(57)【要約】  蛍光ナノダイアモンドを含む基準マーカ組成物、並びに基準マーカ組成物を作成及び使用する方法が開示されている。基準マーカ組成物は、基板と、基板の表面に固定された蛍光ナノダイアモンドと、を含み、基板及び固定された蛍光ナノダイアモンドは、任意選択で不活性トップコーティングによってトップコーティングされる。基準マーカ組成物は、ドリフト及び別のアラインメント不安定を補正するために撮像方法において使用され、特に、超解像撮像において有用である。
2019502907.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基準マーカ組成物であって、
基板と、
基板の表面に固定された蛍光ナノダイアモンドと、
を含み、
前記基板及び固定された蛍光ナノダイアモンドは、少なくとも部分的に不活性トップコーティングによってトップコーティングされている、基準マーカ組成物。
【請求項２】
前記蛍光ナノダイアモンドは、ポリマによって前記基板に固定されている、請求項１に記載の基準マーカ組成物。
【請求項３】
前記ポリマは、荷電ポリマ又は透明ポリマである、請求項２に記載の基準マーカ組成物。
【請求項４】
前記荷電ポリマは、ポリリシン又はポリアルギニンである、請求項３に記載の基準マーカ組成物。
【請求項５】
基準マーカ組成物であって、
基板と、
前記基板の表面に固定された透明ポリマと、
前記透明ポリマに埋め込まれた蛍光ナノダイアモンドと、
を含む、基準マーカ組成物。
【請求項６】
不活性トップコーティングを更に含む、請求項５に記載の基準マーカ組成物。
【請求項７】
前記基板は、ガラスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の基準マーカ組成物。
【請求項８】
前記表面は、実質的に平坦である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の基準マーカ組成物。
【請求項９】
前記基板上での前記蛍光ナノダイアモンドの密度は、１００μｍ2当たり約１０と約５００との間にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の基準マーカ組成物。
【請求項１０】
前記蛍光ナノダイアモンドの平均最大サイズは、約５ｎｍ〜約１００ｎｍである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の基準マーカ組成物。
【請求項１１】
前記ポリマは、前記基板表面でパターン化されている、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の基準マーカ組成物。
【請求項１２】
少なくとも２つの蛍光ナノダイアモンドが、前記少なくとも２つの蛍光ナノダイアモンドと前記基板表面との間の距離が同一でないように前記ポリマ内に固定されている、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の基準マーカ組成物。
【請求項１３】
前記蛍光ナノダイアモンドは、多色蛍光ナノダイアモンドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の基準マーカ組成物。
【請求項１４】
基準マーカ組成物を作成する方法であって、
基板の表面に蛍光ナノダイアモンドを固定することと、
前記固定された蛍光ナノダイアモンド及び表面を不活性トップコーティングによってコーティングすることと、
を含む、方法。
【請求項１５】
基板の表面に蛍光ナノダイアモンドを固定することは、
前記基板の表面に前記蛍光ナノダイアモンドとポリマの水溶液とを含む組合せを適用すること
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
基板の表面に蛍光ナノダイアモンドを固定することは、
ポリマ溶液によって前記表面をコーティングすることと、
前記ポリマコーティングに前記蛍光ナノダイアモンドを分散させることと、
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリマコーティングは、前記蛍光ナノダイアモンドを分散させる前又はその後にパターン化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記基板は、ガラスである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマは、荷電ポリマ又は透明ポリマである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
基板の表面に蛍光ナノダイアモンドを固定することは、
前記蛍光ナノダイアモンドと反応する官能基、又は官能基化された蛍光ナノダイアモンドの官能基によって、前記基板の表面を官能基化させることと、
任意選択で、前記官能基化された表面をパターン化することと、
前記蛍光ナノダイアモンド又は前記官能基化された蛍光ナノダイアモンドを含む溶液を前記官能基化された表面に適用することと、
を含む、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
基板の表面に蛍光ナノダイアモンドを固定することは、
前記基板表面に透明ポリマを含む予め形成された形状を固定することを含み、前記蛍光ナノダイアモンドは、物体内部又は前記物体の表面に含有される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリマは、透明ポリジメチルシロキサンである、請求項２〜３及び５〜１２のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１５〜１９及び２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
基準マーカ組成物であって、
蛍光ナノダイアモンドと、非蛍光撮像方法のための造影剤と、を含むマーカ錯体を含む基準マーカ組成物。
【請求項２４】
前記非蛍光撮像方法は、磁気共鳴撮像、コンピュータ断層撮像、Ｘ線撮像、又は電子顕微鏡法である、請求項２３に記載の基準マーカ組成物。
【請求項２５】
前記マーカ錯体は、リポソーム内にカプセル化された前記蛍光ナノダイアモンドを含み、
前記リポソームは、前記造影剤を更にカプセル化する、請求項２３又は２４に記載の基準マーカ組成物。
【請求項２６】
前記造影剤は、オスミウム含有成分である、請求項２５に記載の基準マーカ組成物。
【請求項２７】
前記オスミウム含有成分は、四酸化オスミウムである、請求項２６に記載の基準マーカ組成物。
【請求項２８】
前記マーカ錯体は、ガドリニウム含有部分、ジスプロシウム含有部分、又は高電子密度材料に結合された前記蛍光ナノダイアモンドを含む、請求項２３に記載の基準マーカ組成物。
【請求項２９】
前記高電子密度材料は、金、ウラニウム、又はタングステンを含む、請求項２８に記載の基準マーカ組成物。
【請求項３０】
前記蛍光ナノダイアモンドは、シリカ内にカプセル化されている、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の基準マーカ組成物。
【請求項３１】
撮像方法であって、
請求項１〜１２又は２３〜３０のいずれか一項に記載の基準マーカ組成物と試料を接触させることと、
前記試料内のターゲット及び蛍光ナノダイアモンドの複数の蛍光画像を取得することと、
全ての画像内の前記蛍光ナノダイアモンドの位置を整列させることによってそれぞれの画像内でのターゲット位置を補正することと、を含む撮像方法。
【請求項３２】
前記方法は、第２の撮像方法を含む、請求項３１に記載の撮像方法。
【請求項３３】
前記第２の撮像方法は、磁気共鳴撮像、コンピュータ断層撮像、Ｘ線撮像、又は電子顕微鏡法である、請求項３２に記載の撮像方法。
【請求項３４】
前記蛍光ナノダイアモンドは、リポソーム内にカプセル化されており、前記リポソームは、オスミウム含有成分を更にカプセル化する、請求項３２に記載の撮像方法。
【請求項３５】
前記オスミウム含有成分は、四酸化オスミウムである、請求項３４に記載の撮像方法。
【請求項３６】
前記蛍光ナノダイアモンドは、ガドリニウム含有部分、ジスプロシウム含有部分、又は高電子密度材料に結合されている、請求項３２に記載の撮像方法。
【請求項３７】
前記高電子密度材料は、金、ウラニウム、又はタングステンを含む、請求項３６に記載の撮像方法。
【請求項３８】
３次元撮像方法である、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の撮像方法。
【請求項３９】
撮像方法であって、
蛍光ナノダイアモンドを含む基準マーカ組成物を試料と接触させることと、
複数の蛍光画像を取得することであって、それぞれの画像は、前記試料内のターゲット及び前記蛍光ナノダイアモンドを含む、ことと、
全ての画像内の前記蛍光ナノダイアモンドの位置を整列させることによって、それぞれの画像内のターゲット位置を補正することと、を含む撮像方法。
【請求項４０】
前記蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）を前記試料と接触させることは、
前記ＦＮＤ上の官能基を前記試料に連結することを含む、請求項３９に記載の撮像方法。
【請求項４１】
前記方法は、第２の撮像方法を含む、請求項３９又は４０に記載の撮像方法。
【請求項４２】
前記第２の撮像方法は、磁気共鳴撮像、コンピュータ断層撮像、Ｘ線撮像、又は電子顕微鏡法である、請求項４１に記載の撮像方法。
【請求項４３】
前記蛍光ナノダイアモンドは、リポソーム内にカプセル化されており、前記リポソームは、オスミウム含有成分を更にカプセル化する、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の撮像方法。
【請求項４４】
前記オスミウム含有成分は、四酸化オスミウムである、請求項４３に記載の撮像方法。
【請求項４５】
前記蛍光ナノダイアモンドは、ガドリニウム含有部分、ジスプロシウム含有部分、又は高電子密度材料に結合されている、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の撮像方法。
【請求項４６】
前記高電子密度材料は、金、ウラニウム、又はタングステンを含む、請求項４５に記載の撮像方法。
【請求項４７】
３次元撮像方法である、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の撮像方法。
【請求項４８】
前記蛍光ナノダイアモンドは、シリカ内にカプセル化されている、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の撮像方法。
【請求項４９】
前記試料は、溶液、懸濁液、細胞、組織、細胞膜、細胞器官、又は生体である、請求項３１〜４８のいずれか一項に記載の撮像方法。
【請求項５０】
超解像撮像補正方法であって、
それぞれの画像内のそれぞれの蛍光ナノダイアモンドの点像分布関数のガウシアンフィッティングによって、複数のｎ個の画像のそれぞれの画像内のｍ個の蛍光ナノダイアモンドのそれぞれの位置座標を決定することであって、ｍ≧４かつｎ＞１である、ことと、
全ての画像内の第１の蛍光ナノダイアモンドの前記座標を整列させるためにそれぞれの画像を変位させることと、
前記第１の蛍光ナノダイアモンド以外のそれぞれの蛍光ナノダイアモンドについて、全てのｎ個の変位させられた画像にわたって前記蛍光ナノダイアモンドの位置の分布の中心を計算することと、
前記第１の蛍光ナノダイアモンド以外の全ての蛍光ナノダイアモンドの位置の分散が全ての画像にわたって最小化されるようにそれぞれの画像を変位させることと、を含む、方法。
【請求項５１】
前記撮像方法は、２次元の方法である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記撮像方法は、３次元の方法である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記変位させることは、平行移動、回転、又は拡張／収縮のうちの少なくとも１つである、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１の蛍光ナノダイアモンドは、最大強度を有する前記蛍光ナノダイアモンドである、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
第１の蛍光ナノダイアモンド以外の全ての蛍光ナノダイアモンドの位置の前記分散が最小化されるように、それぞれの画像を変位させることは、
第１の蛍光ナノダイアモンド以外の全ての蛍光ナノダイアモンドについての全てのｎ個の変位させられた画像にわたって前記蛍光ナノダイアモンドの位置の分布の中心の平均を計算することと、
それぞれの画像内の第１の蛍光ナノダイアモンド以外の全ての蛍光ナノダイアモンドの平均位置を計算することと、
第１の蛍光ナノダイアモンド以外の全ての蛍光ナノダイアモンドについての全てのｎ個の変位させられた画像にわたる前記蛍光ナノダイアモンドの前記位置の分布の中心の平均と、所定の画像内の第１の蛍光ナノダイアモンド以外の全ての蛍光ナノダイアモンドの前記平均位置との間の差を最小にするように前記所定の画像を変位させることと、を含む、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡法及び蛍光撮像ための基準マーカとしての蛍光ナノダイアモンドに関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６２／２６２，０５８号の利益を主張し、この出願の全体が参照により本明細書に援用される。
【０００３】
基準マーカが、様々なタイプの撮像システムでのスライド又は試料に安定した定点を提供する。全ての測定値は、試料ドリフトを除くためにこれらの点に基準を置かれる。
【０００４】
既存の基準マーカは、金ナノ粒子、蛍光ラベル付きのｎｍスケールビーズ、及び一般的ではないが、量子ドットに基づいている。これらの基準マーカの３つ全てが、複数の限界を有する。
【０００５】
現在、最も一般に使用される基準マーカは、金ナノ粒子であって、Ｈｅｓｔｚｉｇ合同会社等のいくつかの供給源から商業的に入手可能である。このアプローチでは、金ナノ粒子は、ガラスのカバーグラスに埋め込まれる。金粒子は、サイズ及び形状に依存した発光を表し、この発光は時間が経過しても脱色しない。
【０００６】
しかし、金ナノ粒子基準マーカは、複数の欠点を有する。すなわち、それらは、粒子のサイズに関係する狭い発光（ホトルミネセンス）波長を有する。発光波長、発光強度、及び粒子サイズが連結しているので、金粒子の発光を制御することは困難である。そのため、発光波長を変えることなく、発光強度を調整することが困難である場合がある。それに加えて、金は、極性に依存する発光強度を示し得る。複数の波長にわたって相関を得ることが困難である。また、金粒子は、時間経過とともに明滅する場合がある。
【０００７】
色素ラベル付きのｎｍスケールビーズ、例えば、ＴｅｔｒａＳｐｅｃｋ  ｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．＃Ｔ７２７９）は、別のより稀にしか使われない基準マーカである。その利点は、小型サイズ（１００ｎｍ）であること、及び発光波長の広範囲をカバーする４つの異なる色素を組み込むことである。これらのビーズの重大な限界は、それらが時間経過とともに脱色して、長期間の撮像実験に対するそれらの有用性を制限することである。
【０００８】
量子ドットが基準マーカとして使用されるのはかなり稀である。それらは、明るい蛍光プローブであるけれども、明滅する狭い発光波長を被り、それらの発光強度は、調節するのが困難であり、そして、長い期間にわたり脱色する。したがって、それらが明るすぎて、その中で測定される蛍光団が非常に暗い多くの用途に使用されることができないことがしばしばであり、そして、それらは長期間にわたって適用対象を追跡するのに好適ではない。
【０００９】
従来の蛍光顕微鏡法の長所にもかかわらず、この技術は、標準物体によって捕捉され得る情報の量を制限する光の回折によって設定される解像限界のために超微細構造検査が妨げられる。光学顕微鏡の解像限界は、超解像顕微鏡法として集合的に知られている技術によって凌駕されるようになった。
【００１０】
様々な超解像顕微鏡法技術が近年開発されて、光学顕微鏡の回折限界を克服するようになり、その結果、小型分子構造の可視化を可能にした。このうち、単一分子局在性顕微鏡法（ＳＭＬＭ）と呼ばれる超解像技術のカテゴリーは、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）及び確率的光学再構築顕微鏡（ＳＴＯＲＭ）を含み、最高レベルの撮像精度（１０〜２０ｎｍ）を可能にする。ＳＭＬＭ技術は、オン（蛍光）とオフ（暗／蛍光切換え）状態の間で切り換えられ得る蛍光プローブと、単一分子からの蛍光の分離と、ガウシアンフィッティングされた蛍光ピークの連続した局在化と、を共通に有する。
【００１１】
商用の色素及び顕微鏡についての互換性のために、直接ＳＴＯＲＭ（ｄＳＴＯＲＭ）は、広く採用されるＳＭＬＭ技術になった。それに加えて、ｄＳＴＯＲＭは、通常、ＰＡＬＭによって達成された約２０ｎｍと比較して、約１０ｎｍの局在化精度を達成する場合がある。しかし、高い局在化精度（一般的にトンプソンの式を使用して計算される）にもかかわらず、ＳＭＬＭを使用する単一分子の正確な局在化は、いくつかの問題によって妨げられてきた。第１に、「局在化精度」は、「局在化正確さ」としばしば混同されてきた（例えば、１０ｎｍ精度を有するガウシアンフィッチングピークは、誤って蛍光プローブの真の位置の１０ｎｍの範囲内にあるとされてきた）。このことは、（ほとんどのｄＳＴＯＲＭ研究によって達成された）５〜１０ｎｍの局在化精度は、高い信頼度を伴って正確に単一分子を局在化するには十分でないという点で、重要な結果を有する。第２に、更なる局在化不確実性が、ドリフト及び振動を含む顕微鏡ステージ移動によってもたらされる。
【００１２】
回折限界に加えて、研究者らは、光学顕微鏡に対するスペクトル限界によって制限されてきた。複数分子の同時可視化は、非重複スペクトルプロファイルを有する蛍光プローブを必要とし、その結果、通常、蛍光顕微鏡法を６色に制限する。ＳＭＬＭにおいて、ほんのわずかな蛍光プローブだけが、正確な単一分子局在化に必要な特性を有し、その結果、大部分の研究を２〜３色に制限する。更に、カラーチャネル間の非線形の色収差が、有意な不確実性を多重化画像のアラインメントに付加する（非特許文献１、非特許文献２）。これらのスペクトル限界を克服するために、代替の多重化方式が考案された（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。これらの方策は、予めラベル付けされた蛍光プローブの循環を利用し、このプローブは、細胞内部の関心のタンパク質に結合され、撮像され、次いで蛍光又は化学脱色される。かかる多重化方策は、実際に顕微鏡法のスペクトル限界を回避し得るけれども、蛍光プローブの最終的な蓄積が、細胞内の追加の連結部位の立体的な遮蔽をもたらす可能性があり、更なる多重化を妨げる。更に、蛍光脱色が有毒な処理であることが知られているので（非特許文献６）、長期のわたる蛍光又は化学脱色は、よくない効果、例えば、細胞タンパク質の逆の架橋及び変性を生じさせる可能性がある。
【００１３】
現在まで、超解像撮像は、利用可能な基準マーカの性能によって制限されてきた。これらの限界は、１０、２０、又はそれより多くのタンパク質を順番に撮像するのに必要な長い記録時間によって悪化させられる。それぞれのタンパク質の撮像は、１時間よりも長い時間を要する場合があり、そして、それぞれのタンパク質を撮像することに関連した反復される洗浄及び保温ステップによってもたらされる相当な機械的ドリフトが存在する場合がある。個々のタンパク質についての画像の最終的な分解及び登録は、基準追跡の安定性及び正確さによって決定される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｐｅｒｔｓｉｎｉｄｉｓ，Ａ．他  （２０１０）  Ｎａｔｕｒｅ  ４６６（７３０６）：６４７−６５１
【非特許文献２】エルデーイ，Ｍ．他  （２０１３）Ｏｐｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ２１（９）：１０９７８−１０９８８
【非特許文献３】ゲルデス，Ｍ．Ｊ．他  （２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０（２９）：１１９８２−１１９８７
【非特許文献４】ユングマン，Ｒ．他  （２０１４）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１（３）：３１３−３１８
【非特許文献５】シューベルト，Ｗ．  （２０１４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  ２７（１）：３−１８
【非特許文献６】ヤコブソン，Ｋ．他  （２００８）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８（９）：４４３−４５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、蛍光撮像等の撮像用途、特に１週間以上の長きでもあり得る期間にわたる単一試料の長期撮像のための基準マーカの改善に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）を含む基準マーカ組成物、並びにその組成物の調製及び使用のための方法が、本明細書において開示される。
【００１７】
一実施形態では、基準マーカ組成物は、基板と、基板の表面に固定された蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）と、を含み、基板及び固定されたＦＮＤは、少なくとも部分的に不活性トップコーティングによってトップコーティングされている。
【００１８】
一実施形態では、基準マーカ組成物は、基板と、基板の表面に固定された透明ポリマと、透明ポリマに埋め込まれた蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）と、を含む。
【００１９】
一実施形態では、基準マーカ組成物は、非蛍光撮像方法ための蛍光ナノダイアモンド及び造影剤を含むマーカ錯体を含む。
【００２０】
一実施形態では、基準マーカ組成物を作成する方法は、基板の表面に蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）を固定することと、不活性トップコーティングによって固定されたＦＮＤ及び表面をコーティングすることと、を含む。
【００２１】
基準マーカとしてＦＮＤを使用する方法が、また開示される。
【００２２】
一実施形態では、撮像方法は、試料を本明細書において開示された基準マーカ組成物と接触させることと、試料内のターゲット及びＦＮＤの複数の蛍光画像を取得することと、全ての画像内のＦＮＤの位置を整列させることによってそれぞれの画像内のターゲット位置を補正することと、を含む。
【００２３】
一実施形態では、複数のｎ個の画像のそれぞれの画像内のｍ個の蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）のそれぞれの位置座標を、それぞれの画像内のそれぞれのＦＮＤの点像分布関数のガウシアンフィッティングによって決定することであって、ｍ≧４かつｎ＞１である、ことと、全ての画像内の第１のＦＮＤ（ＦＮＤ１）の座標を整列させるためにそれぞれの画像を変位させることと、ＦＮＤ１以外のそれぞれのＦＮＤに対して、全てのｎ個の変位させられた画像にわたってＦＮＤの位置の分布の中心を計算することと、ＦＮＤ１以外の全てのＦＮＤの位置の分散が全ての画像にわたって最小化されるようにそれぞれの画像を変位させることと、を含む。
【００２４】
これらの及び別の利点、並びに追加の発明の特徴が、以下の図面、詳細な説明、実施例、及び請求項から明らかになるであろう。
【００２５】
以下のものは、図面の概要であり、図面においては、同様の要素は、同様の番号が付され、そして、図面は、本明細書で開示した例示的実施形態を例示するために表されており、同一のものに限定することを目的としない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】蛍光顕微鏡撮像においてナノ金又はナノダイアモンド基準マーカから測定された画像フレームの関数としての蛍光強度のグラフを表す。
【図２】ナノ金又はナノダイアモンド基準マーカの画像、及び蛍光顕微鏡撮像での位置誤差についての関連する期待及び観測標準偏差を表す。
【図３】ナノ金又はナノダイアモンド基準マーカについてのＸ軸又はＹ軸に沿った蛍光顕微鏡撮像の位置誤差の観測標準偏差を表すヒストグラムである。
【図４】それぞれの連続して撮像されるタンパク質の撮像中及びそれらの間のドリフトを除去するための３つのタンパク質のうちの１つ及びＦＮＤに対するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７ラベル付き抗体の同時撮像による、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内にタンパク質（ＬＡＴ、ＳＬＰ７６、及びｐＺｅｔａ）を形成する３つのＴ細胞受容体マイクロ錯体の連続撮像によって取得された免疫シナプスの多重化超解像視野である。平均局在化精度＝３．６１ｎｍ；平均アラインメント精度＝２．０７ｎｍ。
【図５】非着色蛍光ナノダイアモンド（〜５ナノメートル）の透過電子顕微鏡写真である。
【図６Ａ】３つの技術（交差相関、基準補正、及び点補正）を比較して、取得されたＳＭＬＭ画像でのステージ移動を補正しており、パネルＡ〜Ｃは、それぞれ交差相関、基準補正、又は点補正による補正後のＦＮＤの画像であり、パネルＤ〜Ｆは、パネルＡ〜Ｃの画像の局在化分布の３Ｄヒストグラムプロットであり、パネルＧは、方法のそれぞれによる補正後の不確実性比を表すヒストグラムであり、そして、パネルＨは、方法のそれぞれによる補正後のＸ／Ｙ局在化比のヒストグラムである。
【図６Ｂ】３つの技術（交差相関、基準補正、及び点補正）を比較して、取得されたＳＭＬＭ画像でのステージ移動を補正しており、パネルＡ〜Ｃは、それぞれ交差相関、基準補正、又は点補正による補正後のＦＮＤの画像であり、パネルＤ〜Ｆは、パネルＡ〜Ｃの画像の局在化分布の３Ｄヒストグラムプロットであり、パネルＧは、方法のそれぞれによる補正後の不確実性比を表すヒストグラムであり、そして、パネルＨは、方法のそれぞれによる補正後のＸ／Ｙ局在化比のヒストグラムである。
【図６Ｃ】３つの技術（交差相関、基準補正、及び点補正）を比較して、取得されたＳＭＬＭ画像でのステージ移動を補正しており、パネルＡ〜Ｃは、それぞれ交差相関、基準補正、又は点補正による補正後のＦＮＤの画像であり、パネルＤ〜Ｆは、パネルＡ〜Ｃの画像の局在化分布の３Ｄヒストグラムプロットであり、パネルＧは、方法のそれぞれによる補正後の不確実性比を表すヒストグラムであり、そして、パネルＨは、方法のそれぞれによる補正後のＸ／Ｙ局在化比のヒストグラムである。
【図６Ｄ】３つの技術（交差相関、基準補正、及び点補正）を比較して、取得されたＳＭＬＭ画像でのステージ移動を補正しており、パネルＡ〜Ｃは、それぞれ交差相関、基準補正、又は点補正による補正後のＦＮＤの画像であり、パネルＤ〜Ｆは、パネルＡ〜Ｃの画像の局在化分布の３Ｄヒストグラムプロットであり、パネルＧは、方法のそれぞれによる補正後の不確実性比を表すヒストグラムであり、そして、パネルＨは、方法のそれぞれによる補正後のＸ／Ｙ局在化比のヒストグラムである。
【図６Ｅ】３つの技術（交差相関、基準補正、及び点補正）を比較して、取得されたＳＭＬＭ画像でのステージ移動を補正しており、パネルＡ〜Ｃは、それぞれ交差相関、基準補正、又は点補正による補正後のＦＮＤの画像であり、パネルＤ〜Ｆは、パネルＡ〜Ｃの画像の局在化分布の３Ｄヒストグラムプロットであり、パネルＧは、方法のそれぞれによる補正後の不確実性比を表すヒストグラムであり、そして、パネルＨは、方法のそれぞれによる補正後のＸ／Ｙ局在化比のヒストグラムである。
【図６Ｆ】３つの技術（交差相関、基準補正、及び点補正）を比較して、取得されたＳＭＬＭ画像でのステージ移動を補正しており、パネルＡ〜Ｃは、それぞれ交差相関、基準補正、又は点補正による補正後のＦＮＤの画像であり、パネルＤ〜Ｆは、パネルＡ〜Ｃの画像の局在化分布の３Ｄヒストグラムプロットであり、パネルＧは、方法のそれぞれによる補正後の不確実性比を表すヒストグラムであり、そして、パネルＨは、方法のそれぞれによる補正後のＸ／Ｙ局在化比のヒストグラムである。
【図６Ｇ】３つの技術（交差相関、基準補正、及び点補正）を比較して、取得されたＳＭＬＭ画像でのステージ移動を補正しており、パネルＡ〜Ｃは、それぞれ交差相関、基準補正、又は点補正による補正後のＦＮＤの画像であり、パネルＤ〜Ｆは、パネルＡ〜Ｃの画像の局在化分布の３Ｄヒストグラムプロットであり、パネルＧは、方法のそれぞれによる補正後の不確実性比を表すヒストグラムであり、そして、パネルＨは、方法のそれぞれによる補正後のＸ／Ｙ局在化比のヒストグラムである。
【図６Ｈ】３つの技術（交差相関、基準補正、及び点補正）を比較して、取得されたＳＭＬＭ画像でのステージ移動を補正しており、パネルＡ〜Ｃは、それぞれ交差相関、基準補正、又は点補正による補正後のＦＮＤの画像であり、パネルＤ〜Ｆは、パネルＡ〜Ｃの画像の局在化分布の３Ｄヒストグラムプロットであり、パネルＧは、方法のそれぞれによる補正後の不確実性比を表すヒストグラムであり、そして、パネルＨは、方法のそれぞれによる補正後のＸ／Ｙ局在化比のヒストグラムである。
【図７Ａ】パネルＡ及びＢは、ＦＮＤ（パネルＡ）及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７のラベル付き抗体（Ａ６４７）（パネルＢ）についての平均値の期待標準誤差の関数として観測標準偏差を表すプロットであり、パネルＣ及びＤは、それぞれＦＮＤのＸ−Ｙ分布及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７のラベル付き抗体のプロットであり、パネルＥ及びＦは、３つのタイプの補正後の抗体の可視化及び局在化の画像(Ｅ)及び３Ｄヒストグラム(Ｆ)である。
【図７Ｂ】パネルＡ及びＢは、ＦＮＤ（パネルＡ）及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７のラベル付き抗体（Ａ６４７）（パネルＢ）についての平均値の期待標準誤差の関数として観測標準偏差を表すプロットであり、パネルＣ及びＤは、それぞれＦＮＤのＸ−Ｙ分布及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７のラベル付き抗体のプロットであり、パネルＥ及びＦは、３つのタイプの補正後の抗体の可視化及び局在化の画像(Ｅ)及び３Ｄヒストグラム(Ｆ)である。
【図７Ｃ】パネルＡ及びＢは、ＦＮＤ（パネルＡ）及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７のラベル付き抗体（Ａ６４７）（パネルＢ）についての平均値の期待標準誤差の関数として観測標準偏差を表すプロットであり、パネルＣ及びＤは、それぞれＦＮＤのＸ−Ｙ分布及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７のラベル付き抗体のプロットであり、パネルＥ及びＦは、３つのタイプの補正後の抗体の可視化及び局在化の画像(Ｅ)及び３Ｄヒストグラム(Ｆ)である。
【図７Ｄ】パネルＡ及びＢは、ＦＮＤ（パネルＡ）及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７のラベル付き抗体（Ａ６４７）（パネルＢ）についての平均値の期待標準誤差の関数として観測標準偏差を表すプロットであり、パネルＣ及びＤは、それぞれＦＮＤのＸ−Ｙ分布及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７のラベル付き抗体のプロットであり、パネルＥ及びＦは、３つのタイプの補正後の抗体の可視化及び局在化の画像(Ｅ)及び３Ｄヒストグラム(Ｆ)である。
【図７Ｅ】パネルＡ及びＢは、ＦＮＤ（パネルＡ）及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７のラベル付き抗体（Ａ６４７）（パネルＢ）についての平均値の期待標準誤差の関数として観測標準偏差を表すプロットであり、パネルＣ及びＤは、それぞれＦＮＤのＸ−Ｙ分布及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７のラベル付き抗体のプロットであり、パネルＥ及びＦは、３つのタイプの補正後の抗体の可視化及び局在化の画像(Ｅ)及び３Ｄヒストグラム(Ｆ)である。
【図７Ｆ】パネルＡ及びＢは、ＦＮＤ（パネルＡ）及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７のラベル付き抗体（Ａ６４７）（パネルＢ）についての平均値の期待標準誤差の関数として観測標準偏差を表すプロットであり、パネルＣ及びＤは、それぞれＦＮＤのＸ−Ｙ分布及びＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７のラベル付き抗体のプロットであり、パネルＥ及びＦは、３つのタイプの補正後の抗体の可視化及び局在化の画像(Ｅ)及び３Ｄヒストグラム(Ｆ)である。
【図８Ａ】それぞれの画像フレーム内の４つのＦＮＤ基準マーカを使用して、点補正方法の工程を示す概要図である。
【図８Ｂ】それぞれの画像フレーム内の４つのＦＮＤ基準マーカを使用して、点補正方法の工程を示す概要図である。
【図８Ｃ】それぞれの画像フレーム内の４つのＦＮＤ基準マーカを使用して、点補正方法の工程を示す概要図である。
【図８Ｄ】それぞれの画像フレーム内の４つのＦＮＤ基準マーカを使用して、点補正方法の工程を示す概要図である。
【図８Ｅ】それぞれの画像フレーム内の４つのＦＮＤ基準マーカを使用して、点補正方法の工程を示す概要図である。
【図９Ａ】単一発光源から複数の局在化の分布を特徴付けるプロット及び画像である。
【図９Ｂ】単一発光源から複数の局在化の分布を特徴付けるプロット及び画像である。
【図９Ｃ】単一発光源から複数の局在化の分布を特徴付けるプロット及び画像である。
【図９Ｄ】単一発光源から複数の局在化の分布を特徴付けるプロット及び画像である。
【図９Ｅ】単一発光源から複数の局在化の分布を特徴付けるプロット及び画像である。
【図９Ｆ】単一発光源から複数の局在化の分布を特徴付けるプロット及び画像である。
【図９Ｇ】単一発光源から複数の局在化の分布を特徴付けるプロット及び画像である。
【図１０】異なる倍率設定を使用する同一のＦＮＤの画像である。
【図１１】多重化抗体サイズ制限ｄＳＴＯＲＭ（ｍａｄＳＴＯＲＭ）を示す概要図であり、Ａｌｅｘａ−６４７複合化抗体が、固定細胞試料に結合され、抗体サイズ制限ｄＳＴＯＲＭを使用して撮像され（図１１Ａ）、それらは、ストリッピングバッファを使用して解放され、そしてそれらの蛍光は光脱色され（図１１Ｂ）、次いで、細胞試料が新たなＡｌｅｘａ−６４７複合化抗体によって結合され、撮像され、解放され、光脱色される（図１１Ｃ、Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）を含む基準マーカ組成物、及び基準マーカ組成物を作成及び使用する方法が開示される。
【００２８】
ＦＮＤは、明滅しないか又は脱色しない明るい蛍光プローブである。それに加えて、ＦＮＤは、広域の蛍光励起及び発光ピークを有し、そして、蛍光強度は、ＦＮＤのサイズ、弱い磁界の適用によってナノダイアモンド内又は原位置に生成される蛍光中心の数によって容易に制御され得る（特に、ＮＶ−又は負の窒素空孔中心の場合に対して）（サルカール，Ｓ．Ｋ．他  （２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ５（４）：１１９０−１２０２）。これらの特性は、ＦＮＤを蛍光顕微鏡法用の理想的な基準マーカにする。本発明者らは、ＦＮＤが、直接比較において蛍光顕微鏡法用の現行の基準マーカを上回り、そして、金ナノ粒子又は蛍光ビーズ等の現行の基準マーカを超えるいくつかの重要な利点を提供することを示した。
【００２９】
いくつかの実施形態では、基準マーカ組成物が、開示される。一実施形態では、基準マーカ組成物は、基板、及び基板の表面に固定された蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）を含む。様々な異なる固定技術が、使用されてもよい。固定技術に基づいて、トップコートが付加されてＦＮＤをより恒久的に固定してもよい。例えば、基板及び固定されたＦＮＤは、シリカ（ＳｉＯ２）等の不活性材料によって少なくとも部分的にトップコーティングされる。別の実施形態では、基準マーカ組成物は、基板と、基板の表面に固定された透明ポリマと、透明ポリマに埋め込まれた蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）と、を含み、任意選択的に不活性トップコーティング、を含む。別の実施形態では、基準マーカ組成物は、蛍光ナノダイアモンドと、非蛍光撮像方法用の造影剤とを含むマーカ錯体を含む。
【００３０】
ＦＮＤは、ポリマによって基板に固定されてもよい。ポリマは、荷電ポリマ又は透明ポリマであってもよい。荷電ポリマの例としては、例えばホモポリマポリ−Ｌ−リシン及びポリ−Ｌ−アルギニン等の天然起源又は合成両方のポリペプチド、が挙げられる。透明ポリマの例としては、ポリ（ジメチルシロキサン)（ＰＤＭＳ）等のシロキサン、ポリ(メチルアクリレート）及びポリ(メチルメタクリレート）等のポリ(メタ)アクリレート、ポリカーボネート、ポリホスホン酸エステル、ポリ(ビニルブチラール）、ポリエステル、並びにポリイミドが挙げられる。その代替として、ＦＮＤは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル等のゲルに分散されてもよい。ＦＮＤは、溶液内に懸濁されても、又は適当な濃度のポリマの溶融物であってもよく、次いで、懸濁液又は溶融物が、当該技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、ピペット操作又はスピンコーティングによって、基板に分散されてもよい。その代替として、基板がポリマによって最初にコーティングされてもよく、次いで、続けて懸濁液の形式のＦＮＤが、例えば、ポリマコーティングされた基板上に分散されてもよい。ポリマコーティングは、蛍光ナノダイアモンドを基板に分散させる前又はその後に、パターン化されてもよい。基板は、また、ポリマによって最初にパターン化されてもよく、次いで、続けてＦＮＤの懸濁液が、基板上のポリマパターン上に分散されてもよい。任意の従来のパターニング技術が使用されて、ポリマパターン、例えばフォトリソグラフィ又はソフトリソグラフィを生成してもよい。ＦＮＤは、また、ＦＮＤと反応する官能基によって、又は官能基化されたＦＮＤの官能基によって基板の表面を官能基化させること、及びＦＮＤの溶液又は官能基化されたＦＮＤを官能基化された表面に適用することによって、基板の表面に固定されてもよい。官能基化された基板面は、任意選択でパターン化されてもよい。ＦＮＤを表面に固定する方法のうちの任意のものにおいて、固定されないＦＮＤは、水又はバッファ等の好適な溶液によって表面を洗浄することによって除去されてもよい。
【００３１】
基板の表面官能基化のための当該技術分野で公知の任意の好適な方法が使用されてもよい。シリカ又はガラスの表面を共有結合で誘導体化することの１つの方法は、有機官能性トリ（Ｃ１−８アルコキシ）シラン又はトリクロロシラン、例えば、アミノ（Ｃ１−８アルキル）トリ（Ｃ１−８アルコキシ）シラン、アミノ（Ｃ１−８アルキル）トリクロロシラン、メルカプト（Ｃ１−８アルキル）トリ（Ｃ１−８アルコキシ）シラン、ヒドロキシ（Ｃ１−８アルキル）トリ（Ｃ１−８アルコキシ）シラン、ヒドロキシ（Ｃ１−８アルキル）トリクロロシラン、カルボキシ（Ｃ１−８アルキル）トリ（Ｃ１−８アルコキシ）シラン、エポキシ（Ｃ１−８アルキル）トリ（Ｃ１−８アルコキシ）シラン、Ｎ−（アミノＣ１−８アルキル）（アミノＣ１−８アルキル）トリ（Ｃ１−８アルコキシ）シラン、その他によるシラン化である。特定の例としては、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、（３−アミノプロピル）−ジメチルエトキシシラン（ＡＰＤＭＥＳ）、Ｎ−(２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＥＡＰＳ）、３−アルデヒドプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＭＳ）、メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）、及びメルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＴＥＳ）、並びにアミノトリエトキシシラン等のその他が挙げられる。特にシリカ表面の物理的特性（例えば、親水性）を修正するのに適した誘導体化剤の別の特定の例としては、２−[メトキシ(ポリエチレンオキシ)プロピル]トリメトキシシラン、２−[メトキシ(ポリエチレンオキシ−プロピレンオキシ)プロピル]トリメトキシシラン、オクタデシルトリクロロシラン等の（Ｃ１−３２アルキル）トリクロロシランが挙げられる。
【００３２】
誘導体化剤が官能基を含む場合、官能基は、更に誘導体化されてもよい。したがって、シリカ表面と別の分子との間の連結基として、官能基化されたトリアルコキシシラン又はトリクロロシラン、例えばモノマー又は親水性ポリマ（例えば、メチルセルロース、ポリ（ビニルアルコール）、デキストラン、デンプン、又はグルコース）等を使用することがまた可能である。トリアルコキシシラン又はトリクロロシランの官能基は、別の分子と反応するように選択され、そして、上記のもののうちの任意のもの、例えば、ビニル、アリル、エポキシ、アクリロイル、メタクリロイル、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシ、その他であってもよい。官能基化は、同時的又は段階的であってもよい。
【００３３】
シリカ表面の非共有結合官能基化は、約ｐＨ３．５を上回るシリカの負の性質に起因する静電相互作用に基づいてもよい。例えば、正荷電ポリマがシリカ表面に静電気的に吸着してもよい。
【００３４】
ＦＮＤの表面官能基化のための当該技術分野で公知の任意の好適な方法が使用されてもよい。ＦＮＤを官能基化させる１つの方法は、国際公開第２０１４０１４９７０号、又はＢｕｍｂ，Ａ．他の（２０１３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３５（２１）：７８１５−７８１８に記載されているようにシリカによってＦＮＤをカプセル化することである。官能基化されたシリカ前駆体が、官能基化されたシリカコーティングを取得するためのカプセル化処理に使用されてもよい。シリカコーティングされたＦＮＤは、また、交叉リンカーＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）ナトリウム又は誘導体化ＮＨＳ等の反応剤との、ＦＮＤ及びアルコキシシラン等のシランとの反応によって誘導体化されてもよい。（国際公開第２０１４０１４９７０号、Ｂｕｍｂら、２０１３）ＦＮＤは、酸処理によって酸化されて、ナノダイアモンド表面の上でアニオン性カルボキシレート基を生成する（チャン，Ｂ．Ｍ．他  （２０１３）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３（４６）：５７３７−５７４５）。酸化ＦＮＤは、アミノ基（エルマコワ  Ａ．他（２０１３）Ｎａｎｏｌｅｔｔｅｒｓ  １３：３３０５−３３０９）、又はポリリシン（フウ  Ｃ．−Ｃ．他（２００７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４（３）：７２７−７３２）を有するタンパク質等の正荷電基を有する様々な生体分子を吸着する。かかる酸化ＦＮＤは、アミノ基によって更に官能基化させられてもよい。例えば、酸化ＦＮＤの表面カルボキシレート基は、Ｎ−(３−ジメチルアミノプロピル)−Ｎ−エチル−カルボジイミドヒドロクロリド等の反応剤と反応させられてもよい(フウ他、２００７)。ＦＮＤは、また、ペグ化され、更に誘導体化された（チャン他、２０１３）。
【００３５】
代替として、基板に固定されるべき透明ポリマは、基板上でその形状に固定される前に、最初にシート又は別の形状に形成（例えば、鋳造）されてもよい。ＦＮＤは、透明ポリマの溶液中に混合されることにより、溶液をある形状に形成すると、ＦＮＤがその形状全体にわたってランダムな位置に置かれて、ＦＮＤが透明形状内部の異なる焦点面に存在することになる。代替として、表面にその形状を固定した後に、ＦＮＤは、分散されてその形状の表面に固定されてもよい。一実施形態では、透明ポリマは、シートに鋳造され、このシートは、次いでより小さい形状に分割（例えば、切断）される。固定された透明ポリマ形状の高さが変化する場合、透明ポリマ形状の表面に固定されたＦＮＤは、複数の焦点面にＦＮＤ基準マーカを有し、そのため、３次元撮像方法のより優れた補正を提供するために使用されてもよい。
【００３６】
基板上でのＦＮＤの密度は、１００μｍ２当たり約１０〜約５００ＦＮＤ、詳細には１００μｍ２当たり約１０〜約３００ＦＮＤ、より詳細には１００μｍ２当たり約１０〜約５０ＦＮＤ、１００μｍ２当たり約５０〜約１５０ＦＮＤ、又は１００μｍ２当たり約１５０〜約３００ＦＮＤである。
【００３７】
実施形態のうちの任意のものでは、少なくとも２つのＦＮＤが、ＦＮＤと基板表面との間の距離が２つのＦＮＤに対して同一ではないように、透明ポリマ内に固定されるか、又は基板表面に固定される。
【００３８】
不活性トップコーティングは、シリカ、アルミナ等の不活性材料、又はアルコーン等のハイブリッド有機無機材料であってもよい。トップコーティングは、当該技術分野で公知の任意の方法によって作成されてもよい。例えば、シリカ又はアルミナトップコーティングは、それぞれシリカ又はアルミナを有する組成物をスパッタコーティングすることによって作成されてもよい。組成物上の不活性トップコーティングは、任意のＦＮＤ動作の可能性を制限し、任意の試料から組成物を絶縁し、そして、組成物の再利用を可能にする。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、用語「ナノダイアモンド」は、ナノサイズのダイヤモンド粒子を指す。本明細書で使用されるような「ダイヤモンド」は、微粒子形状の「ダイヤモンド状炭素」（ＤＬＣ）だけでなく、天然及び様々な合成プロセスからの合成ダイヤモンドの両方を含む。ダイヤモンドは、少なくとも１つの寸法がナノサイズ、すなわち、約１マイクロメートル、約８００ｎｍ、約５００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約９０ｎｍ、約８０ｎｍ、約７０ｎｍ、約６０ｎｍ、約５０ｎｍ、約４０ｎｍ、約３０ｎｍ、約２０ｎｍ、又は約１０ｎｍよりも小さいならば、任意の形状、例えば、長方形、球状、円筒形、立方体、又は不規則のものであってもよい。特に、ナノダイアモンドの最大寸法は、撮像条件でのアッベ回折限界によって規定される顕微鏡の回折限界スポットサイズ未満でなければならない。
【００４０】
当該技術分野において公知のように、ナノメートル範囲にある粒子寸法の正確な決定は、困難である場合がある。一実施形態では、ナノダイアモンドの寸法は、それらの流体力学的径を使用して決定される。ナノダイアモンド又はナノダイアモンドの集合体の流体力学的径は、水溶液等の好適な溶媒系内で測定されてもよい。流体力学的径は、沈降、動的光散乱、又は当該技術分野で公知の別の方法によって測定されてもよい。一実施形態では、流体力学的径は、頻度別遠心沈降法によって決定される。頻度別遠心沈降法は、例えば、分離板形遠心沈降機内で実行されてもよい。一実施形態では、流体力学的径は、動的光散乱法によって決定されるＺ平均直径である。Ｚ平均直径は、測定された相関曲線の累積率分析から誘導される平均強度直径であり、この場合、単一の粒子サイズが仮定され、そして、単一の指数関数適合が自己相関関数に適用される。Ｚ平均直径は、例えば脱イオン水中に分散された試料を用いる動的光散乱法によって測定されてもよい。動的光散乱法によって粒子サイズ及び／又は多分散指数を決定するのに好適な器具の例は、マルヴァーンゼータサイザーナノである。
【００４１】
本明細書で用いられるとき、用語「蛍光ナノダイアモンド」（「ＦＮＤ」と略記される）は、適切な吸収（励起）スペクトルに暴露されるときに蛍光を示すナノダイアモンドを指す。蛍光ナノダイアモンドは、いくつかの供給源、例えば、Ａｄａｍａｓ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）、又はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能である。ＦＮＤのサイズは、約５ｎｍ〜約２００ｎｍであってもよい。
【００４２】
ナノダイアモンド粒子の蛍光は、ダイヤモンド格子の中に組み込まれた色中心に基づいている。この蛍光は、赤色蛍光を提供する窒素空孔（ＮＶ）中心（窒素原子はナノダイアモンド内で空孔の隣に位置する）、及び／又は緑色光を提供する窒素−空孔−窒素（Ｎ−Ｖ−Ｎ、又はＨ３）中心の存在によって生じさせられてもよい。ＮＶ中心の光学的特性は、大部分の自家蛍光細胞成分から離れた４９０〜５６０ｎｍからの光学励起、及び赤＼近赤外線（６３７〜８００ｎｍ）での発光によって、生体撮像応用にうまく適している。発光は、また、周囲組織でのより大きい光の貫入のために生物学的な標識化に対して魅力的な低い吸収のスペクトル窓に生じる。ＮＶ中心を含有するナノダイアモンドから放出される発光の強度は、粒子内のＮＶ中心の数に依存する。Ｎ−Ｖ−Ｎ中心は、青色光によって励起されると、最大約５３０ｎｍの緑色蛍光を放出する。ＮＶ及びＮ−Ｖ−Ｎ中心以外の多数の色中心が、既にナノダイアモンド内で製作され、特徴付けられている。ＦＮＤ内に製作された別の色中心の例としては、クロム（Ｃｒ）中心、シリコン空孔（Ｓｉ−Ｖ）中心、及び、７９７ｎｍで放出するＮｉｃｋｅｌ（Ｎｉ）−窒素錯体が挙げられる（アハラノビッチ，Ｉ．他  Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｂ８１，１２１２０１，１５  Ｍａｒｃｈ  ２０１０；ウラソフ  Ｉ．Ｉ．他．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ  ２００９，２１，８０８−８１２；ラボー  Ｊ．Ｒ．他  Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．（２００５）８６，１３１９２６）。任意の好適な色中心によって生成されるナノダイアモンドは、本明細書で開示された組成物及び方法に使用されてもよい。したがって、開示された組成物及び方法では、ＦＮＤは、少なくとも２つの色中心を有する多色ＦＮＤであってもよい。例えば、多色ＦＮＤは、ＮＶ及びＮ−Ｖ−Ｎ中心の両方を含んでもよく、又は多色ＦＮＤは、Ｎ−Ｖ−Ｎ及びＳｉ−Ｖ中心を含んでもよい。ダイヤモンド内部の色中心の１つの有利な特徴は、それらが、それらの前例のない光安定性のために、それらを従来の発色団よりも優れたものにする持続的な高エネルギ励起条件の下でさえ、光脱色又は明滅しないことである。色中心がダイヤモンドマトリックス内部に組み込まれているので、それらの蛍光特性は、表面修飾又は環境条件、例えば溶剤、ｐＨ、及び温度によって影響を受けない。
【００４３】
「基板」は、剛性又は半剛性の１つ又は複数の表面を有する１つの材料又は材料のグループを指す。かかる材料の例としては、ポリマ（例えば、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリエチレンテレフタラート、ポリ(メセドリン)アクリレート）、ガラス、及びシリコンウェハ、具体的にはガラス、より具体的には石英が挙げられる。いくつかの態様では、基板の少なくとも１つの表面は、実質的に平坦であるけれども、いくつかの態様では、例えば、孔、隆起領域、ピン、刻み込まれた溝等を有することが望ましい場合がある。特定の態様では、基板は、ビーズ（例えば、ラテックスビーズ）、ゲル、小球体、又は別の幾何学的外形の形状を呈してもよい。
【００４４】
別の態様では、基準マーカ組成物を作成する方法が開示される。
【００４５】
一実施形態では、方法は、基板の表面に蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）を固定することと、ＳｉＯ2等の不活性トップコーティングによって固定されたＦＮＤ及び表面をコーティングすることと、を含む。固定されたＦＮＤ及び基板表面は、任意の好適な方法、例えば基板表面をスパッタ被覆することによって被覆されてもよい。不活性トップコーティングは、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、具体的には約１００ｎｍ〜約２００ｎｍ、より具体的には約１５０ｎｍの厚さを有する。
【００４６】
ＦＮＤは、任意の既知の方法、例えば、本明細書で開示された方法のうちの任意のものによって、基板表面に固定されてもよい。ＦＮＤは、ポリマの水性溶液内のＦＮＤの混合物を基板の表面に適用することによって固定されてもよい。ＦＮＤは、また、ポリマを用いて表面をコーティングすること、及びポリマコーティング上にＦＮＤを分散させることによって固定されてもよい。任意選択により、ポリマコーティングは、ＦＮＤがコーティング上に分散される前又はその後に、パターン化されてもよい。ポリマは、例えば、ポリ−Ｌ−リジン又はポリ−Ｌ−アルギニンのようなポリペプチド等の透明ポリマ又は荷電ポリマであってもよい。好適な荷電ポリマ及び透明ポリマの例が、上記で開示されている。ＦＮＤは、また、基板表面に透明ポリマを含むプレキャスト物体を固定することによって基板に固定されてもよく、この場合、ＦＮＤは、その物体の内部、又はその物体の表面に含まれる。ＦＮＤは、また、基板の表面をＦＮＤと反応するか、又はＦＮＤを官能基化させる官能基を用いて官能基化させることと、官能基化された表面にＦＮＤの溶液又は官能基化されたＦＮＤを適用することと、によって固定されてもよい。実施形態のうちの任意のものでは、固定されていないＦＮＤは、例えば水又はバッファ等の好適な溶液によって基板表面を洗浄することによって除去されてもよい。
【００４７】
別の態様では、撮像方法が開示される。
【００４８】
一実施形態では、方法は、試料を本明細書で開示された基準マーカ組成物と接触させることと、試料内のターゲット及びＦＮＤについての複数の蛍光画像を取得することと、ＦＮＤの蛍光の位置を用いてそれぞれの画像を登録することによって、ドリフト及びアラインメントのために複数の画像のそれぞれの画像のターゲット位置を補正することと、を含む。
【００４９】
撮像方法は、蛍光撮像と異なる少なくとも１つの追加の撮像技術が使用されるようなマルチモード撮像方法であってもよい。追加の撮像方法は、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層（ＣＴ）撮像、Ｘ線撮像、又は電子顕微鏡法であってもよい。かかるマルチモード撮像方法のいくつかの実施形態では、ＦＮＤは、リポソーム内にカプセル化され、そして、リポソームは、追加の撮像技術用の造影剤又はイメージング剤を更にカプセル化する。かかるマルチモード撮影方法のいくつかの実施形態では、ＦＮＤは、追加の撮像技術用の造影剤又はイメージング剤に結合される。造影剤又はイメージング剤の例としては、オスミウム含有成分、ガドリニウム含有成分、ジスプロシウム含有成分、又は高電子密度（Ｚ）材料が挙げられる。オスミウム含有成分の例は、四酸化オスミウムである。ガドリニウム含有成分の例としては、ガドリニウム−ジエチレントリアミンペンタ酢酸ジメグルミン（[ＮＭＧ]２Ｇｄ−ＤＴＰＡ]）、オムニスキャン（商標）（Ｇｄジエチレントリアミンペンタ酢酸ビス(メチルアミド））、プロハンス（商標）（Ｇｄ(１０−(２’−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリ酢酸））、及び国際公開第１９９６０１０３５９号に開示されるその他のもの、並びにガドリニウムのポリアミノポリカルボン酸錯体等のガドリニウムキレートが挙げられる。ジスプロシウム含有成分の例としては、ジスプロシウム（Ｄｙ）−ジエチレントリアミンペンタ酢酸ビス（メチルアミド）等のＤｙキレート、及び国際公開第１９９６０１０３５９号に開示されたその他のものが挙げられる。高Ｚ材料の例としては、金、ウラニウム、又はタングステンが挙げられる。
【００５０】
試料を開示された基準マーカ組成物と接触させることは、様々な方法によって実行されてもよい。試料を基準マーカ組成物と接触させる方法としては、試料を基準マーカ組成物上に、又は試料上に基準マーカ組成物をピペッティングするか又は埋め込むこと、基準マーカ組成物を試料の中に注入すること、又は、基準マーカ組成物を生体に与えることが挙げられる。蛍光ナノダイアモンドは、ＦＮＤ表面上の官能基又はリガンドを介して試料に連結してもよい。
【００５１】
「試料」は、撮像されるべきターゲットを含有する標本を指す。試料は、溶液、懸濁液、細胞、組織、器官、細胞膜、細胞器官、又は生体であってもよい。
【００５２】
用語「ターゲット」は、撮像されるべき関心の分子又は分子錯体を指す。ターゲットは、自然由来又は人工の分子であってもよい。また、それらは、それらの元来の状態で、又は他の種との集合体として利用されてもよい。ターゲットの例としては、生体分子錯体（例えば、Ｔ細胞受容体マイクロクラスタ）、タンパク質（例えば、細胞膜受容体又は抗体）、医薬品、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、共同因子、レクチン、糖、多糖、細胞、細胞膜、及び細胞器官が挙げられる。
【００５３】
一実施形態では、超解像撮像補正方法は、それぞれの画像でのそれぞれのＦＮＤの点像分布関数のガウシアンフィッティングによって、複数のｎ個の画像のそれぞれの画像内のｍ個の蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）のそれぞれの位置座標を決定することであって、ｍ≧４かつｎ＞１である、ことと、全画像内で第１のＦＮＤ（ＦＮＤ１）の座標を整列させるために、それぞれの画像を変位させることと、ＦＮＤ１以外のそれぞれのＦＮＤについて、ｎ個の変位させられた画像の全てにわたってＦＮＤの位置の分布の中心を計算することと、ＦＮＤ１以外の全てのＦＮＤの位置の分散が全ての画像にわたって最小化されるようにそれぞれの画像を変位させることと、を含む。一実施形態では、ＦＮＤ１は、最大強度を有するＦＮＤであるように選択される。
【００５４】
補正されるべき撮像方法は、ＦＮＤが基準マーカとして適切に使用されるような任意の撮影方法であってもよい。かかる撮像方法の例としては、蛍光顕微鏡法、電子顕微鏡法、ＭＲＩ、ＣＴ、及びＸ線撮像が挙げられ、具体的には、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）を含む単一分子局在性顕微鏡法（ＳＭＬＭ）等の任意の超解像顕微鏡法、確率的光学再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）、及び直接ＳＴＯＲＭ（ｄＳＴＯＲＭ）が挙げられる。撮像方法は、２次元（２Ｄ）又は３次元（３Ｄ）の撮像方法であってもよい。更に、撮像方法は、マルチモードであってもよい。
【００５５】
特定の撮像方法によって取得された画像中の物体の位置又は位置座標を決定する方法が、当該技術分野において周知であり、そして、任意の好適な方法が使用されてもよい。画像中での位置を決定するためのソフトウェアが、商業的に及び様々なフリーのインターネットソースからの両方で利用可能である。例えば、Ｉｍａｇｅ−Ｊ又はＦＩＪＩのためのいくつかのフリープラグイン、例えば、Ｍｏｓａｉｃ、Ｔｒａｃｋ  Ｍａｔｅ、ｍｕｌｔｉ  ｔｒａｃｋｅｒ、及びＴｈｕｎｄｅｒｓｔｏｒｍ等がある。それに加えて、位置決定は、Ｎｉｋｏｎからのプロプライエタリソフトウェア（例えば、ＮＩＳ-Ａ  Ｎ−ＳＴＯＲＭ）において、又はＭａｔＬａｂ若しくはＬａｂＶｉｅｗ環境において実行されてもよい。例えば、最近のトラッキングソフトウェアについて解説のための（Ｃｈｅｎｏｕａｒｄ，Ｎ．ら  （２０１４）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  １１（３）：２８１−２８９）を参照されたい。蛍光強度分布、重心決定、及び極大フィッティングについての２次元ガウシアンフィッティングを含むいくつかのアルゴリズムが、位置決定ために使用されてもよい。
【００５６】
変位は、平行移動、回転、又は拡張／収縮のうちの少なくとも１つであってもよい。
【００５７】
ＦＮＤ１以外の全てのＦＮＤの位置の分散が最小化されるようにそれぞれの画像を変位させることが、任意の好適な方法によって実行されてもよい。一実施形態では、ＦＮＤ１以外の全てのＦＮＤの位置の分散が最小化されるようにそれぞれの画像を変位させることは、ＦＮＤ１以外の全てのＦＮＤについてｎ個の変位させられた画像の全てにわたってＦＮＤの位置の分布の中心の平均を計算することと、それぞれの画像内のＦＮＤ１以外の全てのＦＮＤの平均位置を計算することと、ＦＮＤ１以外の全てのＦＮＤについてｎ個の変位させられた画像の全てにわたってＦＮＤの位置の分布の中心の平均と、所与の画像内のＦＮＤ１以外の全てのＦＮＤの平均位置との間の差を最小化するように所与の画像を変位させることと、を含む。代替の手法は、１つの参照画像内のｍ個の基準マーカの位置を決定することを含む。それぞれの後続の画像が、参照画像内の基準マーカの位置と変換された画像との間の差の二乗和を最小化するように変換される。差は、それぞれの基準マーカの輝度によって重み付けられることにより、変換プロセスの頑健性を増加させてもよい。変換は、単純な剛体平行移動、剛体平行移動と回転との組合せ、剛体平行移動、回転、及び一様な拡張若しくは収縮の組合せ、又は、変換された画像の参照画像上への非線形マッピングであってもよい。以下の実施例は、本明細書で開示された基準マーカ組成物及び方法の単なる例示であって、これらの範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【００５８】
実施例１．蛍光撮像におけるＦＮＤと金粒子との比較
蛍光ナノダイアモンド基準マーカスライドを、ポリリシンを用いてＦＮＤをガラススライド上にスピンコーティングすることによって生成した。
【００５９】
ＦＮＤ基準マーカを市販のナノ金粒子基準マーカスライドと比較した。
【００６０】
全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）共焦点画像をＮＩＫＯＮ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ倒立顕微鏡を使用して取得した。蛍光団ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）、及び金基準マーカを、６４７ｎｍの音響光学可同調フィルタ（ＡＯＴＦ）−変調ＮＩＫＯＮ  ＬＵ−ＮＢ固体レーザ（１２５ｍＷ）によって励起させた。
発光を、ＮＩＫＯＮ  １００ｘＳＲ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ＴＩＲＦ対物レンズ（１．４９ＮＡ）によって収集し、Ａｎｄｏｒ  ｉＸｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ８９７  ＥＭＣＣＤカメラ（５１２ｘ５１２、１６μｍスクエアピクセル）で撮影した。ＴＩＲＦ共焦点画像の直接確率的光学再構成顕微鏡法（ｄＳＴＯＲＭ）局在化を、Ｉｍａｇｅ  Ｊ．のＴｈｕｎｄｅｒｓｔｏｒｍプラグイン（１．２版）を使用して実行した。ＦＮＤからの蛍光に基づくｄＳＴＯＲＭ局在化データの点補正を、ＭＡＴＬＡＢで記述されたカスタマイズされたコードを使用して実行した。特に明記しない限り、画像を、２００ｍｓの積分時間によって取得した。
【００６１】
図１は、時間経過とともにそれぞれのタイプの基準マーカから測定された強度を表す。
ＦＮＤマーカは、ナノ金マーカよりも良好な時間安定性を示す。
【００６２】
図２は、それぞれ、ナノ金及びナノダイアモンドマーカの画像、及びそれぞれについての位置誤差の期待及び観測標準偏差（シグマ）についての値を表す。ＦＮＤ基準マーカについての位置誤差は、ナノ金基準マーカのものの半分よりも小さい観測標準偏差を有する。
【００６３】
図３は、それぞれ、Ｘ軸及びＹ軸に沿ったナノ金又はナノダイアモンド基準マーカの方位分解能の観測標準偏差を比較するヒストグラムを示す。観測標準偏差は、ナノ金基準マーカについてのものよりも、ＦＮＤ基準マーカについてのものの方がそれぞれの方向においてより小さい。
【００６４】
したがって、ＦＮＤ基準マーカは、ナノ金基準マーカと比較して、より高い精度の位置追跡及びより良好な安定性をもたらす。
【００６５】
実施例２．透過電子顕微鏡法でのＦＮＤ基準マーカ
ＦＮＤ基準マーカを、透過電子顕微鏡法（ＥＭ）を介した撮影でのそれらの効用について試験した。
【００６６】
約５ｍｍの粒径を有するＦＮＤを分散させ、着色なしで透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を介して撮像した。図５は、かかるＦＮＤ試料の電子顕微鏡写真を表し、〜５ｎｍのＦＮＤが着色なしでＴＥＭにおいて良好なコントラストを提供することを表している。
【００６７】
実施例３．多重化ｄＳＴＯＲＭ
この実施例では、ｄＳＴＯＲＭを使用して蛍光プローブの無制限多重化を潜在的に可能にする新規な撮像技術と結合された、ドリフト補正及びアラインメントに対して資料を登録するための蛍光ナノダアヤモンドの（ＦＮＤ）基準マーカを使用する新たなアルゴリズムを説明する。ＦＮＤベースのドリフト補正及び多重化ｄＳＴＯＲＭを使用して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）マイクロクラスタの分子構成要素のナノスケール微細構成、及びＴ細胞の活性化表層膜近傍の別の細胞組織を探索する。
【００６８】
光学顕微鏡の分解限界は、超解像顕微鏡法として集合的に知られている技術によって凌駕された。しかし、光学顕微鏡に対するスペクトル限界が存在する。多色撮像は、異なる蛍光プローブについての非重複波長プロファイルの限界利用可能性のために６色に制限される。著者らは、直接確率的光学再構成顕微鏡法（ｄＳＴＯＲＭ）を使用して、可能性として無制限の多重化超解像撮影を可能にするための新規な技術を開発した。それに加えて、著者らは、蛍光ナノダイアモンド基準マーカを使用して、ドリフト補正及びアラインメントのための試料を登録するより正確な方法を開発し、従来の研究の２倍以上の精度の改善を達成した。このｄＳＴＯＲＭ技術を使用して、著者らは、２．５ｎｍの平均局在化精度及び３．５ｎｍのアラインメント精度を伴って、同一の細胞内の２０の異なる分子を視覚化することに成功した。同時に、ＴＣＲシグナル伝達カスケード及び別の分子ネットワークに関係する分子の空間分布を探査することが、多重化ｄＳＴＯＲＭに用いて間もなく可能になるであろう。
【００６９】
ＴＣＲの関わりが、Ｔ細胞活性化中の基本的なシグナル伝達ユニットとして機能するＴＣＲマイクロクラスタの形成に繋がる（バネル，Ｓ．Ｃ．他  （２００２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５８（７）：１２６３−１２７５；カンピ，Ｇ．他  （２００５）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０２（８）：１０３１−１０３６）。更に、活性化Ｔ細胞表面におけるこれらのマイクロクラスタの差動運搬及び蓄積が、免疫シナプスと呼ばれる構造に繋がる。ＴＣＲマイクロクラスタは、従来の光学顕微鏡を使用して広範囲に研究されてきたけれども、それらのナノ構造及びＴＣＲシグナル伝達分子の相対分布が、光学顕微鏡の回折及びスペクトル限界に起因してうまく特徴付けられていない。
【００７０】
著者らは、ＰＡＬＭを使用して、ＴＣＲマイクロクラスタの分子構成要素が局在化の異なるパターンを示すことを明かにした（シャーマン，Ｅ．他  （２０１１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３５（５）：７０５−７２０）。しかし、ＰＡＬＭを使用してＴＣＲマイクロクラスタ構成要素の相対分布を撮影することは、２色だけで撮影する能力によって妨げられてきた。更に、著者らその他は、蛍光タグ付き分子の人為的クラスタ形成、具体的には、それらが蛍光タンパク質ＰＡ−ｍＣｈｅｒｒｙによってタグ付けされるのを観察したため、免疫シナプスを視覚化する際の新たな撮像モダリティを追及することになった（ワン，Ｓ．Ｙ．他、（２０１４）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１１（２３）：８４５２−８４５７）。
【００７１】
点補正
ｄＳＴＯＲＭ取得中のステージ移動を補償するために、現行の補正方法は、視野全体から局在化ピークをサンプリングすること（「交差相関」）、又は既知の基準マーカからの局在化位置の回帰ベースのスムージング（「基準補正」）のいずれかによってステージドリフトの軌跡を推定する。これらの方法は、それぞれの画像についてサンプリング／回帰パラメータの最適化を必要とし、それで、以下に示すように、全てのステージ移動を十分に修正するわけではない。ステージ移動残像取得を補正するよりはむしろ、２、３の研究は、ハードウェアベースの方策を利用して、実時間において能動的にステージを安定化させた。しかし、それらは、複雑なハードウェア及びソフトウェア修正を必要とし、それらを実装することを困難にした。
【００７２】
著者らは、基準マーカとしてＦＮＤを使用して「点補正」と呼ばれる新たな補正方法を開発した。ＦＮＤは、小さく（＜１００ｎｍ）、明るく、光安定性があり、そして、蛍光の広域スペクトル範囲を示すので、理想的なＳＭＬＭ基準マーカである。点補正は、５ステッププロセスであり、全ての画像フレーム内に＞４のＦＮＤ基準マーカが存在することを必要とする。最初に、ガウシアンピークが、全てのＦＮＤに対して局在化され、最も明るいＦＮＤが、ＦＮＤ１として指定され、そして、ＦＮＤ１の全ての局在化のＸ、Ｙ位置が、第１のフレーム内でそれ自体の位置まで動かされる（ステップ１；図８Ａ）。次に、ステップ１からの変位が、全ての他のＦＮＤに適用される（ステップ２；図８Ｂ）。第３に、局在化分布の中心が、ＦＮＤ１以外の全てのＦＮＤに対して規定され、それらの局在化と分布の中心との間の最小距離がそれぞれのフレームに対する単一変位として計算される（ステップ３；図８Ｃ）。この変位は、次いで、ＦＮＤ１に適用される（ステップ４；図８Ｄ）。最後に、ステップ１及び３からの変位が画像スタック全体に適用されてステージ移動を修正する（ステップ５；図８Ｅ）。
【００７３】
ポリ−Ｌ−リシンコーティングされたカバーグラスに埋め込まれたＦＮＤを使用して、著者らは、取得されたＳＭＬＭ画像内のステージ移動を補正するために交差相関、基準補正、及び点補正の性能を試験した。交差相関及び基準補正は大きいステージドリフトを補償することができる可能性があるけれども、それらは、小さいステージ振動を修正することができず、振動方向の局在化の細長い非対称分布をもたらすことがある。（ｎ＝３０，０００フレーム；図６、パネルＡ〜Ｂ及びＨ）。逆に、点補正によって補正された同一のＦＮＤは、局在化の対称分布を一貫して生じさせた（図６Ｃ及び６Ｈ）。また、点補正による局在化分布の範囲は、別の補正方法と比較するとより小さく、それは、視覚的に３Ｄヒストグラムプロット（図６Ｄ〜Ｆ）から、そして、それらの標準偏差（ＳＤ）（６．０ｎｍ、１１．３ｎｍ[Ｘ、Ｙ軸]、交差相関；４．８ｎｍ、１０．８７ｎｍ、基準補正；３．８ｎｍ、３．９ｎｍ、点補正）によって明らかである。点補正後の複数の局在化についてのＳＤは、それぞれの局在化に対して計算された平均値の平均標準誤差（ＳＥＭ；σによって表される）とよく一致し（３．８、３．９ｎｍのＳＤを４．０ｎｍのＳＥＭと比較、図６Ｃ、Ｆ）、全てのステージ移動が補正されたことを示した。実際、繰返し実験が、ＦＮＤ局在化の観測ＳＤが予測ＳＥＭよりもより正確であることを表し、それは、点補正の適用後の低い（ＳＤ／ＳＥＭによって計算される）不確実性比（０．７１＋０．０７、ＰＣ；ｎ＝２６  ＦＮＤ；図６Ｇ）によって明らかであり、一方、交差相関及び基準補正は、期待の１／２〜１／３のより低い精度を生じさせた（３．２３＋２．１４、ＣＣ；２．２０＋２．０７、ＦＤ；ｎ＝２６  ＦＮＤ；図６Ｇ）。
【００７４】
複数の局在化の分布
次に、著者らは、単一発光源からの複数の局在化の分布を特徴付けることを追求した。従来の研究は、かかる分布は、画像取得中の蛍光強度のランダム変動に起因して局在化精度の確率的変動を反映することを示唆した。このことを試験するために、著者らは、点補正適用されたＦＮＤからの局在化分布を、不確実性値の確率的変動（変動；ｎ＝９９７  局在化；図９Ａ；平均σ＝４．０ｎｍ）又は４±０．０１ｎｍの精度値に制限された確率的変動（制限；ｎ＝９９７  局在化；図９Ｃ）によって分析した。著者らは、それらのそれぞれのＳＤ値（３．３ｎｍ、３．５ｎｍ、変動、対、３．３ｎｍ、３．４ｎｍ、制限[Ｘ、Ｙ軸]）又はそれらの分布の正味の範囲（２２．７ｎｍ、変動  対２４．３ｎｍ  制限；図９Ｂ、Ｄ）にほとんど差を観察せず、精度の変動が、局在化分布の主成分でないことを示した。
【００７５】
単一局在化についての精度値がそれ自体の予測ＳＥＭの測定値であるので、著者らは、同一発光源からの複数の局在化の分布が正規分布に従うか否かについて質した。実際、ＦＮＤからの局在化の分布は、分布のうちの７１．２％が１σ内にあり、９６．１％が２σ内にあり、９９．７％が３σ内にあるとき（図９Ｅ、Ｆ）、及びガウス分布フィッティングがアンダーソン−ダーリング試験（ｈ＝０；図９Ｇ）によって確認されたとき、ガウス分布によく適合する。これに基づいて、単一局在化に対する期待ＳＥＭ値が、複数の局在化の観測ＳＤと相関するか否かについて試験した。これを行うために、蛍光強度を変えるＦＮＤを、点補正を使用して局在化し、補正し、そして、それぞれの局在化された位置を、それ自体の期待精度値に基づいて捨てた。図７Ａに表すように、局在化の観測ＳＤは、それらの期待ＳＥＭと強く相関した（Ｒ2＝０．９７）。この相関は、また、分離Ａｌｅｘａ−６４７−複合化抗体（Ｒ2＝０．９４、図７Ｂ）によって観測された。それに加えて、分離Ａｌｅｘａ−６４７−標識抗体からの複数の局在化は、ＦＮＤに類似したガウス分布をもたらし、その平均値付近の局在化の正規分布は、ＳＭＬＭの一般関数である（図７Ｃ、Ｄ）。
【００７６】
複数の局在化の分布の中心が、発光体の最適の近似位置を表すので、そして、それぞれの局在化についての分布平均からの確からしい距離がＳＥＭ（σ）によって計算されるので、用語「局在化精度」と「局在化正確さ」とを区別するために、本発明者らは統計上の定義を提案する。「局在化精度」は、トンプソンの式によって計算されるようなそれぞれの個々のピーク（σ）を局在化する精度として規定され、そして、「局在化正確さ」は、それぞれの局在化についての分布平均からの確からしい距離として規定されることになる。このように、９５．５％信頼度で「局在化正確さ」を取得するために、「局在化精度」は、単一局在化に対して４（２*２σ）を掛けられる必要がある（例えば、蛍光分子は９５．５％の確からしさで１０ｎｍ精度の単一の局在化ピークの付近の幅４０ｎｍの領域に位置決めされることができる）。同一の発光体からの複数の局在化から誘導されるとき、「局在化精度」は有意により良好であり得るけれども（討論を参照）、本論文の範囲について、「局在化精度」は、σとして、及び「局在化正確さ」は ４σとして規定されることになる。
【００７７】
抗体サイズ限界精度
単一分子の正確な局在化は、長い間、ＳＭＬＭの目標であった。様々な統計的アプローチが、ＳＭＬＭ画像を分析するために使用されてきたけれども、それらは、個々の分子構造についての洞察をほとんど伴わずに、個体群の平均推定値に限定されてきた。いくつかのＳＭＬＭ研究が相関ＥＭ又はアラインメント平均算出を使用して分子レベル分析を達成したけれども、それらは、既知の分子パターンを有する構造に限定されてきた（ソカキ，シュテンゲルら  ２０１４）。単一分子撮像及び分析のための適切なフレームワークが欠如することを考えると、Ｔ細胞マイクロクラスタ等の不均一構造のナノスケール組織を解読することは、挑戦的であった。
【００７８】
ステージ移動補正に加えて、単一分子の正確な局在化についての主要な障害は、不十分な局在化精度であった。単一分子レベル精度に必要な最小限の精度を見つけるために、ステージ移動補正についての３つの方法を使用して、増加した精度レベルでＦＮＤを局在化して補正した。ＦＮＤ局在化のもたらされた分布を３ｘ３ｎグリッドの縮尺に合わせて引かれた９個の抗体（１２ｎｍ間隔の１２ｎｍサイズの抗体）によって覆うことにより、ｄＳＴＯＲＭ撮像中に高密度にラベルが付けられた試料をシミュレーションした。
【００７９】
５．４ｎｍの平均精度において、局在化分布の範囲（＞２０ｎｍ）が、抗体サイズよりも大きかったので（最上段、図７Ｅ、Ｆ）、補正方法のどれもが、抗体の離散した可視化を可能にしなかった。３．３ｎｍにおいて、局在化の９５．５％が抗体のサイズ内（２．５ｎｍ、２．５ｎｍ、[Ｘ、Ｙ]ＳＤ、点補正、中段、図７Ｅ、Ｆ）に分布させられたので、点補正適用ＦＮＤ局在化は、抗体位置の離散した可視化を表し始めた。１．０ｎｍにおいて、基準及び点補正適用局在化の両方は、抗体の離散した可視化を表したが、交差相関適用局在化はそうではなかった（最下段、図７Ｅ）。更に、著者らは、点補正適用局在化の分布でのサブナノメートルのＳＤを測定した結果（０．５ｎｍ、０．５ｎｍ、[Ｘ、Ｙ]ＳＤ；最下段、図７Ｅ、Ｆ）、フィードバックループベースのステージドリフト除去によって達成された精度のレベルと一致した。これらの結果は、２つの事項を表す。第１に、交差相関は、抗体位置同士の間で区別するのに十分な局在化正確さを達成しないが、基準補正は、非常に高い精度レベルにおいてのみ達成する。第２に、抗体サイズ限界正確さによってｄＳＴＯＲＭ撮像を実行するために、局在化分布の範囲（すなわち、局在化正確さ）は、抗体サイズよりも小さくある必要がある。したがって、著者らは、ステージ移動補正ために点補正を使用することを選び、ｄＳＴＯＲＭ局在化ピークに対する最小限の精度レベルとしての３ｎｍを選んだ。
【００８０】
抗体サイズ限定正確さを達成するために、著者らは、ｄＳＴＯＲＭ撮像中にＡｌｅｘａ-６４７ラベル付き抗体の局在化精度を最適化することを追求した。トムソンの式に従うと、より小さいシグマ（すなわち、画素サイズ）、より小さい背景ノイズ、又はより高い光子発光が、より高い精度に繋がる場合がある（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌａｒｓｏｎ他  ２００２）。異なる倍率設定を使用する同一のＦＮＤの局在化が、１．５ｘの倍率の付加がシグマ値を減少させ、そして精度を０．５ｎｍだけ増加させることを示した（図１０）。
【００８１】
多重化ｄＳＴＯＲＭ
既知の分子パターンを有する細胞構造（例えば、微小管、クラスリン被覆ピット、核孔複合体）が、超解像顕微鏡法技術を使用してうまく特徴付けられたけれども、Ｔ細胞マイクロクラスタ等の不均一複合体は、局在化正確さ及び多重化における限界のために研究が困難であった。特に、後者は、高性能のＳＭＬＭ蛍光リポーターが無いこと及び蛍光リポーター同士の間の色収差及びスペクトル重複によって妨げられた。これらの問題を克服するために、著者らは、多重化抗体サイズ限界ｄＳＴＯＲＭ（ｍａｄＳＴＯＲＭ）と呼ばれる新たな技術を開発した。
【００８２】
ｍａｄＳＴＯＲＭ撮像の調整において、全ての抗体は、Ａｌｅｘａ−６４７に直接接合される必要がある。一旦Ａｌｅｘａ−６４７接合抗体が固定細胞試料に結合され、そして抗体サイズ限界ｄＳＴＯＲＭを使用して撮像されると（図１１Ａ）、それらは、ストリッピングバッファを使用して解放される（図１１Ｂ）。結合したままである任意の抗体について、それらの蛍光は、脱酸素溶液を欠いた状態での６４７レーザへの暴露によって光脱色される（図１１Ｂ）。細胞試料が、Ａｌｅｘａ−６４７−複合化抗体の新たなセットによって結合され、撮像され、解放され、そして、光脱色される（図１１Ｃ、Ｄ）。これらのステップが無期限に循環することにより、抗体サイズ限界正確さを伴う潜在的に無制限の数の分子ターゲットについてのｄＳＴＯＲＭ撮像を可能にする。
【００８３】
免疫シナプスの多重化超解像視野
図４は、上記のように補正されたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内にタンパク質を形成する３つのＴ細胞受容体マイクロ錯体（ＬＡＴ、ＳＬＰ７６、及びｐＺｅｔａ）の連続撮像の顕微鏡写真を表す。
【００８４】
ＴＩＲＦ共焦点画像を、ＮＩＫＯＮ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ倒立顕微鏡、６４７ｎｍＡＯＴＦ変調ＬＵＮＢ固体レーザ（１２５ｍＷ）、１００ｘＳＲ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ＴＩＲＦ対物レンズ（１．４９ＮＡ）、Ａｎｄｏｒ  ｉＸｏｎ  Ｕｌｔｒａ８９７  ＥＭＣＣＤカメラ（５１２ｘ５１２、１６μｍ画素）を使用して取得した。ＴＩＲＦ共焦点画像のｄＳＴＯＲＭ局在化は、Ｉｍａｇｅ  ＪソフトウェアでのＴｈｕｎｄｅｒｓｔｏｒｍプラグイン（１．２版）を使用して実行した。ｄＳＴＯＲＭ局在化データについての点補正は、ＭＡＴＬＡＢソフトウェア（Ｒ２０１４ｂ）に記述されたカスタマイズされたコードを使用して実行した。
【００８５】
それぞれのタンパク質に対するＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ−６４７ラベル付き抗体を、順番に結合させ、撮像し、細胞から洗い落した。ＦＮＤを、同時に、それぞれのラベル付き抗体の撮像中及び撮像同士の間にドリフトを除去するために撮像した。それぞれの抗体は、２０００秒（〜３３分）の全撮像期間の間に２００ｍｓの暴露で１００００フレームについて撮像された。それぞれのラベル付き抗体についての洗浄及び抗体着色は、〜３０分の追加時間を必要とした。全体で、それぞれのタンパク質の撮像は、約７０分を必要とした。この多重化画像において、平均局在化精度は、３．６１ｎｍであり、平均アラインメント精度は、２．０７ｎｍであった。したがって、ドリフトは、〜３時間の撮像及び反復洗浄からの機械的摂動を経て〜２ｎｍに低減された。
【００８６】
後続の超解像実験において、抗体当たり１．５時間の全画像収集時間の間に、２００００フレームに対してフレーム当たり２００ｍｓのデータ収集を用いた。現在まで、２９の異なるタンパク質に対応する２９の独立した抗体の多重撮像を実行した。このことは、１０日間にわたる４３．５時間の撮像を含んだ。平均アライメント誤差は、１０日間にわたって取得されたこれらの２９のｄＳＴＯＲＭ画像の間では２．０ｎｍであり、これは、一般的により短い期間（＜１時間）に２〜３色によって行われる従来の多色ｄＳＴＯＲＭ画像（一般的に２０〜４０ｎｍのアライメント誤差）の１０倍を越える改善である。これらの結果は、ＦＮＤ基準マーカ、及びＦＮＤの光学特性（安定性及び寿命）に基づいて実装されることができる追跡処置無しでは得られることができなかったであろう。
【００８７】
本明細書において開示された組成物及び方法は、少なくとも以下の実施形態を含む。
【００８８】
実施形態１：基準マーカ組成物であって、基板と、基板の表面に固定された蛍光ナノダイアモンドと、を含み、基板及び固定された蛍光ナノダイアモンドは、少なくとも部分的に不活性トップコーティングによってトップコーティングされている、基準マーカ組成物。
【００８９】
実施形態２：蛍光ナノダイアモンドがポリマによって基板に固定されている、実施形態１に記載の基準マーカ組成物。
【００９０】
実施形態３：ポリマは、荷電ポリマ又は透明ポリマである、実施形態２に記載の基準マーカ組成物。
【００９１】
実施形態４：荷電ポリマは、ポリリシン又はポリアルギニンである、実施形態３に記載の基準マーカ組成物。
【００９２】
実施形態５：基板と、基板の表面に固定された透明ポリマと、透明ポリマ内に埋め込まれた蛍光ナノダイアモンドと、を含む基準マーカ組成物。
【００９３】
実施形態６：不活性トップコーティングを更に含む、実施形態５に記載の基準マーカ組成物。
【００９４】
実施形態７：基板は、ガラスである、実施形態１〜６のうちのいずれか１つに記載の基準マーカ組成物。
【００９５】
実施形態８：表面は、実質的に平坦である、実施形態１〜７のうちのいずれか１つに記載の基準マーカ組成物。
【００９６】
実施形態９：基板上の蛍光ナノダイアモンドの密度は、１００μｍ2当たり約１０〜約５００の間にある、実施形態１〜８のうちのいずれか１つに記載の基準マーカ組成物。
【００９７】
実施形態１０：蛍光ナノダイアモンドの平均最大サイズは、約５ｎｍ〜約１００ｎｍである、実施形態１〜９のうちのいずれか１つに記載の基準マーカ組成物。
【００９８】
実施形態１１：ポリマは、基板表面にパターン化されている、実施形態２〜１０のうちのいずれか１つに記載の基準マーカ組成物。
【００９９】
実施形態１２：少なくとも２つの蛍光ナノダイアモンドが、少なくとも２つの蛍光ナノダイアモンドと基板表面との間の距離が同一ではないようにポリマ内に固定されている、実施形態２〜１１のうちのいずれか１つに記載の基準マーカ組成物。
【０１００】
実施形態１３：蛍光ナノダイアモンドは、多色蛍光ナノダイアモンドである、実施形態１〜１２のうちのいずれか１つに記載の基準マーカ組成物。
【０１０１】
実施形態１４：基板の表面に蛍光ナノダイアモンドを固定すること、固定された蛍光ナノダイアモンド及び表面を不活性トップコーティングによってコーティングすることと、を含む基準マーカ組成物を作成する方法。
【０１０２】
実施形態１５：基板の表面に蛍光ナノダイアモンドを固定することは、蛍光ナノダイアモンドとポリマの水溶液とを含む組合せを基板の表面に適用することを含む、実施形態１４に記載の方法。
【０１０３】
実施形態１６：蛍光ナノダイアモンドを基板の表面に固定することは、表面をポリマ溶液でコーティングすることと、ポリマコーティング上に蛍光ナノダイアモンドを分散させることと、を含む、実施形態１４に記載の方法。
【０１０４】
実施形態１７：ポリマコーティングは、蛍光ナノダイアモンドを分散させる前又はその後にパターン化される、実施形態１６に記載の方法。
【０１０５】
実施形態１８：基板は、ガラスである、実施形態１４〜１７のうちのいずれか１つに記載の方法。
【０１０６】
実施形態１９：ポリマは、荷電ポリマ又は透明ポリマである、実施形態１５〜１８のうちのいずれか１つに記載の方法。
【０１０７】
実施形態２０：基板の表面に蛍光ナノダイアモンドを固定することは、蛍光ナノダイアモンドと反応する官能基、又は官能基化された蛍光ナノダイアモンドの官能基によって基板の表面を官能基化させることと、任意選択で、官能基化された表面をパターン化することと、蛍光ナノダイアモンド又は官能基化された蛍光ナノダイアモンドを含む溶液を官能基化された表面に適用することと、を含む、実施形態１４〜１９のうちのいずれか１つに記載の方法。
【０１０８】
実施形態２１：基板の表面に蛍光ナノダイアモンドを固定することは、基板表面に透明ポリマを含む予め形成された形状を固定することを含み、蛍光ナノダイアモンドは、物体内部、又は物体の表面に含有されている、実施形態１４に記載の方法。
【０１０９】
実施形態２２：ポリマは、透明ポリジメチルシロキサンである、実施形態２〜３及び５〜１２のうちのいずれか１つに記載の組成物、又は実施形態１５〜１９及び２１のうちのいずれか１つに記載の方法。
【０１１０】
実施形態２３：蛍光ナノダイアモンドを含むマーカ錯体と、非蛍光撮像方法ための造影剤と、を含む基準マーカ組成物。
【０１１１】
実施形態２４：非蛍光撮像方法は、磁気共鳴撮像、コンピュータ断層撮像、Ｘ線撮像、又は電子顕微鏡法である、実施形態２３に記載の基準マーカ組成物。
【０１１２】
実施形態２５：マーカ錯体は、リポソーム内にカプセル化された蛍光ナノダイアモンドを含み、リポソームは、造影剤を更にカプセル化する、実施形態２３又は２４に記載の基準マーカ組成物。
【０１１３】
実施形態２６：造影剤は、オスミウム含有成分である、実施形態２５に記載の基準マーカ組成物。
【０１１４】
実施形態２７：オスミウム含有成分は、四酸化オスミウムである、実施形態２６に記載の基準マーカ組成物。
【０１１５】
実施形態２８：マーカ錯体は、ガドリニウム含有成分、ジスプロシウム含有成分、又は高電子密度材料に結合された蛍光ナノダイアモンドを含む、実施形態２３に記載の基準マーカ組成物。
【０１１６】
実施形態２９：高電子密度材料は、金、ウラニウム、又はタングステンを含む、実施形態２８に記載の基準マーカ組成物。
【０１１７】
実施形態３０：蛍光ナノダイアモンドは、シリカ内にカプセル化されている、実施形態２３〜２９のうちのいずれか１つに記載の基準マーカ組成物。
【０１１８】
実施形態３１：試料を実施形態１〜１２又は２３〜３０のうちのいずれか１つに記載の基準マーカ組成物と接触させることと、試料内のターゲット及び蛍光ナノダイアモンドの複数の蛍光画像を取得することと、全ての画像内の蛍光ナノダイアモンドの位置を整列させることによって、それぞれの画像内のターゲット位置を補正することと、を含む撮像方法。
【０１１９】
実施形態３２：方法は、第２の撮像方法を含む、実施形態３１に記載の撮像方法。
【０１２０】
実施形態３３：第２の撮像方法は、磁気共鳴撮像、コンピュータ断層撮像、Ｘ線撮像、又は電子顕微鏡法である、実施形態３２に記載の撮像方法。
【０１２１】
実施形態３４：蛍光ナノダイアモンドは、リポソーム内にカプセル化されており、リポソームは、オスミウム含有成分を更にカプセル化する、実施形態３２に記載の撮像方法。
【０１２２】
実施形態３５：オスミウム含有成分は、四酸化オスミウムである、実施形態３４に記載の撮像方法。
【０１２３】
実施形態３６：蛍光ナノダイアモンドは、ガドリニウム含有成分、ジスプロシウム含有成分、又は高電子密度材料に結合されている、実施形態３２に記載の撮像方法。
【０１２４】
実施形態３７：高電子密度材料は、金、ウラニウム、又はタングステンを含む、実施形態３６に記載の撮像方法。
【０１２５】
実施形態３８：３次元撮像方法である、実施形態３１〜３７のうちのいずれか１つに記載の撮像方法。
【０１２６】
実施形態３９：蛍光ナノダイアモンドを含む基準マーカ組成物を試料と接触させることと、複数の蛍光画像を取得することであって、それぞれの画像は、試料内のターゲット及び蛍光ナノダイアモンドを含む、ことと、全ての画像内で蛍光ナノダイアモンドの位置を整列させることによってそれぞれの画像内のターゲット位置を補正することと、を含む、撮像方法。
【０１２７】
実施形態４０：蛍光ナノダイアモンド（ＦＮＤ）を試料と接触させることは、ＦＮＤ上の官能基を試料に連結することを含む、実施形態３９に記載の撮像方法。
【０１２８】
実施形態４１：方法は、第２の撮像方法を含む、実施形態３９又は４０に記載の撮像方法。
【０１２９】
実施形態４２：第２の撮像方法は、磁気共鳴撮像、コンピュータ断層撮像、Ｘ線撮像、又は電子顕微鏡法である、実施形態４１に記載の撮像方法。
【０１３０】
実施形態４３：蛍光ナノダイアモンドは、リポソーム内にカプセル化されており、リポソームは、オスミウム含有成分を更にカプセル化する、実施形態３９〜４２のうちのいずれか１つに記載の撮像方法。
【０１３１】
実施形態４４：オスミウム含有成分は、四酸化オスミウムである、実施形態４３に記載の撮像方法。
【０１３２】
実施形態４５：蛍光ナノダイアモンドは、ガドリニウム含有部分、ジスプロシウム含有部分、又は高電子密度材料に結合されている、実施形態３９〜４４のうちのいずれか１つに記載の撮像方法。
【０１３３】
実施形態４６：高電子密度材料は、金、ウラニウム、又はタングステンを含む、実施形態４５に記載の撮像方法。
【０１３４】
実施形態４７：３次元撮像方法である、実施形態３９〜４６のうちのいずれか１つに記載の撮像方法。
【０１３５】
実施形態４８：蛍光ナノダイアモンドは、シリカ内にカプセル化されている、実施形態３９〜４７のうちのいずれか１つに記載の撮像方法。
【０１３６】
実施形態４９：試料は、溶液、懸濁液、細胞、組織、細胞膜、細胞器官、又は生体である、実施形態３１〜４８のうちのいずれか１つに記載の撮像方法。
【０１３７】
実施形態５０：超解像撮像補正方法であって、それぞれの画像内のそれぞれの蛍光ナノダイアモンドの点像分布関数のガウシアンフィッティングによって、複数のｎ個の画像のそれぞれの画像内のｍ個の蛍光ナノダイアモンドのそれぞれの位置座標を決定することであって、ｍ≧４かつｎ＞１である、ことと、全ての画像内の第１の蛍光ナノダイアモンドの座標を整列させるためにそれぞれの画像を変位させることと、第１の蛍光ナノダイアモンド以外のそれぞれの蛍光ナノダイアモンドに対して、全てのｎ個の変位させられた画像にわたって蛍光ナノダイアモンドの位置の分布の中心を計算することと、第１の蛍光ナノダイアモンド以外の全ての蛍光ナノダイアモンドの位置の分散が全ての画像にわたって最小化されるようにそれぞれの画像を変位させることと、を含む、方法。
【０１３８】
実施形態５１：撮像方法は、２次元の方法である、実施形態５０に記載の方法。
【０１３９】
実施形態５２：撮像方法は、３次元の方法である、実施形態５０に記載の方法。
【０１４０】
実施形態５３：変位させることは、平行移動、回転、又は拡張／収縮のうちの少なくとも１つである、実施形態５０〜５２のうちのいずれか１つに記載の方法。
【０１４１】
実施形態５４：第１の蛍光ナノダイアモンドは、最大強度を有する蛍光ナノダイアモンドである、実施形態５０〜５３のうちのいずれか１つに記載の方法。
【０１４２】
実施形態５５：第１の蛍光ナノダイアモンド以外の全ての蛍光ナノダイアモンドの位置の分散が最小化されるように、それぞれの画像を変位させることは、第１の蛍光ナノダイアモンド以外の全ての蛍光ナノダイアモンドについてのｎ個の変位させられた画像の全てにわたって、蛍光ナノダイアモンドの位置の分布の中心の平均を計算することと、それぞれの画像内の第１の蛍光ナノダイアモンド以外の全ての蛍光ナノダイアモンドについての平均位置を計算することと、第１の蛍光ナノダイアモンド以外の全ての蛍光ナノダイアモンドについての全てのｎ個の変位させられた画像にわたる蛍光ナノダイアモンドの位置の分布の中心の平均と、所定の画像内の第１の蛍光ナノダイアモンド以外の全ての蛍光ナノダイアモンドの平均位置との間の差を最小にするように所定の画像を変位させることと、を含む、実施形態５０〜５４のうちのいずれか一つに記載の方法。
【０１４３】
概して、本発明は、代替として、本明細書において開示された任意の好適な構成要素を備えてもよく、それらから構成されてもよく、又は実質的にそれらから構成されてもよい。本発明は、先行技術の組成物において使用されるか、又はそうではなく本発明の機能及び／又は目的の達成に必要でない任意の構成要素、材料、成分、補助物質、又は生物種が全くないか、又は実質的にないように追加的又は代替的に形成されてもよい。同一の構成要素又は特性に向けられた全範囲の端点は、それに含まれ、及び独立して組み合わせることが可能である（例えば、「２５重量％以下、又は５重量％〜２０重量％」の範囲は、端点及び「５重量％〜２５重量％」の範囲の全ての中間値を含む等）。より広域の範囲に加えてより狭い範囲又はより特定のグループを開示することは、より広域の範囲又はより大きいグループの放棄ではない。更に、本明細書での用語「第１の」、「第２の」等は、なんら順位、数量、又は重要性を示さず、むしろ、要素をそれぞれに表すために使用される。本明細書内の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、量の限定を表さず、そして、本明細書で特に明記しないか、又は明らかに文脈によって否定されない限り単数及び複数の両方を網羅するように解釈されるべきである。「又は」は、「及び／又は」を意味する。接尾辞「（ｓ）」は、本明細書で使用されるとき、それが修飾する用語の単数及び複数の両方を含むようには意図されており、それによって、１つ又は複数のその用語を含む（例えば、ｆｉｌｍ（ｓ）は、１つ又は複数のｆｉｌｍを含む）。本明細書全体にわたる「いくつかの実施形態」、「別の実施形態」、「一実施形態」等への参照は、その実施形態と関連して記載された特定の要素（例えば、機能、構造、及び／又は特徴）が本明細書に記載された少なくともいくつかの実施形態に含まれており、そして、別の実施形態に存在しても存在しなくてもよいことを意味する。それに加えて、記載された要素が様々な実施形態において任意の好適な態様で組み合わされてもよいことを理解されたい。
【０１４４】
量に関連して使用される修飾語句「約」は、記述された値を含み、そして、文脈によって示された意味を含む（例えば、特定の量の測定値と関連する誤差の程度を含む）。用語「前方」、「後方」、「底部」、及び／又は「上部」は、特に明記しない限り、単に説明の便宜のために本明細書において使用され、なんら１つの位置又は空間上の向きに限定されない。「任意選択の」又は「任意選択で」とは、続いて説明される事象又は状況が、生じても又は生じなくてもよく、そして、説明は、事象が生じる場合及び事象が生じない場合を含むことを意味する。特に明記しない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的な用語は、本発明が属する当該技術の当業者によって一般に理解されているのと同一の意味を有する。「組合せ」は、混成物、混合物、合金、反応生成物等を含む。
【０１４５】
全ての引用された特許、特許出願、及び別の参考文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。しかし、本出願の用語が、組み込まれた参考文献の用語と矛盾又は対立する場合、本出願からの用語は、組み込まれた参考文献からの矛盾する用語に優先する。
【０１４６】
特定の実施形態が説明されてきたけれども、予測されていないか又は予測されていない可能性がある代替物、修正物、変形物、改善物、及び実質的な均等物が、出願人又は他の当業者に想起されてもよい。したがって、出願時及び補正時の添付の請求項は、全てのかかる代替物、修正形物、変形物、改善物、及び実質的な均等物を包含することが意図されている。
【図１】
2019502907.tif 000003
【図２】
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【図３】
2019502907.tif 000005
【図４】
2019502907.tif 000006
【図５】
2019502907.tif 000007
【図６Ａ】
2019502907.tif 000008
【図６Ｂ】
2019502907.tif 000009
【図６Ｃ】
2019502907.tif 000010
【図６Ｄ】
2019502907.tif 000011
【図６Ｅ】
2019502907.tif 000012
【図６Ｆ】
2019502907.tif 000013
【図６Ｇ】
2019502907.tif 000014
【図６Ｈ】
2019502907.tif 000015
【図７Ａ】
2019502907.tif 000016
【図７Ｂ】
2019502907.tif 000017
【図７Ｃ】
2019502907.tif 000018
【図７Ｄ】
2019502907.tif 000019
【図７Ｅ】
2019502907.tif 000020
【図７Ｆ】
2019502907.tif 000021
【図８Ａ】
2019502907.tif 000022
【図８Ｂ】
2019502907.tif 000023
【図８Ｃ】
2019502907.tif 000024
【図８Ｄ】
2019502907.tif 000025
【図８Ｅ】
2019502907.tif 000026
【図９Ａ】
2019502907.tif 000027
【図９Ｂ】
2019502907.tif 000028
【図９Ｃ】
2019502907.tif 000029
【図９Ｄ】
2019502907.tif 000030
【図９Ｅ】
2019502907.tif 000031
【図９Ｆ】
2019502907.tif 000032
【図９Ｇ】
2019502907.tif 000033
【図１０】
2019502907.tif 000034
【図１１Ａ】
2019502907.tif 000035
【図１１Ｂ】
2019502907.tif 000036
【図１１Ｃ】
2019502907.tif 000037
【図１１Ｄ】
2019502907.tif 000038
【国際調査報告】
2019502907.tif 000039
2019502907.tif 000040
2019502907.tif 000041