(57)【要約】  本発明は、進行性胃癌患者の手術後の予後または抗癌剤適合性予測システムに関し、進行性胃癌の予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と参考遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準の定量的検査結果を利用して予後および抗癌剤適合性を予測できるアルゴリズムを開発して胃癌患者の治療方法を決定するのに補助的情報として活用することができる。
2019537436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤と；
ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤とを含む胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用組成物。
【請求項２】
予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群または参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤は、前記ｍＲＮＡに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用組成物。
【請求項３】
予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群または参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１〜１８に記載されたプライマーセット；またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１９〜２７に記載されたプローブを含む、請求項１に記載の胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用組成物。
【請求項４】
組成物は、胃癌２期および３期患者の再発または抗癌剤反応可能性を全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）または無病生存率（Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）の側面で予測する用途に使用するものである、請求項１に記載の胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物を含む胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用キット。
【請求項６】
キットは、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）キットまたはＤＮＡチップキットである、 請求項５に記載の胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用キット。
【請求項７】
胃癌２期および３期腫瘍から得た生物学的サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定し、下記式１によって各予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を計算する段階と；
前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値と比較して、
生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの最終臨界値よりさらに高い場合、良い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ）に分類し、
生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの少なくとも一つのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢまたはＷＡＲＳの最終臨界値より低い場合、生物学的サンプルのＳＦＲＰ４のΔＣｑ値を既定の基準ＳＦＲＰ４の最終臨界値と比較してΔＣｑ値がさらに低い場合、中間予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ）に分類し、ΔＣｑ値がさらに高い場合、悪い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）に分類する段階とを含み、
前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値は、ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４に対してそれぞれ−２．１４、−５．１８、−２．６９および−３．６３であり、
前記最終臨界値は、胃癌２期および３期腫瘍組織サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を得、前記ΔＣｑ値を利用して各遺伝子別の適応的回帰数値（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）を算出し、前記適応的回帰数値に各遺伝子別の補正値を加算して各遺伝子別の最終臨界値（ｆｉｎａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｖａｌｕｅ）を算出し、前記ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４の適応的回帰数値は、それぞれ−２．５４、−５．５８、−３．５９、−４．５３であり、補正値は、それぞれ＋０．４、＋０．４、＋０．９および＋０．９である、胃癌２期および３期の予後予測のための情報を提供する方法：
［式１］
ΔＣｑ＝（参考遺伝子群のＣｑ値）−（予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のＣｑ値）
ここで、参考遺伝子群のＣｑ値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子の平均Ｃｑ値を示す。
【請求項８】
生物学的サンプルは、新鮮腫瘍組織、新鮮凍結腫瘍組織、パラフィン包埋腫瘍組織、細針吸引液、腹水、管洗浄液および胸膜液よりなる群から選択される、請求項７に記載の胃癌２期および３期の予後予測のための情報を提供する方法。
【請求項９】
予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群および参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準の測定は、逆転写酵素重合酵素反応、競争的逆転写酵素重合酵素反応、リアルタイム逆転写酵素重合酵素反応、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロッティング、またはＤＮＡチップにより行われる、請求項７に記載の胃癌２期および３期の予後予測のための情報を提供する方法。
【請求項１０】
胃癌２期および３期腫瘍から得た生物学的サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定し、下記式１によって各予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を計算する段階と；
前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値と比較して、
生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの最終臨界値よりさらに高い場合、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）に分類し、
生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの少なくとも一つのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢまたはＷＡＲＳの最終臨界値よりさらに低い場合、生物学的サンプルのＣＤＸ１のΔＣｑ値を既定の基準ＣＤＸ１の最終臨界値と比較してΔＣｑ値がさらに低い場合、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）に分類し、ΔＣｑ値がさらに高い場合、抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）に分類する段階とを含み、
前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値は、ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４に対してそれぞれ−２．１４、−５．１８、−２．６９および−３．６３であり、
前記最終臨界値は、胃癌２期および３期腫瘍組織サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を得、前記ΔＣｑ値を利用して各遺伝子別の適応的回帰数値（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）を算出し、前記適応的回帰数値に各遺伝子別の補正値を加算して各遺伝子別の最終臨界値（ｆｉｎａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｖａｌｕｅ）を算出し、前記ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４の適応的回帰数値は、それぞれ−２．５４、−５．５８、−３．５９、−４．５３であり、補正値は、それぞれ＋０．４、＋０．４、＋０．９および＋０．９である、胃癌２期および３期の抗癌剤適合性予測のための情報を提供する方法：
［式１］
ΔＣｑ＝（参考遺伝子群のＣｑ値）−（予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のＣｑ値）
ここで、参考遺伝子群のＣｑ値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子の平均Ｃｑ値を示す。
【請求項１１】
生物学的サンプルは、新鮮腫瘍組織、新鮮凍結腫瘍組織、パラフィン包埋腫瘍組織、細針吸引液、腹水、管洗浄液および胸膜液よりなる群から選択される、請求項１０に記載の胃癌２期および３期の抗癌剤適合性予測のための情報を提供する方法。
【請求項１２】
予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群および参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準の測定は、逆転写酵素重合酵素反応、競争的逆転写酵素重合酵素反応、リアルタイム逆転写酵素重合酵素反応、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロッティング、またはＤＮＡチップにより行われる、請求項１０に記載の胃癌２期および３期の抗癌剤適合性予測のための情報を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、進行性胃癌患者の予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と参考遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準の定量的検査値を利用して予後または抗癌剤適合性を予測できるシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
全世界的に、胃癌は、癌による死亡率のうち三番目に高い癌であり、特に韓国内では、予後が比較的良いと知らている甲状腺癌を除いて最もありふれた癌である。韓国内では、国家次元の健康診断による早期発見と手術の標準化および抗癌治療剤の発見などで胃癌患者の生存率が大きく向上したが、現在の標準化された治療にもかかわらず、依然として２期、３期進行性胃癌の場合、約半分程度の患者が再発を経験する。
【０００３】
癌は、遺伝体疾患と認識されており、ＮＧＳ（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）等の遺伝体検査技術発展に伴い、癌を既存の解剖学的、病理学的表現型による分類でなく、分子的生物学的特性によって分類しようとする努力があった。ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）プロジェクトで胃癌がその多様な分子的特徴によって大きく４種類の形態に分けられることが最近報告されている。これは、解剖学的に同じ病期であるとしても、分子的生物学的特徴によって予後と抗癌剤に対する反応程度が異なり得ることを意味する。
【０００４】
最近に発表された２９５名の胃癌患者のＴＣＧＡプロジェクト結果を見れば、胃癌は、（１）ＥＢＶ陽性胃癌（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ、ＥＢＶ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）（２）マイクロサテライト不安定型（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ−ｈｉｇｈ、ＭＳＩ−Ｈ）、（３）染色体不安定型（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ、ＣＩＮ）（４）遺伝体安定型胃癌（Ｇｅｎｏｍｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ、ＧＳ）の４種類に区分される。このような膨大なＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを通じて胃癌も一つの単一な癌腫でなく、分子遺伝学的に区別される異質な小グループに分けられるという点が分かる。したがって、胃癌の個人オーダーメード治療を実現するためには、分子遺伝学的特徴および病理学的特徴に基づくサブタイプを区別して、それぞれのターゲット遺伝子を発掘、適用することが必要であることを示唆する。また、胃癌の研究の側面において胃癌の亜型区分によって予後が区分され得る結果が報告されている。
【０００５】
胃癌手術による抗癌剤治療後の患者の予後を予測できる場合、各予後によってこれに合う治療戦略を樹立できる根拠資料になる。現在の標準化された治療慣行上、２、３期の進行性胃癌では、手術後に補助抗癌療法をすべての患者に使用されている。これは、予後が悪い群に対しては、過小治療（ｕｎｄｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ）でありうる。すなわち、予後が良くない患者群に対して現在の標準治療以外に他の更なる治療方法に対する戦略を開発できる臨床学的な意味を有しているといえる。
【０００６】
また、抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）と抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）を区分することにより、前記予後情報と結合して既存の治療法に対する情報を提供して、患者治療戦略の設定に対する詳しい根拠資料を提供することができる。すなわち、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）であり且つ予後が良い群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ）は、既存の抗癌剤を続いて使用する過剰治療（ｏｖｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を防止することができ、抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）は、既存の治療法の使用を勧告することができ、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）であり且つ予後が悪い群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）は、積極的な新治療法の開発を誘導できる細分化が可能なものである。
【０００７】
２０１０年以後、現在２期、３期進行性胃癌の場合、標準化されたＤ２胃切除術以後、補助抗癌療法が胃癌患者の生存率を高めることを知見し、現在、これは、標準治療法に該当する。伝統的に、胃癌は、その解剖学的病理学的表現型によって分類し、ＴＮＭ病期分類法によって２期以上の場合、抗癌治療をしているが、抗癌治療による予後を予測できる方法が、ＴＮＭ病期以外にはないことが現況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、進行性胃癌（２期−３期：ＡＪＣＣ６版基準）患者の手術後の予後または抗癌剤適合性を予測できるマーカー遺伝子群と参考遺伝子群の定量値を用いて進行性胃癌の予後または抗癌剤適合性予測用組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、進行性胃癌患者の手術後の予後または抗癌剤適合性を予測できるマーカー遺伝子群と参考遺伝子群の定量値を用いて患者の生存率の側面において予後または抗癌剤適合性を予測するための情報を提供する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、
ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤と；
ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤とを含む胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用組成物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用組成物を含む胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用キットを提供する。
【００１２】
また、本発明は、
胃癌２期および３期腫瘍から得た生物学的サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定し、下記式１によって各予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を計算する段階と；
前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値と比較して、
生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの最終臨界値よりさらに高い場合、良い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ）に分類し、生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの少なくとも一つのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢまたはＷＡＲＳの最終臨界値より低い場合、生物学的サンプルのＳＦＲＰ４のΔＣｑ値を既定の基準ＳＦＲＰ４の最終臨界値と比較してΔＣｑ値がさらに低い場合、中間予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ）に分類し、ΔＣｑ値がさらに高い場合、悪い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）に分類する段階とを含み、
前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値は、ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４に対してそれぞれ−２．１４、−５．１８、−２．６９および−３．６３であり、
前記最終臨界値は、胃癌２期および３期腫瘍組織サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を得、前記ΔＣｑ値を利用して各遺伝子別の適応的回帰数値（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）を算出し、前記適応的回帰数値に各遺伝子別の補正値を加算して、各遺伝子別の最終臨界値（ｆｉｎａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｖａｌｕｅ）を算出し、前記ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４の適応的回帰数値は、それぞれ−２．５４、−５．５８、−３．５９、−４．５３であり、補正値は、それぞれ＋０．４、＋０．４、＋０．９および＋０．９である、胃癌２期および３期の予後予測のための情報を提供する方法を提供する：
【００１３】
［式１］
ΔＣｑ＝（参考遺伝子群のＣｑ値）−（予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のＣｑ値）
【００１４】
ここで、参考遺伝子群のＣｑ値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子の平均Ｃｑ値を示す。
【００１５】
また、本発明は、
胃癌２期および３期腫瘍から得た生物学的サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定し、下記式１によって各予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を計算する段階と；
前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値と比較して、
生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの最終臨界値より高い場合、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）に分類し、生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの少なくとも一つのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢまたはＷＡＲＳの最終臨界値よりさらに低い場合、生物学的サンプルのＣＤＸ１のΔＣｑ値を既定の基準ＣＤＸ１の最終臨界値と比較してΔＣｑ値がさらに低い場合、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）に分類し、ΔＣｑ値がさらに高い場合、抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）に分類する段階とを含み、
前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値は、ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４に対してそれぞれ−２．１４、−５．１８、−２．６９および−３．６３であり、
前記最終臨界値は、胃癌２期および３期腫瘍組織サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を得、前記ΔＣｑ値を利用して各遺伝子別の適応的回帰数値を算出し、前記適応的回帰数値に各遺伝子別の補正値を加算して各遺伝子別の最終臨界値を算出し、前記ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４の適応的回帰数値は、それぞれ−２．５４、−５．５８、−３．５９、−４．５３であり、補正値は、それぞれ＋０．４、＋０．４、＋０．９および＋０．９である、胃癌２期および３期の抗癌剤適合性予測のための情報を提供する方法を提供する：
【００１６】
［式１］
ΔＣｑ＝（参考遺伝子群のＣｑ値）−（予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のＣｑ値）
【００１７】
ここで、参考遺伝子群のＣｑ値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子の平均Ｃｑ値を示す。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、進行性胃癌の予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と参考遺伝子群のｍＲＮＡ発現水準の定量的検査結果を利用して予後および抗癌剤適合性を全体生存率と無病生存率などの生存率の側面で予測できるアルゴリズムを開発して、胃癌患者の治療方法を決定するのに補助的情報として活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、参考遺伝子選定のためにパラフィン包埋サンプルで対象遺伝子の発現量を確認した結果を示すものである。
【図２】図２は、予後および抗癌剤予測マーカー遺伝子の適応的回帰数値を示すΔＣｑ値であって、この数値にＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４の補正値＋０．４、＋０．４、＋０．９、＋０．９の補正値を加えて最終臨界値を決定する。
【図３】図３は、本発明の二酸化基盤２層分類システムの１層分類時に免疫軸（Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｘｉｓ）で分類された良い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ）の分類を示す結果である。
【図４】図４は、本発明の二酸化基盤２層分類システムの１層分類時に免疫軸（Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｘｉｓ）で分類された抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）の分類を示す結果である。
【図５】図５は、本発明の二酸化基盤２層分類システムの２層分類時に類似癌幹細胞軸（Ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  Ａｘｉｓ）で中間および悪い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ  ＆ＩＩＩ）の分類を示す結果である。
【図６】図６は、本発明の二酸化基盤２層分類システムの２層分類時に上皮軸（Ｅｐｉｔｈｅｌａｉｌ  Ａｘｉｓ）で抗癌剤反応群および非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ  ＆Ｒ）の分類を示す結果である。
【図７】図７は、本発明の予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）および抗癌剤適合性（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ＆Ｓ）の分類方式である二酸化基盤２層分類システムの模式図である。
【図８】図８は、本発明の進行性胃癌の予後および抗癌剤適合性を予測できるアルゴリズムによる予後群の５年全体生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  Ｃｕｒｖｅ（ａ）およびそのログランクテスト（ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）結果（ｂ）を示すものである。
【図９】図９は、本発明の進行性胃癌の予後および抗癌剤適合性を予測できるアルゴリズムによる予後群の５年無病生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  Ｃｕｒｖｅ（ａ）およびそのログランクテスト結果（ｂ）を示すものである。
【図１０】図１０は、抗癌化学療法治療を受けたり（ＣＴＸ）、そうではない（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）、胃切除術を受けた胃癌患者において５年全体生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓおよびログランクテストのｐ値（ａ）およびその無病生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓおよびログランクテストのｐ値（ｂ）を表記したものである。
【図１１】図１１は、本発明の進行性胃癌の抗癌剤反応可能性を予測できるアルゴリズムによる抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）の抗癌化学療法治療を受けたり（ＣＴＸ）、そうではない（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）、胃切除術を受けた胃癌患者において５年全体生存率に対するＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓおよびログランクテストのｐ値を表記したものである。
【図１２】図１２は、本発明の進行性胃癌の抗癌剤反応可能性を予測できるアルゴリズムによる抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）の抗癌化学療法治療を受けたり（ＣＴＸ）、そうではない（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）、胃切除術を受けた胃癌患者において５年無病生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓおよびログランクテストのｐ値を表記したものである。
【図１３】図１３は、本発明の進行性胃癌の抗癌剤反応可能性を予測できるアルゴリズムによる抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）の抗癌化学療法治療を受けたり（ＣＴＸ）そうではない（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）、胃切除術を受けた胃癌患者において５年全体生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓおよびログランクテストのｐ値を表記したものである。
【図１４】図１４は、本発明の進行性胃癌の抗癌剤反応可能性を予測できるアルゴリズムによる抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）の抗癌化学療法治療を受けたり（ＣＴＸ）、そうではない（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）、胃切除術を受けた胃癌患者において５年無病生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓおよびログランクテストのｐ値を表記したものである。
【図１５】図１５は、クラシック臨床試験サンプルでＸＥＬＯＸ（Ｘｅｌｏｄａ＋Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）抗癌化学療法治療を受けた患者群（ＣＴＸ）と観察のみをした群（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）の５年全体生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓおよびログランクテストのｐ値を表記したものである。
【図１６】図１６は、本発明の進行性胃癌の予後および抗癌剤適合性を予測できるアルゴリズムによってクラシック臨床試験サンプルを対象とした予後分類群の５年全体生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  Ｃｕｒｖｅ（ａ）およびそのログランクテスト結果（ｂ）を示すものである。
【図１７】図１７は、クラシック臨床試験サンプルでＸＥＬＯＸ（Ｘｅｌｏｄａ＋Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）抗癌化学療法治療を受けた患者群（ＣＴＸ）と観察のみをした群（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）の５年無病生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓおよびログランクテストのｐ値を表記したものである。
【図１８】図１８は、本発明の進行性胃癌の予後および抗癌剤適合性を予測できるアルゴリズムによってクラシック臨床試験サンプルを対象とした予後分類群の５年無病生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  Ｃｕｒｖｅ（ａ）およびそのログランクテスト結果（ｂ）を示すものである。
【図１９】図１９は、本発明の進行性胃癌の抗癌剤反応可能性を予測できるアルゴリズムによるものであって、クラシック臨床試験サンプルを対象としてＸＥＬＯＸ抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）でＸＥＬＯＸ（Ｘｅｌｏｄａ＋Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）抗癌化学療法治療を受けた患者群（ＣＴＸ）と観察のみをした群（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）の５年全体生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓおよびログランクテストのｐ値を表記したものである。
【図２０】図２０は、本発明の進行性胃癌の抗癌剤反応可能性を予測できるアルゴリズムによるものであって、クラシック臨床試験サンプルを対象としてＸＥＬＯＸ抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）でＸＥＬＯＸ（Ｘｅｌｏｄａ＋Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）抗癌化学療法治療を受けた患者群（ＣＴＸ）と観察のみをした群（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）の５年無病生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓおよびログランクテストのｐ値を表記したものである。
【図２１】図２１は、本発明の進行性胃癌の抗癌剤反応可能性を予測できるアルゴリズムによるものであって、クラシック臨床試験サンプルのＸＥＬＯＸ抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）でＸＥＬＯＸ（Ｘｅｌｏｄａ＋Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）抗癌化学療法治療を受けた患者群（ＣＴＸ）と観察のみをした群（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）の５年全体生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓおよびログランクテストのｐ値を表記したものである。
【図２２】図２２は、本発明の進行性胃癌の抗癌剤反応可能性を予測できるアルゴリズムによるものであって、クラシック臨床試験サンプルのＸＥＬＯＸ抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）でＸＥＬＯＸ（Ｘｅｌｏｄａ＋Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）抗癌化学療法治療を受けた患者群（ＣＴＸ）と観察のみをした群（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）の５年無病生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓおよびログランクテストのｐ値を表記したものである。
【図２３】図２３は、本発明の進行性胃癌の予後を予測するアルゴリズムの臨床的性能評価時に予後群の５年全体生存率に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓを示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の構成を具体的に説明する。
【００２１】
本発明は、
ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤と；
ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤とを含む胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用組成物に関する。
【００２２】
本発明の胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用組成物は、進行性胃癌患者の予後および抗癌剤適合性を生存率の側面で予測するための用途に使用できることを特徴とする。
【００２３】
本明細書で、用語「進行性胃癌」は、ＡＪＣＣ６版を基準として２期〜３期に該当する胃癌を意味する。
【００２４】
本明細書で、用語「予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子」は、正常または病的な状態を区分できたり、治療後に５年生存率を予測したり、治療反応予測を客観的に測定できる標識子を意味する。本発明では、進行性胃癌の予後および抗癌剤適合性を予測するのに使用できる遺伝子であって、予後または抗癌剤反応に対して増加したり減少する差等的なｍＲＮＡ発現水準を示す遺伝子である。本発明の一具体例によれば、異形質性を有する胃癌に対して新鮮凍結組織のマイクロアレイデータとＲＴ−ｑＰＣＲデータ、およびパラフィン包埋サンプル検体のＲＴ−ｑＰＣＲデータで統計的有意性を確保して、安定的に測定が可能なＩｍｍｕｎｅモジュールを代表できるマーカー遺伝子（ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ）とＳｔｅｍ−ｌｉｋｅモジュール＆Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌモジュールを代表できるマーカー遺伝子（ＳＦＲＰ４、ＣＤＸ１）の合計４個を選定した。
【００２５】
本明細書で、用語「参考遺伝子、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ」は、常に安定的に発現する遺伝子を指す。すなわちどんな組織でも一定に発現する遺伝子であって、参考遺伝子の発現量とマーカー遺伝子の発現量を比較することにより、マーカー遺伝子の発現量を調査する時に使用する。すなわち、サンプルごとに定性（ｑｕａｌｉｔｙ）的差異、保管機関による変異が存在するので、遺伝子発現量を測定しても、その測定量が生物学的変異であると判断し難い。したがって、標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を通じてサンプル間遺伝子発現量（ΔＣｑ）を決定する。通常、標準化方法には、Ｑｕａｎｔｉｌｅによる方法、Ｇｌｏｂａｌ  Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ方法、参考遺伝子による方法などがあるが、本発明は、参考遺伝子による標準化を使用する。また、単一遺伝子を参考遺伝子として活用することは、正確度に劣り得るので、多数の遺伝子を選定し、変異度を調査して組織の特性に適合した参考遺伝子を選定することができる。本発明では、胃癌と関連して文献に開示されていたり、既存の商用化製品で活用されている遺伝子を選定し、選定された遺伝子を対象として適格可否を立証して、参考遺伝子として使用する。本発明の一具体例によれば、文献に開示された２１個の参考遺伝子を対象として食道癌、すい臓癌、胃癌、大腸癌などの癌組織と正常組織を比較して、ｑＰＣＲを通じて最も変異度が小さい遺伝子を参考遺伝子として選定した。次に、商用化製品で使用する参考遺伝子として、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＨＰＲＴ１、ＰＧＫ１、ＧＰＸ１、ＲＰＬ２９、ＵＢＢおよびＶＤＡＣ２を選定してｑＰＣＲを行い、最終的に、本発明の進行性胃癌の再発または抗癌剤反応可能性を予測するのに使用する参考遺伝子として、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１からなる遺伝子群を使用した。
【００２６】
本明細書で、用語「ｍＲＮＡの発現水準の測定」とは、進行性胃癌の再発または抗癌剤反応可能性を予測するために生物学的試料で予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子または参考遺伝子のｍＲＮＡ発現程度を確認する過程でｍＲＮＡの量を測定することを意味する。そのための分析方法としては、逆転写重合酵素反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競争的逆転写重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＤＮＡチップなどがあるが、これに制限されるものではない。
【００２７】
本発明による組成物において、予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子と参考遺伝子のｍＲＮＡの発現水準を測定する製剤は、予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子と参考遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマー、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含む。本発明による予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子と参考遺伝子の情報は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔなどに知られているので、当業者ならこれを基に遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマー、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを容易にデザインすることができる。
【００２８】
本明細書で、用語「プライマー」は、標的遺伝子配列を認知する断片であって、正方向および逆方向のプライマー対を含むが、好ましくは、特異性および敏感性を有する分析結果を提供するプライマー対である。プライマーの核酸配列が試料内存在する非−標的配列と不一致な配列であるので、相補的なプライマー結合部位を含有する標的遺伝子配列のみを増幅し、非特異的増幅を誘発しないプライマーであるとき、高い特異性が付与され得る。本発明の一具体例によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１〜１８に記載されたプライマーセットを使用することができる。さらに具体的に、ＳＦＲＰ４は、ＮＭ＿００３０１４．２の１２９８−１３６１を参考してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２のプライマーセット、ＧＺＭＢは、ＮＭ＿００４１３１．３の２１３−２７７を参考してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４のプライマーセット、ＷＡＲＳは、ＮＭ＿１７３７０１．１の４０８−４８０を参考してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６のプライマーセット、ＣＤＸ１は、ＮＭ＿００１８０４．２の１３１９−１３８５を参考してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および８のプライマーセット、ＡＣＴＢは、ＮＭ＿００１１０１の２７８−３４９を参考してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０のプライマーセット、ＡＴＰ５Ｅは、ＮＭ＿００６８８６の１１７−１８９を参考してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２のプライマーセット、ＨＰＲＴ１は、ＮＭ＿０００１９４．１の５３１−５９７を参考してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４のプライマーセット、ＧＰＸ１は、ＮＭ＿０００５８１．２の３０８−３７８を参考してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５および１６のプライマーセット、ＵＢＢは、ＮＭ＿０１８９５５．２の６１−１３８を参考してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７および１８のプライマーセットを使用して測定することができる。
【００２９】
本明細書で、用語「プローブ」とは、試料内の検出しようとする標的物質と特異的に結合できる物質を意味し、前記結合を通じて特異的に試料内の標的物質の存在を確認できる物質を意味する。プローブの種類は、当業界で通常的に使用される物質であって、制限はないが、好ましくは、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。より具体的に、前記プローブは、バイオ物質であって、生物に由来したり、これと類似したものまたは生体外で製造されたものを含むものであり、例えば、酵素、蛋白質、抗体、微生物、動植物細胞および器官、神経細胞、ＤＮＡ、およびＲＮＡであり得、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含み、ＲＮＡは、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドを含み、蛋白質の例としては、抗体、抗原、酵素、ペプチドなどを含むことができる。本発明の一具体例によれば、ｑＰＣＲ測定用ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１９−２７のプローブを使用することができる。好ましくは、前記プローブは、蛍光標識されたものであり得る。
【００３０】
本明細書で、用語「アンチセンス」は、アンチセンスオリゴマーがワッソン−クリック塩基対の形成によりＲＮＡ内の標的配列と混成化されて、標的配列内で典型的にｍＲＮＡとＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二重体の形成を許容する、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニット間バックボーンを有するオリゴマーを意味する。オリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性または近似相補性を有し得る。
【００３１】
本明細書で、用語「予後または抗癌剤適合性予測」は、特定疾病または疾患に対する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、特定疾病または疾患にかかった対象の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ；例えば、前−転移性または転移性癌状態の同定、癌の段階決定または治療に対する癌の反応性決定）を判定すること、またはテラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ；例えば、治療効能に対する情報を提供するためにオブジェクトの状態をモニタリングすること）を含む。本発明の目的上、手術後の胃癌患者の予後および抗癌剤適合性の可否を全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）と無病生存率（Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）等の生存率の側面で予測することである。
【００３２】
本発明の胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。
【００３３】
前記薬剤学的に許容可能な担体は、医薬分野において通常使用される担体およびピヒクルを含み、具体的にイオン交換樹脂、アルミナ、アルミニウム  ステアレート、レシチン、血清蛋白質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、各種リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルベート、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物）、水、塩または電解質（例えば、プロタミンサルフェート、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウムおよび亜鉛塩）、膠質性シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレングリコールまたは羊毛脂などを含むが、これに制限されない。
【００３４】
また、本発明の組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、または保存剤などをさらに含むことができる。
【００３５】
また、本発明は、胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用組成物を含む胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用キットに関する。
【００３６】
好ましくは、前記キットは、ＲＴ−ＰＣＲキット、ＤＮＡチップキットなどでありうる。
【００３７】
前記胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用キットは、分析方法に適合した一種類またはそれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置をさらに含むことができる。好ましくは、前記診断用キットは、逆転写重合酵素反応を行うために必要な必須要素をさらに含むことができる。逆転写重合酵素反応キットは、マーカー蛋白質を暗号化する遺伝子に対して特異的なプライマー対を含む。プライマーは、前記遺伝子の核酸配列に特異的な配列を有するヌクレオチドであって、約７ｂｐ〜５０ｂｐの長さ、より好ましく約１０ｂｐ〜３０ｂｐの長さを有し得る。また、対照群遺伝子の核酸配列に特異的なプライマーを含むことができる。その他、逆転写重合酵素反応キットは、テストチューブまたは他の適切な容器、反応緩衝液（ｐＨおよびマグネシウム濃度は多様）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−ポリメラーゼおよび逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ抑制剤ＤＥＰＣ−水（ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ）、滅菌水などを含むことができる。
【００３８】
また、本発明の胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測用キットは、ＤＮＡチップを行うために必要な必須要素を含むことができる。ＤＮＡチップキットは、遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が付着している基板、および蛍光標識プローブを製作するための試薬、製剤、酵素などを含むことができる。また、基板は、対照群遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００３９】
また、本発明は、
胃癌２期および３期腫瘍から得た生物学的サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定し、下記式１によって各予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を計算する段階と；
前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値と比較して、
生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの最終臨界値よりさらに高い場合、良い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ）に分類し、生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの少なくとも一つのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢまたはＷＡＲＳの最終臨界値より低い場合、生物学的サンプルのＳＦＲＰ４のΔＣｑ値を既定の基準ＳＦＲＰ４の最終臨界値と比較してΔＣｑ値がさらに低い場合、中間予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ）に分類し、ΔＣｑ値がさらに高い場合、悪い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）に分類する段階とを含み、
前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値は、ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４に対してそれぞれ−２．１４、−５．１８、−２．６９および−３．６３であり、
前記最終臨界値は、胃癌２期および３期腫瘍組織サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を得、前記ΔＣｑ値を利用して各遺伝子別の適応的回帰数値を算出し、前記適応的回帰数値に各遺伝子別の補正値を加算して各遺伝子別の最終臨界値を算出し、前記ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４の適応的回帰数値は、それぞれ−２．５４、−５．５８、−３．５９、−４．５３であり、補正値は、それぞれ＋０．４、＋０．４、＋０．９および＋０．９である、胃癌２期および３期の予後予測のための情報を提供する方法に関する：
【００４０】
［式１］
ΔＣｑ＝（参考遺伝子群のＣｑ値）−（予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のＣｑ値）
【００４１】
ここで、参考遺伝子群のＣｑ値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子の平均Ｃｑ値を示す。
【００４２】
また、本発明は、
胃癌２期および３期腫瘍から得た生物学的サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定し、下記式１によって各予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を計算する段階と；
前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値と比較して、
生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの最終臨界値よりさらに高い場合、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）に分類し、生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの少なくとも一つのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢまたはＷＡＲＳの最終臨界値よりさらに低い場合、生物学的サンプルのＣＤＸ１のΔＣｑ値を既定の基準ＣＤＸ１の最終臨界値と比較してΔＣｑ値がさらに低い場合、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）に分類し、ΔＣｑ値がさらに高い場合、抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）に分類する段階とを含み、
前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値は、ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４に対してそれぞれ−２．１４、−５．１８、−２．６９および−３．６３であり、
前記最終臨界値は、胃癌２期および３期腫瘍組織サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を得、前記ΔＣｑ値を利用して各遺伝子別の適応的回帰数値を算出し、前記適応的回帰数値に各遺伝子別の補正値を加算して各遺伝子別の最終臨界値を算出し、前記ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４の適応的回帰数値は、それぞれ−２．５４、−５．５８、−３．５９、−４．５３であり、補正値は、それぞれ＋０．４、＋０．４、＋０．９および＋０．９である、胃癌２期および３期の抗癌剤適合性予測のための情報を提供する方法を提供する：
【００４３】
［式１］
ΔＣｑ＝（参考遺伝子群のＣｑ値）−（予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のＣｑ値）
【００４４】
ここで、参考遺伝子群のＣｑ値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子の平均Ｃｑ値を示す。
【００４５】
本発明の胃癌２期および３期の予後または抗癌剤適合性予測のための情報を提供する方法を段階別に具体的に説明すれば、次の通りである。
【００４６】
第１段階として、胃癌２期および３期腫瘍から得た生物学的サンプルで予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と、参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準を測定して各予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のΔＣｑ値を計算する段階を含む。
【００４７】
予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準は、逆転写酵素重合酵素反応、競争的逆転写酵素重合酵素反応、リアルタイム逆転写酵素重合酵素反応、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロッティングまたはＤＮＡチップなどの方法を通じて測定することができる。より好ましくは、リアルタイム逆転写酵素重合酵素反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）を通じて測定することができ、ｍＲＮＡ発現水準をＣｑ値（ｃｙｃｌｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）で得ることができる。
【００４８】
前記で得た予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と参考遺伝子群のＣｑ値を利用して下記式１によってΔＣｑ値を計算する。
【００４９】
［式１］
ΔＣｑ＝（参考遺伝子群のＣｑ値）−（予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のＣｑ値）
【００５０】
ここで、参考遺伝子群のＣｑ値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１を含む参考遺伝子の平均Ｃｑ値を示す。
【００５１】
前記ΔＣｑ値は、マーカー遺伝子の発現量を標準化させた値であり、前記ΔＣｑ値が大きいほど、遺伝子発現が高いことを意味する。
【００５２】
第２段階は、前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の既定の基準最終臨界値と比較して生物学的サンプルの予後群を分類する段階である。
【００５３】
前記予後群分類のために前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子の基準になる最終臨界値をあらかじめ設定する。
【００５４】
このために、胃癌２期および３期腫瘍組織サンプルと正常組織サンプルでＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４を含む予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現水準によるＣｑ値を得、前記式１によりΔＣｑ値を計算し、前記ΔＣｑ値を適応的回帰技法（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）に適用して適応的回帰数値（Ａ．Ｒ．Ｖ．）を算出する。通常、アレイで取る値は、中央値（ｍｅｄｉａｎ）や平均値（ａｖｅｒａｇｅ）を基準としてデータを処理するが、適応的回帰技法によるアルゴリズムは、全体データで任意の一点を区分点とした時、区分された区間値の平均の分散が最も大きいポイントを適応的回帰数値（または臨界値）に設定する。すなわち臨界値は、当該遺伝子の正常および癌組織全体で生物学的意味がある高発現と低発現を区分する基準点になる。適応的回帰数値は、次のように求める。
【００５５】
（１）適応的回帰方式を用いたフィッティング
【数１】
2019537436.tif 000003
【００５６】
この際、Ｆ−ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎのｔａｉｌ−ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙに相当するｐ値は、次の通りである。
【００５７】
【数２】
2019537436.tif 000004
【００５８】
上記過程でｐ値が小さいほどフィッティングが良好であると見られる。
【００５９】
（２）ステップ関数の決定
【数３】
2019537436.tif 000005
【００６０】
（３）本発明の方式は、上記のワンステップ方式を利用して各遺伝子別に全体データで任意の一点を区分点とした時、
【数４】
2019537436.tif 000006
統計値（ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）を最大とするポイントをＡ．Ｒ．Ｖ．に決定し、この値をもって補正値を加算して最終臨界値を定める。
【００６１】
前記マーカー遺伝子の補正値は、臨床的有用性と安全性に基づいて得ることができる。すなわちΔＣｑ値を対象として分析的な性能であるＡ．Ｒ．Ｖ値を獲得し、Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  Ａｘｉｓを構成するＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＳＦＲＰ４とＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ａｘｉｓを構成するＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１を対象としてＷＡＲＳ、ＧＺＭＢは、ΔＣｑ基準０．４〜０．５、ＳＦＲＰ４は、ΔＣｑ基準０．８〜０．９、ＣＤＸ１は、ΔＣｑ基準０．８〜０．９の組合せをスクリーニングして、予後の側面で最適なハザード比を構成する組合せと、抗癌剤適合性の側面で抗癌剤治療の可否とＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ間の相関関係を構成する組合せを選別して決定した。
【００６２】
好ましくは、前記ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４の適応的回帰数値は、それぞれ−２．５４、−５．５８、−３．５９、−４．５３であり、補正値は、それぞれ＋０．４、＋０．４、＋０．９および＋０．９である。
【００６３】
前記適応的回帰数値に補正値を加算して得た前記マーカー遺伝子、すなわちＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ、ＣＤＸ１およびＳＦＲＰ４の最終臨界値は、それぞれ−２．１４、−５．１８、−２．６９および−３．６３である。
【００６４】
前記基準マーカー遺伝子の最終臨界値が定められると、二酸化基盤２層分類システム（Ｂｉｎａｒｙ  ｓｉｇｎａｌ  ｂａｓｅｄ  ｔｗｏ  ｔｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）により予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ）および抗癌剤適合予測群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ）の分類を行う。すなわち、本発明の進行性胃癌の再発または抗癌剤反応可能性を予測するためのアルゴリズムによるグループ分類は、図７に具体的に図示されており、これを参考してみれば、
生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの最終臨界値よりさらに高い場合、良い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ）に分類し、
生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの少なくとも一つのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢまたはＷＡＲＳの最終臨界値より低い場合、生物学的サンプルのＳＦＲＰ４のΔＣｑ値を既定の基準ＳＦＲＰ４の最終臨界値と比較してΔＣｑ値がさらに低い場合、中間予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ）に分類し、ΔＣｑ値がさらに高い場合、悪い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）に分類することができる。
【００６５】
また、生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの最終臨界値よりさらに高い場合、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）に分類し、生物学的サンプルのＧＺＭＢおよびＷＡＲＳの少なくとも一つのΔＣｑ値が既定の基準ＧＺＭＢまたはＷＡＲＳの最終臨界値よりさらに低い場合、生物学的サンプルのＣＤＸ１のΔＣｑ値を既定の基準ＣＤＸ１の最終臨界値と比較してΔＣｑ値がさらに低い場合、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）に分類し、ΔＣｑ値がさらに高い場合、抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）に分類することができる。
【００６６】
前記生物学的サンプルは、新鮮腫瘍組織、新鮮凍結腫瘍組織、パラフィン包埋腫瘍組織、細針吸引液、腹水、管洗浄液または胸膜液などであってもよく、好ましくはパラフィン包埋腫瘍組織でありうる。
【００６７】
また、前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群および参考遺伝子群のｍＲＮＡの発現水準の測定は、逆転写酵素重合酵素反応、競争的逆転写酵素重合酵素反応、リアルタイム逆転写酵素重合酵素反応、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロッティングまたはＤＮＡチップにより行われ得る。好ましくは、リアルタイム逆転写酵素重合酵素反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）でありうる。
【００６８】
本発明の利点および特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述する実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、それぞれ異なる多様な形態で具現され、ただ本実施例は、本発明の開示が完全になるようにし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。
【００６９】
＜実施例１＞進行性胃癌の予後または抗癌剤反応可能性を予測するアルゴリズムの開発
進行性胃癌のパラフィン包埋に５０％以上腫瘍を含む３ｍｍの孔を穿設し、これを利用してプロトコルによりＲＮＡを抽出した。最小４００ｎｇの全体ＲＮＡを得た。必要なＱ．Ｃ要素は、Ａ２６０／Ａ２８０＝＞１．８であった。
【００７０】
ＲＴ−ｑＰＣＲ実験は、ｎＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉキットを使用し、患者の全体ＲＮＡ（４００  ｎｇ／１８μｌ）を使用し、ＧＳＰ（Ｇｅｎｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ）ＭＩＸ（３μｌ）をサンプルに分散させた。２７２０  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を５０℃まで上げ、サンプルを入れた。ＲＮＡサンプルを６５℃で５分間変性し、前記サーマルサイクルを中止した。ＲＴのためにＲＴバッファ（６μｌ）および２μｌのＲＴ  ＭＩＸを添加し、３７℃で６０分間合成した後、７０℃で１５分間維持した。ｑＰＣＲを行うために、ｃＤＮＡ  ＭＩＸ（３μｌ）および各９個のプライマー−プローブＭＩＸ（２μｌ、Ｇｅｎｅ−１〜Ｇｅｎｅ−９  ｆｒｏｍ  Ｋｉｔ）を混合した。サンプルを酵素活性化段階で９５℃で１２０秒間１サイクルを作動させ、９５℃で１０秒間の変性過程および６０℃で３０秒間の検出過程を４０サイクル行った。抽出されたデータは、ｎＤｘＩプログラム（Ｎｏｖｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）で分析した。
【００７１】
ＲＴおよびｑＰＣＲ過程は、ｎＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉにより準備し、ｎＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉは、胃癌用９個の遺伝子から構成されたｍＲＮＡ基盤ｑＰＣＲ  Ｋｉｔである。使用された試薬は、表１の通りである。
【００７２】
【表１】
2019537436.tif 000007
【００７３】
上記９個の遺伝子は、新鮮凍結組織のマイクロアレイデータとＲＴ−ｑＰＣＲデータ、およびパラフィン包埋サンプル検体のＲＴ−ｑＰＣＲデータで統計的有意性を有するマーカー遺伝子４個と参考遺伝子５個である。最終選定されたこれら遺伝子の発現量により予後を分類できる診断キットであるｎＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ  ａｓｓａｙを開発した。
【００７４】
参考遺伝子を選定する過程は、次の通りである。
参考遺伝子は、胃癌に具体的に既適用される参考遺伝子（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ）に対して論文を通じて文献調査を実施した：
ＲＴ−ｑＰＣＲによる胃癌で遺伝子発現研究のための適切な参考遺伝子の把握（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｌｉｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｑＰＣＲ．Ｒｈｏ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０、１０：２４０）；大腸癌、食道癌、胃癌組織で参考遺伝子で参考遺伝子の変化（Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ、ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ、ｇａｓｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃｌａｕｄｉａ  Ｒｕｂｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ．２００５）；ｑＰＣＲを利用した米国類似製品参照遺伝子事例：乳癌参考遺伝子（Ａ  Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  ｔｏ  Ｐｒｅｄｉｃｔ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ−Ｔｒｅａｔｅｄ、Ｎｏｄｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｐａｉｋ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００４  Ｄｅｃ）；大腸癌参考遺伝子（Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｆｏｕｒ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｔａｇｅ  ＩＩ／ＩＩＩ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ａｌｏｎｅ  ｏｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｐｌｕｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  Ｐｌｕｓ  Ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０）。
【００７５】
また、現在商用化された固形癌関連製品で活用されている参考遺伝子を調査した。これらを根拠にして選定された遺伝子が臨床サンプルの参考遺伝子として適格であるか否かを先行研究で検証して最終選定した。
【００７６】
上記の根拠に基づいて一次的に合計８個の参考遺伝子を候補に選定した。
パラフィン包埋サンプル（３０個）で組み合わせた時、最も変異度が小さい遺伝子を選定して（ｇｅＮｏｒｍ利用）、最終５個の参考遺伝子を選定した（図１参照）：ＡＣＴＢ／ＡＴＰ５Ｅ／ＧＰＸ１／ＵＢＢ／ＨＰＲＴ１
【００７７】
次に、アルゴリズム開発のために、２００６〜２０１０年に延世大学校セブランス病院で胃癌手術を受けた２期〜３期患者３１０個のパラフィン包埋サンプル残余検体（３ｍｍ  Ｃｏｒｅ）を対象としてリアルタイム重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ  ＰＣＲ）を行った。
【００７８】
マーカー遺伝子は、胃癌の異形質性を区分し、癌組織で安定的に測定できる遺伝子、すなわち、免疫軸（Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｘｉｓ）を代表できるマーカー遺伝子（ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ）と類似癌幹細胞軸（Ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  Ａｘｉｓ）を代表できるマーカー遺伝子（ＳＦＲＰ４）および上皮軸（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ａｘｉｓ）を代表できるマーカー遺伝子（ＣＤＸ１）の合計４個である。
【００７９】
これから開発されたマーカー遺伝子および参考遺伝子は、下記表２の通りである。
【００８０】
【表２】
2019537436.tif 000008
【００８１】
次に、前記予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と参考遺伝子群の遺伝子別臨界値を決定して、予後と関連した群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ：良い予後群、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ：中間予後群およびＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ：悪い予後群）と抗癌剤適合性に関連した群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ：抗癌剤反応群およびＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ：抗癌剤非反応群）の区分枠組みを用意しようとした。
【００８２】
このような区分枠組みを用意するために二酸化基盤２層分類システム（Ｂｉｎａｒｙ  ｓｉｇｎａｌ  ｂａｓｅｄ  ｔｗｏ  ｔｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）による予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ）および抗癌剤適合予測群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ）の分類を使用した。
【００８３】
前記リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを通じて得た予後または抗癌剤適合性マーカー遺伝子群と参考遺伝子群のＣｑ値を利用して下記式１のように各マーカー遺伝子のΔＣｑ値を算出してｍＲＮＡ発現量を標準化した：
【００８４】
［式１］
ΔＣｑ＝参考遺伝子群のＣｑ値−マーカー遺伝子のＣｑ値
【００８５】
ここで、参考遺伝子群のＣｑ値は、ＡＣＴＢ、ＡＴＰ５Ｅ、ＧＰＸ１、ＵＢＢおよびＨＰＲＴ１からなる参考遺伝子の平均Ｃｑ値を示す。
【００８６】
前記ΔＣｑ値が大きいほど遺伝子発現が高い。
【００８７】
前記ΔＣｑ値を適応的回帰技法（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）に適用して適応的回帰数値（Ａ．Ｒ．Ｖ．）を算出した。通常、アレイで取る値は、中央値（ｍｅｄｉａｎ）や平均値（ａｖｅｒａｇｅ）を基準としてデータを処理するが、適応的回帰技法によるアルゴリズムは、全体データで任意の一点を区分点とした時、区分された区間値平均の分散が最も大きいポイントを適応的回帰数値（または臨界値）に設定する。すなわち臨界値は、当該遺伝子の正常および癌組織全体で生物学的意味がある高発現と低発現を区分する基準点になる。適応的回帰数値は、次のように求める。
【００８８】
（１）適応的回帰方式を用いたフィッティング
【数５】
2019537436.tif 000009
【００８９】
この際、Ｆ−ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎのｔａｉｌ−ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙに相当するｐ値は、次の通りである。
【００９０】
【数６】
2019537436.tif 000010
【００９１】
上記の過程でｐ値が小さいほどフィッティングが良好であると見られる。
【００９２】
（２）ステップ関数の決定
【数７】
2019537436.tif 000011
【００９３】
（３）本発明の方式は、上記のワンステップ方式を利用して各遺伝子別に全体データで任意の一点を区分点とした時、
【数８】
2019537436.tif 000012
統計値（ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）を最大とするポイントをＡ．Ｒ．Ｖ．に決定し、この値をもって補正値を加算して最終臨界値を定める。前記適応的回帰数値は、３１０個の腫瘍組織（ｔｕｍｏｒ）パラフィン包埋サンプルと１０８個の正常組織（ｎｏｒｍａｌ）パラフィン包埋サンプル組織を対象として行われ、正常組織サンプルと胃癌組織サンプルを定量して標準化した。正常組織と胃癌組織のサンプルを対象に遺伝子別に適応的回帰技法を利用して算出した数値を求め、上記の試験基準補正値を適用して下記基準に符合する最終臨界値を決定した。また、遺伝子のＣｑ数値がＮ／Ａあるいは未定（Ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）が算出される場合、このサンプルの当該遺伝子は、適応的回帰数値から除外した。前記の方法により算出されたマーカー遺伝子の最終臨界値は、下記表３に示された通りである（図２参照）。
【００９４】
【表３】
2019537436.tif 000013
【００９５】
４個のマーカー遺伝子による二酸化基盤２層分類システムは、次のように分類した。
【００９６】
まず、１層分類（ｆｉｒｓｔ  ｔｉｅｒ）段階であって、Ｂｏｏｌｅａｎ方法のうちロジックゲートを活用して２つのマーカー遺伝子（ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ）により予後が良い群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ、図３に太線領域）であり、且つ抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ、図４に太線領域）を分類することができる。この際、マーカー遺伝子（ＷＡＲＳ、ＧＺＭＢ）を免疫軸（Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｘｉｓ）と命名した。
【００９７】
次に、２層分類（ｓｅｃｏｎｄ  ｔｉｅｒ）段階であって、１層分類（ｆｉｒｓｔ  ｔｉｅｒ）で分類されない残りの胃癌患者群を対象として二番目の分類を進めるが、この際、残りの２つのマーカー遺伝子であるＣＤＸ１課ＳＦＲＰ４を使用して分類する。
【００９８】
ここで、予後的差異は、癌幹細胞軸（Ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  Ａｘｉｓ）を代表するマーカー遺伝子（ＳＦＲＰ４）により発現が低い群は、予後が中間である群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ、図５に左側の太線領域）に分類され、発現が高い群は、予後が悪い群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ、図５に右側の太線領域）と命名する。
【００９９】
次に、抗癌剤適合性は、上皮軸（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ａｘｉｓ）を代表するマーカー遺伝子（ＣＤＸ１）により発現が高い群は、抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ、図６に上側の太線領域）に分類され、発現が低い群は、１層分類（ｆｉｒｓｔ  ｔｉｅｒ）に分類された群（図４に太線領域）と共に抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ、図６に下側の太線領域）に分類される。
【０１００】
前記のような分類アルゴリズムは、図７に示した。
【０１０１】
＜実施例２＞進行性胃癌の再発および抗癌剤反応可能性の予測アルゴリズムの検証
前記実施例１で得た予測アルゴリズムによる予後と抗癌剤適合性をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  ｃｕｒｖｅおよびＣＯＸ単変量／多変量分析を通じて有意性を検証した（ｎ＝３０７、３個のサンプルは、ＱＣ脱落）。
【０１０２】
図８のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  ｃｕｒｖｅから分かるように、３個の予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ、ＩＩ  ＆ＩＩＩ）の間に予後の差異があることが分かる。５年全体生存率は、それぞれ８３．３、７１．８、５８．２％であって、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉが3個の群間に最も予後が良く、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩが最も予後が悪いことが分かる。
【０１０３】
【表４】
2019537436.tif 000014
【０１０４】
表４のように、本発明による予後群に対するＣＯＸ単変量と多変量分析で予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ）の区分が予後を区分できるだけでなく、独立的な予後予測因子であることが分かる。特に、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩとＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩが予後的に差異があり、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩは、緩衝地帯（ｂｕｆｆｅｒ  ｚｏｎｅ）に設定した。
【０１０５】
予後に関する結果を無病生存率の観点で検証した。図９のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  ｃｕｒｖｅから分かるように、全体生存率と結果と同一に、３個の群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）の間に無病生存率の側面で差異があることが分かる。５年無病生存率は、それぞれ７５．８％、６６．９％、４８．２％であって、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉが３個の群間に最も予後が良く、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩが最も予後が悪いことが分かる。
【０１０６】
また、表５のように、本発明による予後群に対するＣＯＸ単変量と多変量分析で予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ）の区分が無病生存率の側面でも予後を区分できるだけでなく、独立的な予後予測因子であることが分かる。
【０１０７】
【表５】
2019537436.tif 000015
【０１０８】
次に、全体検体（ｎ＝３０７）で抗癌化学療法を受けない患者（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）と、胃癌切除術を受けた後、抗癌化学療法（ａｄｊｕｖａｎｔ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、ＣＴＸ）を受けた患者の全体生存率の側面で予後を比較した時、図１０のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  ｃｕｒｖｅのように、グループ間の有意な差異はなかった。この検体は、後向的サンプルとして収集され、患者の抗癌化学療法の可否の決定にＢＩＡＳが介入したので、このような結果を得たと見られる。従って、この＜実施例２＞では、性別、年齢、ＴＮＭ病期、抗癌剤治療の可否などの要素でＣＯＸ多変量分析を施行して、データを分析する。
【０１０９】
本発明による抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）（ｎ＝１４５）で抗癌療法を受けたり、そうではない患者の予後を比較した結果、図１１に示されたように、ＣＯＸ単変量分析で抗癌療法を受けたグループと受けないグループとの間の差異が有意に現れないが、これは、サンプル集団のＢＩＡＳによるものと判断される。しかし、性別、年齢、ＴＮＭ病期の要素でＣＯＸ多変量分析で抗癌療法を受けたグループが抗癌療法を受けなかったグループに比べて抗癌効果がある、統計的に有意な結果を示している（表６、図１１参照）。
【０１１０】
【表６】
2019537436.tif 000016
【０１１１】
この予後を無病生存率の側面で検証してみても、全体生存率結果と同じ結果を観察することができる。本発明によるＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ（ｎ＝１４５）で化学療法を受けたりそうではない患者の予後を無病生存率の側面で比較した結果、図１２に示されたように、ＣＯＸ単変量分析で抗癌療法を受けたグループと受けないグループの間の差異が有意に現れないが、性別、年齢、ＴＮＭ病期の要素でＣＯＸ多変量分析で抗癌療法を受けたグループが抗癌療法を受けなかったグループに比べて抗癌効果があると見られるが、境界的な（ｍａｒｇｉｎａｌ）側面を示している。無病生存率は、＜実施例４＞で追加に検証された（表７、図１２参照）。
【０１１２】
【表７】
2019537436.tif 000017
【０１１３】
次に、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ（ｎ＝１６２）で抗癌化学療法を受けたりそうではない患者の予後を全体生存率の側面で比較した結果、図１３に示されたように、抗癌療法を受けたグループと受けなかったグループがＣＯＸ単変量、多変量分析で生存差異が有意でない結果を示す（表８、図１３参照）。
【０１１４】
最後に、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ（ｎ＝１６２）で抗癌化学療法を受けたりそうではない患者の予後を無病生存率の側面で比較した結果、図１４に示されたように、抗癌療法を受けたグループと受けなかったグループがＣＯＸ単変量、多変量分析で生存差異が有意でない結果を示す（表９、図１４参照）。
【０１１５】
【表８】
2019537436.tif 000018
【０１１６】
【表９】
2019537436.tif 000019
【０１１７】
＜実施例３＞抗癌剤適合性（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ  ＆Ｒ）群の区分と抗癌療法の可否に対する相関関係の検証
抗癌剤適合性（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ）と抗癌剤投与の可否に対する相関関係（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を比較した時、抗癌化学療法で有益な効果を受けたグループ間の直接的な相関関係がないことを観察したが、後向的サンプル偏向を考慮して、ＣＯＸ多変量分析をした時、抗癌剤適合性（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ）と抗癌化学療法間の相関関係があることを観察した。これは、年齢、性別、ＴＮＭ病期の要素でＣＯＸ多変量で見た時、抗癌化学療法の利点は、抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）で予想されるが、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）では、そうではないことを指示する（表１０参照、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＣＯＸ  ｐ−ｖａｌｕｅ＝０．０３９）。
【０１１８】
【表１０】
2019537436.tif 000020
【０１１９】
これを無病生存率の側面で検証してみても、全体生存率と同じ結果が現れる。これは、抗癌化学療法の利点は、抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）で予想されるが、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）では、そうではないことを指示する（表１１参照、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＣＯＸ  ｐ−ｖａｌｕｅ＝０．０４８）。
【０１２０】
【表１１】
2019537436.tif 000021
【０１２１】
前記結果から本発明のアルゴリズムによって分類された良い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ）と悪い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）の予後予測結果、５年全体生存率と無病生存率に有意な差異を有することが分かり、手術および抗癌剤治療の利点は、５年全体生存率と比較した結果、抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）で統計的に有意であるが、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）では有意でない。また、抗癌剤適合性群の区分と抗癌剤治療の可否の相関関係があることを統計的に示す。
【０１２２】
＜実施例４＞クラシック（ＣＬＡＳＳＩＣ）臨床試験サンプルを利用した予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）および標準治療療法であるＸＥＬＯＸ（Ｘｅｌｏｄａ＋Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）抗癌治療適合性（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ＆Ｓ）のＸＥＬＯＸ補助抗癌療法の利点に対する相関関係の検証
クラシック（ＣＬＡＳＳＩＣ、Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｘａＬｉｐｌａｔｉｎ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  Ｓｔｏｍａｃｈ  Ｃａｎｃｅｒ）臨床試験とは、胃癌病期６版基準２期、３期患者を対象として手術後（Ｄ２  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）  ＸＥＬＯＸ（Ｘｅｌｏｄａ  ＋  Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）の抗癌療法を検証するために、韓国、日本、中国の３７個の病院を対象として進めた無作為第３相国際臨床試験である。合計１０３７名が参加し、このうち５１５名は、手術後に観察のみを施行し、５２０名は、ｘｅｌｏｄａとＯｘａｌｉｐｌａｔｉｎ（以下、ＸＥＬＯＸという）を投薬し、最終結論は、ＸＥＬＯＸ投与群が観察群に比べて１５％予後増進効果を示すものと報告されて、現在２期、３期患者の標準抗癌治療療法で施行されている。
【０１２３】
本実施例では、前記表１のｎＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉのキットを利用して上記のクラシック臨床試験に参加した患者のサンプル６２９名のサンプルを対象とて予後および抗癌剤適合性に対する効果を検証したものである。
【０１２４】
６２９個のサンプルを対象として実施例１のようにＲＮＡを抽出し、ｎＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉ  Ｓｔｏｍａｃｈ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用してｑＰＣＲを施行した。品質管理は、ｎＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉのキットで規定されているように施行して、合計４個のサンプルが中途脱落した。
【０１２５】
ｎＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉのキットにより合計９個の遺伝子のＣｑ値を測定し、式１によるΔＣｑ値は、計算した。計算されたΔＣｑ値を実施例１の表３のように事前に設定された値によって分類の基準点を適用して実施例１の図７のように群を区分した。
【０１２６】
群の分類以前に手術後にＸＥＬＯＸ（Ｘｅｌｏｄａ＋Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）を投与した群と観察のみをした群の間の予後は、図１５に示された通りである。
【０１２７】
全体検体（ｎ＝６２５）で手術後に観察のみをした患者群（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）と、胃癌切除術を受けた後にＸＥＬＯＸを受けた患者（ＣＴＸ）の予後を比較した時、図１５のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  ｃｕｒｖｅのように、グループ間の有意的な差異はあることが分かる。前記実施例１、２および３とは異なって、実施例４で検体は、無作為臨床第３相臨床試験の患者サンプルで収集されたものであるから、ＸＥＬＯＸ治療の選択にＢＩＡＳがないものと判断され、これにより、実施例４は、単変量と多変量分析を実施した。分析結果、ＣＯＸ単変量分析およびＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｒ  ｐｌｏｔでＸＥＬＯＸ処方群（ＣＴＸ）と観察群（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）の間の予後が有意に差異があり、これは、既存に発表された論文の結果と同一である（図１５参照）。これは、無病生存率でも同じ結果を示している（図１７参照）。
【０１２８】
前記実施例１の予測アルゴリズムを通じて予後および抗癌剤適合性をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  ｃｕｒｖｅおよびＣＯＸ単変量および多変量分析を通じて有意性を検証した。
【０１２９】
図１６のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  ｃｕｒｖｅから分かるように、３個の群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）の間に予後の差異があることが分かる。５年全体生存率は、それぞれ８３．２、７４．８、６６．０％であって、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉが３個の群間に最も予後が良く、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩが最も予後が悪いことが分かる。
【０１３０】
また、表１２のように、ＣＯＸ単変量と多変量分析で各亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）が独立的な予後予測因子であることが分かる。特に、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩとＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩが予後的に差異があり、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩは、緩衝地帯（ｂｕｆｆｅｒ  ｚｏｎｅ）に設定した。
【０１３１】
【表１２】
2019537436.tif 000022
【０１３２】
これを無病生存率で検証した結果は、下記の通りである。全体生存率の結果のように、無病生存率でも、図１８のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ  ｃｕｒｖｅから分かるように、３個の群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）の間に予後の差異があることが分かる。５年無病生存率は、それぞれ７６．９、６５．０、５５．３％であって、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉが３個の群間に最も予後が良く、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩが最も予後が悪いことが分かる。
【０１３３】
また、表１３のように、無病生存率で検証してみた時、、ＣＯＸ単変量と多変量分析で各亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）が独立的な予後予測因子であることが分かる。特に、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩとＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩが予後的に差異があり、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩは、緩衝地帯に設定した。
【０１３４】
【表１３】
2019537436.tif 000023
【０１３５】
Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ（ｎ＝２８１）でＸＥＬＯＸ抗癌療法を受けた患者群（ＣＴＸ）と観察のみをした患者群（Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｎｌｙ）の全体生存率の側面で予後を比較した結果、図１９に示されたように、ＣＯＸ単変量分析でＸＥＬＯＸ抗癌療法を受けたグループと受けないグループの間の差異が有意に現れる。ＣＯＸ多変量分析で性別、年齢、ＴＮＭ病期を調整した時、ＸＥＬＯＸ治療を受けたグループが観察のみをしたグループに比べて単変量分析と同一に予後が良い、統計的に有意な結果を示している（表１４、図１９）。
【０１３６】
【表１４】
2019537436.tif 000024
【０１３７】
上記の結果を無病生存率の側面で検証した時にも、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ（ｎ＝２８１）でＸＥＬＯＸ抗癌療法を受けた患者群と観察のみをした患者群の予後を比較した結果、図２０に示されたように、ＣＯＸ単変量分析でＸＥＬＯＸ抗癌療法を受けたグループと受けないグループの間の差異が有意に現れる。ＣＯＸ多変量分析で性別、年齢、ＴＮＭ病期を調整した時、ＸＥＬＯＸ治療を受けたグループが観察のみをしたグループに比べて単変量分析と同一に予後が良い、統計的に有意な結果を示している（表１５、図２０）。
【０１３８】
次に、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ（ｎ＝３４４）でＸＥＬＯＸ抗癌療法を受けた患者群と観察のみをした患者群の間の予後を比較した結果、図２１に示されたように、２つの群間の生存の差異が有意でない結果を示す。これは、ＣＯＸ単変量、多変量分析でも同じ結果を示している（表１６、図２１参照）。
【０１３９】
【表１５】
2019537436.tif 000025
【０１４０】
【表１６】
2019537436.tif 000026
【０１４１】
次に、これを無病生存率の側面で検証した時にも、全体生存率と同じ結果を観察することができる。Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ（ｎ＝３４４）でＸＥＬＯＸ抗癌療法を受けた患者群と観察のみをした患者群の間の予後を比較した結果、図２２に示されたように、２つの群間の生存の差異が有意でない結果を示す。これは、ＣＯＸ単変量、多変量分析でも同じ結果を示している（表１７、図２２参照）。
【０１４２】
【表１７】
2019537436.tif 000027
【０１４３】
次に、抗癌剤適合性（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ）とＸＥＬＯＸ抗癌療法処理の可否に対する相関関係を全体生存率の側面で検証してみた時、直接的な相関関係があることを観察した（表１８）。
【０１４４】
【表１８】
2019537436.tif 000028
【０１４５】
無病生存率の側面で予後を検証した時、全体生存率のように抗癌剤適合性（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ）とＸＥＬＯＸ抗癌療法処理の可否に対する相関関係を検証してみた時、直接的な相関関係があることを観察した（表１９）。
【０１４６】
これは、実施例３の結果を検証したものであって、ＸＥＬＯＸ抗癌化学療法の利点は、抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）で発生し、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）では発生しないことを示している。
【０１４７】
前記結果から、本発明のアルゴリズムにより分類された良い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ）と悪い予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）の予後予測結果、５年生存率に有意な差異を有することが分かる。また、手術後にＸＥＬＯＸ抗癌療法の効果は、抗癌剤反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓ）で有意に発生し、抗癌剤非反応群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ）では、治療効果が現れず、抗癌剤適合性とＸＥＬＯＸ治療の可否の相関関係が有意であることを示す。
【０１４８】
【表１９】
2019537436.tif 000029
【０１４９】
＜実施例５＞進行性胃癌２期と３期患者の手術後にＦＦＰＥ日常的残余検体を利用した予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）の臨床的性能の評価
前記実施例１で得た胃癌患者の予後予測アルゴリズム（ｎＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ  ａｓｓａｙ医療機器）の臨床的性能評価を検証するために、２期と３期（ＡＪＣＣ６版基準）胃癌患者の手術後、ＦＦＰＥ日常的残余検体を対象としてリアルタイム重合酵素連鎖反応を通じて遺伝子のΔＣｑ値を測定し、患者の予後を予測するアルゴリズムの臨床的性能を新しい被験者群で検定した。具体的に、１）  Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓで検証セットで導き出された２つの予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）の５年生存率を確認してアルゴリズムの予測性能を評価しようとした。２）ログランクテストで予後群間の予後差異を統計的有意性の水準で比較検定して、予後群別の差異の安定性を評価して、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉが３個の群のうち最も予後が良い群であり、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩは、最も予後が悪い群であることを検定しようとした。３）多変量Ｃｏｘの比例ハザードモデルによる予後群のハザード比分析で予後群が独立した予後因子であることを検定しようとした。
【０１５０】
本臨床試験の総検体数は、６８４個で進め、検体スクリーニング段階でＲＮＡ量と質の基準に未達して１８個の検体がスクリーニングで脱落した。スクリーニング脱落した１８個の検体を除いた６６６個の検体が本臨床試験で検体として登録された。最初試験および分析段階で６６６個のうち合計１２６個の検体がＱＣ脱落基準に該当して１回再試験を進め、その結果、合計１２６個の検体のうち１２個の検体がＱＣ脱落基準によって最終「中途脱落」処理された。したがって、対象検体６８４個のうちスクリーニング脱落検体（１８個）および再試験基準による脱落検体（１２個）合計３０個を除いた、６５４個の検体を有効性評価分析群に選定した。
【０１５１】
本臨床試験で抗癌剤適合性（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ、Ｓ）に対する評価は行われなかったが、その理由は、６５４個の患者検体のうち９７．７％の患者が抗癌剤治療を受けたので、抗癌剤適合群（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒ、Ｓ）による亜型区分で抗癌治療を受けた患者とそうではない患者の間の予後の差異を比較するには、抗癌治療を受けなかった患者の数が不足するからである。
【０１５２】
まず、予後群の５年生存率予測性能を測定するために、検体別△Ｃｑ値をアルゴリズムに適用して予後群を区分し、これをＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｃｕｒｖｅｓで予後群別の生存率を算出した（図２３、表２０参照）。
【０１５３】
【表２０】
2019537436.tif 000030
【０１５４】
しかも、予後群Ｉと予後群ＩＩＩ、２つの予後群の９５％信頼区間の間に重複の可否を検証した結果、下記表２１のように重複しないことを確認した。
【０１５５】
【表２１】
2019537436.tif 000031
【０１５６】
予後群別の差異の安定性を確認するために、予後群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩに対してログランクテストを使用して統計的に有意な差異を調査し、統計量算出方法は、自由度２にカイ二乗値を計算してｐ値を算出した。比較する予後群の効果に差異がない場合、すべての区間での事件（死亡）の発生は、各区間の３個の予後群の観察対象数（Ｏ）に比例した頻度で起こるべきである。ログランクテストでは、３個の予後群を合わせた全体集団を観察期間順に配列し、二重切断された項目は、消し、事件（死亡）が発生した区間だけを残して整理した。また、区間ごとに各予後群の死亡に対する期待頻度（Ｅ）を計算した。各予後群別の死亡に対する全体観察頻度（Ｏ）と期待頻度（Ｅ）の関係は、自由度２であるカイ自乗の分布を示すので、値（Ｘ２）が５．９９（ｐ値＜０．０５）より大きい場合、３個の予後群は、有意な差異を示すと判断した。ログランクテストで帰無仮説は、次の通りである。
【０１５７】
【数９】
2019537436.tif 000032
【０１５８】
ログランクテストの統計量に対するｐ値が０．０５より小さく出る場合には、予後群間の予後の差異があると解釈し、反対に、統計量に対するｐ値が０．０５より大きく出る場合には、予後群間の予後の差異がないと解釈した。
【０１５９】
その結果、自由度２でカイ二乗値 （Ｘ２）が２４．７（ｐ値＝４．３９ｅ−０６）と算出されて、統計的に有意な差異があることを確認した（表２２参照）。したがって、３個の群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）の間には、予後の差異があることが分かった。
【０１６０】
【表２２】
2019537436.tif 000033
【０１６１】
３個の予後群の間の差異がどこに由来するかを把握するために、ログランクテストを使用してそれぞれ自由度１でカイ自乗の分布を有する事後分析（Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）を施行した結果、全部有意なｐ値が算出されて、予後の差異があることが分かった。すなわち、３個の予後群は、各予後群の間の差異が明確であるので、［予後群別の差異の安定性］結果を満たしたと判断した。
【０１６２】
【表２３】
2019537436.tif 000034
【０１６３】
予後群の危険程度および独立性を確認するために、胃癌の他の危険因子（年齢、性別、ＴＮＭ病期、抗癌剤治療の可否）の影響を補正して、予後群という危険因子によっても生存率に差異があるかをハザード比の分析を通じて評価した。Ｃｏｘの比例ハザードモデル（Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄ  Ｍｏｄｅｌ）分析方法を使用して既存の予後因子を共変数とする多変量分析を通じて本アルゴリズムによる予後群が胃癌の予後に影響を及ぼす独立的な予後因子であるかを把握した。
【０１６４】
Ｃｏｘの比例ハザードモデルで帰無仮説は、次の通りである。
【数１０】
2019537436.tif 000035
【０１６５】
次に、有効性評価分析群に選定された６５４個のサンプルのうち抗癌剤の可否が不明な２２個のサンプルは、分析から除外し、６３２個のサンプルを多変量Ｃｏｘの比例ハザードモデルで分析して、ハザード比（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ）とこれに対する９５％信頼区間およびｐ値を算出した。
【０１６６】
多変量Ｃｏｘの比例ハザードモデル分析結果によって２つの予後集団（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ  ｖｓ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）間のハザード比が統計的に有意に（ｐ値＜０．０５）出る場合、アルゴリズムによる予後群が独立的な予後因子であると解釈した。
【０１６７】
【表２４】
2019537436.tif 000036
【０１６８】
Ｃｏｘの比例ハザードモデルを使用して分析した結果、胃癌の予後に影響を及ぼす危険因子（独立変数）としては、年齢（ｐ値＝０．０００１１２）、ＴＮＭ病期（ｐ値＝１．６７ｅ−０８）と予後群が統計的に有意なものであると示された。
【０１６９】
本臨床試験の評価変数である予後群（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ）の場合、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉを当該独立変数のレファレンスとしてＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩとＩＩＩのハザード比を算出した。したがって、診断時にＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉである場合に比べて、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ（ｐ値＝０．００１４７５）である場合は、２．０４倍、そしてＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ（ｐ値＝１．４０ｅ−０５）である場合は、２．５８倍危険であり、統計的に有意であった。
【０１７０】
したがって、危険因子（年齢、性別、ＴＮＭ病期、抗癌剤治療の可否）で調整（ａｄｊｕｓｔｅｄ）された時にも、胃癌で本アルゴリズムによるＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ区分が独立した予後因子であることが分かった。
【０１７１】
前記臨床試験の安全性評価結果、当該期間の間に、試験者は、検査室の生物学的安全規則遵守によって検体を保管しおよび取り扱った。臨床試験期間中に観察した結果、検体を扱う試験者において検体から異常事例および感染などの副作用に関する安全性の問題は発生しなかった。
【０１７２】
本臨床試験を通じて前記実施例１で得た予測アルゴリズムおよびアルゴリズムの臨界値を適用して予後の臨床的有効性の評価結果を検証した。有効性評価変数で予後群Ｉ（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉ）と予後群ＩＩＩ（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ）の５年生存率を確認した結果、それぞれ８１．９８％（９５％ＣＩ、７４．１２％〜９０．６７％）、５５．７４（９５％ＣＩ、５０．５２％〜６１．４９％）であり、臨床試験計画書で設定した評価基準に符合し、また、予後群Ｉと予後群ＩＩＩの５年生存率の９５％ＣＩが互いに重複しないことを確認することができた。
【０１７３】
また、区分された３個の予後群間に予後の差異があるかを評価するためにログランクテストを実施した結果、３個の群間には、有意な差異があることを確認することができた。また、事後分析結果によれば、全部有意なｐ値が算出されて、予後の差異があることが分かった。すなわち、３個の予後群は、各予後群間の差異が明確であると示されるので、［予後群別の差異の安定性］結果を満たした。
【０１７４】
最後に、年齢、性別、抗癌剤の可否、病期などを共変数として多変量Ｃｏｘの比例ハザードモデル分析を実施してハザード比を算定した結果、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉである場合に比べてＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩ（ｐ値＝０．００１４７５）の場合は、２．０４倍、そしてＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉである場合に比べてＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩ（ｐ値＝１．４０ｅ−０５）である場合は、２．５８倍危険であり、統計的に有意であった。すなわち、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉは、予後が最も良く、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＩＩは、予後が最も悪いことを確認した。すなわち、危険因子（年齢、性別、ＴＮＭ病期、抗癌剤治療の可否）で調整（ａｄｊｕｓｔｅｄ）された時にも、胃癌で本アルゴリズムによるＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ区分が独立した予後因子であることが分かる。
【０１７５】
結論的に、本臨床試験の評価結果から分かるように、前記実施例１で得た胃癌患者の予後予測アルゴリズムおよびｎＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｉ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ  ａｓｓａｙ医療機器の臨床的性能が成功裏に評価されたと見られる。
【産業上の利用可能性】
【０１７６】
本発明は、胃癌患者の治療方法を決定するのに補助的情報として活用することができる。
【図１】
2019537436.tif 000037
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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