(57)【要約】本発明は、ワクチン及び単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団を投与することによってワクチンに対する免疫応答を増強する方法を提供する。本発明はまた、第１の容器にワクチン及び第２の容器に単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団を含むキットを提供する。【選択図】  図５Ｄ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンに対する対象の免疫応答を増強する方法又は非応答対象において免疫応答を誘導する方法であって、前記ワクチンとアジュバントを免疫防御量で同時若しくは順次、前記対象に投与するステップを含み、前記アジュバントが、単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団である、方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が非ヒト動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非ヒト動物がイヌである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト対象が、加齢フレイルの症状を呈する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト対象が、インフラメージングを呈する、請求項２又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記間葉系幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記間葉系幹細胞が、ＳＴＲＯ−１を発現しない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記間葉系幹細胞が、ＣＤ４５を発現しない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記間葉系幹細胞が、線維芽細胞表面マーカーを発現しないか、又は線維芽細胞形態を有さない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記間葉系幹細胞が、遺伝子操作されていない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ワクチンが一価である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ワクチンが多価である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ワクチンが、１つ又は複数の不活化ウイルスを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ又は複数の不活化ウイルスが、アデノウイルス、ピコルナウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、ヘパドナウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、ヒトエンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、トガウイルス、及び風疹ウイルスからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ワクチンが、不活化オルソミクソウイルスを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ワクチンが、不活化インフルエンザウイルスを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ワクチンが、１つ又は複数の生きた弱毒化ウイルスを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ又は複数の弱毒化ウイルスが、アデノウイルス、ピコルナウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、ヘパドナウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、ヒトエンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、トガウイルス、及び風疹ウイルスからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ワクチンが、インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）、ヘマグルチニン２（ＨＡ２）、インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）糖タンパク質１（ｇｐ１）、ＬＡＳＶ糖タンパク質２（ｇｐ２）、ＬＡＳＶヌクレオカプシド関連タンパク質（ＮＰ）、ＬＡＳＶ  Ｌタンパク質、ＬＡＳＶ  Ｚタンパク質、ＳＡＲＳウイルスＳタンパク質、エボラウイルスＧＰ２、麻疹ウイルス融合１（Ｆ１）タンパク質、ＨＩＶ−１膜貫通（ＴＭ）タンパク質、ＨＩＶ−１糖タンパク質４１（ｇｐ４１）、ＨＩＶ−１糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ糖タンパク質１（Ｅ１）、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質２（Ｅ２）、ＨＣＶヌクレオカプシドタンパク質（ｐ２２）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）エンベロープ糖タンパク質１（Ｅ１）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ｇＤタンパク質、ＨＳＶ−１  ｇＧタンパク質、ＨＳＶ−２  ｇＤタンパク質、ＨＳＶ−２  ｇＧタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）糖タンパク質１２５（ｇｐ１２５）、細菌外膜タンパク質アセンブリ因子ＢａｍＡ、細菌移行アセンブリモジュールタンパク質ＴａｍＡ、細菌ポリペプチド輸送関連タンパク質ドメインタンパク質、細菌表面抗原Ｄ１５、炭疽菌保護タンパク質、炭疽菌致死的因子、炭疽菌浮腫因子、チフス菌Ｓ１Ｄａ、チフス菌Ｓ１Ｄｂ、コレラ毒素、コレラ熱ショックタンパク質、ボツリヌス菌抗原Ｓ、ボツリヌス毒素、ペスト菌Ｆ１、ペスト菌Ｖ抗原、ペスト菌ＹｏｐＨ、ペスト菌ＹｏｐＭ、ペスト菌ＹｏｐＤ、ペスト菌プラスミノーゲン活性化因子（Ｐｌａ）、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）、マラリア原虫スポロゾイト表面タンパク質（ＳＳＰ２／ＴＲＡＰ）、マラリア原虫肝臓期抗原１（ＬＳＡＴ）、マラリア原虫搬出タンパク質１（ＥＸＰ  １）、マラリア原虫赤血球結合抗原１７５（ＥＢＡ−１７５）、マラリア原虫システインリッチ防御抗原（ｃｙＲＰＡ）、マラリア原虫熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）、住血吸虫Ｓｍ２９、及び住血吸虫シグナル伝達タンパク質１４−３−３からなる群から選択される抗原性ポリペプチドのうちの１つ又は複数を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アジュバントが、前記ワクチンの前に投与される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アジュバントが、前記ワクチンが投与される少なくとも１週間前に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アジュバントが、前記ワクチンが投与される少なくとも２週間前に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記アジュバントが、前記ワクチンが投与される少なくとも３週間前に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記アジュバントが、前記ワクチンが投与される少なくとも４週間前に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記アジュバントが、少なくとも１年間続く長期間のワクチン応答の増強のために投与される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アジュバントが、全身投与される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記アジュバントが、注入又は直接注射によって投与される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記アジュバントが、静脈内、動脈内、又は腹腔内投与される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記アジュバントが、静脈内投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ワクチンが、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、皮内、経口、又は鼻腔内投与される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ワクチンが、筋肉内投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アジュバントが、約２０×１０６の間葉系幹細胞の用量で投与される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記アジュバントが、約１００×１０６の間葉系幹細胞の用量で投与される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記アジュバントが、約２００×１０６の間葉系幹細胞の用量で投与される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記間葉系幹細胞がヒトドナーから得られ、前記ワクチン及びアジュバントの前記対象への投与に先立って、前記対象に対する前記ヒトドナーのＭＨＣ照合のステップが利用されない、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも２つの容器を有するキットであって、第１の容器にワクチン及び第２の容器にアジュバントを含み、前記アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団である、キット。
【請求項３８】
前記間葉系幹細胞が凍結保存されている、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
第３の容器に希釈緩衝液をさらに含む、請求項３７又は３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記間葉系幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４１】
前記間葉系幹細胞が、ＳＴＲＯ−１を発現しない、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４２】
前記間葉系幹細胞が、ＣＤ４５を発現しない、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４３】
前記間葉系幹細胞が、線維芽細胞表面マーカーを発現しないか、又は線維芽細胞形態を有さない、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４４】
前記間葉系幹細胞が、遺伝子操作されていない、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４５】
前記ワクチンが一価である、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４６】
前記ワクチンが多価である、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４７】
前記ワクチンが、１つ又は複数の不活化ウイルスを含む、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４８】
前記１つ又は複数の不活化ウイルスが、アデノウイルス、ピコルナウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、ヘパドナウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、ヒトエンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、トガウイルス、及び風疹ウイルスからなる群から選択される、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記ワクチンが、不活化オルソミクソウイルスを含む、請求項４７又は４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記ワクチンが、不活化インフルエンザウイルスを含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記ワクチンが、１つ又は複数の生きた弱毒化ウイルスを含む、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５２】
前記１つ又は複数の弱毒化ウイルスが、アデノウイルス、ピコルナウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、ヘパドナウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、ヒトエンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、トガウイルス、及び風疹ウイルスからなる群から選択される、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記ワクチンが、インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）、ヘマグルチニン２（ＨＡ２）、インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）糖タンパク質１（ｇｐ１）、ＬＡＳＶ糖タンパク質２（ｇｐ２）、ＬＡＳＶヌクレオカプシド結合タンパク質（ＮＰ）、ＬＡＳＶ  Ｌタンパク質、ＬＡＳＶ  Ｚタンパク質、ＳＡＲＳウイルスＳタンパク質、エボラウイルスＧＰ２、麻疹ウイルス融合１（Ｆ１）タンパク質、ＨＩＶ−１膜貫通（ＴＭ）タンパク質、ＨＩＶ−１糖タンパク質４１（ｇｐ４１）、ＨＩＶ−１糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ糖タンパク質１（Ｅ１）、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質２（Ｅ２）、ＨＣＶヌクレオカプシドタンパク質（ｐ２２）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）エンベロープ糖タンパク質１（Ｅ１）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ｇＤタンパク質、ＨＳＶ−１  ｇＧタンパク質、ＨＳＶ−２  ｇＤタンパク質、ＨＳＶ−２  ｇＧタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）糖タンパク質１２５（ｇｐ１２５）、細菌外膜タンパク質アセンブリ因子ＢａｍＡ、細菌移行アセンブリモジュールタンパク質ＴａｍＡ、細菌ポリペプチド輸送関連タンパク質ドメインタンパク質、細菌表面抗原Ｄ１５、炭疽菌保護タンパク質、炭疽菌致死的因子、炭疽菌浮腫因子、チフス菌Ｓ１Ｄａ、チフス菌Ｓ１Ｄｂ、コレラ毒素、コレラ熱ショックタンパク質、ボツリヌス菌抗原Ｓ、ボツリヌス毒素、ペスト菌Ｆ１、ペスト菌Ｖ抗原、ペスト菌ＹｏｐＨ、ペスト菌ＹｏｐＭ、ペスト菌ＹｏｐＤ、ペスト菌プラスミノーゲン活性化因子（Ｐｌａ）、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）、マラリア原虫スポロゾイト表面タンパク質（ＳＳＰ２／ＴＲＡＰ）、マラリア原虫肝臓期抗原１（ＬＳＡＴ）、マラリア原虫搬出タンパク質１（ＥＸＰ  １）、マラリア原虫赤血球結合抗原１７５（ＥＢＡ−１７５）、マラリア原虫システインリッチ防御抗原（ｃｙＲＰＡ）、マラリア原虫熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）、住血吸虫Ｓｍ２９、及び住血吸虫シグナル伝達タンパク質１４−３−３からなる群から選択される抗原性ポリペプチドのうちの１つ又は複数を含む、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
前記ワクチンの最初の投与の少なくとも６か月後に前記ワクチン及び前記アジュバントの投与を繰り返すステップをさらに含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
対象における免疫応答を誘導する方法であって、ワクチン及びアジュバントを免疫防御量で同時又は順次、前記対象に投与するステップを含み、前記アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団であり、さらに、前記対象のＢ細胞における細胞内ＴＮＦ−α発現が、前記アジュバントの投与前の前記対象のＢ細胞におけるＴＮＦ−α発現レベルと比較して少なくとも２分の１に低下する、方法。
【請求項５６】
対象における免疫応答を誘導する方法であって、ワクチン及びアジュバントを免疫防御量で同時又は順次、前記対象に投与するステップを含み、前記アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団であり、さらに、前記対象におけるＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比が、前記アジュバントの投与前の前記対象におけるＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比と比較して少なくとも２倍増加する、方法。
【請求項５７】
対象における免疫応答を誘導する方法であって、ワクチン及びアジュバントを免疫防御量で同時又は順次、前記対象に投与するステップを含み、前記アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団であり、さらに、前記対象におけるスイッチしたメモリＢ細胞の数が、前記アジュバントの投与前の前記対象におけるスイッチしたメモリＢ細胞の数と比較して少なくとも２倍増加する、方法。
【請求項５８】
対象における免疫応答を誘導する方法であって、ワクチン及びアジュバントを免疫防御量で同時又は順次、前記対象に投与するステップを含み、前記アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団であり、さらに、前記対象における疲弊Ｂ細胞の数が、前記アジュバントの投与前の前記対象における疲弊Ｂ細胞の数と比較して少なくとも２分の１に減少する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、ワクチン及びワクチンアジュバント、それを使用する方法、並びにそれを含むキットに関する。特に、本発明は、単離同種ヒト間葉系幹細胞を含む、ワクチンアジュバントに関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢フレイル及びインフラメージング
[0002]加齢フレイルは、個体の全体的な健康及び幸福に非常に重大な問題を引き起こす。加齢フレイルは、虚弱、低い身体活動、ゆっくりとした運動行為、極度の疲労、及び意図していない体重減少を特徴とする老年症候群である。Ｙａｏ，  Ｘ．ら、Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｉｎ  Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２７（１）：７９〜８７ページ（２０１１年）を参照。さらに、加齢フレイルと炎症との間の直接的な相関関係を示す多くの研究が存在する。Ｈｕｂｂａｒｄ，  Ｒ．Ｅ．ら、Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  １１（５）：６３５〜６４１ページ（２０１０年）を参照。
【０００３】
[0003]免疫老化は、インフラメージングとして知られる、低度の慢性の全身炎症状態を特徴とする。Ｆｒａｎｃｅｓｈｉ，  Ｃ．ら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９０８：２４４〜２５４ページ（２０００年）を参照。加齢及び加齢フレイルに見られるこの高い炎症状態又は慢性炎症は、免疫調節異常並びに自然免疫及び獲得免疫の両方の複雑な再構築につながる。免疫老化において、Ｔ細胞及びＢ細胞レパートリーは、ＣＤ４５ｒａ（ＴＥＭＲＡ）を再発現しているＣＤ８＋エフェクターメモリＴ細胞及びＣＤ１９＋後期／疲弊メモリＢ細胞の増加、並びにＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、及びスイッチしたメモリＢ細胞（ＣＤ２７＋）の減少の結果として偏る。Ｂｌｏｍｂｅｒｇ，  Ｂ．Ｂ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７（１〜３）：３５４〜３６０ページ（２０１３年）；Ｃｏｌｏｎｎａ−Ｒｏｍａｎｏ，  Ｇ．ら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ａｇｅｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０（１０）：６８１〜６９０ページ（２００９年）；及びＫｏｃｈ  Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ＆  Ａｇｅｉｎｇ：  ５：６（２００８年）を参照。Ｔ細胞及びＢ細胞レパートリーのこの変化は、難治性免疫状態又は効率が低い免疫状態をもたらす。この免疫系の悪化は、感染症の罹患率を高く、ワクチン接種に対する応答を低くする。最適なＢ細胞の機能は、ワクチンに対する効果的な抗体応答及び感染病原体からの保護をもたらすために重要である。全身性炎症（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＮＦγ及びＣＲＰ）の年齢に関係する増加がＢ細胞の機能の低下を引き起こし、不十分な抗体応答及び低いワクチン効果につながることは周知である。
【０００４】
[0004]インフラメージングは、免疫変化と老齢に一般的な多くの疾患及び状態（加齢フレイルなど）との間の関連を提示しているため、かなり注目されてきた。サイトカイン及び急性期タンパク質などの循環する炎症性メディエーターは、加齢に伴い増加することが確認されている、低度の炎症のマーカーである。これらの炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）は、外来性抗原及びワクチンに対する防御抗体を産生するＢ細胞の能力を低下させる。この低下したＢ細胞の応答は、ＩｇＭから二次的なアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＥ）に、アイソタイプをスイッチする免疫グロブリンの能力であるクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の低下によって測定される。免疫グロブリンのアイソタイプスイッチは、エフェクター機能がそれぞれのアイソタイプで異なるため、適切な免疫応答には非常に重要である。ＣＳＲ及び体細胞超変異（ＳＨＭ）における重要な関与物は、Ａｉｃｄａ遺伝子によってコードされる酵素、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である。ＣＳＲ及びＳＨＭにおけるＡＩＤの基本的な機能は、免疫グロブリンのスイッチ領域及び可変領域のシトシンをウラシルに変換することによってＤＮＡの切断を開始することである。Ｔｃｆｅ２ａ（Ｅ２Ａ）遺伝子によってコードされるＥ４７は、Ｅタンパク質としても知られているクラスＩベーシックヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）タンパク質に属する転写因子である。Ｅ４７の発現がないと、Ｂ細胞特異的転写因子ＥＢＦ１（初期Ｂ細胞因子）及びＰａｘ−５（ペアードボックスタンパク質）は発現しない。Ｅ４７及びＰａｘ−５はともにＢ細胞系列の初期の発生及び成熟Ｂ細胞の機能において重要な転写因子である。Ｈａｇｍａｎ  Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７（１）：８〜１０ページ（２００７年）；Ｈｏｒｃｈｅｒ  Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４（６）：７７９〜７９０ページ（２００１年）；Ｒｉｌｅｙ  Ｒ．Ｌ．ら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７（５）：３３０〜３３６ページ（２００５年）を参照。Ｐａｘ−５遺伝子は、Ｂ細胞の分化のすべての段階で発現するが、最終分化したＢ細胞では発現しないＢ細胞系列特異的活性化タンパク質（ＢＳＡＰ）をコードする。Ｐａｘ−５は、Ｂ系列の不適切な遺伝子を抑制し、Ｂ細胞特異的遺伝子を活性化して、Ｂ細胞のゲートキーパーであるＰａｘ−５を産生することによってＢ細胞コミットメントを制御し、コミットプロＢ細胞から成熟Ｂ細胞の段階のＢリンパ球系列においてもっぱら発現される。Ｂ細胞特異的転写因子Ｐａｘ−５は、初期のＢ細胞の発生及びＢ細胞系列コミットメントにおいて極めて重要なだけでなく、ＣＳＲにも関与する。
【０００５】
[0005]産生されるＴＮＦ−αの量は、（１）系の炎症の量により決まり、（２）マイトジェン又は抗原により刺激される同じＢ細胞の能力を低下させることもヒトで示された。Ｆｒａｓｃａ，  Ｄ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８８（１）：２７９〜２８６ページ（２０１２年）を参照。このように、加齢フレイルに悩まされている対象における免疫応答は、多くの理由のために低下している。
【０００６】
高齢者のワクチン接種
[0006]感染から保護するために６５歳を超える個体にインフルエンザに対するワクチン接種が強く推奨されている。インフルエンザに対する市販のワクチンは、小児及び成人において保護をもたらし、免疫記憶を確実に継続するが、高齢者及び虚弱な個体ではあまり効果がない。Ｆｒａｓｃａ  Ｄ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２９：１１２〜１１８ページ（２０１４年）及びＹａｏ  Ｘ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９（３１）：５０１５〜５０２１ページ（２０１１年）を参照。定期的にインフルエンザワクチンを受けているにもかかわらず、高齢の個体はインフルエンザに感染するリスクがより高く、二次性合併症、入院、身体的衰弱、最終的に死亡につながる。Ｇｒｏｓｓ，  Ｐ．ら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２３（７）：５１８〜５２７ページ（１９９５年）；Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  Ｌ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １７８（１）：５３〜６０ページ（１９９８年）；及びＶｕ  Ｔ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０（１３−１４）：１８３１〜１８３６ページ（２００２年）を参照。インフルエンザワクチンは、大半の高齢の個体においてインフルエンザ感染症から生じる他の合併症（例えば、肺炎）も予防して、入院の割合をある程度にまで低下させる。Ｎｉｃｈｏｌ  Ｋ．Ｌ．ら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３３１（１２）：７７８〜７８４ページ（１９９４年）。しかしながら、インフルエンザ関連疾患のための入院の割合は依然として非常に高い。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｗ．Ｗ．ら、ＪＡＭＡ  ２９２（１１）：１３３３〜１３４０ページ（２００４年）を参照。このように、高齢者におけるワクチンの免疫応答を増強するための必要性が依然として存在する。
【０００７】
[0007]以前に公開された結果は、インビトロにおけるインフルエンザワクチンに対するＢ細胞の特異的応答（ＡＩＤによって測定される）、及びインビボにおける血清応答（ＨＡＩアッセイ及びＥＬＩＳＡによって測定される）が加齢に伴い低下し、著しく相関していることを示した。Ｆｒａｓｃａ，  Ｄ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８（５１）：８０７７〜８０８４ページ（２０１０年）を参照。ともにワクチン接種前に測定されたスイッチしたメモリＢ細胞及びＣｐＧに誘導されたＡＩＤのパーセンテージ（ｔ０）は加齢に伴い低下し、インビボにおける応答と著しく相関していることもわかった。このように、これらのマーカーは、インビボにおける応答を予想する。
【０００８】
間葉系幹細胞
[0008]間葉系幹細胞は、損傷の部位に移行することができる複能性細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）であると同時に検出できない程度に主要組織適合抗原クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）分子を発現すること、及び低レベルでＭＨＣ−Ｉ分子を発現することによって免疫特権も有する。Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ，  Ｋ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ３７１（９６２４）：１５７９〜１５８６ページ（２００８年）及びＫｌｙｕｓｈｎｅｎｋｏｖａ  Ｅ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  １２（１）：４７〜５７ページ（２００５年）を参照。したがって、同種間葉系幹細胞は、治療薬及び再生医療に対して大きな将来性を保持し、複数の疾患の過程に対する臨床試験において高い安全性及び有効性プロフィールを有することが繰り返し示されてきた。Ｈａｒｅ，  Ｊ．Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ５４（２４）：２２７７〜２２８６ページ（２００９年）；Ｈａｒｅ，  Ｊ．Ｍ．ら、Ｔｅｘ．  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｓｔ．  Ｊ．  ３６（２）：１４５〜１４７ページ（２００９年）；及びＬａｌｕ，  Ｍ．Ｍ．ら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ７（１０）：ｅ４７５５９  （２０１２年）を参照。間葉系幹細胞は、患者への移植後に悪性形質転換を起こさないことも示された。Ｔｏｇｅｌ  Ｆ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２８９（１）：Ｆ３１〜Ｆ４２  （２００５年）を参照。間葉系幹細胞による処置は、重度の移植片対宿主病を回復させる、急性虚血性腎不全を防ぐ、糖尿病における膵島及び腎糸球体修復に寄与する、劇症肝不全を逆行させる、損傷した肺組織を再生する、敗血症を和らげる、及び心筋梗塞後のリモデリングを逆行させ、心機能を改善することが示された。Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  Ｋ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ３７１（９６２４）：１５７９〜１５８６ページ（２００８年）；  Ｈａｒｅ，  Ｊ．Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ５４（２４）：２２７７〜２２８６ページ（２００９年）；  Ｔｏｇｅｌ  Ｆ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２８９（１）：Ｆ３１〜Ｆ４２  （２００５年）；  Ｌｅｅ  Ｒ．Ｈ．ら、ＰＮＡＳ  １０３（４６）：１７４３８〜１７４４２ページ（２００６）；  Ｐａｒｅｋｋａｄａｎ，  Ｂ．ら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ２（９）：ｅ９４１  （２００７年）；  Ｉｓｈｉｚａｗａ  Ｋ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５５６（１−３）：２４９〜２５２ページ（２００４年）；  Ｎｅｍｅｔｈ  Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５（１）：４２〜４９ページ（２００９年）；  Ｉｓｏ  Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ３５４（３）：７００〜７０６ページ（２００７年）；  Ｓｃｈｕｌｅｒｉ  Ｋ．Ｈ．ら、Ｅｕｒ．  Ｈｅａｒｔｈ  Ｊ．  ３０（２２）：２７２２〜２７３２ページ（２００９年）；及びＨｅｌｄｍａｎ  Ａ．Ｗ．ら、ＪＡＭＡ  ３１１（１）：６２〜７３ページ（２０１４年）を参照。さらに、間葉系幹細胞は、組織工学に使用するための複数の細胞種の潜在的供��源でもある。Ｇｏｎｇ  Ｚ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ６９８：２７９〜２９４ページ（２０１１年）；  Ｐｒｉｃｅ，  Ａ．Ｐ．ら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ  １６（８）：２５８１〜２５９１ページ（２０１０年）；及びＴｏｇｅｌ  Ｆ．ら、Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ７（２）：９６〜１００ページ（２０１１年）を参照。
【０００９】
[0009]間葉系幹細胞は、免疫調節能力を有する。間葉系幹細胞は、免疫抑制毒性の所見がなく炎症並びにリンパ球及び骨髄由来免疫細胞のサイトカイン産生を制御し、低免疫原性である。Ｂｅｒｎａｒｄｏ  Ｍ．Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １３（４）：３９２〜４０２ページ（２０１３年）を参照。
【００１０】
[00010]間葉系幹細胞はまた、中胚葉起源の細胞だけでなく、内胚葉及び外胚葉起源の細胞にも分化する能力を有する。Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  Ｋ．ら、Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３１（１０）：８９０〜８９６ページ（２００３年）を参照。例えば、インビトロにおいて、気道増殖培地中で培養した間葉系幹細胞は、分化して、肺特異的上皮マーカー、例えば、サーファクタントタンパク質Ｃ、クララ細胞分泌タンパク質、及び甲状腺転写因子１を発現する。Ｊｉａｎｇ  Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１８（６８９３）：４１〜４９ページ（２００２年）及びＫｏｔｔｏｎ  Ｄ．Ｎ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８（２４）：５１８１〜５１８８ページ（２００１年）を参照。
【００１１】
[00011]インビボ研究は、ヒト間葉系幹細胞が、ヒツジ胎児に移植されたときに、筋細胞及び心筋細胞を含む、さまざまな細胞種への部位特異的な分化を起こすことを示した。Ａｉｒｅｙ  Ｊ．Ａ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９（１１）：１４０１〜１４０７ページ（２００４年）を参照。これらの間葉系幹細胞は、非免疫抑制免疫適格宿主への移植後、複数の組織で１３か月もの長い間残ることができる。齧歯類、イヌ、ヤギ、及びヒヒを使用した他のインビボ研究は、ヒト間葉系幹細胞異種移植片がレシピエントにおいてリンパ球増殖又は全身的な同種抗体産生を誘起しないことを同様に示している。Ｋｌｙｕｓｈｎｅｎｋｏｖａ  Ｅ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  １２（１）：４７〜５７ページ（２００５年）；  Ａｇｇａｒｗａｌ  Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １０５（４）：１８１５〜２２ページ（２００５年）；  Ａｕｇｅｌｌｏ  Ａ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ５６（４）：１１７５〜８６ページ（２００７年）；  Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ  Ａ．ら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３０（１）：４２〜４８．ページ（２００２年）；  Ｄｏｋｉｃ  Ｊ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４３（７）：１８６２〜７２ページ（２０１３年）；  Ｇｅｒｄｏｎｉ  Ｅ．ら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６１（３）：２１９〜２２７ページ（２００７年）；  Ｌｅｅ  Ｓ．Ｈ．ら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１６  （２０１０年）；  Ｕｒｂａｎ  Ｖ．Ｓ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６（１）：２４４〜２５３ページ（２００８年）；  Ｙａｎｇ  Ｈ．ら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ８（７）：ｅ６９１２９  （２０１３年）；  Ｚａｐｐｉａ  Ｅ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １０６（５）：１７５５〜１７６１ページ（２００５年）；  Ｂｏｎｆｉｅｌｄ  Ｔ．Ｌ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２９９（６）：Ｌ７６０〜７０ページ（２０１０年）；  Ｇｌｅｎｎ  Ｊ．Ｄ．ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ６（５）：５２６〜３９ページ（２０１４年）；  Ｇｕｏ  Ｋ．ら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：８ページ（２０１４年）；  Ｐｕｉｓｓａｎｔ  Ｂ．ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １２９（１）：１１８〜１２９ページ（２００５年）；及びＳｕｎ  Ｌ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７（６）：１４２１〜３２ページ（２００９年）を参照。総じて、同種の安全性及び有効性のこうした繰り返しの発見により、組織再生の成功のために同種移植片として間葉系幹細胞を使用するという考えに一致している。
【００１２】
[00012]しかしながら、安全な治療薬であるにもかかわらず、間葉系幹細胞は、文献において抗体産生並びにＢ細胞の増殖及び成熟に対する抑制効果を発揮することが報告されている。Ｕｃｃｅｌｌｉ，  Ａ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（５）：２１９〜２２６ページ（２００７年）を参照。間葉系幹細胞はまた、抗原提示細胞の生成及び機能を抑制することが報告されている。Ｈｏｏｇｄｕｉｊｎ  Ｍ．Ｊ．ら、Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １０（１２）：１４９６〜１５００ページ（２０１０年）を参照。最後に、間葉系幹細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制することが報告されている。Ｇｈａｎｎａｍ  Ｓ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ＆  Ｔｈｅｒ．１：２  （２０１０年）を参照。
【発明の概要】
【００１３】
[00013]驚くべきことに、間葉系幹細胞が免疫系の局面において抑制効果を有するとの報告にもかかわらず、本発明者らは、ワクチンに対する対象の免疫応答を増強する方法又は非応答対象において免疫応答を誘導する方法であって、ワクチン及びアジュバントを免疫防御量で同時若しくは順次、対象に投与するステップを含み、アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団である、方法並びにそれに関連するキット及び使用を発見した。
【００１４】
[00014]本発明の一実施形態において、対象がヒトである。本発明の別の実施形態において、対象が、加齢フレイルの症状を呈するヒトである。本発明の別の実施形態において、対象が、インフラメージングを呈するヒトである。
【００１５】
[00015]本発明の一実施形態において、間葉系幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である。本発明の一実施形態において、間葉系幹細胞が、ＳＴＲＯ−１を発現しない。本発明の別の実施形態において、間葉系幹細胞が、ＣＤ４５を発現しない。本発明の別の実施形態において、間葉系幹細胞が、線維芽細胞表面マーカーを発現しないか、又は線維芽細胞形態を有さない。本発明の別の実施形態において、間葉系幹細胞が、遺伝子操作されていない。
【００１６】
[00016]本発明の一実施形態において、ワクチンが一価である。本発明の別の実施形態において、ワクチンが多価である。本発明の一実施形態において、ワクチンが、１つ又は複数の不活化ウイルスを含む。別の実施形態において、１つ又は複数の不活化ウイルスが、アデノウイルス、ピコルナウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、ヘパドナウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、ヒトエンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、トガウイルス、及び風疹ウイルスからなる群から選択される。別の実施形態において、ワクチンが、不活化オルソミクソウイルスを含む。別の実施形態において、ワクチンが、不活化インフルエンザウイルスを含む。本発明の一実施形態において、ワクチンが、１つ又は複数の生きた弱毒化ウイルスを含む。別の実施形態において、１つ又は複数の弱毒化ウイルスが、アデノウイルス、ピコルナウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、ヘパドナウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、ヒトエンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、トガウイルス、及び風疹ウイルスからなる群から選択される。
【００１７】
[00017]本発明の一実施形態において、アジュバントが、ワクチンの前に投与される。別の実施形態において、アジュバントが、ワクチンが投与される少なくとも１週間前に投与される。別の実施形態において、アジュバントが、ワクチンが投与される少なくとも２週間前に投与される。別の実施形態において、アジュバントが、ワクチンが投与される少なくとも３週間前に投与される。別の実施形態において、アジュバントが、ワクチンが投与される少なくとも４週間前に投与される。本発明の別の実施形態において、アジュバントが、少なくとも１年間続く長期間のワクチン応答の増強のために投与される。
【００１８】
[00018]本発明の一実施形態において、アジュバント及びワクチンが、非経口投与される。一実施形態において、アジュバントが、全身投与される。本発明の一実施形態において、アジュバントが、注入又は直接注射によって投与される。本発明の一実施形態において、アジュバントが、静脈内、動脈内、又は腹腔内投与される。別の実施形態において、アジュバントが、静脈内投与される。本発明の一実施形態において、ワクチンが、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、皮内、経口、又は鼻腔内投与される。別の実施形態において、ワクチンが、筋肉内投与される。
【００１９】
[00019]本発明の一実施形態において、アジュバントが、約２０×１０６の間葉系幹細胞の用量で投与される。本発明の別の実施形態において、アジュバントは、約１００×１０６の間葉系幹細胞の用量で投与される。本発明の別の実施形態において、アジュバントは、約２００×１０６の間葉系幹細胞の用量で投与される。
【００２０】
[00020]本発明の一実施形態において、間葉系幹細胞がヒトドナーから得られ、ワクチン及びアジュバントの対象への投与に先立って対象に対するヒトドナーのＭＨＣ照合のステップが利用されない。
【００２１】
[00021]本発明の一実施形態において、開示されているワクチンに対する対象の免疫応答を増強する方法又は非応答対象において免疫応答を誘導する方法であって、ワクチンとアジュバントを免疫防御量で同時若しくは順次、対象に投与するステップを含み、アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団である、方法の結果として、対象のＢ細胞における細胞内ＴＮＦ−α発現がアジュバントの投与前の対象のＢ細胞におけるＴＮＦ−α発現レベルと比較して少なくとも２分の１に低下する。本発明の別の実施形態において、対象におけるＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比が、アジュバントの投与前の対象におけるＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比と比較して少なくとも２倍増加する。本発明の別の実施形態において、対象におけるスイッチしたメモリＢ細胞の数が、アジュバントの投与前の対象におけるスイッチしたメモリＢ細胞の数と比較して少なくとも２倍増加する。本発明の別の実施形態において、対象における疲弊Ｂ細胞の数が、アジュバントの投与前の対象における疲弊Ｂ細胞の数と比較して少なくとも２分の１に減少する。別の実施形態において、本発明は、対象における免疫応答を誘導する方法であって、ワクチン及びアジュバントを免疫防御量で同時又は順次、対象に投与するステップを含み、アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団であり、さらに、対象のＢ細胞における細胞内ＴＮＦ−α発現が、アジュバントの投与前の対象のＢ細胞におけるＴＮＦ−α発現レベルと比較して少なくとも２分の１に低下する、方法に関する。本発明はまた、対象における免疫応答を誘導する方法であって、ワクチン及びアジュバントを免疫防御量で同時又は順次、対象に投与するステップを含み、アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団であり、さらに、対象におけるＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比が、アジュバントの投与前の対象におけるＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比と比較して少なくとも２倍増加する、方法に関する。本発明は、対象における免疫応答を誘導する方法であって、ワクチン及びアジュバントを免疫防御量で同時又は順次、対象に投与するステップを含み、アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団であり、さらに、対象におけるスイッチしたメモリＢ細胞の数が、アジュバントの投与前の対象におけるスイッチしたメモリＢ細胞の数と比較して少なくとも２倍増加する、方法にさらに関する。本発明は、対象における免疫応答を誘導する方法であって、ワクチン及びアジュバントを免疫防御量で同時又は順次、対象に投与するステップを含み、アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団であり、さらに、対象における疲弊Ｂ細胞の数が、アジュバントの投与前の対象における疲弊Ｂ細胞の数と比較して少なくとも２分の１に減少する、方法にさらに関する。
【００２２】
[00022]別の態様において、本発明は、少なくとも２つの容器を有するキットであって、第１の容器にワクチン及び第２の容器にアジュバントを含み、アジュバントが、単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団である、キットに関する。本発明の一実施形態において、キットの間葉系幹細胞が、凍結保存されている。本発明の一実施形態において、キットが、第３の容器に希釈緩衝液をさらに含む。キット中に存在するワクチン及び間葉系幹細胞は、本明細書中で開示されているいずれのワクチン又は同種ヒト間葉系幹細胞であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】５人の対象のＥ４７及びＧＡＰＤＨに関するＲＴ−ＰＣＲを示す図である。
【図１Ｂ】５人の対象のＥ４７及びＧＡＰＤＨに関するＲＴ−ＰＣＲを示す図である。
【図２】Ｅ４７発現と相関関係にあるＡＩＤ  ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。Ｆｒａｓｃａ，  Ｄ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８０（８）：５２８３〜５２９０ページ（２００８年）の図３の再現。
【図３】フローサイトメトリーによって測定したスイッチしたＢ細胞の％を示すグラフである。スイッチしたメモリＢ細胞の％の増加は、ベースライン測定と比較して２０×１０６、１００×１０６、又は２００×１０６の間葉系幹細胞を受けた対象で間葉系幹細胞の注入の６か月後に観察された。
【図４】フローサイトメトリーによって測定したスイッチしたメモリＢ細胞及び疲弊Ｂ細胞の％を示すグラフである。スイッチしたメモリＢ細胞及び疲弊Ｂ細胞の％は、最初の間葉系幹細胞の注入の１年後に２回目の間葉系幹細胞の注入を受けた対象で測定した。
【図５Ａ】フローサイトメトリーによって測定したＴ細胞濃度を示すグラフである。図５Ａ〜５Ｄは、どの用量の同種間葉系幹細胞によってもＴ細胞活性化が誘導されないこと（拒絶）を示している。ＣＤ６９はＴ細胞活性化の初期のマーカーである。ＣＤ２５はＴ細胞活性化の後期／長期的マーカーである。
【図５Ｂ】フローサイトメトリーによって測定したＴ細胞濃度を示すグラフである。図５Ａ〜５Ｄは、どの用量の同種間葉系幹細胞によってもＴ細胞活性化が誘導されないこと（拒絶）を示している。ＣＤ６９はＴ細胞活性化の初期のマーカーである。ＣＤ２５はＴ細胞活性化の後期／長期的マーカーである。
【図５Ｃ】フローサイトメトリーによって測定したＴ細胞濃度を示すグラフである。図５Ａ〜５Ｄは、どの用量の同種間葉系幹細胞によってもＴ細胞活性化が誘導されないこと（拒絶）を示している。ＣＤ６９はＴ細胞活性化の初期のマーカーである。ＣＤ２５はＴ細胞活性化の後期／長期的マーカーである。
【図５Ｄ】フローサイトメトリーによって測定したＴ細胞濃度を示すグラフである。図５Ａ〜５Ｄは、どの用量の同種間葉系幹細胞によってもＴ細胞活性化が誘導されないこと（拒絶）を示している。ＣＤ６９はＴ細胞活性化の初期のマーカーである。ＣＤ２５はＴ細胞活性化の後期／長期的マーカーである。
【図６】フローサイトメトリー測定から算出したＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比を示すグラフである。最初の間葉系幹細胞の注入の１年後に２回目の間葉系幹細胞の注入を受けた対象においてＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比（免疫リスク表現型）の改善が観察された。
【図７Ａ】フローサイトメトリーによる間葉系幹細胞の注入後のＢ細胞における細胞内ＴＮＦ−αのダウンレギュレーションを示すグラフである。「ベースライン」は、ベースラインで行ったフローサイトメトリー測定値を指す。「３か月」は、最初の間葉系幹細胞の注入の１年後に２回目の間葉系幹細胞の注入を受けた対象における３か月後に行ったフローサイトメトリー測定値を指す。「ＦＳＣ−Ａ」は前方散乱光であり、細胞表面積又はサイズに比例する。「ＳＳＣ−Ａ」は側方散乱光であり、細胞粒度又は内部の複雑さに比例する。このように、ＦＳＣ−Ａ及びＳＳＣ−Ａの相関関係にある測定値は、不均質な集団における細胞種（例えば、リンパ球）の識別を可能にする。「ＰＥ−Ａ」は、蛍光色素であるフィコエリトリンの測定値である。「ＡＰＣ−Ａ」は、別の蛍光色素であるアロフィコシアニンの測定値である。図７Ａは、１人のＣＲＡＴＵＳ対象のフローサイトメトリー測定値を示す。
【図７Ｂ】フローサイトメトリーによる間葉系幹細胞の注入後のＢ細胞における細胞内ＴＮＦ−αのダウンレギュレーションを示すグラフである。「ベースライン」は、ベースラインで行ったフローサイトメトリー測定値を指す。「３か月」は、最初の間葉系幹細胞の注入の１年後に２回目の間葉系幹細胞の注入を受けた対象における３か月後に行ったフローサイトメトリー測定値を指す。「ＦＳＣ−Ａ」は前方散乱光であり、細胞表面積又はサイズに比例する。「ＳＳＣ−Ａ」は側方散乱光であり、細胞粒度又は内部の複雑さに比例する。このように、ＦＳＣ−Ａ及びＳＳＣ−Ａの相関関係にある測定値は、不均質な集団における細胞種（例えば、リンパ球）の識別を可能にする。「ＰＥ−Ａ」は、蛍光色素であるフィコエリトリンの測定値である。「ＡＰＣ−Ａ」は、別の蛍光色素であるアロフィコシアニンの測定値である。図７Ｂは、第２のＣＲＡＴＵＳ対象のフローサイトメトリー測定値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
[00030]特定の実施形態において、本発明は、高齢の患者におけるワクチンに対する免疫応答を改善する方法を対象とする。この例は、インビボにおける単離同種ヒト間葉系幹細胞の投与が、結果として対象のスイッチしたメモリＢ細胞のパーセンテージを増加させ、疲弊Ｂ細胞を減少させることを示している。この例は、インビボにおける単離同種ヒト間葉系幹細胞の投与が結果として対象におけるＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比を改善することも示している。また、この例で示されているとおり、同種ヒト間葉系幹細胞の注入を受けた対象で細胞内ＴＮＦ−αが減少する。これらの意外な結果から、本発明者らは、単離同種ヒト間葉系幹細胞が加齢フレイルに一般的な特徴であるインフラメージングを低減するのに有効であることを確認した。さらに、単離同種ヒト間葉系幹細胞がインフラメージングを低減することが示されたため、これらの間葉系幹細胞はワクチン接種に対する免疫応答を増強する。
【００２５】
定義
[00031]実施形態は、提示された理論上の態様を用いずに実施されてもよい。さらに、理論上の態様は、実施形態が提示されたいかなる理論にも束縛されないという理解を伴い提示される。
【００２６】
[00032]別に定義されない限り、本明細書中で使用されている（技術及び科学用語を含む）すべての用語は、当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書において定義されている用語などの用語は、関連分野の文脈におけるそれらの用語の意味と一致する意味を有するものと解釈されるべきであり、本明細書において明白にそのように定義されていない限り理想的又は過度に形式的な意味で解釈されないことがさらに理解されるであろう。
【００２７】
[00033]本明細書中で使用される術語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定する意図はない。本明細書中で使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ、ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別のことを示していない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語又はそれらの変形が詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される程度まで、そのような用語は、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と類似の様式で包括的であることが意図される。
【００２８】
[00034]本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別の指示がある場合を除いて、単に範囲内にあるそれぞれ個別の値を個々に言及することの簡単な方法として働くことが意図され、それぞれ個別の値は、本明細書において個々に列挙されたかのように明細書に組み込まれる。本明細書において提供されている任意の及びすべての例、又は例示的表現（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をさらに明確にすることが意図され、別に特許請求されていない限り、本発明の範囲に限定を与えるものではない。本明細書中において、特許請求されていないいかなる要素も、本発明の実施に必須の要素として示すものと解釈されるべき用語はない。
【００２９】
[00035]「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって求められる特定の値に対する許容される誤差範囲内を意味し、値が測定されたか、又は求められる方法によって、すなわち、測定システムの限界によって部分的に決まることになる。例えば、「約」は、当該技術分野における実務に従って１又は１を超える標準偏差を意味することがある。或いは、「約」は、言及された値の±１０％の範囲を意味することがある。
【００３０】
投与量、持続時間及び対象
[00036]「免疫防御量」は、Ｔ細胞依存性（ＴＤ）免疫応答を刺激する量を意味する。そのような応答は、顕著なレベルのＩｇＧ及びオプソニン活性を生じさせる能力を特徴とする。免疫記憶は、産生された抗体が、病原体が関係する感染症及び疾患状態を回復させる、及び／又は病原体による感染症を予防するよう免疫原性抗原に対して生じる。対象に投与される投与量及び用量の数（例えば、単一用量又は複数用量）は、投与経路、患者状態及び特性（性別、年齢、体重、健康、サイズ）、症状の程度、併用処置、処置の頻度並びに所望の効果などを含むさまざまな要因により変化することになる。
【００３１】
[00037]本明細書中で使用される場合、ワクチン及びアジュバントの「免疫防御量」は、アジュバントとワクチンの組合せの効果に基づいて決定される。例えば、アジュバントがワクチンの免疫応答を著しく増強することが示される場合、必要とされるワクチンの量は、ワクチンの免疫応答を増強するのが弱いアジュバントの場合よりも少ない。アジュバント及びワクチンの有効な量は、既知の投与量決定開発技術を使用して当業者が決定することができる。一実施形態において、本発明は、ワクチンに対する対象の免疫応答を増強する方法又は非応答対象において免疫応答を誘導する方法であって、ワクチンとアジュバントを免疫防御量で同時若しくは順次、対象に投与するステップを含み、アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団であり、さらに、免疫防御効果に必要とされるワクチンの量がアジュバントを使用していない場合に免疫防御効果に必要とされる量の半分より少ない、方法を含む。他の実施形態において、免疫防御効果に必要とされるワクチンの量が、アジュバントを使用していない場合に免疫防御効果に必要とされる量の０．１％未満、０．５％未満、１．０％未満、１０％未満、２０％未満、又は３０％未満である。
【００３２】
[00038]本発明の一実施形態において、アジュバントが、ワクチンと同時に投与される。本発明の別の実施形態において、アジュバントが、ワクチンと順次投与される。別の実施形態において、アジュバントが、ワクチンが投与される少なくとも１週間前に投与される。別の実施形態において、アジュバントが、ワクチンが投与される少なくとも２週間前に投与される。別の実施形態において、アジュバントが、ワクチンが投与される少なくとも３週間前に投与される。別の実施形態において、アジュバントが、ワクチンが投与される少なくとも４週間前に投与される。他の実施形態において、アジュバントが、ワクチンの投与の約１〜８週間、１〜１２週間、１〜３６週間、２〜８週間、２〜１２週間、２〜２６週間、２〜３６週間、２〜４８週間、３〜４週間、３〜１２週間、３〜８週間、３〜２６週間、３〜３６週間、３〜４８週間、又は４〜１２週間前に投与される。他の実施形態において、アジュバントが、ワクチンの投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０か月前、又はワクチンの投与の１〜２か月、１〜３か月、１〜４か月、１〜５か月、１〜６か月、２〜３か月、２〜４か月、２〜６か月、若しくは３〜６か月前に投与される。本発明の特定の実施形態において、アジュバントが、少なくとも１年間続く長期間の対象のワクチン応答の増強のために投与される。本開示はまた、以下に限定されないが、アジュバントの投与の約１〜８週間、１〜１２週間、１〜３６週間、２〜８週間、２〜１２週間、３〜４週間、３〜１２週間、３〜８週間、又は４〜１２週間前などワクチンがアジュバントより前に投与される方法に関する。
【００３３】
[00039]本発明の別の実施形態において、アジュバント及びワクチンの投与が、ワクチンの最初の投与の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、若しくは１８か月後などに繰り返されるか、又はワクチンの最初の投与の２〜４、２〜６、２〜８、２〜１０、３〜４、３〜６、３〜８、３〜１０、４〜６、４〜８、４〜１０、６〜８、６〜１０、６〜１２、若しくは１２〜１８か月の間の後に繰り返される。「ワクチン」の反復投与は、以下に限定されないが、後に最初のワクチンと同一でないが２回目の投与又は反復投与の時点で流行している血清型のインフルエンザウイルス型に対するワクチン接種を提供することが認識されるインフルエンザウイルスに対するワクチンが続く、インフルエンザウイルスに対するワクチンの投与を含む。他の実施形態において、アジュバント及びワクチンの同時又は順次投与が、３回、４回、５回、６回、又は５〜１０回繰り返される。例えば、以下に限定されないが、本発明は、０日目にアジュバントの投与、その後、７日目にワクチンの投与、その後、１８０日目にアジュバントの投与及び、その後、１８７日目にワクチンの投与を含む。特定の実施形態において、実際のワクチン含有量は、この反復療法の過程で異なってもよいが、反復療法のそれぞれの時点で投与されるワクチンは同じクラスの病原体に対して向けられることになろう。
【００３４】
[00040]本発明の一実施形態において、アジュバントは、約１×１０６、２×１０６、５×１０６、１０×１０６、２０×１０６、３０×１０６、４０×１０６、５０×１０６、６０×１０６、７０×１０６、８０×１０６、９０×１０６、１００×１０６、１１０×１０６、１２０×１０６、１３０×１０６、１４０×１０６、１５０×１０６、１６０×１０６、１７０×１０６、１８０×１０６、１９０×１０６、２００×１０６、３００×１０６、４００×１０６、５００×１０６、又は１０×１０７の間葉系幹細胞の用量で投与される。別の実施形態において、アジュバントは、約２０×１０６の間葉系幹細胞の用量で投与される。別の実施形態において、アジュバントは、約１００×１０６の間葉系幹細胞の用量で投与される。さらに別の実施形態において、アジュバントは、約２００×１０６の間葉系幹細胞の用量で投与される。さらに別の実施形態において、アジュバントは、約１〜４００×１０６、１０〜４００×１０６、１００〜４００×１０６、２０〜２００×１０６、２０〜４００×１０６、０．１〜５×１０６、０．１〜１０×１０６、０．１〜１００×１０６、１〜５０×１０６、１〜１００×１０６、０．０１〜１０×１０６又は０．０１〜１００×１０６の間葉系幹細胞の用量で投与される。
【００３５】
[00041]いくつかの実施形態において、免疫防御量のアジュバントは、対象におけるＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞の比を増加させる、例えば、アジュバントの投与前の比と比較して少なくとも２、３、４、５又は６倍、ＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞の比を増加させるのに十分である。いくつかの実施形態において、免疫防御量のアジュバントは、対象におけるスイッチしたメモリＢ細胞の数を増加させる、例えば、アジュバントの投与前の数と比較して少なくとも２、３、４、又は５倍、スイッチしたメモリＢ細胞の数を増加させるのに十分である。いくつかの実施形態において、免疫防御量は、対象のＢ細胞における細胞内ＴＮＦ−α発現を低下させる、例えば、アジュバントの投与前のＢ細胞における量と比較して少なくとも２、３、４、５、又は６分の１にＢ細胞における細胞内ＴＮＦ−α量を低下させるのに十分である。いくつかの実施形態において、免疫防御量は、対象における活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）をアップレギュレートするのに十分である。いくつかの実施形態において、免疫防御量は、対象における疲弊Ｂ細胞の数を減少させる、例えば、アジュバントの投与前の数と比較して少なくとも２分の１又は３分の１に疲弊Ｂ細胞の数を減少させるのに十分である。
【００３６】
[00042]別の実施形態において、アジュバントの使用は、問題の患者集団に対してアジュバントがない場合に推奨されるレベルよりも低いレベルのワクチンの投与を可能にし、それでも免疫応答を得る。例えば、現在の推奨は、６５歳以上の患者に対してフルゾン（Ｆｌｕｚｏｎｅ）高用量ワクチン（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）の１回の０．５ｍＬ用量の筋肉内注射を必要とする。本発明の方法では、Ｆｌｕｚｏｎｅワクチンの量は、６５歳以上の患者に対してそれより少ない量、０．３又は０．２ｍＬなどに低減されてもよい。
【００３７】
[00043]組成物を「投与すること」は、経口投与、注射、注入、非経口、静脈内、粘膜、舌下、筋肉内、皮内、鼻腔内、腹腔内、動脈内、皮下吸収によって又はその他の既知の技術と組み合わせた任意の方法によって達成されてもよい。本発明の一実施形態において、アジュバントが、全身投与される。本発明の別の実施形態において、アジュバントが、注入又は直接注射によって投与される。本発明の別の実施形態において、アジュバントが、静脈内、動脈内、又は腹腔内投与される。別の実施形態において、アジュバントが、静脈内投与される。本発明の一実施形態において、ワクチンが、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、皮内、経口、又は鼻腔内投与される。別の実施形態において、ワクチンが、筋肉内投与される。
【００３８】
[00044]「対象」という用語は、本明細書中で使用される場合、以下に限定されるものではないが、ヒト並びに野生動物、飼育動物、及び家畜などの非ヒト脊椎動物を含む。いくつかの実施形態において、この用語は、イヌ、ネコ、トリ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、非ヒト霊長類などの非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態において、この用語は、６５歳以上の高齢のヒト、又は６０〜９５歳の高齢のヒトなどのヒトを指す。いくつかの実施形態において、ヒト対象が、加齢フレイルの症状を呈する。いくつかの実施形態において、ヒト対象が、インフラメージングを呈する。
【００３９】
[00045]本発明の一実施形態において、対象が非応答者である。個体の集団がある疾患に対してワクチン接種をされたとき、その多くがワクチン接種に対して「応答」しないこと、すなわち、その個体の免疫系が投与された抗原に対して反応しないようであることが知られている。この問題は疾患及び関わる集団に応じて多かれ少なかれ実在するが、ワクチン製造業者は、医師が利用可能になるワクチンのそれぞれに対して「非応答者」である可能性の対象の数をなおも減少させようとしている。この問題は、遺伝子操作によって作製されたサブユニットワクチンなどの精製された抗原を含むワクチンに特に重要であると考えられる。
【００４０】
[00046]「同種の」という用語は、「レシピエントホスト」になる動物と同じ動物種であるが、１つ又は複数の遺伝子座が遺伝学的に異なる細胞を指す。これは、通常、ある動物から別の同一ではない同じ種の動物に移植される細胞に当てはまる。
【００４１】
[00047]本明細書中で使用される場合、「それを必要とする」という語句は、対象が特定の方法又は処置の必要性を有すると特定されたことを意味する。いくつかの実施形態において、任意の診断の手段によって特定が可能である。本明細書に記載されている任意の方法及び処置において、対象がそれを必要としている場合もある。いくつかの実施形態において、対象は、特定の疾患、障害、若しくは状態が流行している環境にいるか、又はそのような環境に行くことになる。
【００４２】
[00048]細胞は、本明細書において特定のマーカーに関して陽性又は陰性であると言及される。例えば、細胞がＣＤ４５に関して陰性である可能性があり、これをＣＤ４５−と呼ぶこともできる。上付き表記「−」は、上付きに関連づけられるマーカーに関して陰性である細胞を指す。対照的に、「＋」を伴うマーカーは、そのマーカーに関して陽性である細胞を指す。例えば、「ＣＤ８＋」と言及される細胞は、ＣＤ８に関して陽性である。「＋」もマーカーが陽性であるとの言及に使用することができる。「−」もマーカーが陰性であるとの言及に使用することができる。
【００４３】
[00049]本明細書中で使用される場合、「幹細胞」という用語は、特定の条件下において、長期間、若しくは成体幹細胞の場合、生物の一生をとおして自身を再生する能力を有する、胚、胎児、又は成体からの細胞を指す。幹細胞は、体の組織及び臓器を構成する特殊化した細胞を生じる場合もできる。
【００４４】
[00050]間葉系幹細胞は、とりわけ骨髄、血液、真皮、及び骨膜に見られ、サイトカインなどの生物活性因子からのさまざまな影響に応じて任意の種類の特定のタイプの間葉組織又は結合組織（すなわち、特殊化した要素を支持する体の組織；特に、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、及び線維性結合組織）に分化することができる形成的多能性芽細胞（ｆｏｒｍａｔｉｖｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ）である。
【００４５】
[00051]間葉系幹細胞を単離及び／又は精製する特定の方法は、本明細書に記載されており、当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、間葉系幹細胞は、成人ヒトの骨髄から単離される。いくつかの実施形態において、望ましくない細胞種を除去するために細胞は密度勾配を経る。細胞は、適切な培地に蒔き、培養することができる。いくつかの実施形態において、細胞を、少なくとも１日又は約３〜約７日間培養し、非接着細胞を除去する。その接着細胞を、その後、蒔いて、増殖させることができる。
【００４６】
[00052]幹細胞を単離及び培養するための他の方法も知られている。胎盤は、優れた容易に利用可能な間葉系幹細胞の供給源である。さらに、間葉系幹細胞は脂肪組織から取り出すことができ、骨髄間質細胞はその他の組織に存在することが推測される。成体幹細胞を取り出すことができる臓器には大幅な質的及び量的差があるが、細胞間の初期の差は相対的に表面的なもので、細胞が示す可塑性の類似した範囲によりバランスがとれる。
【００４７】
[00053]すべての間葉系細胞系列に対する前駆細胞として働く均質なヒト間葉系幹細胞組成物が提供される。間葉系幹細胞は、固有のモノクローナル抗体を用いて特定される特定の細胞表面マーカーによって特定される。均質な間葉系幹細胞組成物は、接着骨髄細胞又は骨膜細胞の正の選択によって得られ、この組成物は、造血細胞又は分化した間葉系細胞のいずれかと関連するマーカーを含まない。これらの単離間葉系細胞集団は、間葉系幹細胞とだけ関連づけられるエピトープ特性を示し、分化することなく培養で再生する能力を有し、インビトロで誘導されるか、又はインビボで炎症の部位に置かれたときに特定の間葉系列に分化する能力を有する。
【００４８】
[00054]本明細書中で開示されている組成物、方法、及びキットのためのヒト間葉系幹細胞を得るために、多能性間葉系幹細胞は、骨髄又は他の間葉系幹細胞供給源中の他の細胞から分離される。骨髄細胞は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、又はその他の髄腔から得られ得る。ヒト間葉系幹細胞のその他の場所としては、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎生期及び青年期の皮膚、並びに血液が挙げられる。
【００４９】
[00055]いくつかの実施形態において、ヒト間葉系幹細胞は、マーカーの不在によって特定される。例えば、本発明に有用なヒト間葉系幹細胞としては、ＳＴＲＯ−１が陰性及び／又はＣＤ４５が陰性の細胞が挙げられる。同様に、本発明に有用なヒト間葉系幹細胞としては、線維芽細胞表面マーカーを発現しないか、又は線維芽細胞形態を発現しない細胞が挙げられる。
【００５０】
免疫応答を増強する方法及びそのためのキット
[00056]上記のとおり、本発明は、ワクチンに対する対象の免疫応答を増強する方法又は非応答対象において免疫応答を誘導する方法であって、ワクチンとアジュバントを免疫防御量で同時又は順次、対象に投与するステップを含み、アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団を含む、方法、及びそのような方法に関連するキットを対象とする。本発明の一部の実施形態において、間葉系幹細胞が、遺伝子操作されていない。本発明の一部の実施形態において、間葉系幹細胞がヒトドナーから得られ、ワクチン及びアジュバントの対象への投与に先立って対象に対するヒトドナーのＭＨＣ照合のステップが利用されない。
【００５１】
[00057]本発明の一実施形態において、ワクチンが一価である。本発明の別の実施形態において、ワクチンが多価である。
【００５２】
[00058]本発明の一実施形態において、ワクチンが、１つ又は複数の不活化ウイルスを含む。別の実施形態において、１つ又は複数の不活化ウイルスが、アデノウイルス、ピコルナウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、ヘパドナウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、ヒトエンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、トガウイルス、及び風疹ウイルスからなる群から選択される。別の実施形態において、ワクチンが、不活化オルソミクソウイルスを含む。別の実施形態において、ワクチンが、不活化インフルエンザウイルスを含む。
【００５３】
[00059]本発明の一実施形態において、ワクチンが、１つ又は複数の生きた弱毒化ウイルスを含む。別の実施形態において、１つ又は複数の弱毒化ウイルスが、アデノウイルス、ピコルナウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、ヘパドナウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ロゼオロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、ヒトエンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、トガウイルス、及び風疹ウイルスからなる群から選択される。
【００５４】
[00060]本発明の別の実施形態において、ワクチンが、細菌性病原体由来の抗原を含む。別の実施形態において、細菌性病原体が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）からなる群から選択される。
【００５５】
[00061]本発明の別の実施形態において、ワクチンが、寄生性病原体由来の抗原を含む。別の実施形態において、寄生性病原体が、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）、アニサキス（Ａｎｉｓａｋｉｓ）、ヒト回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ）、条虫綱（Ｃｅｓｔｏｄａ）、ツツガムシ、コクリオミイア・ホミニウオラクス（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ  ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、鉤虫、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、イヌシタムシ（Ｌｉｎｇｕａｔｕｌａ  ｓｅｒｒａｔａ）、肝吸虫、ロア糸状虫（Ｌｏａ  ｌｏａ）、肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、サナダムシ（Ｔａｐｅｗｏｒｍ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、鞭虫、及びバンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）からなる群から選択される。
【００５６】
[00062]本発明の別の実施形態において、ワクチンが、インフルエンザヘマグルチニン１（ＨＡ１）、ヘマグルチニン２（ＨＡ２）、インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）糖タンパク質１（ｇｐ１）、ＬＡＳＶ糖タンパク質２（ｇｐ２）、ＬＡＳＶヌクレオカプシド関連タンパク質（ＮＰ）、ＬＡＳＶ  Ｌタンパク質、ＬＡＳＶ  Ｚタンパク質、ＳＡＲＳウイルスＳタンパク質、エボラウイルスＧＰ２、麻疹ウイルス融合１（Ｆ１）タンパク質、ＨＩＶ−１膜貫通（ＴＭ）タンパク質、ＨＩＶ−１糖タンパク質４１（ｇｐ４１）、ＨＩＶ−１糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープ糖タンパク質１（Ｅ１）、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質２（Ｅ２）、ＨＣＶヌクレオカプシドタンパク質（ｐ２２）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）エンベロープ糖タンパク質１（Ｅ１）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ｇＤタンパク質、ＨＳＶ−１  ｇＧタンパク質、ＨＳＶ−２  ｇＤタンパク質、ＨＳＶ−２  ｇＧタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）糖タンパク質１２５（ｇｐ１２５）、細菌外膜タンパク質アセンブリ因子ＢａｍＡ、細菌移行アセンブリモジュールタンパク質ＴａｍＡ、細菌ポリペプチド輸送関連タンパク質ドメインタンパク質、細菌表面抗原Ｄ１５、炭疽菌保護タンパク質、炭疽菌致死的因子、炭疽菌浮腫因子、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｉ）Ｓ１Ｄａ、チフス菌Ｓ１Ｄｂ、コレラ毒素、コレラ熱ショックタンパク質、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）抗原Ｓ、ボツリヌス毒素、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）Ｆ１、ペスト菌Ｖ抗原、ペスト菌ＹｏｐＨ、ペスト菌ＹｏｐＭ、ペスト菌ＹｏｐＤ、ペスト菌プラスミノーゲン活性化因子（Ｐｌａ）、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）、マラリア原虫スポロゾイト表面タンパク質（ＳＳＰ２／ＴＲＡＰ）、マラリア原虫肝臓期抗原１（ＬＳＡＴ）、マラリア原虫搬出タンパク質１（ＥＸＰ  １）、マラリア原虫赤血球結合抗原１７５（ＥＢＡ−１７５）、マラリア原虫システインリッチ防御抗原（ｃｙＲＰＡ）、マラリア原虫熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）、住血吸虫Ｓｍ２９、及び住血吸虫シグナル伝達タンパク質１４−３−３からなる群から選択される抗原性ポリペプチドのうちの１つ又は複数を含む。
【００５７】
[00063]本発明に使用するための組成物は、任意の適した方法を使用して製剤化することができる。標準的な薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いた細胞の製剤化は、医薬分野における通常の方法を使用して行うことができる。製剤の厳密な性質は、投与される細胞及び投与の所望の経路を含むいくつかの要素により決まることになる。製剤の適した種類は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、米国に完全に記載されている。
【００５８】
[00064]組成物は、生理学的に許容される担体又は希釈剤とともに調製することができる。一般に、そのような組成物は、細胞の液体懸濁物として調製される。細胞は、薬学的に許容され、活性成分と適合した賦形剤と混合されてもよい。適した賦形剤は、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール等及びそれらの組合せである。
【００５９】
[00065]さらに、必要に応じて、本発明の医薬組成物は、有効性を向上させる湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はアジュバントなどの少量の補助物質を含んでもよい。本発明の一実施形態において、アジュバントが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。
【００６０】
[00066]適した担体又は希釈剤の１つは、プラスマライト（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ）Ａ（商標）である。プラスマライトＡ（商標）は、静脈内投与用の滅菌非発熱性等張液である。それぞれ１００ｍＬが５２６ｍｇの塩化ナトリウム、ＵＳＰ（ＮａＣｌ）；５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）；３６８ｍｇの酢酸ナトリウム３水和物、ＵＳＰ（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２３Ｈ２Ｏ）；３７ｍｇの塩化カリウム、ＵＳＰ（ＫＣｌ）；及び３０ｍｇの塩化マグネシウム、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ）を含む。プラスマライトＡ（商標）は、抗菌剤を含まない。ｐＨは、水酸化ナトリウムにより調整される。ｐＨは７．４（６．５〜８．０）である。
【００６１】
[00067]上記のとおり、本発明はまた、少なくとも２つの容器を有するキットであって、第１の容器にワクチン及び第２の容器にアジュバントを含み、アジュバントが単離同種ヒト間葉系幹細胞の集団を含む、キットに関する。本明細書において述べられているいずれのアジュバント又はワクチンも本開示によるキットとして製剤化することができる。本発明の一実施形態において、間葉系幹細胞が、遺伝子操作されていない。本発明の別の実施形態において、間葉系幹細胞が、第２の容器中に凍結保存されている。例えば、間葉系幹細胞は、２％ＨＳＡ及び５％ＤＭＳＯを加えたヘスパン（Ｈｅｓｐａｎ）（登録商標）（０．９％塩化ナトリウム中の６％ヘタスターチ）からなる凍結保護物質に懸濁させた後、気相窒素フリーザーに入れるための凍結保存容器に取り分けることができる。別の実施形態において、第２の容器中の間葉系幹細胞は、１％ＨＳＡを加えたプラスマライトＡ（商標）に入れられてもよい。別の実施形態において、キットは、少なくとも３つの容器を有し、第３の容器は、間葉系幹細胞の懸濁及び希釈のための希釈緩衝液を含む。別の実施形態において、希釈緩衝液は、１％ＨＳＡを加えたプラスマライトＡ（商標）を含む。
【００６２】
[00068]一実施形態において、本発明は、アジュバント及びワクチンを免疫防御量で含む組成物である。当業者は、本明細書中で開示されているアジュバント及びワクチンの中から適した組成物を製剤化することができる。
【実施例】
【００６３】
実施例１
ヒト末梢血由来Ｂ細胞におけるＥ４７ｍ  ＲＮＡ発現に対する加齢の影響
[00069]上記のとおり、Ｅ４７及びＰａｘ−５はともに、Ｂ細胞系列の初期の発生及び成熟Ｂ細胞の機能において重要な転写因子である。Ａｉｃｄａ遺伝子の推定上の調節領域がＡＩＤ遺伝子発現に必須のＥ４７及びＰａｘ−５結合部位の両方を含むことが証明された。以下の実験は、Ｅ４７発現が年齢に応じて低下すること及びＢ細胞におけるＥ４７発現がＡＩＤ発現と正の相関関係にあることを示している。図１及び２を参照。
【００６４】
[00070]年齢が２０〜８５歳の範囲の４６人の対象を募集し、末梢血を採取した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞（１０６細胞／ｍＬ）を抗ＣＤ４０（１μｇ／ｍＬ）及びＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）とともに２４時間培養した。Ｅ４７及びＧＡＰＤＨに関してＰＣＲを実施した。Ｅ４７をＧＡＰＤＨに対して正規化した。図１（Ａ）は、５人の代表的な対象の希釈されない及び１／４希釈されたＲＴ−ＰＣＲを示す。図１（Ｂ）において、グラフは、ＧＡＰＤＨに対して正規化されたＣＴのデンシトメトリー分析を示している。各サンプルに対して示した数は、最高値を１００としたパーセンテージである。年齢とＥ４７発現との間の相関関係を表す直線的な曲線に対する人のｒ値は、ｒ＝−０．８４、ｐ＝０．００００１である。実線は線形回帰を表し、破線は二次回帰を表す。このように、このデータは、Ｅ４７発現が年齢に応じて低下することを示している。
【００６５】
[00071]こうした対象からの血液もＡＩＤ及びＧＡＰＤＨに関してＰＣＲに供し、結果を図２に示す。Ｅ４７（２４時間の刺激）及びＡＩＤ（５日間の刺激）をそれぞれのＧＡＰＤＨ値に対して個々に正規化した。各サンプルに対して示した数は、最高値を１００としたパーセンテージである。Ｅ４７及びＡＩＤのＰＣＲに関するデータは正の相関関係にあった。相関関係は、０．０１レベル（両側）で有意である。実線は線形回帰を表す。図２においてわかるとおり、Ｂ細胞におけるＥ４７発現がＡＩＤ発現と正の相関関係にある。（ｒ＝０．８０、ｐ＝０．０１レベル、両側）。
【００６６】
実施例２
スイッチしたメモリＢ細胞
[00072]以下の実験は、高齢の対象において、同種間葉系幹細胞（ＭＳＣ）により処置した後、スイッチしたメモリＢ細胞が増加することを示している。スイッチしたメモリＢ細胞は、ＣＲＡＴＵＳ試験のヒト患者においてベースライン（ＭＳＣの静脈内注入前）及びＭＳＣ注入の６か月後に測定した。この結果は、ＭＳＣ注入が、改善された抗体応答を予測するバイオマーカーである、スイッチメモリＢ細胞区画をアップレギュレートすることを示している。図３を参照。このことは、試験した３用量のＭＳＣ（２０×１０６、１００×１０６、又は２００×１０６の間葉系幹細胞）に対して当てはまった。このデータは、同種間葉系幹細胞の静脈内投与が一部の患者においてスイッチメモリＢ細胞を２倍増加させることを示している。
【００６７】
[00073]図４は、最初の間葉系幹細胞の注入の１年後に２回目の間葉系幹細胞の注入を受けた対象におけるスイッチしたメモリＢ細胞及び疲弊Ｂ細胞の％を示す。このグラフは、最初の間葉系幹細胞処置から誘導された免疫細胞に対する改善を維持するために１２か月目に２回目の注射が必要な場合もあることを示唆している。
【００６８】
実施例３
Ｔ細胞活性化
[00074]以下の実験は、同種ＭＳＣ処置後に初期及び後期／長期的Ｔ細胞活性化の両方が低下することを示している。ＣＲＡＴＵＳ試験サンプルからＴ細胞活性化の初期マーカー（ＣＤ６９）及びＴ細胞活性化の後期／長期的マーカー（ＣＤ２５）をヒト患者において測定した。図５Ａ及び５Ｂに示されるとおり、どの用量（２０×１０６、１００×１０６、又は２００×１０６の間葉系幹細胞）でも同種間葉系幹細胞によって誘導されるＴ細胞活性化はない（拒絶）。ＣＤ６９細胞％又はＣＤ２５細胞％に対するＭＳＣ注入の６か月後の絶対差を示す図５Ｃ及び５Ｄも参照のこと。
【００６９】
実施例４
免疫リスク表現型
[00075]免疫リスク表現型は、最初のＭＳＣ注入の１年後に２回目のＭＳＣ注入を受けている同じＣＲＡＴＵＳ対象において測定された。図６を参照。この結果は、ＭＳＣ注入がＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比を改善することを示している。さらに、最初の注入の１２か月後までに、効果が消失し始める。その時点における、２回目のＭＳＣ注入がさらなる改善をもたらす。最初の間葉系幹細胞処置から誘導された免疫細胞に対する改善を維持するために１２か月目に２回目の注射が必要な場合もある。
【００７０】
実施例５
ＴＮＦ−アルファ
[00076]ＴＮＦ−αは、ＡＩＤを減少させる。Ｂ細胞の細胞内染色によりフローサイトメトリーによって２人のＣＲＡＴＵＳ対象からのサンプルのＴＮＦ−αを測定し、ｑＰＣＲによって確認した。図７Ａ及び７Ｂに示されるとおり、ベースライン（ＭＳＣの最初の注入の１２か月後）及び３か月（２回目の注入の３か月後）の結果を示す。フローサイトメトリーによる結果は、間葉系幹細胞注入後のＢ細胞における細胞内ＴＮＦ−αのダウンレギュレーションを示している。これらの結果をｑＰＣＲによって確認した。
【００７１】
実施例６
加齢フレイルを有する患者におけるワクチン特異抗体応答に対する同種ヒト間葉系幹細胞の静脈内送達の効果−ＨＥＲＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ＶａｃｃｉｎＥ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｇｉｎｇ  Ｆｒａｉｌｔｙ）試験（第Ｉ／ＩＩ相）
[00077]このＨＥＲＡ試験は、第Ｉ／ＩＩ相無作為化二重盲検プラセボ対照試験である。この試験の主目標は、間葉系幹細胞の静脈内投与が、加齢フレイルを有する対象においてインフルエンザワクチンに対する獲得免疫を改善することができ、Ｂ細胞一次応答を改善することができることを実証することである。
【００７２】
[00078]四十三（４３）人の加齢フレイルを有する対象を登録する。アジュバント（同種間葉系幹細胞）を末梢静脈内注入によって投与する。注入後の各対象に対する総継続時間は、１２か月プラス、スクリーニング及びベースライン訪問のために最大さらに２か月とする。安全性導入期間に二重盲検無作為化段階が続く。全対象は選択／除外基準を満たしていなければならず、ベースラインを確立するために計画された注入に先立って全対象を評価する。
【００７３】
安全性導入期間
[00079]安全性導入期間は３つのコホートの２３人の対象を含み、間葉系幹細胞の注入後にインフルエンザワクチンを投与するための最適な時点を決定するために実施される。
【００７４】
[00080]コホートＡ（３人の対象）：２０×１０６の間葉系幹細胞の１回の末梢静脈内注入を各対象に施す。注入の１週間後に、対象は、６５歳以上の患者に推奨されているフルゾン高用量ワクチン（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）の１回の０．５ｍＬ用量の筋肉内注射を受ける。これらの対象には、最初に（すなわち、コホートＢ及びＣのいずれの対象にも先立って）注入し、５日以上空けずに注入する。
【００７５】
[00081]コホートＢ（１０人の対象）：１００×１０６の間葉系幹細胞の１回の末梢静脈内注入を各対象に施す。注入の１週間後に、対象は、フルゾン高用量ワクチンの１回の０．５ｍＬ用量の筋肉内注射を受ける。
【００７６】
[00082]コホートＣ（１０人の対象）：１００×１０６の間葉系幹細胞の１回の末梢静脈内注入を各対象に施す。注入の４週間後に、対象は、フルゾン高用量ワクチンの１回の０．５ｍＬ用量の筋肉内注射を受ける。
【００７７】
[00083]コホートＢ及びＣの対象を無作為化し、最初の３人の対象に５日以上空けずに注入する。間葉系幹細胞の注入後のワクチン接種の安全性及び有効性を判断するためにワクチン接種の１及び４週間後にフォローアップ訪問を行う。２３人のすべての対象に注入し、ワクチン接種をした後、すべての安全性データを評価するために３０日調査を行う。安全性導入期間が成功裏に完了した後に行った二重盲検無作為化段階は、再検討され、容認された。安全性導入期間データが分析された後、ワクチン接種後１週間及び４週間の両方における標準的なワクチン接種時点を試験の二重盲検無作為化部分のために利用する。
【００７８】
二重盲検無作為化試験
[00084]二重盲検無作為化試験は、２つのコホートの２０人の対象を含む。全対象は包含／除外基準を満たしていなければならず、ベースラインを確立するために計画された注入に先立って全対象を評価する。対象を以下のとおり１：１の比で２つのコホートに無作為化する。
【００７９】
[00085]コホート１（１０人の対象）：１００×１０６の間葉系幹細胞の１回の末梢静脈内注入を各対象に施す。注入（安全性導入期間に決定された１又は４週間）後の最適な時点において、対象は、フルゾン高用量ワクチンの１回の０．５ｍＬ用量の筋肉内注射を受ける。
【００８０】
[00086]コホート２（１０人の対象）：プラセボ（１％ＨＳＡを伴うプラスマライトＡ（商標））の１回の末梢静脈内注入を各対象に施す。注入（安全性導入期間に決定された１又は４週間）後の最適な時点において、対象は、フルゾン高用量ワクチンの１回の０．５ｍＬ用量の筋肉内注射を受けることになる。
【００８１】
[00087]注入及びワクチン接種の１日後に電話によるフォローアップを行う。ワクチン接種後１週目及び４週目、並びに注入後６か月目及び１２か月目に診療所内フォローアップ訪問を行って、すべての安全性及び有効性評価を完了する。ワクチン接種後の最初の７か月の間にインフルエンザタイプの症状を発症したどの対象も、可能性のあるインフルエンザ菌株の評価を決定することができるよう、すぐに診療所訪問を予定に入れなければならない。
【００８２】
一次エンドポイント
[00088]有効性一次エンドポイントは、（１）ｑＰＣＲによるＣｐＧ又はインフルエンザワクチンに反応して活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）をアップレギュレートするＢ細胞の能力並びに（２）ＨＡＩ及びＥＬＩＳＡによるインフルエンザ特異抗体産生によって測定されるＢ細胞の機能である。有効性一次エンドポイントのためのデータを、ベースライン訪問、ワクチン接種訪問（間葉系幹細胞の注入の１又は４週間後に実施される）、ワクチン接種後１週目及び４週目のフォローアップ訪問、並びに注入後６か月目及び１２か月目のフォローアップ訪問から得る。
【００８３】
選択基準
[00089]この試験に登録された全対象は、書面のインフォームドコンセントを提供しなければならず、インフォームドコンセントフォームに署名した時点で６５〜９５歳でなければならず、カナダのフレイルスケールを使用して４〜７のスコアを有するフレイルと診断されていなければならず、≦５％のスイッチしたメモリＢ細胞、≧１０％の後期／疲弊メモリ、≦２０％のＣＤ８＋ナイーブ細胞、及び≧４０％のＣＤ８＋ＴＥＭＲＡ細胞という結果になる全血フローサイトメトリー染色によって測定される免疫老化を示さなければならず、０．３〜１．９ｍｇ／ｄＬの間の総ビリルビンを有さなければならない。
【００８４】
アジュバント及びプラセボ
[00090]１００×１０６の間葉系幹細胞を受ける対象のための最終的な間葉系幹細胞製剤は、１．０％ＨＳＡを含有する８０ｍＬのプラスマライトＡ（商標）中に懸濁した２．５×１０６の間葉系幹細胞／ｍＬである。２０×１０６の間葉系幹細胞を受ける導入段階の対象に対する、最終製剤は、１．０％ＨＳＡを含有する８０ｍＬのプラスマライトＡ（商標）中に懸濁した０．５×１０６の間葉系幹細胞／ｍＬである。アジュバントは、Ｌｏｎｇｅｖｅｒｏｎ  ＬＬＣ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐａｒｋ、１９５１  ＮＷ  ７ｔｈ  Ａｖｅ．，  Ｍｉａｍｉ，  ＦＬ  ３３１３６）の細胞加工施設によって製造される。
【００８５】
[00091]プラセボのために希釈緩衝液が使用される。プラセボの最終製剤は、１．０％ＨＳＡを含有するプラスマライトＡ（商標）（合計８０ｍＬ）である。
【００８６】
アジュバント投与量及び速度
[00092]この試験の対象は、２０×１０６の間葉系幹細胞、１００×１０６の間葉系幹細胞、又はプラセボの１回の注入を受ける。最大注入速度は、２．５×１０６の間葉系幹細胞／分であり、報告されている最大投薬速度よりはるかに低い。表３は、間葉系幹細胞及びプラセボ注入に関する注入パラメータの明細を示す。合計８０ｍＬが各対象に静脈内送達される。
【００８７】
【表１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2019509264.tif 000009
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
2019509264.tif 000013
【図７Ａ】
2019509264.tif 000014
【図７Ｂ】
2019509264.tif 000015
【国際調査報告】
2019509264.tif 000016
2019509264.tif 000017
2019509264.tif 000018
2019509264.tif 000019
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