(57)【要約】  本発明は、ＣＤ２０又はＣＤ２２の発現に関連する疾患を治療するための組成物及び方法を提供する。本発明は、ＣＤ２０又はＣＤ２２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、それをコードするベクター、及びＣＤ２０  ＣＡＲ又はＣＤ２２  ＣＡＲを含む組換えＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞にも関する。本発明は、ＣＤ２０又はＣＤ２２結合ドメインを含むＣＡＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞又はＮＫ細胞を投与する方法も含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸分子であって、前記ＣＡＲは、ＣＤ２０結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、前記ＣＤ２０結合ドメインは、表１又は表３の任意のＣＤ２０結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）の１つ以上と、表１又は表２の任意のＣＤ２０結合ドメインの重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）の１つ以上とを含む、単離核酸分子。
【請求項２】
前記ＣＡＲは、表１又は表３に係るＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
前記ＣＡＲは、表１又は表２に係るＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１又は２に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
前記ＣＡＲは、表１又は表３に係るＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、表１又は表２に係るＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３とを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
（ａ）配列番号１４７、１４８、及び１４９；
（ｂ）配列番号２２８、２２９、及び２３０；
（ｃ）配列番号６６、６７、及び６８；
（ｄ）配列番号９３、９４、及び９５；
（ｅ）配列番号１２０、１２１、及び１２２；
（ｆ）配列番号１２、１３、及び１４；
（ｇ）配列番号１７４、１７５、及び１７６；
（ｈ）配列番号２０１、２０２、及び２０３；
（ｉ）配列番号３９、４０、及び４１；
（ｊ）配列番号２５５、２５６、及び２５７；
（ｋ）配列番号２８２、２８３、及び２８４；
（ｌ）配列番号３０９、３１０、及び３１１；
（ｍ）配列番号３３６、３３７、及び３３８；
（ｎ）配列番号３６３、３６４、及び３６５；
（ｏ）配列番号３９０、３９１、及び３９２；及び
（ｐ）配列番号４１７、４１８、及び４１９
から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、又はＨＣＤＲ３は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
（ａ）配列番号１３６、１３７、及び１３８；
（ｂ）配列番号２１７、２１８、及び２１９；
（ｃ）配列番号５５、５６、及び５７；
（ｄ）配列番号８２、８３、及び８４；
（ｅ）配列番号１０９、１１０、及び１１１；
（ｆ）配列番号１、２、及び３；
（ｇ）配列番号１６３、１６４、及び１６５；
（ｈ）配列番号１９０、１９１、及び１９２；
（ｉ）配列番号２８、２９、及び３０；
（ｊ）配列番号２４４、２４５、及び２４６；
（ｋ）配列番号２７１、２７２、及び２７３；
（ｌ）配列番号２９８、２９９、及び３００；
（ｍ）配列番号３２５、３２６、及び３２７；
（ｎ）配列番号３５２、３５３、及び３５４；
（ｏ）配列番号３７９、３８０、及び３８１；及び
（ｐ）配列番号４０６、４０７、及び４０８
から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項７】
前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３のコードされるアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
（ａ）配列番号１４７、１４８、１４９、１３６、１３７、及び１３８；
（ｂ）配列番号２２８、２２９、２３０、２１７、２１８、及び２１９；
（ｃ）配列番号６６、６７、６８、５５、５６、及び５７；
（ｄ）配列番号９３、９４、９５、８２、８３、及び８４；
（ｅ）配列番号１２０、１２１、１２２、１０９、１１０、及び１１１；
（ｆ）配列番号１２、１３、１４、１、２、及び３；
（ｇ）配列番号１７４、１７５、１７６、１６３、１６４、及び１６５；
（ｈ）配列番号２０１、２０２、２０３、１９０、１９１、及び１９２；
（ｉ）配列番号３９、４０、４１、２８、２９、及び３０；
（ｊ）配列番号２５５、２５６、２５７、２４４、２４５、及び２４６；
（ｋ）配列番号２８２、２８３、２８４、２７１、２７２、及び２７３；
（ｌ）配列番号３０９、３１０、３１１、２９８、２９９、及び３００；
（ｍ）配列番号３３６、３３７、３３８、３２５、３２６、及び３２７；
（ｎ）配列番号３６３、３６４、３６５、３５２、３５３、及び３５４；
（ｏ）配列番号３９０、３９１、３９２、３７９、３８０、及び３８１；及び
（ｐ）配列番号４１７、４１８、４１９、４０６、４０７、及び４０８
から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項８】
前記ＣＡＲは、表１又は表５に挙げられる任意の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項９】
前記ＣＡＲは、表１又は表４に挙げられる任意の重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１０】
前記ＣＡＲは、表１又は表５に挙げられる任意の軽鎖可変領域と、表１又は表４に挙げられる任意の重鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１１】
軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のコードされるアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
（ａ）配列番号１５６及び１４５；
（ｂ）配列番号２３７及び２２６；
（ｃ）配列番号２１及び１０、
（ｄ）配列番号７５及び６４；
（ｅ）配列番号１０２及び９１；
（ｆ）配列番号１２９及び１１８；
（ｇ）配列番号１８３及び１７２；
（ｈ）配列番号２１０及び１９９；
（ｉ）配列番号４８及び３７；
（ｊ）配列番号２６４及び２５３；
（ｋ）配列番号２９１及び２８０；
（ｌ）配列番号３１８及び３０７；
（ｍ）配列番号３４５及び３３４；
（ｎ）配列番号３７２及び３６１；
（ｏ）配列番号３９９及び３８８；及び
（ｐ）配列番号４２６及び４１５
から選択される、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１２】
前記ＣＤ２０結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、任意選択により、前記軽鎖可変領域は、表１又は表５に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２、又は３つの改変であるが、３０、２０又は１０以下の改変を有するアミノ酸配列、又は表１又は表５に提供されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項１３】
前記重鎖可変領域は、表１又は表４に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、３０、２０又は１０以下の改変を有するアミノ酸配列、又は表１又は表４に提供されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項１４】
前記ＣＤ２０結合ドメインは、配列番号１５９、配列番号２４０、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその９５〜９９％の同一性を有するか、若しくは前記アミノ酸配列のいずれかと比べて少なくとも１、２若しくは３つの改変であるが、２０、１０若しくは５つ以下の改変を有する配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項１５】
前記ＣＤ２０結合ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１６０、配列番号２４１、配列番号２５、配列番号５２、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１３３、配列番号１８７、配列番号２１４、配列番号２６８、配列番号２９５、配列番号３２２、配列番号３４９、配列番号３７６、配列番号４０３、及び配列番号４３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項１６】
前記核酸は、表１に挙げられる核酸配列を含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１７】
前記ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項１〜１６又は７７〜８６、９３、１２４若しくは１２５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項１８】
前記膜貫通ドメインは、配列番号８０１又は８０２のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、２０、１０又は５つ以下の改変を含むアミノ酸配列、又は配列番号８０１又は８０２のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含み、任意選択により、前記膜貫通ドメインは、配列番号８０１又は８０２の配列を含む、請求項１〜１７又は７７〜８６、９３、１２４若しくは１２５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項１９】
前記ＣＤ２０結合ドメインは、ヒンジ領域によって前記膜貫通ドメインに結合され、任意選択により、前記ヒンジ領域は、配列番号７９９若しくは配列番号８１４又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜１８又は７７〜８６、９３、１２４若しくは１２５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項２０】
前記ヒンジ領域をコードする核酸配列は、配列番号８００若しくは配列番号８１５の配列又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１９に記載の単離核酸分子。
【請求項２１】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含み、任意選択により、前記共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能性シグナル伝達ドメインである、請求項１〜２０又は７７〜８６、９３、１２４若しくは１２５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項２２】
前記共刺激ドメインは、配列番号８０３のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、２０、１０又は５つ以下の改変を有するアミノ酸配列、又は配列番号８０３のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含み、任意選択により、前記共刺激ドメインは、配列番号８０３の配列を含む、請求項２１に記載の単離核酸分子。
【請求項２３】
前記共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号８０４の配列又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項２１に記載の単離核酸分子。
【請求項２４】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含み、任意選択により、前記一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの機能性シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜２３又は７７〜８６、９３、１２４若しくは１２５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項２５】
ＣＤ３ζの前記機能性シグナル伝達ドメインは、配列番号８０５又は配列番号８０７を含む、請求項２４に記載の単離核酸分子。
【請求項２６】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能性シグナル伝達ドメイン及び／又はＣＤ３ζの機能性シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜２５又は７７〜８６、９３、１２４若しくは１２５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項２７】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３のアミノ酸配列及び／又は配列番号８０５若しくは配列番号８０７の配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、２０、１０又は５つ以下の改変を有するアミノ酸配列、又は配列番号８０３のアミノ酸配列及び／又は配列番号８０５若しくは配列番号８０７の配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含み、任意選択により、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３の配列及び／又は配列番号８０５若しくは配列番号８０７の配列を含む、請求項１〜２６又は７７〜８６、９３、１２４若しくは１２５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項２８】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３の配列及び配列番号８０５又は配列番号８０７の配列を含み、任意選択により、前記細胞内シグナル伝達ドメインを含む前記配列は、同じフレーム内において且つ単一のポリペプチド鎖として発現される、請求項１〜２７又は７７〜８６、９３、１２４若しくは１２５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項２９】
前記細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号８０４の配列又はその９５〜９９％の同一性を有する配列、及び／或いは配列番号８０６若しくは配列番号８０８の配列又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜２８又は７７〜８６、９３、１２４若しくは１２５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項３０】
リーダー配列を更に含み、任意選択により、前記リーダー配列は、配列番号７９７を含む、請求項１〜２９又は７７〜８６、９３、１２４若しくは１２５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項３１】
表１に挙げられる核酸配列を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項３２】
配列番号１６０、配列番号２４１、配列番号２５、配列番号５２、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１３３、配列番号１８７、配列番号２１４、配列番号２６８、配列番号２９５、配列番号３２２、配列番号３４９、配列番号３７６、配列番号４０３、及び配列番号４３０からなる群から選択される核酸配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項３３】
配列番号１６０、配列番号２４１、配列番号２５、配列番号５２、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１３３、配列番号１８７、配列番号２１４、配列番号２６８、配列番号２９５、配列番号３２２、配列番号３４９、配列番号３７６、配列番号４０３、及び配列番号４３０からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項３４】
配列番号１６１、配列番号２４２、配列番号２６、配列番号５３、配列番号８０、配列番号１０７、配列番号１３４、配列番号１８８、配列番号２１５、配列番号２６９、配列番号２９６、配列番号３２３、配列番号３５０、配列番号３７７、配列番号４０４、及び配列番号４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列若しくはその９５〜９９％の同一性を有する配列、又は配列番号１６１、配列番号２４２、配列番号２６、配列番号５３、配列番号８０、配列番号１０７、配列番号１３４、配列番号１８８、配列番号２１５、配列番号２６９、配列番号２９６、配列番号３２３、配列番号３５０、配列番号３７７、配列番号４０４、及び配列番号４３１のアミノ酸の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、３０、２０、１０又は５つ以下の改変を含むアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドをコードし、任意選択により、前記ＣＡＲポリペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰのシグナルペプチドを含まない、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項３５】
配列番号１６１、配列番号２４２、配列番号２６、配列番号５３、配列番号８０、配列番号１０７、配列番号１３４、配列番号１８８、配列番号２１５、配列番号２６９、配列番号２９６、配列番号３２３、配列番号３５０、配列番号３７７、配列番号４０４、及び配列番号４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドをコードし、任意選択により、前記ＣＡＲポリペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰのシグナルペプチドを含まない、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項３６】
配列番号１６２、配列番号２４３、配列番号２７、配列番号５４、配列番号８１、配列番号１０８、配列番号１３５、配列番号１８９、配列番号２１６、配列番号２７０、配列番号２９７、配列番号３２４、配列番号３５１、配列番号３７８、配列番号４０５、及び配列番号４３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含み、任意選択により、前記ＣＡＲ核酸は、
【化１】
2019537433.tif 000260
のシグナルペプチド配列を含まない、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項３７】
配列番号１６２、配列番号２４３、配列番号２７、配列番号５４、配列番号８１、配列番号１０８、配列番号１３５、配列番号１８９、配列番号２１６、配列番号２７０、配列番号２９７、配列番号３２４、配列番号３５１、配列番号３７８、配列番号４０５、及び配列番号４３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、任意選択により、前記ＣＡＲ核酸は、
【化２】
2019537433.tif 000261
のシグナルペプチド配列を含まない、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる単離ポリペプチド分子。
【請求項３９】
ＣＤ２０結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む単離ＣＡＲ分子であって、前記ＣＤ２０結合ドメインは、表１又は表３に挙げられる１つ以上の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）と、表１又は表２に挙げられる１つ以上の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）とを含む、単離ＣＡＲ分子。
【請求項４０】
表１又は表３に挙げられる任意の配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項３９に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項４１】
表１又は表２に挙げられる任意の配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、請求項３９又は４０に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項４２】
表１又は表３に挙げられる任意の配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と、表１又は表２に挙げられる任意の配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３とを含む、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項４３】
前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、又はＬＣＤＲ３は、表１に挙げられるアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項４４】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、又はＨＣＤＲ３は、表１に挙げられるアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項４５】
前記ＣＡＲは、表１又は表５に挙げられる任意の軽鎖可変領域を含む、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項４６】
前記ＣＡＲは、表１又は表４に挙げられる任意の重鎖可変領域を含む、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項４７】
前記ＣＡＲは、表１又は表５に挙げられる任意の軽鎖可変領域と、表１又は表４に挙げられる任意の重鎖可変領域とを含む、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項４８】
前記ＣＤ２０結合ドメインは、ｓｃＦｖである、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項４９】
前記ＣＤ２０結合ドメインは、表１に挙げられるアミノ酸配列の軽鎖と重鎖とを含む、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項５０】
前記ＣＤ２０結合ドメインは、表１又は表５に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、３０、２０又は１０以下の改変を有するアミノ酸配列、又は表１又は表５に提供されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項５１】
前記ＣＤ２０結合ドメインは、表１又は表４に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、３０、２０又は１０以下の改変を有するアミノ酸配列、又は表１又は表４に提供されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項３９〜５０のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項５２】
前記ＣＤ２０結合ドメインは、配列番号１５９、配列番号２４０、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択される配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項３９〜５１のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項５３】
Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを更に含む、請求項３９〜５２又は８８〜１２３のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項５４】
前記膜貫通ドメインは、配列番号８０１のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、２０、１０又は５つ以下の改変を有するアミノ酸配列、又は配列番号８０１のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含み、任意選択により、前記膜貫通ドメインは、配列番号８０１の配列を含む、請求項５３に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項５５】
前記ヒトＣＤ２０又はＣＤ２２結合ドメインは、ヒンジ領域によって前記膜貫通ドメインに結合され、任意選択により、前記ヒンジ領域は、配列番号７９９若しくは配列番号８１４又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項３９〜５４又は８８〜１２３のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項５６】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含み、任意選択により、前記共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質の機能性シグナル伝達ドメインを含む、請求項３９〜５５又は８８〜１２３のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項５７】
前記共刺激ドメインは、配列番号８０３のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、２０、１０又は５つ以下の改変を有するアミノ酸配列、又は配列番号８０３のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含み、任意選択により、前記共刺激ドメインは、配列番号８０３の配列を含む、請求項５６に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項５８】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含み、任意選択により、前記一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの機能性シグナル伝達ドメインを含む、請求項３９〜５７又は８８〜１２３のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項５９】
ＣＤ３ζの前記機能性シグナル伝達ドメインは、配列番号８０５又は配列番号８０７を含む、請求項５８に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項６０】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能性シグナル伝達ドメイン及び／又はＣＤ３ζの機能性シグナル伝達ドメインを含む、請求項３９〜５９又は８８〜１２３のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項６１】
（ｉ）前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３の配列及び／又は配列番号８０５の配列を含むか；又は
（ｉｉ）前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３の配列及び／又は配列番号８０６の配列を含む、請求項３９〜６０又は８８〜１２３のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項６２】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３のアミノ酸配列及び／又は配列番号８０５若しくは配列番号８０７のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、２０、１０又は５つ以下の改変を有するアミノ酸配列、又は配列番号８０３のアミノ酸配列及び／又は配列番号８０５若しくは配列番号８０７のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項３９〜６１又は８８〜１２３のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項６３】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３の配列及び配列番号８０５又は配列番号８０７の配列を含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインを含む前記配列は、同じフレーム内において且つ単一のポリペプチド鎖として発現される、請求項３９〜６２又は８８〜１２３のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項６４】
リーダー配列を更に含み、任意選択により、前記リーダー配列は、配列番号７９７のアミノ酸配列又は配列番号７９７のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、請求項３９〜６３又は８８〜１２３のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項６５】
配列番号１６１、配列番号２４２、配列番号２６、配列番号５３、配列番号８０、配列番号１０７、配列番号１３４、配列番号１８８、配列番号２１５、配列番号２６９、配列番号２９６、配列番号３２３、配列番号３５０、配列番号３７７、配列番号４０４、及び配列番号４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列若しくはその９５〜９９％の同一性を有する配列、又は配列番号１６１、配列番号２４２、配列番号２６、配列番号５３、配列番号８０、配列番号１０７、配列番号１３４、配列番号１８８、配列番号２１５、配列番号２６９、配列番号２９６、配列番号３２３、配列番号３５０、配列番号３７７、配列番号４０４、及び配列番号４３１のアミノ酸の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、３０、２０、１０又は５つ以下の改変を含むアミノ酸配列を含み、任意選択により、前記ＣＡＲポリペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰのシグナルペプチドを含まない、請求項３９〜６４又は８８〜１２３のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項６６】
配列番号１６１、配列番号２４２、配列番号２６、配列番号５３、配列番号８０、配列番号１０７、配列番号１３４、配列番号１８８、配列番号２１５、配列番号２６９、配列番号２９６、配列番号３２３、配列番号３５０、配列番号３７７、配列番号４０４、及び配列番号４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、任意選択により、前記ＣＡＲポリペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰのシグナルペプチドを含まない、請求項３９〜６４又は８８〜１２３のいずれか一項に記載の単離ＣＡＲ分子。
【請求項６７】
配列番号１５９、配列番号２４０、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群における任意のＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）と、配列番号１５９、配列番号２４０、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群における任意のＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）とを含むＣＤ２０結合ドメイン。
【請求項６８】
前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３は、表１又は表３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６７に記載のＣＤ２０結合ドメイン。
【請求項６９】
前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
（ａ）配列番号１４７、１４８、及び１４９；
（ｂ）配列番号２２８、２２９、及び２３０；
（ｃ）配列番号６６、６７、及び６８；
（ｄ）配列番号９３、９４、及び９５；
（ｅ）配列番号１２０、１２１、及び１２２；
（ｆ）配列番号１２、１３、及び１４；
（ｇ）配列番号１７４、１７５、及び１７６；
（ｈ）配列番号２０１、２０２、及び２０３；
（ｉ）配列番号３９、４０、及び４１；
（ｊ）配列番号２５５、２５６、及び２５７；
（ｋ）配列番号２８２、２８３、及び２８４；
（ｌ）配列番号３０９、３１０、及び３１１；
（ｍ）配列番号３３６、３３７、及び３３８；
（ｎ）配列番号３６３、３６４、及び３６５；
（ｏ）配列番号３９０、３９１、及び３９２；及び
（ｐ）配列番号４１７、４１８、及び４１９
から選択される、請求項６７又は６８に記載のＣＤ２０結合ドメイン。
【請求項７０】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３は、表１又は表２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン。
【請求項７１】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
（ａ）配列番号１３６、１３７、及び１３８；
（ｂ）配列番号２１７、２１８、及び２１９；
（ｃ）配列番号５５、５６、及び５７；
（ｄ）配列番号８２、８３、及び８４；
（ｅ）配列番号１０９、１１０、及び１１１；
（ｆ）配列番号１、２、及び３；
（ｇ）配列番号１６３、１６４、及び１６５；
（ｈ）配列番号１９０、１９１、及び１９２；
（ｉ）配列番号２８、２９、及び３０；
（ｊ）配列番号２４４、２４５、及び２４６；
（ｋ）配列番号２７１、２７２、及び２７３；
（ｌ）配列番号２９８、２９９、及び３００；
（ｍ）配列番号３２５、３２６、及び３２７；
（ｎ）配列番号３５２、３５３、及び３５４；
（ｏ）配列番号３７９、３８０、及び３８１；及び
（ｐ）配列番号４０６、４０７、及び４０８
から選択される、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン。
【請求項７２】
前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
（ａ）配列番号１４７、１４８、１４９、１３６、１３７、及び１３８；
（ｂ）配列番号２２８、２２９、２３０、２１７、２１８、及び２１９；
（ｃ）配列番号６６、６７、６８、５５、５６、及び５７；
（ｄ）配列番号９３、９４、９５、８２、８３、及び８４；
（ｅ）配列番号１２０、１２１、１２２、１０９、１１０、及び１１１；
（ｆ）配列番号１２、１３、１４、１、２、及び３；
（ｇ）配列番号１７４、１７５、１７６、１６３、１６４、及び１６５；
（ｈ）配列番号２０１、２０２、２０３、１９０、１９１、及び１９２；
（ｉ）配列番号３９、４０、４１、２８、２９、及び３０；
（ｊ）配列番号２５５、２５６、２５７、２４４、２４５、及び２４６；
（ｋ）配列番号２８２、２８３、２８４、２７１、２７２、及び２７３；
（ｌ）配列番号３０９、３１０、３１１、２９８、２９９、及び３００；
（ｍ）配列番号３３６、３３７、３３８、３２５、３２６、及び３２７；
（ｎ）配列番号３６３、３６４、３６５、３５２、３５３、及び３５４；
（ｏ）配列番号３９０、３９１、３９２、３７９、３８０、及び３８１；及び
（ｐ）配列番号４１７、４１８、４１９、４０６、４０７、及び４０８
から選択される、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン。
【請求項７３】
表１又は表５から選択されるアミノ酸配列の軽鎖と、表１又は表４から選択されるアミノ酸配列の重鎖とを含むｓｃＦｖである、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン。
【請求項７４】
前記軽鎖可変領域及び前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
（ａ）配列番号１５６及び１４５；
（ｂ）配列番号２３７及び２２６；
（ｃ）配列番号２１及び１０、
（ｄ）配列番号７５及び６４；
（ｅ）配列番号１０２及び９１；
（ｆ）配列番号１２９及び１１８；
（ｇ）配列番号１８３及び１７２；
（ｈ）配列番号２１０及び１９９；
（ｉ）配列番号４８及び３７；
（ｊ）配列番号２６４及び２５３；
（ｋ）配列番号２９１及び２８０；
（ｌ）配列番号３１８及び３０７；
（ｍ）配列番号３４５及び３３４；
（ｎ）配列番号３７２及び３６１；
（ｏ）配列番号３９９及び３８８；及び
（ｐ）配列番号４２６及び４１５
から選択される、請求項７３に記載のＣＤ２０結合ドメイン。
【請求項７５】
表１又は表５に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、３０、２０又は１０以下の改変を有するアミノ酸配列、又は表１又は表５のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；及び／又は表１又は表４に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、３０、２０又は１０以下の改変を有するアミノ酸配列、又は表１又は表４のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項６７〜７４のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン。
【請求項７６】
前記ＣＤ２０結合ドメインは、ネズミ科動物、ヒト、又はヒト化である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の単離核酸分子、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子又は請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン。
【請求項７７】
（ｉ）請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＤ２０  ＣＡＲ分子と、
（ｉｉ）Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ−１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７９ａ、又はＣＤ１７９ｂに結合するＣＡＲ分子と
をコードする核酸であって、例えば、前記第１及び前記第２の核酸分子は、単一の核酸分子に置かれる、核酸。
【請求項７８】
（ｉ）請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＤ２０  ＣＡＲ分子をコードする第１の核酸と、
（ｉｉ）Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ−１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７９ａ、又はＣＤ１７９ｂに結合するＣＡＲ分子をコードする第２の核酸と
を含む核酸であって、例えば、前記第１及び前記第２の核酸分子は、別個の核酸分子に置かれる、核酸。
【請求項７９】
前記Ｂ細胞抗原は、ＣＤ１９又はＣＤ２２である、請求項７７又は７８に記載の核酸。
【請求項８０】
Ｂ細胞抗原に結合する前記ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に結合し、及び表１１に係るＣＤ１９  ＣＡＲ、例えばＣＴＬ−０１９又はヒト化ＣＡＲ２をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項７７〜７９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８１】
Ｂ細胞抗原に結合する前記ＣＡＲ分子は、ＣＤ２２に結合し、及び表６に係るＣＤ２２  ＣＡＲ、例えばＣＤ２２−６５  ＣＡＲ、ＣＤ２２−６５ＫＤ  ＣＡＲ、ＣＤ２２−６５ｓ  ＣＡＲ、又はＣＤ２２−６５ｓｓ  ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項７７〜７９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８２】
切断可能ペプチド、例えばＰ２Ａ又はＦ２Ａをコードするヌクレオチド配列又はＩＲＥＳをコードするヌクレオチド配列は、前記ＣＤ２０  ＣＡＲをコードする前記核酸分子と、Ｂ細胞抗原に結合する前記ＣＡＲをコードする前記核酸分子との間に置かれる、請求項７７〜８１のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８３】
前記ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＢ細胞抗原に結合する前記ＣＡＲは、単一のプロモーターにより、例えばバイシストロニック転写産物としてコードされる、請求項７７〜８２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８４】
前記単一のプロモーターは、ＥＦ−１αプロモーターであり、任意選択により、前記ＥＦ−１αプロモーターは、配列番号８３３の配列を含む、請求項８３に記載の核酸。
【請求項８５】
前記ＣＤ２０  ＣＡＲは、第１のプロモーターによってコードされ、及びＢ細胞抗原に結合する前記ＣＡＲは、第２のプロモーターによってコードされる、請求項７７〜８２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８６】
ＲＮＡ又はＤＮＡを含む、請求項７７〜８５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８７】
請求項７７〜８６のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる単離ポリペプチド分子。
【請求項８８】
（ｉ）配列番号８３９の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＣＤ２２−６５ｓＫＤ）のアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉ）例えば配列番号８４０のアミノ酸配列を含むＣＤ２２−６５ｓＫＤの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列
を含むＣＤ２２結合ドメイン又はＣＡＲ分子。
【請求項８９】
前記ＶＨ及びＶＬ配列は、直接、例えばリンカーなしに結合される、請求項８８に記載のＣＤ２２結合ドメイン又はＣＡＲ分子。
【請求項９０】
前記ＶＨ及びＶＬ配列は、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、０、１、２、３、４、５、又は６であり、任意選択により、ｎは、１である）を介して結合される、請求項８８に記載のＣＤ２２結合ドメイン又はＣＡＲ分子。
【請求項９１】
配列番号８３７のアミノ酸配列（ＣＤ２２−６５ｓＫＤ  ｓｃＦｖ）を含む、請求項９０に記載のＣＤ２２結合ドメイン又はＣＡＲ分子。
【請求項９２】
配列番号８３５のｓｃＦｖ（ＣＤ２２−６５ｓ）又は配列番号８３６のｓｃＦｖ（ＣＤ２２−６５ｓｓ）のアミノ酸配列を含むＣＤ２２結合ドメイン又はＣＡＲ分子。
【請求項９３】
請求項８８〜９２のいずれか一項に記載のＣＤ２２結合ドメイン又はＣＡＲ分子をコードする核酸。
【請求項９４】
ＣＤ２０に対する第１の結合特異性と、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａの１つ以上に対する第２の結合特異性とを有する多重特異性、例えば二重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子であって、前記第１の結合特異性は、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメインを含む、多重特異性、例えば二重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項９５】
ＣＤ２２に対する第１の結合特異性と、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａの１つ以上に対する第２の結合特異性とを有する多重特異性、例えば二重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子であって、前記第１の結合特異性は、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載のＣＤ２２結合ドメインを含む、多重特異性、例えば二重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項９６】
ＣＤ１９に対する第１の結合特異性と、ＣＤ２０又はＣＤ２２の一方又は両方に対する第２の結合特異性とを有する多重特異性、例えば二重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子であって、
（ｉ）前記二重特異性抗体分子は、Ｎ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有するか；
（ｉｉ）前記二重特異性抗体分子は、Ｎ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有するか；
（ｉｉｉ）前記二重特異性抗体分子は、Ｎ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有するか；又は
（ｉｖ）前記二重特異性抗体分子は、Ｎ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有し、
リンカーは、２つの抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）間、例えばコンストラクトがＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置される場合にＶＬ１とＶＬ２との間；前記コンストラクトがＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置される場合にＶＨ１とＶＨ２との間；前記コンストラクトがＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置される場合にＶＨ１とＶＬ２との間；又は前記コンストラクトがＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置される場合にＶＬ１とＶＨ２との間に置かれる、多重特異性、例えば二重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項９７】
（ｉ）前記二重特異性抗体分子は、Ｎ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有するか；
（ｉｉ）前記二重特異性抗体分子は、Ｎ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有するか；
（ｉｉｉ）前記二重特異性抗体分子は、Ｎ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有するか；又は
（ｉｖ）前記二重特異性抗体分子は、Ｎ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する、請求項９４又は９５に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項９８】
リンカーは、２つの抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）間、例えばコンストラクトがＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置される場合にＶＬ１とＶＬ２との間；前記コンストラクトがＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置される場合にＶＨ１とＶＨ２との間；前記コンストラクトがＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置される場合にＶＨ１とＶＬ２との間；又は前記コンストラクトがＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置される場合にＶＬ１とＶＨ２との間に置かれる、請求項９７に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項９９】
ＣＤ１９に対する第１の結合特異性と、ＣＤ２０に対する第２の結合特異性とを有し、前記ＣＤ２０結合特異性は、表１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＤ２０−Ｃ３Ｈ２又はＣＤ２０−Ｃ５Ｈ１からのＶＨ及びＶＬを含む、請求項９６に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１００】
ＣＤ１９に対する第１の結合特異性と、ＣＤ２２に対する第２の結合特異性とを有し、任意選択により、前記ＣＤ２２結合特異性は、表６に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＤ２２−６５からのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖ、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖ、又はＣＤ２２−６５ＫＤ  ｓｃＦｖを含む、請求項９６に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１０１】
前記リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）であるか、又は前記リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含むか又はそれからなる、請求項９６、９８、９９又は１００のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１０２】
前記ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＴＬ０１９  ｓｃＦｖ（配列番号７６５）、例えばヒト化ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、例えばヒト化ＣＡＲ２を含む、請求項９６〜１０１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１０３】
ＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２２に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ２結合特異性とを含む、請求項９５、９６、１０１又は１０２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１０４】
前記第１及び第２の結合特異性は、任意選択によりリンカーを含む連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である、請求項９４〜１０３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１０５】
前記多重特異性抗体分子は、ＣＡＲ分子に存在する、請求項９４〜１０４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１０６】
前記ＣＡＲ分子は、第１及び第２の結合特異性を含む多重特異性ＣＡＲを含む、請求項１０５に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１０７】
ＣＡＲ分子は、２つの抗体分子、例えば２つのｓｃＦｖを含む、請求項１０５又は１０６に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１０８】
Ｎ末端からＣ末端に、前記ＣＡＲ分子は、任意選択によりリンカーを介して膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインまで、遠位結合特異性、例えば遠位抗体分子（例えば、遠位抗原結合ドメイン、例えば遠位ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ２）、任意選択によりリンカー、続いて近位結合特異性、例えば近位抗体分子（例えば、近位抗原結合ドメイン、例えば近位ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ１）を含む、請求項１０５〜１０７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１０９】
前記ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する近位又は遠位結合特異性、例えばＣＤ１９結合特異性を含む、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１１０】
前記ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２２に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ２２に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ２結合特異性とを含む、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１１１】
前記ＣＡＲ分子は、ＣＤ２２に対する近位又は遠位結合特異性、例えばＣＤ２２結合特異性を含む、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１１２】
前記ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２２に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ２２に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ２結合特異性とを含む、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１１３】
前記ＣＡＲ分子は、ＣＤ２０に対する近位又は遠位結合特異性、例えばＣＤ２０結合特異性を含む、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１１４】
前記ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２０に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ２０に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ２結合特異性とを含む、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１１５】
前記ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２０に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ２０に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ２結合特異性とを含む、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１１６】
前記第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状であり、任意選択により、前記第１及び第２の結合特異性は、リンカーを含む、請求項９４〜１１５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１１７】
前記リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）を含むか又はそれからなる、請求項１１６に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１１８】
前記リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎを含むか又はそれからなり、及びｎ＝１である、請求項１１７に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１１９】
前記リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）を含むか又はそれからなる、請求項１１７に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１２０】
前記リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）のアミノ酸配列（配列番号２３）を含むか又はそれからなる、請求項１１７に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１２１】
前記リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含むか又はそれからなる、請求項１１６に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１２２】
配列番号８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８６０、８９５、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、又は８７３のいずれかのヌクレオチド配列、又は前記配列のいずれかと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる核酸によってコードされる、請求項１０４〜１２１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１２３】
配列番号８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、又は８７４のいずれかのアミノ酸配列、或いは前記配列のいずれかと少なくとも９５％同一であるか、又は少なくとも１、２若しくは３つの改変であるが、３０、２０若しくは１０以下の改変を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項１０４〜１２１のいずれか一項に記載の多重特異性、例えば二重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子。
【請求項１２４】
請求項９４〜１２３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子をコードする核酸。
【請求項１２５】
配列番号８４４、８４６、８４８、８５０、８５２、８５４、８５６、８６０、８９５、８５９、８６１、８６３、８６５、８６７、８６９、８７１、又は８７３のいずれかのヌクレオチド配列、又は前記配列のいずれかと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、多重特異性抗体分子又はＣＡＲ分子をコードする核酸。
【請求項１２６】
請求項１〜３７、７７〜８６、９３若しくは１２４のいずれか一項に記載の核酸分子、又は請求項３８若しくは８７に記載のポリペプチドをコードする核酸分子、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子をコードする核酸分子、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメインをコードする核酸分子、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載のＣＤ２２結合ドメイン若しくはＣＡＲ分子をコードする核酸分子、又は請求項９４〜１２４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子若しくはＣＡＲ分子をコードする核酸分子を含むベクター、例えば第１及び第２のベクターの一方又は両方。
【請求項１２７】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１２６に記載のベクター。
【請求項１２８】
前記ＣＤ２０  ＣＡＲ分子は、第１のプロモーターによってコードされ、及びＢ細胞抗原に結合する前記ＣＡＲ分子は、第２のプロモーターによってコードされる、請求項７７〜８６のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２９】
インビトロ転写ベクターである、請求項１２６〜１２８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１３０】
前記ベクターの１つ以上の核酸配列は、ポリ（Ａ）テール及び／又は３’ＵＴＲを更に含む、請求項１２６〜１２９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１３１】
請求項１〜３７、７７〜８６、９３若しくは１２４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３８若しくは８７に記載のポリペプチド、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載のＣＤ２２結合ドメイン若しくはＣＡＲ分子、請求項９４〜１２４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子、又は請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団（例えば、第１及び／又は第２の免疫エフェクター細胞の集団）。
【請求項１３２】
１つ以上、例えば第１、第２、及び／又は第３のＣＡＲ分子であって、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ２０  ＣＡＲ若しくはＣＤ２２  ＣＡＲ又はその２つ若しくは３つの組み合わせから選択される１つ以上のＣＡＲ分子を含む、請求項１３１に記載の細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団。
【請求項１３３】
前記１つ以上のＣＡＲ分子は、同じ細胞に存在する、請求項１３１又は１３２に記載の細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団。
【請求項１３４】
前記１つ以上のＣＡＲ分子は、異なる細胞に存在する、請求項１３１又は１３２に記載の細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団。
【請求項１３５】
前記細胞は、ヒトＴ細胞又はＮＫ細胞であり、任意選択により、前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である、請求項１３１〜１３４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３６】
細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団を作製する方法であって、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を請求項１〜３７、７７〜８６、９３若しくは１２４のいずれか一項に記載の核酸又は請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載のベクターで形質導入することを含む方法。
【請求項１３７】
インビトロ転写ＲＮＡ又は合成ＲＮＡを細胞に導入することを含む、ＲＮＡ操作された細胞の集団を作成する方法であって、前記ＲＮＡは、請求項３９〜６６又は８８〜１２３のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子をコードする核酸を含む、方法。
【請求項１３８】
（ｉ）請求項１〜３７、７７〜８６、９３若しくは１２４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３８若しくは８７に記載のポリペプチド、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン、又は請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載のベクターを含む第１の細胞集団と；
（ｉｉ）Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ−１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７９ａ、又はＣＤ１７９ｂに結合するＣＡＲをコードする核酸を含む第２の細胞集団と
を含む免疫エフェクター細胞の集団。
【請求項１３９】
前記Ｂ細胞抗原は、ＣＤ１９又はＣＤ２２である、請求項１３８に記載の集団。
【請求項１４０】
前記ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合し、及び表１１に係るＣＤ１９  ＣＡＲ、例えばＣＴＬ−０１９又はヒト化ＣＡＲ２をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１３８又は１３９に記載の集団。
【請求項１４１】
前記ＣＡＲは、ＣＤ２２に結合し、及び表６に係るＣＤ２２  ＣＡＲ、例えばＣＤ２２−６５  ＣＡＲ、ＣＤ２２−６５ＫＤ  ＣＡＲ、ＣＤ２２−６５ｓ  ＣＡＲ、又はＣＤ２２−６５ｓｓ  ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１３８又は１３９に記載の集団。
【請求項１４２】
哺乳類において抗腫瘍免疫を付与する方法における使用のための、請求項１〜３７、７７〜８６、９３若しくは１２４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３８若しくは８７に記載のポリペプチド、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載のＣＤ２２結合ドメイン、請求項９４〜１２４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子、又は請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載のベクターを含み、例えばそれを発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団であって、前記方法は、前記細胞の有効量を前記哺乳類に投与することを含む、細胞。
【請求項１４３】
哺乳類において抗腫瘍免疫を付与する方法であって、請求項１〜３７、７７〜８６、９３若しくは１２４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３８若しくは８７に記載のポリペプチド、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載のＣＤ２２結合ドメイン、請求項９４〜１２４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子、又は請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載のベクターを含み、例えばそれを発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団の有効量を前記哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項１４４】
前記細胞は、自己Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞であるか、又は同種異系Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞である、請求項１４３又は１４４に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１４５】
前記哺乳類は、ヒトである、請求項１４３又は１４４に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１４６】
ＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２の発現に関連する癌又は疾患を有する哺乳類を治療する方法における使用のための、請求項１〜３７、７７〜８６、９３若しくは１２４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３８若しくは８７に記載のポリペプチド、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載のＣＤ２２結合ドメイン、請求項９４〜１２４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子、又は請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載のベクターを発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団であって、前記方法は、前記細胞の有効量を前記哺乳類に投与することを含む、細胞。
【請求項１４７】
ＣＤ２０、ＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２の発現に関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、請求項１〜３７、７７〜８６、９３若しくは１２４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３８若しくは８７に記載のポリペプチド、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載のＣＤ２２結合ドメイン、請求項９４〜１２４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子、又は請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団の有効量を前記哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項１４８】
ＣＤ２０、ＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２発現に関連する前記疾患は、増殖性疾患、例えば癌若しくは悪性腫瘍、前癌病態、例えば骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病、又はＣＤ２０の発現に関連する非癌関連徴候から選択される、請求項１４７に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１４９】
癌、例えば白血病及びリンパ腫からなる群から選択される血液癌を治療する方法における使用のための、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載のＣＤ２２結合ドメイン若しくはＣＡＲ分子、請求項９４〜１２４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子、又は請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載のベクターを発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団であって、前記方法は、前記細胞の有効量を前記哺乳類に投与することを含む、細胞。
【請求項１５０】
癌、例えば白血病及びリンパ腫から選択される血液癌を治療する方法であって、請求項３８若しくは８７に記載のポリペプチド、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載のＣＤ２２結合ドメイン若しくはＣＡＲ分子、請求項９４〜１２４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子、又は請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載のベクターを発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団の有効量を前記哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項１５１】
前記疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁層リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常若しくは骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病、又はこれらの組み合わせである、請求項１４２〜１５０のいずれか一項に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１５２】
前記疾患は、リンパ腫、例えばびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である、請求項１５１に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１５３】
前記疾患は、Ｂ細胞悪性腫瘍である、請求項１５１に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１５４】
ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ−１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７９ａ、又はＣＤ１７９ｂの阻害薬の１つ以上から選択されるＢ細胞阻害薬を対象に投与することを更に含む、請求項１４２〜１５３のいずれか一項に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１５５】
前記Ｂ細胞阻害薬は、
小分子阻害薬；
ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａの１つ以上に結合するポリペプチド、任意選択により可溶性リガンド、抗体、又はその抗原結合断片；
阻害性核酸、任意選択によりｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ；及び
Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ−１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７９ａ、又はＣＤ１７９ｂに結合するＣＡＲを発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団
からなる群から選択される、請求項１５４に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１５６】
前記Ｂ細胞阻害薬は、Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ−１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７９ａ、又はＣＤ１７９ｂに結合するＣＡＲを発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団を含む、請求項１５５に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１５７】
前記Ｂ細胞阻害薬は、ＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団を含む、請求項１５５又は１５６に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１５８】
前記Ｂ細胞阻害薬は、ＣＡＲ分子を発現する前記細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団の前に投与される、請求項１５５〜１５７のいずれか一項に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１５９】
前記Ｂ細胞阻害薬は、ＣＡＲ分子を発現する前記細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団と同時に投与される、請求項１５５〜１５７のいずれか一項に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１６０】
前記Ｂ細胞阻害薬は、ＣＡＲ分子を発現する前記細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団の後に投与される、請求項１５５〜１５７のいずれか一項に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１６１】
ＣＡＲ分子を発現する前記細胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の有効性を増加させる薬剤と併用して投与される、請求項１５５〜１６０のいずれか一項に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１６２】
ＣＡＲ分子を発現する前記細胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与に関連する１つ以上の副作用を改善する薬剤と併用して投与される、請求項１５５〜１６１のいずれか一項に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１６３】
ＣＡＲ分子を発現する前記細胞は、ＣＤ２０に関連する前記疾患を治療する薬剤と併用して投与される、請求項１５５〜１６２のいずれか一項に記載の使用のための細胞又は方法。
【請求項１６４】
細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第２のポリペプチドに関連している、抑制性分子の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドを含む抑制性分子を更に発現し、任意選択により、前記抑制性分子は、ＰＤ１の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む、請求項１３１〜１３５又は１３８〜１４２のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団。
【請求項１６５】
医薬品としての使用のための、請求項１〜３７、７７〜８６、９３若しくは１２４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３８若しくは８７に記載のポリペプチド、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載のＣＤ２２結合ドメイン若しくはＣＡＲ分子、請求項９４〜１２４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子、又は請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１６６】
ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＣＤ１９に関連する疾患の治療における使用のための、請求項１〜３７、７７〜８６、９３若しくは１２４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項８７に記載のポリペプチド、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のＣＤ２０結合ドメイン、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載のＣＤ２２結合ドメイン若しくはＣＡＲ分子、請求項９４〜１２４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子、又は請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１６７】
ＣＤ１９阻害薬、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して非奏効者、部分奏効者、又は再発者である患者を治療する方法における使用のためのＣＤ２０の阻害薬であって、前記方法は、ＣＤ２０の前記阻害薬、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０  ＣＡＲを前記患者に投与することを含む、ＣＤ２０の阻害薬。
【請求項１６８】
ＣＤ１９阻害薬、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して非奏効者、部分奏効者、又は再発者である患者を治療する方法であって、ＣＤ２０の阻害薬、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０  ＣＡＲを前記患者に投与することを含む方法。
【請求項１６９】
前記患者は、ＣＤ１９陰性癌細胞及びＣＤ２０陽性の癌細胞を含む、請求項１６７又は１６８に記載の使用のためのＣＤ２０の阻害薬又は方法。
【請求項１７０】
前記患者がＣＤ１９陰性癌細胞を含むかどうかを決定するステップを更に含む、請求項１６７〜１６９のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ２０の阻害薬又は方法。
【請求項１７１】
前記患者がＣＤ２０陽性の癌細胞を含むかどうかを決定するステップを更に含む、請求項１６７〜１７０のいずれか一項に記載の使用のためのＣＤ２０の阻害薬又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１６年１０月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４０５，５２０号明細書に対する優先権を主張し、この内容は、全て参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、概して、分化クラスター２０タンパク質（ＣＤ２０）又は分化クラスター２２タンパク質（ＣＤ２２）の発現に関連する疾患を治療するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されたＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くのＢ細胞悪性腫瘍患者は、標準療法では不治である。加えて、従来の治療選択肢は、多くの場合に重篤な副作用を有する。癌免疫療法において試みがなされているものの、幾つかの障害により、これは、臨床効果の実現が極めて困難な目標となっている。何百ものいわゆる腫瘍抗原が同定されているが、それらは、概して自己由来であり、従って免疫原性が低い。更に、腫瘍は、幾つかの機構を用いて自らを免疫攻撃の惹起及び伝播に不適にする。
【０００４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変自己Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）療法を用いた最近の展開は、Ｔ細胞をＢ細胞悪性腫瘍などの癌細胞上の好適な細胞表面分子に仕向け直すことに依存するものであり、免疫系の力を利用したＢ細胞悪性腫瘍及び他の癌の治療において有望な結果を示している（例えば、非特許文献１を参照されたい）。マウス由来ＣＡＲＴ１９（即ち「ＣＴＬ０１９」）の臨床結果は、ＣＬＬ並びに小児ＡＬＬに罹患している患者において完全寛解が得られる見込みを示している（例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４を参照されたい）。遺伝子改変Ｔ細胞上のキメラ抗原受容体が標的細胞を認識し破壊する能力に加えて、治療的Ｔ細胞療法の成功には、白血病再発について調査するために増殖して長期間持続する能力を有することが必要である。アネルギー、抑制又は枯渇に起因するＴ細胞品質のばらつきがＣＡＲ形質転換Ｔ細胞の性能に影響を及ぼし得るが、それに対し、現時点で当業者の制御は限られている。有効であるには、ＣＡＲ形質転換患者Ｔ細胞が、コグネイト抗原に応答して増殖する能力を持続及び維持する必要がある。ＡＬＬ患者Ｔ細胞は、マウスｓｃＦｖを含むＣＡＲＴ１９でこれを行い得ることが示されている（例えば、非特許文献４を参照されたい）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ３：３８８−３９８（２０１３）
【非特許文献２】Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３：９５ｒａ７３（２０１１）
【非特許文献３】Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＥＪＭ  ３６５：７２５−７３３（２０１１）
【非特許文献４】Ｇｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＥＪＭ  ３６８：１５０９−１５１８（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、更なるＣＡＲ療法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、少なくとも一部には、ＣＤ２０及びＣＤ２２に対する新規抗原結合ドメイン及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子、並びに例えば単剤療法としての又は併用療法における使用方法を特徴とする。一部の実施形態において、本明細書に開示される組成物及び方法は、Ｂ細胞阻害薬、例えばＣＤ１９、又はＣＤ２２の阻害薬、又はこれらの組み合わせと併用したＣＤ２０に結合するＣＡＲ分子の併用を含み得る。組成物をコードする核酸、宿主細胞、ベクター、並びに作製及び使用方法も開示される。
【０００８】
ＣＤ２０結合ドメイン及びＣＤ２０  ＣＡＲをコードする核酸
第１の態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸分子を特徴とし、ここで、ＣＡＲは、ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ネズミ科動物、ヒト又はヒト化ＣＤ２０結合ドメイン）と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含む抗体又は抗体断片を含む。一実施形態において、ＣＡＲは、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメイン（例えば、本明細書に記載されるネズミ科動物、ヒト又はヒト化ＣＤ２０結合ドメイン）と、本明細書に記載される膜貫通ドメインと、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含む抗体又は抗体断片を含む。
【０００９】
一実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメインは、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、及び／又は本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、例えば、１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）ＬＣＤＲと１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）ＨＣＤＲとを含むＣＤ２０結合ドメインを含む。ある実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメインは、本明細書の例えば表１に記載され、及び表２に要約される重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３）を含む。ある実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメインは、本明細書の例えば表１に記載され、及び表３に要約される軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３）を含む。
【００１０】
一部の実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメインは、以下のアミノ酸配列の１、２、３、４、５、又は６つを含む：
ＨＣＤＲ１は（Ｎ／Ｓ）ＹＮ（Ｌ／Ｍ）Ｈのアミノ酸配列を含み、又はそれからなり；
ＨＣＤＲ２はＡＩＹＰＧＮ（Ｙ／Ｇ）ＤＴＳＹＮ（Ｑ／Ｐ）ＫＦＫＧのアミノ酸配列を含み、又はそれからなり；
ＨＣＤＲ３は（Ｖ／Ｓ）（Ｄ／Ｙ）Ｆ（Ｇ／Ｙ）（Ｈ／Ｇ）Ｓ（Ｒ／Ｓ）（Ｙ／Ｓ）ＷＹＦＤＶのアミノ酸コンセンサス配列を含み、又はそれからなり；
ＬＣＤＲ１はＲＡ（Ｔ／Ｓ）ＳＳＶＳＳＭ（Ｎ／Ｈ）のアミノ酸配列を含み、又はそれからなり；
ＬＣＤＲ２はＡＴＳＮＬＡＳのアミノ酸配列を含み、又はそれからなり；及び／又は
ＬＣＤＲ３はＱＱＷ（Ｔ／Ｉ）ＦＮＰＰＴのアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００１１】
一実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ネズミ科動物、ヒト又はヒト化ＣＤ２０結合ドメイン）は、本明細書に記載される（例えば、表１にあり、及び表５に要約される）軽鎖可変領域及び／又は本明細書に記載される（例えば、表１にあり、及び表４に要約される）重鎖可変領域を含む。一実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメインは、表１に示されるとおりの軽鎖と重鎖とを含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１にあるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表５に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、３０、２０又は１０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は表５のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；及び／又は表４に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、３０、２０又は１０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は表４のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００１２】
一実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６、好ましくは３又は４である）（配列番号２３）を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、以下の向き：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域又は重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれであり得る。
【００１３】
一実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメインは、配列番号１５９、配列番号２４０、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択される配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００１４】
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１６０、配列番号２４１、配列番号２５、配列番号５２、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１３３、配列番号１８７、配列番号２１４、配列番号２６８、配列番号２９５、配列番号３２２、配列番号３４９、配列番号３７６、配列番号４０３、及び配列番号からなる群から選択される配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインをコードする核酸配列は、表１に示されるとおりの配列を含む。
【００１５】
一部の実施形態において、単離核酸分子は、配列番号１６１、配列番号２４２、配列番号２６、配列番号５３、配列番号８０、配列番号１０７、配列番号１３４、配列番号１８８、配列番号２１５、配列番号２６９、配列番号２９６、配列番号３２３、配列番号３５０、配列番号３７７、配列番号４０４、及び配列番号４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列若しくはその９５〜９９％の同一性を有する配列、又は配列番号１６１、配列番号２４２、配列番号２６、配列番号５３、配列番号８０、配列番号１０７、配列番号１３４、配列番号１８８、配列番号２１５、配列番号２６９、配列番号２９６、配列番号３２３、配列番号３５０、配列番号３７７、配列番号４０４、及び配列番号４３１のアミノ酸の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、３０、２０、１０又は５つ以下の改変を含むアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドをコードし、任意選択により、ＣＡＲポリペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰのシグナルペプチドを含まない。
【００１６】
一部の実施形態において、単離核酸分子は、配列番号１６１、配列番号２４２、配列番号２６、配列番号５３、配列番号８０、配列番号１０７、配列番号１３４、配列番号１８８、配列番号２１５、配列番号２６９、配列番号２９６、配列番号３２３、配列番号３５０、配列番号３７７、配列番号４０４、及び配列番号４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドをコードし、任意選択により、ＣＡＲポリペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰのシグナルペプチドを含まない。
【００１７】
一部の実施形態において、単離核酸分子は、配列番号１６２、配列番号２４３、配列番号２７、配列番号５４、配列番号８１、配列番号１０８、配列番号１３５、配列番号１８９、配列番号２１６、配列番号２７０、配列番号２９７、配列番号３２４、配列番号３５１、配列番号３７８、配列番号４０５、及び配列番号４３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含み、任意選択により、ＣＡＲ核酸は、
【化１】
2019537433.tif 000002
のシグナルペプチド配列を含まない。
【００１８】
一部の実施形態において、単離核酸分子は、配列番号１６２、配列番号２４３、配列番号２７、配列番号５４、配列番号８１、配列番号１０８、配列番号１３５、配列番号１８９、配列番号２１６、配列番号２７０、配列番号２９７、配列番号３２４、配列番号３５１、配列番号３７８、配列番号４０５、及び配列番号４３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、任意選択により、ＣＡＲ核酸は、
【化２】
2019537433.tif 000003
のシグナルペプチド配列を含まない。
【００１９】
一実施形態において、コードされるＣＡＲは、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質、例えば本明細書に記載されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。一実施形態において、コードされる膜貫通ドメインは、配列番号８０１の配列を含む。一実施形態において、コードされる膜貫通ドメインは、配列番号８０１のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、２０、１０又は５つ以下の改変を含むアミノ酸配列、又は配列番号８０１のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、膜貫通ドメインをコードする核酸配列は、配列番号８０２の配列又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００２０】
一実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば本明細書に記載されるヒンジ領域によって膜貫通ドメインに結合される。一実施形態において、コードされるヒンジ領域は、配列番号７９９若しくは配列番号８１４又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ヒンジ領域をコードする核酸配列は、配列番号８００又は配列番号８１５の配列又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００２１】
一実施形態において、単離核酸分子は、共刺激ドメイン、例えば本明細書に記載される共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。
【００２２】
実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００２３】
一実施形態において、共刺激ドメインは、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択される、例えば本明細書に記載されるタンパク質から得られる機能性シグナル伝達ドメインである。一実施形態において、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２７又はＣＤ２８からなる群から選択される。一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号８０３、配列番号８１８又は配列番号８０９からなる群から選択される配列を含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号８０３の配列を含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号８０３のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、２０、１０又は５つ以下の改変を有するアミノ酸配列、又は配列番号８０３のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号８０４の配列又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００２４】
実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの機能性シグナル伝達ドメインを含む。実施形態において、ＣＤ３ζの機能性シグナル伝達ドメインは、配列番号８０５又は配列番号８０７を含む。
【００２５】
一実施形態において、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能性シグナル伝達ドメイン及び／又はＣＤ３ζの機能性シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３の配列及び／又は配列番号８０５若しくは配列番号８０７の配列を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３のアミノ酸配列及び／又は配列番号８０５若しくは配列番号８０７の配列の少なくとも１、２又は３つの改変であるが、２０、１０又は５つ以下の改変を有するアミノ酸配列、又は配列番号８０３のアミノ酸配列及び／又は配列番号８０５若しくは配列番号８０７の配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３の配列及び配列番号８０５又は配列番号８０７の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレーム内において且つ単一のポリペプチド鎖として発現される。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号８０４の配列又はその９５〜９９％の同一性を有する配列、及び／或いは配列番号８０６若しくは配列番号８０８の配列又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００２６】
別の態様において、本発明は、例えば、配列番号７９７のリーダー配列、例えば本明細書に記載されるリーダー配列と、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメイン、例えば本明細書に記載されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むＣＤ２０結合ドメイン、例えば表１に記載されるネズミ科動物、ヒト又はヒト化ＣＤ２０結合ドメイン、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列と、例えば配列番号７９９の本明細書に記載されるヒンジ領域と、例えば配列番号８０１の配列を有する本明細書に記載される膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインとを含むＣＡＲコンストラクトをコードする単離核酸分子に関する。一実施形態において、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば本明細書に記載される共刺激ドメイン、例えば配列番号８０３の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及び／又は一次シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に記載される一次シグナル伝達ドメイン、例えば配列番号８０５又は配列番号８０６の配列を有するＣＤ３ζ刺激ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲコンストラクトをコードする単離核酸分子は、配列番号７９８の核酸配列又はそれと９５〜９９％の同一性を有する配列によってコードされるリーダー配列を含む。
【００２７】
一部の実施形態において、単離核酸分子は、表１に記載されるＣＡＲアミノ酸配列をコードする核酸を含む（例えば、それからなる）。
【００２８】
一実施形態において、単離核酸分子は、配列番号２６、配列番号５３、配列番号８０、配列番号１０７、配列番号１３４、配列番号１６１、配列番号１８８、配列番号２１５、配列番号２４２、配列番号２６９、配列番号２９６、配列番号３２３、配列番号３５０、配列番号３７７、配列番号４０４、及び配列番号４３１のＣＡＲアミノ酸配列、又は配列番号２６、配列番号５３、配列番号８０、配列番号１０７、配列番号１３４、配列番号１６１、配列番号１８８、配列番号２１５、配列番号２４２、配列番号２６９、配列番号２９６、配列番号３２３、配列番号３５０、配列番号３７７、配列番号４０４、及び配列番号４３１のアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む（例えば、それからなる）。
【００２９】
一部の実施形態において、単離核酸分子は、表１に記載される核酸配列を含む（例えば、それからなる）。
【００３０】
一実施形態において、単離核酸分子は、配列番号１６２、配列番号２４３、配列番号２７、配列番号５４、配列番号８１、配列番号１０８、配列番号１３５、配列番号１８９、配列番号２１６、配列番号２７０、配列番号２９７、配列番号３２４、配列番号３５１、配列番号３７８、配列番号４０５、及び配列番号４３２の核酸配列、又は配列番号１６２、配列番号２４３、配列番号２７、配列番号５４、配列番号８１、配列番号１０８、配列番号１３５、配列番号１８９、配列番号２１６、配列番号２７０、配列番号２９７、配列番号３２４、配列番号３５１、配列番号３７８、配列番号４０５、及び配列番号４３２の核酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する核酸配列を含む（例えば、それからなる）。
【００３１】
一態様において、本発明は、ＣＤ２０結合ドメインをコードする単離核酸分子に関し、ここで、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）と、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）とを含み、例えば、１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）ＬＣＤＲと１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）ＨＣＤＲとを含むネズミ科動物、ヒト又はヒト化ＣＤ２０結合ドメインを含む。
【００３２】
一部の実施形態において、重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３）は、表２に記載される又は表１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３）は、表３に記載される又は表１に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
一部の実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
（ａ）配列番号１３６、１３７、及び１３８；
（ｂ）配列番号２１７、２１８、及び２１９；
（ｃ）配列番号５５、５６、及び５７；
（ｄ）配列番号８２、８３、及び８４；
（ｅ）配列番号１０９、１１０、及び１１１；
（ｆ）配列番号１、２、及び３；
（ｇ）配列番号１６３、１６４、及び１６５；
（ｈ）配列番号１９０、１９１、及び１９２；
（ｉ）配列番号２８、２９、及び３０；
（ｊ）配列番号２４４、２４５、及び２４６；
（ｋ）配列番号２７１、２７２、及び２７３；
（ｌ）配列番号２９８、２９９、及び３００；
（ｍ）配列番号３２５、３２６、及び３２７；
（ｎ）配列番号３５２、３５３、及び３５４；
（ｏ）配列番号３７９、３８０、及び３８１；及び
（ｐ）配列番号４０６、４０７、及び４０８
から選択される。
【００３４】
一部の実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
（ａ）配列番号１４７、１４８、及び１４９；
（ｂ）配列番号２２８、２２９、及び２３０；
（ｃ）配列番号６６、６７、及び６８；
（ｄ）配列番号９３、９４、及び９５；
（ｅ）配列番号１２０、１２１、及び１２２；
（ｆ）配列番号１２、１３、及び１４；
（ｇ）配列番号１７４、１７５、及び１７６；
（ｈ）配列番号２０１、２０２、及び２０３；
（ｉ）配列番号３９、４０、及び４１；
（ｊ）配列番号２５５、２５６、及び２５７；
（ｋ）配列番号２８２、２８３、及び２８４；
（ｌ）配列番号３０９、３１０、及び３１１；
（ｍ）配列番号３３６、３３７、及び３３８；
（ｎ）配列番号３６３、３６４、及び３６５；
（ｏ）配列番号３９０、３９１、及び３９２；及び
（ｐ）配列番号４１７、４１８、及び４１９
から選択される。
【００３５】
一部の実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
（ａ）配列番号１４７、１４８、１４９、１３６、１３７、及び１３８；
（ｂ）配列番号２２８、２２９、２３０、２１７、２１８、及び２１９；
（ｃ）配列番号６６、６７、６８、５５、５６、及び５７；
（ｄ）配列番号９３、９４、９５、８２、８３、及び８４；
（ｅ）配列番号１２０、１２１、１２２、１０９、１１０、及び１１１；
（ｆ）配列番号１２、１３、１４、１、２、及び３；
（ｇ）配列番号１７４、１７５、１７６、１６３、１６４、及び１６５；
（ｈ）配列番号２０１、２０２、２０３、１９０、１９１、及び１９２；
（ｉ）配列番号３９、４０、４１、２８、２９、及び３０；
（ｊ）配列番号２５５、２５６、２５７、２４４、２４５、及び２４６；
（ｋ）配列番号２８２、２８３、２８４、２７１、２７２、及び２７３；
（ｌ）配列番号３０９、３１０、３１１、２９８、２９９、及び３００；
（ｍ）配列番号３３６、３３７、３３８、３２５、３２６、及び３２７；
（ｎ）配列番号３６３、３６４、３６５、３５２、３５３、及び３５４；
（ｏ）配列番号３９０、３９１、３９２、３７９、３８０、及び３８１；及び
（ｐ）配列番号４１７、４１８、４１９、４０６、４０７、及び４０８
から選択される。
【００３６】
一部の実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
ａ）配列番号１３９、１４０、及び１４１；
ｂ）配列番号２２０、２２１、及び２２２；
ｃ）配列番号４、５、及び６；
ｄ）配列番号３１、３２、及び３３；
ｅ）配列番号５８、５９、及び６０；
ｆ）配列番号８５、８６、及び８７；
ｇ）配列番号１１２、１１３、及び１１４；
ｈ）配列番号１６６、１６７、及び１６８；
ｉ）配列番号１９３、１９４、及び１９５；
ｊ）配列番号２４７、２４８、及び２４９；
ｋ）配列番号２７４、２７５、及び２７６；
ｌ）配列番号３０１、３０２、及び３０３；
ｍ）配列番号３２８、３２９、及び３３０；
ｎ）配列番号３５５、３５６、及び３５７；
ｏ）配列番号３８２、３８３、及び３８４；及び
ｐ）配列番号４０９、４１０、及び４１１
から選択される。
【００３７】
一部の実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３のコードされるアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
ａ）配列番号１５０、１５１、及び１５２；
ｂ）配列番号２３１、２３２、及び２３３；
ｃ）配列番号１５、１６、及び１７；
ｄ）配列番号４２、４３、及び４４；
ｅ）配列番号６９、７０、及び７１；
ｆ）配列番号９６、９７、及び９８；
ｇ）配列番号１２３、１２４、及び１２５；
ｈ）配列番号１７７；１７８、及び１７９；
ｉ）配列番号２０４、２０５、及び２０６；
ｊ）配列番号２５８、２５９、及び２６０；
ｋ）配列番号２８５、２８６、及び２８７；
ｌ）配列番号３１２、３１３、及び３１４；
ｍ）配列番号３３９、３４０、及び３４１；
ｎ）配列番号３６６、３６７、及び３６８；
ｏ）配列番号３９３、３９４、及び３９５；及び
ｐ）配列番号４２０、４２１、及び４２２
から選択される。
【００３８】
一部の実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
ａ）配列番号１５０、１５１、１５２、１３９、１４０、及び１４１；
ｂ）配列番号：２３１、２３２、２３３、２２０、２２１、及び２２２；
ｃ）配列番号１５、１６、１７、４、５、及び６；
ｄ）配列番号４２、４３、４４、３１、３２、及び３３；
ｅ）配列番号６９、７０、７１、５８、５９、及び６０；
ｆ）配列番号９６、９７、９８、８５、８６、及び８７；
ｇ）配列番号１２３、１２４、１２５、１１２、１１３、及び１１４；
ｈ）配列番号１７７；１７８、１７９、１６６、１６７、及び１６８；
ｉ）配列番号２０４、２０５、２０６、１９３、１９４、及び１９５；
ｊ）配列番号２５８、２５９、２６０、２４７、２４８、及び２４９；
ｋ）配列番号２８５、２８６、２８７、２７４、２７５、及び２７６；
ｌ）配列番号３１２、３１３、３１４、３０１、３０２、及び３０３；
ｍ）配列番号３３９、３４０、３４１、３２８、３２９、及び３３０；
ｎ）配列番号３６６、３６７、３６８、３５５、３５６、及び３５７；
ｏ）配列番号３９３、３９４、３９５、３８２、３８３、及び３８４；及び
ｐ）配列番号４２０、４２１、４２２、４０９、４１０、及び４１１
から選択される。
【００３９】
一部の実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
ａ）配列番号１４２、１４３、及び１４４；
ｂ）配列番号２２３、２２４、及び２２５；
ｃ）配列番号７、８、及び９；
ｄ）配列番号３４、３５、及び３６；
ｅ）配列番号６１、６２、及び６３；
ｆ）配列番号８８、８９、及び９０；
ｇ）配列番号１１５、１１６、及び１１７；
ｈ）配列番号１６９、１７０、及び１７１；
ｉ）配列番号１９６、１９７、及び１９８；
ｊ）配列番号２５０、２５１、及び２５２；
ｋ）配列番号２７７、２７８、及び２７９；
ｌ）配列番号３０４、３０５、及び３０６；
ｍ）配列番号３３１、３３２、及び３３３；
ｎ）配列番号３５８、３５９、及び３６０；
ｏ）配列番号３８５、３８６、及び３８７；及び
ｐ）配列番号４１２、４１３、及び４１４
から選択される。
【００４０】
一部の実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
ａ）配列番号１５３、１５４、及び１５５；
ｂ）配列番号２３４、２３５、及び２３６；
ｃ）配列番号１８、１９、及び２０；
ｄ）配列番号４５、４６、及び４７；
ｅ）配列番号７２、７３、及び７４；
ｆ）配列番号９９、１００、及び１０１；
ｇ）配列番号１２６、１２７、及び１２８；
ｈ）配列番号１８０、１８１、及び１８２；
ｉ）配列番号２０７、２０８、及び２０９；
ｊ）配列番号２６１、２６２、及び２６３；
ｋ）配列番号２８８、２８９、及び２９０；
ｌ）配列番号３１５、３１６、及び３１７；
ｍ）配列番号３４２、３４３、及び３４４；
ｎ）配列番号３６９、３７０、及び３７１；
ｏ）配列番号３９６、３９７、及び３９８；及び
ｐ）配列番号４２３、４２４、及び４２５
から選択される。
【００４１】
一部の実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
ａ）配列番号１５３、１５４、１５５、１４２、１４３、及び１４４；
ｂ）配列番号２３４、２３５、２３６、２２３、２２４、及び２２５；
ｃ）配列番号１８、１９、２０、７、８、及び９；
ｄ）配列番号４５、４６、４７、３４、３５、及び３６；
ｅ）配列番号７２、７３、７４、６１、６２、及び６３；
ｆ）配列番号９９、１００、１０１、８８、８９、及び９０；
ｇ）配列番号１２６、１２７、１２８、１１５、１１６、及び１１７；
ｈ）配列番号１８０、１８１、１８２、１６９、１７０、及び１７１；
ｉ）配列番号２０７、２０８、２０９、１９６、１９７、及び１９８；
ｊ）配列番号２６１、２６２、２６３、２５０、２５１、及び２５２；
ｋ）配列番号２８８、２８９、２９０、２７７、２７８、及び２７９；
ｌ）配列番号３１５、３１６、３１７、３０４、３０５、及び３０６；
ｍ）配列番号３４２、３４３、３４４、３３１、３３２、及び３３３；
ｎ）配列番号３６９、３７０、３７１、３５８、３５９、及び３６０；
ｏ）配列番号３９６、３９７、３９８、３８５、３８６、及び３８７；及び
ｐ）配列番号４２３、４２４、４２５、４１２、４１３、及び４１４
から選択される。
【００４２】
ある実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
一実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメインは、本明細書（例えば、表５）に記載される軽鎖可変領域及び／又は本明細書（例えば、表４）に記載される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメインは、表１から選択されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むｓｃＦｖである。
【００４４】
ある実施形態において、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ以下のａ）〜ｐ）：
（ａ）配列番号１５６及び１４５；
（ｂ）配列番号２３７及び２２６；
（ｃ）配列番号２１及び１０、
（ｄ）配列番号７５及び６４；
（ｅ）配列番号１０２及び９１；
（ｆ）配列番号１２９及び１１８；
（ｇ）配列番号１８３及び１７２；
（ｈ）配列番号２１０及び１９９；
（ｉ）配列番号４８及び３７；
（ｊ）配列番号２６４及び２５３；
（ｋ）配列番号２９１及び２８０；
（ｌ）配列番号３１８及び３０７；
（ｍ）配列番号３４５及び３３４；
（ｎ）配列番号３７２及び３６１；
（ｏ）配列番号３９９及び３８８；及び
（ｐ）配列番号４２６及び４１５
から選択される。
【００４５】
ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表５に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、３０、２０又は１０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は表５のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；及び／又は表４に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、３０、２０又は１０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は表４にあるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００４６】
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、表２、表３、表４、又は表５に示されるものからなる群から選択される配列又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００４７】
一実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、及び本明細書の例えば表１に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書の例えば表１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域にリンカー、例えば本明細書に記載されるリンカーを介して結合する。一実施形態において、コードされるＣＤ２０結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６、好ましくは４である）（配列番号２３）を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、以下の向き：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域又は重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれであり得る。
【００４８】
ＣＤ２０結合ドメイン及びＣＤ２０  ＣＡＲを含むポリペプチド
別の態様において、本発明は、核酸分子によってコードされる単離ポリペプチド分子に関する。一実施形態において、単離ポリペプチド分子は、配列番号１５９、配列番号２４０、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択される配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００４９】
別の態様において、本発明は、ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ＣＤ２０に特異的に結合するネズミ科動物、ヒト又はヒト化抗体又は抗体断片）と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含む単離キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子に関する。一実施形態において、ＣＡＲは、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメイン（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０に特異的に結合するネズミ科動物、ヒト又はヒト化抗体又は抗体断片）と、本明細書に記載される膜貫通ドメインと、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載される共刺激ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含む抗体又は抗体断片を含む。
【００５０】
実施形態において、本明細書には、ＣＤ２０結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む単離ＣＡＲ分子が提供され、ここで、ＣＤ２０結合ドメインは、表１に挙げられる任意のＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）と、表１に挙げられる任意のＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）とを含む。
【００５１】
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）と、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）とを含み、例えば、１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）ＬＣＤＲと１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）ＨＣＤＲとを含むＣＤ２０結合ドメインを含む。一部の実施形態において、重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３）は、表２に記載される又は表１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３）は、表３に記載される又は表１に示されるアミノ酸配列を含む。
【００５２】
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書（例えば、表５）に記載される軽鎖可変領域及び／又は本明細書（例えば、表４）に記載される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、表４又は表５に挙げられるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表５に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、３０、２０又は１０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は表５に提供されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；及び／又は表４に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、３０、２０又は１０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は表４に提供されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、配列番号１５９、配列番号２４０、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択される配列又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、及び本明細書の例えば表５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書の例えば表４に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域にリンカー、例えば本明細書に記載されるリンカーを介して結合する。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６、好ましくは４である）（配列番号２３）を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、以下の向き：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域又は重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれであり得る。
【００５３】
一実施形態において、単離ＣＡＲ分子は、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質、例えば本明細書に記載されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。一実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号８０１の配列を含む。一実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号８０１のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、２０、１０又は５つ以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は配列番号８０１のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００５４】
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば本明細書に記載されるヒンジ領域によって膜貫通ドメインに結合される。一実施形態において、コードされるヒンジ領域は、配列番号７９９、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００５５】
一実施形態において、単離ＣＡＲ分子は、共刺激ドメイン、例えば本明細書に記載される共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。
【００５６】
実施形態において、単離ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。実施形態において、単離ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。実施形態において、単離ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００５７】
一実施形態において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質の機能性シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号８０３の配列を含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号８０３のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、２０、１０又は５つ以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は配列番号８０３のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００５８】
実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの機能性シグナル伝達ドメインを含む。実施形態において、ＣＤ３ζの機能性シグナル伝達ドメインは、配列番号８０５又は配列番号８０７を含む。
【００５９】
一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能性シグナル伝達ドメイン及び／又はＣＤ３ζの機能性シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３の配列及び／又は配列番号８０５若しくは配列番号８０７の配列を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３のアミノ酸配列及び／又は配列番号８０５若しくは配列番号８０７の配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、２０、１０又は５つ以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は配列番号８０３のアミノ酸配列及び／又は配列番号８０５若しくは配列番号８０７の配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３の配列及び／又は配列番号８０５若しくは配列番号８０７の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレーム内において且つ単一のポリペプチド鎖として発現される。
【００６０】
一実施形態において、単離ＣＡＲ分子は、リーダー配列、例えば本明細書に記載されるリーダー配列を更に含む。一実施形態において、リーダー配列は、配列番号７９７のアミノ酸配列、又は配列番号７９７のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００６１】
別の態様において、本発明は、リーダー配列、例えば本明細書に記載されるリーダー配列、例えば配列番号７９７の、又はその９５〜９９％の同一性を有するリーダー配列と、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメイン、例えば本明細書に記載されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むＣＤ２０結合ドメイン、例えば表１に記載されるか又はその９５〜９９％の同一性を有する配列のＣＤ２０結合ドメインと、ヒンジ領域、例えば本明細書に記載されるヒンジ領域、例えば配列番号７９９の又はその９５〜９９％の同一性を有するヒンジ領域と、膜貫通ドメイン、例えば本明細書に記載される膜貫通ドメイン、例えば配列番号８０１の配列又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を有する膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含む単離ＣＡＲ分子に関する。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば本明細書に記載される共刺激ドメイン、例えば配列番号８０３の配列を有するか、又はその９５〜９９％の同一性を有する４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及び／又は一次シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に記載される一次シグナル伝達ドメイン、例えば配列番号８０５又は配列番号８０７の配列を有するか、又はその９５〜９９％の同一性を有するＣＤ３ζ刺激ドメインを含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば本明細書に記載される共刺激ドメイン、例えば配列番号８０３の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及び／又は一次シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に記載される一次シグナル伝達ドメイン、例えば配列番号８０５又は配列番号８０７の配列を有するＣＤ３ζ刺激ドメインを含む。
【００６２】
一実施形態において、単離ＣＡＲ分子は、配列番号１５９、配列番号２４０、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９のアミノ酸配列、又は配列番号１５９、配列番号２４０、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９のアミノ酸配列の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０又は３０の改変（例えば、置換）であるが、６０、５０又は４０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は配列番号１５９、配列番号２４０、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９のアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）。
【００６３】
一態様において、本発明は、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）と、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の（例えば、１つ以上、２つ以上、又は３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）とを含むＣＤ２０結合ドメイン、例えば１つ以上、例えば３つ全てのＬＣＤＲと、１つ以上、例えば３つ全てのＨＣＤＲとを含むＣＤ２０結合ドメインに関する。
【００６４】
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書（例えば、表５）に記載される軽鎖可変領域及び／又は本明細書（例えば、表４）に記載される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、表５からの軽鎖アミノ酸配列と表４からのアミノ酸配列の重鎖とを含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表５に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、３０、２０又は１０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列又は表５にあるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；及び／又は表４に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、３０、２０又は１０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は表４にあるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、配列番号１５９、配列番号２４０、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択される配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、及び本明細書の例えば表５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書の例えば表４に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域にリンカー、例えば本明細書に記載されるリンカーを介して結合する。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６、好ましくは４である）（配列番号２３）を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、以下の向き：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域又は重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれであり得る。
【００６５】
また、本明細書には、例えば、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ｓｃＦｖを含む、例えば本明細書に記載されるリーダー配列を更に含むＣＤ２０結合ドメイン又はポリペプチドも提供される。例えば、リーダー配列は配列番号７９７を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、配列番号１５９、配列番号２４０、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、表１に挙げられる可溶性ｓｃＦｖアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、表１に挙げられる可溶性ｓｃＦｖ核酸配列によってコードされる。
【００６６】
ＣＤ２２結合ドメイン及びＣＤ２２  ＣＡＲ
別の態様において、本発明は、ＣＤ２２−６５ｓＫＤの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸配列、例えば配列番号８３９のアミノ酸配列を含み；及び／又はＣＤ２２−６５ｓＫＤの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列、例えば配列番号８４０のアミノ酸配列を含むＣＤ２２結合ドメイン、又はＣＡＲ分子に関する。実施形態において、ＶＨ配列とＶＬ配列とは、直接、例えばリンカーなしに結合される。実施形態において、ＶＨ配列とＶＬ配列とは、リンカーを介して結合される。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、０、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、ＣＤ２２−６５ｓＫＤのＶＨ領域とＣＤ２２−６５ＫＤのＶＬ領域との間にリンカーはなく、例えば、ｎは、０である。一実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１である）である。一部の実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、例えば、配列番号８３７のアミノ酸配列を含むＣＤ２２−６５ｓＫＤ  ｓｃＦｖのアミノ酸配列を含む。
【００６７】
別の態様において、本発明は、ＣＤ２２−６５ｓ（（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１である））又はＣＤ２２−６５ｓｓ（リンカーなし）のｓｃＦｖのアミノ酸配列を含むＣＤ２２結合ドメイン、又はＣＡＲ分子に関する。一部の実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号８３５のｓｃＦｖを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号８３６のｓｃＦｖを含む。
【００６８】
本発明は、前述の態様又は実施形態のいずれかを含む核酸分子、ベクター、細胞、及び使用にも関する。
【００６９】
抗原結合ドメイン用のリンカー
抗原結合ドメインの可変ドメイン間（例えば、ＶＨとＶＬとの間）に短いリンカーを含むか、又はリンカーを含まないＣＡＲ分子は、長い種類のリンカーと等しいか又はそれより高い活性を示すことが分かった。例えば、一部の実施形態において、ＣＤ２２−６５ｓ（（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１である）を有する）は、腫瘍モデルにおいてＣＤ２２−６５（（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、３である）を有する）と比較して同等の又はそれより高い活性及び／又は有効性を示す。例えば、実施例９及び１２を参照されたい。従って、本明細書に記載されるいずれの抗原結合ドメイン又はＣＡＲ分子も、例えば、約３〜６アミノ酸、４〜５アミノ酸、又は約５アミノ酸の短鎖リンカーを含め、抗原結合ドメインの可変ドメインをつなぐ様々な長さのリンカーを有することができる。一部の実施形態において、例えば、約６〜３５アミノ酸、例えば８〜３２アミノ酸、１０〜３０アミノ酸、１０〜２０アミノ酸の、より長いリンカーを使用することができる。例えば、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、０、１、２、３、４、５、又は６である）を使用することができる。一実施形態において、可変ドメインは、リンカー、例えば（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカーを介して結合しておらず、ｎ＝０である。一部の実施形態において、可変ドメインは、短鎖リンカー、例えば（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（ここで、ｎ＝１である）を介して結合される。一部の実施形態において、可変ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（ここで、ｎ＝２である）を介して結合される。一部の実施形態において、可変ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（ここで、ｎ＝３である）を介して結合される。一部の実施形態において、可変ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（ここで、ｎ＝４である）を介して結合される。一部の実施形態において、可変ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（ここで、ｎ＝５である）を介して結合される。一部の実施形態において、可変ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（ここで、ｎ＝６である）を介して結合される。可変ドメインの順序、例えば抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖにおいてＶＬ及びＶＨドメインが出現する順序（即ちＶＬ−ＶＨ、又はＶＨ−ＶＬの向き）は、様々であり得る。一実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合し、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０抗原結合ドメインである。別の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合し、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２２抗原結合ドメインである。別の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ１９抗原結合ドメインである。
【００７０】
本発明は、前述の態様又は実施形態のいずれかを含む核酸分子、ベクター、細胞、及び使用にも関する。
【００７１】
多重特異性抗体分子及びＣＡＲ
一部の実施形態において、抗体分子は、第１の抗原、例えばＢ細胞エピトープに対する第１の結合特異性と、同じ又は異なる抗原、例えばＢ細胞エピトープに対する第２の結合特異性とを有する多重特異性、例えば二重特異性抗体分子である。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、抗体分子、例えば抗体結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）である。二重特異性抗体分子の各抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）の範囲内において、ＶＨは、ＶＬの上流又は下流にあり得る。
【００７２】
一部の実施形態において、上流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように配置され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。
【００７３】
一部の実施形態において、上流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように配置され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。
【００７４】
一部の実施形態において、上流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように配置され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。
【００７５】
更に一部の実施形態において、上流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように配置され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。
【００７６】
前記構成のいずれにおいても、任意選択により、２つの抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）間、例えばコンストラクトがＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置される場合にＶＬ１とＶＬ２との間；コンストラクトがＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置される場合にＶＨ１とＶＨ２との間；コンストラクトがＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置される場合にＶＨ１とＶＬ２との間；又はコンストラクトがＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置される場合にＶＬ１とＶＨ２との間にリンカーが置かれる。一般に、２つのｓｃＦｖ間のリンカーは、それらの２つのｓｃＦｖのドメイン間での誤対合を回避するのに十分な長さでなければならない。リンカーは、本明細書に記載されるとおりのリンカーであり得る。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含み、例えばそれからなる。
【００７７】
前記構成のいずれにおいても、任意選択により、リンカーは、第１のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に置かれる。任意選択により、リンカーは、第２のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に置かれる。複数のリンカーを有するコンストラクトにおいて、リンカーの任意の２つ以上は、同じであるか又は異なり得る。従って、一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、ＶＬ、ＶＨ、及び任意選択により１つ以上のリンカーを本明細書に記載されるとおりの配置で含む。
【００７８】
一部の実施形態において、各抗体分子、例えば各抗原結合ドメイン（例えば、各ｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【００７９】
特定の実施形態において、抗体分子は、第１のＢ細胞エピトープに対する第１の結合特異性と、同じ又は異なるＢ細胞抗原に対する第２の結合特異性とを有する二重特異性抗体分子である。例えば、一部の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ２０に対する第１の結合特異性と、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａの１つ以上に対する第２の結合特異性とを有する。一部の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ１９に対する第１の結合特異性と、ＣＤ２０に対する第２の結合特異性とを有する。一部の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ１９に対する第１の結合特異性と、ＣＤ２２に対する第２の結合特異性とを有する。
【００８０】
一実施形態において、抗体分子は、ＣＤ１９に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性を有する二重特異性抗体分子である。一実施形態において、結合特異性は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。一実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＴＬ０１９  ｓｃＦｖ（配列番号７６５）を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばヒト化ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、例えばヒト化ＣＡＲ２を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【００８１】
別の実施形態において、ＣＤ１９に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。一実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＴＬ０１９  ｓｃＦｖ（配列番号７６５）を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばヒト化ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、例えばヒト化ＣＡＲ２を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【００８２】
別の実施形態において、ＣＤ１９に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。一実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＴＬ０１９  ｓｃＦｖ（配列番号７６５）を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばヒト化ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、例えばヒト化ＣＡＲ２を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【００８３】
別の実施形態において、ＣＤ１９に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。一実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＴＬ０１９  ｓｃＦｖ（配列番号７６５）を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばヒト化ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、例えばヒト化ＣＡＲ２を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【００８４】
別の実施形態において、抗体分子は、ＣＤ２０に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性を有する二重特異性抗体分子である。一実施形態において、結合特異性は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２０結合特異性は、表１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣ３Ｈ２  ｓｃＦｖ又はＣ５Ｈ１  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【００８５】
別の実施形態において、ＣＤ２０に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２０結合特異性は、表１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣ３Ｈ２  ｓｃＦｖ又はＣ５Ｈ１  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【００８６】
別の実施形態において、ＣＤ２０に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、表１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣ３Ｈ２  ｓｃＦｖ又はＣ５Ｈ１  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【００８７】
別の実施形態において、ＣＤ２０に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、表１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣ３Ｈ２  ｓｃＦｖ又はＣ５Ｈ１  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【００８８】
別の実施形態において、抗体分子は、ＣＤ２２に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性を有する二重特異性抗体分子である。一実施形態において、結合特異性は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、表６に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＤ２２−６５又はＣＤ２２−６５ＫＤ  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖにあるように、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５  ｓｃＦｖにあるように、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖにあるように、リンカーなしに結合される。
【００８９】
別の実施形態において、ＣＤ２２に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、表６に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＤ２２−６５又はＣＤ２２−６５ＫＤ  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖにあるように、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５  ｓｃＦｖにあるように、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖにあるように、リンカーなしに結合される。
【００９０】
別の実施形態において、ＣＤ２２に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、表６に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＤ２２−６５又はＣＤ２２−６５ＫＤ  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖにあるように、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５  ｓｃＦｖにあるように、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖにあるように、リンカーなしに結合される。
【００９１】
別の実施形態において、ＣＤ２２に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、表６に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＤ２２−６５又はＣＤ２２−６５ＫＤ  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖにあるように、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５  ｓｃＦｖにあるように、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖにあるように、リンカーなしに結合される。
【００９２】
一部の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ１９に対する第１の結合特異性、例えば本明細書に記載されるＣＤ１９に対する結合特異性のいずれかと、ＣＤ２２に対する第２の結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２２に対する結合特異性のいずれかとを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含む。
【００９３】
一実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ１９に対する第１の結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２２に対する第２の結合特異性、例えばＣＤ２２に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含む。
【００９４】
一実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ２２に対する第１の結合特異性、例えばＣＤ２２に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性と、ＣＤ１９に対する第２の結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含む。
【００９５】
例えば、本明細書に記載されるとおり、２つ以上の抗体分子を連結して、多重特異性抗体分子、例えば二重、三重又はそれを超える抗体分子を提供することができる。
【００９６】
一部の実施形態において、前記多重特異性、例えば二重特異性抗体分子のいずれかが、本明細書に記載されるとおりのＣＡＲ分子に存在する。実施形態において、ＣＡＲ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりの第１及び第２の結合特異性（例えば、本明細書に記載されるとおりの２つの抗体分子、例えば２つのｓｃＦｖ）を含む二重特異性ＣＡＲを含む。一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、２つの抗体分子を含み、ここで、第１の結合特異性、例えば第１の抗体分子（例えば、第１の抗原結合ドメイン、例えば第１のｓｃＦｖ）は、膜貫通ドメインに一層近く、本明細書では近位抗体分子（例えば、近位抗原結合ドメイン）とも称され、第２の結合特異性、例えば第２の抗体分子（例えば、第２の抗原結合ドメイン、例えば第２のｓｃＦｖ）は、膜から離れており、本明細書では遠位抗体分子（例えば、遠位抗原結合ドメイン）とも称される。従って、Ｎ末端からＣ末端において、ＣＡＲ分子は、任意選択によりリンカーを介して膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインまで、例えば本明細書に記載されるとおりの遠位結合特異性、例えば遠位抗体分子（例えば、遠位抗原結合ドメイン、例えば遠位ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ２）、任意選択によりリンカー、続いて近位結合特異性、例えば近位抗体分子（例えば、近位抗原結合ドメイン、例えば近位ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ１）を含む。二重特異性ＣＡＲ構成の概略図を図２７に示す。
【００９７】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、第１及び第２の結合特異性を含む二重特異性ＣＡＲを含む。一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、Ｂ細胞エピトープに対する第１の結合特異性と、同じ又は異なるＢ細胞抗原に対する第２の結合特異性とを含む。例えば、一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する第１の結合特異性と、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａの１つ以上に対する第２の結合特異性とを有する。一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する第１の結合特異性と、ＣＤ２０に対する第２の結合特異性とを有する。一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する第１の結合特異性と、ＣＤ２２に対する第２の結合特異性とを有する。
【００９８】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２０に対する近位又は遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０結合特異性を含む。
【００９９】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２２に対する近位又は遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２２結合特異性を含む。
【０１００】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２２に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ２２に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含む。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性、任意選択により、Ｇｌｙ４−Ｓｅｒリンカー又はＬＡＥＡＡＡＫリンカーを含む。実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、ＣＤ２２  ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖにあるように、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５  ｓｃＦｖにあるように、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖにあるように、リンカーなしに結合される。
【０１０１】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２２に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ２２に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含む。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性、任意選択により、Ｇｌｙ４−Ｓｅｒリンカー又はＬＡＥＡＡＡＫリンカーを含む。実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、ＣＤ２２  ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖにあるように、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５  ｓｃＦｖにあるように、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖにあるように、リンカーなしに結合される。
【０１０２】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２０に対する近位又は遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０結合特異性を含む。
【０１０３】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２０に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ２０に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含む。
【０１０４】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２０に対する近位又は遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０結合特異性を含む。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２０に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ２０に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含む。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫからなる。
【０１０５】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２０に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ２０に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ２結合特異性とを含む。
【０１０６】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２０に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ２０に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ２結合特異性とを含む。
【０１０７】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、Ｎ末端にヒト配列リーダー、例えばヒトＣＤ８α配列を更に含む。
【０１０８】
一部の実施形態において、多重特異性抗体分子は、配列番号８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、又は８７４のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、それと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれを超えて同一の）配列を含む。
【０１０９】
一部の実施形態において、多重特異性抗体分子は、配列番号８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５８、８６０、８６２、８６４、８６６、８６８、８７０、８７２、又は８７４のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、それと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれを超えて同一の）配列からなる。
【０１１０】
本発明は、前述の態様又は実施形態のいずれかを含む核酸分子、ベクター、細胞、及び使用にも関する。
【０１１１】
ベクター
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される核酸分子のいずれか、例えば本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターに関する。一実施形態において、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターからなる群から選択される。
【０１１２】
一実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。一実施形態において、ベクターは、プロモーターを更に含む。一実施形態において、プロモーターは、ＥＦ−１αプロモーターである。一実施形態において、ＥＦ−１αプロモーターは、配列番号８３３の配列を含む。
【０１１３】
一実施形態において、ベクターは、インビトロ転写ベクター、例えば本明細書に記載される核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。一実施形態において、ベクター中の核酸配列は、例えば、約１５０アデノシン塩基を含む、ポリ（Ａ）テール、例えば本明細書に記載されるポリＡテールを更に含む。一実施形態において、ベクター中の核酸配列は、例えば、ヒトβ−グロブリンに由来する３’ＵＴＲの少なくとも１つのリピートを含む、３’ＵＴＲ、例えば本明細書に記載される３’ＵＴＲを更に含む。一実施形態において、ベクター中の核酸配列は、プロモーター、例えばＴ２Ａプロモーターを更に含む。
【０１１４】
ある実施形態において、切断可能ペプチド、例えばＰ２Ａ又はＦ２Ａ配列をコードする核酸配列は、第１のＣＡＲ分子（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＣＤ１９）をコードする核酸配列と、第２のＣＡＲ分子（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＣＤ１９）との間に置かれる。ある実施形態において、ＩＲＥＳ、例えばＥＭＣＶ又はＥＶ７１  ＩＲＥＳをコードする配列は、第１のＣＡＲ分子をコードする核酸配列と、第２のＣＡＲ分子配列との間に置かれる。これらの実施形態において、第１のＣＡＲ及び第２のＣＡＲは、単一のＲＮＡとして転写される。
【０１１５】
ＣＡＲの組み合わせ
別の態様において、本発明は、（ｉ）例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０  ＣＡＲ分子と、（ｉｉ）Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ−１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７９ａ、又はＣＤ１７９ｂに結合するＣＡＲ分子とをコードする核酸を特徴とする。
【０１１６】
別の態様において、本発明は、（ｉ）例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０  ＣＡＲ分子をコードする第１の核酸と、（ｉｉ）Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ−１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７９ａ、又はＣＤ１７９ｂに結合するＣＡＲ分子をコードする第２の核酸とをコードする核酸を特徴とする。
【０１１７】
一部の実施形態において、Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲ分子は、ＣＤ１９又はＣＤ２２である。
【０１１８】
一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合し、及び表１１に係るＣＤ１９  ＣＡＲ、例えばＣＴＬ−０１９又はヒト化ＣＡＲ２をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１１９】
一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２２に結合し、及び表６に係るＣＤ２２  ＣＡＲ、例えばＣＤ２２−６５  ＣＡＲ、ＣＤ２２−６５ＫＤ  ＣＡＲ、ＣＤ２２−６５ｓ  ＣＡＲ、又はＣＤ２２−６５ｓｓ  ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２０】
一部の実施形態において、切断可能ペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えばＰ２Ａ又はＦ２Ａ配列は、ＣＤ２０  ＣＡＲをコードする核酸分子と、Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸分子との間に置かれる。
【０１２１】
一部の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＢ細胞抗原に結合するＣＡＲは、単一のプロモーターにより、例えばバイシストロニック転写産物としてコードされる。
【０１２２】
一部の実施形態において、単一のプロモーターは、ＥＦ−１αプロモーターであり、任意選択により、ＥＦ−１αプロモーターは、配列番号８３３の配列を含む。
【０１２３】
一部の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲは、第１のプロモーターによってコードされ、及びＢ細胞抗原に結合するＣＡＲは、第２のプロモーターによってコードされる。
【０１２４】
一部の実施形態において、核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含む。
【０１２５】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの核酸分子のいずれかによってコードされるか又はそれを含むポリペプチド分子に関する。
【０１２６】
細胞
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される核酸、単離ポリペプチド、又はベクターを含む細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団に関する。
【０１２７】
一部の実施形態において、細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団は、１つ以上、例えば第１、第２、及び／又は第３のＣＡＲ分子を含み、ここで、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ２０  ＣＡＲ若しくはＣＤ２２  ＣＡＲ又はその２つ若しくは３つの組み合わせから選択される。
【０１２８】
一部の実施形態において、細胞は、ＣＤ１９  ＣＡＲ及び本発明のＣＤ２０  ＣＡＲを含む。
【０１２９】
一部の実施形態において、細胞は、ＣＤ１９  ＣＡＲ及び本発明のＣＤ２２  ＣＡＲを含む。
【０１３０】
一部の実施形態において、細胞は、本発明のＣＤ２０  ＣＡＲ及び本発明のＣＤ２２  ＣＡＲを含む。
【０１３１】
一部の実施形態において、細胞は、２つのＣＡＲ、例えば本発明のＣＤ２２  ＣＡＲ、本発明のＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ１９  ＣＡＲを含む）。
【０１３２】
一部の実施形態において、１つ以上のＣＡＲ分子は、同じ細胞に存在する。
【０１３３】
一部の実施形態において、１つ以上のＣＡＲ分子は、異なる細胞に存在する。
【０１３４】
一実施形態において、細胞は、本明細書に記載される細胞、例えばヒトＴ細胞又はヒトＮＫ細胞、例えば本明細書に記載されるヒトＴ細胞である。一実施形態において、ヒトＴ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、（ｉ）本明細書に記載される核酸、単離ポリペプチド分子、又はベクターを含む第１の細胞集団を含む細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団（例えば、第１及び／又は第２の免疫エフェクター細胞の集団）に関する。
【０１３６】
一部の実施形態において、Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲは、ＣＤ１９又はＣＤ２２である。
【０１３７】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合し、及び表１１に係るＣＤ１９  ＣＡＲ、例えばＣＴＬ−０１９又はヒト化ＣＡＲ２をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１３８】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２２に結合し、及び表６に係るＣＤ２２  ＣＡＲ、例えばＣＤ２２−６５  ＣＡＲ、ＣＤ２２−６５ＫＤ  ＣＡＲ、ＣＤ２２−６５ｓ  ＣＡＲ、又はＣＤ２２−６５ｓｓ  ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１３９】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、別の薬剤、例えばＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を更に発現することができる。例えば、一実施形態において、この薬剤は、抑制性分子を阻害する薬剤であり得る。抑制性分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦβが挙げられる。一実施形態において、抑制性分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第２のポリペプチド、例えば本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインに関連している、第１のポリペプチド、例えば抑制性分子を含む。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４又はＴＧＦβなどの抑制性分子、又はこれらのいずれかの断片（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部分）の第１のポリペプチドと、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン（例えば、例えば本明細書に記載されるとおりの４１ＢＢ、ＣＤ２７又はＣＤ２８）及び／又は一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）を含む）である第２のポリペプチドとを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ１又はその断片（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部分）の第１のポリペプチドと、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び／又は本明細書に記載されるＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）の第２のポリペプチドとを含む。
【０１４０】
作製方法及び使用
別の態様において、本発明は、細胞を作製する方法に関し、この方法は、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸を含むベクターで本明細書に記載される細胞、例えば本明細書に記載されるＴ細胞又はＮＫ細胞を形質導入することを含む。
【０１４１】
本発明は、外因性ＲＮＡを一過性に発現する、ＲＮＡが操作された細胞、例えば本明細書に記載される細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の集団を作成する方法も提供する。本方法は、インビトロ転写ＲＮＡ又は合成ＲＮＡを細胞に導入することを含み、ここで、ＲＮＡは、本明細書に記載されるＣＡＲ分子をコードする核酸を含む。
【０１４２】
別の態様において、本発明は、哺乳類において抗腫瘍免疫を付与する方法に関し、本方法は、ＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ分子、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ分子を発現する細胞の有効量を哺乳類に投与することを含む。一実施形態において、細胞は、自己Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。一実施形態において、細胞は、同種異系Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。一実施形態において、哺乳類は、ヒトである。
【０１４３】
別の態様において、本発明は、哺乳類において抗腫瘍免疫を付与する方法において使用するための、本明細書に記載されるとおりのＣＡＲ分子、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ分子を含む、例えば発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団に関し、ここで、本方法は、細胞の有効量を哺乳類に投与することを含む。
【０１４４】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおりのＢ細胞抗原、例えばＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２、例えば野生型又は突然変異体ＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２の発現に関連する癌、又は疾患（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２の発現に関連する増殖性疾患、前癌病態、及び非癌関連徴候）を有する哺乳類を治療する方法に関し、本方法は、ＣＡＲ分子、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ分子、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ分子を発現する細胞の有効量を哺乳類に投与することを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現するように操作されたＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、例えば、ＣＤ２０の発現に関連する疾患を治療するため１つ以上のＢ細胞阻害薬と併用して投与される。例えば、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、１つ以上の追加的なＢ細胞阻害薬と併用して投与される。一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害薬は、第２のＣＤ２０阻害薬である。一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害薬は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａの１つ以上の阻害薬である。
【０１４５】
別の態様において、本発明は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２の発現に関連する癌又は疾患を有する哺乳類を治療する方法における使用のための、本明細書に記載されるとおりのＣＡＲ分子、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団に関し、本方法は、細胞の有効量を哺乳類に投与することを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現するように操作されたＣＤ２０細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、例えば、ＣＤ２０の発現に関連する疾患を治療するため１つ以上のＢ細胞阻害薬と併用して投与される。例えば、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、１つ以上の追加的なＢ細胞阻害薬と併用して投与される。一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害薬は、第２のＣＤ２０阻害薬である。一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害薬は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａの１つ以上の阻害薬である。
【０１４６】
一実施形態において、ＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２発現に関連する疾患は、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌病態から選択され、又はＣＤ２０、ＣＤ１９若しくはＣＤ２２の発現に関連する非癌関連徴候である。
【０１４７】
一実施形態において、ＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２に関連する癌又は疾患は、血液癌である。例えば、血液癌は、白血病又はリンパ腫である。別の例において、血液癌は、限定はされないが、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含む１つ以上の急性白血病；限定はされないが、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含む１つ以上の慢性白血病；限定はされないが、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁層リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む更なる血液癌又は血液学的病態から選択される。一部の実施形態において、疾患は、「前白血病」であり、これは、骨髄性血球細胞の無効な産生（又は異形成）によってまとめられる多様な血液学的病態の群である。
【０１４８】
一部の実施形態において、ＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２発現に関連する癌又は疾患には、限定はされないが、ＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２を発現する非定型及び／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患；及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０１４９】
一部の実施形態において、癌又はＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２関連疾患は、非ホジキンリンパ腫、例えばＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫；又はＣＬＬなどのＢ細胞悪性腫瘍である。
【０１５０】
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の有効性を増加させる薬剤、例えば本明細書に記載される薬剤と併用して投与される。実施形態において、薬剤は、ｍＴＯＲ阻害薬、例えば本明細書に記載されるとおりのｍＴＯＲ阻害薬である。
【０１５１】
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与に関連する１つ以上の副作用を改善する薬剤、例えば本明細書に記載される薬剤と併用して投与される。
【０１５２】
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞は、ＣＤ２０に関連する疾患を治療する薬剤、例えば本明細書に記載される薬剤と併用して投与される。
【０１５３】
別の態様において、本発明は、例えば、本明細書に記載されるとおりの、医薬品としての使用のための、本発明のＣＡＲをコードする単離核酸分子、本発明のＣＡＲの単離ポリペプチド分子、本発明のＣＡＲを含むベクター、本発明のＣＡＲを含む細胞（又は細胞集団）に関する。
【０１５４】
別の態様において、本発明は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２を発現する疾患、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＣＤ２２を発現する疾患の治療において使用するための、本発明のＣＡＲをコードする単離核酸分子、本発明のＣＡＲの単離ポリペプチド分子、本発明のＣＡＲを含むベクター、本発明のＣＡＲを含む細胞（又は細胞集団）に関する。
【０１５５】
別の態様において、本発明は、例えば、ＣＤ２０の発現に関連する疾患を治療するため１つ以上のＢ細胞阻害薬と併用した、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現するように操作された細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の方法又は使用に関する。例えば、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、１つ以上の追加的なＢ細胞阻害薬と併用して投与される。一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害薬は、第２のＣＤ２０阻害薬である。一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害薬は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａの１つ以上の阻害薬である。
【０１５６】
一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害薬は、小分子阻害薬；Ｂ細胞抗原（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａの１つ以上）に結合するポリペプチド、例えば可溶性リガンド、抗体、又はその抗原結合断片；又は阻害性核酸（例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））である。一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害薬は、Ｂ細胞抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａ）に結合するＣＡＲを発現する細胞（例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞）である。
【０１５７】
一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害薬は、ＣＤ２０  ＣＡＲ分子を含む細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団の前に投与される。
【０１５８】
一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害薬は、ＣＤ２０  ＣＡＲ分子を含む細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団と同時に投与される。
【０１５９】
一部の実施形態において、Ｂ細胞阻害薬は、ＣＤ２０  ＣＡＲ分子を含む細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団の後に投与される。
【０１６０】
一部の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＤ２０阻害薬と共に投与される。第２のＣＤ２０阻害薬は、例えば、小分子、抗体、又はその断片（例えば、単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片）；ＣＤ２０に結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害性核酸；又はＣＤ２０  ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。一実施形態において、第２のＣＤ２０阻害薬は、第２の抗ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ２０  ＣＡＲＴ又はＣＤ２０  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。例示的ＣＤ２０阻害薬については、以下に更に詳細に記載する。
【０１６１】
ある実施形態において、本開示は、２つ以上のＣＤ２０  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、第１のＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、別の第２のＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含む。
【０１６２】
特定の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ２２阻害薬と共に投与される。ＣＤ２２阻害薬は、例えば、小分子、抗体、又はその断片（例えば、単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片）；ＣＤ２２に結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害性核酸；又はＣＤ２２  ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＤ２２  ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。一実施形態において、ＣＤ２２阻害薬は、抗ＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ２２  ＣＡＲＴ又はＣＤ２２  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。例示的ＣＤ２２阻害薬については、以下で例えば表６に更に詳細に記載する。
【０１６３】
ある実施形態において、本開示は、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ２２  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ２２  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含む。
【０１６４】
一部の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１９阻害薬と共に投与される。ＣＤ１９阻害薬は、例えば、小分子、抗体、又はその断片（例えば、単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片）；ＣＤ１９に結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害性核酸；又はＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。一実施形態において、ＣＤ１９阻害薬は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９  ＣＡＲＴ又はＣＤ１９  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。例示的ＣＤ１９阻害薬については、以下で例えば表１１に更に詳細に記載する。
【０１６５】
一実施形態において、本開示は、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含むことができる。
【０１６６】
特定の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、ＲＯＲ１阻害薬と共に投与される。ＲＯＲ１阻害薬は、例えば、小分子、抗体、又はその断片（例えば、単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片）；ＲＯＲ１に結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害性核酸；又はＲＯＲ１  ＣＡＲを発現する細胞、例えばＲＯＲ１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。一実施形態において、ＲＯＲ１阻害薬は、抗ＲＯＲ１発現細胞、例えばＲＯＲ１  ＣＡＲＴ又はＲＯＲ１発現ＮＫ細胞である。例示的ＲＯＲ１阻害薬については、以下に更に詳細に記載する。
【０１６７】
一実施形態において、本開示は、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＲＯＲ１  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＲＯＲ１  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含むことができる。
【０１６８】
一部の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１２３阻害薬と共に投与される。ＣＤ１２３阻害薬は、例えば、小分子、抗体、又はその断片（例えば、単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片）；ＣＤ１２３に結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害性核酸；又はＣＤ１２３  ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＤ１２３  ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。一実施形態において、ＣＤ１２３阻害薬は、抗ＣＤ１２３  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１２３  ＣＡＲＴ又はＣＤ１２３  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。例示的ＣＤ１２３阻害薬については、以下に更に詳細に記載する。
【０１６９】
一実施形態において、本開示は、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ１２３  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ１２３  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含むことができる。
【０１７０】
特定の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１０阻害薬と共に投与される。ＣＤ１０阻害薬は、例えば、小分子、抗体、又はその断片（例えば、単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片）；ＣＤ１０に結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害性核酸；又はＣＤ１０  ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＤ１０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。一実施形態において、ＣＤ１０阻害薬は、抗ＣＤ１０  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１０  ＣＡＲＴ又はＣＤ１０  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。例示的ＣＤ１０阻害薬については、以下に更に詳細に記載する。
【０１７１】
一実施形態において、本開示は、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ１０  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ１０  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含むことができる。
【０１７２】
特定の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ３４阻害薬と共に投与される。ＣＤ３４阻害薬は、例えば、小分子、抗体、又はその断片（例えば、単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片）；ＣＤ３４に結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害性核酸；又はＣＤ３４  ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＤ３４  ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。一実施形態において、ＣＤ３４阻害薬は、抗ＣＤ３４  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ３４  ＣＡＲＴ又はＣＤ３４  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。例示的ＣＤ３４阻害薬については、以下に更に詳細に記載する。
【０１７３】
一実施形態において、本開示は、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ３４  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ３４  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含むことができる。
【０１７４】
特定の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、ＦＬＴ−３阻害薬と共に投与される。ＦＬＴ−３阻害薬は、例えば、小分子、抗体、又はその断片（例えば、単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片）；ＦＬＴ−３に結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害性核酸；又はＦＬＴ−３  ＣＡＲを発現する細胞、例えばＦＬＴ−３  ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。一実施形態において、ＦＬＴ−３阻害薬は、抗ＦＬＴ−３  ＣＡＲ発現細胞、例えばＦＬＴ−３  ＣＡＲＴ又はＦＬＴ−３  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。例示的ＦＬＴ−３阻害薬については、以下に更に詳細に記載する。
【０１７５】
一実施形態において、本開示は、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＦＬＴ−３  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＦＬＴ−３  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含むことができる。
【０１７６】
特定の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ７９ｂ阻害薬と共に投与される。ＣＤ７９ｂ阻害薬は、例えば、小分子、抗体、又はその断片（例えば、単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片）；ＣＤ７９ｂに結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害性核酸；又はＣＤ７９ｂ  ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＤ７９ｂ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。一実施形態において、ＣＤ７９ｂ阻害薬は、抗ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ７９ｂ  ＣＡＲＴ又はＣＤ７９ｂ  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。例示的ＣＤ７９ｂ阻害薬については、以下に更に詳細に記載する。
【０１７７】
ある実施形態において、本開示は、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ７９ｂ  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含む。
【０１７８】
特定の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１７９ｂ阻害薬と共に投与される。ＣＤ１７９ｂ阻害薬は、例えば、小分子、抗体、又はその断片（例えば、単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片）；ＣＤ１７９ｂに結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害性核酸；又はＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。一実施形態において、ＣＤ７９ｂ阻害薬は、抗ＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲＴ又はＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。例示的ＣＤ１７９ｂ阻害薬については、以下に更に詳細に記載する。
【０１７９】
ある実施形態において、本開示は、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含む。
【０１８０】
特定の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ７９ａ阻害薬と共に投与される。ＣＤ７９ａ阻害薬は、例えば、小分子、抗体、又はその断片（例えば、単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片）；ＣＤ７９ａに結合する組換えタンパク質、例えば融合タンパク質；阻害性核酸；又はＣＤ７９ａ  ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＤ７９ａ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。一実施形態において、ＣＤ７９ａ阻害薬は、抗ＣＤ７９ａ  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ７９ａ  ＣＡＲＴ又はＣＤ７９ａ  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。例示的ＣＤ７９ａ阻害薬については、以下に更に詳細に記載する。
【０１８１】
ある実施形態において、本開示は、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ７９ａ  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ７９ａ  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含む。
【０１８２】
一態様において、ＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＲＯＲ１  ＣＡＲ、ＣＤ２０  ＣＡＲ、ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＣＤ１２３  ＣＡＲ、ＣＤ１０  ＣＡＲ、ＣＤ３４  ＣＡＲ、ＦＬＴ−３  ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲ、又はＣＤ７９ａ  ＣＡＲ）は、任意選択のリーダー配列（例えば、本明細書に記載される任意選択のリーダー配列）と、細胞外抗原結合ドメインと、ヒンジ（例えば、本明細書に記載されるヒンジ）と、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載される膜貫通ドメイン）と、細胞内刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載される細胞内刺激ドメイン）とを含む。一態様において、例示的ＣＡＲコンストラクトは、任意選択のリーダー配列（例えば、本明細書に記載されるリーダー配列）と、細胞外抗原結合ドメインと、ヒンジと、膜貫通ドメインと、細胞内共刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載される細胞内共刺激ドメイン）と、細胞内刺激ドメインとを含む。
【０１８３】
実施形態において、本明細書には、ＣＤ２０の阻害薬を患者に投与することを含む、ＣＤ１９阻害薬、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して非奏効者、部分奏効者、又は再発者である患者を治療する方法が提供される。
【０１８４】
一部の実施形態において、本明細書には、ＣＤ２０の阻害薬を患者に投与することを含む、ＣＤ１９阻害薬、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して非奏効者、部分奏効者、又は再発者である患者を治療する方法における使用のためのＣＤ２０の阻害薬が提供される。
【０１８５】
実施形態において、患者は、ＣＤ１９陰性癌細胞、及びＣＤ２０陽性の癌細胞を含む。実施形態において、本方法は、患者がＣＤ１９陰性癌細胞を含むかどうかを決定するステップを更に含む。一部の実施形態において、本方法は、患者がＣＤ２０陽性の癌細胞を含むかどうかを決定するステップを更に含む。
【０１８６】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験では、本明細書に記載されるものと同様の又は均等な方法及び材料を使用し得るが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献の全ては、全体として参照により援用される。加えて、材料、方法、及び例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。見出し、副見出し、又は番号若しくは文字が振られた要素、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｉ）等は、単に読み易いように提供される。本明細書で見出し又は番号若しくは文字が振られた要素を使用しても、ステップ若しくは要素がアルファベット順に実施される必要はなく、又はステップ若しくは要素が必ず互いに別個のものである必要はない。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【０１８７】
本発明の好ましい実施形態についての以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良く理解されるであろう。本発明を例示する目的から、現在好ましい実施形態が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な構成及び手段に限定されないことが理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１Ａ−１Ｅ】ＣＤ２０  ＣＡＲの機能を試験するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴルシフェラーゼ（ＪＮＬ）レポーターアッセイを示すグラフである。ＣＤ２０  ＪＮＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞をバーキットリンパ腫株Ｒａｊｉ及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）株Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、ＨＢＬ−１及びＴＭＤ８；ＣＤ２０陰性対照として供した慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）細胞株Ｋ５６２と共培養した。発光読み取り値がＣＡＲ刺激の直接的な測定値である。４つの標的細胞株全てが、全てのヒト化ＣＤ２０  ＣＡＲの活性化を示す（図１Ａ〜図１Ｄ）。ヒト化マウスＣＡＲのいずれも、ＣＤ２０陰性株Ｋ５６２によっては活性化を示さなかった（図１Ｅ）。
【図２】初代ヒトＴ細胞におけるＣＤ２０  ＣＡＲの発現レベルを示すグラフである。細胞を可溶性ビオチン化プロテインＬ（０．１μｇ／ウェル、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）及びストレプトアビジン−ＰＥ（１：３００、Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジン、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で染色し、フローサイトメトリーによってアッセイした。グラフ中の上の数字がＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを示し、下の数字がその陽性集団内でのＣＡＲ発現レベル（幾何平均）を表す。
【図３Ａ−３Ｂ】ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞がどのようにＣＤ２０発現標的細胞による刺激に応答してＩＦＮ−γを分泌するかを示すグラフである。ＣＡＲ  Ｔ細胞とバーキットリンパ腫株Ｒａｊｉ及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）株Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、ＨＢＬ−１及びＴＭＤ８；ＣＤ２０陰性対照として供した慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）細胞株Ｋ５６２との共培養培地中におけるＩＦＮ−γを測定した。ＣＡＲＴ及び標的細胞を１：１のエフェクター対標的細胞比で２４時間共培養した後、上清を回収してＩＦＮ−γ量を定量化した。ＣＡＲＴは２つの別個の実験でアッセイした（それぞれ図３Ａ及び図３Ｂ）。
【図４】初代ヒトＴ細胞におけるＣＤ２２  ＣＡＲの発現レベルを示すグラフである。細胞を可溶性ＣＤ２２−Ｆｃ（０．２ｕｇ／ウェル、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）及び抗ヒトＦｃ（１：３００、Ｒ−フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）二次抗体で染色し、フローサイトメトリーによってアッセイした。グラフ中の数字はＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを示し、下の数字がその陽性集団内でのＣＡＲ発現レベル（中央値）を表す。
【図５Ａ−５Ｃ】ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ２２発現標的細胞を有効に死滅させることを示すグラフである。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）株Ｎａｌｍ６（図５Ａ）及びＳＥＭ（図５Ｂ）並びにＣＤ２２陰性ＣＭＬ株Ｋ５６２（Ｃ）とのＣＡＲ  Ｔ細胞の２０時間死滅アッセイ。ＣＡＲＴ及び標的細胞を異なるエフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で２０時間共培養した後、発光を用いてルシフェラーゼ発現標的細胞を定量化した。
【図６Ａ−６Ｂ】ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ２２発現標的細胞による刺激に応答してＩＦＮ−γを分泌することを示すグラフである。ＣＡＲ  Ｔ細胞とＡＬＬ株ＳＥＭ（図６Ａ）並びにＣＤ２２陰性ＣＭＬ株Ｋ５６２（図６Ｂ）との共培養培地中におけるＩＦＮ−γを測定した。ＣＡＲＴ及び標的細胞を１：１のエフェクター対標的細胞比で２４時間共培養した後、上清を回収してＩＦＮ−γ量を定量化した。
【図７Ａ−７Ｂ】ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ２２発現標的細胞による刺激に応答して増殖することを示すグラフである。ＣＡＲ  Ｔ細胞をＡＬＬ株ＳＥＭ並びにＣＤ２２陰性ＣＭＬ株Ｋ５６２と１：１のエフェクター対標的細胞比で４日間共培養した。次にＣＡＲＴを抗ＣＤ３抗体及び可溶性ＣＤ２２−Ｆｃで染色してＣＡＲ発現を検出し、続いてフローサイトメトリーによるビーズのカウントを用いて定量分析を行った。（図７Ａ）ＣＤ３＋細胞数／３０００ビーズ及び（図７Ｂ）ＣＤ３＋  ＣＡＲ＋細胞数／３０００ビーズ。
【図８】実施例５に係るＡＬＬモデルで試験したＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の平均生物発光プロットを示すグラフである。
【図９Ａ−９Ｃ】実施例６に係る、ＣＤ２０−３  ＣＡＲ  Ｔ細胞及びＣＤ２２−５３  Ｔ細胞がどのように刺激に応答してＩＦＮ−γを分泌するかを示すグラフである。ＣＡＲ  Ｔ細胞とバーキットリンパ腫株Ｒａｊｉ（図９Ａ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）株Ｐｆｅｉｆｆｅｒ（図９Ｂ）、ＡＬＬ株ＳＥＭ（図９Ｃ）との共培養培地中におけるＩＦＮ−γを測定した。
【図１０Ａ−１０Ｂ】代表的なＣＡＲを示す概略図である。
【図１１】モックＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ、ＣＤ２０−８ａＢＢＺ  ＣＡＲ、ＣＤ２０−Ｃ３Ｈ２  ＣＡＲ、ＣＤ２０−Ｃ５Ｈ１  ＣＡＲ、ＣＤ２０−Ｏｆａ  ＣＡＲ、及びＣＤ２０−３Ｈ５ｋ３  ＣＡＲを発現するＴ細胞又は媒体（ＰＢＳ）で治療したＮＳＧマウスの平均腫瘍容積（ｍｍ３）を示すグラフである。
【図１２】フローサイトメトリー分析を用いて決定したときの、Ｑ６５Ｋ突然変異を含むＣＤ３ζ鎖を有するＣＤ２２  ６５  ＣＡＲ（ＣＤ２２−６５＿Ｚｍｕｔ）、ＣＤ２２−６５野生型ＣＡＲ（ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ）、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ  ＣＡＲ、ｍ９７１＿Ｚｍｕｔ  ＣＡＲ、及びｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ  ＣＡＲの発現レベルを示すグラフである。
【図１３Ａ−１３Ｃ】ＣＤ２２−６５＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ｍ９７１＿Ｚｍｕｔ、及びｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ２２発現標的細胞を有効に死滅させることを示すグラフである。ＡＬＬ株Ｎａｌｍ６（図１３Ａ）、ＡＬＬ株ＳＥＭ（図１３Ｂ）、及びＣＤ２２陰性ＣＭＬ株Ｋ５６２（図１３Ｃ）とのＣＡＲ  Ｔ細胞の２０時間死滅アッセイを示す。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）及びＣＤ１９細胞も示す。ＣＡＲＴ及び標的細胞を異なるエフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で２０時間共培養した後、発光を用いてルシフェラーゼ発現標的細胞を定量化した。
【図１４】ＣＤ２２−６５＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ｍ９７１＿Ｚｍｕｔ、ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ１９、及びＵＴＤ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ２２発現標的細胞による刺激に応答してＩＦＮ−γを分泌することを示すグラフである。ＣＡＲ  Ｔ細胞とＡＬＬ株Ｎａｌｍ６、ＡＬＬ株ＳＥＭ、及びＣＤ２２陰性ＣＭＬ株との共培養培地中におけるＩＦＮ−γを測定した。ＣＡＲＴ及び標的細胞を１：１のエフェクター対標的細胞比で２４時間共培養した後、上清を回収してＩＦＮ−γ量を定量化した。
【図１５Ａ−１５Ｂ】細胞トレーサーバイオレット色素を用いて評価したときのＡＬＬ株Ｎａｌｍ６及びＳＥＭと共培養したＣＤ２２−６５＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ｍ９７１＿Ｚｍｕｔ、ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ１９、及びＵＴＤ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。Ｔ細胞の細胞分裂毎に各娘細胞が保持する蛍光は半分になるため、低い蛍光ほど強い増殖を示す（図１５Ａ）。ＵＴＤについて示されるとおり、非分裂細胞は高い蛍光を示す。細胞増殖はＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して「細胞分裂指数」として定量化及び報告する（図１５Ｂ）。
【図１６】ＣＤ２２−６５＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ｍ９７１＿Ｚｍｕｔ、又はｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で治療したＮａｌｍ６マウスにおける平均生物発光により示されるとおりの腫瘍退縮を示すグラフである。治療にはＵＴＤのＴ細胞又はＰＢＳも含まれた。
【図１７Ａ−１７Ｂ】ＣＤ２２−６５＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ｍ９７１＿Ｚｍｕｔ、又はｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞又はＵＴＤ若しくはＰＢＳで治療したＳＥＭマウスの腫瘍成長を示すグラフである。
【図１８】軽鎖と重鎖との間に長鎖のリンカー（４×（ＧＧＧＧＳ）；ＬＬ）を含む抗ＣＤ２２  ＣＡＲ及び短鎖リンカー（１×（ＧＧＧＧＳ）；ＳＬ）を含む抗ＣＤ２２  ＣＡＲの概略図である。
【図１９】以前ＣＡＲＴ１９細胞による治療を受けたことのある、ＣＡＲＴ２２細胞で治療した成人ＡＬＬ患者のＣＡＲＴ１９及びＣＡＲＴ２２細胞のＤＮＡ量（コピー／ｕｇ）を示すグラフである。ＣＡＲＴ２２細胞による拡大後の２回目のＣＡＲＴ１９細胞の再拡大。
【図２０】短鎖リンカー（ＣＡＲＴ２２Ｓ）又は長鎖リンカー（ＣＡＲＴ２２ＳＬ）を含むＣＡＲ２２を有するＣＡＲＴ２２細胞で治療した、ＮＡＬＭ６又はＣＨＰ１１０Ｒを生着させたＮＳＧマウスの全生存を示すグラフである。
【図２１】フローサイトメトリーを用いて評価したときＮＳＧマウスにおいて１７日目にＣＡＲＴ２２ＳＬ細胞がＣＡＲＴ２２ＬＬ細胞よりも高いインビボ増殖を示したことを示すグラフである。
【図２２】生体内２光子イメージングを用いて評価したときＮＳＧマウスにおいてＣＡＲＴ２２ＳＬ細胞がＣＡＲＴ２２ＬＬ細胞よりも長時間持続するＴ細胞：白血病相互作用を確立したことを示すグラフである。
【図２３】フローサイトメトリー分析を用いて決定したときのＴ細胞におけるＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ（短鎖１×（ＧＧＧＧＳ）リンカー；配列番号８３５）、ＣＤ２２−６５ｓｓ＿Ｚｗｔ（ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーなし；配列番号８３６）、ＣＤ２２−６５ｓＬＨ＿Ｚｗｔ（Ｎ末端の向きにＶＬ領域及びＣ末端の向きにＶＨ領域を有する短鎖１×（ＧＧＧＧＳ）リンカー）、ＣＤ２２−６５ｓＫＤ＿Ｚｗｔ（短鎖１×（ＧＧＧＧＳ）リンカー並びにＶＨ及びＶＬ領域のＦＲ領域における突然変異；配列番号８３７）、及びＣＤ２２−ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ（対照）の発現レベルを示すグラフである。
【図２４Ａ−２４Ｂ】短鎖リンカー（短鎖１×（ＧＧＧＧＳ）リンカー；配列番号８３５）を有するか、又はリンカーを有しないヒト抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖを担持するＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ２２発現標的細胞を有効に死滅させることを示すグラフである。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）株Ｎａｌｍ６（図２４Ａ）及びＳＥＭ（図２４Ｂ）とのＣＡＲ  Ｔ細胞の２０時間死滅アッセイを示す。
【図２５】ＣＡＲ  ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓＫＤ＿Ｚｗｔ、及びＣＤ２２−ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕを含むＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ２２発現標的細胞による刺激に応答してＩＦＮ−γを分泌することを示すグラフである。ＣＡＲ  Ｔ細胞とＡＬＬ株Ｎａｌｍ６及びＳＥＭとの共培養培地中におけるＩＦＮ−γを測定した。
【図２６】ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓＫＤ＿Ｚｗｔ、及びＣＤ２２−ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔで治療したＮａｌｍ６マウスにおける平均生物発光により示されるとおりの腫瘍退縮を示すグラフである。マウスは、ＰＢＳ又はＥＧＦＲｖＩＩＩ  Ｔ細胞の投与も受けた。
【図２７】例示的タンデムＣＡＲコンストラクトの遠位末端及び近位末端を示す概略図である。
【図２８】ＣＤ１９（暗色のバー）又はＣＤ２２（灰色のバー）に対するｓｃＦＶを認識する試薬を使用したＪＮＬ細胞のＦＡＣＳ表面染色に基づくＣＡＲ％を示すグラフである。ｃ１７１、ｃ１７２、及びｃ１７３において、それぞれ１、０．８、及び２．２の感染多重度を使用した。
【図２９】ＦＡＣＳを用いた、表１に示される様々なＣＡＲで機能化したＪＮＬの活性化の評価に使用した種々の標的細胞株がＣＤ１９及びＣＤ２２に関して染色されることを示すグラフである。両方の染色試薬ともフィコエリトリン（ＰＥ）で標識する。表面に検出されるタンパク質に関する陽性細胞のパーセンテージ並びにＭＦＩ（平均蛍光強度）を示す（％）。
【図３０】ＣＤ１９又はＣＤ２２のいずれかを発現する標的細胞株と１：１細胞比で２０時間インキュベートした非形質導入（ＵＴＤ）及び形質導入ＪＮＬを示すグラフである。ＮＦＡＴ誘導ルシフェラーゼレベル（ｙ軸上に示される任意単位）がＣＡＲ活性の尺度である。
【発明を実施するための形態】
【０１８９】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
【０１９０】
用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の指示対象の１つ又は１つより多い（即ち少なくとも１つ）を指す。例として、「要素」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味する。
【０１９１】
用語「約」は、量、時間的な継続期間などの計測可能な値を参照するとき、指定される値から±２０％又は一部の例では±１０％、又は一部の例では±５％、又は一部の例では±１％、又は一部の例では±０．１％の変動が、かかる変動が本開示の方法の実施に適切であるものとして包含されることを意味する。
【０１９２】
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な塩」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応などを伴うことなく対象の組織と接触して使用するのに好適な、且つ合理的なリスク対効果比に見合った塩を指す。薬学的に許容可能な塩は当該技術分野において周知である。例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．が、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１−１９に薬学的に許容可能な塩について詳細に記載している。
【０１９３】
用語「阻害」又は「阻害薬」は、所与の分子、例えばＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａのある種のパラメータ、例えば活性の低減を含む。例えば、活性、例えばＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａの活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又はそれを超える阻害がこの用語に含まれる。従って、阻害は１００％である必要はない。阻害薬の活性は、本明細書に記載されるとおり、又は当該技術分野において公知のアッセイによって決定することができる。
【０１９４】
用語「キメラ抗原受容体」又は代わりに「ＣＡＲ」は、免疫エフェクター細胞中にあるとき、標的細胞、典型的には癌細胞への特異性、及び細胞内シグナル生成をその細胞に付与するポリペプチドの組、最も単純な実施形態では典型的に２つを指す。一部の実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、以下に定義するとおりの刺激分子及び／又は共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）とを含む。一部の態様において、ポリペプチドの組は互いに連続していて、例えば同じポリペプチド鎖内にあり、例えばキメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドの組は互いに連続しておらず、例えば異なるポリペプチド鎖にある。一部の実施形態において、ポリペプチドの組は、二量化分子が存在したときにそれらのポリペプチドを互いにカップリングすることのできる、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインにカップリングすることのできる二量化スイッチを含む。一態様において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するζ鎖である。一態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義するとおりの少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能性シグナル伝達ドメインを更に含む。一態様において、共刺激分子は、本明細書に記載される共刺激分子、例えば４−１ＢＢ（即ちＣＤ１３７）、ＣＤ２７及び／又はＣＤ２８から選択される（図１０Ａ及び表１４）。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の共刺激分子に由来する２つの機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ−ｔｅｒ）に任意選択のリーダー配列を含む（図１０Ｂ及び表１４）。一態様において、ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を更に含み、ここで、リーダー配列は、任意選択により、細胞プロセシング及びＣＡＲの細胞膜局在化の間に抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から切断される。
【０１９５】
用語「シグナル伝達ドメイン」は、二次メッセンジャーを生成するか、又はかかるメッセンジャーに応答してエフェクターとして機能することにより、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するよう細胞内で情報を伝えることにより機能するタンパク質の中の機能性の一部分を指す。
【０１９６】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ２０」は、Ｂ細胞上に検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒトＣＤ２０は、膜貫通４−ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１（ＭＳ４Ａ１）とも称される。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は受託番号ＮＰ＿６９０６０５．１及びＮＰ＿０６８７６９．２で見付けることができ、ヒトＣＤ２０の転写変異体１及び３をコードする核酸配列は、それぞれ受託番号ＮＭ＿１５２８６６．２及びＮＭ＿０２１９５０．３で見付けることができる。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ２０タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＣＤ２０タンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＣＤ２０」には、完全長野生型ＣＤ２０の突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
【０１９７】
本明細書で使用されるとき、用語「ＲＯＲ１」は、白血病前駆細胞上に検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、ヒトＲＯＲ１のアイソフォーム１及び２前駆体のアミノ酸配列は、それぞれ受託番号ＮＰ＿００５００３．２及びＮＰ＿００１０７７０６１．１で見付けることができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、それぞれ受託番号ＮＭ＿００５０１２．３及びＮＭ＿００１０８３５９２．１で見付けることができる。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＲＯＲ１タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＲＯＲ１タンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＲＯＲ１」には、完全長野生型ＲＯＲ１の突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
【０１９８】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ１９」は、白血病前駆細胞上に検出可能な抗原決定基である分化クラスター１９タンパク質を指す。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１５３９１として見付けることができ、ヒトＣＤ１９をコードする核酸配列は受託番号ＮＭ＿００１１７８０９８で見付けることができる。ＣＤ１９は、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び非ホジキンリンパ腫を含むほとんどのＢ細胞系列癌に発現する。ＣＤ１９を発現する他の細胞は、以下の「ＣＤ１９の発現に関連する疾患」の定義に提供する。これは、Ｂ細胞前駆細胞の初期マーカーでもある。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６−１７）：１１５７−１１６５（１９９７）を参照されたい。一態様において、ＣＡＲＴの抗原結合部分はＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＣＤ１９タンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＣＤ１９」には、完全長野生型ＣＤ１９の突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
【０１９９】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ２２」は、白血病前駆細胞上に検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、アイソフォーム１〜５ヒトＣＤ２２のアミノ酸配列は、それぞれ受託番号ＮＰ  ００１７６２．２、ＮＰ  ００１１７２０２８．１、ＮＰ  ００１１７２０２９．１、ＮＰ  ００１１７２０３０．１、及びＮＰ  ００１２６５３４６．１で見付けることができ、ヒトＣＤ２２の変異体１〜５をコードする核酸配列は、それぞれ受託番号ＮＭ  ００１７７１．３、ＮＭ  ００１１８５０９９．１、ＮＭ  ００１１８５１００．１、ＮＭ  ００１１８５１０１．１、及びＮＭ  ００１２７８４１７．１で見付けることができる。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ２２タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＣＤ２２タンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＣＤ２２」には、完全長野生型ＣＤ２２の突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
【０２００】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ１２３」は、一部の悪性血液癌細胞、例えば白血病細胞上に検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、ヒトＣＤ１２３のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００２１７４．１（アイソフォーム１前駆体）；ＮＰ＿００１２５４６４２．１（アイソフォーム２前駆体）で見付けることができ、これらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００２１８３．３（変異体１）；ＮＭ＿００１２６７７１３．１（変異体２）で見付けることができる。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ１２３タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＣＤ１２３タンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＣＤ１２３」には、完全長野生型ＣＤ１２３の突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
【０２０１】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ１０」は、白血病細胞上に検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、ヒトＣＤ１０のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００９２１８．２；ＮＰ＿０００８９３．２；ＮＰ＿００９２１９．２；ＮＰ＿００９２２０．２で見付けることができ、これらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００７２８７．２（変異体１ｂｉｓ）；ＮＭ＿０００９０２．３（変異体１）；ＮＭ＿００７２８８．２（変異体２ａ）；ＮＭ＿００７２８９．２（変異体２ｂ）で見付けることができる。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ１０タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＣＤ１０タンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＣＤ１０」には、完全長野生型ＣＤ１０の突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
【０２０２】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ３４」は、造血幹細胞及び一部の癌細胞上に検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、ヒトＣＤ３４のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００１０２０２８０．１（アイソフォームａ前駆体）；ＮＰ＿００１７６４．１（アイソフォームｂ前駆体）で見付けることができ、これらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００１０２５１０９．１（変異体１）；ＮＭ＿００１７７３．２（変異体２）で見付けることができる。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ３４タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＣＤ３４タンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＣＤ３４」には、完全長野生型ＣＤ３４の突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
【０２０３】
本明細書で使用されるとき、用語「ＦＬＴ−３」は、造血前駆細胞及び一部の癌細胞、例えば白血病細胞上に検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、ヒトＦＬＴ−３のアミノ酸配列は受託番号ＮＰ＿００４１１０．２で見付けることができ、これらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００４１１９．２で見付けることができる。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＦＬＴ−３タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＦＬＴ−３タンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＦＬＴ−３」には、完全長野生型ＦＬＴ−３の突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
【０２０４】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ７９ｂ」は、一部の悪性血液癌細胞、例えば白血病細胞上に検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、ヒトＣＤ７９ｂのアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿０００６１７．１（アイソフォーム１前駆体）、ＮＰ＿０６７６１３．１（アイソフォーム２前駆体）、又はＮＰ＿００１０３５０２２．１（アイソフォーム３前駆体）で見付けることができ、これらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿０００６２６．２（転写変異体１）、ＮＭ＿０２１６０２．２（転写変異体２）、又はＮＭ＿００１０３９９３３．１（転写変異体３）で見付けることができる。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ７９ｂタンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＣＤ７９ｂタンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＣＤ７９ｂ」には、完全長野生型ＣＤ７９ｂの突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
【０２０５】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ７９ａ」は、一部の悪性血液癌細胞、例えば白血病細胞上に検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、ヒトＣＤ７９ａのアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００１７７４．１（アイソフォーム１前駆体）又はＮＰ＿０６７６１２．１（アイソフォーム２前駆体）で見付けることができ、これらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００１７８３．３（転写変異体１）又はＮＭ＿０２１６０１．３（転写変異体２）で見付けることができる。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ７９ａタンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＣＤ７９ａタンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＣＤ７９ａ」には、完全長野生型ＣＤ７９ａの突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
【０２０６】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ１７９ｂ」は、一部の悪性血液癌細胞、例えば白血病細胞上に検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、ヒトＣＤ１７９ｂのアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿０６４４５５．１（アイソフォームａ前駆体）又はＮＰ＿６９０５９４．１（アイソフォームｂ前駆体）で見付けることができ、これらをコードするｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿０２００７０．３（転写変異体１）又はＮＭ＿１５２８５５．２（転写変異体２）で見付けることができる。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ１７９ｂタンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＣＤ１７９ｂタンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＣＤ１７９ｂ」には、完全長野生型ＣＤ１７９ｂの突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
【０２０７】
本明細書で使用されるとき、用語「結合ドメイン」（例えば、「ＣＤ２０結合ドメイン」）は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えばその免疫グロブリン鎖又は断片を指す。用語「結合ドメイン」（本明細書では「抗体分子」とも称される）又は「抗体分子」は、抗体及び抗体断片を包含する。ある実施形態において、抗体分子は多重特異性抗体分子であり、例えば、これは、複数個の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、複数個のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数個のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態において、多重特異性抗体分子は二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は２つ以下の抗原に対して特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列及び第２のエピトープに対して結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。
【０２０８】
用語「抗体断片」は、抗原のエピトープと（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）特異的に相互作用する能力を保持している抗体の少なくとも一部分を指す。抗体断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線状抗体、ｓｄＡｂなどのシングルドメイン抗体（ＶＬ又はＶＨのいずれか）、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片などの抗体断片で形成される多重特異性抗体、及び抗体の単離ＣＤＲ又は他のエピトープ結合断片が挙げられる。抗原結合断片は、シングルドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖにも取り込まれ得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６，２００５を参照されたい）。抗原結合断片は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドをベースとする足場にもグラフトされ得る（フィブロネクチンポリペプチドミニボディについて記載している米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片とを含む融合タンパク質を指し、軽鎖及び重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば短い可動性ポリペプチドリンカーによって近接して連結されており、単鎖ポリペプチドとして発現することが可能であり、及びｓｃＦｖは、その由来であるインタクトな抗体の特異性を保持している。指定されない限り、本明細書で使用されるとき、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域を例えばポリペプチドのＮ端側及びＣ端側末端に対していずれの順序でも有し得、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含み得るか又はＶＨ−リンカー−ＶＬを含み得る。
【０２０９】
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、本明細書で使用されるとき、抗原特異性及び結合親和性を付与する抗体可変領域内にあるアミノ酸の配列を指す。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」付番スキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」付番スキーム）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）付番（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）（「ＩＭＧＴ」付番スキーム）に記載されるものを含め、幾つもの周知のスキームのいずれかを用いて決定することができる。例えば、古典的フォーマットについて、Ｋａｂａｔに基づき、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基は３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され；及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基は２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と付番される。Ｃｈｏｔｈｉａに基づき、ＶＨのＣＤＲアミノ酸は２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され；及びＶＬのアミノ酸残基は２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と付番される。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）並びにヒトＶＬのアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）からなる。ＩＭＧＴに基づき、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基は約２６〜３５（ＣＤＲ１）、５１〜５７（ＣＤＲ２）及び９３〜１０２（ＣＤＲ３）と付番され、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基は約２７〜３２（ＣＤＲ１）、５０〜５２（ＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＣＤＲ３）と付番される（「ＩＭＧＴ」に係る付番）。ＩＭＧＴに基づき、抗体のＣＤＲ領域はプログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ  Ａｌｉｇｎを用いて決定することができる。
【０２１０】
抗体又はその抗体断片を含む本発明のＣＡＲの一部分は、種々の形態で存在し得、抗原結合ドメインは、例えば、シングルドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体又は二重特異性抗体を含め、連続したポリペプチド鎖の一部として発現する（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。一態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。更なる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。
【０２１１】
用語「抗体重鎖」は、その天然に存在するコンホメーションをとる抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の大きい方を指し、通常、これが抗体の属するクラスを決定する。
【０２１２】
用語「抗体軽鎖」は、その天然に存在するコンホメーションをとる抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の小さい方を指す。カッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖が２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【０２１３】
用語「組換え抗体」は、例えば、バクテリオファージ又は酵母発現システムによって発現される抗体など、組換えＤＮＡ技術を用いて作成される抗体を指す。この用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子であって、抗体タンパク質を発現するＤＮＡ分子、又はその抗体を指定するアミノ酸配列の合成によって作成された抗体を意味するとも解釈されるべきであり、ＤＮＡ又はアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能な周知の組換えＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を用いて得られたものである。
【０２１４】
用語「抗原」又は「Ａｇ」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答には、抗体産生、又は特異的免疫適格細胞の活性化のいずれか又は両方が含まれ得る。当業者は、任意の巨大分子が、事実上あらゆるタンパク質又はペプチドを含め、抗原となり得ることを理解するであろう。更に、抗原は、組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、従って、免疫応答を生じさせるタンパク質をコードする核酸配列又は部分的核酸配列を含む任意のＤＮＡが、その用語が本明細書において使用されるとおりの「抗原」をコードすることを理解するであろう。更に、当業者は、抗原がある遺伝子の完全長核酸配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明には、限定されないが、２つ以上の遺伝子の部分的核酸配列の使用が含まれること、及びそれらの核酸配列が所望の免疫応答を生じさせるポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配列されることが容易に明らかである。更に、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は、合成して作成され得、又は生体試料から得られ得、又はポリペプチド以外の巨大分子である可能性もあることが容易に明らかである。かかる生体試料には、限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞又は体液が他の生物学的成分と共に含まれ得る。
【０２１５】
用語「抗癌効果」は、限定されないが、例えば腫瘍容積の減少、癌細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増加、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存の減少、又は癌性病態に関連する様々な生理学的症状の改善を含め、様々な手段によって明らかになり得る生物学的効果を指す。「抗癌効果」は、そもそも癌の発生を防ぐことにおける本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体の能力によっても明らかになり得る。用語「抗腫瘍効果」は、限定されないが、例えば腫瘍容積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、又は腫瘍細胞生存の減少を含め、様々な手段によって明らかになり得る生物学的効果を指す。用語「自己」は、同じ個体に由来する任意の材料であって、後にその個体に再導入されることになる材料を指す。
【０２１６】
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系であると言われる。一部の態様において、同じ種の個体からの同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。
【０２１７】
用語「異種」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【０２１８】
用語「併用」は、１つの投薬量単位形態での固定的併用、又は本発明の化合物及び併用パートナー（例えば、以下に説明するとおりの別の薬物、「治療剤」又は「共薬剤」とも称される）が独立して同じ時点で又は時間間隔内に別々に投与され得る併用投与、特にこれらの時間間隔によって併用パートナーが協同効果、例えば相乗効果を示すことが可能になる併用投与のいずれかを指す。単一の成分がキットに又は別々に包装され得る。成分（例えば、粉末又は液体）の一方又は両方が投与前に所望の用量に再構成又は希釈され得る。用語「共投与」又は「併用投与」などは、本明細書で利用されるとき、それを必要としている単一の対象（例えば、患者）への選択の併用パートナーの投与を包含することが意味され、薬剤が必ずしも同じ投与経路によって又は同じ時点で投与されない治療レジメンを含むことが意図される。用語「医薬併用」は、本明細書で使用されるとき、２つ以上の治療剤を混合し又は組み合わせることにより得られる生成物を意味し、治療剤の固定的組み合わせ及び非固定的組み合わせの両方を含む。用語「固定的組み合わせ」は、治療剤、例えば本発明の化合物と併用パートナーとが両方とも単一の実体又は投薬量の形態で同時に患者に投与されることを意味する。用語「非固定的組み合わせ」は、治療剤、例えば本発明の化合物と併用パートナーとが両方とも別個の実体として特定の時間制限なしに同時に、並行して、又は代わりに逐次的に患者に投与されることを意味し、かかる投与は、患者の体内において２つの化合物の治療上有効なレベルを提供する。後者は、カクテル療法、例えば３つ以上の治療剤の投与にも適用される。
【０２１９】
用語「癌」は、異常細胞の急激な無制御の成長によって特徴付けられる疾患を指す。癌細胞は、局所的に又は血流及びリンパ系を通じて体の他の部位に広がり得る。様々な癌の例が本明細書に記載され、限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられる。用語「腫瘍」及び「癌」は、本明細書では同義的に使用され、例えば両方の用語とも固形及び液性、例えば腫瘍を包含する。本明細書で使用されるとき、用語「癌」又は「腫瘍」は、前癌性、並びに悪性の癌及び腫瘍を含む。
【０２２０】
本明細書で使用されるとおりの語句「ＣＤ２０の発現に関連する疾患」には、限定はされないが、例えば、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌病態を含めた、ＣＤ２０（例えば、野生型又は突然変異体ＣＤ２０）の発現に関連する疾患又はＣＤ２０（例えば、野生型又は突然変異体ＣＤ２０）を発現する、又はいずれかの時点で発現した細胞に関連する病態；又はＣＤ２０（例えば、野生型又は突然変異体ＣＤ２０）を発現する細胞に関連する非癌関連徴候が含まれる。誤解を避けるため、ＣＤ２０の発現に関連する疾患には、例えば、ＣＤ２０を標的とする分子、例えば本明細書に記載されるＣＤ２０阻害薬による治療によって例えばＣＤ２０発現が下方制御されているため現在はＣＤ２０を発現しないが、かつてはＣＤ２０を発現した細胞に関連する病態が含まれ得る。一態様において、ＣＤ２０の発現に関連する癌は血液癌である。一態様において、血液癌には、限定はされないが、ＡＭＬ、骨髄異形成症候群、ＡＬＬ、ヘアリー細胞白血病、前リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物などが含まれる。更に、ＣＤ２０発現の発現に関連する疾患には、限定はされないが、例えば、ＣＤ２０の発現に関連する非定型の及び／又は非古典的な癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患が含まれる。ＣＤ２０の発現に関連する非癌関連徴候も含まれ得る。
【０２２１】
語句「ＣＤ１９の発現に関連する疾患」には、限定されないが、例えば癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌病態を含めた、ＣＤ１９（例えば、野生型又は変異体ＣＤ１９）の発現に関連する疾患又はＣＤ１９（例えば、野生型又は変異体ＣＤ１９）を発現する、若しくはいずれかの時点で発現した細胞に関連する病態、又はＣＤ１９を発現する細胞に関連する非癌関連徴候が含まれる。誤解を避けるため、ＣＤ１９の発現に関連する疾患には、例えば、ＣＤ１９を標的とする分子、例えばＣＤ１９  ＣＡＲによる治療によって例えばＣＤ１９発現が下方制御されているため、現在ではＣＤ１９を発現しないが、かつてはＣＤ１９を発現した細胞に関連する病態が含まれ得る。一態様において、ＣＤ１９の発現に関連する癌は、血液癌である。一態様において、血液癌は、白血病又はリンパ腫である。一態様において、ＣＤ１９の発現に関連する癌には、限定されないが、例えばＢ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を例えば含むがそれに限定されない１つ以上の急性白血病、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を例えば含むがそれに限定されない１つ以上の慢性白血病を含めた癌及び悪性腫瘍が含まれる。ＣＤ１９の発現に関連する更なる癌又は血液学的病態は、限定されないが、例えばＢ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及び骨髄性血球細胞の無効な産生（又は異形成）によってまとめられる様々な血液学的病態の群である「前白血病」などを含む。更に、ＣＤ１９発現の発現に関連する疾患には、限定されないが、例えばＣＤ１９の発現に関連する非定型の及び／又は非古典的な癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患が含まれる。ＣＤ１９の発現に関連する非癌関連徴候には、限定されないが、例えば自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）及び移植が含まれる。一部の実施形態において、ＣＤ１９発現細胞は、ＣＤ１９  ｍＲＮＡを発現するか、又はいずれかの時点で発現した。ある実施形態において、ＣＤ１９発現細胞は、ＣＤ１９タンパク質（例えば、野生型又は突然変異体）を産生し、ＣＤ１９タンパク質は、正常レベル又は低下したレベルで存在し得る。ある実施形態において、ＣＤ１９発現細胞は、一時的に検出可能なレベルのＣＤ１９タンパク質を産生したが、続いて検出可能なＣＤ１９タンパク質を実質的に産生しなくなった。
【０２２２】
用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含む抗体又は抗体断片の結合特性が大きい影響又は変化を被ることのないアミノ酸改変を指す。かかる保存的改変には、アミノ酸置換、付加及び欠失が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発など、当技術分野において公知の標準技法によって本発明の抗体又は抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。従って、本発明のＣＡＲ内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基に置き換えることができ、及び変化したＣＡＲは、本明細書に記載される機能アッセイを用いて試験することができる。
【０２２３】
用語「刺激」は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体又はＣＡＲ）がそのコグネイトリガンド（又はＣＡＲの場合には腫瘍抗原）と結合して、それにより、限定はされないがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達又は適切なＮＫ受容体若しくはＣＡＲのシグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達など、シグナル伝達イベントを媒介することによって生じる一次応答を指す。刺激は、ある種の分子の発現の変化を媒介することができる。
【０２２４】
用語「刺激分子」は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の側面について刺激的方法で免疫細胞の活性化を調節する１つ又は複数の細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＢ細胞によって発現される分子を指す。一態様において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが負荷されたＭＨＣ分子との結合によって惹起される一次シグナルであり、これが、限定はされないが増殖、活性化、分化などを含めたＴ細胞応答の媒介につながる。刺激的方法で機能する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される）は、免疫受容活性化チロシンモチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用なＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列の例には、限定はされないが、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（Ｆｃ  ε  Ｒ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれる。本発明の具体的なＣＡＲにおいて、本発明の任意の１つ以上のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えばＣＤ３−ζの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の具体的なＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ζの一次シグナル伝達配列は、配列番号８０５として提供される配列、又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基である。本発明の具体的なＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ζの一次シグナル伝達配列は、配列番号８０７に提供されるとおりの配列、又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基である。
【０２２５】
用語「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」は、その表面上に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体化した外来抗原を提示するアクセサリー細胞などの免疫系細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）を指す。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこうした複合体を認識し得る。ＡＰＣは、抗原をプロセシングしてそれをＴ細胞に提示する。
【０２２６】
「免疫エフェクター細胞」は、この用語が本明細書で使用されるとき、免疫応答、例えば免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えばα／β  Ｔ細胞及びγ／δ  Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ−Ｔ）細胞、肥満細胞、及び骨髄系由来食細胞が挙げられる。
【０２２７】
「免疫エフェクター機能又は免疫エフェクター応答」は、この用語が本明細書で使用されるとき、標的細胞の免疫攻撃を増強又は促進する例えば免疫エフェクター細胞の機能又は応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能又は応答は、標的細胞の死滅又は成長若しくは増殖阻害を促進するＴ細胞又はＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞の場合、一次刺激及び共刺激が、免疫エフェクター機能又は応答の例である。
【０２２８】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、この用語が本明細書で使用されるとき、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、ＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞における免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性及びサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性が挙げられる。
【０２２９】
ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激、又は抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的共刺激細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激シグナル、又は抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインがＴ細胞受容体の細胞質配列を含むことができ、及び共刺激細胞内シグナル伝達ドメインが共受容体又は共刺激分子からの細胞質配列を含むことができる。
【０２３０】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例には、限定されないが、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれる。
【０２３１】
用語「ζ」若しくは代わりに「ζ鎖」、「ＣＤ３−ζ」又は「ＴＣＲ−ζ」は、ＧｅｎＢａｎ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基として定義され、「ζ刺激ドメイン」若しくは代わりに「ＣＤ３−ζ刺激ドメイン」又は「ＴＣＲ−ζ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分なζ鎖又はその機能性誘導体の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義される。一態様において、ζの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２〜１６４又はその機能性オルソログである非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基を含む。一態様において、「ζ刺激ドメイン」又は「ＣＤ３−ζ刺激ドメイン」は、配列番号８０５として提供される配列である。一態様において、「ζ刺激ドメイン」又は「ＣＤ３−ζ刺激ドメイン」は、配列番号８０７として提供される配列である。
【０２３２】
用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドに特異的に結合して、それにより、限定されないが増殖など、Ｔ細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上のコグネイト結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子には、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ５（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドが含まれる。
【０２３３】
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及び活性化ＮＫ細胞受容体に代表され得る。かかる分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＳＤ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
【０２３４】
細胞内シグナル伝達ドメインは、その由来である分子の細胞内部分全体、又は天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、又はその機能性断片若しくは誘導体を含み得る。
【０２３５】
用語「４−１ＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列、又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、及び「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４〜２５５、又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基として定義される。一態様において、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号８０３として提供される配列又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基である。
【０２３６】
用語「コードする」は、定義付けられたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は定義付けられたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的過程における他のポリマー及び巨大分子の合成の鋳型としての役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなど、ポリヌクレオチド内の特異的ヌクレオチド配列の固有の特性及びそれによってもたらされる生物学的特性を指す。従って、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって細胞又は他の生体系のタンパク質が産生される場合にタンパク質をコードする。その核酸配列がｍＲＮＡ配列と同一の且つ通常配列表に提供されるものであるコード鎖、及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写鋳型として使用される非コード鎖の両方は、その遺伝子のｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすると称することができる。
【０２３７】
特記されない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする核酸配列の全てを含む。タンパク質又はＲＮＡをコードする核酸配列という語句には、そのタンパク質をコードする核酸配列が何らかのバージョンで１つ又は複数のイントロンを含み得る限りにおいて、イントロンも含まれ得る。
【０２３８】
用語「有効量」又は「治療有効量」は、本明細書では同義的に使用され、本明細書に記載されるとおりの化合物、製剤、材料、又は組成物が特定の生物学的結果を達成するのに有効な量を指す。
【０２３９】
用語「内因性」は、生物、細胞、組織又は系由来の、又はその内部で産生される任意の材料を指す。
【０２４０】
用語「外因性」は、生物、細胞、組織又は系の外側から導入されるか又はその外側で産生される任意の材料を指す。
【０２４１】
用語「発現」は、プロモーターによってドライブされる特定の核酸配列の転写及び／又は翻訳を指す。
【０２４２】
用語「トランスファーベクター」は、単離核酸を含む組成物であって、細胞内部への単離核酸の送達に使用し得る組成物を指す。当技術分野では、限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含め、多くのベクターが公知である。従って、用語「トランスファーベクター」には自己複製プラスミド又はウイルスが含まれる。この用語は、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸のトランスファーを促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物も更に含むものと解釈されなければならない。ウイルストランスファーベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
【０２４３】
用語「発現ベクター」は、発現させる核酸配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、他の発現用エレメントは、宿主細胞によって供給されるか、又はインビトロ発現系に供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッド又はリポソームに含まれる）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含め、当技術分野において公知のもの全てが含まれる。
【０２４４】
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させることができる点でレトロウイルスの中でユニークであり、レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡに多量の遺伝情報を送達することができ、そのため、遺伝子デリバリーベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
【０２４５】
用語「レンチウイルスベクター」は、特に、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に提供されるとおりの自己不活性化レンチウイルスベクターを含め、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指す。臨床で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例としては、限定されないが、例えばＯｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子デリバリー技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステムなどが挙げられる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に公知であろう。
【０２４６】
用語「相同」又は「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば２つのＤＮＡ分子又は２つのＲＮＡ分子など、２つの核酸分子間又は２つのポリペプチド分子間におけるサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占有されるとき、例えば２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンによって占有される場合、それらは、その位置で相同又は同一である。２つの配列間の相同性は、一致する位置又は相同な位置の数の直接の関数である。例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマーにおける５個の位置）が相同である場合、それらの２つの配列は、５０％相同である。位置の９０％（例えば、１０個中９個）が一致するか又は相同である場合、それらの２つの配列は、９０％相同である。
【０２４７】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は他の抗原結合部分配列など）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体及びその抗体断片は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体又は抗体断片）においてレシピエントの相補決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基に置き換えられているものである。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。更に、ヒト化抗体／抗体断片は、レシピエント抗体にも、移入されるＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。これらの改変は抗体又は抗体断片の性能を更に精緻化及び最適化し得る。一般に、ヒト化抗体又はその抗体断片は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、及びＦＲ領域の全て又は大部分がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体又は抗体断片は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含むことができる。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６，１９９２を参照されたい。
【０２４８】
「完全にヒト」は、分子全体がヒト起源であるか、又はヒト形態の抗体又は免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなる抗体又は抗体断片などの免疫グロブリンを指す。
【０２４９】
「ネズミ科動物」は、マウス又はラットを指す。例えば、ネズミ科動物抗体又はその断片は、ネズミ科動物、例えばマウス又はラットから単離される抗体又はその断片の配列を含む。
【０２５０】
用語「単離されている」は、自然状態から改変されているか又は取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸又はペプチドは、「単離されている」のではないが、その自然状態の共存する材料から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは、「単離されている」。単離核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、又は例えば宿主細胞など、非天然環境中に存在することができる。
【０２５１】
本発明との関連において、一般的に存在する核酸塩基に関して以下の略称が使用される。「Ａ」は、アデノシンを指し、「Ｃ」は、シトシンを指し、「Ｇ」は、グアノシンを指し、「Ｔ」は、チミジンを指し、及び「Ｕ」は、ウリジンを指す。
【０２５２】
用語「作動可能に連結された」又は「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列との間における後者の発現をもたらす機能的な連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関係した状態に置かれているとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、互いに連続し得、例えば２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。
【０２５３】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、又は胸骨内注射、腫瘍内、又は輸注技法を含む。
【０２５４】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、一本鎖形態又は二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びこれらのポリマーを指す。具体的に限定しない限り、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、且つ天然に存在するヌクレオチドと同じように代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸が包含される。特に指示されない限り、ある詳細な核酸配列は、黙示的に、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補配列並びに明示的に指示される配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択の（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作成することによって達成し得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０２５５】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列又はペプチドの配列を含むことのできるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合によってつなぎ合わされた２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、この用語は、当技術分野では一般に例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短鎖と、当技術分野では概してタンパク質と称される、多数の種類があるより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、又はこれらの組み合わせが含まれる。
【０２５６】
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要である、細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
【０２５７】
用語「プロモーター／調節配列」は、そのプロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。一部の例では、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の例では、この配列は、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要な他の調節エレメントも含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現するものであり得る。
【０２５８】
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、細胞のほとんど又は全ての生理条件下で細胞において遺伝子産物の産生を生じさせる核酸配列を指す。
【０２５９】
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的にプロモーターに対応する誘発物質が細胞に存在する場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせる核酸配列を指す。
【０２６０】
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコード又は指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせる核酸配列を指す。
【０２６１】
用語「可動性ポリペプチドリンカー」又は「リンカー」は、ｓｃＦｖとの関連で使用されるとき、可変重鎖領域と可変軽鎖領域とを共に連結するために単独又は組み合わせで使用されるグリシン及び／又はセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、ｎ回繰り返されたアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）（配列番号８３４）（式中、ｎは、１以上の正の整数、例えばｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５及びｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９及びｎ＝１０である）を含む。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーには、限定されないが、（Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ）４（配列番号２３）又は（Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ）３（配列番号５４１）が含まれる。別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）及び（ＧｌｙＳｅｒ）の複数の繰り返しを含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、リンカーを含まず、例えば（ｎ＝０）である。また、国際公開第２０１２／１３８４７５号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるリンカーも本発明の範囲内に含まれる。
【０２６２】
本明細書で使用されるとき、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップ又はＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも称される）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「前」又は５’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、１番目の転写ヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びＲＮアーゼからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結び付いており、それぞれが他方に影響を与えるようにして同時転写的に起こる。転写開始直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端に、ＲＮＡポリメラーゼに関連するキャップ合成複合体が結合する。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、ｍＲＮＡのその安定性又は翻訳効率などの機能を調整するために改変することができる。
【０２６３】
本明細書で使用されるとき、「インビトロ転写ＲＮＡ」は、インビトロ合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。概して、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから作成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡの作成に使用される鋳型を含む。
【０２６４】
本明細書で使用されるとき、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付加される一連のアデノシンである。一過性発現用のコンストラクトの好ましい実施形態において、ポリＡは、５０〜５０００、好ましくは６４より多く、より好ましくは１００より多く、最も好ましくは３００又は４００より多い。ポリ（Ａ）配列は、局在性、安定性又は翻訳効率などのｍＲＮＡ機能を調整するために化学的又は酵素的に改変することができる。
【０２６５】
本明細書で使用されるとき、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーＲＮＡ分子へのポリアデニリル部分、又はその改変変異体の共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子が３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってｍＲＮＡ前駆体に付加されるアデニンヌクレオチドの長い配列（多くの場合に数百個）である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）テールは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。ポリ（Ａ）テール及びそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するのに役立つ。ポリアデニル化は、転写終結、ｍＲＮＡの核外移行、及び翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写直後に核内で起こるが、更に後に細胞質でも起こり得る。転写が終結した後、ＲＮＡポリメラーゼに関連するエンドヌクレアーゼ複合体の作用によってｍＲＮＡ鎖が切断される。切断部位は、通常、切断部位近傍の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位の遊離３’末端にアデノシン残基が付加される。
【０２６６】
本明細書で使用されるとき、「一過性」は、数時間、数日間又は数週間の期間にわたる組み込まれないトランス遺伝子の発現を指し、この発現期間は、宿主細胞においてゲノムに組み込まれた場合又は安定プラスミドレプリコン中に含まれている場合の遺伝子の発現期間よりも短い。
【０２６７】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、１つ以上の療法（例えば、本発明のＣＡＲなどの１つ以上の療法剤）の投与によってもたらされる増殖性障害の進行、重症度及び／又は持続期間の低減又は改善、又は増殖性障害の１つ以上の症状（好ましくは１つ以上の認識し得る症状）の改善を指す。具体的な実施形態において、用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、患者には必ずしも認識できない、腫瘍の成長などの増殖性障害の少なくとも１つの計測可能な理学的パラメータの改善を指す。一部の実施形態において用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、増殖性障害の進行の物理的な、例えば認識し得る症状の安定化による阻害、生理学的な、例えば理学的パラメータの安定化による阻害のいずれか又は両方を指す。一部の実施形態において用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、腫瘍サイズ又は癌性細胞数の低減又は安定化を指す。
【０２６８】
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。語句「細胞表面受容体」は、シグナルを受け取り、且つ細胞の膜を越えてシグナルを伝える能力を有する分子及び分子複合体を含む。
【０２６９】
用語「対象」は、免疫応答を生じさせることのできる生きている生物（例えば、哺乳類、ヒト）を含むことが意図される。
【０２７０】
用語の「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞とは、その天然に存在する状態でそれが通常結び付いている他の細胞型と分離されている細胞も指す。一部の例では、実質的に精製された細胞の集団とは、均質な細胞の集団を指す。他の例では、この用語は、単に、その自然状態でそれが天然に結び付いている細胞から分離されている細胞を指す。一部の態様において、これらの細胞は、インビトロで培養される。他の態様において、これら細胞は、インビトロで培養されない。
【０２７１】
用語「療法的」とは、本明細書で使用されるとき、治療を意味する。療法的効果は疾患状態の低減、抑制、寛解、又は根絶によって達成される。
【０２７２】
用語「予防」は、本明細書で使用されるとき、疾患又は疾患状態の予防又はそれに対する予防的治療を意味する。
【０２７３】
本発明との関連において、「腫瘍抗原」、又は「過剰増殖性障害抗原」、又は「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、特異的な過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。特定の態様において、本発明の過剰増殖性障害抗原は、限定されないが、原発性又は転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝癌、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌及び腺癌、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌などを含めた癌に由来する。
【０２７４】
用語「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」は、外因性核酸を宿主細胞に移入させるか又は導入するプロセスを指す。「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸をトランスフェクト、形質転換又は形質導入されたものである。細胞には初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
【０２７５】
用語「特異的に結合する」は、試料中に存在する結合パートナー（例えば、刺激性腫瘍抗原）タンパク質を認識し、結合する抗体、又はリガンドであって、しかし、試料中の他の分子は、実質的に認識又は結合しない、抗体又はリガンドを指す。
【０２７６】
「不応性」は、本明細書で使用されるとき、治療に応答しない疾患、例えば癌を指す。実施形態において、不応性癌は、治療の開始前又は開始時点で治療に抵抗性であり得る。一部の実施形態において、不応性癌は、治療中に抵抗性になり得る。不応性癌は、抵抗性癌とも称される。
【０２７７】
対象は、対象における癌のパラメータ（例えば、血液癌、例えば癌細胞成長、増殖及び／又は生存）が、任意の適切な尺度、例えば質量、細胞数又は容積によって決定したとき検出可能な量だけ、例えば約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えて遅延又は減少する場合に治療に「応答する」。一例において、対象の平均余命が治療を投与しない場合に予想される平均余命を超えて約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又はそれを超えて延びる場合、対象は、治療に応答する。別の例において、対象が無病生存、全生存の増加又は無増悪期間の増加を有する場合、対象は、治療に応答する。患者が治療に応答するかどうかは、例えば、ＮＣＣＮ腫瘍学臨床実践ガイドライン（ＮＣＣＮ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）（ＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（登録商標））によって提供される基準を含め、幾つかの方法を用いて決定することができる。例えば、Ｂ−ＡＬＬのコンテクストでは、完全奏効又は完全奏効者は、＜５％ＢＭ芽球、＞１０００好中球／ＡＮＣ（／μＬ）、循環芽球又は髄外疾患を伴わない（リンパ節症、脾腫、皮膚／歯肉浸潤／精巣腫瘤／ＣＮＳ病変を伴わない）＞１００，０００血小板（／μＬ）、三血球系造血、及び４週間無再発の１つ以上を伴い得る。部分奏効者は、ＢＭ芽球の≧５０％減少、＞１０００好中球／ＡＮＣ（／μＬ）、＞１００，０００血小板（／μＬ）の１つ以上を伴い得る。非奏効者は疾患の進行、例えば＞２５％のＢＭ芽球を示し得る。ある実施形態において、完全奏効者は、ＣＤ８＋集団に７％以上のＣＤ２７＋  ＣＤ４５ＲＯ−細胞を有するものとして定義される。ある実施形態において、採取前レベルのＣＡＲ＋細胞のパーセントにより、奏効者（例えば、完全奏効者及び部分奏効者）が非奏効者（ＮＲ）と区別される。
【０２７８】
用語「再発」は、本明細書で使用されるとき、初期の奏効期間（例えば、完全奏効又は部分奏効）後に癌が再び出現することを指す。初期応答期間は、特定の閾値を下回る、例えば２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％を下回るレベルの癌細胞を伴い得る。再出現は、特定の閾値を上回る、例えば２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％を上回るレベルの癌細胞を含み得る。例えば、例としてＢ−ＡＬＬのコンテクストにおいて、再出現は、例えば、完全奏効後の血液、骨髄（＞５％）、又は任意の髄外部位における芽球の再出現を含み得る。これに関連して、完全奏効は、＜５％ＢＭ芽球を含み得る。より一般的には、ある実施形態において、応答（例えば、完全奏効又は部分奏効）は、検出可能なＭＲＤ（微小残存病変）が存在しないことを含み得る。ある実施形態において、初期応答期間は、少なくとも１、２、３、４、５、又は６日、少なくとも１、２、３、又は４週間、少なくとも１、２、３、４、６、８、１０、又は１２ヵ月、又は少なくとも１、２、３、４、又は５年続く。
【０２７９】
その用語が本明細書で使用されるとおりの「調節可能なキメラ抗原受容体（ＲＣＡＲ）」は、ＲＣＡＲＸ細胞内にあるとき、標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性、及び調節可能な細胞内シグナル生成又は増殖をＲＣＡＲＸ細胞に付与し、それによりＲＣＡＲＸ細胞の免疫エフェクター特性を最適化することができるポリペプチドの組、最も単純な実施形態では典型的に２つのポリペプチドを指す。ＲＣＡＲＸ細胞は、抗原結合ドメインが結合する抗原を含む標的細胞に対する特異性を付与するために、少なくとも一部には抗原結合ドメインに頼る。ある実施形態において、ＲＣＡＲは、二量化分子が存在したとき細胞内シグナル伝達ドメインを抗原結合ドメインにカップリングすることができる二量化スイッチを含む。
【０２８０】
「膜アンカー」又は「膜繋留ドメイン」は、この用語が本明細書で使用されるとき、細胞外又は細胞内ドメインを細胞膜にアンカリングするのに十分なポリペプチド又は部分、例えばミリストイル基を指す。
【０２８１】
「スイッチドメイン」は、この用語が本明細書で例えばＲＣＡＲに言及する場合に使用されるとき、二量化分子の存在下で別のスイッチドメインと会合する実体、典型的にはポリペプチドベースの実体を指す。この会合の結果、第１のスイッチドメインに連結、例えば融合した第１の実体と、第２のスイッチドメインに連結、例えば融合した第２の実体との機能的カップリングが生じる。第１及び第２のスイッチドメインは、まとめて二量化スイッチと称される。実施形態において、第１及び第２のスイッチドメインは互いに同じであり、例えばこれらは同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、まとめてホモ二量化スイッチと称される。実施形態において、第１及び第２のスイッチドメインは互いに異なり、例えばこれらは異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、まとめてヘテロ二量化スイッチと称される。実施形態において、スイッチは細胞内である。実施形態において、スイッチは細胞外である。実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えばＦＫＢＰ又はＦＲＢベースであり、二量化分子は小分子、例えばラパログである。実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えばｍｙｃペプチドに結合するｓｃＦｖであり、二量化分子はポリペプチド、その断片、又はポリペプチドの多量体、例えば１つ以上のｍｙｃ  ｓｃＦｖに結合するｍｙｃリガンド又はｍｙｃリガンドの多量体である。実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えばｍｙｃ受容体であり、二量化分子は抗体又はその断片、例えばｍｙｃ抗体である。
【０２８２】
「二量化分子」は、この用語が本明細書で例えばＲＣＡＲに言及する場合に使用されるとき、第１のスイッチドメインと第２のスイッチドメインとの会合を促進する分子を指す。実施形態において、二量化分子は対象に天然に存在しないか、又は有意な二量化をもたらし得る濃度で存在しない。実施形態において、二量化分子は小分子、例えばラパマイシン又はラパログ、例えばＲＡＤ００１である。
【０２８３】
用語「生物学的に同等」は、参照用量又は参照量の参照化合物（例えば、ＲＡＤ００１）によって生じる効果と等価な効果を生じさせるために必要な参照化合物（例えば、ＲＡＤ００１）以外の薬剤の量を指す。ある実施形態において、効果は、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害によって測定したときの、例えばインビボ又はインビトロアッセイで評価したときの、例えば本明細書に記載されるアッセイ、例えばＢｏｕｌａｙアッセイ、又はウエスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定によって測定したときの、ｍＴＯＲ阻害レベルである。ある実施形態において、効果は、細胞選別によって測定したときの、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比の変化である。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の生物学的に同等な量又は用量は、参照用量又は参照量の参照化合物と同じレベルのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量又は用量である。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の生物学的に同等な量又は用量は、参照用量又は参照量の参照化合物と同じレベルのＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比の変化を達成する量又は用量である。
【０２８４】
用語「免疫増強低用量」は、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害薬、例えばＲＡＤ００１又はラパマイシン、又は触媒ｍＴＯＲ阻害薬と併せて使用されるとき、例えばＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性の阻害によって測定したときのｍＴＯＲ活性を、完全ではないが、部分的に阻害するｍＴＯＲ阻害薬の用量を指す。ｍＴＯＲ活性の、例えばＰ７０  Ｓ６キナーゼの阻害による評価方法は、本明細書で考察される。用量は、完全な免疫抑制をもたらすには不十分であるが、免疫応答を増強するには十分である。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の免疫増強低用量は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の数減少、及び／又はＰＤ−１陰性Ｔ細胞数の増加、又はＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の比の増加をもたらす。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の免疫増強低用量は、ナイーブＴ細胞数の増加をもたらす。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の免疫増強低用量は、以下の１つ以上：
例えばメモリーＴ細胞上、例えばメモリーＴ細胞前駆体上の、以下のマーカー：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ１２７ｈｉｇｈ、ＣＤ２７＋、及びＢＣＬ２の１つ以上の発現の増加；
例えばメモリーＴ細胞上、例えばメモリーＴ細胞前駆体上の、ＫＬＲＧ１の発現の減少；及び
メモリーＴ細胞前駆体、例えば以下の特性：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈの増加、ＣＤ１２７ｈｉｇｈの増加、ＣＤ２７＋の増加、ＫＬＲＧ１の減少、及びＢＣＬ２の増加のいずれか１つ又は組み合わせを有する細胞の数の増加
をもたらし、ここで、上記に記載される変化のいずれも、例えば未治療対象と比較したとき、例えば少なくとも一過性に起こる。
【０２８５】
範囲：本開示全体を通じて、本発明の様々な態様が範囲の形式で提示され得る。範囲の形式での記載は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する確固たる限定と解釈されてはならないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲並びにその範囲内にある個々の数値を有すると考えられなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示される部分範囲並びにその範囲内にある個々の数値、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を有すると考えられなければならない。別の例として、９５〜９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するものを含み、及び９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％及び９８〜９９％の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅に関わらず適用される。
【０２８６】
本明細書には、ＣＤ２０及び／又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用した癌などの疾患の治療又は予防のための物質組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｔｔｅｒ）及び使用方法が提供される。
【０２８７】
一態様において、本発明は、ＣＤ２０タンパク質、又はＣＤ２２タンパク質又はその断片に特異的に結合するように操作された抗体又は抗体断片を含む幾つかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。一態様において、本発明は、ＣＡＲを発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を提供し、細胞（例えば、「ＣＡＲＴ」）は、抗腫瘍特性を呈する。一態様において、細胞がＣＡＲで形質転換され、ＣＡＲの少なくとも一部が細胞表面上に発現する。一部の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部のかかる実施形態において、細胞は、ＣＡＲを安定に発現し得る。別の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、ＣＡＲをコードする核酸、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡをトランスフェクトされる。一部のかかる実施形態において、細胞は、ＣＡＲを一過性に発現し得る。
【０２８８】
一態様において、ＣＡＲのＣＤ２０又はＣＤ２２結合ドメイン、例えばネズミ科動物、ヒト、又はヒト化ＣＤ２０結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体断片である。一態様において、かかる抗体断片は、それが同じ重鎖及び軽鎖可変領域を有するＩｇＧ抗体と均等な結合親和性を保持しており、例えばそれが均等な有効性で同じ抗原に結合する点で機能性である。一態様において、かかる抗体断片は、それが、当業者によって理解されるであろうとおり、限定されないが、免疫応答の活性化、その標的抗原から生じるシグナル伝達の阻害、キナーゼ活性の阻害などを含み得る生物学的反応をもたらす点で機能性である。
【０２８９】
一部の態様において、本発明の抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に取り込まれる。一態様において、ＣＡＲは、本明細書に表１として提供されるポリペプチド配列を含む。
【０２９０】
一態様において、本発明のＣＡＲのＣＤ２０又はＣＤ２２結合ドメイン、例えばネズミ科動物、ヒト化、又はヒトＣＤ２０又はＣＤ２２結合ドメイン部分は、配列が哺乳類細胞での発現にコドン最適化されているトランス遺伝子によってコードされる。一態様において、本発明のＣＡＲコンストラクト全体は、配列全体が哺乳類細胞での発現にコドン最適化されているトランス遺伝子によってコードされる。コドン最適化とは、コードＤＮＡにおける同義コドン（即ち同じアミノ酸をコードするコドン）の出現頻度が異なる種で偏っているという発見を指す。かかるコドン縮重により、同一のポリペプチドが種々の核酸配列によってコードされることが可能になる。種々のコドン最適化方法が当技術分野において公知であり、例えば少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号明細書及び同第６，１１４，１４８号明細書に開示される方法が挙げられる。
【０２９１】
一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインはネズミ科動物（例えば、ラット又はマウス）抗体又は抗体断片を含む。一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインはヒトＣＤ２０又はＣＤ２２抗体又は抗体断片を含む。一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインはヒト化ＣＤ２０又はＣＤ２２抗体又は抗体断片を含む。一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含むネズミ科動物ＣＤ２０又はＣＤ２２抗体断片を含む。一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含むヒトＣＤ２０又はＣＤ２２抗体断片を含む。一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインはヒトＣＤ２０又はＣＤ２２  ｓｃＦｖである。一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含むヒト化ＣＤ２０抗体断片を含む。一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインはヒト化ＣＤ２０又はＣＤ２２  ｓｃＦｖである。
【０２９２】
一態様において、ＣＡＲ２０結合ドメインは、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１５９、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２４０、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。
【０２９３】
一態様において、ＣＡＲ２２結合ドメインは、表６に示されるとおりのｓｃＦｖタンパク質を含む。
【０２９４】
更に、本発明は、数ある疾患の中でも特に、ＣＤ２０又はＣＤ２２を発現する細胞又は組織が関わる癌又は任意の悪性腫瘍又は自己免疫疾患を治療するためのＣＤ２０  ＣＡＲ又はＣＤ２２  ＣＡＲ組成物及び医薬品又は方法におけるその使用を提供する。
【０２９５】
一態様において、本発明のＣＡＲはＣＤ２０発現又はＣＤ２２発現正常細胞の根絶に使用することができ、従って細胞移植前の細胞コンディショニング療法としての使用に適用可能である。一態様において、ＣＤ２０発現又はＣＤ２２発現正常細胞は、ＣＤ２０発現又はＣＤ２２発現骨髄系前駆細胞であり、及び細胞移植は幹細胞移植である。
【０２９６】
一態様において、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体（例えば、ＣＡＲＴ）を発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を提供し、ここで、細胞（例えば、「ＣＡＲＴ」）は抗腫瘍特性を呈する。従って、本発明は、ＣＤ２０結合ドメインを含むＣＤ２０−ＣＡＲ及び／又はＣＤ２２結合ドメインを含む、且つＴ細胞又はＮＫ細胞に操作されるＣＤ２２−ＣＡＲ及び養子療法へのその使用方法を提供する。
【０２９７】
一態様において、ＣＤ２０−ＣＡＲ又はＣＤ２２−ＣＡＲは、例えば、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζシグナルドメイン、及びこれらの任意の組み合わせの群から選択される、例えば本明細書に記載される、少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。一態様において、ＣＤ２０−ＣＡＲ又はＣＤ２２−ＣＡＲは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）又はＣＤ２８以外の１つ以上の共刺激分子からのものである少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２９８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、ＣＡＲをコードする配列を含む組換えＤＮＡコンストラクトを包含し、ＣＡＲは、ＣＤ２０及び／若しくはＣＤ２２又はその断片、例えばヒトＣＤ２０又はＣＤ２２に特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体、抗体断片）を含み、ＣＤ２０又はＣＤ２２結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体断片）の配列は、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に連続しており、それと同じリーディングフレーム内にある。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメイン、例えばζ鎖を含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインとは、共刺激分子の細胞内ドメインの少なくとも一部分を含むＣＡＲの一部分を指す。
【０２９９】
具体的な態様において、本発明のＣＡＲコンストラクトは、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１５９、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２４０、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択されるｓｃＦｖドメインを含み、ここで、ｓｃＦｖの前には、配列番号７９７に提供されるなどの任意選択のリーダー配列があり得、後ろには、配列番号７９９、又は配列番号８１４、又は配列番号８１５に提供されるなどの任意選択のヒンジ配列、配列番号８０１に提供されるなどの膜貫通領域、配列番号８０３又は配列番号８０４を含む細胞内シグナル伝達ドメイン及び配列番号８０５又は配列番号８０７を含むＣＤ３ζ配列があり得、例えば、これらのドメインは、連続していて同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。本発明には、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１５９、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２４０、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択されるｓｃＦｖ断片の各々のポリペプチドをコードする核酸配列も含まれる。
【０３００】
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインをコードする核酸配列は、配列番号２５、配列番号５２、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１３３、配列番号１６０、配列番号１８７、配列番号２１４、配列番号２４１、配列番号２６８、配列番号２９５、配列番号３２２、配列番号３４９、配列番号３７６、配列番号４０３、及び配列番号４３０からなる群から選択される配列を含む。ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインをコードする核酸配列は、表１に示されるとおりの配列を含む。
【０３０１】
一実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインをコードする核酸配列は、表６に示されるとおりの配列を含む。
【０３０２】
更なる実施形態は、表１及び／又は表６のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。更なる実施形態は、表１及び／又は表６のいずれかのポリペプチド及び配列番号７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、及び任意選択により８１８のドメインの各々をコードする核酸配列を含む。
【０３０３】
一態様において、例示的ＣＤ２０ＣＡＲコンストラクトは、任意選択のリーダー配列と、細胞外抗原結合ドメインとヒンジと、膜貫通ドメインと、細胞内刺激ドメインとを含む。一態様において、例示的ＣＤ２０ＣＡＲ又はＣＤ２２ＣＡＲコンストラクトは、任意選択のリーダー配列と、細胞外抗原結合ドメインと、ヒンジと、膜貫通ドメインと、細胞内共刺激ドメインと、細胞内刺激ドメインとを含む。
【０３０４】
一部の実施形態において、完全長ＣＤ２０  ＣＡＲ配列は、本明細書に表１としても提供される。
【０３０５】
一部の実施形態において、完全長ＣＤ２２  ＣＡＲ配列は、本明細書に表６としても提供される。
【０３０６】
例示的リーダー配列は配列番号７９７として提供される。例示的ヒンジ／スペーサー配列は、配列番号７９９、又は配列番号８１４、又は配列番号８１６として提供される。例示的膜貫通ドメイン配列は配列番号８０１として提供される。４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの例示的配列は配列番号８０３として提供される。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの例示的配列は配列番号８１８として提供される。例示的ＣＤ３ζドメイン配列は配列番号８０５又は配列番号８０７として提供される。
【０３０７】
一態様において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸コンストラクトを包含し、ここで、核酸分子は、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続的で、それと同じリーディングフレーム内にある、例えば本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインをコードする核酸配列を含む。一態様において、ＣＤ２０結合ドメインは、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１５９、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２４０、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９から選択される。一態様において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸コンストラクトを包含し、核酸分子は、ＣＤ２０結合ドメインをコードする核酸配列を含み、例えば、この配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に連続しており、それと同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲに使用し得る例示的細胞内シグナル伝達ドメインには、限定されないが、例えばＣＤ３−ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。一部の例では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの任意の組み合わせを含み得る。
【０３０８】
一態様において、本発明のＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号２５、配列番号５２、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１３３、配列番号１６０、配列番号１８７、配列番号２１４、配列番号２４１、配列番号２６８、配列番号２９５、配列番号３２２、配列番号３４９、配列番号３７６、配列番号４０３、及び配列番号４３０の１つ以上から選択される。所望の分子をコードする核酸配列は、標準的な技法を用いて、例えばその遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによるか、それを含むことが知られるベクターから遺伝子を誘導することによるか、又はそれを含む細胞及び組織から直接単離することによるなど、当技術分野において公知の組換え方法を用いて得ることができる。代わりに、目的の核酸はクローニングでなく、むしろ合成的に作製することができる。
【０３０９】
本発明は、細胞に直接形質導入することのできるＣＡＲを発現するレトロウイルス及びレンチウイルスベクターコンストラクトを含む。
【０３１０】
本発明は、細胞に直接トランスフェクトすることのできるＲＮＡコンストラクトも含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡの作成方法には、特別に設計したプライマーによる鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）と、続くポリＡ付加が含まれ、それにより、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップ及び／又は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現させようとする核酸、及びポリＡテールを含むコンストラクト、典型的には５０〜２０００塩基長が提供される。このように作製されたＲＮＡは、様々な種類の細胞を効率的にトランスフェクトすることができる。一実施形態において、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。ある実施形態において、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターは、電気穿孔によってＴ細胞又はＮＫ細胞に形質導入される。
【０３１１】
抗原結合ドメイン
一態様において、本発明のＣＡＲは、他の場合には抗原結合ドメインと称される標的特異的結合エレメントを含む。部分の選択は、標的細胞の表面を定義するリガンドの種類及び数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとしての役割を果たすリガンドを認識するように選択され得る。
【０３１２】
一態様において、所望の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインをＣＡＲに操作することにより、ＣＡＲ媒介性Ｔ細胞応答を目的の抗原に仕向けることができる。
【０３１３】
一態様において、抗原結合ドメインを含むＣＡＲの一部分は、ＣＤ２０又はその断片を標的とする抗原結合ドメインを含む。一態様において、抗原結合ドメインはヒトＣＤ２０又はその断片を標的にする。
【０３１４】
一態様において、抗原結合ドメインを含むＣＡＲの一部分は、ＣＤ２２又はその断片を標的にする抗原結合ドメインを含む。一態様において、抗原結合ドメインはヒトＣＤ２２又はその断片を標的にする。
【０３１５】
抗原結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ネズミ科動物抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びその機能性断片、例えば、限定されないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ科動物由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）などのシングルドメイン抗体、及び組換えフィブロネクチンドメインなど、抗原結合ドメインとして機能することが当技術分野において公知の代替的足場を含め、抗原に結合する任意のドメインであり得る。一部の例では、抗原結合ドメインは、ＣＡＲが最終的に使用されることになる同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトでの使用には、ＣＡＲの抗原結合ドメインが抗体又は抗体断片の抗原結合ドメインにヒト又はヒト化残基を含むことが有益であり得る。
【０３１６】
一部の例では、抗原結合ドメインは、ＣＡＲが最終的に使用されることになる同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおける使用について、ＣＡＲの抗原結合ドメインが抗体又は抗体断片の抗原結合ドメインにヒト又はヒト化残基を含むことが有益であり得る。従って、一態様において、抗原結合ドメインは、ヒト抗体又は抗体断片を含む。
【０３１７】
他の場合、抗原結合ドメインは、ＣＡＲが最終的に使用されることになる種（例えば、ヒト）と異なる種（例えば、ネズミ科動物）に由来する。
【０３１８】
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、及び／又は本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、例えば１つ以上、例えば３つ全てのＬＣＤＲと１つ以上、例えば３つ全てのＨＣＤＲとを含むＣＤ２０結合ドメインを含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、例えばＣＤ２０結合ドメインは、本明細書に記載されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を各々含む２つの可変重鎖領域を有する。
【０３１９】
一実施形態において、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３は、表３に挙げられるアミノ酸配列を含む（又はそれからなる）。一実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３は、表２に挙げられるアミノ酸配列を含む（又はそれからなる）。
【０３２０】
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書（例えば、表５）に記載される軽鎖可変領域及び／又は本明細書（例えば、表４）に記載される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書（例えば、表４）に記載される重鎖可変領域、例えば本明細書（例えば、表４）に記載される少なくとも２つの重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、表１のアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表５に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、３０、２０又は１０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は表５のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；及び／又は表４に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２又は３つの改変（例えば、置換）であるが、３０、２０又は１０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、又は表４のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１５９、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２４０、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択される配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、及び本明細書の例えば表５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書の例えば表４に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域にリンカー、例えば本明細書に記載されるリンカーを介して結合する。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６、好ましくは３又は４である）（配列番号２３）を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、以下の向き：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域又は重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれであり得る。
【０３２１】
ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植（例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に援用される欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；及び米国特許第５，２２５，５３９号明細書、同第５，５３０，１０１号明細書及び同第５，５８５，０８９号明細書を参照されたい）、ベニアリング又はリサーフェシング（例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に援用される欧州特許第５９２，１０６号明細書及び同第５１９，５９６号明細書；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４；及びＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３を参照されたい）、鎖シャッフリング（例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい）、並びに例えばそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／００４２６６４号明細書、米国特許出願公開第２００５／００４８６１７号明細書、米国特許第６，４０７，２１３号明細書、米国特許第５，７６６，８８６号明細書、国際公開第９３１７１０５号パンフレット、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１１１９−２５（２００２），Ｃａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１３（５）：３５３−６０（２０００），Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０（３）：２６７−７９（２０００），Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１６）：１０６７８−８４（１９９７），Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９（１０）：８９５−９０４（１９９６），Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ（１９９５），Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（８）：１７１７−２２（１９９５），Ｓａｎｄｈｕ  Ｊ  Ｓ，Ｇｅｎｅ，１５０（２）：４０９−１０（１９９４）及びＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５（３）：９５９−７３（１９９４）に記載の技術を含むが、これらに限定されない、当技術分野で知られる多様な方法を使用して産生できる。多くの場合、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基を、抗原結合を変える、例えば改善するためにＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法、例えば抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、及び特定の位置の異常フレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（例えば、参照により本明細書に援用されるＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５８５，０８９号明細書；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３を参照されたい）。
【０３２２】
ヒト化抗体又は抗体断片は、非ヒトである源から残留している１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、典型的には「インポート」可変ドメインからとられる「インポート」残基と呼ばれる。本明細書に提供されるように、ヒト化抗体又は抗体断片は、フレームワークが完全に又は主にヒト生殖細胞系に由来する、非ヒト免疫グロブリン分子及びフレームワーク領域からの１つ以上のＣＤＲを含む。抗体又は抗体断片のヒト化のための多数の技術が当技術分野で知られ、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従い、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより、即ちＣＤＲ移植（内容全体が参照により本明細書に援用される欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；及び米国特許第４，８１６，５６７号明細書；同第６，３３１，４１５号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第６，５４８，６４０号明細書）により実施できる。このようなヒト化抗体及び抗体断片において、非ヒト種からの対応する配列により置換されるのは、実質的に完全より少ないヒト可変ドメインである。ヒト化抗体は、多くの場合、あるＣＤＲ残基及び場合によりあるフレームワーク（ＦＲ）残基が齧歯類抗体における類似部位からの残基により置換されるヒト抗体である。抗体及び抗体断片のヒト化は、ベニアリング又はリサーフェシング（欧州特許第５９２，１０６号明細書；欧州特許第５１９，５９６号明細書；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４（１９９４）；及びＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３（１９９４）））又は鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）によっても達成でき、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０３２３】
ヒト化抗体を製造するために使用する軽及び重の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を減少するためである。いわゆる「ベストフィット」法により、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既知ヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。齧歯類に最も近いヒト配列を、その後、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（その内容全体が参照により本明細書に援用されるＳｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）を参照されたい）。別の方法は、特定のサブグループの軽鎖又は重鎖の全抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークは、数種の異なるヒト化抗体のために使用され得る（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＮｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６−１７）：１１５７−１１６５（１９９７）；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）。一実施形態において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸からの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの改変、例えば置換を含み得る。
【０３２４】
幾つかの態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗体断片を含む部分は、標的抗原に対する高親和性及び他の有利な生物学的特性を維持しながらヒト化される。本発明の一態様によると、ヒト化抗体及び抗体断片は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び種々の概念的ヒト化産物の分析の過程により製造される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者に熟知されている。選択した候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元立体構造的構造を説明及び提示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらのディスプレイの検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、例えば候補免疫グロブリンの標的抗原への結合能に影響する残基の分析を可能にする。この方法で、ＦＲ残基は、標的抗原に対する親和性増加など、所望の抗体又は抗体断片時調が達成されるように、レシピエント及びインポート配列から選択及び組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合の直接的且つ最も実質的な影響に関与する。
【０３２５】
ヒト化抗体又は抗体断片は、元の抗体と同様の抗原特異性、例えば本発明ではヒトＣＤ２０又はその断片に結合する能力を保持し得る。一部の実施形態において、ヒト化抗体又は抗体断片は、ヒトＣＤ２０又はその断片への結合の親和性及び／又は特異性が向上し得る。
【０３２６】
一態様において、抗原結合ドメイン部分は、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１５９、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２４０、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９から選択される１つ以上の配列を含む。一態様において、ＣＤ２０結合ドメインは、抗体又は抗体断片の特定の機能的特徴又は特性によって特徴付けられる。例えば、一態様において、抗原結合ドメインを含む本発明のＣＡＲ組成物の一部分は、ヒトＣＤ２０又はその断片に特異的に結合する。一態様において、本発明は、抗体又は抗体断片を含む抗原結合ドメインに関し、ここで、抗体結合ドメインはＣＤ２０タンパク質又はその断片に特異的に結合し、ここで、抗体又は抗体断片は、表１から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び／又は可変重鎖を含む。一態様において、抗原結合ドメインは、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１５９、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２４０、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９から選択されるｓｃＦｖのアミノ酸配列を含む。特定の態様において、ｓｃＦｖはリーダー配列と連続的で、それと同じリーディングフレーム内にある。一態様においてリーダー配列は、配列番号７９７として提供されるポリペプチド配列である。
【０３２７】
一態様において、ＣＤ２０結合ドメインは断片、例えば単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一態様において、ＣＤ２０結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、又は二機能性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体である（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））。一態様において、本発明の抗体及びその断片は、ＣＤ２０タンパク質又はその断片に野生型の又は増大した親和性で結合する。
【０３２８】
ある例において、ヒトｓｃＦｖは、ディスプレイライブラリー由来であり得る。ディスプレイライブラリーは、エンティティの集合である。各エンティティは、ポリペプチド成分をコード又は特定するアクセス可能ポリペプチド成分及び回復可能成分を含む。ポリペプチド成分は、異なるアミノ酸配列が表されるように変わる。ポリペプチド成分は、任意の長さ、例えば３アミノ酸〜３００アミノ酸超であり得る。ディスプレイライブラリーエンティティは、Ｆａｂの２つ以上のポリペプチド成分、例えば２つのポリペプチド鎖を含み得る。１つの例示的実施形態において、ディスプレイライブラリーを使用してヒトＣＤ２０結合ドメインを同定できる。選択において、ライブラリーの各メンバーのポリペプチド成分をＣＤ２０又はその断片でプローブし、ポリペプチド成分がＣＤ２０に結合する場合、ディスプレイライブラリーメンバーを典型的には支持体上への保持により同定する。
【０３２９】
保持されたディスプレイライブラリーメンバーを支持体から回収し、分析する。分析は、増幅及び続く類似又は非類似条件下での選択を含み得る。例えば、陽性及び陰性選択が交互であり得る。分析は、ポリペプチド成分、即ち抗ＣＤ２０結合ドメインのアミノ酸配列の決定及び詳細な特徴付けのためのポリペプチド成分の精製も含み得る。
【０３３０】
ディスプレイライブラリーについて多様な形式が使用され得る。例は、ファージディスプレイを含む。ファージディスプレイにおいて、タンパク質成分を典型的には共有的にバクテリオファージコートタンパク質に結合させる。結合は、コートタンパク質に融合したタンパク質成分をコードする核酸の翻訳に由来する。結合は、可動性ペプチドリンカー、プロテアーゼ部位又は停止コドンの抑制の結果として取り込まれたアミノ酸を含む。ファージディスプレイは、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７；国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；国際公開第９１／１７２７１号パンフレット；国際公開第９２／２０７９１号パンフレット；国際公開第９２／１５６７９号パンフレット；国際公開第９３／０１２８８号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９２／０９６９０号パンフレット；国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４：１８２１８−３０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２：３７１−８及びＨｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）３４４−８に記載されている。タンパク質成分をディスプレイするバクテリオファージを、標準ファージ分取法、例えば増殖培地からのＰＥＧ沈降を使用して増殖及び採取できる。個々のディスプレイファージ選択後、選択タンパク質成分をコードする核酸を、増幅後、選択したファージで感染させた細胞又はファージ自体から単離できる。個々のコロニー又はプラークを採り、核酸を単離及び配列決定できる。
【０３３１】
他のディスプレイ形式は、細胞ベースのディスプレイ（例えば、国際公開第０３／０２９４５６号パンフレットを参照されたい）、タンパク質−核酸融合（例えば、米国特許第６，２０７，４４６号を参照されたい）、リボソームディスプレイ（例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２及びＨａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７−９２；Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：４０４−３０；並びにＳｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１（１−２）：１１９−３５を参照されたい）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペリプラズムディスプレイ（２００５  Ｎｏｖ  ２２；ＰＭＩＤ：１６３３７９５８）を含む。
【０３３２】
ある例において、ｓｃＦｖは、当技術分野で知られる方法により製造できる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。ＳｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域とＶＬ領域とを一緒に連結することにより産生できる。ｓｃＦｖ分子は、最適長及び／又はアミノ酸組成を有するリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短ポリペプチドリンカーを用いる場合、（例えば、５〜１０のアミノ酸）、鎖内折りたたみが阻止される。鎖内折りたたみは、２つの可変領域が一体となって機能的エピトープ結合部位を形成させるためにも必要である。リンカー方向及びサイズの例については、例えば、参照により本明細書に援用されるＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号明細書、同第２００５／０１７５６０６号明細書、同第２００７／００１４７９４号明細書及び国際公開第２００６／０２０２５８号パンフレット及び国際公開第２００７／０２４７１５号パンフレットを参照されたい。
【０３３３】
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域との間に少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれを超えるアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。一実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸グリシン及びセリンを含む。別の実施形態において、リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、１以上の正の整数である）などの一連のグリシン及びセリン反復を含む。一実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２３）又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号５４１）であり得る。リンカー長の変動は、活性を維持又は増強し、活性試験において優れた有効性を生じ得る。
【０３３４】
安定性及び突然変異
ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ分子（例えば、可溶性ｓｃＦｖ）の安定性は、従来の対照ｓｃＦｖ分子又は完全長抗体の生物物理学的特性（例えば、熱安定性）を基準として判定することができる。一実施形態において、ヒトｓｃＦｖは、記載されるアッセイにおいて対照結合分子（例えば、従来のｓｃＦｖ分子）と比べてセ氏約０．１、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０度、約１１度、約１２度、約１３度、約１４度、又は約１５度超高い熱安定性を有する。
【０３３５】
続いてＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの熱安定性の向上がＣＡＲＴ２０コンストラクト全体に付与され、ＣＡＲＴ２０コンストラクトの治療特性の向上につながる。ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの熱安定性は、従来抗体と比較したとき少なくとも約２℃又は３℃向上させることができる。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、従来抗体と比較したとき熱安定性が１℃向上している。別の実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、従来抗体と比較したとき熱安定性が２℃向上している。別の実施形態において、ｓｃＦｖは、従来抗体と比較したとき熱安定性が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５℃向上している。例えば、本明細書に開示されるｓｃＦｖ分子と完全長抗体との間で比較を行うことができる。熱安定性は、当該技術分野において公知の方法を用いて測定することができる。例えば、一実施形態では、Ｔｍを測定することができる。Ｔｍの測定方法及びタンパク質安定性を決定する他の方法は、以下に更に詳細に記載する。
【０３３６】
ｓｃＦｖにおける突然変異により、ｓｃＦｖの安定性が変化し、ｓｃＦｖ及びＣＡＲＴ２０コンストラクトの全体的な安定性が向上する。ネズミ科動物、ヒト化又はヒトｓｃＦｖ安定性は、Ｔｍ、変性温度及び凝集温度などの測定値を用いて決定される。
【０３３７】
一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、突然変異ｓｃＦｖがＣＡＲＴ２０コンストラクトに安定性の向上を付与するように少なくとも１つの突然変異を含む。別の実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、突然変異ｓｃＦｖがＣＡＲＴ２０コンストラクトに安定性の向上を付与するようにヒト化プロセスから生じた少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の突然変異を含む。
【０３３８】
タンパク質安定性の判定方法
抗原結合ドメインの安定性は、例えば、以下に記載する方法を用いて評価し得る。かかる方法は、複数の熱変性転移の決定を可能にするものであり、ここで、安定性が最小のドメインが初めに変性するか、又は協調的に変性する多ドメインユニット（例えば、単一の変性転移を呈する多ドメインタンパク質）の全体的な安定性閾値を制限するかのいずれかである。安定性が最小のドメインは、幾つもの更なる方法で同定することができる。突然変異誘発を実施して、どのドメインが全体的な安定性を制限するかを探索することができる。加えて、ＤＳＣ又は他の分光学的方法で安定性が最小のドメインが本質的に変性されることが公知の条件下において多ドメインタンパク質のプロテアーゼ耐性を実施することができる（Ｆｏｎｔａｎａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｆｏｌｄ．Ｄｅｓ．，２：Ｒ１７−２６；Ｄｉｍａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９３：６７２−６９２）。安定性が最小のドメインが同定されれば、そのドメイン（又はその一部分）をコードする配列が、こうした方法において試験配列として用いられ得る。
【０３３９】
ａ）熱安定性
組成物の熱安定性は、当該技術分野において公知の幾つもの非限定的な生物物理学的又は生物化学的技法を用いて分析し得る。特定の実施形態において、熱安定性は分析的分光法によって判定される。
【０３４０】
例示的な分析的分光方法は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）である。ＤＳＣは、ほとんどのタンパク質又はタンパク質ドメインの変性に伴って起こる熱吸収に感受性を有する熱量計を用いる（例えば、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：１６４８−５２，１９８８を参照されたい）。タンパク質の熱安定性を決定するためには、熱量計にタンパク質の試料を挿入し、Ｆａｂ又はｓｃＦｖが変性するまで温度を上昇させる。タンパク質が変性するときの温度が、全体的なタンパク質安定性の指標となる。
【０３４１】
別の例示的な分析的分光方法は、円偏光二色性（ＣＤ）分光法である。ＣＤ分光法は、組成物の光学活性を上昇する温度の関数として測定する。円偏光二色性（ＣＤ）分光法は、構造的非対称性に起因して生じる左回り偏光と右回り偏光との吸収の差を測定する。無秩序な又は変性した構造では、秩序立った又は折り畳まれた構造と全く異なったＣＤスペクトルとなる。ＣＤスペクトルは、温度上昇の変性効果に対するタンパク質の感受性を反映し、従ってタンパク質の熱安定性の指標となる（ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｓｍａ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７９（３）：２８１−９８，２０００を参照されたい）。
【０３４２】
熱安定性を測定する別の例示的な分析的分光方法は、蛍光発光分光法である（ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｓｍａ、前掲を参照されたい）。熱安定性を測定する更に別の例示的な分析的分光方法は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法である（例えば、ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｓｍａ、前掲を参照されたい）。
【０３４３】
組成物の熱安定性は生化学的に測定することができる。熱安定性を評価するための例示的な生化学的方法は、サーマルチャレンジアッセイである。「サーマルチャレンジアッセイ」では、組成物を設定時間にわたってある範囲の高温に供する。例えば、一実施形態では、試験ｓｃＦｖ分子又はｓｃＦｖ分子を含む分子を例えば１〜１．５時間にわたってある範囲の上昇温度に供する。次に関連性のある生化学アッセイによってタンパク質の活性をアッセイする。例えば、タンパク質が結合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ含有ポリペプチド）である場合、結合タンパク質の結合活性は機能的又は定量的ＥＬＩＳＡによって決定することができる。
【０３４４】
かかるアッセイは、ハイスループットフォーマット並びに実施例に開示される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びハイスループットスクリーニングを用いるもので行われ得る。当該技術分野において公知の方法を用いてＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ変異体のライブラリーを作成し得る。ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ発現を誘導し得、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖをサーマルチャレンジに供し得る。チャレンジを受けた試験試料を結合に関してアッセイし得、安定であるＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖをスケールアップして更に特徴付け得る。
【０３４５】
熱安定性は、上記の技法のいずれか（例えば、分析的分光技法）を用いて組成物の融解温度（Ｔｍ）を測定することにより判定される。融解温度は、組成物の分子の５０％が折り畳まれた状態となる熱転移曲線の中点における温度である（例えば、Ｄｉｍａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３９３：６７２−６９２を参照されたい）。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。一実施形態において、ＩｇＧのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。一実施形態において、多価抗体のＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。
【０３４６】
熱安定性は、分析的熱量測定技法（例えば、ＤＳＣ）を用いて組成物の比熱又は熱容量（Ｃｐ）を測定することによっても判定される。組成物の比熱は、１ｍｏｌの水の温度を１℃上げるために必要なエネルギー（例えば、ｋｃａｌ／ｍｏｌ単位）である。高いＣｐは、変性した又は不活性のタンパク質組成物の特徴である。その熱転移の前後の組成物の比熱を決定することにより、組成物の熱容量の変化（ΔＣｐ）を測定する。熱安定性は、変性のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）、変性のエンタルピー（ΔＨ）、又は変性のエントロピー（ΔＳ）を含め、熱力学的安定性の他のパラメータを測定又は決定することにより判定され得る。上記の生化学アッセイの１つ以上（例えば、サーマルチャレンジアッセイ）を用いて、組成物の５０％がその活性（例えば、結合活性）を保持しているときの温度（即ちＴＣ値）が決定される。
【０３４７】
加えて、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖに対する突然変異により、非突然変異ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖと比較してＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの熱安定性が変化する。ＣＡＲＴ２０コンストラクトにネズミ科動物、ヒト化又はヒトＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖを導入すると、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばネズミ科動物、ヒト化又はヒトｓｃＦｖによってＣＤ２０  ＣＡＲＴコンストラクト全体に熱安定性が付与される。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖに熱安定性を付与する単一の突然変異を含む。別の実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖに熱安定性を付与する複数の突然変異を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖにおける複数の突然変異は、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの熱安定性に対して相加効果を有する。
【０３４８】
ｂ）％凝集
組成物の安定性は、その凝集傾向を測定することにより決定され得る。凝集は、幾つもの非限定的な生物化学的又は生物物理学的技法によって測定することができる。例えば、組成物の凝集は、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて判定され得る。ＳＥＣは分子をサイズに基づき分離する。カラムにポリマーゲルの半固体ビーズを充填し、このビーズは、イオン及び小さい分子は内部に入り込めるが大きいものは入れないものである。カラムの上部にタンパク質組成物を加えると、コンパクトな折り畳みタンパク質（即ち非凝集タンパク質）が、大型のタンパク質凝集体に利用可能な多量の溶媒を通じて分散する。結果的に、大型の凝集物ほどカラム中をより速く進み、このようにして混合物をその成分に分離又は分画することができる。各画分をゲルから溶出することに伴い、それを個別に（例えば、光散乱によって）定量化することができる。従って、組成物の％凝集は、ゲルに加えたタンパク質の総濃度に対して画分の濃度を比較することにより決定し得る。安定組成物はカラムから本質的に単一の画分として溶出し、及び溶出プロファイル又はクロマトグラムに本質的に単一のピークとして現れる。
【０３４９】
ｃ）結合親和性
組成物の安定性は、その標的結合親和性を測定することにより評価し得る。結合親和性を決定するための多種多様な方法が当該技術分野において公知である。結合親和性を決定するための例示的方法は、表面プラズモン共鳴を利用する。表面プラズモン共鳴は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用したバイオセンサーマトリックス内におけるタンパク質濃度の変化の検出によるリアルタイム生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象である。更なる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｉ（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７を参照されたい。
【０３５０】
一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗原結合ドメインアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含み、抗原結合ドメインは、本明細書に記載のＣＤ２０抗体断片の所望の機能的特性を保持する。特定の一態様において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体断片を含む。更なる態様において、その抗体断片はｓｃＦｖを含む。
【０３５１】
種々の態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、一方又は両方の可変領域（例えば、ＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内及び／又は１つ以上のフレームワーク領域の、１つ以上のアミノ酸の改変により操作される。特定の一態様において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体断片を含む。更なる態様において、その抗体断片はｓｃＦｖを含む。
【０３５２】
本発明の抗体又は抗体断片が、アミノ酸配列が（例えば、野生型から）異なるように更に改変され得るが、所望の活性は改変されないことが当業者に理解される。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を生じる更なるヌクレオチド置換をタンパク質に行い得る。例えば、分子における非必須アミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換え得る。別の実施形態において、一連のアミノ酸を、側鎖ファミリーメンバーの順番及び／又は組成が異なる構造的に類似する一連のもので置き換えることができ、例えばアミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられた保存的置換をなし得る。
【０３５３】
塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。
【０３５４】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関連して、同一性パーセントは、同じである、２つ以上の配列を指す。２配列は、次の配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は手動アラインメント及び目視により、比較窓又は指定領域にわたり、最大対応を比較及びアラインしたとき、同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドを特定パーセント有する場合、「実質的に同一」である（特定領域又は特定されていないとき、配列全体にわたり、例えば６０％の同一性、任意選択により７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性）。任意選択により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（又は１０アミノ酸）長の領域又はより好ましくは１００〜５００又は１０００又はそれを超えるヌクレオチド（又は２０、５０、２００又はそれを超えるアミノ酸）長の領域にわたり、同一性が存在する。
【０３５５】
配列比較のために、典型的には１配列が対照配列としての役割を果たし、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験及び対照配列をコンピューターに入力し、必要であれば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用でき又は代替パラメータを指定できる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、対照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。比較のために配列をアラインメントする方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４のサーチのための類似法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）又は手動アラインメント及び目視（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）により実施できる。
【０３５６】
配列同一性及び配列類似性パーセントの決定に適するアルゴリズムの２つの例はＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公的に入手可能である。
【０３５７】
２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれている、Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７）アルゴリズムを使用しても決定できる。加えて、２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス及びギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６又は４及び長さ荷重１、２、３、４、５又は６を使用する、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムに取り込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを使用して決定できる。
【０３５８】
一態様において、本発明は、機能的に均等な分子を産生する、出発抗体又は断片（例えば、ｓｃＦｖ）アミノ酸配列の改変を企図する。例えば、例としてＣＡＲを構成するＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖのＶＨ又はＶＬを、ＣＤ２０結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの出発ＶＨ又はＶＬフレームワーク領域の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を保持するように改変できる。本発明は、機能的に均等な分子を産生するための、ＣＡＲ構築物全体の改変、例えばＣＡＲ構築物における種々のドメインの１つ以上のアミノ酸配列における改変を企図する。ＣＡＲ構築物は、出発ＣＡＲ構築物の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を保持するように改変され得る。
【０３５９】
二重特異性ＣＡＲ
ある実施形態において、多重特異性抗体分子は二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に対して特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、及び第２のエピトープに対して結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。ある実施形態において、第１のエピトープと第２のエピトープとは同じ抗原上、例えば同じタンパク質上（又は多量体タンパク質のサブユニット上）にある。ある実施形態において、第１のエピトープと第２のエピトープとは重複している。ある実施形態において、第１のエピトープと第２のエピトープとは重複していない。ある実施形態において、第１のエピトープと第２のエピトープとは異なる抗原上、例えば異なるタンパク質上（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット上）にある。ある実施形態において、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列とを含む。ある実施形態において、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するハーフ抗体と、第２のエピトープに対して結合特異性を有するハーフ抗体とを含む。ある実施形態において、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するハーフ抗体、又はその断片と、第２のエピトープに対して結合特異性を有するハーフ抗体、又はその断片とを含む。ある実施形態において、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するｓｃＦｖ、又はその断片と、第２のエピトープに対して結合特異性を有するｓｃＦｖ、又はその断片とを含む。ある実施形態において、第１のエピトープはＣＤ１９に位置し、第２のエピトープはＣＤ２０、Ｃ２２、又はＲＯＲ１に位置する。
【０３６０】
特定の実施形態において、抗体分子は、多重特異性（例えば、二重特異性又は三重特異性）抗体分子である。二重特異性又はヘテロ二量体抗体分子の作成プロトコルは当該技術分野において公知であり；限定はされないが、例えば、米国特許第５７３１１６８号明細書に例えば記載される「ノブインホール」手法；国際公開第０９／０８９００４号パンフレット、国際公開第０６／１０６９０５号パンフレット及び国際公開第２０１０／１２９３０４号パンフレットに例えば記載されるとおりの静電ステアリングＦｃ対合；国際公開第０７／１１０２０５号パンフレットに例えば記載されるとおりの鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ヘテロ二量体形成；国際公開第０８／１１９３５３号パンフレット、国際公開第２０１１／１３１７４６号パンフレット、及び国際公開第２０１３／０６０８６７号パンフレットに例えば記載されるとおりのＦａｂアーム交換；米国特許第４４３３０５９号明細書に例えば記載されるとおりの、例えばアミン反応基及びスルフヒドリル反応基を有するヘテロ二官能性試薬を使用した抗体架橋結合による二重特異性構造の作成による、二重抗体コンジュゲート；米国特許第４４４４８７８号明細書に例えば記載されるとおりの、２つの重鎖間のジスルフィド結合の酸化還元サイクルを通じて異なる抗体からのハーフ抗体（重鎖−軽鎖対又はＦａｂ）を組み換えることにより作成される二重特異性抗体決定基；米国特許第５２７３７４３号明細書に例えば記載されるとおりの、三機能性抗体、例えばスルフヒドリル反応基によって架橋された３つのＦａｂ’断片；米国特許第５５３４２５４号明細書に例えば記載されるとおりの、生合成結合タンパク質、例えばＣ末端テールを介して好ましくはジスルフィド又はアミン反応性化学架橋結合によって架橋されたｓｃＦｖの対；米国特許第５５８２９９６号明細書に例えば記載されるとおりの、二機能性抗体、例えば定常ドメインに置き換わったロイシンジッパー（例えば、ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎ）によって二量化された異なる結合特異性を有するＦａｂ断片；米国特許第５５９１８２８号明細書に例えば記載されるとおりの、二重特異性及びオリゴ特異性一価及びオリゴ価受容体、例えば典型的には関連する軽鎖を伴う一方の抗体のＣＨ１領域と他方の抗体のＶＨ領域との間でポリペプチドスペーサーによって連結された２つの抗体（２つのＦａｂ断片）のＶＨ−ＣＨ１領域；米国特許第５６３５６０２号明細書に例えば記載されるとおりの、二重特異性ＤＮＡ−抗体コンジュゲート、例えばＤＮＡの二本鎖断片による抗体又はＦａｂ断片の架橋結合；米国特許第５６３７４８１号明細書に例えば記載されるとおりの、二重特異性融合タンパク質、例えば間に親水性ヘリカルペプチドリンカーを有する２つのｓｃＦｖ及び完全な定常領域を含む発現コンストラクト；米国特許第５８３７２４２号明細書に例えば記載されるとおりの、多価及び多重特異性結合タンパク質、例えば概してダイアボディと称される、Ｉｇ重鎖可変領域の結合領域を有する第１のドメインと、Ｉｇ軽鎖可変領域の結合領域を有する第２のドメインとを有するポリペプチドの二量体（二重特異性、三重特異性、又は四重特異性分子を作り出す高次構造も包含される；米国特許第５８３７８２１号明細書に例えば記載されるとおりの、二量化して二重特異性／多価分子を形成することができる、ペプチドスペーサーで抗体ヒンジ領域及びＣＨ３領域に更に結合した、連結されたＶＬ鎖及びＶＨ鎖を有するミニボディコンストラクト；二量体を形成して二重特異性ダイアボディを形成することができる、いずれかの向きの、短いペプチドリンカー（例えば、５又は１０アミノ酸）で、又は全くリンカーなしに連結されたＶＨ及びＶＬドメイン；米国特許第５８４４０９４号明細書に例えば記載されるとおりの、三量体及び四量体；米国特許第５８６４０１９号明細書に例えば記載されるとおりの、ＶＬドメインと更に会合して一連のＦＶ（又はｓｃＦｖ）を形成するＣ末端で架橋基とペプチド結合によってつながったＶＨドメイン（又はファミリーメンバーのＶＬドメイン）のストリング；及び米国特許第５８６９６２０号明細書に例えば記載されるとおりの、ペプチドリンカーによって連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方を有する単鎖結合ポリペプチドが非共有結合性又は化学的架橋結合によって多価構造に組み合わされて、例えばｓｃＦＶ型又はダイアボディ型の両方のフォーマットを使用したホモ二価、ヘテロ二価、三価、及び四価構造を形成するものが挙げられる。更なる例示的多重特異性及び二重特異性分子並びにその作製方法については、例えば、米国特許第５９１０５７３号明細書、米国特許第５９３２４４８号明細書、米国特許第５９５９０８３号明細書、米国特許第５９８９８３０号明細書、米国特許第６００５０７９号明細書、米国特許第６２３９２５９号明細書、米国特許第６２９４３５３号明細書、米国特許第６３３３３９６号明細書、米国特許第６４７６１９８号明細書、米国特許第６５１１６６３号明細書、米国特許第６６７０４５３号明細書、米国特許第６７４３８９６号明細書、米国特許第６８０９１８５号明細書、米国特許第６８３３４４１号明細書、米国特許第７１２９３３０号明細書、米国特許第７１８３０７６号明細書、米国特許第７５２１０５６号明細書、米国特許第７５２７７８７号明細書、米国特許第７５３４８６６号明細書、米国特許第７６１２１８１号明細書、米国特許出願公開第２００２００４５８７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００２０７６４０６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００２１０３３４５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００３２０７３４６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００３２１１０７８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００４２１９６４３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００４２２０３８８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００４２４２８４７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５００３４０３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５００４３５２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５０６９５５２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５０７９１７０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５１００５４３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５１３６０４９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５１３６０５１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５１６３７８２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５２６６４２５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６０８３７４７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６１２０９６０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６２０４４９３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６２６３３６７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７００４９０９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７０８７３８１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７１２８１５０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７１４１０４９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７１５４９０１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７２７４９８５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８０５０３７０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８０６９８２０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８１５２６４５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８１７１８５５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８２４１８８４Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８２５４５１２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００８２６０７３８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１３０１０６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１４８９０５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１５５２７５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１６２３５９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１６２３６０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１７５８５１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９１７５８６７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９２３２８１１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９２３４１０５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９２６３３９２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９２７４６４９Ａ１号明細書、欧州特許出願公開第３４６０８７Ａ２号明細書、国際公開第０００６６０５Ａ２号パンフレット、国際公開第０２０７２６３５Ａ２号パンフレット、国際公開第０４０８１０５１Ａ１号パンフレット、国際公開第０６０２０２５８Ａ２号パンフレット、国際公開第２００７０４４８８７Ａ２号パンフレット、国際公開第２００７０９５３３８Ａ２号パンフレット、国際公開第２００７１３７７６０Ａ２号パンフレット、国際公開第２００８１１９３５３Ａ１号パンフレット、国際公開第２００９０２１７５４Ａ２号パンフレット、国際公開第２００９０６８６３０Ａ１号パンフレット、国際公開第９１０３４９３Ａ１号パンフレット、国際公開第９３２３５３７Ａ１号パンフレット、国際公開第９４０９１３１Ａ１号パンフレット、国際公開第９４１２６２５Ａ２号パンフレット、国際公開第９５０９９１７Ａ１号パンフレット、国際公開第９６３７６２１Ａ２号パンフレット、国際公開第９９６４４６０Ａ１号パンフレットが参照される。上記で参照した出願の内容は、全体として参照により本明細書に援用される。
【０３６１】
例示的多重特異性分子
一部の実施形態において、抗体分子は、１、２、又はそれを超える結合特異性、例えば第１の抗原、例えばＢ細胞エピトープに対する第１の結合特異性と、同じ又は異なる抗原、例えばＢ細胞エピトープに対する第２の結合特異性とを含む多重特異性、例えば二重特異性抗体分子である。
【０３６２】
一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、抗体分子、例えば抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）である。二重特異性抗体分子の各抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）の範囲内で、ＶＨはＶＬの上流又は下流にあり得る。一部の実施形態において、上流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように配置され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。
【０３６３】
一部の実施形態において、上流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように配置され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。
【０３６４】
一部の実施形態において、上流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように配置され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。
【０３６５】
一部の実施形態において、上流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように配置され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。
【０３６６】
前記構成のいずれにおいても、任意選択により、２つの抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）の間、例えばコンストラクトがＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置される場合にＶＬ１とＶＬ２との間；コンストラクトがＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置される場合にＶＨ１とＶＨ２との間；コンストラクトがＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置される場合にＶＨ１とＶＬ２との間；又はコンストラクトがＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置される場合にＶＬ１とＶＨ２との間にリンカーが置かれる。一般に、２つの抗体断片又は抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの間のリンカーは、２つのｓｃＦｖのドメイン間での誤対合を回避するのに十分な長さでなければならない。リンカーは、本明細書に記載されるとおりのリンカーであり得る。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含み、例えばそれからなる。
【０３６７】
前記構成のいずれにおいても、任意選択により、リンカーは第１の抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に置かれる。任意選択により、リンカーは第２の抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に置かれる。複数のリンカーを有するコンストラクトにおいて、リンカーの任意の２つ以上は同じであるか又は異なり得る。従って、一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、ＶＬ、ＶＨ、及び任意選択により１つ以上のリンカーを本明細書に記載されるとおりの配置で含む。
【０３６８】
一部の実施形態において、各抗体分子、例えば各抗原結合ドメイン（例えば、各ｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。他の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【０３６９】
特定の実施形態において、抗体分子は、第１のＢ細胞エピトープに対する第１の結合特異性と、同じ又は異なるＢ細胞抗原に対する第２の結合特異性とを有する二重特異性抗体分子である。例えば、一部の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ２０に対する第１の結合特異性と、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａの１つ以上に対する第２の結合特異性とを有する。一部の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ１９に対する第１の結合特異性と、ＣＤ２０に対する第２の結合特異性とを有する。一部の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ１９に対する第１の結合特異性と、ＣＤ２２に対する第２の結合特異性とを有する。
【０３７０】
一実施形態において、抗体分子は、ＣＤ１９に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性を有する二重特異性抗体分子である。一実施形態において、結合特異性は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。一実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＴＬ０１９  ｓｃＦｖ（配列番号７６５）を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばヒト化ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、例えばヒト化ＣＡＲ２を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【０３７１】
別の実施形態において、ＣＤ１９に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。一実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＴＬ０１９  ｓｃＦｖ（配列番号７６５）を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばヒト化ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、例えばヒト化ＣＡＲ２を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【０３７２】
別の実施形態において、ＣＤ１９に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。一実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＴＬ０１９  ｓｃＦｖ（配列番号７６５）を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばヒト化ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、例えばヒト化ＣＡＲ２を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【０３７３】
別の実施形態において、ＣＤ１９に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。一実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＴＬ０１９  ｓｃＦｖ（配列番号７６５）を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９結合特異性は、表１１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばヒト化ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、例えばヒト化ＣＡＲ２を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ１９に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【０３７４】
別の実施形態において、抗体分子は、ＣＤ２０に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性を有する二重特異性抗体分子である。一実施形態において、結合特異性は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２０結合特異性は、表１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣ３Ｈ２  ｓｃＦｖ又はＣ５Ｈ１  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【０３７５】
別の実施形態において、ＣＤ２０に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２０結合特異性は、表１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣ３Ｈ２  ｓｃＦｖ又はＣ５Ｈ１  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【０３７６】
別の実施形態において、ＣＤ２０に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、表１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣ３Ｈ２  ｓｃＦｖ又はＣ５Ｈ１  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【０３７７】
別の実施形態において、ＣＤ２０に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、表１に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣ３Ｈ２  ｓｃＦｖ又はＣ５Ｈ１  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２０に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
【０３７８】
別の実施形態において、抗体分子は、ＣＤ２２に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性を有する二重特異性抗体分子である。一実施形態において、結合特異性は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、表６に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＤ２２−６５又はＣＤ２２−６５ＫＤ  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖにあるように、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５  ｓｃＦｖにあるように、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖにあるように、リンカーなしに結合される。
【０３７９】
別の実施形態において、ＣＤ２２に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、表６に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＤ２２−６５又はＣＤ２２−６５ＫＤ  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖにあるように、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５  ｓｃＦｖにあるように、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖにあるように、リンカーなしに結合される。
【０３８０】
別の実施形態において、ＣＤ２２に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、表６に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＤ２２−６５又はＣＤ２２−６５ＫＤ  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖにあるように、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５  ｓｃＦｖにあるように、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖにあるように、リンカーなしに結合される。
【０３８１】
別の実施形態において、ＣＤ２２に対する結合特異性、例えば第１及び／又は第２の結合特異性は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように構成され、下流抗体又は抗体断片又は抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２を有する。一実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、表６に示されるとおりのＶＨ及びＶＬ、例えばＣＤ２２−６５又はＣＤ２２−６５ＫＤ  ｓｃＦｖからのＶＨ及びＶＬを含む。一部の実施形態において、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２の結合特異性（例えば、ＣＤ２２に対する第１及び／又は第２のｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖにあるように、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５  ｓｃＦｖにあるように、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖにあるように、リンカーなしに結合される。
【０３８２】
一部の実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ１９に対する第１の結合特異性、例えば本明細書に記載されるＣＤ１９に対する結合特異性のいずれかと、ＣＤ２２に対する第２の結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２２に対する結合特異性のいずれかとを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含み、例えばそれからなる。
【０３８３】
一実施形態において、二重特異性抗体分子はＣＤ１９に対する第１の結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２２に対する第２の結合特異性、例えばＣＤ２２に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含み、例えばそれからなる。
【０３８４】
一実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ２２に対する第１の結合特異性、例えばＣＤ２２に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性と、ＣＤ１９に対する第２の結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含み、例えばそれからなる。
【０３８５】
例えば、本明細書に記載されるとおり、２つ以上の抗体分子を連結して、多重特異性抗体分子、例えば二重、三重、又はそれを超える抗体分子を提供することができる。
【０３８６】
一部の実施形態において、前記多重特異性、例えば二重特異性抗体分子のいずれかが、本明細書に記載されるとおりのＣＡＲ分子に存在する。実施形態において、ＣＡＲ分子は、例えば、本明細書に記載されるとおりの第１及び第２の結合特異性（例えば、本明細書に記載されるとおりの２つの抗体分子、例えば２つのｓｃＦｖ）を含む二重特異性ＣＡＲを含む。一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲは２つの抗体分子を含み、ここで、第１の結合特異性、例えば第１の抗体分子（例えば、第１の抗原結合ドメイン、例えば第１のｓｃＦｖ）は膜貫通ドメインに一層近く、本明細書では近位抗体分子（例えば、近位抗原結合ドメイン）とも称され、第２の結合特異性、例えば第２の抗体分子（例えば、第２の抗原結合ドメイン、例えば第２のｓｃＦｖ）は膜から離れており、本明細書では遠位抗体分子（例えば、遠位抗原結合ドメイン）とも称される。従って、Ｎ末端からＣ末端に、ＣＡＲ分子は、任意選択によりリンカーを介して膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインまで、例えば本明細書に記載されるとおりの遠位結合特異性、例えば遠位抗体分子（例えば、遠位抗原結合ドメイン、例えば遠位ｓｃＦＶ又はｓｃＦｖ２）、任意選択によりリンカー、続いて近位結合特異性、例えば近位抗体分子（例えば、近位抗原結合ドメイン、例えば近位ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ１）を含む。二重特異性ＣＡＲ構成の概略図は図２７に示す。
【０３８７】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、第１及び第２の結合特異性を含む二重特異性ＣＡＲを含む。一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、Ｂ細胞エピトープに対する第１の結合特異性と、同じ又は異なるＢ細胞抗原に対する第２の結合特異性とを含む。例えば、一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲ分子は、ＣＤ２０に対する第１の結合特異性と、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａの１つ以上に対する第２の結合特異性とを有する。一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する第１の結合特異性と、ＣＤ２０に対する第２の結合特異性とを有する。一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する第１の結合特異性と、ＣＤ２２に対する第２の結合特異性とを有する。一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲ分子は、ＣＤ２２に対する第１の結合特異性と、ＣＤ２０に対する第２の結合特異性とを有する。
【０３８８】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する近位又は遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ１９結合特異性を含む。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する近位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ１９結合特異性と、ＣＤ２０に対する遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０結合特異性とを含む。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する近位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ１９結合特異性と、ＣＤ２２に対する遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２２結合特異性とを含む。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２０に対する近位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０結合特異性と、ＣＤ１９に対する遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ１９結合特異性とを含む。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２２に対する近位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２２結合特異性と、ＣＤ１９に対する遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ１９結合特異性とを含む。
【０３８９】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２２に対する近位又は遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２２結合特異性を含む。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２２に対する近位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２２結合特異性と、ＣＤ２０に対する遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０結合特異性とを含む。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２０に対する近位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０結合特異性と、ＣＤ２２に対する遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２２結合特異性とを含む。
【０３９０】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２２に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ２２に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含み、例えばそれからなる。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性、任意選択により、Ｇｌｙ４−Ｓｅｒリンカー又はＬＡＥＡＡＡＫリンカーを含む。実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、ＣＤ２２  ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖにあるように、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５  ｓｃＦｖにあるように、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖにあるように、リンカーなしに結合される。
【０３９１】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２２に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ２２に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含み、例えばそれからなる。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性、任意選択により、Ｇｌｙ４−Ｓｅｒリンカー又はＬＡＥＡＡＡＫリンカーを含む。実施形態において、ＣＤ２２結合特異性は、ＣＤ２２  ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓ  ｓｃＦｖにあるように、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、ＣＤ２２−６５  ｓｃＦｖにあるように、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、例えば、ＣＤ２２−６５ｓｓ  ｓｃＦｖにあるように、リンカーなしに結合される。
【０３９２】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２０に対する近位又は遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０結合特異性を含む。
【０３９３】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２０に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ２０に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含み、例えばそれからなる。
【０３９４】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２０に対する近位又は遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０結合特異性を含む。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ１９に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２０に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ２０に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含む。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫからなる。
【０３９５】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２２に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ２２に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２０に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ２０に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含み、例えばそれからなる。
【０３９６】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２０に対する近位又は遠位結合特異性、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０結合特異性を含む。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２２に対する膜近位結合特異性、例えばＣＤ２２に対するＶＬ１−ＶＨ１結合特異性と、ＣＤ２０に対する膜遠位結合特異性、例えばＣＤ２０に対するＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＬ１結合特異性とを含む。一実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、連続ポリペプチド鎖状、例えば単鎖状である。一部の実施形態において、第１及び第２の結合特異性は、任意選択により、本明細書に記載されるとおりのリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４−Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝３である）（配列番号８４１）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号２３）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫを含む。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫからなる。
【０３９７】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子はＮ末端にヒト配列リーダー、例えばヒトＣＤ８α配列を更に含む。
【０３９８】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１つ以上の更なるアミノ酸、例えば膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域と関係する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜最大１５アミノ酸）及び／又は膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と関係する１つ以上の更なるアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜最大１５アミノ酸）を含み得る。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインの１つに関連するものであり、例えば一実施形態において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン又はヒンジドメインが由来するのと同じタンパク質からのものであり得る。別の態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの任意の他のドメインが由来するのと同じタンパク質に由来しない。ある例において、膜貫通ドメインは、このようなドメインが、同一又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合するのを避けるように、例えば受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように選択され又はアミノ酸置換による改変ができる。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面上の別のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞に存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように改変又は置換され得る。
【０３９９】
膜貫通ドメインは、天然由来又は組み換え源由来であり得る。源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合又は膜貫通タンパク質由来であり得る。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合したときは常に細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β、又はζ鎖、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８α、ＣＤ８β）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含み得る。一実施形態において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐの少なくとも膜貫通領域を含み得る。
【０４００】
ある例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えばヒトタンパク質からのヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えばＣＡＲの抗原結合ドメインに結合できる。例えば、一実施形態において、ヒンジはヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＧＳリンカー（例えば、本明細書に記載されるＧＳリンカー）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、又はＣＤ８ａヒンジであり得る。一実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号７９９のアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）。一態様において、膜貫通ドメインは、配列番号８０１の膜貫通ドメインを含む（例えば、それからなる）。
【０４０１】
一態様において、ヒンジ又はスペーサーはＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、一実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、アミノ酸配列、配列番号８１４のヒンジを含む。一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号８１５の核酸配列によってコードされるヒンジを含む。
【０４０２】
一態様において、ヒンジ又はスペーサーはＩｇＤヒンジを含む。例えば、一実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、アミノ酸配列、配列番号８１６のヒンジを含む。一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、（配列番号８１７）の核酸配列によってコードされるヒンジを含む。
【０４０３】
一態様において、膜貫通ドメインは組み換えであり得、その場合、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。一態様において、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットを、組み換え膜貫通ドメインの各末端に見ることができる。
【０４０４】
任意選択により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴ又はポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域の間に結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは特に適当なリンカーを提供する。例えば、一態様において、リンカーは、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む（配列番号８３４）。
【０４０５】
一態様において、ヒンジ又はスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
【０４０６】
細胞質ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメイン又は領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも１つの活性化ができる。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化した機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る。従って用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、且つ細胞が特殊化した機能を果たすように仕向けるタンパク質の一部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合、必ずしも鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケート部分が使用される限りにおいて、それがエフェクター機能シグナルを伝達するならば、インタクトな鎖の代わりにかかるトランケート部分が使用され得る。従って用語の細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意のトランケート部分を含むことが意味される。
【０４０７】
本発明のＣＡＲにおいて使用する細胞内シグナル伝達ドメインの例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して機能する共受容体の細胞質配列並びにこれらのあらゆる誘導体又はバリアント及び同じ機能的能力を有するあらゆる組み換え配列を含む。
【０４０８】
ＴＣＲ単独により産生されたシグナルはＴ細胞の完全活性化には不十分であり、二次及び／又は共刺激性シグナルも必要であることが知られている。そのため、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列が介在するということができる：ＴＣＲ（初代細胞内シグナル伝達ドメイン）を介して抗原依存性一次活性化を開始するもの及び二次又は共刺激性シグナル（二次細胞質ドメイン、例えば共刺激ドメイン）を提供するように抗原非依存的方法で作用するもの。
【０４０９】
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性方向又は阻害性方向のいずれかで制御する。刺激性方向で作用する初代細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
【０４１０】
本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２のものを含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０４１１】
一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭドメインと比較して改変された（例えば、増加又は減少した）活性を有する、修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば変異ＩＴＡＭドメインを含む。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば最適化及び／又は切断されたＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれを超えるＩＴＡＭモチーフを含む。
【０４１２】
本発明で特に有用である初代細胞内シグナル伝達ドメインを含む分子の更なる例は、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２及びＣＤ３２のものを含む。
【０４１３】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメインをそれ自体で含むことができ又は本発明のＣＡＲに関連して、有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせ得る。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζ鎖部分及び共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激性シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激性分子は、リンパ球の抗原に対する効率的応答に必要である、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。かかる分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）（ＣＤ１１ａ及びＣＤ１８）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲＴ細胞の拡大、エフェクター機能、及び生存を増強することが実証されており、インビボではヒトＴ細胞持続性及び抗腫瘍活性を増大させる（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（３）：６９６−７０６）。かかる共刺激分子の更なる例としては、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ１６ａ、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、及びＰＡＧ／Ｃｂｐが挙げられる。
【０４１４】
本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、互いに無作為に又は特定の順序で連結し得る。任意選択により、例えば、２〜１０アミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸）長の短オリゴ又はポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間に結合を形成し得る。一実施形態において、グリシン−セリンダブレットを適当なリンカーとして使用できる。一実施形態において、単一アミノ酸、例えばアラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用できる。
【０４１５】
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれを超える共刺激性シグナル伝達ドメインを含むように設計される。一実施形態において、２つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれを超える共刺激性シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば本明細書に記載のリンカー分子により分けられる。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、リンカー分子はグリシン残基である。一実施形態において、リンカー分子はアラニン残基である。
【０４１６】
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号８０３のシグナル伝達ドメインである。一態様において、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインは、配列番号８０５のシグナル伝達ドメインである。
【０４１７】
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、配列番号８１８のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、配列番号８１９の核酸配列によってコードされる。
【０４１８】
一態様において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＡＲ、例えば同じ標的（ＣＤ２０）又は異なる標的（例えば、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ３３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、及びＣＤ７９ａ）に対する、例えば第２のＣＡＲの異なる抗原結合ドメインを更に含み得る。一実施形態において、第２のＣＡＲは、例えば、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ３３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、及びＣＤ７９ａなど、急性骨髄性白血病細胞に発現される標的に対する抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、第１の抗原を標的とし、共刺激性シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ、及び第２の異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。理論に拘束されることを望まないが、第１のＣＡＲへの共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、又はＯＸ−４０及び一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζの第２のＣＡＲへの配置は、両標的が発現される細胞に対してＣＡＲ活性を制限する。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ２０結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激性ドメインを含む第１のＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ２０以外の抗原（例えば、ＡＭＬ細胞に発現される抗原、例えばＣＤ２２、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ３３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａ）を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ２０結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ２０以外の抗原（例えば、ＡＭＬ細胞に発現される抗原、例えばＣＤ２２、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａ）を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激性シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。
【０４１９】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載のＣＤ２０  ＣＡＲ及び阻害性ＣＡＲを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えばＣＤ２０を発現する正常細胞で見られるが、癌細胞で見られない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び阻害分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、又はＴＧＦβの細胞内ドメインであり得る。
【０４２０】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞が２つ以上の異なるＣＡＲを含むとき、種々のＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものである。例えば、第１及び第２のＣＡＲを発現する細胞は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えばＶＨＨである第２のＣＡＲの抗原結合ドメインと結合を形成しない、例えば断片、例えばｓｃＦｖとしての第１のＣＡＲの抗原結合ドメインを有し得る。
【０４２１】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子を含み、相補的決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠く結合分子、慣用の４鎖抗体由来の単一ドメイン、操作されたドメイン及び抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドを含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は、当技術分野の又は将来的な単一ドメイン分子であり得る。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ及びウシを含むが、これらに限定されない任意の種由来であり得る。この用語は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）及びサメ以外の種由来の天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
【０４２２】
一態様において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清に見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来であるような、魚類で見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲ（「ＩｇＮＡＲ」）の可変領域由来の単一ドメイン分子を製造する方法は、国際公開第０３／０１４１６１号パンフレット及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２９０１−２９０９に記載されている。
【０４２３】
別の態様によると、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えば、国際公開第９４０４６７８号パンフレット及びＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８に記載されている。明確化するために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来のこの可変ドメインは、ここでは、４鎖免疫グロブリンの慣用のＶＨと区別するためにＶＨＨ又はナノボディとして知られている。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコ由来であり得る。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）以外の他の種は、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生し得、このようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。
【０４２４】
ＳＤＡＢ分子は、組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化及び／又はインビトロ産生され得る（例えば、ファージディスプレイにより選択）。
【０４２５】
受容体の抗原結合ドメイン間を相互作用する抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞は、例えば、抗原結合ドメインの１つ以上がその同族抗原に結合することを阻止するため、望ましくない可能性があることも判明した。従って、本明細書に開示されるのは、このような相互作用を最小化する、抗原結合ドメインを含む第１及び第２の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を有する細胞である。また、本明細書に開示されるのは、このような相互作用を最小化する抗原結合ドメインを含む第１及び第２の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸並びにこのような細胞及び核酸を製造及び使用する方法である。一実施形態において、前記第１及び第２の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の抗原結合ドメインの一方は、ｓｃＦｖを含み、他方は、単一ＶＨドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。
【０４２６】
一実施形態において、本発明は、第１及び第２のＣＡＲを含み、ここで、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽ドメイン及び可変重ドメインを含まない。一実施形態において、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、他方は、ｓｃＦｖではない。一実施形態において、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。一実施形態において、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。一実施形態において、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
【０４２７】
一実施形態において、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、単一ＶＨドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。一実施形態において、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、ナノボディを含む。一実施形態において、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
【０４２８】
一実施形態において、細胞の表面上に存在するとき、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、前記第２のＣＡＲの存在により実質的に低減されない。一実施形態において、前記第２のＣＡＲの存在下の前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、前記第２のＣＡＲの非存在下の前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。
【０４２９】
一実施形態において、細胞の表面上に存在するとき、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より少なく互いに結合する。一実施形態において、前記第１のＣＡＲ及び前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％少なく互いに結合する。
【０４３０】
別の態様において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、別の薬剤、例えばＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を更に発現できる。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えばＰＤ１は、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。抑制性分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦβが挙げられる。一実施形態において、抑制性分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第２のポリペプチド、例えば本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインに関連している、第１のポリペプチド、例えば抑制性分子を含む。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４又はＴＧＦβなどの抑制性分子の第１のポリペプチド、又はこれらのいずれかの断片（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部分）と、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン（例えば、例えば本明細書に記載されるとおりの４１ＢＢ、ＣＤ２７又はＣＤ２８）及び／又は一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）を含む）である第２のポリペプチドとを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ１又はその断片（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部分）の第１のポリペプチドと、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び／又は本明細書に記載されるＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）の第２のポリペプチドとを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、及びＢＴＬＡも含まれるＣＤ２８受容体ファミリーの抑制性メンバーである。ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞及び骨髄性細胞に発現する（Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：７６５−７５）。ＰＤ１の２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１への結合時にＴ細胞活性化を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａ．２０００  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４−４３）。ＰＤ−Ｌ１はヒト癌に豊富にある（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８１：２８１−７；Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５４：３０７−３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５０９４）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との局所的相互作用の阻害によって逆転させることができる。
【０４３１】
一実施形態において、薬剤は抑制性分子、例えばプログラム死１（ＰＤ１）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、４１ＢＢ及びＣＤ３ζなどの膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに融合し得る（本明細書ではＰＤ１  ＣＡＲとも称される）。一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、本明細書に記載されるＣＤ２０  ＣＡＲとの組み合わせで使用すると、Ｔ細胞の持続性を改善する。一実施形態において、ＣＡＲは、配列番号８２０に係るＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＣＡＲである。一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは配列番号８２０のアミノ酸配列を含む。
【０４３２】
一実施形態において、薬剤は、ＰＤ１  ＣＡＲ、例えば本明細書に記載されるＰＤ１  ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲの核酸配列は配列番号８２１である。
【０４３３】
別の態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第１の細胞と、異なるＣＤ２０結合ドメイン、例えば第１の細胞が発現するＣＡＲのＣＤ２０結合ドメインと異なる本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第２の細胞とを含むことができる。別の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣＤ２０結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ２０以外の標的（例えば、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＬＬ−１、ＣＤ１２３、ＦＬＴ３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａ）に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第２の細胞とを含むことができる。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第１の細胞と、二次シグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第２の細胞とを含む。
【０４３４】
別の態様において、本発明は、集団中の少なくとも１つの細胞が、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第２の細胞が別の薬剤、例えばＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、薬剤は、抑制性分子を阻害する薬剤であり得る。例えば、抑制性分子は、一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下させ得る。抑制性分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦβが挙げられる。一実施形態において、抑制性分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第２のポリペプチド、例えば本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインに関連している、第１のポリペプチド、例えば抑制性分子を含む。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４又はＴＧＦβなどの抑制性分子の第１のポリペプチド、又はこれらのいずれかの断片（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部分）と、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン（例えば、例えば本明細書に記載されるとおりの４１ＢＢ、ＣＤ２７又はＣＤ２８）及び／又は一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）を含む）である第２のポリペプチドとを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ１又はその断片（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部分）の第１のポリペプチドと、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び／又は本明細書に記載されるＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）の第２のポリペプチドとを含む。
【０４３５】
一態様において、本発明は、別の薬剤、例えば本明細書に記載のキナーゼ阻害剤などのキナーゼ阻害剤と組み合わせて、ＣＡＲ発現細胞の集団、例えばＣＡＲ発現細胞、例えば種々のＣＡＲを発現する細胞の混合物を投与することを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、集団内の少なくとも１つの細胞が本明細書に記載のような抗癌関連抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第２の細胞が別の薬剤、例えばＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する細胞の集団を別の薬剤、例えば本明細書に記載のキナーゼ阻害剤などのキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。
【０４３６】
調節可能なキメラ抗原受容体
一部の実施形態において、ＣＡＲ療法の安全性及び有効性を最適化するには、ＣＡＲ活性を制御することのできる調節可能なＣＡＲ（ＲＣＡＲ）が望ましい。ＣＡＲ活性を調節することのできる方法は多くある。例えば、二量化ドメインに融合したカスパーゼを例えば使用した誘導性アポトーシス（例えば、Ｄｉ  Ｓｔａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｇｎｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１１  Ｎｏｖ．３；３６５（１８）：１６７３−１６８３を参照されたい）を本発明のＣＡＲ療法における安全スイッチとして用いることができる。一実施形態において、本発明のＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は誘導性アポトーシススイッチを更に含み、ここで、ヒトカスパーゼ（例えば、カスパーゼ９）又は改変バージョンが、条件的二量化を可能にするヒトＦＫＢタンパク質の改変と融合されている。ラパログ（例えば、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７）などの小分子の存在下では、誘導性カスパーゼ（例えば、カスパーゼ９）が活性化され、本発明のＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の急速なアポトーシス及び死滅につながる。カスパーゼベースの誘導性アポトーシススイッチの例（又はかかるスイッチの１つ以上の態様）は、例えば、米国特許出願公開第２００４０４００４７号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２８６９８０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２５５３６０号明細書；国際公開第１９９７０３１８９９号パンフレット；国際公開第２０１４１５１９６０号パンフレット；国際公開第２０１４１６４３４８号パンフレット；国際公開第２０１４１９７６３８号パンフレット；国際公開第２０１４１９７６３８号パンフレット（これらは、全て本明細書において参照によって援用される）に記載されている。
【０４３７】
一態様において、ＲＣＡＲは、本明細書に記載の標準的ＣＡＲの要素、例えば抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインが別々のポリペプチド又はメンバーに配置された、一連の典型的には最も単純な実施形態において２つのポリペプチドを含む。一部の実施形態において、一連のポリペプチドは、二量体化分子の存在下で互いにポリペプチドを結合できる、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる二量体化スイッチを含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、例えば、国際公開第２０１４１２７２６１号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの二量化スイッチを利用する。
【０４３８】
一態様において、ＲＣＡＲは、２つポリペプチド又はメンバーを含む：１）例えば、本明細書に記載の初代細胞内シグナル伝達ドメイン及び第１のスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン；２）例えば、本明細書に記載のようなＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメイン及び第２のスイッチドメインを含む抗原結合メンバー。任意選択により、ＲＣＡＲは、本明細書に記載の膜貫通ドメインを含む。一実施形態において、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー上、抗原結合メンバー上又は両方の上に配置できる。（特に断らない限り、ＲＣＡＲのメンバー又は要素が本明細書に記載されるものであるとき、順番は記載したとおりであり得るが、他の順番も同様に含まれる。換言すると、一実施形態において、順番は、本書に記載のとおりであるが、一部の実施形態において、順番は、異なり得る。例えば、膜貫通領域の一端の要素の順番は、例と異なり得、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに対するスイッチドメインの配置は、異なり、例えば逆であり得る）。
【０４３９】
一実施形態において、第１及び第２のスイッチドメインは、細胞内又は細胞外二量体化スイッチを形成できる。一実施形態において、二量体化スイッチは、例えば、第１及び第２のスイッチドメインが同一であるホモ二量体化スイッチ、又は例えば第１及び第２のスイッチドメインが互いに異なるヘテロ二量体化スイッチであり得る。
【０４４０】
実施形態において、ＲＣＡＲは、「多スイッチ」を含み得る。多スイッチは、ヘテロ二量体化スイッチドメイン又はホモ二量体化スイッチドメインを含み得る。多スイッチは、複数の、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０のスイッチドメインを独立して第１のメンバー、例えば抗原結合メンバー及び第２のメンバー、例えば細胞内シグナル伝達メンバー上に含む。一実施形態において、第１のメンバーは、複数の第１のスイッチドメイン、例えばＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含み得、第２のメンバーは、複数の第２のスイッチドメイン、例えばＦＲＢベースのスイッチドメインを含み得る。一実施形態において、第１のメンバーは、第１及び第２のスイッチドメイン、例えばＦＫＢＰベースのスイッチドメイン及びＦＲＢベースのスイッチドメインを含み得、第２のメンバーは、第１及び第２のスイッチドメイン、例えばＦＫＢＰベースのスイッチドメイン及びＦＲＢベースのスイッチドメインを含み得る。
【０４４１】
一実施形態において、細胞内シグナル伝達メンバーは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば初代細胞内シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。
【０４４２】
一実施形態において、抗原結合メンバーは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば１つ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。一実施形態において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば２つ又は３つの例えば４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ及びＯＸ４０から選択される、本明細書に記載の共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、一実施形態において、初代細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。一実施形態において、抗原結合メンバーは、細胞外から細胞内方向で次の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む：４１ＢＢ−ＣＤ２７；４１ＢＢ−ＣＤ２７；ＣＤ２７−４１ＢＢ；４１ＢＢ−ＣＤ２８；ＣＤ２８−４１ＢＢ；ＯＸ４０−ＣＤ２８；ＣＤ２８−ＯＸ４０；ＣＤ２８−４１ＢＢ；又は４１ＢＢ−ＣＤ２８。このような実施形態において、細胞内結合メンバーは、ＣＤ３ζドメインを含む。このような実施形態において、ＲＣＡＲは、（１）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び２つの共刺激ドメイン及び第１のスイッチドメインを含む抗原結合メンバー；及び（２）膜貫通ドメイン又は膜繋留ドメイン及び少なくとも１つの初代細胞内シグナル伝達ドメイン及び第２のスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０４４３】
ある実施形態は、抗原結合メンバーがＣＡＲ細胞表面に繋留されていないＲＣＡＲを提供する。これは、細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞が、細胞を、抗原結合メンバーをコードする配列で形質転換する必要なく１つ以上の抗原結合ドメインと好都合に対合することを可能とする。このような実施形態において、ＲＣＡＲは、１）第１のスイッチドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば初代細胞内シグナル伝達ドメイン及び第１のスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；及び２）抗原結合ドメイン及び第２のスイッチドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーは、膜貫通ドメイン又は膜繋留ドメインを含まず、任意選択により細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。一実施形態において、ＲＣＡＲは、３）第２の抗原結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインにより結合されるのと異なる抗原に結合する第２の抗原結合ドメイン；及び第２のスイッチドメインを含む第２の抗原結合メンバーを更に含み得る。
【０４４４】
抗原結合メンバーが二特異性活性化及びターゲティング能を含むＲＣＡＲも本明細書で提供される。この実施形態において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば２つ、３つ、４つ、又は５つの抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖを含み得、ここで、各原結合ドメインは、標的抗原、例えば異なる抗原又は同じ抗原、例えば同じ抗原の同一又は異なるエピトープに結合する。一実施形態において、複数の抗原結合ドメインは、タンデムであり、任意選択により、リンカー又はヒンジ領域が抗原結合ドメインの各々の間に配置される。適当なリンカー及びヒンジ領域は、本明細書に記載される。
【０４４５】
ある実施形態は、増殖のスイッチングが可能な配置を有するＲＣＡＲを提供する。この実施形態において、ＲＣＡＲは、１）任意選択により、膜貫通ドメイン又は膜繋留ドメイン；例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ及びＯＸ４０及びスイッチドメインから選択される１つ以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；及び２）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び初代細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーは、スイッチドメインを含まないか、又は細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない。一実施形態において、抗原結合メンバーは、共刺激性シグナル伝達ドメインを含まない。一実施形態において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ホモ二量体化スイッチからのスイッチドメインを含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ヘテロ二量体化スイッチの第１のスイッチドメインを含み、ＲＣＡＲは、ヘテロ二量体化スイッチの第２のスイッチドメインを含む第２の細胞内シグナル伝達メンバーを含む。このような実施形態において、第２の細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバーと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、二量体化スイッチは、細胞内である。一実施形態において、二量体化スイッチは、細胞外である。
【０４４６】
本明細書に記載のＲＣＡＲ配置のいずれかにおいて、第１及び第２のスイッチドメインは、本明細書に記載のようなＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【０４４７】
また本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のＲＣＡＲを含む細胞である。ＲＣＡＲを発現するように操作したあらゆる細胞をＲＣＡＲＸ細胞として使用できる。一実施形態において、ＲＣＡＲＸ細胞は、Ｔ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と称する。一実施形態において、ＲＣＡＲＸ細胞は、ＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と称する。
【０４４８】
ＲＣＡＲコード化配列を含む核酸及びベクターも本明細書で提供される。ＲＣＡＲの種々の要素をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば同じプラスミド又はベクター、例えばウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターに配置できる。一実施形態において、（ｉ）抗原結合メンバーをコードする配列及び（ｉｉ）細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、同じ核酸、例えばベクターに存在できる。対応するタンパク質の産生は、例えば、別々のプロモーターの使用により又はバイシストロニック転写産物（これは、単一翻訳産物の開裂又は２つの別々のタンパク質産物の翻訳により２つのタンパク質の産生を生じ得る）の使用により達成できる。一実施形態において、開裂可能ペプチドをコードする配列、例えばＰ２Ａ又はＦ２Ａ配列を（ｉ）と（ｉｉ）との間に配置する。一実施形態において、ＩＲＥＳ、例えばＥＭＣＶ又はＥＶ７１  ＩＲＥＳをコードする配列を（ｉ）と（ｉｉ）との間に配置する。これらの実施形態において、（ｉ）及び（ｉｉ）は、単一ＲＮＡとして転写される。一実施形態において、（ｉ）及び（ｉｉ）が別々のｍＲＮＡとして転写されるように、第１プロモーターは、（ｉ）に操作可能に連結し、第２プロモーターは、（ｉｉ）に操作可能に連結する。
【０４４９】
代わりに、ＲＣＡＲの種々の要素をコードする配列を種々の核酸分子、例えば異なるプラスミド又はベクター、例えばウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターに配置できる。例えば、（ｉ）抗原結合メンバーをコードする配列を第１核酸、例えば第１ベクターに配置でき、（ｉｉ）細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、第２核酸、例えば第２ベクターに存在できる。
【０４５０】
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは、非共有又は共有であり得る。非共有二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有相互作用を促進する。共有二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有相互作用を促進する。
【０４５１】
一実施形態において、ＲＣＡＲは、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ又はＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチを含む。ＦＫＢＰ１２（ＦＫＢＰ又はＦＫ５０６結合タンパク質）は、天然産物免疫抑制剤、ラパマイシンのための最初の細胞内標的としての役割を果たす豊富な細胞質タンパク質である。ラパマイシンは、ＦＫＢＰ及び大ＰＩ３ＫホモログＦＲＡＰ（ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ）に結合する。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の結合のために十分であるＦＲＡＰの９３アミノ酸部分である（Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｆ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｊ．＆Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．（１９９５）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  １１−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ２８９−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｅｒｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９２：４９４７−５１．）。
【０４５２】
実施形態において、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えばＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチは、二量体化分子、例えばラパマイシン又はラパマイシン類似体を使用できる。
【０４５３】
ＦＫＢＰのアミノ酸配列は配列番号８２４である。
【０４５４】
実施形態において、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ラパマイシン又はラパログの存在下でＦＲＢ（配列番号８２５）、又はその断片若しくは類似体と結合する能力を有するＦＫＢＰの断片を含み得る。
【０４５５】
ＦＲＢのアミノ酸配列は配列番号８２６である。
【０４５６】
本明細書で使用する用語「ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えばＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチ」は、ラパマイシン又はラパログ、例えばＲＡＤ００１の存在下でＦＲＢ又はその断片若しくは類似体と結合する能力を有するＦＫＢＰ断片又はその類似体を含み、配列番号８２４又は８２５のＦＫＢＰ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するか、又は３０、２５、２０、１５、１０、５つ、４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸残基を超えて異ならない第１のスイッチドメイン；及びラパマイシン又はラパログの存在下でＦＲＢ又はその断片若しくは類似体と結合する能力を有するＦＲＢ断片又はその類似体を含み、配列番号８２６のＦＲＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するか、又は３０、２５、２０、１５、１０、５つ、４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸残基を超えて異ならない第２のスイッチドメインを含む二量体化スイッチを指す。一実施形態において、本明細書に記載のＲＣＡＲは、配列番号８２４又は８２５に開示するアミノ酸残基を含む１スイッチドメイン及び配列番号８２６に開示するアミノ酸残基を含む１スイッチドメインを含む。
【０４５７】
実施形態において、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチは、ＦＲＢベースのスイッチドメイン、例えば修飾ＦＲＢスイッチドメイン、ＦＫＢＰベースのスイッチドメイン及び二量体化分子、例えばラパマイシン又はラパログ、例えばＲＡＤ００１間の複合体形成が変えられた、例えば増強された修飾ＦＲＢスイッチドメインを含む。一実施形態において、修飾ＦＲＢスイッチドメインは、アミノ酸位置Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５及びＦ２１０８から選択される１つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれを超える変異を含み、ここで、野生型アミノ酸は、任意の他の天然に存在するアミノ酸へ変異されている。一実施形態において、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は、フェニルアラニン（Ｅ２０３２Ｆ）、メチオニン（Ｅ２０３２Ｍ）、アルギニン（Ｅ２０３２Ｒ）、バリン（Ｅ２０３２Ｖ）、チロシン（Ｅ２０３２Ｙ）、イソロイシン（Ｅ２０３２Ｉ）、例えば配列番号８２７又はロイシン（Ｅ２０３２Ｌ）、例えば配列番号８２８に変異されている。一実施形態において、変異体ＦＲＢは、Ｔ２０９８に変異を含み、ここで、Ｔ２０９８は、フェニルアラニン（Ｔ２０９８Ｆ）又はロイシン（Ｔ２０９８Ｌ）、例えば配列番号８２９に変異されている。一実施形態において、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２及びＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は、任意のアミノ酸に変異され、Ｔ２０９８は、任意のアミノ酸に変異され、例えば配列番号８３０である。一実施形態において、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２Ｉ及びＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば配列番号８３１である。一実施形態において、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２Ｌ及びＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば配列番号８３２である。
【０４５８】
他の適当な二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースの二量体化スイッチ、ジベレリンベースの二量体化スイッチ、タグ／バインダー二量体化スイッチ及びハロタグ／ｓｎａｐタグ二量体化スイッチを含む。本明細書に提供する手引きに従い、このようなスイッチ及び関連する二量体化分子は、当業者に明らかである。
【０４５９】
二量体化分子
スイッチドメイン間の結合は、二量体化分子により促進される。二量体化分子存在下でのスイッチドメイン間の相互作用又は結合は、第１のスイッチドメインに結合、例えば融合したポリペプチドと、第２のスイッチドメインに結合、例えば融合したポリペプチドとの間のシグナル伝達を可能にする。非律速レベルの二量体化分子存在下で本明細書に記載のシステムにおいて測定して、シグナル伝達は、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍増加する。
【０４６０】
ラパマイシン及びラパマイシン類似体（ラパログと称される場合もある）、例えばＲＡＤ００１は、本明細書に記載のＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用できる。一実施形態において、二量体化分子は、ラパマイシン（シロリムス）、ＲＡＤ００１（エベロリムス）、ゾタロリムス、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３（リダフォロリムス）、バイオリムス及びＡＰ２１９６７から選択できる。ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチで使用するのに適する更なるラパマイシン類似体は、「併用療法」と題される節又は「例示的ｍＴＯＲ阻害剤」と題される節に更に記載する。
【０４６１】
スプリットＣＡＲ
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞はスプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲ手法については、国際公開第２０１４／０５５４４２号パンフレット及び同第２０１４／０５５６５７号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に更に詳細に記載される。簡潔に言えば、スプリットＣＡＲシステムは、第１の抗原結合ドメイン及び共刺激ドメイン（例えば、４−１ＢＢ）を有する第１のＣＡＲを発現する細胞を含み、この細胞は、第２の抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を有する第２のＣＡＲも発現する。細胞が第１の抗原に遭遇すると、共刺激ドメインが活性化され、細胞が増殖する。細胞が第２の抗原に遭遇すると、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、細胞殺傷活性が始まる。従って、このＣＡＲ発現細胞は、両方の抗原の存在下に限り完全に活性化される。
【０４６２】
ＲＮＡトランスフェクション
インビトロで転写されたＲＮＡ  ＣＡＲを産生する方法が本明細書に開示される。本発明は、細胞に直接遺伝子導入できるＲＮＡ構築物をコードするＣＡＲも含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、特異的に設計したプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）、続くポリＡ付加を含み、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップ及び／又は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現させる核酸及びポリＡテールを含む構築物、典型的には５０〜２０００塩基長を産生し得る。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞において効率的に翻訳され得る。一態様において、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。
【０４６３】
一態様において、ＣＤ２０  ＣＡＲはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされる。一態様において、ＣＤ２０  ＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ  ＮＫ細胞の作製のため、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に導入される。
【０４６４】
一実施形態において、インビトロ転写ＲＮＡ  ＣＡＲは、一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入することができる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成鋳型を使用したインビトロ転写によって産生される。適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用して、任意の供給源からの目的のＤＮＡをＰＣＲによってインビトロｍＲＮＡ合成用の鋳型に直接変換することができる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列又は任意の他の適切なＤＮＡ供給源であり得る。望ましいインビトロ転写用鋳型は本発明のＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ  ＣＡＲの鋳型は、抗腫瘍抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外領域と；ヒンジ領域、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメイン）と；ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを例えば含む、細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを含む。
【０４６５】
一実施形態において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡはオープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列からのものであり得る。一実施形態において、核酸は５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部又は全てを含み得る。核酸はエクソン及びイントロンを含み得る。一実施形態において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡはヒト核酸配列である。別の実施形態において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、代わりに、天然に存在する生物では通常発現しない人工ＤＮＡ配列であり得る。例示的人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するように共にライゲートされる遺伝子の部分を含むものである。共にライゲートされるＤＮＡの部分は、単一の生物又は２つ以上の生物からのものであり得る。
【０４６６】
トランスフェクションに使用するｍＲＮＡのインビトロ転写用の鋳型はＰＣＲを用いて作成される。ＰＣＲの実施方法は当該技術分野において周知である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ＰＣＲの鋳型として使用されるＤＮＡの領域と実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用されるとき、プライマー配列中の塩基の大部分又は全てが相補的であるか、又は１つ以上の塩基が非相補的若しくはミスマッチであるヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに用いられるアニーリング条件下で意図されるＤＮＡ標的とアニール又はハイブリダイズすることが可能である。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分と実質的に相補的であるように設計することができる。例えば、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲを含めた、細胞で通常転写される核酸の一部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計することができる。プライマーは、特定の目的ドメインをコードする核酸の一部分を増幅するように設計することもできる。一実施形態において、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲの全て又は一部分を含めた、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当該技術分野において周知の合成方法によって作成することができる。「フォワードプライマー」は、増幅しようとするＤＮＡ配列の上流にあるＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドと実質的に相補的なヌクレオチド領域を含むプライマーである。「上流」は、本明細書では、コード鎖に対して増幅しようとするＤＮＡ配列の５，側の位置を指して使用される。「リバースプライマー」は、増幅しようとするＤＮＡ配列の下流にある二本鎖ＤＮＡ鋳型と実質的に相補的なヌクレオチド領域を含むプライマーである。「下流」は、本明細書では、コード鎖に対して増幅しようとするＤＮＡ配列の３’側の位置を指して使用される。
【０４６７】
本明細書に開示される方法では、ＰＣＲに有用な任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。試薬及びポリメラーゼは幾つもの供給元から市販されている。
【０４６８】
安定性及び／又は翻訳効率を促進する能力を備えた化学構造も用いられ得る。ＲＮＡは、好ましくは５’及び３’ＵＴＲを有する。一実施形態において、５’ＵＴＲは１〜３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加される５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは種々の方法によって変えることができ、限定はされないが、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲ用のプライマーを設計することが挙げられる。この手法を用いると、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を実現するために必要な５’及び３’ＵＴＲ長さを改変することができる。
【０４６９】
５’及び３’ＵＴＲは、目的の核酸に関する天然に存在する内因性５’及び３’ＵＴＲであり得る。代わりに、目的の核酸にとって内因性でないＵＴＲ配列が、フォワード及びリバースプライマーへのそのＵＴＲ配列の導入によるか、又は鋳型の任意の他の改変により付加され得る。目的の核酸にとって内因性でないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率を改変するのに有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列におけるＡＵリッチエレメントはｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られている。従って、３’ＵＴＲは、当該技術分野において周知のＵＴＲの特性に基づいて転写ＲＮＡの安定性が増加するように選択又は設計することができる。
【０４７０】
一実施形態において、５’ＵＴＲは内因性核酸のコザック配列を含み得る。代わりに、目的の核酸にとって内因性でない５’ＵＴＲが上記に記載したとおりＰＣＲによって付加される場合、５’ＵＴＲ配列を付加することによりコンセンサスコザック配列を設計し直し得る。コザック配列は一部のＲＮＡ転写物の翻訳効率を増加させることができるが、効率的な翻訳を可能にするため全てのＲＮＡに必要というようには思われない。多くのｍＲＮＡについてのコザック配列の要件は、当該技術分野において公知である。一部の実施形態において、５’ＵＴＲは、細胞において安定しているＲＮＡゲノムのＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。一部の実施形態において、３’又は５’ＵＴＲに様々なヌクレオチド類似体を使用してｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げることができる。
【０４７１】
遺伝子クローニングの必要なしにＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成可能にするには、転写する配列の上流でＤＮＡ鋳型に転写プロモーターが付加されなければならない。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加されると、ＰＣＲ産物において転写しようとするオープンリーディングフレームの上流にＲＮＡポリメラーゼプロモーターが取り込まれることになる。好ましい一実施形態において、プロモーターは、本明細書の他の部分に記載されるとおり、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、限定はされないが、Ｔ３及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられる。Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６プロモーターのコンセンサス核酸配列は当該技術分野において公知である。
【０４７２】
好ましい実施形態において、ｍＲＮＡは５’末端のキャップ及び３’ポリ（Ａ）テールの両方を有し、これらがリボソーム結合、翻訳開始及び細胞における安定性ｍＲＮＡを決定する。環状ＤＮＡ鋳型上、例えばプラスミドＤＮＡ上では、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞における発現に好適でない長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で線状化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後にポリアデニル化されたとしても、真核生物トランスフェクションにおいて有効でない通常のサイズのｍＲＮＡをもたらす。
【０４７３】
線状ＤＮＡ鋳型では、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、転写物の３’末端を鋳型の最後の塩基を超えて伸長させることができる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：６２２３−３６（１９８５）；Ｎａｃｈｅｖａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５−６５（２００３）。
【０４７４】
ＤＮＡ鋳型へのポリＡ／Ｔストレッチの従来の組込み方法は分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに組み込まれたポリＡ／Ｔ配列はプラスミド不安定性を引き起こすこともあり、細菌細胞から得られたプラスミドＤＮＡ鋳型が欠失及び他の異常に高度に汚染されていることが多いのは、このためである。これによりクローニング手順が労力及び時間を要するようになるばかりでなく、信頼性が失われる。そのため、クローニングのないポリＡ／Ｔ  ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の構築を可能にする方法が極めて望ましい。
【０４７５】
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００Ｔテール（サイズは５０〜５０００Ｔであり得る）など、ポリＴテールを含むリバースプライマーを使用してＰＣＲの間に作製するか、又は限定はされないが、ＤＮＡライゲーション又はインビトロ組換えを含め、任意の他の方法によってＰＣＲ後に作製することができる。ポリ（Ａ）テールもＲＮＡに安定性をもたらし、その分解を低減する。概して、ポリ（Ａ）テールの長さは転写されるＲＮＡの安定性と正に相関する。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールは１００〜５０００アデノシンである。
【０４７６】
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、インビトロ転写後に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）などのポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して更に伸長させることができる。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールの長さが１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチドに増加すると、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍になる。加えて、３’末端に異なる化学基を付加すると、ｍＲＮＡ安定性が高まり得る。かかる付加は、改変／人工ヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含み得る。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）テールにＡＴＰ類似体を取り込むことができる。ＡＴＰ類似体はＲＮＡの安定性を更に高めることができる。
【０４７７】
５’キャップもＲＮＡ分子に安定性をもたらす。好ましい実施形態において、本明細書に開示される方法によって作製されるＲＮＡは５’キャップを含む。５’キャップは当該技術分野において公知の及び本明細書に記載される技法を用いて提供される（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６−４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８−９５（２００１）；Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８−９６６（２００５））。
【０４７８】
本明細書に開示される方法によって作製されるＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始して翻訳開始を促進する任意のウイルス配列、染色体配列又は人工的に設計された配列であり得る。糖類、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、及び界面活性剤など、細胞透過及び生存能力を促進する因子を含有し得る、細胞電気穿孔に好適な任意の溶質を含めることができる。
【０４７９】
ＲＮＡは、幾つもの異なる方法、例えば、限定はされないが、電気穿孔（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−ＩＩ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、独国））、（ＥＣＭ  ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）又はＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ、Ｄｅｎｖｅｒ、Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ、Ｈａｍｂｕｒｇ  独国）、リポフェクションを用いたカチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション、ポリマー封入、ペプチド媒介性トランスフェクション、又は「遺伝子銃」などのバイオリスティック粒子デリバリーシステムを含む市販の方法のいずれかを用いて標的細胞に導入することができる（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１−７０（２００１）を参照されたい。
【０４８０】
非ウイルス送達方法
幾つかの態様において、非ウイルス方法を使用して、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸を細胞、又は組織、又は対象に送達できる。
【０４８１】
一実施形態において、非ウイルス方法は、トランスポゾン（転位因子とも呼ばれる）の使用を含む。一実施形態において、トランスポゾンは、ゲノムの位置にそれ自体挿入できるＤＮＡの断片、例えば自己複製性であり、そのコピーをゲノムに挿入することができるＤＮＡの断片又は長い核酸の外にスプライシングされ、ゲノムの別の場所に挿入され得るＤＮＡの断片である。例えば、トランスポゾンは、転移遺伝子に隣接する逆方向反復で構成されたＤＮＡ配列を含む。
【０４８２】
トランスポゾンを使用した核酸送達の例示的方法には、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）トランスポゾン系（ＳＢＴＳ）及びピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ）（ＰＢ）トランスポゾン系が含まれる。例えば、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０．Ｒ１（２０１１）：Ｒ１４−２０；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５（２００８）：２９６１−２９７１；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（２００８）：５８０−５８９；Ｇｒａｂｕｎｄｚｉｊａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８（２０１０）：１２００−１２０９；Ｋｅｂｒｉａｅｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．１２２．２１（２０１３）：１６６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １６．９（２００８）：１５１５−１６；Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２．１２（２００７）：３１５３−６５；及びＤｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．１２２．３（２００５）：４７３−８３（これらは、全て参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０４８３】
ＳＢＴＳは、２つの成分：１）トランス遺伝子を含むトランスポゾン、及び２）トランスポザーゼ酵素源を含む。トランスポザーゼは、トランスポゾンを担体プラスミド（又は他のドナーＤＮＡ）から宿主細胞染色体／ゲノムなどの標的ＤＮＡに転移させることができる。例えば、トランスポザーゼは担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、プラスミドからトランスポゾン（トランス遺伝子を含む）を切り出し、それを宿主細胞のゲノムに挿入する。例えば、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０４８４】
例示的トランスポゾンには、ｐＴ２ベースのトランスポゾンが含まれる。例えば、Ｇｒａｂｕｎｄｚｉｊａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１．３（２０１３）：１８２９−４７；及びＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８．８（２００８）：２９６１−２９７１（これらは、全て参照により本明細書に援用される）を参照されたい。例示的トランスポザーゼには、Ｔｃ１／マリナー型トランスポザーゼ、例えばＳＢ１０トランスポザーゼ又はＳＢ１１トランスポザーゼ（例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現させることのできる高活性トランスポザーゼ）が含まれる。例えば、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．；Ｋｅｂｒｉａｅｉ  ｅｔ  ａｌ．；及びＧｒａｂｕｎｄｚｉｊａ  ｅｔ  ａｌ．（これらは、全て参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０４８５】
ＳＢＴＳを使用することにより、トランス遺伝子、例えば本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸の効率的な組込み及び発現が可能になる。本明細書には、例えば、ＳＢＴＳなどのトランスポゾン系を使用した、本明細書に記載されるＣＡＲを安定に発現する細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の作成方法が提供される。
【０４８６】
本明細書に記載される方法によれば、一部の実施形態において、ＳＢＴＳ成分を含む１つ以上の核酸、例えばプラスミドが細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に送達される。例えば、核酸は、核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）送達の標準方法、例えば本明細書に記載される方法、例えば電気穿孔、トランスフェクション、又はリポフェクションによって送達される。一部の実施形態において、核酸は、トランス遺伝子、例えば本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。一部の実施形態において、核酸は、トランス遺伝子（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸）を含むトランスポゾン並びにトランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態において、２つの核酸を含むシステム、例えばデュアルプラスミドシステムが提供され、例えば、ここで、第１のプラスミドが、トランス遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第２のプラスミドが、トランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。例えば、第１及び第２の核酸は宿主細胞に共送達される。
【０４８７】
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲを発現する細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、ＳＢＴＳを使用した遺伝子挿入と、ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、又は操作されたメガヌクレアーゼが再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ）を使用した遺伝子編集との組み合わせを用いることによって作成される。
【０４８８】
一部の実施形態において、非ウイルス送達方法を用いると、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の再プログラム化、及び対象への細胞の直接注入が可能となる。非ウイルスベクターの利点としては、限定はされないが、患者集団を満たすために必要な十分な量の作製が容易で比較的低コストであること、保存時に安定していること、及び免疫原性がないことが挙げられる。
【０４８９】
ＣＡＲをコードする核酸コンストラクト
本発明は、本明細書に記載される１つ以上のＣＡＲコンストラクトをコードする核酸分子も提供する。一態様において、核酸分子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一態様において、核酸分子はＤＮＡコンストラクトとして提供される。
【０４９０】
従って、一態様において、本発明はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸分子に関し、ここで、ＣＡＲは、ＣＤ２０結合ドメイン（例えば、ネズミ科動物、ヒト化又はヒトＣＤ２０結合ドメイン）と、膜貫通ドメインと、刺激ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメイン、例えばζ鎖を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインは、本明細書に記載されるＣＤ２０結合ドメイン、例えば配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１５９、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２４０、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択される配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含むＣＤ２０結合ドメインである。一実施形態において、膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４からなる群から選択される、例えば本明細書に記載されるタンパク質の膜貫通ドメインである。一実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号８０１の配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインはヒンジ領域、例えば本明細書に記載されるヒンジによって膜貫通ドメインに結合される。一実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号７９９、又は配列番号８１４、又は配列番号８１６、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、単離核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択される、例えば本明細書に記載されるタンパク質の機能性シグナル伝達ドメインである。一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号８０３の配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢの機能性シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζの機能性シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０５又は配列番号８０６の配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列、及び配列番号８０７又は配列番号８０８の配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレーム内において且つ単一のポリペプチド鎖として発現される。
【０４９１】
別の態様において、本発明は、配列番号７９７のリーダー配列と、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１５９、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２４０、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択される配列（又はその９５〜９９％の同一性を有する配列）を有するｓｃＦｖドメインと、配列番号７９９、又は配列番号８１４、又は配列番号８１４（又はその９５〜９９％の同一性を有する配列）のヒンジ領域と、配列番号８０１の配列（又はその９５〜９９％の同一性を有する配列）を有する膜貫通ドメインと、配列番号８０３の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は配列番号８１８の配列（又はその９５〜９９％の同一性を有する配列）を有するＣＤ２７共刺激ドメインと、配列番号８０５又は配列番号８０７の配列（又はその９５〜９９％の同一性を有する配列）を有するＣＤ３ζ刺激ドメインとを含むＣＡＲコンストラクトをコードする単離核酸分子に関する。
【０４９２】
別の態様において、本発明は、核酸分子によってコードされる単離ポリペプチド分子に関する。一実施形態において、単離ポリペプチド分子は、配列番号２５、配列番号５２、配列番号７９、配列番号１０６、配列番号１３３、配列番号１６０、配列番号１８７、配列番号２１４、配列番号２４１、配列番号２６８、配列番号２９５、配列番号３２２、配列番号３４９、配列番号３７６、配列番号４０３、及び配列番号４３０からなる群から選択される配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【０４９３】
別の態様において、本発明は、ＣＤ２０結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸分子に関し、ここで、前記ＣＤ２０結合ドメインは、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１５９、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２４０、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択される配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【０４９４】
一実施形態において、コードされるＣＡＲ分子は、共刺激ドメインをコードする配列を更に含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質の機能性シグナル伝達ドメインである。一実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号８０３の配列を含む。一実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ及びＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒｇ（共通ガンマ）、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４、（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ及びＰＡＧ／Ｃｂｐからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。
【０４９５】
一実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号８０３の配列を含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢの機能性シグナル伝達ドメインとζの機能性シグナル伝達ドメインとを含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８０３の配列と配列番号８０４の配列とを含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレーム内において且つ単一のポリペプチド鎖として発現される。一実施形態において、ＣＤ２０結合ドメインはヒンジ領域によって膜貫通ドメインに結合される。一実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号７９９を含む。一実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号７９９、又は配列番号８１４、又は配列番号８１６を含む。
【０４９６】
別の態様において、本発明は、配列番号７９７のリーダー配列と、配列番号２４、配列番号５１、配列番号７８、配列番号１０５、配列番号１３２、配列番号１５９、配列番号１８６、配列番号２１３、配列番号２４０、配列番号２６７、配列番号２９４、配列番号３２１、配列番号３４８、配列番号３７５、配列番号４０２、及び配列番号４２９からなる群から選択される配列、又はその９５〜９９％の同一性を有する配列を有するｓｃＦｖドメインと、配列番号７９９、又は配列番号８１４、又は配列番号８１６のヒンジ領域と、配列番号８０１の配列を有する膜貫通ドメインと、配列番号８０３の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は配列番号８１８の配列を有するＣＤ２７共刺激ドメインと、配列番号８０５又は配列番号８０７の配列を有するＣＤ３ζ刺激ドメインとを含む、コードされるＣＡＲ分子に関する。
【０４９７】
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用して、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニングにより、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子を誘導化することにより又はそれを含むことが知られる細胞及び組織から直接単離することによるような、組み換え当技術分野で知られる方法を使用して得ることができる。代わりに、目的の遺伝子をクローン化ではなく合成により産生できる。
【０４９８】
本発明は、本発明のＤＮＡが挿入されているベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組込み及び娘細胞への伝播を可能にするため、長期遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できる点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコ−レトロウイルス由来のベクターを超える更なる利点を有する。更に低免疫原性であるという付加的利点も有する。
【０４９９】
別の実施形態において、所望の本発明のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ、ｃｒｉｓｐｅｒ、ＣＡＳ９及び亜鉛フィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成できる。参照により本明細書に包含される下記のＪｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９．１０：７０４−７１６を参照されたい。
【０５００】
概説すると、ＣＡＲをコードする天然又は合成核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸又はその一部をプロモーターに操作可能に連結させ、その構築物を発現ベクターに取り込むことにより達成される。ベクターは、真核生物での複製及び組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列及びプロモーターを含む。
【０５０１】
本発明の構築物の発現は、標準遺伝子送達プロトコルを使用する核酸免疫化及び遺伝子治療にも使用し得る。遺伝子送達のための方法が当技術分野で知られている。例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第５，３９９，３４６号明細書、同第５，５８０，８５９号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書を参照されたい。別の実施形態において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
【０５０２】
核酸は、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクター及びシークエンシングベクターを含む。
【０５０３】
更に、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １  −４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ及び他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ以上の選択可能マーカーを含む（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット；国際公開第０１／２９０５８号パンフレット；及び米国特許第６，３２６，１９３号明細書）。
【０５０４】
多数のウイルスベースの系が哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当技術分野で知られる技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に包装できる。次いで、組み換えウイルスが単離され、対象の細胞にインビボ又はエクスビボで送達され得る。多数のレトロウイルス系が当技術分野で知られている。一実施形態において、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが当技術分野で知られている。一実施形態において、レンチウイルスベクターを使用する。
【０５０５】
更なるプロモーター要素、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。典型的には、これらは、開始部位の上流３０〜１１０ｂｐの領域に位置するが、多数のプロモーターが同様に開始部位の下流に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の空間は、多くの場合、可動性であり、そのため、要素が互いに逆になったとき又は移動したときにプロモーター機能が保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーター要素間の空間は、活性が落ち始める前、５０ｂｐ離れるまで増加し得る。プロモーターにより、個々の要素は、転写を活性化するために協調的又は独立的に機能できるように見える。例示的プロモーターとしては、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣ、又はホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。
【０５０６】
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲ導入遺伝子の発現ができるプロモーターの例は、ＥＦ−１α（ＥＦ１ａ）プロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う伸長因子−１複合体のαサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された導入遺伝子からＣＡＲ発現を駆動するのに有効であることが示されている。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。一態様において、ＥＦ１ａプロモーターは、配列番号８３３として提供される配列を含む。
【０５０７】
プロモーターの別の例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列並びにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターなど、しかし、これらに限定されないヒト遺伝子プロモーターも使用し得る。更に、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定すべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部であるとして意図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、発現が望まれるときに活性化し、発現が望まれないときに遮断することができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０５０８】
ＣＡＲポリペプチド又はその一部の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクター遺伝子導入又はウイルスベクターによる感染が探求される細胞の集団から発現細胞から発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又は両方を含み得る。他の態様において、選択可能マーカーは、ＤＮＡの別の断面に担持され、共トランスフェクション法において使用される。選択可能マーカー及びレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞における発現が可能であるように適切な制御配列が隣接し得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子を含む。
【０５０９】
レポーター遺伝子は、恐らく遺伝子導入されている細胞を同定し、制御配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物又は組織に存在又は発現されず、発現がある容易に検出可能な特性、例えば酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてから適当な時間後にアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。適当な発現系は、周知であり、既知技術により製造できるか又は商業的に入手できる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物をプロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結し、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するのに使用され得る。
【０５１０】
一実施形態において、ベクターは、第２のＣＡＲをコードする核酸を更に含み得る。一実施形態において、第２のＣＡＲは、例えば、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＬＬ−１、ＣＤ１２３、ＦＬＴ３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａなど、急性骨髄白血病細胞に発現される標的に対する抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、ベクターは、第１の抗原を標的とし、共刺激性シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第１のＣＡＲをコードする核酸配列を含み、第２の異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ベクターは、ＣＤ２０結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激性ドメインを含む第１のＣＤ２０  ＣＡＲをコードする核酸及びＣＤ２０以外の抗原（例えば、ＡＭＬ細胞に発現される抗原、例えばＣＤ２２、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＬＬ−１、ＣＤ１２３、ＦＬＴ３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａ）を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲをコードする核酸を含む。別の実施形態において、ベクターは、ＣＤ２０結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＤ２０  ＣＡＲをコードする核酸及びＣＤ２０以外の抗原（例えば、ＡＭＬ細胞に発現する抗原、例えばＣＤ２２、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ３３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａ）を標的とし、その抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激性シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲをコードする核酸を含む。
【０５１１】
一実施形態において、ベクターは、本明細書に記載のＣＤ２０  ＣＡＲをコードする核酸及び阻害性ＣＡＲをコードする核酸を含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えばまたＣＤ２０を発現する正常細胞で見られるが、癌細胞で見られない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び阻害分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、又はＴＧＦβの細胞内ドメインであり得る。
【０５１２】
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は、当技術分野で知られている。発現ベクターに関連して、ベクターは、当技術分野の任意の方法により、宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫細胞に容易に導入できる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的又は生物学的手段により、宿主細胞に移入され得る。
【０５１３】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、エレクトロポレーションなどを含む。ベクター及び／又は外来性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照されたい）。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入に好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０５１４】
宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号明細書及び同第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
【０５１５】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散体系を含む。インビトロ及びインビボで送達媒体として使用するための代表的コロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。標的化ナノ粒子又は他の適当なサブミクロンサイズの送達系を用いるポリヌクレオチドの送達など、最新式の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能である。
【０５１６】
非ウイルス送達系を利用する場合、代表的送達媒体は、リポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入のために意図される（インビトロ、エクスビボ又はインビボ）。別の態様において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部への被包、リポソームの脂質二重層内への分散、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と結合する連結分子を介するリポソームへの結合、リポソームへの封入、リポソームとの複合体化、脂質含有溶液への分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁液としての包含、ミセル内への包含又は複合体化又は他の方法で脂質と結合する。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクター結合組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造において、ミセルとして又は「崩壊」構造を有して存在し得る。それらは、単に溶液に分散され、恐らくサイズ又は形状が均一ではない凝集体も形成し得る。脂質は、天然に存在する又は合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴並びに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物群及びその誘導体を含む。
【０５１７】
使用に適する脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得ることができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から得ることができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ．）から得ることができる。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質の原液を約−２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に揮発するために唯一の溶媒として使用する。「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集体の産生により形成される多様な単及び多層状脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体を伴う小胞構造を有することにより特徴付けられ得る。多層状リポソームは、水性媒体により分離された、複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに自然に形成される。脂質要素は、閉構造形成前に自己凝集し、水及び溶解した溶質を脂質二重層の間に封入する（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５０５−１０）。しかしながら、通常の小胞構造と異なる構造を溶液で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であるか又は単に脂質分子の不均一凝集体として存在すると考えられ得る。リポフェクタミン−核酸複合体も考慮される。
【０５１８】
外来性核酸を宿主細胞に導入するか又はそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝す方法に関係なく、宿主細胞における組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するために多様なアッセイを行い得る。このようなアッセイは、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、薬剤の同定に使用するための、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）により、特定のペプチドの存在又は不在を検出するような「生化学的」アッセイ又は本発明の範囲内に入る本明細書に記載のアッセイを含む。
【０５１９】
本発明は、ＣＡＲコード化核酸分子を含むベクターを更に提供する。一態様において、ＣＡＲベクターを細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に直接形質導入し得る。一態様において、ベクターは、クローニング又は発現ベクター、例えば１つ以上のプラスミド（例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体）、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター構築物を含むが、これらに限定されないベクターである。一態様において、ベクターは、哺乳動物Ｔ細胞又はＮＫ細胞においてＣＡＲ構築物の発現ができる。一態様において、哺乳動物Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。
【０５２０】
細胞の供給源
拡大及び遺伝子改変又は他の改変前に、細胞、例えばＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の供給源を対象から入手することができる。用語「対象」は、免疫応答が誘発され得る生きている生物（例えば、哺乳類）を含むことが意図される。対象の例としては、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びこれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む多数の供給源から得ることができる。本発明の開示の一態様において、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離など、当業者に知られるあらゆる技術を使用して、対象から採取した血液の単位から得ることができる。ある好ましい態様において、個体の循環血液からの細胞をアフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は、典型的にはＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球及び血小板を含む。一態様において、アフェレーシスにより採取した細胞は、血漿画分を除去するために洗浄し、任意選択により細胞を続くプロセシング過程のために適切な緩衝液又は媒体に入れる。本発明の一態様において、細胞をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。別の態様において、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得るか、又は全てではないにしても多くの二価カチオンを欠き得る。カルシウム非存在下の初期活性化過程は、活性化の増強に至り得る。当業者に容易に認識されるように、洗浄工程は、製造業者の指示に従う半自動化「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）により達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ又は他の緩衝剤を含む又は含まない食塩水溶液など、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。代わりに、アフェレーシス試料の望ましくない要素を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
【０５２１】
一態様において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解させて、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）グラジエントでの遠心によるか、又は向流遠心エルトリエーションによって単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離される。
【０５２２】
本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の、例えば陰性選択技術を使用する、例えばＴ制御性細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞の特異的亜集団、例えばＴ細胞の選択を含み得る。好ましくは、Ｔ制御性枯渇細胞の集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
【０５２３】
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋  Ｔ細胞は、抗Ｃ２５抗体、又はその断片、又はＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して集団から除去される。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体、又はその断片、又はＣＤ２５結合リガンドは、基材、例えばビーズにコンジュゲートされるか、又は他の方法で基材、例えばビーズにコーティングされる。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体、又はその断片は、本明細書に記載されるとおり基材にコンジュゲートされる。
【０５２４】
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋  Ｔ細胞は、Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ（商標）からのＣＤ２５枯渇試薬を使用して集団から除去される。一実施形態において、細胞に対するＣＤ２５枯渇試薬の比は、１ｅ７細胞に対して２０ｕＬ、又は１ｅ７細胞に対して１５ｕＬ、又は１ｅ７細胞に対して１０ｕＬ、又は１ｅ７細胞に対して５ｕＬ、又は１ｅ７細胞に対して２．５ｕＬ、又は１ｅ７細胞に対して１．２５ｕＬである。
【０５２５】
一実施形態において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。他の態様において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９〜１×１０１０（及びその間の任意の整数値）ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。一実施形態において、得られたＴ制御性枯渇細胞の集団は、２×１０９Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞又はそれ未満（例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７又はそれ未満のＣＤ２５＋細胞）を含む。
【０５２６】
一実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞を、例えばチュービング１６２−０１など、枯渇チュービングセットと共にＣｌｉｎｉＭＡＣ系を使用して集団から除去する。一実施形態において、ＣｌｉｎｉＭＡＣ系を例えばＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２．１などの枯渇設定において動かす。
【０５２７】
本明細書に記載の方法は、２つ以上の選択工程、例えば２つ以上の枯渇工程を含み得る。陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、例えば、陰性に選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。１つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫粘着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／又は選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含み得る。
【０５２８】
本明細書に記載の方法は、腫瘍抗原、例えばＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４又はＣＤ１１ｂを発現する細胞の集団からの除去を更に含み、それによりＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲの発現に適するＴ制御性枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇及び腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供する。一実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御性、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗Ｃ２５抗体又はその断片及び抗腫瘍抗原抗体又はその断片を同じ基質、例えばビーズに結合でき、これを細胞の除去に使用でき、又は抗ＣＤ２５抗体又はその断片及び抗腫瘍抗原抗体又はその断片を別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。一部の実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去及び腫瘍抗原発現細胞の除去は、逐次的であり、例えばいずれの順番でも生じ得る。
【０５２９】
チェックポイント阻害剤、例えば本明細書に記載のチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えばＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞及びＴＩＭ３＋細胞の１つ以上の集団からの除去を含み、それによりＴ制御性枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇細胞及びチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えばＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋及び／又はＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供する方法も提供される。例示的なチェックポイント阻害剤は、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ＆−１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ及びＬＡＩＲ１を含む。一実施形態において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御性、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗Ｃ２５抗体又はその断片及び抗チェックポイント阻害剤抗体又はその断片を同じビーズに結合でき、それを細胞の除去に使用でき、又は抗ＣＤ２５抗体又はその断片及び抗チェックポイント阻害剤抗体又はその断片を別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。一部の実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去及びチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は、逐次的であり、例えばいずれ順序の順番でも生じ得る。
【０５３０】
本明細書に記載される方法は、ポジティブ選択ステップを含み得る。例えば、Ｔ細胞は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３ｘ２８）コンジュゲートビーズと共に所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間にわたってインキュベートすることにより単離し得る。一態様において、この時間は約３０分である。更なる態様において、時間は３０分〜３６時間又はそれより長い範囲及びその間にあるあらゆる整数値である。更なる態様において、時間は少なくとも１、２、３、４、５、又は６時間である。更に別の好ましい態様において、時間は１０〜２４時間である。一態様において、インキュベーション時間は２４時間である。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を腫瘍組織から又は免疫無防備状態の個体から単離するなど、他の細胞型と比較したときＴ細胞がわずかにのみある任意の状況では、Ｔ細胞の単離により長いインキュベーション時間が用いられ得る。更に、より長いインキュベーション時間を用いると、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の捕捉効率が増加し得る。従って、単純に時間を増減させることにより、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることが可能であり、及び／又はビーズに対するＴ細胞の比を増減させることにより（本明細書に更に記載されるとおり）、培養開始時又はプロセス中の他の時点でＴ細胞の一部の集団を優先的に選択又は除外選択することができる。加えて、ビーズ又は他の表面上の抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体の比率を増減させることにより、培養開始時又は他の所望の時点でＴ細胞の一部の集団を優先的に選択又は除外選択することができる。
【０５３１】
一実施形態において、Ｔ細胞ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ及びパーフォリン又は他の適切な分子、例えば他のサイトカインの１つ以上を発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、国際公開第２０１３／１２６７１２号パンフレットに記載する方法により決定できる。
【０５３２】
陽性又は陰性選択により所望の細胞の集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は、変わり得る。一態様において、細胞とビーズとの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞とを一緒に混合する体積を有意に低下させる（例えば、細胞濃度を増加させる）ことが望まれ得る。例えば、一態様において、約１００億細胞／ｍｌ、９０億細胞／ｍｌ、８０億細胞／ｍｌ、７０億細胞／ｍｌ、６０億細胞／ｍｌ、又は５０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。一態様において、１０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。一態様において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億細胞／ｍｌの濃度を使用する。更なる態様において、１億２５００万又は１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用できる。
【０５３３】
高濃度を使用して細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加できる。更に、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞の、又は多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病性血液、腫瘍組織など）からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞の集団は、治療的価値を有し得、取得することが望ましい。例えば、高濃度細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０５３４】
関連する態様において、低濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を有意に希釈することにより、粒子と細胞との相互作用が最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量で発現する細胞で選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕獲される。一態様において、使用する細胞の濃度は５×１０ｅ６／ｍｌである。他の態様において、使用する濃度は約１×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌ及びその間の任意の整数値であり得る。
【０５３５】
他の態様において、細胞を、種々の長さの時間、種々の速度で２〜１０℃又は室温においてローテータでインキュベートし得る。
【０５３６】
刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄工程後凍結させ得る。理論に拘束されることを望まないが、凍結と続く解凍工程は、細胞集団から顆粒球及びある程度単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液及びパラメータが当技術分野で知られ、これに関連して有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ又は１０％Ｄｅｘｔｒａｎ  ４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯ又は３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ  ４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯを含む培養培地、又は例えばＨｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含む他の適当な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１°／分の速度で−８０℃に凍結し、気相の液体窒素貯蔵タンクに保存する。制御凍結の他の方法並びに直接−２０℃又は液体窒素の非制御凍結も使用できる。
【０５３７】
一態様において、凍結保存細胞を本明細書に記載のように解凍し、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化前に室温で１時間休息させる。
【０５３８】
本発明に関連して、本明細書に記載の増殖細胞が必要となり得る時点の前の期間における対象からの血液試料又はアフェレーシス産物の収集も企図されている。従って、増殖する細胞の供給源を必要な任意の時点で採取でき、Ｔ細胞などの所望の細胞を、本明細書に記載のものなどの免疫エフェクター細胞療法からの利益があるであろう任意の数の疾患及び状態について、免疫エフェクター細胞治療におけるその後の使用のために単離及び凍結できる。一態様において、血液試料又はアフェレーシスを一般に健常対象から採取する。一態様において、血液試料又はアフェレーシスを、一般に、疾患を発症するリスクにあるが、依然として疾患を発症していない健常対象から採取し、目的の細胞をその後の使用のために単離及び凍結する。一態様において、Ｔ細胞をその後の時点で増殖、凍結及び使用し得る。一態様において、試料を、本明細書に記載の特定の疾患の診断の直後に、しかし、何らかの処置前に患者から採取する。更なる態様において、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び照射などの抗体又は他の免疫除去剤による処置を含むが、これらに限定されない、任意の数の関連する処置モダリティの前に対象からの血液試料又はアフェレーシスから細胞を単離する。
【０５３９】
本発明の更なる態様において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後、患者から直接得る。ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置の直後、患者が、通常、その処置から回復するまでの間、得られるＴ細胞の品質がエクスビボで増殖する能力について最適であり得るか又は改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着及びインビボ増殖増強について好ましい状態であり得る。そのため、本発明に関連して、Ｔ細胞、樹状細胞又は造血細胞系統の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期に採取することが企図される。更に、一態様において、可動化（例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの可動化）及びコンディショニングレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生及び／又は増殖に好都合である条件を、特に治療後の定められた時間枠中に対象に形成できる。細胞型の例は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞及び免疫系の他の細胞を含む。
【０５４０】
一実施形態において、免疫エフェクターＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば本明細書に記載のＣＡＲ分子は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から得る。一実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作される免疫エフェクター細胞の集団、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を、対象又は対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞のレベル又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の比が少なくとも一過性に増加するように、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投薬から十分な時間後又は十分な用量の後に採取する。
【０５４１】
一部の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作されているか又は操作する免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の集団を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の数を増やすか又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の比を増やす量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理できる。
【０５４２】
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ  ＲＮＡ又はタンパク質を発現しないか、又はＤＧＫ活性が低下した又は阻害された細胞である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ発現を低減又は阻止するための遺伝的方法、例えばＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。代わりに、ＤＧＫ欠損細胞は、本明細書に記載のＤＧＫ阻害剤での処置により産生できる。
【０５４３】
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスＲＮＡ又はタンパク質を発現しないか、又はイカロス活性が低下した又は阻害された細胞を含み、イカロス欠損細胞は、イカロス発現を低減又は阻止するための遺伝的方法、例えばＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。代わりに、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えばレナリドマイドでの処置により産生できる。
【０５４４】
実施形態において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損及びイカロス欠損であり、例えばＤＧＫ及びイカロスを発現せず、又はＤＧＫ及びイカロス活性が低下又は阻害されている。このようなＤＧＫ及びイカロス欠損細胞は、本明細書に記載の方法のいずれかにより産生できる。
【０５４５】
一実施形態において、ＮＫ細胞を対象から得る。別の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えばＮＫ−９２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
【０５４６】
同種ＣＡＲＴ
本明細書に記載の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えばＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩの発現を欠く同種Ｔ細胞である。
【０５４７】
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に何ら機能的ＴＣＲを発現しないように操作され、機能的ＴＣＲを含む１つ以上のサブユニットを発現しないように操作され、又はその表面に微少の機能的ＴＣＲを産生するように操作され得る。代わりに、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１つ以上の変異した又は切断型の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現し得る。用語「実質的に障害されたＴＣＲ」は、このＴＣＲが宿主で有害な免疫反応を惹起しないことを意味する。かかる細胞は、本明細書に記載されるとおりの１つ以上の遺伝子編集システムを用いて作成することができる。実施形態において、遺伝子編集システムは、ＴＣＲの成分をコードする配列、例えばＴＣＲα定常鎖遺伝子（ＴＲＡＣ）における配列又はその調節エレメントを標的にする。実施形態において、遺伝子編集システムは、ＴＣＲの成分をコードする配列、例えばＴＣＲβ定常鎖遺伝子（ＴＲＢＣ）における配列又はその調節エレメントを標的にする。
【０５４８】
本明細書に記載されるＴ細胞は、例えば、その表面上に機能性ＨＬＡを発現しないように操作することができる。例えば、本明細書に記載されるＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラス１及び／又はＨＬＡクラスＩＩが下方制御されるように操作することができる。かかる細胞は、本明細書に記載されるとおり１つ以上の遺伝子編集システムを用いて作成することができる。実施形態において、遺伝子編集システムは、１つ以上のＨＬＡ分子の成分をコードする配列を標的にする。実施形態において、遺伝子編集システムは、１つ以上のＨＬＡ分子の発現に影響を及ぼす因子をコードする配列を標的にする。実施形態において、遺伝子編集システムは、ＭＨＣクラスＩ発現の調節因子、例えばβ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする配列を標的にする。実施形態において、遺伝子編集システムは、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現の調節因子、例えばＣＩＩＴＡをコードする配列を標的にする。実施形態において、ＭＨＣクラスＩ発現の調節因子（例えば、Ｂ２Ｍ）とＭＨＣクラスＩＩ分子発現の調節因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）との両方を標的にする遺伝子編集システムが、少なくともＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ分子の発現が下方制御されるように細胞に導入される。
【０５４９】
一実施形態において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲ及び機能的ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩを欠き得る。
【０５５０】
機能的ＴＣＲ及び／又はＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲ又はＨＬＡの１つ以上のサブユニットのノックアウト又はノックダウンを含む任意の適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）転写アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用したＴＣＲ及び／又はＨＬＡのノックダウンを含み得る。
【０５５１】
一実施形態において、同種細胞は、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにより、阻害性分子を発現しないか又は低レベルで発現する細胞であり得る。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下できる、阻害分子を発現しないか又は阻害分子を低レベルで発現する細胞であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦβを含む。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質レベルでの阻害による阻害分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。実施形態において、例えば本明細書に記載の阻害性核酸、例えば阻害性核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）、転写アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用できる。
【０５５２】
例えばＴＣＲ又はＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ
一実施形態において、ＴＣＲ発現及び／又はＨＬＡ発現を、Ｔ細胞におけるＴＣＲ及び／又はＨＬＡをコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用して阻害できる。
【０５５３】
Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系などの任意の慣用の発現系を使用して達成できる。
【０５５４】
ＴＣＲの要素の発現を下方制御する代表的ｓｈＲＮＡは、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２１６６７号明細書に記載されている。ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現を下方制御する代表的ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７７３号明細書に開示されている。
【０５５５】
例えばＴＣＲ又はＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
本明細書で使用する「ＣＲＩＳＰＲ」、又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ」、又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ」は、一連の群生性等間隔短回文反復配列又はこのような一連の反復を含む系を指す。本明細書で使用する「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系は、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子の発現抑制又は変異に使用できる、ＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓ由来の系を指す。
【０５５６】
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムの約４０％及び配列決定された古細菌の９０％に見られる。Ｇｒｉｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ８：１７２。この系は、プラスミド及びファージなどの外来遺伝的要素に対する抵抗性を付与する１種の原核生物免疫系であり、後天性免疫の形態を提供する。Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５：１７０９−１７１２；Ｍａｒｒａｇｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２：１８４３−１８４５。
【０５５７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、マウス又は霊長類などの真核生物における遺伝子エディティング（特定の遺伝子のサイレンシング、増強又は変更）に使用するために改変されている。Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  ４８２：３３１−８。これは、真核細胞に、特別に設計したＣＲＩＳＰＲ及び１つ以上の適切なＣａｓを含むプラスミドを導入することにより達成される。
【０５５８】
ＣＲＩＳＰＲ座位と呼ばれることもあるＣＲＩＳＰＲ配列は、交互の反復及びスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは、通常細菌に対して外来であるプラスミド又はファージ配列などの配列を含み、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーは、ＴＣＲ又はＨＬＡ遺伝子配列に由来する。
【０５５９】
ＣＲＩＳＰＲ座位からのＲＮＡは、構成的に発現され、Ｃａｓタンパク質により小ＲＮＡに加工される。これらは、反復配列が隣接したスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質をＲＮＡ又はＤＮＡレベルで外来性遺伝的要素に対して発現抑制するように導く。Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｉｒｅｃｔ  １：７。スペーサーは、そのため、ｓｉＲＮＡに類似して、ＲＮＡ分子の鋳型としての役割を果たす。Ｐｅｎｎｉｓｉ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：８３３−８３６。
【０５６０】
多くの異なるタイプの細菌で自然に生じるように、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置及び構造、Ｃａｓ遺伝子の機能及び数及びそれらの産物は、種毎にいくぶん異なる。Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０；Ｋｕｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．８：Ｒ６１；Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．６０：１７４−１８２；Ｂｏｌｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１：２５５１−２５６１；Ｐｏｕｒｃｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１：６５３−６６３；及びＳｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．２８：３３５−３４０。例えば、Ｃｓｅ（Ｃａｓサブタイプ、大腸菌）タンパク質（例えば、ＣａｓＡ）は、機能的複合体、Ｃａｓｃａｄｅを形成し、これは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ転写物を、Ｃａｓｃａｄｅが保持するスペーサー−反復単位に加工する。Ｂｒｏｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：９６０−９６４。他の原核生物において、Ｃａｓ６は、ＣＲＩＳＰＲ転写物を加工する。大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活性化は、Ｃａｓｃａｄｅ及びＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１又はＣａｓ２を必要としない。パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）及び他の原核生物におけるＣｍｒ（Ｃａｓ  ＲＡＭＰモジュール）タンパク質は、小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと機能的複合体を形成し、これは相補的標的ＲＮＡを認識し、開裂する。より単純なＣＲＩＳＰＲ系は、二重らせんの各鎖のための２活性切断部位を有するヌクレアーゼであるタンパク質Ｃａｓ９に依存する。Ｃａｓ９と修飾ＣＲＩＳＰＲ座位ＲＮＡの組み合わせを遺伝子エディティングのための系に使用できる。Ｐｅｎｎｉｓｉ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：８３３−８３６。
【０５６１】
従ってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いると、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子を編集し（１つ以上の塩基対を付加する又は欠失させる）、又は中途終止を導入して、ひいてはＴＣＲ及び／又はＨＬＡなどの標的遺伝子又は染色体配列の発現を低下させることができる。代わりに、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをＲＮＡ干渉のように用いて、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子を可逆的な方式でオフにすることができる。例えば、哺乳類細胞では、ＲＮＡはＣａｓタンパク質、例えばヌクレアーゼ活性が欠損したＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）をＴＣＲ及び／又はＨＬＡプロモーターにガイドし、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断することができる。
【０５６２】
当該技術分野において公知の、例えば米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号明細書に記載される技法を用いて、例えばＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを作成することができる。本明細書に記載される発明において有用となり得るＣＲＩＳＰＲシステムとしては、例えば、国際公開第２０１７／０９３９６９号パンフレット（この内容は全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。
【０５６３】
例えばＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
「ＴＡＬＥＮ」、又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ」、又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ」は、ＨＬＡ及び／又はＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである転写アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼを指す。
【０５６４】
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ開裂ドメインを融合することにより人工的に産生される。転写アクティベータ様効果（ＴＡＬＥ）は、ＨＬＡ又はＴＣＲ遺伝子の部分を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように操作できる。操作されたＴＡＬＥとＤＮＡ開裂ドメインを合わせることにより、ＨＬＡ又はＴＣＲ配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素を産生できる。次いで、これらを細胞に導入でき、そこで、それらは、ゲノムエディティングのために使用され得る。Ｂｏｃｈ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１３５−６；及びＢｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１２；Ｍｏｓｃｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：３５０１。
【０５６５】
ＴＡＬＥは、ザントモナス細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目及び１３番目のアミノ酸以外、反復した高度に保存的な３３〜３４アミノ酸配列を含む。これらの２箇所は、高度に可変であり、特定のヌクレオチド認識と強い相関を示す。それらは、従って、所望のＤＮＡ配列と結合するように操作され得る。
【０５６６】
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質を、野生型又は変異ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ（Ｎ）と融合する。ＴＡＬＥＮにおいて使用するために、ＦｏｋＩについて幾つかの変異が行われており、これらは、例えば、開裂特異性又は活性の改善を含む。Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：ｅ８２；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４３−８；Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：７３１−７３４；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３：３０７；Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：７４−７９；Ｓｚｃｚｅｐｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：７８６−７９３；及びＧｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００：９６。
【０５６７】
ＦｏｋＩドメインは、二量体として機能し、適切な配向及び間隔を有する標的ゲノムにおける部位のための独特なＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ開裂ドメインとの間のアミノ酸残基数及び２の個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両方が高レベルの活性を達成するために重要なパラメータであると考えられる。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４３−８。
【０５６８】
ＨＬＡ又はＴＣＲ  ＴＡＬＥＮを細胞内で使用して二重鎖切断（ＤＳＢ）を産生できる。変異は、修復機構が切断を非相同末端結合により不適切に修復する場合、切断部位に導入できる。例えば、不適切な修復は、フレームシフト変異を導入し得る。代わりに、外来ＤＮＡをＴＡＬＥＮと共に細胞に導入でき、外来ＤＮＡの配列及び染色体配列により、この方法は、ＨＬＡ又はＴＣＲ遺伝子における欠損の補正、又はｗｔ  ＨＬＡ、又はＴＣＲ遺伝子におけるこのような欠損の導入に使用でき、そうしてＨＬＡ又はＴＣＲの発現を減少させる。
【０５６９】
ＨＬＡ又はＴＣＲにおける配列に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュラー要素を使用する多様なスキームを含む、当技術分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４９−５３；Ｇｅｉｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６：ｅ１９５０９。
【０５７０】
例えばＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
「ＺＦＮ」、又は「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」、又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲに対するＺＦＮ」、又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ」は、ＨＬＡ及び／又はＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである亜鉛フィンガーヌクレアーゼを指す。
【０５７１】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（又はその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上の亜鉛フィンガーを含む。Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １８８：７７３−７８２；及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１５６−１１６０。
【０５７２】
亜鉛フィンガーは、１つ以上の亜鉛イオンにより安定化される小タンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことができ、約３ｂｐ配列を認識できる。既知特異性の多様な亜鉛フィンガーを合わせて、約６ｂｐ、９ｂｐ、１２ｂｐ、１５ｂｐ又は１８ｂｐ配列を認識する多フィンガーポリペプチドを産生できる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッド系、細菌ワンハイブリッド及びツーハイブリッド系及び哺乳動物細胞を含む、特異的配列を認識する亜鉛フィンガー（及びそれらの組み合わせ）を産生するための多様な選択及びモジュラーアセンブリー技術が利用可能である。
【０５７３】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡを開裂するために二量体化しなければならない。そのため、ＺＦＮの対が非パリンドロームＤＮＡ部位を標的とすることが必要である。２の各々のＺＦＮは、そのヌクレアーゼが適切に離れて、ＤＮＡの逆の鎖に結合しなければならない。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０５７０−５。
【０５７４】
またＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡに二重鎖切断を創製でき、これは、不適切に修復された場合にフレームシフト変異を創製でき、細胞におけるＨＬＡ及び／又はＴＣＲの発現及び量の減少に至る。ＺＦＮは、ＨＬＡ又はＴＣＲ遺伝子における変異のために相同組換えとも使用できる。
【０５７５】
ＨＬＡ及び／又はＴＣＲにおける配列に特異的なＺＦＮは、当技術分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。Ｃａｔｈｏｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２００−７；及びＧｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００：９６を参照されたい。
【０５７６】
免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化及び増殖
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書に記載する方法を使用して、一般的に活性化及び増殖できる。
【０５７７】
一般に、本発明の免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体結合シグナルを刺激する薬剤が結合したその表面とＴ細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドを接触させることにより増殖できる。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片又は抗ＣＤ２抗体との接触又はカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベータ（例えば、ブリオスタチン）との接触により、本明細書に記載のように刺激し得る。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖刺激に適する条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体がある。抗ＣＤ２８抗体の例は、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８を含み（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、当技術分野で一般に知られる他の方法のように使用できる（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【０５７８】
一態様において、Ｔ細胞のための一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中でも表面と結合し得る。表面に結合しているとき、薬剤は、同じ表面（即ち「シス」形態）又は別の表面（即ち「トランス」形態）に結合し得る。代わりに、一方の薬剤が表面に結合し、他方が溶液にあり得る。一態様において、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中であるか又は表面と結合する。一態様において、両剤は、溶液中にあり得る。一態様において、薬剤は、不溶性形態であり、Ｆｃ受容体又は抗体又は薬剤と結合する他の結合剤を発現する細胞などの表面に架橋され得る。この点に関して、例えば本発明におけるＴ細胞の活性化及び増殖のために意図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書及び同第２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
【０５７９】
一態様において、２剤は、ビーズに、同じビーズ、即ち「シス」又は別のビーズ、即ち「トランス」で固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合断片であり、両剤は、均等な分子量で同じビーズに共固定化される。一態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及びＴ細胞増殖のためのビーズに結合した１：１比の各抗体を使用する。本発明の一態様において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、Ｔ細胞増殖の増殖が観察されるように、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を使用する。特定の一態様において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して約１〜約３倍増加が観察される。一態様において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体比は、１００：１〜１：１００及びその間の全ての整数値の範囲である。本発明の一態様において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合しており、即ちＣＤ３：ＣＤ２８比が１未満である。本発明の一態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体比は、２：１より大きい。特定の一態様において、ビーズに結合した１：１００  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：７５  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。更なる態様において、ビーズに結合した１：５０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：３０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある好ましい態様において、ビーズに結合した１：１０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：３  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。更なる態様において、ビーズに結合した３：１  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。
【０５８０】
１：５００〜５００：１及びその間の任意の整数値の粒子対細胞比をＴ細胞又は他の標的細胞の刺激のために使用し得る。当業者に容易に認識され得るように、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは、少ない細胞にのみ結合でき、大きいビーズは、多く結合できる。一態様において、細胞対粒子比は、１：１００〜１００：１及びその間の任意の整数値の範囲であり、更なる態様において１：９〜９：１及びその間の任意の整数値からなる比をＴ細胞刺激に使用し得る。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は、上記のように変わり得るが、しかしながら、ある好ましい値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１及び１５：１を含み、１つの好ましい比は少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。一態様において、１：１以下の粒子対細胞比を使用する。特定の一態様において、好ましい粒子：細胞比は、１：５である。更なる態様において、粒子対細胞比は、刺激の日により変わり得る。例えば、一態様において、粒子対細胞比は、１日目は１：１〜１０：１であり、更なる粒子をその後１０日目まで連日又は隔日で細胞に添加し、最終比１：１〜１：１０である（添加の比の細胞数に基づく）。特定の一態様において、粒子対細胞比は、刺激１日目に１：１であり、刺激３日目及び５日目に１：５に調節する。一態様において、粒子を、１日目の１：１及び刺激３日目及び５日目の１：５の最終比に基づき、連日又は隔日で添加する。一態様において、粒子対細胞比は、刺激１日目は２：１であり、刺激３日目及び５日目に１：１０に調節する。一態様において、粒子を、１日目の１：１及び３日目及び５日目の１：１０の最終比に基づき、連日又は隔日で添加する。当業者は、多様な他の比が本発明における使用に適し得ることを認識する。特に、比は、粒子径並びに細胞サイズ及びタイプによる。一態様において、使用するための最も典型的な比は、１日目の１：１、２：１及び３：１付近である。
【０５８１】
本発明の更なる態様において、Ｔ細胞などの細胞を薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズ及び細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。異なる態様において、培養前に薬剤被覆ビーズ及び細胞を分離するが、一緒に培養する。更なる態様において、ビーズ及び細胞を磁気力などの力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘導する。
【０５８２】
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ（３ｘ２８ビーズ）とＴ細胞を接触させることにより、ライゲートし得る。一態様において、細胞（例えば、１０４〜１０９Ｔ細胞）及びビーズ（例えば、ＤＹＮＡビーズＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズを１：１比）を緩衝液、例えばＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなどの二価カチオンなし）中で合わせる。再び、任意の細胞濃度を使用し得ることが当業者に容易に認識され得る。例えば、標的細胞は、試料中で極めて稀であり、試料の０．０１％のみが含まれるか又は試料全体（即ち１００％）が目的の標的細胞で構成され得る。従って、あらゆる細胞数が本発明に関連して一体となる。一態様において、細胞と粒子との最大接触を確実にするために、粒子及び細胞を混合する体積を有意に減少させる（即ち細胞の濃度を高める）ことが望ましいことがある。例えば、一態様において、約１００億細胞／ｍｌ、９０億／ｍｌ、８０億／ｍｌ、７０億／ｍｌ、６０億／ｍｌ、又は５０億／ｍｌの濃度を使用する。一態様において、１億細胞／ｍｌ超を使用する。更なる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万又は５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。更なる態様において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億細胞／ｍｌの濃度を使用する。更なる態様において、１億２５００万又は１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加できる。更に、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞の集団は、治療的価値を有し得、及び特定の態様では得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度細胞の使用は、通常、ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０５８３】
一実施形態において、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸が形質導入された細胞を例えば本明細書に記載の方法により増殖する。一実施形態において、細胞を数時間（例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間）〜約１４日（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日）の期間の培養により増殖する。一実施形態において、細胞は、４〜９日の期間増殖される。一実施形態において、細胞は、８日以下、例えば７日、６日又は５日の期間増殖される。一実施形態において、細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ２０  ＣＡＲ、ＣＤ２２  ＣＡＲ、又はＲＯＲ１  ＣＡＲ細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件において９日間培養で増殖された同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、多様なＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死、サイトカイン産生、活性化、遊走又はそれらの組み合わせにより規定され得る。一実施形態において、５日増殖された細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下において９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍又は４倍増加を示す。一実施形態において、細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ２０  ＣＡＲ、ＣＤ２２  ＣＡＲ、又はＲＯＲ１  ＣＡＲを発現する細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件下において９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えばＩＦＮ−γ及び／又はＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。一実施形態において、５日増殖された細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ２０  ＣＡＲ、ＣＤ２２  ＣＡＲ、又はＲＯＲ１  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下において９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生、例えばＩＦＮ−γ及び／又はＧＭ−ＣＳＦレベルのｐｇ／ｍｌで少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれを超えて増加する。
【０５８４】
本発明の一態様において、混合物を数時間（約３時間）〜約１４日又はその間の任意の時間的整数値だけ培養し得る。一態様において、混合物を２１日培養し得る。本発明の一態様において、ビーズ及びＴ細胞を一緒に約８日培養する。一態様において、ビーズ及びＴ細胞を一緒に２〜３日培養する。Ｔ細胞の培養期間が６０日以上となり得るような数サイクルの刺激も望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、血清（例えば、胎児ウシ又はヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ及びＴＮＦ−α又は当業者に知られる細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又はＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネート、及びＮ−アセチル−システイン、及び２−メルカプトエタノールなどの還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、無血清又は適切な量の血清（又は血漿）が添加されたか、又は規定されたセットのホルモン及び／又はＴ細胞の増殖及び拡大に十分な量のサイトカインが添加されたＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５及びＸ−Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシンは、実験的培養においてのみ包含され、対象に注入すべき細胞の培養に含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。
【０５８５】
一実施形態において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーなどの本明細書に記載の方法により測定して、１４日の増殖期間にわたり、細胞の少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）増加をもたらす１つ以上のインターロイキンを含む適切な培地（例えば、本明細書に記載の培地）で増殖させる。一実施形態において、細胞は、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−７（例えば、ＩＬ−１５及びＩＬ−７）の存在下で増殖させる。
【０５８６】
種々の刺激時間に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液又はアフェレーシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性又はサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体での刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８〜９日目前まで主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８〜９日目後、Ｔ細胞の集団は、徐々に大きくなるＴＣ細胞の集団を含む。従って、処置の目的により、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することは有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットを大きい程度まで増殖させることが有利であり得る。
【０５８７】
更に、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖過程の経過中、有意に、しかし、主に再現性よく変化する。そうして、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物をもたらす能力を可能とする。
【０５８８】
ＣＡＲ、例えばＣＤ２０  ＣＡＲが構築されると、適切なインビトロ及び動物モデルにおける抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でのＴ細胞増殖の持続及び抗癌活性など、しかし、これらに限定されない分子の活性を評価するために種々のアッセイが使用され得る。ＣＡＲ、（例えば、ＣＤ２０  ＣＡＲの効果を評価するためのアッセイは、以下に更に詳細に記載する。
【０５８９】
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウエスタンブロット分析を、単量体及び二量体の存在を検出するために使用できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。極めて簡潔には、ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物）をインビトロで１０日超増殖させ、続いて溶解及び還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。全長ＴＣＲ−ζ細胞質ドメイン及び内因性ＴＣＲ−ζ鎖を含むＣＡＲを、ＴＣＲ−ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出する。同じＴ細胞サブセットを、共有結合性二量体形成の評価を可能とするために非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用する。
【０５９０】
抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞のインビトロ増殖をフローサイトメトリーにより測定できる。例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８  ａＡＰＣで刺激し、続いて分析すべきプロモーターの制御下において、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。代表的プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣ又はホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの培養６日目にフローサイトメトリーにより評価する。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。代わりに、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボソームスキッピング配列を使用するＣＡＲとｅＧＦＰを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、１日目にＣＡＲを形質導入する。培養物を、洗浄後、ＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体存在下ｈＣＤ３２及び４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８）で再刺激する。外来性ＩＬ−２を１００ＩＵ／ｍｌにおいて隔日で培養物に添加する。ＧＦＰ＋Ｔ細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。抗ＣＤ２０  Ｔ細胞（例えば、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ２０１４；１２３：２３４３を参照されたい）を用いて、又は抗ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞と共に類似のアッセイを実施することができる。
【０５９１】
再刺激非存在下の持続するＣＡＲ＋Ｔ細胞増殖も測定できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。簡潔には、平均Ｔ細胞体積（ｆｌ）を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激及び１日目の記載するＣＡＲの形質導入後、培養８日目にＣｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ粒子カウンター、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｃｅｐｔｅｒを使用して測定する。
【０５９２】
動物モデルもＣＡＲＴ活性の測定に使用できる。例えば、免疫欠損マウスにおける初代ヒトプレＢ  ＡＬＬを処置するための、ヒトＣＤ１９特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用する異種移植モデルを使用できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。極めて簡潔には、ＡＬＬ確立後、マウスを処置群に無作為化する。異なる数のαＣＤ１９−ζ及びαＣＤ１９−ＢＢ−ζ操作Ｔ細胞を、Ｂ−ＡＬＬを担持するＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ−／−マウスに１：１の比で共注射する。マウスからの脾臓ＤＮＡにおけるαＣＤ１９−ζ及びαＣＤ１９−ＢＢ−ζベクターのコピー数をＴ細胞注射後種々の時点で評価する。動物を１週間間隔で白血病について評価する。末梢血ＣＤ１９＋Ｂ−ＡＬＬ芽細胞数を、αＣＤ１９−ζ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞又は偽形質導入Ｔ細胞を注射したマウスで測定する。ログ・ランク検定を使用して、群の生存曲線を比較する。更に、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ−／−マウスへのＴ細胞注射４週間後の絶対的末梢血ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞数も分析し得る。マウスに白血病性細胞を注射し、３週間後、ｅＧＦＰに連結したＣＡＲをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターによりＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞を注射する。Ｔ細胞を、注入ＧＦＰ＋Ｔ細胞の４５〜５０％に、注射前に偽形質導入細胞と混合することにより標準化し、フローサイトメトリーにより確認する。動物を１週間間隔で白血病について評価する。ＣＡＲ＋Ｔ細胞群の生存曲線を、ログ・ランク検定を使用して比較する。類似の実験をＣＤ２０  ＣＡＲＴで実施できる。
【０５９３】
用量依存的ＣＡＲ処置応答を評価できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。例えば、２１日目にＣＡＲ  Ｔ細胞、等しい数の偽形質導入Ｔ細胞で処置した又はＴ細胞処置なしの、マウスにおいて白血病が確立した後３５〜７０日後に末梢血を得る。各群からのマウスを末梢血ＣＤ１９＋ＡＬＬ芽細胞数の決定のために無作為に採血し、３５日目及び４９日目に屠殺する。残りの動物を５７日目及び７０日目に評価する。類似の実験をＣＤ２０  ＣＡＲＴで実施できる。
【０５９４】
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価は、例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に以前に記載されている。簡潔には、ＣＡＲ介在増殖の評価を、洗浄したＴ細胞と、ＣＤ１９（Ｋ１９）又はＣＤ３２及びＣＤ１３７（ＫＴ３２−ＢＢＬ）を発現するＫ５６２細胞とを最終Ｔ細胞：Ｋ５６２比２：１で混合することによりマイクロタイタープレートにおいて実施する。Ｋ５６２細胞を使用前にガンマ線で照射する。抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び抗ＣＤ２８（クローン９．３）モノクローナル抗体を、これらのシグナルがエクスビボでの長期ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を支持するため、刺激Ｔ細胞増殖について陽性対照として役立つＫＴ３２−ＢＢＬ細胞の培養物に添加する。Ｔ細胞を、製造者により記載のとおりＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びフローサイトメトリーを使用して培養において数える。ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ−２Ａ連結ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターで操作されたＴ細胞を使用するＧＦＰ発現により同定する。ＧＦＰを発現しないＣＡＲ＋Ｔ細胞について、ＣＡＲ＋Ｔ細胞をビオチニル化組み換えＣＤ１９タンパク質及び二次アビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出する。Ｔ細胞のＣＤ４＋及びＣＤ８＋発現も、特異的モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して同時に検出する。サイトカイン測定を、製造業者の指示に従ってヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカイン細胞数測定ビーズアレイキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して再刺激２４時間後に回収した上清で又はＬｕｍｉｎｅｘ  ３０−ｐｌｅｘキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施する。ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して蛍光を評価し、データを製造業者の指示に従って分析する。類似の実験をＣＤ２０  ＣＡＲＴで実施できる。
【０５９５】
細胞毒性を標準的５１Ｃｒ放出アッセイにより評価できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。簡潔には、標的細胞（Ｋ５６２株及び初代プロＢ−ＡＬＬ細胞）に５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４として、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を３７℃で２時間、頻繁に撹拌しながら充填し、完全ＲＰＭＩで２回洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞をウェル中で完全ＲＰＭＩ中に標的細胞と種々のエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で混合する。更なる培地のみ（自発的放出、ＳＲ）又はｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００洗剤１％溶液（全放出、ＴＲ）を含むウェルも調製する。３７℃で４時間のインキュベーション後、各ウェルから上清を回収する。放出された５１Ｃｒを、次いでガンマ粒子カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して測定する。各条件を少なくとも３回行い、溶解のパーセントを式：溶解％＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＴＲ−ＳＲ）（式中、ＥＲは、各実験条件で放出された平均５１Ｃｒを示す）を使用して計算する。
【０５９６】
造影技術を使用して、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送及び増殖を評価できる。このようなアッセイは、例えば、Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２：１５７５−１５８６（２０１１）に記載されている。簡潔には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−（ＮＳＧ）マウスにＮａｌｍ−６細胞をＩＶ注射し、７日後、ＣＡＲ構築物でエレクトロポレーションから４時間後にＴ細胞を注射する。Ｔ細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルス構築物で安定にトランスフェクトされ、マウスをバイオルミネセンスについて造影する。代わりに、Ｎａｌｍ−６異種移植モデルにおけるＣＡＲ＋Ｔ細胞の単回注射の治療有効性及び特異性を次のように測定できる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように形質導入したＮａｌｍ−６を注射し、続いて７日後にＣＡＲで電気穿孔したＴ細胞を１回尾静脈注射する。動物を注射後の種々の時点で造影する。例えば、５日目（処置２日前）及び８日目（ＣＡＲ＋ＰＢＬ後２４時間）に代表的マウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップを作成できる。
【０５９７】
本明細書の実施例のセクションに記載されるもの、並びに当該技術分野において公知のものを含め、他のアッセイも、本明細書に開示されるＣＤ２０  ＣＡＲ又はＣＤ２２  ＣＡＲコンストラクトの評価に用いることができる。
【０５９８】
治療上の適用
ＣＤ２０、ＣＤ１９、及び／又はＣＤ２２関連疾患及び／又は障害
本発明は、特に、ＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２の発現に関連する癌若しくは疾患又はＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を発現する細胞に関連する病態を治療するための組成物及び方法を提供する。一部の実施形態において、癌又は疾患には、例えば、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌病態；又はＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を発現する細胞に関連する非癌関連徴候が含まれる。一態様において、ＣＤ２０の発現に関連する癌又は疾患は血液癌である。一態様において、血液癌としては、限定はされないが、Ｂ細胞悪性腫瘍が挙げられる。一態様において、血液癌は白血病又はリンパ腫である。一態様において、癌、例えばＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２の発現に関連する癌としては、限定はされないが、例えばＢ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むがそれに限定されない１つ以上の急性白血病；慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含むがそれに限定されない１つ以上の慢性白血病；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁層リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及び「前白血病」（これは骨髄性血球細胞の無効な産生（又は異形成）によってまとめられる多様な血液学的病態の群である）を含むがそれに限定されない更なる血液癌又は血液学的病態を含めた癌及び悪性腫瘍が挙げられる。一部の実施形態において、ＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２発現に関連する疾患としては、限定はされないが、ＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を発現する非定型及び／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０５９９】
ＣＤ２０の発現に関連する非癌関連徴候も含まれ得る。ＣＤ２０の発現に関連する非癌関連徴候としては、限定はされないが、例えば自己免疫疾患（例えば、ループス、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、エバンス症候群、脈管炎、水疱性皮膚障害、１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎及びデビック病、グレーブス眼症、及び自己免疫性膵炎）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）及び移植が挙げられる。
【０６００】
一態様において、本発明は、ＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２発現に関連する疾患を治療する方法を提供する。一態様において、本発明は、腫瘍の一部がＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２陰性であり、且つ腫瘍の一部がＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２陽性である疾患を治療する方法を提供する。例えば、本発明のＣＡＲは、ＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２の発現に関連する疾患の治療を受けたことがある対象の治療に有用であり、ここで、ＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２の発現に関して治療を受けたことがある対象は、ＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２の発現に関連する疾患を呈する。
【０６０１】
一態様において、本発明は、哺乳類Ｔ細胞又はＮＫ細胞における発現用のプロモーターに作動可能に連結された本明細書に記載されるとおりのＣＡＲを含むベクターに関する。一態様において、本発明は、ＣＤ２０、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２発現腫瘍の治療において使用するためのＣＡＲを発現する組換えＴ細胞を提供し、ここで、ＣＤ２０  ＣＡＲ、ＣＤ１９  ＣＡＲ、又はＣＤ２２  ＣＡＲを発現する組換えＴ細胞は、それぞれＣＤ２０  ＣＡＲＴ、ＣＤ１９  ＣＡＲＴ又はＣＤ２２  ＣＡＲＴと称される。一態様において、本発明のＣＤ１９  ＣＡＲＴ又はＣＤ２２  ＣＡＲＴは、ＣＡＲＴが腫瘍細胞を標的にし、且つ腫瘍の成長を阻害するように、その表面上に発現する本発明の少なくとも１つのＣＤ２０  ＣＡＲ、ＣＤ１９  ＣＡＲ、又はＣＤ２２  ＣＡＲに腫瘍細胞を接触させる能力を有する。
【０６０２】
一態様において、本発明は、ＣＤ２０発現、ＣＤ１９発現及び／又はＣＤ２２発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法に関し、本方法は、ＣＡＲ発現細胞が抗原に応答して活性化され、且つ癌細胞を標的とするように、本発明のＣＤ２０、ＣＤ１９−及び／又はＣＤ２２−ＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＤ２０、ＣＤ１９−及び／又はＣＤ２２−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞に腫瘍細胞を接触させることを含み、ここで、腫瘍の成長が阻害される。
【０６０３】
一態様において、本発明は、対象の癌を治療する方法に関する。本方法は、対象において癌が治療されるように、本発明のＣＤ２０、ＣＤ１９−及び／又はＣＤ２２−ＣＡＲ発現細胞を対象に投与することを含む。本発明のＣＤ２０、ＣＤ１９−及び／又はＣＤ２２−ＣＡＲ発現細胞によって治療可能な癌の例は、ＣＤ２０の発現に関連する癌である。本発明のＣＤ２０、ＣＤ１９−及び／又はＣＤ２２−ＣＡＲ発現細胞によって治療可能な癌の例としては、限定はされないが、本明細書に記載される血液癌が挙げられる。本発明は、細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変され、及びＣＡＲ発現細胞がそれを必要としているレシピエントに注入される一種の細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を死滅させることが可能である。抗体療法と異なり、ＣＡＲ改変細胞はインビボで複製可能であるため長期間持続し、これが持続的な腫瘍制御につながり得る。様々な態様において、患者に投与されるＴ細胞、又はその子孫は、患者において、患者への細胞の投与後少なくとも４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、１３ヵ月、１４ヵ月、１５ヵ月、１６ヵ月、１７ヵ月、１８ヵ月、１９ヵ月、２０ヵ月、２１ヵ月、２２ヵ月、２３ヵ月、２年、３年、４年、又は５年持続する。
【０６０４】
本発明は、免疫エフェクター細胞、例えばＮＫ細胞又はＴ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を一過性に発現するように例えばインビトロ転写ＲＮＡによって改変され、及びＣＡＲ発現（例えば、ＣＡＲＴ又はＣＡＲ発現ＮＫ）細胞がそれを必要としているレシピエントに注入される一種の細胞療法も含む。注入された細胞は、レシピエントの癌細胞を死滅させることが可能である。従って、様々な態様において、患者に投与されるＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、患者へのＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の投与後１ヵ月未満、例えば３週間、２週間、１週間存在する。
【０６０５】
何らかの特定の理論に拘束されないが、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞又はＮＫ細胞により惹起される抗腫瘍免疫応答は、能動的又は受動的免疫応答であり得るか又は代わりに直接的対間接的免疫応答によるものであり得る。一態様において、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞又はＮＫ細胞は、ＣＤ２０を発現するヒト癌細胞に応答して特定の炎症誘発性サイトカイン分泌及び強力な細胞溶解性活性を示し、可溶性ＣＤ２０阻害に抵抗し、バイスタンダー細胞死に介在し、確立されたヒト腫瘍の退縮に介在する。例えば、ＣＤ２０発現腫瘍の不均一な場における抗原低腫瘍細胞は、近辺の抗原陽性癌細胞に対して先に反応している癌関連抗原のＣＤ２０再指向Ｔ細胞又はＮＫ細胞による間接的破壊を受け得る。
【０６０６】
一態様において、本発明のＣＡＲ修飾細胞、例えば完全ヒトＣＡＲ発現細胞は、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化及び／又はインビボ治療のための１種のワクチンである。一態様において、哺乳動物は、ヒトである。
【０６０７】
エクスビボ免疫化に関して、次の少なくとも１つは、哺乳動物に細胞を投与する前にインビトロで起こる。ｉ）細胞の増殖、ｉｉ）細胞へのＣＡＲをコードする核酸の導入又はｉｉｉ）細胞の凍結保存。
【０６０８】
エクスビボ過程は、当技術分野で周知であり、下により詳細に記載する。簡潔には、細胞を哺乳動物（例えば、ヒト）から単離し、本明細書に記載するＣＡＲを発現するベクターで遺伝的に改変（即ちインビトロで形質導入又はトランスフェクト）される。ＣＡＲ修飾細胞を哺乳動物レシピエントに投与して、治療効果を提供できる。哺乳動物レシピエントは、ヒトであり得、ＣＡＲ修飾細胞は、レシピエントに対して自己であり得る。代わりに、細胞は、レシピエントに対して同種、同系又は異種であり得る。
【０６０９】
参照により本明細書に援用される米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載する造血幹細胞及び前駆細胞のエクスビボ増殖のための方法を本発明の細胞に適用できる。他の適当な方法は、当技術分野で知られ、従って、本発明は、細胞のエクスビボ増殖の特定の方法に限定されない。簡潔には、Ｔ細胞のエクスビボ培養及び増殖は、（１）哺乳動物からの採取した末梢血又は髄外植体からのＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞回収、及び（２）エクスビボでのこのような細胞の増殖を含む。米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載される細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３及びｃ−ｋｉｔリガンドなどの他の因子を細胞の培養及び増殖に使用できる。
【０６１０】
エクスビボ免疫化の点で細胞ベースのワクチンを使用するのに加えて、本発明は、患者における抗原に対する免疫応答を惹起するための、インビボ免疫化のための組成物及び方法も提供する。
【０６１１】
概して、本明細書に記載されるとおり活性化され、拡大される細胞は、免疫無防備状態の個体に生じる疾患の治療及び予防に利用され得る。詳細には、本発明のＣＡＲ改変細胞は、ＣＤ２０の発現に関連する疾患、障害及び病態の治療に使用される。特定の態様において、本発明の細胞は、ＣＤ２０の発現に関連する疾患、障害及び病態を発症するリスクがある患者の治療に使用される。従って、本発明は、本発明のＣＡＲ改変細胞の治療有効量を、それを必要としている対象に投与することを含む、ＣＤ２０の発現に関連する疾患、障害及び病態の治療又は予防方法を提供する。
【０６１２】
一態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌病態の治療に使用され得る。一態様において、ＣＤ２０の発現に関連する癌は、細胞の異常な成長によって特徴付けられる血液癌、前白血病、過剰増殖性障害、過形成又は異形成である。
【０６１３】
一態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞は癌の治療に使用され、ここで、癌は血液癌である。血液癌病態は、白血病及び悪性リンパ球増殖性病態など、血液、骨髄及びリンパ系に発症する種類の癌である。
【０６１４】
白血病は、急性白血病と慢性白血病とに分類することができる。急性白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）とに細分することができる。慢性白血病には慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が含まれる。他の関連する病態には骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、旧称「前白血病」）が含まれ、これは、骨髄性血球細胞の無効な産生（又は異形成）及びＡＭＬへの形質転換リスクによってまとめられる多様な血液学的病態の群である。
【０６１５】
リンパ腫は、リンパ球から発達する血球細胞腫瘍の群である。例示的リンパ腫には、非ホジキンリンパ腫及びホジキンリンパ腫が含まれる。
【０６１６】
一態様において、本発明の組成物及びＣＡＲ発現細胞は、非ホジキンリンパ腫、例えばＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫、又はＣＬＬなどのＢ細胞悪性腫瘍の治療に特に有用である。
【０６１７】
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、Ｂ細胞又はＴ細胞のいずれかから形成されるリンパ球の癌の群である。ＮＨＬはいずれの年齢でも起こり、多くの場合、正常よりも大きいリンパ節、体重減少、及び発熱によって特徴付けられる。ＮＨＬの異なる種類は、侵攻型（急激に成長する）及び無痛型（成長が遅い）に分類される。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫には、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫が含まれる。Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫の例としては、菌状息肉症、未分化大細胞型リンパ腫、及び前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫が挙げられる。骨髄移植後又は幹細胞移植後に起こるリンパ腫は、典型的にはＢ細胞非ホジキンリンパ腫である。例えば、Ｍａｌｏｎｅｙ．ＮＥＪＭ．３６６．２１（２０１２）：２００８−１６を参照されたい。
【０６１８】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、Ｂ細胞から発達するＮＨＬの一形態である。ＤＬＢＣＬは、リンパ節内又はリンパ系外、例えば胃腸管、精巣、甲状腺、皮膚、乳房、骨、又は脳に生じ得る侵攻性リンパ腫である。ＤＬＢＣＬでは一般に３つの細胞形態変種：中心芽球型、免疫芽球型、及び未分化型が観察される。中心芽球形態は最も一般的であり、細胞質が最小限の中型〜大型リンパ球の出現を有する。ＤＬＢＣＬにはサブタイプが幾つかある。例えば、原発性中枢神経系リンパ腫は、脳にのみ発症するＤＬＢＣＬの一種であり、脳以外の範囲に発症するＤＬＢＣＬと異なって呼ばれ且つ治療される。別の種類のＤＬＢＣＬは原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫であり、これは多くの場合に若年患者に起こり、胸部で急激に成長する。ＤＬＢＣＬの症状には、肥大したリンパ節によって引き起こされる頸部、腋窩、又は鼡径部の無痛性の急激な腫脹が含まれる。一部の対象については、腫脹は有痛性のこともある。ＤＬＢＣＬの他の症状には、寝汗、原因不明発熱、及び体重減少が含まれる。ほとんどのＤＬＢＣＬ患者は成人であるが、この疾患は時に小児に起こる。ＤＬＢＣＬの治療には、化学療法（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、エトポシド）、抗体（例えば、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ））、放射線照射、又は幹細胞移植が含まれる。
【０６１９】
濾胞性リンパ腫は、一種の非ホジキンリンパ腫であり、濾胞中心Ｂ細胞（中心細胞及び中心芽球）のリンパ腫であり、少なくとも部分的に濾胞状のパターンを有する。濾胞性リンパ腫細胞はＢ細胞マーカーのＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２を発現する。濾胞性リンパ腫細胞は、一般にＣＤ５陰性である。形態学的には、濾胞性リンパ腫腫瘍は、中心細胞の混合物を含む濾胞（切断型濾胞中心細胞又は小細胞とも称される）及び中心芽球（大型非切断型濾胞中心細胞又は大細胞とも称される）で構成される。濾胞は非悪性細胞、大部分はＴ細胞に取り囲まれている。濾胞は主に中心細胞を含み、少数の中心芽球を伴う。世界保健機関（ＷＨＯ）は、この疾患を以下のとおり形態学的にグレード分けしている：グレード１（強拡大視野（ｈｐｆ）当たり＜５個の中心芽球；グレード２（６〜１５個の中心芽球／ｈｐｆ）；グレード３（＞１５個の中心芽球／ｈｐｆ）。グレード３は以下のグレードに更に細分される：グレード３Ａ（中心細胞がなおも存在する）；グレード３Ｂ（濾胞がほぼ完全に中心芽球からなる）。濾胞性リンパ腫の治療には、化学療法、例えばアルキル化剤、ヌクレオシド類似体、アントラサイクリン含有レジメン、例えばＣＨＯＰ−シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン／プレドニゾロンと呼ばれる併用療法、抗体（例えば、リツキシマブ）、放射免疫療法、及び造血幹細胞移植が含まれる。
【０６２０】
ＣＬＬは、骨髄、血液、リンパ節、及び脾臓における新生細胞の増殖及び蓄積によって特徴付けられるＢ細胞悪性腫瘍である。ＣＬＬの診断時の年齢中央値は約６５歳である。現行の治療には、化学療法、放射線療法、生物学的療法、又は骨髄移植が含まれる。時に症状は外科的に（例えば、脾摘出術による肥大化した脾臓の除去）又は放射線療法によって（例えば、腫大リンパ節の減量）治療される。ＣＬＬを治療する化学療法剤としては、例えば、フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン）、クロラムブシル、ビンクリスチン、ペントスタチン、シクロホスファミド、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）、ドキソルビシン、及びプレドニゾンが挙げられる。ＣＬＬ用の生物学的療法としては、抗体、例えばアレムツズマブ、リツキシマブ、及びオファツムマブ；並びにチロシンキナーゼ阻害薬療法が挙げられる。幾つもの基準、例えばライ（Ｒａｉ）又はビネー（Ｂｉｎｅｔ）方式を用いてＣＬＬのステージを分類することができる。ライ方式は、ＣＬＬが５つのステージを有するものとして記載する：ステージ０、リンパ球増加症のみが存在する；ステージＩ、リンパ節症が存在する；ステージＩＩ、脾腫、リンパ節症、又は両方が存在する；ステージＩＩＩ、貧血症、臓器肥大、又は両方が存在する（進行は、体重減少、疲労、発熱、重度の臓器肥大、及びリンパ球数の急激な増加によって定義付けられる）；及びステージＩＶ、貧血症、血小板減少症、臓器肥大、又はこれらの組み合わせが存在する。ビネーのステージ分類方式に基づき、３つのカテゴリがある：ステージＡ、リンパ球増加症が存在し、３つ未満のリンパ節が腫大している（このステージには、ライのステージ０患者の全て、ライのステージＩ患者の半分、及びライのステージＩＩ患者の３分の１が含まれる）；ステージＢ、３つ以上のリンパ節に病変がある；及びステージＣ、貧血症又は血小板減少症、又は両方が存在する。これらの分類方式を免疫グロブリン遺伝子の突然変異の測定値と組み合わせて、疾患の状態のより正確な特徴付けを提供することができる。突然変異免疫グロブリン遺伝子の存在は予後判定の改善と相関する。
【０６２１】
別の実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、癌又は白血病、例えば白血病幹細胞を伴うものの治療に使用される。例えば、白血病幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−白血病細胞である。
【０６２２】
本発明は、特に、癌を治療するための組成物及び方法を提供する。一態様において、癌は、限定はされないが、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むがそれに限定されない１つ以上の急性白血病；慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含むがそれに限定されない１つ以上の慢性白血病；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁層リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及び「前白血病」（これは骨髄性血球細胞の無効な産生（又は異形成）によってまとめられる多様な血液学的病態の群である）を含むがそれに限定されない更なる血液癌又は血液学的病態を含めた血液癌、並びに限定はされないが、ＣＤ２０を発現する非定型及び／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患を含めたＣＤ２０発現に関連する疾患；及びこれらの任意の組み合わせである。
【０６２３】
本発明のＣＡＲ改変細胞は、単独で投与されても、又は希釈剤との、及び／又はＩＬ−２若しくは他のサイトカイン若しくは細胞集団などの他の成分との組み合わせで医薬組成物として投与され得る。
【０６２４】
別の態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、以前にＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞で治療された対象の治療に使用することができる。一部の実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、以前にＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞で治療された癌又は他の病態の再発後に投与される。
【０６２５】
一部の実施形態において、癌又は他の病態はＣＤ１９発現性である。一部の実施形態において、癌又は他の病態はＣＤ２０発現性である。一部の実施形態において、癌又は他の病態はＣＤ１９及びＣＤ２０発現性である。
【０６２６】
一部の実施形態において、癌又は他の病態は以前にＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞に応答性であったことがない。一部の実施形態において、主題の癌又は他の病態はＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性である。一部の実施形態において、癌又は他の病態はＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞による治療に現在と比べてより高い応答性を有した。一部の実施形態において、癌又は他の病態はＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった。一部の実施形態において、癌又は他の病態はＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であったと共に、もはやＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞に応答性でない。
【０６２７】
一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞及びＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞（例えば、本明細書に記載されるとおりの）が同時に投与される。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞及びＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞（例えば、本明細書に記載されるとおりの）は、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞に対する応答性が低下した又は失われたため同時に投与される。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞療法は中断されている。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲ療法は、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞に対する応答性が低下した又は失われたため中断されている。
【０６２８】
一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞及びＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞（例えば、本明細書に記載されるとおりの）が同時に投与される。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞及びＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞（例えば、本明細書に記載されるとおりの）は、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞に対する応答性が低下した又は失われたため同時に投与される。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞療法は中断されている。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲ療法は、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞に対する応答性が低下した又は失われたため中断されている。
【０６２９】
一部の実施形態において、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞及びＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞（例えば、本明細書に記載されるとおりの）が同時に投与される。一部の実施形態において、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞及びＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞（例えば、本明細書に記載されるとおりの）は、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞に対する応答性が低下した又は失われたため同時に投与される。一部の実施形態において、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞療法は中断されている。一部の実施形態において、ＣＤ２２  ＣＡＲ療法は、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞に対する応答性が低下した又は失われたため中断されている。
【０６３０】
一部の実施形態において、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞及びＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞（例えば、本明細書に記載されるとおりの）が同時に投与される。一部の実施形態において、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞及びＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞（例えば、本明細書に記載されるとおりの）は、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞に対する応答性が低下した又は失われたため同時に投与される。一部の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞療法は中断されている。一部の実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲ療法は、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞に対する応答性が低下した又は失われたため中断されている。
【０６３１】
本発明は、ＣＤ２０発現細胞集団の増殖を阻害する又はそれを減少させる方法も提供し、本方法は、ＣＤ２０発現細胞を含む細胞の集団と、ＣＤ２０発現細胞に結合する本発明のＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞とを接触させることを含む。ある具体的な態様において、本発明は、ＣＤ２０を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害する又はそれを減少させる方法を提供し、本方法は、ＣＤ２０発現癌細胞集団と、ＣＤ２０発現細胞に結合する本発明のＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞とを接触させることを含む。一態様において、本発明は、ＣＤ２０を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害する又はそれを減少させる方法を提供し、本方法は、ＣＤ２０発現癌細胞集団と、ＣＤ２０発現細胞に結合する本発明のＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞とを接触させることを含む。特定の態様において、本発明のＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ２０発現細胞に関連するＢ細胞悪性腫瘍又は別の癌を有する対象又はそれの動物モデルにおいて、細胞及び／又は癌細胞の分量、数、量又は割合を陰性対照と比べて少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％減少させる。一態様において、対象はヒトである。
【０６３２】
本発明は、ＣＤ２０発現細胞に関連する疾患（例えば、ＣＤ２０を発現する血液癌又は非定型癌）を予防、治療及び／又は管理する方法も提供し、本方法は、必要としている対象にＣＤ２０発現細胞に結合する本発明のＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。一態様において、対象はヒトである。ＣＤ２０発現細胞に関連する障害の非限定的な例としては、自己免疫疾患（例えば、ループス、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、エバンス症候群、脈管炎、水疱性皮膚障害、１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎及びデビック病、グレーブス眼症、及び自己免疫性膵炎）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）、移植、及び癌（ＣＤ２０を発現する血液癌又は非定型癌など）が挙げられる。
【０６３３】
本発明は、ＣＤ２０発現細胞に関連する疾患を予防、治療及び／又は管理する方法も提供し、本方法は、必要としている対象にＣＤ２０発現細胞に結合する本発明のＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。一態様において、対象はヒトである。
【０６３４】
本発明は、ＣＤ２０発現細胞に関連する癌の再発を予防する方法を提供し、本方法は、ＣＤ２０発現細胞に結合する本発明のＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞を、それを必要としている対象に投与することを含む。一態様において、本方法は、ＣＤ２０発現細胞に結合する本明細書に記載されるＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞の有効量を別の療法の有効量と併用してそれを必要としている対象に投与することを含む。
【０６３５】
一部の実施形態において、ＣＤ２０発現細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ−１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１０、ＣＤ３４、及び／又はＣＤ２２を発現する。特定の実施形態において、ＣＤ２０発現細胞は、ＣＤ１９を発現する。一部の実施形態において、ＣＤ２０発現細胞は、ＣＤ１９を発現しない。
【０６３６】
一部の実施形態において、対象はＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して非奏効者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して部分奏効者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して完全奏効者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して非再発者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して再発者である。
【０６３７】
一部の実施形態において、以前ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった癌又は他の病態はＣＤ１９を発現しない。一部の実施形態において、以前ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった癌又は他の病態は、癌又は他の病態がＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であったときと比べてＣＤ１９発現レベルが１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又はそれを超えて低下する。一部の実施形態において、以前ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった癌又は他の病態はＣＤ２２及び／又はＣＤ１２３を発現する。
【０６３８】
一部の実施形態において、本発明のＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、以前ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞で治療された癌又は他の病態の再発後に投与される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞とＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞とは同時に投与される。
【０６３９】
骨髄アブレーション
一態様において、本発明は骨髄アブレーションのための組成物及び方法を提供する。例えば、一態様において、本発明は、対象の既存の骨髄の少なくとも一部分を根絶するための組成物及び方法を提供する。本明細書には、特定の例において、本発明のＣＤ２０  ＣＡＲを含むＣＤ２０発現細胞がＣＤ２０陽性骨髄ミエロイド前駆細胞を根絶させることが記載される。
【０６４０】
一態様において、本発明は骨髄アブレーション方法を提供し、本方法は、骨髄アブレーションを必要としている対象に本発明のＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。例えば、本方法は、骨髄移植又は骨髄再生が有益な治療戦略である疾患又は障害を有する対象の既存の骨髄の一部又は全てを根絶させるために使用され得る。一態様において、本明細書の他の部分に記載されるＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞の投与を含む本発明の骨髄アブレーション方法は、対象において骨髄移植前に実施される。従って、一態様において、本発明の方法は、骨髄又は幹細胞移植前の細胞コンディショニングレジメンを提供する。一態様において、骨髄移植は幹細胞移植を含む。骨髄移植は自己細胞又は同種異系細胞の移植を含み得る。
【０６４１】
本発明は、疾患又は障害の治療方法を提供し、本方法は、既存の骨髄の少なくとも一部分を根絶させるため本発明のＣＤ２０発現細胞を投与することを含む。本方法は、骨髄移植が有益な任意の疾患又は障害を治療するための治療レジメンの少なくとも一部分として使用され得る。即ち、本方法は、骨髄移植を必要としている任意の対象で使用され得る。一態様において、ＣＤ２０発現細胞の投与を含む骨髄アブレーションは、ＡＭＬの治療において有用である。特定の態様において、本方法による骨髄アブレーションは、血液癌、固形腫瘍、血液疾患、代謝障害、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、リソソーム蓄積障害、及び免疫不全症の治療において有用である。
【０６４２】
本明細書に開示される組成物及び方法を使用して既存の骨髄の少なくとも一部分を根絶することにより、限定はされないが、本明細書に記載される癌、例えば白血病、リンパ腫、骨髄腫、ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＣＭＬ、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、ＤＬＢＣＬ又は濾胞性リンパ腫）、及び多発性骨髄腫を含めた血液癌を治療し得る。
【０６４３】
本明細書に開示される組成物及び方法を使用して、限定はされないが、特に、骨髄形成異常、貧血症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、再生不良性貧血、後天性赤芽球癆、ダイアモンド・ブラックファン貧血症、ファンコニー貧血、血球減少症、無巨核球性血小板減少症、骨髄増殖性疾患、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、骨髄線維症、異常ヘモグロビン症、鎌状赤血球症、β重症型サラセミアを含めた血液疾患を治療し得る。
【０６４４】
一態様において、本発明は、骨髄コンディショニングを含む癌の治療方法を提供し、ここで、本発明のＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞によって対象の骨髄の少なくとも一部分が根絶される。例えば、特定の例では、対象の骨髄は、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞の活性によって標的化し除去することのできる悪性前駆細胞を含む。一態様において、骨髄コンディショニング療法は、天然骨髄の根絶後に対象に骨髄又は幹細胞移植を投与することを含む。一態様において、骨髄再生療法は、限定はされないが、抗腫瘍ＣＡＲ療法、化学療法、放射線照射など、１つ以上の他の抗癌療法と組み合わされる。
【０６４５】
一態様において、骨髄の注入前又は幹細胞移植前に、投与されたＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞の根絶が必要になり得る。ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞の根絶は、限定はされないが、自殺遺伝子の使用、ＲＮＡにコードされるＣＡＲを用いた限定的なＣＡＲ持続性、又は抗体若しくは化学療法を含む抗Ｔ細胞モダリティを含めた任意の好適な戦略又は治療を用いて達成され得る。
【０６４６】
ＣＤ２２関連疾患及び／又は障害
本開示は、特に、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は前癌病態を例えば含む、ＣＤ２２の発現に関連する疾患又はＣＤ２２を発現する細胞に関連する病態；又はＣＤ２２を発現する細胞に関連する非癌関連徴候を治療するための組成物及び方法を提供する。一態様において、ＣＤ２２の発現に関連する癌は血液癌である。一態様において、血液癌としては、限定はされないが、Ｂ細胞悪性腫瘍が挙げられる。一態様において、血液癌は白血病又はリンパ腫である。一態様において、ＣＤ２２の発現に関連する癌としては、限定はされないが、例えばＢ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むがそれに限定されない１つ以上の急性白血病；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含むがそれに限定されない１つ以上の慢性白血病；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁層リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含むがそれに限定されない更なる血液癌又は血液学的病態を含めた癌及び悪性腫瘍が挙げられる。別の実施形態において、ＣＤ２２発現に関連する疾患としては、限定はされないが、ＣＤ２２を発現する非定型及び／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患；及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０６４７】
ＣＤ２２の発現に関連する非癌関連徴候も含まれ得る。ＣＤ２２の発現に関連する非癌関連徴候としては、限定はされないが、例えば自己免疫疾患（例えば、ループス、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、エバンス症候群、脈管炎、水疱性皮膚障害、１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎及びデビック病、グレーブス眼症、及び自己免疫性膵炎）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）及び固形臓器移植又は造血細胞移植が挙げられる。
【０６４８】
一態様において、本開示は、ＣＤ２２発現に関連する疾患の治療方法を提供する。一態様において、本開示は、腫瘍の一部がＣＤ２２陰性であり、且つ腫瘍の一部がＣＤ２２陽性である疾患の治療方法を提供する。例えば、本開示のＣＡＲは、ＣＤ２２の発現に関連する疾患に対する治療を受けたことがある対象の治療に有用であり、ここで、ＣＤ２２の発現に関する治療を受けたことがある対象は、ＣＤ２２の発現に関連する疾患を呈する。
【０６４９】
一態様において、本開示は、哺乳類細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）における発現用のプロモーターに作動可能に連結されたＣＤ２２  ＣＡＲを含むベクターに関する。一態様において、本開示は、ＣＤ２２発現腫瘍の治療における使用のためのＣＤ２２  ＣＡＲを発現する組換えＴ細胞を提供し、ここで、ＣＤ２２  ＣＡＲを発現する組換えＴ細胞は、ＣＤ２２  ＣＡＲＴと称される。一態様において、本開示のＣＤ２２  ＣＡＲＴ又はＣＤ２２  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、ＣＡＲＴ又はＣＤ２２  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞が腫瘍細胞を標的にし、腫瘍の成長を阻害するように、腫瘍細胞と、その表面上に発現する本開示の少なくとも１つのＣＤ２２  ＣＡＲとを接触させる能力を有する。
【０６５０】
一態様において、本開示は、ＣＤ２２発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法に関し、本方法は、ＣＡＲＴが抗原に応答して活性化され、癌細胞を標的にするように、腫瘍細胞と、本開示のＣＤ２２  ＣＡＲ細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）とを接触させることを含み、ここで、腫瘍の成長が阻害される。
【０６５１】
一態様において、本開示は、対象の癌を治療する方法に関する。本方法は、対象において癌が治療されるように、本開示のＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を対象に投与することを含む。本開示のＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）によって治療可能な癌の例は、ＣＤ２２の発現に関連する癌である。本開示のＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）によって治療可能な癌の例としては、限定はされないが、本明細書に記載される血液癌が挙げられる。
【０６５２】
本開示は、細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変され、及びＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）がそれを必要としているレシピエントに注入される一種の細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を死滅させることが可能である。抗体療法と異なり、ＣＡＲ改変細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）はインビボで複製可能であるため長期間持続し、これが持続的な腫瘍制御につながり得る。様々な態様において、患者に投与される細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）、又はその子孫は、患者において、患者へのＴ細胞の投与後少なくとも４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、１３ヵ月、１４ヵ月、１５ヵ月、１６ヵ月、１７ヵ月、１８ヵ月、１９ヵ月、２０ヵ月、２１ヵ月、２２ヵ月、２３ヵ月、２年、３年、４年、又は５年持続する。
【０６５３】
本開示は、免疫エフェクター細胞、例えばＮＫ細胞又はＴ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を一過性に発現するように例えばインビトロ転写ＲＮＡによって改変され、及びＣＡＲ発現（例えば、ＣＡＲＴ又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞）細胞がそれを必要としているレシピエントに注入される一種の細胞療法も含む。注入された細胞は、レシピエントの癌細胞を死滅させることが可能である。従って、様々な態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、患者に投与され、患者へのＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の投与後１ヵ月未満、例えば３週間、２週間、１週間持続する。
【０６５４】
いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、ＣＡＲ改変細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動免疫又は受動免疫応答であり得、又は代わりに間接的な免疫応答に対して直接の免疫応答に起因し得る。一態様において、ＣＡＲ形質導入細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、ＣＤ２２を発現するヒト癌細胞に応答して特異的な炎症誘発性サイトカイン分泌及び強力な細胞溶解活性を呈し、可溶性ＣＤ２２阻害に抵抗し、バイスタンダー死滅を媒介し、樹立されたヒト腫瘍の退縮を媒介する。例えば、ＣＤ２２発現腫瘍の異種領域内の抗原のない腫瘍細胞は、以前に隣接する抗原陽性癌細胞に対して応答したＣＤ２２リダイレクトＴ細胞による間接的な破壊を受け易いものであり得る。
【０６５５】
一態様において、本開示のＣＡＲ改変細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）、例えば完全ヒトＣＡＲ発現細胞は、エキソビボ免疫化用及び／又は哺乳類におけるインビボ療法用の一種のワクチンであり得る。一態様において、哺乳類はヒトである。
【０６５６】
エキソビボ免疫化に関して、哺乳類への細胞の投与前に、以下の少なくとも１つがインビトロで行われる：ｉ）細胞の拡大、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入、又はｉｉｉ）細胞の凍結保存。
【０６５７】
エキソビボ手順は当該技術分野において周知であり、以下で更に詳しく考察する。簡潔に言えば、哺乳類（例えば、ヒト）から細胞を単離し、本明細書に開示されるＣＡＲを発現するベクターによって遺伝子改変する（即ちインビトロで形質導入又はトランスフェクトする）。このＣＡＲ改変細胞を哺乳類レシピエントに投与すると、治療利益がもたらされ得る。哺乳類レシピエントはヒトであり得、ＣＡＲ改変細胞はレシピエントにとって自己であり得る。代わりに、細胞はレシピエントにとって同種異系、同系又は異種であり得る。
【０６５８】
造血幹細胞及び前駆細胞のエキソビボ拡大手順については、米国特許第５，１９９，９４２号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されており、本開示の細胞に適用することができる。他の好適な方法が当該技術分野において公知であり、従って本開示は、細胞をエキソビボ拡大するいかなる特定の方法にも限定されない。簡潔に言えば、Ｔ細胞のエキソビボ培養及び拡大は、（１）哺乳類からの末梢血採血又は骨髄外植片からＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞を収集すること；及び（２）かかる細胞をエキソビボで拡大することを含む。米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載される細胞の成長因子に加えて、細胞の培養及び拡大には、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３及びｃ−ｋｉｔリガンドなどの他の因子を使用し得る。
【０６５９】
エキソビボ免疫化の点で細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本開示は、インビボ免疫化により患者において抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物及び方法も提供する。
【０６６０】
概して、本明細書に記載されるとおり活性化され、拡大される細胞は、免疫無防備状態の個体に生じる疾患の治療及び予防に利用され得る。詳細には、本開示のＣＡＲ改変細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、ＣＤ２２の発現に関連する疾患、障害及び病態の治療に使用される。特定の態様において、本開示の細胞は、ＣＤ２２の発現に関連する疾患、障害及び病態を発症するリスクがある患者の治療に使用される。従って、本開示は、ＣＤ２２の発現に関連する疾患、障害及び病態の治療又は予防方法を提供し、本方法は、本開示のＣＡＲ改変細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の治療有効量を、それを必要としている対象に投与することを含む。
【０６６１】
一態様において、本開示のＣＡＲ発現細胞は、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は前癌病態の治療に使用され得る。一態様において、ＣＤ２２の発現に関連する癌は、細胞の異常な成長によって特徴付けられる血液癌、前白血病、過剰増殖性障害、過形成又は異形成である。
【０６６２】
一態様において、本開示のＣＡＲ発現細胞は癌の治療に使用され、ここで、癌は血液癌である。血液癌病態は、白血病及び悪性リンパ球増殖性病態など、血液、骨髄及びリンパ系に発症する種類の癌である。
【０６６３】
白血病は、急性白血病及び慢性白血病に分類できる。急性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）として更に分類され得る。慢性白血病は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び慢性リンパ系白血病（ＣＬＬ）を含む。他の関連する状態は、骨髄球性血液細胞の産生不良（又は異形成）によりまとめられる血液学的状態の多様な集合であり、ＡＭＬに癌化するリスクがある骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、以前は「前白血病状態」として知られる）である。
【０６６４】
リンパ腫は、リンパ球から生じる血液細胞腫瘍の群である。代表的リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫及びホジキンリンパ腫を含む。
【０６６５】
ある態様において、本開示の組成物及びＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、非ホジキンリンパ腫、例えばＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫、又はＣＬＬなどのＢ細胞悪性腫瘍を処置するのに特に有用である。
【０６６６】
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、Ｂ細胞又はＴ細胞のいずれかから形成される、リンパ球の癌の群である。ＮＨＬは、あらゆる年齢で起こり、多くの場合、正常なものより大きいリンパ節、体重減少及び発熱を特徴とする。異なるＮＨＬ型は、中悪性度（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）（急速進行）及び低悪性度（緩徐進行）型として大別される。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫は、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫を包含する。Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫の例としては、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、及び前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫が挙げられる。骨髄又は幹細胞移植後に起こるリンパ腫は、典型的にはＢ細胞非ホジキンリンパ腫である。例えば、Ｍａｌｏｎｅｙ．ＮＥＪＭ．３６６．２１（２０１２）：２００８−１６を参照されたい。
【０６６７】
びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、Ｂ細胞から発生するＮＨＬの一形態である。ＤＬＢＣＬは、リンパ節内又はリンパ系の外部、例えば胃腸管、精巣、甲状腺、皮膚、乳房、骨又は脳において生じ得る中悪性度リンパ腫である。ＤＬＢＣＬでは、細胞の形状の３つの変異体、中心芽球型、免疫芽球型及び未分化型が一般に観察される。中心芽球型の形状が最もよく見られ、最小の細胞質を伴う中〜大型リンパ球の外観を有する。ＤＬＢＣＬには幾つかの亜型がある。例えば、原発性中枢神経系リンパ腫は、もっぱら脳を冒すＤＬＢＣＬの１つの型を指し、脳外の領域を冒すＤＬＢＣＬとは別ものとして処置される。ＤＬＢＣＬのもう１つの型は、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫であり、これは、多くの場合、若年患者において起こり、胸部で急速に進行する。ＤＬＢＣＬの症状としては、肥大したリンパ節に起因する頸部、腋窩部又は鼠径部における無痛の急速な腫脹が挙げられる。一部の対象については、腫脹が有痛であることもある。ＤＬＢＣＬの他の症状としては、寝汗、原因不明の発熱、及び体重減少が挙げられる。ＤＬＢＣＬを有するほとんどの患者は、成人であるが、この疾患が小児において起こることもある。ＤＬＢＣＬの処置としては、化学療法（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、エトポシド）、抗生物質（例えば、リツキサン）、放射線、又は幹細胞移植が挙げられる。
【０６６８】
非ホジキンリンパ腫の１つの型である濾胞性リンパ腫は、少なくとも部分的に濾胞性のパターンを有する濾胞中心Ｂ細胞（セントロサイト及び中心芽球）のリンパ腫である。濾胞性リンパ腫細胞は、Ｂ細胞マーカーＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ２２を発現する。濾胞性リンパ腫細胞は、一般に、ＣＤ５に関して陰性である。形態学的には、濾胞性リンパ腫腫瘍は、セントロサイト（くびれのある濾胞中心細胞又は小細胞とも呼ばれる）と中心芽球（くびれのない大型濾胞中心細胞又は大細胞とも呼ばれる）の混合物を含有する濾胞で構成されている。濾胞は、非悪性細胞、主にＴ細胞によって包囲されている。濾胞は、主としてセントロサイトを含有し、少数の中心芽細胞を有する。世界保健機関（ＷＨＯ）は、形態学的にこの疾患を次のように分類している：グレード１［高倍率視野（ｈｐｆ）当たり＜５個の中心芽球］、グレード２（６〜１５個の中心芽球／ｈｐｆ）、グレード３（＞１５個の中心芽球／ｈｐｆ）。グレード３は、以下のグレードに更に細分される：グレード３Ａ（セントロサイトが依然として存在する）、グレード３Ｂ（濾胞がほぼ全て中心芽球からなる）。濾胞性リンパ腫の処置としては、化学療法、例えばアルキル化剤、ヌクレオシド類似体、アントラサイクリン含有レジメン、例えばＣＨＯＰと呼ばれる併用療法−シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン／プレドニゾロン、抗体（例えば、リツキシマブ）、放射免疫療法、及び造血幹細胞移植が挙げられる。
【０６６９】
ＣＬＬは、骨髄、血液、リンパ節及び脾臓における新生物細胞増殖及び蓄積を特徴とするＢ細胞悪性腫瘍である。ＣＬＬの診断時の年齢中央値は、約６５歳である。現行の処置としては、化学療法、放射線療法、生物学的療法、又は骨髄移植が挙げられる。症状は、外科的に（例えば、肥大した脾臓の脾摘出術での除去）、又は放射線療法（例えば、腫脹したリンパ節を減量すること）によって処置されることもある。ＣＬＬを処置するための化学療法剤としては、例えば、フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン）、クロラムブシル、ビンクリスチン、ペントスタチン、シクロホスファミド、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）、ドキソルビシン及びプレドニゾンが挙げられる。ＣＬＬのための生物学的療法としては、抗体、例えばアレムツズマブ、リツキシマブ及びオファツムマブ；並びにチロシンキナーゼ阻害剤療法が挙げられる。多数の基準、例えばＲａｉ又はＢｉｎｅｔシステムを使用して、ＣＬＬの病期を分類することができる。Ｒａｉシステムは、５つの病期を有するものとして（ｈａｓ  ｈａｖｉｎｇ）ＣＬＬを説明する：リンパ球増加のみが存在する病期０；リンパ節腫大が存在する病期Ｉ；巨脾症、リンパ節腫大、又は両方が存在する病期ＩＩ；貧血、臓器肥大、又は両方が存在する病期ＩＩＩ（進行は体重減少、疲労、発熱、広範囲の臓器肥大、及びリンパ球数急増によって定義される）；及び貧血、血小板減少症、臓器肥大、又はこれらの組み合わせが存在する病期ＩＶ。Ｂｉｎｅｔ病期分類システムのもとには３つのカテゴリがある：リンパ球増加が存在し、３つ未満のリンパ節が肥大している病期Ａ（この病期は、Ｒａｉ病期０の患者全て、Ｒａｉ病期Ｉの患者の半分、及びＲａｉ病期ＩＩの患者の３分の１を含む）；３つ以上のリンパ節が罹患している病期Ｂ；及び貧血若しくは血小板減少症、又は両方が存在する病期Ｃ。これらの分類システムを免疫グロブリン遺伝子の変異の測定値と併用して、その疾患の状況のより正確な特徴付けを行うことができる。変異した免疫グロブリン遺伝子の存在は、予後改善と相関する。
【０６７０】
別の実施形態において、本開示のＣＡＲ発現細胞は、例えば、白血病幹細胞を用いて、癌又は白血病を処置するために使用される。例えば、白血病幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−白血病細胞である。
【０６７１】
本開示は、特に、癌の治療のための組成物及び方法を提供する。一態様において、癌は、限定はされないが、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むがそれに限定されない１つ以上の急性白血病；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含むがそれに限定されない１つ以上の慢性白血病；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁層リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含むがそれに限定されない更なる血液癌又は血液学的病態を含めた血液癌、並びに限定はされないが、ＣＤ２２を発現する非定型及び／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患を含めたＣＤ２２発現に関連する疾患；及びこれらの任意の組み合わせである。
【０６７２】
本開示のＣＡＲ改変細胞は、単独で投与されても、又は希釈剤と、及び／又はＩＬ−２若しくは他のサイトカイン若しくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。
【０６７３】
本開示は、ＣＤ２２発現細胞集団の増殖を阻害する又はそれを減少させる方法であって、ＣＤ２２発現細胞を含む細胞の集団と、ＣＤ２２発現細胞に結合する本開示のＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞とを接触させることを含む方法でもある。ある具体的な態様において、本開示は、ＣＤ２２を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害する又はそれを減少させる方法を提供し、本方法は、ＣＤ２２発現癌細胞集団と、ＣＤ２２発現細胞に結合する本開示のＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞とを接触させることを含む。一態様において、本開示は、ＣＤ２２を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害する又はそれを減少させる方法を提供し、本方法は、ＣＤ２２発現癌細胞集団と、ＣＤ２２発現細胞に結合する本開示のＣＤ２２  ＣＡＲＴとを接触させることを含む。特定の態様において、本開示のＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ２２発現細胞に関連するＢ細胞悪性腫瘍又は別の癌を有する対象又はそれの動物モデルにおいて、細胞及び／又は癌細胞の分量、数、量又は割合を陰性対照と比べて少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％減少させる。一態様において、対象はヒトである。
【０６７４】
本開示は、ＣＤ２２発現細胞（例えば、ＣＤ２２を発現する血液癌又は非定型癌）に関連する疾患を予防、治療及び／又は管理する方法も提供し、本方法は、必要としている対象にＣＤ２２発現細胞に結合する本開示のＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。一態様において、対象はヒトである。ＣＤ２２発現細胞に関連する障害の非限定的な例としては、自己免疫疾患（例えば、ループス、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、エバンス症候群、脈管炎、水疱性皮膚障害、１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎及びデビック病、グレーブス眼症、及び自己免疫性膵炎）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）、移植、及び癌（ＣＤ２２を発現する血液癌又は非定型癌など）が挙げられる。
【０６７５】
本開示は、ＣＤ２２発現細胞に関連する疾患を予防、治療及び／又は管理する方法も提供し、本方法は、必要としている対象にＣＤ２２発現細胞に結合する本開示のＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。一態様において、対象はヒトである。
【０６７６】
本開示は、ＣＤ２２発現細胞に関連する癌の再発を予防する方法を提供し、本方法は、ＣＤ２２発現細胞に結合する本開示のＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞を、それを必要としている対象に投与することを含む。一態様において、本方法は、ＣＤ２２発現細胞に結合する本明細書に記載されるＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞の有効量を別の療法の有効量と併用してそれを必要としている対象に投与することを含む。
【０６７７】
一部の実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ−１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１０、ＣＤ３４、及び／又はＣＤ２０を発現する。特定の実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ＣＤ１９を発現する。一部の実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ＣＤ１９を発現しない。
【０６７８】
一部の実施形態において、対象はＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して非奏効者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して部分奏効者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して完全奏効者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して非再発者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して部分再発者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９  ＣＡＲ療法に対して完全再発者である。
【０６７９】
一部の実施形態において、以前ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった癌又は他の病態はＣＤ１９を発現しない。一部の実施形態において、以前ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった癌又は他の病態は、癌又は他の病態がＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であったときと比べてＣＤ１９発現レベルが１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又はそれを超えて低下している。一部の実施形態において、以前ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった癌又は他の病態はＣＤ２２及び／又はＣＤ１２３を発現する。
【０６８０】
一部の実施形態において、本開示のＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞は、以前ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞で治療された癌又は他の病態の再発後に投与される。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞とＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞とは、本明細書に記載されるとおり、同時に投与される。
【０６８１】
多発性骨髄腫の治療における使用のためのＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞
化学療法、ターゲット療法、及び自己幹細胞移植の現行のレジメンであっても、骨髄腫は不治の疾患と考えられる。ある研究（非開示）では、キメラ抗原受容体を含むＣＤ１９に対する自己Ｔ細胞（レンチウイルス／ＣＤ１９：４−１ＢＢ：ＣＤ３ζ；「ＣＡＲＴ１９」又はＣＴＬ０１９としても知られる）による多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療が記載されている。この例では、ＣＤ１９に対するＣＡＲ療法が、ＣＤ１９の発現レベルが極めて低い（ほとんどの方法によって検出不能な）骨髄腫幹細胞及び／又は腫瘍細胞のターゲティングに基づいて、深い、長期持続性のある寛解を確立できる可能性があることが実証される。
【０６８２】
ホジキンリンパ腫に対するＣＡＲ１９  Ｔ細胞療法
ＣＡＲ１９  Ｔ細胞療法は、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）の治療にも使用することができる。ホジキンリンパ腫は、クローナル胚中心Ｂ細胞に由来する悪性ホジキンリード・スタンバーグ（ＨＲＳ）細胞の存在によって特徴付けられる。ＨＬに対するＣＡＲ１９  Ｔ細胞療法の治療有効性を示す幾つかの要因がある。ＨＬ腫瘍をＣＤ１９染色すると、腫瘍及び腫瘍微小環境内のＣＤ１９発現（ＣＤ１９＋）細胞が明らかになる。ある研究によれば、ＣＤ１９を発現するクローナルＢ細胞集団（ＣＤ２０＋ＣＤ２７＋ＡＬＤＨ＋）がホジキンリンパ腫細胞株の生成及び維持に関与し、またほとんどのＨＬ患者の血中に循環することが示されている（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００９，１１３（２３）：５９２０−５９２６）。このクローナルＢ細胞集団は、悪性ＨＲＳ細胞を生成し、又はその生成に寄与することも示唆されている。従って、ＣＡＲＴ１９療法は、腫瘍発生又は腫瘍細胞の維持に寄与するこのＢ細胞集団を枯渇させるであろう。別の研究では、複数のマウスモデルでＢ細胞枯渇が固形腫瘍成長を遅らせることが示された（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２００８，３１（５）：４４６−５７）。ＨＬ腫瘍微小環境におけるＢ細胞の枯渇が何らかの抗腫瘍効果をもたらすという考えの裏付けとして、リツキサンなどの現行の療法が、ＨＬにおける腫瘍性Ｂ細胞のターゲティング及び枯渇に関して臨床的に試験されているところである（Ｙｏｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１２，１１９（１８）：４１２３−８）。慢性炎症に関連するデノボ発癌もＢ細胞依存性であることが示されている（ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２００５，７（５）：４１１−２３）。これらの研究の結果から、Ｂ細胞集団のターゲティングが、特にＨＬ腫瘍微小環境において、疾患進行又は腫瘍成長の低減又は阻害によるＨＬの治療に有用となり得ることが指摘される。
【０６８３】
ＣＬＬ患者の非奏効者サブセットは免疫チェックポイント抑制分子の発現増加を呈する
ある研究において（データ未発表）、３４人のＣＬＬ患者由来の臨床製品からのＣＡＲＴ１９細胞が、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、及びＴＩＭ３などの免疫チェックポイント抑制分子の発現に関して評価された。このコホートのＣＡＲＴ１９に対する応答は分かっており、従って応答とバイオマーカー発現パターンとの間の相関を評価することができた。
【０６８４】
高齢者における免疫老化に対するｍＴＯＲ阻害効果
免疫老化に対するｍＴＯＲ阻害の有効性については、例えば、国際公開第２０１５／０７３６４４号パンフレットの実施例１に記載されており、この出願全体が本明細書において参照により援用される。
【０６８５】
高齢対象におけるワクチンに対する免疫応答の増強
免疫応答の増強に対するｍＴＯＲ阻害の有効性については、例えば、国際公開第２０１５／０７３６４４号パンフレットの実施例２に記載されており、この出願全体が本明細書において参照により援用される。
【０６８６】
低用量ｍＴＯＲ阻害はエネルギー及び運動を増加させる；
エネルギー及び運動に対するｍＴＯＲ阻害の効果については、例えば、２０国際公開第２０１５／０７３６４４号パンフレットの実施例３に記載されており、この出願全体が本明細書において参照により援用される。
【０６８７】
ＲＡＤ００１によるＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害
Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害に対するｍＴＯＲ阻害の効果については、例えば、国際公開第２０１５／０７３６４４号パンフレットの実施例４に記載されており、この出願全体が本明細書において参照により援用される。
【０６８８】
外因性ＩＬ−７はＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を増強する
ＣＡＲ  Ｔ細胞の養子移入後、一部の患者ではＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性が限られ、その結果、抗腫瘍活性レベルが最適以下となり得る。この例では、外因性ヒトＩＬ−７の投与の効果が、ＣＡＲ  Ｔ細胞に対する初期の最適以下の応答が観察されているマウス異種移植モデルで評価される。
【０６８９】
併用療法
本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、他の既知の薬剤及び療法と組み合わせて使用され得る。本明細書で使用する「組み合わせて」投与するとは、２つ（又はそれを超える）の異なる処置を、対象が障害を患っている過程中に対象に送達することを意味し、例えば、２つ以上の処置を、対象が障害と診断された後に且つ障害が治癒又は撲滅される前に、又は処置が他の理由で中止される前に送達される。一実施形態において、投与期間の重複があるように、一方の処置の送達は、第２の処置の送達開始時に依然として行われている。これは、本明細書では「同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」又は「同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）送達」ということがある。一部の実施形態において、一方の処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終わる。いずれかの場合の一実施形態において、処置は、組み合わせ投与のためにより有効である。例えば、第２の処置剤は、より有効である、例えば等しい効果が少ない第２の処置剤で見られるか、又は第２の処置剤は、第２の処置剤を第１の処置剤の非存在下で投与したときに見られるよりも大きい程度で症状を軽減するか又は第１の処置剤で同様の状況が見られる。一実施形態において、送達、障害と関係する症状又は他のパラメータの減少は、他方の処置剤の非存在下において一方の処置剤の送達で観察されるより大きい。２つの処置の効果は、一部相加的、完全相加的又は相加的より大きいものであり得る。送達は、送達した第１の処置の効果が第２剤の送達時になお検出可能であるようなものであり得る。
【０６９０】
本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞及び少なくとも１つの更なる治療剤を同時に、同じ又は別の組成物で又は逐次的に投与できる。逐次投与について、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞をまず投与し得、更なる薬剤を次に投与し得、又は投与の順番が逆であり得る。
【０６９１】
ＣＡＲ治療及び／又は他の治療剤、方法又はモダリティを活動性障害の期間又は寛解又は低活動性疾患の期間に投与できる。ＣＡＲ治療を他の処置の処置前、処置と同時に、処置後に、又は障害の寛解中に投与できる。
【０６９２】
組み合わせて投与するとき、ＣＡＲ治療及び更なる薬剤（例えば、第２又は第三の薬剤）又は全てを、個々に、例えば単剤療法として使用する各薬剤の量又は投与より高い、低い又は同じ量又は用量で投与できる。一実施形態において、ＣＡＲ治療、更なる薬剤（例えば、第２又は第三薬剤）又は全ての投与される量又は用量は、個々に、例えば単剤療法として使用する各薬剤の量又は用量より低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％）。一部の実施形態において、所望の効果（例えば、癌の処置）を生じるＣＡＲ治療、更なる薬剤（例えば、第２又は第三薬剤）又は全ての投与される量又は用量は、同じ治療効果を達成するのに必要である、個々に、例えば単剤療法として使用する各薬剤の量又は用量より低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％低い）。
【０６９３】
更なる態様において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、手術、サイトカイン、放射線若しくはシトキサン、フルダラビン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、デメチル化剤、又はＩｚｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １０８：９６３−９７１に記載ものなどのペプチドワクチンなどの化学療法剤と組み合わせて治療レジメンにおいて使用し得る。
【０６９４】
ある例において、本発明の化合物を他の抗癌剤、抗アレルギー剤、制吐剤（又は制吐剤）、鎮痛剤、細胞保護剤及びこれらの組み合わせなどの他の治療剤と組み合わせる。
【０６９５】
併用療法における使用が企図される一般的化学療法剤は、アナストロゾール（アリミデックス（登録商標））、ビカルタミド（カソデックス（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（マイレラン（登録商標））、ブスルファン注（ブスルフェクス（登録商標））、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（リューケラン（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（ロイスタチン（登録商標））、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標）又はＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメサゾン、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（ベプシド（登録商標））、リン酸フルダラビン（フルダラ（登録商標））、５−フルオロウラシル（アドルシル（登録商標）、エフデックス（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素（ハイドレア（登録商標））、イダルビシン（イダマイシン（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（アルケラン（登録商標））、６−メルカプトプリン（ピュリネソール（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（ノバントロン（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ｎａｂ−パクリタキセル（アブラキサン（登録商標））、ｐｈｏｅｎｉｘ（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、ポリフェプロザン２０とカルムスチンインプラント（グリアデル（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（ノルバデックス（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（ハイカムチン（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））及びビノレルビン（ナベルビン（登録商標））を含む。
【０６９６】
本発明の化合物との併用に特に有益な抗癌剤としては、抗腫瘍性抗生物質；チロシンキナーゼ阻害薬；アルキル化剤；抗微小管剤又は抗有糸分裂剤；又は腫瘍崩壊ウイルスが挙げられる。
【０６９７】
例示的チロシンキナーゼ阻害薬としては、限定はされないが、エルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；リニファニブ（Ｎ−［４−（３−アミノ−１Ｈ−インダゾル−４−イル）フェニル］−Ｎ’−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）尿素、別名ＡＢＴ  ８６９、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能）；リンゴ酸スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；ボスチニブ（４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル、別名ＳＫＩ−６０６、及び米国特許第６，７８０，９９６号明細書に記載される）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））；パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））；Ｚａｃｔｉｍａ（ＺＤ６４７４）；及びイマチニブ又はメシル酸イマチニブ（Ｇｉｌｖｅｃ（登録商標）及びＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標））が挙げられる。
【０６９８】
例示的アルキル化剤としては、限定はされないが、オキサリプラチン（エロキサチン（登録商標））；テモゾロミド（テモダール（登録商標）及びテモダール（登録商標））；ダクチノマイシン（別名アクチノマイシン−Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標））；メルファラン（別名Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン及びフェニルアラニンマスタード、アルケラン（登録商標））；アルトレタミン（別名ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ブスルファン（ブスルフェクス（登録商標）及びマイレラン（登録商標））；カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））；ロムスチン（別名ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ（登録商標））；シスプラチン（別名ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）及びＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱ）；クロラムブシル（リューケラン（登録商標））；シクロホスファミド（シトキサン（登録商標）及びＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（別名ＤＴＩＣ、ＤＩＣ及びイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））；アルトレタミン（別名ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（別名窒素マスタード、ムスチン及び塩酸メクロロエタミン、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））；ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；チオテパ（別名チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡ及びＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））；シクロホスファミド（エンドキサン（登録商標）、シトキサン（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；及びベンダムスチンＨＣｌ（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））が挙げられる。
【０６９９】
例示的抗腫瘍性抗生物質としては、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）及びＲｕｂｅｘ（登録商標））；ブレオマイシン（ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））；ダウノルビシン（ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン、及びルビドマイシン塩酸塩、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標））；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ  ＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；及びデスアセチルラビドマイシンが挙げられる。
【０７００】
例示的抗微小管剤又は抗有糸分裂剤としては、限定なしに、ビンカアルカロイド（酒石酸ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、及びビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標））など）；タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセルなど）；及びエストラムスチン（Ｅｍｃｙｌ（登録商標）又はＥｓｔｒａｃｙｔ（登録商標））が挙げられる。
【０７０１】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＣＡＲ発現細胞は、腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて投与される。実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞内で選択的に複製し、その死を誘発するか又は増殖を遅延することができる。ある場合、腫瘍溶解性ウイルスは、非癌細胞に効果を有しないか又は効果が最小である。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性レトロウイルス、腫瘍溶解性パルボウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス又は腫瘍溶解性ＲＮＡウイルス（例えば、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、腫瘍溶解性麻疹ウイルス又は腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ））を含むが、これらに限定されない。
【０７０２】
一実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０／０１７８６８４Ａ１号明細書に記載のウイルス、例えば組み換え腫瘍溶解性ウイルスである。一実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０／０１７８６８４Ａ１号明細書に記載のような、免疫又は炎症性応答の阻害剤をコードする核酸配列（例えば、異種核酸配列）を含む。実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルス、例えば腫瘍溶解性ＮＤＶは、アポトーシス促進性タンパク質（例えば、アポプチン）、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン−γ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子−α）、免疫グロブリン（例えば、ＥＤ−Ｂフィブロネクチンに対する抗体）、腫瘍関連抗原、二特異性アダプタータンパク質（例えば、ＮＤＶ  ＨＮタンパク質及びＣＤ３又はＣＤ２８などのＴ細胞共刺激性受容体に対する二特異性抗体又は抗体断片；又はヒトＩＬ−２及びＮＤＶ  ＨＮタンパク質に対する一本鎖抗体の融合タンパク質）を含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＺａｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７．３（２０１２）：３４７−６７を参照されたい。一実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、参照によりそれぞれその全体が本明細書に援用される米国特許第８５９１８８１Ｂ２号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１２２１８５Ａ１号明細書又は米国特許出願公開第２０１４／０２７１６７７Ａ１号明細書に記載のキメラ腫瘍溶解性ＮＤＶである。
【０７０３】
一実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、排他的に癌細胞において複製するよう設計された条件的複製アデノウイルス（ＣＲＡｄ）である。例えば、Ａｌｅｍａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（２０００）：７２３−２７を参照されたい。一実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、その全体が参照により本明細書に援用されるＡｌｅｍａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．の７２５ページの表１に記載のものを含む。
【０７０４】
例示的な腫瘍溶解性ウイルスは、次のものを含むが、これらに限定されない。
Ｂ群腫瘍溶解性アデノウイルス（ＣｏｌｏＡｄ１）（ＰｓｉＯｘｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２０５３２２０を参照されたい）；
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むアデノウイルスであるＯＮＣＯＳ−１０２（以前はＣＧＴＧ−１０２と呼ばれた）（Ｏｎｃｏｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１５９８１２９を参照されたい）；
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼをコードする遺伝的に改変された腫瘍溶解性ヒトアデノウイルスであるＶＣＮ−０１（ＶＣＮ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓ．Ｌ．）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ：ＮＣＴ０２０４５６０２及びＮＣＴ０２０４５５８９を参照されたい）；
網膜芽細胞腫／Ｅ２Ｆ経路の脱制御を伴い癌細胞で選択的に複製するように改変されている野生型ヒトアデノウイルス血清型５（Ｈａｄ５）由来のウイルスである条件的複製アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ−５（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃａｔａｌａ  ｄ’Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１８６４７５９を参照されたい）；
ＩＣＯＶＩＲ５、腫瘍溶解性アデノウイルスで感染させた骨髄由来自己間葉性幹細胞（ＭＳＣ）を含むＣｅｌｙｖｉｒ（Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｆａｎｔｉｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ  Ｎｉｎｏ  Ｊｅｓｕｓ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ／Ｒａｍｏｎ  Ａｌｅｍａｎｙ）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１８４４６６１を参照されたい）；
ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターが必須Ｅ１ａウイルス遺伝子の発現を駆動し、それによりＲｂ経路欠損腫瘍細胞に対するウイルス複製及び細胞毒性を制限する、条件複製腫瘍溶解性血清型５アデノウイルス（Ａｄ５）であるＣＧ００７０（Ｃｏｌｄ  Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｉｎｃ．）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２１４３８０４を参照されたい）；又は
網膜芽細胞腫（Ｒｂ）経路欠損細胞で選択的に複製し、ある種のＲＧＤ結合インテグリンをより効率的に発現する細胞に感染するように操作されているアデノウイルスであるＤＮＸ−２４０１（以前はデルタ−２４−ＲＧＤと称された）（Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  ｄｅ  Ｎａｖａｒｒａ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  ｄｅ  Ｎａｖａｒｒａ／ＤＮＡｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１９５６７３４を参照されたい）。
【０７０５】
一実施形態において、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスを注射、例えば皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射により投与する。実施形態において、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍内、経皮、経粘膜、経口、鼻腔内又は肺投与により投与する。
【０７０６】
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＤ２０阻害薬、例えばＣＤ２０抗体又はＣＤ２０抗体薬物コンジュゲートと併用して（例えば、その前に、それと同時に、及び／又はその後に）投与される。
【０７０７】
例示的ＣＤ２０抗体としては、限定はされないが、リツキシマブ（Ｒｉｕｘａｎ（登録商標）及びＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））；トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））；及びオファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標））が挙げられる。
【０７０８】
例示的ＣＤ２０抗体薬物コンジュゲートとしては、限定はされないが、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））；及びトシツモマブが挙げられる。
【０７０９】
一実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、ＧＩＴＲアゴニスト及び／又は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させるＧＩＴＲ抗体など、ＧＩＴＲを標的にする及び／又はＧＩＴＲ機能を調節する分子と併用して対象に投与される。一実施形態において、ＧＩＴＲ結合分子及び／又はＧＩＴＲ機能を調節する分子（例えば、ＧＩＴＲアゴニスト及び／又はＴｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体）は、ＣＡＲ発現細胞の前に投与される。例えば、一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストは細胞のアフェレーシス前に投与され得る。一実施形態において、対象はＣＬＬを有する。例示的ＧＩＴＲアゴニストは、例えば、米国特許第６，１１１，０９０号明細書、欧州特許第０９０５０５Ｂ１号明細書、米国特許第８，５８６，０２３号明細書、国際公開第２０１０／００３１１８号パンフレット及び同２０１１／０９０７５４号パンフレットに記載のＧＩＴＲ融合タンパク質又は例えば米国特許第７，０２５，９６２号明細書、欧州特許第１９４７１８３Ｂ１号明細書、米国特許第７，８１２，１３５号明細書、米国特許第８，３８８，９６７号明細書、米国特許第８，５９１，８８６号明細書、欧州特許第１８６６３３９号明細書、国際公開第２０１１／０２８６８３号パンフレット、国際公開第２０１３／０３９９５４号パンフレット、国際公開第２００５／００７１９０号パンフレット、国際公開第２００７／１３３８２２号パンフレット、国際公開第２００５／０５５８０８号パンフレット、国際公開第９９／４０１９６号パンフレット、国際公開第２００１／０３７２０号パンフレット、国際公開第９９／２０７５８号パンフレット、国際公開第２００６／０８３２８９号パンフレット、国際公開第２００５／１１５４５１号パンフレット、米国特許第７，６１８，６３２号明細書及び国際公開第２０１１／０５１７２６号パンフレットに記載のような抗ＧＩＴＲ抗体など、例えばＧＩＴＲ融合タンパク質及び抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）を含む。
【０７１０】
一実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、ｍＴＯＲ阻害薬、例えば本明細書に記載されるｍＴＯＲ阻害薬、例えばエベロリムスなどのラパログと併用して対象に投与される。一実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬はＣＡＲ発現細胞の前に投与される。例えば、一実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬は細胞のアフェレーシス前に投与され得る。
【０７１１】
一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞をＧＩＴＲアゴニスト、例えば本明細書に記載のＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて対象に投与する。一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストをＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストを細胞のアフェレーシス前に投与できる。
【０７１２】
一実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬、例えば本明細書に記載されるタンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬と併用して対象に投与される。一実施形態において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬はＳＨＰ−１阻害薬、例えば本明細書に記載されるＳＨＰ−１阻害薬、例えばスチボグルコン酸ナトリウムなどである。一実施形態において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬はＳＨＰ−２阻害薬である。
【０７１３】
一実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞はキナーゼ阻害薬と併用して使用することができる。
【０７１４】
ある実施形態では、この手法を用いて、対象における本明細書に記載されるＣＡＲ細胞のパフォーマンスを最適化することができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、ある実施形態では、内因性の非改変免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞のパフォーマンスが向上すると考えられる。理論によって拘束されることを望むものではないが、ある実施形態では、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞のパフォーマンスが向上すると考えられる。一部の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作されている、又は操作されることになる細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞の数を増加させる、又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の比を増加させる量のｍＴＯＲ阻害薬との接触により、エキソビボで処理することができる。
【０７１５】
ある実施形態において、免疫増強低用量のｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリック阻害薬、例えばＲＡＤ００１、又は触媒阻害薬の投与が、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の投与前に開始される。ある実施形態において、ＣＡＲ細胞は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞のレベル、又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の比が少なくとも一過性に増加しているように、ｍＴＯＲ阻害薬の十分な時間後、又は十分な用量投与後に投与される。
【０７１６】
ある実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作されることになる細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、対象における又は対象から採取されたＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞のレベル、又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の比が少なくとも一過性に増加しているように、免疫増強低用量のｍＴＯＲ阻害薬の十分な時間後、又は十分な用量投与後に採取される。
【０７１７】
一部の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬は、対象の末梢血中において、又は対象から単離されたＴ細胞の調製物においてＰＤ−１陽性Ｔ細胞の集団が減少し、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の集団が増加し、又はＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の比が増加するのに十分な長さの時間にわたって投与される。
【０７１８】
一部の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害によって測定したとき、５％以上９０％以下のｍＴＯＲ阻害薬に関連する。一部の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ阻害によって測定したとき、１０％以上４０％以下のｍＴＯＲ阻害に関連する。
【０７１９】
一実施形態において、キナーゼ阻害薬は、ＣＤＫ４阻害薬、例えば本明細書に記載されるＣＤＫ４阻害薬、例えばＣＤ４／６阻害薬、例えば６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−（５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ）−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オンヒドロクロリド（パルボシクリブ又はＰＤ０３３２９９１とも称される）などである。一実施形態において、キナーゼ阻害薬はＢＴＫ阻害薬、例えば本明細書に記載されるＢＴＫ阻害薬、例えばイブルチニブなどである。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン、ラパマイシン類似体、ＯＳＩ−０２７など、例えば本明細書に記載のｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤及び／又はｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば本明細書に記載のｍＴＯＲＣ１阻害剤及び／又はｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば４−アミノ−５−（４−フルオロアニリノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンなど、例えば本明細書に記載のＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａ及び／又はＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＤＧＫ阻害剤、例えばＤＧＫｉｎｈ１（Ｄ５９１９）又はＤＧＫｉｎｈ２（Ｄ５７９４）など、例えば本明細書に記載のＤＧＫ阻害剤である。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；フラボピリドール又はＨＭＲ−１２７５、２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル］−４−クロメノン；クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４１０６６；２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−１−メチル−３−ピロリジニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ヒドロクロライド（Ｐ２７６−００）；１−メチル−５−［［２−［５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−４−ピリジニル］オキシ］−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン（ＲＡＦ２６５）；インジスラム（Ｅ７０７０）；ロスコビチン（ＣＹＣ２０２）；パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）；ジナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）；Ｎ−［５−［［（５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル）メチル］チオ］チアゾール−２−イル］ピペリジン−４−カルボキサミド（ＢＭＳ  ３８７０３２）；４−［［９−クロロ−７−（２，６−ジフルオロフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンズアゼピン−２−イル］アミノ］−安息香酸（ＭＬＮ８０５４）；５−［３−（４，６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン（ＡＧ−０２４３２２）；４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−（ピペリジン−４−イル）アミド（ＡＴ７５１９）；４−［２−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］−Ｎ−［４−（���チルスルホニル）フェニル］−２−ピリミジンアミン（ＡＺＤ５４３８）；及びＸＬ２８１（ＢＭＳ９０８６６２）から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
【０７２０】
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えばパルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）であり、パルボシクリブを一定期間にわたり１日約５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ（例えば、７５ｍｇ、１００ｍｇ又は１２５ｍｇ）の用量で例えば２８日サイクルの１４〜２１日間連日又は２１日サイクルの７〜１２日間連日投与する。一実施形態において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクル又はそれを超えるパルボシクリブを投与する。
【０７２１】
一実施形態において、キナーゼ阻害薬は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）；ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；及びＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害薬である。
【０７２２】
一実施形態において、キナーゼ阻害薬は、ＢＴＫ阻害薬、例えばイブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）であり、イブルチニブは、約２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇ、４４０ｍｇ、４６０ｍｇ、４８０ｍｇ、５００ｍｇ、５２０ｍｇ、５４０ｍｇ、５６０ｍｇ、５８０ｍｇ、６００ｍｇ（例えば、２５０ｍｇ、４２０ｍｇ又は５６０ｍｇ）の用量で、ある期間毎日、例えば２１日サイクルの間毎日、又は２８日サイクルの間毎日投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２サイクル又はそれを超えるイブルチニブが投与される。
【０７２３】
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；リダフォロリムス（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２−［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ、２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３、２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３及びＭＫ８６６９としても知られる；エベロリムス（ＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９）；セマピモド；（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［トランス−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２）；及びＮ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、分子内塩（ＳＦ１１２６）；及びＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
【０７２４】
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシンであり、ラパマイシンを約３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ（例えば、６ｍｇ）の用量で連日、一定期間、例えば２１日サイクルで連日又は２８日サイクルで連日投与する。一実施形態において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクル又はそれを超えるラパマイシンを投与する。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばエベロリムスであり、エベロリムスを一定期間にわたり１日約２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ（例えば、１０ｍｇ）の用量において例えば２８日サイクルで連日投与する。一実施形態において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクル又はそれを超えるエベロリムスを投与する。
【０７２５】
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８；４−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニルアミノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ＣＧＰ５７３８０）；セルコスポラミド；ＥＴＣ−１７８０４４５〜２；及び４−アミノ−５−（４−フルオロアニリノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
【０７２６】
カルシウム依存的ホスファターゼカルシニューリンを阻害する（シクロスポリン及びＦＫ５０６）又は増殖因子誘発シグナル伝達に重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物（ラパマイシン）（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６：８０７−８１５，１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ．７３：３１６−３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５：７６３−７７３，１９９３）も使用できる。更なる態様において、本発明の細胞組成物を、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、体外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド及び／又はＯＫＴ３又はＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用するＴ細胞除去療法と組み合わせて（例えば、その前に、それと同時に、又はその後に）患者に投与し得る。一態様において、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢ細胞除去療法後に投与する。例えば、一実施形態において、対象を高用量化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付す。一実施形態において、移植後、対象は、本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。更なる実施形態において、増殖細胞を手術前又は後に投与する。
【０７２７】
投与中又は後に本発明の化合物及び／又は他の抗癌剤に対するアレルギー反応を経験する患者がいる場合があり、そのため、多くの場合、アレルギー反応のリスクを最小化するために抗アレルギー剤を投与する。適当な抗アレルギー剤は、デキサメサゾン（例えば、デカドロン（登録商標））、ベクロメタゾン（例えば、Ｂｅｃｌｏｖｅｎｔ（登録商標））、ヒドロコルチゾン（コルチゾン、ヒドロコルチゾンナトリウムスクシネート、ヒドロコルチゾンナトリウムホスフェートとしても知られ、商品名Ａｌａ−Ｃｏｒｔ（登録商標）、ヒドロコルチゾンホスフェート、Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ（登録商標）、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ  Ａｃｅｔａｔｅ（登録商標）及びＬａｎａｃｏｒｔ（登録商標）として販売）、プレドニゾロン（商品名Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｌ（登録商標）、Ｏｒａｐｒｅｄ（登録商標）、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ（登録商標）及びＰｒｅｌｏｎｅ（登録商標）として販売）、プレドニゾン（商品名Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ（登録商標）及びＯｒａｓｏｎｅ（登録商標）として販売）、メチルプレドニゾロン（６−メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンアセテート、メチルプレドニゾロンナトリウムスクシネートとしても知られ、商品名Ｄｕｒ単独（登録商標）、Ｍｅｄｒ単独（登録商標）、Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）、Ｍ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（登録商標）及びＳｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）として販売）などのコルチコステロイド；ジフェンヒドラミン（例えば、Ｂｅｎａｄｒｙｌ（登録商標））、ヒドロキシジン及びシプロヘプタジンなどの抗ヒスタミン剤；及びβ−アドレナリン受容体アゴニスト、アルブテロール（例えば、Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ（登録商標））及びテルブタリン（Ｂｒｅｔｈｉｎｅ（登録商標））などの気管支拡張剤を含む。
【０７２８】
本発明の化合物及び／又は他の抗癌剤の投与中及び後に悪心を経験する患者がいる場合があり、そのため、悪心（胃上部）及び嘔吐の予防に制吐剤を使用する。適当な制吐剤は、アプレピタント（Ｅｍｅｎｄ（登録商標））、オンダンセトロン（Ｚｏｆｒａｎ（登録商標））、グラニセトロンＨＣｌ（Ｋｙｔｒｉｌ（登録商標））、ロラゼパム（Ａｔｉｖａｎ（登録商標）、デキサメサゾン（デカドロン（登録商標））、プロクロルペラジン（Ｃｏｍｐａｚｉｎｅ（登録商標））、カソピタント（Ｒｅｚｏｎｉｃ（登録商標）及びＺｕｎｒｉｓａ（登録商標））及びこれらの組み合わせを含む。
【０７２９】
処置中に経験する疼痛を軽減する投薬も、多くの場合、患者がより快適になるように処方される。タイレノール（登録商標）のような一般的非処方鎮痛剤が多くの場合に使用される。しかしながら、ヒドロコドン／パラセタモール又はヒドロコドン／アセトアミノフェン（例えば、Ｖｉｃｏｄｉｎ（登録商標））、モルヒネ（例えば、Ａｓｔｒａｍｏｒｐｈ（登録商標）又はＡｖｉｎｚａ（登録商標））、オキシコドン（例えば、ＯｘｙＣｏｎｔｉｎ（登録商標）又はＰｅｒｃｏｃｅｔ（登録商標））、塩酸オキシモルホン（Ｏｐａｎａ（登録商標））及びフェンタニル（例えば、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ（登録商標））などのオピオイド鎮痛剤剤も軽度又は重度疼痛に有用である。
【０７３０】
正常細胞を処置毒性から保護する及び臓器毒性を制限する試みにおいて、細胞保護剤（例えば、神経保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、心保護剤、アントラサイクリン溢血中和剤、栄養素など）を補助剤治療として使用し得る。適当な細胞保護剤は、アミホスチン（Ｅｔｈｙｏｌ（登録商標））、グルタミン、ジメスナ（Ｔａｖｏｃｅｐｔ（登録商標））、メスナ（Ｍｅｓｎｅｘ（登録商標））、デクスラゾキサン（Ｚｉｎｅｃａｒｄ（登録商標）又はＴｏｔｅｃｔ（登録商標））、キサリプロデン（Ｘａｐｒｉｌａ（登録商標））及びロイコボリン（カルシウムロイコボリン、シトロボラム因子及びフォリン酸としても既知）を含む。
【０７３１】
コード番号、一般名又は商品名により同定した活性化合物の構造は、標準参考書「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ」の現行版又はデータベース、例えばＰａｔｅｎｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（例えば、ＩＭＳ  Ｗｏｒｌｄ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）から取られ得る。
【０７３２】
本発明の化合物と組み合わせて使用できる上記化合物を、上に引用した文献に記載のものなど、当技術分野で記載されるように製造し、投与できる。
【０７３３】
一実施形態において、本発明は、少なくとも１つの本発明の化合物（例えば、本発明の化合物）又はその薬学的に許容される塩を、ヒト又は動物対象の投与に適する薬学的に許容される担体と共に、単独で又は他の抗癌剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
【０７３４】
一実施形態において、本発明は、癌などの細胞増殖性疾患を有するヒト又は動物対象を処置する方法を提供する。本発明は、治療有効量の本発明の化合物（例えば、本発明の化合物）又はその薬学的に許容される塩を、単独で又は他の抗癌剤と組み合わせて対象に投与することを含む、処置を必要とするヒト又は動物対象を処置する方法を提供する。
【０７３５】
特に、組成物は、併用療法として製剤するか又は別々に投与することができる。
【０７３６】
併用療法において、本発明の化合物及び他の抗癌剤を同時に、一緒に、又は逐次的に特定の時間制限なく投与し得、ここで、このような投与は、患者体内で２化合物の治療的有効なレベルを提供する。
【０７３７】
好ましい実施形態において、本発明の化合物及び他の抗癌剤を一般に任意の順番で注入又は経口により逐次的に投与する。投薬レジメンは、疾患ステージ、患者の体力、個々の薬物の安全性プロファイル及び個々の薬物の耐容性、並びに組み合わせを投与する処置医及び医療従事者に周知の他の基準により変わり得る。本発明の化合物及び他の抗癌剤を、処置に使用する特定のサイクルにより、互いに数分、数時間、数日又は数週間離れて投与する。加えて、サイクルは、処置サイクル中、一方の薬剤の他方より多い投与及び薬物投与当たりの異なる用量を含む。
【０７３８】
本発明の別の態様において、本明細書に開示されるような１つ以上の本発明の化合物及び組み合わせパートナーを含むキットが提供される。代表的キットは、（ａ）本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩、（ｂ）例えば、上記のような少なくとも１つの組み合わせパートナーを含み、それにより、このようなキットは、投与指示を含む添付文書又は他のラベリングを含み得る。
【０７３９】
本発明の化合物は、既知治療法、例えばホルモン投与又は特に放射線と組み合わせても有利に使用され得る。本発明の化合物は、特に放射線療法に低感受性を示す腫瘍の処置のために特に放射線増感剤として使用され得る。
【０７４０】
一実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与に関連する副作用を低減又は緩和する薬剤を投与することができる。ＣＡＲ発現細胞の投与に付随する副作用は、ＣＲＳ及びマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）とも呼ばれる血液貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）を含むが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。ＣＲＳは、発熱、疲労、食欲不振、筋肉痛、関節痛（ａｒｔｈａｌｇｉａｓ）、悪心、嘔吐、頭痛などの臨床的体質的徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、発疹などの臨床皮膚徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、悪心、嘔吐及び下痢などの臨床的消化器徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、頻呼吸及び低酸素血症などの臨床的呼吸器徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、頻脈、脈圧の増大、低血圧、心拍出量の増加（早期）及び心拍出量の低下（後期）などの臨床的心血管徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、凝固兆候及びｄ−二量体増加、出血の有無にかかわらず低フィブリノゲン血などの症状を含み得る。ＣＲＳは、高窒素血症などの臨床腎徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、高トランスアミナーゼ血症及び高ビリルビン血症などの臨床肝徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、頭痛、精神状態の変化、混乱、せん妄、単語発見困難又はフランク失語、幻覚、振戦、ジメトリア、異常歩行、発作などの臨床的神経徴候及び症状を含み得る。従って、本明細書に記載の方法は、対象に本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を投与し、更にＣＡＲ発現細胞処置に由来する可溶性因子のレベル増加を管理する１つ以上の薬剤の投与を含み得る。一実施形態において、対象で増加し得る可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２及びＩＬ−６の１つ以上である。一実施形態において、対象において増加する因子は、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５及びフラクタルカインの１つ以上である。そのため、これらの副作用を処置するために投与する薬剤は、これらの可溶性因子の１つ以上を中和する薬剤であり得る。一実施形態において、これらの可溶性形態の１つ以上を中和する薬剤は、抗体又はその抗原結合断片である。このような薬剤の例は、ステロイド（例えば、コルチコステロイド）、ＴＮＦα阻害剤及びＩＬ−６阻害剤を含むが、これらに限定されない。ＴＮＦα阻害薬の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、及びゴリムマブなどの抗ＴＮＦα抗体分子である。ＴＮＦα阻害薬の別の例は、エタネルセプトなどの融合タンパク質である。小分子ＴＮＦα阻害薬としては、限定はされないが、キサンチン誘導体（例えば、ペントキシフィリン）及びブプロピオンが挙げられる。ＩＬ−６阻害薬の例は、トシリズマブ（ｔｏｃ）、サリルマブ、エルシリモマブ、ＣＮＴＯ  ３２８、ＡＬＤ５１８／ＢＭＳ−９４５４２９、ＣＮＴＯ  １３６、ＣＰＳＩ−２３６４、ＣＤＰ６０３８、ＶＸ３０、ＡＲＧＸ−１０９、ＦＥ３０１、及びＦＭ１０１などの抗ＩＬ−６抗体分子である。一実施形態において、抗ＩＬ−６抗体分子は、トシリズマブである。ＩＬ−１Ｒベースの阻害剤の例は、アナキンラである。
【０７４１】
一実施形態において、対象にとりわけ例えばメチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾンなどのコルチコステロイドを投与する。
【０７４２】
一実施形態において、対象に例えばノルエピネフリン、ドーパミン、フェニレフリン、エピネフリン、バソプレシン又はこれらの組み合わせなどの昇圧剤を投与する。
【０７４３】
一実施形態において、対象に解熱剤を投与できる。一実施形態において、対象に鎮痛剤を投与できる。
【０７４４】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を対象に投与できる。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えばプログラム細胞死１（ＰＤ１）は、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦβを含む。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質レベルでの阻害による阻害分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。実施形態において、阻害性核酸、例えば阻害性核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ、又は群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）、転写−アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、ＣＡＲ発現細胞の阻害分子の発現を阻害できる。一実施形態において、阻害剤は、ｓｈＲＮＡである。一実施形態において、阻害分子は、ＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの実施形態において、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＣＡＲの要素、例えば要素全部をコードする核酸と連結する。
一実施形態において、阻害シグナルの阻害剤は、例えば、阻害分子と結合する抗体又は抗体断片であり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＣＴＬＡ４に結合する抗体又は抗体断片であり得る（例えば、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０及びＭＤＸ−１０１とも称し、ヤーボイ（登録商標）として市販；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ；トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６として既知。））。一実施形態において、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体又は抗体断片である。ある実施形態において、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体又は抗体断片である。ある実施形態において、薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）に結合する抗体又は抗体断片である。
【０７４５】
ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞に発現される（Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：７６５−７５）。ＰＤ１に対する２リガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４−４３）。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌において豊富である（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８１：２８１−７；Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５４：３０７−３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５０９４）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との局所相互作用の阻害により逆転できる。
ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の抗体、抗体断片及び他の阻害剤は、当技術分野で入手可能であり、本明細書に記載のＣＤ２０  ＣＡＲと組み合わせて使用され得る。例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８又はＭＤＸ１１０６とも称す；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）は、ＰＤ１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ＰＤ１に特異的に結合するニボルマブ（クローン５Ｃ４）及び他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第８，００８，４４９号明細書及び国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットに開示されている。ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｃｕｒｅ  Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ１モノクローナル抗体は、国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットに開示されている。ペンブロリズマブ（以前はランブロリズマブとして知られ、キイトルーダＭＫ０３４７５とも称される；Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ１抗体は、米国特許第８，３５４，５０９号明細書及び国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットに開示される。ＭＥＤＩ４７３６（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）は、ＰＤＬ１と結合し、リガンドとＰＤ１との相互作用を阻害するヒトモノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＰＤ−Ｌ１に対するＭＤＰＬ３２８０Ａ及び他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号明細書及び米国特許出願公開２０１２００３９９０６号明細書に記載されている。他の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（重鎖及び軽鎖可変領域は、国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレットの配列番号２０及び２１に示される）及びＭＤＸ−１  １０５（別名ＢＭＳ−９３６５５９及び例えば国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに開示される抗ＰＤ−Ｌ１結合剤）である。ＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇ；Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ；例えば、国際公開第２０１０／０２７８２７号パンフレット及び国際公開第２０１１／０６６３４２号パンフレットに開示）は、ＰＤ１とＢ７−Ｈ１の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ１抗体は、とりわけ、ＡＭＰ  ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、例えば米国特許第８，６０９，０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１００２８３３０号明細書及び／又は米国特許出願公開第２０１２０１１４６４９号明細書に開示の抗ＰＤ１抗体を含む。
【０７４６】
ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリン−３）も、特にＩＦＮ−ｇ分泌ＣＤ４＋Ｔヘルパー１及びＣＤ８＋Ｔ細胞毒性１細胞においてＴ細胞機能を負に制御し、Ｔ細胞疲弊に重要な役割を有する。ＴＩＭ３とそのリガンド、例えばガレクチン−９（Ｇａｌ９）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）及びＨＭＧＢ１の相互作用の阻害は、免疫応答を高め得る。ＴＩＭ３及びそのリガンドの抗体、抗体断片及び他の阻害剤は、当技術分野で利用可能であり、本明細書に記載のＣＡＲ、例えばＣＤ２０  ＣＡＲと組み合わせて使用され得る。例えば、ＴＩＭ３を標的とする抗体、抗体断片、小分子又はペプチド阻害剤は、そのリガンドとの相互作用を阻害するためにＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合する。ＴＩＭ３を阻害する抗体及びペプチドは、国際公開第２０１３／００６４９０号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１００２４７５２１号明細書に開示されている。他の抗ＴＩＭ３抗体は、ＲＭＴ３−２３のヒト化バージョン（Ｎｇｉｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，７１：３５４０−３５５１に開示）及びクローン８Ｂ．２Ｃ１２（Ｍｏｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ，４１５：５３６−５４１に開示）を含む。ＴＩＭ３及びＰＤ−１を阻害する二特異性抗体は、米国特許出願公開第２０１３０１５６７７４号明細書に開示されている。
【０７４７】
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５阻害剤）である。一実施形態において、ＣＥＡＣＡＭの阻害剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。例示的抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体は、国際公開第２０１０／１２５５７１号パンフレット、国際公開第２０１３／０８２３６６号パンフレット、国際公開第２０１４／０５９２５１号パンフレット及び国際公開第２０１４／０２２３３２号パンフレットに開示され、例えばモノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７及び５Ｆ４；又は例えば米国特許出願公開第２００４／００４７８５８号明細書、米国特許第７，１３２，２５５号明細書及び国際公開第９９／０５２５５２号パンフレットに開示のようなその組み換え形態である。一部の実施形態において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  Ｓｅｐ  ２；５（９）．ｐｉｉ：ｅ１２５２９（ＤＯＩ：１０：１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２１１４６）に記載のようにＣＥＡＣＡＭ−５と結合するか、又は例えば国際公開第２０１３／０５４３３１号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１８号明細書に記載のようにＣＥＡＣＡＭ−１及びＣＥＡＣＡＭ−５と交差反応する。
【０７４８】
理論に拘束されることを望まないが、ＣＥＡＣＡＭ−１及びＣＥＡＣＡＭ−５などの癌胎児性抗原細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）は、少なくとも部分的に抗腫瘍免疫応答の阻害を仲介すると考えられる（例えば、Ｍａｒｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  Ｍａｒ  １５；１６８（６）：２８０３−１０；Ｍａｒｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  Ｎｏｖ  １；１７７（９）：６０６２−７１；Ｍａｒｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００９  Ｆｅｂ；１２６（２）：１８６−２００；Ｍａｒｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１０  Ｆｅｂ；５９（２）：２１５−３０；Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｊｕｎ；１１（６）：１３００−１０；Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５  Ｊｕｎ  １；１７４（１１）：６６９２−７０１；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  Ｓｅｐ  ２；５（９）．ｐｉｉ：ｅ１２５２９を参照されたい）。例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１は、ＴＩＭ−３のヘテロ親和性リガンドとして、及びＴＩＭ−３介在Ｔ細胞耐容性及び疲弊に役割を有するとして記載されている（例えば、国際公開第２０１４／０２２３３２号パンフレット；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３８４８）。実施形態において、ＣＥＡＣＡＭ−１及びＴＩＭ−３の共遮断は、異種移植結腸直腸癌モデルにおいて抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている（例えば、国際公開第２０１４／０２２３３２号パンフレット；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）、前掲を参照されたい）。一部の実施形態において、ＣＥＡＣＡＭ−１及びＰＤ−１の共遮断は、例えば、国際公開第２０１４／０５９２５１号パンフレットに記載されるようにＴ細胞耐容性を減少させる。そのため、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤を、本明細書に記載の他の免疫調節剤（例えば、抗ＰＤ−１及び／又は抗ＴＩＭ−３阻害剤）と使用して、癌、例えば黒色腫、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌及び本明細書に記載の他の癌に対する免疫応答を増強させ得る。
【０７４９】
ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子−３又はＣＤ２２３）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊に役割を有することが示されている、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞に発現される細胞表面分子である。ＬＡＧ−３及びそのリガンドの抗体、抗体断片及び他の阻害剤は、当技術分野で入手可能であり、本明細書に記載のＣＡＲ，例えばＣＤ２０  ＣＡＲと組み合わせて使用され得る。例えば、ＢＭＳ−９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂ）は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）は、アンタゴニストＬＡＧ−３抗体であり、ＩＭＰ７３１（Ｉｍｍｕｔｅｐ及びＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）は、枯渇性ＬＡＧ−３抗体である。他のＬＡＧ−３阻害剤は、ＬＡＧ３の可溶性部分とＭＨＣクラスＩＩ分子のＩｇの組み換え融合タンパク質であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化するＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）である。他の抗体は、例えば、国際公開第２０１０／０１９５７０号パンフレットに開示されている。
【０７５０】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第１ドメイン及び第２ドメインを含む融合タンパク質であり得、ここで、第１ドメインは、阻害分子又はその断片であり、第２ドメインは、陽性シグナルと関係するポリペプチド、例えば本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。一実施形態において、陽性シグナルと結合するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８、ＣＤ２７及び／又はＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメイン及び／又は例えば本明細書に記載の例えばＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み得る。一実施形態において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現するのと同じ細胞により発現される。別の実施形態において、融合タンパク質は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現しない細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞により発現される。
【０７５１】
一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ｍｉＲ−１７−９２である。
【０７５２】
低用量のｍＴＯＲ阻害薬との併用
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞は、免疫増強低用量のｍＴＯＲ阻害薬と併用して投与される。
【０７５３】
ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、５％以上９０％以下、１０％以上９０％以下、１５％以上９０％以下、２０％以上９０％以下、３０％以上９０％以下、４０％以上９０％以下、５０％以上９０％以下、６０％以上９０％以下、又は７０％以上９０％以下のｍＴＯＲ阻害に関連するか、又はそれをもたらす。
【０７５４】
ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、５％以上８０％以下、１０％以上８０％以下、１５％以上８０％以下、２０％以上８０％以下、３０％以上８０％以下、４０％以上８０％以下、５０％以上８０％以下、又は６０％以上８０％以下のｍＴＯＲ阻害に関連するか、又はそれをもたらす。
【０７５５】
ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、５％以上７０％以下、１０％以上７０％以下、１５％以上７０％以下、２０％以上７０％以下、３０％以上７０％以下、４０％以上７０％以下、又は５０％以上７０％以下のｍＴＯＲ阻害に関連するか、又はそれをもたらす。
【０７５６】
ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、５％以上６０％以下、１０％以上６０％以下、１５％以上６０％以下、２０％以上６０％以下、３０％以上６０％以下、又は４０％以上６０％以下のｍＴＯＲ阻害に関連するか、又はそれをもたらす。
【０７５７】
ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、５％以上５０％以下、１０％以上５０％以下、１５％以上５０％以下、２０％以上５０％以下、３０％以上５０％以下、又は４０％以上５０％以下のｍＴＯＲ阻害に関連するか、又はそれをもたらす。
【０７５８】
ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、５％以上４０％以下、１０％以上４０％以下、１５％以上４０％以下、２０％以上４０％以下、３０％以上４０％以下、又は３５％以上４０％以下のｍＴＯＲ阻害に関連するか、又はそれをもたらす。
【０７５９】
ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、５％以上３０％以下、１０％以上３０％以下、１５％以上３０％以下、２０％以上３０％以下、又は２５％以上３０％以下のｍＴＯＲ阻害に関連するか、又はそれをもたらす。
【０７６０】
ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、１、２、３、４又は５％以上２０％以下、１、２、３、４又は５％以上３０％以下、１、２、３、４又は５以上３５以下、１、２、３、４又は５％以上４０％以下、又は１、２、３、４又は５％以上４５％以下のｍＴＯＲ阻害に関連するか、又はそれをもたらす。
【０７６１】
ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、１、２、３、４又は５％以上９０％以下のｍＴＯＲ阻害に関連するか、又はそれをもたらす。
【０７６２】
本明細書で考察されるとおり、ｍＴＯＲ阻害の程度はＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害の程度として表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の低下レベルにより、例えばＰ７０  Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化の低下により決定することができる。ｍＴＯＲ阻害レベルは、本明細書に記載される方法、例えばＢｏｕｌａｙアッセイによるか、又はウエスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定により評価することができる。
【０７６３】
例示的ｍＴＯＲ阻害薬
本明細書で使用されるとき、用語「ｍＴＯＲ阻害薬」は、細胞においてｍＴＯＲキナーゼを阻害する化合物又はリガンド、又はその薬学的に許容可能な塩を指す。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬はアロステリック阻害薬である。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬は触媒阻害薬である。
【０７６４】
アロステリックｍＴＯＲ阻害薬としては、中性三環式化合物ラパマイシン（シロリムス）、ラパマイシン関連化合物、即ち例えばラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体（ラパログとも称される）、及びｍＴＯＲ活性を阻害する他のマクロライド系化合物を含めた、ラパマイシンと構造的及び機能的な類似性を有する化合物が挙げられる。
【０７６５】
ラパマイシンは、式Ａに示される構造を有するストレプトミセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）によって産生される公知のマクロライド系抗生物質である。
【化３】
2019537433.tif 000004
【０７６６】
例えば、ＭｃＡｌｐｉｎｅ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（１９９１）４４：６８８；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９１）１１３：７４３３；米国特許第３，９２９，９９２号明細書を参照されたい。ラパマイシンには様々な付番スキームが提案されている。混用を避けるため、本明細書において具体的なラパマイシン類似体の名称を挙げるとき、式Ａの付番スキームを用いたラパマイシンに基づき名称を付ける。
【０７６７】
本発明において有用なラパマイシン類似体は、例えば、米国特許第５，６６５，７７２号明細書及び国際公開第９４／０９０１０号パンフレット（これらの内容は参照によって援用される）に記載されるとおりの、ラパマイシンのシクロヘキシル環のヒドロキシル基がＯＲ１（式中、Ｒ１は、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキル、又はアミノアルキルである）に置き換えられているＯ−置換類似体；例えば、ＲＡＤ００１、別名エベロリムスである。他の好適なラパマイシン類似体としては、２６位又は２８位が置換されているものが挙げられる。ラパマイシン類似体は、例えば、米国特許第６，０１５，８１５号明細書、国際公開第９５／１４０２３号パンフレット及び国際公開第９９／１５５３０号パンフレット（これらの内容は参照によって援用される）に記載されるとおりの、任意選択により更に水素化され得る、上述の類似体のエピマー、特に位置４０、２８又は２６位において置換されている類似体のエピマー、例えばＡＢＴ５７８、別名ゾタロリムス又は米国特許第７，０９１，２１３号明細書、国際公開第９８／０２４４１号パンフレット及び国際公開第０１／１４３８７号パンフレット（これらの内容は参照によって援用される）に記載されるラパマイシン類似体、例えばＡＰ２３５７３、別名リダフォロリムスであり得る。
【０７６８】
米国特許第５，６６５，７７２号明細書からの本発明での使用に好適なラパマイシン類似体の例としては、限定はされないが、４０−Ｏ−ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（４’−ヒドロキシメチル）ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［４’−（１，２−ジヒドロキシエチル）］ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−アリル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［３’−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４（Ｓ）−イル）−プロパ−２’−エン−１’−イル］−ラパマイシン、（２’Ｅ，４’Ｓ）−４０−Ｏ−（４’，５’−ジヒドロキシペンタ−２’−エン−１’−イル）−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エトキシカルボニルメチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（３−ヒドロキシ）プロピル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（６−ヒドロキシ）ヘキシル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［２−（２−ヒドロキシ）エトキシ］エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［（３Ｓ）−２，２−ジメチルジオキソラン−３−イル］メチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［（２Ｓ）−２，３−ジヒドロキシプロパ−１−イル］−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−アセトキシ）エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ニコチノイルオキシ）エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［２−（Ｎ−モルホリノ）アセトキシ］エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−Ｎ−イミダゾリルアセトキシ）エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ’−ピペラジニル）アセトキシ］エチル−ラパマイシン、３９−Ｏ−デスメチル−３９，４０−Ｏ，Ｏ−エチレン−ラパマイシン、（２６Ｒ）−２６−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−アミノエチル）−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−アセトアミノエチル）−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ニコチンアミドエチル）−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−（Ｎ−メチル−イミダゾ−２’−イルカルボエトキシアミド）エチル）−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−エトキシカルボニルアミノエチル）−ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−トリルスルホンアミドエチル）−ラパマイシン及び４０−Ｏ−［２−（４’，５’−ジカルボエトキシ−１’，２’，３’−トリアゾール−１’−イル）−エチル］−ラパマイシンが挙げられる。
【０７６９】
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、ラパマイシンのシクロヘキシル環のヒドロキシル基及び／又は２８位のヒドロキシ基がヒドロキシエステル基に置き換えられている類似体、例えば米国再発行特許第４４，７６８号明細書に見られるラパマイシン類似体、例えばテムシロリムスが公知である。
【０７７０】
本発明で有用な他のラパマイシン類似体としては、１６位のメトキシ基が別の置換基、好ましくは（任意選択によりヒドロキシ置換の）アルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジル又はクロロベンジルに置き換えられているもの及び／又は３９位のメトキシ基が３９炭素と一緒に欠失して、ラパマイシンのシクロヘキシル環が３９位メトキシ基を欠くシクロペンチル環になっているもの；例えば、国際公開第９５／１６６９１号パンフレット及び国際公開第９６／４１８０７号パンフレット（これらの内容は参照によって援用される）に記載されるとおりのものが挙げられる。類似体は、ラパマイシンの４０位のヒドロキシがアルキル化され、及び／又は３２−カルボニルが還元されるように更に改変され得る。
【０７７１】
国際公開第９５／１６６９１号パンフレットからのラパマイシン類似体としては、限定はされないが、１６−デメトキシ−１６−（ペンタ−２−イニル）オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−（ブタ−２−イニル）オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−（プロパルギル）オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−（４−ヒドロキシ−ブタ−２−イニル）オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−オルト−メトキシベンジル−ラパマイシン、１６−デメトキシ−４０−Ｏ−（２−メトキシエチル）−１６−ペンタ−２−イニル）オキシ−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ホルミル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ヒドロキシメチル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−カルボキシ−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−（モルホリン−４−イル）カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−［Ｎ−メチル、Ｎ−（２−ピリジン−２−イル−エチル）］カルバモイル−４２−ノル−ラパマイシン及び３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−（ｐ−トルエンスルホニルヒドラゾノメチル）−４２−ノル−ラパマイシンが挙げられる。
【０７７２】
国際公開第９６／４１８０７号パンフレットからのラパマイシン類似体としては、限定はされないが、３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペンタ−２−イニル−３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペンタ−２−イニル−３２−デオキソ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ−エチル）−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペンタ−２−イニル−３２−（Ｓ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、３２（Ｓ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−ラパマイシン及び３２（Ｓ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンが挙げられる。
【０７７３】
別の好適なラパマイシン類似体は、米国特許出願公開第２００５／０１０１６２４号明細書（この内容は参照によって援用される）に記載されるとおりのウミロリムスである。
【０７７４】
別名エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標））として知られるＲＡＤ００１は、化学名（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１２−｛（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル｝−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−１１，３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペンタオンを有する。
【０７７５】
アロステリックｍＴＯＲ阻害薬の更なる例としては、シロリムス（ラパマイシン、ＡＹ−２２９８９）、４０−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパノエート］−ラパマイシン（テムシロリムス又はＣＣＩ−７７９とも称される）及びリダフォロリムス（ＡＰ−２３５７３／ＭＫ−８６６９）が挙げられる。アロステリックｍＴｏｒ阻害薬の他の例としては、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）及びウミロリムスが挙げられる。
【０７７６】
代わりに又は加えて、触媒ＡＴＰ競合的ｍＴＯＲ阻害薬がｍＴＯＲキナーゼドメインを直接標的にし、並びにｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方を標的にすることが分かっている。これらは、４ＥＢＰ１−Ｔ３７／４６リン酸化及びキャップ依存的翻訳などのラパマイシン耐性ｍＴＯＲＣ１アウトプットを調節するため、ラパマイシンのようなアロステリックｍＴＯＲ阻害薬よりも有効性の高いｍＴＯＲＣ１阻害薬でもある。
【０７７７】
触媒阻害薬としては、ＢＥＺ２３５又は２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリル、又はモノトシル化塩形態、ＢＥＺ２３５の合成については国際公開第２００６／１２２８０６号パンフレットに記載されている；化学名｛５−［２，４−ビス−（（Ｓ）−３−メチル−モルホリン−４−イル）−ピリド［２，３ｄ］ピリミジン−７−イル］−２−メトキシ−フェニル｝−メタノールを有するＣＣＧ１６８（別名ＡＺＤ−８０５５として知られる、Ｃｈｒｅｓｔａ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１０，７０（１），２８８−２９８）；３−［２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ−メチルベンズアミド（国際公開第０９１０４０１９号パンフレット）；３−（２−アミノベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−イル）−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（国際公開第１００５１０４３号パンフレット及び国際公開第２０１３０２３１８４号パンフレット）；Ｎ−（３−（Ｎ−（３−（（３，５−ジメトキシフェニル）アミノ）キノキサリン−２−イル）スルファモイル）フェニル）−３−メトキシ−４−メチルベンズアミド（国際公開第０７０４４７２９号パンフレット及び国際公開第１２００６５５２号パンフレット）；化学名１−［４−［４−（ジメチルアミノ）ピペリジン−１−カルボニル］フェニル］−３−［４−（４，６−ジモルホリノ−１，３，５−トリアジン−２−イル）フェニル］尿素を有するＰＫＩ−５８７（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，５３，２６３６−２６４５）；化学名２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−メトキシ−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドを有するＧＳＫ−２１２６４５８（ＡＣＳ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２０１０，１，３９−４３）；；５−（９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル）ピリミジン−２−アミン（国際公開第１０１１４４８４号パンフレット）；（Ｅ）−Ｎ−（８−（６−アミノ−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）−１−（６−（２−シアノプロパン−２−イル）ピリジン−３−イル）−３−メチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２（３Ｈ）−イリデン）シアナミド（国際公開第１２００７９２６号パンフレット）が挙げられる。
【０７７８】
触媒ｍＴＯＲ阻害薬の更なる例としては、８−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３−メチル−１−（４−ピペラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル）−１，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（国際公開第２００６／１２２８０６号パンフレット）及びＫｕ−００６３７９４（Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，２００９，４２１（１），２９−４２、Ｋｕ−００６３７９４は哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）の特異的阻害薬である）が挙げられる。ＷＹＥ−３５４は、触媒ｍＴＯＲ阻害薬の別の例である（Ｙｕ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ，ａｎｄ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  ＡＴＰ−Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９（１５）：６２３２−６２４０）。
【０７７９】
本発明によって有用なｍＴＯＲ阻害剤は、前記のいずれかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩又はその類似体も含む。
【０７８０】
ＲＡＤ００１などのｍＴＯＲ阻害剤は、本明細書に記載の特定の用量に基づき、当技術分野で十分に確立された方法に基づいて送達用に製剤され得る。特に、米国特許第６，００４，９７３号明細書（参照により本明細書に援用される）は、本明細書に記載のｍＴＯＲ阻害剤で使用できる製剤例を提供する。
【０７８１】
ｍＴＯＲ阻害の評価
ｍＴＯＲはキナーゼＰ７０  Ｓ６をリン酸化し、それによりＰ７０  Ｓ６キナーゼが活性化され、その基質をリン酸化することが可能になる。ｍＴＯＲ阻害の程度はＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害の程度として表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の低下レベル、例えばＰ７０  Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化の低下によって決定することができる。ｍＴＯＲ阻害レベルは、阻害薬の非存在下、例えば阻害薬の投与前、及び阻害薬の存在下、又は阻害薬の投与後にＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性（Ｐ７０  Ｓ６キナーゼが基質をリン酸化する能力）を測定することにより決定し得る。Ｐ７０  Ｓ６キナーゼの阻害レベルがｍＴＯＲ阻害レベルを与える。従って、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼが４０％阻害される場合、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性によって測定したときのｍＴＯＲ活性は４０％阻害される。本明細書において言及される阻害の程度又はレベルは、投薬間隔の平均阻害レベルである。例として、阻害薬が週１回投与される場合、阻害レベルは、その間隔、即ち１週間の平均阻害レベルによって与えられる。
【０７８２】
Ｂｏｕｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００４，６４：２５２−６１（本明細書によって参照により援用される）は、ｍＴＯＲ阻害レベルの評価に用いることのできるアッセイを教示している（本明細書ではＢｏｕｌａｙアッセイと称される）。ある実施形態において、このアッセイは、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばＲＡＤ００１の投与前及び投与後の生体試料からのＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性の測定に頼る。ｍＴＯＲ阻害薬による治療後の予め選択された時点、例えば治療後２４、４８、及び７２時間で試料を採取し得る。例えば皮膚又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの生体試料を使用することができる。試料から全タンパク質抽出物を調製する。Ｐ７０  Ｓ６キナーゼを特異的に認識する抗体を使用した免疫沈降によってタンパク質抽出物からＰ７０  Ｓ６キナーゼを単離する。単離されたＰ７０  Ｓ６キナーゼの活性は、インビトロキナーゼアッセイで測定し得る。基質のリン酸化を許容する条件下で単離キナーゼを４０Ｓリボソームサブユニット基質（Ｐ７０  Ｓ６キナーゼの内因性基質である）及びγ−３２Ｐと共にインキュベートし得る。次に反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを使用して３２Ｐシグナルを分析し得る。４０Ｓリボソームサブユニットのサイズに対応する３２Ｐシグナルが、リン酸化した基質及びＰ７０  Ｓ６キナーゼの活性の指標である。リン酸化基質の３２Ｐシグナルの面積及び強度を（例えば、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓを使用して）定量化し、定量化されたシグナルに任意単位値を割り当て、及び投与後からの値を投与前からの値又は基準値と比較することにより、キナーゼ活性の増加及び減少を計算し得る。例えば、以下の式によってキナーゼ活性のパーセント阻害率を計算することができる：１−（投与後に得られた値／投与前に得られた値）×１００。上記に記載したとおり、本明細書において言及される阻害の程度又はレベルは投薬間隔の平均阻害レベルである。
【０７８３】
キナーゼ活性、例えばＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性の評価方法については、米国特許第７，７２７，９５０号明細書（本明細書によって参照により援用される）にも記載される。
【０７８４】
ｍＴＯＲ阻害レベルは、ＰＤ１陰性とＰＤ１陽性Ｔ細胞との比の変化によっても評価することができる。末梢血からのＴ細胞を当該技術分野において公知の方法によってＰＤ１陰性又は陽性と同定することができる。
【０７８５】
低用量ｍＴＯＲ阻害薬
本明細書に記載される方法は、免疫増強低用量ｍＴＯＲ阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばＲＡＤ００１などのラパログを含めたアロステリックｍＴＯＲ阻害薬の免疫増強低用量を使用する。対照的に、ｍＴＯＲ経路を完全に又はほぼ完全に阻害する阻害薬レベルは免疫抑制性であり、例えば移植臓器拒絶反応の予防に使用される。加えて、ｍＴＯＲを完全に阻害する高用量のラパログは、腫瘍細胞成長も阻害し、種々の癌の治療に使用される（例えば、Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｓａｌｖａｄｏｒｉ  Ｍ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１２  Ｏｃｔ  ２４；２（５）：７４−８３；Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍＴＯＲ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｆｉｎｎ  ＲＳ．Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１２  Ｎｏｖ；１（３−４）：２４７−２５６；Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｏｅｉｎｉ  Ａ，Ｃｏｒｎｅｌｌａ  Ｈ，Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  Ａ．Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１２  Ｓｅｐ；１（２）：８３−９３；Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ−Ａｒｅ  ｔｈｅ  ｄａｙｓ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｎｕｍｂｅｒｅｄ？Ｊｏｏ  ＷＤ，Ｖｉｓｉｎｔｉｎ  Ｉ，Ｍｏｒ  Ｇ．Ｍａｔｕｒｉｔａｓ．２０１３  Ｓｅｐ  ２０．；Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＶＥＧＦＲ−ＴＫＩｓ  ａｎｄ  ｍＴＯＲ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｓａｎｔｏｎｉ  Ｍ，Ｂｅｒａｒｄｉ  Ｒ，Ａｍａｎｔｉｎｉ  Ｃ，Ｂｕｒａｔｔｉｎｉ  Ｌ，Ｓａｎｔｉｎｉ  Ｄ，Ｓａｎｔｏｎｉ  Ｇ，Ｃａｓｃｉｎｕ  Ｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１３  Ｏｃｔ  ２を参照されたい）。
【０７８６】
本発明は、少なくとも一部には、現在の臨床セッティングで用いられている用量をはるかに下回るｍＴＯＲ阻害薬の用量が、対象の免疫応答の増加及びＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増加に優れた効果を有したという意外な知見に基づく。ｍＴＯＲ活性の部分的阻害を生じさせるに過ぎない低用量のｍＴＯＲ阻害薬が、ヒト対象における免疫応答を有効に改善し、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比を増加させることが可能であった点は意外であった。
【０７８７】
代わりに又は加えて、いかなる理論によっても拘束されることを望むものではないが、免疫増強低用量のｍＴＯＲ阻害薬が、例えば未治療対象と比較したとき、ナイーブＴ細胞数を例えば少なくとも一過性に増加させることができると考えられる。代わりに又は加えて、この場合もやはり理論によって拘束されることを望むものではないが、十分な時間後又は十分な用量投与後のｍＴＯＲ阻害薬による治療は、以下：
例えばメモリーＴ細胞上、例えばメモリーＴ細胞前駆体上の、以下のマーカー：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ１２７ｈｉｇｈ、ＣＤ２７＋、及びＢＣＬ２の１つ以上の発現の増加；
例えばメモリーＴ細胞上、例えばメモリーＴ細胞前駆体上の、ＫＬＲＧ１の発現の低下；及び
メモリーＴ細胞前駆体、例えば以下の特徴：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈの増加、ＣＤ１２７ｈｉｇｈの増加、ＣＤ２７＋の増加、ＫＬＲＧ１の減少、及びＢＣＬ２の増加のいずれか１つ又は組み合わせを有する細胞の数の増加
の１つ以上をもたらすと考えられ、ここで、上記に記載される変化のいずれかは、例えば、未治療対象と比較したとき、例えば少なくとも一過性に起こる（Ａｒａｋｉ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６０：１０８−１１２）。メモリーＴ細胞前駆体は、分化プログラム初期のメモリーＴ細胞である。例えば、メモリーＴ細胞は、以下の特徴：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈの増加、ＣＤ１２７ｈｉｇｈの増加、ＣＤ２７＋の増加、ＫＬＲＧ１の減少、及び／又はＢＣＬ２の増加の１つ以上を有する。
【０７８８】
ある実施形態において、本発明は、選択された投与レジメン、例えば１日１回又は週１回で投与したとき、完全な、又は有意な免疫抑制に関連しないが、免疫応答の増強に関連するｍＴＯＲ阻害レベルに関連するｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパログ、ラパマイシン、又はＲＡＤ００１、又は触媒ｍＴＯＲ阻害薬の組成物、又は剤形に関する。
【０７８９】
ｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパログ、ラパマイシン、又はＲＡＤ００１、又は触媒ｍＴＯＲ阻害薬は、徐放製剤で提供することができる。本明細書に記載される組成物又は単位剤形のいずれも、徐放製剤で提供することができる。一部の実施形態において、徐放製剤は即効製剤よりも低いバイオアベイラビリティを有することになる。例えば、実施形態において、即効製剤と同様の治療効果を達成するために、徐放製剤は即効製剤で提供される阻害薬の約２〜約５、約２．５〜約３．５、又は約３倍の量を有することになる。
【０７９０】
ある実施形態において、典型的には週１回投与に用いられる、１単位剤形当たり０．１〜２０、０．５〜１０、２．５〜７．５、３〜６、又は約５ｍｇを有する例えばＲＡＤ００１の即効形態が提供される。週１回投与については、このような即効製剤は、それぞれ０．３〜６０、１．５〜３０、７．５〜２２．５、９〜１８、又は約１５ｍｇのｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１を有する徐放形態に対応する。実施形態において、両方の形態とも、１回／週単位で投与される。
【０７９１】
ある実施形態において、典型的には１日１回投与に用いられる、１単位剤形当たり０．００５〜１．５、０．０１〜１．５、０．１〜１．５、０．２〜１．５、０．３〜１．５、０．４〜１．５、０．５〜１．５、０．６〜１．５、０．７〜１．５、０．８〜１．５、１．０〜１．５、０．３〜０．６、又は約０．５ｍｇを有する例えばＲＡＤ００１の即効形態が提供される。１日１回投与については、このような即効形態は、それぞれ０．０１５〜４．５、０．０３〜４．５、０．３〜４．５、０．６〜４．５、０．９〜４．５、１．２〜４．５、１．５〜４．５、１．８〜４．５、２．１〜４．５、２．４〜４．５、３．０〜４．５、０．９〜１．８、又は約１．５ｍｇのｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１を有する徐放形態に対応する。週１回投与については、このような即効形態は、それぞれ０．１〜３０、０．２〜３０、２〜３０、４〜３０、６〜３０、８〜３０、１０〜３０、１．２〜３０、１４〜３０、１６〜３０、２０〜３０、６〜１２、又は約１０ｍｇのｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１を有する徐放形態に対応する。
【０７９２】
ある実施形態において、典型的には１日１回投与に用いられる、１単位剤形当たり０．０１〜１．０ｍｇを有する例えばＲＡＤ００１の即効形態が提供される。１日１回投与については、このような即効形態は、それぞれ０．０３〜３ｍｇのｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１を有する徐放形態に対応する。週１回投与については、このような即効形態は、それぞれ０．２〜２０ｍｇのｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１を有する徐放形態に対応する。
【０７９３】
ある実施形態において、典型的には週１回投与に用いられる、１単位剤形当たり０．５〜５．０ｍｇを有する例えばＲＡＤ００１の即効形態が提供される。週１回投与については、このような即効形態は、それぞれ１．５〜１５ｍｇのｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１を有する徐放形態に対応する。
【０７９４】
上記に記載したとおり、ｍＴＯＲ経路の一つの標的はＰ７０  Ｓ６キナーゼである。従って、本明細書に記載される方法及び組成物において有用なｍＴＯＲ阻害薬の用量は、例えば、本明細書に記載されるアッセイ、例えばＢｏｕｌａｙアッセイによって測定したとき、ｍＴＯＲ阻害薬の非存在下におけるＰ７０  Ｓ６キナーゼの活性と比べてＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性の８０％以下の阻害を実現するのに十分なものである。更なる態様において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害薬の非存在下におけるＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性と比べてＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性の３８％以下の阻害を実現するのに十分なｍＴＯＲ阻害薬の量を提供する。
【０７９５】
一態様において、本発明の方法及び組成物において有用なｍＴＯＲ阻害薬の用量は、例えば、ヒト対象への投与時に、例えば本明細書に記載されるアッセイ、例えばＢｏｕｌａｙアッセイによって測定したとき、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の９０±５％（即ち８５〜９５％）、８９±５％、８８±５％、８７±５％、８６±５％、８５±５％、８４±５％、８３±５％、８２±５％、８１±５％、８０±５％、７９±５％、７８±５％、７７±５％、７６±５％、７５±５％、７４±５％、７３±５％、７２±５％、７１±５％、７０±５％、６９±５％、６８±５％、６７±５％、６６±５％、６５±５％、６４±５％、６３±５％、６２±５％、６１±５％、６０±５％、５９±５％、５８±５％、５７±５％、５６±５％、５５±５％、５４±５％、５４±５％、５３±５％、５２±５％、５１±５％、５０±５％、４９±５％、４８±５％、４７±５％、４６±５％、４５±５％、４４±５％、４３±５％、４２±５％、４１±５％、４０±５％、３９±５％、３８±５％、３７±５％、３６±５％、３５±５％、３４±５％、３３±５％、３２±５％、３１±５％、３０±５％、２９±５％、２８±５％、２７±５％、２６±５％、２５±５％、２４±５％、２３±５％、２２±５％、２１±５％、２０±５％、１９±５％、１８±５％、１７±５％、１６±５％、１５±５％、１４±５％、１３±５％、１２±５％、１１±５％、又は１０±５％の阻害を実現するのに十分である。
【０７９６】
対象のＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性は、例えば、米国特許第７，７２７，９５０号明細書に記載される方法に従うか、ホスホＰ７０  Ｓ６Ｋレベル及び／又はホスホＰ７０  Ｓ６レベルのイムノブロット分析によるか、又はインビトロキナーゼ活性アッセイによるなど、当該技術分野において公知の方法を用いて測定し得る。
【０７９７】
本明細書で使用されるとき、ｍＴＯＲ阻害薬の用量に関して用語「約」とは、ｍＴＯＲ阻害薬の量の最大±１０％の変動を指すが、記載される用量前後の変動がないことを含み得る。
【０７９８】
一部の実施形態において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリック阻害薬、例えばＲＡＤ００１を目標トラフレベルの範囲内の投薬量で対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、このトラフレベルは、臓器移植及び癌患者に用いられる投与レジメンに関連するトラフレベルと比べて有意に低い。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばＲＡＤ００１、又はラパマイシンは、免疫抑制又は抗癌効果をもたらすトラフレベルの１／２、１／４、１／１０、又は１／２０未満のトラフレベルをもたらすように投与される。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばＲＡＤ００１、又はラパマイシンは、免疫抑制又は抗癌適応における使用に関してＦＤＡ承認済みの添付文書に掲載されるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０、又は１／２０未満のトラフレベルをもたらすように投与される。
【０７９９】
ある実施形態において、本明細書に開示される方法は、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリック阻害薬、例えばＲＡＤ００１を０．１〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．１〜５ｎｇ／ｍｌ、０．１〜３ｎｇ／ｍｌ、０．１〜２ｎｇ／ｍｌ、又は０．１〜１ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルを提供する投薬量で対象に投与することを含む。
【０８００】
ある実施形態において、本明細書に開示される方法は、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリック阻害薬、例えばＲＡＤ００１を０．２〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．２〜５ｎｇ／ｍｌ、０．２〜３ｎｇ／ｍｌ、０．２〜２ｎｇ／ｍｌ、又は０．２〜１ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルを提供する投薬量で対象に投与することを含む。
【０８０１】
ある実施形態において、本明細書に開示される方法は、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリック阻害薬、例えばＲＡＤ００１を０．３〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．３〜５ｎｇ／ｍｌ、０．３〜３ｎｇ／ｍｌ、０．３〜２ｎｇ／ｍｌ、又は０．３〜１ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルを提供する投薬量で対象に投与することを含む。
【０８０２】
ある実施形態において、本明細書に開示される方法は、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリック阻害薬、例えばＲＡＤ００１を０．４〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．４〜５ｎｇ／ｍｌ、０．４〜３ｎｇ／ｍｌ、０．４〜２ｎｇ／ｍｌ、又は０．４〜１ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルを提供する投薬量で対象に投与することを含む。
【０８０３】
ある実施形態において、本明細書に開示される方法は、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリック阻害薬、例えばＲＡＤ００１を０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．５〜５ｎｇ／ｍｌ、０．５〜３ｎｇ／ｍｌ、０．５〜２ｎｇ／ｍｌ、又は０．５〜１ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルを提供する投薬量で対象に投与することを含む。
【０８０４】
ある実施形態において、本明細書に開示される方法は、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリック阻害薬、例えばＲＡＤ００１を１〜１０ｎｇ／ｍｌ、１〜５ｎｇ／ｍｌ、１〜３ｎｇ／ｍｌ、又は１〜２ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルを提供する投薬量で対象に投与することを含む。
【０８０５】
本明細書で使用されるとき、用語「トラフレベル」は、次の用量の直前における血漿中薬物濃度、又は２つの用量間の最低薬物濃度を指す。
【０８０６】
一部の実施形態において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは約０．１〜４．９ｎｇ／ｍｌの範囲である。ある実施形態において、目標トラフレベルは３ｎｇ／ｍｌ未満であり、例えば０．３以下〜３ｎｇ／ｍｌである。ある実施形態において、目標トラフレベルは３ｎｇ／ｍｌ未満であり、例えば０．３以下〜１ｎｇ／ｍｌである。
【０８０７】
更なる態様において、本発明は、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害薬を、ＲＡＤ００１に関して指定される目標トラフレベルと生物学的に同等な目標トラフレベルに関連する量で利用することができる。ある実施形態において、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害薬の目標トラフレベルは、（例えば、本明細書に記載される方法、例えばＰ７０  Ｓ６の阻害によって測定したとき）本明細書に記載されるＲＡＤ００１のトラフレベルが与えるのと同じレベルのｍＴＯＲ阻害を与えるレベルである。
【０８０８】
医薬組成物：ｍＴＯＲ阻害薬
一態様において、本発明は、本明細書に記載されるＣＡＲ細胞との併用での使用向けに製剤化された、ｍＴＯＲ阻害薬、例えば本明細書に記載されるとおりのｍＴＯＲ阻害薬を含む医薬組成物に関する。
【０８０９】
一部の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬は、例えば、本明細書に記載されるとおり、追加的なものとの併用での投与用に製剤化される。
【０８１０】
一般に、本発明の化合物は、上記に記載したとおりの治療有効量で、当該技術分野において公知の通常の許容できる方法のいずれかを用いて、単独又は１つ以上の治療剤との併用のいずれかで投与されることになる。
【０８１１】
医薬製剤は、従来の溶解及び混合手順を用いて調製され得る。例えば、原薬（例えば、ｍＴＯＲ阻害薬又は安定化形態の化合物（例えば、シクロデキストリン誘導体との複合体又は他の公知の複合体形成薬剤）を本明細書に記載される賦形剤の１つ以上の存在下で好適な溶媒中に溶解させる。ｍＴＯＲ阻害薬は、典型的には医薬剤形に製剤化されることにより、容易に制御可能な投薬量の薬物を提供し、且つ患者に洗練された扱い易い製品をもたらす。
【０８１２】
本発明の化合物は医薬組成物として任意の従来経路により、詳細には経腸的に、例えば経口的に、例えば錠剤若しくはカプセルの形態で、又は非経口的に、例えば注射用溶液若しくは懸濁液の形態で、局所的に、例えばローション、ゲル、軟膏若しくはクリームの形態で、又は経鼻若しくは坐薬形態で投与することができる。ｍＴＯＲ阻害薬が、本明細書に記載されるとおりの別の薬剤と併用して（それと同時に、又は代わりにそれと別個に）投与される場合、一態様において、両方の成分が同じ経路によって（例えば、非経口的に）投与され得る。代わりに、別の薬剤は、ｍＴＯＲ阻害薬と比べて異なる経路によって投与され得る。例えば、ｍＴＯＲ阻害薬が経口的に投与され得、他の薬剤が非経口的に投与され得る。
【０８１３】
徐放
本明細書に開示されるｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害薬又は触媒ｍＴＯＲ阻害薬は、本明細書に開示されるｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１を含む経口固形剤形の形態の、製品安定性要件を満たし、及び／又は平均血漿ピーク濃度の低下、薬物吸収の程度及び血漿ピーク濃度の患者間及び患者内変動の低下、Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ比の低下及び／又は食物効果の低下など、即効（ＩＲ）錠剤に優る有利な薬物動態特性を有する医薬製剤として提供することができる。提供される医薬製剤は、より正確な用量調整を可能にし、及び／又は有害事象の頻度を低下させるため、ひいては本明細書に開示されるｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１による患者の治療がより安全となり得る。
【０８１４】
一部の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１の安定持続放出製剤を提供し、これは多微粒子系であり、機能層及びコーティングを有し得る。
【０８１５】
用語「持続放出、多微粒子製剤は、本明細書で使用されるとき、長期間にわたる、例えば少なくとも１、２、３、４、５又は６時間にわたる本明細書に開示されるｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１の放出を可能にする製剤を指す。持続放出製剤は、例えば、本明細書に記載されるとおりの特別な賦形剤で作られたマトリックス及びコーティングを含有し得、これは活性成分が摂取後長期間にわたり利用可能になるような方法で製剤化されるものである。
【０８１６】
用語「持続放出」は、用語「徐放」（ＳＲ）又は「長期放出」と同義的に使用することができる。用語「持続放出」は、錠剤及びカプセルに関する薬局方Ｐｈ．Ｅｕｒ．（第７版）モノグラフ及び医薬剤形に関するＵＳＰ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｃｈａｐｔｅｒ＜１１５１＞の定義に従い活性薬物物質を経口投与後すぐには放出せず、持続して放出する医薬製剤を指す。用語「即効」（ＩＲ）は、本明細書で使用されるとき、Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：“Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｏｒａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ”（ＦＤＡ  ＣＤＥＲ，１９９７）の定義に従い６０分未満以内に活性薬物物質の８５％を放出する医薬製剤を指す。一部の実施形態において、用語「即効」は、例えば、本明細書に記載される溶解アッセイで測定したとき、３０分の時間内での錠剤からの薬物、例えばｍＴＯＲ阻害薬、例えばエベロリムスの放出を意味する。
【０８１７】
本明細書に開示されるｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１の安定持続放出製剤は、当該技術分野において公知のアッセイ、例えば本明細書に記載されるとおりの溶解アッセイ（９００ｍＬリン酸緩衝液  ｐＨ６．８、ドデシル硫酸ナトリウム０．２％含有、３７℃を充填した溶解ベッセル、及び溶解は、それぞれＵＳＰに従うＵＳＰ試験モノグラフ７１１及びＰｈ．Ｅｕｒ．試験モノグラフ２．９．３．に従うことによる７５ｒｐｍでのパドル法を用いて実施される）を用いたインビトロ放出プロファイルによって特徴付けることができる。
【０８１８】
一部の実施形態において、本明細書に開示されるｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１の安定持続放出製剤は、インビトロ放出アッセイにおいて以下の放出仕様に従いｍＴＯＲ阻害薬を放出する：
０．５時間：＜４５％、又は＜４０、例えば＜３０％
１時間：２０〜８０％、例えば３０〜６０％
２時間：＞５０％、又は＞７０％、例えば＞７５％
３時間：＞６０％、又は＞６５％、例えば＞８５％、例えば＞９０％。
【０８１９】
一部の実施形態において、本明細書に開示されるｍＴＯＲ阻害薬、例えばラパマイシン又はＲＡＤ００１の安定持続放出製剤は、インビトロ溶解アッセイにおいて５０％のｍＴＯＲ阻害薬を４５、６０、７５、９０、１０５分又は１２０分以上で放出する。
【０８２０】
ＲＯＲ１阻害薬
また、本明細書には、ＲＯＲ１阻害薬及び併用療法、例えば本明細書に記載されるＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞とＲＯＲ１阻害薬との併用も提供される。ＲＯＲ１阻害薬としては、限定はされないが、抗ＲＯＲ１  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、及び抗ＲＯＲ抗体（例えば、抗ＲＯＲ１単一又は二重特異性抗体）及びその断片が挙げられる。一部の実施形態において、抗ＲＯＲ１阻害薬は、本明細書に記載される疾患の治療に使用することができる。
【０８２１】
例示的抗ＲＯＲ１阻害薬については、Ｈｕｄｅｃｅｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９．１２（２０１３）：３１５３−６４（参照により本明細書に援用される）に記載されている。例えば、抗ＲＯＲ１阻害薬としては、Ｈｕｄｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載される抗ＲＯＲ１  ＣＡＲＴ（例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．の３１５５頁、最初の段落全て（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり作成される）が挙げられる。他の例では、抗ＲＯＲ１阻害薬としては、Ｈｕｄｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．の３１５４〜５５頁にまたがる段落；Ｂａｓｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．ＭＡｂｓ  ４（２０１２）：３４９−６１；及びＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（２０１１）：ｅ２１０１８（参照により本明細書に援用される）に記載される２Ａ２及びＲ１２抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体のＶＨ及び／又はＶＬ配列を含む抗体又はその断片が挙げられる。
【０８２２】
一部の実施形態において、ＲＯＲ１阻害薬としては、米国特許出願公開第２０１３／０１０１６０７号明細書、例えば米国特許出願公開第２０１３／０１０１６０７号明細書の配列番号１又は２（参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含め、ＲＯＲ１を標的にする抗体又はその断片（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））が挙げられる。一部の実施形態において、抗ＲＯＲ１抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は生物学的に活性な分子にコンジュゲート又は融合して、例えば免疫細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞をＲＯＲ１発現細胞に応答するように仕向けるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する。
【０８２３】
一部の実施形態において、例示的ＲＯＲ１阻害薬としては、ＵＣ−９６１（シルムツズマブ）と称される抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体が挙げられる。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０２２２２６８８を参照されたい。シルムツズマブは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、卵巣癌、及び黒色腫などの癌の治療に使用することができる。例えば、Ｈｏｊｊａｔ−Ｆａｒｓａｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．８（４）：ｅ６１１６７；及びＮＣＴ０２２２２６８８を参照されたい。
【０８２４】
一部の実施形態において、シルムツズマブは静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。例えば、注入毎に、約７００〜７０００μｇ（例えば、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００、１０００〜１５００、１５００〜２０００、２０００〜２５００、２５００〜３０００、３０００〜３５００、３５００〜４０００、４０００〜４５００、４５００〜５０００、５０００〜５５００、５５００〜６０００、６０００〜６５００、又は６５００〜７０００μｇ）のシルムツズマブが提供される。一部の実施形態において、シルムツズマブは、１０〜１００μｇ／ｋｇ体重、例えば１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、又は９５〜１００μｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。一実施形態において、シルムツズマブは１５μｇ／ｋｇ体重の出発用量で投与される。
【０８２５】
一部の実施形態において、シルムツズマブは、少なくとも７日、例えば７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超え投与間隔で投与される。例えば、シルムツズマブは、少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、又はそれを超え投与間隔で投与される。
【０８２６】
一部の実施形態において、シルムツズマブは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５年又はそれを超えて投与される。例えば、シルムツズマブは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも２用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０用量、又はそれを超える）が投与される。
【０８２７】
一部の実施形態において、抗ＲＯＲ１抗体は、治療剤にコンジュゲートされるか、又は他の方法で結合する。
【０８２８】
一部の実施形態において、ＲＯＲ１阻害薬としては、抗ＲＯＲ１  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えばｓｃＦｖ、ＣＤＲ、又はＶＨ及びＶＬ鎖を含む抗ＲＯＲ１  ＣＡＲコンストラクトを発現する又はＲＯＲ１結合ＣＡＲによってコードされる細胞が挙げられる。例えば、抗ＲＯＲ１  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞と併用して投与するためＲＯＲ１−ＣＡＲ（ＲＯＲ１結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に操作することにより作成される。また、本明細書には、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を養子療法に使用する方法も提供される。
【０８２９】
別の態様において、本明細書には、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＲＯＲ１  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団が提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団には、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＲＯＲ１  ＣＡＲを発現する第２の細胞とが含まれ得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団には、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＲＯＲ１  ＣＡＲ、ＣＤ２０  ＣＡＲ、又はＣＤ２２  ＣＡＲ）を発現する第１の細胞と、二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＲＯＲ１  ＣＡＲ、ＣＤ２０  ＣＡＲ、又はＣＤ２２  ＣＡＲ））を発現する第２の細胞とが含まれる。
【０８３０】
ＣＤ２２阻害薬
本明細書には、ＣＤ２２阻害薬及び併用療法、例えばＣＤ２２阻害薬と本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞（例えば、本明細書に記載されるＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞）との併用が提供される。
【０８３１】
一実施形態において、ＣＤ２２阻害薬は、本明細書に記載されるＣＤ２２阻害薬である。ＣＤ２２阻害薬は、表６に記載されるなどの例えば抗ＣＤ２２抗体（例えば、抗ＣＤ２２単一又は二重特異性抗体）又はＣＤ２２  ＣＡＲＴであり得る。一部の実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は治療剤にコンジュゲートされるか、又は他の方法で結合する。例示的治療剤としては、例えば、微小管破壊剤（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ）及び毒素（例えば、ジフテリア毒素又は緑膿菌外毒素Ａ、リシン）が挙げられる。
【０８３２】
ある実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は抗ＣＤ２２モノクローナル抗体−ＭＭＡＥコンジュゲート（例えば、ＤＣＤＴ２９８０Ｓ）である。ある実施形態において、抗体は抗ＣＤ２２抗体のｓｃＦｖ、例えば抗体ＲＦＢ４のｓｃＦｖである。このｓｃＦｖは、緑膿菌外毒素Ａの全て又は断片に融合させることができる（例えば、ＢＬ２２）。ある実施形態において、抗体はヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（例えば、エプラツズマブ）である。ある実施形態において、抗体又はその断片は抗ＣＤ２２抗体のＦｖ部分を含み、これは、任意選択により、緑膿菌外毒素Ａの全て又は断片（例えば、その３８ＫＤａ断片）に共有結合的に融合される（例えば、モキセツモマブパスドトクス（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｓｕｄｏｔｏｘ））。ある実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は、任意選択により毒素にコンジュゲートされた、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性抗体である。例えば、一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は、任意選択によりジフテリア毒素（ＤＴ）の全て又は一部分、例えばジフテリア毒素（ＤＴ）の最初の３８９アミノ酸、ＤＴ３９０、例えばＤＴ２２１９ＡＲＬなどのリガンド指向性毒素に連結した抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性部分（例えば、２つのｓｃＦｖリガンド、ヒトＣＤ１９及びＣＤ２２を認識する）を含む）。別の実施形態において、二重特異性部分（例えば、抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２）は、脱グリコシルリシンＡ鎖などの毒素に連結される（例えば、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ））。
【０８３３】
一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性リガンド指向性毒素（例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）の最初の３８９アミノ酸、ＤＴ３９０、例えばＤＴ２２１９ＡＲＬに連結された、ヒトＣＤ１９及びＣＤ２２を認識する、２つのｓｃＦｖリガンド）；抗ＣＤ２２モノクローナル抗体−ＭＭＡＥコンジュゲート（例えば、ＤＣＤＴ２９８０Ｓ）；緑膿菌外毒素Ａの断片に融合した抗ＣＤ２２抗体ＲＦＢ４のｓｃＦｖ（例えば、ＢＬ２２）；脱グリコシルリシンＡ鎖コンジュゲート抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２（例えば、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ））；ヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（例えば、エプラツズマブ）；又は緑膿菌外毒素Ａの３８ＫＤａ断片に共有結合的に融合した抗ＣＤ２２抗体のＦｖ部分（例えば、モキセツモマブパスドトクス）から選択される。
【０８３４】
一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性リガンド指向性毒素（例えば、ＤＴ２２１９ＡＲＬ）であり、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性リガンド指向性毒素は、約１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ，１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１４０μｇ／ｋｇ、１６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２０μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ．ｋｇ（例えば、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、又は８０μｇ／ｋｇ）の用量で、ある期間にわたって、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日毎に又はそれを超えて投与される。一部の実施形態において、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二重特異性リガンド指向性毒素は静脈内注入によって投与される。
【０８３５】
一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体はＢＬ２２であり、ＢＬ２２は、約１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ，１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１４０μｇ／ｋｇ、１６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２０μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ．ｋｇ（例えば、３μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、又は５０μｇ／ｋｇ）の用量で、ある期間にわたって、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日毎に又はそれを超えて投与される。一部の実施形態において、ＢＬ２２は、毎日、隔日、３日毎、又は４日毎に、ある期間、例えば４日サイクル、６日サイクル、８日サイクル、１０日サイクル、１２日サイクル、又は１４日サイクルにわたって投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２サイクル又はそれを超えるＢＬ２２が投与される。一部の実施形態において、ＢＬ２２は静脈内注入によって投与される。
【０８３６】
一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体は脱グリコシルリシンＡ鎖コンジュゲート抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２（例えば、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ））であり、脱グリコシルリシンＡ鎖コンジュゲート抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２は、約５００μｇ／ｍ２、６００μｇ／ｍ２、７００μｇ／ｍ２、８００μｇ／ｍ２、９００μｇ／ｍ２、１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、又は７ｍｇ／ｍ２の用量で、ある期間にわたって、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日毎に又はそれを超えて投与される。一部の実施形態において、脱グリコシルリシンＡ鎖コンジュゲート抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２は、毎日、隔日、３日毎、又は４日毎に、ある期間、例えば４日サイクル、６日サイクル、８日サイクル、１０日サイクル、１２日サイクル、又は１４日サイクルにわたって（例えば、６日間にわたって隔日で）投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２サイクル又はそれを超える脱グリコシルリシンＡ鎖コンジュゲート抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２が投与される。一部の実施形態において、脱グリコシルリシンＡ鎖コンジュゲート抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２は静脈内注入によって投与される。
【０８３７】
一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体はヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（例えば、エプラツズマブ）であり、ヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体は、約１０ｍｇ／ｍ２／週、２０ｍｇ／ｍ２／週、５０ｍｇ／ｍ２／週、１００ｍｇ／ｍ２／週、１２０ｍｇ／ｍ２／週、１４０ｍｇ／ｍ２／週、１６０ｍｇ／ｍ２／週、１８０ｍｇ／ｍ２／週、２００ｍｇ／ｍ２／週、２２０ｍｇ／ｍ２／週、２５０ｍｇ／ｍ２／週、２６０ｍｇ／ｍ２／週、２７０ｍｇ／ｍ２／週、２８０ｍｇ／ｍ２／週、２９０ｍｇ／ｍ２／週、３００ｍｇ／ｍ２／週、３０５ｍｇ／ｍ２／週、３１０ｍｇ／ｍ２／週、３２０ｍｇ／ｍ２／週、３２５ｍｇ／ｍ２／週、３３０ｍｇ／ｍ２／週、３３５ｍｇ／ｍ２／週、３４０ｍｇ／ｍ２／週、３４５ｍｇ／ｍ２／週、３５０ｍｇ／ｍ２／週、３５５ｍｇ／ｍ２／週、３６０ｍｇ／ｍ２／週、３６５ｍｇ／ｍ２／週、３７０ｍｇ／ｍ２／週、３７５ｍｇ／ｍ２／週、３８０ｍｇ／ｍ２／週、３８５ｍｇ／ｍ２／週、３９０ｍｇ／ｍ２／週、４００ｍｇ／ｍ２／週、４１０ｍｇ／ｍ２／週、４２０ｍｇ／ｍ２／週、４３０ｍｇ／ｍ２／週、４４０ｍｇ／ｍ２／週、４５０ｍｇ／ｍ２／週、４６０ｍｇ／ｍ２／週、４７０ｍｇ／ｍ２／週、４８０ｍｇ／ｍ２／週、４９０ｍｇ／ｍ２／週、５００ｍｇ／ｍ２／週、６００ｍｇ／ｍ２／週、７００ｍｇ／ｍ２／週、８００ｍｇ／ｍ２／週、９００ｍｇ／ｍ２／週、１ｇ／ｍ２／週、又は２ｇ／ｍ２／週（例えば、３６０ｍｇ／ｍ２／週又は４８０ｍｇ／ｍ２／週）の用量で、ある期間にわたって、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週間毎に又はそれを超えて投与される。一部の実施形態において、初回用量は後続用量よりも低い（例えば、３６０ｍｇ／ｍ２／週の初回用量に続いて３７０ｍｇ／ｍ２／週の後続用量）。一部の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体は静脈内注入によって投与される。
【０８３８】
一実施形態において、抗ＣＤ２２抗体はモキセツモマブパスドトクスであり、モキセツモマブパスドトクスは、約１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ，１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１４０μｇ／ｋｇ、１６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２０μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ（例えば、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、又は５０μｇ／ｋｇ）の用量で、ある期間にわたって、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日毎に又はそれを超えて投与される。一部の実施形態において、モキセツモマブパスドトクスは、毎日、隔日、３日毎、又は４日毎に、ある期間、例えば４日サイクル、６日サイクル、８日サイクル、１０日サイクル、１２日サイクル、又は１４日サイクルにわたって（例えば、６日間にわたって隔日で）投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２サイクル又はそれを超えるモキセツモマブパスドトクスが投与される。一部の実施形態において、モキセツモマブパスドトクスは静脈内注入によって投与される。
【０８３９】
一実施形態において、ＣＤ２２阻害薬には、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ２２  ＣＡＲＴ、又は例えばＣＤ２２結合ドメインを含み、且つＣＤ２０  ＣＡＲＴと併用して投与するため細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に操作されるＣＤ２２−ＣＡＲが含まれ、及び養子療法へのその使用方法である。一部の実施形態において、ＣＤ２２阻害薬には、ＣＤ２２  ＣＡＲコンストラクトを発現する又はｓｃＦｖ、ＣＤＲ若しくはＶＨ及びＶＬ鎖を含むＣＤ２２  ＣＡＲによってコードされる細胞が含まれる。例えば、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書に記載されるＣＤ２０  ＣＡＲＴと併用して投与するためＣＤ２２−ＣＡＲ（ＣＤ２２結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に操作することにより作成される。
【０８４０】
別の態様において、本発明は、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ２２  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞の集団、例えばＣＡＲ発現細胞を提供する。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ２２  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含み得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（例えば、ＣＤ２０  ＣＡＲ又はＣＤ２２  ＣＡＲ）を発現する第１の細胞と、二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（例えば、ＣＤ２０  ＣＡＲ又はＣＤ２２  ＣＡＲ）を発現する第２の細胞とを含む。一実施形態において、ＣＤ２０  ＣＡＲは、表１に係る配列を含むか又はそれからなる。一実施形態において、ＣＤ２２  ＣＡＲは、表６に係る配列を含むか又はそれからなる。
【０８４１】
ＣＤ１９阻害薬
本明細書には、ＣＤ１９阻害薬及び併用療法、例えばＣＤ１９阻害薬と本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞（例えば、本明細書に記載されるＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞又は本明細書に記載されるＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞）との併用が提供される。ＣＤ１９阻害薬としては、限定はされないが、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞、又は抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９単一又は二重特異性抗体、これは表１１に係る配列を含み得る、又はそれからなり得る）又はその断片若しくはコンジュゲートが挙げられる。ある実施形態において、ＣＤ１９阻害薬は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＲＯＲ１阻害薬、例えばＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＲＯＲ１  ＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞と併用して投与される。
【０８４２】
例示的抗ＣＤ１９抗体又はその断片若しくはコンジュゲートとしては、限定はされないが、ブリナツモマブ、ＳＡＲ３４１９（Ｓａｎｏｆｉ）、ＭＥＤＩ−５５１（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣ）、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）、ＤＴ２２１９ＡＲＬ（Ｍａｓｏｎｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ＭＯＲ−２０８（ＸｍＡｂ−５５７４とも称される；ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）、ＸｍＡｂ−５８７１（Ｘｅｎｃｏｒ）、ＭＤＸ−１３４２（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、及びＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。例えば、Ｈａｍｍｅｒ．ＭＡｂｓ．４．５（２０１２）：５７１−７７を参照されたい。
【０８４３】
一部の態様において、抗ＣＤ１９抗体又はその断片若しくはコンジュゲートはブリナツモマブを含む。ブリナツモマブは、１つがＣＤ１９に結合し、１つがＣＤ３に結合する、２つのｓｃＦｖで構成される二重特異性抗体である。ブリナツモマブはＴ細胞が癌細胞を攻撃するように仕向ける。例えば、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；臨床試験識別番号ＮＣＴ００２７４７４２及びＮＣＴ０１２０９２８６を参照されたい。一部の実施形態において、ブリナツモマブはＮＨＬ（例えば、ＤＬＢＣＬ）又はＡＬＬの治療に使用することができる。
【０８４４】
一部の実施形態において、ブリナツモマブは静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。一部の実施形態において、ブリナツモマブは、約０．５〜１２０μｇ／ｍ２／２４時間、例えば約０．５〜１μｇ／ｍ２／２４時間、１〜５μｇ／ｍ２／２４時間、５〜１５μｇ／ｍ２／２４時間、１５〜３０μｇ／ｍ２／２４時間、３０〜６０μｇ／ｍ２／２４時間、又は６０〜１２０μｇ／ｍ２／２４時間の用量で投与される。
【０８４５】
一部の実施形態において、ブリナツモマブは、少なくとも４日、例えば４、７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超える投与間隔で投与される。例えば、ブリナツモマブは、少なくとも０．５週間、例えば０．５、１、２、３、４、５、６、７、８週間、又はそれを超える投与間隔で投与される。一部の実施形態において、ブリナツモマブは１サイクル当たり２〜８週間にわたって、例えば１サイクル当たり２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、６〜７、又は７〜８週間にわたって連続静脈内注入により投与される。
【０８４６】
一部の実施形態において、ブリナツモマブは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、又はそれを超えて投与される。例えば、ブリナツモマブは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも４用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６用量、又はそれを超える）が投与される。
【０８４７】
一部の態様において、抗ＣＤ１９抗体はＭＥＤＩ−５５１を含む。ＭＥＤＩ−５５１は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増強されるように操作されたＦｃを含むヒト化抗ＣＤ１９抗体である。例えば、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；及び臨床試験識別番号ＮＣＴ０１９５７５７９を参照されたい。一部の実施形態において、ＭＥＤＩ−５５１はＢ細胞悪性腫瘍（例えば、ＮＨＬ、ＣＬＬ、ＤＬＢＣＬ、及び多発性骨髄腫）、多発性硬化症、及び強皮症の治療に使用することができる。
【０８４８】
一部の実施形態において、ＭＥＤＩ−５５１は静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。ある場合には、ＭＥＤＩ−５５１は、約０．５〜１２ｍｇ／ｋｇ、例えば０．５〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜２ｍｇ／ｋｇ、２〜４ｍｇ／ｋｇ、４〜８ｍｇ／ｋｇ、又は８〜１２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０８４９】
一部の実施形態において、ＭＥＤＩ−５５１は、少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、又はそれを超える投与間隔で投与される。一部の実施形態において、ＭＥＤＩ−５５１は、少なくとも７日、例えば７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超える投与間隔で投与される。
【０８５０】
一部の実施形態において、ＭＥＤＩ−５５１は、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５年又はそれを超えて投与される。例えば、ＭＥＤＩ−５５１は、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも２用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０用量、又はそれを超える）が投与される。
【０８５１】
一部の態様において、抗ＣＤ１９抗体又はその断片若しくはコンジュゲートはコンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）を含む。コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）は、ＣＤ１９及びＣＤ２２に結合する免疫毒素の混合物である。この免疫毒素は、脱グリコシルリシンＡ鎖に融合したｓｃＦｖ抗体断片で構成される。例えば、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；及びＨｅｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．３１．１２（２００９）：９３６−４１；Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１５４．４（２０１１）：４７１−６を参照されたい。一部の実施形態において、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）はＢ細胞白血病、例えばＡＬＬの治療に使用することができる。
【０８５２】
一部の実施形態において、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）は静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。ある場合には、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）は、約１〜１０ｍｇ／ｍ２、例えば約１〜２ｍｇ／ｍ２、２〜３ｍｇ／ｍ２、３〜４ｍｇ／ｍ２、４〜５ｍｇ／ｍ２、又は５〜６ｍｇ／ｍ２、６〜７ｍｇ／ｍ２、７〜８ｍｇ／ｍ２、８〜９ｍｇ／ｍ２、又は９〜１０ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０８５３】
一部の実施形態において、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）は、少なくとも２日、例えば２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超える投与間隔で投与される。一部の実施形態において、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）は、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも１週間、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５年又はそれを超えて投与される。例えば、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）は、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも４用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０用量、又はそれを超える）が投与される。
【０８５４】
一部の態様において、抗ＣＤ１９抗体又はその断片若しくはコンジュゲートはＤＴ２２１９ＡＲＬを含む。ＤＴ２２１９ＡＲＬは、２つのｓｃＦｖ及びトランケート型ジフテリア毒素を含む、ＣＤ１９及びＣＤ２２を標的にする二重特異性免疫毒素である。例えば、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；及び臨床試験識別番号ＮＣＴ００８８９４０８を参照されたい。一部の実施形態において、ＤＴ２２１９ＡＲＬは、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えばＢ細胞白血病及びリンパ腫の治療に使用することができる。
【０８５５】
一部の実施形態において、ＤＴ２２１９ＡＲＬは静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。一部の実施形態において、ＤＴ２２１９ＡＲＬは、約２０〜１００μｇ／ｋｇ、例えば約２０〜４０μｇ／ｋｇ、４０〜６０μｇ／ｋｇ、６０〜８０μｇ／ｋｇ、又は８０〜１００μｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０８５６】
一部の実施形態において、ＤＴ２２１９ＡＲＬは、少なくとも２日、例えば２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超える投与間隔で投与される。一部の実施形態において、ＤＴ２２１９ＡＲＬは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５年又はそれを超えて投与される。例えば、ＤＴ２２１９ＡＲＬは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも４用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０用量、又はそれを超える）が投与される。
【０８５７】
一部の態様において、抗ＣＤ１９抗体又はその断片若しくはコンジュゲートはＳＧＮ−ＣＤ１９Ａを含む。ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａは、合成細胞傷害性細胞殺傷剤、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）に連結された抗ＣＤ１９ヒト化モノクローナル抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。例えば、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；及び臨床試験識別番号ＮＣＴ０１７８６０９６及びＮＣＴ０１７８６１３５を参照されたい。一部の実施形態において、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａは、Ｂ細胞ＡＬＬ、ＮＨＬ（例えば、ＤＬＢＣＬ、マントル細胞リンパ腫、又は濾胞性リンパ腫）、バーキットリンパ腫又は白血病、又はＢ系統リンパ芽球性リンパ腫（Ｂ−ＬＢＬ）の治療に使用することができる。
【０８５８】
一部の実施形態において、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａは静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。一部の実施形態において、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａは、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３〜０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜２ｍｇ／ｋｇ、２〜３ｍｇ／ｋｇ、３〜４ｍｇ／ｋｇ、４〜５ｍｇ／ｋｇ、５〜６ｍｇ／ｋｇ、６〜７ｍｇ／ｋｇ、７〜８ｍｇ／ｋｇ、８〜９ｍｇ／ｋｇ、又は９〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０８５９】
一部の実施形態において、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａは、少なくとも７日、例えば７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超える投与間隔で投与される。例えば、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａは、少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、又はそれを超える投与間隔で投与される。
【０８６０】
一部の実施形態において、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５年又はそれを超えて投与される。例えば、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも４用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０用量、又はそれを超える）が投与される。
【０８６１】
一部の態様において、抗ＣＤ１９抗体はＭＯＲ−２０８（ＸｍＡｂ−５５７４とも称される）を含む。ＭＯＲ−２０８は、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合性が増強されているためＡＤＣＣ活性が向上した、Ｆｃ操作された抗ＣＤ１９ヒト化モノクローナル抗体である。例えば、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０１６８５００８、ＮＣＴ０１６８５０２１、ＮＣＴ０２００５２８９、及びＮＣＴ０１１６１５１１；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ｗｏｙａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２４．２４（２０１４）を参照されたい。一部の実施形態において、ＭＯＲ−２０８は、ＮＨＬ（例えば、ＦＬ、ＭＣＬ、ＤＬＢＣＬ）、ＣＬＬ、小リンパ球性リンパ腫、前リンパ球性白血病、又はＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）の治療に使用することができる。
【０８６２】
一部の実施形態において、ＭＯＲ−２０８は静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。一部の実施形態において、ＭＯＲ−２０８は、約０．３〜１２ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．３〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜２ｍｇ／ｋｇ、２〜４ｍｇ／ｋｇ、３〜６ｍｇ／ｋｇ、６〜９ｍｇ／ｋｇ、又は９〜１２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０８６３】
一部の実施形態において、ＭＯＲ−２０８は、少なくとも２日、例えば２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超える投与間隔で投与される。例えば、ＭＯＲ−２０８は、少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、又はそれを超える投与間隔で投与される。
【０８６４】
一部の実施形態において、ＭＯＲ−２０８は、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも１週間、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５年又はそれを超えて投与される。例えば、ＭＯＲ−２０８は、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも４用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０用量、又はそれを超える）が投与される。
【０８６５】
一部の態様において、抗ＣＤ１９抗体又はその断片若しくはコンジュゲートはＳＡＲ３４１９を含む。ＳＡＲ３４１９は、切断可能なリンカーを介してメイタンシン誘導体にコンジュゲートした抗ＣＤ１９ヒト化モノクローナル抗体を含む抗ＣＤ１９抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。例えば、Ｙｏｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３０．２（２０１２）：２７７６−８２；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；臨床試験識別番号ＮＣＴ００５４９１８５；及びＢｌａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１；１７：６４４８−５８を参照されたい。一部の実施形態において、ＳＡＲ３４１９は、ＮＨＬ（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び濾胞性小切れ込み核細胞型リンパ腫）又はＢ細胞ＡＬＬの治療に使用することができる。
【０８６６】
一部の実施形態において、ＳＡＲ３４１９は静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。一部の実施形態において、ＳＡＲ３４１９は、約１０〜２７０ｍｇ／ｍ２、例えば約１０〜２５ｍｇ／ｍ２、２５〜５０ｍｇ／ｍ２、５０〜７５ｍｇ／ｍ２、７５〜１００ｍｇ／ｍ２、１００〜１２５ｍｇ／ｍ２、１２５〜１５０ｍｇ／ｍ２、１５０〜１７５ｍｇ／ｍ２、１７５〜２００ｍｇ／ｍ２、２００〜２２５ｍｇ／ｍ２、２２５〜２５０ｍｇ／ｍ２、又は２５０〜２７０ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０８６７】
一部の実施形態において、ＳＡＲ３４１９は、少なくとも７日、例えば７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超える投与間隔で投与される。例えば、ＳＡＲ３４１９は、少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、又はそれを超える投与間隔で投与される。
【０８６８】
一部の実施形態において、ＳＡＲ３４１９は、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５年又はそれを超えて投与される。例えば、ＳＡＲ３４１９は、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも４用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０用量、又はそれを超える）が投与される。
【０８６９】
一部の態様において、抗ＣＤ１９抗体はＸｍＡｂ−５８７１を含む。ＸｍＡｂ−５８７１は、Ｆｃ操作されたヒト化抗ＣＤ１９抗体である。一部の実施形態において、ＸｍＡｂ−５８７１は、ループスなどの自己免疫疾患の治療に使用することができる。例えば、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０８７０】
一部の態様において、抗ＣＤ１９抗体はＭＤＸ−１３４２を含み、これは、ＡＤＣＣが増強されたヒトＦｃ操作抗ＣＤ１９抗体である。一部の実施形態において、ＭＤＸ−１３４２は、ＣＬＬ及び関節リウマチの治療に使用することができる。例えば、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０８７１】
一部の態様において、抗ＣＤ１９抗体はＡＦＭ１１を含む。ＡＦＭ１１は、ＣＤ１９及びＣＤ３を標的にする二重特異性抗体である。一部の実施形態において、ＡＦＭ１１は、ＮＨＬ（例えば、ＤＬＢＣＬ）、ＡＬＬ、又はＣＬＬの治療に使用することができる。例えば、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；及び臨床試験識別番号ＮＣＴ０２１０６０９１を参照されたい。一部の実施形態において、ＡＦＭ１１は静脈内注入として投与される。
【０８７２】
一部の実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ１９抗体は、治療剤、例えば化学療法剤（例えば、本明細書に記載される化学療法剤）、ペプチドワクチン（Ｉｚｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １０８：９６３−９７１に記載されるものなど）、免疫抑制剤（例えば、本明細書に記載される免疫抑制剤）、又は免疫除去剤（例えば、本明細書に記載される免疫除去剤）、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、ＦＫ５０６、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、サイトキシン、フルダラビン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、又はサイトカインにコンジュゲートされるか、又は他の方法で結合する。
【０８７３】
一部の実施形態において、ＣＤ１９阻害薬は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば抗ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトを発現する細胞を含む。ある実施形態において、抗ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトはネズミ科動物ｓｃＦｖ配列を含む。例えば、ネズミ科動物ｓｃＦｖ配列を含む抗ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトは、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットに提供されるＣＡＲ１９コンストラクト；米国特許第７，４４６，１９０号明細書に提供されるＣＡＲ１９コンストラクト；国際公開第２０１４／０３１６８７号パンフレットに提供されるＣＡＲ１９コンストラクト；又はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＭ８５２９５２に提供され及び本明細書に配列番号２２３として提供されるＣＡＲ１９コンストラクトである。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットに記載されるｓｃＦｖである。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、米国特許第７，４４６，１９０号明細書に記載されるｓｃＦｖである。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、国際公開第２０１４／０３１６８７号パンフレットに記載されるｓｃＦｖである。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＭ８５２９５２に記載されるｓｃＦｖ、又はそれと少なくとも９５％、例えば９５〜９９％同一の配列である。ある実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットに提供されるＣＡＲコンストラクトの一部である。ある実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、米国特許第７，４４６，１９０号明細書に提供されるＣＡＲコンストラクトの一部である。ある実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、国際公開第２０１４／０３１６８７号パンフレットに提供されるＣＡＲコンストラクトの一部である。ある実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＭ８５２９５２に提供されるＣＡＲコンストラクトの一部である。ある場合には、ＣＡＲの抗ＣＤ１９抗原結合ドメインは、その由来であるｓｃＦｖのマウス配列と比較してヒト化されているｓｃＦｖ抗体断片である。例えば、ＣＡＲの抗ＣＤ１９抗原結合ドメインは、例えば、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりのヒト化ｓｃＦｖ抗体断片である。ある実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、表１１からの少なくとも１つの（例えば、２、３、４、５、又は６つの）配列を含む。
【０８７４】
例えば、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞と併用して投与するためＣＤ１９−ＣＡＲ（ＣＤ１９結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に操作することにより作成される。また、本明細書には、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を養子療法に使用する方法も提供される。
【０８７５】
別の態様において、本明細書には、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞の集団、例えばＣＡＲ発現細胞が提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含み得る。
【０８７６】
ＣＤ１２３阻害薬
ＣＤ１２３は、インターロイキン−３受容体のα鎖（ＩＬ−３ＲＡ）とも称される。ＩＬ−３受容体（ＩＬ−３Ｒ）は、α鎖とβ鎖とで構成されるヘテロ二量体である。ＩＬ−３Ｒは膜受容体である。ＩＬ−３Ｒα鎖は３６０アミノ酸残基の糖タンパク質である。一部の白血病性障害では、高頻度でＣＤ１２３の異常が観察される。ＣＤ１２３は、複数の血液学的悪性腫瘍、例えば急性骨髄性及びＢリンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）及びヘアリー細胞白血病において過剰発現する。
【０８７７】
本明細書には、ＣＤ１２３阻害薬及び併用療法が提供される。ＣＤ１２３阻害薬には、限定はされないが、小分子、組換えタンパク質、抗ＣＤ１２３  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、及び抗ＣＤ１２３抗体（例えば、抗ＣＤ１２３単一又は二重特異性抗体）及びその断片が含まれる。一部の実施形態において、抗ＣＤ１２３阻害薬は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ１２３阻害薬は、ＣＤ２０阻害薬、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばネズミ科動物、ヒト、又はヒト化抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と併用して投与される。
【０８７８】
一実施形態において、ＣＤ１２３阻害薬は、例えば、ＣＤ１２３受容体の天然リガンド（又は断片）を含む組換えタンパク質である。例えば、組換えタンパク質はＳＬ−４０１（ＤＴ３８８ＩＬ３とも称される；テキサス大学南西医療センター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ））であり、これは、トランケート型ジフテリア毒素に融合したヒトＩＬ−３を含む融合タンパク質である。例えば、Ｔｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｒｅｓ．２０１４；２：４；及び臨床試験識別番号ＮＣＴ００３９７５７９を参照されたい。
【０８７９】
別の実施形態において、ＣＤ１２３阻害薬は、抗ＣＤ１２３抗体又はその断片である。一実施形態において、抗ＣＤ１２３抗体又はその断片は、モノクローナル抗体、例えば単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片を含む。例えば、抗ＣＤ１２３抗体又はその断片はＣＳＬ３６０（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を含む。ＣＳＬ３６０は、ＣＤ１２３に結合する組換えキメラモノクローナル抗体である。一部の実施形態において、ＣＳＬ３６０は静脈内に、例えば静脈内注入によって投与される。例えば、ＣＳＬ３６０は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、又は５〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０１６３２８５２；及びＴｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０８８０】
別の実施形態において、ＣＤ１２３抗体又はその断片はＣＳＬ３６２（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を含む。ＣＳＬ３６２は、ＣＤ１２３を標的にするヒト化モノクローナル抗体であり、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の活性化の増強に最適化される。一部の実施形態において、ＣＳＬ３６２は静脈内に、例えば静脈内注入によって投与される。一部の例において、ＣＳＬ３６２は、０．１〜１２ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜６ｍｇ／ｋｇ、又は６〜１２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０１６３２８５２を参照されたい。
【０８８１】
一実施形態において、ＣＤ１２３抗体又はその断片は、二重特異性抗体、例えばＭＧＤ００６（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）を含む。ＭＧＤ００６は、ＣＤ１２３及びＣＤ３を標的にする二重特異性抗体である。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０２１５２９５６を参照されたい。
【０８８２】
一部の実施形態において、ＣＤ１２３阻害薬は治療剤にコンジュゲートされるか、又は他の方法で結合する。
【０８８３】
一部の実施形態において、ＣＤ１２３阻害薬は、抗ＣＤ１２３  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば抗ＣＤ１２３  ＣＡＲコンストラクトを発現する又はｓｃＦｖ、ＣＤＲ若しくはＶＨ及びＶＬ鎖を含むＣＤ１２３結合ＣＡＲによってコードされる細胞を含む。例えば、抗ＣＤ１２３  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞と併用して投与するため、ＣＤ１２３−ＣＡＲ（ＣＤ１２３結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に操作することにより作成される。ある実施形態において、抗ＣＤ１２３  ＣＡＲコンストラクトは、ｓｃＦｖ配列、例えば米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２  Ａ１号明細書（参照により本明細書に援用される）に提供されるｓｃＦｖ配列を含む。一実施形態において、抗ＣＤ１２３結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２  Ａ１号明細書に記載されるｓｃＦｖである。ある実施形態において、抗ＣＤ１２３  結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２  Ａ１号明細書に提供されるＣＡＲコンストラクトの一部である。また、本明細書には、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を養子療法に使用する方法も提供される。
【０８８４】
別の態様において、本明細書には、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ１２３  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団が提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ１２３  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含み得る。
【０８８５】
ＣＤ１０阻害薬
分化クラスター１０（ＣＤ１０）は、ネプリライシン、膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、及び共通急性リンパ芽球性白血病抗原（ＣＡＬＬＡ）とも称される。ＣＤ１０は、膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）遺伝子によってコードされる酵素である。ＣＤ１０はプレＢ表現型の白血病細胞に発現し、共通急性リンパ球性白血病抗原である。
【０８８６】
また、本明細書には、ＣＤ１０阻害薬及び併用療法も提供される。ＣＤ１０阻害薬には、限定はされないが、小分子、組換えタンパク質、抗ＣＤ１０  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、及び抗ＣＤ１０抗体（例えば、抗ＣＤ１０単一又は二重特異性抗体）及びその断片が含まれる。一部の実施形態において、抗ＣＤ１０阻害薬は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ１０阻害薬は、ＣＤ２０阻害薬、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばネズミ科動物、ヒト、又はヒト化抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と併用して投与される。
【０８８７】
ある実施形態において、ＣＤ１０阻害薬は、サクビトリル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、バルサルタン／サクビトリル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オマパトリラト（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＲＢ−１０１、ＵＫ−４１４，４９５（Ｐｆｉｚｅｒ）、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体などの小分子を含む。
【０８８８】
ある実施形態において、ＣＤ１０阻害薬は、サクビトリル（ＡＨＵ−３７７；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）（４−｛［（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−ビフェニリル）−５−エトキシ−４−メチル−５−オキソ−２−ペンタニル］アミノ｝−４−オキソブタン酸）、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む。サクビトリルの構造は以下に示す。
【化４】
2019537433.tif 000005
【０８８９】
別の実施形態において、ＣＤ１０阻害薬は、バルサルタン／サクビトリル（ＬＣＺ６９６；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む。バルサルタン／サクビトリルはバルサルタンとサクビトリルとの１：１混合物を含む複合薬である。バルサルタン（（Ｓ）−３−メチル−２−（Ｎ−｛［２’−（２Ｈ−１，２，３，４−テトラゾール−５−イル）ビフェニル−４−イル］メチル｝ペンタンアミド）ブタン酸）の構造は以下に示す。
【化５】
2019537433.tif 000006
【０８９０】
ある実施形態において、ＣＤ１０阻害薬は、オマパトリラト（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）（（４Ｓ，７Ｓ，１０ａＳ）−５−オキソ−４−｛［（２Ｓ）−３−フェニル−２−スルファニルプロパノイル］アミノ｝−２，３，４，７，８，９，１０，１０ａ−オクタヒドロピリド［６，１−ｂ］［１，３］チアゼピン−７−カルボン酸）、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む。オマパトリラトの構造は以下に示す。
【化６】
2019537433.tif 000007
【０８９１】
ある実施形態において、ＣＤ１０阻害薬は、ＲＢ−１０１（ベンジルＮ−（３−｛［（２Ｓ）−２−アミノ−４−（メチルチオ）ブチル］ジチオ｝−２−ベンジルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート）、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む。ＲＢ−１０１の構造は以下に示す。
【化７】
2019537433.tif 000008
【０８９２】
ある実施形態において、ＣＤ１０阻害薬は、ＵＫ−４１４，４９５（Ｐｆｉｚｅｒ）（（Ｒ）−２−（｛１−［（５−エチル−１，３，４−チアジアゾール−２−イル）カルバモイル］シクロペンチル｝メチル）吉草酸）、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む。ＵＫ−４１４，４９５の構造は以下に示す。
【化８】
2019537433.tif 000009
【０８９３】
一部の実施形態において、ＣＤ１０阻害薬は治療剤にコンジュゲートされるか、又は他の方法で結合する。
【０８９４】
一部の実施形態において、ＣＤ１０阻害薬は、抗ＣＤ１０  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば抗ＣＤ１０  ＣＡＲコンストラクトを発現する又はｓｃＦｖ、ＣＤＲ若しくはＶＨ及びＶＬ鎖を含むＣＤ１０結合ＣＡＲによってコードされる細胞を含む。例えば、抗ＣＤ１０  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞と併用して投与するため、ＣＤ１０−ＣＡＲ（ＣＤ１０結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に操作することにより作成される。また、本明細書には、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を養子療法に使用する方法も提供される。
【０８９５】
別の態様において、本明細書には、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ１０  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団が提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ１０  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含み得る。
【０８９６】
ＣＤ３４阻害薬
分化クラスター３４（ＣＤ３４）は造血前駆細胞抗原ＣＤ３４とも称され、細胞間接着因子として機能する細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ３４は、時に、一部の癌／腫瘍、例えば胞巣状軟部肉腫、プレＢ−ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＡＭＬ−Ｍ７、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、巨細胞線維芽細胞腫、顆粒球性肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、髄膜血管外皮細胞腫、髄膜腫、神経線維腫、シュワン腫、及び甲状腺乳頭癌に発現する。
【０８９７】
また、本明細書には、ＣＤ３４阻害薬及び併用療法も提供される。ＣＤ３４阻害薬には、限定はされないが、小分子、組換えタンパク質、抗ＣＤ３４  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、及び抗ＣＤ３４抗体（例えば、抗ＣＤ３４単一又は二重特異性抗体）及びその断片が含まれる。一部の実施形態において、抗ＣＤ３４阻害薬は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ３４阻害薬は、ＣＤ２０阻害薬、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばネズミ科動物、ヒト、又はヒト化抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と併用して投与される。
【０８９８】
ある実施形態において、ＣＤ３４阻害薬は、ＣＤ３４を標的にするモノクローナル抗体若しくはその断片又は抗ＣＤ３４モノクローナル抗体若しくはその断片を含む免疫リポソームを含む。
【０８９９】
ある実施形態において、ＣＤ３４阻害薬は、Ｍｅｒｃａｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３７１．１（１９９８）：１７−２３に記載されるとおりの抗体又はその断片、例えばＭｙ−１０モノクローナル抗体又はＭｙ−１０モノクローナル抗体を含む免疫リポソームを含む。一部の実施形態において、ＣＤ３４阻害薬は、Ｃａｒｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７５．３（２００４）：３１３−２８に記載されるとおりのＣＤ３４発現細胞を標的にする制癌薬、例えばドキソルビシンを含有する免疫リポソームを含む。ある実施形態において、ＣＤ３４阻害薬は、Ｍａｌｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．２２（２０１３）：１−８に記載されるとおりのＣＤ３４に対するモノクローナル抗体を含む。別の実施形態において、ＣＤ３４阻害薬は、Ｍａｌｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｊ．１６．３（２０１４）：３６１−６６に記載されるとおりのＣＤ３４を標的にするモノクローナル抗体を含む。
【０９００】
一部の実施形態において、ＣＤ３４阻害薬は治療剤にコンジュゲートされるか、又は他の方法で結合する。
【０９０１】
一部の実施形態において、ＣＤ３４阻害薬は、抗ＣＤ３４  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば抗ＣＤ３４  ＣＡＲコンストラクトを発現する又はｓｃＦｖ、ＣＤＲ若しくはＶＨ及びＶＬ鎖を含むＣＤ３４結合ＣＡＲによってコードされる細胞を含む。例えば、抗ＣＤ３４  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞と併用して投与するため、ＣＤ３４−ＣＡＲ（ＣＤ３４結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に操作することにより作成される。また、本明細書には、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を養子療法に使用する方法も提供される。
【０９０２】
別の態様において、本明細書には、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ３４  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団が提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ３４  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含む。
【０９０３】
ＦＬＴ−３阻害薬
Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３）は、分化クラスター抗原１３５（ＣＤ１３５）、受容体型チロシンプロテインキナーゼＦＬＴ３、又は胎児肝キナーゼ−２（Ｆｌｋ２）とも称され、受容体チロシンキナーゼである。ＦＬＴ−３は、リガンド、サイトカインＦｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）に対するサイトカイン受容体である。ＦＬＴ−３は多くの造血前駆細胞の表面に発現し、リンパ球発生に重要である。白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）では、ＦＬＴ３遺伝子の突然変異がよく見られる。
【０９０４】
また、本明細書には、ＦＬＴ−３阻害薬及び併用療法も提供される。ＦＬＴ−３阻害薬には、限定はされないが、小分子、組換えタンパク質、抗ＦＬＴ−３  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、及び抗ＦＬＴ−３抗体（例えば、抗ＦＬＴ−３単一又は二重特異性抗体）及びその断片が含まれる。一部の実施形態において、抗ＦＬＴ−３阻害薬は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用することができる。ある実施形態において、ＦＬＴ−３阻害薬は、ＣＤ２０阻害薬、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばネズミ科動物、ヒト、又はヒト化抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と併用して投与される。
【０９０５】
一部の実施形態において、ＦＬＴ−３阻害薬は、キザルチニブ（Ａｍｂｉｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ミドスタウリン（ドレスデン工科大学（Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｄｒｅｓｄｅｎ））、ソラフェニブ（Ｂａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｏｎｙｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、スニチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、レスタウルチニブ（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体などの小分子を含む。
【０９０６】
一部の実施形態において、ＦＬＴ−３阻害薬は、キザルチニブ（ＡＣ２２０；Ａｍｂｉｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む。キザルチニブは小分子受容体チロシンキナーゼ阻害薬である。キザルチニブ（１−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）イソオキサゾール−３−イル）−３−（４−（７−（２−モルホリノエトキシ）ベンゾ［ｄ］イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−２−イル）フェニル）尿素）の構造は以下に示す。
【化９】
2019537433.tif 000010
【０９０７】
一部の実施形態において、ＦＬＴ−３阻害薬はミドスタウリン（ＰＫＣ４１２；ドレスデン工科大学（Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ  Ｄｒｅｓｄｅｎ））又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む。ミドスタウリンは、細菌ストレプトミセス・スタウロスポレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）由来のアルカロイドであるスタウロスポリンの半合成誘導体であるプロテインキナーゼ阻害薬である。
【０９０８】
ミドスタウリン（（９Ｓ，１０Ｒ，１１Ｒ，１３Ｒ）−２，３，１０，１１，１２，１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１１−（メチルアミノ）−９，１３−エポキシ−１Ｈ，９Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｇｈ：３’，２’，１’−ｌｍ］ピロロ［３，４−ｊ］［１，７］ベンゾジアムゾニン（ｂｅｎｚｏｄｉａｍｚｏｎｉｎｅ）−１−オン）の構造は以下に示す。
【化１０】
2019537433.tif 000011
【０９０９】
一部の実施形態において、ミドスタウリンは、例えば、約２５〜２００ｍｇ、例えば約２５〜５０ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、１００〜１５０ｍｇ、又は１５０〜２００ｍｇの用量で経口投与される。例えば、ミドスタウリンは、約２５〜２００ｍｇの用量で１日２回、例えば約２５〜５０ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、１００〜１５０ｍｇ、又は１５０〜２００ｍｇの用量で１日２回、例えば経口的に投与される。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０１８３０３６１を参照されたい。
【０９１０】
ある実施形態において、ＦＬＴ−３阻害薬は、ソラフェニブ（Ｂａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｏｎｙｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む。ソラフェニブは、複数のチロシンプロテインキナーゼ（例えば、ＶＥＧＦＲ及びＰＤＧＦＲ）、Ｒａｆキナーゼ（例えば、Ｃ−Ｒａｆ及びＢ−Ｒａｆ）、及び一部の細胞内セリン／スレオニンキナーゼ（例えば、Ｃ−Ｒａｆ、野生型Ｂ−Ｒａｆ、及び突然変異体Ｂ−Ｒａｆ）の小分子阻害薬である。例えば、ｌａｂｅｌｉｎｇ．ｂａｙｅｒｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．ｃｏｍ／ｈｔｍｌ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｉ／Ｎｅｘａｖａｒ＿ＰＩ．ｐｄｆを参照されたい。ソラフェニブ（４−［４−［［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］−Ｎ−メチル−ピリジン−２−カルボキサミド）の構造は以下に示す。
【化１１】
2019537433.tif 000012
【０９１１】
一部の実施形態において、ＦＬＴ−３阻害薬は、スニチニブ（旧称ＳＵ１１２４８；Ｐｆｉｚｅｒ）又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む。スニチニブは、ＦＬＴ３を含め、複数の受容体チロシンキナーゼを阻害する小分子経口薬である。スニチニブは、食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＦＤＡ）によって腎細胞癌（ＲＣＣ）及びイマチニブ抵抗性消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の治療用に承認されている。スニチニブ（Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド）の構造は以下に示す。
【化１２】
2019537433.tif 000013
【０９１２】
一部の実施形態において、ＦＬＴ−３阻害薬は、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１；Ｃｅｐｈａｌｏｎ）又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む。レスタウルチニブは、スタウロスポリンと構造的に関連性のあるチロシンキナーゼ阻害薬である。レスタウルチニブ（（９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ）−２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−ヒドロキシ−１０−（ヒドロキシメチル）−９−メチル−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１−オン）の構造は以下に示す。
【化１３】
2019537433.tif 000014
【０９１３】
一部の実施形態において、レスタウルチニブは、例えば、約４０〜１００ｍｇの用量で１日２回、例えば約４０〜６０ｍｇ、５０〜７０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、７０〜９０ｍｇ、又は８０〜１００ｍｇの用量で１日２回、経口投与される。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０００７９４８２；又はＮＣＴ０００３０１８６を参照されたい。
【０９１４】
一部の実施形態において、ＦＬＴ−３阻害薬は治療剤にコンジュゲートされるか、又は他の方法で結合する。
【０９１５】
一部の実施形態において、ＦＬＴ−３阻害薬は、抗ＦＬＴ−３  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば抗ＦＬＴ−３  ＣＡＲコンストラクトを発現する又はｓｃＦｖ、ＣＤＲ若しくはＶＨ及びＶＬ鎖を含むＦＬＴ−３結合ＣＡＲによってコードされる細胞を含む。例えば、抗ＦＬＴ−３  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞と併用して投与するため、ＦＬＴ−３−ＣＡＲ（ＦＬＴ−３結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に操作することにより作成される。また、本明細書には、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を養子療法に使用する方法も提供される。
【０９１６】
別の態様において、本明細書には、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＦＬＴ−３  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団が提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＦＬＴ−３  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含み得る。
【０９１７】
ＣＤ７９ｂ阻害薬
ＣＤ７９ｂは免疫グロブリン会合βとも称され、これはＢリンパ球抗原受容体多量体複合体の一成分である。ＣＤ７９ｂは、ＣＤ７９ａ（免疫グロブリン会合α）と呼ばれる別のアクセサリータンパク質とヘテロ二量体を形成し、このヘテロ二量体はＢ細胞上の表面免疫グロブリンと複合体を形成する。ＣＤ７９ｂはＢリンパ球抗原受容体のアセンブリ及びその表面発現に重要である。ＣＤ７９ｂ及びＣＤ７９ａはプレＢ細胞及びＢ細胞発生に重要である。多くのＢ−ＣＬＬ細胞で突然変異及び異常なＣＤ７９ｂ発現が起こり、Ｂ−ＣＬＬにおけるＢリンパ球抗原受容体の表面発現欠損及び／又はシグナル伝達不良と相関を有し得る。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９０．４（１９９７）：１３８７−９４を参照されたい。ある場合には、ＣＤ７９ｂの突然変異型又はスプライス変異体の過剰発現が、Ｂ−ＣＬＬ及び他のリンパ性悪性腫瘍におけるＢリンパ球抗原受容体の減少と相関付けられてきた。例えば、Ｃｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １００．９（２００２）：３０６８−７６を参照されたい。
【０９１８】
本明細書には、ＣＤ７９ｂ阻害薬及び併用療法が提供される。ＣＤ７９ｂ阻害薬には、限定はされないが、小分子、組換えタンパク質、抗ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、及び抗ＣＤ７９ｂ抗体（例えば、抗ＣＤ７９ｂ単一又は二重特異性抗体）及びその断片が含まれる。一部の実施形態において、抗ＣＤ７９ｂ阻害薬は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ７９ｂ阻害薬は、ＣＤ２０阻害薬、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばネズミ科動物、ヒト、又はヒト化抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と併用して投与される。
【０９１９】
ある実施形態において、ＣＤ７９ｂ阻害薬は、抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその断片である。一実施形態において、抗７９ｂ抗体又はその断片は、モノクローナル抗体、例えば単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片を含む。例えば、抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその断片は、抗ＣＤ７９ｂ抗体薬物コンジュゲートであるポラツズマブベドチン（Ｒｏｃｈｅ）を含む。実施形態において、ポラツズマブベドチンは、癌、例えばＮＨＬ、例えば濾胞性リンパ腫又はＤＬＢＣＬ、例えば再発性又は難治性濾胞性リンパ腫又はＤＬＢＣＬの治療に使用される。例えば、ＮＣＴ０２２５７５６７を参照されたい。実施形態において、抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその断片はＭＧＤ０１０（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）を含み、これは、ＣＤ３２Ｂ及びＤ７９Ｂに結合する成分を含む二重特異性抗体である。例えば、ＮＣＴ０２３７６０３６を参照されたい。
【０９２０】
一部の実施形態において、ＣＤ７９ｂ阻害薬は治療剤にコンジュゲートされるか、又は他の方法で結合する。
【０９２１】
一部の実施形態において、ＣＤ７９ｂ阻害薬は、抗ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば抗ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲコンストラクトを発現する又はｓｃＦｖ、ＣＤＲ若しくはＶＨ及びＶＬ鎖を含むＣＤ７９ｂ結合ＣＡＲによってコードされる細胞を含む。例えば、抗ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞と併用して投与するため、ＣＤ７９ｂ−ＣＡＲ（ＣＤ７９ｂ結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に操作することにより作成される。また、本明細書には、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を養子療法に使用する方法も提供される。
【０９２２】
別の態様において、本明細書には、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ７９ｂ  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団が提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含み得る。
【０９２３】
ＣＤ７９ａ阻害薬
ＣＤ７９ａは免疫グロブリン会合αとも称される。ＣＤ７９ａはＣＤ７９ｂとヘテロ二量化してＢリンパ球抗原受容体多量体複合体の一成分を形成する。ＣＤ７９ａは、多くの血液癌、例えば急性白血病（例えば、ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、及び骨髄腫に発現する。
【０９２４】
本明細書には、ＣＤ７９ａ阻害薬及び併用療法が提供される。ＣＤ７９ａ阻害薬には、限定はされないが、小分子、組換えタンパク質、抗ＣＤ７９ａ  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、及び抗ＣＤ７９ａ抗体（例えば、抗ＣＤ７９ａ単一又は二重特異性抗体）及びその断片が含まれる。一部の実施形態において、抗ＣＤ７９ａ阻害薬は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ７９ａ阻害薬は、ＣＤ２０阻害薬、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばネズミ科動物、ヒト、又はヒト化抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と併用して投与される。
【０９２５】
ある実施形態において、ＣＤ７９ａ阻害薬は、抗ＣＤ７９ａ抗体又はその断片である。一実施形態において、抗ＣＤ７９ａ抗体又はその断片は、モノクローナル抗体、例えば単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片を含む。例えば、抗ＣＤ７９ａ抗体又はその断片は、Ｐｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１０．２（２００７）：６１６−２３（参照により本明細書に援用される）に記載される抗ＣＤ７９ａ抗体又はその断片を含む。例えば、抗ＣＤ７９ａ抗体又はその断片は、Ｐｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．に記載される７Ｈ７、１５Ｅ４、又は１６Ｃ１１抗体又はその断片を含む。同上参照。
【０９２６】
一部の実施形態において、ＣＤ７９ａ阻害薬は治療剤にコンジュゲートされるか、又は他の方法で結合する。
【０９２７】
一部の実施形態において、ＣＤ７９ａ阻害薬は、抗ＣＤ７９ａ  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば抗ＣＤ７９ａ  ＣＡＲコンストラクトを発現する又はｓｃＦｖ、ＣＤＲ若しくはＶＨ及びＶＬ鎖を含むＣＤ７９ａ結合ＣＡＲによってコードされる細胞を含む。例えば、抗ＣＤ７９ａ  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞と併用して投与するため、ＣＤ７９ａ−ＣＡＲ（ＣＤ７９ａ結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に操作することにより作成される。また、本明細書には、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を養子療法に使用する方法も提供される。
【０９２８】
別の態様において、本明細書には、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ７９ａ  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団が提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ７９ａ  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含み得る。
【０９２９】
ＣＤ１７９ｂ阻害薬
ＣＤ１７９ｂは、免疫グロブリンλ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）とも称される。ＣＤ１７９ｂは、膜結合型Ｉｇμ重鎖と複合体を形成するヘテロ二量体軽鎖のサブユニットである。一緒になって、軽鎖と重鎖とはプレＢ細胞受容体を形成する。ＣＤ１７９ｂの突然変異はＢ細胞枯渇及び無ガンマグロブリン血症と相関付けられている。ＣＤ１７９ｂは、一部の癌細胞、例えば前駆Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫細胞に発現する。
【０９３０】
本明細書には、ＣＤ１７９ｂ阻害薬及び併用療法が提供される。ＣＤ１７９ｂ阻害薬には、限定はされないが、小分子、組換えタンパク質、抗ＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、及び抗ＣＤ１７９ｂ抗体（例えば、抗ＣＤ１７９ｂ単一又は二重特異性抗体）及びその断片が含まれる。一部の実施形態において、抗ＣＤ１７９ｂ阻害薬は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用することができる。ある実施形態において、ＣＤ１７９ｂ阻害薬は、ＣＤ２０阻害薬、例えばＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばネズミ科動物、ヒト、又はヒト化抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と併用して投与される。
【０９３１】
ある実施形態において、ＣＤ１７９ｂ阻害薬は、抗ＣＤ１７９ｂ抗体又はその断片である。一実施形態において、抗１７９ｂ抗体又はその断片は、モノクローナル抗体、例えば単一特異性又は二重特異性抗体又はその断片を含む。
【０９３２】
一部の実施形態において、ＣＤ１７９ｂ阻害薬は治療剤にコンジュゲートされるか、又は他の方法で結合する。
【０９３３】
一部の実施形態において、ＣＤ１７９ｂ阻害薬は、抗ＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ、例えば抗ＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲコンストラクトを発現する又はｓｃＦｖ、ＣＤＲ若しくはＶＨ及びＶＬ鎖を含むＣＤ１７９ｂ結合ＣＡＲによってコードされる細胞を含む。例えば、抗ＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞と併用して投与するため、ＣＤ１７９ｂ−ＣＡＲ（ＣＤ１７９ｂ結合ドメインを含む）を細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に操作することにより作成される。また、本明細書には、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を養子療法に使用する方法も提供される。
【０９３４】
別の態様において、本明細書には、ＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含むＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団が提供される。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０  ＣＡＲを発現する第１の細胞と、ＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲを発現する第２の細胞とを含み得る。
【０９３５】
ＣＤ２０阻害薬
本明細書には、ＣＤ２０阻害薬及び併用療法、例えば１つ以上のＣＤ２０阻害薬が提供される。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法及び組成物（例えば、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞）は、第２のＣＤ２０阻害薬を更に含む。例えば、本明細書に記載されるＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＤ２０阻害薬と併用して投与される。ＣＤ２０阻害薬には、限定はされないが、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ２０  ＣＡＲＴ細胞、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞、又は抗ＣＤ２０抗体（例えば、抗ＣＤ２０単一又は二重特異性抗体）又はその断片が含まれる。
【０９３６】
一実施形態において、第２のＣＤ２０阻害薬は、抗ＣＤ２０抗体又はその断片である。ある実施形態において、抗体は単一特異性抗体であり、別の実施形態において、抗体は二重特異性抗体である。ある実施形態において、ＣＤ２０阻害薬は、キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体、例えばリツキシマブである。ある実施形態において、ＣＤ２０阻害薬は、オファツムマブなどのヒトモノクローナル抗体である。ある実施形態において、ＣＤ２０阻害薬は、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、又はＰＲＯ１３１９２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などのヒト化抗体である。ある実施形態において、ＣＤ２０阻害薬は、ＴＲＵ−０１５（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）など、抗ＣＤ２０抗体の一部分を含む融合タンパク質である。
【０９３７】
例えば、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、ＴＲＵ−０１５（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、オカラツズマブ、又はＰｒｏ１３１９２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）から選択される。例えば、Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．９５．１（２０１０）：１３５−４３を参照されたい。
【０９３８】
一部の実施形態において、抗ＣＤ２０抗体はリツキシマブを含む。リツキシマブは、例えば、ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０１０／１０３７０５ｓ５３１１ｌｂｌ．ｐｄｆに記載されるとおりの、ＣＤ２０に結合する、且つＣＤ２０発現細胞の細胞溶解を引き起こすキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１κである。
【０９３９】
一部の実施形態において、リツキシマブは静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。例えば、注入毎に、約５００〜２０００ｍｇ（例えば、約５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００、１０００〜１１００、１１００〜１２００、１２００〜１３００、１３００〜１４００、１４００〜１５００、１５００〜１６００、１６００〜１７００、１７００〜１８００、１８００〜１９００、又は１９００〜２０００ｍｇ）のリツキシマブが提供される。
【０９４０】
一部の実施形態において、リツキシマブは、１５０ｍｇ／ｍ２〜７５０ｍｇ／ｍ２、例えば約１５０〜１７５ｍｇ／ｍ２、１７５〜２００ｍｇ／ｍ２、２００〜２２５ｍｇ／ｍ２、２２５〜２５０ｍｇ／ｍ２、２５０〜３００ｍｇ／ｍ２、３００〜３２５ｍｇ／ｍ２、３２５〜３５０ｍｇ／ｍ２、３５０〜３７５ｍｇ／ｍ２、３７５〜４００ｍｇ／ｍ２、４００〜４２５ｍｇ／ｍ２、４２５〜４５０ｍｇ／ｍ２、４５０〜４７５ｍｇ／ｍ２、４７５〜５００ｍｇ／ｍ２、５００〜５２５ｍｇ／ｍ２、５２５〜５５０ｍｇ／ｍ２、５５０〜５７５ｍｇ／ｍ２、５７５〜６００ｍｇ／ｍ２、６００〜６２５ｍｇ／ｍ２、６２５〜６５０ｍｇ／ｍ２、６５０〜６７５ｍｇ／ｍ２、又は６７５〜７００ｍｇ／ｍ２の用量で投与され、ここで、ｍ２は対象の体表面積を示す。
【０９４１】
一部の実施形態において、リツキシマブは、少なくとも４日、例えば４、７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超える投与間隔で投与される。例えば、リツキシマブは、少なくとも０．５週間、例えば０．５、１、２、３、４、５、６、７、８週間、又はそれを超える投与間隔で投与される。
【０９４２】
一部の実施形態において、リツキシマブは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、又はそれを超えて投与される。例えば、リツキシマブは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも４用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６用量、又はそれを超える）が投与される。
【０９４３】
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体はオファツムマブを含む。オファツムマブは、分子量が約１４９ｋＤａの抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１κヒトモノクローナル抗体である。例えば、オファツムマブはトランスジェニックマウス及びハイブリドーマ技術を用いて作成され、組換えマウス細胞株（ＮＳ０）から発現、精製される。例えば、ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２００９／１２５３２６ｌｂｌ．ｐｄｆ；及び臨床試験識別番号ＮＣＴ０１３６３１２８、ＮＣＴ０１５１５１７６、ＮＣＴ０１６２６３５２、及びＮＣＴ０１３９７５９１を参照されたい。
【０９４４】
一部の実施形態において、オファツムマブは静脈内注入として投与される。例えば、注入毎に、約１５０〜３０００ｍｇ（例えば、約１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００、１０００〜１２００、１２００〜１４００、１４００〜１６００、１６００〜１８００、１８００〜２０００、２０００〜２２００、２２００〜２４００、２４００〜２６００、２６００〜２８００、又は２８００〜３０００ｍｇ）のオファツムマブが提供される。
【０９４５】
一部の実施形態において、オファツムマブは、少なくとも４日、例えば４、７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超える投与間隔で投与される。例えば、オファツムマブは、少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、又はそれを超える投与間隔で投与される。
【０９４６】
一部の実施形態において、オファツムマブは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５年又はそれを超えて投与される。例えば、オファツムマブは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも２用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０用量、又はそれを超える）が投与される。
【０９４７】
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体はオクレリズマブを含む。オクレリズマブは、例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０００７７８７０、ＮＣＴ０１４１２３３３、ＮＣＴ００７７９２２０、ＮＣＴ００６７３９２０、ＮＣＴ０１１９４５７０、及びＫａｐｐｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．１９．３７８（２０１１）：１７７９−８７に記載されるとおりのヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【０９４８】
一部の実施形態において、オクレリズマブは静脈内注入として投与される。例えば、注入毎に、約５０〜２０００ｍｇ（例えば、約５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００、１０００〜１１００、１１００〜１２００、１２００〜１３００、１３００〜１４００、１４００〜１５００、１５００〜１６００、１６００〜１７００、１７００〜１８００、１８００〜１９００、又は１９００〜２０００ｍｇ）のオクレリズマブが提供される。
【０９４９】
一部の実施形態において、オクレリズマブは、少なくとも７日、例えば７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超える投与間隔で投与される。例えば、オクレリズマブは、少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、又はそれを超える投与間隔で投与される。
【０９５０】
一部の実施形態において、オクレリズマブは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５年又はそれを超えて投与される。例えば、オクレリズマブは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも４用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０用量、又はそれを超える）が投与される。
【０９５１】
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体はベルツズマブを含む。ベルツズマブは、ＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体である。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ００５４７０６６、ＮＣＴ００５４６７９３、ＮＣＴ０１１０１５８１、及びＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．５１（５）（２０１０）：７４７−５５を参照されたい。
【０９５２】
一部の実施形態において、ベルツズマブは皮下又は静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。一部の実施形態において、ベルツズマブは、５０〜８００ｍｇ／ｍ２、例えば約５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２２５、２２５〜２５０、２５０〜２７５、２７５〜３００、３００〜３２５、３２５〜３５０、３５０〜３７５、３７５〜４００、４００〜４２５、４２５〜４５０、４５０〜４７５、４７５〜５００、５００〜５２５、５２５〜５５０、５５０〜５７５、５７５〜６００、６００〜６２５、６２５〜６５０、６５０〜６７５、６７５〜７００、７００〜７２５、７２５〜７５０、７５０〜７７５、又は７７５〜８００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。一部の実施形態において、５０〜４００ｍｇ、例えば５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、又は４００ｍｇのベルツズマブの用量で投与される。
【０９５３】
一部の実施形態において、ベルツズマブは、少なくとも７日、例えば７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超える投与間隔で投与される。例えば、ベルツズマブは、少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、又はそれを超える投与間隔で投与される。
【０９５４】
一部の実施形態において、ベルツズマブは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５年又はそれを超えて投与される。例えば、ベルツズマブは、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも４用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０用量、又はそれを超える）が投与される。
【０９５５】
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体はＧＡ１０１を含む。ＧＡ１０１（オビヌツズマブ又はＲＯ５０７２７５９とも称される）は、ヒト化された、且つグリコエンジニアリングされた抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Ｒｏｂａｋ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ．１０．６（２００９）：５８８−９６；臨床試験識別番号：ＮＣＴ０１９９５６６９、ＮＣＴ０１８８９７９７、ＮＣＴ０２２２９４２２、及びＮＣＴ０１４１４２０５；及びｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０１３／１２５４８６ｓ０００ｌｂｌ．ｐｄｆを参照されたい。
【０９５６】
一部の実施形態において、ＧＡ１０１は静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。例えば、注入毎に、約１００〜３０００ｍｇ（例えば、約１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜５００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００、１０００〜１２００、１２００〜１４００、１４００〜１６００、１６００〜１８００、１８００〜２０００、２０００〜２２００、２２００〜２４００、２４００〜２６００、２６００〜２８００、又は２８００〜３０００ｍｇ）のＧＡ１０１が提供される。
【０９５７】
一部の実施形態において、ＧＡ１０１は、少なくとも７日、例えば７、１４、２１、２８、３５日、又はそれを超える投与間隔で投与される。例えば、ＧＡ１０１は、少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、２６、２８、２０、２２、２４、２６、２８、３０週間、又はそれを超える投与間隔で投与される。例えば、ＧＡ１０１は、少なくとも１ヵ月、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月、又はそれを超える投与間隔で投与される。一部の実施形態において、ＧＡ１０１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日の投与間隔で投与される。
【０９５８】
一部の実施形態において、ＧＡ１０１は、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、ある期間、例えば少なくとも１週間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０週間又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月又はそれを超えて、又は１、２、３、４、５年又はそれを超えて投与される。例えば、ＧＡ１０１は、本明細書に記載される用量及び投与間隔で、治療サイクル１回当たり合計少なくとも２用量（例えば、治療サイクル１回当たり少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０用量、又はそれを超える）が投与される。
【０９５９】
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体はＡＭＥ−１３３ｖを含む。ＡＭＥ−１３３ｖ（ＬＹ２４６９２９８又はオカラツズマブとも称される）は、リツキシマブと比較してＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する親和性が増加し、且つ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が増強された、ＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、Ｒｏｂａｋ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５．１（２０１１）：１３−２５；及びＦｏｒｅｒｏ−Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８．５（２０１２）：１３９５−４０３を参照されたい。
【０９６０】
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体はＰＲＯ１３１９２１を含む。ＰＲＯ１３１９２１は、リツキシマブと比較してＦｃγＲＩＩＩａに一層良好に結合し、且つＡＤＣＣが増強されるように操作されたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Ｒｏｂａｋ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５．１（２０１１）：１３−２５；及びＣａｓｕｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４．１（２０１４）：３７−４６；臨床試験識別番号ＮＣＴ００４５２１２７を参照されたい。一部の実施形態において、ＰＲＯ１３１９２１は静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。一部の実施形態において、ＰＲＯ１３１９２１は、１５ｍｇ／ｍ２〜１０００ｍｇ／ｍ２、例えば約１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１２５、１２５〜１５０、１５０〜１７５、１７５〜２００、２００〜２２６、２２５〜２５０、２５０〜３００、３００〜３２５、３２５〜３５０、３５０〜３７５、３７５〜４００、４００〜４２５、４２５〜４５０、４５０〜４７５、４７５〜５００、５００〜５２５、５２５〜５５０、５５０〜５７５、５７５〜６００、６００〜６２５、６２５〜６５０、６５０〜６７５、６７５〜７００、７００〜７２５、７２５〜７５０、７５０〜７７５、７７５〜８００、８００〜８２５、８２５〜８５０、８５０〜８７５、８７５〜９００、９００〜９２５、９２５〜９５０、９５０〜９７５、又は９７５〜１０００ｍｇ／ｍ２の用量で投与され、ここで、ｍ２は対象の体表面積を示す。
【０９６１】
一部の態様において、抗ＣＤ２０抗体はＴＲＵ−０１５を含む。ＴＲＵ−０１５は、ＣＤ２０に対する抗体のドメインに由来する抗ＣＤ２０融合タンパク質である。ＴＲＵ−０１５はモノクローナル抗体よりも小さいが、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を保持している。例えば、Ｒｏｂａｋ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５．１（２０１１）：１３−２５を参照されたい。ＴＲＵ−０１５は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインに連結された抗ＣＤ２０単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含有するが、ＣＨ１及びＣＬドメインを欠いている。ある場合には、ＴＲＵ−０１５は静脈内に、例えば静脈内注入として投与される。一部の実施形態において、ＴＲＵ−０１５は、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．０１〜０．０１５、０．０１５〜０．０５、０．０５〜０．１５、０．１５〜０．５、０．５〜１、１〜１．５、１．５〜２．５、２．５〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、又は２５〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。一部の実施形態において、ＴＲＵ−０１５は、少なくとも１日、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日離れた投与間隔で投与される。例えば、Ｂｕｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ．３０．１０（２００８）：１８０６−１６を参照されたい。
【０９６２】
一部の実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ２０抗体は、本明細書に記載される治療剤、例えば化学療法剤（例えば、本明細書に記載される化学療法剤、例えば本明細書に記載されるシトキサン、フルダラビン、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、脱メチル化剤、ペプチドワクチン、抗腫瘍性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害薬、アルキル化剤、抗微小管剤又は抗有糸分裂剤、ＣＤ２０抗体、又はＣＤ２０抗体薬物コンジュゲート）、抗アレルギー剤、抗悪心剤（又は制吐薬）、鎮痛剤、又は細胞保護剤にコンジュゲートされるか、又は他の方法で結合する。
【０９６３】
一実施形態において、抗原結合ドメインＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＦＬＴ−３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａ抗原結合ドメイン）は、ｓｃＦｖ部分、例えばヒト、ヒト化、又はネズミ科動物ｓｃＦｖ部分を含む。ｓｃＦｖには、配列番号７９７に提供されるものなどの任意選択のリーダー配列が前にあり、配列番号７９９、又は配列番号８１４、又は配列番号８１６に提供されるものなどの任意選択のヒンジ配列、配列番号８０１に提供されるものなどの膜貫通領域、配列番号８０３を含む細胞内シグナル伝達ドメイン及び配列番号８０５又は配列番号８０７を含むＣＤ３ζ配列が後ろにあり、例えば、ここで、ドメインは連続的で、同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。
【０９６４】
一部の実施形態において、本開示は、ＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＲＯＲ１  ＣＡＲ、ＣＤ２０  ＣＡＲ、ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＣＤ１２３  ＣＡＲ、ＣＤ１０  ＣＡＲ、ＣＤ３４  ＣＡＲ、ＦＬＴ−３  ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲ、又はＣＤ７９ａ  ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含む組換え核酸コンストラクトを包含し、ここで、核酸分子は、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続的で、それと同じリーディングフレーム内にある、例えば本明細書に記載される抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む。ＣＡＲにおいて使用することのできる例示的細胞内シグナル伝達ドメインには、限定はされないが、例えばＣＤ３−ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。一部の例では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの任意の組み合わせを含む。
【０９６５】
一実施形態において、抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＦＬＴ−３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａ抗原結合ドメイン）は、抗体又は抗体断片の特定の機能的特徴又は特性によって特徴付けられる。例えば、一実施形態において、抗原結合ドメインを含む本発明のＣＡＲ組成物の一部分は、ヒトＢ細胞抗原（例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＦＬＴ−３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、又はＣＤ７９ａ）又はその断片に特異的に結合する。特定の実施形態において、ｓｃＦｖはリーダー配列と連続的で、それと同じリーディングフレーム内にある。一態様において、リーダー配列は、配列番号７９７として提供されるポリペプチド配列である。
【０９６６】
一実施形態において、抗原結合ドメインは断片、例えば単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一実施形態において、抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、又は二機能性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体である（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））。一態様において、本発明の抗体及びその断片は、Ｂ細胞タンパク質又はその断片に野生型の又は増大した親和性で結合する。一部の例では、ヒトｓｃＦｖはディスプレイライブラリーに由来することができる。
【０９６７】
一実施形態において、抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは少なくとも１つの突然変異を含み、突然変異ｓｃＦｖがＣＡＲコンストラクトに安定性の向上を付与する。別の実施形態において、抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、例えば、ヒト化プロセスによって生じた少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の突然変異を含み、突然変異ｓｃＦｖがＣＡＲコンストラクトに安定性の向上を付与する。
【０９６８】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＲＯＲ１  ＣＡＲ、ＣＤ２０  ＣＡＲ、ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＣＤ１２３  ＣＡＲ、ＣＤ１０  ＣＡＲ、ＣＤ３４  ＣＡＲ、ＦＬＴ−３  ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲ、又はＣＤ７９ａ  ＣＡＲ）を発現する第１の細胞と、二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＲＯＲ１  ＣＡＲ、ＣＤ２０  ＣＡＲ、ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＣＤ１２３  ＣＡＲ、ＣＤ１０  ＣＡＲ、ＣＤ３４  ＣＡＲ、ＦＬＴ−３  ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ  ＣＡＲ、又はＣＤ７９ａ  ＣＡＲ）を発現する第２の細胞とを含む。
【０９６９】
一部の実施形態において、第１及び第２のＣＡＲ分子は異なる細胞、例えば第１及び第２の細胞に発現する。
【０９７０】
一部の実施形態において、第１及び第２のＣＡＲ分子は同じ細胞、例えば同じ免疫エフェクター細胞に発現する。
【０９７１】
一実施形態において、第１のＣＡＲ分子はＣＤ１９  ＣＡＲであり、第２のＣＡＲ分子はＣＤ２２である。一実施形態において、第１のＣＡＲ分子はＣＤ１９  ＣＡＲであり、第２のＣＡＲ分子はＣＤ２０である。一実施形態において、第１のＣＡＲ分子はＣＤ２０  ＣＡＲであり、第２のＣＡＲ分子はＣＤ２２である。一部の実施形態において、同じ細胞又は異なる細胞が２つのＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ及び本明細書に記載されるＣＤ２０  ＣＡＲ；ＣＤ１９  ＣＡＲ及び本明細書に記載されるＣＤ２２  ＣＡＲ；本明細書に記載されるＣＤ２０  ＣＡＲ及び本明細書に記載されるＣＤ２２  ＣＡＲ；又は３つ以上のＣＡＲ、例えば本明細書に記載されるＣＤ２２  ＣＡＲ、本明細書に記載されるＣＤ２０  ＣＡＲ及び本明細書に記載されるＣＤ１９  ＣＡＲを発現する。一部の実施形態において、２つ以上のＣＡＲ分子をコードする核酸は、細胞内へと、例えば第１及び第２のＣＡＲ分子をコードする核酸の間に置かれた２Ａ又はＩＲＥＳ部位と共に単一のベクター上に導入することができ、又は２つ以上のベクター、例えば第１のＣＡＲをコードする核酸配列を含む第１のベクター、及び第２のＣＡＲをコードする核酸配列を含む第２のベクターを介して導入することができる。
【０９７２】
医薬組成物及び治療
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のように、ＣＡＲ発現細胞、例えば複数のＣＡＲ発現細胞を１つ以上の薬学的に又は生理学的に許容される担体、希釈剤又は添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチド又はアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、１つの態様において静脈内投与用に製剤される。
【０９７３】
本発明の医薬組成物を、処置する（又は予防する）疾患に適する方法で投与し得る。投与の量及び頻度は、患者の状態及び患者の疾患のタイプ及び重症度などの因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定され得る。
【０９７４】
一実施形態において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯留ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞又はプラスミド成分、細菌及び真菌からなる群から選択される汚染物が実質的になく、例えば検出可能なレベルで存在しない。一実施形態において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ａ群からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０９７５】
「免疫学的に有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」又は「治療量」が示されるとき、本発明の組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染の程度又は転移及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して医師が決定できる。一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、一部の例では１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の投薬量で投与され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、３×１０４、１×１０６、３×１０６、又は１×１０７細胞／ｋｇ体重で投与され得る。細胞組成物は、これらの投薬量で複数回投与され得る。細胞を、免疫療法において一般に知られる注入技術を使用して投与できる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。
【０９７６】
一態様において、活性化細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を対象に投与し、続いて血液を採り（又はアフェレーシスを実施し）、本発明に従ってそれからの細胞を活性化し、これらの活性化し、且つ増殖させた細胞を患者に再注入することが望ましいことがある。この過程を数週間毎に複数回実施できる。一態様において、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血した血液から活性化できる。一態様において、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ又は１００ｃｃの採血した血液から活性化する。
【０９７７】
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、留置又は移植を含む任意の簡便な方法により実施し得る。本明細書に記載の組成物を患者に経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により又は腹腔内に投与し得る。１つの態様において、本発明の細胞組成物、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞組成物を患者に皮内又は皮下注射により投与する。１つの態様において、本発明の細胞組成物、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞組成物をｉ．ｖ．注射により投与する。細胞の組成物、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞組成物を腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接注射し得る。
【０９７８】
特定の例示的態様において、対象は、白血球を採取し、エクスビボで富化又は枯渇させて、目的の細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を選択及び／又は単離する白血球除去を受け得る。これらの細胞単離体、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞単離体を当技術分野で知られる方法により増殖させ、１つ以上の本発明のＣＡＲ構築物が導入され、それにより本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞が創製されるように処理し得る。処置を必要とする対象を、その後、高用量の化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付し得る。一態様において、移植後又は移植と同時に、対象は、増殖させた本発明のＣＡＲ発現細胞の注入を受ける。更なる態様において、増殖細胞を手術前又は後に投与する。
【０９７９】
実施形態において、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ、例えば本明細書に記載されるＣＤ２０結合ＣＡＲを発現する１つ以上の細胞を投与する前に、対象においてリンパ球枯渇が実施される。実施形態において、リンパ球枯渇は、メルファラン、シトキサン、シクロホスファミド、及びフルダラビンの１つ以上を投与することを含む。
【０９８０】
患者に投与すべき上記処置の用量は、処置する状態の正確な性質及び処置のレシピエントにより変わる。ヒト投与のためのスケーリングは、当技術分野で認識されている習慣に従って実施できる。治療剤、例えば抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨの用量は、例えば、概して例えば成人患者に１〜約１００ｍｇの範囲であり得、例えば連日で１〜３０日の期間にわたって投与する。好適な１日用量は、１〜１０ｍｇ／日であるが、幾つかの例において最大４０ｍｇ／日までの高用量を使用し得る（米国特許６，１２０，７６６号明細書に記載）。
【０９８１】
一実施形態において、ＣＡＲを、例えばインビトロ転写を使用して細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に導入し、対象（例えば、ヒト）は、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の初期投与及びその後の本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の１回以上の投与を受け、ここで、その後の１回以上の投与は、先の投与後、１５日、例えば１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日又は２日未満で行う。一実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の１回を超える投与を対象（例えば、ヒト）に１週間当たりに行い、例えば本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の２、３又は４投与を１週間当たりに投与する。一実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の１週間当たり１回を超える投与を受け（例えば、１週間当たり２回、３回又は４回投与）（本明細書ではサイクルとも称される）、続いて１週間、ＣＡＲ発現細胞を投与されず、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞投与又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞投与がなく、その後、更にＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の１回以上の更なる投与（例えば、１週間当たりでＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の１回を超える投与）を対象に投与する。別の実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の１回を超えるサイクルの投与を受け、各サイクル間の期間は、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日又は３日より短い。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞を隔日で１週間３回投与する。一実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞を少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間又はそれを超えて投与する。
【０９８２】
一部の実施形態において、対象は成人対象（即ち１８歳以上）であり得る。特定の実施形態において、対象は１〜３０歳であり得る。一部の実施形態において、対象は１６歳以上であり得る。特定の実施形態において、対象は１６〜３０歳である。一部の実施形態において、対象は小児対象（即ち１〜１８歳）である。
【０９８３】
一態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ２０  ＣＡＲＴは、レンチウイルスなど、レンチウイルスのウイルスベクターを使用して作成される。このように作成されたＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、安定したＣＡＲ発現を有することになる。
【０９８４】
一態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、形質導入４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日後、ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ  ＣＡＲベクター送達により行われ得る。一態様において、ＣＡＲ  ＲＮＡを電気穿孔法により細胞、例えばＮＫ細胞又はＴ細胞に形質導入する。
【０９８５】
一過性に発現されるＣＡＲ細胞、例えばＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞（特にマウスｓｃＦｖ担持ＣＡＲ発現細胞を伴う）を使用して処置される患者で生じ得る可能性のある問題は、複数処置後のアナフィラキシーである。
【０９８６】
この理論に拘束されることを望まないが、このようなアナフィラキシー応答は、液性抗ＣＡＲ応答を発達させる患者、即ち抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体が原因であると考えられる。細胞を産生する患者の抗体は、抗原への暴露の１０〜１４日の中断があるとき、ＩｇＧアイソタイプ（これはアナフィラキシーを生じない）からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを受けると考えられる。
【０９８７】
患者が一過性ＣＡＲ治療（例えば、ＲＮＡ形質導入により完成されたものなど）中に抗ＣＡＲ抗体応答を産生する高リスクにある場合、ＣＡＲＴ注入中断は、１０〜１４日を超えて継続してはならない。
【０９８８】
バイオポリマー送達方法
一部の実施形態において、本明細書に開示されるとおりの１つ以上のＣＡＲ発現細胞は、バイオポリマー足場、例えばバイオポリマーインプラントを介して対象に投与又は送達することができる。バイオポリマー足場は本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞の送達、拡大、及び／又は分散を支持し又は増強することができる。バイオポリマー足場は、天然に存在するもの又は合成であり得る生体適合性（例えば、炎症反応又は免疫応答を実質的に誘導しない）及び／又は生分解性ポリマーを含む。
【０９８９】
好適なバイオポリマーの例としては、限定はされないが、単独での、又は任意の他のポリマー組成物と組み合わせた、任意の濃度及び任意の比率の、寒天、アガロース、アルギン酸塩、アルギン酸塩／リン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）、（１，２，３，４，６−ペンタアセチルａ−Ｄ−ガラクトース）、セルロース、キチン、キトサン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシ−ヘキサノエート）（ＰＨＢＨＨｘ）、ポリ（ラクチド）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリビニルアルコール）（ＰＶＡ）、シルク、ダイズタンパク質、及びダイズタンパク質分離物が挙げられる。バイオポリマーは、付着又は移動促進分子、例えばリンパ球のコラーゲン受容体に結合するコラーゲン模倣ペプチド、及び／又は送達される細胞の送達、拡大、又は機能、例えば抗癌活性を増強する刺激分子で増進させる又は改変することができる。バイオポリマー足場は、注射用の、例えばゲル又は半固体、又は固体組成物であり得る。
【０９９０】
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、対象への送達前にバイオポリマー足場に播種される。実施形態において、バイオポリマー足場は、例えば、足場のバイオポリマーに配合又はコンジュゲートされた、本明細書に記載される１つ以上の追加的な治療剤（例えば、別のＣＡＲ発現細胞、抗体、又は小分子）又はＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を更に含む。実施形態において、バイオポリマー足場は、例えば、腫瘍内に注入されるか、又は腫瘍に、若しくは抗腫瘍効果を媒介するのに十分に腫瘍に近接した範囲内に外科的に植え込まれる。バイオポリマー組成物及びその送達方法の更なる例は、Ｓｔｅｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３３：９７−１０１；及び国際公開第２０１４／１１０５９１号パンフレットに記載されている。
【０９９１】
ＣＤ２０  ＣＡＲコンストラクト
本発明の実施に有用な配列を表１、表６、表１１及び表１４に開示する。本願の文章全体を通じて、本明細書の文章（例えば、表１）と配列表との間に相違があった場合、本明細書の文章が優先するものとする。
【０９９２】
抗ＣＤ２０単鎖可変断片を単離した。表１を参照されたい。ＣＤ３ζ鎖及び４−１ＢＢ共刺激分子を含むレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターに抗ＣＤ２０  ＳｃＦｖをクローニングした。表１４を参照されたい。クローニング方法については、実施例の節に更に記載する。ＣＤ２０  ＣＡＲの配列は以下の表１に提供する。表１の完全ＣＡＲアミノ酸配列の各々は、アミノ酸配列：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰに対応する２１アミノ酸の任意選択のシグナルペプチド配列を含む。表１の完全ＣＡＲヌクレオチド配列の各々は、ヌクレオチド配列：
【化１４】
2019537433.tif 000015
に対応する最初の６３ヌクレオチドに対応する任意選択のヌクレオチドシグナルペプチド配列を含む。
【０９９３】
【表１】
2019537433.tif 000016
【０９９４】
【表２】
2019537433.tif 000017
【０９９５】
【表３】
2019537433.tif 000018
【０９９６】
【表４】
2019537433.tif 000019
【０９９７】
【表５】
2019537433.tif 000020
【０９９８】
【表６】
2019537433.tif 000021
【０９９９】
【表７】
2019537433.tif 000022
【１０００】
【表８】
2019537433.tif 000023
【１００１】
【表９】
2019537433.tif 000024
【１００２】
【表１０】
2019537433.tif 000025
【１００３】
【表１１】
2019537433.tif 000026
【１００４】
【表１２】
2019537433.tif 000027
【１００５】
【表１３】
2019537433.tif 000028
【１００６】
【表１４】
2019537433.tif 000029
【１００７】
【表１５】
2019537433.tif 000030
【１００８】
【表１６】
2019537433.tif 000031
【１００９】
【表１７】
2019537433.tif 000032
【１０１０】
【表１８】
2019537433.tif 000033
【１０１１】
【表１９】
2019537433.tif 000034
【１０１２】
【表２０】
2019537433.tif 000035
【１０１３】
【表２１】
2019537433.tif 000036
【１０１４】
【表２２】
2019537433.tif 000037
【１０１５】
【表２３】
2019537433.tif 000038
【１０１６】
【表２４】
2019537433.tif 000039
【１０１７】
【表２５】
2019537433.tif 000040
【１０１８】
【表２６】
2019537433.tif 000041
【１０１９】
【表２７】
2019537433.tif 000042
【１０２０】
【表２８】
2019537433.tif 000043
【１０２１】
【表２９】
2019537433.tif 000044
【１０２２】
【表３０】
2019537433.tif 000045
【１０２３】
【表３１】
2019537433.tif 000046
【１０２４】
【表３２】
2019537433.tif 000047
【１０２５】
【表３３】
2019537433.tif 000048
【１０２６】
【表３４】
2019537433.tif 000049
【１０２７】
【表３５】
2019537433.tif 000050
【１０２８】
【表３６】
2019537433.tif 000051
【１０２９】
【表３７】
2019537433.tif 000052
【１０３０】
【表３８】
2019537433.tif 000053
【１０３１】
【表３９】
2019537433.tif 000054
【１０３２】
【表４０】
2019537433.tif 000055
【１０３３】
【表４１】
2019537433.tif 000056
【１０３４】
【表４２】
2019537433.tif 000057
【１０３５】
【表４３】
2019537433.tif 000058
【１０３６】
【表４４】
2019537433.tif 000059
【１０３７】
【表４５】
2019537433.tif 000060
【１０３８】
【表４６】
2019537433.tif 000061
【１０３９】
【表４７】
2019537433.tif 000062
【１０４０】
【表４８】
2019537433.tif 000063
【１０４１】
【表４９】
2019537433.tif 000064
【１０４２】
【表５０】
2019537433.tif 000065
【１０４３】
【表５１】
2019537433.tif 000066
【１０４４】
【表５２】
2019537433.tif 000067
【１０４５】
【表５３】
2019537433.tif 000068
【１０４６】
【表５４】
2019537433.tif 000069
【１０４７】
【表５５】
2019537433.tif 000070
【１０４８】
【表５６】
2019537433.tif 000071
【１０４９】
【表５７】
2019537433.tif 000072
【１０５０】
【表５８】
2019537433.tif 000073
【１０５１】
【表５９】
2019537433.tif 000074
【１０５２】
【表６０】
2019537433.tif 000075
【１０５３】
【表６１】
2019537433.tif 000076
【１０５４】
【表６２】
2019537433.tif 000077
【１０５５】
【表６３】
2019537433.tif 000078
【１０５６】
【表６４】
2019537433.tif 000079
【１０５７】
【表６５】
2019537433.tif 000080
【１０５８】
【表６６】
2019537433.tif 000081
【１０５９】
【表６７】
2019537433.tif 000082
【１０６０】
【表６８】
2019537433.tif 000083
【１０６１】
【表６９】
2019537433.tif 000084
【１０６２】
【表７０】
2019537433.tif 000085
【１０６３】
【表７１】
2019537433.tif 000086
【１０６４】
【表７２】
2019537433.tif 000087
【１０６５】
【表７３】
2019537433.tif 000088
【１０６６】
【表７４】
2019537433.tif 000089
【１０６７】
【表７５】
2019537433.tif 000090
【１０６８】
【表７６】
2019537433.tif 000091
【１０６９】
【表７７】
2019537433.tif 000092
【１０７０】
【表７８】
2019537433.tif 000093
【１０７１】
【表７９】
2019537433.tif 000094
【１０７２】
【表８０】
2019537433.tif 000095
【１０７３】
【表８１】
2019537433.tif 000096
【１０７４】
【表８２】
2019537433.tif 000097
【１０７５】
【表８３】
2019537433.tif 000098
【１０７６】
【表８４】
2019537433.tif 000099
【１０７７】
【表８５】
2019537433.tif 000100
【１０７８】
【表８６】
2019537433.tif 000101
【１０７９】
【表８７】
2019537433.tif 000102
【１０８０】
【表８８】
2019537433.tif 000103
【１０８１】
【表８９】
2019537433.tif 000104
【１０８２】
【表９０】
2019537433.tif 000105
【１０８３】
【表９１】
2019537433.tif 000106
【１０８４】
【表９２】
2019537433.tif 000107
【１０８５】
【表９３】
2019537433.tif 000108
【１０８６】
【表９４】
2019537433.tif 000109
【１０８７】
【表９５】
2019537433.tif 000110
【１０８８】
【表９６】
2019537433.tif 000111
【１０８９】
【表９７】
2019537433.tif 000112
【１０９０】
【表９８】
2019537433.tif 000113
【１０９１】
【表９９】
2019537433.tif 000114
【１０９２】
【表１００】
2019537433.tif 000115
【１０９３】
【表１０１】
2019537433.tif 000116
【１０９４】
【表１０２】
2019537433.tif 000117
【１０９５】
【表１０３】
2019537433.tif 000118
【１０９６】
【表１０４】
2019537433.tif 000119
【１０９７】
【表１０５】
2019537433.tif 000120
【１０９８】
【表１０６】
2019537433.tif 000121
【１０９９】
【表１０７】
2019537433.tif 000122
【１１００】
【表１０８】
2019537433.tif 000123
【１１０１】
【表１０９】
2019537433.tif 000124
【１１０２】
【表１１０】
2019537433.tif 000125
【１１０３】
【表１１１】
2019537433.tif 000126
【１１０４】
【表１１２】
2019537433.tif 000127
【１１０５】
【表１１３】
2019537433.tif 000128
【１１０６】
表１のＣＤ２０  ｓｃＦｖドメインのＣＤＲ（Ｋａｂａｔ）配列の配列番号の概要を重鎖可変ドメインについて表２に、及び軽鎖可変ドメインについて表３に示す。配列番号は、表１に掲載されているものを参照する。
【１１０７】
【表１１４】
2019537433.tif 000129
【１１０８】
【表１１５】
2019537433.tif 000130
【１１０９】
【表１１６】
2019537433.tif 000131
【１１１０】
【表１１７】
2019537433.tif 000132
【１１１１】
次にＣＡＲ  ｓｃＦｖ断片をレンチウイルスベクターにクローニングすることにより、完全長ＣＡＲコンストラクトを単一のコーディングフレームで、及び発現にＥＦ１αプロモーター（配列番号８３３）を使用して作成した。クローニング方法については、実施例に更に記載する。
【１１１２】
ｓｃＦｖにおいてＶＬ及びＶＨドメインが現れる順番は様々であった（即ちＶＬ−ＶＨ、又はＶＨ−ＶＬの向き）。ここで、「Ｇ４Ｓ」サブユニットの３コピー又は４コピーのいずれか（各サブユニットが配列ＧＧＧＧＳ（配列番号８３４）を含む（例えば、（Ｇ４Ｓ）３又は（Ｇ４Ｓ）４））が可変ドメインに結合して、例えば表１に示されるとおりのｓｃＦｖドメインの全体を作り出す。
【１１１３】
ＣＤ２２  ＣＡＲコンストラクト
抗ＣＤ２２単鎖可変断片を単離した。表６を参照されたい。ＣＤ３ζ鎖及び４−１ＢＢ共刺激分子を含むレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターに抗ＣＤ２２  ＳｃＦｖをクローニングした。クローニング方法については、実施例の節に更に記載する。ＣＤ２２  ＣＡＲの配列は、以下の表６に提供する。
【１１１４】
【表１１８】
2019537433.tif 000133
【１１１５】
【表１１９】
2019537433.tif 000134
【１１１６】
【表１２０】
2019537433.tif 000135
【１１１７】
【表１２１】
2019537433.tif 000136
【１１１８】
【表１２２】
2019537433.tif 000137
【１１１９】
【表１２３】
2019537433.tif 000138
【１１２０】
【表１２４】
2019537433.tif 000139
【１１２１】
【表１２５】
2019537433.tif 000140
【１１２２】
【表１２６】
2019537433.tif 000141
【１１２３】
【表１２７】
2019537433.tif 000142
【１１２４】
【表１２８】
2019537433.tif 000143
【１１２５】
【表１２９】
2019537433.tif 000144
【１１２６】
【表１３０】
2019537433.tif 000145
【１１２７】
【表１３１】
2019537433.tif 000146
【１１２８】
【表１３２】
2019537433.tif 000147
【１１２９】
【表１３３】
2019537433.tif 000148
【１１３０】
【表１３４】
2019537433.tif 000149
【１１３１】
【表１３５】
2019537433.tif 000150
【１１３２】
【表１３６】
2019537433.tif 000151
【１１３３】
【表１３７】
2019537433.tif 000152
【１１３４】
【表１３８】
2019537433.tif 000153
【１１３５】
【表１３９】
2019537433.tif 000154
【１１３６】
【表１４０】
2019537433.tif 000155
【１１３７】
【表１４１】
2019537433.tif 000156
【１１３８】
【表１４２】
2019537433.tif 000157
【１１３９】
【表１４３】
2019537433.tif 000158
【１１４０】
【表１４４】
2019537433.tif 000159
【１１４１】
【表１４５】
2019537433.tif 000160
【１１４２】
【表１４６】
2019537433.tif 000161
【１１４３】
【表１４７】
2019537433.tif 000162
【１１４４】
【表１４８】
2019537433.tif 000163
【１１４５】
【表１４９】
2019537433.tif 000164
【１１４６】
【表１５０】
2019537433.tif 000165
【１１４７】
【表１５１】
2019537433.tif 000166
【１１４８】
【表１５２】
2019537433.tif 000167
【１１４９】
【表１５３】
2019537433.tif 000168
【１１５０】
【表１５４】
2019537433.tif 000169
【１１５１】
【表１５５】
2019537433.tif 000170
【１１５２】
【表１５６】
2019537433.tif 000171
【１１５３】
【表１５７】
2019537433.tif 000172
【１１５４】
【表１５８】
2019537433.tif 000173
【１１５５】
【表１５９】
2019537433.tif 000174
【１１５６】
表６のＣＤ２２  ｓｃＦｖドメインのＣＤＲ（Ｋａｂａｔ）配列の配列番号の概要を重鎖可変ドメインについて表７に、及び軽鎖可変ドメインについて表８に示す。配列番号は、表６に掲載されているものを参照する。
【１１５７】
【表１６０】
2019537433.tif 000175
【１１５８】
【表１６１】
2019537433.tif 000176
【１１５９】
【表１６２】
2019537433.tif 000177
【１１６０】
【表１６３】
2019537433.tif 000178
【１１６１】
一部の実施形態において、ＣＤ２２  ＣＡＲは、例えば、表６においてコンストラクトＣＤ２２−６５ｓに示されるとおり、ｓｃＦｖのＶＨ配列とＶＬ配列との間に短いＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳリンカー）を含む。
【１１６２】
一部の実施形態において、ＣＤ２２  ＣＡＲは、例えば、表６においてコンストラクトＣＤ２２−６５ｓｓに示されるとおり、ｓｃＦｖのＶＨ配列とＶＬ配列との間にリンカー配列を有しない。
【１１６３】
更に別の実施形態において、ＣＤ２２  ＣＡＲは、ＣＤ２２−６５ｓのアミノ酸配列と比べて１つ以上の突然変異、例えばＶＨ及び／又はＶＬのＦＲ領域に１つ以上の突然変異を含む。一実施形態において、ＣＤ２２  ＣＡＲは、ＶＨ領域ＣＤ２２−６５ｓのアミノ酸４１の突然変異（例えば、ＣＤ２２−６５ｓのＶＨの４１位のＱの、例えばＫによる置換）；及び／又はＣＤ２２−６５ｓのＶＬのアミノ酸４０の突然変異（例えば、ＣＤ２２−６５ｓのＶＬの４０位のＱの、例えばＤによる置換）を含む。一実施形態において、ＣＤ２２ＣＡＲは、以下に示すＣＤ２２−６５ｓＫＤのアミノ酸配列を含む。ＣＤ２２−６５ｓとＣＤ２２−６５ｓＫＤとのアラインメントを以下に示す。
【化１５】
2019537433.tif 000179
【１１６４】
ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクト
一実施形態において、ＣＡＲコンストラクトのＣＤ１９に対する抗原結合ドメインは、例えば、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレット；国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２（７），６８９−７０２（２００９）；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，Ｊ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１６（２０），４０９９−４１０２（２０１０）；国際公開第２０１４／０３１６８７号パンフレット；Ｂｅｊｃｅｋ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５，２３４６−２３５１，１９９５；又は米国特許第７，４４６，１９０号明細書（これらの各々は本明細書によって全体として参照により援用される）に記載される抗原結合部分、例えばＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ）のＣＤＲ、抗体又はその抗原結合断片である。
【１１６５】
一実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットに配列番号１２として提供されるアミノ酸配列を含む。実施形態では、アミノ酸配列は、
【化１６】
2019537433.tif 000180
又はそれと実質的に相同な配列である。任意選択のシグナルペプチド配列は大文字及び括弧で示す。
【１１６６】
一実施形態において、アミノ酸配列は、
【化１７】
2019537433.tif 000181
又はそれと実質的に相同な配列である。
【１１６７】
一実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲはＵＳＡＮ名、ＴＩＳＡＧＥＮＬＥＣＬＥＵＣＥＬ−Ｔを有する。実施形態において、ＣＴＬ０１９は、ＥＦ−１αプロモーターの制御下においてＣＴＬ０１９トランス遺伝子を含む自己不活化複製欠損レンチウイルス（ＬＶ）ベクターで形質導入することによる安定挿入によって媒介されるＴ細胞の遺伝子改変によって作製される。ＣＴＬ０１９は、パーセントトランス遺伝子陽性Ｔ細胞率に基づき対象に送達されるトランス遺伝子陽性及び陰性Ｔ細胞の混合物であり得る。
【１１６８】
一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット（参照により本明細書に援用される）の表３に係る抗原結合ドメイン（例えば、ヒト化抗原結合ドメイン）を含む。
【１１６９】
臨床セッティングにはネズミ科動物ＣＤ１９抗体のヒト化が望ましく、ここで、マウス特異的残基は、ＣＡＲＴ１９治療、即ちＣＡＲ１９コンストラクトで形質導入されたＴ細胞による治療を受ける患者においてヒト抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）反応を引き起こし得る。ヒト化ＣＤ１９  ＣＡＲ配列の作製、特徴付け、及び有効性については、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）に、実施例１〜５（１１５〜１５９頁）、例えば表３、表４、及び表５（１２５〜１４７頁）を含め、記載されている。一実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット（参照により本明細書に援用される）の表３に係るＣＡＲ分子、又は抗原結合ドメイン（例えば、ヒト化抗原結合ドメイン）を含む。ＣＤ１９  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメイン（例えば、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａに従う１、２、３つのＶＨ  ＣＤＲ；及び１、２、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットに指定される。実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲ、又は抗原結合ドメインは、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に示されるアミノ酸を含み、又はヌクレオチド配列を有し、又は前記配列のいずれかと実質的に同一の（例えば、前記配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％又はそれを超えて同一の）配列を含むか又は有する。
【１１７０】
一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトは国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載され、及びネズミ科動物ＣＤ１９  ＣＡＲ及びｓｃＦｖコンストラクトのアミノ酸配列は以下の表１１に示し、又は前記配列のいずれかと実質的に同一の（例えば、本明細書に記載される配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％又はそれを超えて同一の）配列である。
【１１７１】
【表１６４】
2019537433.tif 000182
【１１７２】
【表１６５】
2019537433.tif 000183
【１１７３】
【表１６６】
2019537433.tif 000184
【１１７４】
【表１６７】
2019537433.tif 000185
【１１７５】
【表１６８】
2019537433.tif 000186
【１１７６】
【表１６９】
2019537433.tif 000187
【１１７７】
【表１７０】
2019537433.tif 000188
【１１７８】
【表１７１】
2019537433.tif 000189
【１１７９】
【表１７２】
2019537433.tif 000190
【１１８０】
【表１７３】
2019537433.tif 000191
【１１８１】
【表１７４】
2019537433.tif 000192
【１１８２】
【表１７５】
2019537433.tif 000193
【１１８３】
【表１７６】
2019537433.tif 000194
【１１８４】
【表１７７】
2019537433.tif 000195
【１１８５】
【表１７８】
2019537433.tif 000196
【１１８６】
【表１７９】
2019537433.tif 000197
【１１８７】
【表１８０】
2019537433.tif 000198
【１１８８】
【表１８１】
2019537433.tif 000199
【１１８９】
【表１８２】
2019537433.tif 000200
【１１９０】
ヒト化抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖドメインを含むＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトは、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載される。
【１１９１】
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖドメインのネズミ科動物及びヒト化ＣＤＲ配列の配列を重鎖可変ドメインについて表１２に、及び軽鎖可変ドメインについて表１３に示す。配列番号は、表１１に掲載されているものを参照する。一部の実施形態において、ネズミ科動物又はヒト化ＣＤ１９結合ドメインのＨＣＤＲ１はＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳである。
【１１９２】
【表１８３】
2019537433.tif 000201
【１１９３】
【表１８４】
2019537433.tif 000202
【１１９４】
一般的ＣＡＲ配列
ＣＡＲの作成に有用な配列を以下の表１４に提供する。
【１１９５】
【表１８５】
2019537433.tif 000203
【１１９６】
【表１８６】
2019537433.tif 000204
【１１９７】
【表１８７】
2019537433.tif 000205
【１１９８】
【表１８８】
2019537433.tif 000206
【１１９９】
【表１８９】
2019537433.tif 000207
【１２００】
【表１９０】
2019537433.tif 000208
【１２０１】
【表１９１】
2019537433.tif 000209
【１２０２】
【表１９２】
2019537433.tif 000210
【１２０３】
【表１９３】
2019537433.tif 000211
【１２０４】
【表１９４】
2019537433.tif 000212
【１２０５】
【表１９５】
2019537433.tif 000213
【１２０６】
【表１９６】
2019537433.tif 000214
【１２０７】
ＣＤ１９及びＣＤ２２タンデムＣＡＲコンストラクト
ＣＤ１９及びＣＤ２２を標的にする２つの異なるｓｃＦｖを含むタンデムＣＡＲを作成した。作成した抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖコンストラクトは２つの異なるリンカー：ＬＡＥＡＡＡＫ（配列番号８３８）及びＧＧＧＧＳを含んだ。タンデムＣＡＲの作成及び評価については実施例１３に更に記載する。ＣＤ２２及びＣＤ１９を標的にする単一ＣＡＲの配列を以下の表１５に提供する。
【１２０８】
【表１９７】
2019537433.tif 000215
【１２０９】
【表１９８】
2019537433.tif 000216
【１２１０】
【表１９９】
2019537433.tif 000217
【１２１１】
【表２００】
2019537433.tif 000218
【１２１２】
【表２０１】
2019537433.tif 000219
【１２１３】
【表２０２】
2019537433.tif 000220
【１２１４】
【表２０３】
2019537433.tif 000221
【１２１５】
【表２０４】
2019537433.tif 000222
【１２１６】
【表２０５】
2019537433.tif 000223
【１２１７】
【表２０６】
2019537433.tif 000224
【１２１８】
【表２０７】
2019537433.tif 000225
【１２１９】
【表２０８】
2019537433.tif 000226
【１２２０】
【表２０９】
2019537433.tif 000227
【１２２１】
【表２１０】
2019537433.tif 000228
【１２２２】
【表２１１】
2019537433.tif 000229
【１２２３】
【表２１２】
2019537433.tif 000230
【１２２４】
【表２１３】
2019537433.tif 000231
【１２２５】
【表２１４】
2019537433.tif 000232
【１２２６】
【表２１５】
2019537433.tif 000233
【１２２７】
【表２１６】
2019537433.tif 000234
【１２２８】
【表２１７】
2019537433.tif 000235
【１２２９】
【表２１８】
2019537433.tif 000236
【１２３０】
【表２１９】
2019537433.tif 000237
【１２３１】
【表２２０】
2019537433.tif 000238
【１２３２】
【表２２１】
2019537433.tif 000239
【１２３３】
【表２２２】
2019537433.tif 000240
【１２３４】
【表２２３】
2019537433.tif 000241
【１２３５】
【表２２４】
2019537433.tif 000242
【１２３６】
【表２２５】
2019537433.tif 000243
【１２３７】
【表２２６】
2019537433.tif 000244
【１２３８】
【表２２７】
2019537433.tif 000245
【１２３９】
【表２２８】
2019537433.tif 000246
【１２４０】
【表２２９】
2019537433.tif 000247
【１２４１】
【表２３０】
2019537433.tif 000248
【１２４２】
【表２３１】
2019537433.tif 000249
【１２４３】
【表２３２】
2019537433.tif 000250
【１２４４】
【表２３３】
2019537433.tif 000251
【１２４５】
【表２３４】
2019537433.tif 000252
【１２４６】
【表２３５】
2019537433.tif 000253
【１２４７】
【表２３６】
2019537433.tif 000254
【１２４８】
【表２３７】
2019537433.tif 000255
【実施例】
【１２４９】
以下の実験的実施例を参照することにより、本発明を更に詳細に説明する。これらの例は例示のために提供されるに過ぎず、特記されない限り限定することを意図するものではない。従って、本発明が以下の例に限定されると解釈されることは一切あってはならず、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形例を包含すると解釈されなければならない。
【１２５０】
更なる説明なしに、当業者は、前述の説明及び以下の例示的実施例を用いて本発明の化合物を作製及び利用し、特許請求される方法を実施することができると考えられる。以下の実動する実施例は本発明の様々な態様を具体的に指示するものであり、いかなる形であれ本開示の残りの部分を限定すると解釈されてはならない。
【１２５１】
実施例１：マウス抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体の作成
ヒトＣＤ２０標的に対するモノクローナル抗体のパネルが細胞ベースの免疫化手法によって作成され、選択されている（Ｐｒｏｅｔｚｅｌ  Ｇ，Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ  Ｈ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ  Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，９０１：１−１０，２０１２）。ヒトＣＤ２０をトランスフェクトし、マウスプレＢ細胞株である３００−１９細胞の表面上に発現させた。このＣＤ２０トランスフェクト３００−１９細胞をマウスの免疫化用及び続く細胞融合後の特異的ハイブリドーマ抗体のスクリーニング用の抗原として使用した。
【１２５２】
動物免疫化及び試料採取は、ＩＡＣＵＣ承認済みの標準動物使用プロトコル（１２  ＮＢＣ  ０５９）に従い行った。簡潔に言えば、５〜６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃ  ＶＡＦマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をヒトＣＤ２０トランスフェクト３００−１９細胞で免疫した。マウスは、各動物につき１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中約５×１０６細胞で４回皮下免疫した。注射は２〜３週間毎に実施して動物に免疫応答を生じさせた。ハイブリドーマ作成のための細胞融合の３日前、同じ用量の細胞ベースの抗原でマウスを腹腔内的にブーストし、細胞融合当日に無菌手術条件下で脾臓採取のため安楽死させた。
【１２５３】
免疫化マウスからの脾臓を使用して、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に単一細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞をペレット化し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄した。細胞融合によりハイブリドーマクローンを作成するため、脾細胞を混合し、ポリエチレングリコール−１５００を膜融合因子として使用して本発明者らの標準的融合プロトコル（Ｚｈａｎｇ  Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９０１：１１７−１３５，２０１２）に従いマウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ｋｅａｒｎｅｙ  Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９７９．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３：１５４８−１５５０）と融合させた。細胞融合及び遠心後、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）添加物（Ｓｉｇｍａ  Ｈ−０２６２）を含有する完全ＲＰＭＩ−１６４０培養培地（２００ｍＬ／脾臓）に細胞を懸濁し、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ  ３５９６）に１ウェル当たり２００μＬの細胞懸濁液でプレーティングした。
【１２５４】
３７℃、５％ＣＯ２で３〜４日間インキュベートした後、プレートの各ウェルから１００μＬの培養上清を除去し、ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）添加物（Ｓｉｇｍａ  Ｈ−０１３７）を含有する等容積の完全ＲＰＭＩ−１６４０培養培地に交換した。ハイブリドーマクローンが抗体スクリーニングに十分な大きさのコロニーに成長し終えるまで、プレートのインキュベーションを５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で継続した。
【１２５５】
ハイブリドーマスクリーニング、サブクローニング及び選択
融合後２週間目にハイブリドーマ細胞がプレートウェルにおいて半コンフルエントになるまで成長し、培養上清がオレンジ色に変わったところで、免疫蛍光フローサイトメトリーによる抗体スクリーニング用に培養プレートからハイブリドーマ上清をサンプリングした。一次スクリーニングのため、非トランスフェクト３００−１９細胞と比べたヒトＣＤ２０トランスフェクト３００−１９細胞を使用してハイブリドーマ上清をフローサイトメトリーにより分析した。簡潔に言えば、ヒトＣＤ２０トランスフェクト３００−１９細胞又は非トランスフェクト細胞をそれぞれ５０μＬのハイブリドーマ上清とインキュベートし、続いてフルオレセイン−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆａｂ断片ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）コンジュゲートで標識し、自動モードのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでフローサイトメトリーにより分析した。
【１２５６】
フローサイトメトリー分析により、ヒトＣＤ２０トランスフェクト３００−１９細胞と反応したが、非トランスフェクト３００−１９細胞とは反応しなかったハイブリドーマクローンを培養プレートから同定し、選択した。更なる特徴付けのため、所望のハイブリドーマクローンをＴ１２プレートで拡大した。限界希釈により、及びＣｅｌｌａｖｉｓｔａイメージングシステムで単一コロニーをピックすることにより、目的のハイブリドーマクローンをサブクローニングして、ＣＤ２０特異抗体を産生するモノクローナル集団を得た。選択されたハイブリドーマサブクローンをＴ１２プレートで拡大し、凍結保存用に凍結するか、又はモノクローナル抗体産生に使用した。市販のアイソタイピング試薬を用いることにより、ハイブリドーマクローンに由来する特異的モノクローナル抗体のアイソタイプを試験して抗体特性を決定した。
【１２５７】
スクリーニング結果に基づき、ヒトＣＤ２０抗原によるマウスの免疫化から１９個のヒトＣＤ２０特異的ハイブリドーマクローンのパネルが同定され、選択した（データは示さず）。これらのハイブリドーマ抗体をヒト腫瘍組織又は細胞株に対して更に試験して、その結合プロファイル及び生物学的特性に基づき抗体シーケンシング及びヒト化用の上位クローンを同定した。
【１２５８】
実施例２：マウスｓｃＦｖのヒト化
当業者に周知の標準方法に従い（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６，１９９２）、上位クローンをヒト化した。
【１２５９】
抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ＣＤＲ外の位置、即ち結合に直接又は間接的に影響を及ぼす可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）のフレームワーク領域にある位置とを含む。結合に直接影響を及ぼし得るフレームワーク残基は、例えば、ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置するいわゆる「アウター」ループ領域に見られ得る。結合に間接的に影響を及ぼす残基は、例えば、いわゆるバーニア領域（Ｖｅｒｎｉｅｒ  Ｚｏｎｅ）に見られる（Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  １９９２）。これらはＣＤＲコンホメーションを支持すると考えられている。好適なアクセプターフレームワークを選択する際には、ＣＤＲ外のこれらの位置を考慮して、フレームワーク領域におけるヒト生殖細胞系列アクセプター配列に対する最終的なヒト化抗体のずれの数を最小限に抑えた。
【１２６０】
実施例３：ヒト化抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ担持ＣＡＲＴの分析及びインビトロ活性
ＣＤ３ζ鎖及び４−１ＢＢ刺激分子を含むレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターに、上記の実施例に記載のとおり作成したＣＤ２０に特異的なヒト化ネズミ科動物単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をクローニングした；ＣＤ２０−Ｃ２Ｈ１、−Ｃ２Ｈ２、−Ｃ２Ｈ３、−Ｃ２Ｈ４、−Ｃ３Ｈ１、−Ｃ３Ｈ２、−Ｃ３Ｈ３、−Ｃ３Ｈ４、−Ｃ５Ｈ１、−Ｃ５Ｈ２、−Ｃ５Ｈ３、−Ｃ５Ｈ４、−Ｃ８Ｈ１、−Ｃ８Ｈ２、−Ｃ８Ｈ３、及び−Ｃ８Ｈ４。ラットｓｃＦｖ由来ＣＡＲ  ＣＤ２０−３及びそのヒト化誘導体−ＣＤ２０−３ｍ、−３Ｊ、−３Ｈ５ｋ１、及び−３Ｈ５ｋ３、並びに既発表のＣＡＲ（Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０００、参照により本明細書に援用される）のｓｃＦｖをベースとしたＣＤ２０−８ａＢＢｚ  ＣＡＲを対照として含めた。加えて、オファツムマブモノクローナル抗体（ＣＡＳ登録番号：６７９８１８−５９−８、薬物バンク受託番号：ＤＢ０６６５０）の可変領域をベースとするＣＡＲを構築した（ＣＤ２０−Ｏｆａ）。全てのＣＤ２０  ＣＡＲを表１に示す。ＣＤ２０を発現する（「ＣＤ２０＋」又は「ＣＤ２０陽性」）標的に応答したこれらのＣＤ２０  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（「ＣＤ２０  ＣＡＲＴ」又は「ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞」）のエフェクターＴ細胞応答の量及び質に基づき最適なコンストラクトを選択した。エフェクターＴ細胞応答としては、限定はされないが、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生及び標的細胞殺傷又は細胞溶解活性（脱顆粒）が挙げられる。
【１２６１】
ＣＤ２０  ＣＡＲレンチウイルスの作成
ヒト化ｓｃＦｖをコードするレンチウイルストランスファーベクターを使用して、ＶＳＶｇシュードタイプ化レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム材料を作製した。ＣＡＲをコードするレンチウイルストランスファーベクターＤＮＡをリポフェクタミン試薬との組み合わせで３つのパッケージング成分ＶＳＶｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖと混合してＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をトランスフェクトし、続いて１２〜１８時間後に培地を交換した。培地を取り換えてから３０時間後に培地を回収し、ろ過して、−８０℃で保存する。
【１２６２】
代わりに、ＣＤ２０  ＣＡＲをコードするレンチウイルスは、９６ウェルプレートにおいて小規模の自動化された方式で作成し、ここで、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞レポーター細胞株の形質導入に、凍結せず新鮮なウイルス含有上清を使用した。
【１２６３】
ＣＤ２０  ＣＡＲ  ＪＮＬ細胞の作成
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴルシフェラーゼ（ＪＮＬ）レポーター細胞株は、急性Ｔ細胞白血病株Ｊｕｒｋａｔ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿０３６７）をベースとする。この株を、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメントの制御下でルシフェラーゼを発現するように改変した。ＣＤ２０  ＣＡＲによる形質導入のため、１０，０００個のＪＮＬ細胞／９６ウェルプレートウェルを５０μｌの新鮮な４５μｍろ過ウイルス含有上清で形質導入した。プレートを２０００ｒｐｍで３分間スピンし、４日間培養した。
【１２６４】
ＣＤ２０  ＣＡＲリダイレクトＪＮＬ細胞の有効性を評価する
ＣＤ２０  ＣＡＲがＪＮＬ細胞を活性化させる機能的能力を評価するため、それを標的癌細胞と共培養し、ルシフェラーゼ発現を定量化することによりその活性化を読み取った。ヒト化ｓｃＦｖベースのＣＡＲ  ＣＤ２０−Ｃ２Ｈ１、−Ｃ２Ｈ２、−Ｃ２Ｈ３、−Ｃ２Ｈ４、−Ｃ３Ｈ１、−Ｃ３Ｈ２、−Ｃ３Ｈ３、−Ｃ３Ｈ４、−Ｃ５Ｈ１、−Ｃ５Ｈ２、−Ｃ５Ｈ３、−Ｃ５Ｈ４、−Ｃ８Ｈ１、−Ｃ８Ｈ２、−Ｃ８Ｈ３、及び−Ｃ８Ｈ４をＣＤ２０−８ａＢＢｚ並びにＣＤ２０−３、−３ｍ、−３Ｊ、−３Ｈ５ｋ３、及び−３Ｈ５ｋ１と比較した。対照ＣＡＲ  ＣＤ２０−３及びＣＤ２０−８ａＢＢｚは、全てのアッセイでアッセイ変動の比較に使用し、及び／又は対照としての役割を果たした。ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲ  ２１７４、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１５）を非ターゲティング対照として使用した。
【１２６５】
ＪＮＬ  ＣＡＲＴ細胞をバーキットリンパ腫株Ｒａｊｉ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿０５１１）及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）株Ｐｆｅｉｆｆｅｒ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿３３２６）、ＨＢＬ−１（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿４２１３）及びＴＭＤ８（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ａ４４２）；ＣＤ２０陰性対照として供した慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）細胞株Ｋ５６２（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿０００４）と共培養した。共培養は３８４ウェルプレートに４：１、２：１、１：１及び０．５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でセットアップして２４時間インキュベートし、その後、活性化したＪＮＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるルシフェラーゼの発現をｂｒｉｔｅｌｉｔｅ  ｐｌｕｓレポーター遺伝子アッセイシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって定量化した。各ウェルから放たれる光量（ルミネセンス）が、それぞれのＣＡＲによるＪＮＬ活性化の直接の読み取り値であった。４つ全てのＣＤ２０陽性標的細胞株が、全てのヒト化ＣＤ２０  ＣＡＲの活性化を実証する（図１Ａ〜図１Ｄ）。ネズミ科動物ｓｃＦｖのヒト化はＣＤ２０への結合の喪失にはつながらなかった。ＣＡＲの膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインに融合したヒト化ｓｃＦｖの一部は、ＪＮＬ  Ｔ細胞を活性化するＣＡＲの有効性が向上しているように見える。それらは、ＣＤ２０−Ｃ２Ｈ１、−Ｃ２Ｈ３、−Ｃ５Ｈ１、−Ｃ５Ｈ２、及び−Ｃ８Ｈ３であった。ヒト化マウスＣＡＲのいずれも、ＣＤ２０陰性株Ｋ５６２による活性化は示さなかった（図１Ｅ）。
【１２６６】
ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作成
上記に記載するＪＮＬレポーターアッセイの結果に基づき、初代Ｔ細胞における有効性の分析に以下のＣＡＲを選択した：ＣＤ２０−Ｃ２Ｈ１、−Ｃ２Ｈ３、−Ｃ３Ｈ２、−Ｃ３Ｈ３、−Ｃ５Ｈ１、−Ｃ５Ｈ２、及び−Ｃ８Ｈ２。加えて、ＣＤ２０−Ｏｆａ及び対照ＣＤ２０−８ａＢＢｚ及びＣＤ２０−３Ｈ５ｋ３を追加した。ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作成は、アフェレーシスを受けた健常ドナーの血液から出発し、Ｔ細胞、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球に関するネガティブ選択によってそれらのドナーのナイーブＴ細胞を得た。Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１００μＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、及び５５μＭ  ２−メルカプトエタノール）にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：３（Ｔ細胞対ビーズ）の比で加えることにより、これらの細胞を活性化した。Ｔ細胞は、２４ウェルプレートの１ウェル当たり１ｍＬ培地中０．５×１０６個のＴ細胞で、３７℃、５％ＣＯ２において培養した。２４時間後、Ｔ細胞がブラスト化したところで、０．５ｍＬの非濃縮又は小容積の濃縮ウイルス上清を加えた；Ｔ細胞は５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。Ｔ細胞は対数増殖パターンで分裂し始め、これは細胞数／ｍＬを計測することによりモニタし、及びＴ細胞は２日毎に新鮮培地で希釈した。Ｔ細胞は約１０日後に静止し始めた；成長速度の減速とＴ細胞サイズの減少（ほぼ３５０ｆＬ）との組み合わせにより、後の分析のためＴ細胞を凍結保存する状態が決まる。ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全て研究グレードの（即ち臨床グレードでない）製造条件で作製した。
【１２６７】
凍結保存前に、形質導入された（細胞表面にＣＤ２０特異的ＣＡＲを発現する）細胞の割合をＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）でのフローサイトメトリー分析によって決定した。ウイルス形質導入は同等の発現レベルを示したことから、形質導入効率（パーセント形質導入細胞、図２）並びにそれぞれのＣＡＲの表面発現（平均蛍光強度、ＭＦＩ）が同様であることが指摘される；ＣＤ２０−Ｏｆａ  ＣＡＲは最も低い発現レベルを示した（ＭＦＩ  １３７０対２２００〜４４２０）。ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物の細胞カウントから、非形質導入Ｔ細胞（「ＵＴＤ」）と比較したとき細胞が正常に拡大する能力にヒトｓｃＦｖ担持ＣＡＲ−ＣＤ２０が検出可能な負の効果を及ぼさないことが示された。
【１２６８】
ＣＤ２０  ＣＡＲリダイレクトＴ細胞の有効性を評価する
ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能的能力を評価するため、上記に記載したとおり作成した細胞を解凍し、カウントし、及び標的癌細胞と共培養して、その殺傷能力、サイトカインの分泌並びに増殖を読み取った。ヒト化ｓｃＦｖ担持ＣＡＲ  ＣＤ２０−Ｃ２Ｈ１、−Ｃ２Ｈ３、−Ｃ３Ｈ２、−Ｃ３Ｈ３、−Ｃ５Ｈ１、−Ｃ５Ｈ２、及び−Ｃ８Ｈ２に加えて、ＣＤ２０−Ｏｆａ  ＣＡＲ並びに対照ＣＤ２０−８ａＢＢｚ及びＣＤ２０−３Ｈ５ｋ３を対照として使用した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ及び非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を非ターゲティングＴ細胞対照として使用した。
【１２６９】
ＣＤ２０発現標的細胞に応答したＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン産生を計測するため、ＣＡＲ  Ｔ細胞をバーキットリンパ腫株Ｒａｊｉ及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）株Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、ＨＢＬ−１及びＴＭＤ８；ＣＤ２０陰性対照として供した慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）細胞株Ｋ５６２と共培養した。細胞を１：１のエフェクター：標的比及び９６ウェルプレートの１ウェル当たり２５，０００細胞で２４時間培養し、その後培地を取り出し、サイトカイン定量化用のＶ−ＰＬＥＸ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用してサイトカイン分析を行った。データは、ほとんどのヒト化マウスＣＤ２０  ＣＡＲＴ並びにＣＤ２０−８ａＢＢｚ、ＣＤ２０−Ｏｆａ及びＣＤ２０−３Ｈ５ｋ３  ＣＡＲＴが、ＣＤ２０陽性標的細胞株Ｒａｊｉ、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、ＨＢＬ１及びＴＭＤ８との培養時にＩＦＮ−γを産生したことを示す（図３Ａ及び図３Ｂ）。ＣＤ２０−Ｃ３Ｈ２及び−Ｃ３Ｈ３が最も高いサイトカイン産生量を示したもので、ＣＤ２０−８ａＢＢｚと同様の又はそれより高いレベルであった。対照Ｋ５６２細胞への曝露後にＣＤ２０  ＣＡＲＴによって産生されるサイトカインのレベルは検出不能であったことから（図３Ａ及び図３Ｂ）、ＣＤ２０  ＣＡＲによる非特異的な活性化がなかったことが指摘される。
【１２７０】
結論
ここで試験したヒト化ＣＤ２０特異的ＣＡＲは、全て初代ヒトＴ細胞の細胞表面で同様に良好に発現した。ＣＤ２０−Ｃ２Ｈ１、−Ｃ２Ｈ３、−Ｃ３Ｈ２、−Ｃ３Ｈ３、−Ｃ５Ｈ１、−Ｃ５Ｈ２、及び−Ｃ８Ｈ２は対照ＣＤ２０−８ａＢＢｚ及びＣＤ２０−３Ｈ５ｋと同様に発現した；ＣＤ２０−Ｏｆａのみが、より低い発現レベルを示した。ＪＮＬ  Ｔ細胞レポーターアッセイでは、全てのＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞が同様のＣＤ２０特異的応答性を示した。ＣＤ２０−Ｃ３Ｈ２及びＣＤ２０−Ｃ３Ｈ３は、ＣＤ２０−８ａＢＢｚと比較したとき、初代ヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生の点でやや良好な、又は少なくとも等しい機能を示した。全体的に見て、ＣＤ２０  ＣＡＲの移入は抗ＣＤ２０応答性を誘導し、しかしＣＤ２０陰性細胞株Ｋ５６２で対照したとおりオフターゲット機能は検出されなかった。
【１２７１】
実施例４：ヒト抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖ担持ＣＡＲＴの分析及びインビトロ活性
ＣＤ３ζ鎖及び４−１ＢＢ刺激分子を含むレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターに抗ＣＤ２２抗体の単鎖可変断片をクローニングした；ＣＤ２２−５７、ＣＤ２２−５８、ＣＤ２２−５９、ＣＤ２２−６０、ＣＤ２２−６１、ＣＤ２２−６２、ＣＤ２２−６３、ＣＤ２２−６４、及びＣＤ２２−６５をＣＤ２２−５３と比較した。全てのＣＤ２２  ＣＡＲを表６に示す。ＣＤ２２を発現する（「ＣＤ２２＋」）標的に応答したこれらのＣＤ２２  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（「ＣＤ２２  ＣＡＲＴ」又は「ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞」）のエフェクターＴ細胞応答の量及び質に基づき最適なコンストラクトを選択した。エフェクターＴ細胞応答としては、限定はされないが、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生及び標的細胞殺傷又は細胞溶解活性（脱顆粒）が挙げられる。
【１２７２】
ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作成
ヒトｓｃＦｖをコードするレンチウイルストランスファーベクターを使用して、ＶＳＶｇシュードタイプ化レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム材料を作製した。ＣＡＲをコードするレンチウイルストランスファーベクターＤＮＡをリポフェクタミン試薬との組み合わせで３つのパッケージング成分ＶＳＶｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖと混合してＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をトランスフェクトし、続いて１２〜１８時間後に培地を交換した。培地を取り換えてから３０時間後に培地を回収し、ろ過して、−８０℃で保存した。
【１２７３】
ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作成は、アフェレーシスを受けた健常ドナーの血液から出発し、Ｔ細胞、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球に関するネガティブ選択によってそれらのドナーのナイーブＴ細胞を得た。Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１００μＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、及び５５μＭ  ２−メルカプトエタノール）に３７℃、５％ＣＯ２でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：３（Ｔ細胞対ビーズ）の比で加えることにより、これらの細胞を活性化した。Ｔ細胞は、２４ウェルプレートの１ウェル当たり１ｍＬ培地中０．５×１０６個のＴ細胞で培養した。２４時間後、Ｔ細胞がブラスト化したところで、０．５ｍＬの非濃縮又は小容積の濃縮ウイルス上清を加えた；Ｔ細胞は５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。Ｔ細胞は対数増殖パターンで分裂し始めた。これは細胞数／ｍＬを計測することによりモニタし、及びＴ細胞は２日毎に新鮮培地で希釈する。Ｔ細胞が約１０日後に静止し始めたことに伴い、対数増殖は衰える。成長速度の減速とＴ細胞サイズの減少（ほぼ３５０ｆＬ）との組み合わせにより、後の分析のためＴ細胞を凍結保存する状態が決まる。ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全て研究グレードの（即ち臨床グレードでない）製造条件で作製した。
【１２７４】
凍結保存前に、形質導入された（細胞表面にＣＤ２２特異的ＣＡＲを発現する）細胞の割合をＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）でのフローサイトメトリー分析によって決定した。ウイルス形質導入は同等の発現レベルを示したことから、形質導入効率（パーセント形質導入細胞、図４）並びにそれぞれのＣＡＲの表面発現（平均蛍光強度、ＭＦＩ）が同様であることが指摘される。ＣＤ２２−５８のみが、より低い発現レベルを示した（ＭＦＩ＝５，７００、他のＣＡＲの＞２０，０００と比較）。ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物の細胞カウントは、非形質導入Ｔ細胞（「ＵＴＤ」）と比較したとき細胞が正常に拡大する能力にヒトｓｃＦｖ担持ＣＡＲ−ＣＤ２２が検出可能な負の効果を及ぼさないことを示している。
【１２７５】
ＣＤ２２  ＣＡＲリダイレクトＴ細胞の有効性を評価する
ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能的能力を評価するため、上記に記載したとおり作成した細胞を解凍し、カウントし、及び標的癌細胞と共培養して、その殺傷能力、サイトカインの分泌並びに増殖を読み取った。ヒトｓｃＦｖ担持ＣＡＲ  ＣＤ２２−５７、ＣＤ２２−５８、ＣＤ２２−５９、ＣＤ２２−６０、ＣＤ２２−６１、ＣＤ２２−６２、ＣＤ２２−６３、ＣＤ２２−６４、及びＣＤ２２−６５に加えて、ＣＡＲ  ＣＤ２２−５３を対照として使用した。対照ＣＡＲ  ＣＤ２２−５３は、全てのアッセイでアッセイ変動の比較に使用し、及び／又は対照としての役割を果たした。ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ及び非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を非ターゲティングＴ細胞対照として使用した。
【１２７６】
Ｔ細胞殺傷を急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）株Ｎａｌｍ６（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９２）及びＳＥＭ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９５）；ＣＤ２２陰性対照として供した慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）細胞株Ｋ５６２（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿０００４）に仕向けた。細胞株は、全て細胞生存／死滅のレポーターとしてルシフェラーゼを発現するように形質導入した。ＣＤ２２  ＣＡＲＴの細胞溶解活性を２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１  ０．６３：１及び０．３１：１のエフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）のタイトレーションで計測した。アッセイは、それぞれの数のＴ細胞を一定数の標的細胞（９６ウェルプレートの１ウェル当たり２５，０００細胞）と混合することにより開始した。２０時間後、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）試薬を加えることによりウェル内の残りの細胞を溶解させて、各ウェル内の残りの細胞を定量化した。標的細胞のみが入ったウェルと比べて「％死滅率」を計算した。データは、ＣＤ２２  ＣＡＲＴをコードするレンチウイルスの形質導入によってＴ細胞に抗ＣＤ２２殺傷活性が移入されることを示している（Ｎａｌｍ６（図５Ａ）及びＳＥＭ（図５Ｂ））。ＵＴＤ及びＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞はバックグラウンド殺傷性のみを示す。同様に、ＣＤ２２  ＣＡＲのいずれも、ＣＤ２２陰性対照株Ｋ５６２の殺傷性を示さない（図５Ｃ）。ＣＤ２２−６４及びＣＤ２２−６５は、Ｎａｌｍ６及びＳＥＭの両方の標的細胞株の最も高い殺傷性を示した。
【１２７７】
ＣＤ２２発現標的細胞に応答したＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン産生を計測するため、ＣＡＲ  Ｔ細胞をＡＬＬ株ＳＥＭ；ＣＤ２２陰性対照として供したＣＭＬ株であるＫ５６２と共培養した。細胞を１：１のエフェクター：標的比及び９６ウェルプレートの１ウェル当たり２５，０００細胞で２４時間培養し、その後培地を取り出し、サイトカイン定量化用のＶ−ＰＬＥＸ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用してサイトカイン分析を行った。データは、ほとんどの新規ＣＤ２２  ＣＡＲＴ並びにＣＤ２２−５３  ＣＡＲＴが、ＳＥＭとの培養時にＩＦＮ−γを産生したことを示す（図６Ａ）。ＣＤ２２−６３、−６４及び−６５が最も高いサイトカイン産生量を示したものであった。対照Ｋ５６２細胞への曝露後にＣＤ２２  ＣＡＲＴによって産生されるサイトカインのレベルは低かったことから（図６Ｂ）、ＣＤ２２  ＣＡＲによる非特異的効果がないことが指摘される。
【１２７８】
最後のＴ細胞有効性アッセイでは、ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖能を評価した。この場合もやはり、解凍したＣＡＲ  Ｔ細胞をＡＬＬ株ＳＥＭと共培養し、一方で、ＣＤ２２陰性対照として供したＣＭＬ株であるＫ５６２と共培養した。共培養前にウェルの異常増殖を防ぐため標的細胞株を照射し、次にそれを１：１のエフェクター：標的比及び９６ウェルプレートの１ウェル当たり３０，０００細胞で４日間培養した。追加の対照はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（陽性対照、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）並びに培地のみ（陰性対照）であった。４日目に細胞を抗ＣＤ３抗体並びに可溶性ＣＤ２２−Ｆｃで染色してＣＡＲ発現を検出した。ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａでの取得前に、細胞数の定量分析のため各試料に２０μｌのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えた。図７Ａは、ＣＤ２２−Ｆｃの結合によって決定したときの、３０００個のカウントビーズ当たりのＣＤ３＋  Ｔ細胞の数を示し、一方、図７Ｂは、３０００個のカウントビーズ当たりのＣＤ３＋  ＣＡＲ＋  ＣＡＲＴの数を示す。データは、ＣＤ２２−６４、−６５並びに対照ＣＤ２２−５３  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ２２誘導性増殖が最も強力で、それにＣＤ２２−６３が続くことを示す。いずれのＣＡＲＴも、ＣＤ２２陰性株Ｋ５６２に応答した増殖を示さず、また例えば凝集によるＣＡＲの何らかの細胞固有刺激に起因した増殖も示さなかった。
【１２７９】
結論
ほとんどのＣＤ２２特異的ＣＡＲが、初代ヒトＴ細胞の細胞表面に同様に良好に発現した：ＣＤ２２−５７、ＣＤ２２−５９、ＣＤ２２−６０、ＣＤ２２−６１、ＣＤ２２−６２、ＣＤ２２−６３、ＣＤ２２−６４、及びＣＤ２２−６５は参照ＣＡＲ  ＣＤ２２−５３と同等であった；ＣＤ２２−５８のみが低い発現レベルを示した。Ｔ細胞機能アッセイでは、ＣＤ２２−５７及び−５８が最小の機能性のＣＡＲであった一方、ＣＤ２２−６４及び−６５はＣＤ２２−５３と比較したとき等しいか（ＩＦＮ−γ産生及び増殖）、又はそれより機能的であった（殺傷）。全体的に見て、ＣＤ２２  ＣＡＲのトランスファーは抗ＣＤ２２応答性を誘導し、しかしオフターゲット機能は検出されなかった。
【１２８０】
実施例５：ＡＬＬにおけるＣＤ２２  ＣＡＲＴ
ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の組の抗腫瘍活性をＮＡＬＭ６異種移植モデルにおいてインビボで評価した。ＣＡＲコンストラクトＣＤ２２−６０、ＣＤ２２−６３、及びＣＤ２２−６５を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を陽性対照（ＣＤ２２−５３及びＣＤ１９）及びモックＣＡＲ  Ｔ細胞（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）と比べて評価した。
【１２８１】
材料及び方法
細胞株：ＮＡＬＭ６（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９２）は、１９７６年に１９歳の再発時における急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）男性の末梢血から得られたヒト白血病細胞株である。１０％ウシ胎児血清を含有するＲＭＰＩ培地において細胞を成長させた。この細胞株は組織培養フラスコ内の懸濁液中で成長する。この細胞株はマウスにおいて静脈内への移植時に生き残り、拡大する。ＮＡＬＭ６細胞はルシフェラーゼを発現するように改変されているため、マウスをイメージングすることによっても腫瘍細胞成長をモニタすることができる。
【１２８２】
マウス：６週齢のＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから受け取った（ストック番号００５５５７）。動物は実験前にＮｏｖａｒｔｉｓ  ＮＩＢＲ動物施設で少なくとも３日間順化させた。動物はＮｏｖａｒｔｉｓ  ＡＣＵＣ規則及びガイドラインに従い取り扱った。腫瘍移植の前日に動物識別用の電子トランスポンダーを左側腹部に植え込んだ。
【１２８３】
腫瘍移植：対数増殖期のＮＡＬＭ６細胞を回収し、５０ｍｌファルコンチューブ内において１２００ｒｐｍで５分間、成長培地で１回、次に冷滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を５×１０６／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に再懸濁し、氷上に置き、直ちにマウスに注射した。癌細胞を２００μｌで尾静脈から静脈内注射した。ＮＡＬＭ６モデルはＣＤ２２を内因的に発現するため、インビボでのＣＤ２２指向ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性の試験に使用することができる。このモデルはマウスにおいて静脈内への移植時に良好に成長し、イメージングして腫瘍負荷を測定することができる。ＰＢＳ中１×１０６個の癌細胞を注射すると、３日以内に腫瘍が樹立され、正確に測定することができる。ベースライン測定値は４〜６×１０＾５光子／秒（ｐ／ｓ）である。７日以内に平均生物発光測定値は２〜４×１０＾６ｐ／ｓとなり、未治療の腫瘍は２１〜２６日までにエンドポイント測定値（２〜３×１０＾９）に達する。腫瘍が完全に移植されると、多くの場合に治療剤の抗腫瘍活性が試験される。従って、このモデルでは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を観察することのできるウィンドウが広い。
【１２８４】
ＣＡＲ  Ｔ細胞投与：腫瘍移植７日後にマウスに５×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞（１２．３×１０６個の総Ｔ細胞）を投与した。細胞を３７℃の水浴中で部分的に解凍し、次に細胞が入ったチューブに１ｍｌの温成長培地を加えることにより完全に解凍した。解凍した細胞を５０ｍｌファルコンチューブに移し、成長培地で１２ｍｌの最終容積に調整した。細胞を２回洗浄し、３００ｇで１０分間スピンし、次に血球計算器によってカウントした。次にＴ細胞を冷ＰＢＳ中６１．７×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、マウスへの投与時まで氷上に置いておいた。１マウス当たり５×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞（１２．３×１０６個の総Ｔ細胞）の用量についてマウスに２００μｌのＴ細胞を尾静脈から静脈内投与した。各群５匹のマウスを２００μｌのＰＢＳ単独（ＰＢＳ）、モックＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＤ２２−５３  ＣＡＲ  Ｔ細胞、並びに新規ＣＤ２２−６０、ＣＤ２２−６３、又はＣＤ２２−６５  ＣＡＲ  Ｔ細胞で形質導入したＴ細胞のいずれかで治療した。細胞は、全て同じドナーから並行して調製した。
【１２８５】
動物のモニタリング：週２回の体重測定を含め、マウスの健康状態を毎日モニタした。体重のパーセント変化率は、（ＢＷ現在−ＢＷ初期）／（ＢＷ初期）×１００％として計算した。腫瘍はマウスをイメージングすることにより週２回モニタした。
【１２８６】
結果
Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病異種移植モデルにおいてＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価した（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８９）。０日目の腫瘍細胞移植後、腫瘍担持マウスを治療群に無作為化し、腫瘍移植後７日目に５×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞（１２．３×１０６個の総Ｔ細胞）を外側尾静脈から静脈内投与した。動物がエンドポイントに達するまで腫瘍成長及び動物の健康をモニタした。ＰＢＳ又はモックＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与を受けたマウスは、それぞれ２３日目及び３０日目に、腫瘍が後肢の動きの低下を引き起こすようになったところで安楽死させた。他の群は、全て４３日目に安楽死させた。
【１２８７】
全ての治療群の平均生物発光を図８にプロットする。いかなるＴ細胞の投与も受けなかったＰＢＳ治療群は、静脈内注射したＮＳＧマウスにおけるベースラインＮＡＬＭ６腫瘍成長動態を実証する。ＥＧＦＲｖＩＩＩ治療群は、対照ＣＡＲで形質導入したＴ細胞の投与を受けた。これらの細胞は、このモデルでのヒトドナーＴ細胞の非特異的応答を示すＴ細胞対照としての役割を果たす。ＰＢＳ及びモック治療群の両方が、本試験を通じて継続的な腫瘍進行を実証した。ドナーＴ細胞のバックグラウンド活性に起因して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ群の方がやや遅い腫瘍成長を示す。ＣＤ２２−６０、ＣＤ２２−６３、並びにＣＤ２２−５３は、全てＥＧＦＲｖＩＩＩと比較したとき有意に遅い腫瘍成長を示す。ＣＤ２２−６５は腫瘍退縮を示し、陽性対照ＣＤ１９と同等である。
【１２８８】
考察
本試験では、ＣＤ２２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞ＣＤ２２−６５がＮＡＬＭ６腫瘍の退縮をもたらす能力を有することが実証された。他のコンストラクトは腫瘍成長の減速を示したが、いずれもＣＤ２２−６５の効果ほど完全でなく、又はそれほど長時間持続しなかった。
【１２８９】
実施例６：抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖ担持ＣＡＲＴのインビトロ活性の比較分析
ＣＤ２２又はＣＤ２０ターゲティングＣＡＲ  Ｔ細胞の活性をインビトロで比較するため、対照ＣＡＲ  Ｔ細胞ＣＤ２０−３及びＣＤ２２−５３を、それぞれ実施例３及び４に記載するとおり作成した。ＣＡＲ  Ｔ細胞及び癌細胞株の共培養を実施例３及び４に記載するとおり行った。ＩＦＮ−γ分泌を用いてＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を測定した（図９）。興味深いことに、ＣＤ２０−３  ＣＡＲは、バーキットリンパ腫株Ｒａｊｉ（図９Ａ）及びＤＬＢＣＬ株Ｐｆｅｉｆｆｅｒ（図９Ｂ）と培養したとき、ＣＤ２２−５３  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、より多いサイトカイン分泌につながる。逆に、ＡＬＬ株ＳＥＭは、全体的には低いレベルではあるが、ＣＤ２０−３と比較してより大きくＣＤ２２−５３を刺激した（図９Ｃ）。
【１２９０】
この比較から、一般にＣＤ２０  ＣＡＲ及びＣＤ２２  ＣＡＲの両方のＢ細胞悪性腫瘍に対する一般的応答が実証された。ＣＡＲ  Ｔ活性化の偏りは、それぞれの標的細胞株におけるＣＤ２０及びＣＤ２２発現レベルと相関した。
【１２９１】
実施例７：ヒト化抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖを担持するＣＡＲＴのインビボ活性
ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の組の抗腫瘍活性をＴＭＤ８異種移植モデルにおいてインビボで評価した。ＣＡＲコンストラクトＣＤ２０−Ｃ３Ｈ２、ＣＤ２０−Ｃ５Ｈ１、ＣＤ２０−３Ｈ５ｋ３、ＣＤ２０−Ｏｆａ、及びＣＤ２０−８ａＢＢＺを含むＣＡＲ  Ｔ細胞を評価した。ＣＤ２０−Ｃ３Ｈ２、ＣＤ２０−Ｃ５Ｈ１、ＣＤ２０−３Ｈ５ｋ３  ＣＡＲは、ヒト化マウス（Ｃ３Ｈ２及びＣ５Ｈ１）及びラット（３Ｈ５ｋ３）ＣＤ２０特異的ｓｃＦｖをベースとする。ＣＤ２０−８ａＢＢＺは、既発表のＣＤ２０ターゲティングＣＡＲ（Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０００、参照により本明細書に援用される）をベースとする。
【１２９２】
細胞株：ＴＭＤ８（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ａ４４２）は、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）亜型のヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞株である。１０％ウシ胎児血清、１×ＨＥＰＥＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｌ−Ｇｌｕｔ、及びＮＥＡＡを含有するＭＥＭ培地中において細胞を浮遊状態で成長させた。ＴＭＤ８はマウスにおいて皮下（ｓ．ｃ．）移植時に生き残り、成長する。
【１２９３】
マウス：６週齢のＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから受け取った（ストック番号００５５５７）。動物は実験前にＮｏｖａｒｔｉｓ  ＮＩＢＲ動物施設で少なくとも３日間順化させた。動物はＮｏｖａｒｔｉｓ  ＡＣＵＣ規則及びガイドラインに従い取り扱った。腫瘍移植の前日に動物識別用の電子トランスポンダーを左側腹部に植え込んだ。
【１２９４】
腫瘍移植：対数増殖期の細胞を回収し、５０ｍｌファルコンチューブ内において１２００ｒｐｍで５分間、成長培地で１回、次に冷滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を２５×１０６／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に再懸濁し、氷上に置き、マウスに注射した。癌細胞を２００μｌでｓ．ｃ．注射した。ＴＭＤ８モデルはＣＤ２０を内因的に発現するため、インビボでのＣＤ２０指向ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性の試験に使用することができる。このモデルはマウスにおいてｓ．ｃ．移植時に良好に成長し、これはノギス測定法によって測定することができる。５×１０６癌細胞を注射すると、３〜４日以内に腫瘍が樹立され、正確に測定することができる。腫瘍容積はノギス測定法によって決定し（週２〜３回）、以下のとおり計算した：
腫瘍容積＝（最大値（腫瘍Ｘ，腫瘍Ｙ）＊［最小値（腫瘍Ｘ，腫瘍Ｙ）］＾２＊π）／６
【１２９５】
９日以内に腫瘍容積測定値は２００ｍｍ３になったと共に、未治療の腫瘍は１５〜１８日までにエンドポイント測定値（＞１２００ｍｍ３）に達する。腫瘍が完全に移植されると、多くの場合に治療剤の抗腫瘍活性が試験される。従って、このモデルでは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を観察することのできる好適なウィンドウがある。
【１２９６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞投与：腫瘍移植９日後にマウスに３×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞を投与した。細胞を３７℃の水浴中で部分的に解凍し、次に１ｍｌの温成長培地を加えることにより完全に解凍した。解凍した細胞を５０ｍｌファルコンチューブに移し、成長培地で１２ｍｌの最終容積に調整した。細胞を２回洗浄し、３００ｇで１０分間スピンし、次に血球計算器によってカウントした。次にＴ細胞をそれぞれの濃度で冷ＰＢＳ中に再懸濁し、マウスへの投与時まで氷上に置いておいた。３×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量について、ＣＡＲＴを２００μｌで尾静脈から静脈内投与した。各群５匹のマウスを２００μｌのＰＢＳ単独（ＰＢＳ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的モックＣＡＲ  Ｔ細胞並びにＣＤ２０−Ｃ３Ｈ２、ＣＤ２０−Ｃ５Ｈ１、ＣＤ２０−３Ｈ５ｋ３、ＣＤ２０−Ｏｆａ、及びＣＤ２０−８ａＢＢＺのいずれかで治療した。細胞は、全て同じドナーから並行して調製した。
【１２９７】
動物のモニタリング：週２回の体重測定を含め、マウスの健康状態を毎日モニタした。体重のパーセント変化率は、（ＢＷ現在−ＢＷ初期）／（ＢＷ初期）×１００％として計算した。
【１２９８】
ＤＬＢＣＬ白血病異種移植モデルでＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価した（図１１）。腫瘍細胞移植後、腫瘍担持マウスを治療群に無作為化し、腫瘍移植後９日目にＣＡＲ  Ｔ細胞を外側尾静脈から静脈内投与した。動物がエンドポイントに達するまで腫瘍成長及び動物の健康をモニタした。ＰＢＳ又はモックＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与を受けた陰性対照群のマウスは１７日目に安楽死させた。また、ＣＤ２０−Ｏｆａ及びＣＤ２０−３Ｈ５ｋ３の投与を受けた群も、それぞれのＣＡＲＴの有効性を示さず、１７日目に安楽死させた。他の群は２４日目に安楽死させた。
【１２９９】
いかなるＴ細胞の投与も受けなかったＰＢＳ治療群は、ベースラインＴＭＤ８腫瘍成長動態を実証する。ＥＧＦＲｖＩＩＩ治療群はモックＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の投与を受け、このモデルでのヒトドナーＴ細胞の非特異的応答を示すＴ細胞対照として供した。ＰＢＳ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの両方の治療群が、本試験を通じて継続的な腫瘍進行を実証した。ＣＤ２０−Ｏｆａ及びＣＤ２０−３Ｈ５ｋ３は同様の成長動態を示したことから、これらのＣＡＲＴによっては抗腫瘍有効性がないことが示唆される。ＣＤ２０−Ｃ３Ｈ２、ＣＤ２０−Ｃ５Ｈ１、及び対照ＣＤ２０−８ａＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全て有意に遅い腫瘍成長を示し、最も強力且つ最も速い退縮が見られたのはＣＤ２０−Ｃ３Ｈ２であり、次いでＣＤ２２−Ｃ５Ｈ１であった。
【１３００】
本試験では、ＣＤ２０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞ＣＤ２２−Ｃ３Ｈ２及びＣＤ２２−Ｃ５Ｈ１がＴＭＤ８腫瘍の退縮をもたらす能力を有することが実証された。この有効性は、既発表のベンチマークＣＡＲであるＣＤ２０−８ａＢＢＺよりも優れていた。
【１３０１】
実施例８：短鎖リンカーを含むヒト抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖを担持するＣＡＲＴのインビトロ活性
ＣＤ３ζ鎖及び４−１ＢＢ刺激分子を含むレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターに、抗ＣＤ２２抗体（ＣＤ２２−６５、ＣＤ２２−６５ｓ、陽性対照ＣＤ２２  ＣＡＲ  ｍ９７１（ｍ９７１）、及びｍ９７１ｓ）の単鎖可変断片をコードする遺伝子をクローニングした。ＣＤ３ζ鎖は野生型であるか（Ｚｗｔ）、又はＱ６５Ｋ突然変異を有するか（Ｚｍｕｔ）のいずれかであった。ＣＤ２２を発現する（「ＣＤ２２＋」）標的に応答したこれらのＣＤ２２  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（「ＣＤ２２  ＣＡＲＴ」又は「ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞」）のエフェクターＴ細胞応答に基づきコンストラクトを順位付けした。エフェクターＴ細胞応答としては、限定はされないが、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生及び標的細胞殺傷又は細胞溶解活性（脱顆粒）が挙げられる。
【１３０２】
ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作成：ヒトｓｃＦｖをコードするレンチウイルストランスファーベクターを使用して、ＶＳＶｇシュードタイプ化レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム材料を作製した。ＣＡＲをコードするレンチウイルストランスファーベクターＤＮＡをリポフェクタミン試薬との組み合わせで３つのパッケージング成分ＶＳＶｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖと混合してＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をトランスフェクトし、続いて１２〜１８時間後に培地を交換した。培地を取り換えてから３０時間後に培地を回収し、ろ過して、−８０℃で保存した。
【１３０３】
ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作成は、アフェレーシスを受けた健常ドナーの血液から出発し、Ｔ細胞、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球のネガティブ選択（Ｐａｎ  Ｔ細胞単離、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によってそれらのドナーのＴ細胞をエンリッチした。Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１００μＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、及び５５μＭ  ２−メルカプトエタノール）に３７℃、５％ＣＯ２でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：３（Ｔ細胞対ビーズ）の比で加えることにより、Ｔ細胞を活性化した。Ｔ細胞は、２４ウェルプレートの１ウェル当たり１ｍＬ培地中０．５×１０６個のＴ細胞で培養した。２４時間後、Ｔ細胞がブラスト化したところで、非濃縮又は濃縮ウイルス上清を加えた；Ｔ細胞は５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。Ｔ細胞が増殖し始めた。これは細胞濃度の測定（１ｍＬ当たりのカウントとして）によってモニタし、及びＴ細胞は２日毎に新鮮Ｔ細胞培地で希釈する。Ｔ細胞が約１０日後に静止し始めたことに伴い、対数増殖が衰える。成長速度の減速とＴ細胞サイズの減少（ほぼ３５０ｆＬ）との組み合わせにより、後の分析のためＴ細胞を凍結保存する状態が決まる。ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全て研究グレードの（即ち臨床グレードでない）製造条件下で作製した。
【１３０４】
凍結保存前に、形質導入された（細胞表面にＣＤ２２特異的ＣＡＲを発現する）細胞の割合をＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）でのフローサイトメトリー分析によって決定した（図１２）。ウイルス形質導入は同等の発現レベルを示したことから、形質導入効率並びにそれぞれのＣＡＲの表面発現が同様であることが指摘される。ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物の細胞カウントは、非形質導入Ｔ細胞（「ＵＴＤ」）と比較したとき細胞が正常に拡大する能力にヒトＣＤ２２  ＣＡＲが検出可能な負の効果を及ぼさないことを示している。
【１３０５】
ＣＤ２２  ＣＡＲリダイレクトＴ細胞の効力を評価する：ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能的能力を評価するため、上記に記載したとおり作成した細胞を解凍し、カウントし、癌細胞と共培養して、その殺傷能力、サイトカインの分泌並びに増殖を読み取った。ヒトｓｃＦｖ担持ＣＡＲ  ＣＤ２２−６５＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ｍ９７１＿Ｚｍｕｔ、及びｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔを使用して、ＣＤ１９  ＣＡＲ並びに非ターゲティングＴ細胞対照として使用した非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）と比較した。
【１３０６】
Ｔ細胞殺傷を急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）株Ｎａｌｍ６（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９２）及びＳＥＭ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９５）；ＣＤ２２陰性／低対照として供した慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）細胞株Ｋ５６２（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿０００４）に仕向けた。細胞株は、全て細胞生存／死滅のレポーターとしてルシフェラーゼを発現するように形質導入した。ＣＤ２２  ＣＡＲＴの細胞溶解活性を１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１  ０．６３：１及び０．３１：１のエフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）のタイトレーションで計測した。アッセイは、それぞれの数のＴ細胞を一定数の標的細胞（９６ウェルプレートの１ウェル当たり２５，０００細胞）と混合することにより開始した。２０時間後、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬を加えることによりウェル内の残りの細胞を溶解させて、各ウェル内の残りのＬｕｃ発現癌細胞を定量化した。「％死滅率」を標的細胞のみが入ったウェル（０％、最大Ｌｕｃシグナル）と比べて計算した。データは、Ｎａｌｍ６（図１３Ａ））及びＳＥＭ（図１３Ｂ））においてＣＤ２２  ＣＡＲＴをコードするレンチウイルスの形質導入によってＴ細胞に抗ＣＤ２２殺傷活性が移入されることを示している。ＵＴＤ  Ｔ細胞はバックグラウンド殺傷性のみを示す。同様に、いずれのＣＤ２２  ＣＡＲも、ＣＤ２２陰性対照株Ｋ５６２の殺傷性を示さない（図１３Ｃ）。全てのＣＡＲがＮａｌｍ６及びＳＥＭの両方の標的細胞株の高い殺傷性を示し、ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ及びＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔが上位３つであった。
【１３０７】
ＣＤ２２発現標的細胞に応答したＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン産生を測定するため、ＣＡＲ  Ｔ細胞を上記と同じＡＬＬ株＋ＣＤ２２陰性／低対照として供するＫ５６２と共培養した。細胞を１：１のエフェクター：標的比及び９６ウェルプレートの１ウェル当たり２５，０００細胞で２４時間培養し、その後培地を取り出し、Ｖ−ＰＬＥＸ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してサイトカイン分析を行った。これらのデータは、全てのＣＤ２２  ＣＡＲＴ並びにＣＤ１９  ＣＡＲＴが、Ｎａｌｍ６又はＳＥＭとの培養時にＩＦＮ−γを産生したことを示している（図１４）。ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ及びＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔが最も高いサイトカイン産生量を示したものであった。対照Ｋ５６２細胞への曝露後にＣＤ２２  ＣＡＲＴによって産生されるサイトカインのレベルは低かったことから、ＣＤ２２  ＣＡＲによる非特異的効果がないことが指摘される。
【１３０８】
最後のＴ細胞有効性アッセイでは、ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖能を評価した。この場合もやはり、解凍したＣＡＲ  Ｔ細胞をＡＬＬ株Ｎａｌｍ６及びＳＥＭと共培養した。ＣＡＲＴをＣｅｌｌＴｒａｃｅｒ  Ｖｉｏｌｅｔ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、共培養前にウェル内での異常増殖を防ぐため標的細胞株を照射した。次にこれを１：１のエフェクター：標的比、９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり３０，０００細胞で４日間培養した。４日目、細胞を抗ＣＤ３抗体並びに可溶性ＣＤ２２−Ｆｃで染色し、ＣＡＲ発現を検出した。全てのＣＤ３＋  Ｔ細胞のバイオレット色素の強度から；Ｔ細胞の細胞分裂毎に各娘細胞が保持する蛍光は半分になるため、蛍光が低いほど増殖が強い（図１５Ａ）。ＵＴＤに見られるとおり、非分裂細胞は高い蛍光を示す。細胞増殖はＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して「細胞分裂指数（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）」として定量化及び報告する（図１５Ｂ）。ここで、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔが、中でもＮａｌｍ６に応答した増殖が最良のＣＡＲＴであり、ＳＥＭに応答して最も高い増殖を示した。
【１３０９】
この実験のＣＤ２２特異的ＣＡＲは、全て初代ヒトＴ細胞の細胞表面に同様に良好に発現した：ＣＤ２２−６５＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ｍ９７１＿Ｚｍｕｔ、及びｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ。全てのＣＤ２２  ＣＡＲＴがＴ細胞機能アッセイにおいて有効性を示したが、３つ全てのアッセイで、ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ及びＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔが上位３つのＣＡＲＴであった。全体的に見て、ＣＤ２２  ＣＡＲのトランスファーは抗ＣＤ２２応答性を誘導し、しかしオフターゲット機能は検出されなかった。
【１３１０】
実施例９：短鎖リンカーを含むヒト抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖを担持するＣＡＲＴのインビボ活性
ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の組の抗腫瘍活性をＮＡＬＭ６及びＳＥＭ異種移植モデルにおいてインビボで評価した。ＣＡＲコンストラクトＣＤ２２−６５＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ｍ９７１＿Ｚｍｕｔ、及びｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔを有するＣＡＲ  Ｔ細胞を評価した。
【１３１１】
細胞株：Ｎａｌｍ６（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９２）及びＳＥＭ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９５）の両方は、ヒト急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株である。１０％ウシ胎児血清を含有するＲＭＰＩ培地において細胞を成長させた。両方とも浮遊状態で成長する。両方の細胞株がマウスにおいて静脈内への移植時に生き残り、拡大する。細胞はルシフェラーゼを発現するように改変されているため、基質ルシフェリンを注射した後にマウスをイメージングすることによっても腫瘍細胞成長をモニタすることができる。
【１３１２】
マウス：６週齢のＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから受け取った（ストック番号００５５５７）。動物は実験前にＮｏｖａｒｔｉｓ  ＮＩＢＲ動物施設で少なくとも３日間順化させた。動物はＮｏｖａｒｔｉｓ  ＡＣＵＣ規則及びガイドラインに従い取り扱った。腫瘍移植の前日に動物識別用の電子トランスポンダーを左側腹部に植え込んだ。
【１３１３】
腫瘍移植：対数増殖期の細胞を回収し、５０ｍｌファルコンチューブ内において１２００ｒｐｍで５分間、成長培地で１回、次に冷滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を５×１０６／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に再懸濁し、氷上に置き、マウスに注射した。癌細胞を２００μｌで尾静脈から静脈内注射した。Ｎａｌｍ６及びＳＥＭモデルは両方ともＣＤ２２を内因的に発現するため、従って、インビボでのＣＤ２２指向ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性の試験に使用することができる。これらのモデルはマウスにおいて静脈内への移植時に良好に成長し、これをイメージングして腫瘍負荷を測定することができる。１×１０６個の癌細胞を注射すると、３日以内に腫瘍が樹立され、正確に測定することができる。ベースライン測定値は４〜６×１０５光子／秒（ｐ／ｓ）である。７日以内に平均生物発光測定値は２〜４×１０６ｐ／ｓとなり、未治療の腫瘍は２１〜２６日までにエンドポイント測定値（２〜３×１０９）に達する。腫瘍が完全に移植されると、多くの場合に治療剤の抗腫瘍活性が試験される。従って、これらのモデルでは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を観察することのできるウィンドウが広い。
【１３１４】
ＣＡＲ  Ｔ細胞投与：腫瘍移植７日後にマウスに、Ｎａｌｍ６の治療について１×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞、及びＳＥＭの治療について３×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞を投与した。細胞は３７℃の水浴中で部分的に解凍し、次に１ｍｌの温成長培地を加えることにより完全に解凍した。解凍した細胞を５０ｍｌファルコンチューブに移し、成長培地で１２ｍｌの最終容積に調整した。細胞を２回洗浄し、３００ｇで１０分間スピンし、次に血球計算器によってカウントした。次にＴ細胞をそれぞれの濃度で冷ＰＢＳ中に再懸濁し、マウスへの投与時まで氷上に置いておいた。Ｎａｌｍ６及びＳＥＭ担持マウスに対するそれぞれ１又は３×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量について、ＣＡＲＴを２００μｌで尾静脈から静脈内投与した。各群５匹のマウスを２００μｌのＰＢＳ単独（ＰＢＳ）、非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、並びに新規ＣＤ２２−６５＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ｍ９７１＿Ｚｍｕｔ、又はｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかで治療した。細胞は、全て同じドナーから並行して調製した。
【１３１５】
動物のモニタリング：週２回の体重測定を含め、マウスの健康状態を毎日モニタした。体重のパーセント変化率は、（ＢＷ現在−ＢＷ初期）／（ＢＷ初期）×１００％として計算した。腫瘍はマウスをイメージングすることにより週２回モニタした。
【１３１６】
２つのＢ細胞急性リンパ芽球性白血病異種移植モデルにおいてＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価した。０日目の腫瘍細胞移植後、腫瘍担持マウスを治療群に無作為化し、腫瘍移植後７日目にＣＡＲ  Ｔ細胞を外側尾静脈から静脈内投与した。動物がエンドポイントに達するまで腫瘍成長及び動物の健康をモニタした。
【１３１７】
Ｎａｌｍ６モデルでは、ＰＢＳ又はＵＴＤ  Ｔ細胞の投与を受けたマウスは２２日目に、腫瘍が後肢の動きの低下を引き起こすようになったところで安楽死させた。他の群は、全て４０日目に安楽死させた。いかなるＴ細胞の投与も受けなかったＰＢＳ治療群は、静脈内注射したＮＳＧマウスにおけるベースラインＮａｌｍ６腫瘍成長動態を実証する。ＵＴＤ治療群は非形質導入Ｔ細胞の投与を受け、このモデルでのヒトドナーＴ細胞の非特異的応答を示すＴ細胞対照として供した。ＰＢＳ及びＵＴＤの両方の治療群が、本試験を通じて継続的な腫瘍進行を実証した。ＣＤ２２−６５＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ｍ９７１＿Ｚｍｕｔ、及びｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全て有意に遅い腫瘍成長を示した。ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ及びｍ９７１＿Ｚｍｕｔは、平均生物発光から示されるとおり完全な腫瘍退縮を示した（図１６）。
【１３１８】
ＳＥＭモデルでは、ＰＢＳ又はＵＴＤ  Ｔ細胞の投与を受けたマウスは２７日目に、腫瘍が後肢の動きの低下を引き起こすようになったところで安楽死させた。他の群は、全て４５日目に安楽死させた。いかなるＴ細胞の投与も受けなかったＰＢＳ治療群は、静脈内注射したＮＳＧマウスにおけるベースラインＳＥＭ腫瘍成長動態を実証する。ＵＴＤ治療群は非形質導入Ｔ細胞の投与を受け、このモデルでのヒトドナーＴ細胞の非特異的応答を示すＴ細胞対照として供した。ＰＢＳ及びＵＴＤの両方の治療群が、本試験を通じて継続的な腫瘍進行を実証した。
【１３１９】
ＣＤ２２−６５＿Ｚｍｕｔ、ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ｍ９７１＿Ｚｍｕｔ、ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ、及びＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全て有意に遅い腫瘍成長を示した。ＣＤ１９  ＣＡＲＴが最も速い腫瘍退縮を示し、次にＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ及びｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔが続いた（図１７Ａ）。それぞれの群における単一のマウスについて生物発光曲線も作成し、ｓｃＦｖ内により長いリンカーを有するＣＡＲ変異体（それぞれＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ及びｍ９７１＿Ｚｍｕｔと比較したときのＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ及びｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔの両方の有効性がより強力であることが強調された（図１７Ｂ）。
【１３２０】
本試験では、ＣＤ２２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞ＣＤ２２−６５ｓ＿ＺｗｔがＮＡＬＭ６及びＳＥＭの両方の腫瘍の退縮をもたらす能力を有することが実証された。この有効性はｍ９７１  ＣＡＲ変異体と同等で、長鎖リンカーを有するＣＤ２２−６５変異体と比較すると高かった。
【１３２１】
実施例１０：Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病に対する抗ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の臨床的有効性はｓｃＦｖリンカー長さと相関があり、異種移植モデルを用いて予測することができる
患者及び方法：ｓｃＦｖの軽鎖と重鎖との間に短鎖リンカー（１×（ＧＧＧＧＳ）；ＳＬ）を含む抗ＣＤ２２  ＣＡＲと比較して長いリンカー（４×（ＧＧＧＧＳ）；ＬＬ）を含む抗ＣＤ２２  ＣＡＲ（「ＣＤ２２  ＣＡＲ」）を作成した（図１８）。ｒ／ｒ−ＡＬＬを有する成人（ＮＣＴ０２５８８４５６）及び小児（ＮＣＴ０２６５０４１４）における２つのパイロット臨床試験でＣＤ２２  ＣＡＲ  ＬＬコンストラクトを試験した。ＣＡＲＴ２２ＬＬ  Ｔ細胞はレンチウイルス形質導入を用いて作成した。プロトコル指定ＣＡＲＴ２２用量は、＜５０ｋｇの小児患者について２×１０６〜１×１０７細胞／ｋｇ及び≧５０の小児患者及び成人患者について１〜５×１０８であり、リンパ枯渇化学療法後に注入した。患者特性は表１６に記載する。
【１３２２】
【表２３８】
2019537433.tif 000256
【１３２３】
成人試験については、５人の患者をスクリーニングし、４人を登録し（１人の患者は同意撤回）、３人に注入した（１人は製造不良）。小児試験については、９人の患者をスクリーニングし、８人を登録し（１人はスクリーニング不適合）、６人に注入した（２人の患者は疾患進行のため注入しなかった）。
【１３２４】
前臨床試験のため、ＣＡＲＴ２２ＬＬ及びＣＡＲＴ２２ＳＬを作成し、異種移植モデルを用いてインビボで試験した。ＮＳＧマウスにルシフェラーゼ＋標準Ｂ−ＡＬＬ細胞株（ＮＡＬＭ６）又はＣＡＲＴ１９後の再発患者から得られた初代Ｂ−ＡＬＬ細胞（ＣＨＰ１１０Ｒ）のいずれかを生着させた。加えて、２光子イメージングを用いてインビボ挙動及び免疫シナプス形成を調べ、フローサイトメトリーを用いてＴ細胞活性化を評価した。
【１３２５】
１２人の患者のうちの１０人についてＣＡＲＴ２２細胞の製造に成功した。成人コホートでは、３人中３人の患者がＣＲＳ（グレード１〜３）を発症し、神経毒性は認められなかった；小児コホートでは５人の評価可能患者のうち（１人は注入前骨髄において系統がＡＭＬに転化したため中断した）、５人中３人がサイトカイン関連症候群（ＣＲＳ）（全員グレード２）を発症し、１人の患者が脳症（グレード１）を有した。ＣＡＲＴ２２細胞をＰＢ中で拡大し、１１〜１８日目の中央値ピークが１９７７（１８〜４０３１４）コピー／ｕｇ  ＤＮＡであった。以前ＣＡＲＴ１９の投与を受けたことがある成人患者では、ＣＡＲＴ２２拡大後に２回目のＣＡＲＴ１９再拡大が観察された（図１９）。２８日目、成人コホートでは、形態学的ＣＲで注入された患者はＣＲのままであった一方、他の２人には応答がなかった（ＮＲ）。小児コホートでは、５人の患者のうちの２人がＣＲであり、１人の患者は部分寛解（ＰＲ）であって、次に、これは２ヵ月の時点で回復が不完全なＣＲに変わり、及び２人はＮＲであった。ＣＤ２２陰性白血病の進行は観察されなかった。
【１３２６】
次に、２つの異なるＣＡＲ２２コンストラクト（ＣＡＲＴ２２Ｓ及びＣＡＲＴ２２ＳＬ）の直接比較を実施した。異種移植モデルでは、ＣＡＲＴ２２ＳＬはＣＡＲＴ２２ＬＬよりも有意に優れており（図２０）、全生存が改善された。更に、ＣＡＲＴ２２ＳＬは、１７日目の時点でより高いインビボ増殖を示した（図２１）。機構的に、生体内２光子イメージングにより、ＣＡＲＴ２２ＳＬがＣＡＲＴ２２ＬＬよりも長時間持続するＴ細胞：白血病相互作用を構築したことが示され、生産的シナプスの構築が示唆された（図２２）。更に、インビボで２４時間の時点において、ＮＡＬＭ−６担持マウスのＢＭからＣＡＲＴ２２ＳＬにおいてより高いＴ細胞活性化（ＣＤ６９、ＰＤ−１）が観察された。
【１３２７】
実現可能で、且つ毒性を管理可能であるものの、ＣＡＲＴ２２ＬＬはｒ／ｒ  Ｂ−ＡＬＬ患者に中程度の臨床応答をもたらした。前臨床評価から、本発明者らは、リンカーを１５アミノ酸短縮すると、恐らくはＴ細胞とその標的との間に一層有効な相互作用がもたらされることにより、ＣＡＲＴ２２の抗白血病活性が有意に増加すると結論付けることが可能であった。最後に、交差試験比較の注記として、これらのデータは、異種移植モデルがＣＡＲＴ製品の臨床的有効性を予測し、リード候補選択のためのインビボモデルの使用をバリデートし得ることを示唆している。
【１３２８】
実施例１１：リンカー変異体を含むヒト抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖを担持するＣＡＲＴのインビトロ活性
ＣＤ３ζ鎖及び４−１ＢＢ刺激分子を含むレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターに抗ＣＤ２２抗体の単鎖可変断片をコードする遺伝子をクローニングした。以下の抗ＣＤ２２  ＣＡＲコンストラクトを評価した：ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ（短鎖１×（ＧＧＧＧＳ）リンカー；配列番号８３５）、ＣＤ２２−６５ｓｓ＿Ｚｗｔ（ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーなし；配列番号８３６）、ＣＤ２２−６５ｓＬＨ＿Ｚｗｔ（Ｎ末端に向いたＶＬ領域とＣ末端に向いたＶＨ領域とを有する短鎖１×（ＧＧＧＧＳ）リンカー）、ＣＤ２２−６５ｓＫＤ＿Ｚｗｔ（短鎖１×（ＧＧＧＧＳ）リンカー並びにＶＨ及びＶＬ領域のＦＲ領域における突然変異；配列番号８３７）、及びＣＤ２２−ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ（対照）を評価した。ＣＤ２２−６５ｓＬＨ＿Ｚｗｔを除き、全ての抗ＣＤ２２  ＣＡＲコンストラクトがＮ末端に向いたＶＨ領域を有する。
【１３２９】
ＣＤ３ζ鎖は野生型であるか（Ｚｗｔ）、又はＱ６５Ｋ突然変異を有するか（Ｚｍｕｔ）のいずれかであった。ＣＤ２２発現（「ＣＤ２２＋」）標的に応答したこれらのＣＤ２２  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（「ＣＤ２２  ＣＡＲＴ」又は「ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞」）のエフェクターＴ細胞応答に基づきコンストラクトを順位付けした。エフェクターＴ細胞応答としては、限定はされないが、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生及び標的細胞殺傷又は細胞溶解活性（脱顆粒）が挙げられる。
【１３３０】
ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作成：ヒトｓｃＦｖをコードするレンチウイルストランスファーベクターを使用して、ＶＳＶｇシュードタイプ化レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム材料を作製した。ＣＡＲをコードするレンチウイルストランスファーベクターＤＮＡをリポフェクタミン試薬との組み合わせで３つのパッケージング成分ＶＳＶｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖと混合してＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をトランスフェクトし、続いて１２〜１８時間後に培地を交換した。培地を取り換えてから３０時間後に培地を回収し、ろ過して、−８０℃で保存した。
【１３３１】
ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作成は、アフェレーシスを受けた健常ドナーの血液から出発し、Ｔ細胞、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球のネガティブ選択（Ｐａｎ  Ｔ細胞単離、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によってそれらのドナーのＴ細胞をエンリッチした。Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１００μＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、及び５５μＭ  ２−メルカプトエタノール）に３７℃、５％ＣＯ２でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：３（Ｔ細胞対ビーズ）の比で加えることにより、Ｔ細胞を活性化した。Ｔ細胞は、２４ウェルプレートの１ウェル当たり１ｍＬ培地中０．５×１０６個のＴ細胞で培養した。２４時間後、Ｔ細胞がブラスト化したところで、非濃縮又は濃縮ウイルス上清を加えた；Ｔ細胞は５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。Ｔ細胞が増殖し始めた。これは細胞濃度の測定（１ｍＬ当たりのカウントとして）によってモニタされ、Ｔ細胞は２日毎に新鮮Ｔ細胞培地で希釈される。Ｔ細胞が約１０日後に静止し始めたことに伴い、対数増殖が衰える。成長速度の減速とＴ細胞サイズの減少（ほぼ３５０ｆＬ）との組み合わせにより、後の分析のためＴ細胞を凍結保存する状態が決まる。ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全て研究グレードの（即ち臨床グレードでない）製造条件下で作製した。
【１３３２】
凍結保存前に、形質導入された（細胞表面にＣＤ２２特異的ＣＡＲを発現する）細胞の割合をＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）でのフローサイトメトリー分析によって決定した（図２３）。ウイルス形質導入は同等の発現レベルを示したことから、それぞれのＣＡＲの形質導入効率並びに表面発現が同様であることが指摘される。ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物の細胞カウントは、非形質導入Ｔ細胞（「ＵＴＤ」）と比較したとき細胞が正常に拡大する能力にヒトＣＤ２２  ＣＡＲが検出可能な負の効果を及ぼさないことを示している。
【１３３３】
ＣＤ２２  ＣＡＲリダイレクトＴ細胞の効力を評価する：ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能的能力を評価するため、上記に記載したとおり作成した細胞を解凍し、カウントし、癌細胞と共培養して、その殺傷能力及びサイトカインの分泌を読み取った。ヒトｓｃＦｖ担持ＣＡＲ  ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓＬＨ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓＫＤ＿Ｚｗｔ、及びＣＤ２２−ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔを比較し、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞並びに非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を非ターゲティングＴ細胞対照として使用した。
【１３３４】
Ｔ細胞殺傷を急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）株Ｎａｌｍ６（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９２）及びＳＥＭ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９５）に仕向けた。両方の細胞株とも、細胞生存／死滅のレポーターとしてルシフェラーゼを発現するように形質導入した。ＣＤ２２  ＣＡＲＴの細胞溶解活性を１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１  ０．６３：１及び０．３１：１のエフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）のタイトレーションで計測した。アッセイは、それぞれの数のＴ細胞を一定数の標的細胞（９６ウェルプレートの１ウェル当たり２５，０００細胞）と混合することにより開始した。２０時間後、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬を加えることによりウェル内の残りの細胞を溶解させて、各ウェル内の残りのＬｕｃ発現癌細胞を定量化した。「％死滅率」を標的細胞のみが入ったウェル（０％、最大Ｌｕｃシグナル）と比べて計算した。データは、ＣＤ２２  ＣＡＲＴをコードするレンチウイルスの形質導入によってＴ細胞に抗ＣＤ２２殺傷活性が移入されることを示している（Ｎａｌｍ６及びＳＥＭ（図２４Ａ〜図２４Ｂ））。ＵＴＤ及びＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はバックグラウンド殺傷性のみを示す。ＣＤ２２−６５ｓＬＨ＿Ｚｗｔを除く全てのＣＡＲが、Ｎａｌｍ６及びＳＥＭの両方の標的細胞株の高い殺傷性を示した。
【１３３５】
ＣＤ２２発現標的細胞に応答したＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン産生を測定するため、ＣＡＲ  Ｔ細胞を上記と同じＡＬＬ株と共培養した。細胞を１：１のエフェクター：標的比及び９６ウェルプレートの１ウェル当たり２５，０００細胞で２４時間培養し、その後培地を取り出し、Ｖ−ＰＬＥＸ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してサイトカイン分析を行った。これらのデータは、ＣＤ２２−６５ｓＬＨ＿Ｚｗｔを除く全てのＣＤ２２  ＣＡＲＴが、Ｎａｌｍ６又はＳＥＭとの培養時にＩＦＮ−γを産生したことを示している（図２５）。
【１３３６】
この実験のＣＤ２２特異的ＣＡＲは、全て初代ヒトＴ細胞の細胞表面に同様に良好に発現した：ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓＬＨ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓＫＤ＿Ｚｗｔ、及びＣＤ２２−ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ。加えて、ＣＤ２２−６５ｓＬＨ＿Ｚｗｔを除き、全てのＣＤ２２  ＣＡＲＴがＴ細胞機能アッセイにおいて有効性を示した。
【１３３７】
実施例１２：リンカー変異体を含むヒト抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖを担持するＣＡＲＴのインビボ活性
ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の組の抗腫瘍活性をＮＡＬＭ６異種移植モデルにおいてインビボで評価した。ＣＡＲコンストラクトＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓＬＨ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓＫＤ＿Ｚｗｔ、及びＣＤ２２−ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ（対照）を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を評価した。
【１３３８】
細胞株：Ｎａｌｍ６（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９２）は、ヒト急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株である。１０％ウシ胎児血清を含有するＲＭＰＩ培地において細胞を成長させた。両方とも浮遊状態で成長する。細胞はマウスにおいて静脈内への移植時に生き残り、拡大する。細胞はルシフェラーゼを発現するように改変されているため、基質ルシフェリンを注射した後にマウスをイメージングすることによっても腫瘍細胞成長をモニタすることができる。
【１３３９】
マウス：６週齢のＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから受け取った（ストック番号００５５５７）。動物は実験前にＮｏｖａｒｔｉｓ  ＮＩＢＲ動物施設で少なくとも３日間順化させた。動物はＮｏｖａｒｔｉｓ  ＡＣＵＣ規則及びガイドラインに従い取り扱った。腫瘍移植の前日に動物識別用の電子トランスポンダーを左側腹部に植え込んだ。
【１３４０】
腫瘍移植：対数増殖期の細胞を回収し、５０ｍｌファルコンチューブ内において１２００ｒｐｍで５分間、成長培地で１回、次に冷滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を５×１０６／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に再懸濁し、氷上に置き、マウスに注射した。癌細胞を２００μｌで尾静脈から静脈内注射した。Ｎａｌｍ６細胞は、ＣＤ２２を内因的に発現するため、インビボでのＣＤ２２指向ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性の試験に使用することができる。このモデルはマウスにおいて静脈内への移植時に良好に成長し、これをイメージングして腫瘍負荷を測定することができる。１×１０６個の癌細胞を注射すると、３日以内に腫瘍が樹立され、正確に測定することができる。ベースライン測定値は４〜６×１０５光子／秒（ｐ／ｓ）である。７日以内に平均生物発光測定値は２〜４×１０６ｐ／ｓとなり、未治療の腫瘍は２０〜３０日までにエンドポイント測定値（２〜３×１０９）に達する。腫瘍が完全に移植されると、多くの場合に治療剤の抗腫瘍活性が試験される。従って、これらのモデルでは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を観察することのできるウィンドウが広い。
【１３４１】
ＣＡＲ  Ｔ細胞投与：腫瘍移植７日後にマウスにＮａｌｍ６の治療用の１×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞を投与した。細胞は３７℃の水浴中で部分的に解凍し、次に１ｍｌの温成長培地を加えることにより完全に解凍した。解凍した細胞を５０ｍｌファルコンチューブに移し、成長培地で１２ｍｌの最終容積に調整した。細胞を２回洗浄し、３００ｇで１０分間スピンし、次に血球計算器によってカウントした。次にＴ細胞をそれぞれの濃度で冷ＰＢＳ中に再懸濁し、マウスへの投与時まで氷上に置いておいた。１×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞の用量について、ＣＡＲＴは２００μｌで尾静脈から静脈内投与した。各群５匹のマウスを２００μｌのＰＢＳ単独（ＰＢＳ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ形質導入Ｔ細胞、並びに新規ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓＬＨ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓＫＤ＿Ｚｗｔ、及びＣＤ２２−ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかで治療した。細胞は、全て同じドナーから並行して調製した。
【１３４２】
動物のモニタリング：週２回の体重測定を含め、マウスの健康状態を毎日モニタした。体重のパーセント変化率は、（ＢＷ現在−ＢＷ初期）／（ＢＷ初期）×１００％として計算した。腫瘍はマウスをイメージングすることにより週２回モニタした。
【１３４３】
Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病異種移植モデルにおいてＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価した。０日目の腫瘍細胞移植後、腫瘍担持マウスを治療群に無作為化し、腫瘍移植後７日目にＣＡＲ  Ｔ細胞を外側尾静脈から静脈内投与した。動物がエンドポイントに達するまで腫瘍成長及び動物の健康をモニタした。
【１３４４】
このＮａｌｍ６モデルでは、ＰＢＳ又はＥＧＦＲｖＩＩＩ  Ｔ細胞の投与を受けたマウスは２３日目に、腫瘍が後肢の動きの低下を引き起こすようになったところで安楽死させた。他の群は、全て３７日目に安楽死させた。次に全ての治療群の平均生物発光を決定した（図２６）。いかなるＴ細胞の投与も受けなかったＰＢＳ治療群は、静脈内注射したＮＳＧマウスにおけるベースラインＮａｌｍ６腫瘍成長動態を実証する。ＥＧＦＲｖＩＩＩ治療群はモック形質導入Ｔ細胞の投与を受け、このモデルでのヒトドナーＴ細胞の非特異的応答を示すＴ細胞対照として供した。ＰＢＳ及びＵＴＤの両方の治療群が、本試験を通じて継続的な腫瘍進行を実証した。ＣＤ２２−６５＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓＫＤ＿Ｚｗｔ、及びＣＤ２２−ｍ９７１ｓ＿Ｚｍｕｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全て有意に遅い腫瘍成長を示した。ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ、ＣＤ２２−６５ｓｓ＿Ｚｗｔが最も強力な応答を示した。
【１３４５】
これらのデータは、ＣＤ２２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞ＣＤ２２−６５ｓ＿Ｚｗｔ及びＣＤ２２−６５ｓｓ＿Ｚｗｔが１×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞の低用量でＮＡＬＭ６癌の成長を強力に阻害する能力を有することを実証している。この有効性は対照ｍ９７１  ＣＡＲよりも優れていた。
【１３４６】
実施例１３：タンデム抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２  ｓｃＦＶを含むＣＡＲＴの作成、発現、及び抗原活性化
２つの異なるｓｃＦＶで機能化された単一のＣＡＲＴ細胞が、ＣＡＲＴを認識する抗原のいずれか一方によって活性化され得るかどうかを試験するため、ＣＤ１９及びＣＤ２２を標的にするｓｃＦＶで、一体に連結された２つの異なるｓｃＦＶを含むＣＡＲＴを作成した（表１５及び表１７及び図２７）。これらのコンストラクトは、Ｔ細胞膜に対する抗ＣＤ１９認識部分の位置が異なる（近位又は遠位：それぞれＴ細胞膜により近いか、又はそれから離れている）。
【１３４７】
作成したコンストラクトは、２つのｓｃＦＶを結合する２つの異なるリンカー：ＬＡＥＡＡＡＫ及びＧＧＧＧＳを調べるものである。ＬＡＥＡＡＡＫは、より可動性の低いリンカーであり、一方ＧＧＧＧＳリンカーは、より可動性の高いリンカーである。抗ＣＤ２２  ｓｃＦＶ活性化の範囲内における軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖の向きの影響も調査した。抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶは、全てのコンストラクトにおいて（Ｎ末端からＣ末端の向きに）Ｌ／Ｈの向きとした。抗ＣＤ２２  ｓｃＦＶ内のＨ鎖とＬ鎖とを結合する２つのリンカー：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ及びＧＧＧＧＳも調べた（表１７及び表１８において「ｓｈ」とアノテートされる）。個々のｓｃＦＶ（抗ＣＤ１９又は抗ＣＤ２２）で操作した対照コンストラクトも作成した（表１８）。
【１３４８】
【表２３９】
2019537433.tif 000257
【１３４９】
【表２４０】
2019537433.tif 000258
【１３５０】
ＣＡＲ発現の評価：表１７及び表１８に挙げられるコンストラクトをコードする配列をレンチウイルス骨格ベクターにクローニングした。全てのコンストラクトがそのＮ末端にヒトＣＤ８αのリーダー配列を含んだ。これは共翻訳的に切断されて最終的なタンパク質産物からは除外されるものと予想される。トランス遺伝子発現はＥＦ１αプロモーターによってドライブした。得られたＤＮＡを使用して、ウイルス産生のためＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクトした。例示的ウイルス力価を表１９に示す。ウイルス力価は、２つの異なる染色試薬を使用したＦＡＣＳにより、ＳｕｐＴ１細胞における様々なコンストラクトの表面発現に基づいて決定した。ＣＤ２２に対するｓｃＦＶを染色するためのＣＤ１９及びＣＤ２２−ＦＣに対するｓｃＦｖを認識する抗イディオタイプ抗体を使用した。染色は独立に実施した。
【１３５１】
【表２４１】
2019537433.tif 000259
【１３５２】
各コンストラクトについて、２つの染色試薬で得られたウイルス力価を平均し、ＪＮＬ細胞を形質導入するその能力に関してウイルスを評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、予めＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトで形質導入された。３の感染多重度を使用した。指定のコンストラクトを形質導入した後のＪＮＬにおいてパーセントＣＡＲ陽性細胞率を決定した（図２８）。形質導入後７日で同じ染色試薬を使用したＦＡＣＳによりＣＡＲ発現を決定し、感染ＳｕｐＴ１細胞におけるＣＡＲの発現を確認した。染色は独立に実施し、２つの試薬は妨げとならないよう同時に加えないこととした。
【１３５３】
これらのデータは、種々のコンストラクトでｓｃＦＶが細胞表面に検出されたことを示し、ＣＤ１９及びＣＤ２２の両方を標的にするコンストラクトの発現及び細胞表面への輸送が指摘される。抗原それ自体である染色試薬（ＣＤ２２−Ｆｃ）を使用すると、ＣＤ２２に対するｓｃＦＶが、ＣＤ２２タンパク質内の抗原の認識と適合性のある正しい折り畳み構造を獲得したことが示される。この結果は、抗ＣＤ２２  ｓｃＦＶアームが抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶアームの上流に操作されたか、それとも下流に操作されたかに関わらず観察された。
【１３５４】
ＣＡＲ活性化の評価：標的抗原のいずれかによって２つの異なるｓｃＦＶを含むＣＡＲが活性化され得るかどうかを評価するため、本発明者らは非形質導入（ＵＴＤ）及び形質導入ＪＮＬを、ＣＤ１９（Ｋ５６２−ＣＤ１９）又はＣＤ２２（Ｋ５６２−ＣＤ２２）のいずれかを発現する標的細胞株と共培養した。ＣＡＲがＣＤ１９又はＣＤ２２抗原を認識すると、ＣＡＲの関与により下流ＮＦＡＴ活性化がもたらされた。ＪＮＬ細胞におけるＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーターが、ＣＡＲ活性化を読み取るための尺度を提供した。異なる標的細胞株におけるＣＤ１９及びＣＤ２２の発現レベルを示す（図２９）。
【１３５５】
ＣＡＲ活性尺度としてのＮＦＡＴ誘導性ルシフェラーゼのレベルを示す（図３０）。図２８に示されるデータに基づき、アッセイに加えたＪＮＬ細胞の数はＣＡＲの最も低い発現に対して正規化した。一つがＣＤ１９に対する、及びもう一つがＣＤ２２に対する２つのｓｃＦＶを含む全てのコンストラクトが、Ｔ細胞膜に対するｓｃＦＶの向きに関わらず、両方の標的によって活性化された。モノＣＡＲは、そのｓｃＦＶが認識する抗原（ＣＤ１９又はＣＤ２２）によってのみ活性化された。
【１３５６】
均等物
本明細書に引用するそれぞれの及び全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。本発明は、具体的態様を参照して開示しているが、本発明の他の態様及び変形形態は、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の当業者によって考案され得ることが明らかである。下記の特許請求の範囲は、全てのこのような態様及び均等な変形形態を含むと解釈されることを意図する。
【図１Ａ】
2019537433.tif 000262
【図１Ｂ】
2019537433.tif 000263
【図１Ｃ】
2019537433.tif 000264
【図１Ｄ】
2019537433.tif 000265
【図１Ｅ】
2019537433.tif 000266
【図２】
2019537433.tif 000267
【図３】
2019537433.tif 000268
【図４】
2019537433.tif 000269
【図５−１】
2019537433.tif 000270
【図５−２】
2019537433.tif 000271
【図６】
2019537433.tif 000272
【図７Ａ】
2019537433.tif 000273
【図７Ｂ】
2019537433.tif 000274
【図８】
2019537433.tif 000275
【図９−１】
2019537433.tif 000276
【図９−２】
2019537433.tif 000277
【図１０】
2019537433.tif 000278
【図１１】
2019537433.tif 000279
【図１２】
2019537433.tif 000280
【図１３】
2019537433.tif 000281
【図１４】
2019537433.tif 000282
【図１５Ａ】
2019537433.tif 000283
【図１５Ｂ】
2019537433.tif 000284
【図１６】
2019537433.tif 000285
【図１７Ａ】
2019537433.tif 000286
【図１７Ｂ】
2019537433.tif 000287
【図１８】
2019537433.tif 000288
【図１９】
2019537433.tif 000289
【図２０】
2019537433.tif 000290
【図２１】
2019537433.tif 000291
【図２２】
2019537433.tif 000292
【図２３】
2019537433.tif 000293
【図２４】
2019537433.tif 000294
【図２５】
2019537433.tif 000295
【図２６】
2019537433.tif 000296
【図２７】
2019537433.tif 000297
【図２８】
2019537433.tif 000298
【図２９】
2019537433.tif 000299
【図３０】
2019537433.tif 000300
【配列表】
2019537433000001.app
【国際調査報告】
2019537433.tif 000301
2019537433.tif 000302
2019537433.tif 000303
2019537433.tif 000304
2019537433.tif 000305
2019537433.tif 000306