(57)【要約】  本開示は、気道炎症、気道リモデリングおよび気道過敏性の症状を軽減することを含む、気道疾患を治療するための方法を教示する。本方法は、羊膜上皮細胞もしくはその機能的均等物、またはエキソソームと共に抗線維化剤の投与を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において気道疾患を処置するための方法であって、前記対象へ、治療有効量の羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームを抗線維化剤と共に投与することを含み、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減するのに十分な条件下および当面の間、処置される、前記方法。
【請求項２】
抗線維化剤が、リラキシン−２、リラキシン−２の組換え形態またはリラキシン−２の機能的誘導体もしくは変異体もしくは模倣体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リラキシン−２の組換え形態が、セレラキシンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
リラキシン−２の誘導体が、リラキシン−２の単一Ｂ鎖誘導体またはＡおよびＢ鎖切断体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
リラキシン−２の単一Ｂ鎖誘導体が、Ｈ２−（Ｂ７−３３）であるか、またはＡおよびＢ鎖切断体が、Ｈ２−（Ａ４−２４）（Ｂ７−２４）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＲＸＦＰ１活性化剤またはアゴニストの投与をさらに含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＡＥＣが、リラキシンまたはその誘導体もしくは変異体を発現するよう遺伝的に修飾される、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
羊膜エキソソームが、リラキシンまたはその組換え体もしくは誘導体もしくは変異体形態を含有するよう修飾される、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対象が、競走動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
競走動物が、ウマである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＥＣもしくはエキソソームが、リラキシンと同時もしくは連続して、共投与されるか、またはＡＥＣもしくはエキソソームが、リラキシンを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
リラキシンが投与され、引き続いてＡＥＣまたは羊膜エキソソームである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
リラキシンおよびＡＥＣまたはエキソソームのいずれかまたは両方の投与が、鼻腔内、呼吸器内、咽頭内または静脈内投与による、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＥＣが、処置される対象となるよう自家または同種または異種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
エキソソームが、処置される対象に対し自家または同種または異種である、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
リラキシンが、処置される対象に対し自家または同種または異種である、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
気道疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、上位気道感染および反応性気道機能不全症候群からなるリストより選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
肺線維症が、特発性肺線維症または他の間質性肺疾患である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
気道疾患が、喘息である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
肺組織または呼吸組織線維症における処置、予防または低減における、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
薬学的に許容し得る媒体で再構成され得る形態で、ＡＥＣまたは羊膜エキソソームを含む第一の区画と、肺組織との使用のために抗線維化剤を含む第二の区画とを、区画形態に含む、薬学的キットであって、ここで、ＡＥＣまたはエキソソームは、使用前に薬学的に許容し得る媒体で再構成され、ここで、ＡＥＣおよび抗線維化剤は、対象へ同時または連続して、いずれかの順序で投与される、前記薬学的キット。
【請求項２３】
ＡＥＣまたは羊膜エキソソームと、抗線維化剤と、１または２以上の薬学的に許容し得る担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む、製剤。
【請求項２４】
抗線維化剤が、リラキシン−２、リラキシン−２の組換え形態、またはリラキシン−２の機能的誘導体である、請求項２２に記載の薬学的キットまたは請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
リラキシン−２の組換え形態が、セレラキシンである、請求項２４に記載の薬学的キットまたは製剤。
【請求項２６】
リラキシン−２の誘導体が、リラキシン−２の単一Ｂ鎖誘導体またはＡおよびＢ鎖切断体である、請求項２４に記載の薬学的キットまたは製剤。
【請求項２７】
リラキシン−２の単一Ｂ鎖誘導体が、Ｈ２−（Ｂ７−３３）であるか、またはＡおよびＢ鎖切断体が、Ｈ２−（Ａ４−２４）（Ｂ７−２４）である、請求項２６に記載の薬学的キットまたは製剤。
【請求項２８】
ＲＸＦＰ１活性化剤またはアゴニストをさらに含む、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の薬学的キットまたは製剤。
【請求項２９】
抗線維化剤を含有するＡＥＣまたはエキソソームを代替的に含む、請求項２２に記載の薬学的キットまたは請求項２３に記載の製剤。
【請求項３０】
抗線維化剤が、リラキシンまたはその組換え体もしくは機能的誘導体である、請求項２９に記載の薬学的キットまたは製剤。
【請求項３１】
対象への気道疾患の処置のための医薬の製造における抗線維化剤の組み合わせにおける、ＡＥＣまたは羊膜エキソソームの使用。
【請求項３２】
抗線維化剤が、リラキシン−２、リラキシン−２の組換え形態、またはリラキシン−２の機能的誘導体である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
気道疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、上位気道感染および反応性気道機能不全症候群からなるリストより選択される、請求項３１または３２に記載の使用。
【請求項３４】
肺線維症が、特発性肺線維症または他の間質性肺疾患である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
気道疾患が、喘息である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３６】
肺組織または呼吸組織線維症における処置、予防または低減における、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
対象への気道疾患の処置における使用のための、ＡＥＣまたは羊膜エキソソームおよび抗線維化剤。
【請求項３８】
抗線維化剤が、リラキシン−２、リラキシン−２の組換え形態、またはリラキシン−２の機能的誘導体である、請求項３７に記載のＡＥＣＳまたは羊膜エキソソームおよび抗線維化剤。
【請求項３９】
気道疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、上位気道感染および反応性気道機能不全症候群からなるリストより選択される、請求項３７または３８に記載のＡＥＣまたは羊膜エキソソームおよび抗線維化剤。
【請求項４０】
肺線維症が、特発性肺線維症または他の間質性肺疾患である、請求項３９に記載のＡＥＣまたは羊膜エキソソームおよび抗線維化剤。
【請求項４１】
気道疾患が、喘息である、請求項３９に記載のＡＥＣまたは羊膜エキソソームおよび抗線維化剤。
【請求項４２】
肺組織または呼吸組織線維症における処置、予防または低減における、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のＡＥＣＳまたは羊膜エキソソームおよび抗線維化剤。
【請求項４３】
対象において気道疾患を処置する方法であって、対象へ、治療有効量の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を抗線維化剤と共に投与することを含み、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減する条件下および当面の間、処置される、前記方法。
【請求項４４】
抗線維化剤が、リラキシン−２、リラキシン−２の組換え形態、またはリラキシン−２の機能的誘導体もしくは変異体もしくは模倣体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
リラキシン−２の組換え形態が、セレラキシンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
リラキシン−２の誘導体が、リラキシン−２の単一Ｂ鎖誘導体またはＡおよびＢ鎖切断体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
リラキシン−２の単一Ｂ鎖誘導体が、Ｈ２−（Ｂ７−３３）であるか、またはＡおよびＢ鎖切断体がＨ２−（Ａ４−２４）（Ｂ７−２４）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
対象が、ヒトである、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
対象が、競走動物である、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
気道疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、上位気道感染および反応性気道機能不全症候群からなるリストより選択される、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
肺線維症が、特発性肺線維症または他の間質性肺疾患である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と、抗線維化剤と、１または２以上の薬学的に許容し得る担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む、製剤。
【請求項５３】
抗線維化剤が、リラキシンである、請求項５２に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年８月４日に出願された「処置の方法」と題されたオーストラリア仮特許出願第2016903060号からの優先権と関連および主張し、その全体内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本開示は、気道炎症、気道リモデリングおよび気道過敏性の症状を軽減することを含む、気道疾患を処置するための方法を教示する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書における著者により参照される刊行物の参考文献一覧詳細は、本明細書の末尾にアルファベット順で収録される。
【０００４】
任意の先行刊行物（またはそれに由来する情報）に対し、または公知である任意事項に対し、本明細書における参照は、先行刊行物（またはそれに由来する情報）または公知事項が、本明細書が関係する取り組み分野における共通の一般的な知識の部分を形成するという承認または了承または、任意の示唆形態ではないし、とられるべきではない。
【０００５】
「気道疾患」という用語により集約的に包含される、肺疾患、肺症候群ならびに、気管支収縮および気管支痙攣を含む呼吸炎症障害は、苦しんでいる対象へ有意な罹病率に寄与し、潜在的に生命を脅かす。主要な有意性の一特定容態は、喘息である。喘息は、気道の閉塞および気管支痙攣を含むアレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）である（Levey et al. (2006) Prim. Care Respir. J. 15:20-34）。先進国における喘息の有病率は、最近の数十年で劇的に増大し（Myers and Tomasio (2011) Respir. Care 5(6:1389-1407)）、世界中で３億の人々に影響を与えると概算される（Stanojevic et al. (2012) BMC Public Health 72:204）。喘息は、毎年世界中で２５０毎の死における１つでも、概算される１５００万人の障害調整生存年数（ＤＡＬＹ）の損失原因でもあり、欧州において医療システムに年間２００億ドル以上かかる（Braman (2006) Chest 130:4S-12S）。
【０００６】
コルチコステロイドおよびβ２−アドレノセプターアゴニストは、喘息のための最も広く使用される処置である（Marceau et al. (2006) J. Allergy Clin. Immunol. 118:574-581）。これらの療法は、気道炎症（ＡＩ）または気道過敏性（ＡＨＲ；気道支収縮薬への気道の収縮性応答[Holgate (2008) Clin. Exp. Allergy 38:872-897]）をそれぞれ直接的に標的にすることにより、ＡＨＲを抑止することができる。しかしながら、それらは、それらが、喘息と関連する気道リモデリング（ＡＷＲ）を標的としないことに限定される。気道リモデリングは、限定されないが、気道過敏性を独立して引き起こすことができる喘息と関連する気道の不可逆的閉塞に寄与する、線維症の発症を含む、肺および気道内の構造変化を含む（Royce and Tang (2009) Curr. Mol. Pharmacol 2:169-181）。
【０００７】
幹細胞は、パラ分泌シグナル伝達を介して作用も（Baraniak and McDevitt (2010) Regen. Med. 5:121-143）、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性を増大もする（Weiss (2014) Stem Cells 32:16-25）、魅力的な修復特性（Ge et al. (2013) J. Cell. Biochem. 114:1595-1605）を保有する。幹細胞は、気道リモデリングの処置における使用へ検討されてきた。幹細胞は、炎症および関連する線維症を低減させるためのアレルギー性気道疾患の急性動物モデルにおいて、主として免疫調節を介し、一部の成功を収めてきた（Royce et al. (2014) Pharm. therap. 141:250-260、Sun et al. (2012) Stem Cells 30:2692-2699、Moodley et al. (2010) Am. J. Rspir. Crit. Cre Med. 182:643-651）。しかしながら、幹細胞の使用は、慢性アレルギー性気道疾患モデルにおいては、それらの増殖、分化および修復能の低減により、あまり見込みがなかった（Dolgachev et al. (2009) Am J. Path. 174:390-400）。これは、可能性として幹細胞の生存、標的損傷組織への遊走、増殖、内在組織細胞の統合を損なう、慢性ＡＡＤにおける広範な線維症の存在にあると考えられている（Knight and Rossi (2010) Expert Rev. Respir. Med. 4:74 -758）。
【０００８】
セレラキシン（ＲＬＸ）は、ヒト遺伝子−２（Ｈ２）リラキシン（リラキシン−２）と呼ばれるヒトリラキシンホルモンの主要な貯蔵および循環形態の薬ベースの型である。その同種Ｇタンパク質共役型受容体であるリラキシンファミリーペプチド受容体−１（ＲＸＦＰ１）を通じ仲介される急速発生する抗線維化作用を有すること（Royce et al. (2014)上記）に加えて、セレラキシンは、急性心不全の患者においてその血管拡張性の利点について現に臨床的に評価され（Teerlink et al. (2013) Lancet 281:29-39）、マウスにおいても生物学的に活性がある（Samuel et al. (2007) Cell. Mol. Life Sci. 64:1539-1557）。セレラキシン単独は、肺損傷の多様なモデルにおいて治療有効性を実証する（Unemori et al. (1996) J. Clin. Invest. 98:2739-2745、Kenyon et al. (2003) Toxicol. Appl. Pharmacol. 186:90-100、Tozzi et al. (2005) Pulm. Pharm. Therap. 18:346-353、Huang et al. (2011) Am. J. Path. 179:2751-2765）。慢性ＡＡＤの状況において、セレラキシンを用いた全身（Royce et al. (2009) Endocrinology 150:2692-2699）および鼻腔内（Royce et al. (2014) Clin. Exp. Allergy 44:1399-1408）処置は、過剰なコラーゲン沈着および気道上皮肥厚化を低減も、ＡＨＲの発症を予防もすることが実証された。
【０００９】
セレラキシンをヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と組み合わせることが、これらの細胞の生存率および増殖能力を改善し、閉塞性腎症誘発性腎線維症をより効果的に予防することが見出された（Huuskes et al. (2015) FASEB J. 29:540-553）。しかしながら、他の容態について他の幹細胞型との相乗性が存在し得るかどうかは、知られていなかった。
【００１０】
ヒト羊膜上皮幹細胞（ＡＥＣ）は、いくつかの可能性として有用な特性を保有する。それらは、非免疫原性であり（Akle et al. (1981) Lancet 2:1003-1005）、非侵襲的手順を介し成熟胎盤の羊膜から容易かつ倫理的に収集され得る（Miki et al. (2005) Stem Cells 23:1549-1559）。ＡＥＣは、慢性疾患状況において単離に使用されるとき、限定的な治療効力のみを示すＭＳＣとは違い（Huuskes et al. (2015)上記）、ブレオマイシン誘発間質性肺損傷の慢性マウスモデルにおける炎症および線維症の両方を低減することができる（Moodley et al. (2010)上記）。
【００１１】
気道疾患へのより効果のある療法を開発する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
要約
本発明は、肺組織において活性のある抗線維化剤と羊膜上皮幹細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームの間に存在する驚くべき相乗性の決定に幾分基づく。抗線維化剤の例は、リラキシンまたはその組換え体もしくは機能的誘導体もしくは変異体である。本明細書はそれゆえ、対象における気道疾患を処置するための治療プロトコールを教示する。プロトコールは、抗線維化剤およびＡＥＣまたは羊膜エキソソームの同時または連続して、いずれかの順序で共投与を含む。ＡＥＣは、態様において、同種または特定の事情においては、異種で有り得るが、処置される対象にとって自家であり、エキソソームは、自家、同種、または異種であってよい。対象は一般的に、処置を必要とするヒト対象である。しかしながら、競走馬などの競走動物における、運動誘発肺出血の処置などにおいて獣医的用途はある。投与は、鼻腔内および呼吸内（intrarespiratory）経路によるなどの任意の簡便な経路によるが、静脈内等によってもよい。
【００１３】
ヒト対象に関し、気道疾患は、急性および慢性アレルギー性気道疾患および反応性気道疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症および他の間質性肺疾患を含む肺線維症、上位気道感染および反応性気道機能不全症候群の具体的な容態を含む。これは、気道疾患の網羅的なリストであるよう企図されてはおらず、気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性の構成要素を有する疾患容態すべても、それに依存するあるいはそれと関係した容態も、本発明によって包含される。本治療プロトコールは、これらの容態、特に気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性の症状を処置するためにさらに設計される。ＡＥＣまたは羊膜エキソソームとリラキシンなどの抗線維化剤との組み合わせが、線維症の肺組織を発症する危険における予防または低減において有用であることが、本明細書で提案される。「気道疾患」という用語は、肺および呼吸器、および急性または慢性のいずれかのアレルギー性および非アレルギー性炎症容態へ適用可能である。ゆえに、肺疾患、反応性気道疾患、肺症候群、特発性肺線維症を含む肺線維症、および他の間質性肺疾患、気管支収縮および気管支痙攣を含む呼吸炎症障害などの疾患は、「気道疾患」という用語によりすべて包含される。
【００１４】
ＡＥＣまたはエキソソームは、抗線維化剤へ別個に投与されてよく、または両方共に合剤にされてよく、またはＡＥＣまたはエキソソームは、ＡＥＣにおいて発現する組換え形態もしくはエキソソーム中へ導入される形態など、抗線維化剤の形態を運搬してよい。簡便に、上に示したように、抗線維化剤は、ヒトリラキシン−２などのリラキシン、またはセレラキシン（本明細書ではＲＬＸとして言及される）などのその組換え形態または組換えリラキシンの誘導体である。リラキシンは、処置される対象にとって、および／またはＡＥＣもしくはエキソソームへ自家、同種または異種であってよい。
【００１５】
リラキシンの誘導体は、単一Ｂ鎖機能的誘導体を含む。後者の例は、Hossain et al. (2016) Chem. Sci. 7:3805-3819により記載されるようなＨ２−（Ｂ７−３３）である。リラキシンの誘導体は、そのＡおよびＢ鎖の両方の機能的切断類似体も含む。切断リラキシン類似体の例は、Hossain et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:37555-37565により記載されるようなＨ２−（Ａ４−２４）（Ｂ７−２４）である。Ａおよび／またはＢ鎖のＮ−およびＣ−末端切断体も、Ｃ−末端アミド化類似体、遊離酸形態およびピログルタミン酸類似体も含むリラキシンの他の誘導体も、本明細書で検討される。
【００１６】
リラキシン構成要素と関係する対象プロトコールは、代替的に、または加えて、リラキシン受容体活性化因子またはアゴニストを採用してよい。受容体はＲＸＦＰ１であり、ＡＥＣはＲＸＦＰ１受容体を発現する。受容体の活性化因子またはアゴニストは、抗ＲＸＦＰ１抗体、ファーマコフォア（pharmacophore）または小分子化学もしくはタンパク質性アゴニスト、およびエストラジオールなどのエストロゲンベース化合物を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本例において教示されるように、ＡＥＣまたは羊膜エキソソームとリラキシンとの組み合わせは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とリラキシンとの組み合わせよりも、より効果があることが見出される。ＡＥＣまたはエキソソームおよびリラキシンは、マウスモデルにおいて上皮の厚さを正常化し、部分的に線維症を回復もし、気道過敏性を軽減もする。リラキシン−２受容体、ＲＸＦＰ１または同様のものを含む羊膜エキソソームを発現するＡＥＣの治療および再生能力を高めるので、リラキシンなどの抗線維化剤は、ＡＥＣベースまたは羊膜ベースの療法が採用され得る、改良された環境を提供することが、本明細書で提案される。ＡＥＣの治療利益が羊膜エキソソームへ適用することがさらに提案される。これに関して、羊膜エキソソームは、羊水もしくは胎盤組織から単離されてよく、または不死化ＡＥＣ株を含むＡＥＣ株から単離されてよい。これは、後で単離され、本治療プロトコールにおいて使用されるＡＥＣ株から羊膜エキソソームを発生させるバイオリアクターの使用を含む。
【００１８】
区画形態で、薬学的に許容し得る媒体で再構成され得る形態で、ＡＥＣまたは羊膜エキソソームを含む第一の区画と、肺組織との使用のために抗線維化剤を含む第二の区画とを、区画形態に含む、キットなどの薬学的キットも本明細書で提供され、ここで、ＡＥＣまたはエキソソームは、使用前に薬学的に許容し得る媒体で再構成され、ここで、ＡＥＣおよび抗線維化剤は、同時にまたは連続して、いずれかの順序で対象へ投与され、ここで、対象が、気道疾患を有する。
【００１９】
ＡＥＣまたは羊膜エキソソームと、抗線維化剤と、薬学的な担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む製剤は、本明細書で可能になる。抗線維化剤はリラキシンを含む。リラキシンは、ＡＥＣもしくはエキソソームと合剤にされてよく、またはＡＥＣもしくはエキソソーム内に含有されもしくは産生されてよい。
【００２０】
対象への、気道疾患の処置のための医薬の製造における抗線維化剤との組み合わせにおける、ＡＥＣまたは羊膜エキソソームの使用は、本明細書でさらに検討される。態様において、抗線維化剤との組み合わせにおけるＡＥＣまたはエキソソームは、対象における気道疾患の処置における使用へ提供される。
【００２１】
態様において、抗線維化剤は、単離される自然発生リラキシン、セレラキシンなどの組換えリラキシン、またはＨ２−（Ｂ７−３３）［Hossain et al. (2016)上記］などの一本鎖リラキシン誘導体もしくはＨ２−（Ａ４−２４）（Ｂ７−２４）［Hossain et al. (2011)上記］などのリラキシンの切断体ＡおよびＢ鎖などのリラキシンの形態である。態様において、リラキシン受容体は、代替的に、またはリラキシンに加えて、ＲＸＦＰ１活性化因子またはアゴニストによって活性化される。リラキシンは、拒絶を回避するために安全性検査の認可を必要とするので、治療される対象にとって自家、同種または異種でよい。
【００２２】
本明細書で使用される略語は、表１において定義される。
【表１】
2019523293.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００２３】
図の簡潔な説明
いくつかの図面は、色彩表示または実体を含有する。色彩写真は、要求に応じて特許権者から、または適当な特許庁から入手可能である。特許庁から得られるとき、料金が課されてよい。
【００２４】
【図１ａ−ｂ】
【図１ｃ】図１ａ〜ｃは、ＡＥＣにおけるＲＸＦＰ１の発現の写真表示である。ＡＥＣ、およびヒト腎線維芽細胞（ＲＦ；陽性対照）をＲＸＦＰ１について免疫蛍光により染色し、核をＤＡＰＩにより対比染色した。ＡＥＣおよびｈＲＦの両方は、ＲＸＦＰ１について強い細胞質染色を有した。染色は、一次抗体がアイソタイプ対照で置換される陰性対照細胞からはなかった。
【００２５】
【図２ａ−ｅ】図２ａからｅは、ＡＩ、上皮厚および上皮下コラーゲンへのＲＬＸ、ＭＳＣ、ＡＥＣおよび併用処置の効果の画像およびグラフ表示である。Ａ）気管支壁内への炎症細胞浸潤の程度を実証する、試験した各群からのマッソントリクローム染色された肺切片の代表画像。スケールバー＝１００μｍ。５気道／マウスからの気管支周囲炎症スコアの中央値＋四分位範囲（切片は、０（視認可能な炎症なし）から４（重度の炎症）の尺度での炎症性細胞凝集体の数および分布に基づき評点化した）（Ｂ；ｎ＝６／群）、ＢＡＬ液ｍＬあたりの平均＋ＳＥＭの好酸球計数（Ｃ；ｎ＝６  群）、ＢＭ長に対する平均＋ＳＥＭの上皮厚（μｍ２）（Ｄ；ｎ＝６  群）、およびＢＭ長に対する平均＋ＳＥＭ上皮下コラーゲン厚（μｍ）（Ｅ；ｎ＝６／群）も示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水群、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ群、¶Ｐ＜０．０５、¶¶Ｐ＜０．０１対ＯＶＡ＋ＲＬＸ群、＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１対ＯＶＡ＋ＭＳＣ群、§Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ＋ＡＥＣ群。ＯＶＡ、オボアルブミン。
【００２６】
【図３ａ−ｂ】図３ａおよびｂは、上皮損傷へのＲＬＸ、ＭＳＣ、ＡＥＣおよび併用処置の効果の画像およびグラフ表示である。Ａ）上皮損傷の程度を実証する、試験した各群由来の胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）染色した肺切片の代表的な画像。スケールバー＝１００μｍ。５気道／マウスからの上皮／１００μｍのＢＭ長内での平均＋ＳＥＭ  ＴＳＬＰ陽性細胞（矢印によって示す）の数も示す（Ｂ；ｎ＝６／群）。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水群、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１対ＯＶＡ群、＋Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ＋ＭＳＣ群。
【００２７】
【図４ａ−ｂ】図４ａおよびｂは、杯細胞化生へのＲＬＸ、ＭＳＣ、ＡＥＣおよび併用処置の効果の画像およびグラフ表示である。Ａ）気道上皮内に存在する杯細胞（矢印によって示す）の数を実証する、各処置群からのアルシアンブルー過ヨウ素酸シッフ染色した肺切片の代表的な画像。スケールバー＝１００μｍ。５気道／マウスからの平均＋ＳＥＭ杯細胞計数（杯細胞／１００μｍのＢＭ長の数として表す）も示す（Ｂ；ｎ＝６／群）。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水群；＃Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ群；¶Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ＋ＲＬＸ群；＋Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ＋ＭＳＣ群；§Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ＋ＡＥＣ群；†Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ＋ＭＳＣ＋ＲＬＸ群。
【００２８】
【図５】図５は、総肺コラーゲン濃度へのＲＬＸ、ＭＳＣ、ＡＥＣおよび併用処置の効果のグラフ表示である。各マウスの総肺コラーゲン含有量を、ヒドロキシプロリン分析を介して計算し、次いで分析した対応する肺切片の乾燥重量により割り、％コラーゲン濃度を算出した。試験した各群からの平均＋ＳＥＭ％肺コラーゲン濃度を示す（ｎ＝６／群）。＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水群；＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ群；＋＋Ｐ＜０．０１対ＯＶＡ＋ＭＳＣ群。
【００２９】
【図６ａ−ｄ】図６ａからｄは、気道上皮ＴＧＦ−β１発現および上皮下筋線維芽細胞の蓄積へのＲＬＸ、ＭＳＣ、ＡＥＣおよび併用処置の効果の画像およびグラフ表示である。気道上皮内での上皮ＴＧＦ−β１の発現のレベルおよび分布実証する各処置群からの免疫組織化学染色した肺切片の代表的な画像（Ａ）および上皮下筋線維芽細胞の蓄積（Ｃ）。スケールバー＝１００μｍ（Ａ、Ｃ）。５気道／マウスからの平均＋ＳＥＭ上皮ＴＧＦ−β１染色（生理食塩水対照群における染色と比較；１として表した）（Ｂ；ｎ＝５〜６／群）、および１００μｍのＢＭ長あたりの平均＋ＳＥＭ上皮下筋線維芽細胞数（Ｄ；ｎ＝５〜６／群）＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水群；＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ群、¶Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ＋ＲＬＸ群；＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１対ＯＶＡ＋ＭＳＣ群。
【００３０】
【図７】ＡＨＲへのＲＬＸ、ＭＳＣ、ＡＥＣおよび併用処置の効果のグラフ表示である。ＡＨＲを、吸入投与によって送達される気管支収縮薬メタコリンの用量を増大することに応じ、（侵襲的プレチスモグラフィーを介して）気道抵抗を測定することにより評価した。応答を、生理食塩水に対する基準値からの抵抗変化として表す。試験した各群（ｎ＝６／群）からの、メタコリンの各用量に応じ測定された気道抵抗の平均±ＳＥＭを示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水群；＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ単独群；¶Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ＋ＲＬＸ群；＋＋＋Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ＋ＭＳＣ群；§§Ｐ＜０．０１、§§§Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ＋ＡＥＣ群。グラフの線についての凡例は以下、
【表２】
2019523293.tif 000003
である。
【００３１】
【図８】図８は、１群あたりｎ＝６〜８動物で、５気道／マウスからの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ気管支周囲炎症スコア（切片は、０（視認可能な炎症なし）〜４（重度の炎症）の尺度での炎症細胞凝集体の数および分布に基づいて評点化した）を示すグラフ表示である。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水／トウモロコシ油で処置した非損傷対照群；＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡで処置した慢性アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）群；¶Ｐ＜０．０５、¶¶Ｐ＜０．０１対ＯＶＡ／ＮＡ＋５μｇ  ＡＥＣ由来エキソソーム（ＥＸＯ）で処置した群；＋Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ／ＮＡ＋ｈＡＥＣ＋ＲＬＸで処置した群、§§Ｐ＜０．０１、§§§Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡ＋ＲＬＸで処置した群。
【００３２】
【図９】図９は、群あたりｎ＝６〜８動物で、５気道／マウスからの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ杯細胞計数（１００ｍｍ基底膜（ＢＭ）長あたりの杯細胞の数として表す）を示すグラフ表示である。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水／トウモロコシ油で処置した非損傷対照群；＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡで処置した慢性アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）群；¶¶¶Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡ＋５μｇ  ｈＡＥＣ由来エキソソーム（ＥＸＯ）で処置した群；‡‡‡ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡ＋２５μｇ  ｈＡＥＣ由来ＥＸＯで処置した群；＋ｐ＜０．０５対ＯＶＡ／ＮＡ＋５μｇ  ｈＡＥＣ由来ＥＸＯ＋ＲＬＸで処置した群；+ｐ＜０．０５対ＯＶＡ／ＮＡ＋ｈＡＥＣ＋ＲＬＸで処置した群；§§Ｐ＜０．０１、§§§Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡ＋ＲＬＸで処置した群。
【００３３】
【図１０】図１０は、群あたりｎ＝８動物で、５気道／マウスからの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ  ＴＳＬＰで染色した細胞計数（１００μｍの基底膜（ＢＭ）長あたり）を示すグラフ表示である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水／トウモロコシ油で処置した非損傷対照群；＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡで処置した慢性アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）群；§§§Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡ＋ＲＬＸで処置した群。
【００３４】
【図１１Ａ−Ｂ】図１１は、群あたりｎ＝８動物で、５気道／マウスからの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（Ａ）上皮厚（μｍ２；基底膜（ＢＭ）長に対する比較）、および（Ｂ）上皮下ＥＣＭ厚（μｍ；ＢＭ長に対する比較−線維症の計測）を示すグラフ表示である。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水／トウモロコシ油で処置した非損傷対照群；＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡで処置した慢性アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）群；¶ｐ＜０．０５、¶¶ｐ＜０．０１、¶¶¶Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡ＋５μｇ  ｈＡＥＣ由来エキソソーム（ＥＸＯ）で処置した群；‡‡ｐ＜０．０１対ＯＶＡ／ＮＡ＋２５μｇ  ｈＡＥＣ由来ＥＸＯで処置した群；§Ｐ＜０．０５、§§§Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡ＋ＲＬＸで処置した群。
【００３５】
【図１２】図１２は、群あたりｎ＝７〜８動物からの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ総肺コラーゲン濃度（肺コラーゲン含有量／組織乾燥重量％−線維症の計測）を示すグラフ表示である。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡで処置した慢性アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）群；¶¶ｐ＜０．０１対ＯＶＡ／ＮＡ＋５μｇ  ｈＡＥＣ由来エキソソーム（ＥＸＯ）で処置した群；‡ｐ＜０．０５対ＯＶＡ／ＮＡ＋２５μｇ  ｈＡＥＣ由来ＥＸＯで処置した群；§Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ／ＮＡ＋ＲＬＸで処置した群。
【００３６】
【図１３】図１３は、群あたりｎ＝７〜８動物で、５気道／マウスからの平均±Ｓ．Ｅ．ＭＴＧＦ−β１染色（解析した面積あたりの染色％として表す）を示すグラフ表示である。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水／トウモロコシ油で処置した非損傷対照群；＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡで処置した慢性アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）群；¶¶¶Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡ＋５μｇ  ｈＡＥＣ由来エキソソーム（ＥＸＯ）で処置した群；＋ｐ＜０．０５対ＯＶＡ／ＮＡ＋２５μｇ  ｈＡＥＣ由来ＥＸＯで処置した群；§§§Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡ＋ＲＬＸで処置した群。
【００３７】
【図１４】図１４は、群あたりｎ＝５〜８動物で、上皮下領域における５気道／マウスからの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍα−平滑筋アクチンで染色した筋線維芽細胞の数（１００μｍの基底膜（ＢＭ）長あたり）を示すグラフ表示である。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水／トウモロコシ油で処置した非損傷対照群；＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡで処置した慢性アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）群；¶Ｐ＜０．０５、¶¶¶Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡ＋５μｇ  ｈＡＥＣ由来エキソソーム（ＥＸＯ）で処置した群；＋ｐ＜０．０５、＋＋ｐ＜０．０１対ＯＶＡ／ＮＡ＋２５μｇ  ｈＡＥＣ由来ＥＸＯで処置した群；§§Ｐ＜０．０１、§§§Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡ＋ＲＬＸで処置した群。
【００３８】
【図１５】図１５は、気道過敏性（ＡＨＲ）に関して査定された様々な群の効果を示すグラフ表示である。気道抵抗（ＡＨＲにおける変化を反映）を、霧状化したメタコリン（気管支収縮薬）の用量を増大することに応じ侵襲的プレチスモグラフィーを介して評価した。結果は、ベースラインからの抵抗変化として表す。メタコリン精巣の各用量に対する平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．気道抵抗を示す（群あたりｎ＝５動物）。ｈＡＥＣ＋組換えヒトリラキシン（ＲＬＸ）またはＲＬＸ単独の効果を比較のために含めた。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水／トウモロコシ油で処置した非損傷対照群；＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡで処置した慢性アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）群；¶Ｐ＜０．０５、¶¶Ｐ＜０．０１、¶¶¶Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ／ＮＡ＋５μｇ  ｈＡＥＣ由来エキソソーム（ＥＸＯ）で処置した群；＋ｐ＜０．０５、＋＋ｐ＜０．０１対ＯＶＡ／ＮＡ＋２５μｇ  ｈＡＥＣ由来ＥＸＯで処置した群；§Ｐ＜０．０５、§§Ｐ＜０．０１対ＯＶＡ／ＮＡ＋ＲＬＸで処置した群。
【表３】
2019523293.tif 000004
【００３９】
【図１６】図１６は、群あたりｎ＝７動物での、５視野／マウスからの視野あたりの平均+Ｓ．Ｅ．Ｍ％間質性線維症を示すグラフ表示である。＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水（ＳＡＬ）で処置した非損傷対照群；＃＃＃Ｐ＜０．００１対ブレオマイシン（ＢＬＭ）で処置した肺線維症群。
【００４０】
【図１７】図１７は、群あたりｎ＝７動物での、５気道／マウスからの平均+Ｓ．Ｅ．Ｍ上皮下ＥＣＭ厚（μｍ；ＢＭ長に対する比較）を示すグラフ表示である。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水（ＳＡＬ）で処置した非損傷対照群；＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ブレオマイシン（ＢＬＭ）で処置した肺線維症群；¶ｐ＜０．０５対ＢＬＭ＋５μｇ  ｈＡＥＣ由来エキソソーム（ＥＸＯ）で処置した群；＋ｐ＜０．０５対ＢＬＭ＋２５μｇ  ｈＡＥＣ由来ＥＸＯで処置した群；∞Ｐ＜０．０１、∞∞Ｐ＜０．００１対ＢＬＭ＋ピルフェニドンで処置した群。
【００４１】
【図１８】図１８は、５気道／マウスからの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ％気管支周囲炎症スコア（切片は、０（視認可能な炎症なし）〜４（重度の炎症）の尺度での炎症細胞凝集体の数および分布に基づいて評点化した）のグラフ表示である。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水（ＳＡＬ）で処置した非損傷対照群；＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ブレオマイシン（ＢＬＭ）で処置した肺線維症群；＋ｐ＜０．０５、＋＋ｐ＜０．０１対ＢＬＭ＋ｈＡＥＣ＋ＲＬＸで処置した群。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
詳細な説明
本明細書を通し、文脈が別段に必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる」などの変化形は、記載された要素もしくは整数もしくは方法ステップまたは要素もしくは整数もしくは方法ステップの群の包含を含意するが、しかし任意の他の要素もしくは整数もしくは方法ステップまたは要素もしくは整数もしくは方法ステップの群を除去するものではないことは理解されるであろう。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈が別段に明確に指図しない限り、複数の局面を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、単一の細胞も、２または３以上の細胞も含み、「気道疾患」への言及は、気道疾患の１または２以上の具体的な疾患形態も、気道疾患の１または２以上の症状も含み、「開示」への言及は、開示により教示される単一および複数の局面を含むなどである。本明細書で教示されおよび可能となる局面は、「発明」という用語によって包含される。すべのかかる局面は、本発明の範囲内で可能となる。本明細書で検討される任意の変異形および派生形は、本発明の「形態」によって包含される。
【００４４】
値の範囲が提供される場合、文脈が別段に明確に指図しない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限およびその記載された範囲における任意の他の記載されたまたは介在する値の間で、それぞれの介在する値は、本発明内に包含されることが理解される。それらのより小さな範囲の上限および下限値は、本発明内にも包含される、より小さな範囲に独立して含まれてよく、記載された範囲における任意の具体的に除外された限界の対象となる。記載された範囲が限界の片方または両方を含む場合、それらの含まれた限界の両方のいずれかを除外する範囲も本発明において包含される。２または３つ以上の剤（例えば、細胞、エキソソームまたは治療実体）と関係する「投与」という用語は、同時または連続して、いずれかの順序で剤が付与されることを意味する。「同時に」という用語は、限定されないが、１つの剤（例えば、細胞またはエキソソーム）が治療実体などの別の剤を含むときを含む。
【００４５】
一般的に、技術分野内の細胞培養、幹細胞生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来方法は、本発明を開発するときに採用される。かかる技術は、文献において完全に説明され、例えば、Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)、Sambrook, Russell and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2001)、Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies : A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998)、およびHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)を参照。
【００４６】
本発明は、主として気道疾患（ＡＤ）、および肺の損傷または疾患に続いて発症する線維症への可能性を軽減するための療法に関して記載される。本発明は、気道疾患を処置するためのＡＥＣまたは羊膜エキソソームとの組み合わせにおける抗線維化剤の使用を網羅するよう企図される。
【００４７】
例において使用される多様な用語についての略語は、表１においておよび発明を実施するための形態において定義される。完全な用語または略語は、発明を実施するための形態において使用される。
【００４８】
「気道疾患」という用語は、気道炎症（ＡＩ）、気道リモデリング（ＡＲ）および／または気道過敏性（ＡＨＲ）の症状により起こるまたは増悪する、またはこれらの症状を有する急性または慢性呼吸肺障害を意味する。「気道疾患」という用語および「ＡＤ」というその略語は、肺疾患、反応性気道疾患、肺症候群ならびに気管支収縮および気管支痙攣の容態を含む呼吸炎症障害を包含する。これらは、性質または原因においてアレルギー性または非アレルギーであってよい。気道疾患の例は、アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）または反応性気道疾患（ＲＡＤ）である。気道疾患は、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症および他の間質性肺疾患を含む肺線維症、上気道感染ならびに反応性気道機能不全症候群（ＲＡＤＳ）を含む。これは、「気道疾患」という用語によって包含される容態の包括的なリストであるよう企図されない。本発明は、気道炎症、気道リモデリング、および／または気道過敏性の１または２以上の構成要素を有する呼吸および肺容態にわたる。態様において、気道疾患は、アレルギー性ベースであってよくまたはでなくてよい炎症性気道疾患である。上に示すとおり、気道疾患は急性または慢性であってよい。
【００４９】
「処置」または「処置すること」という用語は、（ｉ）臨床症状を発症させないことに関する予防、（ｉｉ）臨床症状の発症を停止することに関する抑止および／または（ｉｉｉ）臨床症状の後退を生じることに関する除去を含む、対象における任意の治療介入を意味する。態様において、目的は、気道炎症、気道リモデリング、および／または気道過敏性などの気道疾患の容態または症状を軽減させることである。究極的には、目的は、肺または呼吸器の組織の線維症の発症を予防、危険性を低減または緩和することである。呼吸器（respiratory tract）は、気道（airway）を含む。
【００５０】
「治療有効量」という用語は、気道疾患容態の症状の軽減を含む処置を提供するのに十分な投薬を意味する。これは、処置されるべき対象、疾患および／または疾患の総体的症状、送達の方法、ならびに所望の臨床転帰に応じて変わるであろう。１つの主要な転帰は、炎症で低減した気道リモデリングの低減、および線維症の低減した発生もしくは危険性、または線維症の効果の緩和である。態様において、リラキシンの有効量は、１μｇ〜１０，０００μｇ／ｋｇ／対象／用量である。これは、１日あたり、２〜３日あたり、１週間あたり、または１か月間あたりを含む。１μｇ〜１０，０００μｇの間のおよびこれを含む任意の量は、本発明によって包含される。
【００５１】
本発明は、気道疾患および、限定されないが炎症、気管支収縮および／または気管支痙攣、究極的には線維症、気道リモデリングおよび気道過敏性を含むその様々な発現および症状の処置のための治療プロトコールの開発を前提とする。治療プロトコールは、
（Ａ）（ｉ）ＡＥＣ、または
（ｉｉ）羊膜エキソソーム、および
（Ｂ）抗線維化剤
の治療介入を必要とする対象への投与を含む。
投与は、同時または連続して、いずれかの順序であってよい。これは、抗線維化剤が、ＡＥＣまたはエキソソーム内に含有または産生されるときを含む。
【００５２】
態様において、抗線維化剤は、リラキシンまたはその組換え形態もしくは機能的誘導体形態である。リラキシンの抗線維症作用は、Samuel et al. (2017) British Journal of Pharmacology 174:962-976において要約されている。ＡＥＣまたはエキソソームおよび抗線維化剤は、いずれかの順序であるいは同時または数秒、数分、もしくは数時間以内に共投与され、または共に合剤にされ提供されてよい（例えば、ＡＥＣまたはエキソソーム内に含有または産生されるリラキシン）。エキソソーム中でたんぱく質などの生物製剤を産生または含有するための一般的な方法は、Sterzenbach et al. (2017) Molecular Therapy 25(6): 1269-1278、Ha et al. (2016) Acta PharmaceuticaSinicaB 6(4):287-296、WO2014/168548、およびこれらの中にある参考文献において提供される。
【００５３】
「リラキシン」という用語は、無処置の全長リラキシン、または生物活性を保持するリラキシン分子の一部［米国特許第5,023,321号、態様における、組換えヒトリラキシン（Ｈ２）にて記載されるように］、およびリラキシン様因子（米国特許第5,911,997号、配列番号３および４、ならびに第５欄２７行から第６欄４行において記載されるように）、リラキシンならびに生物活性類似体を保持する部分および生物活性を保有する部分（米国特許第5,811,395号、配列番号１および２ならびに第３欄、１６から４０行において記載されるように）、ならびにAgoulnik et al. (2017) British Journal of Pharmacology 174:977-989において記載されるものを含む、受容体から結合リラキシンを競合的に置き換えられる剤などのリラキシン様活性を有する他の活性剤を意味する。リラキシンは、米国特許第4,835,251号および米国特許第5,464,756号において記載されるなど、当業者に知られる任意の方法によって作製され得る。「リラキシン−２」という用語は、Ｈ２リラキシンを意味する。リラキシンの誘導体形態は、Hossain et al. (2011)上記、およびHossain et al. (2016)上記に記載される。
【００５４】
本明細書において、ＲＸＦＰ１（正式にはＬＧＲ７）活性化剤の使用は、さらに検討される。本明細書で使用される場合の「ＲＸＦＰ１」および「ＬＧＲ７」という用語は、Ivell (2002) Science 295:637-638に記載されるように、リラキシンＨ２（リラキシン−２としても言及される）によって活性化されたＧタンパク質共役型受容体である同じ実体を指す。ゆえに、
（Ａ）（ｉ）ＡＥＣ、または
（ｉｉ）羊膜エキソソーム、ならびに
（Ｂ）抗線維化剤および／または抗線維化剤が細胞に作用するために介する活性薬もしくは受容体のアゴニストの治療介入を必要とする対象へ、同時または連続して、いずれかの順序で投与を含む治療プロトコールが本明細書で教示される。
【００５５】
態様において、抗線維化剤は、リラキシンまたはその組換え形態もしくは誘導体形態であり、活性薬またはアゴニストはＲＸＦＰ１に作用する。
【００５６】
本明細書で使用される場合の「ＲＸＦＰ１活性化剤」という用語は、リラキシンと同じ手法、すなわち、本明細書の方法において記載されるようにＡＥＣまたは羊膜エキソソームとの投与の際に、リラキシンと類似する抗線維症応答を提供する活性化で、ＲＸＦＰ１を活性化する能力を有する任意の分子を含む。ＲＸＦＰ１活性化剤は、限定されないが、小分子、ペプチド模倣物、ファーマコフォア、または活性化抗ＲＸＦＰ１抗体もエストラジオールなどのエストロゲンベース化合物も含む。
【００５７】
医薬由来のＡＥＣまたはエキソソームとの組み合わせで使用される医薬は、「ファーマコフォア」を含む。本発明のファーマコフォアは、リラキシンが結合するＲＸＦＰ１のエピトープとの相互作用によってリラキシン活性を模倣する。したがって、本発明のファーマコフォアは、リラキシン：ＲＸＦＰ１複合体によって実質的に定義されるような形状（すなわち、幾何学的仕様）および電気化学的性質を有する。ファーマコフォアという用語は、ペプチド、ペプチド類似体、および小さな化学分子を網羅する。リラキシンの他の誘導体は、リラキシン類似体およびリラキシン模倣物を含む（例えば、WO96/40185、WO96/40186、Patil et al. (2017) British Journal of Pharmacology 174(10):950-961を参照）。
【００５８】
作用の任意の理論または様式に対し本発明を制限するよう企図することなく、本発明は、リラキシンがそのＧタンパク質共役型受容体（ＲＸＦＰ１）を通し［Hsu et al. (2002) Science 295:671-674に記載される］、ＡＥＣまたは羊膜エキソソームの修復効果を増強するという知見を一部前提とする。これは、全体的な抗線維症効果を増強し、気道疾患に起因する肺および呼吸組織における再生応答を促進する。
【００５９】
ゆえに、態様において、
（Ａ）（ｉ）ＡＥＣの集団、または
（ｉｉ）羊膜エキソソーム、および
（Ｂ）リラキシンまたはその組換え形態もしくは機能的誘導体、選択的にＲＸＦＰ１活性化剤またはアゴニストと共に投与により、気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性のその発現を含む気道疾患を処置するための治療プロトコールが、本明細書において教示される。
【００６０】
態様において、気道疾患は、アレルギー性気道疾患または反応性気道疾患である。態様において、気道疾患は、喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症および他の間質性肺疾患を含む肺線維症、上気道感染もしくは反応性気道機能不全症候群またはそれらの症状である。態様において、処置とは、呼吸器組織を含む肺組織の線維症の効果を発症または緩和する危険性を予防または低減させることである。
【００６１】
したがって、本明細書において、対象における気道疾患を処置するための方法であって、対象へ、治療有効量の羊膜上皮幹細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームを抗線維化剤と共に投与することを含む方法であり、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減するのに十分な条件下および当面の間での処置が可能となる。
【００６２】
さらに本明細書において、対象におけるアレルギー性気道疾患または反応性気道疾患を処置するための方法であって、対象へ、治療有効量の羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームを抗線維化剤と共に投与することを含む方法であり、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減するのに十分な条件下および当面の間での処置が教示される。
【００６３】
なおさらに本明細書において、対象における喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症および他の間質性肺疾患を含む肺線維症、上気道感染および反応性気道機能不全症候群を含む、またはからなるリストから選択される気道疾患を処置するための方法であって、対象へ、治療有効量の羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームを抗線維化剤と共に投与することを含む方法であり、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減するのに十分な条件下および当面の間での処置が教示される。
【００６４】
なおさらにいっそう本明細書において、対象における喘息を処置するための方法であって、対象へ、治療有効量の羊膜上皮幹細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームを抗線維化剤と共に投与することを含む、対象における喘息を処置するための方法であり、で、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減するのに十分な条件下および当面の間での処置が教示される。
【００６５】
本明細書において可能となるなおいっそう別の局面は、対象における呼吸組織を含む肺組織の線維症の発症の効果を予防または軽減するための方法であって、対象へ、治療有効量の羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームを抗線維化剤と共に投与することを含む方法であり、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減するのに十分な条件下および当面の間での処置である。「緩和すること」または「緩和」への言及は、症状の回復および軽減を含む。態様において、本明細書に、対象における呼吸組織を含む肺組織の線維症の発症の効果であり、症状の回復または軽減のための方法であって、対象へ、治療有効量の羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームを抗線維化剤と共に投与することを含む方法であって、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を緩和するのに十分な条件下および当面の間での処置が教示される。
【００６６】
態様において、抗線維化剤は、呼吸器組織を含む肺組織の線維症を低減させることができる剤である。例は、リラキシン（特に、リラキシン−２またはＨ２リラキシン）、その組換え形態（セレラキシンなど）、または単一Ｂ鎖誘導体など、リラキシンの機能的誘導体もしくは変異体である。後者の例は、Ｈ２−（Ｂ７−３３）である［Hossain et al. (2016)上記］。他の誘導体は、Ｈ２−（Ａ４−２４）（Ｂ７−２４）などの切断ＡおよびＢ鎖形態を含む。いっそうの他の誘導体は、Ｂ鎖Ｎ末端切断体、Ｂ鎖Ｃ末端切断体、Ｂ鎖Ｎ−およびＣ−末端切断体、Ｃ−末端アミド化相同体、遊離酸類似体、ならびにピログルタミン酸類似体を含む。これらの誘導体は、Hossain et al. (2011)上記およびHossain et al. (2016)上記において記載される。なおも他の誘導体は、WO96/40185およびWO96/40186において記載されるなどの類似体および変異体を含む。リラキシンおよびその様々な形態は、ＲＸＦＰ１活性化またはアゴニスト剤とともに投与されてもよい。リラキシンは、処置されている対象に対して一般的に自家または同種であるが、適切な安全性検査を用いて、異種のリラキシン、すなわち、別の種において使用される１つの種由来のリラキシンが使用されてよい。このことも、ＡＥＣまたはエキソソームとリラキシンとの間の関連性へ適用される。
【００６７】
本明細書において、対象における気道疾患を処置するための方法であって、対象へ、治療有効量の羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームをリラキシンまたはその組換え形態もしくはその機能的誘導体と共に投与することを含む方法であり、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減するのに十分な条件下および当面の間での処置が教示される。
【００６８】
本明細書において、対象におけるアレルギー性気道疾患を処置するための方法であって、対象へ、治療有効量の羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームをリラキシンまたはその組換え形態もしくはその機能的誘導体と共に投与することを含む方法であり、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減するのに十分な条件下および当面の間での処置が教示される。
【００６９】
なおさらに本明細書において、対象における喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症および他の間質性肺疾患を含む肺線維症、上気道感染ならびに反応性気道機能不全症候群を含むまたはからなるリストより選択される気道疾患を処置するための方法であって、対象へ、治療有効量の羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームをリラキシンまたはその組換え形態もしくはその機能的誘導体と共に投与することを含む方法であり、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減するのに十分な条件下および当面の間での処置が教示される。
【００７０】
なおさらにいっそう本明細書において、対象における喘息を処置するための方法であって、対象へ、治療有効量の羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームをリラキシンまたはその組換え形態もしくはその機能的誘導体と共に投与することを含む方法であり１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減するのに十分な条件下および当面の間での処置が教示される。
【００７１】
本明細書において可能となるなおいっそう別の局面は、対象における呼吸組織を含む肺の線維症の発症の効果を予防するまたは緩和するための方法であって、対象へ、治療有効量の羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）または羊膜エキソソームをリラキシンまたはその組換え形態もしくはその機能的誘導体と共に投与することを含む方法であり、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減するのに十分な条件下および当面の間での処置である。この局面は、特発性肺線維症などの肺線維症を含む。
【００７２】
上に示したように、気道疾患である喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症および他の間質性肺疾患を含む肺線維症、上気道感染ならびに反応性気道機能不全症候群のリストは、網羅的であるよう企図されてはいない。上にも示したように、リラキシンまたはその様々な形態はまた、ＲＸＦＰ１活性化またはアゴニスト剤と共に使用されてよい。治療有効量の薬学的に活性のあるリラキシンの投与は、気道疾患およびその結果としての肺損傷に応じたリモデリングにおける低下を生じるＡＥＣおよび羊膜エキソソームの修復特性の増強を生じる。
【００７３】
態様において、線維症における肺組織治癒および予防または低減を促進または増強するための方法が提供される。ＡＥＣまたはエキソソームと共に有効量のリラキシンなどの薬学的に活性のある抗線維化剤の投与は、それらを必要とする対象へ、適切な対照と比較したとき、対象における少なくとも約１０％〜１００％まで、肺組織治癒を促進し、例えば、肺における線維症組織の量は、適切な対照と比較したとき、少なくとも約１０％〜１００％まで低下する。「約１０％〜１００％」という表現は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００を意味する。ＡＥＣまたはエキソソームとの組み合わせにおける肺組織治癒を促進するリラキシンの効能は、肺組織病理学を含む技術分野で知られる任意の方法および呼吸の有効性も生化学マーカーも含む様々な他のアッセイを用いて判定することができる。
【００７４】
本発明の方法は、対象、すなわち、進行性肺線維症をもたらし得る疾患と診断された個体、進行性肺線維症と関係する疾患を有すると疑われた個体、進行性肺線維症に感染しやすいと知られる、および関係する疾患を発症する可能性が高いと考えられる個体、または進行性肺線維症と関係する以前に処置された疾患の再発を発症する可能性が高いと考えられる個体を処置するのに適している。加えて、ヒト対象が対象治療プロトコールの主たる受益者であるにもかかわらず、本プロトコールは、運動誘発性肺出血に苦しみ得るウマ、イヌ、およびラクダなどの競走動物への適用を有する。自家、同種または異種のＡＥＣ、エキソソームまたはリラキシンが採用され得るが、拒絶を最小限にするための適切な安全性検査を必要とする。態様において、ＡＥＣすなわちエキソソームおよびリラキシンの自家または同種形態が使用される。
【００７５】
既存の証拠は、それらの喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症および他の間質性肺疾患を含む肺線維症、上気道感染ならびに反応性気道機能不全症候群を含む様々な気道疾患における線維症と肺疾患過程との関連を実証する。対象治療プロトコールは、ＡＥＣまたは羊膜エキソソームの修復特性を増強するための、リラキシンまたはその組換え形態もしくは機能的誘導体形態などの抗線維化剤を採用する。ゆえに、抗線維化剤とＡＥＣまたはエキソソームの間に相乗性がある。相乗性は、ＲＸＦＰ１活性化またはアゴニスト剤の追加的または代替的な使用にわたる。かかる剤は、抗ＲＸＦＰ１抗体、ファーマコフォア、小化学分子、およびエストラジオールなどのエストロゲンベース化合物を含む。
【００７６】
気道疾患の処置は、適切な対照と比較した、疾患の経過を示す１または２以上の診断パラメータを測定することによって判定し得る。動物モデルとの比較について、「適切な対照」は、リラキシンまたは他の抗線維化剤およびＡＥＣもしくは羊膜エキソソームのいずれかを用いて処置されていない、またはこれらの構成要素の１つもしくはその他を用いない、またはいずれの構成要素も用いない医薬製剤を用いて処置された動物である。ヒト対象の場合、「適切な対照」は、処置前の個体、または偽薬を用いて処置されたヒト（例えば、年齢一致または同様の対照）であってよい。
【００７７】
本発明の方法によって処置されるべき気道疾患は、肺線維芽細胞増殖、または肺線維症による細胞外マトリックスタンパク質合成の活性化と関連する種々な疾患によってよい。これらの疾患は、本発明において効果的に処置されてよい。このような疾患は、喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、上気道感染、および反応性気道機能不全症候群を含む。
【００７８】
抗線維化剤およびＡＥＣまたは羊膜エキソソームは、維持され、別個、同時もしくは連続して、投与、または投与前に合剤にされてよい。代替的には、ＡＥＣまたはエキソソームは、抗線維化剤の形態を含んでよい。例えば、ＡＥＣは、組換えリラキシンまたはその誘導体形態を産生するよう遺伝的に操作されてよい。エキソソームは、リラキシン、その組換え形態、またはリラキシンの誘導体を封入するよう操作されてよい。
【００７９】
本発明の製剤は、治療有効量の薬学的に活性のあるリラキシンまたは他の抗線維化剤と、ＡＥＣまたは羊膜エキソソームと、薬学的に許容し得る担体賦形剤および／または希釈剤とを含む医薬製剤である。抗線維化剤およびＡＥＣもしくはエキソソームは、同じ製剤で共投与、または別個の製剤で同時もしくは連続して、順次投与されてよく、またはＡＥＣは、リラキシンなどの抗線維化剤を発現するよう遺伝的に操作されてよい。加えて、エキソソームは、抗線維化剤を含むよう操作され得る。本明細書で示されるように、抗線維化剤の例はリラキシンである。簡潔さの目的のために、続く記載について、「リラキシン」という用語は、特段の指定がない限り、その組換え形態または機能的誘導体を含む。
【００８０】
したがって、本明細書において、ＡＥＣまたは羊膜エキソソームと、抗線維化剤と、１または２以上の薬学的に許容し得る希釈剤、賦形剤および／または担体とを含む製剤が可能となる。態様において、ＡＥＣまたは羊膜エキソソームと、リラキシンと、１または２以上の薬学的に許容し得る希釈剤、賦形剤および／または担体とを含む製剤が本明細書で可能となる。態様において、羊膜エキソソームと、リラキシンなどの抗線維化剤と、１または２以上の薬学的に許容し得る希釈剤、賦形剤および／または担体とを含む製剤が本明細書で教示される。態様において、製剤は、本明細書で前に定義されたように、気道疾患を処置するための本発明の方法における使用のためである。
【００８１】
抗線維症性タンパク質性分子の例としてのリラキシンは、ポリペプチドとして投与されてよく、またはそれはリラキシンをコードする配列を含むポリヌクレオチドからＡＥＣにおいて発現してよい。本発明の方法における使用に適したリラキシンは、天然源から単離することができ、化学的もしくは酵素により合成してよく、または技術分野で知られた標準的な組換え技術を用いて製造されてよい。組換えリラキシンを作製する方法の例は、例えば、米国特許第4,835,251号、第5,326,694号、第5,320,953号、第5,464,756号および第5,759,807号を含む様々な刊行物において見出される。
【００８２】
使用に適したリラキシンは、限定されないが、ヒトリラキシン、組換えヒトリラキシン、ブタリラキシンなどの非ヒト動物に由来するリラキシン、および技術分野で知られるリラキシンの様々な任意の変異体を含む。リラキシン、薬学的に活性のあるリラキシン変異体、およびリラキシンを含む医薬製剤は、技術分野でよく知られる。例えば、米国特許第5,451,572号、第5,811,395号、第5,945,402号、第6,780,836号、第6,723,702号、第5,166,191号および第5,759,807号を参照。概して、組換えヒトリラキシン（セレラキシン）は、２４アミノ酸のＡ鎖と２９アミノ酸のＢ鎖とからなる、ヒトＨ２遺伝子の天然に発生する産物とアミノ酸配列において同一である。有効量のリラキシンは、１〜１０，０００μｇ／ｋｇ／対象を含む。これは、１μｇ／ｋｇ／対象〜１，０００μｇ／ｋｇ／対象を含む。これは、１０μｇ／〜８００μｇ／ｋｇ／対象またはこれらの範囲の任意の間の量を含む。薬用量は、日、週または月あたりでよい。
【００８３】
リラキシンコードヌクレオチド配列は、技術分野で知られ、ＡＥＣにおいて使用され得る（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１３５８２４、ＡＦ０７６９７１、ＮＭ下位番号−−００６９１１、およびＮＭ下位番号−００５０５９）。本発明のリラキシンポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達媒体によってＡＥＣ内へ導入され得る。遺伝子送達媒体は、ウイルス起源または非ウイルス起源であってよい（一般的にJolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64、Kimura (1994) Human Gene Therapy 5:845-852、Connelly (1995) Human Gene Therapy 1:185-193、および Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153を参照）。本発明のポリヌクレオチドのコード配列を含むコンストラクトの送達のための遺伝子療法媒体は、局所的または全身的のいずれかで投与され得る。これらのコンストラクトは、ウイルス性または非ウイルス性ベクターアプローチを利用することができる。かかるコード配列の発現は、内在哺乳類プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導され得る。コード配列の発現は、恒常的、または調節されるかのいずれかであり得る。
【００８４】
本発明は、ＡＥＣへの関心がある選択された核酸分子を運搬または発現するよう構築される組換えレトロウイルスを採用することができる。採用され得るレトロウイルスベクターは、欧州特許第415 731号、WO90/07936、WO94/03622、WO93/25698、WO93/25234、米国特許第5,219,740号、WO93/11230、WO93/10218、Vile and Hart (1993) Cancer Res. 55:3860-3864、Vile and Hart (1993) Cancer Res. 53:962-967、Ram et al. (1993) Cancer Res. 53:83-88、Takamiya et al (1992) J. Neurosci. Res. 33:493-503、Baba et al. (1993) J. Neurosurg. 79:729-735、米国特許第4,777,127号、および欧州特許第345,242号において記載されるものを含む。
【００８５】
遺伝子送達媒体は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのパルボウイルスを採用することもできる。代表的な例は、WO93/09239におけるSrivastava、Samulski et al. (1989) J. Vir. 63:3822-3828、Mendelson et al. (1988) Virol. 166:154-165、およびFlotte et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10613-10617によって開示されるＡＡＶベクターを含む。
【００８６】
アデノウイルスベクター、例えば、Berkner (1988) Biotechniques 6:616-627、Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434、WO93/19191、Kolls et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219、Kass-Eisler et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502、WO94/12649、WO93/03769、WO93/19191、WO94/28938、WO95/11984およびWO95/00655によって記載されたものも関心がある。
【００８７】
殺滅したアデノウイルス単独へ連結または連結していないポリカチオン縮合ＤＮＡ、例えば、Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147- 154）、リガンド連結ＤＮＡ、例えば、Wu (1989) J. Biol. Chem. 264:16985-16987を参照）、真核細胞送達媒体細胞、光重合ヒドロゲル材料の沈着、米国特許第5,149,655号において記載されるような携帯型遺伝子移入パーティクルガン、米国特許第5,206,152号およびWO92/11033において記載されるような電離放射線、核電荷中和、または細胞膜との融合を含む、他の遺伝子送達媒体および方法が採用されてよい。付加的なアプローチは、Philip (1994) Mol. Cell Biol. 14:2411-2418およびWoffendin (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1581-1585において記載される。
【００８８】
使用に適したさらなる非ウイルス性送達は、Woffendin et al. (1994)上記において記載されるアプローチなどの機械送達システムを含む。このタイプのアプローチは、リラキシンタンパク質をエキソソームへ導入するために使用され得る。その上、かかるもののコード配列および発現の産物は、光重合ヒドロゲル材料の沈着を通し送達され得る。ＡＥＣへのコード配列の送達のために使用され得る遺伝子送達のための他の従来方法は、例えば、米国特許第5,149,655号において記載されるような、携帯型遺伝子移入パーティクルガンの使用、米国特許第5,206,152号およびＰＣＴ第WO92/11033号において記載されるような、移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用を含む。
【００８９】
リラキシンは、エキソソームまたはＡＥＣ内へ組み込まれてもよい。例えば、WO2014/168548を参照。
【００９０】
抗線維化剤（例えば、リラキシン［または抗線維化剤を含むＡＥＣもしくはエキソソーム］）と共にまたは別個にＡＥＣまたは羊膜エキソソームを含む医薬組成物の投与は、当業者に知られる任意の簡便な手段によって実施されてよい。投与の経路は、限定されないが、呼吸、鼻腔内、気管内、鼻咽頭、静脈内、腹腔内、胸腔内、皮下、皮内、筋肉内、眼内、髄腔内、直腸で、および徐放または持続放出インプラントによることを含む。
【００９１】
注射可能な使用に適した医薬形態は、無菌の水溶液または分散を含む。
【００９２】
分散の形態における無菌の注射可能な溶液は一般的に、様々な滅菌した活性成分を、羊膜エキソソームを含有する無菌の媒体内へと組み込むことによって調製される。
【００９３】
非経口投与のために、活性構成要素は、医薬担体とともに製剤され、懸濁剤として投与されてよい。適した担体の実例は、水、塩類溶液、デキストロース溶液、フルクトース溶液、エタノール、または動物、植物もしくは合成起源の油である。担体は、他の成分、例えば、保存剤、緩衝剤なども含有してもよい。活性構成要素が、髄腔内で投与されるとき、これらは、脳脊髄液中で製剤されてもよい。
【００９４】
対象発明の活性構成要素は、ある期間にわたり内部でエキソソームを送達することができる、持続送達または持続放出機序において投与され得る。例えば、羊膜エキソソームの持続送達が可能な生分解性ミクロスフェアもしくはカプセルまたは他の生分解性ポリマー構造は本発明の製剤において含まれ得る（例えば、Putney and Burke (1998) Nat Biotech 16:153-157）。
【００９５】
本発明の医薬組成物を調製するとき、多様な製剤技術は、生体内分布を変更するために使用し操作され得る。生体内分布を変更するためのたくさんの方法は、当業者に知られる。かかる方法の例は、タンパク質、脂質（例えば、リポソーム）、炭水化物、または合成ポリマーなどの物質から構成された小胞中でのエキソソームの保護を含む。薬物動態の一般的な考察については、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21sted. (2006)を参照。
【００９６】
概して、リラキシンの用量は、ＡＥＣまたはエキソソームと同時または連続して、日または週あたり約０．１〜５００μｇ／体重ｋｇであってよい。かかる量は、日あたりもしくは週あたり０．１、０．５、１、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００μｇ／ｋｇ、または医師によって決定されるかかる他の間隔を含む。態様において、約１．０ｎｇ／ｍｌ、約０．５〜約５０ｎｇ／ｍｌ、約１〜約２０ｎｇ／ｍｌ以上のリラキシンの血清濃度を得ることが望ましい。７０ｋｇの人への投与については、薬用量は、日あたり約２μｇ〜約２ｍｇ、日あたり約１０μｇ〜５００μｇ、または日あたり約５０μｇ〜約１００μｇの範囲にあってよい。投与されるリラキシンの量は、もちろん、対象および苦痛の重症度、投与の様式およびスケジュール、また送達されるＡＥＣまたはエキソソームの数、ならびに処方する医師の判断によるであろう。
【００９７】
ＲＸＦＰ１およびリラキシンは、特定分子の相互作用と複合体を形成し、この幾何的および化学的記載に適合するファーマコフォアは、ＲＸＦＰ１−リラキシン界面においてＲＸＦＰ１を活性化するための本方法において使用され得る。これらの活性化因子は、本発明の現在記載された方法においてリラキシンの代わりまたは加えて使用され得る。本発明のファーマコフォアを同定することは、ＲＸＦＰ１へのリラキシン結合部位を含む残基の陽性画像を模倣する小分子、ペプチドなどの同定を必要とする。好結果の化合物は、ＲＸＦＰ１へ結合し、活性化し、それにより、リラキシン投与の際に見られるものと類似した効果がある。
【００９８】
ファーマコフォアを活性化するＲＸＦＰ１としての候補分子は、限定されないが、ペプチドおよび小分子を含む数多くの化学物質のクラスを包含することができる。候補ファーマコフォアは、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含むことができ、典型的には、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基、一般的に官能化学基の少なくとも２つを含む。候補ファーマコフォアはしばしば、１または２以上の上の官能基と置換された環状炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは多環式芳香族構造を含む。阻害候補ファーマコフォアは、限定されないが、ポリヌクレオチド、ぺプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組み合わせを含む生体分子においても見出される。
【００９９】
ファーマコフォアを活性化する候補ＲＸＦＰ１は、合成または天然化合物のライブラリを含む広範な種々の源から得られ得る。例えば、無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、広範な種々の有機化合物および生体分子の無作為および定方向合成で、数多くの手段が利用可能である。代替的には、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態における天然化合物のライブラリは、利用可能または容易に製造される。加えて、天然または合成で製造されたライブラリおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段を通し容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリを製造するために使用されてよい。薬理学的に関連性のある知られる足場は、構造類似体を製造するためにアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの定方向または無作為化学修飾へ供されてよい。
【０１００】
リラキシン−ＲＸＦＰ１複合体形成に関与するタンパク質の構造的局面の同定は、複合体における分子および／またはタンパク質：タンパク質間相互作用を調節するファーマコフォアを設計するためのアッセイにおいて使用される三次構造を定義することができる。具体的には、特定の三次構造を有する化合物（小分子、ペプチドなど）のデータセットは、医化学、コンビナトリアルケミストリー、および分子モデリングなど、技術分野において知られる技術を用いて、ＲＸＦＰ１とリラキシンとの結合に関与するタンパク質の原子または原子の群へ結合しそうな分子を決定するために同定され得る。随意に、疎水性および親水性などの因子、構造モチーフにおける官能残基の配置などを考慮に入れてもよい。
【０１０１】
本発明のアッセイの態様において、アッセイは、（１）ライブラリ中の化合物を空間配向に関する結合部位と一致させること、（２）コンピュータで生じた分子ディスプレイソフトウェアを用いて候補化合物を視覚的にスクリーニングすること、および（３）ＬＧＲ７を通しシグナル伝達活性を増強する化合物を決定するために、リラキシンの存在および非存在下でのＲＸＦＰ１に対する実際の化合物を実験的にスクリーニングすることを包含する。
【０１０２】
標的タンパク質の官能残基が一旦同定されると、分子のこの部分は、例えば、Available Chemicals Database（ACD, Molecular Design Labs, 1997）などのデータベースにおいて知られる分子との比較のためのテンプレートとして供与することができ、またはデノボで分子を設計するために使用されてよい。一例において、同定された分子の初期群は、何万もしくは何百万またはそれ以上の異なる非ペプチド有機化合物を含有してよい。異なるまたは補充群は、化学反応または細菌もしくはファージを介して合成で製造され得る数百万の異なるペプチドを含有してよい。大ペプチドライブラリまたはかかるものを作製する方法は、参照により本明細書に組み込まれる１９９３年１１月３０日に発行された米国特許第5,266,684号および１９９５年５月３０日に発行された米国特許第5,420,246号において開示される。非ペプチド有機分子のライブラリは、ＰＣＴ公報WO96/40202において開示される。
【０１０３】
分子の初期ライブラリは、コンピュータで生じたモデリングを介してスクリーニングされ、例えば、化合物のコンピュータモデルは、リラキシンエピトープの空間配向および基本構造を模倣する分子を発見するために、ＲＸＦＰ１へのリラキシンリガンド結合部位のコンピュータモデルに対して一致する。このスクリーニングは、初期群に関する候補分子の数を実質的に低減するべきである。
【０１０４】
次に、スクリーニングされた群を、分子の視認可能な画像を作る、適したコンピュータプログラムを用い視覚的にさらにスクリーニングに供する。次に、生じる候補分子は、リラキシン−ＲＸＦＰ１複合体形成およびＲＸＦＰ１の生じる活性化を増強する能力について実際に検査される。
【０１０５】
薬学的キットであり、薬学的に許容し得る媒体で再構成され得る形態において、ＡＥＣまたは羊膜エキソソームを含む第一の区画と、肺組織との使用のために抗線維化剤を含む第二の区画とを、区画形態に含む、薬学的キットであって、ここで、ＡＥＣまたはエキソソームは、使用前に薬学的に許容し得る媒体で再構成され、ここで、ＡＥＣおよび抗線維化剤は、対象へ同時にまたは連続して、いずれかの順序で投与され、ここで、対象は気道疾患を有する、前記薬学的キットが本明細書でさらに教示される。
【０１０６】
態様において、抗線維化剤は、リラキシン（リラキシン−２）またはセレラキシンなどのその組換え形態もしくは機能的誘導体形態（例えば、Ｈ２−（Ｂ７−３３）などの単一Ｂ鎖誘導体またはＨ２−（Ａ４−２４）（Ｂ７−２４）などのＡおよびＢ鎖切断体）である。リラキシンの他の誘導体は、Hossain et al.(2011)上記およびHossain et al.(2016)上記において記載されるように、本明細書で検討される。代替的に、ＡＥＣまたはエクソソームは、リラキシンを含む。
【０１０７】
本発明は、対象における気道疾患の処置のための医薬の製造における抗線維化剤との組み合わせにおけるＡＥＣまたは羊膜エクソソームの使用も検討する。上に示したように、抗線維化剤の例は、すでに説明したように、リラキシンである。
【０１０８】
対象における気道疾患の処置における使用のためのＡＥＣまたは羊膜エキソソームおよび抗線維化剤も本明細書で教示される。上の通り、抗線維化剤の例は、リラキシンまたはその組換え形態もしくは誘導体形態である。リラキシンまたはその形態の作用は、上で考察したように、ＲＸＦＰ１活性化またはアゴニスト剤の使用によっても増強されてもよい。
【０１０９】
ＡＥＣが羊膜エキソソームに対する代替物において言及されるにもかかわらず、本発明は、対象治療プロトコールに従った使用のために合剤または共混合されたＡＥＣおよびエキソソームを除外しない。
【０１１０】
羊膜エキソソームは、ＡＥＣを培養するバイオリアクターから簡便に得られてよい。ＡＥＣは、異なる修復特性または範囲を有する羊膜エキソソームを生じる、異なる妊娠期において単離されてよい。ＡＥＣまたはエキソソームは、処置される対象に対して自家、同種、または一部の事情において、拒絶が最小限にされ得る場合、異種であってよい。
【０１１１】
気道疾患を処置するためにＡＥＣまたは羊膜エキソソームおよびリラキシンなどの抗線維化剤を用いる利点にもかかわらず、本開示は、これらの容態を処置するためのＭＳＣとリラキシンなどの抗線維化剤との使用に広がる。したがって、本開示は、対象における気道疾患を処置する方法に広がり、対象へ治療有効量の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を抗線維化剤と共に投与することを含む方法であり、１または２以上の気道炎症、気道リモデリングおよび／または気道過敏性を軽減する条件下およびある間での処置である。態様において、抗線維化剤はリラキシンである。
【０１１２】
ＭＳＣを用いた処置のための気道疾患は、本明細書に開示されるとおりである。気道疾患を処置するために使用されるとき、ＭＳＣとリラキシンなどの抗線維化剤とを含む製剤も本明細書で教示される。
【実施例】
【０１１３】
例
本明細書で開示される局面は、続く非限定例によってさらに記載される。
【０１１４】
材料および方法
動物
６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをMonash Animal Services(Monash University, Clayton, Victoria, Australia)から得て、制御された環境下で、１２時間明／１２時間暗照明周期で、水および実験餌（Barastock Stockfeeds, Pakenham, Victoria, Australia）への自由アクセスで飼育した。全てのマウスは、任意の実験前に４〜５日の順化期間を与えた。
【０１１５】
慢性ＡＡＤの誘発
慢性ＡＡＤにおけるＭＳＣ、ＡＥＣおよびＲＬＸ（セレラキシン）の個々対組み合わされた効果を評価するために、オボアルブミン（ＯＶＡ）誘発ＡＡＤの慢性モデルをマウスにおいて確立した（ｎ＝３６）。０日および１４日後にマウスを、５００μｌの０．９％ｗ／ｖ正常生理食塩水溶液（Baxter Health Care, NSW, Australia）中の１０μｇのＶ等級ニワトリ卵ＯＶＡ（Sigma-Aldrich, MO, USA）および４００μｇの硫酸アルミニウムカリウムアジュバント（alum、AJAX Chemicals, NSW, Australia）の２回の腹腔内注射で感作させた。次に、それらへエアゾール化ＯＶＡ（０．９％ｗ／ｖ正常生理食塩水中の２．５％ｗ／ｖ）への全身吸入曝露（吸入投与）を、２１〜６３日の間、３０分間、週３回、超音波噴霧装置（Omron NE-U07、Omron, Kyoto, Japan）を用いて負荷した。対照マウス（ｎ＝６）に５００μｌの０．９％ｗ／ｖ生理食塩水の腹腔内注射を付与し、ＯＶＡの代わりに０．９％ｗ／ｖ生理食塩水を噴霧した。
【０１１６】
幹細胞および／またはＲＬＸの鼻腔内処置
６４日（慢性ＡＡＤモデルの誘発完了の１日後）に、マウスをイソフルラン（Baxter Health Care, NSW, Australia）で軽く麻酔し、適切な処置の鼻腔内投与を行いながら、半横臥位（semisupine position）で保持した。続く処置を２週の期間にわたって６４〜７７日からマウスへ投与した。ＯＶＡ単独：マウス（ｎ＝６）は、２週の処置期間にわたって６４および７１日に自動ピペットを用いて５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＭＳＣおよびＡＥＣのための媒体）（鼻孔あたり２５μＬ）を受け、損傷対照群として使用した。
【０１１７】
ＲＬＸ単独：マウス（ｎ＝６）は、５０μＬ（鼻孔あたり２５μＬ）の０．８ｍｇ／ｍＬ（０．５ｍｇ／ｋｇ／日と等価）のＲＬＸ溶液（Corthera Inc, San Carlos, CA, USA、Novartis Pharma AG, Basel, Switzerlandの子会社）を、鼻腔内送達（Royce et al.(2014)上記、Royce et al. (2015) Stem Cell Res. 15:495-505）を介して２週の処置期間にわたって毎日受けた（６４〜７７日から）。
【０１１８】
ＭＳＣ単独：ＭＳＣ（Tulane Center for Stem Cell Research and Regenerative Medicineから、New Orleans, LA, USA、ｎ＝３〜４名の健常ドナーからプールする）を以前に記載されたとおり特徴づけおよび培養し（Wise et al.(2014) am. J. Phyisol. Renal Physiol.306:F1222-F1235）、概略された試験について３〜６回継代の間で用いた。投与の前に、１×１０６個のＭＳＣを５０μＬのＰＢＳ中に再懸濁し、マウス（ｎ＝６）へ週１回、鼻孔あたり２５μＬで６４および７１日の２週の処置期間に鼻腔内投与した（Royce et al.(2015)上記）。
【０１１９】
ＡＥＣ単独：ＡＥＣ（胎盤期由来、２〜３の別個ドナーからプールし、および以前に特徴づけられている［Murphy et al.(2010) Curr. Prot. Stem Cell Biol, chapter 1, Unit 1E6］）を得て、１０％ｖ／ｖＦＢＳを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ−１２培地中で使用前に一晩再構成し（液体窒素中で保存されているところから１回解凍）、マウスのＭＳＣ処置について上で詳述したとおり、１ｘ１０６個のＡＥＣを５０μＬのＰＢＳに再懸濁し、６４および７１日にマウスの第四の部分群（ｎ＝６）へ投与した。
【０１２０】
併用処置：２つのさらなる部分群のマウス（ｎ＝６／群）は、２週の処置期間にわたってＭＳＣおよびＲＬＸ、またはＡＥＣおよびＲＬＸのいずれかの鼻腔内投与（各処置について上で記載した通り）を受けた。ＲＬＸを、各場合においてＭＳＣまたはＡＥＣの投与前およそ１５〜２０分に投与した。
【０１２１】
侵襲的プレチスモグラフィー
７８日（ＰＢＳまたは詳述された様々な処置の最終的な鼻腔内投与の２４時間後）に、マウスをケタミン１０ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン２ｍｇ／ｋｇＢＷ（０．９％ｗ／ｖ生理食塩水中）の腹腔内注射で麻酔した。次に、気管切開術を行い、麻酔したマウスをBuxco Fine Pointeプレチスモグラフ（Buxco, Research Systems, Wilmington, NC, USA）のチャンバーの中に置いた。次に、各マウスの気道抵抗を、気管支収縮を誘起するために５回服用にわたり、３．１２５〜５０ｍｇ／ｍｌで気管内送達される、増大用量の噴霧されたアセチル−β−メチルコリンクロリド（メタコリン、Sigma Aldrich, MO, USA）に応じて測定した（ＡＨＲにおける変化を反映）。各服用後の最大抵抗よりベースライン抵抗（ＰＢＳ単独）を引くことにより計算された気道抵抗における変化を、査定されたメタコリンの各用量に対してプロットした。
【０１２２】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）および組織収集
侵襲的プレチスモグラフィーに続き、ＢＡＬ液を、氷冷ＰＢＳを用いた３×０．５ｍＬ洗浄液をプールすることによって収集し、−８０℃の３００μＬの５％ｖ／ｖＦＢＳ中に保存した。次に、肺組織を単離し、４つの別個の葉へと分割する前に、冷ＰＢＳ中ですすいだ。最大の葉を、１０％ｖ／ｖ中性緩衝ホルムアルデヒド中で一晩固定し、切断し、およびパラフィン蝋中に包埋するために、加工した。残りの３つの葉を様々な他のアッセイのために、液体窒素中で瞬間凍結させた。
【０１２３】
肺組織病理
各マウス由来の最大の葉をいったん加工およびパラフィン包埋し、各組織ブロックを連続切片にし（３μｍ厚）、帯電させたMikro Glassスライド（Grale Scientific, Ringwood, Victoria, Australia）に置き、様々な組織学的染色または免疫組織化学へ供した。炎症スコアを評価するために、各マウスからの１枚のスライド（合計４２）は、Mayerのヘマトキシリンおよびエオジン（Amber Scientific, Midvale, Western Australia, Australia）（Ｈ＆Ｅ）染色を経た。同様に、上皮厚および上皮下コラーゲン沈着を評価するために、もう一つのスライドセットは、マッソントリクローム染色を経た。杯細胞化生を評価するために、三つ目のスライドセットは、アルシアンブルー過ヨウ素酸シッフ（ＡＢＰＡＳ）染色を経た。Ｈ＆Ｅ、マッソントリクローム染色およびＡＢＰＡＳ染色した切片を以下に詳述するように形態計測学的に解析した。
【０１２４】
免疫組織化学（ＩＨＣ）および免疫蛍光（ＩＦ）
ＴＧＦ−β１（ポリクローナル抗体、ｓｃ−１４６、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA、１：１０００希釈を使用）、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、筋線維芽細胞分化のマーカー、モノクローナル抗体Ｍ０８５１、DAKO Antibodies, Glostrup, Denmark、１：２００希釈を使用）、および胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ、上皮損傷についてのマーカー、ポリクローナル抗体ＡＢＴ３３０、ＥＭＤ  Millipore Corp`. Temecula, CA, USA、１：１０００希釈を使用）を検出するために、ＩＨＣを使用した。任意の一次抗体の非存在下のＥｎＶｉｓｉｏｎキットへ曝露される陰性対照も含めたのに対し、一次抗体染色は、ＤＡＫＯ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ抗ウサギまたは抗マウスキットおよび３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）色素原を用いて検出した。次に、すべてのスライドをヘマトキシリンで対比染色した。
【０１２５】
チャンバースライド上で培養したＡＥＣおよびヒト腎線維芽細胞（ＲＦ、陽性対照として使用、Kolling Institute of Medical Research, University of Sydney, NSW, Australiaにより提供）に、ＲＸＦＰ１を検出するよう実行したとき（ＲＸＦＰ１に対するポリクローナル抗体ＨＰＡ０２７０６７、Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia、１：２００希釈を使用）。一次抗体を、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５二次抗体（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて検出した。核は４’６−ジアミンジオン−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて可視化したが、アイソタイプ（陰性）対照も含めた。
【０１２６】
ＩＦ染色したスライドを、ＨｙＤ共焦点顕微鏡（Leica SP8 Confical Invert, Monash Micro Imaging, Clayton Victoria, Australia）を用いて撮像したのに対し、すべてのＩＨＣ染色したスライドは、形態計測学的解析のためにScanScope AT Turbo（Aperio, CA, USA)を用い、Monash Histology Services, Clayton, Victoria, Australiaによって、を走査した。
【０１２７】
形態計測学的解析
マッソントリクローム、ＡＢＰＡＳ、およびＩＨＣ染色したスライドは、続くように形態計測学的解析を経た。スライド１枚あたり５気道（直径１５０〜３００μｍ）を無作為に選別し、Aperio ImageScopeソフトウェア（Aperio, CA, USA）を用いて解析した。マッソントリクローム染色をしたスライドは、半定量的気管支周囲炎症評点化を経て、そこで、実験者を盲検にし、以前に記載されたとおり、個々の気道を０（気道の周りに検出可能な炎症はない）から４（広範かつ大規模な炎症細胞凝集体、プールされた大きさ〜約０．６ｍｍ２）まで評点化した（Royce et al.(2015)上記）。マッソントリクローム染色をしたスライドは、上皮および上皮下コラーゲン層（青色に染色）の厚さを測定することによって、上皮厚および上皮下コラーゲンについての解析も経て、μｍ２／基底膜（ＢＭ）長μｍとして表した。
【０１２８】
ＡＢＰＡＳ、α−ＳＭＡ、およびＴＳＬＰ染色したスライドを、ＢＭ長１００μｍあたりの陽性染色した杯細胞、α−ＳＭＡ陽性細胞、およびＴＳＬＰ陽性細胞の数を計数することによって、杯細胞化生、筋線維芽細胞数および損傷した上皮細胞についてそれぞれ解析した。ＴＧＦ−β１染色スライドを、気道上皮内で強い陽性染色した画素を評価するためのアルゴリズムを実行することによって、ＴＧＦ−β１タンパク質発現について解析した。結果を、上皮の総面積（ｍｍ２）あたりの強い陽性画素の数として表し、次に、生理食塩水で処置した対照群のものを１として表してそれと比較した。
【０１２９】
ヒドロキシプロリンアッセイ
各マウス由来の２番目に大きな肺葉を、精製されたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（Sigma-Aldrich）の標準曲線から決定されるヒドロキシプロリン含有量の測定のために、以前記載したとおり加工した（Royce et al.(2009)上記、Royce et al.(2014)上記、Royce et al. (2015)上記）。ヒドロキシプロリン値に、６．９４の因子（たいていの哺乳類組織におけるコラーゲンのアミノ酸組成の〜１４．４％を表すヒドロキシプロリンに基づく）を乗じて（Gallop and Paz (1975) Physiol. Revs. 55:418-487）、総コラーゲン含有量を外挿し、これを次に、それぞれ対応する組織の乾燥重量で割り、コラーゲン濃度百分率を求めた。
【０１３０】
統計解析
すべての統計解析は、GraphPad Prism v6.0（GraphPad Software Inc., CA, USA）を用いて実行し、平均±ＳＥＭとして表した。ＡＨＲ結果をBonferroniのポストホック検定を用いる二元配置ANOVAによって解析した。残りのデータを、群間多重比較のためのNeuman-Keulsのポストホック検定を用いる一元配置ANOVAを介して解析した。それぞれのケースにおいて、データを０．０５よりも低いｐ値で有意とみなした。
【０１３１】
上皮損傷を組み込む慢性アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）の誘発
次は、例９と特に関連する。上皮損傷を組み込む慢性ＡＡＤのオボアルブミン（ＯＶＡ）誘発モデルをマウスにおいて確立した（ｎ＝５６）。マウスを、上に記載したとおり、１０μｇのＶ等級のニワトリ卵ＯＶＡ（Sigma-Aldrich, MO, USA）および４００μｇの硫酸アルミニウムカリウムアジュバント（alum、AJAX Chemicals, NSW, Australia）の２回の腹腔内（ＩＰ）注射で０および１４日に感作した。次に、それらを、エアゾール化ＯＶＡ（０．９％ｗ／ｖ正常生理食塩水中２．５％ｗ／ｖ）へ、３０分間、週３回、２１〜６３日間ので、超音波噴霧装置（Omron NE-U07、Omron, Kyoto, Japan）を用い、全身吸入曝露（吸入投与）によって負荷した。次に、マウスは、Ｃｌａｒａ細胞特異的細胞毒であるナフタレン（ＮＡ、２００ｍｇ／体重ｋｇ、Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）の単回ＩＰ注射を６４日（最後のＯＶＡ噴霧期間後の１日、ＯＶＡ＋ＮＡ群）に受け、さらに３日間放置した（気道上皮損傷を誘発させおよび悪化させるために）。しかしながら、対照マウス（ｎ＝８）について、それらに、ＯＶＡの代わりに０．９％ｗ／ｖ生理食塩水５００μＬのＩＰ注射を付与し、０．９％ｗ／ｖの生理食塩水を噴霧し、それらにＮＡの代わりに、トウモロコシ油（ＣＯ、ＮＡのための媒体）を注射した。
【０１３２】
６８日（慢性ＯＶＡ／ＮＡ誘発ＡＡＤモデルの誘導の完了後１日）に、ｈＡＥＣ、エキソソームおよび／またはＲＬＸの鼻腔内処置に関し、マウスをイソフルラン（Baxter Health Care, NSW, Australia）で軽く麻酔し、適切な処置の鼻腔内投与を行っている間に半横臥位で保持した。続く処置を６８〜７４日から、毎日または週１回、マウスへ投与した。
【０１３３】
ＯＶＡ／ＮＡ単独（損傷対照群）：マウスの部分群（ｎ＝８）は、６８〜７４日から自動ピペットを用いて、５０μＬのリン酸塩類溶液（ＰＢＳ、ＡＥＣおよびＡＥＣ由来エキソソームのための媒体、鼻孔あたり２５μＬ）を毎日受けた。
【０１３４】
ＲＬＸ：マウスの別個の部分群（ｎ＝８）は、５０μＬ（鼻孔あたり２５μＬ）の０．８ｍｇ／ｍＬ（０．５ｍｇ／ｋｇ／日と等価）のＲＬＸ溶液（Corthera Inc, San Carlos, CA, USA、Novartis Pharma AG, Basel, Switzerlandの子会社）を６８〜７４日から毎日受けた。
【０１３５】
ＡＥＣ＋ＲＬＸ：ＡＥＣ（１×１０６個／マウス）＋ＲＬＸ（０．８ｍｇ／ｍｌ）の鼻腔内投与がＯＶＡ誘発気道炎症を低減し、ＯＶＡ誘発気道線維症および気道過敏性を抑止することが以前に示されているので（Royce et al. (2016) Clinical Science 130:3151-65）、併用療法をＯＶＡ／ＮＡ損傷マウスの第三部分群へ適用して、陽性対照群として使用した。凍結したＡＥＣ（胎盤期由来、２〜３の別個のドナーからプールした）を３７℃の水浴中で解凍し、次に、ＰＢＳ中で再懸濁した。１×１０６個のＡＥＣを５０μＬのＰＢＳ中で再懸濁し、６８日にマウスの別個の部分群（ｎ＝８）へ投与した。ＲＬＸ（０．８ｍｇ／ｍｌ）を上に詳述したとおり、６８〜７４日から毎日投与した（５０μｌ／マウス）。
【０１３６】
ＡＥＣ由来エキソソーム：ＯＶＡ／ＮＡ損傷マウスの第四および第五の部分群（部分群あたりｎ＝８）に５μｇまたは２５μｇのいずれかのＡＥＣ由来エキソソームをそれぞれ含有する５０μＬのＰＢＳを各々投与した。エキソソームを６８日にのみ鼻腔内投与した。
【０１３７】
ＡＥＣ由来エキソソーム＋ＲＬＸ：ＯＶＡ／ＮＡ損傷マウスの第六および第七の部分群（部分群あたりｎ＝８）に５μｇまたは２５μｇのいずれかのＡＥＣ由来エキソソームをそれぞれ６８日にのみ各々投与した。これらのマウスは、上で詳述したとおり、６８〜７４日からＲＬＸ（０．８ｍｇ／ｍｌ）の毎日の鼻腔内投与も毎日受けた。
【０１３８】
上で記載したように侵襲的プレチスモグラフィーを７５匹のマウスに実行した。
【０１３９】
組織収集、肺組織学、免疫組織化学（ＩＨＣ）、形態計測学的解析、ヒドロキシプロリンアッセイおよび統計解析は、上で記載したとおりであった。
【０１４０】
ブレオマイシン誘発肺線維症の誘導
次は、例１０と関連する。肺線維症のブレオマイシン（ＢＬＭ）誘発モデルをマウス（ｎ＝４９）において確立した。０および７日にマウスへ５０μｌの生理食塩水中の２０μｇのブレオマイシン硫酸塩（Hospira, Melbourne, Victoria, Australia）を鼻腔内（ＩＮ）投与した。しかしながら、対照マウス（ｎ＝７）については、０および７日にそれらへ、ＢＬＭの代わりに０．９％ｗ／ｖの生理食塩水のＩＮ投与（マウスあたり５０μＬ）を付与した。次に、すべてのマウスは、さらに２週間未処置のまま放置した（２１日まで）。
【０１４１】
２２日（ＢＬＭ誘発肺線維症モデルの誘導の完了後１日）、マウスにイソフルラン（Baxter Health Care, NSW, Australia）で軽く麻酔し、適切な処置のＩＮ投与を行いながら、半横臥位で保持した。続く処置を毎日または週１回マウスへ、２２〜２８日から投与した。
【０１４２】
ＢＬＭ単独（損傷対照群）：マウスの部分群（ｎ＝７）は、２２〜２８日後から自動ピペットを用いて、５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ピルフェニドン、ＡＥＣおよびＡＥＣ由来エキソソームのための媒体、鼻孔あたり２５μＬ）を毎日受けた。
【０１４３】
ピルフェニドン：マウスの別個の部分群（ｎ＝７）は、日あたり１ｍｇのピルフェニドン（Tocris Bioscience, Noble Park, Victoria, Australia）（５０ｍｇ／ｋｇ／日と等価）を１日２回の強制経口によって、２２〜２８日から受けた。
【０１４４】
ＡＥＣ＋組換えヒトリラキシン（ＲＬＸ）：慢性ＡＡＤモデルにより、第三群のＢＬＭ損傷マウスは、ＡＥＣ（１×１０６個／マウス）＋ＲＬＸ（０．８ｍｇ／ｍｌ）の鼻腔内投与を受けた。凍結したＡＥＣ（胎盤期由来、２〜３の別個のドナーからプールした）を３７℃の水浴中で解凍し、次に、ＰＢＳ中で再懸濁した。１×１０６個のＡＥＣを５０μＬのＰＢＳ中で再懸濁し、２２日にマウスの別個の部分群（ｎ＝７）へ投与した。ＲＬＸ（０．８ｍｇ／ｍｌ）を２２〜２８日から毎日ＩＮ投与した（５０μｌ／マウス）。
【０１４５】
ＡＥＣ由来エキソソーム：ＢＬＭ損傷マウスの第四および第五部分群（部分群あたりｎ＝７）に、５μｇまたは２５μｇのいずれかのＡＥＣ由来エキソソームをそれぞれ含有する５０μＬのＰＢＳを各々投与した。エキソソームを２２日にのみＩＮ投与した。
【０１４６】
ＡＥＣ由来エキソソーム＋ＲＬＸ：ＢＬＭ損傷マウスの第六および第七部分群（部分群あたりｎ＝７）に５μｇまたは２５μｇのいずれかのＡＥＣ由来エキソソームをそれぞれ含有する５０μＬのＰＢＳを各々、２２日にのみ投与した。これらのマウスは、上に詳述したとおり、２２〜２８日からＲＬＸの毎日のＩＮ投与（０．８ｍｇ／ｍｌ）も受けた。
【０１４７】
侵襲的プレチスモグラフィー、組織収集、肺組織学、形態計測学的解析および統計学は、上で記載したとおりである。
【０１４８】
例１
ＡＥＣ上のＲＸＦＰ１の発現
ＡＥＣおよびヒト腎線維芽細胞（ＲＦ、陽性対照）は、免疫蛍光によってＲＸＦＰ１について陽性に染色し、核をＤＡＰＩで対比染色した（図１）。ＡＥＣおよびＲＦの両方、ＲＸＦＰ１についての強い細胞質染色を有した。染色は、一次抗体がアイソタイプ対照と置換された陰性対照細胞にはなかった。
【０１４９】
例２
気道炎症（ＡＩ）へのＲＬＸ、ＭＳＣ、ＡＥＣおよび併用処置の効果
マッソントリクローム染色した画像からの気管支周囲炎症スコア（図２Ａおよび２Ｂ）およびＢＡＬ液由来の好酸球浸潤（図２Ｃ）をＡＬの目安として用いた。ＯＶＡ処置したマウスの気管支周囲炎症スコア（１．７０±０．６０）は、生理食塩水対照のそれと比較して有意に上昇した（０．１５±０．４０、Ｐ＜０．００１対生理食塩水群、図２Ｂ）。これは、ＡＡＤの慢性モデルがＯＶＡ処置したマウスにおいて確立されたことを確認した。ＭＳＣ単独（１．３０±０．２０、Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ群、Ｐ＜０．００１対生理食塩水群）は、気管支周囲炎症をわずかだけだが有意に低減したのに対し、動物のＲＬＸ処置は、炎症スコアにおけるＯＶＡ誘発増大に有意に影響しなかった（１．５５±０．８３、Ｐ＜０．００１対生理食塩水群）（図２Ｂ）。比較において、ＡＥＣ単独（１．０５±０．２８）、ＭＳＣ＋ＲＬＸ（１．００±０．４０）およびＡＥＣ＋ＲＬＸ（０．９０±０．７０）は、ＡＥＣ＋ＲＬＸ（Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ群、Ｐ＜０．０１対ＯＶＡ＋ＲＬＸ群、Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ＋ＭＳＣ群）で観察された最大の効果で、ＯＶＡ誘発炎症スコアを〜４０〜５０％有意に低減することができた。しかしながら、ＡＥＣ単独も併用処置のどちらも、生理食塩水処置した対照においてみられるものまで気管支周囲炎症を低減することはできなかった（すべてＰ＜０．０１対生理食塩水群、図２Ｂ）。
【０１５０】
ＯＶＡ処置したマウスは、生理食塩水処置した対照由来のもの（１．０６×１０５±０．２５×１０５個／ＢＡＬ液ｍＬ、Ｐ＜０．０１対生理食塩水群、図２Ｃ）と比較して、好酸球の数も有意に増大した（２．８５＋０．４５／ＢＡＬ液ｍＬ）。ＲＬＸ（１．６０×１０５±０．４７×１０５／ＢＡＬ液ｍＬ）およびＭＳＣ単独（１．７９×１０５±０．２１×１０５／ＢＡＬ液ｍＬ）の両方は、好酸球の浸潤を部分的に、しかし同様の程度まで有意に低下させたが（Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ単独両方）、生理食塩水処置対照において測定されるものと相違しないレベルまでであった（図２Ｃ）。比較において、ＡＥＣ単独（７．３７×１０４±１．４６×１０４／ＢＡＬ液ｍＬ）、およびＭＳＣ＋ＲＬＸ（８．１９×１０４±３．７９×１０４／ＢＡＬ液ｍＬ）またはＡＥＣ＋ＲＬＸ（５．９２×１０４±１．０５×１０４／ＢＡＬ液ｍＬ）の併用された効果は、好酸球浸潤を完全に抑止し、再び生理食塩水処置対照において測定されるものともはや相違しないレベルまでであった（図２Ｃ）。
【０１５１】
例３
上皮厚および損傷へのＲＬＸ、ＭＳＣ、ＡＥＣおよび併用処置の効果
ＯＶＡ処置したマウスの上皮厚（２１．２±０．６０μｍ２）は、生理食塩水処置した対照のものと比較して有意に増大した（１６．８９±０．７６μｍ２、Ｐ＜０．０１対生理食塩水群、図２Ｄ）。この値は、生理食塩水処置した対照マウスから測定されたものとは統計的に異ならなかったが、ＭＳＣ単独を用いた処置（１９．２３±０．７３μｍ２）は、上皮厚におけるＯＶＡ誘発増大を低減させる傾向を誘導したに過ぎなかった。比較において、ＲＬＸ単独（１８．１９±０．７４μｍ２、ｐ＜０．０５対ＯＶＡ単独）、ＡＥＣ単独（１６．９０±０．３９μｍ２）、ＭＳＣ＋ＲＬＸ（１７．７５±０．８７μｍ２）およびＡＥＣ＋ＲＬＸ（１８．２１±２．１９μｍ２）はすべて、生理食塩水処置した対照マウスにおいてみられるものまでに上皮厚におけるＯＶＡ誘発増大を標準化した（すべてＰ＜０．０５対ＯＶＡ単独群、生理食塩水群との差なし、図２Ｄ）。
【０１５２】
ＴＳＬＰを上皮損傷のマーカーとして使用し、気道上皮内のＴＳＬＰ陽性細胞の数（４．６１±０．５３）は、生理食塩水処置した対応物におけるものと比較して、ＯＶＡ処置したマウスにおいて有意に高かった(１．００±０．３０、Ｐ＜０．００１対生理食塩水群)。ＭＳＣ単独（４．５０±０．４２）は、ＴＳＬＰ発現におけるＯＶＡ誘発増大を低減させることはできなかった。しかしながら、ＲＬＸ単独（３．１４±０．３４）、ＡＥＣ単独（３．５０±０．１９）およびＭＳＣ＋ＲＬＸ（３．５３±０．２８）またはＡＥＣ＋ＲＬＸ（３．３０±０．２７）の併用効果はすべて、ＯＶＡ単独群におけるものと比較してＴＳＬＰ発現レベルを有意に低減させた（すべてＰ＜０．０５対ＯＶＡ単独群）が、生理食塩水処置した対照マウスにおいて測定されたレベルまでではない（すべてＰ＜０．０１対生理食塩水群）［図３］。特筆すべきことに、ＲＬＸ単独は、ＭＳＣ単独の効果と比較してＴＳＬＰ発現レベルも低減させた（Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ＋ＭＳＣ群、図３）。
【０１５３】
例４
杯細胞化生へのＲＬＸ、ＭＳＣ、ＡＥＣおよび併用処置の効果
杯細胞化生をＡＢＰ  ＡＳ染色した肺切片から解析し、生理食塩水処置した対応物から測定されたものと比較して、ＯＶＡ処置したマウス（４．８３±０．２０）において有意に増大した（１．６２±０．３２、Ｐ＜０．００１対生理食塩水群、図４）。ＲＬＸ単独（５．０８±０．２５）、ＭＳＣ単独（５．２３±０．４７）、ＡＥＣ単独（５．００±０．１６）またはＭＳＣ＋ＲＬＸ（５．０６±０．４１）はいずれも、杯細胞数におけるＯＶＡ誘発増大に影響しなかった（すべてＰ＜０．００１対生理食塩水群）。比較において、ＡＥＣ＋ＲＬＸの併用効果だけが（４．３９±０．２８）、杯細胞数におけるＯＶＡ誘発増大を有意に低減させたが（Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ単独群、ＯＶＡ＋ＲＬＸ、ＯＶＡ＋ＭＳＣ、ＯＶＡ＋ＡＥＣ、およびＯＶＡ＋ＭＳＣ＋ＲＬＸ群、図４）、生理食塩水処置した対照から測定されたレベルへ十分に戻らなかった（Ｐ＜０．０１対生理食塩水群）。
【０１５４】
例５
気道線維症へのＲＬＸ、ＭＳＣ、ＡＥＣおよび併用処置の効果
気道線維症を、マッソントリクローム染色をした肺切片からの上皮下コラーゲン沈着（図２Ｅ）および総肺コラーゲン濃度のヒドロキシプロリン解析を解析することによって測定した（図５）。上皮下コラーゲンは（基底膜長と比較）、生理食塩水処置した対照から測定されたものと比較してＯＶＡ処置したマウス（２６．２６±１．３７μｍ）において有意に増大した（８．０７±０．５８μｍ、Ｐ＜０．００１対生理食塩水群、図２Ｅ）。ＲＬＸ単独（１８．２７±２．２６μｍ）、ＭＳＣ単独（１９．６７±１．１７μｍ）またはＡＥＣ単独（１７．８７±２．１５０μｍ）は、上皮下コラーゲン沈着におけるＯＶＡ誘発の異常な増大を同様の程度まで有意に低減させた（〜３５〜４５％まで、すべてＰ＜０．０１対ＯＶＡ単独群、図２Ｅ）。上皮下コラーゲン沈着において、ＯＶＡ誘発は、ＭＳＣ＋ＲＬＸの併用された効果によって標準化し（１１．１２±０．９３μｍ）（Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ群、生理食塩水群との差なし）、いずれの療法単独よりも大きな程度までであったのに対し（Ｐ＜０．０５対ＲＬＸ単独またはＡＥＣ単独、Ｐ＜０．０１対ＭＳＣ単独、図２Ｅ）、ＡＥＣ＋ＲＬＸで処置したマウスは、ＯＶＡ誘発マウスにおいて測定されたもの（〜７０％まで、Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ群、Ｐ＜０．０５対生理食塩水群）と比較して上皮下コラーゲン沈着のさらなる低減を有した（１３．７２±１．２５μｍ）。
【０１５５】
同様の知見は,総肺コラーゲン濃度の測定結果で観察され、生理食塩水処置した対照から得られた対応する測定結果（２．８４±０．１１％、Ｐ＜０．００１対生理食塩水群）と比較して、ＯＶＡ処置したマウス（３．８２±０．１０％）において有意に増大し、ＲＬＸ単独（３．０８±０．２３％、Ｐ＜０．０１対ＯＶＡ単独群）またはＡＥＣ単独（３．２６±０．１４％、Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ単独群）によって有意に低減したが、ＭＳＣ単独ではしなかった（３．５２±０．１２％）（図５）。驚くべきことに、ＭＳＣ＋ＲＬＸ（２．７５±０．１１％、Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ単独群）またはＡＥＣ＋ＲＬＸ（２．９０±０．０４％、Ｐ＜０．０１対ＯＶＡ単独群）の併用された効果は、肺コラーゲン濃度におけるＯＶＡ誘発増大を完全に回復し、生理食塩水処置した対照動物において測定されるレベルまで戻った（図５）。ＭＳＣ＋ＲＬＸまたはＡＥＣ＋ＲＬＸの併用された効果は、ＭＳＣ単独である、より大きな程度まで総肺コラーゲン濃度も低減させた（両方Ｐ＜０．０１対ＯＶＡ＋ＭＳＣ群、図５）。
【０１５６】
例６
気道上皮ＴＧＦ−β１発現へのＲＬＸ、ＭＳＣ，ＡＥＣおよび併用処置の効果
ＲＬＸおよびＭＳＣまたはＡＥＣの併用された効果がＯＶＡ誘発上皮下コラーゲン沈着および総肺コラーゲン沈着を標準化することができたことにより起こり得る機序を明瞭にするために、気道上皮ＴＧＦ−β１染色における変化を評価した（図６Ａおよび６Ｂ）。上皮ＴＧＦ−β１発現は、生理食塩水処置した対照におけるものと相対的に比較して、ＯＶＡ処置したマウス（１０．６５±０．８１）において有意に増大した（１．００±０．４７、Ｐ＜０．０１対生理食塩水群、図６Ｂ）。ＲＬＸ単独（５．８５±１．４２）は、しかし、ＭＳＣ単独（８．１５±１．７８）はではないが、別個の研究において既に実証したように（Royce et al.(2015)上記）、異常な上皮ＴＧＦ−β１発現レベルにおけるＯＶＡ誘発上大を部分的だが、有意に低減させることができた。その一方で、ＡＥＣ単独（３．０４±０．４４）およびＭＳＣ＋ＲＬＸ（１．４７±０．４５）またはＡＥＣ＋ＲＬＸ（２．６３±０．０６０）の併用効果は、生理食塩水処置した対照において測定されるレベルとはもはや異ならない程度まで（すべてＰ＜０．００１対ＯＶＡ単独群、生理食塩水群との差なし）、およびＭＳＣ単独の効果よりも大きな程度まで（すべてＰ＜０．０５対ＯＶＡ＋ＭＳＣ群、図６）、気道上皮ＴＧＦ−β１発現を顕著に低減させることができた。
【０１５７】
例７
上皮下筋線維芽細胞の蓄積へのＲＬＸ、ＭＳＣ、ＡＥＣおよび併用処置の効果
マウスのＯＶＡ処置は、生理食塩水処置した対応物から測定されたもの（０．４４±０．１３）と比較して、気道の上皮下層におけるＢＭ長１００μｍあたりのα−ＳＭＡ染色した、有意に増大した多くの筋線維芽細胞（１．７２±０．０７）をも生じた（ｐ＜０．００１対生理食塩水群、図６Ｃおよび６Ｄ）。ＭＳＣ＋ＲＬＸ（０．８８±０．１２）またはＡＥＣ＋ＲＬＸ（０．６３±０．１２）の併用された効果は、生理食塩水処置した対照動物において測定されたものとはもはや異ならない数まで上皮下筋線維芽細胞数をさらに低減したのに対し（両方Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ単独群、生理食塩水群とは差なし、図６Ｄ）、ＲＬＸ単独（１．０８±０．１０）、ＭＳＣ単独（１．０６±０．１０）またはＡＥＣ単独（１．１３±０．１９）を含むすべての個々の処置は、上皮下筋線維芽細胞数におけるＯＶＡ誘発増大を同様の程度まで有意に低減した（〜４５〜５０％まで、すべてＰ＜０．０１対ＯＶＡ単独群、すべてＰ＜０．０５対生理食塩水群）。
【０１５８】
例８
ＡＨＲへのＲＬＸ、ＭＳＣ、ＡＥＣおよび併用処置の効果
侵襲的プレチスモグラフィーを介してＡＨＲを評価し、生理食塩水対象において測定したものと比較してＯＶＡ処置したマウスにおいて有意に増大した（図７）。ＡＨＲは、ＲＬＸ単独（〜５０％まで、Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ群、Ｐ＜０．０１対生理食塩水群）またはＡＥＣ単独（〜３５〜４０％まで、Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ群、Ｐ＜０．００１対生理食塩水群）によって部分的だが有意に低下したが、ＭＳＣ単独（Ｐ＜０．００１対生理食塩水群）はせず、これらの処置が気道／肺線維症を回復させるときにいかに有効であるかと相関した。比較において、ＭＳＣ＋ＲＬＸまたはＡＥＣ＋ＲＬＸの併用された効果は、ＡＨＲを、生理食塩水処置対照マウスから測定されるものとはもはや有意に異ならないレベルまでさらに低減した（両方Ｐ＜０．００１対ＯＶＡ単独群、生理食塩水群との差なし、図７）。ＭＳＣ＋ＲＬＸまたはＡＥＣ＋ＲＬＸの併用された効果は、ＭＳＣ単独よりも有意に大きな程度までＡＨＲも低減した（両方Ｐ＜０．０１対ＯＶＡ＋ＭＳＣ群、図７）。
【０１５９】
例９
上皮損傷を組み込む慢性アレルギー性気道疾患／喘息モデル
図８〜１５において提示されるデータは、リラキシンの存在が、上皮損傷を組み込む慢性アレルギー性気道疾患／喘息モデルの動物モデルにおいてエキソソームの治療可能性を増強することを明確に示す。この動物モデルは、例１の直前の節において記載される。結果は、エキソソーム／リラキシンの組み合わせが、炎症スコア、杯細胞化生、上皮損傷、上皮厚および上皮下ＥＣＭ厚、コラーゲン濃度、上皮ＴＧＦ−β１発現レベル、上皮下筋線維芽細胞密度を有意に低減させ気道過敏性を改善することを示す。まとめると、これらの結果は、リラキシンがＡＥＣおよびエキソソームの治療可能性を増強することを示すものと一致する（例２〜８）。
【０１６０】
各群の試験由来のヘマトキシリンおよびエオジン染色した肺切片は、気管壁内での炎症性細胞浸潤の程度を実証した。５気道／マウスからの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ気管支周囲炎症スコア（切片を０（視認可能な炎症なし）から４（重度の炎症）までの尺度で炎症性細胞凝集体の数および分布に基づいて評点化した）を図８に示す。
【０１６１】
各群の試験由来のアルシアンブルー過ヨウ素酸シッフ染色した肺切片は、杯細胞化生の程度を実証した。５気道／マウスからの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ杯細胞計数（基底膜（ＢＭ）長１００ｍｍあたりの杯細胞の数として表される）を図９に示す。
【０１６２】
免疫組織化学的に染色された肺切片は、試験した各群由来の胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ、上皮損傷のマーカー）を示した。５気道／マウスからの平均±Ｓ．Ｅ．ＭＴＳＬＰ染色した細胞の計数（基底膜（ＢＭ）長１００μｍあたり）を図１０に示す。
【０１６３】
マッソントリクローム染色をした肺切片は、試験した各群由来の上皮厚および上皮下細胞外マトリックス（ＥＣＭ／青色染色）厚の程度を実証した。５気道／マウスからの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（Ａ）上皮厚（μｍ２、基底膜（ＢＭ）長と比較）および（Ｂ）上皮下ＥＣＭ厚（μｍ、ＢＭ長と比較、線維症の目安）を図１１に示す。
【０１６４】
群あたりｎ７〜８動物からの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ総肺コラーゲン濃度（％肺コラーゲン含有量／組織乾燥重量−線維症の目安）を図１２に示す。
【０１６５】
免疫組織化学染色した肺切片は、試験した各群からの上皮ＴＧＦ−β１発現レベルを示した。群あたりｎ＝７〜８動物で、５気道／マウスからの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ  ＴＧＦ−β１染色の（解析した面積あたりの％染色として表す）。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対生理食塩水／トウモロコシ油で処置した非損傷対照群を図１３に示す。
【０１６６】
免疫組織化学染色した肺切片は上皮下筋線維芽細胞密度を示した。５気道／マウス由来の上皮下領域（基底膜（ＢＭ）長１００μｍあたり）におけるα−平滑筋アクチンで染色した筋線維芽細胞の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ数を図１４に示す。
【０１６７】
気道過敏性（ＡＨＲ）への様々な群の効果を図１５に示す。気道抵抗（ＡＨＲにおける変化を反映）を、噴霧化したメタコリン（気管支収縮薬）の増大する用量に応じて侵襲的プレチスモグラフィーを介して評価した。図１５における結果をベースラインからの抵抗変化として表す。メタコリン精巣の各用量に対する気道抵抗（群あたりｎ＝５動物）の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ｈＡＥＣ＋組換えヒトリラキシン（ＲＬＸ）またはＲＬＸ単独の効果を比較のために含めた。
【０１６８】
例１０
ブレオマイシン間質性線維症モデル
試験した各群からのマッソントリクローム染色をした肺切片の代表的画像は、間質性肺細胞外マトリックス／コラーゲン沈着（線維症）の程度を実証した。群あたりｎ＝７動物からの５視野／マウスからの視野あたりの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ間質性線維症（％）を図１６に示す。
【０１６９】
試験した各群由来のマッソントリクローム染色をした肺切片の代表的画像は、上皮下細胞外マトリックス（ＥＣＭ）沈着の程度（線維症のもう一つ目安として）を実証した。５気道／マウス、群あたりｎ＝７動物からの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ上皮下ＥＣＭ厚（μｍ、ＢＭ長と比較）を図１７に示す。
【０１７０】
ブレオマイシンモデルからの線維症データは、すべての処置が（ピルフェニドンを含む）、間質性線維症において増大したブレオマイシン誘発を標準化するのに対し、ＲＬＸ＋エキソソーム（ＥＸＯ）またはＲＬＸ＋ｈＡＥＣのみが上皮下ＥＣＭ／コラーゲン沈着におけるブレオマイシン誘発増大もその上標準化することができることを示した（図１７）。比較において、５μｇのエキソソーム単独は、上皮下コラーゲン沈着を回復するときに部分的な効果を有しているにすぎなかったが、ピルフェニドンは何ら効果を有していなかった。傾向は、同様に、２５μｇのＥＸＯ＋ＲＬＸが最適な保護を提供し、生理食塩水処置した対照マウスにおいて測定されるものまで間質性および上皮下の両方のコラーゲン沈着を回復することを示している。データは、特発性肺線維症などの肺線維症の処置を支持する。
【０１７１】
例１１
ブレオマイシン誘発性肺炎症の回復
ブレオマイシンモデルからの炎症スコアは（図１８）、エキソソーム単独またはピルフェニドン単独が、ブレオマイシン誘発肺炎症を部分的に低減させるに過ぎないが、エキソソーム＋リラキシンの併用された効果が、ブレオマイシン誘発肺炎症を十分に回復することができることを示す。ヘマトキシリンおよびエオジン染色した肺切片は、気管壁を用いて炎症性細胞浸潤の程度を実証した。
【０１７２】
ブレオマイシンモデル（ＢＬＭモデル）は間質性および低い程度の気管支周囲炎症を提示するが、ＡＡＤモデルは主として、気管支周囲炎症を提示する。データは、ＡＥＣ＋リラキシンがＢＬＭ誘発肺炎症を制限することができなかったという結論を支持し、このことは、ＡＥＣがエキソソームを産生する制限された時間を有し、身体から一掃される前に効果を導くという事実により記載されてよい。データは、エキソソーム新生が起こる前に、エキソソームが標的細胞へのそれらの効果を、細胞準備刺激ステップおよびその後のラグを迂回することによって直接発揮することができることも示す。ＢＬＭ誘発肺炎症は、エキソソーム＋リラキシンの併用された効果によって、生理食塩水処置した非損傷対照群において測定されるものと有意に異なっていないレベルまで最適に低減した。
【０１７３】
例１２
治療プロトコールの開発
先行例は、ＡＥＣの治療効果をＭＳＣのそれと、慢性ＯＶＡ誘発ＡＡＤの状況において抗線維化剤（ＲＬＸ）の非存在および存在下で比較する。結果は、１）ＡＥＣ単独が、ＭＳＣ単独の効果と比較して、ＡＩ（気管支周囲炎症スコアおよび好酸球計数における変化によって評価されるとおり）、ＡＷＲ（上皮損傷／上皮厚、総肺コラーゲン濃度、および上皮ＴＧＦ−β１発現における変化によって評価されるとおり）、およびＡＨＲにおける慢性ＡＡＤ誘発増大に対する大きな保護を実証したことを示す。しかしながら、ＡＥＣ処置単独は、モデルと関係した構造的および機能的変化を十分に回復させることはできなかった。２）ＲＬＸの存在は、ＭＳＣおよびＡＥＣによって提示される保護を増強することができ、それにより好酸球計数、上皮厚、コラーゲン沈着、上皮ＴＧＦ−β１発現レベル、上皮下筋線維芽細胞蓄積、およびＡＨＲは、生理食塩水処置した対照マウスにおいて測定されるものへ戻す両方の併用処置群においてすべて標準化された。併用処置の優れた抗線維症効果は、個々の処置の効果と比較して、異常なＴＧＦ−β１発現および筋線維芽細胞分化を回復する、それらの大きな能力によって説明されるように見えた。ゆえに、本発明にしたがって、ＲＬＸをＡＥＣと組み合わせることは、ＡＷＲ（気道／肺線維症を含む）のいくつかの局面、および慢性ＡＡＤの状況において、ＡＨＲにおけるＡＷＲ誘発変化を効果的に回復する。
【０１７４】
査定したすべての処置は、好酸球の浸潤を顕著に低減または標準化することができたが、ＲＬＸ単独およびＭＳＣ単独は、概して、気管支周囲炎症を回復する上でほとんど効果的ではなかった。比較において、ＡＥＣ単独は、最も効果的な抗炎症効果を実証し、生理食塩水処置した対照において測定されるものともはや異ならないレベルまで好酸球計数も顕著に低減した。興味深いことに、ＡＥＣおよびＲＬＸの併用された効果は、気管支周囲炎症スコアを、ＲＬＸ単独またはＭＳＣ単独よりも大きな程度までさらに低減した。慢性ＡＡＤモデルにおいて、ＭＳＣの気管内移植は、ＢＡＬ液内での好酸球、好中球および単球の浸潤を低下することが示された（Ge et al. (2013)上記）。ＡＥＣの効果は、慢性ＡＡＤの状況においてこれまで検討されていなかった。ＲＬＸ単独は、ＡＡＤの慢性マウスモデルにおける単球（Royce et al. (2009)上記、Royce et al. (2014)上記）およびリンパ球（Royce et al. (2009)上記、Royce et al. (2014)上記）ならびに他のモデル（Samuel et al. (2011) Lab. Invest. 91:675-690）におけるマクロファージの浸潤の低減において効果的ではなかった。ＲＬＸとＡＥＣとの併用された効果は、他の処置と比較して幅広い抗炎症効果を有する。
【０１７５】
これらの様々な炎症細胞もＴｈ２  ＣＤ４＋細胞の浸潤も、ＡＷＲを包含する様々な構造変化とも関連する。喘息の間、損傷および修復の反復される周期は、肺機能の不可逆的喪失に寄与する、気道における異常な構造変化の原因となる（Hirota and Martin (2013) Chest 144:1026-1032）。現在例において、上皮の肥厚化、杯細胞化生、気道コラーゲンの沈着（線維症）も上皮ＴＧＦ−β１発現および上皮下筋線維芽細胞蓄積をも介してＡＷＲを評価した。
【０１７６】
上皮の肥厚化は、気道の狭窄に寄与しており、ゆえに、気道抵抗が増大し、喘息誘発呼吸困難の増大を生じる（Hogg (1997) APMIS 105:745-745）。上皮の肥厚化は、ＯＶＡ処置マウスにおいて悪化し、ＭＳＣ単独の処置によって有意に影響されなかった。これは、慢性ＡＡＤモデルにおける上皮の肥厚化を抑止するために、鼻腔内（Royce et al. (2015)上記）または静脈内（ｉ．ｖ．）［Firinci et al. (2011) Int. Immunopharmacol. 11:1120-1126］送達されたＭＳＣの能力のなさを実証する先行結果と一致する。対照的に、ＲＬＸ単独は、上皮の肥厚化を低減させることができ、このことは、全身（Royce et al (2009)上記）または鼻腔内に（Royce et al. (2014)上記）、ＲＬＸを用いて処置した慢性ＡＡＤ損傷マウスを使用する先行知見と一致する。同じく、ＡＥＣ単独およびＲＬＸとの組み合わせにおけるＡＥＣは、上皮の肥厚化において増大したＯＶＡ誘発を標準化することが見出された。これらの知見は、異常な上皮の肥厚化および気道／肺への上皮損傷の後から起こる関連した線維症を標準化することができる処置が、ＡＡＤ誘発ＡＷＲおよびＡＨＲへのＡＷＲの寄与から、より保護しやすいことを示唆してよい。実際に、別の近年の研究は、単独、または上皮修復因子（トレフォイル因子−２；ＴＦＦ２）ともしくはＴＦＦ２およびコルチコステロイドであるデキサメタゾンとの組み合わせにおけるＲＬＸの能力が、上皮厚および肺コラーゲン濃度（線維症の土台）の両方を有意に低減させるこれらの処置の能力により、動的肺コンプライアンスのＯＶＡ誘発喪失を完全に回復することができることを実証した［Patel et al. (2016) Br. J. Pharmacol. doi:10.1111/bph.13494］。
【０１７７】
上皮の肥厚化と関係して、本発明は、喘息様症状の様々な刺激に応じて気道上皮細胞（ＩＬ−２５およびＩＬ−３３とともに）によって顕著に産生されおよび分泌される肺損傷のマーカー（ＴＳＬＰ）を査定する（Bartemes and Kita (2012) Clin. Immunol. 143:222-235）。興味深いことに、上皮の肥厚化を有意に回復することができたすべての処置は、気道上皮ＴＳＬＰ発現におけるＯＶＡ誘発増大も部分的に低減することも見出された。これらの知見は、ＲＬＸまたはＡＥＣ単独の投与、および査定される併用処置が上皮組織の修復を部分的に誘導することができたことを含意する。この研究の知見と一致して、ＲＬＸ単独およびＭＳＣとの組み合わせにおけるＲＬＸは、腎疾患／腎線維症の尿管閉塞誘発モデルにおける上皮腎損傷分子（ＫＩＭ−１）発現を有意に抑制することも見出された（Huuskes et al. (2015)上記）。これは、これらの療法の抗アポトーシスおよび／または血管新生効果によってよい（Samuel et al. (2011)上記、Linthout et al. (2011) Curr. Pharmaceut. Des. 17:3341-3347）。
【０１７８】
過剰なＥＣＭ構成要素、特にコラーゲンの沈着は、喘息個体における気道の上皮下および外膜の内部で生じ、線維症の発症に寄与する（Gillis and Lutchen (1999) J. Appl. Physiol. 86:2011-2012）。現在例において、上皮下および総コラーゲン含有量も、コラーゲン代謝回転の２つのマーカー、すなわち、ＴＧＦ−β１およびα−ＳＭＡ（筋線維芽細胞分化のマーカー）も調査することにより、線維症を査定した。ＭＳＣ単独は、上皮下コラーゲンレベルを部分的に低減することができたが、総肺コラーゲン濃度レベルを低減させる傾向を実証したに過ぎず、このことは、先行研究（Royce et al. (2014)上記、Royce et al. (2014)上記）と幾分不一致であり、これらの細胞の効果が患者および／またはバッチ間に依存的であってよいことを示唆する。比較において、ＲＬＸまたはＡＥＣ単独のいずれかが上皮下コラーゲンおよび総肺コラーゲンの両方におけるＯＶＡ誘発増大を有意にできたが、全体的に回復することはできなかった。これは、ＲＬＸ単独が、慢性ＡＡＤと関連した気道／肺線維症を低減できることを示した先行研究（Royce et al. (2009)上記、Royce et al. (2014)上記、Royce et al. (2015)上記）、およびＡＥＣ単独（Moodley et al. (2010)上記、Murphy et al. (2011)上記）がブレオマイシン誘発損傷に続く間質性肺線維症を低減できることを示すものと一致している。より印象的なことに、両併用処置は、気道／肺線維症におけるＯＶＡ誘発増大をさらに低減、および実際、標準化することができた。これはまた、ＭＳＣおよびＲＬＸの組み合わせを用いて片側尿管閉塞によって誘発される両方の腎線維症を低減するという先行知見と一致している（Huuskes et al. (2015)上記）。
【０１７９】
現在例において、慢性ＡＡＤの状況におけるＭＳＣによって実証された限定された抗線維症効能は、上皮下筋線維芽細胞の蓄積を中等度に低減するのに対し、気道上皮ＴＧＦ−β１発現レベルに影響する能力の欠失と関連することが見出された。ＲＬＸまたはＡＥＣ単独によって実証される抗線維症効能は、気道上皮ＴＧＦ−β１発現レベルおよび上皮下筋線維芽細胞の蓄積の両方を有意に低減する能力と、ならびに気道／肺におけるＲＬＸ（Unemori et al. (1996)上記、Tozzi et al. (2005)上記、Patel et al. (2016)上記）およびＡＥＣ（Moodley et al. (2010)上記、Moodley et al. (2013) PLoS ONE8;e69299）の両方の一般的なＴＧＦ−β１抑制効果と一致した。測定される異常な上皮下および総肺コラーゲン沈着における慢性ＡＡＤ誘発増大の標準化がない場合、上皮下筋線維芽細胞の分化を顕著に低下させ、顕著な回復をもたらすかもしれなかったのに対し、さらに有意なのは、両方の併用療法の増強された抗線維症効能が、慢性ＡＡＤ誘発上皮ＴＧＦ−β１発現レベルにおける異常な上昇を両方とも標準化する能力を生じた。これらの知見は、喘息と関連するＡＷＲおよび関係ＡＨＲを処置するために、これらの移植された細胞が生存し、それらの治療効果／修復効果を発揮することができるより好ましい環境を創出することにより、および／またはこれらの生存性、増殖および遊走を直接促進することによってのいずれかで、ＲＬＸがＲＸＦＰ１を発現する複数の幹細胞タイプと組み合わせ得ること示唆する。
【０１８０】
ＡＩおよびＡＷＲの両方は、ＡＨＲの発症に寄与する（Ober and Hoffjan (2006) Genes Immun. 7:95-100、Kariyawasam et al. (2007) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175:896-904）。ＡＨＲの程度は、喘息の重症度とも関係する（Bourlet et al. (1997) Chest 112:45-52、Holgate et al. (2004) Proc. Am. Thorac. Soc. 1:93-98）。先行研究は、ＥＣＭ構成要素の沈着によるＢＭ厚の増大（上皮下線維症）が、ＡＨＲにおける増大（Milanese et al. (2001) J. Appl. Physiol. 91:1035-1040）と同時に、気道の伸張性における低下と相関することを実証した（Ward et al. (2001) Am. J. Respir. Crit. Care Med.164:1718-1721）。現研究において、侵襲的プレチスモグラフィーを用いて気道抵抗を測定して、ＡＨＲを査定した。併用処置のいずれかが、気道上皮厚、上皮ＴＧＦ−β１発現レベルおよび総肺コラーゲン濃度を標準化する能力に基づいて、生理食塩水処置した対照マウスから測定されるレベルまでＡＨＲを完全に回復し得るので、ＡＨＲにおけるＯＶＡ誘発増大は、調査した処置の各々が気道／肺線維症をいかに有効に回復したかと一致して比例して低減した。これらの知見は、上皮厚および／または損傷も、コラーゲン濃度においても慢性ＡＡＤ誘発の異常な増大を抑制することができた他の療法がメタコリン誘発ＡＨＲを標準化する鍵であることも実証した出版研究（Patel et al. (2016)上記）と一致する。しかしながら、これらの処置が気道／肺線維症を低減させる程度は、それらがＡＨＲをいかに有効に回復することができるかとより相関があるように思われた。
【０１８１】
本発明は、ＲＬＸをＡＥＣまたはエキソソームと組み合わせることがＡＩを有意に低減し、慢性ＡＡＤと関連した気道の上皮の肥厚化、気道上皮のＴＧＦ−β１発現レベル、気道／肺線維症およびＡＨＲを完全に抑制することができたという知見の一部に前提とする。ゆえに、この併用療法は、特にコルチコステロイド療法に耐性のある患者に、気道疾患病原性の３つの中心的な構成要素（ＡＩ、ＡＷＲおよびＡＨＲ）を処置するための新規な手段を与える。ＲＬＸとの組み合わせにおけるＡＥＣは、ＡＩおよびＡＷＲをさらに低減させ、ならびに喘息と関連したＡＨＲを改善することにおいて効果的であった。
【０１８２】
したがって、治療プロトコールは、療法を必要とする対象への投与を含み、
（Ａ）（ｉ）ＡＥＣ、または
（ｉｉ）羊膜エキソソーム、および
（Ｂ）リラキシンまたはその組換えもしくは誘導体形態などの抗線維化剤である、前記治療プロトコールである。
【０１８３】
態様において、治療プロトコールは、羊膜エキソソームおよびリラキシンまたはその組換え形態もしくは誘導体形態などの抗線維化剤の療法を必要とする対象への投与を含む。
【０１８４】
投与は、鼻腔内、呼吸、気管内、鼻咽頭、静脈内、腹腔内、胸腔内、皮下、皮内、筋肉内、眼内、髄腔内または直腸内経路などの任意の簡便な経路による。抗線維化剤が介して作用する受容体（例えば、リラキシンのためのＲＸＦＰ１）の活性化因子またはアゴニストの添加も支援してよい。療法は、ＡＩ、ＡＷＲおよび／またはＡＨＲの任意またはすべてを軽減して線維症を低減するよう提案される。ＡＥＣまたはエキソソームおよび抗線維化剤は、共投与または別個もしくは連続して、いずれかの順序でまたは共に合剤にされてよい。
【０１８５】
本例で教示されるように、ＡＥＣまたはエキソソームとリラキシンとの組み合わせは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とリラキシンとの組み合わせよりもより有効であることが見出される。ＡＥＣまたはエキソソームおよびリラキシンは、マウスモデルにおいて上皮厚を標準化し、線維症を部分的に回復も、気道過敏性を軽減もする。リラキシンなどの抗線維化剤が、ＡＥＣベースの療法が採用され得る改良された環境を提供し、リラキシン−２受容体であるＲＸＦＰ１を発現するＡＥＣの治療および再生能を増強することが本明細書で提案される。ＡＥＣの治療利益が羊膜エキソソームへ適用されることがさらに提案される。これに関し、羊膜エキソソームは、羊水もしくは胎盤組織から単離されてよく、または不死化したＡＥＣ株を含むＡＥＣ株から単離されてよい。これは、その後単離され、本治療プロトコールにおいて使用されるＡＥＣ株から羊膜エキソソームを発生させるためのバイオリアクターの使用を含む。それにもかかわらず、本発明は、気道疾患を処置するための、ＭＳＣとリラキシンなどの抗線維化剤との使用に広がる。
【０１８６】
当業者は、本明細書で記載される開示が、具体的に記載されたもの以外の改変および修正を受けやすいことを認識するであろう。本開示が、かかる改変および修正をすべて熟慮することが理解されるべきである。開示は、個々にまたはまとめて、本明細書で参照または示されるステップ、特徴、組成物および化合物のすべて、およびステップまたは特徴または組成物または化合物の任意の２または３以上のすべておよび任意の組み合わせも可能にする。
【０１８７】
参考文献一覧
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【図１ａ−ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ−ｅ】
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【図３ａ−ｂ】
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【図４ａ−ｂ】
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【図５】
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【図６ａ−ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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