(57)【要約】  本発明は、タンパク質工学および精製の分野内にある。本発明は、金属結合モチーフを含む、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたはプロテインＭなどのＩｇＧ結合ポリペプチドの標的結合ポリペプチド変異体に関する。より厳密には、本発明は、カルシウム結合ＥＦループが導入されている、プロテインＡ由来のＺドメインに基づく操作されたタンパク質を含むＦｃ結合リガンドに関する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属結合モチーフを含むＩｇＧ結合ポリペプチドの標的結合ポリペプチド変異体であって、標的結合が金属イオンの存在下で起こる、ＩｇＧ結合ポリペプチドの標的結合ポリペプチド変異体。
【請求項２】
前記ＩｇＧ結合ポリペプチドがプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたはプロテインＭに由来する、請求項１に記載のポリペプチド変異体。
【請求項３】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の変異体ドメインを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド変異体。
【請求項４】
前記ポリペプチド変異体がＦｃ結合性である、請求項１、２または３に記載のポリペプチド変異体。
【請求項５】
前記Ｆｃ結合変異体が、ＳｐＡドメインＢ由来のドメインＺの変異体である、請求項４に記載のポリペプチド変異体。
【請求項６】
前記金属結合モチーフがカルシウム結合性であり、および前記標的結合がカルシウムイオンの存在下にある、請求項１乃至５の１つ以上に記載のポリペプチド変異体。
【請求項７】
前記金属結合モチーフが前記Ｚドメインのヘリックス２と３の間に挿入されている、請求項５または６に記載のポリペプチド変異体。
【請求項８】
前記金属結合モチーフ配列の前にリンカー、好ましくはＧＧＧを含む、請求項１乃至７の１つ以上に記載のポリペプチド変異体。
【請求項９】
配列番号１〜９（Ｚｍａｔ１〜Ｚｍａｔ９）または前記配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％もしくは９５％の配列相同性を含む対応する配列から選択される、請求項１乃至８の１つ以上に記載のポリペプチド突然変異体。
【請求項１０】
配列番号８（Ｚｍａｔ８）または前記配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％もしくは９５％の配列相同性を含む対応する配列を含む、請求項９に記載のポリペプチド変異体。
【請求項１１】
前記Ｚドメイン中に以下の変異：Ｆ５Ｌ、Ｎ２８Ｋ、Ｋ３５Ｉを含む、請求項１乃至１０の１つ以上に記載のポリペプチド変異体。
【請求項１２】
前記Ｚドメイン中にＮ２３Ｔの変異を含む、請求項１乃至１１の１つ以上に記載のポリペプチド変異体。
【請求項１３】
請求項１乃至１２の１つ以上に記載のポリペプチド変異体を含むリガンド。
【請求項１４】
請求項１０に記載のポリペプチド変異体を含む、請求項１３に記載のリガンド。
【請求項１５】
二量体、三量体、四量体、五量体または六量体、好ましくは四量体から選択される、請求項１３または１４に記載のリガンドのポリペプチドの多量体。
【請求項１６】
請求項１３もしくは１４に記載のリガンドまたはそれに結合した請求項１５に記載のその多量体を含むクロマトグラフィマトリックス。
【請求項１７】
標的または試料タンパク質を、金属イオンの存在下で請求項１３乃至１５に記載のリガンドまたは多量体リガンド、好ましくは四量体に結合させること、および金属結合分子の添加によって結合タンパク質を溶出することを含む、試料タンパク質の精製方法。
【請求項１８】
前記リガンドまたは多量体リガンドを固相に固定化する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合タンパク質を４．５より上のｐＨで溶出する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記結合タンパク質をｐＨ５〜７で溶出する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合タンパク質をｐＨ５．４〜５．６で溶出する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的または試料タンパク質が抗体またはその一部である、請求項１７乃至２１の１つ以上に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的または試料タンパク質がＩｇＧである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的または試料タンパク質がＦｃ融合タンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
金属結合分子による前記溶出がキレート剤によるものである、請求項１７乃至２４の１つ以上に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号１〜９から選択されるポリペプチドをコードする核酸またはベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載の核酸またはベクターを含む発現ベクター。
【請求項２８】
標的結合が金属イオンの存在下で起こる、クロマトグラフィ用の固定化リガンドとしての、金属結合モチーフおよび／またはその多量体を含むポリペプチド／タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質工学および精製の分野内にある。本発明は、金属結合モチーフを含む、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたはプロテインＭなどのＩｇＧ結合ポリペプチドの標的結合ポリペプチド変異体に関する。より厳密には、本発明は、カルシウム結合ＥＦループが導入されている、プロテインＡ由来のＺドメインに基づく操作されたタンパク質を含むＦｃ結合リガンドに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は生物科学において最も広く使用されている試薬の１つであり、治療用抗体の分野は拡大し続けており、年間売上高は１，０００億ドルに迫ろうとしている１。抗体の精製は、一般に、プロテインＡに基づくアフィニティクロマトグラフィ２を使用して行われ、これは、単一の精製工程で純粋で濃縮された生成物を生じる簡単で堅固な方法である３，４。主な欠点は、溶出のために酸性のｐＨ（３〜４）を必要とすることである。多くの抗体は、抗体の凝集を引き起こし、さらにはその機能を喪失させ得る低いｐＨに対する感受性の問題を抱えているため５，６、これは新しい抗体に基づくツールの開発および精製の両方を妨げる。
【０００３】
プロテインＡカラムに捕捉された抗体の溶出環境を改善するために様々な試みがなされてきた。例としては、溶出ｐＨを４〜４．５に高めることができる、プロテインＡ由来のＺドメインの結合部位突然変異７および同じドメインのループの操作改変８が含まれる。尿素またはアルギニンを溶出緩衝液に添加すると、タンパク質の凝集が抑制されることが示されており６、９、またプロテインＡのドメインの疎水性を低下させる突然変異が作製されており、これにより、４０℃での溶出を可能にする熱応答性プロテインＡが得られた１０。
【０００４】
本来、タンパク質活性を制御するための１つの方法は、三次元構造を変化させることによるものである。ＥＦハンドモチーフを含むカルシウム結合タンパク質は、カルシウムイオンによってアロステリックに制御される。カルシウムに結合すると、これらのタンパク質はイオン調節機能を可能にするコンフォメーション変化を受けることができる１１、１２。カルシウムイオンは、１２個のアミノ酸からなるＥＦハンドに見出されるループによって調整され、ここで、タンパク質モチーフ内の特定の位置は保存されたアミノ酸を有するが、他の位置はより柔軟である１３。ＥＦループモチーフはモデルタンパク質に成功裏に移植されている１４。
【０００５】
金属結合は、精製目的でタンパク質工学において利用されてきた。カルシウム依存性溶出によるタンパク質精製においてタグおよびアフィニティハンドルとして使用できる、ＥＦハンドサブドメインに基づくスプリットカルシウムタンパク質が報告されている１５。さらに、連鎖球菌プロテインＧ由来の抗体結合ドメインの１つは、ドメインが遷移金属の存在によって免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と結合する能力を失う原因となる金属結合部位を含むように操作されている１６。
【０００６】
従来のプロテインＡクロマトグラフィに関して上述したように、酸性溶出の必要性は、精製される抗体またはＦｃ融合タンパク質にとって有害であり得る。さらに、酸性ｐＨはタンパク質の凝集を増大させ、収率を低下させることが知られている。したがって、先行技術のｐＨ３〜４．５よりも高いｐＨでの溶出を可能にするプロテインＡリガンドが得られることが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２７６２５６４Ａ１号明細書
【発明の概要】
【０００８】
本発明により、金属結合ループ、好ましくはカルシウム結合ＥＦループが導入されている、好ましくはプロテインＡ由来Ｚドメインに基づく操作改変されたタンパク質を提供することによって上記および他の問題を解決する。操作されたタンパク質ドメインを用いて、先行技術のリガンドで可能であるよりも実質的に高いｐＨでの穏やかな溶出で抗体を精製することができる。本発明の新規リガンドは、特に抗体およびＦｃ融合タンパク質精製のための有益な新しいツールを提供する。
【０００９】
第１の態様では、本発明は、金属結合モチーフを含むＩｇＧ結合ポリペプチドの標的結合ポリペプチド変異体であって、標的結合は金属イオンの存在下で起こる、ＩｇＧ結合ポリペプチドの標的結合ポリペプチド変異に関する。ＩｇＧ結合ポリペプチドは、好ましくはプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたはプロテインＭ、より好ましくはブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の変異体ドメインに由来する。
【００１０】
本発明のポリペプチド変異体は、好ましくはＦｃ結合性であり、すなわち抗体のＦｃ部分もしくは少なくともＦｃ部分を含むその一部、またはＦｃ部分に凝集もしくは融合した他のタンパク質に結合する能力を有する。
【００１１】
好ましい実施形態では、Ｆｃ結合変異体は、ＳｐＡドメインＢに由来するドメインＺの変異体である。
【００１２】
金属結合モチーフは、好ましくはカルシウム結合性であり、例えばランダム突然変異誘発によって得られるか、またはカルパイン、ＡｔｃＢＬ２もしくはカルモジュリンから誘導される。好ましい実施形態によれば、金属結合モチーフはＺドメインのヘリックス２と３の間に挿入される。ポリペプチド変異体は、金属結合モチーフ配列の前にリンカー、好ましくはＧＧＧを含み得る。
【００１３】
好ましくは、ポリペプチド変異体は、配列番号１〜９（Ｚｍａｔ１〜Ｚｍａｔ９）または前記配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％もしくは９５％の配列相同性を含む対応する配列から選択される。より好ましくは、ポリペプチド変異体は、配列番号８（Ｚｍａｔ８）、または前記配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％もしくは９５％の配列相同性を含む対応する配列を含む。標的結合部分ならびに金属結合モチーフは、配列１〜９の最も必須な部分であり、したがって、１〜８個のＮ末端アミノ酸および１〜３個のＣ末端アミノ酸などの末端リンカー配列は、欠失させ得るかまたは前記配列について言及したもの以外の他の任意のアミノ酸もしくは適切な物質から選択され得る。しかしながら、配列１〜９の必須部分内のわずかな変化も、ポリペプチド変異体の所望の特性が維持される限り、本発明に包含される。
【００１４】
アルカリ安定性を高めるために、ポリペプチド変異体は、ＺドメインＮ３Ａ、Ｎ６Ｄ、Ｎ２３Ｔ、好ましくはＮ２３Ｔに以下の変異を含み得る。この特徴は、アルカリ安定なリガンドを必要とするアフィニティクロマトグラフィにおいて特に有用である。
【００１５】
第２の態様では、本発明は、上記のようなポリペプチド変異体を含むリガンド、または結合分子もしくは親和性結合剤に関する。リガンドは、二量体、三量体、四量体、五量体または六量体などの多量体として存在し得る。多量体の場合、シグナルペプチドのアミノ酸残基は、さらに、配列番号１〜９、例えば配列番号８、ならびにＣ末端システイン中に存在し得る。
【００１６】
第３の態様では、本発明は、クロマトグラフィマトリックスであって、それに結合した本発明のリガンドを含むクロマトグラフィマトリックスに関する。クロマトグラフィマトリックスは天然または合成起源のものであってよく、好ましくはアガロースマトリックスなどの多糖マトリックスである。
【００１７】
第４の態様では、本発明は、試料タンパク質の精製方法であって、試料タンパク質を金属イオンの存在下で上記のリガンドまたは多量体に結合させること；および金属結合分子／キレート化分子の添加によって結合タンパク質を溶出することを含む方法に関する。本発明は、ｐＨ５〜７などの４．５を上回るｐＨ、好ましくはｐＨ５．４〜５．６などの約ｐＨ５．５での溶出を可能にする。溶出は、好ましくは、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、グルタミン酸二酢酸およびクエン酸グルタミン酸などのキレート剤を用いて行われる。
【００１８】
標的または試料タンパク質は、抗体またはその一部、例えばＩｇＧまたはＦｃ融合タンパク質であり、培養上清などの複合試料混合物中に存在し得る。
【００１９】
第５の態様では、本発明は、配列番号１〜９から選択されるポリペプチドをコードする核酸またはベクターに関する。
【００２０】
第６の態様では、本発明は、上記の核酸またはベクターのいずれかを含む発現ベクターに関する。
【００２１】
第７の態様では、本発明は、Ｈｉｓタグ付きタンパク質のアフィニティクロマトグラフィまたはＩＭＡＣクロマトグラフィのための固定化リガンドとしての、金属結合モチーフおよび／またはその多量体を含むポリペプチド／タンパク質の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ａ）３回重複して実施した変異体Ａ５についてのファージＥＬＩＳＡのシグナル。ＥＬＩＳＡは、それぞれカルシウム（点）、ＥＤＴＡ（斜め縞）、尿素とカルシウム（縦縞）、および尿素とＥＤＴＡ（横縞）の存在下にポリクローナルＩｇＧで被覆したプレート中でインキュベートしたファージ上清からのシグナルを比較する。ｂ〜ｃ）ポリクローナルＩｇＧ表面上に流動する２５ｎＭのＡ５（ｂ）および１２５ｎＭのＡ５（ｃ）についてのセンサーグラム。ｂ）において、ランニング緩衝液は、カルシウムを含む１×ＴＢＳＴ（上の曲線）またはＥＤＴＡ（下の曲線）である。ｃ）において、ランニング緩衝液は、２Ｍの尿素およびカルシウムを含む１×ＴＢＳＴ（上の曲線）またはＥＤＴＡ（下の曲線）である。Ａ５とＩｇＧの間の相互作用は、ＥＤＴＡよりもカルシウムが存在する場合により強い。
【図２】成熟選択からの上位９個のユニークな変異体についてのファージＥＬＩＳＡからのシグナル読み出し。ＩｇＧで被覆したＥＬＩＳＡプレートをカルシウム（濃い灰色）またはＥＤＴＡ（薄い灰色）の存在下でファージ上清に供した。カルシウム含有緩衝液またはＥＤＴＡ含有緩衝液で洗浄した後、結合ファージを抗Ｍ１３−ＨＲＰ抗体で検出した。シグナルの読み出しをｙ軸上にプロットする。９個すべての変異体がカルシウム含有緩衝液とＥＤＴＡ含有緩衝液の間で大きな相違を示し、ＥＤＴＡが存在する場合は低いシグナルを示す。
【図３】Ｚｍａｔ８（ａ）およびＺドメイン（ｂ）と結合したカラムでのポリクローナルヒトＩｇＧの精製からのＡｂｓ２８０クロマトグラム。ａ）ＩｇＧは、ｐＨを３．２に低下させることによって（長い破線）またはｐＨ５．５でＥＤＴＡによって（実線）Ｚｍａｔ８カラムから溶出したが、ｐＨ５．５でのカルシウム（灰色）では溶出せず、Ｚｍａｔ８によるＩｇＧのカルシウム依存性溶出を実証した。ｂ）ＩｇＧは、ｐＨを３．２に低下させることによってＺカラムから溶出した（長い破線）が、ｐＨ５．５のＥＤＴＡによっては溶出しなかった（実線）。
【図４】Ｚｍａｔ８カラムでの細胞培養上清精製実験のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左）およびウェスタンブロット（右）分析。約１０ｍｇ／ｌのＩｇＧを含有する細胞培養上清を、Ｚｍａｔ８と結合したカラムで精製した。フロースルー（ＦＴ）およびタンパク質を含む溶出画分（Ｅ）を保存し、未精製上清（Ｓ）および分子量マーカー（Ｍ）の次にＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ヒトＨＲＰ結合抗体で検出し、上清および溶出液中でＩｇＧを検出したが、フロースルー中ではＩｇＧは検出されなかった。
【図５】図５は、大幅に過剰のヒトポリクローナルＩｇＧを、ＥＤＴＡ溶出を用いてＺｍａｔ８の単量体（灰色）、二量体（斜め縞）、三量体（白色）または四量体（横縞）で精製した場合の各画分（ｎ＝３）中のタンパク質の平均溶出量を示す実験２からの図である。
【図６】図６は、ＩｇＧで飽和させたＺｍａｔ８三量体（ａ）およびＺｍａｔ８四量体（ｂ）を用いたカラムでの精製の代表的なクロマトグラムを示す。ＩｇＧをｐＨ５．５のＥＤＴＡで溶出した。最初のピークはＩｇＧ注入時のボイドを示し、２番目のピークは洗浄後に溶出したＩｇＧである。
【図７】図７は、１００ｍＭのＮａＯＨおよび１ｍＭのＣａＣｌ２を用いて実施したチップの再生を伴う、３０サイクルにわたるＺｍａｔ８またはＺｍａｔ８（Ｎ２３Ｔ）と結合した表面上を流動するＩｇＧの設定濃度についての正規化最大応答を示す。Ｚｍａｔ８（Ｎ２３Ｔ）は、Ｚｍａｔ８と比較してより高いアルカリ安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、カルシウム依存性ＩｇＧ結合ドメインから開発された、アフィニティクロマトグラフィによる抗体などのタンパク質の精製のための新規リガンドを提示する。親骨格として、プロテインＡのＢドメインに由来するＺドメイン１７が使用されてきた。これは、高い親和性でＩｇＧのＦｃ領域と相互作用する小さな３ヘリックスバンドルタンパク質である。ランダム化したカルシウム結合ループをドメインのヘリックス２と３の間に移植することによってＺドメインライブラリを構築した。ＩｇＧへのカルシウム依存性結合を示すタンパク質変異体を単離するためにファージディスプレイ選択を行った。Ｚｍａｔ８と表される最終ドメインは、複合細胞培養上清からＩｇＧを選択的に捕捉することができ、カルシウム依存性溶出による単一精製工程後に高い度合いの純度を提供する。達成される純度および収率は親Ｚドメインに匹敵する。
【００２４】
Ｚドメイン骨格はまた、ＩｇＧ  Ｆｃ以外の他の標的に親和性を有する変異体の開発のための出発点としても使用されてきた。結合表面のランダム化および所望の標的に対するその後の選択を介して、そのようなＺ変異体（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子）が創製され、様々な用途において商品化されている。その技術とその応用および命名法の総説はＬｏｅｆｂｌｏｍｅｔ  ａｌ３４に記載されている。本発明は、任意の結合親和性を有するＺドメイン変異体に適用可能であること、および金属結合モチーフは、ＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドについて本明細書に記載されているものと同様の方法でそのような変異体に導入され得ることが企図されている。Ｚ変異体の三次元構造は他の親和性を有する変異体を作製する場合にも保存されると考えられるので、カルシウム結合ループは、例えば任意のＺ変異体中の対応する位置に導入することができ、その安定性および結合特性を調節するために使用することができる。
【００２５】
ここで本発明を、添付の図面およびいくつかの非限定的な実験に関連してより詳細に説明する
材料および方法
すべての酵素および精製キットは製造業者の指示に従って使用した。特に明記しない限り、すべての酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から購入した。クローニングＰＣＲ反応はＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて行い、ＰＣＲスクリーニングはＤｙｎａｚｙｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて行った。すべてのＰＣＲ反応物をＱｕｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、Ｑｕｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いてゲル抽出を行った。
【００２６】
クローニング
試験変異体
一本鎖ヘリックス１および２
Ｚのヘリックス１および２に対応する一本鎖ＤＮＡを、Ｚの５’末端の上流にＮｄｅＩ制限部位を含むビオチン化フォワードプライマー（ＳＫＪＮ１）およびヘリックス２の末端に結合するリバースプライマーを用いたＰＣＲによる増幅によって作製した。ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を結合緩衝液（２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．６）で２回洗浄し、結合緩衝液に溶解した。洗浄したビーズ２０μｌをＰＣＲ産物２０μｌと混合し、回転させながら室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。ビーズを１×ＳＣＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）５０μｌ中で洗浄し、０．１５Ｍ  ＮａＯＨ  ２０μｌ中に再懸濁した。非ビオチン化ＤＮＡ鎖を含む上清を廃棄した。一本鎖ビオチン化５’−３’ＤＮＡを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む９５％ホルムアミド中、９０℃で２分間のインキュベーションによってストレプトアビジンビーズから解離させた。一本鎖ＤＮＡを１／１０容量のＮａＡｃ（３Ｍ、ｐＨ５．２）および３倍容量の９５％ＥｔＯＨの添加によって沈殿させた。反応物を−２０℃で一晩インキュベートした後、１４０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを７０％ＥｔＯＨで洗浄し、続いて１４０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを乾燥させた。乾燥後、それを１×ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）１００μｌに溶解した。
【００２７】
ループおよびヘリックス３によるアニーリングと伸長
ヘリックス１および２の一本鎖ＤＮＡ（５ｐｍｏｌ）を、ヘリックス３の一部、カルモジュリンループ、ヘリックス２の３’末端との１８ｂｐのオーバーラップ、およびいくつかの場合にはループの上流のリンカーをコードするリバースプライマー（５ｐｍｏｌ）と混合した。標準的なＰＣＲ反応を６サイクル実施し、その後ＳＫＪＮ１  ２．５ｐｍｏｌおよびＮｈｅＩ制限部位を含むヘリックス３にアニーリングするリバースプライマーを添加し、ＰＣＲをさらに５０サイクル実施した。
【００２８】
切断および連結
精製されたＺ−ループ構築物ならびに元のＺ構築物を含むｐＥＴ−２６ｂ（＋）ベクター（Ｔ７プロモーター、カナマイシン（Ｋｍ）耐性、Ｎｏｖａｇｅｎ）をＮｄｅＩおよびＮｈｅＩ制限酵素で切断した。ＰＣＲ断片を精製し、ベクターを泳動させてアガロースゲルから抽出した。
【００２９】
切断したベクターと挿入物を、３倍過剰の挿入物を用いてＴ４リガーゼで連結した。
【００３０】
Ａ５
Ａ５遺伝子を、それぞれＺの５’および３’末端にアニーリングするプライマーを用いたＰＣＲによってファージミドから増幅した。フォワードプライマーはＮｃｏＩ制限部位を含むオーバーハングを有し、リバースプライマーはＡｓｃＩ制限部位を含むオーバーハングを有していた。
【００３１】
断片およびベクターｐＨｉｓ３２（Ｔ７プロモーター、Ｋｍ耐性）をＮｃｏＩ−ＨＦおよびＡｓｃＩで切断した。精製した断片とゲル抽出したベクターを、５倍過剰の断片を用いてＴ４リガーゼで連結した。
【００３２】
Ｚｍａｔ１〜９
Ｚｍａｔ１〜９をＡ５と同じ方法でクローニングしたが、遺伝子の開始部および／または末端において元の骨格とは異なる突然変異にマッチする特異的プライマーを用いた。
【００３３】
Ｚｍａｔ８不安定化変異体
変異体Ｈ１８Ｒ、Ｆ３０ＡおよびＬ４４Ａを２段階ＰＣＲ反応によってＺｍａｔ８に導入した。段階１では、所望の突然変異を有するミスマッチプライマー２５ｐｍｏｌ、およびＮｃｏＩ制限部位を含むＺｍａｔ８の５’末端にアニーリングするプライマー２５ｐｍｏｌを使用し、Ｚｍａｔ８を鋳型として用いた。２番目の段階（Ｈ１８ＲおよびＦ３０Ａのみ）では、段階１からのＰＣＲ産物５μｌを一方のプライマーとして使用し、ＡｓｃＩ制限部位を含むＺｍａｔ８の３’末端に結合するプライマー２５ｐｍｏｌと組み合わせた。Ｚｍａｔ８を鋳型として使用した。Ｌ４４Ａ  Ｆ３０Ａ置換は、Ｌ４４Ａ置換と同じ方法で行ったが、Ｚｍａｔ８（Ｆ３０Ａ）を鋳型として使用した。変異体をＡｓｃＩとＮｃｏＩ−ＨＦ（Ｈ１８Ａ、Ｆ３０Ａ）またはＮｃｏＩ−ＨＦとＮｈｅＩ−ＨＦ（Ｌ４４Ａ、Ｆ３０ＡＬ４４Ａ）で切断し、５倍過剰でｐＨｉｓベクターに連結し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、対応する制限酵素で切断した。
【００３４】
ライブラリの構築
元のライブラリ
ｐＡＹ０２５９２ファージミド（３３に記載のｐＡｆｆｉ１と基本的に同一）を、Ｚ−ループ遺伝子を含むように修飾した（ｐＡＹＺ−ループ）。Ｚ−ループ構築物を、その５’および３’末端に結合するプライマーを用いて増幅し、フォワードプライマーはＸｈｏＩ制限部位を含み（ＳＡＫＡ１）、リバースプライマーはＳａｃＩ制限部位、続いてＳｎａＢＩ制限部位を含んだ（ＳＡＫＡ２）。ファージミドおよびＺ−ループ遺伝子をＸｈｏＩおよびＳｎａＢＩで切断した。プラスミドをゲル抽出し、脱リン酸化して、断片を精製した。切断した遺伝子とプラスミドを、５％ＰＥＧ６０００を添加して、供給業者の指示に従ってＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結した。
【００３５】
２つのライブラリ（ループライブラリの前にＧＧＧリンカーを含むものと含まないもの）を別々に調製した。
【００３６】
ライブラリ用のプライマー原液を調製した（１００ｐｍｏｌ／μｌ）。フォワード原液は、ヘリックス１および２をコードするプライマーを含み、原液の５０％はＦ３０Ａ変異をコードしていた。リバース原液は、ヘリックス２の３’末端との１８ｂｐのオーバーラップ、リンカー（ＧＧＧループライブラリのみ）、ループライブラリおよびヘリックス３をコードするプライマーを含んだ。原液の５０％は突然変異なしでヘリックス３をコードした。他の５０％は、Ｌ４４、Ａ４８、Ｌ５１の位置に変異を含むか、または３つの任意の組み合わせの変異（Ｌ４４Ｘ＋Ａ４８Ｘ、Ｌ４４Ｘ＋Ｌ５１Ｘ、Ａ４８Ｘ＋Ｌ５１Ｘ、Ｌ４４Ｘ＋Ａ４８Ｘ＋Ｌ５１Ｘ）を含む、等量のプライマーを有していた。
【００３７】
各ライブラリ原液５ｐｍｏｌを混合することによってライブラリをアニーリングおよび伸長させ、６サイクルの間伸長させた。ＳＡＫＡ１およびＳＡＫＡ２  １００ｐｍｏｌを添加し、ライブラリを１５サイクル増幅し、続いてＰＣＲ精製した。
【００３８】
断片をＳａｃＩ−ＨＦおよびＸｈｏＩ制限酵素で切断し、標準的な手順によるフェノール／クロロホルム抽出とそれに続くエタノール沈殿で精製した。精製したライブラリを２％ＧＴＧアガロースゲルに流し、正しいサイズのバンドを切り出してゲル抽出した。
【００３９】
ｐＡＹＺ−ル−プファージミドをライブラリ断片と同じ方法で切断および精製した。
【００４０】
切断したファージミド５μｇを、Ｔ４リガーゼを用いて１６℃で一晩（ＯＮ）、ライブラリ断片１μｇ（５倍過剰）と連結した。連結物をフェノール／クロロホルム抽出とそれに続くエタノール沈殿によって精製した。２つのライブラリをプールした。
【００４１】
指示に従って、プールしたライブラリをエレクトロポレーション、２１反応によってＥＲ２７３８細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換した。１時間の表現型検査の後、形質転換反応物をプールし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ）を含むトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ、３０ｇ／ｌ、Ｍｅｒｃｋ）２×５００ｍｌ中、３７℃で一晩増殖させた。細胞を、１６時間後に２７００×ｇ、１５分、４℃で回収した。ペレットを２０％グリセロール（最終グリセロール濃度１５％）４０ｍｌに溶解し、アリコートに分けて−８０℃で保存した。
【００４２】
成熟ライブラリ
成熟ライブラリを、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、ｐＡＹＺ−ループにおいてＡ５遺伝子のすぐ上流および下流にそれぞれアニーリングするプライマーでのエラープローンＰＣＲによって作製した。鋳型０．１μｇを用いて５回の連続するエラープローンＰＣＲを実施した。ライブラリ断片を、ゲル抽出を用いて精製した。
【００４３】
ライブラリをファージミドに導入するために、ライブラリフ断片を制限フリークローニング反応において使用した。Ａ５遺伝子を含有するｐＡＹＺ−ループ５０ｎｇをライブラリフ断片６０ｎｇと混合し、熱サイクルさせた（９５℃１分［９５℃５０秒、６０℃５０秒、６８℃９分］×２５）。ＤｐｎＩ酵素（１μｌ）を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを用いてプラスミドを精製し、ＥＲ２７３８細胞にエレクトロポレーションした。
【００４４】
ライブラリの増幅
ライブラリサイズの１００倍（２×１０１０（元のライブラリ）または２×１０９（成熟ライブラリ））を、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌのＡｍｐ、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｔｅｔ）および１ｍＭのＣａＣｌ２を含むＴＳＢ  １００ｍｌに接種し、約０．５〜０．８のＯＤ６００まで３７℃でインキュベートした。１０倍過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。培養物を２つに分け、２５００×ｇで１０分間遠心分離した。各ペレットを、酵母抽出物（５ｇ／ｌ、Ｍｅｒｃｋ、ＴＳＢ＋Ｙ）を含むＴＳＢ  ５ｍｌに溶解した。各ペレットを、１００μｇ／ｍｌのＡｍｐ、５０μｇ／ｍｌのＫｍ、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および１ｍＭのＣａＣｌ２を含むＴＳＢ＋Ｙ  ４９５ｍｌに添加した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。
【００４５】
ファージ沈殿
細胞を１００００×ｇで１０分間ペレット化した。上清を保存し、上清容量の１／４の５×ＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ＰＥＧ６０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を添加し、氷上で１〜２時間インキュベートした。ファージを１０５００×ｇで３０分間ペレット化し、ペレットを５０ｍｌの培養物容量当たり１×ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）１０ｍｌに溶解し、０．４５μｍシリンジフィルタで濾過した。１／４容量の５×ＰＥＧ／ＮａＣｌを添加し、氷上で４５分間インキュベートした。沈殿物を３５００×ｇで５０分間遠心分離し、ペレットを１×ＴＢＳＴＢ（１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、３％ＢＳＡ）に溶解した。
【００４６】
ファージの滴定
マイクロプレートにおいて水中で一連の１：１０希釈液を作製することによってファージを滴定した。対数期のＥＲ２７３８細胞１００μｌを各ウェルに添加し、５分間インキュベートした。感染細菌（５μｌ／希釈液）をＡｍｐプレートに塗布し（１００μｇ／ｍｌ）、３７℃で一晩インキュベートした。
【００４７】
選択
回転させながら室温で４５分間、被覆緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩、ｐＨ９．６）３ｍｌ中のポリクローナルヒトＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）で被覆したＥＩＡ／ＲＩＡチューブ（高結合、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）において陰性選択を実施し、その後４℃で保存した。チューブを回転させながら室温で１時間、１００ｍＭのＥＤＴＡを含む１×ＴＢＳＴＢ  ３ｍｌでブロックした。ファージ原液（コロニー形成単位（ｃｆｕ）の量）を、１００ｍＭのＥＤＴＡを含む１×ＴＢＳＴＢ  ２ｍｌに希釈し、ブロックしたチューブに添加した。回転させながら室温で２０分間インキュベートした後、ファージ混合物を新しいチューブに移し、２０分間インキュベートした。
【００４８】
陰性選択の後、残りのファージを、３０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍｌ遠心フィルタ（Ｍｅｒｃｋ）において緩衝液交換した。濃縮器の膜を、１×ＴＢＳＴＢ  ５００μｌを用いて１４０００×ｇで５分間洗浄した。陰性選択からのアウトプット（ｏｕｔｐｕｔ）を一度に５００μｌ添加し、１４０００×ｇで５〜１０分間濃縮した。濃縮したファージを１×ＴＢＳＴ（１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。洗浄したファージを濃縮器から取り出し、２Ｍ尿素および５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１×ＴＢＳＴＢで最終容量１ｍｌに希釈した（インプット（ｉｎｐｕｔ）陽性選択）。
【００４９】
標的ポリクローナルＩｇＧを、ＥＺ−ｌｉｎｋ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて製造業者の指示に従ってビオチン化した。
【００５０】
１×ＴＢＳＴで洗浄し、回転させながら室温で３０分間、１×ＴＢＳＴＢでブロックしたストレプトアビジン被覆ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を予備選択および陽性選択に使用した。
【００５１】
陽性選択インプットを、回転させながら室温で１時間、ストレプトアビジンビーズおよびマイクロチューブ（１×ＴＢＳＴＢでブロックしたもの）に対して予備選択した。予備選択したライブラリ（上清）を５０ｎＭのビオチン化ＩｇＧと共に、回転させながら室温で２時間インキュベートした。標的のインキュベーション後、ファージおよび標的をストレプトアビジン被覆ビーズと共に、回転させながら室温で１５分間インキュベートした。ビーズを、２Ｍ尿素および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１×ＴＢＳＴ  １ｍｌ中で複数回洗浄した。洗浄後、ファージを、２Ｍ尿素および１００ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１×ＴＢＳＴＢ  ５００μｌで、室温で回転させながら５分間溶出させた。上清を保存し、１×ＴＢＳＴ  ４５０μｌおよび１Ｍ  ＣａＣｌ２  ５０μｌで希釈した。
【００５２】
選択後、溶出液（初回後の７５０μｌ、その後のすべての回について５００μｌ）を、さらに３７℃で対数期初期（ＯＤ６００  ０．５〜０．８）のＥＲ２７３８細胞５ｍｌに感染させることによって増幅した。Ａｍｐを最終濃度１００μｇ／ｍｌまで添加し、細胞を３７℃、１５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。５倍過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を３０００×ｇで１５分間ペレット化し、ＴＳＢ＋Ｙ  ５ｍｌに再懸濁した。これに続いて、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）、Ｋｍ（２５μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）およびＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を含むＴＳＢ＋Ｙ  ２００ｍｌ中、３０℃で一晩増幅した。ファージを前述のように沈殿させた。
【００５３】
配列決定
構築物をＰＣＲでスクリーニングし、続いてＢｉｇ  Ｄｙｅ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた単一プライマーサイクル配列決定反応を実施した。すべての配列決定は３７３０ｘｌ  ＤＮＡアナライザ（ＡＭＥ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で行った。
【００５４】
ファージＥＬＩＳＡ
アウトプット滴定からのコロニーを、９６ウェルディープウェルプレートにおいてＡｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）、Ｔｅｔ（１０μｇ／ｍｌ）およびＣａＣｌ２（１ｍＭ）を含むＴＳＢ＋Ｙ  ５００μｌ中に接種した。プレートを３７℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩培養物３０μｌを、Ａｍｐ、ＴｅｔおよびＣａＣｌ２を含むＴＳＢ＋Ｙ  ７２０ｍｌに添加し、３７℃、２５０ｒｐｍで２時間インキュベートした。Ａｍｐ、Ｔｅｔ、ＣａＣｌ２および１０９  Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含むＴＳＢ＋Ｙ  １００μｌを各ウェルに添加し、３７℃でさらに３０分間感染させた。Ａｍｐ、Ｔｅｔ、ＣａＣｌ２、Ｋｍ（２５０μｇ／ｍｌ）およびＩＰＴＧ（０．７ｍＭ）を含むＴＳＢ＋Ｙ  １５０μｌを各ウェルに添加し、プレートを３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。ファージ培養物を３０００×ｇで１５分間回収し、上清を保存した。
【００５５】
未処理の９６ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、１×ＴＢＳ中１μｇ／ｍｌのポリクローナルヒトＩｇＧ、５０μｌ／ウェルで、４℃で一晩被覆した。
【００５６】
各ファージ上清を２つのＥＬＩＳＡ実験に供し、１つはすべての緩衝液が１００ｍＭのＥＤＴＡを含むものであり、もう１つはすべての緩衝液が１ｍＭのＣａＣｌ２を含むものであった。元のＺ骨格を提示するファージを陽性対照として使用し、非ＩｇＧ結合剤を提示するファージを陰性対照として使用した。
【００５７】
プレートを１×ＴＢＳ中の０．５％カゼイン、１４０μｌ／ウェルで、低い振とう速度で室温にて２時間ブロックした。ファージ上清を０．５％カゼイン中で１：２０に希釈し、室温で３０分間放置した。５０μｌ／ウェルの希釈したファージを２つのプレートに添加し、低振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートを１×ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）でさらに３×１０分間、１４０μｌ／ウェルで洗浄し、続いて０．５％カゼイン中で１：５０００に希釈した抗Ｍ１３−ＨＲＰ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に、低振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  ５０μｌで反応を停止させる１５〜３０分前にＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）５０μｌで発色させた。吸光度を、Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）マイクロプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ）において４５０ｎＭで読み取った。
【００５８】
タンパク質生成、精製および分析
発現
選択した変異体を発現ベクターにサブクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ４Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に形質転換した。単一コロニーを、Ｋｍ（５０μｇ／ｍｌ）を含むＴＳＢ＋Ｙ  ５ｍｌに接種し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩増殖させた。Ｋｍ（５０μｇ／ｍｌ）およびＣａＣｌ２（１ｍＭ）を含むＴＳＢ＋Ｙ  １００ｍｌに一晩培養物１ｍｌを添加することによって培養を開始し、ＯＤ６００が０．８〜１に達するまで３７℃、１５０ｒｐｍで増殖させた。培養物をＩＰＴＧ（１ｍＭ）で誘導し、２５℃で一晩増殖させた。培養物を４℃で８分間、２４００×ｇで回収し、続いてペレットを１×ＴＢＳＴ−Ｃ（１×ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）５ｍｌに再懸濁した。再懸濁したペレットを１×ＴＢＳＴ−Ｃで１０ｍｌに希釈し、Ｖｉｂｒａ−ｃｅｌｌ（Ｓｏｎｉｃｓ）を用いて１分３０秒間、４０％振幅、１．０／１．０ｓのパルスで超音波処理した。溶解した細胞を４℃で２０分間、３５０００×ｇでペレット化した後、上清を精製用に保存した。
【００５９】
精製
ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）４ｍｌを充填したカラムを、ｄＨ２Ｏ  ２０ｍｌ、０．３Ｍ  ＨＡｃ（ｐＨ３．２）２０ｍｌおよび１×ＴＢＳＴ−Ｃ  ２０ｍｌで洗浄した。カラムを０．３Ｍ  ＨＡｃ  １０ｍｌでパルスし、続いて１×ＴＢＳＴ−Ｃ  ５０ｍｌで平衡させた。細胞溶解物を添加し、続いて１×ＴＢＳＴ−Ｃ  ７５ｍｌで洗浄した。１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ（ｐＨ５．５）５０ｍｌでカラムを洗浄した後、１５×１ｍｌ画分中の０．３Ｍ  ＨＡｃで溶出した。２８０ｎｍで最も高い吸光度を有する画分を凍結乾燥し、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１×ＴＢＳに溶解し、ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて濃度を決定した。
【００６０】
質量分析
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を用いて、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（５ｍｇ／ｍｌ、Ｂｒｕｋｅｒ）と１：１で混合することによって分子量を決定し、ＭＡＬＤＩ標的上にスポットし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＬＴ３プラス（ＳＡＩ）または４８００  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−ＭＳも使用し、試料をＣ４カラム（μ−Ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ３００  Ｃ４、５μｍ、３００Ａ、内径３００μｍ×５ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ）で脱塩し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５２０  ＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦシステムで分析した。
【００６１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
タンパク質試料を、最終濃度が２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、８８ｍＭ  ＳＤＳ、７２０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１７％グリセロールになるように還元緩衝液と混合することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質の純度を決定し、９５℃で５分間加熱した。還元した試料を、１×ＴＧＳランニング緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中のＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に２００Ｖ、４℃で３０分間流した。ゲルをｄＨ２Ｏ中で３×５分間洗浄した後、ＧｅｌＣｏｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１時間染色した。ゲルをｄＨ２Ｏ中で一晩脱染した。使用したマーカーはＬＭＷ−ＳＤＳマーカーキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。
【００６２】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロット分析のために、１×ＭＥＳ（５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ７．３）をランニング緩衝液として使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で泳動させた。０．４５μｍのＩｎｖｉｔｒｏｌｏｎ  ＰＶＤＦウェスタンブロット膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への転写を、１×転写緩衝液（２５ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ、２５ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％エタノール、ｐＨ７．２）中で、ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を分子量マーカーとして用いて４０Ｖで９０分間行った。ブロッキング緩衝液（５％粉乳、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて室温で１時間ブロッキングを行った。ヒト抗体を、ブロッキング緩衝液中１：５０００希釈のＨＲＰ結合ヤギ抗ヒト抗体（Ｎｏｖｅｘ）を用いて室温で１時間検出した。１×ＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で４×５分間洗浄を行い、続いてＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋システムでＩｍｍｏｂｉｌｏｎウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｅｒｃｋ）を読み取った。
【００６３】
ＣＤ
すべてのＣＤ測定は、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計で行った。ＣＤスペクトルを、１００ｎｍ／分の走査速度および０．１ｎｍのデータピッチで、０．１ｃｍのセル長にて２５０〜１９５ｎｍで測定した。タンパク質融解曲線は、５℃／分の温度勾配を用いて２２１ｎｍで２０〜９０℃の間で測定した。
【００６４】
予備試験：タンパク質を、それぞれ１００倍モル過剰のＥＤＴＡまたはＣａＣｌ２を含む１×ＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎなしの１×ＰＢＳＴ）中で０．４ｍｇ／ｍｌに希釈した。最初の選択：Ａ５を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２もしくは３ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１×ＴＢＳまたは１Ｍ尿素および１ｍＭ  ＣａＣｌ２もしくは３ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１×ＴＢＳ中で０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。成熟選択：Ｚｍａｔ１〜９、ＺまたはＡ５を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２または３ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１×ＴＢＳ中で０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【００６５】
ＳＰＲ
試験変異体
試験変異体をＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にかけた。標準的なアミンカップリング手順を用いてＧＬＭセンサーチップを活性化した。モノクローナルヒトＩｇＧを、５０００ＲＵの固定化レベルに達するようにＮａＡｃ  ｐＨ４に希釈して１０μｇ／ｍｌで注入した。表面をエタノールアミンで不活性化させ、１０ｍＭ  ＨＣｌで再生した。試験前の変異体をランニング緩衝液中で３００、１００、３３、１１、３．７および０ｎＭに希釈し、３３０秒の会合および３０００秒の解離時間を用いて５０μｌ／分で注入した。すべてのタンパク質を、１×ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）、３０μＭ  ＣａＣｌ２を含む１×ＰＢＳＴ、および３０μＭ  ＥＤＴＡを含む１×ＰＢＳＴを用いて泳動した。緩衝液を差し引いたデータを、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアバージョン３．１．０．６を用いて１：１ラングミュア等温線に適合させた。
【００６６】
最初の選択
Ａ５タンパク質をＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。１×ＰＢＳＴをランニング緩衝液として用いて、ポリクローナルヒトＩｇＧを、アミンカップリングによって４０００ＲＵまでＣＭ５チップ表面に固定化した。Ａ５タンパク質を１ｍＭ  ＣａＣｌ２または１００ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１×ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で２００、１００、５０、２５および１２．５ｎＭに希釈し、１８０秒の会合および４２０秒の解離時間を用いて５０μｌ／分で注入した。表面を１０ｍＭ  ＨＣｌ  ３０μｌ／分、３０秒で再生した。Ａ５をまた、同じランニング緩衝液中であるが２Ｍ尿素を添加して注入し、次いで１０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５および０ｎＭに希釈した。
【００６７】
成熟選択
成熟変異体（Ｚｍａｔ１〜９）、Ａ５および元のＺドメインをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析した。１×ＰＢＳＴをランニング緩衝液として用いて、ポリクローナルヒトＩｇＧおよびモノクローナルヒトＩｇＧ１をアミンカップリングによって４０００ＲＵまでＣＭ５チップ上に固定化した。タンパク質を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２または１００ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１×ＴＢＳＴ中に希釈し、１８０秒の会合および４２０秒の解離時間を用いて５０μｌ／分で、単一サイクルキネティクスによって泳動した。再生は、１０ｍＭ  ＨＣｌを用いて３０μｌ／分、３０秒で行った。元のＺドメインは両方の緩衝液中で２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６および０ｎＭで泳動した。Ａ５、Ｚｍａｔ１〜３、Ｚｍａｔ５およびＺｍａｔ７〜９は、カルシウム含有緩衝液中１００、５０、２５、１２．５、６．２５および０ｎＭ、ならびにＥＤＴＡ含有緩衝液中１０００、５００、２５０、１２５、６２．５および０ｎＭで泳動した。Ｚｍａｔ４およびＺｍａｔ６は、カルシウム含有緩衝液中４００、２００、１００、５０、２５および０ｎＭ、ならびにＥＤＴＡ含有緩衝液中４０００、２０００、１０００、５００、２５０および０ｎＭで泳動した。
【００６８】
精製試験ＩｇＧセファロース
ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）約６００μｌをＮＡＰ−５カラムに充填した。カラムを０．３Ｍ  ＨＡｃ（ｐＨ３．２）２ｍｌおよび１×ＴＢＳＴ−Ｃ  ２ｍｌで２回パルスした。１×ＴＢＳＴ−Ｃ中で１．２ｍｌに希釈したタンパク質１００μｇをカラムに添加し、続いて１×ＴＢＳＴ−Ｃ  ６ｍｌで洗浄した。タンパク質を、１００ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ（ｐＨ５、５．７、６、６．５または７）８×２００μｌでの溶出について試験した。ｐＨ５の同じ溶出緩衝液であるがＥＤＴＡの代わりに１ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いた対照実験も行った。最初の溶出後、カラムを１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むｐＨ５．５の５ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ  １．２ｍｌで洗浄し、続いて０．３Ｍ  ＨＡｃ、ｐＨ３．２を含む画分８×２００μｌで溶出した。すべての溶出画分を９６ウェルＵＶ  Ｓｔａｒ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に収集し、それらの２８０ｎＭでの吸光度をＣＬＡＲＩＯＳｔａｒ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）プレートリーダで測定した。
【００６９】
精製試験Ｚｍａｔ８およびＺカラム
Ｚｍａｔ８およびＺを上記のようにクローニングし、作製し、精製した。各タンパク質１０ｍｇを、カップリングｐＨ６．５およびカップリング時間３０分で、製造業者の指示に従ってＨｉＴｒａｐ（商標）ＮＨＳ活性化ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１ｍｌにカップリングした。
【００７０】
純粋なポリクローナルヒトＩｇＧ、スパイクしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞上清（１００ｍｇ／ｌポリクローナルヒトＩｇＧ）および実際のＣＨＯ細胞上清（モノクローナルヒトＩｇＧ約１０ｍｇ／ｌ）の精製を、１ｍｌ／分の流速を用いてＡｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。カラムのパルシングを、６カラム容量（ＣＶ）の１×ＴＢＳＴ−Ｃ、続いて６ＣＶ溶出緩衝液（０．３Ｍ  ＨＡｃ  ｐＨ３．２または１００ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ５．５または１００ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ５．５）で行った。２ｍｌの試料ループを用いて試料注入前に１３ＣＶの１×ＴＢＳＴ−Ｃで平衡化を行った。１３ＣＶの１×ＴＢＳＴ−Ｃ、続いて５ＣＶの５ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ５．５で洗浄を行った。タンパク質を６ＣＶ溶出緩衝液で溶出し、０．５ｍｌ画分に収集した。再生は、３ＣＶの溶出緩衝液および６ＣＶの１×ＴＢＳＴ−Ｃを用いて行った。
【００７１】
実験項
ループ位置の決定
Ｚドメインにカルシウム結合ループを導入するための最良の位置を見つけるために、種々のカルシウム結合タンパク質およびＺドメインの構造を検討した。カルモジュリン（１８、６．６Å）、カルパインドメイン（１９、７．３Å）およびカルシウムが結合したＡｔＣＢＬ２タンパク質（２０、６．６Å）のカルシウム結合ループのＮ末端とＣ末端との間の距離、ならびにカルモジュリンループのアポ型での対応する距離（２１、９．６Å、２２、平均１２Å、２３、９．０Å）を測定した。これらの距離を、Ｚドメインのヘリックス１と２（平均１２Å）、および２と３（平均７Å）の間のループのＮ末端とＣ末端との間の距離と比較した２４。Ｚドメインのヘリックス２と３の間のループのＮ末端とＣ末端との間の距離（７Å）は、種々のカルシウム結合ループのカルシウム結合形態における距離（６．６〜７．３Å）とよく一致し、同時にカルモジュリンループの非結合形態（９〜１２Å）とは異なっていたので、カルシウム結合ループをＺドメインのヘリックス２と３の間に導入した。
【００７２】
カルシウム結合ループの移植
ヘリックス２と３の間のループの構造的および機能的依存性を調べるために、カルモジュリン由来のカルシウム結合ループのうちの１つをＺドメインに移植した。Ｚドメインのヘリックス２と３の間のループ（アミノ酸配列：ＤＰＳＱ）をカルモジュリンループ（アミノ酸配列：ＤＫＤＧＤＧＴＩＴＴＫＥ、配列番号１１）と交換した。ループの前後にリンカーを付加することの影響も検討した。グリシンおよびセリン残基はリンカーとして一般的に使用されており、ロイシンは、ループのＮ末端の疎水性残基の影響を調べるために付加した。したがって、６つの変異体を設計し、検討した：ループのみを付加したもの（Ｚ−ループ）、ループのＮ−末端にＬｅｕ残基を付加したもの（Ｚ−Ｌｅｕ−ループ）、ループのＮ−末端に３つのグリシンまたはセリンを付加したもの（Ｚ−ＧＧＧ−ループ、Ｚ−ＳＳＳ−ループ）、およびループのＮ末端およびＣ末端に３つのグリシンまたはセリンを付加したもの（Ｚ−ＧＧＧ−ループ−ＧＧＧ、Ｚ−ＳＳＳ−ループ−ＳＳＳ）。変異体ならびに元のＺドメインを作製し、ＩｇＧアフィニティクロマトグラフィによって均一になるまで精製した。タンパク質を、円二色性（ＣＤ）を用いて、１×ＰＢＳ、１００倍モル過剰のＣａＣｌ２を含む１×ＰＢＳ、および１００倍モル過剰のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む１×ＰＢＳにおける二次構造含量および融解温度についてそれぞれ分析した。変異体とモノクローナルヒトＩｇＧとの相互作用を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補完したＣＤ実験で使用したものと同じランニング緩衝液で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて検討した。センサーグラムは、ランニング緩衝液にかかわりなく固定化ＩｇＧとの相互作用を示したが、緩衝液中のカルシウムおよびＥＤＴＡに関するデータは速度論的解析に使用することができなかった。ＺドメインのＩｇＧに対する親和性は、カルモジュリンループの単なる導入によって低下した。ループのＮ末端にロイシンを導入すると、ドメインの構造的安定化がもたらされ、これはＩｇＧに対する親和性の回復をもたらした。ループのＮ末端およびＣ末端にグリシンまたはセリンリンカーを有することは、Ｚドメインと比較してＩｇＧに対する親和性の最大の差異を生じさせた。Ｚ−ループおよびＺ−ＧＧＧ−ループは、カルシウム含有緩衝液とＥＤＴＡ含有緩衝液との間の融解温度の差が最も大きく、カルシウム依存安定性を示す、元のＺドメインと比較してＩｇＧに約１０倍低い親和性を示したため、さらなる検討のために選択した。
【００７３】
ライブラリ設計
より顕著なカルシウム依存性を有する変異体を作製するための試みとして、２つの変異体Ｚ−ループおよびＺ−ＧＧＧ−ループ上に構築されるコンビナトリアルファージミドライブラリを設計した。多数のカルシウム結合ループの配列に基づき１３，２５、多種多様な標準的ＥＦハンドループをカバーするように縮重コドンを選択した。Ｚドメインの三次元構造を作製し、それによってＩｇＧへの結合能力をカルシウム結合ループのコンフォメーションにより依存性にするために、構造的に不安定化する突然変異を、３０、４４、４８および５１位を変えることによってライブラリ設計に含めた２６−２８。３０位には、元のフェニルアラニンの他に置換Ｆ３０Ａのみを含めた。４４、４８および５１位については、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、ＴｒｐおよびＶａｌをコードするコドンＫＢＧを使用した。このライブラリは、カルシウム結合ループ中のライブラリに加えて、３０、４４、４８、５１位またはこれらの２もしくは数個の組み合わせのいずれかに、５０％の「野生型」Ｚ骨格および５０％のさらなる置換を有するものを含むように設計した。理論的には、各ライブラリ（Ｚ−ループライブラリおよびＺ−ＧＧＧ−ループライブラリ）のサイズは２×１０８であった。両方のサブライブラリをプールした最終ライブラリは、形質転換後に２×１０８のサイズを有し、これは理論上のサイズの半分に相当する。
【００７４】
最初の選択
ライブラリから所望の変異体を選択するために４回の選択を行った。各々の回はＩｇＧに対する陰性選択から開始し、ＥＤＴＡの存在下でライブラリをインキュベートして、そのような条件下で結合した変異体を除去した。ＥＤＴＡの存在下でＩｇＧに結合することができなかったすべての変異体を含む上清をカルシウム含有緩衝液に緩衝液交換し、陽性選択に使用した。添加したファージの量と比較して過剰の標的（ポリクローナルヒトＩｇＧ）を用いてすべての陽性選択を行った。ファージ提示されたライブラリメンバーをさらに構造的に不安定化するために、漸増回数の洗浄を実施し、すべての工程に２Ｍ尿素が存在した。ファージの溶出はＥＤＴＡを用いて行った。４回の陰性選択および陽性選択の後、ファージ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いてアウトプットをスクリーニングし、カルシウムまたはＥＤＴＡの存在下でのＩｇＧへの結合をそれぞれ測定した。２８２のスクリーニングしたファージ上清のうちで、Ａ５と表される１つのクローンは、カルシウムまたはＥＤＴＡの存在下でＩｇＧへの結合に大きな差異を示した（図１ａ）。
【００７５】
クローンＡ５を配列番号１０と配列決定し、可溶性タンパク質を生成するために発現ベクターにクローニングした。この配列は、元のＺ骨格に組み込まれたループのＮ末端にＧＧＧリンカーを含んでいた。タンパク質を細菌中で発現させ、ＩｇＧセファロース上で均一になるまで精製した。純度および分子量を、それぞれドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および質量分析（ＭＳ）によって確認した。精製したドメインを、緩衝液中に尿素が存在するか否かにかかわらず、カルシウムまたはＥＤＴＡの存在下でＩｇＧに対するその親和性についてＳＰＲによって評価した。ＩｇＧに対するＡ５の解離平衡定数（ＫＤ）は、カルシウムまたはＥＤＴＡでそれぞれ２０および５０ｎＭ、２Ｍ尿素およびカルシウムまたはＥＤＴＡでそれぞれ１７０および３３０ｎＭであった。同じリガンド表面上に注入した種々のランニング緩衝液中の同じ濃度のタンパク質からのセンサーグラムを図１ｂおよびｃに示し、シグナルおよび曲率の違いを視覚化している。ランニング緩衝液中に存在するＥＤＴＡとの解離がカルシウム含有ランニング緩衝液よりもはるかに速いことは明らかである。また、達成された結合シグナルは、カルシウムが存在する場合により高かった。
【００７６】
尿素の有無にかかわらず、カルシウムまたはＥＤＴＡの存在下での二次構造ならびに融解温度を、ＣＤおよび熱変性後のリフォールディング能力を用いて分析した。タンパク質Ａ５は、緩衝液にかかわりなく融解後にリフォールディングすることができた。融解温度は、ＥＤＴＡまたはカルシウムを含む緩衝液間で３〜４度異なった。二次構造を示すＣＤスペクトルから、ＥＤＴＡと比較してカルシウムが緩衝液中に存在する場合、Ａ５はより高いαへリックス含量を有すると考えられる。合わせて考慮すると、これらのデータは、変異体Ａ５が、ＩｇＧに対する親和性および二次構造含量においてカルシウム依存性の差異を示すことを示唆する。しかしながら、ＥＤＴＡが存在する場合のＩｇＧに対する親和性は、カラム精製の設定におけるＥＤＴＡ媒介カルシウム枯渇による効率的な溶出のためにはまだ高すぎた。
【００７７】
成熟ライブラリ
最初の選択は１つの興味深い配列しかもたらさなかったので、選択したクローンの配列アラインメントによって機能的に重要な残基を同定することはできなかった。そのため、Ａ５を鋳型として用いるエラープローンＰＣＲによって成熟ライブラリを作製した。目的は、遺伝子当たり平均２個または３個のランダムなアミノ酸変異を有するライブラリであった。最終ライブラリサイズは２×１０７であり、予想された突然変異頻度は＞２５０クローンの配列決定に基づいた。
【００７８】
成熟選択
２番目の選択を３つの平行なトラックで行った。最初の選択戦略と同様に、第一段階は、ライブラリをＥＤＴＡ含有緩衝液中のポリクローナルヒトＩｇＧに供する陰性選択であった。これに続いて、陰性選択からのすべての非結合変異体を含む上清を、カルシウムの存在下でファージと比較して過剰の標的に曝露する陽性選択を行った。洗浄後、ＥＤＴＡの添加時に溶出したファージを回収した。１つのトラックでは、２Ｍ  尿素がすべての回の陽性選択に存在した。２番目のトラックでは、尿素の量を陽性選択に比べて減少させ、３番目のトラックでは尿素は存在しなかった。３つのトラックからのアウトプット（トラック当たり１９２クローン）を、それぞれカルシウムまたはＥＤＴＡの存在下でのＩｇＧへの結合を比較するファージＥＬＩＳＡでスクリーニングした。最も有望な候補物を三重に再分析し、上位９つのユニークな候補物からの結果を図２に示す。
【００７９】
上位９つの変異体（Ｚｍａｔ１〜Ｚｍａｔ１９）を配列番号１〜９と配列決定した。それらはすべて、ＩｇＧ結合に関与すると記載されている位置に置換を有する（Ｆ５、Ｈ１８、Ｎ２８、Ｑ３２およびＫ３５）２４、２９、３０。さらに、いくつかの変異体（Ｚｍａｔ１〜３）は、ループの前のリンカーにＧｌｙからＳｅｒへの突然変異を有する。変異体のうちの１つ（Ｚｍａｔ３）だけが、Ａ５と比較してカルシウム結合ループに変異を有する。
【００８０】
Ｚｍａｔ１〜９を作製し、均一になるまで精製して、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、分子量をＭＳによって確認した。ドメインを二次構造およびＩｇＧ結合に関して分析し、元のＺドメインおよび親Ａ５変異体と比較した。カルシウムまたはＥＤＴＡの存在下でのＩｇＧに対する変異体の親和性を、それぞれＳＰＲによって測定した。二次構造含量、融解温度および融解後にリフォールディングする能力を同じ条件でＣＤによって調べた。すべての変異体が融解後にリフォールディングすることができた。実験の概要を表１に示す。
【００８１】
【表１】
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精製実験
実験１
ファージＥＬＩＳＡ、ＳＰＲおよびＣＤからの結果に基づき、カルシウムの有無にかかわりなく検出された差異に注目して、Ｚｍａｔ１（配列番号１）、Ｚｍａｔ３（配列番号３）、Ｚｍａｔ６（配列番号６）およびＺｍａｔ８（配列番号８）を精製設定においてさらに検討することを決定した。タンパク質変異体がＥＤＴＡを使用して溶出できるかどうかを調べるために、一定量のタンパク質（１００μｇ）をＩｇＧセファロースカラムに充填した。検討したさらなる因子は、溶出緩衝液への１Ｍ尿素の添加、高温（３７℃）での溶出、および最終溶出前の３０分間の溶出緩衝液とのインキュベーションであった。対照として、ＥＤＴＡ溶出の後にｐＨ３．２での従来の溶出を行い、カラムから残留タンパク質を回収した。元のＺドメインはｐＨ３．２でしか溶出できないが、緩衝液のｐＨが５に低下すれば、Ｚｍａｔ８はカルシウム依存的に溶出できると結論付けられた。溶出したピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。Ｚｍａｔ８の挙動をさらに特徴付けるために、溶出緩衝液のｐＨの段階的上昇（ｐＨ５．５、５．７、６、６．５および７）を検討し、ここでＺｍａｔ８は、ｐＨ５．５ではＥＤＴＡで溶出されるが、ｐＨをさらに上昇させた場合は溶出されないことが示された。
【００８２】
Ｚｍａｔ８の配列は配列番号８に示されている。これは、ヘリックス１および２に３つのアミノ酸置換、Ｆ５Ｌ、Ｎ２８ＫおよびＫ３５Ｉを含む。これは、３７〜３９位にＧＧＧリンカーおよび４０〜５１位にカルシウム結合モチーフを含む。すべての位置がＺドメインとＩｇＧとの間の相互作用にとって重要である。それはまた、５５位の突然変異、Ｑ５５Ｒも含む（元のＺ骨格による番号付け、Ｚｍａｔ８の場合、このアミノ酸は６６位にある）。元のアミノ酸は、元の骨格の他のアミノ酸と水素結合を形成する３１。
【００８３】
適切な精製設定でＺｍａｔ８にチャレンジする（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）ために、これをＮＨＳ活性化マトリックスにカップリングした。親ドメインＺも同様にカップリングし、２つの異なるカラムからの結果を比較した。ポリクローナルヒトＩｇＧをカラムに捕捉することができるかどうか、および捕捉された抗体がどのような条件下で溶出されるかを調べた。ＩｇＧは、ｐＨ５．５でカルシウム依存的にＺｍａｔ８カラムから溶出したが（図３ａ）、Ｚカラムでは溶出しなかった（図３ｂ）。対照として、ｐＨを３．２に下げることによって両方のカラムからＩｇＧを溶出させ、これは、ＩｇＧがＺｍａｔ８カラム上の酸に匹敵する方法でＥＤＴＡで溶出されることを示した。さらに、Ｚｍａｔ８およびＺカラムから低いｐＨで得られた溶出プロフィールは非常に類似することが示された（図３）。
【００８４】
ポリクローナルヒトＩｇＧ（１００ｍｇ／ｌ）でスパイクしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養上清および生成されたヒトＩｇＧ（約１０ｍｇ／ｌ）を含むＣＨＯ細胞培養上清を試験精製に使用した。図４の生成されたＩｇＧを含む上清によって例示されるように、両方の上清を、Ｚｍａｔ８カラムでの捕捉後にＥＤＴＡ溶出を用いて高い均一性および純度まで精製した。
【００８５】
実験２
Ｃ末端システインを含むＺｍａｔ８（配列番号８）の単量体および頭−尾多量体（二量体、三量体および四量体）の遺伝子を増幅し、発現ベクターにクローニングした。タンパク質を大腸菌で発現させ、ＩｇＧセファロースで精製した。
【００８６】
等モル量のタンパク質を、システインの共有結合固定化のためにヨードアセチル樹脂（ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ（商標）カップリング樹脂、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に固定化した。カラムの結合能力を試験するために、ＥＤＴＡ溶出による試験精製設定において大過剰のポリクローナルヒトＩｇＧを樹脂に添加した。
【００８７】
材料および方法
樹脂カップリング
タンパク質のカラムへの共有結合および不可逆的固定化を、Ｃ末端システインを介してヨードアセチル基で活性化したＳｕｌｆｏＬｉｎｋ（登録商標）カップリング樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。Ｚｍａｔ８ＭｏｎｏＣｙｓ  ０．５ｍｇ、Ｚｍａｔ８ＤｉＣｙｓ  １ｍｇ、Ｚｍａｔ８ＴｒｉＣｙｓ  １．５ｍｇおよびＺｍａｔ８ＴｅｔＣｙｓ  ２ｍｇに対応する約７０ナノモルの各タンパク質変異体を、総容量１ｍｌのカップリング緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に希釈した。各タンパク質の正確な量を確保にするために、エッペンドルフバイオフォトメータを用いて２８０ｎｍでの吸光度を測定した。ｐＨを７に調整した０．５Ｍ  ＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ）を２５ｍＭの最終濃度まで添加し、室温で３０分間インキュベートした。空にしたＮＡＰ−５カラムを使用して、暗所でカップリング反応を生じさせることを追加して、１ｍｌのＳｕｌｆｏＬｉｎｋ（登録商標）カップリング樹脂床への各タンパク質の共有結合固定化を製造業者の指示に従って実施した。保存緩衝液として、２０％ＥｔＯＨを含む１×ＴＢＳＴ−Ｃを使用した。カップリング反応後にカラムから回収した非カップリング画分の２８０ｎｍでの吸光度を測定し、それらをタンパク質混合物をカラムに添加する前に測定した吸光度と比較することによってカップリング度を決定した。
【００８８】
精製
カップリングした樹脂の容量を試験するために、試験精製を３回実施した。１×ＴＢＳＴ−Ｃ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．５）２ｍｌ中の大過剰（５０ｍｇ）の純粋なポリクローナルヒトＩｇＧを、各試験精製の間に各カラムで精製した。カラムを０．３Ｍ  ＨＡｃ（ｐＨ３．３）４ｍｌおよび１×ＴＢＳＴ−Ｃ  ４ｍｌで２回パルスした。純粋なＩｇＧ  ２ｍｌを添加し、続いて１×ＴＢＳＴ−Ｃ  １０ｍｌで洗浄した。溶出緩衝液（１００ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５）を１０×３００μｌの画分に添加した。カラムを５ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ  ３ｍｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２で洗浄した後、１０×３００μｌ画分中の０．３Ｍ  ＨＡｃで２回目の溶出を行った。再生は、０．３Ｍ  ＨＡｃ  ４ｍｌ、１×ＴＢＳＴ−Ｃ  ２０ｍｌおよび２０％ＥｔＯＨを含む１×ＴＢＳＴ  ２０ｍｌで実施した。各溶出画分の２８０ｎｍでの吸光度を測定して、カラムから溶出したタンパク質の量を決定した。
【００８９】
結果
カップリング前のタンパク質の吸光度とカップリング後の流動タンパク質の吸光度とを比較すると、樹脂へのカップリング効率は、単量体、二量体、三量体および四量体についてそれぞれ５４、４２、４８および４９％であった。
【００９０】
種々のカラムで過剰のＩｇＧを用いた試験精製を３回行った。各画分中のタンパク質の平均溶出量を図５に示す。Ｚｍａｔ８の多量体変異体から、単量体変異体よりも多くのタンパク質が溶出される。
【００９１】
図５は、大過剰のヒトポリクローナルＩｇＧを、ＥＤＴＡ溶出を用いてＺｍａｔ８の単量体（灰色）、二量体（斜め縞）、三量体（白色）または四量体（横縞）で精製した場合の各画分（ｎ＝３）中のタンパク質の平均溶出量を示す。
【００９２】
各カラムからのｍｇ単位の溶出タンパク質の総量およびその平均を表２に示す。ＨＡｃ溶出画分では吸光度を測定することができず、ＥＤＴＡによる全タンパク質の溶出がすべての多量体変異体で成功したことを意味した。
【００９３】
【表２】
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実験３
Ｃ末端システインを有するＺｍａｔ８の頭−尾多量体を、ＨｉＴｒａｐ（商標）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中のアガロースベースのマトリックス１ｍｌにカップリングした。試験した変異体は三量体および四量体であった。リガンドの量は、三量体については４．５ｍｇ／ｍｌ、四量体については３．２ｍｇ／ｍｌと決定した。
【００９４】
このカラムを、ポリクローナルヒトＩｇＧを用いたＡＥＫＴＡ  Ｐｕｒｅでの精製に使用した。ＩｇＧ  ４０ｍｇの注入は両方のカラムを飽和させることが示された。ＩｇＧを、ｐＨ５．５の１００ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて溶出した（図６）。ｐＨ３．３での溶出も行い、ＩｇＧがカラムに残っていないことを確認した。２つの変異体についての精製能力を決定するために、２つのカラムのＥＤＴＡ溶出ピークの面積を比較した（表３）。四量体は、三量体と比較して、結合分子当たり１．８倍多いＩｇＧおよび結合部位当たり１．３倍多いＩｇＧに結合することができ、カラム精製設定において四量体が三量体よりも高い結合能を有することを示した。
【００９５】
【表３】
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材料および方法
Ｚｍａｔ８ＴｒｉＣｙｓおよびＺｍａｔ８ＴｅｔＣｙｓを、Ｃ末端システインを介してアガロースベースの樹脂に共有結合的に固定化し、ＨｉＴｒａｐ（商標）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１ｍｌに充填した。アミノ酸分析によってカップリング度を決定した。カラムを使用してＡＥＫＴＡ  Ｐｕｒｅクロマトグラフィシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でヒトポリクローナルＩｇＧを精製した。
【００９６】
カラムを６カラム容量（ｃ．ｖ．）の１×ＴＢＳＴ−Ｃ（１×ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５））および６ｃ．ｖ．の溶出緩衝液（０．３Ｍ  ＨＡｃ、ｐＨ３．３または１００ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５）でパルスした後、１３ｃ．ｖ．の１×ＴＢＳＴ−Ｃで平衡させた。次いで、それらを１×ＴＢＳＴ−Ｃ  ２ｍｌ中のＩｇＧ  ４０ｍｇで飽和させ、続いて１３ｃ．ｖ．の１×ＴＢＳＴ−Ｃおよび５  ｃ．ｖ．の５ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２で洗浄した。次に、６ｃ．ｖ．の溶出緩衝液をカラムに添加し、溶出液を５００μｌの画分に収集した。カラムを３ｃ．ｖ．の溶出緩衝液および６ｃ．ｖ．の１×ＴＢＳＴ−Ｃを用いて再生した。両方の溶出緩衝液と両方のタンパク質リガンドを比較するために、各溶出緩衝液を用いた三重測定をＺｍａｔ８ＴｒｉＣｙｓまたはＺｍａｔ８ＴｅｔＣｙｓを用いて各カラムで実施した。各精製のピーク面積を含むＡｂｓ２８０クロマトグラムをＡＥＫＴＡ  Ｐｕｒｅソフトウェアによって作成した。
【００９７】
アルカリ安定性
Ｚｍａｔ８のアルカリ安定性を改善できるかどうかを試験するために、元のＺドメインのアルカリ安定性を改善することが公知の突然変異、Ｎ３Ａ、Ｎ６ＡおよびＮ２３Ｔ、ならびにカルシウム結合ループの一部である２つのアスパラギン、Ｎ４２ＤおよびＮ４４Ｄを分子に導入した。６位、４２位、または４４位の突然変異は、ＩｇＧとＺｍａｔ８との間の親和性を低下させ、精製時にカラムからの漏出を引き起こし、そのためさらなる検討には不適切であると見なされた。Ｎ３Ａ変異は、Ｚｍａｔ８と比較してアルカリ安定性の変化を示さず、親和性の変化も示さなかった。
【００９８】
Ｎ２３Ｔの影響をさらに評価するために、Ｚｍａｔ８およびＺｍａｔ８（Ｎ２３Ｔ）をＢｉａｃｏｒｅチップ表面に結合した。ＩｇＧを表面上に注入し、続いて１００ｍＭ  ＮａＯＨおよび１ｍＭ  ＣａＣｌ２で３０サイクルにわたって再生した。各サイクルの最大応答を正規化し、図７に示すようにプロットした。Ｎ２３Ｔ変異は、Ｚｍａｔ８と比較してアルカリ安定性の改善を示した。
【００９９】
材料および方法
ミスマッチＰＣＲおよび標準的なクローニング手順を用いて変異体を作製した。それらを配列確認し、大腸菌中で産生させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳによって均一性確認されるまで精製した。
【０１００】
ＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。１×ＨＢＳＴＣ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）をランニング緩衝液として使用した。１００ＲＵを目指す固定化ウィザードを使用して変異体をチップ表面に結合した。カップリング後、チップを３回のブランク注入および１０ｍＭ  ＨＣｌ再生を伴う１回の試験ＩｇＧ注入で調整した。
【０１０１】
５００ｎＭのポリクローナルヒトＩｇＧを、１８０秒の会合および４２０秒の解離時間を用いて５０μｌ／分で表面に注入した。１００ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いて３０μｌ／分で３０秒間表面を再生した。ＩｇＧ注入とそれに続く再生の３０サイクルを実施した。
【０１０２】
データ解析は、各注入および表面に対する最大応答レベルを調べることによって行った。１回目のサイクルに対する正規化最大応答が１となるように、各応答を最初のＩｇＧ注入に対する最大応答で除することによって応答を正規化した。アルカリ再生がチップ表面に結合したＺｍａｔ８変異体にどのように影響を与えるかを調べるために、正規化最大応答をサイクルに対してプロットした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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