(57)【要約】本発明は胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物、及びその製造方法に関する。本発明による軟骨再生用組成物は、人工支持体なしに軟骨として使用するのに適した大きさの３次元組織を製作することができ、組成物をゲル状で投与することができながらも高い塗布性及び付着性を持っているので、投与部位の軟骨欠損の大きさ及び形態にかかわらず容易に移植することができ、宿主組織との高い結合能を示すとともに成熟した軟骨組織の表現型を有することによって軟骨再生効能に優れた効果を示す。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物であって、
前記組成物はゲル状であり、インビトロの状態で、１ｍｍ／分の速度で押したときにヤング率が２０ｋＰａ以下である圧縮強度、１ｍｍ／分の速度で１秒間５Ｎの力を垂直に試料に加えたときの拡散程度が０．１〜２．０ｍｍ２／ｍｇである塗布性、及び直径５ｍｍのジグと患部に物質を接触させて付着させた後に１．３ｍｍ／分の速度で引っ張ることによって分離されるときの力が０．５〜５．０ｋＰａである付着強度の物性を有する、軟骨再生用組成物。
【請求項２】
１ｍｍ／分の速度で押したときにヤング率が０．２〜２０ｋＰａである圧縮強度、１ｍｍ／分の速度で１秒間５Ｎの力を垂直に試料に与えたときの拡散程度が０．２〜１．７ｍｍ２／ｍｇである塗布性、及び直径５ｍｍのジグと患部に物質を接触させて付着させた後に１．３ｍｍ／分の速度で引っ張ることによって分離されるときの力が０．９〜４．５ｋＰａである付着強度の物性を有する、請求項１に記載の軟骨再生用組成物。
【請求項３】
前記軟骨再生用組成物は、生体条件で糖タンパクと第二コラーゲンの発現が増進して成熟軟骨の特性を示す、請求項１に記載の軟骨再生用組成物。
【請求項４】
（ａ）胎児軟骨組織から軟骨前駆細胞を分離して培養する段階、
（ｂ）前記培養された軟骨前駆細胞及びその細胞外基質を含む細胞膜を取り出す段階、
（ｃ）前記取り出した細胞膜を遠心分離して細胞ペレットを得る段階、及び
（ｄ）前記細胞ペレットを軟骨分化培地で培養する段階、を含む、胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物の製造方法。
【請求項５】
前記（ｂ）段階の細胞膜の取り出しは、細胞の分離段階なしに底に付着した細胞とともに細胞外基質を全て含めて取り出す、請求項４に記載の軟骨再生用組成物の製造方法。
【請求項６】
前記（ｄ）段階の軟骨分化培地は、インシュリン、ヒトトランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、デキサメタゾン、プロリン及びＴＧＦ−βからなる群から選択される１種以上の成分を含む、請求項４に記載の軟骨再生用組成物の製造方法。
【請求項７】
前記（ｄ）段階の培養の期間は４週以内である、請求項４に記載の軟骨再生用組成物の製造方法。
【請求項８】
前記培養期間によって軟骨再生用組成物の圧縮強度、付着性及び塗布性を調節する、請求項４に記載の軟骨再生用組成物の製造方法。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれかに記載の軟骨再生用組成物の製造方法によって製造された、軟骨再生用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載の軟骨再生用組成物を有効成分として含む、軟骨欠陥疾患治療用薬剤学的組成物。
【請求項１１】
前記軟骨欠陥疾患は、退行性関節炎、リウマチ性関節炎、骨折、筋肉組織の損傷、足底筋膜炎、上腕骨外側上顆炎、石灰沈着性腱炎、骨折の偽関節及び外傷による関節損傷から選択される一つである、請求項１０に記載の軟骨欠陥疾患治療用薬剤学的組成物。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載の軟骨再生用組成物の薬剤学的に有効な量を患者に投与して軟骨欠陥疾患を治療する方法。
【請求項１３】
軟骨欠陥疾患の治療のための薬剤の製造において請求項１〜３のいずれかに記載の軟骨再生用組成物の用途。
【請求項１４】
軟骨欠陥疾患の治療に使うための請求項１〜３のいずれかに記載の軟骨再生用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は軟骨再生用組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は単一細胞である軟骨細胞と細胞外基質のみからなる組織である。軟骨組織は血管と神経がなくて損傷を受ければ治癒しにくいという欠点がある。また、軟骨細胞は堅い細胞外基質で取り囲まれているから、一度損傷を受けるか退化すれば再生しにくい問題点を持っている。
【０００３】
損傷した軟骨組織を治療するために、薬物治療剤（鎮痛剤、ステロイド剤、非ステロイド系抗炎剤など）、軟骨保護剤（ヒアルロン酸、グルコサミン、コンドロイチンなど）を用いるか手術的処置（関節鏡手術、脛骨高位骨切り術、関節部分置換術、膝関節全置換術、骨髄刺激術、骨軟骨組織移植術など）を用いることができる。しかし、薬物治療剤の場合は疼痛や炎症反応自体を非特異的に緩和させる効果のみを有し、軟骨保護剤はただ軟骨細胞に栄養を供給するか衝撃を緩和させることによって一時的に関節を保護する役割をするだけである。また、整形外科で臨床的に様々な手術が施行されているが、代表的な方法としては、骨髄刺激術（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）と骨軟骨移植術（Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｇｒａｆｔ）がある。骨髄刺激術は損傷された軟骨下骨を露出させることで、骨髄から誘導された幹細胞を含む血餅で軟骨損傷を埋める方法であり、比較的手術が簡便であるという利点があるが、手術後に硝子軟骨ではない纎維軟骨として再生されるという欠点がある。骨軟骨組織移植術は、患者自身の軟骨組織において体重がより小さく加わる部位の骨軟骨結合織を採取した後、これを軟骨損傷部位に移植治療する方法であるが、損傷部位が大きな場合には使えない欠点がある。
【０００４】
このような手術治療技術の欠点を克服するために、外部から治療細胞を供給する細胞治療剤が多く研究されている。一番先に製品化した技術は自己軟骨細胞移植術（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＡＣＩ）であって、患者自身の軟骨組織において体重がより少なく加わる部位から元気な軟骨を少し取り離し、これから軟骨細胞を分離し、体外培養した後、損傷部位に再び注入する技法であるが、二回の手術による煩わしさと、元気な部位の軟骨が損傷される欠点があり、何よりも採取した軟骨細胞の数が少なくて一定期間培養しなければならなく、培養期間中に軟骨細胞の特性を失う脱分化現象が発生し、注入された軟骨細胞が非均質的であり、重力のために特定の部位に集中してよく分布されない欠点がある。
【０００５】
これを克服するために、幹細胞を移植する研究が活発に行われている。最近では、同種の臍帯血由来の間葉系幹細胞を培養し、損傷された軟骨部位に移植して治療する技術が製品化した。臍帯血の他にも、骨髄又は脂肪組織から間葉系幹細胞を分離して培養して軟骨損傷を治療する技術が活発に研究されているが、注入された間葉系幹細胞の生存に対する証拠が不十分で、移植後に生体内で軟骨細胞への分化及び軟骨組織の形成効率が証明されておらず、普遍的な治療方法として期待することは難しい状況である。結論として、軟骨細胞又は幹細胞を軟骨損傷部位に注入する細胞治療剤は細胞の生存、分化、分布に対する証拠が不十分で、細胞の作用機序が明かされていないし、細胞治療剤間の相対的有効性が研究されていないため、臨床的に推薦するに値する治療剤として認められる可能性が希薄である。
【０００６】
前述した問題点のため、細胞治療剤の生体内分布及び分化の欠点を克服するために多様な形態の生体材料を支持体（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）として用いて細胞を移植する技術が使われており、ひいてはインビトロで３次元構造の人工軟骨組織（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）を製作する技術が開発されている。
【０００７】
移植部位に細胞を移植するために現在使われる支持体はスポンジ、ゲル、纎維及びマイクロビーズなどの多様な形態を持っており、主に天然又は合成生体素材を用いて製造される。支持体を用いる場合、移植術自体は効率が高まり、移植部位に均一に分布させることができる利点があるが、支持体内で細胞が増殖するか細胞外基質が分泌される場合、この支持体がむしろ空間的制限を与えることがある欠点がある。特に、ハイドロゲル形態の支持体は酸素と栄養分の供給が円滑でなくて細胞の生存率と軟骨分化が低下する欠点があり、膜形態の支持体は３次元の軟骨組織を形成することができなく、３次元スポンジ又はメッシュ形態の支持体を使う場合、製作された人工軟骨が宿主組織との結合力が低くて軟骨がよく再生されない欠点がある。また、全ての支持体は分解することになるが、分解速度が速い天然生体素材の場合は分解によって細胞が遺失される可能性が高い欠点がある。結局、支持体を用いた細胞治療剤も既存の細胞治療剤との相対的有効性が証明されなくて優先的選択を勧めることができる状況ではない。
【０００８】
前記技術とは別に、細胞を生体材料に接種した後、活性因子（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒｓ）とともに生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）で培養して、軟骨と類似した化学的構成を有する人工軟骨素材を製作する研究が行われており、また支持体を使わずに人工軟骨組織を製作する技術も開発されている。例えば、細胞を高濃度で培養トレーに接種した後、外部刺激（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）を与えて人工軟骨を作る方法、牛胎児血清及び成長因子を培養培地に添加して細胞の増殖と分化能を高めて作る方法及び多くの細胞を遠心分離でペレット状に製作する方法などが報告されている。しかし、このような技術は大部分厚さが数十マイクロメートル（ｍｍ）程度の膜形態又は直径１ｍｍ程度の小さなペレット状の組織のみが製造されるため、軟骨として実際に使うのには大きさが小さくて十分な再生効果を示すことができない欠点がある。
【０００９】
このような問題点のために、軟骨組織を置換できる軟骨再生用素材に対する研究開発が継続的に行われており、人体に適した軟骨再生用素材として使うために特に下記のような内容を解決することを目的としている。
【００１０】
一つ目、移植軟骨を固定することができるほどの大きさ及び体積にならなければならない。
【００１１】
二つ目、関節軟骨の欠損はたいてい非定形に発生するから、人工軟骨はこのような非定形欠損形態に適応することができなければならない。
【００１２】
三つ目、体外培養軟骨は組織学的に自然軟骨と類似することができないから、体外で組織が完全に完成されるよりは移植後に体内の環境によって分化及びリモデリングができなければならなく、リモデリングの過程で周囲組織とうまく一体化（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）されなければならない。
【００１３】
しかし、現在の技術では、大きな軟骨を作ったとき、中心組織の壊死などが発生し、骨軟骨複合体を製造する方法に難点があるため、その解決が難しい。また、例えば３次元支持体から製作された人工軟骨組織は体外では物性が固く（ｒｉｇｉｄ）なり、損傷された軟骨組織に移植する場合、周辺組織とのうまく一体化（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）されない欠点がある。また、体外培養された軟骨は人体で拒否反応を引き起こすか組織との一体化の面で十分な安全性が確保されない。
【００１４】
したがって、本発明者らは前述した三つの問題点を解決するために人体に適した軟骨再生用組成物に対して研究開発して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物を提供することである。
【００１６】
また、本発明の目的は前記軟骨再生用組成物を製造する方法を提供することである。
【００１７】
また、本発明の目的は前記軟骨再生用組成物を有効成分として含む軟骨欠陥疾患治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１８】
また、本発明の目的は前記軟骨再生用組成物の薬学的有効量を患者に投与して軟骨欠陥疾患を治療する方法を提供することである。
【００１９】
また、本発明の目的は軟骨欠陥疾患の治療のための薬剤の製造において前記軟骨再生用組成物の用途を提供することである。
【００２０】
また、本発明の目的は軟骨欠陥疾患の治療に使うための前記軟骨再生用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明において、「胎児軟骨組織由来の細胞」という用語は胎児軟骨組織から分離された細胞を総称し、好ましくコラゲナーゼなどを用いて軟骨組織を全く消化させた後に分離させた軟骨前駆細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）である。
【００２２】
本発明において、「胎児軟骨組織由来の細胞外基質」という用語は胎児軟骨組織由来の細胞によって合成され、細胞から細胞の外に分泌、蓄積された分子から構成されている生体高分子の集合体であり、コラーゲン、エラスチンなどの纎維性タンパク質、グリコサミノグリカンなどの複合タンパク質、フィブロネクチン、ラミニンなどの細胞付着性タンパク質などを含む。
【００２３】
本発明において、 「軟骨」という用語は硝子軟骨、纎維軟骨又は弾性軟骨を含み、特に限定されない。関節軟骨、耳軟骨、鼻軟骨、肘軟骨、半月板、膝軟骨、肋軟骨、足首軟骨、気管軟骨、喉頭軟骨及び脊椎軟骨など、軟骨の部位に限定されず含む。
【００２４】
本発明において、「再生」という用語は、一般に生物体には身の一部又はその機能を喪失したとき、その部分の組織又は器官を再び作って元の状態に復旧させるかその機能を回復させようとする作用を言う。このような再生能力は体の作りが簡単で系統的に進化程度が低いものであればあるほど強い。
【００２５】
本発明において、「軟骨再生用組成物」という用語は軟骨の欠損又は損傷部分に移植されたとき、軟骨再生能力を発揮して軟骨損傷に対する改善及び治療効果を示す組成物である。
【００２６】
本発明において、 「ゲル」という用語はゼリーと類似した物質であり、柔らかくて脆弱なものから強固で粗いものまで範囲の物性を有し、正常状態で流動しない固体を意味し、ゲルの塊の大部分は液体であるが３次元ネットワーク構造によって全体的には固体のようなに挙動する。
【００２７】
本発明において、「軟骨欠陥疾患」という用語は、軟骨、軟骨組織及び／又は関節組織（滑膜、関節包、軟骨下骨など）が機械的刺激又は炎症反応によって傷害された軟骨の欠陷、損傷、欠損による疾患を言う。このような軟骨欠陥疾患には、退行性関節炎、リウマチ性関節炎、骨折、筋肉組織の損傷、足底筋膜炎、上腕骨外側上顆炎、石灰沈着性腱炎、骨折の偽関節又は外傷による関節損傷があるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明において、「物理的強度」という用語は、物理的刺激に耐える程度を言い、好ましくは圧縮強度であり、垂直応力で圧縮するときの断面における圧縮荷重を試料の断面積で割った値を言う。本発明において、圧縮強度は試料を１ｍｍ／分の速度で押したとき、歪みが１０〜１６％であるときにヤング率を測定した値を言う。
【００２９】
本発明において、「塗布性（拡散性）」という用語は物性のうち拡散する性質を言い、患部などに塗るときに固まりにならず、滑らかに全面に拡散する性質を言う。本発明において、拡散性は試料に１ｍｍ／分の速度で１秒間５Ｎの力を垂直に加えたとき、試料の単位重さ当たり拡散する程度を言う。
【００３０】
本発明において、「付着性」という用語は物質に他の物質が付く性質を言い、患部などに塗るとき、物質が取れずに付いている性質を言う。本発明において、付着性は、直径５ｍｍのジグと患部に物質を接触させて付着させた後、１．３ｍｍ／分の速度で引っ張るとき、ジグと患部に付着された物質が取れて分離されるまでの抵抗力を言う。
【００３１】
本発明において、「軟骨分化培地」という用語は試験管内の成長及び生存を維持し、軟骨再生用組成物が製造できるように栄養分を供給することができる培地を意味し、培養期間に細胞から分泌された基質などと細胞培養で消費されて残った栄養成分などのいずれも含む。
【００３２】
本発明において、「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」という用語は一般に提供者の細胞、組織又は臓器などを受容者の損傷組織又は臓器に移す過程を意味し、本発明においては軟骨再生用組成物の軟骨欠陷、損傷、欠損部位への適用を意味する。移植は当該分野に公知となった方法で行われることができる。例えば、外科的手術で行われることができ、患部に直接注射することができる。
【００３３】
本発明において、「薬学的に有効な量」という用語は医学的治療に適用可能な合理的な許容／危険の比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体種類、重症度、年齢、性別、疾病の種類、治療期間、同時に使われる薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られた要素によって決定されることができる。
【００３４】
本発明において、「患者」という用語は軟骨欠陷疾患を有する人間を含む全ての動物を意味し、本発明の軟骨再生用組成物を投与して軟骨再生の改善及び治療効果を有することができる集団である。
【００３５】
本発明は胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物を提供する。
【００３６】
本発明による軟骨再生用組成物は人工支持体なしに軟骨として使うのに適した大きさの３次元組織を製作することができ、組成物がゲル状で投与可能でありながらも高い塗布性と付着性を持っているので、投与部位の軟骨欠損の大きさ及び形態にかかわらず容易に移植することが可能であり、宿主組織との高い結合能を示し、成熟した軟骨組織の表現型を有することによって軟骨再生効能に優れた効果を示す。特に、人体外では成熟した実際の軟骨に比べて強度が低いがゲル状であるとともに塗布性及び付着性を有して患部に適用しやすい利点を有し、インビボで患部に移植するとき、成熟とリモデリングによって実際の軟骨と類似した強度を有する。
【００３７】
胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物は下記の段階で製造することができる。
（ａ）胎児軟骨組織から軟骨前駆細胞を分離して培養する段階、
（ｂ）前記培養された軟骨前駆細胞及びその細胞外基質を含む細胞膜を取り出す段階、
（ｃ）前記取り出した細胞膜を遠心分離して細胞ペレットを得る段階、及び
（ｄ）前記細胞ペレットを軟骨分化培地で培養する段階。
【００３８】
前記段階によって製造された胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物は下記のような物性を有する。
形状：ゲル状
圧縮強度：製造後、インビトロの状態で１ｍｍ／分の速度で押して組織の歪みが１０〜１６％に変わるときに加わったヤング率が２０ｋＰａ以下、好ましくは０．２〜２０ｋＰａ、より好ましくは４．１〜１８．９ｋＰａ。
塗布性：製造後、インビトロの状態で１ｍｍ／分の速度で１秒間５Ｎの力を垂直に試料に加えたとき、単位重さ（１ｍｇ）当たり拡散面積が０．１〜２．０ｍｍ２／ｍｇ、好ましくは０．２〜１．７ｍｍ２／ｍｇ、より好ましくは０．４〜１．２ｍｍ２／ｍｇの塗布性。
付着性：製造後、インビトロ状態で直径５ｍｍのジグと患部に物質を接触させて付着させた後、１．３ｍｍ／分の速度で引っ張るとき、ジグと患部に付着した物質が取れて分離されるときの力が０．５〜５．０ｋＰａ、好ましくは０．９〜４．５ｋＰａ、より好ましくは１．０〜２．８ｋＰａである付着性。
【００３９】
本発明による軟骨再生用組成物はゲル状を有することにより、患部に注射で移植されることもでき、塗布されることもできる。本発明による軟骨再生用組成物はインビボに適用する前、インビトロの状態で又は製造直後に前記のような優れた塗布性を有することにより、患部に適用するとき、軟骨再生用組成物を良好に塗布することができる。本発明による軟骨再生用組成物はインビボに適用する前、インビトロの状態で又は製造直後に前記のような優れた付着性を有することにより、患部に適用するとき、組成物が患部から取れずに軟骨組織に再生されることができる。
【００４０】
本発明による軟骨再生用組成物は、ゲル状が２５〜３７℃で２４時間以上、より好ましくは２４時間以上１年以下維持されることができる。前記軟骨再生用組成物は、細胞ペレットを軟骨分化培地で培養する段階で培養期間によってその大きさの調節が可能であり、直径１ｍｍ〜１５ｍｍ、高さ１ｍｍ〜１５ｍｍであり得る。また、細胞ペレットを軟骨分化培地で培養する段階で培養期間によって圧縮強度、塗布性及び付着性を調節して軟骨再生に最適の状態を維持することもできる。
【００４１】
前記軟骨再生用組成物は、生体条件、好ましくは人体内への適用後に時間が経つにつれて糖タンパクと第二コラーゲンの発現が増進して成熟軟骨の特性を示す。
【００４２】
また、本発明は前記胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物を製造する方法を提供する。
【００４３】
本発明による軟骨再生用組成物を製造する方法は細胞ペレット形成及びこれからの培養によってゲル状の物性を提供し、培養期間の調節によって生成される軟骨再生用組成物の物性を調節し、人体に適した軟骨再生用組成物を提供することができる。
【００４４】
前記胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物を製造する方法は下記の段階を含む。
（ａ）胎児軟骨組織から軟骨前駆細胞を分離して培養する段階、
（ｂ）前記培養された軟骨前駆細胞及びその細胞外基質を含む細胞膜を取り出す段階、
（ｃ）前記取り出された細胞膜を遠心分離して細胞ペレットを得る段階、及び
（ｄ）前記細胞ペレットを軟骨分化培地で培養する段階。
【００４５】
前記軟骨再生用組成物を製造する方法は、（ａ）胎児軟骨組織から軟骨前駆細胞を分離して培養する段階を含む。
【００４６】
前記胎児軟骨組織は胎児の関節部位（例えば、膝関節）から分離されることができる。分離された胎児軟骨組織はコラゲナーゼ、ペプシンなどのプロテアーゼで処理され、軟骨組織が分解された後、遊離された細胞を取り合わせて得ることができる。分離された軟骨前駆細胞は通常に使う培養培地（例えば、ＤＭＥＭの下でＦＢＳ及び抗生剤が添加された培地）で培養されて細胞外基質を生成しながら成長することができる。
【００４７】
前記軟骨再生用組成物を製造する方法は、（ｂ）前記培養された軟骨前駆細胞及びその細胞外基質を含む細胞膜を取り出す段階を含む。
【００４８】
一般的な細胞の取得方法とは違い、本発明による取り出し方法は、培養された軟骨前駆細胞及びその細胞外基質の両者を含む細胞膜を取り出すことである。すなわち、培養トレーから細胞を分離するとき、細胞を単一細胞に分離する過程なしに培養トレー内の軟骨前駆細胞及びその細胞外基質を全て含めて取り出す。このような取り出しは、培養培地を除去し、トリプシン−ＥＤＴＡなどで処理し、底に付着した細胞とともに細胞外基質を含む膜全体を取り出すことで可能になる。
【００４９】
前記軟骨再生用組成物を製造する方法は、（ｃ）前記取り出された細胞膜を遠心分離して細胞ペレットを得る段階を含む。
【００５０】
前記（ｂ）段階で取り出された細胞膜は遠心分離によって凝集体（すなわち、ペレット状）に形成することができる。このようなペレット状は、好ましくは１００ｇ〜５００ｇで５分〜３０分間遠心分離することによって製造することができ、より好ましくは軟骨分化因子を含む軟骨分化培地で製造することができる。
【００５１】
前記軟骨分化培地は、好ましくはインシュリン、ヒトトランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、アスコルビン酸、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、デキサメタゾン、プロリン及びＴＧＦ−βからなる群から選択される１種以上の成分を含む培地であり、好ましくは前記成分の全てを含む。
【００５２】
本発明の実施例によれば、１％抗菌・抗真菌剤、１．０ｍｇ／ｍＬインシュリン、０．５５ｍｇ／ｍＬヒトトランスフェリン、０．５ｍｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、１．２５ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、１００ｎＭデキサメタゾン、４０μｇ／ｍＬプロリン及び１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−βを含むダルベッコ変法イーグル培地−高グルコース（ＤＭＥＭ−ＨＧ）である。
【００５３】
前記軟骨再生用組成物を製造する方法は、（ｄ）前記細胞ペレットを軟骨分化培地で培養する段階を含む。
【００５４】
軟骨分化培地での細胞ペレットの培養は培養期間によって圧縮強度、付着性及び塗布性が変わり、患部に適切な軟骨再生用組成物を提供するために培養期間を設定することができる。培養は好ましくは３次元培養で行うことができ、培養期間は４週以内、好ましくは１日〜２１日、より好ましくは３週間行うことができる。
【００５５】
また、本発明は前記胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物を有効成分として含む軟骨欠陥疾患治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００５６】
前記胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物は前述したとおりである。
【００５７】
前述したように、「軟骨欠陥疾患」とは、軟骨、軟骨組織及び／又は関節組織（滑膜、関節包、軟骨下骨など）が機械的刺激又は炎症反応によって傷害された軟骨の欠陷、損傷、欠損による疾患を言う。このような軟骨欠陥疾患には、退行性関節炎、リウマチ性関節炎、骨折、筋肉組織の損傷、足底筋膜炎、上腕骨外側上顆炎、石灰沈着性腱炎、骨折の偽関節又は外傷による関節損傷があるが、これに限定されるものではない。
【００５８】
本発明による治療用薬剤学的組成物は、有効成分として含まれる前記軟骨再生用組成物に加え、薬剤学的に許容される担体をさらに含むことができる。
【００５９】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は製剤時に通常に用いられるもので、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の外に、滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。薬剤学的に許容される適合した担体及び製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．、１９９５）に詳細に記載されている。
【００６０】
本発明の薬剤学的組成物は非経口で投与することができ、非経口投与の場合、好ましくは軟骨欠損、損傷又は欠陥部位に直接投与することができる。
【００６１】
本発明の薬剤学的組成物の適切な投与量（好ましくは、移植量）は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されることができる。一方、本発明の薬剤学的組成物の投与量（好ましくは移植量）は患部の大きさ及び種類によって違うが、好ましくは患部の立方センチメートル当たり２〜５個の軟骨再生用組成物、より好ましくは３〜４個の軟骨再生用組成物が投与（移植）されることができる。
【００６２】
本発明の薬剤学的組成物は、好ましくは患部に直接注入可能な軟骨再生用組成物を含む。本発明の一実施様態によれば、患部に直接注入可能な軟骨再生用組成物は注射製剤型であってもよい。
【００６３】
本発明の軟骨再生用組成物を有効成分として含む患部に直接注入可能な薬剤学的組成物は患部に直接注入可能な形態に剤形化することができ、好ましい投与方式及び製剤の一つは注射剤である。注射剤は、生理食塩額、リンゲル液、Ｈａｎｋ溶液又は滅菌された水溶液などの水性溶剤、オリーブオイルなどの植物油、エチルオレイン酸などの高級脂肪酸エステル及びエタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール又はグリセリンなどの非水性溶剤などを用いて製造することができ、粘膜透過のために、通過すべきバリアに適した当該分野に公知となった非浸透性剤を使うことができ、変質防止のための安定化剤として、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ＢＨＡ、トコフェロール、ＥＤＴＡなどと、乳化剤、ｐＨ調節のための緩衝剤、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、ベンジルアルコールなどの微生物発育を沮止するための保存剤などの薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。
【００６４】
また、本発明は、前記胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物の薬学的に有効な量を患者に投与（好ましくは移植）して軟骨欠陥疾患を治療する方法を提供する。前記投与は、例えば体内への移植時に用いる方法を制限なしに使用して体内に移植することができる。
【００６５】
また、本発明は、軟骨欠陥疾患の治療のための薬剤の製造において前記胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物の用途を提供する。
【００６６】
また、本発明は、軟骨欠陥疾患の治療に使うための前記胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物を提供する。
【００６７】
本発明の用途、組成物、治療方法で言及した事項は互いに矛盾しない限り、同様に適用される。
【発明の効果】
【００６８】
本発明による軟骨再生用組成物は人工支持体なしに軟骨として使用するのに適した大きさの３次元組織を製作することができ、組成物がゲル状で投与可能でありながらも高い塗布性及び付着性を持っているので、投与部位の軟骨欠損の大きさ及び形態にかかわらず容易に移植可能であり、宿主組織との高い結合能を示し、成熟した軟骨組織の表現形を有することによって軟骨再生効能に優れた効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の軟骨再生用組成物の製造方法の模式図である。
【図２】本発明の一実施例によって１週、２週又は３週間培養されて製造されたゲル状の軟骨再生用組成物の外観写真及び組織の体積を示す棒グラフである。
【図３】本発明の一実施例によって１週、２週又は３週間培養されて製造されたゲル状の軟骨再生用組成物のサフラニンＯ染色及びヘマトキシリン・エオジン染色を行った写真である。
【図４】本発明の一実施例によって１週、２週又は３週間培養されて製造された軟骨再生用組成物の水分含有量、ＤＮＡ含量、グルコサミノグリカン及びヒドロキシプロリン含量を示す棒グラフである。
【図５】本発明の一実施例によって製造された軟骨再生用組成物及びエクスビボで投与された軟骨再生用組成物の物理的強度（ヤング率、ｋＰａ）を確認した結果である。
【図６】本発明の一実施例によって製造された軟骨再生用組成物と胎児軟骨細胞から製造された軟骨再生用組成物のプロテオグリカンの量を肉眼で確認するための組織学的染色（サフラニンＯ）を行って確認した結果である。
【図７】本発明の一実施例によって１週、２週又は３週間培養されて製造されたゲル状の軟骨再生用組成物の塗布性（拡散程度）を確認した結果である。
【図８】本発明の一実施例によって１週、２週又は３週間培養されて製造されたゲル状の軟骨再生用組成物の付着性を確認した結果である。
【図９】培地組成による軟骨再生用組成物の形成程度を確認した結果を示す図である。
【図１０】本発明の一実施例によって製造された軟骨再生用組成物をヒトの軟骨ブロックに移植した後、ヌードマウスの皮下で培養した後、組織学的染色及び免疫染色を行った結果である。
【図１１】蛍光発現因子ＰＫＨ−２６を標識した本発明の一実施例によって製造された軟骨再生用組成物の蛍光発現を確認した結果である。
【図１２】蛍光発現因子ＰＫＨ−２６を標識した本発明の一実施例によって製造された軟骨再生用組成物を損傷された軟骨部位に移植して軟骨損傷部位付着を確認した結果である。
【図１３】本発明の一実施例によって製造された軟骨再生用組成物をウサギ膝軟骨損傷モデルに移植し、組織学的分析によって移植後の軟骨損傷の再生を確認した結果である。
【図１４】本発明の一実施例によって製造された軟骨再生用組成物をサル膝軟骨損傷モデルに移植し、ＭＲＩによって軟骨損傷の再生を確認した結果である。
【図１５】本発明の一実施例によって製造された軟骨再生用組成物をサル膝軟骨損傷モデルに移植し、組織染色によって軟骨損傷の再生を確認した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであるので、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるものと解釈されない。
【００７１】
＜実施例１＞軟骨再生用組成物の製造
軟骨再生用組成物の製造のための製造段階に対する模式図は図１に示し、製造方法は下記の通りである。
【００７２】
胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物の製造のために、１０〜１５週齢の胎児（出処：亜洲大学校病院倫理委員会で承認したＩＲＢ  ＮＯ．  ＡＪＩＲＢ−ＭＥＤ−ＳＭＰ−１０−２６８）の膝関節から軟骨前駆細胞を分離した。
【００７３】
具体的に、膝関節から分離された軟骨組織をＰＢＳ（リン酸緩衝整理食塩水）で洗浄した後、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで０．２％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｌａｋｅｗｏｏｄ，  ＮＪ）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）で４時間培養した。軟骨組織が完全に消化されて遊離された軟骨細胞を１７００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、沈澱した軟骨前駆細胞を組織培養トレー（培養トレー当たり１×１０６ｃｅｌｌｓの密度、１５０ｍｍ（直径）×２０ｍｍ（ｈ））に接種した。
【００７４】
軟骨前駆細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）を１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、５０単位／ｍＬペニシリン及び５０μｇ／ｍＬストレープトマイシンの添加されたＤＭＥＭで２×１０５細胞に希薄した後、１５〜１８日間単層培養した。培養後、培地を除去し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を添加して細胞外基質と結合した細胞膜を取り出した。細胞及び細胞外基質が結合した細胞膜の取り出しは、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）処理後、細胞をピペットで分離せずに細胞及び細胞外基質を含む細胞膜全体を一度に取り出した。
【００７５】
取り出した細胞及び細胞外基質を含む細胞膜を軟骨分化培地（１％抗菌・抗真菌剤、１．０ｍｇ／ｍＬインシュリン、０．５５ｍｇ／ｍＬヒトトランスフェリン、０．５ｍｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、１．２５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１００ｎＭデキサメタゾン、４０μｇ／ｍＬプロリン及び１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−βを含むダルベッコ変法イーグル培地−高グルコース（ＤＭＥＭ−ＨＧ））が含まれた５０ｍｌチューブに入れ、２５０ｘｇで２０分間遠心分離してペレット状の構造体を製造した。
【００７６】
製造された細胞ペレットを前記組成と同じ軟骨分化培地が入れられた培養トレーに入れ、３７℃及び５％二酸化炭素のインキュベーターで１週、２週及び３週間培養して軟骨再生用組成物を製造した。
【００７７】
前記製造方法によって製造された軟骨再生用組成物の写真及び組織の体積は図２に示した。図２のＡは組織の肉眼写真（目盛り当たり１ｍｍ）を示し、図２のＢは組織の体積を示す。図２で確認できるように、軟骨再生用組成物の製造によって球形のゲル状組成物が製造され、その大きさ及び体積が培養期間によって増加することが確認された。これは、細胞ペレットから培養によって球形に細胞及び細胞外基質が増殖することによって製造されたものであり、ゲル状に相応して形態が容易に変形されることが確認された。
【００７８】
＜実施例２＞軟骨再生用組成物の組織学的分析
前記実施例１の細胞ペレットから軟骨再生用組成物を製造する過程で、１週経過毎に、４％ホルマリンで固定させた後、パラフィンに包埋し、４μｍ厚さに切断した後、蓄積された硫酸化されたプロテオグリカンの検出のために横断面にサフラニンＯ染色及びヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。
【００７９】
その結果を図３に示した。
【００８０】
図３で確認できるように、１週から３週に時間が経つにつれてヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）では細胞間隔が広くなり、細胞形態が軟骨細胞と類似していくことが確認された。また、サフラニンＯ染色はプロテオグリカンを染色する方法であり、２週及び３週でプロテオグリカンの量が増加し、軟骨で見られる小腔（ｌａｃｕｎａ）が形成されていることが確認された。
【００８１】
＜実施例３＞軟骨再生用組成物の総グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含量及び組成物組成分析
前記実施例１で、１週、２週及び３週間培養された軟骨再生用組成物の水分含有量、ＤＮＡ量、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とヒドロキシプロリンの含量を測定した。
【００８２】
このために、前記軟骨再生用組成物の水分含有量は、培養後の重さを測定し、凍結乾燥後の乾燥重量と比較したときの水分含有量を％で表現した。ＤＮＡ量は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  Ｋｉｔを用いて、乾燥重量１ｍｇに入っているＤＮＡ量を測定した。グリコサミノグリカンの含量は６０℃のパパイン溶液（５ｍＭＬ−システイン、１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、パパインタイプIII１２５μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．５）で１６時間分解した後、１２，０００×ｇ、１０分間遠心分離し、遠心分離した上澄み液とＤＭＢ（ジメチルメチレンブルー）を混合し、比色分析法（Ｈｅｉｄｅ，Ｔ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｏｔ，  Ｊ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １１２:２７１，１９９９）によって、ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢＩＯ−ＴＥＫ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＩＮＣ．，アメリカ）を用いて５５０ｎｍ波長で吸光度を測定した。総コラーゲン含量は、４Ｎ  ＨＣｌ溶液に溶かし、１２１℃で１０分間処理した後、１２，０００×ｇ、１０分間遠心分離し、遠心分離した上澄み液とクロラミンＴ及びジメチルアミノベンズアルデヒドを混合し、ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｅｒを用いて４８０ｎｍ波長で吸光度を測定した。対照群としては正常軟骨を使った。
【００８３】
その結果を図４に示した。
【００８４】
図４で確認できるように、水分含有量は平均９５％、ＤＮＡ量はそれぞれ１週に６．８８±１．０１μｇ／ｍｇ、２週に５．７４±０．４０μｇ／ｍｇ、３週に５．０５±０．７７μｇ／ｍｇで、時間が経つにつれてＤＮＡ量が減少することが確認できるが、大きさが大きくなることと比較したとき、ＤＮＡ量には変化がないことを確認することができる。生化学的に分析された総ＧＡＧ含量はそれぞれ１週に１６．７６±２．８μｇ／ｍｇ（乾燥重量）、２週に３５．８７±５．１μｇ／ｍｇ（乾燥重量）及び３週に４８．９８±８．０μｇ／ｍｇ（乾燥重量）で、培養期間が長くなるにつれてその含量が増加した。特に、天然軟骨組織のＧＡＧの量が約６２．８±５．１μｇ／ｍｇ（乾燥重量）であることを考慮すると、培養期間が長くなるにつれて軟骨再生用組成物の総ＧＡＧ含量が天然軟骨組織に近くなることを示した。ヒドロキシプロリンの量はそれぞれ１週に７．７８±１．８９μｇ／ｍｇ、２週に４０±１１．７４μｇ／ｍｇ、３週に８７．２±３．５７μｇ／ｍｇで、培養期間が長くなるにつれてその含量が増加した。
【００８５】
＜実施例４＞軟骨再生用組成物の物理的強度測定
万能試験機（Ｍｏｄｅｌ  Ｈ５Ｋ−Ｔ、Ｈ．Ｔ．Ｅ、イギリス）を用いて軟骨再生用組成物の圧縮強度を確認した。
【００８６】
前記実施例１で１週、２週及び３週間培養して製造した軟骨再生用組成物を対象として、まず体外条件で圧縮強度を測定し、ついで体外で２週間培養した軟骨再生用組成物をエクスビボモデルで２週、４週及び８週間培養した後、圧縮強度を測定して生体内培養による圧縮強度の変化を比較した。エクスビボ（Ｅｘ  ｖｉｖｏ）モデルは下記のような方法で作成された。まず、骨関節炎患者に対する膝軟骨置換術後に廃棄される軟骨組織（亜洲大学校病院ＩＲＢ  ＮＯ．  ＡＪＩＲＢ−ＭＥＤ−ＳＭＰ−１１−２０５）を取り出して実際の軟骨損傷と類似した形態に欠損を作った後、前記軟骨再生用組成物を欠損部位に挿入し、これをシロネズミの皮下に移植して２週、４週及び８週間培養した。
圧縮強度の測定のために、まず各試料（ｎ＝６）を写真撮影した後、イメージＪ（ｉｍａｇｅ  Ｊ）プログラムを用いて断面積及び高さを計算した。各試料を１ｍｍ／分の速度で組織の歪みが２０％となるまで押した後、歪みが１０〜１６％の区間でのヤング率の値を測定し、インビトロの結果とエクスビボの結果を図５に示した。
【００８７】
図５で確認できるように、軟骨再生用組成物はインビトロで１週に５．２１ｋＰａ、２週に１０．６２ｋＰａ、３週に１５．８３ｋＰａを示し、ゲル状を維持した。しかし、エクスビボの状態で２週に５０．８１ｋＰａ、４週に１５５．５８ｋＰａ、８週に６０２．０４ｋＰａで、体内環境で時間が経つにつれて強度が正常軟骨組織と類似した水準に増加した。
【００８８】
前記結果から、本発明による軟骨再生用組成物が人体に投与されるとき、軟骨組織と類似した圧縮強度を有することができることを確認した。
【００８９】
＜実施例５＞
細胞源の違いによる軟骨再生用組成物生成有無の確認
細胞源を異にしながら本発明による胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む軟骨再生用組成物の軟骨素材への利用可能性を確認した。
【００９０】
本発明の実施例１による軟骨再生用組成物と比較するために、実施例１の方法と同様に製造するが、細胞源としてヒトの胎児軟骨細胞から軟骨再生用組成物を製造した。
【００９１】
前記両軟骨再生用組成物はいずれも３週間軟骨培地で培養したものを使った。前記軟骨再生用組成物を４％ホルマリンで固定させた後、パラフィンに包埋し、４μｍ厚さに切断した後、横断面にサフラニンＯ染色を行った。
【００９２】
その結果を図６に示した。
【００９３】
図６で確認できるように、ヒトの胎児軟骨細胞人工軟骨組織の場合、組織の外側にだけプロテオグリカンが発現するが、ヒトの胎児軟骨前駆細胞人工軟骨組織の場合は、組織全般にわたってプロテオグリカンが均一に分布していることを確認し、本発明による軟骨再生用組成物の優れた効果を確認した。すなわち、細胞源として胎児軟骨前駆細胞及びその細胞外基質を使う場合に限り、本発明の軟骨再生用組成物が製造されることを確認することができる。
【００９４】
＜実施例６＞軟骨再生用組成物の塗布性分析
万能試験機（Ｍｏｄｅｌ  Ｈ５Ｋ−Ｔ、Ｈ．Ｔ．Ｅ、イギリス）を使って、前記実施例１で製造した軟骨再生用組成物の塗布性（拡散程度）を測定した。
【００９５】
軟骨再生用組成物の物理的特性を考慮して塗布性測定に対する実験方法を設定した。軟骨再生用組成物（ｎ＝６）の重さを測定し、平たい底に置いた後、ジグを用いて１ｍｍ／分の速度で１秒間５Ｎの力を垂直に試料に加えた。試料の写真を撮影した後、映像をイメージＪ（ｉｍａｇｅ  Ｊ）プログラムで分析することにより、試料が底に拡散している面積を計算した。
【００９６】
その結果を図７に示した。
【００９７】
図７のＡは塗布性を肉眼で確認した結果を示し、図７のＢはこれを数値に置換した結果を示す。図７で確認できるように、培養期間による試料の塗布性を分析した結果、１週に１．０９±０．０６２ｍｍ２／ｍｇ、２週に０．７７±０．００１ｍｍ２／ｍｇ、３週に０．４８±０．００４ｍｍ２／ｍｇを示すことから、時間が経つにつれて単位重さ当たり塗布性が低下することを確認した。これは、前記実施例４で培養期間が経つにつれて軟骨再生用組成物の強度が高くなり組織が堅くなる結果と関連性があると思われた。
【００９８】
一般に知られた軟骨再生用素材は荷重に耐える強度にのみ集中して技術が開発されたが、軟骨損傷部位に軟骨再生用素材が適切に塗布できない問題があった。
【００９９】
すなわち、本発明による軟骨再生用組成物は、既知の軟骨再生用素材とは違い、軟骨損傷部位に挿入したとき、損傷部位に合うように広がって塗布される特徴を示すことを確認した。
【０１００】
＜実施例７＞軟骨再生用組成物の付着性分析
万能試験機（Ｍｏｄｅｌ  Ｈ５Ｋ−Ｔ、Ｈ．Ｔ．Ｅ、イギリス）を使って、前記実施例１で製造した軟骨再生用組成物の付着性を測定した。
【０１０１】
人工関節手術後に廃棄される患者の軟骨組織を同意書とともに提供を受けた。患者の軟骨組織の表面に６ｍｍ生検パンチ（ｂｉｏｐｓｙ  ｐｕｎｃｈ）を用いて軟骨損傷モデルを製作し、製造された軟骨再生用組成物を挿入した。その後、直径５ｍｍのジグを挿入された軟骨再生用組成物に接触させて付着させた後、１．３ｍｍ／分の速度で引き上げながらジグが軟骨再生用組成物から分離されるまでの抵抗力を測定した。ゲル状の生体素材であるアルギン酸塩を軟骨損傷モデルに同様に挿入して付着性を比較した。
【０１０２】
その結果を図８に示した。
【０１０３】
図８のＡは前記実験モデルとして大人の軟骨組織を用いて軟骨欠損を製作して付着性をテストした結果を示す写真であり、図８のＢは培養期間による軟骨再生用組成物の付着性の変化を確認した結果を示す。
【０１０４】
図８のＢで確認できるように、培養期間による試料の付着性を分析した結果、１週に２．６２４±０．１５４ｋＰａ、２週に１．７９９±０．１４６ｋＰａ、３週に１．０５８±０．０６７ｋＰａで、時間が経つにつれて軟骨再生用組成物と患者軟骨組織の付着力が少しずつ減少したが、対照群として使用したアルギン酸塩（０．０９４±０．０１４ｋＰａ）と比較すると、格段に高い付着力を持っていることを確認した。
【０１０５】
前記結果から、本発明による軟骨再生用組成物は、既存のゲル状試料に比べ、軟骨組織で非常に高い付着力を持っており、培養期間の経過につれて付着力を適度に調節することができることが確認された。
【０１０６】
＜実施例８＞培地組成による軟骨再生用組成物生成有無確認
培地組成の変化による軟骨再生用組成物の生成変化を確認するために、培地の組成を変更しながら実施例１の方法と同様に軟骨再生用組成物を製造した。
【０１０７】
前記実施例１で３週間培養で製造した軟骨再生用組成物とウシ胎児血清を含む分化培地（培地組成：１％抗菌・抗真菌剤、１．０ｍｇ／ｍＬインシュリン、０．５５ｍｇ／ｍＬヒトトランスフェリン、０．５ｍｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、１００ｎＭデキサメタゾン、４０μｇ／ｍＬプロリン及び１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−βを含むダルベッコ変法イーグル培地−高グルコース（ＤＭＥＭ−ＨＧ））を培地として３週間培養で製造した組成物をサフラニンＯ染色によって分析した。前記それぞれの組成物を４％ホルマリンで固定させた後、パラフィンに包埋し、４μｍ厚さに切断した後、横断面にサフラニンＯ染色を行った。
【０１０８】
その結果を図９に示した。
【０１０９】
図９で確認できるように、軟骨分化培地（培地１）で製造された軟骨再生用組成物は細胞全般にわたってＧＡＧが確認されたが、牛胎児血清を含む分化培地（培地２）で製造された組成物は表面にだけ軟骨のＧＡＧが残っており、中心部の細胞は死滅したことが確認された。
前記結果から、本発明による軟骨再生用組成物の製造において、軟骨培地が適した培地組成を有することを確認した。
【０１１０】
＜実施例９＞軟骨再生用組成物の組織学的及び免疫学的特性確認
実施例１で軟骨培地に２週間培養して製造した軟骨再生用組成物を軟骨損傷モデルと同じ形態のブロックを作って移植した後、ヌードマウスの皮下に２週、４週、８週及び１２週間培養し、一般に臨床に使われる骨軟骨自己移植術（Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＯＡＴ）を対照群として使った。該当組織を取り出し、それぞれのブロックを４％ホルマリンで固定させた後、パラフィンに包埋し、４μｍ厚さに切断した後、横断面にサフラニンＯ染色とコラーゲンの量を肉眼で確認するための免疫組織化学的染色を行った。免疫染色で第一コラーゲンと第二コラーゲンを確認した。
【０１１１】
その結果を図１０に示した。
【０１１２】
図１０で確認できるように、軟骨再生用組成物を移植した後、時間が経つにつれて正常軟骨と類似した形態を示すことが確認された。具体的に、プロテオグリカンの量を確認することができるサフラニンＯは、移植２週後には発現がほとんどないことを確認したが、時間が経つにつれて正常軟骨と類似したことを確認した。軟骨が脱分化する場合は第一コラーゲンの量が多くなるが、軟骨に分化して正常硝子軟骨に分化する場合は第二コラーゲンの量が増加する。エクスビボで２週には第一及び第二コラーゲンが染色されなかったが、４週及び８週に経つにつれて第二コラーゲンの量が増加することが発見された。１２週後には第二コラーゲンの量が正常軟骨と類似した結果を示した。特に、軟骨に一番多いコラーゲンであるＩＩ型コラーゲンの発現が１２週目に正常軟骨と類似した水準までに到逹したことが確認された。
【０１１３】
＜実施例１０＞蛍光発現因子ＰＫＨ−２６標識した軟骨再生用組成物の体内付着確認
細胞の表面に標識される蛍光発現因子ＰＫＨ−２６を標識した細胞を前記実施例１の方法にしたがって軟骨培地で培養して軟骨再生用組成物を製造し、培養１日目と７日目にＰＫＨ−２６の発現有無を確認した。
【０１１４】
その結果を図１１に示した。図１１に示したように、インビトロにおいて軟骨再生用組成物で蛍光因子がよく発現することが確認された。
【０１１５】
その後、製造された軟骨再生用組成物をシロネズミの部分軟骨損傷モデルに移植した。
【０１１６】
具体的に、８週齢のシロネズミの膝を切開し、１２号キュレットで大腿骨の軟骨部分を掻いて損傷を作った後、ＰＫＨ−２６蛍光標識因子が付着された軟骨再生用組成物を移植した。
【０１１７】
移植してから３日後と７日後、移植した部位の膝を分離し、凍結切片機で４μｍ厚さの切片にしてスライドを製作した。光学顕微鏡と蛍光顕微鏡を用い、部分軟骨損傷部位の組織と蛍光発現を確認して、移植された軟骨再生用組成物の残存状態を調査した。その結果を図１２に示した。
【０１１８】
図１２で確認できるように、軟骨再生用組成物が塗布されてから３日後及び７日後、いずれも軟骨再生組成物が軟骨損傷部位に付着していることが確認された。
【０１１９】
前記結果から、インビボで本発明による軟骨再生用組成物が患部に塗布されて付着することができることが確認された。
【０１２０】
＜実施例１１＞ウサギの部分軟骨損傷モデルにおける軟骨再生用組成物移植による軟骨再生効果の確認
本発明の実施例１によってインビトロにおいて２週間軟骨培地で培養させた軟骨再生用組成物を実施例９のように製作したウサギの部分層軟骨欠損モデルに移植した。
【０１２１】
移植してから６週及び１２週後、軟骨組織の再生を肉眼で確認し、損傷部位の回復を組織学的染色であるサフラニンＯ染色法で確認した。
【０１２２】
その結果を図１３に示した。
【０１２３】
図１３において、ＡＣＩは自己軟骨細胞移植群、Ｄｅｆｅｃｔは無処理群及びインビトロ２週は２週間軟骨分化培地で培養された軟骨再生用組成物を用いた実験結果を示す。
【０１２４】
図１３で確認できるように、本発明による軟骨再生用組成物を移植してから６週及び１２週が経ったとき、軟骨損傷部位がほとんど確認されないほどに正常組織とほぼ同じに軟骨組織が回復することが確認された。このような効果は陽性対照群である自己軟骨細胞移植群とほぼ同じ水準の効果であることが確認された。
【０１２５】
＜実施例１２＞サル膝軟骨損傷モデルにおいて軟骨再生用組成物移植による軟骨再生効果の確認
サルの膝の大腿骨内側顆（Ｍｅｄｉａｌ  Ｃｏｎｄｙｌｅ）の部分に３ｍｍ生検パンチ（ｂｉｏｐｓｙ  ｐｕｎｃｈ）を用いて軟骨損傷モデルを製作した。損傷された軟骨欠損部位にインビトロで２週間培養した軟骨再生用組成物を移植し、８週、１６週及び２４週間ＭＲＩを撮影して軟骨再生程度を確認した。対照群としては何ら処置しない群を使った。
【０１２６】
前記動物モデルにおける軟骨再生効果はＭＲＩ、サフラニンＯ染色及びヘマトキシリン・エオジン染色で確認した。
【０１２７】
図１４はＭＲＩで分析した実験結果を示す。図１４で確認できるように、２４週間のＭＲＩ結果では時間が経つにつれて軟骨再生用組成物を移植した群で軟骨が形成されることを確認することができ、２４週後に動物を屠殺して肉眼で観察したときにも移植した部位が見えないほどに正常軟骨に再生されたことを確認した。
【０１２８】
また、図１５で、サフラニンＯ染色及びヘマトキシリン・エオシン染色結果から何ら処置しない対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は軟骨が崩れ、プロテオグリカンの量が減少したが、軟骨再生用組成物を移植した実験群（Ａｒｔｉｐａｓｔｅ）における軟骨損傷部位が正常に回復していることを確認した。また、移植した部位である大腿骨部分だけではなくて滑車（Ｔｒｏｃｈｌｅａ）の部分と外側顆（Ｌａｔｅｒａｌ  Ｃｏｎｄｙｌｅ）の部分でも対照群は損傷されて軟骨が崩れたが、軟骨再生用組成物を移植した群では移植した部位の軟骨が形成され、周辺の組織にも影響を及ぼさなかったことが分かった。
【図１】
2019523289.tif 000003
【図２】
2019523289.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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