(57)【要約】本明細書では、補因子非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼの活性を阻害する単離されたペプチドが開示される。一部の例では、単離されたペプチドは、長さが６〜２０アミノ酸であり、配列番号１〜２２または５４のいずれか１つのアミノ酸配列、そのアナログもしくは誘導体、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含む。一部の例では、ペプチドは、６〜１５アミノ酸（例えば、６〜１０アミノ酸）のＮ末端の環、および１〜９アミノ酸（例えば、３〜８アミノ酸）のＣ末端の直鎖状部分を有する、環状ペプチドである。また、本明細書では、被験体における感染を処置または阻害する方法であって、開示されるペプチド、またはそのアナログもしくは誘導体、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルの１つまたは複数を含む、有効量の組成物を被験体に投与することを含む、方法も開示される。
2019527721.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
７〜１３アミノ酸のＮ末端の環構造および１〜７アミノ酸のＣ末端の直鎖状部分を含み、配列番号１〜６、１０〜２０、または５４〜６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む単離された環状ペプチド、そのアナログもしくは誘導体、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステル。
【請求項２】
【化５】
2019527721.tif 000029
【化６】
2019527721.tif 000030
【化７】
2019527721.tif 000031
を含むかまたはそれからなる、請求項１に記載の単離された環状ペプチド。
【請求項３】
少なくとも１つのアミノ酸がＤ−アミノ酸である、請求項１または請求項２に記載の単離された環状ペプチド。
【請求項４】
前記Ｎ末端のアミノ酸がＤ−アミノ酸である、請求項３に記載の単離された環状ペプチド。
【請求項５】
前記Ｎ末端の環構造がチオエーテル結合を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離された環状ペプチド。
【請求項６】
前記チオエーテル結合がＮ末端のアセチル基とシステイン残基との間である、請求項５に記載の単離された環状ペプチド。
【請求項７】
Ｃ末端アミドを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離された環状ペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドの前記直鎖状部分に少なくとも１つのＮ−メチルアミドを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離された環状ペプチド。
【請求項９】
配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、単離されたペプチド。
【請求項１０】
表２、６、８、もしくは９、または図１２Ａ、１２Ｂ、もしくは２１のペプチドのいずれか１つを含むかまたはそれからなる、単離されたペプチド。
【請求項１１】
補因子非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼの活性を１００μＭまたはそれより低いＩＣ５０で阻害する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項１２】
補因子非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼの活性を１ｐＭ〜１００μＭのＩＣ５０で阻害する、請求項１１に記載の単離されたペプチド。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の単離されたペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
被験体における、少なくとも１つの補因子非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼを発現する生物による感染を処置または阻害する方法であって、有効量の請求項１から１２のいずれか一項に記載の単離されたペプチドまたは請求項１３に記載の医薬組成物を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
前記被験体が、線虫、トリパノソーマ、蠕虫、原生動物寄生虫、または細菌からなる群から選択される生物に感染している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体が線虫に感染しており、該線虫が、Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ、Ｂｒｕｇｉａ  ｔｉｍｏｒｉ、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｏａ  ｌｏａ、Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｅｒｃａ、Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ  ｐｅｒｓｔａｎｓ、Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ  ｏｚｚａｒｄｉ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ、Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ  ｂｏｖｉｃｏｌａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｄｅｒｍａｔａｎ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｏｃｈｅｎｇｉ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｄｕｋｅｉ、Ｓｔｅｎｏｆｉｌａｒｉａ  ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ、およびＰａｒａｆｉｌａｒｉａ  ｍｕｌｔｉｐａｐｉｌｌｏｓａの１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体が細菌に感染しており、該細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドまたは前記医薬組成物が、経口的に、静脈内に、または局所的に投与される、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
抗寄生虫剤または抗菌剤の１つまたは複数を前記被験体に投与することをさらに含む、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１６年８月１１日に出願した米国仮出願第６２／３７３，８３５号の利益を主張する。米国仮出願第６２／３７３，８３５号は、その全体がここに参考として援用される。
【０００２】
分野
本開示は、ホスホグリセリン酸ムターゼのペプチド阻害剤、特にペプチド阻害剤、および微生物感染または疾患を処置または阻害するためのそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
線虫ワームは、地球上で最も数の多い動物であり、広く様々な環境で見出される。それらは自由生活性または寄生性であり、植物、動物、およびヒトに感染し得る。ヒトへの寄生性線虫感染は、多数の破壊的な疾患をもたらし得る。リンパ系フィラリア症およびオンコセルカ症は、昆虫によってヒトに伝染するフィラリア線虫寄生虫によって引き起こされる、顧みられない熱帯病である。総合すると、それらは８０を超える国で１億５千万人を苦しめており、１５億を超える人の健康を脅かしている。これらの感染は、極度の虚弱、社会的烙印、および重度の経済的影響の原因となる。Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉおよびＢｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉなどのリンパ管生息寄生虫（lymphatic  dwelling  parasite）は、リンパ浮腫、水瘤、最も極端な場合、象皮症を引き起こす。Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓによる感染では、重度の皮膚炎および／または失明が生じることがある。ここ数年のフィラリア病管理の主力は、限られた数の薬物、主に、イベルメクチンと、アルベンダゾール（オンコセルカ症が風土性である場合）またはクエン酸ジエチルカルバマジン（オンコセルカ症が存在しない場合）との併用であった。これらの化合物は幼虫期を主に標的としており、毎年または半年ごとの投与が必要である。さらに、薬物耐性の出現が報告されている（Churcherら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、１０６巻：１６７１６〜１６７２１頁、２００９年；Osei-Atweneboanaら、PLoS  Negl.  Trop.  Dis.  ５巻：ｅ９９８頁、２０１１年）。したがって、新規の作用機序を有する新たな薬物が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Churcherら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、１０６巻：１６７１６〜１６７２１頁、２００９年
【非特許文献２】Osei-Atweneboanaら、PLoS  Negl.  Trop.  Dis.  ５巻：ｅ９９８頁、２０１１年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
本明細書では、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＭ）活性を阻害するための化合物および組成物が開示される。一部の例では、化合物は、補因子非依存性ＰＧＭ（ｉＰＧＭ）を選択的に阻害する。特定の実施形態では、化合物は、１つまたは複数の環状ペプチドを含む。
【０００６】
一部の実施形態では、化合物または組成物は、補因子依存性ＰＧＭ（ｄＰＧＭ）と比較してｉＰＧＭの活性を選択的にまたは特異的に阻害する、単離されたペプチド（直鎖状または環状ペプチドなど）を含む。一部の例では、単離されたペプチドは、長さが６〜２０アミノ酸であり、配列番号１〜２２および５４〜６９のいずれか１つのアミノ酸配列、そのアナログもしくは誘導体、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含む。一部の例では、ペプチドは、６〜１５アミノ酸（例えば、６〜１０アミノ酸）のＮ末端の環構造、および１〜９アミノ酸（例えば、３〜８アミノ酸）のＣ末端の直鎖状部分を有する、環状ペプチドである。特定の例では、単離されたペプチドは、表２、６、８、もしくは９、または図１２Ａ、１２Ｂ、もしくは２１のいずれか１つのペプチドの構造を有するペプチド、またはそのアナログもしくは誘導体、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含む。
【０００７】
本明細書ではまた、被験体における感染を処置または阻害する方法であって、開示されるペプチド、またはそのアナログもしくは誘導体、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルの１つまたは複数（one  of  more）を含む、有効量の組成物を被験体に投与することを含む、方法も開示される。一部の例では、方法は、線虫による感染を処置すること（例えば、フィラリア病を処置すること）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａによる感染または細菌による感染を処置すること（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染を処置すること）を含む。
【０００８】
本開示より先のおよび本開示の他の特色は、添付の図を参照しながら進める、以下の詳細な説明からさらに明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、ＰＧＭ共役酵素アッセイを示す一連のパネルである。図１Ａは、連続的なＮＡＤＨ依存性の吸光度アッセイによって測定される、反応の時間経過（１時間）を示すグラフである。３４０ｎｍで測定される吸光度は、ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に酸化されると低下し、事前の酵素反応において形成されたピルビン酸に依存する。図１Ｂは、アッセイの線形相が最初の１５分にわたって生じることを示すグラフである。図１Ｃは、７つのＰＧＭオルソログおよびピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）−ＦＬｕｃ対照についての生物発光エンドポイントＨＴＳアッセイのキャリブレーションを示すグラフである。生物発光アッセイで生じる光は、ＡＴＰおよび酸素によるルシフェリンの酸化に基づき、事前の酵素反応で生じたＡＴＰに依存する。酵素濃度（Ｂｍ  ｉＰＧＭ、５ｎＭ；Ｃｅ  ｉＰＧＭ、５ｎＭ；Ｄｉ  ｉＰＧＭ、１０ｎＭ；Ｅｃ  ｉＰＧＭ、１０ｎＭ；Ｏｖ  ｉＰＧＭ、２０ｎＭ；Ｈｓ  ｄＰＧＭ、５ｎＭ；Ｅｃ  ｄＰＧＭ、４ｎＭ）は、５分のアッセイ時間後にほぼ等価のＲＬＵをもたらすように調整した。白いバーは、バックグラウンド測定のための「ＰＧＭなし」対照である。エラーバーは、２４の反復のＳＤである。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、ＰＧＭ共役酵素アッセイを示す一連のパネルである。図１Ａは、連続的なＮＡＤＨ依存性の吸光度アッセイによって測定される、反応の時間経過（１時間）を示すグラフである。３４０ｎｍで測定される吸光度は、ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に酸化されると低下し、事前の酵素反応において形成されたピルビン酸に依存する。図１Ｂは、アッセイの線形相が最初の１５分にわたって生じることを示すグラフである。図１Ｃは、７つのＰＧＭオルソログおよびピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）−ＦＬｕｃ対照についての生物発光エンドポイントＨＴＳアッセイのキャリブレーションを示すグラフである。生物発光アッセイで生じる光は、ＡＴＰおよび酸素によるルシフェリンの酸化に基づき、事前の酵素反応で生じたＡＴＰに依存する。酵素濃度（Ｂｍ  ｉＰＧＭ、５ｎＭ；Ｃｅ  ｉＰＧＭ、５ｎＭ；Ｄｉ  ｉＰＧＭ、１０ｎＭ；Ｅｃ  ｉＰＧＭ、１０ｎＭ；Ｏｖ  ｉＰＧＭ、２０ｎＭ；Ｈｓ  ｄＰＧＭ、５ｎＭ；Ｅｃ  ｄＰＧＭ、４ｎＭ）は、５分のアッセイ時間後にほぼ等価のＲＬＵをもたらすように調整した。白いバーは、バックグラウンド測定のための「ＰＧＭなし」対照である。エラーバーは、２４の反復のＳＤである。
【００１０】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、種依存性のＰＧＭ触媒メカニズム、ならびに２−ホスホグリセレートおよび３−ホスホグリセレート（２−ＰＧ、３−ＰＧ）を検出するためのアッセイ方法を示す一連のパネルである。図２Ａは、ヒト補因子依存性ＰＧＭ（ｄＰＧＭ、上部）のホスホヒスチジン酵素／２，３−ホスホグリセリン酸中間体、およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓの補因子非依存性ＰＧＭ（ｉＰＧＭ、下部）のホスホセリン酵素中間体を示す、ＰＧＭによって触媒される異性化を示す概略図である。図２Ｂは、カイネティックＮＡＤＨ吸光度（生じたピルベートからの）アッセイおよびエンドポイント生物発光（生じたＡＴＰからの）アッセイにおいて使用される共役酵素を示す概略図である。吸光度アッセイのための共役酵素および基質は、エノラーゼ、２−ＰＧ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、ＡＤＰ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸、およびＮＡＤＨである。生物発光アッセイのための共役酵素および基質は、エノラーゼ、２−ＰＧ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、ＡＤＰ、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、およびルシフェリン（ＬＨ２）である。吸光度アッセイの生成物は、ラクテートおよびＮＡＤ＋である。生物発光アッセイの生成物は、オキシルシフェリン（Ｌ）、ＣＯ２、および光（ｈν）である。図２Ｃは、２−ＰＧ／３−ＰＧの直接的な検出において使用されるグラジエント溶離移動境界キャピラリー電気泳動（gradient  elution  moving  boundary  capillary  electrophoresis）（ＧＥＭＢＥ）デバイスの概略図（左）、およびホスホグリセリン酸異性体について検出される電流の一次導関数（右）である。
【図２Ｂ−Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、種依存性のＰＧＭ触媒メカニズム、ならびに２−ホスホグリセレートおよび３−ホスホグリセレート（２−ＰＧ、３−ＰＧ）を検出するためのアッセイ方法を示す一連のパネルである。図２Ａは、ヒト補因子依存性ＰＧＭ（ｄＰＧＭ、上部）のホスホヒスチジン酵素／２，３−ホスホグリセリン酸中間体、およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓの補因子非依存性ＰＧＭ（ｉＰＧＭ、下部）のホスホセリン酵素中間体を示す、ＰＧＭによって触媒される異性化を示す概略図である。図２Ｂは、カイネティックＮＡＤＨ吸光度（生じたピルベートからの）アッセイおよびエンドポイント生物発光（生じたＡＴＰからの）アッセイにおいて使用される共役酵素を示す概略図である。吸光度アッセイのための共役酵素および基質は、エノラーゼ、２−ＰＧ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、ＡＤＰ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸、およびＮＡＤＨである。生物発光アッセイのための共役酵素および基質は、エノラーゼ、２−ＰＧ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、ＡＤＰ、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、およびルシフェリン（ＬＨ２）である。吸光度アッセイの生成物は、ラクテートおよびＮＡＤ＋である。生物発光アッセイの生成物は、オキシルシフェリン（Ｌ）、ＣＯ２、および光（ｈν）である。図２Ｃは、２−ＰＧ／３−ＰＧの直接的な検出において使用されるグラジエント溶離移動境界キャピラリー電気泳動（gradient  elution  moving  boundary  capillary  electrophoresis）（ＧＥＭＢＥ）デバイスの概略図（左）、およびホスホグリセリン酸異性体について検出される電流の一次導関数（右）である。
【００１１】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、ＧＥＭＢＥでのホスホグリセリン酸の分離を示す一連のパネルである。図３Ａは、２−ＰＧおよび３−ＰＧの溶離についての電流（上部）および一次導関数（下部）のプロットを示す。図３Ｂは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ（上部）およびＢ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ（下部）についての、ＧＥＭＢＥで測定される３−ＰＧから２−ＰＧへの変換についての時間経過を示す。左側の軸、（●）２−ＰＧ、（〇）３−ＰＧの変換％；右側の軸、２−ＰＧの３−ＰＧに対する比率（＋）。
【００１２】
【図４Ａ−Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、ＲａＰＩＤ選択からのＤＮＡ配列の配列アラインメントを示す一連のパネルである。図４Ａは、Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭに対するＤＹライブラリーでの選択の第４および第５のラウンドから同定されたＤＮＡ配列のアラインメントである。配列４−６、配列番号２３；配列４−９、配列番号２４；配列４−７、配列番号２５；配列４−１３、配列番号２６；配列５−１３、５−１５、４−１７、４−１８、および５−１０、配列番号２７；配列４−３、配列番号２８；配列４−８、配列番号２９。図４Ｂは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭに対するＤＹライブラリーでの選択の第６および第７のラウンドから同定されたＤＮＡ配列のアラインメントである。配列６−１、配列番号３０；配列６−４および６−５、配列番号３１；配列６−６および６−７、配列番号３２；配列６−９、配列番号３０；配列６−１１、配列番号３１、配列６−１２、配列番号３０；配列６−１３および７−１、配列番号３１；配列７−２、配列番号３３；配列７−３、配列番号３４；配列７−４、配列番号３５；配列７−５、配列番号３１；配列７−６および７−７、配列番号３０；配列７−９および７−１０、配列番号３１；配列７−１２、配列番号３０；配列７−１３、配列番号３１；配列７−１４、配列番号３６；配列７−１５、配列番号３３；配列６−１４、７−８、および７−１１、配列番号３７。図４Ｃは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭに対するＬＹライブラリーでの選択の第５および第６のラウンドから同定されたＤＮＡ配列のアラインメントである。配列５−１、５−２、５−３、５−５、５−８、５−９、５−１０、５−１３、５−１４、配列番号３８；配列５−１６、配列番号３９；配列５−１９、配列番号３８；配列５−２０、配列番号３９；配列５−２１および５−２２、配列番号３８；配列５−２４、配列番号３９；配列５−２８、５−３０、６−１、６−２、６−３、６−４、６−５、および６−６、配列番号３８；配列６−７、配列番号４０；配列６−８および６−９、配列番号３８；配列６−１１、配列番号３９；配列６−１２、配列番号４１；配列６−１３、配列番号４２；配列６−１４、配列番号４０；配列６−１５、配列番号４３；配列６−１６、配列番号３９；配列５−２６、配列番号４４。第２のまたは第３のコドン塩基にある変異は、それぞれ紫または赤で色付けられている。
【００１３】
【図５】図５は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによるＣｅ−２のＭＳＭＳスペクトルおよびフラグメントの分析である。ｂ型、ｙ型、およびｃ型フラグメントイオンを、数によって示す。Ｃｅ−２の親イオン［Ｍ＋Ｈ］＋は、１７９０．６６である。Ｃｅ−２のペプチド配列（配列番号２）を示す。
【００１４】
【図６Ａ−Ｄ】図６Ａ〜６Ｄは、アポＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの結晶およびＣｅ−２ｄとの複合体状の結晶を示す一連のパネルである。図６Ａは、Ｗｉｚａｒｄ  ３−４  Ｄ１１から得られた単斜晶系Ｐ  ｉＰＧＭ（ｉＰＧＭ−ｍ）の最初の試料のデジタル画像であり、図６Ｂは、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  ＨＴ  ｓｃｒｅｅｎ  Ｄ７から観察された結晶を示すデジタル画像である。図６Ｃは、Ｉｎｄｅｘ  ＨＴ  Ｆ７から得られた直方晶系Ｐ  ｉＰＧＭ（ｉＰＧＭ−ｏ）の結晶のデジタル画像である。図６Ｄは、Ｃｅ−２ｄとの共複合体の結晶のデジタル画像である。
【００１５】
【図７Ａ−Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ−ｍの非対称ユニットセルの一連のリボン図である。図７Ａは、サブユニットＡ（マゼンタ）およびＢ（シアン）を示す、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ−ｍの非対称単位の図である。Ｍｎ２＋およびＺｎ２＋イオンは、青色の球で表されている。図７Ｂは、重ね合わせられたサブユニットＡ（マゼンタ）およびＢ（シアン）を示すＣ．ｅｌｅｇａｎｓのアポｉＰＧＭ−ｍのＮＣＳ二量体サブユニットの比較を示す図（上部）、ならびに、水平方向に９０°回転させた同一の図（下部）である。図７Ｃは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ−ｍ（マゼンタ）およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ−ｏ（シアン）の重ね合わせを示す図である。
【００１６】
【図８Ａ−Ｃ】図８Ａ〜８Ｃは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉＰＧＭとの比較を示す、一連のリボン図である。図８Ａは、サブユニットＡ（マゼンタ）を示すＣ．ｅｌｅｇａｎｓのアポｉＰＧＭ−ｍと、重ね合わされたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓからのｉＰＧＭ（灰色、ＰＤＢ：２ＩＦＹ）との重ね合わせを示す。Ｍｎ２＋およびＺｎ２＋イオンは、球で表される。図８Ｂは、サブユニットＡ（マゼンタ）を示すＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ−ｍと、重ね合わされたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのｉＰＧＭ（緑色、ＰＤＢ：１Ｏ９８）との重ね合わせを示す。図８Ｃは、図８Ｂと同一の図を示すが、水平方向に９０°回転されている。矢印は、トランスフェラーゼドメイン内の立体構造上の違いを示している。
【００１７】
【図９Ａ−Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、ｉＰＧＭ内の金属イオン結合部位を示す一連の図である。図９Ａは、３σで輪郭を描いたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄ複合体の金属結合部位での、位相異常差分（phased  anomalous  difference）マップ（メッシュ）を示す。図９Ｂは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄ複合体における金属の配位を示す。タンパク質とＭｎ２＋（大きな黒ずんだ球）イオン、Ｚｎ２＋（大きな淡い球）イオン、および水（小さな球）との接触が示される。図９Ｃは、ｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄについてのＭｇ２＋の結合部位を示す。Ｍｇ２＋イオンは大きな球で、水分子は小さな球で示される。
【００１８】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ｉＰＧＭ大環状ペプチド阻害剤の薬理学的−系統学的関係を示す一連のパネルである。図１０Ａは、親和性選択から得られたＣｅ−２大環状分子（macrocycle）の構造の図であり、Ｃｅ−２ｄを得るためのトランケーションおよびＣｙｓ１４Ｓｅｒ置換の位置を示す。チオエーテル結合およびＤ−チロシンが強調されている。図１０Ｂ〜１０Ｄは、酵素共役生物発光アッセイを使用する、ｉＰＧＭオルソログおよびｄＰＧＭアイソザイムにおけるＣｅ−２（図１０Ｂ）、Ｃｅ−２ｄ（図１０Ｃ）、およびＣｅ−２Ｓ（図１０Ｄ）の特徴付けのためのＩＣ５０濃度−応答曲線を示す一連のグラフである。プロットは個々の実験（Ｎ≧３）の代表であり、エラーバーは、技術的反復の標準偏差値である。挿入図は、０．５ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭ、０．５μＭ、および５μＭのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの、Ｃｅ−２での滴定である。図１０Ｅは、ＰＧＭの７種のオルソログのアミノ酸配列アラインメントについて構築された系統樹である。１，０００の反復に基づくブートストラップ値のパーセンテージを、分枝ノードにおいて示す。
【図１０Ｂ−Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ｉＰＧＭ大環状ペプチド阻害剤の薬理学的−系統学的関係を示す一連のパネルである。図１０Ａは、親和性選択から得られたＣｅ−２大環状分子（macrocycle）の構造の図であり、Ｃｅ−２ｄを得るためのトランケーションおよびＣｙｓ１４Ｓｅｒ置換の位置を示す。チオエーテル結合およびＤ−チロシンが強調されている。図１０Ｂ〜１０Ｄは、酵素共役生物発光アッセイを使用する、ｉＰＧＭオルソログおよびｄＰＧＭアイソザイムにおけるＣｅ−２（図１０Ｂ）、Ｃｅ−２ｄ（図１０Ｃ）、およびＣｅ−２Ｓ（図１０Ｄ）の特徴付けのためのＩＣ５０濃度−応答曲線を示す一連のグラフである。プロットは個々の実験（Ｎ≧３）の代表であり、エラーバーは、技術的反復の標準偏差値である。挿入図は、０．５ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭ、０．５μＭ、および５μＭのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの、Ｃｅ−２での滴定である。図１０Ｅは、ＰＧＭの７種のオルソログのアミノ酸配列アラインメントについて構築された系統樹である。１，０００の反復に基づくブートストラップ値のパーセンテージを、分枝ノードにおいて示す。
【図１０Ｄ−Ｅ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ｉＰＧＭ大環状ペプチド阻害剤の薬理学的−系統学的関係を示す一連のパネルである。図１０Ａは、親和性選択から得られたＣｅ−２大環状分子（macrocycle）の構造の図であり、Ｃｅ−２ｄを得るためのトランケーションおよびＣｙｓ１４Ｓｅｒ置換の位置を示す。チオエーテル結合およびＤ−チロシンが強調されている。図１０Ｂ〜１０Ｄは、酵素共役生物発光アッセイを使用する、ｉＰＧＭオルソログおよびｄＰＧＭアイソザイムにおけるＣｅ−２（図１０Ｂ）、Ｃｅ−２ｄ（図１０Ｃ）、およびＣｅ−２Ｓ（図１０Ｄ）の特徴付けのためのＩＣ５０濃度−応答曲線を示す一連のグラフである。プロットは個々の実験（Ｎ≧３）の代表であり、エラーバーは、技術的反復の標準偏差値である。挿入図は、０．５ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭ、０．５μＭ、および５μＭのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの、Ｃｅ−２での滴定である。図１０Ｅは、ＰＧＭの７種のオルソログのアミノ酸配列アラインメントについて構築された系統樹である。１，０００の反復に基づくブートストラップ値のパーセンテージを、分枝ノードにおいて示す。
【００１９】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＢｍおよびＣｅ環状ペプチドのｉＰＧＭ阻害活性、ならびにＣｅ−２およびＣｅ−２ｄのＧＥＭＢＥ分析についての、一連の代表的な濃度応答曲線（ＣＲＣ）である。図１１Ａは、Ｂｍ−１（上部）、Ｂｍ−４（中央）、およびＣｅ−３（下部）についての、一連のＣＲＣである。図１１Ｂは、Ｃｅ−２についてのＣＲＣを示す。双曲線応答からの有意な偏差は、このプロットのｉＰＧＭデータにフィットさせるために、５パラメータのＨｉｌｌの方程式を要した。ｉＰＧＭオルソログおよびｄＰＧＭアイソザイムからのデータは、酵素共役生物発光アッセイから決定された。ｉＰＧＭ濃度は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｂ．ｍａｌａｙｉでは５ｎＭ、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉでは１０ｎＭ、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓでは２０ｎＭ、およびＥ．ｃｏｌｉ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭでは５ｎＭであった。プロットは、表３に列挙する実験的反復の代表であり、エラーバーは、表３に記載するように定義される。図１１Ｃは、大環状ペプチドＣｅ−２およびＣｅ−２ｄのＧＥＭＢＥ分析を示すグラフである。阻害剤Ｃｅ−２（四角）またはＣｅ−２ｄ（菱形）で処理した、緑色：Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ、青色：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ、琥珀色：Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭ、黒色：Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭである。実験的反復からのｐＥＣ５０値（Ｎ）：Ｃｅ−２−（Ｂｍ  ｉＰＧＭ）８．３７±０．０４（２）；（Ｃｅ  ｉＰＧＭ）８．３６±０．０３（１）；（Ｅｃ  ｉＰＧＭ）８．４９±０．０３（３）；（Ｈｓ  ｄＰＧＭ）明らかな活性なし；Ｃｅ−２ｄ  −（Ｂｍ  ｉＰＧＭ）７．２１±０．１９（１）；（Ｃｅ  ｉＰＧＭ）８．４９±０．０２（１）；（Ｅｃ  ｉＰＧＭ）８．５０±０．０２（３）；（Ｈｓ  ｄＰＧＭ）明らかな活性なし。エラーバーは、実験的反復の標準偏差値である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＢｍおよびＣｅ環状ペプチドのｉＰＧＭ阻害活性、ならびにＣｅ−２およびＣｅ−２ｄのＧＥＭＢＥ分析についての、一連の代表的な濃度応答曲線（ＣＲＣ）である。図１１Ａは、Ｂｍ−１（上部）、Ｂｍ−４（中央）、およびＣｅ−３（下部）についての、一連のＣＲＣである。図１１Ｂは、Ｃｅ−２についてのＣＲＣを示す。双曲線応答からの有意な偏差は、このプロットのｉＰＧＭデータにフィットさせるために、５パラメータのＨｉｌｌの方程式を要した。ｉＰＧＭオルソログおよびｄＰＧＭアイソザイムからのデータは、酵素共役生物発光アッセイから決定された。ｉＰＧＭ濃度は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｂ．ｍａｌａｙｉでは５ｎＭ、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉでは１０ｎＭ、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓでは２０ｎＭ、およびＥ．ｃｏｌｉ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭでは５ｎＭであった。プロットは、表３に列挙する実験的反復の代表であり、エラーバーは、表３に記載するように定義される。図１１Ｃは、大環状ペプチドＣｅ−２およびＣｅ−２ｄのＧＥＭＢＥ分析を示すグラフである。阻害剤Ｃｅ−２（四角）またはＣｅ−２ｄ（菱形）で処理した、緑色：Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ、青色：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ、琥珀色：Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭ、黒色：Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭである。実験的反復からのｐＥＣ５０値（Ｎ）：Ｃｅ−２−（Ｂｍ  ｉＰＧＭ）８．３７±０．０４（２）；（Ｃｅ  ｉＰＧＭ）８．３６±０．０３（１）；（Ｅｃ  ｉＰＧＭ）８．４９±０．０３（３）；（Ｈｓ  ｄＰＧＭ）明らかな活性なし；Ｃｅ−２ｄ  −（Ｂｍ  ｉＰＧＭ）７．２１±０．１９（１）；（Ｃｅ  ｉＰＧＭ）８．４９±０．０２（１）；（Ｅｃ  ｉＰＧＭ）８．５０±０．０２（３）；（Ｈｓ  ｄＰＧＭ）明らかな活性なし。エラーバーは、実験的反復の標準偏差値である。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＢｍおよびＣｅ環状ペプチドのｉＰＧＭ阻害活性、ならびにＣｅ−２およびＣｅ−２ｄのＧＥＭＢＥ分析についての、一連の代表的な濃度応答曲線（ＣＲＣ）である。図１１Ａは、Ｂｍ−１（上部）、Ｂｍ−４（中央）、およびＣｅ−３（下部）についての、一連のＣＲＣである。図１１Ｂは、Ｃｅ−２についてのＣＲＣを示す。双曲線応答からの有意な偏差は、このプロットのｉＰＧＭデータにフィットさせるために、５パラメータのＨｉｌｌの方程式を要した。ｉＰＧＭオルソログおよびｄＰＧＭアイソザイムからのデータは、酵素共役生物発光アッセイから決定された。ｉＰＧＭ濃度は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｂ．ｍａｌａｙｉでは５ｎＭ、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉでは１０ｎＭ、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓでは２０ｎＭ、およびＥ．ｃｏｌｉ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭでは５ｎＭであった。プロットは、表３に列挙する実験的反復の代表であり、エラーバーは、表３に記載するように定義される。図１１Ｃは、大環状ペプチドＣｅ−２およびＣｅ−２ｄのＧＥＭＢＥ分析を示すグラフである。阻害剤Ｃｅ−２（四角）またはＣｅ−２ｄ（菱形）で処理した、緑色：Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ、青色：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ、琥珀色：Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭ、黒色：Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭである。実験的反復からのｐＥＣ５０値（Ｎ）：Ｃｅ−２−（Ｂｍ  ｉＰＧＭ）８．３７±０．０４（２）；（Ｃｅ  ｉＰＧＭ）８．３６±０．０３（１）；（Ｅｃ  ｉＰＧＭ）８．４９±０．０３（３）；（Ｈｓ  ｄＰＧＭ）明らかな活性なし；Ｃｅ−２ｄ  −（Ｂｍ  ｉＰＧＭ）７．２１±０．１９（１）；（Ｃｅ  ｉＰＧＭ）８．４９±０．０２（１）；（Ｅｃ  ｉＰＧＭ）８．５０±０．０２（３）；（Ｈｓ  ｄＰＧＭ）明らかな活性なし。エラーバーは、実験的反復の標準偏差値である。
【００２０】
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、大環状ペプチドアナログの一連の図である。図１２Ａは一連の環状ペプチドを示し、図１２Ｂは一連の直鎖状ペプチドを示す。ヒドロキシル基およびメチル基は、置換を示すために影が付けてある。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、大環状ペプチドアナログの一連の図である。図１２Ａは一連の環状ペプチドを示し、図１２Ｂは一連の直鎖状ペプチドを示す。ヒドロキシル基およびメチル基は、置換を示すために影が付けてある。
【００２１】
【図１３Ａ】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｃｅ−２の大環状ペプチドアナログについてのＰＧＭパネル活性を示す一連のグラフである。図１２Ａは、Ｃｅ−２Ｓ（Ｃｙｓ１４Ｓｅｒ置換）およびＣｅ−２ａ−ｇ（Ｃ末端アミノ酸トランケーションアナログ）の活性を示す一連のグラフである。図１３Ｂは、直鎖状ペプチドＣｅ−Ｌ２、Ｃｅ−Ｌ２ｄ、およびＣｅ−２ｔａｉｌの活性を示す一連のグラフである。Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ（黒四角）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ（上向き黒三角）、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ  ｉＰＧＭ（下向き黒三角）、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ  ｉＰＧＭ（黒ひし形）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭ（黒丸）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭ（白四角）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄＰＧＭ（上向き白三角）、およびＰＫ−ＦＬｕｃ（黒丸）。プロットは、表３に列挙する実験的反復の代表であり、エラーバーは、２つの技術的反復の標準偏差値である。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｃｅ−２の大環状ペプチドアナログについてのＰＧＭパネル活性を示す一連のグラフである。図１２Ａは、Ｃｅ−２Ｓ（Ｃｙｓ１４Ｓｅｒ置換）およびＣｅ−２ａ−ｇ（Ｃ末端アミノ酸トランケーションアナログ）の活性を示す一連のグラフである。図１３Ｂは、直鎖状ペプチドＣｅ−Ｌ２、Ｃｅ−Ｌ２ｄ、およびＣｅ−２ｔａｉｌの活性を示す一連のグラフである。Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ（黒四角）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ（上向き黒三角）、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ  ｉＰＧＭ（下向き黒三角）、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ  ｉＰＧＭ（黒ひし形）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭ（黒丸）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭ（白四角）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄＰＧＭ（上向き白三角）、およびＰＫ−ＦＬｕｃ（黒丸）。プロットは、表３に列挙する実験的反復の代表であり、エラーバーは、２つの技術的反復の標準偏差値である。
【００２２】
【図１４】図１４は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（配列番号４５）、Ｂ．ｍａｌａｙｉ（配列番号４６）、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ（配列番号４７）、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ（配列番号４８）、Ｅ．ｃｏｌｉ（配列番号４９）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（配列番号５０）、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ（配列番号５１）、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ（配列番号５２）、およびＴ．ｂｒｕｃｅｉ（配列番号５３）からのｉＰＧＭオルソログの配列アラインメントである。Ｃｅ−２ｄの５Å以内の残基は、オレンジ色に色付けられている。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭとＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭとの間で同一の残基は、黄色に色付けられている。灰色はヒンジ領域を示し、緑色および青色は金属イオンとリガンド結合するアミノ酸である。
【００２３】
【図１５Ａ−Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｃは、ｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄ複合体の非対称単位の構造を示す、一連の図である。図１５Ａは、サブユニットＡ（マゼンタ）およびＢ（シアン）を示すｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄの非対称単位を示す。Ｍｎ２＋およびＺｎ２＋イオンは、それぞれ青色および黄褐色の球で表され、各サブユニットに結合した環状ペプチドは、灰色の球として描かれている。図１５Ｂは、Ｃｅ−２ｄペプチドについての番号付けを伴う、サブユニットＡ（マゼンタ）と会合したペプチドについての、３σで輪郭を描いた電子密度マップ（メッシュ、Ｆｏ−Ｆｃ省略）を示す。残基Ｔｙｒ１１は、アミドとしてキャップされている。図１５Ｃは、Ｃｅ−２ｄのＣ末端のαヘリックス構造を示す。側鎖を伴う骨格トレースは、示されるαヘリックスの形成に関与する。
【００２４】
【図１６Ａ−Ｅ】図１６Ａ〜１６Ｅは、Ｃｅ−２ｄが開いた立体構造のｉＰＧＭを捕捉することを示す一連の図である。図１６Ａは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭへのＣｅ−２ｄ大環状分子の結合様式を示す非対称単位の１つのサブユニットを示す。Ｍｎ２＋およびＺｎ２＋イオンは、それぞれ青色および黄褐色の球で表され、結合した大環状分子は、５Å以内のｉＰＧＭ残基によって規定される空洞内のＣＰＫ空間充填球（透き通った球（transparent  sphere））として描かれている。図１６Ｂは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ−ｏ（シアン）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ−ｍ（黄褐色）、およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄ（アクアマリン）の重ね合わせを示す。Ｃｅ−２ｄペプチドは円筒として表される。図１６Ｃは、静電気的表面として表されるｉＰＧＭの裂け目内に位置する大環状分子（円筒）を示す。図１６Ｄは、５つのチロシン残基（１、３、７、９、および１１）の「キャッピング」方向を示す、Ｃｅ−２ｄのＣＰＫ空間充填描写を示し、図１６Ｅは、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ９のｅｄｇｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ相互作用を示す。さらなる残基が示されている。
【００２５】
【図１７Ａ−Ｃ】図１７Ａ〜１７Ｅは、Ｃｅ−２ｄ・ｉＰＧＭ相互作用を示す一連のパネルである。図１７Ａは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭとＣｅ−２ｄとの間の水素結合相互作用（黒色の破線）を示す。図１７Ｂは、直接的な相互作用および水（球）媒介性の接触を示す。図１７Ｃは、Ｔｙｒ１１のＣ末端アミドとＺｎ２＋およびＭｎ２＋イオンの中心との間の距離を示す。図１７Ｄは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ＿Ｃｅ−２ｄの構造と、２−ホスホグリセリン酸が結合した形態のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉＰＧＭの構造とを重ね合わせたものを示す（ＰＤＢ：４ＮＷＸ）。以下のＳ．Ａｕｒｅｕｓ：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ残基対をアラインメントに使用した：１２３Ｈｉｓ１４７、１５３〜１５４Ａｓｐ１７７〜１７８、１９１Ａｒｇ２１６、１８５Ａｒｇ２１０、２５７Ａｒｇ２８４、および２６０Ａｒｇ２８７。Ｃｅ−２ｄおよび２−ＰＧは、ＣＰＫ空間充填モデルとして示される。紫色の球はＳ．ａｕｒｅｕｓ  ｉＰＧＭのＭｎ２＋イオンであり、青色および黄褐色の球は、それぞれＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭのＭｎ２＋およびＺｎ２＋イオンである。図１７Ｅは、図１７Ｄからの拡大された一領域であり、２−ＰＧおよびＣｅ−２ｄの相対的位置を、透き通ったファンデルワールス表面と２−ＰＧの周りに集まるアラインメント残基側鎖とを伴う、円筒モデルとして示す。
【図１７Ｄ−Ｅ】図１７Ａ〜１７Ｅは、Ｃｅ−２ｄ・ｉＰＧＭ相互作用を示す一連のパネルである。図１７Ａは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭとＣｅ−２ｄとの間の水素結合相互作用（黒色の破線）を示す。図１７Ｂは、直接的な相互作用および水（球）媒介性の接触を示す。図１７Ｃは、Ｔｙｒ１１のＣ末端アミドとＺｎ２＋およびＭｎ２＋イオンの中心との間の距離を示す。図１７Ｄは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ＿Ｃｅ−２ｄの構造と、２−ホスホグリセリン酸が結合した形態のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉＰＧＭの構造とを重ね合わせたものを示す（ＰＤＢ：４ＮＷＸ）。以下のＳ．Ａｕｒｅｕｓ：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ残基対をアラインメントに使用した：１２３Ｈｉｓ１４７、１５３〜１５４Ａｓｐ１７７〜１７８、１９１Ａｒｇ２１６、１８５Ａｒｇ２１０、２５７Ａｒｇ２８４、および２６０Ａｒｇ２８７。Ｃｅ−２ｄおよび２−ＰＧは、ＣＰＫ空間充填モデルとして示される。紫色の球はＳ．ａｕｒｅｕｓ  ｉＰＧＭのＭｎ２＋イオンであり、青色および黄褐色の球は、それぞれＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭのＭｎ２＋およびＺｎ２＋イオンである。図１７Ｅは、図１７Ｄからの拡大された一領域であり、２−ＰＧおよびＣｅ−２ｄの相対的位置を、透き通ったファンデルワールス表面と２−ＰＧの周りに集まるアラインメント残基側鎖とを伴う、円筒モデルとして示す。
【００２６】
【図１８Ａ−Ｂ】図１８Ａおよび１８Ｂは、Ｃｄ−２ｄのＬｅｕ１０が占有する疎水性ポケットを示す図である。図１８Ａは、Ｌｅｕ１０および緑色のチオエーテル結合を有するＢ因子（Ｂ−ｆａｃｔｏｒ）のα鎖（金色）として示される、Ｃｅ−２ｄ大環状分子の５Å以内のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ残基（透き通った球の下の水色の鎖）を示す。ｉＰＧＭのＡｌａ３３４残基は、ＣＰＫ空間を充填するものとして示され、Ｍｎ２＋およびＺｎ２＋イオンは、それぞれ青色および黄褐色の球として表される。図１８Ｂは、ｉＰＧＭの側鎖をより明らかに表示するために透明の球を除いた図１８Ａを示す。
【００２７】
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｃは、薬理学的−系統学的なＣｅ−２大環状分子シリーズとｉＰＧＭオルソログとの関係の根底にある、構造的基礎を示す一連のパネルである。図１９Ａは、Ｃｅ−２大環状分子トランケーションシリーズのＩＣ５０とｉＰＧＭオルソログとの間の関係を示すグラフである。検出可能な阻害活性を有さないアナログは、不活性であると示される。値は表３からのものであり、ＩＣ５０＝１０−ｐＩＣ５０である場合、ｐＩＣ５０から変換される。エラーバーは、所与のペプチドについて決定された正規分布したＩＣ５０のｌｏｇのＳＤ値を表す。図１９Ｂは、ｉＰＧＭオルソログの一部の選択されたアミノ酸配列のアラインメントを示す（配列番号４５〜４９；図１４で示す完全なアラインメント）。Ｃｅ−２ｄの５Å以内のｉＰＧＭ残基はオレンジ色に色付けられている。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭとＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭとの間で同一の残基は黄色に色付けられており、灰色はヒンジ領域を示し、緑色および青色は金属イオンとリガンド結合するアミノ酸である。図１９Ｃは、示された選択側鎖（Ｔｙｒ３、Ｐｒｏ４、チオエーテル結合、およびＣ末端Ｔｙｒ１１アミド）を有する、Ｂ因子によってスケーリングされたワーム状のα鎖（金色）の描写として示される、Ｃｅ−２ｄ大環状分子の５Å以内のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの残基（透き通った球の下の水色の鎖）から形成された空洞を示す図である。ｉＰＧＭのＡｌａ３３４残基が、ＣＰＫ空間を充填するものとして示される。Ｃｅ−２ｄ結合空洞の静電気的表面も示されている。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜１９Ｃは、薬理学的−系統学的なＣｅ−２大環状分子シリーズとｉＰＧＭオルソログとの関係の根底にある、構造的基礎を示す一連のパネルである。図１９Ａは、Ｃｅ−２大環状分子トランケーションシリーズのＩＣ５０とｉＰＧＭオルソログとの間の関係を示すグラフである。検出可能な阻害活性を有さないアナログは、不活性であると示される。値は表３からのものであり、ＩＣ５０＝１０−ｐＩＣ５０である場合、ｐＩＣ５０から変換される。エラーバーは、所与のペプチドについて決定された正規分布したＩＣ５０のｌｏｇのＳＤ値を表す。図１９Ｂは、ｉＰＧＭオルソログの一部の選択されたアミノ酸配列のアラインメントを示す（配列番号４５〜４９；図１４で示す完全なアラインメント）。Ｃｅ−２ｄの５Å以内のｉＰＧＭ残基はオレンジ色に色付けられている。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭとＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭとの間で同一の残基は黄色に色付けられており、灰色はヒンジ領域を示し、緑色および青色は金属イオンとリガンド結合するアミノ酸である。図１９Ｃは、示された選択側鎖（Ｔｙｒ３、Ｐｒｏ４、チオエーテル結合、およびＣ末端Ｔｙｒ１１アミド）を有する、Ｂ因子によってスケーリングされたワーム状のα鎖（金色）の描写として示される、Ｃｅ−２ｄ大環状分子の５Å以内のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの残基（透き通った球の下の水色の鎖）から形成された空洞を示す図である。ｉＰＧＭのＡｌａ３３４残基が、ＣＰＫ空間を充填するものとして示される。Ｃｅ−２ｄ結合空洞の静電気的表面も示されている。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜１９Ｃは、薬理学的−系統学的なＣｅ−２大環状分子シリーズとｉＰＧＭオルソログとの関係の根底にある、構造的基礎を示す一連のパネルである。図１９Ａは、Ｃｅ−２大環状分子トランケーションシリーズのＩＣ５０とｉＰＧＭオルソログとの間の関係を示すグラフである。検出可能な阻害活性を有さないアナログは、不活性であると示される。値は表３からのものであり、ＩＣ５０＝１０−ｐＩＣ５０である場合、ｐＩＣ５０から変換される。エラーバーは、所与のペプチドについて決定された正規分布したＩＣ５０のｌｏｇのＳＤ値を表す。図１９Ｂは、ｉＰＧＭオルソログの一部の選択されたアミノ酸配列のアラインメントを示す（配列番号４５〜４９；図１４で示す完全なアラインメント）。Ｃｅ−２ｄの５Å以内のｉＰＧＭ残基はオレンジ色に色付けられている。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭとＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭとの間で同一の残基は黄色に色付けられており、灰色はヒンジ領域を示し、緑色および青色は金属イオンとリガンド結合するアミノ酸である。図１９Ｃは、示された選択側鎖（Ｔｙｒ３、Ｐｒｏ４、チオエーテル結合、およびＣ末端Ｔｙｒ１１アミド）を有する、Ｂ因子によってスケーリングされたワーム状のα鎖（金色）の描写として示される、Ｃｅ−２ｄ大環状分子の５Å以内のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの残基（透き通った球の下の水色の鎖）から形成された空洞を示す図である。ｉＰＧＭのＡｌａ３３４残基が、ＣＰＫ空間を充填するものとして示される。Ｃｅ−２ｄ結合空洞の静電気的表面も示されている。
【００２８】
【図２０Ａ−Ｂ】図２０Ａおよび２０Ｂは、Ｃｅ−２ｄ上へのＣｅ−２のＣ末端残基のモデリングを示す一対の図である。図２０Ａは、環状ペプチドの５Å以内の残基から形成されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ残基（透き通った球）の空洞内の、Ｂ因子によってスケーリングされたワーム状のα鎖（金色）の描写として、Ｃｅ−２ｄ大環状分子を示す。Ｃｅ−２のＣ末端残基−Ｇｌｙ１２−Ｔｈｒ１３−Ｃｙｓ１４−Ｇｌｙ１５を、ｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄ複合体上にモデリングし、Ｃｅ−２ｄから延びる黄褐色の棒として示す。結合空洞の静電気的表面も示す。図２０Ｂは、ＣＰＫモデルを使用する、Ｃｅ−２のファンデルワールス半径を示す。Ｃｙｓ１４スルフヒドリルは黄色で示されている。
【００２９】
【図２１】図２１は、Ｃｅ−２ｄコア構造に基づく、例示的な環状ｉＰＧＭ阻害剤ペプチドおよびアナログを示す概略図である。
【００３０】
【図２２Ａ】図２２Ａおよび２２Ｂは、様々な濃度の３−ＰＧ基質にわたって試験したＣｅ−２（右）およびＣｅ−２ｄ（左）についての濃度応答曲線（図２２Ａ）およびＩＣ５０の変動（図２２Ｂ）を示す一連のプロットである。連続的なＮＡＤＨ依存性の吸光度アッセイによって測定された基質添加後の１５分。使用したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ濃度は、Ｃｅ−２およびＣｅ−２ｄでそれぞれ約５および約１５ｎＭであった。吸光度値を酵素なし対照に対して正規化し、ＩＣ５０値を推定する目的で、４パラメータロジスティックフィットを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおいてプロットした。エラーバーは、４回の反復の標準偏差を表す。この研究において計算した場合、３−ＰＧのＫＭ＝２００μＭ。
【図２２Ｂ】図２２Ａおよび２２Ｂは、様々な濃度の３−ＰＧ基質にわたって試験したＣｅ−２（右）およびＣｅ−２ｄ（左）についての濃度応答曲線（図２２Ａ）およびＩＣ５０の変動（図２２Ｂ）を示す一連のプロットである。連続的なＮＡＤＨ依存性の吸光度アッセイによって測定された基質添加後の１５分。使用したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ濃度は、Ｃｅ−２およびＣｅ−２ｄでそれぞれ約５および約１５ｎＭであった。吸光度値を酵素なし対照に対して正規化し、ＩＣ５０値を推定する目的で、４パラメータロジスティックフィットを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおいてプロットした。エラーバーは、４回の反復の標準偏差を表す。この研究において計算した場合、３−ＰＧのＫＭ＝２００μＭ。
【００３１】
【図２３Ａ−Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｃは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ培養アッセイにおけるＣｅ−２およびＣｅ−２ｄのｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を示す一連のグラフである。Ｌ１期のＣ．ｅｌｅｇａｎｓを、５μＭ（図２３Ａ）または１０μＭ（図２３Ｂ）のＣｅ−２またはＣｅ−２ｄに１、２、および７日間曝露した。Ｌ４期のＣ．ｅｌｅｇａｎｓを、５０μＭのＣｅ−２、５０μＭのＣｅ−２ｄ、またはＤＭＳＯに曝露した（図２３Ｃ）。データは、３組の試料の平均±ｓ．ｄ．を表す。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｃは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ培養アッセイにおけるＣｅ−２およびＣｅ−２ｄのｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を示す一連のグラフである。Ｌ１期のＣ．ｅｌｅｇａｎｓを、５μＭ（図２３Ａ）または１０μＭ（図２３Ｂ）のＣｅ−２またはＣｅ−２ｄに１、２、および７日間曝露した。Ｌ４期のＣ．ｅｌｅｇａｎｓを、５０μＭのＣｅ−２、５０μＭのＣｅ−２ｄ、またはＤＭＳＯに曝露した（図２３Ｃ）。データは、３組の試料の平均±ｓ．ｄ．を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
配列表
本明細書および添付の配列表において提供される核酸配列およびアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義される、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸についての標準的な文字略記を使用して示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、相補鎖は、いかなる参照によっても、提示される鎖に含まれることが理解される。
【００３３】
配列番号１〜４は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭでのＲａＰＩＤスクリーニングで同定された環状ペプチドのアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号５および６は、配列番号２に基づく、修飾された環状ペプチドのアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号７〜９は、配列番号２に基づく、直鎖状ペプチドのアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号１０〜１６は、Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭでのＲａＰＩＤスクリーニングで同定された環状ペプチドのアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１７〜２２は、配列番号２に基づく、修飾された環状ペプチドのアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号２３〜２９は、Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭに対するＲａＰＩＤ選択によって同定された核酸配列である。
【００３９】
配列番号３０〜４４は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭに対するＲａＰＩＤ選択によって同定された核酸配列である。
【００４０】
配列番号４５〜５３は、ｉＰＧＭオルソログのアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号５４〜６９は、配列番号２に基づく、さらなる修飾された環状ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４２】
詳細な説明
線虫の生存に必須であるがヒトには存在しない酵素が、介入のための潜在的な標的となる。必須の線虫遺伝子は、自由生活性線虫であるＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓの比較ゲノム研究を使用して同定されている。その結果、フィラリア寄生虫におけるいくつかの新規な薬物標的が提案されている。最高位のものには、補因子非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｉＰＧＭ）（ＥＣ  ５．４．２．１）がある。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＢ．ｍａｌａｙｉにおけるｉｐｇｍをサイレンシングすると、線虫は死亡し（Zhangら、J.  Biol.  Chem.  ２７９巻：３７１８５〜３７１９０頁、２００４年；Singhら、Infect.  Dis.  Poverty  ２巻：５頁、２０１３年）、このことは、線虫の生存能力におけるこの酵素の重要性、したがって、駆虫薬標的としてのその潜在性を実証している。
【００４３】
ＰＧＭは、解糖経路および糖新生経路における２−および３−ホスホグリセレート（ＰＧ）の相互変換を触媒する。これらの経路は異なる生物の間で高度に保存されているが、２つの明確に異なるＰＧＭアイソエンザイム、すなわち、ｉＰＧＭおよび補因子依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｄＰＧＭ）が存在することは公知である。酵素はアミノ酸配列類似性を有さず、その触媒メカニズムは異なる。ｉＰＧＭはおよそ５１０のアミノ酸から構成され、ホスホセリン中間体を経るモノホスホグリセレート上へのホスホリル基の分子内移動を触媒し、線虫における唯一のＰＧＭである（Jedrzejasら、EMBO  J.  １９巻：１４１９〜１４３１頁、２０００年；Jedrzejasら、J.  Biol.  Chem.  ２７５巻：２３１４６〜２３１５３頁、２０００年）。逆に、ｄＰＧＭは、およそ２５０のアミノ酸から構成される、ヒトにおける酵素の形態であり、ホスホリルヒスチジン中間体を経るモノホスホグリセレートと補因子（２，３−ジホスホグリセレート）との間のホスホリル基の分子間移動を触媒する（Rigdenら、J.  Mol.  Biol.  ３１５巻：１１２９〜１１４３頁、２００２年）。ＰＧＭの２つの形態は、明確に異なるアイソザイムであるが、各アイソザイムファミリーのアミノ酸配列は、存在する場合、細菌から高等真核生物まで保存されている（Jedrzejasら、Prog.  Biophys.  Mol.  Biol.  ７３巻：２６３〜２８７頁、２０００年）。ｉＰＧＭ酵素およびｄＰＧＭ酵素の完全に異なる構造および触媒メカニズムは、線虫酵素に対する高い選択性を有する阻害剤の発見のために非常に有望である。さらに、ｉＰＧＭの間の一次配列および触媒特性における高い類似性は、単一の阻害剤が様々な寄生生物および微生物の酵素に対して効果的であり得ることを示す。しかし、ｉＰＧＭは、「ドラッガブルでない（undruggable）」とみなされており、それは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）では、これまで、この酵素の効力の弱い阻害剤が２つしか同定されていないためである（Crowtherら、PLoS  Neglected  Tropical  Diseases  ８巻：ｅ２６２８頁、２０１４年）。
【００４４】
本明細書では、ｉＰＧＭに対する強力かつアイソザイム選択的な阻害を示す一連の環状ペプチドおよびアナログが開示される。開示されるｉＰＧＭ阻害剤の同定は、「ドラッガブルでない」というこの標的の呼称を覆し、新規な抗微生物治療薬を提供する。本明細書において一部の場合では「イプグリセルミド（ipglycermide）」と呼ばれる親ペプチドは、そのそれぞれが同族のｍＲＮＡ鋳型上に提示される、一兆個の環状ペプチドメンバーを含有するライブラリーから同定された。これらのペプチドは、固有のラリアット構造を有する。一部の例では、環ペプチドは、チオエーテル結合によって閉じられている、その１つがＤ−チロシンである８つのアミノ酸残基からなり、テールペプチドは、Ｃ末端領域の、その１つがＬ−システイン（Ｃｙｓ）である７つの残基からなる。構造−活性関係の研究によって、環ペプチドがｉＰＧＭオルソログへの結合に関与する一方で、テールペプチド領域は阻害的薬理学の性質およびオルソログ選択性に関与することが明らかになった。
【００４５】
Ｉ．略記
ｄＰＧＭ    補因子依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ
ＧＥＭＢＥ  グラジエント溶離移動境界キャピラリー電気泳動
ＨＴＳ      ハイスループットスクリーニング
ｉＰＧＭ    補因子非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ
ＰＥＰ      ホスホエノールピルビン酸
ＰＧ        ホスホグリセレート
ＰＧＭ      ホスホグリセリン酸ムターゼ
ＰＫ        ピルビン酸キナーゼ
ＲａＰＩＤ  ランダムな非標準的ペプチド組み込みによる発見
【００４６】
ＩＩ．用語
別段の記載がない限り、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Oxford  University  Pressによって発行されたBenjamin  Lewin、Genes  VII、２０００年（ＩＳＢＮ０１９８７９２７６Ｘ）；Blackwell  Publishersによって発行されたKendrewら（編）、The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology、１９９４年（ＩＳＢＮ０６３２０２１８２９）；および、Wiley,  John  &  Sons,  Inc.  によって発行されたRobert  A.  Meyers（編）、Molecular  Biology  and  Biotechnology:  a  Comprehensive  Desk  Reference、１９９５年（ＩＳＢＮ０４７１１８６３４１）；および他の類似の参考文献において見出すことができる。
【００４７】
別段の説明がない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、語「または」は、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、「および」を含むものとする。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよび全ての分子量または分子質量の値は近似値であり、説明のために提供されることを理解されたい。本明細書において記載されるものに類似のまたは等しい方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。データベースの受託番号を伴う配列または構造は、別段の記載がない限り、示されたデータベースに２０１６年８月１１日の時点で存在するものとして、参照によって本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合、用語の説明を含み、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は例示的なものにすぎず、限定することを意図したものではない。
【００４８】
本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、以下に具体的な用語の説明を提供する。
【００４９】
アナログまたは誘導体：開示されるペプチドと１つまたは複数の位置で異なる化合物。アナログには、例えば、化学構造における増加（アルキル鎖の長さの違いなど）、分子断片、１つもしくは複数の官能基によって異なる構造、またはイオン化の変化によって異なる、親化合物と化学構造が異なる分子が含まれる。誘導体には、例えば１つの原子または原子群が別の原子または原子群で置き換えられている場合、親構造に由来する生物学的に活性な分子が含まれる。
【００５０】
環状ペプチド：少なくとも一部分が環構造を形成するペプチド。一部の例では、環状ペプチドは完全に環状であり、例えば、ヘッドトゥーテールの環化を有する。他の例では、環状ペプチドは、例えば側鎖とＮ末端、側鎖とＣ末端、側鎖と側鎖、または骨格と骨格とでの環化によって形成される、環構造および直鎖状ペプチド構造の両方を含む。特定の非限定的な例では、環状ペプチドは、Ｎ末端の環構造（例えば、側鎖とＮ末端とでの環化によって形成される）およびＣ末端の直鎖状部分（「テール」とも呼ばれる）を含む。
【００５１】
有効量：所望の効果を達成するために十分な特定の作用物質（agent）の分量、例えば、実質的な細胞毒性作用を被験体において引き起こすことなく疾患を阻害または処置するために十分な作用物質の量。例えば、これは、例えば微生物（寄生虫または細菌など）による感染、微生物の症候、または微生物の伝染を低減させるために有用な、ｉＰＧＭ阻害剤の量であり得る。
【００５２】
疾患を阻害または処置すること：「阻害すること」は、例えば疾患のリスクがある被験体において、疾患、障害、または状態の完全な発症を低減または遅延させる（またはさらには予防する）ことを指す。「処置」は、疾患または病態が発症し始めた後にその兆候または症候を改善する治療的介入を指す。本明細書において使用される場合、疾患、病態、または症候に関連する用語「改善すること」は、処置の任意の観察可能な有利な効果を指す。有利な効果は、例えば、感染しやすい被験体における疾患の臨床的症候の発病の遅延、疾患の一部のもしくは全ての臨床的症候の重症度の低減、疾患の進行の減速、疾患の再発数の低減、被験体の全体的な健康もしくは良好な状態の向上、または、当業者に公知の、特定の疾患に特異的な他のパラメータによって、証明することができる。
【００５３】
単離された：「単離された」生体構成成分（核酸、タンパク質、ペプチド、または病原体など）は、他の生体構成成分（細胞残屑、または他のタンパク質もしくは核酸など）から実質的に分離または精製されている。「単離されて」いる生体構成成分には、標準的な精製方法によって精製されたこれらの生体構成成分が含まれる。用語はまた、組換え核酸、ペプチド、または病原体、および化学合成された核酸またはペプチドも包含する。用語「単離された」（または「富化された」または「精製された」）は、完全に純粋である必要はなく、少なくとも５０％単離された、例えば、少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはさらには１００％単離された分子（ペプチドなど）を含み得る。
【００５４】
微生物：顕微鏡を介してのみ見ることができる生物。微生物には、細菌、原生動物、藻類、および真菌、ならびに顕微鏡的な多細胞生物、例えば線虫が含まれる。
【００５５】
線虫：回虫（roundworm）と一般に呼ばれる、Ｎｅｍａｔｏｄａ門のメンバー。線虫には、自由生活性種（土壌線虫であるＣ．ｅｌｅｇａｎｓなど）および寄生性種が含まれる。ヒトに寄生する種には、回虫（ascarid）（例えば、Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、フィラリア、鉤虫（例えば、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅまたはＮｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、ぎょう虫、および鞭虫が含まれる。例示的な種には、ヒトにおいてリンパ浮腫、水瘤、および極端な場合、象皮症を引き起こす、Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、およびＢｒｕｇｉａ  ｔｉｍｏｒｉが含まれる。Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓは、オンコセルカ症（「河川盲目症」）および重度の皮膚炎を引き起こす。寄生性線虫はまた、イヌおよびネコ（例えば、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ、イヌ糸状虫）、ブタ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、およびヒツジ（例えば、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）を含む伴侶動物および家畜にも感染する。昆虫および植物に寄生する線虫種も存在する。
【００５６】
薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来の通りである。Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、The  University  of  the  Sciences  in  Philadelphia、Lippincott,  Williams,  &  Wilkins編、Philadelphia、PA、第２１版（２００５年）は、単独のまたは追加の医薬品と組み合わせた１つまたは複数のｉＰＧＭ阻害剤ペプチドなどの１つまたは複数の治療用化合物または分子の薬学的送達に適した組成物および製剤を記載している。
【００５７】
一般に、担体の性質は、用いられる特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射可能な流体を、ビヒクルとして含む。固体組成物（例えば、粉剤・散剤（powder）、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態）では、従来の無毒の固体担体には、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与する医薬組成物は、微量の無毒の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。
【００５８】
ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＭ）：３−ホスホグリセレートから２−ホスホグリセレートへの可逆的変換を触媒する酵素。２つのクラスのＰＧＭが存在する。補因子非依存性ＰＧＭ（ｉＰＧＭ）（ＥＣ５．４．２．１２）および補因子依存性ＰＧＭ（ｄＰＧＭ）（ＥＣ５．４．２．１１）。ｉＰＧＭは、限定はしないが、植物、藻類、真菌、線虫、および一部の細菌（一部のグラム陽性細菌など）を含む生物において見出される。この酵素は、ホスホセリン中間体を経る２−ＰＧおよび３−ＰＧの異性化を触媒する。ｄＰＧＭは、限定はしないが、脊椎動物、軟体動物、甲殻類、昆虫、藻類、真菌、および一部の細菌（一部のグラム陰性細菌など）を含む生物において見出される。ｄＰＧＭは、ホスホヒスチジン中間体を経る２−ＰＧおよび３−ＰＧの異性化を触媒する。
【００５９】
ＰＧＭの核酸配列およびアミノ酸配列は、公開されている。例示的なＰＧＭアミノ酸配列には、ＧｅｎＢａｎｋに２０１６年８月１１日の時点で存在するものとして、その全てが参照によって本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿８７１８５１（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ＡＡＱ９７６２６（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ）、ＡＡＶ３３２４７（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、ＡＥＡ９１５３４（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ＮＰ＿００２６２０（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）、ならびにＰ３７６８９およびＰ６２７０７（Ｅ．ｃｏｌｉ）が含まれる。当業者であれば、さらなるＰＧＭ配列およびそのバリアントを同定することができる。
【００６０】
被験体：生存する、例えば哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである多細胞脊椎動物の生物。哺乳動物という用語には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。同様に、用語「被験体」には、ヒトおよび獣医学または実験室用の被験体の両方、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびウシ（cow）が含まれる。
【００６１】
ＩＩＩ．ＰＧＭのペプチド阻害剤
本明細書では、ＰＧＭ（例えば、ｉＰＧＭ）の活性を阻害するペプチドが開示される。一部の例では、ペプチドは、ｄＰＧＭと比較してｉＰＧＭの活性を選択的にまたは特異的に阻害する。一部の例では、ｉＰＧＭを選択的にまたは特異的に阻害する（例えば、その活性を低下させる）作用物質は、ｉＰＧＭの活性を低下させるがｄＰＧＭの活性は実質的に低下させない化合物である。例えば、選択的なｉＰＧＭ阻害剤は、ｉＰＧＭの活性を低下させ得るが、ｄＰＧＭに対しては如何なる評価可能な活性も示し得ない。他の例では、ｉＰＧＭの選択的阻害剤は、それがｄＰＧＭの活性を低下させるよりも、ｉＰＧＭの活性を少なくとも２倍高く（例えば、少なくとも５倍高く、少なくとも１０倍高く、少なくとも２０倍高く、５０倍高く、１００倍高く、５００倍高く、１０００倍高く、２０００倍高く、５０００倍高く、１０，０００倍高く、またはそれを超えて）低下させる作用物質である。特定の作用物質がｉＰＧＭを選択的にまたは特異的に阻害するという決定は、ＰＧＭ活性を決定するための通常の手順を使用してまたは適合させることにより容易に行うことができる。ｉＰＧＭおよびｄＰＧＭの活性を測定する例示的な方法は、以下の実施例１に記載する。
【００６２】
一部の実施形態では、開示されるペプチドは、ｉＰＧＭの活性を１００μＭもしくはそれより低い、例えば、５０μＭもしくはそれより低い、１０μＭもしくはそれより低い、５μＭもしくはそれより低い、１μＭもしくはそれより低い、５００ｎＭもしくはそれより低い、１００ｎＭもしくはそれより低い、５０ｎＭもしくはそれより低い、１０ｎＭもしくはそれより低い、５ｎＭもしくはそれより低い、１ｎＭもしくはそれより低い、または１００ｐＭもしくはそれより低いＩＣ５０で阻害する。他の例では、開示されるペプチドは、ｉＰＧＭの活性を約１ｐＭ〜１００μＭ、例えば、約５ｐＭ〜１０ｎＭ、約１０ｐＭ〜５０ｎＭ、約１００ｐＭ〜１００ｎＭ、約１ｎＭ〜１００ｎＭ、約１０ｎＭ〜１μＭ、約１００ｎＭ〜１０μＭ、または約１μＭ〜１００μＭのＩＣ５０で阻害する。
【００６３】
特定の例では、ペプチドは環状ペプチドである。しかし、一部の例では、ｉＰＧＭ活性を阻害する直鎖状ペプチドもまた本明細書において開示される。一部の実施形態では、ペプチドは、長さが６〜２０アミノ酸（例えば、長さが、６〜１５、８〜２０、または１０〜２０アミノ酸、例えば、長さが、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸）である。一部の例では、ｉＰＧＭ阻害剤ペプチドは、６〜１５アミノ酸（例えば、７〜１３、８〜１２、９〜１１、または１０〜１５アミノ酸、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸）の環部分、および１〜９アミノ酸（例えば、１〜５、２〜７、または４〜８アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９アミノ酸）の直鎖状部分を有する。具体的な非限定的な例では、ｉＰＧＭ阻害剤ペプチドは、８アミノ酸の環状部分、および３〜７アミノ酸の直鎖状部分を有する。以下で議論するように、ペプチドのアナログまたは誘導体（修飾されたアミノ酸配列、および／またはＮ末端、Ｃ末端、ペプチド骨格、もしくは側鎖に修飾を有するペプチドなど）もまた、本明細書において開示される。一部の実施形態では、ペプチドまたはそのアナログもしくは誘導体には、薬学的に許容される塩またはエステルが含まれる。
【００６４】
一部の実施形態では、ＰＧＭ阻害剤は、以下の環状ペプチドを含むかまたはそれらからなる。
【化１】
2019527721.tif 000003
【化２】
2019527721.tif 000004
【化３】
2019527721.tif 000005
【化４】
2019527721.tif 000006
【００６５】
他の実施形態では、ＰＧＭ阻害剤は、以下の直鎖状ペプチドを含むかまたはそれからなる：
YDYPGDYSYLYGTCG（配列番号７）。
【００６６】
本明細書において開示される具体的な例では、環状ペプチドの環部分は、ペプチド内のシステイン残基とＮ末端のクロロアセチル基との間のチオエーテル結合を形成することによって生成される（例えば、表２、６、８、および９、ならびに図１２Ａおよび２１において示されるように）。しかし、さらなるリンカーを利用して、環状ペプチドを形成することができる。例えば、一部の例では、ペプチドの環部分は、芳香族または脂肪族リンカーを使用して形成される。例えば、ペプチドの環状部分は、１〜６炭素鎖などの脂肪族リンカーを使用して形成することができる。他の例では、結合は、芳香族基を含み得る。
【００６７】
さらに、本明細書において開示される具体的な例では、環状ペプチドは、側鎖とＮ末端とでの環化によって形成される（例えば、表２、６、８、および９、ならびに図１２Ａおよび２１において示されるように）。しかし、当業者には、さらなるタイプの環化（ヘッドトゥーテール、側鎖と側鎖、側鎖とＣ末端、または骨格と骨格とでの環化など）も環状ｉＰＧＭ阻害剤ペプチドを形成するために利用することができることが認識されよう。
【００６８】
また、本明細書において記載されるものなどのｉＰＧＭ阻害剤のアナログまたは誘導体も開示される。アナログには、例えば、化学構造における増加（アルキル鎖の長さの違いなど）、分子断片、１つもしくは複数の官能基によって異なる構造、またはイオン化の変化によって異なる、親化合物と化学構造が異なる分子が含まれる。誘導体には、例えば１つの原子または原子群が別の原子または原子群で置き換えられている場合、親構造に由来する生物学的に活性な分子が含まれる。したがって、一部の例では、アナログまたは誘導体には、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加によって開示されるペプチドと異なる化合物が含まれる。アナログまたは誘導体にはまた、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、ペプチド骨格、および／またはアミノ酸側鎖での１つまたは複数の原子または原子群の１つまたは複数の修飾、例えば、置換、付加、および／または欠失によって開示されるペプチドと異なる化合物も含まれる。さらに、アナログまたは誘導体には、ペプチドの１つまたは複数のアミノ酸の変化と原子または原子群の１つまたは複数の変化の組合せが含まれ得る。
【００６９】
一部の例では、開示されるペプチドのアナログは、ペプチドの環化を可能にする修飾を含む。したがって、非限定的な一例では、アナログは、ペプチド内のシステイン残基へのチオエーテル結合（thioether  bond）を経てペプチドの環化を可能にする、Ｎ末端アセチル基（例えば、Ｎ末端クロロアセチル）を含む。他の例では、ペプチド（配列番号１〜２２または５４〜６９のいずれか１つなど）は、Ｃ末端アミドの修飾を含む。一部の例では、ペプチドは全てＬ−アミノ酸を含むが、他の例では、アナログは１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含む。特に、非限定的な例では、アナログは、Ｃｅ２またはＣｅ−２ｄなどのＤ−チロシン（例えば、Ｄ−Ｎ−クロロアセチルチロシン）を、Ｎ末端アミノ酸として含む。
【００７０】
さらに別の例では、開示されるペプチドのアナログには、１つもしくは複数のアミノ酸の置換、１つもしくは複数のアミノ酸の欠失（限定はしないが、トランケーション変異体を含む）、および／または１つもしくは複数のアミノ酸の付加を有するペプチドが含まれる。別の例では、開示されるペプチドの誘導体は、システイン残基（開示されるペプチドのいずれか１つの直鎖状部分におけるシステイン残基など）のスルフヒドリル基の、ヒドロキサム酸、ジケト酸、または金属イオンキレーターでの置換を含む。さらなる例では、ペプチドは、安定性（例えば、タンパク質分解に対する耐性）を増大させるための修飾、例えば、ペプチドの直鎖状部分における１つまたは複数のＮ−メチルアミドを含む（表９で示すものによって例示される）。さらに別の例では、炭素鎖（１〜８炭素鎖など）が、本明細書において開示される環状ペプチドのいずれかのＣ末端に付加される。さらに別の例では、アミノアルキルチオール（Ｃ１〜Ｃ８アルキルなど）が、本明細書において開示される環状ペプチドのいずれかのＣ末端に付加される。一部の例では、Ｃ末端炭素鎖またはアミノアルキルチオールは、Ｃ末端に遊離チオール、アルキルチオエステル（Ｃ１〜Ｃ９）、またはアルキル酸を含む。例示的なアナログを図２１に示す。これらは、Ｃｅ−２ｄのコア構造に関して示されたものであるが、対応する修飾を、本明細書において開示されるペプチドのいずれかに行うことができる。修飾または置換の任意の組合せが、本明細書において企図される。
【００７１】
さらなる例では、開示されるペプチドのアナログは、１つまたは複数の（例えば１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの）チロシン残基の、４−Ｆ−Ｐｈｅまたは４−ＭｅＯ−Ｐｈｅでの置き換えを含む。一部の例では、チロシン残基は、開示されるペプチド（配列番号１など）のＴｙｒ１、Ｔｙｒ３、Ｔｙｒ９、またはＴｙｒ１１に対応する。さらなる例では、チロシン残基は、開示されるペプチド（配列番号２など）のＴｙｒ７に対応する。本明細書において開示される他のペプチドにおける対応するチロシン残基は、当業者によって同定され得る。他の修飾は、負の電荷を低減させることによって、例えば、Ａｓｐ２をＡｓｎもしくはＨｉｓで置き換えることによって、および／またはアルキルリンカーに第三級アミンなどの正の電荷を含めることによって、分子の塩基度を増大させることを含む。
【００７２】
開示されるペプチドおよびアナログまたは誘導体は、１つまたは複数の薬学的に許容される塩またはエステルの形態であり得る。開示されるペプチドの薬学的に許容される塩には、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛などの陽イオンから、ならびにアンモニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチル−グルタミン、リシン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およびテトラメチルアンモニウムヒドロキシドなどの塩基から形成されるものが含まれる。塩は、標準的な手順によって、例えば、遊離酸と適切な有機または無機塩基とを反応させることによって、調製することができる。代表的な塩基には、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リシン、アルギニン、およびヒスチジンなどが含まれる。一態様では、反応は、単独のまたは不活性の水混和性有機溶媒と組み合わせた水の中で、約０℃〜約１００℃の温度で、例えば室温で行われる。使用する化合物のモル比は、任意の特定の塩にとって望ましい比率をもたらすように選択される。一部の例では、ペプチドは、中性の塩を得るために、およそ１当量の薬学的に許容される塩基で処理することができる。薬学的に許容される塩はまた、遊離酸、塩基、および両性イオンの形態も含む。適切な薬学的に許容される塩についての記載は、Handbook  of  Pharmaceutical  Salts,  Properties,  Selection  and  Use、Wiley  VCH（２００２年）で見出すことができる。
【００７３】
薬学的に許容されるエステルには、限定はしないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、フェニル、ピリジニル、およびベンジルなどが含まれる。薬学的に許容されるエステルは、例えば、化合物を、適切な量のカルボン酸、エステル、酸塩化物、酸無水物、または、対応する薬学的に許容されるエステルをもたらす混合無水作用物質で処理することによって調製することができる。薬学的に許容されるエステルを調製するために使用することができる典型的な作用物質には、例えば、酢酸、無水酢酸、塩化アセチル、ハロゲン化ベンジル、ベンズアルデヒド、塩化ベンゾイル、メチルエチルアンヒドリド、メチルフェニルアンヒドリド、およびヨウ化メチルなどが含まれる。非限定的な一例では、開示されるペプチドの薬学的に許容されるエステルは、システインエステル（システインアルキルエステル、システインエチルエステル、またはＮ−アセチルシステインエステルなど）または図２１で示すエステルである。
【００７４】
ＩＶ．障害を処置または阻害する方法
本明細書では、本明細書において記載されるＰＧＭの阻害剤を使用する、障害（感染など）を処置または阻害する方法が開示される。一部の実施形態では、方法は、ｉＰＧＭなどのＰＧＭを発現する生物による感染および／またはその生物によって引き起こされる疾患を処置または阻害することを含む。ｉＰＧＭを発現する生物には、限定はしないが、線虫、真菌、細菌（グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌を含む）、トリパノソーマ、原生動物寄生虫、蠕虫、植物、および藻類が含まれる。一部の非限定的な例では、方法は、線虫（限定はしないが、Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ、Ｂｒｕｇｉａ  ｔｉｍｏｒｉ、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ、Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｌｏａ  ｌｏａ、Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｅｒｃａ、Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ  ｐｅｒｓｔａｎｓ、Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ  ｏｚｚａｒｄｉ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ、Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ  ｂｏｖｉｃｏｌａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｄｅｒｍａｔａｎ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｏｃｈｅｎｇｉ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｄｕｋｅｉ、Ｓｔｅｎｏｆｉｌａｒｉａ  ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ、およびＰａｒａｆｉｌａｒｉａ  ｍｕｌｔｉｐａｐｉｌｌｏｓａを含む）による感染を処置または阻害することを含む。他の非限定的な例では、方法は、ｉＰＧＭを発現するグラム陽性細菌（限定はしないが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを含む）による感染を処置または阻害することを含む。他の例では、方法は、ｉＰＧＭを発現する生物、例えば、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉまたはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉなど）もしくは原生動物寄生虫（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌ．ｍａｊｏｒ、Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ、Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、またはＰ．ｋｎｏｗｌｅｓｉなど）、Ｂａｂｅｓｉａ、またはＧｉａｒｄｉａによって引き起こされる感染および／または疾患を処置または阻害することを含む。別の例では、方法は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを含む、ｉＰＧＭを発現するグラム陰性細菌による感染を処置または阻害することを含む。一部の例では、感染および／または疾患は、ｉＰＧＭのみを発現する生物によって引き起こされるが、他の例では、感染および／または疾患は、ｉＰＧＭおよびｄＰＧＭの両方を発現する生物によって引き起こされる。
【００７５】
特定の例では、方法は、被験体に、有効量の、本明細書において開示される１つまたは複数のｉＰＧＭ阻害剤ペプチドを含む組成物を投与することを含む。一部の例では、被験体は、線虫、蠕虫、トリパノソーマ、原生動物寄生虫、または細菌の１つまたは複数に感染している。特定の例では、被験体は、限定はしないが、リンパ系フィラリア症（例えば、リンパ浮腫、水瘤、および／または象皮症）、皮下フィラリア症（皮膚炎および／または失明など）、または漿膜腔フィラリア症を含む、線虫によって引き起こされる疾患を有する。他の例では、被験体は、心臓フィラリア症（例えばイヌまたはネコにおけるイヌ糸状虫）、寄生虫性の出血性皮膚炎（ウシ（cattle））、皮内オンコセルカ症（onchocercosis）（ウシ）、「夏季出血（summer  bleeding）」（ウマ、Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ  ｍｕｌｔｉｐａｐｉｌｌｏｓａによって引き起こされる）、または旋毛虫症（trichnosis）を有する。他の例では、被験体は、限定はしないが、アフリカ睡眠病（またはナガナ病、ウシにおける）、シャーガス病、リーシュマニア症、ジアルジア症、バベシア症、またはマラリアを含む、原生動物寄生虫によって引き起こされる疾患を有する。さらに別の例では、被験体は、限定はしないが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染を含む、細菌感染を有する。
【００７６】
一部の実施形態では、被験体は、ｉＰＧＭの１つまたは複数の環状ペプチド阻害剤、例えば、配列番号１〜６、１０〜２２、および５４〜６９のいずれか１つのアミノ酸配列を有する１つもしくは複数の環状ペプチド（例えば、表２、６、８、もしくは９、または図１２Ａ〜１２Ｂもしくは２１に示す環状ペプチドの１つまたは複数）、またはそのアナログもしくは誘導体、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含む、有効量の組成物を投与される。他の例では、被験体は、ｉＰＧＭの１つまたは複数の直鎖状ペプチド阻害剤、例えば、配列番号７〜９のアミノ酸配列を有する１つもしくは複数のペプチド、またはそのアナログもしくは誘導体、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含む、有効量の組成物を投与される。他の例では、被験体は、本明細書において開示されているものなどの、１つまたは複数の環状ペプチドｉＰＧＭ阻害剤および１つまたは複数の直鎖状ペプチドｉＰＧＭ阻害剤を含む、有効量の組成物を投与される。特定の非限定的な例では、被験体は、ペプチドＣｅ−２（Ｎ末端とＣｙｓ８との間での環化を有する配列番号２）、またはそのアナログもしくは誘導体、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含む、有効量の組成物を投与される。
【００７７】
開示されるペプチドは、当業者に公知の任意の手段によって、例えば、筋肉内、皮下、腹腔内、または静脈内注射によって投与することができるが、さらに経口、経鼻、または肛門投与も企図される。開示されるペプチドはまた、局所的に、経皮的に、または局部注射によって投与することができる。一部の実施形態では、投与は、経口的、静脈内注射による、または局所的である。ペプチドを、感染を阻害または処置するために利用できる時間を延ばすために、ペプチドは、埋植物（implant）、油性注射として、または微粒子系として提供することができる。微粒子系は、ミクロ粒子、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノ粒子、ナノカプセル、または類似の粒子であり得る。当業者であれば、ペプチドを被験体に投与する方法を認識している。例えば、Banga、「Parenteral  Controlled  Delivery  of  Therapeutic  Peptides  and  Proteins」、Therapeutic  Peptides  and  Proteins、Technomic  Publishing  Co．,  Inc．、Lancaster、PA、１９９５年を参照されたい。
【００７８】
一部の例では、提供されるペプチドは、ヒトまたは動物被験体に投与するための薬学的に許容される担体またはビヒクルと組み合わされる。一部の実施形態では、１つより多くの開示されるペプチド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多いペプチド）を組み合わせて、単一の調製物を形成することができる。適切な薬学的に許容される担体、ビヒクル、または賦形剤の例には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、および／またはエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。水性担体には、水、食塩水および緩衝媒体を含むアルコール性／水性の溶液、エマルジョン、または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内のビヒクルには、流体および栄養補充物、および電解質補充物（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの、防腐剤および他の添加物もまた存在し得る。
【００７９】
本明細書において提供されるペプチドおよび医薬組成物は、様々な経路、例えば、頬側および舌下を含む経口、直腸、非経口、エアロゾル、経鼻、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および局所的な経路を介して投与することができる。これらは、限定はしないが、溶液、エマルジョンおよび懸濁液、ミクロスフェア、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子、およびリポソームを含む、様々な形態で投与することができる。
【００８０】
別の実施形態では、ペプチドまたは医薬組成物を、処置を必要とするエリアに局部的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、限定するものではないが、局部的もしくは領域的な注入もしくはかん流、局所的適用、注射、カテーテル、坐剤、または埋植物（例えば、多孔質、非多孔質もしくはゼラチン質の材料、例えば膜、例えばシラスティック（sialastic）膜、または線維から形成された埋植物）などによって達成することができる。
【００８１】
具体的な実施形態では、１つまたは複数の開示されるペプチドは、埋植物にコーティングするまたは浸透させるかのいずれかによって会合させることができる。一例では、埋植物を、部分的にまたは完全にペプチドでコーティングしてよい。ペプチドは、連結剤（linking  agent）を含む任意の化学的または機械的な結合または力によって、埋植物に付着させることができる。あるいは、コーティングを、シラン基などを介して表面に直接結合させて（繋いで）もよい。他の例では、埋植物に、当業者に公知の方法によって少なくとも１つのペプチドを浸透させて、埋植物の複数の表面（外表面および内表面など）がペプチドを含むようにしてもよい。さらなる実施形態では、埋植物に、開示されるペプチドに加えて、生物学的利用性をさらに高めるための材料をコーティングするかまたは浸透させてもよい。適切なコーティングの例は、薬物適用コーティング、薬物溶出コーティング、親水性コーティング、または平滑化コーティングである。
【００８２】
一実施形態では、投与は、処置される組織の部位での直接的な注射によるものであり得る。別の実施形態では、医薬組成物は、小胞で、特にリポソームで送達される（例えば、Langer、Science  ２４９巻：１５２７〜１５３３頁、１９９０年；Treatら、Liposomes  in  the  Therapy  of  Infectious  Disease  and  Cancer、Lopez-BeresteinおよびFidler（編）、Liss、N.Y.、３５３〜３６５頁、１９８９年を参照されたい）。
【００８３】
さらに別の実施形態では、医薬組成物は、制御放出系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（例えば、Langer  Science  ２４９巻：１５２７〜１５３３頁、１９９０年；Sefton  Crit.  Rev.  Biomed.  Eng.  １４巻：２０１〜２４０頁、１９８７年；Buchwaldら、Surgery  ８８巻：５０７〜５１６頁、１９８０年；Saudekら、N.  Engl.  J.  Med.  ３２１巻：５７４〜５７９頁、１９８９年を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（例えば、Rangerら、Macromol.  Sci.  Rev.  Macromol.  Chem.  ２３巻：６１〜６４頁、１９８３年；Levyら、Science  ２２８巻：１９０〜１９２頁、１９８５年；Duringら、Ann.  Neurol.  ２５巻：３５１〜３５６頁、１９８９年；およびHowardら、J.  Neurosurg.  ７１巻：１０５〜１１２頁、１９８９年を参照されたい）。Langer（Science  ２４９巻：１５２７〜１５３３頁、１９９０年）による概説において論じられているものなどの、他の制御放出系もまた、使用することができる。
【００８４】
例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性もしくは油性懸濁剤、分散性の粉剤・散剤もしくは顆粒剤、エマルジョン  ハードもしくはソフトカプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤などの、経口使用のための医薬組成物もまた製剤化することができる。このような組成物は、医薬組成物を製造するための当技術分野で公知の標準的な方法に従って調製することができ、薬学的に優れた、かつ味の良い調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤の群から選択される１つまたは複数の作用物質を含有し得る。錠剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；トウモロコシデンプンまたはアルギン酸などの顆粒化剤および崩壊剤；デンプン、ゼラチン、またはアカシアなどの結合剤；およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどの滑沢剤を含む、適切な無毒の薬学的に許容される賦形剤と混ぜられた活性成分を含有する。錠剤はコーティングされていなくてよく、または錠剤は、消化管における崩壊および吸収を遅延させ、それによってより長い期間にわたって作用を持続させるために、公知の技術によってコーティングすることができる。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いることができる。経口使用のための医薬組成物はまた、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンと混合された、ハードゼラチンカプセル剤として、あるいは、活性成分が水、またはピーナッツ油、液体パラフィン、もしくはオリーブオイルなどの油性媒体と混合された、ソフトゼラチンカプセル剤として提示され得る。
【００８５】
ペプチドは、単位剤形として都合よく提示し、従来の薬学的技術を使用して調製することができる。このような技術は、活性成分と薬学的担体（複数種可）または賦形剤（複数種可）とを組み合わせる（bringing  into  association）ステップを含む。一般に、製剤は、活性成分と液体担体とを均一かつ密接に組み合わせることによって調製される。非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および／または製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る、水性および非水性の無菌の注射液剤；ならびに、懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の無菌の懸濁剤を含む。製剤は、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル中で提供してもよく、また、使用の直前に無菌の液体担体、例えば注射用水の添加のみを要する、フリーズドライの（凍結乾燥された）状態で保管することができる。注射液剤および懸濁剤は、当業者によって一般的に使用される無菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【００８６】
ある特定の実施形態では、単位投薬量の製剤は、投与される成分の一用量もしくは一単位、または適切なその分割を含有するものである。上記で特に言及した成分に加えて、本明細書に包含される製剤が当業者によって一般的に使用される他の作用物質を含み得ることを理解されたい。
【００８７】
有効となるペプチド（複数種可）の量は、処置される障害または状態の性質、および障害または状態のステージに依存する。有効量は、標準的な臨床的技術によって決定することができる。製剤において用いられる正確なペプチド（複数種可）の用量はまた、投与経路にも依存し、健康管理医の判断および各被験体の状況に従って決定されるべきである。このような投薬量範囲の例は、単回または分割用量で１μｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、約５μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２〜１００ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜２５ｍｇ／ｋｇ、約５〜７５ｍｇ／ｋｇ、約５０〜１５０ｍｇ／ｋｇ、または約１００〜２００ｍｇ／ｋｇ）である。投薬量範囲の別の例は、単回または分割用量で１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、約１〜１００μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約５〜２５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜８０ｍｇ／ｋｇ、または約６０〜１００ｍｇ／ｋｇ）である。例えば、適切な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇである。単位剤形もまた可能であり、例えば、用量当たり０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、または最大１０００ｍｇである。しかし、より高いまたはより低い他の投薬量もまた使用することができ、それはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの試験によって決定することができる。
【００８８】
任意の特定の被験体に対する投薬の具体的な用量レベルおよび頻度は変化し得、具体的な化合物の活性、その化合物の代謝の安定性および作用の長さ、処置される特定の疾患または障害、年齢、体重、全体的健康、性別、食事、投与の様式および時間、排泄速度、ならびに／または投与される任意の薬物の組合せを含む、様々な因子に依存する。処置は、数日間または数週間から数ヶ月、またはさらには数年の期間にわたる、化合物（複数種可）の毎日もしくは毎日複数回、毎週、隔月、または毎月の用量を必要とし得る。
【００８９】
本開示の医薬組成物は、処置期間の全体にわたってほぼ同一の用量で、漸増用量レジメンで、または負荷用量投薬計画（regime）（例えば、負荷用量が維持用量の約２〜５倍である投薬計画）で投与することができる。一部の実施形態では、用量は、処置の途中で、処置される被験体の状態、疾患もしくは状態の重症度、療法に対する見かけの応答、および／または当業者によって判断される他の因子に基づいて変更される。
【００９０】
開示されるペプチドは、単独で、または記載された状態を処置するために使用される他の組成物もしくは薬物との組合せ療法で使用することができる。このような組合せ療法には、限定はしないが、関与する薬物の同時のまたは逐次的な投与が含まれる。例えば、線虫の処置では、ペプチド製剤は、現在使用されている抗フィラリア療法、例えば、ジエチルカルバマジン、アルベンダゾール、レバミゾール、ドキシサイクリン、および／またはイベルメクチンの任意の１つまたは複数と組み合わせて投与することができる。同様に、細菌感染の処置では、ペプチド製剤は、１つまたは複数の抗生物質と組み合わせて投与することができる。当業者であれば、処置される感染または疾患に基づいて適切な組合せ療法を同定することができる。
【実施例】
【００９１】
以下の実施例は、ある特定の特色および／または実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、本開示を記載される特定の特色または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
【００９２】
（実施例１）
材料および方法
ＰＧＭ酵素の調製：全てのＰＧＭ酵素をｐＥＴ２１ａ（＋）内にクローニングし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株Ｃ２５６６／Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｆｈｕＡ２  ｌａｃＺ：：Ｔ７  ｇｅｎｅ１［ｌｏｎ］ｏｍｐＴ  ｇａｌ  ｓｕｌＡ１１  Ｒ（ｍｃｒ−７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０−−ＴｅｔＳ）２［ｄｃｍ］Ｒ（ｚｇｂ−２１０：：Ｔｎ１０−−ＴｅｔＳ）ｅｎｄＡ１  Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）内で発現させ、以前に記載されているように発現させ、精製した（Raverdyら、Mol.  Biochem.  Parasitol.  １５６巻：２１０〜２１６頁、２００７年；Zhangら、J.  Biol.  Chem.  ２７９巻：３７１８５〜３７１９０頁、２００４年）。簡潔に述べると、可溶性の組換えｉＰＧＭを産生するための最適な条件は、３７℃での０．６ＯＤ６００までの培養物の成長、０．１ｍＭのＩＰＴＧでの、１６℃での一晩の誘導を伴うものであった。Ｈｉｓタグ付けされたタンパク質を、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ（商標）キレート化ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）上で、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣを製造者の指示に従って使用して、精製した。試料を適用した後、カラムを５カラム容積の緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮａＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）で、その後、１０カラム容積の９２％緩衝液Ａ：８％緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＮａＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、タンパク質を４０〜４００ｍＭのイミダゾールに等しい直線勾配（８〜１００％）の緩衝液Ｂを使用して溶離した。
【００９３】
ｉＰＧＭ−Ｈｉｓ６Ｘを含有する画分をプールし、透析緩衝液（４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、および５０％グリセロール、ｐＨ７．５）に対して透析し、使用するまで−２０℃で保管した。タンパク質の純度を、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって推定し、タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイを使用して決定した。タンパク質濃度は、１０ｍｇ／ｍｌまたはそれより高かった。
【００９４】
この研究において使用したＰＧＭをコードする配列は、以下のＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号を有する。ＧｅｎＢａｎｋに２０１６年８月１１日の時点で存在するものとして、その全てが参照によって本明細書に組み込まれる、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ、ロングフォーム、ＮＰ＿８７１８５１．１；Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ、ショートフォーム、ＮＰ＿４９１８９６．１；Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ  ＡＡＱ９７６２６．１；Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ  ｉＰＧＭ、ＡＡＶ３３２４７．１；Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ  ｉＰＧＭ、ＡＥＡ９１５３４．１；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭ、ＮＰ＿００２６２０．１；Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭ、Ｐ３７６８９．１；およびＥ．ｃｏｌｉ  ｄＰＧＭ、Ｐ６２７０７．２。
【００９５】
ｉＰＧＭおよびｄＰＧＭのアッセイ：ホスホグリセリン酸ムターゼ活性を、連続的なまたはエンドポイントのアウトプットアッセイとしてのいずれかで測定した。連続的なアッセイは、この研究において使用されるＰＧＭのオルソログおよびアイソザイムのために１５３６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットにここでは適合させた、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＢ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭについて以前に記載されているような（Zhangら、J.  Biol.  Chem.  ２７９巻：３７１８５〜３７１９０頁、２００４年；Whiteら、Eur.  J.  Biochem.  ２０７巻：７０９〜７１４頁、１９９２年）一連の共役酵素を介して供給されるピルベートを使用して３４０ｎｍの吸光度でモニタリングされる、ＮＡＤＨの乳酸デヒドロゲナーゼ酸化に基づくものであった。連続的なアッセイから決定された初速度の条件を使用して、阻害剤を評価するためのＰＧＭプロファイリングパネルのためにエンドポイント生物発光アッセイフォーマットを較正した。
【００９６】
１５３６ウェルフォーマットのカイネティックアッセイ：簡潔に述べると、解糖性ＰＧＭ触媒による３−ホスホグリセレート（３−ＰＧ）から２−ホスホグリセレート（２−ＰＧ）への順方向変換を、共役酵素反応を経るＮＡＤＨの消費をモニタリングすることによって間接的に測定した。４μＬのそれぞれのＰＧＭ酵素を、底が透明の黒色１５３６ウェルプレート（カタログ番号７８９０９２−Ｆ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ）内、ｐＨ８．０のアッセイ緩衝液中に、ＢｉｏＲａｐｔｒ（商標）ＦＲＤマイクロ流体ワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）で分配して、最終濃度を３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ４、２０ｍＭのＫＣｌ、および０．０８％ＢＳＡとした。２μｌの３−ＰＧ基質を、共役酵素アッセイ緩衝液中の各酵素溶液に、ＢｉｏＲａｐｔｒ（商標）ＦＲＤを使用して添加し、最終アッセイ濃度を３ｍＭのＡＤＰ、５００μＭのＮＡＤＨ、０．３単位のエノラーゼ、０．３単位のピルビン酸キナーゼ、および０．３単位の乳酸デヒドロゲナーゼとした。いくつかのＰＧＭについての３−ＰＧの見かけのＫｍを確認するために、４μＬのＢ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ酵素、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ酵素、またはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭ酵素を上記のように分配し、最終濃度をｐＨ８．０のアッセイ緩衝液中１ｎＭとした。２μｌの、０．０８３〜２．０ｍＭの範囲の３−ＰＧ基質の１１ポイント滴定シリーズを、共役酵素アッセイ緩衝液中の各酵素溶液に添加した。６０分の時間経過を、図１Ａで示すように、各酵素−基質溶液について、３４０ｎｍの吸光度で、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ１０００  ＰＲＯマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ）で読み取った。ＮＡＤＨの消費を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）で、酵素−基質滴定のそれぞれについて時間（秒）に対する吸光度（３４０ｎｍ）としてプロットし、各基質濃度についての線形相の傾きを、それぞれの酵素について計算した（図１Ｂ）。各酵素−基質反応についての初速度（ｖｉ）を決定し、モル基質濃度に対してプロットして、ミカエリス−メンテン（Menton）曲線を作成し、一方、速度およびモル基質濃度の逆数を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍでラインウィーバー−バークグラフとして再プロットし、見かけのＫｍ値を、各それぞれの酵素について推定した。
【００９７】
１５３６ウェルフォーマットの発光アッセイ：ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）によって触媒されるホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）からピルベートへの変換から生じるＡＴＰを、ＰＧＭ酵素パネルの発光出力を設定するために利用した。最終濃度が１〜５ｎＭの範囲の、様々な濃度のＢ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ酵素、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ酵素、およびＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭ酵素を、ＢｉｏＲａｐｔｒ（商標）ＦＲＤワークステーションを使用して、１５３６ウェル白色／ソリッドボトムプレート（カタログ番号７８９１７３−Ｆ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ）のそれぞれのウェル内の、全容積が４μｌの上記のアッセイ緩衝液中に分配した。推定されたＫｍ濃度で調製された２μｌの３−ＰＧ基質溶液を、上記のように各酵素溶液に添加し、最終アッセイ濃度を０．４ｍＭの３−ＰＧ、３ｍＭのＡＤＰ、０．３単位のエノラーゼ、および０．３単位のＰＫとした。酵素−基質溶液を室温で５分間インキュベートし、４μｌのＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｐｌｕｓ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、ＢｉｏＲａｐｔｒ（商標）ＦＲＤワークステーションで各反応物に添加し、プレートを室温で１０分間、光から保護しながらインキュベートし、ルシフェラーゼに基づくＡＴＰ検出の読み出しを、ＶｉｅｗＬｕｘ（登録商標）プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって測定した。ＰＧＭ酵素選択性パネルをさらなるＰＧＭに拡張するため、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ  ｉＰＧＭ酵素、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ  ｉＰＧＭ酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭ酵素、およびＥ．ｃｏｌｉ  ｄＰＧＭ酵素の発光測定値を、０．４ｍｍｏｌ／Ｌの基質の存在下で１〜２０ｎＭから滴定された各酵素について、上記のように測定した。パネル全体の比較的等価な発光ＲＬＵを生じた各ＰＧＭについての酵素濃度を、大環状ペプチドおよびペプチドアナログのプロファイリングのために選択した。
【００９８】
ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）共役酵素を、酵素パネルにおけるさらなる特異性対照として含めた。０．３単位（約９３０ｎＭ）または０．１５単位（約４６０ｎＭ）のＰＫ濃度を、先に記載したように、全容積が４μｌの上記アッセイ緩衝液中で、１５３６ウェルの白色／ソリッドボトムプレートのそれぞれのウェルに分配した。３−ＰＧ基質に等しい濃度で調製された２μｌのＰＥＰ基質溶液を、上記のようにＰＫ酵素溶液に添加し、最終アッセイ濃度を０．４ｍＭのＰＥＰおよび３ｍＭのＡＤＰとした。このアッセイのプロファイルのためのプロトコールを表１に示す。
【００９９】
ＳＰＰＳ環状ペプチドを、７つの酵素のＰＧＭパネル全体のバックグラウンドに対してロバストかつ均一なシグナルをもたらすように設計された、表１に記載する初期アッセイ条件下で試験した。濃度応答曲線（ＣＲＣ）を、４または５パラメータのＨｉｌｌの方程式（以下）を使用してフィットさせた。モデルの選択を、各オルソログ条件に対するｅｘｔｒａ−ｓｕｍ−ｏｆ−ｓｑｕａｒｅｓ  Ｆ検定によって決定した。環状ペプチドの大部分は双曲線応答を示し、急なＨｉｌｌ勾配を有するかまたは５パラメータフィットを要するものを、より低いｉＰＧＭ濃度を用いるアッセイ条件で再評価した。
【０１００】
５パラメータのＨｉｌｌの方程式：
【数１】
2019527721.tif 000007
式中、
【数２】
2019527721.tif 000008
式中、Ｓ０はゼロ濃度でのシグナルであり、Ｓｍａｘは無限濃度でのシグナルであり、ｎはＨｉｌｌ勾配であり、ＬｏｇＥＣ５０は最大半量シグナルでの濃度のｌｏｇであり、Ｘは濃度のｌｏｇであり、Ｓは非対称パラメータである。
【０１０１】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの滴定：１５３６ウェルフォーマットの発光アッセイ（上記）を、Ｃｅ−２のＩＣ５０に対する酵素濃度を評価するために適合させた。１０ｎＭ〜５０ｐＭの濃度範囲のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭを、最終濃度が３．８３μＭ〜０．２７ｐＭのＣｅ−２の１６ポイント１：３希釈にわたって試験し、一方、１μＭ〜５０ｎＭの酵素濃度範囲を、最終濃度が３．８３μＭ〜１１７ｐＭのＣｅ−２の１６ポイント１：２希釈にわたって試験した。１ｎＭ〜５０ｐＭのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの濃度を、０．４ｍＭの３ＰＧ基質溶液と１５分間、室温でインキュベートし、標準的なアッセイ設定（１秒曝露、中ゲイン、低速、２×ビニング）のＶｉｅｗＬｕｘプレートリーダーで読み取った。１００ｎＭ〜５ｎＭの酵素濃度を、０．４ｍの３ＰＧ基質溶液と５分間、室温でインキュベートし、標準的なアッセイ設定のＶｉｅｗＬｕｘで読み取った。５００ｎＭおよび１μＭの酵素濃度を、基質と５分間、上記のようにインキュベートしたが、ＶｉｅｗＬｕｘプレートリーダーの設定は、曝露過度をなくすために低減させた（１秒曝露、中ゲイン、中速、２×ビニング）。アッセイでは、１６ポイント化合物分配プレートからの２３ｎＬのペプチド滴定シリーズを、１５３６ピンツール（Ｗａｋｏ）を使用して１５３６ウェルアッセイプレート（カタログ番号７８９０９２−Ｆ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ）に同時に移し、最終濃度範囲を３．８μＭ〜０．２７ｐＭとした。
【０１０２】
【表１−１】
2019527721.tif 000009
【表１−２】
2019527721.tif 000010
【０１０３】
グラジエント溶離移動境界電気泳動（ＧＥＭＢＥ）：ＧＥＭＢＥを、基質ならびに生成物である２−ＰＧおよび３−ＰＧの無標識測定を介して、酵素ｉＰＧＭの活性を直接的にモニタリングするために使用した。注文製の器具を、グラジエント溶離移動境界電気泳動を行うために使用した（Strychalskiら、Anal.  Chem.  ８３巻：６３１６〜６３２２頁、２０１１年）。分離チャネルは、カスタム機械加工された２００μＬの試料リザーバーおよび２０００μＬの緩衝液リザーバーを接合する５ｃｍの長さのキャピラリー（３６０μｍのＯＤ、１５μｍのＩＤ）からなった。緩衝液リザーバーのヘッドスペースの圧力を、Ｓｅｒｉｅｓ  ６００自動圧力キャリブレーター（Ｍｅｎｓｏｒ、Ｓａｎ  Ｍａｒｃｏｓ、ＴＸ）を使用して調節した。白金電極をリザーバー内に挿入して、分離チャネル間で電圧を印加した。キャピラリーを、試料リザーバーからおよそ２ｃｍに位置する検出スポットを有するＴｒａｃｅＤｅｃ（登録商標）容積結合非接触性電気伝導度検出器（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｓｓｈｏｆ、Ａｕｓｔｒｉａ）に通した。緩衝液リザーバーに電気泳動緩衝液（３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭのＭｇＣｌ２）を満たし、酵素反応物を混合し、試料リザーバー内で直接泳動した。電気泳動緩衝液中のマグネシウム濃度を、ＧＥＭＢＥエレクトロフェログラム（electopherogram）での２−ＰＧシグナルと３−ＰＧシグナルとの間の分解能を最適化するように選択した（Schaeperら、J.  Capillary  Electrophor.  ３巻：２１５〜２２１頁、１９９６年）（図２Ｃおよび図３Ａ〜３Ｂ）。
【０１０４】
標準的な自由エネルギーから予測される、２−ＰＧの３−ＰＧに対する平衡比は、室温でおよそ１：７である（Clarkeら、Biochem.  J.  １３９巻：４９１〜４９７頁、１９７４年）。その結果として、ＧＥＭＢＥアッセイでは、シグナルの典型的な変化は、２−ＰＧで開始し３−ＰＧに変換した反応で、３−ＰＧで開始し２−ＰＧに変換した反応よりおよそ１１倍大きい。補因子非依存性の酵素（Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ、およびＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭ）では、ムターゼ反応はＧＥＭＢＥアッセイでは可逆的であることが分かった。したがって、これらの酵素を用いる反応は、シグナルを最大化するために、純粋な２−ＰＧで開始し、２−ＰＧの３−ＰＧへの変換をモニタリングして行った。補因子依存性の酵素であるＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭでは、ムターゼ反応はＧＥＭＢＥアッセイで不可逆的であることが分かり、かなり速い反応速度が３−ＰＧから２−ＰＧへの変換で見出された。その酵素を用いる反応は、したがって、純粋な３−ＰＧで開始し、３−ＰＧから２−ＰＧへの変換をモニタリングした。
【０１０５】
生成物および基質の分析的分離を以下のように行った。緩衝液リザーバーの圧力を、分離間および試料のロード中、３０ｋＰａで維持した。試料をロードし、ＧＥＭＢＥ分離を開始したら（以下に記載するように）、圧力を２０ｋＰａに３０秒間下げ、高電圧をオフにした。次いで高電圧（＋２ｋＶ）をオンにし、圧力を７５０Ｐａ〜２５００Ｐａの間の開始圧力にさらに下げ、およそ１４秒間、一定に保持した。これらの結果は、名目上は同一の特性を有する異なるキャピラリーを使用して、数ヶ月間にわたり得た。キャピラリーの電気浸透圧特性および内径のわずかな差が原因で、最適な開始圧力は、分析セット間で変化した。次いで圧力を２−ＰＧおよび３−ＰＧの両方が検出されるまで（２１６秒〜２４０秒）１２．５Ｐａ／ｓの速度で下げた。次いで圧力を２０ｋＰａに上げ、１０秒間、一定に保持した。高電圧をオフにし、圧力を３０ｋＰａに少なくとも３０秒間上げ、その後、次のＧＥＭＢＥ分離を開始した。ＧＥＭＢＥ分離を各試料に対して５回または６回反復して、およそ２５分の期間にわたり基質から生成物への変換をモニタリングした。
【０１０６】
２−ＰＧおよび３−ＰＧのストック溶液を、電気泳動緩衝液（３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭのＭｇＣｌ２）中に４ｍＭの濃度で調製した。酵素希釈緩衝液を、３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、６．４ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで調製した。阻害剤溶液を、ＤＭＳＯ中で、２倍連続希釈によって、濃度が少なくとも１００倍の範囲を網羅するように調製した。ＰＧＭ酵素のストック溶液は５０％グリセロール中にあり、−２０℃で保管した。使用した最終酵素濃度は、ＧＥＭＢＥアッセイと類似の反応速度をもたらすように選択した。各酵素反応混合物をロードする前に、試料リザーバーを電気泳動緩衝液ですすいだ。
【０１０７】
Ｃｅ−２およびＣｅ−２ｄでのＧＥＭＢＥ測定では、酵素反応物を以下に従って混合し、開始した：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ、Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭ、およびＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭのワーキング溶液を、酵素希釈緩衝液での、９３、１３６、６２、および１２５μＭのストックの、それぞれ４７、３４、２５０、および２１ｎＭの酵素濃度への容積希釈によって調製した。反応を開始するために、１５９μＬの電気泳動緩衝液を試料リザーバーに添加し、その後、ＤＭＳＯ中の１μＬの阻害剤溶液（または阻害剤なし対照では純粋なＤＭＳＯ）、および２０μＬの酵素ワーキング溶液を添加した。混合は、激しいピペッティングで達成した。酵素を添加した５分後、２０μＬの基質（２−ＰＧまたは３−ＰＧ）ストック溶液を添加し、試料を再びピペッティングで混合した。基質を添加した４５秒後、第１の分析的分離を開始した。反応物中の全構成成分の最終濃度は、３０ｍＭのトリスＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．６４ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、４００μＭの基質、０．５％ｖ／ｖのＤＭＳＯ，１９５ｐＭ〜２．５μＭの範囲の阻害剤、および３．４ｎＭのＢ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ、４．６ｎＭのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ、２５ｎＭのＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭ、または２．１ｎＭのＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭのいずれかであった。
【０１０８】
ＧＥＭＢＥデータの分析および反応速度の計算は、以前に報告されたものと類似であった（Rossら、Anal.  Chem.  ８０巻：９４６７〜９４７４頁、２００８年）。簡潔に述べると、各エレクトロフェログラム（例えば図３Ａを参照されたい）についての時間データに対する検出器シグナルを、３つの相補誤差関数および二次式ベースライン（quadratic  baseline）：
【数３】
2019527721.tif 000011
の合計からなる関数形式にフィットさせた。３つの誤差関数は、酵素ストック溶液中に存在する２−ＰＧ、３−ＰＧ、および未知の種に対応する。キャリブレーション測定は、Ｃ２およびＣ３について結果として得られたベストフィット値が、分析物２−ＰＧおよび３−ＰＧの濃度にそれぞれ比例することを示した。次いで、変換パーセントを
【数４】
2019527721.tif 000012
から計算した。反応速度を、各試料での最初の４つのＧＥＭＢＥ分離について、反応時間データに対する変換パーセントへの線形フィットの傾きによって決定した。反応速度を、阻害剤なし対照からの反応速度によって正規化した。データを、ＩＣ５０を決定するために、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄを使用して４パラメータのＨｉｌｌの方程式にモデリングした。
【０１０９】
大環状ライブラリーの設計：２つのチオエーテル−大環状ペプチドライブラリーを、Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＦＩＴ）系（Gotoら、Nat.  Protoc.  ６巻：７７９〜７９０頁、２０１１年）を使用して、Ｎ−（２−クロロアセチル）−Ｌ−チロシン（ＣｌＡｃＬＹ）またはＮ−（２−クロロアセチル）−Ｄ−チロシン（ＣｌＡｃＤＹ）のいずれかをイニシエーターとして用いて、構築した。対応するｍＲＮＡライブラリーを、ＡＵＧ（ＣｌＡｃＬ／ＤＹ）イニシエーターコドンと、それに続く、ランダムなタンパク質構成性アミノ酸残基をコードする４〜１２ＮＮＫランダムコドン（Ｎ＝Ｇ、Ｃ、Ａ、またはＵ；Ｋ＝ＧまたはＵ）と、それに続く、Ｃｙｓを割り当てる固定されたＵＧＣコドンとを有するように設計する。個々の形質転換ステップ（以下を参照されたい）の効率の定量的な評価に基づく大環状分子の理論的多様性は、少なくとも１０１２である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳の後、チオエーテル結合が、イニシエーターＬ／ＤＴｙｒ残基のＮ末端ＣｌＡｃ基と下流のＣｙｓ残基のスルフヒドリル基との間で自然発生的に形成された。
【０１１０】
親和性選択および富化：親和性選択を、ランダムな非標準的ペプチド組み込みによる発見（ＲａＰＩＤ）系を用いることによって、Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ（Ｈｉｓ１０タグ付けされた）に対するＤＹライブラリーおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ（Ｈｉｓ１０タグ付けされた）に対するＤ／ＬＹライブラリーで独立して行った。ｍＲＮＡライブラリーであるＣｌＡｃ−Ｌ−Ｔｙｒ−ｔＲＮＡｆＭｅｔＣＡＵおよびＣｌＡｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−ｔＲＮＡｆＭｅｔＣＡＵを、報告されているように調製した（Hayashiら、ACS  Chem.  Biol.  ７巻：６０７〜６１３頁、２０１２年；Hipolitoら、Molecules  １８巻：１０５１４〜１０５３０頁、２０１３年）。１μＭのｍＲＮＡライブラリーを、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを使用して、２５℃で３０分間、１．５μＭのピューロマイシンリンカーとライゲートし、精製した。次いで、１．４μＭのｍＲＮＡ−ピューロマイシンコンジュゲートおよび５０μＭのＣｌＡｃ−Ｌ−Ｔｙｒ−ｔＲＮＡｆＭｅｔＣＡＵまたはＣｌＡｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−ｔＲＮＡｆＭｅｔＣＡＵをメチオニン欠損ＦＩＴ系において使用して、それぞれのペプチドライブラリーを作成した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳反応を３７℃で３０分間行い、追加のインキュベーションを２５℃で行った。ＥＤＴＡ溶液（２００ｍＭ、１５μＬ）の添加後、反応溶液を３７℃で３０分間インキュベートして、大環状化を容易にし、前洗浄したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムに供して塩を除去した。脱塩されたペプチド−ｍＲＮＡ溶液をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｉｓ−ｔａｇ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＆  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ磁気ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に適用して、望ましくないビーズ結合体を除去した。このプロセスはプレクリアランスと呼ばれ、２回（trice）反復した。プレクリアランスの後、ペプチド−ｍＲＮＡ溶液を、Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭまたはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭを固定したＤｙｎａｂｅａｄｓと３０分間、４℃でインキュベートして、ｉＰＧＭ結合体を得た。このプロセスは、正の選択と呼ばれる。ビーズ上の選択された融合ペプチド−ｍＲＮＡを、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって１時間、４２℃で逆転写した。融合ペプチド−ｃＤＮＡを、１×ＰＣＲ反応緩衝液を使用することによってビーズから単離し、５分、９５℃で加熱した。溶離したｃＤＮＡの量を、定量ＰＣＲによって測定した。残りのｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、精製し、ｍＲＮＡに転写し、次の選択ラウンドのためのライブラリーとした。ライブラリー調製、プレクリアランス、および正の選択が、１ラウンドの富化プロセスであった。有意なｃＤＮＡ富化が、Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭについてそれぞれ第６ラウンドおよび第７ラウンドで観察された。回収されたｃＤＮＡを、ＴＡ−クローニングを使用して、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲートした。ベクターをＤＨ５αコンピテント細胞にクローニングした。個々のクローンを選び取り、配列決定した（図４Ａ〜４Ｃ）。
【０１１１】
大環状分子およびアナログの化学合成：以前に記載されているように（Morimotoら、Angew  Chem.  Int.  Ed.  Engl.  ５１巻：３４２３〜３４２７頁、２０１２年；Yamagataら、Structure  ２２巻：３４５〜３５２頁、２０１２年）、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成によって、Ｓｙｒｏ  Ｗａｖｅ（商標）自動ペプチド合成装置（Ｂｉｏｔａｇｅ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ、ＮＣ）を使用して、大環状分子を化学合成した。簡潔に述べると、クロロアセチル基またはアセチル基を、自動合成の後に、それぞれ環状または直鎖状ペプチドアナログを形成させるために、Ｎ末端アミド基にカップリングさせた。ペプチドを、９２．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％水、２．５％トリイソプロピルシラン、および２．５％エタンジチオールの溶液によって切断し、ジエチルエーテルによって沈殿させた。環化反応を行うために、ペプチドペレットを、水中の１０ｍＬのＤＭＳＯ／０．１％ＴＦＡ（１：１）に溶解し、トリエチルアミンを添加することによってｐＨ＞８に調整し、１時間、２５℃でインキュベートした。この環化反応を、ＴＦＡを添加してペプチド懸濁液を酸性化することによってクエンチした。次いで、ペプチドを、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製し、分子質量を、ｍｉｃｒｏｆｌｅｘまたはｕｌｔｒａｆｌｅｘ機器（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって検証した（図５および表２）。
【０１１２】
全てのペプチドは、Ｓｙｒｏ  Ｗａｖｅ自動ペプチド合成装置（Ｂｉｏｔａｇｅ）を使用して、Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学合成（ＳＰＰＳ）によって、２５μｍｏｌｅのスケールで化学合成した。まず、ＮｏｖａＰＥＧ  Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ樹脂を、周囲温度で３０分間、回転させながら、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）とインキュベートし、ＤＭＦで５回洗浄した。各Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸のカップリングを、ＤＭＦ中の０．５ＭのＦｍｏｃ保護されたアミノ酸３００μＬ、０．５Ｍの２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）３００μＬ、ならびに０．５ＭのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）１５０μＬの溶液を満たした樹脂上で行い、１時間、周囲温度で反応させた。樹脂を１ｍＬのＤＭＦで５回洗浄した後、Ｆｍｏｃ脱保護を、樹脂をＤＭＦ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）中の４０％ピペリジン６００μＬとインキュベートすることによって行い、３０分間、周囲温度で反応させた。各ペプチドを、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸のカップリングおよびＦｍｏｃ脱保護ステップを適切に反復することによって、表６および８における配列に対応する適切に保護されたアミノ酸モノマーを使用して合成した。樹脂上の合成されたペプチドのＮ末端α−アミノ基を、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中の０．５ＭのクロロアセチルＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル５００μＬの溶液と、回転させながら６０分間、周囲温度でインキュベートすることによってクロロアセチル化した。Ｃｅ−Ｌ２およびＣｅ−Ｌ２ｄの合成のために、Ｎ末端α−アミノ基を、ＮＭＰ中の０．５Ｍの無水酢酸および０．２５ＭのＤＩＰＥＡの５００μＬ溶液と、回転させながら６０分間、周囲温度でインキュベートすることによってアセチル化した。樹脂を５×１ｍＬのＤＭＦで洗浄した後、ペプチドを完全に脱保護し、２ｍＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、およびエタンジチオール（ＥＤＴ）（９２．５：２．５：２．５：２．５）の溶液と、回転させながら３時間、周囲温度でインキュベートすることによって樹脂から切断し、ジエチルエーテルで沈殿させた。ペプチドペレットを水中のＤＭＳＯ／０．１％ＴＦＡ（１：１）１０ｍＬに溶解し、トリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加することによって＞８にｐＨ調整し、周囲温度で１時間インキュベートして、Ｎ末端のクロロアセトアミド基とシステインスルフヒドリル基との間のチオエーテル結合の形成を介して環化を強化した。ペプチドの質量および環化を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析によって確認した。環化反応を、ＴＦＡを添加してペプチド懸濁液を酸性化することによってクエンチした。次いでペプチドを逆相ＨＰＬＣによって精製し（表４）、分子質量を、ｍｉｃｒｏｆｌｅｘまたはａｕｔｏｆｌｅｘ機器（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析（表４）によって検証した。環の接合をＭＳＭＳスペクトルおよびフラグメント分析によって確認した（図５）。
【０１１３】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【０１１４】
ＰＧＭオルソログにわたる大環状ペプチドの特徴付け：大環状ペプチド溶液を、ＤＭＳＯ中に５ｍＭの濃度で調製し、１１ポイント１：３シリーズまたは１６ポイント１：２シリーズとして滴定した。１１ポイント滴定シリーズでは、化合物分配プレートを、ＮＣＡＴＳ化合物管理によって、１５３６ウェルポリプロピレン製ディープウェルのｖ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、＃７８２２７０）内で、単一の混交型の行型パターンで、大環状ペプチドごとに調製し、５ｍＭ〜８４．７ｎＭの濃度範囲がもたらされた。１６ポイント滴定シリーズでは、化合物分配プレートを、３８４ウェルポリプロピレン製ディープウェルのｖ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、＃７８１２７０）のペプチドごとに単一カラムを置き入れ（hand  down）、１５３６ウェルポリプロピレン製ディープウェルのｖ底プレートに、マルチチャネルピペットで、５ｍＭ〜１５２．６ｎＭの濃度範囲で２組ずつ移すことによって調製した。各大環状ペプチドを、上記のＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ  Ｐｌｕｓ共役酵素アッセイにおける、５つのｉＰＧＭオルソログ、２つのｄＰＧＭアイソザイム、およびＰＫ−ＦＬｕｃ対照にわたって特徴付けした。アッセイでは、１１ポイント化合物分配プレートまたは１６ポイント化合物分配プレートのいずれかからの２３ｎＬのペプチド滴定シリーズを、１５３６ウェルアッセイプレート（カタログ番号７８９０９２−Ｆ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ）に、１５３６ピンツール（Ｗａｋｏ）を使用して同時に移して、それぞれ１９．２μＭ〜０．３３ｎＭまたは１９．２μＭ〜０．５８ｎＭの最終濃度範囲とした。
【０１１５】
曲線フィッティング：全ての濃度応答曲線レポーターを、シグモイド用量応答（可変傾斜）曲線フィッティング関数：
【数５】
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を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用して作成した。
【０１１６】
誤差の分析：試験した示されるＰＧＭ活性の５０％の阻害をもたらす環状ペプチドまたは環状ペプチドアナログの濃度を、表３においてｐＩＣ５０値として報告する。各ペプチドを試験した独立した実験の数を、表３の最後の列において「Ｎ」の下に示す。不活性なペプチドは１回試験した。図１０Ｂにおけるエラーバーの標準偏差（ＳＤ）を報告した全ての実験は、２つの技術的反復で行い、Ｎ≧３の独立した実験の代表的なプロットである。図１９Ａを構築するために使用したデータは表３からのものであり、ｐＩＣ５０（ここで、ＩＣ５０＝１０−ｐＩＣ５０）から変換された。エラーバーは、所与のペプチドについて決定された、正規分布したＩＣ５０のｌｏｇのＳＤ値を表し、その結果、ＩＣ５０ｌｏｗ＝１０−（ｐＩＣ５０＋ＳＤ）、かつＩＣ５０ｈｉｇｈ＝１０−（ｐＩＣ５０−ＳＤ）である。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
排除基準：データポイントは、値がSouthallら、（Handbook  of  Drug  Screening、４４２〜４６４頁、２００９年）において記載されている基準に基づいて外れ値であると決定されれば、曲線フィットから排除される。データポイントが曲線フィットから排除される潜在的理由には、例えば、化合物の移動の、またはアッセイ試薬を１５３６ウェルアッセイプレートの試験ウェルに分配する際の、分かっている失敗が含まれる。濃度応答曲線において排除される必要のあるデータポイントは、この研究においてはなかった。
【０１１９】
サイズ排除クロマトグラフィー：試料を、ＡＫＴＡ（登録商標）Ｐｕｒｅクロマトグラフィー系（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５  １６／６００カラム上で分析および分画した。５００μＬの試料を、３０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２ｍＭのＭｇＳＯ４を含有する緩衝液中で１ｍＬ／分で、４℃で溶離した。溶離プロファイル吸光度を、２８０および５００ｎｍでのインライン検出で記録し、２ｍＬの画分を９６ディープウェルプレートに収集した。
【０１２０】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動：タンパク質（１０μＬ／レーン）を、１×トリスランニング緩衝液中のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ（商標）１２％プレキャストポリアクリルアミドミニスラブゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で、周囲温度で、２００Ｖで４５分間、電気泳動した。試料、すなわち、サイズ排除カラム画分からの１００μＬのアリコートと３３μＬの４×Ｌａｅｍｍｅｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  １６１−０７４７）±２％βＭＥとを、１０分間、９５℃で加熱した。ゲルを３０分間、５０％メタノール１０％酢酸中で固定し、次いで、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０コロイドタンパク質染色（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂ８５２２）で一晩染色し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）画像化系またはＨＰフラットベッドスキャナーで画像化した。分子量ラダーは、Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ番号１６１−０３７６であった。
【０１２１】
系統樹の構築：７つのＰＧＭオルソログのタンパク質配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ多重配列アラインメント分析（ワールドワイドウェブ上で、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／で入手可能である）を使用してアラインした。配列アラインメントの受託番号は、ＧｅｎＢａｎｋに２０１６年８月１１日の時点で存在するものとして、その全てが参照によって本明細書に組み込まれる、ＮＰ＿８７１８５１．１（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ＡＡＱ９７６２６．１（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ）、ＡＡＶ３３２４７．１（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、ＡＥＡ９１５３４．１（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ＮＰ＿００２６２０．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｐ３７６８９．１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ２，３−ビスホスホグリセレート非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ）、およびＰ６２７０７．２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ２，３−ビスホスホグリセレート依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ）である。Ｐｅａｒｓｏｎ／ＦＡＳＴＡアラインメントを、ツリー構築のために、ＲＡｘＭＬ  ＢｌａｃｋＢｏｘ（ワールドワイドウェブ上で、ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｒａｘｍｌで入手可能である）にアップロードした。不均質性の比率のガンマモデル、および最大尤度サーチを伴うＢＬＯＳＵＭ６２タンパク質置換マトリクスを、ツリー構築のために適用した。外群はツリールーティングのために選択しなかった。高速アルゴリズムブートストラッピング分析を、１，０００の反復で行った。
【０１２２】
結晶化およびデータの収集：Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグに及び、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを有する、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ由来の精製された完全長のアポｉＰＧＭを、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、２ｍＭのＴＣＥＰ中、１１．６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ペプチド複合体を調製するための、残基Ｍ１９からＩ５３９に及ぶ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ由来のｉＰＧＭの別の試料を、結晶化スクリーニングのために、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０中、１０．８ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｃｅ−２ｄ環状ペプチド複合体を調製するために、ペプチドＣｅ−２ｄの５０ｍＭのストック溶液をＤＭＳＯ中に調製し、１：１．５（タンパク質：環状ペプチド）モル比で混合し、氷上で３０分間インキュベートし、その後、スクリーニングした。全ての結晶化実験は、Ｃｏｍｐａｃｔ  ３００（Ｒｉｇａｋｕ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）シッティングドロップ蒸気拡散プレートで、２０℃で、等容積のタンパク質、および７５μＬの前記タンパク質に対して平衡化した結晶化溶液を使用して行った。
【０１２３】
アポｉＰＧＭ：天然のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭでは、２つの結晶形態に相当するプレートクラスターを形成した結晶が得られた。単斜晶系Ｐ結晶（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ−ｍ）が、Ｗｉｚａｒｄ  ３−４スクリーン（Ｒｉｇａｋｕ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）条件Ｄ１１（３０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ５０００  ＭＭＥ、１００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、２００ｍＭの硫酸アンモニウム）からおよそ４週間で得られた（図６Ａ）。試料を、Ａｄｄｉｔｉｖｅ  Ｓｃｒｅｅｎ  ＨＴ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用するリファインメントスクリーニングに供した。およそ２週間後、単一板状結晶（図６Ｂ）が、３０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ５０００  ＭＭＥ、１００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、２００ｍＭの硫酸アンモニウム、１００ｍＭのグアニジン−ＨＣｌからなる条件で観察された。直方晶系Ｐ格子（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ−ｏ）に属する第２の結晶形態が、Ｉｎｄｅｘ  ＨＴ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）条件Ｆ７（２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ３３５０、１００ｍＭのＢｉｓ−トリス、ｐＨ６．５、２００ｍＭの硫酸アンモニウム）から６ヶ月後に観察された（図６Ｃ）。試料を、７５％結晶化溶液および２５％ＰＥＧ  ４００から構成される新鮮なドロップに移し、液体窒素中で保管した。
【０１２４】
ｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄ複合体：Ｃｅ−２ｄと１：１．５比で調製されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｍｅｔ１９  ｉＰＧＭによって、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ＨＴ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）条件Ａ６（３０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ４０００、１００ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、２００ｍＭのＭｇＣｌ２）から７日後に、針形態を示す結晶が得られた（図６Ｄ）。試料を、８０％結晶化溶液および２０％グリセロールから構成される新鮮なドロップに移し、液体窒素中で保管した。
【０１２５】
構造の解明およびリファインメント：Ｘ線回折データを、Ｄｅｃｔｒｉｓ  Ｐｉｌａｔｕｓ  ６Ｍピクセルアレイ検出器を使用して、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅビームライン１７−ＩＤで収集した。強度を、Ａｕｔｏｐｒｏｃ（Vonrheinら、Acta  Crystallogr.  D、６７巻：２９３〜３０２頁、２０１１年）を介して、ＸＤＳ（Kabsch、J.  Appl.  Crystallogr.  ２１巻：６７〜７１頁、１９８８年；Kabsch、Acta  Crystallogr.  D、６６巻：１２５〜１３２頁、２０１０年）を使用して積分し、Ｌａｕｅクラス分析およびデータスケーリングをＡｉｍｌｅｓｓ１９で行い、これは、最も高い確率のＬａｕｅクラスが、ｉＰＧＭ−ｍでは２／ｍであり、ｉＰＧＭ−ｏではｍｍｍであることを示唆した。マシューズ係数（Matthewsら、J．Mol．Biol．３３巻：４９１頁、１９６８年）は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｉＰＧＭ−ｍおよびｍｍｍ  ｉＰＧＭ−ｏでそれぞれ（Ｖｍ＝２．７Å３／Ｄａ、％溶媒＝５４％）および（Ｖｍ＝２．５Å３／Ｄａ、％溶媒＝５０％）の非対称単位の２つの分子があることを示した。ｉＰＧＭ−ｍの構造の解明を、Ｂａｌｂｅｓ（Longら、Acta  Crystallogr.  D.、６４巻：１２５〜１３２頁、２００８年）での分子の置き換えによって行い、これによって、事前に決定されたｉＰＧＭ構造（ＰＤＢ：１Ｏ９８；Rigdenら、J.  Mol.  Biol.  ３２８巻：９０９〜９２０頁、２００３年）を使用してサーチモデルを作成した。サーチは空間群Ｐ２およびＰ２１で行い、最高の解は、このポイントから順方向に使用された後者の空間群で得られた。Ｒｅｆｍａｃ（Murshudovら、Acta  Crystallogr.  D、５３巻：２４０〜２５５頁、１９９７年）でのモデルの最初のリファインメントは、３４％／３７％のＲ／Ｒｆｒｅｅで収束した。ｉＰＧＭ−ｏでは、分子の置き換えは、ＰＤＢ  ２ＩＦＹ（Nukuiら、Biophys.  J.  ９２巻：９７７〜９８８頁、２００７年）をサーチモデルとして使用して、２２２ポイントの対称を伴う全ての考えられる空間群内で、Ｐｈａｓｅｒ（Mccoyら、J.  Appl.  Crystallogr.  ４０巻：６５８〜６７４頁、２００７年）を使用して行った。最高の解は、空間群Ｐ２１２１２１内で得られた。モデルを、Ｐｈｅｎｉｘ（Adamsら、Acta  Crystallogr.  D、６６巻：２１３〜２２１頁、２０１０年）での自動モデル構築によって改善した。
【０１２６】
ｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄについての構造の解明を、ｉＰＧＭ−ｏの単一サブユニットをサーチモデルとして使用して、分子の置き換えによって行った。サーチは、非対称単位の２つの分子について空間群Ｐ２およびＰ２１内で行い（Ｖｍ＝２．３Å３／Ｄａ、％溶媒＝４７％）、最高の解は、このポイントから順方向に使用されたＰ２で得られた。モデルの最初のリファインメントを、Ｒｅｆｍａｃ（Murshudovら、Acta  Crystallogr.  D、５３巻：２４０〜２５５頁、１９９７年）で行い、Ａｐｒ／ｗａｒｐ（Langerら、Nat.  Protoc.  ３巻：１１７１〜１１７９頁、２００８年）での自動モデル構築によって改善した。その後のリファインメントおよび手動のモデル構築は、それぞれＰｈｅｎｉｘおよびＣｏｏｔ（Emsleyら、Acta  Crystallogr.  D、６６巻：４８６〜５０１頁、２０１０年）で行った。無秩序側鎖は、電子密度が観察され得るポイントまでトランケートした。構造の検証を、Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ（Chenら、Acta  Crystallogr.  D、６６巻：１２〜２１頁、２０１０年）で行い、図を、ＣＣＰ４ＭＧパッケージ（Pottertonら、Acta  Crystallogr.  D、６０巻：２２８８〜２２９４頁、２００４年）を使用して調製した。ｉＰＧＭ構造の重ね合わせを、ＣＣＰ４（Winnら、Acta  Crystallogr.  D、６７巻：２３５〜２４２頁、２０１１年）インターフェースを介して、ＧＥＳＡＭＴ（Krissinelら、J.  Mol.  Biochem.  １巻：７６〜８５頁、２０１２年）を使用して行った。関連する結晶学的データを表４に提示する。
【０１２７】
【表４】
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【０１２８】
結晶学的分析：ｉＰＧＭ−ｍの最後のモデルは、各サブユニットのドメインＡ（図７Ａ）内にモデリングされた２つのＭｎ２＋およびＺｎ２＋イオンを有する２つのサブユニットからなり、Ｎ末端の最初の２０残基およびＣ末端の最後の１３残基は無秩序であり、モデリングされ得なかった。２つのサブユニットはほぼ同一であり、ＧＥＳＡＭＴ（Krissinelら、J.  Mol.  Biochem.  １巻：７６〜８５頁、２０１２年）を使用してアラインされた５１７残基について、Ｃα原子間で０．５８ÅのＲＭＳＤ偏差を有している（図７Ｂ）。直方晶系形態の結晶（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ−ｏ）をおよそ６ヶ月後に得、ｉＰＧＭ−ｍよりも高い分解能まで回折した。同様に、ＮおよびＣ末端残基は、ｉＰＧＭ−ｏでも無秩序であった。ｉＰＧＭ−ｏのサブユニットは構造的に非常に類似しており、アラインされた５２０残基について、Ｃα原子間で０．７７ÅのＲＭＳＤ偏差を有していた。さらに、ｉＰＧＭ−ｏおよびｉＰＧＭ−ｍの構造は非常に類似しており、アラインされた４９５残基について、Ｃα原子間で１．８５ÅのＲＭＳＤ偏差を有していた。しかし、ホスファターゼドメインは格段に近くアラインされ、一方、トランスフェラーゼドメインはわずかなシフトを示し（図８Ｃ）、これは、このドメインの立体構造上の柔軟性に起因するものであり得る。ｉＰＧＭ−ｏの構造もまた、ｉＰＧＭ−ｍに類似の様式で結合する基質結合部位に２つの金属イオンを含有する（以下を参照されたい）。
【０１２９】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ−ｍの構造と他のアポｉＰＧＭの構造との比較：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｉＰＧＭ−ｍの、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来のｉＰＧＭ（ＰＤＢ：２ＩＦＹ）との重ね合わせによって、Ｃα原子間で２．７６ÅのＲＭＳＤを得た（４７６残基がアラインされた）。重ね合わせからの偏差は２つの構造間である程度大きかったものの、全体的な折り畳みは２つの構造間で非常に類似していた（図８Ａ〜８Ｃ）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ−ｍの構造もまた、基質に結合したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のｉＰＧＭ（ＰＤＢ：１Ｏ９８）の構造と比較した。重ね合わせによって、Ｃα原子間で１．０７ÅのＲＭＳＤを得た。しかし、２８２残基のみがトランスフェラーゼドメインの残基についてアラインされ得、それは、基質の結合によって、ホスファターゼドメインにおける大きな立体構造上の変化が生じたためである（図８Ｂ）。
【０１３０】
金属イオン部位：正の電子密度（Ｆｏ−Ｆｃ）の大きなピークが、リファインメントの後に、ホスファターゼドメインの金属結合部位において観察された（図９Ａ）。この領域は、Ａｓｐ４２６およびＨｉｓ４３０（部位１）、ならびにＡｓｐ３７、Ｓｅｒ８６、Ａｓｐ４６７、およびＨｉｓ４６８（部位２）が占めている。これらの部位をＭｇ２＋イオンとしてリファインすると、残った正の電子密度が観察され、このことは、より大きな金属イオンが存在することが示唆された。Ｍｎ２＋イオンを各部位でモデリングにより、部位１ではおよそ１７Å２のＢ因子が結果として生じたが、部位２は、いくらかの正の電子密度およびおよそ７Å２のＢ因子を含有していた。さらに、部位２での周りの残基とイオンとの間の配位距離はおよそ１．９Å〜２．０Åであり、これは、Ｍｎ２＋イオンで予想される（２．１Å〜２．２Å）よりも短い。位相異常差分マップを、１．００００Åの波長で収集したデータを使用して計算し、それにより、図９Ａに示すように、部位１（５．７σ）および部位２（１１．７σ）のピーク高さを得た。Ｚｎ２＋イオンは、配位距離および異常シグナル、ならびにＥ．ｃｏｌｉのアルカリホスファターゼドメインに対するｉＰＧＭホスファターゼドメインの相同性（Jedrzejas  Prog.  Biophys.  Mol.  Biol.  ７３巻：２６３〜２８７頁、２０００年）に基づくと、部位２を占め得る。１．００００Åの波長での理論上の異常シグナルは、Ｚｎ２＋イオンおよびＭｎ２＋イオンでそれぞれ２．６ｅ−および１．４ｅ−である。さらに、データを、Ｍｎ２＋吸収端の低エネルギー側にある、１．９０１６Åの波長で収集した。この波長での理論上の異常シグナルは、Ｚｎ２＋イオンおよびＭｎ２＋イオンでそれぞれ１．１ｅ−および０．４９ｅ−である。位相異常差分マップを、１．９０１６Åのデータを使用して計算したところ、部位１ではピークは生じなったが、およそ５σのピークが部位２で観察された。部位１および部位２でのＭｎ２＋およびＺｎ２＋イオンのその後のリファインメントでは、それぞれ、残った正の電子密度は得られず、このことはさらに、これらの部位への割り当てを証拠付けた。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭによるこれらの金属の配位を図９Ｂに示し、距離を表５に列挙する。結晶化溶液から、Ｍｇ２＋の結合部位もまた、図９Ｃに示すように観察されたことに留意されたい。
【０１３１】
【表５】
2019527721.tif 000019
【０１３２】
データベースの寄託：配位および構造因子は、その全てが参照によって本明細書に組み込まれる以下の受託コードで、Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋに寄託されている：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのアポｉＰＧＭ−ｍ（ＰＤＢ  ５ＫＧＭ）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのアポｉＰＧＭ−ｏ（ＰＤＢ  ５ＫＧＬ）、および複合体Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｍｅｔ１９  ｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄ（ＰＤＢ  ５ＫＧＮ）。
【０１３３】
（実施例２）
親和性が高いｉＰＧＭリガンドの同定
Ｇｅｎｚｙｍｅ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｓｈａｎｇｈａｉによる、３８０，０００の化合物の組合せライブラリーからｉＰＧＭに対する低分子阻害剤を得る，最近報告された試みの結果、見かけの金属イオンキレーターである、２つの効力の弱い化合物のみが得られた（Crowtherら、PLoS  Neglected  Trop.  Dis.  ８巻：ｅ２６２８頁、２０１４年）。金属イオン配位子の外側での低分子阻害に対するｉＰＧＭの見かけの無反応性、およびアルカリホスファターゼスーパーファミリー酵素クラスの化学種をマイクロモル濃度以下での最適化の潜在性でＨＴＳから同定することの困難さ（Narisawaら、J.  Bone  Miner.  Res.  ２２巻：１７００〜１７１０頁、２００７年）を考慮して、本発明者らは、この課題に、ＲａＰＩＤ（ランダムな非標準的ペプチド組み込みによる発見）と呼ばれる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ系を使用する親和性選択の補完的な方法を介して取り組んだ。
【０１３４】
ＲａＰＩＤ系によって、本発明者らは、一兆の固有のメンバーにおける大環状ペプチド集団の番号付けの多様性を利用すること、およびあまり豊富ではない親和性の高いリガンドを富化し、増幅することが可能になった（Bashiruddinら、Curr.  Opin.  Chem.  Biol.  ２４巻：１３１〜１３８頁、２０１５年）。この特定の選択キャンペーンでは、本発明者らは、Ｌ−またはＤ−チロシン（Ｌ／Ｄ−Ｔｙｒ）のいずれかで開始されるチオエーテル−環状ペプチドライブラリーを利用し、これらの組換え酵素のＣ末端にあるＨｉｓ６タグを介して磁気ビーズ上に個別に固定された２つのタンパク質標的、Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭに対する親和性の高いリガンドの選択を行った。６９個のＲａＰＩＤ由来のクローンからの配列アラインメント（図４Ａ〜４Ｃ）によって、７〜１３アミノ酸の間の範囲の環サイズおよび１〜７アミノ酸のＣ末端テールを有するラリアット構造の大環状ペプチドに対応する、１１の独立した配列ファミリーが結果として得られた（表６）。
【０１３５】
ＲａＰＩＤによって単離された環状ペプチドが、そのカルボキシル末端でピューロマイシンを介してコードｍＲＮＡに繋がれることに留意されたい。環状ペプチドによるその標的への結合の間の、結合を容易にする、または可能な生産的な標的−環状ペプチド相互作用をブロックするための、繋がれた核酸のあらゆる効果は、ｍＲＮＡディスプレイ技術の固有の特性である。核酸を介してもたらされる有意な結合の寄与は、固相ペプチド合成ステップによって作製された試料では存在しない。
【０１３６】
【表６−１】
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【表６−２】
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【０１３７】
（実施例３）
環状ペプチドＰＧＭ阻害剤の機能的評価
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択に由来する環状ペプチドの活性を効率的にプロファイルするために、寄生虫標的であるＢ．ｍａｌａｙｉのｉＰＧＭおよびフィラリアオルソログ（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、対応するモデル生物であるＣ．ｅｌｅｇａｎｓのｉＰＧＭオルソログ、ならびにＨ．ｓａｐｉｅｎｓ抗標的ｄＰＧＭアイソザイムを含む、様々な種に由来するいくつかのホスホグリセリン酸ムターゼ酵素を評価した。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｉＰＧＭ酵素およびｄＰＧＭ酵素の両方もまた含まれた。ＰＧＭによって触媒される３−ＰＧから２−ＰＧへの変換についての、低容積の、１５３６ウェルプレートフォーマットカイネティックおよびエンドポイントアッセイを開発した（図２Ａ）。各アッセイは、生成物である２−ＰＧを、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）を経て、それぞれエノラーゼおよびピルビン酸キナーゼを介してピルベートおよびＡＴＰにさせる、共役酵素アプローチを利用した（Feraudiら、J.  Clin.  Chem.  Clin.  Biochem.  ２１巻：１９３〜１９７頁、１９８３年）。カイネティック吸光度のアウトプットを、ピルベートのラクテートへの変換を介する、乳酸デヒドロゲナーゼ媒介性のＮＡＤＨ濃度変化を使用して達成した（図２Ｂ）（Fuadら、Metallomics  ３巻：１３１０〜１３１７頁、２０１１年；Whiteら、Eur.  J.  Biochem.  ２０７巻：７０９〜７１４頁、１９９２年）。生物発光のエンドポイントアッセイでは、生成されたＡＴＰは、ホタルルシフェラーゼおよびルシフェリンによる光生成において使用される（図２Ｂ、表１）。連続的なＮＡＤＨ依存性吸光度アッセイを使用して、この研究において使用している７つのＰＧＭオルソログおよびアイソザイムのそれぞれについて、相対活性および３−ＰＧ  ＫＭを決定した。これらの酵素および条件のそれぞれを使用して、５分間のインキュベーションの後にシグナル対バックグラウンドの比率が３．５〜５．４倍であった生物発光のエンドポイントアッセイを較正した（図１Ｃおよび表７）。
【０１３８】
【表７】
2019527721.tif 000022
【０１３９】
標的酵素に対する化合物および環状ペプチドを直接評価するため、グラジエント溶離移動境界電気泳動（ＧＥＭＢＥ）（Shackmanら、Anal.  Chem.  ７９巻：５６５〜５７１頁、２００７年；Strychalskiら、Anal.  Chem.  ８１巻：１０２０１〜１０２０７頁、２００９年）を使用して、３−ＰＧを２−ＰＧから電気泳動分離を行った（図２Ｃ、図３Ａ）。方法は、基質ならびに生成物である３−ＰＧおよび２−ＰＧの直接的な無標識測定を提供する（図３Ｂ、上部）。異性体のベースライン分離は、等モル量の３−ＰＧおよび２−ＰＧについての一次導関数プロット（図３Ｂ、下部）で明らかであった。確立された分離条件を使用して、２−ＰＧから３−ＰＧへの変換の時間経過を、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭおよびＢ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭで実証した。ＧＥＭＢＥは、ロースループットであるが、この研究において記載されるｉＰＧＭ阻害剤の活性についての理想的なオルトゴナルな検証を提供する。
【０１４０】
（実施例４）
ｉＰＧＭ阻害剤の強力かつ選択的なクラスの同定
寄生生物標的であるＢ．ｍａｌａｙｉのｉＰＧＭを最初に大環状ペプチドライブラリーに対して選別して、テトラデカペプチドからウンデカペプチドによって表される７つの大環状分子であるＢｍ−１〜Ｂｍ−７を得た（表６）。これらの環状ペプチドをコードする核酸配列（図４Ａ〜４Ｃ）から、７つのＰＧＭオルソログおよびアイソザイムのパネルの酵素活性の阻害剤としての評価のために十分な量を合成した（表６）。ＰＧＭパネルにわたってＢｍ−１〜７について得られた濃度応答曲線によって、選択的な、中程度に強力な大環状シリーズが主に明らかになった。Ｂｍ−２（これについてのＲａＰＩＤ選択は、再合成された環状ペプチドには存在しない繋がれた核酸による影響を受けている可能性がある）以外の全てが、高ナノモル濃度から低マイクロモル濃度の範囲でｉＰＧＭオルソログを阻害し（表６）、ｉＰＧＭ酵素対ｄＰＧＭ酵素について、完全な選択性をさらに示した。これらの環状ペプチドは２つの群を含んでおり、一方は、短い１〜２アミノ酸のテールを伴う１２または１３アミノ酸の大きな環を有し（Ｂｍ−１〜Ｂｍ−３）、２つめは、３〜４アミノ酸の間のＣ末端伸長を伴う７員環を有しており（Ｂｍ−４〜Ｂｍ−７）、７つのペプチド全てが、最後から２番目の位置でシステインを含有していた。Ｂｍ−４は、環状ペプチドの中でも、より短い、強力なウンデカペプチドクラスの配列に相当していたため、Ｂｍ−４を、Ｃ末端トランケーションアナログを介するさらなる研究のための鋳型として選択した。さらに、テールシステインの遊離スルフヒドリル基の重要性を調べるために、Ｃｙｓ１０をＳｅｒで置き換えた。興味深いことに、Ｃｙｓ１０Ｓｅｒの置き換え、および末端のＧｌｙ１１以外全ての排除によって、不活性な大環状分子が結果として生じた（表３）。
【０１４１】
Ｂｍシリーズの環状ペプチドは、比較的効力が弱かった。さらに、Ｂ．ｍａｌａｙｉは、結晶学的構造を決定することが難しいことが証明されている。しかし、結晶は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭで成功裏に得られ、そのことは、大環状分子−ｉＰＧＭ相互作用を導く設計ルールの推論に向けてこのオルソログをＲａＰＩＤ標的化する動機付けとなった。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓモデル生物のｉＰＧＭを使用する第２の親和性選択実験によって、ペンタデカペプチド、イプグリセルミドＡ（Ｃｅ−１）およびＢ（Ｃｅ−２、図１０Ａ）、またはテトラデカペプチド（Ｃｅ−３、Ｃｅ−４）のいずれかの、４つの大環状ペプチドが得られた。対応するＢ．ｍａｌａｙｉ由来のシリーズの環系でそうであるように、大環状分子は、ｄＰＧＭアイソザイムに対して完全に不活性である。これらの２つ、Ｃｅ−１およびＣｅ−２、イプグリセルミドＡおよびＢは、それぞれ、エンドポイントプロファイリングアッセイで使用した初期条件（すなわち、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｂ．ｍａｌａｙｉの［ｉＰＧＭ］では５ｎＭ、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉでは１０ｎＭ、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓでは２０ｎＭである）下で低ｎＭ活性（２〜２０ｎＭ）を名目上示す、ｉＰＧＭオルソログの非常に強力な阻害剤であり、これを、図１１Ａ〜１１Ｂで示す、選択されたＰＧＭについてのＧＥＭＢＥに基づくアッセイにおいて要約した。Ｃｅ−２についての５ｎＭおよびそれより高い酵素濃度で観察された急な濃度応答曲線（図１０Ｂ〜１０Ｄ、１１Ａ、１１Ｂ）から、［Ｅ］＞リガンドのＫｄである条件下で生じ、ひいては効力の過小評価をもたらす、酵素の化学量論上の滴定が示唆される。このことは、濃度応答曲線の双曲線応答、およびｉＰＧＭ濃度を５ｎＭ未満とするとイプグリセルミドＢのＩＣ５０が左側にシフトすることによって裏付けられた（図１０Ｂ）。高ｉＰＧＭ濃度での化学量論上の結合を説明するための二次方程式モデルを使用して、図１０Ｂにおける濃度応答曲線のファミリーを使用して、イプグリセルミドＢについて有効なＫｄが７３±１５ｐＭであることを推定した。
【０１４２】
（実施例５）
イプグリセルミドＢ（Ｃｅ−２）アナログは、ｉＰＧＭオルソログに対する薬理学的−系統学的関係を規定する
Ｃｅ−２を、Ｃ末端トランケーション／置換シリーズを伴う構造活性関係研究のための鋳型として選択し、活性に必要な最小配列を規定するために使用した。この環状ペプチドをまた、直鎖状アナログを調査するために使用して、配列の立体構造上の制約から、親和性に対する効果を決定した（表８および図１２Ａ〜１２Ｂを参照されたい）。Ｃｅ−２の直鎖状配列のほとんどを除去すると、結果としてｉＰＧＭ阻害活性が失われたかまたは大きく弱まったが（Ｃｅ−２ｅからＣｅ−２ｇ）、トランケートされたアナログであるＣｅ−２ａからＣｅ−２ｄは、結果としてｉＰＧＭオルソログの中でも、活性の範囲を広げた。特に注目すべきは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭおよびＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭに対して、アナログＣｅ−２ｄのナノモル濃度活性は保持されるが、Ｂ．ｍａｌａｙｉ、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ、およびＤ．ｉｍｍｉｔｉｓに対する活性は、マイクロモル濃度範囲のＩＣ５０に近似してくることである（図１０Ｂおよび図１３Ａ〜１３Ｂ）。オルソログの活性のこの分離は、これらの酵素のアミノ酸配列間の系統発生上の差に非常に対応している（図１０Ｃ）。
【０１４３】
【表８−１】
2019527721.tif 000023
【表８−２】
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【０１４４】
Ｃｅ−２以外では、Ｇｌｙ１４トランケーションから結果として生じたＣｅ−２ａのみが、ｉＰＧＭオルソログに対するナノモル濃度以下の効力を保持し（表８）、このことから、Ｃｙｓ１４が高親和性結合における鍵となる決定基であることが指摘された。Ｃｅ−２におけるＣｙｓ１４をＳｅｒで等配電子的に置き換えてＣｅ−２Ｓを生成させることによって、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭおよびＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭに対する阻害活性がおよそ１００倍低下し（約１０ｎＭのＩＣ５０）、そしてＣｅ−２ｄに匹敵して、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＥ．ｃｏｌｉのｉＰＧＭと、Ｂ．ｍａｌａｙｉ、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ、およびＤ．ｉｍｍｉｔｉｓのｉＰＧＭとの間で１００倍の効力の分離が引き起こされた（図１０Ｂ）。これらの結果は、Ｃｅ−２の高親和性結合が、ｉＰＧＭの触媒中心での硫黄−遷移金属イオンの相互作用を恐らく伴う、そのＣｙｓ１４チオールに依存することを示す。最後に、Ｃｙｓ１４は重要な結合相互作用に寄与するが、大環状コアを欠き、単にＣｅ−２の残基９〜１４（Ｃｅ−２ｔａｉｌ）のみを含むペプチドは、全てのＰＧＭに対して不活性であった（表８、図１３Ｂ）。ペプチドの大環状化のエントロピー寄与が大きいことは、Ｃｅ−Ｌ２の測定可能な活性があるｉＰＧＭについて、Ｃｅ−２と、Ｃｙｓ８Ｓｅｒ置換によって生じた直鎖状形態のＣｅ−２（Ｃｅ−Ｌ２）との間のＩＣ５０を比較することによって実証された。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ  ｉＰＧＭ、およびＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭからの最も信頼性のあるデータ（図１３Ｂおよび表８を参照されたい）によって、大環状分子の形成によるランダムな状態の低減に起因する、２０００〜１０，０００倍の間の親和性の増強が計算されたが、チオエーテル結合を置き換える水素間の潜在的な立体的衝突も同様に、阻害活性のこの大きな減少に寄与し得る。直鎖状形態のＣｅ−２ｄに由来する関連するペプチドであるＣｅ−Ｌ２ｄは、全てのｉＰＧＭに対して完全に不活性であったが、このことは、Ｃｅ−２大環状分子に対する高い親和性結合を生じるために共に必要な２つの機能的なラリアット大環状分子サブドメインである環系およびＣ末端の重要性をさらに裏付けた。
【０１４５】
（実施例６）
線虫のｉＰＧＭの構造
ｉＰＧＭは、二核金属酵素のアルカリホスファターゼファミリーに構造的に関連するホスファターゼドメインが２つのヒンジペプチドによってホスホトランスフェラーゼドメインに接続されている（Jedrzejasら、EMBO  J.  １９巻：１４１９〜１４３１頁、２０００年）、単量体の二ドメイン酵素である。Ｘ線結晶構造は、２つのトリパノソーマ類およびいくつかの細菌種に由来する酵素について得られている（Jedrzejasら、EMBO  J.  １９巻：１４１９〜１４３１頁、２０００年；Mercaldiら、FEBS  J.  ２７９巻：２０１２〜２０２１頁、２０１２年；Nowickiら、J.  Mol.  Biol.  ３９４巻：５３５〜５４３頁、２００９年；Nukuiら、Biophys.  J.  ９２巻：９７７〜９８８頁、２００７年）。
【０１４６】
大環状分子とｉＰＧＭオルソログとの間の薬理学的−系統学的関係を媒介する分子相互作用を描写する構造モデルを開発するために、本発明者らは、Ｃｅ−２とＢ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭとを共結晶化することを試みたが、結晶を得ることはできなかった。Ｃｅ−２との事前に形成されたｉＰＧＭ結晶を浸漬させることによって結晶が粉々になったが、天然Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの単斜晶系Ｐ格子（ｉＰＧＭ−ｍ）および直方晶系Ｐ格子（ｉＰＧＭ−ｏ）（図６Ａ〜６Ｃ）という２つのアポ結晶形態が得られ、線虫のｉＰＧＭの最初の構造を提供した（表４および図７Ａ〜７Ｃ）。ｉＰＧＭオルソログ間の一次アミノ酸配列の相同性から予想されるとおり、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭは、細菌由来の他のｉＰＧＭに非常に類似している（図１４）。単斜晶系のＣ．ｅｌｅｇａｎｓのアポｉＰＧＭ（ＰＤＢ：５ＫＧＭ）構造を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのアポｉＰＧＭ（ＰＤＢ：２ＩＦＹ）と重ね合わせると、Ｃα原子間で２．７６ÅのＲＭＳＤが得られた（４７６残基がアラインされた）。重ね合わせからの偏差は、２つの構造間でかなり大きいが、全体的な折り畳みは非常に類似している（図８Ａ〜８Ｃ）。単斜晶系のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの構造をまた、基質を結合したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のｉＰＧＭ（ＰＤＢ：１Ｏ９８）の構造と比較した。重ね合わせによって、Ｃα原子間で１．０７ÅのＲＭＳＤが得られた。しかし、２８２残基のみが、トランスフェラーゼドメイン内の残基でアラインすることができ、それは、基質結合によってホスファターゼドメインにおいて立体構造が大きく変化するためである（図８Ａ〜８Ｃ）。他のｉＰＧＭと同様に、Ｍｎ２＋が２つのホスファターゼドメイン金属イオン結合部位の一方を占めているが、アルカリホスファターゼにおけるように、Ｚｎ２＋イオンは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭの第２の結合部位で見出された。これらの遷移金属イオンの同一性を、１．００００Åおよび１．９０１６Åの波長で収集されたデータから計算された位相異常差分マップから検証した。これらの金属イオンは、図９Ａ〜９Ｃに示すように、ヒスチジンおよびアスパラギン酸の三つ組を表５に列挙する配位距離で接触させ、触媒性Ｓｅｒ８６求核試薬はＺｎ２＋イオンに対して配位する。
【０１４７】
（実施例７）
ｉＰＧＭ・大環状複合体の共結晶構造から、ロックド・オープン阻害メカニズムが明らかになる
アポｉＰＧＭ構造から、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭに固有のＮ末端の１８アミノ酸が無秩序であることが観察された。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭからトランケートされた１８アミノ酸のＮ末端を使用する、その後の結晶化の努力において、サイジングクロマトグラフィーによって精製された、事前に形成されたＣｅ−２複合体、およびＣｅ−２ｄとの混合物を調製した。後者によって、１．９５Åに回折する針様の結晶が結果として得られた（図６Ｄおよび表４）。ｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄ複合体の最後のモデル（ＰＤＢ：５ＫＧＮ）は、非対称単位に２つの分子を含有しており（図１５Ａ）、ヒンジペプチドならびに隣接したホスファターゼおよびトランスフェラーゼドメイン表面から形作られたポケットに包まれた大環状分子とのドメイン間の結合様式を明確に示す（図１６Ａ）。非対称単位の２つのサブユニットはほぼ同一であり、ＲＭＳＤ偏差は、アラインされた５２０残基についてＣα原子間で０．２０Åである。したがって、全てのその後の分析を、モデルのサブユニットＡを使用して行った。ｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄの構造を、前述のアポｉＰＧＭ−ｍおよびｉＰＧＭ−ｏ（ＰＤＢ：５ＫＧＬ）の構造と比較した。重ね合わせによって、それぞれ１．９８Å（５０３残基）および２．０５Å（５０２残基）のＲＭＳＤ偏差が得られた。ＲＭＳＤ偏差は幾分大きいが、全体的な構造は著しく類似しており（図１６Ｂ）、ｉＰＧＭの高い柔軟性に起因して二次構造のエレメントがわずかに変位している。Ｃｅ−２ｄ環状ペプチドの結合を提供する（accommodate）空洞は、全ての構造の間で非常に類似しており、ペプチドの結合を提供する上で劇的な立体構造上の変化は観察されなかった。むしろ、親大環状分子を発見するためにここで使用される親和性選択アプローチから予想され得るように、ペプチドがこの空洞内で最適にフィットすることが明らかになる。ｉＰＧＭのこの領域は、図１６Ｃに示すように、Ｃｅ−２ｄの極性残基を提供する、幾分負の非対称に荷電したポケットを形成する。Ｃｅ−２ｄは、表面の全面積、接触面積、および溶媒曝露面積に関する情報を提供するＡｒｅａｉｍｏｌを使用して計算すると（Leeら、J.  Mol.  Biol.  ５５巻：３７９〜４００頁、１９７１年）、４３２．１Å２の全表面積を有し、全部で１２７．１Å２の面積でｉＰＧＭと接触する。全Ｃｅ−２ｄペプチド表面の比較的小さな領域が、ｉＰＧＭに直接接触し（１２７．１Å２）、残りの面積（３０５Å２）は、ホスファターゼドメインとトランスフェラーゼドメインとの間の開いたポケット内に位置するため、溶媒に曝露される。分子量（１５０１．６）およびその２７の環原子に基づいて、Ｃｅ−２ｄは、大きな大環状分子に分類することができる。その表面の２９％が埋もれており、Ｃｅ−２ｄの溶媒は、同等の大きさの大環状分子よりもわずかに広い表面積を曝露する。環状ペプチドの電子密度は、幾分無秩序であった末端のチロシン側鎖を除いて全ての残基で突出していたが、Ｃ末端の４残基は短いα−ヘリックスを形成する（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。Ｃｅ−２ｄのＣＰＫ描写から（図１６Ｃおよび１６Ｄ）、チロシン側鎖３、７、および１１の配向は、環状ペプチドを包むように見え得るが（図１６Ｄ）、チロシン側鎖１および９は、ｅｄｇｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ相互作用に関与する（図１６Ｅ）。Ｃｅ−１では、Ｈｉｓ７でＴｙｒ７が置き換えられ、類似の活性を維持している（表６）。３つの余分な環状Ｃ末端残基であるＴｙｒ９、Ｌｅｕ１０、およびＴｙｒ１１は、コア大環状分子の近くに折り畳まれ（wrapped）、Ｔｙｒ１１のカルボキサミドはこのコンパクトな構造の外表面上で見ることができ、金属イオン活性部位に向けている（図１６Ｅおよび図１７Ａ〜１７Ｃ）。特に、Ｃｅ−２ｄのＴｙｒ１１残基のＣ末端アミドは、Ｍｎ２＋イオンおよびＺｎ２＋イオンからそれぞれ６．５Åおよび８．４Åである（図１７Ｃ）。したがって、Ｃｅ−２（およびＣｅ−１）のより長いＣ末端をこの空洞から潜在的に延ばし、Ｃｙｓ１４をいずれかの金属イオンまでの配位距離内で位置させることが可能である。
【０１４８】
Ｃｅ−２ｄ大環状分子は、図１７Ａおよび１７Ｂに示し、表５に詳述するように、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭとの直接的な水素結合、および水を媒介する接触を形成する。これらの鍵となるＨ結合の２つは、Ｃ末端テール残基である、Ｔｙｒ９、およびＴｙｒ１１のカルボキサミドを用いて作られる。他には、Ｃｅ−２ｄ環系残基と、一方はＡｓｐ２と直接的に、もう一方はＴｙｒ３のヒドロキシルを介して水を媒介する、２つのＨ結合を形成するｉＰＧＭ  Ａｒｇ２８９が含まれるが（図１７Ｂ）、二股のＧｌｙ５のカルボニルのＨ結合は、Ｇｌｎ１０１およびＡｓｐ１０２を介してｉＰＧＭとの間で生ずる（図１７Ｂ）。疎水性相互作用もまた観察され、例えば、大環状分子のＬｅｕ１０は、ｉＰＧＭのＩｌｅ１０３、Ｌｅｕ７８、およびＬｅｕ８２によって形成された小さなポケット内に位置するが（図１８Ａ〜１８Ｂ）、酵素のＩｌｅ９９は、環状ペプチド残基であるＴｙｒ９、Ｌｅｕ１０、およびＴｙｒ７の３．５Åまたはそれ未満以内にある。
【０１４９】
ホスホグリセレートに関するＣｅ−２ｄ結合の配向を調査するために、本発明者らは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｉＰＧＭ  ２−ＰＧ結合物およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭ  Ｃｅ−２ｄ結晶構造を、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ａｒｇのホスホグリセレート結合残基を両構造内のアラインメントポイントとして使用して、重ね合わせた（図１７Ｄおよび１７Ｅ）。モデルでは、大環状分子をホスホグリセレートとオーバーラップしない位置に配置し、これは、イプグリセルミドのアロステリックな結合様式を裏付ける。この結果は、Ｃｅ−２ｄおよびＣｅ−２のＩＣ５０が３−ＰＧ基質濃度に対して独立していることと一致する（図２２Ａ〜２２Ｂ）。
【０１５０】
図１９Ａで観察された、Ｃｅ−２シリーズのｉＰＧＭオルソログの選択性の根底にあるメカニズムについての洞察を得るために、Ｃｅ−２ｄ大環状分子の５Å以内の残基からの結合空洞（図１９Ｂで示すタンパク質配列アラインメントにおいてオレンジ色の影が付けてある）を規定した。これらのアミノ酸によって規定された空洞内で、Ｃｅ−２ｄは、Ｂ因子によってスケーリングされたワーム状のα鎖（金色）の描写として示され、いくつかの側鎖、Ｔｙｒ３、Ｐｒｏ４、Ｔｙｒ１１アミド、およびチオエーテル結合は緑色で示されており（図１９Ｃ）、そこから、いくつかの目立った所見が得られた。先に論じたように、Ｃｙｓ１４を越えたＣｅ−２のトランケーションによって、Ｔｙｒ１１がＣ末端残基となるまで効力が約１０倍低下し（Ｃｅ−２ｂ、ｃ）、その時点では、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭおよびＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭについての効力が回復したが（Ｃｅ−２ｄ）、Ｂ．ｍａｌａｙｉ、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ、およびＤ．ｉｍｍｉｔｉｓオルソログについてはごくわずかであった。阻害効力の向上は恐らく、Ｃｅ−２ｄのＣ末端Ｔｙｒ１１のアミドと、ホスファターゼドメインの高度に保存されたＧｌｕ８７とによって可能になった、新たなＨ結合の結果であった（図１９Ｃ）。Ｔｙｒ１１のその後の除去によって、結果として効力がほぼ１００倍低下し、それは恐らく、Ｔｙｒ１１アミド−Ｇｌｕ８７  Ｈ結合の喪失による。トランケーションを継続すると、大環状分子が実質的に不活化した（Ｃｅ−２ｆ、ｇ）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭオルソログおよびＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭオルソログと、Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭオルソログ、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ  ｉＰＧＭオルソログ、およびＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ  ｉＰＧＭオルソログとの間のＣｅ−２ｄの阻害効力が大きくかけ離れていることについての考えられる説明は、一部、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭおよびＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭのヒンジ２内のＡｌａ３３４による媒介であり得るが、Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭオルソログ、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ  ｉＰＧＭオルソログ、およびＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ  ｉＰＧＭオルソログではグルタメートによって置換えられているためであり得る。Ａｌａ３３４は、Ｃｅ−２ｄのＰｒｏ４およびＴｙｒ３から＜２．５Åであり、したがって、グルタミン酸残基が占めるより大きな容積は、部分的にのみＴｙｒ１１アミドのＨ結合によって代償される、立体的衝突を生じさせ得る。図１４において黄色で強調されている、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｉＰＧＭおよびＥ．ｃｏｌｉ  ｉＰＧＭと、Ｂ．ｍａｌａｙｉ  ｉＰＧＭ、Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ  ｉＰＧＭ、およびＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ  ｉＰＧＭとの間の結合空洞の外側の配列の差もまた、オルソログ選択性に寄与し得る。
【０１５１】
イプグリセルミドＢ（Ｃｅ−２）の進行性Ｃ末端トランケーションから、Ｃｙｓ１４がｐａｎ−オルソログの効力および急なＨｉｌｌ係数（＞１）を大環状分子にもたらしたことが明らかになった。この所見は、潜在的な触媒部位金属イオン配位子としてのシステイニルチオレートの機能と一致し、本明細書における結晶学的知見によって示唆される、ｉＰＧＭ活性部位でのボーダーラインのハード／ソフトルイス酸Ｚｎ２＋、および関連する金属酵素、例えばＥ．ｃｏｌｉ  ＡＰにおけるその存在（Christiansonら、Ann.  Rev.  Biochem.  ６８巻：３３〜５７頁、１９９９年）を伴って、特に妥当である。トランケーションまたはＣｙｓ１４Ｓｅｒ置換の結果としてのスルフヒドリル側鎖の喪失によって、濃度応答曲線のＨｉｌｌ勾配（＜１）の傾きがさらに大きくなり、ｉＰＧＭオルソログの間での効力の差別化がなされる（図１３Ａ）。以下のような明らかな対応が、ｉＰＧＭの効力と系統学的関係との間で見られ得る（図１０Ｃから決定される）：ＩＣ５０Ｃｅ＝ＩＣ５０Ｅｃ＞＞ＩＣ５０Ｂｍ＞ＩＣ５０Ｄｉ≒ＩＣ５０Ｏｖ。総合すると、これらの結果は正の協同的結合メカニズムを示唆し、それによって、環状配列およびＣ末端伸長の大部分がｉＰＧＭに結合し、Ｃｙｓ１４のスルフヒドリルを金属イオン部位への配位距離以内に位置させる。このメカニズムは、急なＨｉｌｌ勾配に反映される階段状のまたは超高感度の濃度応答プロファイルをもたらす結合様式と一致する（Shoichet  J.  Med.  Chem.  ４９巻：７２７４〜７２７７頁、２００６年；Zhangら、Open  Biol.  ３巻：１３００３１頁、２０１３年）。図２０Ａ〜２０Ｂに示すように、ｉＰＧＭ・Ｃｅ−２ｄ結晶構造上へのＣｅ−２のＣ末端の４つのアミノ酸残基のモデリングは、Ｃｙｓ１４のチオレートをＭｎ２＋イオンの配位距離内に位置させる。Ｚｎ２＋イオンとの相互作用は、酵素における立体構造上の調整を必要とする可能性があり、これは恐らく、Ｃｅ−２で浸漬させる際のＣ．ｅｌｅｇａｎｓのアポｉＰＧＭ結晶の不安定性の説明となる。
【０１５２】
（実施例８）
メチル化されたペプチドアナログによるｉＰＧＭの阻害
ペプチドの直鎖状部分上の１つまたは複数のメチル化されたアミド結合を含む、Ｃｅ−２（配列番号２）の一連のアナログを合成した。ペプチドを表９に示す。アナログの活性は、実施例１に記載したように決定し、結果を表１０に示す。
【０１５３】
【表９−１】
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【表９−２】
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【０１５４】
【表１０】
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【０１５５】
（実施例９）
Ｎ末端Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の比較
Ｎ末端Ｌ−またはＤ−アミノ酸を有するペプチドを合成し、実施例１に記載したように、ＰＧＭの阻害について試験した。Ｃｅ−２およびＣｅ−２ｄは、上述したように、Ｎ末端Ｄ−Ｎ−クロロアセチルチロシンを有する。全てＬ−アミノ酸（Ｎ末端Ｌ−Ｎ−クロロアセチルチロシンを有する（Ｌ−Ｔｙｒ１−Ｃｅ２およびＬ−Ｔｙｒ１−Ｃｅ−２ｄ））を有する同一のペプチドもまた試験した。表１１に示すように、全てＬ−アミノ酸を有するペプチドは、Ｃｅ−２およびＣｅ−２ｄの活性の大部分を保持していた。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｄＰＧＭまたはＥ．ｃｏｌｉ  ｄＰＧＭに対する活性はほとんど観察されなかった。
【０１５６】
【表１１】
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【０１５７】
（実施例１０）
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに対するペプチドの効果の評価
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ株Ｎ２（野生型）を化合物の試験に使用した。ワームは標準的な方法を使用して扱った。ワームは、線虫成長培地（ＮＧＭ）プレート上で、２０℃のインキュベーター内で培養し、生きたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＯＰ５０を餌として与えた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯＰ５０細胞を一晩、３７℃で前培養し、その後、ＮＧＭプレートの表面上に広げた。同時に、卵の漂白を介して得られたＬ１  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの同調液体培養物、および顕微鏡下でＮＧＭプレートからピックアップした個々のＬ４を、試験に使用した。２０のＬ１または１つのＬ４のいずれかを、９６ウェルプレートの個々のウェル内で、死滅したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を飼料源として補充した１００μＬのＳ培地中に入れた。化合物を異なる濃度でウェルに添加し、ワームと共に、２０℃で、最大７日間インキュベートした。ワームの健康に対する化合物の効果を、飼料の消費、発育、および繁殖によって測定した。飼料の消費は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーを使用してモニタリングした、ＯＤ６００ｎｍの読み取りの減少によって測定した。ワームの発育およびＦ１子孫の産生を、顕微鏡下で視覚的にモニタリングした。
【０１５８】
図２３Ａおよび２３Ｂは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを５μＭまたは１０μＭのＣｅ−２またはＣｅ−２ｄに１〜７日間曝露した効果を示す。顕微鏡検査は、ペプチドの存在下でＦ１子孫の数がわずかに減少したことを示した。５０μＭのペプチドへの曝露では、成虫期に対する効果はほとんど示されなかった（図２３Ｃ）。これらの２つのペプチドではｉｎ  ｖｉｖｏの有効性はほとんど観察されなかったが、他のペプチド、投与様式、または寄生性種の培養条件にさらに似せて模倣する代替の培養条件（例えば、無菌成長条件）は、より大きな効果を有し得る。
【０１５９】
（実施例１１）
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに対するペプチド効果のさらなる評価
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、実施例１０に記載したように扱い、培養した。化合物を、標準的な技術を使用して、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにマイクロインジェクトする。ワームの発育およびＦ１子孫の産生を、実施例９に記載したようにモニタリングする。活性化合物を、発育、ワームの生存能力（例えば、生存能力の低下）、および子孫の産生に対する影響によって同定する。
【０１６０】
本開示の原理が適用され得る多くの考えられる実施形態を考慮して、説明された実施形態は例にすぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。本発明者らは、したがって、本発明者らの発明として、これらの特許請求の範囲および趣旨に含まれる全てのものを特許請求する。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−Ｃ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ−Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ−Ｃ】
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【図１６Ａ−Ｅ】
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【図１７Ａ−Ｃ】
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【図１７Ｄ−Ｅ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ−Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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