(57)【要約】  リポタンパク質搬出シグナルを含むポリペプチド、リポタンパク質搬出シグナルを含むポリペプチド前駆体、前記ポリペプチドまたはポリペプチド前駆体をコードする核酸、前記リポタンパク質搬出シグナルをコードする核酸および／またはポリペプチドまたはポリペプチド前駆体を含む組換え発現ベクター、およびこれらのベクターを含む５の組換え宿主細胞を本明細書中で記載する。本願はさらに、これらのポリペプチド、ポリペプチド前駆体、核酸、組換え発現ベクターおよび組換え宿主細胞の使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含むグラム陰性菌のリポタンパク質のＮ末端シグナルペプチドであって、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフがアミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃからなり、シグナルペプチダーゼタイプＩＩにより特異的に認識可能である、Ｎ末端シグナルペプチド；
（ｂ）以下のコンセンサス配列：
−Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸがＱであるとする、ＸＪＺＺ；
−ＢがＳおよびＴからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ＵがＤ、ＥおよびＦからなる群から選択される、ＢＺＺＵＺ；または
−ＸおよびＯが任意のアミノ酸であり得、好ましくはＯがＶである、ＸＫＥＯＥＥ
のいずれか１つによるアミノ酸配列を含むリポタンパク質搬出シグナルであって；
ここで、前記リポタンパク質搬出シグナルは全体として負に荷電し、前記リポタンパク質搬出シグナルは前記シグナルペプチドの前記Ｃ末端に直接隣接して位置する、リポタンパク質搬出シグナル；
（ｃ）ポリペプチドであって、前記シグナルペプチドおよび前記リポタンパク質搬出シグナルのＣ末端に位置する前記ポリペプチド；ならびに
（ｄ）任意に、プロテアーゼ切断部位モチーフであって、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフとは異なり、前記シグナルペプチドおよび前記リポタンパク質搬出シグナルのＣ末端ならびに前記ポリペプチドのＮ末端に位置する、前記プロテアーゼ切断部位モチーフ；
を含むポリペプチド前駆体であって、
前記シグナルペプチド、前記リポタンパク質搬出シグナルおよび前記ポリペプチドが、ポリペプチド配列において天然では一緒に存在しない、前記ポリペプチド前駆体。
【請求項２】
グラム陰性菌のリポタンパク質の前記Ｎ末端シグナルペプチドが、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のシアリダーゼ（ｓｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）の前記シグナルペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド前駆体。
【請求項３】
前記リポタンパク質搬出シグナルが、
−配列番号１６〜配列番号２０または配列番号４０〜４７のいずれか１つ；
−配列番号１〜配列番号１５または配列番号２５〜３９のいずれか１つ；あるいは
−配列番号４９〜配列番号５１または配列番号６３のいずれか１つ
によるアミノ酸配列から選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド前駆体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド前駆体をコードする核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸と、プロモータならびに転写および翻訳終止シグナルと、任意に選択マーカーとを含む、組換え発現ベクター。
【請求項６】
（ａ）グラム陰性菌のリポタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸配列であって、前記シグナルペプチドが前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含み、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフが前記アミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃからなり、シグナルペプチダーゼタイプＩＩによって特異的に認識される、核酸配列；
（ｂ）以下のコンセンサス配列：
−Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され；ただし、ＪがＡである場合、ＸはＱであるとする、ＸＪＺＺ；
−ＢがＳおよびＴからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ＵがＤ、ＥおよびＦからなる群から選択される、ＢＺＺＵＺ；または
−ＸおよびＯが任意のアミノ酸であり得、好ましくはＯがＶである、ＸＫＥＯＥＥ
のいずれか１つによるアミノ酸配列を有するリポタンパク質搬出シグナルをコードする核酸配列であって、
前記リポタンパク質搬出シグナルが全体として負に荷電し、前記リポタンパク質搬出シグナルをコードする前記核酸配列が、前記シグナルペプチドをコードする前記核酸配列の直接下流に位置する、核酸配列；
（ｃ）任意に、プロテアーゼ切断部位モチーフをコードする核酸配列であって、前記プロテアーゼ切断部位モチーフが前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフとは異なり、前記リポタンパク質搬出シグナルをコードする前記核酸配列および前記シグナルペプチドをコードする前記核酸配列の下流に位置する、核酸配列；ならびに
（ｄ）マルチクローニングサイトであって、前記リポタンパク質搬出シグナルをコードする前記核酸および前記シグナルペプチドをコードする前記核酸の下流に位置し、任意に前記プロテアーゼ切断部位モチーフの下流に位置する、前記マルチクローニングサイト
を含む、組換え発現ベクター。
【請求項７】
グラム陰性菌のリポタンパク質の前記Ｎ末端シグナルペプチドが、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のシアリダーゼ（ｓｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）の前記シグナルペプチドである、請求項６に記載の組換え発現ベクター。
【請求項８】
前記リポタンパク質搬出シグナルが
−配列番号１６〜配列番号２０または配列番号４０〜４７のいずれか１つ；
−配列番号１〜配列番号１５または配列番号２５〜３９のいずれか１つ；あるいは
−配列番号４９〜配列番号５１または配列番号６３のいずれか１つ
によるアミノ酸配列から選択される、請求項６または７に記載の組換え発現ベクター。
【請求項９】
前記宿主細胞がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の細菌細胞である、請求項５〜８のいずれか１項に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１０】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の前記細菌細胞がＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓまたはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅである、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
以下のコンセンサス配列：
−Ｘが任意のアミノ酸であり得、Ｊが、ＫおよびＡからなる群から選択され、Ｚが、ＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸはＱであるとする、ＸＪＺＺ；
−Ｂが、ＳおよびＴからなる群から選択され、Ｚが、ＤおよびＥからなる群から選択され、Ｕが、Ｄ、ＥおよびＦからなる群から選択される、ＢＺＺＵＺ；または
−ＸおよびＯが任意のアミノ酸であり得、好ましくは、ＯがＶである、ＸＫＥＯＥＥ；
の１つによるアミノ酸配列を含むリポタンパク質搬出シグナルの使用であって、
前記リポタンパク質搬出シグナルは全体的に負に荷電し、前記リポタンパク質搬出シグナルは、前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含むグラム陰性菌のリポタンパク質のＮ末端シグナルペプチドに由来するＮ末端脂質修飾システイン残基に直接隣接して位置し、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフはアミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃからなり、宿主細胞において、ポリペプチドの表面露出に関して、シグナルペプチダーゼタイプＩＩによって特異的に認識可能であり、前記ポリペプチドは前記宿主細胞と同じかまたは異なる生物に由来し、前記リポタンパク質搬出シグナルおよび前記ポリペプチドは、ポリペプチド配列において天然では一緒に存在しない、リポタンパク
質搬出シグナルの使用。
【請求項１２】
グラム陰性菌のリポタンパク質の前記Ｎ末端シグナルペプチドが、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のシアリダーゼ（ｓｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）の前記シグナルペプチドである、請求項１１に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１３】
前記リポタンパク質搬出シグナルが、
−配列番号１６〜配列番号２０もしくは配列番号４０〜４７のいずれか１つ；
−配列番号１〜配列番号１５もしくは配列番号２５〜３９のいずれか１つ；または
−配列番号４９〜配列番号５１または配列番号６３のいずれか１つ
によるアミノ酸配列から選択される、請求項１１または１２に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１４】
（ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド前駆体、
（ｉｉ）請求項４に記載の核酸、
（ｉｉｉ）請求項５〜８のいずれか１項に記載の発現ベクター；または
（ｉｖ）請求項９もしくは１０に記載の宿主細胞
の、ワクチンを製造するため、抗体を産生するため、バイオソープション適用のため、バイオセンサーを製造するため、細菌ディスプレイを実施するため、全細胞に基づく生体触媒適用のため、またはタンパク質産生および精製のための使用であって、前記抗体産生が治療方法ではない、前記使用。
【請求項１５】
前記ポリペプチド前駆体が、前記ポリペプチド前駆体、前記核酸および／または前記発現ベクターを含む前記Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の細菌細胞の前記表面に露出する抗原、もしくはそのエピトープ、または酵素、もしくはその触媒活性なフラグメントを含む、ならびに／あるいは前記核酸または前記発現ベクターが前記ポリペプチド前駆体、前記核酸および／または前記発現ベクターを含む前記Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の細菌細胞の前記表面に露出する抗原、もしくはそのエピトープ、または酵素、もしくはその触媒活性なフラグメントをコードする、請求項１４に記載のポリペプチド前駆体、核酸または発現ベクターの使用。
【請求項１６】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の前記細菌細胞が、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓまたはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅである、請求項１４または１５に記載のポリペプチド前駆体、核酸、発現ベクターまたは宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポタンパク質シグナルペプチドの分野に存する。さらに詳細には、本発明は、これらのシグナルペプチドを含むポリペプチド、その使用、前記ポリペプチドをコードする核酸、これらのペプチドをコードする核酸配列と組換え発現ベクターとを含む核酸構築物ならびにこれらの核酸構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面ディスプレイにより、アンカー型モチーフとして細菌、酵母、またはさらには哺乳動物細胞の表面タンパク質を使用して安定的に細胞の表面上でのタンパク質もしくはペプチド、またはそのフラグメントの発現が可能になる。この強力なツールは、ヒト共生もしくは弱毒化病原菌細胞上に異種エピトープを露出させて抗原特異的抗体応答を誘発するための生ワクチンまたは不活化ワクチン開発、スクリーニングディスプレイ（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ）ペプチドライブラリー、動物においてポリクローナル抗体を産生するために表面抗原を発現させることによる抗体産生、酵素を固定化することによる全細胞触媒作用、バイオセンサー開発ならびに有害な化学物質や重金属の除去のための環境的バイオ吸着（ｂｉｏ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）などの広範囲のバイオテクノロジーおよび工業用途で使用されてきた。
【０００３】
８０年代半ばに、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｐ．Ｓｍｉｔｈは、バクテリオファージの表面上で繊維状ファージのｐＩＩＩタンパク質と融合したペプチドおよび小タンパク質を提示することによって、はじめて表面発現系を開発した。それ以来、ファージの表面上で外来タンパク質を発現するために様々なファージディスプレイシステムが開発されてきた。しかしながら、ファージの表面上で提示される外来タンパク質のサイズはかなり限定される。その結果、微生物細胞表面ディスプレイシステムが開発された。微生物細胞表面ディスプレイは、通常、細胞表面タンパク質またはそれらのフラグメント（「キャリアタンパク質」）である、様々なアンカー型モチーフとの融合タンパク質として関心対象の異種ペプチドまたはタンパク質を発現することにより実施される。
【０００４】
典型的には、キャリアタンパク質の使用は細胞生理学に影響を及ぼし得る。例えば、外膜（ＯＭ）タンパク質および細胞付属物（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｐｐｅｎｄａｇｅ）のサブユニットの使用は、成長異常および細胞表層統合性の不安定化につながり得る。さらに、有効なキャリアは、異種配列の挿入または融合に対して不安定になってはならず、またペリプラズム腔または培地中に存在するプロテアーゼによる攻撃に対して耐性でなければならない。
【０００５】
ＯｐｒＦ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＸ、外膜タンパク質Ｓ、マルトプロテインＬａｍＢおよびリポタンパク質ＴｒａＴをはじめとする様々なアンカー型モチーフが開発された。多くの成功結果が達成されたにもかかわらず、現行のアンカー型モチーフの使用は、全ての標的タンパク質の効率的なディスプレイを必ずしも可能にするものではなかった。細胞表面ディスプレイシステムにおいて、有効なタンパク質ディスプレイはアンカー型モチーフの選択に非常に依存する。したがって、組換えタンパク質の発現およびディスプレイのための新規かつ改善された細胞表面ディスプレイシステムを調査し開発することが非常に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは表面に露出したリポタンパク質に対して特異的な新規コンセンサス配列モ
チーフを見出し、前記特異的モチーフはリポタンパク質搬出シグナル（ＬＥＳ）として作用する。そのようなＬＥＳを含むポリペプチドは、高い効率および安定性で宿主細胞の細胞表面にうまく搬出することができ、ディスプレイすることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本明細書中で提供されるのは、
（ａ）前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含むグラム陰性菌のリポタンパク質のＮ末端シグナルペプチドであって、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフがアミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃ（配列番号２３０）からなり、シグナルペプチダーゼタイプＩＩにより特異的に認識可能である、Ｎ末端シグナルペプチド；
（ｂ）以下のコンセンサス配列：
−Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸがＱであるとする、ＸＪＺＺ（配列番号１９７）；
−ＢがＳおよびＴからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ＵがＤ、ＥおよびＦからなる群から選択される、ＢＺＺＵＺ（配列番号１９８）；または
−ＸおよびＯが任意のアミノ酸であり得、好ましくはＯがＶである、ＸＫＥＯＥＥ（配列番号２００）
のいずれか１つによるアミノ酸配列を含むリポタンパク質搬出シグナルであって、
前記リポタンパク質搬出シグナルが全体的に負に荷電し、前記リポタンパク質搬出シグナルが前記シグナルペプチドのＣ末端に直接隣接して位置する、リポタンパク質搬出シグナル；
（ｃ）前記シグナルペプチドおよび前記リポタンパク質搬出シグナルのＣ末端に位置するポリペプチド；および
（ｄ）任意に、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフとは異なり、前記シグナルペプチドおよび前記リポタンパク質搬出シグナルのＣ末端かつ前記ポリペプチドのＮ末端に位置する、プロテアーゼ切断部位モチーフ
を含むポリペプチド前駆体であって；
前記シグナルペプチド、前記リポタンパク質搬出シグナルおよび前記ポリペプチドがポリペプチド配列において天然では一緒に存在しない、ポリペプチド前駆体である。特定の実施形態において、グラム陰性菌のリポタンパク質の前記Ｎ末端シグナルペプチドは、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のシアリダーゼ（ｓｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）のシグナルペプチドである。特定の実施形態において、リポタンパク質搬出シグナルは、配列番号１６〜配列番号２０または配列番号４０〜４７；配列番号１〜配列番号１５または配列番号２５〜３９のいずれか１つ；あるいは配列番号４９〜配列番号５１または配列番号６３のいずれか１つによるアミノ酸配列から選択される。
【０００８】
本明細書中で記載するようなポリペプチド前駆体をコードする核酸も本明細書中で提供される。
【０００９】
本明細書中で記載されるような核酸とプロモータと転写および翻訳終止シグナル、ならびに任意に選択マーカーを含む組換え発現ベクターも本明細書中で提供される。
【００１０】
（ａ）グラム陰性菌のリポタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸配列であって、前記シグナルペプチドが前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含み、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフが前記アミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃからなり、シグナルペプチダーゼタイプＩＩによって特異的に認識される、核酸配列；
（ｂ）以下のコンセンサス配列：
−Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよび
Ｅからなる群から選択され；ただし、ＪがＡである場合、ＸはＱであるとする、ＸＪＺＺ；
−ＢがＳおよびＴからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ＵがＤ、ＥおよびＦからなる群から選択される、ＢＺＺＵＺ；または
−ＸおよびＯが任意のアミノ酸であり得、好ましくはＯがＶである、ＸＫＥＯＥＥ
のいずれか１つによるアミノ酸配列を有するリポタンパク質搬出シグナルをコードする核酸配列であって；前記リポタンパク質搬出シグナルが全体として負に荷電し、前記リポタンパク質搬出シグナルをコードする前記核酸配列が、前記シグナルペプチドをコードする前記核酸配列の直接下流に位置する、核酸配列；
（ｃ）任意に、プロテアーゼ切断部位モチーフをコードする核酸配列であって、前記プロテアーゼ切断部位モチーフが前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフとは異なり、前記リポタンパク質搬出シグナルをコードする前記核酸配列および前記シグナルペプチドをコードする前記核酸配列の下流に位置する、核酸配列；ならびに
（ｄ）マルチクローニングサイトであって、前記リポタンパク質搬出シグナルをコードする前記核酸および前記シグナルペプチドをコードする前記核酸の下流で、任意に前記プロテアーゼ切断部位モチーフの下流に位置する、前記マルチクローニングサイト
を含む組換え発現ベクターも本明細書中で提供される。特定の実施形態において、グラム陰性菌のリポタンパク質の前記Ｎ末端シグナルペプチドは、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のシアリダーゼ（ｓｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）のシグナルペプチドである。特定の実施形態において、前記リポタンパク質搬出シグナルは、配列番号１６〜配列番号２０もしくは配列番号４０〜４７のいずれか１つ；配列番号１〜配列番号１５もしくは配列番号２５〜３９のいずれか１つ；または配列番号４９〜配列番号５１もしくは配列番号６３のいずれか１つによるアミノ酸配列から選択される。
【００１１】
本明細書中で記載するようなベクターを含む組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の細菌細胞である組換え宿主細胞も本明細書中で提供する。特定の実施形態において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の前記細菌細胞はＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓまたはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅである。別の態様は、以下のコンセンサス配列：
【００１２】
−Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され；ただし、ＪがＡである場合、ＸはＱであるとする、ＸＪＺＺ；
−ＢがＳおよびＴからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ＵがＤ、ＥおよびＦからなる群から選択される、ＢＺＺＵＺ；または
−ＸおよびＯが任意のアミノ酸であり得、好ましくはＯがＶである、ＸＫＥＯＥＥ
の１つによるアミノ酸配列を含むリポタンパク質搬出シグナルの使用に関し；
前記リポタンパク質搬出シグナルは全体的に負に荷電し、前記リポタンパク質搬出シグナルは、前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含むグラム陰性菌のリポタンパク質のＮ末端シグナルペプチドから生じるＮ末端脂質修飾システイン残基に直接隣接した位置にあり、宿主細胞におけるポリペプチドの表面露出のためには、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフはアミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃからなり、シグナルペプチダーゼタイプＩＩにより特異的に認識可能であり、前記ポリペプチドは、前記宿主細胞と同じかまたは異なる生物に由来し、前記リポタンパク質搬出シグナルおよび前記ポリペプチドはポリペプチド配列において天然では一緒に存在しない。特定の実施形態において、グラム陰性菌のリポタンパク質の前記Ｎ末端シグナルペプチドは、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のシアリダーゼ（ｓｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）のシグナルペプチドである。特定の実施形態において、前記リポタンパク質搬出シグナルは、配列番号１６〜配列番号２０もしくは配列番号４０〜４７；配列番号１〜配列番号１５もしくは配列番号２５〜３９のいずれか１つ；または配列番号４９〜配列番号５１もしくは
配列番号６３のいずれか１つによるアミノ酸配列から選択される。
【００１３】
さらに本明細書中で提供するのは、
（ｉ）本明細書中で前述したポリペプチド前駆体、
（ｉｉ）本明細書中で前述した核酸、
（ｉｉｉ）本明細書中で前述した発現ベクター、または
（ｉｖ）本明細書中で前述した宿主細胞
の、ワクチンを製造するため、抗体を産生するため、バイオソープション（ｂｉｏｓｒｐｔｉｏｎ）適用のため、バイオセンサーを製造するため、細菌ディスプレイを実施するため、全細胞に基づく生体触媒適用のため、またはタンパク質産生および精製のための使用であり、前記抗体産生は、治療法ではない。特定の実施形態において、前記ポリペプチド前駆体は、抗原、もしくはそのエピトープ、または酵素、もしくはその触媒活性なフラグメントを含む、および／または前記核酸もしくは前記発現ベクターは、抗原、もしくはそのエピトープ、または酵素、もしくはその触媒活性なフラグメントをコードし、それらは、前記ポリペプチド前駆体、前記核酸および／または前記発現ベクターを含むＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の細菌細胞の表面に露出される。特定の実施形態において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の前記細菌細胞はＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓまたはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ−１】図１は、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓリポタンパク質の多重配列アライメントを示す。図１Ａ−１は、成熟表面露出リポタンパク質のＭＡＦＦＴアライメントを示す。保存されたＫ−（Ｄ／Ｅ）モチーフを示すＮ末端領域のみが表示されている。高度に保存された残基を強調する。誘導されたコンセンサス配列を以下に示す。
【図１Ａ−２】図１Ａ−１のつづき。
【図１Ｂ】図１Ｂは、細胞内外膜（ＯＭ）成熟リポタンパク質の最初の１５のＮ末端アミノ酸のＭＡＦＦＴアライメントを示す。各配列の最初の不変システイン残基を除去した後、アライメントを実施した。高度に保存された残基が強調されている。誘導されたコンセンサス配列を以下に示す。シアリダーゼ（ＳｉａＣ；Ｃｃａｎ＿０４７９０）を星印で示す。
【図２Ａ】図２は、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ表面露出リポタンパク質のアライメントによりＮ末端保存モチーフの存在が明らかになることを示す。図２Ａは、成熟表面露出リポタンパク質の最初の１５のＮ末端アミノ酸の配列アライメントを示す。各配列の第１不変システイン残基を除去した後、アライメントを実施した。高度に保存された残基を強調する。誘導されたコンセンサス配列を以下に示す。ムチナーゼ（ＭｕｃＧ）を星印によって表示する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａで決定したコンセンサス配列の生成したＷｅｂＬｏｇｏである。＋１システインに対する位置を以下に示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、パーセンテージで表した、コンセンサス配列の各位置のアミノ酸頻度である。各位置の３つの最も代表的なアミノ酸を示す。
【図３Ａ】図３は、ＬＥＳはＳｉａＣ表面露出を可能にすることを示す。図３Ａは、シアリダーゼ（ＳｉａＣ）ｗｔおよびコンセンサス配列変異体構築物を示す。コンセンサス由来のアミノ酸を濃灰色で示し、点変異を薄灰色で示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａで記載するＳｉａＣ構築物を発現する株の総細胞抽出物のウェスタンブロット分析を示す。ムチナーゼ（ＭｕｃＧ）の発現をローディング対照としてモニタリングした。
【図３Ｃ】図３Ｃは、抗ＳｉａＣ血清で標識した生細胞のフローサイトメトリーによるＳｉａＣ表面露出の定量化を示す。標識された細胞のパーセンテージを下に示す。検出限界より低い株（ＮＲ、関連性なし；＜２．５％）は灰色で強調され、統計的に低い染色集団を有する株は灰色である。示されているのは平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。３つの独立した実験からの平均を示す。エラーバーは平均からの１標準偏差を表す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、抗ＳｉａＣ血清で標識した細菌の免疫蛍光顕微鏡画像を示す。スケールバー：５μｍ。
【図３Ｅ】図３Ｅは、異なるＳｉａＣ構築物を発現する細菌の総ライセート（ＴＬ）および外膜（ＯＭ）フラクションのウェスタンブロット分析によるＳｉａＣの検出を示す。ＭｕｃＧの発現をローディング対照としてモニタリングした。
【図４Ａ】図４は、最小ＬＥＳの位置はその機能にとって重大であることを示す。図４Ａは、シアリダーゼ（ＳｉａＣ）ｗｔおよびコンセンサス配列変異体構築物を示す。コンセンサス由来のアミノ酸を濃灰色で示し、点変異を薄灰色で示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａに記載されるＳｉａＣ構築物を発現する株の総細胞抽出物のウェスタンブロット分析によるＳｉａＣの検出を示す。ムチナーゼ（ＭｕｃＧ）発現をローディング対照としてモニタリングした。
【図４Ｃ】図４Ｃは、抗ＳｉａＣ血清で標識した生細胞のフローサイトメトリーによるＳｉａＣ表面露出の定量化を示す。示されているのは染色した細胞のみの蛍光強度である；ＮＲ：関連性なし。少なくとも３回の独立した実験からの平均を示す。エラーバーは平均からの１標準偏差を表す；＊＊＊、ｐ≦０．００１。染色細胞のパーセンテージを下に示す；ＳＤ：標準偏差。検出限界以下（≦２．５％）の株を灰色で強調し、統計的に有意な低染色集団を有する株は灰色である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、抗ＳｉａＣ血清で染色された細菌の免疫蛍光顕微鏡画像を示す。スケールバー：５μｍ。
【図４Ｅ】図４Ｅは、異なるＳｉａＣ構築物を発現する細菌の総ライセート（ＴＬ）および外膜（ＯＭ）フラクションのウェスタンブロット分析を示す。ＭｕｃＧ発現をローディング対照としてモニタリングした。
【図５Ａ】図５は、ＭｕｃＧは表面露出リポタンパク質であることを示す。図５Ａは、ムチナーゼ（ＭｕｃＧ）ドメインの注釈を示す。予想される構造ドメインを灰色の四角で示し、アミノ酸位置を一番上に示す。予想されるリポタンパク質搬出シグナル（ＬＥＳ）を下に示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、３Ｈパルミテートで標識した細菌のＭｕｃＧ免疫沈澱の溶出フラクションのウェスタンブロット分析（上）およびフルオログラフィー（下）を示す。ＭｕｃＧは、ｗｔおよびΔｍｕｃＧ＋ＭｕｃＧ株では脂質付加されているが、脂質付加の予想される部位が変異しているΔｍｕｃＧ＋ＭｕｃＧＣ２１Ｇ株では脂質付加されておらず、ＭｕｃＧがリポタンパク質であることを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、異なるＭｕｃＧ構築物を発現する細菌の総細胞ライセート（ＴＬ）および外膜（ＯＭ）フラクションのウェスタンブロット分析によるＭｕｃＧ検出を示す。ＭｕｃＧはＯＭフラクションで検出されるが、溶解性ＭｕｃＧＣ２１Ｇは検出されず、ＭｕｃＧが真正のＯＭリポタンパク質であることを示す。ＳｉａＣ発現をローディング対照としてモニタリングした。
【図５Ｄ】図５Ｄは、抗ＭｕｃＧ血清で標識された生細胞のフローサイトメトリーによるＭｕｃＧ表面露出の定量化を示す。示されているのは染色した細胞のみの蛍光強度である；ＮＲ：関連性なし。少なくとも３回の独立した実験からの平均を示す。エラーバーは平均からの１標準偏差を表す；＊＊＊、ｐ≦０．００１。染色細胞のパーセンテージを下に示す；ＳＤ：標準偏差。検出限界以下（≦２．５％）の株は灰色で強調されている。
【図５Ｅ】図５Ｅは、抗ＭｕｃＧ血清で標識された細菌の免疫蛍光顕微鏡写真を示す。スケールバー：５μｍ。
【図５Ｆ】図５Ｆは、異なるＭｕｃＧ構築物を発現する細菌とのインキュベーション後のヒト唾液のＰＮＡレクチン染色によるムチンの検出を示す。未処理の唾液は陰性対照としての役割を果たす。ＰＮＡ染色の減少は、表面局在化ＭｕｃＧによるムチン分解を示す。
【図６Ａ】図６は、ＭｕｃＧ  ＬＥＳの添加はＳｉａＣの表面露出をもたらすことを示す。図６Ａは、シアリダーゼ（ＳｉａＣ）ｗｔおよびムチナーゼ（ＭｕｃＧ）コンセンサス配列変異体構築物を示す。ＭｕｃＧコンセンサス由来のアミノ酸を濃灰色で示し、点変異を灰色で示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａに示すＳｉａＣ構築物を発現する株の総細胞抽出物のウェスタンブロット分析によるＳｉａＣの検出を示す。ＭｕｃＧ発現をローディング対照としてモニタリングした。
【図６Ｃ】図６Ｃは、抗ＳｉａＣ血清で標識した生細胞のフローサイトメトリーによるＳｉａＣ表面露出の定量化を示す。示されているのは染色した細胞のみの蛍光強度である；ＮＲ：関連性なし。少なくとも３回の独立した実験からの平均を示す。エラーバーは平均からの１標準偏差を表す；＊＊＊、ｐ≦０．００１。染色細胞のパーセンテージを下に示す；ＳＤ：標準偏差。検出限界以下（≦２．５％）の株を灰色の影を付け、統計的に有意な低染色集団は灰色である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、抗ＳｉａＣ血清で標識された細菌の免疫蛍光顕微鏡写真を示す。スケールバー：５μｍ。
【図６Ｅ】図６Ｅは、異なるＳｉａＣ構築物を発現する細菌の総ライセート（ＴＬ）および外膜（ＯＭ）フラクションのウェスタンブロット分析を示す。ＭｕｃＧ発現をローディング対照としてモニタリングした。
【図７Ａ】図７は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＦ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅリポタンパク質の多重配列アライメントを示す。図７Ａは、プロテイナーゼＫ感受性Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓリポタンパク質の最初の１６個のＮ末端アミノ酸のＭＡＦＦＴアライメントを示す。高度に保存された残基が強調されている。対応するＷｅｂｌｏｇｏおよびアミノ酸頻度を下に示す。
【図７Ｂ】図７Ａのつづき。
【図７Ｃ】図７Ｂのつづき。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＳｕｓＤ様Ｆ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅリポタンパク質の最初の１６個のＮ末端アミノ酸のＭＡＦＦＴアライメントを示す。高度に保存された残基が強調されている。対応するＷｅｂｌｏｇｏおよびアミノ酸頻度を下に示す。
【図７Ｅ】図７Ｄのつづき。
【図７Ｆ】図７Ｅのつづき。
【図８Ａ】図８は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＦ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ  ＬＥＳはＳｉａＣ表面局在化を可能にすることを示す。図８Ａは、シアリダーゼ（ＳｉａＣ）ｗｔおよびコンセンサス配列変異体構築物を示す。Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓまたはＦ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅコンセンサス由来のアミノ酸を濃灰色で示し、点変異を薄灰色で示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａで記載するＳｉａＣ構築物を発現する株の総細胞抽出物のウェスタンブロット分析によるＳｉａＣの検出を示す。ムチナーゼ（ＭｕｃＧ）発現をローディング対照としてモニタリングした。
【図８Ｃ】図８Ｃは、抗ＳｉａＣ血清で標識した生細胞のフローサイトメトリーによるＳｉａＣ表面露出の定量化を示す。示されているのは染色した細胞のみの蛍光強度である；ＮＲ：関連性なし。少なくとも３回の独立した実験からの平均を示す。エラーバーは平均からの１標準偏差を表す；＊＊＊、ｐ≦０．００１。染色細胞のパーセンテージを下に示す；ＳＤ：標準偏差。検出限界（≦２．５％）以下の株を灰色で強調する。
【図８Ｄ】図８Ｄは、抗ＳｉａＣ血清で標識した細菌の免疫蛍光顕微鏡画像を示す。スケールバー：５μｍ。
【図９Ａ】図９は、ＳｉａＣにおけるＭｕｃＧ  ＬＥＳの特性化を示す。図９Ａは、シアリダーゼ（ＳｉａＣ）ｗｔおよびムチナーゼ（ＭｕｃＧ）ＬＥＳ配列変異体構築物を示す。ＭｕｃＧ由来のアミノ酸を濃灰色で示し、点変異を薄灰色で示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａで記載するＳｉａＣ構築物を発現する株の総細胞抽出物のウェスタンブロット分析によるＳｉａＣの検出を示す。ＭｕｃＧの発現をローディング対照としてモニタリングした。
【図９Ｃ】図９Ｃは、抗ＳｉａＣ血清で標識した生細胞のフローサイトメトリーによるＳｉａＣ表面露出の定量化を示す。示されているのは染色した細胞のみの蛍光強度である；ＮＲ：関連性なし。少なくとも３回の独立した実験からの平均を示す。エラーバーは平均からの１標準偏差を表す；＊＊＊、ｐ≦０．００１。染色細胞のパーセンテージを下に示す；ＳＤ：標準偏差。検出限界（２．５％）以下の株を灰色で強調し、統計的に有意な低染色集団を有する株は灰色である。
【図１０Ａ】図１０は、ＭｕｃＧ  ＬＥＳ突然変異分析−単一置換を示す。図１０Ａは、ムチナーゼ（ＭｕｃＧ）ｗｔおよび変異体構築物を示す。点変異を薄灰色で示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａで記載するＭｕｃＧ構築物を発現する株の総細胞抽出物のウェスタンブロット分析によるＭｕｃＧの検出を示す。シアリダーゼ（ＳｉａＣ）の発現をローディング対照としてモニタリングした。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、抗ＭｕｃＧ血清で標識した生細胞のフローサイトメトリーによるＭｕｃＧ表面露出の定量化を示す。示されているのは染色した細胞のみの蛍光強度である；ＮＲ：関連性なし。少なくとも３回の独立した実験からの平均を示す。エラーバーは平均からの１標準偏差を表す；＊＊＊、ｐ≦０．００１。染色細胞のパーセンテージを下に示す；ＳＤ：標準偏差。検出限界（２．５％）以下の株を灰色で強調する。
【図１１Ａ】図１１は、ＭｕｃＧ  ＬＥＳ突然変異分析−多重置換を示す。図１１Ａは、ムチナーゼ（ＭｕｃＧ）ｗｔおよび変異体構築物を示す。点変異は薄灰色で示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、図１１Ａで記載するＭｕｃＧ構築物を発現する株の総細胞抽出物のウェスタンブロット分析によるＭｕｃＧの検出を示す。シアリダーゼ（ＳｉａＣ）の発現をローディング対照としてモニタリングした。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、抗ＭｕｃＧ血清で標識した生細胞のフローサイトメトリーによるＭｕｃＧ表面露出の定量化を示す。示されているのは染色した細胞のみの蛍光強度である；ＮＲ：関連性なし。少なくとも３回の独立した実験からの平均を示す。エラーバーは平均からの１標準偏差を表す；＊＊＊、ｐ≦０．００１。染色細胞のパーセンテージを下に示す；ＳＤ：標準偏差。検出限界（２．５％）以下の株を灰色で強調し、統計的に有意な低染色集団を有する株は灰色である。
【図１２Ａ】図１２は、アルギニンはＭｕｃＧ  ＬＥＳにおけるリジンを機能的に置換することができることを示す。図１２Ａは、ムチナーゼ（ＭｕｃＧ）ｗｔおよび変異体構築物を示す。アルギニン置換を濃灰色で示し、アラニン置換を薄灰色で示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、抗ＭｕｃＧ血清で標識された生細胞のフローサイトメトリーによるＭｕｃＧ表面露出の定量化を示す。示されているのは染色した細胞のみの蛍光強度である；ＮＲ：関連性なし。少なくとも３回の独立した実験からの平均を示す。エラーバーは平均からの１標準偏差を表す；＊＊＊、ｐ≦０．００１。染色細胞のパーセンテージを下に示す；ＳＤ：標準偏差。検出限界（２．５％）以下の株を灰色で強調し、統計的に有意な低染色集団を有する株は灰色である。
【図１２Ｃ】図１２Ｂのつづき。
【図１３】図１３は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の宿主細胞における表面露出リポタンパク質バイオジェネシスおよび輸送経路の例示的概略図を示す。本明細書中で記載するようなＮ末端シグナルペプチド、ＬＥＳおよびポリペプチドを含むポリペプチド前駆体はＳｅｃトランスロカーゼによって内膜中に挿入される。Ｎ末端シグナルペプチド内に含まれるｌｉｐｏｂｏｘモチーフは、ジアシルグリセリル部分を＋１システインのＳＨに結合させるリポタンパク質ジアシルグリセリルトランスフェラーゼ（Ｌｇｔ）によって認識される。次いで、シグナルペプチドはタイプＩＩシグナルペプチダーゼ（ＳＰａｓｅ  ＩＩ）によって切断される。シグナルペプチド切断後、Ｎ末端システイン残基は、リポタンパク質Ｎ−アシル−トランスフェラーゼ（Ｌｎｔ）によってさらなるアシル鎖で修飾される。成熟リポタンパク質は、内膜から抽出され、Ｌｏｌ系によりペリプラズムを越えて外膜へ輸送され、そして最終的に外膜に挿入され、未知の機序（破線によって示される）により細菌表面へ転位置される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明で用いられるこれらのペプチド、これらのポリペプチドを含むキット、ポリペプ
チド前駆体、これらのポリペプチドおよび／またはポリペプチド前駆体をコードする核酸配列と組換え発現ベクターとを含む核酸構築物、ならびにこれらの核酸構築物を含む組換え宿主細胞の当該使用を記載する前に、本発明は、記載した特定のポリペプチド、ポリペプチド前駆体、使用、核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞に限定されず、したがって、特定のポリペプチド、ポリペプチド前駆体、使用、核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞は、もちろん、様々であり得ることを理解すべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書中で使用する専門用語は限定的あることを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００１６】
特に別段の定めのない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語や科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有すると解釈される。本明細書中で記載するものと類似または同等のいかなる方法および材料も本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および材料をここで記載する。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、文脈でそうでないことが明示されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。
【００１８】
「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」という用語は、本明細書中で用いられる場合、「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、両端を含むかまたは制限がなく、言及されていないさらなるメンバー、要素または方法ステップを除外しない。
【００１９】
「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」という用語はまた、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語も包含する。
【００２０】
本明細書中で使用する「約」という用語は、例えばパラメータ、量、持続期間（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｕｒａｔｉｏｎ）などの測定可能な値について言及する場合、そのような変化が開示された発明を実施するために適切である限り、特定の値の、そして指定された値から＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、さらに好ましくは＋／−１％以下、そしてなお一層好ましくは＋／−０．１％以下の変化を包含することが意図される。修飾語「約」が指す値は、それ自体もまた具体的かつ好ましくは開示されていると理解すべきである。
【００２１】
端点による数値範囲の記載は、列挙した端点と同様に、各範囲内に含まれるすべての数値および分数を包含する。
【００２２】
「アミノ酸」という用語は、本明細書中で用いられる場合、一般に、アミン官能基およびカルボキシル官能基の両方を含む分子を指す。生化学では、この用語は、特に、一般式Ｈ２ＮＣＨＲＣＯＯＨを有するα−アミノ酸を指し、式中、Ｒは有機置換基である。α−アミノ酸では、アミノ基およびカルボキシレート基は同じ炭素、すなわちα−炭素に結合している。この用語は２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで翻訳後に修飾されることが多い、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含むアミノ酸；ならびに２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない他の異常アミノ酸（ｕｎｕｓｕａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を包含する。この用語はＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方を包含する。Ｌ−アミノ酸が好ましい。本願の範囲内では、アミノ酸をそれらの１文字コードまたはそれらの正式な名称で言及する。例えば、システインはシ
ステインまたはＣとして言及され得る。
【００２３】
略号Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｔは、本明細書中で用いられる場合、当該技術分野で公知であり、以下に再現する一文字アミノ酸コードに対応する：
【００２４】
【表１】
2019527560.tif 000002
【００２５】
略号Ｂ、Ｊ、Ｏ、Ｕ、Ｘ、ＹおよびＺ、ならびにＸ１〜Ｘ１０は、可変アミノ酸を示し、変異の性質は本明細書中で指定されているとおりである。
【００２６】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語は、交換可能に用
いることができ、隣接するアミノ酸残基間のペプチド結合によって一緒に結合したアミノ酸を含む任意の天然、合成、または組換え分子に関する。「ペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄ）」、「ペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｎｋ）」または「アミド結合」は、１つのアミノ酸のカルボキシル基が他のアミノ酸のアミノ基と反応し、それによって水の分子が放出される場合、２つのアミノ酸間に形成される共有結合である。ポリペプチドは任意のソースからのものであり得、例えば、天然に存在するポリペプチド、化学的に合成されたポリペプチド、組換え分子遺伝学的技術によって産生されるポリペプチド、または細胞もしくは翻訳系からのポリペプチドであり得る。好ましくは、ポリペプチドは組換え分子遺伝学的技術によって産生されるポリペプチドである。ポリペプチドは、直鎖であり得るか、または折り畳んで球形にしてもよい。「アミノ酸」および「アミノ酸残基」という語は、本明細書中で同義的に用いることができる。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質という語は、完全長タンパク質のフラグメントを包含する。
【００２７】
「機能的に活性なポリペプチド、タンパク質またはペプチド」という語は、本明細書中で用いられる場合、意図する機能を発揮し得るポリペプチド、タンパク質またはペプチドの形態を指す。例えば、酵素の機能的に活性な形態は化学反応を加速または触媒することができる。機能的に活性なポリペプチドは宿主細胞に対して相同（同じ生物に由来する）または異種（異なる生物に由来する）であり得る。
【００２８】
タンパク質の「フラグメント」という語は、前記タンパク質のＮ末端および／もしくはＣ末端が欠失または切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）した形態を指す。この語は、限定されるものではないが、代替翻訳（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）、細胞外および／または細胞内タンパク質分解および／または例えば、物理的、化学的および／または酵素的タンパク質分解による、例えば、インビボまたはインビトロなどの前記タンパク質の分解などの任意のメカニズムによって生じるフラグメントを包含する。限定されないが、タンパク質のフラグメントは、前記タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも約５％（アミノ酸数による）、または少なくとも約１０％、例えば２０％以上、３０％以上、または４０％以上、例えば好ましくは５０％以上、例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上であり得る。
【００２９】
本明細書がタンパク質のフラグメントを言及または包含する場合、これは、機能的に活性であるかまたは機能的であるフラグメント、すなわち、個別または対応するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの生物学的活性または意図する官能性を少なくとも部分的に保持するフラグメントを含む。特定の実施形態において、フラグメントまたはポリペプチドは、対応するタンパク質の抗原特性を少なくとも部分的に保持する。
【００３０】
以下の節で、本発明の異なる態様または実施形態をさらに詳細に定義する。そのように定義される各態様または実施形態は、明らかに反対の指示がない限り、任意の他の態様（複数可）または実施形態（複数可）と組み合わせることができる。特に、好ましいかまたは有利であると示されている任意の特徴を、好ましいかまたは有利であると示されている任意の他の特徴（複数可）と組み合わせることができる。
【００３１】
本明細書全体にわたる「一実施形態」、「実施形態」に対する言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたって様々な場所での「一実施形態において」または「実施形態において」という表現の出現は、必ずしもすべて同じ実施形態を指すとは限らないが、そうである場合もある。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１つ以上の実施形態において、本開示から当業者には明らかであるように、任意の好適な方法で組み合わせることができる。さらに、当業者には理解されるように、本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるある特徴を含むが、他の特
徴は含まず、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内にあり、そして，異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、請求される実施形態のいずれも任意の組み合わせで用いることができる。
【００３２】
グラム陰性菌は、内部の細胞質側の細胞膜（ｉｎｎｅｒ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）および細菌外膜（ＯＭ）間に挟まれた薄いペプチドグリカン細
胞壁で構成された、それらの細胞膜によって特徴づけられる細菌群である。グラム陰性菌にはプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）だけでなく、膨大なバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門も含まれる。現在、本発明者らは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の数種由来のリポタンパク質を細胞表面へ向けるシグナルを見出した。さらに詳細には、本発明者らは、表面に露出したリポタンパク質に対して特異的な新規コンセンサス配列モチーフ、すなわち、
−Ｘ１が任意のアミノ酸であり得、Ｘ２がＫ、Ｓ、ＴおよびＡからなる群から選択され、ただし、Ｘ２がＡである場合、Ｘ１はＱである、Ｘ１Ｘ２（Ｄ／Ｅ）２（配列番号６８〜７１）；
−Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸがＱであるとする、ＸＪＺＺ（配列番号１９７）；
−ＢがＳおよびＴからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ＵがＤ、ＥおよびＦからなる群から選択される、ＢＺＺＵＺ（配列番号１９８）；または
−ＸおよびＯが任意のアミノ酸であり得、好ましくはＯがＶである、ＸＫＥＯＥ（配列番号１９９）、好ましくはＸＫＥＯＥＥ（配列番号２００）
を見出し；
前記特異的モチーフはリポタンパク質搬出シグナル（ＬＥＳ）として作用する。さらに、前記ＬＥＳを含むポリペプチドは、高い効率および安定性を有する細胞表面にうまく分泌されディスプレイされた。
【００３３】
なお、２０個の天然に存在するアミノ酸のうちの１つの略号を表すのではなく可変アミノ酸を表す、本明細書中で記載するコンセンサス配列で使用するＸ、Ｊ、Ｚ、ＢおよびＯという文字は、本明細書中では代わりに「Ｘｎ」と称する場合があり、ここで、「ｎ」は１または２以外の自然数である。例えば、「Ｘ」は「Ｘ５」と記載することができ、「Ｊ」は「Ｘ６」と記載することができ、「Ｚ」は「Ｘ７」と記載することができ、「Ｂ」は「Ｘ８」と記載することができ、「Ｕ」は「Ｘ９」と記載することができ、また「Ｏ」は「Ｘ１０」と記載することができる。同様に、アミノ酸が２つの選択肢のうちの１つであるとして、例えば、Ｅ／Ｄ、Ｓ／ＡまたはＡ／Ｇとして表される場合、それらの選択肢も特定のＸｎによって表すことができる。
【００３４】
本願はこのように、前記ＬＥＳを含むポリペプチドに関する。したがって、本発明の第１の態様は：
（ａ）前記ポリペプチドのＮ末端領域の最初の１５個のアミノ酸内に位置するリポタンパク質搬出シグナルであって、以下のコンセンサス配列：Ｘ１Ｘ２ＤＤ（配列番号６８）、Ｘ１Ｘ２ＤＥ（配列番号６９）、Ｘ１Ｘ２ＥＤ（配列番号７０）またはＸ１Ｘ２ＥＥ（配列番号７１）のいずれか１つによるアミノ酸配列であって、Ｘ１が任意のアミノ酸であり得、Ｘ２がＫ、Ｓ、ＴおよびＡからなる群から選択され、ただしＸ２がＡである場合、Ｘ１がＱであるアミノ酸配列を含む前記リポタンパク質搬出シグナル；
（ｂ）機能的に活性なポリペプチドまたはそのフラグメント；および
（ｃ）任意に、前記リポタンパク質搬出シグナルのＣ末端および前記機能的に活性なポリペプチドまたはそのフラグメントのＮ末端にプロテアーゼ切断部位モチーフ
を含むポリペプチドに関する。
【００３５】
特定の実施形態において、前記タンパク質は、タンパク質に連結したＮ末端シグナルペプチドを含むポリペプチドである、前駆体ポリペプチドに由来する成熟タンパク質である。そのような前駆体ポリペプチドは、典型的には、Ｎ末端シグナルペプチド内に、シグナルペプチダーゼタイプＩＩで切断可能なｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含む。その結果として、シグナルペプチダーゼタイプＩＩの切断により前記前駆体タンパク質から得られる成熟タンパク質は、ｌｉｐｏｂｏｘモチーフの残遺物である＋１システインを含む。したがって、特定の実施形態において、成熟ポリペプチドは前記リポタンパク質搬出シグナルのＮ末端に＋１システインを含む。なお、この文脈では、アミノ酸位置「＋１」は、シグナルペプチダーゼの切断部位の後（またはＣ末端側）の最初のアミノ酸を指す。本明細書中に記載する前駆体タンパク質に由来する成熟リポタンパク質では、これは、成熟リポタンパク質の最初のアミノ酸残基に相当する。
【００３６】
本発明はさらに：
（ａ）任意に、Ｎ末端システイン残基であって、好ましくは脂質修飾された、前記システイン残基；
（ｂ）以下のコンセンサス配列：
−Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸがＱであるとする、ＸＪＺＺ（配列番号１９７）；
−ＢがＳおよびＴからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ＵがＤ、ＥおよびＦからなる群から選択される、ＢＺＺＵＺ（配列番号１９８）；または
−ＸおよびＯが任意のアミノ酸であり得、好ましくはＯがＶである、ＸＫＥＯＥ（配列番号１９９）、好ましくはＸＫＥＯＥＥ（配列番号２００）；
好ましくは、Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸがＱであるとする、ＸＪＺＺ
のいずれか１つによるアミノ酸配列を含むリポタンパク質搬出シグナルであって、直接前記システイン残基のＣ末端に位置する、前記リポタンパク質搬出シグナル；
（ｃ）前記リポタンパク質搬出シグナルおよび前記システイン残基のＣ末端に位置するポリペプチド；ならびに
（ｄ）任意に、前記リポタンパク質搬出シグナルのＣ末端かつ前記ポリペプチドのＮ末端に位置するプロテアーゼ切断部位モチーフ
を含む成熟ポリペプチドにも関する。
【００３７】
上述のように、特定の実施形態において、前記Ｎ末端システイン残基は、シグナルペプチダーゼタイプＩＩ（ＳＰａｓｅＩＩ）によるポリペプチド前駆体からの前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含むＮ末端シグナルペプチドの切断から生じる、ｌｉｐｏｂｏｘモチーフの保存された＋１システインである。
【００３８】
特定の実施形態において、前記リポタンパク質搬出シグナルは全体として負に荷電している。
【００３９】
特定の実施形態において、前記Ｎ末端システイン残基、前記リポタンパク質搬出シグナルおよび前記ポリペプチドは、ポリペプチド配列において天然では一緒に存在しない。
【００４０】
特定の実施形態において、機能的に活性なポリペプチドまたはそのフラグメントなどのポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端タグに連結される。
【００４１】
したがって、「リポタンパク質搬出シグナル」または「ＬＥＳ」は、本明細書中で用いられる場合、リポタンパク質に由来し、グラム陰性菌細胞、好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉ
ｄｅｔｅｓ門由来の細菌細胞の細胞表面に搬出するためのリポタンパク質を標的とするシグナルペプチドとして作用する、少なくとも３つのアミノ酸残基、好ましくは最大３０個のアミノ酸残基の短いアミノ酸配列を指す。ＬＥＳは、任意の他のタンパク質またはポリペプチドに、さらに詳細には、本来、グラム陰性菌細胞の細胞表面に搬出されない／されないであろうタンパク質またはポリペプチドに添加することができる。
【００４２】
好ましくは、タンパク質またはポリペプチドは、２００ｋＤａ以下、１５０ｋＤａ以下、１００ｋＤａ以下、５０ｋＤａ以下、さらに好ましくは、１００ｋＤａ以下または５０ｋＤａ以下のサイズを有する。好ましくは、完全長タンパク質のフラグメントを含むタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８のアミノ酸、少なくとも９のアミノ酸または少なくとも１０のアミノ酸、好ましくは少なくとも１０のアミノ酸残基を含む。前記ＬＥＳを含む前記タンパク質またはポリペプチドは、グラム陰性菌細胞表面、好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門からの細菌細胞へ輸送される能力を獲得する。好ましくは、ＬＥＳをポリペプチドのＮ末端、さらに好ましくは成熟ポリペプチドのＮ末端領域の最初の１５のアミノ酸内に、またはその近くに、なお好ましくは成熟ポリペプチドのＮ末端領域の最初の１０のアミノ酸内に、なお一層好ましくは成熟ポリペプチドのＮ末端領域の最初の５のアミノ酸内に挿入される。最も好ましくは、ＬＥＳはシステイン残基のちょうどＣ末端に位置する。好ましくは、前記システイン残基は脂質修飾され、さらに好ましくは、前記システイン残基はｌｉｐｏｂｏｘモチーフの保存されたシステインであり、これは、Ｎ末端シグナルペプチドに由来し、典型的には、シグナルペプチダーゼタイプＩＩ（ＳＰａｓｅＩＩ）による前記Ｎ末端シグナルペプチドを含むポリペプチド前駆体の切断後に成熟ポリペプチドの最初のアミノ酸（すなわち「＋１システイン」）を形成する。
【００４３】
特定の実施形態において、本発明は、Ｎ末端シグナルペプチドを含むが、ＬＥＳを含まず、したがって表面露出されないグラム陰性菌のポリペプチド露出させるために使用することができる。これらの実施形態において、ＬＥＳ配列は、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフのＣ末端に直接隣接して挿入できるが、これは、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフがアミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃ（配列番号２０３）からなる場合に、そのシステイン残基に直接隣接している。
【００４４】
ある特定の用途に関して、その表面露出後のポリペプチドからＬＥＳモチーフを除去することが望ましい場合がある。例えば、ＬＥＳモチーフの除去により、「天然の」形態の機能的に活性なポリペプチドまたはそのフラグメントを生成する。この除去は、高特異性プロテアーゼ切断部位モチーフをＬＥＳモチーフと機能的に活性なポリペプチドとの間に挿入することによって達成することができる。好ましくは、特異的切断は、特異的配列（プロテアーゼ／基質対）を認識する組換えエンドプロテアーゼによって得られる。
【００４５】
「プロテアーゼ切断部位モチーフ」という用語は、本明細書中で用いられる場合、プロテアーゼまたは所与のタンパク質中の化学物質によって切断されたアミノ酸配列モチーフを指す。「プロテアーゼ」、「ペプチダーゼ」、または「プロテイナーゼ」という用語は、本明細書中で用いられる場合、タンパク質のさらに小さなポリペプチドまたはアミノ酸への分解であるタンパク質分解を実施する任意の酵素を指す。特定の実施形態において、アミノ酸配列モチーフは高特異性プロテアーゼ−感受性配列である。非限定例は、ＴＥＶプロテアーゼによって特異的に切断されるタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱ｜Ｇ）（配列番号２０４）、ｓｃＵｌｐ１ｐプロテアーゼによって特異的に切断されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｓｃ）ＳＵＭＯ（Ｓｍｔ３ｐ）、ｂｄＳｅＮＰ１プロテアーゼによって特異的に切断されるＢｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ（ｂｄ）ＳＵＭＯ、ｂｄＮＥＰＤ１によって特異的に切断されるｂｄＮＥＤＤ８、ｓｓＮＥＤＰ１によって特異的に切断されるＳａｌｍ
ｏ  ｓａｌａｒ（ｓｓ）ＮＥＤＤ８、ｓｃＡｔｇ４によって特異的に切断されるｓｃＡｔｇ８、Ｕｓｐ２によって特異的に切断されるＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  Ｕｂ、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエンテロペプチダーゼによって特異的に切断されるＤＤＤＤＫ（配列番号２０５）アミノ酸モチーフならびにトロンビンおよび第Ｘａ因子によって特異的に切断されるＬＶＰＲＧＳ（配列番号２０６）アミノ酸モチーフである。好ましくは、プロテアーゼはタグを含み、これによって、アフィニティ精製によりプロセスからプロテアーゼを除去することが可能になる。タグの非限定例は、Ｈｉｓ−タグ、ＦＬＡＧ、ＳｔｒｅｐタグＩＩ、ＨＡ−タグ、ｃ−ｍｙｃおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである。
【００４６】
特定の実施形態において、タンパク質またはポリペプチドは相同タンパク質またはポリペプチドである。
【００４７】
本発明に係るＬＥＳによりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門からの細菌細胞の細菌表面でタンパク質を発現させることにより、このタイプのタンパク質をＥ．ｃｏｌｉなどの他の遠いかまたは関連性のない細菌で発現させる場合に起こり得るような、非機能的または部分機能的タンパク質を有する危険性なしに、グリコシルヒドロラーゼまたはプロテアーゼなどのＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ由来の完全に機能的な酵素を生成することが可能になる。
【００４８】
特定の実施形態において、タンパク質またはポリペプチドは、リポタンパク質、例えばシアリダーゼ（ＳｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）、好ましくはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓのシアリダーゼ（ｓｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）、さらに好ましくは、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のシアリダーゼ（ＳｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）である。特定の実施形態において、タンパク質またはポリペプチドは異種タンパク質またはポリペプチドである。特定の実施形態において、異種タンパク質またはポリペプチドは哺乳動物タンパク質またはポリペプチド、例えばヒトタンパク質またはポリペプチドである。特定の実施形態において、異種タンパク質またはポリペプチドは、ウイルスタンパク質もしくはポリペプチドまたはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門ではない細菌細胞からのタンパク質もしくはポリペプチド、例えばグラム陽性菌タンパク質またはポリペプチドである。
【００４９】
細菌界はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓなどのいくつかの門に分類することができる。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門はＢａｃｔｅｒｏｉｄｉａ、Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、ＳｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉａおよびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｉｎｃｅｒｔａｉ  ｓｅｄｉｓなどのいくつかの綱にさらに分類することができる。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａの綱はさらに、科：Ｃｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ＭｙｒｏｉｄａｃｅａｅおよびＢｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅに分類することができる。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科は、いくつかの属、例えば、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ、ＯｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＣｏｅｎｏｎｉａを含む。Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属は、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ、Ｃ．ｃａｎｉｓ  ｎｏｖ．  ｓｐ．、Ｃ．ｃｙｎｏｄｅｇｍｉ、Ｃ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃ．ｇｒａｎｕｌｏｓａ、Ｃ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｏｃｈｒａｃｅａおよびＣ．ｓｐｕｔｉｇｅｎａなどの種にさらに分類することができる。これらの科学的分類は、当業者には公知である。本発明者らは、ＬＥＳがＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門において保存されることを見出した。本発明に係るＬＥＳは好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ＬＥＳであり、さらに好ましくはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ＬＥＳ、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＬＥＳまたはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ  ＬＥＳであり、なお一層好ましくはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ＬＥＳである。さらに、本発明者らは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｓ門においてリポタンパク質搬出のための共通の新規経路があることを見出した。
【００５０】
本発明者らは、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ表面露出リポタンパク質において、その後にアスパルテート（Ｄ）またはグルタメート（Ｅ）残基のいずれかが続くリジン（Ｋ）残基が、位置＋１でＮ末端システイン（Ｃ）に近接して保存され、さらに詳細には、保存モチーフは以下のアミノ酸配列：ＣＸＫ（Ｄ／Ｅ）２Ｘ（配列番号２１〜２４）を有し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得ることを見出した。前記保存モチーフのＮ末端システインは、好ましくはｌｉｐｏｂｏｘモチーフのシステインであり、これはＮ末端シグナルペプチドに由来し、典型的には、前記Ｎ末端シグナルペプチドを含むポリペプチド前駆体のシグナルペプチダーゼタイプＩＩ（ＳＰａｓｅＩＩ）による切断後に、成熟ポリペプチドの最初のアミノ酸を形成する。したがって、前記システイン残基のちょうどＣ末端に位置する保存されたＬＥＳモチーフは保存されたアミノ酸モチーフＸＫ（Ｄ／Ｅ）２Ｘ（配列番号１９１〜１９４）を有し得、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。特に、アミノ酸配列ＱＫＤＤＥ（配列番号１６）に対応するＬＥＳコンセンサスモチーフは、それぞれ１６％（Ｑ）、７２％（Ｋ）、４８％（Ｄ）、４４％（Ｄ）および２３％（Ｅ）の保存を有する。位置＋３の正に荷電した残基（Ｋ）に続いてシステイン残基、好ましくは脂質付加したシステイン残基の直後の位置＋４、＋５および＋６に２〜３個の負に荷電したアミノ酸（Ｄおよび／またはＥ）がある。＋１システインの下流の位置＋２および＋６の残基はなくてもよい。ペプチドの全体の電荷は負でなければならない。最小コンセンサスモチーフはアミノ酸配列ＫＤＤ、ＫＥＥ、ＫＤＥまたはＫＥＤ、好ましくはＫＤＤに対応し、リポタンパク質を表面に向かわせるために充分である。
【００５１】
例えば、配列ＱＫＤＤＥ（配列番号１６）を有するＬＥＳ内で、最も保存されていないアミノ酸、すなわちＱおよびＥは、Ａで置換し、その結果、以下の配列：ＡＫＤＤＥ（配列番号１７）およびＡＫＤＤＡ（配列番号１８）を有するＬＥＳとすることができる。また、ＤをＥで置換し、その結果、配列ＡＫＥＥＡ（配列番号１９）を有するＬＥＳとすることができ、ＫをＡで置換して、その結果、配列ＱＡＤＤＥ（配列番号２０）を有するＬＥＳとすることができる。
【００５２】
また、本発明者らは、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓの自然に表面露出したリポタンパク質であるＭｕｃＧのＬＥＳが、ＫＫＥＶＥＥＥ（配列番号４９）またはこの配列の一部、例えば、ＫＫＥＶＥＥ（配列番号６３）であって、ＫＫＥＶＥＥＥおよびＫＫＥＶＥＥどちらも負に荷電しているものであるか、または電荷が中性であるＫＫＥＶＥ（配列番号６４）であることを見出した。ＭｕｃＧのＬＥＳは、＋１システインの直接Ｃ末端に位置し、これは、Ｎ末端シグナルペプチドに由来し、通常は、シグナルペプチダーゼタイプＩＩ（ＳＰａｓｅＩＩ）による前記Ｎ末端シグナルペプチドを含むポリペプチド前駆体の切断後に、成熟ポリペプチドの最初のアミノ酸を形成する、ｌｉｐｏｂｏｘモチーフのシステインである。好ましくは、ＫＫＥＶＥＥＥ（配列番号４９）またはＫＫＥＶＥＥ（配列番号６３）である。ＫＫＥＶＥ（配列番号６４）のＫ残基の１つのＡへの置換を使用し、結果としてＫＡＥＶＥ（配列番号６５）またはＡＫＥＶＥ（配列番号６６）とすることによって、ＬＥＳの全体的な電荷を負にすることができる。しかしながら、正に荷電したアミノ酸の位置、すなわち位置＋３のＫは適切な表面局在化のために重要である。したがって、アミノ酸配列ＡＫＥＶＥ（配列番号６６）を有するＬＥＳが好ましい。
【００５３】
配列ＫＫＥＶＥＥＥ（配列番号４９）を有するＬＥＳ内で、個々のアミノ酸をＡで置換することができ、その結果、以下の配列：ＡＫＥＶＥＥＥ（配列番号５０）、ＫＫＥＡＥＥＥ（配列番号５１）、ＫＫＥＶＥＡＥ（配列番号５２）、ＫＡＥＶＥＥＥ（配列番号５３）、ＫＫＡＶＥＥＥ（配列番号５４）またはＫＫＥＶＡＥＥ（配列番号５５）を有するＬＥＳを得る。以下のＬＥＳ配列が好ましい：ＡＫＥＶＥＥＥ（配列番号５０）、ＫＫＥＡＥＥＥ（配列番号５１）またはＫＫＥＶＥＡＥ（配列番号５５）。さらに、配列ＫＫＥ
ＶＥＥＥ（配列番号４９）を有するＬＥＳ中の一方または両方のリジンをＲで置換することができ、その結果、以下の配列：ＲＲＥＶＥＥＥ（配列番号６０）、ＲＡＥＶＥＥＥ（配列番号６１）またはＡＲＥＶＥＥＥ（配列番号６２）、好ましくはＲＡＥＶＥＥＥ（配列番号６１）またはＡＲＥＶＥＥＥ（配列番号６２）、さらに好ましくはＲＡＥＶＥＥＥ（配列番号６１）を有するＬＥＳを得る。
【００５４】
ＬＥＳ内で、位置＋２のＳもしくは位置＋３のＫ、または位置＋２もしくは＋３で正の電荷を有するアミノ酸が表面搬出のために必要である。至適ＭｕｃＧ表面露出のための最小ＬＥＳは、＋１Ｃ、好ましくは脂質修飾Ｃから下流のＸＫ（Ｄ／Ｅ）３（配列番号４０〜４７）であり、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。
【００５５】
さらに、本発明者らは、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ表面露出リポタンパク質が＋１システインにきわめて近接したＮ末端の負に荷電したコンセンサス配列を有し、好ましくは、前記システインは脂質修飾され、さらに詳細には、アミノ酸配列ＳＤＤＤＤ（配列番号１）を有するコンセンサス配列であることを見出した。また、本発明者らは、Ｆ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ表面露出リポタンパク質が、アミノ酸配列ＳＤＤＦＥ（配列番号２）を有するＮ末端コンセンサス配列を有することを見出した。アミノ酸ＤおよびＥ、ならびにＳおよびＴは、配列番号１および配列番号２内で交換可能である。したがって、ＬＥＳは配列番号３〜配列番号１５または配列番号２５〜配列番号３９のいずれか１つを含み得る。全体の電荷が負である限り。
【００５６】
Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＦ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅのＬＥＳは、正荷電または極性残基とそれに続く２または３個の負に荷電した残基を共有し、＋１システインときわめて近接して全体的に負の電荷をもたらす。当業者は、本発明に係るＬＥＳが、これらの特性に適合する任意のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓＬＥＳであり得ることを理解するであろう。
【００５７】
したがって、本発明に係るＬＥＳは、以下のコンセンサス配列Ｘ１Ｘ２ＤＤ（配列番号６８）、Ｘ１Ｘ２ＤＥ（配列番号６９）、Ｘ１Ｘ２ＥＤ（配列番号７０）またはＸ１Ｘ２ＥＥ（配列番号７１）のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸であり得、Ｘ２は、Ｋ、Ｓ、ＴおよびＡからなる群から選択され、ただし、Ｘ２がＡである場合、Ｘ１はＱであるとする。
【００５８】
あるいは、本発明に係るＬＥＳは、以下のコンセンサス配列：
−Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸがＱであるとする、ＸＪＺＺ（配列番号１９７）；
−ＢがＳおよびＴからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ＵがＤ、ＥおよびＦからなる群から選択される、ＢＺＺＵＺ（配列番号１９８）；または
−ＸおよびＯが任意のアミノ酸であり得、好ましくはＯがＶである、ＸＫＥＯＥ（配列番号１９９）、好ましくはＸＫＥＯＥＥ（配列番号２００）；
好ましくは、Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸがＱであるとする、ＸＪＺＺ
のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む。
【００５９】
特定の実施形態において、前記リポタンパク質搬出シグナルは全体として負に荷電している。
【００６０】
特定の実施形態において、前記ＬＥＳは、ＫＤＤ、ＫＤＥ、ＫＥＥ、または配列番号１
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７に記載するような配列のいずれか、さらに好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７に記載するような配列のいずれか、なお一層好ましくは、配列番号１、２、１６、１７または１８に記載するような配列のいずれかである。
【００６１】
特定の実施形態において、前記ＬＥＳは、
−配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、１９１、１９２、１９３または１９４、好ましくは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７；
−配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９；あるいは
−配列番号４９、５０、５１、６３、６４または６６、好ましくは、配列番号４９、５０、５１または６３に記載するような配列のいずれかである。特定の実施形態において、前記ＬＥＳは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、１９１、１９２、１９３または１９４、好ましくは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７に記載するような配列のいずれかである。
【００６２】
【表２−１】
2019527560.tif 000003
【表２−２】
2019527560.tif 000004
【表２−３】
2019527560.tif 000005
＊ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｂは、ＳおよびＴからなる群から選択され、Ｚは、ＤおよびＥからなる群から選択され、Ｕは、Ｄ、ＥおよびＦからなる群から選択され、Ｏは任意のアミノ酸であり得、好ましくは、ＯはＶである
＊＊Ｘは任意のアミノ酸であり得、ＪはＫおよびＡからなる群から選択され、Ｚは、ＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸはＱであるとする
＊＊＊Ｘ１は任意のアミノ酸であり得、Ｘ２は、Ｋ、Ｓ、ＴおよびＡからなる群から選択され、ただし、Ｘ２がＡである場合、Ｘ１はＱである。
【００６３】
本発明に係るＬＥＳを含むポリペプチドの有効な表面露出は、膜タンパク質分画、蛍光または共焦点顕微鏡法、蛍光ベースのフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡを含むいくつかの実験の使用により、また、ポリペプチドが酵素である場合、活性検査により検証することができる。
【００６４】
特定の実施形態において、ＬＥＳを含むポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＤＤまたはＸＫＤＤＸ（配列番号７０）、好ましくはＸＫＤＤＸを含み、Ｘは任意のアミノ酸残基であり得る。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明によるＬＥＳを含むポリペプチドは、本発明によるコンセンサス配列のいずれか１つで記載するアミノ酸配列のＮ末端から＋１のアミノ酸位置で１つのシステイン残基を含み、好ましくは、前記システイン残基は脂質修飾され、さらに好ましくは、前記システイン残基はＮ末端シグナルペプチドから生じる。
【００６６】
対象のポリペプチドをＮ末端融合によってＬＥＳに融合させることができる。
【００６７】
サイトゾルから細菌細胞表面へ効率的に輸送されるために、組換えポリペプチドは、ＬＥＳモチーフに加えて、少なくとも１つの特異的シグナルペプチドを必要とする。さらに詳細には、ＳＰａｓｅＩＩによって特異的に認識されるｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含む古典的リポタンパク質シグナルペプチドが、細菌細胞のサイトゾルからペリプラズムへポリペプチドを転位置させるために必要である。したがって、ポリペプチドが細菌細胞のペリ
プラズムに到達したらシグナルペプチドは切断されるので、最終的な機能的活性ポリペプチドではなくポリペプチド前駆体のみが、完全なシグナルペプチド配列を含むであろう。
【００６８】
したがって、本発明の別の態様は、
（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドであって、好ましくは、シグナルペプチダーゼタイプＩＩによって特異的に認識されるｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含む、前記シグナルペプチド、
（ｂ）以下のコンセンサス配列：Ｘ１Ｘ２ＤＤ（配列番号６８）、Ｘ１Ｘ２ＤＥ（配列番号６９）、Ｘ１Ｘ２ＥＤ（配列番号７０）またはＸ１Ｘ２ＥＥ（配列番号７１）のいずれか１つによるアミノ酸配列を含むＬＥＳであって、Ｘ１が任意のアミノ酸であり得、Ｘ２が、Ｋ、Ｓ、ＴおよびＡからなる群から選択され、ただし、Ｘ２がＡである場合、Ｘ１はＱであり、前記リポタンパク質搬出シグナルが前記シグナルペプチドのＣ末端に位置する、前記ＬＥＳ；
（ｃ）任意に、プロテアーゼ切断部位モチーフであって、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフとは異なり、前記シグナルペプチドおよび前記ＬＥＳのＣ末端に位置する、前記プロテアーゼ切断部位モチーフ；ならびに
（ｄ）ポリペプチド
を含むポリペプチド前駆体である。
【００６９】
「ポリペプチド前駆体」または「プロポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用する場合、本発明に係るＬＥＳを含むポリペプチドをコードするｍＲＮＡの第一翻訳産物を指す。前記ポリペプチド前駆体は、ポリペプチド前駆体をある特定の位置に対して標的化させるために必要な短いＮ末端シグナルペプチドを含む。ポリペプチド前駆体がその位置に到達したら、シグナルペプチドが切断され、その結果としてポリペプチドが得られる。好ましくは、前記位置は、グラム陰性菌細胞の内膜またはペリプラズム腔である。
【００７０】
「Ｎ末端シグナルペプチド」という用語は、本明細書中で使用する場合、ＳＰａｓｅＩＩによって認識され切断され、ポリペプチドの、さらに詳細にはリポタンパク質のＮ末端に位置し、ポリペプチドの、さらに詳細にはリポタンパク質の、サイトゾルからグラム陰性菌細胞の内膜を越える搬出に必要とされるリポタンパク質シグナルペプチドを指す。リポタンパク質シグナルペプチドのＣ末端は、「ｌｉｐｏｂｏｘ」と呼ばれる４アミノ酸モチーフを含む。好ましくは、Ｎ末端シグナルペプチドは、少なくとも１６個のアミノ酸残基で最大３５個のアミノ酸残基からなる。当業者は、Ｎ末端シグナルペプチドが、ＳＰａｓｅ  ＩＩによって認識され切断されるｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含む任意のリポタンパク質シグナルペプチドであり得ることを理解するであろう。そのようなＮ末端シグナルペプチドの非限定例は、アミノ酸配列ＭＮＲＩＦＹＬＬＦＡＦＶＬＬＳＡＣＧＳ（配列番号１９５）を有するＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のシアリダーゼ（ｓｉａＣ）またはアミノ酸配列ＭＫＫＩＶＳＩＳＬＦＦＬＩＳＡＴＩＷＬＡＣＫ（配列番号１９６）を有するムチナーゼ（ＭｕｃＧ）のシグナルペプチドであり得る。「ｌｉｐｏｂｏｘモチーフ」という用語は、本明細書中で用いられる場合、膜ホスファチジルグリセロール由来のジアシルグリセロール部分を＋１システインのＳＨに結合させるプロリポタンパク質ジアシルグリセロールトランスフェラーゼによって最初に認識されるアミノ酸配列モチーフを指す。次いで、ｌｉｐｏｂｏｘは、プロリポタンパク質からシグナルペプチドを切断するＳＰａｓｅ  ＩＩによって認識される。シグナルペプチド切断後、成熟タンパク質のＮ末端を形成するシステインは、さらなるアシル鎖で修飾され、Ｌｏｌ系によって内膜から抽出され、ペリプラズムを越えて輸送され、そしてその後、ＯＭに挿入される（図１３）。ｌｉｐｏｂｏｘモチーフは、通常は、保存された脂質修飾システイン残基、さらに詳細にはグリセリド−脂肪酸脂質が結合したシステイン残基を有する４アミノ酸モチーフであり、これによって、原形質膜または外膜のペリプラズムリーフレット上にリポタンパク質が結合することが可能になる。さらに詳細には、保存されたシステインは位置＋１に位置し、位置−１でＧまたはＡを有し、位置−２でＡまたはＳを有し、位置−３でＬを有する。ＳＰａｓ
ｅＩＩによるプロリポタンパク質の切断は、＋１位システイン残基のＮ末端で、すなわち、ｌｉｐｏｂｏｘ内で起こる。
【００７１】
別の態様は、
（ａ）前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含むグラム陰性菌のリポタンパク質のＮ末端シグナルペプチドであって、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフがアミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃ（配列番号２０３）からなり、シグナルペプチダーゼタイプＩＩにより特異的に認識可能である、Ｎ末端シグナルペプチド；
（ｂ）以下のコンセンサス配列：
−Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸがＱであるとする、ＸＪＺＺ（配列番号１９７）；
−ＢがＳおよびＴからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ＵがＤ、ＥおよびＦからなる群から選択される、ＢＺＺＵＺ（配列番号１９８）；または
−ＸおよびＯが任意のアミノ酸であり得、好ましくはＯがＶである、ＸＫＥＯＥ（配列番号１９９）
のいずれか１つ；
好ましくは、Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸがＱであるとする、ＸＪＺＺ
によるアミノ酸配列を含むリポタンパク質搬出シグナルであって、
前記シグナルペプチドのＣ末端に直接隣接して位置する、前記リポタンパク質搬出シグナル；
（ｃ）前記シグナルペプチドおよび前記リポタンパク質搬出シグナルのＣ末端に位置するポリペプチド；ならびに
（ｄ）任意に、プロテアーゼ切断部位モチーフであって、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフとは異なり、前記シグナルペプチドおよび前記リポタンパク質搬出シグナルのＣ末端ならびに前記ポリペプチドのＮ末端に位置する、前記プロテアーゼ切断部位モチーフ
を含むポリペプチド前駆体に関する。
【００７２】
特定の実施形態において、前記リポタンパク質搬出シグナルは全体として負に荷電している。
【００７３】
特定の実施形態において、前記シグナルペプチド、前記リポタンパク質搬出シグナルおよび前記ポリペプチドは、ポリペプチド配列において天然では一緒に存在しない。
【００７４】
明確にするために、アミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃ（配列番号２０３）を有するｌｉｐｏｂｏｘモチーフの表現は、本明細書中ではアミノ酸配列ＬＸ３Ｘ４Ｃとも称される場合があり、ここで、「Ｘ３」はアミノ酸ＳまたはＡであり得、「Ｘ４」はアミノ酸ＡまたはＧであり得る。
【００７５】
特定の実施形態において、前記ＬＥＳは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７に記載される配列のいずれか、好ましくは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７に記載される配
列のいずれか、さらに好ましくは、配列番号１、２、１６、１７または１８に記載される配列のいずれかである。
【００７６】
特定の実施形態において、ポリペプチド前駆体中に存在する前記ＬＥＳは
−配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、１９１、１９２、１９３または１９４、好ましくは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７；
−配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９；あるいは
−配列番号４９、５０、５１、６３、６４または６６、好ましくは、配列番号４９、５０、５１または６３に記載される配列のいずれかである。
【００７７】
好ましい実施形態において、ポリペプチド前駆体中に存在する前記ＬＥＳは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、１９１、１９２、１９３または１９４、好ましくは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７に記載するような配列のいずれかである。
【００７８】
特定の実施形態において、ポリペプチド前駆体中に存在する前記Ｎ末端シグナルペプチドはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓのＮ末端シグナルペプチドであり、さらに好ましくは、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓのＮ末端シグナルペプチド、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓのＮ末端シグナルペプチドまたはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅのＮ末端シグナルペプチドであり、なお一層好ましくはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓのＮ末端シグナルペプチドである。
【００７９】
特定の実施形態において、前記Ｎ末端シグナルペプチドは、シアリダーゼ（ｓｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）、好ましくはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓのシアリダーゼ（ｓｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）、なお一層好ましくはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のシアリダーゼ（ＳｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）のシグナルペプチドである。
【００８０】
特定の実施形態において、前記Ｎ末端シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＮＲＩＦＹＬＬＦＡＦＶＬＬＳＡＣＧＳ（配列番号１９５）を有するＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のシアリダーゼ（ｓｉａＣ）のシグナルペプチド、またはアミノ酸配列ＭＫＫＩＶＳＩＳＬＦＦＬＩＳＡＴＩＷＬＡＣＫ（配列番号１９６）を有するＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のムチナーゼ（ＭｕｃＧ）のシグナルペプチドである。
【００８１】
本発明の別の態様は、本発明によるポリペプチドまたはポリペプチド前駆体をコードする核酸である。
【００８２】
「核酸」とは、本質的に、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドから構成される任意の長さのオリゴマーおよびポリマーを意味する。核酸は、プリンおよび／またはピリミジン塩基および／または他の天然のヌクレオチド塩基（例えば、キサンチン、イノシン、ヒポキサンチン）、化学的もしくは生化学的に修飾された（例えば、メチル化）ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。核酸の骨格は、典型的にはＲＮＡもしくはＤＮＡで見られるように糖およびリン酸基、および／または一つもしくは複数の修飾もしくは置換糖および／または一つもしくは複数の修飾もしくは置換リン酸基を含み得る。リン酸基または糖の修飾は、安定性、酵素的分解に対する抵抗性、または他のいくつかの有用な特性を
改善するために導入され得る。「核酸」は、例えば、二本鎖、部分的二本鎖、または一本鎖であり得る。一本鎖である場合、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。加えて、核酸は環状または線状であり得る。「核酸」という用語は、本明細書中で使用される場合、好ましくはＤＮＡおよびＲＮＡを包含し、特にＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、プロウイルス、プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む。
【００８３】
本発明による核酸は、好適な発現宿主においてポリペプチドを発現させることができる一つもしくは複数の制御配列に機能的に連結された核酸構築物中に含まれ得る。核酸構築物という用語は、発現宿主に移される予定の核酸の人工的に構築されたセグメントを指す。機能的連結は、発現させようとする調節配列および配列が、前記発現を可能にするような方法で結合されている連結である。例えば、プロモータおよびＯＲＦなどの配列は、前記配列間の連結の性質が：（１）フレームシフト変異の導入をもたらさない、（２）ＯＲＦの転写を指示するプロモータの能力を妨害しない、（３）プロモータ配列から転写されるＯＲＦの能力を妨害しない場合に、機能的に連結されているということができる。したがって、「機能的に連結される」とは、プロモータなどの発現制御配列が、本明細書中で定義する核酸分子などの関心対象のコーディング配列の発現を効果的に制御するように、遺伝子構築物に組み込まれることを意味し得る。
【００８４】
核酸配列はまた、タグをコードする核酸フラグメントも含み得る。タグは、発現されたペプチドの精製（例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグ）、適切なタンパク質フォールディングを支援するため（例えば、チオレドキシン）、分離技術を支援するため（例えば、ＦＬＡＧ−タグ）、または酵素的もしくは化学的修飾を支援するため（例えば、ビオチンリガーゼタグ、ＦＩＡｓｈ）、あるいは検出（例えば、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリン−タグ、ポリグルタメートタグ、Ｅ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ、緑色蛍光タンパク質タグ、ハロ−タグ、マルトース結合タンパク質−タグ、Ｎｕｓ−タグ、チオレドキシン−タグまたはＦｃ−タグ）などの様々な目的のために有用であり得る。本発明の文脈では、それらの主な目的は精製である。
【００８５】
本発明の別の態様は、本発明にかかる核酸、プロモータ、および転写、翻訳終止シグナル、および好ましくは、選択マーカーを含む組換え発現ベクターに関する。
【００８６】
「ベクター」という用語は、本明細書中で使用する場合、１つの環境から別の環境への実体の移動を可能にするかまたは容易にするツールである。挿入されたセグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメントを挿入することができるのは、プラスミド、ファージ、またはコスミッドなどのレプリコンである。本願では、ベクターは、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子である。ベクターの１種は「プラスミド」であり、これは、環状二本鎖ＤＮＡループであって、その中にさらなるＤＮＡセグメントをライゲートできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプはファージベクターである。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲートすることができる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律増殖が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが機能的に連結される遺伝子の発現を行うことができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または簡単に「組換えベクター」）と称される。概して、組換えＤＮＡ技術において有用性を有する発現ベクターは、多くの場合、プ
ラスミドの形態である。本明細書において、プラスミドは最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いることができる。
【００８７】
特定のベクターの選択において重要性を有する因子としては、特に：レシピエント宿主細胞の選択、ベクターを含むレシピエント細胞が認識され、ベクターを含まないレシピエント細胞から選択され得る容易さ；特定のレシピエント細胞において望まれるベクターのコピー数；ベクターにとって染色体に組み込まれるか、それともレシピエント細胞において染色体外にとどまるのが望ましいか；そして異なる種のレシピエント細胞間のベクターを「往復」させることができることが望ましいか否かが挙げられる。
【００８８】
発現ベクターは自律的または組込み型であり得る。組換え核酸は、宿主細胞中にプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミッドまたはウイルス粒子などの発現ベクターの形態で導入することができる。組換え核酸は、染色体外に維持することができるか、または細胞染色体ＤＮＡに組み込むことができる。発現ベクターは、選択された条件下で細胞生存率のために必要なタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子（例えば、ウラシル生合成に必要な酵素をコードするＵＲＡ３またはトリプトファン生合成に必要な酵素をコードするＴＲＰ１）を含んで、所望の核酸で形質転換された細胞の検出および／または選択を可能にすることができる。発現ベクターはまた、自律増殖配列（ＡＲＳ）を含み得る。
【００８９】
組込み型ベクターは、概して、少なくとも第１の挿入可能なＤＮＡフラグメント、選択マーカー遺伝子、および第２の挿入可能なＤＮＡフラグメントの順次配置された配列を含む。第１および第２の挿入可能なＤＮＡフラグメントは、各々、約２００（例えば、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、または約１０００以上）のヌクレオチド長であり、形質転換される宿主細胞種のゲノムＤＮＡの一部と相同性であるヌクレオチド配列を有する。発現のための関心対象の遺伝子を含むヌクレオチド配列を、マーカー遺伝子の前または後を問わず、このベクターに第１および第２の挿入可能なＤＮＡフラグメント間で挿入する。組込み型ベクターは、形質転換前に線形化して、関心対象のヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの組込みを容易にすることができる。
【００９０】
ベクターは様々な方法を使用して宿主細胞に導入することができる。外来ＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクションする方法は当該技術分野で公知であり、手段（例えば、エレクトロポレーション、微粒子銃技術、マイクロインジェクション、レーザーフェクション（ｌａｓｅｒｆｅｃｔｉｏｎ）、オプトインジェクション（ｏｐｔｏ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ））または試薬（例えば、脂質、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥ−デキストラン、活性化デンドリマーまたは磁気ビーズ）を含み得、ウイルス媒介性であり得るか、または当業者に公知の任意の他の手段によるものであり得る。安定なトランスフェクションにおいて、細胞は、それらのゲノム中に外来ＤＮＡを組み入れている。一過性トランスフェクションにおいて、外来ＤＮＡはゲノム中に組込まれないが、遺伝子が限定された時間で発現される（２４〜９６時間）。「形質転換」という用語は、細菌および非動物真核細胞中の外来ＤＮＡ移入を説明するために用いられる。これは、化学的にコンピテントな細菌の熱ショックによるか、エレクトロポレーションによるか、または当該技術分野で公知の他の形質転換法によって得ることができる。
【００９１】
「宿主細胞」という用語は、本明細書中で使用する場合、一つもしくは複数のポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡが、トランスフェクションにより導入された細胞を指す。一例として、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞を含む真菌細胞、動物細胞、またはヒト細胞および非ヒト哺乳動物細胞を含む哺乳動物細胞であってよい。好ましくは、バイオセーフティレベル（ＢＳＬ）１または２で使用することができる種由来の細菌細胞（細菌のＢＳＬは、例えば、アメリカ合衆国公衆衛生局ガイドラインまたは作業時の生物学的製剤への
曝露に関連する危険性からの作業員の保護に関する１９９０年１１月２６日の理事会指令９０／６７９／ＥＥＣ、ＯＪ  Ｎｏ．Ｌ３７４、ｐ．１によって決定される）、さらに好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、なお一層好ましくはＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓまたはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ、最も好ましくはＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓの細菌細胞である。
【００９２】
本明細書中で使用する場合、「プロモータ」という用語は、遺伝子が転写されることを可能にするＤＮＡ配列を指す。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、これは次に転写を開始する。したがって、プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼによって直接結合するか、またはＲＮＡポリメラーゼの動員に関与するかのいずれかであるＤＮＡ配列を含む。プロモータ配列はまた、「エンハンサー領域」も含み得、これは、タンパク質（すなわち、トランス作用因子）と結合して、遺伝子クラスター中で遺伝子の転写レベルを増強することができるＤＮＡの一つもしくは複数の領域である。エンハンサーは、通常はコーディング領域の５’にあるが、プロモータ配列から分離することもでき、例えば、遺伝子のイントロン領域または遺伝子のコーディング領域内に対して３’側にあり得る。
【００９３】
プロモータは構成的または誘導性（条件的）プロモータであり得る。構成的プロモータは、その発現が標準的培養条件下で定常的であるプロモータであると理解される。誘導性プロモータは、一つもしくは複数の誘導の手がかりに応答するプロモータである。例えば、誘導性プロモータは、化学的に調節することができる（例えば、その転写活性が、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属、もしくは他の小分子などの化学的誘導剤の有無によって調節されるプロモータ）または物理的に調節することができる（例えば、その転写活性が、光または高温もしくは低温などの物理的誘導因子の有無によって調節されるプロモータ）。誘導性プロモータはまた、化学的または物理的手がかりによってそれ自身が直接調節される一つもしくは複数の転写因子によって間接的に調節され得る。
【００９４】
本明細書中で使用する場合、「終止シグナル」という用語は、転写ターミネータまたは翻訳終止コドンを指す。転写ターミネータは、転写の間のゲノムＤＮＡ中の遺伝子またはオペロンの末端を示す核酸配列のフラグメントである。この配列は、転写複合体からｍＲＮＡを放出し、それによって転写終結を媒介するプロセスを引き起こす、新たに合成されたｍＲＮＡにおけるシグナルを提供する。終止コドンは、アミノ酸をコードせず、それによってタンパク質の合成の終結のシグナルを送るｍＲＮＡ内のヌクレオチドトリプレットである。ＲＮＡにおいて、この終止コドンは、ＵＡＧ、ＵＡＡまたはＵＧＡであり得、ここで、Ｕはウラシルであり、Ａはアデニンであり、Ｇはグアニンである。
【００９５】
本明細書中で使用する場合、「選択マーカー」という用語は、細胞がこのマーカー遺伝子の発現に基づいて核酸構築物の異なる核酸を発現することができるか否かが判定できるマーカー遺伝子を指す。典型的には、宿主細胞の培養培地に添加される化合物に対する耐性を付与し、トランスフェクトされていない細胞を除去するが、トランスフェクトされた細胞を除去しない（正の選択、例えば、抗生物質に対する耐性）、マーカー遺伝子を使用する。例えば、選択抗生物質は、ジェネテシン、ゼオシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、エリスロマイシン、セフォキシチン、ゲンタマイシンまたはブラスチシジンであり得る。それらのコーディング配列は、典型的には、遺伝子材料を標的細胞に送達するために使用される核酸ベクターに組み込まれる。
【００９６】
さらに、本発明はさらに、
（ａ）以下のコンセンサス配列：Ｘ１Ｘ２ＤＤ（配列番号６８）、Ｘ１Ｘ２ＤＥ（配列番号６９）、Ｘ１Ｘ２ＥＤ（配列番号７０）またはＸ１Ｘ２ＥＥ（配列番号７１）であって、Ｘ１が任意のアミノ酸であり得、Ｘ２が、Ｋ、Ｓ、ＴおよびＡからなる群から選択され
、ただし、Ｘ２がＡである場合、Ｘ１がＱであるもののうちのいずれか１つによるアミノ酸配列を含むＬＥＳをコードする核酸配列；
（ｂ）任意に、シグナルペプチドをコードする核酸配列であって、前記シグナルペプチドが、好ましくは、シグナルペプチダーゼタイプＩＩによって特異的に認識されるｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含み、前記シグナルペプチドをコードする前記核酸配列が、前記ＬＥＳをコードする前記核酸配列の５’に位置する、核酸配列；
（ｃ）任意に、プロテアーゼ切断部位モチーフをコードする核酸配列であって、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフをコードする前記核酸配列とは異なり、前記ＬＥＳをコードする前記核酸配列の３’に位置する、前記プロテアーゼ切断部位モチーフをコードする前記核酸配列；および
（ｄ）マルチクローニングサイトであって、前記ＬＥＳおよび前記プロテアーゼ切断部位モチーフをコードする前記核酸の３’に位置する、前記マルチクローニングサイト
を含む組換え発現ベクターにも関する。
【００９７】
「マルチクローニングサイト」という用語は、本明細書中で使用する場合、複数の、好ましくは５、１０、１５または２０の、互いに非常に接近した制限酵素認識部位を含むＤＮＡの短いセグメントを指し、この場合、前記制限酵素認識部位は、典型的には前記マルチクローニングサイトを含むベクター内で１回だけ存在し得る。したがって、制限酵素が前記制限酵素認識部位のうちの１つを切断する場合、ベクターは直線化されるが、フラグメント化されない。
【００９８】
本発明はさらに、
（ａ）グラム陰性菌のリポタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸配列であって、前記シグナルペプチドが前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含み、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフが前記アミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃ（配列番号２０３）からなり、シグナルペプチダーゼタイプＩＩによって特異的に認識される核酸配列；
（ｂ）以下のコンセンサス配列：
−Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸがＱであるとする、ＸＪＺＺ（配列番号１９７）；
−ＢがＳおよびＴからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ＵがＤ、ＥおよびＦからなる群から選択される、ＢＺＺＵＺ（配列番号１９８）；または
−ＸおよびＯが任意のアミノ酸であり得、好ましくはＯがＶである、ＸＫＥＯＥ（配列番号１９９）、好ましくはＸＫＥＯＥＥ（配列番号２００）
のいずれか１つ；
好ましくは、Ｘが任意のアミノ酸であり得、ＪがＫおよびＡからなる群から選択され、ＺがＤおよびＥからなる群から選択され、ただし、ＪがＡである場合、ＸがＱであるとする、ＸＪＺＺ
によるアミノ酸配列を有するリポタンパク質搬出シグナルをコードする核酸配列であって；
前記リポタンパク質搬出シグナルをコードする前記核酸配列が前記シグナルペプチドをコードする前記核酸配列の直接下流に位置する、核酸配列；
（ｃ）任意に、プロテアーゼ切断部位モチーフをコードする核酸配列であって、前記プロテアーゼ切断部位モチーフが前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフとは異なり、前記リポタンパク質搬出シグナルをコードする前記核酸配列および前記シグナルペプチドをコードする前記核酸配列の下流に位置する、核酸配列；ならびに
（ｄ）マルチクローニングサイトであって、前記リポタンパク質搬出シグナルをコードする前記核酸および前記シグナルペプチドをコードする前記核酸の下流に位置し、そして任意に、前記プロテアーゼ切断部位モチーフの下流に位置する、マルチクローニングサイト
を含む組換え発現ベクターにも関する。
【００９９】
特定の実施形態において、前記リポタンパク質搬出シグナルは全体として負に荷電している。
【０１００】
特定の実施形態において、前記ＬＥＳは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７に記載れている配列のいずれか、好ましくは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７に記載されている配列のいずれか、さらに好ましくは、配列番号１、２、１６、１７または１８に記載されている配列のいずれかである。
【０１０１】
特定の実施形態において、前記ＬＥＳは、
−配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、１９１、１９２、１９３または１９４、好ましくは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７；
−配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９；あるいは
−配列番号４９、５０、５１、６３、６４または６６、好ましくは、配列番号４９、５０、５１または６３
に記載されている配列のいずれかである。
【０１０２】
好ましい実施形態において、前記ＬＥＳは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、１９１、１９２、１９３または１９４、好ましくは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７
に記載されている配列のいずれかである。
【０１０３】
特定の実施形態において、前記Ｎ末端シグナルペプチドは、ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓのＮ末端シグナルペプチド、さらに好ましくはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓのＮ末端シグナルペプチド、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓのＮ末端シグナルペプチドまたはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅのＮ末端シグナルペプチド、なお一層好ましくはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓのＮ末端シグナルペプチドである。
【０１０４】
特定の実施形態において、前記Ｎ末端シグナルペプチドは、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓのシアリダーゼ（ｓｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）、なお一層好ましくはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のシアリダーゼ（ＳｉａＣ）またはムチナーゼ（ＭｕｃＧ）のシグナルペプチドである。
【０１０５】
特定の実施形態において、前記Ｎ末端シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＮＲＩＦＹＬＬＦＡＦＶＬＬＳＡＣＧＳ（配列番号１９５）を有するＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のシアリダーゼ（ｓｉａＣ）のシグナルペプチドまたはアミノ酸配列ＭＫＫＩＶＳＩＳＬＦＦＬＩＳＡＴＩＷＬＡＣＫ（配列番号１９６）を有するＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５のムチナーゼ（ＭｕｃＧ）のシグナルペプチドである。
【０１０６】
細菌宿主細胞は、当業者に公知のすべての細菌種由来の細菌細胞であり得る。好ましくは、バイオセーフティレベル（ＢＳＬ）１もしくは２（細菌のＢＳＬは、例えば、アメリカ合衆国公衆衛生局ガイドラインによって、または、作業時の生物学的製剤への曝露に関連する危険性からの作業員の保護に関する１９９０年１１月２６日の理事会指令９０／６７９／ＥＥＣ、ＯＪＮｏ．Ｌ３７４、ｐ．１によって決定される）で使用できる細菌種である。
【０１０７】
特定の実施形態において、本発明による宿主細胞は細菌細胞であり、好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ門の細菌細胞であり、さらに好ましくはＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ
ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓまたはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ、なお一層好ましくはＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓである。
【０１０８】
本発明はまた以下のコンセンサス配列：Ｘ１Ｘ２ＤＤ（配列番号６８）、Ｘ１Ｘ２ＤＥ（配列番号６９）、Ｘ１Ｘ２ＥＤ（配列番号７０）またはＸ１Ｘ２ＥＥ（配列番号７１）であって、Ｘ１が任意のアミノ酸であり得、Ｘ２が、Ｋ、Ｓ、ＴおよびＡからなる群から選択され、Ｘ１がＱである場合、Ｘ２はＡのみであり得るもののいずれか一つによるアミノ酸配列を含むＬＥＳの、宿主細胞中の機能的に活性なポリペプチドなどのポリペプチドの表面露出のための使用も提供し、前記ポリペプチドは前記宿主細胞と同じかまたは異なる生物に由来する。
【０１０９】
さらに、本発明は、以下のコンセンサス配列：
−Ｘが任意のアミノ酸であり得、Ｊが、ＫおよびＡからなる群から選択され、Ｚが、ＤおよびＥからなる群から選択され；ただし、ＪがＡである場合、ＸはＱであるとする、ＸＪＺＺ（配列番号１９７）；
−Ｂが、ＳおよびＴからなる群から選択され、Ｚが、ＤおよびＥからなる群から選択され、そしてＵが、Ｄ、ＥおよびＦからなる群から選択される、ＢＺＺＵＺ（配列番号１９８）；または
−ＸおよびＯが任意のアミノ酸であり得、好ましくは、ＯはＶである、ＸＫＥＯＥ（配列番号１９９）、好ましくはＸＫＥＯＥＥ（配列番号２００）
のいずれか１つ；
好ましくは、Ｘが任意のアミノ酸であり得、Ｊが、ＫおよびＡからなる群から選択され、Ｚが、ＤおよびＥからなる群から選択され；ただし、ＪがＡである場合、ＸはＱであるとする、ＸＪＺＺ
によるアミノ酸配列を含むリポタンパク質搬出シグナル、宿主細胞におけるポリペプチドの表面露出のための使用も提供し、前記ポリペプチドは同じかまたは前記宿主細胞とは異なる生物由来である。
【０１１０】
特定の実施形態において、前記リポタンパク質搬出シグナルは全体で負に荷電している。
【０１１１】
特定の実施形態において、前記リポタンパク質搬出シグナルは、前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含むグラム陰性菌のリポタンパク質のＮ末端シグナルペプチドに由来するＮ末端脂質修飾システイン残基に直接隣接する位置にあり、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフは、アミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃ（配列番号２３０）からなり、シグナルペプチダーゼタイプＩＩによって特異的に認識可能である。
【０１１２】
特定の実施形態において、前記リポタンパク質搬出シグナルおよび前記ポリペプチドはポリペプチド配列において天然では一緒に存在しない。
【０１１３】
特定の実施形態において、前記ＬＥＳは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７に記載される配列のいずれか、好ましくは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７に記載される配列のいずれか、さらに好ましくは、配列番号１、２、１６、１７または１８に記載される配列のいずれかである。
【０１１４】
特定の実施形態において、前記ＬＥＳは
−配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、１９１、１９２、１９３または１９４、好ましくは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７；
−配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９；あるいは
−配列番号４９、５０、５１、６３、６４または６６、好ましくは配列番号４９、５０、５１または６３
に記載される配列のいずれかである。
【０１１５】
好ましい実施形態において、前記ＬＥＳは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、１９１、１９２、１９３または１９４、好ましくは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７に記載される配列のいずれかである。
【０１１６】
以前は死因となっていた多くの疾患が、現在はワクチン接種によって予防される。ワクチンは、特定の疾患に対する免疫を改善する生物学的製剤である。ワクチンは、典型的には疾患を引き起こす微生物（「抗原」）に似た薬剤を含み、多くの場合、前記微生物の弱毒化または死菌形態、その毒素またはその表面タンパク質の１つから作製される。ワクチンは非常に成功を収めているが、いくつかの既存のワクチンの有効性を増大させるため、またはマラリアやＨＩＶなどの疾患を予防もしくは治療するための新しい戦略を見出す必要がある。アジュバントを使用して、免疫系を刺激して、ワクチンに対してより活発に応答し、したがって特定の疾患に対する増大した免疫を提供することによって、ワクチンの効果を修飾または増強することができる。特に、アジュバントは、抗原に対する免疫応答を増強および／または所望の免疫応答へ向けて調節する成分であり、今日では、ＤＣ上に存在する表面分子と相互作用する溶解性メディエータおよび抗原キャリア（例えば、ＬＰＳ、Ｆｌｔ３Ｌ、熱ショックタンパク質）、ＡＰＣに利用可能であるが、他の細胞タイプには利用可能でない機序によって取り込まれる微粒子状抗原（例えば、免疫刺激複合体、ラテックス、ポリスチレン粒子）および抗原提示細胞に感染するウイルス／細菌ベクター（例えば、ワクシニア、レンチウイルス、アデノウイルス）が含まれる。
【０１１７】
生細菌細胞は、組換え抗原を送達するためのビヒクルとして使用することができる。遺伝子工学技術の発展によって、異なる細胞コンパートメントにおいて異種タンパク質を発現できる組換え型微生物の構築が可能になり、ウイルス、細菌、および寄生虫に対するワクチンの生産のためのそれらの抗原の可能性が改善された。例えば、病原体の弱毒化型または非病原性型由来のワクチンは、その病原体によって引き起こされる疾患の予防または
治療において非常に有効である。特に、異種抗原を発現するためにそのような弱毒化または非病原性病原体を改変できることは公知である。
【０１１８】
キャリアを組換え抗原のソースとして使用することによって、反応原性である可能性がある病原体からの任意のさらなる産物の存在が排除される（例えば、細胞ワクチン中の潜在的な微量の共精製された産物）。細菌キャリアの使用は、低い生産バッチ調製コスト、他の処方と比べて増大した有効期間および安定性、容易な投与および低い送達費用などのいくつかの利点と関連する。
【０１１９】
抗原送達系として好適であるとみなされ、良好な免疫原性プロフィールを示す細菌種の非限定例は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ、Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．である。
【０１２０】
タイプＩおよびタイプＩＩＩ分泌系などの多数の細菌分泌系を使用して、関心対象の抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）のサイトゾルに直接送達し、エフェクタおよびメモリーＴ−ＣＤ８＋リンパ球の活性化に至る。あるいは、抗原を細菌の表面上に発現させて、免疫応答を誘導することができる。この露出のために、関心対象の抗原を典型的に発現させて、ベクターの表面タンパク質に融合させる（ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１４，４５（４））。これらの融合タンパク質の数例としては、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ、ＴｏｌＣ、ならびにＥ．ｃｏｌｉのＦｉｍＨおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａのＰｕｌＡが挙げられる。
【０１２１】
本発明に係るＬＥＳを、関心対象の抗原に導入するかまたは結合させることができ、細菌細胞の表面上での前記抗原の発現に至り、それによって抗原特性が増強される。したがって、本明細書中で記載するＬＥＳを含むペプチドまたはポリペプチドおよび好ましくは前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含むグラム陰性菌のリポタンパク質のＮ末端シグナルペプチドであって、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフがアミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃからなり、本明細書中で記載するシグナルペプチダーゼタイプＩＩによって特異的に認識可能であるものは、ヒト共生または弱毒化病原菌細胞上に相同または異種エピトープを露出させて抗原特異的抗体応答を誘導するための生または不活化ワクチン開発のために使用できる。
【０１２２】
さらに、関心対象のタンパク質の表面発現を達成するために、関心対象のタンパク質と、ＯｍｐＡもしくはＴｏｌＣなどのトランスポータータンパク質、またはＦｉｍＨなどの複雑な細胞機構の一部であるタンパク質との融合タンパク質の形成は、宿主細菌の生理学的影響がないわけではない可能性がある。本発明に係る、ＬＥＳ配列のみ、および好ましくはＮ末端シグナルペプチドも含むタンパク質またはポリペプチドを使用して、細菌生理学に影響を及ぼすことなく細胞表面の充分な被覆を達成することができ、したがって、タンパク質の細胞表面発現を得るための既存の方法よりも有利である。
【０１２３】
したがって、本発明の別の態様は、ワクチンを製造するための、本発明にかかるペプチドまたはポリペプチド、ポリペプチド前駆体、核酸、組換え発現ベクターおよび組換え宿主細胞の使用である。
【０１２４】
特定の実施形態において、本発明にかかるペプチドまたはポリペプチドは、抗原、またはそのエピトープである。
【０１２５】
「抗原」という用語は、本明細書中で使用する場合、宿主生物の部分に対して免疫応答を誘導することができる任意のポリペプチド、またはそのフラグメントを指し、それに対する抗体の産生をもたらす。好ましくは、抗原は、２００ｋＤａ以下、１５０ｋＤａ以下、１００ｋＤａ以下、５０ｋＤａ以下、さらに好ましくは、１００ｋＤａ以下または５０ｋＤａ以下のサイズを有する。好ましくは、抗原は少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸または少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸を含む。さらに、抗原は、好ましくは、その元の宿主（病原体）において、ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓまたはＦ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅのような非病原性Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓにおいて表面露出している。
【０１２６】
ＬＥＳおよび／または古典的リポタンパク質のＮ末端シグナルペプチド、好ましくは前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフであって、本明細書中で記載されるように、アミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃ（配列番号２０３）からなり、シグナルペプチダーゼタイプＩＩによって特異的に認識可能である前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含むグラム陰性菌のリポタンパク質のＮ末端シグナルペプチドを抗原に添加すると、前記抗原の表面発現がもたらされる。したがって、特定の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、相同または異種抗原であり、宿主細胞の表面に露出している。
【０１２７】
宿主細胞は、好ましくは、関心対象である抗原を発現することができる細胞である。さらに、宿主細胞は、好ましくは一つもしくは複数の輸送系と、古典的リポタンパク質シグナルペプチド、好ましくは前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含むグラム陰性菌のリポタンパク質のＮ末端シグナルペプチドを認識できるＳＰＩＩペプチダーゼとを含み、この場合、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフは、アミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃ（配列番号２０３）からなり、本明細書中で記載するようなシグナルペプチダーゼタイプＩＩ、および／またはＬＥＳコンセンサスモチーフを特異的に認識可能であり、本発明に係る前記ＬＥＳモチーフを含む抗原を細胞表面へ輸送することができる。好ましくは、宿主細胞は細菌細胞であり、さらに好ましくはグラム陰性菌細胞であり、なお一層好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門由来の細菌細胞である。
【０１２８】
特定の実施形態において、２つ以上の異なる関心対象の抗原が、同じ宿主細胞の細胞表面で発現され、露出している。
【０１２９】
本発明に係る表面抗原を発現する宿主細胞を使用して、動物においてポリクローナル抗体などの抗体を産生することができる。これは、血清中の抗原特異的抗体の高い発現レベルを上昇させるために、表面抗原を発現する前記宿主細胞を実験動物または家畜に注射することによって達成され、これは次に、動物から回収することができる。ポリクローナル抗体は血清から直接回収することができる一方で、モノクローナル抗体は、免疫化されたマウスからの抗体を分泌する脾臓細胞を不死化骨髄腫細胞と融合させて、細胞培養上清において特異的抗体を発現するモノクローナルハイブリドーマ細胞系を作製することによって産生される。
【０１３０】
したがって、本発明の別の態様は、抗体産生のための、本発明にかかるポリペプチド、ポリペプチド前駆体、核酸、組換え発現ベクターおよび組換え宿主細胞の使用であって、好ましくは、前記ポリペプチドは抗原であり、さらに好ましくは異種抗原である。
【０１３１】
特定の実施形態において、２つ以上の異なるポリペプチドは、宿主細胞の表面上で発現される。好ましくは、前記ポリペプチドは抗原であり、さらに好ましくは異種抗原である。
【０１３２】
特定の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門、好ましくはＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓまたはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ由来の細菌細胞の表面に露出される。
【０１３３】
組換えタンパク質は生物学的および生物医科学全体にわたって使用される。組換えＤＮＡ技術によって、多量の所望のタンパク質を産生する細胞の開発が可能になる。組換え型発現によってタンパク質が標識され（例えば、Ｈｉｓ−タグ）、これによって精製が容易になり、天然源で存在するよりも高い割合で関心対象のタンパク質が発現される。通常、タンパク質精製プロトコルは一つもしくは複数の沈殿およびクロマトグラフィーステップを含み、所望のタンパク質を単離することが可能になる。関心対象のタンパク質が生物によって周囲の溶液中に分泌されない場合、各精製プロセスの最初のステップは、タンパク質を含有する細胞の破砕である。これは、例えば、繰り返し凍結および解凍すること、超音波処理、高圧均質化または界面活性剤および／もしくは酵素による透過処理によって達成することができる。残念なことに、プロテアーゼも、細胞溶解の間に放出され、これはタンパク質の溶液中での消化を開始する。したがって、反応を減速するために抽出物を迅速に取り扱い、冷却しなければならない。別法として、一つもしくは複数のプロテアーゼ阻害剤を細胞破砕の直前に溶解緩衝液に添加することができる。場合によって、高ＤＮＡ含有量に起因する細胞ライセートの粘度を低下させるために、ＤＮＡｓｅも添加する必要がある。
【０１３４】
本発明に係るＬＥＳを含むポリペプチドおよび好ましくはさらに前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含むグラム陰性菌のリポタンパク質のＮ末端シグナルペプチドであって、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフがアミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃからなり、本明細書中で記載するようなシグナルペプチダーゼタイプＩＩによって特異的に認識可能であるものは、サイトゾルまたは分泌された組換えタンパク質の入念な精製ステップを回避する純粋なタンパク質を直ちに産生することが可能になる新規システムとして使用することができる。これは、関心対象の遺伝子の５’領域において、（ｉ）シグナルペプチダーゼタイプＩＩによって特異的に認識されるｌｉｐｏｂｏｘモチーフ、好ましくは前記シグナルペプチドのＣ末端の一番端に位置するｌｉｐｏｂｏｘモチーフを含むグラム陰性菌のリポタンパク質のＮ末端シグナルペプチドを含む古典的リポタンパク質シグナルペプチドであって、前記ｌｉｐｏｂｏｘモチーフがアミノ酸配列Ｌ（Ｓ／Ａ）（Ａ／Ｇ）Ｃ（配列番号２０３）からなり、本明細書中で記載するようなシグナルペプチダーゼタイプＩＩによって特異的に認識可能である前記リポタンパク質シグナルペプチド、（ｉｉ）本発明に係るＬＥＳおよび（ｉｉｉ）特異的プロテアーゼ（例えばＴＥＶ）の切断部位を有するリポタンパク質を生成するオリゴヌクレオチドをクローニングすることによって達成できる。次に、関心対象の遺伝子は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ群の細菌（例えば、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓまたは好ましくはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅのようなバイオセーフティクラスＩ生物）で発現される。培養後、関心対象のタンパク質で覆われた細菌を得る。関心対象のタンパク質は脂質アンカーによってＯＭに結合したままである。その後、細菌を洗浄することができ、またタンパク質不含緩衝液中に再懸濁することができる。次いで、導入された切断部位を切断する特異的プロテアーゼの使用によって組換えタンパク質を放出させる。細菌をペレット化したのち、関心対象のタンパク質およびプロテアーゼのみを含む溶液を得る。プロテアーゼは、例えば、イムノビーズの使用によって容易に除去することができる。したがって、純粋な組換えタンパク質は、本発明に係るポリペプチド、核酸、組換え発現ベクターおよび組換え宿主細胞を使用する最小数の精製ステップによって得ることができる。
【０１３５】
したがって、本発明の別の態様は、本発明にかかるポリペプチド、ポリペプチド前駆体、核酸、組換え発現ベクターおよび組換え宿主細胞の、タンパク質産生および精製のため
の使用である。
【０１３６】
細菌表面ディスプレイは、タンパク質の機能を、それをコードする遺伝子と関連付けることを可能にし、所望の特性を有する標的タンパク質（例えば、酵素基質、細胞特異的ペプチドまたはタンパク質結合ペプチド）を見出し、細胞特異的アフィニティリガンドを作製する、タンパク質工学技術である。ポリペプチドのライブラリは、細菌の表面上でディスプレイすることができ、その後、蛍光活性化細胞選別、磁気活性化細胞選別および／または反復選択手順を使用してスクリーニングすることができる。
【０１３７】
したがって、本発明の別の態様は、本発明にかかるポリペプチド、ポリペプチド前駆体、核酸、組換え発現ベクターおよび組換え宿主細胞の、細菌ディスプレイを実施するための使用である。
【０１３８】
特定の実施形態において、２つ以上の異なるポリペプチドが宿主細胞の表面上で発現される。
【０１３９】
酵素をそれらの細胞表面に露出させる細菌を固定することができ、固体支持体またはマトリックスへの酵素固定化のための代替策として使用することができる。細菌は、例えば、キャリア結合、自己凝集または捕捉により固定化することができる。細菌の表面上に露出した酵素は、関心対象の酵素が抽出するのが困難もしくは費用がかかる場合、または一連の酵素が反応において必要とされる場合に特に有用である。酵素をそれらの細胞表面に露出させる細菌は全細胞生体触媒として作用し得る。固定化された全細胞生体触媒によって触媒される反応は、任意に補助因子または完全な代謝経路を伴う、単一の酵素、複数の酵素系を含む反応であり得る。典型的には、酵素を露出させる細菌を、基質またはエフェクタまたは阻害剤分子を含む培地と接触させ、酵素的反応を起こさせる。固定化酵素を、抗生物質、飲料またはアミノ酸の工業生産を含む多くの用途のために、薬物送達系として、疾患の診断および治療において、食品の生産において（例えば、果実および野菜からのシロップ）、バイオディーゼルの生産において、下水および工業廃水の廃水処理において、繊維産業において（例えば、精錬、バイオポリッシング（ｂｉｏ−ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ））、衣類の汚れ除去のためなどで使用することができる。例えば、それらの細胞表面上でアミノ−アシラーゼを発現する細菌を、Ｌ−アミノ酸産生のために使用できる。
【０１４０】
したがって、本発明の別の態様は、本発明にかかるポリペプチド、ポリペプチド前駆体、核酸、組換え発現ベクターおよび組換え宿主細胞の、全細胞に基づく生体触媒適用のための使用であり、好ましくは、前記ポリペプチドは酵素またはその触媒活性なフラグメントである。
【０１４１】
特定の実施形態において、２つ以上の異なるポリペプチドが宿主細胞の表面上に発現される。好ましくは、前記ポリペプチドは酵素、またはその触媒活性なフラグメントである。
【０１４２】
バイオセンサーは、生物学的認識成分（「バイオレセプター」）を物理化学的検出器と組み合わせ、とりわけ、バイオプロセスモニタリング、食品中の残留薬剤の測定、創薬、糖尿病患者におけるグルコースモニタリングまたは環境への応用に有用である。生物学的認識成分は、それらの細胞表面上で関心対象のバイオレセプターを発現する、細菌などの宿主細胞であり得る。バイオレセプターとサンプル中の関心対象のアナライトとの相互作用は、サンプル中の標的アナライトの存在に比例して測定可能なシグナルを出力する物理化学的検出器によって測定することができる。バイオレセプター／アナライト相互作用は、抗体／抗原、酵素、核酸／ＤＮＡ、細胞構造／細胞または生体模倣物質の相互作用に基づくものであり得る。
【０１４３】
したがって、本発明の別の態様は、バイオセンサーを産生するための本発明にかかるポリペプチド、ポリペプチド前駆体、核酸、組換え発現ベクターおよび組換え宿主細胞の使用である。
【０１４４】
自身の細胞表面上に汚染物質を結合させることができるポリペプチドを発現する、細菌などの宿主細胞は、汚染物質を宿主細胞の細胞表面上に吸着させる、バイオ吸着（「バイオソープション」）と呼ばれるプロセスのために使用することができる。宿主細胞のバイオソープション能力は、前記宿主細胞の細胞表面上で発現されるポリペプチドのセットを修飾することによって増強することができる。例えば、関心対象の化学物質または重金属を特異的に認識して結合するポリペプチドを発現する細菌は、環境から関心対象の前記特異的有害化学物質または重金属を除去するために使用することができる。工業規模で、バイオソープションは、汚染物質を含有する廃液が供給される収着カラムを使用して実施されることが多い。
【０１４５】
したがって、本発明の別の態様は、バイオソープション適用のための本発明にかかるポリペプチド、ポリペプチド前駆体、核酸、組換え発現ベクターおよび組換え宿主細胞の使用である。
【０１４６】
本発明さらに、本発明に係るポリペプチド、ポリペプチド前駆体、核酸または発現ベクターの使用であって、前記ポリペプチドおよび／または前記ポリペプチド前駆体が、前記ポリペプチド、前記ポリペプチド前駆体、前記核酸および／または前記発現ベクターを含む宿主細胞の表面に露出される抗原、もしくはそのエピトープ、または酵素、もしくはその触媒活性なフラグメントを含む、ならびに／あるいは前記核酸もしくは前記発現ベクターが、前記ポリペプチド、前記ポリペプチド前駆体、前記核酸および／または前記発現ベクターを含む宿主細胞の表面に露出される抗原、もしくはそのエピトープ、または酵素、もしくはその触媒活性なフラグメントをコードする前記使用にも関する。
【０１４７】
特定の実施形態において、前記宿主細胞は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、好ましくはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓまたはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅである。
【０１４８】
本発明をさらに、以下の非限定的実施例で説明する。
【実施例】
【０１４９】
材料および方法
１．菌種および成長条件
この研究で使用した菌種を表Ｓ１に列挙する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株を溶原性ブロス（ＬＢ）中、３７℃にて通例どおり成長させた。Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ株を、５％ヒツジ血液（Ｏｘｏｉｄ）を追加したハートインフュージョン寒天（Ｄｉｆｃｏ）プレート（ＳＢプレート）で２日間、３７℃にて５％ＣＯ２の存在下で通例どおり成長させた。プラスミドを選択するために、抗生物質を以下の濃度で添加した：Ｅ．ｃｏｌｉについて１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ａｍｐ）、５０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｋｍ）およびＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓについて１０μｇ／ｍｌエリスロマイシン（Ｅｍ）、１０μｇ／ｍｌセフォキシチン（Ｃｆｘ）、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｍ）。
【０１５０】
２．正常なヒト血清（ＮＨＳ）の熱不活性化
ＮＨＳの１０ｍｌアリコート（Ｓ１−Ｌｉｔｅｒ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を解凍し、５６℃で１時間熱不活性化した。熱不活性化ヒト血清（ＨＩＨＳ）を次いで単回使用のアリコート中に分注し、−２０℃で保存した。
【０１５１】
３．ｓｉａＣおよびｍｕｃＧ発現プラスミドの構築
この研究で使用したプラスミドおよびプライマーをそれぞれ表Ｓ２およびＳ３に列挙する。ｓｉａＣ（Ｃｃａｎ＿０４７９０）は、Ｑ５  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０４９１Ｓ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してプライマー４１５９および７６９６で１００ｎｇのＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５ゲノムＤＮＡから増幅させた。初期変性は９８℃にて２分間、続いて３０サイクルの増幅（９８℃で３０秒、５２℃で３０秒、そして７２℃で２分）を行い、最後に７２℃で１０分間であった。精製後、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いてフラグメントを消化し、プラスミドｐＭＭ４７．Ａにクローニングし、プラスミドｐＦＬ１１７を得た。プライマー７１８２および７６２５を増幅のために使用し、フラグメントをｐＰＭ５にクローニングする以外は同じようにしてｍｕｃＧ（Ｃｃａｎ＿１７４３０）をクローニングした。
【０１５２】
部位特異的点変異は、ｓｉａＣについてはプライマー４１５９および７６９６そしてｍｕｃＧについては７１８２および７６２５と組み合わせてそれらの配列において所望の変異を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて各遺伝子のＮ末端部分およびＣ末端部分を別々に増幅することによって導入された。両ＰＣＲフラグメントを精製し、次いでＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒ０１０Ａ；Ｔａｋａｒａ）を使用してＰＣＲのために等量で混合した。初期変性は９８℃で２分間、続いて３０サイクルの増幅（９８℃で１０秒、６０℃で５秒、そして７２℃で３分３０秒）、そして最後に７２℃で１０分であった。最終的ＰＣＲ産物を次いで精製し、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を使用して消化し、ｓｉａＣおよびｍｕｃＧについてそれぞれプラスミドｐＭＭ４７またはｐＰＭ５にクローニングした。全ての挿入物における所望の点変異の組込みは配列決定によって確認した。ｓｉａＣおよびｍｕｃＧ変異体を発現するプラスミドをＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５  ｓｉａＣおよびｍｕｃＧ欠失株にそれぞれエレクトロポレーションによって移した。
【０１５３】
４．ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング
ＳＢプレート上で２日間成長させた細菌を集め、ＰＢＳで１回洗浄し、そして約５×１０８細菌に相当する、１のＯＤ６００で１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。細菌を、３分間５，０００ｇでの遠心分離によって集め、１００μｌのＳＤＳ  ＰＡＧＥ緩衝液（１％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５０ｍＭジチオトレイトール、０．０２％ブロモフェノールブルー、４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８）中に再懸濁させた。サンプルを５分間９６℃で加熱し、５μｌを１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上にロードした。ゲル電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜（１０６０００８；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に移し、一次抗体としてウサギ抗ＳｉａＣまたは抗ＭｕｃＧ抗血清、ならびに二次抗体としてブタ−ＨＲＰ抗ウサギ（Ｐ０２１７；Ｄａｋｏ）を使用してウェスタンブロットによって分析した。タンパク質は、ＬｕｍｉＧＬＯ（５４−６１−００、ＫＰＬ）を製造業者の指示に従って使用して検出した。
【０１５４】
５．ヒト唾液ムチン分解
新鮮なヒト唾液を健常なボランティアから集め、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してろ過滅菌した。ＳＢプレート上で２日間成長させた細菌を集め、ＰＢＳで１回洗浄し、そして１のＯＤ６００に設定した。１００μｌの細菌懸濁液（約５×１０７細菌）を次に１００μｌのヒト唾液と混合し、２４０分間３７℃でインキュベートした。陰性対照として、１００μｌの唾液を１００μｌのＰＢＳとインキュベートした。サンプルを次いで５分間１３，０００ｇで遠心分離し、上清を慎重に集め、１０％ＳＤＳ
ＰＡＧＥゲル上にロードした。ＰＮＡアグルチニン（ＤＩＧグリカン分化キット、１１２１０２３８００１；Ｒｏｃｈｅ）を用いて製造業者の指示に従ってレクチン染色することによってムチン分解をモニタリングした。ムチン分解は、陰性対照と比較した、ＰＮＡ
染色の損失または減少によって評価した。
【０１５５】
６．外膜タンパク質精製
外膜タンパク質を、（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ
ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ，２０１５  １０（２）：ｅ０１１７７３２  ａｎｄ  Ｋｏｔａｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ
ｇｒｏｗｎ  ｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８４．１５８（１）：ｐ．１０２−９）で記載されているようにして、いくつかの修飾を加えて、単離した。すべてのステップは、特に明記しない限り氷上で実施した。全てのスクロース濃度は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中のｗ／ｖのパーセンテージとして表す。２つのプレートから集めた細菌を３０ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、４．５ｍｌの１０％スクロース中に懸濁させた。細菌細胞を次いで、３５，０００ｐｓｉにてフレンチプレスに２回通すことによって破砕した。ライセートを集め、１６，５００ｇにて１０分間遠心分離して、不溶性物質をペレット化した。粗細胞抽出物を次いで、１．３３ｍｌの７０％スクロースおよび６ｍｌの３７％スクロースから構成されるスクロース段階勾配の最上部に積層し、１００，０００ｇ（２８，０００ｒｐｍ）で７０分間４℃にてＳＷ４１Ｔｉローター中で遠心分離した。溶解性で濃縮された内膜タンパク質に対応する、３７％スクロース溶液上および１０％／３７％界面の黄色物質を集め、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で７ｍｌに希釈した。濃縮された外膜タンパク質に相当する３７％／７０％界面での高密度バンドを集め、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で７ｍｌに希釈した。両フラクションからの膜を次いで、３２０，０００ｇ（６８，０００ｒｐｍ）で９０分間４℃にて７０．１Ｔｉローター中で遠心分離した。溶解性タンパク質に相当する黄色物質フラクションの上清を新しいチューブに移し、−２０℃で保存した。内および外膜フラクションの混合物に相当する、同じチューブのペレットを１ｍｌの４０％スクロース中に再懸濁させ、そして−２０℃で保存した。外膜タンパク質バンドの上清を捨て、ペレットを、１％Ｓａｒｋｏｚｙｌ（Ｌ５７７７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む７ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、一定して撹拌しながら室温にて３０分間インキュベートした。外膜を次いで３２０，０００ｇで６０分間４℃にて７０．１Ｔｉローター中で遠心分離し、７ｍｌの１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ１１）中に再懸濁させ、濃縮された外膜タンパク質に相当する界面を４℃でインキュベートし、回収し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で７ｍｌに希釈した。両フラクション（ｆｒａｃｙ）からの膜、精製された外膜を２００〜４００μｌのバッファリングされていない４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中に再懸濁させ、−２０℃で保存した。全フラクションのタンパク質濃度を、製造業者の指示に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（５００−０００６；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて評価した。全細胞ライセートおよび外膜フラクションの全タンパク質１〜２μｇを１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにロードした。ゲル電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜上に移し、ウェスタンブロットによって分析した。
【０１５６】
７．フローサイトメトリーおよび顕微鏡分析のための免疫蛍光標識
ＳＢプレート上で２日間成長させた細菌を集め、ＰＢＳで１回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ中に０．１のＯＤ６００となるように再懸濁させた。５μｌの細菌懸濁液（約３×１０５細菌）を使用して、１２ウェルプレート（６６５  １８０；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）中に１０％熱不活性化ヒト血清（ＨＩＨＳ）を含有する２．５ｍｌのＤＭＥＭ（４１９６５−０３９；Ｇｉｂｃｏ）を接種した。５％ＣＯ２の存在下、３７℃での２３時間成長させた後に細菌を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁さ
せた。６００ｎｍでの光学密度を測定し、約３×１０７細菌に相当する等量を各株について集めた。細菌を、１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含有する２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、そして３０分間室温でインキュベートした。細菌を次いで遠心分離し、２００μｌの一次抗体希釈液（１：１５００ウサギ抗ＳｉａＣ抗血清または１：５００ウサギ抗ＭｕｃＧ抗血清）中に再懸濁させ、そして３０分間室温でインキュベートした。遠心分離後、細菌細胞を３回洗浄した後、２００μｌの二次抗体１：５００希釈液（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に結合したロバ抗ウサギ；Ａ−２１２０６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁し、３０分間室温にて暗所でインキュベートした。遠心分離後、細菌細胞を３回洗浄した後、２００μｌの４％ＰＦＡ（ｗ／ｖ）中に再懸濁させ、そして１５分間室温で暗所にてインキュベートした。最後に、細菌を遠心分離し、１回洗浄し、７００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。フローサイトメトリー分析のために、サンプルをＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で直接分析し、そしてデータをＢＤ  ＦＡＣＳｕｉｔｅ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理した。顕微鏡分析のために、標識した細菌をポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたカバースリップの上に添加し、３０分間室温で付着させた。細菌懸濁液の除去後、カバースリップを３回洗浄し、ガラス製スライド上に上下さかさまで載せ、そして室温で暗所にて一晩乾燥させた。Ｏｒｃａ−Ｆｌａｓｈ  ４．０カメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）およびＺｅｎ  ２０１２ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を備えたＡｘｉｏｓｃｏｐ（Ｚｅｉｓｓ）顕微鏡で全ての顕微鏡画像を撮影した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて画像を処理した。対照として、ウサギ予備免疫血清を標識のために使用する以外は、上記のとおり並行してサンプルを調製した。
【０１５７】
８．［３Ｈ］パルミテートを用いたインビボ放射標識、免疫沈澱およびフルオログラフィー
６ウェルプレート（６５７  １６０；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）中、５ｍｌの培地中で成長させる以外は、細菌を免疫蛍光標識のために上記のように一晩成長させた。１８時間のインキュベーションの後、［９，１０−３Ｈ］パルミチン酸（３２Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＮＥＴ０４３；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を５０μＣｉ／ｍｌの最終濃度になるように添加し、インキュベーションを６時間継続した。細菌を次いで遠心分離により集め、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、ペレットをさらなる使用まで−２０℃で保存した。ペレットを、１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００（２８８１７．２９５；ＶＷＲ）を含む３００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、１０秒間ボルテックスして、細菌を溶解させた。ライセートを２分間１４，０００ｇで遠心分離し、そして上清を新しいチューブに移した。１５μｌのＭｕｃＧ抗血清を９０分間室温にて一定して撹拌しながら添加することによって、ＭｕｃＧタンパク質を免疫沈降させた。並行して、２０μｌのプロテインＡアガローススラリー（Ｐ３４７６；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５００μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００）で２回洗浄し、５００μｌの０．２％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）で３０分間飽和させ、再度洗浄緩衝液で２回洗浄した。プロテインＡアガローススラリーを次いで細胞ライセートに添加し、そして３０分間室温にて一定して撹拌しながらインキュベーションを継続した。サンプルを次いで１４，０００ｇにて２分間遠心分離し、そして上清を捨てた。ペレットを５００μｌの洗浄緩衝液で５回洗浄した。５０μｌのＳＤＳ  ＰＡＧＥ緩衝液を添加し、１０分間９５℃で加熱することによって、結合したタンパク質を溶出させた。サンプルを再度遠心分離し、上清を慎重にアガロースビーズから分離し、１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにロードした。ゲル電気泳動後、ゲルを２５／６５／１０のイソプロパノール／水／酢酸溶液中で一晩固定し、その後、Ａｍｐｌｉｆｙ（ＮＡＭＰ１００；Ａｍｅｒｓｈａｍ）溶液中に３０分間浸漬した。ゲルを真空乾燥し、所望のシグナル強度に達するまで、ＳｕｐｅｒＲＸオートラジオグラフィフィルム（Ｆｕｊｉ）に１３〜２１日間曝露した。
【０１５８】
リポタンパク質多重配列アライメント
Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５の表面プロテオームの一部であることが前以て特定され
ている４０のリポタンパク質の配列（Ｍａｎｆｒｅｄｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｏｆ  Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ｒｅｖｅａｌ  ａ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃａｎ  ｆｏｒａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｈｏｓｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１１．８１（４）：ｐ．１０５０−６０）をＵｎｉｐｒｏｔデータベース（Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１５＿１２；ＵｎｉＰｒｏｔ：  ａ  ｈｕｂ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２０１５．４３（Ｄａｔａｂａｓｅ
ｉｓｓｕｅ）：ｐ．Ｄ２０４−１２）から検索した。さらに、細菌表面で検出されるがＳＰＩシグナルを保有すると推測される２つのＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５タンパク質（Ｆ９ＹＳＤ４およびＦ９ＹＴＴ３）をＰＡＴＲＩＣデータベース（Ｗａｔｔａｍ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＡＴＲＩＣ，  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２０１４．４２（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：ｐ．Ｄ５８１−９１）で再分析し、ＳＰＩＩシグナルおよびひいては考慮されるリポタンパク質を有することが判明し、４３の予想される表面露出リポタンパク質の最終的リスト（表Ｓ４）を示す。次に、ＬｉｐｏＰソフトウェア（１．０Ｓｅｒｖｅｒ、初期設定）を使用して各タンパク質のＳＰＩＩ切断部位を予測し、すべてのタンパク質は１つの明確なＳＰＩＩ切断部位を有することを示した。したがって、タンパク質配列をそれらの予想される成熟形態にトリミングした。＋１システインの下流の完全長タンパク質配列または１５のアミノ酸のいずれかに対応するリストを作成した。データセットを次に、ＭＡＦＦＴオンラインツール（バージョン７．２６８、初期設定）を使用して多重配列アライメントにかけ、Ｊａｌｖｉｅｗソフトウェア（バージョン２．９．０ｂ２）を使用して出力を分析した。最終的なコンセンサス配列ロゴを、ＷｅｂＬｏｇｏ（バージョン２．８．２、初期設定）を用いて描いた。ペリプラズムに面すると推定される１７のＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ外膜リポタンパク質の配列（Ｍａｎｆｒｅｄｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｏｆ  Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ｒｅｖｅａｌ  ａ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃａｎ  ｆｏｒａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｈｏｓｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ２０１１．８１（４）：ｐ．１０５０−６０）を同様に処理した（表Ｓ５）。２２の事前に同定されたプロテイナーゼＫ感受性Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓＮＣＴＣ９３４３表面露出リポタンパク質の配列（Ｗｉｌｓｏｎ  ＭＭ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＤＥ，＆Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ＨＤ（２０１５）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  １０（２）：ｅ０１１７７３２）を同様に処理した（表Ｓ６）。４２のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ  ＵＷ１０１推定ＳｕｓＤ様リポタンパク質をＣＡＺＹデータベースのＰＵＬＤＢで同定し（Ｔｅｒｒａｐｏｎ  Ｎ，Ｌｏｍｂａｒｄ  Ｖ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＨＪ，＆Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  Ｂ（２０１５）  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ
ｏｆ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３１（５）：６４７−６５５．）、対応する配列をＵｎｉｐｒｏｔデータベースから抽出し、前記のように処理した（表Ｓ７）。
【０１５９】
９．統計分析
全てのデータは平均±標準偏差（ＳＤ）として提示する。一元配置分散分析と、それに続いてＷｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．００、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｇｒａ
ｐｈｐａｄ．ｃｏｍを用いたＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ試験によって統計分析を行った。０．０５以下のＰ値は統計的に有意とみなした。
【０１６０】
実験１：推定リポタンパク質搬出シグナルのインシリコ同定
特異的アミノ酸モチーフがリポタンパク質の細菌表面へのターゲティングの一因となるか否かを調べるために、本発明者らはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５の表面で検出された４３のリポタンパク質の配列を詳細に調べた（Ｍａｎｆｒｅｄｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｏｆ  Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ｒｅｖｅａｌ  ａ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃａｎ  ｆｏｒａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｈｏｓｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ２０１１．８１（４）：ｐ．１０５０−６０）。本発明者らはまず、ＬｉｐｏＰソフトウェアを用いてＳＰＩＩ切断部位を特定し、次にＭＡＦＦＴを用いて成熟リポタンパク質を整列させた。いくつかの残基は、タンパク質配列全体にわたって保存されているようであるが、明確なモチーフを構成しないようであった（データは不掲載）。しかしながら、アスパルテート（Ｄ）またはグルタメート（Ｅ）残基のいずれかが続くリジン（Ｋ）残基は、位置＋１でＮ末端システインにきわめて近接して保存されているようであった（図１Ａ）。これは、＋１システインを除く成熟リポタンパク質の１５のＮ末端残基のみを使用してこの不変残基が分析を妨害することを回避した２回目のアラインメントによって精密化した（図２Ａ）。同定されたコンセンサスモチーフは、Ｑ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｅ（配列番号１６）（図２Ｂ）に相当し、それぞれ１６、７２、４８、４４および２３％の保存率であった（図２Ｃ）。したがって、それは、位置＋３の正に荷電した残基（Ｋ）と、それに続く、脂質付加システインの直後の位置＋４、＋５および＋６の２〜３個の負に荷電したアミノ酸（Ｄおよび／またはＥ）からなる。このモチーフが表面露出リポタンパク質に対して特異的であるか否かを調べるために、細菌表面で検出されず、したがってペリプラズムに面すると推定されたＯＭリポタンパク質に関して同じ分析を実施した。これらのリポタンパク質のうち、位置＋３の保存されたＤまたはＥ残基だけが同定され（図１Ｂ）、ＱＫＤＤＥ（配列番号１６）ペプチドが確かに真正のリポタンパク質搬出シグナル（ＬＥＳ）であり得ることを示唆した。
【０１６１】
実験２：ＱＫＤＤＥ配列はペリプラズムリポタンパク質ＳｉａＣの表面局在化を導く
この仮説を検証するために、本発明者らは、ペリプラズムに面することが前以て示されている外膜リポタンパク質であるＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓシアリダーゼ（ＳｉａＣ）タンパク質の配列にＱＫＤＤＥ（配列番号１６）モチーフを導入した（Ｍａｌｌｙ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ：ａ  ｈｕｍａｎ
ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ，
２００８．４（９）：ｐ．ｅ１０００１６４  ａｎｄ  Ｒｅｎｚｉ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｇｐｄ）ｆｒｏｍ  Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ，２０１１．７（６）：ｐ．ｅ１００２１１８）。そうするために、本発明者らは、ｗｔＳｉａＣ、アシル化されないＳｉａＣＣ１７Ｇまたはｗｔ残基１８〜２２の代わりに仮説の搬出シグナルを保有するＳｉａＣ＋２ＱＫＤＤＥ＋６のいずれかをコードする遺伝子をＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ発現ベクターにクローニングし、また本発明者らはｓｉａＣ欠失株においてこれらの遺伝子を発現させた（図３Ａ）。本発明者らはまず、３つのタンパク質の発現が類似していることを検証し（図３Ｂ）、次にインタクトな細胞でフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡法を使用して、免疫蛍光によって表面露出をモニタリングした（図３ＣおよびＤ）。興味深いことに、ｗｔＳｉａＣおよびＳｉａＣＣ１７Ｇは予想どおりどちらもいずれかの方法によって細菌表面で検出不可能であったが、ＳｉａＣ
＋２ＱＫＤＤＥ＋６タンパク質の発現は、予想通り、フローサイトメトリーおよび顕微鏡法によって測定されるように強力な蛍光をもたらし（図２ＣおよびＤ）、タンパク質が表面に露出されていることを示した。これらの結果は、同定されたコンセンサス配列がリポタンパク質の表面への輸送を駆動するためにそのままで充分であることを意味した。
【０１６２】
実験３：ＳｉａＣの表面局在化を可能にする最小コンセンサスの決定
本発明者らは次に、ＱＫＤＤＥ（配列番号１６）コンセンサスの５個の残基すべてが機能的ＬＥＳを形成するために必要であるか否かを問うた。本発明者らはまず、最も保存されていないアミノ酸、すなわちＱ１８およびＥ２２をアラニンで置換して、構築物ＳｉａＣ＋２ＡＫＤＤＥ＋６およびＳｉａＣ＋２ＡＫＤＤＡ＋６を生成した（図３Ａ）。タンパク質発現（図３Ｂ）をモニタリングした後、フローサイトメトリーおよび顕微鏡法は、両構築物が表面に局在化しているが（図３ＣおよびＤ）、ＳｉａＣ＋２ＱＫＤＤＥ＋６よりも若干程度が低いことを示した。このことは、ＫＤＤモチーフがリポタンパク質を表面に向かわせるために充分であり、したがって、＋１システインの下流の位置＋２および＋６の残基がなくてもよいことを示した。本発明者らは次いで、両残基がコンセンサスで濃縮されていたので（図２Ｃ）、グルタメートがアスパルテートを機能的に置換可能（ＳｉａＣ＋２ＡＫＥＥＡ＋６）か否かを試験した（図３Ａ）。図３ＣおよびＤで示されるように、２つのグルタメートでのアスパルテートの置換は表面局在化を防止しなかったが、位置＋４および＋５でのグルタメートの低い保存と一致して蛍光の明らかな減少をもたらし（図２Ｃ）、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ表面リポタンパク質において、アスパルテートがグルタメートよりも好ましい可能性があることを示す。注目すべきことに、全ての分析された変異体細胞は抗血清によって標識されたので、細菌表面でディスプレイされたＳｉａＣの総量のみがこれらの変異によって影響を受け（図３Ｃ）、これらの変異がＳｉａＣの表面への輸送の効率を減少させただけであることを示唆する。
【０１６３】
本発明者らは次いで、ＫＤまたはＫＥ（ＳｉａＣ＋２ＡＫＤＡＡ＋６およびＳｉａＣ＋２ＡＫＥＡＡ＋６）のいずれかのみを有する２つのＳｉａＣ構築物（図３Ａ）を生成したが、わずか２９．８±４．７（ＳｉａＣ＋２ＡＫＤＡＡ＋６）および１６．３±２．５％（ＳｉａＣ＋２ＡＫＤＡＡ＋６）の細胞しかそれらの表面でタンパク質をディスプレイしなかったので（図３Ｃ）、これらの２つの残基だけが非常に劣悪なＬＥＳであることが判明した。加えて、蛍光強度は弱く、ＳｉａＣ＋２ＱＫＤＤＥ＋６基準について観察された強度のそれぞれ２８．２および２９．４％であった（図３Ｃ）。これらの構築物がＯＭへのそれらの輸送を損なわなかったことを検証するために、本発明者らは単離された外膜フラクションに関するウェスタンブロットによってタンパク質の局在化を確認した（図３Ｅ）。このことは、Ｋ（Ｄ／Ｅ）２が最小ＬＥＳを表すという彼らの仮説を裏付けた。これらの構築物はまた、機能的ＬＥＳが全体的な負の電荷を必要とし得ることを示唆し、これはＫＤＤがＳｉａＣの表面への効率的な輸送を可能にする一方で、ＫＤは可能にしないという事実によって示された（図３Ｃ）。
【０１６４】
最後に、本発明者らは位置＋３で高度に保存されたリジン残基の重要性を調べた（図３Ａ）。意外なことに、Ｋ単独の置換（ＳｉａＣ＋２ＱＡＤＤＥ＋６）は細菌表面のＳｉａＣのディスプレイに対してごくわずかしか影響を及ぼさなかった（図３ＣおよびＤ）。しかしながら、ＫおよびＱの両方の除去（ＳｉａＣ＋２ＡＡＤＤＡ＋６）は、ＳｉａＣ＋２ＡＫＤＤＡ＋６と比較して蛍光強度の６０％を超える減少をもたらした。グルタミン残基自体は重要ではなかったので（ＳｉａＣ＋２ＡＫＤＤＥ＋６、図３Ｃ）、＋２Ｑまたは＋３Ｋのいずれかが効率的なＬＥＳのために必要であると結論付けざるを得ない。
【０１６５】
まとめると、これらのデータは、ＳｉａＣの表面局在化を可能にする最小搬出モチーフが正に荷電しているかまたは極性の残基に続く２つの負に荷電したアミノ酸（アスパルテートおよび／またはグルタメート）だけで構成されていることを示す。コンセンサスに基
づいて、本発明者らはしたがって、位置＋２でのＱの低い保存を考慮して、最小ＬＥＳがＫ（Ｄ／Ｅ）２であると定義した。
【０１６６】
実験４：ＳｉａＣ表面局在化に対する最小ＬＥＳの位置効果
初期アライメントは、Ｋが位置＋３で強力な保存（７２％）を有し、位置＋２で低い保存（１３％）を有し（図２Ｃ）、位置＋４で完全に存在しなかったことを示した。対照的に、ＤおよびＥは位置＋４、＋５および＋６で保存され（それぞれ、Ｄについて４８、４４および１１％、Ｅについて２０、１３および２３％）（図２Ｃ）、位置＋３で完全に存在しなかった。このことは、搬出モチーフの組成だけでなく、＋１システインに対するその位置も重要であることを示唆した。したがって、本発明者らは、ＫＤＤモチーフが＋１システインから０、２、３または４個のアラニン残基によって隔てられている構築物を作製した（図４Ａ）。４つのタンパク質が発現されたが（図４Ｂ）、いずれも、１つのアラニンだけが＋１システインからＫＤＤモチーフを分離していたものほど効率的に搬出されなかった（図４ＣおよびＤ）。興味深いことに、すべてのタンパク質はＯＭに固定され、したがって、これもまた、表面への輸送の最終ステップだけがこれらの変異により影響を受けることを意味する。（図４Ｅ）。
全体として、これらのデータは＋１システインに対するＬＥＳの位置の重要性を強調する。
【０１６７】
実験５：ＭｕｃＧ搬出シグナルは表面露出ＳｉａＣを決定する
本発明者らは、自身の結果のロバスト性を確認するために、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓの天然の表面露出リポタンパク質の搬出モチーフを分析した。この目的のために、本発明者らは前以て特性が決定されたＰＵＬ９コード化ＭｕｃＧタンパク質を選択した（Ｒｅｎｚｉ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｙｃａｎ−ｆｏｒａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｔｈｅ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｏｇ  ｍｏｕｔｈ．ＭＢｉｏ，２０１５．６（２）：ｐ．ｅ０２５０７）。本発明者らは、まず、パルミチン酸標識および細胞分画によって、ＭｕｃＧが実際にＯＭリポタンパク質であることをチェックし、本発明者らは免疫蛍光および酵素アッセイによってその表面局在化を確認した（図５Ａ〜Ｆ）。図２にしたがって、本発明者らは、ＭｕｃＧのＬＥＳが＋１システインの直接Ｃ末端に位置する、ＫＫＥＶＥＥＥ（配列番号４９）またはこの配列の一部（図５Ａ）のいずれかであると仮定した。興味深いことに、仮定したＭｕｃＧ  ＬＥＳは、２つのリジン残基の存在およびグルタメート残基間の非極性バリンの存在のために、コンセンサス配列とは若干異なる。したがって、本発明者らは、仮定したＭｕｃＧ  ＬＥＳ（図６Ａ）からのＳｉａＣの残基１８〜２２を残基２２〜２６（ＳｉａＣ＋２ＫＫＥＶＥ＋６）、２２〜２７（ＳｉａＣ＋２ＫＫＥＶＥＥ＋７）または２２〜２８（ＳｉａＣ＋２ＫＫＥＶＥＥＥ＋８）を置換し、タンパク質の発現を確認した（図６Ｂ）。興味深いことに、フローサイトメトリーおよび顕微鏡法によって示されるように、ＳｉａＣ＋２ＫＫＥＶＥＥ＋７およびＳｉａＣ＋２ＫＫＥＶＥＥＥ＋８タンパク質のみが表面に局在化していた（図６ＣおよびＤ）。対照的に、ＳｉａＣ＋２ＫＫＥＶＥ＋６は細胞の１４．２±３．２％だけで表面露出していたが（図６ＣおよびＤ）、それでもＯＭに固定されていた（図６Ｅ）。後者の構築物は、他の２つのものと同じくらい、前記ＬＥＳが＋１システインのＣ末端に直接位置するコンセンサスＬＥＳ（Ｘ−Ｋ−（Ｄ／Ｅ）２−Ｘ）（配列番号４０〜４７）から近いので、別の特徴が関与するはずである。この特徴は、２つだけの負に荷電した残基と組み合わせた２つの正に荷電した残基が存在して、全体的なシグナル領域を負に荷電するのではなく中性にすることである可能性が高い。この事実もまた、ＬＥＳが負に荷電していなかった場合にＳｉａＣが細胞表面に輸送されなかったことを示す彼らの以前の結果と一致した（図３ＣおよびＤ）。
【０１６８】
まとめると、ＭｕｃＧ搬出シグナルに関するデータは、２つの新しい情報を付け加える
：第一に、カノニカルＬＥＳ（Ｘ−Ｋ−（Ｄ／Ｅ）２−Ｘ）（配列番号１９１〜１９４）であって、前記ＬＥＳが＋１システインの直接Ｃ末端に位置するものは、小さな疎水性残基により中断されている場合があり、第二に、ＬＥＳの全体的な電荷は負でなければならない。これは、＋２および＋６残基がコンセンサスモチーフの全体的な負の電荷と干渉しないという条件で、ＫＤＤがＳｉａＣの表面局在化を促進するために充分であるという結論を補強する。
【０１６９】
実験６：ＬＥＳはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門で保存される
本発明者らは次に、同定されたＬＥＳが他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ種の表面リポタンパク質において存在するか否かを調べようとした。本発明者らはしたがって、最近公開されたＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ｓｕｒｆｏｍｅ分析（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｄ．Ｅ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ａｎｄ  Ｈ．Ｄ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ
ｔｈｅ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１５．１０（２）：ｐ．ｅ０１１７７３２）を活用し、表面で同定されたリポタンパク質のＮ末端に関してバイオインフォーマティック分析を実施した（図７Ａ〜Ｃ）。Ｎ末端は、＋１システインときわめて近接した負に荷電したアミノ酸を多く含むことが判明した（ＳＤＤＤＤ、配列番号１）（図８Ａ）。しかしながら、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ＬＥＳにおいてとは異なり、アスパルテート残基は、＋４および＋５の代わりに主に位置＋３および＋４に位置していた。さらに、この領域は正に荷電したアミノ酸ではなく、極性残基に富んでいた。本発明者らは、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓにおいて、グルタミンが位置＋２に存在していたならば、リジン残基はアラニンで置換することができること（図３ＣおよびＤ）を示したので、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ＬＥＳと強く矛盾しない。したがって、本発明者らは、ＳＤＤＤＤ（配列番号１）がＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓのＬＥＳを形成すると仮定する。Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓおよびＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓは系統学的に遠いので、本発明者らはＬＥＳが、より密接に関連した種、すなわちＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅにおいてより類似しいているかどうかを調べようとした。この細菌に関してｓｕｒｆｏｍｅ分析は実施されていなかったので、本発明者らは、ＣＡＺＹデータベースのＰＵＬＤＢから、全ての予想されたＳｕｓＤ−ホモログの配列、予想される表面露出リポタンパク質を回収した。本発明者らは次にこれらのリポタンパク質のＮ末端を分析し、コンセンサス配列ＳＤＤＦＥ（配列番号２）（図７Ｄ〜Ｆ）を得た。興味深いことに、これらのリポタンパク質のＮ末端は、正に荷電した残基よりもむしろ極性残基に富んでいるという意味で、この配列は、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓのＬＥＳに対してよりもＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓのＬＥＳにより近いようである。しかしながら、負に荷電したアミノ酸は、依然としてタンパク質のこの領域において依然として優勢である。
【０１７０】
実験７：Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＦ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ由来のＬＥＳはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓにおいて機能的である
最後に、本発明者らはＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓについて予測されるカノニカル配列（ＳＤＤＤＤ、配列番号１）およびＦ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅについて予測されるカノニカル配列（ＳＤＤＦＥ）（配列番号２）がＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ（図８Ａ）において機能的ＬＥＳを表すか否かを試験した。両配列をＳｉａＣに挿入し、組換えタンパク質をＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ５で試験した。図８ＣおよびＤに示すように、両構築物は表面局在化されることが判明した。
【０１７１】
まとめると、これらのデータは、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓで同定されたＬＥＳが、他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ属でかなり保存されること、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａからのＬＥＳがＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａにお
いてリポタンパク質の表面輸送を可能にすることを示す。興味深いことに、＋３Ｋの保存または負に荷電したアミノ酸の位置などのＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ＬＥＳの特徴のすべてが他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓで保存されるわけではない。しかしながら、３つの同定されたＬＥＳが正に荷電した、または極性の残基と、それに続く２または３個の負に荷電した残基についての要件を共有し、＋１システインときわめて近接して全体的に負の電荷を与える。したがって、これは、グラム陰性菌のこの門におけるリポタンパク質搬出の共有された新規経路の証拠を裏付ける。
【０１７２】
実験８：ＳｉａＣにおけるＭｕｃＧ  ＬＥＳのさらなる調査
本発明者らは、インシリコ分析から、ＭｕｃＧ  ＬＥＳが２２−ＫＫＥＶＥＥＥ−２８（配列番号４９）（図５Ａ）に相当すると推定し、これは次にこの配列をＳｉａＣに導入した場合に確認された（図６）。興味深いことに、ＳｉａＣへの２２−ＫＫＥＶＥ−２６（配列番号６４）のみの挿入はタンパク質の非常に不充分な表面局在化をもたらし（図６ＣおよびＤ）、これは、負に荷電したＬＥＳの要件の彼らの以前の知見を裏付けた。実際、２２−ＫＫＥＶＥ−２６（配列番号６４）ペプチドは、２つの正電荷および２つの負電荷の存在のために電荷において中性であり、その一方で、２２−ＫＫＥＶＥＥ−２７（配列番号６３）および２２−ＫＫＥＶＥＥＥ−２８（配列番号４９）は、どちらもＳｉａＣの明らかな表面局在化をもたらし（図６）、さらなるグルタメート残基のために負に荷電している。
【０１７３】
この仮説をさらに裏付けるために、本発明者らは、リジン残基のうちの１つをアラニンに変異させたＳｉａＣＫＫＥＶＥタンパク質の２つのバージョン（それぞれＳｉａＣ＋２ＫＡＥＶＥ＋６およびＳｉａＣ＋２ＡＫＥＶＥ＋６）を構築し、かくしてシグナルの全体の電荷を負にした（図９Ａ）。発現を確認するためのウェスタンブロット分析（図９Ｂ）後に、本発明者らはこれらのＳｉａＣ変異体の細胞表面での存在をフローサイトメトリーによってモニタリングした（図９Ｃ）。興味深いことに、ＳｉａＣ＋２ＡＫＥＶＥ＋８変異体は細胞の７９．３±３．４％で表面局在化（図９Ｃ）していたが、各細胞によってディスプレイされるＳｉａＣの総量は、ＳｉａＣ＋２ＫＫＥＶＥＥ＋７およびＳｉａＣ＋２ＫＫＥＶＥＥＥ＋８構築物におけるよりも低かった（約２５％）。これはＳｉａＣ＋２ＫＫＥＶＥ＋６と比べて劇的な増加であり、１つの正に荷電したアミノ酸の除去が表面ターゲティングに実際に有利であることを裏付けた。ごく少量のＳｉａＣしかこの関連では表面に輸送されなかったという事実は、グルタメートがアスパルテートよりもＳｉａＣ表面搬出の促進に効率的でないという彼らの以前の知見を反映し得る（図３ＣおよびＤ）。一方、ＳｉａＣ＋２ＫＡＥＶＥ＋６はＳｉａＣ＋２ＫＫＥＶＥ＋６として挙動し、表面へはタンパク質はほとんど輸送されなかった（図９Ｃ）。この結果は、導入されたペプチドモチーフは全体的に負に荷電しているが、正に荷電したアミノ酸の位置（位置＋３のＫ）は適切な表面局在化にとって重要であるらしいという事実を強調した。
【０１７４】
この点をさらに検証するために、本発明者らは、ＳｉａＣからのアミノ酸１８〜２２をＭｕｃＧのアミノ酸２３〜２７で置換し、付加されたＭｕｃＧペプチドをＳｉａＣ＋２ＫＫＥＶＥ＋６と比較して１つのアミノ酸だけシフトさせることによってさらなるハイブリッドタンパク質（ＳｉａＣ＋２ＫＥＶＥＥ＋６）を構築した。したがって、この結果、１つだけ正に荷電した残基を有するが、位置＋３ではなく＋２にＫを有するシグナルペプチドが得られる（図９Ａ）。ＳｉａＣ＋２ＫＡＥＶＥ＋６構築物と同様に、そして我々の以前の結果とよく一致して、この構築物は標識された細胞の４７．９±１．９％の細胞表面でのみ局在化していた（図９Ｃ）。さらに、蛍光強度は低く、表面輸送に対するリジン残基の位置効果を裏付けた。
【０１７５】
まとめると、ＳｉａＣ中のＭｕＧ  ＬＥＳに関する本発明者らのデータは、ＳｉａＣ中のコンセンサスＬＥＳに関して事前に得られた結果、すなわち、Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕ
ｓ  ＬＥＳの組成ならびに位置要件をさらに強化する。
【０１７６】
実験９：モデル表面露出リポタンパク質  ＭｕｃＧにおけるＬＥＳの調査
本発明者らは次に、その天然の背景でＭｕｃＧ  ＬＥＳを分析し、それらをして、ｗｔＭｕｃＧタンパク質においてアラニンで残基２２〜２９を系統的に置換させようとした（図１０Ａ）。全変異体タンパク質が発現されたことを検証した後（図１０Ｂ）、フローサイトメトリーによってＭｕｃＧ変異体の表面露出をモニタリングした（図１０Ｃ）。Ｋ２２、Ｖ２５およびＥ２７のアラニン置換はＭｕｃＧの表面露出を著しく変更しなかったが、Ｋ２３、Ｅ２４、Ｅ２６、Ｅ２８またはＰ２９Ａの変異は露出の２５〜５０％の減少をもたらした。単一変異のいずれも表面局在化を完全に無効にすることはなく、このことは、おそらくは２つのリジンおよび４つのグルタメートの存在のために、ＭｕｃＧモチーフが重複性であることを示唆する。したがって、それらの残基の１つの変異は、きわめて近接した別のものの存在によって相殺され得る。Ｋ２２の変異は、ＳｉａＣで得られたそれらの以前のデータや位置＋２での残基がＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ表面リポタンパク質（図２ＢおよびＣ）において高度に保存されないという事実と一致して、表面露出を変更しなかった。驚くことではないが、Ｖ２５Ａ置換はＭｕｃＧ表面露出を変更せず、このことは、この残基が、ＭｕｃＧ  ＬＥＳ配列に関与しない可能性があることを意味する。この結果もまた、ＳｉａＣで前以て得られたデータと一致し、タンパク質の表面露出は付加されたコンセンサス配列中にバリン残基が無い状態で達成された（図３ＣおよびＤ）。
【０１７７】
ＭｕｃＧ  ＬＥＳは重複性であるので、本発明者らは複数の残基を同時に変異させることによって、二回目のセットとなるアラニン置換を実施した（図１１Ａ）。全構築物の正しい発現をチェックした後（図１１Ｂ）、本発明者らはフローサイトメトリーによってそれらの表面局在化を分析した（図１１Ｃ）。予想されるように、２つのリジン残基の置換（ＭｕｃＧ＋２ＡＡＥＶＥＥＥ＋８）の結果、細胞のわずか２３．１±４．５％でＭｕｃＧ表面露出が得られた（図１０Ｃ）。さらに、細胞のこのサブセットにおける蛍光強度はｗｔ株（２３．８％）と比較して著しく減少し、このことは、輸送効率もこの亜集団において強力に影響を受けたことを意味する。これは、＋２セリンまたは＋３リジンが表面搬出のために必要であることを示す事前データとよく一致している。
【０１７８】
同じアプローチを使用して、負に荷電した残基（ＭｕｃＧ＋２ＫＫＡＡＡＡＡ＋８、ＭｕｃＧ＋２ＫＫＡＡＡＥＥ＋８およびＭｕｃＧ＋２ＫＫＥＶＡＡＡ＋８変異）の役割を調査した（図１１Ａ）。ＭｕｃＧ＋２ＫＫＡＡＡＥＥ＋８およびＭｕｃＧ＋２ＫＫＥＶＡＡＡ＋８はすべての分析した細胞において表面露出されていたが、蛍光強度の５０％減少により反映されるように、表面でのそれらの存在量は減少した（図１１Ｃ）。一方、ＭｕｃＧ＋２ＫＫＡＡＡＡＡ＋８は細胞のわずか４１．９±６．９％で表面局在化し（図１１Ｃ）この亜集団における蛍光強度はｗｔ株と比べて減少した（２４．５％）。これによって、負に荷電した残基は、それらの役割がＳｉａＣで観察されたものよりは若干重要ではないようであっても、ＭｕｃＧの表面局在化に重要であることが確認された。
【０１７９】
単一および多重アラニン置換から得られたデータを組み合わせると、至適ＭｕｃＧ表面露出についての最小ＬＥＳは、ＳｉａＣでの分析から推測されるように、ちょうど＋１システインから下流のＸ−Ｋ−（Ｄ／Ｅ）３（配列番号４０〜４７）のようである。
【０１８０】
実験１０：アルギニンはＭｕｃＧ  ＬＥＳにおいてリジンを機能的に置換できる
本発明者らの最初のインシリコ分析において、位置＋３に位置するリジンはＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ表面露出リポタンパク質において最も保存された残基であった（図２ＢおよびＣ）。しかしながら、驚くべきことに、＋２残基も変異しない限り、この残基の点変異は表面露出に影響を及ぼさなかった（図３ＣおよびＤ）。リジンの高い保存がアミノ酸自体の性質に関連づけられるか、またはその電荷のみに関連付けられるかを明らかにする
ために、本発明者らはＭｕｃＧ  ＬＥＳのリジン残基をアルギニン残基で置換した（図１２Ａ）。次いで、結果として得られる構築物である、ＭｕｃＧ＋２ＲＲＥＶＥＥＥ＋８、ＭｕｃＧ＋２ＲＡＥＶＥＥＥ＋８およびＭｕｃＧ＋２ＡＲＥＶＥＥＥ＋８の発現をウェスタンブロットによって確認した（図１２Ｂ）。興味深いことに、両リジンのアルギニンでの置換は、ＭｕｃＧ＋２ＲＲＥＶＥＥＥ＋８の明らかな表面局在化をもたらしたが、ｗｔ株においてと同様に若干低かった（図１２Ｃ）。これは、位置＋３でのアルギニンがＣ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ表面リポタンパク質においてごくまれにしか見られないという事実によって説明がつく可能性が高い。これはまた、実際、表面標的化に重要なのはアミノ酸自体というよりもむしろアミノ酸の電荷であることを示す。驚くべきことに、ＭｕｃＧ＋２ＲＡＥＶＥＥＥ＋８およびＭｕｃＧ＋２ＡＲＥＶＥＥＥ＋８はまた、どちらも表面露出され、２２−ＲＡＥＶＥＥＥ−２８（配列番号６１）はＭｕｃＧ搬出に関してｗｔ配列よりも一層強力であった（図１２Ｃ）。一方、ＭｕｃＧ＋２ＡＲＥＶＥＥＥ＋８はあまり効率的には輸送されなかった（図１２Ｃ）。
【０１８１】
まとめると、これらのデータは、位置＋２または＋３のアミノ酸の性質ではなくむしろ電荷がＭｕｃＧ表面露出に関与することを示している。
【０１８２】
【表３】
2019527560.tif 000006
【０１８３】
【表４−１】
2019527560.tif 000007
【表４−２】
2019527560.tif 000008
【表４−３】
2019527560.tif 000009
【表４−４】
2019527560.tif 000010
ａ：Ｃ．ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓの選択マーカーは括弧内である。
【０１８４】
【表５−１】
2019527560.tif 000011
【表５−２】
2019527560.tif 000012
【表５−３】
2019527560.tif 000013
【表５−４】
2019527560.tif 000014
【表５−５】
2019527560.tif 000015
ａ：制限部位に下線を施している
【０１８５】
【表６−１】
2019527560.tif 000016
【表６−２】
2019527560.tif 000017
【表６−３】
2019527560.tif 000018
ａ：注釈をつけた翻訳開始部位を使用すると、Ｃｃａｎ＿１７４３０は細胞質タンパク質であることが予想されるが、翻訳が１３コドン下流のＡＵＧで開始する場合、それはリポタンパク質であると予想される。
ｂ：注釈をつけた翻訳開始部位を使用すると、Ｃｃａｎ＿２０１２０は細胞質タンパク質であると予想されるが、翻訳が１８コドン下流のＡＵＧで開始する場合、それはリポタンパク質であると予想される。
ｃ：ＬｉｐｏＰソフトウェアによって予想されるＳＰＩＩ切断部位；数字は、シグナルペプチドの最後のアミノ酸の位置および＋１システインの位置を示す。
ｄ：（Ｍａｎｆｒｅｄｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｏｆ  Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ  ｒｅｖｅａｌ  ａ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃａｎ  ｆｏｒａｇｉｎｇ
ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｈｏｓｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１１．８１（４）：ｐ．１０５０−６０）で記載されるような、パーセンテージで表されたｓｕｒｆｏｍｅ組成に対する定量的
寄与。
「／」は定量化されていないことを表す。
【０１８６】
【表７−１】
2019527560.tif 000019
【表７−２】
2019527560.tif 000020
ａ：ＬｉｐｏＰソフトウェアによって予想されるＳＰＩＩ切断部位；数字は、シグナルペプチドの最後のアミノ酸の位置および＋１システインの位置を示す。
【０１８７】
【表８−１】
2019527560.tif 000021
【表８−２】
2019527560.tif 000022
ａ：ＢＦ９３４３＿１２９５の翻訳開始部位は１５コドン下流に移動し、その結果、予想リポタンパク質が得られた。
ｂＢＦ９３４３＿ｐ２０の翻訳開始部位は３８コドン下流に移動し、その結果、予想リポタンパク質が得られた。
ｃ：ＬｉｐｏＰソフトウェアによって予想されるＳＰＩＩ切断部位；数字は、シグナルペプチドの最後のアミノ酸の位置と＋１システインの位置を示す。
【０１８８】
【表９−１】
2019527560.tif 000023
【表９−２】
2019527560.tif 000024
【表９−３】
2019527560.tif 000025
ａ：ＬｉｐｏＰソフトウェアによって予測されるＳＰＩＩ切断部位；数字は、シグナルペプチドの最後のアミン酸の位置および＋１システインの位置を示す。
【図１Ａ−１】
2019527560.tif 000026
【図１Ａ−２】
2019527560.tif 000027
【図１Ｂ】
2019527560.tif 000028
【図２Ａ】
2019527560.tif 000029
【図２Ｂ】
2019527560.tif 000030
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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