(57)【要約】  本開示のいくつかの側面は、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン（例えばｄＣａｓ９などのＣａｓ９のヌクレアーゼ不活性バリアント）、任意のリンカー、およびリコンビナーゼ触媒ドメイン（例えばチロシンリコンビナーゼ触媒ドメインまたはセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン、例えばＧｉｎリコンビナーゼ触媒ドメイン）を含む、融合タンパク質を提供する。この融合タンパク質は、ガイドＲＮＡ特異的配列が隣接する最小のリコンビナーゼコア部位を含むＤＮＡ部位を組み換えることができる。本開示は、未修飾細胞におけるプログラム可能な瘢痕のないゲノム編集への、内因性の細胞機構または細胞状態からは独立した、ステップを表す。
2019526248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、融合タンパク質：
（ｉ）ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン；
（ｉｉ）リンカー；および
（ｉｉｉ）リコンビナーゼ触媒ドメイン。
【請求項２】
ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメイン、ヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１ドメイン、ヌクレアーゼ不活性アルゴノートドメイン、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１のＤ１０ＡまたはＨ８４０Ａ変異に対応する変異を含む、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１のＤ１０Ａ変異に対応する変異および配列番号１のＨ８４０Ａ変異に対応する変異を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１の欠けているＮ末端メチオニンに対応する変異をさらに含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列が、配列番号７１２を含む、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列が、配列番号７１２と９５％以上の配列同一性を有する、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列が、配列番号７１２と９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
リコンビナーゼ触媒ドメインが、セリンリコンビナーゼ触媒ドメインまたはチロシンリコンビナーゼ触媒ドメインである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
セリンリコンビナーゼ触媒ドメインまたはチロシンリコンビナーゼ触媒ドメインが、Ｇｉｎ、Ｓｉｎ、Ｔｎ３、Ｈｉｎ、β、γδ、ＰｈｉＣ３１、Ｃｒｅ、またはＦＬＰリコンビナーゼ触媒ドメインから選択される、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列が、配列番号７１３のＨ１０６Ｙ、Ｉ１２７Ｌ、Ｉ１３６Ｒ、またはＧ１３７Ｆの変異からなる群から選択される１つ以上の変異を含む、請求項１０または１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列が、配列番号７１３を含む、請求項１１または１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
Ｃｒｅリコンビナーゼのアミノ酸配列が切断されている、請求項１０または１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
チロシンリコンビナーゼ触媒ドメインが、Ｃｒｅリコンビナーゼの２５ｋＤａカルボキシ末端ドメインである、請求項１１または１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
Ｃｒｅリコンビナーゼが、アミノ酸Ｒ１１８、Ａ１２７、Ｅ１３８、またはＲ１５４で始まる、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
リコンビナーゼのアミノ酸配列が、さらに変異している、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
リコンビナーゼ触媒ドメインが、進化型リコンビナーゼ触媒ドメインである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
リンカーが、約３３オングストローム〜約８１オングストロームの長さを有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
リンカーがペプチドリンカーである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
ペプチドリンカーが、ＸＴＥＮリンカー（ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号８）、もしくはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９））、トリペプチドＧＧＳの１つ以上の反復を含むアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列のいずれか：ＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣ（配列番号１０）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１１）、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡ（配列番号１２）、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡ（配列番号１３）、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳ（配列番号１４）、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳ（配列番号１５）、ＭＳＲＰＤＰＡ（配列番号１６）、もしくはＧＧＳＭ（配列番号１７）、を含む、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
ペプチドリンカーが、トリペプチドＧＧＳの１つ以上の反復を含む、請求項２０または２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
ペプチドリンカーが、トリペプチドＧＧＳの６〜１０の反復を含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
ペプチドリンカーが、トリペプチドＧＧＳの８個の反復を含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
ペプチドリンカーが、約１８〜約２７アミノ酸長である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
ペプチドリンカーが、２４アミノ酸長である、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
ペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１８３）を有する、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
リンカーが、非ペプチドリンカーである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
非ペプチドリンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、コポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖類、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む、請求項２８に記載の融合タンパク質
【請求項３０】
アルキルリンカーが、式−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−を有し、式中、ｓが、１以上〜１００以下の任意の整数であり得る、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
ｓが、１以上〜２０以下の整数である、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
ＮＬＳドメインが、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインまたはＧｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインに、１つ以上の第２のリンカーを介して結合している、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
第２のリンカーが、ペプチドリンカーである、請求項３３記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
第２のリンカーが、ＸＴＥＮリンカー（ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号８）、もしくはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９））、トリペプチドＧＧＳの１つ以上の反復を含むアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列のいずれか：ＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣ（配列番号１０）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１１）、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡ（配列番号１２）、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡ（配列番号１３）、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳ（配列番号１４）、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳ（配列番号１５）、ＭＳＲＰＤＰＡ（配列番号１６）、もしくはＧＧＳＭ（配列番号１７）、を含む、請求項３３または３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
第２のリンカーが、トリペプチドＧＧＳの１つ以上の反復を含む、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
第２のリンカーが、トリペプチドＧＧＳの１〜５個の反復を含む、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
第２のリンカーが、トリペプチドＧＧＳの１つの反復を含む、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
第２のリンカーが、配列ＧＧＳを有する、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
第２のリンカーが、非ペプチドリンカーである、請求項３３に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
非ペプチドリンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、コポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖類、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む、請求項４０に記載の融合タンパク質
【請求項４２】
アルキルリンカーが、式−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−を有し、式中、ｓが、１以上〜１００以下の任意の整数であり得る、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
ｓが、１以上〜２０以下の任意の整数である、請求項４２に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
融合タンパク質が、構造：ＮＨ２−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨを含む、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
融合タンパク質が、構造：ＮＨ２−［Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨを含む、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
融合タンパク質が、配列番号７１９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３２〜３９、４４、または４５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
１つ以上のアフィニティタグをさらに含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
アフィニティタグが、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン（ポリＨｉｓ）タグ、ポリアルギニン（ポリＡｒｇ）タグ、Ｍｙｃタグ、およびＨＡタグからなる群から選択される、請求項４７に記載の融合タンパク質。
【請求項４９】
アフィニティタグがＦＬＡＧタグである、請求項４７または４８に記載の融合タンパク質。
【請求項５０】
ＦＬＡＧタグが、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７０２）を有する、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
１つ以上のアフィニティタグが、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、リコンビナーゼ触媒ドメイン、またはＮＬＳドメインに、１つ以上の第３のリンカーを介して結合している、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
第３のリンカーが、ペプチドリンカーである、請求項５１に記載の融合タンパク質。
【請求項５３】
第３のリンカーが、ＸＴＥＮリンカー（ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号８）、もしくはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９））、トリペプチドＧＧＳの１つ以上の反復を含むアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列のいずれか：ＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣ（配列番号１０）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１１）、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡ（配列番号１２）、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡ（配列番号１３）、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳ（配列番号１４）、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳ（配列番号１５）、ＭＳＲＰＤＰＡ（配列番号１６）、もしくはＧＧＳＭ（配列番号１７）、を含む、請求項５１または５２に記載の融合タンパク質。
【請求項５４】
第３のリンカーが、トリペプチドＧＧＳの１つ以上の反復を含む、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５５】
第３のリンカーが、トリペプチドＧＧＳの１〜５個の反復を含む、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５６】
第３のリンカーが、トリペプチドＧＧＳの１つの反復を含む、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５７】
第３のリンカーが、配列ＧＧＳを有する、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５８】
第３のリンカーが、非ペプチドリンカーである、請求項５１に記載の融合タンパク質。
【請求項５９】
非ペプチドリンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、コポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖類、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む、請求項５８に記載の融合タンパク質。
【請求項６０】
アルキルリンカーが、式−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−を有し、式中、ｓが、１以上〜１００以下の任意の整数であり得る、請求項５９に記載の融合タンパク質。
【請求項６１】
ｓが、１以上〜２０以下の任意の整数であり得る、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項６２】
融合タンパク質が、構造：ＮＨ２−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨ、またはＮＨ２−［アフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨ、を含む、請求項４７〜６１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６３】
融合タンパク質が、配列番号１８５に示されるアミノ酸配列と９９％を超える配列同一性を有する、請求項４７〜５７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６４】
融合タンパク質が、配列番号１８５に示されるアミノ酸配列と９０％または９５％を超える配列同一性を有する、請求項４７〜５７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６５】
融合タンパク質が、配列番号１８５に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４７〜５７、６３、または６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６６】
ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に結合している、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６７】
請求項６６に記載の融合タンパク質の、二量体。
【請求項６８】
二量体が、ＤＮＡ分子に結合している、請求項６７に記載の融合タンパク質の二量体。
【請求項６９】
二量体の各融合タンパク質が、ＤＮＡ分子の同じ鎖に結合している、請求項６８に記載の融合タンパク質の二量体。
【請求項７０】
二量体の各融合タンパク質が、ＤＮＡ分子の対向鎖に結合している、請求項６８に記載の融合タンパク質の二量体。
【請求項７１】
二量体のｇＲＮＡが、リコンビナーゼ部位に隣接するｇＲＮＡ結合部位にハイブリダイズする、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の二量体。
【請求項７２】
リコンビナーゼ部位が、ｒｅｓ、ｇｉｘ、ｈｉｘ、ｓｉｘ、ｒｅｓＨ、ＬｏｘＰ、ＦＴＲ、もしくはａｔｔコアまたは関連コアの配列を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
リコンビナーゼ部位が、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列を含む、請求項７１または７２に記載の融合タンパク質の二量体。
【請求項７４】
ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離が、３〜７塩基対である、請求項７２または７３に記載の二量体。
【請求項７５】
ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離が、５〜６塩基対である、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の二量体。
【請求項７６】
第１の二量体が第２の二量体に結合し、それによって融合タンパク質の四量体を形成する、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載の融合タンパク質の二量体。
【請求項７７】
請求項６６に記載の融合タンパク質の、四量体。
【請求項７８】
四量体が、ＤＮＡ分子に結合している、請求項７７に記載の融合タンパク質の四量体。
【請求項７９】
各二量体が、ＤＮＡの対向鎖に結合している、請求項６８記載の融合物の四量体。
【請求項８０】
各二量体が、ＤＮＡの同じ鎖に結合している、請求項６８に記載の融合タンパク質の四量体。
【請求項８１】
２つのＤＮＡ分子間の部位特異的組換え方法であって、
（ａ）第１のＤＮＡを第１の融合タンパク質と接触させること、ここで、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、第１のＤＮＡの第１領域にハイブリダイズする第１のｇＲＮＡに結合する；
（ｂ）第１のＤＮＡを第２の融合タンパク質と接触させること、ここで、第２の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、第１のＤＮＡの第２領域にハイブリダイズする第２のｇＲＮＡに結合する；
（ｃ）第２のＤＮＡを第３の融合タンパク質と接触させること、ここで、第３の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、第２のＤＮＡの第１領域にハイブリダイズする第３のｇＲＮＡに結合する；および
（ｄ）第２のＤＮＡを第４の融合タンパク質と接触させること、ここで、第４の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、第２のＤＮＡの第２領域にハイブリダイズする第４のｇＲＮＡに結合する；を含み、
ここで、ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合タンパク質の結合は、ＤＮＡが組み換えされるような条件下で、融合タンパク質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらし、およびここで、第１、第２、第３、および／または第４の融合タンパク質は、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質である、前記方法。
【請求項８２】
第１および第２のＤＮＡ分子が、異なる配列を有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡが第１のＤＮＡの対向鎖にハイブリダイズし、ステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが第２のＤＮＡの対向鎖にハイブリダイズする、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡ、および／またはステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが、１００塩基対以下の間隔にあるそれらのそれぞれのＤＮＡの領域にハイブリダイズする、請求項８１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡ、および／またはステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、または９０以下の塩基対の間隔にあるそれらのそれぞれのＤＮＡの領域にハイブリダイズする、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡ、および／またはステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが、それらのそれぞれのＤＮＡの領域に、リコンビナーゼ部位に隣接するｇＲＮＡ結合部位においてハイブリダイズする、請求項８１〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
リコンビナーゼ部位が、ｒｅｓ、ｇｉｘ、ｈｉｘ、ｓｉｘ、ｒｅｓＨ、ＬｏｘＰ、ＦＴＲ、もしくはａｔｔコアまたは関連コアの配列を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
リコンビナーゼ部位が、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列を含む、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項８９】
ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離が、３〜７塩基対である、請求項８７または８８に記載の方法。
【請求項９０】
ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離が、５〜６塩基対である、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
単一のＤＮＡ分子の２つの領域間の部位特異的組換え方法であって、
（ａ）ＤＮＡを第１の融合タンパク質と接触させること、ここで、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＤＮＡの第１領域にハイブリダイズする第１のｇＲＮＡに結合する；
（ｂ）ＤＮＡを第２の融合タンパク質と接触させること、ここで、第２の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＤＮＡの第２領域にハイブリダイズする第２のｇＲＮＡに結合する；
（ｃ）ＤＮＡを第３の融合タンパク質と接触させること、ここで、第３の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＤＮＡの第３領域にハイブリダイズする第３のｇＲＮＡに結合する；および
（ｄ）ＤＮＡを第４の融合タンパク質と接触させること、ここで、第４の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＤＮＡの第４領域にハイブリダイズする第４のｇＲＮＡに結合する；を含み、
ここで、ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合タンパク質の結合は、ＤＮＡが組み換えされるような条件下で、融合タンパク質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらし、およびここで、第1、第２、第３、および／または第４の融合タンパク質は、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質である、前記方法。
【請求項９２】
組み換えられる単一のＤＮＡ分子の２つの領域が、異なる配列を有する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
組換えが、ＤＮＡ分子の領域の欠失をもたらす、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９４】
欠失されるＤＮＡ分子の領域が、減数分裂における交差事象を起こしやすい、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ステップ（ａ）〜（ｄ）の第１および第２のｇＲＮＡがＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイズし、ステップ（ａ）〜（ｄ）の第３および第４のｇＲＮＡがＤＮＡの対向鎖にハイブリダイズする、請求項９１〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡが、１００塩基対以下の間隔にあるＤＮＡの領域にハイブリダイズし、ステップ（ｃ）および（ｃ）のｇＲＮＡが、１００塩基対以下の間隔にあるＤＮＡの領域にハイブリダイズする、請求項９１〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡが、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、または９０以下の塩基対の間隔にあるＤＮＡの領域にハイブリダイズし、ステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、または９０以下の塩基対の間隔にあるＤＮＡの領域にハイブリダイズする、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡ、および／またはステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが、リコンビナーゼ部位に隣接するｇＲＮＡ結合部位にハイブリダイズする、請求項９１〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
リコンビナーゼ部位が、ｒｅｓ、ｇｉｘ、ｈｉｘ、ｓｉｘ、ｒｅｓＨ、ＬｏｘＰ、ＦＴＲ、もしくはａｔｔコアまたは関連コアの配列を含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
リコンビナーゼ部位が、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列を含む、請求項９８または９９に記載の方法。
【請求項１０１】
ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離が、３〜７塩基対である、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０２】
ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離が、５〜６塩基対である、請求項９９〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
ＤＮＡが細胞内にある、請求項８１〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
細胞が真核細胞である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
細胞が原核細胞である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
細胞が対象内にある、請求項１０４または１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
対象がヒトである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
請求項１〜６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
請求項１０８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１１０】
請求項１〜６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項１１１】
請求項１〜６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するための遺伝子構築物を含む、細胞。
【請求項１１２】
請求項１〜６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、キット。
【請求項１１３】
請求項１〜６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、キット。
【請求項１１４】
組換えタンパク質発現用ベクターを含むキットであって、ベクターが、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、前記キット。
【請求項１１５】
請求項１〜６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するための遺伝子構築物を含む細胞を含む、キット。
【請求項１１６】
１つ以上のｇＲＮＡおよび／または１つ以上のｇＲＮＡを発現するためのベクターをさらに含む、請求項１１２〜１１５のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)の元で、２０１６年８月９日に出願された米国特許仮出願U.S.S.N. 62/372,755、および２０１７年２月７日に出願された米国特許仮出願U.S.S.N. 62/456,048の優先権を主張する；これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の財政的支援
本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金番号R01EB022376およびR35GM118062の下、政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において、一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
効率的でプログラム可能および部位特異的な相同組換えは，遺伝学およびゲノム編集の長年の目標である。組換えを関心のある座位へ指向する初期の試みは、標的座位に相同な長い隣接配列を有するドナーＤＮＡのトランスフェクションに頼っていた。この戦略は、非常に低い効率および、それ故に成分を同定するための厳格な選択の必要性により妨げられていた。より最近の努力は、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）の、相同性指向修復（ＨＤＲ）を誘導する能力を利用している。ホーミングエンドヌクレアーゼおよび後のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、Ｃａｓ９、およびｆＣａｓ９などは、標的化ＤＳＢを導入し、ドナーＤＮＡの存在下でＨＤＲを誘導するために使用されてきた。しかしながら、ほとんどの有糸分裂後細胞において、ＤＳＢ誘導性のＨＤＲは強く下方制御されており、一般に非効率的である。さらに、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）などの誤りがちな修復経路によるＤＳＢの修復は、ＨＤＲよりも高い頻度で、ＤＳＢ部位におけるヌクレオチドのランダムな挿入または欠失（インデル）を引き起こす。ＨＤＲの効率は、細胞が細胞周期の同期を強制する条件にさらされている場合、またはＮＨＥＪに関与する酵素が阻害されている場合に、高めることができる。しかし、かかる条件は、多くのランダムかつ予測不可能な事象を引き起こす可能性があり、潜在的な用途を制限する。本開示は、ガイドＲＮＡ特異的配列が隣接する最小リコンビナーゼコア部位を含むＤＮＡ部位を組換えることができ、内因性細胞機構または細胞状態からは独立した、未修飾細胞におけるプログラム可能な瘢痕のないゲノム編集へのステップを表す、融合タンパク質を提供する。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概要
本開示は、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、任意のリンカー、およびリコンビナーゼ触媒ドメイン（例えば、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインなどのセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン、チロシンリコンビナーゼ触媒ドメイン、または任意の進化型リコンビナーゼ触媒ドメイン）を含む融合タンパク質の開発を記載する。この融合タンパク質は、２つのガイドＲＮＡ特異的ＤＮＡ配列が隣接する最小ｇｉｘコアリコンビナーゼ部位（ＮＮＮＮＡＡＡＳＳＷＷＳＳＴＴＴＮＮＮＮ、配列番号１９）で作動する。記載された融合タンパク質により媒介される組換えは、両方のガイドＲＮＡに依存し、異なるガイドヌクレオチド：融合タンパク質複合体の間で直交性をもたらし、培養ヒト細胞において、ヒトゲノムで見出されるものと一致するＤＮＡ配列に対して効率的に機能する。本開示の融合タンパク質はまた、ヒト細胞（例えば、培養ヒト細胞）のゲノムに直接作用することができ、約１４キロ塩基離れて位置する２つのｒｅｃＣａｓ９疑似部位間の欠失、挿入、反転、転座、または組換えを触媒する。この研究は、修飾されていないゲノムにおいてユーザ定義の単一塩基対分解を用いて、遺伝子挿入、欠失、反転、または染色体転座を触媒することができる、操作された酵素を提供する。
【０００５】
一側面において、本開示は、以下を含む融合タンパク質を提供する：（ｉ）ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン；（ｉｉ）任意のリンカー；（ｉｉｉ）リコンビナーゼ触媒ドメイン、例えば任意のセリンリコンビナーゼ触媒ドメイン（Ｇｉｎ、Ｓｉｎ、Ｔｎ３、Ｈｉｎ、β、γδ、またはＰｈｉＣ３１リコンビナーゼ触媒ドメインを含むがこれらに限定されない）、任意のチロシンリコンビナーゼ触媒ドメイン（ＣｒｅまたはＦＬＰリコンビナーゼ触媒ドメインを含むがこれらに限定されない）、または任意の進化型リコンビナーゼ触媒ドメイン。
【０００６】
ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメイン、ヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１ドメイン、ヌクレアーゼ不活性アルゴノートドメイン、およびそれらのバリアント、からなる群から選択され得る。一定の態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメインである。一定の態様において、ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異に対応する変異を含む。別の態様において、ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１のＤ１０Ａ変異に対応する変異、および配列番号１のＨ８４０Ａ変異に対応する変異を含む。別の態様において、ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列はさらに、配列番号１に示されるＮ末端メチオニンを含まない。一定の態様において、ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列は、配列番号７１２を含む。一態様において、ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列は、配列番号７１２と９５％を超える配列同一性を有する。一態様において、ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列は、配列番号７１２と９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの態様において、リコンビナーゼ触媒ドメインは、セリンリコンビナーゼ触媒ドメインまたはチロシンリコンビナーゼ触媒ドメインである。
【０００７】
一態様において、リコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列は、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインである。いくつかの態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインは、配列番号７１３のＨ１０６Ｙ、Ｉ１２７Ｌ、Ｉ１３６Ｒおよび／またはＧ１３７Ｆの変異から選択される１つ以上の変異に対応する変異を含む。一態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列は、配列番号７１３のＩ１２７Ｌ、Ｉ１３６Ｒ、および／またはＧ１３７Ｆ変異から選択される２つ以上の変異に対応する変異を含む。一態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列は、配列番号７１３のＩ１２７Ｌ、Ｉ１３６Ｒ、およびＧ１３７Ｆ変異に対応する変異を含む。別の態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼのアミノ酸配列は、さらに変異している。特定の態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列は、配列番号７１３を含む。
【０００８】
別の態様において、リコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列は、Ｈｉｎリコンビナーゼ、βリコンビナーゼ、Ｓｉｎリコンビナーゼ、Ｔｎ３リコンビナーゼ、γδリコンビナーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、またはｐｈｉＣ３１リコンビナーゼ触媒ドメインである。
【０００９】
一態様において、Ｃｒｅリコンビナーゼのアミノ酸配列は、切断されている。別の態様において、チロシンリコンビナーゼ触媒ドメインは、Ｃｒｅリコンビナーゼの２５ｋＤａのカルボキシ末端ドメインである。別の態様において、Ｃｒｅリコンビナーゼは、アミノ酸Ｒ１１８、Ａ１２７、Ｅ１３８、またはＲ１５４（それぞれメチオニンが先行する）で始まる。一態様において、リコンビナーゼのアミノ酸配列は、さらに変異している。一定の態様において、リコンビナーゼ触媒ドメインは、進化型リコンビナーゼ触媒ドメインである。いくつかの態様において、リコンビナーゼのアミノ酸配列はさらに変異している。
【００１０】
いくつかの態様において、リンカー（例えば、第１、第２、または第３のリンカー）は、約０オングストローム〜約８１オングストロームの長さを有し得る。リンカーは典型的には、約３３オングストローム〜約８１オングストロームの長さを有する。リンカーは、ペプチド性、非ペプチド性、または両方の種類のリンカーの組み合わせであり得る。一定の態様において、リンカーはペプチドリンカーである。一定の態様において、ペプチドリンカーは、ＸＴＥＮリンカーＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号８）、またはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９）、トリペプチドＧＧＳの１つ以上の反復を含むアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列のいずれか：ＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣ（配列番号１０）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１１）、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡ（配列番号１２）、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡ（配列番号１３）、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳ（配列番号１４）、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳ（配列番号１５）、ＭＳＲＰＤＰＡ（配列番号１６）、またはＧＧＳＭ（配列番号１７）、を含む。別の態様において、ペプチドリンカーは、トリペプチドＧＧＳの１つ以上の反復を含む。一態様において、ペプチドリンカーは、トリペプチドＧＧＳの１〜５個の反復を含む。別の態様において、ペプチドリンカーは、トリペプチドＧＧＳの６〜１０個の反復を含む。特定の態様において、ペプチドリンカーは、トリペプチドＧＧＳの８個の反復を含む。別の態様において、ペプチドリンカーは、１８〜２７アミノ酸長である。一定の態様において、ペプチドリンカーは、２４アミノ酸長である。一定の態様において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１８３）を有する。
【００１１】
一定の態様において、リンカーは非ペプチドリンカーである。一定の態様において、非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、コポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖類、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む。一定の態様において、アルキルリンカーは、式：−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−を有し、式中、ｓは１以上１００以下の任意の整数である。一定の態様において、ｓは、１以上２０以下の任意の整数である。
【００１２】
別の態様において、融合タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインをさらに含む。一定の態様において、ＮＬＳドメインは、１つ以上の第２のリンカーを介して、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインまたはリコンビナーゼ触媒ドメインに結合している。
【００１３】
一態様において、融合タンパク質は、構造：ＮＨ２−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意の第２リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨを含む。一定の態様において、融合タンパク質は、配列番号７１９に示されるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を超える配列同一性を有する。特定の態様において、融合タンパク質は、配列番号７１９に示されるアミノ酸配列を含む。一態様において、融合タンパク質は、配列番号７１９に示されるアミノ酸配列からなる。
【００１４】
別の態様において、融合タンパク質は、１つ以上のアフィニティタグをさらに含む。一態様において、アフィニティタグは、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン（ポリＨｉｓ）タグ、ポリアルギニン（ポリＡｒｇ）タグ、Ｍｙｃタグ、およびＨＡタグからなる群から選択される。一態様において、アフィニティタグはＦＬＡＧタグである。特定の態様において、ＦＬＡＧタグは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７０２）を有する。別の態様において、１つ以上のアフィニティタグは、１つ以上の第３のリンカーを介して、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、リコンビナーゼ触媒ドメイン、またはＮＬＳドメインに結合される。一定の態様において、第３のリンカーはペプチドリンカーである。
【００１５】
本明細書に記載の融合タンパク質の要素は、限定なしで、任意の順序であってよい。いくつかの態様において、融合タンパク質は、構造：ＮＨ２−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ、またはＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ、を有する。
【００１６】
いくつかの態様において、融合タンパク質は、構造：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨ、またはＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨ、を有する。
【００１７】
一定の態様において、融合タンパク質は、配列番号１８５に示されるアミノ酸配列と、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を超える配列同一性を有する。特定の態様において、融合タンパク質は、配列番号１８５に示されるアミノ酸配列を有する。一定の態様において、融合タンパク質のリコンビナーゼ触媒ドメインは、配列番号７１３に示される配列と同一である、配列番号１８５のアミノ酸１〜１４２に示されるアミノ酸配列と、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％を超える配列同一性を有する。一定の態様において、ｄＣａｓ９ドメインは、配列番号７１２に示される配列と同一である、配列番号１８５のアミノ酸１６７〜１５３３に示されるアミノ酸配列と、９０％、９５％、または９９％を超える配列同一性を有する。一定の態様において、本開示の融合タンパク質は、配列番号７１９に示される配列と同一である、配列番号１８５のアミノ酸１〜１５４４に示されるアミノ酸配列と、９０％、９５％、または９９％を超える配列同一性を有する。一態様において、融合タンパク質は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に結合している。
【００１８】
一側面において、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質の二量体を提供する。一定の態様において、二量体は、標的ＤＮＡ分子に結合している。一定の態様において、二量体の各融合タンパク質は、標的ＤＮＡ分子の同じ鎖に結合している。一定の態様において、二量体の各融合タンパク質は、標的ＤＮＡ分子の対向鎖に結合している。一定の態様において、二量体のｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ分子のリコンビナーゼ部位に隣接するｇＲＮＡ結合部位にハイブリダイズする。一定の態様において、リコンビナーゼ部位は、ｒｅｓ、ｇｉｘ、ｈｉｘ、ｓｉｘ、ｒｅｓＨ、ＬｏｘＰ、ＦＴＲ、もしくはａｔｔコア、または関連コアの配列を含む。一定の態様において、リコンビナーゼ部位は、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列を含む。さらなる態様において、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離は、３〜７塩基対である。一定の態様において、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離は、５〜６塩基対である。
【００１９】
一定の態様において、第１の二量体は第２の二量体に結合し、それによって融合タンパク質の四量体を形成する。一側面において、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質の四量体を提供する。一定の態様において、四量体は、標的ＤＮＡ分子に結合している。一定の態様において、各二量体は、ＤＮＡの対向鎖に結合している。別の態様において、各二量体は、ＤＮＡの同じ鎖に結合している。
【００２０】
別の側面において、本開示は、２つのＤＮＡ分子間の部位特異的組換えのための方法を提供し、この方法は以下：（ａ）第１のＤＮＡを第１の融合タンパク質と接触させること、ここで、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、第１のＤＮＡの第１領域にハイブリダイズする第１のｇＲＮＡに結合する；（ｂ）第１のＤＮＡを第２の融合タンパク質と接触させること、ここで、第２の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、第１のＤＮＡの第２領域にハイブリダイズする第２のｇＲＮＡに結合する；（ｃ）第２のＤＮＡを第３の融合タンパク質と接触させること、ここで、第３の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、第２のＤＮＡの第１領域にハイブリダイズする第３のｇＲＮＡに結合する；および、（ｄ）第２のＤＮＡを第４の融合タンパク質と接触させること、ここで、第４の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、第２のＤＮＡの第２領域にハイブリダイズする第４のｇＲＮＡに結合する；を含み、ここで、ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合タンパク質の結合は、ＤＮＡが組み換えされるような条件下で、融合タンパク質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらし、およびここで、第１、第２、第３、および／または第４の融合タンパク質は、本明細書に記載の任意の融合タンパク質である。
【００２１】
一態様において、第１および第２のＤＮＡ分子は、異なる配列を有する。別の態様において、ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡは第１のＤＮＡの対向鎖にハイブリダイズし、ステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡは第２のＤＮＡの対向鎖にハイブリダイズする。別の態様において、ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡ、および／またはステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡは、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００以下の塩基対の間隔にある、それらそれぞれのＤＮＡの領域にハイブリダイズする。一定の態様において、ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡ、および／またはステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡは、リコンビナーゼ部位に隣接するｇＲＮＡ結合部位においてそれらそれぞれのＤＮＡの領域にハイブリダイズする（例えば図１Ｄ参照）。一定の態様において、リコンビナーゼ部位は、ｒｅｓ、ｇｉｘ、ｈｉｘ、ｓｉｘ、ｒｅｓＨ、ＬｏｘＰ、ＦＴＲ、もしくはａｔｔコア、または関連コアの配列を含む。一定の態様において、リコンビナーゼ部位は、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列を含む。一定の態様において、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離は、３〜７塩基対である。一定の態様において、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離は、５〜６塩基対である。
【００２２】
本明細書に提供される部位特異的組換えのための方法はまた、単一のＤＮＡ分子と共に使用され得る。一側面において、本開示は、単一ＤＮＡ分子の２つの領域間の部位特異的組換えのための方法を提供し、これは以下：（ａ）ＤＮＡを第１の融合タンパク質と接触させること、ここで、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＤＮＡの第１領域にハイブリダイズする第１のｇＲＮＡに結合する；（ｂ）ＤＮＡを第２の融合タンパク質と接触させること、ここで、第２の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＤＮＡの第２領域にハイブリダイズする第２のｇＲＮＡに結合する；（ｃ）ＤＮＡを第３の融合タンパク質と接触させること、ここで、第３の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＤＮＡの第３領域にハイブリダイズする第３のｇＲＮＡに結合する；および、（ｄ）ＤＮＡを第４の融合タンパク質と接触させること、ここで、第４の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＤＮＡの第４領域にハイブリダイズする第４のｇＲＮＡに結合する；を含み、ここで、ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合タンパク質の結合は、ＤＮＡが組み換えされるような条件下で、融合タンパク質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらし、およびここで、第1、第２、第３、および／または第４の融合タンパク質は、記載された融合タンパク質のいずれかである。
【００２３】
一定の態様において、組み換えられる単一ＤＮＡ分子の２つの領域は、異なる配列を有する。別の態様において、組換えは、ＤＮＡ分子の領域の欠失をもたらす。特定の態様において、欠失されるＤＮＡ分子の領域は、減数分裂における交差事象を起こしやすい。一態様において、ステップ（ａ）〜（ｄ）の第１および第２のｇＲＮＡは、ＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイズし、ステップ（ａ）〜（ｄ）の第３および第４のｇＲＮＡは、ＤＮＡの対向鎖にハイブリダイズする。別の態様において、ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡは、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００以下の塩基対の間隔にあるＤＮＡの領域にハイブリダイズし、ステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡは、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００以下の塩基対の間隔にあるＤＮＡの領域にハイブリダイズする。一定の態様において、ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡ、および／またはステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡは、リコンビナーゼ部位に隣接するｇＲＮＡ結合部位にハイブリダイズする。一定の態様において、リコンビナーゼ部位は、ｒｅｓ、ｇｉｘ、ｈｉｘ、ｓｉｘ、ｒｅｓＨ、ＬｏｘＰ、ＦＴＲ、もしくはａｔｔコアまたは関連コアの配列を含む。一態様において、リコンビナーゼ部位は、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列を含む。一定の態様において、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離は、３〜７塩基対である。一定の態様において、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離は、５〜６塩基対である。
【００２４】
本明細書に記載のＤＮＡは、細胞内にあってもよい。一定の態様において、細胞は真核細胞である。一定の態様において、細胞は植物細胞である。一定の態様において、細胞は原核細胞である。いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞であり得る。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞であり得る。一定の態様において、細胞は対象内にある。いくつかの態様において、対象は哺乳動物であり得る。一定の態様において、対象はヒトである。一定の態様において、細胞は植物細胞であり得る。
【００２５】
一側面において、本開示は、本明細書に開示の任意の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。一定の態様において、本開示は、本明細書に開示の任意の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２６】
別の側面において、本開示は、本明細書に開示の任意の融合タンパク質を発現するための遺伝子構築物を含む細胞を提供する。
【００２７】
一側面において、本開示は、本明細書に開示の任意の融合タンパク質を含むキットを提供する。別の側面において、本開示は、本明細書に開示の任意の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むキットを提供する。別の側面において、本開示は、組換えタンパク質発現用のベクターを含むキットを提供し、ここでベクターは、本明細書に開示の任意の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。別の側面において、本開示は、本明細書に開示の任意の融合タンパク質を発現させるための遺伝子構築物を含む細胞を含むキットを提供する。一態様において、キットは、１つ以上のｇＲＮＡおよび／または１つ以上のｇＲＮＡを発現するためのベクターを、さらに含む。
【００２８】
本発明の一定の態様の詳細は、以下に説明するように、一定の態様の詳細な説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、定義、実施例、図、および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ−１Ｄ】実験構成の概要。細胞は、（図１Ａ）ｈＵ６プロモーターの制御下のガイドＲＮＡ発現ベクター、（図１Ｂ）ＣＭＶプロモーターの制御下のｒｅｃＣａｓ９発現ベクター、および（図１Ｃ）ｒｅｃＣａｓ９レポータープラスミド、によりトランスフェクトされる。これらの成分の同時トランスフェクションは、標的部位においてガイドＲＮＡでプログラムされたｒｅｃＣａｓ９の再アセンブリをもたらす（図１Ｄ）。これはポリＡターミネーターの欠失を媒介し、ＧＦＰの転写を可能にするであろう。ガイドＲＮＡ発現ベクターおよびガイドＲＮＡ配列は、ｇＲＮＡと略される。
【００３０】
【図２Ａ−２Ｆ】融合リンカー長および標的部位スペーサーバリアントの最適化。単一標的ガイドＲＮＡ発現ベクター、ｐＨＵ６−ＮＴ１、または非標的ベクターｐＨＵ６−ＢＣ７４を、これらの実験に使用した。配列は表６〜９に見出すことができる。（図２Ａ）標的部位の一部を、破線の下線付き黒色のガイドＲＮＡ標的部位、および黒色のｇｉｘコア配列部位と共に示す。疑似ｇｉｘ部位の両側の５’および３’配列は同一であるが、反転しており、ｐＨＵ６−ＮＴ１によって認識される。ｇｉｘ擬似部位を５’および３’結合部位から隔てる塩基対スペーサーの数は、それぞれＸおよびＹによって表される。この図は、それぞれ配列番号７００および７０３を表す。（図２Ｂ）Ｚは、ＧｉｎβをｄＣａｓ９に接続するＧＧＳ反復の数を表す。Ｘ＝Ｙの場合のｒｅｃＣａｓ９活性を、Ｇｉｎ触媒ドメインをｄＣａｓ９ドメインに接続する（図２Ｃ）（ＧＧＳ）２（配列番号１８２）、（図２Ｄ）（ＧＧＳ）５（配列番号７０１）、および（図２Ｅ）（ＧＧＳ）８（配列番号１８３）リンカーについて評価する。（図２Ｆ）一様でない塩基対スペーサー（Ｘ≠Ｙ）からなる標的部位に対するｒｅｃＣａｓ９の活性を決定した；比較のためにＸ＝Ｙ＝６が含まれている。全ての実験は三重に行われ、バックグラウンド蛍光がこれらの実験から差し引かれる。ｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、トランスフェクトされた細胞（すなわち、構成的に発現されたｉＲＦＰ遺伝子を発現する細胞）のみのものであり、各実験について少なくとも６，０００のライブイベントが記録されている。ガイドＲＮＡ発現ベクターおよびガイドＲＮＡ配列は、「ｇＲＮＡ」と略記される。値およびエラーバーはそれぞれ、３つの独立した生物学的反復の平均および標準偏差を表す。
【００３１】
【図３Ａ−３Ｂ】フォワードおよびリバースガイドＲＮＡの、ｒｅｃＣａｓ９活性への依存性。（図３Ａ）ＰＣＤＨ１５内に見出される配列は、図１Ａ〜１Ｄにおいて試験された標的部位を置換する。２つのオフセット配列は、疑似ｇｉｘコア部位の５’側および３’側の両方でガイドＲＮＡによって標的化され得る。この図は、それぞれ配列番号７０４〜７０５を表す。（図３Ｂ）ｒｅｃＣａｓ９活性の測定を、ｒｅｃＣａｓ９発現ベクターおよびレポータープラスミドを４つすべてのガイドＲＮＡ発現ベクター対およびオフターゲット（Ｏ．Ｔ．）ガイドＲＮＡベクターを有する個々のガイドＲＮＡベクターと同時トランスフェクトすることにより、実施した。オフターゲットフォワードおよびリバースは、それぞれＣＬＴＡおよびＶＥＧＦを標的とするガイドＲＮＡ配列を含んでいた。レポータープラスミドであるが標的ガイドＲＮＡなしでトランスフェクトされた対照実験も示す。ｒｅｃＣａｓ９発現ベクターなしで、異なるガイドＲＮＡ発現ベクターと同時トランスフェクトしたレポータープラスミドの結果も示す。全ての実験は四重に行われ、バックグラウンド蛍光はこれらの実験から差し引かれない。ｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、トランスフェクトされたもの（すなわち、構成的に発現されたｉＲＦＰ遺伝子を発現するもの）のみのものであり、各実験について少なくとも６，０００のライブイベントが記録される。ガイドＲＮＡ発現ベクターおよびガイドＲＮＡ配列は、ｇＲＮＡと略される。値およびエラーバーはそれぞれ、４つの独立した生物学的複製の平均および標準偏差を表す。
【００３２】
【図４Ａ−４Ｄ】ｒｅｃＣａｓ９は、ヒトゲノムの配列と同一の複数の配列を標的化することができる。（図４Ａ）図１Ａ〜１Ｄに示される標的部位は、ヒトゲノム内に見出される配列によって置き換えられる。配列については表６を参照。ｒｅｃＣａｓ９発現ベクターを、ガイドＲＮＡベクター対とレポータープラスミドのすべての組み合わせで同時形質転換した。オフターゲットガイドＲＮＡベクターもｒｅｃＣａｓ９発現ベクターとレポータープラスミドで同時形質転換され、これはＣＬＴＡおよびＶＥＧＦを標的とするガイドＲＮＡ配列を含む（例えば、Guilinger et al., Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nature biotechnology, (2014)を参照、この全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ｅＧＦＰ陽性細胞の割合は、トランスフェクトされた（ｉＲＦＰ陽性）細胞の割合を反映する。少なくとも６，０００のライブイベントが各実験について記録される。値およびエラーバーはそれぞれ、少なくとも３つの独立した生物学的反復の平均および標準偏差を表す。（図４Ｂ）トランスフェクション実験を、ｒｅｃＣａｓ９発現ベクターおよびｐＵＣ中の耐性マーカーをＳｐｅｃＲで置き換えて、再度行った。同時トランスフェクションおよびインキュベーションの後、エピソームＤＮＡを抽出し、大腸菌に形質転換し、カルベニシリン耐性について選択した。次いでコロニーを配列決定して、完全に無傷のプラスミドに対する組換えプラスミドの比率を決定した（図４Ｃ）。（図４Ｄ）トランスフェクト細胞から単離されたエピソーム抽出物からの配列決定データ。列および行は、トランスフェクション条件を表す。各細胞は、組換えプラスミドの割合とその比率を示す。示されている値は、２つの独立した生物学的反復の平均および標準偏差を反映する。平均値と各反復値の平均差が、エラーとして表示される。ガイドＲＮＡ発現ベクターおよびガイドＲＮＡ配列は、ｇＲＮＡと略される。
【００３３】
【図５Ａ−５Ｄ】ｒｅｃＣａｓ９は、培養ヒト細胞におけるガイドＲＮＡおよびｒｅｃＣａｓ９に依存したゲノムＤＮＡの欠失を媒介する。（図５Ａ）１２番染色体のＦＡＭ１９Ａ２座位のイントロン領域内に位置する予測ｒｅｃＣａｓ９標的部位および、ネステッドＰＣＲに使用したプライマーの位置を示す概略図。この図は、上から下および左から右にそれぞれ配列番号７０６〜７０９を示す。（図５Ｂ）示された発現ベクターでトランスフェクトされた細胞からの鋳型のネステッドゲノムＰＣＲの代表的な結果（ｎ＝３つの生物学的複製物；ＮＴＣ＝鋳型なしの対照）。アステリスクは、１．３ｋｂの予測一次ＰＣＲ産物の位置を示す。矢印は、二次ＰＣＲ後の予測欠失産物を示す。両方のペインは同じゲルからのものであるが、カットして空白のレーンが削除されている。（図５Ｃ）４つすべてのｇＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクトされた細胞のネステッドゲノムＰＣＲから生じたＰＣＲ産物のサンガー配列決定、およびｒｅｃＣａｓ９発現ベクターは、予測された組換え後産物と一致する。この図は、上から下にそれぞれ配列番号７１０および７１１を示す。（図５Ｄ）限界希釈ネステッドＰＣＲによって決定された、ＦＡＭ１９Ａ２座位の推定最小欠失効率。示されている値は、３つの複製の平均および標準偏差を反映している。
【００３４】
【図６】レポータープラスミド構築。ゴールデンゲートアセンブリを使用して、この研究に記載のレポータープラスミドを構築した。全てのアセンブリは、ｐＣＡＬＮＬ−ＥＧＦＰに由来しＥｓｐ３Ｉ制限部位に含まれる共通のプラスミド、ｐＣＡＬＮＬ−ＥＧＦＰ−Ｅｓｐ３Ｉで開始した。示されている断片は、Ｅｓｐ３Ｉ部位に隣接している。Ｅｓｐ３Ｉ消化は一連の適合性のあるユニークな４塩基対５’オーバーハングを作り出すので、アセンブリは示された順序で起こる。標的部位をアセンブルするために、Ｅｓｐ３Ｉ（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）および５つの断片を１つの反応チューブに添加して、Ｅｓｐ３Ｉ消化およびＴ７ライゲーションの反復サイクルを可能にした。次いで、反応物をPlasmid-Safe-ATP-dependent DNAse（Epicentre, Madison, WI）で消化して、バックグラウンドを低下させた。コロニーを、コロニーＰＣＲにより分析して、予想される全長の５部構成のアセンブリ産物と一致するＰＣＲ産物を同定した；次いでこれらのコロニーからのプラスミドを、サンガー配列決定のために送った。図４に示されるゲノムレポーターについては、断片１および２ならびに断片４および５が、標的部位全体をコードする２つのｇＢｌｏｃｋ（IDT, Coralville, IA）断片に結合された（図示せず）。その後アセンブリは、上述のように完了した。構築の詳細は、支持材料のための方法に見出すことができる。断片を作製するためのオリゴヌクレオチドおよびｇＢＬＯＣＫＳは、表２に見出すことができる。
【００３５】
【図７ＡＢ】「３６Ｃ６」と呼ばれるヒトゲノムのＲｏｓａ座位内の部位を標的化するように進化したＣｒｅリコンビナーゼを、ｄＣａｓ９に融合した。次いで、この融合物を使用して、Ｒｏｓａ標的部位を含有するプラスミドベースのレポーターを、ガイドＲＮＡ依存性様式で組み換えた。図７Ａは、野生型Ｃｒｅおよび３６Ｃ６を用いたリンカー最適化の結果を示す。その同族レポーターを標的とするＧｉｎＢ構築物を、参考のために示す。示されている１×２×、５×、および８×リンカーは、リンカー中のＧＧＳ反復の数である。図７Ｂは、ｄＣａｓ９に融合した３６Ｃ６に変異を作製することが、キメラ融合の相対的ガイド依存性に影響を及ぼし得ることを実証した、復帰変異分析（reversion anaylsis）の結果を示す。その同族レポーターを標的とするＧｉｎＢ構築物を、参考のために示す。ＧＧＳ−３６Ｃ６：１×ＧＧＳリンカー；２ＧＧＳ−３６Ｃ６（リンカー配列番号１８１を使用）：２×ＧＧＳリンカー（リンカー配列番号１８１を使用）。
【００３６】
【図８】ｄＣａｓ９結合を支持することができる、ヒトゲノム中のＲｏｓａ２６部位に隣接するＰＡＭが同定された（上部参照）。ガイドＲＮＡおよびプラスミドレポーターは、内因性プロトスペーサーがｄＣａｓ９−３６Ｃ６活性を支持し得るかどうかを試験するために設計された。ｇｉｘレポーターを標的とするＧｉｎＢ構築物が、参考のために示されている。Ｍｉｘ：Ｃａｓ９と３６Ｃ６の間の５つ全てのリンカーバリアントの等量混合物。配列は、配列番号７６９（ヌクレオチド配列）および７７０（アミノ酸配列）に対応する。
【００３７】
【図９Ａ−９Ｂ】Ｃｒｅリコンビナーゼの種々の試験された切断の位置を、図９Ａに示す。ｄＣａｓ９に融合したＣｒｅリコンビナーゼの切断型バリアントは、Ｌｏｘプラスミドレポーター系においてかなりのリコンビナーゼ活性およびガイドＲＮＡの存在への厳密な依存の両方を示す（図９Ｂ）。ｄＣａｓ９に融合した野生型Ｃｒｅが、陽性対照として示される。
【００３８】
定義
本明細書において単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈から明らかにそうでないと示されない限り、単数形および複数形の言及を含む。したがって、例えば、「作用物質」への言及は、１つの作用物質および複数のかかる作用物質を含む。
【００３９】
非限定的で例示的なＲＮＡプログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２Ｃ３、およびアルゴノートが含まれる。用語「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ９タンパク質を含むＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ、またはその断片を指す（例えば、Ｃａｓ９の活性または不活性ＤＮＡ切断ドメインおよび／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）。Ｃａｓ９は、特定のＤＮＡ鎖（例えばセンス鎖およびアンチセンス鎖）を切断する２つの切断ドメインを有する。いずれかの鎖（ｓｐＣａｓ９のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａを含むが、これらに限定されない）を切断するＣａｓ９ニッカーゼを、生成することができる。Ｃａｓ９ドメイン（例えば、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９、またはＣａｓ９ニッカーゼ）は、本明細書に記載の融合タンパク質および方法において、限定なく使用され得る。さらに、本明細書に記載の任意のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、ニッカーゼとして有用であり得る。
【００４０】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼはまた、ｃａｓｎ１ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し）関連ヌクレアーゼと呼ばれる場合もある。ＣＲＩＳＰＲは、移動性の遺伝的要素（ウイルス、転移性要素、および共役プラスミド）に対する保護を提供する、適応免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、先行移動要素に相補的な配列、および標的侵入核酸を含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に転写および処理される。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるプレｃｒＲＮＡの正しいプロセシングは、トランスコードされた低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）、およびＣａｓ９タンパク質を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼ３支援プロセシングのためのガイドとして役立つ。続いて、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な直鎖状または環状ｄｓＤＮＡ標的を、エンドヌクレアーゼ的に切断する。ｃｒＲＮＡに相補的ではない標的鎖は、最初にエンドヌクレアーゼ的に切断され、次いで３’−５’エキソヌクレアーゼ的にトリミングされる。本来、ＤＮＡ結合および切断は、典型的にはタンパク質および両方のＲＮＡ配列を必要とする。しかしながら、単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」、または単に「ｇＲＮＡ」）は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の側面を単一のＲＮＡ種に組み込むように操作することができる。例えば、Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E.  Science 337:816-821(2012)を参照のこと；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列内の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己と非自己の区別を支援する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列および構造は、当業者によく知られている（例えば、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  98:4658-4663(2001)；"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)；および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照のこと；これら各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。Ｃａｓ９オルソログは、S. pyogenesおよびS. thermophilusを含むがこれらに限定されない様々な種において記載されている。さらなる適切なＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであり、かかるＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列には、Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737（この全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている生物および座位由来のＣａｓ９配列が含まれる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、不活性（例えば、不活性化された）ＤＮＡ切断ドメインを有し、すなわちＣａｓ９はニッカーゼである。一例として、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）は、ｇＲＮＡに結合しているＤＮＡ鎖を切断することができる。別の例として、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９ニッカーゼ）は、ｇＲＮＡに結合していないＤＮＡ鎖を切断することができる。別の態様において、任意のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、不活性（例えば、不活性化された）ＤＮＡ切断ドメインを有し得、すなわち、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、ニッカーゼである。一例として、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、ｇＲＮＡに結合しているＤＮＡ鎖を切断し得る。別の例として、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、ｇＲＮＡに結合していないＤＮＡ鎖を切断し得る。
【００４１】
さらなる例示的なＣａｓ９配列は、２０１７年４月２７日に公開され、「遺伝子編集のための進化型Ｃａｓ９タンパク質」と題された国際公開番号WO/2017/070633に見出すことができる。
【００４２】
ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質は、互換的に「ｄＣａｓ９」タンパク質（ヌクレアーゼについて「デッドな（dead）」Ｃａｓ９）と呼ばれることがある。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、以下の配列番号１として記載されているアミノ酸に対応するか、またはその一部もしくは全部を含む。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９のバリアント（例えば、配列番号１のバリアント）が提供される。例えば、いくつかの態様において、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ以外の変異を有するバリアントが提供され、これは、例えばヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をもたらす。かかる変異は、例として、Ｄ１０およびＨ８４０における他のアミノ酸置換、またはＣａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の置換を含む（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよび／またはＲｕｖＣ１サブドメイン内の置換）。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９のバリアントまたは相同体（例えば、配列番号１のバリアント）が提供され、これは配列番号１と、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９のバリアント（例えば、配列番号１のバリアント）が提供され、これは配列番号１よりも、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸、またはそれ以上、より短いかまたはより長いアミノ酸配列を有する。
ｄＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）：
【化１】
2019526248.tif 000003
（配列番号１）
【００４３】
不活性ＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９タンパク質（またはその断片）を生成する方法は知られている（例えば、Jinek et al., Science. 337:816-821(2012)；Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28;152(5):1173-83を参照；これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインは、２つのサブドメイン、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメイン、およびＲｕｖＣ１サブドメインを含むことが知られている。ＨＮＨサブドメインはｇＲＮＡに相補的な鎖を切断するのに対し、ＲｕｖＣ１サブドメインは非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を沈黙させることができる。例えば、変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａは、S. pyogenesＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（例えば、Jinek et al., Science.  337:816-821(2012); Qi et al., Cell.  28;152(5):1173-83 (2013)参照）。いくつかの態様において、Ｃａｓ９の断片を含むタンパク質が提供される。例えば、いくつかの態様において、タンパク質は、次の２つのＣａｓ９ドメインのうちの１つを含む：（１）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン；または（２）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメイン。いくつかの態様において、Ｃａｓ９を含むタンパク質またはその断片は、「Ｃａｓ９バリアント」と呼ばれる。Ｃａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９またはその断片と相同性を共有する。例えば、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９の対応する断片に対して、断片が少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一であるように、Ｃａｓ９の断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含む。いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９は、Streptococcus pyogenes由来のＣａｓ９に対応する（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０１７０５３．１、配列番号２（ヌクレオチド）；配列番号３（アミノ酸））。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、野生型Ｃａｓ９と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である、アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、野生型Ｃａｓ９と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、��７、４８、４９、５０またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、野生型Ｃａｓ９と比較して、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００の同一の連続アミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９バリアントは、断片が野生型Ｃａｓ９の対応する断片と、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一であるように、Ｃａｓ９の断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含む。いくつかの態様において、断片は、対応する野生型Ｃａｓ９のアミノ酸長の、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％である。
【００４４】
いくつかの態様において、断片は、少なくとも１００アミノ酸長である。いくつかの態様において、断片は、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、または１３００アミノ酸長である。
【化２−１】
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【化２−２】
2019526248.tif 000005
【化３】
2019526248.tif 000006
【００４５】
いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９は、配列番号４（ヌクレオチド）および／または配列番号５（アミノ酸）に対応するか、またはそれを含む。
【化４】
2019526248.tif 000007
【化５】
2019526248.tif 000008
【００４６】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、以下由来のＣａｓ９：Corynebacterium ulcerans（NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1）；Corynebacterium diphtheria（NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1）；Spiroplasma syrphidicola（NCBI Ref: NC_021284.1）；Prevotella intermedia（NCBI Ref: NC_017861.1）；Spiroplasma taiwanense（NCBI Ref: NC_021846.1）；Streptococcus iniae（NCBI Ref: NC_021314.1）；Belliella baltica (NCBI Ref: NC_018010.1）；Psychroflexus torquisI（NCBI Ref: NC_018721.1）；Streptococcus thermophilus (NCBI Ref: YP_820832.1）；Listeria innocua (NCBI Ref: NP_472073.1）；Campylobacter jejuni（NCBI Ref: YP_002344900.1）；もしくはNeisseria meningitidis（NCBI Ref: YP_002342100.1)、または他の生物からのＣａｓ９を指す。
【００４７】
Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡ配列中のＣＲＩＳＰＲ反復配列中の短いモチーフ（ＰＡＭモチーフ）を認識する。本明細書で使用される「ＰＡＭモチーフ」または「プロトスペーサー隣接モチーフ」は、ＣＲＩＳＰＲ細菌適応免疫系においてＣａｓ９ヌクレアーゼによって標的化されるＤＮＡ配列の直後のＤＮＡ配列を指す。ＰＡＭは侵入ウイルスまたはプラスミドの構成要素であるが、細菌のＣＲＩＳＰＲ座位の構成要素ではない。当然ながら、Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列が後に続かなければ、標的ＤＮＡ配列にうまく結合することも切断することもできない。ＰＡＭは、細菌の自己と非自己のＤＮＡとを区別し、それによってＣＲＩＳＰＲ座位がＣａｓ９ヌクレアーゼ活性によって標的化され破壊されるのを防止する、標的指向性成分（targeting component）（細菌ゲノムには見られない）である。
【００４８】
野生型Streptococcus pyogenesのＣａｓ９は、標準（canonical）ＰＡＭ配列（例えば、Streptococcus thermophiles、Staphylococcus aureus、Neisseria meningitidis、またはTreponema denticolaor由来のＣａｓ９）を認識し、そのＣａｓ９バリアントは、異なるかまたはより緩和されたＰＡＭの要件を有することが当分野において記載されている。典型的には、S. pyogenes由来のＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）などのＣａｓ９タンパク質は、特定の核酸領域に結合するために標準ＮＧＧ ＰＡＭ配列を必要とし、ここで「ＮＧＧ」中の「Ｎ」はアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）であり、Ｇはグアニンである。これは、ゲノム内の所望の塩基を編集する能力を制限し得る。いくつかの態様において、本明細書で提供される塩基編集融合タンパク質は、正確な位置に、例えば標的塩基が４塩基領域（例えば「脱アミノ化ウィンドウ」）内にあるところに配置される必要があり、これはＰＡＭの約１５塩基上流である。Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016)を参照、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、脱アミノ化ウィンドウは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基領域内にある。いくつかの態様において、脱アミノ化ウィンドウは、ＰＡＭの、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基上流にある。したがって、いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合タンパク質は、標準（例えば、ＮＧＧ）ＰＡＭ配列を含まないヌクレオチド配列に結合することができるＣａｓ９ドメインを含み得る。非標準ＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは当分野で記載されており、当業者に明らかである。例えば、非標準ＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは、以下に記載されている：Kleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015)；およびKleinstiver, B. P., et al., "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)；これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。さらに以下も参照のこと：Klenstiver et al., Nature 529, 490-495, 2016；Ran et al., Nature, Apr 9; 520(7546): 186-191, 2015；Hou et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 110(39):15644-9, 2014；Prykhozhij et al., PLoS One, 10(3): e0119372, 2015；Zetsche et al., Cell 163, 759-771, 2015；Gao et al., Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.3547, 2016；Want et al., Nature 461, 754-761, 2009；Chavez et al., doi: dx dot doi dot org/10.1101/058974；Fagerlund et al., Genome Biol.  2015; 16: 25, 2015；Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015；およびSwarts et al., Nat Struct Mol Biol, 21(9):743-53, 2014；これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
したがって、本開示のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、限定するものではないが以下を含む様々なＰＡＭ配列を、認識することができる：ＮＧＧ、ＮＧＡＮ（配列番号７４１）、ＮＧＮＧ（配列番号７４２）、ＮＧＡＧ（配列番号７４３）、ＮＧＣＧ（配列番号７４４）、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号７４５）、ＮＧＲＲＮ（配列番号７４６）、ＮＮＮＲＲＴ（配列番号７４７）、ＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号７４８）、ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号７４９）、ＮＡＡＡＣ（配列番号７５０）、ＴＴＮ、ＴＴＴＮ（配列番号７５１）、およびＹＴＮ、この式中、Ｙはピリミジンであり、およびＮは任意の核酸塩基である。
【００５０】
異なるＰＡＭ特異性を有するＲＮＡプログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質の一例は、Prevotella and Francisella 1からのクラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（Ｃｐｆ１）である。Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１もクラス２のＣＲＩＳＰＲエフェクターである。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９とは異なる特徴を有する強いＤＮＡ干渉を媒介することが示されている。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一のＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼであり、Ｔリッチなプロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＴＮ、ＴＴＴＮ（配列番号７５１）、またはＹＴＮ）を利用する。さらに、Ｃｐｆ１は、スタッガード（千鳥状、staggered）ＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。１６個のＣｐｆ１ファミリータンパク質のうち、AcidaminococcusおよびLachnospiraceaeからの２つの酵素は、ヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を有することが示されている。
【００５１】
さらに本明細書に提供されるのは、ＲＮＡプログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインとして使用することができる、ヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１）バリアントである。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに類似したＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有するが、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Ｃｐｆ１のＮ末端は、Ｃａｓ９のαヘリックス認識ローブを有さない。Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）には、Ｃｐｆ１のＲｕｖＣ様ドメインが両方のＤＮＡ鎖の切断の原因であり、ＲｕｖＣ様ドメインの不活性化がＣｐｆ１ヌクレアーゼ活性を不活性化することが示されている。例えば、Francisella novicidaのＣｐｆ１（配列番号７１４）におけるＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、またはＤ１２５５Ａに対応する変異は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ活性を不活性化する。いくつかの態様において、本開示のｄＣｐｆ１は、配列番号７１４のＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含む。Ｃｐｆ１のＲｕｖＣドメインを不活性化する任意の変異、例えば置換変異、欠失、または挿入が、本開示に従って使用され得ることを理解されたい。
【００５２】
いくつかの態様において、本開示のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＰＡＭ配列についての要件を全く有さない。かかるガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質の一例は、Natronobacterium gregoryiからのアルゴノートタンパク質であり得る（ＮｇＡｇｏ）。ＮｇＡｇｏは、ｓｓＤＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼである。ＮｇＡｇｏは、約２４ヌクレオチドの５’リン酸化ｓｓＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合してそれをその標的部位に誘導し、ｇＤＮＡ部位でＤＮＡ二本鎖を切断する。Ｃａｓ９とは対照的に、ＮｇＡｇｏ−ｇＤＮＡ系はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要としない。ヌクレアーゼ不活性ＮｇＡｇｏ（ｄＮｇＡｇｏ）を使用すると、標的とされ得るコドンを大幅に拡張することができる。ＮｇＡｇｏの特徴付けおよび使用は、Gao et al., Nat Biotechnol. Epub 2016 May 2. PubMed PMID: 27136078；Swarts et al., Nature.  507(7491) (2014):258-61；およびSwarts et al., Nucleic Acids Res. 43(10) (2015):5120-9に記載されており、これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。Natronobacterium gregoryiのアルゴノートの配列は、配列番号７１８に提供されている。
【００５３】
本明細書ではまた、緩和されたＰＡＭ要件を有するＣａｓ９バリアント（ＰＡＭなしＣａｓ９）も提供される。ＰＡＭなしＣａｓ９は、その３’末端に標準ＰＡＭ（ＮＧＧ）を含まない標的配列に対して、配列番号１によって提供されるStreptococcus pyogenesＣａｓ９と比較して、増加した活性、例えば少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍高い活性を示す。したがって、本開示のｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼは、ＰＡＭ要件を緩和する変異、例えば、配列番号１のＡ２６２Ｔ、Ｋ２９４Ｒ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、またはＥ１２１９Ｖに対応する変異を、さらに含み得る。
【００５４】
バリアントおよび相同体を含むさらなるＣａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼデッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９）は、本開示の範囲内であることを理解されたい。例示的なＣａｓ９タンパク質としては、限定はされないが、以下に提供されるものが挙げられる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼデッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、以下に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。いくつかの態様において、ｎＣａｓ９は、以下に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９である。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９は、以下に示されるアミノ酸配列を含む。
例示の触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）：
【化６−１】
2019526248.tif 000009
【化６−２】
2019526248.tif 000010
例示のＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）：
【化７−１】
2019526248.tif 000011
【化７−２】
2019526248.tif 000012
例示の触媒的に活性なＣａｓ９：
【化８−１】
2019526248.tif 000013
【化８−２】
2019526248.tif 000014
【００５５】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９とは、単細胞原核微生物のドメインおよび界を構成する古細菌（例えば、ナノ古細菌）由来のＣａｓ９を指す。いくつかの態様において、Ｃａｓ９はＣａｓＸまたはＣａｓＹを指し、これは例えば、Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21（その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ゲノム分解メタゲノミクスを用いて、生物の古細菌ドメインで最初に報告されたＣａｓ９を含む、多数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが同定された。この分岐したＣａｓ９タンパク質は、活性なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一部としてほとんど研究されていないナノ古細菌に見出された。細菌において、これまで知られていなかった２つのシステム、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸとＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹが発見され、これらはこれまで発見された中で最もコンパクトなシステムである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、ＣａｓＸ、またはＣａｓＸのバリアントを指す。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、ＣａｓＹ、またはＣａｓＹのバリアントを指す。他のＲＮＡ誘導性ＤＮＡ結合タンパク質が、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質として使用されてもよく、本開示の範囲内であることを理解されたい。
【００５６】
いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＣａｓＸタンパク質またはＣａｓＹタンパク質であり得る。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＣａｓＸタンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＣａｓＹタンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、天然に存在するＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、天然に存在するＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、本明細書に記載の例示的なＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、本明細書に記載の例示的ＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のＣａｓＸおよびＣａｓＹもまた、本開示に従って使用され得ることを理解されたい。
ＣａｓＸ（uniprot.org/uniprot/F0NN87; uniprot.org/uniprot/F0NH53）
＞tr|F0NN87|F0NN87_SULIH ＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓｘタンパク質ＯＳ＝Sulfolobus islandicus（株ＨＶＥ１０／４）GN=SiH_0402 PE=4 SV=1
【化９】
2019526248.tif 000015
＞ tr|F0NH53|F0NH53_SULIRＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、Ｃａｓｘ ＯＳ＝Sulfolobus islandicus（株ＲＥＹ１５Ａ）GN=SiRe_0771 PE=4 SV=1
【化１０】
2019526248.tif 000016
ＣａｓＹ（ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1）
＞ APG80656.1ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ＣａｓＹ［未培養Parcubacteria群細菌］
【化１１−１】
2019526248.tif 000017
【化１１−２】
2019526248.tif 000018
【００５７】
用語「コンジュゲートする」、「コンジュゲートした」、および「コンジュゲーション」は、２つの実体の会合、例えば、２つのタンパク質などの２つの分子、２つのドメイン（例えば、結合ドメインおよび切断ドメイン）、またはタンパク質と作用物質、例えばタンパク質結合ドメインと小分子の会合を指す。いくつかの側面において、会合は、タンパク質（例えば、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ）と核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）との間のものである。会合は、例えば、直接的または間接的（例えば、リンカーを介して）共有結合によるものであり得る。いくつかの態様において、会合は共有結合である。いくつかの態様において、２つの分子は、両方の分子を連結するリンカーを介してコンジュゲートされる。例えば、２つのタンパク質、例えば操作されたヌクレアーゼの結合ドメインと切断ドメインが互いにコンジュゲートされてタンパク質融合体を形成するいくつかの態様において、２つのタンパク質は、ポリペプチドリンカー、例えば１つのタンパク質のＣ末端を他のタンパク質のＮ末端に連結するアミノ酸配列を介して、コンジュゲートされ得る。
【００５８】
核酸配列の文脈において本明細書で使用される「コンセンサス配列」という用語は、複数の類似配列の各位置に見られる最も頻繁なヌクレオチド残基を表す、計算配列（calculated sequence）を指す。典型的には、コンセンサス配列は、類似の配列が互いに比較されて類似の配列モチーフが計算される、配列アラインメントにより決定される。リコンビナーゼ標的部位配列の文脈において、リコンビナーゼ標的部位のコンセンサス配列は、いくつかの態様において、所与のリコンビナーゼにより最も頻繁に結合されるか、または最高のアフィニティで結合される配列であり得る。
【００５９】
本明細書で使用される「操作された」という用語は、ヒトによって設計、生産、調製、合成、および／または製造されたタンパク質分子、核酸、複合体、物質、または実体を指す。したがって、操作された生成物は、自然界には存在しない生成物である。
【００６０】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の生物学的応答を引き出すのに十分な、生物学的に活性な作用物質の量を指す。いくつかの態様において、有効量のリコンビナーゼとは、リコンビナーゼにより特異的に結合され組み換えられた標的部位での組換えを誘導するのに十分な、リコンビナーゼの量を指す場合がある。当業者に理解されるように、作用物質、例えばヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、ハイブリッドタンパク質、融合タンパク質、タンパク質二量体、タンパク質（またはタンパク質二量体）とポリヌクレオチドの複合体、またはポリヌクレオチドの有効量は、様々な要因、例えば所望の生物学的応答、特異的アレル、ゲノム、標的部位、細胞、または標的とされる組織、ならびに使用される作用物質などに応じて、変動し得る。
【００６１】
本明細書で使用される「ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質」とは、ＤＮＡに結合することができるタンパク質、ポリペプチド、またはドメインであって、その標的ＤＮＡ配列への結合がガイドヌクレオチド配列によって媒介される該タンパク質、ポリペプチド、またはドメインを指す。「ガイドヌクレオチド」は、標的配列に相補的であり、かつＤＮＡ結合タンパク質を標的配列に誘導することができる、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子（例えば、一本鎖ＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ分子）であり得る。したがって、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡプログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質、またはｓｓＤＮＡプログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質であり得る。「プログラム可能」とは、ガイドヌクレオチドが標的とする任意のＤＮＡ配列に結合するように、ＤＮＡ結合タンパク質をプログラムできることを意味する。本明細書で言及されるガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、当技術分野において知られている任意のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質であり得、限定はされないが、分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ配列を含む。用語「循環置換」とは、タンパク質中のアミノ酸の順序が変化し、その結果、結合性は変化しているが類似の（全体的な）三次元形状を有するタンパク質構造をもたらすタンパク質を指す。循環置換は、元のｎおよびｃ末端アミノ酸がペプチド結合を介して結合されている場合に形成され、その後、ペプチド配列がペプチド配列内の別の位置で切断され、新しいｎ末端とｃ末端が生じる。循環置換は、進化的事象、翻訳後修飾、または人工的に操作された変異を含む、いくつかのプロセスを通して起こり得る。例えば、循環置換は、タンパク質の触媒活性または熱安定性を改善するために使用され得る。循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、本明細書に記載の任意の態様と共に使用され得る。用語「分岐した」とは、典型的には２つの部分に分けられる単量体タンパク質を指す。典型的には、両方の部分が単量体タンパク質の機能に必要とされる。分岐タンパク質は、機能的タンパク質を再構成するためにそれ自体で二量体化してもしなくてもよい。分岐は、進化的事象、翻訳後修飾、または人工的に操作された変異を含む多くのプロセスを通して起こり得る。分岐ドメインと融合した場合、他のタンパク質ドメインを使用して、分岐タンパク質の再アセンブリを強制することができる。いくつかの場合において、その相互作用が小分子に依存するタンパク質ドメインを、各分岐ドメインに融合することができ、その結果、分岐タンパク質の小分子調節性二量体化がもたらされる。
【００６２】
本明細書で使用される「相同」という用語は、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列のレベルで高度に関連している核酸またはポリペプチドを指す、当技術分野で理解されている用語である。互いに相同な核酸またはポリペプチドは、「相同体」と呼ばれる。２つの配列間の相同性は、当業者に知られている配列アラインメント法により決定することができる。本発明によれば、２つの配列は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、または少なくとも２００アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、それらが少なくとも約５０〜６０％同一である、例えば、一方または他方の配列に含まれる全残基の少なくとも約５０〜６０％において同一の残基（例えばアミノ酸残基）を共有する場合、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一の場合に、相同であるとみなされる。
【００６３】
本明細書で使用される「配列同一性」または「配列同一性パーセント」という用語は、参照配列と同一である、所与のＤＮＡまたはタンパク質内の核酸残基またはアミノ酸残基の割合をそれぞれ指すことができる。例えば、Christopher M.  Holman, Protein Similarity Score: A Simplified Version of the BLAST Score as a Superior Alternative to Percent Identity for Claiming Genuses of Related Protein Sequences, 21 SANTA CLARA COMPUTER & HIGH TECH.  L.J. 55, 60 (2004)を参照、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６４】
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、結合（例えば、共有結合）、化学基、または分子であって、２つの分子もしくは部分を、例えば融合タンパク質の２つのドメイン、例えばヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインと核酸編集ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ）を連結する前記のものを指す。いくつかの態様において、リンカーは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを含むＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼのｇＲＮＡ結合ドメインと、核酸編集タンパク質の触媒ドメインとを連結する。いくつかの態様において、リンカーは、ｄＣａｓ９と核酸編集タンパク質とを連結する。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に位置するか、またはそれらに隣接し、共有結合を介してそれぞれに結合されて、これら２つを結合する。いくつかの態様において、リンカーは、１つのアミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの態様において、リンカーは、５〜１００アミノ酸長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、または１５０〜２００アミノ酸である。より長いまたはより短いリンカーも企図される。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）を含み、これはＸＴＥＮリンカーとも呼ばれ得る。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳ（配列番号７５８）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号７５８）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７５９）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７２２）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号７２３）、（ＧＧＳ）ｎ、もしくは（ＸＰ）ｎモチーフ、またはこれらの任意の組み合わせを含み、ここで、ｎは独立して１〜３０の整数であり、およびここで、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
【００６５】
本明細書で使用される「変異」という用語は、配列内の残基、例えば核酸配列もしくはアミノ酸配列の、別の残基による置換、または配列内の１つ以上の残基の欠失もしくは挿入を指す。変異は、典型的には、元の残基と続いて配列内の残基の位置を同定することにより、および新たに置換された残基の同一性により、本明細書に記載される。本明細書に提供されるアミノ酸置換（変異）を作製するための様々な方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))に提供されている。
【００６６】
「核局在化配列」または「ＮＬＳ」という用語は、タンパク質の細胞核への移入を例えば核内輸送によって促進するアミノ酸配列を指す。核局在化配列は当分野で知られており、当業者に明らかである。例えばＮＬＳ配列は、Plank et al.の、２０００年１１月２３日に出願の国際ＰＣＴ出願PCT/EP2000/011690、２００１年５月３１日にWO/2001/038547として公開、に記載されており、例示的な核局在化配列の開示について、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７０２）またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号７６１）を含む。
【００６７】
本明細書で使用される「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸分子内の２つのヌクレオチド残基を接続するホスホジエステル結合を切断することができる作用物質、例えばタンパク質を指す。いくつかの態様において、「ヌクレアーゼ」は、ヌクレアーゼがホスホジエステル結合を切断することができないように、不活性ＤＮＡ切断ドメインを有するタンパク質を指す。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、タンパク質、例えば核酸分子に結合して核酸分子内のヌクレオチド残基を結合するホスホジエステル結合を切断することができる、酵素である。ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼ、またはポリヌクレオチド鎖の末端でホスホジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼであり得る。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、本明細書で「認識配列」、「ヌクレアーゼ標的部位」、または「標的部位」とも呼ばれる、特定のヌクレオチド配列内の特定のホスホジエステル結合を、結合および／または切断する部位特異的ヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導性（すなわち、ＲＮＡプログラム可能）ヌクレアーゼであり、これは、標的部位を相補する配列を有するＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ、「ｇＲＮＡ」）と会合（例えば結合）して、それによりヌクレアーゼの配列特異性を提供する。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、一本鎖標的部位を認識し、一方別の態様において、ヌクレアーゼは、二本鎖標的部位、例えば二本鎖ＤＮＡ標的部位を認識する。多くの天然に存在するヌクレアーゼ、例えば多くの天然に存在するＤＮＡ制限ヌクレアーゼの標的部位は、当業者によく知られている。ヌクレアーゼタンパク質は、典型的には、タンパク質と核酸基質との相互作用を仲介し、および場合によっては標的部位に特異的に結合する「結合ドメイン」、および核酸骨格内のホスホジエステル結合の切断を触媒する「切断ドメイン」を含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼタンパク質は、単量体型で核酸分子に結合して切断することができ、一方、他の態様において、ヌクレアーゼタンパク質は、標的核酸分子を切断するために二量体化または多量体化しなければならない。天然に存在するヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメイン、ならびに融合して特定の標的部位に結合するヌクレアーゼを作製することができる、モジュラー結合ドメインおよび切断ドメインは、当業者によく知られている。例えば、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質、または不活性ＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９タンパク質の結合ドメインは、結合ドメイン（例えば、ｇＲＮＡに結合して、標的部位への結合を導くもの）として使用して、所望の標的部位に特異的に結合し、切断ドメインに融合またはコンジュゲートすることができる。
【００６８】
本明細書で使用される「核酸」および「核酸分子」という用語は、核酸塩基および酸性部分を含む化合物、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを指す。典型的には、ポリマー核酸、例えば３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は直鎖状分子であり、ここでは隣接するヌクレオチドはホスホジエステル結合を介して互いに連結している。いくつかの態様において、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）をいう。いくつかの態様において、「核酸」は、３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、少なくとも３つのヌクレオチドのストリング）を指すために、互換的に使用することができる。いくつかの態様において、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡを包含する。核酸は、例えばゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｇＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然に存在する核酸分子の文脈において、天然に存在し得る。一方で、核酸分子は、天然に存在しない分子、例えば、組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノム、またはそれらの断片、または合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得、または天然に存在しないヌクレオチドもしくはヌクレオシドを含む。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または類似の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外の骨格を有する類似体を含む。核酸は、天然の供給源から精製することができ、組換え発現系を使用して生成され、そして場合により精製されるか、化学合成されることなどができる。適切な場合には、例えば化学合成分子の場合には、核酸は、化学修飾塩基、糖、および骨格修飾を有する類似体などの、ヌクレオシド類似体を含むことができる。他に示されない限り、核酸配列は５’から３’方向に提示される。いくつかの態様において、核酸は、以下であるか、またはそれを含む：天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学修飾塩基；生物学的修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレート塩基；修飾糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）。
【００６９】
用語「直交する」は、仮にあったとしても最小限に相互作用する生物学的成分を指す。異なるｇＲＮＡ結合部位を含むリコンビナーゼ標的部位は、ｇＲＮＡ指向性ｒｅｃＣａｓ９タンパク質が他の潜在的リコンビナーゼ部位と相互作用しないか、または最小限にしか相互作用しない場合、直交性である。用語「直交性」は、システム構成要素を、他の構成要素の性能に影響を与えることなく独立して変化させることができるという概念を指す。複合体のｇＲＮＡ指向性は、リコンビナーゼ活性をｇＲＮＡ指向性部位のみに指向させることができる、ｒｅｃＣａｓ９タンパク質と複合体化したｇＲＮＡ分子のセットを作る。系の直交性は、ｇＲＮＡ分子のセットの、標的リコンビナーゼ部位における酵素活性に対する完全またはほぼ完全な依存性により、実証される。
【００７０】
本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、疾患または障害の処置および／または予防の文脈において、対象に投与することができる組成物を指す。いくつかの態様において、医薬組成物は、活性成分、例えば、Ｃａｓ９タンパク質に融合したリコンビナーゼ、またはその断片（またはかかる融合をコードする核酸）、および任意に薬学的に許容し得る賦形剤を含む。いくつかの態様において、医薬組成物は、本発明のＣａｓ９バリアント／融合（例えば、ｆＣａｓ９）タンパク質（単数または複数）と、Ｃａｓ９バリアント／融合タンパク質を標的核酸に標的化するのに適したｇＲＮＡとを含む。いくつかの態様において、標的核酸は遺伝子である。いくつかの態様において、標的核酸は疾患に関連するアレルであり、該アレルはＣａｓ９バリアント／融合タンパク質の作用により切断される。いくつかの態様において、アレルは、ＣＬＴＡ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＰＣＤＨ１５遺伝子、またはＦＡＭ１９Ａ２遺伝子のアレルである。例えば実施例を参照のこと。
【００７１】
本明細書で使用される「増殖性疾患」という用語は、細胞または細胞集団が異常に高い増殖率を示すという点で、細胞または組織の恒常性が乱される任意の疾患を指す。増殖性疾患には、新生物発生前の過形成状態および腫瘍性疾患などの、過剰増殖性疾患が含まれる。腫瘍性疾患は、細胞の異常増殖を特徴とし、良性および悪性の両方の腫瘍（新生物）を含む。悪性新生物はがんとも呼ばれる。いくつかの態様において、本明細書で提供される組成物および方法は、増殖性疾患を処置するのに有用である。例えば、いくつかの態様において、Ｃａｓ９（例えば、ｆＣａｓ９）タンパク質（単数または複数）およびＣａｓ９タンパク質をＶＥＧＦアレルに標的化するのに適したｇＲＮＡを含む医薬組成物、ここでアレルは、Ｃａｓ９タンパク質（単数または複数）の作用により不活性化される。例えば実施例を参照のこと。
【００７２】
「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド（アミド）結合によって互いに結合したアミノ酸残基のポリマーを指す。用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸長であろう。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質の集合を指すことがある。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸は、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化、または他の修飾のためのリンカーなどの、化学物質の付加によって、修飾することができる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドはまた、単一分子であってもよく、または多分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単なる断片であり得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然のもの、組換えのもの、または合成のもの、あるいはそれらの任意の組み合わせであり得る。本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質由来のタンパク質ドメインを含む、ハイブリッドポリペプチドを指す。１つのタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部分またはカルボキシ末端（Ｃ末端）タンパク質に位置してもよく、したがって、それぞれ「アミノ末端融合タンパク質」または「カルボキシ末端融合タンパク質」を形成する。本明細書に提供されるタンパク質のいずれも、当技術分野において知られている任意の方法によって生産され得る。例えば、本明細書に提供されるタンパク質は、組換えタンパク質の発現および精製を介して生産され得、これはペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に適している。組換えタンパク質の発現および精製の方法はよく知られており、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))に記載のものを含む；この全内容は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で言及される特定の融合タンパク質は、ｒｅｃＣａｓ９、すなわち触媒的に不活性なｄＣａｓ９をリコンビナーゼの触媒ドメインに融合することによって作製された、哺乳動物細胞において機能することができる、ＲＮＡプログラム化された小セリンリコンビナーゼである。
【００７３】
本明細書で論じる「疑似ｇｉｘ」部位または「ｇｉｘ疑似部位」は、Ｇｉｘリコンビナーゼの天然のＤＮＡ認識配列に似た、特定の疑似パリンドロームコアＤＮＡ配列である。例えば、N. D. F. Grindley, K. L. Whiteson, P A Rice, Mechanisms of site-specific recombination.  Annu Rev Biochem 75, 567-605 (2006)を参照；これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。同様に、「疑似ｈｉｘ」または「ｈｉｘ疑似部位」、「疑似ｓｉｘ」または「ｓｉｘ疑似部位」、「疑似ｒｅｓＨ」または「ｒｅｓＨ疑似部位」、「疑似ｒｅｓ」または「ｒｅｓ疑似部位」、「疑似ＬｏｘＰ」または「Ｌｏｘ疑似部位」、「疑似ａｔｔ」または「ａｔｔ疑似部位」、「疑似ＦＴＲ」または「ＦＴＲ疑似部位」は、Ｈｉｎリコンビナーゼ、βリコンビナーゼ、Ｓｉｎリコンビナーゼ、Ｔｎ３またはγδリコンビナーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、λファージインテグラーゼ、またはＦＬＰリコンビナーゼの天然のＤＮＡ認識配列に似た、特異的な擬似パリンドロームコアＤＮＡ配列である。
【００７４】
用語「ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ」および「ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ」は、本明細書中で互換的に使用され、切断の標的ではない１つ以上のＲＮＡと複合体を形成する（例えば、結合または会合する）ヌクレアーゼをいう。いくつかの態様において、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼは、ＲＮＡと複合体を形成している場合、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体と呼ばれることがある。典型的には、結合したＲＮＡはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれる。ｇＲＮＡは、２つ以上のＲＮＡの複合体として、または単一のＲＮＡ分子として存在し得る。単一のＲＮＡ分子として存在するｇＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも称され得るが、ただし「ｇＲＮＡ」は互換的に、単一分子または２つ以上の分子の複合体として存在するガイドＲＮＡを指すために使用される。典型的には、単一のＲＮＡ種として存在するｇＲＮＡは、次の２つのドメインを含む：（１）標的核酸と相同性を共有する（例えば、Ｃａｓ９複合体の標的への結合を指示する）ドメイン；および（２）Ｃａｓ９タンパク質に結合するドメイン。いくつかの態様において、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして知られる配列に対応し、ステムループ構造を含む。例えば、いくつかの態様において、ドメイン（２）は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるJinek et al., Science 337:816-821(2012)の図１Ｅに示されるように、ｔｒａｃｒＲＮＡと相同である。ｇＲＮＡの他の例（例えば、ドメイン２を含むもの）は、以下に見出すことができる：２０１３年９月６日に出願された米国仮特許出願U.S.S.N. 61/874,682、名称「切替え可能Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびその用途」；２０１３年９月６日に出願された米国仮特許出願U.S.S.N.  61/874,746、名称「機能性ヌクレアーゼのための送達システム」；２０１３年３月１５日に出願されたＰＣＴ出願WO 2013/176722、名称「ＲＮＡ指向性標的ＤＮＡ修飾および転写のＲＮＡ指向性調節のための方法および組成物」；および２０１３年３月２０日に出願されたＰＣＴ出願WO 2013/142578、名称「Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ複合体によるＲＮＡ指向性ＤＮＡ切断」；これら各々の全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ｇＲＮＡのさらに他の例が、本明細書に提供される。例えば実施例を参照のこと。いくつかの態様において、ｇＲＮＡはドメイン（１）および（２）の２つ以上を含み、「伸長（extended）ｇＲＮＡ」と呼ばれる場合がある。例えば伸長ｇＲＮＡは、本明細書に記載のように、例えば２つ以上のＣａｓ９タンパク質に結合し、標的核酸の２つ以上の異なる領域に結合する。ｇＲＮＡは、標的部位を相補するヌクレオチド配列を含み、これはヌクレアーゼ／ＲＮＡ複合体の前記標的部位への結合を媒介し、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の配列特異性を提供する。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）９エンドヌクレアーゼ、例えばStreptococcus pyogenesからのＣａｓ９（Ｃｓｎ１）などの、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼである。（例えば以下を参照のこと："Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc.  Natl.  Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663 (2001)；"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)；および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E.  Science 337:816-821(2012)；これら各々の全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００７５】
ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、標的ＤＮＡ切断部位を決定するためにＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを使用するため、これらのタンパク質は原則として、ガイドＲＮＡによって特定される任意の配列を切断することができる。Ｃａｓ９などのＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼを、部位特異的切断のため（例えばゲノムを修飾するため）に使用する方法は、当分野で知られている（例えばCong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)；Mali, P. et al.  RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013) ；Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)；Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)；Dicarlo, J.E. et al  Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)；Jiang, W. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)を参照、これら各々の全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００７６】
本明細書で使用される用語「リコンビナーゼ」は、リコンビナーゼ認識配列間のＤＮＡの組換えを媒介する部位特異的酵素を指し、これはリコンビナーゼ認識配列間のＤＮＡ断片の切り出し、組み込み、反転、または交換（例えば転座）をもたらす。リコンビナーゼは、２つの異なるファミリーに分類することができる：セリンリコンビナーゼ（例えば、レゾルバーゼおよびインベルターゼ）およびチロシンリコンビナーゼ（例えば、インテグラーゼ）。セリンリコンビナーゼの例としては、限定はされないが、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｔｎ３、β−ｓｉｘ、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、γδ、Ｂｘｂ１、φＣ３１、ＴＰ９０１、ＴＧ１、φＢＴ１、Ｒ４、φＲＶ１、φＦＣ１、ＭＲ１１、Ａ１１８、Ｕ１５３、およびｇｐ２９が挙げられる。チロシンリコンビナーゼの例としては、限定はされないが、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、Ｒ、λ、ＨＫ１０１、ＨＫ０２２、およびｐＳＡＭ２が挙げられる。本明細書中で言及されるＧｉｎリコンビナーゼは、当技術分野で知られている任意のＧｉｎリコンビナーゼであってよく、これには、限定はされないが、次に記載のＧｉｎリコンビナーゼが含まれる：T. Gaj et al., A comprehensive approach to zinc-finger recombinase customization enables genomic targeting in human cells. Nucleic Acids Research 41, 3937-3946 (2013)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一定の態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインは、配列番号７１３に示されるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を超える配列同一性を有する。別の態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列は、Ｈ１０６Ｙ、および／またはＩ１２７Ｌ、および／またはＩ１３６Ｒ、および／またはＧ１３７Ｆに対応する変異を含む。さらに別の態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列は、Ｈ１０６Ｙ、Ｉ１２７Ｌ、Ｉ１３６Ｒ、およびＧ１３７Ｆに対応する変異を含む。さらなる態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼのアミノ酸配列は、さらに変異している。特定の態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列は、配列番号７１３を含む。Ｇｉｎリコンビナーゼは、ｇｉｘ標的部位（本明細書では「ｇｉｘコア」、「最小ｇｉｘコア」または「ｇｉｘ関連コア」の配列とも呼ばれる）に結合する。最小ｇｉｘコアリコンビナーゼ部位は、ＮＮＮＮＡＡＡＳＳＷＷＳＳＴＴＴＮＮＮＮ（配列番号１９）であり、ここでＮは任意のアミノ酸として定義され、ＷはＡまたはＴ、およびＳはＧまたはＣである。ｇｉｘ標的部位は、当分野で知られている任意の変異を含み得る。一定の態様において、ｇｉｘ標的部位は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と９０％、９５％、または９９％を超える配列同一性を有する。ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位の間の距離は、１〜１０塩基対、３〜７塩基対、５〜７塩基対、または５〜６塩基対であり得る。ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基対であり得る。
【００７７】
セリンおよびチロシンリコンビナーゼの名称は、リコンビナーゼがＤＮＡを攻撃するために使用し、鎖交換中にＤＮＡと共有結合される、保存された求核性アミノ酸残基に由来する。リコンビナーゼは、遺伝子ノックアウト／ノックインの作製および遺伝子治療用途を含む、多数の用途を有する。例えば、以下を参照：Brown et al., "Serine recombinases as tools for genome engineering." Methods. 2011;53(4):372-9；Hirano et al., "Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration." Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011; 92(2):227-39；Chavez and Calos, "Therapeutic applications of the ΦC31 integrase system." Curr. Gene Ther. 2011;11(5):375-81；Turan and Bode, "Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications." FASEB J.  2011; 25(12):4088-107；Venken and Bellen, "Genome-wide manipulations of Drosophila melanogaster with transposons, Flp recombinase, and ΦC31 integrase." Methods Mol.  Biol. 2012; 859:203-28; Murphy, "Phage recombinases and their applications." Adv. Virus Res. 2012; 83:367-414；Zhang et al., "Conditional gene manipulation: Creating a new biological era." J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2012; 13(7):511-24；Karpenshif and Bernstein, "From yeast to mammals: recent advances in genetic control of homologous recombination." DNA Repair (Amst). 2012; 1;11(10):781-8；これら各々の全内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に提供されるリコンビナーゼは、本発明の態様において使用することができるリコンビナーゼの、排他的な例であることを意味しない。本発明の方法および組成物は、新しい直交リコンビナーゼについてデータベースをマイニングすること、または定義されたＤＮＡ特異性を有する合成リコンビナーゼを設計することによって、拡張することができる（例えば、Groth et al., "Phage integrases: biology and applications." J. Mol. Biol. 2004; 335, 667-678；Gordley et al., "Synthesis of programmable integrases." Proc.  Natl.  Acad. Sci. U S A. 2009; 106, 5053-5058を参照；これら各々の全内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７８】
本明細書に記載の方法および組成物において有用であるリコンビナーゼの他の例は、当業者に知られており、発見または生成された任意の新しいリコンビナーゼは、本発明の異なる態様において使用可能であることが予想される。いくつかの態様において、リコンビナーゼの触媒ドメインは、リコンビナーゼドメインが核酸結合ドメインを含まないか、または、続いて酵素的触媒作用をもたらす標的核酸に結合することができないように、ヌクレアーゼ不活性化ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９、またはその断片）に融合される（例えば、リコンビナーゼドメインは、それが特異的ＤＮＡ結合活性を持たないように操作される）。そのＤＮＡ結合活性の一部を欠くリコンビナーゼ、およびアクセサリータンパク質とは無関係に作用するもの、およびそれらを操作する方法は知られており、これには、以下に記載されているものが含まれる：Klippel et al., "Isolation and characterisation of unusual gin mutants." EMBO J. 1988; 7: 3983-3989；Burke et al., "Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation. Mol Microbiol. 2004; 51: 937-948；Olorunniji et al., "Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants."  Nucleic Acids Res.  2008; 36: 7181-7191；Rowland et al., "Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome." Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298；Akopian et al., "Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition." Proc Natl Acad Sci USA.  2003;100: 8688-8691；Gordley et al., "Evolution of programmable zinc finger-recombinases with activity in human cells. J Mol Biol.  2007; 367: 802-813；Gordley et al., "Synthesis of programmable integrases." Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106: 5053-5058；Arnold et al., "Mutants of Tn3 resolvase which do not require accessory binding sites for recombination activity." EMBO J. 1999;18: 1407-1414；Gaj et al., "Structure-guided reprogramming of serine recombinase DNA sequence specificity." Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108(2):498-503；およびProudfoot et al., "Zinc finger recombinases with adaptable DNA sequence specificity." PLoS One. 2011;6(4):e19537；これら各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、レゾルバーゼ−インベルターゼ群のセリンリコンビナーゼ、例えば、Ｔｎ３およびγδレゾルバーゼならびにＨｉｎおよびＧｉｎインベルターゼは、部分的に自律的な触媒ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを有するモジュール構造を有する（例えば、Grindley et al., "Mechanism of site-specific recombination." Ann Rev Biochem.  2006; 75: 567-605を参照、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、これらのリコンビナーゼの触媒ドメインは、例えば、いかなる補助因子（例えば、ＤＮＡ結合活性）も必要としない「活性化」リコンビナーゼ変異体の単離後に、本明細書に記載のヌクレアーゼ不活性化ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９、またはその断片）と組み換えられやすい（例えば、以下を参照：Klippel et al., "Isolation and characterisation of unusual gin mutants." EMBO J. 1988; 7: 3983-3989；Burke et al., "Activating mutations of Tn3 resolvase marking interfaces important in recombination catalysis and its regulation.  Mol Microbiol. 2004; 51: 937-948；Olorunniji et al., "Synapsis and catalysis by activated Tn3 resolvase mutants." Nucleic Acids Res.  2008; 36: 7181-7191；Rowland et al., "Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model of the synaptosome." Mol Microbiol. 2009; 74: 282-298；Akopian et al., "Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition." Proc Natl Acad Sci USA.  2003;100: 8688-8691）。
【００７９】
さらに、Ｎ末端触媒ドメインおよびＣ末端ＤＮＡ結合ドメインを有する他の多くの天然セリンリコンビナーゼが知られており（例えば、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ、ＴｎｐＸトランスポザーゼ、ＩＳ６０７トランスポザーゼ）、それらの触媒ドメインは、本明細書に記載されているように、プログラム可能な部位特異的リコンビナーゼを操作するように選出することができる（例えば、Smith et al., "Diversity in the serine recombinases." Mol Microbiol. 2002;44: 299-307を参照、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、チロシンリコンビナーゼのコア触媒ドメイン（例えば、Ｃｒｅ、λインテグラーゼ）は知られており、本明細書に記載されるように、プログラム可能な部位特異的リコンビナーゼを操作するように選出することができる（例えば、Guo et al., "Structure of Cre recombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse." Nature. 1997; 389:40-46；Hartung et al., "Cre mutants with altered DNA binding properties." J Biol Chem 1998; 273:22884-22891；Shaikh et al., "Chimeras of the Flp and Cre recombinases: Tests of the mode of cleavage by Flp and Cre. J Mol Biol. 2000; 302:27-48；Rongrong et al., "Effect of deletion mutation on the recombination activity of Cre recombinase." Acta Biochim Pol. 2005; 52:541-544；Kilbride et al., "Determinants of product topology in a hybrid Cre-Tn3 resolvase site-specific recombination system." J Mol Biol. 2006; 355:185-195；Warren et al., "A chimeric cre recombinase with regulated directionality." Proc Natl Acad Sci USA.  2008 105:18278-18283；Van Duyne, "Teaching Cre to follow directions." Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Jan 6;106(1):4-5；Numrych et al., "A comparison of the effects of single-base and triple-base changes in the integrase arm-type binding sites on the site-specific recombination of bacteriophage λ." Nucleic Acids Res.  1990; 18:3953-3959；Tirumalai et al., "The recognition of core-type DNA sites by λ integrase." J Mol Biol. 1998; 279:513-527；Aihara et al., "A conformational switch controls the DNA cleavage activity of λ integrase." Mol Cell. 2003; 12:187-198；Biswas et al., "A structural basis for allosteric control of DNA recombination by λ integrase." Nature. 2005; 435:1059-1066；およびWarren et al., "Mutations in the amino-terminal domain of λ-integrase have differential effects on integrative and excisive recombination." Mol Microbiol. 2005; 55:1104-1112を参照、これら各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８０】
核酸修飾（例えば、ゲノム修飾）の文脈において、用語「組み換える」または「組換え」は、２つ以上の核酸分子、または単一の核酸分子の２つ以上の領域が、リコンビナーゼタンパク質（例えば、本明細書に提供される本発明のリコンビナーゼ融合タンパク質）の作用によって修飾されるところのプロセスを指す。組換えは、とりわけ、例えば１つ以上の核酸分子内またはその間における、核酸の挿入、反転、切除、または転座をもたらし得る。
【００８１】
タンパク質または核酸の文脈において本明細書で使用される「組換え体（recombinant）」という用語は、天然には存在しないが、ヒトによる操作の産物であるタンパク質または核酸を指す。例えば、いくつかの態様において、組換えタンパク質または核酸分子は、任意の天然の配列と比較して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの変異を含む、アミノ酸またはヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
本明細書で使用される「対象」という用語は、個々の生物、例えば個々の哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象はげっ歯類である。いくつかの態様において、対象は、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、またはイヌである。いくつかの態様において、対象は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚、昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの態様において、対象は研究動物である。いくつかの態様において、対象は遺伝子操作された、例えば遺伝子操作された非ヒト対象である。対象は、いずれかの性別で任意の発達段階のものであってよい。いくつかの態様において、対象は遺伝子操作された、例えば遺伝子操作された非ヒト対象である。対象は、いずれかの性別で任意の発達段階のものであってよい。
【００８３】
ヌクレアーゼの文脈において本明細書で使用される「標的核酸」および「標的ゲノム」という用語はそれぞれ、所与のヌクレアーゼの少なくとも１つの標的部位を含む、核酸分子またはゲノムを指す。（ヌクレアーゼ不活性化）ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼおよびリコンビナーゼドメインを含む融合物の文脈において、「標的核酸」および「標的ゲノム」はそれぞれ、少なくとも１つの標的部位を含む、１つ以上の核酸分子、またはゲノムを指す。いくつかの態様において、標的核酸は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つの標的部位を含む。いくつかの態様において、標的核酸は、４つの標的部位を含む。
【００８４】
用語「標的部位」は、リコンビナーゼ（例えば、本明細書で提供されるｄＣａｓ９−リコンビナーゼ融合タンパク質）により、（例えば、標的部位またはその近傍で）結合され組み換えられている、核酸分子内の配列を指す。標的部位は、一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、いくつかの態様において、４つのリコンビナーゼ単量体が、標的核酸を組み換えるように配位され、各単量体は、ｇＲＮＡによって誘導される（ヌクレアーゼ不活性化）Ｃａｓ９タンパク質に融合される。かかる例において、各Ｃａｓ９ドメインは、異なるｇＲＮＡによって誘導されて標的核酸と結合し、したがって標的核酸は４つの標的部位を含み、各部位は別々のｄＣａｓ９−リコンビナーゼ融合物によって標的化される（それによって、標的核酸を組み換える４つのリコンビナーゼモノマーを配位する）。ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（またはそのｇＲＮＡ結合ドメイン）および本発明のＣａｓ９の融合物については、標的部位は、いくつかの態様において、１７〜２０塩基対プラス３塩基対のＰＡＭ（例えば、ＮＮＮ、ここでＮは独立して、任意のヌクレオチドを表す）である。典型的には、ＰＡＭの最初のヌクレオチドは任意のヌクレオチドであり得るが、一方２つの下流ヌクレオチドは、特異的ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼに応じて特定される。Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼのための例示的な標的部位（例えば、ＰＡＭを含む）は、当業者に知られており、限定はされないが、ＮＮＧ、ＮＧＮ、ＮＡＧ、およびＮＧＧを含み、ここで各Ｎは、独立して任意のヌクレオチドである。さらに、異なる種（例えば、S. pyogenesの代わりにS. thermophilus）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼは、配列ＮＧＧＮＧ（配列番号７６３）を含むＰＡＭを認識する。さらなるＰＡＭ配列が知られており、これには、限定はされないが、ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号７４９）およびＮＡＡＲ（配列番号７７１）が含まれる（例えば、Esvelt and Wang, Molecular Systems Biology, 9:641 (2013)を参照、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの側面において、例えばＣａｓ９などのＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼの標的部位は、構造［ＮＺ］−［ＰＡＭ］を含み得、式中各Ｎは、独立して任意のヌクレオチドであり、ｚは１以上５０以下の整数である。いくつかの態様において、ｚは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０である。いくつかの態様において、ｚは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０である。いくつかの態様において、ｚは２０である。一定の態様において、本明細書でさ��に説明されるように緩和されたＰＡＭ要件を有する「ＰＡＭなし」ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ（例えば、ＰＡＭなしＣａｓ９）、または、本明細書にさらに記載される緩和されたＰＡＭ要件を有するＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼを使用してもよい。いくつかの態様において、「標的部位」はまた、ヌクレアーゼによって結合されるが切断されない核酸分子内の配列を指すこともある。例えば、本明細書に記載の一定の態様は、不活性（または不活性化された）Ｃａｓ９ ＤＮＡ切断ドメインを含むタンパク質を提供する。かかるタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ ＲＮＡ結合ドメインも含む場合）は、ｇＲＮＡによって特定される標的部位に結合することができる；しかしながら、ＤＮＡ切断部位は不活性化されているので、標的部位は特定のタンパク質によっては切断されない。いくつかの態様において、かかるタンパク質は、標的核酸の組換えを媒介するリコンビナーゼ（またはリコンビナーゼの触媒ドメイン）にコンジュゲート、融合、または結合している。いくつかの態様において、実際に切断または組み換えられる配列は、核酸分子の切断または組換えを媒介するタンパク質（例えば、リコンビナーゼ）または分子に依存し、そしていくつかの場合には、例えば、不活性化Ｃａｓ９タンパク質（単数または複数）が結合している近接性または距離に関連するであろう。
【００８５】
本明細書で使用される用語「転写アクチベーター様エフェクター」（ＴＡＬＥ）は、高度に可変性の２つのアミノ酸モチーフ（反復可変二残基、ＲＶＤ）を含む高度に保存された３３〜３４アミノ酸配列を含む、ＤＮＡ結合ドメインを含む細菌タンパク質を指す。ＲＶＤモチーフは核酸配列に対する結合特異性を決定し、当業者に知られている方法に従って、所望のＤＮＡ配列に特異的に結合するように操作することができる。（例えば、Miller, Jeffrey; et.al.  (February 2011). "A TALE nuclease architecture for efficient genome editing". Nature Biotechnology 29 (2): 143-8；Zhang, Feng; et.al.  (February 2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription" Nature Biotechnology 29 (2): 149-53；Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. "Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity". PLoS ONE 6 (5): e19509; Boch, Jens (February 2011). "TALEs of genome targeting". Nature Biotechnology 29 (2): 135-6；Boch, Jens; et.al. (December 2009). "Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors". Science 326 (5959): 1509-12；およびMoscou, Matthew J.; Adam J. Bogdanove (December 2009). "A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors" Science 326 (5959): 1501を参照、これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間の単純な関係は、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組み合わせを選択することにより、特定のＤＮＡ結合ドメインの操作を可能にした。
【００８６】
本明細書で使用される用語「転写アクチベーター様エレメントヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡ切断ドメイン、例えばＦｏｋＩドメインに対する転写アクチベーター様エフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む、人工ヌクレアーゼを指す。操作されたＴＡＬＥ構築物を生成するための多数のモジュラーアセンブリスキームが報告されている（例えば、Zhang, Feng; et.al. (February 2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription". Nature Biotechnology 29 (2): 149-53；Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. "Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity". PLoS ONE 6 (5): e19509；Cermak, T.; Doyle, E. L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C.; Baller, J. A.; Somia, N. V. et al  (2011). "Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting". Nucleic Acids Research；Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (2011). "Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning". Nucleic Acids Research；Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D. A.; Carpenter, S.; Spalding, M. H.; Weeks, D. P.; Yang, B. (2011). "Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes". Nucleic Acids Research.；Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C.; Marillonnet, S. (2011). Bendahmane, Mohammed. ed. "Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning". PLoS ONE 6 (5): e19722を参照、これら各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８７】
用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載の、疾患または障害、またはその１つ以上の症状の、逆転、軽減、発症の遅延、または進行の抑制を目的とした、臨床的介入を指す。本明細書で使用する場合、用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載の、疾患もしくは障害、またはその１つ以上の症状の、逆転、軽減、発症の遅延、または進行の抑制を目的とする臨床的介入を指す。いくつかの態様において、処置は、１つ以上の症状が現れた後および／または疾患が診断された後に、施すことができる。別の態様において、処置は、症状の非存在下で、例えば、症状の発症を予防または遅延するために、あるいは疾患の発症または進行を阻害するために、施すことができる。例えば、処置は、感受性の個体に対して、症状の発症前に（例えば、症状の履歴に照らしておよび／または遺伝的もしくは他の感受性因子に照らして）、施すことができる。処置はまた、症状が解消した後も、たとえば症状の再発を予防または遅延させるために、継続することができる。
【００８８】
「ベクター」という用語は、本発明の１つ以上の組換えポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、例えば、本明細書に提供されるＣａｓ９タンパク質（またはその融合物）および／またはｇＲＮＡをコードするものを指す。ベクターとしては、限定はされないが、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、人工染色体、およびファージミドが挙げられる。ベクターは宿主細胞中で複製することができ、ベクターが切断されそこに所望の核酸配列が挿入され得る１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位により、さらに特徴付けられ得る。ベクターは、ベクターで形質転換またはゲノム修飾されているかまたはされていない細胞の同定および／または選択における使用に適した、１つ以上のマーカー配列を含み得る。マーカーには、例えば、抗生物質（例えば、カナマイシン、アンピシリン）または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、活性が当技術分野で知られている標準アッセイによって検出可能な酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニー、またはプラークの表現型に視覚的な影響を及ぼす遺伝子が含まれる。本発明に包含されるような宿主細胞（例えば大腸菌、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞等）の形質転換に適した任意のベクター、例えばｐＵＣシリーズ、ｐＧＥＭシリーズ、ｐＥＴシリーズ、ｐＢＡＤシリーズ、ｐＴＥＴシリーズ、またはｐＧＥＸシリーズに属するベクター。いくつかの態様において、ベクターは、組換えタンパク質産生のために宿主細胞を形質転換するのに適している。タンパク質（例えば、本明細書中に提供されるもの）を発現し、細胞を形質転換し、および組換えタンパク質を発現／精製するためのベクターおよび宿主細胞を選択および操作する方法は、当分野でよく知られており、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))により提供される。
【００８９】
本明細書で使用される用語「ジンクフィンガー」は、折り目およびその折り目を安定化させる１つ以上の亜鉛イオンの配位によって特徴付けられる、小さな核酸結合タンパク質構造モチーフを指す。ジンクフィンガーは、多種多様な異なるタンパク質構造を包含する（例えば、Klug A, Rhodes D (1987). "Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition". Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52: 473-82を参照：その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ジンクフィンガーは、ヌクレオチドの特定の配列に結合するように設計することができ、一連のジンクフィンガーの融合物を含むジンクフィンガーアレイは、実質的に任意の所望の標的配列に結合するように設計することができる。かかるジンクフィンガーアレイは、例えば、核酸切断ドメインにコンジュゲートされている場合、例えばヌクレアーゼなどのたんぱく質の結合ドメインを形成することができる。異なる種類のジンクフィンガーモチーフが当業者に知られており、これには、限定はされないが、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２、Ｇａｇナックル、Treble clef、亜鉛リボン、Ｚｎ２／Ｃｙｓ６およびＴＡＺ２ドメイン様モチーフを含む（例えば、Krishna SS, Majumdar I, Grishin NV (January 2003). "Structural classification of zinc fingers: survey and summary". Nucleic Acids Res. 31 (2): 532-50を参照）。典型的には、単一のジンクフィンガーモチーフが、核酸分子の３または４ヌクレオチドに結合する。したがって、２つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは、６〜８ヌクレオチドに結合し得、３つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは、９〜１２ヌクレオチドに結合し得、４つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは、１２〜１６ヌクレオチドに結合し得る、等々である。任意の適切なタンパク質工学技術を用いて、ジンクフィンガーのＤＮＡ結合特異性を変更し、および／または長さ３〜３０ヌクレオチドの実質的にあらゆる所望の標的配列に結合するための新規なジンクフィンガー融合物を設計することができる（例えば、Pabo CO, Peisach E, Grant RA (2001). "Design and selection of novel cys2His2 Zinc finger proteins". Annual Review of Biochemistry 70: 313-340；Jamieson AC, Miller JC, Pabo CO (2003). "Drug discovery with engineered zinc-finger proteins".  Nature Reviews Drug Discovery 2 (5): 361-368；およびLiu Q, Segal DJ, Ghiara JB, Barbas CF (May 1997). "Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  94 (11)を参照、これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。操作されたジンクフィンガーアレイと核酸を切断するタンパク質ドメインとの間の融合を用いて、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」を生成することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、典型的には、核酸分子内の特定の標的部位に結合するジンクフィンガードメイン、および結合ドメインによって結合された標的部位内またはその近傍で核酸分子を切断する核酸切断ドメインを含む。典型的な操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼは、３〜６の間の個々のジンクフィンガーモチーフおよび９塩基対〜１８塩基対の長さの範囲の結合標的部位を有する結合ドメインを含む。より長い標的部位は、所与のゲノムにおいてユニークである標的部位を結合し切断することが望まれる状況において、特���魅力的である。
【００９０】
本明細書で使用される用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、ジンクフィンガーアレイを含む結合ドメインにコンジュゲートされた核酸切断ドメインを含む、ヌクレアーゼを指す。いくつかの態様において、切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの切断ドメインである。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、切断のために所与の核酸分子中の実質的に任意の所望の配列を標的とするように設計することができ、複雑なゲノムの文脈でユニークな部位に結合するジンクフィンガー結合ドメインを設計する可能性は、生細胞における単一のゲノム部位を標的化切断して、例えば、治療的価値のある標的にされたゲノム変化を達成することを可能とする。所望のゲノム座位に二本鎖切断を標的化することを用いて、非相同ＤＮＡ修復経路の誤りがちな性質により、フレームシフト変異を遺伝子のコード配列に導入することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、当業者に知られている方法によって、目的の部位を標的とするように生成され得る。例えば、所望の特異性を有するジンクフィンガー結合ドメインを、既知の特異性の個々のジンクフィンガーモチーフを組み合わせることによって設計することができる。ＤＮＡに結合したジンクフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８の構造は、この分野における多くの研究についての教示を与える；６４個の可能な塩基対トリプレットのそれぞれについてジンクフィンガーを得、次いでこれらのモジュラージンクフィンガーを混合およびマッチングして、任意の所望の配列特異性を有するたんぱく質を設計するという概念が記載されている（Pavletich NP, Pabo CO (May 1991). "Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A". Science 252 (5007): 809-17；その全内容が本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、それぞれが３塩基対のＤＮＡ配列を認識する別々のジンクフィンガーを組み合わせて、長さが９塩基対から１８塩基対の範囲の標的部位を認識する３−、４−、５−、または６−フィンガーアレイを生成する。いくつかの態様において、より長いアレイが企図される。別の態様において、６〜８ヌクレオチドを認識する２フィンガーモジュールを組み合わせて、４−、６−、または８−ジンクフィンガーアレイを生成する。いくつかの態様において、細菌またはファージディスプレイを用いて、所望の核酸配列、例えば長さ３〜３０ｂｐの所望のヌクレアーゼ標的部位を認識するジンクフィンガードメインを開発する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、いくつかの態様において、リンカー、例えばポリペプチドリンカーを介して互いに融合またはコンジュゲートしているジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ドメインを含む。リンカーの長さは、ジンクフィンガードメインによって結合された核酸配列からの切断の距離を決定する。より短いリンカーが使用される場合、切断ドメインは結合核酸配列により近い核酸を切断し、一方より長いリンカーは、切断と結合核酸配列との間により大きな距離をもたらすであろう。いくつかの態様において、ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインは、結合核酸を切断するために二量体化しなければならない。いくつかのかかる態様において、二量体は、それぞれが異なるジンクフィンガー結合ドメイ���を含む２つの単量体のヘテロ二量体である。例えば、いくつかの態様において、二量体は、ＦｏｋＩ切断ドメインＡにコンジュゲートしたジンクフィンガードメインＡを含む１つのモノマー、およびＦｏｋＩ切断ドメインにコンジュゲートしたジンクフィンガードメインＢを含む１つのモノマーを含み得る。この非限定的な例において、ジンクフィンガードメインＡは標的部位の一方の側の核酸配列に結合し、ジンクフィンガードメインＢは標的部位の他方の側の核酸配列に結合し、二量体化ＦｏｋＩドメインは、ジンクフィンガードメイン結合部位間で核酸を切断する。
【００９１】
本発明の一定の態様の詳細な説明
本発明のこれらおよび他の態様の機能および利点は、以下の実施例からさらに十分に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の利点を説明することおよび特定の態様を説明することを意図しているが、本発明の全範囲を例示することは意図していない。したがって、実施例は本発明の範囲を限定することを意味しないことが理解されるであろう。
【００９２】
ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質
本明細書に記載の融合タンパク質および方法は、任意のプログラム可能ＤＮＡ結合ドメインを使用することができる。
【００９３】
いくつかの態様において、プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のＤＮＡ結合ドメインまたは転写アクチベーター様エフェクタードメイン（ＴＡＬＥ）を含む。いくつかの態様において、プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ガイドヌクレオチド配列によってプログラムされることができ、したがって「ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン」と呼ばれる。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９、またはｄＣａｓ９である。本明細書で使用されるｄＣａｓ９は、そのヌクレアーゼ活性において完全に不活性であるか、またはそのヌクレアーゼ活性において部分的に不活性である、Ｃａｓ９（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）を包含する。したがって、いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９ニッカーゼである。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性アルゴノートである。
【００９４】
いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、ｄＣａｓ９ドメインである。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９ニッカーゼである。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９ドメインは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に提供されるＣａｓ９ドメインのいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、および配列番号１のＤ１０Ｘ（Ｘは、Ｄ以外の任意のアミノ酸）、および／またはＨ８４０Ｘ（Ｘは、Ｈ以外の任意のアミノ酸）に対応する変異を含む。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に提供されるＣａｓ９ドメインのいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、および配列番号１のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａに対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、本明細書に提供されるＣａｓ９ドメインのいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、および配列番号１のＤ１０Ｘ（Ｘは、Ｄ以外の任意のアミノ酸）に対応する変異、および配列番号１の８４０位に対応する位置にヒスチジンを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、本明細書に提供されるＣａｓ９ドメインのいずれか１つと、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、および配列番号１のＤ１０Ａに対応する変異、および配列番号１の８４０位に対応する位置にヒスチジンを含む。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼのバリアントまたは相同体（例えば、それぞれ配列番号２または配列番号３のバリアント）が提供され、これらは、それぞれ配列番号２または配列番号３と、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一であり、および配列番号１のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａに対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９のバリアント（例えば、配列番号２のバリアント）であって、配列番号２よりも約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸、またはそれ以上、短いかまたは長いアミノ酸配列を有する前記バリアントが提供され、ただし、ｄＣａｓ９バリアントが、配列番号１のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａに対応する変異を含むという条件下においてである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼのバリアント（例えば、配列番号３のバリアント）であって、配列番号３よりも約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸、またはそれ以上、短いかまたは長いアミノ酸配列を有する前記バリアントが提供され、ただし、ｄＣａｓ９バリアントが、配列番号１のＤ１０Ａに対応する変異、および配列番号１の８４０位に対応する位置にヒスチジンを含むという条件下においてである。
【００９５】
さらなる適切なヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメインは、本開示および当分野の知識に基づいて当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。かかるさらなる例示の適切なヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインとしては、限定はされないが、配列番号１のＤ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異体ドメイン（例えば、Prashant et al., Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838を参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）、またはＫ６０３Ｒ（例えばChavez et al., Nature Methods 12, 326-328, 2015を参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
【００９６】
いくつかの態様において、本明細書に記載の核酸塩基エディタは、野生型Ｃａｓ９ドメインと比較して、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖−リン酸骨格との間の静電相互作用が減少したＣａｓ９ドメインを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖−リン酸骨格との間の会合を減少させる１つ以上の変異を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の核酸塩基エディタは、ｄＣａｓ９（例えば、配列番号１のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａの変異を有する）、またはＣａｓ９ニッカーゼ（例えば、配列番号１のＤ１０Ａの変異を有する）を含み、ここでｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼはさらに、配列番号１０に提供されるアミノ酸配列の１つ以上のＮ４９７Ｘ、Ｒ６６１Ｘ、Ｑ６９５Ｘ、および／またはＱ９２６Ｘの変異、または配列番号１１〜２６０に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）。いくつかの態様において、本明細書に記載の核酸塩基エディタは、ｄＣａｓ９（例えば、配列番号１のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａの変異を有する）、またはＣａｓ９ニッカーゼ（例えば、配列番号１のＤ１０Ａの変異を有する）を含み、ここでｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼはさらに、配列番号１０に提供されるアミノ酸配列の１つ以上のＮ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、および／またはＱ９２６Ａの変異、または配列番号１１〜２６０に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、（例えば、本明細書で提供される任意の核酸塩基エディタの）Ｃａｓ９ドメインは、配列番号７２０に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、核酸塩基エディタは、配列番号７２１に記載のアミノ酸配列を含む。高いフィデリティを有するＣａｓ９ドメインは当分野で知られており、当業者には明らかである。例えば、高いフィデリティを有するＣａｓ９ドメインは、Kleinstiver, B.P., et al. "High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects." Nature 529, 490-495 (2016)；およびSlaymaker, I.M., et al. "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity." Science 351, 84-88 (2015)に記載されおり、これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓ９とＤＮＡ骨格間の静電相互作用が減少したＣａｓ９バリアント
【化１２−１】
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【化１２−２】
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高フィデリティ核酸塩基エディタ
【化１３】
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【００９７】
Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９−ＤＮＡ相互作用に必要であるがガイドＲＮＡヌクレオチド配列に対する相補性によって決定されない、標的ＤＮＡ配列内の短いモチーフ（ＰＡＭモチーフ）を認識する。本明細書で使用される「ＰＡＭモチーフ」または「プロトスペーサー隣接モチーフ」は、ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ配列の直後の５’または３’に隣接するＤＮＡ配列を指す。Ｃａｓ９は、適切なＰＡＭ配列が後に続いていない場合には、標的ＤＮＡ配列に首尾よく結合、切断、または切れ目を入れない。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、Ｃａｓ９酵素中の特定のアミノ酸残基は、ＰＡＭの塩基との相互作用に関与し、ＰＡＭ特異性を決定する。したがって、これらの残基または近傍の残基における変化は、異なるまたは緩和されたＰＡＭ特異性をもたらす。本開示に基づいて当業者に明らかであるように、ＰＡＭ特異性を変化させるかまたは緩和することは、Ｃａｓ９が結合できる場所をシフトし得る。
【００９８】
野生型Streptococcus pyogenesＣａｓ９は、標準ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）を認識する。他のＣａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Streptococcus thermophiles、Staphylococcus aureus、Neisseria meningitidis、またはTreponema denticolaorからのＣａｓ９）およびそのＣａｓ９バリアントは、当技術分野において、異なるまたはより緩和されたＰＡＭ要件を有すると記載されている。例えば、以下である：Kleinstiver et al., Nature 523, 481-485, 2015；Klenstiver et al., Nature 529, 490-495, 2016；Ran et al., Nature, Apr 9; 520(7546): 186-191, 2015；Kleinstiver et al., Nat Biotechnol, 33(12):1293-1298, 2015；Hou et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 110(39):15644-9, 2014；Prykhozhij et al., PLoS One, 10(3): e0119372, 2015；Zetsche et al., Cell 163, 759-771, 2015；Gao et al., Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.3547, 2016；Want et al., Nature 461, 754-761, 2009；Chavez et al., doi: dx.doi dot org/10.1101/058974；Fagerlund et al., Genome Biol.  2015; 16: 25, 2015；Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015；およびSwarts et al., Nat Struct Mol Biol, 21(9):743-53, 2014；これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
したがって、本開示のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は様々なＰＡＭ配列を認識し得、これには、限定はされないが、ガイドＲＮＡによって決定されるＤＮＡ配列の３’末端または５’末端にあるＰＡＭ配列が含まれる。例えば、配列は以下である：ＮＧＧ、ＮＧＡＮ（配列番号７４１）、ＮＧＮＧ（配列番号７４２）、ＮＧＡＧ（配列番号７４３）、ＮＧＣＧ（配列番号７４４）、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号７４５）、ＮＧＲＲＮ（配列番号７４６）、ＮＮＮＲＲＴ（配列番号７４７）、ＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号７４８）、ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号７４９）、ＮＡＡＡＣ（配列番号７５０）、ＴＴＮ、ＴＴＴＮ（配列番号７５１）、およびＹＴＮ；この式中、Ｙはピリミジンであり、Ｒはプリンであり、およびＮは任意の核酸塩基である。
【０１００】
本開示のいくつかの側面は、塩基エディタなどの、タンパク質を特定の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列に導くために使用され得るＲＮＡプログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質を提供する。核酸プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質としては、限定はされないが、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２Ｃ３、およアルゴノートが挙げられる。異なるＰＡＭ特異性を有するＲＮＡプログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質の一例は、PrevotellaおよびFrancisella 1（Ｃｐｆ１）からのクラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返しである。Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１も、クラス２のＣＲＩＳＰＲエフェクターである。Ｃｐｆ１が、Ｃａｓ９とは異なる特徴を有する強いＤＮＡ干渉を媒介することが示されている。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一のＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼであり、ガイドＲＮＡによって決定されたＤＮＡ配列の５’末端にある、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（例えばＴＴＮ、ＴＴＴＮ（配列番号７５１）、またはＹＴＮ）を利用することができる。さらに、Ｃｐｆ１は、スタッガードＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。１６個のＣｐｆ１ファミリータンパク質のうち、AcidaminococcusとLachnospiraceaeからの２つの酵素は、ヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を有することが示されている。Ｃｐｆ１タンパク質は当技術分野において知られており、以前に記載されており、例えば、Yamano et al., "Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA." Cell (165) 2016, p. 949-962；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
さらに本発明の組成物および方法において有用であるのは、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインとして使用され得る、ヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１）バリアントである。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに類似しているがＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有さない、ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有し、Ｃｐｆ１のＮ末端は、Ｃａｓ９のαヘリックス認識ローブを有さない。Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015（これは参照により本明細書に組み込まれる）に示されているように、Ｃｐｆ１のＲｕｖＣ様ドメインは、両方のＤＮＡ鎖の切断に関与し、ＲｕｖＣ様ドメインの不活性化は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ活性を不活性化する。例えば、Francisella novicidaのＣｐｆ１（配列番号７１４）のＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、またはＤ１２５５Ａに対応する変異は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ活性を不活性化する。いくつかの態様において、本開示のｄＣｐｆ１は、配列番号７１４のＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含み得る。別の態様において、本開示のＣｐｆ１ニッカーゼは、配列番号７１４のＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含み得る。本開示の態様に有用なＣｐｆ１ニッカーゼは、当分野で知られている他の変異および／またはさらなる変異を含み得る。Ｃｐｆ１のＲｕｖＣドメインを完全にまたは部分的に不活性化する任意の変異、例えば置換変異、欠失、または挿入が、本開示に従って使用され得ること、およびＣｐｆ１のこれらの変異が、例えばｄＣｐｆ１またはＣｐｆ１ニッカーゼをもたらし得ることを理解されたい。
【０１０２】
したがって、いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１）である。いくつかの態様において、ｄＣｐｆ１は、配列番号７１４〜７１７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｄＣｐｆ１は、配列番号７１４〜７１７のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、および、配列番号７１４のＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含む。他の細菌種由来のＣｐｆ１もまた、ｄＣｐｆ１またはＣｐｆ１ニッカーゼとして、本開示に従って使用され得る。
野生型Francisella novicidaＣｐｆ１（配列番号７１４）（Ｄ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５は太字かつ下線）
【化１４−１】
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【化１４−２】
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Francisella novicida Ｃｐｆ１ Ｄ９１７Ａ（配列番号７１５）
【化１５】
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Francisella novicida Ｃｐｆ１ Ｅ１００６Ａ（配列番号７１６）
【化１６】
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Francisella novicida Ｃｐｆ１ Ｄ１２５５Ａ（配列番号７１７）
【化１７−１】
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【化１７−２】
2019526248.tif 000027
【０１０３】
Ｃａｓ９およびＣｐｆ１に加えて、３つの異なるクラス２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、およびＣ２ｃ３）がShmakov et al., "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems", Mol. Cell, 2015 Nov 5; 60(3): 385-397に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。２つのシステム、Ｃ２ｃ１およびＣ２ｃ３のエフェクターは、Ｃｐｆ１に関連するＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含む。第３のシステム、Ｃ２ｃ２は、２つの予測ＨＥＰＮ ＲＮａｓｅドメインを有するエフェクターを含む。成熟したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの生産は、Ｃ２ｃ１によるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの生産とは異なり、ｔｒａｃｒＲＮＡに依存しない。Ｃ２ｃ１は、ＤＮＡ切断に関してＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方に依存する。細菌Ｃ２ｃ２は、そのＲＮＡ活性化一本鎖ＲＮＡ分解活性とは異なり、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ成熟のためのユニークなＲＮａｓｅ活性を有することが示されている。これらのＲＮａｓｅ機能は互いに異なり、Ｃｐｆ１のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡプロセシング挙動とも異なる。例えば、East-Seletsky, et al., "Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection", Nature, 2016 Oct 13;538(7624):270-273を参照；この全内容は参照により本明細書に組み込まれる。Leptotrichia shahiiにおけるＣ２ｃ２のin vitro生化学分析は、Ｃ２ｃ２が単一のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡによって誘導され、相補的なプロトスペーサーを有するｓｓＲＮＡ標的を切断するようにプログラムされ得ることを示している。２つの保存されたＨＥＰＮドメイン中の触媒残基は、切断を仲介する。触媒残基の変異は、触媒的に不活性なＲＮＡ結合タンパク質を生成する。例えば、Abudayyeh et al., "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector", Science, 2016 Aug 5; 353(6299)を参照、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
Alicyclobaccillus acidoterrastrisのＣ２ｃ１（ＡａｃＣ２ｃ１）の結晶構造が、キメラ単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体において報告されている。例えば、Liu et al., "C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism", Mol. Cell, 2017 Jan 19;65(2):310-322を参照、この全内容は参照により本明細書に組み込まれる。結晶構造は、標的ＤＮＡに結合したAlicyclobacillus acidoterrestrisのＣ２ｃ１においても、三元複合体として報告されている。例えば、Yang et al., "PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease", Cell, 2016 Dec 15;167(7):1814-1828を参照、この全内容は参照により本明細書に組み込まれる。標的ＤＮＡ鎖および非標的ＤＮＡ鎖の両方を有するＡａｃＣ２ｃ１の触媒的にコンピテントな立体配座は、単一のＲｕｖＣ触媒ポケット内に独立して配置されるとして捉えられており、Ｃ２ｃ１媒介切断が、標的ＤＮＡのスタッガードな７ヌクレオチド切断をもたらす。Ｃ２ｃ１三元複合体と、以前に同定されたＣａｓ９およびＣｐｆ１対応物との間の構造比較は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムによって使用されるメカニズムの多様性を実証する。
【０１０５】
いくつかの態様において、本明細書で提供される任意の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３タンパク質であってよい。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃ２ｃ１タンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃ２ｃ２タンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃ２ｃ３タンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、天然に存在するＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３タンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、天然に存在するＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３タンパク質である。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、本明細書に記載のＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３タンパク質のいずれかと、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、本明細書に記載のＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３タンパク質のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３もまた、本開示に従って使用され得ることを理解されたい。
Ｃ２ｃ１（uniprot.org/uniprot/T0D7A2#）
sp|T0D7A2|C2C1_ALIAG ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣ２ｃ１ ＯＳ＝Alicyclobacillus acidoterrestris（株ATCC 49025/DSM 3922/CIP 106132/NCIMB 13137/GD3B）ＧＮ＝ｃ２ｃ１  ＰＥ＝１  ＳＶ＝１
【化１８】
2019526248.tif 000028
Ｃ２ｃ２（uniprot.org/uniprot/P0DOC6）
＞sp|P0DOC6|C2C2_LEPSD ＣＲＩＳＰＲ関連エンドリボヌクレアーゼＣ２ｃ２ ＯＳ＝Leptotrichia shahii（株DSM 19757/CCUG 47503/CIP 107916/JCM 16776/LB37）ＧＮ＝ｃ２ｃ２  ＰＥ＝１  ＳＶ＝１
【化１９】
2019526248.tif 000029
【０１０６】
いくつかの態様において、本開示のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＰＡＭ配列についての要件を全く有さない。かかるガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質の一例は、Natronobacterium gregoryiからのアルゴノートタンパク質であり得る（ＮｇＡｇｏ）。ＮｇＡｇｏは、ｓｓＤＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼである。ＮｇＡｇｏは、約２４ヌクレオチドの５’リン酸化ｓｓＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合してこれをその標的部位に導き、ＤＮＡ二本鎖をｇＤＮＡ部位で切断する。Ｃａｓ９とは対照的に、ＮｇＡｇｏ−ｇＤＮＡシステムは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要としない。ヌクレアーゼ不活性ＮｇＡｇｏ（ｄＮｇＡｇｏ）を使用すると、標的とされ得るコドンを大幅に拡張することができる。ＮｇＡｇｏの特徴付けおよび使用については、Gao et al., Nat Biotechnol., 2016 Jul;34(7):768-73. PubMed PMID: 27136078；Swarts et al., Nature. 507(7491) (2014):258-61；およびSwarts et al., Nucleic Acids Res. 43(10) (2015):5120-9を参照、これらの各々は、本明細書に参照により組み込まれる）。Natronobacterium gregoryiアルゴノートの配列は、配列番号７１８に提供されている。
野生型Natronobacterium gregoryiアルゴノート（配列番号７１８）
【化２０】
2019526248.tif 000030
【０１０７】
本明細書においてさらに提供されるのは、緩和されたＰＡＭ要件を有するＣａｓ９バリアント（ＰＡＭなしＣａｓ９）である。ＰＡＭなしＣａｓ９は、配列番号１によって提供されるStreptococcus pyogenesＣａｓ９と比較して、その３’末端に標準ＰＡＭ（例えば、ＮＧＧ）配列を含まない標的配列に対して増加した活性を示す、例えば少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも５００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍増加した活性を示す。緩和されたＰＡＭ要件を有するかかるＣａｓ９バリアントは、米国仮出願である２０１５年１０月２３日出願の62/245,828；２０１６年１月１５日出願の62/279,346；２０１６年３月２２日出願の62/311,763；２０１６年４月１３日出願の62/322,178；および２０１６年６月３０日出願の62/357,332に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、本開示において有用なｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼはさらに、ＰＡＭ要件を緩和する変異、例えば、配列番号１のＡ２６２Ｔ、Ｋ２９４Ｒ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、またはＥ１２１９Ｖに対応する変異を含み得る。
【０１０８】
本明細書で論じられる一般的構成において使用される「−」は、任意のリンカーの存在を示し得る。本明細書で使用される「リンカー」という用語は、２つの分子または部分、例えばガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインとリコンビナーゼ触媒ドメイン等の、融合タンパク質の２つのドメインなどを連結する化学基または分子を指す。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に位置するかまたはそれらに隣接し、共有結合を介して互いに結合され、したがってこれら２つを結合する。いくつかの態様において、リンカーは、単一アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの態様において、リンカーは、５〜１００アミノ酸長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、または１５０〜２００アミノ酸長である。より長いかまたはより短いリンカーも企図される。リンカーは、当分野で知られている任意の形態であってよい。例えば、リンカーは、www[dot]ibi[dot]vu[dot]nl/programs/linkerdbwww/、またはwww[dot] ibi[dot]vu[dot]nl/programs/linkerdbwww/src/database.txtなどのウェブサイトからのリンカーであってよい。リンカーはまた、非構造化、構造化、らせん状、または延長されていてもよい。
【０１０９】
いくつかの態様において、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインとリコンビナーゼ触媒ドメインは、リンカーを介して互いに融合している。ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインとリコンビナーゼ触媒ドメインとの間に、様々なリンカー長および柔軟性を使用することができる（例えば、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７５９）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７２２）、（ＧＧＳ）ｎ、および（Ｇ）ｎの形態のフレキシブルなリンカーから、より剛性の高いリンカーの形態（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号７２３）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７２４）（例えば、Guilinger et al., Nat.  Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82参照；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）、（ＸＰ）ｎ、またはこれらの任意の組み合わせであり、ここで、特定用途の活性のための最適な長さを実現するために、Ｘは任意のアミノであり、ｎは独立して１〜３０の間の整数である。いくつかの態様において、ｎは独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０であり、または、１つ以上のリンカーまたは１つ以上のリンカーモチーフが存在する場合、それらの任意の組み合わせである。いくつかの態様において、リンカーは（ＧＧＳ）ｎモチーフを含み、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。いくつかの態様において、リンカーは（ＧＧＳ）ｎモチーフを含み、ここでｎは、１、３、または７である。いくつかの態様において、リンカーは、ＸＴＥＮリンカーを含む。ＸＴＥＮリンカーは、配列：ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号８）、またはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９）を有し得る。いくつかの態様において、リンカーは、ＡＧＶＦ（配列番号７７２）、ＧＦＬＧ（配列番号７７３）、ＦＫ、ＡＬ、ＡＬＡＬ（配列番号７７４）、およびＡＬＡＬＡ（配列番号７７５）を含むがこれらに限定されない群から選択される、アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、適切なリンカーモチーフおよび立体配置は、Chen et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65(10):1357-69に記載されているものを含む；これは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、リンカーは、以下のアミノ酸配列のいずれかを含み得る：ＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣ（配列番号１０）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１１）、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡ（配列番号１２）、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡ（配列番号１３）、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳ（配列番号１４）、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳ（配列番号１５）、ＭＳＲＰＤＰＡ（配列番号１６）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号７）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号８）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９）、およびＧＧＳＭ（配列番号１７）。
【０１１０】
さらなる適切なリンカー配列が、本開示に基づき、当業者には明らかであろう。一定の態様において、リンカーは、約３３オングストロームから約８１オングストロームの長さを有し得る。別の態様において、リンカーは、約５４オングストロームから約８１オングストロームの長さを有し得る。さらなる態様において、リンカーは、約６３から約８１オングストロームの長さを有し得る。別の態様において、リンカーは約６５オングストロームから約７５オングストロームの長さを有し得る。いくつかの態様において、リンカーは、約１．２０ｋＤａから約１．８５ｋＤａの重量を有し得る。一定の態様において、リンカーは、約１．４０ｋＤａから約１．８５ｋＤａの重量を有し得る。一定の態様において、リンカーは、約１．６０ｋＤａから約１．７ｋＤａの重量を有し得る。いくつかの態様において、リンカーは、単一のアミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの態様において、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、またはそれ以上のアミノ酸を有する、アミノ酸の任意のストレッチである。一定の態様において、ペプチドリンカーは、１８〜２７アミノ酸長である。特定の態様において、ペプチドリンカーは、２４アミノ酸長である。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、例えば配列（ＧＧＳ）ｎを含むトリペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの反復を含み、式中、ｎは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の反復を表す。いくつかの態様において、リンカーは、配列（ＧＧＳ）６（配列番号６）を含む。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、１６残基の「ＸＴＥＮ」リンカー、またはそのバリアントである（例えば、実施例；およびSchellenberger et al. A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009)を参照）。いくつかの態様において、ＸＴＥＮリンカーは、配列：ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号８）、またはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９）を含む。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、ＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣ（配列番号１０）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１１）、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡ（配列番号１２）、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡ（配列番号１３）、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳ（配列番号１４）、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳ（配列番号１５）、ＭＳＲＰＤＰＡ（配列番号１６）；またはＧＧＳＭ（配列番号１７）から選択される。いくつかの態様において、リンカーは非ペプチドリンカーである。一定の態様において、非ペプチドリンカーは、１または２以上の、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰ���）、コポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖類、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む。一態様において、アルキルリンカーは式：−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−を有し、式中、ｓは、任意の整数であってよい。さらなる態様において、ｓは１〜２０の任意の整数であってよい。
【０１１１】
リコンビナーゼ触媒ドメイン
本開示の組成物および方法において使用するためのリコンビナーゼ触媒ドメインは、任意のリコンビナーゼ由来であってよい。開示された方法および組成物における使用のための適切なリコンビナーゼ触媒ドメインは、例えば、限定はされないが、チロシンリコンビナーゼおよびセリンリコンビナーゼから得ることができる。本明細書で提供されるいくつかの例示の適切なリコンビナーゼとしては、例えば、限定はされないが、Ｇｉｎリコンビナーゼ（ｇｉｘ部位に作用する）、Ｈｉｎリコンビナーゼ（ｈｉｘ部位に作用する）、βリコンビナーゼ（ｓｉｘ部位に作用する）、Ｓｉｎリコンビナーゼ（ｒｅｓＨ部位に作用する）、Ｔｎ３リコンビナーゼ（ｒｅｓ部位に作用する）、γδリコンビナーゼ（ｒｅｓ部位に作用する）、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビナーゼ（ＬｏｘＰ部位に作用する）；真菌由来のＦＬＰリコンビナーゼ（ＦＴＲ部位に作用する）。およびｐｈｉＣ３１インテグラーゼ（ａｔｔ部位に作用する）が挙げられる。例示の適切なリコンビナーゼの非限定的な配列は、以下に見出され得る。
Ｃｒｅリコンビナーゼ配列
【化２１】
2019526248.tif 000031
ＦＬＰリコンビナーゼ
【化２２】
2019526248.tif 000032
γδリコンビナーゼ（ガンマデルタレゾルバーゼ）
【化２３】
2019526248.tif 000033
γδリコンビナーゼ（Ｅ１２４Ｑ変異）
【化２４】
2019526248.tif 000034
γδコンビナーゼ（Ｅ１０２Ｙ／Ｅ１２４Ｑ変異）
【化２５】
2019526248.tif 000035
βリコンビナーゼ
【化２６】
2019526248.tif 000036
βリコンビナーゼ（Ｎ９５Ｄ変異）
【化２７】
2019526248.tif 000037
Ｓｉｎリコンビナーゼ
【化２８】
2019526248.tif 000038
Ｓｉｎリコンビナーゼ（Ｑ８７Ｒ／Ｑ１１５Ｒ変異）
【化２９】
2019526248.tif 000039
Ｔｎ３リコンビナーゼ
【化３０】
2019526248.tif 000040
Ｔｎ３リコンビナーゼ（Ｇ７０Ｓ／Ｄ１０２Ｙ、Ｅ１２４Ｑ変異）
【化３１】
2019526248.tif 000041
Ｈｉｎリコンビナーゼ
【化３２】
2019526248.tif 000042
Ｈｉｎリコンビナーゼ（Ｈ１０７Ｙ変異）
【化３３】
2019526248.tif 000043
ＰｈｉＣ３１リコンビナーゼ
【化３４】
2019526248.tif 000044
【０１１２】
開示された組成物および方法と共に使用するためのリコンビナーゼはまた、さらなる変異を含み得る。本開示のいくつかの態様は、本明細書で論じられるリコンビナーゼ配列の配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むリコンビナーゼを提供し、ここで、リコンビナーゼのアミノ酸配列は、本明細書で論じられるリコンビナーゼ配列の配列と比較して、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの態様において、リコンビナーゼのアミノ酸配列は、本明細書で論じられるリコンビナーゼ配列の配列と比較して、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５の変異を含む。
【０１１３】
例えば、γδリコンビナーゼは、リスト：Ｒ２Ａ、Ｅ５６Ｋ、Ｇ１０１Ｓ、Ｅ１０２Ｙ、Ｍ１０３Ｉ、またはＥ１２４Ｑからの１つ以上の変異を含み得る。一態様において、γδリコンビナーゼは、Ｅ１０２Ｙ変異、Ｅ１２４Ｑ変異、またはＥ１０２ＹとＥ１２４Ｑの両方の変異を含み得る。別の態様において、βリコンビナーゼは、Ｎ９５Ｄを含むがこれに限定されない１つ以上の変異を含み得る。例えば、Sirk et al., "Expanding the zinc-finger recombinase repertoire: directed evolution and mutational analysis of serine recombinase specificity determinants" Nucl Acids Res (2014) 42 (7): 4755-4766を参照。別の態様において、Ｓｉｎリコンビナーゼは、Ｑ８７Ｒ、Ｑ１１５Ｒ、またはＱ８７ＲおよびＱ１１５Ｒを含むがこれらに限定されない、１つ以上の変異を有し得る。別の態様において、Ｔｎ３リコンビナーゼは、Ｇ７０Ｓ、Ｄ１０２Ｙ、Ｅ１２４Ｑ、およびそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、１つ以上の変異を有し得る。別の態様において、Ｈｉｎリコンビナーゼは、Ｈ１０７Ｙを含むがこれらに限定されない、１つ以上の変異を有し得る。別の態様において、Ｓｉｎリコンビナーゼは、Ｈ１０７Ｙを含むがこれらに限定されない、１つ以上の変異を有し得る。開示の組成物および方法と共に使用するための任意のリコンビナーゼ触媒ドメインは、天然（または野生型）アミノ酸配列と、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％を超える配列同一性を有し得る。例えば、一定の態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインは、配列番号７１３に示されるアミノ酸配列と、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を超える配列同一性を有する。別の態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列は、Ｈ１０６Ｙ、および／またはＩ１２７Ｌ、および／またはＩ１３６Ｒ、および／またはＧ１３７Ｆに対応する変異を含む。さらに別の態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列は、Ｈ１０６Ｙ、Ｉ１２７Ｌ、Ｉ１３６Ｒ、およびＧ１３７Ｆに対応する変異を含む。さらなる態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼのアミノ酸配列は、さらに変異している。特定の態様において、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列は、配列番号７１３を含む。
【０１１４】
本開示の組成物および方法において使用するためのリコンビナーゼ触媒ドメインは、進化型リコンビナーゼ由来であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「進化型リコンビナーゼ」とは、非天然ＤＮＡ標的配列を認識するように（例えば、変異を通して）改変されているリコンビナーゼをいう。
【０１１５】
進化させることができる適切なリコンビナーゼとしては、例えば、限定されないが、チロシンリコンビナーゼおよびセリンリコンビナーゼ（例えば本明細書で論じられる任意のリコンビナーゼ）が挙げられる。本明細書に提供される方法および戦略によって進化させることができるいくつかの例示的な適切なリコンビナーゼとしては、例えば、限定はされないが、Ｇｉｎリコンビナーゼ（ｇｉｘ部位に作用する）、Ｈｉｎリコンビナーゼ（ｈｉｘ部位に作用する）、βリコンビナーゼ（ｓｉｘ部位に作用する）、Ｓｉｎリコンビナーゼ（ｒｅｓＨ部位に作用する）、Ｔｎ３リコンビナーゼ（ｒｅｓ部位に作用する）、γδリコンビナーゼ（ｒｅｓ部位に作用する）、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビナーゼ（ＬｏｘＰ部位に作用する）；λファージインテグラーゼ（ａｔｔ部位に作用する）；真菌由来のＦＬＰリコンビナーゼ（ＦＴＲ部位に作用する）；ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ；Ｄｒｅリコンビナーゼ、ＢｘＢ１；および原核生物のβリコンビナーゼが挙げられる。
【０１１６】
例えば、本開示の組成物および方法と共に使用するための進化型リコンビナーゼは、非標準リコンビナーゼ標的配列と相互作用する（例えば、結合および組み換えする）ように改変されていてもよい。非限定的な例として、非標準リコンビナーゼ標的配列は天然に存在し得、例えば、哺乳動物ゲノムの「セーフハーバー」ゲノム座位内の配列、例えば望ましくない影響を与えることなくゲノム改変に耐性であることが知られているゲノム座位内の配列である。かかる配列を標的とするリコンビナーゼは、例えば、相同組換え技術による、従来の時間と労力のかかる遺伝子標的化手順を必要とせずに、例えば、核酸構築物の特定のゲノム位置での標的挿入を可能にする。さらに、本明細書に提供される指向性進化戦略は、変化した活性プロファイルを有するリコンビナーゼ、例えばその配列の切り出しよりも核酸配列の組込みに、またはその逆に、有利に働くリコンビナーゼを進化させるために、使用することができる。
【０１１７】
進化型リコンビナーゼは、それらの野生型対応物と比較して改変された標的配列優先性を示し、実質的に任意の標的配列をリコンビナーゼ活性について標的化するために使用することができる。したがって、進化型リコンビナーゼは、例えば、細胞または対象のゲノム内の任意の配列を修飾するために使用することができる。リコンビナーゼは、異種核酸分子の標的核酸分子への挿入、核酸配列の核酸分子からの切り出し、核酸配列の反転、または置換をもたらすことができるので、本明細書に提供される技術は、ゲノム標的の効率的な修飾を、様々な方法（例えば、核酸配列の組込み、欠失、反転、交換）によって可能にする。
【０１１８】
本開示の方法および組成物と共に使用するための進化型リコンビナーゼ由来の触媒ドメインは、野生型リコンビナーゼの配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、進化型リコンビナーゼのアミノ酸配列は、野生型リコンビナーゼの配列と比較して少なくとも１つの変異を含み、およびここで進化型リコンビナーゼは、標準リコンビナーゼ標的配列と少なくとも１ヌクレオチド異なるＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼは、標準リコンビナーゼ標的配列（例えば、ｒｅｓ、ｇｉｘ、ｈｉｘ、ｓｉｘ、ｒｅｓＨ、ＬｏｘＰ、ＦＴＲ、もしくはａｔｔコアまたは関連コアの配列）と、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０ヌクレオチド異なる、ＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼは、標準リコンビナーゼ標的配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド異なる、ＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。
【０１１９】
いくつかの態様において、一部のリコンビナーゼのみが、本明細書に記載の融合タンパク質および方法において使用される。非限定的な態様として、リコンビナーゼのＣ末端部分のみが、本明細書に記載の融合タンパク質および方法において使用され得る。特定の態様において、Ｃｒｅリコンビナーゼの２５ｋＤａカルボキシ末端ドメインを、組成物および方法に使用することができる。例えば、Hoess et al, "DNA Specificity of the Cre Recombinase Resides in the 25 kDa Carboxyl Domain of the Protein," J. Mol. Bio. 1990 Dec 20, 216(4):873-82を参照、これはすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。Ｃｒｅリコンビナーゼの２５ｋＤａカルボキシ末端ドメインは、Ｒ１１８からタンパク質のカルボキシ末端まで伸びる部分である。いくつかの態様において、本融合タンパク質および方法で使用するためのＣｒｅリコンビナーゼの２５ｋＤａカルボキシ末端ドメインは、Ｃｒｅリコンビナーゼの標準的な２５ｋＤａカルボキシ末端ドメインと、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０のアミノ酸が異なる。いくつかの態様において、本融合タンパク質および方法で使用するためのＣｒｅリコンビナーゼの２５ｋＤａカルボキシ末端ドメインは、Ｃｒｅリコンビナーゼの標準的な２５ｋＤａカルボキシ末端ドメインと、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸が異なる。一定の態様において、Ｃｒｅリコンビナーゼの２５ｋＤａカルボキシ末端ドメインの一部のみを、本明細書に記載の融合タンパク質および方法に使用することができる。例えば、使用されるＣｒｅリコンビナーゼの部分は、Ｒ１３０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｔ１４０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｅ１５０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｎ１６０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｔ１７０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｉ１８０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｇ１９０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｔ２００からタンパク質のカルボキシ末端、Ｅ２１０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｌ２２０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｖ２３０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｃ２４０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｐ２５０からタンパク質のカルボキシ末端、Ａ２６０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｒ２７０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｇ２８０からタンパク質のカルボキシ末端、Ｓ２９０からタンパク質のカルボキシ末端、Ａ３００からタンパク質のカルボキシ末端、またはＭ３１０からタンパク質のカルボキシ末端である。別の非限定的な例のセットとして、使用されるＣｒｅリコンビナーゼの部分は、Ｒ１１８−Ｅ３４０、Ｒ１１８−Ｓ３３０、Ｒ１１８−Ｉ３２０、Ｒ１１８−Ｍ３１０、Ｒ１１８−Ａ３００、Ｒ１１８−Ｓ２９０、Ｒ１１８−Ｇ２８０、Ｒ１１８−Ｒ２７０、Ｒ１１８−Ａ２６０、Ｒ１１８−Ｐ２５０、Ｒ１１８−Ｃ２４０、Ｒ１１８−Ｖ２３０、Ｒ１１８−Ｌ２２０、またはＲ１１８−Ｅ２１０であってよい。さらなる非限定的な例として、使用されるＣｒｅリコンビナーゼの部分は、Ｒ１１８−Ｅ２１０、Ｇ１９０−Ｒ２７０、Ｅ２１０−Ｓ２９０、Ｐ２５０−Ｍ３１０、またはＲ２７０からタンパク質のカルボキシ末端であり得る。
【０１２０】
いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質および方法で使用されるＣｒｅリコンビナーゼは、任意の位置で切断されていてもよい。特定の態様において、本明細書に記載の融合タンパク質および方法で使用されるＣｒｅリコンビナーゼは、それがアミノ酸Ｒ１１８、Ａ１２７、Ｅ１３８、またはＲ１５４で始まるように切断されてもよい（それぞれメチオニンが先行する）。別の非限定的な態様のセットにおいて、本明細書に記載の融合タンパク質および方法において使用されるＣｒｅリコンビナーゼは、Ｒ１１８、Ａ１２７、Ｅ１３８、またはＲ１５４の１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、または１アミノ酸以内で切断され得る。
【０１２１】
いくつかの態様において、リコンビナーゼ標的配列は、１０〜５０ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、またはＦＬＰリコンビナーゼである。いくつかの態様において、標準リコンビナーゼ標的配列は、ＬｏｘＰ部位（５’−ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ ＧＣＡＴＡＣＡＴ ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ−３’）（配列番号７３９）である。いくつかの態様において、標準リコンビナーゼ標的配列は、ＦＲＴ部位（５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡ ＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ−３’）（配列番号７４０）である。いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼのアミノ酸配列は、野生型リコンビナーゼの配列と比較して、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５の変異を含む。いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼは、左半部位、スペーサー配列、および右半部位を含み、かつ左半部位が右半部位のパリンドロームではない、ＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。
【０１２２】
いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼは、天然に存在する配列を含むＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼは、哺乳動物のゲノムに含まれるＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼは、ヒトのゲノムに含まれるＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼは、哺乳動物のゲノム中に一度だけ出現するＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼは、哺乳動物のゲノム中のＤＮＡリコンビナーゼ標的配列であって、ゲノム中の任意の他の部位から少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５ヌクレオチド異なるものを認識する。いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼは、セーフハーバーゲノム座位に位置するＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。いくつかの態様において、セーフハーバーゲノム座位は、Ｒｏｓａ２６座位である。いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼは、疾患または障害に関連するゲノム座位に位置するＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。
【０１２３】
一定の態様において、進化型リコンビナーゼは、ヒトゲノムのＲｏｓａ座位内の部位（例えば、３６Ｃ６）を標的とし得る。かかるリコンビナーゼの非限定的なセットは、例えば、国際ＰＣＴ公開WO2017/015545A1、「部位特異的リコンビナーゼの進化」と題された２０１７年１月２６日公開のものに見出すことができ、これはこの目的のために参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼのアミノ酸配列は、野生型リコンビナーゼの配列と比較して、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５の変異を含む。３６Ｃ６をコードするヌクレオチド配列を、以下に太字で示す；ＧＧＳリンカーをコードするものはイタリック体で示す；ｄＣａｓ９リンカーをコードするものは黒色で示す；ＦＬＡＧタグとＮＬＳをコードするものにはそれぞれ、下線を引き、小文字を使用する。
ｄＣａｓ９−３６Ｃ６（ヌクレオチド）（配列番号７６５）
【化３５−１】
2019526248.tif 000045
【化３５−２】
2019526248.tif 000046
ｄＣａｓ９−３６Ｃ６（アミノ酸）（配列番号７６６）
【化３６】
2019526248.tif 000047
【０１２４】
本開示のいくつかの側面は、本明細書で論じられるリコンビナーゼ配列（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）の配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む進化型リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）を提供し、ここで、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）のアミノ酸配列は、本明細書で論じられるリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）配列の配列と比較して、少なくとも１つの変異を含み、ここでリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）は、少なくとも１つのヌクレオチドにおいて、標準的なＬｏｘＰ部位５’−ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ ＧＣＡＴＡＣＡＴ ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ−３’（配列番号７３９）とは異なるＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。
【０１２５】
いくつかの態様において、進化型リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）のアミノ酸配列は、本明細書で論じられるリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）配列の配列と比較して、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５の変異を含み、標準的な標的部位（例えば、ＬｏｘＰ部位）と少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５ヌクレオチドにおいて異なるＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。
【０１２６】
いくつかの態様において、進化型Ｃｒｅリコンビナーゼは、左半部位、スペーサー配列、および右半部位を含み、かつ左半部位が右半部位のパリンドロームではない、ＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。いくつかの態様において、進化型Ｃｒｅリコンビナーゼは、天然に存在する配列を含む、ＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。いくつかの態様において、進化型Ｃｒｅリコンビナーゼは、哺乳動物のゲノムに含まれる、ＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。
【０１２７】
いくつかの態様において、進化型Ｃｒｅリコンビナーゼは、ヒトのゲノムに含まれるＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。いくつかの態様において、進化型Ｃｒｅリコンビナーゼは、哺乳動物のゲノム中に１回だけ含まれるＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。いくつかの態様において、進化型Ｃｒｅリコンビナーゼは、哺乳動物のゲノム中のＤＮＡリコンビナーゼ標的配列であって、他の部位とは少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５ヌクレオチド異なるものを認識する。いくつかの態様において、進化型Ｃｒｅリコンビナーゼは、セーフハーバーゲノム座位に位置するＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。いくつかの態様において、セーフハーバーゲノム座位は、Ｒｏｓａ２６座位である。いくつかの態様において、進化型Ｃｒｅリコンビナーゼは、疾患または障害に関連するゲノム座位に位置する、ＤＮＡリコンビナーゼ標的配列を認識する。
【０１２８】
本方法および組成物と共に使用するためのさらなる進化型リコンビナーゼ（およびその作製方法）は、例えば、米国特許出願第15/216,844号に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
リコンビナーゼ触媒ドメインまたは進化型リコンビナーゼ触媒ドメインの両方を提供するための、さらなる適切なリコンビナーゼが当業者に明らかであり、かかる適切なリコンビナーゼとしては、限定なく、以下に開示されたものである：Hirano et al., Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration. Appl Microbiol Biotechnol. 2011 Oct;92(2):227-39；Fogg et al., New applications for phage integrases. J Mol Biol. 2014 Jul 29;426(15):2703;Brown et al., Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 2011 Apr;53(4):372-9；Smith et al., Site-specific recombination by phiC31 integrase and other large serine recombinases. Biochem Soc Trans. 2010 Apr;38(2):388-94;Grindley et al., Mechanisms of site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 2006;75:567-605；Smith et al., Diversity in the serine recombinases. Mol Microbiol. 2002 Apr;44(2):299-307；Grainge et al., The integrase family of recombinase: organization and function of the active site. Mol Microbiol. 1999 Aug;33(3):449-56；Gopaul et al., Structure and mechanism in site-specific recombination. Curr Opin Struct Biol. 1999 Feb;9(1):14-20;Cox et al., Conditional gene expression in the mouse inner ear using Cre-loxP. J Assoc Res Otolaryngol. 2012 Jun;13(3):295-322;Birling et al., Site-specific recombinases for manipulation of the mouse genome. Methods Mol Biol. 2009;561:245-63;およびMishina M, Sakimura K. Conditional gene targeting on the pure C57BL/6 genetic background. Neurosci Res. 2007 Jun;58(2):105-12；これら各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
融合タンパク質の構造
本開示の融合タンパク質は、本明細書に記載される要素の任意の組み合わせおよび順序であり得る。例示的な融合タンパク質としては、以下の構造のいずれかが挙げられるが、これらに限定はされない：ＮＨ２−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意リンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［リンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。
【０１３１】
別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨ、またはＮＨ２−［アフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨ。
【０１３２】
別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。一態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。一態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。一態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［リンカー配列］−[アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。
【０１３３】
別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［任意のＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［リンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。
【０１３４】
別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［任意のＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［リンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。
【０１３５】
別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［任意のＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［リンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。
【０１３６】
別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［任意のＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［任意のアフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−［リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［リンカー配列］−［アフィニティタグ］−ＣＯＯＨ。
【０１３７】
一態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［任意のＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−ＣＯＯＨ。一態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−ＣＯＯＨ。一態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−ＣＯＯＨ。一態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−ＣＯＯＨ。
【０１３８】
一態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［任意のＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−ＣＯＯＨ。一態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−ＣＯＯＨ。一態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−ＣＯＯＨ。一態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−ＣＯＯＨ。
【０１３９】
別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［任意のＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または環状置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。
【０１４０】
別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［任意のＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または環状置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。
【０１４１】
別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［任意のＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［任意のリンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。
【０１４２】
別の態様において、融合タンパク質は次の構造を有する：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［任意のＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［任意のアフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［任意のリンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。別の態様において、融合タンパク質は次の構造を含む：ＮＨ２−［アフィニティタグ］−［リンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＮ末端部分］−［リンカー配列］−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［分岐または循環置換ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインのＣ末端部分］−ＣＯＯＨ。
【０１４３】
融合タンパク質はさらに、１つ以上のアフィニティタグを含み得る。本明細書で提供される適切なアフィニティタグとしては、限定はされないが、ビオチンカルボキシラーゼキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ヒスチジンタグまたはＨｉｓタグとも呼ばれるポリヒスチジンタグ、ポリアルギニン（ポリＡｒｇ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、Ｓｏｆｔａｇ（例えば、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３）、ｓｔｒｅｐタグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、およびＳＢＰタグが含まれる。さらなる適切な配列は、当業者に明らかであろう。ＦＬＡＧタグは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７０２）を有し得る。１つ以上のアフィニティタグは、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、リコンビナーゼ触媒ドメイン、またはＮＬＳドメインに、１つ以上の第３のリンカーを介して結合している。第３のリンカーは、本明細書に記載の任意のペプチドリンカーであってよい。例えば、第３のリンカーはペプチドリンカーであってよい。
【０１４４】
例の非限定的なセットとして、第３のリンカーは、ＸＴＥＮリンカーＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号８）、またはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９）、トリペプチドＧＧＳの１つ以上の反復を含むアミノ酸配列、又は以下のアミノ酸配列のいずれか：ＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣ（配列番号１０）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１１）、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡ（配列番号１２）、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡ（配列番号１３）、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳ（配列番号１４）、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳ（配列番号１５）、ＭＳＲＰＤＰＡ（配列番号１６）、またはＧＧＳＭ（配列番号１７）、を含み得る。一定の態様において、第３のリンカーはトリペプチドＧＧＳの１つ以上の反復を含む。一態様において、第３のリンカーは、トリペプチドＧＧＳの１〜５個の反復を含む。別の態様において、第３のリンカーはトリペプチドＧＧＳの１つの反復を含む。特定の態様において、第３のリンカーは配列ＧＧＳを有する。
【０１４５】
第３のリンカーはまた、非ペプチドリンカーであってよい。一定の態様において、非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、コポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖類、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む。別の態様において、アルキルリンカーは、式：−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−を有し、式中、ｓは、１以上１００以下の任意の整数であり得る。特定の態様において、ｓは、１以上２０以下の任意の整数である。
【０１４６】
本開示の融合タンパク質は、配列番号１８５のアミノ酸１〜１５４４に示されるアミノ酸配列と９０％、９５％、または９９％を超える配列同一性を有し、これは配列番号７１９に示される配列と同一である。
【化３７】
2019526248.tif 000048
【０１４７】
例えば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（またはＣａｓ９ ｇＲＮＡ結合ドメイン）とリコンビナーゼ（またはリコンビナーゼの触媒ドメイン）との間の融合物などの、二量体化（または多量体化）するタンパク質の文脈においては、標的部位は典型的には、左半部位（１つのタンパク質によって結合される）、右半部位（第２のタンパク質によって結合される）、および組換えが行われる半部位の間のスペーサー配列を含む。いくつかの態様において、左半部位または右半部位（かつスペーサー配列ではない）のいずれかが組み換えられる。別の態様においては、スペーサー配列が組み換えられる。この構造（［左半部位］−［スペーサー配列］−［右半部位］）を、本明細書ではＬＳＲ構造と呼ぶ。いくつかの態様において、左半部位および／または右半部位は、ＲＮＡ誘導性標的部位（例えば、Ｃａｓ９標的部位）に対応する。いくつかの態様において、一方または両方の半部位は、例えばＣａｓ９によって標的化される典型的な領域よりも短いかまたは長い、例えば２０ヌクレオチドよりも短いかまたは長い。いくつかの態様において、左および右半部位は、異なる核酸配列を含む。いくつかの態様において、スペーサー配列は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、または少なくとも２５０ｂｐの長さである。いくつかの態様において、スペーサー配列は、約１５ｂｐから約２５ｂｐの間の長さである。いくつかの態様において、スペーサー配列は約１５ｂｐ長である。いくつかの態様において、スペーサー配列は約２５ｂｐ長である。
【実施例】
【０１４８】
例１：哺乳動物細胞のＤＮＡ配列に作用するプログラム可能Ｃａｓ９−セリンリコンビナーゼ融合タンパク質
材料および方法
オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ
全てのオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies（IDT, Coralville, CA）から購入したものであり、表１〜５に列挙されている。酵素は、特記しない限り、New England Biolabs（Ipswich, MA）から購入した。プラスミドセーフＡＴＰ依存性ＤＮＡｓｅは、Epicenter（Madison, WI）から購入した。全てのアセンブルされたベクターを、One Shot Mach1-T1ファージ耐性化学的コンピテント細胞（Fisher Scientific, Waltham, MA）に形質転換した。特に明記しない限り、すべてのＰＣＲ反応はQ5 Hot Start High-Fidelity 2Xマスターミックスを用いて行った。Phusionポリメラーゼを、環状ポリメラーゼ伸長クローニング（ＣＰＥＣ）アセンブリに使用した。
表１．ｇＲＮＡ構築のためのオリゴヌクレオチド
【表１】
2019526248.tif 000049
表２．レポーター構築用のオリゴヌクレオチドおよびｇＢｌｏｃｋ
【表２−１】
2019526248.tif 000050
【表２−２】
2019526248.tif 000051
【表２−３】
2019526248.tif 000052
【表２−４】
2019526248.tif 000053
【表２−５】
2019526248.tif 000054
表３．ｒｅｃＣａｓ９構築のためのオリゴヌクレオチド
【表３−１】
2019526248.tif 000055
【表３−２】
2019526248.tif 000056
表４．カスタム配列決定オリゴヌクレオチド
【表４】
2019526248.tif 000057
表５．ゲノムＰＣＲプライマー
【表５】
2019526248.tif 000058
【０１４９】
レポーター構築
５部構成のゴールデンゲートアセンブリを使用して、下記のレポーターを構築した。断片１〜５はＥｓｐ３Ｉ部位に隣接していた；Ｅｓｐ３Ｉ消化は、断片の集合の順序を特定する相補的５’オーバーハングを作り出した（図６）。断片１、２、４、および５は、表５に示すフォワードおよびリバースの相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより作製した。断片は、１０μｌの各オリゴヌクレオチド（１００μＭ）を、２０μｌの分子等級水の中で混合し、９５℃で３分間インキュベートし、温度を−０．１℃／秒の速度で１６℃に下げることによってアニーリングした。断片３は、ｋａｎＲおよびポリＡ終止コドンを含む領域を、プライマー３−ｆｏｒおよび３−ｒｅｖを用いてＰＣＲ増幅することにより作製した。これらのプライマーにはまた、Ｅｓｐ３Ｉが、この配列の５’および３’末端に付加された。
【０１５０】
アニーリングした断片１、２、４および５を１２，０００倍に希釈し、０．６２５μｌの各断片を、以下を含有する混合物に添加した：
１）４０〜５０ｎｇの断片３
２）１００ｎｇのｐＣＡＬＮＬ ＥＧＦＰ−Ｅｓｐ３Ｉ
３）１μＬのＴａｎｇｏ緩衝液（１０倍）
４）１μＬのＤＴＴ（１０ｍＭ）
５）１μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）
６）０．２５μＬのＴ７リガーゼ（３，０００Ｕ／μＬ）
７）０．７５μＬのＥｓｐ３Ｉ（１０Ｕ／μＬ）
８）１０μＬまでのＨ２Ｏ
【０１５１】
反応物を、２０サイクル（３７℃で５分間、２０℃）にプログラムされたサーマルサイクラー中でインキュベートした。
【０１５２】
ゴールデンゲート反応終了後、７μＬの各反応物を１μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）、１μＬの１０ＸプラスミドセーフＡＴＰ依存性ＤＮＡｓｅ緩衝液（１０Ｘ）、および１μＬのプラスミドセーフＡＴＰ依存性ＤＮＡｓｅ（１０Ｕ／μＬ）（Epicenter, Madison, WI）と混合し、直鎖状ＤＮＡを除去してバックグラウンドを低減させた。ＤＮＡｓｅ消化物を３７℃で３０分間インキュベートし、７０℃で３０分間熱殺菌した。各反応物の半分（５μＬ）を、Mach1-T1細胞に形質転換した。コロニーをコロニーＰＣＲにより分析し、配列決定した。
【０１５３】
プロトコルを、図４で使用したレポーター用に修正した。断片１、２、４および５の代わりに、ポリＡターミネーターの５’または３’への標的部位をコードする２つのｇＢｌｏｃｋを使用した。これらのｇＢｌｏｃｋ（１０ｎｇ）をＭＭＸに添加し、これを１０回循環させ（３７℃で５分間、２０℃）、上記のように進行させた。
【０１５４】
プラスミド
特記しない限り、ＤＮＡ断片は、アガロースゲルからQIAquickゲル抽出キット（Qiagen、Valencia, CA）を用いて単離し、DNA Clean & Concentrator-5（Zymo Research, Irvine, CA）またはQiaquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen, Valencia, CA）を用いてさらに精製した。ゲル精製を必要としないＰＣＲ断片を、上記のキットの１つを用いて単離した。
【０１５５】
ｐＣＡＬＮＬ−ＧＦＰサブクローニングベクター、ｐＣＡＬＮＬ−ＥＧＦＰ−Ｅｓｐ３Ｉを用いて、全てのｒｅｃＣａｓ９レポータープラスミドをクローニングし、これは以前に記載されたｐＣＡＬＮＬ−ＧＦＰベクター（Matsuda and Cepko, Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 1027-1032 (2007)、参照により本明細書に組み込まれる）に基づいた。ｐＣＡＬＮＬ−ＥＧＦＰ−Ｅｓｐ３Ｉを作製するために、ｐＣＡＬＮＬ−ＧＦＰベクターをＸｈｏＩおよびＭｌｕＩで消化し、ゲル精製してｌｏｘＰ部位、カナマイシン耐性マーカー、およびポリＡターミネーターを除去した。アニーリングしたオリゴヌクレオチドは、反転Ｅｓｐ３Ｉ部位ならびにＸｈｏＩおよびＭｌｕＩ適合性オーバーハングを含むＥｓｐＩ−Ｉｎｓｅｒｔを形成した；この挿入物を、ＸｈｏＩおよびＭｌｕＩで消化したプラスミドにライゲートし、形質転換した。
【０１５６】
ｐＣＡＬＮＬ−ＧＦＰ ｒｅｃＣａｓ９レポータープラスミドを、アニーリングしたオリゴおよび適合性Ｅｓｐ３Ｉオーバーハングを含むＰＣＲ産物を用いるゴールデンゲートアセンブリによって作製した。ゴールデンゲート反応をセットアップし、Ｅｓｐ３Ｉを用いて以前の記載のように実施した（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）（Sanjana et al., A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols 7, 171-192 (2012)、この全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。図６は、一般的なアセンブリスキームおよびレポーターアセンブリのための関連するプライマー、ならびにすべてのｒｅｃＣａｓ９標的部位のための配列が、それぞれ表２および６に列挙されていることを概説する。２つのｒｅｃＣａｓ９標的部位が隣接するＫａｎＲ（太字および下線付き）およびポリＡターミネーター（イタリック体および下線付き）を含む、代表的なＤＮＡ配列を以下に示す。表示されている標的部位は、両方ともPAM_NT1-0bp-gix_core-0bp-NT1_PAMである（表６を参照）。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は太字で表す。塩基対スペーサーは小文字で表す。Ｇｉｘ部位またはＧｉｘ関連部位はイタリック体で表し、ｄＣａｓ９結合部位には下線が引かれている。図４のアッセイに使用したゲノムレポータープラスミドについては、ＧからＴへの転換がカナマイシン耐性マーカーにおいて観察され、以下の配列中にＧ／Ｔで示されている。これはこの図で使用されているすべてのレポーターに存在しており、ポリＡターミネーターおよびｒｅｃＣａｓ９標的部位からはかけ離れているため、結果に影響を与えることは予想されない。
【化３８−１】
2019526248.tif 000059
【化３８−２】
2019526248.tif 000060
表６．レポーターアッセイで使用した標的部位配列のリスト
【表６−１】
2019526248.tif 000061
【表６−２】
2019526248.tif 000062
【表６−３】
2019526248.tif 000063
【０１５７】
ｒｅｃＣａｓ９遺伝子を含有するプラスミドの構築は、進化型超活性化Ｇｉｎバリアント（Ｇｉｎβ）をコードするｇＢｌｏｃｋの、オリゴヌクレオチド１ＧＧＳ−ｒｅｖ−ＢａｍＨＩまたは２ＧＧＳ−ｒｅｖ−ＢａｍＨＩ（リンカー配列番号１８２を使用）およびＧｉｎ−ｆｏｒ−ＮｏｔＩを用いたＰＣＲ増幅によりなされた（Gaj et al., A comprehensive approach to zinc-finger recombinase customization enables genomic targeting in human cells.  Nucleic acids research 41, 3937-3946 (2013)、この全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、精製し、前述の発現ベクター（Addgeneプラスミド４３８６１）にライゲートして（例えば、Fu et al., High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.  Nature biotechnology 31, 822-826 (2013)を参照、この全内容は参照により本明細書に組み込まれる）、サブクローニングベクターｐＧｉｎ−１ＧＧＳおよびｐＧＩＮ−２ＧＧＳを生成した（リンカー配列番号１８３を用いる）。オリゴヌクレオチド：ＢａｍＨＩに対する１ＧＧＳリンク、ＢａｍＨＩに対する５ＧＧＳリンク（リンカー配列番号７０１を用いる）、またはＢａｍＨＩに対する８ＧＧＳリンク（リンカー配列番号１８３を用いる）を、Ｃａｓ９−ｒｅｖ−ＦＬＡＧ−ＮＬＳ−ＡｇｅＩと共に用いて、１、５、または８個のＧＧＳリンカーを有するＣａｓ９−ＦＬＡＧ−ＮＬＳをコードするＰＣＲ断片を構築した（表３参照）。ＧＧＳアミノ酸リンカーをコードするＤＮＡ配列については、表７を参照のこと。ＰＣＲ断片およびサブクローニングプラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＡｇｅＩで消化し、ライゲートして、プラスミドｐＧｉｎβ−２ｘＧＧＳ−ｄＣａｓ９−ＦＬＡＧ−ＮＬＳ（リンカー配列番号１８２を使用）、ｐＧｉｎβ−５×ＧＧＳ−ｄＣａｓ９−ＦＬＡＧ−ＮＬＳ（リンカー配列番号７０１を使用）、およびｐＧｉｎβ−８×ＧＧＳ−ｄＣａｓ９−ＦＬＡＧ−ＮＬＳ（リンカー配列番号１８３を使用）を作製した。ｐＧｉｎβ−８×ＧＧＳ−ｄＣａｓ９−ＦＬＡＧ−ＮＬＳ（すなわちｒｅｃＣａｓ９）のＤＮＡおよびアミノ酸配列については、以下を参照のこと。Ｇｉｎβをコードする配列は太字で示す；ＧＧＳリンカーをコードするものは、イタリック体で示す。これらのコーディングｄＣａｓ９リンカーは黒色で表す；ＦＬＡＧタグとＮＬＳをコードするものにはそれぞれ、下線および小文字で表す。
【化３９−１】
2019526248.tif 000064
【化３９−２】
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【化３９−３】
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【化３９−４】
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【化４０−１】
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【化４０−２】
2019526248.tif 000069
【０１５８】
配列番号１８５のアミノ酸１〜１４２であるＧｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインは、配列番号７１３の配列と同一である。配列番号１８５のアミノ酸１６７〜１５３３であるｄＣａｓ９ドメインは、配列番号７１２の配列と同一である。
【化４１】
2019526248.tif 000070
【化４２−１】
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【化４２−２】
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表７．ＧＧＳリンカーをコードするＤＮＡ配列
【表７】
2019526248.tif 000073
【０１５９】
プラスミド配列決定実験のために、ｐＧｉｎβ−８×ＧＧＳ−ｄＣａｓ９−ＦＬＡＧ−ＮＬＳ中のＡｍｐＲ遺伝子（リンカー配列番号１８３を使用）を、ＰＣＲ断片を用いたゴールデンゲートクローニングにより、ＳｐｅｃＲで置換した。Ｅｓｐ３Ｉ部位を、ｐＧｉｎβ−８×ＧＧＳ−ｄＣａｓ９−ＦＬＡＧ−ＮＬＳ（リンカー配列番号１８３を使用）プラスミドのＡｍｐＲ遺伝子に隣接する部位に、Ｅｓｐ３Ｉ−ｆｏｒ−プラスミドおよびＥｓｐ３Ｉ−ｒｅｖ−プラスミドを用いたＰＣＲにより導入した。プライマーspec-Esp3I-forおよびspec-Esp3I-revを使用して、ＳｐｅｃＲマーカーを増幅し、またＥｓｐ３Ｉ部位を導入し、およびＥｓｐ３Ｉは、Ｅｓｐ３Ｉ切断プラスミドＰＣＲ産物によって生成されたものと適合するオーバーハングを生成した。ゴールデンゲートアセンブリは、２つの断片に対して、本明細書に記載のようにレポータープラスミドの生成に使用されたプロトコルに従って、実施された。
【０１６０】
ｐＨＵ６−ＮＴ１ガイドＲＮＡ発現ベクターは、細菌ルシフェラーゼ遺伝子ＬｕｘＡＢ内の領域を標的とするように変更された、以前に記載されたｐＦＹＦ１３２８（Fu et al., High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature biotechnology 31, 822-826 (2013)；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に基づいた。ガイドＲＮＡ発現ベクターは、ベクター全体を、ユニバーサルプライマーR.pHU6.TSS(−1).univおよび固有のガイドＲＮＡ配列をコードするプライマーを用いてＰＣＲ増幅することにより、作製した（表１）。ガイドＲＮＡ配列のリストを表８に示す。これらのプライマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。ＰＣＲ反応産物および直鎖状ガイドＲＮＡ発現ベクターを、平滑末端ライゲートして形質転換した。最初の最適化において使用されたガイドＲＮＡ発現ベクター、オフターゲット対照ガイドＲＮＡ配列、および第１０染色体座位を標的とするものは、ＡｍｐＲを含んでいた。この研究に記載されている他のすべてのプラスミドは、配列決定実験を容易にするためにｓｐｅｃＲを含んでいた。スペクチノマイシン耐性を、ＣＰＥＣにより、本質的に記載されているようにして、最初にガイドＲＮＡ発現ベクターに導入し（Quan et al., Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways. PloS one 4, e6441 (2009)；およびHillson (2010), vol. 2015, pp. CPEC protocol；それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）、次にガイドＲＮＡプラスミドを、ベクターのＰＣＲ増幅により上記のようにして構築した。反応物を４０ＵのＤｐｎＩと共に３７℃で一晩インキュベートし、精製し、形質転換した。ＣＰＥＣのための断片は、オリゴヌクレオチドcpec−assembly−for spec2およびcpec assembly−revを用いた、ガイドＲＮＡ発現ベクターのＰＣＲ増幅により生成した。ｓｐｅｃＲ断片は、オリゴヌクレオチドcpec-assembly-for-specおよびcpec-assembly-rev-specを介したＳｐｅｃＲ遺伝子のＰＣＲ増幅により、生成した。ｐＵＣ１９（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）も、同様に修飾した。
表８．ｇＲＮＡ配列のリスト
【表８−１】
2019526248.tif 000074
【表８−２】
2019526248.tif 000075
【０１６１】
細胞培養とトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から購入した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（FBS, Life Technologies, Carlsbad, CA）を添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（４．５ｇ／ＬのＤグルコース＋１１０ｍｇ／ｍＬのピルビン酸ナトリウム）中で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で加湿インキュベーター内で培養した。
【０１６２】
トランスフェクションに使用したプラスミドは、PureYield Plasmid Miniprep System（Promega, Madison, WI）から単離した。トランスフェクションの前夜に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１ウェルあたり３×１０５細胞の密度で、４８ウェルのコラーゲン処理プレート（Corning, Corning, NY）に播種した。トランスフェクション反応は、２５μＬのOpti-MEM（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）中で調製した。各トランスフェクションについて、４５ｎｇの各ガイドＲＮＡ発現ベクター、９ｎｇのレポータープラスミド、９ｎｇのｐｉＲＦＰ６７０−Ｎ１（Addgene Plasmid 45457）、および１６０ｎｇのｒｅｃＣａｓ９発現ベクターを、Opti-MEM（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）中０．８μＬのリポフェクタミン２０００と共に混合し、個々のウェルに添加した。
【０１６３】
フローサイトメトリー
トランスフェクションの６０〜７２時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、５０μＬの０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Life Technologies, Carlsbad, CA）で３７℃で５〜１０分間回収した。細胞を２５０μＬの培養培地で希釈し、BD Fortessaアナライザーで泳動した。ｉＲＦＰ蛍光を６３５ｎｍのレーザーを用いて励起し、発光を６７０／３０バンドパスフィルターを用いて収集した。４８８ｎＭのレーザーを使用してＥＧＦＰを励起し、発光蛍光を５０５ロングパスフィルターおよび５３０／３０バンドパスフィルターで取得した。データを、ライブイベントおよびトランスフェクトイベント（ｉＲＦＰを発現する）についてゲートされたFlowJoソフトウェアで分析した。陽性ＧＦＰ発現細胞を、少なくとも６，０００のライブイベントからゲートされたトランスフェクト細胞の割合として測定した。最適化実験のために、アッセイバックグラウンドの決定を、ｒｅｃＣａｓ９またはガイドＲＮＡ発現ベクターなしで、レポータープラスミドとｐＵＣとの同時トランスフェクションの際にｅＧＦＰを産生するトランスフェクト細胞のパーセンテージを測定することにより、行った。次いでこのバックグラウンドを、レポータープラスミドをｒｅｃＣａｓ９および標的または非標的ガイドＲＮＡ発現ベクターで同時トランスフェクトした場合に観察されたｅＧＦＰ陽性細胞の割合から、差し引いた。
【０１６４】
ゲノム標的部位の同定
適切な標的部位の検索は、Ｒ統計プログラミングを用いたオープンソースバイオインフォマティクスパッケージであるBioconductor（Fu et al., High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature biotechnology 31, 822-826 (2013)；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）を用いて行った。Genome Reference Consortiumにより公開されたヒト参照ゲノムの最新リリース（ＧＲＣｈ３８）を使用して、Ｃａｓ９のＰＡＭ要件と本文に記載されている進化型ｇｉｘ配列の両方に一致する部位を検索した。ゲノムにＲをロードすると、各検索パターンはBiostringとして表現された；これは、文字列のマッチングと操作を可能にするＲ内のコンテナーである。指定されたパラメータを使用して両方のＤＮＡ鎖を全ゲノムについてスキャンすると、約４５０の潜在的標的が、ＧＲＣｈ３８参照アセンブリを使用して検索した場合のヒトゲノムにおいて明らかになった（表９）。
表９．in silicoで同定されたｒｅｃＣａｓ９ゲノム標的
【表９−１】
2019526248.tif 000076
【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−８】
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【表９−９】
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【表９−１０】
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【表９−１１】
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【表９−１２】
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【表９−１３】
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【表９−１４】
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【表９−１５】
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【表９−１６】
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【表９−１７】
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【表９−１８】
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【表９−１９】
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【表９−２０】
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【表９−２１】
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【表９−２２】
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【表９−２３】
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【０１６５】
ＤＮＡ配列決定
２９３Ｔ細胞のトランスフェクションを上記のように６重で実施し、７２時間インキュベートした。細胞を採取し、複製物を合わせた。エピソームＤＮＡを、アルカリ溶解およびスピンカラム精製を含む修正ＨＩＲＴ抽出を用いて、本質的に記載されているようにして抽出した（Quan et al., Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways. PloS one 4, e6441 (2009)；およびHillson (2010), vol. 2015, pp. CPEC protocol；これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に説明すると、採取後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５００μＬの氷冷ＰＢＳで洗浄し、２５０μＬのＧＴＥ緩衝液（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡおよびｐＨ８．０）に再懸濁し、室温で５分間インキュベートし、氷上で５分間、２００μＬの溶解緩衝液（２００ｍＭのＮａＯＨ、１％ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて溶解した。溶解を１５０μＬの酢酸カリウム溶液（５Ｍ酢酸塩、３Ｍカリウム、ｐＨ６．７）で中和した。細胞破片を、２１，１３０ｇで１５分間の遠心分離によりペレット化し、溶解物をEconospin Spinカラム（Epoch Life Science, Missouri City, TX）に供した。カラムを７５０μＬの洗浄緩衝液（Omega Bio-tek, Norcross, GA）で２回洗浄し、４５μＬのＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０中で溶出した。
【０１６６】
単離されたエピソームＤＮＡを、ＲｅｃＢＣＤ（１０Ｕ）で３７℃で２時間、製造者の指示に従って消化し、MinElute反応クリーンアップキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて１０μＬのＥＢに精製した。Mach1-T1化学的コンピテント細胞を、５μＬのエピソーム抽出物で形質転換し、カルベニシリン耐性について選択するアガロースプレート（５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含む）上にプレーティングした。個々のコロニーを、プライマーpCALNL-for-1を用いて配列決定して、組換え率を決定した。配列決定読取り（read）により、「左」の無傷の非組換えｒｅｃＣａｓ９部位、予想される組換え産物、小さなインデルを有する「左」非組換え部位のまれな事例、または大きな欠失産物の１つの事例が明らかにされた。
【０１６７】
ｒｅｃＣａｓ９に触媒されたゲノム欠失の分析
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１ウェルあたり６×１０５細胞の密度で２４ウェルコラーゲン処理プレートに播種し、一晩増殖させた（Corning, Corning, NY）。トランスフェクション反応は、Opti-MEM（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）中で最終容量１００μＬにした。各トランスフェクションについて、９０ｎｇの各ガイドＲＮＡ発現ベクター、２０ｎｇのpmaxGFP（Lonza, Allendale, NJ）および３２０ｎｇのｒｅｃＣａｓ９発現ベクターを、Opti−MEM（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）中の２μＬのリポフェクタミン２０００と混合し、個々のウェルに加えた。４８時間後、細胞を採取し、ＧＦＰトランスフェクション対照について、BD FACS AriIIIuセルソーター上で選別した。細胞を純度モードで１００μｍのノズルを用いて選別し、バックグラウンドの蛍光を、トランスフェクトしていない細胞との比較により決定した。選別した細胞をＰＢＳ中の氷上で収集し、ペレット化し、冷ＰＢＳで２回洗浄した。ゲノムＤＮＡは、E.Z.N.A. Tissue DNAキット（Omega Bio-Tek, Norcross, GA）を用いて採取し、１００μＬのＥＢで溶出した。ゲノムＤＮＡを、Tecan Infinite M1000 Pro蛍光プレートリーダー上で測定するQuant-iT PicoGreen dsDNAキット（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）を用いて定量した。
【０１６８】
ネステッドＰＣＲを、３％ＤＭＳＯを補充し、かつ分子生物学等級のHyClone水（GE Life Sciences, Logan, UT）で希釈したQ5 Hot-Start Polymerase 2xマスターミックスを使用して実施した。一次ＰＣＲを、２０ｎｇのゲノムＤＮＡを鋳型として用いて２５μＬスケールで、プライマー対ＦＡＭ１９Ａ２−Ｆ１およびＦＡＭ１９Ａ２−Ｒ１を用いて行った（表５）。一次ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９８℃で１分間、３５サイクル（９８℃で１０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）、７２℃で１分間。一次ＰＣＲの１：５０希釈物を二次ＰＣＲの鋳型として使用し、プライマーＦＡＭ１９Ａ２−Ｆ２およびＦＡＭ１９Ａ２−Ｒ２を使用した。二次ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９８℃で１分間、３０サイクル（９８℃で１０秒間、５９℃で２０秒間、７２℃で２０秒間）、７２℃で１分間。１ＫｂプラスＤＮＡラダー（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）と並んだＴＡＥ中の１％アガロースゲル上での電気泳動により、ＤＮＡを分析した。サンガー配列決定される材料は、Qiagen Mineluteカラム（Valencia, CA）で製造者のプロトコルを使用して精製した。３つの生物学的複製物からの鋳型ＤＮＡを、３つの独立したゲノムネステッドＰＣＲに使用した。
【０１６９】
検出限界を、ヒト染色体の１つの完全なセットの重さが約３．６ｐｇ（３．３×１０９ｂｐ×１×１０−２１ｇ／ｂｐ）であると仮定して計算した。したがって、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ鋳型を播種したＰＣＲ反応には、約５５００セットの染色体が含まれている。
【０１７０】
ゲノム欠失の定量化のために、ネステッドＰＣＲを、上記の条件を用いて３つの生物学的複製物のそれぞれについて三重に実施した。ゲノムＤＮＡの２倍希釈系列を鋳型として使用し、希釈しないストック（サンプル１では４７．１７ｎｇ／μＬ、サンプル２では７５．９６ｎｇ／μＬ、サンプル３では２２．８３ｎｇ／μＬ）から始めて、ピペッティングエラーの潜在的源を低減した。欠失ＰＣＲ産物が観察され得る最も低いＤＮＡ濃度は、全ゲノムＤＮＡあたり１つの欠失産物を含むと仮定された。
【０１７１】
所与の量の鋳型ＤＮＡ中に存在するゲノムの数を推測することができ、したがって、ＦＡＭ１９Ａ２座位におけるｒｅｃＣａｓ９についての最小欠失効率の予測値を決定することができる。例えば、２倍希釈系列の場合を、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ鋳型から始めて考えてみる。ネステッドＰＣＲ後、２０ｎｇを播種したウェルのみが正しいＰＣＲ産物を生じた。ゲノムあたり３．６ｐｇでは、そのＰＣＲは約５５００のゲノムを含み、少なくとも１つの組換えゲノムが存在していたはずであるので、最小欠失効率は５５００中１（０．０１８％）である。
【０１７２】
ゲノムＤＮＡレベルを、ゲノム鋳型の限界希釈を用いて定量したが、これは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いてゲノム編集の絶対レベルを決定するためには、組換え後のゲノムＤＮＡからのみ明確かつ特異的に増幅するＰＣＲ条件のセットが必要となるからである。図５Ｂに示されるように、ゲノムＤＮＡを鋳型として用いる一次ＰＣＲは、優勢な種としておよそ２．５ｋｂのオフターゲットバンドをもたらす；ネステッドプライマーを用いた２回目のＰＣＲが、ガイドＲＮＡおよびｒｅｃＣａｓ９に依存するゲノム編集を明らかにするためには必要である。
【０１７３】
結果
ＧｉｎリコンビナーゼをｄＣａｓ９に融合する
最近、ｄＣａｓ９のＮ末端がＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインに融合すると、２つのガイドＲＮＡ特異的配列に隣接するＤＮＡ部位を切断する二量体ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ融合物をもたらし得ることが実証された（例えば、下記参照：Guilinger et al., Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nature biotechnology,  (2014)；Tsai et al., Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nature biotechnology (2014)；これら各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。同じ融合配向を用いて、ｄＣａｓ９を、以前にBarbasらによって進化された二量体Ｇｉｎインベルターゼの高活性触媒ドメインであるＧｉｎβに結合させた（Gaj et al., A comprehensive approach to zinc-finger recombinase customization enables genomic targeting in human cells. Nucleic acids research 41, 3937-3946 (2013)；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。Ｇｉｎβは、天然コア配列ＣＴＧＴＡＡＡＣＣＧＡＧＧＴＴＴＴＧＧＡ（配列番号７００）に関連するいくつかの２０ｂｐコア「ｇｉｘ」配列を、無差別に組換える（Gaj et al., A comprehensive approach to zinc-finger recombinase customization enables genomic targeting in human cells. Nucleic acids research 41, 3937-3946 (2013)；Klippel et al., The DNA Invertase Gin of Phage Mu - Formation of a Covalent Complex with DNA Via a Phosphoserine at Amino-Acid Position-9. Embo Journal 7, 1229-1237 (1988)；Mertens et al., Site-specific recombination in bacteriophage Mu: characterization of binding sites for the DNA invertase Gin. The EMBO journal 7, 1219-1227 (1988)；Plasterk et al., DNA inversions in the chromosome of Escherichia coli and in bacteriophage Mu: relationship to other site-specific recombination systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80, 5355-5358 (1983)；これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ガイドＲＮＡは、ｒｅｃＣａｓ９二量体を２つのガイドＲＮＡ特異的配列が隣接するｇｉｘ部位に局在化し、ＤＮＡ組換えを、ＧｉｎβドメインがガイドＲＮＡプログラム化様式で触媒することを可能にする（図１Ｄ）。
【０１７４】
得られたｄＣａｓ９−Ｇｉｎβ（ｒｅｃＣａｓ９）融合物をアッセイするために、ＥＧＦＰ転写を遮断するポリＡターミネーターに隣接する２つのｒｅｃＣａｓ９標的部位を含むレポータープラスミドを構築した（図１Ａ〜１Ｃ）。各ｒｅｃＣａｓ９標的部位は、ガイドＲＮＡプロトスペーサー配列と一致する部位が隣接する、ｇｉｘコア擬似部位からなる。リコンビナーゼ媒介欠失によりターミネーターが除去され、ＥＧＦＰの転写が回復した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、このレポータープラスミド、ガイドＲＮＡを転写するプラスミド、および候補ｄＣａｓ９−Ｇｉｎβ融合タンパク質を産生するプラスミドを同時トランスフェクトし、ＥＧＦＰ蛍光を示す細胞画分を用いて、各融合構築物の相対活性を評価した。
【０１７５】
コアｇｉｘ部位とガイドＲＮＡ結合部位との間の間隔（０〜７ｂｐ）、ならびにｄＣａｓ９とＧｉｎβ部分との間のリンカー長（（ＧＧＳ）２（配列番号１８２）、（ＧＧＳ）５（配列番号７０１）、または（ＧＧＳ）８（配列番号１８３））を含む、ｒｅｃＣａｓ９成分の構造に影響を及ぼすパラメータを変化させた（図２Ａ〜図２Ｆ）。ほとんどの融合構造は、観察可能なガイドＲＮＡ依存性ＥＧＦＰ発現をもたらさなかった（図１Ｃ〜１Ｄ）。しかしながら、８つのＧＧＳ反復のリンカーおよび３〜６塩基対のスペーサーを含む１つの融合構築物は、マッチしたがミスマッチではないガイドＲＮＡが存在した場合に、約１％の組換えをもたらした（図２Ｅ〜２Ｆ）。組換え活性は、５〜６塩基対がコアからｄＣａｓ９結合部位を分離している場合に、一貫してより高かった（図２Ｆ）。これらの結果をまとめると、ｄＣａｓ９とＧｉｎβとの間の特異的融合構造が、ヒト細胞におけるスペーサー隣接ｇｉｘ関連コア部位でガイドＲＮＡ依存性組換え活性をもたらし得ることを明らかにする。８×ＧＧＳリンカー融合構築物は、「ｒｅｃＣａｓ９」と呼ばれる。
【０１７６】
ヒトゲノムに見られるＤＮＡ配列のｒｅｃＣａｓ９を用いた標的化
観察された低レベルの活性は、最適以下のガイドＲＮＡ配列またはコアｇｉｘ配列によって引き起こされ得、これは、ガイドＲＮＡ：Ｃａｓ９結合の効率が配列依存的であることを示す以前の報告と一致する（例えば、Xu et al., Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome research 25, 1147-1157 (2015)を参照、この全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、本最適化は天然のｇｉｘコア配列を用いて実施されたが（例えば、Klippel et al., The DNA Invertase Gin of Phage Mu - Formation of a Covalent Complex with DNA Via a Phosphoserine at Amino-Acid Position-9. Embo Journal 7, 1229-1237 (1988)；Mertens et al., Site-specific recombination in bacteriophage Mu: characterization of binding sites for the DNA invertase Gin. The EMBO journal 7, 1219-1227 (1988)；Plasterk et al., DNA inversions in the chromosome of Escherichia coli and in bacteriophage Mu: relationship to other site-specific recombination systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80, 5355-5358 (1983)を参照；これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）、しかしいくつかの研究は、ジンクフィンガー−Ｇｉｎ融合体またはＴＡＬＥ−Ｇｉｎ融合体が活性であり、ある場合にはわずかに変更されたコア部位において、より活性であることを示した。例えば、以下を参照：Gordley et al., 3rd, Synthesis of programmable integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 5053-5058 (2009)；Gersbach et al., Targeted plasmid integration into the human genome by an engineered zinc-finger recombinase. Nucleic acids research 39, 7868-7878 (2011)；Mercer et al., Chimeric TALE recombinases with programmable DNA sequence specificity. Nucleic acids research 40, 11163-11172 (2012)；Gaj et al., A comprehensive approach to zinc-finger recombinase customization enables genomic targeting in human cells.  Nucleic acids research 41, 3937-3946 (2013)；Gordley et al., 3rd, Evolution of programmable zinc finger-recombinases with activity in human cells. J Mol Biol 367, 802-813 (2007)；Gersbach et al., 3rd, Directed evolution of recombinase specificity by split gene reassembly. Nucleic acids research 38, 4198-4206 (2010)；およびGaj et al., Structure-guided reprogramming of serine recombinase DNA sequence specificity.  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 498-503 (2011)；これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。したがって、未修飾のヒトゲノム配列がｒｅｃＣａｓ９によって標的化され得るかどうかを試験するため、およびガイドＲＮＡおよびコア配列を変化させることがｒｅｃＣａｓ９活性を増加させるかどうかを試験するために、ヒトゲノム内に見出される配列を標的とした。
【０１７７】
潜在的な標的部位を同定するために、進化型Ｇｉｎバリアントを特徴付ける以前の知見（例えば、Gaj et al., A comprehensive approach to zinc-finger recombinase customization enables genomic targeting in human cells.  Nucleic acids research 41, 3937-3946 (2013)；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）、および上記の観察を使用した。この情報を使用して、ヒトゲノムを、ＣＣＮ（３０−３１）−ＡＡＡＳＳＷＷＳＳＴＴＴ−Ｎ（３０−３１）−ＧＧ（配列番号６９９）を含む部位について検索した；ここで、ＷはＡまたはＴであり、ＳはＧまたはＣであり、およびＮは任意のヌクレオチドである。Ｎ（３０−３１）は、ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のＮ、２０塩基対のＣａｓ９結合部位、Ｃａｓ９とｇｉｘ部位との間の５〜６塩基対の間隔、およびｇｉｘコア部位の４つの最も外側の塩基対のＮを含む。ｇｉｘコア部位の内部１２塩基対（ＡＡＡＳＳＷＷＳＳＴＴＴ、配列番号６９９）は、Ｇｉｎβ活性にとって重要であることが以前に決定されていた（例えば、Gaj et al., Nucleic acids research 41, 3937-3946 (2013)参照）。
【０１７８】
検索により、ヒトゲノム中に約４５０個のかかる座位が明らかとなった（表９）。ＰＣＤＨ１５に見られるこれらのゲノム座位の１つと同一の配列を含むレポーター構築物を作製し、次いでガイドＲＮＡ発現ベクターを構築して、ｒｅｃＣａｓ９をこの配列に指向させた（図３Ａ）。これらのベクターは、２対のガイドＲＮＡをコードし、それぞれがＰＣＤＨ１５疑似ｇｉｘ部位に隣接する５’および３’領域に一致するスペーサー配列を含む。レポータープラスミド、これらの隣接ガイドＲＮＡ発現ベクターの組み合わせ、およびｒｅｃＣａｓ９発現ベクターの同時トランスフェクションは、トランスフェクト細胞の１１％〜１３％でＥＧＦＰ発現をもたらし（図３Ｂ）、図２に示された結果に対して１０倍を超える活性の向上を表す。これらの知見は、ｒｅｃＣａｓ９標的配列のより賢明な選択が、ヒトゲノムにおいて見出されるものと一致するＤＮＡ配列において実質的に改善された組換え効率をもたらし得ることを実証する。
【０１７９】
次に、両方のガイドＲＮＡ配列がｒｅｃＣａｓ９媒介欠失を引き起こすのに必要であるかどうかを決定した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＰＣＤＨ１５疑似ｇｉｘコア部位の５’または３’隣接配列を標的とするガイドＲＮＡベクターの１つのみ、ＰＣＤＨ１５レポータープラスミド、およびｒｅｃＣａｓ９発現ベクターと、同時トランスフェクトした。これらの同時トランスフェクションは、２．５〜３％のＥＧＦＰ発現をもたらした（図３Ｂ）。標的化ガイドＲＮＡの１つのみとｒｅｃＣａｓ９の発現の際に観察される低レベルの活性は、二量体を形成する高活性化ｇｉｘ単量体の傾向によって引き起こされ得る（例えば、Gaj et al., Enhancing the Specificity of Recombinase-Mediated Genome Engineering through Dimer Interface Redesign. J Am Chem Soc 136, 5047-5056 (2014)；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。一過性二量体化は、時折、単一のプロトスペーサー配列が二量体を標的部位に局在化させることを可能にし得る。オフターゲットガイドＲＮＡベクターを使用した場合、またはｒｅｃＣａｓ９ベクターをｐＵＣで置換した場合（図３Ｂ）、バックグラウンドを超える活性は検出されなかった。
【０１８０】
これらの知見は、異なる標的部位を選択しガイドＲＮＡ配列を一致させることにより、初期実験で観察された適度の活性を超えてｒｅｃＣａｓ９活性を実質的に増加可能であることを実証する。元の標的配列と比較して、ＰＣＤＨ１５部位に対する活性の１０倍を超える増加が観察された（図３Ｂと図２Ｆを比較されたい）。さらに、最大の組換え活性は、ガイドＲＮＡとｒｅｃＣａｓ９の両方の存在に依存する。
【０１８１】
ｒｅｃＣａｓ９の直交性
次に、ｒｅｃＣａｓ９が、ヒトゲノム中に見出される複数の別々の座位に一致する配列を直交する様式で標的とし得るかどうかを試験した。ヒトゲノム中のｒｅｃＣａｓ９標的部位のサブセットの選択を、ゲノム組込みのためのセーフハーバー座位としてのそれらの潜在的使用に基づき、またはある場合には遺伝病に関与する遺伝子内のそれらの位置に基づいて、行った。
【０１８２】
これらの部位を同定するために、ＥＮＳＥＭＢＬ（リリース８１）を検索して、どの予測ｒｅｃＣａｓ９標的部位が注釈付き（annotated）遺伝子に含まれるかを同定した（例えば、Gaj et al., Enhancing the Specificity of Recombinase-Mediated Genome Engineering through Dimer Interface Redesign. J Am Chem Soc 136, 5047-5056 (2014)参照；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。かかる部位の１つは、ＦＧＦ１４のイントロン領域内に入った。ＦＧＦ１４内の変異は、脊髄小脳性運動失調症２７（ＳＣＡ２７）を引き起こすと考えられている（例えば以下を参照：van Swieten et al., A mutation in the fibroblast growth factor 14 gene is associated with autosomal dominant cerebellar ataxia [corrected]. Am J Hum Genet 72, 191-199 (2003)；Brusse et al., Spinocerebellar ataxia associated with a mutation in the fibroblast growth factor 14 gene (SCA27): A new phenotype. Mov Disord 21, 396-401 (2006)；Choquet et al., A novel frameshift mutation in FGF14 causes an autosomal dominant episodic ataxia. Neurogenetics 16, 233-236 (2015)；Coebergh et al., A new variable phenotype in spinocerebellar ataxia 27 (SCA 27) caused by a deletion in the FGF14 gene. Eur J Paediatr Neurol 18, 413-415 (2014)；Shimojima et al., Spinocerebellar ataxias type 27 derived from a disruption of the fibroblast growth factor 14 gene with mimicking phenotype of paroxysmal non-kinesigenic dyskinesia. Brain Dev 34, 230-233 (2012)；これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。最後に、遺伝子内に入らなかった予測ｒｅｃＣａｓ９標的部位の一部を手作業で調べて、いくつかの配列がセーフハーバー座位に含まれるかどうかを決定した。ＥＮＳＥＭＢＬの注釈を使用して、Bushmanおよび共同研究者により記載されたセーフハーバー座位についての５つの基準の大部分に一致するゲノム標的が同定された（Cunningham et al., Ensembl 2015. Nucleic acids research 43, D662-669 (2015)；およびSadelain et al., Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nat Rev Cancer 12, 51-58 (2012)；これら各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。５つのレポーターおよび、ゲノム中の配列と同一の配列を含有する対応するガイドＲＮＡベクター対を構築した。異なるガイドＲＮＡを用いてプログラムした場合のｒｅｃＣａｓ９の直交性を評価するために、５つのガイドＲＮＡ対と５つのレポーターの全ての組み合わせを試験した。
【０１８３】
レポーター、ガイドＲＮＡプラスミド、およびｒｅｃＣａｓ９発現ベクターの同時トランスフェクションは、試験した５つのレポーターのうち３つが、ｒｅｃＣａｓ９媒介組換えと一致する相当レベルのＥＧＦＰ陽性細胞をもたらすことを明らかにした。このＥＧＦＰ発現は、ｒｅｃＣａｓ９発現ベクターとレポーター構築物上の標的部位配列と一致するガイドＲＮＡプラスミドとの同時トランスフェクションに、厳密に依存していた（図４Ａ）。同族レポータープラスミドとｒｅｃＣａｓ９ベクターを同時トランスフェクトした場合に組換えを引き起こした同じガイドＲＮＡ対は、非同族レポータープラスミドと同時トランスフェクトした場合に、組換えを媒介することができなかった（図４Ａ）。これらの結果は、ｒｅｃＣａｓ９活性が直交性であり、隣接配列と一致する一対のガイドＲＮＡでプログラムされた場合にのみ、ｇｉｘ関連コア部位での組換えを触媒することを実証する。アッセイのバックグラウンドレベルを超えるリコンビナーゼ活性は、レポータープラスミドを、ｒｅｃＣａｓ９およびガイドＲＮＡを発現するベクターなしでトランスフェクトした場合に、観察されなかった。
【０１８４】
ｒｅｃＣａｓ９産物の特徴付け
レポータープラスミドのｒｅｃＣａｓ９媒介組換えの産物を特徴付けして、ＥＧＦＰ発現がポリＡターミネーター配列のｒｅｃＣａｓ９媒介性除去の結果であることを確認した。レポータープラスミドを、ｒｅｃＣａｓ９発現ベクターと同族または非同族ガイドＲＮＡ対を産生するプラスミドとの同時トランスフェクションの後に、５番染色体部位１、１２番染色体、および１３番染色体（ＦＧＦ１４座位）について配列決定した。７２時間のインキュベーション後、エピソームＤＮＡを抽出し（上記の通り）、大腸菌に形質転換してレポータープラスミドを単離した。レポータープラスミドを含有する単一コロニーを配列決定した（図４Ｂ）。
【０１８５】
個々のコロニーは、未修飾または組換えレポータープラスミドのいずれかを含むと予想された（図４Ｃ）。各生物学的複製物について、各トランスフェクション条件から単離されたレポータープラスミドで形質転換された平均９７個のコロニーを配列決定した。組換えプラスミドは、レポータープラスミドが同族ガイドＲＮＡプラスミドおよびｒｅｃＣａｓ９発現ベクターと以前に同時トランスフェクトされた場合にのみ、観察された（図４Ｄ）。２つの別々の実験において、組換えプラスミドのパーセントは、５番染色体の部位１の１２％から１３番染色体のＦＧＦ１４座位の平均３２％までの範囲であった。したがって、配列決定データは、図４Ａの初期のフローサイトメトリー分析と一致した。組換えプラスミドの絶対レベルは、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合よりいくらか高かった（図４）。この違いは、フローサイトメトリーアッセイが、単一細胞中にレポータープラスミドの複数のコピーが存在する場合に起こり得る複数の組換え事象については報告しないために、生じる可能性が高い；単一の組換え事象であっても、ＥＧＦＰ蛍光を生じ得る。結果として、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合は、組換えレポータープラスミドの実際の割合の下限に対応し得る。あるいは、その差は、プラスミドのサイズと形質転換効率との間の負の相関を反映しているかもしれない（例えば、Hanahan, Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol 166, 557-580 (1983)を参照；この全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。組換えプラスミドは約５，７００塩基対であり、無傷のプラスミド（約６，９００塩基対）よりわずかに良く形質転換することができる。
【０１８６】
ジンクフィンガーリコンビナーゼは、リコンビナーゼコア−部位接合部に変異を引き起こすことが報告されており（例えば、Gaj et al., A comprehensive approach to zinc-finger recombinase customization enables genomic targeting in human cells. Nucleic acids research 41, 3937-3946 (2013)；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）、かかる変異誘発がｒｅｃＣａｓ９処理から生じるかどうかを試験した。レポーター構築物において、ｒｅｃＣａｓ９は、最初に両方のｇｉｘコア部位の中央ジヌクレオチドを切断し、次に２つのコアを互いに再ライゲートすることによって、ｋａｎＲおよびポリＡターミネーターを削除するはずである（図４Ｃ）。したがって、組換え産物は、「左」の標的部位の前半および「右」の標的部位の後半からなる単一の組換え部位であるべきである。誤った反応または不完全な反応は、別の産物をもたらす可能性がある。驚くべきことに、調べた１３４個の組換え配列の全てが、予想される組換え産物を含んでいた。さらに、トランスフェクション実験の２つの別々のセットからの合計２，３１７の配列決定の読取りは、他の方法では組み換えられていないプラスミドにおいて、潜在的な欠失産物を含有する３つの配列決定読取りのみを明らかにした。
【０１８７】
これらの欠失含有読取りのうちの１つは、ｐＵＣ対照でトランスフェクトされ、ｒｅｃＣａｓ９標的部位ならびにポリＡターミネーターの両方を欠いた、１２番染色体レポータープラスミドにおいて観察された。この産物は、トランスフェクション、単離、またはそれに続く操作の間に生じたＤＮＡ損傷に起因していた。ｒｅｃＣａｓ９は、レポーターと同族ガイドＲＮＡ発現ベクターとで同時トランスフェクトした場合にのみ、配列に局在し得るので、より適切な測定基準は、レポータープラスミドを、同族ガイドＲＮＡベクターおよびｒｅｃＣａｓ９発現ベクターと同時トランスフェクトした場合に観察される欠失産物の総数を測定することであり得る。５番染色体部位１レポーターと同族ガイドＲＮＡとの同時トランスフェクションから配列決定された合計１８５のプラスミドから、１つのインデルが観察された。同様に、同族ガイドＲＮＡとｒｅｃＣａｓ９発現ベクターでのトランスフェクション後に、１２番染色体レポーターからの２０４個のプラスミドから、１つのインデルが観察された。特に、最高の観察レベルの組換えをもたらしたにもかかわらず、２０２の配列決定読取りのうち、同族ガイドＲＮＡとｒｅｃＣａｓ９の同時トランスフェクション後の１３番染色体レポーターから、インデルは観察されなかった。これらの観察結果はまとめて、ｒｅｃＣａｓ９がほぼエラーのない組換えを媒介することを示唆している。
【０１８８】
まとめると、これらの結果は、ｒｅｃＣａｓ９が、ヒトゲノム内に見出される複数の部位を、最小の交差反応性または副産物形成を伴って、標的とし得ることを立証する。基質は、同族ガイドＲＮＡ配列およびｒｅｃＣａｓ９の存在下でのみ効率的な組換えを受け、ヒト細胞においてクリーンな組換え産物を与え、コア−部位接合部における変異または細胞ＤＮＡ修復から生じるインデルなどの産物を、一般的に生じない。
【０１８９】
ｒｅｃＣａｓ９媒介性ゲノム欠失
最後に、ｒｅｃＣａｓ９が、培養ヒト細胞のゲノムＤＮＡに対して直接作用することができるかどうかを調べた。ヒトゲノム中の潜在的なｒｅｃＣａｓ９認識部位のリスト（表９）を使用して、ｒｅｃＣａｓ９によって標的化された場合にＰＣＲにより検出可能な染色体欠失事象を生じるであろう部位の対を探した。ガイドＲＮＡ発現ベクターは、５番染色体部位１または１３番染色体（ＦＧＦ１４座位）、すなわち両者とも一過性トランスフェクションアッセイにおいて組み換えられることが示された部位に、ｒｅｃＣａｓ９を導くように設計された（図４）。新しい標的部位は、５番染色体部位１の約３から２３Ｍｂｐ上流および７から１０Ｍｂｐ下流、および１３番染色体ＦＧＦ１４部位の１２から４４Ｍｂｐ上流の範囲であった。ｒｅｃＣａｓ９発現ベクターを、これらの新しいガイドＲＮＡ対および５番染色体部位１または１３番染色体ＦＧＦ１４に使用される検証済みガイドＲＮＡ対のそれぞれと、同時トランスフェクトしたが、ゲノムＰＣＲによる染色体欠失の証拠は観察されなかった。
【０１９０】
ゲノム欠失は、ｒｅｃＣａｓ９標的部位がゲノム上で互いに接近している場合に、より効率的であり得ると考えられていた。ＦＡＭ１９Ａ２のイントロン領域内で１４．２ｋｂ離れた２つのｒｅｃＣａｓ９部位が同定された；これらの部位もまた、欠失を促進するであろう同一のジヌクレオチドコアを含んでいた。ＦＡＭ１９Ａ２は、免疫細胞および神経細胞において調節的役割を果たすと考えられている小さな分泌タンパク質をコードする５つの密接に関連したＴＡＦＡファミリー遺伝子のうちの１つである（例えばParker et al., Admixture mapping identifies a quantitative trait locus associated with FEV1/FVC in the COPDGene Study. Genet Epidemiol 38, 652-659 (2014)を参照；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ＦＡＭ１９Ａ２のイントロン配列に位置する小ヌクレオチド多型は、ゲノムワイド関連研究における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のリスク上昇と関連している（例えば、Parker et al., Admixture mapping identifies a quantitative trait locus associated with FEV1/FVC in the COPDGene Study. Genet Epidemiol 38, 652-659 (2014)参照；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）；それゆえ、この遺伝子のイントロン領域の欠失は、これらの疾患の原因への洞察を提供し得る。４つのガイドＲＮＡ配列を、これら２つのＦＡＭ１９Ａ２部位の間のｒｅｃＣａｓ９欠失を媒介するように設計された発現ベクターにクローニングした。これらのガイドＲＮＡを発現するベクターを、ｒｅｃＣａｓ９発現ベクターと同時トランスフェクトした（図５Ａ）。２つの部位間のｒｅｃＣａｓ９媒介組換えは、１４．２ｋｂの介在領域の欠失をもたらすはずである。実際、この欠失事象は、２つのＦＡＭ１９Ａ２ ｒｅｃＣａｓ９標的に隣接する遺伝子特異的プライマーを用いたネステッドＰＣＲによって検出された。ｒｅｃＣａｓ９を介した欠失と一致する、予想されるＰＣＲ産物は、ｒｅｃＣａｓ９と４つすべてのガイドＲＮＡ発現ベクターで同時トランスフェクトされた細胞から単離されたゲノムＤＮＡでのみ、観察された（図５Ｂ）。欠失ＰＣＲ産物は、上流または下流いずれか一対のみのガイドＲＮＡ発現ベクターなしでトランスフェクトされたか、ｒｅｃＣａｓ９発現プラスミドなしでトランスフェクトされた細胞のゲノムＤＮＡにおいて、またはトランスフェクトされていない対照細胞のゲノムＤＮＡについては、検出されなかった（図５Ｂ）。これらのネステッドＰＣＲ産物についての予測検出限界は、５，５００染色体コピーあたり約１の欠失事象であった。予想されるゲノム欠失に対応する４１５ｂｐのＰＣＲ産物を単離し、配列決定した。配列決定により、ＰＣＲ産物が、リコンビナーゼ媒介ゲノム欠失から予測される予測接合部と一致し、ＮＨＥＪを示唆するいかなる挿入または欠失も含まないことが確認された（図５Ｃ）。
【０１９１】
最小ゲノム欠失効率の下限は、ゲノム鋳型の連続希釈物に対するネステッドＰＣＲを用いて予測した（上記または例えばSykes et al., Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques 13, 444-449 (1992)参照；その全内容は、より詳細に、参照により本明細書に組み込まれる）。ｒｅｃＣａｓ９特異的ネステッドＰＣＲ産物を生成するゲノムＤＮＡの一定量は、少なくとも１つの編集された染色体を含まねばならない。このｒｅｃＣａｓ９媒介のゲノム欠失事象の下限を確立するために、ネステッドＰＣＲを、ゲノムＤＮＡの連続希釈物（ｒｅｃＣａｓ９および４つのＦＡＭ１９Ａ２ガイドＲＮＡ発現ベクターを用いてトランスフェクトした細胞から単離される）に対して行い、検出可能な欠失産物をもたらすゲノム鋳型ＤＮＡの最小濃度を決定した。これらの実験は、欠失効率の下限が０．０２３±０．０１７％（３つの生物学的複製の平均）であることを明らかにし（図５Ｄ）、これはｒｅｃＣａｓ９媒介ゲノム欠失が、少なくともこの効率で進行することを示唆する。非トランスフェクト細胞のゲノムＤＮＡのネステッドＰＣＲは産物をもたらさず、予測検出限界は、＜０．００７２％の組換えであった。
【０１９２】
他の代替リコンビナーゼの使用
「３６Ｃ６」と呼ばれるヒトゲノムのＲｏｓａ座位内の部位を標的とするように進化させたＣｒｅリコンビナーゼを、ｄＣａｓ９に融合した。次いで、この融合物を使用して、Ｒｏｓａ標的部位を含有するプラスミドベースのレポーターを、ガイドＲＮＡ依存性様式で組み換えた。図７Ａは、野生型Ｃｒｅおよび３６Ｃ６を用いたリンカー最適化の結果を示す。示されている１×２×、５×、および８×リンカーは、リンカー中のＧＧＳ反復の数である。復帰変異分析（reversion analysis）は、ｄＣａｓ９に融合した３６Ｃ６に変異を作ることが、キメラ融合物の相対的ガイド依存性に影響を及ぼし得ることを実証した（図７Ｂ）。復帰変異は、それらの非変異アミノ酸で標識されている。例えば、Ｍに変異した３０６位は、アッセイが行われる前にＩに戻された。同族レポーターを標的とするＧｉｎＢ構築物を、図７Ａおよび７Ｂに示される実験データのための対照として使用した。オンターゲットのガイドは、ｃｈｒ１３−１０２０１０５７４ガイド（プラスミドＢＣ１６５および１６６）であった。示されている略語は、ＧＧＳ−３６Ｃ６：ｄＣａｓ９−ＧＧＳ−３６Ｃ６；２ＧＧＳ−３６Ｃ６（リンカー配列番号１８２を使用）：ｓｄＣａｓ９−ＧＧＳＧＧＳ−３６Ｃ６（リンカー配列番号１８２を使用）である。
【０１９３】
３６Ｃ６およびすべてのバリアントのトランスフェクションに使用された標的配列を、以下に示す：（ガイド−イタリック体；Ｒｏｓａ部位−太字）：
【化４３】
2019526248.tif 000099
【０１９４】
図７Ａ、７Ｂ、８、９Ａおよび９Ｂにおいて、ＧｉｎＢのためのオンターゲットのガイドは、ｃｈｒ１３−１０２０１０５７４ガイド（プラスミドＢＣ１６５および１６６）であった。図７Ａ、７Ｂ、８、９Ａおよび９Ｂにおける全てのオフターゲットのガイドは、ｃｈｒ１２−６２４１８５７７ガイド（ＢＣ１６３およびＢＣ１６４）から構成されていた。
【０１９５】
ｄＣａｓ９結合を支持し得るヒトゲノム中のＲｏｓａ２６部位に隣接するＰＡＭが同定された（図８、上）。次いで、ガイドＲＮＡおよびプラスミドレポーターを設計して、内因性プロトスペーサーがｄＣａｓ９−３６Ｃ６活性を支持し得るかどうかを試験した。同族レポーターを標的とするＧｉｎＢ構築物を対照として使用した。図８を参照のこと。Ｍｉｘ：Ｃａｓ９と３６Ｃ６の間の５つ全てのリンカーバリアントの等量混合物。ｈＲｏｓａの場合、ガイドＲＮＡ標的を含む標的配列は、以下の通りである。（ガイド−イタリック体；Ｒｏｓａ部位−太字）
【化４４】
2019526248.tif 000100
【０１９６】
ｈＲｏｓａ用のオンターゲットガイドプラスミドは、プロトスペーサーが上記に示したものと置き換えられていることを除いて、他のｇＲＮＡ発現プラスミドと同一である（図８）。
【０１９７】
ｄＣａｓ９−Ｃｒｅリコンビナーゼ融合体のいくつかの試験されたＣｒｅ切断型を、図９Ａに示す。ｄＣａｓ９に融合したＣｒｅリコンビナーゼの切断型バリアントは、Ｌｏｘプラスミドレポーター系において、かなりのリコンビナーゼ活性とガイドＲＮＡの存在への厳密な依存の両方を示した（図９Ｂ）。切断型バリアントは、切断型Ｃｒｅが始まる残基で標識されている。図９Ａおよび９Ｂに示されるすべての融合タンパク質に対するリンカーは、８×ＧＧＳである。ｄＣａｓ９に融合した野生型Ｃｒｅを、陽性対照として用いた。３６Ｃ６およびすべてのバリアントのトランスフェクションに使用された標的配列を、以下に示す。（ガイド−イタリック体；Ｒｏｓａ部位−太字）：
【化４５】
2019526248.tif 000101
【０１９８】
使用したオンターゲットガイドは、ｃｈｒ１３−１０２０１０５７４ガイド（プラスミドＢＣ１６５および１６６）であり、オフターゲットガイドは、ｃｈｒ１２−６２４１８５７７ガイド（ＢＣ１６３およびＢＣ１６４）であった。
参考文献
【表１０−１】
2019526248.tif 000102
【表１０−２】
2019526248.tif 000103
【表１０−３】
2019526248.tif 000104
【表１０−４】
2019526248.tif 000105
【表１０−５】
2019526248.tif 000106
【表１０−６】
2019526248.tif 000107
均等物と範囲
【０１９９】
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験を超えないものを用いて確認できるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図せず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載の通りである。
【０２００】
特許請求の範囲において、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、逆が示されているかまたは文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味し得る。グループの１つ以上のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、逆が示されているかまたは文脈から明らかでない限り、１つ、複数、またはすべてのグループメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在する、使用されている、またはその他の方法で関連がある場合に、満たされると見なされる。本発明は、そのグループの正確に１つのメンバーが所与の生成物またはプロセス中に存在するか、使用されるか、またはその他の方法で関連する態様を含む。本発明はまた、複数の、または全てのグループメンバーが、所与の生成物またはプロセス中に存在するか、使用されるか、またはその他の方法で関連する態様も含む。
【０２０１】
さらに、本発明は、１つ以上の請求項からまたは説明の関連する部分からの、１つ以上の制限、要素、条項、説明用語などが別の請求項に導入されている、すべての変形形態、組合せ、および置換を包含することを理解されたい。例えば、別の請求項に従属する請求項は、同じ基本請求項に従属する任意の別の請求項に見いだされる１つ以上の制限を含むように、修正することができる。さらに、請求項が組成物を示している場合、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、本明細書に開示された目的のいずれかに該組成物を使用する方法、および本明細書に開示された製造方法もしくは当分野で知られている他の方法に従って該組成物を製造する方法が含まれることも、理解される。
【０２０２】
要素がリストとして、例えばマーカッシュグループフォーマットで提示される場合、要素の各サブグループも開示され、また任意の要素がグループから削除され得ることを理解されたい。「含む」という用語は、開かれていることを意図しており、追加の要素またはステップを含めることを許容することにも留意されたい。一般に、本発明または本発明の側面が、特定の要素、特徴、ステップ等を含むものとして言及されている場合、本発明の一定の態様または本発明の側面は、かかる要素、特徴、ステップ等からなるか、または本質的にこれらからなることが、理解されるべきである。簡潔にするために、これらの態様は、本明細書中で具体的に説明されてはいない。したがって、１つ以上の要素、特徴、ステップ等を含む本発明の各態様について、本発明はまた、それらの要素、特徴、ステップ等からなるかまたは本質的にこれらからなる態様も提供する。
【０２０３】
範囲が与えられている場合、終点が含まれる。さらに、他に示されていない限り、または文脈および／または当業者の理解から別が明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈上明らかにそうでないと指示しない限り、本発明の異なる態様において述べられた範囲内の任意の特定の値を、範囲の下限の１０分の１単位まで取り得ることを理解されたい。また、他に示されていない限り、または文脈および／または当業者の理解から別が明らかでない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意の部分範囲をとることができ、ここで部分範囲の終点は、範囲の下限の単位の１０分の１と同じ精度で表されることも理解されたい。
【０２０４】
さらに、本発明の任意の特定の態様は、任意の１つ以上の請求項から明示的に排除され得ることを理解されたい。範囲が示される場合、その範囲内の任意の値は、任意の１つ以上の請求項から明示的に除外され得る。本発明の組成物および／または方法の任意の態様、要素、特徴、用途、または側面は、任意の１つ以上の請求項から除外することができる。簡潔にするために、１つ以上の要素、特徴、目的、または側面が除外されているすべての態様が、本明細書に明示的に記載されているわけではない。
【０２０５】
上記に列挙したものを含む、本明細書に記載のすべての刊行物、特許および配列データベースエントリーは、あたかも各個別の刊行物または特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書中の任意の定義を含む本出願が支配するであろう。
【図１Ａ−１Ｄ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図２Ｃ−２Ｄ】
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【図２Ｅ−２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ−５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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