(57)【要約】  変異体ＡｌｋＢ酵素を発現する微生物細胞であって、当該変異体ＡｌｋＢ酵素がＡｌｋＢの野生型配列に少なくとも１つの点変異を含み、当該点変異が、当該野生型ＡｌｋＢ酵素のアミノ酸位置Ｖ１２９および／またはＴ１３６においてである、細胞を提供する。さらに、この細胞を使用してオメガ−ヒドロキシカルボン酸および／またはそのエステルを製造する方法も提供する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異体ＡｌｋＢ酵素を発現する微生物細胞であって、該変異体ＡｌｋＢ酵素が、ＡｌｋＢの野生型配列において少なくとも１つの点変異を含み、該点変異が、該野生型ＡｌｋＢ酵素のアミノ酸位置Ｖ１２９および／またはＴ１３６においてであり、アミノ酸位置Ｖ１２９における該点変異が、Ｖ１２９ＴおよびＶ１２９Ａからなる群より選択される、細胞。
【請求項２】
前記点変異は、アミノ酸位置Ｔ１３６においてである、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
アミノ酸位置Ｔ１３６における前記点変異は、Ｔ１３６Ａである、請求項１または２のどちらかに記載の細胞。
【請求項４】
前記点変異は、アミノ酸位置Ｖ１２９においてであり、ならびにＶ１２９ＴおよびＶ１２９Ａからなる群より選択される、請求項１記載の細胞。
【請求項５】
前記点変異は、アミノ酸位置Ｖ１２９およびＴ１３６においてである、請求項１記載の細胞。
【請求項６】
アミノ酸位置Ｖ１２９における前記点変異は、Ｖ１２９ＴおよびＶ１２９Ａからなる群より選択され、アミノ酸位置Ｔ１３６における前記点変異は、Ｔ１３６Ａである、請求項５記載の細胞。
【請求項７】
ＡｌｋＢの前記野生型配列は配列番号１である、請求項１〜６のいずれか一項記載の細胞。
【請求項８】
前記細胞は、さらに、オメガ−オキソカルボン酸および／またはそのエステルの、対応するオメガ−アミノカルボン酸および／またはそのエステルへの転換を触媒することができる酵素Ｅ１、ω−トランスアミナーゼ、の野生型の細胞と比べて、増加した発現を有するように遺伝的に改変される、請求項１〜７のいずれか一項記載の細胞。
【請求項９】
基質としての少なくとも１種のカルボン酸および／またはそのエステルから、少なくとも１種のオメガ−ヒドロキシカルボン酸および／またはそのエステルを製造する方法であって、
・変異体ＡｌｋＢ酵素を発現する少なくとも１種の遺伝的に改変された細胞を、該基質であるカルボン酸および／またはそのエステルに接触させる工程
を含み、
該基質であるカルボン酸および／またはそのエステルが、Ｃ６〜Ｃ１４カルボン酸および／またはそのエステルであり、ならびに
該変異体ＡｌｋＢ酵素が、ＡｌｋＢの野生型配列における少なくとも１つの点変異を含み、
該点変異が、該野生型ＡｌｋＢ酵素のＶ１２９、Ｌ１３２、およびＴ１３６からなる群より選択されるアミノ酸位置においてである、
方法。
【請求項１０】
該点変異は、Ｖ１２９Ｔ、Ｔ１３６Ａ、Ｖ１２９Ａ、およびＬ１３２Ｖからなる群より選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＡｌｋＢの前記野生型配列は配列番号１である、請求項９または１０のどちらかに記載の方法。
【請求項１２】
前記基質であるカルボン酸および／またはそのエステルは、ラウリン酸および／またはラウリン酸メチルエステル（ＬＡＭＥ）であり、ならびに、前記対応するオメガ−ヒドロキシカルボン酸および／またはそのエステルは、オメガ−ヒドロキシラウリン酸および／またはオメガ−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル（ＨＬＡＭＥ）である、請求項９〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
基質としての少なくとも１種のカルボン酸および／またはそのエステルから、少なくとも１種のオメガ−ヒドロキシカルボン酸および／またはそのエステルを製造する方法であって、
・請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも１種の遺伝的に改変された細胞を、該基質であるカルボン酸および／またはそのエステルに接触させる工程
を含む、方法。
【請求項１４】
基質としての少なくとも１種のカルボン酸および／またはそのエステルから、少なくとも１種のオメガ−アミノカルボン酸および／またはそのエステルを製造する方法であって、
・請求項８記載の細胞を、該基質であるカルボン酸および／またはそのエステルに接触させる工程
を含む方法。
【請求項１５】
カルボン酸および／またはそのエステルの、対応するオメガ−ヒドロキシカルボン酸および／またはそのエステルおよび／またはオメガ−アミノカルボン酸および／またはそのエステルへの前記転換を触媒するための、請求項１〜８のいずれか一項記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１種のＣ６〜Ｃ１４カルボン酸から少なくとも１種のオメガ−ヒドロキシカルボン酸および／またはそのエステルを製造するための生物工学的手段に関する。特に、当該生物工学的手段は、具体的にはオメガ−ヒドロキシカルボン酸および／またはそのエステルを製造することが可能であり得る少なくとも１つの特定の点変異を含む変異体ＡｌｋＢ遺伝子を使用し得る。
【背景技術】
【０００２】
オメガ−ヒドロキシル化（ω−ヒドロキシ）カルボン酸誘導体は、産業用薬剤の成分として、多くの商業的用途を有する。産業界において有用なω−ヒドロキシカルボン酸誘導体のいくつかの例としては、ω−ヒドロキシカルボン酸；ω−ヒドロキシカルボン酸メチルエステル；ω−オキソカルボン酸；ω−アミノカルボン酸；ω−アミノカルボン酸メチルエステル；アルファ−、オメガ−二酸（α、ω−二酸）；オメガ−カルボキシカルボン酸メチルエステル（ω−カルボキシカルボン酸メチルエステル）；アルファ−、オメガ−ジエステル（α、ω−ジエステル）；アルファ−、オメガ−ジオール（α、ω−ジオール）；など、が挙げられる。これらの化合物は、他の様々な化合物の製造のための前駆体としても使用され得る。例えば、これらの前駆体は、α、ω−ジカルボン酸の製造のために使用することができ、ならびにα、ω−二官能性分子は、ポリマー樹脂、金属加工液、接着剤、腐食防止剤、コンデンサー用電解質、ジエステル合成潤滑剤、繊維、パウダーコーティング医薬、可塑剤、ポリエステル塗料、エポキシ樹脂、ポリアミド樹脂、風味剤、芳香剤、界面活性剤、洗剤、添加剤などのために、工業的用途において特に重要な化学物質である。
【０００３】
一般的に、ω−ヒドロキシカルボン酸誘導体は、主に、石油ベースの材料から、あるいはω−ヒドロキシカルボン酸および／またはその誘導体へのパラフィンおよびカルボン酸の生物変換から製造される。これらの化合物を製造するための化学的方法は、危険な試薬の使用を必要とする。当技術分野において使用される当該方法は、エネルギー集約的であり、ならびに環境に対して大きな悪影響を及ぼす。代替の新生の発酵ルートは、環境に優しいプロセスであると考えられるが、依然として高価すぎ、作製することができる生成物のタイプおよび量が制限される。
【０００４】
したがって、ω−ヒドロキシカルボン酸およびその誘導体を製造するための、改良された環境に優しい方法が当技術分野において必要とされている。
【０００５】
オメガ−アミノラウリン酸メチルエステルを製造する実施例の１つにおいて、前駆体は、ラウリン酸メチルエステル（ＬＡＭＥ）であり得、この場合、中間体は、オメガ−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル（ＨＬＡＭＥ）であり得る。モノオキシゲナーゼであるＡｌｋＢは、ＬＡＭＥからＨＬＡＭＥを形成する反応を触媒することが知られている酵素である。当該ＡｌｋＢ酵素は、オメガ−オキソラウリン酸メチルエステル（ＯＬＡＭＥ）へのＨＬＡＭＥの酸化を触媒することもできる。したがって、当該モノオキシゲナーゼＡｌｋＢは、結果としてＨＬＡＭＥを介したＬＡＭＥからのＯＬＡＭＥの形成を生じる、両方の当該酸化工程を触媒することができる。しかしながら、ＡｌｋＢ酵素は、さらに、ドデカン二酸モノメチルエステル（ＤＤＡＭＥ）へのＯＬＡＭＥの転化も触媒することができ、その結果として、ＯＬＡＭＥの製造収率の減少を生じる。
【０００６】
したがって、不必要な副産物の生成の減少した、基質として使用した対応するカルボン酸および／またはそのエステルからの特定のオメガ−ヒドロキシル化カルボン酸および／またはそのエステルの収率を増加させる、改良された生物工学的方法が当技術分野において必要とされている。さらに、効果的に、ＨＬＡＭＥおよび／またはＯＬＡＭＥなどの所望の生成物の収率を増加させることも当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の説明
本発明は、野生型酵素と比べて少なくとも１つの点変異を含む変異体ＡｌｋＢ酵素を提供することによって、上記の問題を解決することを試みるものである。当該変異体酵素は、変異体ＡｌｋＢ酵素を発現する微生物細胞を産生するために、少なくとも１つの細胞に転写され得る。変異体ＡｌｋＢ酵素を発現するこの細胞は、少なくとも１種のオメガ−ヒドロキシル化カルボン酸および／またはそのエステルを、基質として使用した対応するカルボン酸および／またはそのエステルから産生することができ得る。特に、当該カルボン酸および／またはそのエステルは、Ｃ６〜Ｃ１４カルボン酸および／またはそのエステルからなる群より選択され得る。特に、当該変異体ＡｌｋＢ酵素を発現するこの細胞は、野生型ＡｌｋＢ酵素を発現する細胞と比べて、より多くのオメガ−ヒドロキシル化カルボン酸および／またはそのエステルを産生することができ得る。変異体ＡｌｋＢ酵素を発現する当該細胞からのオメガ−ヒドロキシル化カルボン酸および／またはそのエステルの収率は、野生型ＡｌｋＢ酵素を発現する細胞と比べて高い。一実施例において、当該変異体ＡｌｋＢは、野生型細胞（すなわち、当該変異体ＡｌｋＢ酵素を発現しない細胞）に比べて、当該変異体ＡｌｋＢを発現する細胞においてオメガ−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル（ＨＬＡＭＥ）の産生および／または蓄積を増加させることができ得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様により、変異体ＡｌｋＢ酵素を発現する少なくとも１つの微生物細胞であって、当該変異体ＡｌｋＢ酵素は、ＡｌｋＢの野生型配列に少なくとも１つの点変異を含み、当該点変異は、野生型ＡｌｋＢ酵素のアミノ酸位置Ｖ１２９および／またはＴ１３６においてである、細胞が提供される。特に、当該変異体ＡｌｋＢ酵素における点変異は、野生型ＡｌｋＢ酵素のアミノ酸位置Ｖ１２９および／またはＴ１３６においてである。
【０００９】
オキシドレダクターゼであるＡｌｋＢのこのクラスの原型は、２つの補助ポリペプチドであるＡｌｋＧおよびＡｌｋＴに応じた、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＡｌｋＢＧＴ系由来のレドックスタンパク質である。ＡｌｋＴは、ＮＡＤＨからＡｌｋＧへと電子を移動させるＦＡＤ依存性ルブレドキシン還元酵素である。ＡｌｋＧは、ＡｌｋＢへの直接的な電子供与体として機能する鉄含有レドックスタンパク質である、ルブレドキシンである。実施例において、用語「ＡｌｋＢタイプのオキシドレダクターゼ」は、本明細書において使用される場合、炭化水素結合部位を有する、ルブレドキシン依存性オキシドレダクターゼを意味する。特に、用語「炭化水素結合部位」は、本明細書において使用される場合、より詳細にはタンパク質の触媒中心の至近距離内において、炭化水素、特にアルカンおよび／またはアルケン、に結合することができるタンパク質表面の伸長を意味する。一実施例において、用語「ルブレドキシン依存性アルカンオキシダーゼ」は、本明細書において使用される場合、ルブレドキシンを介して電子を受け取るアルカンをその基質として認識するオキシドレダクターゼを意味し、当該ルブレドキシンは、特定の実施例において、電子をアルカンオキシダーゼへと移動させる、２つのαヘリックスおよび２つから３つのβストランドによるα＋βクラスの折り畳みを有する鉄−硫黄タンパク質を有する。より詳細には、当該ａｌｋＢタイプのオキシドレダクターゼは、シュードモナス・プチダＧｐｏ１（アクセスコード：ＣＡＢ５４０５０．１、本願において使用される任意のアクセスコードは、ＮＣＢＩによって実行されるＧｅｎｂａｎｋデータベースからのそれぞれの配列を意味し、参照されるリリースは、２０１２年１月１５日にオンラインで利用可能なものである）またはその多様体に由来するＡｌｋＢであり得る。
【００１０】
特に、当該野生型ＡｌｋＢは、配列番号１のポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。より詳細には、当該野生型ＡｌｋＢは、機能、例えば、タンパク質の触媒活性など、または当該タンパク質の折り畳みまたは構造、にとって必須である、配列番号１のアミノ酸を含むポリペプチド配列を有する。他のアミノ酸は、欠失され得るか、置換され得るか、または挿入体によって置き換えられ得るか、あるいは野生型ＡｌｋＢの生物活性が保存されるという意味で保存的な方法において必須アミノ酸が置き換えられる。特に、本発明の任意の態様による当該野生型ＡｌｋＢは、配列番号１に対して７０％の配列同一性を有し得、この場合、当該野生型ＡｌｋＢ酵素は、アミノ酸位置１２９、１３２、および１３６に変異を含まない。特に、当該野生型ＡｌｋＢ酵素は、アミノ酸位置１２９にアミノ酸バリン（Ｖ）を、アミノ酸位置１３２にロイシン（Ｌ）を、ならびにアミノ酸位置１３６にトレオニン（Ｔ）を含む。
【００１１】
用語「酵素」は、１つまたは複数の化学反応または生化学反応を、幾分具体的には、触媒または促進するタンパク質またはポリペプチドで完全にまたは主に構成された任意の物質を意味する。本発明の任意の態様により使用される酵素の例は、ＡｌｋＢであり得る。特に、ＥＣ１．１４．１５．３のＡｌｋＢアルカンヒドロキシラーゼまたはアルカンモノオキシゲナーゼであり得る。当該ＡｌｋＢアルカンヒドロキシラーゼは、３つの酵素成分、ＥＣ１．１４．１５．３のＡｌｋＢアルカンヒドロキシラーゼ、ＥＣ１．１８．１．１またはＥＣ１．１８．１．４のＡｌｋＴルブレドキシンＮＡＤ（Ｐ）＋レダクターゼ、ならびにルブレドキシンＡｌｋＧ、を含む反応系の成分である。ＡｌｋＴは、ＮＡＤＨからＡｌｋＧへと電子を移動させるＦＡＤ依存性ルブレドキシン還元酵素である。ＡｌｋＧは、ＡｌｋＢへの直接的な電子供与体として機能する鉄含有レドックスタンパク質である、ルブレドキシンである。好ましい実施形態において、用語「ＡｌｋＢタイプのオキシドレダクターゼ」は、本明細書において使用される場合、炭化水素結合部位を有する、ルブレドキシン依存性オキシドレダクターゼを意味する。当該ＡｌｋＢ酵素は、ＡｌｋＢＧＴによってコード化されるシュードモナス・プチダＧＰｏ１由来のアルカンモノオキシゲナーゼに対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。特に、当該ＡｌｋＢ野生型酵素は、ポリペプチドＣＡＢ５４０５０．１（配列番号１：本願において使用される任意のアクセスコードは、ＮＣＢＩによって実行されるＧｅｎｂａｎｋデータベースからのそれぞれの配列を意味し、参照されるリリースは、２０１６年４月２８日にオンラインで利用可能なものである）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し得る。
【００１２】
「ポリペプチド」（１つまたは複数のペプチド）は、ペプチド結合と呼ばれる化学結合によって一緒に連結された、アミノ酸と呼ばれる化学構築ブロックの鎖である。タンパク質またはポリペプチドは、酵素を含め、「天然」または「野生型」であり得、これは、それぞれ、それらが自然に生じたものであるか、または本来のタンパク質のアミノ酸配列を有することを意味する。これらの用語は、場合により、相互互換的に使用される。ポリペプチドは、グリコシル化されていても、またはされていなくてもよい。細胞または微生物と併せて本明細書において使用される場合、用語「野生型」は、野生において天然に見られるような形態のゲノム構成を有する細胞を意味し得る。当該用語は、全細胞および個々の遺伝子の両方に対して適用可能であり得る。したがって、用語「野生型」は、他の態様において（すなわち、１つまたは複数の遺伝子に関して）遺伝的に改変されてはいるが関心対象の遺伝子には関連していない細胞も含み得る。したがって、用語「野生型」は、関心対象の特定の遺伝子の遺伝子配列が、遺伝子組換え法を使用して人によって少なくとも部分的に変更されているような細胞を含まない。したがって、本発明の任意の態様による野生型細胞は、全ゲノムおよび／または特定の遺伝子に関して遺伝子変異を有さない細胞を意味する。したがって、一実施例において、野生型ＡｌｋＢは、本発明の任意の態様によるいかなる特定の変異も有さない、自然において天然に見出される酵素であり得る。別の実施例において、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢに関連する野生型細胞は、アミノ酸位置１２９、１３２、および１３６以外は、天然において生じ得る変異を有するＡｌｋＢの天然の発現／変更されていない発現を有する細胞に関する。
【００１３】
ポリペプチドも、「変異体」であってもよく、それは、当該ポリペプチドが、その野生型の形態から、または別の変異体から、作製、変更、誘導されているか、または何らかの点において、それらとは異なっているかまたはそれらから変化することを意味する。変異体タンパク質は、典型的には、１つまたは複数の位置にアミノ酸置換を有する。変異体ＤＮＡ分子は、典型的には、１つまたは複数の位置にヌクレオチド置換を有する。タンパク質またはＤＮＡ分子の変異体形態は、野生型と比較して、同じ機能または変更された機能を有し得る。簡素化のため、変異体は、変異が生じた単一のアミノ酸コードからの変化によって称され得る。例えば、一形式において、当該変異体は、ＸＰＯＳＹとも称され、この場合、「Ｘ」は、元の配列における当該アミノ酸の単一の文字コードを意味し、「ＰＯＳ」は、当該配列における変異の位置を意味し、Ｙは、当該変異の位置に現れる新しいアミノ酸に対する単一の文字コードを意味する。例えば、Ｖ１２９Ｔは、元のタンパク質において、当該アミノ酸の位置１２９は、バリン（「Ｖ」）であるが、変異体では、当該バリンは、トレオニン（「Ｔ」）で置き換えられていることを意味する。
【００１４】
特に、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素は、当該ＡｌｋＢ酵素のアミノ酸位置１２９、１３２、および／または１３６に少なくとも１つの点変異を含み得る。特に、当該点変異は、アミノ酸位置１２９、１３２、または１３６においてであり得る。別の実施例において、当該点変異は、アミノ酸位置１２９および１３２、または１２９および１３６、または１３２および１３６においてであり得る。さらなる実施例において、当該点変異は、アミノ酸位置１２９、１３６、および１３６においてであり得る。より詳細には、位置１２９のアミノ酸バリンは、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、およびグルタメートからなる群より選択されるアミノ酸に転換され得る。特に、位置１２９のアミノ酸バリンは、トレオニン、アラニン、セリン、システイン、アスパラギン、およびグリシンからなる群より選択されるアミノ酸に転換され得る。より詳細には、位置１２９のアミノ酸バリンは、トレオニンまたはアラニンに転換され得る。位置１３６のアミノ酸トレオニンも、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、バリン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、およびグルタメートからなる群より選択されるアミノ酸に転換され得る。特に、位置１３６のアミノ酸トレオニンは、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、バリン、システイン、およびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸に転換され得る。本発明の任意の態様による点変異は、位置１２９および／または１３６においてであり得る。一実施例において、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢにおける点変異は、位置１２９においてであり得る。別の実施例において、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢにおける点変異は、位置１３６においてであり得る。さらなる実施例において、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢにおける点変異は、位置１２９および１３６の組み合わせにおいてであり得る。より詳細には、本発明の任意の態様による細胞の点変異は、ＡｌｋＢの野生型配列に対するＶ１２９Ｔ、Ｔ１３６Ａ、Ｖ１２９Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。当該変異体ＡｌｋＢ酵素は、Ｖ１２９Ｔ、Ｔ１３６Ａ、またはＶ１２９Ａの点変異を含み得る。特に、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素は、点変異Ｖ１２９Ｔを含み得る。一実施例において、当該ＡｌｋＢ酵素はさらに、点変異Ｔ１３６Ａを含み得る。別の実施例において、本発明の任意の態様による任意の細胞の変異体ＡｌｋＢ酵素は、点変異Ｖ１２９ＴおよびＴ１３６Ａ、Ｖ１２９ＡおよびＴ１３６Ａを含み得る。
【００１５】
特に、微生物細胞は、変異体ＡｌｋＢ酵素を発現し得、当該変異体ＡｌｋＢ酵素がＡｌｋＢの野生型配列に少なくとも１つの点変異を含み、当該点変異が、野生型ＡｌｋＢ酵素のアミノ酸位置Ｖ１２９および／またはＴ１３６においてであり、アミノ酸Ｖ１２９における点変異が、Ｖ１２９ＴおよびＶ１２９Ａからなる群より選択される。より詳細には、当該点変異は、アミノ酸位置Ｔ１３６においてであり得る。さらにより詳細には、アミノ酸位置Ｔ１３６における点変異は、Ｔ１３６Ａであり得る。一実施例において、当該点変異が、アミノ酸位置Ｖ１２９においてである場合、当該変異は、Ｖ１２９ＴおよびＶ１２９Ａからなる群より選択され得る。別の実施例において、当該点変異は、アミノ酸位置Ｖ１２９およびＴ１３６においてであり得る。特に、アミノ酸位置Ｖ１２９における点変異は、Ｖ１２９ＴおよびＶ１２９Ａからなる群より選択され得、ならびにアミノ酸位置Ｔ１３６における点変異は、Ｔ１３６Ａである。
【００１６】
特に、当該点変異は、Ｖ１２９Ａであり得る。一実施例において、当該野生型配列は、配列番号１またはその多様体であり得る。
【００１７】
本明細書において使用される場合、ＡｌｋＢまたは少なくとも配列番号１の「多様体」は、１つまたは複数のアミノ酸によって変更されたアミノ酸配列を意味する。この多様体は、「保存的」変化を有し得、この場合、置換されたアミノ酸は、同様の構造的または化学的特性を有する（例えば、ロイシンからイソロイシンへの置き換え）。より稀に、多様体は、「非保存的」変化も有し得る（例えば、グリシンからトリプシンへの置き換え）。類似した小さな変化は、アミノ酸の欠失または挿入、あるいはその両方も含み得る。生物学的または免疫学的活性を損なうことなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失することができるかを特定するためのガイドラインは、当技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア、を使用することにより、見出すことができる。本発明の任意の態様により、野生型ＡｌｋＢとして使用される配列番号１の多様体は、アミノ酸位置１２９、１３２、および／または１３６に変異を含み得ない。
【００１８】
特定の点変異を有するＡｌｋＢ酵素を作製するために、分子生物学における任意の技術を使用することができる。用語「点変異」、または単一の塩基修飾は、遺伝物質、ＤＮＡ、またはＲＮＡの単一のヌクレオチド塩基の変化、挿入、または欠失を生じるようなタイプの変異である。一実施例において、点変異は、ＡｌｋＢ遺伝子の野生型配列におけるアミノ酸置換を意味し得る。使用され得る方法のいくつかの例としては、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応、カセット変異導入（最適化された特定の領域が、合成的に変異誘発されたオリゴヌクレオチドで置き換えられる）、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、並列ＰＣＲ（１つの反応の生成物が別の反応の生成物をプライミングするように、同じ容器において並列に生じる多数の異なるＰＣＲ反応を使用する）、ランダム変異誘発（ランダムな断片化と相互のプライミングによる当該断片の再構築とによる）；部位特異的変異（テンプレートのランダムな断片化およびその後の変異原性オリゴヌクレオチドの存在下での当該断片の再構築によって長い配列中に導入される）；並列ＰＣＲ（ＤＮＡ配列のプールにおける遺伝子組換え）；セクシャル（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲ；ならびに、化学的変異誘発（例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ギ酸による、あるいはヌクレオチド前駆体に変わって、ＰＣＲ反応へのニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、およびアクリジンの添加による；あるいはプロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどのインターカレート剤の添加による）；放射線照射（Ｘ線または紫外線、および／または正常なＤＮＡの損傷修復機能に欠陥のある宿主細胞でのポリヌクレオチドの増殖）；あるいはＤＮＡシャッフリング（例えば、核酸断片またはポリヌクレオチドのプールのインビトロまたはインビボでの相同的遺伝子組換え）が挙げられる。これらの技術のいずれか１つは、長い配列にわたってランダムに低レベルの点変異を導入するため、または未知の配列の断片の混合物を変異誘発するために、忠実度の低い重合条件下においても用いることができる。
【００１９】
本発明の任意の態様により使用される酵素はいずれも、単離された酵素であり得る。特に、本発明の任意の態様により使用される酵素は、活性状態において、ならびに全ての補助因子、基質、助剤、および／または活性化するポリペプチドまたはその活性化に必須な因子の存在下において使用され得る。用語「単離された」は、本明細書において使用される場合、関心対象の酵素が、それが自然に生じる細胞と比較して濃縮されることを意味する。当該酵素は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動および／または活性アッセイによって濃縮され得る。例えば、関心対象の酵素は、クマシーブルー染料による染色の後のポリアクリルアミドゲルの目視検査によって判断した場合に、調製物中に存在する全てのポリペプチドの５、１０、２０、５０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセント超を構成し得る。
【００２０】
本発明の任意の態様により、当該微生物細胞は、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ａｃｃｕｍｕｌｉｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｅｒｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｆｉｐｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｈｒｅｎｓｉａ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ、Ａｌｉｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ、Ａｌｋａｌｉｌｉｍｎｉｃｏｌａ、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ、Ａｍｙｃｏｌｉｃｉｃｏｃｃｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｎａｅｒｏｆｕｓｔｉｓ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、Ａｎａｐｌａｓｍａ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ、Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ、Ａｒｏｍａｔｏｌｅｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ、Ａｓｔｉｃｃａｃａｕｌｉｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｓ、Ａｚｏａｒｃｕｓ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ、Ｂａｓｆｉａ、Ｂａｕｍａｎｎｉａ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ｂｅｇｇｉａｔｏａ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ、Ｂｅｒｍａｎｅｌｌａ、Ｂｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｌｏｃｈｍａｎｎｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｉｄｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃａｌｄａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｌｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ、Ｃａｌｄｉｔｅｒｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃａｍｉｎｉｂａｃｔｅｒ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｉｂｒａｃｈｉｕｍ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｒｓｏｎｅｌｌａ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ、Ｃａｔｏｎｅｌｌａ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ、Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ、Ｃｈｅｌａｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｉｔｒｅｉｃｅｌｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｉｔｒｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏａｃａｍｏｎａｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｃｏｎｅｘｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｎｇｒｅｇｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒａｌｉｏｍａｒｇａｒｉｔａ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｒｙｐｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ、Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｄｅｈａｌｏｇｅｎｉｍｏｎａｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｄｅｎｉｔｒｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｓｍｏｓｐｏｒａ、Ｄｅｓｕｌｆａｒｃｕｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｐｈａｔｅｉｂａｃｉｌｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｃａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｔｈｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｉｃｋｅｙａ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ、Ｄｉｅｔｚｉａ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｏｒｅａ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｅｎｄｏｒｉｆｔｉａ、Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｐｕｌｏｐｉｓｃｉｕｍ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｔｈａｎｏｌｉｇｅｎｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｅｒｒｉｍｏｎａｓ、Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ、Ｆｌｅｘｉｓｔｉｐｅｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｒａｎｋｉａ、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｆｕｌｖｉｍａｒｉｎａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇａｌｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇａｌｌｉｏｎｅｌｌａ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｇｅｍｍａｔａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｌａｃｉｅｃｏｌａ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｏｓｓｉｎａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｇｒａｎｕｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ｇｒｉｍｏｎｔｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈａｈｅｌｌａ、Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉｕｍｎｓ、Ｈａｌｉａｎｇｉｕｍ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ、Ｈａｌｏｔｈｅｒｍｏｔｈｒｉｘ、Ｈａｌｏｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｍｉｌｔｏｎｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｈｅｒｍｉｎｉｉｍｏｎａｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ、Ｈｉｐｐｅａ、Ｈｉｒｓｃｈｉａ、Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｏｄｇｋｉｎｉａ、Ｈｏｅｆｌｅａ、Ｈｏｌｄｅｍａｎｉａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｖｉｒｇａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｈｙｌｅｍｏｎｅｌｌａ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｉｓｏｐｔｅｒｉｃｏｌａ、Ｉｓｏｓｐｈａｅｒａ、Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｊｏｎｅｓｉａ、Ｊｏｎｑｕｅｔｅｌｌａ、Ｋａｎｇｉｅｌｌａ、Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｋｏｓｍｏｔｏｇａ、Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｂｒｅｎｚｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｌａｕｔｒｏｐｉａ、Ｌａｗｓｏｎｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ、Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｍｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｌｏｋｔａｎｅｌｌａ、Ｌｕｔｉｅｌｌａ、Ｌｙｎｇｂｙａ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｍａｈｅｌｌａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ、Ｍａｒｉｃａｕｌｉｓ、Ｍａｒｉｎｉｔｈｅｒｍｕｓ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ、Ｍａｒｉｐｒｏｆｕｎｄｕｓ、Ｍａｒｉｔｉｍｉｂａｃｔｅｒ、Ｍａｒｖｉｎｂｒｙａｎｔｉａ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈａｇａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌａｌｅｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｎｅｐｔｕｎｉｉｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｒｕｐｔｏｒ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ、Ｏｃｅａｎｉｂｕｌｂｕｓ、Ｏｃｅａｎｉｃａｕｌｉｓ、Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ、Ｏｃｅａｎｉｔｈｅｒｍｕｓ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ、Ｏｃｔａｄｅｃａｂａｃｔｅｒ、Ｏｄｙｓｓｅｌｌａ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ、Ｏｐｉｔｕｔｕｓ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｒｉｅｎｔｉａ、Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｏｓｃｉｌｌｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒａｓｃａｒｄｏｖｉａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ、Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｏｓｐｈａｅｒａ、Ｐｅｌａｇｉｂａｃａ、Ｐｅｌａｇｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａ、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ、Ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｉｒｅｌｌｕｌａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｌｅｓｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅ
ｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｏｒｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｒａｍｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｖｉｂｒｉｏ、Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐｕｓｉｌｌｉｍｏｎａｓ、Ｐｙｒａｍｉｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｒｅｇｉｅｌｌａ、Ｒｅｉｎｅｋｅａ、Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｅｌｌａ、Ｒｉｅｓｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｏｓｅｉｂｉｕｍ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｕｅｇｅｒｉａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｕｔｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ、Ｓａｇｉｔｔｕｌａ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓａｎｇｕｉｂａｃｔｅ、Ｓｃａｒｄｏｖｉａ、Ｓｅｂａｌｄｅｌｌａ、Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ、Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ、Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｓｏｄａｌｉｓ、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｒｋｅｙａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、ｓｕｂｖｉｂｒｉｏｉｄｅｓ、Ｓｕｃｃｉｎａｔｉｍｏｎａｓ、Ｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｕｌｆｕｒｉｃｕｒｖｕｍ、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍ、Ｓｕｌｆｕｒｉｍｏｎａｓ、Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｕｌｆｕｒｏｖｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂｏｔｕｌｕｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ、ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｔａｙｌｏｒｅｌｌａ、Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ、Ｔｅｒｒｉｇｌｏｂｕｓ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｂｉｕｍ、Ｔｈａｕｅｒａ、Ｔｈｅｒｍａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ、Ｔｈｅｒｍｉｎｃｏｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｓｐｏｒａ、Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｐｈａｔｅａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、Ｔｈｅｒｍｏｖｉｂｒｉｏ、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｔｈｉｏａｌｋａｌｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｔｈｉｏａｌｋａｌｉｖｉｂｒｉｏ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ、Ｔｈｉｏｍｏｎａｓ、Ｔｏｌｕｍｏｎａｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、ｔｒｉｂｏｃｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｒｕｅｐｅｒａ、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｖｅｒｒｕｃｏｓｉｓｐｏｒａ、Ｖｅｓｉｃｏｍｙｏｓｏｃｉｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｖｉｃｔｉｖａｌｌｉｓ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ、Ｗｏｌｂａｃｈｉａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ、Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｚｉｎｄｅｒｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓからなる群からの細菌種より選択され得る。
【００２１】
特に、当該微生物細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｃｙａｎｏｂａｋｔｅｒｉｅｎ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．およびＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、ブレビバクテリウム属Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．、ならびにＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．に由来し得る。より詳細には、当該微生物細胞は、大腸菌であり得る。
【００２２】
別の実施例において、当該微生物細胞は、酵母細胞であり得る。本発明の任意の態様による好適な酵母は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｙｅａｓｔｓ．ｈｔｍに一覧される属に属し得る。特に、当該酵母は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓからなる群より選択され得る。
【００２３】
本発明の任意の態様により使用される酵素は、組換え体であり得る。本明細書において使用される場合、用語「組換え体」は、それ自体は自然には生じないが遺伝子工学の結果として生じる分子、またはそのような分子によってコード化されるもので、特に、ポリペプチドまたは核酸、を意味するか、または遺伝子組換え分子を含む細胞を意味する。例えば、核酸分子が、触媒的に活性なポリペプチドをコード化する配列に機能的に連結されたプロモータを含み、ならびに触媒的に活性なポリペプチドが、元の変更されていない核酸分子を含む対応する野生型細胞におけるポリペプチドのレベルに比べて過剰発現されるように、当該プロモータが設計されている場合、当該核酸分子は、組換え体である。
【００２４】
当業者は、当技術分野において既知の任意の方法を使用して、細胞または微生物を遺伝的に改変することができるであろう。本発明の任意の態様により、当該遺伝的に改変された細胞は、２時間以内、特に８時間または２４時間以内の規定された期間に、野生型細胞と比べて、少なくとも１倍または２倍、とりわけ少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１００００倍多くω−官能化カルボン酸エステルを形成するように、遺伝的に改変され得る。産生物形成の増加は、例えば、本発明の任意の態様による細胞および野生型細胞を同じ条件下（同じ細胞密度、同じ栄養培地、同じ培養条件）において、指定された期間、好適な栄養培地において、それぞれ別々に培養し、次いで、当該栄養培地中の目的産生物（ω−官能化カルボン酸エステル）の量を測定することによって、特定することができる。当該遺伝的に改変された細胞または微生物は、野生型の細胞または微生物と遺伝的に異なり得る。本発明の任意の態様による遺伝的に改変された微生物と、野生型微生物との間の遺伝的な差は、野生型微生物には不在であり得る、遺伝的に改変された微生物における完全な遺伝子、アミノ酸、ヌクレオチドなどの存在であり得る。一実施例において、本発明の任意の態様による遺伝的に改変された微生物は、酵素、特に、野生型の発現を有するかまたはＡｌｋＢ発現を有さない野生型の細胞と比べてより多くのＨＬＡＭＥを当該微生物に産生させることができる変異体ＡｌｋＢ、を含み得る。本発明における遺伝的に改変された微生物と比べて、野生型微生物は、当該酵素の活性を全く有し得ないかまたは検出可能な活性を有し得ない。本明細書において使用される場合、「遺伝的に改変された微生物」は、用語「遺伝的に改変された細胞」と相互互換的に使用され得る。本発明の任意の態様による遺伝的改変は、微生物の細胞において実施される。
【００２５】
本発明の任意の態様による細胞は、当技術分野において既知の任意の方法により、遺伝的に形質転換される。特に、当該細胞は、国際公開第２０１３／０２４１１４号において開示される方法に従って、作り出すことができる。語句「遺伝的に改変された細胞は、酵素において、その野生型と比較して、増加した活性を有する」は、本明細書において使用される場合、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より詳細には少なくとも１００倍、さらにより詳細には少なくとも１０００倍、さらにより詳細には少なくとも１００００倍増加した、それぞれの酵素の活性を意味する。
【００２６】
本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素は、
（ａ）基質としてのＣ６〜Ｃ１４カルボン酸および／またはそのエステルの、対応するオメガ−ヒドロキシカルボン酸および／またはそのエステルへの転換を触媒する；または
（ｂ）基質としてのＣ６〜Ｃ１４カルボン酸および／またはそのエステルの、対応するオメガ−オキソカルボン酸および／またはそのエステルへの転換を触媒する
ことができ得る。
【００２７】
用語「基質」は、酵素触媒の作用によって別の化合物へ転換されるかまたは転換されることが意図される、任意の物質または化合物を意味する。当該用語は、芳香族および脂肪族化合物を包含し、単一の化合物だけでなく、化合物の組み合わせ、例えば、溶液、混合物、または少なくとも１種の基質を含有する他の材料など、も包含する。本発明の任意の態様により、当該基質は、少なくとも１種のＣ６〜Ｃ１４カルボン酸および／またはそのエステルであり得る。したがって、当該基質は、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、およびそのエステルからなる群より選択され得る。当該基質は、Ｃ６〜Ｃ１４カルボン酸および／またはそのエステルの組み合わせであり得る。特に、当該基質は、少なくとも１種のＣ８〜Ｃ１２カルボン酸および／またはそのエステル、少なくとも１種のＣ６〜Ｃ１０カルボン酸および／またはそのエステル、あるいは少なくとも１種のＣ８〜Ｃ１０カルボン酸および／またはそのエステルであり得る。一実施例において、当該基質は、ラウリン酸および／またはそのエステルであり得る。特に、当該エステルは、当該カルボン酸のエチルまたはメチルエステルであり得る。一実施例において、本発明の任意の態様による基質としてのエステルは、メチルラウリン酸メチルエステル（ＬＡＭＥ）であり得る。この実施例において、当該変異体ＡｌｋＢは、それぞれ、オメガ−ヒドロキシラウリン酸および／またはオメガ−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル（ＨＬＡＭＥ）への、ラウリン酸および／またはラウリン酸メチルエステル（ＬＡＭＥ）の転換の酸化反応を触媒することができ得る。別の実施例において、当該変異体ＡｌｋＢは、それぞれ、オメガ−オキソラウリン酸および／またはオメガ−オキソラウリン酸メチルエステル（ＯＬＡＭＥ）への、ラウリン酸および／またはラウリン酸メチルエステル（ＬＡＭＥ）の転換を触媒することができ得る。さらなる実施例において、当該変異体ＡｌｋＢは、オメガ−ヒドロキシラウリン酸および／またはオメガ−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル（ＨＬＡＭＥ）ならびにオメガ−オキソラウリン酸および／またはオメガ−オキソラウリン酸メチルエステル（ＯＬＡＭＥ）への、ラウリン酸および／またはラウリン酸メチルエステル（ＬＡＭＥ）の転換を同時に触媒することが可能であり得る。
【００２８】
「酸化反応」または「酸素化反応」は、本明細書において使用される場合、酸素化または酸化された基質または生成物を形成するための、基質への酸素の付加を伴う化学反応または生化学反応である。酸化反応は、典型的には、還元反応を伴う（したがって、酸化および還元に対して、用語「レドックス」反応）。化合物は、酸素を受け取るかまたは電子を失うときに「酸化される」。化合物は、酸素を失うかまたは電子を獲得するときに「還元される」。酸化反応のいくつかの例としては、これらに限定されるわけではないが、ＬＡＭＥからＨＬＡＭＥへ、ＨＬＡＭＥからＯＬＡＭＥへ、ＯＬＡＭＥからＤＤＡＭＥへなどの転換が挙げられる。
【００２９】
特に、当該変異体ＡｌｋＢ酵素は、野生型ＡｌｋＢ酵素と比べて、カルボン酸から、より多くのオメガ−ヒドロキシ−および／またはオメガ−オキソカルボン酸および／またはそのエステルを産生することができ得る。さらに、形成される副産物も少ないであろう。
【００３０】
一実施例において、本発明の任意の態様によるＡｌｋＢ変異体の異種発現の効果は、宿主細胞として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を使用することにより分析され得る。これらの変異体ＡｌｋＢ酵素は大腸菌に形質転換され得、これらの形質転換細胞は、ＬＡＭＥなどの基質の存在の下、バイオリアクターにおいてプロセス関連条件下で培養され得る。野生型ＡｌｋＢを発現する任意の参考株と比較して、当該変異体株は、ＬＡＭＥによるＨＬＡＭＥへの生物変換率における顕著な増加ならびに最大で２倍まで向上したＨＬＡＭＥ：ＤＤＡＭＥの比率を有することが示され得る。ＨＬＡＭＥは、ＡｌｋＢ反応カスケードにおけるＤＤＡＭＥ産生の前駆体であるため、この比率は、ＨＬＡＭＥに対して基質特異性が減少したことを示し得る。したがって、本発明の任意の態様による細胞は、空時収量ならびに産生物収量が増加され得て、より経済的なポリアミドの１２の前駆製造プロセスに貢献する、よりエネルギー効率に優れるプロセスを生み出し得る。
【００３１】
特に、本発明の任意の態様による細胞および／または方法は、野生型細胞におけるＨＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ比に比べて、オメガ−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル（ＨＬＡＭＥ）対ドデカン二酸モノメチルエステル（ＤＤＡＭＥ）（ＨＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ）比を増加させることができ得る。特に、この方法は、本発明の任意の態様による細胞を、基質であるＬＡＭＥに接触させる工程を含む。この比率は、所定の時点での、反応混合物中で産生されたＨＬＡＭＥの総量を当該反応において産生されたＤＤＡＭＥの総量で割ることによって計算される。特に、ＨＬＡＭＥおよび／またはＤＤＡＭＥの量は、当技術分野において既知の任意の方法によって、任意の所定の時点において測定することができる。より詳細には、ＨＬＡＭＥおよび／またはＤＤＡＭＥの濃度は、質量分析計に接続されたガスまたは液体クロマトグラフィを使用して測定することができる。ＨＬＡＭＥの濃度が高いほど、当該比率も高い。特に、当該ＨＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ比は、少なくとも１：１であり得る。これは、それ自体、野生型の酵素および／または細胞よりも高くあり得る。より詳細には、当該ＨＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ比は、少なくとも約１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１，２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５；１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１などであり得る。さらにより詳細には、当該ＨＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ比は、少なくとも１．５：１であり得る。
【００３２】
別の実施例において、本発明の任意の態様による細胞および／または方法は、野生型細胞におけるＡＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ比と比べて、オメガ−アミノラウリン酸メチルエステル（ＡＬＡＭＥ）対ドデカン二酸モノメチルエステル（ＤＤＡＭＥ）（ＡＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ）比を増加させることができ得る。特に、この方法は、本発明の任意の態様による細胞を、基質であるＬＡＭＥに接触させる工程を含む。この比率は、所定の時点での、反応混合物中で産生されたＡＬＡＭＥの総量を当該反応において産生されたＤＤＡＭＥの総量で割ることによって計算される。特に、ＡＬＡＭＥおよび／またはＤＤＡＭＥの量は、当技術分野において既知の任意の方法によって、任意の所定の時点において測定することができる。より詳細には、ＡＬＡＭＥおよび／またはＤＤＡＭＥの濃度は、質量分析計に接続されたガスまたは液体クロマトグラフィを使用して測定することができる。ＡＬＡＭＥの濃度が高いほど、当該比率も高い。特に、当該ＡＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ比は、少なくとも１：１であり得る。これは、それ自体、野生型の酵素および／または細胞よりも高くあり得る。より詳細には、当該ＡＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ比は、少なくとも約１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５；１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１などであり得る。さらにより詳細には、当該ＡＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ比は、少なくとも１．５：１であり得る。
【００３３】
本発明のさらなる態様により、オメガ−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル（ＨＬＡＭＥ）への、ラウリン酸メチルエステル（ＬＡＭＥ）の転換を触媒するための、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素ならびに／あるいは本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素を含みおよび発現する細胞の使用が提供される。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「約」または「およそ」は、所定の値または範囲の２０パーセント以内、特に１０パーセント以内、より詳細には５パーセント以内を意味するものとする。
【００３５】
特に、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素は、基質である、非官能化末端メチル結合を有するＣ６〜Ｃ１４のカルボン酸および／またはそのエステル、例えば、カルボン酸メチル、エチル、またはプロピルエステル、またはアルカンなど、に関して、野生型ＡｌｋＢ酵素と比べて、減少したＫｍ値または増加したｖｍａｘ値を有し得、しがたって、結果として、向上した変異体ＡｌｋＢの活性を生じ得る。例えば、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素は、ＬＡＭＥを認識することが可能であり得、したがって、基質のＬＡＭＥからＨＬＡＭＥへの酸化的転換を触媒することが可能であり得る。別の実施例において、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素は、基質であるＯＬＡＭＥまたはオキソ官能化末端結合を有する他の基質、例えば、オメガ−オキソカルボン酸メチル、エチル、またはプロピルエステル、またはアルカナールなど、に関して、野生型ＡｌｋＢ酵素と比べて、増加したＫｍ値または減少したｖｍａｘ値を有し得、したがて、結果として、減少した活性を生じ得る。さらなる実施例において、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素は、基質であるＨＬＡＭＥまたはヒドロキシル官能化末端結合を有する他の基質、例えば、オメガ−ヒドロキシ脂肪酸メチル、エチル、またはプロピルエステル、またはアルカノールなど、に関して、野生型ＡｌｋＢ酵素と比べて、増加したＫｍ値または減少したｖｍａｘ値を有し得、したがって、結果として、減少した活性を生じ得る。
【００３６】
したがって、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素は、ＨＬＡＭＥの製造および／または蓄積にとって有用であり得る。特に、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素は、野生型ＡｌｋＢ酵素と比べてより多くのＨＬＡＭＥを産生することが可能であり得、および／または、このＨＬＡＭＥは、他の下流産生物、例えば、ＯＬＡＭＥおよび／またはＤＤＡＭＥに転換され得ない。あるいは、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素は、望ましくない副産生物として同時に産生されるＤＤＡＭＥと比べて、より多いＨＬＡＭＥの産生および／または蓄積にとって有用であり得る。特に、本発明の任意の態様による変異体ＡｌｋＢ酵素は、野生型ＡｌｋＢ酵素との比較において、望ましくない副産生物として同時に産生され得るＤＤＡＭＥと比べて、より多いＨＬＡＭＥを産生することが可能であり得る。したがって、野生型ＡｌｋＢ酵素と比べて、多量のＨＬＡＭＥの産生のために少量の基質のＬＡＭＥで十分であり得るため、浪費される資源はより少ない。特に、本発明の任意の態様によるＡｌｋＢ変異体は、野生型ＡｌｋＢと比較して、より高いＨＬＡＭＥ産生能と、追加的に、ＨＬＡＭＥおよび／またはＯＬＡＭＥに対して低下した基質特異性とを有する（結果として、増加したＨＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ産生物比を生じる）ことが判明することを実証することができた。同様の説明は、見られ得る増加したＡＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ比にも関連し得る。一実施例において、本発明の任意の態様による細胞において見出される内因性アルコール脱水素酵素は、ＡＬＡＭＥの形成に関与し得、したがって、ＯＬＡＭＥの増加を示さない。
【００３７】
本発明の任意の態様による細胞は、さらに、酵素Ｅ１、ω−トランスアミナーゼ、の野生型の細胞と比べて、増加した発現を有するように遺伝的に改変され得る。特に、酵素Ｅ１は、オメガ−オキソカルボン酸および／またはそのエステルの、対応するオメガ−アミノカルボン酸および／またはそのエステルへの転換を触媒することができ得る。
【００３８】
語句「増加した酵素の活性」は、本明細書において使用される場合、増加した細胞内活性として理解されるべきである。基本的に、酵素活性の増加は、当該遺伝子配列のコピー数または当該酵素をコードする遺伝子配列を増加させること、強力なプロモータを使用するか、または増加した活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子もしくはアレルを用いること、遺伝子のコドン利用率を変更すること、様々な方法においてｍＲＮＡまたは酵素の半減期を増加させること、遺伝子の発現のレギュレーションを変更すること、ならびに、任意選択により、これらの手段を組み合わせることによって達成することができる。本発明の任意の態様により使用される、遺伝的に改変された細胞は、例えば、所望の遺伝子、この遺伝子のアレル、またはそれらの一部を含有するベクター、ならびに当該遺伝子の発現を可能にするベクターを用いた、形質転換、形質導入、コンジュゲート化、またはこれらの方法の組み合わせによって作製される。特に、異種発現は、細胞の染色体または染色体外複製ベクターにおける、遺伝子またはアレルの統合によって達成される。一実施例において、本発明の任意の態様による細胞は、ω−トランスアミナーゼ（Ｅ１）の野生型細胞に比べて、増加した発現を含み得る。特に、当該ω−トランスアミナーゼ（Ｅ１）は、ＥＣ２．６．１由来である。特に、酵素Ｅ１は、シュードモナス・プチダ（ＷＰ＿０１６５０２１４４；ＷＰ＿０１６５００６７５．１）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）（ＮＰ＿９０１６９５．１）、ロドバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）２．４．１（ＹＰ＿３５３４５５．１）、ならびに３ＨＭＵ＿Ａ、ＡＡＤ４１０４１．１、ＡＡＫ１５４８６．１、ＡＢＥ０３９１７．１、ＡＤＲ６０６９９．１、ＡＤＲ６１０６６．１、ＡＤＲ６２５２５．１、ＡＥＬ０７４９５．１、ＣＡＺ８６９５５．１、ＥＦＷ８２３１０．１、ＥＦＷ８７６８１．１、ＥＧＣ９９９８３．１、ＥＧＤ０３１７６．１、ＥＧＥ５８３６９．１、ＥＧＨ０６６８１．１、ＥＧＨ０８３３１．１、ＥＧＨ２４３０１．１、ＥＧＨ３２３４３．１、ＥＧＨ４６４１２．１、ＥＧＨ５５０３３．１、ＥＧＨ６２１５２．１、ＥＧＨ６７３３９．１、ＥＧＨ７０８２１．１、ＥＧＨ７１４０４．１、ＥＧＨ７８７７２．１、ＥＧＨ８５３１２．１、ＥＧＨ９７１０５．１、ＥＧＰ５７５９６．１、ＮＰ＿１０２８５０．１、ＮＰ＿１０６５６０．１、ＮＰ＿２４８９１２．１、ＮＰ＿２４８９９０．１、ＮＰ＿３５４０２６．２、ＮＰ＿４２１９２６．１、ＮＰ＿６３７６９９．１、ＮＰ＿６４２７９２．１、ＮＰ＿７４４３２９．１、ＮＰ＿７４４７３２．１、ＮＰ＿７４７２８３．１、ＮＰ＿７９５０３９．１、ＸＰ＿００２９４３９０５．１、ＹＰ＿００１０２１０９５．１、ＹＰ＿００１０５９６７７．１、ＹＰ＿００１０６１７２６．１、ＹＰ＿００１０６６９６１．１、ＹＰ＿００１０７４６７１．１、ＹＰ＿００１１２０９０７．１、ＹＰ＿００１１４０１１７．１、ＹＰ＿００１１７０６１６．１、ＹＰ＿００１１８５８４８．１、ＹＰ＿００１１８８１２１．１、ＹＰ＿００１２３３���８８．１、ＹＰ＿００１２６８８６６．１、ＹＰ＿００１２７０３９１．１、ＹＰ＿００１３４５７０３．１、ＹＰ＿００１４１２５７３．１、ＹＰ＿００１４１７６２４．１、ＹＰ＿００１５２６０５８．１、ＹＰ＿００１５７９２９５．１、ＹＰ＿００１５８１１７０．１、ＹＰ＿００１６６８０２６．１、ＹＰ＿００１６６９４７８．１、ＹＰ＿００１６７１４６０．１、ＹＰ＿００１６８５５６９．１、ＹＰ＿００１７４７１５６．１、ＹＰ＿００１７４９７３２．１、ＹＰ＿００１７６５４６３．１、ＹＰ＿００１７６６２９４．１、ＹＰ＿００１７９０７７０．１、ＹＰ＿００１８０８７７５．１、ＹＰ＿００１８０９５９６．１、ＹＰ＿００１８５９７５８．１、ＹＰ＿００１８８８４０５．１、ＹＰ＿００１９０３２３３．１、ＹＰ＿００１９７７５７１．１、ＹＰ＿００２２２９７５９．１、ＹＰ＿００２２３１３６３．１、ＹＰ＿００２２８０４７２．１、ＹＰ＿００２２９７６７８．１、ＹＰ＿００２５４３８７４．１、ＹＰ＿００２５４９０１１．１、ＹＰ＿００２７９６２０１．１、ＹＰ＿００２８０１９６０．１、ＹＰ＿００２８７５３３５．１、ＹＰ＿００２８９７５２３．１、ＹＰ＿００２９１２２９０．１、ＹＰ＿００２９７４９３５．１、ＹＰ＿００３０６０８９１．１、ＹＰ＿００３２６４２３５．１、ＹＰ＿００３５５２３６４．１、ＹＰ＿００３５７８３１９．１、ＹＰ＿００３５９１９４６．１、ＹＰ＿００３６０７８１４．１、ＹＰ＿００３６４１９２２．１、ＹＰ＿００３６７４０２５．１、ＹＰ＿００３６９２８７７．１、ＹＰ＿００３７５５１１２．１、ＹＰ＿００３８９６９７３．１、ＹＰ＿００３９０７０２６．１、ＹＰ＿００３９１２４２１．１、ＹＰ＿００４０８６７６６．１、ＹＰ＿００４１４２５７１．１、ＹＰ＿００４１４７１４１．１、ＹＰ＿００４２２８１０５．１、ＹＰ＿００４２７８２４７．１、ＹＰ＿００４３０５２５２．１、ＹＰ＿００４３５６９１６．１、ＹＰ＿００４３６１４０７．１、ＹＰ＿００４３７８１８６．１、ＹＰ＿００４３７９８５６．１、ＹＰ＿００４３９０７８２．１、ＹＰ＿００４４７２４４２．１、ＹＰ＿００４５９０８９２．１、ＹＰ＿００４６１２４１４．１、ＹＰ＿００４６７６５３７．１、ＹＰ＿００４６９３２３３．１、ＹＰ＿００４７０１５８０．１、ＹＰ＿００４７０１６３７．１、ＹＰ＿００４７０４４４２．１、ＹＰ＿１０８９３１．１、ＹＰ＿１１０４９０．１、ＹＰ＿１６８６６７．１、ＹＰ＿２３７９３１．１、ＹＰ＿２６０６２４．１、ＹＰ＿２６２９８５．１、ＹＰ＿２７１３０７．１、ＹＰ＿２７６９８７．１、ＹＰ＿３３４１７１．１、ＹＰ＿３３７１７２．１、ＹＰ＿３５０６６０．１、ＹＰ＿３５１１３４．１、ＹＰ＿３６４３８６．１、ＹＰ＿３６６３４０．１、ＹＰ＿３６９７１０．１、ＹＰ＿３７０５８２．１、ＹＰ＿４２６３４２．１、ＹＰ＿４４０１４１．１、ＹＰ＿４４２３６１．１、ＹＰ＿４６８８４８．１、ＹＰ＿５２１６３６．１、ＹＰ＿５５４３６３．１、ＹＰ＿６０８４５４．１、ＹＰ＿６１０７００．１、ＹＰ＿６１４９８０．１、ＹＰ＿６２２２５４．１、ＹＰ＿６２５７５３．１、ＹＰ＿６８０５９０．１、ＹＰ＿７５１６８７．１、ＹＰ＿７６７���７１．１、ＹＰ＿７７４０９０．１、ＹＰ＿７７４９３２．１、ＹＰ＿７８８３７２．１、ＹＰ＿８５８５６２．１、ＹＰ＿９２８５１５．１、ＹＰ＿９８３０８４．１、ＹＰ＿９９５６２２．１、ＺＰ＿００９４８８８９．１、ＺＰ＿００９５４３４４．１、ＺＰ＿００９５９７３６．１、ＺＰ＿００９９８８８１．１、ＺＰ＿０１０１１７２５．１、ＺＰ＿０１０３７１０９．１、ＺＰ＿０１０５８０３０．１、ＺＰ＿０１０７６７０７．１、ＺＰ＿０１１０３９５９．１、ＺＰ＿０１１６７９２６．１、ＺＰ＿０１２２４７１３．１、ＺＰ＿０１４４２９０７．１、ＺＰ＿０１４４６８９２．１、ＺＰ＿０１５５０９５３．１、ＺＰ＿０１６２５５１８．１、ＺＰ＿０１７４５７３１．１、ＺＰ＿０１７５０２８０．１、ＺＰ＿０１７５４３０５．１、ＺＰ＿０１７６３８８０．１、ＺＰ＿０１７６９６２６．１、ＺＰ＿０１８６５９６１．１、ＺＰ＿０１８８１３９３．１、ＺＰ＿０１９０１５５８．１、ＺＰ＿０２１４５３３７．１、ＺＰ＿０２１５１２６８．１、ＺＰ＿０２１５２３３２．１、ＺＰ＿０２１６７２６７．１、ＺＰ＿０２１９００８２．１、ＺＰ＿０２２４２９３４．１、ＺＰ＿０２３６０９３７．１、ＺＰ＿０２３６７０５６．１、ＺＰ＿０２３８５４７７．１、ＺＰ＿０２４５６４８７．１、ＺＰ＿０２８８３６７０．１、ＺＰ＿０３２６３９１５．１、ＺＰ＿０３２６３９９０．１、ＺＰ＿０３４０００８１．１、ＺＰ＿０３４５２５７３．１、ＺＰ＿０３４５６０９２．１、ＺＰ＿０３５１７２９１．１、ＺＰ＿０３５２９０５５．１、ＺＰ＿０３５７１５１５．１、ＺＰ＿０３５７２８０９．１、ＺＰ＿０３５８７７８５．１、ＺＰ＿０３５８８５６０．１、ＺＰ＿０３６９７２６６．１、ＺＰ＿０３６９７９６２．１、ＺＰ＿０４５２１０９２．１、ＺＰ＿０４５９０６９３．１、ＺＰ＿０４８９０９１４．１、ＺＰ＿０４８９１９８２．１、ＺＰ＿０４８９３７９３．１、ＺＰ＿０４９０２１３１．１、ＺＰ＿０４９０５３２７．１、ＺＰ＿０４９４１０６８．１、ＺＰ＿０４９４４５３６．１、ＺＰ＿０４９４５２５５．１、ＺＰ＿０４９５９３３２．１、ＺＰ＿０４９６４１８１．１、ＺＰ＿０５０５３７２１．１、ＺＰ＿０５０６３５８８．１、ＺＰ＿０５０７３０５９．１、ＺＰ＿０５０７７８０６．１、ＺＰ＿０５０８２７５０．１、ＺＰ＿０５０９１１２８．１、ＺＰ＿０５０９５４８８．１、ＺＰ＿０５１０１７０１．１、ＺＰ＿０５１１６７８３．１、ＺＰ＿０５１２１８３６．１、ＺＰ＿０５１２７７５６．１、ＺＰ＿０５６３７８０６．１、ＺＰ＿０５７４２０８７．１、ＺＰ＿０５７８３５４８．１、ＺＰ＿０５７８６２４６．１、ＺＰ＿０５８４３１４９．１、ＺＰ＿０５９４５９６０．１、ＺＰ＿０６４５９０４５．１、ＺＰ＿０６４８７１９５．１、ＺＰ＿０６４９２４５３．１、ＺＰ＿０６４９３１６２．１、ＺＰ＿０６７０３６４４．１、ＺＰ＿０６７３１１４６．１、ＺＰ＿０６８３９３７１．１、ＺＰ＿０７００７３１２．１、ＺＰ＿０７２６６１９４．１、ＺＰ＿０７３７４０５０．１、ＺＰ＿０７６６２７８７．１、ＺＰ＿０７７７８１９６．１、ＺＰ＿０７７９７９８３．１、ＺＰ＿０８０９９４５９．１、ＺＰ＿０８１３８２０３．１、Ｚ���＿０８１４１７１９．１、ＺＰ＿０８１４２９７３．１、ＺＰ＿０８１７７１０２．１、ＺＰ＿０８１８５８２１．１、ＺＰ＿０８１８６４６８．１、ＺＰ＿０８２０８８８８．１、ＺＰ＿０８２６６５９０．１、ＺＰ＿０８４０２０４１．１、ＺＰ＿０８４０６８９１．１、ＺＰ＿０８５２２１７５．１、ＺＰ＿０８５２７４８８．１、ＺＰ＿０８６３１２５２．１、およびＺＰ＿０８６３６６８７．１からなる群より選択されるアミノトランスフェラーゼ（Ｅｈ）であり得る。
【００３９】
特に、酵素Ｅ１は、ＮＰ＿９０１６９５．１、ＺＰ＿０３６９７２６６．１、ＡＡＤ４１０４１．１、ＹＰ＿００２７９６２０１．１、ＺＰ＿０３６９７９６２．１、ＹＰ＿００１８５９７５８．１、ＹＰ＿００２２２９７５９．１、ＹＰ＿００１１２０９０７．１、ＹＰ＿１１０４９０．１、ＺＰ＿０４９６４１８１．１、ＹＰ＿７７４９３２．１、ＹＰ＿００１７６６２９４．１、ＹＰ＿００１５８１１７０．１、ＹＰ＿６２２２５４．１、ＺＰ＿０３５８８５６０．１、ＹＰ＿００１８０９５９６．１、ＹＰ＿３７０５８２．１、ＺＰ＿０３５７２８０９．１、ＮＰ＿２４８９９０．１、ＹＰ＿００１８８８４０５．１、ＺＰ＿０４９０５３２７．１、ＹＰ＿００１０６１７２６．１、ＹＰ＿００１６６８０２６．１、ＺＰ＿０１７５０２８０．１、ＺＰ＿０７７７８１９６．１、ＥＧＨ７１４０４．１、ＮＰ＿７４４３２９．１、ＹＰ＿００４１４７１４１．１、ＡＤＲ６１０６６．１、ＺＰ＿０５７８３５４８．１、ＹＰ＿００４７０１６３７．１、ＹＰ＿３６６３４０．１、ＹＰ＿００３２６４２３５．１、ＥＧＤ０３１７６．１、ＹＰ＿００１２６８８６６．１、ＺＰ＿０１９０１５５８．１、ＺＰ＿０５１２１８３６．１、ＹＰ＿００３６９２８７７．１、ＺＰ＿０３５１７２９１．１、ＹＰ＿００２９７４９３５．１、ＹＰ＿００１６６８０２６．１、ＡＤＲ６１０６６．１、ＮＰ＿７４４３２９．１、ＹＰ＿００１２６８８６６．１、ＹＰ＿００４７０１６３７．１、ＺＰ＿０８１４２９７３．１、ＡＤＲ６２５２５．１、ＹＰ＿６１０７００．１、ＮＰ＿７４７２８３．１、ＡＤＲ６２５２５．１、ＹＰ＿００１２７０３９１．１、ＹＰ＿００４７０４４４２．１、ＹＰ＿６１０７００．１、ＹＰ＿００１７４７１５６．１、ＺＰ＿０８１３８２０３．１、ＺＰ＿０７２６６１９４．１、ＥＧＨ７０８２１．１、ＹＰ＿３５１１３４．１、ＥＧＨ３２３４３．１、ＥＧＨ０８３３１．１、ＥＧＨ６７３３９．１、ＹＰ＿００１６６８０２６．１、ＹＰ＿００４７０１６３７．１、ＹＰ＿２３７９３１．１、ＺＰ＿０３４０００８１．１、ＺＰ＿０５１１６７８３．１、ＺＰ＿０１５５０９５３．１、ＺＰ＿０７６６２７８７．１、ＹＰ＿９２８５１５．１、ＹＰ＿７８８３７２．１、ＹＰ＿００１０２１０９５．１、ＺＰ＿０７７９７９８３．１、ＹＰ＿００３５７８３１９．１、ＹＰ＿００４３０５２５２．１、ＮＰ＿２４８９１２．１、ＺＰ＿０８６３６６８７．１、ＹＰ＿００３９１２４２１．１、ＹＰ＿７５１６８７．１、ＺＰ＿０８１４２９７３．１、ＹＰ＿２７１３０７．１、ＺＰ＿０５０８２７５０．１、ＹＰ＿００１４１７６２４．１、およびＹＰ＿３５３４５５．１からなる群より選択されるアミノトランスフェラーゼであり得る。
【００４０】
より詳細には、当該酵素Ｅ１は、クロモバクテリウム・ビオラセウムＤＳＭ３０１９１由来のトランスアミナーゼＣＶ２０２５であり得る。本発明の任意の態様による酵素Ｅ１は、配列番号２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。より詳細には、Ｅ１は、ポリペプチド配列番号２に対して少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
【００４１】
例えば、Ｅ１などの酵素はポリペプチド配列からなり、当該アミノ酸残基の６０％まで、好ましくは２５％まで、特に１５％まで、特に１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％までが、下記の参考配列（受託番号）と比べて、欠失、挿入、置換、またはそれらの組み合わせによって改変されるが、依然として、対応する下記の参考配列を有するタンパク質の活性の少なくとも５０％、好ましくは６５％、特に好ましくは８０％、特に９０％超を有し、この場合、当該参考配列の１００％の活性は、生触媒として使用される細胞の活性の増加、すなわち、参考タンパク質の不在下での生触媒の活性と比較して、使用される細胞量に対する単位時間当たりの転換された物質の量（細胞の乾燥重量のグラム当たりのユニット［Ｕ／ｇＣＤＷ］）、を意味するとして理解される。所定のポリペプチドの特性および機能の著しい変更を生じない、所定のポリペプチド配列のアミノ酸残基の改変は、当業者に既知である。したがって、例えば、多くのアミノ酸は、多くの場合、問題なく、お互いに交換可能であり；そのようなアミノ酸置換の例は、ＳｅｒによるＡｌａ；ＬｙｓによるＡｒｇ；ＧｌｎまたはＨｉｓによるＡｓｎ；ＧｌｕによるＡｓｐ；ＳｅｒによるＣｙｓ；ＡｓｎによるＧｌｎ；ＡｓｐによるＧｌｕ；ＰｒｏによるＧｌｙ；ＡｓｎまたはＧｌｎによるＨｉｓ；ＬｅｕまたはＶａｌによるＩｌｅ；ＭｅｔまたはＶａｌによるＬｅｕ；ＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕによるＬｙｓ；ＬｅｕまたはＩｌｅによるＭｅｔ；ＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒによるＰｈｅ；ＴｈｒによるＳｅｒ；ＳｅｒによるＴｈｒ；ＴｙｒによるＴｒｐ；ＴｒｐまたはＰｈｅによるＴｙｒ；ＩｌｅまたはＬｅｕによるＶａｌである。特に、例えば、アミノ酸の挿入または欠失などの形態の、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端における改変は、多くの場合、当該ポリペプチドの機能に大きな影響を及ぼさない。
【００４２】
上記において言及した酵素および遺伝子の発現ならびに以下において言及される全ては、一次元および二次元タンパク質ゲル分離と、その後の適切な評価ソフトウェアによる当該ゲル中の当該タンパク質の濃度の光学的同定によって特定される。
【００４３】
酵素活性の増加が、排他的に、対応する遺伝子の発現の増加に基づいている場合、当該酵素活性の増加の定量化は、単純に、野生型細胞と遺伝的に改変された細胞との間の一次元または二次元タンパク質分離の比較によって特定することができる。細菌を用いたタンパク質ゲルの調製ならびに当該タンパク質の同定のための一般的方法は、Ｈｅｒｍａｎｎらによって記載された手法である（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２：１７１２−２３（２００１））。タンパク質濃度も、特定されるタンパク質に対して特異的な抗体によるウエスタンブロット交配（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ＵＳＡ，１９８９）と、その後の濃度特定のための適切なソフトウェアによる光学的評価（Ｌｏｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ（１９８９）Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ，５：３２−３９；Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ（１９９９），Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  １１１：２６３０−２６４７）によって分析することができる。この方法も、常に、特定される酵素活性によって触媒される反応における可能な生成物が、微生物によって急速に代謝される場合、あるいは、野生型における活性それ自体が、産生物形成に基づいて特定される酵素活性を特定することが適切に可能であるためには低すぎる場合の選択肢である。
【００４４】
本発明の別の態様により、基質としての少なくとも１種のカルボン酸および／またはそのエステルから、少なくとも１種のオメガ−ヒドロキシカルボン酸および／またはそのエステルを作製する方法であって、
・変異体ＡｌｋＢ酵素を発現する、少なくとも１種の遺伝的に改変された細胞を、基質であるカルボン酸および／またはそのエステルに接触させる工程
を含み、
この場合、当該基質であるカルボン酸および／またはそのエステルが、Ｃ６〜Ｃ１４カルボン酸および／またはそのエステルであり、ならびに
当該変異体ＡｌｋＢ酵素が、ＡｌｋＢの野生型配列において少なくとも１つの点変異を含み、
当該点変異が、野生型ＡｌｋＢ酵素のＶ１２９、Ｌ１３２、およびＴ１３６からなる群より選択されるアミノ酸位置においてである、
方法が提供される。
【００４５】
特に、当該点変異は、Ｖ１２９Ｔ、Ｔ１３６Ａ、Ｖ１２９Ａ、およびＬ１３２Ｖからなる群より選択され得る。
【００４６】
本発明の別の態様により、基質としての少なくとも１種のカルボン酸および／またはそのエステルから、少なくとも１種のオメガ−ヒドロキシカルボン酸および／またはそのエステルを作製する方法であって、
・本発明の任意の態様による細胞を、当該基質であるカルボン酸および／またはそのエステルに接触させる工程
を含む方法が提供される。
【００４７】
本発明のさらなる態様により、基質としての少なくとも１種のカルボン酸および／またはそのエステルから、少なくとも１種のオメガ−アミノカルボン酸および／またはそのエステルを作製する方法であって、
・本発明の任意の態様による細胞を、当該基質であるカルボン酸および／またはそのエステルに接触させる工程
を含む方法が提供される。
【００４８】
本発明のさらなる態様により、カルボン酸および／またはそのエステルの、対応するオメガ−ヒドロキシカルボン酸および／またはそのエステルならびに／あるいはオメガ−アミノカルボン酸および／またはそのエステルへの転換を触媒するための、本発明の任意の態様による細胞の使用が提供される。
【００４９】
用語「接触させる」は、本明細書において使用される場合、水溶液中において、基質であるカルボン酸および／またはそのエステルと本発明の任意の態様による細胞との間の直接的な接触を生じさせることを意味する。例えば、当該細胞とカルボン酸および／またはそのエステルとは、無機膜などの障壁によって分離された異なるコンパートメントにあり得ない。当該カルボン酸および／またはそのエステルが、可溶性であるかまたは可溶性にされ、ならびに当該細胞によって吸収され得るかまたは生体膜を通って拡散することができる場合、それらは、単純に、水溶液中において本発明の任意の態様による細胞に加えられ得る。それらの可溶性が不十分な場合、それらは、当該水溶液に加える前に、好適な有機溶媒に溶解され得る。当業者は、好適な有機溶媒および／または極性溶媒を加えることによって、不十分は溶解性を有するカルボン酸および／またはそのエステルの水溶液を調製することができる。そのような溶媒は、液体有機溶媒を含む有機相の形態において提供され得る。一実施例において、当該有機溶媒または有機相は、２５℃および標準気圧において液体である場合、液体と見なすことができる。別の実施例において、当該化合物および触媒は、インビトロにおいて、すなわち、幾分富化された状態か、または精製された状態において接触され得るか、あるいは、インサイチューにおいて接触され得、すなわち、それらは、当該細胞の代謝の一部として産生され、続いて当該細胞内において反応する。
【００５０】
用語「水溶液」は、用語「水性媒体」と相互互換的に使用され、ならびに、本発明の任意の態様による細胞を少なくとも一時的に代謝的に活性な状態および／または生存可能な状態に維持するために使用され得、必要な場合には、任意のさらなる基質を含む溶媒としての、水を含む任意の溶液、主に水、を意味する。当業者は、通常、本発明の細胞を維持するために使用され得る、培地と呼ばれる多数の水溶液、例えば、大腸菌の場合にはＬＢ培地、の調製に詳しい。望ましくない副産物による当該産生物の不必要な汚染を避けるために、最少培地、すなわち、複合培地とは対照的に、代謝的に活性な状態および／または生存可能な状態に当該細胞を維持するために不可欠な塩および栄養分の最小限のセットのみを含む、合理的にシンプルな化合物の培地、を水溶液として使用することは有利である。例えば、Ｍ９培地は、最少培地として使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１Ａ】生物変換の２９時間後のＨＬＡＭＥおよびＤＤＡＭＥ濃度のグラフ。
【図１Ｂ】生物変換の２９時間後のＨＬＡＭＥおよびＤＤＡＭＥ濃度のグラフ。
【図１Ｃ】生物変換の２９時間後のＨＬＡＭＥおよびＤＤＡＭＥ濃度のグラフ。
【図１Ｄ】生物変換の２９時間後のＨＬＡＭＥおよびＤＤＡＭＥ濃度のグラフ。ＨＬＡＭＥ：オメガ−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル；ＤＤＡＭＥ：ドデカン二酸モノメチルエステル；ＯＬＡＭＥ：オメガ−オキソラウリン酸メチルエステル；ＬＡＭＥ：ラウリン酸メチルエステル。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５２】
上記において好ましい実施形態について説明したが、当業者であれば、特許請求の範囲を逸脱することなく、設計、構築、または操作において変形または変更を行うことができることは理解するであろう。これらの変形は、例えば、特許請求の範囲によって網羅されることが意図される。
【００５３】
実施例１
部位特異的変異誘発
ＡｌｋＢのアミノ酸位置Ｖ１２９、Ｌ１３２、およびＴ１３６は、基質認識および基質位置決めに関与すると考えられた。ＡｌｋＢ酵素のアミノ酸を交換するために、所望のアミノ酸をコードする対応する塩基トリプレット（ｂａｓｅ  ｔｒｉｐｌｅｔ）を、合成オリゴヌクレオチドに導入した。ＰＣＲテンプレートとして野生型ＡｌｋＢ遺伝子配列を用いて、当該変異体ＡｌｋＢ遺伝子（それぞれ、ＡｌｋＢ変異体Ｖ１２９Ｔ、Ｖ１２９Ａ、およびＴ１３６Ａをコードする）を、当該合成オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより増幅した。当該ＰＣＲ生成物を、発現プラスミドのインビトロ構築のためのインサートＤＮＡとして使用した。当業者に既知の方法により、部位特異的変異誘発によってヌクレオチド交換を導入し、それを表１の右側の欄に示す。これらの交換は、表１の左側の欄に示された対応するＡｌｋＢ多様体を生じた。
【００５４】
【表１】
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表１．特定のＡｌｋＢ変異体を産生するように変えられたヌクレオチド配列
【００５５】
実施例２
発現プラスミドのインビトロ構築
プラスミド構築のためのバックボーンベクターとして、プラスミドｐＢＴ１０＿ａｌｋＬ［配列および構築については、国際公開第２０１１／１３１４２０号の実施例１を参照されたい（国際公開第２０１１／１３１４２０号の配列番号８）］を使用した。ｐＢＴ１０＿ａｌｋＬにおいて、ＮＥＢ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．）製のＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用し、製造元の仕様書に従って、変異体ＡｌｋＢ遺伝子を含有するＰＣＲ生成物を使用して、野生型ＡｌｋＢ配列を置き換えた。
【００５６】
【表２】
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表２．大腸菌株の構築のために使用したプラスミド。プラスミドｐＪ２９４＿ａｌａＤＨ＿Ｂ．ｓ．＿ＴＡ＿Ｃ．ｖ．（Ｃｔ）の構築については、国際公開第２０１３／０２４１１４号の実施例１を参照されたい。
【００５７】
実施例３
大腸菌株の構築
大腸菌Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ（ｂ−酸化なし）ΔｂｉｏＨ（メチルエステル加水分解なし）を使用した。ｂｉｏＨの発現をノックアウトするための大腸菌Ｗ３１１０  ΔｂｉｏＨ株を、欧州特許出願公開第２７３０６５５号の実施例１において開示される方法を使用して作製した。続いて、欧州特許出願公開第２６０７４９０号の実施例１において開示される方法を使用して、この菌株を用いてｆａｄＥの発現をノックアウトした。結果として得られる菌株を大腸菌Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥΔｂｉｏＨと称した。野生型ＡｌｋＢ、ＡｌｋＢ変異遺伝子（ＡｌｋＢ多様体）、および／またはトランスアミナーゼを発現する大腸菌株の構築のために、当該大腸菌株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥΔｂｉｏＨを、当業者に既知の方法により、エレクトロポレーションによる形質転換のための宿主として使用した。形質転換体を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および／またはアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天プレート上において選択した。形質転換体のリストを表３に提供する。
【００５８】
【表３】
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表３．プラスミド１による大腸菌Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥΔｂｉｏＨの形質転換によって得られた大腸菌株。両方のプラスミド（プラスミド１およびプラスミド２）の形質転換によって、両方のプラスミドを有する大腸菌が作り出される。
【００５９】
実施例４
ＡｌｋＢ変異体の活性
表３の菌株の、オメガ−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル、オメガ−オキソラウリン酸メチルエステル、およびドデカン二酸モノメチルエステルをラウリン酸メチル（ラウリン酸メチルエステル）から産生する能力を調べるために、それらの菌株を流加発酵にかけた。これは、ＤＡＳＧＩＰ（登録商標）製の８倍並行発酵システムにおいて実施した。
【００６０】
当該発酵のために、オーバーヘッド撹拌機およびインペラ式タービンを備えた１Ｌの反応器を使用した。当該プロセスをモニターするために、当技術分野において既知の方法を使用して、当該プロセスの間のｐＨおよびｐＯ２を直接的かつ連続的に測定した。ＯＴＲ／ＣＴＲ測定は、とりわけ、代謝活性および細胞の適合性を評価するために役立った。
【００６１】
ＤＡＳＧＩＰの技術参考資料に従って、ｐＨ４．０およびｐＨ７．０の測定溶液を用いた２点較正によって当該ｐＨプローブを較正した。技術参考資料に従って、必要なセンサーおよび接続部を備える当該反応器を準備し、撹拌機シャフトを取り付けた。当該反応器を３００ｍｌの水で満たし、無菌を保証するために１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。当該ｐＯ２プローブを、測定増幅器に接続した後に、一晩（少なくとも６時間）分極させた。次いで、クリーンベンチ下において水を除去し、炭素源として１５ｇ／ｌのグルコース（５００ｇ／ｌのグルコース、１％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および２．２％（ｗ／ｖ）のＮＨ４Ｃｌからなる３０ｍｌ／ｌの無菌供給液の計量添加によって加えた）および５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む、１．７６ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１９．０８ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、１２．５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、６．６６ｇ／ｌの酵母抽出物、１１．２ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム二水和物、１７ｍｌ／ｌのろ過滅菌処理した１％濃度のクエン酸鉄アンモニウム溶液、および５ｍｌ／ｌのろ過滅菌処理した微量元素ストック溶液（３６．５０ｇ／ｌのＨＣｌ（３７％）、１．９１ｇ／ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．８７ｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８４ｇ／ｌのエチレンジアミン四酢酸二水和物、０．３０ｇ／ｌのＨ３ＢＯ３、０．２５ｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．７０ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１７．８０ｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ｌのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる）からなる高細胞密度培地で置き換えた。
【００６２】
続いて、当該ｐＯ２プローブを、１点較正（撹拌機：６００ｒｐｍ／ガス処理：１０ｓＬ／ｈ空気）を使用して１００％に較正し、一連の供給材料、補正剤、および導入剤を、技術参考資料に従ってＣＩＰ洗浄により洗浄した。このために、当該チューブを、最初に７０％エタノール、次いで１ＭのＮａＯＨ、次いで無菌脱塩水で洗い流し、最後にそれぞれの培地で満たした。
【００６３】
前述の大腸菌株の全てを、最初に、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（１００ｍｌのバッフル付き振盪フラスコ中における２５ｍｌ）において、３７℃および２００ｒｐｍにおいて一晩、約１８時間かけて、凍結培養物（ｃｒｙｏｃｕｌｔｕｒｅ）から培養した。次いで、２ｍｌのこの培養物を、第二前培養段階のために、１００ｍｌの振盪フラスコにおける、炭素源として１５ｇ／ｌのグルコース（５００ｇ／ｌのグルコース、１％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および２．２％（ｗ／ｖ）のＮＨ４Ｃｌからなる３０ｍｌ／ｌの無菌供給液の計量添加によって加えた）および既に説明した抗生物質を含む、１．７６ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４，１９．０８ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４，１２．５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４，６．６６ｇ／ｌの酵母抽出物、１１．２ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム二水和物、１７ｍｌ／ｌのろ過滅菌処理した１％濃度のクエン酸鉄アンモニウム溶液、および５ｍｌ／ｌのろ過滅菌処理した微量元素ストック溶液（３６．５０ｇ／ｌのＨＣｌ（３７％）、１．９１ｇ／ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．８７ｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８４ｇ／ｌのエチレンジアミン四酢酸二水和物、０．３０ｇ／ｌのＨ３ＢＯ３，０．２５ｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．７０ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１７．８０ｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ｌのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる）からなる２５ｍｌの高細胞密度培地に移し、３７℃／２００ｒｐｍにおいてさらに６時間インキュベートした。
【００６４】
０．１の光学濃度において当該反応器に播種するために、当該第二前培養段階のＯＤ６００を測定し、播種に必要な培養物の量を計算した。必要な量の培養物を、５ｍｌのスポイトを使用して、熱処理および曝気された反応器中へ隔壁を通して加えた。
【００６５】
使用した標準プログラムを表４に示す。
【表４】
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表４．ＡｌｋＢ変異体の活性を特定するための標準プログラム。
【００６６】
１２．５％濃度のアンモニア溶液によって、片側のｐＨをｐＨ６．８に調整した。培養および生物変換の間、当該培養物中の溶存する酸素（ｐＯ２またはＤＯ）を、撹拌供給およびガス処理速度を用いて、少なくとも３０％に調整した。播種後、当該ＤＯは１００％からこの３０％まで低下し、発酵の残部に対して、それを安定に維持した。
【００６７】
当該発酵は、流加培養として実施し、この場合、供給開始は、バッチ相の終わりを誘導するＤＯピークにより、５００ｇ／ｌのグルコース、１％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および２．２％（ｗ／ｖ）のＮＨ４Ｃｌからなる５ｇ／ｌ・ｈのグルコース供給による供給相への送達としてトリガーした。供給開始により、３７℃の温度は、３０℃まで低下した。供給開始から１０時間後、０．０２５％（ｖ／ｖ）のＤＣＰＫによって、酸化遺伝子の発現を誘導した。メチルヒドロキシラウレート産生の開始（＝生物変換の開始）は、供給開始の１４時間後に実施した。このために、ラウリン酸メチルおよびオレイン酸（工業グレード９０％）の１５０ｍｌの混合物を、当該発酵培養液にバッチとして加えた。結果を図１Ａ〜１Ｄに示す。全ての変異体は、コントロールに比べてより速いＨＬＡＭＥ産生（２〜３倍）、コントロールに比べてより速い酸化全体（１．５〜２倍）、コントロールに比べて全ての変異体における向上した化学種選択性（ＨＬＡＭＥ／ＤＤＡＭＥ比）（１．２０〜１．７５対０．８４）を示している。ＯＬＡＭＥ産生は、全ての菌株において低い（Ｖ１２９Ａ変異体において１ｇ／Ｌ、全ての他の菌株において＜０．６ｇ／Ｌ）。
【００６８】
実施例５
産生物のＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ２ベースの定量化
発酵試料中のＬＡＭＥおよびＨＬＡを定量化するために、生物変換の開始の１／２／４／２０／２２時間後にサンプルを採取した。分析のためにこれらのサンプルを調製した。発酵試料における抽出物、中間体、および産生物の定量化を、全ての分析物（０．１〜５０ｍｇ／ｌ）に対して外部較正を参照するＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ２によって、また、内部標準のアミノウンデカン酸（ＡＵＤ、ＨＬＡＭＥに対して）およびｄ３−ＬＡＭＥ（ＬＡＭＥに対して）を使用して実施した。
【００６９】
以下の機器を使用した：
・  オートサンプラー（Ｇ１３６７Ｅ）、バイナリポンプ（Ｇ１３１２Ｂ）、およびカラムオーブン（Ｇ１３１６Ａ）を備えるＨＰＬＣシステム１２６０（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ｂｏｂｌｉｎｇｅｎ）
・ＥＳＩ源を備える質量分析計ＴｒｉｐｅｌＱｕａｄ  ６４１０（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ｂｏｂｌｉｎｇｅｎ）
・ＨＰＬＣカラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８、１００×２．１ｍｍ、粒径：２．６μｍ、孔径１００Å（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ；アシャッフェンブルク）
・プレカラム：ＫｒｕｄＫａｔｃｈｅｒ  Ｕｌｔｒａ  ＨＰＬＣ  Ｉｎ−Ｌｉｎｅフィルター；０．５μｍのフィルター深さおよび０．００４ｍｍの内径（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ；アシャッフェンブルク）
【００７０】
当該サンプルは、１９００μｌの溶媒（８０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル、２０％（ｖ／ｖ）の二回蒸留したＨ２Ｏ、＋０．１％のギ酸）および１００μｌの試料をピペットにより２ｍｌの反応器に装入することによって調製した。当該混合物を約１０秒間ボルテックスし、次いで、約１３，０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した。透明な上澄みをピペットを使用して除去し、適切な希釈の後、希釈剤（８０％（ｖ／ｖ）のＡＣＮ、２０％の２回蒸留したＨ２Ｏ、＋０．１％のギ酸）を用いて分析した。１００μＬのＩＳＴＤを、ピペットにより各９００μＬの試料に加えた（９０μＬのサンプル量に対して１０μＬ）。
【００７１】
前述のカラムおよびプレカラムを用いて、ＨＰＬＣ分離を実施した。注入量は０．７μＬであり、カラム温度は５０℃であり、流量は０．６ｍＬ／分であった。移動相は、溶離液Ａ（０．１％（ｖ／ｖ）濃度のギ酸水溶液）および溶離液Ｂ（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含むアセトニトリル）からなった。表５に示されるような勾配プロファイルを使用した。
【００７２】
【表５】
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表５．ＨＰＬＣ分離において使用した勾配プロファイル
【００７３】
当該ＥＳＩ−ＭＳ２分析は、ＥＳＩ源の以下のパラメータを用いて、ポジティブモードにおいて実施した：
・ガス温度２８０℃
・ガス流量１１Ｌ／分
・噴霧圧力５０ｐｓｉ
・キャピラリ管電位４０００Ｖ
【００７４】
化合物ＡＬＡＭＥ、ＤＤＡＭＥ、ＨＬＡＭＥ、ＯＬＡＭＥ、ＬＡＭＥ、Ｄｉ−ＯＬＡＭＥの検出および定量化は、以下のＭＲＭパラメータを用いて実施し、各場合において、生成物イオンを、確認イオン（ｑｕａｌｉｆｉｅｒ）として、およびもう一方を定量イオン（ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ）として使用した。
【００７５】
実施例６
トランスアミナーゼによるＡｌｋＢ変異体の活性
ラウリン酸メチル（ラウリン酸メチルエステル）からオメガ−ヒドロキシラウリン酸メチルエステル、オメガ−オキソラウリン酸メチルエステル、およびドデカン二酸モノメチルエステルを産生する当該菌株の能力を調査するために、当該菌株に対して、実施例５において説明した流加発酵を行った。これは、実施例４において説明したＤＡＳＧＩＰからの８倍並行発酵システムにおいて行った。
【００７６】
実施例７
トランスアミナーゼによるＡｌｋＢ変異体の産生物のＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ２ベースの定量化
抽出物、中間体、および産生物の定量化のための手順は、実施例５において説明される通りに実施した。菌株ＥｃＷ３１１０ΔｆａｄＥΔｂｉｏＨ＿ｐＢＴ１０＿ａｌｋＬ＿Ｖ１２９Ｔ＿ＴＡ、ＥｃＷ３１１０ΔｆａｄＥΔｂｉｏＨ＿ｐＢＴ１０＿ａｌｋＬ＿Ｔ１３６Ａ  ＿ＴＡ、およびＥｃＷ３１１０ΔｆａｄＥΔｂｉｏＨ＿ｐＢＴ１０＿ａｌｋＬ＿Ｖ１２９Ａ＿ＴＡは、参考株ＥｃＷ３１１０ΔｆａｄＥΔｂｉｏＨ＿ｐＢＴ１０＿ａｌｋＬ＿ＴＡと比べて、ＤＤＡＭＥに対してより多くのＡＬＡＭＥを産生する。
【図１】
2019519237.tif 000007
【配列表】
2019519237000001.app
【国際調査報告】
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2019519237.tif 000009
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