(57)【要約】  本出願は、哺乳動物に栄養素（例えば、過アセチル化Ｎ−アジドガラクトサミンＡｃ４ＧａｌＮＡｚ）を投与するか、又はそのような栄養素を含有するバイオリアクター内で臓器若しくは組織を培養することにより、哺乳動物の臓器又は組織を官能基化する方法を提供する。本出願は、哺乳動物に栄養素（例えば、過アセチル化Ｎ−アジドガラクトサミンＡｃ４ＧａｌＮＡｚ）を投与することにより、哺乳動物の臓器又は組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を選択的に官能基化する方法も提供する。いくつかの態様では、本出願は、細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドであって、脱細胞化スカフォールドの細胞外マトリックスは、生体直交型化学反応で反応性の化学基、例えばアジド化学基で官能基化される、脱細胞化スカフォールドを提供する。本出願は、本出願の方法に従って調製された生物学的補綴メッシュ並びに移植のための哺乳動物臓器及び組織も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化する方法であって、
（ｉ）前記臓器又は組織の前記細胞外マトリックスを官能基化するために前記哺乳動物を選択するステップと、
（ｉｉ）前記哺乳動物に栄養素を投与するステップであって、前記栄養素は、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化される、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
哺乳動物の臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化する方法であって、
（ｉ）前記臓器又は組織を採取するステップと、
（ｉｉ）生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素を含む培地を用いて前記臓器又は組織を培養するステップと
を含む方法。
【請求項３】
移植のための臓器又は組織を調製する方法であって、
（ｉ）生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素をドナー対象に投与するステップと、
（ｉｉ）前記ドナー対象から手術により前記臓器又は組織を取り出すステップと、
（ｉｉｉ）前記摘出された臓器又は組織を、前記官能基化された栄養素の反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子を含む保存液で処理するステップと
を含む方法。
【請求項４】
前記臓器又は組織は、ウシ、ブタ、マウス又はヒト臓器又は組織である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記臓器又は組織は、頸動脈、肺、心臓、肝臓、腎臓及び皮膚からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体直交型化学反応で反応性の前記化学基は、アジド（−Ｎ３）、アルキン、ニトロン、イソシアニド、シクロプロペン及びテトラジンからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
生体直交型化学反応で反応性の前記化学基は、アジド（−Ｎ３）及びアルキンから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生体直交型化学反応で反応性の前記化学基は、アジド（−Ｎ３）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記栄養素は、糖、アミノ酸、脂肪酸及びトリグリセリドからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記栄養素は、単糖である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された前記栄養素は、アジド標識ガラクトサミン、アジド標識グルコサミン及びアジド標識マンノサミンからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された前記栄養素は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ及びＡｃ４ＧｌｃＮＡｚから選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された前記栄養素は、テトラアシル化Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記栄養素は、腹腔内注射、皮下注射又は気管内経路によって投与される、請求項１又は３〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記栄養素は、腹腔内注射によって投与される、請求項１又は３〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
官能基化された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドであって、前記細胞外マトリックスは、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法によって官能基化される、脱細胞化スカフォールド。
【請求項１７】
細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドであって、前記脱細胞化スカフォールドの前記細胞外マトリックスは、少なくとも１つの生物活性分子で化学選択的に官能基化される、脱細胞化スカフォールド。
【請求項１８】
請求項１７に記載の脱細胞化スカフォールドを調製する方法であって、請求項１６に記載の脱細胞化スカフォールドを、前記官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子と反応させるステップを含む方法。
【請求項１９】
生物学的補綴メッシュを調製する方法であって、請求項１６に記載の脱細胞化スカフォールドを、前記官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子と反応させるステップを含む方法。
【請求項２０】
前記反応させるステップは、前記脱細胞化スカフォールドへの前記生物活性分子の注入を含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記相補的な反応性化学基は、アジド（−Ｎ３）、アルキン、ニトロン、イソシアニド、シクロプロペン又はテトラジンである、請求項３又は１８若しくは１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アルキンは、脂肪族アルキン又はシクロオクチンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記シクロオクチンは、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、ジフルオロベンゾシクロオクチン（ＤＩＦＢＯ）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、二フッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）、一フッ素化シクロオクチン（ＭＯＦＯ）、ジメトキシアザシクロオクチン（ＤＩＭＡＣ）又はアリールレスオクチン（ＡＬＯ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アルキンは、脂肪族アルキンであり、及び前記反応させるステップは、銅（Ｉ）触媒の存在下で実施される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記アルキンは、シクロオクチンであり、及び前記反応させるステップは、銅フリー条件下で実施される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記生物活性分子は、成長因子、ペプチド、抗体、抗凝血剤又は抗生物質である、請求項３又は１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗凝血剤は、クマリン、ヘパリン、第Ｘａ因子の五糖類阻害剤、直接第Ｘａ因子阻害剤又は直接トロンビン阻害剤である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗凝血剤は、ヘパリンである、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗生物質は、キノロン、β−ラクタム、セファロスポリン、ペニシリン、カルバペネム、リポペプチド、アミノグリコシド、グリコペプチド、マクロライド、アンサマイシン又はスルホンアミドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗生物質は、バンコマイシンである、請求項２６又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）に対して特異的な抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記官能基化された細胞外マトリックスの前記反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された前記生物活性分子は、ヘパリン−アルキン、ヘパリン−アルキン−ビオチン（ヘパリンＡＢ）、バンコマイシン−アルキン、ヘパリン−ＤＢＣＯ、バンコマイシン−ＤＢＣＯ、抗ＴＮＦ−α−アルキン及び抗ＴＮＦ−α−ＤＢＣＯから選択される、請求項３又は１８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記官能基化された細胞外マトリックスの前記反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された前記生物活性分子は、ヘパリン−アルキン、バンコマイシン−アルキン、ヘパリン−ＤＢＣＯ、バンコマイシン−ＤＢＣＯ、抗ＴＮＦ−α−アルキン及び抗ＴＮＦ−α−ＤＢＣＯから選択される、請求項３又は１８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
移植のための哺乳動物臓器又は組織を調製する方法であって、請求項１７又は２６〜３３のいずれか一項に記載の哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドにレシピエント由来の細胞を播種して、移植のための前記臓器又は組織を取得するステップを含む方法。
【請求項３５】
前記レシピエント由来の細胞は、上皮細胞、内皮細胞、間質細胞、筋肉細胞及びニューロンから選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３４又は３５に記載の方法によって調製される、移植のための哺乳動物臓器又は組織。
【請求項３７】
請求項３〜１６又は２１〜３３のいずれか一項に記載の方法によって調製される、移植のための哺乳動物臓器又は組織。
【請求項３８】
少なくとも１つの生物活性分子で生体直交的に官能基化された生物学的補綴メッシュであって、請求項２０〜３３のいずれか一項に記載の方法によって調製される生物学的補綴メッシュ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１６年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３５０，２５９号明細書の利益を主張する。上記出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、哺乳動物臓器及び組織の代謝標識及びさらに官能基化に関する。
【背景技術】
【０００３】
補綴メッシュは、様々な臨床的問題に対する一般的な解決策であり、最も高い頻度でヘルニア修復がある。合成補綴メッシュは、強力であり且つ低い再発率を示すが、感染を含むメッシュ関連の合併症の増加が明らかにされている（Ｄａｒｅｈｚｅｒｅｓｈｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．３８，４０−５０（２０１４））。合成メッシュは、活動性感染の環境で禁忌とされ、感染のリスクが高い患者又は汚染のリスクが高い手術にでも比較的禁忌とされる。
【０００４】
多様な組織供給源及び加工技術を用いて生物学的補綴物が開発されている。これらのメッシュのほとんどは、滅菌され、多くの場合、固定された脱細胞化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）から構成される。最も一般的に使用されるメッシュは、ブタ小腸（Ｓｕｒｇｉｓｉｓ（登録商標））、ブタ真皮（Ｓｔｒａｔｔｉｃｅ（登録商標）、Ｐｅｒｍａｃｏｌ（商標））又は死体のヒト真皮（Ａｌｌｏｄｅｒｍ（登録商標）、Ａｌｌｏｍａｘ（商標））から得られる。これらの生物学的補綴物は、感染に対する耐性が高いが、これらの材料の故障率及び細菌感染が存続している（Ｄａｒｅｈｚｅｒｅｓｈｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．３８，４０−５０（２０１４）；Ｂｅｌｌｏｗｓ，Ｃ．Ｆ．，Ｗｈｅａｔｌｅｙ，ｂ．Ｍ．，Ｍｏｒｏｚ，Ｋ．，Ｒｏｓａｌｅｓ，Ｓ．Ｃ．＆Ｍｏｒｉｃｉ，Ｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，（２０１１））。さらに、生物学的メッシュの生体力学的特性は、細菌のコロニー形成後に大幅に低下する（Ｂｅｌｌｏｗｓ，Ｃ．Ｆ．，Ｗｈｅａｔｌｅｙ，Ｂ．Ｍ．，Ｍｏｒｏｚ，Ｋ．，Ｒｏｓａｌｅｓ，Ｓ．Ｃ．＆Ｍｏｒｉｃｉ，Ｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，（２０１１））。メッシュ感染は、ヘルニア修復の１〜８％を悪化させるが、これは、最も一般的には、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、特に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）（Ｂ群溶血性レンサ球菌（ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）を含む）及び他のレンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種に起因する（Ｃｏｌｌａｇｅ，Ｒ．Ｄ．＆Ｒｏｓｅｎｇａｒｔ，Ｍ．Ｒ．Ｓｕｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．（Ｌａｒｃｈｍｔ）．１１，３１１−８（２０１０））。バンコマイシンは、全メッシュ感染の半分以上の原因であるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）及びレンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）細菌の両方に対して殺菌作用があるグリコペプチド抗生物質である（Ｃｏｌｌａｇｅ，Ｒ．Ｄ．＆Ｒｏｓｅｎｇａｒｔ，Ｍ．Ｒ．Ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｗａｌｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｍｅｓｈ．Ｓｕｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．（Ｌａｒｃｈｍｔ）．１１，３１１−８（２０１０））。バンコマイシンによる全身治療は、効力を確実にすると共に、有害な腎毒性を回避するために静脈内注入及び連続的な治療薬レベルのモニタリングを必要とする。
【０００５】
臓器移植は、末期臓器不全に対する決定的治療法である。しかし、これは、ドナー臓器の不足によって制限される。脱細胞化臓器スカフォールドに基づく臓器再生は、移植のための生存移植片の代替供給源を提供する。この概念は、げっ歯類モデルにおける心臓（Ｏｔｔ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４（２）：２１３−２１（２００８））、肺（Ｏｔｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６（８）：９２７−３３（２０１０）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９（５９９１）：５３８−４１（２０１０））、肝臓（Ｕｙｇｕｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６（７）：８１４−８２０（２０１０））及び腎臓（Ｓｏｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９（５）：６４６−５１（２０１３））の再生で実証されている。この戦略は、人間とほぼ同じサイズの臓器の脱細胞及び再生にスケールアップされている（Ｋｏ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ４０：７２−９（２０１４）；Ｒｅｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３，１０９７−１１０２（２０１５）；Ｇｕｙｅｔｔｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１８（１）：５６−７２（２０１６））。脱細胞化臓器スカフォールドは、主として細胞外マトリックスから構成され、これは、臓器の解剖学的、機械的及び生化学的特徴を決定する必須成分の１つである。生物活性分子の固定化による脱細胞化臓器スカフォールドの官能基化は、臓器再生を促進すると共に、再生移植片のインビボ性能を向上させるうえで期待できる。しかしながら、脱細胞化臓器スカフォールドを官能基化するための既存の技術は、ランダム架橋化学に基づき、選択的ではなく（Ｍａ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １（１）：８１−９（２０１４）；Ｂａｏ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：１０７５６（２０１５））、生体材料の機械的及び生化学的特徴を著しく改変する。
【０００６】
臓器（例えば、肺）移植片は、臓器（例えば、肺）不全により分類される状態、とりわけ慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、肺癌及び先天性肺疾患などを経験している多くの患者にとって最後の希望となる。臓器（例えば、肺）移植の典型的な待ち時間は２年以上となり得るが、その結果、順番待ちリストに載っている患者の死亡率は３０％に達する。その広範な可能性にもかかわらず、臓器移植の継続的な成功は、臓器の適切な供給に依存する。脳幹死ドナーから従来の方法で得られた臓器の数が高原状態に達したことは一層明らかである。さらに、虚血−再灌流傷害は、臓器移植後に頻発する結果であり、短期及び長期の移植片転帰に影響を及ぼす。臨床的に、虚血−再灌流傷害は、移植片機能の遅延、移植片拒絶、慢性拒絶及び慢性移植片機能不全に関連する。移植に伴う細菌への曝露及び組織損傷により、病原体関連合併症及び損傷関連合併症（例えば、血液凝固）の両方の発生、並びに交差反応性アロ反応性Ｔ細胞の生成が起こる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
いくつかの態様では、本開示は、哺乳動物の臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化する方法であって、
（ｉ）臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化するために哺乳動物を選択するステップと、
（ｉｉ）哺乳動物に栄養素を投与するステップであって、栄養素は、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化される、ステップと
を含む方法を提供する。
【０００８】
いくつかの態様では、本開示は、哺乳動物の臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化する方法であって、
（ｉ）臓器又は組織を採取するステップと、
（ｉｉ）生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素を含む培地を用いて臓器又は組織を培養するステップと
を含む方法を提供する。
【０００９】
いくつかの態様では、本開示は、移植のための臓器又は組織を調製する方法であって、
（ｉ）生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素をドナー対象に投与するステップと、
（ｉｉ）ドナー対象から手術により臓器又は組織を取り出すステップと、
（ｉｉｉ）摘出された臓器又は組織を、官能基化された栄養素の反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子を含む保存液で処理するステップと
を含む方法を提供する。
【００１０】
いくつかの態様では、臓器又は組織は、ウシ、ブタ、マウス又はヒト臓器又は組織である。
【００１１】
いくつかの態様では、臓器又は組織は、頸動脈、肺、心臓、肝臓、腎臓及び皮膚からなる群から選択される。
【００１２】
いくつかの態様では、生体直交型化学反応で反応性の化学基は、アジド（−Ｎ３）、アルキン、ニトロン、イソシアニド、シクロプロペン及びテトラジンからなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの態様では、生体直交型化学反応で反応性の化学基は、アジド（−Ｎ３）及びアルキンから選択される。
【００１４】
いくつかの態様では、生体直交型化学反応で反応性の化学基は、アジド（−Ｎ３）である。
【００１５】
いくつかの態様では、栄養素は、糖、アミノ酸、脂肪酸及びトリグリセリドからなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの態様では、栄養素は、単糖である。
【００１７】
いくつかの態様では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、アジド標識ガラクトサミン、アジド標識グルコサミン及びアジド標識マンノサミンからなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの態様では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ及びＡｃ４ＧｌｃＮＡｚから選択される。
【００１９】
いくつかの態様では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、テトラアシル化Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ）である。
【００２０】
いくつかの態様では、栄養素は、腹腔内注射、皮下注射又は気管内経路によって投与される。
【００２１】
いくつかの態様では、栄養素は、腹腔内注射によって投与される。
【００２２】
いくつかの態様では、本開示は、官能基化された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドであって、細胞外マトリックスは、本明細書に記載する方法のいずれか１つによって官能基化される、脱細胞化スカフォールドを提供する。
【００２３】
いくつかの態様では、本開示は、細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドであって、脱細胞化スカフォールドの細胞外マトリックスは、少なくとも１つの生物活性分子で化学選択的に官能基化される、脱細胞化スカフォールドを提供する。
【００２４】
いくつかの態様では、本開示は、脱細胞化スカフォールドを調製する方法であって、本明細書に記載の脱細胞化スカフォールドを、官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子と反応させるステップを含む方法を提供する。
【００２５】
いくつかの態様では、本開示は、生物学的補綴メッシュを調製する方法であって、本明細書に記載の脱細胞化スカフォールドを、官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子と反応させるステップを含む方法を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、反応させるステップは、脱細胞化スカフォールドへの生物活性分子の注入（例えば、生物活性分子を含有するバッファー溶液のスカフォールドへの注入）を含む。
【００２７】
いくつかの態様では、相補的な反応性化学基は、アジド（−Ｎ３）、アルキン、ニトロン、イソシアニド、シクロプロペン又はテトラジンである。
【００２８】
いくつかの態様では、アルキンは、脂肪族アルキン又はシクロオクチンである。
【００２９】
いくつかの態様では、シクロオクチンは、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、ジフルオロベンゾシクロオクチン（ＤＩＦＢＯ）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、二フッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）、一フッ素化シクロオクチン（ＭＯＦＯ）、ジメトキシアザシクロオクチン（ＤＩＭＡＣ）又はアリールレスオクチン（ａｒｙｌ−ｌｅｓｓ  ｏｃｔｙｎｅ）（ＡＬＯ）である。
【００３０】
いくつかの態様では、アルキンは、脂肪族アルキンであり、及び反応させるステップは、銅（Ｉ）触媒の存在下で実施される。
【００３１】
いくつかの態様では、アルキンは、シクロオクチンであり、及び反応させるステップは、銅フリー条件下で実施される。
【００３２】
いくつかの態様では、生物活性分子は、成長因子、ペプチド、抗体、抗凝血剤又は抗生物質である。
【００３３】
いくつかの態様では、抗凝血剤は、クマリン、ヘパリン、第Ｘａ因子の五糖類阻害剤、直接第Ｘａ因子阻害剤又は直接トロンビン阻害剤である。
【００３４】
いくつかの態様では、抗凝血剤は、ヘパリンである。
【００３５】
いくつかの態様では、抗生物質は、キノロン、β−ラクタム、セファロスポリン、ペニシリン、カルバペネム、リポペプチド、アミノグリコシド、グリコペプチド、マクロライド、アンサマイシン又はスルホンアミドである。
【００３６】
いくつかの態様では、抗生物質は、バンコマイシンである。
【００３７】
いくつかの態様では、抗体は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）に対して特異的な抗体である。
【００３８】
いくつかの態様では、官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子は、ヘパリン−アルキン、ヘパリン−アルキン−ビオチン（ヘパリンＡＢ）、バンコマイシン−アルキン、ヘパリン−ＤＢＣＯ、バンコマイシン−ＤＢＣＯ、抗ＴＮＦ−α−アルキン及び抗ＴＮＦ−α−ＤＢＣＯから選択される。
【００３９】
いくつかの態様では、本開示は、移植のための哺乳動物臓器又は組織を調製する方法であって、本明細書に記載の哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドにレシピエント由来の細胞を播種して、移植のための臓器又は組織を取得するステップを含む方法を提供する。
【００４０】
いくつかの態様では、レシピエント由来の細胞は、上皮細胞、内皮細胞、間質細胞、筋肉細胞及びニューロンから選択される。
【００４１】
いくつかの態様では、臓器又は組織は、本明細書に記載する方法のいずれか１つによって調製される。
【００４２】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載する方法のいずれか１つによって調製される、移植のための哺乳動物臓器又は組織を提供する。
【００４３】
いくつかの態様では、本開示は、少なくとも１つの生物活性分子で生体直交的に官能基化された生物学的補綴メッシュであって、本明細書に記載する方法のいずれか１つによって調製される生物学的補綴メッシュを提供する。
【００４４】
別に定義されない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語の全ては、本出願が属する技術分野の通常の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。方法及び材料は、本出願での使用のために本明細書に記載される。当技術分野で公知の他の好適な方法及び材料を使用することもできる。材料、方法及び例は、例示的なものに過ぎず、限定を意図するものではない。本明細書で述べる全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー及び他の参照文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先される。
【００４５】
本出願の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００４６】
本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公報のコピーは、要請及び必要な費用の支払いに応じて特許庁から提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１Ａは、アジド標識された糖をドナー動物に投与するステップを示す。図１Ｂは、アジドタグで標識された非細胞外マトリックス（ＥＣＭ）結合糖タンパク質及びＥＣＭ結合グリコアミノグリカン又は糖タンパク質を示す。図は、一例としての肺を示す。図１Ｃは、脱細胞後にＥＣＭ中に保存されるグリコサミノグリカン又は糖タンパク質上のアジドタグを示す。図は、一例としての肺を示す。図１Ｄは、アルキン官能基と共役した多様な官能基を有する生体分子を示す。図１Ｅは、高度に選択性の銅触媒クリック反応によって脱細胞化臓器スカフォールド上に固定されたアルキン共役生体分子を示す。図は、一例としての肺を示す。
【図２】図２Ａは、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ及びＡｃ４ＧｌｃＮＡｚを用いたインビボ代謝操作後の脱細胞化ラット肺スカフォールドにおけるアジド標識の検出を示す。図２Ｂは、ビオチン染色の蛍光強度（ＥＣＭラミニン染色の蛍光強度に正規化）を測定することによるビオチン標識の定量を示す。図２Ｃは、３つのアジド標識された糖（Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ及びＡｃ４ＭａｎＮＡｚ）の代謝標識効率の比較を示す。
【図３】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いたラット頸動脈のインビボ代謝標識を示す。
【図４】クリッカブルヘパリン（ヘパリン−アルキン）の産生を示す。
【図５】カニューレが挿入された深下腹壁動脈及び静脈を有する脱細胞化ラット腹壁真皮マトリックス皮弁を示す。
【図６】図６Ａは、死体腹壁皮弁（ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色）の低出力画像を示す。図６Ｂは、死体腹壁皮弁（ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色）の高出力画像を示す。図６Ｃは、脱細胞化腹壁皮弁（ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色）の低出力画像を示す。図６Ｄは、脱細胞化腹壁皮弁（ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色）の高出力画像を示す。
【図７】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いたラット腹壁皮弁のインビボ代謝標識を示す。
【図８】ラット臓器／組織の脱細胞化スカフォールドのエクスビボ代謝操作の図を示す。
【図９】ヒト肺の脱細胞化スカフォールドのエクスビボ代謝操作の図を示す。
【図１０】エクスビボ代謝操作後の脱細胞化ラット肺スカフォールドにおけるアジド標識の検出を示す。
【図１１】エクスビボ代謝操作後の脱細胞化ラット頸動脈スカフォールドにおけるアジド標識の検出を示す。
【図１３】ラット臓器／組織の脱細胞化スカフォールドのインビボ代謝操作の図を示す。
【図１４】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いたインビボ代謝操作後の脱細胞化ラット頸動脈スカフォールドにおけるアジド標識の検出を示す。
【図１５】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いたインビボ代謝操作後の脱細胞化ラット心臓スカフォールドにおけるアジド標識の検出を示す。
【図１６】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いたインビボ代謝操作後の脱細胞化ラット肝臓スカフォールドにおけるアジド標識の検出を示す。
【図１７】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いたインビボ代謝操作後の脱細胞化ラット腎臓スカフォールドにおけるアジド標識の検出を示す。
【図１８】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いたインビボ代謝操作後の脱細胞化ラット皮膚スカフォールドにおけるアジド標識の検出を示す。
【図１９】移植のための低温保存工程でのドナー肺組織の分子精製の手順を示す図である。
【図２０】氷上の臨床Ｐｅｒｆａｄｅｘ溶液中に保存されたＤＢＣＯ−ビオチン及びアジド糖標識肺移植片並びに対照肺移植片の銅フリークリック反応を示す写真である。
【図２１】摘出された臓器を培養するのに有用なバイオリアクターを示す図である。
【図２２】バンコマイシンとアルキン−ＰＥＧ５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルとの共役反応を示す図である。
【図２３】バンコマイシン−アルキンの構造に対応するＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図２４】クリック反応後の脱細胞化ラット腹壁皮弁（ＲＥＦ）上のバンコマイシンの免疫蛍光染色を示す画像である。
【図２５Ａ】ラットにおける臓器ＥＣＭのインビボ代謝操作の図である。手短には、腹腔内注射で代謝標識試薬を３日間毎日投与することにより、インビボ代謝操作を実施する。次に、臓器を採取し、脱細胞化した。
【図２５Ｂ】クリック反応によりビオチン−アルキンをアジドリガンドと共役させた後、蛍光団共役ストレプトアビジンを用いたビオチン検出により、組織切片上のＥＣＭ中のアジドリガンドを検出するステップの図である。
【図２５Ｃ】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ及びＡｃ４ＧｌｃＮＡｚによる無細胞肺ＥＣＭのインビボ代謝標識効率の比較を示す画像を含む。ビオチン−アルキンクリック反応及びストレプトアビジン染色を用いた無細胞肺ＥＣＭにおけるアジドリガンドのイメージング検出であり（図２５Ｂに示す通り）、無細胞肺ＥＣＭは、ラミニンで同時染色した（スケールバー：２００μｍ）。
【図２５Ｄ】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ及びＡｃ４ＧｌｃＮＡｚによる無細胞肺ＥＣＭのインビボ代謝標識効率の比較を示す棒グラフである。ラミニンの蛍光強度に正規化したアジド−ビオチン−ストレプトアビジン標識強度の定量（各代謝標識試薬についてｎ＝３）。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２５Ｅ】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯ（対照）（各群につきｎ＝３）を用いたインビボ代謝操作後に無細胞肺ＥＣＭから抽出したＥＣＭタンパク質中のアジド−ビオチン−ストレプトアビジン標識の検出を示すウエスタンブロットである。ラミニンウエスタンブロットは、ローディング対照として使用した。
【図２６Ａ】ラット及びブタ肺ＥＣＭのエクスビボ代謝操作の図である。手短には、新しく摘出したラット肺又はブタ左肺を、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ（５０μＭ）又はＤＭＳＯ（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを含まない対照）の存在下、バイオリアクターにおいてエクスビボで２４時間培養し、脱細胞化した。
【図２６Ｂ】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯ（各群につきｎ＝３）を用いたエクスビボ代謝操作後、無細胞ラット肺中のアジドリガンドの検出を示す画像を含む。アジドリガンドは、Ｃｕ（Ｉ）触媒と一緒に及び触媒なしでのビオチン−アルキンクリック反応を用いて検出した後、ストレプトアビジン染色を行った。無細胞肺ＥＣＭは、ラミニンで同時染色した（スケールバー：２００μｍ）。
【図２６Ｃ】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯ（各群につきｎ＝３）を用いたエクスビボ代謝操作後、無細胞ラット肺から抽出したＥＣＭタンパク質中のアジド−ビオチン−ストレプトアビジン標識の検出を示すウエスタンブロットである。ラミニンウエスタンブロットは、ローディング対照として使用した。
【図２６Ｄ】エクスビボ培養及び代謝操作を実施中のブタ左肺を示す画像である。
【図２６Ｅ】エクスビボ脱細胞を実施中のブタ左肺を示す画像である。
【図２６Ｆ】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯを用いたエクスビボ代謝操作後、無細胞ブタ左肺中のアジドリガンドの検出を示す画像である（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯブタ左肺の３つの代表的領域を分析した；スケールバー：２００μｍ）。
【図２６Ｇ】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯを用いたエクスビボ代謝操作後、無細胞ブタ左肺から抽出したＥＣＭタンパク質中のアジド−ビオチン−ストレプトアビジン標識の検出を示すウエスタンブロットである（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯブタ左肺の３つの代表的領域を分析した）。
【図２６Ｈ】インタクトなアジド標識無細胞臓器スカフォールドへの目的のアルキン標識生体分子の固定化を可能にする全臓器注入クリック反応の図である（図は、一例としての肺を示す）。
【図２６Ｉ】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯを用いたエクスビボ代謝操作後、無細胞ラット肺中のビオチン−アルキン注入クリック反応、続くビオチンのストレプトアビジン染色及びラミニン同時染色を示す画像を含む（上の画像のスケールバー：２０００μｍ；下の画像のスケールバー：２００μｍ）。
【図２７Ａ】クリッカブルヘパリン−アルキン−ビオチン（ヘパリン−ＡＢ）の調製を示す図である。手短には、ＥＤＣ及びスルホ−ＮＨＳによりヘパリン中のカルボキシル基を活性化してアミン−反応性にし、アミン−ＰＥＧ４−アルキン及びアミン−ＰＥＧ３−ビオチンと共役させた。
【図２７Ｂ】コラーゲン−アジド（コラーゲン−Ａｚ）プレートアッセイを示す図である。手短には、アジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（Ａｚ−ＮＨＳ）を用いて、コラーゲンＩをコーティングした組織培養プレートにアジド基を共役させ、これにより、視覚化及び生物活性評価のために、プレートでのクリック反応を介したヘパリン−ＡＢの固定化を達成した。クリック−固定化ヘパリン−ビオチン（ヘパリン−Ｂ）は、さらにＡＴＩＩＩに結合してそれを固定化し、第Ｘａ因子（ＦＸａ）を阻害するＡＴＩＩＩ活性を増強した。
【図２７Ｃ】クリック−固定化ヘパリン−Ｂのストレプトアビジン染色後の、Ａｚ−ＮＨＳ共役を有する及び有さない代表的なコラーゲンウェルの画像を含む。ＥＣＭを示すためにコラーゲンＩを同時染色した。
【図２７Ｄ】Ａｚ−ＮＨＳ共役を有する及び有さないコラーゲンウェル上の固定化ヘパリン−Ｂの定量を示す線グラフである（各群につきｎ＝４）。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２７Ｅ】Ａｚ−ＮＨＳ共役を有する及び有さないコラーゲンウェル上の固定化ＡＴＩＩＩの定量を示す線グラフである（各群につきｎ＝４）。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２７Ｆ】コラーゲンウェル中で５、１５及び３０分間のインキュベーション後、基質Ｓ２２２２との発色反応を用いた残留ＦＸａ活性の定量を示す線グラフである。コラーゲンウェルは、Ａｚ−ＮＨＳ共役を有し及び有さず、ヘパリン−ＡＢクリック反応ミックス及びＡＴＩＩＩと一緒に順次インキュベートした（図２７Ｂに示す通り）。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２７Ｇ】注入クリック反応によるエクスビボで代謝操作されたアジド標識ラット肺に対するヘパリン−ＡＢ固定化、及び続くＡＴＩＩＩの固定化の図である。
【図２７Ｈ】エクスビボＡｃ４ＧａｌＮＡｚ代謝操作を伴う及び伴わない無細胞ラット肺上でのクリック固定化ヘパリン−Ｂのストレプトアビジン染色及び視覚化を示す画像を含む。無細胞肺ＥＣＭをラミニンで同時染色した（上の画像のスケールバー：２０００μｍ；下の画像のスケールバー：２００μｍ）。
【図２７Ｉ】エクスビボＡｃ４ＧａｌＮＡｚ代謝操作を伴う及び伴わないヘパリン−Ｂクリック無細胞ラット肺に固定化されたＡＴＩＩＩの分析を示すウエスタンブロットである。ラミニンウエスタンブロットは、ローディング対照として使用した。
【図２７Ｊ】無細胞ラット肺の５、１５、３０及び６０分間の灌流後、基質Ｓ２２２２との発色反応を用いた残留ＦＸａ活性の定量を示す線グラフである。エクスビボＡｃ４ＧａｌＮＡｚ代謝操作を伴う及び伴わない無細胞ラット肺を、ヘパリン−ＡＢクリック反応ミックス及びＡＴＩＩＩと一緒に順次インキュベートした（図２７Ｇに示す通り）後、ＦＸａ灌流及び阻害アッセイに付した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２８】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯ（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを含まない対照）を用いたインビボ代謝操作後、無細胞ラット心臓中のアジドリガンドの検出を示す画像を含む。アジドリガンドは、Ｃｕ（Ｉ）触媒あり及びなしでのビオチン−アルキンクリック反応を用いて検出した後、蛍光団共役ストレプトアビジンで染色を行った。無細胞心臓ＥＣＭは、ラミニンで同時染色した（各群につきｎ＝３；スケールバー：２００μｍ）。
【図２９】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯ（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを含まない対照）を用いたインビボ代謝操作後、無細胞ラット腎臓中のアジドリガンドの検出を示す画像を含む。アジドリガンドは、Ｃｕ（Ｉ）触媒あり及びなしでのビオチン−アルキンクリック反応を用いて検出した後、蛍光団共役ストレプトアビジンで染色を行った。無細胞腎臓ＥＣＭは、ラミニンで同時染色した（各群につきｎ＝３；スケールバー：２００μｍ）。
【図３０】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯ（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを含まない対照）を用いたインビボ代謝操作後、無細胞ラット肝臓中のアジドリガンドの検出を示す画像を含む。アジドリガンドは、Ｃｕ（Ｉ）触媒あり及びなしでのビオチン−アルキンクリック反応を用いて検出した後、蛍光団共役ストレプトアビジンで染色を行った。無細胞肝臓ＥＣＭは、ラミニンで同時染色した（各群につきｎ＝３；スケールバー：２００μｍ）。
【図３１】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯ（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを含まない対照）を用いたインビボ代謝操作後、無細胞ラット皮膚中のアジドリガンドの検出を示す画像を含む。アジドリガンドは、Ｃｕ（Ｉ）触媒あり及びなしでのビオチン−アルキンクリック反応を用いて検出した後、蛍光団共役ストレプトアビジンで染色を行った。無細胞皮膚ＥＣＭは、ラミニンで同時染色した（各群につきｎ＝３；スケールバー：２００μｍ）。
【図３２】Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ又はＤＭＳＯ（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを含まない対照）を用いたインビボ代謝操作後、無細胞ラット頸動脈中のアジドリガンドの検出を示す画像を含む。アジドリガンドは、Ｃｕ（Ｉ）触媒あり及びなしでのビオチン−アルキンクリック反応を用いて検出した後、蛍光団共役ストレプトアビジンで染色を行った。無細胞頸動脈ＥＣＭは、ラミニンで同時染色した（各群につきｎ＝３；スケールバー：１００μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本出願は、細胞外マトリックスの官能基のランダム架橋を用いない、ネイティブ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の選択的な共有結合的修飾に関する。ネイティブマトリックスは、例えば、デタージェント還流による全臓器若しくは組織の脱細胞又は反復凍結−解凍サイクルに組織（例えば、肺組織）を付すことによって生成される。選択的修飾は、第１に、例えばアジド標識糖をドナー動物に投与する（例えば、給餌又は注射により）ことにより、アジドタグを臓器／組織ＥＣＭに導入することによって達成することができ、アジド標識糖は、脱細胞化後もＥＣＭスカフォールド中に残る。別の例では、臓器／組織ＥＣＭへのアジドタグの導入は、組織（例えば、肺組織）を、アジド標識糖を含有する培地と一緒に培養することによって達成され得る。次に、高度に選択性の銅触媒クリック反応又は銅フリークリック反応により、脱細胞化臓器／組織スカフォールド上のアジド標識とアルキン標識生体分子を共役させることができる。例えば、目的の生体分子をアルキン基と共役させることにより、様々な生体分子及び小分子をアジド標識脱細胞化臓器／組織スカフォールド上に固定化し得る。本出願の方法は、例えば、成長因子／ペプチド（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ）でＥＣＭを固定化することによるＥＣＭに対する細胞生着の増強、例えば抗凝血試薬（例えば、ヘパリン）を用いてＥＣＭを固定化することによる血栓形成の低減、並びに例えば抗生物質（例えば、バンコマイシン）を用いてＥＣＭを固定化することによる感染リスクの低下を可能にする。
【００４９】
合成又は天然材料に対する成長因子及びヘパリンなどの生体分子の固定化は、主に、カルボジイミド試薬（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ））／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＮＳ）−媒介架橋ケミストリーを用いて実施されている１〜３。ＥＣＭ生体材料官能基化のための従来の方法は、通常、生体材料中のリシン残基などのネイティブアミノ酸残基を使用する架橋ケミストリーを含む３、９〜１０。例えば、ＥＤＣ／ＨＮＳ架橋ケミストリーは、第１級アミンと活性化カルボキシル基との反応に依存する。カルボキシル基及びアミン基のいずれもタンパク質（例えば、コラーゲン）中に広く存在し、ＥＣＭの主成分である。こうした反応性アミノ酸残基は、ネイティブＥＣＭ中に豊富に存在するため、これらの架橋結合反応は、特異性に欠ける１１〜１５。従って、ネイティブ細胞外マトリックスに適用される場合、非選択的ＥＤＣ／ＮＨＳケミストリーは、マトリックスの不要な架橋を引き起こし、ＥＣＭの生化学的及び機械的特性を著しく変化させる。本出願の方法は、化学選択的クリックケミストリーによるネイティブＥＣＭの選択的修飾を可能にする。銅触媒又は銅フリークリックケミストリーは、アジド及びアルキン官能基間の共役反応である。アジド及びアルキン官能基は、生体分子中に存在しないため、アジドで官能基化された生体分子と、アルキン官能基を含む分子との反応は、高度に特異的（生体直交型）である。ＥＤＣ／ＮＨＳケミストリーは、通常、生物又は生体系と不適合性である極端な化学条件（例えば、極端なｐＨ、有機溶媒）下で実施する必要があるが、銅触媒又は銅フリークリックケミストリーは、標準の生物学的バッファー中で実施することができる。従って、本出願の方法は、生体材料の官能基化に有利に使用することができる。
【００５０】
天然の生体系において、アジド及びアルキン部分は、生物学的及び化学的に不活性であるため、例えば、アジド修飾及びアルキン修飾生体分子間の共役は、高度に特異的である。しかし、脱細胞化ＥＣＭ生体材料の官能基化へのクリックケミストリーの適用は、ＥＣＭへの、アジド又はアルキンなどのクリック反応性リガンドの生体適合性及び効率的な組込み方法がないために妨げられている。クリック反応性リガンドをアミノ酸、グリカン、脂質及び核酸に組み込むためにインビボ代謝操作アプローチが開発されている１６〜２５。これらの研究は、細胞成分の標識に重点を置き、組織及び臓器のＥＣＭの代謝標識の実現可能性、効果及び安定性にほとんど関心が向けられていなかった。本明細書では、インビボ代謝操作による組織及び臓器のＥＣＭ中に例えばクリック反応性アジドリガンドを組み込むための代謝操作アプローチが記載される。
【００５１】
いくつかの態様では、本出願は、真皮マトリックスを摘出した後、ネイティブ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の選択的な共有結合的修飾を用いて抗生物質（例えば、バンコマイシン）を固定化することにより、抗生物質がコーティングされた生物学的メッシュを製造する新規の方法に関する。クリックケミストリー（アジド−アルキンヒュスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）環化付加とも呼ばれる）は、触媒として銅（Ｃｕ）を室温で使用する。生体分子を固定化するのに使用される他の方法と異なり、本明細書に記載する方法は、あらゆるオフターゲット架橋を回避する。反応の成功には、そうでなければ身体内に存在しない官能基であるアジドでドナー動物のネイティブＥＣＭを標識する必要がある。これを達成するために、エンドポイント組織採取まで特定の時間間隔において動物にアジド標識糖を投与する（例えば、腹腔内注射で）。注射されたアジド標識炭水化物をＥＣＭ中に組み込み、クリック反応に必要なアジド基でグリコアミノグリカン又は糖タンパク質を標識する。分子をアルキン官能基と共役させることによるバンコマイシンに対する単純な修飾により、バンコマイシン上のアルキン基とＥＣＭ上のアジド基とのクリック反応を介して抗生物質をＥＣＭに共有結合させることができる。
【００５２】
いくつかの態様では、本出願は、アルキン及びアジド（例えば、ＤＢＣＯ及びアジド）間の生体直交型化学反応を用いてドナー臓器に生物活性分子を固定化することにより、改善されたドナー臓器移植片（例えば、肺移植片）を提供する。ＴＮＦ−αは、臓器移植後の虚血／再灌流障害の主要な原因の１つであるため、ＴＮＦ−αシグナル伝達の遮断／無効化は、臓器移植後の虚血／再灌流障害を改善するうえで有益である。いくつかの態様では、本出願に開示される方法は、低温保存中のドナー臓器に抗ＴＮＦ−α抗体を固定化することを可能にし、従って虚血／再灌流障害中に生じるＴＮＦ−αを中和してドナー肺移植片を有利に保護し、その移植転帰を改善する。
【００５３】
定義
本明細書で使用される場合、用語「細胞」は、インビトロ、エクスビボ又はインビボの細胞を指すものとする。一部の実施形態では、エクスビボ細胞は、哺乳動物などの生物から切除された組織サンプルの一部であり得る。一部の実施形態では、インビトロ細胞は、細胞培養物中の細胞であり得る。一部の実施形態では、インビボ細胞は、哺乳動物などの生物における生きた細胞である。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「脱細胞化」及び「無細胞」は、置き換え可能に使用され、標準的な組織染色手順により、組織切片中に検出可能な細胞内、内皮細胞、上皮細胞及び核が完全又はほぼ完全に存在しないこととして定義される。好ましくは、しかし、必ずしもではないが、残留する細胞残屑も脱細胞化臓器又は組織から除去されている。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「生体直交型」は、ネイティブ生化学プロセスを妨害することなく、生体系においてインビトロ及びインビボで起こり得る化学反応を指すために用いられる。一部の実施形態では、生体直交型反応は、成長因子、酵素、細胞外タンパク質及び核酸などの２つ以上の生体分子間で起こり得る。一部の実施形態では、生体直交型反応は、生体分子と生体内異物との間で起こり得る。一部の実施形態では、生体直交型反応は、２つ以上の生体内異物間で起こり得る。一部の実施形態では、生体直交型化学反応は、アジドとアルキンとの間の１，３−双極子環化付加である。一部の実施形態では、生体直交型化学反応は、ニトロンとアルキンとの間の反応である。一部の実施形態では、生体直交型化学反応は、アジドとホスフィンとの間のシュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）反応である。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「化学選択的」は、他の官能基の存在下で１つの官能基の別の官能基との選択的反応性を指すために使用される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「予防する」は、例えば、患者又は対象が、ある状態に罹患しやすいか、又はある疾患若しくは状態に罹患するリスクがあるとき、疾患又は状態（例えば、感染、虚血若しくは再灌流傷害）が発生するのを完全に又はほぼ完全に止めることを意味する。予防は、状態の阻害、例えば発現の停止も含む。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「治療する」又は「治療」は、１）疾患の阻害、例えば疾患、状態若しくは障害の病状若しくは症状を経験しているか若しくは呈示している個体の疾患、状態若しくは障害の阻害（すなわち病状及び／若しくは症状のそれ以上の発現の停止）、又は２）疾患の改善、例えば疾患、状態若しくは障害の病状若しくは症状を経験しているか若しくは呈示している個体の疾患、状態若しくは障害の改善（すなわち病状及び／若しくは症状の反転）を指す。
【００５９】
本明細書で使用される場合、置き換え可能に用いられる用語「個体」、「患者」又は「対象」は、哺乳動物を含むあらゆる動物、好ましくはマウス、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ又は霊長類、及び最も好ましくはヒトを指す。一部の実施形態では、対象は、臓器若しくは組織のドナー又は臓器若しくは組織のレシピエントであり得る。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「生体直交的に結合した」は、生体直交型化学反応を用いて互いにカップリングされた２つ以上の分子を表すために用いられる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃｎ−ｍアルキル」は、単独又は他の用語と組み合わせて用いられ、直鎖又は分岐のいずれかであり得る飽和炭化水素基を指し、これは、ｎ〜ｍ個の炭素を有する。アルキル部分の例として、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルなどの化学基；２−メチル−１−ブチル、ｎ−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、１，２，２−トリメチルプロピルなどの高級同族体が挙げられる。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜６個の炭素原子、１〜４個の炭素原子、１〜３個の炭素原子又は１〜２個の炭素原子を含む。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「アルキレン」は、炭素及び水素のみを含む二価分岐、又は直鎖化学基、例えばメチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソ−プロピレン、ｎ−ブチレン、イソ−ブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ｔｅｒｔ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、イソ−ペンチレン、ｓｅｃ−ペンチレン及びネオ−ペンチレンなどを意味する。アルキレン基は、非置換であるか又は１つ若しくは複数の置換基で置換され得る。アルキレン基は、１つ又はいくつかの位置で飽和又は不飽和（例えば、−Ｃ＝Ｃ−又は−Ｃ≡Ｃ−サブユニットを含む）であり得る。一部の実施形態では、アルキレン基は、１〜９個の炭素（例えば、１〜６個の炭素原子、１〜４個の炭素原子又は１〜２個の炭素原子）を含む。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃｎ−ｍアルキニル」又は「アルキニル」は、１つ又は複数の三重炭素−炭素結合を有するアルキル基を指す（ここで、「ｎ〜ｍ」は、アルキニル基が含有し得る炭素原子の数を指す）。一部の実施形態では、アルキニル基は、脂肪族である。脂肪族アルキニル基の例として、限定されないが、エチニル、プロピン−１−イル、プロピン−２−イルなどが挙げられる。一部の実施形態では、脂肪族アルキニル部分は、２〜６、２〜４又は２〜３個の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、アルキニル基は、−Ｃ≡ＣＨ又は−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨである。一部の実施形態では、アルキニル基は、環状（例えば、シクロオクチン又はシクロノニン）である。一部の実施形態では、シクロオクチンは、本明細書に記載するように、ＤＢＣＯ、ＭＯＦＯ、ＤＩＦＯ、ＯＣＴ、ＤＩＭＡＣ、ＡＬＯ及びＢＣＮから選択される。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「クリック反応」は、低活性化エネルギーバリアを有する２つ以上の基質間の高収率性且つ高度に特異的な反応を指す。一部の実施形態では、クリック反応は、アルキン担持分子とアジド担持分子との反応を指す。他の実施形態では、クリック反応は、アルケン担持分子とテトラジン担持分子との反応を指す。また別の実施形態では、クリック反応は、アルケン担持分子とアジド担持分子との反応を指す。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「栄養素」は、生存及び成長のために生体系（例えば、動物又は植物）によって代謝される分子を指す。本明細書で使用される場合、栄養素は、炭水化物（例えば、糖（例えば、単糖、オリゴ糖、多糖））、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂肪酸、トリグリセリド、ビタミン又は補因子であり得る。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「細胞外マトリックス（ＥＣＭ）」は、周辺の細胞及び組織の構造支持体（例えば、物理的スカフォールディング）及び生化学的キュー（ｃｕｅ）を提供する細胞外生体分子の群を指す。一部の実施形態では、コラーゲン（例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ及び／又はＸＩＶ型）が細胞外マトリックスの主成分である。一部の実施形態では、細胞外マトリックスの線維は、エラスチン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、フィブロネクチン及び／又はラミニンも含む。一部の実施形態では、ＥＣＭは、ミクロ解剖学の輪郭を描く物質を残しながら、全ての細胞成分を除去することにより、ネイティブ組織及び臓器から得られる。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「培養する」という用語は、代謝に好適な条件下において、摘出された臓器若しくは組織（又は臓器若しくは組織の一部）の細胞を維持することを可能にするインビトロ／エクスビボ実験技術を指す。一部の実施形態では、培養は、臓器又は組織の機能を保存する。これは、１つの栄養素又は複数の栄養素を含む培地で約３７℃において臓器又は組織を処置することにより達成することができる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「摘出された臓器」、「摘出された組織」、「採取された臓器」又は「採取された組織」という用語は、再使用（例えば、レシピエント対象への臓器又は組織移植）のためにドナー対象から手術により取り出された臓器又は組織（例えば、心臓、肝臓、腎臓、肺、血管又は皮膚）を指す。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「臓器移植」又は「組織移植」という用語は、ドナー対象から手術により臓器又は組織を取り出した後、その臓器又は組織をレシピエント対象に配置することを指す。一部の実施形態では、ドナー対象がレシピエント対象である場合、臓器又は組織移植は、「自己移植」と呼ばれる。一部の実施形態では、ドナー対象とレシピエント対象とが同じ種に属する場合（例えば、ドナー対象がヒトであり、レシピエント対象もヒトであるとき）、臓器又は組織移植は、「同種移植」と呼ばれる。一部の実施形態では、ドナー対象とレシピエント対象とが異なる種に属する場合（例えば、ドナー対象がブタであり、レシピエント対象がヒトであるとき）、臓器又は組織移植は、「異種移植」と呼ばれる。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「生物学的補綴メッシュ」及び「補綴メッシュ」という用語は、例えば、組織付着を促進するための瘢痕ヘルニア修復に有用な補綴用生体材料（例えば、メッシュ層を含むフラットシート）を指す。一部の実施形態では、メッシュは、手術が完了した後、メッシュの開口部から組織の成長を可能にして周囲の組織への付着を強化する柔軟なシートのクラスを指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「スカフォールド」という用語は、インビトロ及びインビボで周囲の組織の構造的支持体を提供する材料（例えば、細胞付着及び組織形成のために）を指す。一部の実施形態では、スカフォールドは、細胞を培養する（例えば、生存及び増殖させる）ことができるマトリックスである。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「相補的反応基」は、別の官能基と反応して化学結合を形成することが一般に知られている官能基を指す。例えば、１，２，３−トリアゾール環を形成する反応では、第１の反応性官能基がアジドである場合、相補的反応基は、アルキンである。他方では、第１の官能基がアルキンである場合、相補的反応性官能基は、アジドである。
【００７３】
本開示の方法
一部の実施形態では、本開示は、哺乳動物の臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化する方法であって、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基された栄養素を哺乳動物に投与するステップを含む方法を提供する。
【００７４】
一部の実施形態では、本開示は、哺乳動物の臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化する方法であって、（ｉ）臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化するための哺乳動物を選択するステップと、（ｉｉ）哺乳動物に栄養素を投与するステップであって、栄養素は、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基される、ステップとを含む方法を提供する。
【００７５】
一部の実施形態では、本開示は、哺乳動物の臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化する方法であって、（ｉ）臓器又は組織を採取するステップと、（ｉｉ）生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基された栄養素を含む培地を用いて臓器又は組織を培養するステップとを含む方法を提供する。
【００７６】
一部の実施形態では、本開示は、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドを提供する。
【００７７】
一部の実施形態では、本開示は、細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドであって、脱細胞化スカフォールドの細胞外マトリックスは、生物活性分子で化学選択的に官能基化される、脱細胞化スカフォールドを提供する。
【００７８】
一部の実施形態では、本開示は、生物活性分子で生体直交的に官能基化された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドを調製する方法であって、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドを、官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基された生物活性分子と反応させるステップを含む方法を提供する。
【００７９】
一部の実施形態では、本開示は、生物学的補綴メッシュを調製する方法であって、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドを、官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基された生物活性分子と反応させるステップを含む方法を提供する。
【００８０】
一部の実施形態では、本開示は、移植のための臓器又は組織を調製する方法であって、（ｉ）生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基された栄養素をドナー対象に投与するステップと、（ｉｉ）ドナー対象から手術により臓器又は組織を取り出すステップと、（ｉｉｉ）摘出された臓器又は組織を、官能基化された栄養素の反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子を含む保存液で処理するステップとを含む方法を提供する。
【００８１】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のように生物活性分子で官能基化される、移植のための臓器又は組織を提供する。
【００８２】
生体直交型化学反応において反応性の化学基で官能基化された栄養素
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基された栄養素は、炭水化物（例えば、糖）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂肪酸、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はトリグリセリドである。例えば、栄養素は、天然アミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン若しくはバリン）又は非天然アミノ酸（例えば、ホルミルメチオニン、セレノシステイン、ピロリシン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ｐ−アミノ安息香酸、アミノレブリン酸、デヒドロアラニン、アミノ酪酸、ランチオニン、アロイソロイシン、ノルバリン、オルニチン、アロトレオニン若しくはサルコシン）であり得る。一部の実施形態では、栄養素は、約２〜約５０アミノ酸を含むペプチドである。一部の実施形態では、栄養素は、５つ以上、１０以上、１５以上、２０以上又は２５以上のアミノ酸を含むペプチドである。別の例では、栄養素は、タンパク質である。一部の実施形態では、ペプチド又はタンパク質は、本明細書に記載するアミノ酸のいずれか１つを含み得る。
【００８３】
別の例では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基された栄養素は、脂肪酸（例えば、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキジン酸、ヘンイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、セロチン酸、ヘプタコシル酸、モンタン酸、ノナコシル酸、メリシン酸、ヘナトリアコンチル酸、ラセロイン酸、プシリン酸、ゲジン酸、セロプラスチン酸、ヘキサトリアコンチル酸、ヘプタトリアコンタン酸若しくはオクタトリアコンタン酸などの飽和脂肪酸；又は例えばクロトン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸若しくはネルボン酸などのモノ不飽和脂肪酸；又は例えばリノール酸、エイコサジエン酸若しくはドコサジエン酸などのジ不飽和脂肪酸；又は例えばリノレン酸、ピノレン酸、エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ−γ−リノール酸若しくはエイコサトリエン酸などのトリ不飽和脂肪酸；又は例えばステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸若しくはアドレン酸などのテトラ不飽和脂肪酸；又は例えばボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド、イワシ酸若しくはテトラコサノールペンタエン酸などのペンタ不飽和脂肪酸；又は例えばドコサヘキサエン酸若しくはニシン酸などのヘキサ不飽和脂肪酸）であり得る。別の例では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、トリグリセリド（例えば、本明細書に記載するグリセロール及び３つの脂肪酸から構成されるエステル）であり得る。一部の実施形態では、トリグリセリドは、グリセロール及びオレイン酸、パルミチン酸及びステアリン酸のエステルである。
【００８４】
別の例では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、糖（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）などの炭水化物であり得る。一部の実施形態では、単糖は、アラビノース、リキソース、リボース、リズロース、キシルロース若しくはキシロースなどのペントース（例えば、Ｄ−若しくはＬ−ペントース）である。一部の実施形態では、単糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース若しくはタガトースなどのヘキソース（例えば、Ｄ−若しくはＬ−ヘキソース）である。一部の実施形態では、二糖は、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、キトビオース、コジビオース、ニゲロース、イソマルトース、β，β−トレハロース、α，β−トレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ルチノース、ルチヌロース又はキシロビオースである。
【００８５】
別の例では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、核酸（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ））であり得る。
【００８６】
別の例では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、ヌクレオシドであり得る。一部の実施形態では、ヌクレオシドは、リボヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、５−メチルウリジン、ウリジン又はシチジン）である。一部の実施形態では、ヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシド（例えば、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン又はデオキシシチジン）である。別の例では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、ヌクレオチド（例えば、本明細書に記載するヌクレオシドのいずれか１つの一リン酸塩、二リン酸塩又は三リン酸塩）であり得る。例えば、ヌクレオチドは、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ又はＵＴＰであり得る。
【００８７】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された単糖は、アミノ糖又はその誘導体（例えば、ガラクトサミン、グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ダウノサミン、ノイラミン酸、シアル酸、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、β−Ｄ−ガラクトサミン五酢酸塩、β−Ｄ−グルコサミン五酢酸塩又はβ−Ｄ−マンノサミン五酢酸塩）である。一例では、単糖は、スルホキノボースである。
【００８８】
一部の実施形態では、化学基は、ヒュスゲン環化付加（トリアゾールを形成するアルキン及びアジドの［３＋２］環化付加又は「クリック」反応としても知られる）で反応性の化学基のいずれか１つである。一部の実施形態では、化学基は、シュタウディンガーライゲーション反応（すなわちアジドとホスフィンとの反応）、トリアゾールを形成するオキサノルボルナジエンとアジドとの反応、テトラジン（例えば、ジピリジルテトラジン）とトランス−シクロチンとの逆電子要請型ディールス・アルダー（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ）反応、テトラジン（例えば、モノアリールテトラジン）とノルボルネンとの逆電子要請型ディールス・アルダー反応、テトラジンとシクロプロペンとの反応、シクロプロペンとニトリルイミンとの反応、テトラゾールとアルケンとの光誘導性１，３−双極性環化付加、ニトリルオキシドとノルボルネンとの１，３−双極性環化付加、イソシアニドとテトラジンとの［４＋１］環化付加又はニトロンとアルキンとの１，３−環化付加において反応性の化学基のいずれか１つである。
【００８９】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基は、アジド（−Ｎ３）、アルキン（例えば、−Ｃ≡ＣＨ）、シクロオクチン、シクロオクテン、ニトロン、イソシアニド、シクロプロペン、ノルボレン、ジフェニルホスフィン、ニトリルイミン、テトラゾール、ニトリルオキシド又はテトラジンである。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基は、アジド（−Ｎ３）又はアルキンである。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基は、アジド（−Ｎ３）である。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基は、アルキンである。
【００９０】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、Ｌ−アジドオアラニン、Ｌ−アジドホモアラニン、Ｌ−ホモプロパルギルグリシン、（２Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−５−アジド−ペンタン酸、（Ｒ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−（２’−プロピニル）アラニン、（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−（２’−プロピニル）アラニン、（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−（４’−アジドブチル）アラニン、（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−（５’−アジドペンチル）アラニン、（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−（６’−アジドヘキシル）アラニン、２−アミノ−３−メルカプト−Ｎ−（プロプ−２−イニル）プロピオンアミド、２−アミノ−Ｎ−（３−アジドプロピル）−３−メルカプトプロピオンアミド、Ｂｏｃ−Ｄ−プロパルギルグリシン、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＯＨ、Ｂｏｃ−アジドリシン、Ｆｍｏｃ−４−アジドフェニルアラニン及びＦｍｏｃ−Ｄ−プロパルギルグリシンから選択される。
【００９１】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１５），１−１２（その開示内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているアジド修飾ＲＮＡ分子のいずれか１つである。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、３’−末端アジド修飾ＲＮＡ（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０１４  Ｊａｎ  １５；２５（１）：１８８−１９５（その開示内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される通り）である。
【００９２】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、アジドヌクレオシドである。一部の実施形態では、アジドヌクレオシドは、３’−アジド−３’−デオキシチミジン又は下記の式：
【化１】
2019527040.tif 000002
の化合物である。
【００９３】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、アルキンヌクレオシドである。一部の実施形態では、アルキンヌクレオシドは、（２’Ｓ）−２’−デオキシ−２’−フルオロ−５−エチニルウリジン、５−エチニル−２’−デオキシシチジン又は５−エチニル−２’−デオキシウリジンである。
【００９４】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、アジドヌクレオチドである。一部の実施形態では、アジドヌクレオチドは、８−アジド−ＡＭＰ、８−アジド−ＡＤＰ、８−アジド−ＡＴＰ、γ−（２−アジドエチル）−ＡＴＰ、γ−（６−アジドヘキシル）−ＡＴＰ、γ−［（６−アジドヘキシル）−イミド］−ＡＴＰ、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−ＡＴＰ、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−３’−ｄＡＴＰ、Ｎ６−（６−アジド）ヘキシル−ｄＡＴＰ、５−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ｄＣＴＰ、５−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ｄＵＴＰ、３’−アジド−２’，３’−ｄｄＡＴＰ、アジド−ＰＥＧ４−アミノアリル−ｄＵＴＰ、５−アジド−Ｃ３−ＵＴＰ、５−アジド−ＰＥＧ４−ＵＴＰ、５−アジド−ＰＥＧ４−ＣＴＰ、ｐＣｐ−アジド、ＡｚＴＭＰ、ＡｚＴＴＰ、２’−アジド−２’−デオキシデノシン−５’−三リン酸塩、２’−アジド−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸塩、２’−アジド−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸塩又は２’−アジド−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸塩である。
【００９５】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、アルキンヌクレオチドである。一部の実施形態では、アルキンヌクレオチドは、Ｎ６−プロパルギル−ＡＴＰ、５−ＴＣＯ−ＰＥＧ４−ｄＵＴＰ、５−トランス−シクロオクテン−ＰＥＧ４−ＵＴＰ、γ−［（プロパルギル）−イミド］−ＡＴＰ、γ−プロパルギル−ＡＴＰ、γ−［（プロパルギル）−イミド］−ＡＴＰ、２−エチニル−ＡＴＰ（２−ＥＡＴＰ）、Ｃ８−アルキン−ｄＣＴＰ、Ｃ８−アルキン−ｄＵＴＰ、５−エチニル−ＵＴＰ（５−ＥＵＴＰ）又は５−エチニル−ｄＵＴＰ（５−ＥｄＵＴＰ）である。
【００９６】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、アジド脂肪酸（例えば、ωアジド脂肪酸）又はアルキニル脂肪酸である。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、式Ｚ−（Ｙ）ｘＣＯＯＲの脂肪酸誘導体であり、ここで、Ｙは、−ＣＨ２−又は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｚは、−Ｎ３又はアルキニルであり、ｘは、１〜２０の整数であり（例えば、ｎは、６又は７である）、Ｒは、Ｈ又はＣ１〜６アルキルである。一部の実施形態では、アジド脂肪酸又はアルキニル脂肪酸は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００９，８６，１１１５−１１２１に記載されるアジド脂肪酸又はアルキニル脂肪酸のいずれか１つである。
【００９７】
一部の実施形態では、アジド脂肪酸は、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２０１５，１６（１１），１５８８−１５９１（その開示内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているアジド脂肪酸のいずれか１つである。一部の実施形態では、アジド脂肪酸は、１２−アジドドデカン酸、１１−アジドウンデカン酸、９−アジドノナン酸、１３−アジドトリデカン酸、５−（１−アジド−ヘキサン−６−チア）ペンタン酸、２−（１−アジド−ノナン−９−チア）酢酸、４−（１−アジド−オクタン−６−チア）プロピオン酸、９−（１−アジド−エタン−２−オキサ）ノナン酸、８−（１−アジド−プロパン−３−オキサ）オクタン酸、５−（１−アジド−ヘキサン−６−オキサ）ペンタン酸及び２−（１−アジド−ノナン−９−オキサ）酢酸から選択される。一部の実施形態では、アルキニル脂肪酸は、１５−ヘキサデシン酸、１７−オクタデシン酸及び５Ｚ、８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ−エイコサテトラエン−１９−イン酸から選択される。
【００９８】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、アルキニルサッカリド（例えば、アルキニル糖）である。一部の実施形態では、アルキニルサッカリドは、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８８７号明細書（その開示内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているアルキニルサッカリドのいずれか１つである。一部の実施形態では、アルキニルサッカリドは、アルキニルフコース及びアルキニルＭａｎＮＡｃから選択される。
【００９９】
一部の実施形態では、アルキニルフコースは、下記の式：
【化２】
2019527040.tif 000003
の１，２，３，４−テトラアセチルアルキニルフコースである。
【０１００】
一部の実施形態では、アルキニルＭａｎＮＡｃは、下記の式：
【化３】
2019527040.tif 000004
の１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｎ−４−ペンチノイルマンノサミンである。
【０１０１】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、アルキン標識ガラクトサミン、アルキン標識グルコサミン又はアルキン標識マンノサミンである。
【０１０２】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、１−アジド−１−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−アジド−Ｄ−ガラクトース五酢酸塩、６−アジド−６−デオキシ−Ｄ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノピラノシルアジド五酢酸塩、２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−キシロピラノシルアジド、２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グリコピラノシルアジド、２−アジド−β−Ｄ−グルコース五酢酸塩、６−アジド−６−デオキシ−Ｄ−グルコース、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノース、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース、１，６−アンヒドロ−２−アジド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、１，６−アンヒドロ−２−アジド−４−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、１，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノース、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルアジド、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルアジド、２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−アジド−１−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラヌロン酸メチルエステル、２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−６−アジド−６−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシルアジド、２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−６−アジド−６−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシルアミン、２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシルアジド、２−アジド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノース１，３，４，６−五酢酸塩、２−アジド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース１，３，４，６−五酢酸塩、２−クロロ−４−ニトロフェニル２−アジド−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−フルオロ−４−ニトロフェニル２−アジド−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−Ｏ−アセチル−１，６−アンヒドロ−２−アジド−２’，３’−ジ−Ｏ−ベンジル−４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−β−Ｄ−セロビオース、３−Ｏ−アセチル−２−アジド−２’，３’−ジ−Ｏ−ベンジル−４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−セロビオサン、６，６’−ジアジド−６，６’−ジデオキシ−α，α−Ｄ−トレハロース、６−アジド−６−デオキシ−２’、３’−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｌ−ソルボフラノース、６−アジド−６−デオキシ−Ｄ−ガラクトース、６−アジド−６−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース、６−アジド−６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース、６−アジド−６−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル６−アジド−６−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド、６−アジド−６−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシルアミン、６−アジド−Ｄ−フコース、６−アジド−Ｌ−フコース、６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３，４−ジ−ベンジル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース、メチル（６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）メチル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ���グルコピラノシルウロネート−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−メチル２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−イドピラノシルウロネート−（１→４）−６−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド、メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラヌロノシルアジド、メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−６−アジド−６−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド、α−Ｄ−マンノピラノシルアジド、α−Ｄ−キシロピラノシルアジド、β−Ｄ−グルコピラノシルアジド及びβ−Ｄ−キシロピラノシルアジドから選択される。
【０１０３】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、アジド標識ガラクトサミン、アジド標識グルコサミン又はアジド標識マンノサミンである。
【０１０４】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、テトラアシル化Ｎ−アジドアセチルグルコサミン（Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ）：
【化４】
2019527040.tif 000005
である。
【０１０５】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、テトラアシル化Ｎ−アジドアセチルマンノサミン（Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ）：
【化５】
2019527040.tif 000006
である。
【０１０６】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、テトラアシル化Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ）：
【化６】
2019527040.tif 000007
である。
【０１０７】
インビボでの代謝臓器標識（動物給餌）
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、経口、直腸、鼻、局所（口腔及び舌下を含む）又は非経口（腹腔内、皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）経路で哺乳動物に投与され得る。一部の実施形態では、栄養素は、食物と一緒に、又は薬学の分野において公知である任意の方法により調製され得る単位剤形（例えば、錠剤、カプセル、小袋、粉末、顆粒、徐放性カプセル又はリポソーム）として哺乳動物に投与され得る。経口投与される場合、栄養素は、ラクトース及びトウモロコシデンプンなどの一般に使用される担体と一緒に投与され得る。必要に応じて、一般的な甘味料、及び／又は香味料、及び／又は着色料を添加し得、当技術分野で周知の様々な希釈剤及び賦形剤を用い得る（例えば、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝剤物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー及びポリエチレングリコール）。
【０１０８】
一部の実施形態では、筋肉内、静脈内、腹腔内（ｉ．ｐ．）又は皮下注射によって哺乳動物に栄養素を投与し得る。一部の実施形態では、腹腔内注射によって栄養素を投与し得る。注射（例えば、腹腔内又は皮下注射）に好適な組成物は、製剤を対象のレシピエントの血液と等張性にする抗酸化剤、バッファー、静菌薬及び溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射液、並びに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。滅菌注射調製物は、例えば、１，３−ブタンジオール溶液など、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射液又は懸濁液でもあり得る。一部の実施形態では、溶媒は、水、ＤＭＳＯ又はそれらの混合物（例えば、約１０／９０、約２０／８０、約３０／７０、約４０／６０、約５０／５０、約６０／４０、約７０／３０、約８０／２０又は約９０／１０ＤＭＳＯ／水）である。使用することができる他の許容されるビヒクル及び溶媒として、マンニトール、リンガー液及び等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌の不揮発性油が、通常、溶媒又は懸濁媒として使用される。この目的のために、合成モノ−又はジグリセリドを含むいずれの非刺激性の不揮発性油も使用し得る。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、注射液の調製に有用であり、天然の薬学的に許容される油、例えばオリーブ油又はひまし油など、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンも同様である。これらの油溶液又は懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤も含有し得る。
【０１０９】
一部の実施形態では、栄養素は、吸入又は噴霧療法（例えば、気管内、鼻内投与又は肺経路による送達）によって哺乳動物に投与され得る。一部の実施形態では、栄養素は、スプレー又はエアロゾル（例えば、鼻エアロゾル又は吸入器）によって投与され得る。栄養素を含む吸入及び／又は噴霧療法のための組成物（並びにこれらの組成物の投与のための装置）は、医薬製剤の分野で公知の方法及び技術に従って調製することができ、またベンジルアルコール若しくは他の好適な保存料、バイオアベイラビリティを増大するための吸収促進剤、フルオロカーボン、推進剤（例えば、ブタン若しくはプロパン）及び／又は当技術分野で知られる他の溶解剤若しくは分散剤を使用して、溶液（例えば、水性若しくは塩溶液）、固体製剤として（例えば、本明細書に記載のいずれか１つの賦形剤として）調製され得る。例えば、Ａｌｅｘｚａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡されたＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＪＤ  ａｎｄ  Ｚａｆｆａｒｏｎｉ  ＡＣ、米国特許第６，８０３，０３１号明細書を参照されたい。一部の実施形態では、栄養素の粒径は、吸入投与のために縮小される。一部の実施形態では、粒径は、栄養素を乾式粉砕又は湿式粉砕（例えば、ボールミル、ジェットミル、ピンミル、流体エネルギーミル、ロッドミル、ローラミル、クラッシャーミル、ｓｐｅｘ型ミル、ａｔｔｒｉｔｏｒ型ミル、ｓｉｅｂｔｅｃｈｎｉｋミル、ｓｉｍｏｌｏｙｅｒミル又はｈｉｃｏｍミルを用いて）により縮小することができる。一部の実施形態では、栄養素の粒径は、粒子体積平均に基づいて約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約９００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約８００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約７０ｎｍ〜約４００ｎｍ、約７０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約２００ｎｍである。）。一部の実施形態では、粒子体積平均に基づく栄養素の粒径は、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ又は約１０００ｎｍである。一部の実施形態では、粒子体積平均に基づく栄養素の粒径は、約１μｍ〜約１００μｍ、約１μｍ〜約９０μｍ、約１μｍ〜約８０μｍ、約１μｍ〜約７０μｍ、約１μｍ〜約６０μｍ、約１μｍ〜約５０μｍ、約１μｍ〜約４０μｍ、約１μｍ〜約３０μｍ、約１μｍ〜約２０μｍ又は約１μｍ〜約１０μｍである。一部の実施形態では、粒子体積平均に基づく栄養素の粒径は、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約７５μｍ、約１００μｍ、約１５０μｍ又は約２００μｍである。栄養素の粒径は、同等球形粒子体積に基づく中央粒径として決定される中央粒径である。「中央」は、集団の５０％がその粒径より大きいか又は小さい、集団を半分ずつに分割する粒径を表す。
【０１１０】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素の用量は、約１００ｍｇ〜約１０００ｇ、約１００ｍｇ〜約９００ｇ、約１００ｍｇ〜約８００ｇ、約１００ｍｇ〜約７００ｇ、約１００ｍｇ〜約６００ｇ、約１００ｍｇ〜約５００ｇ、約１００ｍｇ〜約４００ｇ、約１００ｍｇ〜約３５０ｇ、約１００ｍｇ〜約３００ｇ、約１００ｍｇ〜約２００ｇ、約１００ｍｇ〜約１００ｇ、約１００ｍｇ〜約５０ｇ、約１００ｍｇ〜約４０ｇ、約１００ｍｇ〜約３０ｇ、約１００ｍｇ〜約２０ｇ、約２００ｍｇ〜約１５ｇ、約３００ｍｇ〜約１０ｇ、約４００ｍｇ〜約９ｇ、約５００ｍｇ〜約８ｇ、約６００ｍｇ〜約７ｇ、約７００ｍｇ〜約６ｇ、約８００ｍｇ〜約５ｇ、約９００ｍｇ〜約４ｇ又は約１ｇ〜約３ｇであり得る。一部の実施形態では、用量は、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１ｇ、約２ｇ、約３ｇ、約４ｇ、約５ｇ、約６ｇ、約７ｇ、約８ｇ、約９ｇ、約１０ｇ、約１５ｇ、約２０ｇ、約２５ｇ、約３０ｇ、約４０ｇ、約５０ｇ、約６０ｇ、約７０ｇ、約８０ｇ、約９０ｇ、約１００ｇ、約１５０ｇ、約２００ｇ、約２５０ｇ、約３００ｇ、約３５０ｇ、約４００ｇ、約５００ｇ、約６００ｇ、約７００ｇ、約８００ｇ、約９００ｇ又は約１０００ｇである。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素の対象の体重当たりの用量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約７．５ｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５ｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約４ｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約３ｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ〜約２ｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、約２５０ｍｇ／ｋｇ〜約９００ｍｇ／ｋｇ、約３００ｍｇ／ｋｇ〜約８００ｍｇ／ｋｇ、約３５０ｍｇ／ｋｇ〜約７００ｍｇ／ｋｇ、約４００ｍｇ／ｋｇ〜約６００ｍｇ／ｋｇであり得る。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素の対象の体重当たりの用量は、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１２０ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１７５ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、約２２５ｍｇ／ｋｇ、約２５０ｍｇ／ｋｇ、約２７５ｍｇ／ｋｇ、約３００ｍｇ／ｋｇ、約３５０ｍｇ／ｋｇ、約４００ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ、約７５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｇ／ｋｇ、約２ｇ／ｋｇ、約３ｇ／ｋｇ、約４ｇ／ｋｇ、約５ｇ／ｋｇ、約６ｇ／ｋｇ、約７ｇ／ｋｇ、約８ｇ／ｋｇ、約９ｇ／ｋｇ又は約１０ｇ／ｋｇであり得る。一部の実施形態では、栄養素の用量は、約３００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１１１】
一部の実施形態では、栄養素は、１日１回、１日２回又は１日３回投与する。一部の実施形態では、栄養素は、１日１回投与する。
【０１１２】
一部の実施形態では、栄養素が腹腔内注射により投与される場合、注射量は、約１００μＬ〜約２０００ｍＬ、約１００μＬ〜約１９００ｍＬ、約１００μＬ〜約１８００ｍＬ、約１００μＬ〜約１７５０ｍＬ、約１００μＬ〜約１７００ｍＬ、約１００μＬ〜約１６００ｍＬ、約１００μＬ〜約１５００ｍＬ、約１００μＬ〜約１２５０ｍＬ、約１００μＬ〜約１０００ｍＬ、約１００μＬ〜約９００ｍＬ、約１００μＬ〜約８００ｍＬ、約１００μＬ〜約７００ｍＬ、約１００μＬ〜約６００ｍＬ、約１００μＬ〜約５００ｍＬ、約１００μＬ〜約４００ｍＬ、約１００μＬ〜約３００ｍＬ、約１００μＬ〜約２００ｍＬ、約１００μＬ〜約１５０ｍＬ、約１００μＬ〜約１００ｍＬ、約１００μＬ〜約５０ｍＬ、約１００μＬ〜約４０ｍＬ、約１００μＬ〜約２０ｍＬ、約１００μＬ〜約１５ｍＬ、約１５０μＬ〜約１２ｍＬ、約２００μＬ〜約１０ｍＬ、約２５０μＬ〜約５ｍＬ、約３００μＬ〜約４ｍＬ、約４００μＬ〜約３ｍＬ、約５００μＬ〜約２ｍＬ、約５００μＬ〜約１ｍＬである。一部の実施形態では、注射量は、約５０μＬ、約１００μＬ、約１５０μＬ、約２００μＬ、約２５０μＬ、約３００μＬ、約５００μＬ、約１ｍＬ、約２ｍＬ、約４ｍＬ、約７．５ｍＬ又は約１０ｍＬである。
【０１１３】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、エンドポイント臓器又は組織採取前の約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日間にわたって哺乳動物に投与され得る。一部の実施形態では、栄養素は、約３日〜約７日間にわたって哺乳動物に投与され得る。一部の実施形態では、栄養素は、約３日間にわたって哺乳動物に投与され得る。他の実施形態では、栄養素は、約７日間にわたって哺乳動物に投与され得る。
【０１１４】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚであり、栄養素は、約３日〜約７日間、約７０％水性ＤＭＳＯ中約３００ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回腹腔内注射によって哺乳動物に投与される。
【０１１５】
エクスビボでの代謝臓器標識（臓器培養）
一部の実施形態では、哺乳動物の非官能基化摘出臓器又は組織（例えば、臓器又は組織の細胞外マトリックス）を官能基化するために、本明細書に記載される生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素を含む培地を用いて摘出臓器又は組織を培養し得る。
【０１１６】
本明細書に記載される臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化するために、細胞増殖を持続し且つ促進する当技術分野で公知のあらゆる増殖又は培地を用い得る。一部の実施形態では、培地は、水性溶媒、電解質（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３）、栄養素（例えば、アミノ酸（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸のいずれか１つ）、グルコース）、ビタミン（例えば、葉酸、ニコチンアミド、リボフラビン、Ｂ１２）、鉱物（例えば、鉄、マグネシウム）又はグルタミン（例えば、Ｌ−グルタミン）を含む。一部の実施形態では、培地は、ヒトアルブミン、ヘタスターチ、デキストラン、ピリドキシン又はピリドキサールを含む。一部の実施形態では、培地は、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２栄養素混合物を含む。一部の実施形態では、培地は、塩化カルシウム二水和物、硫酸銅五水和物、硫酸鉄七水和物、無水塩化マグネシウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、無水リン酸ナトリウム二塩基性、硫酸亜鉛四水和物、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、無水Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン塩酸塩、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩、Ｌ−バリン、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−Ｃａ−パントテン酸塩、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２、ｉ−イノシトール（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、Ｄ−グルコース、ヒポキサンチンナトリウム塩、リノール酸、リポ酸、フェノールレッドナトリウム塩、プトレシン二塩酸塩、ピルビン酸ナトリウム及びチミジンから選択される化合物を含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、培地は、約１０ｍｇ／Ｌ〜約１００００ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ〜約９０００ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ〜約８０００ｍｇ／Ｌ、約４０ｍｇ／Ｌ〜約７０００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ〜約６０００ｍｇ／Ｌ、約６０ｍｇ／Ｌ〜約５０００ｍｇ／Ｌ、約７０ｍｇ／Ｌ〜約４０００ｍｇ／Ｌ、約８０ｍｇ／Ｌ〜約３０００ｍｇ／Ｌ、約９０ｍｇ／Ｌ〜約２０００ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約２００ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約３００ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約４００ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約６００ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌ、約２０００ｍｇ／Ｌ〜約６０００ｍｇ／Ｌ、約３０００ｍｇ／Ｌ〜約５０００ｍｇ／Ｌ又は約３５００ｍｇ／Ｌ〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度でグルコースを含む。一部の実施形態では、培地は、約５００ｍｇ／Ｌ、約６００ｍｇ／Ｌ、約７００ｍｇ／Ｌ、約８００ｍｇ／Ｌ、約９００ｍｇ／Ｌ、約１０００ｍｇ／Ｌ、約２０００ｍｇ／Ｌ、約３０００ｍｇ／Ｌ、約４０００ｍｇ／Ｌ、約４５００ｍｇ／Ｌ又は約５０００ｍｇ／Ｌの濃度でグルコースを含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、培地は、約０．１ｇｍ／Ｌ〜約１．１ｇｍ／Ｌ、約０．２ｇｍ／Ｌ〜約１．０ｇｍ／Ｌ、約０．３ｇｍ／Ｌ〜約０．９ｇｍ／Ｌ、約０．４ｇｍ／Ｌ〜約０．８ｇｍ／Ｌ又は約０．５ｇｍ／Ｌ〜約０．７ｇｍ／Ｌの濃度でＬ−グルタミンを含む。一部の実施形態では、培地は、約０．１ｇｍ、約０．２ｇｍ、約０．３ｇｍ／Ｌ、約０．４ｇｍ／Ｌ、約０．５ｇｍ／Ｌ、約０．６ｇｍ／Ｌ又は約０．７ｇｍ／Ｌの濃度でＬ−グルタミンを含む。一部の実施形態では、Ｌ−グルタミンの濃度は、約０．５８４ｇｍ／Ｌである。
【０１１９】
一部の実施形態では、培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む。一部の実施形態では、培地中のＦＢＳの濃度（ｗ／ｗ％）は、約１％〜約３０％、約５％〜約２０％又は約１０％〜約１５％である。一部の実施形態では、培地中のＦＢＳの濃度は、約５％、約１０％、約１５％又は約２０％である。
【０１２０】
一部の実施形態では、培地は、抗生物質（例えば、本明細書に記載される抗生物質のいずれか１つ）を含む。一部の実施形態では、抗生物質は、ペニシリン−ストレプトマイシンである。一部の実施形態では、抗生物質は、ゲンタマイシン−アムホテリシンＢである。一部の実施形態では、抗生物質がペニシリン−ストレプトマイシンであるとき、培地は、約１０単位／ｍＬ〜約５００単位／ｍｌのペニシリン及び約１０μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、約２０単位／ｍＬ〜約４００単位／ｍｌのペニシリン及び約２０μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、約３０単位／ｍＬ〜約３００単位／ｍｌのペニシリン及び約３０μｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、約４０単位／ｍＬ〜約２００単位／ｍｌのペニシリン及び約４０μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン又は約５０単位／ｍＬ〜約１００単位／ｍｌのペニシリン及び約５０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む。一部の実施形態では、抗生物質がペニシリン−ストレプトマイシンであるとき、培地は、約１００単位／ｍｌのペニシリン及び約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む。一部の実施形態では、抗生物質がゲンタマイシン−アムホテリシンＢであるとき、培地は、約１μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、約５μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び約０．１２μｇ／ｍｌ〜約０．４μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ又は約８μｇ／ｍｌ〜約１２μｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び約０．１５μｇ／ｍｌ〜約０．３５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢを含む。一部の実施形態では、抗生物質がゲンタマイシン−アムホテリシンＢであるとき、培地は、約１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び約０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢを含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、培地は、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素を含む。一部の実施形態では、培地中において生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、本明細書に記載の栄養素のいずれか１つである。一部の実施形態では、培地中の栄養素の濃度は、約１μＭ〜約１０００μＭ、約２μＭ〜約９００μＭ、約３μＭ〜約８００μＭ、約４μＭ〜約７００μＭ、約５μＭ〜約６００μＭ、約６μＭ〜約５００μＭ、約７μＭ〜約４００μＭ、約８μＭ〜約３００μＭ、約９μＭ〜約２００μＭ、約１０μＭ〜約１００μＭ、約２０μＭ〜約９０μＭ、約２５μＭ〜約８０μＭ、約３０μＭ〜約７０μＭ又は約４０μＭ〜約６０μＭである。一部の実施形態では、培地中の栄養素の濃度は、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約４５μＭ、約５０μＭ、約５５μＭ、約６０μＭ、約６５μＭ、約７０μＭ、約７５μＭ、ｖ、約８０μＭ、約８５μＭ、約９０μＭ又は約１００μＭである。
【０１２２】
一部の実施形態では、培地は、イーグル最少必須培地、グラスゴー最少必須培地、ロズウェルパーク記念研究所培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はダルベッコ／フォークト改変イーグル最少必須培地である。一部の実施形態では、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２である。
【０１２３】
一部の実施形態では、培地は、濃度約５０μＭのＡｃ４ＧａｌＮＡｚを含む。一部の実施形態では、培地は、約１０ｗ／ｗ％のウシ胎児血清、濃度約５０μＭのＡｃ４ＧａｌＮＡｚ及びペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００単位／ｍＬのペニシリンと１０，０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンとのストックの１：１００希釈物）又はゲンタマイシン−アムホテリシンＢ（５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢのストックの１：５００希釈物）を含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、臓器又は組織は、バイオリアクター内で培養する。一部の実施形態では、バイオリアクターは、臓器及び組織又はその断片を培養するうえで好適であることが当技術分野で知られている任意のバイオリアクターである。一部の実施形態では、バイオリアクターは、例えば、米国特許出願公開第２０１６／００５３２１３号明細書、米国特許第９，１２７，２４２号明細書、国際公開第２００９／００２７７２号明細書、米国特許出願公開第２００７／０２７５３６３号明細書又は同第２０１３／０１７７９７２号明細書（これらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているバイオリアクターのいずれか１つである。一部の実施形態では、臓器又は組織の培養に用いることができるバイオリアクターは、図２１に描かれている。図２１を参照すると、バイオリアクターは、培地及び培地中の摘出臓器又は組織を含むチャンバーと、培地に酸素を供給する酸素供給コイルと、フィルターと、臓器又は組織への培地の連続的な供給のためのポンプ及びカニューレとを含む。ほとんどの臓器又は組織の場合、摘出臓器又は組織に供給する大動脈とカニューレを接続し得る。頸動脈のような血管の場合、カニューレを血管の一端に接続する。酸素供給コイルは、灌流液と周囲環境（インキュベータなど）との間で酸素及び二酸化炭素の効率的な交換をもたらす。ポンプは、定速の灌流を可能にする。一部の実施形態では、臓器又は組織の培養は、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素を含む培地を用いた臓器又は組織の灌流を含む。必要に応じて、灌流の速度を調節して、圧力制御された灌流を実施することもできる。チャンバーの内部と、インキュベータなどの周囲環境との間の圧力及びガス量を平衡させるためにフィルターが設けられる。
【０１２５】
一部の実施形態では、臓器又は組織を一定灌流速度の培地で灌流する。一部の実施形態では、培地の灌流速度は、約０ｍＬ／分〜約１０００ｍＬ／分、約１ｍＬ／分〜約９００ｍＬ／分、約２ｍＬ／分〜約８００ｍＬ／分、約３ｍＬ／分〜約７００ｍＬ／分、約４ｍＬ／分〜約６００ｍＬ／分、約５ｍＬ／分〜約５００ｍＬ／分、約６ｍＬ／分〜約４００ｍＬ／分、約７ｍＬ／分〜約３００ｍＬ／分、約８ｍＬ／分〜約２００ｍＬ／分、約９ｍＬ／分〜約１００ｍＬ／分又は約１０ｍＬ／分〜約１００ｍＬ／分である。一部の実施形態では、培地の灌流速度は、約０ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０ｍＬ／分〜約７．５ｍＬ／分、約０ｍＬ／分〜約５ｍＬ／分、約０ｍＬ／分〜約２．５ｍＬ／分又は約０。１ｍＬ／分〜約０．２ｍＬ／分である。一部の実施形態では、培地の灌流速度は、約０ｍＬ／分〜約５０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約１ｍＬ／分〜約３０ｍＬ／分、約２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分、約４ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分又は約５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、培地の灌流速度は、約０．１ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分、約１ｍＬ／分、約２ｍＬ／分、約５ｍＬ／分、約７．５ｍＬ／分、約１０ｍＬ／分、約１５ｍＬ／分又は約２０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、臓器は、ラット肺であり、灌流速度は、約５ｍＬ／分である。一部の実施形態では、臓器は、ヒト肺葉であり、灌流速度は、約１０ｍＬ／分である。一部の実施形態では、臓器は、ラット腹壁皮弁であり、灌流速度は、約０．２ｍＬ／分である。
【０１２６】
一部の実施形態では、臓器又は組織は、約１時間〜約１０日、約６時間〜約９日、約１２時間〜約８日、約１８時間〜約７日、約２４時間〜約６日の期間にわたって培養する。約２日〜約５日又は約３日〜約４日である。一部の実施形態では、臓器又は組織は、約１時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日又は約１週間にわたって培養する。
【０１２７】
臓器採取（死体臓器、移植のための臓器）
一部の実施形態では、臓器又は組織は、ヒト臓器又は組織である。一部の実施形態では、臓器又は組織は、非ヒト臓器又は組織である。一部の実施形態では、臓器若しくは組織又はその部分は、ウシ（例えば、動物界のウシ科（Ｂｏｖｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）、ウシ亜科（Ｂｏｖｉｄａｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ））、ブタ（例えば、動物界のイノシシ科（Ｓｕｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）、イノシシ亜科（Ｓｕｉｎａｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ））、霊長類（例えば、サル若しくは類人猿）、ヒツジ（例えば、動物界のウシ科（Ｂｏｖｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）、ヤギ亜科（Ｃａｐｒｉｎａｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ））、マウス（例えば、動物界のネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）、ネズミ亜科（Ｍｕｒｉｎａｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ））又はヒトの臓器又は組織である。臓器又は組織は、小型動物又は大型動物の臓器又は組織であり得る。一部の実施形態では、臓器又は組織は、マウス、ラット、ブタ（野生若しくは家畜）、イノシシ、ウシ、雄牛、バイソン、スイギュウ、ウサギ、ノウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ（例えば、家畜ヤギ）、ヒツジ（例えば、家畜ヒツジ）、ゴリラ、チンパンジー又はオランウータンの臓器又は組織である。一部の実施形態では、臓器又は組織は、雄又は雌の対象種から摘出する。一部の実施形態では、臓器又は組織は、成長中又は高齢の対象から摘出する。
【０１２８】
一部の実施形態では、臓器又は組織は、肢（例えば、腕などの上肢又は脚などの下肢）、骨、舌、胃、小腸（例えば、十二指腸、空腸、回腸）、大腸、肝臓、胆嚢、膵臓、気管、肺（例えば、右肺又は左肺）、気管支、横隔膜、腎臓、膀胱、卵管、子宮、血管、リンパ管、動脈（例えば、大動脈、肺動脈、臍動脈、腕頭動脈、頸動脈、鎖骨下動脈）、静脈（例えば、下大静脈、腹静脈、鎖骨下静脈）、脾臓、心臓、軟骨、筋肉組織（例えば、平滑筋、心筋、骨格筋）、軟骨、上皮、腱、靭帯及び皮膚（例えば、皮弁）からなる群から選択される。一部の実施形態では、臓器又は組織は、頸動脈、肺、心臓、肝臓、腎臓及び皮膚からなる群から選択される。
【０１２９】
ヒト及び動物ドナー対象からドナー臓器（例えば、肺）を摘出するための方法及び材料は、当技術分野で公知である。対象の性別、年齢及び一般的健康状態、場合により他の治療処置に応じて、熟練した外科医は、臓器又は組織を手術により取り出す（例えば、摘出する）うえで適切な時機、方法及び／又は器具を選択することができるであろう。例えば、適切な方法は、Ｐａｓｑｕｅ  ＭＫ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｉｎｇ  ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｏｒｇａｎ  ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．２０１０  Ｊａｎ；１３９（１）：１３−７．及びＢｒｉｂｒｉｅｓｃｏ  ＡＣ  ｅｔ  ａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ（Ｅｌｉｔｅ  Ｅｄ）．２０１３  Ｊａｎ  １；５：２６６−７２に記載されている。本明細書に記載される臓器又は組織を摘出するのに適切な任意の方法を使用することができる。
【０１３０】
脱細胞化組織及び臓器スカフォールドの調製
一部の実施形態では、哺乳動物の臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化する方法は、（ｉ）本明細書に記載される生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素を哺乳動物に投与するステップを含み、且つ（ｉｉ）本明細書に記載される臓器又は組織を摘出するステップと、（ｉｉｉ）臓器又は組織を脱細胞化して、臓器又は組織の官能基化された細胞外マトリックスを含む脱細胞化スカフォールドを取得するステップとをさらに含む。
【０１３１】
一部の実施形態では、哺乳動物の臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化する方法は、（ｉ）臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化するための哺乳動物を選択するステップと、（ｉｉ）本明細書に記載される生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素を哺乳動物に投与するステップとを含み、且つ（ｉｉｉ）本明細書に記載される臓器又は組織を摘出するステップと、（ｉｖ）臓器又は組織を脱細胞化して、臓器又は組織の官能基化された細胞外マトリックスを含む脱細胞化スカフォールドを取得するステップとをさらに含む。
【０１３２】
一部の実施形態では、哺乳動物の臓器又は組織の細胞外マトリックスを官能基化する方法は、（ｉ）本明細書に記載される臓器又は組織を採取するステップと、（ｉｉ）本明細書に記載される生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素を含む培地を用いて、臓器又は組織を培養するステップとを含み、且つ（ｉｉｉ）臓器又は組織を脱細胞化して、臓器又は組織の官能基化された細胞外マトリックスを含む脱細胞化スカフォールドを取得するステップとをさらに含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、臓器又は組織は、脱細胞化臓器又は組織マトリックスを調製するための当技術分野で公知の方法及び材料を用いて脱細胞化され得る。そうしたマトリックスを調製するために、いずれか適切な材料を使用することができる。一部の実施形態では、臓器又は組織マトリックスは、脱細胞化臓器又は組織から作製した無細胞組織スカフォールドであり得る。例えば、ヒト肺、例えばヒト肺の一方若しくは両方の肺又はその部分、或いは例えばヒト、ブタ、ウシ、霊長類又はヒツジ死体の肺又はその部分などの組織を適切な方法により脱細胞化して、組織又は組織部分の形態学的完全性及び血管系を維持すると共に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を保存しながら、組織からネイティブ細胞を除去することができる。哺乳動物臓器及び組織を脱細胞化する方法は、例えば、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｕｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｆｏｒ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．２０１３  Ｓｅｐ；９６（３）：１０４６−５５；Ｎｉｃｈｏｌｓ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ  ｐｉｇ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．２０１３  Ｓｅｐ；１９（１７−１８）：２０４５−６２；Ｇｉｌｐｉｎ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｕｎｇｓ：Ｂｒｉｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃａｌｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ；Ｓｏｎｇ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｌｕｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１２  Ｆｅｂ；１２（２）：２８３−８；Ｇｕｙｅｔｔｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｏｒｇａｎｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ９，１４５１−１４６８（２０１４），Ｏｔｔ  ＨＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｌｕｎｇ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１０  Ａｕｇ；１６（８）：９２７−３３；国際公開第２０１６／０３６７６４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５／０３０６１４８号明細書、国際公開第２０１４／００８８４４号パンフレット、米国特許第８，４７０，５２０号明細書、同第８，７９０，９２０号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２５６５８８号明細書、米国特許第６，４７９，０６４号明細書、国際公開第２００２／０４０６３０号パンフレット、米国特許出願公開第２００２／０１１５２０８号明細書、米国特許第６，７５３，１８１号明細書、米国特許出願公開第２０１５／０３４４８４２号明細書、同第２０１５／０２３８６５６号明細書、同第２０１１／００４５５６６号明細書、同第２００８／００９５６６２号明細書及び���第２００７／０２４４５６８号明細書に記載されており、これらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的な脱細胞化方法は、例えば、液体窒素を用いて反復凍結解凍サイクルに組織（例えば、肺組織）を付すことを含み得る。他の場合、組織をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）、３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＴｒｉｔｏｎＸなどのアニオン又はイオン系細胞破壊培地に付す（例えば、培地で灌流する）ことができる。また、組織は、ヌクレアーゼ溶液（例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ）又はホスホリパーゼ溶液で処理して（例えば、灌流して）、穏やかに攪拌しながら滅菌リン酸緩衝食塩水で洗浄され得る。例示的な方法は、当技術分野において公知であり、例えばＯ’Ｎｅｉｌｌ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｕｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｆｏｒ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．２０１３  Ｓｅｐ；９６（３）：１０４６−５５に見出される。一部の実施形態では、脱細胞化は、当技術分野で公知の方法及び材料を用いて臓器又は組織の血管、管路及び／又は空洞をフラッシングすることによって実施することができる。例えば、Ｍａｇｈｓｏｕｄｌｏｕ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏ−ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ａ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  ｉｎｔｒａ−ｔｒａｃｈｅａｌ  ｆｌｏｗ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１３  Ｓｅｐ；３４（２８）：６６３８−４８に記載されている通りである。フラッシングステップ後、前述した細胞破壊培地、例えば脱イオン水中１％ＳＤＳで導管を介して臓器又は組織を灌流することができる。組織を通過する灌流は、順行性又は逆行性のいずれでもあり得、灌流効率を向上させるために方向を交互に変え得る。臓器又は組織のサイズ及び重量、並びに具体的なアニオン又はイオン系デタージェント、並びに細胞破壊培地中のアニオン又はイオン系デタージェントの濃度に応じて、一般に、組織１０グラム当たり約２〜約１２時間にわたり細胞破壊培地で組織を灌流する。洗浄を含め、組織１０グラム当たり最大約１２〜約７２時間にわたって組織を灌流することができる。灌流は、一般に、流量及び圧力を含む生理学的条件、例えば５〜１００ｍｍＨｇの圧力、由来生物又は個体の生理学的心拍出量の０．１〜１０倍の流量に調節する。
【０１３４】
例示的な方法では、脱細胞化方法は、３０ｃｍＨ２Ｏの定圧において、肺動脈を通じてデタージェント、例えば（１）０．１％ＳＤＳ、（２）２％、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）又は（３）８ｍｍｏｌ／リットルの（３）３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）（ｐＨ１２）デタージェントを灌流させるステップを含む。３種のデタージェントの全てについて、プロトコルは、（１）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１０分の初期順行性洗浄、（２）半透明マトリックス（脱細胞化を示す）を視覚化するのに必要な時間に初期時間の２０％を加えた時間（例えば、７０分＋１４分）にわたるデタージェント灌流、（３）１５分の脱イオンＨ２Ｏ洗浄、及び（４）抗生物質及び抗菌剤を添加したＰＢＳでさらに１７２時間の洗浄を含む。この脱細胞化方法は、例えば、脱イオンＨ２Ｏ洗浄後、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘのさらなる洗浄を含み得る。ＳＤＣプロトコルは、ＳＤＣ前の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ灌流と、ＳＤＣ後の１ｍｏｌ／リットルのＮａＣｌ洗浄とを含み得る。
【０１３５】
同様に、ブタ及びヒト臓器及び組織（例えば、肺）脱細胞化方法は、定圧で肺動脈を介したデタージェント又は他の脱細胞化剤の灌流、続いてＨ２Ｏ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液及びＰＢＳを用いた連続的洗浄を含み得る。ラット肺と同様に、脱細胞化は、視覚検査時に半透明マトリックスの外観をしていれば完全とみなすことができる。主として採取中の入念な前フラッシング及びその結果生じたあらゆる凝血による出発臓器の変化性は、必要な灌流の長さに影響を与え得る。一般に、脱細胞化灌流の時間は、例えば、４〜７日の範囲で変動し得る。
【０１３６】
臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドは、血管樹のＥＣＭ成分を含む組織の全領域又はほとんどの領域の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分から実質的に（例えば、重量基準で少なくとも８５％純粋、９０％純粋、９２％純粋、９５％純粋、９６％純粋、９７％純粋、９８％純粋及び９９％純粋）構成され得る。ＥＣＭ成分は、フィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンファミリー（例えば、コラーゲンＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）のメンバー、グリコサミノグリカン、基質、細網線維及びトロンボスポンジンのいずれか若しくは全部又はそれらの任意の組合せを含み得、これらは、基底膜のような所定構造として組織化された状態を維持し得る。一部の実施形態では、脱細胞化臓器又は組織（例えば、肺）マトリックスは、インタクトな脱細胞化血管系を保持する。実質的にインタクトな脱細胞化血管系を保存することにより、移植時の組織マトリックスと対象の血管系との接続が可能になる。加えて、脱細胞化組織マトリックス上又はマトリックス中に残るいずれかのタイプの微生物の存在を低減又は排除するために、脱細胞化組織マトリックスを例えば照射（例えば、ＵＶ、γ線）でさらに処理することもできる。
【０１３７】
物理的、化学的及び酵素的手段を用いて脱細胞化組織マトリックスを取得する方法は、当技術分野で公知であり、例えばＬｉａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９（８）：１０６５−７４（２００８）；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７（９）：３６７５−８３（２００６）；Ｔｅｅｂｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｅｎｄｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１９：３８１−８６（２０００）を参照されたい。また、米国特許出願公開第２００９／０１４２８３６号明細書；同第２００５／０２５６５８８号明細書；同第２００７／０２４４５６８号明細書；同第２００３／００８７４２８号明細書も参照されたい。
【０１３８】
臓器及び組織並びに脱細胞化組織／臓器スカフォールドの分子増強のための生物活性分子
一部の実施形態では、生物活性分子は、治療用生体分子（例えば、ポリペプチド、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、多糖（例えば、オリゴ糖）、ポリヌクレオチド及び核酸又はそうした分子の類似体若しくは誘導体）、治療用タンパク質（例えば、抗体、ホルモン、膜貫通タンパク質、成長因子、酵素若しくは構造タンパク質）或いは治療用小分子からなる群から選択される。
【０１３９】
一部の実施形態では、生物活性分子は、細菌感染を治療又は予防するうえで有用である。一部の実施形態では、生物活性分子は、炎症性疾患又は状態を治療又は予防するうえで有用である。一部の実施形態では、生物活性分子は、臓器移植拒絶を治療又は予防する（例えば、急性腎移植拒絶を治療する）うえで有用である。一部の実施形態では、生物活性分子は、臓器移植後の虚血及び再灌流傷害から選択される状態を予防するうえで有用である。
【０１４０】
一部の実施形態では、生物活性分子は、小分子薬剤である。小分子薬剤は、低分子量有機化合物（典型的に約２０００ダルトン以下）である。
【０１４１】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、キノリン抗生物質（例えば、レボフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、ペルフロキサシン、ロメフロキサシン、フレロキサシン、スパルフロキサシン、グレパフロキサシン、トロバフロキサシン、クリナフロキサシン、ゲミフロキサシン、エノキサシン、シタフロキサシン、ナジフロキサシン、トスルフロキサシン、シンノキサシン、ロソキサシン、ミロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、シンノキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、ロマフレロキサシン、ロメフロキサシン、ミロキサシン、ナリジクス酸、ナジフロキサシン、オキソリン酸、ペフロキサシン、ピリミジン酸、ピペミジン酸、ロソキサシン、ルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、トロバフロキサシン又はベシフロキサシン）である。
【０１４２】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、β−ラクタム抗生物質（例えば、ペニシリン又はセファロスポリンクラス抗生物質）である。
【０１４３】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、ペニシリン抗生物質（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、プロカインペニシリン及びベンザチンペニシリン、アンピシリン及びアモキシシリン、ベンジルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、オキサシリン、メチシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、テモシリン、アズロシリン、カルベニシリン、リカルシリン、メズロシリン、ピペラシリン、アパルシリン、ヘタシリン、バカムピシリン、スルベニシリン、メシシラム、ペブメシリナム、シクラシリン、タラピシリン、アスポキシシリン、クロキサシリン、ナフシリン又はピバムピシリン）である。
【０１４４】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、セファロスポリン抗生物質（例えば、セファゾリン、セフロキシム、セフタジジム、セファレキシン、セファロリジン、セファマンドール、セフスロジン、セホニシド、セホペラジン、セホプロジル又はセフトリアキソン）である。
【０１４５】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、カルバペネム抗生物質（例えば、チエナマイシン、トモペネム、レナペネム、テビペネム、ラズペネム、イピペネム、メロペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム（ベタミプロン）又はビアペネム）である。
【０１４６】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、リポペプチド抗生物質（例えば、ポリミキシンＢ、コリスチン（ポリミキシンＥ）又はダプトマイシン）である。
【０１４７】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、グリコペプチド抗生物質（例えば、バンコマイシン、テイコプラニン、テラバンシン、ラモプラニン、ダプトマイシン、デカプラニン又はブレオマイシン）である。
【０１４８】
一部の実施形態では、生物活性分子は、バンコマイシンである。バンコマイシン（ＣＡＳ登録番号１４０４−９０−６）は、式：
【化７】
2019527040.tif 000008
の化合物又はその薬学的に許容される塩である。
【０１４９】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、マクロライド抗生物質（例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンＡ、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン／酢酸ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン／チロシン、ロキシスロマイシン、ジリスロマイシン、トロレアンドマイシン、スペクチノマイシン、メチマイシン、ネオメチマイシン、エリスロノリド、メガロマイシン、ピクロマイシン、ナルボマイシン、オレアンドマイシン、トリアセチル−オレアンドマイシン、ラウカマイシン、クジマイシンＡ、アルボサイクリン又はシネロマイシンＢ）である。
【０１５０】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、アンサマイシン抗生物質（例えば、ストレプトバリシン、ゲルダナマイシン、ヘルビマイシン、リファマイシン、リファンピン、リファブチン、リファペンチン又はリファミキシン）である。
【０１５１】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、スルホンアミド抗生物質（例えば、スルファニルアミド、スルファセタルニド、スルファピリジン、スルファチアゾール、スルファジアジン、スルファメラジン、スルファジミジン、スルファソミジン、スルファサラジン、メフェニド、スルファメトキサゾール、スルファメトキシピリダジン、スルファジメトキシン、スルファシマジン、スルファドキシン、スルファメトピラジン、スルファグアニジン、スクシニルスルファチアゾール又はフタリルスルファチアゾール）である。
【０１５２】
一部の実施形態では、抗生物質は、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、特に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）（Ｂ群溶血性レンサ球菌（ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）を含む）、Ｅ．ｓｐｐ．、Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ａ．バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又は炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に起因する感染症を治療するうえで有用である。
【０１５３】
一部の実施形態では、抗生物質は、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バルトネラ・ヘンセラエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・クインタナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅｌｉｉ）、ボレリア・レカレンチレス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・キャニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・サンタロサイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓａｎｔａｒｏｓａｉ）、レプトスピラ・ウェイリ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｗｅｉｌｉｉ）、レプトスピラ・ノグチ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｎｏｇｕｃｈｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア・リケッチ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）又は腐性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）に起因する感染症を治療するうえで有用である。
【０１５４】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、凝固カスケードの阻害剤（例えば、抗凝血剤）、例えばヘパリン、アスピリン、クロピドグレル、チクロピジン、シロスタゾール、ジピリダモール、ペントキシフィリン、アブシキシマブ、エピチフィバチド、チロフィバン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、リボロキサバン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、アボラルスタット又はダギトランなどである。一部の実施形態では、抗凝血剤は、ビタミンＫアンタゴニスト（例えば、クマリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモン、アトロメンチン又はフェニンジオン）である。一部の実施形態では、抗凝血剤は、ヘパリンの低分子量誘導体（例えば、エノキサパリン、ダルテパリン又はチンザパリン）である。
【０１５５】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、抗線維溶解薬（例えば、アミノカプリン酸、トラネキサム酸、ビソブリン、アプロチニン、アミカル、シクロカプロン、トラシロール）である。
【０１５６】
一部の実施形態では、小分子薬剤は、抗炎症薬（例えば、アセトアミノフェン、アスピリン、コデイン、フェンタニル、イブプロフェン、インドメタシン、ケトドラク、モルヒネ、ナプロキセン、フェナセチン、ピロキシカム、ステロイド性鎮痛薬、スフェンタニル、スンリンダク又はテニダプ）である。
【０１５７】
一部の実施形態では、生物活性分子は、成長因子、例えばアドレノメデュリン、アンジオポエチン、自己分泌型運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ウシ胎児ソマトロピン（ＦＢＳ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、増殖分化因子９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（例えば、「治療因子」）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）又は胎盤増殖因子（ＰＧＦ）である。
【０１５８】
一部の実施形態では、生物活性分子は、サイトカイン、例えばトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インターフェロン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））及び胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）などである。一部の実施形態では、インターフェロンは、インターフェロンαｃｏｎ１、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンαｎ３、インターフェロンβ１ａ又はインターフェロンγ１ｂである。一部の実施形態では、サイトカインは、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７又はインターロイキン−８などのインターロイキンである。
【０１５９】
一部の実施形態では、生物活性分子は、免疫抑制薬（例えば、フィンゴリモド、サイトカイン、インターフェロンなど）である。一部の実施形態では、移植臓器及び組織の拒絶を予防するために免疫抑制薬を用い得る。
【０１６０】
一部の実施形態では、生物活性分子は、抗血栓溶解剤（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、アニストレプラーゼ又はウロキナーゼ及びそれらの機能的均等物）である。
【０１６１】
一部の実施形態では、生物活性分子は、抗体である。一部の実施形態では、抗体は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に対して特異的である（例えば、アダリムマブ）。一部の実施形態では、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に対して特異的な抗体は、米国特許出願公開第２００４／０２６００６９号明細書又は米国特許第７，２２７，００３号明細書（これらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＴＮＦ−α抗体のいずれか１つである。一部の実施形態では、生物活性分子は、炎症性疾患又は状態を治療又は予防するうえで有用な抗体（例えば、アダリムマブ、アレムツズマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、ムロモナブ、エファリズマブ、フォントリズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、メポリズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、ルプリズマブ、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ザノリムマブ、ベドリズマブ、ベリムマブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、エプラツズマブ、エクリズマブ又はブリアキヌマブ）である。
【０１６２】
一部の実施形態では、生物活性分子は、アルブミン、ヒトアルブミン又はイムノグロブリンである。一部の実施形態では、生物活性分子は、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、抗トロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、ドロトレコジンα、フィルグラスチン、ペグフィルグラスチン、サルグラモスチム又はオプレルベキンである。
【０１６３】
一部の実施形態では、本明細書に記載する生物活性分子のいずれか１つは、少なくとも１つの反応性官能基を含む。これらの実施形態のいくつかの態様では、官能基は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、ケト基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、アルデヒド基（−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ）、アミノ基（−ＮＨ２）、チオール基（−ＳＨ）（例えば、システイン残基）、カルボン酸（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、カルボン酸エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｃ１〜３アルキル）、スルホン酸基（−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ）又はリン酸基（−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）である。これらの官能基は、例えば、本明細書に記載するように、生体直交型化学反応で反応性の官能基を含む好適な試薬と生物活性分子を共役させるために用いられ得る。
【０１６４】
生体直交型化学反応で反応性の官能基による生体分子の官能基化
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基を含む試薬を用い、生体直交型化学反応で反応性の化学基で、本明細書に記載の生体分子のいずれか１つを官能基化し得る。一部の実施形態では、反応性化学基は、官能基化栄養素（例えば、本明細書に記載する官能基化栄養素のいずれか１つ）の反応性化学基に対して相補的である。一部の実施形態では、官能基化栄養素の反応性化学基がアジドであるとき、生物活性分子は、アルキン（例えば、脂肪族アルキン又はシクロアルキン）反応基で官能基化することができる。一部の実施形態では、官能基化栄養素の反応性化学基がアルキン（例えば、脂肪族アルキン又はシクロアルキン）であるとき、生物活性分子は、アジド反応基で官能基化することができる。一部の実施形態では、栄養素は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚであり、生物活性分子は、本明細書に記載するようなアルキン（例えば、脂肪族アルキン又はシクロアルキン）反応性化学基で官能基化することができる。
【０１６５】
一部の実施形態では、化学基は、ヒュスゲン環化付加（トリアゾールを形成するアルキン及びアジドの［３＋２］環化付加又は「クリック」反応としても知られる）において反応性の化学基のいずれか１つである。一部の実施形態では、化学基は、シュタウディンガーライゲーション反応（すなわちアジドとホスフィンとの反応）、トリアゾールを形成するオキサノルボルナジエンとアジドとの反応、テトラジン（例えば、ジピリジルテトラジン）とトランス−シクロチンとの逆電子要請型ディールス・アルダー反応、テトラジン（例えば、モノアリールテトラジン）とノルボルネンとの逆電子要請型ディールス・アルダー反応、テトラジンとシクロプロペンとの反応、シクロプロペンとニトリルイミンとの反応、テトラゾールとアルケンとの光誘導性１，３−双極性環化付加、ニトリルオキシドとノルボルネンとの１，３−双極性環化付加、イソシアニドとテトラジンとの［４＋１］環化付加又はニトロンとアルキンとの１，３−環化付加において反応性の化学基のいずれか１つである。
【０１６６】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基は、アジド（−Ｎ３）、脂肪族アルキン（例えば、−Ｃ≡ＣＨ）、シクロオクチン、シクロオクテン、ニトロン、イソシアニド、シクロプロペン、ノルボレン、ジフェニルホスフィン、ニトリルイミン、テトラゾール、ニトリルオキシド又はテトラジンである。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基は、アジド（−Ｎ３）又はアルキンである。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基は、アジド（−Ｎ３）である。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基は、アルキンである。
【０１６７】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基を含む試薬は、式（Ｉ）：
【化８】
2019527040.tif 000009
（式中、Ｆは、Ｎ３、−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ、−Ｏ−ＮＨ２、シクロオクチン、シクロオクテン、ニトロン、イソシアニド、シクロプロペン、ノルボレン、ジフェニルホスフィン、ニトリル、イミン、テトラゾール、ニトリルオキシド及びテトラジンから選択される反応性化学基である）
の化合物である。
【０１６８】
一部の実施形態では、アルキン官能基を含む試薬は、式（Ｉａ）：
【化９】
2019527040.tif 000010
の化合物である。
【０１６９】
一部の実施形態では、アジド官能基を含む試薬は、式（Ｉｂ）：
【化１０】
2019527040.tif 000011
の化合物である。
【０１７０】
本明細書に開示する式のいずれか１つの一部の実施形態において、
Ｌは、存在しないか、又は
Ｌは、Ｃ１〜２０アルキレン及び下記の式：
【化１１】
2019527040.tif 000012
のいずれか１つから選択されるリンカーであり；
Ｘ１は、存在しないか、又はＸ１は、Ｃ１〜６アルキレンであり；
Ｘ２は、存在しないか、又はＸ２は、Ｃ１〜６アルキレンであり；
Ｘ３は、Ｃ１〜６アルキレンであり；
Ｘ４は、存在しないか、又はＸ４は、Ｃ１〜６アルキレンであり；
Ｙ１は、存在しないか、又は−Ｏ−及び−ＮＨ−から選択され；
Ｙ２は、存在しないか、又は−Ｏ−及び−ＮＨ−から選択され；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から独立に選択される整数であり；
ｘは、アルキン官能基との結合点を示し、ｙは、Ｂとの結合点を示し；
Ｂは、ハロゲン、−ＯＨ、−Ｏ−ＮＨ２、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、式：
【化１２】
2019527040.tif 000013
の基、下記の式：
【化１３】
2019527040.tif 000014
のいずれか１つの活性化フェノールエステル、下記の式：
【化１４】
2019527040.tif 000015
のＮＨＳエステル、及び下記の式：
【化１５】
2019527040.tif 000016
のいずれか１つのマレイミドから独立に選択される官能基であり；
Ｈａｌは、Ｉ、Ｂｒ及びＣｌから選択されるハロゲンであり；
Ｘ５は、Ｃ１〜６アルキレンである。
【０１７１】
一部の実施形態では、ハロゲンは、Ｉ、Ｂｒ又はＣｌである。これらの実施形態の一部の態様では、ハロゲンは、Ｉである。
【０１７２】
一部の実施形態では、Ｂは、式：
【化１６】
2019527040.tif 000017
の官能基である。
【０１７３】
一部の実施形態では、Ｂは、式：
【化１７】
2019527040.tif 000018
の官能基である。
【０１７４】
一部の実施形態では、Ｘ１は、存在しない。一部の実施形態では、Ｘ１は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブテレン又はヘキシレンである。一部の実施形態では、Ｘ１は、エチレンである。
【０１７５】
一部の実施形態では、Ｘ２は、存在しない。一部の実施形態では、Ｘ２は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブテレン又はヘキシレンである。一部の実施形態では、Ｘ２は、メチレンである。
【０１７６】
一部の実施形態では、Ｘ３は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブテレン又はヘキシレンである。一部の実施形態では、Ｘ３は、エチレンである。
【０１７７】
一部の実施形態では、Ｘ４は、存在しない。一部の実施形態では、Ｘ４は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブテレン又はヘキシレンである。一部の実施形態では、Ｘ４は、エチレンである。
【０１７８】
一部の実施形態では、Ｙ１は、存在しない。一部の実施形態では、Ｙ１は、−Ｏ−である。一部の実施形態では、Ｙ１は、−ＮＨ−である。一部の実施形態では、Ｙ２は、存在しない。一部の実施形態では、Ｙ２は、−Ｏ−である。別の実施形態では、Ｙ２は、−ＮＨ−である。
【０１７９】
一部の実施形態では、Ｘ５は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブテレン又はヘキシレンである。一部の実施形態では、Ｘ５は、エチレンである。一部の実施形態では、Ｘ５は、プロピレンである。
【０１８０】
一部の実施形態では、ｎは、１である。一部の実施形態では、ｎは、３である。一部の実施形態では、ｎは、６である。一部の実施形態では、ｎは、１０である。
【０１８１】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、下記の化合物：
【化１８】
2019527040.tif 000019
【化１９】
2019527040.tif 000020
（式中、ｎは、本明細書に記載の通りである）
のいずれか１つから選択される。
【０１８２】
一部の実施形態では、アルキン官能基を含む試薬は、アルキン−ＰＥＧ５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである。一部の実施形態では、アルキン官能基を含む試薬は、アミノ−ＰＥＧ４−アルキンである。一部の実施形態では、アルキン官能基を含む試薬は、下記の試薬：
ＨＣ≡Ｃ−ＣＨ２−ＰＥＧｎ−ＮＨ２；
ＨＣ≡Ｃ−ＣＨ２−ＰＥＧｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＮＨＳエステル；
ＨＣ≡Ｃ−ＣＨ２−ＰＥＧｎ−ＯＨ；
ＨＣ≡Ｃ−ＣＨ２−ＰＥＧｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ；
ＨＣ≡Ｃ−ＣＨ２−ＰＥＧｎ−ＳＨ
のいずれか１つから選択される。
【０１８３】
一部の実施形態では、アジド官能基を含む試薬は、下記の試薬：
Ｎ３−ＰＥＧｎ−ＮＨ２；
Ｎ３−ＰＥＧｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＮＨＳエステル；
Ｎ３−ＰＥＧｎ−ＯＨ；
Ｎ３−ＰＥＧｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ；
Ｎ３−ＰＥＧｎ−ＳＨ
のいずれか１つから選択される。
【０１８４】
一部の実施形態では、アルキン官能基を含む試薬は、下記の式（ＩＩ）：
【化２０】
2019527040.tif 000021
の化合物であり、式中、
Ａは、下記の式：
【化２１】
2019527040.tif 000022
のいずれか１つのシクロオクチン含有部分であり；
Ｌは、存在しないか、又はＬは、Ｃ１〜２０アルキレン及び下記の式：
【化２２】
2019527040.tif 000023
のいずれか１つから選択されるリンカーであり；
Ｗ１は、存在しないか、又はＣ１〜６アルキレンであり；
Ｗ２は、Ｃ１〜６アルキレンであり；
Ｚ１は、−Ｏ−、−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）−及び−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−から選択され；
Ｚ２は、−Ｏ−、−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）−及び−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−から選択され；
Ｗ３は、Ｃ１〜６アルキレンであり；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から独立に選択される整数であり；
ｘは、シクロアルキンとの結合点を示し、ｙは、Ｂとの結合点を示し；
Ｂは、ハロゲン、−ＯＨ、−Ｏ−ＮＨ２、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、式：
【化２３】
2019527040.tif 000024
の基、下記の式：
【化２４】
2019527040.tif 000025
のいずれか１つの活性化フェノールエステル、下記の式：
【化２５】
2019527040.tif 000026
のいずれか１つのＮＨＳエステル、及び下記の式：
【化２６】
2019527040.tif 000027
のいずれか１つのマレイミドから独立に選択される官能基であり；
Ｈａｌは、Ｉ、Ｂｒ及びＣｌから選択されるハロゲンであり；
Ｗ４は、Ｃ１〜６アルキレンである。
【０１８５】
一部の実施形態では、ハロゲンは、Ｉ、Ｂｒ又はＣｌである。これらの実施形態のいくつかの態様では、ハロゲンは、Ｉである。
【０１８６】
一部の実施形態では、Ｂは、式：
【化２７】
2019527040.tif 000028
の官能基である。
【０１８７】
一部の実施形態では、Ｂは、式：
【化２８】
2019527040.tif 000029
の官能基である。
【０１８８】
一部の実施形態では、Ｗ１は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブテレン又はヘキシレンである。一部の実施形態では、Ｗ１は、エチレンである。
【０１８９】
一部の実施形態では、Ｗ２は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブテレン又はヘキシレンである。一部の実施形態では、Ｗ２は、エチレンである。
【０１９０】
一部の実施形態では、Ｚ１は、−Ｏ−である。一部の実施形態では、Ｚ１は、−ＮＨ−である。一部の実施形態では、Ｚ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−である。
【０１９１】
一部の実施形態では、Ｚ２は、−Ｏ−である。一部の実施形態では、Ｚ２は、−ＮＨ−である。
【０１９２】
一部の実施形態では、Ｗ３は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブテレン又はヘキシレンである。一部の実施形態では、Ｗ３は、エチレンである。
【０１９３】
一部の実施形態では、Ｗ４は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブテレン又はヘキシレンである。一部の実施形態では、Ｗ４は、エチレンである。
【０１９４】
一部の実施形態では、ｎは、１である。一部の実施形態では、ｎは、３である。一部の実施形態では、ｎは、６である。一部の実施形態では、ｎは、１０である。
【０１９５】
一部の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、下記の化合物：
【化２９】
2019527040.tif 000030
【化３０】
2019527040.tif 000031
（式中、ｎは、本明細書に記載の通りである）
のいずれか１つから選択される。
【０１９６】
一部の実施形態では、シクロアルキン官能基を含む試薬は、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステルである。一部の実施形態では、シクロアルキン官能基を含む試薬は、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミンである。
【０１９７】
一部の実施形態では、ＮＨＳエステル官能基を含む試薬は、第１級アミン基を含む生物活性分子にアルキン又はシクロオクチン反応性化学基を共役させるうえで有用である。
【０１９８】
一部の実施形態では、アミン官能基を含む試薬は、ケト基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、アルデヒド基（−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ）、カルボン酸基（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸基（−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ）又はリン酸基（−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）を含む生物活性分子にアルキン又はシクロオクチン反応性化学基を共役させるうえで有用である。
【０１９９】
一部の実施形態では、マレイミド官能基を含む試薬は、チオール基（例えば、システイン残基）を含む生物活性分子にアルキン又はシクロオクチン官能基を共役させるうえで有用である。
【０２００】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び式（ＩＩ）の試薬は、考えられる様々な合成経路に従って、本明細書に記載する生物活性分子のいずれか１つと共役させることができる。当業者は、適切な合成経路を選択及び実施する方法を知っている。出発材料、中間体及び生成物の好適な合成方法は、以下の参照ソース：Ｃａｒｒｅｉｒａ，ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｓ．１−４８（２００１−２０１０）；Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ，ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）；Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，６ｔｈ  Ｅｄ．（Ｗｉｌｅｙ，２００７）；Ｔｒｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）を含む文献を参照することにより見出すことができる。
【０２０１】
本明細書に記載する化合物を調製するための反応は、有機合成の分野の当業者が容易に選択できる好適な溶媒を用いて実施することができる。好適な溶媒は、反応が実施される温度、例えば溶媒の凍結温度から溶媒の沸騰温度まで変動し得る温度で出発材料（反応体）、中間体又は生成物と実質的に非反応性であり得る。所与の反応は、１種の溶媒又は２種以上の溶媒の混合物中で実施することができる。特定の反応ステップに応じて、当業者は、好適な溶媒を選択することができる。
【０２０２】
本明細書に記載する化合物の調製は、様々な化学基の保護及び脱保護を含み得る。保護及び脱保護の必要性並びに適切な保護基の選択は、当業者が容易に決定することができる。保護基の化学は、例えば、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ及びＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００６）に見出すことができる。
【０２０３】
一部の実施形態では、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳエステル）を含むアルキン又はシクロアルキン含有試薬を用いて、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などの成長因子をアルキン又はシクロアルキン（例えば、ＤＢＣＯ）官能基と共役させることができる。様々な長さのＰＥＧリンカー若しくはアルキレンリンカー又はその両方を試薬のアルキン又はシクロアルキン官能基とＮＨＳエステル（例えば、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物について記載の通り）との間に導入することができる。このアプローチは、第１級アミンを含有する多くの他の成長因子及び他のタンパク質にも適用可能である。
【０２０４】
一部の実施形態では、マレイミドを含むアルキン又はシクロアルキン含有試薬を用いることにより、抗体をアルキン又はシクロアルキン（例えば、ＤＢＣＯ）官能基と共役させることができる。様々な長さのＰＥＧリンカー若しくはアルキレンリンカー又はその両方を試薬のアルキン又はシクロアルキン官能基とＮＨＳエステル（例えば、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物について記載の通り）との間に導入することができる。このアプローチは、システイン残基を含有する抗体及び他のタンパク質にも適用可能である。
【０２０５】
一部の実施形態では、ＮＨＳエステルを含むアジド、脂肪族アルキン又はシクロアルキン含有試薬を用いることにより、バンコマイシンなどの抗生物質をアジド、脂肪族アルキン又はシクロアルキン（例えば、ＤＢＣＯ）官能基と共役させることができる。バンコマイシンは、１つの遊離第１級アミンのみを有するため、アルキン共役ＮＨＳエステルと反応することによってアルキンと、又はＤＢＣＯ共役ＮＨＳエステルと反応することによってＤＢＣＯと共役させることができる。様々な長さのＰＥＧリンカー若しくはアルキレンリンカー又はその両方を試薬のアルキン又はシクロアルキン官能基とＮＨＳエステル（例えば、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び式（ＩＩ）の化合物について記載の通り）との間に導入することができる。
【０２０６】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、バンコマイシン−アジドである。
【０２０７】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、下記の式：
【化３１】
2019527040.tif 000032
（式中、Ｌは、式（Ｉａ）について記載した通りである）
のバンコマイシン−アルキンである。
【０２０８】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、下記の式：
【化３２】
2019527040.tif 000033
（式中、Ａ及びＬは、式（ＩＩ）について記載した通りである）
のバンコマイシン−シクロオクチンである。
【０２０９】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、バンコマイシン−ＤＢＣＯである。
【０２１０】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、下記の式：
【化３３】
2019527040.tif 000034
のバンコマイシン−アルキンである。
【０２１１】
一部の実施形態では、バンコマイシン−アルキン又はバンコマイシン−シクロオクチン（例えば、バンコマイシン−ＤＢＣＯ）は、式（Ｉａ）の化合物又は式ＩＩの化合物をバンコマイシンと反応させることによって調製され得る。反応させるステップは、当技術分野で公知の任意の合成方法に従って実施され得る。例えば、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）などのバッファー中の濃度約１ｍＭのバンコマイシンをほぼ室温で本明細書に記載する式のいずれか１つの試薬（例えば、アルキン−ＰＥＧ５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）と約２４時間反応させることができる。当業者であれば、適切な合成方法を容易に選択して実施するであろう。
【０２１２】
一部の実施形態では、バンコマイシン−アルキンは、下記の式：
【化３４】
2019527040.tif 000035
を有する。
【０２１３】
一部の実施形態では、バンコマイシン−ＤＢＣＯは、下記の式：
【化３５】
2019527040.tif 000036
を有する。
【０２１４】
一部の実施形態では、バンコマイシン−ＤＢＣＯは、下記の式：
【化３６】
2019527040.tif 000037
を有する。
【０２１５】
一部の実施形態では、ヘパリンなどの抗凝血剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて、ヘパリン中の遊離カルボキシル基の部分的活性化、続いてアミノ官能基を含むアルキン又はシクロアルキン含有試薬との反応により、アルキン又はシクロアルキン（例えば、ＤＢＣＯ）と共役させることができる。様々な長さのＰＥＧリンカー若しくはアルキレンリンカー又はその両方を試薬のアルキン又はシクロアルキン官能基とＮＨＳエステル（例えば、式（Ｉ）、（Ｉａ）及び式（ＩＩ）の化合物について記載の通り）との間に導入することができる。他の実施形態では、脱アミノ化ヘパリン（例えば、硝酸処理条件下で脱アミノ化したヘパリン）中の遊離アルデヒド基を、例えば触媒としてアニリンを用いてアミノオキシアルキンと共役させることができる。
【０２１６】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、ヘパリン−アジドである。
【０２１７】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、下記の式：
【化３７】
2019527040.tif 000038
（式中、Ｌは、式（Ｉａ）について記載した通りである）
のいずれかのヘパリン−アルキンである。
【０２１８】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、下記の式：
【化３８】
2019527040.tif 000039
（式中、各Ｌは、式（Ｉａ）について記載した通りである）
のいずれかのヘパリン−アルキン−ビオチン（ヘパリンＡＢ）である。
【０２１９】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、下記の式：
【化３９】
2019527040.tif 000040
（式中、Ｌは、式（ＩＩ）について記載した通りである）
のいずれか１つのヘパリン−アルキンである。
【０２２０】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、下記の式：
【化４０】
2019527040.tif 000041
（式中、各Ａ及び各Ｌは、式（ＩＩ）について記載した通りである）
のいずれかのヘパリン−アルキン−ビオチン（ヘパリンＡＢ）である。
【０２２１】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、下記の式：
【化４１】
2019527040.tif 000042
（式中、各ｎは、独立に、１〜２０の整数である）
のヘパリン−アルキン−ビオチン（ヘパリンＡＢ）である。一部の実施形態では、各ｎは、３である。
【０２２２】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、下記の式：
【化４２】
2019527040.tif 000043
のヘパリン−アルキン−ビオチン（ヘパリンＡＢ）である。
【０２２３】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、ヘパリン−ＤＢＣＯである。
【０２２４】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、下記の式：
【化４３】
2019527040.tif 000044
のいずれか１つのヘパリン−アルキンである。
【０２２５】
一部の実施形態では、ヘパリン−アルキンは、下記の式：
【化４４】
2019527040.tif 000045
を有する。
【０２２６】
一部の実施形態では、ヘパリン−アルキンは、下記の式：
【化４５】
2019527040.tif 000046
を有する。
【０２２７】
一部の実施形態では、ヘパリン−ＤＢＣＯは、下記の式：
【化４６】
2019527040.tif 000047
を有する。
【０２２８】
一部の実施形態では、ヘパリン−アルキン又はヘパリン−シクロオクチン（例えば、ヘパリン−ＤＢＣＯ）は、式（Ｉａ）の化合物又は式ＩＩの化合物をヘパリンと反応させることによって調製され得る。反応させるステップは、当技術分野で公知のいずれの合成方法に従っても実施され得る。例えば、濃度約１０ｍＭの脱アミノ化ヘパリンを、ｐ−フェニレンジアミンなどの触媒の存在下において、ほぼ室温の約０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液中で約２０時間にわたり、本明細書に記載される式のいずれか１つの試薬（例えば、濃度約１００ｍＭのｏ−（プロプ−２−イニル）−ヒドロキシルアミン塩酸塩と反応させ得る。当業者であれば、適切な合成方法を容易に選択して実施するであろう。
【０２２９】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化される生物活性分子は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に対して特異的な抗体（例えば、アダリムマブ）である。一部の実施形態では、抗ＴＮＦ−α抗体は、脂肪族アルキンで官能基化される。一部の実施形態では、抗ＴＮＦ−α抗体は、シクロオクチンで官能基化される）。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、抗ＴＮＦ−αアルキンである。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された生物活性分子は、抗ＴＮＦ−α−ＤＢＣＯである。一部の実施形態では、抗ＴＮＦ−α抗体は、アジドで官能基化される。
【０２３０】
脱細胞化ネイティブ生体材料を官能基化するのと同様の方法で他の生体分子、例えば免疫抑制剤、細胞表面受容体の阻害剤又は活性化因子をアルキン又はシクロアルキンと共役させ得る。
【０２３１】
一部の実施形態では、本明細書に記載される生体直交型化学反応で反応性の化学基を含む試薬（式Ｉ、Ｉａ、Ｉｂ及び式ＩＩの試薬のいずれか１つ）を用いて、本明細書に記載される栄養素のいずれか１つを生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化することもできる。
【０２３２】
化学選択的ライゲーションを用いた臓器スカフォールドの官能基化
一部の実施形態では、本開示は、細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドであって、脱細胞化スカフォールドの細胞外マトリックスは、生物活性分子で化学選択的に官能基化される、脱細胞化スカフォールドを提供する。
【０２３３】
一部の実施形態では、本開示は、生物活性分子で生体直交的に官能基化された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドを調製する方法であって、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドを、官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子と反応させるステップを含む方法を提供する。
【０２３４】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の反応性化学基は、アジドであり、生物活性分子は、バンコマイシン又はヘパリンであり、及び官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基は、アルキンである。
【０２３５】
一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の反応性化学基は、アルキンであり、生物活性分子は、バンコマイシン又はヘパリンであり、及び官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基は、アジドである。
【０２３６】
一部の実施形態では、哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドは、アジドで官能基化された細胞外マトリックスを含む。一部の実施形態では、哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドは、アルキンで官能基化された細胞外マトリックスを含む。
【０２３７】
一部の実施形態では、生物活性分子は、アルキンで官能基化される。一部の実施形態では、生物活性分子は、脂肪族アルキンで官能基化される。一部の実施形態では、生物活性分子は、シクロオクチンで官能基化される。一部の実施形態では、生物活性分子は、アジドで官能基化される。一部の実施形態では、生物活性分子は、バンコマイシン−アジドである。一部の実施形態では、生物活性分子は、バンコマイシン−アルキンである。一部の実施形態では、生物活性分子は、ヘパリン−アジドである。一部の実施形態では、生物活性分子は、ヘパリン−アルキンである。
【０２３８】
一部の実施形態では、哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドは、アジドで官能基化された細胞外マトリックスを含み、及び生物活性分子は、アルキン（例えば、脂肪族アルキン又はシクロアルキン）で官能基化される。一部の実施形態では、哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドは、アルキンで官能基化された細胞外マトリックスを含み、及び生物活性分子は、アジドで官能基化される。一部の実施形態では、哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドは、アジドで官能基化された細胞外マトリックスを含み、及び生物活性分子は、バンコマイシン−アルキンである。一部の実施形態では、哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドは、アルキンで官能基化された細胞外マトリックスを含み、及び生物活性分子は、バンコマイシン−アジドである。
【０２３９】
一部の実施形態では、哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドは、アジドで官能基化された細胞外マトリックスを含み、及び生物活性分子は、ヘパリン−アルキンである。一部の実施形態では、哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドは、アルキンで官能基化された細胞外マトリックスを含み、及び生物活性分子は、ヘパリン−アジドである。
【０２４０】
一部の実施形態では、反応させるステップは、溶媒（例えば、ＤＭＦ、アセトニトリル、ＤＭＳＯ）中で実施する。一部の実施形態では、反応させるステップは、水中で実施する。一部の実施形態では、反応させるステップは、エタノール、メタノール又はｔ−ブタノールなどのアルコール中で実施する。一部の実施形態では、反応させるステップは、ｔ−ブタノール／水中で実施する。一部の実施形態では、反応させるステップは、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で実施する。一部の実施形態では、反応させるステップは、溶媒の非存在下で実施する（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：Ｇｅｎｅｒａｌ，４５３，２６，２０１３，１５１−１５８に記載の通り）。一部の実施形態では、反応させるステップは、“Ｃｏｐｐｅｒ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ａｚｉｄｅ−Ａｌｋｙｎｅ  Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１１；３（４）：１５３−１６２（その開示内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている条件下で実施する。一部の実施形態では、反応させるステップは、エアフリー条件で実施する。一部の実施形態では、反応させるステップは、大気中で実施する。
【０２４１】
一部の実施形態では、反応させるステップは、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載するバイオリアクターのいずれか１つ）内において、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドを、官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子を含むバッファー又は培地（例えば、本明細書に記載する任意のバッファー又は培地）で灌流することによって実施される。これらの実施形態のいくつかの態様では、灌流の速度は、約０．１ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．３ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約５ｍＬ／分である。これらの実施形態の他の態様では、灌流の速度は、約０．１ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分、約０．３ｍＬ／分、約０．４ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分、約１ｍＬ／分、約２ｍＬ／分、約５ｍＬ／分又は約１０ｍＬ／分である。
【０２４２】
一部の実施形態では、反応は、バイオリアクター内において、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドに、官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子を含むバッファー又は培地（例えば、本明細書に記載する任意のバッファー又は培地）を注入することによって実施される。一部の実施形態では、注入用培地中の官能基化生物活性分子の濃度は、約１μＭ〜約１０Ｍ、約５μＭ〜約５Ｍ、約１０μＭ〜約１Ｍ、約１０μＭ〜約１００ｍＭ、約２０μＭ〜約５０ｍＭ、約５０μＭ〜約２０ｍＭ又は約１００μＭ〜約１０ｍＭである。一部の実施形態では、注入は、ほぼ室温で実施する。一部の実施形態では、反応させるステップは、注入後のスカフォールドを約１０分〜約２４時間、約３０分〜約６時間、約４５分〜約３時間又は約１時間〜約２時間の期間にわたってインキュベートするステップを含む。
【０２４３】
一部の実施形態では、反応させるステップは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（カタログ番号Ｃ１０２６９）製のＣｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｎ  Ｋｉｔを用いて実施する。
【０２４４】
一部の実施形態では、反応性化学基が脂肪族アルキンであるとき、反応させるステップは、銅触媒の存在下で実施する。一部の実施形態では、反応性化学基が脂肪族アルキンであるとき、反応させるステップは、銅触媒の非存在下で実施する。一部の実施形態では、銅触媒は、還元剤と一緒に用いられる金属銅、銅（Ｉ）化合物及び銅（ＩＩ）化合物から選択される。一部の実施形態では、銅触媒は、ＣｕＳＯ４、ＣｕＡＡＣ、Ｃｕ（ＭｅＣＮ）４ＰＦ６、ＣｕＢｒ及びＣｕＩから選択される。一部の実施形態では、銅触媒は、安定化リガンド（例えば、ＴＢＴＡ、ＴＨＰＴＡ）と一緒に使用される。一部の実施形態では、反応させるステップは、アスコルビン酸ナトリウムの存在下で実施される。一部の実施形態では、銅触媒の量は、約０．１ｍｏｌ．％〜約５ｍｏｌ％、約０．２ｍｏｌ．％〜約４ｍｏｌ％、約０．３ｍｏｌ．％〜約３ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ．％〜約２ｍｏｌ％又は約０．７ｍｏｌ．％〜約１．５ｍｏｌ％である。一部の実施形態では、銅触媒の量は、約０．１ｍｏｌ．％、約０．２ｍｏｌ．％、約０．３ｍｏｌ．％、約０．４ｍｏｌ．％、約０．５ｍｏｌ．％、約０．６ｍｏｌ．％、約０．７ｍｏｌ．％、約０．８ｍｏｌ．％、約０．９ｍｏｌ．％、約１．０ｍｏｌ．％、約１．１ｍｏｌ．％、約１．２ｍｏｌ．％、約１．３ｍｏｌ．％、約１．５ｍｏｌ．％又は約２．０ｍｏｌ．％である。
【０２４５】
一部の実施形態では、反応性化学基がシクロオクチンであるとき、反応させるステップは、銅触媒の非存在下で実施する。一部の実施形態では、反応性化学基がシクロオクチンであるとき、反応させるステップは、銅触媒（例えば、本明細書に記載されるように、ＣｕＳＯ４、ＣｕＡＡＣ、Ｃｕ（ＭｅＣＮ）４ＰＦ６、ＣｕＢｒ及びＣｕＩ）の存在下で実施する。
【０２４６】
一部の実施形態では、反応させるステップは、約０℃〜約５０℃、約０℃〜約４０℃、約０℃〜約３０℃、約０℃〜約２５℃、約０℃〜約２０℃、約０℃〜約１５℃、約０℃〜約１０℃又は約０℃〜約５℃の温度で実施する。一部の実施形態では、反応させるステップは、約０℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃又は周囲温度で実施する。一部の実施形態では、反応させるステップは、約０℃で実施する。一部の実施形態では、反応させるステップは、周囲温度で実施する。
【０２４７】
一部の実施形態では、官能基化された生物活性分子の濃度は、約１μＭ〜約１０００μＭ、約２μＭ〜約９００μＭ、約３μＭ〜約８００μＭ、約４μＭ〜約７００μＭ、約５μＭ〜約６００μＭ、約６μＭ〜約５００μＭ、約７μＭ〜約４００μＭ、約８μＭ〜約３００μＭ、約９μＭ〜約２００μＭ、約１０μＭ〜約１００μＭ、約２０μＭ〜約９０μＭ、約２５μＭ〜約８０μＭ、約３０μＭ〜約７０μＭ又は約４０μＭ〜約６０μＭである。一部の実施形態では、官能基化された生物活性分子の濃度は、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約４５μＭ、約５０μＭ、約５５μＭ、約６０μＭ、約６５μＭ、約７０μＭ、約７５μＭ、約８０μＭ、約８５μＭ、約９０μＭ又は約１００μＭである。一部の実施形態では、官能基化された生物活性分子の濃度は、約１ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約２ｍＭ〜約９００ｍＭ、約３ｍＭ〜約８００ｍＭ、約４ｍＭ〜約７００ｍＭ、約５ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６ｍＭ〜約５００ｍＭ、約７ｍＭ〜約４００ｍＭ、約８ｍＭ〜約３００ｍＭ、約９ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約８０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ又は約４０ｍＭ〜約６０ｍＭである。一部の実施形態では、官能基化された生物活性分子の濃度は、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約５ｍＭ、約７．５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、ｖ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ又は約１００ｍＭである。
【０２４８】
一部の実施形態では、反応させるステップは、約５分〜約２４時間、約１５分〜約１８時間、約３０分〜約１２時間、約４５分〜約６時間又は約１時間〜約２時間の期間にわたって実施する。一部の実施形態では、反応させるステップは、約１５分、約３０分、約４５分、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約４時間、約５時間又は約６時間にわたって実施する。
【０２４９】
細胞播種／移植のための再細胞化臓器及び組織
一部の実施形態では、本開示は、移植のための哺乳動物臓器又は組織を調製する方法であって、本明細書に記載の生物活性分子で生体直交的に官能基化された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドにレシピエント由来の細胞を播種して、移植のための臓器又は組織を取得するステップを含む方法を提供する。
【０２５０】
一部の実施形態では、レシピエント由来細胞は、分化細胞又は再生細胞である。本明細書に記載の臓器又は組織スカフォールドに播種するために、ネイティブ又は未分化細胞型などのあらゆる適切な再生細胞型を使用することができる。限定されないが、幹細胞期（例えば、誘導後）、前駆細胞期、血管芽細胞期又は分化期（例えば、ＣＤ３１＋、ｖＷＦ＋）を含む様々な段階で播種し得る。本明細書で使用される場合、再生細胞は、限定されないが、始原細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）、前駆細胞並びに臍帯細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞）及び胎児幹細胞を含む「成体」由来幹細胞を含み得る。再生細胞は、分化又は単分化能細胞型も含み得る。本明細書に記載される方法及び材料に適切な幹細胞としては、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（例えば、未分化、分化内胚葉、前方化内胚葉、ＴＴＦ−１陽性肺前駆体）、ヒト間葉系幹細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、多能性成体始原細胞（ＭＡＰＣ）、ｉＰＳ由来の間葉細胞又は胚性幹細胞を挙げることができる。いくつかの場合、他の組織由来の再生細胞も使用することができる。例えば、皮膚、骨、筋肉、骨髄、滑膜又は脂肪組織由来の再生細胞を使用して、幹細胞が播種された組織マトリックスを作製することができる。
【０２５１】
一部の実施形態では、代わりに又はさらに、本明細書で提供する臓器又は組織に（好ましくはヒトの）上皮細胞及び内皮細胞などの分化細胞型を播種することができる。例えば、肺マトリックスに血管系を介して（例えば、動脈ライン又は静脈ラインを通して）内皮細胞を播種することができ、また臓器又は組織が肺である場合、気道を介して（例えば、気管ラインを通して）上皮細胞を播種することができる。また、臓器又は組織スカフォールドに１つ若しくは複数の細胞型（例えば、１つ若しくは複数の上皮及び間葉細胞、成体の末梢血液由来の上皮細胞、臍帯血由来の上皮細胞、ｉＰＳ由来の上皮細胞、始原段階細胞（例えば、平滑筋）、成体肺由来の細胞混合物（例えば、ラット・ヒト）、市販の小気道上皮細胞若しくは肺胞上皮細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞由来の上皮細胞及び／又はヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種することができる。
【０２５２】
いずれのタイプの適切な市販の培地及び／又は培地キットも細胞の播種及び培養に使用し得る。例えば、小気道細胞にＳＡＧＭ培地を使用し得（例えば、Ｌｏｎｚａ製のＳＡＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）、また内皮細胞にＥＧＭ−２キットを使用し得る（例えば、Ｌｏｎｚａ製のＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）。例えば、Ｂｒｕｄｎｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｖｅｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏ−ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３４（２０１３）９２０１−９２０９に記載されているように、播種された内皮細胞型に合わせて（例えば、ＶＥＧＦなどの成長因子を増加又は減少させることにより）カスタマイズした培地を使用し得る。内皮細胞の場合、細胞の播種、増殖、生着及び成熟の様々な段階を誘導するために一連の異なる培地組成を使用し得る。例えば、第１の段階では、内皮細胞の増殖、移動及び代謝を増大するために細胞播種構築物を「血管形成培地」で２〜３０日間灌流し得る。この培地は、高濃度のサイトカイン、例えば５〜１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び５〜１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及びホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）、例えば５〜１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡの存在を特徴とし、それにより、タンパク質キナーゼＣの活性化及び内皮細胞の出芽を刺激するＡｎｇ−１の活性化を通して血管形成経路を活性化させる。第２の段階では、細胞播種構築物を、次に、内皮の成熟及び密着結合の形成を支持する「密着培地（ｔｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）」を用いて灌流することができる。密着培地は、低レベルのサイトカインを有し、基本的組成が血管形成培地と同じであるが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＰＭＡのレベルが低い（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ及びＰＭＡは、０．１〜５ｎｇ／ｍｌである）。密着結合形成を促進し、肺浮腫を低減することがわかっているヒドロコルチゾンを密着培地にさらに添加して、血管の成熟を促進することができる。脈管形成を増大するためにＰＤＧＦ及びＡｎｇ−２などのさらなる成熟促進因子を密着培地に添加し得る。これらの因子の濃度は、異なる血管サイズに対応するように滴定され得る。急激なサイトカインの変化による有害な作用を回避するために培地の交換を段階的に行うことができる。内皮細胞支持培地と同様に、連続的な培地の変化を使用して上皮細胞の運命を誘導することができる。初期培地は、例えば、胚体内胚葉を誘導するために、１０〜２００ｎｇ／ｍｌのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ及び０．０１〜１ｕＭのＺＳＴＫ  ４７４などのＰｉ３Ｋ阻害剤を含有し得、それに続いて、前方化内胚葉を誘導するために、０１〜１０ｕＭのＡ−８３０１などのＴＧＦ−β阻害剤及び０．０５〜１ｕＭのＤＭＨ−１などのＢＭＰ４アンタゴニストを含有し得、最後に、肺始原細胞の産生を誘導するために、１〜１００ｕｇ／ｍｌのＢＭＰ４、１０〜５００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、１０〜５００ｎＭのＣＨＩＲ  ９９０２１などのＧＳＫ−３β阻害剤、１〜１００ｎＭのＰＩＫ−７５などのＰＩ３Ｋ阻害剤及び１��１００ｎＭのメトトレキセートを含有し得る。
【０２５３】
播種のための細胞を分離し、収集するいずれかの適切な方法を使用することができる。例えば、人工多能性幹細胞は、一般に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８などの転写因子の異所的発現により、多能性状態に「再プログラムされた」体細胞から得ることができる。Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−７２（２００７）；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：１４１−１４６（２００８）；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−２０（２００７）；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．７：６５１−５  ２０１０；及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１：１９６−２０４（２０１１）；Ｍａｌｉｋ  ａｎｄ  Ｒａｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１３；９９７：２３−３３；Ｏｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｆｅｂ  １；１１２（３）：５２３−３３；Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｙｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１３；９３６：２９５−３１２を参照されたい。末梢血液由来の単核細胞を患者の血液サンプルから分離して、人工多能性幹細胞を生成するために使用することができる。他の例では、人工多能性幹細胞は、トランスフォーミング成長因子β（ＳＢ４３１５４２）、ＭＥＫ／ＥＲＫ（ＰＤ０３２５９０１）及びＲｈｏキナーゼシグナル伝達（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）などの小分子と一緒に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭＹＣの高度同時発現のために最適化した構築物を用いて再プログラムすることにより取得することができる。Ｇｒｏβ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１３：７６５−７６（２０１３）及びＨｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：６５１−６５４（２０１３）を参照されたい。幹細胞から内皮細胞を生成する方法は、Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３  Ａｐｒ；７５（４）：８９７−９０６で検討されている。臍帯血幹細胞は、新鮮な又は凍結した臍帯血から分離することができる。間葉系幹細胞は、例えば、生の未精製の骨髄又はフィコール精製骨髄から分離することができる。上皮及び内皮細胞は、当技術分野で公知の方法に従って生体又は死体ドナーから、例えば本明細書に記載する臓器又は組織を受ける予定の対象から摘出して収集することができる。例えば、上皮細胞は、皮膚組織サンプルから得ることができ（例えば、パンチ生検）、内皮細胞は、血管組織サンプルから得ることができる。一部の実施形態では、タンパク質分解酵素は、血管系内に挿入されたカテーテルを通して組織サンプル中に灌流される。酵素処理した組織の一部を酵素的及び機械的破壊にさらに付すことができる。このようにして得られた細胞の混合物を分離して上皮及び内皮細胞を精製することができる。いくつかの場合、フローサイトメトリーに基づく方法（例えば、蛍光励起細胞選別）を使用して、特定の細胞表面マーカーが存在するかしないかに基づいて細胞を選別することができる。例えば、臓器又は組織細胞（上皮、間葉系及び内皮）は、臓器又は組織生検から得ることができ、これらは、臓器が肺である場合、経気管支及び気管支内生検を介して又は臓器若しくは組織の外科的生検を介して得ることができる。非自家細胞が使用される場合、対象に移植したときに臓器又は組織が拒絶されないように、免疫型が適合した細胞を選択することを考慮すべきである。
【０２５４】
摘出した細胞は、緩衝溶液（例えば、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水）ですすぎ、細胞培地中に再懸濁することができる。標準的な細胞培養方法を使用して、細胞の集団を培養し、それを増殖させることができる。得られたら、細胞を用いて臓器又は組織スカフォールドに播種することができ、例えば動脈若しくは静脈ラインを介して（内皮細胞）又は気道（気管）ラインを通して（上皮細胞）マトリックスに導入することができる。例えば、組織マトリックスに任意の適切な細胞密度で少なくとも１つの細胞型をインビトロで播種することができる。例えば、マトリックスに播種する細胞密度は、マトリックス１グラム当たり少なくとも１×１０３個であり得る。細胞密度は、マトリックス１グラム当たり約１×１０５〜約１×１０１０個（例えば、マトリックス１グラム当たり少なくとも１００，０００個、１，０００，０００個、１０，０００，０００個、１００，０００，０００個、１，０００，０００，０００個又は１０，０００，０００，０００個）であり得る。
【０２５５】
一部の実施形態では、脱細胞化又は人工肺組織マトリックスは、本明細書で提供するように、灌流播種により、前述した細胞型及び細胞密度で播種することができる。例えば、フロー灌流システムを使用して、（例えば、動脈ラインを通して）組織マトリックス中に保存された血管系を介して脱細胞化肺組織マトリックスを播種することができる。いくつかの場合、適切な条件下で自動フロー灌流システムを使用することができる。こうした灌流播種方法は、播種効率を改善し、組成物全体に細胞のより均一な分布を提供することができる。定量的な生化学的及び画像分析技術を使用して、静的又は灌流いずれかの播種方法後、播種された細胞の分布を評価することができる。一部の実施形態では、細胞播種のステップは、例えば、米国特許第６，４７９，０６４号明細書、同第８，４７０，５２０号明細書、米国特許出願公開第２０１２／００６４５３７号明細書及び同第２０１３／０１５６７４４号明細書（これらの開示内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法及び手順に従って実施され得る。
【０２５６】
一部の実施形態では、臓器又は組織スカフォールドに１つ又は複数の成長因子を含浸させて、播種された再生細胞の分化を刺激することができる。例えば、臓器又は組織スカフォールドに、本明細書で提供する方法及び材料に適した成長因子、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＴＧＦ−β成長因子、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−４）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えばＦＧＦ−１０、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）又は成長分化因子−５（ＧＤＦ−５）を含浸させることができる。例えば、Ｄｅｓａｉ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｒｅｓｐｉｒｅ．Ｒｅｓ．３：２（２００２）を参照されたい。これらの成長因子は、時間的放出を制御するようにカプセル化することができる。スカフォールドの様々な部分を異なる成長因子で増進して、成長因子刺激の空間的制御を追加することができる。
【０２５７】
播種された組織マトリックスを播種後にある期間（例えば、数時間〜約１４日以上）にわたってインキュベートして、組織マトリクス中の細胞の生着及び浸透を改善することができる。播種された臓器又は組織スカフォールドは、再生細胞の少なくとも一部が無細胞組織マトリックス内部及びその上で増加及び／又は分化することができる条件下で維持することができる。こうした条件としては、限定されないが、適切な温度（３５〜３８℃）及び／又は圧力（例えば、大気圧）、電気的及び／又は機械的活性（例えば、呼気終端陽圧１〜２０ｃｍＨ２Ｏ、平均気道圧５〜５０ｃｍＨ２Ｏ、最大吸気圧５〜６５ｃｍＨ２Ｏで、陽圧又は陰圧を介した換気）、適切な量の流体、例えばＯ２（１％〜１００％ＦｉＯ２）及び／又はＣＯ２（０％〜１０％ＦｉＣＯ２）、適切な量の湿度（１０％〜１００％）、並びに滅菌又はほぼ滅菌条件を挙げることができる。こうした条件として湿潤換気、湿潤・乾燥換気及び乾燥換気も挙げることができる。いくつかの場合、栄養補助剤（例えば、栄養素及び／又はグルコースなどの炭素源）、外性ホルモン又は成長因子を、播種された組織マトリックスに添加することができる。組織学及び細胞染色を行って、播種された細胞の増殖に関するアッセイを実施することができる。任意の適切な方法を実施して、播種された細胞の分化についてアッセイすることができる。
【０２５８】
このように、本明細書に記載する方法を使用して、例えばヒトレシピエント対象への移植のために移植可能な臓器又は組織を作製することができる。一部の実施形態では、移植可能な臓器又は組織は、患者の血管系に接続することができる十分にインタクトな血管系を保持している。
【０２５９】
補綴メッシュ
一部の実施形態では、本開示は、生物学的補綴メッシュを調製する方法であって、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドを、官能基化された細胞外マトリックスの反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子と反応させるステップを含む方法を提供する。これらの実施形態のいくつかの態様では、反応させるステップは、本明細書に記載の方法及び手順のいずれかを用いて実施する。これらの実施形態のいくつかの態様では、臓器又は組織は、本明細書に記載の臓器又は組織のいずれか１つである。これらの実施形態の他の態様では、臓器又は組織は、皮弁である。
【０２６０】
一部の実施形態では、本開示は、生物活性分子で官能基化された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドを含む生物学的補綴メッシュを提供する。これらの実施形態のいくつかの態様では、生物活性分子は、バンコマイシン又はヘパリンである。これらの実施形態のいくつかの態様では、臓器又は組織は、本明細書に記載の臓器又は組織のいずれか１つである。これらの実施形態の他の態様では、臓器又は組織は、皮弁である。
【０２６１】
一部の実施形態では、生物学的補綴メッシュは、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、ｅＰＴＦＥ）、ダクロン、オーロン、ポリエチレン、マイラー及びマーレックスから選択される材料をさらに含む。一部の実施形態では、生物学的補綴メッシュは、生分解性ポリマーをさらに含む。一部の実施形態では、生物学的補綴メッシュは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）をさらに含む。一部の実施形態では、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）は、例えば、約１：９〜約９：１、約１：４〜約４：１、約３：７〜約７：３又は約３：２〜約２：３の範囲の比で乳酸：グリコール酸モノマーを含む。一部の実施形態では、生物学的補綴メッシュは、脂肪族ポリエステルポリマーを含む。一部の実施形態では、脂肪族ポリエステルポリマーは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）及びポリヒドロキシ酪酸などのポリヒドロキシルアルカノエート（ＰＨＡ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、脂肪族ポリエステルポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びポリグリコール酸（ＰＧＡ）から選択される。一部の実施形態では、メッシュは、チタン／プロピレン複合材料を含む。一部の実施形態では、メッシュは、複合メッシュである。一部の実施形態では、生物学的補綴メッシュは、積層複合材料である。一部の実施形態では、メッシュは、吸収性である。一部の実施形態では、メッシュは、恒久性である。一部の実施形態では、メッシュは、遮蔽コーティングを含む。一部の実施形態では、メッシュは、グリセロール及びプロピレングリコール（例えば、これらの材料を含む薄膜）を含む。
【０２６２】
一部の実施形態では、メッシュは、モノフィラメントである。一部の実施形態では、メッシュは、デュアルフィラメントである。他の実施形態では、メッシュは、マルチフィラメントである。一部の実施形態では、メッシュは、軽重量である。他の実施形態では、メッシュは、高重量である。一部の実施形態では、メッシュの重量は、約１ｇ／ｃｍ２〜約５００ｇ／ｃｍ２、約１０ｇ／ｃｍ２〜約４００ｇ／ｃｍ２、約２０ｇ／ｃｍ２〜約３００ｇ／ｃｍ２、約３０ｇ／ｃｍ２〜約２００ｇ／ｃｍ２、約４０ｇ／ｃｍ２〜約１５０ｇ／ｃｍ２又は約５０ｇ／ｃｍ２〜約１５０ｇ／ｃｍ２である。一部の実施形態では、メッシュの重量は、約１ｇ／ｃｍ２、約１０ｇ／ｃｍ２、約２０ｇ／ｃｍ２、約３０ｇ／ｃｍ２、約４０ｇ／ｃｍ２、約５０ｇ／ｃｍ２、約６０ｇ／ｃｍ２、約７０ｇ／ｃｍ２、約８０ｇ／ｃｍ２、約９０ｇ／ｃｍ２、約１００ｇ／ｃｍ２、約１５０ｇ／ｃｍ２又は約２００ｇ／ｃｍ２である。
【０２６３】
一部の実施形態では、マクロファージ、線維芽細胞、血管及びコラーゲンの浸透を可能にする生物学的補綴メッシュの細孔径である。一部の実施形態では、生物学的補綴メッシュの細孔径は、約１μｍ〜約１０００μｍ、約２μｍ〜約９５０μｍ、約３μｍ〜約９００μｍ、約４μｍ〜約８５０μｍ、約５μｍ〜約８００μｍ、約６μｍ〜約７５０μｍ、約７μｍ〜約７００μｍ、約８μｍ〜約６５０μｍ、約９μｍ〜約６００μｍ、約１０μｍ〜約５５０μｍ、約２０μｍ〜約５００μｍ、約３０μｍ〜約４５０μｍ、約４０μｍ〜約４００μｍ、約５０μｍ〜約３５０μｍ、約６０μｍ〜約３００μｍ、約７０μｍ〜約２５０μｍ、約８０μｍ〜約２００μｍ又は約１００μｍ〜約２００μｍである。一部の実施形態では、生物学的補綴メッシュの細孔径は、約１μｍ、約５μｍ、約７μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約７５μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７５０μｍ又は約１０００μｍである。
【０２６４】
一部の実施形態では、約３２Ｎ／ｃｍでのメッシュの弾性は、約１０％〜約８０％、約２０％〜約７０％又は約３０％〜約６０％である。一部の実施形態では、約３２Ｎ／ｃｍでのメッシュの弾性は、約１０％、約２０％、約３０％、約３８％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％又は約８０％である。一部の実施形態では、約１６Ｎ／ｃｍでのメッシュの弾性は、約１％〜約６０％、約２％〜約５０％、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約４％〜約２０％、約４％〜約１５％又は約２０％〜約４０％である。一部の実施形態では、約１６Ｎ／ｃｍでのメッシュの弾性は、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約２０％、約３０％又は約４０％である。
【０２６５】
一部の実施形態では、補綴メッシュの引っ張り強さは、約１０Ｎ／ｃｍ〜約１０００Ｎ／ｃｍ、約２０Ｎ／ｃｍ〜約９００Ｎ／ｃｍ、約３０Ｎ／ｃｍ〜約８００Ｎ／ｃｍ、約４０Ｎ／ｃｍ〜約７００Ｎ／ｃｍ、約５０Ｎ／ｃｍ〜約６００Ｎ／ｃｍ、約６０Ｎ／ｃｍ〜約５００Ｎ／ｃｍ、約７０Ｎ／ｃｍ〜約４００Ｎ／ｃｍ、約８０Ｎ／ｃｍ〜約３００Ｎ／ｃｍ又は約７５Ｎ／ｃｍ〜約１５０Ｎ／ｃｍである。一部の実施形態では、補綴メッシュの引っ張り強さは、約１０Ｎ／ｃｍ、約２０Ｎ／ｃｍ、約３０Ｎ／ｃｍ、約４０Ｎ／ｃｍ、約５０Ｎ／ｃｍ、約６０Ｎ／ｃｍ、約７０Ｎ／ｃｍ、約８０Ｎ／ｃｍ、約９０Ｎ／ｃｍ、約１００Ｎ／ｃｍ、約１５０Ｎ／ｃｍ、約２００Ｎ／ｃｍ、約３００Ｎ／ｃｍ又は約５００Ｎ／ｃｍである。
【０２６６】
一部の実施形態では、生物学的補綴メッシュは、本明細書に記載する生物活性分子で官能基化された細胞外マトリックスを含む哺乳動物臓器又は組織の脱細胞化スカフォールドを用いて調製することができる。一部の実施形態では、生物学的補綴メッシュは、例えば、米国特許出願公開第２００２／００４２６５８号明細書、同第２００９／０１９２５２８号明細書、同第２０１０／０２７２７８２号明細書、同第２０１０／０３１８１０８号明細書、同第２０１５／０２９７７９８号明細書、同第２０１６／００１５５０３号明細書、国際公開第２０１３／０９３９２１号パンフレット及び同第２０１６／０６１４５０号パンフレットに記載されている方法のいずれか１つによって調製され得、これらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６７】
本明細書に記載する生物学的補綴メッシュは、腹部開放、感染及び／又は重篤な感染、従来から知られている補綴メッシュの使用を不適切にする状態を含む大部分の困難な複雑ヘルニアを有利に処置する。本明細書に記載する生物学的補綴メッシュは、完全な治癒に必要な細胞外成分を有利に提供し、新しく且つ健全な組織の再建を可能にすると共に、機械的及び機能的統合性を腹壁に回復させる。
【０２６８】
臓器又は組織移植片の分子増強
一部の実施形態では、本開示は、生物活性分子（例えば、本明細書に記載する生物活性分子のいずれか１つ）で官能基化される、移植のための臓器又は組織を提供する。これらの実施形態のいくつかの態様では、生物活性分子は、バンコマイシンである。これらの実施形態の別の態様では、生物活性分子は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に対して特異的な抗体（例えば、アダリムマブ）である。
【０２６９】
一部の実施形態では、本開示は、移植のための臓器又は組織を調製する方法であって、（ｉ）生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素をドナー対象に投与して（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて）、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された臓器又は組織を取得するステップと、（ｉｉ）本明細書に記載のドナー対象から手術により臓器又は組織を取り出すステップと、（ｉｉｉ）摘出された臓器又は組織を、本明細書に記載の官能基化栄養素の反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子を含む保存液で処理することにより、生物活性分子で官能基化された臓器又は組織を取得するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、生物活性分子で官能基化された臓器又は組織を保存液で洗浄して、移植のために調製された臓器又は組織を取得するステップをさらに含む。
【０２７０】
一部の実施形態では、栄養素を官能基化する反応性化学基は、アジド又はアルキン（例えば、脂肪族アルキン又はシクロオクチン）である。一部の実施形態では、生体直交型化学反応で反応性の化学基で官能基化された栄養素は、本明細書に記載する栄養素のいずれか１つである。これらの実施形態のいくつかの態様では、栄養素は、アルキニルフコース、アルキニルＭａｎＮＡｃ、アルキン標識ガラクトサミン、アルキン標識グルコサミン、アルキン標識マンノサミン、アルキン標識ガラクトサミン、アルキン標識グルコサミン、アルキン標識マンノサミン、アジド標識ガラクトサミン（例えば、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ）、アジド標識グルコサミン（例えば、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ）、アジド標識マンノサミン（例えば、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ）から選択される。これらの実施形態のいくつかの態様では、栄養素は、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ及びＡｃ４ＧａｌＮＡｚから選択される。これらの実施形態のいくつかの態様では、栄養素は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚである。
【０２７１】
一部の実施形態では、官能基化栄養素の反応性化学基に対して相補的な反応性化学基は、アジドである。一部の実施形態では、官能基化栄養素の反応性化学基に対して相補的な反応性化学基は、脂肪族アルキンである。一部の実施形態では、官能基化栄養素の反応性化学基に対して相補的な反応性化学基は、シクロオクチンである。一部の実施形態では、シクロオクチンは、ＤＢＣＯである。一部の実施形態では、ＤＢＣＯで官能基化された生物活性分子は、バンコマイシンである。一部の実施形態では、アジドで官能基化された生物活性分子は、バンコマイシンである。一部の実施形態では、アルキンで官能基化された生物活性分子は、バンコマイシンである。一部の実施形態では、ＤＢＣＯで官能基化された生物活性分子は、ヘパリンである。一部の実施形態では、アジドで官能基化された生物活性分子は、ヘパリンである。一部の実施形態では、アルキンで官能基化された生物活性分子は、ヘパリンである。一部の実施形態では、ＤＢＣＯで官能基化された生物活性分子は、抗ＴＮＦ−α抗体である。一部の実施形態では、アジドで官能基化された生物活性分子は、抗ＴＮＦ−α抗体である。一部の実施形態では、アルキンで官能基化された生物活性分子は、抗ＴＮＦ−α抗体である。一部の実施形態では、レシピエント対象は、本明細書に記載する生物活性分子で官能基化された臓器又は組織の移植後、虚血、再灌流傷害及び細菌感染から選択される状態に罹患しにくい。
【０２７２】
一部の実施形態では、処置は、約０℃〜約４０℃、約０℃〜約３７℃、約２５℃〜約３７℃、約０℃〜約２５℃、約０℃〜約２０℃、約０℃〜約１５℃、約０℃〜約１０℃又は約０℃〜約５℃の温度で実施される。一部の実施形態では、処置は、約０℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３７℃、約４０℃又は周囲温度で実施される。一部の実施形態では、処置は、約０℃で実施される。一部の実施形態では、処置は、約２５℃で実施される。一部の実施形態では、処置は、約３７℃で実施される。
【０２７３】
一部の実施形態では、処置は、約５分〜約２４時間、約１５分〜１８時間、約３０分〜約１２時間、約４５分〜約６時間又は約１時間〜約２時間の期間にわたって実施される。一部の実施形態では、処置は、約１５分、約３０分、約４５分、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間又は約２４時間で実施される。
【０２７４】
一部の実施形態では、処置は、あらゆる触媒の非存在下で実施される。一部の実施形態では、処置は、銅触媒の非存在下で実施される。一部の実施形態では、処置は、銅（Ｉ）触媒の存在下で実施される。一部の実施形態では、銅（Ｉ）触媒は、ＣｕＳＯ４、ＣｕＡＡＣ、Ｃｕ（ＭｅＣＮ）４ＰＦ６、ＣｕＢｒ及びＣｕＩから選択される。これらの実施形態のいくつかの態様では、銅触媒は、安定化リガンド（例えば、ＴＢＴＡ、ＴＨＰＴＡ）と一緒に使用される。これらの実施形態のいくつかの態様では、処置は、アスコルビン酸ナトリウムの存在下で実施される。これらの実施形態のいくつかの態様では、銅触媒の量は、約０．１ｍｏｌ．％〜約５ｍｏｌ％、約０．２ｍｏｌ．％〜約４ｍｏｌ％、約０．３ｍｏｌ．％〜約３ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ．％〜約２ｍｏｌ％又は約０．７ｍｏｌ．％〜約１．５ｍｏｌ％である。これらの実施形態の他の態様では、銅触媒の量は、約０．１ｍｏｌ．％、約０．２ｍｏｌ．％、約０．３ｍｏｌ．％、約０．４ｍｏｌ．％、約０．５ｍｏｌ．％、約０．６ｍｏｌ．％、約０．７ｍｏｌ．％、約０．８ｍｏｌ．％、約０．９ｍｏｌ．％、約１．０ｍｏｌ．％、約１．１ｍｏｌ．％、約１．２ｍｏｌ．％、約１．３ｍｏｌ．％、約１．５ｍｏｌ．％又は約２．０ｍｏｌ．％である。
【０２７５】
一部の実施形態では、保存液は、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（登録商標）又はＣｏＳｔｏｒＳｏｌ（登録商標）保存液のいずれか１つである。一部の実施形態では、保存液は、水溶液（注射グレード水）である。一部の実施形態では、保存液は、当技術分野で公知の保存液のいずれか１つである。一部の実施形態では、保存液は、ラクトビオン酸、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム七水和物、ラフィノース五水和物、アデノシン、アロプリノール、グルタチオン、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム及び塩酸から選択される成分を含む。
【０２７６】
一部の例では、保存液は、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（登録商標）又は表１に示す組成物などの低カリウム細胞外タイプの溶液を含み得る。また、アミノ酸、抗生物質又は薬剤（例えば、表２に示すもの又は本明細書に記載するアミノ酸、抗生物質及び薬剤のいずれか１つ）を保存液に添加し得る。
【０２７７】
【表１】
2019527040.tif 000048
【０２７８】
【表２】
2019527040.tif 000049
【０２７９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の官能基化栄養素の反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子の、保存液中の濃度は、約０．０１μＭ〜約１０００ｍＭであり、約０．０１μＭ〜約１００ｍＭ、約０．０１μＭ〜約１０ｍＭ、約０．０１μＭ〜約１ｍＭ、約０．０１μＭ〜約５００μＭ、約０．０１μＭ〜約２５０μＭ、約０．０１μＭ〜約１００μＭ、約０．０１μＭ〜約５０μＭ、約０．０１μＭ〜約２５μＭ、約０．０１μＭ〜約１０μＭ、約０．０１μＭ〜約１μＭ、約０．０１μＭ〜約０．５μＭ、約０．０５μＭ〜約１０μＭ、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約０．０５μＭ〜約１ｍＭ、約０．１μＭ〜約１ｍＭ、約０．５μＭ〜約１ｍＭ、約１μＭ〜約１ｍＭ、約１０μＭ〜約１ｍＭ、約１００μＭ〜約１ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約２ｍＭ〜約９００ｍＭ、約３ｍＭ〜約８００ｍＭ、約４ｍＭ〜約７００ｍＭ、約５ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６ｍＭ〜約５００ｍＭ、約７ｍＭ〜約４００ｍＭ、約８ｍＭ〜約３００ｍＭ、約９ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約８０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ又は約４０ｍＭ〜約６０ｍＭである。一部の実施形態では、本明細書に記載の官能基化栄養素の反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子の、保存液中の濃度は、約０．０１μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、約２５μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、約２５０μＭ、約５００μＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約５ｍＭ、約７．５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、ｖ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ又は約１００ｍＭである。一部の実施形態では、本明細書に記載の官能基化栄養素の反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子の、保存液中の濃度は、約１μＭ〜約１０００μＭ、約２μＭ〜約９００μＭ、約３μＭ〜約８００μＭ、約４μＭ〜約７００μＭ、約５μＭ〜約６００μＭ、約６μＭ〜約５００μＭ、約７μＭ〜約４００μＭ、約８μＭ〜約３００μＭ、約９μＭ〜約２００μＭ、約１０μＭ〜約１００μＭ、約２０μＭ〜約９０μＭ、約２５μＭ〜約８０μＭ、約３０μＭ〜約７０μＭ又は約４０μＭ〜約６０μＭである。一部の実施形態では、本明細書に記載の官能基化栄養素の反応性化学基に対して相補的な反応性化学基で官能基化された生物活性分子の、保存液中の濃度は、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約４５μＭ、約５０μＭ、約５５μＭ、約６０μＭ、約６５μＭ、約７０μＭ、約７５μＭ、約８０μＭ、約８５μＭ、約９０μＭ又は約１００μＭである。
【０２８０】
参照文献
１．Ｃｈｉｕ，Ｌ．Ｌ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｒａｄｉｓｉｃ，Ｍ．（２０１０）．Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＶＥＧＦ  ａｎｄ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１  ｆｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３１，２２６−２４１．
２．Ｓｈｅｎ，Ｙ．Ｈ．，Ｓｈｏｉｃｈｅｔ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｒａｄｉｓｉｃ，Ｍ．（２００８）．Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ４，４７７−４８９．
３．Ｗｉｓｓｉｎｋ，Ｍ．Ｊ．Ｂ．，Ｂｅｅｒｎｉｎｋ，Ｒ．，Ｐｉｅｐｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｐｏｏｔ，Ａ．Ａ．，Ｅｎｇｂｅｒｓ，Ｇ．Ｈ．Ｍ．，Ｂｅｕｇｅｌｉｎｇ，Ｔ．，ｖａｎ  Ａｋｅｎ，Ｗ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｆｅｉｊｅｎ，Ｊ．（２００１）．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｔｏ  ＥＤＣ／ＮＨＳ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２，１５１−１６３．
４．Ｄａｒｅｈｚｅｒｅｓｈｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｖｅｒｓｕｓ  ｎｏｎｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｍｅｓｈ  ｉｎ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｈｅｒｎｉａ  ｒｅｐａｉｒ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．３８，４０−５０（２０１４）．
５．Ｂｅｌｌｏｗｓ，Ｃ．Ｆ．，Ｗｈｅａｔｌｅｙ，Ｂ．Ｍ．，Ｍｏｒｏｚ，Ｋ．，Ｒｏｓａｌｅｓ，Ｓ．Ｃ．＆Ｍｏｒｉｃｉ，Ｌ．ａ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｓｈ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，（２０１１）．
６．Ｃｏｌｌａｇｅ，Ｒ．Ｄ．＆Ｒｏｓｅｎｇａｒｔ，Ｍ．Ｒ．Ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｗａｌｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｍｅｓｈ．Ｓｕｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．（Ｌａｒｃｈｍｔ）．１１，３１１−８（２０１０）．
７．Ｏｔｔ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ  ｍａｔｒｉｘ：ｕｓｉｎｇ  ｎａｔｕｒｅ’ｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｏ  ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ａ  ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｈｅａｒｔ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４，２１３−２２１（２００８）．
８．Ｈａｌａｗｅｉｓｈ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｅｒｎｉａ  ｒｅｐａｉｒ  ｍｅｓｈｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｒｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｓｕｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．（Ｌａｒｃｈｍｔ）．１１，４４９−４５４（２０１０）．
９．Ｃｈｉｕ，Ｌ．Ｌ．Ｙ．＆Ｒａｄｉｓｉｃ，Ｍ．Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＶＥＧＦ  ａｎｄ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１  ｆｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３１，２２６−２４１（２０１０）．
１０．Ｙａｎｇ，Ｃ．−Ｈ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｐｏｎｇｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９，１４３３−１４４０（２００８）．
１１．Ｇｒｏｖｅｒ，Ｃ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｂａｓｅｄ  ｆｉｌｍｓ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ８，３０８０−３０９０（２０１２）．
１２．Ｐｉｅｐｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｏｏｓｔｅｒｈｏｆ，Ａ．，Ｄｉｊｋｓｔｒａ，Ｐ．Ｊ．，Ｖｅｅｒｋａｍｐ，Ｊ．Ｈ．＆ｖａｎ  Ｋｕｐｐｅｖｅｌｔ，Ｔ．Ｈ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｏｕｓ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｌｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｐｈａｔｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０，８４７−８５８（１９９９）．
１３．Ｏｌｄｅ  Ｄａｍｉｎｋ，Ｌ．Ｈ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅｅｐ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １７，７６５−７７３（１９９６）．
１４．Ｇｒｏｖｅｒ，Ｃ．Ｎ．，Ｆａｒｎｄａｌｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｅｓｔ，Ｓ．Ｍ．＆Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｒ．Ｅ．Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｉｌｍｓ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅｉｒ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ  １００Ａ，２４０１−２４１１（２０１２）．
１５．Ｄａｖｉｄｅｎｋｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ２５，１３１−１４２（２０１５）．
１６．Ｃｈａｎｇ，Ｐ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｋｙｎｙｌ  Ｓｕｇａｒｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４８，４０３０−４０３３（２００９）．
１７．Ｈａｎｇ，Ｈ．Ｃ．，Ｙｕ，Ｃ．，Ｋａｔｏ，Ｄ．Ｌ．＆Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．Ａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏｗａｒｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｃｉｎ−ｔｙｐｅ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １００，１４８４６−１４８５１（２００３）．
１８．Ｃｈａｎｇ，Ｐ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｐｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ａｎｉｍａｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０７，１８２１−１８２６（２０１０）．
１９．Ｓａｌｉｃ，Ａ．＆Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０５，２４１５−２４２０（２００８）．
２０．Ｊａｏ，Ｃ．Ｙ．，Ｒｏｔｈ，Ｍ．，Ｗｅｌｔｉ，Ｒ．＆Ｓａｌｉｃ，Ａ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｏｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０６，１５３３２−１５３３７（２００９）．
２１．Ｈｉｎｚ，Ｆ．Ｉ．，Ｄｉｅｔｅｒｉｃｈ，Ｄ．Ｃ．，Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．＆Ｓｃｈｕｍａｎ，Ｅ．Ｍ．Ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ｔｏ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅ  ａｎｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｉｆｙ  Ｎｅｗｌｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｌａｒｖａｌ  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３，４０−４９（２０１２）．
２２．Ｊａｏ，Ｃ．Ｙ．＆Ｓａｌｉｃ，Ａ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０５，１５７７９−１５７８４（２００８）．
２３．Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｓｔｏｌｅｒｕ，Ｄ．＆Ｓａｌｉｃ，Ａ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｌｋｙｎｅ  ａｎａｌｏｇ  ｏｆ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０９，４１３−４１８（２０１２）．
２４．Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ−ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｎｅｗｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ９，２２３７−２２５５（２０１４）．
２５．Ｓｃｈｉａｐｐａｒｅｌｌｉ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３，３９６６−３９７８（２０１４）．
２６．Ｏｔｔ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｌｕｎｇ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １６，９２７−９３３（２０１０）．
２７．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｌｕｎｇｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，５３８−５４１（２０１０）．
２８．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｃｏｕｒｔｍａｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｋｌｅｍｅｎｔ，Ｐ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｍ．＆Ｙｅｇｅｒ，Ｈ．Ａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ：Ａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｂｙｐａｓｓ  ａｎｄ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．６０，Ｓ３５３−３５８（１９９５）．
２９．Ｂａｄｙｌａｋ，Ｓ．Ｆ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．＆Ｕｙｇｕｎ，Ｋ．Ｗｈｏｌｅ−Ｏｒｇａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．１３，２７−５３，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ−ｂｉｏｅｎｇ−０７１９１０−１２４７４３（２０１１）．
３０．Ｃｒａｐｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．＆Ｂａｄｙｌａｋ，Ｓ．Ｆ．Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｗｈｏｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２，３２３３−３２４３（２０１１）．
３１．Ｈｏｎｇ，Ｖ．，Ｐｒｅｓｏｌｓｋｉ，Ｓ．Ｉ．，Ｍａ，Ｃ．＆Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｐｐｅｒ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ａｚｉｄｅ−Ａｌｋｙｎｅ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｅｄ．ｉｎ  Ｅｎｇｌｉｓｈ）４８，９８７９−９８８３（２００９）．
３２．Ｐｒｅｓｏｌｓｋｉ，Ｓ．Ｉ．，Ｈｏｎｇ，Ｖ．Ｐ．＆Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．Ｃｏｐｐｅｒ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ａｚｉｄｅ−Ａｌｋｙｎｅ  Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）．
３３．Ｄｕｂｅ，Ｄ．Ｈ．，Ｐｒｅｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｑｕａｎｇ，Ｃ．Ｎ．＆Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｍｕｃｉｎ−ｔｙｐｅ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ａｎｉｍａｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０３，４８１９−４８２４（２００６）．
３４．Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｓ．Ｔ．＆Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｌｙｃａｎｓ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４，１０６８−１０７２（２００９）．
【０２８１】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するわけではない。
【実施例】
【０２８２】
材料及び一般的方法
インビボ代謝操作及び臓器／組織脱細胞化
全ての動物実験は、マサチューセッツ総合病院動物実験委員会（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認され、動物保護法（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ）を順守して実施した。雄スプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（１００〜１２５ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に代謝標識試薬（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ又はＡｃ４ＭａｎＮＡｚ）（３０ｍｇ／日、クリックケミストリーツール）を腹腔内注射により３日間投与した。最後の代謝標識試薬の投与から１日後、臓器を動物から摘出し、下記条件を用いた灌流により脱細胞化した：肺の場合、肺動脈（ＰＡ）を介して０．１％ＳＤＳ；心臓の場合、上行大動脈を介して１％ＳＤＳ逆行性冠灌流；腎臓の場合、腎動脈を介して１％ＳＤＳ；肝臓の場合、下大静脈（上大静脈を結紮して）を介して１％ＳＤＳ）。動物の腹部から全層植皮を摘出し、１％ＳＤＳ中に攪拌しながら浸漬することによって脱細胞化した。脱細胞化臓器及び組織スカフォールドは、蒸留水、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ及びＰＢＳで順次洗浄した。
【０２８３】
ラット及びブタ肺のエクスビボ代謝操作及び脱細胞化
ラット肺のエクスビボ代謝操作のために、雄スプラーグ・ドーリーラット（１００〜１２５ｇ）から肺を新しく摘出した。摘出したラット肺を、バイオリアクター内において、ＰＡを介した定速灌流（５ｍｌ／分）下、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ（５０μＭ）又はＤＭＳＯ（０．１％）の補充を含み、１０％ウシ胎児血清（ＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＦＢＳ）を含有する１００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で２４時間培養した後、前述した通りに灌流脱細胞化を実施した。
【０２８４】
ブタ肺のエクスビボ代謝操作のために、左肺を雄ヨークシャー種（Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ）ブタ（１８〜２０ｋｇ、タフツ大学（Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））から肺を新しく摘出した。摘出したブタ左肺を、バイオリアクター内において、左主ＰＡを介した定速灌流（３００ｍｌ／分）下、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ（５０μＭ）又はＤＭＳＯ（０．１％）の補充を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＦＢＳ培地中で２４時間培養した。最初に３Ｌの培地を使用し、最初の１６時間の培養後、さらに２Ｌの培地で１回取り替えた。培養中、流量１５０ｍｌ／分で同時酸素供給ループを使用した。培養後、以前に記載されている方法（Ｚｈｏｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｇｒａｆｔｓ  ｏｎ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈ  Ａｈｅａｄ  ｏｆ  Ｐｒｉｎｔ（２０１７））から改変して、０．５％ＳＤＳ、蒸留水、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ及びＰＢＳによる左主ＰＡを介した連続的シングルパス灌流によってブタ左肺を脱細胞化した。
【０２８５】
コラーゲン−アジドウェルアッセイ
９６ウェルプレート内のウェルを２００μｇ／ｍＬのコラーゲンＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングし、ＤＰＢＳ（ｐＨ８．０）中の５ｍＭアジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（Ａｚ−ＨＮＳ、１０％ＤＭＳＯ）又は１０％ＤＭＳＯ（対照）と一緒に一晩インキュベートした後、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．０）で入念に洗浄した。Ａｚ−ＮＨＳ共役を有する及び有さないコラーゲンウェルを、１ｍＭ硫酸銅（ＩＩ）を含有するＣｌｉｃｋ−ｉＴ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用い、室温で２０μＭヘパリン−ＡＢと１時間クリック反応させた（ｃｌｉｃｋｅｄ）。これらのウェルをＴＢＳ（２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を含有）及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）で順次洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）中１％ＢＳＡでブロックした後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）中１％ＢＳＡ中の抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ、２５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と一緒に３７℃で１時間にわたってインキュベータした。Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）での洗浄後、各ウェルをＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）中の２．４ｎｋａｔ／ｍｌの第Ｘａ因子（ＦＸａ）３０μｌと一緒に３７℃で５、１５又は３０分間インキュベートした。各時点でＳ−２２２２発色基質（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を用いて、製造者の指示に従い、各ウェルに残留するＦＸａ活性を定量した。２０％酢酸の添加により発色反応を停止し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて吸光度を４０５ｎｍで読み取った。ウェル内でのイメージングのために、ヘパリン−ビオチン（ヘパリン−Ｂ）をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−共役ストレプトアビジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓ−３２３５６、１：５００）で染色し、ＡＴＩＩＩは、ヤギ抗ＡＴＩＩＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−３２４５３、１：１００）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−共役ロバ−抗ヤギ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ−１１０５８、１：５００）で順次染色し、コラーゲンＩは、ウサギ抗コラーゲンＩ（Ａｂｃａｍ，ａｂ３４７１０、１：２００）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−共役ロバ−抗ウサギ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ−２１２０６、１：５００）で順次染色した。染色後のウェルの蛍光強度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用い、ヘパリン−Ｂ及びＡＴＩＩＩについて５８４ｎｍ（ｅｘ）／６１２ｎｍ（ｅｍ）で、またコラーゲンＩについて４８５ｎｍ（ｅｘ）／５３８ｎｍ（ｅｍ）で定量した。染色ウェルの蛍光イメージスキャニングは、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００顕微鏡及びＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓイメージングソフトウエア（Ｎｉｋｏｎ）を用いて実施した。
【０２８６】
無細胞肺におけるビオチン及びヘパリン−ＡＢ注入クリック反応
エクスビボでのＡｃ４ＧａｌＮＡｚ代謝操作を有する又は有さない無細胞ラット肺に１０ｍｌのビオチン−アルキンクリック反応ミックス（１０μＭビオチン−アルキン及びＣｌｉｃｋ−ｉＴ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔを含む）又はヘパリン−ＡＢクリック反応ミックス（２０μＭヘパリン−ＡＢ及びＣｌｉｃｋ−ｉＴ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔを含む）を注入した。クリック反応ミックスの注入前に気管を結紮した。注入後室温で１時間のインキュベーション後、気管結紮を除去し、ＰＡを介したシングルパス灌流により、５００ｍｌのＴＢＳ（２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）及び１ＬのＰＢＳで無細胞肺を順次洗浄した。
【０２８７】
ヘパリン−ＡＢ官能基化無細胞肺におけるＡＴＩＩＩ固定化及びＦＸａ阻害アッセイ。エクスビボでのＡｃ４ＧａｌＮＡｚ代謝操作を有する又は有さない無細胞肺でのヘパリン−ＡＢ注入クリック反応後、ヘパリン−Ｂ固定化の組織学的分析のために右前葉及び中葉を採取した。残った肺を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）中１％ＢＳＡでブロックし、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）中１％ＢＳＡのＡＴＩＩＩ（２５μｇ／ｍｌ）３ｍｌにより、３７℃において１時間にわたり３ｍｌ／分で灌流した。ＡＴＩＩＩ灌流後、肺を５０ｍｌのＵｌｔｒａｐｕｒｅ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒによる３ｍｌ／分、３７℃で１０分間の灌流により３回洗浄した。続いて、ＡＴＩＩＩ固定化のウエスタンブロット分析のために右後葉及び副葉を摘出した。残った肺をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）中２．４ｎｋａｔ／ｍｌのＦＸａ  ３ｍｌにより、３ｍｌ／分、３７℃で、５、１５、３０及び６０分間灌流してＦＸａ不活性化を可能にした。各時点で５０μｌのＦＸａ灌流液を肺灌流物から取り出し、前述のＳ２２２２発色基質を用いて、灌流液中に残留するＦＸａ活性を定量した。
【０２８８】
組織切片に対するクリック反応及び組織学
全てのサンプルを４％パラホルムアルデヒド（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）で固定し、パラフィン包埋した後、５μｍの厚さに切断した。脱パラフィン、再水和及びＡｎｔｉｇｅｎ  Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた抗原賦活化後、オンセクションクリック反応又は通常の組織染色のいずれかのために切片を処理した。オンセクションクリック反応の場合、インビボ又はエクスビボ代謝操作から得られた無細胞臓器スカフォールドの切片を、硫酸銅（ＩＩ）と共に及び硫酸銅（ＩＩ）なしで、ビオチン−アルキンクリック反応ミックスと一緒に室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで入念に洗浄した。ビオチン及びラミニンの通常の組織染色の場合、切片をウサギ抗ラミニン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１５７５、１：２００）と一緒に４℃で一晩インキュベートした後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８共役ロバ抗ウサギ抗体（Ａ−２１２０６、１：５００）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７共役ストレプトアビジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓ−３２３５７、１：５００）で染色した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００顕微鏡及びＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓイメージングソフトウエアを用いて画像を取得した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いてアジド−ビオチン−ストレプトアビジン及びラミニン染色の蛍光強度を定量した。
【０２８９】
クリック反応及びウエスタンブロット
ウエスタンブロット分析を目的として、アジド標識無細胞肺ＥＣＭにビオチン−アルキンを共役させるために、肺組織の小切片をＰＢＳ中でｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によりホモジナイズしてから、１ｍｌのビオチン−アルキンクリック反応ミックスと一緒に室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで入念に洗浄した。クリック反応させた肺組織からのＥＣＭタンパク質を、以下に記載する尿素バッファーを用いて抽出した。肺ＥＣＭ及びＥＣＭ関連タンパク質の直接抽出のために、無細胞肺組織を尿素バッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の５Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、５０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％ＳＤＳ及び１％プロテアーゼ阻害剤）（例えば、Ｎｇｏｋａ，Ｌ．Ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ｒｅｖｅａｌ  ｄｒａｍａｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ｕｒｅａ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６，３０（２００８））中でｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒによりホモジナイズしてから、攪拌しながら室温で２時間インキュベートした後、１０ｋＤａ分子量カットオフ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅフィルターを用いてＰＢＳに対して透析した。ＢＣＡ定量後、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてタンパク質サンプルを分析し、ニトロセルロースブロッティング膜に移してから一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートし、続いてＨＲＰ共役二次抗体と一緒に室温で１時間のインキュベーション後、オートラジオグラフィーを実施した。使用した一次抗体は、ＡＴＩＩＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−３２４５３、１：４００）及びラミニン（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１５７５、１：１０００）を含み、使用した二次抗体は、ＨＲＰ共役ロバ抗ウサギ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９８４４０、１：１０，０００）及びＨＲＰ共役ロバ抗ヤギ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９８５１９、１：１０，０００）を含む。ビオチン分析のためにブロットをＨＲＰ共役ストレプトアビジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４３４３２３、１：１０，０００）と一緒にインキュベートした。
【０２９０】
統計分析
テューキーの多重比較検定又はスチューデントのｔ検定を用いた一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＯＮＯＶＡ）により、統計分析を実施した。統計的有意性は、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１として定義した。グラフ中の値は、ｓ．ｄ．を含む平均値として表示した。データ管理、統計分析及びグラフ作成のために、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）及びＰｒｉｓｍ  ７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用した。
【０２９１】
実施例１  −  ３つのアジド標識糖（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ及びＡｃ４ＭａｎＮＡｚ）の代謝標識効率の比較
本明細書に記載する方法及び手順の第１のステップは、アジド標識糖を用いる代謝標識により、化学選択的ライゲーション（クリック反応）のために脱細胞化臓器／組織スカフォールドに対するリガンド（アジドタグ）を作製することである。記載されている方法では、アジド標識ガラクトサミン（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ）を用いて脱細胞化ネイティブ臓器／組織スカフォールドを代謝標識した。モデルとして脱細胞化肺スカフォールドを選択すると、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ及びＡｃ４ＭａｎＮＡｚなどの他の市販のアジド標識糖と比較して、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚは、優れた標識効率を示すことが実証された。
【０２９２】
図２Ａにおいて、画像は、ドナーラットにおける３日間の代謝標識後、脱細胞化ラット肺に対するアジドタグ（紫色）及びＥＣＭ成分ラミニン（緑色）の染色を示した。アジドタグ染色は、ビオチン−アルキン（クリック反応を介して）
【化４７】
2019527040.tif 000050
（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号７６４２１３）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７共役ストレプトアビジンを用いて実施した。（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号：Ｓ２１３７４）。Ａｃ４ＧａｌＮＡｚは、Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚ及びＡｃ４ＭａｎＮＡｚと比較して脱細胞化ラット肺スカフォールドの標識において優れた効率を示した（図２Ａ及び２Ｂを参照されたい）。Ａｃ４ＧａｌＮＡｚは、無細胞肺において最も強力な代謝アジド標識強度をもたらした（図２５Ｃ〜２５Ｄ）。
【０２９３】
ビオチン−アルキンとのクリック共役後にＡｃ４ＧａｌＮＡｚで標識した脱細胞化肺から単離したＥＣＭタンパク質を分析し、ウエスタンブロットによりビオチン標識の存在量を明らかにし、これは、肺ＥＣＭのアジド標識が、本質的に共有結合性であることを実証した（図２５Ｅを参照されたい）。
【０２９４】
Ａｃ４ＧａｌＮＡｚの３日間の腹腔内投与により、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚは、ラット頸動脈、心臓、肝臓、腎臓及び皮膚の脱細胞化スカフォールドのインビボ代謝アジド標識で効率的であることも実証された（実施例５を参照されたい）。
【０２９５】
さらに、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いた代謝標識は、成長期及び高齢動物の両方で実施することができ、エクスビボ培養中の摘出臓器でも実施し得る（実施例４を参照されたい）ことも実証された。肺以外に血管（図３を参照されたい）及び皮弁の脱細胞化スカフォールドでも、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いて効率的な代謝標識が達成された。同じ標識技術を多くの他の臓器／組織及びブタスカフォールドなどのより大型の動物からの脱細胞化生成物に対して適用することができる。図３で、画像は、ドナーラットの３日間の代謝標識後、脱細胞化ラット頸動脈に対するアジドタグ（紫色）及びＥＣＭ成分ラミニン（緑色）の染色を示した。アジドタグ染色は、ビオチンアルキン（クリック反応を介して）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７共役ストレプトアビジンを用いて実施した。
【０２９６】
実施例２ａ  −  クリッカブルヘパリンの生成（ヘパリン−アルキン）
アジド修飾脱細胞化臓器スカフォールドに対してアルキン−生体分子を選択的に固定化することができるように、目的のアルキン共役生体分子を生成する方法を開発した。例えば、アルキン基を脱アミノ化ヘパリンのアルデヒド末端に共役させることにより、クリッカブルヘパリンを生成した。手短には、約１０ｍＭの脱アミノ化ヘパリン（Ｃａｒｂｏｍｅｒ）を、９０ｍＭのｐ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）触媒の存在下において０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）中１００ｍＭのｏ−（プロプ−２−イニル）−ヒドロキシアミン塩酸塩（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と室温で２０時間反応させた。３ｋＤａ分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅフィルターを用い、生成物を水に対して透析した。４５０ｕＭの透析生成物を５５０ｕＭ  ３０ｋＤａ  ＰＥＧ−アジド分子と１時間にわたって２種のクリック条件で（銅触媒を伴って又は伴わずに）反応させた後、０．０５Ｍジアミノプロパンバッファー（ｐＨ９．０）中１％（ｗ／ｖ）酢酸バリウム０．５％アガロースゲルを用いた電気泳動により、脱アミノ化ヘパリンとｏ−（プロプ−２−イニル）−ヒドロキシアミン塩酸塩との共役の成功を調べた。水中０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム臭化物中にゲルを１５分間浸漬することにより、ゲルを固定し、酢酸：エタノール：水（０．１：５：５比）中０．１％（ｗ／ｖ）トルイジンブルーの新鮮な溶液で３時間染色した後、１０％（ｖ／ｖ）エタノール中で脱染した。
【０２９７】
図４では、アルキン共役ヘパリン（ヘパリン−アルキン）を、銅触媒を伴う及び伴わないクリック反応を用い、ＰＥＧ（３０Ｋ）−アジドと反応させた。銅触媒の存在下でのみ、ヘパリン上のアルキンとＰＥＧ（３０Ｋ）上のアジドとのクリック反応を介したヘパリン及びＰＥＧ（３０Ｋ）−アジド間の共役により、ヘパリン−アルキンが分子シフトを示した。
【０２９８】
実施例２ｂ  −  ヘパリン−アルキン−ビオチン（ヘパリン−ＡＢ）の合成及び特性
２４０ｍｇのヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＭＥＳバッファー（ｐＨ４．７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の１２ｍＭ  ＥＤＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１２ｍＭ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と室温で３０分間混合した。続いて、２０ｍＭ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ａｍｉｎｅ−ＰＥＧ３−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と２０ｍＭ  Ａｍｉｎｅ−ＰＥＧ４−Ａｌｋｙｎｅ（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ）とを反応物に添加し、ｐＨを８．０に上昇させた。室温で攪拌しながら２時間のインキュベーションの後、３−ｋＤａ分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅフィルター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、生成物をＰＢＳに対して入念に透析した。
【０２９９】
ヘパリン−アルキン−ビオチン（ヘパリン−ＡＢ）の合成を図２７Ａに示す。
【０３００】
ヘパリンのビオチン修飾により、固定化したヘパリンを容易に視覚化することが可能になる。コラーゲン−アジドウェルアッセイをさらに展開し、アジド−標識ＥＣＭの単純なモデルとして、コラーゲンでコーティングしたウェルにアジドを共役させた。これにより、視覚化及び生物活性評価のためのアジド標識ＥＣＭに対するヘパリン−ＡＢのクリック固定化が達成された（図２７Ｂの図を参照されたい）。アジド標識を伴って及びアジド標識を伴わずにコラーゲンウェルへのヘパリン−ＡＢのクリック固定化を実施したところ、ヘパリン−ビオチン（ヘパリン−Ｂ）の特異的固定化が観察され（図２７Ｃ及び２７Ｄを参照されたい）、これは、さらに抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）を固定化し（図２７Ｅを参照されたい）、第Ｘａ因子（ＦＸａ）阻害の促進を可能にした（図２７Ｆを参照されたい）。
【０３０１】
実施例３  −  クリッカブルバンコマイシン（バンコマイシン−アルキン）の作製
方法：
バンコマイシンは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ番号１５３２７、ＣＡＳ  Ｎｏ．１４０４−９３−９）から購入した。アルキン−ＰＥＧ５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号７６４１９１）から購入した。アルキン−ＰＥＧ５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルは、ＤＭＳＯ中３０ｍＭのストック溶液として調製した。
【０３０２】
バンコマイシン−アルキンの調製：
バンコマイシン（１ｍＭ）をＤＰＢＳ（ｐＨ８．３）中３ｍＭアルキン−ＰＥＧ５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと室温で２４時間反応させた。得られたバンコマイシン−アルキンをＨＰＬＣにより精製した。図２２は、バンコマイシン及びアルキン−ＰＥＧ５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルからのバンコマイシン−アルキンの調製のための合成スキームを示す。図２３は、バンコマイシン−アルキン生成物のフルスキャンマススペクトルを示す。
【０３０３】
実施例４．臓器／組織の細胞外マトリックスのインビボ代謝標識
方法
ラットモデルにおいて臓器／組織をインビボで代謝操作するために、腹腔内注射によりアジド標識糖（７０％ＤＭＳＯ中、体重ｋｇ当たり３００ｍｇ）を毎日投与した。最後のアジド標識糖投与から１日後、臓器／組織を採取し、灌流で脱細胞化した（図１及び１３を参照されたい）。銅触媒クリック反応を実施することにより、脱細胞化スカフォールドにおけるアジド標識の存在を評価した。
【０３０４】
動物給餌、臓器摘出及び脱細胞化：
エンドポイント組織採取前の３日又は７日間、１００グラムのスプラーグ・ドーリーラットにアジド標識ガラクトサミン（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ）を腹腔内注射し（７０％ＤＭＳＯ中、体重ｋｇ当たり３００ｍｇ）、全臓器の灌流脱細胞化を実施した。図２５Ａの図を参照されたい。インビボ組込み段階が完了した後、動物に麻酔をかけ、脱毛し、手術の準備をした。開腹を実施し、動物を全身ヘパリン処置した後、放血により犠牲にした。深下腹筋動脈の分布における全層皮弁をインタクトな血管茎と一緒に採取した。動脈にカニューレを挿入し、全ての分枝を結紮した。次に、皮弁を灌流脱細胞バイオチャンバー中に滅菌状態で移し、以前に記載されているプロトコル（例えば、Ｏｔｔ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００８，１４，２１３−２２１に記載されているプロトコル）に従って脱細胞化した（図５を参照されたい）。脱細胞化後、サンプルを切除し、組織学分析のために固定した（図６Ａ〜Ｄを参照されたい）。
【０３０５】
アジド組込みの確認：
代謝操作及び脱細胞化後の脱細胞化スカフォールドを４％パラホルムアルデヒド中に４℃で一晩固定した。次に、スカフォールドをパラフィン中に包埋してから、５μｍ厚さに切断した。パラフィン包埋切片を脱パラフィンした後、標準的組織学染色手順に従って再水和した。アルキン共役ビオチン（１０μＭ）及びＣｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号：Ｃ１０２６９）を用いて、銅触媒クリック反応をこれらの切片に対して室温で１時間実施した後、蛍光団共役ストレプトアビジンによるビオチンの検出を実施した。
【０３０６】
組織切片上の脱細胞化ＥＣＭ内のアジド組込みは、クリック反応を用いたアジドリガンドにビオチン−アルキンを共役した後、蛍光団共役ストレプトアビジンを用いたビオチン検出により評価した（図２５Ｂを参照されたい）。脱細胞化ＥＣＭへのアジド組込みの確認は、免疫蛍光法を含む組織学的分析を用いて実施した。
【０３０７】
図７において、画像は、ドナーラットの３日間の代謝標識後の脱細胞化腹壁皮弁上のアジドタグ（紫色）及びＥＣＭ成分ラミニン（緑色）の染色を示す（クリック＃１及びクリック＃２）。アジドタグ染色は、ビオチン−アルキン（クリック反応を介して）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７共役ストレプトアビジンを用いて実施した。画像は、陰性対照（Ｄｅｃｅｌｌ）の場合、Ｃｕの有無にかかわらず、３日間のＤＭＳＯ注射後の脱細胞化ラット腹壁皮弁上のアジドタグの欠如を示す。
【０３０８】
図１４は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いたインビボ代謝操作後の脱細胞化ラット頸動脈スカフォールド中のアジド標識の検出を示す。サンプルは、脱細胞化ＥＣＭの視覚化を容易にするために、豊富なＥＣＭタンパク質であるラミニンで同時染色した（スケール：５００μｍ）。
【０３０９】
図１５は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いたインビボ代謝操作後の脱細胞化ラット心臓スカフォールド中のアジド標識の検出を示す。サンプルは、脱細胞化ＥＣＭの視覚化を容易にするために、豊富なＥＣＭタンパク質であるラミニンで同時染色した（スケール：２００μｍ）。
【０３１０】
図１６は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いたインビボ代謝操作後の脱細胞化ラット肝臓スカフォールド中のアジド標識の検出を示す。サンプルは、脱細胞化ＥＣＭの視覚化を容易にするために、豊富なＥＣＭタンパク質であるラミニンで同時染色した（スケール：２００μｍ）。
【０３１１】
図１７は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いたインビボ代謝操作後の脱細胞化ラット腎臓スカフォールド中のアジド標識の検出を示す。サンプルは、脱細胞化ＥＣＭの視覚化を容易にするために、豊富なＥＣＭタンパク質であるラミニンで同時染色した（スケール：２００μｍ）。
【０３１２】
図１８は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを用いたインビボ代謝操作後の脱細胞化ラット皮膚スカフォールド中のアジド標識の検出を示す。サンプルは、脱細胞化ＥＣＭの視覚化を容易にするために、豊富なＥＣＭタンパク質であるラミニンで同時染色した（スケール：５００μｍ）。
【０３１３】
図２８〜３２に示す実験は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚを投与した動物に由来する心臓、肝臓、腎臓、皮膚及び頸動脈の強力且つ特異的なＥＣＭ標識を示した。これは、本明細書に記載する代謝操作戦略の広範な適用可能性を明示している。
【０３１４】
実施例５  −  アジド標識脱細胞化スカフォールドとバンコマイシン−アルキンとのクリック反応
前述したように、存在する唯一の第１級アミンにアルキン基を共役させることにより、バンコマイシンをクリッカブルにする（例えば、図２２、実施例３を参照されたい）。得られたクリッカブルバンコマイシン−アルキンの構造をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって確認した（図２３）。以前に記載されているクリック反応を用いてバンコマイシンをＥＣＭに固定化した。バンコマイシン−アルキン（１００μＭ）及びＣｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号：Ｃ１０２６９）を用いて、灌流（０．５ｍｌ／分）により銅触媒クリック反応を脱細胞化ラット腹壁皮弁に対して室温で１時間実施した後、入念に洗浄してから、バンコマイシン特異的抗体を用いて固定化バンコマイシンの検出を実施した。
【０３１５】
図２４において、画像は、クリック反応後のラット腹壁皮弁（ＲＥＦ）の脱細胞化ＥＣＭに固定化されたバンコマイシンの免疫蛍光染色、すなわちバンコマイシンの染色（赤）後のＤＭＳＯ対照（Ａ、左上の画像）及びＡｃ４ＧａｌＮＡｚ標識ＲＥＦ（Ｂ、右上の画像）を示す（スケールバー：１００μＭ）。図２４を参照すると、Ａ／Ｂからの染色の蛍光強度定量は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ標識ＲＥＦでのバンコマイシンの増加を示す（ｐ＜０．０５）。図２４は、全組織標本ＲＥＦ、ＤＭＳＯ対照（Ｄ、左下の画像）及びＡｃ４ＧａｌＮＡｚ標識ＲＥＦ（Ｅ、右下の画像）に対するバンコマイシンの落射蛍光染色（緑）を示す。Ｄ／Ｅからの染色の蛍光強度定量は、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ標識ＲＥＦでのバンコマイシンの増加を示す（ｐ＜０．００１）。断面及び全組織標本染色の両方で、バンコマイシンのレベルは、アジド標識なしのＥＣＭ（ＤＭＳＯ対照）と比較して、代謝標識アジドタグを含むＥＣＭの方が高い。続いて、得られたメッシュを、本明細書に記載するように、さらなる試験及び／又は使用のために−２０℃で２０％スクロース中に保存する。
【０３１６】
結論：
バンコマイシンを固定化した皮膚マトリックスメッシュには様々な有益性の可能性がある。メッシュは、バンコマイシン感受性細菌侵入及びそれに続くバイオフィルム形成に対してはるかにより耐性となるはずである。バンコマイシンは、感染したメッシュから培養した最も一般的な細菌を効果的に殺傷する。これらの細菌を排除することにより、メッシュは、不可欠な生体力学的特性を良好に維持し、複雑な腹壁の疾患を有する患者に対してより持続可能で長期の解決法である。さらに、このメッシュを使用することにより、メッシュによる腹壁再建後の表層部位の感染が著しく減少するであろう。バンコマイシンによる患者の治療は、困難であり、医療システムへの負担が大きい。この治療は、患者が静脈アクセスを有することを必要とし、一般に、効果及び安全性のために治療薬レベルをモニターすることに加えて、少なくとも１日２回の投与を要する。バンコマイシンに起因する腎毒性は、重大な健康問題である。本明細書に記載するシステムでは、バンコマイシン官能基化メッシュをＥＣＭに固定化するため、全身循環に入るバンコマイシンはほとんどなく、従って毒性の可能性が大幅に低減する。腹壁再建以外にも、生物学的メッシュは、補綴インプラントを支持するために再建術に広く使用される。感染は、これらの処置の場合に稀ではあるが、破壊的な合併症であるため、感染耐性メッシュは、これらの処置に使用するうえで利益をもたらす。
【０３１７】
利点
バンコマイシンコーティングメッシュは、細菌感染に対してかなりの耐性を提供し、これにより、より持続可能且つ機能性の再建用材料が得られる。
【０３１８】
実施例６ａ  −  臓器／組織の細胞外マトリックスのエクスビボ代謝標識
ＥＣＭへの生体直交型反応性リガンドの組み込み方法
エクスビボ培養中の摘出臓器／組織の代謝操作のために、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００単位／ｍＬのペニシリンと１０，０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンのストックの１：１００希釈物）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用した。アジド標識糖（Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ）を５０μＭで培地に添加した。バイオリアクター内において、定速灌流を用いて臓器／組織を１日間培養した（図２１）。ラット肺の場合、灌流速度は、５ｍｌ／分であった。ヒト肺葉の場合、灌流速度は、１０ｍｌ／分であった。ラット腹壁皮弁の場合、灌流速度は、０．２ｍｌ／分であった。培養後、臓器／組織を灌流脱細胞化した（図８及び図９を参照されたい）。
【０３１９】
新しく摘出された臓器のエクスビボ培養中のＥＣＭの代謝アジド標識を示す図２６Ａの図を参照されたい。新しく摘出したラット肺を、定速灌流（５ｍｌ／分）下のバイオリアクター内において、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ（５０μＭ）の補充を含む及び含まない１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＦＢＳ）中で１日間培養した後、灌流脱細胞化すると（図２６Ａ）、エクスビボ培養工程中ではＡｃ４ＧａｌＮＡｚの存在下、ビオチン−アルキンとのクリック共役工程中ではＣｕ（Ｉ）触媒の存在下でのみ、肺ＥＣＭの頑健な共有結合的アジド標識を示した（図２６Ｂ及び図２６Ｃ並びに本明細書に記載する実験を参照されたい）。
【０３２０】
定速灌流（３００ｍｌ／分）下、５０μＭ  Ａｃ４ＧａｌＮＡｚの補充を含む及び含まない同じＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＦＢＳ培地中で、新しく摘出したブタ左肺を１日間培養した後、灌流脱細胞化した（図２６Ａ、図２６Ｄ及び図２６Ｅ）。無細胞ラット肺ＥＣＭ操作で観察されたものと一致して、ビオチン−アルキンとのクリック共役を用いて、代謝操作された無細胞ブタ肺ＥＣＭへの特異的且つ共有結合的アジド組込みを検出することができる（図２６Ｆ及び２６Ｇを参照されたい）。
【０３２１】
アジド組込みの確認
銅触媒クリック反応を実施することにより、脱細胞化スカフォールド中のアジド標識の存在を評価した。代謝操作及び脱細胞化後の脱細胞化スカフォールドを４℃の４％パラホルムアルデヒド中に一晩固定した。次に、スカフォールドをパラフィン中に包埋してから５μｍ厚さに切断した。パラフィン包埋切片を脱パラフィンした後、標準的組織学染色手順に従って再水和した。アルキン共役ビオチン（１０μＭ）及びＣｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号：Ｃ１０２６９）を用いて、銅触媒クリック反応をこれらの切片に対して室温で１時間実施した後、蛍光団共役ストレプトアビジンによるビオチンの検出を実施した。
【０３２２】
図１０は、エクスビボ代謝操作後の脱細胞化ラット肺スカフォールド中のアジド標識の検出を示す。これらのサンプルは、脱細胞化ＥＣＭの視覚化を容易にするために、豊富な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質であるラミニンで同時染色した（スケール：２００μｍ）。
【０３２３】
図１１は、頸動脈の脱細胞化スカフォールド標識の成功を示す。これらのサンプルは、脱細胞化ＥＣＭの視覚化を容易にするために、豊富なＥＣＭタンパク質であるラミニンで同時染色した（スケール：２００μｍ）。
【０３２４】
エクスビボ代謝操作アプローチは、ラット、ヒト及びブタモデルなどの他のモデルの別の臓器／組織に適用することもできる。
【０３２５】
実施例６ｂ  −  臓器／組織の代謝標識細胞外マトリックスと修飾生体分子との反応
臓器注入中のクリック反応
全臓器操作など、官能基化ＥＣＭの後の生物医学適用を可能にするために、注入クリック反応による全組織標本中のアジド標識無細胞臓器スカフォールドに対する目的のアルキン修飾生体分子の共役の実現可能性が証明された（図２６Ｈを参照されたい）。エクスビボ操作アジド標識無細胞ラット肺及びビオチン−アルキンをモデルとして用いてクリック反応ミックスを肺に注入し、室温で１時間インキュベートした後、無細胞肺全体を通してビオチンの効率的且つ均質なクリック固定化が実証された（図２６Ｉを参照されたい）。
【０３２６】
合成ＥＣＭ表面への生体分子固定化
合成ＥＣＭ表面へのクリック固定化後のヘパリン−ＡＢの生物活性の保存の確認（図２ｂを参照されたい）に続いて、アジド標識無細胞肺へのヘパリン−ＡＢの固定化が実証された（図２７Ｇの図を参照されたい）。エクスビボＡｃ４ＧａｌＮＡｚ代謝操作を伴って及び伴わずに無細胞ラット肺でのヘパリン−ＡＢの注入クリック反応を実施し、アジド標識無細胞肺全体を通してヘパリン−Ｂの特異的且つ均質な固定化が観察された（図２７Ｈを参照されたい）。コラーゲン−アジドウェルについて観察されるもの（実施例２ｂを参照されたい）と同様に、アジド標識無細胞肺に固定化したヘパリン−Ｂは、ＡＴＩＩＩ固定化（図２７Ｉを参照されたい）及びＦＸａ阻害（図２７Ｊを参照されたい）の増強をもたらした。全体として、これらの結果から、固定後もその生物活性を維持しながら、クリック共役により目的のアルキン修飾生体分子を固定するために、Ａｃ４ＧａｌＮＡｚ代謝操作から得られたアジド標識、クリック反応性無細胞肺ＥＣＭを効果的に使用できることが実証された。
【０３２７】
実施例７  −  臓器保存及び移植を改善するためのドナー臓器移植片の生体直交型修飾
手順
この手順は、２つのステップを含む。第１のステップでは、ドナーラットにＡｃ４ＧａｌＮＡｚを３日間注射した（実施例４に記載の通り）。これにより、アジドタグによるドナー肺の代謝標識が達成された。第２のステップでは、アジド標識を有するドナー肺を、ＤＢＣＯ活性化ビオチンを濃度１００μＭで含有する保存液（Ｐｅｒｆａｄｅｘ）中に氷上で１時間保存した。次に、肺を保存液（Ｐｅｒｆａｄｅｘ）で入念に洗浄し、移植のために準備した。肺を固定化生物活性分子の組織染色のために固定した（ビオチンにより例示した通り）。移植のためのその低温保存中の、ドナー肺組織の分子精製の手順の図を図１９に示す。
【０３２８】
結果
臨床関連現場で銅フリークリックケミストリーを用いて移植可能な生肺組織を官能基化するコンセプトを証明するために、氷上で臨床保存液Ｐｅｒｆａｄｅｘ中での低温肺保存の段階でクリック反応を実施した。原理証明のためにＤＢＣＯ活性化ビオチンを使用した。
【０３２９】
図２０に示すように、生体直交型及び化学選択的反応を用いたドナー肺組織へのビオチンへの固定化は、低温臨床保存液中で１時間以内に高い効率で起こった。
【０３３０】
本明細書では、インビボ及びエクスビボでのアジドリガンドの共有結合的組込みにより、ネイティブＥＣＭ生体材料を代謝操作する戦略が記載される。これにより、例えば、クリックケミストリーを介したアルキン修飾生物活性分子の共有結合的固定化により付与される所望の特徴を有するこれらの生体材料の化学選択的官能基化が可能になる。Ａｃ４ＧａｌＮＡｚの腹腔内投与により、クリック反応性アジドリガンドを臓器のＥＣＭ中に効率的に組み込み得ることが判明した。効果的なアジド組込みは、肺、心臓、腎臓、肝臓、皮膚及び血管を含め、試験した全ての組織及び臓器（実施例を参照されたい）のＥＣＭに観察される。これは、本明細書に記載の戦略が多様なネイティブＥＣＭ生体材料に適用可能であることを示す。
【０３３１】
モデルとして肺を用いて、げっ歯類及びブタモデルの両方で、新しく摘出した臓器のエクスビボ培養工程中でも効率的なＡｃ４ＧａｌＮＡｚ代謝ＥＣＭ操作を達成できることが証明された。これは、ドナー動物へのＡｃ４ＧａｌＮＡｚの投与が実現可能ではない状況へと記載の方法の適用可能性をさらに広げる。これは、代謝ＥＣＭ操作をドナーヒト臓器に直接適用する可能性も開く。ヘパリン−ＡＢをモデルとして用いて、代謝操作から得られた「クリッカブル」無細胞肺を生物活性分子の固定化に効果的に使用することができ、これらの分子は、全臓器ＥＣＭへのクリック固定化後も生物活性を依然として維持することが実証された。
【０３３２】
重要なことに、ネイティブ生体材料官能基化のための本明細書に記載のアプローチによって生体適合性が確認されている。生存且つ機能する臓器のＥＣＭにアジドリガンドをインビボで組み込み可能であることが判明し、これは、アジド組込み部位が、臓器の正常な機能に対する明らかな妨害を引き起こさない「安全部位」として考えられ得ることを示す。脱細胞化に続いて、クリックケミストリーを用いて、目的のアルキン修飾生体分子をこれらの「安全部位」にさらに共役させることもできる。総合して、ＥＣＭへの生物学的に選択的なアジド組込みと、これに続く所望のアルキン修飾生物活性分子による化学選択的クリックライゲーションとを組み合わせることにより、本明細書に記載の方法は、高度の特異性及び生体適合性でネイティブＥＣＭ生体材料の官能基化を可能にする革新的な解決策を提供する。
【０３３３】
さらに、架橋ケミストリーを用いる従来の生体材料官能基化では、固定化反応は、通常、その異なる化学的特性のために目的の生体分子各々について個別に展開する必要がある。生体材料官能基化のために架橋ケミストリーを使用すると、化学的活性化の際に生体分子間で交差反応する可能性があり、生体材料とそれらの反応性が異なるために、複数の機能性生体分子を１回の反応で結合することも困難である。対照的に、アジド標識した「クリッカブル」ＥＣＭ生体材料を使用すれば、クリックケミストリーに基づく共役反応を最小の修飾でほとんどのアルキン修飾生体分子に適用することができる。さらに、これらのアルキン修飾生体分子の互いに対する化学的不活性を考慮すれば、異なるアルキン修飾生体分子を単一の共役反応で結合することも可能である。従って、複数の所望の特徴を備える複合生体材料の作製が可能である。
【０３３４】
本開示のいくつかの特徴は、明瞭化のために個別の実施形態に関して説明されているが、これらは、単一の実施形態において組み合わせて提供することも可能であることが理解されるであろう。反対に、簡略化のために、単一の実施形態に関して説明される本開示の様々な特徴を個別に又は任意の好適な部分組合せで提供することも可能である。
【０３３５】
他の実施形態
本出願を詳細な説明と一緒に記載してきたが、以上の説明は、例示を目的とし、本出願の範囲を限定することを意図するものではなく、本出願の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義されるものと理解されたい。他の態様、利点及び変更形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
2019527040.tif 000051
【図２】
2019527040.tif 000052
【図３】
2019527040.tif 000053
【図４】
2019527040.tif 000054
【図５】
2019527040.tif 000055
【図６】
2019527040.tif 000056
【図７】
2019527040.tif 000057
【図８】
2019527040.tif 000058
【図９】
2019527040.tif 000059
【図１０】
2019527040.tif 000060
【図１１】
2019527040.tif 000061
【図１３】
2019527040.tif 000062
【図１４】
2019527040.tif 000063
【図１５】
2019527040.tif 000064
【図１６】
2019527040.tif 000065
【図１７】
2019527040.tif 000066
【図１８】
2019527040.tif 000067
【図１９】
2019527040.tif 000068
【図２０】
2019527040.tif 000069
【図２１】
2019527040.tif 000070
【図２２】
2019527040.tif 000071
【図２３】
2019527040.tif 000072
【図２４】
2019527040.tif 000073
【図２５Ａ】
2019527040.tif 000074
【図２５Ｂ】
2019527040.tif 000075
【図２５Ｃ】
2019527040.tif 000076
【図２５Ｄ】
2019527040.tif 000077
【図２５Ｅ】
2019527040.tif 000078
【図２６Ａ】
2019527040.tif 000079
【図２６Ｂ】
2019527040.tif 000080
【図２６Ｃ】
2019527040.tif 000081
【図２６Ｄ】
2019527040.tif 000082
【図２６Ｅ】
2019527040.tif 000083
【図２６Ｆ】
2019527040.tif 000084
【図２６Ｇ】
2019527040.tif 000085
【図２６Ｈ】
2019527040.tif 000086
【図２６Ｉ】
2019527040.tif 000087
【図２７Ａ】
2019527040.tif 000088
【図２７Ｂ】
2019527040.tif 000089
【図２７Ｃ】
2019527040.tif 000090
【図２７Ｄ】
2019527040.tif 000091
【図２７Ｅ】
2019527040.tif 000092
【図２７Ｆ】
2019527040.tif 000093
【図２７Ｇ】
2019527040.tif 000094
【図２７Ｈ】
2019527040.tif 000095
【図２７Ｉ】
2019527040.tif 000096
【図２７Ｊ】
2019527040.tif 000097
【図２８】
2019527040.tif 000098
【図２９】
2019527040.tif 000099
【図３０】
2019527040.tif 000100
【図３１】
2019527040.tif 000101
【図３２】
2019527040.tif 000102
【国際調査報告】
2019527040.tif 000103
2019527040.tif 000104
2019527040.tif 000105
2019527040.tif 000106