(57)【要約】  本発明は、様々な研究、診断、画像化および治療の用途で使用するための改変された細胞外小胞（ＥＶ）に関する。これらのＥＶは、本質的に外在性および／または内在性であり得る、対象の様々なタンパク質の組込みおよび表面提示を可能にするよう改変されている。ＥＶのコーティングは、本発明のＥＶポリペプチドのタンパク質改変を通じて達成され、したがって、本発明は、ＥＶのコーティング方法、ＥＶ自体、ならびに上記改変されたＥＶに基づくキット、検出方法、診断用途、画像化および送達方法に関する。
2019523407.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
研究ツール、診断ツール、画像化ツールとして、生物学的基準材料（ＲＭ）として、実験対照および／または実験標準としての、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含む細胞外小胞（ＥＶ）の使用。
【請求項２】
前記使用が、フローサイトメトリー、イメージングフローサイトメトリー、ナノ粒子トラッキング解析、ナノイメージング、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、動的光散乱、電子顕微鏡、発光に基づく検出、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく技術、磁気、蛍光、および／または浮力に基づく標識に基づく正もしくは負の選択技術、粒子の密度、電荷、もしくはサイズに基づく正もしくは負の選択技術、または任意のそれらの組み合わせにおけるものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドが少なくとも１つのエキソソームポリペプチドと共に融合タンパク質の一部を形成する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記Ｆｃ結合ポリペプチドがＦｃ含有タンパク質のＦｃドメインに結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記Ｆｃ含有タンパク質が少なくとも１つのフルオロフォア、少なくとも１つの放射性標識、少なくとも１つのＰＥＴリガンド、少なくとも１つのＭＲＩ剤、ナノ粒子、無機化合物、または任意の他の検出部分に付着している、請求項２〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記使用が、フローサイトメトリー、ナノ粒子トラッキング解析、および／または動的光散乱のための生物学的ＲＭとしてのものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記ＲＭが、補償、較正、標準化、検証、または任意の他の同様の目的のために使用される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記ＥＶ自体が、少なくとも１つの検出部分を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記検出部分が、少なくとも１つのフルオロフォア、少なくとも１つの染料、少なくとも１つの蛍光ポリペプチド、少なくとも１つの放射性標識、少なくとも１つのＰＥＴ剤、少なくとも１つのＭＲＩ剤、無機化合物、有機化合物、または任意の他の検出部分を含む群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
Ｆｃ含有タンパク質を標的細胞に送達する、インビトロ、インビボ、および／またはエクスビボの方法であって、（ｉ）少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶを提供すること、（ｉｉ）前記Ｆｃ結合ポリペプチドを前記Ｆｃ含有タンパク質に結合させること、（ｉｉｉ）標的細胞を、Ｆｃ結合ポリペプチドにＦｃ含有タンパク質を付着させた前記ＥＶに接触させること、を含む方法。
【請求項１２】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、標的細胞の細胞内環境に送達される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドが少なくとも１つのエキソソームポリペプチドと共に融合タンパク質の一部を形成する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｆｃ含有タンパク質が少なくとも１つのフルオロフォア、少なくとも１つの放射性標識、少なくとも１つのＰＥＴリガンド、少なくとも１つのＭＲＩ剤、ナノ粒子、無機化合物、または任意の他の検出部分に付着している、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥＶ自体が、任意選択で、少なくとも１つのフルオロフォア、少なくとも１つの染料、少なくとも１つの蛍光ポリペプチド、少なくとも１つの放射性標識、少なくとも１つのＰＥＴ剤、少なくとも１つのＭＲＩ剤、ナノ粒子、無機化合物、または任意の他の検出部分を含む群から選択される、検出部分を含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＥＶを含む検出キットであって、前記ＥＶが少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドおよび少なくとも１つのエキソソームポリペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質を含む、検出キット。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドがＦｃ含有タンパク質のＦｃドメインに結合する、請求項１７に記載の検出キット。
【請求項１９】
前記Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項１７または１８に記載の検出キット。
【請求項２０】
前記Ｆｃ含有タンパク質が少なくとも１つのフルオロフォア、少なくとも１つの放射性標識、少なくとも１つのＰＥＴリガンド、少なくとも１つのＭＲＩ剤、ナノ粒子、無機化合物、または任意の他の検出部分に付着している、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の検出キット。
【請求項２１】
細胞外または細胞内の生体分子の検出における使用のための、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の検出キット。
【請求項２２】
前記生体分子の前記検出が、生細胞または死細胞および／もしくは組織ならびに／または器官において実施される、請求項２１に記載の検出キット。
【請求項２３】
前記生体分子の前記検出が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される、請求項２１または２２に記載の検出キット。
【請求項２４】
前記ＥＶ自体が、任意選択で、少なくとも１つの蛍光ポリペプチド等の少なくとも１つのフルオロフォア、生物発光を産生する少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つの放射性標識、少なくとも１つのＰＥＴ剤、少なくとも１つのＭＲＩ剤、ナノ粒子、無機化合物、または任意の他の検出部分から選択される、少なくとも１つの追加の検出部分を含む、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の検出キット。
【請求項２５】
フローサイトメトリー、ナノ粒子トラッキング解析、ナノイメージング、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、動的光散乱、電子顕微鏡、発光に基づく検出、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく技術、磁気、蛍光、および／または浮力に基づく標識に基づく正もしくは負の選択技術、密度、電荷、もしくはサイズに基づく正もしくは負の選択技術、またはそれらの任意の組み合わせにおける使用のための、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の検出キット。
【請求項２６】
（ｉ）少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶ、および（ｉｉ）少なくとも１つのＦｃ含有タンパク質を含むパーツのキット。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドが少なくとも１つのエキソソームポリペプチドと共に融合タンパク質の一部を形成する、請求項２６に記載のパーツのキット。
【請求項２８】
前記Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項２６または２７に記載のパーツのキット。
【請求項２９】
前記Ｆｃ含有タンパク質が少なくとも１つのフルオロフォア、少なくとも１つの放射性標識、少なくとも１つのＰＥＴ剤、少なくとも１つのＭＲＩ剤、ナノ粒子、無機化合物、または任意の他の検出部分に付着している、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のパーツのキット。
【請求項３０】
前記ＥＶが、少なくとも１つのフルオロフォア、少なくとも１つの放射性標識、少なくとも１つのＰＥＴリガンド、少なくとも１つのＭＲＩ剤、ナノ粒子、無機化合物、または任意の他の検出部分から選択される少なくとも１つの追加の検出部分を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載のパーツのキット。
【請求項３１】
（ｉ）少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶと（ｉｉ）Ｆｃ含有タンパク質とのナノ粒子複合体。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドが少なくとも１つのエキソソームポリペプチドと共に融合タンパク質の一部を形成する、請求項３１に記載のナノ粒子複合体。
【請求項３３】
前記Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項３１または３２に記載のナノ粒子複合体。
【請求項３４】
前記Ｆｃ含有タンパク質が少なくとも１つのフルオロフォア、少なくとも１つの放射性標識、少なくとも１つのＰＥＴ剤、少なくとも１つのＭＲＩ剤、ナノ粒子、無機化合物、または任意の他の検出部分に付着している、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のナノ粒子複合体。
【請求項３５】
フローサイトメトリー、ナノ粒子トラッキング解析、ナノイメージング、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、動的光散乱、電子顕微鏡、発光に基づく検出、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく技術、磁気、蛍光、および／または浮力に基づく標識に基づく正もしくは負の選択技術、密度、電荷、もしくはサイズに基づく正もしくは負の選択技術における、研究ツール、画像化ツール、診断ツール、画像化ツール、基準材料、検出キットとして、かつ／または、Ｆｃ含有タンパク質のインビトロ、インビボ、および／もしくはエクスビボの送達のための使用のための、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載のナノ粒子複合体。
【請求項３６】
フローサイトメトリー、ナノ粒子トラッキング解析、ナノイメージング、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、動的光散乱、電子顕微鏡、発光に基づく検出、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく技術、磁気、蛍光、および／または浮力に基づく標識に基づく正もしくは負の選択技術、密度、電荷、もしくはサイズに基づく正もしくは負の選択技術における、研究ツール、診断ツール、画像化ツール、生物学的ＲＭ、検出キットとして、かつ／あるいは、Ｆｃ含有タンパク質のインビトロ、インビボ、および／またはエクスビボの送達、もしくはそれらの任意の組み合わせのための、（ｉ）請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の検出キット、（ｉｉ）請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のパーツのキット、および／または（ｉｉｉ）請求項３１〜３５のいずれか１項に記載のナノ粒子複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、様々な疾患の診断における、ＥＶ分析のアッセイの標準化および評価のための研究および診断のツールとして、ならびに、例えばフローサイトメトリーのための生物学的基準材料（ＲＭ）として機能するように改変された細胞外小胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外小胞（ＥＶ）は、ＥＶ産生細胞によって細胞外環境に放出される、ナノサイズの小胞である。ＥＶおよび、特にエキソソームは、抗体およびデコイ受容体等の生物学的タンパク質を輸送することができ、組換えタンパク質の特異性と組み合わせたＥＶの特性を利用する進歩的な生物学的治療薬の全く新規の形態を可能にすることが示されてきている。さらに、ＥＶの起源および生命体の疾患状態に応じた種々の質のＥＶの存在、ならびにそれに続く、診断の観点での、ＥＶの特定の型または質の検出の評価が実証されてきている。この多量の種々の可能性のある用途に刺激されて、ＥＶを区分、列挙および表現型決定することを目的とした多くの分析法が確立されてきているか、または確立しつつある。そのような方法は、フローサイトメトリー、光散乱、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）、および／または種々のプローブとの結合後の蛍光の検出を含む。
【０００３】
ヒト体液中のＥＶの分子含有量および濃度は、それらのバイオマーカーとしての使用に関する関心を高めてきている（Ｆａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＥＶに基づくバイオマーカーは、部分的には標準化が欠如しているために、完全に実現されていない。装置の較正、結果の解釈および検証、ならびに測定の比較が、ＥＶの特性と同等または非常に類似した物理特性を有する基準材料（ＲＭ）を必要とするために、標準化は困難である。ＥＶ試料の最も分析された特性の１つは、濃度である。しかしながら測定されたＥＶの濃度は、サイズ分布および屈折率（ＲＩ）等のＥＶの物理特性に依存し、以下にさらに説明するように分析を複雑にする。
【０００４】
３００ｎｍより小さいＥＶが、ＥＶ集団の大部分を構成する（Ａａｔｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＥＶの典型的なサイズ分布は、約３０ｎｍから開始し、１００ｎｍ未満の直径でピークを示し、１００ｎｍを超える直径について、減少するべき乗関数または指数関数に従う（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。透過型電子顕微鏡法を例外として、現在の分析法のいずれも、ＥＶの集団の全体を検出することができない（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。最小のＥＶを検出することの不可能性は、決定された濃度の相違と過少評価の両方をもたらす。それゆえに、正常ヒト血清中の報告されたＥＶの数は、１０４〜１０１２／ｍＬ−１の範囲である（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４ａ）。これらのＥＶの濃度における８桁の相違は、標準化の必要性を強調する。
【０００５】
ＥＶ研究において最も一般的に使用されている方法  （Ｌａｃｒｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）の１つであるフローサイトメトリーにおいて、粒子検出はしばしば光散乱に基づく。シリカ（１．４５）およびポリスチレン（１．６１）のビーズのＲＩが、天然に存在するＥＶの平均ＲＩ（約１．３９）よりも大きいので、シリカまたはポリスチレンのビーズの散乱シグナルにゲートを適用することは、ＥＶのサイズおよび濃度の間違った評価をもたらす（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，２０１４ｂ）。例えば、約５００ｎｍのＥＶと同量の光を散乱する２００ｎｍのポリスチレンビーズ（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）で設定されたより小さいサイズのゲートは、２００〜５００ｎｍのＥＶの排除をもたらす（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４ｂ）。ＥＶの濃度が、直径の増加と共に減少するので、ポリスチレンのサイズのゲートは、実際のＥＶの濃度の過小評価を一般的にもたらす。
【０００６】
ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）によって、ストークス・アインシュタイン式がＥＶの流体力学的直径をそれらのブラウン運動から導出するのに使用される（Ｄｒａｇｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＮＴＡにおいて、ＥＶのＲＩは、測定された直径に影響を及ぼさないが、測定された濃度が、散乱粒子の輝度に依存するので、ＥＶのサイズ分布およびＲＩは、測定された濃度に影響を及ぼす（Ｆｉｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０００７】
要するに、これらの例は、類似のＲＩおよびサイズ分布を有するが、好ましくは研究されたＥＶと類似する形態（ＴＥＭに関して）およびゼータ電位（調整可能な抵抗パルスセンシング、ＴＲＰＳに関して）をも有するＲＭを開発する緊急の必要性を強調する。最終的に、表面分子または内部の積み荷を含む、他のＲＭの特性もまた、ＥＶのものと合致する。ＥＶ研究のための最適なＲＭの開発とそれらの検出のための分析法とが互いに依存しているので、これは困難である。さらに、種々の分析技術が、種々のＥＶの特性に依存する。
【０００８】
いくつかの研究が、単分散（Ｌａｃｒｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｍａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）および二峰性（Ｎｉｃｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）の合成ＲＭの使用を分析および記載してきているが、報告された生物学的ＲＭの使用は限定されている。ＥＶと類似した物理的および生化学的特性を有するサブミクロンの粒子は、天然に存在する源から単離することができ、１）例えば細胞培養、２）血漿リポタンパク質、植物および海洋ウイルス、ならびに３）小さな球状（球菌様）の細菌、またはピコプランクトンから単離したＥＶを含み得る。可能性のあるＥＶ源は、インビトロ細胞培養、治療用臨床グレードの赤血球および血小板濃縮物、尿、ならびに細菌によって産生された外膜小胞である。ここで、特別の利点は、得られたＲＭが、分子含有量を含む、改善された、実際のＥＶとの物理的および生化学的類似性を有することである。
【０００９】
リポタンパク質および植物および海洋の源からのウイルス粒子は、それらが、ＥＶの大部分と重複したサイズ分布を有し、サイズにおける比較的小さな変動を有するので、ＥＶ−ＲＭとして好適である。しかしながら、リポタンパク質およびウイルス粒子の主な欠点は、それらの粒子のＲＩが、それらの高いタンパク質含量のために、ＥＶのＲＩよりも高いことであり、特にタンパク質エンベロープウイルスの顕著な問題である。ウイルス粒子を用いることの別の問題は、それらのバイオセーフティーであり、これは、ウイルス様粒子、すなわち、ウイルスゲノムを欠く粒子を産生することによって回避できる。
【００１０】
生物学的ＲＭは、細胞を破壊することによって、断片から小さな小胞を産生することによってさらに産生でき、様々な直径の粒子をもたらす。そのような材料を用いることの主な利点は、得られたＲＭの物理的および生化学的な特性が、合成ＲＭと比べてＥＶによりよく類似することである。赤血球は、それらの細胞膜組成が、よく分析されており、それらが細胞内膜を欠いているので、使用するのに理論的に理想的な材料である。さらに、赤血球は、長期間の貯蔵の間に構造的に安定であり、容易に入手可能な材料である。これらの理由から、臨床余剰濃縮物からの赤血球は、試験および評価のためのＲＭを産生するのに使用されてきており、赤血球破壊のための種々の方法がまた比較されてきている。生物学的ＲＭはまた、リポソーム等の脂質構築物から取得でき、それらは、送達ビヒクルとして広範に使用され、それらの産生方法も周知である。所望のサイズのリポソームは、出発材料の超音波処理、または、例えば所定の孔径のポリカーボネートフィルターを通す押出成形によって調製できる。リポソームの利点は、産生中にそれらのＲＩを操作できることである。
【００１１】
現在、凍結乾燥されたエキソソームが、免疫捕獲性能評価のための標準化された正の対照として使用されている。凍結乾燥は様々な型の生物学的試料の長期間の安定性を保護するために一般的に適用される技術であり、凍結乾燥されたエキソソームは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロッティング（ＷＢ）、ＥＬＩＳＡを含む複数の用途のための対照標準として、ならびに、生物学的試料からのエキソソーム由来のマーカーの定量化のための較正基準として、購入できる。しかしながら、凍結乾燥はＥＶの生物物理学的および生物学的特性にかなり影響を及ぼし、そのために、生物学的ＲＭを産生するためのこの方法は、天然形態のＥＶに対する類似性が必要とされる強力な分析法に対しては好適ではない。
【００１２】
したがって、ＥＶに関連するＲＭを考案するために広範な試みがなされているが、当該技術分野は、好適な解決に到達するまで未だ遠いところにある。さらに、ＥＶおよびそれらの薬物の積み荷を輸送する能力への集中した研究にもかかわらず、研究および／または診断ツールとしてのＥＶの有用な用途はごくわずかのみが現れてきている。
【発明の概要】
【００１３】
それゆえ、ＥＶおよびエキソソームと類似しない特性を有する粒子からなる、ビーズのような非生物学的ＲＭまたは生物学的ＲＭを用いることに関連した上述の問題を克服することが本発明の目的である。本発明はまた、例えば、研究または診断のために、例えば、抗体、経口プローブ、および／または様々な生体分子を使用する、ＥＶを検出、列挙、区分、または表現型決定する任意の種類のアッセイにおいて、予想可能で特異的な正の対照として、補償対照として、または生物学的ＲＭとして、ＥＶを使用することを可能にするような、当該技術分野における他の既存の必要性を満たすことを目的とする。さらに、本発明はまた、例えば、免疫組織化学、顕微鏡、放射性同位元素標識等と組み合わせた、前臨床、臨床、および診断の状況における研究ツールとしてのＥＶの新規の重要な使用を提供することを目的とする。特に、改変されたＥＶの独特の送達特性は、本出願において、幅広い分野の生物医学研究におけるいくつかの障害に対処するように利用されている。
【００１４】
本発明は、ヒトおよび／または非ヒト起源のＦｃ結合ポリペプチド（本明細書においてしばしばＦｃ結合因子と呼ばれる）を使用してＥＶの含有物および特性を改変することによってこれらおよび他の目的を達成する。そのようなＦｃ結合ポリペプチドは、ＥＶへのＦｃ結合ポリペプチドの積載を増強するために頻繁にエキソソームポリペプチドに融合される。したがって、Ｆｃ結合ポリペプチドを含むＥＶは、抗体、天然でＦｃドメインを含む他のタンパク質、および／または、本発明の目的のためにＦｃドメインを含むよう修飾されているタンパク質に存在するＦｃドメインへと結合できるようになり得る。
【００１５】
したがって、本発明は、任意選択でエキソソームポリペプチドと共に融合タンパク質の一部を形成する、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含む生物学的ＲＭを提供する。有益な実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質（検出部分によって標識されていてもよい抗体等）のＦｃドメインは、ＥＶのＦｃ結合ポリペプチドによって結合されており、それによって、ＲＭ、診断ツール、画像化ツールとして、および本質的に全ての研究目的のための広範囲な用途を有するコーティングされたＥＶを産生する。したがって、第１の態様において、本発明は、研究ツール、診断ツール、画像化ツールとして、検出キットにおいて、生物学的ＲＭとして、実験対照および／または実験標準としての、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶの使用を提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、Ｆｃ含有タンパク質の標的細胞への送達のためのインビトロ、インビボ、および／またはエクスビボの方法に関する。方法は、（ｉ）少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶを提供するステップ、（ｉｉ）Ｆｃ結合ポリペプチドにＦｃ含有タンパク質を結合するようにさせるステップ、および（ｉｉｉ）Ｆｃ含有タンパク質をそのＦｃ結合ポリペプチドに付着するようにしたＥＶを標的細胞と接触させて配置して、問題のＦｃ含有タンパク質の、細胞内、細胞外、および／または膜内送達を可能にするステップを含む。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、ＥＶを含む検出キットであって、ＥＶが少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドおよび少なくとも１つのエキソソームポリペプチドを含む融合タンパク質を含む、キットを提供する。Ｆｃ結合ポリペプチドは、抗体等の少なくとも１つのＦｃ含有タンパク質に結合（付着）し得る。結合キットは、例えば、問題の抗原に対する標識化抗体を送達することによる、例えば、細胞内、膜内、または細胞外の抗原の検出のような、様々な目的に使用し得る。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、（ｉ）少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶ、および（ｉｉ）少なくとも１つのＦｃ含有タンパク質を含むパーツのキットに関する。上述のように、Ｆｃ結合ポリペプチドは、少なくとも１つのエキソソームポリペプチドに融合して、ＥＶ内またはＥＶ上のＦｃ結合因子の数を増加させてもよい。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、（ｉ）少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶと（ｉｉ）少なくとも１つのＦｃ含有タンパク質とのナノ粒子複合体に関する。少なくとも１つのＦｃ含有タンパク質は、１つの型のＦｃ含有タンパク質のいくつかのコピー（例えば、細胞内腫瘍遺伝子タンパク質を標的とする抗体の複数のコピー）、または１つを超える型のＦｃ含有タンパク質（例えば、１つの細胞内標的に対する抗体の複数のコピーおよび膜標的に対する別の抗体の複数のコピー）であってもよい。一般的に、本発明によるＥＶ間のナノ粒子複合体とＦｃ含有タンパク質は、例えば、フローサイトメトリー、電子顕微鏡、共焦点および／または蛍光顕微鏡において、インビトロ、インビボ、および／またはエクスビボの、診断、画像化、および／または標的細胞の治療、ならびに多数の他の目的のために、様々な研究、診断、および治療の領域にわたって広範囲に使用できる。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、Ｆｃドメインを含むタンパク質に結合することが可能なＥＶを産生する方法に関する。そのような方法は、以下のステップを含み得る：（ｉ）ＥＶ源細胞に、少なくとも１つのＦｃ結合因子と少なくとも１つのエキソソームポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを導入するステップ、および（ｉｉ）ＥＶ源細胞から分泌されたＥＶを回収するステップであって、上記ＥＶが対象の融合タンパク質を含む、ステップ。さらに、本発明は、少なくとも１つのＦｃドメインを含むタンパク質によってＥＶをコーティングする方法であって、（ｉ）少なくとも１つのＦｃ結合因子と少なくとも１つのエキソソームポリペプチドを含む融合タンパク質を含むＥＶを提供するステップ、および（ｉｉ）融合タンパク質のＦｃ結合因子を、Ｆｃドメインを含む少なくとも１つのタンパク質のＦｃドメインに結合するようにさせるステップ、を含む方法に関する。
【００２１】
最終的に、本発明はまた、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドと少なくとも１つのエキソソームポリペプチドを含む融合タンパク質、およびそのような融合タンパク質をコードするポリペプチドコンストラクト、ならびに、そのようなコンストラクトを含むＥＶおよび細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｆｃ結合ポリペプチド（すなわちＦｃ結合因子ドメイン）に融合されたエキソソームタンパク質を含む融合タンパク質を含むＥＶの概略図。Ｆｃ結合因子は、例えば、抗体、および／またはＦｃドメインを含む他のタンパク質に結合することができ、それによってＥＶを、タンパク質治療のための多価送達ビヒクルに変える。
【図２】Ｆｃ結合ポリペプチドを含むＥＶ（Ａ）の電子顕微鏡写真が、ナノゴールド標識された抗体（すなわち、Ｆｃ含有タンパク質）で装飾され、一方で、Ｆｃ結合ポリペプチドを欠く対照のＥＶ（Ｂ）は、それらの表面に結合する抗体を全く有さない。
【図３】結合ポリペプチドを含むＥＶが対照のＦｃ含有タンパク質（ヒトＩｇＧ）に結合することを示すフローサイトメトリーのデータ。キットに含まれる、非特異的／アイソタイプ／負の対照のビーズ集団を含む、全てのビーズ集団に対して、結合は非常に効率的である。
【図４】ＨＥＲ２高発現細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−３６１においてのみ、抗ＨＥＲ２抗体が、アイソタイプの対照で装飾されたＥＶおよび野生型のＥＶと比べて、抗体で装飾されたＥＶの取り込みを増加させるが、ＨＥＲ２低発現細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においては増加させない。
【図５】蛍光顕微鏡（Ａ）およびフローサイトメトリー（Ｂ）によって測定すると、蛍光標識された抗体のシグナルは、それらの表面にＦｃドメインを含む抗体を付着させたＦｃ結合ＥＶで処理された細胞において明確に存在するが、非処理（１）または対照ＥＶで処理された（２）細胞において、蛍光シグナルは存在しない。これは、抗体等のＦｃ含有タンパク質が、Ｆｃ結合ＥＶによって細胞内に送達できること、およびＥＶへの結合が、抗体の細胞への取り込みを劇的に増加することを実証する。
【図６】Ｆｃ結合ＥＶ（すなわち、少なくとも１つのエキソソームポリペプチドに融合された少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶ）によって抗ＮＦｋＢ抗体が、細胞内に送達されるときのＮＦｋＢ媒介性細胞内シグナルの成功裏の阻害。
【００２３】
本発明は、多数の研究、診断、および治療用途にわたる使用のための、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶに関する。有益な実施形態において、各々のＥＶ中のＦｃ結合ポリペプチド数を増大させるために、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドは、ＥＶポリペプチドと共に融合タンパク質に含まれる。有益な実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質（検出部分によって標識されていてもよい抗体等）のＦｃドメインは、ＥＶのＦｃ結合ポリペプチドによって結合され、それによって、ＥＶは、その表面にＦｃ含有タンパク質を付着させ、診断ツール、画像化ツールとして、ならび、本質的に全ての研究、画像化、診断、および治療の目的のために、フローサイトメトリー、ナノ粒子トラッキング解析、顕微鏡および電子顕微鏡等の幅広い用途技術を有するナノ粒子をもたらす。
【００２４】
便宜と明瞭さのために、本明細書において使用される特定の用語を集めて以下に記載する。別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。
【００２５】
本発明の特徴、態様、実施形態、または代替が、マーカッシュ群で記載される場合、本発明がまた、それによって、マーカッシュ群の任意の個別のメンバー、またはマーカッシュ群のメンバーのサブグループで記載されていることを、当業者は理解するであろう。当業者は、本発明はまた、それによって、マーカッシュ群の個別のメンバーまたはマーカッシュ群のメンバーのサブグループの任意の組み合わせで記載されていることを、さらに理解するであろう。さらに、本発明の１つの態様および／または実施形態に関連して記載されている実施形態および特徴はまた、変更すべきところは変更して、本発明の全ての他の態様および／または実施形態に適用されるということは注意すべきである。例えば、Ｆｃ結合ポリペプチを含む融合タンパク質を含むＥＶと関連して明細書において記載されるＦｃ結合ポリペプチドは、本明細書における全ての他の態様、技術、および実施形態、例えば、本明細書において記載される、ＥＶを産生もしくはコーティングするための方法と関連する、またはポリヌクレオチドおよびポリペプチドコンストラクトと関連する態様および／または実施形態と関連し、互換性を有するものとして開示されていると理解されるべきである。さらに、例えば、生物学的ＲＭとしての利用に関連して記載されるような複数のＦｃ含有タンパク質をＥＶに付着させているＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶの使用のようなある特定の態様と関連して記載されるある特定の実施形態はまた、例えば、病理学および／または免疫組織化学における、例えば、診断ツールおよび／または画像化ツールとしてのＥＶの使用に関する実施形態のような、他の態様および／または実施形態に関連するものと当然に関連し得る。さらに、本明細書において同定される全てのポリペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドを融合するための従来の戦略を用いて融合タンパク質において自由に組み合わせることができる。非限定的な例として、本明細書において記載される全てのＦｃ結合ポリペプチドは、１つ以上のエキソソームポリペプチドとの任意の組み合わせで自由に組み合せ得る。同様に、Ｆｃ結合ポリペプチドは、１つを超えるＦｃ結合ポリペプチドを含むコンストラクトを産生するために互いに組み合わせることができる。さらに、任意および全ての特徴（例えば、マーカッシュ群の任意および全てのメンバー）は、任意および全ての他の特徴（例えば任意および全ての他のマーカッシュ群のメンバー）と自由に組み合わせることができ、例えば、任意のＦｃ結合タンパク質は、任意の抗体等の任意のＦｃ含有タンパク質と組み合わせることができ、または任意のエキソソームポリペプチドは任意のＦｃ結合ポリペプチドと組み合わせることができる。さらに、本明細書における教示が、ＥＶ（および／またはＥＶ係留融合タンパク質−Ｆｃ含有タンパク質複合体）を単数形で指すとき、ならびに／またはＥＶを個別のナノ粒子様小胞として指すとき、全てのそのような教示は、複数のＥＶならびにＥＶおよびＦｃ含有タンパク質によってコーティングされたＥＶの集団に同様に関連し、適用可能であることは理解すべきである。一般的な所見として、本発明による、Ｆｃ結合ポリペプチド、抗体等のＦｃ含有タンパク質、ＥＶ産生細胞源、エキソソームポリペプチド、ならびに全ての他の態様、実施形態および代替物は、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、任意および全ての可能性のある組み合わせで自由に組み合わせることができる。さらに、本発明の、任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、または任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの配列（それぞれ、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列）は、任意の与えられた分子がそれらと関連した所望の技術的効果を実行する能力を残している限り、元のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および配列から大幅に逸脱することができる。それらの生物学的特性が維持されている限り、本出願によるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの配列は、天然の配列と比較して、５０％（例えば、ＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて計算される）をも逸脱することができるが、可能な限り高い配列同一性が好ましい（例えば６０％、７０％、８０％、または例えば９０％もしくはそれ以上）。例えば、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドと少なくとも１つのエキソソームタンパク質の組み合わせ（融合）は、それぞれのポリペプチドの特定のセグメントが置き換えおよび／もしくは修飾され得ること、ならびに／または配列が、他のアミノ酸ストレッチの挿入によって中断され得ることを暗示し、天然の配列からの逸脱が、重要な特性（例えばＦｃ結合特性、エキソソーム表面への転送、結合親和性等）が保存されている限り、考慮し得ることを意味する。したがって、同様の理由は、当然に、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に適用される。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質に関連して本明細書において述べられている、全ての受入番号および配列番号は、例としてのみおよび情報としてのみ見られるべきであり、全てのペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、当業者がそれらを理解するような、それらの通常の意味が与えられるべきである。したがって、上述のように、当業者はまた、本発明が、本明細書において言及されている特定の配列番号または受入番号のみを包含するのではなく、それらのバリアントおよび誘導体をも包含するということを理解するであろう。他に述べられていない限り、本明細書において言及される全ての受入番号は、データベースの２０１７年６月２２日のバージョンのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号であり、本明細書において述べられている全てのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ヌクレオチド、およびポリヌクレオチドは、当業者によって理解されるようなそれらの従来の意味に解釈されるべきである。
【００２６】
用語「細胞外小胞」または「ＥＶ」または「エキソソーム」は、交換可能に使用され、任意の形態で細胞から取得可能な任意の型の小胞、例えば、微小胞（例えば、細胞の細胞膜から放出された任意の小胞）、エキソソーム（例えば、エンドリソソーム経路に由来する任意の小胞、アポトーシス小体（例えば、アポトーシス細胞から取得可能）、微小粒子（例えば血小板に由来し得る）、エクトソーム（例えば血清中の好中球および単球に由来し得る）、プロスタトソーム（ｐｒｏｓｔａｔｏｓｏｍｅ）（例えば、前立腺癌細胞から取得可能）、またはカルディオソーム（ｃａｒｄｉｏｓｏｍｅ）（例えば、心細胞に由来し得る）等に関連していると理解されるべきである。ＥＶのサイズは、大幅に変動し得るが、ＥＶは典型的には、ナノサイズの流体力学的半径、すなわち１０００ｎｍ未満の半径を有する。明らかに、ＥＶは、インビボ、エクスビボ、およびインビトロの全てからの任意の細胞型に由来し得る。さらに、上記の用語はまた、細胞外小胞模倣体、例えば膜押出、超音波処理、または他の技術等を通じて得られる細胞膜に基づく小胞に関連していると理解されるべきである。ＥＶの、研究、診断、医学、技術、および科学の使用および用途について記載するとき、本発明は通常、複数のＥＶ、すなわち、何千万、何百万、何十億、または何兆という数でさえも含み得る、ＥＶの集団を指すということは、当業者にとって明らかであろう。以下の実験セクションにおいてみられるように、ＥＶは、容量の単位当たり（例えば、ｍｌ当たり）１０５、０８、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１８、１０２５、１０３０のＥＶ（しばしば「粒子」と呼ばれる）等、または任意の他のより大きい数もしくはより小さい数もしくはその間のいずこかの数の濃度で存在し得る。同様に、例えば、エキソソームポリペプチドとＦｃ結合ポリペプチドとの間の特定の融合タンパク質を含み、結果として対象のＦｃ含有タンパク質に結合し得るＥＶに関連し得る用語「集団」は、そのような集団を構成する複数の実体を包含していると理解されるべきである。換言すると、複数で存在するときの個々のＥＶは、ＥＶ集団を構成する。したがって、当然に、本発明は、当業者に明らかであろうように、個々のＥＶとＥＶを含む集団の両方に関する。さらに、本発明のＥＶはまた、ＥＶ表面に結合し得るＦｃ含有タンパク質に加えて、追加の治療薬および／または診断薬を含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＶは、フルオロフォア、放射性化合物、トレーサー、無機および有機の化合物、イメージング剤等の診断薬およびトレース剤（ｔｒａｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含み得る。さらなる実施形態において、追加の治療薬は、少なくとも１つの治療用小分子薬を含み得る。いくつかの実施形態において、治療用小分子薬は、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡ合成を阻害する剤、微小管およびチューブリン結合剤、代謝拮抗薬、酸化損傷誘導剤、抗血管新生薬、内分泌療法、抗エストロゲン薬、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストまたはアンタゴニスト等の免疫調節薬、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、キナーゼの阻害剤等のシグナル伝達の阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、レチノイド、増殖因子受容体の阻���剤、抗有糸分裂化合物、抗炎症薬、細胞周期調節因子、転写因子阻害剤、およびアポトーシス誘導剤、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択し得る。さらなる実施形態において、追加の剤は、治療および／または診断および／または画像化の核酸に基づいた剤であり得る。そのような核酸に基づいた治療薬は、１本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ等のオリゴヌクレオチド、スプライススイッチングＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイド鎖、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド、プラスミド、または任意の他のＲＮＡもしくはＤＮＡのベクターを含む群から選択し得る。化学合成された核酸に基づいた剤、および／または、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−Ａｌｌｙｌ、２’−Ｏ−ＭＯＥ、２’−Ｆ、２’−ＣＥ、２’−ＥＡ  ２’−ＦＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ホスホロチオエート、トリシクロ−ＤＮＡ等の化学修飾されたヌクレオチドを含む核酸に基づいた剤が特に興味深い。なおもさらなる実施形態において、本発明によるＥＶは、タンパク質および／またはペプチドであり得る、追加の治療薬および／または診断薬を含み得る。そのようなタンパク質および／またはペプチドは、ＥＶの内側に存在してもよく、ＥＶ膜に挿入されていてもよく、ＥＶ膜と結合していてもよく、またはＥＶから細胞外環境にはみ出ていてもよい。そのようなタンパク質および／またはペプチドは、抗体、細胞内抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、アフィボディ、二特異性および多特異性抗体または結合因子、アフィボディ、ダルピン（ｄａｒｐｉｎ）、受容体、リガンド、例えば酵素補充療法または遺伝子編集のための酵素、腫瘍抑制因子、ウイルスまたは細菌抑制剤、細胞成分タンパク質、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復阻害剤、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、増殖因子、アポトーシス阻害剤および誘導剤、毒素（例えば、緑膿菌外毒素）、構造タンパク質、ＮＴ３／４、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）、および２．５Ｓベータサブユニット等のその個別のサブユニット等の神経栄養因子、イオンチャネル、膜輸送体、タンパク質恒常性因子、細胞シグナル伝達に関与するタンパク質、翻訳および転写関連タンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、タンパク質結合タンパク質、脂質結合タンパク質、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびＧＡＧ結合タンパク質、代謝タンパク質、細胞ストレス制御タンパク質、炎症および免疫系制御タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、および熱ショックたんぱく質等を含む非限定的な例からなる群から選択され得る。好ましい実施形態において、治療薬は、ＲＮＡ鎖と関連する（すなわちそれを担持する）無傷のヌクレアーゼ活性を有し、ＥＶによって送達されるときに、Ｃａｓポリペプチドが、そのヌクレアーゼ活性を標的細胞に運び出すことを可能にする、ＣＲＩＳＰＲ−関連（Ｃａｓ）ポリペプチド（Ｃａｓ９等（非限定的な例として、受入番号Ｑ９９ＺＷ２））であり得る。代替的に、別の好ましい実施形態において、Ｃａｓポリペプチドは、標的の遺伝子の操作を可能にす��ために、触媒的に不活性であり得る。さらに別の代替物は、シングルＲＮＡに誘導されたエンドヌクレアーゼＣｐｆ１（ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ等の種由来）（非限定的な例として、受入番号Ｕ２ＵＭＱ６およびＡ０Ｑ７Ｑ２）等の他の型のＣＲＩＳＰＲエフェクターであり得る。さらに好ましい実施形態は、リソソーム蓄積症に対する酵素、例えば、グルコセレブロシダーゼ、例えば、イミグルセラーゼ、αガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼおよびイズルスルファーゼ、アリルスルファターゼ、ガルスルファーゼ、酸性αグルコシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、グルコシルセラミダーゼ（非限定的な例として、受入番号Ｐ０４０６２）セラミダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、βガラクトシダーゼ、リゾリーマル酸リパーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ１（非限定的な例として、受入番号Ｏ１５１１８）、ＮＰＣ２（非限定的な例として、受入番号Ｐ６１９１６）、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラン−α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ヒアルロニダーゼ、α−Ｎ−アセチルノイラミニダーゼ、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ、ムコリピン１、パルミトイル−プロテインチオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、パルミトイル−プロテインチオエステラーゼ１、トリペプチジルペプチダーゼ１、バッテニン（ｂａｔｔｅｎｉｎ）、リンクリン（ｌｉｎｃｌｉｎ）、α−Ｄ−マンノシダーゼ、ベータ−マンノシダーゼ、アルパルチルグルコサミニダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、シチノシン（ｃｙｓｔｉｎｏｓｉｎ）、カテプシンＫ、シアリン、ＬＡＭＰ２、およびヘキソアミニダーゼ（ｈｅｘｏａｍｉｎｉｄａｓｅ）を含む群から選択される治療用タンパク質を含む。他の好ましい実施形態において、治療用タンパク質は、例えば、炎症反応を修飾する細胞内タンパク質、例えば、メチラーゼおよびブロモドメイン等のエピジェネティックタンパク質、または、筋機能を修飾する細胞内タンパク質、例えば、ＭｙｏＤ（非限定的な例として、受入番号Ｐ１５１７２）もしくはＭｙｆ５等の転写因子、筋収縮を調整するタンパク質、例えば、ミオシン、アクチン、トロポニン等のカルシウム／結合タンパク質、またはジストロフィン（非限定的な例として、受入番号Ｐ１１５３２）、ミニジストロフィン（非限定的な例として、受入番号Ｐ１５１７２）、ユートロフィン、タイチン、ネブリン、ジストロフィン関連タンパク質、例えば、ジストロブレビン、シントロフィン、シンコイリン（Ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ）、デスミン、サルコグリカン、ジストログリカン、サルコスパン、アグリン、および／もしくはフクチン等の構造タンパク質であり得る。重要なことに、上述の治療用タンパク質の全ては、ＥＶに存在するＦｃ結合ポリペプチドへの結合を可能にするために、Ｆｃドメインを含むように遺伝子操作を受けることができる。別の非��定的な例は、後に続く標的細胞への送達のための、酵素ＮＰＣ１へのＦｃドメインの融合である。ＥＶ送達されたＦｃ含有タンパク質（例えば、Ｆｃ−Ｃａｓ９または抗体）の細胞内生物活性を向上させるために使用し得るさらに別の非限定的な例は、Ｆｃドメインを、ＨＡ２等のエンドソームエスケープペプチドまたはタンパク質、ＴＡＴペプチド、トランスポータン、ペネラチン（ｐｅｎｅｒａｔｉｎ）、ポリリジン、またはｇｐ４１等の細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）、コレラ毒素、志賀毒素、サポリン、ジフテリア毒素ペプチド等と融合することである。ＥＶ表面にそのようなエンドソームエスケープドメインを提示することは、標的細胞内への内部移行および続くエンドソームエスケープを増強する。
【００２７】
どのようにＦｃドメインを対象のタンパク質に融合できるかということについての有益な非限定的な例は、標的細胞内へのＥＶ媒介性送達のための、Ｆｃドメインの、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、非切断Ｃａｓバリアント、または他の型の遺伝子編集タンパク質、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）への融合である。好ましい実施形態において、Ｆｃドメインは、インビトロまたはエクスビボでシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）鎖が予め積載した（ＲＮＡを予め積載したＣａｓは、いわゆるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する）Ｃａｓ９のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合される。したがって、そのように形成されて生じるＦｃドメイン含有ＲＮＰ複合体は、好適なＥＶのＦｃ結合ポリペプチドによって結合されるようにされ、それらをＥＶ表面に付着させ、標的細胞内への送達が後に続く。ＲＮＰ複合体の生成は、種々の方法、ならびに従来のシングルガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの両方を含む合成のガイドＲＮＡ等の種々のＲＮＡ構成要素によって達成でき、任意選択で、ヘアピンループ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびそれらの様々な組み合わせと組み合わせられる。相同組換え、または非相同性末端結合、または任意の他の修復もしくは置換のメカニズムのための修復テンプレートはまた、予め形成されたＲＮＰ中に含まれ得、したがってそれは、Ｆｃドメイン−Ｆｃ結合ポリペプチド結合を用いてＥＶに付着することができる。
【００２８】
本明細書において記載されるとき、用語「抗体」および「ｍＡｂ」および「Ａｂ」は、それらの全体の抗体（すなわち抗体全体）と、抗原結合特性を有するそれらの任意の誘導体の両方を含むと理解されるべきである。慣例的に、抗体は、ジスルフィド結合によって相互結合した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と少なくとも２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはそれらの抗原結合部分を指す。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと略される）と重鎖定常領域からなる。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬと略される）と軽鎖定常領域からなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分割され得る。重要なことに、本発明の目的のために、対象の抗体は、好ましくは、ＥＶ表面のコーティングを可能にするため、本発明のＦｃ結合ポリペプチドが結合することのできるＦｃドメインまたはそれらの誘導体を有する。本発明において使用される抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはポリクローナル抗体であってもよく、好ましくはｍＡｂであってもよい。本発明における特定の用途の抗体は、本発明による融合タンパク質に典型的に含まれるＦｃ結合ポリペプチドによって結合され得る限り、キメラ抗体、ＣＤＲを移植された抗体、ナノボディ、ヒトもしくはヒト化抗体、またはそれらの任意の誘導体であってもよい。抗体の生成は本発明の範囲の外側であるが、典型的には、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方は、ヤギ、ウサギ、ラマ、ラクダ、ラット、またはマウス等の実験的な非ヒトの動物で惹起されるが、好適な抗体はまた、他の産生方法、例えばＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術の結果であり得る。例えばマウスにおけるハイブリドーマ産生は、非常によく確立された手順であり、当該技術分野において周知の技術を用いて達成できる。本発明における使用の抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、および／または任意の型のキメラ抗体であってもよい。本明細書において使用されるとき、用語「ヒト抗体」は、フレームワークとＣＤＲの両方が、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。本発明における使用のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、インビトロにおける、またはインビボでの体細胞変異による、ランダムまたは部位特異的な変異導入による変異）。用語「抗体誘導体」は、抗体の任意の修飾された形態、例えば、任意の方法で修飾されたアミノ酸配列を有する抗体、抗体と別の剤または抗体との複合体、二特異性抗体、多特異性抗体、抗体ドメイン等を指す。用語「ヒト化抗体」は、マウス、ラクダ、ラマ等の別の哺乳動物種に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている、抗体を指す。追加のフレームワーク領域の修飾は、ヒトフレームワーク配列内においてなされ得る。本発明による抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｄ、およびＩｇＧ２ｃ）、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＭ、ＩｇＤ等の全てのアイソタイプおよびサブタイプ、単量体、二量体、ならびにそれらの多量体を含み得る。さらに、本発明による抗体は、ＥＶ上に提示されるとき、いくつかの機能を有し得る：（１）抗体は、特異的な細胞型、組織、および／または器官を対象とし得る、（２）対象の標的抗原と相互作用する診断および／または治療の抗体は、ＥＶを用いて対象の組織に効率的に送達できる、（３）ＥＶ表面の多重化抗体は、標的結合との結合において顕著により良好であり得る、（４）抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、例えば、抗体に付着した放射性核種の効力を増強するために、ＥＶ上で多重化されていてもよい、（５）Ｆｃ結合ポリペプチドによって結合された抗体は、Ｆｃ結合ポリペプチドと抗体のＦｃドメインとの間の結合のために、標的に対するより高い親和性を有し得る、（６）本発明によるＥＶ上にコーティングされた抗体は、診断および／または治療および／または画像化および／または研究の目的のために、細胞内に送達され得る。重要なことに、本発明による抗体および他のＦｃ含有タンパク質は、いくつかの形態の検出部分によって有利にも標識される。フルオロフォア、放射性物質、ＰＥＴトレーサー、ＭＲＩ剤、または任意の他の型の検出部分等の検出部分の存在は、インビボ、インビトロおよび／またはエクスビボのいずれかにおいて、標識されたＦｃ含有タンパク質、すなわちＥＶの追跡に関して非常に有益である。したがって、追跡、トレース、および検出は、このように、ＰＥＴスキャン、共焦点顕微鏡および蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、Ｘ線スキャン、ＣＡＴスキャン、フローサイトメトリー、ナノ粒子トラッキング解析等の多種多様な種々の方法を使用することによって達成することができる。
【００２９】
用語「Ｆｃ含有タンパク質」および「Ｆｃドメインを含むタンパク質」および「Ｆｃドメイン含有タンパク質」および「Ｆｃドメイン含有タンパク質」および「Ｆｃドメインタンパク質」および同様の用語は、本明細書において交換可能に使用され、天然または問題のタンパク質におけるＦｃドメインを導入するための遺伝子操作のいずれかで少なくとも１つのＦｃドメインを含む、任意のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（すなわち、アミノ酸配列を含む任意の分子）に関連すると理解されるべきである。Ｆｃは、「結晶化可能フラグメント」を意味し、抗体の尾部領域の名称である。しかしながら、Ｆｃドメインはまた、抗体だけでなく、他のタンパク質においても生じさせ、使用することができる。そのようなＦｃドメイン含有タンパク質の非限定的な例は、抗体および抗体誘導体、Ｆｃ修飾デコイ受容体および／またはシグナル伝達物質、例えば、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６（シグナル伝達物質ｇｐ１３０等（非限定的な例として、受入番号Ｐ４０１８９））、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１７（ＩＬ１７Ｒ等、非限定的な例として、受入番号Ｑ９６Ｆ４６）、ＩＬ２３（ＩＬ２３Ｒ等、非限定的な例として、受入番号Ｑ５ＶＷＫ５）等のためのインターロイキンデコイ受容体、Ｆｃドメイン含有二特異性および多特異性結合因子、Ｆｃドメイン含有受容体またはリガンドの任意の型、例えば、酵素補充療法のための、または遺伝子編集のためのＦｃドメイン修飾酵素、Ｆｃドメインが移植されたＣａｓおよびＣａｓ９等のヌクレアーゼ、Ｆｃドメインに融合された腫瘍抑制因子等を含む。天然でＦｃドメインを欠いている対象のタンパク質に融合し得る好適なＦｃドメインは、以下の非限定的な例を含む：ヒトＩＧＨＭ（非限定的な例として、受入番号Ｐ０１８７１）、ヒトＩＧＨＡ１（非限定的な例として、受入番号Ｐ０１８７６）、ヒトＩＧＨＡ２（非限定的な例として、受入番号Ｐ０１８７７）、ヒトＩＧＫＣ（非限定的な例として、受入番号Ｐ０１８３４）、ヒトＩＧＨＧ１（非限定的な例として、受入番号Ｐ０１８５７）、ヒトＩＧＨＧ２（非限定的な例として、受入番号Ｐ０１８５９）、ヒトＩＧＨＧ３（非限定的な例として、受入番号Ｐ０１８６０）、ヒトＩＧＨＧ４（非限定的な例として、受入番号Ｐ０１８６１）、ヒトＩＧＨＤ（非限定的な例として、受入番号Ｐ０１８８０）、ヒトＩＧＨＥ（非限定的な例として、受入番号Ｐ０１８５４）、およびまたはそれらの任意のドメイン、誘導体または組み合わせ。本質的に、対象の任意のタンパク質は、Ｆｃドメインを組み込むように修飾され得る。Ｆｃドメインを導入できるタンパク質の非限定的な例は、例えば、腫瘍抑制因子、ウイルスまたは細菌抑制剤、細胞成分タンパク質、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復阻害剤、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグレース、転写因子、増殖因子、アポトーシス阻害剤および誘導剤、毒素（例えば、緑膿菌外毒素）、構造タンパク質、ＮＴ３／４、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）、および２．５Ｓベータサブユニット等のその個別のサブユニット等の神経栄養因子、イオンチャネル、膜輸送体、タンパク質恒常性因子、細胞シグナル伝達に関与するタンパク質、翻訳および転写関連タンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、タンパク質結合タンパク質、脂質結合タンパク質、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびＧＡＧ結合タンパク質、代謝タンパク質、細胞ストレス制御タンパク質、炎症および免疫系制御タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、および熱ショックたんぱく質等を含む。上述の対象のタンパク質のリストは排他的ではなく、他のタンパク質もまた、タンパク質が、Ｆｃドメインを含むか、または問題のタンパク質がＦｃドメインを含むように遺伝子操作することができるかのいずれかである限り、関連し得る。そのようなＦｃドメインを導入するためのタンパク質の遺伝子操作の１つの非限定的な例は、Ｆｃドメインをデコイ受容体に付加すること、例えば、遺伝子編集を可能にするために標的細胞内に生物活性を送達するためのＦｃドメインをＣａｓ９酵素に付加することを含む。そのようなＦｃドメインを導入するためのタンパク質の遺伝子操作の別の非限定的な例は、酵素補充療法のための酵素にＦｃドメインを付加すること（例えば、Ｆｃドメイン−グルコセレブロシダーゼまたはＦｃドメイン−ａ−ガラクトシダーゼまたはＦｃドメイン−ＮＰＣ１）を含む。市販されるＦｃドメイン−修飾タンパク質のよく知られる例は、ＴＮＦ受容体２に融合したＩｇＧのＦｃドメインを含む、様々な自己免疫疾患の治療のための生物学的製剤である、エタネルセプトである。したがって、上述から明らかなように、本発明によるＦｃドメイン含有タンパク質は、天然またはそれらの導入の結果のいずれかとして、Ｆｃドメインを含む、本質的に任意の対象のタンパク質であり得る。上述のように、抗体に関連して、全てのＦｃドメイン含有タンパク質は、問題の分子および／または問題のＥＶの検出およびトレースを可能にするために、検出部分を組み込むように修飾できる。
【００３０】
用語「Ｆｃ結合ポリペプチド」および「Ｆｃ結合タンパク質」および「Ｆｃ結合因子」および「Ｆｃ−結合タンパク質」および「結合因子」は本明細書において交換可能に使用され、対象の任意のタンパク質のＦｃドメインに結合することのできる、任意のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（すなわち、アミノ酸配列を含む任意の分子）に関連すると理解されるべきである。典型的には、本発明のＦｃ結合ポリペプチドは、ヒトまたは非ヒト（例えば、哺乳動物源、細菌、等）のいずれかである、様々な源に由来し、それらは、様々な抗体のアイソタイプ、サブタイプ、および種（例えば、ＩｇＧ（より具体的には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｄ、および／またはＩｇＧ２ｃ）、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＭ、ＩｇＤ等）のＦｃドメインに対する高い親和性を有し、それらはＥＶタンパク質と融合することができる。本発明によるＦｃ結合ポリペプチドの非限定的な例は、本出願全体にわたって記載されている他のＦｃ結合ポリペプチドに加えて、プロテインＡ（非限定的な例として、配列番号７７）、プロテインＧ（非限定的な例として、配列番号７８）、プロテインＡ／Ｇ（非限定的な例として、配列番号７２）、Ｚドメイン（非限定的な例として、配列番号７３）、ＺＺドメイン（非限定的な例として、作動可能に連結した配列番号７３の２つのコピー、すなわち、非限定的な例として、配列番号７４）、ヒトＦＣＧＲＩ（非限定的な例として、配列番号３１）、ヒトＦＣＧＲＩＩＡ（非限定的な例として、配列番号３３）、ヒトＦＣＧＲＩＩＢ（非限定的な例として、受入番号３１９９４）、ヒトＦＣＧＲＩＩＣ（非限定的な例として、受入番号３１９９５）、ヒトＦＣＧＲＩＩＩＡ（非限定的な例として、受入番号Ｐ０８６３７）、ヒトＦＣＧＲ３Ｂ（非限定的な例として、受入番号０７５０１５）ヒトＦＣＡＭＲ（非限定的な例として、配列番号２８）、ヒトＦＣＥＲＡ、ヒトＦＣＡＲ、マウスＦＣＧＲＩ（非限定的な例として、配列番号７９）、マウスＦＣＧＲＩＩＢ  （非限定的な例として、配列番号８０）、マウスＦＣＧＲＩＩＩ（非限定的な例として、配列番号８１）、マウスＦＣＧＲＩＶ（非限定的な例として、配列番号８２）、マウスＦＣＧＲｎ（非限定的な例として、配列番号８３）、およびそれらの様々な組み合わせ、誘導体、または代替物を含む。
【００３１】
本明細書において、Ｆｃ含有タンパク質は、しばしばＥＶおよび／またはＦｃ結合ポリペプチドに「付着している」として記載される。代替的に、ＥＶはしばしば、Ｆｃ含有タンパク質「によってコーティングされている」として、またはＦｃ含有タンパク質を、「それらの表面に結合」させている、または「それらの表面に付着」させているとして記載される。これらの用語は、Ｆｃ結合ポリペプチドとＦｃドメインの間の標準的な相互作用、すなわち２つのポリペプチドが、Ｆｃ結合因子とＦｃドメインの間に形成される化学結合（典型的に非共有結合）を生じるように互いに相互作用するようなことに関連して理解されるべきである。したがって、これは通常、Ｆｃ結合ポリペプチドを含むＥＶが、それゆえに、化学結合によって、Ｆｃ含有タンパク質のＦｃドメインを付着させていることを意味する。当業者によって理解されるであろうが、結果としてＥＶは、複数のそのようなＦｃ含有タンパク質をそれに結合させて（付着させて）有し得、結合がＥＶ表面に生じるとき、コーティングの形態となる。
【００３２】
用語「ＥＶタンパク質」および「ＥＶポリペプチド」および「エキソソームポリペプチド」および「エキソソームタンパク質」は、交換可能に使用され、ポリペプチドコンストラクト（典型的に、ＥＶタンパク質に加えて、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドと任意選択で追加のポリペプチドおよび／またはリンカーを含む）を、好適な小胞構造、すなわち好適なＥＶへと輸送するのに使用できる任意のポリペプチドと関連すると理解されるべきである。より具体的に、これらの用語は、融合タンパク質コンストラクトをＥＶ等の小胞構造へと輸送、転送、または往復することのできる任意のポリペプチドを含むとして理解されるべきである。そのようなエキソソームポリペプチドの例は、例えば、ＣＤ９（非限定的な例として、配列番号１）、ＣＤ５３（非限定的な例として、配列番号２）、ＣＤ６３（非限定的な例として、配列番号３）、ＣＤ８１（非限定的な例として、配列番号４）、ＣＤ５４（非限定的な例として、配列番号５）、ＣＤ５０（非限定的な例として、配列番号６）、ＦＬＯＴ１（非限定的な例として、配列番号７）、ＦＬＯＴ２（非限定的な例として、配列番号８）、ＣＤ４９ｄ（非限定的な例として、配列番号９）、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体としても知られる）（非限定的な例として、配列番号１０）、およびそのエンドソーム選別ドメイン、すなわちトランスフェリン受容体エンドソーム選別ドメイン（非限定的な例として、配列番号２３）、ＣＤ１３３（非限定的な例として、配列番号１１）、ＣＤ１３８（シンデカン−１）（非限定的な例として、配列番号１２）、ＣＤ２３５ａ（非限定的な例として、配列番号１３）、ＡＬＩＸ（非限定的な例として、配列番号１４）、シンテニン−１（非限定的な例として、配列番号１５）、シンテニン−２（非限定的な例として、配列番号１６）、Ｌａｍｐ２ｂ（非限定的な例として、配列番号１７）、シンデカン−２（非限定的な例として、配列番号２０）、シンデカン−３（非限定的な例として、配列番号２１）、シンデカン−４（非限定的な例として、配列番号２２）、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１  ａ、ＣＤ１１  ｂ、ＣＤ１１  ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ成分、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９（非限定的な例として、配列番号２６）、ＣＤ３０（非限定的な例として、配列番号２７）、ＴＳＧ１０１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１  ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１α、Ｍａｃ−１β、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１  Ｂ、他のエキソソームポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせであるが、ＥＶにポリペプチドコンストラクトを輸送することのできる多数の他のポリペプチドは本発明の範囲内に含まれる。典型的には、本発明の多くの実施形態において、少なくとも１つのエキソソームポリペプチドは、ＥＶに存在する融合タンパク質を形成するために、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドに融合される。そのような融合タンパク質はまた、それらの機能を最適化するために、リンカー、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、多量体化ドメイン等を含む、様々な他の構成要素を含み得る。
【００３３】
用語「源細胞」または「ＥＶ源細胞」または「親細胞」または「細胞源」または「ＥＶ産生細胞」または任意の他の同様の用語は、例えば、懸濁培養、もしくは接着培養における、または任意の他の型の培養系におけるような好適な条件下でＥＶを産生することのできる任意の型の細胞に関連すると理解されるべきである。本発明による源細胞はまた、インビボでエキソソームを産生する細胞を含み得る。本発明による源細胞は、例えば、間充織幹細胞または間質細胞または線維芽細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、ワルトン膠様質、出生時組織、歯蕾、臍帯血、皮膚組織等から取得可能）、羊膜細胞、より具体的には、任意選択で様々な初期マーカーを発現する羊膜上皮細胞、骨髄系サプレッサー細胞、Ｍ２極性化マクロファージ、脂肪細胞、内皮細胞、線維芽細胞等の広範囲の細胞および細胞株から選択され得る。特に興味深い細胞株は、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、微小血管内皮細胞またはリンパ管内皮細胞等の内皮細胞株、軟骨細胞、種々の起源のＭＳＣ、気道上皮細胞または肺胞上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞等である。同様に、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞（ＤＣ）等の免疫細胞もまた、本発明の範囲内であり、本質的に、ＥＶを産生することのできる任意の型の細胞がまた、本明細書に包含される。一般的に、ＥＶは、本質的に任意の細胞源に由来し得、それは、初代培養細胞源または不死化細胞株であり得る。ＥＶ源細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および他の任意の方法に由来する他の肝細胞を含む、任意の胚性、胎児性、および成人の体性幹細胞型であり得る。神経疾患を治療するとき、源細胞として、例えば、初代培養の神経細胞、星状細胞、希突起神経膠細胞、小膠細胞、および神経前駆細胞を使用することを企図し得る。源細胞は、治療される患者に対して本質的に、同種異系、自家性、または異種のいずれかであり得、すなわち、細胞は、患者自身由来、または、無関係、一致するもしくは一致しないドナー由来であり得る。ある文脈において、同種異系細胞は、それらが特定の適応症に罹患する患者の同種異系細胞から得ることのできない免疫調節効果をもたらし得るので、医学的観点から好ましくあり得る。例えば、全身性、末梢性および／または神経性の炎症の治療の文脈において、同種異系ＭＳＣは、そのような細胞から種痘可能なＥＶが、例えば、マクロファージ、および／または好中球の表現型スイッチング（炎症誘発性のＭ１またはＮ１の表現型から、それぞれ炎症誘発性のＭ２またはＮ２の表現型への）を介した免疫調節を可能にし得るので、好ましくあり得る。
【００３４】
第１の態様において、本発明は、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶの研究ツールとしての使用に関する。関連する非限定的な使用は、検出キットにおけるＦｃ結合ＥＶの使用、フローサイトメトリー、イメージングフローサイトメトリー、ナノ粒子トラッキング解析、ナノイメージング、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、動的光散乱、電子顕微鏡、発光に基づく検出、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく技術、磁気、蛍光、および／または浮力に基づく標識に基づく正もしくは負の選択技術、粒子の密度、電荷、もしくはサイズに基づく正もしくは負の選択技術、または本質的に任意の他の技術もしくは方法における、生物学的ＲＭとして、対照および／または標準としてのＦｃ結合ＥＶの使用を含み、ここで、Ｆｃドメイン含有タンパク質（抗体等）に結合する能力を有するＥＶが有用であり得る。有益な実施形態において、ＥＶに含まれている少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドは、少なくとも１つのエキソソームポリペプチドと共に、任意選択で他のポリペプチドのドメインおよび／または領域と共に、融合タンパク質の一部を形成する。
【００３５】
本発明によるＥＶは、様々な研究、診断、画像化、および治療の使用に関して、特に、ＥＶのＦｃ結合ポリペプチドがＦｃドメインを含むタンパク質に結合するとき、非常に有益である。ＥＶのＦｃ結合ポリペプチドとＦｃ含有タンパク質の結合は、例えば、フローサイトメトリーにおいて、抗体等のＦｃ含有タンパク質の輸送ビヒクルとして、ナノ粒子トラッキング解析において、動的光散乱において、電子顕微鏡において、および／または様々な他の型の技術において、類まれな有用性を有するナノサイズのＥＶ−Ｆｃタンパク質複合体の形成をもたらす。好ましい実施形態において、本発明によるＥＶの使用は、抗体を少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドに付着することを含み、さらにより好ましい実施形態において、抗体は、検出部分のいずれかの形態で標識されている。抗体（または任意の他のＦｃ含有タンパク質）に付着し得る好適な検出部分および／または剤は、フルオロフォア、放射性標識、ＰＥＴリガンド、ＭＲＩ剤、ナノ粒子、無機および／または有機化合物、酵素、またはＥＶが使用される方法に適応する任意の他の好適な検出部分である。
【００３６】
一態様において、本発明は、本明細書において開示されるＥＶに基づく、小胞基準材料（ＲＭ）を提供する。用語ＲＭは、任意の種類のアッセイ、方法、または用途において、標準化、正の対照、較正対照、および／または補償対照、または任意の他の型の基準対照の目的で使用し得る任意の材料を意味し得る。ＥＶ研究および分析のためのＲＭの文脈において、最適なＲＭは生物由来の小胞であり、これは、本発明のＦｃ結合ポリペプチ含有ＥＶがこの目的に最適に適している理由である。したがって、一実施形態において、本発明は、本明細書において記載されるようなＥＶ、すなわち、任意選択で少なくとも１つのＥＶタンパク質との融合タンパク質に含まれるＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶの集団を含むＲＭに関する。有益な実施形態において、Ｆｃ結合ポリペプチドは、Ｆｃ含有タンパク質（抗体等）に結合し、ＲＭに情報および機能の追加の層を付加する。ＲＭは、液体、粉末、エアロゾル、凍結乾燥材料等の任意の物理形態で存在し得る。上述のように、生物学的に関連したＲＭは、ＥＶ分野内のみでなく、より広い科学全体にわたって非常に求められており、本発明の改変されたＥＶは、フローサイトメトリーおよびナノ粒子トラッキング解析から蛍光顕微鏡および電子顕微鏡までの多くの用途に対してほぼ完ぺきなＲＭの役割を果たす。
【００３７】
一実施形態において、ＥＶに含まれている少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドは、少なくとも１つのエキソソームポリペプチドと共に融合タンパク質の一部を形成する。少なくとも１つのＥＶタンパク質との融合は、通常、ＥＶへの転送を、その後、Ｆｃ結合ポリペプチドの組込みおよび／または提示を増強する。ＥＶ内および／またはＥＶ上に存在するＦｃ結合ポリペプチドは、ＥＶへと結合することが明らかに意図され、それによってＥＶ、抗体等のＦｃドメインを含むタンパク質、および／またはＦｃドメインが融合しているタンパク質に付着する。結合は、当然に、ＥＶのＦｃ結合ポリペプチドと対象のタンパク質のＦｃドメインの間で、典型的には標準的な非共有相互作用を介して起こる。
【００３８】
上述のように、好ましい実施形態において、生物学的ＲＭは、抗体の形態のＦｃ含有タンパク質を付着させる。さらに有益な実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は、インビトロ、インビボ、エクスビボ、または任意の研究環境において、ＲＭの検出、トレース、および画像化を可能にするために、少なくとも１つのフルオロフォア、少なくとも１つの放射性標識、少なくとも１つのＰＥＴリガンド、少なくとも１つのＭＲＩ剤、または任意の他の検出部分を付着させる。生物学的ＲＭを使用し得る研究環境は、以下の非限定的な例を含む：フローサイトメトリー、イメージングフローサイトメトリー、ナノ粒子トラッキング解析、ナノイメージング、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、動的光散乱、電子顕微鏡、発光に基づく検出、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく技術、磁気、蛍光、および／または浮力に基づく標識に基づく正もしくは負の選択技術、粒子の密度、電荷、もしくはサイズに基づく正もしくは負の選択技術、または任意のそれらの組み合わせ。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つの型のＦｃ含有タンパク質を標的細胞に送達する、インビトロ、インビボ、および／またはエクスビボの方法であって、（ｉ）少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶを提供すること、（ｉｉ）Ｆｃ結合ポリペプチドをＦｃ含有タンパク質に結合させること、（ｉｉｉ）標的細胞を、Ｆｃ結合ポリペプチドにＦｃ含有タンパク質を付着させたＥＶに接触させること、を含む方法を提供する。一実施形態において、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドは、少なくとも１つのエキソソームポリペプチドと共に、任意選択で、様々な他のポリペプチド（リンカー、多量体化ドメイン、サイトカイン受容体、および、シグナル伝達物質等）と共に、融合タンパク質の一部を形成し得る。一つの有益な実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は抗体である。他の有益な実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質少なくとも１つのフルオロフォア、少なくとも１つの放射性標識、少なくとも１つのＰＥＴリガンド、または任意の他の検出部分に付着する。
【００４０】
さらに別の態様において、本発明は、ＥＶを含む検出キットに関し、ここでＥＶは少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチド（少なくとも１つのエキソソームポリペプチド融合される）を含み、ここでＦｃ結合ポリペプチドは、任意選択で少なくとも１つのＦｃ含有タンパク質に結合する。抗体は、明らかに、様々な標的抗原の検出に特に好適であり、本発明によるＥＶの助けにより、細胞外のみでなく、細胞内の標的にもプローブを調べることができる。検出を可能にするために、Ｆｃ含有タンパク質（例えば、少なくとも１つの型の抗体）は、検出部分で標識され得る。検出部分の性質は、完全に適用される検出方法に依存するが、好適な検出部分は、例えば、以下の非限定的な例から選択され得る：フルオロフォア、放射性標識、ＰＥＴリガンド、ＭＲＩ剤、酵素検出のための酵素、比色検出部分、生物発光および／または化学発光検出部分、無機または有機化合物、金属、量子ドット、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）、または、適用しようとする検出方法に依存する任意の他の検出部分。
【００４１】
上述のように、本発明は、標的細胞の内側と外側の両方、または細胞膜内における検出を可能にし、細胞外膜に付着する、および／または細胞内の生体分子が、本発明のＥＶに基づく検出を用いて調べることができることを意味する。さらに、特定の生体分子の検出は、インビトロ、インビボおよび／またはエクスビボで起こり得る。試料（動物、組織、器官、細胞、細胞内小器官、体液等）は、例えば、免疫組織化学のために、または顕微鏡および電子顕微鏡のためのスライドおよびガラス上で、例えば、凍結、保存、固定、または保全された、生存または死亡のいずれかを可視化および／または画像化し得る。
【００４２】
本発明による検出キットは、フローサイトメトリー、ナノ粒子トラッキング解析、ナノイメージング、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、動的光散乱、電子顕微鏡、発光に基づく検出、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく技術、磁気、蛍光、および／または浮力に基づく標識に基づく正もしくは負の選択技術、密度、電荷、もしくはサイズに基づく正もしくは負の選択技術、または任意のそのような方法の組み合わせにおいて使用され得る。典型的には、検出キットは、Ｆｃ結合ポリペプチド−含有ＥＶとＦｃ含有タンパク質との結合が、様々な条件下で無傷のままにあり、他の条件下でＦｃ含有タンパク質を時折放出することを可能にするように設計または製剤化される。ＥＶとＦｃ含有タンパク質との複合体は、様々な物理的および科学的状態、例えば、溶液、ゲル、エマルション、好適な緩衝液、凍結乾燥形態、噴霧形態、微粒子形態、ハイドロゲル、リポソーム製剤、ポリマー製剤等において、存在し得る。
【００４３】
さらなる態様において、本発明は、（ｉ）少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶ、および（ｉｉ）少なくとも１つのＦｃ含有タンパク質を含むパーツのキットに関する。少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドは、少なくとも１つのエキソソームポリペプチドと共に、任意選択で他のそれらのポリペプチドおよびドメインと共に、融合タンパク質に含まれ得る。構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、例えば、どのようにキットが使用され、保管され、販売され、輸送されるかに応じて、例えば異なる容器中に、または同一の容器中に存在し得る。構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、使用直前に混合してもよく、またはそれらは、ＥＶとＦｃ含有タンパク質とのナノ粒子複合体として、予め混合して輸送されてもよい。
【００４４】
さらに別の態様において、本発明は、（ｉ）少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶと（ｉｉ）Ｆｃ含有タンパク質とのナノ粒子複合体に関する。少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドは、そのＥＶへの組込みおよび／またはＥＶ表面上のＦｃ結合ポリペプチドの提示を増加させるために、少なくとも１つのエキソソームポリペプチドと共に、融合タンパク質の一部を形成し得る。改変されたＥＶとＦｃ含有タンパク質の間で形成されたナノ粒子複合体は、概略的に、Ｆｃ含有タンパク質（例として、抗体の複数のコピー）でコーティングされたナノ粒子として、記載され得る。抗体は、高い標的特異性を示し、開発が容易であり、検出部分を含むよう修飾でき、本発明のＥＶの助けによって標的細胞内に送達され得るので、本発明の特に好ましい実施形態を構成する。本発明のナノ粒子複合体は、研究、診断、画像化、分析、および治療にわたる広範囲の用途を有し、生物学的ＲＭとして、研究ツールとして、診断ツールとして、画像化ツールとして、検出キットとして、および／または種々の型のＦｃ含有タンパク質のインビトロ、インビボおよび／またはエクスビボの送達のために使用され得る。
【００４５】
一実施形態において、ＥＶ自体は、任意選択で、Ｆｃ含有タンパク質に付着した検出部分（蛍光標識抗体等）と組み合わせることができる検出部分を含む。ＥＶがナノサイズ小胞であるので、例えば、フルオロフォア、線量、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、および任意の蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質、ウミシイタケルシフェラーゼ、ナノルシフェラーゼ、および他の型の生物発光シグナルを産生する酵素、放射性物質、ＰＥＴおよびＭＲＩの剤およびトレーサー、可溶化または様々な複合体中のいずれかの、ナノ粒子、無機化合物、金属および金属イオン等の、様々な型の検出部分を使用することができる。有益な実施形態は、ＥＶのＦｃ結合ポリペプチドに付着した例えば蛍光標識された抗体（または任意のＦｃ含有タンパク質と組み合わせた、ＧＦＰおよび／またはルシフェラーゼ、／ナノルシフェラーゼを含むＥＶである。本質的に、そのように任意の他の型の検出部分をＥＶに付加することは、例えば、顕微鏡、フローサイトメトリー、ナノ粒子トラッキング解析、動的光散乱、および様々な他の技術において非常に有用であり得る１つを超える手段を介した検出を提供する。
【００４６】
本発明のＦｃ結合ポリペプチドは、非ヒト起源またはヒト起源であり得る。Ｆｃ結合因子は、細菌、ウイルス、または非ヒト哺乳動物から取得し得る。別の実施形態において、Ｆｃ結合因子は、ヒトまたは哺乳動物起源である。好ましい実施形態において、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドは、プロテインＡ（非限定的な例として、配列番号７７）、プロテインＧ（非限定的な例として、配列番号７８）、プロテインＡ／Ｇ（非限定的な例として、配列番号７２）、Ｚドメイン（非限定的な例として、配列番号７３）、ＺＺドメイン（非限定的な例として、配列番号７４）、プロテインＬ（非限定的な例として、ｐｄｂ識別番号１  ＨＥＺ）、プロテインＬＧ、ヒトＦＣＧＲＩ（非限定的な例として、配列番号３１）、ヒトＦＣＧＲ２Ａ（非限定的な例として、受入番号Ｐ１２３１８）、ヒトＦＣＧＲ２Ｂ（非限定的な例として、受入番号Ｐ３１９９４）、ヒトＦＣＧＲ２Ｃ（非限定的な例として、受入番号Ｐ３１９９４）、ヒトＦＣＧＲ３Ａ（非限定的な例として、受入番号Ｐ０８６３７）、ヒトＦＣＧＲ３Ｂ（非限定的な例として、受入番号Ｏ７５０１５）、ヒトＦＣＧＲＢ（非限定的な例として、受入番号Ｑ９２６３７）（非限定的な例として、配列番号３２）、ヒトＦＣＡＭＲ（非限定的な例として、配列番号２８）、ヒトＦＣＥＲＡ（非限定的な例として、配列番号３０）、ヒトＦＣＡＲ（非限定的な例として、配列番号２９）、マウスＦＣＧＲＩ（非限定的な例として、配列番号７９）、マウスＦＣＧＲＩＩＢ（非限定的な例として、配列番号８０）、マウスＦＣＧＲＩＩＩ（非限定的な例として、配列番号８１）、マウスＦＣＧＲＩＶ（非限定的な例として、配列番号８２）、マウスＦＣＧＲｎ（非限定的な例として、配列番号８３）、および任意の上述のＦｃ結合ポリペプチドの任意の組み合わせを含む群から選択し得る。例えばファージディスプレイ選別およびバイオインフォマティクスを介して取得された他の好適なＦｃ結合ポリペプチドは、Ｆｃ結合ペプチド、ＳＰＨ（非限定的な例として、配列番号５７）、ＳＰＡ（非限定的な例として、配列番号５８）、ＳＰＧ２（非限定的な例として、配列番号５９）、ＳｐＡ模倣物１（非限定的な例として、配列番号６０）、ＳｐＡ模倣物２（非限定的な例として、配列番号６１）、ＳｐＡ模倣物３（非限定的な例として、配列番号６２）、ＳｐＡ模倣物４（非限定的な例として、配列番号６３）、ＳｐＡ模倣物５（非限定的な例として、配列番号６４）、ＳｐＡ模倣物６（非限定的な例として、配列番号６５）、ＳｐＡ模倣物７（非限定的な例として、配列番号６６）、ＳｐＡ模倣物８（非限定的な例として、配列番号６９）、ＳｐＡ模倣物９（非限定的な例として、配列番号７０）、ＳｐＡ模倣物１０（非限定的な例として、配列番号７１）、Ｆｅｙ模倣物１（非限定的な例として、配列番号６７）、およびＦｅｙ模倣物２（非限定的な例として、配列番号６８）、およびそれらの任意の組み合わせまたは誘導体を含む。特定のコンストラクトのための最も好適なＦｃ結合ポリペプチドの選択は、所望の結合特性、親和性、エキソソームポリペプチドと融合するときのＦｃ結合ポリペプチドの方向、および様々な他の要素に大きく依存する。
【００４７】
プロテインＡ／Ｇは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのセグメントＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣから取得したプロテインＡ部分、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのセグメントＣ１およびＣ３からのプロテインＧ部分と共に、７つのＦｃ−結合ドメインＥＤＡＢＣ−Ｃ１Ｃ３からなる、遺伝的に改変された組換えタンパク質である。有利には、プロテインＡ／Ｇ（非限定的な例として、配列番号７２）は、プロテインＡ（非限定的な例として、配列番号７７）またはプロテインＧ（非限定的な例として、配列番号７８）単独のいずれかよりも幅広い結合能を有し、それは様々な種由来の抗体に対し幅広い結合親和性を有する。プロテインＡ／Ｇは、様々なヒト、マウス、およびラットのＩｇＧサブクラス、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびラットＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃに結合する。さらに、プロテインＡ／Ｇは、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、およびネコからの全ＩｇＧに結合する。プロテインＡ／Ｇは、細胞壁結合領域、細胞膜結合領域、およびアルブミン結合領域を除去して、抗体等の対象のタンパク質のＦｃドメインへの強い結合を可能にするよう改変されてきている。したがって、本発明による有益な実施形態においてＦｃ結合因子は、広い範囲の抗体の結合を可能にするために、プロテインＡ、プロテインＧ、およびプロテインＡ／Ｇの場合のように、１つを超えるＦｃ結合領域を含む。代替的な実施形態において、Ｆｃ結合因子は、対象の抗体の１つを超えるコピーの結合を可能にするために、増加し得る。例えば、短いＺドメインのＦｃ結合因子は、１つを超えるＦｃドメインの結合を可能にする作動する連結を介して、１つを超えるコピーの融合タンパク質中に含まれ得る。この方法は、個別の融合タンパク質間のみでなく、単一の融合タンパク質内においても、抗体および他のＦｃドメイン含有タンパク質を増加することが可能であり、したがって、１つを超える抗体と結合し得る。例えば、Ｆｃ結合ポリペプチドが、テトラスパニンファミリー（ＣＤ６３等）に属するＥＶタンパク質に導入されるとき、１つのＦｃ結合因子を１つのループに挿入し、別のＦｃ結合因子（同一または異なるものであり得る）、をタンパク質の別のループに挿入することが有利であり得る。Ｆｃ結合因子は、Ｆｃ含有タンパク質が、ＥＶの内腔内またはＥＶの表面上のいずれかに積載されることを意図するかに応じて、内向きおよび／または外向きのループに配置し得る。本発明による融合タンパク質のいくつかの非限定的な例は、以下のように、概略的に示され得る（以下の表記は、いずれかのＣおよび／またはＮ末端の方向を示すものとして意図されているのではなく、例示の目的を意図するに過ぎない）：
エキソソームポリペプチド−Ｆｃ結合ポリペプチド−Ｆｃ結合ポリペプチド
エキソソームポリペプチドドメイン−Ｆｃ結合ポリペプチド−エキソソームポリペプチドドメイン−Ｆｃ結合ポリペプチド
エキソソームポリペプチドドメイン−Ｆｃ結合ポリペプチドＡ−エキソソームポリペプチドドメイン−Ｆｃ結合ポリペプチドＢ
【００４８】
いくつかの実施形態において、エキソソームポリペプチドとＦｃ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質はまた、追加のポリペプチド、ポリペプチド、ドメイン、または配列を含み得る。そのような追加のポリペプチドドメインは、様々な機能を発揮し得、例えば、そのようなドメインは、（ｉ）融合タンパク質のＥＶ表面提示の増強に寄与し得る、（ｉｉ）融合タンパク質の集団化をもたらし、それによって、Ｆｃ結合ポリペプチドの親和性を増加し得る、（ｉｉｉ）エキソソームポリペプチドとＦｃ結合ポリペプチドの間の相互作用を最適化するリンカーとして機能し得る、および／または（ｉｖ）ＥＶ膜での係留を向上し得る、ならびに様々な他の機能を発揮し得る。本発明の融合タンパク質の一部または全体に、有利にも含まれ得る２つのそのような追加のポリペプチドは、ｇｐ１３０（非限定的な例として、配列番号１８）および腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）（非限定的な例として、配列番号１９）である。特に、これらの追加のアポリペプチドの膜貫通ドメインは、Ｆｃ結合ポリペプチドのＥＶへの挿入および提示を最適化するのに非常に有用であり得る。全般的に、様々な膜貫通ドメインは、融合タンパク質における追加のドメインとして非常に有益であり得る。例えば、エキソソームタンパク質シンテニンを使用するとき、ＴＮＦＲの膜貫通ドメイン、またはｇｐ１３０の膜貫通ドメイン等の追加のポリペプチドドメインを、例えば、融合タンパク質のシンテニンとＦｃ結合ポリペプチドの間に挿入することは非常に有益である。さらなる追加のドメインは、表面提示および／または親和性を向上させるために、フォールドオンドメイン、ロイシンジッパードメインおよび／または三量体化ドメイン等の多量体化ドメインを含み得る。この非限定的な概略的な例を以下に示す：
シンテニン−細胞質ＴＮＲＦ−フォールドオン三量体化ドメイン−膜貫通ＴＮＦＲドメイン−Ｚドメイン−細胞外ＴＮＦＲドメイン
シンデカン−ロイシンジッパードメイン−ｇｐ１３０細胞質ドメイン−ｇｐ１３０膜貫通ドメイン−Ｆｃ結合ポリペプチド−ｇｐ１３０細胞外ドメイン
【００４９】
さらなる実施形態において、エキソソームポリペプチドは、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、アリックス、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３、シンデカン−４、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２（非限定的な例として、配列番号２４）、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ  １、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ構成要素、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１α、Ｍａｃ−１β、ＭＦＧＥ８（非限定的な例として、配列番号２５）、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、他のエキソソームポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせを含む群から選択され得る。
【００５０】
本発明による特に有益な融合タンパク質は、少なくとも１つのコピーの以下のＦｃ結合ポリペプチドに融合したヒトエキソソームタンパク質、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）、Ｌａｍｐ２、およびシンテニンを含み得る：  Ｚ  ドメイン、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、ＦＣＧＲＩ、ヒトＦＣＧＲ２Ａ、ヒトＦＣＧＲ２Ｂ、ヒトＦＣＧＲ２Ｃ、ヒトＦＣＧＲ３Ａ、ヒトＦＣＧＲ３Ｂ、ヒトＦＣＧＲ３Ｃ、ヒトＦＣＡＭＲ、ヒトＦＣＡＲ、およびヒトＦＣＥＲＡ。特に、ＥＶタンパク質ＣＤ６３（非限定的な例として、配列番号３）に対する２つのＺドメインの融合は、小さなサイズのＺドメインとＣＤ６３の非常に高いＥＶ表面の発現の結果として、ＥＶ表面に大量に提示される非常に強力なＦｃ結合因子をもたらす。Ｆｃ結合因子のＥＶ外部表面上の提示は、対象のＦｃドメイン含有タンパク質の外来性の結合を可能にするために、当然に好ましい。ＣＤ６３−ＺＺドメインの融合タンパク質の場合、Ｚドメインは、ＣＤ６３の第１および第２のループに挿入でき、ＣＤ６３のＥＶ膜中の係留の後に、ＥＶ外部表面上の提示を可能にする。さらに、上述のように、好適な追加のポリペプチドおよびポリペプチドドメインおよびリンカーはまた、融合タンパク質中に含ませることができ、それは当然に、エキソソームポリペプチドおよびＦｃ結合ポリペプチドを含む。そのような追加のポリペプチドは、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２、ＩＬ６シグナル伝達物質、ｇｐ１３０、ならびに様々な他のサイトカインおよびサイトカイン関連ポリペプチド等の様々なサイトカイン受容体からのドメインを含む。ある場合において、サイトカインおよびサイトカイン関連ポリペプチド（様々なサイトカイン受容体等）は、単独でＦｃ結合ポリペプチドをＥＶに輸送し得る。特に有用なリンカーは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）等の小さくて柔軟なアミノ酸の、重複および／または組み合わせであり、典型的にＧＳ、例えば２×ＧＳまたは４×ＧＳを表示する。精製およびアッセイを簡単にするためのＨｉｓタグを付加することもでき、Ｃ末端とＮ末端の両方に負荷することもでき、ＧＦＰ等の様々な蛍光タンパク質であり得る。以下は、しばしばリンカーを介して連結され、任意選択で追加のポリペプチドまたはポリペプチドドメインを含む、少なくとも１つのエキソソームポリペプチドと少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含む、融合タンパク質の特に有益な非限定的な例である：
-  ＣＤ８１−プロテインＡ／ＧＣＤ８１第２ループ（非限定的な例として、配列番号７５）
-  ＣＤ９−ＺＺドメインＣＤ９Ｓ第２ループ（非限定的な例として、配列番号７６）
-  ＦＣＡＲ細胞外ドメイン−２ＸＧＧＧｇＳリンカー−Ｌａｍｐ２ｂ（非限定的な例として、配列番号５５）
-  ＦＣＡＲ細胞外ドメイン−４ＸＧＳリンカー−Ｌａｍｐ２ｂ（非限定的な例として、配列番号５４）
-  ＦＣＧＲ１Ａ細胞外ドメイン−２ＸＧＧＧｇＳリンカーＬａｍｐ２ｂ（非限定的な例として、配列番号４９）
-  ＦＣＧＲ１Ａ細胞外ドメイン−４ＸＧＳリンカー−Ｌａｍｐ２ｂ（非限定的な例として、配列番号４８）
-  ＦｃＲＮ細胞外ドメイン−４ＸＧＳリンカー−Ｌａｍｐ２ｂ（非限定的な例として、配列番号３９）
-  ＦｃＲＮ−２ＸＧＧＧｇＳリンカー−Ｌａｍｐ２ｂ（非限定的な例として、配列番号４０）
-  Ｇｐ１３０細胞外ドメイン−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−ＦＣＡＲ細胞外ドメイン−Ｇｐ１３０膜貫通ドメイン−ロイシンジッパー−Ｎ末端シンテニン（非限定的な例として、配列番号５２）
-  Ｇｐ１３０細胞外ドメイン−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−ＦＣＧＲＩＡ細胞外ドメイン−Ｇｐ１３０膜貫通ドメイン−ロイシンジッパー−Ｎ末端シンテニン（非限定的な例として、配列番号４６）
-  Ｇｐ１３０細胞外ドメイン−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−ＦｃＲＮ細胞外ドメイン−Ｇｐ１３０膜貫通ドメイン−ロイシンジッパー−Ｎ末端シンテニン（非限定的な例として、配列番号４３）
-  Ｇｐ１３０細胞外ドメイン−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−Ｚドメイン−Ｇｐ１３０膜貫通ドメイン−ロイシンジッパー−Ｎ末端シンテニン（非限定的な例として、配列番号３４）
-  トランスフェリン受容体−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−ＦＣＡＲ細胞外ドメイン（非限定的な例として、配列番号５６）
-  トランスフェリン受容体−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−ＦＣＧＲ１Ａ細胞外ドメイン（非限定的な例として、配列番号５０）
-  トランスフェリン受容体−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−ＦｃＲＮ細胞外ドメイン（非限定的な例として、配列番号４１）
-  トランスフェリン受容体−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−Ｚドメイン（非限定的な例として、配列番号３８）
-  ＣＤ６３−ＦＣＡＲ細胞外ドメインＣＤ６３第１ループおよびＣＤ６３第２ループ（非限定的な例として、配列番号５３）
-  ＣＤ６３−ＦＣＧＲ１Ａ細胞外ドメインＣＤ６３第１ループおよびＣＤ６３第２ループ（非限定的な例として、配列番号４７）
-  ＣＤ６３−ＦｃＲＮ細胞外ドメインＣＤ６３第１ループおよびＣＤ６３第２ループ（非限定的な例として、配列番号４４）
-  ＣＤ６３−ＺドメインＣＤ６３第１ループおよびＣＤ６３第２ループ（非限定的な例として、配列番号３５）
-  ＴＮＦＲ細胞外ドメイン−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−ＦＣＡＲ細胞外ドメイン−ＴＮＦＲ膜貫通ドメイン−フォールドオン−Ｎ末端シンテニン（非限定的な例として、配列番号５１）
-  ＴＮＦＲ細胞外ドメイン−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−ＦＣＧＲＩＡ細胞外ドメイン−ＴＮＦＲ膜貫通ドメイン−フォールドオン−Ｎ末端シンテニン（非限定的な例として、配列番号４５）
-  ＴＮＦＲ細胞外ドメイン−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−ＦｃＲＮ細胞外ドメイン−ＴＮＦＲ膜貫通ドメイン−フォールドオン−Ｎ末端シンテニン（非限定的な例として、配列番号４２）
ＴＮＦＲ細胞外ドメイン−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−Ｚドメイン−ＴＮＦＲ膜貫通ドメイン−フォールドオン−Ｎ末端シンテニン（非限定的な例として、配列番号３３）
-  Ｚドメイン−２ＸＧＧＧｇＳリンカー−Ｌａｍｐ２ｂ（非限定的な例として、配列番号３７）
-  Ｚドメイン−４ＸＧＳリンカー−Ｌａｍｐ２ｂ（非限定的な例として、配列番号３６）
-  トランスフェリン受容体−プロテインＡＧ  （非限定的な例として、配列番号７２に作動可能に融合した、非限定的な例として、配列番号１０）
【００５１】
上述の融合タンパク質は、本発明が可能にし得る多くの遺伝子操作の可能性の例に過ぎず、そのため、それらは、本発明の非限定的な実施形態に過ぎない。本発明による融合タンパク質の全ての構成要素は、自由に組み合わせることができ、例えば、融合タンパク質は、Ｃ末端、Ｎ末端、またはその両方、または融合タンパク質の任意の場所に配置し得る、１つまたは複数のエキソソームポリペプチドを含み得る。さらに、融合タンパク質はまた、Ｃ末端、Ｎ末端、またはその両方、または１つ以上の任意のループ、例えば、膜貫通部分、または融合タンパク質の任意の部分に配置し得る、１つまたは複数のＦｃ結合ポリペプチドを含み得る。明確化のために、１つを超える型のエキソソームポリペプチドおよび１つを超える型のＦｃ結合ポリペプチドが、単一のコンストラクト中に含まれ得る。さらに、リンカー等の追加のアミノ酸のストレッチ（しばしばグリシンおよびセリンのアミノ酸を含む）およびＨｉｓタグが、精製、アッセイ、および可視化を簡単にするために含まれ得る。同様に、他のペプチドおよびポリペプチドドメインもまた、融合タンパク質配列の任意の場所に含まれ得る。例えば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、ｇｐ１３０、ＩＬ６Ｒ等の様々なドメインのような、例えば様々なサイトカイン受容体からの様々なドメインおよび領域が、有利にも含まれ得る。
【００５２】
さらなる実施形態において、上述のようなＦｃ結合ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む任意のタンパク質、すなわち抗体のみでなく、上述のいくつかの例において述べられたもののような、天然に存在するものおよび遺伝子操作を受けたＦｃドメイン含有タンパク質を含む、他のＦｃドメインを含むタンパク質にも結合する。有利にも、本発明は、Ｆｃ結合ポリペプチドと少なくとも１つのＦｃ含有タンパク質の相互作用を通じて、Ｆｃドメインを含む複数のタンパク質でコーティングされたＥＶをもたらす。Ｆｃ結合因子とＦｃ含有タンパク質の相互作用は、通常、Ｆｃ結合ポリペプチドとＦｃ含有タンパク質のＦｃドメインの非共有結合に基づく。当然に１つの単一のＥＶは、１つを超える型のＦｃドメイン含有タンパク質によってコーティングされ得る。一つの非限定的な例において、Ｆｃ結合ＥＶは、ＰＤ１軸に沿った好適な標的を標的とする１つの抗体によってコーティングされ、一方で別の抗体は、ＣＴＬＡ４軸に沿った好適な標的を標的とする。別の非限定的な例において、Ｆｃ結合ＥＶは、細胞内腫瘍性タンパク質を標的とする抗体とＦｃドメインに融合した腫瘍抑制因子でコーティングされる。典型的な例として、１つの単一のＥＶもまた、１つの型のモノクローナル抗体等の、実質的に複数の１つの単一の型のＦｃドメイン含有タンパク質を含み得る。検出抗体、標的化抗体、治療用抗体、Ｆｃ含有非抗体の対象のタンパク質、および抗体−薬物複合体（ＡＤＣ、（診断、画像化、および治療の目的で使用され得る）の様々な組み合わせは、本発明の好ましい実施形態を構成する。有益な実施形態において、本発明によるＥＶは、Ｆｃドメインを含む複数のタンパク質でコーティングされる。例えば、ＣＤ６３またはＣＤ８１またはシンテニン等の高発現のＥＶタンパク質を用いるとき、Ｆｃ結合ポリペプチドとＦｃ含有タンパク質のＦｃドメインの相互作用を介して、ＥＶ表面の非常に密なコーティングを達成できる。したがって、本発明は、Ｆｃドメインを含む少なくとも１０個のタンパク質、好ましくは、Ｆｃドメインを含む少なくとも２０個のタンパク質、さらにより好ましくは、Ｆｃドメインを含む少なくとも３０個のタンパク質によってコーティングされ得る。そのようなタンパク質は、同一のタンパク質のコピーであってもよく（例えば、例として、１つの単一のＥＶに付着する、細胞内タンパク質を標的とする５０の抗体）、または、１つを超えるタンパク質（例えば、細胞内タンパク質を標的とする３０個の抗体と、例えば４０個のＦｃドメイン含有の腫瘍抑制因子タンパク質）であってもよい。ＥＶタンパク質とＦｃ結合因子の最適な組み合わせを選択することによって、さらに提示を増加することが可能であり得、ある場合において、ＥＶ当たり、５０個を超えるＦｃドメインを含むタンパク質、または、約７５個を超えるＦｃドメインを含むタンパク質でさえ、またはある場合には、１００個を超えるＦｃ含有タンパク質でさえ、ＥＶをコーティングすることが可能であり得る。
【００５３】
さらなる態様において、本発明は、抗体およびＦｃドメインを含むよう改変されたタンパク質等のＦｃドメインを含むタンパク質に結合することのできるＥＶを産生する方法に関する。そのような方法は、典型的には、（ｉ）少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドと任意選択で少なくとも１つのエキソソームポリペプチドをコードするポリヌクレオチドコンストラクトを、ＥＶ源細胞に導入するステップ、（ｉｉ）ＥＶ産生源細胞から分泌されたＥＶを回収するステップを含み、ここでＥＶが、ポリヌクレオチドコンストラクトから発現された、Ｆｃ結合ポリペプチド（任意選択で融合タンパク質に含まれる）を含む。続くステップにおいて、Ｆｃ結合ポリペプチドを含むＥＶは、好適な精製技術を用いて精製し得、抗体等のＦｃ含有タンパク質への曝露が後に続き、Ｆｃ結合ポリペプチドと対象のタンパク質のＦｃドメインの相互作用を通じて、Ｆｃ含有タンパク質の結合を可能にする。上述のように、代替的な実施形態において、ステップ（ｉ）はまた、同一のＥＶ源細胞中のポリヌクレオチドコンストラクトから対象のＦｃ含有タンパク質を発現することを含み得、それによって、ＥＶの内在性積載を達成する。Ｆｃ結合ポリペプチド（任意選択で少なくとも１つのエキソソームポリペプチドと共に融合タンパク質に含まれる）とＦｃ含有タンパク質は、コンストラクト設計に依存して、同一のまたは異なるポリヌクレオチドコンストラクトから発現され得る。さらに別の態様において、本発明は、抗体等の少なくとも１つのＦｃドメインを含むタンパク質でＥＶをコーティングする方法に関する。そのような方法は、（ｉ）任意選択で少なくとも１つのエキソソームポリペプチドに融合された、少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質を含む、少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドを含むＥＶを提供するステップ、（ｉｉ）Ｆｃ結合ポリペプチドが、Ｆｃドメインを含む少なくとも１つのタンパク質のＦｃドメインに結合することを可能にするステップ、を含む。Ｆｃ結合ポリペプチドを含むＥＶの産生に使用されるＥＶ源細胞は、Ｆｃ結合ポリペプチド−Ｆｃ含有タンパク質複合体を積載するＥＶを産生するのに必要なポリヌクレオチドコンストラクトによって安定的にまたは一過性のいずれかによってトランスフェクトされ得る。安定的なトランスフェクションは、マスターセルバンク（ＭＣＢ）およびワーキングセルバンク（ＷＣＢ）の作成を可能にするので有益である。しかしながら、一過性のトランスフェクションもまた、場合によっては、例えば、患者自身のＥＶ産生細胞から取得したＥＶを含む自家性治療を迅速に作成するとき、有利である。これらの方法は、研究、診断、画像化、および治療における用途のために、ＥＶおよびＦｃ含有タンパク質の最適化のためのさらなるステップが後に続き得る。例えば、Ｆｃ結合ポリペプチドを含むＥＶは、貯蔵および使用のための好適な容器中の液体製剤として製剤化され得る。そのような液体製剤は、問題の用途に応じて任意の好適な方法によって、凍結、凍結乾燥、液体またはタンパク質製剤として製剤化、および／または、処理され得る。Ｆｃ含有タンパク質はまた、液体製剤として製剤化され得るが、代替的に、例えば凍結乾燥された粉末等の別の物理的形態としても製剤化され得る。重要なことに、検出キットおよびパーツのキットの種々の構成要素は、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、インビトロ、インビボ、および／またはエクスビボ送達方法等である最終用途を念頭において設計され産生されるべきである。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、インビトロ、エクスビボおよび／またはインビボでの、対象の抗体および他のＦｃドメイン含有タンパク質のための送達ビヒクルとしてのＥＶの使用に関する。さらに、本発明はまた、対象の他の診断、画像化、および／または治療薬のための送達ビヒクルとしての、Ｆｃ含有タンパク質に付着したＥＶの使用を提供する。非限定的な例として、表面に標的化抗体を付着させているＥＶはまた、ＥＶの内部および／またはＥＶ膜のいずれかに存在し得る、追加の診断および／または治療薬を含み得る。例えば、抗体コーティングＥＶは、ＲＮＡ治療の積み荷（ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド等）を、標的細胞、組織、および／または器官に送達するのに使用され得る。別の非限定的な例において、ＥＶは、表面にＦｃ含有標的化タンパク質（Ｆｃドメインを含むよう改変されているｓｃＦｖ等）を付着させ、ＥＶの内部、またはＥＶ膜の内部／上に、遺伝子編集のためのＣａｓ９等の治療用タンパク質、任意選択でＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイド鎖と共に含む。
【００５５】
さらなる態様において、本発明の方法はまた、生じるＥＶの収量または特性に影響を及ぼすために、ＥＶ源細胞を、血清飢餓、低酸素、バフィロマイシン、またはＴＮＦ−αおよび／またはＩＦＮ−γ等のサイトカインに曝すことを含み得る。ＥＶ産生スケールおよび予定表は、ＥＶ産生細胞または細胞株に大幅に依存し、したがって、当業者によって適応され得る。本発明による方法は、Ｆｃ結合ポリペプチドを含むＥＶを、ＥＶに付着させるためのＦｃドメイン含有タンパク質（抗体等）と共インキュベートする前に実施され得るＥＶ精製ステップをさらに含み得る。ＥＶは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ビーズ溶出液クロマトグラフィー、スピン濾過、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）中空糸濾過、遠心、免疫沈降、フィールドフローフラクショネーション、透析、マイクロ流体に基づく分離等、またはそれらの組み合わせを含む技術の群から選択される手順を通じて精製され得る。有益な実施形態において、ＥＶの精製は、濾過（好ましくは限外濾過（ＵＦ）、タンジェント流濾過、または中空糸濾過）、サイズ排除液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、またはビーズ抽出液クロマトグラフィーの連続的な組み合わせを用いて実施される。この精製ステップの組み合わせは、結果として、様々な用途、アッセイ、および分析方法において、より優れた活性および効力をもたらす、最適な精製をもたらす。さらに、エキソソームを生成するために日常的に使用される限外濾過（ＵＣ）と比べて、連続的濾過−クロマトグラフィーは、十分に速く、従来技術を支配する現在のＵＣ方法論の重大な欠点であるより大きな製造容量の規模にすることが可能である。別の有利な精製方法論は、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）であり、これは拡張性および純度を提供し、そして任意の他の型の精製技術と組み合わせることができる。
【００５６】
さらに別の態様において、本発明は、通常は本発明によるＥＶの集団の形態でＥＶを含む、医薬、診断、および／または画像化の組成物に関する。典型的に、本発明による組成物は、少なくとも１種の許容可能な賦形剤と共に製剤化された１つの型のＥＶ（すなわち、特定の型のＦｃ結合タンパク質を含み、１つ以上の型の抗体等のＦｃ含有タンパク質を付着させたＥＶの集団）を含む。しかしながら、当然に、１つを超えるＥＶ集団の型は、例えば、抗体の組み合わせが望ましい場合において、単一の組成物に含まれ得る。しかしながら、当然に、上述のように、単一のＥＶまたはＥＶの単一の集団は、ＥＶ表面に結合した１つを超えるＦｃ含有タンパク質（例えば抗体）を含み得る。好適な賦形剤の選択は、実際の用途によって決定され、賦形剤は、任意の薬学的に許容可能な、および／または研究グレードの材料、組成物、またはビヒクル、例えば、ＥＶ集団を懸濁、その活性の維持、積載、または輸送するのに関与し得る、固体または液体の充填剤、希釈剤、賦形剤、担体、溶媒、またはカプセル化物質、を含む群から選択され得る。
【００５７】
さらに別の態様において、本発明は、例えば、画像化、診断、および／または治療、もしくはセラノスティクス等の医薬における使用のための、本発明によるＥＶに関する。当然に、本発明によるＥＶが、医薬において使用されるとき、それは実際、通常は、使用されるＥＶの集団である。患者に投与されるＥＶの用量は、例えば、ＥＶ表面にコーティングされる対象のＦｃ含有タンパク質の数、検出、診断、治療、緩和される疾患または病状、投与経路、任意の追加の診断、画像化、および／または治療薬自体の作用機序、ＥＶの固有の特性、任意の標的化抗体または他の標的化実体、ならびに当業者に知られている関連する様々なパラメータに依存するであろう。
【００５８】
Ｆｃ含有タンパク質を積載する本発明のＥＶは、様々な異なる診断、画像化、および／または治療薬のために使用し得る。一実施形態において、ＥＶは、特異的な細胞型、組織、および／または器官を標的化する、抗体または他のＦｃ含有タンパク質によって包まれる。これは対象の組織にＥＶを標的化する非常に強力な方法であり、Ｆｃ含有タンパク質に加えて他のイメージング剤または医薬品を含み得、セラノスティクス、診断、画像化、および薬物送達におけるステップの機会を表し得る。別の実施形態において、対象の抗原と相互作用する抗体または他のＦｃドメイン含有タンパク質は、生物学的障壁を超える能力を有するＥＶを用いて、典型的に到達するのが困難である対象の組織へと効率的に送達され得る。このアプローチは、例えば、治療と診断／画像化の両方のための、モノクローナル抗体の中枢神経系または脳への送達を可能にする。さらに別の実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質によるＥＶのコーティングは、インビトロ、エクスビボ、およびインビボにおける、その標的親和性またはその対象の標的への結合の構造を増強またはそれに影響を与えるための、対象のＦｃ含有タンパク質の多重化の方法である。さらに別の実施形態において、向上した送達および抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）または受容体−薬物複合体の有効性について、ＡＤＣの多重化が大幅にそれらの治療活性を高め、それらのＥＶ上の存在がそれらが標的細胞に侵入できることをも意味するので、本発明によるＥＶが可能にする。さらなる実施形態において、ＥＶの標的細胞に侵入する能力は、本発明のＥＶが細胞内スペース全体を切り開き、本質的に全てのＦｃドメインを含むタンパク質および／またはＦｃドメインを融合できる全てのタンパク質（酵素補充療法のための酵素、Ｃａｓ９等のヌクレアーゼ、またはｐ５３、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、およびＳＴ１４のいずれか１つのような腫瘍抑制因子等）を新薬の開発につながるようにすることを意味する。
【００５９】
したがって、本発明によるＥＶおよびそれらのＥＶ集団は、診断、画像化、研究、予防および／または治療の目的、例えば、診断、画像化、評価、予防、および／または様々な疾患および障害の治療および／または緩和における使用において使用することができる。本発明によるＥＶを適用し得る、疾患の非限定的な実例は、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、特発性肺線維症、乾癬、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＲＡ）、子宮内膜症、自己免疫性肝炎、強皮症、筋炎、発作、急性脊髄損傷、血管炎、ギラン・バレー症候群、急性心筋梗塞、ＡＲＤＳ、敗血症、髄膜炎、脳炎、肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、腎不全、心不全または任意の急性または慢性の臓器不全および関連する基礎にある病因、移植片対宿主、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび他の筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、例えばゴーシェ病、ファブリー病、ＭＰＳ  Ｉ、ＩＩ（ハンター症候群）、およびＩＩＩ、ニーマン・ピック病、ポンペ病等、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病を含む神経変性疾患、および他のトリヌクレオチドリピート関連疾患、痴呆、ＡＬＳ、癌誘発性悪液質食欲不振、２型糖尿病、ならびに様々な癌を含む。例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ−関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、小脳または大脳、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、脳幹部神経膠腫、脳癌、脳腫瘍（小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上の原始神経外胚葉腫瘍、視覚路および視床下部の神経膠腫、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（小児、消化管）、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮体癌、上衣腫、食道癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌（眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫）、胆嚢癌（胃）癌、消化管カルチノイド、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫（頭蓋外、性腺外、または卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫（脳幹の神経膠腫、大脳星状細胞腫、視覚路および視床下部の神経膠腫）、胃カルチノイド、ヘアリー細胞白血病、頭頚部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、島細胞癌（膵島）、カポジ肉腫、腎癌（腎細胞癌）、喉頭癌、白血病（急性リンパ芽球（急性リンパ性白血病とも呼ばれる））、急性骨髄（急性骨髄性白血病とも呼ばれる）、慢性リンパ（慢性リンパ性白血病とも呼ばれる）、慢性骨髄（慢性骨髄性白血病とも呼ばれる）、ヘアリー細胞白血病）、口唇と口腔癌、脂肪肉腫、肝癌（原発性）、肺癌（非小細胞、小細胞）、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキン、髄芽腫、メルケル細胞癌���中皮腫、原発不明転移性皮膚頸部癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病（急性、慢性）、骨髄腫、鼻腔と副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮−間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、膵島細胞癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果腺星状細胞腫、松果腺胚細胞腫、松果体芽腫およびテント上の原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎癌）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（ユーイング腫瘍肉腫、カポジ肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫）、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫、黒色腫）、小腸癌、扁平細胞、扁平頸部癌、胃癌、テント上の原始神経外胚葉腫瘍、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、腟癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および／またはウィルムス腫瘍のような、事実的に全ての型の癌が、本発明のための関連する疾患標的である。
【００６０】
本発明によるＥＶは、例えば、耳介（耳）、頬側、結膜、皮膚、歯、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外の、体外の、血液透析、浸透、間質性、腹腔内、羊水内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、口内、心内、軟骨内、仙骨内、洞内、腔内、大脳内、槽内、角膜内、歯冠内（歯）、冠動脈内、海綿体内、皮内、脊髄内、管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、腔内、リンパ腺内、骨髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、洞内、脊髄内、滑膜内、腱内、精巣内、包膜内、胸腔内、尿細管内、腫瘍内、鼓膜内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、静脈内点滴、心室内、膀胱内、硝子体内、イオン浸透法、洗浄、喉頭、鼻、経鼻胃、閉鎖包帯法、眼、経口、口腔咽頭、その他、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸（吸入）、眼球後、軟組織、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、粘膜内、経胎盤、気管内、鼓膜内、尿管、尿道、および／または膣の投与、および／または上述の投与経路の組み合わせのような、典型的には治療すべき疾患、および／または抗体もしくはそのようなＥＶ集団の特性に依存する、様々な異なる投与経路を介して、ヒトまたは動物に投与され得る。
【００６１】
本発明による好適な標的化抗体は、例えば、腫瘍、実質臓器、生物の特定の複雑な解剖学的部分、細胞または組織の型に由来する抗原を標的とし得る。標的化抗体によって標的化し得る抗原の起源の非限定的な例は、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、副腎、甲状腺、副甲状腺、全ての脳領域（例えば、視床、視床下部、線条体等）を含む脳、血液脳関門、ＣＮＳ、ＰＮＳ、骨髄、皮膚、脈管系、脾臓を含むリンパ系、関節、眼、筋組織、炎症部位、損傷部位、ならびに、脂肪細胞、筋細胞（筋芽細胞および筋管）、サテライト細胞、心細胞、内皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、腎細胞、周皮細胞、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、希突起膠細胞、マクロファージ、ＤＣ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、上皮細胞、赤血球、等の細胞型、多能性造血幹細胞／血球芽細胞、骨髄系前駆細胞、リンパ球前駆細胞等のより初期の前駆体、等を含む。癌標的に関連する非限定的な例は、腺癌抗原、αフェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、４−ＩＢＢ、５Ｔ４、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３  （ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４  ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴ０８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエキストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧＩ、ＬＩ−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インシュリン様増殖因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンανβ３、レグマイン、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−ＩＣ、ＰＤＧＦ−Ｒａ、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ  ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、葉酸受容体、トランスフェリン受容体、およびそれらの組み合わせを含む。
【００６２】
さらなる実施形態において、本発明による抗体の好適な非限定的な例は、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ、アクトクスマブ（ａｃｔｏｘｕｍａｂ）、アダリムマブ、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アドトラスツズマブエムタンシン（Ａｄｏｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、アデュカヌマブ（ａｄｕｃａｎｕｍａｂ）、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブペンテタート（ａｌｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトックス（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ  ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アニフロルマブ（Ａｎｉｆｒｏｌｕｍａｂ）、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ（ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アテゾリズマブ、アチヌマブ（Ａｔｉｎｕｍａｂ）、アツリズマブ（Ａｔｌｉｚｕｍａｂ）、アトロリムマ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ（Ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ビシロマブ（Ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、ビマグルマブ（Ｂｉｍａｇｒｕｍａｂ）、ビバツズマブメルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ、ブロソズマブ（Ｂｌｏｓｏｚｕｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ  ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、カプラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）、カプロマブペンデチド、カルルマブ（Ｃａｒｌｕｍａｂ）、カツマキソマブ、ｃＢＲ９６−ドキソルビシン免疫複合体、セデリズマブ（Ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ  ｂｏｇａｔｏｘ）、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クラザキズマブ（Ｃｌａｚａｋｉｚｕｍａｂ）、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、コンシズマブ（Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ）、クレネズマブ、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダラツムマブ、デムシズマブ（Ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、デノスマブ、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ジヌツキシマブ、ドルリモマブアリトクス（Ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、デュリゴツマブ（Ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュピルマブ、デュルバルマブ、デュシギツマブ（Ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ、エドバコマブ（Ｅｄｏｂａｃｏｍａｂ）、エドレコロマブ、エファリズマブエフングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エルデルマブ（Ｅｌｄｅｌｕｍａｂ）、エロツズマブ、エルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、エナバツズマブ（Ｅｎａｖａ��ｕｚｕｍａｂ）、エンリモマブペゴール（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、エノキズマブ（Ｅｎｏｋｉｚｕｍａｂ）、エノチクマブ（Ｅｎｏｔｉｃｕｍａｂ）、エンシツキシマブ（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エピツモマブシツキセタン（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ  ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）、エプラツズマブ、エルリズマブ（Ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタネルセプト、エタラシズマブ、エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、エボロクマブ、エキスビビルマブ（Ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、ファーレツズマブ、ファシヌマブ（Ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ（Ｆｅｌｖｉｚｕｍａｂ）、フェザキヌマブ（Ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フォントリズマブ、フォラルマブ（Ｆｏｒａｌｕｍａｂ）、フォラビルマブ（Ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）、フルラヌマブ（Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ）、フツキシマブ（Ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガリキシマブ、ガニツマブ（Ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブベドチン（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ（Ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、グセルクマブ、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、ＩＭＡＢ３６２、イムシロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、イムガツズマブ（Ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インクラクマブ（Ｉｎｃｌａｃｕｍａｂ）、インダツキシマブラブタンシン（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ  ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、インフリキシマブ、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イノリモマブ（Ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イトリズマブ、イキセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ケリキシマブ、ラベツズマブ、ランブロリズマブ、ラムパリズマブ（Ｌａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ）、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、レマレソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、レクサツムマブ、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、リンツズマブ、リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）、ロデルシズマブ（Ｌｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）、ロルボツズマブメルタンシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキシマブ、マパツズマブ、マルジェツキシマブ、マスリモマブ（Ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、マブリリムマブ（Ｍａｖｒｉｌｉｍｕｍａｂ）、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ、ミンレツモマブ（���ｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モガムリズマブ、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）モタビズマブ（Ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ）、モキセツモマブパスドトクス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）、ムロモナブ−ＣＤ３（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）、ナコロマブタフェナトクス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ  ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナミルマブ（Ｎａｍｉｌｕｍａｂ）、ナプツモマブ・エスタフェナトクス、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ（Ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ）、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ  ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）、オカラツズマブ（Ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ、オデュリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オファツムマブ、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オンキシズマブ（Ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、オポルツズマブモナトクス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ  ｍｏｎａｔｏｘ）、オレゴボマブ、オルチクマブ（Ｏｒｔｉｃｕｍａｂ）、オテリキシズマブ、オトレルツズマブ（Ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、オキセルマブ（Ｏｘｅｌｕｍａｂ）、オザネズマブ（Ｏｚａｎｅｚｕｍａｂ）、オゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パンコマブ（Ｐａｎｋｏｍａｂ）、パノバクマブ（Ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、パルサツズマブ（Ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パスコリズマブ（Ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、パテクリズマブ（Ｐａｔｅｃｌｉｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペラキズマブ（Ｐｅｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ、パキセリズマブ、ピディリズマブ、ピナツズマブベドチン（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プラクルマブ（Ｐｌａｃｕｌｕｍａｂ）、ポラツズマブベドチン（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、ポネズマブ、プリリキシマブ（Ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、プリトキサキシマブ（Ｐｒｉｔｏｘａｘｉｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ＰＲＯ１４０、クイリズマブ（Ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リサンキズマブ（Ｒｉｓａｎｋｉｚｕｍａｂ）、リツキシマブ、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、ロレデュマブ（Ｒｏｌｅｄｕｍａｂ）、ロモソズマブ、ロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、サツモマブペンデチド（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セクキヌマブ、セリバンツマブ（Ｓｅｒｉ��ａｎｔｕｍａｂ）、セトキサキシマブ（Ｓｅｔｏｘａｘｉｍａｂ）、セビルマブ（Ｓｅｖｉｒｕｍａｂ）、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）、シルツキシマブ、シムツズマブ（Ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、シプリズマブ、シルクマブ（Ｓｉｒｕｋｕｍａｂ）、ソラネズマブ、ソリトマブ（Ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、ソンツズマブ（Ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、スタムルマブ（Ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ）、スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）、スビズマブ（Ｓｕｖｉｚｕｍａｂ）、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）、タカツズマブテトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、タドシズマブ（Ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｐｔｏｘ）、テフィバズマブ（Ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、テリモマブアリトクス（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テネリキシマブ（Ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）、テプリズマブ、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、チシリムマブ、チルドラキズマブ（Ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ティガツズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ（Ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トシツモマブ、ベキサール、トベツマブ（Ｔｏｖｅｔｕｍａｂ）、トラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）、トラスツズマブ、トレガリズマブ（Ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ  ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ツビルマブ（Ｔｕｖｉｒｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バンチクツマブ（Ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、バテリズマブ（Ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、ベセンクマブ（Ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマフォドチン（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ  ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ（Ｚａｔｕｘｉｍａｂ）、ジラリムマブ（Ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）、ゾリモマブアリトクス（Ｚｏ
ｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）、またはそれらの任意の組み合わせの任意の１つ以上であり得る。重要なことに、本発明は、その標的が細胞内および／または細胞外のいずれかにかかわらず、任意の抗体の送達を提供する。本発明のＥＶの抗体を内在化する能力は、モノクローナル抗体開発における段階変化を表し、抗原を標的とすることができ、標的細胞の細胞内小器官全体にわたって標的とする。重要なことに、本発明による抗体およびＦｃ含有タンパク質は、検出および画像化の目的のために、例えば、フルオロフォア、ＭＲＩ剤、ＰＥＴ剤、放射性物質、酵素、ナノ粒子、金属、有機および無機化合物等を用いて、有利にも標識され得る。
【００６３】
上述の例示的態様、実施形態、代替物、および変形は、本発明の範囲を離れることなく改変され得ることは理解されるべきである。本発明は、包含される実施例と共に、ここでさらに例示され、それは当然に、本発明の範囲および主旨を離れることなく大きく改変できる。
実験部分
材料および方法
【００６４】
コンストラクト設計およびクローニング少なくとも１つのＦｃ結合ポリペプチドと、任意選択で少なくとも１つのエキソソームポリペプチドを含む様々なタンパク質コンストラクトが構築され、ベクターにクローニングされ、いくつかの異なるＥＶ産生細胞源において産生された。ＯＲＦは、典型的に、合成によって産生され、哺乳動物発現ベクターｐＳＦ−ＣＡＧ−Ａｍｐにクローニングされた。手短に、合成されたＤＮＡおよびベクタープラスミドは、製造者の説明書（ＮＥＢ）によってＮｏｔＩとＳＡｌＩによって切断された。制限され、精製されたＤＮＡ断片は、製造者の説明書（ＮＥＢ）によってＴ４ライゲースを用いて共に連結された。成功した連結事象は、アンピシリン補充プレート上の細菌形質転換によって選択された。トランスフェクションのためのプラスミドは、製造者の説明書によって「ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ」によって産生された。
【００６５】
Ｆｃ含有タンパク質が、融合タンパク質を発現する同一のＥＶ産生細胞源内において内在的に産生される場合、ＯＲＦ配列は、購入され（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）、増幅され、ｐＩＲＥＳバイシストロン性発現ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）のＭＳＣのＡ部位にクローニングされ、翻訳の際、１つのコンストラクトにおいて任意選択のエキソソームポリペプチドがＦｃ結合ポリペプチドに融合され、一方で対象のＦｃ含有タンパク質が個別に翻訳され（同一のコンストラクトからの個別のコンストラクト）、ＥＶ産生細胞源において形成されるＥＶに輸送するようにされた。クローニングの多くは、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （ＮＥＢ，  Ｉｎｃ．）を用いて実施され、サンガー法（Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて確認された。ｐＩＲＥＳベクターは、両方の導入遺伝子の同時のバイシストロン性発現を可能にし、ＥＶ産生細胞が、Ｆｃ結合ポリペプチド（任意選択で融合タンパク質として）と対象のＦｃ含有タンパク質を同時に発現することを確証する。プラスミドは、ＮＥＢ  ５−ａｌｐｈａ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ  （ＮＥＢ，  Ｉｎｃ．）に形質転換され、製造者の推奨に従って、振盪インキュベーター内で一晩増殖させた。プラスミドは、製造者の説明書によって、「ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離および精製された。
・細胞培養およびトランスフェクション
【００６６】
実験デザインとアッセイに応じて、特定の場合において、非ウイルス一過性トランスフェクションおよびエキソソーム産生が、標準的な２Ｄ細胞培養において実施され、一方で他の場合において、ウイルス媒介性形質導入が安定な細胞株を作製するために使用され、それは典型的に種々の型のバイオリアクター中で培養された。簡潔にするために、本明細書ではいくつかの例のみを記載する。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、典型的には、ＡＴＣＣに推奨されるように、１５ｃｍディッシュに播種され（ディッシュ当たり９×１０６細胞）、血清含有ＤＭＥＭ中に一晩残した。次の日に、細胞を、細胞に直接添加したリポプレックス化ＤＮＡで一過性にトランスフェクトされた。手短に、ＤＮＡとポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を個別にＯｐｔｉＭＥＭ中で５分間インキュベートし、その後に、２０分間、室温で、共に混合した。リポプレックス化ＤＮＡと細胞を、６時間共インキュベートし、続いて、培養上清をＯｐｔｉＭＥＭに４８時間交換した。ディッシュ、フラスコ、および他の細胞培養容器中で評価された他の細胞および細胞株は、骨髄由来間葉系間質細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）およびワルトン膠様質由来ＭＳＣ（ＷＪ−ＭＳＣ）、羊膜細胞、線維芽細胞、様々な内皮細胞および上皮細胞、ならびに様々な免疫細胞および細胞株を含んだ。
【００６７】
Ｆｃ結合ポリペプチド（任意選択で、エキソソームポリペプチドとの融合タンパク質位含まれる）と対象のＦｃ含有タンパク質の様々な組み合わせのための、ウイルス形質導入および安定細胞株の場合、ＢＭ−ＭＳＣ、ＷＪ−ＭＳＣ、線維芽細胞、羊膜細胞、線維芽細胞、様々な内皮および上皮細胞等の細胞源は、、典型的にはレンチウイルス（ＬＶ）を用いてウイルス形質導入された。典型的には感染の２４時間前に、１００．０００細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣ等）、または２００．０００細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ）が６ウェルプレートに播種される。２ｕＬのＬＶと任意選択でポリブレン（または臭化ヘキサジメトリン、８ｕｇ／ｍＬのウェルでの最終濃度）が添加され、形質導入後２４時間で、形質導入細胞の培地を新鮮な完全培地に変更する。形質導入後７２時間で、ピューロマイシン選択（４〜６μｇ／ｍｌ）が、通常は７日間実施され、Ｆｃ結合ポリペプチド（任意選択で、ＥＶタンパク質と共に融合タンパク質として）の安定な発現の分析が後に続く。
【００６８】
安定な細胞は、２Ｄ、または、典型的には中空糸バイオリアクター、またはスターランクバイオリアクターであるバイオリアクターのいずれかで培養され、その後、エキソソーム調製のために培養上清を採取した。様々な調製および精製ステップが実施された。標準的なワークフローは、上清のプレ清浄化、濾過に基づく濃縮、クロマトグラフィーに基づくタンパク質混入の除去、および、インビトロ、エクスビボ、および／またはインビボのアッセイのために好適なバッファーにおける生じるエキソソーム組成物の最適な製剤化のステップを含む。
・アッセイおよび分析
【００６９】
ウェスタンブロットは、ＥＶにおける融合タンパク質の濃縮を評価する非常に簡便な分析方法である。手短に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが、製造者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｎｏｖｅｘ  ＰＡＧＥ  ４−１２％ゲル）に従って実施され、そこで１×１０１０のエキソソームおよび２０ｕｇの細胞溶解物がウェル当たりロードされた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのタンパク質は、製造者の説明書（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、ＰＶＤＦ膜に移された。膜を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  （Ｌｉｃｏｒ）中でブロッキングし、供給者の説明書（一次抗体−Ａｂcａｍ、二次抗体−Ｌｉｃｏｒ）に従って、Ｆｃ結合ポリペプチドおよび／またはエキソソームタンパク質に対する抗体によって調べられた。分子プローブは、６８０ｎｍおよび８００ｎｍの波長で可視化された。
【００７０】
ＥＶサイズ決定のために、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）が、分析ソフトウェアを備えたＮａｎｏＳｉｇｈｔ装置によって実施された。全ての記録について、１３または１５のカメラレベルを用い、全ての取得後設定について、自動機能を用いた。電子顕微鏡および蛍光顕微鏡は、細胞内局在化および放出を理解するために、ならびにＥＶおよび抗体等の標識化されたＦｃ含有タンパク質によってコーティングされたＥＶを定量化および分析するために、しばしば使用された。
典型的にはＴＦＦおよびＬＣ、特にビーズ溶出液ＬＣ等の濾過の組み合わせである様々な方法を用いてＥＶは単離および精製された。典型的には、ＥＶ含有媒体は、回収され、３００ｇ５分間の低速度回転に供され、続いて、２０００ｇ１０分間の回転により、より大きな粒子および細胞残屑を除去した。上清を０．２２μｍシリンジフィルターによって濾過し、種々の精製ステップに供した。大容量は、Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ５０Ｒ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ（ＴＦＦ）装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、１００ｋＤａカットオフフィルターによって、またはＫＲ２ｉ  ＴＦＦ  ｓｙｓｔｅｍ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ）を用いて、１００または３００ｋＤａカットオフ中空糸フィルターによって、透析濾過され、およそ２０ｍｌに濃縮した。予め濃縮された媒体は、続けて、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓまたはＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ２５クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続されたビーズ溶出液カラム（ＨｉＳｃｒｅｅｎ  ｏｒ  ＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００  ｃｏｌｕｍｎ，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードされた。カラム平衡化のための流速設定、試料ロード、および適切なカラム清浄化の手順は、製造者の説明書に従って選択された。試料は、ＵＶ吸収クロマトグラムに従って回収され、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １０ｋＤａ分子量カットオフスピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、１００μｌの最終容量に濃縮され、さらなる下流の分析のために−８０℃で保存された。タンパク質およびＲＮＡの溶出プロファイルを評価するために、媒体は濃縮され、１００ｋＤａおよび３００ｋＤａ中空糸フィルターを用いるＫＲ２ｉ  ＴＦＦ  ｓｙｓｔｅｍによって透析濾過され、Ｔｒｉｃｏｒｎ  １０／３００  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （Ｓ４ＦＦ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で試料分析した。
実施例
実施例１Ｆｃ結合ポリペプチドを含むＥＶ（Ｆｃ−結合ＥＶ）へのＩｇＧの結合
【００７１】
３００ｋｄ中空糸カラムによるタンジェント流濾過用いて、遺伝子操作を受けたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（対照対Ｇｐ１３０細胞外ドメイン−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−Ｚドメイン−Ｇｐ１３０膜貫通ドメイン−ロイシンジッパー−Ｎ末端シンテニン−Ｈｉｓタグを安定に発現するＦｃ−結合コンストラクト）の培養上清からＥＶを単離し、１０ｋｄスピンフィルターを用いる限外濾過が後に続いた。次いで、Ｆｃ結合ＥＶによるＩｇＧに対する結合能力を、電子顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いて評価した。
【００７２】
電子顕微鏡について、１×１０Λ９のＥＶを、金ナノ粒子と結合したウサギ抗ヤギ１０ｎｍ抗体と共に２時間３７℃でインキュベートした。図２に示すように、Ｆｃ−結合ＥＶ（Ａ）は、ナノゴールド標識抗体（すなわち、Ｆｃ含有タンパク質）で装飾され、一方で、対照ＥＶ（Ｂ）は、結合した抗体を全く有さない。
【００７３】
フローサイトメトリーについて、１×１０Λ８のＥＶを、ＭＡＣＳＰｌｅｘ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｋｉｔ，  ｈｕｍａｎ  （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｏｒｄｅｒ  ｎｏ  １３０−１０８−８１３からの１５μｌの抗体コーティング捕捉ビーズを有する１２０μｌＰＢＳ中で、４５０ｒｐｍ、１６時間の軌道式振盪機で一晩インキュベートした。洗浄後、３μｇのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７−結合ヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ００９−６００−００８）を、ＥＶを含まない対照（Ａ）、対照ＥＶ（Ｂ）、またはＦｃ結合（ＥＶ）（シンテニン−ｇｐ１３０−ｚドメイン−ｇｐ１３０）（Ｃ）へと添加した。室温での１時間のインキュベーションの後、未結合のＦｃフラグメントを洗浄して除去し、試料をフローサイトメトリーを介して分析した。図３において、Ｂ１−Ａ（励起：  ４８８ｎｍ，  発光フィルター：  ５００−５５０  ｎｍ；  領域）  対Ｂ２−Ａ  （励起：  ４８８  ｎｍ，  発光フィルター：  ５６５−６０５  ｎｍ，  領域）のパラメータを用い、それぞれの左の滴は、強く染められた捕捉ビーズ集団を示す。それぞれの右のプロットは、Ｒ１−Ａ（励起：  ６３５  ｎｍ，  発光フィルター：  ６５５−７３０  ｎｍ，  領域）対Ｂ２−Ａのパラメータを示し、捕捉ビーズに結合したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識Ｆｃ−フラグメントのＥＶに対する結合が（Ｃ）のみに存在することを実証する。図３は、Ｆｃ結合ＥＶがＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ＦＣフラグメント（ヒトＩｇＧ）と、２つの負の対照ビーズ集団を含むキットに含まれる製造者によって全ての捕捉ビーズ集団にコーティングされている全ての３９の異なる抗体のＦｃドメインとの両方に非常に効率的に結合することを示す。
【００７４】
これらの結果は、Ｆｃ結合ＥＶが、抗体またはＦｃ含有タンパク質またはプローブのＥＶへの結合を含む、任意の種類のアッセイ、方法、または用途において、標準化、正の対照、較正対照、または補償対照の目的に使用できることを実証する。通常、抗体またはＦｃ含有タンパク質は、フルオロフォアまたは他の種類の検出部分によって標識されている。抗体またはＦｃ含有タンパク質のＦｃ媒介性結合から予想されるシグナルは、通常、抗体のＥＶに対する特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）媒介性結合から予想されるシグナルと少なくとも同じくらい高く、これらのＦｃ結合ＥＶは、例えば、フローサイトメトリーに基づくＥＶの表現型決定、のような任意の種類のアッセイのための好適な正の対照を表し、フローサイトメトリーで使用され得る任意の種類の抗体とも適合可能であり、また、そのことについて、任意の他の型の技術またはアッセイ（蛍光顕微鏡、ナノイメージング、ナノ粒子トラッキング解析、動的光散乱、例えば金ナノ粒子に付着した抗体を用いる電子顕微鏡等）に適合可能である。これは、特に、異なる蛍光標識を有する異なる型の抗体、例えば、ＦＩＴＣで標識された抗体１とＰＥで標識された抗体２を混合することを目的とする多色アッセイにおいて有用である。そのような多色アプローチにおいて、多くの方法は、それぞれの抗体の発光する蛍光シグナル間のスペクトルの重なりの補償を必要とし、したがって、このスペクトルの補正を実施するために正の対照が必要とされ、これは、それぞれの抗体を有するＦｃ結合ＥＶを標識することによって産生され得る。装置もしくは試薬の較正またはアッセイの標準化の観点から、所与の抗体またはＦｃ含有プローブに結合するＥＶ実体はまた、変動を観察するのに好適でもあり、例えば、診断テストまたは実験室環境における安定な較正の源として、経時的な完全な設定を有効にする。
実施例２：抗ＨＥＲ２抗体の送達のためのＦＣＧＲ１Ａ  Ｌａｍｐ２Ｂ  ＥＶ
【００７５】
ＥＶは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＦＣＧＲ１Ａ細胞外ドメイン−４ＸＧＳリンカー−Ｌａｍｐ２ｂ、Ｆｃ結合因子ＦＣＧＲ１Ａ単独、またはそれらの野生型対照のいずれかを安定に発現する）から、限外濾過およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて単離された。ＥＶは、ＰＫＨ２６赤色蛍光染料によって標識され、ＥＶと抗体を３７℃で１時間共インキュベートすることによって抗ＨＥＲ２抗体またはそのアイソタイプ対照によって装飾された。非結合抗体をサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。抗体装飾ＥＶの取り込みは、ＨＥＲ２低発現細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＨＥＲ２高発現細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−３６１において、フローサイトメトリーを用いて分析された。図４は、ＨＥＲ２高発現細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−３６１においてのみ、抗ＨＥＲ２抗体が、アイソタイプの対照で装飾されたＥＶおよび野生型のＥＶと比べて、装飾されたＥＶの取り込みを増加させるが、ＨＥＲ２低発現細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においては増加させないことを示す。ＦＣＧＲ１Ａ単独（融合タンパク質に含まれない）を発現するＥＶは、同様の活性を示し、ＣＤ６３−ＺＺ融合タンパク質を発現するＥＶと同様の結果がまた得られた。
実施例３：Ｆｃ結合ＥＶを介する抗体の細胞内取り込みおよび送達
【００７６】
ＥＶは、ワルトン膠様質由来ＭＳＣ（ＴＮＦＲ細胞外ドメイン−２ＸＧＧＧＧＳリンカー−Ｚドメイン−ＴＮＦＲ膜貫通ドメイン−フォールドオン−Ｎ末端シンテニン融合タンパク質または対照のいずれかを安定に発現する）の培養上清から、限外濾過とサイズ排除クロマトグラフィーを用いて単離された。Ｆｃ結合ＥＶが、Ａｂｓの細胞内送達に利用できるかどうかを調べるために、４×１０Λ１１のＥＶが、４００μｌ中で３μｇのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ラミニンＢ２ ＩｇＧ［ａｂcａｍ  ａｂ２００４２６，  ウサギモノクローナルＥＰＲ９７０１（Ｂ）］と共に、１６時間（一晩）インキュベートされた。取り込み実験のために、Ｈｕｈ７細胞が、４８ウェルプレートにウェル当たり３０，０００細胞で播種され、０．６７５×１０Λ１１の抗体標識ＥＶを添加する前に１６時間インキュベートされた。細胞は、トリプシン処理され、図５に示されるように、蛍光顕微鏡（Ａ）およびフローサイトメトリー（Ｂ）で分析される前に、加湿雰囲気で、３７℃、２時間、５％ＣＯ２でインキュベートされ、Ａ）は、位相差画像と融合された緑色蛍光シグナルを示す。Ｂ）におけるヒストグラムは、ｘ軸に対数スケールでの緑色蛍光強度を示し、標準化された頻度をｙ軸に示す。１：  抗体またはＥＶで全く処理されていないＨｕＨ７細胞２：  抗ラミニンＢ２抗体でインキュベートされた対照ＥＶで処理されたＨｕＨ７細胞３：  抗ラミニンＢ２抗体でインキュベートされたＦｃ結合ＥＶで処理されたＨｕＨ７細胞図５は、蛍光抗体のシグナルが、Ｆｃ結合ＥＶプラス抗体で処理した細胞中に明らかに存在するが、一方で、非処理（１）または対照のＥＶで処理した（２）ときに蛍光シグナルが不存在であることを示す。これは、抗体が、Ｆｃ結合ＥＶを介して細胞内に送達できること、およびＥＶへの結合が、抗体の細胞への取り込みを劇的に増加することを実証する。
【００７７】
機能的な細胞内送達を実証するために、抗ＮＦｋＢ抗体（抗ＮＦｋＢ−Ａｂ）を、それぞれのＥＶで１時間３７℃インキュベートした。レポーター細胞株、ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼを安定に発現するＨＥＫ細胞を、５ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦ−αおよびＥＶ−Ａｂ−混合物で処理した。処理の６時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。図６は、抗ＮＦｋＢ−ａｂがＦｃ結合ＥＶで送達されるとき、阻害の成功を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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