(57)【要約】  修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成するための方法、プラットフォーム、抗体、ワクチン、構築物、およびキットが本明細書で開示されている。いくつかの例では、修飾されたイオンチャネルポリペプチドを生成するための方法、プラットフォーム、抗体、ワクチン、構築物、およびキットが本明細書で開示されている。場合によっては、ＧＰＣＲを生成するための方法、プラットフォーム、抗体、ワクチン、構築物、およびキットも本明細書で開示されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに対して治療薬をスクリーニングする方法であって、
（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；
（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、
工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、
随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；
（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；
（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；
（ｆ）治療薬を用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、
（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物と治療薬との間の結合を検知する工程、を含む、方法。
【請求項２】
治療薬は小分子またはポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
小分子は薬物または小分子フラグメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドは抗体またはその結合フラグメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体、またはこれらの結合フラグメントを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗体またはその結合フラグメントは、ファージディスプレイ法または酵母ディスプレイ法によって生成される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｆ）のインキュベートする工程は、治療薬を用いてインキュベートする前に、ナノ粒子上の複数膜貫通型ポリペプチド生成物を固定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ナノ粒子は常磁性のナノ粒子、超常磁性のナノ粒子、金属ナノ粒子、または無機のナノチューブを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第１の選択マーカー遺伝子は、複数膜貫通型ポリペプチドの早熟な切断を防ぐように選択され、および／または複数膜貫通型ポリペプチドの安定したかつ適切な折り畳みを容易にする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第２の選択マーカー遺伝子は、複数膜貫通型ポリペプチドの安定したかつ適切な折り畳みを促す、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
修飾されたＧＰＣＲは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
修飾されたＧＰＣＲは、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
修飾は挿入、欠失、または突然変異を含む、請求項１、または１１−１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
突然変異はナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
修飾はＮ末端切断、Ｃ末端切断、またはその組み合わせを含む、請求項１、または１１−１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
修飾されたＧＰＣＲは哺乳動物のＧＰＣＲである、請求項１、または１４−２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
修飾されたＧＰＣＲはヒトのＧＰＣＲである、請求項１、または１４−２１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
第１の選択マーカー遺伝子と第２の選択マーカー遺伝子は、同じである、請求項１、９、または１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
第１の選択マーカー遺伝子と第２の選択マーカー遺伝子は異なる、請求項１、９、または１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
第１の選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、または転写活性化因子あるいは転写抑制因子を含む、請求項１、９、２３、または２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
第１の選択マーカー遺伝子はレポータータンパク質をコードしない、請求項１、９、２３、または２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
第１の選択マーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子を含む、請求項１、９、または２３−２６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
第２の選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、または転写活性化因子あるいは転写抑制因子を含む、請求項１、１０、２３、または２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
第２の選択マーカー遺伝子はレポータータンパク質をコードしない、請求項１、１０、２３、または２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
第２の選択マーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子を含む、請求項１、１０、２３、２４、２８、または２９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
第１の選択マーカー遺伝子は第１の選択ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
第２の選択マーカー遺伝子は第２の選択ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
第１の選択ポリペプチドが修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端部分に適切に表示され、随意に、第２の選択ポリペプチドが修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端部分に適切に表示されるときに、少なくとも１つの選択剤は、第１の選択ポリペプチドと随意に第２の選択ポリペプチドとの相互作用によって第１の複数の宿主細胞に対して無毒化される、請求項１、３１、または３２に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つの選択剤は第１の選択剤と第２の選択剤を含む、請求項１または３３に記載の方法。
【請求項３５】
第１の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
第２の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
抗生物質はアンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、あるいはテトラサイクリンを含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
毒性の代謝産物は、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３９】
第１の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
第２の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
工程ｄ）の産生ベクターは、第１の選択マーカー遺伝子または第２の選択マーカー遺伝子を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
発現ベクターの第１のセットと産生ベクターはさらに、タグをコードするポリヌクレオチドを独立して含む、請求項１または４１に記載の方法。
【請求項４３】
タグは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端、またはこれらの組み合わせに連結している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
タグは、ＭＢＰ、ＴｒｘＡ、ＦＬＡＧタグ、ＡＶＩタグ、またはＨｉｓＴａｇを含む、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
さらに、
（ａ）産生ベクターの第２のセットを生成する工程であって、ここで、各産生ベクターは、請求項１の工程ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、工程；
（ｂ）第３の複数の宿主細胞中の産生ベクターの第２のセットを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；および、
（ｃ）請求項１の工程ｆ）の治療薬に対してスクリーニングするために、物理化学的性質が増強または改善したセットから複数膜貫通型ポリペプチド生成物を決定するための分析方法によって工程（ｂ）の複数膜貫通型ポリペプチド生成物のセットを分析する工程であって、ここで、物理化学的性質の増強または改善は、対照複数膜貫通型ポリペプチドに対するものである、工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
物理化学的性質の増強または改善は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、または経路活性化選択性を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
対照は、野生型の複数膜貫通型ポリペプチド、あるいは異なる修飾を備える修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
工程（ｇ）の結合は、フローサイトメトリー方法、あるいは酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）によって検知される、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
フローサイトメトリー方法は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）あるいは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、または昆虫宿主細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
第１の複数の宿主細胞は、原核生物宿主細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
原核生物宿主細胞は大腸菌細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
第２の複数の宿主細胞は哺乳動物宿主細胞または昆虫宿主細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに対して抗体またはその結合フラグメントをスクリーニングする方法であって、
（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；
（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、
工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、
随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；
（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；
（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；
（ｆ）抗体またはその結合フラグメントを用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、
（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物と抗体またはその結合フラグメントとの間の結合を検知する工程、を含む、方法。
【請求項５５】
抗体またはその結合フラグメントは、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ法によって生成される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体、またはこれらの結合フラグメントを含む、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とを含む、単離および精製された抗体またはその結合フラグメントであって、
ここで、重鎖と軽鎖のＣＤＲは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドと相互作用し、および、ここで、抗体またはその結合フラグメントは以下のプロセス：
（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；
（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、
工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、
随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；
（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；
（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；
（ｆ）抗体のセットまたはその結合フラグメントを用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、
（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物に特異的に結合する抗体またはその結合フラグメントを選択する工程、
によって生成される、単離および精製された抗体またはその結合フラグメント。
【請求項６２】
抗体またはその結合フラグメントは、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ法によって生成される、請求項６１に記載の単離および精製された抗体またはその結合フラグメント。
【請求項６３】
抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体、またはこれらの結合フラグメントを含む、請求項６１または６２に記載の単離および精製された抗体またはその結合フラグメント。
【請求項６４】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である、請求項６１に記載の単離および精製された抗体またはその結合フラグメント。
【請求項６５】
修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である、請求項６４に記載の単離および精製された抗体またはその結合フラグメント。
【請求項６６】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項６１に記載の単離および精製された抗体またはその結合フラグメント。
【請求項６７】
修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である、請求項６６に記載の単離および精製された抗体またはその結合フラグメント。
【請求項６８】
請求項６１−６７に記載の単離および精製された抗体またはその結合フラグメントを含むワクチン。
【請求項６９】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチド、または、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチンであって、
ここで、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、以下のプロセス：
（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；
（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、
工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、
ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、
随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；
（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；
（ｄ）産生ベクターの第２のセットを生成する工程であって、ここで、各産生ベクターは、工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、工程；
（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターの第２のセットを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；および、
（ｆ）ワクチンの生成のために物理化学的性質が増強または改善した安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドを決定するための分析方法によって工程ｅ）の発現ベクターの第２のセットから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物のセットを分析する工程であって、ここで、物理化学的性質の増強または改善は、対照複数膜貫通型ポリペプチドに対するものである、工程、
によって生成される、ワクチン。
【請求項７０】
物理化学的性質の増強または改善は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、または経路活性化選択性を含む、請求項６９に記載のワクチン。
【請求項７１】
対照は、野生型の複数膜貫通型ポリペプチド、あるいは異なる修飾を備える修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む、請求項６９に記載のワクチン。
【請求項７２】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である、請求項６９に記載のワクチン。
【請求項７３】
修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である、請求項７２に記載のワクチン。
【請求項７４】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項６９に記載のワクチン。
【請求項７５】
修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である、請求項７４に記載のワクチン。
【請求項７６】
アジュバントをさらに含む、請求項６８−７５のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項７７】
アジュバントは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む、請求項７６に記載のワクチン。
【請求項７８】
式（Ｉ）の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドであって、
【化１】
2019527065.tif 000013
式中、
ＭＳＭＰは少なくとも１つの修飾を含む複数膜貫通型ポリペプチドであり、
ＳＰ１はＭＳＭＰのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２はＭＳＭＰのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、
ｘは独立して０−３であり、
ｙは独立して１−５であり、
ｚは独立して１−３であり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド。
【請求項７９】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項８０】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である、請求項７８または７９に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項８１】
修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である、請求項８０に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項８２】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項７８または７９に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項８３】
修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である、請求項８２に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項８４】
修飾されたＧＰＣＲは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む、請求項８２に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項８５】
修飾されたＧＰＣＲは、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む、請求項８２に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項８６】
少なくとも１つの修飾は無作為の突然変異誘発方法によって生成される、請求項７８−８５のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項８７】
少なくとも１つの修飾は挿入、欠失、または突然変異を含む、請求項７８−８６のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項８８】
突然変異はナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異を含む、請求項８７に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項８９】
少なくとも１つの修飾は、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、またはその組み合わせを含む、請求項７８−８８のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項９０】
修飾されたＧＰＣＲは哺乳動物のＧＰＣＲである、請求項８２−８９のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項９１】
修飾されたＧＰＣＲはヒトのＧＰＣＲである、請求項８２−９０のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項９２】
ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分または細胞外部分にある、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項９３】
ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分または細胞外部分にある、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項９４】
ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にある、請求項７８または９２に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項９５】
ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にある、請求項７８または９３に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項９６】
ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にあり、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にある、請求項７８または９２−９５のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項９７】
第１の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、または転写活性化因子あるいは転写抑制因子によってコードされる、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項９８】
第１の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項９９】
第１の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである、請求項７８、９７、または９８のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１００】
第２の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、または転写活性化因子あるいは転写抑制因子によってコードされる、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１０１】
第２の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１０２】
第２の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである、請求項７８、１００、または１０１に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１０３】
ＳＰ１ｚはＳＰ１２−３であり、各ＳＰ１は他とは異なる、請求項７８，９２、９４、または９６−９９のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１０４】
ＳＰ２ｘはＳＰ２２−３であり、各ＳＰ２は他とは異なる、請求項７８、９３、９５、９６、または１００−１０２のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１０５】
第１の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１０６】
第２の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１０７】
抗生物質は、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、あるいはテトラサイクリンを含む、請求項７８、１０５、または１０６のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１０８】
毒性の代謝産物は、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含む、請求項７８、１０５、または１０６のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１０９】
第１の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１１０】
第２の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１１１】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはタグをさらに含む、請求項７８−１１０のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１１２】
タグは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端、またはこれらの組み合わせに連結している、請求項１１１に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１１３】
タグは、ＭＢＰ、ＴｒｘＡ、ＦＬＡＧタグ、ＡＶＩタグ、またはＨｉｓＴａｇを含む、請求項１１１または１１２に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１１４】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはさらに、式（Ｉａ）の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含み、
【化２】
2019527065.tif 000014
式中、
ＭＳＭＰは少なくとも１つの修飾を含む複数膜貫通型ポリペプチドであり、
ＳＰ１はＭＳＭＰのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２はＭＳＭＰのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１１５】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはさらに、式（ＩＩ）の修飾された受容体ポリペプチドを含み、
【化３】
2019527065.tif 000015
式中、
ＲＰはイオンチャネルポリペプチドまたはＧＰＣＲから選択された受容体ポリペプチドであり、ここで、ＲＰは少なくとも１つの修飾を含み、
ＳＰ１はＲＰのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２はＲＰのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、
ｘは独立して０−３であり、
ｙは独立して１−５であり、
ｚは独立して１−３であり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である、請求項７８に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１１６】
イオンチャネルポリペプチドは、電位依存性イオンチャネルポリペプチドまたは一時的な受容器電位チャネルポリペプチドである、請求項１１５に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１１７】
イオンチャネルポリペプチドは、ＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６を含む、請求項１１６に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１１８】
ＧＰＣＲは、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体を含む、請求項１１６に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１１９】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはさらに、式（ＩＩＩ）の修飾された受容体ポリペプチドを含み、
【化４】
2019527065.tif 000016
式中、
ＧＰＣＲは少なくとも１つの修飾を含むＧＰＣＲであり、
ＳＰ１は、ＧＰＣＲのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にあり、第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２は、ＧＰＣＲのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にあり、第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、
ｘは独立して０−３であり、
ｙは独立して１−５であり、
ｚは独立して１−３であり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である、請求項１１５に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１２０】
ＧＰＣＲは哺乳動物のＧＰＣＲである、請求項１１９に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１２１】
ＧＰＣＲはヒトのＧＰＣＲである、請求項１１９または１２０に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１２２】
ＧＰＣＲは、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体を含む、請求項１１９−１２１のいずれか１つに記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１２３】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはさらに、式（ＩＶ）の修飾された受容体ポリペプチドを含み、
【化５】
2019527065.tif 000017
式中、
ＩＣＰは少なくとも１つの修飾を含むイオンチャネルポリペプチドであり、
ＳＰ１はＩＣＰのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２はＩＣＰのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、
ｘは独立して０−３であり、
ｙは独立して１−５であり、
ｚは独立して１−３であり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である、請求項１１５に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１２４】
イオンチャネルポリペプチドは、ＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６を含む、請求項１２３に記載の修飾された複数膜貫通型タンパク質。
【請求項１２５】
請求項７８−１２４の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードするベクター。
【請求項１２６】
請求項７８−１２４の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを発現する宿主細胞と細胞培養培地とを含む細胞培養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年５月４日に出願された米国仮特許出願第６２／３３１，６２８号の利益を主張し、該出願は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１７年５月３日に作成された上記のＡＳＣＩＩのコピーは、５０２４７−７０２＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔのファイル名であり、５，８８２バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は複数膜貫通型タンパク質のメンバーであり、ＧＰＣＲスーパーファミリーは約８００のヒトＧＰＣＲメンバーを含む。それぞれのリガンドによるＧＰＣＲの活性化は、細胞内の複数のシグナル伝達プロセスのカスケードを開始し、例えば、細胞の成長、代謝、および他の本質的な細胞の機能を調節する。これらのＧＰＣＲの調節異常と異常な発現、およびその後のシグナル伝達カスケードは、様々なタイプの疾患の病状に関連付けられる。
【発明の概要】
【０００４】
ある実施形態では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む方法、プラットフォーム、抗体、ワクチン、構築物、およびキットが本明細書に開示されている。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルポリペプチドである。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはＧＰＣＲである。いくつかの例では、修飾されたイオンチャネルポリペプチドを含む方法、プラットフォーム、抗体、ワクチン、構築物、およびキットが本明細書に記載される。さらなる例では、修飾されたＧＰＣＲを含む方法、プラットフォーム、抗体、ワクチン、構築物、およびキットが本明細書に記載される。
【０００５】
ある実施形態では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに対して治療薬をスクリーニングする方法が本明細書に開示され、該方法は、（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；（ｆ）治療薬を用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物と治療薬との間の結合を検知する工程、を含む。いくつかの実施形態において、治療薬は小分子またはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、小分子は薬物または小分子フラグメントである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体、またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、ファージディスプレイ法または酵母ディスプレイ法によって生成される。いくつかの実施形態において、工程ｆ）のインキュベートする工程は、治療薬を用いてインキュベートする前に、ナノ粒子上の複数膜貫通型ポリペプチド生成物を固定する工程を含む。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は常磁性のナノ粒子、超常磁性のナノ粒子、金属ナノ粒子、または無機のナノチューブを含む。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子は、複数膜貫通型ポリペプチドの早熟な切断（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）を防ぐように選択され、および／または複数膜貫通型ポリペプチドの安定したかつ適切な折り畳みを容易にする。いくつかの実施形態において、第２の選択マーカー遺伝子は、複数膜貫通型ポリペプチドの安定したかつ適切な折り畳みを促す。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核���タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む。いくつかの実施形態では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は挿入、欠失、または突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異はナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異を含む。いくつかの実施形態において、修飾はＮ末端切断、Ｃ末端切断、またはその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲは哺乳動物のＧＰＣＲである。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲはヒトのＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子と第２の選択マーカー遺伝子は、同じである。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子と第２の選択マーカー遺伝子は異なる。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、または転写活性化因子あるいは転写抑制因子を含む。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子はレポータータンパク質をコードしない。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、または転写活性化因子あるいは転写抑制因子を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択マーカー遺伝子はレポータータンパク質をコードしない。いくつかの実施形態において、第２の選択マーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリ��ロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子は第１の選択ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第２の選択マーカー遺伝子は第２の選択ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドが修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端部分に適切に表示され、随意に、第２の選択ポリペプチドが修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端部分に適切に表示されるときに、少なくとも１つの選択剤は、第１の選択ポリペプチドと随意に第２の選択ポリペプチドとの相互作用によって第１の複数の宿主細胞に対して無毒化される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの選択剤は第１の選択剤と第２の選択剤を含む。いくつかの実施形態において、第１の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、抗生物質はアンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、あるいはテトラサイクリンを含む。いくつかの実施形態において、毒性の代謝産物は、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含む。いくつかの実施形態において、第１の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、工程ｄ）の産生ベクターは、第１の選択マーカー遺伝子または第２の選択マーカー遺伝子を含まない。いくつかの実施形態において、発現ベクターの第１のセットと産生ベクターはさらに、タグをコードするポリヌクレオチドを独立して含む。いくつかの実施形態において、タグは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端、またはこれらの組み合わせに連結している。いくつかの実施形態において、タグは、ＭＢＰ、ＴｒｘＡ、ＦＬＡＧタグ、ＡＶＩタグ、またはＨｉｓＴａｇを含む。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、（ａ）産生ベクターの第２のセットを生成する工程であって、ここで、各産生ベクターは、上に議論された方法の工程ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、工程；（ｂ）第３の複数の宿主細胞中の産生ベクターの第２のセットを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；および、（ｃ）上に議論された方法の工程ｆ）の治療薬に対してスクリーニングするために、物理化学的性質が増強または改善したセットから複数膜貫通型ポリペプチド生成物を決定するための分析方法によって工程（ｂ）の複数膜貫通型ポリペプチド生成物のセットを分析する工程であって、ここで、物理化学的性質の増強または改善は、対照複数膜貫通型ポリペプチドに対するものである、工程を含む。いくつかの実施形態において、物理化学的性質の増強または改善は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、または経路活性化選択性を含む。いくつかの実施形態において、対照は、野生型の複数膜貫通型ポリペプチド、あるいは異なる修飾を備える修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、工程（ｇ）の結合は、フローサイトメトリー方法、あるいは酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）によって検知される。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリー方法は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）あるいは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、原核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、または昆虫宿主細胞である。いくつかの実施形態では、第１の複数の宿主細胞は、原核生物宿主細胞を含む。いくつかの実施形態において、原核生物宿主細胞は大腸菌細胞である。いくつかの実施形態において、第２の複数の宿主細胞は哺乳動物宿主細胞または昆虫宿主細胞を含む。
【０００６】
ある実施形態では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに対して抗体またはその結合フラグメントをスクリーニングする方法が本明細書に開示され、該方法は、（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；（ｆ）抗体またはその結合フラグメントを用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物と抗体またはその結合フラグメントとの間の結合を検知する工程、を含む。いくつかの実施形態において、工程ｆ）のインキュベートする工程は、治療薬を用いてインキュベートする前に、ナノ粒子上の複数膜貫通型ポリペプチド生成物を固定する工程を含む。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は常磁性のナノ粒子、超常磁性のナノ粒子、金属ナノ粒子、または無機のナノチューブを含む。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子は、複数膜貫通型ポリペプチドの早熟な切断（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）を防ぐように選択され、および／または複数膜貫通型ポリペプチドの安定したかつ適切な折り畳みを容易にする。いくつかの実施形態において、第２の選択マーカー遺伝子は、複数膜貫通型ポリペプチドの安定したかつ適切な折り畳みを促す。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ法によって生成される。いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体、またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施���態では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は挿入、欠失、または突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異はナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異を含む。いくつかの実施形態において、修飾はＮ末端切断、Ｃ末端切断、またはその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲは哺乳動物のＧＰＣＲである。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲはヒトのＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子と第２の選択マーカー遺伝子は、同じである。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子と第２の選択マーカー遺伝子は異なる。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、または転写活性化因子あるいは転写抑制因子を含む。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子はレポータータンパク質をコードしない。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、または転写活性化因子あるいは転写抑制因子を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択マーカー遺伝子はレポータータンパク質をコードしない。いくつかの実施形態において、第２の選択マーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、��ＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子は第１の選択ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第２の選択マーカー遺伝子は第２の選択ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドが修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端部分に適切に表示され、随意に、第２の選択ポリペプチドが修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端部分に適切に表示されるときに、少なくとも１つの選択剤は、第１の選択ポリペプチドと随意に第２の選択ポリペプチドとの相互作用によって第１の複数の宿主細胞に対して無毒化される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの選択剤は第１の選択剤と第２の選択剤を含む。いくつかの実施形態において、第１の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、抗生物質はアンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、あるいはテトラサイクリンを含む。いくつかの実施形態において、毒性の代謝産物は、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含む。いくつかの実施形態において、第１の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、工程ｄ）の発現ベクターは、第１の選択マーカー遺伝子または第２の選択マーカー遺伝子を含まない。いくつかの実施形態において、発現ベクターの第１のセットと発現ベクターはさらに、タグをコードするポリヌクレオチドを独立して含む。いくつかの実施形態において、タグは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端、またはこれらの組み合わせに連結している。いくつかの実施形態において、タグは、ＭＢＰ、ＴｒｘＡ、ＦＬＡＧタグ、ＡＶＩタグ、またはＨｉｓＴａｇを含む。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、（ａ）産生ベクターの第２のセットを生成する工程であって、ここで、各産生ベクターは、上に議論された方法の工程ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、工程；（ｂ）第３の複数の宿主細胞中の産生ベクターの第２のセットを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；および、（ｃ）上に議論された方法の工程ｆ）の治療薬に対してスクリーニングするために、物理化学的性質が増強または改善したセットから複数膜貫通型ポリペプチド生成物を決定するための分析方法によって工程（ｂ）の複数膜貫通型ポリペプチド生成物のセットを分析する工程であって、ここで、物理化学的性質の増強または改善は、対照複数膜貫通型ポリペプチドに対するものである、工程を含む。いくつかの実施形態において、物理化学的性質の増強または改善は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、または経路活性化選択性を含む。いくつかの実施形態において、対照は、野生型の複数膜貫通型ポリペプチド、あるいは異なる修飾を備える修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、工程（ｇ）の結合は、フローサイトメトリー方法、あるいは酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）によって検知される。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリー方法は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）あるいは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、原核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、または昆虫宿主細胞である。いくつかの実施形態では、第１の複数の宿主細胞は、原核生物宿主細胞を含む。いくつかの実施形態において、原核生物宿主細胞は大腸菌細胞である。いくつかの実施形態において、第２の複数の宿主細胞は哺乳動物宿主細胞または昆虫宿主細胞を含む。
【０００７】
ある実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とを含む、単離および精製された抗体またはその結合フラグメントが本明細書に開示され、ここで、重鎖と軽鎖のＣＤＲは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドと相互作用し、および、ここで、抗体またはその結合フラグメントは以下のプロセスによって生成される：（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；（ｆ）抗体のセットまたはその結合フラグメントを用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物に特異的に結合する抗体またはその結合フラグメントを選択する工程、を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ法によって生成される。いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体、またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。
【０００８】
ある実施形態では、上に記載された、単離および精製された抗体またはその結合フラグメントを含むワクチンが本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、ワクチンはアジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態において、アジュバントは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む。
【０００９】
ある実施形態では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド、または、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチンが本明細書で開示され、ここで、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは以下のプロセスによって生成される：（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ｄ）産生ベクターの第２のセットを生成する工程であって、ここで、各産生ベクターは、工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターの第２のセットを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；および、（ｆ）ワクチンの生成のために物理化学的性質が増強または改善した安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドを決定するための分析方法によって工程ｅ）の発現ベクターの第２のセットから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物のセットを分析する工程であって、ここで、物理化学的性質の増強または改善は、対照複数膜貫通型ポリペプチドに対するものである、工程を含む。いくつかの実施形態において、物理化学的性質の増強または改善は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、または経路活性化選択性を含む。いくつかの実施形態において、対照は、野生型の複数膜貫通型ポリペプチド、あるいは異なる修飾を備える修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。いくつかの実施形態では、ワクチンはアジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態において、アジュバントは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む。
【００１０】
ある実施形態において、式（Ｉ）の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドが本明細書で開示され：
【００１１】
【化１】
2019527065.tif 000003
式中、
ＭＳＭＰは少なくとも１つの修飾を含む複数膜貫通型ポリペプチドであり、
ＳＰ１はＭＳＭＰのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２はＭＳＭＰのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、
ｘは独立して０−３であり、
ｙは独立して１−５であり、
ｚは独立して１−３であり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む。いくつかの実施形態では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は無作為の突然変異誘発方法によって生成される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は挿入、欠失、または突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異はナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、またはその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲは哺乳動物のＧＰＣＲである。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲはヒトのＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分または細胞外部分にある。いくつかの実施形態において、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分または細胞外部分にある。いくつかの実施形態において、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にある。いくつかの実施形態において、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にある。いくつかの実施形態において、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にあり、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にある。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、または転写活性化因子あるいは転写抑制因子によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、または転写活性化因子あるいは転写抑制因子によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＳＰ１ｚはＳＰ１２−３であり、各ＳＰ１は他とは異なる。いくつかの実施形態において、ＳＰ２ｘはＳＰ２２−３であり、各ＳＰ２は他とは異なる。いくつかの実施形態において、第１の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、抗生物質は、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、あるいはテトラサイクリンを含む。いくつかの実施形態において、毒性の代謝産物は、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含む。いくつかの実施形態において、第１の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはタグをさらに含む。いくつかの実施形態において、タグは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端、またはこれらの組み合わせに連結している。いくつかの実施形態において、タグは、ＭＢＰ、ＴｒｘＡ、ＦＬＡＧタグ、ＡＶＩタグ、またはＨｉｓＴａｇを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはさらに、式（Ｉａ）の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含み、
【００１４】
【化２】
2019527065.tif 000004
式中、
ＭＳＭＰは少なくとも１つの修飾を含む複数膜貫通型ポリペプチドであり、
ＳＰ１はＭＳＭＰのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２はＭＳＭＰのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはさらに、式（ＩＩ）の修飾された受容体ポリペプチドを含み、
【００１６】
【化３】
2019527065.tif 000005
式中、
ＲＰはイオンチャネルポリペプチドまたはＧＰＣＲから選択された受容体ポリペプチドであり、ここで、ＲＰは少なくとも１つの修飾を含み、
ＳＰ１はＲＰのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２はＲＰのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、
ｘは独立して０−３であり、
ｙは独立して１−５であり、
ｚは独立して１−３であり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、イオンチャネルポリペプチドは、電位依存性イオンチャネルポリペプチドまたは一時的な受容器電位チャネルポリペプチドである。いくつかの実施形態において、イオンチャネルポリペプチドは、ＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはさらに、式（ＩＩＩ）の修飾された受容体ポリペプチドを含み、
【００１９】
【化４】
2019527065.tif 000006
式中、
ＧＰＣＲは少なくとも１つの修飾を含むＧＰＣＲであり、
ＳＰ１は、ＧＰＣＲのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にあり、第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２は、ＧＰＣＲのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にあり、第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、
ｘは独立して０−３であり、
ｙは独立して１−５であり、
ｚは独立して１−３であり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは哺乳動物のＧＰＣＲである。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲはヒトのＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはさらに、式（ＩＶ）の修飾された受容体ポリペプチドを含み、
【００２２】
【化５】
2019527065.tif 000007
式中、
ＩＣＰは少なくとも１つの修飾を含むイオンチャネルポリペプチドであり、
ＳＰ１はＩＣＰのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２はＩＣＰのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、
ｘは独立して０−３であり、
ｙは独立して１−５であり、
ｚは独立して１−３であり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、イオンチャネルポリペプチドは、ＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６を含む。
【００２４】
ある実施形態では、上記の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードするベクターが本明細書に開示される。
【００２５】
ある実施形態では、上記の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを発現する宿主細胞と細胞培養培地とを含む細胞培養組成物が本明細書に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本開示の様々な態様はとりわけ添付の請求項で説明されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【図１】物理化学的性質が増強または改善された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成するための本明細書に記載されたプラットフォームの概念的な概略図を例証する。
【図２】野生型の膜受容体とその増強された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのウェスタンブロットを示す（本明細書では「使用可能な膜タンパク質（Ｅｎａｂｌｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「ＥＭＰ」とも呼ばれる）。ＦＬＡＧタグ付けされた融合修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの染色を、抗ＦＬＡＧ  ＨＲＰ結合抗体を用いて行った。タンパク質マーカーはＫＤａでの分子量を示す。
【図３】１ラウンドの突然変異誘発後に複雑なタンパク質−洗浄薬複合体中の精製された膜受容体上で蛍光性のサイズ排除クロマトグラフィー（ｆＳＥＣ）を使用して測定された熱的変性曲線を例証する。野生型の受容体は閉じた円で示され、安定した突然変異体は三角形で示される。
【図４】精製された野生型の（黒い痕跡）膜受容体と５つの突然変異体複数膜貫通型ポリペプチドの正規化されたｆＳＥＣピークを例証する。分析された複数膜貫通型ポリペプチド（分析されたサンプルの予想されるオリゴマーの状態）の単量体と２量体に対応するピークは、黒い矢で示される。
【図５Ａ】サンプル精製工程の略図を例証する。
【図５Ｂ】ＩＭＡＣ精製工程後のＧＰＣＲサンプル（ＷＴとＥＭＰ  ００４と００５）のＨＰＬＣプロフィールを使用して、サンプルの均質性を示す。
【図５Ｃ】図５Ｂで示されるのと同じサンプル、つまり、ＷＴとＥＭＰ  ００４と００５の収率を比較する。
【図５Ｄ】高い塩緩衝液条件下でのＣＰＭアッセイを使用して得られたＧＰＣＲサンプル（ＷＴとＥＭＰ  ００１、００２、および００３）の正規化された融解プロフィールを例証する。
【図６Ａ】ＳＰＲを使用して結合データを示す。両方のセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）は、ＥＭＰ００５サンプルの結合特性を例証する。
【図６Ｂ】ＳＰＲを使用して結合データを示す。両方のセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）は、ＥＭＰ００５サンプルの結合特性を例証する。
【図６Ｃ】ＥＭＰ００５品質と結合動力学を決定するために小分子化合物を使用して動力学データを示す。
【図７】ＷＴ受容体でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞に対してＧＰＲ５５  ＥＭＰ−０１２  ＤＮＡと精製されたタンパク質とで免疫したＣ５７ＢＬ６マウスから得られた蛍光標識されたポリクローナル力価のＦＡＣＳデータを例証する。矢印で示されるような右のパネルは：陰性対照（ａ）、ＤＮＡ免疫化の３週間後（ｂ）、ＤＮＡの第１の追加免疫（ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ）（ｃ）、ＤＮＡの第２の追加免疫（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）（ｄ）、精製されたタンパク質追加免疫（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）（ｅ）を示す。免疫処置作業は、Ｉｎ−Ｃｅｌｌ−Ａｒｔ（Ｎａｎｔｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）でＮａｎｏＴａｘｉ（登録商標）を使用して行われた。示されたデータは２匹の代表的な動物由来のものである。無関係なＧＰＣＲ（左のパネル）またはＷＴ−ＧＰＲ５５（右のパネル）でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を使用する、ＧＰＲ５５  ＥＭＰ−０１２で免疫化した動物からの血清のＦＡＣＳ分析。
【図８】ＥＬＩＳＡフォーマットでのＷＴケモカイン受容体に特異的な抗体の結合を試験するために使用された精製されたケモカイン受容体ＥＭＰ００４を例証する。２つのタイプのＥＭＰ受容体捕獲を試験した：凍結融解事象の前（▲）と後（●）であり、それらは同一の信号を示す。ＥＭＰ００４精製受容体はＨＩＳタグを使用して捕らえられた。
【図９】ＧＰＣＲ−ＧＰＲ５５  ＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の原発性のアミノ酸配列を示す。
【図１０】ＧＰＣＲ−ＧＰＲ５５−ＥＭＰ−０１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の原発性のアミノ酸配列を示す。強調された残留物は野生型のＧＰＲ５５配列に関連する突然変異位置を表示する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
複数膜貫通型タンパク質は、細胞の細胞外環境と細胞内環境との間の結合をもたらすことから、細胞性膜の必須の成分である。いくつかの例では、複数膜貫通型タンパク質は、プロテオームの約３０％を構成し、多くの細胞プロセスと生理的なプロセスにとって重要である。いくつかの例では、複数膜貫通型タンパク質は多くの病態（例えば、内分泌疾患または癌）にも関連付けられている。さらに、例えば、市場の現在の医薬品の約６０％は複数膜貫通型タンパク質と相互に作用するか、あるいは複数膜貫通型タンパク質を調節する。
【００２８】
いくつかの例では、複数膜貫通型タンパク質の脂質相互作用表面は高疎水性であり、膜二重層環境を模倣する洗浄薬または両親媒性分子の使用を必要とするため、複数膜貫通型タンパク質を用いる実験作業には問題がある。さらに、複数膜貫通型タンパク質は、高い配座柔軟性、低い安定性、および／または低い発現レベルを含む。さらに、例えば、実験作業中の複数膜貫通型タンパク質の取り扱いはしばしば、複数膜貫通型タンパク質の変性、不活性化、および／または分解を引き起こす。
【００２９】
いくつかの実施形態において、実験作業中の取り扱いのために特性（例えば、物理化学的性質）を改善した複数膜貫通型タンパク質（または修飾された複数膜貫通型ポリペプチド）を生成するための方法とプラットフォームが本明細書に記載されている。いくつかの例では、上記の方法とプラットフォームは、無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、上記のライブラリーから修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；および、安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、治療薬（例えば、抗体または小分子などのポリペプチド）をスクリーニングする方法が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに対して治療薬をスクリーニングする方法は、（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーから修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；（ｆ）治療薬を用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物と治療薬との間の結合を検知する工程、を含む。
【００３１】
他の実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドから生成されるワクチン（例えば、抗体ベースのワクチン、核酸ベースのワクチン、またはポリペプチドベースのワクチン）が本明細書に記載されている。いくつかの例では、ワクチンは抗体ベースのワクチンである。他の例では、ワクチンはポリペプチドベースのワクチンまたは核酸ベースのワクチンであり、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、以下のプロセスによって生成される：（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ｄ）産生ベクターの第２のセットを生成する工程であって、ここで、各産生ベクターは、工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターの第２のセットを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；および、（ｆ）ワクチンの生成のために物理化学的性質が増強または改善したセットから複数膜貫通型ポリペプチド生成物を決定するための分析方法によって工程ｅ）の産生ベクターの第２のセットから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物のセットを分析する工程であって、ここで、物理化学的性質の増強または改善は、対照複数膜貫通型ポリペプチドに対するものである、工程。
【００３２】
さらなる実施形態において、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに対して選択された抗体組成物が本明細書に記載される。いくつかの例では、本明細書に記載される単離および精製された抗体またはその結合フラグメントは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とを含み、ここで、重鎖と軽鎖のＣＤＲは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドと相互作用し、および、ここで、抗体またはその結合フラグメントは以下のプロセスによって生成される：（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；（ｆ）抗体のセットまたはその結合フラグメントを用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物に特異的に結合する抗体またはその結合フラグメントを選択する工程。
【００３３】
さらなる実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド構築物（例えば、式Ｉ−ＩＶの修飾された複数膜貫通型ポリペプチド）と、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド構築物、精製された修飾された複数膜貫通型ポリペプチド、本明細書に記載される抗体、あるいは本明細書に記載されるワクチンを含むキットも本明細書に記載されている。
【００３４】
複数膜貫通型ポリペプチド
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成するためのプラットフォームが本明細書で開示される。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成する方法も本明細書に含まれている。いくつかの実施形態において、複数膜貫通型ポリペプチドは完全長の膜タンパク質またはそのフラグメントを含む。いくつかの例では、複数膜貫通型ポリペプチドフラグメントは生物学的に活性なポリペプチドフラグメントである。いくつかの例では、生物学的に活性なポリペプチドフラグメントは、機能的に活性なポリペプチドフラグメント、構造上安定した（例えば、熱的に安定したまたはｐＨの安定した）ポリペプチドフラグメント、あるいはこれらの組み合わせである。場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドは、内在性膜タンパク質、表在性膜タンパク質、またはポリペプチド毒素を含む。場合によっては、内在性膜タンパク質は、内在性ポリトピックタンパク質（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｐｏｌｙｔｏｐｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）または膜貫通型タンパク質）、または内在性モノトピックタンパク質にさらに分類される。いくつかの例では、内在性ポリトピックタンパク質は、少なくとも一度膜を貫通し、かつ２つの三次構造クラス：ヘリックス束タンパク質またはベータバレルタンパク質に分類される、膜タンパク質である。いくつかの例では、内在性モノトピックタンパク質は、膜の１つの側にのみ結合し、脂質二分子膜を貫通しない膜タンパク質である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは原形質膜タンパク質を含む。場合によっては、原形質膜タンパク質は、細胞の原形質膜あるいは最外層に留まる膜タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは核膜タンパク質を含む。場合によっては、核膜タンパク質は、核エンベロープの膜と結合するか、該膜に留められる膜タンパク質を含む。場合によっては、核膜タンパク質はさらに、例えば、ラミンＢ受容体（ＬＢＲ）、ラミナ結合（ｌａｍｉｎａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ポリペプチド１（ＬＡＰ１）、ラミナ結合（ｌａｍｉｎａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ポリペプチド−２（ＬＡＰ２）、エメリン、およびＭＡＮ１（ＬＥＭドメイン含有タンパク質３またはＬＥＭＤ３）などの核膜内タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは表在性膜タンパク質を含む。場合によっては、表在性膜タンパク質は、生体膜に一時的にのみ付着する膜タンパク質を含む。例えば、内在性膜タンパク質と相互に作用するか、脂質二重層の末梢領域に浸透する膜タンパク質は、しばしば、表在性膜タンパク質と呼ばれる。加えて、イオンチャネルあるいは膜貫通型受容体の調節サブユニットはしばしば表在性膜タンパク質と呼ばれる。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、細胞内膜タンパク質（例えば、ミトコンドリア膜タンパク質）を含む。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは輸送体を含む。場合によっては、輸送体は、膜貫通性ポンプ、エスコートタンパク質、酸輸送タンパク質、陽イオン輸送タンパク質、あるいは陰イオン輸送タンパク質を含む。場合によっては、輸送体はさらに担体タンパク質と呼ばれる。担体タンパク質は、生体膜にわたってイオン、小分子、または高分子（例えばタンパク質）を渡すタンパク質である。いくつかの例では、担体タンパク質は小胞輸送タンパク質である。小胞輸送タンパク質は生体膜全体で小胞輸送を促進する膜貫通型タンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはチャネルタンパク質を含む。場合によっては、チャネルタンパク質は、イオンまたは小分子などの溶質が輸送される脂質二重層全体に伸びる水性の気孔を形成するタンパク質を含む。いくつかの例では、チャネルタンパク質はイオンチャネルタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはアドヘシンを含む。場合によっては、アドヘシンは、所望の細胞または表面に付着する微生物細胞表面タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはトランスロカーゼを含む。場合によっては、トランスロカーゼは、いくつかの例では、生体膜全体に別の分子を輸送するのを支援するタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは受容体を含む。いくつかの例では、受容体は、４つのカテゴリーへさらに細分される：１型受容体またはイオンチャネル型受容体；２型受容体またはＧタンパク質共役受容体；３型受容体またはキナーゼ結合および関連受容体；ならびに、４型受容体または核受容体。いくつかの例では、受容体は、１型受容体またはイオンチャネル型受容体（例えば、イオンチャネルタンパク質のサブグループを含む）である。いくつかの例では、受容体は２型受容体またはＧタンパク質共役受容体である。いくつかの例では、受容体は３型受容体またはキナーゼ結合および関連受容体である。いくつかの例では、受容体は４型受容体または核受容体である。
【００３６】
Ｇタンパク質共役受容体
７回膜貫通型ドメイン受容体、７ＴＭ受容体、ヘプタヘリカル（ｈｅｐｔａｈｅｌｉｃａｌ）受容体、セルペンチン受容体、またはＧタンパク質結合受容体（ＧＰＬＲ）としても知られているＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、輸送体オプシンＧタンパク質共役受容体（ＴＯＧ）スーパーファミリー下の受容体のＧＰＣＲファミリーを形成する。ＧＰＣＲアーキテクチャーは、細胞外のＮ末端部分と、エキソループ（ｅｘｏｌｏｏｐｓ）（ＥＬ−１〜ＥＬ−３）とサイトループ（ｃｙｔｏｌｏｏｐｓ）（ＩＬ−１〜ＩＬ−３）の３つのセットによって連続して接続された７回膜貫通型（ＴＭ）コアと、細胞内Ｃ末端尾部とを含む。場合によっては、Ｃ末端尾部がシステイン残留物でさらにパルミトイル化するとき、第４の細胞質のループは形成される。リガンド結合（例えば、イオン、タンパク質、脂質、ホルモン、神経伝達物質、アミン、ヌクレオチド、嗅覚分子、または光子との相互作用）に際して、ＧＰＣＲは構造変化を受け、その後、これは、Ｇタンパク質（あるいはグアニンヌクレオチド結合タンパク質）を活性化し、例えば、Ｇタンパク質のαサブユニットのそのβとγのサブユニットからの解離を引き起こし、それにより下流のシグナル伝達活性化のカスケードを開始する。場合によっては、細胞内シグナル伝達タンパク質および／または標的機能タンパク質は、Ｇタンパク質のαサブユニットタイプ（例えば、Ｇｑ／１１α、Ｇ１２／１３α、Ｇｉ／ｏα（Ｇ抑制的、その他のＧ）、およびＧｓα（Ｇ刺激的）によって調節される。しばしば、ＧＰＣＲは襟鞭毛虫と酵母を含む真核生物で観察される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは、配列相同性と機能的な類似性に基づいて６つのクラスにさらに分類される。場合によっては、６つのクラスは、クラスＡ（または１；ロドプシン様）ＧＰＣＲ、クラスＢ（または２；セクレチン受容体ファミリー）ＧＰＣＲ、くいラスＣ（または３；代謝型グルタミン酸／フェロモン）ＧＰＣＲ、クラスＤ（または４；真菌交配型（ｆｕｎｇａｌ  ｍａｔｉｎｇ）フェロモン受容体）ＧＰＣＲ、クラスＥ（または５；環状ＡＭＰ受容体）ＧＰＣＲ、およびクラスＦ（または６；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体）ＧＰＣＲである。
【００３８】
クラスＡのＧＰＣＲ（またはクラス１）は、約８００のメンバーを含むＧＰＣＲの最大のグループである。いくつかの例では、ロドプシン様ＧＰＣＲは、ホルモン、神経伝達物質、および光受容体を含む。さらなる例では、ロドプシン様ＧＰＣＲはさらに、１９のサブグループ、サブファミリーＡ１−Ａ１９に分類される。典型的なクラスＡ（ロドプシン様）ＧＰＣＲとしては、限定されないが、アミン作動性：アセチルコリン（ムスカリン性アセチルコリン受容体Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、およびＭ５）、アドレナリン作動性（アルファ１Ａ、アルファ１Ｂ、アルファ１Ｄ、アルファ２Ａ、アルファ２Ｂ、アルファ２Ｃ−１、ベータ−１、ベータ−２、ベータ−３）、ドーパミン（Ｄ（１Ａ）、Ｄ（１Ｂ）、Ｄ（２）、Ｄ（３）、Ｄ（４））、ヒスタミン（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４）、セロトニン（５−ＨＴ−１Ａ、５−ＨＴ−１Ｂ、５−ＨＴ−１Ｄ、５−ＨＴ−１Ｅ、５−ＨＴ−１Ｆ、５−ＨＴ−２Ａ、５−ＨＴ−２Ｂ、５−ＨＴ−２Ｃ、５−ＨＴ−４、５−ＨＴ−５Ａ、５−ＨＴ−６、５−ＨＴ−７）、カンナビノイド（ＣＢ１、ＣＢ２）、糖タンパク質ホルモン（濾胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨ−Ｒ）、ＧＰＲ２４メラニン凝集ホルモン受容体、ルトロピン絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体（ＬＳＨ−Ｒ）、ＧＰＣＲ０４５９メラニン凝集ホルモン受容体２（ＭＣＨ２）、サイロトロピン受容体（ＴＳＨ−Ｒ））、脂質（エイコサノイド（ロイコトリエン（ＬＴＢ（ロイコトリエンＢ４受容体（ａｋａ  Ｐ２Ｙ  プリン受容体７、Ｐ２Ｙ７）、ロイコトリエンＢ４受容体（ａｋａ  Ｆｉｓｈｂｏｙ  Ｇタンパク質共役型受容体）、および、ＬＴＣ（システイニルロイコトリエン受容体ＣｙｓＬＴ２）、システイニルロイコトリエン受容体（ＣＹＳＬＴ１）、プロスタノイド（ＣＲＴＨ２（ＧＰＲ４４）、プロスタサイクリン受容体（プロスタノイドＩＰ受容体）、プロスタグランジンＤ２受容体（プロスタノイドＤＰ受容体）、プロスタグランジンＥ２受容体ＥＰ１サブタイプ（プロスタノイドＥＰ１受容体）、プロスタグランジンＥ２受容体ＥＰ２サブタイプ（プロスタノイドＥＰ２受容体）、プロスタグランジンＥ２受容体ＥＰ３サブタイプ（プロスタノイドＥＰ３受容体）、プロスタグランジンＥ２受容体ＥＰ４サブタイプ（プロスタノイドＥＰ４受容体）、プロスタグランジンＦ２α受容体（プロスタノイドＦＰ受容体）、トロンボキサンＡ２受容体（ＴＸＡ２−Ｒ）（プロスタノイドＴＰ受容体）、リゾスフィンゴ脂質（ｌｙｓｏｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）（ＥＤＧ−４、ＥＤＧ−１、ＥＤＧ６、ＥＤＧ−７、ＥＤＧ−２、ＥＤＧ−３、ＥＤＧ５、ＥＤＧ−８）、スフィンゴシルホスフォリルコリン（ＯＧＲ１）、リゾホスファチジルコリン（Ｇ２Ａ））、メラトニン（Ｈ９、ＭＥＬ−１Ａ−Ｒ、ＭＥＬ−１Ｂ−Ｒ））、ヌクレオチド（Ｐ２Ｙ１２血小板ＡＤＰ受容体）、アデノシン（Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３）（ヌクレオシド−砂糖  ＫＩＡＡ０００１、ＵＤＰグルコース）、Ｐ２Ｕ（Ｐ２Ｕ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ１１、Ｐ２Ｙ６）、嗅覚（ＯＲ１Ａ２、ＯＲ１Ａ１、嗅覚受容体１７−９０、ＯＲ１７−２４、６Ｍ１−１６＊０１／０２／０３、６Ｍ１−１８＊０１／０２、６Ｍ１−４Ｐ＊０２／０５、嗅覚受容体８９、ＡＣ００６２７１、ＡＦ１４３３２８、ＡＬ０９６７７０−０１、ＡＬ０９６７７０−０２、ＡＬ０９６７７０−０３、ＡＬ０９６７７０−０４、ＡＬ１２１９４４、ＡＬ１３５８４１、ＢＣ６２９４０＿２、ＢＣ８５３９５＿１、ＢＣ８５３９５＿３、Ｆ２０５６９＿１、Ｆ２０７２２＿１、Ｆ２０７２２＿２、ＦＡＴ１１、ＧＰＲ１、ＧＲＩＲ−１、ＯＲ１７−４、ＨＧＭＰ０７Ｉ、ＨＧＭＰ０７Ｊ、ＨＩ７、ＨＯＲ’５ベータ、ＨＯＲ’５ベータ、ＨＯＲ３’ベータ１、ＨＰＦＨ１ＯＲ、ＨＳ６Ｍ１−１、ＨＳ６Ｍ１−３、ＨＳ６Ｍ１−６、ＨＳＡ１、ＨＳＡ１０、ＨＳＡ３、ＨＳＡ５、ＨＳＡ８、ＯＲ１６−３５、Ｈ＿ＤＪ０８５５Ｄ２１．１、Ｈ＿ＤＪ０９８８Ｇ１５．２、ＪＣＧ２、ＯＬＦ１、ＯＬＦ３、ＯＬＦ４、ＯＬＦＲ４２Ｂ、ＯＬＦＲ４２Ｂ、ＯＬＲＣＣ１５、ＯＲ１−２５、ＯＲ１−２６、ＯＲ１０Ａ１、ＯＲ１７−２０１、ＯＲ１７−２０９、ＯＲ１７−２１０、ＯＲ１７−２１９、ＯＲ１７−２２８、ＯＲ１７−３０、ＯＲ１７−４０、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｄ２、ＯＲ５−４０、ＯＲ５Ｄ３、ＯＲ５Ｆ１、ＯＲ６Ａ１、ＯＲ７−１３８、Ｒ３０３８５＿１、ＴＰＣＲ１００、ＴＰＣＲ１１０、ＴＰＣＲ１２０、ＴＰＣＲ１６、ＴＰＣＲ２４、ＴＰＣＲ２５、ＴＰＣＲ２６、ＴＰＣＲ２７、ＴＰＣＲ８５、ＴＰＣＲ９２、Ｚ９８７４４、ｄＪ２５Ｊ６．１、ｄＪ８８Ｊ８．１、前立腺特異的嗅覚受容体）、推定上の味覚受容体ＨＴＲ２、オプシン（青感性のオプシン、  エンセファロプシン（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐｓｉｎ）、緑感性のオプシン、メラノプシン、ＲＰＥ網膜Ｇタンパク質共役受容体、赤感性のオプシン、ロドプシン、視色素様受容体、ペロプシン、ペプチド（アンギオテンシン（ＡＴ１、ＡＴ２）、アペリン（ＡＰＪ）、ボンベシン（ＢＲＳ−３、ＧＲＰ−Ｒ（ＧＲＰ選択性ボンベシン受容体）、ニューロメジン−Ｂ受容体、ＮＭＢ−Ｒ（ニューロメジン−Ｂ−選択性ボンベシン受容体））、ブラジキニン（ＢＫ−１受容体、ＢＫ−２受容体）、ケモカイン（ＣＣ（ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸ３ＣＲ１、ＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＦＭＥＴ−ＬＥＵ−ＰＨＥ受容体（ＦＭＬＰ受容体）、ＦＭＬＰ関連受容体Ｉ（ＦＭＬＰ−Ｒ−Ｉ）、ＦＭＬＰ関連受容体ＩＩ（ＦＭＬＰ−Ｒ−ＩＩ）、インターロイキン（ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２）、アナフィラトキシン（Ｃ３Ａ−Ｒ、Ｃ５Ａ−Ｒ）、コレシストキニン（ＣＣＫ−Ａ受容体、ＣＣＫ−Ｂ受容体）、エンドセリン（ＥＴ−Ｂ、ＥＴ−Ａ）、ガラニン（ＧＡＬ１−Ｒ、ＧＡＬ２−Ｒ、ＧＡＬ３−Ｒ）、メラノコルチン（ＭＣ１−Ｒ（ＭＳＨ−Ｒ）、ＭＣ２−Ｒ（ＡＣＴＨ−Ｒ）、ＭＣ３−Ｒ、ＭＣ５−Ｒ））、モチリン（ＧＰＲ３８（モチリン受容体））、神経ペプチド（ＮＰＦＦ（ＮＰＦＦ２、ＲＦａｍｉｄｅ関連ペプチド受容体）、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ１−Ｒ、ＮＰＹ２−Ｒ、ＮＰＹ４−Ｒ、ＮＰＹ５−Ｒ、ＮＰＹ６−Ｒ）、ニューロテンシン（ＮＴＲ１、ＮＴＲ２）、オピオイド（ＤＯＲ−１、ＫＯＲ−１、ＭＯＲ−１、ノシセプチン受容体、ＫＯＲ−３）、オレキシン（オレキシン受容体１���、ＯＸ１Ｒ（ヒポクレチン受容体１型）、ＯＸ２Ｒ（ヒポクレチン受容体２型））、他のペプチド（ＫｉＳＳ受容体（ＧＰＲ５４））、プロテアーゼ活性化（ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３、ＰＡＲ−４、トロンビン受容体）、ソマトスタチン（ＳＳ５Ｒ、ＳＳ１Ｒ、ＳＳ２Ｒ、ＳＳ３Ｒ、ＳＳ４Ｒ）、タキキニン（ＮＫ−３受容体、ＮＫ−４受容体、ＮＭＵ１Ｒ（ａｋａ  ＦＭ３）、ＮＭＵ２Ｒ、ＮＫ−２受容体、ＮＫ−１受容体）、ウロテンシン（ウロテンシンＩＩ受容体、ＧＰＲ１４）、バソプレシン（ＯＴ−Ｒ、バソプレシンＶ１Ａ受容体、バソプレシンＶ１Ｂ受容体、バソプレシンＶ２受容体）、血小板活性因子（白血球血小板活性因子受容体（血小板活性因子受容体（ＰＡＦ−Ｒ）））、放出ホルモン（ＧＮＲＨ−Ｒ、ＧＨＳ−Ｒ、プロラクチン放出ペプチド受容体（ＧＰＲ１０）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体（ＴＲＨ−Ｒ）、ＩＩ型ＧｎＲＨ−Ｒタンパク質））が挙げられる。
【００３９】
いくつかの例では、１つ以上のクラスＡのＧＰＣＲは、オーファンＧＰＣＲとしてさらに分類される。いくつかの例では、オーファンＧＰＣＲは、その内因性のリガンドが同定されていないＧＰＣＲを指す。こうした場合、リガンドが同定されると、オーファンの状態は採用されたＧＰＣＲとして再度割り当てられる。典型的なクラスＡオーファンＧＰＣＲとしては、限定されないが、５−ヒドロキシトリプタミン受容体ホモログ、膜貫通型受容体ＨＥＯＡＤ５４、ケモカイン受容体、ケモカイン受容体様１、Ｇタンパク質共役受容体ＤＥＺ、ケモカイン受容体様２、ＩＬ−８関連受容体ＤＲＹ１２  ＧＰＲ３０  ＣＥＰＲ、後根受容体１  ＤＲＲ１、後根受容体２  ＤＲＲ２、後根受容体３  ＤＲＲ３、後根受容体４  ＤＲＲ４、後根受容体５  ＤＲＲ５、後根受容体６  ＤＲＲ６、ダッフィ抗原、ＥＢＶ誘発Ｇタンパク質共役受容体２（ＥＢＩ２）、ＥＤＧホモログ、ＥＤＧホモログ（ＧＰＲ４５）、ＥＤＧホモログ、ＧＰＲ３５、ＧＰＲ３７、ＧＰＲ７５、Ｇタンパク質共役受容体（ＲＡＩＧ１）、ＢＯＮＺＯ（ＳＴＲＬ３３）、Ｄ３８４４９、ＥＴＢＲ−ＬＰ−２、ＧＰＲ１、ＧＰＲ１２、ＧＰＲ１５、ＧＰＲ１７、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ２０、ＧＰＲ２２、ＧＰＲ３（ＡＣＣＡ「オーファン」受容体）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ３２、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ３９、ＧＰＲ４（ＧＰＲ１９）、ＧＰＲ４０、ＧＰＲ４１、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ５５、ＧＰＲ６、ＧＰＲ７、ＧＰＲ７３、ＧＰＲ８、ＨＧ３８、ＨＭ７４、ＬＧＲ４、ＲＤＣ１ホモログ、ＧＰＲ４８、ＧＰＲ６１、ＧＰＲ６２、ＧＰＲ７７、ＧＰＲ８４、ＧＰＲ８６、ＧＰＲ８７、ＧＰＲ７２、ＧＰＲＣ５Ｂ、Ｈ７ＴＢＡ６２、Ｇタンパク質共役型受容体Ｒ９７２２２、ＳＡＬＰＲ、Ｙ１３５８３、Ｙ３６３０２、ＧＰＲ５８、ＧＰＲ５７、ＲＥ２、ＧＰＲ２１、ＧＰＲ５２、ＳＲＥＢ１、ＳＲＥＢ２、ＳＲＥＢ３、ＬＧＲ７、ＭＡＳプロト癌遺伝子、ＭＡＳ関連Ｇタンパク質共役受容体ＭＲＧ、ニューロテンシン受容体ｎｔｒ２受容体ホモログ、ＧＰＲ２５、Ｈ９６３、Ｐ２Ｙ１０、Ｐ２Ｙ５、Ｐ２Ｙ９、ＦＭＬＰ関連受容体ホモログ、フェロモン受容体ホモログ、Ｎ−ホルミルペプチド受容体ホモログ、ＧＰＲ９２、ＲＡＩＧ１ホモログ、ＦＫＳＧ４６、ＦＫＳＧ４７、Ｖ１ＲＬ１、ＣＲＡＭ−Ａ、ＦＫＳＧ８０、７回膜貫通型ドメインタンパク質ｐ４０ホモログＴＡＳＰ睾丸特異的アドリアマイシン感受性タンパク質、線条体特異的Ｇタンパク質共役受容体、Ｔ細胞死亡関連タンパク質、および胸大動脈Ｇタンパク質共役受容体が挙げられる。
【００４０】
クラスＢＧＰＣＲ（またはクラス２）はＧＰＣＲのセクレチンファミリーを含む。いくつかの例では、セクレチン受容体はグルカゴンホルモンファミリーからペプチドホルモンによって調節される。いくつかの例では、典型的なクラスＢのＧＰＣＲは、限定されないが、セクレチン（ＢＡＩ−１、ＢＡＩ−２、ＢＡＩ−３）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド１型受容体、カルシトニン受容体（ＣＴ−Ｒ）、ＧＩＰ−Ｒ、グルカゴン受容体（ＧＬ−Ｒ）、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１受容体）、グルカゴン様ペプチド−２受容体（ＧＬＰ２Ｒ）、成長ホルモン放出ホルモン受容体（ＧＨＲＨ受容体）、白血球抗原ＣＤ９７、眼白子症１型タンパク質、ＰＴＨ２受容体、ＰＴＨＲ受容体、ＰＡＣＡＰ−Ｒ−１、ＦＭＩ１（ＭＥＧＦ２）、ＳＣＴ−Ｒ、ＣＲＨ（ＣＲＦ１、ＣＲＦ２）、ＶＩＰ（ＶＩＰ−Ｒ−１、ＶＩＰ−Ｒ−２）を含む。
【００４１】
場合によっては、クラスＢのオーファンＧＰＣＲとしては、例えば、カドヘリンＥＧＦＬＡＧ  ７回膜貫通型Ｇ型受容体（ＣＥＬＳＲ１）、細胞表面糖タンパク質ＥＭＲ１、クラスＢのＧタンパク質共役受容体Ｙ９１６２５、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様受容体ＥＭＲ３、フラミンゴ（ｆｌａｍｉｎｇｏ）１（ＦＭＩ１）、ＥＭＲ２、ＦＬＪ１４４５４、ＫＩＡＡ１８２８、ＡＬ０３３３７７（ＨＥ６ホモログ）、ＥＴＬ、ＧＰＲ５６、ＨＥ６、ＫＩＡＡ０７５８、ラトロフィリン−１、ラトロフィリン−２、ラトロフィリン−３、ＶＬＧＲ１が挙げられる。
【００４２】
クラスＣ  ＧＰＣＲ（またはクラス３）は、ＧＰＣＲの代謝型グルタミン酸フェロモンを含む。いくつかの例では、典型的なクラスＣのＧＰＣＲは、限定されないが、代謝型カルシウム感知受容体（ＣＡＳＲ）、代謝型グルタミン酸受容体１、代謝型グルタミン酸受容体２、代謝型グルタミン酸受容体３、代謝型グルタミン酸受容体４、代謝型グルタミン酸受容体５、代謝型グルタミン酸受容体６、代謝型グルタミン酸受容体７、代謝型グルタミン酸受容体８、感覚伝達Ｇタンパク質共役受容体−Ｂ３、味覚受容体ＧＰＣＲ−Ｂ４、およびＧＡＢＡ−Ｂ（ＧＡＢＡ−Ｂ１Ａ受容体、ＧＡＢＡ−Ｂ２受容体）が挙げられる。
【００４３】
クラスＤのＧＰＣＲ（またはクラス４）は、真菌交配型フェロモン受容体を含む。典型的な交配因子受容体はＳＴＥ２とＳＴＥ３を含んでいる。
【００４４】
クラスＥのＧＰＣＲ（またはクラス５）は、環状ＡＭＰ受容体を含む。
【００４５】
クラスＦのＧＰＣＲ（またはクラス６）は、ＧＰＣＲのＦｒｉｚｚｌｅｄ／Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄファミリーを含む。典型的なクラスＦのＧＰＣＲとしては、限定されないが、ｆｒｉｚｚｌｅｄ１膜貫通型受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ１０膜貫通型受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ２膜貫通型受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ３膜貫通型受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ４膜貫通型受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ５膜貫通型受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ６膜貫通型受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ７膜貫通型受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ９膜貫通型受容体、ｆｒｉｚｚｌｅｄ様受容体ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄホモログ（ＳＭＯ）、およびｆｒｉｚｚｌｅｄ７ホモログが挙げられる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＧＰＣＲはさらに味覚ＧＰＣＲを含む。典型的な味覚ＧＰＣＲとしては、限定されないが、Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、およびＴ２Ｒ９が挙げられる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、受容体はＧＰＣＲである。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはＧＰＣＲである。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、クラスＡ、クラスＢ、クラスＣ、クラスＤ、クラスＥ、またはクラスＦのＧＰＣＲである。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは味覚ＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。
【００４８】
イオンチャネルポリペプチド
イオンチャネルタンパク質は、細胞膜全体のイオンの流れを調節し、細胞量を制御し、静止膜電位を確立する、気孔形成膜タンパク質である。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は電位依存性イオンチャネルまたはリガンド依存性イオンチャネルを含む。場合によっては、イオンチャネルタンパク質は、カルシウム活性化カリウムチャネル、ＣａｔＳｐｅｒおよび二孔チャネル、環状ヌクレオチド調節チャネル、内向き整流性カリウムチャネル、リアノジン受容体、一過性受容体電位チャネル、２Ｐカリウムチャネル、電位依存性カルシウムチャネル、電位依存性カリウムチャネル、電位依存性陽子チャネル、電位依存性ナトリウムチャネル、５−ＨＴ３−受容体、酸感知（陽子依存性）イオンチャネル（ＡＳＩＣ）、上皮のナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）、ＧＡＢＡＡ受容体、グリシン受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ＩＰ３受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、Ｐ２Ｘ受容体、あるいはＺＡＣを含む。
【００４９】
ある実施形態では、受容体はイオンチャネルポリペプチドである。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルポリペプチドである。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、カルシウム活性化カリウムチャネル、ＣａｔＳｐｅｒおよび二孔チャネル、環状ヌクレオチド調節チャネル、内向き整流性カリウムチャネル、リアノジン受容体、一過性受容体電位チャネル、２Ｐカリウムチャネル、電位依存性カルシウムチャネル、電位依存性カリウムチャネル、電位依存性陽子チャネル、電位依存性ナトリウムチャネル、５−ＨＴ３−受容体、酸感知（陽子依存性）イオンチャネル（ＡＳＩＣ）、上皮のナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）、ＧＡＢＡＡ受容体、グリシン受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ＩＰ３受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、Ｐ２Ｘ受容体、あるいはＺＡＣから選択されるイオンチャネルポリペプチドを含む。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、あるいはＴＲＰＣ６を含む。
【００５０】
修飾された膜貫通ポリペプチドを生成するためのプラットフォーム
ある実施形態では、物理化学的性質が増強または改善された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成する方法とプラットフォームが本明細書に開示される。いくつかの例では、本明細書に記載される方法またはプラットフォームは、突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成する工程、Ｃ末端選択マーカーと随意にＮ末端選択マーカーを含む発現ベクターに修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入する工程、および、安定的に折り畳まれた修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを同定するために少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で宿主細胞中のベクターを発現させる工程を含む。
【００５１】
いくつかの例では、物理化学的性質が増強または改善された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成するための本明細書に記載される方法とプラットフォームは、図１で例証される通りである。いくつかの例では、方法またはプラットフォームは突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成する工程を含む（１０１）。いくつかの例では、突然変異誘発方法は無作為の突然変異誘発である。典型的な無作為の突然変異誘発は、エラープローンＰＣＲ、ローリングサークル、エラープローンＰＣＲ、突然変異誘発株、一時的突然変異誘発株、挿入突然変異誘発、エチルメタンスルホン酸、亜硝酸、あるいはＤＮＡシャフリングを含む。いくつかの例では、突然変異誘発はエラープローンＰＣＲ法である。いくつかの例では、突然変異誘発方法はＤＮＡシャフリング法である。他の例では、突然変異誘発法は非無作為の突然変異誘発法である。ライブラリーの生成に際して、ライブラリー内での修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはそれぞれ選択プロセスを経験するための発現ベクター中でコードされる（１０２）。いくつかの例では、発現ベクターはさらに、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端に位置する第１の選択マーカーを含む。このような選択マーカーはしばしば、複数膜貫通型ポリペプチドの早熟な切断（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）を防ぐように選択され、および／または複数膜貫通型ポリペプチドの安定したかつ適切な折り畳みを容易にする。場合によっては、発現ベクターは随意に、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端に位置する第２の選択マーカーを含む。場合によっては、第２の選択マーカーの存在は、複数膜貫通型ポリペプチドの安定したかつ適切な折り畳みを促す。いくつかの例では、誤って折り畳まれたポリペプチドは標識され、分解用の宿主細胞機構によって除去される。いくつかの例では、第１の選択マーカーは第１の選択ポリペプチドをコードし、第２の選択マーカーは第２の選択ポリペプチドをコードする。いくつかの例では、発現ベクターは、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下（例えば、抗生物質の存在下、または栄養要求性薬剤の不在下）において宿主細胞中で発現される。場合によっては、第１の選択ポリペプチドが修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端部分に適切に表示され、第２の選択ポリペプチドが修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端部分に適切に表示されるときに、少なくとも１つの選択剤は、第１の選択ポリペプチドと第２の選択ポリペプチドとの相互作用によって宿主細胞に対して無毒化される。いくつかの例では、少なくとも１つの選択剤は、抗生物質（例えば、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、またはテトラサイクリン）、あるいは毒性の代謝産物（例えば、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）を含む。いくつかの例では、少なくとも１つの選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。選択プロセス（１０２）からのいくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは���所望の物理化学的性質を伝えることができる突然変異の最小限のセットを同定するために、無作為の突然変異誘発（１０１）の追加のラウンド（例えば、無作為の突然変異誘発の２、３、４、または５以上のラウンド）と選択プロセス（１０２）とを経験するために同定される。選択プロセス（１０２）からの他の例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、発現と特性決定（１０３）のために同定される。いくつかの例では、物理化学的性質の１つ以上、例えば、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、あるいは経路活性化選択性の１つ以上が評価される。いくつかの例では、増強された安定性（例えば、耐熱性またはｐＨ安定性）や結晶の形成におけるタンパク質の改善された傾向などの物理化学的性質の増強はさらに、改善された免疫原性と抗原性に相互に関連する。いくつかの例では、１つ以上の分析技術は、特性決定プロセス（１０３）のために利用され、Ｘ線結晶学、電子結晶学、クライオ電子顕微鏡、核磁気共鳴スペクトル測定法（ＮＭＲ）、熱変性技術、および／または化学変性技術を含む。場合によっては、発現と特性決定工程（１０３）から、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの候補は、大規模タンパク質産生（１０４）について同定され、その後、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド候補の結晶化（１０５）、小分子スクリーニング（１０６）、ペプチドスクリーニング（１０７）、抗体および／またはワクチン産生（１０８）について同定される。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド候補は、昆虫宿主細胞または哺乳動物宿主細胞中で生成される。いくつかの例では、ファージディスプレイあるいは酵母ディスプレイは抗体スクリーニングに使用され、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド候補はスクリーニングプロセス中にナノ粒子上で固定される。いくつかの例では、抗体スクリーン（１０７）から同定された抗体は、ワクチンのためにさらに製剤される。いくつかの例では、ペプチド・スクリーニング（１０７）から同定された修飾された複数膜貫通型ポリペプチド候補のペプチドは、ワクチンのためにさらに製剤される。他の例では、タンパク質産生工程（１０４）から生成された修飾された複数膜貫通型ポリペプチド候補はワクチン（例えば、核酸ベースのワクチン、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベースのワクチン、あるいはウイルスベースのワクチン）のためにさらに製剤される。
【００５２】
修飾された複数膜貫通型ポリペプチド
いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは１つ以上の修飾を含む。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは約１から約１００の修飾を含む。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、約１から約９０まで、約５から約８０まで、約１０から約７０まで、約１５から約６０まで、約２０から約５０まで、約３０から約４０まで、約１から約８０まで、約１から約６０まで、約１から約５０まで、約１から約４０まで、約１から約３０まで、約１から約１５まで、約１から約１０まで、約１０から約８０まで、約１０から約６０まで、約１０から約５０まで、約１０から約４０まで、約２０から約８０まで、約２０から約６０まで、約２０から約４０まで、約３０から約８０まで、約３０から約６０まで、または約３０から約５０までの修飾を含む。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。
【００５３】
場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質）、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む。場合によっては、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質）、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体から選択される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、約１から約１００の修飾を含む。場合によっては、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質）、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体から選択される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、約１から約９０まで、約５から約８０まで、約１０から約７０まで、約１５から約６０まで、約２０から約５０まで、約３０から約４０まで、約１から約８０まで、約１から約６０まで、約１から約５０まで、約１から約４０まで、約１から約３０まで、約１から約１５まで、約１から約１０まで、約１０から約８０まで、約１０から約６０まで、約１０から約５０まで、約１０から約４０まで、約２０から約８０まで、約２０から約６０まで、約２０から約４０まで、約３０から約８０まで、約３０から約６０まで、または約３０から約５０までの修飾を含む。いくつかの例では、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質）、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体から選択される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルタンパク質である。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約１から約１００の修飾を含む。場合によっては、イオンチャネルタンパク質は、約１から約９０まで、約５から約８０まで、約１０から約７０まで、約１５から約６０まで、約２０から約５０まで、約３０から約４０まで、約１から約８０まで、約１から約６０まで、約１から約５０まで、約１から約４０まで、約１から約３０まで、約１から約１５まで、約１から約１０まで、約１０から約８０まで、約１０から約６０まで、約１０から約５０まで、約１０から約４０まで、約２０から約８０まで、約２０から約６０まで、約２０から約４０まで、約３０から約８０まで、約３０から約６０まで、または約３０から約５０までの修飾を含む。
【００５５】
いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約１以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約２以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約３以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約４以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約５以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約６以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約７以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約８以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約９以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約１０以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約１１以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約１２以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約１３以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約１４以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約１５以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約１６以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約１７以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約１８以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約１９以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約２０以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約２５以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約３０以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約３５以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約４０以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約４５以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、イオンチャネルタンパク質は約５０以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは受容体である。場合によっては、受容体はＧＰＣＲである。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約１から約１００の修飾を含む。場合によっては、ＧＰＣＲは、約１から約９０まで、約５から約８０まで、約１０から約７０まで、約１５から約６０まで、約２０から約５０まで、約３０から約４０まで、約１から約８０まで、約１から約６０まで、約１から約５０まで、約１から約４０まで、約１から約３０まで、約１から約１５まで、約１から約１０まで、約１０から約８０まで、約１０から約６０まで、約１０から約５０まで、約１０から約４０まで、約２０から約８０まで、約２０から約６０まで、約２０から約４０まで、約３０から約８０まで、約３０から約６０まで、または約３０から約５０までの修飾を含む。
【００５７】
いくつかの例では、ＧＰＣＲは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約１以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約２以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約３以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約４以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約５以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約６以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約７以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約８以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約９以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約１０以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約１１以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約１２以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約１３以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約１４以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約１５以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約１６以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約１７以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約１８以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約１９以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約２０以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約２５以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約３０以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約３５以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約４０以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約４５以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲは約５０以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質）、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む。いくつかの例では、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質）、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体から選択される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルタンパク質である。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約０．５％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約１％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約２％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約３％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約４％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約５％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約６％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約７％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約８％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約９％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約１０％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約１１％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約１２％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約１３％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約１４％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約１５％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約２０％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約２５％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、イオンチャネルタンパク質は約３０％またはそれ以上の修飾を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは受容体である。場合によっては、受容体はＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約０．５％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約１％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約２％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約３％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約４％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約５％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約６％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約７％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約８％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約９％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約１０％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約１１％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約１２％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約１３％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約１４％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約１５％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約２０％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約２５％またはそれ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは約３０％またはそれ以上の修飾を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾は、ＧＰＣＲのＮ末端部分、ＧＰＣＲの膜貫通コア（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｒｅ）（ＴＭ）、ＧＰＣＲのＣ末端部分、またはこれらの組み合わせに位置する。いくつかの例では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、またはそれ以上の修飾は、ＧＰＣＲのＮ末端部分に位置する。場合によっては、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、またはそれ以上の修飾は、ＧＰＣＲのＴＭ内、例えば、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６、ＴＭ７、またはこれらの組み合わせ内にある。さらなる場合には、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、またはそれ以上の修飾は、ＧＰＣＲのＣ末端部分に位置する。
【００６２】
いくつかの実施形態において、上記の修飾は、複数膜貫通型ポリペプチドの、その野性型に対する物理化学的性質の増強または改善に相関する。いくつかの例では、物理化学的性質は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、および／または経路活性化選択性を含む。場合によっては、上記の修飾は、複数膜貫通型ポリペプチドの、その野性型に対する物理化学的性質の増強または改善に相関し、物理化学的性質は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、および／または経路活性化選択性から選択される。場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルタンパク質またはＧＰＣＲである。場合によっては、上記の修飾は、イオンチャネルタンパク質の、その野性型に対する物理化学的性質の増強または改善に相関し、物理化学的性質は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、および／または経路活性化選択性から選択される。さらなる場合には、上記の修飾は、ＧＰＣＲの、その野性型に対する物理化学的性質の増強または改善に相関し、物理化学的性質は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、および／または経路活性化選択性から選択される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、物理化学的性質は改善または増強された発現レベルである。いくつかの例では、上記の修飾は、複数膜貫通型ポリペプチドの、その野性型に対する発現レベルの増強または改善に相関する。場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルタンパク質またはＧＰＣＲである。いくつかの例では、上記の修飾は、イオンチャネルタンパク質の、その野性型に対する発現レベルの増強または改善に相関する。いくつかの例では、上記の修飾は、ＧＰＣＲの、その野性型に対する発現レベルの増強または改善に相関する。
【００６４】
いくつかの実施形態において、物理化学的性質は改善または増強された安定性である。場合によっては、安定性はｐＨ安定性と耐熱性をさらに含む。場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドのｐＨ安定性は、折り畳まれたままで留まるポリペプチドの能力であり、定義されたｐＨ範囲で生体機能（例えば生物学的活性）を保持する。いくつかの例では、定義されたｐＨ範囲は、長さが約１から約１１、約３から約９、約４から約９、約５から約９、約６から約９、あるいは約７から約９である。場合によっては、定義されたｐＨは、少なくとも約１、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、またはそれ以上である。
【００６５】
場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドの熱安定性は、折り畳まれたままで留まるポリペプチドの能力であり、定義された温度で生体機能（例えば生物学的活性）を保持する。いくつかの例では、定義された温度範囲は、約０°Ｃから約１２０°Ｃ、約１０°Ｃから約１００°Ｃ、約１５°Ｃから約８０°Ｃ、約２０°Ｃから約６０°Ｃ、約２５°Ｃから約５０°Ｃ、約３０°Ｃから約４０°Ｃ、約１５°Ｃから約３７°Ｃ、約２０°Ｃから約３７°Ｃ、約２５°Ｃから約３７°Ｃ、約２５°Ｃから約５０°Ｃ、約３７°Ｃから約５０°Ｃである。場合によっては、定義された温度は、少なくとも約１°Ｃ、４°Ｃ、５°Ｃ、８°Ｃ、１０°Ｃ、１５°Ｃ、１６°Ｃ、１８°Ｃ、２０°Ｃ、２５°Ｃ、３０°Ｃ、３５°Ｃ、３７°Ｃ、４０°Ｃ、４２°Ｃ、４５°Ｃ、５０°Ｃ、５５°Ｃ、６０°Ｃ、６５°Ｃ、７０°Ｃ、８０°Ｃ、９０°Ｃ、１００°Ｃ、またはそれ以上である。
【００６６】
いくつかの例では、複数膜貫通型ポリペプチドの熱安定性はさらに、複数膜貫通型ポリペプチドの融点に関連している。場合によっては、融点曲線は、複数膜貫通型ポリペプチドサンプルを熱し、変性、不活性化、凝集または分解の程度を、熱シフトアッセイ（例えば、染料を使用する蛍光シフト）、示差走査熱量測定、円偏光二色性分光分析、ピークシフトアッセイ（ＨＰＬＣ／サイズ排除クロマトグラフィーに基づく）などの技術を利用して測定することにより生成される。場合によっては、熱安定性は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの、その野性型に対する融点（または融解温度）の上昇を指す。場合によっては、上昇は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上の温度の上昇である。
【００６７】
場合によっては、安定性はさらに、その正常な膜環境の外部での精製を可能にする、洗浄薬、界面活性剤、および可溶化緩衝液の範囲中の複数膜貫通型ポリペプチドの安定性を含む。したがって、複数膜貫通型ポリペプチドは、非標的膜タンパク質、膜関連タンパク質、またはリポタンパク質、アポリポタンパク質、脂質、ホスホイノシトール脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｌｉｐｉｄｓ）、およびリポ糖（ｌｉｐｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）などの他の膜成分といった非所望抗原から除去された単離形態で提供される。
【００６８】
いくつかの例では、上記の修飾は、複数膜貫通型ポリペプチドの、その野性型に対する増強または改善された安定性（例えば、ｐＨ安定性または熱安定性）に相関する。場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルタンパク質またはＧＰＣＲである。いくつかの例では、上記の修飾は、イオンチャネルタンパク質の、その野性型に対する増強または改善された安定性（例えば、ｐＨ安定性または熱安定性）に相関する。いくつかの例では、上記の修飾は、ＧＰＣＲの、その野性型に対する増強または改善された安定性（例えば、ｐＨ安定性または熱安定性）に相関する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、物理化学的性質は改善または増強された配座の選択性である。いくつかの例では、上記の修飾は、複数膜貫通型ポリペプチドの、その野性型に対する配座の選択性の増強または改善に相関する。場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルタンパク質またはＧＰＣＲである。いくつかの例では、上記の修飾は、イオンチャネルタンパク質の、その野性型に対する配座の選択性の増強または改善に相関する。いくつかの例では、上記の修飾は、ＧＰＣＲの、その野性型に対する配座の選択性の増強または改善に相関する。
【００７０】
いくつかの実施形態において、物理化学的性質は改善または増強された均質性である。いくつかの例では、均質性は、複数膜貫通型ポリペプチドの集団内での１つ以上の物理化学的性質の構造的な類似性あるいは均一性、および／または均一性を指す。いくつかの例では、複数膜貫通型ポリペプチドのタンパク質の配座の可変性の減少は、サンプル内での複数膜貫通型ポリペプチドの均質性の増加または高度な均質性に相関する。他の例では、複数膜貫通型ポリペプチドの分解および／または変性の増大は、サンプル内での複数膜貫通型ポリペプチドの均質性の減少に相関する。
【００７１】
いくつかの例では、上記の修飾は、複数膜貫通型ポリペプチドの、その野性型に対する均質性の増強または改善に相関する。場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルタンパク質またはＧＰＣＲである。いくつかの例では、上記の修飾は、イオンチャネルタンパク質の、その野性型に対する均質性の増強または改善に相関する。いくつかの例では、上記の修飾は、ＧＰＣＲの、その野性型に対する均質性の増強または改善に相関する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、物理化学的性質は改善または増強されたタンパク質結晶化である。いくつかの例では、改善または増強されたタンパク質結晶化は、容易に結晶化される複数膜貫通型ポリペプチドの傾向を指す。例えば、複数膜貫通型ポリペプチドとそれらの複合体は、過飽和条件下で結晶を形成するように促される。こうした条件下では、個々のタンパク質分子は非共有相互作用によって一緒にまとめられて反復アレイ中に詰められる。その後、こうした結晶は、タンパク質の分子構造を調べるために、および／または、工業的または生物工学的な目的のために、構造生物学で使用される。いくつかの例では、タンパク質結晶化は、水性環境の制約、高品質のタンパク質サンプルを得る難しさ、あるいは、温度、ｐＨ、およびイオン強度に対するタンパク質サンプルの感度などの因子のせいで困難であると考えられている。いくつかの例では、複数膜貫通型タンパク質の同じグループ内の複数膜貫通型タンパク質は、その物理化学的特性において異なり、そのため、所望の特定のタンパク質の結晶化は予測可能ではない。場合によっては、所定のタンパク質のための適切な結晶化条件の決定は、優れた結晶化条件が見つかる前に、多くの条件の実証的な検定を必要とする。場合によっては、本明細書に記載される改善または増強されたタンパク質結晶化は、高品質のタンパク質サンプルの増加、タンパク質結晶回折の増加、あるいは異質性の減少または安定性の改善を指す。
【００７３】
いくつかの例では、上記の修飾は、複数膜貫通型ポリペプチドの、その野性型に対するタンパク質結晶化の増強または改善に相関する。場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルタンパク質またはＧＰＣＲである。いくつかの例では、上記の修飾は、イオンチャネルタンパク質の、その野性型に対するタンパク質結晶化の増強または改善に相関する。いくつかの例では、上記の修飾は、ＧＰＣＲの、その野性型に対するタンパク質結晶化の増強または改善に相関する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、物理化学的性質は改善または増強された抗原性である。いくつかの例では、抗原性は、抗体またはその結合フラグメントに、あるいは、液性免疫応答および／または細胞媒介性免疫応答の生成物に相互作用するまたは特異的に結合する化学構造（例えば抗原）の能力である。
【００７５】
いくつかの例では、上記の修飾は、複数膜貫通型ポリペプチドの、その野性型に対する抗原性の増強または改善に相関する。場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルタンパク質またはＧＰＣＲである。いくつかの例では、上記の修飾は、イオンチャネルタンパク質の、その野性型に対する抗原性の増強または改善に相関する。いくつかの例では、上記の修飾は、ＧＰＣＲの、その野性型に対する抗原性の増強または改善に相関する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、物理化学的性質は改善または増強された免疫原性である。場合によっては、免疫原性は、液性免疫応答および／または細胞媒介性免疫応答を誘発する化学構造（例えば、免疫原）の能力である。
【００７７】
いくつかの例では、上記の修飾は、複数膜貫通型ポリペプチドの、その野性型に対する免疫原性の増強または改善に相関する。場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルタンパク質またはＧＰＣＲである。いくつかの例では、上記の修飾は、イオンチャネルタンパク質の、その野性型に対する免疫原性の増強または改善に相関する。いくつかの例では、上記の修飾は、ＧＰＣＲの、その野性型に対する免疫原性の増強または改善に相関する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、物理化学的性質は改善または増強された経路活性化選択性である。いくつかの例では、改善または増強された経路活性化選択性は、複数膜貫通型ポリペプチドが複数の利用可能な代謝経路またはシグナル伝達経路の中から１つ以上の数の代謝経路またはシグナル伝達経路を選択的に活性化する能力を指す。
【００７９】
いくつかの例では、上記の修飾は、複数膜貫通型ポリペプチドの、その野性型に対する経路活性化選択性の増強または改善に相関する。場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドはイオンチャネルタンパク質またはＧＰＣＲである。いくつかの例では、上記の修飾は、イオンチャネルタンパク質の、その野性型に対する経路活性化選択性の増強または改善に相関する。いくつかの例では、上記の修飾は、ＧＰＣＲの、その野性型に対する経路活性化選択性の増強または改善に相関する。
【００８０】
いくつかの実施形態において、改善された熱安定性および／または均質性はさらに、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのタンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、経路活性化選択性、および／または他の物理化学的性質を調節する（例えば、改善する）。
【００８１】
いくつかの実施形態において、修飾は挿入、欠失、または突然変異を含む。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、挿入、欠失、突然変異、あるいはこれらの組み合わせを含む。場合によっては、突然変異はナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異を含む。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはさらに切断を含む。場合によっては、切断は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端、またはこれらの末端の両方に位置する。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは内部の欠失または挿入も含む。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは内部の欠失を含む。他の場合には、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは内部の挿入を含む。
【００８２】
いくつかの例では、修飾は、疎水性または非極性のアミノ酸残基への突然変異を含む。場合によっては、疎水性または非極性のアミノ酸は、小さな疎水性アミノ酸と大きな疎水性アミノ酸を含む。典型的な小さな疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、およびそれらのアナログを含む。典型的な大きな疎水性アミノ酸は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびこれらのアナログを含む。いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、小さな疎水性アミノ酸への突然変異（例えばグリシン、アラニン、プロリン、およびこれらのアナログへの突然変異）を含む。いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、大きな疎水性アミノ酸への突然変異（例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびこれらのアナログへの突然変異）を含む。
【００８３】
いくつかの例では、修飾は、非極性のアミノ酸残基への突然変異を含む。場合によっては、極性アミノ酸は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、およびこれらのアナログを含む。いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、非極性のアミノ酸残基への突然変異（例えば、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、およびこれらのアナログへの突然変異）を含む。
【００８４】
さらなる例では、修飾は、荷電アミノ酸残基への突然変異を含む。場合によっては、荷電アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、あるいはこれらのアナログを含む。いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、荷電アミノ酸残基への突然変異（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、あるいはこれらのアナログへの突然変異）を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、非必須アミノ酸への修飾を含む。いくつかの例では、非必須アミノ酸残基は、その必須の生物学的または生物化学的な活性（例えば、受容体結合あるいは活性化）を消失させるまたは実質的に変化させることなく、ポリペプチドの野生型配列から変化する残基である。場合によっては、本明細書で提供される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは必須アミノ酸を含む。場合によっては、必須アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から変えられると、ポリペプチドの必須の生物学的または生物化学的な活性を消失させるまたは実質的に消失させる残基である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは保存的アミノ酸置換を含む。場合によっては、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と取り替えられるアミノ酸置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。こうしたファミリーは、例えば、塩基性側鎖（例えば、Ｋ、Ｒ、Ｈ）、酸性側鎖（例えば、Ｄ、Ｅ）、非荷電極性側鎖（例えば、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ）、無極性側鎖（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ）、ベータ分岐側鎖（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ）、および芳香族側鎖（例えば、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ））を備えたアミノ酸を含む。したがって、ポリペプチド中の予測される非必須アミノ酸残基は、例えば、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と取り替えられる。許容可能な置換の他の例は、当電子の考察（例えばメチオニン用ノルロイシン）または他の特性（例えば、フェニルアラニン用の２−チエニルアラニン、あるいはトリプトファン用の６−Ｃｌ−トリプトファン）に基づく置換を含む。
【００８７】
選択マーカー
いくつかの実施形態において、選択マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子を含む。いくつかの例では、選択マーカー遺伝子はレポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質）をコードしない。上に議論されるように、いくつかの例の選択マーカーは、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの安定したかつ適切な折り畳みを促す。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの安定したかつ適切な折り畳みは、翻訳後プロセシングの後のその構造的な建築物によって生体機能を達成することができるポリペプチドを指す。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの安定した適切な折り畳みはさらに、生物学的に活性な機能を備えたポリペプチドを指す。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの安定した適切な折り畳みは、誤って折り畳まれた構造的なアーキテクチャーを備えたポリペプチド、あるいはその生体機能または活性を経験するのを防ぐ構造的なアーキテクチャーを備えたポリペプチドを指さない。
【００８８】
いくつかの例では、選択マーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質をコードする遺伝子、あるいはルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む。いくつかの例では、第２の選択マーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子をコードする。いくつかの例では、選択マーカー遺伝子は、第１の選択マーカー遺伝子あるいは第２の選択マーカー遺伝子である。いくつかの例では、第１の選択マーカー遺伝子および／または第２の選択マーカー遺伝子は、レポーター遺伝子を含まない。
【００８９】
いくつかの例では、選択マーカー遺伝子は第１の選択マーカー遺伝子である。いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子を含む。いくつかの例では、第１の選択マーカー遺伝子はレポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質）をコードしない。いくつかの例では、第１の選択マーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子をコードする。
【００９０】
いくつかの例では、選択マーカー遺伝子は第２の選択マーカー遺伝子である。いくつかの実施形態において、第２の選択マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子を含む。いくつかの例では、第２の選択マーカー遺伝子はレポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質）をコードしない。いくつかの例では、第２の選択マーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子を含む。
【００９１】
いくつかの例では、第１の選択マーカー遺伝子と第２の選択マーカー遺伝子は同じである。他の例では、第１の選択マーカー遺伝子と第２の選択マーカー遺伝子は異なる。
【００９２】
いくつかの実施形態において、第１の選択マーカー遺伝子および／または第２の選択マーカー遺伝子は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的に、あるいは、約１〜約６０のアミノ酸残基をコードするリンカー遺伝子を介して間接的に動作可能に連結される。いくつかの例では、第１の選択マーカー遺伝子は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的に、あるいは、約１〜約６０のアミノ酸残基をコードするリンカー遺伝子を介して間接的に動作可能に連結される。いくつかの例では、第２の選択マーカー遺伝子は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに直接的に、あるいは、約１〜約６０のアミノ酸残基をコードするリンカー遺伝子を介して間接的に動作可能に連結される。場合によっては、リンカー遺伝子は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基をコードする。
【００９３】
いくつかの実施形態において、第１と第２の選択マーカーは選択剤に対して選択的である。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は抗生物質または毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、抗生物質は、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、あるいはテトラサイクリンを含む。いくつかの実施形態において、毒性の代謝産物は、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含む。いくつかの実施形態において、選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態において、選択剤は第１の選択剤と第２の選択剤を含む。いくつかの実施形態において、第１の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、抗生物質は、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、あるいはテトラサイクリンを含む。いくつかの実施形態において、毒性の代謝産物は、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、第１の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。
【００９６】
式Ｉ−ＩＶの修飾された膜貫通ポリペプチド
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成することが本明細書で開示され、
【００９７】
【化６】
2019527065.tif 000008
式中、
ＭＳＭＰは少なくとも１つの修飾を含む複数膜貫通型ポリペプチドであり、
ＳＰ１はＭＳＭＰのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２はＭＳＭＰのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、
ｘは独立して０−３であり、
ｙは独立して１−５であり、
ｚは独立して１−３であり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である。
【００９８】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質）、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む。いくつかの実施形態では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は無作為の突然変異誘発方法によって生成される。いくつかの例では、無作為の突然変異誘発方法はエラープローンＰＣＲ法を含む。いくつかの例では、無作為の突然変異誘発方法はＤＮＡシャフリング法を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は挿入、欠失、または突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異はナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、またはその組み合わせを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは哺乳動物のＧＰＣＲである。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲはヒトのＧＰＣＲである。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【０１０４】
いくつかの例では、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分または細胞外部分にある。いくつかの例では、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にある。いくつかの例では、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分または細胞外部分にある。いくつかの例では、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にある。いくつかの例では、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にあり、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にある。
【０１０５】
いくつかの例では、ＳＰ１とＳＰ２は同じである。他の例では、ＳＰ１とＳＰ２は異なる。場合によっては、ＳＰ１とＳＰ２はさらに、それぞれＬ１とＬ２によってＭＳＭＰに連結している。いくつかの例では、Ｌ１は長さが約０〜約６０のアミノ酸残基、例えば、長さが約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基である。場合によっては、Ｌ２は長さが約０〜約６０のアミノ酸残基、例えば、長さが約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、ＳＰ１ｚはＳＰ１２−３であり、ＳＰ１の各々は他とは異なる。いくつかの例では、ＳＰ１ｚはＳＰ１３であり、３つのＳＰ１の２つは同じである。いくつかの例では、ＳＰ１の各々はさらに、直接的に、または、リンカーポリペプチドによって間接的に、別のＳＰ１に連結している。いくつかの例では、リンカーポリペプチドは、約１〜約６０のアミノ酸残基、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ＳＰ２ｘはＳＰ２２−３であり、ＳＰ２の各々は他とは異なる。いくつかの例では、ＳＰ２ｘはＳＰ２３であり、３つのＳＰ２の２つは同じである。いくつかの例では、ＳＰ２の各々はさらに、直接的に、または、リンカーポリペプチドによって間接的に、別のＳＰ２に連結している。いくつかの例では、リンカーポリペプチドは、約１〜約６０のアミノ酸残基、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、第１の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、抗生物質は、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、あるいはテトラサイクリンを含む。いくつかの実施形態において、毒性の代謝産物は、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、第１の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはタグをさらに含む。いくつかの実施形態において、タグは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端、またはこれらの組み合わせに連結している。いくつかの実施形態において、タグは、ＭＢＰ、ＴｒｘＡ、ＦＬＡＧタグ、ＡＶＩタグ、またはＨｉｓＴａｇを含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、式（Ｉａ）の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成することが本明細書で開示され、
【０１１２】
【化７】
2019527065.tif 000009
式中、
ＭＳＭＰは少なくとも１つの修飾を含む複数膜貫通型ポリペプチドであり、
ＳＰ１はＭＳＭＰのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２はＭＳＭＰのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質）、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む。いくつかの実施形態では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は無作為の突然変異誘発方法によって生成される。いくつかの例では、無作為の突然変異誘発方法はエラープローンＰＣＲ法を含む。いくつかの例では、無作為の突然変異誘発方法はＤＮＡシャフリング法を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は挿入、欠失、または突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異はナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、またはその組み合わせを含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは哺乳動物のＧＰＣＲである。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲはヒトのＧＰＣＲである。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【０１１９】
いくつかの例では、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分または細胞外部分にある。いくつかの例では、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にある。場合によっては、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分または細胞外部分にある。いくつかの例では、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にある。いくつかの例では、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にあり、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にある。
【０１２０】
いくつかの例では、ＳＰ１とＳＰ２は同じである。他の例では、ＳＰ１とＳＰ２は異なる。場合によっては、ＳＰ１とＳＰ２はさらに、それぞれＬ１とＬ２によってＭＳＭＰに連結している。いくつかの例では、Ｌ１は長さが約０〜約６０のアミノ酸残基、例えば、長さが約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基である。場合によっては、Ｌ２は長さが約０〜約６０のアミノ酸残基、例えば、長さが約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基である。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、第１の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、抗生物質は、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、あるいはテトラサイクリンを含む。いくつかの実施形態において、毒性の代謝産物は、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、第１の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはタグをさらに含む。いくつかの実施形態において、タグは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端、またはこれらの組み合わせに連結している。いくつかの実施形態において、タグは、ＭＢＰ、ＴｒｘＡ、ＦＬＡＧタグ、ＡＶＩタグ、またはＨｉｓＴａｇを含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成することが本明細書で開示され、
【０１２５】
【化８】
2019527065.tif 000010
式中、
ＲＰはイオンチャネルポリペプチドまたはＧＰＣＲから選択された受容体ポリペプチドであり、ここで、ＲＰは少なくとも１つの修飾を含み、
ＳＰ１はＲＰのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２はＲＰのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、
ｘは独立して０−３であり、
ｙは独立して１−５であり、
ｚは独立して１−３であり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、ＲＰは修飾されたイオンチャネルポリペプチドである。いくつかの例では、修飾されたイオンチャネルポリペプチドは、電位依存性イオンチャネルポリペプチドまたは一時的な受容器電位チャネルポリペプチドである。いくつかの実施形態において、修飾されたイオンチャネルポリペプチドは、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの実施形態において、ＲＰは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は無作為の突然変異誘発方法によって生成される。いくつかの例では、無作為の突然変異誘発方法はエラープローンＰＣＲ法を含む。いくつかの例では、無作為の突然変異誘発方法はＤＮＡシャフリング法を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は挿入、欠失、または突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異はナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、またはその組み合わせを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは哺乳動物のＧＰＣＲである。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲはヒトのＧＰＣＲである。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【０１３２】
いくつかの例では、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分または細胞外部分にある。いくつかの例では、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にある。場合によっては、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分または細胞外部分にある。いくつかの例では、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にある。いくつかの例では、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にあり、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にある。
【０１３３】
いくつかの例では、ＳＰ１とＳＰ２は同じである。他の例では、ＳＰ１とＳＰ２は異なる。場合によっては、ＳＰ１とＳＰ２はさらに、それぞれＬ１とＬ２によってＲＰに連結している。いくつかの例では、Ｌ１は長さが約０〜約６０のアミノ酸残基、例えば、長さが約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基である。場合によっては、Ｌ２は長さが約０〜約６０のアミノ酸残基、例えば、長さが約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基である。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、ＳＰ１ｚはＳＰ１２−３であり、ＳＰ１の各々は他とは異なる。いくつかの例では、ＳＰ１ｚはＳＰ１３であり、３つのＳＰ１の２つは同じである。いくつかの例では、ＳＰ１の各々はさらに、直接的に、または、リンカーポリペプチドによって間接的に、別のＳＰ１に連結している。いくつかの例では、リンカーポリペプチドは、約１〜約６０のアミノ酸残基、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、ＳＰ２ｘはＳＰ２２−３であり、ＳＰ２の各々は他とは異なる。いくつかの例では、ＳＰ２ｘはＳＰ２３であり、３つのＳＰ２の２つは同じである。いくつかの例では、ＳＰ２の各々はさらに、直接的に、または、リンカーポリペプチドによって間接的に、別のＳＰ２に連結している。いくつかの例では、リンカーポリペプチドは、約１〜約６０のアミノ酸残基、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、第１の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、抗生物質は、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、あるいはテトラサイクリンを含む。いくつかの実施形態において、毒性の代謝産物は、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、第１の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはタグをさらに含む。いくつかの実施形態において、タグは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端、またはこれらの組み合わせに連結している。いくつかの実施形態において、タグは、ＭＢＰ、ＴｒｘＡ、ＦＬＡＧタグ、ＡＶＩタグ、またはＨｉｓＴａｇを含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成することが本明細書で開示され、
【０１４０】
【化９】
2019527065.tif 000011
式中、
ＧＰＣＲは少なくとも１つの修飾を含むＧＰＣＲであり、
ＳＰ１は、ＧＰＣＲのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にあり、第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２は、ＧＰＣＲのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にあり、第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、
ｘは独立して０−３であり、
ｙは独立して１−５であり、
ｚは独立して１−３であり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は無作為の突然変異誘発方法によって生成される。いくつかの例では、無作為の突然変異誘発方法はエラープローンＰＣＲ法を含む。いくつかの例では、無作為の突然変異誘発方法はＤＮＡシャフリング法を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は挿入、欠失、または突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異はナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、またはその組み合わせを含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、修飾されたＧＰＣＲは哺乳動物のＧＰＣＲである。いくつかの実施形態では、修飾されたＧＰＣＲはヒトのＧＰＣＲである。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【０１４７】
いくつかの例では、ＳＰ１とＳＰ２は同じである。他の例では、ＳＰ１とＳＰ２は異なる。場合によっては、ＳＰ１とＳＰ２はさらに、それぞれＬ１とＬ２によってＧＰＣＲに連結している。いくつかの例では、Ｌ１は長さが約０〜約６０のアミノ酸残基、例えば、長さが約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基である。場合によっては、Ｌ２は長さが約０〜約６０のアミノ酸残基、例えば、長さが約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基である。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ＳＰ１ｚはＳＰ１２−３であり、ＳＰ１の各々は他とは異なる。いくつかの例では、ＳＰ１ｚはＳＰ１３であり、３つのＳＰ１の２つは同じである。いくつかの例では、ＳＰ１の各々はさらに、直接的に、または、リンカーポリペプチドによって間接的に、別のＳＰ１に連結している。いくつかの例では、リンカーポリペプチドは、約１〜約６０のアミノ酸残基、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、ＳＰ２ｘはＳＰ２２−３であり、ＳＰ２の各々は他とは異なる。いくつかの例では、ＳＰ２ｘはＳＰ２３であり、３つのＳＰ２の２つは同じである。いくつかの例では、ＳＰ２の各々はさらに、直接的に、または、リンカーポリペプチドによって間接的に、別のＳＰ２に連結している。いくつかの例では、リンカーポリペプチドは、約１〜約６０のアミノ酸残基、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、第１の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、抗生物質は、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、あるいはテトラサイクリンを含む。いくつかの実施形態において、毒性の代謝産物は、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、第１の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはタグをさらに含む。いくつかの実施形態において、タグは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端、またはこれらの組み合わせに連結している。いくつかの実施形態において、タグは、ＭＢＰ、ＴｒｘＡ、ＦＬＡＧタグ、ＡＶＩタグ、またはＨｉｓＴａｇを含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ）の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを生成することが本明細書で開示され、
【０１５４】
【化１０】
2019527065.tif 000012
式中、
ＩＣＰは少なくとも１つの修飾を含むイオンチャネルポリペプチドであり、
ＳＰ１はＩＣＰのＣ末端に連結された第１の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ１は第１の選択剤に対して耐性を有し、
ＳＰ２はＩＣＰのＮ末端に連結された第２の選択ポリペプチドであり、ここで、ＳＰ２は第２の選択剤に対して耐性を有し、
Ｌ１は第１のリンカーであり、
Ｌ２は第２のリンカーであり、
ｘは独立して０−３であり、
ｙは独立して１−５であり、
ｚは独立して１−３であり、および、
ｍとｎは各々独立して０−６０のアミノ酸残基である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの実施形態では、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の修飾されたアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の修飾を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は無作為の突然変異誘発方法によって生成される。いくつかの例では、無作為の突然変異誘発方法はエラープローンＰＣＲ法を含む。いくつかの例では、無作為の突然変異誘発方法はＤＮＡシャフリング法を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は挿入、欠失、または突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異はナンセンス突然変異またはミスセンス突然変異を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾は、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、またはその組み合わせを含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、修飾されたイオンチャネルタンパク質は哺乳動物のイオンチャネルタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾されたイオンチャネルタンパク質はヒトのイオンチャネルタンパク質である。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない。いくつかの実施形態において、第１の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドは、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドはレポータータンパク質ではない。いくつかの実施形態において、第２の選択ポリペプチドは、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ｐｙｒＥ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＡＤＥ１−２遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、あるいはアルカリホスファターゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【０１６１】
いくつかの例では、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分または細胞外部分にある。いくつかの例では、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にある。場合によっては、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分または細胞外部分にある。いくつかの例では、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にある。いくつかの例では、ＳＰ１は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞内部分にあり、ＳＰ２は、宿主細胞中で発現するとき、宿主細胞の細胞外部分にある。
【０１６２】
いくつかの例では、ＳＰ１とＳＰ２は同じである。他の例では、ＳＰ１とＳＰ２は異なる。場合によっては、ＳＰ１とＳＰ２はさらに、それぞれＬ１とＬ２によってＩＣＰに連結している。いくつかの例では、Ｌ１は長さが約０〜約６０のアミノ酸残基、例えば、長さが約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基である。場合によっては、Ｌ２は長さが約０〜約６０のアミノ酸残基、例えば、長さが約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基である。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、ＳＰ１ｚはＳＰ１２−３であり、ＳＰ１の各々は他とは異なる。いくつかの例では、ＳＰ１ｚはＳＰ１３であり、３つのＳＰ１の２つは同じである。いくつかの例では、ＳＰ１の各々はさらに、直接的に、または、リンカーポリペプチドによって間接的に、別のＳＰ１に連結している。いくつかの例では、リンカーポリペプチドは、約１〜約６０のアミノ酸残基、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、ＳＰ２ｘはＳＰ２２−３であり、ＳＰ２の各々は他とは異なる。いくつかの例では、ＳＰ２ｘはＳＰ２３であり、３つのＳＰ２の２つは同じである。いくつかの例では、ＳＰ２の各々はさらに、直接的に、または、リンカーポリペプチドによって間接的に、別のＳＰ２に連結している。いくつかの例では、リンカーポリペプチドは、約１〜約６０のアミノ酸残基、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、第１の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は抗生物質あるいは毒性の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、抗生物質は、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、あるいはテトラサイクリンを含む。いくつかの実施形態において、毒性の代謝産物は、５−フルオロオロチン酸または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、第１の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。いくつかの実施形態において、第２の選択剤は、温度の上昇、温度の低下、栄養素の不足、または補助因子の不足を含む。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ）の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドはタグをさらに含む。いくつかの実施形態において、タグは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＮ末端、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのＣ末端、またはこれらの組み合わせに連結している。いくつかの実施形態において、タグは、ＭＢＰ、ＴｒｘＡ、ＦＬＡＧタグ、ＡＶＩタグ、またはＨｉｓＴａｇを含む。
【０１６８】
無作為の突然変異誘発
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは無作為の突然変異誘発方法によって生成される。いくつかの例では、無作為の突然変異誘発は、様々な機能特性を備えたタンパク質突然変異体のライブラリーを生成する方法である。例えば、無作為な突然変異は、この遺伝子の何十億もの様々なバージョンを含むライブラリーを生成するために、最初に遺伝子へ導入される。その後、この遺伝子のバージョンあるいは変異体が発現され、その後、機能についてそれぞれの発現されたタンパク質の特性を評価する。場合によっては、無作為の突然変異誘発は、エラープローンＰＣＲ、ローリングサークル、エラープローンＰＣＲ、突然変異誘発株、一時的突然変異誘発株、挿入突然変異誘発、エチルメタンスルホン酸、亜硝酸、あるいはＤＮＡシャフリングを用いて達成される。場合によっては、無作為の突然変異誘発は、例えば、ＵＶ、イオン化放射能、Ｘ線、ガンマ線、あるいは、例えば、マスタードガス、シクロホスファミド、またはシスプラチンなどの化学薬品によって生成される。
【０１６９】
いくつかの例では、無作為の突然変異誘発はエラープローンＰＣＲ方法を使用して達成される。場合によっては、エラープローンＰＣＲは、忠実度の低いポリメラーゼ（例えば、高いエラー率のポリメラーゼ）を用いるＰＣＲ方法である。場合によっては、そのようなＰＣＲ方法は、最も一般的なタイプの突然変異として点突然変異あるいは単一ヌクレオチド突然変異を備える野生型の配列の増幅中に最大で２％の誤差をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、エラープローンＰＣＲ方法によって生成される。
【０１７０】
いくつかの例では、無作為の突然変異誘発はローラーサークルエラープローンＰＣＲ方法を使用して達成される。ローリングサークルエラープローンＰＣＲでは、例えば、野生型の配列はまずプラスミドへクローン化され、その後、全体のプラスミドはエラープローンＰＣＲ条件下で増幅される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、ローリングサークルエラープローンＰＣＲ方法によって生成される。
【０１７１】
いくつかの例では、無作為の突然変異誘発は突然変異誘発株手法を使用して達成される。場合によっては、突然変異誘発株手法はＸＬ１−Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）などの突然変異誘発株を利用し、これは、３つのＤＮＡ修復経路（ｍｕｔＳ、ｍｕｔＤ、およびｍｕｔＴ）が欠損している大腸菌株であり、したがって、複製中にエラーを引き起こす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、突然変異誘発株手法によって生成される。
【０１７２】
いくつかの例では、無作為の突然変異誘発は一時的突然変異誘発株方法を使用して達成される。場合によっては、一時的突然変異誘発株方法は、３つのＤＮＡ修復経路の代わりに１つのＤＮＡ修復経路（ｍｕｔＤ５）が欠損している。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、一時的突然変異誘発株方法によって生成される。
【０１７３】
いくつかの例では、無作為の突然変異誘発は挿入突然変異誘発を使用して達成される。場合によっては、挿入突然変異誘発は、所望の配列の全体にわたって１５の塩基配列を無作為に挿入するためにトランスポゾンベースのシステムを利用する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、挿入突然変異誘発によって生成される。
【０１７４】
いくつかの例では、無作為の突然変異誘発はエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）手法を使用して達成される。場合によっては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）手法は、グアニジン残基をアルキル化するために化学的なＥＭＳを利用し、それにより、ＤＮＡ複写中にそれらを不正確にコピーする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、エチルメタンスルホン酸手法によって生成される。
【０１７５】
いくつかの例では、無作為の突然変異誘発は亜硝酸を使用して達成される。場合によっては、亜硝酸は、アデニンとシトシンの残基を脱アミノ化することによって突然変異を導入する化学的突然変異誘発要因であり、それによって、トランスバージョン点突然変異を引き起こす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、亜硝酸によって生成される。
【０１７６】
いくつかの例では、無作為の突然変異誘発は亜硝酸を使用して達成される。ＤＮＡシャフリングは、ある症例には、興味のある配列あるいはＤＮＡｓｅＩを備えた配列ライブラリーおよび自給式のＰＣＲを使用して、任意にフラグメントを再連結することを任意に要約することによって達成される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、一時的突然変異誘発株方法によって生成される。
【０１７７】
非無作為の突然変異誘発
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、非無作為の突然変異誘発方法によって生成される。典型的な非無作為の突然変異誘発方法は、部位特異的突然変異誘発を含む。部位特異的突然変異誘発は、所望の遺伝子内の特定の変質あるいは修飾を可能にする方法である。いくつかの例では、部位特異的突然変異誘発は、カセット突然変異誘発、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発、全プラスミド突然変異誘発、Ｋｕｎｋｅｌの方法、あるいはインビボ部位特異的突然変異誘発方法を利用する。カセット突然変異誘発は、例えば、制限酵素とライゲーション方法を使用して、ＤＮＡの合成されたフラグメントをプラスミドに挿入させる。場合によっては、それは重合を含まない。いくつかの例では、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発は、カセット突然変異誘発に似ているが、より大きなフラグメントが得られ、ゲル電気泳動によって鋳型フラグメントから分離され、その後、所望の遺伝子へらいゲーとされる。Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）方法などの全プラスミド突然変異誘発は、１つ以上のプライマーを使用して突然変異を挿入することを可能にし、その後、全プラスミドを増幅する。いくつかの例では、この方法は、プラスミドが線形のフォーマットであり、ＰＣＲでのように指数関数的に増幅される必要がないという点で、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発とは異なる。Ｋｕｎｋｅｌの方法は、例えば、プライマーに基づく部位特異的な方法であり、生成物と鋳型菌株とを区別し、それにより、所望の突然変異を含むプラスミドのより容易な選択を可能にするために、ＤＮＡ複製の間に細菌がウラシルを取り込むことを防ぐ酵素であるｄＵＴＰａｓｅが欠損している大腸菌株を利用するという点で、前述の方法とは異なる。場合によっては、インビボの部位特異的突然変異誘発方法は、Ｄｅｌｉｔｔｏ  ｐｅｒｆｅｔｔｏ方法、移転（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）「ポップイン・ポップアウト（ｐｏｐ−ｉｎ  ｐｏｐ−ｏｕｔ）」方法、直接的な遺伝子欠失およびＰＣＲと１つの再利用可能なマーカーとを用いる部位特異的な突然変異誘発、直接的な遺伝子欠失および長いホモログ領域を使用するＰＣＲと１つの再利用可能なマーカーとを用いる部位特異的な突然変異誘発、あるいは、合成オリゴヌクレオチドを用いるインビボの部位特異的な突然変異誘発を含む。
【０１７８】
発現ベクター
いくつかの実施形態において、ベクターは、真核生物源または原核生物源に由来する任意の適切なベクターを含む。場合によっては、ベクターは、細菌（例えば、大腸菌）、昆虫、酵母（例えば、ピキア・パストリス）、アルジー、あるいは哺乳動物源から得られる。典型的な細菌ベクトルはｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＳＫ７５、ｐＢＡＤベクターシリーズ、ｐＢＡＤＭベクターシリーズ、ｐＥＴベクターシリーズ、ｐＥＴＭベクターシリーズ、ｐＧＥＸベクターシリーズ、ｐＨＡＴ、ｐＨＡＴ２、ｐＭａｌ−ｃ２、ｐＭａｌ−ｐ２、ｐＱＥベクターシリーズ、ｐＲＳＥＴ  Ａ、ｐＲＳＥＴ  Ｂ、ｐＲＳＥＴ  Ｃ、ｐＴｒｃＨｉｓ２シリーズ、ｐＺＡ３１−Ｌｕｃ、ｐＺＥ２１−ＭＣＳ−１、ｐＦＬＡＧ  ＡＴＳ、ｐＦＬＡＧ  ＣＴＳ、ｐＦＬＡＧ  ＭＡＣ、ｐＦＬＡＧ  Ｓｈｉｆｔ−１２ｃ、ｐＴＡＣ−ＭＡＴ−１、ｐＦＬＡＧ  ＣＴＣ、あるいはｐＴＡＣ−ＭＡＴ−２を含む。
【０１７９】
典型的な媒介昆虫は、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＤＵＡＬ、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＥＴ、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴａ、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴｂ、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴｃ、ｐＦａｓｔＢａｃ  Ｍ３０ａ、ｐＦａｓｔＢａｃｔ  Ｍ３０ｂ、ｐＦａｓｔＢａｃ、Ｍ３０ｃ、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＶＬ１３９３  Ｍ１０、ｐＶＬ１３９３  Ｍ１１、ｐＶＬ１３９３  Ｍ１２、ｐＰｏｌｈ−ＦＬＡＧ１またはｐＰｏｌｈ−ＭＡＴ  ２などのＦＬＡＧベクター、あるいはｐＰｏｌｈ−ＭＡＴ１またはｐＰｏｌｈ−ＭＡＴ２などのＭＡＴベクターを含む。
【０１８０】
場合によっては、酵母ベクターは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１４ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１５ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１７ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）２４ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２ベクター、ｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ４９  Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）デスティネーションベクター、ｐＡＯ８１５ピキアベクター、ｐＦＬＤ１  ピキ・パストリスベクター、ｐＧＡＰＺＡ、Ｂ、＆  Ｃピキア・パストリスベクター、ｐＰＩＣ３．５Ｋピキアベクター、ｐＰＩＣ６  Ａ、Ｂ、＆  Ｃピキアベクター、ｐＰＩＣ９Ｋピキアベクター、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２酵母ベクター、ｐＹＥＳ２／ＣＴ酵母ベクター、ｐＹＥＳ２／ＮＴ  Ａ、Ｂ、＆  Ｃ酵母ベクター、あるいはｐＹＥＳ３／ＣＴ酵母ベクターを含む。
【０１８１】
典型的なアルジーベクターは、ｐＣｈｌａｍｙ−４ベクターまたはＭＣＳベクターを含む。
【０１８２】
哺乳動物ベクターの例は一時的発現ベクターまたは安定した発現ベクターを含む。哺乳動物の一時的発現ベクターは、例えば、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ  ８、ｐＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ  １９、ｐＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ  ２３、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ  ２、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ  ６ａ，ｂ，ｃ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ  ５．１、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ  ５ａ，ｂ，ｃ、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ  ７．１、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ  ２０、ｐ３ｘＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ  ２４、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＭＡＴ１、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＭＡＴ２、ｐＢＩＣＥＰ−ＣＭＶ  ３、またはｐＢＩＣＥＰ−ＣＭＶ  ４を含む。哺乳動物の安定した発現ベクターは、例えば、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ  ３、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ  ９、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ  １３、ｐＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ  ２１、ｐ３ｘＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ  ２５、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ  ４、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ  １０、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ  １４、ｐＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ  ２２、ｐ３ｘＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ  ２６、ｐＢＩＣＥＰ−ＣＭＶ  １、またはｐＢＩＣＥＰ−ＣＭＶ  ２を含む。
【０１８３】
いくつかの例では、無細胞系は、細胞からの細胞質成分および／または核成分の混合物であり、インビトロの核酸合成に使用される。場合によっては、無細胞系は、原核細胞成分または真核細胞成分のいずれかを利用する。しばしば、核酸合成は、例えば、ショウジョウバエ細胞、ツメガエル卵、またはＨｅＬａ細胞に基づく無細胞系で得られる。典型的な無細胞系としては、限定されないが、大腸菌Ｓ３０抽出物系、大腸菌Ｔ７  Ｓ３０系、あるいはＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）が挙げられる。
【０１８４】
宿主細胞
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、天然由来細胞あるいは遺伝子組み換え細胞などの任意の適切な細胞を含む。いくつかの例では、宿主細胞は産生宿主細胞である。いくつかの例では、宿主細胞は真核細胞である。他の例では、宿主細胞は原核細胞である。場合によっては、真核細胞は、真菌（例えば、酵母菌）、動物細胞、または植物細胞を含む。場合によっては、原核細胞は細菌細胞である。細菌細胞の例はグラム陽性菌またはグラム陰性菌を含んでいる。しばしば、グラム陰性菌は嫌気性であり、桿状であり、あるいはその両方である。
【０１８５】
いくつかの例では、グラム陽性菌はアクチノバクテリア、ファーミキューテス、またはテネリキューテスを含む。場合によっては、グラム陰性菌は、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、デイノコッカス−サーマス、フィブロバクター−クロロビ／バクテロイデス門（ＦＣＢ群）、フゾバクテリウム、ゲンマティモナス門、ニトロスピラ門、プランクトミケス門−ヴェルコミクロビウム門／クラミジア門（ＰＶＣグループ）、プロテオバクテリア、スピロヘータ、あるいはシネルギステス門を含む。他の細菌は、例えば、アキドバクテリウム門、クロロフレクサス門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア、デフェリバクター門、ディクチオグロムス門、サーモデスルフォバクテリア門、またはテルモトガ門を含む。細菌細胞は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ボツリヌス菌、あるいは大腸菌（Ｃｏｌｉ  ｂａｃｉｌｌｉ）である。
【０１８６】
典型的な原核生物の宿主細胞としては、限定されないが、ＢＬ２１、Ｍａｃｈ１（商標）、ＤＨ１０Ｂ（商標）、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）、ＯｍｎｉＭａｘ（商標）、ＭｅｇａＸ（商標）、ＤＨ１２Ｓ（商標）、ＩＮＶ１１０、ＴＯＰ１０Ｆ’、ＩＮＶαＦ、ＴＯＰ１０／Ｐ３、ｃｃｄＢ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＰＩＲ１、ＰＩＲ２、Ｓｔｂｌ２（商標）、Ｓｔｂｌ３（商標）、またはＳｔｂｌ４（商標）が挙げられる。
【０１８７】
いくつかの例では、動物細胞は、脊椎動物または無脊椎動物からの細胞を含む。場合によっては、動物細胞は、海の無脊椎動物、魚、昆虫、両生類、爬虫類、あるいは哺乳動物からの細胞を含む。場合によっては、真菌細胞は、ビール酵母、パン酵母、またはワイン酵母などの酵母菌を含む。
【０１８８】
真菌は、酵母、カビ、糸状菌、担子菌あるいは接合菌などの子嚢菌を含む。いくつかの例では、酵母は子嚢菌門または担子菌門を含む。場合によっては、子嚢菌門がサッカロミケス亜門（真正酵母菌、例えば、ビール酵母菌）（パン酵母））あるいはタフリナ菌亜門（例えば、シゾサッカロミケス属（分裂酵母））を含んでいる。場合によっては、担子菌門は、ハラタケ亜門（例えばシロキクラゲ綱）あるいはサビキン亜門（例えばミクロボトリウム菌綱）を含んでいる。
【０１８９】
典型的な酵母あるいは糸状菌は、例えば、属：サッカロミケス、分裂酵母、カンジダ属、ピチア属、ハンゼヌラ、クリベロマイセス属、チゴサッカロミセス、ヤロウイア属、毛芽胞菌属、ロドスポリジウム、アスペルギルス属、フザリウム属、またはトリコデルマ属を含む。典型的な酵母あるいは糸状菌は、例えば、種：サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミケス・ポンベ、カンジダ−ユチリス、カンジダボイディニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ−トロピカリス、カンジダ−ステラトイデア、カンジダ・グラブラータ、カンジダ−クルセイ、カンジダ−パラシローシス、カンジダ−ギリエルモンジィ、カンジダ・ビスワナチイ、カンジダ・ルシタニエ、ロドトルラ・ムシラギノーサ、ピキア・メタノリカ、ピキア・アングスタ、ピキア・パストリス、ピキア・アノマラ、ハンセヌラ・ポリモルファ、クルイベロマイセス・ラクティス、チゴサッカロミセス・ルーキシィ、ヤロウィア・リポリティカ、トリコスポロン・プルランス、ロドスポリジウム・トル−アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、ヤロウィア・リポリティカ、ブレタノマイセス・ブリュッセルンシス、カンジダ・ステラータ、シゾサッカロミケス・ポンベ、トルラスポラ・デルブルッキ、チゴサッカロミセス・バイリイ、クリプトコックス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ガッティ、またはサッカロマイセス・ブラウディを含む。
【０１９０】
典型的な酵母宿主細胞としては、限定されないが、ＧＳ１１５、ＫＭ７１Ｈ、ＳＭＤ１１６８、ＳＭＤ１１６８Ｈ、およびＸ−３３などのピキア・パストリス酵母菌株；および、ＩＮＶＳｃ１などのサッカロマイセス・セレビシエ酵母菌株が挙げられる。
【０１９１】
いくつかの例では、追加の動物細胞は、軟体動物、節足動物、環形動物、あるいは海綿動物から得られた細胞を含んでいる。場合によっては、追加の動物細胞は、例えば、霊長類、類人猿、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類からの哺乳動物細胞である。場合によっては、げっ歯類は、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、ハムスター、チンチラ、ファンシーラット、またはモルモットを含む。
【０１９２】
典型的な哺乳動物の宿主細胞としては、限定されないが、２９３Ａ細胞株、２９３ＦＴ細胞株、２９３Ｆ細胞、２９３Ｈ細胞、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）２９３細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−２９３細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）３Ｔ３細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−ＢＨＫ細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−ＣＨＯ細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−ＣＶ−１細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−Ｊｕｒｋａｔ細胞株、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＧｒｉｐＴｉｔｅ（商標）２９３ＭＳＲ細胞株、ＧＳ−ＣＨＯ細胞株、ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞、Ｔ−ＲＥｘ（商標）Ｊｕｒｋａｔ細胞株、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞株、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−ＣＨＯ細胞株、およびＴ−ＲＥｘ（商標）−ＨｅＬａ細胞株が挙げられる。
【０１９３】
いくつかの例では、哺乳動物の宿主細胞は、安定した細胞株、あるいはそれ自体のゲノムに所望の遺伝物質を組み入れた細胞株であり、多くの世代の細胞分裂の後に遺伝物質の生成物を発現する能力を有する。場合によっては、哺乳動物の宿主細胞は、一時的な細胞株、あるいはそれ自体のゲノムに所望の遺伝物質を組み入れていない細胞株であり、多くの世代の細胞分裂の後に遺伝物質の生成物を発現する能力を持っていない。
【０１９４】
典型的な昆虫宿主細胞としては、限定されないが、ショウジョウバエＳ２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）細胞、およびｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）細胞が挙げられる。
【０１９５】
いくつかの例では、植物細胞はアルジーからの細胞を含む。典型的な昆虫細胞株としては、限定されないが、クラミドモナス・レインハルディ１３７ｃまたはシネココッカスエロンガタスＰＰＣ７９４２からの菌株が挙げられる。
【０１９６】
物理化学的性質を特徴づけるための分析技術
いくつかの実施形態において、１つ以上の分析技術が、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの物理化学的性質を特徴づけるために利用される。上で議論されたように、物理化学的性質は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、および／または経路活性化選択性を含む。いくつかの例では、１つ以上の分析技術は、Ｘ線結晶学、電子結晶学、クライオ電子顕微鏡、核磁気共鳴スペクトル測定法（ＮＭＲ）、熱変性技術、および／または化学変性技術を含む。
【０１９７】
いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの物理化学的性質を特徴づけるために使用された分析技術は、Ｘ線結晶学である。いくつかの例では、１つ以上の結晶化方法がタンパク質結晶を生成するために使用される。例えば、蒸気拡散法は、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのタンパク質結晶の生成のためにしばしば使用される。他のときには、脂質立方相（ＬＣＰ）結晶化方法は、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのタンパク質結晶を生成するために使用される。いくつかの例では、タンパク質（例えば、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチド）の結晶化は、精製されたタンパク質を、上記タンパク質を過飽和、結晶核生成、および結晶成長まで駆り立てるように意図された溶液と混合することを含む。
【０１９８】
いくつかの例では、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、そのタンパク質結晶化特性、例えば、タンパク質結晶を形成する際の能力、採取可能な結晶の形成の時間、Ｘ線検出素子によって選別可能な結晶の形成の時間、まとめて融合された複数の結晶ではなく単結晶を形成する能力、および回折分解能に基づいて評価される。いくつかの例では、採取可能な結晶の形成の時間は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０日、またはそれ以上の日を含む。いくつかの例では、採取可能な、または、Ｘ線検出素子によって選別可能な結晶のサイズは、約５ミクロン、１０ミクロン、１５ミクロン、２０ミクロン、３０ミクロン、４０ミクロン、５０ミクロン、８０ミクロン、１００ミクロン、１５０ミクロン、２００ミクロン、２５０ミクロン、３００ミクロン、４００ミクロン、またはそれ以上の直径を有する結晶を含む。いくつかの例では、回折分解能は、６Å、５．５Å、５Å、４．５Å、４Å、３．５Å、３Å、２．５Å、２Åまたはそれ以上の分解能である。いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、野生型の複数膜貫通型ポリペプチドあるいは異なる修飾された複数膜貫通型ポリペプチドと比べて、例えば、タンパク質結晶を形成する際の能力、採取可能な結晶の形成の時間、Ｘ線検出素子によって選別可能な結晶の形成の時間、まとめて融合された複数の結晶ではなく単結晶を形成する能力、および回折分解能の１つ以上における、改善された特性または優れた特性を含む。
【０１９９】
いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは修飾されたＧＰＣＲである。
【０２００】
いくつかの例では、本明細書に記載される修飾されたＧＰＣＲは、そのタンパク質結晶化特性、例えば、タンパク質結晶を形成する際の能力、採取可能な結晶の形成の時間、Ｘ線検出素子によって選別可能な結晶の形成の時間、まとめて融合された複数の結晶ではなく単結晶を形成する能力、および回折分解能に基づいて評価される。いくつかの例では、本明細書に記載された修飾されたＧＰＣＲは、野生型のＧＰＣＲあるいは異なる修飾されたＧＰＣＲと比べて、例えば、タンパク質結晶を形成する際の能力、採取可能な結晶の形成の時間、Ｘ線検出素子によって選別可能な結晶の形成の時間、まとめて融合された複数の結晶ではなく単結晶を形成する能力、および回折分解能の１つ以上における、改善された特性または優れた特性を含む。
【０２０１】
いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの物理化学的性質を特徴づけるために使用された分析技術は、電子結晶学である。いくつかの例では、電子結晶学は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して、標的ポリペプチドの原子の配置を決定する方法である。いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは修飾されたＧＰＣＲである。いくつかの例では、電子結晶学（例えばＴＥＭ）は修飾されたＧＰＣＲの物理化学的性質を特徴づけるために使用される。
【０２０２】
いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの物理化学的性質を特徴づけるために使用された分析技術は、クライオ電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）である。いくつかの例では、ｃｒｙｏ−ＥＭはサンプルを極低温分析するＴＥＭの形態である。いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは修飾されたＧＰＣＲである。いくつかの例では、クライオ電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）は、修飾されたＧＰＣＲの物理化学的性質を特徴づけるために使用される。
【０２０３】
いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの物理化学的性質を特徴づけるために使用された分析技術は、核磁気共鳴スペクトル測定法（ＮＭＲ）である。いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは修飾されたＧＰＣＲである。いくつかの例では、ＮＭＲは修飾されたＧＰＣＲの物理化学的性質を特徴づけるために使用される。
【０２０４】
いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの物理化学的性質を特徴づけるために使用された分析技術は、熱変性（例えば、円偏光二色性分光分析または示差走査熱量測定）である。いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは修飾されたＧＰＣＲである。いくつかの例では、熱変性技術（例えば円偏光二色性分光分析または示差走査熱量測定）は、修飾されたＧＰＣＲの物理化学的性質を特徴づけるために使用される。
【０２０５】
いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの物理化学的性質を特徴づけるために使用された分析技術は、化学変性技術（例えば、尿素、グアニジン−ＨＣｌ、または、短鎖洗浄薬、陰イオン洗浄剤、あるいは陽性洗浄剤などの刺激の強い洗浄薬（ｈａｒｓｈ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）である。いくつかの例では、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは修飾されたＧＰＣＲである。いくつかの例では、化学変性技術（例えば、尿素、グアニジン−ＨＣｌ、または、短鎖洗浄薬、陰イオン洗浄剤、あるいは陽性洗浄剤などの刺激の強い洗浄薬）は、修飾されたＧＰＣＲの物理化学的性質を特徴づけるために使用される。
【０２０６】
治療薬をスクリーニングする方法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドから治療薬をスクリーニングするための方法とプラットフォームが本明細書で開示される。いくつかの例では、治療薬はポリペプチドまたは小分子である。いくつかの実施形態において、治療薬はポリペプチドである。他の実施形態では、治療剤は小分子である。
【０２０７】
いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに対して治療薬をスクリーニングする方法が本明細書に記載され、該方法は、（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；（ｆ）治療薬を用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物と治療薬との間の結合を検知する工程、を含む。場合によっては、該方法はさらに、ａ）産生ベクターの第２のセットを生成する工程であって、ここで、各産生ベクターは、上の工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットから複数膜貫通型ポリペプチド生成物を含む、工程；（ｂ）第３の複数の宿主細胞中の産生ベクターの第２のセットを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；および、（ｃ）上に議論された工程ｆ）の治療薬に対してスクリーニングするために、物理化学的性質が増強または改善したセットから発現された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドを決定するための分析方法によって複数膜貫通型ポリペプチド生成物のセットを分析する工程であって、ここで、物理化学的性質の増強または改善は、対照複数膜貫通型ポリペプチドに対するものである、工程を含む。いくつかの例では、物理化学的性質の増強または改善は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、または経路活性化選択性を含む。いくつかの例では、対照は、野生型の複数膜貫通型ポリペプチド、あるいは異なる修飾を備える修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む。いくつかの例では、上記の工程ｇ）の結合は、フローサイトメトリー方法によって、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）、後方散乱干渉法、蛍光偏光方法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法、プラズモン導光路共振法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）方法、等温滴定熱量測定方法、熱変性アッセイ、蛍光リガンド結合アッセイ、または放射リガンド結合アッセイによって検知される。いくつかの例では、上記の工程（ｇ）の結合は、フローサイトメトリー方法、あるいは酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）によって検知される。場合によっては、フローサイトメトリー方法は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）あるいは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。
【０２０８】
いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質）、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。場合によっては、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。場合によっては、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。
【０２０９】
ポリペプチドをスクリーニングする方法
いくつかの実施形態において、治療薬はポリペプチドである。いくつかの例では、ポリペプチドは複数膜貫通型ポリペプチドと相互に作用するポリペプチドである。場合によっては、複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質）、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む。場合によっては、治療薬は、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質）、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体と相互に作用するポリペプチドである。いくつかの例では、治療薬は受容体と相互に作用するポリペプチドである。場合によっては、受容体はイオンチャネルタンパク質である。場合によっては、治療薬はイオンチャネルタンパク質と相互に作用するポリペプチドである。場合によっては、受容体はＧＰＣＲである。場合によっては、治療薬はＧＰＣＲと相互に作用するポリペプチドである。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、治療薬は抗体またはその結合フラグメントである。場合によっては、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体、またはその結合フラグメントを含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに対して抗体またはその結合フラグメントをスクリーニングする方法が本明細書に記載され、該方法は、（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；（ｆ）抗体またはその結合フラグメントを用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物と抗体またはその結合フラグメントとの間の結合を検知する工程、を含む。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ法によって生成される。場合によっては、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体、またはその結合フラグメントを含む。
【０２１２】
場合によっては、該方法はさらに、（ａ）産生ベクターの第２のセットを生成する工程であって、ここで、各産生ベクターは、上記の工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、工程；（ｂ）第３の複数の宿主細胞中の産生ベクターの第２のセットを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；および、（ｃ）上に議論された工程ｆ）の抗体またはその結合フラグメントに対してスクリーニングするために、物理化学的性質が増強または改善したセットから、発現された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドを決定するための分析方法によって複数膜貫通型ポリペプチド生成物のセットを分析する工程であって、ここで、物理化学的性質の増強または改善は、対照複数膜貫通型ポリペプチドに対するものである、工程を含む。いくつかの例では、物理化学的性質の増強または改善は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、または経路活性化選択性を含む。いくつかの例では、対照は、野生型の複数膜貫通型ポリペプチド、あるいは異なる修飾を備える修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む。いくつかの例では、上記の工程ｇ）の結合は、フローサイトメトリー方法によって、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）によって、後方散乱干渉法によって、蛍光偏光方法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法、プラズモン導光路共振法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）方法、等温滴定熱量測定方法、または熱変性アッセイによって検知される。いくつかの例では、上記の工程（ｇ）の結合は、フローサイトメトリー方法、あるいは酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）によって検知される。場合によっては、フローサイトメトリー方法は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）あるいは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。
【０２１３】
いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、原形質膜タンパク質、核膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞内膜タンパク質、輸送体、チャネルタンパク質（例えば、イオンチャネルタンパク質）、アドヘシン、トランスロカーゼ、または受容体を含む。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。場合によっては、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。場合によっては、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法によって生成される抗体またはその結合フラグメントも本明細書で記載される。いくつかの例では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とを含む、単離および精製された抗体またはその結合フラグメントが本明細書で記載され、ここで、重鎖と軽鎖のＣＤＲは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドと相互作用し、および、ここで、抗体またはその結合フラグメントは以下のプロセスによって生成される：（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；（ｆ）抗体のセットまたはその結合フラグメントを用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物に特異的に結合する抗体またはその結合フラグメントを選択する工程、を含む。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ法によって生成される。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体、またはその結合フラグメントを含む。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。いくつかの例では、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの例では、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。
【０２１５】
いくつかの例では、宿主細胞は、原核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、または昆虫宿主細胞である。場合によっては、第１の複数の宿主細胞は、原核生物宿主細胞を含む。場合によっては、原核生物宿主細胞は大腸菌細胞である。場合によっては、第２の複数の宿主細胞は哺乳動物宿主細胞または昆虫宿主細胞を含む。
【０２１６】
「抗体」と「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的な特徴を有する糖タンパク質である。これらの用語は同じ意味で使用される。いくつかの例では、免疫グロブリンの抗原特異性は知られている。
【０２１７】
用語「抗体」は最も広い意味で使用され、完全に組み立てられた抗体、抗原に結合することができる抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ、抗体キメラ、ハイブリッド抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体など）、および前述のものを含む組み換えペプチドを包含する。
【０２１８】
本明細書で使用されるような「モノクローナル抗体」や「ｍＡｂ」との用語は、抗体の実質的に均質の集団から得られた抗体を指し、つまり、上記集団を含む個々の抗体は、少量で存在することがある起こりうる自然発生の突然変異を除けば同一である。
【０２１９】
「天然の抗体」と「免疫グロブリン」は通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。軽鎖はそれぞれ１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合するが、ジスルフィド結合の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。重鎖と軽鎖はそれぞれ規則的に距離をおいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は一方の端部に可変ドメイン（ＶＨ）とその後の多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は一方の端部に可変ドメイン（ＶＬ）を、もう一方の端部に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと位置合わせされ、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと位置合わせされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変領域の間で境界面を形成すると考えられている。
【０２２０】
用語「可変」とは、可変ドメインのある部分が抗体中で配列が大きく異なるという事実を指す。可変領域は抗原結合特異性を与える。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。それは、軽鎖と重鎖の可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域、その両方の３つのセグメントに集中している。可変ドメインの高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、ループ接続を形成し、場合によっては、β−プリーツシート構造の一部を形成する、３つのＣＤＲにより接続された、β−プリーツシート構造を採用している４つのＦＲ領域を含む。各鎖におけるＣＤＲは、他方の鎖からのＣＤＲとともに、ＦＲ領域によって近接してまとめられ、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体依存性の細胞の毒性への抗体の関与、補体依存性細胞傷害の開始、およびマスト細胞脱顆粒などの様々なエフェクター機能を示す。
【０２２１】
用語「超可変領域」は、本明細書で使用するとき、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補的決定領域」または「ＣＤＲ」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、および８９−９７（Ｌ３）と、重鎖可変ドメイン中の残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、および９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．）  からのアミノ酸残基、および／または、「超可変ループ」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、および、９１−９６（Ｌ３）と、重鎖可変ドメイン中の残基（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、および９６−１０１（１３）；Ｃｌｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７）からの残基を含む。本明細書で認められるように、「フレームワーク」あるいは「ＦＲ」残基は、超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン残基である。
【０２２２】
「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；線形の抗体；（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：１０５７−１０６２）単鎖抗体分子；および、抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合性フラグメントと、その名前が容易に結晶させる能力を反映している残基「Ｆｃ」フラグメントを生成する。ペプシン処置により、２つの抗原結合部位を有するとともに依然として抗原を架橋結合することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成される。
【０２２３】
「Ｆｖ」は、完全抗原認識部位および結合部位を含む最小限の抗体フラグメントである。この領域は、緊密な非共有結合性会合中の１つの重鎖と１つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するために、それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用するのはこの構造内においてである。まとめて、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、全結合部位よりも親和性は低いが、１つの可変ドメインでも（または、抗原に特異的なわずか３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）、抗原を認識して結合する能力を有している。
【０２２４】
Ｆａｂフラグメントはさらに、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を加えることでＦａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に関する本明細書での命名である。Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖ジスルフィド架橋を還元することにより生成される。抗体フラグメントの他の化学的結合も知られている。
【０２２５】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明らかに異なるタイプの１つに割り当て可能である。
【０２２６】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンを様々なクラスに割り当てることができる。５つの主要なクラスのヒト免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることもある。様々なクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造と三次元構造は周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１とＩｇＧ３アイソタイプはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性を有する。
【０２２７】
ファージディスプレイ
いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントはファージディスプレイ方法によって生成される。いくつかの例では、結合抗体を示す１０１０のファージ変異体が利用される。いくつかの例では、選択プロセスで同定された修飾された複数膜貫通型ポリペプチド候補は、哺乳動物細胞株（例えば、安定した哺乳動物細胞株）で発現され、そこから、発現されたポリペプチドは精製され、ナノ粒子に固定されるか、あるいは、表面（例えばプレートのコーティングされた表面）へ固定される）。いくつかの例では、発現されたポリペプチドは、ナノ粒子に固定される。いくつかの例では、ナノ粒子は常磁性のナノ粒子、超常磁性のナノ粒子、金属ナノ粒子、または無機のナノチューブを含む。いくつかの例では、ナノ粒子は常磁性のナノ粒子である。いくつかの例では、ナノ粒子は、例えば、ストレプトアビジンタグ、ビオチンタグなどの反応的なタグ、あるいは本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに共役することができる反応的な部分でさらに誘導体化される。
【０２２８】
いくつかの例では、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む固定されたナノ粒子は、その後、ファージライブラリーに対してスクリーニングされ、ここでは、例えば、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド標的に対する選択的な親和性を備えた抗体を表示するファージを単離させるために磁気分離を使用する。いくつかの例では、濃縮されたファージ集団はクローン単離物へ分離され、ファージでコードされた抗体遺伝子が配列決定され、産生のために哺乳動物の発現ベクターへクローン化される。
【０２２９】
いくつかの例では、本明細書に記載される固定された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに結合された抗体またはその結合フラグメントをスクリーニングするために、１つ以上の方法が利用される。
【０２３０】
いくつかの例では、本明細書に記載される固定された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに結合された抗体またはその結合フラグメントをスクリーニングするために、フローサイトメトリー方法が利用される。場合によっては、フローサイトメトリー方法は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）あるいは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。場合によっては、本明細書に記載される固定された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに結合された抗体またはその結合フラグメントをスクリーニングするために、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）が利用される。
【０２３１】
場合によっては、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、例えば、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド標的に対する選択的な親和性を備えた抗体を表示するファージを単離させるために磁気分離を使用するファージライブラリーに対してスクリーニングする前に、リポソーム、例えば、リポソームカプセル化ナノ粒子とともに（例えば、ポリマーアンフィポール（Ａｍｐｈｉｐｏｌ）（Ａ８−３５）とともに）さらに製剤される。
【０２３２】
いくつかの例では、ファージディスプレイ抗体ライブラリーは、グリフィン−１ライブラリー（Ｈ  Ｇｒｉｆｆｉｎ、ＭＲＣ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｉライブラリー、または、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｏ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，”に記載されるライブラリーなどを含む。
【０２３３】
酵母ディスプレイ
いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは酵母ディスプレイ−方法によって生成される。いくつかの例では、酵母表面ディスプレイは、哺乳動物の（例えばヒト）のタンパク質の折り畳みと翻訳後の修飾を促し、さらに蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して定量的かつ視覚的な選別を可能にする真核生物発現装置を含む。いくつかの例では、酵母ディスプレイ・システムは酵母サッカロマイセス・セレビシエを利用する。
【０２３４】
いくつかの例では、選択プロセスで同定された修飾された複数膜貫通型ポリペプチド候補が発現され、精製され、その後、ナノ粒子に固定されるか、あるいは表面（例えば、プレートのコーティングされた表面）へ固定される。いくつかの例では、発現されたポリペプチドは、ナノ粒子に固定される。いくつかの例では、ナノ粒子は常磁性のナノ粒子、超常磁性のナノ粒子、金属ナノ粒子、または無機のナノチューブを含む。いくつかの例では、ナノ粒子は常磁性のナノ粒子である。いくつかの例では、ナノ粒子は、例えば、ストレプトアビジンタグ、ビオチンタグなどの反応的なタグ、あるいは本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに共役することができる反応的な部分でさらに誘導体化される。
【０２３５】
いくつかの例では、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む固定されたナノ粒子は、その後、酵母ディスプレーライブラリーに対してスクリーニングされ、ここでは、例えば、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド標的に対する選択的な親和性を備えた抗体を表示する酵母を単離させるために磁気分離を使用する。
【０２３６】
いくつかの例では、本明細書に記載される固定された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに結合された抗体またはその結合フラグメントをスクリーニングするために、１つ以上の方法が利用される。いくつかの例では、本明細書に記載される固定された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに結合された抗体またはその結合フラグメントをスクリーニングするために、フローサイトメトリー方法が利用される。場合によっては、フローサイトメトリー方法は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）あるいは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。場合によっては、本明細書に記載される固定された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに結合された抗体またはその結合フラグメントをスクリーニングするために、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）が利用される。
【０２３７】
ＦＡＣＳは比較的小規模な細胞集団の選択に制限される。大きなライブラリーの効率的な選択については、ライブラリーをＦＡＣＳが分類することができるサイズにするために、磁気活性化された細胞選別（ＭＡＣＳ）の追加の工程が必要となる。ファージと比較して、比較的大量の酵母細胞と低いライブラリー密度（１０９細胞／ｍｌ）を考慮すると、約１ｘ１０１０実体のライブラリーを効率的に選択するためには、数十〜数百ミリメートルの出発酵母とともに、複数の並列のＭＡＣＳとＦＡＣＳのプロセスが必要となる。
【０２３８】
いくつかの実施形態において、酵母ディスプレイ抗体ライブラリーの例は、Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒｍ  ａ  ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，”２１（２）：１６３−１７０  （２００３）；Ｗｅａｖｅｒ−Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｙｅａｓｔ  ｍａｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｆａｂ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，”５６４（１−２）：２４−３４（２００４）に記載されているものを含む。
【０２３９】
ポリペプチドをスクリーニングする追加の方法
いくつかの実施形態において、追加の方法は、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチド候補をスクリーニングするために使用される。いくつかの例では、追加の方法は、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生し、および、その後、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチド候補に対してスクリーニングする工程を含む。場合によっては、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドフラグメントを、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド抗原を発現する培養細胞を、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを発現する樹状細胞を、樹状細胞由来のエキソソームを、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド候補を含有する組み換えの細胞外バキュロウィルスの発芽ウイルス形態を、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド候補を含む細胞膜を、あるいは精製された修飾された複数膜貫通型ポリペプチド候補を、接種する工程を含む。
【０２４０】
場合によっては、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドフラグメントを、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、ポリペプチドフラグメントは、長さが約１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ポリペプチドフラグメントはＧＰＣＲフラグメントを含む。いくつかの例では、ＧＰＣＲフラグメントは、Ｎ末端部分、Ｃ末端部分、１つ以上のＴＭコア、エキソループ（ｅｘｏｌｏｏｐ）、細胞内ループ、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、該方法は、ポリペプチドフラグメント（例えば、ＧＰＣＲフラグメント）に対する抗体を収穫および精製する工程をさらに含む。
【０２４１】
いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド抗原を発現する培養細胞を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド抗原は、修飾されたＧＰＣＲ抗原である。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、修飾されたＧＰＣＲを発現する培養細胞を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、該方法は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド抗原（例えば、修飾されたＧＰＣＲ抗原）に対する抗体を収穫および精製する工程をさらに含む。
【０２４２】
いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド発現樹状細胞を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、樹状細胞は修飾されたＧＰＣＲを発現する。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、修飾されたＧＰＣＲ発現樹状細胞を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、上記方法は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド発現樹状細胞（例えば、修飾されたＧＰＣＲ発現樹状細胞）に対する抗体を収穫および精製する工程をさらに含む。
【０２４３】
いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、樹状細胞由来のエキソソームを、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、樹状細胞由来のエキソソームは、抗原特異性のＢ細胞抗体応答の活性化を誘発する抗原（例えば、複数膜貫通型ポリペプチド抗原）を含む。場合によっては、樹状細胞由来のエキソソームは、複数膜貫通型ポリペプチド抗原を含む。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド抗原は、修飾されたＧＰＣＲ抗原である。場合によっては、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、ＧＰＣＲ抗原を発現する樹状細胞由来のエキソソームを、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、該方法は、樹状細胞由来のエキソソームに対する抗体を採取および精製する工程をさらに含む。
【０２４４】
いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含有する組み換えの細胞外バキュロウィルスの発芽ウイルス形態を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド抗原は、修飾されたＧＰＣＲである。場合によっては、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、修飾されたＧＰＣＲを含有する組み換えの細胞外バキュロウィルスの発芽ウイルス形態を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、該方法は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド（例えば、修飾されたＧＰＣＲ）を含有する組み換えの細胞外バキュロウィルスの発芽ウイルス形態に対する抗体を、収穫および精製する工程をさらに含む。
【０２４５】
いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む細胞膜を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド抗原は、修飾されたＧＰＣＲである。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、修飾されたＧＰＣＲを含む培養膜を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、該方法は、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド（例えば、修飾されたＧＰＣＲ）を含む細胞膜に対する抗体を、収穫および精製する工程をさらに含む。
【０２４６】
いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、精製された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド抗原は、修飾されたＧＰＣＲである。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントを生成または産生する方法は、精製された修飾されたＧＰＣＲを、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、あるいはウサギ）に接種する工程を含む。いくつかの例では、該方法は、精製された修飾された複数膜貫通型ポリペプチド（例えば、精製された修飾されたＧＰＣＲ）に対する抗体を、収穫および精製する工程をさらに含む。
【０２４７】
小分子をスクリーニングする方法
いくつかの実施形態において、治療薬は小分子である。場合によっては、小分子は薬物または小分子フラグメントである。いくつかの例では、薬物は治療効果を示す分子（例えば、化学分子または生物製剤）である。他の例では、薬物は治療効果を示さない分子（例えば、化学分子または生物製剤）である。いくつかの例では、本明細書に記載される治療薬は、治療効果を示す薬物（例えば、化学分子または生物製剤）である。他の例では、本明細書に記載される治療薬は、治療効果を示さない薬物（例えば、化学分子または生物製剤）である。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに対して小分子をスクリーニングする方法が本明細書に記載され、該方法は、（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；（ｆ）小分子を用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物と小分子との間の結合を検知する工程、を含む。
【０２４９】
場合によっては、該方法はさらに、（ａ）産生ベクターの第２のセットを生成する工程であって、ここで、各産生ベクターは、上記の工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、工程；（ｂ）第３の複数の宿主細胞中の産生ベクターの第２のセットを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；および、（ｃ）上に議論された工程ｆ）の小分子に対してスクリーニングするために、物理化学的性質が増強または改善したセットから発現された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドを決定するための分析方法によって複数膜貫通型ポリペプチド生成物のセットを分析する工程であって、ここで、物理化学的性質の増強または改善は、対照複数膜貫通型ポリペプチドに対するものである、工程を含む。いくつかの例では、物理化学的性質の増強または改善は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、または経路活性化選択性を含む。いくつかの例では、対照は、野生型の複数膜貫通型ポリペプチド、あるいは異なる修飾を備える修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む。いくつかの例では、上記の工程ｇ）の結合は、等温滴定熱量測定、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、後方散乱干渉法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）方法、蛍光偏光方法、プラズモン導光路共振法、蛍光リガンド結合アッセイ、放射リガンド結合アッセイなどの分析技術によって検知される。
【０２５０】
いくつかの例では、小分子は小分子フラグメントである。場合によっては、小分子フラグメントは非天然発生分子である。場合によっては、小分子フラグメントは、天然および／または非天然のペプチドフラグメント、あるいは哺乳動物の身体内で自然に生成される小分子（例えば、代謝産物）を含まない。
【０２５１】
いくつかの例では、小分子フラグメントは、約１００ダルトン以上の分子量を含む。いくつかの実施形態において、小分子フラグメントは、約１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００ダルトン以上の分子量を含む。
【０２５２】
いくつかの例では、小分子フラグメントはマイクロモル濃度あるいはミリモル濃度の結合親和性を含む。いくつかの例では、小分子フラグメントは、約１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、あるいはそれ以上の結合親和性を含む。
【０２５３】
場合によっては、小分子フラグメントは高いリガンド効率（ＬＥ）を有する。リガンド効率は、リガンドの、その結合パートナー（例えば、ＧＰＣＲ）に対する１つの原子当たりの結合エネルギーの測定値である。いくつかの例では、リガンド効率は、化合物（Ｎ）の非水素原子の数に対するギブスの自由エネルギー（ΔＧ）の比率として定義される：
ＬＥ＝（ΔＧ）／Ｎ．
【０２５４】
場合によっては、ＬＥは以下のようにも配される：
ＬＥ＝１．４（−ｌｏｇＩＣ５０）／Ｎ．
【０２５５】
いくつかの例では、ＬＥスコアは、約０．３ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１ＨＡ−１、約０．３５ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１ＨＡ−１、約０．４ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１ＨＡ−１、あるいはそれ以上である。
【０２５６】
いくつかの実施形態において、小分子フラグメントは３の法則（ｔｈｅ  Ｒｕｌｅ  ｏｆ  ３）に基づいて設計されている。いくつかの実施形態において、３の法則は、約３以下の無極性溶媒−極性溶媒（例えば、オクタノール−水）分配係数対数Ｐ、約３００ダルトン以下の分子量、約３以下の水素結合供与体、約３以下の水素結合受容体、および約３以下の回転可能な結合を含む。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、小分子フラグメントは、小分子フラグメントをそれ以上最適化することなく投与される治療薬としては不適切な薬物動態パラメータをさらに含む。いくつかの例では、治療薬として適切な薬物動態パラメータは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）のガイドラインに沿った、あるいは米国外の同等の食品医薬品局のガイドラインに沿ったパラメータを含む。いくつかの例では、薬物動態パラメータは、ピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）、治療薬の最低濃度（Ｃｍｉｎ）、分布容積、Ｃｍａｘ到達時間、排出半減期、クリアランスなどを含む。いくつかの実施形態において、小分子フラグメントの薬物動態パラメータは、ＦＤＡのガイドラインによって、あるいは米国外の同等の食品医薬品局のガイドラインによって設定されたパラメータの外にある。いくつかの例では、当業者は、本明細書に記載される小分子フラグメントの薬物動態パラメータを考慮すれば、これらの小分子フラグメントがそれ以上の最適化を行わなければ治療薬としては不適切であるということを理解する。
【０２５８】
いくつかの例では、典型的な小分子フラグメントの例としては、限定されないが、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ、Ｐｙｒａｍｉｄ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ、ＦＲＧｘ  ｆｒｏｍ  ＡｎａｌｙｔｉＣｏｎ、ＴＣＩ−Ｆｒａｇ  ｆｒｏｍ  ＡｎＣｏｒｅＸ、Ｂｉｏ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋｓ  ｆｒｏｍ  ＡＳＩＮＥＸ、ＢｉｏＦｏｃｕｓ  ３Ｄ  ｆｒｏｍ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  （ＦＯＬ）  ｆｒｏｍ  Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｂｉｏ、Ｅｎａｍｉｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ、ＩＯＴＡ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  １５００、ＢＩＯＮＥＴ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｌｉｂｒａｒｙ、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＯＴＡＶＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ、Ｓｅｌｃｉａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ、ＴｉｍＴｅｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｂａｓｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ、Ａｌｌｉｕｍ  ｆｒｏｍ  Ｖｉｔａｓ−Ｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、またはＺｅｎｏｂｉａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙが挙げられる。
【０２５９】
ワクチン
いくつかの実施形態において、ワクチンと、本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに基づいたワクチン製剤が本明細書にさらに記載されている。いくつかの例では、ワクチンは、生の弱毒化した病原体、あるいは、例えば、化学製品、熱、放射線によって不活性化された不活性化病原体から調製される。いくつかの例では、ワクチンは、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのサブユニットまたは一部を含み、上記サブユニットまたは一部は随意に共役される。いくつかの例では、ワクチンは、ペプチドベースのワクチン、核酸ベースのワクチン、抗体ベースのワクチン、あるいは抗原提示細胞ベースのワクチンとして調製される。
【０２６０】
いくつかの例では、ワクチンは、薬学的に使用される調製物への活性化合物の処理を促す賦形剤と助剤を含む１つ以上の生理学的に許容可能な担体を使用して、従来のやり方で製剤される。適切な製剤は、選択される投与の経路に依存する。周知の技術、担体、および賦形剤のいずれかが、適切なものとして、および当該技術で理解されているように使用される。
【０２６１】
場合によっては、ワクチンは、ペプチドベースのワクチン、核酸ベースのワクチン、抗体ベースのワクチン、あるいは細胞ベースのワクチンとして製剤される。例えば、ワクチン組成物はしばしば、カチオン性脂質製剤に中にネイキッドｃＤＮＡ；リポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，  １９９５）、ネイキッドｃＤＮＡまたはペプチド、例えば、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）中にカプセル化されたマイクロスフェア（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２８：２８７−  ２９４，  １９９１：  Ａｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：２９９−３０６，  １９９４；  Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：６７５−６８１，  １９９５を参照）；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）中に含まれるペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：８７３−８７５，  １９９０；  Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１３：２３５−２４３，  １９９８を参照）；あるいは、複数の抗原ペプチドシステム（ＭＡＰ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．  Ｐ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：５４０９−５４１３，  １９８８；  Ｔａｒｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１７−３２，  １９９６を参照）。しばしば、ワクチンは、ペプチドベースのワクチン、あるいは核酸ベースのワクチンとして製剤され、ここで、核酸は、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする。しばしば、ワクチンは抗体ベースのワクチンとして製剤される。しばしば、ワクチンは細胞ベースのワクチンとして製剤される。
【０２６２】
抗体ベースのワクチン
いくつかの実施形態において、ワクチンは抗体ベースのワクチンである。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに結合する。いくつかの例では、ワクチンは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とを含む、単離および精製された抗体またはその結合フラグメントを含み、ここで、重鎖と軽鎖のＣＤＲは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドと相互作用し、および、ここで、抗体またはその結合フラグメントは以下のプロセスによって生成される：（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ｄ）工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む産生ベクターを生成する工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；（ｆ）抗体のセットまたはその結合フラグメントを用いて、工程（ｅ）の産生ベクターから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物をインキュベートする工程；および、（ｇ）複数膜貫通型ポリペプチド生成物に特異的に結合する抗体またはその結合フラグメントを選択する工程、を含む。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ法によって生成される。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。いくつかの例では、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの例では、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。いくつかの例では、ワクチンはアジュバントをさらに含む。いくつかの例では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦを含む。
【０２６３】
いくつかの例では、抗体ベースのワクチンは、周知の技術、担体、および賦形剤のいずれかを用いて、適切なように、かつ、当該技術分野で理解されるとおりに製剤される。上記のように、抗体またはその結合フラグメントは、例えば、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいはラクダ科抗体、またはその結合フラグメントを含む。いくつかの例では、抗体は、自然抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または抗体フラグメントである。場合によっては、モノクローナル抗体は、任意の適切な種、例えば、ネズミ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトのモノクローナル抗体から得られる。
【０２６４】
核酸ベースのワクチン
いくつかの実施形態において、ワクチンは核酸ベースのワクチンとして製剤される。いくつかの例では、核酸ベースのワクチンは、周知の技術、担体、および賦形剤のいずれかを用いて、適切なように、かつ、当該技術分野で理解されるとおりに製剤される。場合によっては、核酸は、ＤＮＡ、ゲノムとｃＤＮＡ、ＲＮＡの両方、またはハイブリッドであり、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせ、および、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン・ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含んでいる。場合によっては、核酸が化学合成方法、あるいは組み換え法によって得られる。いくつかの例では、ワクチンは、ＤＮＡベースのワクチン、ＲＮＡベースのワクチン、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡベースのワクチン、あるいはハイブリッド核酸／ペプチドベースのワクチンである。
【０２６５】
場合によっては、本明細書に記載される核酸ベースのワクチンは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは以下のプロセスによって生成される：（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ａ）産生ベクターの第２のセットを生成する工程であって、ここで、各産生ベクターは、工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターの第２のセットを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；および、（ｆ）ワクチンの生成のために物理化学的性質が増強または改善したセットから複数膜貫通型ポリペプチド生成物を決定するための分析方法によって工程ｅ）の産生ベクターの第２のセットから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物のセットを分析する工程であって、ここで、物理化学的性質の増強または改善は、対照複数膜貫通型ポリペプチドに対するものである、工程を含む。いくつかの例では、物理化学的性質の増強または改善は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、または経路活性化選択性を含む。いくつかの例では、対照は、野生型の複数膜貫通型ポリペプチド、あるいは異なる修飾を備える修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。いくつかの例では、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの例では、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。いくつかの例では、ワクチンはアジュバントをさらに含む。いくつかの例では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦを含む。
【０２６６】
いくつかの例では、本明細書で使用されるような核酸分子は、ともに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを指す。本明細書に記載される核酸は、例えば、リン酸ジエステル結合を含むが、場合によっては、（例えば、プライマーや標識プローブなどのプローブの構造において）以下に概説されるように、例えば、代替的なバックボーンを有する核酸アナログが含まれ、例えば、ホスホラミド  （Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５  （１９９３）  およびこれに記載の文献；  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ３５：３８００  （１９７０）；  Ｓｐｒｉｎｚｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ８１：５７９  （１９７７）；  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：３４８７  （１９８６）；  Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  ８０５  （１９８４），  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１０：４４７０  （１９８８）；  および、Ｐａｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１  ９１９８６）），  ホスホロチオエート  （Ｍａｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：１４３７  （１９９１）；およびＵ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，６４４，０４８），  ジチオリン酸（Ｂｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１１：２３２１  （１９８９），  Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照），  および、ペプチド核酸（“ＰＮＡ”としても知られている）  骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１４：１８９５  （１９９２）；  Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３１：１００８  （１９９２）；  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６５：５６６  （１９９３）；  Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７  （１９９６）を参照）である。他のアナログ核酸は、ロックド核酸（本明細書では「ＬＮＡ」とも呼ばれる）、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２０．１３２５２  ３  （１９９８）；  陽性の骨格（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）（Ｄｅｎｐｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：６０９７  （１９９５）；非イオン性骨格（ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏｓ．  ５，３８６，０２３，  ５，６３７，６８４，  ５，６０２，２４０，  ５，２１６，１４１  ａｎｄ  ４，４６９，８６３；  Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３  （１９９１）；  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１０：４４７０  （１９８８）；  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆ａｍｐ；  Ｎｕｃｌｅｏｔ��ｄｅ  １３：１５９７  （１９９４）；  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２  ａｎｄ  ３，  ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，  “Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，  Ｅｄ．  Ｙ．  Ｓ．  Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ；  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  ４：３９５  （１９９４）；  Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７  （１９９４）；  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３７：７４３  （１９９６））、および、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏｓ．  ５，２３５，０３３および５，０３４，５０６，  ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  ７，  ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，  “Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，  Ｅｄ．  Ｙ．  Ｓ．  Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに記載されるものを含む非リボース骨格（ｎｏｎ−ｒｉｂｏｓｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）を含んでいる二環式の構造を有するものを含む。１つ以上の炭素環式糖を含む核酸も、核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｒｅｖ．  （１９９５）  ｐｐ  １６９  １７６を参照）。いくつかの核酸アナログはＲａｗｌｓ，  Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎ．  ２，  １９９７  ｐａｇｅ  ３５に記載されている。「ロックド核酸」も核酸アナログの定義内に含まれる。ＬＮＡは、リボース環が２’−Ｏ原子をＣ−４’原子に結合するメチレン架橋によりロックされている、核酸アナログのクラスである。リボース−リン酸塩骨格のこれらの修飾は、生理的環境でこうした分子の安定性と半減期を増加させるために行うことができる。例えばＰＮＡ：ＤＮＡとＬＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドは、より高い安定性を示すことがあり、ゆえに、いくつかの実施形態において使用することができる。標的核酸は指定されるとおりに一本鎖または二本鎖であってもよく、あるいは二本鎖または一本鎖の両方の配列の一部を含むことができる。用途によっては、核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、およびｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡとｒＲＮＡを含む）、またはハイブリッドであり得るが、核酸はデオキシリボ−ヌクレオチドとリボ−ヌクレオチドの任意の組み合わせ、および、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キササニン（ｘａｔｈａｎｉｎｅ）ヒポキササニン（ｈｙｐｏｘａｔｈａｎｉｎｅ）、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組み合わせを含んでいる。
【０２６７】
いくつかの例では、ベクターは円形のプラスミドまたは線形の核酸である。場合によっては、円形のプラスミドまたは線形の核酸は、適切な被験体の細胞の特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる。場合によっては、ベクターは、終結シグナルに動作可能に連結されるポリペプチドコードヌクレオチド配列に動作可能に連結されるプロモーターを有する。いくつかの例では、ベクターはさらに、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要とされる配列を含む。所望のヌクレオチド配列を含むベクターはキメラであり得、このことは、その成分の少なくとも１つがその他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞が特定の外部刺激にさらされるときにのみ転写を開始することができる構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターにより制御可能である。
【０２６８】
いくつかの例では、ベクターはプラスミドである。場合によっては、プラスミドがポリペプチドをコードする核酸を細胞にトランスフェクトするのに役立ち、変形した宿主細胞は、ポリペプチドの発現が行われる条件下で培養および維持可能である。
【０２６９】
いくつかの例では、プラスミドは、本明細書に開示された修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの１つ以上をコードする核酸配列を含む。単一のプラスミドは、例えば、単一のポリペプチドのためのコード配列、あるいは１つを超えるポリペプチドのためのコード配列を含む。しばしば、プラスミドは、免疫刺激分子またはサイトカインなどのアジュバントをコードするコード配列をさらに含む。いくつかの例では、プラスミドはさらに、開始コドン、終止コドン、コード配列に動作可能に連結されるプロモーター、およびコード配列の上流のエンハンサーを含む。
【０２７０】
いくつかの例では、プラスミドは、プラスミドを染色体外に維持し、かつ細胞中のプラスミドの複数のコピーを生成するために、哺乳動物起源の複製を含む。プラスミドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのｐＶＡＸＩ、ｐＣＥＰ４、あるいはｐＲＥＰ４であり得る。
【０２７１】
いくつかの例では、プラスミドは制御配列をさらに含み、これは、プラスミドが投与される細胞中での遺伝子発現を可能にする。場合によっては、コード配列は、宿主細胞中のコード配列のより効率的な転写を可能にするコドンをさらに含む。
【０２７２】
典型的なプラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのタンパク質生成に使用することができるｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；酵母のサッカロマイセス・セレビシエ菌株でのタンパク質生成に使用されるｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；昆虫細胞でのタンパク質生成に使用されるＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウィルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；および、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞でのタンパク質生成に使用されるｐｃＤＮＡ  Ｉ、またはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む。
【０２７３】
いくつかの例では、ベクターは円形のプラスミドであり、これは、細胞のゲノムへ統合することにより、または染色体外に存在する（例えば、複製開始点を有するプラスミドを自律的に複製する）ことにより、標的細胞を変形する。典型的なベクターとしては、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、またはｐｒｏｖａｘ、あるいは、抗原をコードするＤＮＡを発現することができ、細胞が免疫系によって認識される抗原へと配列を翻訳することを可能にする他の発現ベクターが挙げられる。
【０２７４】
いくつかの例では、核酸ベースのワクチンは線形の核酸ワクチンまたは線形の発現カセット）（「ＬＥＣ」）であり、電気穿孔法によって被験体に効率的に送達可能であり、かつ、本明細書に開示された１つ以上のポリペプチドを発現することができる。ＬＥＣは任意のリン酸塩骨格が欠けている任意の線形のＤＮＡであり得る。ＤＮＡは本明細書に開示された１つ以上のポリペプチドをコードすることができる。ＬＥＣはプロモーター、イントロン、終止コドン、および／またはポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリペプチドの発現はプロモーターによって制御されてもよい。場合によっては、ＬＥＣは抗生物質耐性遺伝子および／またはリン酸塩骨格を含まない。場合によっては、ＬＥＣはポリペプチド発現と無関係の他の核酸配列を含まない。
【０２７５】
ペプチドベースのワクチン
しばしば、ワクチンは細胞ベースのワクチンとして製剤される。場合によっては、本明細書に記載されたペプチドベースのワクチンは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含み、ここで、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは以下のプロセスによって生成される：（ａ）無作為の突然変異誘発方法によって修飾された複数膜貫通型ポリペプチドライブラリーを生成する工程；（ｂ）発現ベクターの第１のセットを生成する工程であって、各発現ベクターが、工程（ａ）のライブラリーからの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドのＣ末端に動作可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子と、随意に、ポリヌクレオチドのＮ末端に動作可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含む、工程；（ｃ）安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットを選択するために、少なくとも１つの選択剤の存在または不在下で第１の複数の宿主細胞中の発現ベクターの第１のセットを発現させる工程；（ａ）産生ベクターの第２のセットを生成する工程であって、ここで、各産生ベクターは、工程（ｃ）で同定された安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドのセットからの安定的に折り畳まれた複数膜貫通型ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、工程；（ｅ）第２の複数の宿主細胞中の産生ベクターの第２のセットを発現させる工程であって、ここで、宿主細胞は産生宿主細胞である、工程；および、（ｆ）ワクチンの生成のために物理化学的性質が増強または改善したセットから複数膜貫通型ポリペプチド生成物を決定するための分析方法によって工程ｅ）の産生ベクターの第２のセットから生成された複数膜貫通型ポリペプチド生成物のセットを分析する工程であって、ここで、物理化学的性質の増強または改善は、対照複数膜貫通型ポリペプチドに対するものである、工程を含む。いくつかの例では、物理化学的性質の増強または改善は、発現レベル、安定性、配座の選択性、均質性、タンパク質結晶化、抗原性、免疫原性、または経路活性化選択性を含む。いくつかの例では、対照は、野生型の複数膜貫通型ポリペプチド、あるいは異なる修飾を備える修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを含む。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたイオンチャネルタンパク質である。いくつかの例では、修飾されたイオンチャネルタンパク質は、修飾されたＴＲＰＶ３、ＫＣａ３．１、またはＴＲＰＣ６である。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの例では、修飾されたＧＰＣＲは、修飾されたＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＧＰＲ５５、ＮＴＲ１、ＥＰ２、またはＥＰ４の受容体である。いくつかの例では、ワクチンはアジュバントをさらに含む。いくつかの例では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦを含む。
【０２７６】
場合によっては、ペプチドベースのワクチンは、周知の技術、担体、および賦形剤のいずれかを用いて、適切なように、かつ、当該技術分野で理解されるとおりに製剤される。いくつかの例では、１つ以上の修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、同じ配列を含む複数のポリペプチドのカクテル、あるいは異なるポリペプチドの複数のコピーのカクテルとして製剤される。いくつかの例では、ペプチドは、例えば、脂質修飾、または担体タンパク質への結合などによって修飾される。場合によっては、脂質修飾はポリペプチドに対する脂質群の共有結合である。いくつかの例では、脂質付加されたペプチドまたは脂質付加されたポリペプチドは、構造を安定させ、ワクチン処置の有効性を増強する。
【０２７７】
いくつかの例では、脂質付加されたペプチドはさらにリポソームに組み入れられる。例えば、脂質付加されたペプチドの脂質部分は自発的にリポソームの脂質二重層へ統合する。したがって、リポペプチドはリポソームの「表面」上で提示される。いくつかの例では、脂質付加されたペプチドは、リポソーム内でカプセル化される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドを指す。
【０２７８】
製剤中での取り込みに適切な典型的なリポソームとしては、限定されないが、多重層ベシクル（ＭＬＶ）、オリゴ層状ベシクル（ＯＬＶ）、単層ベシクル（ＵＶ）、小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）、中程度の大きさの単層ベシクル（ＭＵＶ）、大きな単層ベシクル（ＬＵＶ）、巨大な単層ベシクル（ＧＵＶ）、多胞体ベシクル（ＭＶＶ）、逆相蒸発法によって作られた単一またはオリゴ層状ベシクル（ＲＥＶ）、逆相蒸発法によって作られた多重層ベシクル（ＭＬＶ−ＲＥＶ）、安定した複数層ベシクル（ＳＰＬＶ）、凍結融解したＭＬＶ（ＦＡＴＭＬＶ）、押出法によって調製されたベシクル（ＶＥＴ）、フレンチプレスによって調製されたベシクル（ＦＰＶ）、融合によって調製されたベシクル（ＦＵＶ）、脱水−再水和ベシクル（ＤＲＶ）およびバブルソーム（ｂｕｂｂｌｅｓｏｍｅｓ）（ＢＳＶ）が挙げられる。いくつかの例では、リポソームはＡｍｐｈｉｐｏｌ（Ａ８−３５）を含む。リポソームを調製するための技術は、例えば、ＣＯＬＬＯＩＤＡＬ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ｖｏｌ．６６（Ｊ．  Ｋｒｅｕｔｅｒ  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．  （１９９４））に記載されている。
【０２７９】
調製方法に依存して、リポソームは単層状または多層状であり、約０．０２μｍ〜約１０μｍまでにｎ及ぶ直径のサイズが異なる。
【０２８０】
いくつかの例では、リポソームは多くのタイプの細胞を吸収し、その後、取り込んだ薬剤（例えば、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチド）を放出する。場合によっては、リポソームは標的細胞と融合し、それによってリポソームの内容物は標的細胞中にすべて移される。場合によっては、リポソームは食作用性の細胞によってエンドシトーシスされる。エンドサイトーシスの後、リポソーム脂質のリソソーム内分解とカプセルに包まれた薬剤の放出が行われる。Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，４４６：３６８（１９８５）。
【０２８１】
いくつかの例では、本明細書に提供されるリポソームはさらに担体脂質を含む。いくつかの実施形態において、担体脂質はリン脂質である。リポソームを形成することができる担体脂質としては、限定されないが、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ；レシチン）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、またはホスファチジルセリン（ＰＳ）が挙げられる。他の適切なリン脂質はさらにジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）；ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）など、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、リポソームは、リポソーム形成を調節するステロール（例えばコレステロール）をさらに含む。担体脂質は任意の既知の非リン酸塩極性脂質であり得る。
【０２８２】
いくつかの例では、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、ワクチンとして送達される担体タンパク質にも結合される。いくつかの例では、担体タンパク質は免疫原の要素であり、任意の組み換えの技術によって結合される。典型的な担体タンパク質は、Ｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  キーホールリンペットヘモシニアン（ｍｃＫＬＨ）、ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｍｃＫＬＨ、Ｂｌｕｅ  Ｃａｒｒｉｅｒ（登録商標）タンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カチオン化ＢＳＡ、オバルブミン、および破傷風トキソイドなどの細菌タンパク質（ＴＴ）を含む。
【０２８３】
場合によっては、ポリペプチドは多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）として調製される。場合によっては、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端において小さな非免疫原性コアに結合される。場合によっては、コアは、二機能性の単位から構成された樹状コア残基またはマトリックスを含む。ＭＡＰの構築に適切なコア分子は、例えば、アンモニア、エチレンジアミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびリジンを含む。本明細書で使用されるように、ＭＡＰ系構造の「線形の部分または分子」は、コアマトリクスに連結された抗原ペプチドを指す。したがって、抗原エピトープのクラスターは、ＭＡＰの表面を形成し、小さなマトリックスがそのコアを形成する。樹状コアと全ＭＡＰは、いくつかの例では、古典的Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ合成手順を使用して、固体樹脂上で合成される。ＭＡＰ合成は一般に、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏｓ．  ５，５８０，５６３、および、６，３７９，６７９、並びに、Ｔａｍ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５４０９−５４１３，  １９８８で記載されている。
【０２８４】
いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドは化学的に合成されるか、あるいは細胞系または無細胞系で組み換え発現される。ペプチドは、例えば、液相合成、固相合成によって、あるいはマイクロ波支援ペプチド合成によって、合成される。
【０２８５】
ポリペプチドの生成後、ポリペプチドはしばしば、不純物を取り除くために１回以上の精製工程にさらされる。場合によっては、精製工程は、親和性に基づく、サイズ排除に基づく、イオン交換に基づくなどの分離方法を利用するクロマトグラフィー工程を含む。場合によっては、ポリペプチドは、せいぜい３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または１００％純粋であるか、あるいは不純物が存在しない。場合によっては、ポリペプチドは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または１００％純粋であるか、あるいは不純物が存在しない。
【０２８６】
本明細書で使用されるように、ポリペプチドは天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、アミノ酸残基は、アミノ基とカルボキシル基の両方を含む分子を指す。適切なアミノ酸は、限定されないが、有機合成あるいは他の代謝性ルートによって調製された非自然発生のアミノ酸と同様に、自然発生のアミノ酸のＤ異性体とＬ異性体の両方を含む。アミノ酸との用語は、本明細書で使用されるように、限定されないが、α−アミノ酸、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、およびアミノ酸類似体を含む。
【０２８７】
いくつかの例では、（α）−アミノ酸は、アミノ基と、α−炭素と示される炭素に結合されたカルボキシル基とを両方含む分子を指す。
【０２８８】
いくつかの例では、（β）−アミノ酸は、β配置にアミノ基とカルボキシル基の両方を含む分子を指す。
【０２８９】
いくつかの例では、自然発生アミノ酸は、自然界において合成されたペプチド中で一般に見られ、かつ、１つの文字略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶによって知られている２０のアミノ酸のいずれか１つを指す。
【０２９０】
いくつかの例では、疎水性アミノ酸は、小さな疎水性アミノ酸と大きな疎水性アミノ酸を含む。小さな疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、およびそれらのアナログである。大きな疎水性アミノ酸は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびこれらのアナログである。極性アミノ酸は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、およびこれらのアナログである。荷電アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、あるいはこれらのアナログである。
【０２９１】
いくつかの例では、アミノ酸アナログは、アミノ酸に構造上似ていて、かつ、ペプチド模倣大環状分子の形成においてアミノ酸の代わりに用いられる、分子を指す。アミノ酸アナログは、限定されないが、β−アミノ酸、および、アミノまたはカルボキシの基が同様の反応基によって置き換えられる（例えば、二級または三級アミンによる一級アミンの置換、あるいはエステルによるカルボキシ基の置換）アミノ酸を含む。
【０２９２】
いくつかの例では、自然発生アミノ酸は、自然界において合成されたペプチド中で一般に見られ、かつ、１つの文字略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶによって知られている２０のアミノ酸のいずれか１つを指す。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸またはアミノ酸アナログは、限定されないが、以下を含む：
【０２９４】
下記などのβ−アミノ酸アナログ：環状のβ−アミノ酸アナログ；β−アラニン；（Ｒ）−β−フェニルアラニン；（Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−酢酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（１−ナフチル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−フリル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−ナフチル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−チエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３，４−ジフルオロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−ベンゾチエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−ピリジル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−チエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ブロモフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ヨードフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ニトロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ピリジル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−ペンタフルオロ−フェニル酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−ヘキセン酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−ヘキシン酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−フェニルペンタン酸；（Ｒ）−３−アミノ−６−フェニル−５−ヘキセン酸；（Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−酢酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（１−ナフチル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−クロロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−フリル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−ナフチル）−酪酸（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−チエニル）−酪酸（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３，４−ジフルオロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−ベンゾチエニル）−酪酸；（Ｓ）���３−アミノ−４−（３−クロロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−ピリジル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−チエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ブロモフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−クロロフェニル（酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−フルオロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ヨードフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ニトロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ピリジル）−酪酸（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−ペンタフルオロ−フェニル酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−ヘキセン酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−ヘキシン酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−フェニルペンタン酸；（Ｓ）−３−アミノ−６−フェニル−５−ヘキセン酸；１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−カルボン酸；１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−４−カルボン酸；３−アミノ−３−（２−クロロフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（２−チエニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（３−ブロモフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（４−クロロフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（４−メトキシフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ−酪酸；３−アミノアジピン酸；Ｄ−β−フェニルアラニン；β−ロイシン；Ｌ−β−ホモアラニン；Ｌ−β−ホモアスパラギン酸γ−ベンジルエステル；Ｌ−β−ホモグルタミン酸δ−ベンジルエステル；Ｌ−β−ホモイソロイシン；Ｌ−β−ホモロイシン；Ｌ−β−ホモメチオニン；Ｌ−β−ホモフェニルアラニン；Ｌ−β−ホモプロリン；Ｌ−β−ホモトリプトファン；Ｌ−β−ホモバリン；ＬＮω−ベンジルオキシカルボニル−β−ホモリジン；Ｎω−Ｌ−β−ホモアルギニン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモヒドロキシプロリン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモセリン；Ｏベンジル−Ｌ−β−ホモトレオニン；Ｏベンジル−Ｌ−β−ホモチロシン；γ−トリチル−Ｌ−β−ホモアスパラギン；（Ｒ）−β−フェニルアラニン；Ｌ−β−ホモアスパラギン酸γ−ｔ−ブチルエステル；Ｌ−β−ホモグルタミン酸δ−ｔ−ブチルエステル；Ｌ−Ｎω−β−ホモリジン；Ｎδ−トリチル−Ｌ−β−ホモグルタミン；Ｎω−２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル−Ｌ−β−ホモアルギニン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモヒドロキシ−プロリン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモセリン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモトレオニン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモチロシン；２−アミノシクロペンタンカルボン酸；および、２−アミノシクロヘキサンカルボン酸。
【０２９５】
下記などのアラニン、バリン、グリシン、あるいはロイシンのアナログ：α−メトキシグリシン；α−アリル−Ｌ−アラニン；α−アミノイソ酪酸；α−メチル−ロイシン；β−（１−ナフチル）−Ｄ−アラニン；β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン；β−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン；β−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン；β−（２−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（２−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−（２−チエニル）−Ｄ−アラニン；β−（２−チエニル）−Ｌ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｌ−アラニン；β−（３−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−（４−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（４−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−クロロ−Ｌ−アラニン；β−シアノ−Ｌ−アラニン；β−シクロヘキシル−Ｄ−アラニン；β−シクロヘキシル−Ｌ−アラニン；β−シクロペンテン−１−イル−アラニン；β−シクロペンチル−アラニン；β−シクロプロピル−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；β−ｔ−ブチル−Ｄ−アラニン；β−ｔ−ブチル−Ｌ−アラニン；γ−アミノ酪酸；Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；２，４−ジニトロ−フェニルグリシン；２，５−ジヒドロ−Ｄ−フェニルグリシン；２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸；２−フルオロ−フェニルグリシン；３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ−酪酸；３−フルオロ−バリン；４，４，４−トリフルオロ−バリン；４，５−デヒドロ−Ｌ−ｌｅｕ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；４−フルオロ−Ｄ−フェニルグリシン；４−フルオロ−Ｌ−フェニルグリシン；４−ヒドロキシ−Ｄ−フェニルグリシン；５，５，５−トリフルオロ−ロイシン；６−アミノヘキサン酸；シクロペンチル−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；シクロペンチル−Ｇｌｙ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸；Ｄ−α−アミノ酪酸；Ｄ−α−ｔ−ブチルグリシン；Ｄ−（２−チエニル）グリシン；Ｄ−（３−チエニル）グリシン；Ｄ−２−アミノカプロン酸；Ｄ−２−インダニルグリシン；Ｄ−アリルグリシン−ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ−シクロヘキシルグリシン；Ｄ−ノルバリン；Ｄ−フェニルグリシン；β−アミノ酪酸；β−アミノイソ酪酸；（２−ブロモフェニル）グリシン；（２−メトキシフェニル）グリシン；（２−メチルフェニル）グリシン；（２−チアゾイル）グリシン；（２−チエニル）グリシン；２−アミノ−３−（ジメチルアミノ）−プロピオン酸；Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；Ｌ−α−アミノ酪酸；Ｌ−α−ｔ−ブチルグリシン；Ｌ−（３−チエニル）グリシン；Ｌ−２−アミノ−３−（ジメチルアミノ）−プロピオン酸；Ｌ−２−アミノカプロン酸ジシクロヘキシル−アンモニウム塩；Ｌ−２−インダニルグリシン；Ｌ−アリルグリシン．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｌ−シクロヘキシルグリシン；Ｌ−フェニルグリシン；Ｌ−プロパルギルグリシン；Ｌ−ノルバリン；Ｎ−α−アミノメチル−Ｌ−アラニン；Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；β−シクロプロピル−Ｌ−アラニン；（Ｎ−β−（２，４−ジニトロフェニ��）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−４−メチルトリチル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−アリルオキシカルボニル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−γ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−４−メチルトリチル）−Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−４−メチルトリチル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−４−アリルオキシカルボニル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；４，５−デヒドロ−Ｌ−ロイシン；シクロペンチル−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨ；シクロペンチル−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｄ−アリルグリシン；Ｄ−ホモシクロヘキシルアラニン；Ｌ−１−ピレニルアラニン；Ｌ−２−アミノカプロン酸；Ｌ−アリルグリシン；Ｌ−ホモシクロヘキシルアラニン；および、Ｎ−（２−ヒドロキシ−４−メトキシ−Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ−ＯＨ。
【０２９６】
アミノ酸アナログは、アルギニンまたはリジンのアナログを含み得る。アルギニンとリジンのアミノ酸アナログの例としては、限定されないが、以下が挙げられる：シトルリン；Ｌ−２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸；Ｌ−２−アミノ−３−ウレイドプロピオン酸；Ｌ−シトルリン；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２−ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｎ３）−−ＯＨ；Ｎδ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−オルニチン；Ｎω−ニトロ−Ｄ−アルギニン；Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン；α−メチル−オルニチン；２，６−ジアミノヘプタン二酸；Ｌ−オルニチン；（Ｎδ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−オルニチン；（Ｎδ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−オルニチン；（Ｎδ−４−メチルトリチル）−Ｄ−オルニチン；（Ｎδ−４−メチルトリチル）−Ｌ−オルニチン；Ｄ−オルニチン；Ｌ−オルニチン；Ａｒｇ（Ｍｅ）（Ｐｂｆ）−ＯＨ；Ａｒｇ（Ｍｅ）２−ＯＨ（非対称）；Ａｒｇ（Ｍｅ）２−ＯＨ（対称）；Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２−ＯＨ．ＨＣｌ；Ｌｙｓ（Ｍｅ３）−ＯＨクロリド；Ｎω−ニトロ−Ｄ−アルギニン；およびＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニン。
【０２９７】
下記などのアスパラギン酸またはグルタミン酸のアナログ：α−メチル−Ｄ−アスパラギン酸；α−メチル−グルタミン酸；α−メチル−Ｌ−アスパラギン酸；γ−メチレン−グルタミン酸；（Ｎ−γ−エチル）−Ｌ−グルタミン；［Ｎ−α−（４−アミノベンゾイル）］−Ｌ−グルタミン酸；２，６−ジアミノピメリン酸；Ｌ−α−アミノスベリン酸；Ｄ−２−アミノアジピン酸；Ｄ−α−アミノスベリン酸；α−アミノピメリン酸；イミノ二酢酸；Ｌ−２−アミノアジピン酸；トレオ−β−メチル−アスパラギン酸；γ−カルボキシ−Ｄ−グルタミン酸γ，γ−ジ−ｔ−ブチルエステル；γ−カルボキシ−Ｌ−グルタミン酸γ，γ−ジ−ｔ−ブチルエステル；Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ；Ｌ−Ａｓｕ（ＯｔＢｕ）−−ＯＨ；および、ピログルタミン酸。
【０２９８】
下記などのシステインとメチオニンのアナログ：システイン（ファルネシル）−ＯＨ、システイン（ファルネシル）−ＯＭｅ、α−メチル−メチオニン、システイン（２−ヒドロキシエチル）−ＯＨ、システイン（３−アミノプロピル）−ＯＨ、２−アミノ−４−（エチルチオ）酪酸、ブチオニン、ブチオニンスルホキシイミン、エチオニン、メチオニン・チルスルホンイウムクロリド、セレノメチオニン、システイン酸、［２−（４−ピリジル）エチル］−ＤＬ−ペニシルアミン、［２−（４−ピリジル）エチル］−Ｌ−システイン、４−メトキシベンジル−Ｄ−ペニシラミン、４−メトキシベンジル−Ｌ−ペニシラミン、４−メチルベンジル−Ｄ−ペニシラミン、４−メチルベンジル−Ｌ−ペニシラミン、ベンジル−Ｄ−システイン、ベンジル−Ｌ−システイン、ベンジル−ＤＬ−ホモシステイン、カルバモイルＬ−システイン、カルボキシエチル−Ｌ−システイン、カルボキシメチル−Ｌ−システイン、ジフェニルメチル−Ｌ−システイン、エチル−Ｌ−システイン、メチル−Ｌ−システイン、ｔ−ブチル−Ｄシステイン、トリチル−Ｌ−ホモシステイン、トリチル−Ｄ−ペニシラミン、シスタチオニン、ホモシスチン、Ｌ−ホモシスチン、（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン、セレノ−Ｌ−シスチン、シスタチオニン、システイン（ＳｔＢｕ）−−ＯＨ、および、アセトアミドメチル−Ｄ−ペニシラミン。
【０２９９】
下記などのフェニルアラニンとチロシンのアナログ：β−メチル−フェニルアラニン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、α−メチル−３−メトキシ−ＤＬ−フェニルアラニン、α−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、α−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸；２，４−ジクロロ−フェニルアラニン、２−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、２−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、２−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、２−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、２−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、２−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、２−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン；２−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン；２−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、２−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、２−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、２，４，５−トリヒドロキシ−フェニルアラニン、３，４，５−トリフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４，５−トリフルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４−ジフルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジメトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，５，３’−トリヨード−Ｌ−サイロニン３，５−ジヨード−Ｄ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−サイロニン、３−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、３−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、３−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｌ−チロシン、３−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン；３−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン；３−フルオロ−チロシン、３−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、３−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、３−メトキシ−Ｌ−チロシン、３−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、３−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、４−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、４−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−アミノ−Ｄ−フェニルアラニン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｄ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ビス（２−クロロエチル）アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、４−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン；４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン；４−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェ��ルアラニン、ホモフェニルアラニン、サイロキシン、３，３−ジフェニルアラニン、サイロニン、エチル−チロシン、および、メチル−チロシン。
【０３００】
下記などのプロリンアナログ：３，４−デヒドロ−プロリン、４−フルオロ−プロリン、ｃｉｓ−４−ヒドロキシ−プロリン、チアゾリジン−２−カルボキシル酸、およびトランス−４−フルオロ−プロリン。
【０３０１】
下記などのセリンとスレオニンのアナログ：３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸、２−アミノ−３−エトキシブタン酸、２−アミノ−３−メトキシブタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−アミノ−３−ベンジルオキシプロピオン酸、２−アミノ−３−ベンジルオキシプロピオン酸、２−アミノ−３−エトキシプロピオン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、およびα−メチルセリン。
【０３０２】
下記などのトリプトファンアナログ：α−メチル−トリプトファン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｌ−アラニン；１−メチル−トリプトファン；４−メチル−トリプトファン；５−ベンジルオキシ−トリプトファン；５−ブロモ−トリプトファン；５−クロロ−トリプトファン；５−フルオロ−トリプトファン；５−ヒドロキシ−トリプトファン；５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン；５−メトキシ−トリプトファン；５−メトキシ−Ｌ−トリプトファン；５−メチル−トリプトファン；６−ブロモ−トリプトファン；６−クロロ−Ｄトリプトファン；６−クロロ−トリプトファン；６−フルオロ−トリプトファン；６−メチル−トリプトファン；７−ベンジルオキシ−トリプトファン；７−ブロモ−トリプトファン；７−メチル−トリプトファン；Ｄ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ノルハルマン−３−カルボン酸；６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−１−カルボン酸；７−アザトリプトファン；Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ノルハルマン−３−カルボン酸；５−メトキシ−２−メチル−トリプトファン；および、６−クロロ−Ｌ−トリプトファン。
【０３０３】
いくつかの実施形態において、アミノ酸アナログはラセミ混合物である。いくつかの例では、アミノ酸アナログのＤ異性体は使用される。場合によっては、アミノ酸アナログのＬ異性体は使用される。いくつかの例では、アミノ酸アナログは、ＲまたはＳ配置にあるキラル中心を含む。しばしば、β−アミノ酸アナログのアミノ基は、保護基、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、トシルなどで随意に置換される。しばしば、β−アミノ酸アナログのカルボン酸官能基は、例えば、そのエステル誘導体として保護される。場合によっては、アミノ酸アナログの塩が使用される。
【０３０４】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベースのワクチン
いくつかの例では、ワクチンは抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベースのワクチンである。場合によっては、ＡＰＣベースのワクチンは、周知の技術、担体、および賦形剤のいずれかを用いて、適切なように、かつ、当該技術分野で理解されるとおりに製剤される。ＡＰＣは単球、単球由来の細胞、マクロファージ、および樹状細胞を含んでいる。しばしば、ＡＰＣベースのワクチンは樹状細胞ベースのワクチンであり得る。
【０３０５】
いくつかの例では、樹状細胞ベースのワクチンは、当該技術分野で周知の任意の方法によって調製される。場合によっては、樹状細胞（ＤＣ）ベースのワクチンは、エクスビボまたはインビボの方法により調製される。エクスビボ方法は例えば、患者への投与の前にＤＣを活性化または充填するために、本明細書に記載されたポリペプチドにおいてエクスビボでパルス化した自己由来のＤＣの使用を含む。いくつかの例では、インビボ方法は、本明細書に記載されたポリペプチドと結合した抗体を使用して、特定のＤＣ受容体を標的とする工程を含む。ＤＣベースのワクチンはさらに、ＴＬＲ３、ＴＬＲ−７−８、およびＣＤ４０のアゴニストなどのＤＣアクチベーターを含むことができる。ＤＣベースのワクチンはさらに、アジュバントと、薬学的に許容可能な担体とを含むことができる。
【０３０６】
ウイルスベースのワクチン
いくつかの実施形態において、ワクチンはウイルスベースのワクチンである。いくつかの例では、ウイルスベースのワクチンは、生ウイルスまたは不活性化ウイルスに基づいて生成される。生ウイルスベースのワクチンは、弱毒化ウイルス、あるいは低温に適応したウイルスを使用する。いくつかの例では、不活性化ウイルスに基づくワクチンは、全ビリオン、分離したビリオン、または精製された表面抗原（例えば、インフルエンザＡ型ウイルスからのＨＡおよび／またはＮ）を含む。ウイルスを不活性化するための化学的な手段は、以下の薬剤：洗浄薬、ホルムアルデヒド、β−プロビオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、二元性のエチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはこれらの組み合わせの１つ以上の効果的な量を用いる処置を含んでもよい。ウイルスの不活性化の非化学的な方法、例えば、ＵＶ光またはγ線照射などが、当該技術分野で知られている。
【０３０７】
場合によっては、ビリオンは、様々な方法によってウイルスを含有する流体から収穫される。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための洗浄薬を含む線形の蔗糖勾配溶液を使用するゾーン遠心分離を含むことができる。抗原は、任意の希釈の後に、ダイアフィルトレーションによって精製可能である。
【０３０８】
場合によっては、分離したビリオンは、「トゥイーン−エーテル」分離プロセスを含むサブビリオン調製物を生成するために、洗浄薬（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルリン酸塩、トリトンＸ−１００、トリトンＮ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）で、精製されたビリオンを処置することにより得られる。
【０３０９】
アジュバント
いくつかの例では、本明細書に記載されたワクチンはアジュバントをさらに含む。いくつかの例では、アジュバントは、ワクチンを受け取る患者において誘発された免疫反応（体液および／または細胞）を増強するために使用される。しばしば、アジュバントはＴｈ１型応答を誘発する。またあるときには、アジュバントはＴｈ２型応答を誘発する。いくつかの例では、Ｔｈ１型応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０などのサイトカインの産生を特徴とするＴｈ２型応答に対立するものとしてのＩＦＮ−γなどのサイトカインの産生を特徴とする。
【０３１０】
いくつかの態様では、ＭＰＬＡやＭＤＰなどの脂質ベースのアジュバントは、本明細書に開示されたワクチンと共に使用することができる。モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）は、例えば、特定のＴリンパ球に対するリポソーム抗原の提示の増加をもたらすアジュバントである。加えて、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）は、本明細書に記載されたワクチン製剤と協働する適切なアジュバントとして使用可能である。
【０３１１】
いくつかの例では、アジュバントは、サイトカインなどの刺激分子を含む。サイトカインの非限定的な例は以下を含む：ＣＣＬ２０、ａ−インターフェロン（ＩＦＮ−ａ）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦａ、ＴＮＦｐ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚のＴ細胞吸引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮の胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連性上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ１５、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰｌａ、ＭＩＰ−１−、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲＳ、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性のＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰＩ、およびＴＡＰ２。
【０３１２】
追加のアジュバントは以下を含む：ＭＣＰ−１、ＭＩＰｌａ、ＭＩＰ−ｌｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、ＩＬ−２２、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性のＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびその機能性フラグメント。
【０３１３】
いくつかの態様では、アジュバントはトール様受容体のモジュレーターである。トール様受容体のモジュレーターの例は、ＴＬＲ−９アゴニストを含み、イミキモドなどのトール様受容体の小分子モジュレーターに限定されない。本明細書に記載されたワクチンと組み合わせて使用されるアジュバントの他の例としては、限定されないが、サポニン、ＣｐＧ  ＯＤＮなどが挙げられる。
【０３１４】
しばしば、アジュバントは、タンパク質の輸送と再折り畳みに関与する、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＤｎａＫ、および、ＤｎａＪなどの熱ショックタンパク質分子シャペロンである。
【０３１５】
しばしば、アジュバントは、細菌トキソイド、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックポリマー、アルミニウム塩、リポソーム、ＣｐＧポリマー、水中油型エマルション、あるいはこれらの組み合わせから選択される。
【０３１６】
しばしば、アジュバントは水中油型エマルションである。水中油型エマルションは少なくとも１つの油と少なくとも１つの界面活性剤を含むことがあり、油と界面活性剤は生物分解性（代謝可能）であるとともに生体適合性である。エマルジョン中の油滴は一般に直径が５μｍ未満であり、サブミクロン直径を有することさえもあり、こうした小さなサイズは、安定したエマルジョンを提供するために、高圧ホモジナイザーで達成される。濾過滅菌にさらすことができるように、２２０ｎｍ未満のサイズの液滴が好ましい。
【０３１７】
場合によっては、使用される油は、動物源（魚など）または植物源由来のものを含む。植物油の源はナッツ、種子、および穀物を含み得る。ピーナッツオイル、ダイズオイル、ココナッツオイル、およびオリーブオイルが最も一般に利用されており、落花生油を例証する。例えば、ホホバ豆から得られたホホバ油を使用することができる。種子油はベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などを含む。穀物群は以下を含み得る：トウモロコシ油、および小麦、オートミール、ライ麦、コメ、テフ、ライコムギなどの他の穀物の油。グリセロールと１，２−プロパンジオールの６−１０の炭素脂肪酸エステルは、種子油で自然に生じないが、ナットと種子油から出発する適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって製造されることがある。哺乳動物の乳からの油脂は代謝可能であり、ゆえに、本明細書に記載されるワクチンと共に使用可能である。分離、精製、鹸化、および動物源から純粋な油を得るために必要な他の手段の手順は、当該技術分野で周知である。魚は、容易に回収可能な代謝可能の油を含むことができる。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書で使用することができる魚油のいくつかを例証することができる。多くの分枝鎖油は、５つの炭素イソプレン単位で生化学的に合成可能であり、一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクワレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして知られている、分枝した不飽和のテルペノイドを含む。スクワレンの飽和したアナログであるスクアランも使用することができる。スクワレンとスクアランを含む魚油は、商業源から容易に入手可能であり得るか、あるいは当該技術分野で知られている方法によって入手可能である。
【０３１８】
他の有用な油としては、例えば、高齢の患者（例えば、６０歳以上）で使用されるワクチン中に含まれるトコフェロールを含んでいる。これは、ビタミンＥが患者群中で免疫反応に好ましい効果があると報告されているためである。さらに、トコフェロールには、エマルジョンを安定させるのを助ける抗酸化剤特性がある。様々なトコフェロールが存在する（α、β、γ、δ、ε、あるいはξ）が、通常αが使用される。α−トコフェロールの例は、ＤＬ−α−トコフェロールである。α−トコフェロール琥珀酸塩は、インフルエンザワクチンと適合することができ、水銀化合物の代用物として有用な防腐剤になりえる。
【０３１９】
例えば、スクワレンやα−トコフェロールを含む油の混合物がしばしば使用される。２−２０（容量）％の範囲の油分がしばしば使用される。
【０３２０】
いくつかの例では、界面活性剤はその「ＨＬＢ」（吸湿性／脂溶性の平衡）によって分類される。場合によっては、界面活性剤は、少なくとも１０、少なくとも１５、および／または少なくとも１６のＨＬＢを有する。界面活性剤としては、限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にトゥイーンと呼ばれる）、例えば、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（線形のＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどのＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標名で売られている）；オクトキシノール−９を有する、反復エトキシ−（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数で異なり得る、オクトキシノール（トリトンＸ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズなどのノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）などの、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られている）に由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル；および、三オレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５）とソルビタンラウリン酸モノエステルなどのソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして知られている）。非イオン性の界面活性剤は本明細書に使用することができる。
【０３２１】
使用される界面活性剤の混合物は、例えば、トウィーン８０／Ｓｐａｎ８５混合物を含む。ポリオキシエチレンソルビタンエステルとオクトキシノールの組み合わせも適切であり得る。別の組み合わせは、ラウレス９と、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含むことができる。
【０３２２】
場合によっては、界面活性剤の量（重量％）以下を含む：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（トウィーン８０など）０．０１〜１％、とりわけ、約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（トリトンＸ−１００またはトリトンシリーズ中の他の洗浄薬）０．００１〜０．１％、とりわけ、０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、とりわけ、０．１〜１％あるいは約０．５％。
【０３２３】
担体と賦形剤
いくつかの例では、ワクチンは、担体と賦形剤（限定されないが、緩衝液、炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、あるいは、グリシン、抗酸化剤、静菌薬、キレート剤、懸濁化剤、増粘剤および／または保存剤などのアミノ酸を含む）、水、油、石油、動物起源、野菜起源、あるいは合成起原、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ごま油など、食塩水、水溶性デキストロースおよびグリセリン溶液、香料、着色料、粘着剥奪剤（ｄｅｔａｃｋｉｆｉｅｒｓ）および他の許容可能な添加剤、アジュバント、あるいは結合剤、生理学的条件を禁じさせるために必要とされる他の薬学的に許容可能な補助物質、例えば、ｐＨ緩衝剤、等張化剤、乳化剤などを含む。賦形剤の例としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。別の例では、医薬品製剤は実質的に保存剤を含まない。他の例では、医薬品製剤は少なくとも１つの防腐剤を含むことができる。製薬剤形における一般的な方法は、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．  （１９９９）で見られる。本明細書に記載される医薬品組成物を投与するために当業者に知られている任意の適切な担体を採用することができるが、担体のタイプは投与のモードに依存して変わることが認識される。
【０３２４】
いくつかの例では、ワクチンの医薬品組成物は、周知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化される。生物分解性のマイクロスフェアも、本発明の医薬品組成物用の担体として使用可能である。適切な生物分解性のマイクロスフェアは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８９７，２６８；５，０７５，１０９；５，９２８，６４７；５，８１１，１２８；５，８２０，８８３；５，８５３，７６３；５，８１４，３４４、および、５，９４２，２５２で開示される。
【０３２５】
場合によっては、医薬品組成物は、リポソームまたはマイクロスフェア（あるいは微粒子）中で投与される。患者への投与用のリポソームとマイクロスフェアを調製する方法は、当業者に周知である。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．４，７８９，７３４は、例えば、リポソーム中の生体試料をカプセル化する方法を記載している。本質的に、材料は、水溶液、適切なリン脂質、および追加された脂質に、必要に応じて界面活性剤とともに溶かされ、材料を必要に応じて透析して超音波で処理した。既知の方法の調査は、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，”Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ｐｐ．  ２．ｓｕｐ．８７−３４１  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９７９）によって提供される。
【０３２６】
ポリマーまたはタンパク質から作られたマイクロスフェアは当業者には周知であり、胃腸管を通って直接血流へ至る通路に合わせることができる。代替的に、化合物は組み込むことができ、マイクロスフェアまたはマイクロスフェアの複合体を、数日から数か月まで及ぶ期間にわたって徐放するために埋め込むことができる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９０６，４７４、４，９２５，６７３、および３，６２５，２１４、ならびにＪｅｉｎ，ＴＩＰＳ  １９：１５５−１５７（１９９８）を参照。
【０３２７】
場合によっては、ワクチンは、チオメルサールあるいは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含む。いくつかの例では、ワクチンは実質的に、水銀材料を含まず（例えば、＜１０μｇ／ｍｌ）、例えば、チオメルサールを含まない。α−トコフェロール琥珀酸塩は水銀の化合物の代わりとして使用されてもよい。
【０３２８】
張性を制御するために、ナトリウム塩などの生理的な塩が随意にワクチンに含まれている。他の塩は、塩化カリウム、カリウム二水素リン酸塩、塩化マグネシウム、および／またはリン酸二ナトリウムを含む。
【０３２９】
いくつかの例では、ワクチンは、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇから約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２４０から約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、あるいは２９０−３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内の重量モル浸透圧濃度を有する。
【０３３０】
場合によっては、ワクチンはトリス緩衝液；ホウ酸塩緩衝液；コハク酸塩緩衝液；ヒスチジン緩衝液（例えば、水酸化アルミニウムアジュバントを含む）；あるいは、クエン酸塩緩衝液などの１つ以上の緩衝液を含む。緩衝液は、場合によっては、５−２０ｍＭの範囲で含まれる。
【０３３１】
場合によっては、ワクチンのｐＨは、約５．０〜約８．５、約６．０〜約８．０、約６．５〜約７．５、あるいは約７．０〜約７．８である。
【０３３２】
いくつかの例では、ワクチンは無菌である。場合によっては、ワクチンは、非発熱性であり、例えば、１回の投与量当たり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準測定値）を含み、１回の投与量当たり＜０．１ＥＵであり得る。
【０３３３】
いくつかの例では、ワクチンは、とりわけ、分割または表面抗原のワクチンのために、洗浄薬、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「トゥイーン」として知られている）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（トリトンＸ−１００）、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、セチルトリメチル臭化アンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、あるいはデオキシコール酸ナトリウムを含んでいる。洗浄薬は極微量でのみ存在することができる。したがって、ワクチンは、１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトキシノール−１０とポリソルベート８０を各々含み得る。極微量の他の残余成分は随意に抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ポリミキシンＢ）である。
【０３３４】
いくつかの例では、ワクチンは、当該技術分野で周知の適切なビヒクル中で無菌液または懸濁液として製剤される。医薬品組成物は従来の周知の滅菌技術によって殺菌可能であるか、あるいは滅菌ろ過可能である。結果として生じる水溶液は、そのままで使用されるためにパッケージ化可能であり、あるいは凍結乾燥可能であり、凍結乾燥された調製物は投与前に無菌液と組み合わされる。適切な製剤と追加の担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  “Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．）に記載される。
【０３３５】
いくつかの例では、ワクチンは１つ以上の薬学的に許容可能な塩で製剤される。例えば、薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムのイオンなど無機のイオンの塩を含み得る。こうした塩は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マンデル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、あるいはマレイン酸などの無機または有機の酸を含む塩を含んでもよい。加えて、薬剤がカルボキシ基または他の酸性基を含む場合、それは無機または有機の塩基を備えた薬学的に許容可能な添加塩に変換可能である。適切な塩基の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシル・アミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどが挙げられる。
【０３３６】
ペプチド、核酸、抗体、またはそのフラグメントなどの有効な薬剤、および／または、本明細書に記載されるＡＰＣを、１つ以上のアジュバントと組み合わせて含む医薬品組成物は、あるモル比を含むように製剤可能である。例えば、１つ以上のアジュバントと組み合わせた、ペプチド、核酸、抗体、あるいはそのフラグメント、および／または本明細書に記載されるＡＰＣなどの有効な薬剤の約９９：１〜約１：９９のモル比を使用することができる。いくつかの例では、１つ以上のアジュバントと組み合わせた、ペプチド、核酸、抗体、あるいはそのフラグメント、および／または本明細書に記載されるＡＰＣなどの有効な薬剤のモル比の範囲は、約８０：２０〜約２０：８０、約７５：２５〜約２５：７５、約７０：３０〜約３０：７０、約６６：３３〜約３３：６６、約６０：４０〜約４０：６０、約５０：５０、および、約９０：１０〜約１０：９０から選択される。１つ以上のアジュバントと組み合わせた、ペプチド、核酸、抗体、あるいはそのフラグメント、および／または本明細書に記載されるＡＰＣなどの有効な薬剤のモル比は、約１：９であり得、場合によっては、約１：１であり得る。１つ以上のアジュバントと組み合わせた、ペプチド、核酸、抗体、あるいはそのフラグメント、および／または本明細書に記載されるＡＰＣなどの有効な薬剤は、同じ投与単位、例えば、１つのバイアル、坐薬、錠剤、カプセル、エアロゾルスプレーで製剤可能であり、あるいは、各々の薬剤、形態、および／または化合物は、別々の単位、例えば、２つのバイアル、坐剤、錠剤、２つのカプセル、錠剤およびバイアル、エアロゾルスプレーなどで製剤可能である。
【０３３７】
修飾された膜貫通ポリペプチドに由来するワクチンによる疾患または疾病の処置
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたワクチンは、癌などの疾患または疾病の処置のために製剤される。いくつかの例では、癌は固形腫瘍または血液系悪性腫瘍である。いくつかの例では、癌は転移癌、または再発性あるいは難治性の癌である。いくつかの例では、固形腫瘍は、肛門癌、虫垂癌、胆管癌（つまり、胆管細胞癌）、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頚部癌、結腸癌、未知の原発性の（ＣＵＰ）の癌、食道癌、目癌、卵管癌、胃腸癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、髄芽腫、黒色腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、甲状腺疾患、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、子宮癌、膣癌、あるいは外陰癌を含む。
【０３３８】
いくつかの例では、血液系悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞悪性腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞悪性腫瘍は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、特段の定めのない限り（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、芽細胞性ＮＫ−細胞リンパ腫、腸疾患−血液系悪性腫瘍Ｔ細胞性リンパ腫、肝脾ガンマ−デルタＴ細胞性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、鼻のＮＫ／Ｔ細胞性リンパ腫、または処置関連Ｔ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞悪性は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、高リスクＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬリンパ腫、あるいは前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）を含む。いくつかの実施形態において、癌は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ高悪性度Ｂリンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽細胞性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、プラスマ細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性体腔性リンパ腫、あるいはリンパ腫様肉芽腫症である。
【０３３９】
いくつかの例では、本明細書に記載される抗体ベースのワクチンは、癌の処置に使用される。いくつかの例では、癌は固形腫瘍である。他の例では、癌は血液悪性腫瘍である。いくつかの例では、癌は転移癌、または再発性あるいは難治性の癌である。
【０３４０】
いくつかの例では、本明細書に記載される核酸ベースのワクチンは、癌の処置に使用される。いくつかの例では、癌は固形腫瘍である。他の例では、癌は血液悪性腫瘍である。いくつかの例では、癌は転移癌、または再発性あるいは難治性の癌である。
【０３４１】
いくつかの例では、本明細書に記載されるペプチドベースのワクチンは、癌の処置に使用される。いくつかの例では、癌は固形腫瘍である。他の例では、癌は血液悪性腫瘍である。いくつかの例では、癌は転移癌、または再発性あるいは難治性の癌である。
【０３４２】
いくつかの例では、本明細書に記載される樹状細胞ベースのワクチンは、癌の処置に使用される。いくつかの例では、癌は固形腫瘍である。他の例では、癌は血液悪性腫瘍である。いくつかの例では、癌は転移癌、または再発性あるいは難治性の癌である。
【０３４３】
いくつかの例では、本明細書に記載される抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベースのワクチンは、癌の処置に使用される。いくつかの例では、癌は固形腫瘍である。他の例では、癌は血液悪性腫瘍である。いくつかの例では、癌は転移癌、または再発性あるいは難治性の癌である。
【０３４４】
いくつかの例では、本明細書に記載されるウイルスベースのワクチンは、癌の処置に使用される。いくつかの例では、癌は固形腫瘍である。他の例では、癌は血液悪性腫瘍である。いくつかの例では、癌は転移癌、または再発性あるいは難治性の癌である。
【０３４５】
ワクチン製剤
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるワクチンは、１つ以上のアジュバントと組み合わせて、例えば、有効な薬剤の投与可能な調製物へと処理を促す、賦形剤、希釈剤、および／または、助剤を含む１つ以上の生理学的に許容可能な担体を使用して、従来の方法で製剤される。適切な製剤は、選択された投与経路に少なくとも部分的に依存する。本明細書に記載される薬剤は、吸入と同様に、経口、バッカル、局所、直腸、経皮、口腔粘膜、皮下、静脈内、および筋肉内の適用を含む多くの投与経路または投与様式を用いて、患者に送達可能である。
【０３４６】
いくつかの例では、有効な薬剤は、非経口適用（例えば、注射、例えば、ボーラス注入または持続注入による）のために製剤され、アンプル、プレフィルドシリンジ、少量の注入液、あるいは追加の保存剤を備えた複数回投与用の包装容器で、単位投与量形態で提示することができる。組成物は、油性または水溶性のビヒクル中で懸濁液、溶液、あるいはエマルジョンなど、例えば、水溶性のポリエチレングリコール中で溶液などの形態をとることができる。
【０３４７】
注射可能な製剤については、ビヒクルは、水溶液あるいは油性懸濁液（すなわちエマルジョン）を、ごま油、トウモロコシ油、綿実油あるいはピーナッツ油とともに、エリキシル剤、マンニトール、デキストロース、あるいは無菌水溶液と同様に賦形薬と含んで、適切となるように当該技術分野で知られているものから選択可能である。製剤は、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール）酸などの、生体適合性または生物分解性のポリマー組成物をさらに含むことができる。これらの材料を、薬物を充填してマイクロスフィアまたはナノススフィアにすることができ、さらにコーティングまたは誘導体化することで、非常に優れた徐放性パフォーマンスを発揮することができる。眼周囲または眼内の注射に適したビヒクルは、例えば、脂肪親和性の強い物質に適している注射グレードの水、リポソーム、およびビヒクル中に治療薬の懸濁液を含んでいる。眼周囲または眼内の注射用の他のビヒクルは、当該技術分野で周知である。
【０３４８】
投与が注射による場合、有効な薬剤はしばしば水溶液で、とりわけ、ハンクス液、リンゲル溶液、あるいは生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液で製剤される。溶液は、懸濁剤、安定剤、および／または、分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を任意に含み得る。代替的に、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質を含まない蒸留水との構成のための粉末形態であってもよい。別の実施形態では、医薬品組成物は、アジュバントあるいはペプチドによって刺激された免疫反応を増強するために加えられた他の物質も含まない。別の実施形態では、医薬品組成物は、ペプチドへの免疫反応を阻害する物質を含む。例えば、製剤の方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐで開示されるように、当該技術分野で知られている。
【０３４９】
経口投与については、有効な薬剤はしばしば、有効な薬剤を、当該技術分野で知られている薬学的に許容可能な担体と組み合わせることにより容易に製剤される。このような担体は、本発明の薬剤を、治療される患者による経口摂取のための、咀嚼錠、丸剤、ドラジェ、カプセル、ロゼンジ、ハードキャンディー、液体、ゲル、シロップ、スラリー、粉末、懸濁液、エリキシル剤、ウエハーなどを含む錠剤として製剤することを可能にする。こうした製剤は、固体の希釈剤あるいは充填剤を含む薬学的に許容可能な担体、無菌の水性培地、および様々な無毒な有機溶媒を含むことができる。固体の担体は、希釈剤、香料、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、あるいは封入材料として作用し得る１つ以上の物質であり得る。粉末では、担体は一般に、微粉化された有効成分を含む混合物である微粉化された固体である。錠剤では、有効成分は一般に、適切な大きさで必要な結合能力を有し、かつ、望ましい形状と大きさに圧縮される担体と混合される。粉末と錠剤は好ましくは、活性化合物の約１〜約７０パーセントを含む。適切な担体としては、限定されないが、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低い融解ろう、ココアバター、などが挙げられる。一般に、有効な薬剤は、所望の投与量単位を提供するのに十分な量で、経口剤形の全組成物の、約０．５重量％、約５重量％、約１０重量％、約２０重量％、あるいは約３０％〜約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、あるいは約９０重量％までの範囲の濃度レベルで含まれ得る。
【０３５０】
いくつかの例では、ワクチンはエアロゾル溶液、懸濁液、あるいは乾燥粉末へ製剤される。エアロゾルは呼吸器系または鼻路を介して投与可能である。例えば、当業者は、本発明の組成物を適切な担体、例えば、薬学的に許容可能な噴霧剤）中で懸濁または溶解させることができ、鼻内噴霧薬または吸入薬を用いて肺へ直接投与することができるということを認識する。例えば、輸送体、担体、あるいはイオンチャネル阻害剤を含むエアロゾル製剤を、例えば、鼻内噴霧薬または吸入薬として投与される噴霧剤または溶媒と噴霧剤の混合物中に溶解、懸濁、または乳化させることができる。エアロゾル製剤は、当該技術分野で従来使用されているように、化粧用に、または皮膚科学的に、または薬学的に許容可能な噴霧剤などの、圧力下で任意の許容可能な噴霧剤を含むことができる。
【０３５１】
経鼻投与のためのエアロゾル製剤は一般に、滴剤またはスプレーで鼻路に投与されるように設計された水溶液である。点鼻液は、一般に等張であり、約５．５〜約６．５のｐＨを維持するためにわずかに緩衝されるが、この範囲外のｐＨ値も使用することができるという点で、鼻の分泌物に似ていることがある。抗菌薬または保存剤も製剤に含むことができる。
【０３５２】
いくつかの例では、吸入剤と吸入薬のためのエアロゾル製剤は、薬剤または薬剤の組み合わせが鼻または経口の呼吸器系のルートによって投与されるときに被験体の呼吸樹へ運ばれるように設計される。吸入溶液は、例えば、噴霧器によって投与可能である。微粉化された、または液体の薬物を含む吸入剤または吹入剤は、例えば、分配を助けるべく、噴霧剤中の薬剤または薬剤の組み合わせの溶液または懸濁液の製薬エアロゾルとして呼吸器系に送達可能である。噴霧剤は、ハロゲン化炭素、例えば、フッ素化した塩素化炭化水素、ヒドロクロロフルオロカーボン、およびヒドロクロロカーボンなどのフルオロカーボンを、炭化水素および炭化水素エーテルと同様に、含む液化ガスであり得る。
【０３５３】
ハロゲン化炭素噴霧剤は、水素がすべてフッ素と取り替えられたフルオロカーボン噴霧剤、水素がすべて塩素と少なくとも１つのフッ素と取り替えられたクロロフルオロカーボン噴霧剤、水素含有フルオロカーボン噴霧剤、および水素含有クロロフルオロカーボン噴霧剤を含み得る。ハロゲン化炭素噴霧剤は、Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３７６，３５９；  Ｂｙｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．  Ｎｏ．５，１９０，０２９；  および、Ｐｕｒｅｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７７６，４３４に記載されている。本発明に役立つ炭化水素噴霧剤は、例えば、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン、ペンタン、イソペンタン、およびネオペンタンを含んでいる。炭化水素の混合物混合物も噴霧剤として使用することができる。エーテル噴霧剤は例えば、エーテルと同様にジメチルエーテルも含んでいる。いくつかの例では、エアロゾル製剤はさらに１つを超える噴霧剤を含む。例えば、エアロゾル製剤は、２つ以上のフルオロカーボンなどの同じクラスからの１つを超える噴霧剤；あるいはフッ化炭化水素と炭化水素などの様々なクラスからの１つを超える、２つを超える、および３つを超える噴霧剤を含み得る。いくつかの例では、ワクチンは、圧縮ガス、例えば、二酸化炭素、亜酸化窒素、または窒素などの不活性ガスで分配される。
【０３５４】
エアロゾル製剤はさらに、他の成分、例えば、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコールを、界面活性剤または油と洗浄薬などの他の成分と同様に含み得る。これらの成分は、製剤を安定させる役目を果たし、および／または、弁構成要素を潤滑する。
【０３５５】
いくつかの例では、エアロゾル製剤は圧力下でパッケージ化され、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、および半固形製剤を使用して、エアロゾルとして製剤される。例えば、溶液エアロゾル製剤は、（実質的に）純粋な噴霧剤中で、あるいは噴霧剤と溶媒の混合物として、輸送体、担体、あるいはイオンチャネル阻害剤などの本発明の薬剤の溶液を含むことができる。溶媒は薬剤を溶かすために、および／または、噴霧剤の蒸発を遅らせるために、使用することができる。溶媒は例えば、水、エタノール、およびグリコールを含み得る。適切な溶媒の任意の組み合わせが、保存剤、抗酸化剤、および／または、他のエアロゾル成分と随意に組み合わせて使用可能である。
【０３５６】
いくつかの例では、エアロゾル製剤は分散液または懸濁液である。懸濁液エアロゾル製剤は、本発明の薬剤の懸濁液あるいは薬剤の組み合わせ（例えば、輸送体、担体、イオンチャネル阻害剤、分散剤）を含み得る。分散剤は、例えば、ソルビタントリオレアート、オレイルアルコール、オレイン酸、レシチン、およびトウモロコシ油を含み得る。懸濁液エアロゾル製剤はさらに、滑沢剤、保存剤、抗酸化剤、および／または他のエアロゾル成分を含み得る。
【０３５７】
場合によっては、エアロゾル製剤はエマルジョンとして製剤される。エマルジョンエアロゾル製剤は、本発明の薬剤、例えば、輸送体、担体、イオンチャネルの組み合わせと同様に、例えば、エタノールなどのアルコール、界面活性剤、水、および噴霧剤を含み得る。使用された界面活性剤は非イオン性、アニオン性、またはカチオン性であり得る。エマルジョンエアロゾル製剤の１つの例は、例えば、エタノール、界面活性剤、水、および噴霧剤を含む。エマルジョンエアロゾル製剤の別の例は、例えば、植物油、モノステアリン酸グリセリン、およびプロパンを含む。
【０３５８】
ワクチン投与量、投与経路、および治療レジメン
いくつかの例では、ワクチンは様々なルート送達される。典型的な送達ルートは、経口（バッカルまたは舌下）、直腸、経鼻、局所、経皮パッチ、肺、膣、坐薬、あるいは非経口（筋肉内、動脈内、髄腔内、皮内、腹腔内、皮下、および静脈内）投与、あるいはエアロゾル投与、吸入、あるいは吹入れによる投与に適した形態での投与を含む。薬物送達系に関する一般的な情報は、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．  （１９９９）で見つけることができる。いくつかの例では、本明細書に記載されるワクチンは筋肉に投与され、あるいは皮内または皮下注射によって、またはイオン浸透療法によるなどして経皮的に投与可能である。場合によっては、ワクチンの表皮投与が使用される。
【０３５９】
いくつかの例では、ワクチンは鼻路による投与のために製剤される。担体が固体である経鼻投与に適した製剤は、嗅ぎタバコを摂取するようなやり方、つまり、鼻にできるだけ接近させた状態の粉末の容器から鼻路を通る迅速な吸入によって投与される、例えば、約１０〜約５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含み得る。製剤は鼻内噴霧剤、点鼻液、あるいは噴霧器によるエアロゾル投与であり得る。製剤は、ワクチンの水溶性または油性の溶液を含み得る。
【０３６０】
場合によっては、ワクチンは懸濁液、シロップ、またはエリキシルなどの液体調合物である。ワクチンは、無菌の懸濁液またはエマルジョンなどの非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内の投与（例えば、注射可能な投与）のための調合物であってもよい。
【０３６１】
いくつかの例では、ワクチンは、単一の免疫処置のための材料を含むこともあれば、複数の免疫処置（つまり「複数回投与量」キット）のための材料を含むこともある。いくつかの例では、保存剤は複数回投与量構成に含まれる。複数回投与量組成物中に保存剤を含むことの代わりとして（に加えて）、組成物は材料の除去のための無菌のアダプターを有する容器に含まれ得る。
【０３６２】
いくつかの例では、ワクチンは約０．５ｍＬの投与量で投与されるが、子どもには半分の投与量（つまり、約０．２５ｍＬ）しか投与することができない。しばしば、ワクチンは高用量（例えば、約１ｍｌ）で投与可能である。
【０３６３】
いくつかの例では、ワクチンは、１、２、３、４、または５回以上の投与量コースレジメンとして投与される。しばしば、ワクチンは２、３、あるいは４回の投与量コースレジメンとして投与される。しばしば、ワクチンは２回投与量コースレジメンとして投与される。
【０３６４】
いくつかの例では、２回投与量コースレジメンの第１の投与量と第２の投与量の投与は、約０日、１日、２日、５日、７日、１４日、２１日、３０日、２か月、４か月、６か月、９か月、１年、１．５年、２年、３年、４年、またはそれ以上に分けられる。
【０３６５】
いくつかの例では、本明細書に記載されたワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年、またはそれ以上ごとに投与される。しばしば、本明細書に記載されたワクチンは２、３、４、５、６、７年、またはそれ以上ごとに投与される。しばしば、本明細書に記載されたワクチンは４、５、６、７年、またはそれ以上ごとに投与される。しばしば、本明細書に記載されたワクチンは一度投与される。
【０３６６】
投与量の例は限定的なものではなく、本明細書に記載されたワクチンを投与するための特定の投薬レジメンを例証するために使用されているに過ぎない。ヒトで使用される有効な量は動物モデルから決定することができる。例えば、ヒトのための投与量は、動物に効果的であると分かっている循環型の肝臓、局所、および／または胃腸の濃度を達成するために製剤可能である。動物データと他のタイプの同様のデータに基づいて、当業者はヒトに適切な有効な量のワクチン組成物を決定することができる。
【０３６７】
薬剤あるいは薬剤の組み合わせを参照する際に、有効な量とは、医療または製薬の分野における様々な規制機関または諮問機関（例えば、ＦＤＡ、ＡＭＡ）のいずれかによって、あるいはメーカーまたは供給元によって推奨または承認されている、投与量範囲、投与のモード、製剤などを一般に意味する。
【０３６８】
いくつかの例では、ワクチンは、疾患または疾病（例えば癌）に関連した症状の発症の前に、間、または後に、投与することができる。典型的な症状としては、熱、咳、咽喉痛、鼻水および／または鼻づまり、頭痛、悪寒、疲労、悪心、嘔吐、下痢、疼痛、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの例では、ワクチンは癌の処置のために投与される。場合によっては、ワクチンは癌の予防療法などの予防のために投与される。場合によっては、ワクチンは患者からの免疫反応を誘発するために投与される。
【０３６９】
いくつかの態様では、本明細書に記載されたワクチンとキットは、２°Ｃと８°Ｃの間で保存される。いくつかの例では、ワクチンは冷凍で保存されない。いくつかの例では、ワクチンは−２０°Ｃまたは−８０°Ｃなどの温度で保管される。いくつかの例では、ワクチンは日光から離れて保管される。
【０３７０】
キット／製品
ある実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の方法とプラットフォームとともに使用されるキットおよび製品が本明細書で開示される。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１以上の容器を収容するために仕切られた運搬装置、包装または容器を含み、各容器は本明細書中に記載されている方法を使用するための分けられた要素の１つを備える。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。他の実施形態において、容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成される。
【０３７１】
本明細書で提供される製品は包装材料を含む。製薬用包装材料の例としては、限定されないが、ブリスターパック、瓶、チューブ、バッグ、容器、瓶、および選択された製剤と意図した投与および随意の処置のモードに適する任意の包装材料が挙げられる。
【０３７２】
例えば、包装容器は、精製された修飾された複数膜貫通型ポリペプチド（例えば、イオンチャネルポリペプチドまたはＧＰＣＲ）、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド（例えば、イオンチャネルポリペプチドまたはＧＰＣＲ）構築物、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド（例えば、イオンチャネルポリペプチドまたはＧＰＣＲ）に対する抗体、あるいは本明細書に記載された修飾された複数膜貫通型ポリペプチド（例えばイオンチャネルポリペプチドまたはＧＰＣＲ）に基づくワクチンを含む。そのようなキットは、識別用の記載またはラベル、あるいは本明細書に記載される方法における使用に関する説明書を随意に含む。
【０３７３】
キットは典型的には、使用される内容物および／または説明書を列挙するラベルと、使用される説明書を備えた添付文書とを含んでいる。１セットの説明書も典型的に含まれる。
【０３７４】
１つの実施形態では、ラベルは容器上にあるか容器に付随する。１つの実施形態において、ラベルを形成する文字、数字または他の表示が、容器自体に貼り付けられるか、成形されるかまたは刻まれている場合は、ラベルは容器上に取り付けられる。ラベルは、例えば添付文書として容器を保持するレセプタクルまたは運搬装置内に存在するとき、容器に付随する。の実施形態において、ラベルは、内容物が特定の治療用途に用いられるべきものであるということを示すために用いられる。ラベルは、例えば、本明細書に記載の方法で、内容物を用いる使用するための指示を示すように使用されてもよい。
【０３７５】
ある実施形態では、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチド（例えばイオンチャネルポリペプチドまたはＧＰＣＲ）に基づくワクチンは、本明細書で提供される化合物を含む１つ以上の単位剤形を含んでいるパックまたはディスペンサー装置で提示される。実施形態において、パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含む。さらなる実施形態において、パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付してある。別の実施形態において、パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用または販売を制御する政府機関によって規定された形態の容器に付属の通知書が添付してあり、この通知書は、ヒトまたは動物の投与のための薬物の形態についての、政府機関の承認を反映するものである。実施形態において、このような通知書は、例えば、処方薬または承認された生成物の挿入に関して、米国食品医薬品局により承認されたラベルである。１つの実施形態において、適合性の製薬担体で製剤される本明細書で提供される化合物を含む組成物も調製され、適切な容器に入れられ、示された疾病の処置のためにラベル付けされる。
【０３７６】
特定の化学用語
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、主張される主題が属する当該技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を持っている。一般的な記載と詳細な記載は典型的かつ説明的なものに過ぎず、主張される主題を制限するものではないことを理解されたい。本出願では、単数の使用は、特別に別記しない限り、複数を含む。明細書および添付の請求項内で用いられる通り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その文脈が明確に定めていない限り、複数の指示対象を含むことに留意する。本出願において、「または」の使用は特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形態と同じく、限定的なものではない。
【０３７７】
本明細書で使用されるように、範囲と量は「約」特定の値または範囲として表現可能である。「約」は正確な量も含んでいる。従って、「約５μＬ」とは「約５μＬ」と「５μＬ」を意味する。一般に、用語「約」は、実験誤差の範囲内、例えば、±５％、±１０％、±１５％内であると典型的に予想される量を含む。
【０３７８】
本明細書に使用される段落の見出しは、組織化するためのものに過ぎず、記載される主題を制限するものと解釈されてはならない。
【０３７９】
本明細書で使用されるように、用語「個体」、「被験体」、および「患者」は任意の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は非ヒトである。いかなる用語も、保健従事者（例えば、医者、正看護師、臨床看護師、医師助手、看護助手、あるいはホスピスの職員）の監督（例えば、常時または断続的）を特徴とする状況に制限されない。
【０３８０】
本明細書で使用されるように、「動作可能に連結された」との用語は、例えば、第１の核酸分子が第２の核酸分子とインフレームで（またはリーディングフレーム中で）結合していること、および、第１の核酸分子と第２の核酸分子の両方が、翻訳の際に、それぞれ第１のポリペプチドと第２のポリペプチドをコードすることを意味する。いくつかの例では、「動作可能に連結された」とは、直接連結または間接連結をさらに含み、例えば、第１の核酸分子は第２の核酸分子に直接連結するか、あるいは、リンカー配列によって間接連結する。いくつかの例では、第１の選択マーカー遺伝子と第２の選択マーカー遺伝子の文脈では、第１の選択マーカー遺伝子は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのコードされたＣ末端に動作可能に連結される（あるいはインフレームで連結される）。場合によっては、第２の選択マーカーは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのコードされたＮ末端に動作可能に連結される（あるいはインフレームで連結される）。いくつかの例では、第１の選択マーカー遺伝子および／または第２の選択マーカー遺伝子は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドに直接連結されるか、または、リンカー配列によって本ポリヌクレオチドに間接連結される。場合によっては、リンカー配列は、長さが約１〜約６０のアミノ酸残基、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または約６０のアミノ酸残基のリンカーポリペプチドをコードする。
【０３８１】
本明細書で使用されるように、用語「産生ベクター」は、所望のタンパク質の産生のために利用される発現ベクターを意味する。例えば、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型ポリペプチドの文脈では、産生ベクターは、修飾された複数膜貫通型ポリペプチドのタンパク質産生に使用される発現ベクターである。いくつかの例では、産生ベクターは、細菌の（例えば、大腸菌）発現ベクター、昆虫発現ベクター、酵母発現ベクター、アルジー発現ベクター、あるいは哺乳動物の発現ベクターである。いくつかの例では、産生ベクターは、（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端に直接的に連結または間接的に連結される）修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードし、および、修飾された複数膜貫通型ポリペプチド−選択マーカーポリペプチド融合タンパク質をコードする遺伝子に動作可能に連結される本明細書に記載されるような選択マーカー遺伝子を含まない。場合によっては、産生ベクターは、式Ｉ−ＩＶの修飾された複数膜貫通型ポリペプチドをコードしない。
【実施例】
【０３８２】
これらの実施例は説明目的のために提供されるにすぎず、請求項の範囲を制限するものではない。
【０３８３】
実施例１−ライブラリー生成相
ＤＮＡシャフリングと随意に結び付けられた無作為の突然変異誘発は、複数の位置における全種類の組み合わせのアミノ酸置換に同時に影響を及ぼす。エラープローンＰＣＲは遺伝子のライブラリー（第１のレベル・ライブラリー）を生成するために使用され、ＤＮＡコード領域（突然変異のかなり均質な頻度）の各１Ｋｂあたりの翻訳後に、２−８のアミノ酸残基を任意に突然変異させた。随意に、ＤＮＡシャフリング（ＳｔＥＰ、Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ  ＰＣＲ）は、第２のライブラリー（第２のレベル）を生成するために続いて使用され、遺伝子を、ＤＮＡコード領域の各１Ｋｂ当たり約１〜１５の異なるアミノ酸中で無作為に突然変異させた。
【０３８４】
構築物の様々な成分の機能的な折り畳みを可能にするために、これらのドメインをすべて、様々な小さなオリゴペプチドリンカーによって分離させた。化学的な誘導物質（例えば、アラビノース、ＩＰＴＧ）を加えるとともに、構成的なプロモーター（例えば、Ｐｌａｃ）または誘導性プロモーター（例えば、ａｒａＢＡＤ、Ｔ７）を使用して、構築物を選択宿主大腸菌中で永久的に転写させた。
【０３８５】
実施例２−複数膜貫通型ポリペプチドバリアント選択のための構築物の設計
変異させた遺伝子を、以下を含むあらかじめ形成された構築物（プラスミド形態）に挿入した：
・シグナル配列、
・そのＣ末端側の第１の選択マーカータンパク質／酵素（例えば、カナマイシン耐性遺伝子）、
・受容体のＮ末端側のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）または第２の選択マーカータンパク質／酵素（例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子）。
【０３８６】
実施例３−選別相
その後、修飾された遺伝子を含有する構築物ライブラリーをその後用いて、大腸菌株（例えば、ＢＬ２１またはＤＨ１０ｂｅｔａ）を変形させた。液体培養物と寒天プレートの両方でカナマイシンの濃度を変動させながら（非形質転換細胞用のＭＩＣはおよそ１０ｍｇ／Ｌであった）ＬＢ培地上で成長を試験した。
【０３８７】
ラット（ＮＴＳＲ１、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２０７８９）からの野生型のニューロテンシン受容体１のＮ末端切断（ａａ  ４３−４２４）が対照系として使用された。
【０３８８】
約２５の構築物を、以下の組み合わせからなる野生型のＮＴＳＲ１を用いて生成した：
・３つの様々なシグナル配列（ｇＩＩＩｓｓ、ＤｓｂＡｓｓ、ＭＢＰｓｓ）；
・２つの融合パートナー（ＴｒｘＡ、ＭＢＰ）；
・いくつかのオリゴペプチドリンカー；および、
・抗生物質耐性酵素（カナマイシン抵抗性についてＮＰＴＩＩ、ゲンタマイシン抵抗性についてＡＡＣ（３）−１、カルベニシリン抵抗性についてＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼ）。
【０３８９】
大腸菌がＮＴＳＲ１（＞５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、＞７５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン）を含む特定の構築物を発現するとき、試験された両方の抗生物質（カルベニシリンとゲンタマイシン）の明白なＭＩＣはかなり増加した。
【０３９０】
大腸菌がヒトからの野生型の膜貫通タンパク質受容体ＧＰＲ５５（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９Ｙ２Ｔ６）（約２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン、４０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン）をコードするプラスミドを含んでいたとき、試験された両方の抗生物質（カルベニシリンとカナマイシン）のＭＩＣも増加した。
【０３９１】
変異したＧＰＲ５５遺伝子のライブラリーは、１つの遺伝子当たり約３〜１５の突然変異（残基）を含むように作られた。増強された受容体突然変異体を含むプラスミドの選択は５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンで行われた。
【０３９２】
これらのライブラリーを備えた大腸菌株の形質転換は、高濃度のカナマイシン（＞５０ｍｇ／Ｌ）あるいはカルベニシリン（＞８０ｍｇ／Ｌ）に対する耐性を与えることができる突然変異ＧＰＲ５５クローンの単離をもたらした。
【０３９３】
突然変異したクローンを、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを使用するトランスフェクションによって、ＨＥＫ２９３Ｔを含む哺乳動物の発現宿主へ移した。発現は、電気泳動（図２）とｆＳＥＣ技術で判断されるように、野生型のＧＰＲ５５を含む構築物の５倍以上増加することがわかった。
【０３９４】
突然変異したクローンが発現されて精製された；結果として生じたタンパク質−洗浄薬複合体サンプルは、（ｆＳＥＣ（図３）と蛍光測定技術で判断されるように）突然変異誘発の１回のラウンドの後に野性型を上回って最大で７°Ｃまでの熱安定性の増加を実証した。
【０３９５】
突然変異したクローンはさらに、受容体サンプルをリガンドのない形態（図４）中で精製したとき、野性型と比較して、より均質なオリゴマー状態を実証した。
【０３９６】
選択宿主として超好熱性種（例えばサーマス・サーモフィラス）を使用する場合、大腸菌中で行われた選択プロセスと比較すると、（熱的変性フォーマット中の）同定された突然変異体のタンパク質融解温度は優れていることが予想される。（つまり、野生型よりも１０°Ｃ以上高い）。
【０３９７】
実施例４−タンパク質産生のための構築物の設計
１セットの構築物は、発現され、細胞性膜から抽出され、均質になるまで単離および精製され、かつ、化合物スクリーニング、抗体選択、あるいは結晶化に適している、修飾された複数膜貫通型タンパク質を生成するように設計される。いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型タンパク質は、Ｎ末端とＣ末端の切断、表面の突然変異、および、内部切断ならびに／またはポリペプチド挿入を含む他の修飾を含んでいる。
【０３９８】
これらの構築物は、精製のためにＣ末端またはＮ末端のヒスチジンタグで操作され、精製後にタグまたは融合タンパク質を切断することができるように、タバコエッチウイルスプロテアーゼまたはＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位を含んでいる。
【０３９９】
複数膜貫通型タンパク質用のｃＤＮＡは、大規模な発現と精製に適した選択された宿主中での発現に適しているベクターにクローン化される（例えば、細菌細胞、または真核細胞。哺乳動物細胞または昆虫細胞は、ヒトの複数膜貫通型タンパク質に特に適している）。
【０４００】
実施例５−薬理学（細胞に基づくアッセイ）
薬物化合物のスクリーニングまたは結晶化において使用前の複数膜貫通型タンパク質の機能が評価され、これはタンパク質が生物学的に関連する形態で折り畳まれているという証拠を与える。受容体の機能は、アゴニストまたはアンタゴニスト特性（リガンド）を用いて、小分子化合物、ペプチド、あるいはタンパク質結合剤に対するその反応を測定することにより決定される。これは、ＨＥＫ２９３またはＣＯＳなどのインビトロの培養された真核細胞系において膜タンパク質を発現することにより行われる。追加されたモジュレーターに対する機能的反応は、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）またはカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の量の蓄積または減少などの測定可能な代謝産物のその後の産生を引き起こす、１つ以上の直接的なエフェクタータンパク質の活性化を介して評価される、細胞生理学に対するイオンチャネルポリペプチドなどの修飾された複数膜貫通型タンパク質の効果は、例えば、電気化学ポテンシャル勾配の変動によって測定される。
【０４０１】
追加されたリガンドによるＧＰＣＲなどの修飾された複数膜貫通型タンパク質の活性化は特定のＧタンパク質シグナル伝達経路を作動させることがあり、これは、ｃＡＭＰの産生の増加または減少を引き起こす。アゴニストリガンドによるＧＰＣＲの活性化は、ＥＣ５０として知られている５０％の応答を達成するのに必要な有効濃度を決定するために使用されるｃＡＭＰレベルの増加を引き起こすことがある。アンタゴニストリガンドは産生ｃＡＭＰを阻害することがあり、このことは、５０％の抑制濃度（ＩＣ５０）として発現される、アゴニストリガンドシグナル伝達による競合を示している。ＥＣ５０とＩＣ５０の値は、リガンドの相対的効力をアゴニストまたはアンタゴニストの特性と比較するために使用される。
【０４０２】
修飾された複数膜貫通型タンパク質の薬理学的な機能の評価は、既知のアゴニストの存在に応じた細胞内のＣａ２＋レベルの測定を介して行われる。ＧＰＣＲあるいは著しいＣａ２＋透過性を備えたイオンチャネルを安定的にまたは一時的に発現する哺乳動物の細胞株に、細胞透過性であり、かつ細胞内のＣａ２＋に対する反応で蛍光を発する染料をあらかじめ充填する。既知のリガンドでの刺激後、蛍光は、プレートリーダーまたは蛍光イメージングプレートリーダー、あるいは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づくＣａ＋＋動員検出技術によって測定される。
【０４０３】
既知のリガンドに応じた膜電位の変動も、イオンチャネルを安定的にまたは一時的に発現する哺乳動物の細胞株において、細胞内部の正の荷電イオンに従う際に蛍光シグナルを増加させ、逆に、細胞外部での正の荷電イオンに従う際に蛍光シグナルを減少させる染料を使用して測定される。
【０４０４】
実施例６−サンプル精製とＱＣ
サンプル精製
【０４０５】
複数膜貫通型タンパク質（本明細書では「使用可能な膜タンパク質」あるいは「ＥＭＰ」とも呼ばれる）は、洗浄薬を使用して、および、クロマトグラフィー方法を使用して、リガンド（化合物、ペプチド、あるいは抗体）を用いてまたは用いずに精製された。１００ＫＤａの分子量カットオフを備えたＶｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）回転カラムを使用してサンプルを濃縮した。サンプル精製工程の略図が図５Ａで例証される。
【０４０６】
サンプルＱＣ
【０４０７】
複数膜貫通型ポリペプチドの精製収率、均質性、オリゴマー状態、および安定性を検証し、タンパク質−洗浄薬複合体の形態で分析的なサイズ排除クロマトグラフィー（図５Ｂと図５Ｃ）によって評価されるような野生型の複数膜貫通型タンパク質と比較した。純度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色または他の染色と組み合わせてＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して評価された。タンパク質の安定性は、熱蛍光測定アッセイ、例えば、図５Ｄで示されるようなＣＰＭアッセイを使用して評価された。
【０４０８】
ＥＭＰサンプルの品質と収率は、タンパク質−洗浄薬複合体の形態で分析的なサイズ排除クロマトグラフィーによって評価された。タンパク質の安定性はＣＰＭアッセイを使用して評価された。すべてのＥＭＰは、ｅＧＦＰ部分を含む融合タンパク質として生成された。
【０４０９】
実施例７−表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用しりＥＭＰ結合および動力学的データ
結合データ
【０４１０】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、両分子の相互作用の親和性をモニタリングするために使用された（会合と解離の速度定数の分析、両分子の相互作用動力学のモデリング、平衡結合分析、およびリガンド特異性研究）。ＮＨＳ／ＥＤＣカプラー（図６Ａ）を使用して、例証的なＥＭＰ−００５をＢｉａｃｏｒｅチップに連結した。ＨＩＳ標識したＥＭＰ−００５をＮＴＡチップ（図６Ｂ）に連結した。両方のセンサーグラムは、ＥＭＰ−００５サンプルの最適な結合特性を示す。
【０４１１】
動力学的データ
【０４１２】
２つの小分子化合物（〜４５０Ｄａ）を用いて、ＥＭＰ−００５の品質と結合動力学を判定した。センサー表面は、両方の小分子化合物（図６Ｃ）の結合動力学（Ｋａ、Ｋｄ、ＫＤ）を観察および測定するために十分な密度であった。２つの化合物の１つだけのための実証的なデータが図６Ｃで示される。化学的に結合した受容体は非共有的に捕獲された受容体に等しく機能的であり、このことは、タンパク質がカップリング化学検査に耐えることを示す。
【０４１３】
実施例８−ナノテクノロジーに基づくＤＮＡ送達系を使用するＧＰＲ５５  ＥＭＰｓ（商標）クローン０１２を用いる免疫処置
遺伝子免疫処置とタンパク質を用いる追加免疫
【０４１４】
いくつかの実施形態において、ＥＭＰｓ（商標）は、野生型または内在性のＧＰＣＲ標的に対する抗体の生成を可能にする。ＧＰＲ５５  ＥＭＰｓ（商標）の免疫原性は、インビボのＤＮＡ免疫処置と、その後の精製されたＥＭＰｓ（商標）タンパク質を用いるタンパク質の追加免疫を用いて、マウスにおいて試験された。
【０４１５】
遺伝子免疫処置は、Ｉｎ−Ｃｅｌｌ−Ａｒｔ（Ｎａｎｔｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）でＮａｎｏＴａｘｉ（登録商標）を使用して行われた。ＮａｎｏＴａｘｉ（登録商標）は、送達された遺伝物質が脂質とポリマーの様々な化学ファミリーの混合物とともに製剤される遺伝子免疫処置に最適化されたＤＮＡ送達系である。
【０４１６】
ＧＰＲ５５受容体のＥＭＰ０１２に対応するｃＤＮＡはｐＣＭＶベースのベクターへクローン化され、細胞表面発現は免疫原投与の前にＨＥＫ２９３ＴとＨｅＬａの細胞の一時的なトランスフェクションによって確認された。
【０４１７】
Ｃ５７ＢＬ６マウスを、一次攻撃誘発のためにＮａｎｏＴａｘｉ（登録商標）へ製剤された５０μｇのＥＭＰ０１２  ｃＤＮＡ構築物で免疫化し、その後、２回の週ごとの間隔で同じＮａｎｏＴａｘｉ（登録商標）ベースの製剤を用いて５０μｇの２回の追加免疫を行い、その後、ＩＦＡアジュバント中の精製されたＥＭＰ０１２タンパク質５０μｇを用いて１回追加免疫した。いくつかの例では、追加免疫は１次抗体応答の体細胞の超突然変異によってインビボの親和性成熟のために実行された。免疫反応のレベルは、無関係なＧＰＣＲ（左のパネル）またはＷＴ−ＧＰＲ５５（右のパネル）でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を使用して、ＦＡＣＳ分析によって等間隔で評価された（図７）。
【０４１８】
ＧＰＲ５５受容体のＥＭＰ０１２は、ＦＡＣＳ分析（図７）によって野生型のＧＰＲ５５トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を特異的に認識するポリクローナル抗体によって示されるようにＷＴ−ＧＰＲ５５に対する頑強かつ特異的な免疫反応をもたらした。
【０４１９】
野生型のＧＰＲ５５とＧＰＲ５５−ＥＭＰ−０１２の配列がそれぞれ図９と図１０で例証される。
【０４２０】
実施例９−固定されたＥＭＰ（商標）はＥＬＩＳＡフォーマットでＷＴ受容体に特異的な抗体と結合する。
精製されたケモカイン受容体（ＥＭＰ（商標）は、ＥＬＩＳＡフォーマットでのＷＴ受容体に特異的な抗体の結合を試験するために使用された。蛍光標識抗体を使用するとき、凍結／解凍の事象およびその両方が同一の優れた蛍光シグナルを与えた前後に、抗体の結合を測定した（図８）。
【０４２１】
実施例１０−薬理学（タンパク質に基づくアッセイ）
複数膜貫通型タンパク質の結合薬理学は、発現された修飾された複数膜貫通型タンパク質に対するアゴニストリガンドまたはアンタゴニストリガンド（小分子、ペプチド、あるいはタンパク質）の結合を、直接的または間接的にモニタリングする方法によってタンパク質レベルで評価される。所望の複数膜貫通型タンパク質を発現する真核生物または原核生物の宿主から精製された細胞性膜の調合物は単離され、結合アッセイフォーマットで使用され、ここで、所望の修飾された複数膜貫通型タンパク質を含む細胞膜は放射標識された化合物でインキュベートされ、残余に結合した化合物は、過剰な標識を除去するためにサンプルを洗浄した後に測定される。残余結合標識の放射能の測定はシンチレーション計数器によって測定される。
【０４２２】
洗浄薬で可溶化および精製された修飾された複数膜貫通型タンパク質に対する小分子化合物、ペプチド、およびタンパク質の結合は、シンチレーション近接アッセイを使用して判定される。原核生物または真核生物の宿主中で発現された修飾された複数膜貫通型タンパク質は、洗浄薬を用いて細胞膜から抽出され、その後、修飾された複数膜貫通型タンパク質は精製され、シンチレーション近接ビーズに結合される。放射標識されたリガンドをビーズでインキュベートし、その後、洗浄して未結合のリガンドを除去し、シグナルをシンチレーションカウンターで読み取る。
【０４２３】
実施例１１−突然変異誘発の複数回ラウンド
同定された修飾された複数膜貫通型タンパク質コード化遺伝子は、異なる複数膜貫通型タンパク質の物理化学的性質へさらなる利点を与える新たな突然変異を同定するために、後に一連の突然変異誘発を経験する。
【０４２４】
多くの同定された修飾された複数膜貫通型タンパク質コード化遺伝子は混ぜ合わされ、ＤＮＡシャフリングと選択を経験することで、前もって同定されていたものの様々な修飾された複数膜貫通型タンパク質遺伝子中に存在する協同突然変異を同定した。こうした協同突然変異は、異なる複数膜貫通型タンパク質の物理化学的性質へさらなる利点を与える。
【０４２５】
修飾された複数膜貫通型タンパク質の遺伝子と野生型遺伝子の混合物を使用してＤＮＡシャフリングを行うことにより、多くの突然変異を含む同定された修飾された複数膜貫通型タンパク質から、不必要な突然変異が除去される。選択宿主はこの生成物を用いて再度形質転換され、最後の選択ラウンドは、元々の修飾された複数膜貫通型タンパク質の物理化学的性質を維持することができると最小限の突然変異セットを同定するために行われる。
【０４２６】
実施例１２−結晶化と構造決定
結晶化試行については、精製および濃縮されたサンプルは、クリスタラント（ｃｒｙｓｔａｌｌａｎｔ）緩衝液と混ぜ合わされ、特定の温度において蒸気拡散状態でインキュベートされる。代替的に、タンパク質サンプルは、脂質立方相を形成するために脂質と混ぜ合わされ、後に、合わせガラスプレートに分配され、ここで、ＬＣＰは特定の温度でのインキュベーションの前にクリスタラント緩衝液と接触する。
【０４２７】
結晶はナイロンループを使用して収穫され、蒸気拡散結晶化方法の場合には、結晶を移し、凍結防止剤を含む母液にひたして、液体窒素中で急速冷凍させる。代替的に、ＬＣＰマトリックスから結晶を収穫し、液体窒素中で直接、急速冷凍させる。
【０４２８】
データセットはシンクロトロンビームラインで集められ、モデルの構成および改善のように、データを結晶学的なソフトウェアを使用して処理する。構造は、ＲＣＳＢプロテインデータバンク（ＰＤＢ）から、得られたサーチモデルとして既知で、かつ、構造上同様の膜タンパク質から原子の座標を使用して、分子の交換によって例えば解決される。
【０４２９】
実施例１３−修飾された複数膜貫通型タンパク質を用いる追加免疫処置方法タンパク質を用いる遺伝子免疫処置と追加免疫
対応する修飾された複数膜貫通型タンパク質をコードするｃＤＮＡは、特殊な遺伝子免疫処置ベクターへクローン化され、細胞表面発現は、遺伝子銃または他のＤＮＡ送達系を用いる他の免疫処置ルートにより皮内投与の前に、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｃｏｓ−７、またはＨｅＬａ細胞の一時的なトランスフェクションによって確認される。免疫処置は、受託試験機関の固有の免疫処置を使用し、ベクターあるいは内部で開発された遺伝子免疫処置ベクターをスクリーニングして、受託試験機関によって行われる。
【０４３０】
免疫学的に関連するＴ−ヘルパー（Ｔｈ）エピトープは、マウス免疫処置の手順を最適化するために免疫処置ベクター配列に含まれる。さらに、免疫処置とスクリーニング用のベクターは検出タグを含むように操作され、それにより、例えば、全細胞上での血清の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によって、免疫処置の発現の成功と発現構築物との間の判別が可能となる。
【０４３１】
Ｂａｌｂ−ｃマウスとウィスターラットを含む様々な種を、一次攻撃誘発のために複数膜貫通型ポリペプチドｃＤＮＡ構築物５０−１００μｇで免疫化し、その後、２回の週ごとの間隔をおいて同じ複数膜貫通型ポリペプチドのｃＤＮＡ５０−１００μｇを３−６回追加免疫し、その後さらに、５０μｇの精製された複数膜貫通型ポリペプチドを用いて１−３回の追加免疫処置を行った。
【０４３２】
追加免疫処置は、１次抗体応答の体細胞超突然変異によるインビボの親和性の成熟に必要とされる。免疫応答のレベルはＦＡＣＳ分析とＥＬＩＳＡによって等間隔で評価される。
【０４３３】
ＦＡＣＳによる免疫応答における血清力価の評価
細胞を発現する修飾された複数膜貫通型タンパク質上での免疫化された動物における誘発された免疫応答をモニタリングするために、マウス、ラット、あるいはウサギからの免疫前の血清サンプルは一時的な出血と比較される。ＦＡＣＳ分析を使用して、修飾された複数膜貫通型タンパク質を発現する細胞ＶＳ無関係のｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞およびトランスフェクトされていない細胞によって、免疫化されたコホートでの免疫応答の有意差を観察して、免疫応答の特異性をモニタリングする。
【０４３４】
平均の蛍光強度（ＭＦＩ）は、マウスまたはラットの血清サンプルに関するヒストグラムプロフィールを用いて、各血清サンプルについて棒グラフとしてプロットされている。これは、免疫応答が特異的な抗体反応を起こしたことを実証する。
【０４３５】
ＥＬＩＳＡによる免疫応答における血清力価の評価
Ｈｉｓタグ付けした修飾された複数膜貫通型タンパク質は、９６ウェルのニッケルキレート化合物プレート上に固定され、血清サンプルを分析のために希釈化して、複数膜貫通型ポリペプチドとそのＷＴ対応物への結合を定量化および評価する。マウスでは、修飾された複数膜貫通型タンパク質に追加免疫を行うことで、力価を同じレベルで維持するか、力価を増大させる。
【０４３６】
免疫蛍光検査法
免疫蛍光検査データは、対応する野性型受容体で観察されたデータと比較して、修飾された複数膜貫通型タンパク質の発現と細胞内での局在性を実証するために使用される。宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｃｏｓ−７、またはＨｅＬａ）は、修飾された複数膜貫通型タンパク質あるいは対応するＷＴコード化遺伝子のいずれかで、一時的にあるいは安定的にトランスフェクトされる。マウスとラットの血清サンプルは、修飾された複数膜貫通型タンパク質を発現する細胞、ＷＴ、および、トランスフェクトされていない細胞でインキュベートされ、結合された血清は、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８と抗ラットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８をそれぞれ使用して検知される。
【０４３７】
実施例１４−アゴニストまたはアンタゴニストの立体構造での修飾された複数膜貫通型タンパク質遺伝子免疫処置
アゴニストまたはアンタゴニスト立体構造を保持するためにインビボの選択された修飾された複数膜貫通型タンパク質のコード化ＤＮＡ配列は、遺伝子免疫処置ベクターへとクローン化され、細胞表面発現は、例えば、遺伝子銃アプローチを使用して皮内投与の前に、ＨＥＫ２９３、Ｃｏｓ−７、ＨｅｌａまたはＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的または安定的なトランスフェクションによって確認される。Ｂａｌｂ−ｃまたはＣ５７Ｂｌ６マウスは、一次攻撃誘発のために５０−１００μｇの複数膜貫通型ポリペプチドｃＤＮＡ構築物、あるいはＷＴ  ｃＤＮＡで免疫化され、２回の週ごとの間隔で５０−１００μｇのｃＤＮＡの３−６回の追加免疫を行った。免疫応答のレベルはＦＡＣＳ分析によって等間隔で評価される。
【０４３８】
ＨＥＫ２９３、Ｃｏｓ−７、ＨｅＬａ、またはＨＥＫ２９３Ｔの細胞における細胞表面発現の確認
修飾された複数膜貫通型タンパク質の発現は、抗ＦＬＡＧ抗体によって検知され、第１の結合曲線によって表され、陰性対照（無関係のｃＤＮＡ）は第２の結合曲線によって表される。
【０４３９】
ＦＡＣＳ分析を使用する修飾された複数膜貫通型ポリペプチドに対する免疫応答における血清力価の評価
第１の結合曲線は、修飾された複数膜貫通型タンパク質ｃＤＮＡ、あるいは修飾された複数膜貫通型タンパク質発現細胞に結合する精製されたタンパクによって免疫化されたマウスからの血清を表し；第３の曲線は対応する野性型膜受容体発現細胞に結合する同じ血清サンプルを表し；第４の曲線は、無関係のｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞を表す。
【０４４０】
免疫化されたコホートにおける有意な免疫応答は、野生型かつ修飾された複数膜貫通型タンパク質に同様に結合するマウスのポリクローナル血清を特徴とする。
【０４４１】
ＦＡＣＳ分析を使用して対応するＷＴ受容体で免疫化されたマウス
第１の結合曲線は、修飾された複数膜貫通型タンパク質発現細胞に結合するＷＴ  ｃＤＮＡによって免疫化されたマウスからの血清を表し；第３の結合曲線は野生型の修飾された複数膜貫通型タンパク質発現細胞に結合する同じ血清サンプルを表し；第４の結合曲線は、無関係のｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞を表す。
【０４４２】
免疫化されたコホートにおける有意な免疫応答は、野生型かつ修飾された複数膜貫通型タンパク質受容体に同様に結合するマウスまたはラットのポリクローナル血清を特徴とする。
【０４４３】
ＥＬＩＳＡ分析
血清サンプルは、ニッケルキレート化合物プレート面に固定された関連する修飾された複数膜貫通型タンパク質の可溶化された膜調合物に対する結合について分析される。検出はＴＭＢ基質を含む抗マウスＨＲＰ抱合体を用いて行われ、陽性対照は、抗膜タンパク質ポリクローナルによって、抗モルモットまたは他の種のＨＲＰ抱合体を使用して、提供される。
【０４４４】
ＥＬＩＳＡデータは、以前のＦＡＣＳ分析を反映する、例えば、修飾された複数膜貫通型タンパク質に基づくＤＮＡ免疫処置は、ＷＴ  ＤＮＡ免疫処置と同様の抗体応答を与え、血清力価の増加は、出血前を、一時的な出血（ＩＢ）、例えば、（ＩＢ１）、（ＩＢ２）、および最終的な出血と比較することより示されるような追加免疫期間中に検知される。血清サンプルは、様々な希釈（１：５０、１：１００、１：５００、１：１０００、および１：５０００）で評価される。実施例１５−修飾された複数膜貫通型タンパク質のワクチンとしての使用を示す関数データワクチンとしての修飾された複数膜貫通型タンパク質は、修飾された複数膜貫通型タンパク質の機能的な活性に影響を与えるまたは該活性を試験するポリクローナル抗体を誘発する。
【０４４５】
修飾された複数膜貫通型タンパク質またはそのコード化遺伝物質の効果的なワクチンとしての使用は、宿主の免疫応答で生成された機能的な活性、つまり、ポリクローナル抗体によって実証される。修飾された複数膜貫通型タンパク質コード化遺伝子を使用して、主に遺伝子銃による予防接種／免疫処置によって、様々な動物種を免疫化する。
【０４４６】
結果として生じる血清の機能的な活性を評価するために使用される１つの呼び出しは、ｃＡＭＰシグナル伝達への影響である。
【０４４７】
ＡＣ−ｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路の活性化からのＣＲＥ応答が読み出しである場合、ＣＲＥ−ｌｕｃリポーターアッセイが使用される。
【０４４８】
その後の分析は、アッセイがＷＴトランスフェクトされたＨＥＫ２９３または他の細胞株上で行われるとき、ポリクローナル血清が、対応するアゴニスト化合物とのアゴニスト相乗作用と、アゴニスト活性のみの両方を実証したことを明らかにするものである。この活性は、ウサギの分析から生成されたデータによって実証されるように、かつ、免疫前の血清と比較されるように、免疫処置プロトコルで早期に検知される。活性は免疫前の血清サンプルのいずれでも検知されない。標的特異性は、トランスフェクトされていないか、または、無関係の複数膜貫通型受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３あるいは他の細胞株を使用して、示される。
【０４４９】
実施例１６−アジュバントを用いる修飾された複数膜貫通型タンパク質に対する免疫応答の増強ＧＭ−ＣＳＦによる免疫応答の増強
ＧＭ−ＣＳＦまたはサイトカインベースの分子アジュバント（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−βなど）は、免疫応答を増強するために、ＤＮＡ、つまり、遺伝子アジュバントをコードする修飾された複数膜貫通型タンパク質とともに同時投与される。これは種特異的であり得るが、ヒト以外の霊長類の表皮へ投与されたＨ１Ｎ１インフルエンザＤＮＡワクチンの粘膜および全身的な免疫原性を増大させることが実証されている。使用される免疫応答を増強する他の方法は、例えば、アジュバントとしての破傷風とジフテリアのトキソイドであり、げっ歯類におけるＰＡＤＲＥ  ＴｈエピトープとオバルブミンＴｈエピトープについて示されているように、Ｔｈエピトープの使用が発現構築物の一部として組み込まれた。他のＣＤ４＋エピトープは患者または免疫化した集団から同定され、ＨＩＶとマラリア熱のワクチン開発で組み込まれるか、さらにモノホスホリルリピドＡなどの最近開発されたアジュバントにも組み込まれている。アジュバントの実施のために使用された戦略は、複数膜貫通型タンパク質完全性と適合する化合物の遺伝成分または製剤の形態をとる。
【０４５０】
大腸菌ＧｒｏＥＬを使用する免疫応答の増強
ＧｒｏＥＬのアジュバント活性は、起こりうる標準的な免疫担体効果に加えて、トール様受容体４による炎症性サイトカインメディエーターを推定上含む。ＧｒｏＥＬを使用するＤＮＡ免疫処置は、機能分析のために、あるいは、修飾された複数膜貫通型タンパク質に対する抗体を引き起こすために、抗体を産生するための方法として使用される。修飾された複数膜貫通型タンパク質は、大腸菌ＧｒｏＥＬあるいはＧｒｏＥＬフラグメントに縮合されるか、あるいはＧｒｏＥＬまたはＧｒｏＥＬフラグメントをコードするＤＮＡ配列を同時注入される。
【０４５１】
Ｃ末端で大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＧｒｏＥＬに縮合された修飾された複数膜貫通型タンパク質をコードするプラスミドによるマウスまたはラットのＤＮＡ免疫処置は、ＷＴと修飾された複数膜貫通型タンパク質に対する特異的な抗体反応の誘発に関して試験される。修飾された複数膜貫通型タンパク質と、ＧｒｏＥＬあるいはＧｒｏＥＬ発現遺伝子との同じ組み合わせを発現するプラスミドの同時注入も試験される。修飾された複数膜貫通型タンパク質は、Ｈｓｐ７０またはＦｃフラグメントに縮合されるか、あるいはＨｓｐ７０またはＦｃフラグメントをコードするＤＮＡ配列を同時注入される。
【０４５２】
修飾された複数膜貫通型タンパク質は、樹状細胞による取り込みを増強するために、Ｈｓｐ７０またはＦｃフラグメントに縮合されるか、あるいはＨｓｐ７０あるいはＦｃフラグメントをコードするＤＮＡ配列を同時注入される。Ｆｃの、ＣＤ９１を有するそのＦｃｇＲｓおよび／またはＨｓｐのタンパク質との相互作用は、抗原提示に関与する表面分子とサイトカインをアップレギュレートすることにより、樹状細胞を活性化する。さらに、樹状細胞表面受容体経路の利用は、クロスプレゼンテーションの十分に特徴づけられたメカニズムによって（ＭＨＣクラスＩＩに加えて）樹状細胞による効率的なＭＨＣクラスＩ拘束性抗原提示のための特権的な抗原内在化ルートを表すこともある。
【０４５３】
ｓＦｌｔ−１に縮合されたか、ｓＦｌｔ−１をコードするＤＮＡ配列を同時注入された、修飾された複数膜貫通型タンパク質
修飾された複数膜貫通型タンパク質はさらに、免疫療法／抗血管新生抑制併用療法において、ｓＦｌｔ−１に縮合される。腫瘍の増殖を遅らせ得る免疫療法のみあるいは抗血管新生療法のみの適用とは対照的に、２つの治療の組み合わせは腫瘍の増殖の完全な阻害をもたらす機会を有する。抗血管新生療法と同時の組み合わせでの免疫療法による腫瘍標的化を用いることで、固形腫瘍の処置により効率的な戦略が提供される。修飾された複数膜貫通型タンパク質は、フラジェリン、ＴＬＲ５アゴニストなどの活性なＴＬＲアゴニストに縮合されるか、あるいは、フラジェリンまたはＴＬＲ５をコードするＤＮＡ配列を同時注入される。
【０４５４】
サルモネラからの第１相フラジェリン（ＦｌｉＣと呼ばれる）はモノマーサブユニットタンパク質であり、細菌の鞭毛を形成するために重合する。それは大規模に研究されており、ＴＬＲ５相互作用に必要なフラジェリンの領域と残基が定義されている。Ｔｈ１様の応答を誘発する事象のカスケードに影響を与えるＤＮＡコード化Ａｇｓを用いて感染症への免疫応答を強化することができることが実証されているが、特定の状況下では、Ｔｈ２様の応答の誘発も観察されている。これらの観察は、ＦｌｉＣがＴＬＲ活性化に似た炎症性の免疫応答を引き起こすことを示す。
【０４５５】
カルレティキュリン（ＣＲＴ）に縮合されるか、ＣＲＴをコードするＤＮＡ配列を同時注入される修飾された複数膜貫通型タンパク質
野生型のＡｇをコードするＤＮＡでトランスフェクトされたＤＣによって生成された弱い免疫応答を補う戦略：これらの戦略のいくつかは、カルレティキュリン（ＣＲＴ）に対する、あるいはリソソームに関連する膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）の選別シグナルに対するＴＡＡ抗原の融合を含む。
【０４５６】
実施例１７−修飾された複数膜貫通型タンパク質を用いる追加免疫処置
リガンド結合アッセイを使用して、修飾された複数膜貫通型タンパク質安定性に対するアジュバント／修飾された複数膜貫通型タンパク質製剤の効果を試験する。
単離させた修飾された複数膜貫通型タンパク質は、多くの様々なアジュバントと組み合わされ、リガンド結合アッセイで２時間にわたって３７°Ｃでその安定性について調べられた。評価されるアジュバントとしては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＭ（マウスモノクローナルＧｅｒｂｕの生成のために市販されている）およびＰｈａｒｍａ（Ｇｅｒｂｕ）、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｃｌａｓｓｉｃ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＴｉｔｅｒＭａｘアメリカ／Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＡｄｊｕＰｒｉｍｅ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  （Ｐｉｅｒｃｅ）が挙げられる。アジュバントはすべて複数膜貫通型ポリペプチドと組み合わせて試験され、対照の未製剤サンプルと比較して、リガンド結合アッセイにおいて２時間が３７°Ｃでのインキュベーション後に、様々な安定度を示す。リガンド結合アッセイ試験条件は、体温での精製された複数膜貫通型タンパク質免疫原との試験された免疫アジュバントの相対的な適合性を示すように設計されている。ＦＡＣＳとＥＬＩＳＡを使用して、引き起こされた免疫応答に対するアジュバント／修飾された複数膜貫通型タンパク質製剤の効果を試験する。
【０４５７】
修飾された複数膜貫通型タンパク質は、１：１の比率を使用して多くのアジュバントを用いて製剤される。Ｂａｌｂ−ｃマウスとウィスターラットは腹腔内注射によって結果として生じた様々な抗原／アジュバント製剤を用いて免疫化され、免疫処置プロトコルは一時的な出血１（４×５０μｇの修飾された複数膜貫通型タンパク質）までタンパク質の初回抗原刺激と追加免疫を使用し、その後、臨時の出血２（２×５０μｇの複数膜貫通型タンパク質）までタンパク質を使用する短い追加免疫相を用いた。様々な実験条件下での免疫応答は、ＦＡＣＳとＥＬＩＳＡによって免疫化された動物からの血清の様々な希釈を試験して評価される。修飾された複数膜貫通型タンパク質への機能的な抗体産生応答もウサギにおいて生成される。
【０４５８】
アゴニストおよびアンタゴニストの抗体は、タンパク質免疫処置、遺伝子免疫処置、および遺伝子とタンパク質免疫処置の戦略の組み合わせを用いて、第３の宿主種（ニュージーランドホワイトウサギ）において生成される。初期のＤＮＡまたはタンパク質の攻撃（免疫初回抗原刺激）＋タンパク質の追加免疫には、その後に、短い一時的な追加免疫期間と最終のタンパク質の追加免疫を伴う。免疫化された動物からの血清は、精製されたＷＴと、修飾された複数膜貫通型タンパク質ＷＴと、修飾された複数膜貫通型タンパク質との結合についてＥＬＩＳＡによって評価され、ＷＴと修飾された複数膜貫通型コード遺伝子で一時的あるいは安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞への細胞表面結合について、ＦＡＣＳを使用して評価される。誘発された血清のアゴニスト活性は、細胞ベースのリポーターアッセイを用いて機能評価として試験される。頑強な免疫応答が見られ、機能的な活性は第１の一時的な出血と同じくらい早い段階で検知されている。
【０４５９】
いくつかの例では、修飾された複数膜貫通型タンパク質を使用する免疫処置は、例えば、ウシ抗体、サメ抗体、ラクダ科抗体、ヒト自己抗体、あるいはヒト抗ＨＩＶ抗体のＣＤＲ−Ｈ３領域に似ている先天的に長いＣＤＲ−Ｈ３領域を有する抗体を生成するために使用される。場合によっては、拡張ＣＤＲ−Ｈ３領域を有する抗体は、ＧＰＣＲ、イオンチャネル、および他の複数膜貫通型タンパク質などの結合するのが困難なエピトープを標的とするために使用される。場合によっては、拡張ＣＤＲ−Ｈ３領域を有する抗体はさらに、本明細書に記載される修飾された複数膜貫通型タンパク質を標的とするヒト化抗体を生成するためにヒト化プロセスを経験する。
【０４６０】
本開示の好ましい実施形態が本明細書で示され記載されてきたが、こうした実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。多くの変更、変化、および置き換えは、本開示から逸脱することなく、当業者の心に思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本開示の実施形態の様々な代替物が、本開示の実施において利用されることもあることを理解されたい。以下の請求項は本開示の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法がそれに包含されるものであるということが意図されている。
【図１】
2019527065.tif 000018
【図２】
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【図３】
2019527065.tif 000020
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2019527065.tif 000023
【図５Ｃ】
2019527065.tif 000024
【図５Ｄ】
2019527065.tif 000025
【図６Ａ】
2019527065.tif 000026
【図６Ｂ】
2019527065.tif 000027
【図６Ｃ】
2019527065.tif 000028
【図７】
2019527065.tif 000029
【図８】
2019527065.tif 000030
【図９】
2019527065.tif 000031
【図１０】
2019527065.tif 000032
【配列表】
2019527065000001.app
【国際調査報告】
2019527065.tif 000033
2019527065.tif 000034
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