(57)【要約】本発明は、マイクロバイオーム調節異常の処置に関する。該調節異常は、続いていくつかの慢性疾患の発生の一因となる場合がある。したがって、宿主−微生物叢相互作用に有益な変化を誘導する新しいポストバイオティック化合物の特徴づけが、極めて望ましい場合がある。本発明者らは、Ｎｌｒｐ６がＣｓｎｋ２阻害剤を用いた処置に応答して上皮の可塑性への腸内微生物叢の多様性の周期性適応を日周性に調和させることを示した。したがって、本発明は、特に概日時計の乱れに関連するマイクロバイオーム調節異常の処置に使用するためのＣｓｎｋ２阻害剤に関する。該阻害剤は、フラボンなどの、化学合成された又は天然の選択的Ｃｓｎｋ２阻害剤より選択され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
概日時計の乱れに関連するマイクロバイオーム調節異常の処置を必要とする対象における処置における使用のためのカゼインキナーゼ２（Ｃｓｎｋ２）活性阻害剤。
【請求項２】
マイクロバイオーム調節異常が、ディスバイオシス及び／又は腸内微生物叢の日周リズム性喪失を含む、請求項１記載の使用のためのカゼインキナーゼ２（Ｃｓｎｋ２）活性阻害剤。
【請求項３】
対象が概日リズム睡眠障害を患っている又は対象にそのリスクがある、請求項１又は２のいずれか一項に記載の使用のためのＣｓｎｋ２活性阻害剤。
【請求項４】
フラボン、チロホスチン及びその誘導体より選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のためのＣｓｎｋ２活性阻害剤。
【請求項５】
アピゲニン、ルテオリン、及びチロホスチンＡＧ９９からなる群より選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のためのＣｓｎｋ２活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、マイクロバイオーム調節異常の処置、特に概日時計の乱れに関連するマイクロバイオームの調節異常の処置に使用するための方法及び医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
数百万年の共進化にわたり、腸内微生物群落（微生物叢）のその富栄養環境への適応は、宿主の全身の健康に貢献した。この高度に複雑な微生物生態系は、腸管微生物群落（微生物叢）の多様性の詳細な像が明らかにされた最近まで、その重要性が過小評価されてきた。
【０００３】
腸内微生物叢は、誕生の初日から、衛生状態、性別、加齢、薬物摂取及び摂食行動を含む内因性メカニズムと外因性メカニズムとの間の複雑な相互作用によって形づくられた環境に適応した地球上で最も高密度の生態系の一つに相当する（１）。所与のヒト個体の腸内におよそ５００〜１，０００個の異なる細菌種が存在し得る。結腸は、生息が最も高密度の区画であり、細菌数は、ヒトにおいて内容物１グラムあたり細胞約１０１１〜１０１２個に達する。
【０００４】
そのような微生物叢は、消化及び免疫調節などの重要な生理学的機能を維持し、それにより、宿主の全身の健康を増進する。マイクロバイオームは、宿主をいくつかの病態から防御する無数の機能を果たす。実際、宿主−微生物叢の共生は、少なくとも３方向で進化した。第一に、共生微生物による定着は、免疫の発達に重要である。第二に、共生群落は、侵入する病原体を食い止めておき、病原体が有毒であることを防止する。第三に、腸内微生物叢は、マウスにおいて、及び潜在的にヒトにおいて、グリカンを消化し、脂肪貯蔵を調節するように見受けられる。
【０００５】
腸内微生物叢における、したがって腸内マイクロバイオームにおける不安定性（ディスバイオシスとして公知）は、発生率及び社会経済的影響が増え続けている癌、自己免疫障害及び炎症障害などのいくつかの一般的なヒト免疫病態の発病に関連付けられた。その結果、免疫レベル及び代謝レベルの両方で宿主−微生物相利共生のいくつかの機能的欠陥が報告されており、健康及び疾患における腸内マイクロバイオームの重要性がますます認識されるに至った。
【０００６】
腸内微生物叢の組成における日内周期変動が最近になって観察されており（２）、この変動は、上皮の自己再生における時刻の変動と一致する（３）。逆に、無菌マウスではいくつかの時計ベースの腸管機能が抑止されている（４、５）。そのようなリズムは、おおよそ２４時間サイクルに従う周期性生理的変化を特徴とする。
【０００７】
このリズムは、規則的に再発する生理的パターンを大部分の生存生物に予期させる、内因性、自家持続性、時間追跡性の分子機構である概日時計によって維持されている。そのうえ、時計機構は環境変化に適応することもできる（６）。疫学研究が、昼夜サイクルを障害する状態と、結腸直腸癌、メタボリックシンドローム及びＩＢＤなどの多様な慢性炎症疾患との間の関連を示したので（８）、前述の時間追跡システムの障害は、ヒトの健康にとって潜在的に広範な意味を有する。
【０００８】
遺伝的乱れ又は時間移行のいずれかによる宿主概日時計のこの乱れが、続いてＩＢＤなどのいくつかの慢性疾患の発生の原因になり得る、ディスバイオシスとも呼ばれる（Thaiss et al., 2014; Liang et al., 2014）微生物叢の調節異常の原因であることがさらに示されている。最近のゲノムワイド関連研究が、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ；ｒｓ１１１６８２４９）；核因子インターロイキン３調節型（ＮＦＩＬ３、Ｅ４ＢＰ４とも呼ばれる；ｒｓ４７４３８２０）；及びカゼインキナーゼＩＩ型（ＣＳＮＫ２；ｒｓ９２６７５３１）を含む概日時計に関与する遺伝子における、ＩＢＤの素因となるいくつかの一塩基多型を明らかにしたことは、実際に注目に値する。しかし、宿主の健康に及ぼすマイクロバイオームの高い生理的関連性にもかかわらず、微生物叢の概日調節の基礎となる分子決定因子は、まだ未知である。
【０００９】
概日タイミングの持続期間の乱れへの慢性曝露は（世界中の工業化社会で数百万人を冒すので、宿主概日時計の乱れによって誘導されるディスバイオシスを予防又は治療するために適切な新しい化合物を開発する強い必要性がある。このような方法で、宿主−微生物叢相互作用に有益な変化を誘導する新しいポストバイオティック化合物の特徴づけが概日時計の乱れを有する被験者にとって、特に概日時計の乱れに関連するディスバイオシスに苦しむ対象において、極めて望ましい場合があることが示唆されている。
【００１０】
発明の概要：
本出願の発明者らは、Ｎｏｄ様受容体タンパク質６（Ｎｌｒｐ６）がカゼインキナーゼ２（Ｃｓｎｋ２）との直接相互作用により時計ベースの腸陰窩恒常性を保つことを報告した。
【００１１】
本発明者らは、腸細胞系列の仕様における重度の時計調整不良がＮｌｒｐ６欠損マウスにおいて周期変動している細菌属の蓄積に繋がることを示し、機構的にＮｌｒｐ６の欠如が陰窩基底部円柱細胞の再生を犠牲にしてＣｓｎｋ２のリズミカルな核シャトリングを抑止することを実証した。
【００１２】
本発明者らは、Ｃｓｎｋ２阻害剤によるＣｓｎｋ２活性の全身阻害が機能的Ｎｌｒｐ６により増殖中の前駆細胞の増大を抑制する一方で、カスパーゼ−１と独立して腸の炎症から防御する腸内微生物叢における変化を導くことをさらに実証した。まとめると、本発明者らの結果は、Ｎｌｒｐ６が微生物叢の組成を制御すること、特にＮｌｒｐ６が食物フラボノイドなどのＣｓｎｋ２阻害剤を用いた処置に応答して上皮の可塑性への腸内微生物叢の多様性の周期性適応を日周性に調和させることを示した。
【００１３】
したがって、本発明は、微生物叢の調節異常又はマイクロバイオームの調節異常、優先的に概日時計の乱れに関連する微生物叢又はマイクロバイオームの調節異常の処置を必要とする対象における該処置に使用するためのカゼインキナーゼ２（Ｃｓｎｋ２）活性の阻害剤に関する。
【００１４】
本発明は、睡眠機能障害などの概日リズム睡眠障害を患う又はそのリスクがある対象における、特に補助食品として特に有用である。
【００１５】
典型的には、本発明によるＣｎｓｋ２阻害剤は、例えばアピゲニン、ルテオリン、クリシン、又はチロホスチンＡＧ９９などのフラボノイド、チロホスチン及びその誘導体の間より選択することができる。
【００１６】
発明の詳細な説明：
本発明は、微生物叢の調節異常又はマイクロバイオームの調節異常の処置を必要とする対象における該処置に使用するための方法及び組成物（例えば医薬組成物）を提供する。
【００１７】
より詳細には、本発明は、特に概日時計の乱れに関連する、微生物叢の調節異常又はマイクロバイオームの調節異常の処置に使用するためのＣｓｎｋ２活性の阻害剤に関する。
【００１８】
本明細書に使用される用語「Ｃｓｎｋ２」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、「ＣＫ２」としても公知のカゼインキナーゼ２型又は「カゼインキナーゼ２」を表す。したがって、Csnk2は、真核界全体で進化的に保存されている、二つのα／α’触媒サブユニット及び二つの非触媒（すなわち調節性）βサブユニットから構成される四量体セリン／トレオニン選択的プロテインキナーゼである。この広範に分布する高度に多面発現性で構成的活性型のセリン／トレオニンキナーゼは、例えばCozza G及びPinna L A.（Expert Opin Ther Targets. 2016; 20(3):319-40）によって記載されたように、ヒトホスホプロテオームの実質的な比率の生成を担っている。
【００１９】
本発明による「カゼインキナーゼ２活性阻害剤」という用語は、Ｃｓｎｋ２タンパク質の生物学的活性を（部分的又は完全に）阻害する能力を有する、天然又は非天然の化合物を表す。本発明の範囲は、今や公知の全てのそれらのＣｓｎｋ２阻害剤及び将来発見されるべきそれらのＣｎｓｋ２阻害剤を含む。Ｃｓｎｋ２阻害剤は、一般に、以下の三つのカテゴリーに分類される：（１）Ｃｓｎｋ２の調節サブユニットを標的化する阻害剤（例えば、遺伝的に選択されたペプチドアプタマー）；（２）Ｃｓｎｋ２の触媒活性の阻害剤（例えば、キノベン、ＴＢＢ、ＤＭＡＴ、ＩＱＡ）；及び（３）しばしばＣｓｎｋ２サブユニット界面に結合する分子であり、そのサブユニットの高親和性相互作用を阻害するＣｓｎｋ２ホロ酵素撹乱物質。各クラスのＣｓｎｋ２阻害剤は、小分子、機能性核酸、ペプチド模倣薬、抗体（任意の抗体フラグメントも含む）、又はＣｎｓｋ２の生物学的活性が阻害される、Ｃｓｎｋ２、特に触媒サブユニット若しくは調節サブユニットに対するアプタマーペプチドなどの任意の種類の分子であることができる。
【００２０】
Ｃｓｎｋ２阻害剤は、ｉ）ＡＴＰ結合部位と直接相互作用できることで、ＡＴＰの接近及びリン酸転移反応を遮断するＡＴＰ競合阻害剤（Ｉ型阻害剤とも呼ばれる）又はｉｉ）ＡＴＰ結合領域と無関係の構造エレメントに結合する非競合ＡＴＰ阻害剤（アロステリック阻害剤又は基質競合物質）（Cozza et al., Expert Opinion on Therapeutic Patents, 2012; 22:9, 1081-1097に記載されたものなど）より選択することができる。
【００２１】
いくつかの実施態様では、ＣＫ２阻害剤は、以下に記載されている化合物である：
-  Maksym O. Chekanov, Olga V. Ostrynska, Sergii S. Tarnavskyi, Anatoliy R. Synyugin, Nadiia V. Briukhovetska, Volodymyr G. Bdzhola, Alexander E. Pashenko, Andrey A. Fokin, Sergiy M. Yarmoluk. Design, synthesis and biological evaluation of 2-aminopyrimidinones and their 6-aza-analogs as a new class of CK2 inhibitors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry 2014 Oct;29(5):639-46。
-  Maksym O. Chekanov, Olga V. Ostrynska, Anatoliy R. Synyugin, Volodymyr G. Bdzhola, Sergiy M. Yarmoluk. Design, synthesis and evaluation of 2-phenylisothiazolidin-3-one-1,1-dioxides as a new class of human protein kinase CK2 inhibitors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry 2014 Jun;29(3):338-43。
-  Giorgio Cozza, Lorenzo A Pinna, Stefano Moro. Protein kinase CK2 inhibitors: a patent review. Expert Opinion on Therapeutic Patents Sep 2012, Vol. 22, No. 9, Pages 1081-1097。
-  Cozza et al, How druggable is protein kinase CK2? Med Res Rev. 2010 May;30(3):419-62。
-  Zhu et al., Inhibition of protein kinase CK2 expression and activity blocks tumor cell growth. Mol Cell Biochem. 2010 Jan;333(1-2):159-67。
-  Lopez-Ramos et al., New potent dual inhibitors of CK2 and Pim kinases: discovery and structural insights. FASEB J. 2010 Sep;24(9):3171-85。
-  Giorgio Cozza & Lorenzo A Pinna, Casein kinases as potential therapeutic targets. Expert Opin Ther Targets. 2016 Mar;20(3):319-40。
【００２２】
Ｃｓｎｋ２阻害剤の例には、以下が非限定的に含まれる：
−  ＴＢＢ（ＴＴＢｔ、４，５，６，７テトラブロモベンゾトリアゾール、Ｋｉ＝０．４０μM、ＰＤＢコード：１Ｊ９１）、ＴＢＩ（ＴＴＢｚ、４，５，６，７−１Ｈ−テトラブロモベンズイミダゾール、Ｋｉ＝０．３０μM、ＰＤＢコード：２ＯＸＹ）、ＤＲＢ（５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール）などのポリハロゲン化ベンゾトリアゾール及びベンズイミダゾール誘導体、ＩＱＡ（［５−オキソ−５，６−ジヒドロインドロ−（１，２−ａ）キナゾリン−７−イル］酢酸）などのインドロキナゾリン誘導体、又は類似体Ｋ２５／ＤＭＡＴ（２−ジメチルアミノ−４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンズイミダゾール、Ｋｉ＝０．０４μM、ＰＤＢコード：１ＺＯＥ）；
−  アントラキノン、フラボノイド（典型的には下記のフラボン）、チロホスチン、クマリン及びその誘導体、例えばエモジン（５，６−ジクロロ−ｌ−Ｐ−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＢ）、６−メチル−１，３，８−トリヒドロキシアントラキノン）（Ｋｉ＝１．５μM、ＰＤＢコード：１Ｆ０Ｑ、３ＰＺＨ、３ＢＱＣ及び３Ｃ１３）、ケルセチン（２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３，５，７−トリヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン）、レゾルフィン、４，４’，５，５’，６，６’−ヘキサヒドロキシジフェン酸２，６，２’，６’−ジラクトン（エラグ酸）、ＭＮＡ（１，８−ジヒドロキシ−４−ニトロアントラキノン、Ｋｉ＝０．７８μM）、ＭＮＹ（１，４−ジアミノ−５，８−ジヒドロキシ−アントラキノン）、キナリザリン（１，２，５，８−テトラヒドロキシ−アントラキノン、Ｋｉ＝０．０６μM、ＰＤＢコード：３ＦＬ５、３Ｑ９Ｙ、３Ｑ９Ｚ）、ＭＮＸ（１，８−ジヒドロキシ−４−ニトロ−キサンテン−９−オン、Ｋｉ＝０．８μM）又はＤＢＣ（３，８−ジブロモ−７−ヒドロキシ−４−メチルクロメン−２−オン）などのヒドロキシクマリン（hydroxycourmarine）誘導体などの天然化合物
−  Novartis IQA（５−オキソ−５，６−ジヒドロインドロ−（１，２−ａ）キナゾリン−７−イル酢酸、ＩＣ５０＝０．３９μM、ＰＤＢコード：１ＯＭ１）、ＴＢＣＡ（（Ｅ）−３−（２，３，４，５−テトラブロモフェニル）アクリル酸、Ｋｉ＝０．０７７μM）及び安息香酸化合物２６（３，４，５トリブロモ安息香酸ＩＣ５０＝０．６４μM）及び化合物１０（（Ｅ）−３−（３−スチボノフェニル）プロパ−２−エン酸、ＩＣ５０＝０．１５μM）のようなその誘導体、又は化合物７（５，６，８−トリクロロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸、Ｋｉ＝０．０６μM）、ＴＩＤ４６（２−（４，５，６，７−テトラヨード−１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈイソインドール−２−イル）プロパン酸、ＩＣ５０＝０．１５μM)、及びキサンテン系化合物３５（２，３，４，５−テトラブロモ−６−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸、ＩＣ５０＝０．０８μM）、若しくはＣＸ−４９４５（（５−（３−クロロ−フェニルアミノ）−ベンゾ［ｃ］［２，６］ナフチリジン−８−カルボン酸、ＩＣ５０＝０．００２μM、ＰＤＢコード＝３ＰＥ１）のような異なる足場からの他の誘導体などの、Ｃｓｎｋ２のＡＴＰ結合部位の基礎的なＬｙｓ６８との相互作用を確立することができる共通のカルボキシル特徴を有する化合物
−  多環足場によって特徴づけられるピラゾロ−トリアジン、ピリドカルバゾール、ベンゾピリドインドール及びインデノインドール誘導体（ＰＤＢコード：２ＰＶＨ、２ＰＶＪ、２ＰＶＫ、２ＰＶＬ、２ＰＶＮ及び３ＢＥ９）
−  インビトロＣＫ２ホロ酵素構造を破壊することができるＰｈｅ５０８欠失を有するＣＦＴＲ配列由来のペプチド（ＩＣ５０＝１５μM）、環状ペプチド及びそのポドフィロトキシンインドロ類似体（Ｗ１６、ＩＣ５０＝２０μM）のような小型ペプチドなどの非ＡＴＰ部位特異的ＣＫ２阻害剤、並びにヘマテイン（３，４，６ａ，１０−テトラヒドロキシ−６，７−ジヒドロインデノ［２，１−ｃ］クロメン−９−オン、ＩＣ５０＝０．５５μM）、ベンゾチアゾール誘導体（特に化合物１，２’−（４−ジメチルアミノ−フェニル）−３，６，３’−トリメチル−［２，６’］ビベンゾチアゾリル−７−スルホン酸、ＩＣ５０＝０．５μM）及び無機ポリオキソ金属酸塩（ＰＯＭ、ＩＣ５０＝０．００１４μM）などの他の化合物。
【００２３】
本発明によるＣｓｎｋ２阻害剤には、国際特許出願PCT/US2007/077464、PCT/US2008/074820、及びPCT7US2009/035609、及び米国仮出願第６１／１７０，４６８号（２００９年４月１７日出願）、同第６１／２４２，２２７号（２００９年９月１４日出願）、同第６１，１８０，０９０号（２００９年５月２０日出願）、同第６１／２１８，３１８号（２００９年６月１８日出願）、同第６１／１７９，９９６号（２００９年５月２０日出願）、同第６１／２１８，２１４号（２００９年６月１４日出願）、同第６１／４１，８０６号（２００９年９月１１日）、同第６１／１８０，０９９号（２００９年５月２０日出願）、同第６１／２１８，３４７号（２００９年６月１８日出願）、同第６１／２３７，２２７号（２００９年８月２６日出願）、同第６１／２４３，１０７号（２００９年９月１６日出願）及び同第６１／２４３，１０４号（２００９年９月１６日出願）に記載された式のうちのいずれかの化合物も非限定的に含まれ、これらの各々の内容は、その全体で参照により本明細書に組み入れられる。ＣＫ２阻害剤は、国際特許出願PCT/US2007/077464、PCT/US2008/074820、及びPCT/US2009/035609に開示される方法を含む、当技術分野において公知の方法によって合成することができる。
【００２４】
いくつかの実施態様では、ＣＫ２阻害剤は：
【化１】
2019519514.tif 000002
2019519514.tif 000003
からなる群より選択される。
【００２５】
いくつかの実施態様では、ＣＫ２阻害剤は、ＣＸ−４９４５：
【化２】
2019519514.tif 000004
である。
【００２６】
ＣＸ−４９４５は、ファーストインクラスの強力、選択的で経口利用可能なＣＫ２のＡＴＰ競合阻害剤であって、好都合な薬物特性を有する（Siddiqui-Jain A, Bliesath J, Macalino D, Omori M, Huser N, Streiner N, Ho CB, Anderes K, Proffitt C, O'Brien SE, Lim JK, Von Hoff DD, Ryckman DM, Rice WG, Drygin D. CK2 inhibitor CX-4945 suppresses DNA repair response triggered by DNA-targeted anticancer drugs and augments efficacy: mechanistic rationale for drug combination therapy. Mol Cancer Ther. 2012 Apr;11(4):994-1005. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-11-0613. Epub 2012 Jan 20）。
【００２７】
いくつかの実施態様では、ＣＫ２阻害剤は、式：
【化３】
2019519514.tif 000005
を有する化合物（化合物１若しくは化合物２）又はその薬学的に許容し得る塩若しくはエステルである。
【００２８】
いくつかの実施態様では、ＣＫ２阻害剤は、国際公開公報第２０１１／０１３００２号に記載された化合物であり、特に：
【化４】
2019519514.tif 000006
及びその薬学的に許容し得る塩又はエステルからなる群より選択される。
【００２９】
いくつかの実施態様では、ＣＫ２阻害剤は、アロステリックＣＫ２阻害剤、すなわち、ＡＴＰと競合しないが、酵素が不活性になるようにＣＫ２サブユニット（例えばＣＫ２アルファ）のコンフォメーションを改変することによってＣＫ２をまだ阻害する化合物である。アロステリックＣＫ２阻害剤の例には、Moucadel V, Prudent R, Sautel CF, Teillet F, Barette C, Lafanechere L, Receveur-Brechot V, Cochet C. Antitumoral activity of allosteric inhibitors of protein kinase CK2. Oncotarget. 2011 Dec;2(12):997-1010に記載されたようなアゾナフタレン誘導体（化合物Ｍ４）が非限定的に含まれる。
【００３０】
いくつかの実施態様では、アロステリックＣＫ２阻害剤は、一般式：
【化５】
2019519514.tif 000007
を有するＤ３．１である。
【００３１】
いくつかの実施態様では、アロステリックＣＫ２阻害剤は、一般式：
【化６】
2019519514.tif 000008
を有するＭ４である。
【００３２】
上記のような本発明の化合物は、例えば、March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4.sup.th Ed., (Wiley 1992); Carey and Sundberg, ADVANCED ORGANIC CHEMISTY 3.sup.rd Ed., Vols. A and B (Plenum 1992)、及びGreen and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS 2.sup.nd Ed. (Wiley 1991)に記載されているような当業者に公知の方法、技法、及び材料を使用して合成することができる。本発明の化合物及びその中間体を調製するために有用な出発材料は、Aldrich Chemical Co.（Milwaukee, Wis.）、Sigma Chemical Co.（St. Louis, Mo.）、Maybridge（Cornwall, England）、Asinex（Winston-Salem, NC）、ChemBridge（San Diego, CA）、ChemDiv（San Diego, CA）、SPECS（Delft, The Netherlands）、Timtec（Newark, DE）などの販売元から市販されており、又はその代わりに、周知の合成方法によって調製することができる（例えば、Harrison et al., "Compendium of Synthetic Organic Methods", Vols. 1-8 (John Wiley and Sons, 1971 - 1996); "Beilstein Handbook of Organic Chemistry," Beilstein Institute of Organic Chemistry, Frankfurt, Germany; Feiser et al., "Reagents for Organic Synthesis," Volumes 1 -21, Wiley Interscience; Trost et al., "Comprehensive Organic Synthesis," Pergamon Press, 1991 ; "Theilheimer's Synthetic Methods of Organic Chemistry," Volumes 1 -45, Karger, 1991 ; March, "Advanced Organic Chemistry," Wiley Interscience, 1991 ; Larock "Comprehensive Organic Transformations," VCH Publishers, 1989; Paquette, "Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis," 3d Edition, John Wiley & Sons, 1995を参照されたい）。本化合物及び／又はその出発材料の合成のための他の方法は、当技術分野において記載されているか、又は当業者に容易に明らかである。試薬及び／又は保護基の代替は、上記に提供される参考文献及び当業者に周知の他の一覧から見出され得る。特に、本化合物の調製は、保護及び脱保護（例えば、アセタール基の形成及び除去）の１つ以上のステップを含み得る。適切な保護基を選択するための手引きは、例えば、Greene & Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis," Wiley Interscience, 1999に見出すことができる。加えて、調製は、カラムクロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、再結晶化、蒸留、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等のような様々な精製を含み得る。また、プロトン及び炭素−１３核磁気共鳴（１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲ）、赤外及び紫外分光分析（ＩＲ及びＵＶ）、Ｘ線結晶解析、元素分析（ＥＡ）、ＨＰＬＣ並びに質量分析（ＭＳ）などの化学反応産物の同定及び定量のための化学分野において周知の様々な技法も、同様に使用することができる。調製は、化学分野において周知の保護及び脱保護、精製及び同定及び定量の任意の他の方法も伴い得る。
【００３３】
アントラキノン、フラボノイド、チロホスチン及びその誘導体より、特にフラボン、チロホスチン及びその誘導体より選択されるＣｓｎｋ２の天然阻害剤は、本発明により特に好ましい。そのような化合物の追加的で非限定的な例は、Lolli Gら（Biochemistry 2012; 51:60-97-6107）にも記載されている。そのような化合物の例には、上述の化合物に加えて、ケルセチン、フィセチン、ケンフェロール、ルテオリン、アピゲニン、クリシン、及びチロホスチンＡＧ９９が含まれる。典型的には、ナリンゲニン、ナリンギン、ヘスペリチン、タキシフォリン、ガランギン、ビオチャニンＡ及びゲニステインは、本発明によるＣｓｎｋ２阻害剤として使用されない。
【００３４】
特に、フラボン、チロホスチン及びその誘導体より選択されるＣｎｓｋ２阻害剤は、本発明により、よく適している。最も好ましくは、Ｃｎｓｋ２阻害剤は、アピゲニン、ルテオリン、クリシン、及びチロホスチンＡＧ９９、特にアピゲニン、ルテオリン、及びチロホスチンＡＧ９９からなる化合物の群より選択することができる。最も好ましくは、Ｃｓｎｋ２阻害剤は、ヒトの食事の著名な構成成分であるアピゲニンである。
【００３５】
好ましくは、本発明によるＣｓｎｋ２阻害剤（天然又は非天然）は、Ｃｓｎｋ２に対して１０未満、最も好ましくは５μM未満、なおより好ましくは１μM未満のＩＣ５０を有する。好ましくは、選択された阻害剤は、Ｃｓｎｋ２の選択阻害剤でもある。典型的には、該選択的阻害剤は、Ｇ−ＣＫ及びＣＫ１、特にＣＫ１αに対して１μMを超える、特に１０μMを超えるＩＣ５０を有する。
【００３６】
いくつかの実施態様では、Ｃｓｎｋ２活性の阻害は、Ｃｓｎｋ２遺伝子発現の阻害剤を通じても達成され得る。本発明により、Ｃｓｎｋ２阻害剤は、遺伝子の発現を阻害する又は顕著に低下させる生物学的効果を有する天然又は合成化合物を表す。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をＣｓｎｋ２遺伝子発現阻害剤として本発明に使用することもできる。例として、Ｃｓｎｋ２α／α’を特異的に標的化する一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡキメラオリゴマー又はｓｉＲＮＡが使用され得る（Trembley JH, Unger GM, Korman VL, et al., PLoS One 2014;9(10):e109970; Unger GM, Kren BT, Korman VL, et al., Mol Cancer Ther 2014;13(8):2018-29; Kren BT, Unger GM, Abedin MJ, et al., Breast Cancer Res 2015;17:19）。
【００３７】
微生物叢は、対象中又は対象上に存在する微生物全体を表す。マイクロバイオームは、対象中又は対象上に存在する微生物全体及びその総体的な遺伝物質を表す。したがって、マイクロバイオーム調節異常は、微生物叢調節異常に直接起因する。本明細書に使用される用語「微生物叢調節異常」又は「マイクロバイオーム調節異常」は、好ましくは、それぞれ「腸内微生物叢調節異常」及び「腸内マイクロバイオーム調節異常」を表す。本明細書に使用される「マイクロバイオーム調節異常」、特に「腸内マイクロバイオーム調節異常」は、特にディスバイオシスを表す。「微生物不均衡」とも名付けられるディスバイオシスは、腸管微生物叢又はマイクロバイオームの逸脱したレパートリーとして定義することができる。
【００３８】
特に、個体内のこの微生物群落の組成における極端な複雑さ及び変動性のせいで、微生物叢の十分な特徴づけは、まだ欠落している。しかし、微生物叢の細菌成分は、近年ヒトマイクロバイオームプロジェクト（Petersen et al., The NIH Human Microbiome Project. Genome Res. 2009; (12):2317-23を参照されたい）などの大規模プロジェクトによって推進された集中的な研究の主題であった。メタゲノム研究により、群落組成における幅広い個人間変動性にもかかわらず、マイクロバイオームに共通の機能性中核があることが確立された。この知識に基づき、微生物叢を特徴づけている文献は急拡大している（Clemente et al., Cell 2012; 148(6): 1258-70; Sartor RB, Mucosal Immunology 2011; 4(2): 127-132を参照されたい。ヒト胃腸管微生物叢の分析を総説しているFrank DN et Pace NR Current Opinion in Gastroenterology 2001, 17:52-57も参照されたい）。
【００３９】
所与の対象における微生物不均衡は、前記対象の微生物叢を少なくとも健康な対象の微生物叢と比較することによって特徴づけられる場合がある。したがって、群落組成における違いが微生物不均衡を明らかにする場合がある。微生物叢の分析は、便試料などの腸内微生物叢試料に対して行われる場合がある。
【００４０】
好ましくは、少なくとも１人の健康な対象は、代謝疾患、炎症疾患、免疫疾患又は癌性疾患を全く患わない。好ましくは、少なくとも１人の健康な対象は、概日リズム障害も患わない。典型的には、該対象は、ＩＢＤ、メタボリックシンドローム、糖尿病又は結腸直腸癌を患わない。同じく典型的には、対象は、正常な睡眠パターン及び規則的な食物摂取パターンを有する。
【００４１】
同様に好ましくは、少なくとも１人の健康な対象は、所与の対象と同じ年齢、同じ性別及び同じ地理上の区域出身である。同様に好ましくは、少なくとも１人の健康な対象は、所与の対象と同じ食生活（例えば、欧米様食生活）を有する。有利には、腸内微生物叢の比較は、１人を超える健康な対象（すなわち健康集団）の微生物叢の健康プロファイルに対して行われる。
【００４２】
所与の対象におけるマイクロバイオーム調節異常は、腸内マイクロバイオーム試料（例えば、便試料）の代謝産物を定性的及び／又は定量的に分析すること並びに得られた代謝産物のプロファイルを少なくとも１人の健康な対象（上に定義）の代謝プロファイルと比較することによっても検出され得る。例として、腸内マイクロバイオーム試料中のフラボン化合物（アピゲニンなど）の定量分析が、所与の対象に行われ、結果が、少なくとも１人の健康な対象、好ましくは健康集団におけるフラボンレベルと比較される場合がある。マイクロバイオーム調節異常は、典型的には、少なくとも１人の健康な対象におけるレベルと比較した所与の対象におけるフラボン化合物の減少したレベルによって特徴づけることができる。
【００４３】
少なくとも１人の健康な対象と比較して所与の対象のマイクロバイオームにおいて差次的に産生されると考えられ得る代謝産物は、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍若しくはそれを超えてアップレギュレーションされる、又は少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍若しくはそれを超えてダウンレギュレーションされ得る。
【００４４】
いくつかの実施態様では、ディスバイオシスは、有益細菌の減少したレベル及び／又は減少した細菌多様性と一般的に関連する、有害細菌の増加したレベルに関連する。
【００４５】
有害／有益細菌の非限定的な例は、以下であり得る。
【００４６】
【表１】
2019519514.tif 000009
【００４７】
有害／有益細菌の例は、Clemente et al., Cell 2012; 148(6): 125-1270; Sartor Mucosal Immunology 2011; 4(2):127-132; Schwabe FR et Jobin C, Nat Rev Cancer. 2013 Nov; 13(11): 800-812; Gagniere J et al., World J Gastroenterol. 2016 Jan 14;22(2):501-18; Keku TO et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2015 Mar 1;308(5):G351-63にも記載されている。
【００４８】
さらに、以前に言及されたように、腸内微生物叢、したがって腸内マイクロバイオームの組成は、上皮の自己再生における時刻変動と一致する日内周期変動にも供される。本出願に含まれる結果によって示されるように、Ｎｌｒｐ６の不在は、微生物叢の組成変化を導いた日周性に周期変動する細菌属の強い蓄積に関連する。より一般的には、本データは、Ｃｎｓｋ２がＮｌｒｐ６活性の抑制を通じて上皮幹細胞活性の十分に特徴づけられた日内周期変動を編成することを示している。概日時計の乱れに関連する微生物叢調節異常又はマイクロバイオーム調節異常という用語は、腸内微生物叢又は腸内マイクロバイオームの日周リズム性の欠如も表す。
【００４９】
したがって、これに関連して、ディスバイオシスを患う対象は、典型的には、腸内微生物叢の日周変動の変化及び／又は欠如によって特徴づけることができる。微生物叢日周リズム性の欠如を、１日の経過にわたる腸内微生物叢の連続分析により対象において検出することができる（例えば結果に示すが、Thaiss CA et al., Gut Microbes. 2015;6(2):137-42又はThaiss CA et al., Cell. 2014;159(3):514-29も参照されたい）。
【００５０】
本明細書に使用される「概日時計の乱れ」は、通常、生物がその生物特性及び挙動を昼夜サイクルにおける毎日の環境変化と調和させることを可能にする対象の概日リズムにおける乱れを表す。
【００５１】
本明細書に使用される用語「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒト対象を意味する。
【００５２】
いくつかの実施態様では、本発明に従う対象は、晩に起きていることが困難で朝に寝ていることが困難なことによって特徴づけられる睡眠相前進障害（ＡＳＰＤ）、睡眠開始及び終了の正常なタイミングよりもずっと遅いこと並びに夜中の覚醒ピーク期間によって特徴づけられる睡眠相後退障害（ＤＳＰＤ）、不規則睡眠覚醒リズム、又は罹患した個体の睡眠が日毎に遅くなり、覚醒ピークの期間も日毎に時計回りに連続して進む非２４時間睡眠覚醒障害などの概日リズム睡眠障害を患っている。本発明に従う対象には、例えば高齢、夜勤、交代制勤務、又はアルツハイマー病、パーキンソン病、若しくは任意の精神衛生疾患（mental health disease）などの疾患が原因の概日リズム睡眠障害のリスクもある可能性がある。
【００５３】
いくつかの実施態様では、本発明による対象（好ましくはヒト）は、ディスバイオシスに苦しむ又は苦しみやすい可能性もある。特定の実施態様では、「対象」という用語は、宿主概日時計の乱れによって起こるディスバイオシスに苦しむ又は苦しみやすい対象を表す。
【００５４】
本明細書に使用される「ディスバイオシスの素因となる疾患」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＩＢＤ、メタボリックシンドローム、肥満、耐糖能障害、アレルギー及び癌などの、宿主概日時計の乱れに関連するディスバイオシスによって誘導される疾患を表す（Jones et al., 2016; Scavuzzi et al., 2016; Thaiss et al., 2014; Liang et al., 2014）。
【００５５】
「処置」、「処置すること」又は「処置する」等の用語は、所望の薬理効果及び／又は生理効果を得ることを表す。この効果は、疾患及び／又は疾患に起因し得る有害作用の部分又は完全改善又は治癒に関して特に治療的である。処置は、疾患の症状を阻害する（すなわち、その発生を停止する）又は疾患の症状を軽減する（すなわち、疾患若しくは症状の後退を引き起こす）ことを目的とする、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を対象とする。「処置」、「処置すること」又は「処置する」等の用語は、疾患又はその症状を完全又は部分的に予防する点で所望の薬理予防効果及び／又は生理予防効果を得ることも表す。したがって、これらの用語は、疾患又は症状のリスク又は素因があり得るが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患又は症状が起こるのを予防することを目的とする、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を対象とする。
【００５６】
特に、「微生物叢調節異常の処置」又は「マイクロバイオーム調節異常の処置」という用語は、腸内微生物叢若しくは腸内マイクロバイオームの有益な機能性の日周リズム性の回復及び／又は有害細菌、特に有害腸内細菌の比率の減少を特に含む。
【００５７】
さらにまとめると、本発明者らによって得られたデータは、Ｃｓｎｋ２の阻害が代謝機能を調節し、腸炎を軽減することを示している。例として、それらのデータは、Ｃｓｎｋ２阻害剤で処置されたＬＤサイクル（１２時間／１２時間の明／暗）の野生型マウスが、大腸炎の前臨床モデルとしてのデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の経口投与に対してあまり重度でない体重減少を有したことを実証している。また、対照と比較したときに、Ｃｓｎｋ２阻害剤で処置されたマウスの結腸の代表的なヘマトキシリン・エオシン染色切片上に炎症細胞の減少した浸潤が顕著に証明された。
【００５８】
したがって、「微生物叢調節異常又はマイクロバイオーム調節異常の処置」という用語は、微生物叢調節異常又はマイクロバイオーム調節異常の予防も表すことができる。そのような予防、特に日周予防は、概日リズムの睡眠の乱れを患う又はそのリスクがある対象において特に関心対象である。Ｃｓｎｋ２阻害剤は、健康な患者における予防的処置としても使用され得る。好ましくは、前記の健康な患者は、概日リズム障害のリスクがある、又は炎症疾患、免疫疾患、代謝疾患若しくは癌を患うリスクがある。該リスクは、発病家族歴又は衛生状態及び食習慣に基づき確立される場合がある。
【００５９】
本発明のいくつかの実施態様では、「微生物叢調節異常の処置」という用語は、概日リズムの乱れに関連するいくつかの病気、特に結腸直腸癌、メタボリックシンドローム及びＩＢＤなどの概日リズムの乱れに関連する微生物叢調節異常によって誘導される病気の予防も表すことができる。したがって、本発明によるＣＫ２阻害剤は、例えば発病家族歴、若しくは食事療法が原因で結腸直腸癌、メタボリックシンドローム及びＩＢＤのリスクがある対象に、又は結腸直腸癌再発の予防に使用され得る。
【００６０】
「微生物叢調節異常の処置」という用語は、健康状態、特に正常な生理的消化機能及び免疫機能の維持も表す。
【００６１】
これに関連して、本発明によるＣｓｎｋ２阻害剤は、生理的消化及び免疫調節を保つために、任意の生理的症状の不在下で、特に任意の消化又は免疫症状の不在下で補助食品として使用され得る。
【００６２】
Ｃｓｎｋ２遺伝子発現阻害剤又はＣｓｎｋ２阻害剤は、医薬組成物の形態で投与され得る。好ましくは、該阻害剤は、治療有効量で投与される。
【００６３】
「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利益／リスク比で微生物調節異常を治療及び／又は予防するために十分な量のＣｓｎｋ２遺伝子発現阻害剤又はＣｓｎｋ２阻害剤が意味される。
【００６４】
本発明のいくつかの実施態様では、「治療有効量」によって、概日リズムの乱れに関連するいくつかの病気、特に概日リズムの乱れに関連する微生物叢調節異常によって誘導される病気を予防するために十分なＣｓｎｋ２遺伝子発現阻害剤又はＣｓｎｋ２阻害剤の量も意味される。
【００６５】
本発明のいくつかの実施態様では、「治療有効量」によって、対象を健康な状態に維持するために、特に、該対象における正常な生理的消化及び／又は免疫機能を維持するために十分なＣｓｎｋ２遺伝子発現阻害剤又はＣｓｎｋ２阻害剤の量も意味される。
【００６６】
本発明の化合物及び組成物の１日合計使用量は、担当医師が健全な医学的判断の範囲内で決定できると理解される。任意の特定の対象に特異的な治療又は食物レジメンは、治療又は予防されるべき障害又は調節異常及びその重症度；採用される特異的化合物の活性；採用される特異的組成物、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食餌；投与時間、投与経路、及び採用される特異的化合物の排泄速度；処置の持続期間；採用される特異的ポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野で周知の類似の要因を含む多様な要因に依存し得る。例えば、所望の治療効果を達成するために要求されるレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始して、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることは、十分に当業者の技能の範囲内である。
【００６７】
「治療又は食物レジメン」によって、治療の間に使用される投薬パターンが意味される。治療又は食物レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含み得る。「導入レジメン」又は「導入期間」という語句は、初回処置のために使用される治療若しくは食物レジメン（又は治療若しくは食物レジメンの部分）を表す。導入レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初回期間の間に対象に高レベルの薬物を提供することである。導入レジメンは、維持レジメンの間に医師が採用するよりも多い用量の薬物を投与すること、維持レジメンの間に医師が薬物を投与するよりも多い頻度で薬物を投与すること、又はその両方を含み得る「負荷レジメン」を（部分的又は全体的に）採用し得る。「維持レジメン」又は「維持期間」という語句は、障害又は調節異常の処置の間に対象を維持するために、例えば、対象を寛解状態又は良好な健康状態に長期間（数ヶ月又は数年）保つために使用される治療又は食物レジメン（又は治療若しくは食物レジメンの部分）を表す。維持レジメンは、連続療法（例えば、薬物を一定の間隔で、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などで投与する）又は間欠療法（例えば、断続処置、間欠処置、再発時の処置）を採用し得る。
【００６８】
本発明に従う使用のためのＣｓｎｋ２遺伝子発現阻害剤又はＣｓｎｋ２阻害剤を、薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により生分解性ポリマーなどの徐放マトリックスと組み合わせて治療又は食物組成物が形成される場合がある。
【００６９】
本発明の食物組成物の医薬において、活性主薬は、単独又は別の活性主薬と組み合わせて、従来の医薬又は生理的支持体との混合物としての単位投薬形態で動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤及び経口懸濁剤又は液剤、舌下及び口内投与形態、エアロゾル、移植片、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内及び鼻腔内投与形態並びに直腸投与形態などの経口経路を含む。好ましくは、適切な投与は、経口又は直腸経路を通じて行われる。
【００７０】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤にとって薬学的又は生理的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張無菌食塩水（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウム等又はそのような塩の混合物）、又は場合に応じて無菌水若しくは生理食塩水を添加すると注射液の構成が可能になる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。注射用途に適切な医薬形態には、無菌水溶液若しくは分散液；ゴマ油、ラッカセイ油若しくは水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射液若しくは分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。全ての場合で、形態は、無菌でなければならず、容易なシリンジ通過性が存在する程度に流動性でなければならない。形態は、製造及び保存条件で安定でなければならず、細菌、ウイルス及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。
【００７１】
本発明の化合物を遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として含む溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中に調製することができる。分散液を、グリセロール、液体プロピレングリコール、及びその混合物中並びに油中に調製することもできる。普通の保存及び使用条件で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。
【００７２】
本発明のＣｓｎｋ２遺伝子発現阻害剤又はＣｓｎｋ２阻害剤は、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的又は生理的に許容し得る塩には、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等などの有機酸と形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等などの有機塩基由来であることもできる。
【００７３】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体プロピレングリコール等）、その適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒でもあることができる。適度の流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合は所要の粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【００７４】
製剤化されると、液剤は投薬製剤と適合性の方法で、治療的に有効な量で投与される。製剤は、多様な投薬形態で、例えば薬物放出カプセル等により容易に投与され、他の薬学的又は生理的に許容し得る形態には、例えば錠剤又は経口投与様の他の固形剤；リポソーム製剤；持続放出カプセル；及び現在使用される任意の他の形態が含まれる。
【００７５】
本発明は、概日時計の乱れに関連するものを含む微生物叢調節異常を処置する方法であって、それを必要とする対象に上記Ｃｓｎｋ２阻害剤を投与することを含む方法にも関する。
【００７６】
本発明は、良好な健康状態の維持するため、並びに／又は生理的消化及び免疫調節を保つための方法であって、対象に上記Ｃｓｎｋ２阻害剤を含む補助食品を投与することを含む方法にも関する。該補助食品は、以前に記載されたような食物レジメンに従って投与され得る。例えば、Ｃｓｎｋ２阻害剤の該全身補助は、１日の特定時間に、特に食物Ｃｎｓｋ２阻害剤の吸収があまり効果的でないときに、投与され得る。
【００７７】
いくつかの実施態様では、対象は、概日リズム睡眠障害を患う又はそのリスクがある。
【００７８】
いくつかの実施態様では、補助食品は、任意の病理症状の不在下で、特に任意の消化又は免疫症状の不在下で投与される。
【００７９】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに例証される。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定すると決して解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】日周性に周期変動する細菌の蓄積は、Ｎｌｒｐ６欠損マウスにおける抗微生物ペプチド及びインターロイキン−１８の周期性発現と同時発生する。Ａ．野生型（ＺＴあたりｎ＝５）及びＮｌｒｐ６欠損（ＺＴあたりｎ＝６）マウスの腸内微生物叢内で周期変動している細菌ＯＴＵの相対的存在量。Ｂ．野生型（ＺＴあたりｎ＝５）及びＮｌｒｐ６欠損（ＺＴあたりｎ＝６）マウスにおける連続３日にわたるバクテロイデス門（Bacteroidetes）／ファーミキューテス門（Firmicutes）の比の概日周期変動。Ｃ．野生型（ＺＴあたりｎ＝４）及びＮｌｒｐ６−／−（ＺＴあたりｎ＝４）マウスの粘膜領域におけるリゾチーム（lysosyme）陽性シグナルの平均強度。Ｄ．野生型（１時点あたりｎ＝４〜５）及びＮｌｒｐ６−／−（１時点あたりｎ＝５〜６）マウスの回腸組織における抗菌遺伝子発現。Ｅ．野生型（ＺＴあたりｎ＝４）及びＮｌｒｐ６−／−（ＺＴあたりｎ＝４）マウスの粘膜領域内のＭｕｃ２陽性細胞数。Ｆ．野生型（１時点あたりｎ＝４〜５）及びＮｌｒｐ６−／−（１時点あたりｎ＝５〜６）マウスの結腸組織外植片におけるＩＬ−１８タンパク質レベル。Ｇ．野生型（ＺＴあたりｎ＝４〜５）及びＮｌｒｐ６−／−（ＺＴあたりｎ＝５〜６）マウスの結腸組織におけるＩＬ−１８コード遺伝子の相対発現。黒及び白のマークはそれぞれ野生型マウス及びＮｌｒｐ６−／−マウスを表す。スケールバーは１００mmを表す。エラーバーはＳＥＭを示す。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
【図２】上皮Ｎｌｒｐ６の周期性発現が概日時計を調節する。Ａ．野生型マウス（ｎ＝５）の結腸及び小腸におけるＮｌｒｐ６、Ｂｍａｌ１及びＤｂｐについての転写レベルの周期変動。Ｂ、Ｃ．野生型マウス及びＮｌｒｐ６−／−マウス（ｎ＝５）の小腸組織における遺伝子発現。Ｄ．小腸オルガノイドにおける免疫蛍光染色の代表的な図。スケールバーは５０μMを表す。Ｅ．結腸組織試料におけるＫｉ６７の免疫染色の代表的な図。スケールバーは１００mmを表す。黒及び白のマークは、それぞれ野生型マウス及びＮｌｒｐ６−／−マウスを表す。エラーバーはＳＥＭを示す。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
【図３】Ｎｌｒｐ６は、カゼインキナーゼ２により上皮自己再生の時間生物学的性質を調節する。Ａ、ＦＬＡＧ  Ａｂを用いた回腸組織におけるＮｌｒｐ６−３×Ｆｌａｇ−ＧＦＰタンパク質の免疫共沈。Ｂ、抗ＣＮＳＫ２抗体、抗ｐＥＲＫ抗体及び抗ＥＲＫ抗体を使用して、ＺＴ１２及びＺＴ２４での野生型ＭＥＦ及びＮｌｒｐ６欠損ＭＥＦからの核（Ｎ）及び細胞質（Ｃ）抽出物をウエスタンブロット分析に供した。示した結果は、二つの独立した実験の代表である。Ｃ、アピゲニン（７５０μg/マウス、週２回）の３週間レジメンの結果としてのシグナル伝達経路の上位五つ。差次的に発現した遺伝子の数を各富化経路について示す。Ｄ、ビヒクル処置マウス及びアピゲニン処置マウスの結腸組織における時計遺伝子の発現。Ｅ、結腸陰窩あたりのＫｉ６７＋細胞の平均数。Ｆ、２％ ＤＳＳを投与する前にアピゲニンで３週間前処置された野生型（ｎ＝５）マウス（７５０μg/マウス、週２回）の体重減少。Ｇ、結腸の長さ。Ｈ、組織学的スコア。Ｉ、２％ ＤＳＳを投与する前にアピゲニンで３週間前処置されたＮｌｒｐ６−／−（ｎ＝４）マウス（７５０μg/マウス、週２回）の体重減少。Ｊ、結腸の長さ。Ｋ、組織学的スコア。エラーバーはＳＥＭを示す。＊ｐ≦０．０５。示した結果は、三つの独立した実験の代表である。黒及び白のマークはそれぞれ野生型マウス及びＮｌｒｐ６−／−マウスを表す。
【図４】Ｎｌｒｐ６による腸内微生物叢の制御は、アピゲニンの抗炎症効果の一因である。ＮＴマウス及びＡｐｉマウスを３週間のＡｐｉ処置の間に同時飼育した。Ａ、アピゲニンで処置された又はされなかった野生型（ｎ＝５）マウス及びＮｌｒｐ６−／−（ｎ＝５）マウスからプロファイルされた糞便細菌群落の主座標分析。主座標を、比較された試料の群落組成を表す非存在度ベースのジャカール距離に基づき計算した。野生型（ｎ＝５）マウス及びＮｌｒｐ６−／−（ｓｈ  ｎ＝４、ｃｈ  ｎ＝５）マウスについて、体重減少（Ｂ、Ｅ）、結腸の長さ（Ｃ、Ｆ）、及び大腸炎スコア（Ｄ、Ｇ）示す。黒及び白のマークは、それぞれ野生型マウス及びＮｌｒｐ６−／−マウスを表す。エラーバーは、ＳＥＭを示す。＊ｐ≦０．０５。スケールバーは１００μMを表す。
【００８１】
実施例：
本明細書に提供される結果は、Ｎｌｒｐ６がカゼインキナーゼ２による宿主−微生物叢相互作用の日内周期変動を支援することを示している。言い換えると、著者らは、非古典的Ｎｌｒｐ６インフラマソームがＣｓｎｋ２を通じて概日時計を調節することを実証した。
【００８２】
概日タイミングの持続時間の乱れ（例えば交代制夜勤又は睡眠不足）への慢性曝露は、世界中で数百万人に影響を及ぼす。睡眠機能障害の健康上の影響は、ほとんど理解されていないメカニズムによる炎症性腸疾患への感受性を含む。本明細書において、本発明者らは、Ｎｏｄ様受容体タンパク質６（Ｎｌｒｐ６）が、カゼインキナーゼ２（Ｃｓｎｋ２）と直接相互作用することを通じて時計ベースの腸管陰窩ホメオスタシス保護することを実証する。腸管細胞系列の仕様における重度の時計調整不良は、Ｎｌｒｐ６欠損マウスにおいて周期変動している細菌属の蓄積に導く。機構的に、Ｎｌｒｐ６の欠如は、陰窩基底部円柱細胞の再生を犠牲にしてＣｓｎｋ２のリズム的な核シャトリングを打ち消す。逆に、フラボノイドアピゲニンによるＣｓｎｋ２活性の阻害は、機能的Ｎｌｒｐ６による増殖中の前駆細胞の増大を抑制し、一方で、カスパーゼ−１と独立して腸炎から防御する腸内微生物叢の変化に導く。まとめると、Ｎｌｒｐ６は、食物フラボノイドに応答して上皮可塑性への腸内微生物叢多様性の周期性適応を日周性に調和させる。
【００８３】
略語の一覧。ＡＮＯＳＩＭ：類似性分析、Ａｒｎｔｌ：アリール炭化水素受容体核内輸送体様、Ｃｓｎｋ２：ホスビチン／カゼインキナーゼＩＩ型、ＤＳＳ：デキストラン硫酸ナトリウム、ＩＥＣ：腸管上皮細胞、ｅＧＦＰ：強化緑色蛍光タンパク質、ＥＲＫ１／２：細胞外シグナル制御キナーゼ１及び２、ＩＢＤ：炎症性腸疾患、ＬＤ：１２時間／１２時間の明／暗、ＭＥＦ：マウス胚性線維芽細胞、Ｎｌｒｐ６：ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体６、ＯＴＵ：操作的分類単位、Ｐｐａｒ−アルファ：ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ、Ｐｐａｒ−ガンマ：ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ、Ｒｏｒａ、ＲＡＲ関連オーファン受容体Ａ、ｒＲＮＡ：１６ＳリボソームＲＮＡ、ＺＴ：ツァイトゲーバー。
【００８４】
材料及び方法
マウス及び試薬。Ｎｌｒｐ６−３×Ｆｌａｇ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰマウスをInstitut Clinique de la Souris（Illkirch、France；さらなる詳細は請求により入手可能）で作製した。半日の明サイクル曝露及び温度制御環境中で、齢及び性別が一致するＮｌｒｐ６欠損（Ｎｌｒｐ６−／−）マウス及び対照Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに標準的な実験用固形飼料を自由摂取させた。全ての動物実験は、政府のガイドライン８６／６０９／ＣＥＥ号に従って認定された施設（Ｂ５９−１０８号）において地域の実験審査委員会（ＣＥＥＡ２３２００９Ｒ）によって承認された。大腸炎の実験モデルを、以前１０に記載されたように行った。組織及び血液採取をＬＤ条件で行い、ＺＴ０は明期の開始（午前８時）であり、ＺＴ１２は、夕暮れ（午後８時）であった。アピゲニン（７５０μg/マウス；Santa Cruz）を、週に２回ＺＴ６に１又は３週間腹腔内に与えた。
【００８５】
初代ＩＥＣの単離、不死化マウス胚性線維芽細胞の作製及び培養。以前３１に記載されたように、初代ＩＥＣ及び固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）を遠位回腸及び結腸から単離した。製造業者の説明書に従ってＣＤ１１ｂ＋ ＬＰＭＣをMiltenyiキットによって富化した。線維芽細胞の単離のために、ＩＥＣを単離して廃棄し、残りの組織を収集し、ＰＢＳ中で洗浄した。無菌メスを使用して、結腸組織を小片に切り分けた（２５〜３０片）。標準的な細胞培養皿の底に無菌メスにより網目を刻み、管腔側を下にして組織片を網の接点に置いた。皿を２０分間放置して乾燥させ、皿の底に組織を付着させ、５％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した培地ＤＭＥＭ、１０％ ＦＣＳを慎重に添加した。皿を３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。次の５日間に皿の中の培地を新鮮ＤＭＥＭ、１０％ ＦＣＳ、２．５％ペニシリン／ストレプトマイシンと毎日交換し、その後、１週間に２回新鮮ＤＭＥＭ、１０％ ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンと交換した。組織部分から生じた個別の細胞の存在を毎日モニタリングした。培養５日後に大型で星形の線維芽細胞が最初に認められた。合計３週間培養後、組織部分を皿から除去し、懸濁細胞をＰＢＳで洗浄して除き、トリプシン／ＥＤＴＡと共に３７℃で５分間２回インキュベートすることにより接着細胞を剥離させた。接着細胞を４００×ｇで３分間ペレット化し、細胞培養フラスコ中のＤＭＥＭ、１０％ ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンに移した。細胞を１週間に２回継代し、継代４回目にさらなる操作のために使用した。妊娠したＮｌｒｐ６欠損雌及び野生型雌の子宮角から胎生Ｅ１３．５〜１４．５日に得られた胚から、不死化マウス胚生線維芽細胞（ＭＥＦ）を作製した。各胚から胎盤及び卵黄嚢を取り除き、胎仔の内臓を摘除し、断頭し、その後、氷冷０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて３７℃で２０分間消化した。トリプシン消化を中和後、懸濁細胞に１００Ｍフィルターを通過させ、１０％ ＦＢＳ、可欠アミノ酸及び抗生物質を補充したＤＭＥＭ培地（Life technology）を有する０．１％ゼラチンコーティングされたフラスコ上で培養した。２５回を超える継代の不死化（ＭＥＦｉ）を使用した。実験の２４時間前に、６ウェルプレート中、２％ ＩＴＳ−Ａ（Life technologies）＋２％ ＦＢＳを含有するDMEM Glutamax培地（Life technologies）にＭＥＦｉ（細胞０．０８×１０６個）を三つ組で蒔いた。２４時間毎に７日間、トリプシン処理により細胞を収集し、Countess（登録商標）装置を製造業者の説明書（Life technologies）に従って使用して計数した。以前３２に記載されたようにＭＥＦの同期化を行った。化学合成された有機化合物Ｕ０１２６を２０Ｍで使用した（Sigma-Aldrich）。
【００８６】
腸管オルガノイドの形成及び免疫蛍光染色。以前３３に記載されたように小腸陰窩を単離した。丸底プレートに１０μl/ウェルで埋め込まれた低成長因子matrigel（Corning）注に陰窩５００個／ウェルを蒔いた。３７℃、５％ ＣＯ２で２０分間インキュベート後、以前３３に記載されたように陰窩培地１００μl/ウェルを陰窩に過剰負荷した。培地を４日毎に交換した。播種の６日後に、Cell Recovery溶液（BD Bioscience）を添加してmatrigelからオルガノイドを回収し、次に、ＨＢＳＳ中の０．８U/μl ＤＮアーゼ及び０．３U/μl ディスパーゼで処理して単一細胞を得た。次に、細胞懸濁液をＡＦ４８８コンジュゲート生／死染色（Life Technologies）で染色し、固定し、透過処理し、抗Ｋｉ６７ ｅＦｌｕｏｒ６６０ Ａｂ（クローンSolA15, eBioscience）と共にインキュベートした。次に細胞をBD FACS Canto IIで取得し、結果をFlowJoソフトウェアにより解析した。免疫蛍光染色のために、オルガノイドを４％ ＰＦＡで固定し、すでに３４に記載されたように４％低融点アガロース中に包埋した。HM650V vibratome（Thermo Fisher Scientific）を使用することによって１５０mm切片を得た。抗体抗Ｋｉ６７ ｅｆｌｕｏｒ６６０クローン：ＳｏｌＡ１５（eBioscience）及びＡＦ４８８コンジュゲート型ファロイジン（Life Technologies）を使用した。核をＤＡＰＩによって染色した（１μg/ml, Life Technologies）。ProLong Gold Antifade試薬（Life Technologies）を用いて切片をマウントした。Opterraマルチポイント走査共焦点顕微鏡（Bruker）を使用して画像を取得した。
【００８７】
免疫組織化学、免疫蛍光及び組織分析。腸管組織をホルマリン中で固定し、一連の漸増する濃度のアルコール及びトルエン中で脱水し、その後パラフィン中に包埋した。免疫組織化学のために、厚さ５μMの組織切片をSuperfrost Plusスライド（Thermo Scientific）上に置き、６０℃で１０分間インキュベートし、一連の段階的アルコール及び蒸留水により再水和させた。内因性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素により１０分間ブロッキングした。電子レンジ中で切片を２０分間蒸すことによって抗原賦活化をクエン酸緩衝液（１０mM、ｐＨ６）中で行った。５％ ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて組織切片をＲＴで３０分間ブロッキングし、Ｋｉ６７に対する一次Ａｂ（1:100, ab15580, Abcam）、Ｆｌａｇ Ｍ２に対する一次Ａｂ（1:100, F3165, Sigma）又は切断されたカスパーゼ３に対する一次Ａｂ（1:50, 9661, Cell Signalling）のいずれかを直接適用し、室温（ＲＴ）で１時間又は４℃で一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳ中で３回洗浄し、その後、二次ペルオキシダーゼコンジュゲート型ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｂ（1:100, Interchim）又はペルオキシダーゼコンジュゲート型ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｂ（1:100, Interchim）のいずれかをＲＴで２時間適用した。３．３’−ジアミノベンジジン溶液（BD Pharmingen）を使用することによって標的抗原を視覚化し、続いてヘマトキシリンを用いて核を対比染色した。リゾチームに対する一次抗体（A0099, Dako）を１：１０００で、Cell Signalling Technologyによって提供されるプロトコールに従って４℃で一晩インキュベートすることによって免疫蛍光染色手技を行った。二次Ａｂ（1:200, A11008, Life Technologies）をＲＴで１時間適用し、続いてＤＡＰＩを用いて核を対比染色した。ProLongR Gold Antifade試薬（Life Technologies）を使用することによって組織切片をカバーした。Zeiss Axioplan 2画像顕微鏡、Axio Imager Z1顕微鏡、Axiovisionソフトウェア（全てZeiss, Oberkochen, Germany製）、及びImageJソフトウェアを使用することによって顕微鏡分析を行った。凍結切片（５ｍ）の染色を行って、製造業者の説明書（Cell Signaling Technology）に従って結腸組織上のＧＦＰを染色した。ポリクローナルウサギ抗ＧＦＰ Ａｂ（1/1000, Molecular Probes）及びモノクローナルラット抗インテグリン６Ａｂ（1/100, BD Pharmingen）を一次Ａｂとして使用し、試料上で一緒にＲＴで３時間インキュベートした。二次ＡＦ４８８共役ヤギ抗ウサギＡｂ及びＡＦ５９４共役ヤギ抗ラットＡｂ（1:500, Molecular Probes）をＲＴで１時間適用し、続いてＤＡＰＩで対比染色した。切片をMowiolでカバーした。
【００８８】
ツーハイブリッドスクリーニング、免疫共沈及びウエスタンブロッティング。製造業者（Agilent technologies）の説明書に従って細菌ツーハイブリッドスクリーニングを行った。completeプロテアーゼ阻害剤（Roche）を補充したＰＹ緩衝液（５０mM トリス−ＨＣｌ、１５０mM ＮａＣｌ、５mM ＥＤＴＡ、１％(v/v) Triton X-100、ｐＨ＝８）中に遠位回腸組織試料を溶解した。組み換えプロテインＧセファロース（Life Technologies）及びマウス抗ｆｌａｇ Ｍ２ Ａｂ（Sigma-Aldrich）を使用してＮｌｒｐ６−３×Ｆｌａｇ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰマウスの総組織タンパク質からＮｌｒｐ６タンパク質を沈殿させた。completeプロテアーゼ阻害剤（Roche）を補充したＲｉｐａ緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０mM ＮａＣｌ、１％(v/v) Triton X-100、０．１％(w/v) ＳＤＳ、０．５％(w/v) デオキシコール酸Ｎａ）中でＭＥＦ細胞を溶解することによりウエスタンブロッティング用のタンパク質を単離した。タンパク質濃度をPierce BCAキット（Thermo Fisher）によって測定し、Blot LDS Sample Buffer及びBlot Sample Reducing Agent中のタンパク質１０μgをBlot 4-12% Bis-Tris Plus gel（Life Technologies）に負荷した。試料を膜に移行させるためにiBlot2及びNC Regular Stockを使用し、ブロッキング及びＡｂ希釈のために５％乳汁溶液を使用した。以下の一次Ａｂを使用した：ウサギ抗アクチン（Interchim）、ウサギ抗Ｃｓｎｋ２ Sigma）、ウサギ抗ホスホＥＲＫ１／２（Cell Signalling）、ウサギ抗ＥＲＫ１／２（Cell Signalling）、マウス抗Ｆｌａｇ Ｍ２（Sigma）、ヤギ抗Ｎｌｒｐ６ Ｅ２０（Santa Cruz）、ウサギ抗ＳＰ１（Santa Cruz）及びマウス抗チューブリン（Cell Signalling）。ペルオキシダーゼコンジュゲート型ロバ抗ヤギＩｇＧ Ａｂ（Santa Cruz）、ペルオキシダーゼコンジュゲート型ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｂ（Interchim）及びペルオキシダーゼコンジュゲート型ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｂ（Interchim）を二次Ａｂとして使用した。
【００８９】
組織外植片の分析。遠位結腸組織部分（長さ０．５cm）を縦に開き、ＰＢＳ中でよく洗浄して便及び細片を廃棄した。組織をDMEM GlutaMax、１０％ ＦＣＳ(v/v)、１％(v/v) ペニシリン／ストレプトマイシン中でインキュベートし、３７℃、５％ ＣＯ２で８時間放置した。製造業者（ＭＢＬ）の説明書に従ってＥＬＩＳＡにより培地中のＩＬ−１８を測定した。
【００９０】
遺伝子発現及びマイクロアレイ分析。ｃＤＮＡ合成キット（Agilent Technologies）を製造業者の説明書に従って用いて、単離したＲＮＡを逆転写した。SYBR GreenリアルタイムＰＣＲキットを使用して、結果として生じたｃＤＮＡ（総ＲＮＡ ５ngに相当）を増幅し、Stratagene Mx3005P（Agilent Technologies）で検出した。フォワードプライマー及びリバースプライマー（要請があれば配列は入手可能）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅が完了後、単一アンプリコンの存在を確認するためにＤＮＡ融解曲線の分析を実施した。転写物レベルを規準化するためにＡｃｔｂを内部基準遺伝子として使用した。（ａ）関心対象の遺伝子とＡｃｔｂとについてＰＣＲサイクルの閾値（Ｃｔ）を比較すること（ΔＣｔ）および（ｂ）処置群と対照群とについてのΔＣｔ値を比較すること（ΔＣｔ）によって相対ｍＲＮＡレベル（２−Ｃｔ）を決定した。アピゲニン処置マウス又はビヒクル処置マウスから単離されたＩＥＣに対するマイクロアレイ分析を以前１０に記載されたように行った。以前２８に記載されたように両側フィッシャー直接確率法を使用して遺伝子オントロジー分析を行った。関心対象の遺伝子に関連する生物学的過程をGene Ontology Consortium（http://www.geneontology.org）から検索した。
【００９１】
微生物叢の分析。デュアルインデックスの融合プライマー、簡潔には、illuminaリンカー配列、１２塩基のバーコード配列及び不均一性スペーサーに続き、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子特異的フォワード（３１９Ｆ：ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ）プライマー配列又はリバース（８０６Ｒ：ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ）プライマー配列のいずれかからなるプライマーを使用して、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子可変領域Ｖ３及びＶ４を増幅した２９。上述のコンポジットプライマーを使用して、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００（Applied Biosystems, Foster City, California, USA）において以下のサイクリング条件を使用して二つ組でＤＮＡを増幅した：９８℃で３分の初回変性、続いて９８℃で１０秒の変性、５０℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長を３０サイクル。最終の伸長は７２℃で１０分間であった。増幅産物をアガロースゲルで泳動してアンプリコンのサイズ及び増幅性能を評価した。SequalPrepキット（Invitrogen）を使用してアンプリコンの量を規準化し、単一のライブラリーとしてプールした。２×３００配列決定キットを使用し、標準ＨＰ１０及びＨＰ１１プライマーを用いてIllumina MiSeqで配列決定を行った。ソフトウェアMOTHURを使用して、品質管理のために配列決定の読み取りデータを主に処理した。フォワード及びリバース読み取りデータを集合させて、コンティグを形成し、特異的プライマー及びバーコードと完全にはマッチせず、任意の多義の塩基及び八つを超えるホモポリマーを有する読み取りデータを下流の分析から除去した。所望の細菌Ｖ３−Ｖ４可変領域と整列しない配列、キメラの疑い及び非細菌起源の可能性を検出し、除去した。少なくとも９７％の類似性を有する配列を操作的分類単位（ＯＴＵ）にクラスター形成した。Mothur改変ＲＤＰ参照及び分類学データベースを使用してこれらのＯＴＵを分類学的に分類した３０。群落間のJaccard距離に対して主座標分析（ＰｃｏＡ）を行った。Ｒアプリケーションパッケージ（www.r-project.org）を用いてｒｇｌを使用して主座標を視覚化した。分析された群間の差に寄与する顕著なＯＴＵを同定するために指標分析を行った。多様性のノンパラメトリックShannon指数をアルファ多様性指数の尺度として計算した。ノンパラメトリックMann-Whitney検定によって統計的な差を決定した。
【００９２】
統計。Prism4.0（GraphPad Software, San Diego, CA）を使用してデータを解析した。Dunnの多重比較検定を伴うノンパラメトリックKruskal-wallis検定、Bonferroniの多重比較検定を伴うノンパラメトリックMann-Whitney検定又はパラメトリック一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用した。種レベルのＯＴＵで潜在的周期性成分を検出するためにＪＴＫ＿サイクルアルゴリズムを実行した１２。このツールは、組み合わせJonckheere-Terpstra-Kendallアルゴリズムに基づき秩序化された独立群にわたるデータのサブセットにおいて秩序化の単調さ（例えばリズム的パターン）を検出するためにノンパラメトリック検定法を使用する。値は、規準化されたデータの平均＋／−ＳＥＭを表す。星印、Ｐ≦０．０５で有意差。
【００９３】
結果
ハイスループット配列決定における最近の進歩は、出生したその日から、衛生状態、性別、加齢、薬物摂取及び摂食行動を含む内因性メカニズムと外因性メカニズムとの間の複雑な相互作用によって形づくられた環境に適応した腸内微生物群落（微生物叢）の構築の詳細な観察を可能にした（１）。安定な生態的地位の存在は、消化又は免疫調節などの重要な生理機能を維持し、それにより、宿主の全身の健康を増進する。腸内微生物叢の組成における日内周期変動は、宿主の摂食時間、性別及びいくつかのコア時計成分の関数として観察され（２、３、４）、それらは、上皮の自己再生における時刻変動と一致する（３）。逆に、腸上皮細胞（ＩＥＣ）による糖質コルチコイドの感知（５）を含むいくつかの時計ベースの腸管機能は、無菌マウスにおいて打ち消される（４）。そのようなリズムは、大まかに２４時間サイクルに従う周期性生理的変化を特徴づける。リズムは、内因性、自家持続性、時間追跡性の分子機構である概日時計によって維持されており、大部分の生きた生物が規則的に再発する生理的パターンを予期できるようにする。そのうえ、時計機構は環境変化に適応することもできる（６）。前述の時間追跡システムの障害は、ヒトの健康にとって潜在的に広範な意味を有する。勤労者の約１５〜２０％が、夜勤を含む交代制勤務スケジュールに定期的に従事しており（７）、それは、全勤務生活にわたり潜在的に概日リズムを障害するものである。疫学研究が、昼夜サイクルを障害する状態（例えば交代制勤務、断眠、時差ぼけ）と、結腸直腸癌、メタボリックシンドローム及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの多様な慢性炎症疾患との間の関連を示した（８）。リズム的な栄養摂取の明らかに強い影響にもかかわらず、ＩＥＣと腸内微生物叢との相互作用がどのように調節され、そのような相利的な相互作用の安定性が日周サイクルにわたりどのように維持されるかは、驚くほどほとんど知られていない。
【００９４】
ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体６（Ｎｌｒｐ６）は、腸内微生物叢の組成を調製することによって腸管ホメオスタシスを制御することが示されている（９〜１１）。Ｎｌｒｐ６が１日の経過にわたり腸内微生物叢の組成を制御し得るかどうかを判定するために、本発明者らは、１２時間毎に３日間にわたり収集した便試料からの１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子配列決定ベースの細菌プロファイルにおける周期性変数の検出のためにノンパラメトリックＪＴＫ＿サイクルアルゴリズムを適用した（１２）。以前の結果と一致して（２）、約０．６％（４２／２６７２）の細菌操作的分類単位（ＯＴＵ）の存在度が日周性に周期変動することが見出された（Ｐ値＜０．０５、Benjamini-Hochberg補正後、図１Ａ）。これらのリズム的な周期変動ＯＴＵのうち、厳密な１２時間／１２時間明暗条件（ＬＤ）で自由摂取させた野生型マウスとＮｌｒｐ６欠損マウスとの間で８ＯＴＵが共有された。特有の８ＯＴＵだけが野生型マウスにおいて周期変動挙動を表すことが示された。対照的に、Ｎｌｒｐ６の不在は、２６ＯＴＵを有する日周性に周期変動する細菌属の強い蓄積に導き、これらは、有意なリズムパターンによって特徴づけられた（Ｐ値＜０．０５、Benjamini-Hochberg補正後、図１Ａ）。前述の周期性ＯＴＵの間で、これらの大部分はクロストリジウム目（Clostridiales）群と関係した。その結果、変化したリズム性は、微生物叢の変化した組成に導き、バクテロイデス（Bacteroides）／ファーミキューテス（Firmicutes）比のより強いゆらぎがあり（図１Ｂ）、それは、最終的にＮｌｒｐ６欠損マウスにおける公知の前糖尿病状態の一因となり得る（１３）。より重要なことには、いくつかの抗微生物ペプチドについての転写物レベルのリズム的な変化が、Ｎｌｒｐ６欠損マウスの遠位回腸で観察された（示さず）。その結果、パネート細胞によるリゾチーム含有顆粒は、Ｎｌｒｐ６欠損マウスにおいて夜明けに（ツァイトゲーバー時間０、ＺＴ０）あまり豊富でないことが見出され、一方でＺＴ６及びＺＴ１２に差は見られなかった（図１Ｃ、Ｄ）。Ｎｌｒｐ６欠損マウスにおける前述の遺伝子のこのリズム的な発現パターンは、Ｍｕｃ２陽性ＩＥＣ数（図１Ｅ）並びに杯細胞の成熟を防止すると考えられるインターロイキン−１８の転写物（図１Ｆ）及びタンパク質（図１Ｇ）レベルの両方の周期変動と相関した（１４）。タイミングにおけるこの異常な相は、一緒になってＮｌｒｐ６欠損マウスにおけるディスバイオシスの徴候の一因となり得る、日周性に周期変動している細菌属の蓄積も説明することもできる（９）。
【００９５】
コルチコトロピン放出ホルモン（コルチコリベリンとも呼ばれる）における夜間減少を考えて（５）、本発明者らは、Ｎｌｒｐ６の発現が、Ｎｌｒｐ６の発現を抑制することが公知であるそのような視床下部放出ペプチドホルモンの日内ゆらぎの結果として変動し得るという仮説を立てた（１５）。それ自体興味深いことに、概日サイクルにわたる変動が、Ｎｌｒｐ６の転写レベルについて遠位回腸及び結腸の両方で観察された（図２Ａ）。小腸及び大腸でのＮｌｒｐ６発現の底点位相（bathyphase）は、ＩＥＣにおけるＲＡＲ関連オーファン受容体Ａ（Ｒｏｒａ）シグナル伝達によって調節されることが公知である、アリール炭化水素受容体核内輸送体様（Ａｒｎｔｌ又はＢｍａｌ１とも呼ばれる）（図２Ｂ）のリズム的発現と逆相関した（５）。仮説と一致して、Ｎｌｒｐ６欠損マウスの遠位回腸における遺伝子発現分析は、Ｂｍａｌ１（図２Ｂ）及びいくつかの核内受容体（図２Ｃ）の異常な日内周期変動を明らかにし、その調節解除はメタボリックシンドロームを引き起こすことが示された（５）。特に、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ（Ｐｐａｒ−アルファ）及びガンマ（Ｐｐａｒ−ガンマ）の遺伝子発現は、野生型マウスの遠位回腸及び結腸の両方で「休止期」の間に低下したが、Ｎｌｒｐ６欠損マウスにおいて最高レベルのままであった（図２Ｃ）。それと一致して、Ｎｌｒｐ６欠損マウスの小腸及び大腸は、Ｐｐａｒ−ガンマの活性を高めることが公知であるノクターニンのより大きな発現を示した（図２Ｃ）。まとめると、本発明者らの結果は、核内受容体の増悪した上皮活性化を明らかにし、このせいで、Ｎｌｒｐ６欠損マウスの腸管バリアは、１日の経過にわたり損傷に対する炎症応答をより発生しやすくなり得る。
【００９６】
どの細胞型が微生物叢との腸管界面でＮｌｒｐ６を発現し得るかを定義するために、本発明者らは、カルボキシ末端３×Ｆｌａｇタグ及びＩＲＥＳ−ｅＧＦＰカセットを有するＮｌｒｐ６を発現しているノックインマウスを作製した（示さず）。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｐｐａｒ−ガンマについて報告されたことのように（１６）、分化したＩＥＣに限定されたＮｌｒｐ６の発現を明らかにし（データは示さず）、それは、免疫蛍光及び免疫組織化学分析によって確認された（データは示さず）。本発明者らは、次に、野生型マウス及びＮｌｒｐ６欠損マウスの空腸由来の三次元培養ＩＥＣのモデル（オルガノイドとしても公知）を利用した。興味深いことに、オルガノイドにおけるＮｌｒｐ６の発現喪失は、Ｋｉ６７＋細胞の比率の増加を招いた（図２Ｄ）。Ｎｌｒｐ６欠損マウスから得られたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において類似の結果が観察され、その結果では、ＬＰＳに応答して細胞外シグナル制御キナーゼ１及び２（ＥＲＫ１／２）並びにＡｋｔシグナル伝達の活性化増加が観察された（データは示さず）。本発明者らは、次に、細胞外シグナル制御キナーゼ１及び２（ＥＲＫ１／２）シグナル伝達の選択的阻害剤であるＵ０１２６を用いた処置を行って細胞増殖を評価した。Ｕ０１２６処理された野生型ＭＥＦの増殖速度は、類似処理されたＮｌｒｐ６欠損ＭＥＦの一つに匹敵することが見出された（データは示さず）。Ｋｉ６７を使用する免疫組織化学分析により、結腸ＩＥＣのより高い増殖指数も夕暮れに観察された（データは示さず）が、切断型カスパーゼ−３陽性細胞数は、野生型マウスとＮｌｒｐ６欠損マウスとの間で類似であることが見出された（データは示さず）。したがって、Ｎｌｒｐ６−／−マウスにおける大腸炎のリスク強化は、ＩＥＣの調節解除されたサイクリング及びＩＥＣの増殖に関与するＥＲＫ１／２標的遺伝子の発現強化と同時発生した（１０）。これらの結果は、Ｎｌｒｐ６のリズム的な上皮発現が上皮バリア機能の時計ベースの維持に関与する可能性があることを本発明者らに示唆した。
【００９７】
Ｎｌｒｐ６シグナル伝達が上皮の自己再生をどのように日周性に指示し得るかのさらなる洞察を得るために、本発明者らは、ベイトとしてマウスＮｌｒｐ６のピリンドメインを適用することによりＭＥＦ ｃＤＮＡライブラリーの細菌ツーハイブリッドスクリーニングを行った。二つの陽性重複クローンは、ホスビチン／カゼインキナーゼＩＩ型の調節性ベータサブユニット（Ｃｓｎｋ２β、ＯＭＩＭ １１５４４１）をコードするｃＤＮＡを含有した。Ｃｓｎｋ２は、真核界にわたり進化的に保存されている四量体性セリン／トレオニン選択的プロテインキナーゼである。興味深いことに、Ｃｓｎｋ２は、期間延長及びストレス応答経路の調節に関与する概日時計のコアメンバーである（１７、１８）。ショウジョウバエ（Drosophila）において、アンダンテ変異体は、異常に長い概日期を招くＣｓｎｋ２の喪失によって特徴づけられる（１７）。本発明者らのツーハイブリッドスクリーニングによって予測されるように、Ｎｌｒｐ６は、マウス腸内のＣｓｎｋ２βと一緒に内因性に免疫沈降した（図３Ａ）。Ｃｓｎｋ２が活性化時に核区画に移行することを考えて（１９）、本発明者らは、次に、Ｎｌｒｐ６の不在下でのＥＲＫ１／２シグナル伝達の活性化増加が、Ｃｓｎｋ２の異常な昼夜シャトリングに起因し得ると仮定した（２０、２１）。それと一致して、Ｃｓｎｋ２β及びリン酸化ＥＲＫ１／２の核シャトリングの日内周期変動は、Ｎｌｒｐ６の不在下で時刻依存的に妨害されることが分かった（図３Ｂ）。Ｎｌｒｐ６がＣｓｎｋ２の下流で機能し得るかどうかを評価するために、本発明者らは、Ｃｓｎｋ２活性のＡＴＰ競合阻害剤である天然の植物フラボンとしてアピゲニン（４’，５，７−トリヒドロキシフラボン）を利用した。注目すべきことに、マイクロアレイ分析は、アピゲニン投与された野生型マウスにおいてＬｏｇｆｃ １．５で差次的に発現された５４種の遺伝子の特異的サブセットを明らかにした。興味深いことに、アピゲニン処置のシグネチャーは、癌及び概日リズムシグナル伝達に関連する遺伝子が富化されていることが見出された（図３Ｃ）。重要なことに、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、いくつかの時計機構遺伝子の結腸転写レベルが、Ｎｌｒｐ６によるアピゲニン投与によって有意に影響されたことを明らかにした（図３ｄ）。その結果、Ｋｉ６７ Ａｂ染色によって示されるようにアピゲニンの３週間レジメンはＩＥＣの増殖を低下させ、カスパーゼ−３陽性ＩＥＣ数に全く変化を有さなかった（図３Ｄ）。対照的に、アピゲニンの抗増殖効果は、Ｎｌｒｐ６欠損マウスにおいて打ち消された（図３Ｄ）。これらの結果は、Ｃｎｓｋ２がＮｌｒｐ６活性の抑制により上皮幹細胞活性の十分に特徴づけられた日内周期変動を編成することを強く実証している。
【００９８】
フラボンは、ヒトの食餌の重要な成分であるフラボノイドのクラスである。食物フラボノイド、アピゲニンは、概日リズムの乱れに関連するいくつかの病気の処置のために有望な薬物である。ＬＤサイクルを受けているアピゲニン処置された野生型マウスは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の経口投与を受けてあまり重度でない体重減少を有した（図３Ｆ）。アピゲニンを投与すると、他のフラボンで観察されたのと同様に、より低い疾患−活性指数がより大きな結腸の長さと相関した（２２）。一致して、対照と比較したとき、アピゲニンで処置されたマウスからの結腸の代表的なヘマトキシリン・エオシン染色切片について、炎症細胞の浸潤減少が顕著に証明された（図３Ｊ）。対照的に、ＤＳＳ曝露の間にマウスが暗条件で３概日サイクルの間、飼育された場合、アピゲニンの抗炎症効果は観察されなかった。本発明者らは、次に、アピゲニンがＮｌｒｐ６を経由してＤＳＳ誘導大腸炎から防御し得るかどうかを判定した。本発明者らの以前の結果と一致して、Ｎｌｒｐ６を欠如するマウスのアピゲニンを用いた処置は、消耗性疾患を改善せず（図４Ｉ）、結腸の長さを変えず（図３Ｊ）、その後の組織分析において炎症に効果を有しなかった（図３Ｋ）。まとめると、これらの観察は、アピゲニンがマウスを腸炎から防御するかどうかをＮｌｒｐ６が大きく決定することを実証している。
【００９９】
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定によって、本発明者らは、次に、アピゲニンの抗炎症役割が腸内微生物叢の細菌組成における変化に関連したかどうかに取り組んだ。Ｊａｃｃａｒｄ距離に関する類似性の統計解析（ＡＮＯＳＩＭ）は、アピゲニンで処置された野生型マウスの腸内微生物叢組成が、対照の一つと顕著に異なったことを明らかにした（Ｒ２＝０．３３、ｐ＝０．０１５；図Ａ）。細菌ＯＴＵの間でアピゲニンが誘導する変化は、アリスティペス（Alistipes）、パラサチュエルラ（Parasatuerlla）及びバクテロイデスを含む、バクテロイデス門由来のいくつか属の増大を含んでいた。より重要なことには、野生型マウスにおけるアピゲニン処置は、狭義のクロストリジウム（Clostridium）及び未分類ルミノコッカス科（Ruminococcacceae）の減少に導き、それらは、Ｎｌｒｐ６欠損マウスにおいて周期変動することが容易に見出された。以前の結果と一致して（９）、腸内微生物叢組成の大規模変化は、Ｎｌｒｐ６の不在下で細菌多様性の減少を引き起こした（ｐ＝０．００１）。特に、Ｎｌｒｐ６欠損マウスの腸内細菌の生態は、バクテロイデス門（アリスティペス、バルネシエラ（Barnesiella）及びアロバクルム（Allobaculum）を含む）に属する無鞭毛及び酪酸産生細菌の存在度低下によって特徴づけられ、それは、未分類のポルフィロモナス科（Porphyromonadaceae）及びクロストリジウム目の属の成長と相関した。アピゲニンが誘導するディスバイオシスが腸管ホメオスタシスに果たす役割をさらに確認するために、ビヒクル処置マウス及びアピゲニン処置マウスを３週間にわたり同時飼育し、その後ＤＳＳで誘発した。重要なことには、同時飼育されたビヒクル処置動物における消耗性疾患を、アピゲニンを投与されている野生型マウスで観察されたのと類似の程度まで改善した（図４Ｂ、Ｃ、Ｄ）。対照的に、Ｎｌｒｐ６欠損マウスにおける同時飼育実験は、同時飼育された動物と単一飼育された動物との間で大腸炎の防御に何も差を明らかにしなかった（図４Ｏ〜Ｒ）。それと一致して、本発明者らは、アピゲニン処置Ｎｌｒｐ６欠損マウス及びビヒクル処置Ｎｌｒｐ６欠損マウスからの腸内微生物叢の組成に全般的な変化を観察しなかった（ＡＮＯＳＩＭ、ｐ＝０．２８３）（図４Ｅ、Ｆ、Ｇ）。総合して、これらの結果は、アピゲニンによる概日時計の同調化が、腸炎に対する伝達性の防御を付与する腸内微生物叢におけるＮｌｒｐ６依存性変化を伴うことを示している。
【０１００】
まとめると、本発明者らは、Ｎｌｒｐ６がＩＥＣの増殖及び腸内細菌の生態の日内周期変動を編成すると結論する。本発明者らは、Ｎｌｒｐ６がＣｓｎｋ２の下流で作用し、そのことが、多様な種において概日期間を延長することができることを実証した（１７、１８）。より重要なことには、食物アピゲニンによるＣｓｎｋ２活性の薬理学的阻害は、Ｎｌｒｐ６を通じてマウスを腸炎から防御した。アピゲニンは、広範囲の疾患を処置するための、中医学の生物学的活性成分である天然植物フラボンである。第一に、同時飼育実験は、アピゲニン条件付け微生物叢の防御活性が野生型成マウスにさえ伝播可能であることを明らかにした。対照的に、アピゲニンで処置されたＮｌｒｐ６欠損マウスは、同時飼育された未処置の変異型動物に防御を付与しなかった。注目すべきは、アピゲニンの生物学的活性は、腸内微生物叢内に見られるＣ環切断活性を有するいくつかの共生菌の異化活性にほとんど依存する（２３）。あまり多様化していないことが公知であるＩＢＤ患者由来の腸内微生物叢によるフラボンの吸収及び代謝を評価するためのさらなる研究が今や切に待たれる。このパラダイムを理解することは、重度の代謝及び睡眠障害を経験したＩＢＤ患者における個別化医療の開発に向けて必須である。さらに、最近のゲノムワイド関連研究は、ＩＢＤの素因となる対立遺伝子が、ＣＳＮＫ２をコードする遺伝子中にあることを明らかにしたが（２４）、ＣＳＮＫ２は、ＩＢＤ患者からの結腸陰窩の核にあまり発現されず、そこに移行することが見出されている（２５、２６）。興味深いことに、ビタミンＤ受容体（ｒｓ１１１６８２４９）；核因子及びインターロイキン３調節因子（ｒｓ４７４３８２０）を含む、いくつかの他の概日時計成分がＩＢＤにおいて差次的に発現されるのと同時に（２５）、ＩＢＤの素因にも関与することも見出された（２７、２８）。まとめると、本発明者らの結果は、Ｃｓｎｋ２に対して公知の阻害活性を有する食物フラボン及び栄養補給食品のバイオアベイラビリティーを改善することによる、ＩＢＤにおける時間生物学的療法を考慮する必要性を主張するものである。それは、該療法がＮｌｒｐ６を通じて微生物叢の構築を決定することによって腸管上皮の再生及び大腸炎の転帰に大きく影響するからである。
【０１０１】
参考文献
【表２】
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【０１０２】
本出願にわたり、本発明が属する技術の現状を様々な参考文献が説明している。これらの参考文献の開示は、これによって参照により本開示に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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