(57)【要約】  油相成分、界面活性剤及び水相成分を含み、水相成分は、癌細胞蛍光誘導物質及び癌細胞ターゲティング多糖体を含む油中水ナノエマルジョンを水中で分散させ、油相成分を除去して獲得される、水相成分を含むミセル構造のナノ伝達体、そのナノ伝達体を含む癌診断用薬学組成物、及びそのナノ伝達体の製造方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
油相成分、界面活性剤及び水相成分を含み、前記水相成分は、癌細胞蛍光誘導物質及び癌細胞ターゲティング多糖体を含む油中水ナノエマルジョンを水中で分散させ、油相成分を除去して獲得される前記水相成分を含むミセル構造のナノ伝達体。
【請求項２】
前記ミセル構造のナノ伝達体は、相互浸透高分子網状構造を有することを特徴とする請求項１に記載のナノ伝達体。
【請求項３】
前記ミセル構造のナノ伝達体は、平均粒子サイズが２００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のナノ伝達体。
【請求項４】
前記ナノ伝達体の平均粒子サイズは、２００ｎｍ以下であり、ゼータ電位の値は、−１０ｍＶないし〜３０ｍＶ、または１０〜３０ｍＶであることを特徴とする請求項１に記載のナノ伝達体。
【請求項５】
前記ナノエマルジョンは、前記ナノエマルジョン全体重量を基準に、前記油相成分を７０〜８０重量％、前記水相成分を１０〜２０重量％、前記界面活性剤を５〜１５重量％含むことを特徴とする請求項１に記載のナノ伝達体。
【請求項６】
前記界面活性剤は、単一界面活性剤または共界面活性剤であることを特徴とする請求項１に記載のナノ伝達体。
【請求項７】
前記界面活性剤は、ＨＬＢ値が６〜９である共界面活性剤であることを特徴とする請求項１に記載のナノ伝達体。
【請求項８】
前記界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステル（Span）及びポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル（Tween）の混合物であり、ＨＬＢ値が６〜９であることを特徴とする請求項１に記載のナノ伝達体。
【請求項９】
前記癌細胞蛍光誘導物質は、ヘム、ヘミン、亜鉛プロトポルフィリン、マグネシウムプロトポルフィリン、ヘマトポルフィリン、ベンゾポルフィリン、メタロポルフィリン、５−アミノレブリン酸、テキサフィリン、クロリン、プルプリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、及びそれらの任意の組み合わせによって構成された群のうちから選択されることを特徴とする請求項１に記載のナノ伝達体。
【請求項１０】
前記癌細胞ターゲティング多糖体は、ヒアルロン酸または癌細胞標的指向性リガンド結合多糖体であることを特徴とする請求項１に記載のナノ伝達体。
【請求項１１】
前記癌細胞標的指向性リガンド結合多糖体のリガンドは、アプタマー、抗体、ペプチド、及び葉酸によって構成された群のうちから選択され、前記多糖体は、アルギン酸、キトサン、ペクチン、ベータ−グルカン、セルロース、ゼラチン、ヘミセルロース、ガラクトマンナン、イヌリン、ガム、キチン、及びそれらの任意の組み合わせによって構成された群のうちから選択されることを特徴とする請求項１０に記載のナノ伝達体。
【請求項１２】
前記リガンド結合多糖体は、葉酸結合アルギン酸であることを特徴とする請求項１１に記載のナノ伝達体。
【請求項１３】
前記癌細胞蛍光誘導物質は、５−アミノレブリン酸であり、前記癌細胞ターゲティング多糖体は、ヒアルロン酸であることを特徴とする請求項１に記載のナノ伝達体。
【請求項１４】
前記油相成分は、大豆油、オリーブ油、ブドウ種子油、キャノーラ油、コーンオイル、ミネラルオイル、シリコンオイル、キャスターオイル、パラフィンオイル、及びそれらの任意の組み合わせによって構成された群のうちから選択されることを特徴とする請求項１に記載のナノ伝達体。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のうちいずれか１項に記載のナノ伝達体を含む癌診断用薬学組成物。
【請求項１６】
前記癌は、脳腫瘍、肺癌、胃癌及び卵巣癌によって構成された群のうちから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の癌診断用薬学組成物。
【請求項１７】
油相成分を準備する段階と、
界面活性剤を準備する段階と、
水相成分を準備する段階と、
前述の油相成分、界面活性剤及び水相成分を撹拌混合し、油中水ナノエマルジョンを製造する段階と、
前記油中水ナノエマルジョンを水中で再分散させた後、油相部分を除去することにより、ナノ粒子を分離する段階と、
を含む、請求項１ないし１４のうちいずれか１項に記載のナノ伝達体の製造方法。
【請求項１８】
前記水相成分を準備する段階は、癌細胞ターゲティング多糖体を含む第１水性成分を準備する段階と、
癌細胞蛍光誘導物質を含む第２水性成分を準備する段階と、
を含むことを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞の選択的蛍光標識のためのナノ伝達体及びその製造方法に係り、さらに具体的には、生体内癌細胞に吸収されて蛍光物質を生成させることができる癌細胞蛍光誘導物質、及び癌細胞に選択的に結合することができる癌細胞ターゲティング多糖体を含むナノ伝達体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）は、１９７９年から、腫瘍手術のための蛍光発光物質として使用され、臨床使用時、副作用が少ない物質であり、患者が服用すれば、患者の脳膠腫細胞と反応し、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ：protoporphyrin ＩＸ）という物質を生成することが知られている。５−ＡＬＡは、ミトコンドリア内において、ヘム（heme）生合成過程の中間物質であるプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）に転換され、５−ＡＬＡ物質自体は、蛍光性質がないが、癌細胞と反応して生成されるＰｐＩＸは、約４００ｎｍの励起波長（excitation wavelength）で、６３５ｎｍの蛍光を放出（emission）することにより、正常組織と悪性膠腫とを区分させることができる。従来の研究によれば、５−ＡＬＡの使用は、悪性膠腫の完全切除成功率を、約１．４倍上昇させ、切除されなかった悪性膠腫の大きさを１／１６に縮小させ、悪性膠腫の再発防止に効果的に使用されると報告された。
【０００３】
しかし、５−ＡＬＡを始めとするほとんどの光学的診断、及び手術時に使用される造影剤は、病変部に対して非特異的性質を有しており、正確な診断あるいは手術が困難である。従って、該造影剤に、病変部に対する標的特異性を付与するために、病変部に対する特異性があるペプチド、抗体または多糖体などの腫瘍特異的リガンドを造影剤に、共有結合を介して、架橋を形成する方法を積極活用している。しかし、該共有結合による架橋時、その複合体の化学的構造安定性、標的指向力低下及び人体内副作用のような新たな問題点が生じ、癌の正確な診断と外科的な切除術とを困難にする。
【０００４】
非特許文献１は、多孔性構造を有しているシリカナノ粒子を製造した後、多孔性構造体内部に５−ＡＬＡを封入し、一部上皮癌細胞で過発現される葉酸受容体アルファ（folate receptor alpha）と特異的結合を行うターゲティングモイエティを付与するために、葉酸を表面に接合させたナノ粒子を開示する。ところで、前記ナノ粒子は、最終産物を作った後、持続的に５−ＡＬＡが放出され、多孔性シリカが天然材料ではない無機物に該当し、実際の臨床に適用し難いという問題がある。
【０００５】
非特許文献２は、ターゲティングモイエティであるビオチン（biotin）に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：polyethylene glycol）、メチルアミノレブリネート（ＭＡＬ：methyl aminolevulinate）、テトラフェニレン（ＴＥＰ：tetraphenylene（aggregation induced fluorescence emission；凝集されれば蛍光を示す性質を有する）を共有結合で連結した複合体を開示する。前記複合体は、前記２つの蛍光誘導物質（ＭＡＬ、ＴＥＰ）を、癌細胞に選択的に伝達することができると開示されているが、さまざまな段階を経た化学的結合により、製造工程の複雑されている上、蛍光誘導物質がターゲティングモイエティに共有結合されることにより、本来ビオチンが有していた標的指向力が低下する恐れがあり、ビオチンの構造変更により、薬効安定性が憂慮される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ma et al., Targeted Delivery of 5Aminolevulinic Acid by Multifunctional Hollow Mesoporous Silica Nanoparticles for Photodynamic Skin Cancer Therapy ACS Appl. Mater. Interfaces 2015, 7, 10671-10676
【非特許文献２】Jin et al., Intracellular Dual Fluorescent Lightup Bioprobes for Image-Guided Photodynamic Cancer Therapy Small 2016, 12, No. 28, 3870-3878
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一様相は、癌診断に使用される造影剤に対する薬物伝達体として、腫瘍特異的リガンドとの共有結合を利用せず、癌細胞にターゲティングすることができる薬物伝達体を提供することである。
【０００８】
本発明の他の一様相は、前記薬物伝達体を癌診断に使用する医薬用途を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の一様相は、前記薬物伝達体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一様相は、油相成分、界面活性剤及び水相成分を含み、前記水相成分は、癌細胞蛍光誘導物質及び癌細胞ターゲティング多糖体を含む油中水（water in oil）ナノエマルジョンを水中で分散させて油相成分を除去して獲得される、前記水相成分を含むミセル構造のナノ伝達体を提供するものである。
【００１１】
本発明の他の一様相は、本発明の一様相による、ミセル構造のナノ伝達体を含む癌診断用薬学組成物を提供するものである。
【００１２】
本発明のさらに他の一様相は、本発明の一様相によるミセル構造のナノ伝達体の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の一様相によるナノ伝達体は、癌細胞蛍光誘導物質及び癌細胞ターゲティング多糖体をいずれもナノ伝達体内の水相に含むことにより、正常細胞ではない癌細胞に、蛍光誘導物質を選択的に伝達することができ、従って、癌組織に対して、特定波長の励起光を当てるときに放射される蛍光により、正常組織と明確に区分される。従って、癌の病変部位に対する精密診断、及び効率的な外科切除術を期待することができ、究極的には、癌の治療効果を極大化させることができる。また、前記ナノ伝達体は、ナノ粒子サイズの均質性を有し、熱力学的安定性にすぐれ、長期間保管が可能であるので、薬剤学的に優秀な製剤である。また、前記ナノ伝達体は、比較的簡単な方法によっても製造され、量産が可能であるので、経済的である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施例による、内部に５−ＡＬＡ及びヒアルロン酸を含むミセル構造のナノ伝達体（Ａ）、そのナノ伝達体が有する相互浸透高分子網状構造（Ｂ）、そのナノ伝達体が正常細胞及び癌細胞と出合う場合、正常細胞では、何の反応も示されないのに反し、（Ｃ）、癌細胞の場合、ナノ伝達体の表面に突出したヒアルロン酸の、癌細胞表面のＣＤ４４受容体との細胞相互作用（Ｄ）を示した模式図である。
【図２】癌細胞内部に、５−ＡＬＡが流入期前には、蛍光が発生しないのに反し、癌細胞内部に５−ＡＬＡが流入される場合、蛍光が発生する過程を示した模式図（Ａ）；癌細胞内において、５−ＡＬＡにより、プロトポルフィリンＩＸの生成が誘導されるメカニズム、及びプロトポルフィリンＩＸに４１０ｎｍ波長の光を照射したとき、６３５ｎｍの蛍光が放射されるメカニズム（Ｂ）を共に示した模式図である。
【図３】実施例１で製造されたナノ伝達体を、低倍率及び高倍率の透過電子顕微鏡で観察及び測定して得られたナノ伝達体映像、並びにナノ伝達体サイズを示したグラフである。
【図４】実施例１ないし３のナノ伝達体を、１ないし６０日間冷蔵保管した後、動的散乱光測定装置（ＤＬＳ）を介して、粒子の平均サイズを測定した結果を示したグラフである。
【図５】実施例１のナノ伝達体を多様な癌細胞に処理した後、プロトポルフィリンＩＸの吸光度を測定した結果（Ｂ）、分光蛍光計で蛍光スペクトルを測定した結果（Ｃ）を示したグラフであり、癌細胞に処理する前のナノ伝達体自体に対する蛍光スペクトル（Ａ）と共に示した。
【図６】線維芽細胞、及び３種類の癌細胞（脳腫瘍、肺癌、胃癌）に対する細胞毒性試験のためのＣＣＫ−８アッセイ結果であり、細胞生存率を測定した結果を示したグラフである。
【図７】線維芽細胞、及び３種類の癌細胞（脳腫瘍、肺癌、胃癌）に対する細胞毒性試験のためのＣＣＫ−８アッセイ結果であり、細胞生存率を測定した結果を示したグラフである。
【図８】線維芽細胞、及び３種類の癌細胞（脳腫瘍、肺癌、胃癌）に対する細胞毒性試験のためのＣＣＫ−８アッセイ結果であり、細胞生存率を測定した結果を示したグラフである。
【図９】線維芽細胞、及び３種類の癌細胞（脳腫瘍、肺癌、胃癌）に対する細胞毒性試験のためのＣＣＫ−８アッセイ結果であり、細胞生存率を測定した結果を示したグラフである。
【図１０】実施例１のヒアルロン酸基盤ナノ伝達体（ＨＡ−based carrier）、及び比較例１のアルギン酸基盤ナノ伝達体（Ａｌｇ−based carrier）を正常細胞である３Ｔ３−Ｌ１（マウス線維芽細胞）に処理し、所定時間放置した後、ＤＡＰＩ及びＰｐＩＸに対する蛍光を、蛍光顕微鏡で観察した結果を示した写真である。
【図１１】実施例１のヒアルロン酸基盤ナノ伝達体（ＨＡ−based carrier）、及び比較例１のアルギン酸基盤ナノ伝達体（Ａｌｇ−based carrier）を脳腫瘍細胞に処理し、所定時間放置した後、ＤＡＰＩ及びＰｐＩＸに対する蛍光を、蛍光顕微鏡で観察した結果を示した写真である。
【図１２】実施例１のヒアルロン酸基盤ナノ伝達体（ＨＡ−based carrier）、及び比較例１のアルギン酸基盤ナノ伝達体（Ａｌｇ−based carrier）を肺癌細胞に処理し、所定時間放置した後、ＤＡＰＩ及びＰｐＩＸに対する蛍光を、蛍光顕微鏡で観察した結果を示した写真である。
【図１３】実施例１のヒアルロン酸基盤ナノ伝達体（ＨＡ−based carrier）、及び比較例１のアルギン酸基盤ナノ伝達体（Ａｌｇ−based carrier）を胃癌細胞に処理し、所定時間放置した後、ＤＡＰＩ及びＰｐＩＸに対する蛍光を、蛍光顕微鏡で観察した結果を示した写真である。
【図１４】実施例４の葉酸・アルギン酸基盤ナノ伝達体（ＦＡ−Ａｌｇ−based carrier）、及び比較例１のアルギン酸基盤ナノ伝達体（Ａｌｇ−based carrier）を卵巣癌細胞及び肺腺癌細胞に処理し、所定時間放置した後、ＤＡＰＩ及びＰｐＩＸに対する蛍光を、蛍光顕微鏡で観察した結果を示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００１６】
本発明で使用される全ての技術用語は、取り立てて定義されない以上、本発明の関連分野において当業者が一般的に理解するような意味で使用される。また、本明細書には、望ましい方法や試料が記載されるが、それと類似していたり、同等であったりするものも、本発明の範疇に含まれる。また、本明細書に記載された数値は、明示がなくとも、「約」の意味を含むものであると見なす。本明細書において、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、それは、特別に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいということを意味する。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は、全体が本明細書に参照として統合される。
【００１７】
本発明者らは、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）のような癌細胞蛍光誘導物質を、腫瘍特異的リガンドとの共有結合を利用せずに、癌細胞にターゲティングすることができる薬物伝達体について研究した結果、水相を内相とするナノ伝達体の内部が、癌細胞蛍光誘導物質及び癌細胞ターゲティング多糖体を共に含むように、ナノ伝達体を製造する場合、癌細胞に、選択的に癌細胞蛍光誘導物質が流入され、蛍光により、癌組織の判別が可能であるということを明らかにした。前記ナノ伝達体は、まず油相成分、界面活性剤、並びに癌細胞蛍光誘導物質及び癌細胞ターゲティング多糖体を含む水相成分を共に混合し、油中水（water in oil）ナノエマルジョンを製造した後、そのナノエマルジョンを水中で分散させ、油相成分を除去することによって得られる。
【００１８】
従って、本発明は、一様相において、油相成分、界面活性剤及び水相成分を含み、前記水相成分は、癌細胞蛍光誘導物質及び癌細胞ターゲティング多糖体を含む油中水ナノエマルジョンを水中で分散させて油相成分を除去して獲得される、前記水相成分を内相として含むミセル構造のナノ伝達体を提供する。
【００１９】
前記ナノ伝達体は、結果として、癌細胞蛍光誘導物質及び癌細胞ターゲティング多糖体を含む水性成分を内相として含み、表面に、界面活性剤が存在するミセル構造のナノ伝達体である。
【００２０】
本明細書において、「油相成分」とは、脂溶性であり、オイルに溶ける物質を意味する。前記油相成分は、当該技術分野において、ナノエマルジョン製造に使用される任意のオイルでもあり、例えば、大豆油、オリーブ油、ブドウ種子油、キャノーラ油、コーンオイル、ミネラルオイル、シリコンオイル、キャスターオイル、パラフィンオイル、及びそれらの任意の組み合わせによって構成された群のうちから選択されたオイルでもある。一具体例において、前記油相成分は、大豆油である。
【００２１】
本明細書において、「水相成分」とは、水溶性であり、水に溶ける物質を意味する。一具体例において、前記水相成分は、水を媒質とし、癌細胞蛍光誘導物質及び癌細胞ターゲティング多糖体を含む水溶液である。
【００２２】
本明細書において、「癌細胞蛍光誘導物質」とは、生体内癌細胞に流入され、蛍光物質を発生させることができる任意の物質を意味する。前記癌細胞蛍光誘導物質は、当該技術分野において、癌細胞に流入され、蛍光を発生させることができることが知られているか、あるいは将来的に発見されるであろう任意の物質でもあり、例えば、蛍光物質であるプロトポルフィリンＩＸ（protoporphyrin ＩＸ）を発生させる物質は、ヘム（heme）、ヘミン（hemin）、亜鉛プロトポルフィリン（zinc protoporphyrin）、マグネシウムプロトポルフィリン（magnesium protoporphyrin）、ヘマトポルフィリン（hematoporphyrin）、ベンゾポルフィリン（benzoporphyrin）、メタロポルフィリン（metalloporphyrin）、５−アミノレブリン酸（５−aminolevulinic acid）、テキサフィリン（texaphyrins）、クロリン（chlorins）、プルプリン（purpurins）、バクテリオクロリン（bacteriochlorins）、フタロシアニン（pthalocyanine）、ナフタロシアニン（napthalocyanine）、及びそれらの誘導体、並びにそれらの任意の組み合わせによって構成された群のうちから選択された癌細胞蛍光誘導物質でもあるが、それらに限定されるものではない。一具体例において、前記癌細胞蛍光誘導物質は、５−ＡＬＡである。
【００２３】
本明細書において、「癌細胞ターゲティング多糖体」とは、癌細胞表面で過発現される分子または受容体などに、選択的に結合することができる任意の多糖体を意味する。前記癌細胞ターゲティング多糖体は、当該技術分野において、癌細胞表面で過発現される分子または受容体などに、選択的に結合することができることが知られているか、あるいは将来的に発見されるであろう任意の癌細胞ターゲティング多糖体でもある。
【００２４】
前記癌細胞ターゲティング多糖体は、ヒアルロン酸または癌細胞標的指向性リガンド結合多糖体でもある。
【００２５】
本明細書において、「癌細胞標的指向性リガンド結合多糖体」とは、癌細胞表面で過発現されるマーカー、すなわち、分子または受容体などに選択的に結合することができる任意の癌細胞標的指向性リガンドが多糖体に共有結合された複合体を意味する。癌細胞表面で過発現されるマーカー、それに対して結合することができる癌細胞標的指向性リガンド、またはその癌細胞標的指向性リガンドを多糖体に結合する方法は、当該技術分野で周知である。前記癌細胞標的指向性リガンドは、例えば、アプタマー（aptamer）、抗体またはペプチドでもあり、前記多糖体は、例えば、アルギン酸、キトサン、ペクチン、ベータ−グルカン、セルロース、ゼラチン、ヘミセルロース、ガラクトマンナン、イヌリン、ガム及びキチンによって構成された群のうちから選択されるが、それらに限定されるものではない。
【００２６】
一具体例において、前記標的指向性リガンドは、葉酸である。
【００２７】
一具体例において、前記癌細胞ターゲティング多糖体は、ヒアルロン酸である。前記ヒアルロン酸は、癌細胞に特異的に過発現されるヒアルロン酸受容体であるＣＤ４４と結合が可能であるので、癌細胞ターゲティング多糖体として作用することができる。ヒアルロン酸とは異なり、アルギン酸、キトサン、ペクチンのような天然多糖体は、ほとんど癌細胞との特異的結合能がないことが知られているが、そのような多糖体は、前記癌細胞標的指向性リガンドに共有結合されることにより、標的指向性が付与される。従って、癌細胞標的指向性リガンド結合多糖体は、そのリガンドと結合可能な癌細胞表面の特異的過発現受容体と結合が可能であるので、癌細胞ターゲティング多糖体として作用することができる。
【００２８】
一具体例において、前記癌細胞ターゲティング多糖体は、癌細胞標的指向性リガンド結合アルギン酸である。アルギン酸は、マンヌロン酸（Ｍ：mannuronic acid）及びグルロン酸（Ｇ：gluronic acid）によって構成されたブロック共重合体であり、一般的に海藻から抽出することができる。
【００２９】
本明細書において、「アプタマー」は、単一螺旋または二重螺旋のＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり、ターゲットタンパク質との三次元的結合を介して、ターゲットタンパク質と特異的に相互作用して結合することができる任意の生高分子物質を意味する。前記アプタマーは、種類により、金属イオン、小分子、タンパク質及び全体細胞とまで結合することが知られている。そのうち、バイオマーカーとしても使用されるタンパク質にも特異的に結合するアプタマーも存在する。
【００３０】
一具体例において、前記アプタマーは、ムチン、特に、ムチン１（Ｍｕｃ１：mucin１）に結合するアプタマーでもある。該ムチンは、内部膜貫通ドメインとして、細胞に付着している細胞表面関連糖タンパク質であるが、そのうち、ムチン１（Ｍｕｃ１）は、３１個アミノ酸の疎水性膜横断（spanning）ドメイン、６９個アミノ酸の細胞質ドメイン、及び２０個アミノ酸がほぼ同一に反復された細胞外ドメインを含む。ムチン１は、乳房、胃、大腸、肺、前立腺、卵巣、膵膓及び膀胱の癌を含む、ほとんど全てのヒト上皮細胞腺癌（epithelial cancer cells）で過発現される。さらに、それら組織において、ムチン１の発現は、大体正常な発現パターンが欠如し、細胞表面全体にかけて偏在したり、ランダムに発現したりする特性がある。それにより、ムチン１に特異的に結合するアプタマー（anti−Ｍｕｃ１ aptamer）は、癌細胞標的指向性リガンドとして作用することができ、それを結合させた多糖体を、前記癌細胞ターゲティング多糖体として使用することができる。
【００３１】
前記抗体は、従来、癌細胞に選択的に結合することができることが知られた任意の抗体でもあり、その具体的な例は、当該技術分野で周知であり、その製造方法も、当該技術分野で公知の知識を利用し、当業者が製造することができるであろう。
【００３２】
前記葉酸は、卵巣癌などで過発現されることが知られている葉酸受容体アルファ（folate receptor-alpha）に特異的に結合することができる。該葉酸受容体アルファは、卵巣癌の９０〜９５％で過発現されることが知られている。一具体例において、前記葉酸は、アルギン酸に結合され、癌細胞ターゲティング多糖体を形成することができ、具体的には、アルギン酸のカルボキシ基（ＣＯＯＨ−）と葉酸のアミン基（ＮＨ２）とが共有結合され、癌細胞ターゲティング多糖体を形成することができる。
【００３３】
一具体例において、癌細胞ターゲティング多糖体として、葉酸結合アルギン酸を製造し、かつ癌細胞蛍光誘導物質として、５−ＡＬＡを含むミセル構造のナノ伝達体を製造し、そのナノ伝達体を、葉酸受容体アルファが過発現された卵巣癌細胞（ＳＫ−ＯＶ−３）に対して処理した結果、癌細胞に選択的に流入され、プロトポルフィリンＩＸによる選択的な蛍光誘導効果を確認した。
【００３４】
一具体例において、前記ミセル構造のナノ伝達体は、相互浸透高分子網状構造（ＩＰＮ：interpenetrating polymer network）のナノ粒子を有することができる。
【００３５】
本明細書において、相互浸透高分子網状構造とは、２種以上の構成成分が共有結合で連結されず、構成成分が互いに噛み合ってもつれ合った（entangled）ネットワークを形成することを意味する。本発明の一実施例によるナノ伝達体の相互浸透高分子網状構造の模式図を、図１の（Ｂ）に示した。前記ミセル構造のナノ伝達体は、相互浸透高分子網状構造を有することにより、水相成分に含まれた癌細胞蛍光誘導物質及び癌細胞ターゲティング多糖体が、物理的にカプセル化され、機械的強度を高め、熱力学的安定性を増大させることができる。また、前記ナノ伝達体は、含む癌細胞ターゲティング多糖体の陽イオン性または陰イオン性により、表面に高い絶対値のゼータ電位を有することができ、そのような高いゼータ電位による粒子間反発力により、オストワルド熟成（Ostwald ripening）現象が防止され、ナノ伝達体の安定性が増大する。試験結果、本発明の一実施例によるナノ粒子を、冷蔵保管するとき、経時的に、動的散乱光分析装置を介して製造したナノ伝達体に対して、６０日間サイズ変化を測定し、ナノ伝達体の径変化がほぼないと分かり、熱力学的に非常に安定していることが確認された（試験例３、図４参照）。
【００３６】
前記ミセル構造のナノ伝達体は、平均粒子サイズが約２００ｎｍ以下でもある。一具体例において、前記ミセル構造のナノ伝達体は、５０ないし１５０ｎｍである。
【００３７】
一具体例において、前記ミセル構造のナノ伝達体のゼータ電位は、−１０ないし−５０ｍＶ、１０ないし５０ｍＶ、さらに具体的には、−１０ないし−３０ｍＶ、あるいは１０ないし３０ｍＶでもある。前記ゼータ電位値は、癌細胞ターゲティング多糖体が、水相において、負電荷値を有することによって示される値であり、ナノ伝達体の内部封入される物質の相互作用によるイオン性結合により、表面ゼータ電位値が変わる。前記範囲の低いゼータ電位を有する場合には、粒子の反発力増大により、オストワルド熟成のような現象が防止され、安定したナノ粒子を維持することができる。
【００３８】
一具体例において、前記ナノ伝達体の平均粒子サイズは、２００ｎｍ以下であり、ゼータ電位の値は、−１０ｍＶないし−３０ｍＶである。ナノ粒子の均質性面においては、ナノ粒子の平均粒子サイズは、１００ｎｍ前後、ゼータ電位の値は、−１０ｍＶないし−３０ｍＶである場合が望ましい。
【００３９】
本発明の一実施例によって製造されたミセル構造のナノ伝達体（実施例１〜３）について、粒子サイズ及びゼータ電位を測定し、その結果を表１及び図３に示した。図３の結果によれば、水相成分の含量比が変わることにより、平均粒子サイズとゼータ電位とが変わることが確認された。双性イオン物質である５−ＡＬＡの含量比の増大するほど、ゼータ電位が低下し、ナノ粒子サイズも縮小されることが確認された。それは、陰イオン性多糖体と、双性イオンである５−ＡＬＡとの、ナノ伝達体内部でのイオン性結合が増大することにより、ナノ伝達体の表面ゼータ電位値が低下すると見られる。
【００４０】
一具体例において、前記ミセル構造のナノ伝達体を製造するためのナノエマルジョンは、ナノエマルジョン全体重量を基準に、前記油相成分を７０〜８０重量％、前記水相成分を１０〜２０重量％、前記界面活性剤を５〜１５重量％含んでもよい。前記界面活性剤は、単一界面活性剤及び共界面活性剤のうち少なくとも一つを含む。
【００４１】
前記ナノエマルジョンは、前記成分比率の範囲において、油中水ナノエマルジョンの水相ナノ粒子サイズを調節することができ、該水相ナノ粒子の安定性を維持することもできる。特に、ナノエマルジョン全体重量を基準に、水相成分の重量比が、界面活性剤の重量比より大きいことにより、ナノサイズ粒子が形成され、粒子の安定性にもすぐれる。
【００４２】
本明細書において、「共界面活性剤」とは、２種以上の界面活性剤の混合物を意味し、ナノサイズのナノ粒子を有するナノエマルジョンの製造に有利に使用される。該共界面活性剤は、互いに異なるＨＬＢ値を有する界面活性剤を組み合わせることにより、所望ＨＬＢ値を有することができる。ＨＬＢとは、親水性及び親油性との程度を示す尺度であり、界面活性剤は、０ないし２０の固有ＨＬＢ値を有し、０に近いほど親油性であり、２０に近いほど親水性である。該界面活性剤が有している固有の親水性・親油性バランス（ＨＬＢ：hydrophilic-lipophilic balance）値に基づいて、共界面活性剤のＨＬＢを算定する方法は、当該技術分野で公知である。
【００４３】
一具体例において、前記界面活性剤は、ＨＬＢ値が６〜９である共界面活性剤でもある。ＨＬＢ値が６〜９の共界面活性剤がナノエマルジョンの粒子サイズをナノサイズに維持させるのにさらに有利である。
【００４４】
一具体例において、前記共界面活性剤は、ＨＬＢ値が６〜９である、ソルビタン脂肪酸エステル（Span）及びポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル（Tween）の混合物である。
【００４５】
一具体例において、前記界面活性剤は、トゥイーン８０（Tween ８０、ＨＬＢ １５）及びスパン８０（Span ８０、ＨＬＢ ４．３）を含んだＨＬＢ値が約７である共界面活性剤である。
【００４６】
本発明は、他の一様相において、前記本発明の一様相によるナノ伝達体を含む癌診断用薬学組成物を提供する。
【００４７】
前記癌診断用薬学組成物が含むナノ伝達体の詳細は、前記本発明の一様相によるミセル構造のナノ伝達体についての説明がそのまま適用される。
【００４８】
前記本発明の一様相によるミセル構造のナノ伝達体は、癌細胞蛍光誘導物質を、正常細胞ではない癌細胞に選択的に伝達することができるので、癌細胞に流入された蛍光誘導物質によって誘導された蛍光物質により、癌細胞を正常組織に対して、蛍光により、明確に区分させる造影剤としても使用される。
【００４９】
図１は、本発明の一実施例による、内部に５−ＡＬＡ及びヒアルロン酸を含むミセル構造のナノ伝達体（Ａ）、そのナノ伝達体が有する相互浸透高分子網状構造（Ｂ）、そのナノ伝達体が、正常細胞及び癌細胞と出合う場合、正常細胞では何らの反応も示されないのに対し（Ｃ）、癌細胞の場合、ナノ伝達体の表面に突出したヒアルロン酸の、癌細胞表面のＣＤ４４受容体との細胞相互作用（Ｄ）を示した模式図である。該ヒアルロン酸は、ナノ伝達体に封入された形態ではあるが、ヒアルロン酸の鎖状分子構造上ナノ伝達体の表面に一部突出した形態を有することができる。
【００５０】
図１の（Ｄ）に示されているように、前記ミセル構造のナノ伝達体は、ナノ伝達体の封入されているヒアルロン酸を介して、癌細胞の表面に過発現されているＣＤ４４受容体に結合することにより、癌細胞に選択的に結合することができる。具体的には、ヒアルロン酸とＣＤ４４受容体との結合は、ヒアルロン酸に存在する鎖構造と、癌細胞で過発現されるＣＤ４４受容体との特異的相互作用に起因する。癌細胞表面に結合したナノ伝達体は、ＣＤ４４受容体媒介細胞内流入（ＣＤ４４ receptor-mediated endocytosis）を介して、５−ＡＬＡが流入される。癌細胞の場合、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）生合成に必要な律速酵素（rate-limiting enzyme）であるポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（porphobilinogen deaminase）が増加しているだけではなく、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）をヘムに転化させる酵素であるフェロケラターゼ（ferrochelatase）が正常細胞に比べて減少していることが知られている。従って、外部から高濃度の５−ＡＬＡが流入されれば、正常細胞に比べ、顕著に効率的に癌細胞において、プロトポルフィリン（ＰｐＩＸ）の生成が促進される。
【００５１】
前記ミセル構造のナノ伝達体は、癌細胞内部に５−ＡＬＡが流入される前には、蛍光が発生しないのに対し、前記ヒアルロン酸のターゲティング効果により、癌細胞内部に５−ＡＬＡが流入される場合、癌細胞の細胞質内部に存在するミトコンドリアにより、５−ＡＬＡがプロトポルフィリンＩＸに誘導され、生成されたプロトポルフィリンＩＸは、４１０ｎｍ波長の光を照射するとき、６３５ｎｍの蛍光が放射される。そのような一実施例によるミセル構造のナノ伝達体が、癌細胞に選択的に吸収されて蛍光を示す過程の模式図を図２に示した。従って、本発明の一様相によるミセル構造のナノ伝達体は、癌細胞を正常組織に対し、蛍光によって明確に区分させることができるので、癌診断に効果的に使用される。
【００５２】
実際の試験結果、本発明の一実施例によるナノ伝達体は、正常細胞に対しては、蛍光を示さないのに対し、癌細胞に対しては、選択的に蛍光を示すことができることが確認された。実施例１によって製造されたヒアルロン酸及び５−ＡＬＡを水相に含むミセル構造のナノ伝達体を、ヒアルロン酸の代わりに、癌細胞ターゲティング多糖体ではないアルギン酸を含むナノ伝達体（比較例１）と共に、４種種類の細胞（線維芽細胞、脳腫瘍、肺癌及び胃癌細胞）に対して処理した結果、アルギン酸基盤ナノ伝達体が、癌細胞に対する選択的な蛍光を示さないのに対し、ヒアルロン酸基盤ナノ伝達体は、癌細胞に対する選択的な蛍光を示すことを確認することができた（図１０〜図１３）。
【００５３】
前記「癌診断用」は、癌の存在いかんを診断するだけではなく、癌治療時、治療経過または癌悪化程度を確認するために、造影剤として使用することをいずれも含む。また、癌組織の外科的切除過程において、癌組織を正常組織と明確に区別するための造影剤としての使用を含む概念でもある。それら以外にも、癌組織を正常組織と区別して蛍光を示すことによって得られる任意の有益な用途を含むと解釈されなければならない。
【００５４】
前記癌は、前記癌細胞ターゲティング多糖体がターゲティングすることができると共に、癌細胞内において、前記癌細胞蛍光誘導物質から蛍光物質が誘導される任意の癌でもあり、前記癌細胞蛍光誘導物質及び／または癌細胞ターゲティング多糖体の具体的な種類によっても異なる。例えば、前記癌は、脳腫瘍、肺癌、胃癌及び卵巣癌を含むが、それらに限定されるものではない。
【００５５】
一具体例において、前記ミセル構造のナノ伝達体は、生体に投与するとき、有意の毒性がないナノ伝達体である。
【００５６】
一具体例において、前記ナノ伝達体は、その原料物質として、生体適合性にすぐれるヒアルロン酸、アルギン酸またはキトサンのような生体適合性高分子を含む癌細胞ターゲティング多糖体を含み、癌細胞蛍光誘導物質である５−アミノレブリン酸も、生体内にすでに存在する物質として細胞毒性がないので、安全に使用される。
【００５７】
本発明の一実施例によるナノ伝達体に対して、線維芽細胞、及び３種類の癌細胞（脳腫瘍、肺癌、胃癌）に対する細胞毒性試験を、ＣＣＫ−８アッセイによって行い、その結果を図６ないし図９に示した。図６ないし図９によれば、４種細胞群において、細胞生死判別試験の結果、ナノ伝達体が、２ｍｇ／ｍＬ濃度でも無毒性であることが確認された。
【００５８】
前記癌診断用組成物は、前記癌細胞蛍光誘導物質の種類によっても、その投与量が異なり、癌細胞蛍光誘導物質が５−ＡＬＡである一具体例は、その成分として、成人男子を基準に、約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ投与することができるが、人種、性別、年齢、体重、癌腫の種類などにより、専門医師が適切に増減することができる。
【００５９】
前記癌診断用薬学組成物は、癌診断のために、ナノ伝達体を癌組織部位に伝達させる任意の剤形にも製剤化され、例えば、注射剤としても製剤化される。該注射剤に製剤化される場合、血液と等張である無毒性緩衝溶液を希釈剤として含み、例えば、ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液などがある。前記薬学組成物は、緩衝溶液以外に、その他の希釈剤または添加剤を含んでもよい。そのような注射剤に付加することができる賦形剤及び添加剤は、当該技術分野で当業者に周知であり、例えば、下記文献を参照すれば知ることができる（Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995); Dr. H.P. Fiedler "Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete" [Encyclopaedia of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related fields]）。
【００６０】
本発明は、他の一様相において、
油相成分を準備する段階と、
界面活性剤を準備する段階と、
水相成分を準備する段階と、
前記油相成分、界面活性剤及び水相成分を撹拌混合し、油中水ナノエマルジョンを製造する段階と、
前記油中水ナノエマルジョンを水中で再分散させた後、油相部分を除去することにより、ナノ粒子を分離する段階と、を含む、前記本発明の一様相によるミセル構造のナノ伝達体の製造方法を提供する。
【００６１】
前記製造方法の詳細は、前記本発明の一様相によるミセル構造のナノ伝達体に係わる説明がそのまま適用される。
【００６２】
一具体例において、前記水相成分を準備する段階は、癌細胞ターゲティング多糖体を含む第１水相成分を準備する段階と、癌細胞蛍光誘導物質を含む第２水相成分を準備する段階と、を含む。
【００６３】
前述の油相成分、界面活性剤及び水相成分を撹拌混合し、油中水ナノエマルジョンを製造する段階において、前記撹拌混合は、超音波処理を利用することができ、一具体例によれば、６ｍｍプローブチップソニケート（Sonics、ＶＣ−７５０ amplitude ２０〜４０％）を使用し、５ないし１０分間高エネルギー超音波を利用することができる。
【００６４】
前記油中水ナノエマルジョンを水中で再分散させた後、油相部分を除去する過程は、単に水中に再分散させるとき、上層に浮く油相成分を除去することにってなされる。
【００６５】
前記製造方法は、追加で、前記油相成分が除去されて得られるミセル構造のナノ伝達体を、酢酸セルロースシリンジフィルタを介して濾過する段階をさらに含んでもよい。前述の濾過する段階を介して、ナノ伝達体粒子が凝集されずに分散された形態で得られるという効果がある。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明について、下記実施例によって、さらに詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものであるのみ、それにより、本発明の範囲が限定されるものではない。
【００６７】
実施例１：ヒアルロン酸基盤ナノ伝達体の製造（１）
【００６８】
ヒアルロン酸ナトリウム（research grade from Lifecore、ＭＷ＝９１〜１７５ｋＤａ）、精製した大豆油（soy bean oil：Sigma）及び５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ：Sigma）を準備した。細胞培養に適切な界面活性剤Span ８０（ＨＬＢ値４．３：Sigma）及びTween８０（ＨＬＢ値１５：Sigma）を準備した。
【００６９】
親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）値に基づいて、Span ８０とTween ８０とを組み合わせることにより、ＨＬＢ値が７である共界面活性剤を準備した。また、第１水相成分（１ｗ／ｗ％アルギン酸ナトリウム水溶液）と第２水相成分（５ｗ／ｗ％５−ＡＬＡ水溶液）とを製造した。
【００７０】
前記準備された油相成分（大豆油）：共界面活性剤：第１水相成分：第２水相成分を、７：１：１：１の重量比で混合した混合溶液を、１０分間、超音波処理（Sonic、ＶＣ−７５０ model、振幅（amplitute）：４０％）で撹拌し、不透明色の混合物が、透明または半透明になるまで超音波で処理し、油中水（ｗ／ｏ）ナノエマルジョンを製造した。
【００７１】
前記ナノエマルジョンを脱イオン水（ＤＩ water）内で再分散させ、油相成分を除去してナノ粒子を分離した。分離されたナノ粒子を、酢酸セルロースシリンジフィルタ（cellulose acetate syringe filter（model ＤＩＳＭＩＣ−１３ from Advantec））で濾過し、水相中に分散されたナノ伝達体溶液を製造した。
【００７２】
実施例２：ヒアルロン酸基盤ナノ伝達体の製造（２）
【００７３】
前記実施例１と同一方法で製造するが、第２水相成分として、５％（ｗ／ｗ）５−ＡＬＡ水溶液を使用する代わりに、３％（ｗ／ｗ）５−ＡＬＡ水溶液を使用することを除いては、同一方法でナノ伝達体溶液を製造した。
【００７４】
実施例３：ヒアルロン酸基盤ナノ伝達体の製造（３）
【００７５】
前記実施例１と同一方法で製造するが、第２水相成分として、５％（ｗ／ｗ）５−ＡＬＡ水溶液を使用する代わりに、１％（ｗ／ｗ）５−ＡＬＡ水溶液を使用することを除いては、同一方法でナノ伝達体溶液製造した。
【００７６】
実施例４：葉酸・アルギン酸（ＦＡ−Ａｌｇ）基盤ナノ伝達体の製造
【００７７】
前記実施例１と同一方法で製造するが、１％（ｗ／ｗ）アルギン酸ナトリウム水溶液の代わりに、葉酸が共有結合で連結されたアルギン酸ナトリウム（葉酸・アルギン酸）水溶液１％（ｗ／ｗ）を使用することを除いては、同一方法でナノ伝達体溶液を製造した。
【００７８】
前記実施例１ないし４において、ナノエマルジョンの製造に使用された油相：共界面活性剤：第１水相：第２水相の比率を下記表１に示した。
【００７９】
【表１】
2019537612.tif 000003
【００８０】
比較例１：アルギン酸基盤ナノエマルジョンの製造
【００８１】
前記実施例１と同一方法で製造するが、１％（ｗ／ｗ）ヒアルロン酸ナトリウム水溶液の代わりに、１％（ｗ／ｗ）アルギン酸ナトリウム水溶液を使用することを除いては、同一方法でナノ伝達体溶液を製造した。
【００８２】
試験例１：ナノ伝達体のサイズの測定
【００８３】
前記実施例１で得られたナノ伝達体溶液５μｌを、４００メッシュの銅からなる透過電子顕微鏡グリッド上に落とした後、用心深くグリッド周辺部をタオルで拭いた。グリッド内に過量に残っている水分を除去するために、約１時間真空チャンバ内で乾燥させた。十分に乾燥された状態で、高倍率透過電子顕微鏡でナノ伝達体のサイズを測定し、ＴＥＭ（transmission electron microscope）映像を撮影した。その結果を図３に示した。図３の左側に、ナノ伝達体を低倍率と高倍率とで観察したＴＥＭ映像を示し、右側に、その映像分析に基づいた粒子サイズを示すグラフを示した。該ナノ伝達体の平均粒子サイズは、約５３．５８ｎｍ径を有し、標準偏差は、１６．２５ｎｍであることが分かった。
【００８４】
試験例２：ナノ伝達体サイズ及び表面電荷の測定
【００８５】
前記実施例１ないし４で得られたナノ伝達体の平均サイズ及び表面電荷を、動的散乱光測定装置（ＤＬＳ（dynamic light scattering） Zeta Nano ＺＳ ３６００、Malvern、ＵＫ）で測定した。それぞれのサンプルに対して、３回反復的に測定した値の平均値を求めた。その結果を下記表２に示した。
【００８６】
【表２】
2019537612.tif 000004
【００８７】
試験例３：ナノ伝達体の安定性試験
【００８８】
前記実施例１ないし３で得られたナノ伝達体を、１ないし６０日間冷蔵保管した後、動的散乱光測定装置で粒子の平均サイズを測定し、それぞれのサンプルに対して、３回以上反復的に測定した値の平均値を計算した。経時的なナノ伝達体の粒子平均サイズを測定した結果を図４に示した。
【００８９】
図４の結果によれば、粒子の平均サイズが６０日以上である期間の間、ナノサイズとして安定して維持されるということが分かった。
【００９０】
試験例４：ナノ伝達体の癌細胞に対するターゲティング試験
【００９１】
前記実施例１で得られたナノ伝達体で癌細胞を処理し、癌細胞で実際にプロトポルフィリンＩＸが誘導されるか否かを試験した。
【００９２】
まず、Ｃ６（マウス脳腫瘍）、Ａ５４９（ヒト肺腺癌細胞）、ＭＫＮ−７４（ヒト胃癌細胞）の細胞株を韓国細胞種銀行（ＫＣＬＢ：Korea Cell Line Bank）から分譲され、１％のペニシリン・ストレプトマイシン（WELLGENE）、及び１０％のＦＢＳ（fetal bovine serum（WELLGENE）が含有されたＲＰＭＩ １６４０培地（WELLGENE）を使用し、３７℃、５％ ＣＯ２恒温器で培養し、継代培養は２日に１回行った。
【００９３】
その後、３種の癌細胞群を２４ウェルプレートに、１ｍＬ（５ｘ１０５個／ｍＬ）濃度で２４時間培養した後、無血清培地に交替させた後、前記実施例１で得られたナノ伝達体で、１００μＬ（１ｍｇ／ｍＬ濃度）癌細胞を処理した後、６時間培養した。細胞内に存在するプロトポルフィリンＩＸを抽出するために、細胞培養培地を吸入させた後、リパバッファ溶液（ＲＩＰＡ buffer solution）を１００μＬ落とし、細胞膜タンパク質を分解した。抽出されたプロトポルフィリンＩＸの吸光度を測定し（図５（Ｂ））、分光蛍光計で蛍光スペクトル（図５（Ｃ））を測定した。癌細胞に処理する前のナノ伝達体自体についても、分光蛍光計で蛍光スペクトル（図５（Ａ））を測定した。
【００９４】
その結果を図５に示した。
【００９５】
図５の結果によれば、ナノ伝達体自体の蛍光スペクトル結果（図５（Ａ））、３５０ｎｍ波長と７５０ｎｍ波長との間に、いかなる励起波長も放出波長も示されないのに対し、ナノ伝達体を癌細胞に処理した場合、プロトポルフィリンＩＸの吸光ピークが発見されることが分かり（図５（Ｂ））、癌細胞内において、プロトポルフィリンＩＸが誘導されると推定することができた。また、図５（Ｃ）の蛍光スペクトルから、そのような推定がさらに裏付けられた。
【００９６】
結果として、実施例１のナノ伝達体内部に５−アミノレブリン酸を封入しており、癌細胞に処理されるとき、内部に良好に伝達され、癌細胞内において、プロトポルフィリンＩＸが誘導されるということが証明された。
【００９７】
試験例５：ナノ伝達体の細胞毒性試験
【００９８】
前記実施例１で得られたナノ伝達体に対する細胞毒性試験を行った。
【００９９】
前記試験例４で培養されたＣ６（マウス脳腫瘍）、Ａ５４９（ヒト肺腺癌細胞）、ＭＫＮ−７４（ヒト胃癌細胞）の細胞株を使用した。
【０１００】
さらには、３Ｔ３−Ｌ１（マウス線維芽細胞）細胞株も韓国細胞種銀行から分譲され、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（WELLGENE）及び１０％牛胎児血清（ＢＣＳ、WELLGENE）を含むＤＥＭＥ培地（WELLGENE）を使用し、３７℃、５％ ＣＯ２恒温器で培養し、継代培養は、３日に１回ずつ施行した。
【０１０１】
前記４種細胞株に対して、ＣＣＫ（Cell Counting ＫＩＴ）−８アッセイを行った。
【０１０２】
具体的には、４種の細胞（５．０ｘ１０４／ｍＬ）を９６ウェルプレート（well plate）の各ウェルにシーディングした後、２４時間培養させた。無血清培地に交替させた後、濃度別ナノ伝達体（０．０６２，０．１２５，０．２５，０．５，１及び２ｍｇ／ｍＬ）を、全体体積の１０％体積で添加した。それを、６時間、１２時間、２４時間培養した後、ＣＣＫ−８ソリューション（ＣＣＫ−８、Dojindo）１０μｇを添加し、２時間さらに培養した。マイクロプレートリーダー器（ｉＭａｒｋ Bio-Rad instrumenis. Inc.）を使用し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。各実験条件について３回行った平均吸光度値を求め、ナノ伝達体の代わりに、無毒性のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を入れた対照群の平均吸光度値と比較し、細胞毒性の程度を調べた。
【０１０３】
その結果を図６ないし図９に示した。
【０１０４】
図６ないし図９の結果によれば、本発明の一実施例によるナノ伝達体は、癌細胞いずれについても細胞毒性を示さず、正常細胞についても、細胞毒性を示さないと確認された。
【０１０５】
試験例６：ヒアルロン酸基盤ナノ伝達体の癌細胞に対する標的指向性評価
【０１０６】
試験例４及び５で培養された、Ｃ６（マウス脳腫瘍）、Ａ５４９（ヒト肺腺癌細胞）、ＭＫＮ−７４（ヒト胃癌細胞）及び３Ｔ３−Ｌ１（マウス線維芽細胞）の細胞株について、前記実施例１のヒアルロン酸基盤ナノ伝達体と、比較例１のアルギン酸基盤ナノ伝達体との吸収アッセイ（uptake assay）を行った。
【０１０７】
具体的には、４種の細胞（５．０ｘ１０５／ｍＬ）を２４ウェルプレートの各ウェルにシーディングした後、２４時間培養した。無血清培地に交替させた後、全体体積の１０％に該当するナノ伝達体（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを添加した。それを、１時間、３時間、６時間培養した後、細胞固定を施した。ウェルにある培地をいずれも吸入した後、ＰＢＳで３回洗浄した。４％パラホルムアルデヒド溶液で１０分間細胞固定させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、細胞核染色のための４’，６−ジアミノ−２フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色を進めた。ＤＡＰＩ １Ｘ濃度で細胞を３分間染色させた後、ＰＢＳで３回洗浄した。顕微鏡観察時、細胞表面での水分蒸発を防ぐために、カバーガラスでそれぞれのウェルを覆った。各条件において、蛍光顕微鏡（Carl Zeiss、Axiovert ２００）で、ＤＡＰＩ、ＰｐＩＸに対する蛍光が示されるか否かということを観察した。
【０１０８】
それぞれの結果を、図１０ないし図１３に示した。
【０１０９】
図１０ないし図１３の結果によれば、本発明の一実施例による、癌細胞に標的機能があるヒアルロン酸基盤ナノ伝達体は、癌細胞いずれに対しても、ＰｐＩＸ蛍光を示し、正常細胞においては、ＰｐＩＸ蛍光を示さないのに対し、癌細胞に標的機能がないアルギン酸基盤ナノ伝達体は、癌細胞及び正常細胞のいずれにおいても、ＰｐＩＸに対する蛍光を示さなかった。一方、核に対する染色結果であるＤＡＰＩ蛍光は、癌細胞いかん及びヒアルロン酸基盤ナノ伝達体いかんに係わりなく、全ての試験群において、ＤＡＰＩ蛍光が示された。
【０１１０】
また、蛍光スペクトルの結果、３５０ｎｍ波長と７５０ｎｍ波長との間において、いかなる励起波長も放出波長も示さず、ヒアルロン酸基盤ナノ伝達体により、５−アミノレブリン酸を含んだナノ伝達体が、癌細胞内部に正確に流入された場合、プロトポルフィリンＩＸが誘導されることを推定することができ、その推定結果と相応する吸光度及び蛍光スペクトル結果を導み出すことができた。結果として、本発明の一実施例によるナノ伝達体は、内部に５−アミノレブリン酸を封入しており、癌細胞内部に５−アミノレブリン酸が伝達され、プロトポルフィリンＩＸが誘導されるということが立証された。
【０１１１】
試験例７：葉酸・アルギン酸基盤ナノ伝達体の癌細胞に対する標的指向性評価
【０１１２】
前記実施例４で得られた癌細胞標的指向性リガンド結合多糖体である葉酸・アルギン酸基盤ナノ伝達体の細胞吸収アッセイ（cell uptake assay）を行った。
【０１１３】
まず、Ａ５４９（ヒト肺腺癌細胞）及びＳＫ−ＯＶ−３（ヒト卵巣癌細胞）の細胞株を韓国細胞種銀行（ＫＣＬＢ）から分譲され、１％のペニシリン・ストレプトマイシン（WELLGENE）及び１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ、WELLGENE）が含有されたＲＰＭＩ １６４０培地（WELLGENE）を使用し、３７℃、５％ ＣＯ２恒温器で培養し、継代培養は、２日に１回ずつ施した。
【０１１４】
前記試験例６で進めた細胞吸収アッセイ（cell uptake assay）と同一方法で行い、ただし、ナノ伝達体を添加し、３時間培養した後、細胞固定を施した。その結果を図１４に示した。
【０１１５】
図１４の結果によれば、本発明の一実施例による癌細胞標的指向性リガンド結合多糖体を含むナノ伝達体は、標的癌細胞である卵巣癌細胞（ＳＫ−ＯＶ−３）において、ＰｐＩＸ蛍光を示し、非標的癌細胞に該当する肺腺癌細胞（Ａ５４９）においては、ＰｐＩＸ蛍光を示さなかった。また、癌細胞に標的機能がない比較例１のアルギン酸基盤ナノ伝達体は、２つの細胞のいずれにおいても、ＰｐＩＸに対する蛍光を示さなかった。一方、核に対する染色結果であるＤＡＰＩ蛍光は、癌細胞いかん及び標的指向性リガンド結合多糖体基盤ナノ伝達体いかんに係わりなく、全ての試験群において、ＤＡＰＩ蛍光が示された。
【０１１６】
結果として、本発明の一実施例による標的指向性リガンドが連結された多糖体基盤のナノ伝達体は、内部に５−アミノレブリン酸を封入しており、標的とする癌細胞内部に５−アミノレブリン酸が選択的に伝達され、プロトポルフィリンＩＸが誘導されるということが立証された。
【０１１７】
前記試験例６及び７によれば、本発明によるナノ伝達体は、癌細胞を標的化する機能があり、癌細胞に対して、選択的にＰｐＩＸ蛍光を示し、癌診断に使用されるということが確認された。
【０１１８】
以上、本発明について、その望ましい実施例を中心に説明した。本発明が属する技術分野で当業者であるならば、本発明が、本発明の本質的な特性からはずれない範囲で変形された形態に具現されるということを理解することができるであろう。従って、前述の開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点から考慮されなければならない。本発明の範囲は、前述の説明ではなく、特許請求の範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての差異は、本発明に含まれたものであると解釈されなければならないのである。
【０１１９】
（付記）
（付記１）
油相成分、界面活性剤及び水相成分を含み、前記水相成分は、癌細胞蛍光誘導物質及び癌細胞ターゲティング多糖体を含む油中水ナノエマルジョンを水中で分散させ、油相成分を除去して獲得される前記水相成分を含むミセル構造のナノ伝達体。
【０１２０】
（付記２）
前記ミセル構造のナノ伝達体は、相互浸透高分子網状構造を有することを特徴とする付記１に記載のナノ伝達体。
【０１２１】
（付記３）
前記ミセル構造のナノ伝達体は、平均粒子サイズが２００ｎｍ以下であることを特徴とする付記１に記載のナノ伝達体。
【０１２２】
（付記４）
前記ナノ伝達体の平均粒子サイズは、２００ｎｍ以下であり、ゼータ電位の値は、−１０ｍＶないし〜３０ｍＶ、または１０〜３０ｍＶであることを特徴とする付記１に記載のナノ伝達体。
【０１２３】
（付記５）
前記ナノエマルジョンは、前記ナノエマルジョン全体重量を基準に、前記油相成分を７０〜８０重量％、前記水相成分を１０〜２０重量％、前記界面活性剤を５〜１５重量％含むことを特徴とする付記１に記載のナノ伝達体。
【０１２４】
（付記６）
前記界面活性剤は、単一界面活性剤または共界面活性剤であることを特徴とする付記１に記載のナノ伝達体。
【０１２５】
（付記７）
前記界面活性剤は、ＨＬＢ値が６〜９である共界面活性剤であることを特徴とする付記１に記載のナノ伝達体。
【０１２６】
（付記８）
前記界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステル（Span）及びポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル（Tween）の混合物であり、ＨＬＢ値が６〜９であることを特徴とする付記１に記載のナノ伝達体。
【０１２７】
（付記９）
前記癌細胞蛍光誘導物質は、ヘム、ヘミン、亜鉛プロトポルフィリン、マグネシウムプロトポルフィリン、ヘマトポルフィリン、ベンゾポルフィリン、メタロポルフィリン、５−アミノレブリン酸、テキサフィリン、クロリン、プルプリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、及びそれらの任意の組み合わせによって構成された群のうちから選択されることを特徴とする付記１に記載のナノ伝達体。
【０１２８】
（付記１０）
前記癌細胞ターゲティング多糖体は、ヒアルロン酸または癌細胞標的指向性リガンド結合多糖体であることを特徴とする付記１に記載のナノ伝達体。
【０１２９】
（付記１１）
前記癌細胞標的指向性リガンド結合多糖体のリガンドは、アプタマー、抗体、ペプチド、及び葉酸によって構成された群のうちから選択され、前記多糖体は、アルギン酸、キトサン、ペクチン、ベータ−グルカン、セルロース、ゼラチン、ヘミセルロース、ガラクトマンナン、イヌリン、ガム、キチン、及びそれらの任意の組み合わせによって構成された群のうちから選択されることを特徴とする付記１０に記載のナノ伝達体。
【０１３０】
（付記１２）
前記リガンド結合多糖体は、葉酸結合アルギン酸であることを特徴とする付記１１に記載のナノ伝達体。
【０１３１】
（付記１３）
前記癌細胞蛍光誘導物質は、５−アミノレブリン酸であり、前記癌細胞ターゲティング多糖体は、ヒアルロン酸であることを特徴とする付記１に記載のナノ伝達体。
【０１３２】
（付記１４）
前記油相成分は、大豆油、オリーブ油、ブドウ種子油、キャノーラ油、コーンオイル、ミネラルオイル、シリコンオイル、キャスターオイル、パラフィンオイル、及びそれらの任意の組み合わせによって構成された群のうちから選択されることを特徴とする付記１に記載のナノ伝達体。
【０１３３】
（付記１５）
付記１ないし１４のうちいずれか１つに記載のナノ伝達体を含む癌診断用薬学組成物。
【０１３４】
（付記１６）
前記癌は、脳腫瘍、肺癌、胃癌及び卵巣癌によって構成された群のうちから選択されることを特徴とする付記１４に記載の癌診断用薬学組成物。
【０１３５】
（付記１７）
油相成分を準備する段階と、
界面活性剤を準備する段階と、
水相成分を準備する段階と、
前述の油相成分、界面活性剤及び水相成分を撹拌混合し、油中水ナノエマルジョンを製造する段階と、
前記油中水ナノエマルジョンを水中で再分散させた後、油相部分を除去することにより、ナノ粒子を分離する段階と、
を含む、付記１ないし１４のうちいずれか１つに記載のナノ伝達体の製造方法。
【０１３６】
（付記１８）
前記水相成分を準備する段階は、癌細胞ターゲティング多糖体を含む第１水性成分を準備する段階と、
癌細胞蛍光誘導物質を含む第２水性成分を準備する段階と、
を含むことを特徴とする付記１７に記載の製造方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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