(57)【要約】  胃癌細胞の表面に機能的に発現するポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ２（ＰＯＤＸＬ−ｖ２）に対するモノクローナル抗体とその生成方法及び使用を提供し、前記抗体のＬ鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はその保存的変異体配列であり、Ｈ鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はその保存的変異体配列である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃癌細胞の表面に機能的に発現するポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ２に対するモノクローナル抗体であって、
当該抗体のＬ鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はその保存的変異体配列であり、当該抗体のＨ鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はその保存的変異体配列であるモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記Ｌ鎖可変領域におけるコード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はその保存的変異体配列であり、前記Ｈ鎖可変領域におけるコード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はその保存的変異体配列であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体は、マウス由来であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１Ｈ鎖及びκＬ鎖のサブタイプの免疫グロブリンであることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体におけるＨ鎖及び／又はＬ鎖の可変領域或いは全アミノ酸配列をコードする分離されたＤＮＡ分子。
【請求項６】
請求項５に記載の分離されたＤＮＡ分子を含む構造体。
【請求項７】
請求項６に記載の構造体が宿主細胞にトランスフェクションされて構成されるモノクローナル抗体の発現系。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体の生成方法であって、
前記抗体の発現に適した条件で、前記モノクローナル抗体の発現系を培養することで前記モノクローナル抗体を発現し、前記モノクローナル抗体を精製及び分離するステップを含む方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体の、腫瘍治療薬の生成又はスクリーニングにおける使用、或いは、腫瘍診断薬の生成における使用。
【請求項１０】
前記腫瘍は胃癌であり、より好ましくは、胃扁平上皮癌、胃腺癌、胃小細胞癌、胃腺扁平上皮癌、胃カルチノイド、或いは、胃及び十二指腸癌であることを特徴とする請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
治療有効投与量の、胃癌細胞の表面に機能的に発現するポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ２に対するモノクローナル抗体又はその免疫複合体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
１以上の薬学的に許容されるベクター又は賦形剤を含むことを特徴とする請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
胃癌細胞の表面に機能的に発現するポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ２に対するモノクローナル抗体又はその免疫複合体を含む診断用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオファーミング分野に関し、特に、胃癌細胞の表面に機能的に発現するポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ２（ＰＯＤＸＬ−ｖ２）に対するモノクローナル抗体（ＭＳ１７−３８と命名）とその生成方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明者である陸梅生らが過去に出願した「細胞表面の異所性発現に抵抗するモノクローナル抗体ＭＳ１７−５７とその生成方法及び使用（特許文献１。公開・許可済）の背景知識に記載されているように、胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ，ＧＣ）はヒトにとって最も一般的な消化器系の悪性腫瘍であって、腫瘍関連死の主な原因の一つとなっている。中国、日本などは世界で最も胃癌発症率の高い国である。これらの国では毎年新たに６０〜７０万近い発症例が確認されており、世界の症例の多数を占めている。また、胃癌患者の多くは初診の段階ですでに臨床末期となっている。現在、胃癌の早期スクリーニング検査や診断は主に胃カメラと組織病理学的生検に依存しているが、こうした早期スクリーニング検査や診断に依存した手段では、その特異性、感度、精度及び安全性にある程度の限界があり、普及が困難である。また、様々な干渉要因が存在するほか、臨床での応用効果が満足のいくものとなっていない。結果、胃癌患者の多くには初診の段階ですでに他の臓器への転移が認められ、外科手術や放射線治療、全身化学療法等に頼らざるを得ない。こうした従来の治療或いは救命対策は費用が高騰するだけでなく、個人や社会の経済的負担が大幅に増加するほか、治療の特異性や治療効果が十分でない等の課題がある。概算によれば、末期胃癌患者の５年生存率は一般的に１０％以下となっている。よって、胃癌における特異的且つ高効率の新たな臨床治療方法が緊急に必要とされている。近年、新たな化学治療薬や併用療法（オーダーメイド医療）の実施によって胃癌患者の治療反応性はある程度向上している。しかし、臨床研究についてランダム調査を実施した結果、生存期間中央値１年以上との治療目標は未だ達成されていないことがわかった。
【０００３】
化学療法や放射線治療は胃癌に対する感度が一般的に低く、且つ、これらに代わる治療プランも存在しない。そのため、ここ数年は胃癌の新たな治療方法や薬物の研究開発が基礎研究及び臨床研究の焦点となっている。２００２年、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）の癌専門家らは、腫瘍患者のカスタマイズ治療や再発検査、予後評価等が効果的に実現されるよう、腫瘍の分子分析について定義を提案した。こうした新たな理念を指針として、胃癌の分子標的治療や分子生体機能学的治療が急速に発展しており、腫瘍治療の新たな流れともなっている。
【０００４】
発明者である陸梅生らは、過去に出願した「細胞表面の異所性発現に抵抗するモノクローナル抗体とその生成方法及び使用」（特許文献１。開示・許可済）において、更に、腫瘍マーカーを標的とした治療や生体機能学的治療では、腫瘍細胞の表面に過剰に発現又は機能的に発現する何らかのバイオマーカー分子を標的にすると述べている。１９９０年代以降、様々な分子標的治療薬（抗体薬を含む）が続々と臨床試験における腫瘍治療に取り入れられ、良好な治療効果を示してきた。これらは、大分子のモノクローナル抗体（細胞外に作用する治療抗体薬）と、小分子のチロシンキナーゼ阻害薬（細胞内に作用する化学系薬物）の２種類に大別される。抗体薬は、対応する腫瘍細胞外受容体を高度な特異性をもって識別及び結合可能であり、速やかに細胞の生体機能を活性化する。また、機能の活性化が不可能な場合には、１．抗体−薬物複合（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，ＡＤＣ）、２．抗体と放射性同位体を結合して実施する特異性放射免疫療法、３．キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）によるＴ細胞免疫療法、といったその他いくつかの抗体療法が存在する。我々は、これらを腫瘍の抗体標的療法（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＡＴＴ）と抗体生体機能学的療法（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＡＢＴ）としてまとめた。更に、後者の抗体生体機能学的療法（ＡＢＴ）は、抗体と生体機能を連携させるアゴニスト（Ａｇｏｎｉｓｔ）と、抗体と生体機能を競わせるアンタゴニスト（Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）に分けられる。抗体の生体機能は主な役割として、腫瘍細胞から発生して成長する関連分子を標的とし、腫瘍の特異的殺傷を実現することで、転移を防止したり、腫瘍を成長させる微小環境に干渉したりする。そのため、従来の化学療法や放射線治療、東洋医学・漢方薬と比較して、抗体薬は効果がより明らかであり、効用が長く持続し、且つ副作用も少ない。したがって、腫瘍の抗体生体機能学的療法は腫瘍治療発展の大勢になるものと考えられる。
【０００５】
発明者である陸梅生らが過去に出願した「細胞表面の異所性発現に抵抗するモノクローナル抗体とその生成方法及び使用」（特許文献１。開示・許可済）では、胃癌の抗体治療の背景について、更に、抗体薬による胃癌治療がここ数年急速に発展しているとの記載がある。しかし、現在米国ＦＤＡの承認を受けている一部抗体薬については、前臨床毒性試験や各臨床フェーズでの症例報告から、特異性の低さ、標的性の弱さ、実際の臨床治療効果が総体的に十分でないといった点が明らかになっている。これらの薬物には、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に抵抗するセツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）モノクローナル抗体薬であるアービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、抗上皮成長因子受容体−２（ＥＧＦＲ２）又はＨＥＲ２を標的とするトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）モノクローナル抗体薬であるハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、及び、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とするベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）モノクローナル抗体薬であるアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）等が含まれる。そこで、現在の腫瘍臨床医学における喫緊の必要性に対応すべく、胃癌の生体機能を標的とする高効率のモノクローナル抗体薬を生成することが求められている。学者のＢｒｉｃｈｏｒｙは、世界で初めてプロテオミクスにおけるポリペプチドの合成又は構築方法を、腫瘍関連抗原の鑑定とスクリーニング、及び抗腫瘍抗体分野に取り入れた。人々は、このような構想及び方法から、例えばグルコース調節タンパク質（Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＲＰ７８）、熱ショックタンパク質−２７，−６０，−７０等（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ−２７，−６０，−７０等）、及びフィブリノペプチド−Ａ（Ｆｉｂｒｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ａ）など、新たな細胞内及び細胞外の腫瘍マーカータンパク質分子を多数開示してきた。しかし、こうした手段は多くの限界をもたらしてもいる。なぜなら、腫瘍の生体機能学的標的は細胞表面の特異性抗原だけでなく、機能としてタンパク質の空間構造又は天然の立体構造を備えている必要があるからである。このことが、Ｂｒｉｃｈｏｒｙ構想の更なる研究及び応用を大きく制限している。一方、本研究及び発明では、人体が生物学的に自然な状態で、生細胞の免疫及びハイスループットフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）による生細胞のスクリーニングを行い、胃癌又はその他腫瘍細胞表面の特異性抗原を鑑定することで、特異的且つ高効率の治療抗体薬を捕捉及び生成する。また、胃癌の分子マーカー鑑定及び胃癌の標的治療用モノクローナル抗体薬の臨床応用に有力なツールを提供する。
【０００６】
ポドカリキシン（Ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ，ＰＣ）は、主に糸球体の基底膜における足細胞（Ｐｏｄｏｃｙｔｅ）表面に発現する糖タンパク質である。タンパク質の等電点（ｐＩ）は７未満であり、酸性且つマイナス電荷を有している。ポドカリキシンは、糸球体の足細胞上で濾過隙間の開発を維持する役割を果たす。また、ポドカリキシンは、血小板による凝血、初期糖尿病の発症においても一定の役割を果たす。一方で、ポドカリキシン様タンパク質（Ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ−Ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＯＤＸＬ）はヒト特有のものであり、ＰＯＤＸＬ遺伝子でコードされる唾液ムチンファミリーに属している。ポドカリキシン様タンパク質は、細胞内の構成要素を有するＮａ＋／Ｈ＋交換輸送体（Ｎａ＋／Ｈ＋ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ、ＮＨＥ）と複合物を構成するとともに、造血細胞の分化において一定の役割を果たす。ポドカリキシン様タンパク質は血管内皮細胞で発現し、Ｌ−セレクチン（Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）と結合可能である。また、ＰＯＤＸＬは、異なるアミノ酸配列や異なるポリペプチド断片長さのサブタイプを有し、且つ、異なる組織、細胞及び腫瘍上で発現する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】中国特許出願第２０１３１００９０５６５．９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した従来技術の欠点に鑑みて、本発明は、従来技術の課題を解決するための胃癌細胞の表面に機能的に発現するポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ２（英文略称：ＰＯＤＸＬ−ｖ２、英文正式名称：Ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ  Ｉｓｏｆｏｒｍ  ２  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＰＯＤＸＬ−ｖ２）に抵抗するモノクローナル抗体とその生成方法及び使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的及びその他関連の目的を実現すべく、本発明は第一の局面において、胃癌細胞の表面に機能的に発現するポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ２（ＰＯＤＸＬ−ｖ２）に対するモノクローナル抗体（ＭＳ１７−３８）であって、当該抗体のＬ鎖可変領域におけるアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はその保存的変異体配列であり、当該抗体のＨ鎖可変領域におけるアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はその保存的変異体配列であるモノクローナル抗体を提供する。
【００１０】
好ましくは、前記Ｌ鎖可変領域におけるコード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はその保存的変異体配列であり、前記Ｈ鎖可変領域におけるコード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はその保存的変異体配列である。
【００１１】
好ましくは、前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体はマウス由来である。
【００１２】
より好ましくは、前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１Ｈ鎖及びκ  Ｌ鎖のサブタイプの免疫グロブリンである。
【００１３】
本発明で提供するＭＳ１７−３８モノクローナル抗体は、腫瘍細胞の表面に機能的に発現するＰＯＤＸＬ−ｖ２抗原（又は受容体或いはエピトープ）に抵抗（結合又は作用）するか、或いは、部分的にＰＯＤＸＬ抗原に抵抗（結合又は作用）するか、或いは、部分的にＰＯＤＸＬ−ｖ１抗原に抵抗（結合又は作用）するモノクローナル抗体である。
【００１４】
更に、本発明は、前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体の誘導体を提供する。前記誘導体は、前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体の断片としてもよいし、或いは、前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体又はＭＳ１７−３８モノクローナル抗体の断片を含む融合タンパク質としてもよい。また、前記モノクローナル抗体の断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖ等である。
【００１５】
本発明は第二の局面において、前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体におけるＨ鎖及び／又はＬ鎖の可変領域或いは全アミノ酸をコードする分離されたＤＮＡ分子を提供する。
【００１６】
本発明は第三の局面において、前記分離されたＤＮＡ分子を含む構造体を提供する。
【００１７】
好ましくは、前記ＤＮＡベクター発現構造体は、前記分離された抗体のＤＮＡ分子を発現ベクターのマルチクローニングサイトに挿入することで構築される。
【００１８】
前記発現ベクターは、具体的に、当業者が熟知するこれまで常用されてきた発現ベクターとすればよい。具体的に適用可能な発現ベクターには、ｐＥＴ系発現ベクター、ｐＧＥＸ系発現ベクター、ｐｃＤＮＡ系発現ベクター等が含まれるがこれらに限らない。
【００１９】
本発明は第四の局面において、上記構造体が宿主細胞にトランスフェクションされて構成されるモノクローナル抗体の発現系を提供する。
【００２０】
発現ベクター（構造体）に適用されて本件特許に記載する抗体を発現するあらゆる細胞が宿主細胞となり得る。例えば、酵母、昆虫、植物等の細胞が可能である。好ましくは、前記宿主細胞は真核細胞であり、抗体を産生しない哺乳動物の宿主細胞系を用いればよい。具体的に使用可能な細胞系には、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）、幼少ハムスターの腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、幼少マウスのセルトリ細胞（Ｓｅｒｔｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ）、サルの腎細胞（ＣＯＳ細胞）、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５ １）により形質転換したサルの腎臓ＣＶＩ細胞、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ−２９３）、サルの腎細胞（ＣＶＩ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７０）、アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）等が含まれるがこれらに限らない。
【００２１】
本発明では、効果的な腫瘍生細胞のハイスループットスクリーニング方法を構築する。ヒトの胃癌細胞系生細胞を混合してマウスを免疫するとともに、高い免疫反応を示したマウスの脾臓を選択してマウスのＳＰ２／０細胞系と融合することで抗体ハイブリドーマを産生する。そして、抗胃癌細胞系ハイブリドーマ抗体に対しハイスループット生細胞スクリーニングを行うとともに、健常人の新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対し対照スクリーニングを行うことで、このハイブリドーマ株からなる胃癌細胞に対し高い特異的反応を示すモノクローナル抗体ＭＳ１７−３８を取得する。更に、本発明は発現ベクターを構築すべく、モノクローナル抗体を培養する細胞株からスクリーニングにより目的の抗体の遺伝子コード配列を取得する。発現系による発現で抗体は活性を再構築し、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体が得られる。
【００２２】
前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体は、次の手順でスクリーニングすることで得られる。即ち、４種類の混合胃癌細胞株ＳＧＣ７９０１、ＢＧＣ８２３、ＭＫＮ２８、ＭＫＮ４５の生細胞を用いて複数部位でマウスを免疫し、免疫したマウスの脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞を融合する。そして、上記４種類の胃癌生細胞の表面に結合可能な抗原を分泌可能だが健常人の末梢血単核細胞とは反応しないハイブリドーマ株をスクリーニングする。このハイブリドーマ株をサブクローニングしてから、培養されたハイブリドーマの上清液を取得して、親和及び精製すれば前記モノクローナル抗体ＭＳ１７−３８が得られる。本発明の一実施例において、前記４種類の混合胃癌細胞株ＳＧＣ７９０１、ＢＧＣ８２３、ＭＫＮ２８、ＭＫＮ４５の生細胞は等しい比率で混合することが好ましい。また、前記マウスの骨髄腫細胞は、ＳＰ２／０マウスの骨髄腫細胞である。具体的な融合方法としてはＰＥＧ化学融合法を用い、ハイブリドーマの培養上清液を免疫アフィニティークロマトグラフィーで精製する。
【００２３】
本発明は第五の局面において、前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体の生成方法であって、前記抗体の発現に適した条件で、前記モノクローナル抗体の発現系を培養することで前記モノクローナル抗体を発現し、前記モノクローナル抗体を精製及び分離するステップを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明の抗体をコードする核酸配列を取得した後、以下の方法で目的の抗体を生産可能である。例えば、目的の抗体をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞に直接組み込み、適切な条件で細胞を培養することでコードされた抗体の発現を誘導する。本発明で使用する発現ベクター及び宿主細胞はいずれも従来技術であり、商業ルートから直接取得可能である。培養に使用する１０％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地もまた各種の一般的な哺乳細胞培地である。当業者であれば、適用するＤＭＥＭ培地を経験的に選択し、宿主細胞の成長に適した条件で培養することが可能である。宿主細胞が適切な細胞密度まで成長すると、適切な方法（例えば、温度変換又は化学誘導）で誘導及び選択したプロモーターを用い、細胞を更に一定期間培養する。上記方法における組み換えポリペプチドは、細胞内又は細胞膜上に発現可能であるか、細胞外に分泌される。本発明で述べるモノクローナル抗体を取得すれば、その物理的特性、化学的特性及びその他の特性を利用して、各種分離方法により前記モノクローナル抗体を分離及び精製可能となる。これらの方法は、当業者が熟知するものである。また、これらの方法の例としては、一般的な復元処理、タンパク質沈殿剤処理（塩析方法）、遠心、浸透菌破砕、超処理、超遠心、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びその他各種の液体クロマトグラフィー技術及びこれらの組み合わせを含むが上記に限らない。
【００２５】
本発明は第六の局面において、前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体の、腫瘍治療薬の生成又はスクリーニングにおける使用、或いは、腫瘍診断薬の生成における使用を提供する。
【００２６】
前記腫瘍治療薬とは、具体的に、腫瘍細胞の表面に機能的に発現するＰＯＤＸＬ−ｖ２を抗原とし、前記抗原ＰＯＤＸＬ−ｖ２に結合又は作用することで癌の治療及び原発癌の転移予防を行う薬物のことをいう。前記抗原ＰＯＤＸＬ−ｖ２に対する結合又は作用には、具体的に、ＰＯＤＸＬ−ｖ２抗原の免疫抑制、又は、特異性モノクローナル抗体により腫瘍の抗原を識別し、腫瘍治療薬を指向的に腫瘍部位に集中させることで腫瘍細胞を選択的に殺傷すること等が含まれるが、これらに限らない。
【００２７】
したがって、腫瘍診断薬とは、具体的に、腫瘍細胞の作用標的であるＰＯＤＸＬ−ｖ２に対し、ＰＯＤＸＬ−ｖ２をバイオマーカーとして、鑑別診断、病理診断、早期診断、映像診断及び予後診断等を行うための診断用試薬をいう。
【００２８】
好ましくは、前記腫瘍は胃癌である。
【００２９】
より好ましくは、前記胃癌は、胃扁平上皮癌、胃腺癌、胃小細胞癌、胃腺扁平上皮癌、胃カルチノイド又は胃・十二指腸癌である。
【００３０】
本発明は第七の局面において、治療有効量の前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体又はその免疫複合体を含む医薬組成物を提供する。
【００３１】
前記免疫複合体は、前記モノクローナル抗体又はその断片及び薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素又はその他の診断用試薬等を組み合わせてなる複合体を含むがこれらに限らない。
【００３２】
前記医薬組成物とは、腫瘍細胞の表面に機能的に発現するＰＯＤＸＬ−ｖ２を抗原とし、前記抗原に結合又は作用することで癌の治療及び／又は原発癌の転移予防を行うものをいう。
【００３３】
本発明のＭＳ１７−３８モノクローナル抗体は、当該分野における既知のあらゆる方式で医薬組成物を調合して使用すればよい。このような組成物は、前記モノクローナル抗体を活性成分とし、１又は複数の薬学的に受け入れ可能なベクター又は賦形剤が加えられる。前記ベクター又は賦形剤は、前記モノクローナル抗体と親和性のあるものとすべきである。
【００３４】
前記医薬組成物は胃癌の治療に用いられ、好ましくは、胃扁平上皮癌、胃腺癌、胃小細胞癌、胃腺扁平上皮癌、胃カルチノイド又は胃・十二指腸癌の１又は複数の組み合わせの治療に用いられる。前記医薬組成物を対象体内の腫瘍の予防又は治療に用いる場合には、有効投与量の前記医薬組成物を対象に投与すればよい。
【００３５】
本発明は第八の局面において、治療有効量の前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体又はその免疫複合体を含む診断用試薬キットを提供する。
【００３６】
したがって、診断用試薬キットとは、腫瘍細胞の作用標的であるＰＯＤＸＬ−ｖ２に対し、ＰＯＤＸＬ−ｖ２をバイオマーカーとして、鑑別診断、病理診断、早期診断、映像診断及び予後診断等を行うものをいう。
【００３７】
好ましくは、前記診断用試薬キットは、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体のマーカーを更に含む。
【００３８】
前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体のマーカーとＭＳ１７−３８モノクローナル抗体との結合に適用可能なマーカーの種類には、蛍光マーカー、放射性マーカー、酵素標識マーカー、化学発光性マーカーのうち１又は複数の組み合わせが含まれるがこれらに限らない。
【００３９】
試薬キットの検出原理に応じて、前記試薬キットは検出に必要な１又は複数の試薬を含んでもよい。また、必要に応じて、前記試薬キットには、容器、対照物（陰性又は陽性）、緩衝剤、助剤等を含んでもよい。
【００４０】
本発明は、更に、逆スクリーニングにより胃癌細胞表面の抗原を鑑定し、新たなバイオマーカー抗原を取得する抗胃癌モノクローナル抗体を生成して取得する。具体的に、本発明は、腫瘍バイオマーカーを発見及び鑑定するとともに、当該マーカー抗原（胃癌細胞表面における天然立体構造のＰＯＤＸＬ−ｖ２抗原）に対する特異性ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体を生成する一方、当該特異性抗体に基づいて、対応する特異性胃癌分子マーカーである細胞膜発現タンパク質ＰＯＤＸＬ−ｖ２をスクリーニングにより鑑定する。
【００４１】
本発明において、抗体に結合される腫瘍細胞表面の発現抗原を抗体のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）によって逆鑑定するとの戦略は、胃癌細胞表面の分子マーカーに対する特異性モノクローナル抗体を生成するとともに、スクリーニングにより新たな胃癌分子マーカーを鑑定可能とすることを目的としている。モノクローナル抗体は、プロテオミクス研究にとって良好なツールである。従来のモノクローナル抗体生成過程では抗体をハイブリダイゼーションする方法を用いており、通常は分子マーカーによる免疫は用いず、融合後に大量のプレーティングを行うＨＴＳ方法を用いることも少なかった。そのため、抗細胞抗原天然エピトープ抗体が取得される確率が低かった（従来の抗体スクリーニング生成方法では、腫瘍生細胞表面の天然立体構造の抗原を識別するような抗体を得ることは難しかった）。これに対し、本発明では、「ショットガン法」（“Ｓｈｏｔ−Ｇｕｎ”ｍｅｔｈｏｄ）に類似する方法で生細胞を免疫し、抗体のハイブリダイゼーション技術とフローサイトメトリーハイスループット検出を組み合わせている。腫瘍生細胞でマウスを免疫し、独特の抗体ハイブリダイゼーションによる高融合手法で融合及び大量のプレーティング（毎回５０〜８０枚）を行い、生細胞に対する蛍光フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）−ＨＴＳを組み合わせて検出及びスクリーニングする方法で、細胞表面に立体構造エピトープ（Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅ）を備える分子マーカーに対するモノクローナル抗体を生細胞レベルで直接スクリーニングするとともに、再検査により抗体ハイブリドーマのサブクローンを鑑定する。そして、最後に、特異的且つ高親和性のモノクローナル抗体として、胃癌細胞表面の天然立体構造ＰＯＤＸＬ−ｖ２抗原に対するＭＳ１７−３８特異性抗体を選択する。また、ＭＳ１７−３８抗体を鑑定するとともに、ＭＳ１７−３８抗体及び胃癌について臨床病理学的なパラメーターの相関分析を行った後、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法及びタンパク質質量分析によって、生成されたＭＳ１７−３８抗体が特異的に結合する標的抗原タンパク質を迅速に鑑定する。こうして、ＰＯＤＸＬ−ｖ２という新たな胃癌細胞表面の分子マーカーがスクリーニングにより発見された。
【００４２】
本発明のＭＳ１７−３８モノクローナル抗体は、複合物全体の分子量が１３５ｋＤａであり、腫瘍細胞表面に自然に発現するとともに空間立体構造を有するポドカリキシン様タンパク質前駆体サブタイプ２（ＰＯＤＸＬ−ｖ２）の分子に対しては高い特異性をもって反応する一方、ＰＯＤＸＬ−ｖ２単体の分子量が約５１ｋＤａである線形体分子のタンパク質に対しては反応しない。本発明における特殊なモノクローナル抗体のハイブリドーマスクリーニング設計では、発現するモノクローナル抗体がＭＳ１７−３８と称されるモノクローナル抗体のハイブリドーマ株から分泌されて産生する。また、マウスのモノクローナル抗体のサブタイプはＩｇＧ１Ｈ鎖及びκＬ鎖に属している。
【００４３】
本発明では、生成により取得した胃癌混合細胞株に対する特異性モノクローナル抗体と胃癌等の消化器腫瘍について臨床病理学的パラメーターの関連分析を実施した。そして、腫瘍細胞表面のＰＯＤＸＬ−ｖ２分子に対するＭＳ１７−３８モノクローナル抗体の作用及び機能を分析したところ、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体がヒト胃癌細胞の表面のＰＯＤＸＬ抗原に対して産生されたものであり、特異性及び機能的生体反応を誘導可能なことから、胃癌等の消化器腫瘍を特異的に識別して標的治療することが可能であるとともに、消化器腫瘍の診断及び映像にも応用可能であることを発見した。本発明は、胃癌及び消化器固形腫瘍細胞の表面の天然立体構造を持つ抗原に対する特異性抗体をハイスループットで生成可能な全く新しい方法を構築した。また、取得されるＭＳ１７−３８モノクローナル抗体はプロテオミクス研究のツールとなり、胃癌等の消化器固形腫瘍細胞の表面における分子標的マーカーを逆スクリーニングにより鑑定可能である。前記モノクローナル抗体は、キメラ化又はヒト化することで、更にヒトの胃癌治療用バイオ薬剤を開発可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、４種類の混合胃癌細胞株で免疫したマウスの血清と、健常人ＰＢＭＣ、胃癌ＳＧＣ７９０１及びＢＧＣ８２３細胞株との力価反応をＦＡＣＳにより検出したものである。
【図２】図２は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と、４種類の免疫用胃癌細胞株及びその他の対照細胞株とを異なるレベルでそれぞれ結合反応させた場合をＦＡＣＳにより検出したものである。図２（Ａ）は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体及び対照抗体と、ＳＧＣ−７９０１及びＢＧＣ−８２３胃癌細胞株との結合反応を示す。図２（Ｂ）は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体及び対照抗体と、ＭＫＮ−４５、ＢＧＣ−８２３及び健常人の末梢血ＰＢＭＣ細胞とをそれぞれ結合反応させた場合を示す。
【図３】図３は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と２種類の胃癌細胞株を異なるレベルでそれぞれ結合反応させた場合をＦＡＣＳにより検出したものである。図３では、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体及び対照抗体と、ＭＫＮ−２８及びＡＧＳ−Ｎ細胞株との反応を示している。
【図４】図４は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と２つの対照細胞株を異なるレベルでそれぞれ結合反応させた場合をＦＡＣＳにより検出したものである。図４では、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体及び対照抗体と、健常人の末梢血ＰＢＭＣ細胞及び胎児の胃粘膜上皮形質転換細胞株ＧＥＳ−１細胞株とをそれぞれ結合反応させている。
【図５】図５は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と、胃癌ＢＧＣ８２３細胞膜抽出タンパク質との結合反応をＥＬＩＳＡで検出したものである。
【図６】図６は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と、胃癌ＭＫＮ４５細胞膜抽出タンパク質との結合反応をＥＬＩＳＡで検出したものである。
【図７】図７は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体及びアイソタイプが同じ無関係なモノクローナル抗体の、Ａ．胃粘膜形質転換細胞ＧＥＳ−１、Ｂ．胃癌細胞ＭＫＮ−４５、Ｃ．胃癌細胞ＢＧＣ−８２３における免疫組織化学反応を検出したものである。
【図８】図８は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体によって胃癌ＢＧＣ８２及びＭＫＮ４５の細胞膜抽出標的タンパク質に対し実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの精製ストリップを示す。
【図９】図９は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体によって胃癌ＢＧＣ８２及びＭＫＮ４５の細胞膜抽出標的タンパク質に対し実施した３度の質量分析の結果である。
【図１０】図１０は、マイクロマトリックスチップに積載した６−ｍｅｒ及び８−ｍｅｒのアミノ酸をＭＳ１７−３８モノクローナル抗体により分析したものである。
【図１１】図１１は、ＰＯＤＸＬ、ＰＯＤＸＬ−ｖ１、ＰＯＤＸＬ−ｖ２のアミノ酸配列における比較及びこれらの違いと、ＰＯＤＸＬ−ｖ２における空間立体構造の座位のうちＭＳ１７−３８モノクローナル抗体が具体的に結合する２つの座位を示している。
【図１２】図１２は、ＭＫＮ４５細胞膜上でのＰＯＤＸＬ−ｖ２の発現をＰＯＤＸＬ−ｖ２とｓｉＲＮＡが干渉することをウェスタンブロット試験により示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下に、特定の具体的実施例を挙げて本発明の実施形態につき説明する。なお、当業者であれば本明細書に開示の内容から本発明のその他の利点及び効果を容易に理解可能である。更に、本発明はその他の異なる具体的実施形態によっても実施又は応用可能である。また、本明細書の各詳細事項については、視点及び応用の違いに応じて、本発明の精神を逸脱しないことを前提に各種の補足又は変更が可能である。
【００４６】
本発明の具体的実施形態について更に記載する前に、本発明による保護の範囲は後述する特定の具体的実施方案に限らないと解釈すべきである。また、本発明の実施例で使用される用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明による保護の範囲を制限するものではないと解釈すべきである。本発明の明細書及び請求の範囲では、特に明記しない限り、「１つ」「一の」及び「この」といった単数形には複数形が含まれる。
【００４７】
実施例が数値範囲を提示する場合、本発明においては特に説明がない限り、各数値範囲の２つの端点及び２つの端点間の任意の数値をいずれも使用可能であると解釈すべきである。また、特に定義されない限り、本発明で使用されるあらゆる技術用語及び科学用語は、当業者が一般的に理解する意味と同義である。実施例で使用される具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者が把握する従来技術及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例における上記の方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。
【００４８】
また、別途説明がない限り、本発明で開示される実験方法、検出方法、生成方法には、当業者にとって一般的な分子生物学、生物化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野の一般的技術を採用可能である。これら技術については、既存の文献に十分に説明されている。具体的には、以下の文献等を参照すればよい。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  他，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９  ａｎｄ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１
Ａｕｓｕｂｅｌ  他，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ
ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８
ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９
ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹと、Ｖｏｌ．１１９，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９
【００４９】
実施例１
４種類の等しい比率で混合した４株の胃癌細胞（ＢＧＣ−８２３、ＭＫＮ−２８、ＭＫＮ−４５及びＳＧＣ−７９０１。いずれも中国科学院上海細胞生物学研究所製）を用い、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地及び５％ＣＯ２、３７℃環境で培養した後、収集した生細胞をＰＢＳ緩衝液内で混合して免疫原とした。続いて、これをＡ／Ｊ−ＪＡＸマウス（南京大学実験動物モデルセンターより購入。マウスは米国ジャクソン研究所由来）の背部皮下及び尾静脈に注射して免疫した。なお、毎回マウス１匹につき各部位３〜５百万の細胞（０．１ｍｌ）を注射した。免疫は隔週で実施された。３回目の免疫から１週間後にマウスの血清を抽出し、フローサイトメトリーハイスループットシステム（ＦＡＣＳ−ＨＴＳ）によって、血清と４種類の混合胃癌細胞株との反応状況を検出した（具体的には実施例３を参照）。また、健常人ボランティアのＰＢＭＣを対照細胞とした（健常人ボランティアの末梢血からフィコール液で末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣ）を分離し、蛍光フローサイトメトリーハイスループットスクリーニング（ＦＡＣＳ−ＨＴＳ）における健常人の細胞抗原として対照スクリーニングした）。そして、血清の力価が高く、且つ対照細胞ＰＢＭＣとの交叉反応レベルが低いマウス（同じ希釈比率で、血清と胃癌細胞及び対照細胞との平均蛍光強度値の差＞５００）を選択し、融合前に免疫を強化した。
【００５０】
そして、免疫を強化したマウスの脾臓を抽出し、無血清のＤＭＥＭ培養液を用いて免疫応答性の高かった１号マウスの脾臓細胞を単一細胞懸濁液とした。５０％ＰＥＧ（ｐＨ７．４）条件下で脾臓細胞とＳＰ２／０マウスの骨髄腫細胞を融合し、融合後に大量プレーティング（５０プレート）してから、抗体ハイブリドーマのクローンが形成されるまでＨＡＴ選択培地で１０日間培養した。次に、大量培養した前記４種類の胃癌細胞株をスクリーニング対象として収集及び混合するとともに、健常人の末梢血ＰＢＭＣ細胞をスクリーニング用の対照細胞として分離した。２群の細胞（第１群は４種類の胃癌細胞を等しい比率で混合したもの、第２群は健常人の末梢血ＰＢＭＣ細胞）はいずれも氷上で予め冷却した１．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ系ブロッキング溶液中でそれぞれ再懸濁し、５１枚の９６ウェルＵ型プレート内に均一に（各ウェルにつき約１０万〜２０万細胞）分配した（合計１０２枚。５１枚目のプレート２枚については、それぞれ陽性（免疫後のマウス血清且つ段階希釈）及び陰性（正常なマウス血清、段階希釈及びＨＡＴ選択培養液）の対照プレートとした）。
【００５１】
続いて、５０枚の抗体ハイブリドーマ融合プレート（９６ウェルプレート）の上清液（初期モノクローナル抗体である第１抗体に相当）を毎回７０μＬ／ウェルずつ対応するスクリーニングプレート及び対照プレートにそれぞれ移し、振とう混合した。そして、氷浴反応させ、ブロッキング溶液で洗浄した後に、１００μＬ／ウェルのＦＩＴＣ蛍光標識したヤギ抗マウスを加えて細胞蛍光染色実験を実施し反応させた。これによる蛍光フローサイトメトリーハイスループットスクリーニング（ＦＡＣＳ−ＨＴＳ）では、まずブランク対照ウェルとアイソタイプ対照ウェルの細胞でＦＡＣＳのパラメーターを調節し、バックグラウンドとした。そして、２群の９６ウェルＵ型プレートにおける各ウェルの細胞サンプルについて一つずつＦＡＣＳ検出を実施し、下記２つの条件を満たしたものを陽性細胞ウェルとした。
（１）４株の胃癌細胞の表面抗原との間に結合反応がある（即ち、アイソタイプ対照の信号ピークと比較して、サンプルの信号ピークのずれ幅が対数値１つ分よりも大きい）。
（２）ＰＢＭＣ細胞との間に結合反応がない（即ち、アイソタイプ対照の信号ピークと比較して、サンプルの信号ピークのずれ幅が５〜１０％未満）。
このようにして選択及び採取された独特な結合を示すハイブリドーマのハイスループットスクリーニング細胞は、選択培地や一般的な１０％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地、ハイブリドーマのサブクローニング及び複数回に渡る抗体ハイブリドーマの培養上清検出を経たものである。ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体に対応するハイブリドーマの上清は、親和及び精製を経て０．２μｍ膜で濾過し、４℃で無菌保存した。或いは、５０％グリセリンを添加して−２０℃で長期保存した。
【００５２】
実施例２
ＱＩＡＧＥＮ社（米国カリフォルニア州バレンシア）のＲＮｅａｓｙ試薬キットを用いてＭＳ１７−３８モノクローナル抗体のハイブリドーマ株からトータルＲＮＡを抽出し、インビトロジェン社（米国ニューヨーク州グランドアイランド）のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ試薬キットを用いてｍＲＮＡをＭＳ１７−３８モノクローナル抗体のｃＤＮＡライブラリに逆転写した。次に、ドイツＰｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社の「Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ」（Ｆ２０１０）試薬キットに含まれる２３個のプライマー及び実験方法を用い、２１個の特定のプライマー対によるＰＣＲ反応を実施した（λＬ鎖の反応は含まない）。そして、発生した特異的なＬ鎖・Ｈ鎖の産物について、ＤＮＡシークエンシング、アミノ酸ポリペプチド配列の翻訳、及びＣＤＲｓ（抗原決定基領域）とＦＷ（足場領域）の識別を実施した。具体的な結果を以下に示す。
【００５３】
ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体のＬ鎖可変領域におけるコード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のようになった。
2019510506.tif 000002
【００５４】
ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体のＬ鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のようになった。
2019510506.tif 000003
【００５５】
ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体のＨ鎖可変領域におけるコード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のようになった。
2019510506.tif 000004
【００５６】
ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体のＨ鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のようになった。
2019510506.tif 000005
【００５７】
コード配列であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、それぞれアミノ酸配列であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対応している。アミノ酸配列における下線部はＣＤＲ領域の位置を示しており、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の順で配列されている。また、これらの間の領域が足場タンパク質配列（ＦＷ）である。
【００５８】
実施例３
ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体全長における真核発現ベクターの構築及びその発現細胞株の作製：
【００５９】
ＰＣＲ反応によって上記Ｌ鎖可変領域及びＨ鎖可変領域のＤＮＡのコード配列を増幅し、抗体のＨ鎖可変領域とＬ鎖可変領域の遺伝子の両端に適切な酵素切断点を組み込んだ。ＰＣＲ増幅後に、Ｌ鎖可変領域の遺伝子及びＨ鎖可変領域の遺伝子のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で回収し精製した。Ｌ鎖及びＨ鎖の増幅産物はそれぞれ対応する制限酵素に加え、酵素切断産物をＤＮＡ回収・精製試薬キットにより精製した。ＰＣＲにより取得したＨ鎖（ＶＨ）及びＬ鎖（ＶＬ）の産物をヒトＩｇＧ１ＣＨ１及びＣＬを含有する中間ベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ）とライゲーションすることで中間ベクターｐＧＥＭ−Ｔ−Ｈ及びｐＧＥＭ−Ｔ−Ｌをそれぞれ取得してから、取得したＶＬ＋ＣＬ及びＶＨ＋ＣＨ１遺伝子をベクターｐｃＤＮＡ３．１に組み替えた。ライゲーション産物はＤＨ５α大腸菌に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する２ＹＴ寒天培地に塗布した。取得した陽性クローンは５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する２ＹＴ液体培地で培養し、インビトロジェン社によるシークエンシング検証の後に、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて陽性クローンのプラスミドを抽出した。
【００６０】
続いて、インビトロジェン社のＮｅｏｎシステムを用い、線形化したプラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションしたＣＨＯ細胞は希釈クローニング培養し、５０マイクロモル（μｍｏｌ）のメチオニンスルホキシミン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ，ＭＳＸ）を含有する９４１１３培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でスクリーニングすることで、モノクローナル抗体発現細胞系を取得した。
【００６１】
取得したモノクローナル細胞系は、５０μｍｏｌのメチオニンスルホキシミンを含有する９４１１３培地で振とうフラスコ培養し、生細胞の密度が３０％未満となってから細胞培養液の上清を収集した。そして、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムを用い、細胞培養上清から目的の抗体を分離精製した。
【００６２】
次に、モノクローナル細胞からＲＮＡを抽出して目的遺伝子の検出を行い、取得したモノクローナル細胞の目的遺伝子のコピー数を確認して、前記ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体であることを検証した。また、抗体タンパク質のＮ末端シークエンシングを実施した結果、抗体ハイブリドーマ株から検出される抗体アミノ酸と配列と一致していた。
【００６３】
実施例４
９６ウェル「Ｕ」型プレート上で、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて各ウェルにつき平均約２０万個の異なる胃癌細胞（胃癌のＳＧＣ７９０１及びＢＧＣ８２３細胞株と、対照として健常人ＰＢＭＣ）／１００μＬとなるよう配合し、Ｕ型プレートに加えた。そして、胃癌生細胞で免疫した血清（実施例１で取得した免疫後のマウス血清）をそれぞれ５倍力価で段階希釈した後、各ウェルに１００マイクロリットル（μＬ）ずつ加えて均一に混合し、氷上又は４℃下で２０分間反応させた。そして、２回洗浄してから１：３３３で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ−ＦＩＴＣを１００μＬ／ウェル加え、４℃で反応及び洗浄した後、ＢＤ社のＬＳＲ−ＩＩ蛍光フローサイトメーター・ＨＴＳ機で各ウェルの平均蛍光強度値（ＭＦＩ）を読み取った。
【００６４】
その結果、免疫応答性の高かった１号マウスの血清を胃癌細胞と結合させた場合の力価反応は、健常人ＰＢＭＣと結合させた場合の力価よりも明らかに高かった。そこで、当該マウスの脾臓細胞をＭＳ１７−３８モノクローナル抗体のハイブリドーマ産生のための融合実験に使用した（図１は、４種類の混合胃癌細胞株で免疫したマウスの血清と、健常人ＰＢＭＣ、胃癌ＳＧＣ７９０１及びＢＧＣ８２３細胞株との力価反応をＦＡＣＳにより検出したものである）。
【００６５】
実施例５
親和及び精製したＭＳ１７−３８モノクローナル抗体に対し実施例４の説明で述べたＵ型ウェルプレートによる細胞染色方法を適用し、４種類の免疫用胃癌細胞株を結合染色反応させてＬＳＲ−ＩＩ ＦＡＣＳメーターでＭＦＩを読み取った。なお、その他の実験手順については実施例４と同様とした。
【００６６】
結果、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と３種類の免疫用胃癌細胞株とを異なるレベルでそれぞれ結合反応させてＦＡＣＳにより検出したところ、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体はＭＫＮ−４５胃癌細胞株に対する反応が最も高いことがわかった。これに対し、ＳＧＣ−７９０１細胞及びＢＧＣ−８２３細胞に対する反応はやや低く、健常人ＰＢＭＣの応答性については結合反応がみられなかった（図２は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と、３種類の免疫用胃癌細胞株及び健常人ＰＢＭＣ細胞とを異なるレベルでそれぞれ結合反応させた場合をＦＡＣＳにより検出したものである。このうち、図２（Ａ）は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体及び対照抗体（アイソタイプが同じ無関係のマウスのモノクローナル抗体。ＩｇＧ１Ｈ鎖、ＫａｐｐａＬ鎖。後述する対照抗体はいずれも同一の対照モノクローナル抗体）と、ＳＧＣ−７９０１及びＢＧＣ−８２３胃癌細胞株との結合反応を示している。また、図２（Ｂ）は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体及び対照抗体と、ＭＫＮ−４５、ＢＧＣ−８２３及び健常人の末梢血ＰＢＭＣ細胞とをそれぞれ結合反応させた場合を示している）。
【００６７】
実施例６
親和及び精製したＭＳ１７−３８モノクローナル抗体に対し実施例４の説明で述べたＵ型ウェルプレートによる細胞染色方法を適用し、健常人ＰＢＭＣ、胃癌細胞株ＭＫＮ−２８、ＧＥＳ−１、ＡＧＳ−Ｎを結合染色反応させてＬＳＲ−ＩＩ ＦＡＣＳメーターでＦＩＴＣ蛍光のＭＦＩ値を読み取った。
【００６８】
結果、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体はＧＥＳ−１及びＡＧＳ細胞株の双方に対し高い結合反応を有するが、健常人ＰＢＭＣには結合反応がみられないことがわかった。また、アイソタイプ対照である無関係のモノクローナル抗体については、いずれも結合反応のない陰性対照であった（図３及び図４は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と、２種類の胃癌細胞株及び２つの対照細胞株とを異なるレベルでそれぞれ結合反応させた場合をＦＡＣＳにより検出したものである。このうち、図３では、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体及び対照抗体と、ＭＫＮ−２８及びＡＧＳ−Ｎ細胞株との反応を示している。また、図４では、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体及び対照抗体と、健常人の末梢血ＰＢＭＣ細胞及びＧＥＳ−１（胎児の胃粘膜上皮形質転換細胞）細胞株とをそれぞれ結合反応させた場合を示している）。
【００６９】
実施例７
親和及び精製したＭＳ１７−３８モノクローナル抗体を、それぞれ胃癌細胞株ＢＧＣ８２３及び胃癌細胞株ＭＫＮ−４５の細胞膜抽出タンパク質（事前に米国Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＩｍｍｕｎｌｏｎ−ＩＩ ９６−ウェルＥＬＩＳＡ反応プレートに充填）と酵素結合反応をさせ（例えばＥＬＩＳＡ等）、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４５０−ｎｍの光学密度でＯＤ値を読み取って作図した。
【００７０】
ＥＬＩＳＡの結果より、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と胃癌ＢＧＣ８２３及び胃癌ＭＫＮ−４５の膜抽出タンパク質との間には結合反応が認められなかった。このことは、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体がＥＬＩＳＡプレートに付着して分解された結合標的タンパク質とは反応し得ないことを意味している。つまり、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と抗原の立体構造エピトープとの特異な反応が示された。これは、後述する抗体の共免疫沈降法における特殊な操作条件のための準備的実験となった（ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と、胃癌ＢＧＣ８２３（図５参照）及び胃癌ＭＫＮ−４５（図６参照）の細胞膜抽出タンパク質とを結合させたＥＬＩＳＡ検出反応を参照）。
【００７１】
実施例８
胃粘膜形質転換細胞ＧＥＳ−１及び胃癌細胞ＢＧＣ８２３、ＭＫＮ４５をサイトスピン（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ）してからＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と結合し、カタラーゼ染色反応させた結果、標的タンパク質がいずれも細胞膜表面に分布していることがわかった（拡大倍率は各４０ｘ）（免疫組織化学法）。また、胃粘膜形質転換細胞ＧＥＳ−１についてはサイトスピン（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ）後に、培養上清液を親和及び精製して取得したＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と結合した。これをカタラーゼ染色反応させた結果、モノクローナル抗体が細胞膜表面の標的タンパク質に結合可能なことがわかった。
【００７２】
免疫組織化学法の検出結果から、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体が胃粘膜形質転換細胞ＧＥＳ−１及び胃癌細胞ＢＧＣ８２３、ＭＫＮ４５の細胞膜表面に結合可能なことが示されたが、このことは、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体が標的タンパク質に照準を合わせていることの証拠でもある（図７は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体及びアイソタイプが同じ無関係なモノクローナル抗体の、Ａ．胃粘膜形質転換細胞ＧＥＳ−１、Ｂ．胃癌細胞ＭＫＮ−４５、Ｃ．胃癌細胞ＢＧＣ−８２３における免疫組織化学反応を検出したものである）。
【００７３】
実施例９
胃癌細胞株ＢＧＣ８２３及びＭＫＮ４５の細胞膜抽出タンパク質をＭＳ１７−３８モノクローナル抗体との親和カラム（特に、結合するＭＳ１７−３８モノクローナル抗体との親和精製カラム）で精製及び共免疫沈降（ＩＰ）した後、産物を分子量の異なる分子マーカーサンプルとともにそれぞれサンプル投入して電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施した。電気泳動後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをブロモフェノールブルー染色した結果、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体により精製された胃癌ＭＫＮ４５及びＢＧＣ８２３の細胞膜抽出タンパク質は抗原純度がたいへん高いことがわかった。また、抗原ストリップゲルをそれぞれ切り出すことで、更に抗原の質量分析を実施したいとの要求にも対応可能であった（図８は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体によって胃癌ＢＧＣ８２及びＭＫＮ４５の細胞膜抽出標的タンパク質に対し実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの精製ストリップを示す）。
【００７４】
実施例１０
実施例９で述べたように、間接免疫沈降法では、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体との親和カラムによって、結合する抗原を胃癌細胞（ＭＫＮ４５及びＢＧＣ８２３）の膜抽出タンパク質から精製し、抗体のＦｃ末端がＰｒｏｔｅｉｎ−Ａの磁気ビーズに特異的に結合して非特異的吸着タンパクが洗い流された後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにサンプルを投入し、緩衝液を加えて加熱解離した。一方、直接免疫沈降法では、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体を、米国インビトロジェン社（米国ニューヨーク州グランドアイランド）製の活性化したＤｙｎａｂｅａｄｓ磁気ビーズに直接連結し、それ以降の反応手順は間接免疫沈降法と同様とした。実践より、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体の免疫沈降法としては、直接法でなければ特異的且つ明瞭な標的ストリップを得られないことが証明された（図８参照）。その後、複数回の高感度質量分析によって、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体に対応する標的がＰＯＤＸＬ−ｖ２タンパク質であることが特定された（図９は、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体によって胃癌ＢＧＣ８２及びＭＫＮ４５の細胞膜抽出標的タンパク質に対し実施した３度の質量分析の結果を示す）。
【００７５】
実施例１１
ＮＣＢＩの大規模データベースのデータより、ＰＯＤＸＬのいくつかのサブタイプのうち最長のアミノ酸配列における８−ｍｅｒのアミノ酸と６−ｍｅｒのアミノ酸を重複させ、マイクロマトリックスチップに積層した。次に、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体に蛍光標識したヤギ抗体を加えて間接的なハイブリダイゼーションを実施したところ、アミノ酸配列のうち２２１〜２２４と４７３〜４７７の２つセグメントにおいて強い蛍光結合強度が認められた。即ち、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体は、異性体ＰＯＤＸＬ−ｖ２と結合することが示された（図１０は、マイクロマトリックスチップに積載した６−ｍｅｒ及び８−ｍｅｒのアミノ酸をＭＳ１７−３８モノクローナル抗体により分析したものである）。ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体が異性体ＰＯＤＸＬ−ｖ２と特異的に結合したのは、ＰＯＤＸＬ−ｖ２のみが２つの空間立体構造の結合座位間に配列の欠損を有していたからである。このような２つの立体構造の座位が形成されるにはフォールディングが必要であり、ＰＯＤＸＬとＰＯＤＸＬ−ｖ１にはＭＳ１７−３８モノクローナル抗体とＰＯＤＸＬ−ｖ２との結合のような立体構造座位は形成され得ない（図１１は、ＰＯＤＸＬ、ＰＯＤＸＬ−ｖ１、ＰＯＤＸＬ−ｖ２のアミノ酸配列における比較及びこれらの違いと、ＰＯＤＸＬ−ｖ２における空間立体構造の座位のうちＭＳ１７−３８モノクローナル抗体が具体的に結合する２つの座位を示している）。
【００７６】
実施例１２
ＭＫＮ−４５細胞の培養では、Ａｍｂｉｏｎ  Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社（現サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）から購入した各２５ｎＭ（ナノモル）の最終濃度のＰＯＤＸＬ−ｖ２（品番ｓ１０７６９）、ＦＡＭ１２０Ｂ、Ｓｅｃ１６Ａ、ＳＭＡＲＣＣ１及びブランク対照ｓｉＲＮＡをそれぞれ添加した。そして、細胞に対しｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることで、最終的に各ｓｉＲＮＡの標的タンパク質の発現が抑制された。次に、処理済みの細胞タンパク質を抽出し、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて各タンパク質ストリップを分離した。そして、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体とβ−Ａｃｔｉｎ抗体（ウェスタンブロットの対照）を用いて特異的に反応させたところ、ＰＯＤＸＬ−ｖ２とｓｉＲＮＡで処理したＭＫＮ−４５の細胞抽出タンパク質のみにおいて、ＭＳ１７−３８モノクローナル抗体と結合可能なＰＯＤＸＬ−ｖ２ストリップベルトが消失した。即ち、別の観点からもＭＳ１７−３８モノクローナル抗体がＰＯＤＸＬ−ｖ２と特異的に反応することが証明された（図１２は、ＭＫＮ４５細胞膜上でのＰＯＤＸＬ−ｖ２の発現をＰＯＤＸＬ−ｖ２とｓｉＲＮＡが干渉することをウェスタンブロット試験により示したものである）。
【００７７】
以上述べたように、本発明は従来技術における様々な欠点を解消するものであり、高度な産業上の利用価値を有する。
【００７８】
上記の実施例は本発明の原理と効果を例示的に説明するものにすぎず、本発明を制限するものではない。本技術を熟知する者であれば、本発明の精神及び範囲を逸脱しないことを前提に、上記の実施例を補足又は変形可能である。したがって、当業者が本発明で開示した精神及び技術的思想から逸脱することなく遂行するあらゆる等価の補足又は変形もまた本発明の請求の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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