(57)【要約】  本発明は、新規のＣＤＫ７阻害剤およびその薬学的組成物：2019537616.tif 000045  またはその薬学的に許容される塩を提供する。
2019537616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
2019537616.tif 000040
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
式（ＩＩ）の請求項１に記載の化合物
【化２】
2019537616.tif 000041
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
式（ＩＩ）の請求項２に記載の化合物
【化３】
2019537616.tif 000042
【請求項４】
式（ＩＩＩ）の請求項１に記載の化合物
【化４】
2019537616.tif 000043
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
式（ＩＩＩ）の請求項４に記載の化合物
【化５】
2019537616.tif 000044
【請求項６】
［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項７】
［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項８】
［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項４に記載の化合物または塩。
【請求項９】
［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項４に記載の化合物または塩。
【請求項１０】
結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項２または請求項６に記載の化合物または塩。
【請求項１１】
ＣｕＫα線を使用して、２θ±０．２°において、１２．４°、１７．３°、および１５．８°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた２１．５°で生じる特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項１０に記載の化合物または塩。
【請求項１２】
結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項２または請求項７に記載の化合物または塩。
【請求項１３】
ＣｕＫα線を使用して、２θ±０．２°において、２１．５°、１６．７°、および１５．２°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた１８．５°で生じる特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項１２に記載の化合物または塩。
【請求項１４】
結晶性［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項４または請求項８に記載の化合物または塩。
【請求項１５】
結晶性［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項４または請求項９に記載の化合物または塩。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
１つ以上の他の治療薬を含む、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、または神経膠腫を治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記癌が、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が、乳癌である、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
患者における、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療する方法であって、前記患者からの生物学的試料においてＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤまたはＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの機能喪失変異の存在を試験することと、前記試料が前記機能喪失変異について陽性であると試験された場合に、前記患者に治療有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することと、を含む、方法。
【請求項２２】
患者における、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療する方法であって、前記患者からの生物学的試料がＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤまたはＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの機能喪失変異を含有するという条件で、前記患者に治療有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項２３】
患者における、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療する方法であって、前記患者からの生物学的試料がＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤまたはＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの機能喪失変異について陽性であると試験された場合に、前記患者が治療のために選択されるという条件で、前記患者に治療有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
前記化合物または塩が、［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物または塩が、［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記塩が、ベシル酸塩である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記塩が、ヘミエジシル酸塩水和物である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物学的試料が、腫瘍試料であり、前記試料が、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が、前記化合物または塩を前記患者に最初に投与する前に、前記患者から得られる、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子が、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子である、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子が、ＫＭＴ２Ｃ遺伝子である、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子が、ＫＭＴ２Ｄ遺伝子である、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子が、ＲＢ１遺伝子である、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
治療に使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項３５】
尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫の治療に使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項３６】
前記癌が、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌である、請求項３５に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項３７】
前記癌が、乳癌である、請求項３５または３６に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項３８】
前記患者からの生物学的試料を使用してインビトロアッセイを行うことと、ＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤおよびＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異の存在を決定することと、遺伝子のいずれかにおける少なくとも１つの不活性化変異が存在する場合に、前記患者に治療有効量の前記化合物またはその塩を投与することと、もまた含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその塩。
【請求項３９】
前記生物学的試料が、腫瘍試料であり、前記試料が、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる、請求項３８に記載の使用のための化合物またはその塩。
【請求項４０】
前記試料が、前記化合物またはその塩を前記患者に最初に投与する前に、前記患者から得られる、請求項３８または３９に記載の使用のための化合物またはその塩。
【請求項４１】
ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその塩。
【請求項４２】
ＫＭＴ２Ｃ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその塩。
【請求項４３】
ＫＭＴ２Ｄ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその塩。
【請求項４４】
ＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその塩。
【請求項４５】
前記化合物またはその塩が、約１ｍｇ〜２ｇの用量で前記患者に投与される、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその塩。
【請求項４６】
尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項４７】
前記癌が、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌からなる群から選択される、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記患者からの生物学的試料を使用してインビトロアッセイを行うことと、ＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤおよびＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異の存在を決定することと、前記遺伝子のいずれかにおける少なくとも１つの不活性化変異が存在する場合に、前記患者に治療有効量の前記化合物またはその塩を投与することと、もまた含む、請求項４６または４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記生物学的試料が、腫瘍試料であり、前記試料が、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記試料が、前記化合物またはその塩を前記患者に最初に投与する前に、前記患者から得られる、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５１】
ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が選択される、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５２】
ＫＭＴ２Ｃ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が選択される、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５３】
ＫＭＴ２Ｄ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が選択される、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５４】
ＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が選択される、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５５】
前記化合物またはその塩が、約１ｍｇ〜２ｇの用量で前記患者に投与される、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ７（ＣＤＫ７）を阻害するのに有用な化合物、薬学的組成物、およびＣＤＫ７活性に関連する疾患を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、主要なクラスのキナーゼであり、がん細胞の増殖および調節されていない発癌性転写において重要である。ＣＤＫ７は、サイクリンＨおよびＭＡＴＩに結合して、細胞周期制御に関与する他のＣＤＫをリン酸化することによってその機能を果たす三量体サイクリン活性化キナーゼ（ＣＡＫ）を形成する。この複合体は、細胞周期における２つの後続する相間の特異的な移行を制御する。ＣＤＫ７は、細胞周期の一時的制御と転写活性の両方に関係している。ＣＤＫ７は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩ）のＲｂｐ１サブユニットのリン酸化による転写開始プロセスに関与している。制御されていない細胞増殖および調節されていない転写は癌の特徴である。ＣＤＫ７の選択的な標的化は、活発な転写および細胞周期進行を同時に阻害することによって利点を提供し得る。したがって、ＣＤＫ７は、癌、特に攻撃的で治療困難な癌の治療のための有望な標的である。
【０００３】
ＣＤＫ７に対する低分子阻害剤が文献に報告されている（例えば、ＷＯ２０１５／１５４０２２、ＷＯ２０１６／１４２８５５、ＷＯ２０１６／１６０６１７、ＷＯ２０１６／１９３９３９、およびＷＯ２０１７／０４４８５８を参照）。癌などの細胞増殖性疾患の治療に使用することができるＣＤＫ７阻害剤を提供する必要性が依然としてある。さらに、他のＣＤＫと比べてＣＤＫ７に対して選択的であるＣＤＫ７阻害剤を提供する必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、選択的ＣＤＫ７阻害剤である新規化合物を提供する。そのような新規の化合物は、癌、特に転写が調節されていない癌の強力で効果的な治療の必要性に応えることができる。本発明はまた、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、および／または神経膠腫の強力で効果的な治療の必要性に応えることができる。
【０００５】
本発明は、式：
【化１】
2019537616.tif 000003
またはその薬学的に許容される塩を提供する。特に好ましいのはベシル酸塩である。ヘミエジシル酸塩水和物も好ましい。
【０００６】
本発明はまた、癌、特に転写が調節されていない癌を治療するための方法を提供する。好ましくは、癌は、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫である。より好ましくは、癌は、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌である。最も好ましくは、癌は、乳癌である。
【０００７】
本発明はまた、患者における、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療する方法であって、患者からの生物学的試料においてＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄおよび／またはＲＢ１遺伝子に少なくとも１つの機能喪失変異が存在することを試験することと、試料がＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄおよび／またはＲＢ１遺伝子のいずれかにおいて少なくとも１つの機能喪失変異について陽性であると試験された場合に、患者に治療有効量の、本発明の化合物または塩、特に［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩を投与することと、を含む、方法を提供する。好ましくは、塩は、ベシル酸塩またはヘミエジシル酸塩水和物である。より好ましくは、癌は、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌である。最も好ましくは、癌は、乳癌である。好ましくは、生物学的試料は、腫瘍試料であり、試料は、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる。好ましくは、試料は、化合物またはその塩、好ましくは［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩を患者に最初に投与する前に患者から得られる。好ましくは、塩は、ベシル酸塩またはヘミエジシル酸塩水和物である。好ましくは、遺伝子は、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子である。好ましくは、遺伝子は、ＫＭＴ２Ｃ遺伝子である。好ましくは、遺伝子は、ＫＭＴ２Ｄ遺伝子である。好ましくは、遺伝子は、ＲＢ１遺伝子である。
【０００８】
本発明はまた、患者における、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療する方法であって、患者からの生物学的試料がＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄおよび／またはＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの機能喪失変異を含有するという条件で、患者に治療有効量の、本発明の化合物または塩、特に［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。好ましくは、塩は、ベシル酸塩またはヘミエジシル酸塩水和物である。より好ましくは、癌は、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌である。最も好ましくは、癌は、乳癌である。好ましくは、生物学的試料は、腫瘍試料であり、試料は、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる。好ましくは、試料は、化合物またはその塩、好ましくは［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩を患者に最初に投与する前に患者から得られる。好ましくは、塩は、ベシル酸塩またはヘミエジシル酸塩水和物である。好ましくは、遺伝子は、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子である。好ましくは、遺伝子は、ＫＭＴ２Ｃ遺伝子である。好ましくは、遺伝子は、ＫＭＴ２Ｄ遺伝子である。好ましくは、遺伝子は、ＲＢ１遺伝子である。
【０００９】
本発明はまた、患者における、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療する方法であって、患者からの生物学的試料がＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄおよび／またはＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの機能喪失変異について陽性であると試験される患者が、治療のために選択されるという条件で、患者に治療有効量の、本発明の化合物または塩、特に［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。好ましくは、塩は、ベシル酸塩またはヘミエジシル酸塩水和物である。より好ましくは、癌は、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌からなる群から選択される。最も好ましくは、癌は、乳癌である。好ましくは、生物学的試料は、腫瘍試料であり、試料は、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる。好ましくは、試料は、化合物またはその塩、好ましくは［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩を患者に最初に投与する前に患者から得られる。好ましくは、塩は、ベシル酸塩またはヘミエジシル酸塩水和物である。好ましくは、遺伝子は、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子である。好ましくは、遺伝子は、ＫＭＴ２Ｃ遺伝子である。好ましくは、遺伝子は、ＫＭＴ２Ｄ遺伝子である。好ましくは、遺伝子は、ＲＢ１遺伝子である。
【００１０】
本発明はまた、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む、薬学的組成物を提供する。さらなる実施形態では、組成物は、１つ以上の他の治療薬をさらに含む。さらなる実施形態では、本発明は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む、癌を治療するための薬学的組成物を提供する。またさらなる実施形態では、本発明は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む、転写が調節されていない癌を治療するための薬学的組成物を提供する。該実施形態では、癌は、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫である。
【００１１】
好ましい実施形態では、癌は、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌である。より好ましい実施形態では、癌は、乳癌である。
【００１２】
さらに、本発明は、患者からの生物学的試料を使用してインビトロアッセイを行うことと、ＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤおよびＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異の存在を決定することと、遺伝子のいずれかに少なくとも１つの不活性化変異が存在する場合に、患者に治療有効量の化合物またはその塩を投与することと、もまた含む、癌の治療における使用のための、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。該実施形態では、癌は、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫である。好ましくは、生物学的試料は、腫瘍試料であり、試料は、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる。好ましくは、化合物またはその塩は、約１ｍｇ〜２ｇの用量で患者に投与される。好ましくは、試料は、化合物またはその塩を患者に最初に投与する前に、患者から得られる。好ましくは、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子に不活性化変異を有する患者が選択される。好ましくは、ＫＭＴ２Ｃ遺伝子に不活性化変異を有する患者が選択される。好ましくは、ＫＭＴ２Ｄ遺伝子に不活性化変異を有する患者が選択される。好ましくは、ＲＢ１遺伝子に不活性化変異を有する患者が選択される。
【００１３】
さらに、本発明は、治療に使用するための、特に転写が調節されていない癌を治療するための、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、転写が調節されていない癌を治療するための薬剤の製造のための、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。該実施形態では、癌は、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫である。好ましい実施形態では、癌は、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌から選択される。より好ましい実施形態では、癌は、乳癌である。
【００１４】
またさらなる実施形態では、本発明は、治療に使用するための、特に癌を治療するための、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、癌を治療するための薬剤の製造のための、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。該実施形態では、癌は、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫である。好ましい実施形態では、癌は、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌である。より好ましい実施形態では、癌は、乳癌である。さらに、本発明は、患者からの生物学的試料を使用してインビトロアッセイを行うことと、ＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤおよびＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異の存在を決定することと、遺伝子のいずれかに少なくとも１つの不活性化変異が存在する場合に、患者に治療有効量の化合物またはその塩を投与することと、もまた含む、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫の治療のための薬剤の製造を提供する。好ましくは、生物学的試料は、腫瘍試料であり、試料は、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる。好ましくは、化合物またはその塩は、約１ｍｇ〜２ｇの用量で患者に投与される。好ましくは、試料は、化合物またはその塩を患者に最初に投与する前に、患者から得られる。好ましくは、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子に少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が選択される。好ましくは、ＫＭＴ２Ｃ遺伝子に少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が選択される。好ましくは、ＫＭＴ２Ｄ遺伝子に少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が選択される。好ましくは、ＲＢ１遺伝子に少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が選択される。
【００１５】
本発明は、結晶性の塩の形態である、本発明の化合物の［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートを提供する。本発明はまた、結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物を提供する。本発明はまた、ＣｕＫα線を使用して、２θ±０．２°において、２１．５°、１６．７°、および１５．２°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた１８．５°で生じる特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、結晶形態の［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物を提供する。本発明はまた、結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩を提供する。本発明はまた、ＣｕＫα線を使用して、２θ±０．２°において、１２．４°、１７．３°、および１５．８°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた２１．５°で生じる特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、結晶形態の［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩を提供する。本発明はまた、結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート塩酸塩を提供する。本発明はまた、ＣｕＫα線を使用して、２θ±０．２°において、５．５°、１５．５°、および９．７°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた１８．９°で生じる特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、結晶形態の［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート塩酸塩を提供する。
【００１６】
本発明はまた、本発明の化合物の合成に有用な中間体およびプロセスを包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で使用する「治療する」（または「治療する」または「治療」）という用語は、既存の症状、状態または障害の進行または重症度を抑制、減速、停止または逆転させることを指す。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「癌」および「癌性」という用語は、典型的には未制御細胞増殖を特徴とする患者における生理学的状態を指すか、または記載する。この定義には、良性および悪性の癌が含まれる。「早期癌」または「早期腫瘍」は、進行癌もしくは転移癌ではないか、またはステージ０、Ｉ、もしくはＩＩ癌として分類される癌を意味する。癌の例としては、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の化合物は、反応して薬学的に許容される塩を形成することができる。薬学的に許容される塩およびそれらを調製するための一般的な方法論は当該技術分野において周知である（例えば、Ｐ．  Ｓｔａｈｌ，  ｅｔ  ａｌ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ，  ２ｎｄ  Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  ２０１１）；  Ｓ．Ｍ．  Ｂｅｒｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｖｏｌ．  ６６，  Ｎｏ．１，  Ｊａｎｕａｒｙ  １９７７を参照）。
【００２０】
当業者には、（Ｉ）に示される本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩が、下記の＊によって表される通り、１つのキラル中心を含有するコアを含むことが理解されるであろう。
【化２】
2019537616.tif 000004
【００２１】
本発明は、全ての個々のエナンチオマー、ならびにラセミ体を含む該化合物のエナンチオマーの混合物を企図するが、本発明の好ましい化合物は下記の（ＩＩ）によって表される。
【化３】
2019537616.tif 000005
で表されるものまたはその薬学的に許容される塩である。
【００２２】
当業者であれば、全てのキラル中心のカーン−インゴルド−プレローグ順位則（Ｒ）または（Ｓ）指定は、特定の化合物の置換パターンに依存して変化することも理解するであろう。単一のエナンチオマーは、キラル試薬で開始するか、または立体選択的もしくは立体特異的合成技術によって調製されてもよい。あるいは、単一のエナンチオマーは、本発明の化合物の合成における任意の都合のよい時点で、標準的なキラルクロマトグラフィーまたは結晶化技術によって混合物から単離されてもよい。本発明の化合物の単一のエナンチオマーは、本発明の好ましい実施形態である。
【００２３】
本発明の化合物は、好ましくは、様々な経路によって投与される薬学的組成物として製剤化される。そのような薬学的組成物およびそれを調製するためのプロセスは当該技術分野において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （Ａ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  ２１ｓｔ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  ２００５）を参照）。より特に好ましくは、以下の式の化合物、
【化４】
2019537616.tif 000006
またはその薬学的に許容される塩および１つ以上の薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物である。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態は、
【化５】
2019537616.tif 000007
またはその薬学的に許容される塩である。
【００２５】
本発明の特に好ましい実施形態は、化合物、（３Ｓ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル４−｛［５−メチル−３−（プロパン−２−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル］アミノ｝ピペリジン−１−カルボキシレート：
【化６】
2019537616.tif 000008
またはその薬学的に許容される塩に関する。ヘミエジシル酸塩水和物またはベシル酸塩が特に好ましい。
【００２６】
本発明の別の特に好ましい実施形態は、化合物、（３Ｓ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル４−｛［５−メチル−３−（プロパン−２−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル］アミノ｝ピペリジン−１−カルボキシレート：
【化７】
2019537616.tif 000009
【００２７】
本発明のさらなる特に好ましい実施形態は、化合物、（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル４−｛［５−メチル−３−（プロパン−２−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル］アミノ｝ピペリジン−１−カルボキシレート（下記の（ＩＩＩ）によって示される）：
【化８】
2019537616.tif 000010
またはその薬学的に許容される塩に関する。ヘミエジシル酸塩水和物またはベシル酸塩が特に好ましい。
【００２８】
本発明の別の特に好ましい実施形態は、化合物、（３Ｒ）−１−［（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル４−｛［５−メチル−３−（プロパン−２−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル］アミノ｝ピペリジン−１−カルボキシレート：
【化９】
2019537616.tif 000011
【００２９】
本発明の化合物は、概して、幅広い用量範囲にわたって有効である。例えば、１日当たりの投与量は、約１ｍｇ〜約２ｇの範囲内に入る。いくつかの例では、上記範囲の下限を下回る投与量レベルは十分すぎるかもしれないが、他の場合には、より大きな用量が好ましい利益／リスクプロファイルを維持しながら使用され得るので、上記投与量範囲は、本発明の範囲を決して限定するものではない。実際に投与される化合物の量は、治療される状態、選択される投与経路、投与される実際の化合物または複数の化合物、個々の患者の年齢、体重、および応答、ならびに患者の症状の重症度を含む、関連する状況に照らして、医師によって決定されることが理解されるであろう。
【００３０】
個々の異性体およびエナンチオマーは、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィーなどの方法によって、本発明の化合物の合成における任意の好都合な時点において、当業者により分離または分割され得る（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，  Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８１、およびＥ．Ｌ．  Ｅｌｉｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．  Ｗｉｌｅｎ，”  Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９４を参照）。
【００３１】
さらに、本明細書に記載の特定の中間体は、１つ以上の保護基を含有し得る。可変保護基は、各出現において、特定の反応条件および実施する特定の変換に応じて、同じでも異なっていてもよい。保護および脱保護の条件は、当業者に周知であり、文献に記載されている（例えば、“Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｂｙ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．  Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．２００７を参照）。
【００３２】
特定の略語は、以下の通りに定義される：「１Ｈ  ＮＭＲ」は１Ｈ核磁気共鳴を指し、「ｅｑ」は当量を指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンを指し、「ＭｅＣＮ」または「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＭＴＢＥ」はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを指し、「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを指し、「ＨＡＴＵ」は、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１８−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシド−ヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＭｅＯＨ」はメタノールを指し、「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィーを指し、「ＵＶ」は紫外線を指し、「ＬＣカラム」は液体クロマトグラフィーカラムを指し、「ＤＭＥＡ」はジメチルエチルアミンを指し、「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルを指し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指し、「ＳＣＸ」は強い陽イオン交換を指し、「ｃａ．」は約またはおよそを指し、「ＲＢＦ」は丸底フラスコを指し、「ＡＴＰ」はアデノシン三リン酸を指し、「ＤＴＴ」はジチオトレイトールを指し、「ＨＥＰＥＳ」は（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）を指し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し、「ＡＴＣＣ」はアメリカンタイプカルチャーコレクションを指し、「ＲＴ」は室温を指し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝食塩水を指し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指し、「ＦＢＳ」はウシ胎児血清を指し、「ＲＮＡａｓｅ」はリボヌクレアーゼを指し、「ｃＤＮＡ」は相補的ＤＮＡを指し、「ＧＳＴ」はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを指し、「Ｈｉｓ」はヒスチジンを指し、「ＧＳＨ」はグルタチオンを指し、「ＨＢＳＳ」はハンクス平衡塩溶液を指す。
【００３３】
本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩は、当該技術分野において既知の様々な手順、ならびに以下の調製物および実施例によって調製されてもよい。記載される経路の各々についての特定の合成ステップは、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を調製するために、異なる様式で、または他のスキームからのステップと併せて、組み合わせてもよい。以下のスキームにおける各々のステップの産物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、ろ過、磨砕、および結晶化を含む、当該技術分野で周知の従来の方法によって回収することできる。試薬および出発物質は、当業者にとって容易に入手可能である。
【００３４】
以下の調製物および実施例は、本発明をさらに例示し、本発明の化合物の典型的な合成を表す。
【実施例】
【００３５】
調製物および実施例
調製１
３−イソプロピルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５，７−ジオールの合成
【化１０】
2019537616.tif 000012
【００３６】
ナトリウムエトキシド（９７９ｇ、１４．４モル、３．０当量）およびマロン酸ジエチル（９９８ｇ、６．２３モル、３．０当量）を２３℃で、４−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−アミン（６００ｇ、４．７９モル）をエタノール（４．２Ｌ）に溶かした溶液に添加し、混合物を８０℃（内部温度）に１５時間加熱する。混合物を２５℃に冷却し、１ＭのＨＣｌ水溶液（２．０Ｌ）（最終ｐＨ＝２．０）を添加し、ろ過し、固体を水（２．０Ｌ）で洗浄し、乾燥させて、３−イソプロピルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５，７−ジオール（６００ｇ、６５％）を白色固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ１９４（Ｍ＋Ｈ）。
【００３７】
調製２
５，７−ジクロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンの合成
【化１１】
2019537616.tif 000013
【００３８】
ＭｅＣＮ（１．２５Ｌ）中の３−イソプロピルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５，７−ジオール（５００ｇ、２．５８モル）の懸濁液に、ＰＯＣｌ３（２．００Ｌ、２５．８モル、１０当量）およびＮ、Ｎ−ジメチルアニリン（１６２ｍＬ、２．５８モル、１．０当量）を５０℃で添加し、混合物を１００℃に３６時間加熱する。２３℃に冷却し、１：１の氷／リン酸緩衝液（１Ｍ、ｐＨ＝８、１０Ｌ）に滴下し、１５時間撹拌する。ろ過し、固体を水（５．０Ｌ）で洗浄し、乾燥させて、５，７−ジクロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン（３７５ｇ、６３％）を褐色固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２３０／２３２（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．３２（ｄ，６Ｈ），３．１９（ｄｑ，１Ｈ），７．５８（ｓ，１Ｈ），８．３１（ｓ，１Ｈ）。
【００３９】
５，７−ジクロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンの代替の合成
【００４０】
エタノール（１７．９ｍＬ、４７．９ｍｍｏｌ）中の２１％ナトリウムエトキシドを、エタノール（１５０ｍＬ）に４−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（５ｇ、３９．９ｍｍｏｌ）およびマロン酸ジエチル（６．７４ｍＬ、４３．９ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に添加し、室温で撹拌する。５分後、９０℃に加熱し、撹拌する。１８時間後、室温に冷却し、減圧下で濃縮する。残渣を水に溶解し、１Ｎ塩酸を添加して、ｐＨ＝３にする。白い沈殿物をろ過し、減圧下、５０℃で１８時間乾燥させる。得られた固体、３−イソプロピルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５，７−ジオール（４．９２ｇ、２５．５ｍｍｏｌ、０．６３８）をオキシ塩化リン（４８ｍＬ）に懸濁し、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン（２．３ｍＬ）を添加する。混合物を１１０℃で還流する。２時間後、室温に冷却し、減圧下で濃縮する。残渣を氷／水溶液に注ぎ、ＤＣＭで抽出する（２回）。有機層を合わせ、食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させる。ろ過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。ヘキサン：酢酸エチルで溶出するフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル）により残渣を精製して、５，７−ジクロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン（４．４５ｇ、１９．３ｍｍｏｌ）を褐色固体として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２３０，２３２（Ｍ＋１）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．２１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：８．３１（ｓ，１Ｈ），７．５８（ｓ，１Ｈ），３．１９（ｍ，１Ｈ），１．３２（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ）。
【００４１】
調製３
ｔｅｒｔ−ブチル４−［（５−クロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの合成
【化１２】
2019537616.tif 000014
【００４２】
Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１８９ｍＬ、１４０ｇ、１０８０ｍｍｏｌ、２当量）および４−アミノピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１１４ｇ、５７０ｍｍｏｌ、１．０５当量）を、２−プロパノール（１．０Ｌ）中の５，７−ジクロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン（１３０ｇ、５４２ｍｍｏｌ）の懸濁液に２３℃で添加し、混合物を１８時間撹拌し、ろ過し、固体をＭＴＢＥ（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、ｔｅｒｔ−ブチル４−［（５−クロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１８２ｇ、収率８５％）を黄色固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）３９４／３９６（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．２８（ｄ，６Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．６１（ｍ，２Ｈ），１．８３（ｍ，２Ｈ），２．８７（ｍ，１Ｈ），３．１０（ｄｑ，１Ｈ），３．３２（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．９８（ｍ，２Ｈ），６．３４（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），８．０７（ｄ，１Ｈ）。
【００４３】
調製４
ｔｅｒｔ−ブチル４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（５−クロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの合成
【化１３】
2019537616.tif 000015
【００４４】
Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６９．１ｍＬ、５１．２ｇ、３９６ｍｍｏｌ、１当量）、４−ジメチルアミノピリジン（４．８４ｇ、３９．６ｍｍｏｌ、０．１当量）、およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（２００ｍＬ、１９０ｇ、８７１ｍｍｏｌ、２．２当量）を、ＴＨＦ（９３６ｍＬ）にｔｅｒｔ−ブチル４−［（５−クロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１５６ｇ、３９６ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に２３℃で添加し、混合物を５０℃（内部温度）で２１時間加熱する。２３℃に冷却し、真空中で濃縮して、ｔｅｒｔ−ブチル４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（５−クロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１９５ｇ、９９％）をオレンジ色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）４３８／４４０（Ｍ＋Ｈ−５６）。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．２０（ｓ，９Ｈ），１．３１（ｄ，６Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ），１．４６（ｍ，２Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），２．７５（ｍ，１Ｈ），３．１９（ｄｑ，１Ｈ），３．３２（ｍ，１Ｈ），３．９５（ｍ，１Ｈ），４．１８（ｍ，２Ｈ），７．２０（ｓ，１Ｈ），８．１９（ｓ，１Ｈ）。
【００４５】
ｔｅｒｔ−ブチル４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（５−クロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの代替の合成
【００４６】
エタノール（３２ｍＬ）に５，７−ジクロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン（３．１ｇ、１３ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に、４−アミノピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２．８ｇ、１４ｍｍｏｌ）を添加する。８０℃で加熱する。１８時間後、室温に冷却し、減圧下で濃縮する。酢酸エチル：ＤＣＭで溶出するフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル）により残渣を精製して、ｔｅｒｔ−ブチル４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（５−クロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートを白色固体として得る。質量スペクトル（ｍ／ｅ）：３９４，３９６（Ｍ＋１）ｔｅｒｔ−ブチル４−［（５−クロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（９４０ｍｇ、２．３８６ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（２９０ｍｇ、２．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（７ｍＬ）に溶かした溶液に、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルｔｅｒｔ−ブチルカーボネート（１．１４ｇ、５．２２ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を６０℃で加熱する。３０分後、室温に冷却し、減圧下で濃縮する。ＤＣＭで溶出するフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル）により残渣を精製して、ｔｅｒｔ−ブチル４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（５−クロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１．１ｇ）を黄色がかった油状物として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４３８（Ｍ−ｔ−Ｂｕ）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：８．１９（ｓ，１Ｈ），７．２０（ｓ，１Ｈ），５．７６（ｓ，１Ｈ），４．１７（ｍ，１Ｈ），３．９５（ｍ，２Ｈ），３．１９（ｍ，１Ｈ），１．８７（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｍ，２Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ），１−３１（ｄ，６Ｈ），１．１９（ｓ，９Ｈ）。
【００４７】
調製５
ｔｅｒｔ−ブチル４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの合成
【化１４】
2019537616.tif 000016
【００４８】
ｔｅｒｔ−ブチル４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（５−クロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１９０ｇ、３８５ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（１．５Ｌ）に溶かした溶液に、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）ＤＣＭ付加物（１５．７ｇ、１９．３ｍｍｏｌ、０．０５当量）、三塩基性リン酸カリウム（２４５ｇ、１１６０ｍｍｏｌ、３当量）、および２，４，６−トリメチル−１，３，５，２，４，６−トリオキサトリボリナン（ＴＨＦ中５０質量％、７５．３ｍＬ、６７．６ｇ、２７０ｍｍｏｌ、０．７当量）を９０℃（内部温度）で添加する。５日後、２３℃に冷却し、珪藻土のパッドを通してろ過し、固体をＴＨＦ（３ｘ２５０ｍＬ）で洗浄する。合わせたろ液を２３℃でＳｉｌｉａＭｅｔＳ（登録商標）チオール樹脂（４０〜６３μｍ；充填量＝１．４６ｍｍｏｌ／ｇ；３２０ｇ、４６７ｍｍｏｌ）で処理し、６５℃に１８時間加熱する。２３℃に冷却し、ろ過し、樹脂をＤＣＭ（２ｘ２５０ｍＬ）で洗浄する。合わせたろ液を真空中で濃縮し、残渣をＭＴＢＥ（１ｍＬ）に溶解し、水（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、真空中で濃縮して、ｔｅｒｔ−ブチル４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１８２ｇ、１００％）を褐色固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ４７４（Ｍ＋Ｈ）。
【００４９】
調製６
３−イソプロピル−５−メチル−Ｎ−（４−ピペリジル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン二塩酸塩の合成
【化１５】
2019537616.tif 000017
【００５０】
２−プロパノール中の塩酸（５．５０ｍｏｌ／Ｌ、３４９ｍＬ、１９２０ｍｍｏｌ、５当量）を、２−プロパノール（１．４Ｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１８２ｇ、３８４ｍｍｏｌ）の懸濁液に２３℃で添加し、混合物を７０℃（内部温度）に３時間加熱する。２３℃に冷却し、ろ過し、固体をＭＴＢＥ（２×２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、３−イソプロピル−５−メチル−Ｎ−（４−ピペリジル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン二塩酸塩（９５ｇ、収率７１％）を黄色固体として得る。母液を合わせ、ＭＴＢＥ（２Ｌ）で希釈し、ろ過し、固体をＭＴＢＥ（２×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、追加の物質（８．４２ｇ、収率１５％）を得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ２７４（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．２８（ｄ，６Ｈ），２．０４（ｍ，４Ｈ），２．６１（ｓ，３Ｈ），３．００（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｍ，３Ｈ），４．１６（ｍ，２Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｓ，１Ｈ），８．８０（ｍ，１Ｈ），９．２１（ｍ，１Ｈ），９．８６（ｍ，１Ｈ）。
【００５１】
３−イソプロピル−５−メチル−Ｎ−（４−ピペリジル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン二塩酸塩の代替の合成
【００５２】
７−クロロ−３−イソプロピル−５−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン（２．１ｋｇ、１０．０ｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（４．１８Ｌ、２．４当量）をイソプロパノール（１６．８Ｌ、８ｍＬ／ｇ）に溶解する。４−アミノピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２．６ｋｇ、１．３当量）を反応混合物に加え、７５〜８０℃に１６時間加熱する。反応混合物を５〜１０℃に冷却し、イソプロパノール（１７．５Ｌ、７．０当量）中の４Ｍ塩酸溶液を添加する。４０〜４５℃に４時間加熱する。２５〜３０℃に冷却し、混合物をろ過して、表題化合物（２．２５ｋｇ、収率７２．７％）を得る。物質を、さらに精製することなく次の工程に使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ８．１６（ｓ，１Ｈ），６．４５（ｓ，１Ｈ），４．２９−４．２６（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２６−３．１２（ｍ，３Ｈ），２．６４（ｓ，３Ｈ），２．４０（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，２Ｈ），２．０８（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，２５．０Ｈｚ，２Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，６Ｈ）。
【００５３】
遊離塩基としての３−イソプロピル−５−メチル−Ｎ−（４−ピペリジル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミンの代替の合成
【００５４】
ｔｅｒｔ−ブチル４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（５−クロロ−３−イソプロピル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（６８９ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）、２，４，６−トリメチル−１，３，５，２，４，６−トリオキサトリボリナン（３５０ｍｇ、２．７９ｍｍｏｌ）および三塩基性リン酸カリウム（１．２ｇ、５．５ｍｍｏｌ）の混合物に、１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）を添加する。５分間、溶液にＮ２を泡立てる。［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）ＤＣＭ付加物（６０ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）を添加する。１１０℃で加熱する。１．５時間後、さらに［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（６０ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）を添加し、１００℃で加熱する。１８時間後、室温に冷却し、混合物をフィルターセルのパッドを通してろ過し、酢酸エチルで洗浄し、減圧下で濃縮する。酢酸エチルおよびＤＣＭで溶出するフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル）により残渣を精製して、ｔｅｒｔ−ブチル４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（５３７ｍｇ、１．０７７ｍｍｏｌ）を橙色油状物として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４７４（Ｍ＋１）。
【００５５】
ｔｅｒｔ−ブチル４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（５３７ｍｇ、１．０７７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１２ｍＬ）に溶かした溶液に、トリフルオロ酢酸（２．５ｍＬ、３３ｍｍｏｌ）を滴下する。室温で撹拌する。２時間後、混合物を減圧下で濃縮する。１０％ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、次いでＭｅＯＨ（２Ｎ  ＮＨ３）で溶出するＳＣＸ−２カートリッジにより残渣を精製する。塩基性画分を減圧下で濃縮して、３−イソプロピル−５−メチル−Ｎ−（４−ピペリジル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（３４５ｍｇ、１．１９９ｍｍｏｌ）を褐色がかった固体として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：２７４（Ｍ＋１）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：７．８２（ｓ，１Ｈ），７．２３（ｄ，１Ｈ），６．０８（ｓ，１Ｈ），３．５８（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｍ，１Ｈ），２．９７（ｍ，２Ｈ），２．５８（ｍ，２Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｍ，２Ｈ），１．２８（ｄ，６Ｈ）。
【００５６】
調製７
［（３Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの合成
【化１６】
2019537616.tif 000018
【００５７】
ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｓ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート（７６．５ｇ、４０９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（７６５ｍＬ）に溶かした溶液に、ホスゲン（トルエン中２０質量％、３４８ｍＬ、４８５ｇ、９８１ｍｍｏｌ、２．４当量）を添加し、３２％ＮＨ４ＯＨ水溶液を含有するスクラバートラップボトルに接続された３首ＲＢＦに２３℃で１時間入れる。３０分間、混合物を通してＮ２を泡立て、真空中で濃縮する。残渣をＤＣＭ（７５７ｍＬ）に溶解し、０℃（内部温度）に冷却し、あらかじめトリエチルアミン（２２８ｍＬ、１６６ｇ、１６３９ｍｍｏｌ、６当量）で処理された、ＤＣＭ（７５６．８ｍＬ）中の３−イソプロピル−５−メチル−Ｎ−（４−ピペリジル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン二塩酸塩（９４．６ｇ、２７３．２ｍｍｏｌ）の懸濁液を添加する（７分かけてゆっくり添加する）。添加後に冷却浴を除去し、３０分後に３５％ＨＣｌ水溶液（２０ｍＬ）および１Ｍ  ＨＣｌ水溶液（３００ｍＬ）で反応をクエンチする（最終ｐＨ＝７）。有機層を分離し、水（３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（３００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮する。残渣（約１８０ｇ）をＤＣＭ（１．５Ｌ）に溶解し、２３℃でＳｉｌｉａＭｅｔＳ（登録商標）チオール樹脂（４０〜６３μｍ；充填量＝１．４６ｍｍｏｌ／ｇ；１０ｇ、１４．６ｍｍｏｌ、Ｐｄ含有量に基づいて１４０当量）を添加し、次いで混合物を４０℃に２時間加熱する。ろ過し、樹脂をＤＣＭ（２×１０ｍＬ）で洗浄し、合わせたろ液を真空中で濃縮して、［（３Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１２９ｇ、９７％）を黄色固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ４８７（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．２８（ｄ，６Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ），１．６５（ｍ，２Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），１．９６（ｍ，１Ｈ），２．０７（ｍ，１Ｈ），２．４６（ｓ，３Ｈ），２．９０（ｍ，２Ｈ），３．３１（ｍ，５Ｈ），３．８９（ｍ，１Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），５．１０（ｍ，１Ｈ），６．３２（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ）。
【００５８】
［（３Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの代替の合成
【００５９】
ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｓ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート（４３８ｇ、１．３当量）を、１５〜３０℃でＡＣＮ（４．４Ｌ、１０．０ｍＬ／ｇ）に溶解する。トリエチルアミン（５９５ｍＬ、４．５当量）、続いてクロロぎ酸４−ニトロフェニル（４９０ｇ、１．４当量）を１５〜３０℃で添加する。３５〜４０℃に加熱し、混合物を４時間撹拌する。１５〜２５℃に冷却し、３−イソプロピル−５−メチル−Ｎ−（ピペリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（５００ｇ、１．８ｍｏｌ）を添加する。１５〜３０℃で５時間撹拌する。減圧下で濃縮する。２−メチルテトラヒドロフラン（４．４Ｌ、１０．０ｍＬ／ｇ）を添加し、撹拌し、ろ過する。ろ液を、２Ｍ  ＮａＯＨ（１．１Ｌ、２．５ｍＬ／ｇ、４回）および飽和ＮａＣｌ水溶液（４．４Ｌ、１０．０ｍＬ／ｇ）で順次洗浄する。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮する。イソプロピルアルコール（２．２Ｌ、５ｍＬ／ｇ）を添加して、表題化合物（６６０ｇ、収率７５．４％）の溶液を得る。
【００６０】
調製８
［（３Ｓ）−ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの合成
【化１７】
2019537616.tif 000019
【００６１】
２−プロパノール中の塩酸（５．５０ｍｏｌ／Ｌ、２１７ｍＬ、１１９０ｍｍｏｌ、５当量）を、２−プロパノール（７５５ｍＬ）中の［（３Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１１６ｇ、２３９ｍｍｏｌ）の懸濁液に２３℃で添加し、混合物を７０℃に９０分間加熱する。２３℃に冷却し、真空中で濃縮する。残渣をＤＣＭ（１．５Ｌ）中に懸濁し、１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液（４００ｍＬ）および５０％ＮａＯＨ水溶液（１００ｍＬ）を添加する。１５分間撹拌する。有機相を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮する。残渣（約１３１ｇ）を、ＭＴＢＥ／ヘキサン（２：１、９００ｍＬ）中に懸濁し、混合物を１８時間撹拌する。ろ過し、ろ過した固体をヘキサン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、［（３Ｓ）−ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（８２．７ｇ、収率９０％）を黄色固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ３８７（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．２８（ｄ，６Ｈ），１．６０（ｍ，３Ｈ），１．８８（ｍ，３Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），２．７５（ｍ，２Ｈ），２．９１（ｍ，４Ｈ），３．１３（ｄｑ，１Ｈ），３．７８（ｍ，１Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），５．１０（ｍ，１Ｈ），６．１４（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｄ，１Ｈ），７．８７（ｓ，１Ｈ）。
【００６２】
［（３Ｓ）−ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの代替の合成
【００６３】
（Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３−イル４−（（３−イソプロピル−５−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ）ピペリジン−１−カルボキシレート（８１９ｇ）を含有するイソプロピルアルコール溶液に、イソプロピルアルコール（８．４Ｌ、５．０ｍＬ／ｇ）中の５．５Ｍ塩酸を２０〜３０℃で添加する。反応混合物を５０〜６０℃に５時間加熱する。３０〜３５℃に冷却し、ＭＴＢＥ（８．２Ｌ、１０ｍＬ／ｇ）を添加し、１時間撹拌する。ろ過し、湿ったケーキを０〜５℃で水酸化ナトリウム水溶液（３．０当量）に添加し、３０分間撹拌する。２−メチルテトラヒドロフラン（８．２Ｌ、１０．０ｍＬ／ｇ）を添加し、撹拌する。有機相を抽出し、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で１〜２容量に濃縮する。ＭＴＢＥ（２．４６Ｌ、３ｍＬ／ｇ）を添加し、３時間撹拌する。ろ過により、表題化合物（５５０ｇ）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８２（ｓ，１Ｈ），６．１２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．７８（ｓ，１Ｈ），５．２７−５．１３（ｍ，１Ｈ），４．２６−４．０１（ｍ，２Ｈ），３．７４−３．５９（ｍ，１Ｈ），３．３６−３．２３（ｍ，１Ｈ），３．１４−２．９８（ｍ，５Ｈ），２．９０（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．１，８．４，５．４Ｈｚ，１Ｈ），２．５２（ｓ，３Ｈ），２．１８−２．００（ｍ，３Ｈ），１．８７（ｄｄ，Ｊ＝１２．６，６．４Ｈｚ，１Ｈ），１．７６（ｓ，１Ｈ），１．６６−１．５２（ｍ，２Ｈ），１．３４（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ）。
【００６４】
［（３Ｓ）−ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの代替の合成。
【００６５】
ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｓ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート（５００ｍｇ、２．６７ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．３７ｍＬ、２．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１３ｍＬ）に溶かした冷（０℃）溶液に、ホスゲン（１．１４ｍＬ、トルエン中２０質量％、３．２０ｍｍｏｌ）を添加する。冷浴を除去し、混合物を室温で撹拌する。３０分後、混合物を減圧下で濃縮し、残渣をＤＣＭ（１１ｍＬ）に溶解する。この溶液を、３−イソプロピル−５−メチル−Ｎ−（４−ピペリジル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（Ｃ、３６５ｍｇ、１００質量％、０．３６５ｇ）およびＴＥＡ（０．３ｍＬ）をＤＣＭ（１１ｍＬ）に溶かした溶液に添加する。混合物を室温で撹拌する。１０分後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加し、さらにＤＣＭで抽出する。有機層を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。ＤＣＭ：ＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル）により残渣を精製して、［（３Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（６７１ｍｇ）を黄色がかった油状物として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４８７（Ｍ＋１）。
【００６６】
［（３Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（６７１ｍｇ、１．２６９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１２ｍＬ）に溶かした溶液に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ、２６．４５ｍｍｏｌ）を滴下する。室温で撹拌する。１８時間後、混合物を減圧下で濃縮する。残渣をＤＣＭに溶解し、有機相を１０％Ｋ２ＣＯ３水溶液で洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、［（３Ｓ）−ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（２７４ｍｇ、０．６５９３ｍｍｏｌ）を白色の泡状物として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：３８７（Ｍ＋１）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：７．８７（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．１３（ｓ，１Ｈ），５．００（ｄｄｄ，Ｊ＝９．０，５．２，２．５Ｈｚ，１Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｍ，１Ｈ），３．１３（ｍ，１Ｈ），２．８９（ｍ，４Ｈ），２．７２（ｍ，２Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），１．８７（ｄｄ，Ｊ＝６．８，１４．１Ｈｚ，２Ｈ），１．６３（ｍ，３Ｈ），１．２８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）。
【００６７】
調製９
［（３Ｒ）−ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの合成
【化１８】
2019537616.tif 000020
【００６８】
ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート（５００ｍｇ、２．６７ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．３７ｍＬ、２．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１３ｍＬ）に溶かした冷（０℃）溶液に、ホスゲン（１．１４ｍＬ、トルエン中２０質量％、３．２０ｍｍｏｌ）を添加する。冷浴を除去し、混合物を室温で撹拌する。
【００６９】
３０分後、混合物を減圧下で濃縮し、残渣をＤＣＭ（１１ｍＬ）に溶解する。この溶液を、３−イソプロピル−５−メチル−Ｎ−（４−ピペリジル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（３６５ｍｇ、１００質量％、０．３６５ｇ）およびＴＥＡ（０．３ｍＬ）をＤＣＭ（１１ｍＬ）に溶かした溶液に添加する。混合物を室温で撹拌する。１０分後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加し、さらにＤＣＭで抽出する。有機層を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、残渣を得る。ヘキサン：酢酸エチルで溶出するフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル）により残渣を精製して、［（３Ｒ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（３５０ｍｇ）を黄色がかった油状物として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４８７（Ｍ＋１）。
【００７０】
［（３Ｒ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（３５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７ｍＬ）に溶かした溶液に、トリフルオロ酢酸（０．８ｍＬ、０．７２ｍｍｏｌ）を滴下する。室温で撹拌する。４５分後、混合物を減圧下で濃縮する。１０％ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、次いでＭｅＯＨ（２Ｎ  ＮＨ３）で溶出するＳＣＸ−２カートリッジにより残渣を精製する。塩基性画分を減圧下で濃縮して、［（３Ｒ）−ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（２４６ｍｇ）を褐色がかった固体として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：３８７（Ｍ＋１）。
【００７１】
調製１０
３−イソプロピル−５−メチル−４Ｈ−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−オンの合成
【化１９】
2019537616.tif 000021
【００７２】
４−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（２．２ｋｇ、１７．６ｍｏｌ）およびアセト酢酸エチル（２．８６ｋｇ、１．２５当量）を、酢酸（１７．６Ｌ、８．０ｍＬ／ｇ）に溶解する。混合物を１１０〜１１５℃に加熱し、次いで３５〜４０℃に冷却する。ヘプタンおよびＭＴＢＥ（４４Ｌ、２０ｍＬ／ｇ、５／１の比）を添加する。ろ過し、固体をヘプタン（４．４Ｌ、２ｍＬ／ｇ）で洗浄して、表題化合物（２．２８ｋｇ、収率８５．５％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１１．８１（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｓ，１Ｈ），５．５０（ｓ，１Ｈ），３．０８−３．０５（ｍ，１Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），１．２２（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，６Ｈ）。
【００７３】
調製１１
７−クロロ−３−イソプロピル−５−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンの合成
【化２０】
2019537616.tif 000022
【００７４】
３−イソプロピル−５−メチル−４Ｈ−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−オン（２．１ｋｇ、１１．０ｍｏｌ）およびＮ、Ｎ−ジメチルアニリン（０．８６ｋｇ、０．６５当量）を、ＡＣＮ（８．４Ｌ、４ｍＬ／ｇ）に溶解する。反応液を５０〜５５℃に加熱し、ＰＯＣｌ３（４．２ｋｇ、２．５当量）を滴下する。温度を６０〜６５℃に調整し、混合物を９時間撹拌する。混合物を２５〜３０℃に冷却し、２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝８．０、４２Ｌ、２０ｍＬ／ｇ）に注ぐ。ＭＴＢＥ（２３．９Ｌ、１１．４ｍＬ／ｇ）を添加し、有機相を抽出する。有機相を、２０％クエン酸溶液（４．２Ｌ、２．０ｍＬ／ｇ）２回、１０％ＮａＨＣＯ３水溶液（１０．５Ｌ、５．０ｍＬ／ｇ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（１０．５Ｌ、５．０ｍＬ／ｇ）で順次洗浄する。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（１．８ｋｇ、収率７８％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０２（ｓ，１Ｈ），６．７５（ｓ，１Ｈ），３．２７−３．２５（ｍ，１Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ），１．４２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，６Ｈ）。
【００７５】
調製１２
３−イソプロピル−５−メチル−Ｎ−（４−ピペリジル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン
【化２１】
2019537616.tif 000023
【００７６】
３−イソプロピル−５−メチル−Ｎ−（４−ピペリジル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン二塩酸塩（２．２ｋｇ、６．４ｍｏｌ）を、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１９．２Ｌ、３．０当量）に１０〜１５℃で添加する。反応混合物を１５〜２０分間撹拌し、次いで２−メチルテトラヒドロフラン（４．７０Ｌ、１０．０当量）を添加し、２０〜２５分間撹拌する。有機相を分離し、水相を２−メチルテトラヒドロフラン（６．６Ｌ、３．０ｍＬ／ｇ、３回）で洗浄する。有機溶液を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液（１１Ｌ、５．０ｍＬ／ｇ）で洗浄する。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮する。ＭＴＢＥ（６．６Ｌ、３．０ｍＬ／ｇ）を添加し、２５〜３０℃で４０分間撹拌する。ろ過により、表題化合物（１．５ｋｇ、収率８５．７％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８１（ｓ，１Ｈ），６．１０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ１Ｈ），５．７５（ｓ，１Ｈ），３．５９−３．５４（ｍ，１Ｈ），３．３２−３．２８（ｍ，１Ｈ），３．２２−３．１９（ｍ，２Ｈ），２．７７−２．７３（ｍ，２Ｈ），２．５１（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），１．５６−１．５０（ｍ，３Ｈ），１．３４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，６Ｈ）。
【００７７】
実施例１
［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの合成
【化２２】
2019537616.tif 000024
【００７８】
［＊実施例１に示される通り、キラル中心は配向を変え、Ｓエナンチオマー形態は、構造（ＩＩ）の上記実施例に示されるものとは異なって表されることに留意されたい。］（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エン酸塩酸塩（１５．０ｇ、９０．３ｍｍｏｌ、１．２当量）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３１．３ｍＬ、２３．４ｇ、１８１ｍｍｏｌ、２．４当量）、およびＨＡＴＵ（４２．９ｇ、１１３ｍｍｏｌ、１．５当量）を、ＴＨＦ（１４６ｍＬ）中の［（３Ｓ）−ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（２９．１ｇ、７５．３ｍｍｏｌ）の懸濁液に２３℃で添加し、混合物を９０分間撹拌する。リン酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ＝９、１５０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（２×３７５ｍＬ）で抽出し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮する。得られた残渣（約９５ｇ）を、クロマトグラフィー（残留物を６５ｍＬのＤＣＭに溶解；３３０ｇのＳｉＯ２；溶出液：ＭｅＯＨ中のＭＴＢＥ／７Ｎ  ＮＨ３  ０％〜１０％；ＴＬＣ：ＭｅＯＨ中のＭＴＢＥ／７Ｎ  ＮＨ３  ５：１）により精製する。物質（約４０ｇ）をＤＣＭ（４００ｍＬ）に溶解し、１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４水溶液（１Ｍ、８０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮する。残渣（約３８ｇ）を、クロマトグラフィー（ＳｉＯ２（５０ｇ）中に残留物を吸収させる；３３０ｇのＳｉＯ２；溶出液：ＭｅＯＨ中のＭＴＢＥ／７Ｎ  ＮＨ３  ０％〜１０％）により精製して、［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（２８．１ｇ、７５％）を白色固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ４９８（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．３３（ｄ，６Ｈ），１．６４（ｍ，２Ｈ），２．１０（ｍ，２Ｈ），２．１８（ｍ，１Ｈ），２．２６（ｍ，１Ｈ），２．２９（ｓ，６Ｈ），２．５０（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｍ，２Ｈ），３．１８（ｄｄ，２Ｈ），３．２９（ｄｑ，１Ｈ），３．７０（ｍ，３Ｈ），３．８７（ｍ，２Ｈ），４．１４（ｍ，２Ｈ），５．３１（ｍ，１Ｈ），６．１２（ｓ，１Ｈ），６．４７（ｍ，１Ｈ），６．８６（ｍ，１Ｈ），７．８８（ｓ，１Ｈ）。［α］Ｄ２０＝＋４９．９°（Ｃ＝２．０，ＭｅＯＨ）。鏡像体過剰率（ｅｅ）＝９７％。Ｒｔ（保持時間）＝２．７９分（ＵＶ）、ＬＣカラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＡＳ（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）、ＭｅＯＨ＋０．２％ＤＭＥＡ、流速：１．０ｍＬ／分。
【００７９】
［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの代替の合成。
【００８０】
［（３Ｓ）−ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１７０ｍｇ、０．４０９１ｍｍｏｌ）、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エン酸塩酸塩（１３５ｍｇ、０．８１５１２ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（３１７ｍｇ、０．８１８１ｍｍｏｌ）を、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）に溶かした溶液に、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３６ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ）を添加する。室温で撹拌する。５分後、混合物を減圧下で濃縮する。１０％ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、次いでＭｅＯＨ（２Ｎ  ＮＨ３）で溶出するＳＣＸ−２カートリッジにより残渣を精製する。塩基性画分を減圧下で濃縮し、残渣を、ＮＨ４ＣＯ３ｐＨ９／ＡＣＮで溶出するＩＳＣＯ（商標）逆相Ｃｌａｒｉｃｅｐ  Ｃシリーズにより精製して、［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１２９ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ）を白色固体として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４９８（Ｍ＋１）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：７．８８（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｍ，１Ｈ），６．４７（ｍ，１Ｈ），６．１２（ｓ，１Ｈ），３．９１−３．５２（ｍ，５Ｈ），３．１３（ｍ，１Ｈ），３．０３（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｍ，１Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｓ，６Ｈ），２．０６（ｍ，１Ｈ），１．８８（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６６（ｍ，２Ｈ），１．２８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）。
【００８１】
［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの代替の合成。
【００８２】
［（３Ｓ）−ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（５５０ｇ、１．４ｍｏｌ）を、１５〜３０℃でＴＨＦ（５．５Ｌ、１０．０ｍＬ／ｇ）に溶解する。（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エン酸塩酸塩（２７８ｇ、１．２当量）およびＴＥＡ（１．１７Ｌ、６．０当量）を１５〜３０℃で添加し、４０分間撹拌する。ＥｔＯＡｃ中の５０％プロピルホスホン酸無水物（１．６８Ｌ、１．２当量）を１５〜３０℃で添加し、１２時間撹拌する。ろ過し、ろ液を減圧下で酢酸イソプロピルと溶媒交換する。２Ｍ  ＮａＯＨ水溶液（２．７５Ｌ、５ｍＬ／ｇ）を添加し、２５〜３０℃で２０分間撹拌する。有機相を抽出し、飽和ＮａＣｌ水溶液（２．７５Ｌ、５ｍＬ／ｇ）で洗浄する。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮する。１５〜３０℃でヘプタン（３．８５Ｌ、７ｍＬ／ｇ）およびＴＨＦ（１６．５Ｌ、３ｍＬ／ｇ）を添加する。１時間撹拌し、ろ過して、表題化合物（４４０ｇ、収率６３．２％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．８６（ｓ，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄｄ，Ｊ＝３４．３，１４．９Ｈｚ，１Ｈ），６．０８（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｄ，Ｊ＝２４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．８５（ｓ，２Ｈ），４．２２−４．０１（ｍ，２Ｈ），３．９０−３．７６（ｍ，２Ｈ），３．６１−３．４７（ｍ，１Ｈ），３．３６−３．２１（ｍ，２Ｈ），３．１７−３．１１（ｍ，２Ｈ），３．１２−２．９８（ｍ，２Ｈ），２．４７（ｓ，３Ｈ），２．２８−２．２１（ｍ，７Ｈ），２．１６−２．００（ｍ，３Ｈ），１．６８−１．４８（ｍ，２Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，６Ｈ）。
【００８３】
実施例２
［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート塩酸塩の合成。
【化２３】
2019537616.tif 000025
【００８４】
［＊実施例２に示される通り、キラル中心は配向を変え、Ｓエナンチオマー形態は、構造（ＩＩ）の上記実施例に示されるものとは異なって表されることに留意されたい。］［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン］−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（０．２８３ｇ、０．５４９ｍｍｏｌ）をアセトン（５．５ｍＬ）に溶かした溶液に、ＨＣｌ（ＥｔＯＡｃ中１Ｍ（０．５８９ｍＬ、０．５９０ｇ、０．５８９ｍｍｏｌ、１．０７当量））を２３℃で添加し、混合物を５時間撹拌する。真空中で濃縮して、［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート塩酸塩（０．２４４ｇ、８１％）を白色固体として得る。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ４９８（Ｍ＋Ｈ）。
【００８５】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１．３４（ｄ，６Ｈ），１．６６（ｍ，２Ｈ），２．１１（ｍ，２Ｈ），２．２０（ｍ，１Ｈ），２．３０（ｍ，１Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ），２．９０（ｓ，６Ｈ），３．１２（ｍ，２Ｈ），３．２８（ｄｑ，１Ｈ），３．７４（ｍ，４Ｈ），３．９５（ｄｄ，２Ｈ），４．１６（ｍ，２Ｈ），４．６３（ｍ，１Ｈ），５．３２（ｍ，１Ｈ），６．２２（ｓ，１Ｈ），６．７８（ｍ，２Ｈ），７．９４（ｓ，１Ｈ）。
【００８６】
実施例３
［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートの合成
【化２４】
2019537616.tif 000026
【００８７】
［＊実施例３に示される通り、キラル中心は配向を変え、Ｒエナンチオマー形態は、構造（ＩＩＩ）の上記実施例に示されるものとは異なって表されることに留意されたい。］［（３Ｒ）−ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１７０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エン酸塩酸塩（１５０ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（３４３ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶かした溶液に、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を添加する。室温で撹拌する。５分後、混合物を減圧下で濃縮する。１０％ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、次いでＭｅＯＨ（２Ｎ  ＮＨ３）で溶出するＳＣＸ−２カートリッジにより残渣を精製する。塩基性画分を減圧下で濃縮し、残渣を、ＮＨ４ＣＯ３ｐＨ９／ＡＣＮで溶出するＩＳＣＯ逆相Ｃｌａｒｉｃｅｐ  Ｃシリーズにより精製して、［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（１８８ｍｇ）を白色固体として得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４９８（Ｍ＋１）。
【００８８】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００．２１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：７．８６（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｍ，１Ｈ），６．６３（ｍ，１Ｈ），６．３７（ｍ，１Ｈ），６．１３（ｓ，１Ｈ），５．１６（ｍ，１Ｈ），４．０９−３．９２（ｍ，２Ｈ），３．７８（ｍ，２Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．１３（ｍ，１Ｈ），３．０３（ｍ，２Ｈ），２．９３（ｍ，１Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．１４（ｓ，６Ｈ），２．０６（ｍ，１Ｈ）１．８８（ｍ，２Ｈ），１．６０（ｍ，２Ｈ），１．２８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）。
【００８９】
実施例４
結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物の合成
【化２５】
2019537616.tif 000027
【００９０】
［＊実施例４に示される通り、キラル中心は配向を変え、Ｓエナンチオマー形態は、構造（ＩＩ）の上記実施例に示されるものとは異なって表されることに留意されたい。］［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン］−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート２．０ｇを、室温で磁気撹拌しながらアセトン８ｍＬに入れる。別のバイアルにおいて、アセトン６ｍＬに１，２−エタンジスルホン酸水和物５０５ｍｇを溶解する。酸溶液を遊離塩基溶液に添加し、室温で混合する。混合が完全になるように試料を撹拌し、必要ならば追加の溶媒を添加してスラリーを希釈する。懸濁液を一晩５０℃でスラリー化する。一晩撹拌後、残っている濃厚な白色固体のスラリーを２０℃に冷却する。ろ紙上での真空ろ過により固体を単離し、得られた白色固体のケーキをフィルター上の適所で乾燥させる（２．１ｇ、収率８８％）。
【００９１】
３５ｋＶおよび５０ｍＡで作動する、ＣｕＫα源λ＝１．５４０６０ÅおよびＶａｎｔｅｃ検出器を備えた、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ４  ＥｎｄｅａｖｏｒＸ線粉末回折装置で、結晶性固体のＸＲＤパターンを得る。試料を、２θにおいて０．００８°のステップサイズおよび０．５秒／ステップの走査速度、ならびに０．６ｍｍ発散、５．２８固定散乱防止、および９．５ｍｍ検出器スリットで、２θにおいて４〜４０°の間で走査する。乾燥粉末を石英試料ホルダー上に充填し、ガラススライドを使用して滑らかな表面を得る。結晶形回折パターンを室温および相対湿度にて収集する。所定の結晶型について、回折ピークの相対強度が、結晶形態および晶癖などの要因からの結果として生じる好ましい配向に起因して変化し得ることが結晶学技術分野において周知である。好ましい配向の効果が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特徴的なピーク位置は変化しない。例えば、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ＃２３，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ＃１８，  ｐａｇｅｓ  １８４３−１８４４，  １９９５を参照。さらに、結晶学分野では、任意の所与の結晶形に関して、ピークの角度位置が若干変化し得ることもまた周知である。例えば、ピーク位置は、試料が分析される温度もしくは湿度の変動、試料の位置ずれ、または内部標準の有無に起因してシフトし得る。本発明の場合、２θの±０．２のピーク位置の変動は、示された結晶形の明確な同定を妨げることなくこれらの起こり得る変動として考慮される。結晶形の確認は、特徴的なピーク（°２θの単位で）、典型的にはより顕著なピークの任意の固有の組み合わせに基づいて行われ得る。室温および相対湿度にて収集した結晶形回折パターンを、８．８５３および２６．７７４°２シータにおけるＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づいて調節する。
【００９２】
結晶性ヘミエジシル酸塩水和物の調製試料は、ＣｕＫα線を使用したＸＲＤパターンによって、０．２度の回析角に対する許容度で、以下の表に記載される回折ピーク（２シータ値）を有するものとして、特に、２１．５°、１６．７°、および１５．２°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた１８．５°におけるピークを有するものとして特徴付けられる。
【表１】
2019537616.tif 000028
【００９３】
実施例５
結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩の合成
【化２６】
2019537616.tif 000029
【００９４】
［＊実施例５に示される通り、キラル中心は配向を変え、Ｓエナンチオマー形態は、構造（ＩＩ）の上記実施例に示されるものとは異なって表されることに留意されたい。］［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン］−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート１９９８ｍｇを、室温で１０００ｒｐｍで撹拌しながらアセトン１５ｍＬに入れる。（５ｍＬのアセトンに溶解した）ベンゼンスルホン酸６５０ｍｇを添加する。試料を室温で１０００ｒｐｍで１時間撹拌し、その後しばらくして、溶液が白濁し、濃厚な白色固体のスラリーが生じる。ろ紙上での真空ろ過により白色固体を単離する。試料を７０℃の真空オーブンで１時間乾燥させる（２．２３ｇ、収率８５％）。
【００９５】
結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩の合成
【００９６】
［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート（４４０ｇ、１．１ｍｏｌ）を、１５〜３０℃でＥｔＯＡｃ（１．４Ｌ）およびアセトン（３５７ｍＬ）に溶解する。５０〜５５℃に加熱する。ベンゼンスルホン酸一水和物（１５６ｇ、０．８９当量）をＥｔＯＡｃ（７０９ｍＬ）およびアセトン（１６６ｍＬ）に溶解し、５０〜５５℃で５〜１０ｍＬ／分で反応混合物に添加する。１時間撹拌する。１５〜３０℃に冷却し、１２時間撹拌する。ろ過し、湿ったケーキを窒素下で乾燥させて、表題化合物（５２５ｇ、収率７２．９％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．８９（ｓ，１Ｈ），７．８５−７．７９（ｍ，２Ｈ），７．４３−７．３９（ｍ，３Ｈ），６．８２−６．６６（ｍ，２Ｈ），６．１５（ｓ，１Ｈ），５．２７（ｄ，Ｊ＝２１．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１１（ｄ，Ｊ＝３２．９Ｈｚ，２Ｈ），３．９４−３．７９（ｍ，４Ｈ），３．３３−３．１８（ｍ，２Ｈ），３．１０−２．９７（ｍ，２Ｈ），２．８４（ｓ，６Ｈ），２．４９（ｓ，３Ｈ），２．２５−１．９４（ｍ，５Ｈ），１．６８−１．５１（ｍ，２Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）。
【００９７】
本質的に実施例４に記載されている通りに、結晶性固体のＸＲＤパターンを得る。結晶性ベシル酸塩の調製試料は、ＣｕＫα線を使用したＸＲＤパターンによって、０．２度の回析角に対する許容度で、以下の表に記載される回折ピーク（２シータ値）を有するものとして、特に、１２．４°、１７．３°、および１５．８°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた２１．５°におけるピークを有するものとして特徴付けられる。
【表２】
2019537616.tif 000030
【００９８】
実施例６
結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート塩酸塩の合成
【化２７】
2019537616.tif 000031
【００９９】
［＊実施例６に示される通り、キラル中心は配向を変え、Ｓエナンチオマー形態は、構造（ＩＩ）の上記実施例に示されるものとは異なって表されることに留意されたい。］［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン］−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレート５５７ｍｇを、室温で１０００ｒｐｍで撹拌しながらアセトン４ｍＬに入れる。１２００μＬのＨＣｌ（酢酸エチル中１Ｍ、１．０７当量）を添加する。試料を１０００ｒｐｍで一晩撹拌して、白色固体の濃厚なスラリーを得る。ろ紙上での真空ろ過により白色固体を単離する。得られた白色固体のケーキをフィルター上の適所にて空気流下で１０分間乾燥させる（３８５ｍｇ、収率６４％）。
【０１００】
本質的に実施例４に記載されている通りに、結晶性固体のＸＲＤパターンを得る。結晶性塩酸塩の調製試料は、ＣｕＫα線を使用したＸＲＤパターンによって、０．２度の回析角に対する許容度で、以下の表に記載される回折ピーク（２シータ値）を有するものとして、特に、５．５°、１５．５°、および９．７°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた１８．９°におけるピークを有するものとして特徴付けられる。
【表３】
2019537616.tif 000032
【０１０１】
生物学的アッセイ
以下のアッセイにより、本発明の化合物がＣＤＫ７活性の阻害剤であることが実証される。またアッセイの結果により、本発明の化合物が癌細胞におけるＣＤＫ７シグナル伝達を阻害することが示される。さらに、本発明の化合物は、癌細胞株における増殖および癌の異種移植腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を阻害する。
【０１０２】
「ＩＣ５０」は、その薬物について可能な最大阻害応答の５０％を生じる薬物の濃度、あるいは、受容体へのリガンド特異的結合の５０％置換を生じる薬物の濃度を指し、相対ＩＣ５０値は、蛍光ユニットを使用して、プレート上の「ＭＩＮ」および「ＭＡＸ」対照に関して阻害パーセントを計算し、次いで１０点用量反応データを４パラメーターロジスティック式に当てはめることにより決定される。
【０１０３】
ＣＤＫ７およびＣＤＫ９キナーゼ活性アッセイ
このアッセイの目的は、本発明の化合物の、ＣＤＫ７／ＣｙｃｌｉｎＨ／Ｍａｔ１複合体のキナーゼ活性を阻害する能力を測定することである。本発明に含まれる化合物がＣＤＫ７、ＣＤＫ７およびＣＤＫ９に対して何らかの親和性を示すかどうかを実証するために、生化学的アッセイは、化合物と酵素のプレインキュベーションなしで、または３時間のプレインキュベーションをして行われる。機能アッセイにより、本発明の化合物がＣＤＫ７およびＣＤＫ９キナーゼ活性を阻害する能力を示すかどうかについての裏付けが提供される。以下のアッセイで使用される全てのリガンド、溶媒、および試薬は、商業的供給源から容易に入手可能であるか、または当業者によって容易に合成され得る。ＣＤＫ７およびＣＤＫ９についてのＩＣ５０の決定は、以下のように決定される。
【０１０４】
ＣＤＫ７／ＣｙｃｌｉｎＨ／ＭＡＴ１の阻害についての生化学的アッセイ
阻害剤のＩＣ５０活性は、ＡＴＰ／［３３Ｐ］ＡＴＰおよびペプチド基質の存在下で精製ヒト組換え酵素を使用した放射標識フィルター結合（ＦＢ）アッセイを使用して決定される。選択されるＡＴＰ濃度は、ＡＴＰに対する酵素Ｋｍまたはその付近である。
【０１０５】
反応は、９６ウェルポリスチレンプレート中で、１ウェルあたり２５μＬの最終容量で行われる。２０％ＤＭＳＯ中の５μＬの試験化合物、１０μＬの基質溶液（ＡＴＰ／３３ＰＡＴＰおよびＣＤＫ７／９）および１０μＬの酵素溶液を混合する。基質溶液を、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％のＴＲＩＴＯＮＴＭＸ−１００、２ｍＭのＤＴＴおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳのキナーゼ緩衝液中に希釈された、最終濃度１００μＭのＡＴＰ／［３３Ｐ］ＡＴＰ（ＮＥＮ１０μＣｉ／μＬ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および２５０μＭのＣＤＫ７／９ペプチド（（ＹＳＰＴＳＰＳＹＳＰＴＳＰＳＹＳＴＴＳＰＳＫＫＫＫ）（配列番号１））を得るように調製する。キナーゼ緩衝液中に希釈された最終濃度１ｎＭのＣＤＫ７／ＣｙｃｌｉｎＨ／Ｍａｔ１酵素［Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ０３６６−０３６０−４Ｌｏｔ００２）］で酵素溶液を調製する。試験化合物を２０％ＤＭＳＯで１：３に段階希釈して、２０μＭの開始濃度で１０点曲線を作成する。試験化合物を含まない２０％ＤＭＳＯ緩衝液単独を高対照（任意の阻害剤の非存在下での全活性）として用い、５００ｍＭ  ＥＤＴＡを使用して酵素活性の非存在下でのバックグラウンドのレベルを決定する（低対照）。５μＬの化合物を１０μＬの酵素溶液と混合した後、プレートを２２℃で０または１８０分間インキュベートする。その後、１０μＬの基質溶液を添加して反応を開始させ、２２℃で５０分間インキュベートする。反応を、８０μＬの冷１０％オルトリン酸溶液を添加することによって終了させる。フィルタープレート（不透明、無菌のフィルタープレート）を、各ウェルに１０μＬの１０％オルトリン酸溶液で予備洗浄する。１００μＬの混合物をホスホセルロースフィルターに移し、室温で４５分間インキュベートする。フィルタープレートを、フィルタープレートプロセッサーで２００μＬの０．５％オルトリン酸で３回洗浄する。３３Ｐｉの取り込み（「ｃｐｍ」の計数）は、各ウェルに８０μＬのＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（商標）を添加し、１時間後にカウンターで読むことによって決定される。データは、ＧＥＮＥＤＡＴＡ  ＳＣＲＥＥＮＥＲ（登録商標）ツールを介して処理される。データは、４パラメーター非線形ロジスティック式（４パラメーターロジスティック濃度−応答曲線）を使用して分析され、Ｙ＝ｂｏｔ＋［（ｔｏｐ−ｂｏｔ）／１＋（ｘ／ＩＣ５０）ｓｌｏｐｅ］、式中、Ｙ＝阻害％、Ｘ＝ｙ阻害％をもたらす濃度、Ｂｏｔｔｏｍ＝曲線によって達成されるｙの最小値、Ｔｏｐ＝曲線によって達成されるｙの最大値、およびＳｌｏｐｅ＝ＩＣ５０での曲線の勾配。阻害％＝［（最大中央値−ｘ／最大中央値−最小中央値）］・１００
【０１０６】
ＩＣ５０：所与の反応（リガンド結合、酵素反応）を５０％減少させる化合物の濃度。
【０１０７】
実施例１および３に記載の化合物は、プレインキュベーションなしのＣＤＫ７において、それぞれ０．０１７３μＭおよび０．０４８７μＭのＩＣ５０を示す。実施例１および３とのＣＤＫ７酵素の３時間のプレインキュベーションの後、これらはそれぞれ０．００２３７μＭおよび０．００５０６μＭのＩＣ５０を示す。これらのデータは、実施例１および３の両方がＣＤＫ７を阻害することを示している。
【０１０８】
ＣＤＫ９／ＣｙｃｌｉｎＴ１キナーゼ活性の阻害についてのアッセイ：
阻害剤のＩＣ５０活性は、ＡＴＰおよびペプチド基質の存在下で精製ヒト組換え酵素を使用した放射標識フィルター結合（ＦＢ）アッセイを使用して決定される。選択されるＡＴＰ濃度は、ＡＴＰに対する酵素Ｋｍまたはその付近である。反応は、９６ウェルポリスチレンプレート中で、１ウェルあたり２５μＬの最終容量で行われる。２０％ＤＭＳＯ中の５μＬの試験化合物、１０μＬの基質溶液（ＡＴＰ／［３３Ｐ］ＡＴＰおよびＣＤＫ７／９）および１０μＬの酵素溶液を混合する。基質溶液を、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００２５％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、１．５８ｍＭのＤＴＴおよび１５．８０ｍＭのＨＥＰＥＳのキナーゼ緩衝液中に希釈された、最終濃度１００μＭのＡＴＰ／［３３Ｐ］ＡＴＰ（ＮＥＮ１０ｕＣｉ／μＬ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および２００μＭのＣＤＫ７／９ペプチド（（ＹＳＰＴＳＰＳＹＳＰＴＳＰＳＹＳＴＴＳＰＳＫＫＫＫ）（配列番号１））を得るように調製する。キナーゼ緩衝液中に希釈された最終濃度７．５ｎＭのＣＤＫ９／ＣｙｃｌｉｎＴ１酵素［Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ０３７１−０３４５−１（Ｌｏｔ００４）］で酵素溶液を調製する。試験化合物を２０％ＤＭＳＯで１：３に段階希釈して、２０μＭの開始濃度で１０点曲線を作成する。試験化合物を含まない２０％ＤＭＳＯ緩衝液単独を高対照（任意の阻害剤の非存在下での全活性）として用い、５００ｍＭ  ＥＤＴＡを使用して酵素活性の非存在下でのバックグラウンドのレベルを決定する（低対照）。５μＬの化合物を１０μＬの酵素溶液と混合した後、プレートを２２℃で０または１８０分間インキュベートする。その後、１０μＬの基質溶液を添加して反応を開始させ、２２℃で６０分間インキュベートする。反応を、８０μＬの冷１０％オルトリン酸溶液を添加することによって終了させる。フィルタープレート（不透明、無菌のフィルタープレート）を、１ウェルあたり１０μＬの１０％オルトリン酸溶液で予備洗浄する。１００μＬの混合物をホスホセルロースフィルターに移し、室温で４５分間インキュベートする。フィルタープレートを、フィルタープレートプロセッサーで２００μＬの０．５％オルトリン酸で３回洗浄する。８０μＬのＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（商標）を各ウェルに添加し、１時間後にシンチレーションカウンターで読み取る。データは、ＧＥＮＥＤＡＴＡ−ＳＣＲＥＥＮＥＲ（登録商標）ツールを介して処理される。データは、４パラメーター非線形ロジスティック式（４パラメーターロジスティック濃度−応答曲線）を使用して分析され、Ｙ＝ｂｏｔ＋［（ｔｏｐ−ｂｏｔ）／１＋（ｘ／ＩＣ５０）ｓｌｏｐｅ］、式中、Ｙ＝阻害％、Ｘ＝ｙ阻害％をもたらす濃度、Ｂｏｔｔｏｍ＝曲線によって達成されるｙの最小値、Ｔｏｐ＝曲線によって達成されるｙの最大値、およびＳｌｏｐｅ＝ＩＣ５０での曲線の勾配。阻害％＝［（最大中央値−ｘ／最大中央値−最小中央値）］・１００ＩＣ５０：所与の反応（リガンド結合、酵素反応）を５０％減少させる化合物の濃度。相対ＩＣ５０：化合物の最大応答の半分を与える濃度。
【０１０９】
実施例１および３に記載の化合物は、（３時間プレインキュベーションした）ＣＤＫ９に対して、それぞれ５．９３μＭおよび２．４５μＭのＩＣ５０を示す。これらのデータは、実施例１および３がＣＤＫ９活性を強力に阻害しないことを示している。
【０１１０】
まとめると、上記のアッセイからのデータは、実施例１および３の化合物がＣＤＫ９よりもＣＤＫ７を選択的に阻害することを実証している。
【０１１１】
ＣＤＫ７およびＣＤＫ９の細胞メカニズムアッセイ
これらのアッセイの目的は、化合物の、インビトロで癌細胞におけるＣＤＫ７およびＣＤＫ９のシグナル伝達を阻害する能力を測定することである。
【０１１２】
ホスホ−カルボキシル末端ドメイン（Ｒｂｐ２）（Ｓｅｒ２）ｐ−ＣＴＤ（Ｓ２）細胞ベースのＡｃｕｍｅｎアッセイ
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）を、１０％ＦＢＳ、１％ＮａＰｙｒおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＭｃＣｏｙの５Ａ培地修飾培地中で培養し、１００μＬ容量中の１ウェルあたり５，０００細胞の密度で９６ウェル平底プレート中で平板培養する（７０％コンフルエントになる前に）。次いで、細胞を、細胞培養インキュベーター（５％ＣＯ２、９５％相対湿度（ＲＨ）、および３７℃）で一晩インキュベートし、プレートに付着させる。翌朝、細胞に化合物が投与される。化合物阻害剤を、０．６％ＤＭＳＯを含有する培地中に６０μＭで最初に可溶化する。続いて、化合物連続希釈物（１：３）を、６０μＭ〜０．００３μＭの範囲にわたって調製する。細胞に、連続希釈プレートから１００μＬの培地を付着させた細胞を含有するアッセイプレートに５０μＬを添加することで投与し、最終化合物濃度が２０〜０．００１μＭの範囲で投与されて、最終ＤＭＳＯ濃度０．２％を生じる。最高点については０．２％のＤＭＳＯを含有する培地を使用し、最低点については、０．２％のＤＭＳＯを含有する増殖培地中の０．８３μＭの最終濃度に希釈した対照化合物を使用する。化合物を投与した後、細胞プレートを、３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベートする。増殖培地を注意深く除去し、１００μＬの４％パラホルムアルデヒドを室温で３０分間添加することにより細胞を固定する。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、細胞透過のために室温で１５分間１００μＬの冷ＭｅＯＨと共にインキュベートする。細胞をＰＢＳ（各１００μＬ）で２回洗浄し、１００μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温で３０分間ブロックする。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に希釈した１：１０００一次抗体（抗ホスホＣＴＤ  Ｓｅｒ２  Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ５０９５−１００）５０μＬを各ウェルに添加し、プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートする。
【０１１３】
翌日、細胞を、ＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、ＰＢＳ中の二次抗体（１：２０００希釈、ヤギ抗ウサギＩｇＭ  ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８）５０μＬ／ウェルと共に室温で１時間インキュベートする。ＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）で３回洗浄した後、５０μｇ／ｍＬのＲＮＡａｓｅ１００μＬおよびＰＢＳ中の１：１０００のヨウ化プロピジウム希釈物を各ウェルに添加する。プレートを密封し、ベンチ上で室温で１時間インキュベートする（光から保護する）。プレートをＡｃｕｍｅｎのＦＬ２（平均強度）、およびＦＬ３（全強度）で分析する。蛍光プレートを、Ａｃｕｍｅｎ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）［ＴＴＰ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＤによって製造されたレーザー走査蛍光マイクロプレートサイトメーター］を用いて走査して、セリン２における抗ホスホカルボキシル末端ドメイン（ｐＣＴＤ）を測定する。画像分析は、陽性細胞を同定するための細胞蛍光シグナルに基づく。ｐＣＴＤ（Ｓ２）陽性細胞は、閾値を超える５００〜５３０の平均強度によって同定される。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの５７５〜６４０の全強度を使用して、個々の細胞を同定する。アッセイ出力は、％ｐＣＴＤ陽性細胞である。
【０１１４】
ＩＣ５０は、ＧＥＮＥ  ＤＡＴＡ（商標）を使用して各出力について４パラメーターロジスティックにカーブフィッティングすることにより決定される。実施例１および３に記載の化合物は、ホスホＣＴＤ（Ｓ２）に対して、それぞれ＞２０μＭおよび３．５２μＭの相対ＩＣ５０を示す。これらのデータは、実施例１および３の両方が細胞中のＣＤＫ９を強力に阻害しないことを示している。
【０１１５】
ホスホ−カルボキシル末端ドメイン（Ｒｂｐ２）（Ｓｅｒ５）ｐ−ＣＴＤ（Ｓ５）細胞ベースのＡｃｕｍｅｎアッセイ
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）を、１０％ＦＢＳ、１％ＮａＰｙｒおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＭｃＣｏｙの５Ａ培地修飾培地中で培養し、１００μＬ容量中の１ウェルあたり５，０００細胞の密度で９６ウェル平底プレート中で平板培養する（７０％コンフルエントになる前に）。細胞を、細胞培養インキュベーター（５％ＣＯ２、９５％相対湿度（ＲＨ）、および３７℃）で一晩インキュベートし、プレートに付着させる。翌朝、細胞に化合物が投与される。化合物阻害剤を、０．６％ＤＭＳＯを含有する培地中に６０μＭで可溶化する。続いて、化合物連続希釈物（１：３）を、６０μＭ〜０．００３μＭの範囲にわたって調製する。細胞に、連続希釈プレートから１００μＬの培地を付着させた細胞を含有するアッセイプレートに５０μＬを添加することで投与し、最終化合物濃度が２０〜０．００１μＭの範囲で投与されて、最終ＤＭＳＯ濃度０．２％を生じる。最高点については０．２％のＤＭＳＯを含有する培地を使用し、最低点については、０．２％のＤＭＳＯを含有する増殖培地中の０．８３μＭの最終濃度に希釈した対照化合物を使用する。化合物を投与した後、細胞プレートを、３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベートする。増殖培地を注意深く除去し、１００μＬの４％パラホルムアルデヒドを室温で３０分間添加することにより細胞を固定する。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、細胞透過のために室温で１５分間１００μＬの冷ＭｅＯＨと共にインキュベートする。また細胞をＰＢＳ（各１００μＬ）で２回洗浄し、１００μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温で３０分間ブロックする。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に希釈した１：１０００一次抗体（抗ホスホＣＴＤ  Ｓｅｒ５  Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ａ３００−６５５Ａ）５０μＬを各ウェルに添加し、プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートする。
【０１１６】
翌日、細胞を、ＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、ＰＢＳ中の二次抗体（１：２０００希釈、ヤギ抗ウサギＩｇＭ  ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８）５０μＬ／ウェルと共に室温で１時間インキュベートする。ＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）で３回洗浄した後、５０μｇ／ｍＬのＲＮＡａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）１００μＬおよびＰＢＳ中の１：１０００のヨウ化プロピジウム希釈物を各ウェルに添加する。プレートを密封し、ベンチ上で室温で１時間インキュベートする（光から保護する）。プレートをＡｃｕｍｅｎのＦＬ２（平均強度）、およびＦＬ３（全強度）で分析する。蛍光プレートを、Ａｃｕｍｅｎ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）［ＴＴＰ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＤによって製造されたレーザー走査蛍光マイクロプレートサイトメーター］を用いて走査して、セリン５における抗ホスホカルボキシル末端ドメイン（ｐＣＴＤ）を測定する。画像分析は、陽性細胞を同定するための細胞蛍光シグナルに基づく。ｐＣＴＤ（Ｓ５）陽性細胞は、閾値を超える５００〜５３０の平均強度によって同定される。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの５７５〜６４０の全強度を使用して、個々の細胞を同定する。アッセイ出力は、％ｐＣＴＤ陽性細胞である。ＩＣ５０は、ＧＥＮＥ  ＤＡＴＡ（商標）を使用して各出力について４パラメーターロジスティックにカーブフィッティングすることにより決定される。
【０１１７】
実施例１および３に記載の化合物は、ｐＣＴＤ  Ｓｅｒ５に対して、それぞれ０．１４８μＭおよび０．１９８μＭの相対ＩＣ５０を示す。これらのデータは、実施例１および３の両方がＣＤＫ７細胞活性を阻害することを示している。
【０１１８】
ｃＭｙｃ細胞ベースのＡｃｕｍｅｎアッセイ
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）を、１０％ＦＢＳ、１％ＮａＰｙｒおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＭｃＣｏｙの５Ａ培地修飾培地中で培養し、１００μＬ容量中の１ウェルあたり５，０００細胞の密度で９６ウェル平底プレート中で平板培養する（７０％コンフルエントになる前に）。次いで、細胞を、細胞培養インキュベーター（５％ＣＯ２、９５％相対湿度（ＲＨ）、および３７℃）で一晩インキュベートし、プレートに付着させる。翌朝、細胞に化合物が投与される。化合物阻害剤を、０．６％ＤＭＳＯを含有する培地中に６０μＭで可溶化する。続いて、化合物連続希釈物（１：３）を、６０μＭ〜０．００３μＭの範囲にわたって調製する。細胞に、連続希釈プレートから１００μＬの培地を付着させた細胞を含有するアッセイプレートに５０μＬを添加することで投与し、最終化合物濃度が２０μＭ〜０．００１μＭの範囲で投与されて、最終ＤＭＳＯ濃度０．２％を生じる。最高点については０．２％のＤＭＳＯを含有する培地を使用し、最低点については、０．２％のＤＭＳＯを含有する増殖培地中の０．８３μＭの最終濃度に希釈した対照化合物を使用する。化合物を投与した後、細胞プレートを、３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベートする。増殖培地を注意深く除去し、１００μＬの４％パラホルムアルデヒドを室温で３０分間添加することにより細胞を固定する。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、細胞透過のために室温で１５分間１００μＬの冷ＭｅＯＨと共にインキュベートする。また細胞をＰＢＳ（各１００μＬ）で２回洗浄し、１００μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温で３０分間ブロックする。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に希釈した１：１０００一次抗体（抗ｃＭｙｃ抗体［Ｙ６９］Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ３２０７２）５０μＬを各ウェルに添加し、プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートする。翌日、細胞を、ＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、ＰＢＳ中の二次抗体（１：２０００希釈、ヤギ抗ウサギＩｇＭ  ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８）５０μＬ／ウェルと共に室温で１時間インキュベートする。ＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）で３回洗浄した後、５０μｇ／ｍＬのＲＮＡａｓｅ１００μＬおよびＰＢＳ中の１：１０００のヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）希釈物を各ウェルに添加する。プレートを密封し、ベンチ上で室温で１時間インキュベートする（光から保護する）。プレートをＡｃｕｍｅｎのＦＬ２（平均強度）、およびＦＬ３（全強度）で分析する。蛍光プレートを、Ａｃｕｍｅｎ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）［ＴＴＰ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＤによって製造されたレーザー走査蛍光マイクロプレートサイトメーター］を用いて走査して、セリン５における抗ホスホカルボキシル末端ドメイン（ｐＣＴＤ）を測定する。画像分析は、陽性細胞を同定するための細胞蛍光シグナルに基づく。ｐＣＴＤ（Ｓ５）陽性細胞は、閾値を超える５００〜５３０の平均強度によって同定される。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの５７５〜６４０の全強度を使用して、個々の細胞を同定する。アッセイ出力は、％ｐＣＴＤ陽性細胞である。ＩＣ５０は、ＧＥＮＥ  ＤＡＴＡ（商標）を使用して各出力について４パラメーター��ジスティックにカーブフィッティングすることにより決定される。
【０１１９】
実施例１および３に記載の化合物は、ｃＭｙｃに対して、それぞれ０．０８２８μＭおよび０．０５７３μＭの相対ＩＣ５０を示す。これらのデータは、実施例１および３の両方が、ＨＣＴ１１６細胞におけるｃＭｙｃの転写を阻害することを示している。
【０１２０】
選択性プロファイリング実験：Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ  ＷＴ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ
化合物のキナーゼ阻害プロファイルは、３２０の野生型プロテインキナーゼアッセイにおいて残留活性値を４つの濃度で一回測定することによって決定される。化合物を、２０μＭ、２μＭ、０．２μＭおよび０．０２μＭで一回試験する。全ての反応カクテル（高対照および低対照を含む）における最終ＤＭＳＯ濃度は１％である。
【０１２１】
プロテインキナーゼアッセイ
放射性プロテインキナーゼアッセイ（３３ＰＡＮＱＩＮＡＳＥ（登録商標）活性アッセイ、ＰｒｏＱｉｎａｓｅ）を、３２０のプロテインキナーゼのキナーゼ活性を測定するために使用する。全てのキナーゼアッセイを、５０μＬの反応容量で９６ウェルのＦＬＡＳＨＰＬＡＴＥＳＴＭで行う。反応カクテルを以下の順序で４段階でピペットで移す。
１．１０μＬの非放射性ＡＴＰ溶液（Ｈ２Ｏ中）
２．２５μＬのアッセイ緩衝液／［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰ混合物
１０％ＤＭＳＯ中の試験試料３．５μＬ
４．１０μＬの酵素／基質混合物
【０１２２】
全てのプロテインキナーゼのアッセイは、７０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＭｎＣｌ２、３μＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１．２ｍＭのＤＴＴ、ＡＴＰ（可変量、それぞれのキナーゼの見かけのＡＴＰ−Ｋｍに対応する、表１参照）、［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰ（１ウェルあたり約８×１００５ｃｐｍ）、プロテインキナーゼ（可変量；表１参照）、および基質（可変量；表１参照）を含有する。全てのＰＫＣアッセイ（ＰＫＣ−ｍｕおよびＰＫＣ−ｎｕアッセイを除く）は、１ｍＭのＣａＣｌ２、４ｍＭのＥＤＴＡ、５μｇ／ｍｌのホスファチジルセリン、および１μｇ／ｍＬの１，２−ジオレイルグリセロールをさらに含有する。ＣＡＭＫ１Ｄ、ＣＡＭＫ２Ａ、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＣＡＭＫ２Ｇ、ＣＡＭＫ４、ＣＡＭＫＫ１、ＣＡＭＫＫ２、ＤＡＰＫ２、ＥＥＦ２Ｋ、ＭＹＬＫ、ＭＹＬＫ２およびＭＹＬＫ３アッセイは、１μｇ／ｍＬのカルモジュリンおよび０．５ｍＭのＣａＣｌ２をさらに含有する。ＰＲＫＧ１およびＰＲＫＧ２アッセイは、１μＭのｃＧＭＰをさらに含有する。ＤＮＡ−ＰＫアッセイは、２．５μｇ／ｍＬのＤＮＡをさらに含有する。
【０１２３】
プロテインキナーゼ反応カクテルを、３０℃で６０分間インキュベートする。５０μＬの２％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４で反応を停止し、プレートを吸引し、２００μＬの０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで２回洗浄する。３３Ｐｉの取り込み（「ｃｐｍ」の計数）は、マイクロプレートシンチレーションカウンターで決定する。全てのプロテインキナーゼアッセイを、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ  ＢＩＯＭＥＫ（登録商標）２０００／ＳＬロボットシステムを用いて行う。ＰｒｏＱｉｎａｓｅによって提供する全てのプロテインキナーゼは、Ｓｆ９昆虫細胞または大腸菌において、組換えＧＳＴ融合タンパク質またはＨｉｓタグ付加タンパク質として、完全長または酵素的に活性な断片のいずれかとして発現する。全てのキナーゼは、ヒトｃＤＮＡから産生され、ＧＳＨアフィニティークロマトグラフィーまたは固定化金属のいずれかによって精製される。親和性タグは、精製中にいくつかのキナーゼから除去される。プロテインキナーゼの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシー染色によって調べ、同一性は質量分析によって確認する。外部の販売業者（ＣＡＲ＝Ｃａｒｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、ＩＮＶ＝Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（商標））、ＭＩＬ＝Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（商標））、表１参照）によるキナーゼは、販売業者の測定によって発現、精製および品質管理されている。アッセイのための酵素および基質の濃度を表１に示す。
【０１２４】
生データの評価
各キナーゼについて、３つのウェルのｃｐｍの中央値を「低対照」と定義する（ｎ＝３）。この値は、プロテインキナーゼの非存在下ではあるが基質の存在下での、プレートへの放射活性の非特異的結合を反映する。さらに、各キナーゼについて、他の３つのウェルのｃｐｍの中央値を「高対照」、すなわち任意の阻害剤の非存在下での全活性とみなす（ｎ＝３）。各酵素の高対照と低対照との間の差を１００％活性とみなす。データ評価の一環として、各キナーゼの低対照値を、高対照値ならびにそれらの対応する「化合物値」から差し引く。各化合物ウェルに対する残存活性（％で）は、次の式：残存活性（％）＝１００×［（化合物のシグナル−低対照）／（高対照−低対照）］を使用して計算される。非標準ＩＣ５０は、ＸＬＦｉｔアドインと共にカスタマイズされたエクセルスプレッドシートを使用して計算される。データ点数が少ないため、（４）ＸＬ−Ｆｉｔは３つのパラメーターが固定値に固定されている４パラメトリック方程式を使用して非標準ＩＣ５０を計算する。
【０１２５】
式は以下である：
Ｙ＝Ｂ＋（（Ａ−Ｂ））／[１＋（ｘ／Ｃ）]＾Ｄ
Ａ：活性の最小値、Ｂｏｔｔｏｍとしても知られる。０に固定
Ｂ：活性の最大値、Ｔｏｐとしても知られる。１００に固定
Ｃ：曲線の変曲点
Ｄ：勾配１に固定
Ｙ：従属変数（すなわち、シグナルとして測定したもの）
Ｘ：独立変数（すなわち、コントロールするもの、例えば、用量、濃度など）
【０１２６】
非標準ＩＣ５０を計算する方法は、Ｃパラメーターにランダムな値を割り当て、それを反復的に繰り返すことである。次いで、アルゴリズムは残差の二乗和の差を測定し、残差の変化が収束している連続した連続反復を探す。収束限界が満たされると、解は最適とみなし、フィッティングプロセスを終了する。
【０１２７】
ＣＤＫ１２およびＣＤＫ１３（ＰｒｏＱｉｎａｓｅ）は、本質的に上記の通りに試験されるが、半対数希釈を使用して１０の濃度（２×１０５Ｍ〜６×１０１０Ｍ）で別々に試験される。１０点について、分析は各濃度についての残存活性であり、化合物のＩＣ５０値は、ＱＵＡＴＴＲＯ（登録商標）ＷＯＲＫＦＬＯＷ（商標）Ｖ３．１．１を使用して計算される。ＩＣ５０決定のためのフィッティングモデルは、「ｔｏｐ」を１００％および「ｂｏｔｔｏｍ」を０％に固定した「シグモイド応答（可変勾配）」であった。使用したフィッティング方法は最小二乗法であった。データを以下の表１に示す。
【表４】
2019537616.tif 000033
【０１２８】
これらのデータは、実施例１の化合物が代表的なキナーゼ群からＣＤＫ７に対して非常に選択的であることを示している。
【０１２９】
細胞増殖アッセイ
表２のデータは、実施例１の化合物が特定の腫瘍細胞株の増殖および生存率を阻害することを示している。細胞株を、１ウェルあたり１００μＬの増殖培地中、１ウェルあたり細胞５０００個の密度で、白色の９６ウェル細胞培養プレートにプレーティングする。細胞株および培地の情報については表２を参照されたい。プレートを３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。翌日、試験化合物の連続希釈物を、化合物をＤＭＳＯ中に１：３で１０点で希釈することによって調製する。ＤＭＳＯプレートは最終濃度の１０００倍である。ＣＤＫ７阻害剤に加えて、ＤＭＳＯ単独カラムが最大増殖対照として含まれ、１０μＭスタウロスポリン最終カラムが最大増殖阻害対照として含まれる。次いで、１０００×ＤＭＳＯプレートからウェル当たり２μＬをＯＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，、カタログ番号３１９８５−０７０）１９８μＬに添加することによって１０倍希釈プレートを調製する。１×最終濃度のために、１ウェル当たり１００μＬの増殖培地を含有する細胞プレートに、１０×ＯＭＥＭプレートから１ウェル当たり１１μＬを添加することによって、指示された化合物で細胞を処理する。プレートを３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーターに戻す。化合物添加の７日後、プレートをインキュベーターから取り出し、ＲＴに平衡化させる。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）試薬を室温で解凍し、次いで１バイアルのアッセイ緩衝液を１バイアルの基質と混合することにより調製し、穏やかに回転させて混合する。次いで、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）試薬を細胞プレートに１００μＬ／ウェルで添加し、Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｓｈａｋｅｒ上にスピード設定２で室温で１５分間置く。振盪機上で１５分間インキュベートした後、Ｗａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ２（商標）を使用して、１ウェルあたり１秒間発光を読み取る。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いて、非線形回帰およびシグモイド用量反応曲線を使用して半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を計算する。
【表５】
2019537616.tif 000034
【０１３０】
これらのデータは、実施例Ｉの化合物が結腸、乳房、肺、卵巣および胃を含む種々の組織からの癌細胞株のインビトロ増殖を用量依存的に阻害することを示している。
【０１３１】
異種移植腫瘍モデル
このアッセイの目的は、実施例１の化合物に応答する腫瘍体積の減少を測定することである。試験化合物のインビボでの有効性を評価するために、複数の異種移植腫瘍モデルが利用される。手短に言えば、１：１ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）混合物（総体積０．２ｍＬ）中の５〜１０×１０６個の腫瘍細胞を、異種移植片腫瘍モデルの大部分について雌性無胸腺ヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｈａｒｌａｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に皮下注射する。代替のマウス系統を利用して、ＭＤＡＭＢ４６８（ＮＯＤ  ＳＣＩＤ  Ｇａｍｍａ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ）、ＣＴ２６およびＥＭＴ６（ＢＡＬＢ／ｃ、Ｅｎｖｉｇｏ、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）異種移植片を樹立する。腫瘍を〜３００〜５００ｍｍ３の所望の大きさに到達させた後、動物は、有効性試験のための６〜８のグループに無作為に分けられる。試験化合物は、指示された用量および計画で強制経口投与（ＰＯ）により投与される。腫瘍増殖および体重を経時的にモニターして、有効性および毒性の徴候を評価する。
【０１３２】
試験化合物は、精製水（ＨＥＣ）中の１％ヒドロキシエチルセルロース、０．２５％ポリソルベート８０、０．０５％消泡剤中の５％Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中に製剤化され、表４に示す用量で経口胃管栄養法（最終容量０．２ｍＬ）で投与される。試験化合物は、毎週製剤化され、４℃で保存される。ビヒクルは、１用量当たり０．２ｍＬの容量を使用して上記で用いたスケジュールに従って対照群に投与される。マウスに経口胃管栄養法により投与し、腫瘍試料を終了時に収集し、−８０℃で保存する。
【０１３３】
腫瘍サイズおよび体重を記録し、隔週で分析する。投与の２時間後および終了時に、ＤＢＳ（ｄｒｉｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｓｐｏｔ）カードを使用して採血する。試験終了時に腫瘍を収集し、３つの切片に切断し、曝露およびタンパク質分析のために急速冷凍するか、またはＲＮＡ分析のためにＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）に入れる。組織試料を凍結し、−８０℃で保存する。
【０１３４】
実施例１の化合物は、ヒト癌異種移植モデルにおいて有意な抗腫瘍活性を示す（表３）。
【表６】
2019537616.tif 000035
【０１３５】
デルタＴ／Ｃ％は、処置群におけるエンドポイント腫瘍体積がベースライン腫瘍体積にあるか、または超える場合に算出する。式は１００＊（Ｔ−Ｔ０）／（Ｃ−Ｃ０）である。ここで、ＴおよびＣは、それぞれ処置群または対照群における平均エンドポイント腫瘍体積である。Ｔ０およびＣ０は、これらの群における平均ベースライン腫瘍体積である。＊：有意（ｐ＜０．０５）
【０１３６】
バイオマーカー試験
この試験の目的は、本発明の化合物についての潜在的な予測バイオマーカーを評価することである。
【０１３７】
癌細胞株は、試験化合物の抗増殖活性を評価するためにインビトロでプロファイルされる。癌細胞株におけるＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄおよび／またはＲＢ１遺伝子の変異、コピー数および遺伝子発現情報は、ＣＯＳＭＩＣデータベース（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）およびｃＢｉｏｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／）から得られる。細胞を増殖培地中で培養し、１００μＬ／ウェル増殖培地中の５０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに蒔き、次いで３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。当該技術分野で周知の供給業者推奨培地および条件、例えば、ＨＥＰＥＳ＆Ｌ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＨ３０２５５．０１）および１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）を含むまたは含まないＲＰＭＩ１６４０を用いて細胞を培養する。１０００倍の中間希釈プレートは、ＤＭＳＯ中の試験試料の１０ｍＭ作業溶液を作製し、ＤＭＳＯ中で１：３の希釈を１０点で行うことによって調製される。１０倍投与プレートは、１０００倍の中間希釈プレートからの２μＬを１９８μＬのＯＰＴＩＭＥＭ（登録商標）＋１０％ＦＢＳに添加し、よく混合することによって調製される。次いで、細胞プレートを、１０倍投与プレートからの１１μＬを１００μＬ／ウェル細胞プレートに最終濃度１倍で添加することにより処理する。スタウロスポリンは、最終濃度５μＭで最大増殖阻害対照として使用される。細胞プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベートする。処理の７日後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ＃Ｇ７５７１）アッセイ緩衝液および基質を−２０℃から取り出し、ＲＴに平衡化させる。アッセイ緩衝液を基質に添加し、穏やかに回転させて混合する。ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）試薬（１００μＬ／ウェル）を細胞プレートに添加し、室温で１５分間インキュベートする。１５分後、プレートリーダーを使用して発光を読み取る。データはＥｘｃｅｌで分析され、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍでグラフ化される。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用したＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリックｔ検定を使用して、統計分析およびｐ値を計算する。
【０１３８】
増殖データの概要を表４に示す。試験化合物の抗増殖効果は、鈍感（ＩＣ５０≧１μＭ）、細胞増殖抑制（ＩＣ５０＜１μＭおよび％阻害＜７０％）または細胞毒性（ＩＣ５０＜１μＭおよび％阻害≧７０％）として分類される。ＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤまたはＲＢ１遺伝子のいずれかにおいて不活性化または機能喪失（ＬＯＦ）変異を有する細胞株は、パネル中の残りの細胞株と比較して実施例１に対して有意に大きい細胞毒性応答を示した（表５）。対照的に、非ＬＯＦ細胞株は、実施例１に応答してより高い（％）細胞増殖抑制応答を示した。
【０１３９】
さらに、これらの変異を有するいくつかの異種移植腫瘍モデルを利用して、単剤療法としての実施例１の有効性を評価した（表３）。
【０１４０】
有効性試験および抗腫瘍活性（ΔＴ／Ｃ）の概要を表３に示す。実施例１は、ＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２ＣまたはＲＢ１遺伝子における変異を含む腫瘍モデルにおいて顕著な退行が認められ、様々な腫瘍モデルにおいて強力な有効性を実証した。まとめると、これらの知見は、ＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤまたはＲＢ１遺伝子における不活性化変異が、複数の癌タイプにわたる実施例１による治療のための潜在的な患者選択戦略を提示することを示す。
【０１４１】
表４：示した通り様々な癌細胞株において実施例１の抗増殖性ｌｏｇ−ＧＩ５０（ｎＭ）および増殖阻害（％）のまとめ細胞株を７日間処理し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイを使用して分析する。
【表７−１】
2019537616.tif 000036
【表７−２】
2019537616.tif 000037
【表７−３】
2019537616.tif 000038
【０１４２】
培地情報
Ａ．ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ１１８３５、Ｇｉｂｃｏ２２４００−０８９、またはＨｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ＃ＳＨ３００２７）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｂ．Ｌ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  ｃａｔ＃ＳＨ３００２２）＋ＮａＰｙｒ＋ＮＥＡＡ＋ＨＥＰＥＳ＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）を含むＤＭＥＭ
Ｃ．ＨＥＰＥＳおよびＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ２２４００＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）を含むＲＰＭＩ１６４０。
Ｄ．Ｆ−１２Ｋ培地（ｃａｔ＃３０−２００４）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｅ．ＥＭＥＭ（ＣｅｌｌＧｒｏ  ｃａｔ＃１７−３０５−ＣＶ）＋Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ＋Ｎａ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ＋Ｎａ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｆ．ＥＭＥＭ（ＣｅｌｌＧｒｏ  ｃａｔ＃１７−３０５−ＣＶ）＋Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ＋Ｎａ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ＋Ｎａ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ＋ＮＥＡＡ＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｇ．ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ１１９９５）＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｈ．ＤＭＥＭ高グルコース（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ＃ＳＨ３００２２）＋１０％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）＋１Ｘ  ＮＥＡＡ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＨ３０３２８）
Ｉ．ＡＴＣＣ変性ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ  Ａ１０４９１０１）＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｊ．ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｋ．ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ１１９６５）＋１０％ＦＢＳ
Ｌ．アール塩入りＭＥＭイーグル（Ｇｉｂｃｏ１１０９５−０８０）＋１％ＮＥＡＡ＋１％ＮａＰｙｒ＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｍ．Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ＋１０％熱不活性化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０
Ｎ．Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｃａｔ＃ＳＨ３００２２）＋ピルビン酸ナトリウム＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｏ．ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ１１０９５）＋ピルビン酸ナトリウム＋ＮＥＡＡ＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｐ．ＨＥＰＥＳおよびＬ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＨ３０２５５．０１またはＧｉｂｃｏ１１８３５）を含むＲＰＭＩ１６４０＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｑ．ＤＭＥＭ：Ｆ１２ｗ／２．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．５ｍＭ  ＮａＰｙｒｕｖ＋１０％ＦＢＳ
Ｒ．４９％ＲＰＭＩ１６４０＋４９％ハムのＦ１２＋２％ｈ．ｉ．ＦＢＳ
Ｓ．４５％ＲＰＭＩ１６４０＋４５％ハムのＦ１２＋１０％ｈ．ｉ．ＦＢＳ
Ｔ．ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ１１９６５）＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｕ．ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ１５（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１１４１５−０６４）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）、ＣＯ２なし
Ｖ．高Ｇｌｕ＆Ｌ−ｇｌｎ＋１０％熱不活性化ＦＢＳ＋ＮａＰｙｒ＋ＮＥＡＡ＋ＨＥＰＥＳを用いたＤＭＥＭ
Ｗ．ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）＋ＩＴＳ＋１０ｎＭヒドロコルチゾン＋１０ｎＭβ−エストラジオール＋４．５ｍＭ  Ｌ−グルタ＋５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
Ｘ．Ｌ−グルタミンとＨＥＰＥＳ＋１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０
Ｙ．ＨＥＰＥＳおよびＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ２２４００）＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋ＮＥＡＡ＋２０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）を含むＲＰＭＩ１６４０
Ｚ．ＤＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＮａＰ）＋２０ＩＵ／ｌウシインスリン＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
ＡＡ．ＷｉｌｌｉａｍのＥメディア（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１２５５１）＋１０％ＦＢＳ
ＢＢ．ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ＮａＰｙｒ＋ＮＥＡＡ＋ＨＥＰＥＳ＋１．５ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３
ＣＣ．ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ（Ｇｉｂｃｏ１６６００）＋１５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
ＤＤ．１：１ＭＥＭ（１１０９５）：Ｆ１２（ＣｅｌｌＧｒｏ１０−０８０−ＣＶ）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
ＥＥ．グルタミンおよびＨＥＰＥＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ＃ＳＨ３０２５５）を含むＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１６０００）＋１Ｘ  ＮａＰｙｒ
ＦＦ．Ｉｓｃｏｖｅの改良型ダルベッコ培地、Ｌ−グルタミン、２５ｍＭＨＥＰＥＳ［ＧＩＢＣＯ１２４４０−０５３］＋２０％ＦＢＳ
ＧＧ．ＨＥＰＥＳおよびＬ−グルタミン（フェノールレッドフリー）＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）を含むＲＰＭＩ１６４０
ＨＨ．１：１ハムＦ１２：ＤＭＥＭ＋Ｌ−グルタミン＋５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
ＩＩ．ＲＰＭＩ−１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ＃ＳＨ３００２７）＋１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ＃１００８２）
ＪＪ．１：１の最終濃度１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含有するＭＣＤＢ１０５培地と２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム＋１５％ＦＢＳを含有する培地１９９との混合物
【表８】
2019537616.tif 000039
【配列表】
2019537616000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月21日(2019.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
2019537616.tif 000046
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
式（ＩＩ）の請求項１に記載の化合物
【化２】
2019537616.tif 000047
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
式（ＩＩ）の請求項２に記載の化合物
【化３】
2019537616.tif 000048
【請求項４】
式（ＩＩＩ）の請求項１に記載の化合物
【化４】
2019537616.tif 000049
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
式（ＩＩＩ）の請求項４に記載の化合物
【化５】
2019537616.tif 000050
【請求項６】
［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項７】
［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項８】
［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項４に記載の化合物または塩。
【請求項９】
［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項４に記載の化合物または塩。
【請求項１０】
結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項２または請求項６に記載の化合物または塩。
【請求項１１】
ＣｕＫα線を使用して、２θ±０．２°において、１２．４°、１７．３°、および１５．８°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた２１．５°で生じる特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項１０に記載の化合物または塩。
【請求項１２】
結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項２または請求項７に記載の化合物または塩。
【請求項１３】
ＣｕＫα線を使用して、２θ±０．２°において、２１．５°、１６．７°、および１５．２°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた１８．５°で生じる特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項１２に記載の化合物または塩。
【請求項１４】
結晶性［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項４または請求項８に記載の化合物または塩。
【請求項１５】
結晶性［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項４または請求項９に記載の化合物または塩。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
１つ以上の他の治療薬を含む、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療するための薬学的組成物。
【請求項１９】
前記癌が、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌である、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記癌が、乳癌である、請求項１８または請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
患者からの生物学的試料がＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤまたはＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの機能喪失変異を含有するという条件で、前記患者に投与される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記化合物または塩が、［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記化合物または塩が、［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記塩が、ベシル酸塩である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記塩が、ヘミエジシル酸塩水和物である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記生物学的試料が、腫瘍試料であり、前記試料が、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記試料が、前記化合物または塩を前記患者に最初に投与する前に、前記患者から得られる、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記遺伝子が、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記遺伝子が、ＫＭＴ２Ｃ遺伝子である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記遺伝子が、ＫＭＴ２Ｄ遺伝子である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記遺伝子が、ＲＢ１遺伝子である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
ＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤおよびＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者に投与される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
前記不活性化変異の存在が、生物学的試料を使用して、インビトロアッセイによって決定され、前記生物学的試料が、腫瘍試料であり、前記試料が、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
前記試料が、前記化合物またはその塩を前記患者に最初に投与する前に、前記患者から得られる、請求項３２または３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
ＫＭＴ２Ｃ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
ＫＭＴ２Ｄ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
ＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
前記化合物またはその塩が、約１ｍｇ〜２ｇの用量で前記患者に投与される、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
【表８】
2019537616.tif 000051
本発明は次の態様を含む。
（１）式（Ｉ）の化合物
【化２８】
2019537616.tif 000052
またはその薬学的に許容される塩。
（２）式（ＩＩ）の請求項１に記載の化合物
【化２９】
2019537616.tif 000053
またはその薬学的に許容される塩。
（３）式（ＩＩ）の上記（２）に記載の化合物
【化３０】
2019537616.tif 000054
（４）式（ＩＩＩ）の上記（１）に記載の化合物
【化３１】
2019537616.tif 000055
またはその薬学的に許容される塩。
（５）式（ＩＩＩ）の上記（４）に記載の化合物
【化３２】
2019537616.tif 000056
（６）［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、上記（２）に記載の化合物または塩。
（７）［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、上記（２）に記載の化合物または塩。
（８）［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、上記（４）に記載の化合物または塩。
（９）［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、上記（４）に記載の化合物または塩。
（１０）結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、上記（２）または上記（６）に記載の化合物または塩。
（１１）ＣｕＫα線を使用して、２θ±０．２°において、１２．４°、１７．３°、および１５．８°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた２１．５°で生じる特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、上記（１０）に記載の化合物または塩。
（１２）結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、上記（２）または上記（７）に記載の化合物または塩。
（１３）ＣｕＫα線を使用して、２θ±０．２°において、２１．５°、１６．７°、および１５．２°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた１８．５°で生じる特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、上記（１２）に記載の化合物または塩。
（１４）結晶性［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、上記（４）または（８）に記載の化合物または塩。
（１５）結晶性［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、上記（４）または（９）に記載の化合物または塩。
（１６）上記（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む、薬学的組成物。
（１７）１つ以上の他の治療薬を含む、上記（１６）に記載の薬学的組成物。
（１８）尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、または神経膠腫を治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の上記（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
（１９）前記癌が、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌である、上記（１８）に記載の方法。
（２０）前記癌が、乳癌である、上記（１８）または（１９）に記載の方法。
（２１）患者における、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療する方法であって、前記患者からの生物学的試料においてＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤまたはＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの機能喪失変異の存在を試験することと、前記試料が前記機能喪失変異について陽性であると試験された場合に、前記患者に治療有効量の上記（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することと、を含む、方法。
（２２）患者における、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療する方法であって、前記患者からの生物学的試料がＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤまたはＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの機能喪失変異を含有するという条件で、前記患者に治療有効量の上記（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
（２３）患者における、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療する方法であって、前記患者からの生物学的試料がＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤまたはＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの機能喪失変異について陽性であると試験された場合に、前記患者が治療のために選択されるという条件で、前記患者に治療有効量の上記（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
（２４）前記化合物または塩が、［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩である、上記（１８）〜（２３）のいずれか一項に記載の方法。
（２５）前記化合物または塩が、［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩である、上記（１８）〜（２３）のいずれか一項に記載の方法。
（２６）前記塩が、ベシル酸塩である、上記（１８）〜（２５）のいずれか一項に記載の方法。
（２７）前記塩が、ヘミエジシル酸塩水和物である、上記（１８）〜（２５）のいずれか一項に記載の方法。
（２８）前記生物学的試料が、腫瘍試料であり、前記試料が、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる、上記（２１）〜（２７）のいずれか一項に記載の方法。
（２９）前記試料が、前記化合物または塩を前記患者に最初に投与する前に、前記患者から得られる、上記（２１）〜（２８）のいずれか一項に記載の方法。
（３０）前記遺伝子が、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子である、上記（２１）〜（２９）のいずれか一項に記載の方法。
（３１）前記遺伝子が、ＫＭＴ２Ｃ遺伝子である、上記（２１）〜（２９）のいずれか一項に記載の方法。
（３２）前記遺伝子が、ＫＭＴ２Ｄ遺伝子である、上記（２１）〜（２９）のいずれか一項に記載の方法。
（３３）前記遺伝子が、ＲＢ１遺伝子である、上記（２１）〜（２９）のいずれか一項に記載の方法。
（３４）治療に使用するための、上記（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
（３５）尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫の治療に使用するための、上記（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
（３６）前記癌が、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌である、上記（３５）に記載の使用のための化合物または塩。
（３７）前記癌が、乳癌である、上記（３５）または（３６）に記載の使用のための化合物または塩。
（３８）前記患者からの生物学的試料を使用してインビトロアッセイを行うことと、ＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤおよびＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異の存在を決定することと、遺伝子のいずれかにおける少なくとも１つの不活性化変異が存在する場合に、前記患者に治療有効量の前記化合物またはその塩を投与することと、もまた含む、上記（３４）〜（３７）のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその塩。
（３９）前記生物学的試料が、腫瘍試料であり、前記試料が、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる、上記（３８）に記載の使用のための化合物またはその塩。
（４０）前記試料が、前記化合物またはその塩を前記患者に最初に投与する前に、前記患者から得られる、上記（３８）または（３９）に記載の使用のための化合物またはその塩。
（４１）ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、上記（３４）〜（４０）のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその塩。
（４２）ＫＭＴ２Ｃ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、上記（３４）〜（４０）のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその塩。
（４３）ＫＭＴ２Ｄ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、上記（３４）〜（４０）のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその塩。
（４４）ＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、上記（３４）〜（４０）のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその塩。
（４５）前記化合物またはその塩が、約１ｍｇ〜２ｇの用量で前記患者に投与される、上記（３４）〜（４４）のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその塩。
（４６）尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療するための薬剤の製造における、上記（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
（４７）前記癌が、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌からなる群から選択される、上記（４６）に記載の使用。
（４８）前記患者からの生物学的試料を使用してインビトロアッセイを行うことと、ＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤおよびＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異の存在を決定することと、前記遺伝子のいずれかにおける少なくとも１つの不活性化変異が存在する場合に、前記患者に治療有効量の前記化合物またはその塩を投与することと、もまた含む、上記（４６）または（４７）に記載の使用。
（４９）前記生物学的試料が、腫瘍試料であり、前記試料が、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる、上記（４８）に記載の使用。
（５０）前記試料が、前記化合物またはその塩を前記患者に最初に投与する前に、前記患者から得られる、上記（４６）〜（４９）のいずれか一項に記載の使用。
（５１）ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が選択される、上記（４６）〜（５０）のいずれか一項に記載の使用。
（５２）ＫＭＴ２Ｃ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が選択される、上記（４６）〜（５０）のいずれか一項に記載の使用。
（５３）ＫＭＴ２Ｄ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が選択される、上記（４６）〜（５０）のいずれか一項に記載の使用。
（５４）ＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が選択される、上記（４６）〜（５０）のいずれか一項に記載の使用。
（５５）前記化合物またはその塩が、約１ｍｇ〜２ｇの用量で前記患者に投与される、上記（４６）〜（５０）のいずれか一項に記載の使用。
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月28日(2019.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
2019537616.tif 000057
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
式（ＩＩ）の請求項１に記載の化合物
【化２】
2019537616.tif 000058
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
式（ＩＩ）の請求項２に記載の化合物
【化３】
2019537616.tif 000059
【請求項４】
式（ＩＩＩ）の請求項１に記載の化合物
【化４】
2019537616.tif 000060
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
式（ＩＩＩ）の請求項４に記載の化合物
【化５】
2019537616.tif 000061
【請求項６】
［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項７】
［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項８】
［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項４に記載の化合物または塩。
【請求項９】
［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項４に記載の化合物または塩。
【請求項１０】
結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項２または請求項６に記載の化合物または塩。
【請求項１１】
ＣｕＫα線を使用して、２θ±０．２°において、１２．４°、１７．３°、および１５．８°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた２１．５°で生じる特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートベシル酸塩である、請求項１０に記載の化合物または塩。
【請求項１２】
結晶性［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項２または請求項７に記載の化合物または塩。
【請求項１３】
ＣｕＫα線を使用して、２θ±０．２°において、２１．５°、１６．７°、および１５．２°からなる群から選択される１つ以上のピークと組み合わせた１８．５°で生じる特徴的なピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴付けられる、［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートヘミエジシル酸塩水和物である、請求項１２に記載の化合物または塩。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
１つ以上の他の治療薬を含む、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療するための薬学的組成物。
【請求項１７】
前記癌が、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌である、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記癌が、乳癌である、請求項１６または１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
患者からの生物学的試料がＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤまたはＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの機能喪失変異を含有するという条件で、前記患者に投与される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記化合物または塩が、［（３Ｓ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記化合物または塩が、［（３Ｒ）−１−［（Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）ブト−２−エノイル］ピロリジン−３−イル］４−［（３−イソプロピル−５−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）アミノ］ピペリジン−１−カルボキシレートまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記塩が、ベシル酸塩である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記塩が、ヘミエジシル酸塩水和物である、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記生物学的試料が、腫瘍試料であり、前記試料が、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記試料が、前記化合物または塩を前記患者に最初に投与する前に、前記患者から得られる、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記遺伝子が、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記遺伝子が、ＫＭＴ２Ｃ遺伝子である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記遺伝子が、ＫＭＴ２Ｄ遺伝子である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記遺伝子が、ＲＢ１遺伝子である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
ＡＲＩＤ１Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２ＤおよびＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者に投与される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記不活性化変異の存在が、生物学的試料を使用して、インビトロアッセイによって決定され、前記生物学的試料が、腫瘍試料であり、前記試料が、ゲノム／ＤＮＡ配列決定によってアッセイされる、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記試料が、前記化合物またはその塩を前記患者に最初に投与する前に、前記患者から得られる、請求項３０または３１に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
ＫＭＴ２Ｃ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
ＫＭＴ２Ｄ遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
ＲＢ１遺伝子における少なくとも１つの不活性化変異を有する患者が治療のために選択される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
前記化合物またはその塩が、約１ｍｇ〜２ｇの用量で前記患者に投与される、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
尿路上皮癌、子宮癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、肝胆癌、膵臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、血液癌、肉腫、皮膚癌、または神経膠腫を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【国際調査報告】
2019537616.tif 000062
2019537616.tif 000063
2019537616.tif 000064
2019537616.tif 000065