(57)【要約】  本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療で使用するための特定の投薬レジメンを用いる、ダイマー又はマルチマー形態のアポリポタンパク質の経口投与のための新規組成物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポリポタンパク質１のダイマー及び／又はマルチマー形態の１種又は２種以上のムテインを含む組成物であって、
前記ムテインは植物種子中でダイマー及び／又はマルチマー形態で生成され、
前記組成物は前記植物の種子から抽出されたミルク及び／又はその誘導体を含み、そして
前記１種又は２種以上のムテインは、アテローム性動脈硬化症の治療で使用するために、体重１ｋｇ当たり０．２〜４ｍｇの１日投薬量で患者に経口投与される、上記組成物。
【請求項２】
１種又は２種以上のムテインが体重１ｋｇ当たり０．４〜３ｍｇの１日投薬量で患者に経口投与される、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
１種又は２種以上のムテインが体重１ｋｇ当たり０．５〜２ｍｇの１日投薬量で患者に経口投与される、請求項２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
１種又は２種以上のムテインが体重１ｋｇ当たり０．５〜１．８ｍｇの１日投薬量で患者に経口投与される、請求項３に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
１種又は２種以上のムテインが体重１ｋｇ当たり０．５〜１．５ｍｇの１日投薬量で患者に経口投与される、請求項４に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
植物がマメ科植物、穀物又はタバコである、請求項１から５のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項７】
植物がイネ、トウモロコシ、コムギ、硬質（デュラム）又は軟質コムギ、オートムギ、スペルトコムギ、オオムギ、ダイズ、エンドウ、マメ、タバコを含む群から選択される、請求項６に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
１種又は２種以上のムテインが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８を有するムテインの群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項９】
粉末、錠剤、カプセル、硬質又は軟質ゼラチン、シロップ、スプレー、懸濁液、ミルク剤、溶液の形態の、請求項１から８のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
ミルクが液体状態であるか、凍結乾燥形態であるか、又は適切な担体に再懸濁されている、請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
組成物が、医薬組成物の形態、栄養補助食品の形態、医療デバイスの形態又は特別な医療目的のための食品の形態である、請求項１から１０のいずれかに記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療で使用するための特定の投薬レジメンを用いる、ダイマー又はマルチマー形態のアポリポタンパク質の経口投与のための新規組成物に関する。
【０００２】
従来技術
心筋梗塞、卒中、不安定狭心症及び心臓性突然死は、ひとまとめにして世界的な死亡の主因に相当し、発生率が高まっている。これらのＣＶＤの最も一般的な原因は、大きな及び中程度の大きさの動脈にプラーク又はアテロームと呼ばれる病変が形成される緩徐進行性疾患であるアテローム性動脈硬化症である。アテローム形成プロセスは、動脈の限局的領域、特に、血流の乱れを特徴とする解剖学的部域（例えば、分岐、湾曲など）におけるコレステロール含有血漿リポタンパク質の内皮下貯留によって引き起こされる。
【０００３】
血中の高コレステロールレベルは脂質異常症と呼ばれる障害と関係があり、これは、遺伝的な形態のものでも、遺伝的原因のものでない二次的状態に起因するものでも、アテローム性動脈硬化症の関連危険因子に相当する。血中の総コレステロール（ＴＣ）及びＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ、低密度リポタンパク質コレステロール）の増大、並びに超低密度リポタンパク質（ＶＤＬＤ）の増大、スモールデンス低密度リポタンパク質の増大、及びＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ、高密度リポタンパク質コレステロール）の低下によってもたらされる、いわゆるアテローム形成脂質三徴候は、心血管疾患の関連因子であるように思われる。修正可能な危険因子及び上記すべての脂質異常症の一因となる因子の早期診断及び管理は、心血管疾患の予防の第１の選択肢となる。
【０００４】
ＡｐｏＡ１タンパク質（アポリポタンパク質Ａ１）の有望な治療的可能性が文献で既知である。このタンパク質は、リン脂質と強く結合して複合体を形成し、コレステロールに富む細胞からのコレステロールの流出を促進することが見出されている。アテローム性動脈硬化症の症状を緩和又は予防するためにＡｐｏＡ１の適切な血漿レベルを維持することは、実行するのが容易ではない。
ＨＤＬコレステロールの高血漿レベルと心血管疾患の間に見つかった逆相関は、ＨＤＬ及びその主な成分であるＡｐｏＡ１タンパク質がコレステロール逆輸送（ＲＣＴ現象）において有する役割に帰せられる。ＲＣＴの効率は、ＡｐｏＡ１タンパク質が細胞からのコレステロールの流出を促進する、脂質に結合する、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）を活性化する、及び特異的受容体と相互作用し、それを排除するタンパク質を血漿流から肝臓まで移行させる成熟ＨＤＬを形成する能力に依存する。
【０００５】
ＡｐｏＡ１又はＡｐｏＥ（両方とも組換え体であり抽出したもの）などのタンパク質の注入は、アテローム性動脈硬化性疾患の動物実験モデルにおいてアテローム性動脈硬化性の負荷の低減を定めることが示されている。アテローム性動脈硬化症の動物モデルにおける様々な研究が、治療戦略としてのＨＤＬの使用の可能性を示したが、臨床研究は、組換えＨＤＬ分子又は関連したＨＤＬ模倣ペプチドを注入によって投与した場合に、重要な有効性パラメーターであるアテローム体積の有意な低減を示すことに実質的に成功しなかった［Ａ．Ｍ．Ｆｏｇｅｌｍａｎ、ＨＤＬの可能性の利用の試み：希望的観測又は確実な戦略？（Ｔｒｙｉｎｇ  ｔｏ  ｈａｒｎｅｓｓ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ＨＤＬ：ｗｉｓｈｆｕｌ  ｔｈｉｎｋｉｎｇ  ｏｒ  ｓｏｕｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｙ？）Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．３５（２０１４）３２４８〜３２４９．］。
【０００６】
アテローム性動脈硬化症に関する、ＨＤＬコレステロールを標的化する療法は、コレステロール逆輸送代謝の様々な側面に作用することによる、ＨＤＬ−Ｃの血漿レベルの正常化に基づく。これらの中で、スタチンは、肝臓における内性コレステロール合成を低減させ、それによって、ＬＤＬ−Ｃレベルを低減させるために使用される。一方で、ＣＥＴＰ阻害剤はＨＤＬ−Ｃレベルを増大させる。他の治療方法は、再構成されたＨＤＬ及びＡｐｏＡ１模倣物の血流への注入に基づく。このタイプの分子については、目的は、ＨＤＬ粒子中のコレステロールの量を増大させ、それによって、これらの分子の機能性を向上させることである。これらの戦略は、実験モデルにおいて適切な結果もたらしたが、臨床研究において明らかな利点をもたらさなかった。
【０００７】
ＡｐｏＡ１リポタンパク質の実際の臨床適用のいかんを問わず及びＡｐｏＡ１リポタンパク質の高い治療的可能性にもかかわらず、脂質代謝の機能不全又は異常（例えば、家族性高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症など）と関係がある障害におけるその治療的使用は、まだ十分に開発されていない。ＡｐｏＡ１ベースの療法が成功しないことを説明する２つの主な制限が存在し、それは、すなわち、これらの分子の生成及び／又は精製の方法が非常に低効率であること、並びにそれらを必要とする患者へのそれらの投与の限界である。
【０００８】
アテローム性動脈硬化症の治療に現在使用されている療法の欠くことのできない部分は、患者の食習慣の実質的な修正である。そのような修正は、食習慣をほとんど制御できない人々に必要であることが多いので、しばしば失敗し、患者に使用される薬理学的療法の有効性及び結果をひどく害する。上記の病態の治療における食事の関連性は、文献（例えば、Ｃｏｎｎｏｒ  ＷＥ、Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＬ「家族性高コレステロール血症の治療における食事の重要性（Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｅｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）」Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９３  Ｓｅｐ  ３０；７２（１０）：４２Ｄ〜５３Ｄ、Ｃｏｎｎｏｒ  ＷＥ、Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＬ「食事、アテローム性動脈硬化症及び魚油（Ｄｉｅｔ，ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｆｉｓｈ  ｏｉｌ）」Ａｄｖ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１９９０；３５：１３９〜７１、Ｃｈａｐｍａｎ  ＭＪ、Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇ  Ｓ、Ｌａｎｄｍｅｓｓｅｒ  Ｕ（２０１６）心臓病学の年２０１５：予防（Ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ２０１５：ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．）Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  ３７：ｅｈｖ７２１〜５１９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｅｕｒｈｅａｒｔｊ／ｅｈｖ７２１）において周知である。
【０００９】
特許出願ＷＯ２００８／０１７９０は、ダイマー又はマルチマー形態のＡｐｏＡ１のムテインの植物種子における生成を記載しており、実証されてはいないが、これらのアポリポタンパク質の静脈内投与だけでなく、経口又は直腸投与も想定している。経口投与では、投与は、該特許出願に記載されている植物の種子から、又はそれらの細粉などから抽出されたミルク（milk）を投与することによって、直接想定されている。
【００１０】
さらに、この文書は、医薬的有効濃度、例えば体重１Ｋｇ当たり１０ｍｇ又は体重１Ｋｇ当たり５０ｍｇなどの、記載されるムテインの１種又は２種以上のダイマー及び／又はオリゴマーを含む医薬組成物によるアポリポタンパク質Ａ１の１日投薬量を教示する。
【００１１】
発明の概要
本発明の発明者らは、ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されている植物の種子から抽出されたミルクによって、及び様々な細胞及び動物モデルでそれらの活性を評価することによって、経口投与を効果的に使用する可能性を検証した。
しかし、本発明の発明者らは、ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されている植物の種子から抽出されたミルクの投与が、上記の特許出願で示唆されるものよりも１０〜１００倍低い投薬量でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて有効であったこと、及びアッセイした経口組成物による治療の間に、高コレステロール化食に付された動物において、抗アテローム性動脈硬化の治療効果も観察可能であったことを驚くべきことに発見している。
【００１２】
発明者らは、ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されている植物の種子から抽出されたミルクは、凍結乾燥形態で、凍結した凍結乾燥物（例えば、−２０℃）の又は室温での保存の後に、及び適切な希釈剤を用いるそれらの再懸濁の後においても、その有効性を保持することも有利なことに発見している。
高コレステロール食で処理したマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ実験では、前記組成物は、治療前後に高コレステロール化食に付された動物においても、アテローム性動脈硬化性プラークの進行を予防することができるだけでなく、その領域を有意に低減させることもできることを驚くべきことに証明した。
【００１３】
文献では、アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）又はそのムテインの経口投与に関する実験データ、したがって、正確な投薬レジメンを想定することを可能にするデータがなく、それに加えて、前記分子の静脈内投与に関する既存のデータ（Ｉｂａｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ２０１２及びＣｉｍｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００９（１週で合計１５０ｍｇ／Ｋｇのための、４日間隔で２回のＩＶ注入のＡＰＯＡ１Ｍｉｌａｎｏ１Ｋｇ当たり７５ｍｇの、高コレステロール血症及びアテローム性動脈硬化性のウサギへの投与を報告する）を参照されたい）は、経口投与に関して本明細書で記載及び請求されるものよりもはるかに高い投薬量で、アテローム性動脈硬化性プラークの＜５％の低減を示す。
本明細書で報告されるデータでは、大動脈洞のレベルで約５０％のプラークの低減、及び大動脈弓におけるプレート領域の４０％の低減が示される。
そのようなデータは、さらに、高コレステロール食を与えたマウスについて得られ、これは、食事レベルで特に規則を守らされていない患者の、はるかに現実的に可能な食事レジメンを反映している。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ−１）のダイマー及び／又はマルチマー形態の１種又は２種以上のムテインを含む組成物であり、前記ムテインは、植物種子においてダイマー及び／又はマルチマー形態で生成され、前記組成物は、前記植物の種子から抽出されたミルク及び／又はその誘導体を含み、前記ムテインは、アテローム性動脈硬化症の治療で使用するために、体重１ｋｇ当たり０．２〜４ｍｇの１日投薬量で患者に経口投与される。
【００１５】
本発明の目的はまた、アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）のダイマー及び／又はマルチマー形態の１種又は２種以上のムテインを含む組成物の、それを必要とする患者への経口投与による、アテローム性動脈硬化症の治療のための方法であり、前記ムテインは、植物種子においてダイマー及び／又はマルチマー形態で生成され、前記組成物は、前記植物の種子から抽出されたミルク及び／又はその誘導体を含み、前記ムテインは、体重１ｋｇ当たり０．２〜４ｍｇの１日投薬量で投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、イネのミルク中のＡｐｏＡ−１Ｍが、マクロファージ活性化の防止において、組換えＡｐｏＡ−１よりも有効であることを示す図である。ＴＨＰ−１マクロファージ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−２０２（商標））の溶解物に対するＭＣＰ−１の代表的な免疫ブロットである。この図は５つの独立した実験の代表である。２μｇ／ｍｌに相当する濃度の（特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されていることに従って）ＡｐｏＡ１−Ｍを含むイネのミルクとともに、又は対照として２μｇ／ｍｌの濃度のＡｐｏＡ１−Ｒとともに、ＴＨＰ−１マクロファージをインキュベートした。            図１Ｂは、イネのミルク中のＡｐｏＡ−１Ｍが、マクロファージ活性化の防止において、組換えＡｐｏＡ−１よりも有効であることを示す図である。ＭＣＰ−１の発現はｏｘＬＤＬの投与によって有意に誘導された。ＡｐｏＡ１−Ｒではなく、ＡｐｏＡ１−Ｍを含むミルクのみがＴＨＰ−１マクロファージにおけるＭＣＰ−１発現を阻害することができた。＊ｐ＜０．０５。エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図２】図２Ａは、イネのミルク中のＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ１−Ｍ）ムテインがＴＨＰ−１マクロファージによるｏｘＬＤＬ誘導性のＭＣＰ−１発現を低減することを示す図である。ＴＨＰ−１マクロファージの溶解物に対するＭＣＰ−１の代表的な免疫ブロットである。この図は５つの独立した実験の代表である。イネのミルク中のＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏの濃度をパネルＡに示す。            図２Ｂは、イネのミルク中のＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ１−Ｍ）ムテインがＴＨＰ−１マクロファージによるｏｘＬＤＬ誘導性のＭＣＰ−１発現を低減することを示す図である。ＭＣＰ−１の発現はイネのミルク中のＡｐｏＡ１−Ｍの濃度に反比例した。
【図３】図３Ａは、対応するイネ植物クローン（特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されている）に由来するミルク中に存在するＡｐｏＡ−１  １７３−２１５（ＡＰＯ−１７）及びＡｐｏＡ−１  １５１−１７３（ＡＰＯ−３８）ムテインが、（常に、特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に従って調製した）イネのミルク中のＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯＡ１−Ｍ）のより低い濃度でＴＨＰ−１活性化の防止に有効であったことを示す図である。ＴＨＰ−１マクロファージの溶解物に対するＭＣＰ−１の代表的な免疫ブロットである。この図は５つの独立した実験の代表である。イネのミルクによって投与したＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏの濃度は、２μｇ／ｍｌに相当したが、イネのミルクによって投与されたＡｐｏＡ−１  １７３−２１５（ＡＰＯ−１７）及びＡｐｏＡ−１１５１−１７３（ＡＰＯ−３８）ムテインの濃度は、それぞれ、１．５μｇ／ｍｌ及び１．６μｇ／ｍｌであった。            図３Ｂは、対応するイネ植物クローン（特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されている）に由来するミルク中に存在するＡｐｏＡ−１  １７３−２１５（ＡＰＯ−１７）及びＡｐｏＡ−１  １５１−１７３（ＡＰＯ−３８）ムテインが、（常に、特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に従って調製した）イネのミルク中のＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯＡ１−Ｍ）のより低い濃度でＴＨＰ−１活性化の防止に有効であったことを示す図である。ＭＣＰ−１の発現はｏｘＬＤＬの投与によって有意に誘導された。ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ１−Ｍ）、ＡｐｏＡ−１  １７３−２１５（配列番号８、ＡＰＯ−１７）及びＡｐｏＡ−１  １５１−１７３（配列番号３４、ＡＰＯ−３８）ムテインを含むイネのミルクと異なり、等濃度のＷＴイネのミルクは、ＭＣＰ−１の生成に影響しなかった。二重変異クローンのＡｐｏＡ−１  １７３−２１５（配列番号８、ＡＰＯ−１７）及びＡｐｏＡ−１  １５１−１７３（配列番号３４、ＡＰＯ−３８）は、イネのミルク中のＡｐｏＡ１−Ｍと比較して、より低い濃度で有効であった。＊ｐ＜０．０５。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図４】図４Ａは、ＡｐｏＡ−１ムテイン含有イネのミルクがＴＨＰ−１マクロファージにおける脂質の蓄積を阻害することを示す図である。３つの独立した実験のＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を代表する図である。イネのミルクによってマクロファージに与えたＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏの濃度は２μｇ／ｍｌであったが、ＡｐｏＡ−１  １７３−２１５（ＡＰＯ−１７）及びＡｐｏＡ−１  １５１−１７３（ＡＰＯ−３８）ムテインの濃度は、それぞれ１．５μｇ／ｍｌ及び１．６μｇ／ｍｌであった。            図４Ｂは、ＡｐｏＡ−１ムテイン含有イネのミルクがＴＨＰ−１マクロファージにおける脂質の蓄積を阻害することを示す図である。Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色は、ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯＡ１−Ｍ）、ＡｐｏＡ−１  １７３−２１５（ＡＰＯ−１７）及びＡｐｏＡ−１  １５１−１７３（ＡＰＯ−３８）ムテインを含むイネのミルクの投与によって、有意に低減した。＊ｐ＜０．０５。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図５】野生型（ＷＴ）又はＡｐｏＡ−１Ｍ（ＡＰＯ）含有イネのミルクはＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウスに十分に忍容されることを示す図である。ＷＴ又はＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏムテイン含有イネのミルクを、５ｇ／週で１５日間、８〜１０週齢の雄のマウスに投与した。血液学的及び生化学的臨床分析は、苦痛の徴候を示さなかった。腎臓及び肝臓の機能は変化が見られなかった。Ｈｔ＝ヘマトクリット、Ｈｂ＝ヘモグロビン、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ。灰色の領域は、マウスフェノームデータベースプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｐｈｅｎｏｍｅ．ｊａｘ．ｏｒｇ／）のデータセットに基づいて、マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの野生型（ＷＴ）動物に関する正常値の範囲を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図６】図６Ａは、ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）含有ミルクが、高脂肪食に付されたＢ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスにおいてプラークの拡大を低減させることができることを示す図である。高脂肪食を与え、５ｇ／週で、１５日間、ＷＴイネのミルク又はＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）ダイマーを含むイネのミルク（それぞれに、左側及び右側パネルに示す）で処理したホモ接合型Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスの大動脈洞の切片のヘマトキシリン／エオシン（上部パネル）及びＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（下部パネル）染色の図の代表である。バーは５００μｍを示す。            図６Ｂは、ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）含有ミルクが、高脂肪食に付されたＢ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスにおいてプラークの拡大を低減させることができることを示す図である。ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）ダイマーを含むイネのミルクは、プラーク領域（上部パネル）及びＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色に対して陽性の領域（中央パネル）を有意に低減させた。ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）ダイマーを含むイネのミルクもＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色の強度を低下させた（下部パネル）。＊＊ｐ＜０．０１。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図７】図７Ａは、ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）含有イネのミルクが、高脂肪食を与えたＢ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスの大動脈弓においてアテローム性動脈硬化性プラーク及びその脂質含量を低減させることを示す図である。「エンフェイス（ｅｎ  ｆａｃｅ）」技法によって処理し、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏとともにインキュベートした、５ｇ／週で、１５日間、ＷＴイネのミルク（対照、ｎ＝６）又はＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏを含むイネのミルク（ＡＰＯ、ｎ＝８）で処理した、高脂肪食を与えたホモ接合型Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスの大動脈の代表的な画像である。Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色は赤色で示される。ＡＡ：大動脈弓、ＴＡ：胸部大動脈、ＡｂＡ：腹部大動脈。            図７Ｂは、ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）含有イネのミルクが、高脂肪食を与えたＢ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスの大動脈弓においてアテローム性動脈硬化性プラーク及びその脂質含量を低減させることを示す図である。ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）含有イネのミルクは、アテローム性動脈硬化性プラークの発生が最もよくある大動脈の部分である大動脈弓において、アテローム性動脈硬化性プラーク領域を有意に低減させた。脂質病変は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、大動脈弓（ＡＡ）のレベルでの大動脈弓領域のパーセントとして表した。            図７Ｃは、ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）含有イネのミルクが、高脂肪食を与えたＢ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスの大動脈弓においてアテローム性動脈硬化性プラーク及びその脂質含量を低減させることを示す図である。ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）含有イネのミルクは、アテローム性動脈硬化性プラークの発生が最もよくある大動脈の部分である大動脈弓において、脂質濃度を有意に低減した。脂質病変は、大動脈弓（ＡＡ）領域の平方ミリメートル当たりの可溶化されたＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏの濃度として表した。エラーバーは平均±平均値の標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１（Ｂ、Ｃ）。
【図８】図８Ａは、ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）含有イネのミルクが、高脂肪食を与えたＢ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスの肝臓においてマクロファージの数を減少させることを示す図である。５ｇ／週で１５日間、ＷＴイネのミルク（対照、ｎ＝５）又はＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ含有イネのミルク（ＡＰＯ、ｎ＝７）で処理した、高脂肪食を与えたホモ接合型Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスの、免疫組織化学実験においてＣＤ６８抗原について標識された肝臓切片の代表的な画像である。            図８Ｂは、ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）含有イネのミルクが、高脂肪食を与えたＢ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスの肝臓においてマクロファージの数を減少させることを示す図である。ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ（ＡＰＯ）含有イネのミルクは、高脂肪食を与えたホモ接合型Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスの肝臓において、ＣＤ６８マーカー陽性マクロファージのパーセントを有意に低減させた。エラーバーは平均±平均値の標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５。
【００１７】
すべての実験において、ＡｐｏＡ−１ダイマーを含むイネのミルクは、ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されているように生成された植物に由来するイネ種子のミルクを含み、ＡｐｏＡ−１ムテインは、（その中に挿入されたｃｙｓ変異の数に応じて）ダイマー及び／又はマルチマー形態で、種子組織中で直接的に発現される。
本文中では、「Ａｐｏ」は、その野生型形態が配列４０に報告されているＡｐｏＡ−１を常に意味する。
【００１８】
発明の詳細な説明
したがって上記のように、本発明の目的とするものはアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ−１）のダイマー及び／又はマルチマー形態の１種又は２種以上のムテインを含む組成物であり、前記ムテインは、植物種子においてダイマー及び／又はマルチマー形態で生成され、前記組成物は、前記植物の種子から抽出されたミルク及び／又はその誘導体を含み、前記ムテインは、アテローム性動脈硬化症の治療で使用するために、体重１ｋｇ当たり０．２〜４ｍｇの１日投薬量で患者に経口投与される。
【００１９】
ダイマー／マルチマー形態のヒトＡｐｏＡ−１ムテインの種子内生成方法は、特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に詳細に記載されている。
【００２０】
本出願で使用されるムテイン及び種子は、特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されている方法そのものにより生成される。
【００２１】
要するところ、本発明によればまた、植物種子中で異種アポリポタンパク質の合成を指示することができる発現カセットを使用し、前記アポリポタンパク質は、制御された方法で目的のために変異誘発された配列に基づいて、ダイマー及び／又はオリゴマーとして大部分は蓄積される。
【００２２】
前述の種子ミルクを生成することができる改変植物を実行するのに有用な発現カセットは、種子の貯蔵器官における発現に対して特異的な、植物遺伝子のプロモーターを含む。そのようなプロモーターの非限定例は、穀物における発現のための、ＰＣＴ／ＩＴＢ２００３／０５０９２に記載されている、イネのプロラミンプロモーター、ｐＰＲＯＬ（受託番号ＡＦ１５６７１４）、又はＱｕｉｎｇ及びＴａｋａｗａ  ２００４，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．２：１１３〜１１５に記載されているイネのグルテリンプロモーター、ｐＧｌｕＢ−１（受託番号ＡＹ４２７５６９）若しくはｐＧｌｕＢ−４（受託番号ＡＹ４２７５７１）、或いはマメ科及びナス科植物に属する植物における発現のための、ダイズ７Ｓ塩基性グロブリン、又はＷＯ００／０４１４６に記載されているダイズのベータ−コングリシニンプロモーターによって代表される。上述のグルテリンのプロモーターは、イネ、オオムギ、スペルトコムギなどの産業的脱穀を受けるすべての種子における発現で特に有利である。これは、これらが、種子の胚乳のすべてにわたって拡散した様式で発現を指示するからである。発現カセットは、考慮されたムテイン中に存在するシステインの数に応じて、ダイマー又はマルチマー形態のＡｐｏムテインタンパク質を蓄積させるためにＡｐｏムテインを種子の貯蔵器官に導くことができる、植物タンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列をさらに含むであろう。適切なシグナル配列の非限定例は、イネのプロラミン遺伝子（受託番号ＡＦ１５６７１４）若しくはイネのグルテリン遺伝子（受託番号Ｙ４２７５６９及びＡＹ４２７５７１）又はダイズのグロブリン及びベータ−コングリシニン遺伝子（特許ＷＯ００／０４１４６）のシグナル配列によって代表される。カセットは、ダイマー及び／又は３つ以上のモノマーを含むオリゴマーを形成することができる、ヒトアポリポタンパク質のムテインをコードするＤＮＡ配列も含むであろう。
【００２３】
ヒトＡｐｏＡ−１をコードする配列（以下に記載する配列番号４０）から始めて、本発明のムテインに適する変異の非限定例は以下のとおりである：配列番号２変異Ｒ１７３Ｃ、配列番号４変異Ｒ１２３Ｃ、配列番号６変異Ｒ２１５Ｃ、配列番号８変異Ｒ１７３Ｃ−Ｒ２１５Ｃ、配列番号１０変異Ｒ１２３Ｃ−Ｒ２１５Ｃ、配列番号１２変異Ｒ１０Ｃ、配列番号１４変異Ｒ６１Ｃ、配列番号１６変異Ｒ８３Ｃ、配列番号１８変異Ｒ１５１Ｃ、配列番号２０変異Ｒ１０Ｃ−Ｒ２１５Ｃ、配列番号２２変異Ｒ６１Ｃ−Ｒ１７３Ｃ、配列番号２４変異Ｒ６１Ｃ−Ｒ２１５Ｃ、配列番号２６変異Ｒ６１Ｃ−Ｒ１５１Ｃ、配列番号２８変異Ｒ８３Ｃ−Ｒ１７３Ｃ、配列番号３０変異Ｒ８３Ｃ−Ｒ１５１Ｃ、配列番号３２変異Ｒ８３Ｃ−Ｒ２１５Ｃ、配列番号３４変異Ｒ１５１Ｃ−Ｒ１７３Ｃ、配列番号３６変異Ｒ１５１Ｃ−Ｒ２１５Ｃ、配列番号３８変異Ｒ１０Ｃ−Ｒ１７３Ｃ。上記のムテインをコードするヌクレオチド配列は、前記アミノ酸配列から直接推定できる。特定のアミノ酸との各コドンの対応を考えれば、それをコードするあらゆるヌクレオチド配列に戻るためのアミノ酸配列を有することは十分である。したがって、上記のムテインをコードするヌクレオチド配列は、それがコードするアミノ酸配列の説明によって記載されると考えられる。アミノ酸配列それ自体が、それをコードするあらゆるヌクレオチド配列の知識に必要な情報を与えることはもちろんである。
【００２４】
前記ムテインは、当業者に既知のすべての標準的な技法によって得ることができる；例えば、部位特異的変異誘発によって、定められた位置におけるアミノ酸の置換を行うことが可能である。本発明の実施に適するムテインの例は上記のものであるが、本発明はそれらに限定されず、例示されていないが、文献で既知のＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏムテインの薬理学的活性を保持する又は向上させるダイマー及び／又はマルチマーを形成することができる、ヒトアポリポタンパク質Ａ−１の他のムテインも含む。
【００２５】
本明細書では、「マルチマー」は、３つ以上のモノマーを含む構造体、したがって、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、最大でオリゴマー又はポリマーの複合体までを意味する。ダイマーを形成する可能性は、アポリポタンパク質ＡｐｏＡ−１ムテイン鎖に少なくとも１つのシステイン（１Ｃ）を存在させる変異に起因する。１つのシステインの存在によって、ジスルフィド架橋の形成が可能になり、その結果、ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏに特有なものと異なる箇所においてでさえ分子のダイマー化を可能にする。トリマーを形成する可能性は、アポリポタンパク質ＡｐｏＡ−１ムテイン鎖に少なくとも２つのシステイン（２Ｃ）を存在させる変異に起因する。トリマーの形成のために、適切な化学量論比で１Ｃ分子と２Ｃ分子を組み合わせることが必要になるであろう。モノマー当たり少なくとも２つのシステインが存在する場合、テトラマーから始まって、ポリマーの形成に達するまで、マルチマーの形成を可能にする異なる組み合わせを有することが可能であろう。
【００２６】
最後に、発現カセットは、例えば、上述のプロラミン、グルテリン若しくはグロブリンの遺伝子由来、又はアグロバクテリウムのＮＯＳ遺伝子のターミネーター由来でもよい、ポリアデニル化シグナルを含むであろう。
上記の発現カセットを構成する要素は、５’→３’の方向で、上に列挙した順序で機能的に結合される必要がある。
【００２７】
プロモーター、シグナル配列及びポリアデニル化配列をコードするヌクレオチド配列は、「混合」方法、すなわち、異なる遺伝子に属するプロモーター、シグナル配列及びポリアデニル化配列（例えば、プロラミンプロモーター、グルテリンリーダー及びグロブリンポリアデニル化配列など）で発現カセットに配置することができ、又は同じ遺伝子に属する上記の調節エレメント（例えば、すべてプロラミン遺伝子由来、すべてグルテリン遺伝子由来、すべてグロブリン遺伝子由来など）をカセットに挿入することができる。
【００２８】
発現カセットは、植物の形質転換用の適切なベクターに挿入され、これは、アグロバクテリウム方法を用いる又は物理的方法を用いる、及び植物細胞におけるタンパク質生成物の発現のための、植物細胞の形質転換に適したいかなる既知のベクターでもよい。前記ベクターをより適切な制限部位で切断することができ、上記のように、発現カセットをその中に挿入することができる。適切なベクターの例示的リストは、ＷＯ２００８／０１７９０６の説明において、ベクター関連セクションに公開されている。
【００２９】
したがって、本発明による組成物のための植物ミルクを抽出する種子をつけることができる植物は、記載される発現カセットを含む組換えベクターで植物細胞を形質転換する又は該ベクターを植物細胞にトランスフェクトすることによって、及びタンパク質を発現する形質転換細胞又はトランスフェクト細胞を選択することによって得ることができる。形質転換細胞は、近時の技術において一般に知られている選択マーカーによって選択することができる。選択された形質転換植物細胞は、したがって、特定の部門で既知の農業技術方法に従って、本質的にダイマー又はマルチマーの活性型で目的のアポリポタンパク質を発現する種子をつけることができる完全な繁殖性植物を再生するように誘導することができる。非限定例として、植物が再生される植物細胞の形質転換は、エレクトロポレーションによってコンピテントな状態にした後に導入された発現ベクターを含むアグロバクテリウムの細胞を用いて行うことができる。次いで、ベクターを含む系統を使用して、成熟胚又は子葉によって生成されたカルスを形質転換する。選択に使用される抗生物質の存在下で形成されたカルスから、最初の芽、次いで根の形成が誘導される。次いで、遺伝的に形質転換された安定な植物を選択することができ、形質転換後に導入されたその遺伝情報は、単一コピーでおそらく存在し、後に続く世代で、遺伝子サイレンシング現象を示すことなく発現する。
【００３０】
ＷＯ２００８／０１７９０６における記載事項によれば、同公報に記載されており上記のように生成されたアポリポタンパク質のムテインは、種子中に存在するアポリポタンパク質の少なくとも８５％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上において、ダイマー及び／又はマルチマー形態である。
【００３１】
本発明の一態様によれば、上記の組成物中のムテインは、体重１ｋｇ当たり０．２〜３ｍｇの１日投薬量で患者に経口投与され、特に、ムテインは体重１ｋｇ当たり０．４〜２ｍｇの１日投薬量で患者に経口投与することができ、好ましくは、これは体重１ｋｇ当たり０．５〜１．８ｍｇの１日投薬量で患者に経口投与され、さらにより好ましくは、これは、体重１ｋｇ当たり０．５〜１．５ｍｇの１日投薬量で患者に経口投与される。
【００３２】
下記及び図６及び図７に示される実験データから明らかなように、体重１ｋｇ当たり約０．６ｍｇのＡｐｏＡ−１ムテインの１日投薬量のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は、全く予想外の結果をもたらした。計算された最大１日投薬量は体重１ｋｇ当たり１．５ｍｇであった。投与された投薬量が少なくとも１０分の１にもかかわらず、ＷＯ２００８／０１７９０６で示唆されたものの５０分の１でない場合、本発明の発明者らは、示される低減されたレジメンで投与された組成物の治療効果を見出し、高脂肪食を自由に与え続けた動物で前記効果が検出可能であったことを驚くべきことに観察し、これは、心血管疾患の場合に対して強く勧められ、この場合、疾患の進行の低下又は停止を示す本当の治療効果が得られるはずである。
【００３３】
図７から特に明らかなように、本明細書に記載のイネのミルクによるＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏムテインの投与は、アテローム性動脈硬化性病変の発生が、高脂肪食を与えたホモ接合型Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスにおける疾患のこの段階で大抵観察される大動脈の領域である大動脈弓全体においてでさえ、アテローム性動脈硬化性プラーク及び脂質含量の領域を有意に低減させた（それぞれ４０％及び２８％）。
さらに、予想外に、ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏムテインを含むイネのミルクの投与は、高脂肪食を与えたホモ接合型Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスの肝臓において、ＣＤ６８マーカー陽性マクロファージ細胞の数も有意に減少させた（図８）。
【００３４】
本発明を実施するためには、タンパク質含量が高い種子を有する植物が適切である。中でも、マメ科植物、例えばダイズ及びすべての植物専門家に既知の、前記特徴を有する他のマメ科植物、穀物、例えば、イネ、オートムギ、オオムギ、スペルトコムギ、軟質コムギ、デュラムコムギ、トウモロコシ及び高タンパク質含量の種子を有する他の穀物、さらにタバコが特に適している。これらの植物では、実際に、種子のタンパク質含量は、マメ科植物の種子で約２５〜３５％、穀物で約１０〜１５％、タバコで約２０％である。アポリポタンパク質の精製が所望される場合に前記精製を複雑にしないために、好ましくは最小限であるべきである脂質含量も特に重要である。
【００３５】
したがって、一態様によれば、上記の組成物のための種子ミルクが得られる植物はマメ科植物、穀物又はタバコである。特に、前記植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、硬質（デュラム）又は軟質コムギ、オートムギ、スペルトコムギ、オオムギ、ダイズ、エンドウ、マメ、タバコを含む群から選択することができる。
【００３６】
例のセクションに記載されている実験データによって、及び図によって強調されるように、本明細書に記載の組成物及び治療方法に使用される種子ミルクは、新鮮なものでも、凍結乾燥されていても、再懸濁されていてもよい。実際に、凍結乾燥及び適切な緩衝液又は水への再懸濁のステップは、ミルクそれ自体の中に存在するムテインＡｐｏの有効性を変えなかった。したがって、上記植物の種子から抽出されたミルクを新鮮な形態、凍結乾燥形態、再懸濁形態で使用することができ、したがって、本明細書による組成物は、粉末、錠剤、カプセル、硬質又は軟質ゼラチン、シロップ、スプレー、懸濁液、ミルク剤（milk）、溶液の形態で製造することができる。
【００３７】
組成物は、治療される患者の体重に基づいて計算されるであろう既知の１日投薬量で投与されなければならないので、これは、使用される適切な量の計算を容易にする形態で実施することができる。組成物は、単回投与又は複数回の１日の投与で必要とされる１日の総量の投与を可能にするために、例えば、１日の投薬量の約量（submultiple）で実施することができる。
組成物とともに、患者の体重１ｋｇ当たりの活性成分の量の形態で投与される製剤で一般に使用される、適切な１日用量の計算を容易にするデバイスを提供することができる。
本明細書によれば、本発明の組成物は、適切な賦形剤を用いて、医薬組成物、栄養補助食品、医療デバイスに関する指令９３／４２／ＥＥＣに記載されているクラスのうちのいずれか１つによる医療デバイス（この用語の機械的な意味の「デバイス」だけでなく、物質も含む）又は医療食品の形態で製造することができる。
【００３８】
一態様によれば、上記の投薬レジメンを用いる上記の組成物は、アテローム性動脈硬化症の治療に使用することができる。上記のように、及び得られた実験データによって示されるように、組成物は、有利なことに、なんらかの理由（精神的、経済的、社会的、仕事若しくは家族関連、又はこれらの混合）で、食習慣を修正することができない患者のそのクラスについて使用することもできる。特に、組成物は、アテローム性動脈硬化症の治療に使用することができる。
【００３９】
上記のように、本発明は、アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ−１）のダイマー及び／又はマルチマー形態の１種又は２種以上のムテインを含む組成物のそれを必要とする患者への経口投与による、アテローム性動脈硬化症の治療のための方法にも関し、前記ムテインは、植物種子においてダイマー及び／又はマルチマー形態で生成され、前記組成物は、前記植物の種子から抽出されたミルク及び／又はその誘導体を含み、及び前記ムテインは、体重１ｋｇ当たり０．２〜４ｍｇの１日投薬量で投与される。
本明細書に記載されたことは、必要な変更を加えて、治療方法に援用される。
以下の例は、発明のより詳細な説明を提供することを意図するものであって、特許が希求される対象を限定するものではない。
【００４０】
例
（例１）
種子ミルクの生成及び植物内で生成したＡｐｏ  Ａ−１  Ｍｉｌａｎｏタンパク質の安定性評価
ａ．イネ
イネのミルクを、上に及びＷＯ２００８／０１７９０６に記載されているように生成したイネのトランスジェニック系の種子から得た。成熟時に種子を採取し、イネの研究室用サンプルコーン（Ｇ１５０／Ｒ、Ｃｏｌｏｍｂｉｎｉ）で脱穀した。水中で懸濁液を形成することができる粒子を有する細粉を得るまで、精米した種子を石の粉砕機で製粉した。細粉を１０％の量で水に再懸濁し、この懸濁液をアミラーゼの存在下で３０分間９０℃に加熱して、糖化を促した。糖化プロセスが終了すると、イネのミルクを４℃に保存し、存在するＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏタンパク質の安定性を、時間０（調製の終了）から時間６（＋１５日）まで２日間隔で評価した。このタンパク質は、ミルクから抽出した総タンパク質の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に行ったウエスタンの５６．０００Ｄａにある主要バンドの存在によって示されるように、試験期間の全体を通して安定であることが判明した。イネのミルク中の推定されるＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ濃度は、導入遺伝子の発現レベルに応じて、平均して、上記のように調製したミルク１リットル当たり３．５〜７ｍｇの範囲にわたり得る。アポリポタンパク質の濃度は、イネの細粉の代わりに抽出したイネ総タンパク質抽出物を使用することによって著しく増大され得、例えば、タンパク質の４０、５０、６０又は７０％である。
【００４１】
ｂ．ダイズ
ダイズのミルクは、１．２Ｌの水を使用して、１００ｇのダイズ種子から得る。種子を製粉し、同時に、水を１０分間８０℃にし、次いで、５分間１００℃に上げる。そのようにして得られたミルクを濾過して、おから（種子の固形残渣）を除去する。８．３％に相当するタンパク質含量を有するミルクが得られ、これは、市販のものに匹敵する。特に、本発明者らは自動豆乳製造機（より正確には、ＳｏｙＱｕｉｃｋ）を使用した。
【００４２】
２．特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されているように生成したイネ種子ミルクを用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの実験
特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６で教示されるように、（鎖中に導入されたＣｙｓの数に応じて）種子でＡｐｏＡ−１ムテインのダイマー及び／又はマルチマーを発現する遺伝子改変イネ植物に由来するミルクを使用することによって、細胞及び動物への抗アテローム形成性ＡｐｏＡ−１ムテインのダイマーの投与を行った。種子で生成され、細胞及び動物に投与されたＡｐｏＡ−１タンパク質は、したがって、ダイマー又はマルチマーを形成するその能力を増大させるために（Ａｌａ−Ｃｙｓ変異によって）変異誘発された全長タンパク質からなる。
【００４３】
投与方法の有効性を酸化ＬＤＬに曝露された培養マクロファージのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでアッセイし（ｏｘＬＤＬ、フェーズ１）、次いで、投与方法のあり得る毒性及び忍容性を健康なマウスでアッセイした（フェーズ２）。最後に、特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６で教示されるように生成した植物の種子から得られたイネのミルク中で直接投与したＡｐｏＡ−１ムテインのダイマー／マルチマーの有効性（ＡＰＯミルク）を早期アテローム性動脈硬化性疾患のマウスモデルでアッセイした（フェーズ３）。
【００４４】
（ＷＴのＡｐｏＡ−１タンパク質に導入された変異の数に応じてダイマー及び／又はマルチマー形態の）機能的ＡｐｏＡ−１ムテインの提供における、特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６で教示されるように改変された植物の種子から得られたイネのミルクの、細胞に対する有効性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマクロファージへの分化が誘導され得る培養単球系であるＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−２０２（商標））細胞系を使用して、評価した。生物の血管系では、血管中の単球／マクロファージは早期アテロームの病因に関与する主な細胞である。これらは、実際に、活性化されてＬＤＬ粒子を貪食し、次いで、ＬＤＬ粒子がこれらの細胞内部に蓄積され、これが、アテローム形成に特有である変性プロセスにつながる。ＴＨＰ−１細胞は、ｏｘＬＤＬへの暴露などの有毒な刺激によるこれらの細胞の分子的活性化を検証するための信頼できる実験モデルに相当する。
【００４５】
マクロファージに分化したＴＨＰ−１を、ｏｘＬＤＬ単独で、又は対照として組換えＡｐｏＡ−１で、又は特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されているように改変した、したがって、ＡｐｏＡ−１ムテインのダイマー／マルチマーを含む、イネのミルク（手短に説明すると、本文中でＡｐｏ−ミルクとも称される）で処理した。ｏｘＬＤＬで２時間インキュベーションした後、Ａｐｏ及びミルクを加えた。等量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又は等量のＷＴミルクとともに対照を加え、次いで、ＭＣＰ−１発現を評価した。ＭＣＰ−１は、病変部位の単球動員に関与する走化性活性を有するサイトカイン（ケモカイン）であり、マクロファージ活性化マーカーである。ｏｘＬＤＬ処理したマクロファージへのＡｐｏ−ミルクの投与は、ＭＣＰ−１発現の誘導を完全に無効にし、それによって、イネのミルク中に保持されたＡｐｏＡ−１のダイマー／マルチマーのムテインが効果的にマクロファージに達し、これらの細胞において効果的にｏｘＬＤＬ誘導性活性化を低減したことが示される（図１）。Ａｐｏ−ミルクの投与は、同じ細胞への組換えＡｐｏＡ−１分子の投与よりもさらにいっそう有効であることが判明した。
【００４６】
ＭＣＰ−１阻害の点からのＡｐｏ−ミルクの保護効果は、用量依存的であることが判明し（図２）、単独のＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏムテイン（ダイマー）に対して特異的でなかった。実際に、投与方法は、特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されているように改変されたイネのミルクにおいて、ダイマー／マルチマー形態のＡｐｏＡ−１の他のムテインを投与した場合でさえ、ｏｘＬＤＬ処理したマクロファージにおけるＭＣＰ−１発現の阻害において有効であることが判明した（図３）。方法が、それ自体で、保持された分子の機能性を妨げないという証拠として、ＡｐｏＡ−１分子を含まない、同じＷＴイネ品種に由来するミルクは、ｏｘＬＤＬ誘導性のＭＣＰ−１発現に対して顕著な効果がなかった（図３）。
【００４７】
投与方法が、アテローム性動脈硬化性の病因及び進行の典型的な特徴である、マクロファージによる脂質の異常な蓄積を低減させることもできるかどうかを検証するために、分化したマクロファージをｏｘＬＤＬに曝露し、次いで、組換えＡｐｏＡ−１、ＷＴイネのミルク、又は特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されているように生成した種子から抽出されたＡｐｏＡ−１ムテインのダイマー／マルチマーを含む様々なイネのミルクで処理し、次いで、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色アッセイによって脂質の蓄積を測定した。イネのミルク中で投与されたＡｐｏＡ−１ムテインのみが脂質の蓄積を完全に無効にすることができ（図４）、これは、この投与方法が、ｏｘＬＤＬへの暴露によって誘導される毒性からマクロファージを保護することができることを示すものである。
【００４８】
Ａｐｏ−ミルクの毒性を健康なマウスにおけるアッセイによっても評価した。あるマウス群には野生型イネに由来するミルクを与えたが、第２のマウス群にはＡｐｏ−ミルクを与えた。すべての場合において、体重１Ｋｇ当たり０．６ｍｇのＷＯ２００８／０１７９０６で教示されるように改変された植物の種子から生成したＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏムテインを含むＡｐｏ−ミルクで、３週にわたって、１週間につき５日、１日１回マウスを処理した。処理の終わりに、マウスを屠殺し、分析用に採血した。同じ遺伝的背景を有する未処理のマウスにおける参照値と比較して、腎臓又は肝臓の毒性は処理と関係がなく、イネのミルクで処理したマウスにおいて炎症の徴候は見られなかった（Ｓ．Ｃ．Ｇｒｕｂｂ，Ｃ．Ｊ．Ｂｕｌｔ，Ｍ．Ａ．Ｂｏｇｕｅ、マウスフェノームデータベース（Ｍｏｕｓｅ  ｐｈｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４２（２０１４）Ｄ８２５〜３４及び図５）。
【００４９】
ＷＯ２００８／０１７９０６で教示されるように改変された植物の種子から生成したＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏのムテインの体重１Ｋｇ当たり約０．６ｍｇの１日投薬量を用いる、イネのミルクによるＡｐｏＡ−１ムテインの投与方法も、アテローム性動脈硬化性疾患の進行の有意な遅れ、及びアテローム性動脈硬化性マウスの動脈壁における脂質の異常な蓄積の有意な低減を引き起こした。ホモ接合型Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウス（これはＡｐｏＥ遺伝子ノックアウトマウスモデルであり、アテローム性動脈硬化性疾患を発生する傾向がある）に、早期アテローム性動脈硬化症を発生させるために、高脂肪食（ウェスタンダイエット、Ｍｕｃｅｄｏｌａ  ｓｒｌ、Ｓｅｔｔｉｍｏ  Ｍｉｌａｎｅｓｅ、ＭＩ、Ｉｔａｌｙ）を５６日間与えた（Ｊｅｏｎ  ＵＳ、Ｃｈｏｉ  Ｊ−Ｐ、Ｋｉｍ  Ｙ−Ｓ、ｅｔ  ａｌ（２０１５）ウェスタンタイプダイエットが与えられたＡｐｏＥ欠損マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の早期進行中のＩＬ−１７分泌Ｔ細胞の発現増大（Ｔｈｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１７−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ＡｐｏＥ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｆｅｄ  ｏｎ  ａ  ｗｅｓｔｅｒｎ−ｔｙｐｅ  ｄｉｅｔ．）Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｅｍｍ．２０１５．１９、Ｇａｎｄｈｉ  Ｃ、Ｋｈａｎ  ＭＭ、Ｌｅｎｔｚ  ＳＲ、Ｃｈａｕｈａｎ  ＡＫ（２０１２）マウスにおいて、ＡＤＡＭＴＳ１３は血管炎症及び早期アテローム性動脈硬化症の発生を低減する（ＡＤＡＭＴＳ１３  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．）Ｂｌｏｏｄ  １１９：２３８５〜２３９１．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１１−０９−３７６２０２、Ｗａｔｔ  Ｖ、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  Ｊ、Ｓｔｅｉｎｅｒ  Ｔ、ｅｔ  ａｌ（２０１１）アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスにおいて、ＴＲＡＩＬはアテローム性動脈硬化症の発生を軽減する（ＴＲＡＩＬ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ２１５：３４８〜３５４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．２０１１．０１．０１０）。５６日後に、マウスを２つの群（それぞれｎは８）にランダム化し、特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に記載されているように変異誘発した植物の種子（これは、種子中でダイマー／マルチマー形態でＡｐｏＡ−１ムテインを直接生成する）から生成したイネのミルクの経口強制栄養による１日１回の投与で、又はＷＴイネのミルクで、３週にわたって、１週間につき５日処理した。１日投薬量は体重１ｋｇ当たり約０．６ｍｇのＡｐｏ  Ａ−１Ｍｉｌａｎｏムテインであった。高脂肪ウェスタンダイエットは、実験全体を通して自由に時間を延ばした。処理の終わりに、動物を屠殺し、組織学的分析及び脂質蓄積の分析のために臓器を収集した。イネのミルクによるＡｐｏＡ−１ムテインの投与は、たとえマウスが高脂肪食を与えられ続けたとしても、ＷＴ−ミルクで処理したマウスと比較して、Ａｐｏ−ミルクの上記の投薬レジメンで処理したマウスの大動脈洞で検出されるアテローム性動脈硬化性プラークの領域を有意に低減した（図６）。さらに、すなわち、細胞及び組織の内部の脂質の蓄積の測定の評価を可能にするアッセイである、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏとともにインキュベートした切片のデジタル定量化は、Ａｐｏ−ミルクの投与が、野生型イネのミルクが与えられた対照のものと比較して、処理したマウスの動脈壁において脂質の量を低減することを示した（図６）。
【００５０】
さらに、図７に示すように、イネのミルクによるＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏムテインの投与は、アテローム性動脈硬化性プラークの発生が、高脂肪食を与えたホモ接合型Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスにおける疾患のこの段階で最も頻繁に観察される大動脈の領域である大動脈弓全体においても、アテローム性動脈硬化性プラーク及び脂質含量の領域を有意に低減させた（それぞれ４０％及び２８％）。
予想外に、最後に、ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏムテインを含むイネのミルクの投与は、高脂肪食を与えたホモ接合型Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスの肝臓において、ＣＤ６８マーカー陽性マクロファージ細胞の数も有意に減少させた（図８）。
【００５１】
３．材料と方法
３．１  イネのミルク．
使用したイネのミルクは、Ｐｌａｎｔｅｃｈｎｏ  Ｓｒｌ（Ｖｉｃｏｍｏｓｃａｎｏ、（ＣＲ）、Ｉｔａｌｙ）から凍結乾燥粉末として提供された。遺伝子改変イネのミルク（ＡＰＯ）は、特許出願ＷＯ２００８／０１７９０６に示されるように、及び例１で上に示したように生成した。同じ品種（Ｒｏｓａ−Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ）のＷＴイネのミルクを対照として使用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験については、イネのミルクを無菌条件下で取り扱い、凍結乾燥し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に２．５ｇ／ｍｌの濃度で再懸濁し、Ｚｅｌｌ−Ｓｈｉｅｌｄ（Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えた。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験については、イネのミルクを滅菌水中に２．５ｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。
【００５２】
３．２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージ／単球モデル．
１０％ウシ胎仔血清（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、熱失活化）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地の懸濁液中で、ＴＨＰ−１単球を培養した。すべての細胞は、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーター中で維持した。ＴＨＰ−１単球は、１＊１０６細胞／ｍｌの濃度を超えることは決してなかった。
マクロファージへのＴＨＰ−１の分化は、ホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート（ＰＭＡ）５０ｎｇ／ｍｌ及び５０ｍＭβ−メルカプトエタノールを４８時間にわたって加えることによって行った。
【００５３】
特定の示されている場合には、処理の全体を通して（６時間）細胞にｏｘＬＤＬ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ、１００ｕｇ／ｍｌ）を与えた。ｏｘＬＤＬで２時間インキュベーションした後に、イネのミルク（ＷＴ若しくはＡｐｏ）又は組換えＡｐｏＡ−１タンパク質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。対照は、等量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）とともに加えた。
【００５４】
３．３細胞溶解、タンパク質抽出及び免疫ブロット．
処理の終わりに、スクレーパーを用いて、ＴＨＰ−１マクロファージをプレート表面から機械的に取り出した。改変ＲＩＰＡ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５００ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ＥＧＴＡ  １ｍＭ、ＤＴＴ  １ｍＭ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ホスファターゼ阻害剤（カクテル＃２及び＃３、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））を用いて、収集した細胞を溶解した。総タンパク質抽出物を、製造者の指示に従ってブラッドフォード試験（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）によって定量化した。製造者の指示に従って、タンパク質抽出物を処理して、ＮｕＰＡＧＥビス−トリスミニゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードした。ｉＢｌｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ニトロセルロース膜ブロッティング（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を行った。
【００５５】
ブロッキングした後、選択した一次抗体とともに膜をインキュベートし、次いで、適切な二次抗体とともにインキュベートした。Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を膜に加え、ＧＢｏｘ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）によって、化学発光シグナルをデジタル的に得た。使用した一次抗体は、抗ＭＣＰ−１（マウスモノクローナル、［１Ｆ１０］、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗ＧＡＰＤＨ（マウスモノクローナル、［ＧＡＰＤＨ−７１．１］、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。使用した二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化ヒツジ抗マウスＩｇＧ  ＥＣＬ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。
【００５６】
３．４  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色．
処理の終わりに、１０％ホルマリン中で細胞を固定した。洗浄した後、細胞を６０％イソプロパノールとともにインキュベートし、次いで、乾燥させた。Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（イソプロパノール中に０．３５％ｗ／ｖ、濾過した）を固定した細胞に加えた。インキュベーションの終わりに、ｄｄＨ２０で細胞を洗浄した。次いで、光学カメラ（Ｍｏｔｉｃ）を使用して、倒立光学顕微鏡（Ｍｏｔｉｃ）で画像を得た。５つの独立した実験を行い、ウェル当たり少なくとも５つの視野を得た。次いで、ＩｍａｇｅＪプログラム（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＣＡ、Ｒａｓｂａｎｄ  ＷＳ、Ｅｌｉｃｅｉｒｉ  ＫＷ．ＮＩＨ  ＩｍａｇｅからＩｍａｇｅＪ：２５年間の画像解析（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｔｏ  ＩｍａｇｅＪ：２５  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２；９：６７１〜５．）を使用して、画像を定量化した。赤色の閾値を設定し、すべての画像に適用した。
【００５７】
３．５  Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究．
動物でのすべての実験は、実験における動物の使用に関するイタリアの法律（法令２６／２０１４）及び欧州連合指令（２０１０／６３／ＥＵ）に、さらに、イタリア保健省によって許可されたプロトコール（プロジェクト０８／２０１４、承認番号２０２／２０１５−ＰＲ）に従って行った。忍容性研究については、８〜１０週齢の雄のＢ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｃａｌｃｏ、ＬＣ、Ｉｔａｌｙ）を使用した。０日目に、マウスをランダム化し、１５日間にわたって、ＷＴ又はＡｐｏイネのミルク（１０ｍｌ／ｋｇ、１週間につき５日）による経口投与に付した。処理の終わりに、各動物について血液試料を収集し、灌流後に、肝臓及び腎臓を収集した。
血液学的分析は、Ｍｉｌａｎ−Ｂｉｃｏｃｃａ大学の動物育種学部を支援する研究室で行った。
【００５８】
有効性研究については、８〜１０週齢の雄のＢ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊマウスに、ウェスタンダイエット（Ｍｕｃｅｄｏｌａ  Ｓｒｌ、Ｓｅｔｔｉｍｏ  Ｍｉｌａｎｅｓｅ（ＭＩ）、Ｉｔａｌｙ）を５６日間自由に与えた。５６日の間、マウスを２つの群（ｎ＝８）にランダム化し、イネのミルク（それぞれ、Ａｐｏ又はＷＴ）を胃の強制栄養によってマウスに１５日間投与した。ウェスタンダイエットは、実験全体を通して自由に継続した。処理の終わりに、動物を屠殺し、灌流し、様々な臓器を収集した。
【００５９】
３．６組織学的実験．
心臓を固定し、凍結保存した（３０％ショ糖）。心尖を除去し、試料をＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＯＣＴ）に浸漬し、直ちに凍結した。クリオスタットを使用して切断するまで、組織を−８０℃で保存した。続いて、スライドをヘマトキシリン／エオシンとともにインキュベートした。Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ分析については、大動脈洞の凍結切片化切片を１，２−プロパンジオールに浸漬し、次いで、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（１，２−プロパンジオール中に０．５％ｗ／ｖ、濾過した）とともにインキュベートした。次いで、スライドを洗浄し、水性マウント剤でマウントした。
【００６０】
次いで、すべてのスライドをスライドスキャナーＳｃａｎＳｃｏｐｅ（Ａｐｅｒｉｏ）によってデジタル化した。定量化領域及びシグナルはＩｍａｇｅｓｃｏｐｅ（Ａｐｅｒｉｏ）を使用して行った。
【００６１】
６．７免疫組織化学実験．
肝臓を収集し、４％パラホルムアルデヒド溶液中で固定した。次いで、組織をパラフィン中に包埋し、標準的手順に従ってミクロトーム切断について処理した。続いて、肝臓切片を脱パラフィンし、アルコール濃度スケールでの後続ステップで再水和した。次いで、ｐＨ６のクエン酸ナトリウム溶液（Ｈ−３３００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）における９５℃でのインキュベーションによって、切片を抗原アンマスキングに付した。次いで、切片を３％Ｈ２Ｏ２溶液とともにインキュベートし、市販のキットのＩｍｍＰＲＥＳＳ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＩｍｍＰＡＣＴ  ＤＡＢ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、免疫組織化学について処理した。次いで、Ｇｉｌｌヘマトキシリンを用いて切片を対比染色し、ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ  Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって、カバーガラスをマウントした。１：３００の濃度で使用する抗ＣＤ６８一次抗体は、Ａｂｃａｍ（ａｂ１２５２１２）から購入した。
【００６２】
スライドをＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｎｉ−Ｕ顕微鏡で観察し、顕微鏡に装着したＮｉｋｏｎ  ＤＳ−Ｆｉ１ｃカメラ（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）によってデジタル画像を得た。その結果、各切片について、少なくとも８つの異なる視野を分析し、各視野について、ＣＤ６８シグナルに対して陽性及び陰性の細胞を計数した。
【００６３】
６．８大動脈弓の分析
大動脈全体を収集し、４％パラホルムアルデヒド溶液中で保存した。大動脈の分析手順は、以前に記載されたプロトコール［Ｂｅａｔｔｉｅ  ＪＨ、Ｄｕｔｈｉｅ  ＳＪ、Ｋｗｕｎ  ＩＳ、Ｈａ  ＴＹ、Ｇｏｒｄｏｎ  ＭＪ．ａｐｏＥ（−／−）マウスにおける大動脈病変の迅速な定量化（Ｒａｐｉｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｏｒｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｐｏＥ（−／−）ｍｉｃｅ．）Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２００９；４６：３４７〜３５２］に従って行った。大動脈は、血管周囲の外膜を除去すると、切開によって長軸方向に開き、蒸留水及び７０％２−プロパノール中で洗浄した。次いで、大動脈をＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏとともにインキュベートし、黒色面上に置き、Ｓｏｎｙ  Ａ３０００デジタルフォトカメラで撮影した。次いで、ＩｍａｇｅＪソフトウェア［Ｃ．Ａ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｗ．Ｓ．Ｒａｓｂａｎｄ、Ｋ．Ｗ．Ｅｌｉｃｅｉｒｉ、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅからＩｍａｇｅＪ：２５年間の画像解析（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｔｏ  ＩｍａｇｅＪ：２５  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９（２０１２）６７１〜６７５］によって画像を処理し、プラークを大動脈弓の全領域のパーセントとして表した。次いで、大動脈弓を大動脈の残りの部分からさらに細分し、連続的に撹拌しながら、吸収された色素をクロロホルム／メタノール（２：１ｖ／ｖ）中に溶解した。次いで、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏの濃度を５２０ｎｍのマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）で測定し、標準濃度曲線と比較した。
【００６４】
配列についての記載
偶数番号の配列２〜３８は、それぞれヒトタンパク質ＡｐｏＡ１のムテインを表す。これは下記配列４０において報告され、すでにＷＯ２００８／０１７９０６において配列番号４０として記載されている：
配列番号４０
【化１】
2019526536.tif 000003
【００６５】
偶数番号の配列２〜３８は配列番号４０に対応するが以下に示す変異を有する。
配列番号２変異Ｒ１７３Ｃ、配列番号４変異Ｒ１２３Ｃ、配列番号６変異Ｒ２１５Ｃ、配列番号８変異Ｒ１７３Ｃ−Ｒ２１５Ｃ、配列番号１０変異Ｒ１２３Ｃ−Ｒ２１５Ｃ、配列番号１２変異Ｒ１０Ｃ、配列番号１４変異Ｒ６１Ｃ、配列番号１６変異Ｒ８３Ｃ、配列番号１８変異Ｒ１５１Ｃ、配列番号２０変異Ｒ１０Ｃ−Ｒ２１５Ｃ、配列番号２２変異Ｒ６１Ｃ−Ｒ１７３Ｃ、配列番号２４変異Ｒ６１Ｃ−Ｒ２１５Ｃ、配列番号２６変異Ｒ６１Ｃ−Ｒ１５１Ｃ、配列番号２８変異Ｒ８３Ｃ−Ｒ１７３Ｃ、配列番号３０変異Ｒ８３Ｃ−Ｒ１５１Ｃ、配列番号３２変異Ｒ８３Ｃ−Ｒ２１５Ｃ、配列番号３４変異Ｒ１５１Ｃ−Ｒ１７３Ｃ、配列番号３６変異Ｒ１５１Ｃ−Ｒ２１５Ｃ、配列番号３８変異Ｒ１０Ｃ−Ｒ１７３Ｃ。
【００６６】
奇数の配列１〜３９は、それぞれ、偶数の配列２〜３８及び配列４０をコードするヌクレオチド配列の例である。
【図１】
2019526536.tif 000004
【図２】
2019526536.tif 000005
【図３】
2019526536.tif 000006
【図４】
2019526536.tif 000007
【図５】
2019526536.tif 000008
【図６】
2019526536.tif 000009
【図７】
2019526536.tif 000010
【図８】
2019526536.tif 000011
【配列表】
2019526536000001.app
【国際調査報告】
2019526536.tif 000012
2019526536.tif 000013
2019526536.tif 000014
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