチドを置き換える。ポリメラーゼ処理は、例えば同じ反応容器で、ライゲーションと同時に実行してもよい。一部の例において、ポリメラーゼ処理は、ライゲーションの前に実行される。
【００７８】
二本鎖ＮＰＰＦ：ライゲートした標的核酸分子は、ｓｓ核酸分子に分離され（例えば、変性を促進する環境を作り出すこと、例えば加熱（例えば、緩衝液中で約９５℃またはｄＨ２Ｏ中で約５０℃）、試料のｐＨを増加させること、または５０％ホルムアミド／０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤での処理、またはこのような処理の組合せなどによって）、それによってｓｓＮＰＰＦおよびｓｓのライゲートした標的核酸分子の混合物が生成される。一例において、二本鎖ＮＰＰＦ：ライゲートした標的核酸分子は、水中の０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤中で５０℃１０分、３回洗浄することによって、ｓｓ核酸分子に分離される。一例において、二本鎖ＮＰＰＦ：ライゲートした標的核酸分子は、室温で５０％ホルムアミド／０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤で洗浄することによって、ｓｓ核酸分子に分離される。一部の例において、二本鎖ＮＰＰＦ：ライゲートした標的のその対応するｓｓ核酸分子への分離は、例えば標的分子がＲＮＡであり、ＮＰＰＦがＤＮＡであり、３ＣＦＳおよび５ＣＦＳがＲＮＡである場合、ＤＮアーゼでの処理を含む。このような例において、ＮＰＰＦは、ライゲートしたＲＮＡ標的分子から分解、切断、消化、分離することができ、またはそれらの組合せを行ってもよく、それによって遊離したｓｓのライゲートした標的のさらなる分析（例えば増幅、逆転写、シーケンシング、またはそれらの組合せなど）が可能になる。一部の例において、二本鎖ＮＰＰＦ：ライゲートした標的のその対応するｓｓ核酸分子への分離は、例えば標的分子がＤＮＡであり、ＮＰＰＦがＲＮＡであり、３ＣＦＳおよび５ＣＦＳがＤＮＡである場合、ＲＮアーゼでの処理を含む。このような例において、ＮＰＰＦは、ライゲートしたＤＮＡ標的分子から分解、切断、消化、分離することができ、またはそれらの組合せを行ってもよく、それによって遊離したｓｓのライゲートした標的のさらなる分析（例えば増幅、シーケンシング、またはそれらの組合せなど）が可能になる。ｓｓのライゲートした標的核酸分子は、任意選択で、例えばそれを捕獲することによって、例えばハイブリダイゼーションまたは捕獲部分（例えば、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳ上の）の使用によって回収される。一部の例において、ｓｓＮＰＰＦおよびｓｓのライゲートした標的核酸分子の混合物は、少なくとも１つのｄＵＴＰ（例えば２、３、４、５、または６つまたはそれより多くのｄＵＴＰ）を有するｓｓＮＰＰＦを切断または破壊するのに十分な条件下で、ウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）と共にインキュベートされる。
【００７９】
本方法は、例えばＮＰＰＦ、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳの使用によって、シーケンシングされる標的の捕獲または回収を可能にする１つまたは複数のステップを含んでいてもよい。例えば、図２Ｂ〜２Ｄで示されるように、このような捕獲は、ハイブリダイゼーション中に、ヌクレアーゼ消化後に、またはハイブリダイゼーション後に、ただしライゲーションの前に行うことができる。図２Ａおよび２Ｃは、捕獲がヌクレアーゼ消化の後になされる例を示す。さらに、例えばライゲーション後に、追加の捕獲ステップが含まれていてもよい。一例において、ＮＰＰＦ、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳは、固体基板（例えばマルチウェルプレートなど）に付着しており、それにより、捕獲される分子を、それらが係留されたＮＰＰＦ、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳにハイブリダイズさせることを可能にする。別の例において、捕獲部分（例えば標的、ＮＰＰＦ、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳに付着した粒子または標識など）を使用して、捕獲部分を含有する分子に付着またはハイブリダイズした分子を、試料の他の構成要素から物理的に分離することを可能にする。捕獲方法に応じて、このような方法は、固体捕獲部分を収集するための遠心分離、磁気ビーズの捕獲、固体支持体への結合またはハイブリダイゼーション、ろ過などを含んでいてもよい。加えて、このような捕獲ステップは、捕獲された核酸分子を洗浄することを含んでいてもよい（それによって捕獲されていない分子、例えばハイブリダイズしていないＮＰＰＦおよびハイブリダイズしていないＣＦＳなどを、分離または除去することができる）。このような方法は、例えばマルチウェルプレートのウェルまたは単回反応用の管もしくは容器などの固体支持体から捕獲された核酸分子を放出させることを含んでいてもよいし、または捕獲された核酸分子は、固体支持体に、または固体支持体中に付着されたままでもよい。一部の例において、このステップは、例えば容器または管の底部に標的核酸分子を捕獲するための遠心分離、および望ましくないまたは不必要な薬剤を除去するために洗浄することを含む。一部の例において、このステップは、磁気ビーズによる標的核酸分子の捕獲、および望ましくないまたは不必要な薬剤を除去するための洗浄を含む。一部の例において、このステップは、標的核酸分子を捕獲するためのろ過、および望ましくないまたは不必要な薬剤を除去するための洗浄を含む。このステップは、標的核酸分子を洗浄することを含んでいてもよく、この洗浄は、一部の例において、もはや必要でない薬剤（例えば、ヌクレアーゼ）を除去し、および／または標的核酸分子を別の溶液中に懸濁することを許容し、それにより、特定の方法の実施形態では、１つまたは複数の次のステップを容易にすることができる。
【００８０】
一部の例において、本方法の複数のステップ（例えば図２Ａに示されるステップのうち２、３、または４つなど）が、同じ容器またはコンテナー中で実行される。例えば、開示された方法は、複数のステップにわたり同じ容器中に望ましい構成要素を留めつつ、望ましくないまたは不必要な構成要素を除去する（例えば、繰り返しの捕獲および洗浄ステップを使用して）。例えば、分析される試料は、容器中で溶解することができる。その容器に、適切なＮＰＰＦおよびＣＦＳを添加し、その容器にヌクレアーゼを添加し、その容器中でｄｓ核酸分子を捕獲する（例えば、容器の底部に引き寄せられた磁気ビーズを用いて）。捕獲されたｄｓ核酸分子を洗浄して望ましくない薬剤を除去し、容器に望ましい緩衝液または試薬（例えば、リガーゼ緩衝液）を添加する。次いで容器中でｓｓのライゲートした標的核酸分子を捕獲し、洗浄することができる。
【００８１】
ライゲートした標的核酸分子を、任意選択で、例えばＰＣＲ増幅を使用して増幅する。このような方法は、実験タグおよび／または配列アダプターをライゲートした標的に付加するため、および／またはライゲートした標的のコピー数を増加させるために使用することができる。ｓｓのライゲートした標的核酸分子（またはそのアンプリコン）の少なくとも一部がシーケンシングされ、それによって試料中の少なくとも１つの標的核酸分子の配列が決定される。一部の例において、標的核酸分子は、ＲＮＡであり、本方法は、シーケンシングの前にそれらをＤＮＡに逆転写することを含む。
【００８２】
ライゲートした標的は、１つまたは複数の増幅プライマーを使用して増幅することができ、それによってライゲートした標的アンプリコンが生成される。少なくとも１つの増幅プライマーは、標的にライゲートしたＣＦＳに相補的な領域を含む。一部の例において、標的は、その５’末端における５ＣＦＳおよびその３’末端における３ＣＦＳにライゲートされ、２つの増幅プライマーが使用され、この場合、一方の増幅プライマーは、５ＣＦＳの領域に同一な領域を有し、他方の増幅プライマーは、３ＣＦＳの領域に相補的な領域を有する。一部の例において、標的は、それぞれその５’末端および３’末端における５ＣＦＳまたは３ＣＦＳのいずれかにライゲートされ、１つの増幅プライマーが使用され（例えば迅速増幅またはｃＤＮＡ末端を使用して）、この場合、増幅プライマーは、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳの領域に相補的な領域を有する。増幅プライマーの一方または両方は、実験タグおよび／または増幅中にライゲートした標的アンプリコンへのシーケンシングアダプターの付着を許容する配列を含んでいてもよく、一方または両方のプライマーを標識して、ＮＰＰＦアンプリコンの標識付けを許容することができる。一部の例において、実験タグおよびシーケンシングアダプターの両方は、例えばライゲートした標的アンプリコンの逆の末端に付加される。例えば、このようなプライマーの使用により、ライゲートした標的アンプリコンの５’末端もしくは３’末端から、または３’末端および５’末端の両方から伸長する実験タグおよび／または配列アダプターが生成して、生じ得る多重性の程度を増加させることができる。実験タグは、試料、対象、または標的核酸配列の同定を許容する固有な核酸配列を含んでいてもよい。シーケンシングアダプターは、シーケンシングプラットフォーム上で得られたライゲートした標的アンプリコンの捕獲を許容する核酸配列を含んでいてもよい。一部の例において、プライマーは、シーケンシングの前に混合物から除去される。
【００８３】
ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコン（またはそれらの一部）がシーケンシングされる。ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンをシーケンシングするための任意の方法を使用することができ、本開示は、特定のシーケンシング方法に限定されない。一部の例において、使用されるシーケンシング方法は、鎖終結シーケンシング、色素終結シーケンシング、パイロシーケンシング、ナノポアシーケンシング、または大規模並列シーケンシング（次世代シーケンシング（またはＮＧＳ）とも称される）であり、その例示としては、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ（商標））、ＩｌｌｕｍｉｎａブランドのＮＧＳシーケンサー（例えば、ＭｉＳｅｑ（商標）、ＨｉＳｅｑ（商標））（またはそれ以外のものとしてＳｏｌｅｘａ（商標）シーケンシングから派生したもの）、およびＲｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓより入手可能な４５４シーケンシングが挙げられる。一部の例において、単一分子シーケンシングが使用される。一部の例において、本方法はまた、得られた標的配列を配列データベースと比較して、例えば、標的突然変異が存在しているか、または存在していないかを決定することも含む。一部の例において、本方法は、例えばｂｏｗｔｉｅ、ｂｏｗｔｉｅ２、またはＴＭＡＰ配列アライナーを使用して、得られた各標的配列（例えば、野生型、ＳＮＰ、新たに同定されたバリアントなど）の数を決定すること（例えば、計数すること）を含む。一部の例において、本方法は、適切なゲノム（例えば、標的核酸分子がヒト遺伝子である場合、適切なゲノムはヒトゲノムである）またはそれらの一部にシーケンシング結果をアラインすることを含む。一例において、本方法は、予期される標的配列のみにアラインすること、ただし予期される配列への適合と予期される配列内のあらゆる変化の両方を挙げることを含む。
ＩＩ．標的核酸分子の直接シーケンシングの方法
【００８４】
試料中に存在する１つまたは複数の標的核酸分子の直接シーケンシングの方法が本明細書で開示される。一部の例において、同じ試料または同じアッセイで、少なくとも２つの異なる標的核酸分子が検出される。一部の例において、少なくとも２つの異なる試料またはアッセイで（例えば、異なる患者からの試料で）、同じ標的核酸分子が検出される。したがって、開示された方法は、多重化（例えば、単一試料中の複数の標的を検出すること）、ハイスループット（例えば、複数の試料中の標的を検出すること）、または多重化かつハイスループット（例えば、複数の試料中の複数の標的を検出すること）が可能である。
【００８５】
開示された方法において、ＮＰＰＦのそれらの標的および対応するＣＦＳへのハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ消化の後、ＣＦＳを標的にライゲートさせて（一部の例において、ポリメラーゼで処理して）、ライゲートした標的が生成される。次いでｄｓＮＰＰＦ：ライゲートした標的を分離して（例えば、変性させ）、結果としてｓｓＮＰＰＦおよびｓｓのライゲートした標的を得る。一部の例において、ｓｓのライゲートした標的を、例えば３ＣＦＳまたは５ＣＦＳ上の捕獲部分を使用することによって、回収または捕獲する（例えば、ＮＰＰＦから単離する）。一部の例において、例えばＣＦＳに相補的な（さらに、ライゲートした標的に実験タグおよび／または配列アダプターの取り込みを可能にする配列を含んでいてもよい）領域を有するプライマーを使用することによって、ｓｓのライゲートした標的を増幅する。次いでこのｓｓのライゲートした標的を直接的にシーケンシングすることができる（またはそのアンプリコンをシーケンシングすることができる）。一部の例において、開示された方法は、例えば変動が２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、または０．１％以下、例えば０．００１％〜５％、０．０１％〜５％、０．１％〜５％、または０．１％〜１％などの、試験試料中と同様の類似した相対的な量の核酸分子である、シーケンシングされた核酸分子を提供する。
【００８６】
図１Ａおよび１Ｂは、例示的なＮＰＰＦを示す概略図である。図１Ａで示されるように、少なくとも一方のフランキング配列を有するヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）１００は、標的核酸配列（例えば、標的核酸配列の少なくとも一部）に特異的に結合する（例えばハイブリダイズする）配列を含む領域１０２を含む。標的核酸配列に特異的に結合する（例えばハイブリダイズする）配列を含む領域１０２、またはフランキング配列１０４、１０６、は、計画的なヌクレオチドミスマッチを含んでいてもよく（すなわち、ヌクレオチドは、それぞれ標的配列中またはＣＦＳ中の対応するヌクレオチドに相補的ではなく）、それにより例えば標的分子からＮＰＰＦを区別することを可能にする。標的核酸配列は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）もしくはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）、または両方であってもよい。ＮＰＰＦは、１つまたは複数のフランキング配列１０４および１０６を含む。図１Ａは、５’−フランキング配列１０４および３’−フランキング配列１０６の両方を有するＮＰＰＦ１００を示す。しかしながら、ＮＰＰＦは、一部の例において、１つのみのフランキング配列（例えば、１０４または１０６の１つのみ）を有していてもよい。一部の例において、ＮＰＰＦ１００は、例えばフランキング配列１０４、１０６の少なくとも１つ中に、少なくとも１つのｄＵＴＰを含み、それにより例えばＮＰＰＦ１００の分解を許容することができる。図１Ａは、単一の核酸分子である例示的なＮＰＰＦ１００を示す。図１Ｂは、一緒にライゲートできない２つの別個の核酸分子１２８、１３０で構成される例示的なＮＰＰＦ１２０を示す。例えばＮＰＰＦ１００が１００ｍｅｒである場合、ＮＰＰＦ１２０は、２つの５０ｍｅｒであってもよい。図１Ａに示されるＮＰＰＦ１００のように、ＮＰＰＦ１２０は、標的核酸配列（例えば、標的核酸配列の少なくとも一部）に特異的に結合する（例えばハイブリダイズする）配列、および１つまたは複数のフランキング配列１２４および１２６を含む領域１２２を含む。２つの別個の核酸分子で構成されるＮＰＰＦ（図１Ｂ）の使用は、不完全なヌクレアーゼ消化によるバックグラウンドシグナルを減少させるのに使用することができる。
【００８７】
図２Ａは、ＮＰＰＦ２０２を使用して核酸分子をシーケンシングするための開示された方法の実施形態の概説を示す概略図である。ステップ１で示されるように、試料（例えば、試料崩壊緩衝液で処理済みの（例えば、溶解するかまたはそれ以外の方法で処理して核酸を接近可能にした）標的核酸２００を含有することがわかっているかまたはその疑いのある試料など）は、第１の標的核酸２００（例えば標的ＤＮＡまたはＲＮＡなど）に特異的に結合する少なくとも１つのＮＰＰＦを含む、１つまたは複数のフランキング配列（ＮＰＰＦ）２０２（ここでは５’および３’−フランキング配列の両方、すなわちそれぞれ２０４および２０６と共に示される）を有する複数のヌクレアーゼ保護プローブと接触させるかまたはインキュベートする。一部の例において、少なくとも１つのＮＰＰＦ２０２は、複数の標的核酸分子、例えば特定の遺伝子の野生型およびバリアント配列など（例えば、図１０を参照）に結合することができる。この反応はまた、第２の標的核酸（または複数の追加の標的核酸分子）に特異的に結合する他のＮＰＰＦなども含んでいてもよい。一例において、本方法は、それぞれの固有な標的核酸分子に特異的になるように設計された１つまたは複数の異なるＮＰＰＦを使用する。したがって、１００個の異なる核酸標的（例えば、遺伝子または遺伝子発現産物）の測定は、少なくとも１００個の異なるＮＰＰＦを使用することができ、ここで標的１つ当たり少なくとも１つのＮＰＰＦが特異的である（例えば標的１つ当たり数個の異なるＮＰＰＦ）。別の例において、本方法は、複数の標的核酸分子、例えば野生型遺伝子およびそれらのバリエーションに特異的になるように設計された１つまたは複数の異なるＮＰＰＦを使用する。したがって、複数の異なる核酸標的の測定は、単一のＮＰＰＦを使用することができる。一部の例において、これらの２つのタイプのＮＰＰＦの組合せは、単一の反応で使用される。したがって、本方法は、少なくとも２つの異なるＮＰＰＦ、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、または少なくとも２０００個の異なるＮＰＰＦ（例えば、２から５００、２から１００、５から１０、２から１０、２から２０、１００から５００、１００から１０００、５００から５０００、または１０００から３０００個の異なるＮＰＰＦ）を使用することができる。加えて、一部の例において、複数のＮＰＰＦは、単一の標的核酸分子に特異的な１つより多くの（例えば２、３、４、５、１０、２０、５０個またはそれより多くの）ＮＰＰＦ（これは、ＮＰＰＦのタイル状のセット（ｔｉｌｅｄ  ｓｅｔ）と称される）を含んでいてもよいことが理解されるであろう。この反応はまた、フランキング配列（ＣＦＳ）２０８、２１０に相補的な核酸分子も含む。したがって、ＮＰＰＦが５’−フランキング配列２０４を有する場合、この反応は、５’−フランキング配列に相補的な配列（５ＣＦＳ）２０８を含み、ＮＰＰＦが３’−フランキング配列２０６を有する場合、この反応は、３’−フランキング配列���相補的な配列（３ＣＦＳ）２１０を含む。一部の例において、５ＣＦＳ２０８は、５’末端リン酸を有し（例えば、図３を参照）、それにより後のステップにおける標的２００へのライゲーションが可能になる。一部の例において、ＣＦＳの少なくとも１つは、望ましい時間で標的の回収を許容する捕獲部分２１２を含む。捕獲部分２１２は、５ＣＦＳ２０８で示されているが、それが存在する実施形態では、代替として３ＣＦＳ２１０、ＮＰＰＦ２０２または標的２００上に存在していてもよいことが理解されるであろう。当業者は、ＣＦＳの配列は存在するフランキング配列に応じて様々であることを理解するであろう。加えて、フランキング領域が保護されていることを確認するのに、１つより多くのＣＦＳを使用することができる（例えば、単一のフランキング配列の異なる領域に結合する少なくとも２つのＣＦＳを使用することができる）。ＣＦＳは、天然または天然にはない塩基を含んでいてもよい。
【００８８】
図３は、５ＣＦＳ２０８、標的２００、および３ＣＦＳ２０８の方向（例えば、各分子の５’および３’末端に関する）のさらなる詳細を示す。図２に関して上記で論じられたように、図３の捕獲部分２１２は任意選択であるか、または３ＣＦＳ２１０または標的２００上にあってもよい。試料、ＮＰＰＦおよびＣＦＳを、ＮＰＰＦがそれらそれぞれの標的核酸分子に特異的に結合する（例えばハイブリダイズする）のに十分な条件下で、さらに、ＣＦＳがＮＰＰＦフランキング配列上のそれらの相補的配列に結合する（例えばハイブリダイズする）のに十分な条件下でインキュベートする。一部の例において、ＣＦＳ２０８、２１０は、ＮＰＰＦ２０２より過剰に添加され、例えばＮＰＰＦより少なくとも２倍多くのＣＦＳ（過剰モル量で）、例えば、ＮＰＰＦより、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍多くのＣＦＳが添加される。一部の例において、ＮＰＰＦ２０２は、試料中の総核酸分子より過剰に添加され、例えば、試料中の総核酸分子より少なくとも５０倍多くのＮＰＰＦ（過剰モル量で）、例えば、試料中の総核酸分子より、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍多くのＮＰＰＦが添加される。実験上の便宜のために、測定された最も豊富な核酸標的に関して、その核酸標的に対する少なくとも５０倍多くのＮＰＰＦ、例えば少なくとも１００倍過剰のＮＰＰＦが存在するようにカクテルを作製するために、類似の濃度の各ＮＰＰＦを含めることができる。使用される全てのＮＰＰＦの実際の過剰な量および総量は、標的核酸標的にハイブリダイズしない全てのＮＰＰＦを破壊するヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）の能力によってのみ制限される。一部の例において、この反応を加熱し、例えば５０℃で一晩インキュベートする（例えば１６時間）。
【００８９】
図２Ａのステップ２で示されるように、結合／ハイブリダイゼーション反応を生じさせた後、ｓｓ核酸分子、例えば未結合の核酸分子など（例えば未結合のＮＰＰＦ、未結合のＣＦＳ、および未結合の標的核酸分子など、またはこのような分子の一本鎖のままの部分、例えば標的核酸分子のＮＰＰＦに結合していない部分など）を除去（または消化する）するのに十分な条件下で、試料を一本鎖（ｓｓ）核酸分子に特異的な試薬（例えばヌクレアーゼなど）と接触させる。これにより、ｄｓＮＰＰＦ／標的のハイブリダイズした複合体（または二重鎖）２１４が生成される。図２Ａで示されるように、試料をｓｓ核酸分子に特異的なヌクレアーゼと共にインキュベートすることにより、存在する全てのｓｓ核酸分子の分解が起こり、結合したＮＰＰＦ、ならびにＣＦＳおよび標的核酸分子などのインタクトな二本鎖核酸分子が残る。例えば、この反応は、Ｓ１ヌクレアーゼと共に５０℃で１．５時間インキュベートすることができる（加水分解が、他の温度で起こる可能性があり、他の期間で行ってもよく、部分的に、必要な時間および温度は、加水分解に必要なヌクレアーゼの量および核酸の量、加えて保護されている二本鎖領域のＴｍに応じて決まる）。
【００９０】
図２Ａのステップ３で示されるように、ＮＰＰＦ／標的複合体２１４（これは、ライゲーション前のある時点で捕獲または回収され、図２Ｂ〜２Ｄを参照すれば、ハイブリダイズしていない材料が除去される）は、標的配列２００（これは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい）をＣＦＳ（例えば、５ＣＦＳ２０８、３ＣＦＳ２１０、または両方）にライゲートさせるライゲーション条件に晒され、それによってライゲートした標的２１６が生成される。標的配列およびＣＦＳを共有結合で合体させることが可能なあらゆるリガーゼ、例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、またはＴａｑリガーゼなどを、使用することができる。使用されるリガーゼは、標的配列に最も近いＣＦＳに存在するヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）によって決めることができる。図４は、ライゲートされるエレメントのさらに詳細な図を示す。５ＣＦＳ２０８は、標的２００の３’末端にライゲートすることができる５’末端リン酸を含んでいてもよい。３ＣＦＳ２１０は、標的の５’末端リン酸にライゲートすることができる３’末端（例えば３’末端ヌクレオチドなど）を含んでいてもよい。３ＣＦＳ２１０は、オリゴヌクレオチドの５’末端の近くに（ただし５’末端にではなく）、ストレプトアビジンビーズまたは他の固体支持体への結合を可能にする内部ビオチン化Ｔを含んでいてもよい。代替として、５ＣＦＳ２０８は、オリゴヌクレオチドの３’末端の近くに（ただし３’末端にではなく）、ストレプトアビジンビーズまたは他の固体支持体への結合を可能にする内部ビオチン化Ｔを含んでいてもよい。２つのＣＦＳが示されているが、単一のＣＦＳの実施形態もこの開示により予期される。１つのみのフランキング配列がＮＰＰＦに存在する場合、１つのみのＣＦＳがＮＰＰＦ／標的複合体において結合することになり、標的が１つのみのＣＦＳにライゲートする。ＣＦＳは、ＤＮＡまたはＲＮＡ（または両方のヌクレオチドタイプの混合物）であってもよい。ＣＦＳまたは標的がＤＮＡである場合、ＤＮＡへのライゲーションのための５’末端リン酸ドナーは、リボヌクレオチドであることはできない。一例において、標的がＲＮＡである場合、５ＣＦＳ２０８は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、３ＣＦＳ２１０は、ＲＮＡである。一例において、標的がＤＮＡである場合、５ＣＦＳ２０８は、ＤＮＡであるか（または５ＣＦＳ２０８の少なくとも５’末端ヌクレオチドは、標的の３’末端にライゲートするｄＮＴＰであるか）またはＲＮＡであり、３ＣＦＳ２１０は、ＲＮＡである。
【００９１】
一部の例において、図２Ａのステップ３はまた、ライゲーションに加えて、重合ステップも含む。例えば、重合は、ライゲーションと同時に（例えば、同じ反応で）、またはライゲーションの前に実行することができる。これは、ヌクレアーゼステップ中にＣＦＳまたは標的から偶発的に除去されたヌクレオチドを回復させることができる。一部の例において、使用されるポリメラーゼは、有意な鎖置換活性または５’−３’エキソヌクレアーゼ能力を有さない（これは、単に失われた塩基を置き換えるというよりプローブにハイブリダイズした標的を除去して置き換えることができる）。一例において、例えばＴ４またはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼ欠損熱安定性ポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼが、ｄＮＴＰの存在下で使用される。一例において、ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼではない（エキソヌクレアーゼ活性を失っていない限り）。一例において、例えばＥ．ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼが、ｒＮＴＰの添加を伴い使用される。ＲＮＡポリメラーゼが使用される場合、本方法は、逆転写ステップをさらに含んでいてもよい（例えば、以下で論じられるライゲートした標的２１６のＰＣＲ増幅のときに）。一部の例において、例えば標的がＤＮＡおよびＲＮＡを含む場合、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼの両方が使用される。
【００９２】
図２Ａのステップ４で示されるように、ＣＦＳを標的にライゲートした後、ライゲートした標的２１６からＮＰＰＦ２０２を分離する。すなわち、ＮＰＰＦ／標的複合体２１４（例えば、二本鎖核酸分子）は、２つの一本鎖核酸分子、ＮＰＰＦ２０２およびライゲートした標的２１６に分離される。一部の例において、ＮＰＰＦ２０２をＤＮアーゼで処理し、それによってライゲートした標的２１６からＮＰＰＦ２０２を分離することを可能にする。このような例において、ＮＰＰＦ２０２は、ＤＮＡであってもよく、標的２００は、ＲＮＡであってもよく、５ＣＦＳ２０８は、ＲＮＡであってもよく、３ＣＦＳ２１０は、ＲＮＡであってもよい。一部の例において、ＮＰＰＦ２０２をＲＮアーゼで処理し、それによってライゲートした標的２１６からＮＰＰＦ２０２を分離することを可能にする。このような例において、ＮＰＰＦ２０２は、ＲＮＡであってもよく、標的２００は、ＤＮＡであってもよく、５ＣＦＳ２０８は、ＤＮＡであってもよく、３ＣＦＳ２１０は、ＤＮＡであってもよい。このステップはまた、ライゲートしていない核酸分子（例えば、ライゲートしていないＣＦＳ）を除去することもできる。例えば、この反応物を、ライゲートした標的２１６からＮＰＰＦ２０２を解離させる条件下で加熱するかまたはｐＨを変更することができ（例えば、塩基性ｐＨを有する反応物が得られるように）、結果として一本鎖ＮＰＰＦ２０２および一本鎖のライゲートした標的２１６の混成集団が生じる。一部の例において、反応物にＤＮアーゼを添加して、ＤＮＡで構成されるＮＰＰＦ２０２を、分解、消化、切断、分離することができ、またはそれらの任意の組合せを行ってもよく、それにより、ライゲートした標的２１６（これは、この例においてＲＮＡであり得る）をＮＰＰＦ２０２から遊離または分離させることが許容される。一部の例において、反応物にＲＮアーゼを添加して、ＲＮＡで構成されるＮＰＰＦ２０２を、分解、消化、切断、分離することができ、またはそれらの任意の組合せを行ってもよく、それにより、ライゲートした標的２１６（これは、この例においてＤＮＡであり得る）をＮＰＰＦ２０２から遊離または分離させることが許容される。一部の例において、ライゲートした標的２１６は、ＣＦＳ上の捕獲部分２１２を使用することによってこの混合物から分離される。本明細書に記載される捕獲方法を使用して、ライゲートした標的２１６を捕獲することができる。例えば捕獲部分２１２がビーズである場合、ライゲートした標的２１６は、遠心分離を使用して回収することができる。捕獲部分２１２が金属ビーズである場合、ライゲートした標的２１６は、磁石を使用して回収することができる。捕獲部分２１２がカルボキシル基を含む場合、ライゲートした標的２１６は、適切にアミンで標識された固体基板を使用して捕獲することができる。ライゲートした標的２１６の捕獲後、反応物の残り（例えば、ＮＰＰＦ２０２）を除去することができる（例えば、洗浄することによって）。一部の例において、ライゲートした標的２１６は、ろ過を使用して捕獲される。
【００９３】
図２Ａのステップ５で示されるように、次いで単離されたライゲートした標的２１６（またはそのアンプリコン）は、シーケンシングされる。一部の例において、複数のライゲートした標的は、並行して、例えば同時または同時発生的にシーケンシングされる。したがって、この方法を使用して、複数のライゲートした標的配列をシーケンシングすることができる。
【００９４】
任意選択で、ライゲートした標的２１６を、シーケンシングの前に増幅（例えば、ＰＣＲを使用して）、洗浄するか、または両方を行う。一部の例において、例えば少なくとも一方のフランキング配列（例えば、図１Ａの１０４、１０６）、または捕獲配列（例えば、図１Ａの１０２）がｄＵＴＰを含む場合（図５を参照）、ＮＰＰＦ２０２はウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で分解される。このような分解は、増幅の前または増幅中に行うことができる。一部の例において、例えば標的がＲＮＡである場合、逆転写ステップが増幅の一部として含まれていてもよい。したがって、得られたライゲートした標的アンプリコン２２６を次いで、シーケンシングすることができる。図５は、ＰＣＲプライマーまたはプローブを矢印として示す。ＰＣＲプライマーまたはプローブは、１つまたは複数の実験タグ２２２、２２４および／またはシーケンシングアダプター２１８、２２０（例えば、それにより、特定のシーケンシングプラットフォームによりライゲートした標的のシーケンシングを可能にするものであり、したがってこのようなアダプターは、シーケンシングチップ上の捕獲配列に相補的である）を含んでいてもよい。ＰＣＲプライマー／プローブの少なくとも一部は、５ＣＦＳ２０８および／または３ＣＦＳ２１０に特異的である。一部の例において、プライマーの濃度は、ライゲートした標的２１６より過剰であり、例えば少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも１５０，０００倍、少なくとも２００，０００倍、少なくとも４００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、少なくとも６００，０００倍、少なくとも８００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍過剰である。一部の例において、反応物中におけるプライマー２０８の濃度は、少なくとも２００ｎＭ（例えば少なくとも４００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも６００ｎＭ、少なくとも７５０ｎＭ、または少なくとも１０００ｎＭなど）である。
【００９５】
図２Ｂ〜２Ｄで示されるように、ライゲーション前の時点（例えば、図２Ａのステップ３）で、それに付着／ハイブリダイズした標的（図２Ａの２００）および他の分子が回収または捕獲され（ステップ３２０）、したがって試料中の残存する薬剤（例えば、ハイブリダイズしていない材料）の除去、および新しい試薬の添加が可能になる。加えて、標的の捕獲は、それに続く標的にハイブリダイズした、またはそれ以外の方法で付着した核酸分子の洗浄（例えば残留した酵素を不活性化または除去するために）を可能にする。
【００９６】
一例において、標的は、ハイブリダイゼーション時に回収または捕獲される（図２Ｂ）。図２Ｂで示されるように、任意選択の変性３００後、標的を含有する試料を、ハイブリダイゼーション３１０を許容する条件下でＮＰＰＦおよびＣＦＳと共にインキュベートし、それによってハイブリダイズした複合体を産生する。このような例では、標的を、ハイブリダイズするＮＰＰＦ、およびＮＰＰＦにハイブリダイズすることができるＣＦＳと共に、得られたハイブリダイズした複合体３２０の捕獲を可能にする材料を含有する固体支持体の存在下でインキュベートする。例えば、３ＣＳＦ、５ＣＳＦ、および／またはＮＰＰＦ上に存在する捕獲部分（例えば、図２Ａの２１２）は、固体支持体として利用することができる。例えば捕獲部分がビーズまたはプレートである場合（例えば、カルボキシ−アミン結合、例えばＣＦＳ上のアミノ基およびビーズ上のカルボキシなどを使用してＣＦＳに付着したもの）、固体支持体は、ビーズまたはプレートである。このケースにおいて、捕獲部分／固体支持体は、ハイブリダイズした複合体が固体支持体に結合することを可能にする（これはなぜなら、例えば、ＮＰＰＦは、固体支持体に付着したＣＦＳにハイブリダイズし、標的および他のＣＦＳは、ＮＰＰＦにハイブリダイズするためである）。本方法は、ハイブリダイゼーション後に洗浄ステップを含んでいてもよい。それに続くステップ、例えばヌクレアーゼ消化３３０、洗浄３４０、ライゲーション３５０、ＵＤＧ消化３７０（任意選択であり、ＮＰＰＦがｄＵＴＰを含む場合のみ）、および／またはＰＣＲ増幅３８０などの１つまたは複数は、固体支持体の存在下で行うことができ、それにより、試薬を除去したり捕獲された標的に添加したりすることが可能になる。
【００９７】
一例において、標的は、ヌクレアーゼ処理後に（例えば、図２Ａのステップ２の後に）、ただしライゲーション前に（例えば、図２Ａのステップ３の前に）回収または捕獲される（図２Ｃ）。図２Ｃで示されるように、任意選択の変性４００、ハイブリダイゼーション４１０、およびヌクレアーゼ消化４３０の後、ＮＰＰＦ／標的複合体（図２Ａの２１４）が産生され、ＮＰＰＦ／標的複合体は、ステップ４２０で試料混合物から回収される。一部の例において、ＮＰＰＦ／標的複合体は、ＮＰＰＦ／標的二重鎖をｓｓ核酸分子に分離することなく、ＣＦＳ上の捕獲部分を使用することによって回収される。例えば、３ＣＳＦ、５ＣＳＦ、および／またはＮＰＰＦ上に存在する捕獲部分（例えば、図２Ａの２１２）は、固体支持体として利用することができる。例えば捕獲部分がビーズまたはプレートである場合（例えば、カルボキシ−アミン結合、例えばＣＦＳ上のアミノ基およびビーズ上のカルボキシなどを使用してＣＦＳに付着したもの）、固体支持体は、ビーズまたはプレートである。このケースにおいて、捕獲部分／固体支持体は、ＮＰＰＦ／標的複合体の一部であり、その捕獲または回収が可能になる。本方法は、回収後に洗浄ステップ４４０を含んでいてもよい。それに続くステップの１つまたは複数、例えばライゲーション４５０、洗浄４６０、ＵＤＧ消化４７０（任意選択であり、ＮＰＰＦがｄＵＴＰを含む場合のみ）、および／またはＰＣＲ増幅４８０などは、固体支持体の存在下で行うことができ、それにより、試薬を除去したり捕獲された標的に添加したりすることが可能になる。
【００９８】
一例において、標的は、ハイブリダイゼーション後に（例えば、図２Ａのステップ１の後に）、ただしヌクレアーゼ消化の前に（例えば、図２Ａのステップ２の前に）回収または捕獲される（図２Ｄ）。図２Ｄで示されるように、任意選択の変性５００およびハイブリダイゼーション５１０の後、ハイブリダイズした複合体が産生され、得られたハイブリダイズした複合体は、ステップ５２０で試料混合物から回収される。一部の例において、ハイブリダイズした複合体は、ＣＦＳ上の捕獲部分を使用することによって回収される。例えば、３ＣＳＦ、５ＣＳＦ、および／またはＮＰＰＦ上に存在する捕獲部分（例えば、図２Ａの２１２）は、固体支持体として利用することができる。例えば捕獲部分がビーズまたはプレートである場合（例えば、カルボキシ−アミン結合、例えばＣＦＳ上のアミノ基およびビーズ上のカルボキシなどを使用してＣＦＳに付着したもの）、固体支持体は、ビーズまたはプレートである。このケースにおいて、捕獲部分／固体支持体は、ハイブリダイズした複合体の一部であり、その捕獲または回収が可能になる。本方法は、回収後に洗浄ステップを含んでいてもよい。それに続くステップ、例えばヌクレアーゼ消化５３０、ライゲーション５５０、洗浄５４０、５６０、ＵＤＧ消化５７０（任意選択であり、ＮＰＰＦがｄＵＴＰを含む場合のみ）、および／またはＰＣＲ増幅５８０などの１つまたは複数は、固体支持体の存在下で行うことができ、それにより、試薬を除去したり捕獲された標的に添加したりすることが可能になる。
Ａ．例示的なハイブリダイゼーション条件
【００９９】
ＮＰＰＦまたは複数のＮＰＰＦが、標的核酸分子、例えば対象からの試料中に存在するＤＮＡおよびＲＮＡなどに特異的にハイブリダイズする、加えてフランキング配列に相補的なＣＦＳに特異的にハイブリダイズするのに十分な条件が、本明細書で開示される。一部の例において、複数のＮＰＰＦは、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも３０００個の（例えば２から５０００、２から３０００、１０から１０００、５０から５００、２５から３００、５０から３００、１０から１００、５０から１００、５００から１０００、または１０００から５０００個の）固有なＮＰＰＦ配列を含む。
【０１００】
ハイブリダイゼーションは、二重鎖分子（ハイブリダイゼーション複合体とも称される）を形成する相補的一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの能力である。例えば、他の物質または分子への非特異的なハイブリダイゼーションを最小化しながら、選択されたストリンジェンシーの条件下における核酸（例えば、ＮＰＰＦ）の別の核酸（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡまたはＣＦＳ）へのハイブリダイズを可能にする特徴（例えば長さ、塩基組成、および相補性の程度など）は、本開示に基づき決定することができる。「特異的にハイブリダイズする」および「特異的に相補的な」は、第１の核酸分子（例えば、ＮＰＰＦ）と第２の核酸分子（例えば核酸標的、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ標的、またはＣＦＳなど）との間で安定で特異的な結合が起こるような十分な程度の相補性を示す用語である。第１および第２の核酸分子は、必ずしも１００％相補的でなくても、特異的にハイブリダイゼーション可能である。また特異的なハイブリダイゼーションは、本明細書では「特異的な結合」とも称される。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション方法の性質およびハイブリダイズする核酸配列の組成物および長さに応じて様々となる。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（例えばＮａ＋濃度など）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。特定の程度のストリンジェンシーを達成するためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ（９および１１章）で論じられている。
【０１０１】
以下のセクションＩＩＩで、ＮＰＰＦの特徴をより詳細に論じる。典型的には、ＮＰＰＦの領域は、選択されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下におけるそのハイブリダイゼーションを可能にする、その対応する標的核酸分子に対する十分な相補性を有する核酸配列（例えば、図１Ａ、１０２）、加えて、選択されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下におけるそのハイブリダイゼーションを可能にする、その対応するＣＦＳに対する十分な相補性を有する領域（例えば、図１Ａ、１０４、１０６）を有する。一部の例において、ＮＰＰＦは、その標的配列に対する、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の相補性を共有する。例示的なハイブリダイゼーション条件は、約３７℃またはそれより高い温度（例えば約３７℃、４２℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、またはそれより高い、例えば４５〜５５℃または４８〜５２℃など）でのハイブリダイゼーションを含む。変更可能なハイブリダイゼーションの反応パラメーターは、なかでも特に、塩濃度、緩衝液、ｐＨ、温度、インキュベーション時間、例えばホルムアミドなどの変性剤の量およびタイプである。例えば、核酸（例えば、複数のＮＰＰＦ）は、緩衝液（例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｈ２ＰＯ４、ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはそれらの組合せを含有する緩衝液など）、例えば溶解緩衝液中、約１０ｐＭから約１０ｎＭの範囲の濃度（例えば約３０ｐＭから５ｎＭ、約１００ｐＭから約１ｎＭ、例えば１ｎＭのＮＰＰＦなど）で試料に添加することができる。
【０１０２】
一部の例において、ＮＰＰＦは、試料中の対応する標的核酸分子より過剰に添加され、例えば、試料中の対応する標的核酸分子より少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも１，０００，０００倍、または少なくとも１０，０００，０００倍の過剰モル量、またはそれより多くのＮＰＰＦが添加される。一例において、各ＮＰＰＦは、少なくとも１０ｐＭ、例えば少なくとも２０ｐＭ、少なくとも３０ｐＭ、少なくとも５０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも１５０ｐＭ、少なくとも２００ｐＭ、少なくとも５００ｐＭ、少なくとも１ｎＭ、または少なくとも１０ｎＭの最終濃度で試料に添加される。一例において、各ＮＰＰＦは、約３０ｐＭの最終濃度で試料に添加される。別の例において、各ＮＰＰＦは、約１６７ｐＭの最終濃度で試料に添加される。さらなる例において、各ＮＰＰＦは、約１ｎＭの最終濃度で試料に添加される。さらなる例において、各ＮＰＰＦは、１μｌ当たり、少なくとも約１００，０００，０００、少なくとも３００，０００，０００、または少なくとも約３，０００，０００，０００コピーで試料に添加される。一部の例において、ＣＦＳは、ＮＰＰＦより過剰に添加され、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の過剰モル量のＣＦＳがＮＰＰＦに添加される。一例において、各ＣＦＳは、プローブの量の少なくとも約６倍、例えばプローブの量の少なくとも１０倍または少なくとも２０倍（例えばプローブの量の６から２０倍）の最終濃度で試料に添加される。一例において、各ＣＦＳ（例えば、５ＣＦＳおよび３ＣＦＳ）は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、または少なくとも２００ｎｍ、例えば１から１００、５から１００または５から５０ｎＭで添加される。例えば６つのプローブが各１６６ｐＭで存在する場合、各ＣＦＳは、５から５０ｎＭで添加することができる。
【０１０３】
ハイブリダイゼーションの前に、試料中の核酸を変性し、それらを一本鎖にし、ハイブリダイゼーション（例えば約９５℃から約１０５℃で約５〜１５分、例えば９５℃で１０分など）に利用可能にする。異なる変性溶液を使用することによって、この変性温度は、温度および緩衝液組成の組合せが一本鎖標的ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは両方の形成を引き起こす限り、変更することができる。次いで試料中の核酸および５ＣＦＳ、３ＣＦＳ、または両方を、約４℃から約７０℃の範囲の温度（例えば、約３７℃から約６５℃、約４２℃から約６０℃、または約５０℃から約６０℃、例えば５０℃など）で、約１０分間から約７２時間の間（例えば、少なくとも約１時間から４８時間、約２から１６時間、約６時間から２４時間、約１２時間から１８時間、約１６時間、または一晩、例えば２から２０時間など）、複数のＮＰＰＦにハイブリダイズさせる。一例において、ハイブリダイゼーションは、５０℃で２から２０時間実行される。ハイブリダイゼーション条件は、使用される特定のＮＰＰＦおよびＣＦＳに応じて様々となるが、ＮＰＰＦが標的分子およびＣＦＳに確実にハイブリダイズするように設定される。一部の例において、複数のＮＰＰＦおよびＣＦＳは、少なくとも約３７℃、少なくとも約４０℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、または少なくとも約７０℃の温度で試料と共にインキュベートされる。一例において、複数のＮＰＰＦおよびＣＦＳは、約３７℃、約４２℃、または約５０℃で試料と共にインキュベートされる。
【０１０４】
一部の実施形態では、本方法は、核酸精製を含まない（例えば、核酸精製が、試料をＮＰＰＦおよびＣＦＳと接触させる前に実行されないか、および／または核酸精製が、試料をＮＰＰＦおよびＣＦＳと接触させた後に実行されない）。一部の例において、細胞溶解を除いて、試料の予備加工は必要ではない。一部の例において、細胞溶解および試料を複数のＮＰＰＦおよびＣＦＳと接触させることは、逐次的に行われる。他の例において、介在するステップがまったくない一部の非限定的な例では、細胞溶解および試料を複数のＮＰＰＦおよびＣＦＳと接触させることは、同時に行われる。
Ｂ．ヌクレアーゼでの処理
【０１０５】
試料中の標的核酸およびＣＦＳへのＮＰＰＦのハイブリダイゼーション後、試料は、ヌクレアーゼ保護手順に供される。ＮＰＰＦにハイブリダイズした標的核酸分子およびＣＦＳ（ＮＰＰＦ上に５’および３’−フランキング配列の両方または一方のみがあるかどうかに応じて、１または２つのＣＦＳ）は、ヌクレアーゼによって加水分解されず、引き続きシーケンシングすることができる（任意選択で増幅することができる）。
【０１０６】
ヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合を切断する酵素である。エンドヌクレアーゼは、ヌクレオチド鎖中の内部ホスホジエステル結合を切断する（ヌクレオチド鎖末端のホスホジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼとは対照的に）。したがって、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびそれらの組合せは、開示された方法で使用することができる。エンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼまたは他の部位特異的なエンドヌクレアーゼ（これらは、配列特異的な部位でＤＮＡを切断する）、ＤＮアーゼＩ、膵臓ＲＮアーゼ、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１、ＲＮアーゼＩ、ＲＮアーゼＰｈｙＭ、ＲＮアーゼＵ２、ＲＮアーゼＣＬＢ、小球菌ヌクレアーゼ、およびアプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼが挙げられる。エキソヌクレアーゼとしては、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩが挙げられる。特定の例において、ヌクレアーゼは、一本鎖核酸に特異的であり、例えばＳ１ヌクレアーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、またはＢＡＬ３１ヌクレアーゼなどである。これらの酵素の反応条件は当技術分野において周知であり、経験的に最適化することができる。
【０１０７】
１つまたは複数のヌクレアーゼでの処理は、全てのｓｓ核酸分子（ＮＰＰＦにハイブリダイズしない（したがってそれにより保護されない）試料中のＲＮＡおよびＤＮＡ、標的核酸にハイブリダイズしないＮＰＰＦ、およびＮＰＰＦにハイブリダイズしないＣＦＳを含む）を破壊することができるが、例えばＣＦＳおよび試料中に存在する標的核酸分子にハイブリダイズしたＮＰＰＦなどのｄｓ核酸分子を破壊しない。例えば、試料が細胞抽出物または溶解産物を含む場合、不要な核酸、例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ核酸標的のケースにおいて核酸の標的配列の大部分を構成する、非標的ゲノムＤＮＡ（例えば変性したゲノムＤＮＡなど）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および相補的ＮＰＰＦ配列にハイブリダイズしない標的核酸分子の一部（例えばオーバーハングなど）の１つまたは複数は、このステップで実質的に破壊することができる。一部の実施形態では、このステップは、およそ化学量論量の標的核酸／ＣＦＳ／ＮＰＰＦ二重鎖をあとに残す。標的分子が、固着により生じる組織に架橋されている場合、ＮＰＰＦは、架橋された標的分子にハイブリダイズし、一部の実施形態では、逆の架橋、またはそれ以外の方法でそれに架橋された組織から標的核酸を放出する必要はない。
【０１０８】
一部の例において、緩衝液（例えば酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＺｎＳＯ４、抗微生物剤（例えばＰｒｏＣｌｉｎ（商標）殺生剤など）、またはそれらの組合せを含有する緩衝液など）で希釈したＳ１ヌクレアーゼを、ハイブリダイズしたプローブ／試料混合物に添加し、約３７℃から約６０℃（例えば約５０℃など）で１０〜１２０分（例えば、１０〜３０分、３０から６０分、６０〜９０分、９０分、または１２０分）インキュベートして、試料からのハイブリダイズしていない核酸ならびにハイブリダイズしていないＮＰＰＦおよびＣＦＳを消化する。一例において、ヌクレアーゼ消化は、試料をヌクレアーゼ緩衝液中のヌクレアーゼと共に５０℃で６０から９０分インキュベートすることによって実行される。
【０１０９】
試料は、任意選択で、残留した酵素を不活性化または除去するために処理することができる（例えば、フェノール抽出、沈殿、カラムろ過、プロテイナーゼｋの添加、ヌクレアーゼ阻害剤の添加、活性のためにヌクレアーゼが必要とする２価カチオンのキレート化、またはそれらの組合せによって）。一部の例において、試料は、例えばＫＯＨもしくはＮａＯＨまたは緩衝液（例えばｐＨ９でトリス−ＨＣｌまたはｐＨ８でトリス−ＨＣｌを含有する緩衝液など）の添加によって、ｐＨを約７から約８に調整するために処理される。ｐＨを上昇させることは、ＤＮＡの脱プリンを防ぐことができ、さらに多くのｓｓ特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１）の完全な機能化も防ぐことができる。一部の例において、ヌクレアーゼを不活性化するために、試料を例えば１０〜３０分加熱する（例えば８０〜１００℃）。
【０１１０】
一部の例において、ヌクレアーゼ消化後に、試料を、ＳＳＣを含む緩衝液で洗浄し、それに続いてより高いストリンジェントの洗浄（例えば、５０〜６０℃の水、５０ｍＭのＮａＯＨ、またはホルムアミド）を行うことができる。
Ｃ．標的の捕獲
【０１１１】
本方法中の時間のどこかの時点で、シーケンシングされる標的核酸分子が回収または捕獲され、それにより反応混合物中の他の分子からの標的の分離が可能になる。図２Ｂ〜２Ｄに、標的をいつ捕獲できるかの例を示す。標的が一旦捕獲されたら、本方法の後続のステップの間中、標的が捕獲されたままにしてもよいし、または望ましいときに放出させてもよい。一部の例において、ＮＰＰＦ、５ＣＦＳ、または３ＣＦＳ上に存在する捕獲部分を使用することによって、標的は反応物から回収される。捕獲部分は、例えば未結合のＮＰＰＦ、未結合の標的、および未結合のＣＦＳの１つまたは複数の一部などの反応物中のタグを有さない分子から、標的を物理的に分離することを可能にする。
【０１１２】
一例において、捕獲部分は、ＮＰＰＦ、５ＣＦＳ、または３ＣＦＳに共有結合で付着している。このような付着の例としては、アミンおよびカルボキシル結合（例えば、ＮＰＰＦ、５ＣＦＳ、または３ＣＦＳに付着したアミン基、例えば５ＣＦＳの３’末端（例えば、図３を参照）であり、これは、捕獲部分、例えば磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄ）上のカルボキシル基（例えば、カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ））に結合することができる）、および炭素−炭素結合が挙げられる。一例において、ＮＰＰＦ、５ＣＦＳ、または３ＣＦＳは、アミンを含み、捕獲部分は、１級脂肪族アミン、芳香族アミン、クロロメチル、アミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシル、チオール、またはエポキシを含み、それにより核酸分子が捕獲部分に付着することが可能になる。他の例示的な付着は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供される（例えばｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ／ｄｏｃｓ／ｄｅｆａｕｌｔ−ｓｏｕｒｃｅ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ−ｒｅｐｏｒｔｓ／ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ−ｆｏｒ−ａｔｔａｃｈｉｎｇ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｔｏ＿ｖ６−３−１４−１４．ｐｄｆ？ｓｆｖｒｓｎ＝２を参照）。このような結合と共に使用できる捕獲部分の例としては、これらに限定されないが、ビーズ（例えば、磁気ビーズまたはポリスチレンビーズ）、アガロース、セファロースなど、加えてプレート（例えば、マルチウェル）、スライド（例えば、ガラス、一部の例ではシランでコーティングされたガラス）が挙げられる。一部の例において、捕獲部分へのＮＰＰＦ、５ＣＦＳ、または３ＣＦＳの共有結合による付着を使用して、ハイブリダイゼーションステップ中に標的を捕獲し、少なくともライゲートするステップにわたり標的を捕獲されたままにする。
【０１１３】
別の例において、捕獲部分は、ＮＰＰＦ、５ＣＦＳ、または３ＣＦＳに非共有結合で付着している。このような付着の例としては、例えばアビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ニュートラビジン−ビオチン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン（またはあらゆるタンパク質／抗体の組合せ、例えばプロテインＡもしくはプロテインＧおよびそれらの抗体など）、グルタチオン、およびハプテン／タンパク質などの化学基または標識が挙げられる。したがって、捕獲部分に非共有結合で付着した、標的およびそのハイブリダイズしたＮＰＰＦ、５ＣＦＳ、または３ＣＦＳを含有する反応混合物は、相補的結合分子（捕獲部分に相補的）を含有する適切な固体支持体と共に、捕獲部分の固体支持体への結合を可能にする条件下でインキュベートされる。次いで未結合の材料は、単に洗い落とすかまたは除去することができる。例えば、捕獲部分は、ビオチンを含んでいてもよい。このような例において、反応混合物は、アビジン、ニュートラビジンまたはストレプトアビジンを含む（例えばそれらでコーティングされた）固体支持体（例えばビーズまたはマルチウェルプレートなど）と共にインキュベートされる。ビオチンタグを含有する標的複合体は、アビジン、ニュートラビジンまたはストレプトアビジンに結合し、それにより反応混合物中のタグを有さない分子を除去すること（例えば、洗い落とすこと）が可能になる。別の例において、捕獲部分は、アミンを含んでいてもよい。このような例において、反応混合物は、カルボキシル基（例えば、カルボン酸）を含む（例えば、それでコーティングされた）固体支持体（例えばビーズまたはマルチウェルプレートなど）と共にインキュベートされる。アミン基を有する標的複合体は、カルボキシル基に結合し、それにより反応混合物中のタグを有さない分子を除去することが可能になる。別の例において、捕獲部分は、ジゴキシゲニンまたはハプテンを含んでいてもよい。このような例において、反応混合物は、それぞれ抗ジゴキシゲニン抗体または抗ハプテン抗体を含む（例えば、それらでコーティングされた）固体支持体（例えばビーズまたはマルチウェルプレートなど）と共にインキュベートされる。ジゴキシゲニン（またはハプテン）との標的複合体は、抗ジゴキシゲニン（または抗ハプテン）抗体に結合し、それにより反応混合物中のタグを有さない分子を除去することが可能になる。
【０１１４】
一部の例において、捕獲部分は、固体支持体および化学基の両方を含む（例えば、カルボキシル基末端ビーズ）。
【０１１５】
足場の存在は、反応混合物からの標的（例えば、図２ＡのＮＰＰＦ／標的二重鎖２１４）の捕獲または回収を可能にする。例えば、反応物を遠心分離し、洗浄することができ、それにより標的の濃縮および収集が可能になる。または標的が結合する足場を容器の底部に沈降させ、洗浄することができる。別の例において、足場は磁性物質であり、それにより磁石を使用したその収集（および標的の収集）が可能になる。一部の例において、標的は、ろ過を使用することによって（例えば、ビーズを捕獲するためのフィルターを使用することによって）回収される。標的を固着させた後、反応混合物の残りを除去することができる（例えば、洗浄によって）。次いでそれに続く方法のステップに好適な適切な試薬を標的に添加することができる。一部の例において、標的は、標的複合体を変性させることなく捕獲される。捕獲に続いて、固体支持体または足場に付着した（または容器と会合した、例えば容器中で会合した）標的複合体を、固体支持体から放出させることができる（またはそれから除去することができる）。代替として、標的複合体は、反応中に添加される次のステップのために、固体支持体および試薬（ｒｅｇｅｎｔ）に付着させた（または容器と会合した、例えば容器中で会合した）ままにすることができる。
【０１１６】
一部の例において、捕獲は、室温で（例えば１５〜３５℃、例えば２０〜３０℃または２５〜３０℃など、少なくとも１０分、例えば１０〜１２０分、１０〜３０分、３０から６０分、６０〜９０分、３０分、または６０分など）実行される。一部の例において、捕獲の後、１つまたは複数の洗浄ステップが、例えばＳＳＣ−Ｔ緩衝液（１×ＳＳＣ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０界面活性剤）などを用いて実行される。
【０１１７】
このような付着と共に使用できる固体支持体の例としては、これらに限定されないが、ビーズ（例えば、磁気ビーズまたはポリスチレンビーズ）、アガロース、セファロース、など、加えてプレート（例えば、マルチウェル）、およびスライド（例えば、ガラス、一部の例ではシランでコーティングされたガラス）が挙げられる。一部の例において、捕獲部分へのＮＰＰＦ、５ＣＦＳ、または３ＣＦＳの非共有結合による付着を使用して、ハイブリダイゼーションステップ後（ただしライゲーション前）に標的を捕獲し、少なくともライゲートするステップにわたり標的を捕獲されたままにする。
【０１１８】
捕獲部分は、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳ（またはＮＰＰＦ）に（例えば、スペーサー、例えば炭素スペーサーなどを介して）直接的または間接的に付着またはコンジュゲートさせることができる。捕獲部分は、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳ（またはＮＰＰＦ）の内部ヌクレオチドに付着させることができる。一例において、捕獲部分は、５ＣＦＳの３’末端ヌクレオチドに（またはそれに近接して、例えば３’末端に近接しているが３’末端にはないビオチン−ｄＴを使用して）付着している。一例において、捕獲部分は、３ＣＦＳの５’−ヌクレオチドに（またはそれに近接して、例えば５’末端に近接しているが５’末端にはないビオチン−ｄＴを使用して）付着している。一部の例において、捕獲部分は、５ＣＦＳの５’末端ヌクレオチドまたは３ＣＦＳの３’末端ヌクレオチドに付着していない。一部の例において、捕獲部分は、例えば炭素スペーサー（例えば約６から６０個の炭素原子、例えば約６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、３０、３６、４２、４８、５４、または６０個の炭素原子）、ホスホロチオエート結合を有する塩基、ビオチン−アビジン、またはそれらの組合せを使用することによって、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳに間接的に付着している。
【０１１９】
開示された方法およびキットと共に使用できる固体支持体としては、検出試薬によるアクセスおよび好適な表面親和性をもたらし捕獲試薬（例えば、オリゴヌクレオチド）を固着させるものが挙げられる。使用できる例示的な固体支持体または足場としては、ビーズまたは粒子（例えばアガロース、セファロース（または他のマトリックス／樹脂）、ラテックス粒子、ポリスチレンビーズ、超常磁性ビーズ、または磁気ビーズなど）、マルチウェルプレート（例えば、９６−、３８４−、または１５３６−ウェルマイクロタイタープレート）、反応トレイのウェルの壁、試験管、遠沈管、膜、および微粒子（例えばラテックス粒子など）が挙げられる。固体支持体は、あらゆる好適な材料、例えばガラス、プラスチック、膜、金属、ラテックス、寒天、アガロースなどから作製することができる。一部の例において、固体支持体は、アガロースビーズまたは磁気ビーズである。一部の例において、ビーズまたは粒子は、少なくとも１μｍ、少なくとも２μｍ、少なくとも３μｍ、少なくとも４μｍ、少なくとも１０μｍ、または少なくとも５０μｍ、例えば５０μｍから１４０μｍ、１μｍから２μｍ、１μｍから３μｍ、１μｍから４μｍ、１μｍから５μｍ、または１μｍから１０μｍである。
Ｄ．ＣＦＳおよび標的のライゲーションならびに任意選択の重合
【０１２０】
ハイブリダイズしていない材料を除去し、ＮＰＰＦ／標的二重鎖を回収した後、標的配列（これは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る）をＣＦＳに（例えば、５ＣＦＳ、３ＣＦＳ、または両方に）ライゲートし、それによってライゲートした標的が生成される。したがって、標的と各ＣＦＳとの間の「ギャップ」（例えば、図３および４を参照）、は、リガーゼの使用によって「閉じられる」。一部の例において、ポリメラーゼステップは、例えばヌクレアーゼによって除去された可能性があるＣＦＳまたは標的のヌクレオチドを置き換えるために含まれる。例えばヌクレアーゼは、ＣＦＳおよび／または標的の５’および／または３’末端から数個のヌクレオチド（例えば１、２、３または４ヌクレオチド）を除去することができる。ポリメラーゼは、リガーゼと共に含まれていてもよいし、または重合は、ライゲートするステップの前に実行してもよい。
【０１２１】
リガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を触媒することによって核酸分子を一緒に合体させることを容易にする酵素である。例としては、ＤＮＡリガーゼ（例えば、ＥＣ  ６．５．１．１）およびＲＮＡリガーゼ（例えば、ＥＣ  ６．５．１．３）が挙げられる。例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２（例えばトランケートされた形態など）、またはＴａｑリガーゼなどのあらゆるリガーゼを使用することができる。使用されるリガーゼは、標的配列に最も近いＣＦＳ上に存在するヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）、加えて標的配列のタイプ（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）によって決めることができる。例えば、ＲＮＡは、ＲＮＡにライゲートし、ＤＮＡは、ＤＮＡにライゲートし、ＲＮＡ３’末端は、ＤＮＡ５’末端にライゲートする。一部の例において、ＣＦＳは、リガーゼが確実に適した基質を有するように、リン酸または他の５’末端の改変を含む。例えば、ＣＦＳ（例えば、図２Ａの２１０）は、３’末端に１つまたはそれより多くのＲＮＡ塩基を含むＤＮＡ分子であってもよい。例えば、ＣＦＳ（例えば、図２Ａの２０８）は、５’末端に１つまたはそれより多くのＤＮＡ塩基を含むＲＮＡ分子であってもよい。一部の例において、リガーゼの組合せが使用される。一部の例において、標的がＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方を含む場合、別個のライゲーション（任意選択で重合を含む）が使用され、一方で他の例において、標的がＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方を含む場合、単一のライゲーション（任意選択で重合を含む）が使用される。以下に一部の非限定的な例を示す。
【表Ａ】
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【０１２２】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、ＡＴＰ依存性酵素であって、これは、二重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにおいて、並列させた５’ホスホリル（例えばヌクレアーゼ消化後に、１つは５ＣＦＳ上に存在し、１つは標的ＤＮＡまたはＲＮＡ上に存在し、例えば、図３および４を参照）と、３’−ヒドロキシル末端（例えば１つは３ＣＦＳ上に存在し、１つは標的ＤＮＡまたはＲＮＡ上に存在し、例えば、図３および４を参照）との間でホスホジエステル結合の形成を触媒する。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼはまた、二重鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中の一本鎖ニックを修復することもできる。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼはまた、二重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの平滑末端および付着末端の断片の両方を合体させることもできる。
【０１２３】
Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼは、並列させた５’リン酸（例えばヌクレアーゼ消化後に、１つは５ＣＦＳ上に存在し、１つは標的ＤＮＡまたはＲＮＡ上に存在し、例えば、図３および４を参照）と、相補的標的ＤＮＡにハイブリダイズした２つの隣接するオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシル末端（例えば１つは３ＣＦＳ上に存在し、１つは標的ＤＮＡ上に存在し、例えば、図３および４を参照）との間のホスホジエステル結合の形成を触媒する。ライゲーションは、オリゴヌクレオチドが相補的標的ＤＮＡに完全に対合し、それらの間にギャップがないときに起こる。Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼは、高温（４５℃〜６５℃）で活性である。
【０１２４】
Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１（ｓｓＲＮＡリガーゼ）は、５’ホスホリル末端を有する核酸ドナー（例えばヌクレアーゼ消化後に、１つは５ＣＦＳ上に存在し、１つは標的ＤＮＡまたはＲＮＡ上に存在し、例えば、図３および４を参照）の、３’ヒドロキシル末端を有する核酸アクセプター（例えば１つは３ＣＦＳ上に存在し、１つは標的ＤＮＡまたはＲＮＡ上に存在し、例えば、図３および４を参照）への、ＡＴＰからＡＭＰおよびＰＰｉへの加水分解による３’から５’のホスホジエステル結合の形成を介したライゲーションを触媒する。基質は、一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡに加えて、ジヌクレオシドピロリン酸を含む。
【０１２５】
Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２はまた、Ｔ４Ｒｎｌ−２としても公知であり、分子間および分子内両方のＲＮＡ鎖を合体させる活性を有する。これは、５’リン酸（例えばヌクレアーゼ消化後に、１つは標的ＤＮＡまたはＲＮＡ上に存在し、例えば、図３および４を参照）の、３’ヒドロキシル（例えば１つは３ＣＦＳ上に存在し、例えば、図３および４を参照）へのライゲーションを触媒する。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２はまた、ＲＮＡの３’ヒドロキシルをＤＮＡの５’リン酸にライゲートすることもできる。一部の例において、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２のトランケートされた形態が使用される（例えば、アミノ酸１〜２４９）。
【０１２６】
一部の例において、リガーゼを、緩衝液（例えば必須の補因子、例えばＮＡＤ＋またはＡＴＰなど、緩衝剤、およびカチオンを含有する緩衝液など）で希釈し、ＮＰＰＦ／標的二重鎖を含有する混合物に添加し、約４℃〜６０℃（リガーゼに応じて）（例えば少なくとも４℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３７℃、少なくとも５０℃、または少なくとも６０℃、例えば４から３７℃、４から２５℃、または２０から２５℃）で、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、または少なくとも１６時間インキュベートして、ＣＦＳを標的核酸分子にライゲートさせる（この場合、ＣＦＳおよび標的はすでに、ＮＰＰＦにハイブリダイズしている）。一例において、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼのための緩衝液は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭのＡＴＰを含む。
【０１２７】
ポリメラーゼは、例えば核酸分子の末端に１つまたは複数のヌクレオチドを付加することによって核酸分子の鎖または核酸ポリマーを合成することができる酵素である。例としては、ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＣ２．７．７．７）およびＲＮＡポリメラーゼ（ＥＣ２．７．７．６）が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ分子をその３’末端で伸長させる、すなわち、その３’末端にヌクレオチドを付加するのに使用することができる。一例において、例えばＴ４またはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼ欠損熱安定性ポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰの存在下で使用される。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ分子をその３’末端で伸長させる、すなわち、その３’末端にリボヌクレオチドを付加するのに使用することができる。一例において、例えばＥ．ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼは、ｒＮＴＰを添加して使用される。ＲＮＡポリメラーゼが使用される場合、本方法は、逆転写ステップ（例えば、ライゲートした標的をＰＣＲ増幅するときに）をさらに含んでいてもよい。一部の例において、例えば標的核酸分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む場合、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼの両方が使用される。
【０１２８】
一部の例において、重合反応は、ライゲーション反応の前に実行される。例えば捕獲された標的は、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰおよび／またはｒＮＰＴと共に、約４℃〜６０℃（例えば少なくとも４℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３７℃、少なくとも５０℃、または少なくとも６０℃、例えば４℃から３７℃、４℃から２５℃、または室温（２０から２５℃））で、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、または少なくとも１６時間インキュベートすることができる。一例において、ポリメラーゼは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼであり、インキュベーション条件は、３７℃で１時間である。一例において、ポリメラーゼは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼであり、インキュベーションは、室温（例えば２０〜２５℃など）で３０分実行される。
【０１２９】
一部の例において、ポリメラーゼは、例えばｄＮＴＰおよび／またはｒＮＰＴと共にライゲーション反応物に添加され、約４℃〜６０℃（リガーゼに応じて）（例えば少なくとも４℃、少なくとも１６℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３７℃、少なくとも５０℃、または少なくとも６０℃、例えば４から３７℃、４から２５℃、または２０から２５℃）で、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、または少なくとも１６時間インキュベートされる。一例において、重合／ライゲーション反応物は、室温（例えば２０から２５℃など）で少なくとも１５分、少なくとも３０分、または少なくとも１時間、例えば３０〜６０分インキュベートされる。
Ｅ．ライゲートした標的からのＮＰＰＦの分離
【０１３０】
ＣＦＳを標的にライゲートし、ライゲートした標的を形成した後、ライゲートした標的からＮＰＰＦを分離する（例えば、変性させる）。したがって、二本鎖ＮＰＰＦ／標的複合体は、２つの一本鎖核酸分子、ｓｓＮＰＰＦおよびｓｓのライゲートした標的に分離することができる。一部の例において、ＤＮアーゼでＮＰＰＦを分解することによってＮＰＰＦをライゲートした標的から分離し（例えば、ＮＰＰＦがＤＮＡである場合、標的はＲＮＡであり、ＣＦＳはＲＮＡである）、それによってライゲートした標的が残る。一部の例において、ＲＮアーゼでＮＰＰＦを分解することによってＮＰＰＦをライゲートした標的から分離し（例えば、ＮＰＰＦがＲＮＡである場合、標的はＤＮＡであり、ＣＦＳはＤＮＡである）、それによってライゲートした標的が残る。このステップはまた、物理的な分離を介してライゲートしていない核酸分子（例えば、ライゲートしていないＣＦＳ）を除去することもできる。
【０１３１】
一例において、反応物は、例えば洗浄緩衝液の存在下で、ライゲートした標的からＮＰＰＦを解離させる条件下で加熱され、それによりｓｓＮＰＰＦおよびｓｓのライゲートした標的の混成集団が生じる。例えば、反応物は、水溶液中で加熱することができる。一例において、反応物は、水中で少なくとも約５０℃（例えば５０から１００℃、例えば５０℃）に加熱され、少なくとも１０分インキュベートされる。一部の例において、反応物は、３回の約５０℃での水による１０分の洗浄に供される。一例において、反応物は、約５０℃で１０分、水中の０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）非イオン性界面活性剤で３回洗浄される（界面活性剤は、ビーズが凝集しないようにするために添加することができる）。別の例において、反応物は、１００％ホルムアミド溶液中で、少なくとも９０℃、例えば約９８℃に少なくとも１０分加熱される。一部の例において、溶液の添加および加熱ステップを繰り返し（例えば１から５回）、それに続き、ＮＰＰＦおよびライゲートしていない種を実質的に除去し、それらをｓｓのライゲートした産物から洗い落とすために洗浄を行う。一部の例において、反応物は、室温で、５０％ホルムアミド／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）非イオン性界面活性剤で洗浄される。
【０１３２】
別の例において、変性は、ｐＨを塩基（例えばＫＯＨまたはＮａＯＨなど）で変更することによって実行され、それによりライゲートした標的からＮＰＰＦを解離させ、ｓｓＮＰＰＦおよびｓｓのライゲートした標的の混成集団が生じる。例えば、ＮａＯＨを５０ｍＭから２Ｍ（例えば１００ｍＭなど）の最終濃度に添加し、室温で少なくとも１０分インキュベートすることができる。一部の例において、ＮａＯＨの添加およびインキュベーションを繰り返す（例えば１から５回など）。塩基での洗浄後、反応物を、水性緩衝液、例えばトリス−ＨＣｌなどに再懸濁してもよいし、または反応物を、等量から通常の量の適切な緩衝化溶液の酸溶液で中和してもよい。
【０１３３】
一部の例において、試料は、ＤＮアーゼと共に、例えば、試料１つ当たり少なくとも１ユニットのＤＮアーゼＩ（例えば少なくとも５ユニット、少なくとも１０ユニット、もしくは少なくとも２０ユニット、例えば１から１０ユニット、１から２０ユニット、または５、６、７、８、９もしくは１０ユニット）の濃度で、少なくとも１０分、少なくとも３０分、少なくとも６０分、または少なくとも１２０分、例えば１０分、３０分、６０分、９０分、または２時間、３７℃でインキュベートされる。
【０１３４】
一部の例において、試料は、ＲＮアーゼ、例えばＲＮアーゼＨなどと共に、例えば、試料１つ当たり少なくとも１ユニットのＲＮアーゼＨ（例えば少なくとも５ユニット、少なくとも１０ユニット、少なくとも２０ユニット、または少なくとも５０ユニット、例えば１から１０ユニット、１から２０ユニット、または１から５０ユニット、例えば５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０もしくは５０ユニット）の濃度で、少なくとも１０分、少なくとも３０分、少なくとも６０分、または少なくとも１２０分、例えば１０分、３０分、６０分、９０分、または２時間、３７℃でインキュベートされる。
Ｆ．ライゲートした標的の捕獲
【０１３５】
ｓｓのライゲートした標的は、セクションＩＩ．Ｃで上述したものに類似の方法を使用して、例えばＣＦＳ上の捕獲部分（標的にライゲートされている）を使用することによって回収することができる。一部の例において、捕獲の後、試料を、ＳＳＣ（例えばＳＳＣ−Ｔなど）を含む緩衝液で洗浄し、それに続いて、よりストリンジェントな洗浄（例えば、５０〜６０℃の水、５０ｍＭのＮａＯＨ、またはホルムアミド）、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０界面活性剤（例えば、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０界面活性剤）を含む洗浄を行うことができる。次いで得られたｓｓのライゲートした標的をシーケンシングすることができる。一部の例において、シーケンシングの前に、ｓｓのライゲートした標的を増幅し、それによってライゲートした標的アンプリコンが生成される。
Ｇ．ライゲートした標的の任意選択の増幅
【０１３６】
得られた捕獲されたライゲートした標的分子は、シーケンシングの前に、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または酵素による増幅の他の形態またはライゲーションベースの増幅方法などの方法を使用して増幅することができる。標的がＲＮＡである場合、またはｒＮＴＰと共にＲＮＡポリメラーゼが使用された場合（上記のセクションＤを参照）、逆転写ステップを含めることができる。
【０１３７】
一部の例において、３０サイクル以下の増幅が実行され、例えば２５サイクル以下の増幅、２０サイクル以下の増幅、１５サイクル以下の増幅、１０サイクル以下の増幅、８サイクル以下の増幅、または５サイクル以下の増幅、例えば２から３０サイクル、５から３０サイクル、８から３０サイクル、８から２５サイクル、２から２５サイクル、５から２５サイクル、５から２０サイクル、５から１５サイクル、または５から１０サイクルの増幅が実行される。
【０１３８】
使用することができる核酸増幅方法としては、核酸分子、例えばライゲートした標的またはそれらの一部などのコピー数の増加をもたらす方法が挙げられる。得られた産物は、増幅産物またはアンプリコンと呼ばれる。一般的に、このような方法は、増幅させる材料（例えば、ライゲートした標的）を、オリゴヌクレオチドプライマーの一方または対と、プライマーの増幅させる核酸分子へのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させることを含む。プライマーを好適な条件下で伸長させ、テンプレートから解離させ、次いで再アニールさせ、伸長させ、解離させて、核酸分子のコピー数を増幅する。
【０１３９】
使用することができるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増幅方法の例としては、これらに限定されないが、ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量リアルタイムＰＣＲ、定量リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ、等温増幅方法、鎖置換増幅；無転写等温増幅；修復連鎖反応増幅；およびＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ無転写増幅が挙げられる。一例において、ライゲーションベースの増幅方法が使用され、この場合、プライマーはＣＦＳの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする。ライゲーションは、酵素によるものでもよいし、または酵素によらないものでもよい。一例において、ヘリカーゼ依存性増幅が使用される。
【０１４０】
ライゲートした標的の増幅中に、実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターを、例えばプライマーおよび伸長構築物の一部として、取り込むことができる（図５を参照）。しかしながら、このようなタグ／アダプターの付加は任意選択である。例えば、増幅プライマーは、５ＣＦＳまたは３ＣＦＳの全てまたは一部に相補的な第１の部分を含んでおり、望ましい実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターに相補的な第２の部分を含んでいてもよい。当業者は、実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターの異なる組合せを、ライゲートした標的の末端のいずれかに付加できることを理解するであろう。一例において、ライゲートした標的は、５ＣＦＳの全てまたは一部に相補的な第１の部分、および望ましいシーケンシングアダプターに相補的な（またはそれを含む）第２の部分を含む第１の増幅プライマーを使用して増幅され、第２の増幅プライマーは、３ＣＦＳの全てまたは一部に相補的な第１の部分、および望ましい実験タグに相補的な（またはそれを含む）第２の部分を含む（例えば、図５を参照）。一例において、２つの異なるシーケンシングアダプターおよび２つの異なる実験タグが使用される。一部の例において、２つの異なるシーケンシングアダプターおよび１つの実験タグが使用される。別の例において、ライゲートした標的は、５ＣＦＳに相補的な第１の部分の全てまたは一部、ならびに望ましいシーケンシングアダプターおよび望ましい実験タグに相補的な（またはそれを含む）第２の部分を含む第１の増幅プライマーを使用して増幅され、第２の増幅プライマーは、３ＣＦＳの全てまたは一部に相補的な第１の部分、および望ましい実験タグに相補的な（またはそれを含む）第２の部分を含む。
【０１４１】
増幅はまた、生成したライゲートした標的アンプリコンに検出可能な標識を導入したり（例えば追加の標識付けが望ましい場合）、または検出もしくはクエンチを許容する他の分子を導入したりするのにも使用することができる。例えば、増幅プライマーは、増幅中にライゲートした標的に取り込まれる、検出可能な標識、ハプテン、またはクエンチャーを含んでいてもよい。このような標識、ハプテン、またはクエンチャーは、ライゲートした標的アンプリコンのいずれかの末端（または両方の末端）に、またはその間のどこにでも導入することができる。
【０１４２】
一部の例において、得られたライゲートした標的アンプリコンは、シーケンシングの前に精製される。例えば、増幅反応混合物は、シーケンシングの前に、当技術分野において公知のもの（例えば、ゲルでの精製、ビオチン／アビジン捕獲および放出、キャピラリー電気泳動、サイズ排除精製、または常磁性ビーズ（固相の可逆的な固着）への結合およびそれからの放出）を使用して精製することができる。一例において、ライゲートした標的アンプリコンは、ビオチン化され（または別のハプテンを含み）、アビジンまたは抗ハプテンでコーティングされたビーズまたは表面上に捕獲され、洗浄され、次いでシーケンシングのために放出させる。同様に、ライゲートした標的アンプリコンは、相補的オリゴヌクレオチド（例えば表面に結合したものなど）上に捕獲され、洗浄され、次いでシーケンシングのために放出させることができる。開示された方法は、ゲノムまたはトランスクリプトームのほとんどをなくし、ライゲートした標的を残すことから、アンプリコンの捕獲は特に特異的である必要はない。他の方法が、必要に応じて増幅した産物を精製するのに使用することができる。
【０１４３】
増幅した産物はまた、最後の増幅ステップの後に、一本鎖オリゴヌクレオチドを加水分解するヌクレアーゼ（例えばエキソヌクレアーゼＩなど）を使用する方法によって二本鎖化されたままで精製することもでき、このヌクレアーゼは順に、引き続き例えばシーケンシングなどの次のステップを行う前に不活性化することができる。
１．ＣＦＳと結合するプライマー
【０１４４】
ＣＦＳ（５ＣＦＳ、３ＣＦＳ）に特異的に結合するかまたはハイブリダイズする増幅プライマーは、例えばＰＣＲ増幅などの増幅を開始させるのに使用することができる。したがって、プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによってＣＦＳ中の相補的配列にアニールして、プライマーとライゲートした標的のＣＦＳとのハイブリッドを形成することができ、次いでプライマーがポリメラーゼ酵素により相補鎖に沿って伸長する。加えて、増幅プライマーは、得られたライゲートした標的アンプリコンに、核酸マーカー（例えば１つまたは複数の実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターなど）および／または検出可能な標識を導入するのに使用することができる。プライマーは、少なくとも１２ヌクレオチドの長さ（例えば約１５、２０、２５、３０、５０、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７５または８０ヌクレオチドまたはそれを超える長さ、例えば１５から２５ｎｔ、５０から８０ｎｔ、６０〜７０ｎｔまたは６２〜６６ｎｔ）の例えばＤＮＡオリゴヌクレオチドなどの短い核酸分子である。例えば、このようなプライマーは、ＣＦＳに相補的な部分（例えば、ＣＦＳに相補的な、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５ｎｔなど）を有していてもよい。一部の例において、プライマーは、検出可能な標識、例えばフルオロフォアまたはビオチンなどを含み、これは、ライゲートした標的アンプリコンに取り込まれる。
【０１４５】
例えば、増幅プライマーは、ＣＦＳに相補的な領域を有することに加えて、得られたライゲートした標的アンプリコンへの実験タグ、シーケンシングアダプター、検出可能な標識、またはそれらの組合せの付加をもたらす核酸配列を有する第２の領域を含んでいてもよい。実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターは、ライゲートした標的の５’および／または３’末端に導入することができる。一部の例において、２つまたはそれより多くの実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターは、例えば２つまたはそれより多くの実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターの付加をもたらす核酸配列を有する単一のプライマーを使用して、ライゲートした標的アンプリコンの単一の末端または両方の末端に付加される。実験タグは、例えば１つの試料または配列を別のものから区別するのに使用することができる。配列アダプターは、特定のシーケンシングプラットフォームによって、得られたライゲートした標的アンプリコンの捕獲を許容する。
２．実験タグの付加
【０１４６】
実験タグは、例えば患者、試料、細胞型、時間経過のタイムポイント、または処理によって独立して認識される１つまたは数々の反応のための識別子として役立つ短い配列または改変された塩基である。実験タグは、ＣＦＳの一部であってもよい。別の例において、実験タグは、後で、例えばライゲートした標的の増幅中に付加され、それにより実験タグを含有するライゲートした標的アンプリコンが生じる。ＣＦＳ中の万能な配列の存在は、万能なプライマーの使用を許容し、このようなプライマーは、例えば増幅中、ライゲートした標的上に他の配列を導入することができる。例えばネステッド増幅、または二段階増幅などの増幅にも、実験的タグを使用することができる。
【０１４７】
実験タグ、例えば一方の試料を他方から識別する実験タグなどは、特定の標的配列を同定するのに使用することができる。したがって、実験タグは、実験または患者を互いに区別するのに使用することができる。一例において、実験タグは、ライゲートした標的アンプリコンの５’および／または３’末端の最初の３、５、１０、２０、または３０ヌクレオチドである。一部の例において、実験タグは、シーケンシングプライマー部位に近接して設置される。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングの場合、実験タグは、リード１およびリード２のプライマー部位のすぐ隣にある。ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）シーケンシングの場合、実験タグは、一般的に、最初の数個の塩基リードである。特定の例において、実験タグは、少なくとも３ヌクレオチドの長さ、例えば少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０ヌクレオチドの長さ、例えば３〜５０、３〜２０、１２〜５０、６〜８、６〜１２、または１２〜３０ヌクレオチド、例えば、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さである。
【０１４８】
一例において、実験タグは、一方の試料を他方から識別するのに使用される。例えば、このような配列は、検出された特定の配列を、特定の試料、患者、または実験（例えば特定の反応ウェル、日または反応条件のセットなど）と相関させるためのバーコードとして機能することができる。これは、シーケンシングされる特定のライゲートした標的を、例えば特定の患者または試料または実験と関連付けることを許容する。このようなタグを使用することで、例えば１回のシーケンシング試行または検出アレイで複数のライゲートした標的アンプリコンをタグ付けし、次いで（例えば異なる実験または患者から）合わせることができるため、試料１つ当たりのコストを低減して試料のスループットを増加させる方法が提供される。これは、同じ機器チャネルまたはシーケンシングの消耗品（例えばフローセルまたは半導体チップなど）中での単一の試行に、異なる実験または患者の試料を合わせる能力をもたらす。例えば、このようなタグは、１００または１，０００回の異なる実験を、単一のフローセルまたはチップ中での単一の試行でシーケンシングすることを許容する。加えて、本方法が、完了した増幅反応物をゲルで精製するステップ（または実際の分離を必要としない他の精製または浄化方法）を含む場合、検出またはシーケンシング試行ごとに試行する必要があるゲル（または浄化または精製反応または加工）は、１回のみである。次いでシーケンシングしたライゲートした標的アンプリコンは、例えば実験タグによってソートすることができる。
【０１４９】
一例において、実験タグは、特定の標的配列を同定するのに使用される。このケースにおいて、特定の標的配列に対応させるのに実験的タグを使用することによって、ライゲートした標的全体の代わりにライゲートした標的の末端をシーケンシングすれば十分であることから、必要となるシーケンシングの時間または量を少なくすることができる。例えば、このような実験タグがライゲートした標的アンプリコンの３’末端に存在する場合、標的配列を同定するのにライゲートした標的アンプリコン配列そのもの全体をシーケンシングしなくてもよい。その代わりに、実験タグを含有するライゲートした標的アンプリコンの３’末端のみをシーケンシングすればよい。これは、シーケンシングする必要がある材料がより少ないため、シーケンシングの時間および資源を顕著に低減することができる。
３．シーケンシングアダプターの付加
【０１５０】
シーケンシングアダプターは、生成されたときに、ＣＦＳの一部であってもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。別の例において、シーケンシングアダプターは、後で、例えばライゲートした標的の増幅中に付加され、それによりシーケンシングアダプターを含有するライゲートした標的アンプリコンが生じる。ＣＦＳ中の万能な配列の存在は、万能なプライマーの使用を許容し、このようなプライマーは、例えば増幅中に、ライゲートした標的上に他の配列を導入することができる。
【０１５１】
シーケンシングアダプターは、ライゲートした標的（またはそのアンプリコン）に特定のシーケンシングプラットフォームに必要な配列を付加するのに使用することができる。例えば、一部のシーケンシングプラットフォーム（例えば４５４ブランドのもの（Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｏｎ  ＴｏｒｒｅｎｔブランドのものおよびＩｌｌｕｍｉｎａブランドのものなど）は、シーケンシングされる核酸分子が、その５’および／または３’末端に例えばシーケンシングされる分子を捕獲するための特定の配列を含むことを必要とする。例えば、適切なシーケンシングアダプターがシーケンシングチップまたはビーズ上の相補的配列によって認識され、ライゲートした標的（またはそのアンプリコン）がシーケンシングアダプターの存在によって捕獲される。
【０１５２】
一例において、ポリＡ（またはポリＴ）、例えば少なくとも１０ヌクレオチドの長さのポリＡまたはポリＴなどが、ＰＣＲ増幅中にライゲートした標的に付加される。具体的な例において、ポリＡ（またはポリＴ）がライゲートした標的の３’末端に付加される。一部の例において、この付加された配列は、その３’末端でターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用してポリアデニル化される。
【０１５３】
特定の例において、付加されたシーケンシングアダプターは、少なくとも１２ヌクレオチド（ｎｔ）の長さ、例えば少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０または少なくとも７０ｎｔの長さ、例えば１２〜５０、２０〜３５、５０〜７０、２０〜７０、または１２〜３０ｎｔの長さである。
Ｈ．ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンのシーケンシング
【０１５４】
ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンは、例えば、ライゲートした標的全体もしくはライゲートした標的アンプリコン、またはそれらの一部（例えば、標的核酸分子の同定を許容するか、または特定の突然変異の存在または非存在の決定を許容するのに十分な量）をシーケンシングすることによってシーケンシングされる。本開示は、特定のシーケンシング方法に限定されない。ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンは、現在公知の、または将来的な任意のシーケンサーでの任意の方法によるシーケンシングのために設計できることが理解されるであろう。ライゲートした標的そのものは、使用されるシーケンシング方法も使用される酵素も限定しない。他のシーケンシング方法が開発されているかまたは今後開発され、当業者であれば、生成されたライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンが、これらのシステムでのシーケンシングにも好適であることを理解することができる。一部の例において、単一の反応で、複数の異なるライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンがシーケンシングされる。したがって、複数のライゲートした標的は、並行して、例えば同時または同時発生的にシーケンシングすることができる。
【０１５５】
得られたライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンの配列、例えばＤＮＡで構成される配列などを決定するのに使用できる例示的なシーケンシング方法としては、これらに限定されないが、鎖終結方法、色素終結シーケンシング、およびパイロシーケンシング（例えばＢｉｏｔａｇｅ（低スループットシーケンシングの場合）および４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ハイスループットシーケンシングの場合）によって商品化された方法など）が挙げられる。一部の例において、ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（例えば、ＨｉＳｅｑ）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）、４５４（登録商標）、Ｈｅｌｉｃｏｓ、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）、Ｓｏｌｉｄ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｖｉｏａｓｙｓｔｅｍｓ）または他の任意の市販のシーケンシングシステムを使用してシーケンシングされる。一例において、シーケンシング方法は、架橋ＰＣＲ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））を使用する。一例において、Ｈｅｌｉｃｏｓ（登録商標）またはＰａｃＢｉｏ（登録商標）単一分子シーケンシング方法が使用される。一例において、次世代シーケンス（ＮＧＳ）、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｒｏｃｈｅ、またはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのもの、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＳＯＬｉＤ／Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）からのゲノムアナライザー／ＨｉＳｅｑ２０００／ＭｉＳｅｑ、ＲｏｃｈｅからのＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ／ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ、またはＱｉａｇｅｎ  ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒ（商標）システムなどが使用される。特定のプラットフォームでのシーケンシングのために、シーケンシングアダプター（例えばＰＣＲを使用して導入された、例えばライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコン上に存在するポリＡまたはポリＴテールなど）は、ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンの捕獲に使用することができる。一例において、ナノポアタイプのシーケンサーが使用される。
【０１５６】
４５４（登録商標）またはＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）によるシーケンシングは、典型的には、開示された方法のための、核酸のランダムな断片化、それに続くｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける共通のアダプター配列ライゲーションによって達成される核酸調製を含むが、シーケンシングされる核酸のランダムな断片化のステップは、行わなくてもよく、さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアダプター配列のライゲーションは、ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコン、例えばライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコン中に存在する実験タグなどに対してなすことができる。４５４（登録商標）シーケンシングの場合、シーケンシングプライマーは、シーケンシングチップ／ビーズアンプリコン上での増幅の後にライゲートした標的にハイブリダイズする。
Ｉ．対照
【０１５７】
一部の実施形態では、本方法は、１つまたは複数の陽性および／または陰性対照の使用を含む。一部の例において、対照は、実際の実験ＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳと同じ反応条件に晒される。タグ付けを使用することによって、実際の異なる試料を対照として使用するが、シーケンシングのために加工して、同じシーケンシングレーンで試験試料として泳動することが許容される。
【０１５８】
一部の例において、対照は、試料が接触する、複数のＮＰＰＦ中に含まれる「陽性対照」ＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳである。一部の例において、この陽性対照は、例えば各試料の溶解した細胞の数、ＤＮＡもしくはＲＮＡの回収率、またはハイブリダイゼーション効率などの可変値に対する内部正規化対照である。一例において、標的ＲＮＡを測定する場合、ＤＮＡが、細胞の数に対する対照として測定される。一部の例において、陽性対照は、試料中に存在することがわかっているＤＮＡまたはＲＮＡに特異的な、１つまたは複数のＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳ（例えば、試験される種中に存在する可能性が高い核酸配列、例えば１つまたは複数の基底レベルのまたは構成的なハウスキーピング遺伝子、または繰り返しのＤＮＡエレメントなど）を含む。例示的な陽性対照標的としては、これらに限定されないが、構造遺伝子（例えば、アクチン、チューブリン、またはその他）またはＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写調節因子、またはその他）、加えてハウスキーピング遺伝子が挙げられる。一部の例において、陽性対照標的としては、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ペプチジルプロリルイソメラーゼ（ｐｅｐｔｉｄｙｌｐｒｏｙｌｙｌ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）Ａ（ＰＰＩＡ）、大きいリボソームタンパク質（ＲＰＬＰ０）、リボソームタンパク質Ｌ１９（ＲＰＬ１９）、ＳＤＨＡ（コハク酸デヒドロゲナーゼ）、ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ＨＢＳ１Ｌ（ＨＢＳ１様タンパク質）、β−アクチン（ＡＣＴＢ）、５−アミノレブリン酸シンターゼ１（ＡＬＡＳ１）、β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、アルファヘモグロビン安定化タンパク質（ＡＨＳＰ）、リボソームタンパク質Ｓ１３（ＲＰＳ１３）、リボソームタンパク質Ｓ２０（ＲＰＳ２０）、リボソームタンパク質Ｌ２７（ＲＰＬ２７）、リボソームタンパク質Ｌ３７（ＲＰＬ３７）、リボソームタンパク質３８（ＲＰＬ３８）、オルニチンデカルボキシラーゼアンチザイム１（ＯＡＺ１）、ポリメラーゼ（ＲＮＡ）ＩＩ（ＤＮＡ依存性）ポリペプチドＡ、２２０ｋＤａ（ＰＯＬＲ２Ａ）、チオレドキシン様１（ＴＸＮＬ１）、ｙｅｓ関連タンパク質１（ＹＡＰ１）、エステラーゼＤ（ＥＳＤ）、プロテアソーム（プロソーム（ｐｒｏｓｏｍｅ）、マクロペイン（ｍａｃｒｏｐａｉｎ））２６Ｓサブユニット、ＡＴＰアーゼ１（ＰＳＭＣ１）、真核生物翻訳開始因子３、サブユニットＡ（ＥＩＦ３Ａ）、または１８Ｓ  ｒＲＮＡに特異的な、１つまたは複数のＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳが挙げられる。一部の例において、陽性対照標的は、繰り返しのＤＮＡエレメント、例えばＨＳＡＴ１、ＡＣＲＯ１、およびＬＴＲ３などである。一部の例において、陽性対照標的は、単一コピーのゲノムＤＮＡ配列である（一倍体ゲノムと仮定して）。例えば、対応する陽性対照ＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳは、ハイブリダイゼーションの前またはその間に、複数の試験ＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳと共に試料に添加することができる。
【０１５９】
一部の例において、陽性対照としては、１つまたは複数のＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳであって、その相補物が、ハイブリダイゼーションの前またはその間に、複数のＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳと共に、試料に添加されたスパイクインされた（例えば、添加された）標的核酸分子（例えば、１つまたは複数のｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写された核酸、関連のない試料からから単離された核酸、または合成核酸、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドなど）であるものが挙げられる。一例において、陽性対照ＮＰＰＦおよびスパイクインは、単一のヌクレオチドミスマッチを有する。一例において、複数のＮＰＰＦおよびスパイクインが添加され、スパイクインは、インプットの「ラダー」を形成し、最終的なシーケンシングアウトプットにおけるアッセイのダイナミックレンジを示す公知の濃度範囲（例えば１ｐＭ、１０ｐＭ、および１００ｐＭなど）で添加される。
【０１６０】
一部の例において、「陰性対照」としては、例えばハイブリダイゼーションの特異性に関する対照としての、その相補物が試料に存在しないことがわかっている１つまたは複数のＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳ、例えば、試験される種以外の種からの核酸配列、例えばヒト核酸が分析される場合、植物核酸配列（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＡＰ２様エチレン応答性転写因子（ＡＮＴ））、または天然に認められない核酸配列などが挙げられる。
【０１６１】
一部の例において、対照は、本方法における特定のステップが適切に作動するかどうかを決定するのに使用される。一部の例において、陽性または陰性対照は、最後のシーケンシング結果で評価される。一例において、対照は、標的捕獲後、ただしそのシーケンシング前に（例えば、図２Ａにおけるステップ４と５の間に）分析を含む。１つのこのような例において、この分析は、アッセイ中におけるヌクレアーゼの有効性を評価するための陰性対照プローブに対するＴａｑｍａｎプローブの使用を含む。全ての陰性対照プローブは、ヌクレアーゼステップによって除去されるはずであり、それゆえに陰性対照プローブの量が多い場合、それは、ヌクレアーゼ保護が適切に実行されなかったこと、および試料が損なわれた可能性があることを指し示す場合がある。別のこのような例において、陰性対照プローブのためのＴａｑｍａｎアッセイは、捕獲された標的全体の量の同時測定による定量化（すなわち、ＳＹＢＲベースのｑＰＣＲ方法を使用すること）と組み合わされる。
【０１６２】
一例において、分析される試料は、開示された方法を実行する前に増幅条件（例えば、ｑＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲ）に晒され、試料が十分な量の（および品質の）核酸分子を有するかどうかを決定する。例えば、目的の標的領域、例えばＫＲＡＳまたはＢＲＡＦなど、ハウスキーパーＲＮＡ遺伝子、例えばＧＡＰＤＨなど、または繰り返しのＤＮＡエレメント、例えばＬＴＲ３などを増幅するプライマーを使用してｑＰＣＲを実行し、試料中の評価可能な核酸を決定することができる。一例において、所与のＮＰＰＦの標的部位より小さい核酸断片は、ヌクレアーゼ消化中にＮＰＰＦを保護しないため、それらは評価されないことから、利用可能な核酸が評価されるほど十分に大きいかどうかを決定するために、プライマーが標的領域のサイズに近い領域が増幅されるようにプライマーを設計する。一例において、許容できる試料の量および品質の範囲は、例えば特定の試料タイプ（例えば、肺または黒色腫の試料）または様式（例えば、ホルマリン固定された組織または細胞株）を使用して実験的に決定される。
ＩＩＩ．フランキング配列を有するヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰＦ）
【０１６３】
開示された方法は、１つまたは複数の標的核酸分子を、例えば同時または同時発生的に直接シーケンシングすることを許容する。標的核酸に基づいて、ＮＰＰＦは、開示された方法で使用するために、本明細書に記載の基準を当業者の知見と合わせて使用して設計することができる。一部の例において、開示された方法は、特定の標的核酸分子を検出するための１つまたは複数の適切なＮＰＰＦの生成を含む。ＮＰＰＦは、様々な条件（公知の、または経験的に決定された）下で、このような標的が試料中に存在する場合、標的核酸またはその一部に特異的に結合する（または特異的に結合することが可能であり、例えば特異的にハイブリダイズすることが可能である）。
【０１６４】
図１Ａは、標的核酸配列に特異的に結合するかまたはハイブリダイズする配列を含む領域１０２を有する例示的なＮＰＰＦ１００、加えてそれぞれＮＰＰＦの５’および３’末端におけるフランキング配列１０４、１０６を示し、フランキング配列は、それらの相補的配列（本明細書ではＣＦＳと称される）に結合またはハイブリダイズする。２つのフランキング配列が示されるが、一部の例において、ＮＰＰＦは、１つのみのフランキング配列を有し、例えば５’末端に１つまたは３’末端に１つのフランキング配列を有する。一部の例において、ＮＰＰＦは、２つのフランキング配列を含み、５’末端に一方および３’末端に他方のフランキング配列を含む。一部の例において、５’末端におけるフランキング配列は、３’末端におけるフランキング配列とは異なる。図１Ｂは、２つの別個の核酸分子１２８、１３０で構成されるＮＰＰＦ１２０の実施形態を示す。一例において、ＮＰＰＦは、各フランキング配列１０４、１０６に対して１００ｎｔ、２５ｎｔであり、標的核酸配列に特異的に結合するかまたはハイブリダイズする領域１０２に対して５０ｎｔである。
【０１６５】
ＮＰＰＦ（加えてＮＰＰＦに結合するＣＦＳ）は、任意の核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子などであってもよく、天然にはない塩基を含んでいてもよい。したがって、ＮＰＰＦ（加えてＮＰＰＦに結合するＣＦＳ）は、天然（例えばリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）など）または非天然ヌクレオチド（例えばロックド核酸（ＬＮＡ、例えば、米国特許第６，７９４，４９９号を参照）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）などで構成されていてもよい。ＮＰＰＦは、一本鎖であってもよいし、または二本鎖であってもよい。一例において、ＮＰＰＦは、ｓｓＤＮＡであり、ＣＦＳは、ＲＮＡである（例えば、標的は、ＲＮＡである）。一例において、ＮＰＰＦは、ｓｓＲＮＡであり、ＣＦＳは、ＤＮＡである（例えば、標的は、ＤＮＡである）。一部の例において、ＮＰＰＦ（加えてＮＰＰＦに結合するＣＦＳ）は、１つまたは複数の合成塩基または代替塩基（例えばイノシンなど）を含む。改変されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、合成または代替ヌクレオチドは、ＮＰＰＦにおいて、１つまたは複数の位置で（例えば１、２、３、４、５つ、またはそれより多くの位置で）使用することができる。例えば、ＮＰＰＦおよび／またはＣＦＳは、改変された塩基、および／または改変されたリン酸骨格を含有する１つまたは複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の例において、ＮＰＰＦにおける１つまたは複数の改変されたまたは非天然ヌクレオチドの使用は、改変された核酸を含まない同じ長さおよび組成を有するＮＰＰＦのＴｍと比べてＮＰＰＦのＴｍを増加させることができる。当業者は、望ましいＴｍを有するプローブを得るために、このような改変されたヌクレオチドを含むプローブを設計することができる。一例において、ＮＰＰＦは、例えば一本鎖（ｓｓＤＮＡ）または分岐状ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）などのＤＮＡまたはＲＮＡで構成される。一例において、ＮＰＰＦは、アプタマーである。
【０１６６】
ＮＰＰＦは、１つまたは複数の標的核酸分子に相補的な領域を含む。同じ反応で使用されるＮＰＰＦは、類似のＴｍを有するように設計することができる。一例において、反応物中に、単一の標的核酸配列に特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦが存在する。このような例において、検出またはシーケンシングされる２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なる標的核酸配列がある場合、本方法は、それに対応して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なるＮＰＰＦを使用することができる（この場合、各ＮＰＰＦは、特定の標的に対応するか、特定の標的にハイブリダイズするのに十分な相補性を有する）。したがって、一部の例において、本方法は、少なくとも２つのＮＰＰＦを使用し、この場合、各ＮＰＰＦは異なる標的核酸分子に特異的である。しかしながら、特定の標的核酸分子、例えば単一の標的核酸配列の多くの様々な領域などに対して、数種の異なるＮＰＰＦを生成できることが理解されるであろう。一例において、ＮＰＰＦは、トランスクリプトーム中の単一の遺伝子にのみ認められる配列に相補的な領域を含む。
【０１６７】
しかしながら、一部の例において、反応物中に、例えば野生型配列などの２つまたはそれより多くの標的核酸配列、および特定の遺伝子に関する１つまたは複数の突然変異配列に特異的な単一のＮＰＰＦが存在する（例えば、図１０を参照）。したがって、一部の例において、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なる標的遺伝子（例えばＢＲＡＦ、ＫＲＡＳおよびＥＧＦＲなど）があり、それぞれ２つまたはそれより多くの標的核酸配列が検出またはシーケンシングされる場合、本方法は、それに対応して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なるＮＰＰＦを使用することができる（この場合、各ＮＰＰＦは、特定の遺伝子に対応するが、遺伝子配列の複数のバリエーションを検出することができる）。
【０１６８】
これらのタイプのＮＰＰＦの組合せを単一の反応で使用することができ、このような組合せは、例えば（１）それぞれ単一の標的核酸配列に対する特異性（例えば相補性）を有する１つまたは複数のＮＰＰＦ（例えば、単一の標的核酸分子に十分ハイブリダイズすることのみ可能である）、および（２）それぞれ単一の標的遺伝子に対する特異性（例えば相補性）を有するが、その遺伝子における複数のバリエーションを検出する能力を有する１つまたは複数のＮＰＰＦ（例えば、標的遺伝子の２つまたはそれより多くのバリエーション、例えば野生型配列およびその少なくとも１つのバリエーション、例えば野生型遺伝子配列の２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なるバリエーションに十分にハイブリダイズすることができる）などである。一部の例において、反応物は、（１）それぞれ単一の標的核酸配列に対する特異性（例えば相補性）を有する、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０個の異なるＮＰＰＦ、および（２）それぞれ単一の標的遺伝子に対する特異性（例えば相補性）を有するが、その遺伝子における複数のバリエーションを検出する能力を有する、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０個の異なるＮＰＰＦを含む。
【０１６９】
したがって、単一の試料を、１つまたは複数のＮＰＰＦと接触させることができる。ＮＰＰＦのセットは、それぞれ（１）異なる標的配列および／または同じ標的遺伝子の異なる部分に特異的な、または（２）単一の標的遺伝子であるが、遺伝子配列のバリエーションを検出する能力を有するものに特異的な、２つまたはそれより多くのＮＰＰＦの集合体である。ＮＰＰＦのセットは、少なくとも、最大で、または正確に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、５０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００または１０，０００個の異なるＮＰＰＦを含んでいてもよい。一部の例において、標的が過剰になるように、このようなＮＰＰＦに対して、例えば１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍または１０６倍過剰になるように、試料を十分な量のＮＰＰＦと接触させる。一部の例において、ＮＰＰＦのセットが使用される場合、そのセットの各ＮＰＰＦは、試料中のそのそれぞれの標的（または標的の一部）に対して過剰に提供することができる。過剰なＮＰＰＦは、特定の標的に結合するＮＰＰＦの量の定量を容易にすることができる。一部の方法の実施形態は、複数の試料（例えば、少なくとも、最大で、または正確に１０、２５、５０、７５、１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００または１０，０００個の異なる試料）を、同じＮＰＰＦまたはＮＰＰＦのセットと同時または同時発生的に接触させることを含む。
【０１７０】
特定の標的または試料（例えば固定または架橋された試料など）と共に使用するためのＮＰＰＦの適切なサイズを経験的に決定する方法は、慣例的である。具体的な実施形態において、ＮＰＰＦは、最大５００ヌクレオチドの長さ、例えば最大４００、最大２５０、最大１００、または最大７５ヌクレオチドの長さであってもよく、例えば、２０〜５００、２０〜２５０、２５〜２００、２５〜１００、２５〜７５、または２５〜５０ヌクレオチドの範囲内の長さであってもよい。１つの非限定的な例において、ＮＰＰＦは、少なくとも３５ヌクレオチドの長さ、例えば少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドの長さ、例えば５０から２００、５０から１５０、５０から１００、７５から２００、４０から８０、３５から１５０、または３６、７２、７５、もしくは１００ヌクレオチドの長さである。特定のＮＰＰＦの実施形態は、望ましい機能性に応じてそれより長くてもよいし、またはそれより短くてもよい。一部の例において、ＮＰＰＦは、固定および／または架橋された試料に浸透するのに適切なサイズにされる（例えば、十分に小さい）。固定または架橋された試料は、固定または架橋の程度において変化する可能性があるため、当業者は、例えば、すでにわかっている固定された標的濃度を有する試料を使用した一連の実験を試行し、標的シグナル強度に対するＮＰＰＦサイズを比較することによって、特定の試料の条件またはタイプごとの適切なＮＰＰＦサイズを決定することができる。一部の例において、試料（それゆえに少なくともある比率の標的）が固定または架橋されており、ＮＰＰＦは、シグナル強度が高いままであり、ＮＰＰＦサイズに応じて実質的に変化しない程度に十分小さい。
【０１７１】
ＮＰＰＦ−標的およびＮＰＰＦ−ＣＦＳハイブリダイゼーションの特異性に影響を与える要因としては、ＮＰＰＦおよびＣＦＳの長さ、融解温度、自己相補性、および繰り返しのまたは固有ではない配列の存在が挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９９２年（および２０００年までの別冊）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９９年を参照されたい。特定の程度のハイブリダイゼーションをもたらす条件（ストリンジェンシー）は、ハイブリダイゼーション方法の性質およびハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて様々となる。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（例えばＮａ＋濃度など）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。一部の例において、開示された方法で利用されるＮＰＰＦは、少なくとも約３７℃、少なくとも約４２℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、少なくとも約８０℃、例えば約４２℃〜８０℃（例えば、約３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０℃）のＴｍを有する。１つの非限定的な例において、開示された方法で利用されるＮＰＰＦは、約４２℃のＴｍを有する。プローブのＴｍを計算する方法は当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年、１０章を参照）。一部の例において、特定の反応のためのＮＰＰＦは、試料中の複数の標的核酸分子の同時の検出またはシーケンシングを容易にするために、それぞれ同じまたは類似のＴｍ、例えば互いに±約１０℃、例えば互いに±１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃、または１℃であるＴｍを有するように選択される。
Ａ．標的にハイブリダイズする領域
【０１７２】
ＮＰＰＦ配列１０２（または１２２）の標的核酸配列に特異的にハイブリダイズする部分は、配列において、シーケンシングされる標的核酸配列に相補的である。この相補性は、ＮＰＰのみが単一の標的核酸配列にハイブリダイズするように設計することができ、または複数の標的核酸配列、例えば野生型遺伝子およびそのバリエーションなどにハイブリダイズすることができるように設計することができる。例えば、図１０で示されるように、単一のＮＰＰＦ（配列番号１）を、野生型ＢＲＡＦ配列だけでなく、Ｖ６００Ｅ／Ｋ／Ｒ／Ｅ２／Ｄ突然変異をコードする突然変異配列にもハイブリダイズするように設計し、単一のＮＰＰＦ（配列番号８）を、野生型ＫＲＡＳ配列だけでなく、Ｇ１２／Ｄ／Ｖ／Ａ／Ｃ／Ｓ／ＲおよびＧ１２Ｄ突然変異をコードする突然変異配列にもハイブリダイズするように設計し、さらに、単一のＮＰＰＦ（配列番号１７）を、野生型ＫＲＡＳ配列だけでなく、Ｑ６１Ｅ／Ｒ／Ｌ／Ｈ／Ｃ／Ｔ突然変異をコードする突然変異配列にもハイブリダイズするように設計した。図１０は、ＮＰＰＦの配列、および標的配列を示す（したがって、ＢＲＡＦおよびアミノ酸Ｖ６００に突然変異をもたらす突然変異（赤色のヌクレオチド）に特異的な配列番号１に示されるＮＰＰＦは、配列番号２〜７の相補配列にハイブリダイズし、ＫＲＡＳならびにアミノ酸Ｇ１２およびＧ１３に突然変異をもたらす突然変異（赤色のヌクレオチド）に特異的な配列番号８に示されるＮＰＰＦは、配列番号９〜１６の相補配列にハイブリダイズし、ＫＲＡＳおよびアミノ酸Ｑ６１に突然変異をもたらす突然変異（赤色のヌクレオチド）に特異的な配列番号１７に示されるＮＰＰＦは、配列番号１８〜２３の相補配列にハイブリダイズする）。
【０１７３】
当業者は、配列１０２（または１２２）は、必ずしも標的核酸全体に相補的でなくてもよいことを理解するであろう（例えば、標的が１００，０００ヌクレオチドの遺伝子である場合、配列１０２（または１２２）は、特定の標的核酸分子に相補的なその一部であってもよく、例えば少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００個、またはそれより多くの連続したヌクレオチドであってもよい）。プローブの特異性は長さに応じて増加する。したがって、例えば、２５個の連続したヌクレオチドを含む、標的核酸配列に特異的に結合する配列１０２（または１２２）は、１５ヌクレオチドのみの対応する配列より高い特異性で標的配列にアニールする。したがって、本明細書で開示されたＮＰＰＦは、特定の標的核酸分子（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡに相補的な、約６から５０、６から６０、１０から４０、１０から６０、１５から３０、１８から２３、１９から２２、または２０から２５個の連続したヌクレオチド）に相補的な、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも１００個、またはそれより多くの連続したヌクレオチドを含む標的核酸配列に特異的に結合する配列１０２（または１２２）を有していてもよい。
【０１７４】
本開示の方法を実施するのに使用されるＮＰＰＦの一部であり得る標的核酸配列に特異的に結合する配列１０２（または１２２）の特定の長さとしては、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続した、標的核酸分子に相補的なヌクレオチドが挙げられる。標的核酸分子がｍｉＲＮＡ（またはｓｉＲＮＡ）である一部の例において、標的核酸配列に特異的に結合する配列１０２（または１２２）の長さは、ｍｉＲＮＡ（またはｓｉＲＮＡ）の長さに適合させるために、例えば２０〜３０ヌクレオチドの長さなど（例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドなど）のより短い長さであってもよい。しかしながら、当業者は、標的に特異的に結合する配列１０２（または１２２）は、必ずしも標的核酸分子に１００％相補的でなくてもよいことを理解するであろう。一部の例において、標的に相補的なＮＰＰＦの領域と標的核酸とは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相補性を有するが、ヌクレアーゼでの消化後に何らかのミスマッチが残る可能性がある。一部の例において、例えば点突然変異の検出が望ましい場合、２つのＮＰＰＦを使用することができ、その場合、１つのＮＰＰＦの配列１０２（または１２２）は、野生型配列に特異的であり、第２のＮＰＰＦの配列１０２（または１２２）は、突然変異配列に特異的である（それにより定量的な測定が可能になる）。反応条件およびそれに対応する使用されるヌクレアーゼの選択性に応じて、例えばヌクレアーゼ消化を助けるために、１つより多くのミスマッチ（例えば少なくとも２つの隣接するミスマッチなど）が存在していてもよい。一部の例において、ＮＰＰＦは、１つまたは複数の位置（例えば１、２、３、４、５つ、またはそれより多くの位置）に縮重を有し、例えば、標的に特異的に結合する配列１０２（または１２２）中の特定された位置におけるヌクレオチドの混合物（例えば２、３、または４ヌクレオチドなど）である。他の例において、点突然変異の検出が望ましい場合、単一のＮＰＰＦを使用することができ、その場合、ＮＰＰＦの配列１０２（または１２２）は、野生型配列および突然変異配列の両方へのハイブリダイゼーションが可能になるようなものである（例えば、図１０を参照）。一部の例において、ＮＰＰＦは、例えば突然変異を含有する領域を同定するために、１つまたは複数のランダム塩基を含む。
【０１７５】
一部の例において、ＮＰＰＦの配列１０２（または１２２）は、少なくとも１つのｄＵＴＰ（例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのｄＵＴＰ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個のｄＵＴＰ）を含む。一部の例において、ｄＴＴＰの全てがｄＵＴＰで置き換えられている。このような塩基の存在は、後続のステップ（例えば、ライゲートした標的からのＮＰＰＦの変性の後、ただしシーケンシングの前）において、ウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で一本鎖ＮＰＰＦを分解または破壊することを可能にする。
【０１７６】
一例において、標的核酸分子の全てまたは一部に相補的なＮＰＰＦの配列１０２（または１２２）は、少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む。すなわち、少なくとも１つのヌクレオチドは、標的核酸分子中のその対応するヌクレオチドに相補的ではなく、したがってこの位置で塩基対を形成しない。例えば、図１０で示されるように、配列番号１は、１２位に「Ａ」の代わりに「Ｇ」を含有し、配列番号８は、１５位に「Ａ」の代わりに「Ｇ」を含有し、配列番号１７は、１３位に「Ｃ」の代わりに「Ｔ」を含有する。一部の例において、フランキング配列中に、ミスマッチは存在しない。一部の例において、フランキング配列の２塩基以内に、ミスマッチは存在しない（したがってＮＰＰＦの標的核酸分子の全てまたは一部に相補的な領域の５’末端または３’末端の２塩基以内に存在しない）。一部の例において、ミスマッチは、ＮＰＰＦの３’または５’末端から少なくとも２塩基離れている。一部の例において、ミスマッチの存在は、標的核酸分子からＮＰＰＦを区別することを可能にする。
Ｂ．フランキング配列
【０１７７】
フランキング配列１０４、１０６（または１２４、１２６）の配列は、ＣＦＳが特異的にハイブリダイズできる相補的配列を提供する。したがって、各フランキング配列１０４、１０６（または１２４、１２６）は、ＣＦＳの少なくとも一部に相補的である（例えば、５’−フランキング配列は、５ＣＦＳに相補的であり、３’−フランキング配列は、３ＣＦＳに相補的である）。フランキング配列は、他の状況で試料中に認められる（例えば、ヒトゲノム中に認められない）配列に類似していない。したがって、フランキング配列は、他の状況で試料中に存在するが核酸分子中に認められない連続したヌクレオチドの配列を含む。例えば、標的核酸がヒト配列である場合、フランキング配列の配列は、標的（例えばヒト）ゲノム中に認められる配列に類似していない。これは、標的ゲノム中に存在する可能性がある非標的配列のＮＰＰＦへの非特異的な結合（または交差反応性）の低減に役立つ。ゲノムに対するその類似性について配列を分析する方法は、公知である。
【０１７８】
ＮＰＰＦは、１または２つのフランキング配列（例えば、５’末端に１つ、３’末端に１つ、または両方）を含んでいてもよく、フランキング配列は、同一であってもよいし、または異なっていてもよい。具体的な例において、各フランキング配列は、他のいかなるＮＰＰＦ配列（例えば、配列１０２、１２２または他のフランキング配列）にも、または試料のいかなる構成要素にも特異的に結合しない。一部の例において、２つのフランキング配列がある場合、各フランキング配列１０４、１０６（または１２４、１２６）の配列は、異なる。２つの異なるフランキング配列（例えば同じＮＰＰＦ上の２つの異なるフランキング配列、および／またはＮＰＰＦのセット中の他のＮＰＰＦのフランキング配列）がある場合、一部の例において、各フランキング配列１０４、１０６（または１２４、１２６）は、類似の融解温度（Ｔｍ）、例えば互いにＴｍ±約１０℃または±５℃、例えば±４℃、３℃、２℃、または１℃を有する。
【０１７９】
一部の例において、少なくとも一方のフランキング配列は、少なくとも１つのｄＵＴＰ（例えば、フランキング配列中、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのｄＵＴＰ、例えばフランキング配列１つ当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個のｄＵＴＰ）を含む。このような塩基の存在は、後続のステップ（例えば、ライゲートした標的からのＮＰＰＦの変性の後、ただしシーケンシングの前）において、ウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で一本鎖ＮＰＰＦを分解または破壊することを可能にする。一部の例において、ＮＰＰＦは、それぞれ少なくとも１つのｄＵＴＰを有する２つのフランキング配列を含む。一部の例において、ＮＰＰＦは、２つのフランキング配列を含むが、１つのみのフランキング配列が、少なくとも１つのｄＵＴＰを有する。一部の例において、ＮＰＰＦは、少なくとも１つのｄＵＴＰを有する単一のフランキング配列を含む。一部の例において、ｄＵＴＰの配置は、標的核酸分子の領域に相補的な配列に近接しており、例えば、標的核酸分子の領域に相補的な配列から１、２、３、４、５塩基離れている（例えば、標的核酸分子の領域に相補的な配列の１、２、３、４、５塩基以内である）。一部の例において、ｄＵＴＰの配置は、標的核酸分子の領域に相補的な配列から少なくとも２塩基（例えば少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５塩基）離れている。例えば、５’末端フランキング配列１０４（または１２４）中の少なくとも１つのｄＵＴＰは、５’末端フランキング配列１０４（または１２４）の３’末端から１、２、３、４、または５塩基であってもよい。例えば、３’末端フランキング配列１０６（または１２６）中の少なくとも１つのｄＵＴＰは、３’末端フランキング配列１０６（または１２６）の５’末端から１、２、３、４、または５塩基であってもよい。
【０１８０】
一例において、ＮＰＰＦのフランキング配列１０４、１０６（または１２４、１２６）部分は、少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む。すなわち、少なくとも１ヌクレオチドは、ＣＦＳ中のその対応するヌクレオチドに相補的ではなく、したがってこの位置で塩基対を形成しない。
【０１８１】
特定の例において、ＮＰＰＦのフランキング配列１０４、１０６（または１２４、１２６）部分は、少なくとも１２ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２５ヌクレオチドの長さ、例えば少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０ヌクレオチドの長さ、例えば１２から５０、１２から２５、または１２から３０ヌクレオチド、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さであり、この場合、この連続したヌクレオチドは、試験される試料中に存在する核酸分子中に認められない。フランキング配列に相補的な配列（ＣＦＳ）を有する分子をフランキング配列にハイブリダイズすることによって、フランキング配列は、ヌクレアーゼによる分解から保護される。
ＩＶ．相補的フランキング配列（ＣＦＳ）
【０１８２】
各ＣＦＳ（例えば、図２Ａの２０８または２１０）は、ＮＰＰＦのその対応するフランキング配列に相補的である。例えば、ＮＰＰＦが５’−フランキング配列を含む場合、５ＣＦＳが本方法に使用される。ＮＰＰＦが３’−フランキング配列を含む場合、３ＣＦＳが本方法に使用される。５’−および３’−フランキング配列が互いに異なる場合、５ＣＦＳおよび３ＣＦＳは、互いに異なる。当業者は、ＣＦＳおよびＮＰＰＦのフランキング配列は、ＮＰＰＦとその標的および対応するＣＦＳとのハイブリダイゼーションが起こり得る限り、必ずしも１００％相補的でなくてもよいことを理解するであろう。一部の例において、ＮＰＰＦおよびＣＦＳのフランキング配列は、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相補性を共有する。一部の例において、ＣＦＳは、ＮＰＰＦのその対応するフランキング配列と同じ長さである。例えば、フランキング配列が２５ｎｔの場合、ＣＦＳは２５ｎｔであり得る。
【０１８３】
一部の例において、ＣＦＳは、標的ゲノムで認められる配列に類似していない。例えば、標的核酸がヒト配列である場合、ＣＦＳの配列（および対応するフランキング配列）は、標的ゲノムで認められる配列に類似していない。これは、ＣＦＳ（およびＮＰＰＦ）への結合から標的ゲノム中に存在する可能性がある非標的配列の結合を低減するのに役立つ。ゲノムに対するその類似性に関して配列を分析する方法は当技術分野において周知である。
【０１８４】
ＣＦＳは、増幅プライマーの少なくとも一部に相補的な万能な増幅ポイントを提供することができる。したがってＣＦＳは、異なる標的核酸分子ごとにライゲートした標的を増幅するのに同じ増幅プライマーを使用することを許容する。したがって、ＣＦＳの配列の少なくとも一部は、増幅プライマーの少なくとも一部に相補的である。図５で示されるように、これは、プライマーをＣＦＳにハイブリダイズさせ、ＣＦＳがライゲートされている標的核酸分子を増幅することを可能にする。ＣＦＳは異なる標的核酸分子間で同一であってもよいことから、これは、任意の数のＣＦＳがライゲートされている異なる標的を増幅するのに同じプライマーを使用することを許容する。したがって、５ＣＦＳに相補的な配列を含む増幅プライマー、および３ＣＦＳに相補的な配列を含む増幅プライマーはどちらも、標的配列が異なっているとしても、複数のライゲートした標的を増幅するのに単一の反応で使用することができる。
【０１８５】
一部の例において、ＣＦＳは、実験タグ配列および／またはシーケンシングアダプター配列を含まない。一部の例において、ＣＦＳは、実験タグ配列および／またはシーケンシングアダプター配列を含むかまたはそれらからなる。他の例において、ライゲートした標的（少なくとも１つのＣＦＳを含む）を増幅するのに使用されるプライマーは、実験タグ配列および／またはシーケンシングアダプター配列（例えば一部のシーケンシングプラットフォームに必要なポリＡまたはポリＴ配列など）を含み、したがってライゲートした標的の増幅中に、実験タグおよび／またはシーケンシングアダプターをライゲートした標的アンプリコンに取り込むことが許容される。実験的タグおよびシーケンシングアダプターは、セクションＩＩ、Ｇで上述されている。１つより多くの実験タグ（例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つの異なる実験タグ）、例えばライゲートした標的、ライゲートした標的アンプリコン、または試料を固有に同定するのに使用されるタグなどを含めることができることが理解されるであろう。
【０１８６】
図６ＡおよびＢで例示されているように、本方法は、単一のＣＦＳを使用することができる。図６Ａおよび６Ｂは、５’末端にＣＦＳ（５ＣＦＳ）を示すが、その代わりに３’末端にあってもよいことが理解されるであろう。図６Ａは、反応物中の標的の全てが同じＣＦＳ  Ｆ１にライゲートされる例（したがって反応物中のＮＰＰＦが同じフランキング配列を有する例）を示す。Ｆ１特異的プライマーを用いた増幅は、各ライゲートした標的に同じ５’−または３’−タグ（例えば、シーケンシングアダプターまたは実験的タグ）を付加するのに使用することができる。例えば、同じシーケンシングアダプターは、ライゲートした標的の全てに付加することができ、それにより、同じシーケンシングプラットフォームで標的をシーケンシングすることが許容される。図６Ｂは、反応物中の各標的が異なるＣＦＳ  Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３にライゲートされる例（したがって反応物中のＮＰＰＦまたはＮＰＰＦの各部分集団が異なるフランキング配列を有する例）を示す。別の例において、Ｔ１−Ｆ１、Ｔ２−Ｆ２、およびＴ３−Ｆ３特異的プライマーを用いた増幅は、それぞれの異なるライゲートした標的に異なる実験的タグを付加するのに使用することができる。
【０１８７】
図６Ｃ〜６Ｆで例示されているように、標的は、一部の例において、２つのＣＦＳに、一方は標的の５’末端で、他方は３’末端でライゲートすることができる（したがって使用されるＮＰＰＦは、２つのフランキング配列を有する）。図６Ｃは、反応物中の標的の全てが両方の末端で同じＣＦＳ、Ｆ１にライゲートされる例を示す。図６Ｄは、５’末端上のＣＦＳの全てが同じ（例えば、Ｆ１）であり、３’末端上のＣＦＳの全てが同じ（例えば、Ｆ（ａ））であるが、５’末端および３’末端のＣＦＳが異なる例を示す。このような例において、これは、標的の一方の末端に同じ実験タグを含め、標的の他方の側に同じシーケンシングアダプターを含めることを許容する。図６Ｅは、一方の末端上のＣＦＳの全てが同じであるが（例えば、５’末端上のＦ１）、他方の末端上のＣＦＳの全てが互いに異なる例（例えば、Ｆ（ａ）、Ｆ（ｂ）、およびＦ（ｃ））を示す。このような例において、これは、ライゲートした標的の全てにシーケンシングアダプターを使用することを許容する。他方の末端上のフランキング配列、Ｆ（ａ）、Ｆ（ｂ）およびＦ（ｃ）は、例えば各標的を差次的に標識する（例えば異なる実験タグを使用して）のに使用することができる。図６Ｆは、ＣＦＳの全てが、それらの位置に関わりなく異なる例（例えば、Ｆ（ａ）、Ｆ（ｂ）、Ｆ（ｃ）、Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３）を示す。この例において、各ＣＦＳは、異なる実験タグにつき、または異なる実験タグおよび異なるシーケンシングアダプターの組合せにつき使用することができる。
Ｖ．試料
【０１８８】
試料は、１つまたは複数の標的を含む任意の集合体であり、例えば生体試料または生物学的検体であり、例えば対象（例えばヒトまたは他の哺乳類対象、例えば獣医学的な対象、例えば腫瘍または感染を有することがわかっているかまたはその疑いのある対象）から得られたものである。試料は、当業者に周知の方法を使用して収集または入手することができる。開示された方法で使用される試料としては、核酸（例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸断片、改変された核酸、合成核酸など）を含む任意の検体を挙げることができる。一例において、試料は、ＲＮＡを含む。一部の例において、シーケンシングされる標的核酸分子は、試料中で架橋されているか（例えば架橋されたＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｖＲＮＡなど）、または試料中で可溶性である。一部の例において、試料は、固定された試料、例えば標的分子の架橋を引き起こす薬剤を含む試料（したがって、一部の例において、標的核酸分子が固定されていてもよい）などである。一部の例において、試料中の標的核酸は、標的核酸分子を検出またはシーケンシングする前に、抽出されていないか、可溶化されていないか、または両方である。一部の例において、試料は、ｅｘ  ｓｉｔｕの生体試料である。
【０１８９】
一部の例において、開示された方法は、試料の分析の前に試料を得ることを含む。一部の例において、開示された方法は、特定の疾患または腫瘍を有する対象を選択すること、次いで一部の例において、１つまたは複数の標的ＤＮＡまたはＲＮＡをさらに選択して、対象の特定の疾患または腫瘍に基づき検出すること、例えば、対象につき、または１つまたは複数の療法の選択につき、診断または予後を決定することを含む。一部の例において、分析される試料中の核酸分子は、まず試料から単離されるか、抽出されるか、濃縮されるか、またはそれらの組合せが行われる。
【０１９０】
一部の例において、試料中のＲＮＡは、本明細書で提供される方法を実行する前に逆転写される。
【０１９１】
一部の例において、試料、例えばｅｘ  ｓｉｔｕの試料などは、溶解している。ある特定の例における溶解緩衝液は、ＲＮＡを分解する酵素を不活性化することができるが、ハイブリダイゼーション希釈緩衝液への限界希釈の後、ヌクレアーゼ活性を許容し、ストリンジェントな特異性でのハイブリダイゼーションを促進する。希釈緩衝液を添加して、溶解および他の緩衝液の阻害活性、例えば他の酵素（例えば、ポリメラーゼ）に対する阻害活性を中和することができる。代替として、溶解緩衝液および他の緩衝液の組成を、例えばポリメラーゼまたはリガーゼに容認される組成に変えてもよい。
【０１９２】
一部の例において、本方法は、複数の試料を同時または同時発生的に分析することを含む。例えば、本方法は、少なくとも２つの異なる試料（例えば異なる対象、例えば患者からの）を同時または同時発生的に分析することができる。１つのこのような例において、本方法は、さらに、少なくとも２つの異なる試料（例えば少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも１０，０００個の異なる試料）中の少なくとも２つの異なる標的核酸分子（例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なる標的）を同時または同時発生的に検出またはシーケンシングすることができる。
【０１９３】
例示的な試料としては、これらに限定されないが、細胞、細胞溶解産物、血液塗抹標本、細胞遠心分離調製物、フローソーティングされたまたはそれ以外の方法で選択された細胞集団、細胞学的な塗抹標本、染色体調製物、体液（例えば、血液およびその画分、例えば白血球、血清または血漿など；唾液；痰；尿；脊髄液；胃液；汗；精液など）、口腔細胞、組織、細胞もしくは臓器の抽出物、組織生検（例えば、腫瘍またはリンパ節生検）、液体生検、細針吸引物、気管支洗浄物（ｂｒｏｃｏｓｃｏｐｉｃ  ｌａｖａｇｅ）、パンチ生検、循環腫瘍細胞、骨髄、羊水穿刺試料、病理解剖材料、新鮮な組織、凍結した組織、固定された組織、固定およびワックス（例えば、パラフィン）包埋組織、骨髄、ならびに／または組織切片（例えば、クライオスタット組織切片および／またはパラフィン包埋組織切片）が挙げられる。また生体試料は、例えば細胞培養試料または上清などの実験調査試料であってもよい。
【０１９４】
例示的な試料は、正常な細胞もしくは組織から、または新生細胞もしくは組織から得ることができる。新形成は、１つまたは複数の細胞が、分化の損失、成長速度の増加、周囲組織の浸潤を伴う特徴的な退形成を受け、そのような細胞が転移可能な状態であり得る生物学的な状態である。特定の例において、生体試料としては、腫瘍試料、例えば新生細胞を含有する試料などが挙げられる。
【０１９５】
例示的な新生細胞または組織は、例えば、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、例えば肺扁平上皮癌など）、乳癌（例えば小葉および管癌）、副腎皮質がん、エナメル上皮腫、乳頭部がん、膀胱がん、骨がん、子宮頸がん、胆管腫、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、神経膠腫、顆粒細胞腫、頭頸部がん、肝細胞がん、胞状奇胎（ｈｙｄａｔｉｆｏｒｍ  ｍｏｌｅ）、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔がん、骨軟骨腫、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、毛基質細胞腫、前立腺がん、腎細胞がん、唾液腺腫瘍、軟部組織腫瘍、スピッツ母斑、扁平上皮がん、奇形様のがん、および甲状腺がんなどの固形腫瘍に含まれるもの、またはそれから単離されたものであり得る。例示的な新生細胞としてはまた、例えば、白血病、例えば、急性白血病（例えば急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球および赤白血病など）、慢性白血病（例えば慢性骨髄性（顆粒球）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病など）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度の形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、および脊髄形成異常などの血液がんに含まれるもの、またはそれから単離されたものも挙げることができる。
【０１９６】
例えば、細胞性物質を含有する腫瘍からの試料は、腫瘍の全てまたは一部の外科的切除、腫瘍からの穿刺吸引物の収集、加えて他の方法により得ることができる。一部の例において、組織または細胞試料を基板に適用し、分析して、１つまたは複数の標的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を決定する。開示された方法において有用な固体支持体は、生体試料を有していればよく、任意選択で、試料中の構成要素（例えば、タンパク質および／または核酸配列）を都合よく検出することを許容する。例示的な支持体としては、顕微鏡スライド（例えば、ガラス顕微鏡スライドまたはプラスチック顕微鏡スライド）、カバーガラス（例えば、ガラスカバーガラスまたはプラスチックカバーガラス）、組織培養皿、マルチウェルプレート、膜（例えば、ニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ））またはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップが挙げられる。
【０１９７】
開示された方法は、高感度で特異的であり、限られた数の細胞しか含有しない試料中の標的核酸分子であってもシーケンシングを可能にする。少数の細胞、例えば２５０，０００個未満の細胞（例えば１００，０００個未満、５０，０００個未満、１０，０００個未満、１，０００個未満、５００個未満、２００個未満、１００個未満の細胞、または１０個未満の細胞）などを含む試料としては、これらに限定されないが、ＦＦＰＥ試料、細針吸引物（例えば肺、前立腺、リンパ液、乳房、または肝臓からのものなど）、パンチ生検、針生検、（例えば、ＦＡＣＳ）ソートされた細胞または循環腫瘍細胞の小集団、肺吸引物、少数のレーザー捕獲された、フローソーティングされた、もしくは肉眼での解剖で得られた細胞または循環腫瘍細胞、エキソゾームおよび他の細胞内粒子、または体液（例えば血漿、血清、脊髄液、唾液、および乳房吸引物など）が挙げられる。例えば、１０００個もの少ない細胞でも（例えば１０００個またはそれより多くの細胞、例えば１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、５０，０００個、またはそれより多くの細胞を含む試料など）、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡをシーケンシングすることができる（したがって検出することができる）。一部の例において、約１０００から１００，０００個の細胞、例えば約１０００から５０，０００、１０００から１５，０００、１０００から１０，０００、１０００から５０００、３０００から５０，０００、６０００から３０，０００、または１０，０００から５０，０００個の細胞で、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡの発現を検出することができる。一部の例において、約１００から２５０，０００個の細胞、例えば約１００から１００，０００、１００から５０，０００、１００から１０，０００、１００から５０００、１００から５００、１００から２００、または１００から１５０個の細胞で、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡの発現を検出することができる。他の例において、約１から１０００個の細胞（例えば、約１から５００個の細胞、約１から２５０個の細胞、約１から１００個の細胞、約１から５０個の細胞、約１から２５個の細胞、または約１個の細胞など）で、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡをシーケンシングすることができる。
【０１９８】
試料は、試料を標的特異的な試薬（例えばＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳなど）と接触させる前に（またはそれと同時発生的に）多数の方法で処理することができる。１つの比較的簡単な処理は、緩衝液、例えば溶解緩衝液中での試料の懸濁であり、それにより、単一の溶液中に試料の全ての構成要素が維持される。一部の例において、試料は、試料から標的（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を単離（例えば、抽出）するために部分的または完全に処理される。標的（例えばＤＮＡまたはＲＮＡなど）が、試料中の他の非標的の生物学的構成要素から分離されて精製される場合、それは単離または抽出されている。精製は、試料中にも認められる１つまたは複数の無関係な構成要素（例えば、細胞器官、タンパク質）から標的を分離することを指す。混成の検体または試料から単離、抽出または精製される構成要素は、典型的には、未精製または未抽出の試料と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９８％、またはさらに少なくとも９９％に富化される。
【０１９９】
試料からの生物学的な構成要素の単離は、時間がかかり、例えば分解および／もしくは不良な効率または単離に使用されるプロセスの不完全さによって単離されている構成要素を損失するリスクを有する。さらに、例えば固定された組織などの一部の試料を用いる場合、標的（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）など）は、高い忠実度で単離することが困難なことで知られている（例えば、新鮮なまたは凍結した組織と比較して）。これはなぜなら、少なくともある程度の比率の標的が固定された試料中の他の構成要素に架橋され、それゆえに容易に単離または可溶化できず、可溶性および不溶性画分が分離されるときに失われる可能性があるためと考えられる。加えて、非常に短いＤＮＡおよびＲＮＡ断片は、沈殿またはマトリックス結合ステップ中に失われる可能性があり、測定バイアスが生じる。したがって、一部の例において、開示された標的核酸をシーケンシングする方法は、試料を１つまたは複数のＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳと接触させる前に試料から標的核酸分子を精製、抽出または単離することを必要としないかまたは含まず、および／または試料をＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳと接触させる前に、試料の全ての構成要素を保持する溶液、例えば溶解緩衝液中に試料を懸濁することのみを含む。したがって、一部の例において、本方法は、核酸分子の分析の前に、試料から核酸分子を単離することを含まない。
【０２００】
一部の例において、試料中の細胞を、水溶液中で（例えば溶解緩衝液を使用して）溶解させるかまたは透過化する。水溶液または溶解緩衝液は、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウムなど）および１つまたは複数のカオトロピック剤（例えばホルムアミド、グアニジニウムＨＣｌ、グアニジンイソチオシアネート、または尿素など）を含む。溶液はまた、緩衝液（例えばＳＳＣ）を含有していてもよい。一部の例において、溶解緩衝液は、約８％から６０％のホルムアミド（ｖ／ｖ）、約０．０１％から０．１％のＳＤＳ、および約０．５〜６×ＳＳＣ（例えば、約３×ＳＳＣ）を含む。緩衝液は、任意選択で、ｔＲＮＡ（例えば、約０．００１から約２ｍｇ／ｍｌ）；リボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ；プロテイナーゼＫ；タンパク質、マトリックス、炭水化物、脂質、もしくはオリゴヌクレオチドの１種を分解する酵素（例えばコラゲナーゼまたはリパーゼ）、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。溶解緩衝液はまた、ｐＨインジケーター、例えばフェノールレッドなどを含んでいてもよい。細胞を、水溶液（任意選択で油で覆われた）中で、十分な期間（例えば約１分から約６０分、例えば約５分から約２０分、または約１０分）、十分な温度（例えば約２２℃から約１１０℃、例えば、約８０℃から約１０５℃、約３７℃から約１０５℃、または約９０℃から約１００℃）でインキュベートして、細胞を溶解または透過化する。一部の例において、溶解は、約５０℃、６５℃、９５℃、または１０５℃で実行される。一部の例において、溶解ステップは、試料を約９５℃で約５〜１５分インキュベートして、試料中の、ゲノムＤＮＡではなくＲＮＡを変性させることを含む。他の例において、溶解ステップは、試料を約１０５℃で約５〜１５分インキュベートして、試料中のＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方を変性させることを含む。一例において、溶解緩衝液中に、プロテイナーゼＫが含まれる。
【０２０１】
一部の例において、粗細胞溶解物は、さらなる精製を行わずに直接使用される。細胞は、ＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳの１つまたは複数の存在または非存在で溶解してもよい。ＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳの非存在下で細胞を溶解する場合、それに続き、１つまたは複数のＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳを粗溶解産物に添加することができる。他の例において、核酸（例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡなど）は、溶解産物を１つまたは複数のＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳと接触させる前に、細胞溶解産物から単離される。
【０２０２】
他の例において、組織試料は、組織を媒体に固着および包埋させることによって調製されるか、または例えば細胞を固体支持体上に塗抹または遠心分離することによって、固体支持体（例えばスライドガラスなど）上に単分子層として調製される細胞懸濁液を含む。さらなる例において、新鮮な凍結した（例えば、固着していない）組織または組織切片は、本明細書で開示された方法で使用することができる。特定の例において、ＦＦＰＥ組織切片が開示された方法で使用される。
【０２０３】
一部の例において、包埋媒体が使用される。包埋媒体は、組織および／または細胞を包埋して今後の分析のためにそれらを保存することを助ける不活性材料である。包埋はまた、組織試料を薄い切片にスライスすることも可能にする。包埋媒体としては、パラフィン、セロイジン、ＯＣＴ（商標）コンパウンド、寒天、プラスチック、またはアクリル系樹脂が挙げられる。多くの包埋媒体は疎水性であるため、不活性材料は、主として親水性試薬を利用する分析前に、除去する必要がある場合がある。脱パラフィンまたは脱ろうという用語は、生体試料から任意のタイプの包埋媒体を部分的または完全に除去することを指す。例えば、パラフィン包埋組織切片は、有機溶媒、例えばトルエン、キシレン、リモネン、または他の好適な溶媒などに通過させることによって脱ろうされる。他の例において、パラフィン包埋組織切片は、直接（例えば、脱ろうステップを行わずに）利用される。
【０２０４】
組織は、灌流などの任意の好適なプロセスによって、または固定剤中の浸漬によって固着することができる。固定剤は、架橋剤（例えばアルデヒド、例えばホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドなど、加えて非アルデヒド架橋剤）、酸化剤（例えば、金属イオンおよび錯体、例えば四酸化オスミウムおよびクロム酸など）、タンパク質変性剤（例えば、酢酸、メタノール、およびエタノール）、未知のメカニズムの固定剤（例えば、塩化第二水銀、アセトン、およびピクリン酸）、試薬の組合せ（例えば、カルノア固定剤、メタカルン（ｍｅｔｈａｃａｒｎ）、ブアン液、Ｂ５固定剤、ロスマン液、およびジェンダー液）、マイクロ波、および種々の固定剤（例えば、排除体積固定および蒸気固定）として分類することができる。また固定剤中に、例えば緩衝液、界面活性剤、タンニン酸、フェノール、金属塩（例えば塩化亜鉛、硫酸亜鉛、およびリチウム塩など）、およびランタンなどの添加剤が含まれていてもよい。
【０２０５】
組織または細胞試料の調製において最も一般的に使用される固定剤は、ホルムアルデヒドであり、これは、一般的にはホルマリン溶液（緩衝溶液中４％ホルムアルデヒド、１０％緩衝ホルマリンと称される）の形態である。一例において、固定剤は、１０％中性緩衝ホルマリンであり、したがって一部の例において、試料は、ホルマリン固定されている。
【０２０６】
一部の例において、試料は、環境試料（例えば土壌、空気、空気フィルター、もしくは水試料、または表面から得られた試料（例えば綿棒などでのふき取りによる）など）であるか、または例えば存在する可能性がある病原体を検出するための食品試料（例えば野菜、果実、乳製品または肉類を含有する試料など）である。
ＶＩ．標的核酸
【０２０７】
標的核酸分子（例えば標的ＤＮＡまたはＲＮＡなど）は、開示された方法を用いてその検出、量、および／または配列が決定されること（例えば定量的または定性的な方式で）が意図される核酸分子である。一例において、標的は、核酸分子、例えば目的のＤＮＡまたはＲＮＡの定義された領域または特定の部分である。標的核酸配列が標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡである例において、このような標的は、その特異的な配列または機能によって；その遺伝子またはタンパク質の名称によって；または他の核酸のなかからそれを固有に同定する他の任意の手段によって定義することができる。
【０２０８】
一部の例において、標的核酸配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の変更は、疾患または状態に「関連する」。すなわち、標的核酸配列のシーケンシングは、疾患または状態に関する試料のステータスを推論するのに使用することができる。例えば、標的核酸配列は、第１の形態が疾患または状態の非存在と相関し、第２の（または異なる）形態が疾患または状態の存在と相関するように、２つの（またはそれより多くの）区別可能な形態で存在していてもよい。２つの異なる形態は、例えばヌクレオチド多形または突然変異などによって定性的に区別可能であり、および／または２つの異なる形態は、例えば試料中に存在する標的核酸配列のコピー数などによって定量的に区別可能である。
【０２０９】
標的は、真核生物、原核生物、ウイルス、真菌、細菌、寄生虫、または他の生物由来かどうかにかかわらず、一本鎖、二本鎖または他の複数鎖の核酸分子（例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノム、ミトコンドリア、または合成）、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、長い非コード（ｎｃ）ＲＮＡ、生物学的に発生するアンチセンスＲＮＡ、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、または低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）など）を含む。ゲノムＤＮＡ標的は、ゲノムの１つまたは数々の部分、例えばコード領域（例えば、遺伝子またはエクソン）、非コード領域（生物学的機能が公知かまたは未知かにかかわらず、例えば、エンハンサー、プロモーター、調節領域、テロメア、または「ナンセンス」ＤＮＡ）などを含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的は、天然に存在する可能性がある突然変異（例えば、生殖細胞または体細胞突然変異）、またはそれ以外の方法で誘発された突然変異（例えば、化学的に、または放射線誘発突然変異）を含有していてもよいし、またはその結果であってもよい。このような突然変異は、ゲノム再編成（例えば転座、挿入、欠失、または転位など）、単一ヌクレオチド多様性、および／またはゲノム増幅を含んでいてもよい（またはそれらに起因する）。一部の実施形態では、標的は、１つまたは複数の修飾されたまたは合成の単量体単位（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、メチル化核酸、翻訳後修飾されたアミノ酸、架橋された核酸または架橋されたアミノ酸）を含有していてもよい。
【０２１０】
ＮＰＰＦが特異的に結合することができる標的核酸分子の部分も「標的」と称することができ、ここでも文脈に応じて、ただしより具体的に、標的部分、相補的領域（ＣＲ）、標的部位、保護された標的領域または保護された部位などと称する場合もある。その相補的領域に特異的に結合したＮＰＰＦは、複合体を形成し、この複合体は、全体および／または試料として標的と統合されたままであってもよいし、または全体および／または試料として標的から離れていてもよい（または分離されているかもしくは分離した状態になり得る）。一部の実施形態では、ＮＰＰＦ／ＣＲ複合体は、例えばヌクレアーゼ、例えばＳ１ヌクレアーゼなどの作用によって、全体および／または試料として標的から分離されている（または解離した状態になる）。
【０２１１】
開示された方法を使用して、あらゆるタイプの標的核酸分子を分析することができる。一例において、標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）などである。別の例において、標的は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、例えばゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）、ウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、ｃＤＮＡ、またはトランスフェクトされたＤＮＡなどである。具体的な例において、標的は、アンチセンスヌクレオチドである。一部の例において、開示された方法を使用して、細胞または組織のトランスクリプトーム全体をシーケンシングすることができる。一例において、シーケンシングされる標的核酸分子は、試料中に、例えば約１００，０００回未満、約１０，０００回未満、約５，０００回未満、約１００回未満、１０回未満、または１回のみしか出現しないまれな核酸分子であり、試料中に、例えば１から１０，０００、１から５，０００、１から１００、または１から１０回しか出現しない核酸分子である。
【０２１２】
複数の標的は、同じ試料またはアッセイで、または複数の試料またはアッセイであっても、例えば同時または同時発生的にシーケンシングすることができる。同様に、単一の標的も、複数の試料中で、例えば同時または同時発生的にシーケンシングすることができる。一例において、標的核酸分子は、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡである。したがって、このような例において、本方法は、ｍｉＲＮＡに特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦおよびｍＲＮＡに特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦの使用を含む。一例において、標的核酸分子は、２つの異なるＤＮＡ分子である。したがって、このような例において、本方法は、第１の標的ＤＮＡに特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦおよび第２の標的ＤＮＡに特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦの使用を含む。一例において、標的核酸分子は、２つの異なるＲＮＡ分子である。したがって、このような例において、本方法は、第１の標的ＲＮＡに特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦおよび第２の標的ＲＮＡに特異的な少なくとも１つのＮＰＰＦの使用を含む。
【０２１３】
一部の例において、開示された方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）またはバリアント（ｓＮＰＶ）、スプライスジャンクション、メチル化ＤＮＡ、遺伝子融合または他の突然変異、タンパク質に結合したＤＮＡまたはＲＮＡ、さらにはｃＤＮＡのシーケンシング、加えて発現のレベル（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ発現、例えばｃＤＮＡ発現、ｍＲＮＡ発現、ｍｉＲＮＡ発現、ｒＲＮＡ発現、ｓｉＲＮＡ発現、またはｔＲＮＡ発現など）を許容する。ヌクレアーゼ保護プローブがハイブリダイズするように設計することができる任意の核酸分子は、開示された方法によって定量化および同定することができる。
【０２１４】
一例において、標的試料の処理のときにメチル化塩基がＮＰＰＦ中の塩基に相補的な異なる塩基に変換されるように、メチル化が生じた、または生じていない部位に塩基ミスマッチを含むＮＰＰＦを使用することによって、ＤＮＡメチル化が検出される。したがって、一部の例において、本方法は、試料を重亜硫酸塩で処理することを含む。
【０２１５】
当業者は、標的は、天然の塩基もしくは天然にはない塩基、またはそれらの組合せを含んでいてもよいことを理解するであろう。
【０２１６】
具体的な非限定的な例において、新生物（例えば、がん）に関連する標的核酸（例えば標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡなど）が選択される。新生細胞、特にがん細胞、例えばＢ細胞およびＴ細胞性白血病、リンパ腫、乳がん、結腸がん、神経系がんなどにおいて、多数の染色体異常（転座および他の再編成、倍加または欠失など）または突然変異が同定されている。
【０２１７】
一部の例において、標的核酸分子としては、野生型および／または突然変異した：デルタアミノレブリン酸シンターゼ１（ＡＬＡＳ１）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６８８．５またはＯＭＩＭ１２５２９０）、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３８（ＲＰＬ３８）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００９９９．３またはＯＭＩＭ６０４１８２）、癌原遺伝子Ｂ−Ｒａｆ（ＢＲＡＦ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４３３３．４またはＯＭＩＭ１６４７５７）（例えば野生型ＢＲＡＦまたはＶ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｒ、Ｖ６００Ｅ２、および／またはＶ６００Ｄ突然変異など、例えば、図１０を参照）、フォークヘッドボックスタンパク質Ｌ２（ＦＯＸＬ２）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２３０６７．３またはＯＭＩＭ６０５５９７）（例えば野生型ＦＯＸＬ２またはｎｔ８２０  ｓｎｐ  Ｃ→Ｇなど）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２２８．３またはＯＭＩＭ１３１５５０）（例えば野生型ＥＧＦＲ、および／またはＴ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、Ｄ７６１Ｙ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、およびＧ７１９Ｃ突然変異の１つもしくは複数、または図９に示される他の突然変異）；ＧＮＡＳ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５１６．５またはＯＭＩＭ１３９３２０）；またはＫＲＡＳ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９８５．４またはＯＭＩＭ１９００７０）（例えば野生型ＫＲＡＳ、Ｄ７６１Ｙ突然変異、Ｇ１２突然変異、例えばＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒの１つまたは複数、Ｇ１３突然変異、例えばＧ１３Ｄ、および／またはＱ６１突然変異、例えばＱ６１Ｅ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｈ−Ｃ、および／またはＱ６１Ｈ−Ｔの１つまたは複数、例えば、図１０を参照）；（図７Ａ、７Ｂ、８も参照）が挙げられる。
【０２１８】
一部の例において、標的核酸分子としては、ＧＡＰＤＨ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０４６）、ＰＰＩＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１１３０）、ＲＰＬＰ０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１００２またはＮＭ＿０５３２７５）、ＲＰＬ１９（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００９８１）、ＺＥＢ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０７５１）、Ｚｅｂ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１７１６５３またはＮＭ＿０１４７９５）、ＣＤＨ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４３６０）、ＣＤＨ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００７６６４）、ＶＩＭ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３８０）、ＡＣＴＡ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１４１９４５またはＮＭ＿００１６１３）、ＣＴＮＮＢ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９０４、ＮＭ＿００１０９８２０９、またはＮＭ＿００１０９８２１０）、ＫＲＴ８（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２２７３）、ＳＮＡＩ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５９８５）、ＳＮＡＩ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３０６８）、ＴＷＩＳＴ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４７４）、ＣＤ４４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６１０、ＮＭ＿００１００１３８９、ＮＭ＿００１００３９０、ＮＭ＿００１２０２５５５、ＮＭ＿００１００１３９１、ＮＭ＿００１２０２５５６、ＮＭ＿００１００１３９２、ＮＭ＿００１２０２５５７）、ＣＤ２４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１３２３０）、ＦＮ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２１２４７４、ＮＭ＿２１２４７６、ＮＭ＿２１２４７８、ＮＭ＿００２０２６、ＮＭ＿２１２４８２、ＮＭ＿０５４０３４）、ＩＬ６（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６００）、ＭＹＣ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４６７）、ＶＥＧＦＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０２５３６６、ＮＭ＿００１１７１６２３、ＮＭ＿００３３７６、ＮＭ＿００１１７１６２４、ＮＭ＿００１２０４３８４、ＮＭ＿００１２０４３８５、ＮＭ＿００１０２５３６７、ＮＭ＿００１１７１６２５、ＮＭ＿００１０２５３６８、ＮＭ＿００１１７１６２６、ＮＭ＿００１０３３７５６、ＮＭ＿００１１７１６２７、ＮＭ＿００１０２５３７０、ＮＭ＿００１１７１６２８、ＮＭ＿００１１７１６２２、ＮＭ＿００１１７１６３０）、ＨＩＦ１Ａ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１５３０、ＮＭ＿１８１０５４）、ＥＰＡＳ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１４３０）、ＥＳＲ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０４０２７６、ＮＭ＿００１０４０２７５、ＮＭ＿００１２１４９０２、ＮＭ＿００１４３７、ＮＭ＿００１２１４９０３）、ＰＲＫＣＥ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５４００）、ＥＺＨ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２０３２４８、ＮＭ＿１５２９９８、ＮＭ＿００１２０３２４７、ＮＭ＿００４４５６、ＮＭ＿００１２０３２４９）、ＤＡＢ２ＩＰ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３２５５２、ＮＭ＿１３８７０９）、Ｂ２Ｍ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４０４８）、およびＳＤＨＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４１６８）が挙げられる。
【０２１９】
一部の例において、標的ｍｉＲＮＡとしては、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５（ＭＩＲ２０５、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９６２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４（ＭＩＲ３２４、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９８９６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ（ＭＩＲ３０１Ａ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９８４２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ（ＭＩＲ１０６Ｂ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９８３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７７（ＭＩＲ８７７、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０３０６１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９（ＭＩＲ３３９、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９８９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（ＭＩＲ１０Ｂ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９６０９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５（ＭＩＲ１８５、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９７０６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ（ＭＩＲ２７Ｂ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９６６５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９２（ＭＩＲ４９２、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０３０１７１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ（ＭＩＲ１４６Ａ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９７０１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ（ＭＩＲ２００Ａ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９８３４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９８３３、ＮＲ＿０２９５９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ（ＭＩＲ２９Ｃ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９８３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１（ＭＩＲ１９１、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０２９６９０）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−６５５（ＭＩＲ６５５、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＲ＿０３０３９１）が挙げられる。
【０２２０】
一例において、標的は、病原体の核酸、例えばウイルスＲＮＡまたはＤＮＡなどである。例示的な病原体としては、これらに限定されないが、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、および原生動物が挙げられる。一例において、標的は、ウイルスＲＮＡである。ウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスおよびマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含む。例示的なプラス鎖ＲＮＡウイルスとしては、これらに限定されないが、ピコルナウイルス（例えばＡｐｈｔｈｏｖｉｒｉｄａｅ［例えば口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）］）、Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｉｄａｅなど；Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えばコクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、およびポリオウイルスなど）；Ｒｈｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ（ライノウイルス））；Ｈｅｐａｔａｖｉｒｉｄａｅ（Ａ型肝炎ウイルス）；トガウイルス（その例としては、風疹；アルファウイルス（例えば西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスなど）が挙げられる）；フラビウイルス（その例としては、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、および日本脳炎ウイルスが挙げられる）；およびコロナウイルス（その例としては、ＳＡＲＳコロナウイルス、例えばＵｒｂａｎｉ株などが挙げられる）が挙げられる。例示的なマイナス鎖ＲＮＡウイルスとしては、これらに限定されないが、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｙｏｖｉｒｕｓ）（例えばインフルエンザウイルスなど）、ラブドウイルス（例えば狂犬病ウイルスなど）、およびパラミクソウイルス（その例としては、麻疹ウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、およびパラインフルエンザウイルスが挙げられる）が挙げられる。一例において、標的は、ＤＮＡウイルスからのウイルスＤＮＡ、例えばヘルペスウイルス（例えば水痘帯状疱疹ウイルスなど、例えばＯｋａ株；サイトメガロウイルス；および単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１型および２型）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス１型およびアデノウイルス４１型など）、ポックスウイルス（例えばワクシニアウイルスなど）、およびパルボウイルス（例えばパルボウイルスＢ１９など）である。別の例において、標的は、レトロウイルスの核酸であり、例えばヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、例えばサブタイプＣ、ＨＩＶ−２など；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；およびトリ肉腫ウイルス由来のものである。一例において、標的核酸は、細菌の核酸である。一例において、細菌の核酸は、グラム陰性細菌、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｋ−１２およびＯ１５７：Ｈ７）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、およびＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅなどに由来するものである。別の例において、細菌の核酸は、グラム陽性菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、肺炎球菌、淋菌、および連鎖球菌性髄膜炎（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）に由来するものである。一例において、標的核酸は、原生動物、線虫、または真菌由来の核酸である。例示的な原生動物としては、これらに限定されないが、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ、およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａが挙げられる。例示的な真菌としては、これらに限定されないが、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓおよびＢｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓが挙げられる。
【０２２１】
当業者は、本明細書で開示された方法を利用して検出することができる追加の標的ＤＮＡもしくはＲＮＡおよび／または追加の標的ｍｉＲＮＡを確認することができる。
ＶＩＩ．アッセイアウトプット
【０２２２】
一部の実施形態では、開示された方法は、試料中の１つまたは複数の標的核酸分子の配列を決定することを含み、検出された配列の定量化を含んでいてもよい。本方法の結果は、使用者（例えば科学者、臨床医または他の医療従事者、実験技師、または患者など）に、試験結果に関する情報を提供する感知できるアウトプットの形態で提供することができる。一部の例において、アウトプットは、紙でのアウトプット（例えば、文書のアウトプットまたは印刷されたアウトプット）、スクリーン上の表示、グラフィックのアウトプット（例えば、グラフ、チャート、または他の図表）、または可聴のアウトプットであり得る。一例において、アウトプットは、試料中のシーケンシングされた標的核酸（または検出されなかった配列）の存在または量の定性的または定量的な指標（例えば正規化した量など）を含む表またはグラフである。他の例において、実施形態において、アウトプットは、試料中の１つまたは複数の標的核酸分子の配列であり、このような報告は、標的分子中の特定の突然変異の存在を指し示す。
【０２２３】
アウトプットは、定量的情報（例えば、特定の標的核酸分子の量、または対照試料もしくは値と比べた特定の標的核酸分子の量）を提供することができ、または定性的情報（例えば、特定の標的核酸分子の存在または非存在の決定）を提供することができる。追加の例において、アウトプットは、試料中の標的核酸分子の相対量に関する定性的情報を提供することができ、例えば、対照と比べて増加したのか、もしくは減少したのか、または対照と比べて変化がないのかが同定される。
【０２２４】
本明細書で論じられるように、ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンは、例えば特定の患者、試料、実験、または標的配列を同定するのに使用できる１つまたは複数の実験タグを含んでいてもよい。このようなタグの使用は、シーケンシングされたライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンを「ソートする」またはさらに計数することを許容し、したがって複数の異なる試料（例えば異なる患者からの）、複数の異なる標的（例えば少なくとも２つの異なる核酸標的）、またはそれらの組合せを単一の反応で分析することを許容する。一例において、このような分析に、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＢｏｗｔｉｅソフトウェアを使用することができる。
【０２２５】
一例において、ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンは、それぞれの異なる標的核酸分子に固有な実験タグを含む。このようなタグの使用は、ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコン全体をシーケンシングせずに、単にこのタグをシーケンシングまたは検出することによって、ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンを同定することを可能にする。加えて、複数の核酸標的を分析しようとする場合、各標的に対して固有な実験タグを使用することは、それぞれの検出またはシーケンシングされた実験タグをソートし、必要に応じて計数することができるため、分析を簡易化する。これは、ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンが、試料中の標的に対しておよその化学量論的な比率で存在するため、試料中に存在していた標的核酸の半定量化または定量化を許容する。例えば試料中で複数の標的核酸が検出またはシーケンシングされる場合、本方法は、単に実験的タグを検出またはシーケンシングし、次いでソーティングすることによって、各標的配列および検出またはシーケンシングされたコピー数を示す表またはグラフの作成を許容する。
【０２２６】
別の例において、ライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンは、それぞれの異なる試料に固有な実験タグ（例えば各患者試料につき固有なタグなど）を含む。このようなタグの使用は、特定の検出されたライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンを特定の試料と関連付けることを可能にする。したがって、同じ反応で（例えば同じウェルまたは同じシーケンシング反応で）複数の試料が分析される場合、各試料に対して固有な実験タグを使用することは、それぞれの検出またはシーケンシングされたライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンを特定の試料と関連付けることができるため、分析を簡易化する。例えば試料中の標的核酸が検出またはシーケンシングされる場合、本方法は、各試料の分析結果を示す表またはグラフの作成を許容する。
【０２２７】
当業者は、それぞれのライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンは、複数の実験タグ（例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の実験タグ）、例えば標的配列を示すタグ、および試料を示す別のタグなどを含んでいてもよいことを理解するであろう。各タグが検出またはシーケンシングされたら、適切なソフトウェアを使用して、例えばグラフまたは表などの任意の望ましいフォーマットでデータをソーティングすることができる。例えば、これは、複数の試料中で複数の標的配列を同時または同時発生的に分析することを許容する。
【０２２８】
一部の例において、シーケンシングされたライゲートした標的またはライゲートした標的アンプリコンは、各標的核酸配列につき公知の配列のデータベースと比較される。一部の例において、このような比較は、突然変異、例えばＳＮＰなどの検出を許容する。
ＶＩＩＩ．キット
【０２２９】
また、１つまたは複数の標的核酸分子を直接シーケンシングするのに使用することができるキットも本明細書で開示される。
【０２３０】
キットは、１つまたは複数の核酸標的に特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のＮＰＰＦを含む。キットはまた、対応するＣＦＳも含む。例えば、ＮＰＰＦが５’−フランキング配列を含む場合、キットは、５’−フランキング配列に相補的な５ＣＦＳを含んでいてもよい。ＮＰＰＦが３’−フランキング配列を含む場合、キットは、３’−フランキング配列に相補的な３ＣＦＳを含んでいてもよい。一部の例において、ＮＰＰＦおよびＣＦＳは、同じバイアルまたはコンテナー中である。一部の例において、キットは、５ＣＦＳおよび３ＣＦＳの両方を含み、ＣＦＳの一方は、捕獲部分を含む。一部の例において、キットは、単一の標的核酸分子に特異的な複数のＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳ、例えば、標的核酸分子に特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、または少なくとも２０個の異なるＮＰＰＦ（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５または２０個の異なるＮＰＰＦ）を含む。一部の例において、キットは、複数の異なる標的核酸分子に特異的な複数のＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳ、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００個の異なる標的核酸分子（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、４０、５０、７５、１００、２００、または５００個の異なる標的核酸分子）を含む。一部の実施形態では、開示されたキットは、より多くの対照核酸分子、例えば陽性対照（例えば、ハウスキーパー）または陰性対照（例えば、ＡＮＴ）などに特異的な、少なくとも１つのＮＰＰＦおよび対応するＣＦＳを含む。
【０２３１】
一部の例において、キットは、標的核酸分子、例えばライゲートした標的核酸分子などの増幅を許容する核酸プローブまたはプライマーを（例えば別個のバイアルまたはコンテナー中に）含む。一部の例において、このようなプローブまたはプライマーの少なくとも一部は、キット中のＣＦＳに相補的であり、したがってプローブまたはプライマーとＣＦＳとのハイブリダイゼーションが可能になる。一部の例において、このようなプローブまたはプライマーは、シーケンシングアダプター配列および／または実験的タグ配列（またはそれらに対する相補性を有する配列）を含む。
【０２３２】
一部の例において、キットは加えて、緩衝液（例えば溶解緩衝液、血漿溶解緩衝液；ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄緩衝液、増幅緩衝液、変性緩衝液、ライゲーション緩衝液、溶出緩衝液；および／またはシーケンシング緩衝液など）を含有するコンテナー；一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼ（例えばＳ１ヌクレアーゼなど）を含有するコンテナー；エタノール（例えば８０％エタノールなど）を含有するコンテナー；変性油を含有するコンテナー；プロテイナーゼＫを含有するコンテナー；リガーゼおよびポリメラーゼ（例えば緩衝液中）を含有するコンテナー；ＤＮアーゼ（例えばＤＮアーゼＩなど）を含有するコンテナー；ＲＮアーゼ（例えばＲＮアーゼＨなど）を含有するコンテナー；アンプリコン（例えば、ＣＦＳを含むライゲートした標的アンプリコン）に特異的に結合できるビーズを含有するコンテナー；およびＰＣＲのための試薬（例えばＰＣＲ緩衝液、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、逆転写酵素、ＵＤＧの２つまたはそれより多く）を含有するコンテナーの１つまたは複数（そのうちの、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つ）を含む。一部の例において、キットは、対照試料、例えば特定の核酸分子を含むまたは含まないことがわかっている試料などをさらに含む。一部の例において、キットは、対照ＮＰＰＦまたは陽性対照のためのスパイクイン標的をさらに含む。
【０２３３】
一部の例において、キットは、ＮＰＰＦ、ＣＦＳ、緩衝液およびＳ１酵素を含む消化溶液、洗浄緩衝液、リガーゼ（および任意選択でポリメラーゼ）および緩衝液を含むライゲーション溶液、ＰＣＲマスターミックス（これは、ポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＵＤＧ（任意選択の）逆転写酵素、プライマーを含んでいてもよい）、浄化用ビーズ溶液、８０％エタノール、溶出溶液、溶解緩衝液、変性油、プロテイナーゼＫ、および任意選択で血漿溶解緩衝液を含む（例えば別個のバイアル中に）。一部の例において、このようなキットはさらに、ＤＮアーゼ（例えばＤＮアーゼＩなど）、ＲＮアーゼ（例えばＲＮアーゼＨなど）、または両方を含む。
【０２３４】
キットは、指導用教材をさらに含んでいてもよい。指導用教材は、文書であってもよいし、電子的形態であってもよいし、または視覚的なものであってもよい（例えばビデオファイルなど）。
【実施例】
【０２３５】
（実施例１）
単一塩基分解能を用いて核酸標的を検出するよう設計された複数のｃＮＰＰＦの同時シーケンシング
この実施例は、ｃＮＰＰＦ（即ち、ライゲートした標的）を生成およびシーケンシングするのに使用する方法について記載する。２４個のＮＰＰＦのセットを生成した。ＮＰＰＦはそれぞれ、２４個全てのプローブに関して、７０．３℃のメジアンＴｍを有する５０ヌクレオチドの長さの特定の標的核酸分子に特異的である領域、ならびに両方の末端上のフランキング配列を含んでいた。
【０２３６】
全てのＮＰＰＦに関して、それらの標的に関わらず、５’−および３’−フランキング配列は、互いに異なっていたが、各５’ＣＦＳおよび各３’ＣＦＳは、各ＮＰＰＦ上で同じであった。５’−フランキング配列（５’ＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＵＣＴ３’、配列番号２４）は、Ｔｍ  ６２．８℃を有する２５ヌクレオチドであり、３’−フランキング配列（５’ＧＡＵＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴ３’、配列番号２５）は、Ｔｍ  ６０．５℃を有する２５ヌクレオチドであった。ＮＰＰＦはそれぞれ、フランキング配列中に２個のｄＵＴＰ塩基を用いて設計された。これらのｄＵＴＰ塩基は、配列番号２４および配列番号２５において「Ｕ」と称する（上記で下線を付した）。
【０２３７】
上述のＮＰＰＦを使用して、プローブの７個に相当する標的材料の混合物に関して、ハイブリダイゼーションを実行した。標的材料インプットを用量設定して、ライゲーションの効率に関する情報を提供した。標的は、それらの５’末端でリン酸化された。
【０２３８】
種々のＮＰＰＦをプールして、溶液中の標的の希釈系列に、ならびにＮＰＰＦ上のフランキング領域に相補的なＣＦＳにハイブリダイズさせた。３’ＣＦＳは、内部ビオチン部分を保有し、５’末端でリン酸化された。ハイブリダイゼーションは、９５℃で５分間の初期変性の後に、５０℃で実行した。
【０２３９】
ハイブリダイゼーション後、緩衝液中のＳ１酵素の添加によって、ハイブリダイズされた混合物に関してＳ１消化を実行した。Ｓ１反応物は、５０℃で１時間インキュベートした。
【０２４０】
ハイブリダイズされていない標的ＤＮＡ、ＮＰＰＦ、およびＣＦＳのＳ１媒介性消化後、反応物を室温に冷却した。続いて、４μｇ／μｌの濃度のＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃ１ストレプトアビジン常磁性ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１０μｌを反応物に添加した。ビーズを室温で３０分間、混合物とともにインキュベートして、３’ＣＦＳ上のビオチン部分を、ビーズ上のストレプトアビジンによって捕獲させた。
【０２４１】
ビーズを、１×ＳＳＣ−Ｔ緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎを有する１×ＳＳＣ緩衝液）５０μｌ中で、室温にて３回洗浄した。反応管をスタンドマグネット上に配置させて、ビーズを収集させること、続いてビーズを１×ＳＳＣ−Ｔ中に再懸濁することによって、洗浄を実行した。このマイルドな緩衝液中での洗浄は、ハイブリダイズされた構造がインタクトなままであることを可能にする。
【０２４２】
ビーズを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ２００ユニットを含有するライゲーション混合物２０μｌ中に再懸濁した。ライゲーションは、室温で１時間続行した。ライゲーション反応後、ビーズを、ｄＨ２Ｏ  ５０μｌを用いて５０℃で洗浄した。反応管をスタンドマグネット上に配置させることおよびビーズを収集させること、続いて洗浄緩衝液をビーズに添加することおよび管を５０℃で１０分間インキュベートすることによって、洗浄を実行した。総計３回の洗浄のため、これを２回繰り返した。これらの洗浄は、二本鎖産物を変性して、ＮＰＰＦを洗い流して、ビーズ上にライゲートした標的−ＣＦＳ複合体を残す。洗浄後、最終的にビーズを収集して、ｄＨ２Ｏ  ２０μｌ中に再懸濁した。
【０２４３】
次に、試料中で使用される元の標的のライゲートしたｃＮＰＰＦを含有する上述の反応物の一部を、ＰＣＲプライマーとともにインキュベートした。一方のプライマーは、５’−フランキング配列に相補的である配列を含み、第２のプライマーは、３’−フランキング配列に相補的である配列を含んでいた。プライマーはともに、実験タグの、得られたアンプリコンへの組込みを可能にする配列を含み、その結果、これらのプライマーを使用して増幅した単一試料中のｃＮＰＰＦはそれぞれ、同じ２個のヌクレオチド実験タグを有した。
【０２４４】
第１のプライマー（５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣｘｘｘｘｘｘｘｘＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧ３’、配列番号２６）は６６塩基の長さであり、８ヌクレオチド実験的タグ（上記配列において「ｘｘｘｘｘｘｘｘ」と称する）を保有した。これらの塩基の２２個が、５’−フランキング配列に対して同一であった。これらの２２個の塩基は、Ｔｍ  ６０．９℃を有した。第２のプライマー（５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴｘｘｘｘｘｘＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧ３’、配列番号２７）は６０塩基の長さであり、６ヌクレオチド実験的タグ（上記配列において「ｘｘｘｘｘｘ」と称する）を保有した。第２のプライマーの最初の２２ヌクレオチドが、３’−フランキング領域に正確に相補的であり、Ｔｍ  約５９．５℃を有した。
【０２４５】
上記の「ｘｘｘｘｘｘｘｘ」または「ｘｘｘｘｘｘ」と称した実験的タグは、下記配列の１つであった：
【表Ｂ】
2019509724.tif 000003
【０２４６】
反応物をそれぞれ、別々のＰＣＲ反応で増幅させて、それぞれを、実験的タグの種々の組合せを用いて増幅させ、そのため反応物はそれぞれ、プールされた反応のシーケンシング後に別々に同定することができた。全ての反応においてウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理が、増幅に先行した。ＵＤＧは、オリゴヌクレオチドまたは一本鎖ＤＮＡを含むウラシル含有ＤＮＡからの遊離ウラシルの放出を触媒する。ＵＤＧの機能は、先の酵素ステップおよび洗浄ステップ後に存在する任意の残りのＮＰＰＦを破壊することである。ＵＤＧ処理に続いて、２０サイクルのＰＣＲを行った。
【０２４７】
得られたアンプリコンを一緒にプールし、ビーズベース試料クリーンアップ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒからのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ）を使用してクリーンアップした。続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して、ｃＮＰＰＦおよび実験的タグを含有するアンプリコンをシーケンシングした。実験的タグは、幾つかの場所に配置させることができるが、この実施例では、それらは、指標−リードシーケンシングプライマーに相補的な領域のすぐ下流で、アンプリコンの両側に配置された。したがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、３ステップで行い、配列の初期リードに続いて、２個の他のシーケンシングプライマーを使用した実験的タグの２回のより短いリードを行った（シーケンシングプライマーは全て、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａキットに含まれていた）。本明細書中に記載し、また使用するシーケンシング方法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上での多重性試料に関する標準的な方法である。
【０２４８】
シーケンシングされた分子はそれぞれ、まず実験タグに基づいて、続いて各実験タグ群内でソートし、種々のタグそれぞれに関して同定される分子数を計数した。アンプリコンは、オープンソースソフトウェアｂｏｗｔｉｅ（Ｌａｎｇｍｅａｄら、Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １０：Ｒ２５）を使用して予想配列と比較した。
【０２４９】
図７Ａ〜図７Ｂおよび図８は、ライゲートした標的およびＣＦＳのシーケンシングからの結果を示す。グラフは、初期ハイブリダイゼーション反応物に添加される標的に相当する７個の特有のＮＰＰＦそれぞれに関して検出されるアンプリコンの数を表す。７個の標的のみが、反応物に添加された。これらは、シーケンシング反応においてシグナルを有すると予想されたが、他のシグナルは予想されず、他の１７個のプローブは、標的が存在しない陰性対照であり、シグナルを発生するとは予測されなかった。結果を全ての配列に対して並べた（標的が、それらに関して含まれたとしても、または含まれなかったとしても）。図７Ａは、添加した標的が、有意な検出可能なシグナルを生じたのに対して、他は、有意なシグナルを発生しなかったことを示す。生計数が示される。
【０２５０】
インプット材料の用量設定をハイブリダイゼーションに添加して、したがって、標的シグナルは、希釈を表すはずである。図７Ｂは、標的インプットにおいて２倍の差を有する２個の反応間の変化を示し、それらは実際には、７個全ての場合で用量設定する。標的が添加されない陰性対照反応も示す（ＡＮＴ）。全ての場合において、数は、生計数を表す。
【０２５１】
これらの結果は、開示された方法が、単一塩基変化間を識別することができることを示す。２４個のＮＰＰＦのうちの６個が、野生型（ＷＴ）／単一塩基突然変異対に関して設計された。ハイブリダイゼーションに添加された７個の標的のうち３個が、プローブのＷＴバージョンに適合した。図８は、ＷＴ／ＳＮＰ対に関して同定される総計数を示す（生計数を示す）。野生型（ＷＴ）配列が同定されたが、ＳＮＰ配列は同定されず、この方法が、単一塩基差を識別することが可能であることを実証した。
（実施例２）
例示的なＮＰＰＦ設計
【０２５２】
この実施例は、２個の異なるＮＰＰＦ設計戦略を使用してｃＮＰＰＦを生成およびシーケンシングするのに使用する方法について記載する。両方の混合物において、ＮＰＰＦはそれぞれ、特定の標的核酸分子に特異的である５０ヌクレオチド領域を含んでいた。
【０２５３】
第１の混合物中では、特異的な別個のＮＰＰＦを、各対立遺伝子に関して生成し、当該対立遺伝子の各ヌクレオチドの差を測定した。例えば、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異に関して、ＮＰＰＦは、野生型（ＢＲＡＦ  １７９９に相当するヌクレオチドは、ｄＴＴＰまたはＴである）対立遺伝子に関して特異的に、また別のＮＰＰＦは、突然変異体対立遺伝子（ヌクレオチド１７９９は、ｄＡＴＰまたはＡである）に関して特異的に生成された。ＮＰＰＦそれぞれが、１００％塩基相補性を伴って特異的な標的に関して設計されるように、２４個のＮＰＰＦをこの様式で生成した。
【０２５４】
第２の混合物中では、各対立遺伝子に関して、１個のＮＰＰＦが設計されたが、プローブは、突然変異体標的のみに１００％相補的であるように設計された（例えば、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅに関して、ＢＲＡＦの１７９９位に相当するヌクレオチドは、Ａであった）。したがって、ＮＰＰＦは、野生型対立遺伝子に、または未知の変化を保有し得る任意の他の対立遺伝子に１００％相補的ではあるようには設計されなかった。１２個のこのようなＮＰＰＦを生成した。
【０２５５】
両方のミックス中の全てのＮＰＰＦに関して、５’−および３’−フランキング配列は、互いに異なっていたが、各５’フランキング配列および各３’フランキング配列は、各ＮＰＰＦ上で同じであった。５’フランキング配列（５’ＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＵＣＴ３’、配列番号２４）は、Ｔｍ  ６２．８℃を有する２５ヌクレオチドであり、３’フランキング配列（５’ＧＡＵＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴ３’、配列番号２５）は、Ｔｍ  ６０．５℃を有する２５ヌクレオチドであった。ＮＰＰＦはそれぞれ、フランキング配列中の２個のｄＵＴＰ塩基を用いて設計された。これらのｄＵＴＰ塩基は、上記配列において「Ｕ」と称する。
【０２５６】
試験試料のセットは、１２個の二本鎖ＤＮＡアンプリコンを利用して生成した。アンプリコンはそれぞれ、野生型または突然変異体ＮＰＰＦに相補的な標的配列を保有した。アンプリコンはそれぞれ、さらなる非標的配列を含有した。野生型および突然変異体標的アンプリコン（それぞれ６個）を、希釈系列の比で一緒に混合して（アンプリコンの最終濃度は同じであったが、組成は異なっていた、表１を参照）、７個の異なる試料を形成した。
【表１】
2019509724.tif 000004
【０２５７】
上述のＮＰＰＦの２個のセットをそれぞれ、ＮＰＰＦ上のフランキング領域に相補的なＣＦＳと一緒に混合した。３’ＣＦＳは、内部ビオチン部分を保有し、５’ＣＦＳは、５’末端でリン酸化された。続いて、ＮＰＰＦおよびＣＦＳをアンプリコン試料にハイブリダイズさせた。各ＮＰＰＦセットに関して、各試料を三重反復で試行した。ＮＰＰＦの、それらの標的へのハイブリダイゼーションは、９５℃で１０分間の初期変性の後に、５０℃にて溶液中で実行した。
【０２５８】
ハイブリダイゼーション後、緩衝液中のＳ１酵素の添加によって、ハイブリダイズされた混合物に関してＳ１消化を実行した。Ｓ１反応物は、５０℃で９０分間インキュベートした。一本鎖核酸（ハイブリダイズされていないＤＮＡ、ＮＰＰＦ、およびＣＦＳを含む）のＳ１媒介性消化後、反応物を室温に冷却して、４μｇ／μｌの濃度のＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃ１ストレプトアビジン常磁性ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５μｌに添加した。ビーズを室温で３０分間、混合物とともにインキュベートして、３’ＣＦＳ上のビオチン部分を、ビーズ上のストレプトアビジンによって捕獲させた。
【０２５９】
ビーズを、１×ＳＳＣ−Ｔ緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤を有する１×ＳＳＣ緩衝液）１５０μｌ中で、室温にて３回洗浄した。このマイルドな緩衝液中での洗浄は、ハイブリダイズされた構造がインタクトなままであることを可能にする。反応管をスタンドマグネット上に配置させて、ビーズを収集させること、上清を除去すること、続いてビーズを１×ＳＳＣ−Ｔ中に再懸濁することによって、洗浄を実行した。
【０２６０】
洗浄したビーズを、ｄＮＴＰを補充したＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中にＴ４  ＤＮＡリガーゼ８０ユニットおよびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ０．６ユニットを含有するライゲーション混合物（酵素および緩衝液は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから）２０μｌ中に再懸濁した。ライゲーションは、室温で１時間続行した。ライゲーション反応後、ビーズを、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０界面活性剤１５０μｌを用いて３回洗浄した。反応管をスタンドマグネット上に配置させて、ビーズを収集させること、上清を除去すること、続いてビーズを１×ＳＳＣ−Ｔ中に再懸濁することおよび管を５０℃で１０分間インキュベートすることによって、洗浄を実行した。これらの洗浄は、二本鎖産物を変性して、ＮＰＰＦを洗い流して、ビーズ上にライゲートした標的−ＣＦＳ複合体を残す。ビーズを、増幅前に、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤２０μｌ中に再懸濁した。
【０２６１】
次に、試料中で使用される元の標的のライゲートしたｃＮＰＰＦを含有する上述の反応物の一部を、ＰＣＲプライマーとともにインキュベートした。一方のプライマーは、ＮＰＰＦの５’−フランキング配列に対して同一である配列を含み、第２のプライマーは、ＮＰＰＦの３’−フランキング配列に相補的である配列を含んでいた。また、プライマーはともに、実験タグの、得られたアンプリコンへ組込みを可能にする配列を含み、その結果、これらのプライマーを使用して増幅した単一試料中のｃＮＰＰＦはそれぞれ、同じ２個のヌクレオチド実験タグを有した。
【０２６２】
第１のプライマー（５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣｘｘｘｘｘｘｘｘＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧ３’、配列番号２６）は６６塩基の長さであり、８ヌクレオチド実験的タグ（上記配列において「ｘｘｘｘｘｘｘｘ」と称する）を保有した。これらの塩基の２２個が、ＮＰＰＦの５’フランキング配列に対して同一であった。これらの２２個の塩基は、Ｔｍ  ６０．９℃を有した。
【０２６３】
第２のプライマー（５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴｘｘｘｘｘｘＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧ３’、配列番号２７）は６０塩基の長さであり、６ヌクレオチド実験タグ（上記配列において「ｘｘｘｘｘｘ」と称する）を保有した。第２のプライマーの最初の２２ヌクレオチドが、ＮＰＰＦの３’フランキング配列に正確に相補的であり、Ｔｍ  約５９．５℃を有した。
【０２６４】
上記の「ｘｘｘｘｘｘｘｘ」または「ｘｘｘｘｘｘ」と称した実験的タグは、表２に示す配列の１つであった。
【表２】
2019509724.tif 000005
【０２６５】
反応物をそれぞれ、別々のＰＣＲ反応で増幅させて、それぞれを、実験的タグ（５’プライマー１個および３’プライマー１個）の種々の組合せを用いて増幅させ、そのため反応物はそれぞれ、プールされた反応物のシーケンシング後に別々に同定することができた。全ての反応においてウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理が、増幅に先行した。ＵＤＧは、オリゴヌクレオチドまたは一本鎖ＤＮＡを含むウラシル含有ＤＮＡからの遊離ウラシルの放出を触媒する。上述の反応において、ＵＤＧの機能は、先の酵素ステップおよび洗浄ステップ後に存在する任意の残りのＮＰＰＦを破壊することである。ＵＤＧ処理に続いて、２２サイクルのＰＣＲを行った。
【０２６６】
得られたＰＣＲ反応物を一緒にプールし、ビーズベース試料クリーンアップ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒからのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ）を使用してクリーンアップした。続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して、ｃＮＰＰＦおよび実験的タグを含有するアンプリコンをシーケンシングした。実験的タグは、幾つかの場所に配置させることができるが、この実施例では、それらは、指標−リードシーケンシングプライマーに相補的な領域のすぐ下流で、アンプリコンの両側に配置された。したがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、３ステップで行い、配列の初期リードに続いて、２個の他のシーケンシングプライマーを使用した実験的タグの２回のより短いリードを行った（シーケンシングプライマーは全て、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａキットに含まれていた）。本明細書中に記載し、また使用するシーケンシング方法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上での多重性試料に関する標準的な方法である。
【０２６７】
シーケンシングされた分子はそれぞれ、まず実験タグに基づいて、続いて各実験タグ群内でソートし、種々のタグそれぞれに関して同定される分子数を計数した。アンプリコンは、オープンソースソフトウェアｂｏｗｔｉｅ（Ｌａｎｇｍｅａｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １０：Ｒ２５）を使用して予想配列と比較した。
【０２６８】
図１１Ａ〜図１１Ｂは、ライゲートした標的およびＣＦＳ（ｃＮＰＰＦ）のシーケンシングからの結果を示す。グラフは、ＮＰＰＦの２個のセット（野生型および突然変異体の両方に関して特異的なプローブ（「両方のプローブ」）、または両方に関して一方だけのプローブ（「１個のプローブ」）のいずれか）を使用して、８個の試料中で検出される野生型および突然変異体アンプリコンの相対パーセントを表す。三重反復試料から作成された生データを平均化して、数を作成し、続いて所定のＮＰＰＦに関するシグナルは全て、１００％に等しいと設定し、野生型および突然変異体対立遺伝子の相対パーセントをその１００％の比率として示す。パーセントを示すグラフおよび表をともに示す。２個の野生型／突然変異体アンプリコン試料希釈セット（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦに関して）を示す（それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂ）。
【０２６９】
図１１Ａ〜図１１Ｂに示すように、各試料混合物中の野生型および突然変異体アンプリコンの比は、２個のＮＰＰＦ混合物のどちらを使用する場合でもほぼ同一である（正確な数に関しては、グラフの下の表を参照）。これにより、ＮＰＰＦと標的との間の少数のヌクレオチドの差（例えば、１個、２個、３個、４個または５個のミスマッチ）を有するＮＰＰＦは、依然として標的にハイブリダイズし、標的をヌクレアーゼ消化から保護することが実証される。これは、プローブに正確に適合しない標的の意義ある損失を伴わずに行われる（両方のプローブセットにおける野生型のアンプリコンの検出を比較する）。これにより、ＮＰＰＦは、既知の差異と予想されなかった領域内の突然変異、即ち新生突然変異の限られた発見の両方に使用することができることが実証される。これは、アッセイにおいてより柔軟性を可能にするだけでなく、それはまた、プローブ設計時間、構築費用を低減して、構成成分を単純化することによって系における頑強性を増加させる。
（実施例３）
特異的な領域を標的とし、突然変異ステータスがわかっている細胞株における当該領域内の核酸変異体を同定するように設計された複数のｃＮＰＰＦの同時シーケンシング
【０２７０】
この実施例は、ＫＲＡＳ突然変異ステータスがわかっている細胞株試料のセットにおけるゲノムＫＲＡＳ突然変異ステータスを評価するのに使用する方法について記載する。さらに、この実施例は、プローブと標的とを区別して、標的領域内の未知の突然変異の同定を可能にするＮＰＰＦ設計について記載する。
【０２７１】
３個の市販されている細胞株を使用した。ＣＯＬＯ−２０５（「ＫＲＡＳ  ＷＴ」株）は、ＢＲＡＦ  １７９９Ｔ＞Ａ塩基変化（Ｖ６００Ｅアミノ酸変化）を保有するが、ＫＲＡＳについて野生型である。ＮＣＩ−Ｈ１１５５（「ＫＲＡＳ  ｍｕｔ」株）は、ＫＲＡＳ  １８３Ａ＞Ｔ塩基変化（Ｑ６１Ｈ＿Ｔ）を保有し、この突然変異体対立遺伝子にとってホモ接合性である。ＳＷ９４８（「ＫＲＡＳヘテロ接合性」）は、ＫＲＡＳのＷＴ対立遺伝子および１８２Ａ＞Ｃ突然変異体対立遺伝子（Ｑ６１Ｌ）の両方を保有する。細胞株を溶解緩衝液中に希釈した。
【０２７２】
１９個のＮＰＰＦのセットを生成した。これらのＮＰＰＦの設計は、実施例２に基づき、そこでは、プローブ内のミスマッチが、プローブの、１個または複数の塩基が異なる標的用のハイブリダイゼーションスカフォールドとして機能を果たす能力を変化させないことが示された。ＮＰＰＦはそれぞれ、１９個全ての領域に関して、７１．０℃のメジアンＴｍを有する５０ヌクレオチドの長さの特定の標的核酸分子に特異的である領域、ならびに両方の末端上のフランキング配列を含んでいた。各プローブはまた、ゲノム標的配列に対して単一ミスマッチを含む。これらの場合において、ミスマッチは、ＮＰＰＦ内の保護配列の５’の３番目に配置された。Ｃ＞ＴまたはＡ＞Ｇのいずれかの変化をミスマッチとして使用した。
【０２７３】
全てのＮＰＰＦに関して、それらの意図する標的に関わらず、５’−および３’−フランキング配列は、互いに異なっていたが、各５’フランキング配列および各３’フランキング配列は、各ＮＰＰＦ上で同じであった。５’−フランキング配列（５’ＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＵＣＴ３’、配列番号２４）は、Ｔｍ  ６２．８℃を有する２５ヌクレオチドであり、３’−フランキング配列（５’ＧＡＵＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴ３’、配列番号２５）は、Ｔｍ  ６０．５℃を有する２５ヌクレオチドであった。ＮＰＰＦはそれぞれ、総計４個のｄＵＴＰ塩基を用いて設計された。２個のｄＵＴＰ塩基は、フランキング配列に配置された。これらのｄＵＴＰ塩基は、上記配列において「Ｕ」と称する。さらなる２個のｄＵＴＰ塩基を、ＮＰＰＦの標的特異的な領域内に配置した。これらのｄＵＴＰ塩基の位置は、標的特異的な保護配列内のｄＴＴＰ塩基の配置に依存して変動する。種々のＮＰＰＦを、ＮＰＰＦ上のフランキング領域に相補的なＣＦＳを用いてプールした。５’ＣＦＳは、５’末端でリン酸化されて、３’ＣＦＳは、内部ビオチン部分を保有した。
【０２７４】
細胞株溶解産物を三重反復で試行し、反復はそれぞれ、溶解緩衝液中に５０００個の細胞を含有していた。溶解産物を、上述のＮＰＰＦおよびＣＦＳ混合物と混合して、ハイブリダイゼーションは、９５℃で１０分間の初期変性の後に、５０℃で１８時間実行した。
【０２７５】
ハイブリダイゼーション後、緩衝液中のＳ１酵素の添加によって、ハイブリダイズされた混合物に関してＳ１消化を実行した。Ｓ１反応物は、５０℃で９０分間インキュベートした。Ｓ１媒介性消化後、反応物を室温に冷却した。その時点で、反応物を、緩衝液中の４μｇ／μｌの濃度のＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃ１ストレプトアビジン常磁性ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５μｌに添加した。ビーズを室温で３０分間、混合物とともにインキュベートして、３’ＣＦＳ上のビオチン部分を、ビーズ上のストレプトアビジンによって捕獲させた。
【０２７６】
ビーズを、１×ＳＳＣ−Ｔ緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤を有する１×ＳＳＣ緩衝液）１５０μｌ中で、室温にて３回洗浄した。このマイルドな緩衝液中での洗浄は、ハイブリダイズされた構造がインタクトなままであることを可能にする。反応管をスタンドマグネット上に配置させて、ビーズを収集させること、上清を除去すること、続いてビーズを１×ＳＳＣ−Ｔ中に再懸濁することによって、洗浄を実行した。
【０２７７】
洗浄したビーズを、ｄＮＴＰを補充したＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中にＴ４  ＤＮＡリガーゼ８０ユニットおよびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ０．６ユニットを含有するライゲーション混合物（酵素および緩衝液は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから）２０μｌ中に再懸濁した。ライゲーションは、室温で１時間続行した。ライゲーション反応後、ビーズを、５０％ホルムアミド／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０  １５０μｌを用いて３回、および０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０界面活性剤１５０μｌ中で１回洗浄した。これらの洗浄は、二本鎖産物を変性して、ＮＰＰＦを洗い流して、ビーズ上にライゲートした標的−ＣＦＳ複合体を残す。反応管をスタンドマグネット上に配置させて、ビーズを収集させること、上清を除去すること、続いてビーズを洗浄緩衝液中に再懸濁することによって、洗浄を実行した。洗浄したビーズを、増幅前に、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤２０μｌ中に再懸濁した。
【０２７８】
次に、試料中の標的のライゲートしたｃＮＰＰＦを含有する上述の反応物の一部を、ＰＣＲプライマーとともにインキュベートした。これらのプライマーは、実施例２に記載するように設計された。使用した実験的タグを表３に示す。
【０２７９】
【表３】
2019509724.tif 000006
【０２８０】
反応物をそれぞれ、別々のＰＣＲ反応で増幅させて、それぞれを、実験的タグ（５’プライマー１個および３’プライマー１個）の種々の組合せを用いて増幅させ、そのため反応物はそれぞれ、プールされた反応物のシーケンシング後に別々に同定することができた。全ての反応においてウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理が、増幅に先行した。ＵＤＧは、オリゴヌクレオチドまたは一本鎖ＤＮＡを含むウラシル含有ＤＮＡからの遊離ウラシルの放出を触媒する。上述の反応において、ＵＤＧの機能は、先の酵素ステップおよび洗浄ステップ後に存在する任意の残りのＮＰＰＦを破壊することである。ＵＤＧ処理に続いて、２２サイクルのＰＣＲを行った。
【０２８１】
得られたアンプリコンを一緒にプールし、ビーズベース試料クリーンアップ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒからのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ）を使用してクリーンアップした。続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームを使用して、ｃＮＰＰＦおよび実験的タグを含有するアンプリコンをシーケンシングした。実験的タグは、幾つかの場所に配置させることができるが、この実施例では、それらは、指標−リードシーケンシングプライマーに相補的な領域のすぐ下流で、アンプリコンの両側に配置された。したがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、３ステップで行い、配列の初期リードに続いて、２個の他のシーケンシングプライマーを使用した実験的タグの２回のより短いリードを行った（シーケンシングプライマーは全て、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａキットに含まれていた）。本明細書中に記載し、また使用するシーケンシング方法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上での多重性試料に関する標準的な方法である。
【０２８２】
シーケンシングされた分子はそれぞれ、まず実験タグに基づいて、続いて各実験タグ群内でソートし、種々のタグそれぞれに関して同定される分子数を計数した。アンプリコンは、オープンソースソフトウェアｂｏｗｔｉｅを使用して予想配列と比較した。
【０２８３】
図１２は、反応物のシーケンシングからの結果を示す。グラフを得るために、三重反復試料からの生データを平均化して、Ｑ６１領域に関するシーケンシングした計数を全て、対立遺伝子によってグラフにした。プローブのみから得られた計数もまた示されるが、意義あるシグナルは検出されなかった（図１２における「ＫＲＡＳ＿Ｑ６１＿プローブ」を参照）。
【０２８４】
これらの結果により、評価した試料内の変異体または野生型対立遺伝子を検出するための単一プローブ設計の有効性が実証される−ＫＲＡＳ  Ｑ６１領域における様々な突然変異が評価されたのに対して、単一ＮＰＰＦが使用された。したがって、ＮＰＰＦは、非特異的であるが、捕獲された標的（ｃＮＰＰＦ）のシーケンシングからのアッセイの結果は、非常に特異的である。アッセイの特異性は、公知の細胞株内の特異的な予想ＫＲＡＳ対立遺伝子の正しい検出によって実証され、さらに、３個全ての細胞株の等価な細胞インプットに関して、検出される総ＫＲＡＳシグナルの量は、対立遺伝子のステータスに関わらず、細胞株間でほぼ等価であった。結果はシーケンシングによって作成されるため、標的領域における任意の予想外の突然変異（いずれも検出されなかった、図１２を参照）を同定または発見することもできる。
【０２８５】
特異性は、偽陽性または偽陰性シグナルによって負の影響を受ける。したがって、ＮＰＰＦ設計が、ＮＰＰＦと標的領域との間で塩基ミスマッチを含むとしても、このミスマッチは、既知の目的の領域から離れて配置され、残留プローブの存在から（アッセイ内のまたはＰＣＲ設定区域における環境汚染からの）生じる任意の偽シグナルを、結果からスクリーニングで排除するのを可能にする。この実験において、検出可能なプローブ配列は存在しなかった（図１２「ＫＲＡＳ＿Ｑ６１＿プローブ」を参照）。
（実施例４）
複数のｃＮＰＰＦの同時シーケンシング；多重化反応における線形性、特異性および感度
【０２８６】
この実施例は、ｃＮＰＰＦを生成およびシーケンシングするのに使用する方法について記載する。３０個のＮＰＰＦのセットを生成した。ＮＰＰＦはそれぞれ、特定の標的核酸分子に特異的である領域（５０ヌクレオチドの長さ）、ならびに両方の末端上のフランキング配列を含んでいた。ＮＰＰＦは、実施例３のように設計された。ＮＰＰＦは、ＮＰＰＦ上のフランキング配列に相補的なＣＦＳを用いてプールした。３’ＣＦＳは、内部ビオチン部分を保有し、５’ＣＦＳは、５’末端でリン酸化された。
【０２８７】
標的配列を含有する２３個の二本鎖ＤＮＡアンプリコンの混合物に関して、ハイブリダイゼーションを実行した。アンプリコンはそれぞれ、公知のヒト対立遺伝子の野生型または突然変異体コピーのいずれか、ならびにさらなる非標的配列を保有した。２３個全てのアンプリコンを高濃度で一緒にプールして、続いてプールを溶解緩衝液中に希釈した。１００ｆＭ〜１００ａＭの範囲の７個の希釈物を生成した。次に、この希釈系列を使用して、上述のＮＰＰＦプールを使用した多重的なアッセイの再現性、線形性、感度、および特異性を試験した。ＮＰＰＦおよびＣＦＳを、アンプリコン試料と混合することによって、ハイブリダイゼーションを溶液中で実行した。ハイブリダイゼーションは、９５℃で１０分間の初期変性の後に、５０℃で実行した。
【０２８８】
ハイブリダイゼーション後、緩衝液中のＳ１酵素の添加によって、ハイブリダイズされた混合物に関してＳ１消化を実行した。Ｓ１反応物は、５０℃で９０分間インキュベートした。一本鎖核酸（ハイブリダイズされていないＤＮＡ、ＮＰＰＦ、およびＣＦＳを含む）のＳ１媒介性消化後、反応物を室温に冷却して、４μｇ／μｌの濃度のＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃ１ストレプトアビジン常磁性ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５μｌに添加した。ビーズおよび試料混合物を室温で３０分間インキュベートして、３’ＣＦＳ上のビオチン部分を、ビーズ上のストレプトアビジンによって捕獲させた。このステップはまた、Ｓ１反応を停止させるのに機能を果たす。
【０２８９】
ビーズを、１×ＳＳＣ−Ｔ緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤を有する１×ＳＳＣ緩衝液）１５０μｌ中で、室温にて３回洗浄した。このマイルドな緩衝液中での洗浄は、ハイブリダイズされた構造がインタクトなままであることを可能にする。反応管をスタンドマグネット上に配置させて、ビーズを収集させること、上清を除去すること、続いてビーズを１×ＳＳＣ−Ｔ中に再懸濁することによって、洗浄を実行した。
【０２９０】
洗浄したビーズを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ８０ユニットおよびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ０．６ユニットを含有するライゲーション混合物２０μｌ中に再懸濁した。ライゲーションは、室温で７５分間続行した。ライゲーション反応後、ビーズを、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０界面活性剤中の５０％ホルムアミド１５０μｌを用いて３回で洗浄した後、ｄＨ２Ｏ中の０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０界面活性剤中で１回洗浄した。反応管をスタンドマグネット上に配置させて、ビーズを収集させること、上清を除去すること、続いて洗浄緩衝液をビーズに添加することによって、洗浄を実行した。これらの洗浄は、二本鎖産物を変性して、ＮＰＰＦを洗い流して、ビーズ上にライゲートした標的−ＣＦＳ複合体を残す。洗浄したビーズを、増幅前に、ｄＨ２Ｏ中の０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０界面活性剤２０μｌ中に再懸濁した。
【０２９１】
次に、試料中で使用される元の標的のライゲートしたｃＮＰＰＦを含有する上述の反応物の一部を、ＰＣＲプライマーとともにインキュベートした。これらのプライマーは、実施例２に記載するように設計された。使用した実験的タグを表４に示す。
【表４】
2019509724.tif 000007
【０２９２】
反応物をそれぞれ、別々のＰＣＲ反応で増幅させて、それぞれを、実験的タグ（５’プライマー１個および３’プライマー１個）の種々の組合せを用いて増幅させ、そのため反応物はそれぞれ、プールされた反応物のシーケンシング後に別々に同定することができた。全ての反応においてウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理が、増幅に先行した。ＵＤＧは、オリゴヌクレオチドまたは一本鎖ＤＮＡを含むウラシル含有ＤＮＡからの遊離ウラシルの放出を触媒する。上述の反応において、ＵＤＧの機能は、先の酵素ステップおよび洗浄ステップ後に存在する任意の残りのＮＰＰＦを破壊することである。ＵＤＧ処理に続いて、２２サイクルのＰＣＲを行った。
【０２９３】
得られたＰＣＲ反応物を一緒にプールし、ビーズベース試料クリーンアップ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒからのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ）を使用してクリーンアップした。プールすることを実行して、その結果、用量設定試料を互いに関して分析することができた（即ち、より高い用量設定は、より低いものよりもシーケンシング試行に対してより多くのインプット材料を有する）。続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して、ｃＮＰＰＦおよび実験的タグを含有するアンプリコンをシーケンシングした。実験的タグは、幾つかの場所に配置させることができるが、この実施例では、それらは、指標−リードシーケンシングプライマーに相補的な領域のすぐ下流で、アンプリコンの両側に配置された。したがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、３ステップで行い、配列の初期リードに続いて、２個の他のシーケンシングプライマーを使用した実験的タグの２回のより短いリードを行った（シーケンシングプライマーは全て、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａキットに含まれていた）。本明細書中に記載し、また使用するシーケンシング方法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上での多重性試料に関する標準的な方法である。
【０２９４】
シーケンシングされた分子はそれぞれ、まず実験タグに基づいて、続いて各実験タグ群内でソートし、種々のタグそれぞれに関して同定される分子数を計数した。得られた配列は、オープンソースソフトウェアｂｏｗｔｉｅを使用して予想配列と比較した。
【０２９５】
図１３Ａ〜図１３Ｂおよび図１４は、ライゲートした標的およびＣＦＳ（ｃＮＰＰＦ）のシーケンシングからの結果を示す。これは、２３個のアンプリコン標的を含有する多重化試料であった。反応物内のＮＰＰＦは、２３個のアンプリコン標的のうち２０個を検出するように設計され、２０個全てが検出され、アッセイの、小さな変化を伴う標的の多重化検出を実行する能力を実証した。
【０２９６】
さらに、アンプリコンをそれぞれ、３ｌｏｇスケールにわたって用量設定し、２０個のアンプリコンそれぞれに関して、線形性を測定した。２０個全てのアンプリコンに関するデータを図１３Ａにプロットし（生データ、三重反復の平均値、ｌｏｇ１０スケール）、２０個全てのアンプリコンの線形性を示す。データは、非常に線形性であり、２０個全てのアンプリコンに関する７個の用量設定点からのデータのメジアンＲ２は、０．９９８であった（範囲０．９９７〜０．９９、線形スケール）。
【０２９７】
図１３Ｂは、１５００〜１．５Ｍインプットコピーの範囲にわたる検出の再現性、線形性、感度、および特異性を実証する。より詳細に表示するために、２個のアンプリコンを選択し、それぞれ、第２の標的アンプリコンとは１個のみ塩基が異なるが、混合物内で特異的に識別された。生データを、これらの２個のアンプリコンに関して三重反復で平均化し、再現性は、誤差棒によって実証される（表示：平均値からの１個の標準偏差（ｌｏｇ１０スケールでプロットする））。データはまた、非常に線形であり、Ｒ２値はグラフ上に示され、０．９９８〜０．９９７である（線形スケール）。
【０２９８】
図１４におけるチャートは、アンプリコン標的の希釈系列にわたるアッセイの再現性を実証する。各インプット濃度でのアンプリコン標的の４個に関する平均値、標準偏差、および％ＣＶ（三重反復反応、生データ）を表に示す。これらの４個の標的は、２０個の集団全体を非常に代表している。
（実施例５）
開示されたアッセイを使用したＢＲＡＦ突然変異ステータスに関する臨床ＦＦＰＥ試料の評価
【０２９９】
この実施例は、ＢＲＡＦ突然変異ステータスがわかっている市販の黒色腫のホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料のセットにおいてＢＲＡＦゲノム突然変異ステータスを評価するのに使用する方法について記載する。
【０３００】
ＦＦＰＥ試料を溶解緩衝液中に溶解して、試料１個につき２ｍｍ２を使用した。各試料を三重反復で試行した。実施例３に記載するＮＰＰＦおよびＣＦＳ混合物を試料に添加した。ハイブリダイゼーションは、９５℃で１０分間の初期変性の後に、５０℃で一晩、溶液中で実行した。
【０３０１】
ハイブリダイゼーション後、緩衝液中のＳ１酵素の添加によって、ハイブリダイズされた混合物に関してＳ１消化を実行した。Ｓ１反応物は、５０℃で９０分間インキュベートした。一本鎖核酸（ハイブリダイズされていないＤＮＡ、ＮＰＰＦ、およびＣＦＳを含む）のＳ１媒介性消化後、反応物を室温に冷却した。その時点で、反応物を４μｇ／μｌの濃度のＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃ１ストレプトアビジン常磁性ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５μｌに添加した。ビーズおよび試料混合物を室温で３０分間インキュベートして、３’ＣＦＳ上のビオチン部分を、ビーズ上のストレプトアビジンによって捕獲させた。このステップはまた、Ｓ１反応を停止させるのに機能を果たす。
【０３０２】
ビーズを、１×ＳＳＣ−Ｔ緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎを有する１×ＳＳＣ緩衝液）１５０μｌ中で、室温にて３回洗浄した。このマイルドな緩衝液中での洗浄は、ハイブリダイズされた構造がインタクトなままであることを可能にする。反応管をスタンドマグネット上に配置させて、ビーズを収集させること、上清を除去すること、続いてビーズを１×ＳＳＣ−Ｔ中に再懸濁することによって、洗浄を実行した。
【０３０３】
洗浄したビーズを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ８０ユニットおよびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ０．６ユニットを含有するライゲーション混合物（酵素および緩衝液は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから）２０μｌ中に再懸濁した。ライゲーションは、室温で１時間続行した。ライゲーション反応後、ビーズを、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０界面活性剤中の５０％ホルムアミド１５０μｌを用いて３回で洗浄した。反応管をスタンドマグネット上に配置させることおよびビーズを収集させること、上清を除去すること、続いてビーズを洗浄緩衝液中に再懸濁することによって、洗浄を実行した。これらの洗浄は、二本鎖産物を変性して、ＮＰＰＦを洗い流して、ビーズ上にライゲートした標的−ＣＦＳ複合体を残す。洗浄したビーズを、最後に収集して、ｄＨ２Ｏ中の０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０界面活性剤２０μｌ中に再懸濁した。
【０３０４】
次に、試料中の標的のライゲートしたｃＮＰＰＦを含有する上述の反応物の一部を、ＰＣＲプライマーとともにインキュベートした。これらのプライマーは、実施例２に記載するように設計された。使用した実験的タグを表５に示す。
【表５】
2019509724.tif 000008
【０３０５】
反応物をそれぞれ、別々のＰＣＲ反応で増幅させて、それぞれを、実験的タグ（５’プライマー１個および３’プライマー１個）の種々の組合せを用いて増幅させ、そのため反応物はそれぞれ、プールされた反応物のシーケンシング後に別々に同定することができた。全ての反応においてウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理が、増幅に先行した。ＵＤＧは、オリゴヌクレオチドまたは一本鎖ＤＮＡを含むウラシル含有ＤＮＡからの遊離ウラシルの放出を触媒する。上述の反応において、ＵＤＧの機能は、先の酵素ステップおよび洗浄ステップ後に存在する任意の残りのＮＰＰＦを破壊することである。ＵＤＧ処理に続いて、２２サイクルのＰＣＲを行った。
【０３０６】
得られたアンプリコンを一緒にプールし、ビーズベース試料クリーンアップ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒからのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ）を使用してクリーンアップした。続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して、ｃＮＰＰＦおよび実験的タグを含有するアンプリコンをシーケンシングした。実験的タグは、幾つかの場所に配置させることができるが、この実施例では、それらは、指標−リードシーケンシングプライマーに相補的な領域のすぐ下流で、アンプリコンの両側に配置された。したがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、３ステップで行い、配列の初期リードに続いて、２個の他のシーケンシングプライマーを使用した実験的タグの２回のより短いリードを行った（シーケンシングプライマーは全て、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａキットに含まれていた）。本明細書中に記載し、また使用するシーケンシング方法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上での多重性試料に関する標準的な方法である。
【０３０７】
シーケンシングされた分子はそれぞれ、まず実験タグに基づいて、続いて各実験タグ群内でソートし、種々のタグそれぞれに関して同定される分子数を計数した。アンプリコンは、オープンソースソフトウェアｂｏｗｔｉｅを使用して予想配列と比較した。
【０３０８】
図１５は、ライゲートした標的およびＣＦＳ（ｃＮＰＰＦ）のシーケンシングからの結果を示す。グラフは、まず三重反復試料からの生計数を平均化することによって作成した。ＢＲＡＦ  Ｖ６００位置に着目した（野生型遺伝子座（「Ｖ６００ｗ」）、Ｖ６００Ｅ突然変異（「Ｖ６００Ｅ」）およびＶ６００Ｅ２突然変異（「Ｖ６００Ｅ２」）に関して、標的配列を図１５に示す）。ＢＲＡＦ  Ｖ６００シグナル全て（野生型および突然変異体）から生成される計数の総数を合計して、各試料に関する野生型または突然変異体シグナルの比率を算出した。これらの比率を図１５においてグラフに描いた。
【０３０９】
データにより、これらの臨床ＦＦＰＥ試料内のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を正しく同定する能力が実証される。単一の試料のみが、Ｖ６００Ｅ２突然変異を保有した（図１５に示す配列）が、開示されたプローブ設計が、Ｖ６００ＥとＶ６００Ｅ２との間の区別を可能にした（Ｅ２突然変異ステータスは予想外であり、試料は、ＢＲＡＦ突然変異体試料と称されていたが、正確な突然変異については記載されておらず、供給業者に知られていなかった可能性がある）。これは、この実施例で使用するプローブ設計を使用して未知の突然変異を明らかにする能力を実証する（実施例３に記載）。さらに、これらの結果は、倹約量（２ｍｍ２）の固定組織を使用して作成され、ＮＰＰＦアッセイの、少量の臨床的に意義のある試料を使用して機能する能力を実証した。
（実施例６）
ＮＰＰＦアッセイを使用したＲＮＡの評価
【０３１０】
この実施例は、組織溶解産物または単離ＲＮＡのいずれかを含む試料において、開示された方法を使用してＲＮＡ発現レベル定量化を評価するのに使用する方法について記載する。
【０３１１】
３３個のＮＰＰＦのセットを生成した。これらのＮＰＰＦの設計は、実施例３に記載するものに倣う。ＮＰＰＦはそれぞれ、５０ヌクレオチドの長さの特定の標的核酸分子に特異的である領域を含んでいた。また、プローブはそれぞれ、標的配列に関して単一ミスマッチを含む。Ｃ＞ＴまたはＡ＞Ｇの変化のいずれかを、ミスマッチとして使用した。全てのＮＰＰＦに関して、５’−および３’−フランキング配列は、実施例３に記載する通りであった。
【０３１２】
ＮＰＰＦのセットを、ＮＰＰＦ上のフランキング領域に相補的なＣＦＳとともにプールした。５’−ＣＦＳは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドであり（最も５’の３個のヌクレオチドがＲＮＡ塩基であった）、５’末端でリン酸化された。３’−ＣＦＳは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドであり（最も３’の３個のヌクレオチドがＲＮＡ塩基であった）、内部ビオチン部分を保有した。また、混合物中でＮＰＰＦの２個に関して標的として機能を果たす５０塩基の長さで、５’末端でリン酸化された２個のＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ＮＰＰＦおよびＣＦＳ混合物中に含まれた。これらは、ＤＮＡであり、ＲＮＡではないため、それらは、ヌクレオチド特異的な対照としてこの特定の実施例で使用される。
【０３１３】
３個の試料型を利用した。試料型の１つは、５０塩基の長さで、５’末端でリン酸化された既知の配列のＲＮＡオリゴであった。第２の試料型は、全てが５０塩基の長さを上回る既知の配列の６個のｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されるＲＮＡ配列の混合物であった。第３の試料は、溶解緩衝液中で均質化された結腸がん組織試料であった。試料型はそれぞれ、溶解緩衝液中に希釈されて、用量設定系列で試行された。上述のＮＰＰＦおよびＣＦＳ混合物を試料に添加した。ハイブリダイゼーションは、９５℃で１０分間の初期変性の後に、５０℃で一晩、溶液中で実行した。
【０３１４】
ハイブリダイゼーション後、緩衝液中のＳ１酵素の添加によって、ハイブリダイズされた混合物に関してＳ１消化を実行した。Ｓ１反応物は、５０℃で９０分間インキュベートした。一本鎖核酸（ハイブリダイズされていない核酸、ＮＰＰＦ、およびＣＦＳを含む）のＳ１媒介性消化後、反応物を室温に冷却した。反応物を４μｇ／μｌの濃度のＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃ１ストレプトアビジン常磁性ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５μｌに添加した。ビーズおよび試料混合物を室温で３０分間インキュベートして、３’ＣＦＳ上のビオチン部分を、ビーズ上のストレプトアビジンによって捕獲させた。このステップはまた、Ｓ１反応を停止させる。
【０３１５】
ビーズを、１×ＳＳＣ−Ｔ緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を有する１×ＳＳＣ緩衝液）１５０μｌ中で、室温にて３回洗浄した。このマイルドな緩衝液中での洗浄は、ハイブリダイズされた構造がインタクトなままであることを可能にする。反応管をスタンドマグネット上に配置させて、ビーズを収集させること、上清を除去すること、続いてビーズを１×ＳＳＣ−Ｔ中に再懸濁することによって、洗浄を実行した。
【０３１６】
洗浄したビーズを、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２  ２ユニットおよびＥ．ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼ０．５ユニットを含有するライゲーション混合物（ともに、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから）２０μｌ中に再懸濁した。ライゲーションは、３７℃で１時間続行した。ライゲーション反応後、ビーズを、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０中の５０％ホルムアミド１５０μｌを用いて、５０℃で３回で洗浄した。反応管をスタンドマグネット上に配置させることおよびビーズを収集させること、上清を除去すること、続いてビーズを洗浄緩衝液中に再懸濁することによって、洗浄を実行した。これらの洗浄は、二本鎖産物を変性して、ＮＰＰＦを洗い流して、ビーズ上にライゲートした標的−ＣＦＳ（ｃＮＰＰＦ）複合体を残す。洗浄したビーズを、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０  １０μｌ中に収集して、逆転写ミックス１０μｌを添加した（逆転写酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）２００ユニット、緩衝液および最終濃度５００ｎＭになるようなプライマーを含有する）。逆転写は、４５℃で２時間実行した。続いて、ビーズを、ＳＳＣ−Ｔ  １５０μｌ中で１回洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０  ２０μｌ中に再懸濁した。
【０３１７】
次に、試料中の標的のライゲートしたｃＮＰＰＦを含有する上述の反応物の一部を、ＰＣＲプライマーとともにインキュベートした。これらのプライマーは、実施例２に記載するように設計された。使用した実験的タグを表６に示す。
【表６】
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【０３１８】
反応物をそれぞれ、別々のＰＣＲ反応で増幅させて、それぞれを、実験的タグ（５’プライマー１個および３’プライマー１個）の種々の組合せを用いて増幅させ、反応物はそれぞれ、プールされた反応物のシーケンシング後に別々に同定することが可能となった。全ての反応においてウラシルＤＮＡデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理が、増幅に先行した。ＵＤＧは、オリゴヌクレオチドまたは一本鎖ＤＮＡを含むウラシル含有ＤＮＡからの遊離ウラシルの放出を触媒する。上述の反応において、ＵＤＧは、先の酵素ステップおよび洗浄ステップ後に存在する任意の残存ＮＰＰＦを破壊した。ＵＤＧ処理に続いて、２４サイクルのＰＣＲを行った。
【０３１９】
得られたアンプリコンを試料型によってプールし、ビーズベース試料クリーンアップ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒからのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ）を使用してクリーンアップした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して、ｃＮＰＰＦおよび実験的タグを含有するアンプリコンをシーケンシングした。実験的タグは、幾つかの場所に配置させることができるが、この実施例では、それらは、指標−リードシーケンシングプライマーに相補的な領域のすぐ下流で、アンプリコンの両側に配置された。したがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、３ステップで行い、配列の初期リードに続いて、２個の他のシーケンシングプライマーを使用した実験的タグの２回のより短いリードを行った（シーケンシングプライマーは全て、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａキットに含まれていた）。本明細書中に記載し、また使用するシーケンシング方法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上での多重性試料に関する標準的な方法である。
【０３２０】
シーケンシングされた分子はそれぞれ、まず実験タグに基づいてソートした。このようにタグによってソートされるシーケンシングリードを、オープンソースソフトウェアｂｏｗｔｉｅ（Ｌａｎｇｍｅａｄら、Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １０：Ｒ２５）を使用して予想配列と比較して、試料１個につき予想配列１個当たりのシーケンシングされた分子の数（「計数」）に関して、データ表を構築した。
【０３２１】
図１６Ａ〜図１６Ｄは、ライゲートした標的およびＣＦＳ（ｃＮＰＰＦ）のシーケンシングからの結果を示す。生シーケンシング計数をプロットする。図１６Ａは、特異的なＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する試料からの結果を示す。これらの結果により、開示された方法の、特異的なＲＮＡ標的を測定する能力が実証される。結果はまた、アッセイ内に相補的なＮＰＰＦを有するにも関わらず、アッセイに添加される２個のＤＮＡオリゴヌクレオチド（グラフ上の「ＰＯＳ１」および「ＰＯＳ２」）が測定されなかったため、上記方法はＲＮＡを正しく測定したが、ＤＮＡを測定しなかったことを実証する。これは、ＲＮＡがＤＮＡ鎖から離れて転写されるため重要である。この実施例内で使用する方法が、ＲＮＡに特異的でなかった場合、シーケンシングの結果は、ＲＮＡまたはＤＮＡ標的に起因したかどうかを同定することは困難である。結果はまた、偽またはバックグラウンドシグナルを伴わずに、試料中に存在する唯一の標的が測定されることを実証する（「ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ＿ｗｔ」は、きれいなバックグラウンドの例として示され、ＢＲＡＦ  ＲＮＡ標的は、使用する試料中に存在しなかった）。この特異的な実施例に関して、ＲＮＡのみを測定することによって、本明細書中に記載する方法が、ＲＮＡまたはＤＮＡを特異的に測定するように標的とされ得ることが実証された。しかしながら、このことは、本明細書中に記載する方法のみが、所定の時間で、または所定のアッセイにおいて、核酸（即ち、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の１個の型を測定するのに使用することができることを意味しない。ＤＮＡおよびＲＮＡは、混合ＲＮＡ−ＤＮＡアッセイが望ましい場合には、上記方法を使用して同時測定されてもよい。
【０３２２】
図１６Ｂは、インプット（用量設定系列）の範囲にわたる特異的なＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する試料のセットからの結果を示す。試料インプットの５点用量設定からの生データが示され、結果に関するＲ２値は、０．９９４１である（線形スケール）。これにより、測定の良好な線形性が実証される。
【０３２３】
図１６Ｃは、組織溶解産物を含有する試料のセットからのデータを示す。３個のＲＮＡ標的は、４点試料インプット用量設定にわたって測定され、３個全てに関するＲ２値は、少なくとも０．９３であり、生理学的試料におけるインプットの用量設定にわたって優れた線形性を実証する。
【０３２４】
図１６Ｄは、６個のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物からなる試料からの結果を示す。６個全てが、６個の標的に関してプロットされる計数によって示されるように、正しくかつ特異的に測定される。図１６Ｃおよび図１６Ｄはともに、種々の試料型におけるＲＮＡ標的の多重化検出を実証する。
【０３２５】
これらのデータは、本明細書中に開示された方法を使用して、ＲＮＡ標的を特異的かつ定量的に測定する能力を実証する。
開示された本発明の原理が適用され得る多くの考え得る実施形態を鑑みて、例示した実施形態は本開示の単なる例であり、開示の範囲を限定すると解釈されるべきではないことが認識されるはずである。そうではなく、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神内の範疇にある全てを、本発明者らの発明として特許請求する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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