(57)【要約】  本発明のパンドラチン誘導体又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物を有効成分として含む組成物に関するものであって、前記組成物は、破骨細胞分化を抑制して、骨損失疾患の治療、予防又は改善効果を有して、天然物として副作用なく安全に使用することができて、医薬品、医薬部外品又は食品に効果的に使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボエセンベルギアパンドラタ(Boesenbergia pandurata)抽出物又はその分画物を有効成分として含む骨損失疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項２】
前記抽出物は、炭素数１乃至６の有機溶媒、亜臨界水及び超臨界流体からなる群から選ばれた一つ以上の溶媒の抽出物である請求項１記載の薬学組成物。
【請求項３】
前記炭素数１乃至６の有機溶媒は、炭素数１乃至６のアルコール、アセトン、エーテル、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、塩化メチレン、ヘキサン、シクロヘキサン及び石油エーテルからなる群から選ばれた一つ以上の溶媒の抽出物である請求項２記載の薬学組成物。
【請求項４】
前記分画物は、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物の、ヘキサン、クロロホルム及び酢酸エチルからなる群から選ばれた一つ以上を含む溶媒による分画物である請求項１記載の薬学組成物。
【請求項５】
前記抽出物又はその分画物は、下記化学式１乃至化学式３の化合物からなる群から選ばれた一つ以上のパンドラチン誘導体を含むものである請求項１記載の薬学組成物。
【化５】
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【化６】
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【化７】
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【請求項６】
前記骨損失疾患は、骨多孔症、パジェット病、歯槽骨損失、骨軟化症及び骨異栄養症からなる群から選ばれた請求項１乃至５のいずれかに記載の薬学組成物。
【請求項７】
ボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はその分画物を有効成分として含む骨損失予防又は改善用医薬部外品組成物。
【請求項８】
前記骨損失は、骨多孔症、パジェット病、歯槽骨損失、骨軟化症及び骨異栄養症からなる群から選ばれた疾患によるものである請求項７記載の医薬部外品組成物。
【請求項９】
ボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はその分画物を有効成分として含む骨損失予防又は改善用医薬部外品。
【請求項１０】
ボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はその分画物を有効成分として含む骨損失予防又は改善用食品組成物。
【請求項１１】
前記抽出物は、水、炭素数１乃至６の有機溶媒、亜臨界水及び超臨界流体からなる群から選ばれた一つ以上の溶媒の抽出物である請求項10記載の食品組成物。
【請求項１２】
前記炭素数１乃至６の有機溶媒は、炭素数１乃至６のアルコール、アセトン、エーテル、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、塩化メチレン、ヘキサン、シクロヘキサン及び石油エーテルからなる群から選ばれた一つ以上である請求項11記載の食品組成物。
【請求項１３】
前記分画物は、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物の、ヘキサン、クロロホルム及び酢酸エチルからなる群から選ばれた一つ以上を含む溶媒による分画物である請求項10記載の食品組成物。
【請求項１４】
前記抽出物又はその分画物は、下記化学式１乃至化学式３の化合物からなる群から選ばれた一つ以上のパンドラチン誘導体を含むものである請求項10記載の食品組成物。
【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【請求項１５】
前記骨損失は、骨多孔症、パジェット病、歯槽骨損失、骨軟化症及び骨異栄養症からなる群から選ばれた疾患によるものである請求項10乃至14のいずれかに記載の食品組成物。
【請求項１６】
下記化学式１乃至化学式３の化合物からなる群から選ばれたパンドラチン誘導体又はその塩を有効成分として含む骨損失疾患の予防又は治療用薬学組成物。
【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【請求項１７】
前記パンドラチン誘導体は、ボエセンベルギアパンドラタから抽出されたものである請求項16記載の薬学組成物。
【請求項１８】
前記骨損失疾患は、骨多孔症、パジェット病、歯槽骨損失、骨軟化症及び骨異栄養症からなる群から選ばれた請求項16乃至17のいずれかに記載の薬学組成物。
【請求項１９】
下記化学式１乃至化学式３の化合物からなる群から選ばれたパンドラチン誘導体又はその塩を有効成分として含む骨損失の予防又は改善用医薬部外品組成物。
【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【請求項２０】
下記化学式１乃至化学式３の化合物からなる群から選ばれたパンドラチン誘導体又はその塩を有効成分として含む骨損失の予防又は改善用医薬部外品。
【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【請求項２１】
下記化学式１乃至化学式３の化合物からなる群から選ばれたパンドラチン誘導体又はその塩を有効成分として含む骨損失の予防又は改善用食品組成物。
【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【請求項２２】
前記パンドラチン誘導体は、ボエセンベルギアパンドラタから抽出されたものである請求項21記載の食品組成物。
【請求項２３】
前記骨損失は、骨多孔症、パジェット病、歯槽骨損失、骨軟化症及び骨異栄養症からなる群から選ばれた疾患によるものである請求項21記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パンドラチン（panduratin）誘導体又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物を含む骨損失疾患の予防、改善又は治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
正常的な骨の機能のためには、破骨細胞（osteoclast）による骨吸収（bone resorption)と造骨細胞（osteoblast）による骨形成（bone formation）の恒常性作用による骨リモデリング（bone remodeling)過程が必要である。しかし、破骨細胞の過剰な活性や造骨細胞の活性低下は、リモデリング過程の不均衡をもたらし、骨多孔症(Osteoporosis)のような骨損失疾患(骨格系疾患)を誘導する。
【０００３】
骨多孔症は、多発性骨髄症、骨関節炎などの骨関連疾患の中で、最も一般的な骨損失疾患であって、一般的に骨折の増加及び骨強度の減少が特徴である。(Nat. Rev. Endocrinol 8: 212-227, 2011; J. Dent. Res. 91: 736-744, 2012).
【０００４】
一方、口腔内では歯槽骨の破骨細胞活性が急激に増加して骨吸収反応がもたらされ、歯槽組織で歯槽骨の損失が起こり、歯を損失する歯槽骨損失疾患が現れることになる(J. Immunol Res. 2015: 1-10, 2015)。これらの不均衡を解消するために、一般的に破骨細胞の過剰な活性を抑制したり、造骨細胞の活性を促進させたり、又は破骨細胞の活性を抑制して造骨細胞の活性を促進する方法が使用されている(Nat. Rev. Rheumatol 7: 631-638, 2011)。
【０００５】
破骨細胞は造血母細胞で形成されるが、分化した破骨細胞は、無機質化された骨を分解するので、身体骨格の成長及び恒常性維持に極めて重要な働きをする。破骨細胞の分化は、TNF(tumor necrosis factor)リガンドであるRANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)、RANK(receptor activator of nuclear factor kappa-B)及びOPG(osteoprotegerin)等の受容体により調節される。RANKLは、造骨細胞やヒトの歯槽線維芽細胞（human gingival fibroblast)のような細胞から分泌され、破骨細胞や破骨細胞前駆体細胞（osteoclast precursor cell）に発現されているRANKに付着するようになる。この付着信号により、主な転写因子のNFATc1(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1)の活性が増加され、それにより、骨分解及び吸収に重要な役割を果たすTRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)、カテプシンK（cathepsin K)のような酵素と、破骨細胞分化特異的生体指標のカルシトニン受容体(calcitonin receptor)の合成が促進される。OPGは、デコイ（decoy)受容体としてRANKLに付着して、RANKLがRANKに直接付着できないように防ぐようになる。従って、RANKLとOPGの相対的な濃度が、骨格の恒常性維持に極めて重要な役割をすることになる(J. Immunol. Res. 2015: 1-10, 2015)。
【０００６】
今までに開発された代表的な骨多孔症治療剤は、破骨細胞の機能を低下させて骨の損失を防ぐ、ビスホスホネート（bisphosphonates)製剤が主流をなしている。しかし、このような化学合成品は、胃腸障害、腎臓毒性、筋骨格痛症、顎骨壊死のような副作用を誘発するという短所がある。従って、少ない副作用と高い安全性の特徴を有する天然物を基に、骨多孔症又は歯槽骨の損失を予防して治療することは極めて重要な研究課題である(Datamonitor Research Reports, 2007; Korean J. Fam. Pract. 3: 16-24, 2013)。
【０００７】
ボエセンベルギアパンドラタ(Boesenbergia pandurata、同名-Boesenbergia rotunda)は、フィンガールート（fingerroot）と称されるショウガ科(zingiberaceae family)植物であり、根茎(rhizome)部位は風邪、腸炎、皮膚疾患及び尿道痛症に広く使用されている。ボエセンベルギアパンドラタにはピノセンブリンカルコン（pinocembrin chalcone）、カルダモニン（cardamonin）、ピノセンブリン（pinocembrin)、ピノストロビン（pinostrobin)、4-ヒドロキシパンドラチンＡ（4-hydroxypanduratin A）、パンドラチンＡ（panduratin A）などが含まれているが、これらの成分は、抗癌効果を示すことが報告されており(Trakoontivakom， G. ，et al， J. Arig. Food chem., 49, 3046-3050, 2001)、フラボノイド系のジヒドロカルコン（dihydrochalcone)の化合物は、殺虫効果を示すことが報告されている(Phytochemistry， 34, 415-419, 1993)。
【０００８】
しかし、本発明の以前には、パンドラチン誘導体又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物の骨多孔症又は歯槽骨の損失を含む骨損失疾患での予防、改善又は治療効果については、詳細に報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
［発明の詳細な説明］
［技術的課題］
本発明は、破骨細胞の分化を抑制し、骨リモデリングの過程で骨の生成と吸収作用の均衡を回復及び改善させる効果を有しながらも、安全に適用することができる天然物である、パンドラチン誘導体及び／又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物を含む組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
［課題解決手段］
前記目的を達成するために、本発明は、ボエセンベルギアパンドラタ（Boesenbergia pandurata）抽出物又はその分画物を有効成分として含む組成物を提供する。
【００１１】
具体的には、本発明は、ボエセンベルギアパンドラタ（Boesenbergia pandurata）抽出物又はその分画物を有効成分として含む骨損失疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、ボエセンベルギアパンドラタ（Boesenbergia pandurata）抽出物又はその分画物を有効成分として含む骨損失疾患の予防又は改善用医薬部外品組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、ボエセンベルギアパンドラタ（Boesenbergia pandurata）抽出物又はその分画物を有効成分として含む骨損失の予防又は改善用医薬部外品を提供する。
【００１４】
また、本発明は、ボエセンベルギアパンドラタ（Boesenbergia pandurata）抽出物又はその分画物を有効成分として含む骨損失の予防又は改善用食品組成物を提供する。
【００１５】
前記目的を達成するために、他の態様では、本発明は、パンドラチン誘導体又はその塩を有効成分として含む組成物を提供する。
【００１６】
具体的には、本発明はパンドラチン誘導体又はその塩を有効成分として含む骨損失疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、パンドラチン誘導体又はその塩を有効成分として含む骨損失の予防又は改善用医薬部外品組成物を提供する。
【００１８】
また、本発明は、パンドラチン誘導体又はその塩を有効成分として含む骨損失の予防又は改善用医薬部外品を提供する。
【００１９】
また、本発明は、パンドラチン誘導体又はその塩を有効成分として含む骨損失の予防又は改善用食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のパンドラチン誘導体又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物は、破骨細胞分化を抑制し、骨損失疾患の治療、予防又は改善効果を有していて、天然物として副作用なく安全に使用することができ、医薬品、医薬部外品又は食品などの製造に効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、RANKL誘導RAW264.7細胞から、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物(BPE)処理によるNFATc1、TRAP及びカテプシンＫ（cathepsin K）のmRNA発現を測定した結果を示すものである。
【図２】図２は、RANKL誘導RAW264.7細胞から、パンドラチンＡ(panduratin A、 Pan)の処理に伴うNFATc1、TRAP及びカテプシンＫのmRNA発現を測定した結果を示すものである。
【図３】図３は、RANKL誘導RAW264.7細胞から、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物(BPE)処理によるNFATc1、TRAP及びカテプシンＫのタンパク質発現を測定した結果を示すものである。
【図４】図４は、RANKL誘導RAW264.7細胞から、パンドラチンＡ（Pan）の処理によるNFATc1、TRAP及びカテプシンＫのタンパク質発現を測定した結果を示すものである。
【図５】図５は、RANKL誘導RAW264.7細胞から、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物(BPE)がTRAP活性に及ぼす影響を測定したグラフである。
【図６】図６は、RANKL誘導RAW264.7細胞から、パンドラチンＡ（Pan）がTRAP活性に及ぼす影響を測定したグラフである。
【図７】図７は、RANKL誘導RAW264.7細胞から、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物(BPE)が破骨細胞分化に及ぼす影響を、顕微鏡分析を通じて示したものである。
【図８】図８は、RANKL誘導RAW264.7細胞から、パンドラチンＡ（Pan）が破骨細胞分化に及ぼす影響を、顕微鏡分析を通じて示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明者らは、破骨細胞の分化を抑制して骨リモデリング過程で均衡を回復及び維持させる効果を有し、安全に適用できる天然物質を探索及び研究した結果、パンドラチン誘導体及び／又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はその分画物が、骨損失疾患の予防、改善又は治療効果を有することを確認して本発明を完成した。
【００２３】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００２４】
本発明は、ボエセンベルギアパンドラタ（Boesenbergia pandurata）抽出物又はその分画物を有効成分として含む骨損失疾患の予防、治療又は改善用組成物に関するものである。
【００２５】
また、本発明は、パンドラチン誘導体又はその塩を有効成分として含む骨損失疾患の予防、治療又は改善用組成物に関するものである。
【００２６】
前記「ボエセンベルギアパンドラタ(Boesenbergia pandurata、同名-Boesenbergia rotunda)」は、フィンガールート（fingerroot）とも称され、東南アジアに自生するショウガ科(zingiberaceae family)の植物である。根茎部位は風邪、腸炎、皮膚疾患などに広く使用されている。
【００２７】
本発明の抽出物の製造は、前記フィンガールートの全ての部位を使用することができ、抽出部位の制限を受けるものではないものの、ボエセンベルギアパンドラタ植物体の根茎を好ましく使用することができる。抽出物を製造するためには、前記植物体形態により制限されず、前記植物体は乾燥、粉砕などの加工過程を経たものを全て含む意味である。
【００２８】
本発明の一実施例では、前記ボエセンベルギアパンドラタから抽出した抽出物の破骨細胞抑制効果を確認し、これを利用して、骨が損失及び生成されるリモデリング過程で過度の損失を抑制して均衡を合わせることにより、骨損失疾患を治療又は改善することができることを確認した。
【００２９】
本発明のボエセンベルギアパンドラタ抽出物は、好ましくは、パンドラチン（Panduratin）誘導体を含むものであってよい。本発明の一実施例で、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物からパンドラチン化合物を分離及び同定し、前記抽出物だけではなく、分離されたパンドラチン化合物も破骨細胞の分化を抑制する効果があることを実験的に確認した。
【００３０】
前記「パンドラチン(pandurtin)」は、フィンガールート（ボエセンベルギアパンドラタ）という植物の根から抽出された成分で、AMPK活性効果を有していることが知られている。
【００３１】
前記パンドラチン誘導体は、パンドラチンＡ（Panduratin A）、4-ヒドロキシパンドラチンＡ(4-hydroxypanduratin A)及びイソパンドラチンＡ(isopanduratin A)を含む。
前記パンドラチンＡは（2,6-ジヒドロキシ-4-メトキシフェニル）[3-メチル-2-（3-メチルブト-2-エニル）-5-フェニルシクロヘキス-3-エニル]メタノンで、分子式はC26H30O4であり、好ましくは、下記化学式1の構造を有する化合物が挙げられる。前記4-ヒドロキシパンドラチンＡは（2,4,6-トリヒドロキシフェニル[3-メチル-2-（3-メチルブト-2-エニル）-6-フェニルシクロヘキス-3-エニル]メタノンで、分子式はC25H28O4であり、好ましくは、下記化学式2の構造を有する化合物が挙げられる。また、前記イソパンドラチンＡ(isopanduratin A)は、（2-メトキシ-4,6-ジヒドロキシフェニル）-[3-メチル-2-（3-メチルブト-2-エニル）-6-フェニルシクロヘキス-3-エニル]メタノンであり、分子式はC26H30O4であって、好ましくは下記化学式3の構造を有する化合物が挙げられる。
【００３２】
【化１】
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【００３３】
【化２】
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【００３４】
【化３】
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【００３５】
本発明の組成物は、前記パンドラチン誘導体の塩を有効成分として含むことができる。前記塩は、薬学的に許容可能な塩であってよい。
【００３６】
本発明の一実施例で、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物から活性成分を分離及び同定した結果、パンドラチンＡであることを確認し、前記パンドラチンＡが、破骨細胞分化を抑制する効果があることを確認した。従って、本発明のパンドラチン誘導体は、ボエセンベルギアパンドラタ（Boesenbergia pandurata）から抽出されたものであってよい。
【００３７】
本明細書で、「抽出物」とは、或る物質を溶媒に溶かして、その活性成分又は特性成分を分離したことを意味する。具体的には、植物に抽出溶媒を加えて抽出した抽出物及び抽出溶媒から抽出して製造した抽出物に、分画溶媒を加えて分画した分画物を含む。従って、本発明のボエセンベルギアパンドラタ抽出物は、ボエセンベルギアパンドラタに溶媒を加えて抽出した抽出物と、これに再度分画溶媒を加えて分画した分画物を、全て含む意味である。
【００３８】
具体的には、前記抽出物は、ボエセンベルギアパンドラタの根茎を利用したエタノール抽出物、熱水抽出物、ヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物又は超高圧抽出物であってよい。
【００３９】
前記抽出溶媒は、水、有機溶媒、亜臨界水及び超臨界流体からなる群から選ばれた一つ以上であってよい。前記有機溶媒は、極性溶媒、非極性溶媒、極性及び非極性混合溶媒又は水であってよい。具体的には、炭素数1乃至6のアルコール(alcohol)、アセトン(acetone)、エーテル(ether)、ベンゼン(benzene)、クロロホルム(chloroform)、酢酸エチル(ethyl acetate)、塩化メチレン(methylene chloride)、ヘキサン(hexane)、シクロヘキサン(cyclohexane)、石油エーテル(petroleum ether)及び水からなる群から選ばれたいずれか一つが挙げられる。
【００４０】
本発明の一実施例で、ボエセンベルギアパンドラタにエタノールを加えて抽出物を製造し、前記ボエセンベルギアパンドラタのエタノール抽出物の、破骨細胞活性を抑制する効果を確認したところ、エタノールは、抽出溶媒として好ましく使用することができる。
【００４１】
前記植物体抽出物は、通常の植物体抽出物の製造方法により製造されたものであってよい。より具体的には、不純物を除去した前記植物体に、抽出溶媒を加えて、抽出過程を遂行する方法で遂行することができる。前記抽出過程は、冷浸抽出法、温浸抽出法、加圧抽出法又は超音波粉砕抽出法であってよい。例えば、乾燥した植物体を、食品加工に適した精製水、エタノール及び亜臨界水又は超臨界二酸化炭素を利用して、抽出、精製するか、又は、ボエセンベルギアパンドラタ植物体を、100MPa以上の超高圧条件下で、超高圧抽出装置を利用して、抽出、精製するか、又は、植物体を直接圧搾して得たオイルから分離精製して得ることができる。
【００４２】
前記分画溶媒は、水、ブタノール、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン又はこれらの混合物であってよい。前記分画物は、前記抽出法で製造した抽出物、具体的には、粗抽出液に、分画過程をさらに実施した分画物が挙げられる。前記分画溶媒は、酢酸エチル、エーテル、クロロホルム、ベンゼン、ヘキサン、塩化メチレン及びこれらの混合溶媒からなる群から選ばれた溶媒であってよい。前記分画過程は、具体的には、前記粗抽出液に混合溶媒を順に加えた後、層分離した分画物を、順次に収得する方法で行うことができる。
【００４３】
本発明の一実施例で、前記抽出物は、ボエセンベルギアパンドラタのエタノール抽出物に、ヘキサン、クロロホルム及び酢酸エチルの混合溶媒を加えて分画した、ヘキサンクロロホルム酢酸エチル第1分画物であってよい。また、前記第1分画物に、再びヘキサン、酢酸エチル及びメタノールを展開溶媒として使用して分画したヘキサン酢酸エチルメタノール第2分画物であってよい。前記ヘキサン、クロロホルム、及び酢酸エチルの混合溶媒は、1乃至5：1：0.1乃至0.5の嵩比で混合されたものであってよく、前記ヘキサン、酢酸エチル及びメタノールは、15乃至20：0.5乃至4：1の嵩比で混合されたものであってよい。前記本発明の分画物に、パンドラチン成分が最も多く含まれていて、骨損失疾患の予防、治療又は改善効果に優れた長所がある。
【００４４】
前記抽出物又は分画物は、抽出又は分画過程を遂行した後、減圧濾過過程を行うか、さらに濃縮及び／又は凍結乾燥を行い、濃縮するか又は溶媒を除去することができる。前記収得した抽出物は、使用時まで急速冷凍冷蔵庫(deep freezer)に保管することができる。
【００４５】
前記分画は、溶媒分画、シリカゲルクロマトグラフィー(silica gel chromatography)、prep-HPLCなどの技術を利用して、活性物質が濃縮された特定分画物を製造することができる。
【００４６】
本明細書で、「骨損失」とは、破骨細胞と造骨細胞との不均衡によってもたらされる、骨が損失する症状を意味するもので、「骨損失疾患」とは、前記の症状と関連した疾患の全てを含む意味である。従って、破骨細胞の活性が過度に高くなり、骨が損失されて骨の密度が低下したり、造骨細胞の活性が低下して、骨の生成が円滑になされないためにもたらされたりする疾患を全て含む。具体的な例として、骨多孔症、パジェット病(paget’s disease)、歯槽骨損失、骨軟化症及び骨異栄養症を含む。
【００４７】
前記骨多孔症（osteoporosis）は、骨の量が減少して、質的変化により、骨の強度が弱くなり、骨折が起こる可能性が高い状態を意味するもので、破骨細胞の機能を低下させたり、骨母細胞を活性化させたりする方法で、症状を緩和、改善、治療又はその疾患を予防することができる。
【００４８】
前記パジェット病(paget’s disease)は、骨リモデリング（bone remodeling)が過度に亢進して、広い範囲の部位の骨格系が侵される骨疾患を意味するもので、骨吸収及び／又は骨形成を抑制する方法で、症状を緩和、改善、治療するか又は、その疾患を予防することができる。
【００４９】
前記歯槽骨損失は、歯槽(歯周)部位の骨が損失される症状を全て含む意味で、歯周炎又は歯齦炎により発生することがあるが、これに限定されるものではない。
【００５０】
前記骨軟化症(Osteomalacia)は、新たに生成される骨基質の石灰化異常により、骨密度の減少を示す疾患を意味するもので、くる病（rickets)とも呼ばれている。破骨細胞の活性を抑制することにより、骨の軟化を遅延したり、骨軟化による骨折などを防いだりすることができる。
【００５１】
前記骨異栄養症(Osteodystrophy)は、栄養不均衡による骨の成長阻害症であって、骨多孔症を伴うことがある。骨の形成障害、骨形成障害又は骨形成異常症とも呼ばれる。前記骨異栄養症は新成骨異栄養症、肥大性骨異栄養症(Hypertrophic Osteodystrophy)及び胎児性軟骨異栄養症(chondrodystrophia foetalis, fetal chonchodystrophy)を含む。
【００５２】
本発明の一実施例で、破骨細胞にパンドラチン又は本発明の抽出物を処理した結果、破骨細胞の活性が抑制されることを実験的に確認した。従って、本発明の組成物は、破骨細胞の活性を阻害することにより、骨の損失を誘発する過剰な骨の吸収を、抑制及び遅延することにより、骨損失疾患の予防、治療又は改善に効果的である。
【００５３】
本明細書で、「予防」とは、疾病又は病症の発症を抑制するか、又は、遅延させる全ての行為を意味する。本発明においては、破骨細胞の活性を抑制して骨損失疾患の発症時期を遅延させたり、発症を抑制したりすることを意味する。
【００５４】
本明細書で、「改善」とは、疾病又は病症状態を好転させる、又は、良いように変更する全ての行為を意味するもので、本発明においては、破骨細胞の活性を抑制する作用を通じて、骨多孔症の症状又は歯槽骨の損失のような症状を好転させることを意味する。
【００５５】
本明細書で、「治療」とは、疾病又は病症の進行を遅延、中断、又は逆転させる全ての行為を意味するもので、本発明においては、破骨細胞の活性を抑制する作用を通じて、歯槽骨又は骨などの損失を中断、軽減、緩和又はなくしたり、逆転させたりすることを意味する。
【００５６】
本発明の一実施例で、ボエセンベルギアパンドラタ（Boesenbergia pandurata）抽出物又はパンドラチンを処理して、骨多孔症の発症原因となる破骨細胞分化を抑制できることを確認した。
【００５７】
従って、このような面で、本発明の組成物は、骨損失疾患の予防又は治療用薬学組成物であってよい。
【００５８】
本発明の組成物は、骨損失疾患の予防又は治療のために、前記有効成分の他に、追加して同一又は類似した機能を有する有効成分を、1種以上含むことができる。例えば、骨損失疾患の予防又は治療に効果がある公知の骨多孔症治療剤、歯槽骨疾患治療剤などをさらに含むことができる。追加的な成分を含むと、本発明の組成物の骨損失疾患に対する予防又は治療効果はさらに増進される。前記成分の追加時には、複合使用に伴う安定性、製剤化の容易性、有効成分の安定性を考慮することができる。前記追加の成分は、全体組成物の重量に対して、0.0001重量％以上乃至10重量％以下で含まれ得る。例えば、0.0001重量％以上乃至1重量％以下、0.0001重量％以上乃至0.1重量％以下、0.0001重量％以上乃至0.001重量％以下、0.001重量％以上乃至10重量％以下、0.001重量％以上乃至1重量％以下、0.001重量％以上乃至0.1重量％以下、0.01重量％以上乃至10重量％以下、0.01重量％以上乃至1重量％以下であってよい。前記含量範囲は、安全性、本発明のボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチン化合物の製剤化の際の容易性などの要件により、調節することができる。
【００５９】
本発明の薬学組成物は、パンドラチンの薬学的に許容可能な塩を、さらに含むことができる。本明細書において、用語「薬学的に許容可能な」とは、生理学的に許容されて、ヒトに投与されるとき、通常的にアレルギー反応又は類似した反応を起こさないことを意味し、前記塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸(free acid)によって形成された酸付加塩が好ましい。
【００６０】
前記薬学的に許容可能な塩は、有機酸又は無機酸を利用して形成された酸付加塩であってよく、前記有機酸は、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、ブチル酸、イソブチル酸、トリフルオロ酢酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、コハク酸モノアミド、グルタミン酸、酒石酸、シュウ酸、クエン酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、安息香酸、フタル酸、サリチル酸、アントラニル酸、ジクロロ酢酸、アミノオキシ酢酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸又はメタンスルホン酸を含む。無機酸は、例えば、塩酸、臭素酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸又はホウ酸を含む。酸付加塩は、好ましくは塩酸塩又は酢酸塩の形態であって、より好ましくは塩酸塩の形態である。
【００６１】
前記酸付加塩は、a)パンドラチン及び酸を直接混合するか、b)これらの内のいずれかを溶媒又は含水溶媒中に溶解させて混合するか、又はc）パンドラチンを溶媒又は水和溶媒中の酸に置いてこれらを混合する、一般的な塩の製造方法で製造される。
【００６２】
前記とは別に、追加的に塩として可能な形態は、ギャバ塩、ガバペンチン塩、プレガバリン塩、ニコチン酸塩、アジピン酸塩、ヘミリンゴ酸塩、システイン塩、アセチルシステイン塩、メチオニン塩、アルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩又はアスパラギン酸塩などがある。
【００６３】
また、本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。
【００６４】
薬学的に許容される担体は、例えば、経口投与用担体又は非経口投与用担体をさらに含むことができる。経口投与用担体は、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などを含むことができる。また、非経口投与用担体は、水、適切なオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含むことができる。また、安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチル又はプロピルパラベン、及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体には、次の文献に記載されていることを参考にすることができる(Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995)。
【００６５】
本発明の薬学組成物は、ヒトをはじめとする哺乳動物に、どのような方法でも投与することができる。例えば、経口又は非経口投与することができ、非経口的な投与方法としては、これに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、境膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下又は直腸内投与が挙げられる。
【００６６】
本発明の薬学組成物は、前述した通り、投与経路によって、経口投与用又は非経口投与用製剤に製剤化することができる。製剤化する場合には、一つ以上の緩衝剤(例えば、生理食塩水又はPBS)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン等)、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤(例えば、EDTA又はグルタチオン)、充填剤、増量剤、結合剤、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)、懸濁剤、濃厚剤、湿潤剤、崩解剤又は界面活性剤、希釈剤、又は賦形剤を使用して調剤することができる。
【００６７】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液又はカプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、本発明の薬学組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉(トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉等を含む)、炭酸カルシウム(Calcium carbonate)、スクロース(sucrose)、ラクトース(lactose)、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース又はゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。例えば、活性成分を固体賦形剤と配合して、これを粉砕して、適切な補助剤を添加した後、顆粒の混合物に加工することにより、錠剤又は糖衣錠剤を得ることができる。
【００６８】
単純な賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウムタルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤又はシロップ剤などが該当するが、広く使用される単純希釈剤である水又は液体パラフィン以外にも、多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、又は保存剤などが含まれる。
【００６９】
また、場合によっては、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどを崩解剤に添加することができ、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などを追加して含むことができる。
【００７０】
非経口的に投与する場合、本発明の薬学組成物は、適切な非経口用担体と一緒に、注射剤、経皮投与剤及び鼻腔吸込剤の形態で、当業界に公知された方法により剤形化することができる。前記注射剤の場合には、必ず滅菌しなければならず、バクテリア及び真菌などの微生物の汚染から保護されるべきである。注射剤の場合、適切な担体の例としては、これに限定はされないが、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等)、これらの混合物及び／又は植物油を含む溶媒又は分散媒質であってよい。より好ましくは、適切な担体には、ハンクス溶液、リンゲル溶液、トリエタノールアミンが含まれたPBS(phosphate buffered saline)又は注射用滅菌水、10％エタノール、40％プロピレングリコール及び5％デキストロースのような等張溶液などを使用することができる。前記注射剤を微生物汚染から保護するには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのような、多様な抗菌剤及び抗真菌剤をさらに含むことができる。また、前記注射剤は、殆どの場合、糖又は塩化ナトリウムのような等張化剤をさらに含むことができる。
【００７１】
経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、ペースト剤、リニメント剤、エアロゾル剤などの形態が含まれる。前記「経皮投与」とは、薬学組成物を、局所的に皮膚に投与して、薬学組成物に含まれた有効な量の活性成分が、皮膚内に伝達されることを意味する。
【００７２】
吸込投与剤の場合、本発明により使用される化合物は、適切な推進剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切な気体を使用して、加圧パック又は煙霧機からエアロゾルスプレーの形態で便利に伝達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を伝達するバルブを提供して決定することができる。例えば、吸込器又は吹込器に使用されるゼラチンカプセル及びカートリッジは、化合物及びラクトース又はデンプンのような適切な粉末基剤の粉末混合物を含有するように製剤化することができる。非経口投与用剤形は、全て製薬化学で一般的に公知された処方書の文献(Remington’ s Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)に記載されている。
【００７３】
本発明の薬学組成物は、パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はその分画物を有効量で含んでいるとき、好ましい骨損失疾患の予防、改善又は治療効果を提供することができる。本明細書で「有効量」とは、陰性対照群に比べて、それ以上の反応を示す量を意味し、好ましくは骨損失疾患の予防、改善又は治療に十分な量を意味し、本発明の薬学組成物には、パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物が、0.01乃至99.99％含まれることができ、残量は薬学的に許容可能な担体が占めることができる。本発明の薬学組成物に含まれるパンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はその分画物の有効量は、組成物が製品化される形態などによって異なる。
【００７４】
本発明の薬学組成物の総有効量は、単一投与(single dose)で患者に投与することができ、複数回投与(multiple dose)で長期間投与される分割治療方法(fractionated treatment protocol)により投与することもできる。本発明の薬学組成物は、疾患の程度によって、有効成分の含有量を異にすることができる。例えば、パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物を基準に、一日に体重1kg当たり好ましくは0.001乃至100mg、より好ましくは0.01乃至10mgの量で投与するように、1乃至数回に分けて投与することができる。しかし、前記パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物の容量は、薬学組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率など、多様な要因を考慮して、患者に対する有効投与量が決定されるので、このような点を考慮すると、当分野の通常的な知識を有する者であれば、前記パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物の、骨損失予防、治療又は改善のための特定用途による適切な有効投与量を決定することができる。本発明に係る薬学組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
【００７５】
本発明の骨損失疾患の予防又は治療用の薬学組成物は、単独で、又は手術、放射線治療、ホルモン療法、化学治療、又は生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００７６】
本発明の骨損失疾患の予防又は治療用薬学組成物は、また、パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物を有効成分として含む外用剤の剤形で提供することができる。この点で、本発明の組成物は、骨損失の予防又は改善用医薬部外品組成物及び前記組成物を含む医薬部外品でもある。
【００７７】
前記外用剤は、皮膚又は口腔内に直接適用することができる。本発明の骨損失疾患の予防又は治療用薬学組成物を外用剤として使用する場合、追加して脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤(foaming agent)、芳香剤、界面活性剤、水、イオン性乳化剤、非イオン性乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、エッセンシャルオイル、染料、顔料、親水性活性剤、親油性活性剤又は脂質小嚢などの皮膚外用剤に通常使用される任意の他の成分のような、皮膚科学分野で通常的に使用される補助剤を含むことができる。また、前記成分は、皮膚科学分野で一般的に使用される量で導入することができる。
【００７８】
本発明の組成物が外用剤で提供される場合、これらに制限されるものではないが、液剤、軟膏、パッチ、ゲル、クリーム、又は噴霧剤などの剤形であってよい。本発明の一具現例によると、本発明の医薬部外品は、歯磨き粉、洗口液及びマウススプレーを含む口腔管理製品、軟膏剤、マスク、湿布剤、貼付剤(パッチ)及び経皮吸収剤などを含むことができる。
【００７９】
本発明の一実施例で、パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物を処理する場合、破骨細胞の分化が抑制されて、前記有効成分を口腔管理製品に適用する場合、破骨細胞の骨吸収が過剰に起きて、問題となる歯槽骨疾患の予防又は改善に効果がある。従って、前記の医薬部外品組成物は、骨損失の予防又は改善のための口腔管理用組成物であってよい。
【００８０】
本発明の組成物を医薬部外品組成物として使用する場合、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンをそのまま添加したり、他の医薬部外品成分と共に通常的な方法により適切に使用したりすることができる。有効成分の混合量は、使用目的(予防、健康又は治療的処置)により適切に決定することができる。
【００８１】
本発明の医薬部外品組成物及び医薬部外品について、前記医薬組成物及び下記食品組成物の内容が準用されることもある。
【００８２】
本発明の組成物は、他の態様では、骨損失予防又は改善用食品組成物でもある。
【００８３】
前記食品組成物は健康機能性食品組成物でもある。
【００８４】
本発明の一実施例で、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチン誘導体を処理した場合、破骨細胞の分化及び活性を抑制することにより、骨損失を直接的に予防又は遅延できることを確認した。従って、前記の骨損失は、骨損失を誘発する疾患によるもので、好ましくは破骨細胞の過剰な活性などにより表れる骨損失疾患によるものでもある。
【００８５】
本発明の食品組成物は、機能性食品(functional food)、栄養補助剤(nutritional supplement)、健康食品(health food)、食品添加剤(food additives)及び飼料などの全ての形態を含めて、ヒト又は家畜をはじめとする動物を取食対象とする。
【００８６】
前記類型の食品組成物は、当業界に公知された通常的な方法により、多様な形態で製造することができる。一般食品は、これに限定はされないが、飲料(アルコール飲料を含む)、果実及びその加工食品(例：果物缶詰、瓶詰、ジャム、マーマレード等)、魚類、肉類及びその加工食品(例：ハム、ソーセージ、コンビーフ等)、パン類及び麺類(例：うどん、そば、ラーメン、スパゲッティ、マカロニ等)、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品(例：バター、チーズ等)、食用植物油脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料(例：味噌、醤油、ソース等)等に、前記パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物を添加して製造することができる。
【００８７】
また、栄養補助剤は、これに限定はされないが、カプセル、錠剤、丸剤などに、前記パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物を添加して製造することができる。
【００８８】
また、健康機能食品としては、これに限定はされないが、例えば、前記パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物自体を、お茶、ジュース及びドリンクの形態で製造して飲用(健康飲料)できるように液状化、顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取することができる。また、前記パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物を、食品添加物の形態で使用するために、粉末又は濃縮液形態で製造して使用することができる。また、前記パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物と、骨損失予防又は改善に効果があると知られている公知の活性成分とを共に混合して、組成物の形態で製造することができる。
【００８９】
本発明の食品組成物が健康飲料組成物として利用される場合、前記健康飲料組成物は、通常の飲料のように、多様な香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物はブドウ糖、果糖のような単糖類;マルトース、スクロースのようなジサッカライド(二糖)；デキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド;キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールでもある。甘味料は、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料;サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物100mL当たり、一般的に約0.01〜0.04g、好ましくは約0.02〜0.03gである。
【００９０】
パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物は、骨損失予防又は改善用食品組成物の有効成分として含有することができるが、その量は、骨損失疾患の予防、改善効果を得るために有効な量で、特に限定されるものではないが、全組成物の総重量に対して、0.01乃至100重量％であることが望ましい。本発明の食品組成物は、パンドラチン又はボエセンベルギアパンドラタ抽出物と共に骨損失予防又は抑制に効果があることが知られている他の活性成分と共に混合して製造することができる。
【００９１】
前記の他に、本発明の健康食品は多様な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸塩、アルギン酸、アルギン酸塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、又は炭酸化剤などを含有することができる。その他に、本発明の健康食品は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、又は野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。これらの成分は、独立的に又は混合して使用することができる。これらの添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明の組成物100重量部当り0.01〜0.1重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【００９２】
以下、本発明を、実施例を通じて、より詳細に説明する。ただし、本発明は、多様な変更を加えることができ、多様な形態を有することができて、以下で記述する特定の実施例及び説明は、本発明の理解を容易にするためだけのもので、本発明を、特定した開示形態に対して限定しようとするものではない。本発明の範囲は、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変更、均等物乃至代替物を含むものと理解されるべきである。
【００９３】
[実施例１］ボエセンベルギアパンドラタ抽出物の製造
乾燥したボエセンベルギアパンドラタ抽出物をミキサーで粉砕した後、粉砕したボエセンベルギアパンドラタの試料100gを、エタノール500mLに入れて、50℃で30分間攪拌しながら抽出物を製造した。抽出された試料は、ワットマン(Whatman)2番濾紙で濾過して、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して溶媒成分を除去した後、凍結乾燥して水分を除去して、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物を得た。
【００９４】
[実施例２]パンドラチンＡの分離及び構造決定
実施例2-1．パンドラチンＡの分離
前記実施例1で得た濃縮されたボエセンベルギアパンドラタ抽出物と酢酸エチルを混合して、酢酸エチル溶解性成分を抽出し、減圧下で酢酸エチルを除去して、酢酸エチル溶解性成分だけを濃縮した。次に、シリカゲルを、6X15cmで充填したカラムに前記濃縮された成分を積載して、ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチルを、15：5:1.5(v/v/v)の割合で混合した溶媒システムを利用して分取した。前記分取順に従って、合計6つの分画に分け、それぞれの分画を濃縮乾燥した。6つの分画のうち、3番分画(分画3)を、ヘキサン、酢酸エチル、メタノールをそれぞれ18：2：1(v/v/v)の割合で混合した溶媒を展開溶媒として使用して、薄層クロマトグラフィー(TLC、silica gel 60F254、Merck)を行い、分取した順に従って、合計3つの分画に分けて濃縮乾燥した。最終的に、前記3つの分画のうちの2番分画(分画3-2)を利用して、リサイクル分取高速流体クロマトグラフィー(recycling HPLC、column: W252、20.0 mm ID X 500 mm L)を行い、分取順に従って、合計2つの分画に分けて、それぞれの分画を濃縮乾燥した。最終的に、前記の2つの分画のうちの2番分画(分画3-2-2)を濃縮乾燥して、純粋な単一の活性物質を分離した。
【００９５】
実施例2-2. パンドラチンＡの構造決定
前記実施例2-1で分離された単一活性物質の構造決定のために、1H-NMRスペクトルと13C-NMRスペクトルを、それぞれ500MHz及び125MHz(溶媒:CDCl3)で測定した。収得した13C-NMRスペクトルと1H-NMRスペクトルの結果をもとに、1H-1Hの相関関係と1H-13Cの相関関係を測定するために、1H-1H COSYスペクトルと13C-HSQCスペクトルを測定して、炭素共鳴を通じて出てくる波長でそれぞれの炭素信号を区別して、その結果を測定した。
【００９６】
また、前記分離された単一物質の質量分析のためにEI/MSを測定した。本化合物は、EI/MSで[M+H+]がm/z値407で観測され、分子量が406であることが判明され、分子式はC26H30O4であった。
【００９７】
以上の1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC及びEI/MSに対する結果と、過去に発表された研究報告(Phytochemistry, 26: 1542-1543, 1987)とを比較分析して同定した結果、前記実施例2-1で分離された単一物質は（2,6-ジヒドロキシ-4-メトキシフェニル）[3-メチル-2-（3-メチルブト-2-エニル）-5-フェニルシクロへキス-3-エニル]メタノンであって、下記化学式1で表示されるパンドラチンＡ(panduratin A)化合物と確認された。
【００９８】
【化４】
2019510815.tif 000006
【００９９】
[試験例１］ボエセンベルギアパンドラタ抽出物及びパンドラチンＡの破骨細胞分化抑制効果の確認
試験例1-1．RT-PCRを通じたボエセンベルギアパンドラタ抽出物及びパンドラチンＡの破骨細胞分化抑制効果の確認
RAW 264.7破骨細胞前駆細胞(American Type Culture Collection(ATCC), Manassas, VA, USA)を、6-ウェル平板培養器(6-well microtiter plate)に、10％の牛胎児血清が含有されたDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Hyclone, Logan, UT, USA)培地を利用して、8X104細胞／ウェル(cells/well)になるように入れた。24時間後、10％の牛胎児血清が含まれたα-MEM(α-modified Eagle’s Medium, Gibco, Grand Island, NY, USA)培地に、25ng/mlのRANKL(Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ, USA)と、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物1μg/ml、10μg/ml、又は、前記実施例2で得られたパンドラチンＡ0.1μM、1μMとをそれぞれ処理して、4日間分化を誘導した。培地は2日に一回ずつ交換した。
【０１００】
破骨細胞分化の際に発現される主な転写因子であるNFATc1(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1)と酵素TRAP、カテプシンＫ（cathepsin K）のmRNA発現量を調べるために、RT-PCRを行った。分化した細胞から、TRIzol試薬(Takara, Tokyo, Japan)を使用して、全RNAを収穫して、cDNA合成のために前記RNAを逆転写酵素で逆転写させた後、次のプライマーを利用してRT-PCRを行った。その結果は図1又は図2に示した。
【０１０１】
βアクチン（β-Actin）：
Forward primer：5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
Reverse primer：5'-TCACTATTGGCAACGAGCGG-3'
NFATc1：
Forward primer：5'-CCTGGAGATCCCGTTGCTTC-3'
Reverse primer：5'-TCCCGGTCAGTCTTTGCTTC-3'
TRAP：
Forward primer：5'-AAATCACTCTTTAAGACCAG-3'
Reverse primer：5'-TTATTGAATAGCAGTGACAG-3'
カテプシンＫ：
Forward primer：5'-ATCTCTCTGTACCCTCTGCA-3'
Reverse primer：5'-CCTCTCTTGGTGTCCATACA-3'
【０１０２】
図1又は図2に示した通り、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物及びパンドラチンＡ処理によって分化された破骨細胞から、NFATc1とTRAP、カテプシンＫのmRNA発現量が減少したことが確認できた。特に、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物10μg/ml又はパンドラチンＡ1μM処理群では、TRAPとカテプシンＫのmRNA発現が殆ど示されていないことを確認できた。これは、本発明のボエセンベルギアパンドラタ抽出物及びパンドラチンＡが、破骨細胞の骨吸収作用を抑制する効能に優れていることを意味する。
【０１０３】
試験例1-2．Western blotを通じたボエセンベルギアパンドラタ抽出物及びパンドラチンAの破骨細胞分化抑制効果の確認
RAW 264.7破骨細胞前駆細胞(ATCC)を、6ウェル平板培養器に10％の牛胎児血清が含有されたDMEM(Hyclone)培地を利用して、1X105細胞/ウェル（cells/well）になるように入れた。24時間後、10％の牛胎児血清が含まれたα-MEM(Gibco)培地に25ng/mlのRANKL(Peprotech)とボエセンベルギアパンドラタ抽出物1μg/ml、10μg/ml又はパンドラチンＡ0.1μM、1μMをそれぞれ処理して、24時間培養した。その後、破骨細胞分化時に発現される主な転写因子NFATc1と酵素TRAP、カテプシンＫのタンパク質発現量を調べるために、ウェスタンブロット(western blot)を行った。
【０１０４】
具体的には、プロテイナーゼインヒビターカクテル（proteinase inhibitor cocktail)が含まれたNP-40緩衝溶液(ELPIS-Biotech, Daejeon, Korea)で細胞を溶解させた。緩衝溶液に溶解された細胞を1.5mlチューブ（tube）に移して、13,000rpmで10分間遠心分離し、上澄み液だけをとった。上澄み液を、ブラッドフォード(Bradford, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)法を利用して定量した。定量されたタンパク質を5分間煮沸した後、10％SDS-PAGEで電気泳動して分離し、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。NFATc1とTRAP、カテプシンＫの1次抗体を、2.5％ウシ血清アルブミン(BSA)に1：1000の割合で希釈して、ニトロセルロース膜に転写されたタンパク質と、20時間、常温で反応させた。1次抗体を反応させた後、Tween20含有トリス緩衝生理食塩水 (TBST)を利用して、ニトロセルロース膜を10分間、3回洗浄した。洗浄後、1次抗体に結合する2次抗体を、2.5％BSAに1：5000になるように希釈して、ニトロセルロース膜と、2時間、常温で反応させ、TBSTを利用して、10分ずつ、3回に渡って洗浄した。タンパク質バンド(Protein band)は、ECLウェスタンブロッティング検出試薬(Amersham, Tokyo, Japan)を使用して発色し、G;BOX EFイメージングシステム(Syngene, cambridge, UK)を利用して、発色されたタンパク質バンド(protein band)を確認した。その結果を図3に示した。
【０１０５】
図3又は図4に示した通り、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡ処理によって分化された破骨細胞から、NFATc1とTRAP、カテプシンＫのタンパク質発現量が減少したことが確認できた。特に、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物10μg/ml又はパンドラチンＡ1μM処理群から、NFATc1とカテプシンＫのタンパク質の発現が殆ど認められなかった。これは、本発明のボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡが、破骨細胞の骨吸収作用を抑制する効能に優れていることを意味する。
【０１０６】
試験例1-3．ボエセンベルギアパンドラタ抽出物及びパンドラチンAのTRAP酵素活性抑制効能の検証
前記試験例1-1と同様の方法で、RAW264.7破骨細胞前駆細胞を、6-ウェル平板器に付着させた後、10％の牛胎児血清が含まれたα-MEM（Gibco）に、25ng/mlのRANKL（Peprotech）と、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物1μg/ml、10μg/ml又は、前記実施例2で得られたパンドラチンＡ0.1μM、1μMをそれぞれ処理して、4日間、分化を誘導した。培地は、2日に一回ずつ交換した。その後、上澄み液を全て除去した後、0.1％ Triton X-100(Oriental chemical industries, Seoul, Korea)で細胞を溶解させた。緩衝溶液に溶解された細胞を1.5mlチューブに移して、13,000rpmで15分間遠心分離し、上澄み液だけをとった。TRAPを含むこの上澄み液は白血球酸性リン酸化酵素キット(Leukocyte acid phosphatase kit)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)を利用して、製造社のガイドラインに基づいて分析した。その結果を図5又は図6に示した。
【０１０７】
図5又は図6に示した通り、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡ処理によって分化された破骨細胞から、TRAP酵素活性が有意に減少したことが確認された(##p < 0.01、**p < 0.01)。特に、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物10μg/ml又はパンドラチンＡ1μM処理群から、著しくTRAP酵素活性が低くなることを確認した。これは、本発明のボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡが、骨細胞の骨吸収作用を抑制する効能に優れていることを意味する。
【０１０８】
試験例1-4．TRAP染色を通じたボエセンベルギアパンドラタ抽出物及びパンドラチンＡの破骨細胞分化抑制効果の確認
前記試験例1-1におけるのと同じ方法で、RAW264.7破骨細胞前駆細胞を、6-ウェル平板器に付着させた後、10％の牛胎児血清が含まれたα-MEM（Gibco）に25ng/mlのRANKL（Peprotech）と前記実施例2で得られたパンドラチンＡ0.1μMと1μMをそれぞれ処理して、4日間分化を誘導した。培地は2日に一回ずつ交換した。4日後、上澄液を全て除去して2％ホルムアルデヒド(Junsei chemical, Tokyo, Japan)で細胞を固定した。その後、白血球酸性リン酸化酵素キット(Leukocyte acid phosphatase kit, Sigma-Aldrich)の製造社のガイドラインによりTRAP染色を行い、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡの破骨細胞分化抑制効果を、顕微鏡分析を通じて分析した。その結果を、図7又は8に示した。
【０１０９】
その結果、図7又は図8に示した通り、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡ処理により、破骨細胞分化が抑制されたことを確認できた。特に、ボエセンベルギアパンドラタ抽出物10μg/ml又はパンドラチンＡ1μM処理群から、対照群(control)と殆ど類似した水準まで分化を抑制したことを確認した。これは、本発明のボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡが、破骨細胞の骨吸収作用を抑制する効能に優れていることを意味する。
【０１１０】
以下、本発明に係る実施例1乃至2のボエセンベルギアパンドラタ抽出物及び／又はパンドラチンＡを有効成分として含む医薬品及び食品の製造例を説明するが、本発明をこれに限定するためではなく、単に具体的に説明しようとするのである。前記骨多孔症又は歯槽骨の損失予防、改善又は治療効果が優れたボエセンベルギアパンドラタ抽出物及び／又はパンドラチンＡを有して、下記のような組成成分及び組成比により、製造例1乃至2の医薬品及び食品組成物を、通常的な方法によって製造した。
【０１１１】
[製造例１]医薬品
製造例1-1．散剤
前記実施例1乃至2のボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡ50mg、結晶セルロース2gを混合した後、通常の散剤製造方法により、気密包に充填して、散剤を製造した。
【０１１２】
製造例1-2．錠剤
前記実施例1乃至2のボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡ50mg、結晶セルロース400mg、ステアリン酸マグネシウム5mgを混合した後、通常の錠剤製造方法によって打錠して、錠剤を製造した。
【０１１３】
製造例1-3．カプセル剤
前記実施例1乃至2のボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡ30mg、乳清タンパク質100mg、結晶セルロース400mg、ステアリン酸マグネシウム6mgを混合した後、通常のカプセル剤の製造方法によってゼラチンカプセルに充填して、カプセル剤を製造した。
【０１１４】
製造例1-4．注射剤
通常の注射剤の製造方法によって、活性成分を注射用蒸留水に溶解して、pHを約7.5に調節した後、前記実施例2のパンドラチンＡ100mg、注射用蒸留水、pH調節剤を混合して、2ml容量のアンプルに充填して、滅菌して注射剤を製造した。
【０１１５】
[製造例２]食品
製造例2-1．健康食品の製造
前記実施例1乃至2のボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡ1000mg、ビタミンＡ酢酸塩70μg、ビタミンE 1.0mg、ビタミンB1 0.13mg、ビタミンB2 0.15mg、ビタミンB6 0.5mg、ビタミンB12 0.2μg、ビタミンC 10mg、ビオチン10μg、ニコチン酸アミド1.7mg、葉酸50μg、パントテン酸カルシウム0.5mg、硫酸第一鉄1.75mg、酸化亜鉛0.82mg、炭酸マグネシウム25.3mg、第1リン酸カリウム15mg、第2リン酸カルシウム55mg、クエン酸カリウム90mg、炭酸カルシウム100mg、塩化マグネシウム24.8mgを混合して製造した。
【０１１６】
ただし、前記の配合比を任意に変形して実施しても差し支えなく、通常の健康食品の製造方法により前記の成分を混合して顆粒を製造し、通常の方法により健康食品組成物の製造に使用することができる。
【０１１７】
製造例2-1．健康飲料の製造
前記実施例1乃至2のボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡ1000mg、クエン酸1000mg、オリゴ糖100g、梅濃縮液2g、タウリン1gに精製水を加えて全体900mlとし、通常の健康飲料製造方法により、前記の成分を混合した後、約1時間、85℃で攪拌加熱した後、製作された溶液を濾過して、滅菌された2L容器に取得して密封滅菌した後、冷蔵保管して健康飲料組成物の製造に使用することができる。
【０１１８】
製造例2-3．チューインガム
ガムベース20重量％、砂糖76.9重量％、香料1重量％及び水2重量％と、実施例1乃至2のボエセンベルギアパンドラタ抽出物及びパンドラチンＡ0.1重量％を配合して通常の方法でチューインガムを製造した。
【０１１９】
製造例2-4．キャンディ
砂糖60重量％、水飴39.8重量％及び香料0.1重量％と実施例1乃至2のボエセンベルギアパンドラタ抽出物及びパンドラチンＡ0.1重量％を配合して、通常の方法でキャンディを製造した。
【０１２０】
製造例2-5．ビスケット
薄力１等粉25.59重量％、中力１等粉22.22重量％、精白糖4.80重量％、食塩0.73重量％、ブドウ糖0.78重量％、パームショートニング11.78重量％、アンモニウム1.54重量％、重曹0.17重量％、重亜硫酸ナトリウム0.16重量％、米粉1.45重量％、ビタミンB 0.0001重量％、ミルクフレーバー0.04重量％、水20.6998重量％、全脂粉乳1.16重量％、代用粉乳0.29重量％、第1リン酸カルシウム0.03重量％、散布塩0.29重量％及び噴霧油7.27重量％と、実施例1乃至2のボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチンＡ重量％を配合して通常の方法でビスケットを製造した。
【０１２１】
[製造例３]医薬部外品及びその他
実施例で製造したボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチン誘導体を利用して、下記の通り医薬部外品などを製造した。
【０１２２】
製造例3-1．歯磨き粉
下記表1に示した通り、実施例で製造したボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチン誘導体を含む歯磨き粉を製造した。
【０１２３】
【表１】
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【０１２４】
製造例3-2.洗口液
下記表２に示した通り、実施例で製造したボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチン誘導体を含む洗口液を製造した。
【０１２５】
【表２】
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【０１２６】
製造例3-3．マウススプレー
下記表３に示した通り、実施例で製造したボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチン誘導体を含むマウススプレーを製造した。
【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
製造例3-4．食用フィルム
下記表４に示した通り、実施例で製造したボエセンベルギアパンドラタ抽出物又はパンドラチン誘導体を含む食用フィルムを製造した。
【０１２９】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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