(57)【要約】  結合剤及びキャリアータンパク質、並びに少なくとも1つの治療剤の組成物であって、結合剤がT細胞上で発現される抗原に結合することができる上記組成物、及び該組成物、特にT細胞癌 治療薬としての該組成物、を製造し且つ使用する方法が本明細書において記載されている。結合剤及びキャリアータンパク質、並びに少なくとも1つの治療剤の凍結乾燥組成物、及び該組成物、特にT細胞癌治療薬としての該組成物、を製造し且つ使用する方法が本明細書においてまた記載されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外表面を有する複数のナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、該複数のナノ粒子のそれぞれが、
(a)キャリアータンパク質、
(b)T細胞抗原結合部位を有する結合剤、及び
(c)治療的に有効な量のパクリタキセル
を含み、
ここで、水性溶液で再構成すると、上記結合剤の上記抗原結合部位が、イン・ビボでT細胞抗原に結合することができる、
上記ナノ粒子組成物。
【請求項２】
上記ナノ粒子が約100〜約1000の結合剤を含む、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項３】
上記抗原結合部位がT細胞受容体に結合することができる、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項４】
上記抗原結合部位が、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD30、CD40、CD52、CD122又はCCR4から選択される抗原に結合する、請求項３に記載のナノ粒子組成物。
【請求項５】
上記ナノ粒子が凍結乾燥されている、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項６】
上記組成物が、約20℃〜約25℃で、約12ヶ月以上まで安定である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項７】
上記結合剤が、スリピズマブ、ムロモナブ-CD3(OKT3)、Leu  1、ザノリムマブ、ザノリムマブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、Mik-β1、KW-0761、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項８】
上記結合剤がムロモナブ-CD3(OKT3)である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項９】
上記抗原結合部位が、アプタマー、受容体リガンド、Fabフラグメント、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１０】
上記組成物が１以上の追加の癌治療剤を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１１】
上記追加の癌治療剤が、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、シスプラチン、クロラムブシル、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシウレア、イマチニブ、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチン又はシクロホスファミドを含む、請求項１０に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１２】
上記ナノ粒子の約50%未満がオリゴマーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１３】
上記組成物中に存在する上記ナノ粒子の40%未満がオリゴマーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１４】
上記組成物中に存在する上記ナノ粒子の30%未満がオリゴマーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１５】
上記組成物中に存在する上記ナノ粒子の20%未満がオリゴマーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１６】
上記組成物中に存在する上記ナノ粒子の10%未満がオリゴマーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１７】
上記組成物中に存在する上記ナノ粒子の5%未満がオリゴマーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１８】
上記ナノ粒子の平均サイズが90nm〜800nmである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項１９】
上記キャリアータンパク質が、アルブミン、ゼラチン、エラスチン、グリアジン、レグミン、ゼイン、ダイズタンパク質、ミルクタンパク質、ホエータンパク質、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項２０】
上記キャリアータンパク質が抗体結合モチーフを含む、請求項１９に記載のナノ粒子組成物。
【請求項２１】
上記キャリアータンパク質がアルブミンである、請求項２０に記載のナノ粒子組成物。
【請求項２２】
上記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項２１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項２３】
上記アルブミンが組み換えヒト血清アルブミンである、請求項２１に記載のナノ粒子組成物。
【請求項２４】
上記組成物が、静脈内送達の為に製剤化されている、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項２５】
上記ナノ粒子が、約1x10-11M〜約1x10-8Mの解離定数を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項２６】
T細胞癌の細胞を処置する為の方法であって、該癌の細胞を有効量のナノ粒子組成物と接触させることを含み、該ナノ粒子組成物は、該癌の細胞を処置する為に十分な期間に亘って該細胞と接触し続けられ、ここで、上記ナノ粒子組成物は、外表面を有する複数のナノ粒子を含み、該複数のナノ粒子のそれぞれが、
(a)キャリアータンパク質、
(b)T細胞抗原結合部位を有する結合剤、及び
(c)治療的に有効な量のパクリタキセル
を含み、
上記結合剤の上記抗原結合部位が、イン・ビボでT細胞抗原に結合することができる、
上記方法。
【請求項２７】
上記ナノ粒子が約100〜約1000の結合剤を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記抗原結合部位がT細胞受容体(TCR)に結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
上記抗原結合部位が、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD30、CD40、CD52、CD122又はCCR4から選択される抗原に結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
上記抗原がCD2又はCD3である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
上記ナノ粒子組成物が、投与前に水性溶液中で再構成される凍結されたナノ粒子組成物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
上記組成物が、約20℃〜約25℃で、約12ヶ月以上まで安定である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
上記結合剤が、スリピズマブ、OKT3、Leu  1、ザノリムマブ、ザノリムマブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、Mik-β1、KW-0761、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
上記結合剤がムロモナブ-CD3(OKT3)である、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
上記抗原結合部位が、アプタマー、受容体リガンド又はFabフラグメントである、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
上記組成物が１以上の追加の癌治療剤を含む、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
上記追加の癌治療剤が、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、シスプラチン、クロラムブシル、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシウレア、イマチニブ、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチン又はシクロホスファミドを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
上記ナノ粒子の約50%未満がオリゴマーである、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
上記組成物中に存在する上記ナノ粒子の40%未満がオリゴマーである、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
上記組成物中に存在する上記ナノ粒子の30%未満がオリゴマーである、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
上記組成物中に存在する上記ナノ粒子の20%未満がオリゴマーである、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
上記組成物中に存在する上記ナノ粒子の10%未満がオリゴマーである、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
上記組成物中に存在する上記ナノ粒子の5%未満がオリゴマーである、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
上記ナノ粒子の平均サイズが90nm〜800nmである、請求項２７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
上記ナノ粒子の平均サイズが約90nm〜約160nmである、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
上記キャリアータンパク質が、アルブミン、ゼラチン、エラスチン、グリアジン、レグミン、ゼイン、ダイズタンパク質、ミルクタンパク質、ホエータンパク質、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
上記キャリアータンパク質がアルブミンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
上記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
上記アルブミンが組み換えヒト血清アルブミンである、請求項４７に記載の方法
【請求項５０】
上記組成物が、静脈内送達の為に製剤化される、請求項２７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
上記ナノ粒子が、約1x10-11M〜約1x10-8Mの解離定数を有する、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
上記ナノ粒子組成物の治療的に有効な量が、約75mg／m2〜約175mg／m2のパクリタキセルを含む、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
上記T細胞癌が、末梢T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ腫皮膚T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病／リンパ腫(ATLL)、腸症型T細胞リンパ腫、造血性ガンマデルタT細胞リンパ腫、芽細胞性NK細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、鼻NK／T細胞リンパ腫、処置に関連したT細胞リンパ腫、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
上記T細胞癌がT細胞リンパ腫である、請求項２７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、結合剤及びキャリアータンパク質の新規な組成物、並びにそれらを特にT細胞癌治療剤として製造し及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学療法は、黒色腫を含む多くの種類の癌に対する全身治療の頼みの綱であり続けている。ほとんどの化学療法剤は腫瘍細胞に対してわずかしか選択的でなく、そして健康な増殖細胞に対する毒性が高い可能性があり(Allen  TM．(2002年)  Cancer  2：750-763)、しばしば用量の減少及びさらには処置の中止さえも必要とする。理論的には、化学療法の毒性問題を克服し並びに薬効を改善する一つの方法は、腫瘍細胞によって選択的に発現される(又は過剰発現される)タンパク質に特異的である抗体を用いて化学療法薬物を腫瘍に標的化して、該標的化された薬物を該腫瘍に引きつけることであり、それによって化学療法の体内分布が変化し、そしてより多くの薬物が該腫瘍に行き渡り且つ健康な組織への影響が少なくなるということを結果として生じる。しかしながら、30年にも及び研究にも拘わらず、特異的標的化が治療的状況で成功することはめったにない。
【０００３】
慣用的な抗体依存性化学療法(ADC：antibody  dependent  chemotherapy)は、合成プロテアーゼで切断可能なリンカーを介して標的抗体に結合された毒性物質を用いて設計される。そのようなADC治療の有効性は、抗体に結合する為の標的T細胞の能力、切断されるべきリンカー、及び毒性物質の標的T細胞への取り込みに依存する(Schrama，D．等  (2006年)  Nature  reviews．Drug  discovery  5：147-159)。
【０００４】
抗体標的化化学療法は、それが標的化能力、複数の細胞傷害剤、及び潜在的に低い毒性を伴う改善された治療能力の組み合わせを提供するので、慣用的な治療を超える利点を約束した。広範な研究にもかかわらず、臨床的に有効な抗体標的化化学療法はわかりにくいままである：主な障害は、抗体と化学療法薬物との間のリンカーが不安定であること、該抗体に結合された場合の化学治療剤の腫瘍毒性が低下されること、及び該複合体が腫瘍細胞に結合し且つそれに入ることができないことを含む。さらに、これらの治療法は、抗体-薬物複合体のサイズに対する制御を許さなかった。
【０００５】
先行技術の治療よりも信頼性があり且つ改善された抗腫瘍有効性を提供する為に、標的化された薬物送達の為の細胞傷害性効果を保持する抗体に基づく癌について、当分野における必要性が依然としてある。
【０００６】
加えて、任意の治療用途に関して、該組成物がその物理的、化学的及び生物学的特性において安定であることがまた必要とされている。
【０００７】
T細胞リンパ腫(「TCL」：T-cell  lymphomas)は、リンパ腫のおよそ15%を占める異種の群の血液癌である。毎年、米国では、TCLの約6,500の新たな症例がある。TCLは、末梢T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病／リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫などを含む。TCLの幾つかのサブタイプにおいて、主に10代の若者及び子供がこの血液疾患、例えばリンパ芽球性リンパ腫、による影響を受けているが、研究はTCLが子供及び大人の両方に影響を及ぼすことができることを示す。TCLを有する患者は、腫脹したリンパ節、高悪性度の病変、並びに全身症状、例えば重度の発疹、発熱及び疲労、を彼ら自身呈する。
【０００８】
TCL患者は伝統的に、細胞リンパ腫を有する患者と同じ化学療法(例えば、アントラサイクリン)で処置された。しかしながら、B細胞リンパ腫に対するそれらの有効性と比較して、アントラサイクリンに基づく処方計画は、TCL患者の為の生存率を高めることにおいて有効でなかった（Vose  J，等，J  Clin  Oncol．2008年；26(25)：4124-30）。アントラサイクリンに基づく処方計画は、TCL患者について、奏功率が低く且つ進行までの時間が短いことを伴う。伝統的な化学療法での哀れな結末を考えると、非アントラサイクリンに基づく治療的処方計画が、TCL患者にとって大いに必要とされている。
【０００９】
それ故に、最小限の副作用で又は副作用のない、T細胞癌を処置する為のより効率的な組成物又は免疫療法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本開示書は、外表面を有する複数のナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、該複数のナノ粒子のそれぞれが、キャリアータンパク質、T細胞上で発現される抗原を標的とする抗原結合部分を有する結合剤、及び治療的に有効な量の治療剤を含む、上記ナノ粒子組成物に関する。一つの観点において、該結合剤は、T細胞又はT細胞癌(例えば、OKT3)上で発現される抗原に結合することができると同時に、抗体(例えば、OKT3)の免疫原性及び分裂促進性の潜在的限界に関連付けられた重篤な副作用を低減又は排除することができる。従って、本明細書に記載されたナノ粒子は、このように、重篤な副作用及び／又は毒性を有する慣用的なADCと比較して有意な改善である。
【００１１】
抗体に基づく治療は、リンパ腫患者の為の新しい治療法の選択肢として浮上してきている。例えば、モノクロナール抗体、リツキシマブ(Rituxan(登録商標))は、有意に改善された臨床成績を伴うB細胞リンパ腫を処置する際に使用されてきているT細胞新生物(neoplasm)について、幾つかの抗体がそれらの有効性を示している。それらの中で、ムロモナブ(muromonab)-CD3(Orthoclone(登録商標)，「OKT3」)、T細胞上のCD3受容体に対するマウスIgG2aモノクロナール抗体、は例えば、末梢循環及びリンパ組織からのCD3+  T細胞の、補体によって誘発された溶解を誘発することができる(Chatenoud，L．等，Nat．Rev．Immunoo．3，123-32  (2003年))。しかしながら、OKT3の免疫原性及び分裂促進性の潜在的限界に関連付けられた重篤な副作用は、TCL患者を処置する際におけるその使用と共に広く広まっている。例えば、OKT3の治療上の利益は、抗体のCD3受容体との係合によって引き起こされるサイトカインに基づく炎症反応によって妨げられる(Abramowicz  D，等，Transplantation，1989年；47：606-608)。その上、T細胞についてのOKT3の強力な分裂促進特性は悪性免疫細胞の増殖を増加させてもよく、それによってTCL患者におけるT細胞新生物を悪化させうる(Landergren  U，等，Eur  J  Immunol．1984年4月；14(4)：325-8)。
【００１２】
理論に縛られることなしに、結合剤は、疎水性相互作用を介してキャリアータンパク質によって結合されると考えられており、それはその性質上、弱い。それでもなお、個々の成分の活性、並びにナノ粒子中のそれらの相対的な関係は、本明細書において後述されるとおり、該組成物の凍結乾燥及び再構成に応じてさえも維持される。キャリアータンパク質への結合、例えば結合剤のキャリアータンパク質に対する複合体形成は、結合剤上のアルブミン結合モチーフ及び／又はキャリアータンパク質上の抗体結合モチーフを通じて生じるとなおさらに考えられている。一つの実施態様において、水性溶液との再構成に応じて、該結合剤の抗原結合部位は、T細胞癌上の抗原に結合することができる(認識する)。他の実施態様において、該ナノ粒子の約50%の未満がオリゴマーである。
【００１３】
該ナノ粒子が治療において使用されるので、さらなる挑戦が課されている。
【００１４】
ナノ粒子における成分の再配列は成分間の共有結合を通じて軽減されうるが、そのような共有結合は癌処置におけるナノ粒子の治療的使用に課題をもたらす。結合剤、キャリアータンパク質及び追加の治療剤は典型的には、腫瘍内の異なる位置で勝つ異なるメカニズムを通じて作用する。非共有結合は、ナノ粒子の成分が腫瘍で解離することを許す。このように、共有結合は凍結乾燥には有利でありうるが、治療用途には不利でありうる。
【００１５】
本開示書は、外表面を有する複数のナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、該複数のナノ粒子のそれぞれが、キャリアータンパク質、T細胞上で発現される抗原を標的とする抗原結合部分を有する結合剤、及び任意的に、治療的に有効な量の治療剤を含む、上記ナノ粒子組成物に関する。
【００１６】
ナノ粒子のサイズ、及び該サイズの分布がまた重要である。ナノ粒子は、それらのサイズに従って、異なる挙動をしうる。大きいサイズでは、ナノ粒子又は粒子の凝集は血管を塞ぐ可能性があり、そのどちらも該組成物の性能及び安全性に影響を及ぼすことができる。一つの実施態様において、ナノ粒子の平均サイズは90nm〜800nmである。他の実施態様において、ナノ粒子の平均サイズは300nm〜500nmである。なおさらなる実施形態において、ナノ粒子の平均サイズは約90nm〜約160nmである。
【００１７】
最後に、抗凍結剤及び凍結乾燥工程を助ける剤は、安全であり且つ治療的使用に耐性でなければならない。
【００１８】
一つの観点において、該結合剤は、イン・ビボでT細胞又はT細胞癌上に発現される抗原に結合することができる。他の実施態様において、該結合剤の抗原結合部位は、T細胞又はT細胞癌上に発現される抗原に結合する。一つの実施態様において、該抗原は、T細胞癌上で発現されるタンパク質であり、これはCD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD30、CD40、CD52、CD122及びCCR4を包含するが、これらに限定されない。更なる実施態様において、該抗原は、T細胞癌(例えば、T細胞リンパ腫)において過剰発現されるバイオマーカーである。該バイオマーカーは、PD-L1、Ly6E、HER3／EGFR  DAF、ERBB-3受容体、CSF-1R、HER2、STEAP1、CEA、OX40、Ang2-VEGF又はVEGFを含みうる。好ましい実施態様において、該結合剤の結合部分は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD30、CD40、CD52、CD122又はCCR4に結合することができる。他の実施態様において、該結合剤の結合部分は、PD-L1、Ly6E、HER3／EGFR  DAF、ERBB-3受容体、CSF-1R、HER2、STEAP1、CEA、OX40、Ang2-VEGF又はVEGFに結合することができる。一つの実施態様において、T細胞癌はT細胞リンパ腫である。他の実施態様において、T細胞癌は、末梢T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ腫皮膚T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病／リンパ腫(ATLL：Adult  T-cell  Leukemia/Lymphoma)、腸症型T細胞リンパ腫、造血性ガンマデルタT細胞リンパ腫、芽細胞性NK細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、鼻NK／T細胞リンパ腫、処置に関連したT細胞リンパ腫、又はそれらの組み合わせである。一つの観点において、該抗原は、本明細書において列挙されている１以上の抗原を除外しうる。一つの実施態様において該抗原は、VEGF、HER2又はEGFRではない。
【００１９】
一つの観点において、複数のナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、該複数のナノ粒子のそれぞれが、キャリアータンパク質、T細胞抗原結合部位を有する結合剤、及び任意的に、少なくとも1つの治療剤を含み、ここで、水性溶液で再構成すると、該結合剤の該抗原結合部位が、イン・ビボでT細胞上に発現される抗原に結合することができる、上記組成物が、本明細書において提供される。
【００２０】
静脈内に投与される場合、大きな粒子(例えば、lμm超)は、それらが肺の微小血管系に留まることがあるので、典型的には好ましくはない。同時に、より大きな粒子が、腫瘍又は特定の臓器に蓄積することができる。例えば、放射線塞栓形成としても知られている放射線元素の送達の為の、肝臓の腫瘍に栄養を与える冠動脈に注入される20〜60ミクロンのガラス粒子であるTHERASPHERE(登録商標)が、肝臓癌の為に臨床的に使用されている。
【００２１】
それ故に、静脈内投与の為に、1μm以下の粒子が使用される。lμm超の粒子はより典型的には、腫瘍内に直接投与される（直接注入）か又は腫瘍の部位に栄養補給する動脈内に投与される。
【００２２】
一つの観点において、該ナノ粒子は、約100〜約1000の結合剤、好ましくは約400〜約800の結合剤、を含む。該組成物における結合剤の数はまた、粒子の数に依存する。ナノ粒子が多量体化すると、結合剤の数が比例して増加する。例えば、160nmのナノ粒子が400の結合剤を含む場合に、320nmの二量体は約800の結合剤を含むと予想される。
【００２３】
他の実施態様において、該ナノ粒子は、多量体化し又はオリゴマー化し、例えば二量体化する。多量体化は、単位分子の重量又はサイズの倍数として観察され、例えば160nmの粒子は、約320nm、約480nm、約640nmなどに多量化する。幾つかの実施態様において、集団中の40%未満のナノ粒子がオリゴマー化されている。幾つかの実施態様において、30%未満のナノ粒子がオリゴマー化されている。更なる実施態様において、20%未満のナノ粒子がオリゴマー化されている。他の実施態様において、存在するナノ粒子の10%未満がオリゴマー化されている。好ましい実施態様において、5%未満のナノ粒子がオリゴマー化されている。
【００２４】
一つの実施態様において、キャリアー結合薬物の結合剤に対する重量比(例えば、アルブミン結合パクリタキセルのOKT3に対する比)は、約5：1〜約1：1である。一つの実施態様において、キャリアー結合薬物の結合剤に対する重量比は、約10：4である。一つの実施態様において、該結合剤は、ナノ粒子の表面の全部又は一部上の実質的に単層である。一つの実施態様において、該組成物における0.01%未満のナノ粒子は、200nm超、300nm超、400nm超、500nm超、600nm超、700nm超及び800nm超から成る群から選択されるサイズを有する。より大きいサイズは、幾つかのナノ粒子の多量化(又はオリゴマー化)の結果であると考えられている。
【００２５】
本発明はさらに、凍結乾燥組成物、及び新たに調製されたナノ粒子の性質と実質的に異ならない又はそれらと同じではない凍結乾燥組成物を含む。特に、凍結乾燥組成物は、水性溶液中での再懸濁に応じて、粒子サイズ、粒子サイズ分布、癌細胞に対する毒性、結合剤親和性、及び結合剤特異性に関して、該新鮮な組成物と類似又は同一である。驚くことに、凍結乾燥されたナノ粒子は、これらの粒子中に2つの異なるタンパク質成分の存在にも拘わらず、再懸濁液後に、新たに製造されたナノ粒子の特性を保持する。
【００２６】
一つの実施態様において、再構成されたナノ粒子の平均サイズは、約90nm〜約1μmである。好ましい実施態様において、再構成されたナノ粒子の平均サイズは、約90nm〜約200nm、より好ましくは約100〜約160nm、である。一つの実施態様において、再構成されたナノ粒子の平均サイズは800nm超〜約3.5μmであり、これは、より小さいナノ粒子の多量体、例えば100〜200nmナノ粒子の多量体、を含む。一つの実施態様において、コアの結合剤に対する重量比は、1：1超〜約1：3である。一つの実施態様において、再構成されたナノ粒子の平均サイズは、約160nm〜約225nmである。
【００２７】
一つの観点において、本発明は、複数のナノ粒子を含む凍結乾燥されたナノ粒子組成物であって、該複数のナノ粒子のそれぞれはキャリアー結合薬物コア及び結合剤を含む、上記組成物に関する。一つの実施態様において、該結合剤は、水性溶液で再構成すると、ナノ粒子の外側表面とのそれらの会合を維持する。一つの実施態様において、再構成後に、該結合剤は、該結合剤の結合部分がその表面から外側に向けられるように、コアの表面に配置される。一つの実施態様において、該凍結乾燥組成物は、室温で、少なくとも約3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月又はそれ以上の間、安定である。一つの実施態様において、該凍結乾燥組成物は、室温で、少なくとも3ヶ月の間、安定である。一つの実施態様において、該再構成されたナノ粒子は、治療剤の活性を保持し且つイン・ビボで標的に結合することができる。他の実施態様において、該組成物は、約20℃〜約25℃で、約12ヶ月以上まで安定である。
【００２８】
幾つかの実施態様において、該少なくとも1つの治療剤は、該ナノ粒子の内部に位置する。他の実施態様において、該少なくとも1つの治療剤は、該ナノ粒子の外側表面に位置する。なお他の実施態様において、該少なくとも1つの治療剤は、該ナノ粒子の内部に且つ該ナノ粒子の外側表面に位置する。更なる実施態様において、該治療剤は、癌の為の治療剤である。
【００２９】
幾つかの実施態様において、該ナノ粒子は、1超の種類の治療剤を含む。一つの実施態様において、該治療剤は、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、シスプラチン、クロラムブシル、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシウレア、イマチニブ、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン(triplatin)、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチン又はシクロホスファミドでありうる。好ましい実施態様において、該治療剤はパクリタキセルである。
【００３０】
他の観点において、該結合剤は、スリピズマブ(Slipizumab)、OKT3、Leu  1、ザノリムマブ(Zanolimumab)、ブレンツキシマブ・ベドチン(Brentuximab  vedotin)、Mik-β1、KW-0761、又はそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施態様において、該結合剤は、ムロモナブ(muromonab)-CD3(OKT3)である。
【００３１】
なお他の実施態様において、該抗原結合部位は、アプタマー、受容体リガンド、Fabフラグメント、又はそれらの組み合わせを含む。好ましい実施態様において、該抗原結合部位は、その一部の抗体である。
【００３２】
幾つかの実施態様において、該キャリアータンパク質は、ゼラチン、エラスチン、グリアジン、レグミン、ゼイン、ダイズタンパク質、ミルクタンパク質及びホエータンパク質を含む。他の実施態様において、該キャリアータンパク質は、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、である。幾つかの実施態様において、該アルブミンは、ヒト血清アルブミン(HAS：human  serum  albumin)である。幾つかの実施態様において、該アルブミンは、組み換えアルブミン、例えば組み換えヒト血清アルブミン、である。
【００３３】
幾つかの実施態様において、該組成物は、静脈内送達の為に製剤化されている。
【００３４】
幾つかの実施態様において、該ナノ粒子は、約1x10-11M〜約1x10-9Mの解離定数を有する。
【００３５】
T細胞癌において癌細胞を殺す為の方法であって、該細胞を、癌性T細胞を殺す為に十分な期間、本明細書において開示されたナノ粒子組成物の有効量と接触させることを含む上記方法がまた本明細書において提供される。他の実施態様において、該ナノ粒子組成物は、静脈内に投与される。
【００３６】
幾つかの実施態様において、本明細書において提供される該方法は、a)該ナノ粒子組成物を週に1回、3週間投与すること；b)該ナノ粒子組成物の投与を1週間中止すること；及びc)腫瘍を処置する為に、必要に応じて工程a)及びb)を繰り返すことを含む。
【００３７】
関連した実施態様において、該処置は、該ナノ粒子の投与の前に、標的結合剤(targeting  binding  agent)を投与することを含む。一つの実施態様において、該標的結合剤は、該ナノ粒子の投与の約6〜48時間又は約12〜48時間前に投与される。他の実施態様において、該標的結合剤は、該ナノ粒子の6〜12時間前に投与される。なお他の実施態様において、該標的結合剤は、該ナノ粒子2〜8時間前に投与される。なお他の実施態様において、該標的結合剤は、該ナノ粒子の投与の１週間前に投与される。例えば、ナノ粒子の投与の24時間前にOKT3の投与量が投与される。他の例において、OKT3は、該ナノ粒子を投与する前に投与される。該ナノ粒子の前に投与される結合剤は、治療量以下の量、例えば通常治療的と考えられる1／2、1／10又は1／20の量、として投与されうる。従って、ヒトにおいて、OKT3での前処置は、通常の用量の1／10であるlmg／kg  OKT3を投与すること、その後ナノ粒子を投与することを含みうる。
【００３８】
幾つかの実施態様において、治療的に有効な量は、約75mg／m2〜約175mg／m2のキャリアータンパク質(すなわち、患者の1m2当たり、ミリグラムのキャリアータンパク質)を含む。他の実施態様において、該治療的に有効な量は、約75mg／m2〜約175mg／m2の治療剤(例えば、パクリタキセル)を含む。他の実施態様において、該治療的に有効な量は、約30mg／m2〜約70mg／m2の結合剤を含む。なお他の実施態様において、該治療的に有効な量は、約30mg／m2〜約70mg／m2のOKT3を含む。
【００３９】
一つの特定の実施態様において、凍結乾燥組成物は、約75mg／m2〜約175mg／m2のキャリアータンパク質(好ましくはアルブミンである)；約30mg／m2〜約70mg／m2の結合剤(好ましくはOKT3である)；及び約75mg／m2〜約175mg／m2のパクリタキセルを含む。
【００４０】
本発明の実施態様は、キャリアータンパク質及び、抗体、例えば抗原と特異的に結合する抗体又は癌細胞によって放出される抗体、と表面複合体を有する化学治療剤を含むナノ粒子における化学治療剤を投与することによって、化学治療剤の癌細胞取り込みの期間を増加させる為の方法であって、該癌細胞がT細胞を含む、上記の方法を含む。
【００４１】
ナノ粒子組成物を生成する方法であって、所望のナノ粒子の形成を許すであろう成分の条件及び比の下で、pH5.0〜7.5及び約5℃〜約60℃、約23℃〜約60℃又は約55℃〜約60℃の温度を有する溶液中で、キャリアータンパク質及び任意的に、少なくとも1つの治療剤を抗体と接触させることを含む上記方法が本明細書においてさらに提供される。一つの実施態様において、該ナノ粒子は、55℃〜60℃及びpH7.0で生成される。他の観点において、ナノ粒子組成物を生成する方法であって、所望のナノ粒子の形成を許すであろう成分の条件及び比の下で、pH約5.0〜約7.5及び約5℃〜約60℃、約23℃〜約60℃又は約55℃〜約60℃の温度を有する溶液中で、該コアを該抗体と接触させることを含む上記方法が本明細書において提供される。
【００４２】
成分(例えば、キャリアータンパク質、抗体、治療剤又はそれらの組み合わせ)の量は、所望のナノ粒子の形成を提供する為に制御される。成分の量が薄すぎる組成物は、本明細書において記載されたナノ粒子を形成しないであろう。好ましい実施態様において、キャリアータンパク質の結合剤に対する重量比は、10：4である。幾つかの実施態様において、キャリアータンパク質の量は、約1mg／mL〜約100mg／mLである。幾つかの実施態様において、結合剤の量は、約1mg／mL〜約30mg／mLである。例えば、幾つかの実施態様において、キャリアータンパク質：結合剤：溶液の比は、1mLの溶液(例えば、食塩水)中、およそ9mgのキャリアータンパク質((例えば、アルブミン)対4mgの結合剤(例えば、OKT3)である。ある量の治療剤、例えばパクリタキセル、がまた、例えば抗体と接触される前に、キャリアータンパク質に加えられることができる。
【００４３】
下記の図は、本発明の代表例に過ぎず且つ限定として意図されるものでない。一貫性の為に、ABRAXANE(登録商標)及びベバシズマブを用いる本発明のナノ粒子が、頭文字「AB」を用い、ABの後の数字、例えばAB160、は、これらのナノ粒子の平均粒子サイズ(ナノメートルで)を与えることが意味される。同様に、該結合剤がリツキシマブである場合に、頭文字は「AR」であり、その後の数字は同じである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図1は、光吸収バイオ−レイヤー干渉法(BLItz：Bio-layer  interferometry)技術によって決定された、アブラキサン(Abraxane)及びOKT3の結合親和性を示す。解離定数(Kd)は、2.246X10-9である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本明細書を読んだ後に、様々な代替の実施形態及び代替の用途において本発明を如何に実施するかは当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の様々な全ての実施態様は本明細書において記載されていない。本明細書に提示された実施態様は例としてのみ提示され、限定ではないことが理解されるであろう。従って、様々な代替の実施態様のこの詳細な説明は、以下に記載される本発明の範囲又は広さを限定すること解釈されるべきではない。
【００４６】
本発明が開示され且つ記載される前に、以下に記載される観点は特定の組成物、そのような組成物を調製する方法に限定されないこと、又はそれらのそれ自体の使用は勿論変わりうることが理解されるべきである。本明細書において使用される語は特定の態様を説明することのみであること且つ限定することをいとされていないことがまた理解されるべきである。
【００４７】
本発明の詳細な説明は、読者の便宜の為にのみ様々な項に分割されており、且つ任意の項に見られる開示は他の項に見られる項と組み合わせられうる。タイトル又はサブタイトルは、読者の便宜の為に本明細書において使用されることがあり、それらは本発明の範囲に影響を及ぼすことを意図されるものでない。
【００４８】
定義
【００４９】
他に定義されない限り、本明細書において用いられる技術用語及び化学用語の全ては、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において且つ添付の特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義されるべき幾つかの語を参照する。
【００５０】
本明細書で用いられる語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、且つ本発明を限定することを意図されるものでない。本明細書で用いられる場合に、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことを意図されている。
【００５１】
「任意の」又は「任意的に」は、後で説明される事象若しくは状況が起こり得る若しくは起こり得ないこと、及びその記述が事象若しくは状況が起こる場合とそれが起こらない場合を含むことを意味する。
【００５２】
範囲を含む数字表示、例えば、温度、時間、量、濃度などの前に使用される場合に、語「約」は、(+)又は(-)10%、5%、1%、又はそれらの間の任意の部分範囲若しくは部分値で変化しうる近似値を示す。
【００５３】
好ましくは、投与量に関して用いられる場合に、語「約」は、投与量が+／-10%変わりうることを意味する。例えば、「約400〜約800の結合剤」は、ナノ粒子の外側表面が360〜880の粒子の結合剤の量を含むことを示す。
【００５４】
「含んでいる」は「含む」は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが他を除外しないことを意味することを意図されている。組成物及び方法を定義するために使用される場合に、「本質的に〜なる」は、言及された目的の為の組み合わせに対してとって本質的に重要な意味の他の要素を除外することを意味するものとする。従って、本明細書において定義された要素の本質的になる組成物は、特許請求の範囲に記載された発明の基本的且つ新規な1以上の特徴に実質的に影響を及ぼさない他の物質又は工程を排除するものでない。「〜からなる」は、他の生分の微量以上の要素及び実質的な方法の工程を除外することを意味します。これらの遷移語のそれぞれによって定義される実施態様は、本発明の範囲内である。
【００５５】
本明細書において使用される語「ナノ粒子」は、5ミクロン未満である少なくとも1つの寸法を有する粒子を云う。好ましい実施態様において、例えば静脈内投与について、該ナノ粒子は1ミクロン未満である。直接投与について、該ナノ粒子はより大きい。もっとより大きな粒子でさえも本発明によって明確に企図される。
【００５６】
粒子の集団において、個々の粒子のサイズは平均的に分布している。それ故に、該集団についての粒子サイズは、平均値によって、及びまたパーセンタイルによって表されることができる。D50は、50%の粒子が落ちるサイズ未満の粒子サイズである。10%の粒子はD10値よりも小さく、且つ90%の粒子はD90よりも小さい。不明な場合は、「平均」サイズはD50と同等である。
【００５７】
語「ナノ粒子」はまた、より小さい単位のナノ粒子の離散多量体を含みうる。例えば、320nmの粒子は、単位160nmのナノ粒子の二量体を含みうる。それ故に、160nmのナノ粒子について、多量体は、およそ320nm、480nm、640nm、800nm、960nm、1120nmなどであろう。
【００５８】
本明細書において使用される語「キャリアータンパク質」は、結合剤及び／又は治療剤を輸送する為の機能を有するタンパク質を云う。本開示書の該結合剤は、キャリアータンパク質に可逆的に結合することができる。キャリアータンパク質の例は、以下でより詳細に説明される。
【００５９】
本明細書において使用される語「コア」は、キャリアータンパク質、キャリアータンパク質及び治療剤若しくは他の剤又は剤の組み合わせからなりうるナノ粒子の中央部又は内側部を云う。幾つかの実施態様において、該結合剤の疎水性部分が、コアに組み込まれうる。
【００６０】
本明細書において使用される語「治療剤」は、治療的に有用である剤、例えば、病状、生理学的状態、症状若しくは病因的因子の処置、寛解若しくは減弱の為の剤、又はそれらの評価又は診断のための剤を意味する。治療剤は、化学療法剤、例えば分裂抑制剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ステロイド、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、アルキル化剤、酵素、プロテアソーム阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせ、でありうる。
【００６１】
本明細書において使用される場合に、語「結合剤」、「〜に特異的な結合剤」、又は「〜に特異的に結合する結合剤」は、標的抗原に結合し、且つ無関係の化合物に有意に結合しない剤を云う。開示された方法において効果的に用いられることができる結合剤の例は、レクチン、タンパク質及び抗体、例えばモノクロナール抗体、例えばヒト化モノクロナール抗体、キメラ抗体又はポリクロナール抗体、又はそれらの抗原-結合フラグメント、並びにアプタマー、又は融合タンパク質を含むがこれらに限定されない。一つの実施態様において、該結合剤は、アルブミン結合モチーフを含む。アルブミン-結合モチーフの比限定的な例は、2017年8月4日に出願された国際特許出願PCT／US2017／045643号において見出されることができる。該出願は、その全体を参照によって本明細書に取り込まれる。実施態様において、該結合剤は、外因性抗体である。外因性抗体は、哺乳類の免疫システムによって、哺乳動物において、例えばヒトにおいて、天然に産生されない抗体である。
【００６２】
本明細書において使用される語「1つの抗体」又は「複数の抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分(すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子)を云う。該語はまた、2つの免疫グロブリン重鎖及び2つの免疫グロブリン軽鎖からなる抗体、並びに完全長抗体及びその一部を含む様々な形態を云う；例えば、免疫グロブリン分子、モノクロナール抗体、キメラ抗体、CDRグラフト化抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合されたFv、scFv、単一ドメイン抗体(dAb)、二重特異性抗体(diabody)、多重特異的抗体、二重特異的抗体(dual  specific  antibody)、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体(bispecific  antibody)、それらの機能的に活性なエピトープ-結合フラグメント、二機能性ハイブリッド抗体(例えば、Lanzavecchia等，Eur．J  Immunol．17，105  (1987年))、及び単鎖(例えば、Huston等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85，5879-5883  (1988年)及びBird等，Science  242，423-426  (1988年))など（該文献は参照によって本明細書内に取り込まれる）を参照)、を含む。(一般に、Hood等，Immunology，Benjamin，N．Y．，第2版  (1984年)；Harlow  and  Lane，Antibodies．A  Laboratory  Manual，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  (1988年)；Hunkapiller  and  Hood，Nature，323，15-16  (1986年)、該文献は参照によって本明細書内に取り込まれる、を参照)。該抗体は、任意の種類(例えば、IgG、IgA、IgM、IgE又はIgD)でありうる。好ましくは、該抗体はIgGである。抗体は、非ヒト(例えば、マウス、ヤギ又は他の任意の動物)、完全ヒト、ヒト化またはキメラでありうる。1つの抗体又は複数の抗体が、本明細書内に開示された抗体の任意の1以上のバイオシミラーを含む。本明細書において使用される場合に、バイオシミラーは、確信企業によって販売されている参照製品と、品質、安全性、及び有効性において同等であると見なされるバイオ医薬品を云う(Public  Health  Service  ActのSection  351(i)(42  U．S．C．  262(i))。
【００６３】
語「解離定数」はまた、特定の物質が個々の成分(例えば、タンパク質キャリアー、抗体及び治療剤)に分離する程度を表す量を云う。
【００６４】
本明細書において使用される語「凍結乾燥された」、「凍結乾燥」などは、乾燥されるべき物質(例えば、ナノ粒子)が最初に凍結され、そして次に、氷又は凍結された溶媒が真空環境における昇華によって除かれる方法を云う。添加剤は、保存時の凍結乾燥された製品の安定性を高めるために、予備凍結乾燥製剤に任意的に含まれる。幾つかの実施態様において、該ナノ粒子は、治療薬として使用する前に、凍結乾燥された成分(キャリアータンパク質、抗体及び任意の治療剤)から形成されることができる。他の実施態様において、該キャリアータンパク質、結合剤、例えば抗体、及び任意の治療剤がナノ粒子に最初に組み合わされて、そして次に凍結乾燥される。該凍結乾燥されたサンプルはさらに、追加の添加剤を含みうる。
【００６５】
語「充填剤」は、凍結乾燥製品の構造を提供する剤を含む。充填剤の為に使用される一般的な例は、マンニトール、グリシン、ラクトース及びスクロースを含む。薬学的に洗練されたケーキを提供することに加えて、充填剤がまた、崩壊温度を改変し、凍結融解保護を提供し、且つ長期保存にわたるタンパク質安定性を高めることに関して有用な品質を与えることができる。これらの剤はまた、張性調節剤として役立ちうる。幾つかの実施態様において、該凍結乾燥組成物は充填剤を含む。幾つかの実施態様において、該凍結乾燥組成物は充填剤を含まない。
【００６６】
語「バッファー」は、凍結乾燥前に許容範囲内に溶液のpHを維持する剤を包含し、及びコハク酸塩(ナトリウム又はカリウム)、トリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、ジエタノールアミン、クエン酸(ナトリウム)などを含みうる。本発明のバッファーは、約5.5〜約6.5の範囲のpHを有する。この範囲のpHを制御するだろうバッファーの例は、コハク酸塩(例えば、コハク酸ナトリウム)、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸バッファーを含む。
【００６７】
語「抗凍結剤」は一般に、おそらくタンパク質表面から優先的に排除されることによって、凍結誘発ストレスに対して、タンパク質に安定性を提供する剤を含む。それらはまた、一次乾燥及び二次乾燥並びに長期の製品貯蔵の間に保護を提供しうる。例が、ポリマー、例えばデキストラン及びポリエチレングリコール；糖類、例えばスクロース、グルコース、トレハロース及びラクトース；並びにアミノ酸。例えばグリシン、アルギニン及びセリンである。
【００６８】
語「凍結防止剤」は、おそらく非晶質ガラス状マトリックスを提供することによって、及び乾燥プロセス中に除去される水分子を置換して、水素結合を介してタンパク質と結合することによって、乾燥又は「脱水」工程（一次及び二次の乾燥サイクル）中にタンパク質に安定性を提供する剤を含む。これは、タンパク質の立体配座を維持すること、凍結乾燥サイクルの間のタンパク質分解を最小限に抑えること、且つ長期的な製品を改善することに役立つ。例は、ポリオール、又は糖類、例えばスクロース及びトレハロース、を含む。
【００６９】
語「医薬製剤」は、活性成分が有効になることを許すような形態であり、及び製剤が投与されるであろう対象にとって毒性であるさらなる成分を含まない製剤を云う。
【００７０】
「薬学的に許容される」添加剤（ビヒクル、添加物）は、使用される有効成分の有効量を提供する為に対象哺乳動物に合理的に投与されることができるものである。
【００７１】
「再構成時間」は、凍結乾燥された製剤を溶液中に再水和する為に必要とされる時間である。
【００７２】
「安定な」製剤は、その中のタンパク質が貯蔵時にその中のタンパク質が貯蔵時にその物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的活性を本質的に保持しているものである。例えば、タンパク質の安定性を測定する為の様々な分析技術が、当該分野で利用可能であり且つPeptide  and  Protein  Drug  Delivery，247-301，Vincent  Lee編集，Marcel  Dekker，Inc．，ニューヨーク，N．Y．，Pubs  (1991年)及びJones，A．Adv．Drug  Delivery  Rev．10：29-90  (1993年)においてレビューされている。安定性は、選択された温度で、選択された期間、測定されることができる。
【００７３】
本明細書において使用される語「エピトープ」は、結合剤、例えば抗体、によって認識される抗原の部分を云う。エピトープは、タンパク質（例えば抗体）又はリガンドとの特異的相互作用を可能にする短いアミノ酸配列又はペプチド（任意的に、グリコシル化されているか又は他の方法で修飾されている）を含むが、これらに限定されない。例えば、エピトープは、結合剤の抗原結合部位が付着する分子の一部でありうる。
【００７４】
語「処置する」又は「処置」は、対象、例えばヒト、における疾病又は障害(例えば、癌)の処置を包含し、且つ(i)疾病又は障害を抑制すること、すなわち、その発症を阻止すること；(ii)疾病又は障害を軽減すること、すなわち疾病又は障害を後退させること；(iii)疾病又は障害の進行を遅らせること；及び／又は(iv)疾病又は障害の１以上の症状の進行を抑制、緩和若しくは進行を遅らせることを含む。幾つかの実施態様において、「処置する」又は「処置」は、癌細胞を殺すことを云う。
【００７５】
癌処置に関連して語「殺す」又は「殺している」は、その癌細胞又は癌細胞の集団の少なくとも一部の死をもたらすであろう任意の種類の操作を含むことに向けられている。
【００７６】
語「アプタマー」は、標的分子、例えばポリペプチド、に結合することができる拡散分子を云う。例えば、本発明のアプタマーは、T細胞癌上で発現される抗原、例えばCD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD20、CD38、CD25、CD30、CD40、CD52、CD122又はCCR4、に特異的に結合することができる。特定の結合特異性を有する抗体の生成及びアプタマーの治療的使用は、当分野において十分に確立されている。例えば、米国特許第5,475,096号、米国特許第5,270,163号、米国特許第5,582,981号、米国特許第5,840,867号、米国特許第6,011,020号、米国特許第6,051,698号、米国特許第6,147,204号、米国特許第6,180,348号及び米国特許第6,699,843号、並びに加齢黄斑変性を処置する為のMacugen(登録商標)(Eyetech，ニューヨーク)の治療的有効性を参照。
【００７７】
本明細書において使用される語「オリゴマー」又は「オリゴマーの」又は「オリゴマー化された」は、2以上のモノマーからなるオリゴマーを云う。
【００７８】
融合タンパク質は、望ましい構造機能特性及び重要な治療上の可能性を持つ分子を生成する為に、タンパク質の一部(例えば、抗体の結晶化可能フラグメント(Fc)ドメイン；又は抗体のアルブミン結合モチーフ)を他の生物学的に活性な剤、例えばタンパク質ドメイン、ペプチド、又は核酸若しくはペプチドアプタマー、と結合させる生物工学によって作られたポリペプチドである。ガンマ免疫グロブリン(IgG)アイソタイプは、好ましい特徴、例えばエフェクター機能の動員及び増加された血漿半減期、のために、Fc-融合タンパク質を生成するための基礎としてしばしば使用される。融合パートナーとして使用することができるアプタマー（ペプチド及び核酸の両方）の範囲を考慮すると、融合タンパク質は、多数の生物学的及び薬学的用途を有する。
【００７９】
さらに、本明細書において用いられている幾つかの語は、下記でより具体的に定義されている。
【００８０】
概要
【００８１】
本発明は、任意的に凍結乾燥されたナノ粒子がキャリアータンパク質、結合剤、例えば抗体、アプタマー、又はアルブミン結合モチーフ及び抗原結合ドメインを有する融合タンパク質、例えばT細胞又はT細胞癌上に発現される抗原に結合することができる、細胞受容体のアプタマー又はリガンドに融合されたアルブミン-結合モチーフ、を含むという驚くべき発見に部分的に基づき、及び治療剤は、患者に対する毒性を最小に抑えながら、腫瘍に対して標的化された治療を提供する。一つの観点において、該結合剤は、T細胞又はT細胞癌上での発現される抗原に結合することができると同時に、OKT3の免疫原性及び分裂促進性の潜在的限界に関連付けられた重篤な副作用を低減又は排除することができる。従って、本明細書に記載されたナノ粒子は、このように、重篤な副作用及び／又は毒性を有する慣用的なADCと比較して有意な改善である。
【００８２】
当業者には理解されるように、慣用的なADCが有効であるためには、リンカーが体循環中で解離しないが、腫瘍部位での十分な薬物放出を許すのに十分安定であることが重要である(Alley，S．C．，等  (2008年)  Bioconjug  Chem  19：759-765）)。これは、効果的な薬物複合体を開発する際の大きな障害であることが証明されている(Julien，D．C．，等  (2011年)  MAbs  3：467-478；Alley，S．C．，等  (2008年)  Bioconjug  Chem  19：759-765)；それ故に、ナノ免疫複合体の魅力的な特徴は、生化学的リンカーが必要とされないことである。
【００８３】
現在のADCもう1つの欠点は、腫瘍内へのより高い薬物浸透性が、ヒト腫瘍において実質的に証明されていないことである。マウスモデルにおけるADCの早期試験は、抗体での腫瘍ターゲティングが腫瘍中の高濃度の活性剤を結果として生じることを示唆した(Deguchi，T．等  (1986年)  Cancer  Res  46：3751-3755)；しかしながら、これは、ヒトの疾病の処置に相関していない。なぜなら、ヒトの腫瘍はマウスの腫瘍よりも透過性がはるかに不均一であるためと思われる(Jain，R．K．，等  (2010年)  Nat  Rev  Clin  Oncol  7：653-664)。また、ナノ粒子のサイズは、血管系から腫瘍内への血管外漏出に重要である。ヒト結腸腺癌異種移植モデルを用いたマウス研究において、血管孔はリポソームに対して最大400nmまで透過性であった(Yuan，F．，等  (1995年)  Cancer  Res  55：3752-3756)。腫瘍孔サイズ及び透過性の別の研究は、退行性腫瘍及び頭蓋腫瘍が200nm未満の粒子に対して透過性であり、両方の特徴が腫瘍の位置及び成長状態に依存したことを実証した(Hobbs，S．K．，等  (1998年)  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  95：4607-4612)。本明細書に記載されたナノ免疫コンジュゲートは、200nm未満のインタクトである大きな複合体が全身循環において腫瘍組織を容易に透過することができるより小さな機能単位に部分的に解離されるという事実によってこの問題を克服する。その上、さらに、コンジュゲートが腫瘍部位に到達すると、より小さな毒性ペイロードが放出されることができ、且つコンジュゲート全体ではなく、毒性部分のみが腫瘍細胞によって取り込まれる必要がある。
【００８４】
治療剤(すなわち、ABRAXANE(登録商標))を含むアルブミンナノ粒子で被覆された抗体(すなわち、AVASTIN(登録商標))の出現は、イン・ビボで、2以上の治療剤の所定の部位への指向性送達の新しいパラダイムをもたらしている。国際特許出願WO2012／154861号パンフレット及びWO2014／055415号パンフレットを参照。当該パンフレットのそれぞれは、その全体を参照によって本明細書に取り込まれる。
【００８５】
アルブミン及び結合剤、例えば抗体、の組成物が水性溶液中で、特定の濃度及び比で一緒に混合される場合に、本発明において有用な結合剤は、アルブミン内に及びその上に自発的に自己集合して、結合剤の複数のコピー(500以上まで)を有するナノ粒子を形成する。
【００８６】
単一源のタンパク質を含むタンパク質組成物は一般に、それらが有意な有効期間を示す凍結乾燥形態で貯蔵されるが、そのような凍結乾燥組成物は、疎水性−疎水性相互作用によって一緒に組み合わされた2つの異なるタンパク質の自己集合ナノ粒子を含まない。その上、結合剤の結合部分の大部分がナノ粒子の表面上に曝露されているナノ粒子構成は、そうでなければ良性と考えられる条件による移動又は再構成に影響を受けやすいことにふさわしい。例えば、凍結乾燥中に、タンパク質上のイオン電荷は脱水され、それによって基礎となる電荷が露出される。露出された電荷は、2つのタンパク質間の電荷−電荷相互作用を許し、それは各タンパク質の他方に対する結合親和性を変化させることができる。加えて、ナノ粒子の濃度は、溶媒（例えば水）が除去されるにつれて有意に増加する。ナノ粒子のそのような増加された濃度は、不可逆的なオリゴマー化をもたらす可能性がある。オリゴマー化は、モノマー形態と比較してオリゴマーの生物学的特性を低下させ且つときには1 ミクロン超の粒子のサイズを増大させるタンパク質の既知の特性である。
【００８７】
他方で、安定な形態のナノ粒子組成物は、少なくとも3ヶ月の貯蔵寿命が必要とされ、そして6ヶ月又は9ヶ月超の貯蔵寿命が好ましい臨床的及び／又は商業的な使用に必要とされる。そのような安定な組成物は、静脈内注射に容易に利用可能でなければならず、イン・ビボで所定の部位にナノ粒子を向かわせる為に、静脈内注射の際にその自己組織化形態を保持しなければならず、血流中に送達されるときの如何なる虚血性事象を回避するために、1ミクロン未満の最大サイズでなければならず、及び最後に、注射に用いられる水性組成物と適合されなければならない。
【００８８】
化合物
【００８９】
本開示書を読むと当業者には明らかであるとおり、本開示書は、キャリアータンパク質、結合剤及び少なくとも1つの治療剤を含む、ナノ粒子の組成物であって、該組成物が任意的に凍結乾燥されている上記組成物に関する。
【００９０】
幾つかの実施態様において、該キャリアータンパク質は、アルブミン、ゼラチン、エラスチン(トポエラスチンを含む)又はエラスチン由来のポリペプチド(例えば、α-エラスチン及びエラスチン様ポリペプチド(ELPs：elastin-like  polypeptides))、グリアジン、レグミン、ゼイン、ダイズタンパク質(例えば、ダイズタンパク質単離物(SPI：soy  protein  isolate))、ミルクタンパク質(例えば、β&shy;ラクトグロブリン(BLG：β-lactoglobulin)及びカゼイン)、又はホエータンパク質(例えば、ホエータンパク質濃縮物(WPC：whey  protein  concentrates)及びホエータンパク質単離物(WPI：whey  protein  isolates))であることができる。好ましい実施態様において、該キャリアータンパク質はアルブミンである。好ましい実施態様において、該アルブミンは、卵白(オボアルブミン)、ウシ血清アルブミン(BSA：bovine  serum  albumin)などである。なおより好ましい実施態様において、該キャリアータンパク質は、ヒト血清アルブミン(HAS：human  serum  albumin)である。幾つかの実施態様において、該キャリアータンパク質(例えば、アルブミン)は、組み換えタンパク質(例えば、組み換えHSA)である。幾つかの実施態様において、該キャリアータンパク質は、米国食品医薬品局(FDA：Food  and  Drug  Administration)によって承認された一般に安全と見なされる(GRAS：generally  regarded  as  safe)添加剤である。一つの実施態様において、該キャリアータンパク質は、抗体結合モチーフを含む。抗体結合モチーフの非限定的な例は、2017年8月4日に出願された国際特許出願PCT／US2017／045643号において見出されることができる。それら出願は、その全体を参照によって本明細書に取り込まれる。
【００９１】
幾つかの実施態様において、該結合剤は、アド−トラスツズマブ  エムタンシン、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、リツキシマブ、及びトラスツズマブから成る群から選択される抗体である。幾つかの実施態様において、該結合剤は、スリピズマブ(Slipizumab)、OKT3、Leu  1、ザノリムマブ(Zanolimumab)、ザノリムマブ(Zanolimumab)、ブレンツキシマブ・ベドチン(Brentuximab  vedotin)、Mik-β1、KW-0761、又はそれらの組み合わせを含む抗体から選択される抗体である。幾つかの実施態様において、これらの抗体の１以上が明示的に除外される。幾つかの実施態様において、該抗体は、該ナノ粒子の表面の全部又は一部上の実質的に単層の抗体である。
【００９２】
一つの観点において、該抗体の結合部分は、T細胞又はT細胞癌上に発現される抗体に結合することができる。一つの実施態様において、該抗原はT細胞癌上で発現されるタンパク質であり、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD30、CD40、CD52、CD122及びCCR4を含むがこれらに限定されない。更なる実施態様において、該抗原は、T細胞癌(例えば、T細胞リンパ腫)において過剰発現されるバイオマーカーである。T細胞癌において過剰発現されるバイオマーカーは、PD-L1、Ly6E、HER3／EGFR  DAF、ERBB-3受容体、CSF-1R、HER2、STEAP1、CEA、OX40、Ang2-VEGF又はVEGFを含みうる。好ましい実施態様において、該抗体の結合部分は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD30、CD40、CD52、CD122又はCCR4に結合することができる。他の実施態様において、該抗体の結合部分は、PD-L1、Ly6E、HER3／EGFR  DAF、ERBB-3受容体、CSF-1R、HER2、STEAP1、CEA、OX40、Ang2-VEGF又はVEGFに結合することができる。
【００９３】
下記の表1は、T細胞白血病及びリンパ腫を処置する為のモノクロナール抗体の非限定的なリストの一覧を示す。
【００９４】
【表１】
2019526579.tif 000003
【００９５】
幾つかの実施態様において、該少なくとも1つの治療剤又は少なくとも1つの追加の治療剤は、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、シスプラチン、クロラムブシル、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシウレア、イマチニブ、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチン及びシクロホスファミドから成る群から選択される。一つの実施態様において、該治療剤は、アドリアマイシン、ブレオマイシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、エトポシド、プレドニゾン、シクロホスファミド及びダカルバジンの１以上を含む。一つの実施態様において、該治療剤は、アラノン（ネララビン）、アビトレキセート(abitrexate)、アドリアマイシン（塩酸ドキソルビシン）、アンボクロリン(ambochlorin)（クロラムブシル）、ジデリグ(Zydelig)(イデラリシブ)、ビンカサル(Vincasar)  PFS (硫酸ビンクリスチン)、ベルサル(Velsar)(硫酸ビンブラスチン)、ベルケイド(ボルテゾミブ)、ベルバン(Velban)(硫酸ビンブラスチン)、トレアンダ(塩酸ベンダムスチン)、ロミデプシン、リウマトレックス(メトトレキサート)、レブラミド(レナリドミド)、塩酸プロカルバジン、プレドニゾン、プララトレキサート、プレリキサホル、ネオサル(Neosar)(シクロホスファミド)、マスタルゲン(Mustargen)(塩酸メクロレタミン)、メトトレキサート、塩酸メクロレタミン、マチュラン(Matulane)(塩酸プロカルバジン)、ロムスチン、リンホリジン(Linfolizin)又はロイケラン(クロラムブシル)、イストダックス(Istodax)(ロミデプシン)、インブルビカ(Imbruvica)(イブルチニブ)、DTIC-ドーム(Dome)(ダカルバジン)、塩酸ドキソルビシン、デニロイキンディフチトクス、シトキサン(シクロホスファミド)、カルムスチン、ベレオダック(Beleodaq)(ベリノスタット)、又はアラノン(ネララビン)の１以上を含む。一つの実施態様において、該治療剤は、マスタード誘導体(例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン又はイホスファミド)、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、エトポシド及びプレドニゾンの１以上を含む。当業者は、これらが単なる例であり、且つ任意の化学治療剤又は癌治療剤が含まれうることを理解するであろう。
【００９６】
好ましくは、該ナノ粒子は、治療剤としてパクリタキセルを含む。
【００９７】
該治療剤は、該ナノ粒子の内側に、該ナノ粒子の外側表面に、又はその両方に位置しうることを理解されたい。該ナノ粒子は、1超の治療剤、例えば2つの治療剤、3つの治療剤、4つの治療剤、5つの治療剤、又はそれ以上を含みうる。その上、ナノ粒子は、該ナノ粒子の内側及び外側に同じ又は異なる治療剤を含みうる。
【００９８】
一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している少なくとも100の結合剤を含む。一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している少なくとも200の結合剤を含む。一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している少なくとも300の結合剤を含む。一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している少なくとも400の結合剤を含む。一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している少なくとも500の結合剤を含む。一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している少なくとも600の結合剤を含む。
【００９９】
一つの観点において該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している約100〜約1000の結合剤を含む。一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している約200〜約1000の結合剤を含む。一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している約300〜約1000の結合剤を含む。一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している約400〜約1000の結合剤を含む。一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している約500〜約1000の結合剤を含む。一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している約600〜約1000の結合剤を含む。一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している約200〜約800の結合剤を含む。一つの観点において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している約300〜約800の結合剤を含む。好ましい実施態様において、該ナノ粒子は、該ナノ粒子の表面に非共有結合している約400〜約800の結合剤を含む。考えられる値は、終点を含む列挙された範囲の任意の範囲内の任意の値又は部分範囲を含む。
【０１００】
一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約1μm未満である。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約90nm〜約1μmである。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約90nm〜約900nmである。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約90nm〜約800nmである。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約90nm〜約700nmである。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約90nm〜約600nmである。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約90nm〜約500nmである。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約90nm〜約400nmである。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約90nm〜約300nmである。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約90nm〜約200nmである。好ましい実施態様において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約100nm〜約180nmである。特に好ましい実施態様において、該ナノ粒子組成物における平均粒子サイズは、約100nm〜約160nmである。考えられる値は、終点を含む列挙された範囲の任意の範囲内の任意の値、部分範囲又は範囲を含む。
【０１０１】
一つの観点において、該ナノ粒子組成物は、静脈注射用に製剤化されている。虚血事象を避ける為に、静脈注射用に製剤化された該ナノ粒子組成物は、約1μm未満の平均粒子サイズを有するナノ粒子を含む。
【０１０２】
一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約1μmより大きい。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約1μm〜約5μmである。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約1μm〜約4μmである。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約1μm〜約3μmである。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約1μm〜約2μmである。一つの観点において、該ナノ粒子組成物の平均粒子サイズは、約1μm〜約1.5μmである。考えられる値は、終点を含む列挙された範囲の任意の範囲内の任意の値、部分範囲又は範囲を含む。
【０１０３】
一つの観点において、該ナノ粒子組成物は、腫瘍内への直接注入の為に製剤化されている。直接注入は、腫瘍部位内への又はその近傍への注射、腫瘍内への灌流などを含む。腫瘍内への直接注入の為に製剤化されている場合、該ナノ粒子は、任意の平均粒子サイズを含みうる。理論に縛られることなしに、より大きな粒子(例えば、500nm超、1μm超など)が腫瘍内に固定化される可能性が高く、それによって有益な効果を提供することが信じられている。より大きな粒子は、腫瘍又は特定の器官において蓄積されることができる。例えば、(肝臓癌の臨床的用途において)TheraSphere(登録商標)」と呼ばれる、肝臓の腫瘍に栄養を補給する肝臓の動脈に注入する為に使用される20〜60ミクロンのガラス粒子を参照のこと。それ故に、静脈内投与の為に、1μm未満の粒子が典型的に使用される。1μm超の粒子はより典型的には、腫瘍内に直接投入される(「直接注入」)か又は腫瘍の部位に栄養補給する動脈内に投与される。
【０１０４】
一つの観点において、該組成物内の約0.01%未満のナノ粒子は、200nm超、300nm超、400nm超、500nm超、600nm超、700nm超、又は800nm超、の粒子サイズを有する。一つの観点において、該組成物内の約0.001%未満のナノ粒子は、200nm超、300nm超、400nm超、500nm超、600nm超、700nm超、又は800nm超、の粒子サイズを有する。好ましい実施態様において、該組成物内の約0.01%未満のナノ粒子は、800nm超の粒子サイズを有する。より好ましい実施態様において、該組成物内の約0.001%未満のナノ粒子は、800nm超の粒子サイズを有する。
【０１０５】
好ましい観点において、本明細書内に列挙されたサイズ及びサイズ範囲は、再構成された凍結乾燥ナノ粒子組成物の粒子サイズに関する。すなわち、凍結乾燥ナノ粒子は、水性溶液(例えば、水、他の薬学的に許容される添加剤、バッファーなど)内に再懸濁された後に、粒子サイズ又は平均粒子サイズが本明細書内に列挙された範囲内にある。
【０１０６】
一つの観点において、該ナノ粒子の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又は99.9%が、単一のナノ粒子として、再構成された組成物中に存在する。すなわち、該ナノ粒子の約50%未満、約40%未満、約30%未満などが二量体化又は多量体化(オリゴマー化)されている。
【０１０７】
幾つかの実施態様において、該組成物中のナノ粒子は、20%未満の二量体化数、10%未満の二量体化数、及び好ましくは5%未満の二量体化数を有する。
【０１０８】
幾つかの実施態様において、ナノ粒子のサイズは、キャリアータンパク質の結合剤に対する量(例えば、比)を調節することによって制御されることができる。ナノ粒子のサイズ及びサイズ分布がまた重要である。本発明のナノ粒子は、それらのサイズに従って異なる挙動をしうる。大きいサイズでは、凝集が血管を塞ぎうる。それ故に、ナノ粒子の凝集は、該組成物の性能及び安全性に影響を及ぼすことができる。一方、より大きな粒子は、或る条件下(例えば、静脈内に投与されていない場合)で、より治療的でありうる。
【０１０９】
一つの観点において、該ナノ粒子組成物は、少なくとも1つの追加の治療剤を含む。一つの実施態様において、該少なくとも1つの追加の治療剤は、該ナノ粒子の外側表面に非共有結合している。一つの実施態様において、該少なくとも1つの追加の治療剤は、該ナノ粒子の外側表面に配置されている。一つの実施態様において、該少なくとも1つの追加の治療剤は、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、シスプラチン、クロラムブシル、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシウレア、イマチニブ、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチン及びシクロホスファミドから成る群から選択される。一つの実施態様において、該少なくとも1つの追加の治療剤は、抗癌結合剤、例えば抗癌抗体、である。
【０１１０】
ナノ粒子の製造方法
【０１１１】
幾つかの観点において、本発明は、本明細書において記載されたナノ粒子組成物を製造する方法に関する。本明細書において記載されたナノ粒子は、任意の方法によって製造されることができる。ナノ粒子、ナノ粒子組成物及び凍結乾燥されたナノ粒子組成物を製造する方法の非限定的な例が、PCT公開公報WO2014／055415号パンフレット及びPCT公開公報WO2016／057554号パンフレットにおいて見出されることができる。それら公報のそれぞれは、その全体を参照によって本明細書に取り込まれる。
【０１１２】
一つの観点において、該ナノ粒子組成物のナノ粒子は、キャリアータンパク質又はキャリアータンパク質治療剤粒子を結合剤と、約10：1〜約10：30のキャリアータンパク質粒子又はキャリアータンパク質治療剤粒子  対  結合剤の比で接触させることによって形成される。一つの実施態様において、該比は約10：2〜約10：25である。一つの実施態様において、該比は約10：2〜約1：1である。好ましい実施態様において、該比は約10：2〜約10：6である。特に好ましい実施態様において、該比は約10：4である。考えられる比は、終点を含む、列挙された範囲の任意の範囲内の任意の値、部分範囲又は範囲を含む
【０１１３】
一つの実施態様において、ナノ粒子を形成する為に用いられる溶液又は他の液体培地の量が特に重要である。ナノ粒子は、キャリアータンパク質(又は、キャリアータンパク質治療剤)及び抗体の過度に希釈された溶液中に形成されない。過度に濃縮された溶液は、構造化されていない凝集物を結果として生じるであろう。幾つかの実施態様において、用いられる溶液(例えば、滅菌水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水)の量は、約0.5mLの溶液〜約20mLの溶液である。幾つかの実施態様において、キャリアータンパク質の量は、約1mg／mL〜約100mg／mLの量である。幾つかの実施態様において、結合剤の量は、約1mg／mL〜約30mg／mLである。例えば、幾つかの実施態様において、キャリアータンパク質：結合剤：溶液の比は、1mLの溶液(例えば、食塩水)中のおよそ9mgのキャリアータンパク質(例えば、アルブミン)対4mgの結合剤、例えば抗体(例えば、OKT3)である。治療剤(例えば、タキソール)の量はまた、キャリアータンパク質に加えられることができる。例えば、1mgのタキソールは、1mLの溶液中の、9mgのキャリアータンパク質(10mgのキャリアータンパク質治療薬)及び4mgの結合剤、例えば抗体、Fc融合分子又はアプタマーに加えられることができる。例えばおよそ1リットルの溶液と典型的なi.v.バッグを用いて、1mLで使用される量と比較して、1000倍量のキャリアータンパク質／キャリアータンパク質&shy;治療剤及び抗体を用いる必要があるだろう。従って、標準i.v.バッグにおいて本発明のナノ粒子を形成することができない。その上、成分が本発明の治療量で標準i.v.バッグに加えられる場合に、該成分はナノ粒子を形成する為に自己集合しない。
【０１１４】
一つの実施態様において、キャリアータンパク質又はキャリアータンパク質治療剤粒子は、約4〜約8のpHを有する溶液中で結合剤と接触される。
【０１１５】
一つの実施態様において、キャリアータンパク質又はキャリアータンパク質治療剤粒子は、約4のpHを有する溶液中で結合剤と接触される。一つの実施態様において、キャリアータンパク質又はキャリアータンパク質治療剤粒子は、約5のpHを有する溶液中で結合剤と接触される。一つの実施態様において、キャリアータンパク質又はキャリアータンパク質治療剤粒子は、約6のpHを有する溶液中で一つの実施態様において、キャリアータンパク質又はキャリアータンパク質治療剤粒子は、約7のpHを有する溶液中で結合剤と接触される。一つの実施態様において、キャリアータンパク質又はキャリアータンパク質治療剤粒子は、約8のpHを有する溶液中で結合剤と接触される。好ましい実施態様において、キャリアータンパク質又はキャリアータンパク質治療剤粒子は、約5〜約7のpHを有する溶液中で結合剤と接触される。
【０１１６】
一つの実施態様において、キャリアータンパク質粒子又はキャリアータンパク質治療剤粒子は、約5℃〜約60℃の温度、又は終点を含むその範囲の任意の範囲、部分範囲若しくは値を含む。好ましい実施態様において、キャリアータンパク質粒子又はキャリアータンパク質治療剤粒子は、約23℃〜約60℃の温度で結合剤と接触される。
【０１１７】
理論に縛られることなしに、該ナノ粒子組成物内のナノ粒子の安定性は、少なくとも部分的には、ナノ粒子が形成される温度及び／又はpH、並びに溶液中の成分(すなわち、キャリアータンパク質、結合剤、及び任意的に、治療剤)の濃度に依存すると考えられている。一つの実施態様において、ナノ粒子のKdは、約1x10-11M〜約2x10-5Mである。一つの実施態様において、ナノ粒子のKdは、約1x10-11M〜約2x10-8Mである。一つの実施態様において、ナノ粒子のKdは、約1x10-11M〜約7x10-9Mである。好ましい実施態様において、ナノ粒子のKdは、約1x10-11M〜約3x10-8Mである。考えられる値は、終点を含む列挙された範囲の任意の範囲内の任意の値、部分範囲又は範囲を含む。
【０１１８】
凍結乾燥
【０１１９】
本発明の凍結乾燥組成物は、安定剤、バッファーなどの存在下又は非存在下で、標準凍結乾燥技術によって調製される。驚くことに、これらの条件は、ナノ粒子の比較的に脆い構造を変えない。その上、せいぜい、これらのナノ粒子は、凍結乾燥に応じて、それらのサイズ分布を保持し、そしてより重要なことに、あたかも新たに生成したのと実質的に同じ形態及び比率で、イン・ビボでの投与(例えば、静脈内送達)の為に再構成されることができる。
【０１２０】
凍結乾燥、又はフリーズドライは、組成物から水を除く。この方法において、乾燥されるべき材料が最初に凍結され、そして次に、水又は凍結された溶媒が真空環境における昇華によって除かれる。添加剤が、凍結乾燥工程中の安定性を高める為に及び／又は保存時の凍結乾燥製品の安定性を改善する為に、予め凍結乾燥された製剤中に含められうる(Pikal，M．Biopharm．3(9)26-30  (1990年)及びArakawa等，Pharm．Res．8(3)：285-291  (1991年))。
【０１２１】
タンパク質が凍結乾燥されうる間、凍結乾燥及び再構成の工程がタンパク質の特性に影響を及ぼしうる。タンパク質は伝統的な有機及び無機の薬物よりも大きく且つより複雑である(すなわち、複雑な三次元構造に加えて多数の官能基を有する)ので、そのようなタンパク質の製剤は特別な問題を提起する。タンパク質が生物学的に活性なままである為には、製剤は、タンパク質の複数の官能基を分解から保護すると同時に、タンパク質のアミノ酸の少なくともコア配列の立体配座の完全性を維持しなければならない。タンパク質の分解経路は、化学的不安定性（すなわち、結合の形成又は開裂によるタンパク質の修飾をもたらし且つ新しい化学的実体を結果として生じる任意の工程）又は物理的不安定性（すなわち、タンパク質の高次構造の変化）を含むことができる。化学的不安定性は、脱アミド化、ラセミ化、加水分解、酸化、ベータ脱離又はジスルフィド交換に起因することができる。物理的不安定性は、例えば、変性、凝集、沈殿又は吸着によって生じることができる。3つの最も一般的なタンパク質分解経路は、タンパク質凝集、脱アミド化及び酸化である(Cleland等，Critical  Reviews  in  Therapeutic  Drug  Carrier  Systems  10(4)：307-377  (1993年))。
【０１２２】
製剤
【０１２３】
一つの観点において、該ナノ粒子組成物は、全身送達、例えば静脈内投与、用に製剤化される。
【０１２４】
一つの観点において、該ナノ粒子組成物は、腫瘍内への直接注入用に製剤化される。直接注入は、腫瘍部位内への又は腫瘍部位の近傍への注射、腫瘍内への灌流を含む。該ナノ粒子組成物は全身的に投与されないので、腫瘍内への直接注入用に製剤化されているナノ粒子組成物は、任意の平均粒子サイズを含みうる。理論に縛られることなしに、より大きな粒子(例えば、500nm超、1μm超など)は腫瘍内に固定化される可能性が高く、それによって良好な有益な効果であると考えられているものを提供すると考えられる。
【０１２５】
他の観点において、本明細書で提供される化合物を含む組成物、及び少なくとも1つの薬学的に許容される添加剤が本明細書において提供される。
【０１２６】
一般に、本明細書において提供される化合物は、許容される投与方法の任意のものによって患者に投与する為に製剤化されることができる。様々な製剤及び薬物送達システムが当技術分野において利用可能である。例えば、Gennaro，A．R．編集  (1995年)  Remington's  Pharmaceutical  Sciences，第18版，Mack  Publishing  Co.を参照。
【０１２７】
一般に、本明細書において提供される化合物は、下記の経路のいずれか一つによって医薬組成物として投与されるだろう：経口、全身(例えば、経皮的、鼻腔内、又は座薬による)又は非経口(例えば、筋肉内、静脈内又は皮下)投与。
【０１２８】
該組成物は一般に、少なくとも1つの薬学的に許容される添加剤と組み合わせた本発明の化合物からなる。許容される添加剤は、非毒性であり、投与を助け、且つ特許請求された化合物の治療上の有効性に悪影響を及ぼさない。そのような添加剤は、任意の固体、液体、半固体であってもよく、又はエアロゾル組成物の場合には、当業者に一般的に入手可能な気体添加剤であってもよい。
【０１２９】
固形医薬添加剤は、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルクなどを含む。液体及び半固体の添加剤は、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、及び、例えば石油、動物、植物又は合成起源、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む様々な油から選択されうる。好ましい液体キャリアー、特に注射溶液の為の液体キャリアー、は、水、食塩水、水性デキストロース及びグリコールを含む。他の適切な医薬添加剤及びそれらの製剤が、E．W．Martinにより編集されたるRemington's  Pharmaceutical  Sciences(Mack  Publishing  Company，第18版，1990年)において記載されている。
【０１３０】
本組成物は、所望であれば、活性成分を含有する1以上の単位剤形を含むパック又はディスペンサー装置において提供されうる。そのようなパック又は装置は例えば、金属又はプラスチックのホイル、例えばブリスターパック、又はガラス、及びゴム栓、例えばバイアル内のゴム栓、を含みうる。該パック又はディスペンサー装置は、投与の為の説明書を添付されうる。適合性の医薬キャリアーにおいて処方された本発明の化合物を含む組成物がまた調製され、適切な容器に入れられ、そして指示された状態の処置の為にラベル付けされた。
【０１３１】
処置方法
【０１３２】
本明細書に記載のナノ粒子組成物は、哺乳動物における癌細胞及び／又は腫瘍を処置するのに有用である。好ましい実施態様において、該哺乳動物は、ヒト(すなわち、ヒトの患者)である。好ましくは、凍結乾燥されたナノ粒子組成物が投与前に再構成される(水性添加剤中に懸濁される)。
【０１３３】
一つの観点において、癌細胞を処置する為の方法であって、該細胞を本明細書に記載された有効量のナノ粒子組成物に接触させて、該癌細胞を処置することを含む上記方法を提供する。癌細胞の処置は、増殖の減少、該細胞を殺すこと、該細胞の転移を予防することなどを含むがこれらに限定されない。
【０１３４】
一つの観点において、処置を必要とする患者において、T細胞又はT細胞癌を処置する為の方法であって、該方法が、患者に、本明細書に記載されたナノ粒子組成物の治療的に有効な量を投与することを含み、該T細胞癌が、末梢T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ腫皮膚T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病／リンパ腫(ATLL)、腸症型T細胞リンパ腫、造血性ガンマデルタT細胞リンパ腫、芽細胞性NK細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、鼻NK／T細胞リンパ腫、処置に関連したT細胞リンパ腫、又はそれらの組み合わせを含む、上記方法が提供される。
【０１３５】
一つの観点において、処置を必要とする患者において、腫瘍を処置する為の方法であって、患者に、本明細書に記載されたナノ粒子組成物の治療的に有効な量を投与することを含む上記方法が提供される。一つの実施態様において、腫瘍のサイズが縮小される。一つの実施態様において、該腫瘍サイズは、処置中及び／又は処置後に少なくとも一定期間増加(すなわち、進行)しない。
【０１３６】
一つの実施態様において、該ナノ粒子組成物は、静脈内に投与される。一つの実施態様において、該ナノ粒子組成物は、腫瘍に直接的に投与される。一つの実施態様において、該ナノ粒子組成物は、腫瘍内への直接注入又は灌流によって投与される。
【０１３７】
一つの実施態様において、該方法は、a)該ナノ粒子組成物を週に1回、3週間投与すること；b)該ナノ粒子組成物の投与を1週間中止すること；及びc)腫瘍を処置する為に、必要に応じて工程a)及びb)を任意的に繰り返すことを含む。
【０１３８】
一つの実施態様において、本明細書に記載された該ナノ粒子の治療的に有効な量は、約1mg／m2〜約200mg／m2抗体、約2mg／m2〜約150mg／m2、約5mg／m2〜約100mg／m2、約10mg／m2〜約85mg／m2、約15mg／m2〜約75mg／m2、約20mg／m2〜約65mg／m2、約25mg／m2〜約55mg／m2、約30mg／m2〜約45mg／m2、又は約35mg／m2〜約40mg／m2抗体を含む。他の実施態様において、該治療的に有効な量は、約20mg／m〜約90mg／m2抗体を含む。一つの実施態様において、該治療的に有効な量は、30mg／m2〜約70mg／m2抗体を含む。一つの実施態様において、本明細書に記載された該ナノ粒子の治療的に有効な量は、約50mg／m2〜約200mg／m2のキャリアータンパク質又はキャリアータンパク質及び治療剤を含む。好ましい実施態様において、該治療的に有効な量は、約75mg／m2〜約175mg／m2のキャリアータンパク質又はキャリアータンパク質及び治療剤を含む。考えられる値は、終点を含む列挙された範囲の任意の範囲内の任意の値、部分範囲又は範囲を含む。
【０１３９】
一つの実施態様において、該治療的に有効な量は、約20mg／m2〜約90mg／m2の結合剤、例えば抗体、アプタマー又は融合タンパク質、を含む。好ましい実施態様において、該治療的に有効な量は、30mg／m2〜約70mg／m2の結合剤、例えば、抗体、アプタマー又は融合タンパク質、を含む。考えられる値は、終点を含む列挙された範囲の任意の範囲内の任意の値、部分範囲又は範囲を含む。
【０１４０】
一つの観点において、該癌はT細胞癌である。幾つかの実施態様において、該癌はT細胞リンパ腫である。他の実施態様において、該癌は、末梢T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ腫皮膚T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病／リンパ腫(ATLL：Adult  T-cell  Leukemia／Lymphoma)、腸症型T細胞リンパ腫、造血性ガンマデルタT細胞リンパ腫、芽細胞性NK細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、鼻NK／T細胞リンパ腫、処置に関連したT細胞リンパ腫、又はそれらの組み合わせである。
【０１４１】
一般に、本発明の化合物は、同様の用途に役立つ薬剤について許容されている投与方法のいずれかによって治療的に有効な量で投与されるだろう。本発明の化合物、すなわちナノ粒子、の実際の量は、多くの因子、例えば、処置される疾病の重症度、対象者の年齢及び相対的健康、使用される化合物の効力、投与の経路及び形態、並びに当業者に修理の他の因子、に依存するだろう。
【０１４２】
そのような剤の有効量は、最も効果的で且つ便利な投与経路、及び最も適切な製剤と同様に、ルーチン的な実験によって容易に決定されることができる。様々な製剤及び薬物送達システムが、当技術分野において利用可能である。例えば、Gennaro，A．R．，編集  (1995年)  Remington's  Pharmaceutical  Sciences，第18版編集，Mack  Publishing  Co.を参照。
【０１４３】
剤、例えば本発明の化合物、の有効量又は治療的に有効な量又は投与量は、対象者における症状の改善又は生存期間の延長を結果として生じる剤又は化合物の量を云う。そのような分子の毒性及び治療的有効性は、細胞培養又は実験動物における標準的な医薬的手順によって、例えばLD50(集団の50%に致命的な用量)及びED50(集団の50%において治療的に有効な用量)を決定することによって決定されることができる。毒性効果の治療効果に対する用量比は治療的指数であり、それはLD50／ED50のヒトして表されることができる。高い治療指数を示す剤が好ましい。
【０１４４】
有効量又は治療的に有効な量は、研究者、獣医師、医師又は他の臨床家によって求められている組織、系。動物及びヒトの生物学的又は医学的な反応を誘発するだろう化合物または医薬組成物の量である。投与量は、使用される剤形及び／又は利用される投与経路に依存して、この範囲内で変わりうる。正確な製剤、投与経路、投与量及び投与間隔は、対象の状態の詳細を考慮して、当技術分野において知られている方法に従って選択されるべきである。
【０１４５】
投与量及び投与間隔は、所望の効果を達成する為に十分である活性部分の血漿レベル、すなわち最小有効濃度(MEC：minimal  effective  concentration)、を提供する為に個々に調製されうる。MECは、各化合物によって異なるだろうが、例えばイン・ビトロでのデータ及び動物実験から推定されることができる。MECを達成する為に必要な投与量は、個々の特徴及び投与経路に依存するだろう。局所投与または選択的な摂取の場合に、薬物の有効局所濃度が血漿濃度とは関係ないかもしれない。
【実施例１】
【０１４６】
本開示は、コアとしてアルブミン結合パクリタキセル(すなわち、ABRAXANE(登録商標))又はシスプラチンと、癌性T細胞(例えば、OKT3)上で又は癌性T細胞(例えば、OKT3)によって発現される1以上の抗原を認識する抗体とからなるナノ粒子を用いて説明される。
【０１４７】
当業者は、実施例のナノ粒子を製造し且つ使用することは例示の目的の為だけであること及び本開示はこの例示によって限定されないことを理解するであろう。
【０１４８】
本明細書において用いられる任意の略語は、通常の科学的意味を有する。特に記載がない限り、全ての温度は℃である。本明細書において、下記の語は、他に定義されていない限り、以下の意味を有する。
【０１４９】
【表２】
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【０１５０】
実施例1：ナノ粒子調製
ABRAXANE(登録商標)(ABX)は、0.9%の食塩水を含むムロモナブ-CD3(OKT3)中で懸濁される。混合物は、30分間、室温で(又は示された温度で)、インキュベーションされて、粒子形成をもたらす。ABX：OKT3複合体の粒子サイズを測定する為のマスターサイザー(Mastersizer)実験の為に、10mgのABXが、0〜25mg／mlの濃度で、OKT3中に懸濁される。
【０１５１】
ヒトでの使用の為に、ABX：OKT3複合体が、用量適正数(dose  appropriate  number)のOKT3を得て、そして、下記の指示に従って各バイアルを様々な濃度に希釈することによって調製されうる。ABXの用量適正数の100mgバイアルは、10mg／mLのABXナノ粒子を含む最終濃度に再構成することによって調製することができる。滅菌した3mLシリンジを用いて、OKT3が引き抜かれ、そして1分間かけて、100mgのABXを含むバイアルのそれぞれの内壁上にゆっくりと注入されることができる。OKT3溶液は、凍結乾燥されたケーキ上に直接的に注入されるべきではない。なぜならば、これは泡を結果として生じるからである。次に、滅菌した12mL滅菌シリンジを用いて、8.4mLの0.9%塩化ナトリウム注射液(USP)が抜き取られ、そして100mgのABX及び0〜40mgのOKTを含む各バイアルの内壁上に、最低1分間で、8.4mLをゆっくり注入されることができる。OKT3及び8.4mLの0.9%塩化ナトリウム注射液(USP)の添加が完了したら、各バイアルは、如何なるケーキ／粉末の完全な溶解が生じるまで、少なくとも2分間、穏やかに回転され及び／又はゆっくりと反転されることができる。泡の発生は避けられるべきである。ABX及びOKT3を含むバイアルは、60 分間、静置されるべきである。1以上のバイアルは、複合体を混合し続ける為に、穏やかに回転され及び／又は10分毎に反転されるべきである。60分が経過した後、計算された投与量のABX及びOKT3が各バイアルから抜き取られ、そして空のバイアフレックスバッグにゆっくりと加えられるべきである。次に、等容量の0.9%塩化ナトリウム注射液(USP)が、ABX及びOKT3の混合物に加えられる。次に、該バッグは、混合するために、1分間、穏やかに回転され及び／又はゆっくりと反転されるべきである。ABX：OKT3ナノ粒子が、最終希釈後、室温で、4時間まで保存されることができる。
【０１５２】
実施例2：イン・ビトロでのABXとOKT3との結合
【０１５３】
ABXとOKT3とが相互作用するかを決定する為に、実施例1で形成されたナノ粒子が、フローサイトメトリー及び電子顕微鏡によって解析された。
【０１５４】
方法
【０１５５】
フローサイトメトリー：ABX及びOKT3を含むナノ粒子組成物は、上記の実施例1に記載された通りに製造される。OKT3のABXへの結合を決定する為に、組成物の視覚化が、Accuri  C6フローサイトメーター(BD  Franklin  Lakes，NJ)で行われ、そしてデータ解析がAccuri  C6ソフトウェアを用いて行われる。ビオチン化された(5μg)ヤギ抗マウスIgG(Abeam，Cambridge，MA)が、5μgのストレプトアビジPE(Abeam，Cambridge，MA)でラベル付けされた。OKT3のFab部分がマウス由来であるために、ヤギ抗マウスIgGが該組成物をラベル付けする為に選択される。ABX及び該組成物は、PEラベル付けされたヤギ抗マウスIgGで、30分間、室温で、インキュベーションされ、洗われ、そしてフローサイトメトリーによって可視化される。
【０１５６】
電子顕微鏡：PBS中に溶解されたABXが、300-メッシュのパロディアン−カーボン(parlodian-carbon)で被覆された銅グリッドに加えられ、そして1分間放置される。ろ紙の先のとがった部分が液滴に触れられて、余分な液体を除き、グリッド上に薄いフィルムを残す。該グリッドが乾燥される。乾燥されたグリッド上に残ったバッファー結晶を溶解するために、サンプルがdH2O中で3回洗われた。小滴の1%リンタングステン酸(PTA：phosphotungstic  acid)，pH7.2，が該グリッドに加えられた。次に、該グリッドが再び、ろ紙の先のとがった部分によって触れられて、余分な液体を除き、グリッド上に薄いフィルムを残し、そして乾燥する。0.9%の塩化ナトリウム溶液中のOKT3が、PBSで1：10の比で希釈される。OKT3がニッケルフォームバー(nickel  formvar)で被覆されたグリッド上に載せられ、そして30分〜1時間、風乾される。組成物について、PBS中に溶解されたABX及び0.9%の塩化ナトリウム溶液中のOKT3が混合される。複合体がさらに、PBSで、1：5に希釈される。該複合体がニッケルフォームバー(nickel  formvar)で被覆されたグリッド上に載せられ、そして30分〜1時間、風乾される。両方のサンプルが、6nmの金複合化(gold-conjugated)粒子を有するヤギ抗マウスIgG(Electron  Microscopy  Sciences)中で、1時間、インキュベーションされ、10%のFCB／PBSで1：30に希釈され、PBSで6回洗われ(各2分間)、dH2Oで6回洗われ、次に2%のメチルセルロース及び4%のUAの混合物(9：1)で、5分間染色される。ろ紙が、汚れを排出するために用いられ、そして該グリッドが1時間、風乾される。両方のサンプルが、6nmの金複合化粒子を有するロバ抗マウスIgG(Jackson  Immuno  Research)中で、一晩インキュベーションされ、10%のFCB／PBSで1：25に希釈され、PBSで6回洗われ(各2分間)、dH2O水で6回洗われ、1%のPTAで、5分間染色され、風乾され、2%のメチルセルロースで覆われ、そして1 時間、風乾される。顕微鏡写真が80KVで作動しているJEOL1400で撮影された。
【０１５７】
実施例3：イン・ビトロでのナノ粒子組成物の機能
【０１５８】
実験は、複合体中の2つの重要な要素、抗体及びパクリタキセル、が、複合体中に存在する場合に、それらの機能を保持することを確認する為のものである。
【０１５９】
イン・ビトロでの毒性：HuT-78ヒトT細胞リンパ腫細胞株(ATCC  Manassas，VA)は、4.5g／L-グルコース、L-グルタミン及び10%の胎児ウシ血清(MG-72，CLS  order  number  820702)で補充されたRPMI  1640培地中で培養される。細胞が収穫され、そして24ウェルプレート中、1ウェル当たり、106細胞で蒔かれる。細胞が、ABX又は該組成物上に、0〜200μg／mlのパクリタキセル濃度で、一晩、37℃、及び5%のCO2下で曝露される。増殖を測定する為に、Click-iT  EdU(Molecular  Probes，Eugene，OR)キットが利用される。簡単に説明すると、10mMのEdUがウェルに加えられ、そして、細胞及びABX又は該ナノ粒子組成物とともに、一晩インキュベーションされる。該細胞が1%のサポニンで透過処理され、そしてインターカレートされたEdUがFITC-複合化抗体でラベル付けされる。増殖指標が、各処置からのFITC陽性細胞を未処理のEdUラベル付けされた細胞の最大増殖で割ることによって決定される。
【０１６０】
VEGF  ELISA：ABXに結合される場合に、OKT3がそのリガンドであるCD3になお結合できるかどうかを決定する為に、標準CD3  ELISAが使用される。該組成物は記載されているように調製され、そしてCD3-Ig融合タンパク質が、複合体又はABX単独で該組成物に加えられる。CD3-Ig融合タンパク質は、ナノ粒子と、2時間、室温でインキュベーションされる。懸濁液が、6000rpmで、15分間回転され、上清が回収され、そして遊離の融合タンパク質がELISAによって測定される。吸光度が、Versamax  ELISAプレート・リーダー(Molecular  Devices，Sunnyvale，CA)によって測定される。未結合のVEGFの濃度は、0〜2000pg／mlの標準曲線を用いて決定される。
【０１６１】
実施例4：粒子サイズ
【０１６２】
OKT3をABXに結合する場合に形成されるナノ粒子の特徴を理解する為に、ABX：OKT3複合体のサイズがABXに対して決定される。
【０１６３】
マスターサイザー及びナノサイト：ABX及び抗体-ABX薬物複合体の粒子サイズが、Mastersizer  2000(Malvern  Instruments，Westborough，MA)で動的光散乱によって測定される。粒子サイズを測定する為に、2ml(5mg／ml)のABRAXANE(登録商標)又は複合体がサンプルチェンバに加えられる。データがMalvernソフトウェアを用いて解析され、そして粒子サイズ分布が体積で表される。粒子サイズ及び安定性は後に、Nanosight  System(Malvern  Instruments，Westborough，MA)を用いて確認される。ABX又は複合粒子は、粒子サイズを正確に測定する為に、適切な範囲に希釈される。データが粒子サイズ分布によって表される；しかしながら、ナノ粒子追跡分析は、粒子サイズを決定する為に、ブラウン運動を用いる。
【０１６４】
実施例5：タンパク質親和性
【０１６５】
OKT3をAbraxaneに結合するときに形成されたナノ粒子の特性を理解する為に、複合体の結合親和性がバイオ−レイヤー干渉法(BLItz)アッセイによって決定された。該アッセイは、2つのタンパク質の結合親和性を決定する為に２つのタンパク質の結合親和性を決定するために白色光反射の干渉を用いる光学技術である。
【０１６６】
BLItzアッセイにおいて、2つのタンパク質が結合する場合に、反射光が、2つのタンパク質の結合親和性に相関する様式で波長を変える。ここで、100μg／mlでのビオチン化されたOKT3は、ストレプトアビジ含有プローブ上で固定化され、そして2つの濃度、500μg／ml(実行2)及び1000μg／ml(実行3)、でアブラキサンに曝露される。
【０１６７】
抗ヒトCD3抗体(OKT3)及びアブラキサンの場合、100μg／mlでのビオチン化されたOKT3が、ストレプトアビジ含有プローブ上で固定化された。次に、OKT3担持プローブが、2つの濃度、500μg／ml及び1000μg／ml(実行2及び実行3)、で、アブラキサン中に浸漬された。次に、アブラキサンが、濃度依存的様式でOKT3に結合された。タンパク質上の会合及び解離定数は、BLItzソフトウェアによって計算された。図18を参照
【０１６８】
結果は、OKT3及びアブラキサンの解離定数が2.246X109であったことを示し、それは、これらの2つのタンパク質間の強い非共有結合があることを示す。
【０１６９】
実施例6：マウスにおけるABX：OKT3複合体の有効性
【０１７０】
胸腺欠損ヌードマウスに移植されたHuT-78ヒトT細胞リンパ腫細胞の異種移植モデルが、イン・ビボで、ABX：OKT3複合体を有する組成物の有効性を試験する為に用いられる。
【０１７１】
イン・ビボ実験が、少なくとも2回行われる。それらの実験に必要とされるマウスの数は、検出力分析(power  analysis)によって決定される。完全な腫瘍応答を有するマウスが、治療後60〜80日間モニターされる。マウス研究の終点は、生存期間中央値である。カプランマイヤー(Kaplan-Meier)曲線が作成され、マントルコックス(Mantle-Cox)検定が、処置群間の生存期間中央値の有意性を決定する為に行われる。提示されたイン・ビトロでの結果は、少なくとも5回の反復実験を代表する。ベースライン実験からのイン・ビトロでの及びイン・ビボでのパーセント変化の統計分析が、スチューデントｔ検定を用いて行われる。
【０１７２】
マウスモデル：腫瘍有効性を試験するために、1x106のHuT-78ヒトT細胞リンパ腫細胞が、胸腺欠損ヌードマウス(Harlan  Sprague  Dawley，Indianapolis，IN)の右側腹部に移植される。腫瘍が約700mm3の大きさに達する場合に、該マウスが無作為化され、そしてPBS、ABX、OKT3(12mg／kg)、OKT3の後にABX又は上記の濃度での上記に記載された組成物で処置される。より大きなナノ粒子を試験するマウス実験の為に、より大きな粒子を生成する為に必要な最高用量のOKT3が、OKT3のみの処置群で使用される。腫瘍サイズが3回／週でモニターされ、そして腫瘍体積が下記の式を用いて計算される：(長さx幅2)／2。マウスは、腫瘍サイズがマウスの体重の10%、すなわち約2500mm3、に等しくなった場合に屠殺される。ベースラインからの7日目の増減率は下記の通りに計算される：[(処置日での腫瘍サイズ−7日目の腫瘍サイズ)／処置日での腫瘍サイズ]x100。
【０１７３】
実施例7：マウスにおけるパクリタキセルの薬物動態
【０１７４】
組成物及びABXの薬物動態 (pk)を比較する為に、血漿パクリタキセル濃度が、0、4、8、12及び24 時間で組成物又はABXを投与されたマウスにおいて測定された。
【０１７５】
方法
【０１７６】
パクリタキセル 薬物動態：パクリタキセルとd5パクリタキセルとの液体クロマトグラフ分離が、Agilent  Poroshell  120  EC-C18分析カラム(2.1x100mm，2.7μm  Chrom  Tech，Apple  Valley，MN)に取り付けられたAgilent  Poroshell  120  EC-C18プレカラム(2.1x5mm，2.7μm，Chrom  Tech，Apple  Valley，MN)を用いて達成され、0.1%の蟻酸を有する水(A)及び0.1%の蟻酸(B)を有するCANから成るグラジエント移動相で、40℃で、0.5ml／分の一定流速で溶出される。溶出が0.5分間、60%のA及び40%のBで開始され、次に、Bが4.5分間、40〜85%で直線的に増加され、0.2分間、85%のBで保持され、そして1.3分間、初期条件に戻された。オートサンプラー温度は10℃であり、及びサンプル注入量は2μlである。パクリタキセル及び内部標準のd5-パクリタキセルの検出が、0.075秒の滞留時間で多重反応モニタリング(MRM：multiple  reaction  monitoring)スキャンモードを用いて、キャピラリー電圧1.75kV、供給源温度150℃、脱溶媒和温度500℃、コーンガス流150L／時間、脱溶媒和ガス流1000L／時間を有するポジティブＥＳＩモードにおける質量分析計を用いて達成される。コーン電圧及び衝突エネルギーが、MassLynx-Intellistart，v4.1，ソフトウェアによって決定され、且つ6〜16V  〜12〜60eVでそれぞれ変化する。MRM前駆体及び生成物のイオンが、パクリタキセルについてはm／z  854.3>105.2で且つd5パクリタキセルについては859.3>291.2でモニターされる。パクリタキセルの一時原液(EtOH中、1mg／ml)及びd5パクリタキセル一時原液(EtOH中、1mg／ml)が、4mlの他のアンバーシラン処理ガラスバイアル中に調製され、そして−20℃で保存される。作業標準は、2mlのアンバーシラン処理ガラスバイアルバイアル中で貯蔵溶液をACNで希釈することによって調製され、そして−20℃で保存される。血漿サンプルが、下記の通りに抽出され、100μl血漿サンプルが、d5パクリタキセル(116.4nM又は100ng／ml)及び300μlのCANを含む1.7mlの微量遠心管に加えられ、ボルテックスされ、室温で、10分間インキュベーションされて、タンパク質を沈殿し、そして3分間、遠心分離される(14,000rpm)。上清が、Agilent  Captiva  ND液体プレート(Chrom  Tech，Apple  Valley，MN)上で濾過され、深い96-ウェルプレート内に集められ、そして窒素ガスを用いて乾燥される。サンプルが100μlのCANを用いて再構成され、そして振盪される。パクリタキセル(0.59〜55855nM又は0.5〜5000ng／ml)及びd5パクリタキセル(116.4nM)を含む血漿標準曲線が、パクリタキセル定量化の為に毎日調製される。マウス腫瘍が氷上で解凍され、秤量され、そして1xPBS中で、2部(重量対体積)に希釈される。次に、腫瘍が、鋸歯状プローブ(saw  tooth  probe)(5mmx75mm)を用いて、PRO200組織ホモジナイザーを用いてホモジナイズされる。次に、腫瘍ホモジネートは、ヒト血漿サンプルと同じように処理される。
【０１７７】
マウスのイメージング：簡単に説明すると、トリスバッファー(0.125M  トリス-HCl，pH  6.8，0.15M  NaCl)及び5mCi  Na125 Iが、ヨウ素化試験管(ThermoFischer  Scientific，Waltham，MA)に直接加えられる。ヨウ化物が活性化され、そして室温で旋回される。活性化されたヨウ化物がタンパク質溶液と混合される。50μlのスカベンジングバッファー(PBS中、10mgチロシン／mL，pH7.4)が加えられ、そして5分間、インキュベーションされる。トリス／BSAバッファーを添加しそして混合した後に、サンプルが10KのMWCO透析カセット中で、予冷したPBSに対して、0分間、1時間、2時間及び一晩、4℃で適用される。放射能がガンマカウンターによって決定され、次に1分当たりの崩壊(DPM：disintegrations  per  minute)及び比放射能が計算される。マウスが、それらの尾静脈に、OKT3、ABX-OKT3、ABX-ヒトIgG、ヒトIgG及びABXのみを注射される。投与3、10、24及び2時間後に、U-SPECT-II／CTスキャナー(MILabs，Utrecht，オランダ)を用いて、動物は、SPECT&shy;CTイメージングを介してイメージ化される。SPECT再構成が、POSEM(期待値最大化によるピクセル化順序付きサブセット：pixilated  ordered  subsets  by  expectation  maximization)アルゴリズムを用いて実行される。ＣＴデータが、フェルドカンプ(Feldkamp)アルゴリズムの間に再構成される。同時登録画像はさらに、PMODソフトウェア(PMOD  Technologies，チューリッヒ，スイス)を用いてレンダリングされ、そして視覚化される。動物は、注射の72時間後に屠殺され、そして解剖される。関心のある選択された組織及び器官が、放射性同位体用量キャリブレータ(Capintec  CRC-127R，Capintec  Inc．)を用いて測定される。
【０１７８】
実施例8：ナノ粒子組成物の凍結乾燥
【０１７９】
該ナノ粒子組成物は、OKT3をABRAXANE(登録商標)に加えることによって合成される。次に、0.9%の食塩水が加えられて、最終容量を2mlとし、そして混合物が、15mlのポリプロピレンコニカルチューブにおいて、室温で、30分間、インキュベーションされる。
【０１８０】
30分間、室温でのインキュベーション後に、混合物がそれぞれ、0.9%の食塩水中で1：2に希釈される。これらは、患者への投与の為に、薬局によって調製される場合の2つの薬の濃度である。
【０１８１】
該ナノ粒子組成物が、1.5mlのポリプロピレン製エッペンドルフ中の20個の200μ1アリコートに分けられ、そして−80℃で凍結される。
【０１８２】
一旦凍結すると、該アリコートが、卓上型凍結乾燥機Virtis  3L(SP  Scientific，Warmister，PA)で、一晩結乾燥された。凍結乾燥された調製物が生成される。
【０１８３】
乾燥されたアリコートが、同じ1.5mlのポリプロピレン製エッペンドルフ中に、室温で保存される。これらのサンプルは、室温で、30分間、食塩水で容易に再構成され、続いて7分間、2000xgで遠心分離される。次に、結果として得られたサンプルが、必要に応じて、適切なバッファー中に再懸濁される。
【０１８４】
比較すると、熱及び高速真空で乾燥されるサンプルは再構成することが不可能である。
【０１８５】
実施例9：凍結乾燥された調製物の試験
【０１８６】
サンプルが、凍結乾燥後の異なる時点で再構成され、そしてABXに対するそれらの物理的性質が及び新たに製造されたナノ粒子組成物が試験される。
【０１８７】
粒子サイズ分布が上記された通り評価される。
【０１８８】
CD3結合は、サンプルをCD3-IgG融合タンパク質で、2 時間、室温でインキュベーションし、2000 x gで、7 分間、遠心分離することによって評価される。(ナノ粒子に対応する)ペレットに結合したCD3の量又は上清中に残っているＣＤ３の量が、ELISAで測定される。
【０１８９】
パクリタキセル活性が、イン・ビトロで、HuT-78ヒトT細胞リンパ腫細胞に対する細胞傷害性によって評価される。
【０１９０】
実施例10：OKT3を用いた前処置がターゲティングを改善するかどうかを調べるための追跡調査
【０１９１】
上記の一般的なプロトコルに従って、胸腺欠損ヌードマウスが、右側腹部に1x106のHuT-78細胞を注射され、そして次に、PBS、OKT3、ABX、該ナノ粒子組成物で処置され、又はOKT3で前処置され、そして24時間後に該ナノ粒子組成物で処置された。データは、処置後7日目及び10日目に腫瘍体積（mm3）として表される。該腫瘍サイズは、10日間にわたって追跡される。
【図１】
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【国際調査報告】
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