(57)【要約】  本発明は、ヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）を含む医薬組成物であって、ｈＩＤＰＳＣはＣＤ４４およびＣＤ１３を発現する、前記医薬組成物を提供する。本発明はまた、神経学的疾患または状態を治療する方法であって、ｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物を対象に全身投与することを含み、ｈＩＤＰＳＣはＣＤ４４およびＣＤ１３を発現する、前記方法を提供する。例えば、初期ＨＤと診断された対象における神経保護機構を支持すること、またはＰＤと診断された対象における喪失したＤＡニューロンを修復することを含む、神経学的疾患または状態の治療のためである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）を含む医薬組成物であって、ｈＩＤＰＳＣはＣＤ４４およびＣＤ１３を発現する、前記医薬組成物。
【請求項２】
ｈＩＤＰＳＣが、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠く、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＣＤ４４およびＣＤ１３の発現が、ｈＩＤＰＳＣの血液脳関門（ＢＢＢ）の通過を可能にする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、および／またはＨＬＡ−ＡＢＣの発現の欠如が、免疫細胞によるｈＩＤＰＳＣの拒絶反応を予防する、請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ｈＩＤＰＳＣがＢＤＮＦおよびＤＡＲＰＰ３２を発現する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ｈＩＤＰＳＣが、複数回の継代後にコロニー形成能を維持している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
静脈内（ＩＶ）注射用に製剤化されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ｈＩＤＰＳＣが、免疫調節因子および神経栄養因子を分泌する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
神経学的疾患または状態を治療する方法であって、ｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物を対象に全身投与することを含み、ｈＩＤＰＳＣはＣＤ４４およびＣＤ１３を発現する、前記方法。
【請求項１０】
ｈＩＤＰＳＣが、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠く、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
医薬組成物が対象に静脈内投与される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｈＩＤＰＳＣが、対象に対して自家および／または同種異系である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
神経学的疾患または状態が、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病、およびハンチントン病（ＨＤ）からなる群から選択される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
神経学的疾患または状態がハンチントン病（ＨＤ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象が初期ＨＤと診断され、対象へのｈＩＤＰＳＣの投与が、対象における神経保護機構を支持する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
神経学的疾患または状態がパーキンソン病（ＰＤ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
対象がＰＤと診断され、対象へのｈＩＤＰＳＣの投与が、対象における喪失したドーパミン作動性ニューロンを修復する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
神経学的疾患または状態が、自閉症、統合失調症、脳卒中、虚血、運動障害、およびけいれん性障害からなる群から選択される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ｈＩＤＰＳＣがＢＤＮＦおよびＤＡＲＰＰ３２を発現する、請求項９〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
神経学的疾患または状態が、ＢＢＢを通過するｈＩＤＰＳＣによって治療される、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
対象の中枢神経系（ＣＮＳ）におけるニューロン喪失を予防する方法であって、ｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ｈＩＤＰＳＣはＣＤ４４およびＣＤ１３を発現する、前記方法。
【請求項２２】
医薬組成物の投与が全身性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
全身投与が静脈内または腹腔内である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｈＩＤＰＳＣが、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠く、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ｈＩＤＰＳＣが、対象に対して自家および／または同種異系である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
対象のＣＮＳにおけるニューロン細胞増殖および修復を促進する方法であって、ｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ｈＩＤＰＳＣはＣＤ４４およびＣＤ１３を発現する、前記方法。
【請求項２７】
医薬組成物の投与が全身性である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
全身投与が静脈内または腹腔内である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｈＩＤＰＳＣが、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠く、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ｈＩＤＰＳＣが、対象に対して自家および／または同種異系である、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
対象のＣＮＳにおけるドーパミンおよびｃＡＭＰ調節性のニューロンリン酸化タンパク質（ＤＡＲＰＰ−３２）、ドーパミン受容体Ｄ２、ならびに／または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現を増加させる方法であって、ｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ｈＩＤＰＳＣはＣＤ４４およびＣＤ１３を発現する、前記方法。
【請求項３２】
医薬組成物の投与が全身性である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
全身投与が静脈内または腹腔内である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ｈＩＤＰＳＣが、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠く、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ｈＩＤＰＳＣが、対象に対して自家および／または同種異系である、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病（ＨＤ）、自閉症、統合失調症、脳卒中、虚血、運動障害、およびけいれん性障害からなる群から選択される神経学的疾患または状態の治療に使用するための、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現するｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物。
【請求項３７】
パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病（ＨＤ）、自閉症、統合失調症、脳卒中、虚血、運動障害、およびけいれん性障害からなる群から選択される神経学的疾患または状態を治療するための、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現するｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物の使用。
【請求項３８】
パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病（ＨＤ）、自閉症、統合失調症、脳卒中、虚血、運動障害、およびけいれん性障害からなる群から選択される神経学的疾患または状態を治療する医薬を調製するための、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現するｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物の使用。
【請求項３９】
ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現するヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）。
【請求項４０】
実施例のいずれか１つまたは添付の図面のいずれか１つを参照して本明細書中で先に実質的に記載されたｈＩＤＰＳＣ、組成物または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月９日に出願された米国特許出願第１５／０６５，２５９号（米国特許出願公開第２０１６／０１８４３６号として公開される）に対する優先権を主張し、先の出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
この出願は、幹細胞を生成する方法、幹細胞、および全身投与に適した、いくつかの疾患、特に神経学的疾患の治療に適した幹細胞を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経変性疾患に関与する遺伝子およびそのタンパク質が同定されているとしても、これらの疾患に関与する病因の機構はいまだに不明であり、効率的な治療介入の開発を妨げる。現在公知であることは、遍在的に分布しているが、突然変異形態のハンチントンタンパク質は、例えば、線条体において、および初期の疾患の大脳皮質のより深い層において優先的に生じる、神経変性および中型棘状ニューロンの選択的喪失を引き起こすことである。したがって、細胞療法は、この疾患および他の類似の神経変性疾患の過程において積極的に寄与し得る追加または代替の治療として調査されている。幹細胞は、生命の不可欠なビルディングブロックであり、全ての高等生物の起源および発生に重要な役割を果たす。例えば、突然変異したハンチンチン（ｍＨＴＴ）タンパク質の蓄積によって引き起こされるニューロン細胞死に起因して、このような脳損傷が薬物ベースの治療によって単独で治療される可能性は低い。幹細胞ベースの治療は、患者の損傷した脳領域における神経組織の形態学的設計および機能的能力を再構築するために重要である。これらの治療法は二重の役割を有していた：局所細胞の生存を刺激し、炎症を阻害する、移植された幹細胞のパラクライン作用（抗アポトーシス性、抗炎症性、抗瘢痕性、抗菌性および血管形成作用）、ならびに固有の幹細胞からのおよびおそらくドナー幹細胞からの新しいニューロン生成を支持するように働く、生物活性分子の生成を介した脳組織再生。
【０００４】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、脳および脊髄に見られるＢＤＮＦタンパク質の発現に関与する遺伝子である。このタンパク質は、これらの細胞の増殖、成熟（分化）、および維持において役割を果たすことによって、神経細胞（ニューロン）の生存を促進する。脳において、ＢＤＮＦタンパク質は、細胞間情報交換が起こる神経細胞間の接続（シナプス）において活性である。ＢＤＮＦタンパク質は、学習および記憶に重要であるシナプス可塑性を調節するのを助け、摂食、飲むことおよび体重を制御する脳の領域において発現されることが見出されている。したがって、ＢＤＮＦは、これらの機能を全て調節する上でさらなる作用を有する。アルツハイマー病を含む神経変性疾患において、シナプス機能障害が重要な病態生理学的特徴であることを示唆する証拠が増えている。ＢＤＮＦシグナル伝達の欠損が、ハンチントン病およびうつ病などのいくつかの主要な疾患および障害の病因に寄与する。したがって、ＢＤＮＦ経路を操作することは、様々な神経学的および精神医学的な障害に対する実行可能な治療アプローチを表す。ＢＤＮＦ単独の投与は、神経変性疾患を治療するための実行可能なアプローチを提供する。しかしながら、神経変性疾患発現は遺伝的および個々に多型であるため、各患者に理想的な用量を見出すことは困難である。ＢＤＮＦの過量摂取は、脳内に腫瘍形成を誘導する可能性がある：他方、低ＢＤＮＦ用量は効果的な治療を提供することができなかった。移植後の幹細胞は患者生物学の制御下にあり、各患者に対して、細胞によるＢＤＮＦ分泌を効率的に調節することができる。さらに、アルツハイマー病を治療するための幹細胞移植の利点を調査した研究は、移植された神経幹細胞（ＮＳＣ）が、宿主の脳細胞間の新たな接続の形成を支持することを実証した。これらの研究は、これらの接続の強化が、アルツハイマー病のマウスモデルにおける記憶喪失を逆転させ得ることを実証している。ＢＤＮＦは、ＮＳＣによって自然に分泌される因子であり、幹細胞移植によってもたらされる効果を再現することができると考えられる。
【０００５】
これまで、ＮＳＣにアクセスすることは一般的に困難であり、静脈内（ＩＶ）注射による幹細胞療法に適用するのに十分な治療量で得ることができない。典型的には、２つの戦略が、ＢＤＮＦ分泌を増加させるために使用される。第１に、ＢＤＮＦ分泌を誘導するために、インビトロの培養幹細胞の培地に増殖因子を添加することである。しかしながら、この戦略は、幹細胞がインビトロ条件下でのみこの因子を生成するという事実のため、大きな制限がある。結果として、このような細胞が患者に移植されると、細胞はＢＤＮＦの「ストック」を急速に費やし、神経変性疾患の長期治療を妨げる。別のアプローチは、ＢＤＮＦを過剰発現するように適切に改変された、遺伝子操作された幹細胞を生成することである。治療的に十分なレベルのＢＤＮＦを生成するためには、ＮＳＣでさえも遺伝子工学で作製することが必要であることに留意することは重要である。しかしながら、遺伝子改変は、遺伝子治療−なおも証明される必要があるアプローチに根底がある。したがって、ＢＤＮＦの分泌の上昇を伴う幹細胞へと導くことができる新しい細胞型および細胞培養法が非常に必要とされている。
【０００６】
脳室下帯（subventricular zone）（ＳＶＺ）は、新しいニューロンが生涯にわたって生成され（Ａｌｔｍａｎ  ＪおよびＤａｓ  ＧＤ、１９６５年）、成人期を通して修復の機能を果たす細胞を生成する点において固有の脳領域である。ＳＶＺのすぐ下にある血管は、接線の神経芽細胞の移動方向に平行に走り、ＢＤＮＦシグナル伝達を介して移動性神経芽細胞を誘導する。現在、成人の脳におけるＳＶＺの組織化は、他に研究されたいずれかの脊椎動物のものとは有意に異なるものと理解される。具体的には、成体ヒト脳におけるこの領域は、インビボで増殖し、インビトロでＮＳＣとして機能し得る、星状細胞のユニークな型（tape）を含む。中枢神経系の星状細胞は、多数の重要で多様な機能を果たす。それらは、ニューロン、星状細胞および血管で構成される神経−血管ユニットの形成に関与している。星状細胞プロセスは、血管に及び、血管と相互作用する。星状細胞のエンドフィート（endfeet）は、血管壁の構成要素である基底膜と密接に接触した状態であり、内皮細胞とともに血液脳関門（ＢＢＢ）を形成する。幹細胞の単離は、神経原性ニッチならびに成人ヒト脳の血管周辺に移動およびホーミングする能力を有し、さらにニューロンおよびグリア細胞に分化することができ、新規な神経変性細胞療法の開発の基礎である。
【０００７】
ドーパミン（ＤＡ）は、成人ＳＶＺにおける主要な神経発生因子である（Ｂａｋｅｒら、２００４年）。線条体とのＳＶＺの近接は、それをハンチントン病（ＨＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）などの線条体−神経変性関連疾患の神経変性治療標的とさせる。両方の病理学は、運動機能障害の異なる臨床症状によって特徴付けられ、両方は異なる機構によるＳＶＺ−線条体ＤＡマイクロ回路経路を伴うと考えられている。ＨＤで起こる、疾患を生じさせるＤＡ神経支配は、固有の遺伝的突然変異によって引き起こされる線条体の内部ニューロン変性病理学を補償するための自然な保護フィードバック機構である（Ｐａｒｅｎｔ  Ｍら、２０１３年）。ＤＡ受容体Ｄ２の調節異常は、モデルマウスにおけるハンチントン病の病理学の精度が高い尺度である（Ｃｒｏｏｋら、２０１２年；Ｃｈｅｎら、２０１３年）。対照的に、ＰＤは、黒質線条体領域における神経発生の障害に起因したＤＡニューロンの大規模な変性と関連付けられ、病理学の主要な原因である（Ｈｏｇｌｉｎｇｅｒら、２００４年）。
【０００８】
初期の炎症反応は、生体内で起こり、外来の細菌またはウイルスまたは寄生生物の侵入を制限し、抗炎症機構によって生物からさらに除去される分子敵に対する組織を防御する。しかしながら、慢性炎症（ＣＩ）は両刃の剣である。ＣＩは持続的な事象であり、例えば、炎症が自立するようになる関節リウマチとして、健常な細胞に継続的に害を与え、死滅させる。
【０００９】
神経変性疾患では、タンパク質のいくつかの分子が細胞内で互いに密接に凝集しており、病理学者は「アミロイド」構造と呼び、それらは脳を詰まらせやすい。このようなタンパク質は、アルツハイマー病−アミロイドβおよびタウにおいて；パーキンソン病−αシヌクレインにおいて；ハンチントン病−ハンチンチンにおいて見出される。これらの凝集体は、しばしば脳に大きな不溶性の沈着物を形成する。しかしながら、真に毒性のあるものは、これらのタンパク質の小さい、可溶性の凝集体であると考えられている。脳におけるこれらの凝集体の蓄積に起因して、慢性炎症反応は、中には前述の疾患である多数の加齢に関連した神経変性障害に依然として留まった（Ｎｕｚｚｏら、２０１４年）。
【００１０】
アルツハイマー病（ＡＤ）キャリアの脳における変性組織、損傷したニューロンおよび神経突起の存在、高度に不溶性のアミロイドβペプチド沈着物、ならびに神経原線維のもつれが、炎症に明らかな刺激を与える（Ｚｏｔｏｖａら、２０１０年；ＳｃｈｏｔｔおよびＲｅｖｅｓｚ、２０１３年）。
【００１１】
多数の研究は、ＡＤにおいて観察された慢性炎症が疾患プロセスを加速し、さらには疾患の引き金となる可能性があることを示唆している。頭部外傷および全身性感染の病歴は、典型的には脳の炎症を引き起こし、ＡＤの危険因子であることが公知である因子である。グリア細胞である脳の免疫細胞の過度の作用は、アルツハイマー病の別の特徴である。炎症はニューロンに対する傷害および毒性に関連することが示唆されているが、グリア細胞、ニューロンおよびアミロイド斑の関係は依然として不明なままである。グリア細胞によって放出される炎症性メディエーターは、ニューロンに対して極めて毒性であり得る。したがって、それらは神経変性のメディエーターとみなされてきた。
【００１２】
２つの密接に関連した炎症促進タンパク質であるＩＬ−１２およびＩＬ−２３は、細胞が免疫学的に活性になると、ミクログリアによって排出されるものの１つである。この研究は、これらのタンパク質がＡＤ患者の脳脊髄液中に高レベルで存在することを実証した。脳にすでにプラークが多発している高齢のアルツハイマーマウスにおいて、これらの炎症性タンパク質をブロッキングすることにより、可溶性であり、毒性形態のアミロイドベータのレベルが低下し、マウスの認知機能障害が逆転した（Ｖｏｍ  Ｂｅｒｇら、２０１２年；Ｇｒｉｆｆｉｎ、２０１３年）。
【００１３】
より最近では、タンパク質ＮＬＲＰ３およびミクログリアタンパク質ＭＲＰ１４のブロッキングなどの他の抗炎症アプローチが記載されており、同じアルツハイマー病モデルにおいてもうまく作用するようである。これらのアプローチは、脳の炎症、アミロイドβ沈着、および認知障害を低下させる。ＮＬＲＰ３を欠くように遺伝子工学で作製されたアルツハイマーマウスにおいて、ミクログリアは、非常に多くのアミロイドβを消費し、ニューロンの有益なタンパク質を分泌する非炎症状態に逆戻りした。別の研究では、ミクログリアタンパク質ＭＲＰ１４が標的化され、ミクログリアを非炎症状態に戻すのにも役立った（Ｈｅｎｅｋａら、２０１３年；Ｚｈａｎｇら、２０１２年）。
【００１４】
ＡＤに重要である他の要因は加齢である。加齢は、機能的に欠損するようになり、タンパク質を輸送し、適切に配置する能力を喪失するニューロンとの共通の加齢に関連した問題を悪化させることによって、アルツハイマー病を誘発するのに役立ち得る。炎症は、炎症領域におけるアミロイドβの生成を増加させ、ニューロンにストレスを与え、タンパク質輸送および廃棄システムの加齢に関連した低下を促進することにより、この問題を悪化させる。炎症は、ミクログリアを炎症状態に再活性化し、したがって、脳を良くする能力を低下させる（Ｓｗｉｎｄｅｌｌら、２０１３年）。
【００１５】
現在、炎症は、アミロイドβの生成を増加させることによってＡＤプロセスを開始するのに役立つと推定されている。アミロイドβを除去するミクログリアの能力を低下させるため、炎症は、ＡＤにおいて自立しているようである。したがって、アミロイドβの一定の沈着は、炎症が解消することを可能にせず、加齢したＡＤキャリアにおいて悪化する（Ａｋｉｙａｍａら、２０００年；Ｖｏｍ  Ｂｅｒｇら、２０１２年；Ｚａｎｇら、２０１２年；Ｇｒｉｆｆｉｎ、２０１３年；Ｈｅｎｅｋａら、２０１３年；Ｓｗｉｎｄｅｌｌら、２０１３年；ＳｃｈｏｔｔおよびＲｅｖｅｓｚ、２０１３年）。
【００１６】
ハンチントン病（ＨＤ）における神経変性に対する炎症の寄与が強く示唆されている；しかしながら、次に、それはＡＤにおいてはあまり研究されていない（ＳｏｕｌｅｔおよびＣｉｃｃｈｅｔｔｉ、２０１１年；Ｅｌｌｒｉｃｈｍａｎｎら、２０１３年）。したがって、ＨＤにおける免疫系の活性化は、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αなどの身体の免疫反応に重要である炎症誘発性サイトカインの上昇した発現によって明確に証明された。これらの炎症誘発性サイトカインは、マウスモデルにおける、および症候性ＨＤ患者ならびに発症前のＨＤ患者における、線条体、血漿およびＣＳＦにおいて有意に増加した。さらに、自然免疫細胞の機能亢進は、ＨＤ患者とマウスモデルの両方において、中枢自然免疫系（ミクログリア）および末梢自然免疫系（単球およびマクロファージ）の、突然変異体ｍＨＴＴを発現するミエロイド細胞におけるＩＬ−６生成の上昇によって検出された。また、異常に高レベルのサイトカインが、症状の発症の何年も前にＨＤ遺伝子を有する人々の血中に存在することも報告されている（Ｂｊｏｒｋｑｖｉｓｔら、２００８年；Ｔｒａｇｅｒら、２０１４ａ、ｂ）。患者の血液中で測定することができるサイトカインの組成およびそれらの発現レベルは、治療のための介入を開始する必要性、ならびに治療のタイミングを確立するために有用であり得る。
【００１７】
血液細胞は、細胞内の異常なＨＤタンパク質（ハンチンチン）の存在に起因して、ＨＤ患者ならびに脳におけるミクログリアにおいて機能亢進しており、したがって、異常な免疫活性化がＨＤにおいて最も初期の異常の１つであり得ることを示唆している。患者の血液シグネチャーは、脳内のＨＤの影響、ならびにＨＤの重症度のマーカーについての新しい洞察を提供することができる。異常な免疫活性化は、ＨＤの減速を目的とした将来の治療の標的となり得る（ＳｏｕｌｅｔおよびＣｉｃｃｈｅｔｔｉ、２０１１年、Ｅｌｌｒｉｃｈｍａｎｎら、２０１３年）。
【００１８】
パーキンソン病は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの遅延した、進行性の変性によって特徴付けられる。動物モデルを用いて、研究者らは、ＰＤにおける免疫反応を開始する、炎症に応答した末梢神経系免疫成分と中枢神経系免疫成分の両方の関与について一貫した所見を得た。継続的であり、増加する炎症誘発機構の存在は、細胞保護機構が克服され、ドーパミン作動性ニューロンなどのより感受性の高い細胞が細胞死経路に入り、これがＰＤの進行に不可欠である一連の事象へと導くプロセスをもたらす（Ｄｏｕｒｓｏｕｔら、２０１３年）。グリア反応、Ｔ細胞浸潤、および炎症性サイトカインの発現増加、ならびに活性化されたグリア細胞に由来する他の毒性メディエーターの発現増加によっても示される炎症反応は、ＰＤの周知の特徴である。しかしながら、より最近のインビトロでの研究は、たとえニューロン喪失の主な原因である可能性は低いとしても、損傷したドーパミン作動性ニューロンによって放出されたメディエーターを介したミクログリアおよびその後の星状細胞の活性化が関与することを提案した（Ｈｉｒｓｃｈら、２００３年）。患者において、疫学的研究および遺伝学的研究は、ＰＤの病態生理学における神経炎症の役割を支持する。死後研究は、ＰＤ患者において冒された脳領域における自然免疫ならびに適応免疫の関与を確認する。活性化されたミクログリア細胞およびＴリンパ球は、炎症誘発性メディエーターの発現増加と同時に、患者の黒質において検出されている（Ｔｕｆｅｋｃｉら、２０１２年；Ｈｉｒｓｃｈら、２０１２年）。２００８〜２０１２年の間に８７人のパーキンソン病患者、ならびに３７人の健常対照を登録した別の研究は、日常的な血液検査において、炎症のマーカー、例えば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子−α、エオタキシン、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質−１０、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）およびマクロファージ炎症性タンパク質１−βを測定した。全ての参加者は、さらに身体検査を受けた。この研究は、年齢、性別および疾患の持続時間などの因子を調節した後でさえ、神経炎症の程度が、重度のうつ病、疲労、および認知障害と有意に関連付けられることを実証した（Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔら、２０１３年）。神経炎症プロセスは神経保護の標的を表し、抗炎症戦略はＰＤの治療における主要なアプローチの１つであり得る。
【００１９】
臨床的運動機能障害を含む神経変性に関連したＣＮＳ疾患を修復するための複数のアプローチが試験されている（Ｗｅｒｎｉｇ  Ｍら、２０１１年）。神経再生細胞療法に使用される幹細胞供給源には、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経前駆細胞（ＮＰ）、ヒト胎児神経幹細胞（ｈｕＮＳＣ）、および多能性幹細胞（胚性（ＥＳＣ）と誘導（ｉＰＳＣ）の両方）が含まれる。神経学的状態のための細胞療法に関する研究の大部分は、主要な細胞操作および／または高度に侵襲的な送達方法を通じてニューロン様細胞を使用した。例えば、国際公開第２００８／１３２７２２号および米国特許出願公開第２０１３／０３４４０４１号は、幹細胞形質を誘導するために、または神経栄養因子を放出するために遺伝子操作された幹細胞を開示している；国際公開第２００９／１４４７１８号および米国特許出願公開第２０１４／０３３５０５９号および同第２０１４／０１５４２２２号は、培養中の生物学的、天然または化学的な化合物への曝露を介して、非誘導段階より高いレベルで神経栄養因子の放出を誘導することを開示している；他の研究は、ニューロン分化の初期マーカーを発現する胎児幹細胞の不死化された細胞株を用いる。幹細胞療法に関する研究にもかかわらず、静脈内（ＩＶ）注射による幹細胞療法は、神経変性疾患に罹患した脳コンパートメントにおけるＢＤＮＦ分泌またはＤ２発現を介した直接的な神経発生をもたらし得ることをデータは示していない。
【発明の概要】
【００２０】
一部の態様では、本発明は、未成熟歯髄幹細胞（immature dental pulp stem cell）（ＩＤＰＳＣ）に言及する。
一実施形態では、本発明は、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現し、ＣＤ１４６の発現を欠くヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）に言及し、これは、ａ）ヒト乳歯から歯髄（ＤＰ）を得ること；ｂ）抗生物質を含有する溶液でＤＰを洗浄し、培地を含む容器にＤＰを入れること；ｃ）ｈＩＤＰＳＣの増殖（outgrowth）および接着が観察された後に、培地を含む別の容器にＤＰを機械的に移して、外植片培養物を確立すること；ｄ）ステップｂ）およびｃ）を反復して、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現し、ＣＤ１４６の発現を欠くｈＩＤＰＳＣを収集することを含む方法によって得られる。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現し、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠くヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）を対象とし、これは、ａ）ヒト乳歯から歯髄（ＤＰ）を得ること；ｂ）抗生物質を含有する溶液でＤＰを洗浄し、培地を含む容器にＤＰを入れること；ｃ）ｈＩＤＰＳＣの増殖および接着が観察された後に、培地を含む別の容器にＤＰを機械的に移して、外植片培養物を確立すること；ｄ）ステップｂ）およびｃ）を反復して、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現し、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠くｈＩＤＰＳＣを収集することを含む方法によって得られる。
【００２２】
一部の態様では、ｈＩＤＰＳＣは、ｅ）ｈＩＤＰＳＣの試料を免疫染色して、ＣＤ４４、ＣＤ１３、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、および／またはＨＬＡ−ＡＢＣを検出することにより、ｈＩＤＰＳＣにおけるＣＤ４４およびＣＤ１３の発現、ならびにＣＤ１４６の発現の欠如を確認することをさらに含む方法によって得られる。
【００２３】
他の態様では、免疫染色は、フローサイトメトリーによる試料の分析を伴う。
特定の実施形態では、ステップｂ）およびｃ）を５回を超えて反復し、ＤＰの５回の移動後に生成された外植片培養物からｈＩＤＰＳＣを収集する。他の実施形態では、ステップｂ）およびｃ）を１０回を超えて反復し、ＤＰの１０回の移動後に生成された外植片培養物からｈＩＤＰＳＣを収集する。
【００２４】
一態様では、外植片培養物は、ｈＩＤＰＳＣの半コンフルエントなコロニーを含む。別の態様では、ステップｃ）からのｈＩＤＰＳＣの外植片培養物は、収集前に継代される。さらに別の態様では、ｈＩＤＰＳＣの外植片培養物の継代は、ｈＩＤＰＳＣの酵素処理、および外植片培養物を拡大増殖するためのｈＩＤＰＳＣの移動を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、本発明のｈＩＤＰＳＣは、以下を含む方法によって得られる：歯から歯髄（ＤＰ）を抽出すること；第１の容器中の基礎培地でＤＰを培養し、ＤＰ外植片培養物を確立すること、ここでＤＰ外植片培養物は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリリジン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエナクチンからなる群から選択される少なくとも１つの細胞外マトリックス成分を伴わずにまたは伴って培養される；第２の容器にＤＰを機械的に移動して、第２のＤＰ外植片培養物を確立すること；少なくとも１５個のＤＰ外植片培養物が確立されるまで、ＤＰを機械的に移動するステップを反復すること；ＤＰ外植片培養物を継代して、継代されたＤＰ培養物を生成すること；ならびに初期採取集団および後期採取集団の継代されたＤＰ培養物を合わせて、医薬組成物を生成すること、ここで初期採取集団は、最初の１５回のＤＰ外植片培養物の少なくとも１つから確立された、継代されたＤＰ培養物を含み、後期採取集団は、１５回目のＤＰ外植片培養後のＤＰ外植片培養物の少なくとも１つから確立された、継代されたＤＰ培養物を含む。一部の実施形態では、培養ステップは、低酸素条件下で起こる。一部の実施形態では、初期採取集団および後期採取集団の継代ＤＰ培養物を合わせて医薬組成物を生成するステップは、以下を含む：初期採取集団および後期採取集団の継代ＤＰ培養物の凍結ストックを同時に解凍すること；ならびに解凍した継代ＤＰ培養物をプールして、医薬組成物を生成すること。
【００２６】
一部の実施形態では、生産方法における基礎培地でＤＰを培養することは、ＤＰを機械的に移動させる前に、少なくとも３日間持続する。一部の実施形態では、生産方法は、継代されたＤＰ培養物の凍結ストックを作製することをさらに含む。一部の態様では、継代されたＤＰ培養物の凍結ストックは、ＤＰ外植片培養物の第３継代で作製される。
【００２７】
一部の実施形態では、本発明は、以下を含む方法によって得られるｈＩＤＰＳＣを対象とする：歯から歯髄（ＤＰ）を抽出すること；神経堤起源の組織由来の濃縮された後期採取物を含む幹細胞がＣＤ４４およびＣＤ１３に対して二重陽性である、ＤＰ外植片培養物を確立するために、第１の容器中の基礎培地でＤＰを培養すること。一部の態様では、神経堤起源の組織由来の濃縮された、ＣＤ４４およびＣＤ１３に対して二重陽性である幹細胞は、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）である。
【００２８】
一部の実施形態では、本発明は、以下を含む方法によって得られるｈＩＤＰＳＣを対象とする：歯から歯髄（ＤＰ）を抽出すること；第１の容器中の基礎培地でＤＰを培養して、ＤＰ外植片培養物を確立すること、ここで神経堤起源の組織由来の濃縮された後期採取物を含む幹細胞は、初期採取物から得られた幹細胞と比較した場合、内因性ＢＤＮＦおよび／または他の神経栄養因子（ＮＦ３、ＮＦ４およびＮＦ５）の分泌レベルの増加を示している。一部の態様では、神経堤起源の組織由来の濃縮された、高レベルの内因性ＢＤＮＦおよび／または他の神経栄養因子（ＮＦ３、ＮＦ４およびＮＦ５）を分泌する幹細胞は、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）である。
【００２９】
さらに他の実施形態では、本発明のｈＩＤＰＳＣは、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現し、ＣＤ１４６の発現を欠き、それによりｈＩＤＰＳＣがＢＢＢを通過でき、かつ／またはＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、および／もしくはＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠き、それにより免疫細胞によるｈＩＤＰＳＣの拒絶反応が予防されるｈＩＤＰＳＣを生成する方法によって得られる。
【００３０】
一実施形態では、本発明のｈＩＤＰＳＣは、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、ｐ５３、および不活性なｎａｎｏｇからなる群から選択される少なくとも１つの安全性マーカーを発現する幹細胞を生成する方法によって得られる。不活性なｎａｎｏｇは、主に幹細胞の細胞質に局在する発現されたｎａｎｏｇである。一部の態様では、少なくとも７５％の幹細胞はＡＢＣＧ２を発現し、少なくとも７５％の幹細胞はｐ５３を発現するか、または５％以下の幹細胞は不活性なｎａｎｏｇを発現する。一部の幹細胞は、安全性マーカーＳＯＸ２をさらに発現する。一部のこのような実施形態では、３０％以下の幹細胞はＳＯＸ２を発現する。
【００３１】
本発明のｈＩＤＰＳＣは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（neutrotrophin）−３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン（neutrotrophin）−４（ＮＴ４）、ニューロトロフィン（neutrotrophin）−５（ＮＴ５）、およびｐ７５からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーをさらに分泌し得る幹細胞を生成する方法によってさらに得られる。一部のこのような実施形態では、医薬組成物の幹細胞は、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５（ＣＤ２７１）を発現する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明のｈＩＤＰＳＣは、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５からなる群から選択される少なくとも１つの神経上皮幹細胞マーカーを発現する幹細胞を生成する方法によって得られる。一部の態様では、本発明の方法によって生成される幹細胞は、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５を発現する。これらの細胞は、ＡＢＣＧ２、不活性なｎａｎｏｇ、ｐ５３、およびＳＯＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの安全性マーカーをさらに発現し得る。一部の態様では、少なくとも１つのマーカーがＡＢＣＧ２である場合、少なくとも７５％の幹細胞は少なくとも１つのマーカーを発現する。一部の態様では、少なくとも７５％の幹細胞はｐ５３を発現する。一部の態様では、５％以下の幹細胞は不活性なｎａｎｏｇを発現する。一部の態様では、３０％以下の幹細胞はＳＯＸ２を発現する。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、幹細胞が、神経堤起源の組織由来の濃縮された後期採取物を含む幹細胞を対象とする。一部の実施では、神経堤起源の組織は歯髄である。一部の態様では、神経堤起源の組織由来の濃縮された幹細胞は、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）である。神経堤起源の組織由来の濃縮された初期採取幹細胞は、最初の１５回または２５回の採取サイクルのＩＤＰＳＣを含む一方で、後期採取幹細胞は、６０回以降または２６回目以降の採取サイクルのＩＤＰＳＣを含む。
【００３４】
さらに他の実施形態では、本発明は、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現し、ＣＤ１４６の発現を欠き、それによりｈＩＤＰＳＣがＢＢＢを通過でき、かつ／またはＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、および／もしくはＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠き、それにより免疫細胞によるｈＩＤＰＳＣの拒絶反応が予防されるｈＩＤＰＳＣを含む。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、ｐ５３、および不活性なｎａｎｏｇからなる群から選択される、少なくとも１つの安全性マーカーを発現する幹細胞に言及する。不活性なｎａｎｏｇは、主に幹細胞の細胞質に局在する発現されたｎａｎｏｇである。一部の態様では、少なくとも７５％の幹細胞はＡＢＣＧ２を発現し、少なくとも７５％の幹細胞はｐ５３を発現するか、または５％以下の幹細胞は不活性なｎａｎｏｇを発現する。一部の幹細胞は、安全性マーカーＳＯＸ２をさらに発現する。このような一部の実施形態では、３０％以下の幹細胞はＳＯＸ２を発現する。
【００３６】
本発明の幹細胞は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（neutrotrophin）−３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン（neutrotrophin）−４（ＮＴ４）、ニューロトロフィン（neutrotrophin）−５（ＮＴ５）、およびｐ７５からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーをさらに分泌し得る。一部のこのような実施形態では、医薬組成物の幹細胞は、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５（ＣＤ２７１）を発現する。
【００３７】
別の実施形態では、本発明の幹細胞は、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５からなる群から選択される少なくとも１つの神経上皮幹細胞マーカーを発現する。一部の態様では、本発明の幹細胞は、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５を発現する。これらの細胞は、ＡＢＣＧ２、不活性なｎａｎｏｇ、ｐ５３、およびＳＯＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの安全性マーカーをさらに発現し得る。一部の態様では、少なくとも７５％の幹細胞は、少なくとも１つのマーカーがＡＢＣＧ２である場合、少なくとも１つのマーカーを発現する。一部の態様では、少なくとも７５％の幹細胞はｐ５３を発現する。一部の態様では、５％以下の幹細胞が不活性なｎａｎｏｇを発現する。一部の態様では、３０％以下の幹細胞はＳＯＸ２を発現する。
【００３８】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されている方法に従って生成されるｈＩＤＰＳＣを含む組成物を対象とする。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されているｈＩＤＰＳＣを含む組成物を対象とする。
【００３９】
他の実施形態では、本発明は、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、虚血、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病（ＨＤ）、自閉症、統合失調症、運動障害、およびけいれん性障害からなる群から選択される神経学的疾患または状態の治療に使用するための医薬組成物に関する。
【００４０】
本発明はさらに、神経学的状態を治療するために、対象に全身投与するための医薬組成物に関する。神経学的疾患または状態は、神経変性疾患もしくは状態、自閉症、統合失調症、てんかん、脳卒中、虚血、運動障害、またはけいれん性障害であり得る。神経変性疾患または状態は、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病、またはハンチントン病（ＨＤ）であり得る。
【００４１】
本発明はまた、神経学的疾患または状態を治療するために、本発明のｈＩＤＰＳＣおよび／または医薬組成物を使用する方法に関する。
本発明はまた、本発明のｈＩＤＰＳＣおよび／または医薬組成物を対象に投与することを含む、神経学的疾患または状態を治療する方法に関する。
【００４２】
一部の実施形態では、本発明のｈＩＤＰＳＣおよび／または医薬組成物の投与は全身性であり、それを必要とする対象に投与される。
本発明の一部の実施形態では、このような方法は、初期ＨＤと診断された対象における自然の神経保護機構、またはＰＤと診断された対象における喪失したＤＡニューロンの修復を支持する。この方法はまた、ＨＤの危険性がある対象のための予防的治療として使用され得る。
【００４３】
本方法の一実施形態では、神経学的疾患または状態は、血液／脳関門（ＢＢＢ）を通過し、神経発生を誘導する、本発明の幹細胞および／または医薬組成物によって治療される。一部の態様では、ｈＩＤＰＳＣは、ＢＢＢの通過後に、線条体を含む脳実質に直接移植される。一部の実施形態では、誘導された神経発生はドーパミン関連性である。例えば、ドーパミン関連性の神経発生は、幹細胞の自己分化または外因性幹細胞による内因性幹細胞の移動および分化の活性化を介して起こる。一部の態様では、大量のドーパミン関連性の神経発生は、脳室下帯（ＳＶＺ）において起こる。
【００４４】
本方法の一部の実施形態では、ｈＩＤＰＳＣおよび／または医薬組成物は、神経保護を提供する。例えば、高い基礎レベルの、神経栄養因子および免疫保護因子の発現、ならびに医薬組成物の幹細胞の放出パターンを有する全身神経保護が提供される。一部の態様では、医薬組成物のこれらの幹細胞はＩＤＰＳＣである。
【００４５】
一部の実施では、本方法は、対象におけるＤＡ受容体の量を測定することをさらに含む。一部の態様では、ＤＡ受容体は受容体Ｄ２である。一部の実施形態では、対象におけるＤＡ受容体、例えば、受容体Ｄ２の量を測定することは、対象を画像化して、ＤＡ受容体の存在を検出することを含む。
【００４６】
一部の態様では、対象は、医薬組成物の単回投与または第１および第２の投与を投与される。ｈＩＤＰＳＣおよび／または医薬組成物の反復投与（１〜６回）は、第１の投与の少なくとも７日後、少なくとも１４日後、少なくとも２１日後、または少なくとも３０日後に行われ、ならびに年に１回、または年に２回行われる。一部の実施では、ｈＩＤＰＳＣおよび／または医薬組成物の投与は、静脈内注射による。一部の実施では、医薬組成物の投与は、毎年反復され、例えば、３回反復され得る。
【００４７】
本方法の一部の実施では、ｈＩＤＰＳＣおよび／または幹細胞を含む医薬組成物は、対象に対して自家である幹細胞を含む。例えば、対象に対して自家である幹細胞は、これらの疾患の大部分が遺伝的および年齢依存性であるとすると、条件付きで（contingently）「健康な細胞」から疾患発現前に対象から収集される。他の実施形態では、幹細胞によって発現される主要組織適合性複合体が対象によって発現される主要組織適合性複合体と合致するかどうかにかかわらず、対象に対して同種異系である、ｈＩＤＰＳＣおよび／またはｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物。医薬組成物はまた、対象に対して自家である幹細胞と対象に対して同種異系である幹細胞の組み合わせを含み得る。
【００４８】
一態様では、本発明は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）におけるニューロン喪失を予防する方法であって、ｈＩＤＰＳＣおよび／またはｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ｈＩＤＰＳＣはＣＤ４４およびＣＤ１３を発現する、前記方法を対象とする。
【００４９】
別の態様では、本発明は、対象のＣＮＳにおけるニューロン細胞の増殖および修復を促進する方法であって、ｈＩＤＰＳＣおよび／またはｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ｈＩＤＰＳＣはＣＤ４４およびＣＤ１３を発現する、前記方法を提供する。
【００５０】
さらに別の態様では、本発明は、対象のＣＮＳにおけるドーパミンおよびｃＡＭＰ調節性のニューロンリン酸化タンパク質（ＤＡＲＰＰ−３２）、ドーパミン受容体Ｄ２、ならびに／または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現を増加させる方法であって、および／またはｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ｈＩＤＰＳＣはＣＤ４４およびＣＤ１３を発現する、前記方法を対象とする。
【００５１】
特定の態様では、ｈＩＤＰＳＣおよび／または医薬組成物の投与は全身性である。一態様では、全身投与は、静脈内または腹腔内である。
他の態様では、本発明は、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病（ＨＤ）、自閉症、統合失調症、脳卒中、虚血、運動障害、およびけいれん性障害からなる群から選択される神経学的疾患または状態の治療において使用するための、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現するｈＩＤＰＳＣおよび／またはｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物に関する。
【００５２】
さらに他の態様では、本発明は、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病（ＨＤ）、自閉症、統合失調症、脳卒中、虚血、運動障害、およびけいれん性障害からなる群から選択される神経学的疾患または状態を治療するための、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現するｈＩＤＰＳＣおよび／またはｈＩＤＰＳＣを含む医薬組成物の使用を対象とする。
【００５３】
本発明はまた、神経学的疾患または状態を治療する医薬を調製するための、本発明のｈＩＤＰＳＣおよび／または医薬組成物を使用する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、初期および後期採取物からのｈＩＤＰＳＣの免疫表現型決定を示す。採取物０〜１０は、初期採取物として定義された。１０を超える採取物を有する全ての採取物は、後期採取物として定義された。
【図２−１】図２は、後期採取物（１３個の採取物）および継代３でのＩＤＰＳＣを示す。細胞は、Ｐ７５（ＣＤ２７１）（Ａ、Ｃ、Ｄ）、ネスチン（Ｅ〜Ｇ）、ＣＤ１３（Ｈ）およびＣＤ７３（Ｉ）に対して免疫陽性であり、ＣＤ１４６（Ｊ）およびＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｋ）と反応しなかった。差し込み図は、それぞれの二次抗体の対照を示す。Ａ〜Ｇ  光顕微鏡検査。Ｈ〜Ｌ  落射蛍光。倍率：Ａ、Ｊ−２０倍；Ｃ、Ｅ〜Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ−１０倍；Ｄ、Ｋ−４０倍。
【図２−２】図２は、後期採取物（１３個の採取物）および継代３でのＩＤＰＳＣを示す。細胞は、Ｐ７５（ＣＤ２７１）（Ａ、Ｃ、Ｄ）、ネスチン（Ｅ〜Ｇ）、ＣＤ１３（Ｈ）およびＣＤ７３（Ｉ）に対して免疫陽性であり、ＣＤ１４６（Ｊ）およびＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｋ）と反応しなかった。差し込み図は、それぞれの二次抗体の対照を示す。Ａ〜Ｇ  光顕微鏡検査。Ｈ〜Ｌ  落射蛍光。倍率：Ａ、Ｊ−２０倍；Ｃ、Ｅ〜Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ−１０倍；Ｄ、Ｋ−４０倍。
【図３−１】図３は、ａ）において、ＣＦＵ−Ｆアッセイは、Ｔ２０、継代３で三連で実施され、ＩＤＰＳＣのＬＰ集団の高いクローン原性能を実証することを示す。ｂ）およびｃ）において、ＦＡＣＳは、ＬＰ（後期集団）ＩＤＰＳＣ（バッチ＃１１）がＢＤＮＦおよびＤＡＲＰＰ３２を発現する約８０％の細胞を含む一方で、ＥＰ初期集団ＩＤＰＳＣがこれらのマーカーに対して陰性であり（データを示さず）、Ｄ２を発現する非常に少数の細胞を含むことを示すために実施された。
【図３−２】図３は、ａ）において、ＣＦＵ−Ｆアッセイは、Ｔ２０、継代３で三連で実施され、ＩＤＰＳＣのＬＰ集団の高いクローン原性能を実証することを示す。ｂ）およびｃ）において、ＦＡＣＳは、ＬＰ（後期集団）ＩＤＰＳＣ（バッチ＃１１）がＢＤＮＦおよびＤＡＲＰＰ３２を発現する約８０％の細胞を含む一方で、ＥＰ初期集団ＩＤＰＳＣがこれらのマーカーに対して陰性であり（データを示さず）、Ｄ２を発現する非常に少数の細胞を含むことを示すために実施された。
【図３−３】図３は、ａ）において、ＣＦＵ−Ｆアッセイは、Ｔ２０、継代３で三連で実施され、ＩＤＰＳＣのＬＰ集団の高いクローン原性能を実証することを示す。ｂ）およびｃ）において、ＦＡＣＳは、ＬＰ（後期集団）ＩＤＰＳＣ（バッチ＃１１）がＢＤＮＦおよびＤＡＲＰＰ３２を発現する約８０％の細胞を含む一方で、ＥＰ初期集団ＩＤＰＳＣがこれらのマーカーに対して陰性であり（データを示さず）、Ｄ２を発現する非常に少数の細胞を含むことを示すために実施された。
【図４−１】図４Ａは、二次抗体を用いた対照細胞におけるＢｒｄＵ（Ｂ〜Ｊ）に対する陽性免疫染色を示す。図４Ｂおよび４Ｃは、ＢｒｄＵ抗体と正に反応するＬＰ（後期集団）ＩＤＰＳＣの定量化を示す。（Ａ）−落射蛍光、（Ｂ）および（Ｃ）−ＦＡＣＳ分析。倍率（Ａ）−２００倍。（Ｂ、ＥおよびＨ）−４００倍。（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｄ、ＧおよびＪ）−１０００倍。
【図４−２】図４Ａは、二次抗体を用いた対照細胞におけるＢｒｄＵ（Ｂ〜Ｊ）に対する陽性免疫染色を示す。図４Ｂおよび４Ｃは、ＢｒｄＵ抗体と正に反応するＬＰ（後期集団）ＩＤＰＳＣの定量化を示す。（Ａ）−落射蛍光、（Ｂ）および（Ｃ）−ＦＡＣＳ分析。倍率（Ａ）−２００倍。（Ｂ、ＥおよびＨ）−４００倍。（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｄ、ＧおよびＪ）−１０００倍。
【図４−３】図４Ａは、二次抗体を用いた対照細胞におけるＢｒｄＵ（Ｂ〜Ｊ）に対する陽性免疫染色を示す。図４Ｂおよび４Ｃは、ＢｒｄＵ抗体と正に反応するＬＰ（後期集団）ＩＤＰＳＣの定量化を示す。（Ａ）−落射蛍光、（Ｂ）および（Ｃ）−ＦＡＣＳ分析。倍率（Ａ）−２００倍。（Ｂ、ＥおよびＨ）−４００倍。（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｄ、ＧおよびＪ）−１０００倍。
【図５】図５は、リプログラミング前（黒色）およびリプログラミング後（白色）のｈＩＤＰＳＣ、ならびにヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）（縞状）において観察された内在性Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２遺伝子の発現についての定量ＰＣＲを示す。
【図６−１】図６は、フローサイトメトリーによるＥＰ（初期集団）およびＬＰ（後期集団）ＩＤＰＳＣにおけるＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）およびβ−ＩＩＩ−チューブリン発現の定量化を示す。
【図６−２】図６は、フローサイトメトリーによるＥＰ（初期集団）およびＬＰ（後期集団）ＩＤＰＳＣにおけるＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）およびβ−ＩＩＩ−チューブリン発現の定量化を示す。
【図７】図７は、ＥＰ（初期集団）およびＬＰ（後期集団）ｈＩＤＰＳＣのフローサイトメトリー分析を示す。ＣＤ１４６およびＣＤ１３発現の変化は、インビトロでのＤＰ採取およびｈＩＤＰＳＣ継代後に観察された。ＥＰ−ｈＩＤＰＳＣについて、約３３％のＣＤ１４６陽性細胞が観察される一方で、ＬＰ−ｈＩＤＰＳＣについて、１％未満の細胞がこのマーカーに対して陽性であった。ＥＰ−ｈＩＤＰＳＣについて、約５２％のＣＤ１３陽性細胞が観察される一方で、ＬＰ−ｈＩＤＰＳＣについて、９５％の細胞がこのマーカーに対して陽性であった。
【図８−１】図８は、Ｃ５７ＢＬ−６マウスの歯髄から単離されたＩＤＰＳＣの免疫染色を示す。ＩＤＰＳＣは、Ｏｃｔ４（Ａ〜Ｂ）に対して陽性であり、発現は主に核に位置する。発現は（Ｃ）に限定されるが、細胞はまたＮａｎｏｇに対して陽性である。Ｎａｎｏｇ＋細胞（Ｄ）において対称分裂が観察された。２つのＳｏｘ２＋ＩＤＰＳＣおよび１つのＳｏｘ２−細胞は、対称および非対称分裂（Ｅ）から生じた。Ｓｏｘ２＋細胞の対称分裂では、核タンパク質の局在化は観察され得る（Ｆ）。細胞Ｓｏｘ２＋の非対称分裂では、より多くの傾倒した娘細胞はＳｏｘ２発現を喪失する（Ｇ）。Ａ〜Ｃ：２００倍。Ｄ〜Ｇ：４００倍。
【図８−２】図８は、Ｃ５７ＢＬ−６マウスの歯髄から単離されたＩＤＰＳＣの免疫染色を示す。ＩＤＰＳＣは、Ｏｃｔ４（Ａ〜Ｂ）に対して陽性であり、発現は主に核に位置する。発現は（Ｃ）に限定されるが、細胞はまたＮａｎｏｇに対して陽性である。Ｎａｎｏｇ＋細胞（Ｄ）において対称分裂が観察された。２つのＳｏｘ２＋ＩＤＰＳＣおよび１つのＳｏｘ２−細胞は、対称および非対称分裂（Ｅ）から生じた。Ｓｏｘ２＋細胞の対称分裂では、核タンパク質の局在化は観察され得る（Ｆ）。細胞Ｓｏｘ２＋の非対称分裂では、より多くの傾倒した娘細胞はＳｏｘ２発現を喪失する（Ｇ）。Ａ〜Ｃ：２００倍。Ｄ〜Ｇ：４００倍。
【図９】図９は、視葉における対称性神経幹細胞分裂から非対称性神経幹細胞分裂へのスイッチを示す。
【図１０−１】図１０は、異なる培地中で７日間、プラスチック基質上で増殖させたＩＤＰＳＣにおける未分化ＬＳＣおよび分化した角膜細胞タンパク質（角膜縁部神経外胚葉系統の例として）の発現を示す。ＥｐｉＬｉｆｅ、ＤＭＥＭ／ＫＯ、ＫＳＦＭ、およびＳＨＥＭ培地で培養されたＩＤＰＳＣは、ＡＢＣＧ２（Ａ１〜Ａ４）の発現を欠いた。しかしながら、ＡＢＣＧ２の発現は、基礎培地（Ａ５）としても公知であるＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養されたＩＤＰＳＣにおいて検出された。これらの細胞は、線維芽細胞様形態を発生させた。ＥｐｉＬｉｆｅ、ＫＳＦＭ、およびＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養されたＩＤＰＳＣは、ＣＫ３／１２（Ｂ１、Ｂ３、Ｂ５）の発現を欠いた。しかしながら、ＤＭＥＭ／ＫＯで培養されたＩＤＰＳＣおよびＳＨＥＭはＣＫ３／１２を発現し、上皮細胞様形態（Ｂ２、Ｂ４）を有した。落射蛍光（ＥＦ）。核はＤＡＰＩ（青色）で染色された。スケールバー：Ａ１〜Ａ４、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ４については１０μｍ、Ａ５、Ｂ３、およびＢ５については５μｍ。
【図１０−２】図１０は、異なる培地中で７日間、プラスチック基質上で増殖させたＩＤＰＳＣにおける未分化ＬＳＣおよび分化した角膜細胞タンパク質（角膜縁部神経外胚葉系統の例として）の発現を示す。ＥｐｉＬｉｆｅ、ＤＭＥＭ／ＫＯ、ＫＳＦＭ、およびＳＨＥＭ培地で培養されたＩＤＰＳＣは、ＡＢＣＧ２（Ａ１〜Ａ４）の発現を欠いた。しかしながら、ＡＢＣＧ２の発現は、基礎培地（Ａ５）としても公知であるＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養されたＩＤＰＳＣにおいて検出された。これらの細胞は、線維芽細胞様形態を発生させた。ＥｐｉＬｉｆｅ、ＫＳＦＭ、およびＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養されたＩＤＰＳＣは、ＣＫ３／１２（Ｂ１、Ｂ３、Ｂ５）の発現を欠いた。しかしながら、ＤＭＥＭ／ＫＯで培養されたＩＤＰＳＣおよびＳＨＥＭはＣＫ３／１２を発現し、上皮細胞様形態（Ｂ２、Ｂ４）を有した。落射蛍光（ＥＦ）。核はＤＡＰＩ（青色）で染色された。スケールバー：Ａ１〜Ａ４、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ４については１０μｍ、Ａ５、Ｂ３、およびＢ５については５μｍ。
【図１１−１】図１１は、羊膜（ＡＭ）上の異なる培地で７日間増殖させたＩＤＰＳＣにおける未分化ＬＳＣおよび分化した角膜細胞マーカーの発現を示す。ビメンチンは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳＨＥＭ、ＫＳＦＭおよびＤＭＥＭ／ＫＯ培地で増殖させたＩＤＰＳＣにおいて検出された（ＡおよびＡ１〜Ａ３）。ＡＢＣＧ２は、基礎培地およびＳＨＥＭ（ＢおよびＢ１）で増殖させたＩＤＰＳＣにおいて検出されたが、ＫＳＦＭおよびＤＭＥＭ／ＫＯ（Ｂ２およびＢ３）で増殖させたＩＤＰＳＣにおいて検出されなかった。ＣＫ３／１２発現は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳＨＥＭおよびＫＳＦＭで培養したＩＤＰＳＣにおいて検出されなかった（Ｃ、Ｃ１、およびＣ２）。ＣＫ３／１２を発現するＩＤＰＳＣの一部は、ＤＭＥＭ／ＫＯ（Ｃ３）で増殖させたＩＤＰＳＣにおいて検出された。ＣＫ３／１２を発現するこれらのＩＤＰＳＣは、線維芽細胞様形態を有する。核はＤＡＰＩ（青色）で染色された。ＥＦ。スケールバー：Ａ１〜Ａ４、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ４＝１０μｍ；Ａ５、Ｂ３、Ｂ５＝５μｍ。
【図１１−２】図１１は、羊膜（ＡＭ）上の異なる培地で７日間増殖させたＩＤＰＳＣにおける未分化ＬＳＣおよび分化した角膜細胞マーカーの発現を示す。ビメンチンは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳＨＥＭ、ＫＳＦＭおよびＤＭＥＭ／ＫＯ培地で増殖させたＩＤＰＳＣにおいて検出された（ＡおよびＡ１〜Ａ３）。ＡＢＣＧ２は、基礎培地およびＳＨＥＭ（ＢおよびＢ１）で増殖させたＩＤＰＳＣにおいて検出されたが、ＫＳＦＭおよびＤＭＥＭ／ＫＯ（Ｂ２およびＢ３）で増殖させたＩＤＰＳＣにおいて検出されなかった。ＣＫ３／１２発現は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳＨＥＭおよびＫＳＦＭで培養したＩＤＰＳＣにおいて検出されなかった（Ｃ、Ｃ１、およびＣ２）。ＣＫ３／１２を発現するＩＤＰＳＣの一部は、ＤＭＥＭ／ＫＯ（Ｃ３）で増殖させたＩＤＰＳＣにおいて検出された。ＣＫ３／１２を発現するこれらのＩＤＰＳＣは、線維芽細胞様形態を有する。核はＤＡＰＩ（青色）で染色された。ＥＦ。スケールバー：Ａ１〜Ａ４、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ４＝１０μｍ；Ａ５、Ｂ３、Ｂ５＝５μｍ。
【図１２−１】治験製品ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）の薬理学的有効性研究を示す。
【図１２−２】治験製品ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）の薬理学的有効性研究を示す。
【図１２−３】治験製品ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）の薬理学的有効性研究を示す。
【図１２−４】治験製品ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）の薬理学的有効性研究を示す。
【図１３】図１３は、神経学的疾患および状態の治療に適した初期集団と後期集団のＩＤＰＳＣを含むＩＤＰＳＣの組成物の製造プロセスのスキームを示す。
【図１４】図１４は、ヒト疾患の動物モデルにおける局所適用前の解凍および輸送後の、長期凍結保存中のｈＩＤＰＳＣの安定性試験のタイムラインを示す。
【図１５】図１５は、ＨＤ疾患モデルにおけるパイロット研究のタイムラインを示す。ＨＤは、３−ＮＰを投与することにより、０日目（Ｄ０）から４日目（Ｄ４）の最初の４日間に誘導された。５日目（Ｄ５）に、ＩＤＰＳＣ移植を静脈内注射により投与した。動物を９日目（Ｄ９）に安楽死させ、続いて、ＩＤＰＳＣの生体内分布および生着（Ｖｙｂｒａｎｔ＋特異抗体を用いた免疫組織化学）の検出のために、脳組織を固定し、病変の組織学的分析を行った。
【図１６】図１６は、ＨＤ疾患モデルにおける群Ｉ研究のタイムラインを示す。ＨＤは、０日目（Ｄ０）から４日目（Ｄ４）の最初の４日間に誘導された。５日目（Ｄ５）に、ＩＤＰＳＣ移植を静脈内注射により投与した。動物を３５日目（Ｄ３５）に安楽死させ、続いて、ＩＤＰＳＣの生体内分布および生着（Ｖｙｂｒａｎｔ＋特異抗体を用いた免疫組織化学）の検出のために、脳組織を固定し、病変の組織学的分析を行った。
【図１７】図１７は、３−ＮＰによって誘導された神経変性プロセスの評価に使用される「グローバルバイオマーカー」（すなわち、国際的に受け入れられている）、ならびにこのプロセスにおけるＩＤＰＳＣｗ移植の効果を列挙する。
【図１８−１】図１８は、神経変性の評価に使用されるマーカーの局在化を示す。赤い円は、ＨＤ病変の通常の位置を指し、瘢痕組織を形成し、コラーゲンＩの陽性発現を記した。健康領域では、ＧＡＢＡ作動性および受容体Ｄ２タンパク質の発現を観察することができる。ＩＶ投与後のｈＩＤＰＳＣの生着は、免疫組織化学を用いたヒト核の検出によって、ならびに免疫蛍光法を用いたＣＤ７３およびｈＩＤＰＳＣの共局在化によって示される。
【図１８−２】図１８は、神経変性の評価に使用されるマーカーの局在化を示す。赤い円は、ＨＤ病変の通常の位置を指し、瘢痕組織を形成し、コラーゲンＩの陽性発現を記した。健康領域では、ＧＡＢＡ作動性および受容体Ｄ２タンパク質の発現を観察することができる。ＩＶ投与後のｈＩＤＰＳＣの生着は、免疫組織化学を用いたヒト核の検出によって、ならびに免疫蛍光法を用いたＣＤ７３およびｈＩＤＰＳＣの共局在化によって示される。
【図１９−１】図１９は、動物への静脈注射後のｈＩＤＰＳＣの生着を示す。光学カットは、異なる焦点深度（Ａ１〜Ａ４）で、Ｖｙｂｒａｎｔ（緑色）で染色されたｈＩＤＰＳＣ、ＰＩ（赤色）で染色された核の存在を示す。細胞は、毛細血管支配の会合および異なる形態学的タイプ：ニューロン様細胞および周皮細胞を示す（Ａ６）。Ａ２〜Ａ４では、毛細血管に沿った異なる位置にある２つの周皮細胞を観察することができる。両方とも類似の形態を示す。Ａ４では、軸索の塞栓も示される。Ａ５は、Ａ２〜Ａ４で示された脳組織内のニューロン形態のスキームを示す。ニューロン核は明るく、核小体を有し、周皮細胞の核との相違は、強く染色され、観察することができる。青色は共焦点顕微鏡の人工的な色である。落射蛍光＋デジタル干渉コントラスト（ＤＩＣ）。スケールバー＝１０μｍ。
【図１９−２】図１９は、動物への静脈注射後のｈＩＤＰＳＣの生着を示す。光学カットは、異なる焦点深度（Ａ１〜Ａ４）で、Ｖｙｂｒａｎｔ（緑色）で染色されたｈＩＤＰＳＣ、ＰＩ（赤色）で染色された核の存在を示す。細胞は、毛細血管支配の会合および異なる形態学的タイプ：ニューロン様細胞および周皮細胞を示す（Ａ６）。Ａ２〜Ａ４では、毛細血管に沿った異なる位置にある２つの周皮細胞を観察することができる。両方とも類似の形態を示す。Ａ４では、軸索の塞栓も示される。Ａ５は、Ａ２〜Ａ４で示された脳組織内のニューロン形態のスキームを示す。ニューロン核は明るく、核小体を有し、周皮細胞の核との相違は、強く染色され、観察することができる。青色は共焦点顕微鏡の人工的な色である。落射蛍光＋デジタル干渉コントラスト（ＤＩＣ）。スケールバー＝１０μｍ。
【図１９−３】図１９は、動物への静脈注射後のｈＩＤＰＳＣの生着を示す。光学カットは、異なる焦点深度（Ａ１〜Ａ４）で、Ｖｙｂｒａｎｔ（緑色）で染色されたｈＩＤＰＳＣ、ＰＩ（赤色）で染色された核の存在を示す。細胞は、毛細血管支配の会合および異なる形態学的タイプ：ニューロン様細胞および周皮細胞を示す（Ａ６）。Ａ２〜Ａ４では、毛細血管に沿った異なる位置にある２つの周皮細胞を観察することができる。両方とも類似の形態を示す。Ａ４では、軸索の塞栓も示される。Ａ５は、Ａ２〜Ａ４で示された脳組織内のニューロン形態のスキームを示す。ニューロン核は明るく、核小体を有し、周皮細胞の核との相違は、強く染色され、観察することができる。青色は共焦点顕微鏡の人工的な色である。落射蛍光＋デジタル干渉コントラスト（ＤＩＣ）。スケールバー＝１０μｍ。
【図２０】図２０は、ＩＶ投与の４日後、ｈＩＤＰＳＣの生着を示す。光学カットは、ｈＩＤＰＳＣがＶｙｂｒａｎｔ（緑色）で染色され、抗ＩＤＰＳＣ抗体と陽性に反応した（赤色）ことを示す。両方の重畳により黄色が生成される。この細胞は、毛細血管の局在化に近いことを示している。ＭＳＣの２つのマーカーを使用した：ＣＤ７３およびＣＤ１０５は、ｈＩＤＰＳＣと陽性反応を示した（Ａ〜Ｄ）。Ｅ．インビトロで培養した陽性対照ｈＩＤＰＳＣ。共焦点顕微鏡。落射蛍光＋デジタル干渉コントラスト（ＤＩＣ）。スケールバー：Ａ＝５μｍ；Ｂ＝１０μｍ；Ｃ＝２０μｍ；Ｄ＝５μｍ。
【図２１】図２１は、抗ヒト核（ｈＮｕ）抗体を用いた免疫組織化学結果を示す。いくつかのｈＩＤＰＳＣ細胞はラット脳の皮質で観察することができる一方で、複数の細胞は線条体で観察することができる。光学顕微鏡。９０倍。スケールバー：５μｍ（左）および２５μｍ（右）。
【図２２】図２２は、抗ヒト核（ｈＮｕ）抗体を用いたＩＤＰＳＣ注射の３０日後、脳の免疫組織化学結果を示す。青い円は、三角ニューロン様体を提示する細胞を指す。三角形体の細胞のサイズは、細胞が「ニューロン」であることを示す。白い円は線維芽細胞様細胞を指す。光学顕微鏡。９０倍。
【図２３】図２３は、抗ヒト核（ｈＮｕ）抗体を用いた脳の免疫組織化学結果を示す。青色の円では、線条体およびＳＶＺに局在するｈＩＤＰＳＣが示される。光学顕微鏡。９０倍。
【図２４】図２４は、ｈＩＤＰＳＣ移植の３０日後、ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）処置動物におけるニューロンに対する陽性ＤＡＲＰＰ３２免疫染色を示す。（Ａ、Ｂ）線条体または皮質においてＤＡＲＰＰ３２免疫染色を示さない未処置動物（３−ＮＰ＋生理食塩水）。（Ｃ、Ｄ）ｈＩＤＰＳＣ処理動物の皮質および線条体におけるラットニューロン生成。青色の円では、（Ｃ）のニューロン、（Ｄ）の高倍率の領域。光学顕微鏡。倍率：２０倍および９０倍。
【図２５】図２５は、ＩＤＰＳＣ投与前およびＩＤＰＳＣ投与の３０日後のＨＤラットモデルの線条体における受容体Ｄ２の発現を示す。スコア３および２を有する動物由来の試料は、３−ＮＰで処置された動物のものであるが、ＩＤＰＳＣ処置を受けなかった。スコア２の試料では、ほんのわずかな受容体Ｄ２陽性細胞が観察され得る一方で、このような細胞はスコア３の試料では観察されなかった。スコア１の動物由来の試料は、３−ＮＰおよびＩＤＰＳＣで処理された動物のものである。スコア１の試料では、複数の受容体Ｄ２陽性細胞を見ることができた。挿入された高倍率は、免疫染色およびニューロン形態の詳細を示した。
【図２６】図２６は、ＨＤ疾患モデルにおける複数回のＩＤＰＳＣ移植および上昇した細胞用量の影響を研究するための群ＩＩおよびＩＩＩの実験設計を示す。
【図２７】図２７は、３−ＮＰにより誘導されたＨＤを有するラットにおける運動機能の低下の程度をどのように決定するかについての例示的スキームを示す。
【図２８−１】図２８は、３−ＮＰ誘導前、３−ＮＰ誘導後（４日目）、およびＩＤＰＳＣ（ｈＩＤＰＳＣ）による処置後のパイロット研究動物の体重を示す。
【図２８−２】図２８は、３−ＮＰ誘導前、３−ＮＰ誘導後（４日目）、およびＩＤＰＳＣ（ｈＩＤＰＳＣ）による処置後のパイロット研究動物の体重を示す。
【図２９−１】図２９は、３−ＮＰ誘導前および３−ＮＰ誘導後の群ＩＩおよび群ＩＩＩの動物の体重を示す。
【図２９−２】図２９は、３−ＮＰ誘導前および３−ＮＰ誘導後の群ＩＩおよび群ＩＩＩの動物の体重を示す。
【図３０−１】図３０は、３−ＮＰ誘導後およびｈＩＤＰＳＣによる処置の３０日後の群ＩＩの動物の体重を示す。
【図３０−２】図３０は、３−ＮＰ誘導後およびｈＩＤＰＳＣによる処置の３０日後の群ＩＩの動物の体重を示す。
【図３１−１】図３１は、３−ＮＰ誘導後およびｈＩＤＰＳＣによる処置の３０日後の群ＩＩＩの動物の体重を示す。
【図３１−２】図３１は、３−ＮＰ誘導後およびｈＩＤＰＳＣによる処置の３０日後の群ＩＩＩの動物の体重を示す。
【図３２】図３２は、ＨＤ疾患モデル（群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ）におけるパイロット研究のタイムラインを示す。ＨＤは３−ＮＰによって、０日目（Ｄ０）から４日目（Ｄ４）の最初の４日間に誘導された。５日目（Ｄ５）に、ＩＤＰＳＣ移植を静脈内注射により投与した。動物を９日目（Ｄ９）に安楽死させ、続いて、ＩＤＰＳＣの生体内分布および生着（Ｖｙｂｒａｎｔ＋特異抗体を用いた免疫組織化学）の検出のために、脳組織を固定し、病変の組織学的分析を行った。群ＩおよびＩＩＩは、３５日目（Ｄ３５）に安楽死され、群ＩＩおよびＩＶは、９５日目に安楽死され、続いて、ＩＤＰＳＣの生体内分布および生着（Ｖｙｂｒａｎｔ＋特異抗体を用いた免疫組織化学）の検出のために、脳組織を固定し、病変の組織学的分析を行った。
【図３３−１】図３３は、ｈＩＤＰＳＣ投与の４日後、ラット脳組織におけるｈＩＤＰＳＣの局在を示す。ｈＩＤＰＳＣ細胞を緑色（Ｖｙｂｒａｎｔ）染色し、核を赤色（ＰＩ）染色した（Ａ１〜Ａ４）。細胞は、主に毛細血管に局在し、２つの形態学的タイプ：ニューロン様細胞および周皮細胞が観察された。Ａ２、Ａ３、およびＡ４の毛細血管における周皮細胞の異なる局在に留意されたい；Ａ４では、ｈＩＤＰＳＣは軸索分岐に局在する。Ａ５：脳組織におけるニューロン形態（Ａ２〜Ａ４）；Ａ６：周皮細胞の局在を示す脳毛細血管の模式図。共焦点顕微鏡法。落射蛍光＋デジタル干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡。スケールバー＝１０μｍ。
【図３３−２】図３３は、ｈＩＤＰＳＣ投与の４日後、ラット脳組織におけるｈＩＤＰＳＣの局在を示す。ｈＩＤＰＳＣ細胞を緑色（Ｖｙｂｒａｎｔ）染色し、核を赤色（ＰＩ）染色した（Ａ１〜Ａ４）。細胞は、主に毛細血管に局在し、２つの形態学的タイプ：ニューロン様細胞および周皮細胞が観察された。Ａ２、Ａ３、およびＡ４の毛細血管における周皮細胞の異なる局在に留意されたい；Ａ４では、ｈＩＤＰＳＣは軸索分岐に局在する。Ａ５：脳組織におけるニューロン形態（Ａ２〜Ａ４）；Ａ６：周皮細胞の局在を示す脳毛細血管の模式図。共焦点顕微鏡法。落射蛍光＋デジタル干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡。スケールバー＝１０μｍ。
【図３３−３】図３３は、ｈＩＤＰＳＣ投与の４日後、ラット脳組織におけるｈＩＤＰＳＣの局在を示す。ｈＩＤＰＳＣ細胞を緑色（Ｖｙｂｒａｎｔ）染色し、核を赤色（ＰＩ）染色した（Ａ１〜Ａ４）。細胞は、主に毛細血管に局在し、２つの形態学的タイプ：ニューロン様細胞および周皮細胞が観察された。Ａ２、Ａ３、およびＡ４の毛細血管における周皮細胞の異なる局在に留意されたい；Ａ４では、ｈＩＤＰＳＣは軸索分岐に局在する。Ａ５：脳組織におけるニューロン形態（Ａ２〜Ａ４）；Ａ６：周皮細胞の局在を示す脳毛細血管の模式図。共焦点顕微鏡法。落射蛍光＋デジタル干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡。スケールバー＝１０μｍ。
【図３４】図３４は、ＩＶ投与の４日後、ｈＩＤＰＳＣの生着を示す。光学カットは、ＩＤＰＳＣがＶｙｂｒａｎｔ（緑色）で染色され、抗ｈＩＤＰＳＣ抗体と陽性に反応した（赤色）ことを示す。両方の重畳により黄色が生成される。この細胞は、毛細血管の局在化に近いことを示している。ＭＳＣの２つのマーカーを使用した：ＣＤ７３およびＣＤ１０５は、ｈＩＤＰＳＣと陽性反応を示した（Ａ〜Ｄ）。Ｅ．インビトロで培養した陽性対照ｈＩＤＰＳＣ。共焦点顕微鏡。落射蛍光＋デジタル干渉コントラスト（ＤＩＣ）。スケールバー：Ａ＝５μｍ；Ｂ＝１０μｍ；Ｃ＝２０μｍ；Ｄ＝５μｍ。
【図３５−１】図３５は、ｈＩＤＰＳＣ投与の３０日後、ｈＩＤＰＳＣの陽性抗ヒト核（ｈＮｕ）染色およびラット脳組織におけるそれらの局在を示す免疫組織化学画像を示す。注記：皮質（左）におけるいくつかのｈＩＤＰＳＣ、および線条体（corpus striatum）（右）における多数のｈＩＤＰＳＣ。光学顕微鏡。９０倍の倍率。スケールバー：それぞれ５μｍおよび２５μｍ。
【図３５−２】図３５は、ｈＩＤＰＳＣ投与の３０日後、ｈＩＤＰＳＣの陽性抗ヒト核（ｈＮｕ）染色およびラット脳組織におけるそれらの局在を示す免疫組織化学画像を示す。注記：皮質（左）におけるいくつかのｈＩＤＰＳＣ、および線条体（corpus striatum）（右）における多数のｈＩＤＰＳＣ。光学顕微鏡。９０倍の倍率。スケールバー：それぞれ５μｍおよび２５μｍ。
【図３５−３】図３５は、ｈＩＤＰＳＣ投与の３０日後、ｈＩＤＰＳＣの陽性抗ヒト核（ｈＮｕ）染色およびラット脳組織におけるそれらの局在を示す免疫組織化学画像を示す。注記：皮質（左）におけるいくつかのｈＩＤＰＳＣ、および線条体（corpus striatum）（右）における多数のｈＩＤＰＳＣ。光学顕微鏡。９０倍の倍率。スケールバー：それぞれ５μｍおよび２５μｍ。
【図３５−４】図３５は、ｈＩＤＰＳＣ投与の３０日後、ｈＩＤＰＳＣの陽性抗ヒト核（ｈＮｕ）染色およびラット脳組織におけるそれらの局在を示す免疫組織化学画像を示す。注記：皮質（左）におけるいくつかのｈＩＤＰＳＣ、および線条体（corpus striatum）（右）における多数のｈＩＤＰＳＣ。光学顕微鏡。９０倍の倍率。スケールバー：それぞれ５μｍおよび２５μｍ。
【図３６】図３６は、３−ＮＰ注射およびｈＩＤＰＳＣの投与後のラット脳組織の免疫組織化学画像を示す。注記：細胞における陽性抗ヒト核（ｈＮｕ）免疫染色。ニューロン様細胞は青色で囲まれ、線維芽細胞様細胞は白色で囲まれている。光学顕微鏡、９０倍の倍率。
【図３７−１】図３７は、未処理動物（３−ＮＰ＋生理食塩水）（ａ〜ｂ１）；対照動物（３−ＮＰおよびｈＩＤＰＳＣなし）（ｃ、ｃ１）；および処理動物（３−ＮＰ＋ｈＩＤＰＳＣ）（ｄ〜ｆ１）の線条体におけるニッスル染色を示す。異なるスコアが、実験群において観察された：スコア１（ａ、ａ１、ｄ、およびｄ１）；スコア２（ｂ、ｂ１、ｅ、およびｅ１）；ならびにスコア３（ｃ、ｃ１、ｆ、およびｆ１）。広範な変性の領域（ａ、ａ１）；重度（ｄ、ｄ１）、中等度（ｂ、ｂ１、ｅ、およびｅ１）、軽度（ｆ、ｆ１）、ならびに無い（ｃ、ｃ１）のニューロン喪失。倍率：１０倍（ａ〜ｆ）および２０倍（ａ〜ｆ１）。（ｂ、ｃ、ｅ、およびｆ）における差し込み図は、典型的なニッスル染色されたニューロン形態（４０倍）を示す。光学顕微鏡法（ａ〜ｆ）。
【図３７−２】図３７は、未処理動物（３−ＮＰ＋生理食塩水）（ａ〜ｂ１）；対照動物（３−ＮＰおよびｈＩＤＰＳＣなし）（ｃ、ｃ１）；および処理動物（３−ＮＰ＋ｈＩＤＰＳＣ）（ｄ〜ｆ１）の線条体におけるニッスル染色を示す。異なるスコアが、実験群において観察された：スコア１（ａ、ａ１、ｄ、およびｄ１）；スコア２（ｂ、ｂ１、ｅ、およびｅ１）；ならびにスコア３（ｃ、ｃ１、ｆ、およびｆ１）。広範な変性の領域（ａ、ａ１）；重度（ｄ、ｄ１）、中等度（ｂ、ｂ１、ｅ、およびｅ１）、軽度（ｆ、ｆ１）、ならびに無い（ｃ、ｃ１）のニューロン喪失。倍率：１０倍（ａ〜ｆ）および２０倍（ａ〜ｆ１）。（ｂ、ｃ、ｅ、およびｆ）における差し込み図は、典型的なニッスル染色されたニューロン形態（４０倍）を示す。光学顕微鏡法（ａ〜ｆ）。
【図３８】図３８は、未処理動物（３−ＮＰ＋生理食塩水）（ａ〜ｂ）、対照（３−ＮＰおよびｈＩＤＰＳＣなし）（ｃ）、ならびに処置動物（３−ＮＰ＋ｈＩＤＰＳＣ）（ｄ〜ｅ１）の線条体（corpus striatum）におけるＤＡＲＰＰ３２免疫染色を示す。（ａ）では、免疫染色なし（青色矢印、スコア１）、（ｂ）少数のＤＡＲＰＰ３２＋細胞（スコア２）、および陽性ＤＡＲＰＰ３２免疫染色を示す対照動物（３−ＮＰおよびｈＩＤＰＳＣなし）（スコア３）。（ｄ、ｄ１）では、処置動物（３−ＮＰ＋ｈＩＤＰＳＣ）におけるニューロン喪失があり、ＤＡＲＰＰ３２染色細胞はほとんどなかった（スコア２）（黒矢印）。（ｅ、ｅ１）では、強力な抗ＤＡＲＰＰ−３２免疫染色があった（スコア３）。差し込み図（ａ、ｂ、ｃ、ｄ１）は、ＤＡＲＰＰ３２＋ニューロン（黒矢印）（４０倍）を示す。ＨＥ（ヘマトキシリンおよびエオシン）染色された核は青色である。倍率：１０倍（ａ、ｃ、ｄ、ｅ）および２０倍（ｄ、ｅ１）。
【図３９−１】図３９は、ｈＩＤＰＳＣ後のラットの線条体におけるニューロン増殖を示す。ｈＩＤＰＳＣの投与は、（Ａ）ニッスル染色、および（Ｂ）ＤＡＲＰＰ３２発現によって、ｈＩＤＰＳＣ処置動物において神経回復効果をもたらした。（Ｃ）対照と比較した、ｈＩＤＰＳＣ投与後のニューロン回復を示す動物の数。ほとんどのｈＩＤＰＳＣ処置動物（３−ＮＰ＋ｈＩＤＰＳＣ）はスコア３および２（中等度および軽度）を有する一方で、ほとんどの未処置動物（３ＮＰ＋生理食塩水）はスコア２および１（重度および中等度）を有した。
【図３９−２】図３９は、ｈＩＤＰＳＣ後のラットの線条体におけるニューロン増殖を示す。ｈＩＤＰＳＣの投与は、（Ａ）ニッスル染色、および（Ｂ）ＤＡＲＰＰ３２発現によって、ｈＩＤＰＳＣ処置動物において神経回復効果をもたらした。（Ｃ）対照と比較した、ｈＩＤＰＳＣ投与後のニューロン回復を示す動物の数。ほとんどのｈＩＤＰＳＣ処置動物（３−ＮＰ＋ｈＩＤＰＳＣ）はスコア３および２（中等度および軽度）を有する一方で、ほとんどの未処置動物（３ＮＰ＋生理食塩水）はスコア２および１（重度および中等度）を有した。
【図３９−３】図３９は、ｈＩＤＰＳＣ後のラットの線条体におけるニューロン増殖を示す。ｈＩＤＰＳＣの投与は、（Ａ）ニッスル染色、および（Ｂ）ＤＡＲＰＰ３２発現によって、ｈＩＤＰＳＣ処置動物において神経回復効果をもたらした。（Ｃ）対照と比較した、ｈＩＤＰＳＣ投与後のニューロン回復を示す動物の数。ほとんどのｈＩＤＰＳＣ処置動物（３−ＮＰ＋ｈＩＤＰＳＣ）はスコア３および２（中等度および軽度）を有する一方で、ほとんどの未処置動物（３ＮＰ＋生理食塩水）はスコア２および１（重度および中等度）を有した。
【図４０−１】図４０は、（ａ〜ｆ）３−ＮＰ注入後、および（ｇ〜ｊ）ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）投与後（ａ、ｂ）のラット脳組織におけるＢＤＮＦ発現を示す。３−ＮＰ注入の７日後のＢＤＮＦ発現の不存在（ｃ、ｄ）、および３０日後の低発現（ｅ、ｆ）。対照動物（３−ＮＰおよびＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）なし）。ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）投与の７日後（ｇ、ｈ）および３０日後（ｉ、ｊ）のＢＤＮＦ発現。倍率：１０倍（ａ、ｃ、ｅ、ｇ、およびｈ）および２０倍（ｂ、ｄ、ｉ、およびｊ）。
【図４０−２】図４０は、（ａ〜ｆ）３−ＮＰ注入後、および（ｇ〜ｊ）ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）投与後（ａ、ｂ）のラット脳組織におけるＢＤＮＦ発現を示す。３−ＮＰ注入の７日後のＢＤＮＦ発現の不存在（ｃ、ｄ）、および３０日後の低発現（ｅ、ｆ）。対照動物（３−ＮＰおよびＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）なし）。ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）投与の７日後（ｇ、ｈ）および３０日後（ｉ、ｊ）のＢＤＮＦ発現。倍率：１０倍（ａ、ｃ、ｅ、ｇ、およびｈ）および２０倍（ｂ、ｄ、ｉ、およびｊ）。
【図４１】図４１は、ＨＤの３−ＮＰモデルにおけるＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）投与の３０日後、ラットの線条体におけるＤＡＲＰＰ３２発現を示す。共焦点顕微鏡、Ａ．落射蛍光顕微鏡＋デジタル干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡での画像をオーバーラップ。Ｂ〜Ｄ：落射蛍光顕微鏡。スケールバー：１０μｍ。
【図４２】図４２は、処置（３−ＮＰ＋ｈＩＤＰＳＣ）および未処置動物（３−ＮＰ＋生理食塩水）の体重におけるｈＩＤＰＳＣ投与の効果を示す。３−ＮＰ投与前および投与の４日後、ならびに各ｈＩＤＰＳＣ投与後（３０日ごと）に体重を記録した。３−ＮＰ投与の３０日、６０日、および９０日後、３−ＮＰ処置動物において体重の増加は観察されなかった。ｈＩＤＰＳＣ処置動物（１×１０６用量）の体重は、第１のｈＩＤＰＳＣ投与後に増加した。
【図４３−１】図４３は、ｈＩＤＰＳＣ静脈移植の４日後、３−ＮＰ処置動物の脳におけるＢＤＮＦ発現の代表的な図を示す。皮質において強いＢＤＮＦ分泌が観察された（１ａ、１ｂ）。より低いＢＤＮＦ分泌は海馬で示された（１ｃ、１ｄ）。強いＢＤＮＦ発現は線条体で観察された（１ｅ、１ｆ）。対照３−ＮＰ群は、同じ脳領域においてＢＤＮＦ分泌を示さなかった（２ａ〜２ｆ）。光学顕微鏡。１ａ、１ｃ、１ｅ、２ａ、２ｃ、２ｅにおいて倍率２０倍；１ｂ、１ｄ、１ｆ、２ｂ、２ｄ、２ｆにおいて倍率４０倍。１ｂおよび１ｄの矢印、ならびに１ｅおよび１ｆのアスタリスクは、ＢＤＮＦ分泌細胞を示す。核は、ＨＥ（ヘマトキシリンおよびエオシン）で対比染色された。
【図４３−２】図４３は、ｈＩＤＰＳＣ静脈移植の４日後、３−ＮＰ処置動物の脳におけるＢＤＮＦ発現の代表的な図を示す。皮質において強いＢＤＮＦ分泌が観察された（１ａ、１ｂ）。より低いＢＤＮＦ分泌は海馬で示された（１ｃ、１ｄ）。強いＢＤＮＦ発現は線条体で観察された（１ｅ、１ｆ）。対照３−ＮＰ群は、同じ脳領域においてＢＤＮＦ分泌を示さなかった（２ａ〜２ｆ）。光学顕微鏡。１ａ、１ｃ、１ｅ、２ａ、２ｃ、２ｅにおいて倍率２０倍；１ｂ、１ｄ、１ｆ、２ｂ、２ｄ、２ｆにおいて倍率４０倍。１ｂおよび１ｄの矢印、ならびに１ｅおよび１ｆのアスタリスクは、ＢＤＮＦ分泌細胞を示す。核は、ＨＥ（ヘマトキシリンおよびエオシン）で対比染色された。
【図４４−１】図４４は、ｈＩＤＰＳＣ静脈移植の３０日後、３−ＮＰ処置動物の脳における代表的なＢＤＮＦ発現を示す。強いＢＤＮＦ分泌が、皮質において観察された（１ａ、１ｂ）。より低いＢＤＮＦ分泌は海馬において観察された（１ｃ、１ｄ）。強いＢＤＮＦ発現は線条体において観察された（１ｅ、１ｆ）。対照３−ＮＰ群は、同じ脳領域においてＢＤＮＦ分泌を示さなかった（２ａ〜２ｆ）。光学顕微鏡。１ａ、１ｃ、１ｅ、２ａ、２ｃ、２ｅにおいて倍率２０倍；１ｂ、１ｄ、１ｆ、２ｂ、２ｄ、２ｆにおいて倍率４０倍。１ｂおよび１ｄの矢印、ならびに１ｅおよび１ｆのアスタリスクは、ＢＤＮＦ分泌細胞を示す。
【図４４−２】図４４は、ｈＩＤＰＳＣ静脈移植の３０日後、３−ＮＰ処置動物の脳における代表的なＢＤＮＦ発現を示す。強いＢＤＮＦ分泌が、皮質において観察された（１ａ、１ｂ）。より低いＢＤＮＦ分泌は海馬において観察された（１ｃ、１ｄ）。強いＢＤＮＦ発現は線条体において観察された（１ｅ、１ｆ）。対照３−ＮＰ群は、同じ脳領域においてＢＤＮＦ分泌を示さなかった（２ａ〜２ｆ）。光学顕微鏡。１ａ、１ｃ、１ｅ、２ａ、２ｃ、２ｅにおいて倍率２０倍；１ｂ、１ｄ、１ｆ、２ｂ、２ｄ、２ｆにおいて倍率４０倍。１ｂおよび１ｄの矢印、ならびに１ｅおよび１ｆのアスタリスクは、ＢＤＮＦ分泌細胞を示す。
【図４５】図４５は、ＩＤＰＳＣ移植後にＨＤ誘導されたラットの機能特性を評価するための、全てのＨＤ疾患モデル研究の実験設計を示す。
【図４６】図４６は、正常なＭＳＣとＥＳ（またはｉＰＳ）細胞の間の主な相違を示す。腫瘍形成は、ＥＳおよびｉＰＳ細胞と相関であるが、正常なＭＳＣとは相関しない。
【図４７】図４７は、神経発生を誘導し、神経保護を提供する際のｈＩＤＰＳＣの有効性の機構についてのスキームを示す。
【図４８】図４８は、ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）単離およびバッチ製剤の初期段階開発プロセスを示す。
【図４９】図４９は、ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）のための別の初期段階開発製造プロセスを示す。
【図５０】図５０は、いくつかの主要なステップで構成されるＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）生成プロセスを示す。
【図５１−１】図５１は、治験製品ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）の安全性研究を示す。
【図５１−２】図５１は、治験製品ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）の安全性研究を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本明細書で使用するとき、動詞「含む」は、本明細書および特許請求の範囲で使用され、その活用は、単語に続く項目が含まれることを意味するために、その非制限的な意味で使用されるが、具体的に言及されていない項目は排除されない。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、文脈が、要素のうち１つおよびただ１つが存在することを明確に要求していない限り、１を超える要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００５６】
本明細書で使用するとき、細胞の集団における遺伝子の発現レベル（目的の抗原に対する強い免疫陽性）に関して「高発現」という用語は、遺伝子を発現する集団の少なくとも７５％を指す。
【００５７】
本明細書で使用するとき、細胞の集団における遺伝子の発現レベルに関して「低発現」という用語は、遺伝子を発現する集団の３０％以下を指す。好ましい実施形態では、低発現とは、遺伝子を発現する集団の２５％以下を指す。
【００５８】
本明細書で使用するとき、細胞の集団における遺伝子の発現レベルに関して「発現しない」という用語は、集団において目的の遺伝子を発現する検出可能な細胞がないことを指す。検出可能な発現は、発現を測定する方法の誤差の範囲内にある発現レベルを含まない。
【００５９】
本明細書で使用するとき、「対象」または「患者」という用語は、任意の脊椎動物を指し、限定されないが、ヒトおよび他の霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、飼育動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、げっ歯類、例えばマウス、ラットおよびモルモットなどの）、および鳥類（例えば、飼育、野生および狩猟の鳥、例えばニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽、アヒル、ガチョウなど）が挙げられる。一部の実施では、対象は哺乳動物であり得る。他の実施では、対象はヒトであり得る。
【００６０】
本明細書で使用するとき、用語「幹細胞」とは、特定の条件下で、成熟した機能的細胞に分化し得る未成熟の特殊化されていない細胞を指す。
本明細書で使用するとき、用語「神経幹細胞」または「ＮＳＣ」とは、自己再生可能であり、最終的にニューロン、星状細胞、および乏突起膠細胞に分化することができる多能性細胞を指す。
【００６１】
本明細書で使用するとき、用語「神経前駆細胞」とは、神経幹細胞よりも細胞分化の段階に沿ってさらに未分化の細胞を指す。したがって、これらの細胞は、神経幹細胞に由来し、１を超える細胞型の中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）に分化することができる子孫を生成することができる。
【００６２】
本明細書で使用するとき、用語「神経先駆細胞」または「ＮＰＣ」は、神経幹細胞およびその未分化子孫の全てからなる細胞の混合集団を指す。したがって、ＮＰＣには、ＮＰＣとＮＳＣの両方が含まれる。ＮＰＣはまた、ニューロンおよびグリア細胞をそれぞれ生成するニューロンＮＰＣおよびグリアＮＰＣに分類することができる。
【００６３】
本明細書で使用するとき、用語「採取サイクル」は、組織中の幹細胞の接着および増殖後、新しい細胞培養容器への臓器（例えば、歯髄のような神経堤起源）または組織の移動、それに続く、ＩＤＰＳＣの保存（例えば、凍結保存）および／または増殖物の継代培養を構成する。外植片技術を用いて臓器培養（歯髄）から最初に単離された幹細胞は初期集団であり、したがって、第１の採取サイクル（臓器培養の第１の移動）から単離された幹細胞は初期集団細胞である。例えば、歯髄組織からの単離された幹細胞のうち、ヒト脱落乳歯（ＳＨＥＤ）由来の幹細胞は、初期および後期集団に分けることができない。これは、これらの細胞が、酵素法を用いて歯髄から１回だけ単離され、ＳＨＥＤ単離後に廃棄されるためである。したがって、ただ１つのＳＨＥＤ細胞集団を単離することができる。さらに、酵素消化後、ＳＨＥＤを一方から他方の細胞培養フラスコに継代して、したがって、細胞継代を計算することができ、これは一般的に、ＳＨＥＤが半コンフルエンスに達したときに行われる。
【００６４】
未成熟歯髄幹細胞（ＩＰＤＳＣ）についてはＳＨＥＤとは対照的に、酵素的方法は使用されない。ＩＤＰＳＣは、ＤＰをプラスチックに最初に接着させ、細胞増殖させた後、歯髄の外植片培養物から単離することがすることができる−初期集団細胞。この段階で、歯髄は廃棄されず、その後の外植片歯髄培養のために使用される−後期集団。したがって、第２またはその後の採取サイクルから単離されたＩＤＰＳＣは、後期集団細胞である。例えば、第２の採取サイクルまたはその後の採取サイクルから単離されたＩＰＤＳＣは、後期集団未分化幹細胞である。本明細書で使用するとき、用語「初期継代」は、外植片培養物の最初の５継代由来の細胞を指す。本明細書で使用するとき、用語「後期継代」とは、外植片培養物の第５の継代後の継代、例えば、第６の継代またはその後の継代からの細胞を指す。したがって、ＩＤＰＳＣは、初期または後期集団由来であり、さらに初期または後期継代として分類され得る。
【００６５】
本発明は、神経堤起源の組織由来の、初期幹細胞集団および後期幹細胞集団によって構成される、固有の幹細胞集団である、ＩＤＰＳＣの特定の組成物が、血液／脳関門（ＢＢＢ）を通過して神経発生を誘導するという発見に関する。神経堤起源の組織には、例えば、歯組織、歯周組織、および毛包組織が含まれる。毛包組織には、触毛の濾胞組織が含まれる。
【００６６】
ｈＩＤＰＳＣを３−ＮＰ（３ニトロプロピオン酸）ＨＤラットモデルで評価した。ｈＩＤＰＳＣは、蛍光タンパク質（Ｖｉｂｒａｎｔ）で標識された１×１０６および１×１０７細胞／移植（３×１０６細胞／ｋｇおよび３×１０７細胞／ｋｇ）の静脈注射、ならびに特異的抗ヒト抗体を用いた免疫組織化学分析の１カ月後にラット脳内に生着を示した。細胞生着は、異なる脳区画（皮質、線条体および脳室下帯−ＳＶＺ）で観察された。
【００６７】
ＢＢＢを通過する能力は、幹細胞療法の全身投与（例えば、ＩＶ投与）が、より局所的な投与方法よりも有意な利点を提供する、神経学的状態を治療することができるようにする。全身投与は侵襲性が低いことに加えて、支援を必要とする場所に幹細胞を移動させることは、投与部位で有害な細胞塊が発生する危険性を低下させる。例えば、幹細胞療法の髄腔内（ＩＴ）投与は、前臨床および臨床研究において一般的に意図されているが、この方法は、幹細胞がＭＳＣである場合に著しい危険性を有する可能性がある。細胞密度に依存して、脳室内（ＩＣＶ）を介して脳実質に引き込まれた（おそらくこの炎症からの化学誘引物質シグナルに応答して）骨髄由来のＭＳＣは、６４％の重度の実験的アレルギー性脳脊髄炎動物において細胞塊を形成したことが報告されている。また、初期継代では核型に関して正常なＭＳＣは、ナイーブな動物において塊を誘導した（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら、２０１１年）。したがって、ＣＮＳ内に直接移植されたＭＳＣは、それ自体が、いまだに未知である結果の局所病理学を引き起こし得る（Ｓｎｙｄｅｒら、２０１１年）。これらの塊の容積は、細胞密度と相関するようであった。したがって、細胞数ならびに適用回数は、ＩＶとは対照的に、制限され、ＩＴおよびＩＣＶ適用の危険因子となり得る。
【００６８】
ＩＤＰＳＣの組成物は、間葉系および神経上皮幹細胞の免疫表現型を発現する幹細胞を含む医薬組成物の形態であり得る。一部の実施では、間葉系および神経上皮幹細胞の分子プロファイルの発現は、ＭＳＣおよび神経上皮細胞／前駆細胞のマーカーの発現、ならびに神経保護因子および免疫防御因子をコードする遺伝子の発現である。
【００６９】
ＭＳＣ免疫表現型を発現する細胞は、ＣＤ４４の発現を含む。多発性硬化症の以前の動物モデルでは、炎症を起こした内皮細胞へのＮＣＳ接着、続くＢＢＢを経て炎症を起こしたＣＮＳ領域への経内皮移行が、機能的な細胞接着分子（ＣＡＭ）、特にＣＤ４４の構成的発現によって逐次的に媒介されることが見出された（Ｒａｍｐｏｎ  Ｃら、２００８年）。ｈＩＤＰＳＣがどのようにＢＢＢを通過することができるかについての正確な機構は明らかではないが、これらの細胞は、周皮細胞様の特性を有するため、この能力を有すると考えられている（Ｂａｒｒｏｓら、２０１４年）。周皮細胞は、神経血管単位での内皮および星状細胞機能の統合において、ならびにＢＢＢの調節におけるにおいて重要な役割を果たすことが公知である（Ａｒｍｕｌｉｋら、２０１０年；Ｌｉｕら、２０１２年）。以前の研究（Ｙｉｌｍａｚら、２０１１年）によれば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、ＥおよびＬ血管内皮セレクチンのリガンドであるＣＤ４４の発現により、全身投与後に脳内に生着することができる（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆら、２００１年）。ＭＳＣは、白血球と同様のホーミング機構を示す。白血球移動の第１ステップは、セレクチンとして公知である糖タンパク質によって媒介される、血流中を自由に流れる白血球の捕捉を伴う。Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンは、血管内皮によって発現され、血管を通る白血球移動におけるローリング反応の主要な媒介因子である（Ｌｕｓｔｅｒら、２００５年）。ＭＳＣは、脳などの一部の臓器に生着する（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎら、２００８年）ために、この機構または類似の機構を使用し得る。したがって、ＣＤ４４は、ＭＳＣが脳内に移動するための重要な因子であると考えられている。ＢＭ  ＭＳＣと同様に、ｈＩＤＰＳＣはＣＤ４４を発現し、これは、ＣＤ４４がまた静脈内投与後の脳を含む一部の臓器へのｈＩＤＰＳＣ移動に関与していることを示唆する（Ｂａｒｒｏｓら、２０１４年、Ｃａｓｔａｎｈｅｉｒａら、２０１３年）。驚くべきことに、ｈＩＤＰＳＣは、多機能性タンパク質であり、細胞移動、細胞増殖、細胞分化において様々な役割を果たすＣＤ１３（アミノペプチダーゼＮ）（Ｋｅｒｋｉｓら、２００６年；ＫｅｒｋｉｓおよびＣａｐｌａｎ、２０１２年）も発現する（Ｔａｙｌｏｒら、１９９３年；Ｍｉｎａ−Ｏｓｏｒｉｏら、２００８ａ／ｂ）。ＣＤ１３は、毛細血管形成のプロセスにおいて、および血管形成の血管のマーカーとして、血管形成の発生および血管形成シグナルの調節に関与する（Ｂｈａｇｗａｔら、２００１年）。これは、移動し、脳脈管構造を標的とするｈＩＤＰＳＣ能力におけるその可能な役割を示唆する。３−ＮＰラットの研究では、ｈＩＤＰＳＣは、脳毛細血管との密接な関連を示した。
【００７０】
一部の実施形態では、ＩＤＰＳＣは、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、および／またはＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠く。これらのマーカーの発現の欠如は、安全な異種療法としてのｈＩＤＰＳＣの使用を容易にする。内皮は、分子の交換において重要な役割を果たすが、さらに、血液とその下の組織の間の免疫細胞の役割を果たす。内皮分子Ｓ−Ｅｎｄｏ１抗原（ＣＤ１４６）は、内皮結合に優先的に位置され、内皮の完全性を支持すると主張されている。したがって、ヒトでは、ＭＣＡＭ（ＣＤ１４６）は、健常人の個体の末梢循環においてＴ細胞（３％）に発現される。ＭＣＡＭ陽性Ｔ細胞はまた、内皮単層に結合する増大した能力を示し、これらの細胞は、適応免疫反応の初期成分を表すことができる（Ｄａｇｕｒら、２０１５年）。したがって、このマーカーを発現する幹細胞は、ＢＢＢに結合し、ＢＢＢを通過しないとともに免疫反応性であり得る。
【００７１】
間葉系幹細胞の遺伝子型パターンはまた、多能性マーカーＯＣＴ３／４およびｎａｎｏｇの低発現を含む。興味深いことに、本発明の医薬組成物の未分化幹細胞は、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬｆ−４、およびＲＥＸ−１を発現する必要はない。実際に、これらの幹細胞は、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬｆ−４、およびＲＥＸ−１に対して陰性であり得る。
【００７２】
神経上皮幹細胞分子プロファイルを発現する幹細胞は、ビメンチン、ネスチン、ＳＯＸ２、ｐ７５、ならびに神経細胞の発生および生存に必須の他の神経栄養因子からなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは２を超えるＮＰＣバイオマーカーおよびＮＳＣバイオマーカーを発現する。ｐ７５は、神経栄養受容体マーカーである。最近の研究では、ｐ７５ＮＴＲおよび／もしくはＴｒｋＢ発現またはそれらのシグナル伝達の正常化が、ハンチントン病におけるＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）神経保護療法を改善することが仮定されている（Ｂｒｉｔｏら、２０１３年）。
【００７３】
神経発生および生存に必須の例示的な神経栄養因子には、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＧＮＤＦ（グリア細胞株由来の神経栄養因子）、ＮＧＦ（神経増殖因子）、およびＮＴ（ニューロトロフィン）が含まれる。ＢＮＤＦは、両者がドーパミンに関連した神経変性疾患であるハンチントン病（Ｇａｕｔｈｉｅｒら；Ｓｔｒａｎｄら）およびパーキンソン病（Ｍｏｇｉら）において重要な役割を果たす。一部の研究は、野生型ＨＤを過剰発現したｈｔｔタンパク質は、ＣＮＳ細胞におけるＢＤＮＦ発現を増加させるが、突然変異したｈｔｔタンパク質は、ＢＤＮＦの下方制御へと導き、不十分な神経栄養支持およびニューロン細胞死をもたらすことを示す（Ｚｕｃｃａｔｏら、２００１年）。ＡＤ患者の脳はＮＧＦレベルを低下させた（Ｃａｌｉｓｓａｎｏら）。しかしながら、ＮＧＦ投与は、加齢のげっ歯類におけるコリン作動性萎縮を部分的に低下させる可能性がある（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｗら）。一部の実施形態では、好ましいＮＧＦはＮＧＦ−βである。ニューロンの発生および生存に必須のＮＴは、ＮＴ３、ＮＴ４、またはＮＴ５を含む。ＮＴ４およびＮＴ５が、感覚および運動軸索の増殖を促進することは公知である。
【００７４】
一部の実施では、幹細胞は、医薬組成物を必要とする対象に対して自家である細胞を含む。他の実施では、幹細胞は、医薬組成物を必要とする対象に対して同種異系である細胞を含む。一部の実施では、幹細胞は、医薬組成物を必要とする対象に対して自家および同種異系である細胞の組み合わせを含む。
【００７５】
一実施形態では、幹細胞の組成物は、歯組織、歯周組織、および毛包組織からなる群から選択される神経堤起源の組織から単離される。好ましい実施形態では、神経堤起源の組織は歯髄である。最も好ましい実施形態では、幹細胞は、未成熟歯髄由来であり、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ１４／５９８５０号および米国特許出願第１４／２１４０，０１６号に開示されているヒト未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）である。ＩＤＰＳＣは、複数のニューロンマーカーを有し、ニューロンへの強力な分化を受ける。ＩＤＰＳＣ免疫表現型の新規性は、これらのマーカー、および同時にＭＳＣに典型的なマーカーの予期せぬ発現であり、多細胞性間葉系間質細胞を規定するための国際細胞治療学会の最小基準（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、２００６年）に従って免疫表現型を提示する。ＭＳＣのＩＤＰＳＣによる発現と複数のニューロンマーカーの組み合わせは、ＭＳＣでは典型的ではなく（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、２００６年）、ＭＳＣについては開示されていない。
【００７６】
本発明において意図される医薬組成物は、好ましくは等張性である。静脈内注射について、未成熟幹細胞集団は、１回の注射につき１０４〜１０１０細胞、例えば、体重１ｋｇあたり１０４、１０５、１０６および１０７細胞でなければならない。幹細胞集団を含む医薬組成物は、他の医薬的に活性な化合物または様式に付随して使用され得る。したがって、一部の実施形態では、医薬組成物は、別の医薬的に活性な化合物または治療様式をさらに含み得る。
間葉系幹細胞
生体内では、ＭＳＣは、骨髄、臍帯組織、歯髄および脂肪体に見出される。しかしながら、骨髄では、ＭＳＣは比較的稀であり、１０，０００細胞のうち１細胞のみを含むが、他の供給源はこれらの細胞で有意に豊富である。生物では、ＭＳＣは、人命を通じて疾患、外傷または損傷の場合の組織再生に関与する。ＭＳＣのこの機能は、それらの自己再生および可塑性の能力（分化−多様な細胞型の生成のための能力）によって媒介される。ＭＳＣは、上記の組織から単離され、実験室で容易に培養することができる。患者から限られた数の細胞を得た後、ＭＳＣをインビトロで迅速に増殖させ、将来の臨床応用のために凍結保存することができる。
【００７７】
ＭＳＣは、再生微小環境を構築することによって「栄養活性」を提供するサイトカイン、および免疫調節細胞機能に寄与する他の分子などの種々の生物活性分子を分泌し、さらにミトコンドリアほど大きさの生成物を、助けを必要とする損傷した細胞に移すことができる。インビボで移植した場合、走化性刺激に応答して、ＭＳＣは、局所部位と周囲部位の両方からの局所的損傷に移動することができる。さらに、ＭＳＣは、慢性炎症を低減し、アポトーシスを阻害し、筋線維芽細胞の出現をもたらし、瘢痕形成を阻害し、組織固有の前駆体の有糸分裂を刺激し、したがって、損傷組織をリモデリングする。それが、ＭＳＣは「医薬シグナリング細胞（Medicinal Signaling Cell）」とも呼ばれている理由である。それらは、新しい血管を形成するプロセスである血管形成を刺激し、これは神経発生に密接に連結し、このプロセスによって新しい神経細胞が生成される。血管は、損傷した脳領域へ向かうニューロン前駆細胞の移動の枠組みとして重要な役割を果たす。ＭＳＣによって分泌される因子はまた、酸化的損害の破壊的影響を低減させる。これらの作用機序の全てを用いることにより、ＭＳＣは、損傷細胞の修復へと導く、損傷した微小環境を有意に改善することができる。したがって、ＭＳＣは「細胞の救急救命士」と考えられている。
【００７８】
ヒトから得られたＭＳＣを標識して、ＭＳＣを追跡し、何らかのタイプの組織損傷を有するマウスに注射した場合、ＭＳＣは、損傷した組織全体に明らかに均等に移動した。これらの細胞は、疾患モデルに依存する実質的な期間、組織内に存在してもよいし、または存在しなくてもよい。ＭＳＣが継続的に存在することは、本質的ではないが、治療の進展に重要である。これは、治療の潜在的に陽性な長期効果を持続させる可能性があり得ることを示しているためである。
【００７９】
機能的免疫系の有無にかかわらず、損傷されたマウスの実験で同じ結果が得られたため、ＭＳＣの一時的な存在は宿主免疫系の作用の結果ではないことを理解することが重要である。さらなる調査は、ＭＳＣが免疫系を抑制し、炎症を低減させることを実証した。換言すれば、ＭＳＣは、移植を受けると、生物の免疫系が外来組織を攻撃するときに起こる、非常に低い免疫拒絶反応を示す生物間で移すことができる。この所見は、宿主の免疫系による拒絶反応を避けることができるため、ＭＳＣを、宿主への移植または注射のための良好な候補とさせる（Ｌｅ  Ｂｌａｎｋ、Ｒｉｎｇｄｅｎ、２００６年；Ｅｎｇｌｉｓｈ、２０１２年；Ｍｉｇｕｅｌら、２０１２年；Ｇｒｉｆｆｉｎら、２０１２年；Ａｎｋｒｕｍら、２０１４年）。
【００８０】
細胞療法の重要な問題は、多数の様々な方法でアプローチされている、脳内へのＭＳＣの送達経路である。髄腔内、静脈内、脊髄を取り囲む空間への注射、およびさらには鼻を通る経路などの、脳内にＭＳＣを送達させるためのいくつかのアプローチが提案されている。初期発生では、未成熟内皮細胞と、ＭＳＣと同様の特徴を共有する、神経前駆体、ニューロン、放射状グリア、および周皮細胞との間の複合的多細胞相互作用の結果として、血液／脳関門（ＢＢＢ）が形成され、血流と脳間質腔の間の選択的分子または細胞トラフィッキングを制御する。ＢＢＢは、脳悪性腫瘍および神経変性障害を治療するための治療薬（薬物または細胞）の送達にとって著しい問題を提示する。全身注入されたＭＳＣは、再生能力、および栄養性、免疫調節性または他の工学的に作製された治療因子を分泌する能力のため、急性傷害、炎症性疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）の脳卒中およびさらには脳腫瘍を治療し得る。しかしながら、ＭＳＣが正常および病理学的状態においてＢＢＢを通過して移動する能力を有するかどうかは未解決のままである（Ｌｉｕら、２０１３年）。
【００８１】
インビトロで拡大増殖されたＭＳＣの全身注入（例えば、ＩＶ）は、多数の進行中の臨床試験において使用される最小侵襲性および簡便な手法である。したがって、移植されたＭＳＣが、脳における虚血性部位および損傷部位にホーミングし、生着して、それらの治療効果を発揮することができるかどうかを理解することは不可欠である。最小限に操作されたＭＳＣの全身送達は、ＢＢＢを介した脳内への細胞の直接移植をもたらし得ることを示唆または開示しているデータはいまだにない。
【００８２】
ＭＳＣが得られ、培養され得る簡便さ、ならびにそれらの固有の「栄養活性」および免疫拒絶反応を伴わない宿主へのそれらの移動の可能性は、ＭＳＣによる幹細胞療法が神経学的疾患および状態、例えば、神経変性の治療に対して有望な手段であるという理由による。最近の刊行物によると、ＭＳＣは、細胞の分化および生存を刺激するタンパク質である栄養因子を分泌することによって神経変性の修復を支援することができる。これらの要因の効果は、神経細胞が、生存：軸索伸長、増殖、および細胞接着を支持することができるいくつかのプロセスを実施することを可能にする。ＭＳＣが脳における細胞増殖および修復を促進することができるという証拠であるが、ＭＳＣが、他の神経細胞にシグナル伝達しまたはそれと情報交換する能力を有する成熟した神経細胞になり得ることはいまだに明確に確定されていない。
【００８３】
以前の研究は、ＨＤ動物モデル（ＨＤがＱＡまたは３−ＮＰによって誘導される化学モデル、およびトランスジェニックマウス系統Ｒ６／２−Ｊ２、Ｎ１７１−８２Ｑ、およびＲ６／２）におけるＭＳＣ療法の可能性を試験している。しかしながら、著者らは細胞試験したＭＳＣと呼んでいるが、これらの細胞は、国際細胞治療学会によって定義されたＭＳＣに典型的な免疫表現型を有するものとして確認されなかった（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、２００６年）。これらの前臨床研究は、正常レベルの酸素（正常酸素）または低レベルの酸素（低酸素）下で増殖させた骨髄、脂肪組織、および臍帯血由来の同種異系および異種の初代培養および不死化細胞株、ならびに単核細胞を使用した。したがって、これらの研究は、国際細胞治療学会によってＭＳＣとみなされる細胞が、以前の特別な培養操作なしに神経学的疾患を治療するために首尾よく用いられ得ることを確立していない。
【００８４】
これらの実験で使用された細胞数は、半球／線条体あたり１０５、２×１０５、４×１０５、５×１０５、および１０６個まで変化させた。ＭＳＣ移植の投与時間は、研究の全体にわたって、１〜３日間、２〜４週間および８週間の時間で有意に変化させた。これらの細胞は、直接移植後に脳内に見出されたが、直接的な脳内送達は、侵襲性が高く、危険な手法である。したがって、これらの研究は、ＩＶ注射による全身投与などの幹細胞療法を投与する最小限の侵襲的方法が使用できることを実証していない。
【００８５】
使用される研究の１つを除く全ての研究では、１０回以内で継代した細胞を使用した。排除研究は、継代が４０回および５０回であるマウス臍帯血由来（ｍＵＢＣ由来）のＭＳＣを使用した。興味深いことに、この研究は、ステージ特異的胚抗原４（ＳＳＥＡ４）などの多能性幹細胞のマーカーの発現が、継代に伴って増加し、高い継代のｍＵＣＢ由来ＭＳＣの移植は、低い継代のｍＵＣＢ由来ＭＳＣによる移植とは異なって、有意な運動利益を付与することを観察した。残念なことに、潜在的な多能性起源およびより高い継代数による核型突然変異の高い危険性は、臨床適用を危険にさらす。
【００８６】
これらの研究とは対照的に、本発明は、例えば、古典的なＩＶの送達経路を通じて、低侵襲的な投与でされ効果的である、国際細胞治療学会によって定義されたＭＳＣに典型的な免疫表現型を有するＩＤＰＳＣの固有集団を使用する神経学的疾患および状態を治療する方法を提供する。
【００８７】
想定されたＭＳＣを用いてＨＤを治療するこれらの以前の研究によって示されるように、神経変性疾患を治療するための１つの望みは幹細胞を使用することである。残念なことに、線条体への胎児ドナー組織の投与による治療のみが臨床試験に進んだが、それはほんの小規模な試験であった。
【００８８】
ＨＤにおける細胞療法は、疾患に罹りやすいニューロン集団を保護し、および／または機能不全もしくは瀕死のニューロンを置換することを意図している。したがって、ＨＤ細胞療法における臨床的進展は、胎児由来細胞を、罹患した線条体に移植するためのプロトコールの確立に中心を置いている。この戦略は、クリニックでの幹細胞療法の開発を支援しており、数年間の改善および安定性を提供するが、疾患の永続的治癒を提供するものではない（Ｂａｃｈｏｕｄ−Ｌｅｖｉら、２００６）。患者の術後期間の３〜１０年の長期間にわたる追跡は、ＨＤにおける胎児線条体の同種異系移植が安全であることを結論付けている。しかしながら、ＨＤを有する患者におけるより成功した移植についての他の報告と比較して、おそらくこの安全性研究において移植された細胞の量が少ないため、持続的な機能的利益は見られなかった（Ｂａｒｋｅｒら、２０１３年）。
【００８９】
幹細胞療法の使用は、細胞内および細胞機構がＨＤ表現型に関与するため不可避である。幹細胞療法はまた、脳組織再生のプロセスを加速させ得る。幹細胞は重要な治療法であり、ＨＤにおいて最も損傷を受けた脳の領域を再構築するのに役立つ。唯一の薬物アプローチは、特にＨＤの後期段階において損傷した脳領域を再構築することができない。
【００９０】
ＭＳＣは、酵素消化（Ｇｒｏｎｔｈｏｓら、２０００年；Ｍｉｕｒａら、２００３年）によって、または国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ１４／５９８５０号および米国特許出願第１４／２１４０，０１６号に開示されている臓器培養、続く外植片（未成熟歯髄幹細胞、ＩＤＰＳＣ）技術によって、抽出されたヒトの永久歯と乳歯の両方から得ることができる。ＩＤＰＳＣは、異所的に外胚葉性間充織組織に由来し、より正確には、胚の初期形成に存在する組織の塊である神経堤に由来する歯髄組織から得られる。それは最終的に、首および頭蓋の硬組織および軟組織を形成する。
【００９１】
神経堤起源であるＩＤＰＳＣは、出生前に様々な、主に外胚葉組織に移行し、自己再生能力を有し、胚性幹（ＥＳ）細胞とほぼ同じである発生可能性を示すことが公知であるが、インビトロでの胚体の形成およびインビボでの奇形腫の形成の危険性はない（ＫｅｒｋｉｓおよびＣａｐｌａｎ、２０１２年）。神経堤起源の移動後の幹細胞は、全ての頭蓋顔面骨、中枢および末梢神経系の細胞および組織の大部分、ならびに、とりわけ心臓血管系の平滑筋細胞、皮膚の色素細胞、軟骨、結合組織、角膜上皮および歯髄などの一部の非神経細胞型を発生する。神経堤起源の移動後の出生後幹細胞は、発生の可能性が限られているものであるが、それらは、それらの胚対応物に似た機能的特徴および広範囲の細胞型に分化する能力を維持する（Ｌｅ  Ｄｏｕａｒｉｎら、２００４年、２００７年、２００８年；Ｄｕｐｉｎら、２００７年；Ｌｅ  ＤｏｕａｒｉｎおよびＤｕｐｉｎ、２００３年、２０１２年）。
【００９２】
インビトロのＩＤＰＳＣは、ニューロンおよびグリア細胞への均一な分化を受ける。ヒトＩＤＰＳＣのインビボ移植は、ニューロンを含む様々な組織において高密度の生着を示した。ニューロンの運命の分化は、それらの異なる発生学的起源に基づいて、軸性骨および虫垂骨（骨髄および回腸紋）におけるものと比較して、歯髄を含む口腔骨のエピジェネティックな「記憶」に基づく。上顎、下顎、例えば歯槽骨（すなわち、象牙質、歯髄および歯周靱帯）は、神経堤細胞によってのみ形成される一方で、軸性骨および虫垂骨は中胚葉から発生する。したがって、ＩＤＰＳＣは、神経再生および神経保護の可能性を有する。
【００９３】
Ｌｏｇａｎ  Ａらは、複数のＮＴＦ（神経栄養因子）が、神経保護に相乗効果をもたらすために細胞によって生成されるべきであることを記載している。したがって、ｈＩＤＰＳＣ細胞は、複数のＮＴＦを発現し、放出することが重要である。最近の刊行物は、ＮＧＦ（神経増殖因子）、ＢＤＮＦおよびＮＴ３などの多数のＮＴＦの遺伝子発現を伴う、神経支援における歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）作用のパラクライン機構の証拠を報告しており、その結果は、ｈＩＤＰＳＣが、ｈＢＭＳＣ（骨髄由来ＭＳＣ）またはｈＡＭＳＣ（脂肪組織由来ＭＳＣ）のいずれかよりも軸索切断されたＲＧＣの神経保護および神経発生を有意に促進することを実証している（Ｍｅａｄ  Ｂら、２０１３年；Ｍｅａｄ  Ｂら、２０１４年；Ｍａｒｔｅｎｓ  Ｗら、２０１３年）。硝子体内に移植されたＤＰＳＣは、網膜治療のために、ＢＭＳＣよりもより適切な細胞型として示唆された（Ｍｅａｄ  Ｂら、２０１４年）。これらの研究は、トリプシンを用いて成体ラットに酵素的に由来するＤＰＳＣ（＝ＳＨＥＤ）を用いた。
【００９４】
加えて、最近では、病変部位に近接しておよび直接的に直接的な硬膜移植によるＳＨＥＤの移植を伴う、脊髄損傷のげっ歯類モデルを用いた研究の結果によって強化されており、ＳＨＥＤは、細胞自律神経とパラクライン神経再生活性の両方を通じた神経保護および神経再生に関して、３つのヒト皮膚線維芽細胞株よりも優れていた（Ｓａｋａｉら、２０１２年）。これらの研究では、コラゲナーゼを用いて、未成熟および成人の親知らずから酵素的に由来する培養ＤＰＳＣを用いた。ＤＰＳＣの移植中に、動物はまた免疫抑制のためにシクロスポリンで処置された。
【００９５】
幹細胞の全身投与の安全性
移植が自家移植でない限り、宿主の免疫系が移植を攻撃する危険性は常に存在する。十分に一致した同種移植であっても、免疫抑制前処置を必要とする。これは、幹細胞移植にも適用される。
【００９６】
宿主の免疫系が、移植された細胞を攻撃するのを避けるために、治療的幹細胞集団は免疫原性ではないことが必要である。免疫原性は、移植後に宿主免疫系に直面した場合、同種異系幹細胞が免疫応答を引き起こす能力である（Ｓｃｈｕ  Ｓら、２０１２年）。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のミスマッチによるＮＰＣの、マウス肝炎ウイルス誘導性ＣＮＳ脱髄マウスへの移植は、Ｔ細胞浸潤およびＮＰＣ拒絶の増加をもたらした（Ｗｅｉｎｇｅｒ  ＪＧら、２０１２年）。しかしながら、最近の証拠は、未分化の成人幹細胞が免疫学的に特権的な地位を与えられ、同種異系拒絶反応の通常のプロセスを逃れることができる可能性を支持している（Ｂｉｆａｒｉ  Ｆら、２０１０年）。細胞がＭＨＣの発現を欠く場合、細胞集団に対して免疫学的に特権を有する状態があり得る。例えば、ＭＨＣのヒトバージョンであるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対して本質的に対して陰性である幹細胞集団によって、ヒトにおける免疫原性は生じ得ない。したがって、ＩＤＰＳＣの品質管理特性であるＨＬＡ−ＤＲの不存在は、患者に対する毒性免疫抑制前処置を必要とせずに、全身細胞療法に使用される細胞の必須マーカーである。
【００９７】
幹細胞移植の別の危険性は、これらの細胞が他の細胞型へ分化する可能性があるため、特に未分化細胞の腫瘍発生の危険性が高いことである。多能性幹細胞、特にｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ細胞は、インビトロで胚様体およびインビボで奇形腫に似た球体を形成することができる。多能性細胞を適用するために現在利用可能な全ての技術は、腫瘍原性危険性を保持する。特定の遺伝子の発現および発現の欠如は、幹細胞集団の全身投与を可能にする危険性を低下させる。
【００９８】
Ｎａｎｏｇは、内部細胞塊の多能性細胞の維持および胚性幹細胞の形成に関連する転写因子である。Ｎａｎｏｇは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、および転写非依存性因子３（ＳＴＡＴ−３）の活性化因子である。それは、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２によって調節され、順にそれぞれのプロモーター遺伝子領域に結合することによってＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびそれ自体の発現を正に調節する（Ｂｏｙｅｒら、２００５年；Ｌｏｈら、２００６年；Ｌｉ、２０１０年）。まとめると、これらの３つの転写因子は、多能性幹細胞の分化を防止する上で本質的な役割を果たす（Ｂｏｙｅｒら、２００５年）。ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧを有するトランスフェクション細胞核は、成人体細胞における多分化能（ｉＰＳＣの生成）を誘導するのにすでに十分であったが、次に、胚性幹細胞の理論的特徴の完全パターン：生体における２００種類の細胞への分化、無制限の拡大増殖、再生可能性、胚体形成、奇形腫形成へと導く。奇形腫形成は、細胞療法における安全性の主な脅威である。しかしながら、核内でｎａｎｏｇが発現しないことは、幹細胞集団が全身投与に適しているかどうかを決定するための必須の安全性マーカーである。インビボでの未分化幹細胞の腫瘍原性の欠如は、核内にｎａｎｏｇが存在しないことを必要とする。したがって、不活性なｎａｎｏｇを発現する未分化幹細胞、すなわち、細胞質に局在するｎａｎｏｇはまたインビボで腫瘍原性を欠く。
【００９９】
全身投与に適した幹細胞集団のもう１つの重要な安全性マーカーは、ｐ５３の発現である。このタンパク質は、多細胞生物において重要であり、そこでは、細胞周期を調節し、したがって、腫瘍抑制因子として機能することによって癌を予防する。
【０１００】
ＡＢＣＧ２タンパク質発現はまた、幹細胞集団が全身投与に適していることを示す安全性マーカーである。ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）、ＡＢＣＧ２タンパク質（ＢＣＲＰ）発現は、ＭＳＣ未分化集団表現型の重要な決定因子である。ＡＢＣＧ２は、その発現が分化とともに急激に下方制御されるため、様々な供給源からの未分化幹細胞のマーカーとして役立つ可能性がある。特に、アルツハイマー病（Ａ〜Ｄ）を伴うＡＢＣＧ２トランスポーターは、ＡＤ症例および対照において組織病理学的に確認されたように、能動的にＡβを輸送する。ゲノムワイド関連研究（Ｂｅｒｔｒａｍ  Ｌら、２００７年）は、遺伝的変異体を含む、ＡＤ危険性を調節する同定された遺伝子を、ＡＢＣ遺伝子の変異体であるＡＢＣＡ７と結びつけた。ＡＤ中のＡＢＣＡ７発現の増加は疾患進行をブロックするには不十分であるが、ＡＢＣＡ７発現の増加はＡＤ危険性を低下させることが結論付けられた（Ｊａｒｅｄ  Ｂら、２０１４年）。
【０１０１】
したがって、本発明の医薬組成物の一部の実施形態は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、不活性なｎａｎｏｇ、ｐ５３、およびＳＯＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの安全性マーカーを発現する神経堤起源の組織由来の幹細胞を含む。一部の態様では、少なくとも１つの安全性マーカーは、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、不活性なｎａｎｏｇ、およびｐ５３からなる群から選択される。ＩＤＰＳＣは、ＡＢＣＧ２およびｐ５３の高い発現を有するが、不活性なｎａｎｏｇおよびＳＯＸ２の発現は低い。例えば、少なくとも１つの安全性マーカーがＡＢＣＧ２またはｐ５３である場合、医薬組成物の幹細胞の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％が少なくとも１つの安全性マーカーを発現する。他方、少なくとも１つの安全性マーカーが不活性なｎａｎｏｇまたはＳＯＸ２である場合、幹細胞の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または５％以下が少なくとも１つの安全マーカーを発現する。一部の態様では、医薬組成物の幹細胞は、ＡＢＣＧ３、ｐ５３、不活性なｎａｎｏｇ、およびＳＯＸ２を同時発現し、少なくとも７５％の幹細胞はＡＢＣＧ２を発現し、少なくとも７５％の幹細胞はｐ５３を発現し、５％以下の幹細胞は不活性なｎａｎｏｇを発現し、３０％以下の幹細胞はＳＯＸ２を発現する。
【０１０２】
医薬組成物の別の実施形態は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（neutrotrophin）−３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン（neutrotrophin）−４（ＮＴ４）、ニューロトロフィン（neutrotrophin）−５（ＮＴ５）、およびｐ７５からなる群から選択される少なくとも１つの神経上皮幹細胞マーカーを発現する神経堤起源の組織由来の幹細胞を含む。一部の態様では、幹細胞は、少なくとも１つの神経上皮幹細胞マーカーの高発現を有する。例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、または９０％の細胞は、少なくとも１つの神経上皮幹細胞マーカーを発現する。一部の実施形態では、医薬組成物の幹細胞は、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５を同時発現する。
【０１０３】
一部の態様では、これらの実施形態の医薬組成物は、ＨＬＡ−ＤＲに対して陰性である神経堤起源の組織由来の幹細胞を含む。医薬組成物の幹細胞はまた、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬｆ−４、およびＲＥＸ−１からなる群から選択される特定のＭＳＣマーカーに対して陰性であり得る。好ましい実施形態では、医薬組成物の幹細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬｆ−４、およびＲＥＸ−１に対して陰性である。
【０１０４】
医薬組成物の様々な実施形態を組み合わせることもできる。例えば、医薬組成物は、ＡＢＣＧ２、不活性なｎａｎｏｇ、およびｐ５３から選択される少なくとも１つの安全性マーカーを発現する神経堤起源の組織からの幹細胞を含み得、さらに、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５からなる群から選択される少なくとも１つの神経上皮幹細胞マーカーを発現し得る。別の例として、医薬品は、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５からなる群から選択される少なくとも１つの神経上皮幹細胞マーカーを発現し、さらに、ＡＢＣＧ２、不活性なｎａｎｏｇ、ｐ５３、およびＳＯＸ２から選択される少なくとも１つの安全性マーカーを発現する神経堤起源の組織由来の幹細胞を含み得る。
【０１０５】
医薬組成物の使用方法
本発明は、本発明の医薬組成物を対象に全身投与することを含む、神経学的疾患および状態を治療する方法を提供する。一部の実施において、神経学的疾患および状態を治療するこれらの方法は、神経変性疾患のモデルにおいて神経発生を促進し、保護的である。一部の実施形態では、ＩＶ投与などの幹細胞集団の全身投与は、脳への細胞の直接送達をもたらす。一部の態様では、神経発生は、移動および分化させるために、自己分化しおよび／または固有の幹細胞を活性化する幹細胞集団によって起こる。一部の態様では、神経発生は、好ましくはドーパミン関連性である。
【０１０６】
本方法の一部の実施形態では、神経学的疾患または状態は、血液／脳関門（ＢＢＢ）を通過し、神経発生を誘導する幹細胞によって治療される。一部の態様では、幹細胞は、ＢＢＢの通過後に、線条体を含む脳実質内に直接移植される。一部の実施形態では、誘導された神経発生はドーパミン関連性である。例えば、ドーパミン関連性の神経発生は、幹細胞の自己分化、または外因性幹細胞による内因性幹細胞の移動および分化の活性化を介して起こる。一部の態様では、大量のドーパミン関連性の神経発生は、脳室下帯（ＳＶＺ）において起こる。
【０１０７】
一部の実施では、本方法は、対象におけるＤＡ受容体の量を測定することをさらに含む。一部の実施形態では、対象におけるＤＡ受容体の量の測定は、対象を画像化してＤＡ受容体を検出することを含む。本方法の最も好ましい実施形態では、神経発生は、ドーパミン受容体Ｄ２によって媒介され、したがって、一部の実施形態では、測定されるＤＡ受容体は受容体Ｄ２である。
【０１０８】
本方法の一部の実施形態では、医薬組成物は神経保護を提供する。例えば、高い基礎レベルの、神経栄養因子および免疫保護因子の発現、ならびに医薬組成物の幹細胞の放出パターンを有する全身神経保護が提供される。一部の態様では、医薬組成物のこれらの幹細胞はＩＤＰＳＣである。
【０１０９】
神経学的疾患および状態には、例えば、自閉症、統合失調症、てんかん、脳卒中および虚血、神経変性疾患もしくは状態、運動障害、またはけいれん性障害が含まれる。神経変性疾患または状態は、例えば、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病、およびハンチントン病であり得る。運動障害には、例えば、トゥレット症候群、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性球麻痺、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ポリオ後症候群（ＰＰＳ）が含まれる。けいれん性障害には、例えば、てんかんが含まれる。
【０１１０】
一部の実施では、神経学的疾患および状態を治療する方法は、初期ＨＤと診断された対象における自然の神経保護機構を支持する。他の実施では、神経学的疾患および状態を治療する方法は、ＰＤと診断された対象における喪失したＤＡニューロンを修復する。
【０１１１】
本発明はまた、ＨＤの危険性がある対象のための予防的治療としての医薬組成物の使用方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、不活性なｎａｎｏｇ、およびｐ５３からなる群から選択される少なくとも１つの安全性マーカーを発現する神経堤起源の組織由来の未分化幹細胞を含む、神経学的状態を治療するための、対象に全身投与するための医薬組成物を対象とする。特定の態様では、不活性なｎａｎｏｇは、未分化幹細胞の細胞質に主に局在する、発現されたｎａｎｏｇである。別の態様では、少なくとも１つのマーカーがＡＢＣＧ２またはｐ５３である場合、未分化幹細胞の少なくとも７５％は少なくとも１つのマーカーを発現する。さらに別の態様では、少なくとも１つのバイオマーカーがｎａｎｏｇである場合、５％以下の未分化幹細胞は少なくとも１つのマーカーを発現する。
【０１１２】
一部の実施形態では、未分化幹細胞は、ＡＢＣＧ２、不活性なｎａｎｏｇ、およびｐ５３を発現する。一態様では、未分化幹細胞の少なくとも７５％がＡＢＣＧ２を発現し、未分化幹細胞の少なくとも７５％がｐ５３を発現し、未分化幹細胞の５％以下が不活性なｎａｎｏｇを発現する。別の態様では、未分化幹細胞はＳＯＸ２をさらに発現し、未分化幹細胞の３０％以下がＳＯＸ２を発現する。さらに別の態様では、未分化幹細胞は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（neutrotrophin）−３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン（neutrotrophin）−４（ＮＴ４）、ニューロトロフィン（neutrotrophin）−５（ＮＴ５）、およびｐ７５からなる群から選択される少なくとも１つの神経上皮幹細胞マーカーを発現することができる。
【０１１３】
他の実施形態では、未分化幹細胞は、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５を発現する。一実施形態では、本発明は、神経堤起源の組織由来の未分化幹細胞を含む神経学的状態を治療するための、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、ｐ７５からなる群から選択される少なくとも１つの神経上皮幹細胞マーカーを対象に全身投与するための医薬組成物を対象とする。
【０１１４】
特定の態様では、未分化幹細胞は、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５を発現する。他の態様では、未分化幹細胞は、ＡＢＣＧ２、不活性なｎａｎｏｇ、ｐ５３、およびＳＯＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの安全性マーカーをさらに発現する。特定の態様では、不活性なｎａｎｏｇは、未分化幹細胞の細胞質に主に局在する、発現されたｎａｎｏｇである。
【０１１５】
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのマーカーがＡＢＣＧ２またはｐ５３である場合、少なくとも７５％未分化幹細胞が少なくとも１つのマーカーを発現する。特定の態様では、未分化幹細胞は、ＨＬＡ−ＤＲに対して陰性である。一実施形態では、神経堤起源の組織は歯髄である。さらに他の態様では、神経堤起源の未分化幹細胞は未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）である。
【０１１６】
別の態様では、本発明は、ＡＢＣＧ２、不活性なネスチン、およびｐ５３からなる群から選択される少なくとも１つの安全性マーカーを発現する、神経堤起源の組織由来の未分化幹細胞を含む医薬組成物を対象に全身投与することを含む、神経学的疾患または状態を治療する方法を提供する。一部の態様では、医薬組成物の未分化幹細胞は、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５からなる群から選択される少なくとも１つの神経上皮幹細胞マーカーをさらに発現する。
【０１１７】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＢＤＮＦ、ＮＦ３、ＮＴ４、ＮＴ５、およびｐ７５からなる群から選択される少なくとも１つの神経上皮幹細胞マーカーを発現する神経堤起源の組織由来の未分化幹細胞を含む医薬組成物を対象に全身投与することを含む、神経学的疾患または状態を治療する方法を対象とする。
【０１１８】
特定の実施形態では、医薬組成物の未分化幹細胞は、ＡＢＣＧ２、不活性なネスチン、ｐ５３、およびＳＯＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの安全性マーカーをさらに発現する。
【０１１９】
他の態様では、対象は、医薬組成物を静脈内投与される。一部の実施形態では、神経学的疾患または状態は、血液／脳関門を通過して、神経発生を誘導する未分化幹細胞集団によって治療される。一態様では、神経学的疾患または状態は、ドーパミン関連性の神経発生を介して神経発生を誘導する未分化幹細胞によって治療される。別の態様では、ドーパミン関連性の神経発生は、未分化幹細胞の自己分化、または未分化幹細胞による固有の幹細胞の移動および分化の活性化によるものである。
【０１２０】
特定の実施形態では、医薬組成物の未分化幹細胞は、神経栄養因子および免疫保護因子を提供する。他の実施形態では、医薬組成物の未分化幹細胞は、全身神経保護を提供する。一実施形態では、未分化幹細胞は、対象に対して自家および／または同種異系である。
【０１２１】
特定の態様では、神経学的疾患または状態は、神経変性疾患または神経変性状態である。神経変性疾患または神経変性状態は、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病、およびハンチントン病（ＨＤ）からなる群から選択され得る。
【０１２２】
一部の態様では、この方法は、対象に医薬組成物を全身投与することを含み、対象は初期ＨＤと診断され、対象における自然の神経保護機構を支持する。他の態様では、本方法は、対象に医薬組成物を全身投与することを含み、対象はＰＤと診断され、対象における喪失したドーパミン作動性ニューロンを修復する。別の実施形態では、神経学的疾患または状態は、自閉症、統合失調症、脳卒中、および虚血からなる群から選択される。他の実施形態では、神経学的疾患または状態は、運動障害およびけいれん性障害からなる群から選択される。
【０１２３】
特定の態様では、対象には、医薬組成物の単回投与が投与される。一実施形態では、対象は、医薬組成物の単回静脈内注射が投与される。さらに他の実施形態では、対象には、医薬組成物の第１および第２の投与が投与される。
【０１２４】
他の実施形態では、対象には、医薬組成物の第１および第２の静脈内注射が投与される。一部の態様では、医薬組成物の第２の投与または静脈内注射は、第１の投与または静脈内注射の少なくとも７日後に行われる。
【０１２５】
一態様では、この方法は、対象におけるＤＡ受容体の量を測定することをさらに含む。別の態様では、この方法は、対象におけるＤＡ受容体の量を測定することを含み、対象を画像化してＤＡ受容体を検出することを含む。一態様では、ＤＡ受容体は受容体Ｄ２である。
【０１２６】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、限定的に解釈されるべきではない。本出願を通して引用される全ての参考文献、特許、および公開された特許出願ならびに図面の内容は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１２７】
実施例１．初期および後期採取ＩＤＰＳＣの特徴付けならびに初期および後期採取ＩＤＰＳＣからの神経細胞およびグリア細胞の誘導
初期および後期採取ＩＤＰＳＣの特徴付け
初期（ｎ＝８）および後期（ｎ＝４）採取物（表１）からのｈＩＤＰＳＣの特性を特徴付けるために、間葉系マーカーＣＤ１３、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４４のフローサイトメトリー分析を行った。ＦＡＣＳ実験は、２×１０５細胞を用いて行った。細胞をＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）で２回洗浄し、試験した抗体を１５分間、室温で添加した。次に、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎフローサイトメーターで分析した。ＰＥ（ＦＬ２）、ＦＩＴＣ（ＦＬ１）、ＡＰＣ（ＦＬ４）の蛍光をそれぞれ５７５ｎｍ、５３ｎｍ、および６００ｎｍの発光波長で検出した。
【０１２８】
【表１】
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【０１２９】
初期採取物と後期採取物の両方からの細胞は、高レベルの間葉系マーカーを発現した。両方の集団は、これらの細胞集団の同種異系移植を可能にするＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＡＢＣ抗原発現について陰性であった。両方の集団は、ＣＤ１３およびＣＤ４４他などの間葉系幹細胞マーカーに対して二重免疫陽性であり、ならびにネスチン、Ｐ７５（ＣＤ２７１）、神経上皮幹細胞マーカー、および神経増殖因子（ＮＧＦ）を発現した（図１および２Ａ〜２Ｌ、ならびに表２参照）。それらは、ＣＤ１４６およびＨＬＡ−ＡＢＣに対して陰性であった。
【０１３０】
ＤＰ組織の多重採取および外植片培養後、ＩＤＰＳＣは、コロニーを形成する能力を示す（図３）。コロニー形成アッセイ（ＣＦＵ−Ｆ）アッセイは、各プレートに播種した４８０個の細胞を用いてＴ２０、Ｐ３で三連で行われ、８日目に複数のコロニーが現れ、各プレートに約１００個のコロニーが形成された（図３）。コロニー形成能は、幹細胞の主要な特徴の１つである。したがって、本発明者らは、開示された多重採取臓器および組織外植片法を用いて細胞を得た場合、この能力が維持された（mantained）と結論付ける。さらに、ＬＰ  ＩＤＰＳＣの増殖活性を図４に示されるように評価した。これらの細胞は、非常に高い増殖速度を示した。
【０１３１】
【表２】
2019510758.tif 000003
【０１３２】
表２は、同じドナーに由来するｈＩＤＰＳＣの異なる採取物からの細胞マーカー発現を比較する（すなわち、Ｈ０Ｐ３＝最初の採取物；Ｈ１３Ｐ３＝後期の採取物；Ｈ１６Ｐ９＝最後の採取物）。後期採取集団は、初期採取集団よりも高いレベルのＮＧＦを有していた。アデノシン三リン酸結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターの発現もまた細胞において試験された。ＡＢＣトランスポーターは、生体膜を横切る極めて多様な基質の能動輸送に関与している。これらのトランスポーターは、一般的に、多剤耐性の発生に関与し、また、脂質輸送、細胞移動および分化を含む多数の生理学的および恒常的プロセスに関与している。さらに、ＡＢＣトランスポーターが表現型マーカーおよび幹細胞の機能調節因子として役立つという証拠がある（Ｂｕｎｔｉｎｇ、２００２年）。初期と後期の採取集団の両方は、ＭＤＲ１遺伝子産物であるＡＢＣＢ１タンパク質を発現したが、後期採取物において発現がより高かった。Ｉｓｌａｍら（２００５年）によると、ＡＢＣＢ１は、ヒト胎児神経幹／前駆細胞（ｈＮＳＰＣ）において発現される。
【０１３３】
ＦＡＣＳ分析は、ＩＤＰＳＣのＬＰ（バッチ＃１１）が、ＢＤＮＦおよびＤＡＲＰＰ３２を発現する約８０％の細胞を含む一方で、ＥＰは、これらのマーカーについて陰性であり（データは示さず）、Ｄ２を発現する細胞は非常に少ないことを示す（図３）。ｈＩＤＰＳＣの初期採取物および後期採取物をさらに特徴付けるために、培地中のＢＮＤＦの量によって表される全脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）レベルをＥＬＩＳＡを用いて決定した（表３）。ＢＤＮＦレベルは、製造業者のプロトコールに従って、ヒトＢＤＮＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用することによって定量化された。様々な採取物由来の細胞（１×１０６）を７５ｃｍプラスチックフラスコに接種した。接種の約４日後に上清を採取した。結果をＢＤＮＦ濃度として表した。ＢＤＮＦは、全ての細胞サブセットにおいて分泌されたが、そのレベルは、後期採取物において４〜１０倍高かった。
【０１３４】
【表３】
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【０１３５】
他のＭＳＣとの比較はｈＩＤＰＳＣが非常に多くのＢＤＮＦを分泌することを示す
１×１０６個のｈＩＤＰＳＣによって分泌されるＢＤＮＦの平均レベルは６５８９ｐｇであり、これは、Ｇｏｔｈｅｌｆら、２０１４年（Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１４年、３巻：２１頁）のＭＳＣなどのＢＮＤＦを分泌する他のタイプのＭＳＣよりも数倍高い。Ｇｏｔｈｅｌｆらは、１ｍＭのジブチリルサイクリック１５ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）、５ｎｇ／ｍｌのヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、および５０ｎｇ／ｍｌのヒトヘレグリンβ１を含有する培地中でＢＭ−ＭＳＣを７２時間インキュベートすることによって、神経栄養因子分泌細胞（ＢＭ−ＭＳＣ−ＮＴＦ）に分化させるために骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）を誘導した。誘導培地はＢＤＮＦ分泌をほぼ倍増させたが（１６４０ｐｇのＢＮＤＦ／１０６ＢＭ−ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞と比較して８２７ｐｇのＢＮＤＦ／１０６ＢＭ−ＭＳＣ）、ｈＩＤＰＳＣはなおもＢＭ−ＭＳＣ−ＮＴＦよりも４倍多くＢＤＮＦを分泌した。したがって、ｈＩＤＳＰＣは、神経栄養因子を分泌するように誘導された骨髄由来ＭＳＣよりも非常に大きな神経保護能を有する。
【０１３６】
Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびｐ５３の発現
ＭＳＣは、一般的に、文献（Ｊｉａｎｇら、２００２年；Ｇｕｉｌｌｏｔら、２００７年）に記載されているように、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２などの多能性マーカーを低レベルで発現することが公知である。本発明者らは、ｈＩＤＰＳＣが、ヒト胚性幹細胞、およびさらにはｈＩＤＰＳＣから得られた誘導多能性幹細胞と比較して、非常に低レベルのこのようなマーカーを発現することを示した（図５参照）。さらに重要なことに、本発明者らは、ｈＩＤＰＳＣが高レベルのｐ５３を発現することを実証した。腫瘍抑制遺伝子ｐ５３は、癌を食い止めるのに役立つマスター調節因子として周知である。ｐ５３経路をブロックすることにより、分化した細胞を誘導多能性幹細胞に形質転換することの容易さおよび効率が大幅に改善される（Ｄｏｌｇｉｎ、２００９年）。
【０１３７】
初期採取および後期採取ＩＤＰＳＣからの神経細胞およびグリア細胞の誘導
ニューロン系は、２つのクラスの神経先駆細胞：ニューロンに分化するニューロンＮＰＣ、およびグリアに分化するグリアＮＰＣからなる。ニューロンＮＰＣとグリアＮＰＣの両方は、同じ神経外胚葉先駆体に由来する。神経先駆細胞の第３のクラスである神経膠芽細胞（neuroglioblast）もまた示唆された。この第３のクラスの細胞は、放射状グリア細胞を含み、またニューロン先駆体として作用することができ、後期にのみ、神経発生後には星状細胞の排他的な世代にシフトする。
【０１３８】
細胞療法における細胞の集団がニューロンＮＰＳまたはグリアＮＰＣであるかどうかを区別する能力は、主としてグリアとニューロン両方の損傷または喪失を伴う神経変性疾患を治療するための効率的な細胞療法戦略を開発するために極めて重要である。分化させるためにこれらの細胞を誘導することによって、ニューロンまたはグリアに分化する可能性について公知の細胞集団を試験することが可能である。
【０１３９】
ニューロンおよびグリアを生成するためのＥＰ（初期集団）およびＬＰ（後期集団）ＩＤＰＳＣの能力は、以前に記載されたプロトコール（Ｋｅｒｋｉｓら、２００６年）に従って、初期（Ｐ２）および後期継代（Ｐ７）でＥＰおよびＬＰ  ＩＤＰＳＣにおいてニューロン分化を誘導することによって試験された（図６）。７日後、細胞を収集し、ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）およびβ−ＩＩＩ−チューブリン抗体をそれぞれ用いてフローサイトメトリーにより分析した。ＥＰ（Ｂ〜Ｅ、左）とＬＰ（Ｂ〜Ｅ、右）の間にこれらのマーカーを発現する細胞数には有意差が存在し、これは歯髄（ＤＰ）採取プロトコールに従って確立された。他方、酵素消化後に得られた異なる継代（Ｐ２およびＰ７）間で、両方のタンパク質の発現に有意差は検出されなかった（図６）。驚くべきことに、ＩＤＰＳＣはニューロンＮＰＣおよびグリアＮＰＣであり得る。初期ＤＰ採取（ＥＰ  ＩＤＰＳＣ）は、主にグリア分化に傾倒した神経前駆細胞の単離へと導く一方で、後期ＤＰ採取（ＬＰ  ＩＤＰＳＣ）は、主にニューロン分化に傾倒した神経前駆細胞の単離へと導く。
【０１４０】
したがって、ＤＰ採取は、ニューロンおよびグリアに発生する可能性のあるＮＰＣ集団を確立するために重要である。ヒト乳歯からの幹細胞であるＳＨＥＤは、ＤＰ採取なしに歯髄細胞から単離された幹細胞であるため、初期集団または後期集団に分類することができない。単一のＳＨＥＤ集団は、ニューロンに傾倒し、グリアに傾倒しない前駆体を含有する。Ｍｉｕｒａら、（２００３年）において、ＳＨＥＤのニューロン分化は、β−ＩＩＩチューブリン、ＧＡＤ、およびＮｅｕＮの発現の増加をもたらし、一方でネスチン、ＧＦＡＰ、ＣＮＰアーゼ、およびＮＦＭの発現は、分化の誘導後も同じままであった（Ｍｉｕｒａの図４Ｉ参照）。
【０１４１】
実施例２．初期（ＥＰ）および後期（ＬＰ）ｈＩＤＰＳＣにおけるＣＤ１４６およびＣＤ１３の発現
ＣＤ１４６およびＣＤ１３発現は、ＥＰ−ｈＩＤＰＳＣおよびＬＰ−ｈＩＤＰＳＣにおけるフローサイトメトリーによって分析された。図７の結果は、ＣＤ１３が５２％のＥＰ−ｈＩＤＰＳＣにおいて発現され、９５％のＬＰ−ｈＩＤＰＳＣにおいて発現されたことを示す。これらの結果は、インビトロのＤＰ採取およびｈＩＤＰＳＣ継代手順が、ＣＤ１３を発現し、ＣＤ１４６の発現を欠くｈＩＤＰＳＣの量を増加させたことを実証している。
【０１４２】
実施例３．ＩＤＰＳＣとＳＨＥＤの比較
異なる供給源（例えば、骨髄および脂肪組織）由来のＭＳＣは、異なる刺激に対して異なる応答をすることができる（Ｆｒａｓｅｒ  ＪＫら、２００６年）。培養条件（例えば、ヒト血清もしくはウシ胎児血清（ＦＣＳ）のいずれかが補充された、または無血清の培地）はまた、同じ起源のＭＳＣでさえも分化能に影響を及ぼし得る（Ｌｉｎｄｒｏｏｓら、２０１１年；Ｌｉｚｉｅｒら、２０１２年）。分化効率の差は、ＭＳＣ集団の異種性（すなわち、異なる亜集団の存在）を極度に反映している可能性が非常に高い（Ｈｏら、２００８年；Ｔｏｒｍｉｎら、２００９年；Ｍａｒｅｄｄｙら、２００９年；Ｒａｄａら、２０１１年）。異なる群によって使用される異なる単離および培養プロトコールは、明確な分化能を有する特定のＭＳＣ亜集団の優位性を説明することができる（Ｈｏら、２００８年；Ｐｅｖｓｎｅｒ−Ｆｉｓｃｈｅｒら、２０１１年；Ｒａｄａら、２０１１年）。
【０１４３】
ＳＨＥＤおよびＩＤＰＳＣは異なる単離方法があり、異なる幹細胞ニッチに由来する。したがって、ＳＨＥＤおよびＩＰＳＣもまた、幹細胞マーカーの異なる発現を有することは驚くべきことではない（表４参照）。ＳＨＥＤは血管周囲環境に由来し、ＳＴＲＯ−１およびＣＤ１４６陽性細胞は、免疫組織化学的染色によって歯髄残遺物の血管周辺に位置することが判明した。エクスビボで拡大増殖したＳＨＥＤのうちわずかな割合（９％）のみが、ＦＡＣＳを用いたＳＴＲＯ−１抗体に対して陽性に染色された。
【０１４４】
【表４】
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【０１４５】
分化を誘導するための要件はまた、ＳＨＥＤとＩＤＰＳＣの間で相違する。例えば、ニューロン分化を誘導するために、ＳＨＥＤはＥＧＦ  ２０ｎｇ／ｍｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＦＧＦ  ４０ｎｇ／ｍｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および３％ラット血清を必要とする。それらは、神経の形態を示し、ニューロンマーカーの発現を増加させるために、４週間の神経誘導培養が必要である。
【０１４６】
一つにはこれらの差異のために、ＩＤＰＳＣは神経発生に関してＳＨＥＤよりも利点を有した。ある研究では、ＳＨＥＤを免疫不全マウスの海馬の歯状回に注射した。データは、ＳＨＥＤがマウス海馬において１０日以上、生存することができ、未分化ＳＨＥＤによっても発現されるＮＦＭを発現することができることを実証した（Ｍｉｕｒａら、２００３年）。別の研究では、前分化ＳＨＥＤ（インビトロで７日間、ＥＧＦとｂＦＧＦの組み合わせによって作製されたＳＨＥＤ由来球体）をパーキンソン病ラットに移植した。ラットの２ＤＡ枯渇線条部位（１部位あたり２．５μＬ）に細胞懸濁液（２００，０００／μＬ）を注入した。ＤＡニューロンへの適度な分化が観察された（Ｗａｎｇら、２０１０年）。第３の研究では、出生後５日目のマウスの傷害された脳にＳＨＥＤを注射したが、これは高率の神経学的欠損および死亡を有する周産期低酸素虚血（ＨＩ）で誘導された。シクロスポリンＡは、生着された細胞を異種宿主免疫反応から保護するために使用されたが、それにもかかわらずに、移植の８週間後、生着されたＳＨＥＤは、ニューロン、乏突起膠細胞、または星状細胞に分化した細胞がほとんどないかまたは全くなかった（Ｙａｍａｇａｔａら、２０１３年）。
【０１４７】
３つ全ての実験の共通テーマは、ＳＨＥＤをシクロスポリンＡと一緒に投与したことである。シクロスポリンＡは、ラットの虚血性脳梗塞のサイズを減少させ、外傷性脳梗塞のげっ歯類モデルのシナプス機能障害および細胞死から保護し、ならびにハンチントン病のミトコンドリア機能不全から線条体ニューロンを保護することが示されている（Ｍａｔｓｏｍｏｔｏら、１９９９年；Ａｌｂｅｎｓｉら、２０００年；Ｌｅｖｅｎｔｈａｌら、２００３年）。したがって、パーキンソン病ラットおよびＨＩで観察される利益は、純粋にＳＨＥＤに起因するものでなく、シクロスポリンＡの介入にも起因し得る。
【０１４８】
実施例４．神経学的状態を治療するための他の治療用幹細胞との比較
表５に示されるように、Ａｖｉｔａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＴＤからのｈＩＤＰＳＣは、市場または臨床試験における他の治療用幹細胞よりも有利である。Ａｖｉｔａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＴＤのｈＩＤＰＳＣは、免疫原性の危険性が低い良好な安全性プロファイルを有し、低温保存することができるため、生産コストが低い。
【０１４９】
【表５】
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【０１５０】
実施例５．滅菌ＩＶ注射に使用されるＩＤＰＳＣ（Ｃｅｌｌａｖｉｔａ）の分析証明書
動物モデルへのＩＶ注射に用いられるＩＤＰＳＣの代表的なバッチの分析証明書（表６）により、ＩＤＰＳＣの特徴付けの結果が確認される。
【０１５１】
【表６】
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【０１５２】
実施例６．幹細胞治療の安全な全身投与のためのパラメーターの同定
ＩＤＰＳＣは、Ｏｃｔ４核局在化を示す（図８Ａ〜Ｂ）。ＩＤＰＳＣの大部分は細胞の細胞質にＮａｎｏｇを有するが（図８Ｃ〜Ｄ）、非常に稀な細胞も同様に核局在化を実証する。ＩＤＰＳＣにおけるＳｏｘ２の細胞内局在は主に核である（図８Ｅ〜Ｇ）が、いくつかの細胞もまた細胞質局在を示すことができる。興味深いことに、本発明者らは、両娘細胞においてＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の発現が観察された場合に対称分裂を観察することができる（図８Ｄ〜Ｆ）、分裂後に娘細胞がこれらのマーカーを発現しないかまたは幹細胞の特徴を喪失し、あまり強力でない前駆体または分化した細胞になった場合に非対称分裂を観察することができる（図８Ｅ〜Ｆ）。
【０１５３】
本発明者らのデータは、多能性幹細胞とは対照的に、ＩＤＰＳＣはＭＳＣまたは成人幹細胞に分類されることを実証する。Ｎａｎｏｇの細胞内局在は、タンパク質がほとんど不活性であることを示す。これは、多能性幹細胞と、多能性幹細胞マーカーを発現する成人幹細胞の間の劇的な差異である。これらの細胞は、古典的なＭＳＣよりも未成熟であり、成熟細胞のより広いスペクトルに分化することができるが、Ｎａｎｏｇの不活性状態のために奇形腫を生成することはできない。対称および非対称分裂に関する本発明者らのデータは、これらの細胞が非対称性の神経幹細胞分裂を模倣することを明確に実証している（図９）。
【０１５４】
奇形腫形成は、任意の多能性細胞、例えば、胚性または誘導多能性幹細胞（ＥＳおよびｉＰＳ細胞）の多能性を決定する上で不可欠なツールである。Ｇｒｏｐｐら（２０１２年）によって最近公表されたプロトコールと同様に、細胞の奇形腫形成能を評価するための確立した、一貫したプロトコールを本発明者らの研究に使用した。本発明者らの最近公表された方法は、規定数の未分化のマウスまたはヒトＥＳおよびｉＰＳ細胞ならびにマトリゲルの、免疫不全マウスへの皮下同時移植に基づく。本発明者らの方法は、１０６細胞（１０５細胞を使用するＧｒｏｐｐら、２０１２年とは異なる）のマウスＥＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞を使用した場合、高い再現性および効率を有することが示された。１００％の症例で、本発明者らは、多数の動物および長期の追跡調査（最大６カ月）において奇形腫形成を観察した。本発明者らはまた、乳歯の歯髄、臍帯および脂肪組織に由来するものなどの他の成人ＭＳＣの生体安全性分析にこれらの方法を用いた。
【０１５５】
奇形腫アッセイの主な基準
本発明者らは、奇形腫アッセイのための次の基準を評価した：感度および定量性；最終的な細胞数および単一細胞懸濁液の生産；多能性細胞マーカーおよび核型における発現に関して研究された細胞の免疫表現型決定；マトリゲルと一緒に研究細胞の同時移植。細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下（ｓ．ｃ）移植し、奇形腫の発生を簡単に監視できるようにした。
【０１５６】
腫瘍の発生を４カ月（約１６週間）から監視した。奇形腫の組織学的基準は、多能性細胞の三胚葉に由来する細胞への分化である。このような研究は、通常、病理学者によって行われた。
【０１５７】
成人／間葉系幹細胞では、細胞の注射部位における正常な組織の完全性に対する任意のタイプまたは変化が考慮された。
奇形腫基準の適用
Ａ．実験システム（単数または複数）：
ａ．マウス胚性幹細胞
ｂ．マウス３Ｔ３線維芽細胞、恒久的マウス細胞株Ｂａｌｂｃ  ３Ｔ３細胞株、クローンＡ３１
ｃ．ヒトｉＰＳ−ＩＤＰＳＣ
ｄ．ヒトＥＳ細胞
ｅ．ヒトＩＤＰＳＣ
本発明者らは、本発明者らによって確立された様々なマウスＥＳ細胞株の多能性を特徴付け、ならびに２５回以上の高継代でＥＳ細胞の多能性を確認するため、およびマウスＥＳ細胞株から得られたサブクローンの特徴付けるために、多様な研究において上記方法を使用した（Ｓｕｋｏｙａｎら、２００２年；Ｃａｒｔａら、２００６年；Ｋｅｒｋｉｓら、２００７年；Ｌａｖａｇｎｏｌｌｉら、２００７年；Ｈａｙｓｈｉら、２０１０年）。
【０１５８】
さらに、この方法は、本発明者らのグループのより最近の刊行物（Ｂｅｌｔｒａｏ−Ｂｒａｇａら、２０１１年）において、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）に由来するｉＰＳ細胞の多能性を特徴付けるために使用された。この刊行物では、ヒトＩＤＰＳＣをｉＰＳ−ＩＤＰＳＣの対照として使用した。本発明者らは、ｉＰＳ−ＩＤＰＳＣが、３つの胚層全てに由来する組織を有する立派な奇形腫を形成し、一方でｈＩＤＰＳＣは、任意のタイプの奇形腫または任意の他のタイプの新生物を生成することができなかったことを示した。さらに、ｉＰＳ−ＩＤＰＳＣは核内にＮａｎｏｇを発現し、ｈＩＤＰＳＣは核内に発現させなかった。
【０１５９】
結果
未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）集団を単離するために使用される培養物のような、開示された多重採取外植片は、正常な核型および幹細胞に特徴的な拡大増殖速度を維持しながら、少なくとも１５回の継代中に、胚性幹細胞マーカーＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１、ならびにいくつかの間葉系幹細胞マーカーの発現をもたらす。これらのマーカーの発現は、これらの細胞から得られたサブクローンにおいて維持された。さらに、インビトロで、これらの細胞は、化学的に規定された培養条件下で、平滑筋および骨格筋、ニューロン、軟骨および骨への均一な分化を受けるように誘導することができる。ＩＤＰＳＣは、細胞小器官に乏しい小さなサイズおよび細胞質を有するが、典型的な間葉系線維芽細胞様の形態を呈するナイーブな多能性細胞と異なることを言及することは重要である。したがって、ＩＤＰＳＣは、上皮タイプのものであるＥＳおよびｉＰＳ細胞とは対照的に、間葉系タイプのものである（図８）。ＭＳＣとＥＳまたはｉＰＳ細胞の間の主な相違点は、ＭＳＣが移動して、プラスチックのアンカーリングを行い、細胞外マトリックスを合成し、細胞接合がない細胞であるという点である。
【０１６０】
Ｂ．実験システム：
ａ．初期継代（ｎ＝１０）および後期継代（ｎ＝１０）での３つの異なるＩＤＰＳＣ初代培養
ｂ．ヒト初代線維芽細胞
さらに、この方法は、多能性マーカーも発現する骨髄、肝臓、卵黄嚢、尿嚢および羊水由来のイヌ胎児幹細胞を用いて検証した。
【０１６１】
ＩＤＰＳＣは、多能性マーカーを発現する可変数の幹細胞（細胞の１〜２５％）を有するＭＳＣ集団によって構成される（Ｌｉｚｉｅｒら、２０１２年）。これらの細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝２０）に移植し、腫瘍の発生を４カ月（約１６週間）から監視した。細胞注入部位における正常な組織の完全性に関するあらゆるタイプの変化を考慮した。このプロトコールは、特に、ＩＤＰＳＣの２０％が多能性マーカーを発現することに基づいて計算された、使用された細胞の数に関してＩＤＰＳＣ集団に適合された。ＥＳおよびｉＰＳ細胞を用いた本発明者らの以前の試験では、本発明者らは１０６細胞を使用し、一方でＩＤＰＳＣおよび対照細胞の奇形発生を試験するために、５×１０６細胞を使用した。４カ月後、肉眼的に腫瘍が観察されない場合でさえ、マウスを屠殺し、脳、肺、腎臓、脾臓、肝臓などの様々な臓器から凍結切片を得、病理学者によって分析した。
【０１６２】
全ての研究された臓器内のＩＤＰＳＣのＤＮＡの存在が見出されたが、腫瘍形成もいずれの形態学的変化も観察されなかった。
実施例７．幹細胞治療の有効な全身投与のためのパラメーターの同定
幹細胞の適切な集団を確立するための細胞培養条件
培地および接着表面などの培養条件は、細胞の遺伝子発現に影響し得る。このような遺伝子には、ＡＢＣＧ２およびビメンチンが含まれ、これらは、治療に使用するための培養細胞、特に本発明のような全身細胞系の適合性を示すことができる２つの遺伝子である。試験される最も適切な培地の形態は、ＦＢＳ、抗生物質、およびグルタミン酸塩を５−１０−１５％補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地であり、細胞は接着層なしで（例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および足場なしで）培養されるべきであり、それにより細胞は培養皿またはビーズプラスチックに直接接着する。上皮増殖培地条件で増殖させた細胞は、上皮様細胞に変化する。様々な異種不含有培地を使用するには、増殖因子の補充を必要とし、適切なＥＣＭ被覆の選択は、テルモ（Ｔｅｒｕｍｏ）ホロファイバーバイオリアクター、ビーズを含むエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）−ニューブランズウィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）バイオリアクターなどのバイオリアクターを含む３Ｄ培養条件への現在の細胞のスケールアップに有用であり得る。ＡＢＣＧ２の発現と細胞の未分化状態との関連付けを図１０および図１１に示す。この場合、ＡＢＣＧ２が、変化した培地または被覆層に起因して発現しなくなると、細胞は明らかにより多くの線維芽細胞または上皮細胞様の形態を有することが実証された。別の驚くべき発見は、胚性幹細胞の維持または誘導のための先行技術において日常的に使用されている典型的な培地、すなわちダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）血清ノックアウト培地ＫＯＳＲ（ＫＳＦＭ）は、ｈＤＰＳＣに由来する多能性細胞を発生または維持するために有利でないことであった。図１１において実証されるように、足場／ＥＣＭマトリックス被覆もしくは足場を含有するフィブロネクチンを含むおよび含まないこの培地の使用は、ｈＩＤＰＳＣの線維芽細胞様細胞（図１１）または上皮様細胞への分化をもたらした。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）単独の使用とは対照的に、Ｂ２７が補充され、場合によりＦＧＦおよび／またはＥＧＦが補充された場合、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはニューロバサル（Neurobasal）培地（ＮＢ）は、ニューロン様系統（leneage）の形成を引き起こすことが見出された。神経系統の細胞に分化させるための例示的なプロトコールはまた、以前の特許出願、例えば、国際出願番号第ＰＣＴ／ＩＢ１４／５９８５０号および米国特許出願第１４／２１４０，０１６号に記載されている。
【０１６３】
角膜細胞への分化
材料と方法
ｈＩＤＰＳＣ細胞培養のための潜在的なフィブロネクチン含有足場としての羊膜の脱上皮化
羊膜（ＡＭ）をドナーの胎盤から得、−８℃で保存した（Ｃｏｖｒｅ  ＪＬら、２０１１年）。ＡＭを使用する前に、室温で解凍し、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、ＡＭをニトロセルロース膜から取り出し、再び洗浄した。上皮を除去するために、ＡＭをＥＤＴＡとともに２時間インキュベートした。次に、上皮を機械的に除去した。上皮除去後、ＡＭは透明になる。完全に透明なＡＭをインサートに移した（Ｃｏｖｒｅ  ＪＬら、２０１１、およびＭｅｌｏ  ＧＢら、２００７年）。
【０１６４】
ＩＤＰＳＣ培養
ヒトＩＤＰＳＣ（２ｎ＝４６、ＸＸ）を乳歯の歯髄から単離し、以前に特徴付けされている（Ｋｅｒｋｉｓら、２００６年）。ｈＩＤＰＳＣは、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１００単位／ｍＬのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、および２ｍＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）で補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓ−ｂａｄ、ＣＡ）中に維持された。培地を毎日交換し、細胞を３日ごとに交換した。それらが８０％コンフルエンスに達した後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で酵素的に処理した菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ；０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、先に調製した羊膜に播種した。
【０１６５】
培地
ＡＭ上でＩＤＰＳＣを培養するために最良の培地を選択するために、本発明者らは、以下の培地を試験した：Ａ）第１は、補充ホルモン上皮細胞培地（supplemental hormonal epithelial medium）（ＳＨＥＭ）、５μｇ／ｍｌの結晶性ウシインスリンが補充された１．０５ｍＭのカルシウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｕｉｃｅ、ＭＯ）、３０ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、２ｎｇ／ｍｌの上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、０．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５μｇ／ｍｌのハイドロコルチゾン、５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、および５μｇ／ｍｌのアポトランスフェリンを含有し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２栄養混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｉｂｃｏ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ；１：１）の組み合わせであった。全ての試薬は、本文に示されているものを除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から入手された。Ｂ）第２は、３０ｍｇ／ｍｌの下垂体ウシ抽出物、０．２ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０％のＦＢＳ、およびアンピシリン／ストレプトマイシンが補充された、０．０９ｍＭのカルシウムを含有するケラチノサイト無血清培地（ＫＳＦＭ）であった。Ｃ）第３は、０．２％の下垂体ウシ抽出物、５ｇ／ｍｌのウシインスリン、０．１８ｍｇ／ｍｌのハイドロコルチゾン、５μｇ／ｍｌのウシトランスフェリン、０．２ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、さらに１％のペニシリンＧナトリウム（０．８５％のＮａＣｌ中の１０，０００ｇ／ｍｌのペニシリンＧナトリウム、２５ｍｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ）、および５％のＦＢＳを含有し、１％の「ヒト角膜増殖補充物」（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）が補充された、０．０６ｍＭのカルシウムを含有するＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）であった。Ｄ）ノックアウト培地。
【０１６６】
抗体
マウス抗ヒトモノクローナル抗体：ＡＢＣＧ２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および細胞質／核モノクローナル抗体：マウス抗サイトケラチン３／１２（Ｋ３／１２）（ＲＤＩ、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）は、ヒトおよびウサギと反応する。マウス抗ヒトＩＤＰＳＣ抗体は、記載されているように得られ（Ｋｅｒｋｉｓら、２００６年）、以前の研究（Ｆｏｎｓｅｃａら、２００９年；Ｍｏｎｔｅｉｒｏら、２００９年）において本発明者らにより首尾よく使用された。
【０１６７】
免疫蛍光染色
細胞を７０％コンフルエンスまでガラスカバースリップ上で増殖させ、さらにＡＭ上で増殖させ、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で一晩固定した。カバースリップは、２０ｍｍのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４（Ｖｅｔｅｃ、Ｄｕｑｕｅ  ｄｅ  Ｃａｘｉａｓ、ＲＪ、Ｂｒａｚｉｌ）、０．１５ｍのＮａＣｌ（Ｄｉｎａｍｉｃａ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ、ＳＰ、Ｂｒａｚｉｌ）、および０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で３回洗浄された。０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて１５分間、透過化を行った（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。細胞を３回洗浄し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ）中の５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）中で３０分間インキュベートした。一次抗体が、異なる希釈率（ＡＢＣＧ２およびＫ３／１２（１：１００）および抗ｈＩＤＰＳＣ（１：１０００））で各スライドに１時間添加され、室温でインキュベートされた。ＴＢＳ中で（３回）洗浄した後、細胞は、１：５００の希釈率のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）をコンジュゲートした二次抗マウス抗体とともに暗所で１時間インキュベートされた。顕微鏡スライドは、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含む褪色防止溶液（ベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）マウンティング培地、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）にマウントされ、共焦点顕微鏡を用いて分析された。対照反応物を一次抗体の代わりにＰＢＳとともにインキュベートし、続いて、洗浄し、それぞれの二次抗体とともにインキュベートした。全ての実験は三重にして行った。
【０１６８】
結果
プラスチック基質上の異なる培地で増殖させたＩＤＰＳＣにおける未分化ＬＳＣおよび分化した角膜細胞タンパク質の発現
ＬＳＣの特徴付けに一般的に使用されるＡＢＣＧ２タンパク質（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２）、ならびにＩ型中間フィラメント鎖をコードするＣＫ３（サイトケラチン３）およびサイトケラチン１２、ならびに角膜上皮で発現される両方の発現パターンを分析した。図１２は、７日間の異なる培地で培養した場合に、研究したタンパク質の発現に関してＩＤＰＳＣが示差反応を示したことを示す。ＳＨＥＭ、ＫＳＦＭ、ＥｐｉＬｉｆｅおよびＤＭＥＭ／ＫＯ（図１０Ａ１〜Ａ４）で培養した場合、プラスチック表面上で増殖させたＩＤＰＳＣはＡＢＣＧ２を発現せず、このタンパク質は基底培地で培養した場合のみＩＤＰＳＣで発現された（図１０Ａ５）。興味深いことに、ＳＨＥＭおよびＤＭＥＭ／ＫＯで培養したＩＤＰＳＣは、７日後、それらの線維芽細胞様形態（図１０  Ａ５）を上皮様形態（図１０  Ｂ２およびＢ４）に変化させ、ＣＫ３／１２の発現を開始し、一方でＥｐｉＬｉｆｅおよびＫＳＦＭおよびＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養したＩＤＰＳＣは、Ｋ３／１２の発現を開始しなかった（図１０Ｂ１、Ｂ３、Ｂ５）。
【０１６９】
異なる培地中のＡＭ上で増殖させたＩＤＰＳＣにおける未分化ＬＳＣおよび分化したビメンチンマーカーの発現
次に、ＡＭ上で７日間増殖させたＩＤＰＳＣにおいて、これらのマーカーおよびさらにビメンチンの発現が確認された（図１１）。ＥｐｉＬｉｆｅは、この培地で増殖させた場合、細胞の生存率が非常に低いため（５０％未満）、およびＥｐｉＬｉｆｅと組み合わせるとＡＭ上での細胞の付着が低いため、この研究から除外された。ビメンチン発現は、全ての試料（図１１Ａ〜Ａ３）で観察され、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＳＨＥＭで培養されたＩＤＰＳＣにおいて陽性であり（図１１ＡおよびＡ２）、ＫＳＦＭおよびＤＭＥＭ／ＫＯで培養されたＩＤＰＳＣで弱い陽性を示した（図１１Ａ２およびＡ３）。ＡＢＣＧ２抗体は、ＳＨＥＭおよびＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養されたＩＤＰＳＣにおいて強い免疫陽性を示し（図１１ＢおよびＢ１）、ＫＳＦＭで培養されたＩＤＰＳＣでは発現せず（図１１Ｂ２）、ＤＭＥＭ／ＫＯで培養されたＩＤＰＳＣと弱い免疫反応性を示した（図１１Ｂ３）。ＩＤＰＳＣは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ｅ  ＫＳＦＭで培養されたＩＤＰＳＣと反応せず（図１１ＣおよびＣ４）、ＳＨＥＭおよびＤＭＥＭ／ＫＯで培養した場合、Ｋ３／１２と非常に弱い免疫陽性を示した（図１１Ｃ１およびＣ３）。
【０１７０】
実施例８．前臨床薬理学研究
図１２は、治験製品ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）の様々な臨床応用を調べることを目的とする前臨床薬理学研究を要約する。研究の多くは、様々な適応症についての細胞の薬理学的有効性を調査するために実施されたが、それらは全て、製品の安全性プロファイルおよび提案された静脈内投与の安全性プロファイルを実証する。
【０１７１】
実施例９．製品の説明と仕様
表７は、ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）の仕様を示す。
【０１７２】
【表７】
2019510758.tif 000008
【０１７３】
分析手法
安全性ＱＣ−マイコプラズマ試験
マイコプラズマ試験は、製造業者のプロトコールに従って、社内ＲＴ−ＰＣＲ試験（ＥＺ−ＰＣＲ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を用いてｈＩＤＰＳＣの培養中に定期的に実施される。
【０１７４】
安全性上の特性−核型分析
核型の安定性を実証するために、核型分析が実施されており、このデータは既に公表されている（Ｋｅｒｋｉｓら、２００６年；Ｂｅｌｔｒａｏ−Ｂｒａｇａ、２０１１年；Ｌｉｚｉｅｒら、２０１２年）。
【０１７５】
安全性および同一性ＱＣ−細胞表面抗原のフローサイトメトリー分析
細胞表面マーカーの免疫染色は、様々な表面抗原マーカー：ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＡＰＣ、ＣＤ１０５−ＰＥ、ＣＤ７３−ＦＩＴＣ、ＣＤ９０−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＳＯＸ２−ＰＥ、ネスチン−ＰＥ、β−ＩＩＩチューブリン−ＡＰＣ、ＮＧＦ−ＰＥに対するモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を用いて行われた。２×１０５個の細胞をＦＡＣＳ実験に用いた。細胞をＰＢＳ（ｗ／ｏ  ＣａおよびＭｇ）で２回洗浄し、５０μｌのＰＢＳに懸濁した。次に、細胞を室温で１５分間、抗体とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎフローサイトメーターで分析した。ＰＥ（ＦＬ２）、ＦＩＴＣ（ＦＬ１）、ＡＰＣ（ＦＬ４）の蛍光は、それぞれ５７５ｎｍ、５３０ｎｍおよび６００ｎｍの発光波長で検出された。
【０１７６】
活性バイオアッセイＱＣ−ＥＬＩＳＡアッセイ
ＢＤＮＦレベルは、製造業者のプロトコール（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）に従って、ヒトＢＤＮＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキットを用いて定量された。
【０１７７】
異なる採取物からの１×１０６個の細胞を７５ｃｍ２のプラスチックフラスコに接種した。接種の約４日後に上清を採取した。結果をＢＤＮＦ濃度として表した。
バッチ分析
表８は、バッチ番号００１Ｈ１−３０／Ｐ１−５／Ｆ分析を示す。
【０１７８】
【表８】
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【０１７９】
安定性
Ａｖｉｔａは、ｈＩＤＰＳＣの安定性に関する非ＧＭＰ、非ＧＬＰ研究を行った。この目的のために、最終バッチの変動性を緩和し得る単一のマスター細胞バンクが確立された。それは５つのバッチによって構成され、それぞれが１個体の歯髄に由来するものであった。細胞は、図１３に記載されるように生成された。ｈＩＤＰＳＣの安定性試験のタイムラインを図１４に示す。
【０１８０】
凍結保存前の４つのバッチに由来するｈＩＤＰＳＣの幹細胞マーカーの発現、細胞増殖のダイナミクス、および分化能、ならびにヌードマウスへの注入後の様々な臓器における移動および生体内分布を研究した。ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）は、標準的な培養条件下で、４つの独立したバッチから継代６のこれらの細胞が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、およびＣＤ１３などの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の表面マーカーを発現することを示した。それにもかかわらず、それらはＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ４３、およびＨＬＡ−ＤＲの発現を欠く。これらの細胞は、インビトロで骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞、筋肉細胞およびニューロンへの自然のおよび誘導されたインビトロでの分化を受けることができた。正常マウスへ移植した後、これらの細胞は、とりわけ肝臓、脾臓、脳および腎臓などに有意な生着を示した。
【０１８１】
安定性プログラムの開発
過去の経験は、初期細胞Ｐｏｌ１（初代細胞）とその最終ブレンド（Ｐ５拡大増殖および全ての移入物の混合後）の両方が、−１９２℃で凍結保存した場合に安定であることを示した。
【０１８２】
実施例１０．ハンチントン病の動物モデル実験
ハンチントン病（ＨＤ）−神経変性のモデルとして
ハンチントン病（ＨＤ）は、特定の脳細胞を損傷する脳の遺伝性疾患である。この疾患は、脳の神経細胞の一部に損傷を与え、脳のこれらの領域の機能の低下および漸進的な喪失を引き起こす。これは、運動、認知（知覚、認識、思考、判断）および行動に影響を及ぼし得る。筋肉の自然のおよび一時的な収縮によって現れる、舞踏病と呼ばれる典型的な不随意運動がある。この症状は、この疾患の患者の９０％以上に認められる。経時的に、患者の自発的な運動はより遅くなり、平衡状態では重度の困難を示した。しばしば言葉の発生の困難さ（構音障害）および食物嚥下障害（嚥下困難）が認められる。患者はまた、筋肉の硬直、認知症、ならびにうつ病および妄想などの精神障害を呈し得る。
【０１８３】
ＨＤおよびニューロン細胞喪失
ＨＤは、基底核において、主にＧＡＢＡ作動性ニューロンである中型棘状ニューロンの進行性喪失によって特徴付けられる。さらに、ＨＤは、重度の線条体Ｄ１およびＤ２受容体喪失と関連付けられ、最近、モデルマウスにおけるハンチントン病の病理学の感度の高い尺度としてのドーパミン受容体Ｄ２の調節不全が報告されたことが考慮される（Ｃｒｏｏｋら、２０１２年；Ｃｈｅｎら、２０１３年）。ＨＤは、尾状核および被殻も含む、一般的に線条体と呼ばれる新線条体において最も顕著になる。事後分析の間に、平均容積減少が５８％であるＨＤ脳の９５％における線条体萎縮が明らかにされた（Ｌａｎｇｅら、１９７６年；ＶｏｎｓａｔｔｅｌおよびＤｉＦｉｇｌｉａら、１９９８年）。大脳皮質で最大２９％、視床で２８％、終脳白質の２９％〜３４％の容積喪失は、ＨＤ患者においても観察された（Ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、１９８８年）。さらに、ＨＤ患者では、健常対照脳（Ｈａｌｌｉｄａｙら、１９９８年）と比べた場合、総脳容積が１９％減少した。
【０１８４】
免疫系およびＨＤ
今日、いくつかの神経変性疾患の発症における神経炎症の重要な役割について、一貫した証拠が存在する。ＨＤにおける神経変性に対する炎症の寄与が強く示唆されている。したがって、ＨＤにおける免疫系の活性化は、マウスモデルにおいて、ならびに症候性および発症前のある患者において、ＩＬ−６などのサイトカインの発現の上昇によって明確に証明された。ＨＤにおけるＣＮＳ自然免疫細胞の活性化は、いくつかの神経変性疾患の発症に直接関与するミクログリアおよび星状細胞を介して起こる。
【０１８５】
ＨＤおよび神経増殖因子
いくつかの研究は、野生型ｈｔｔタンパク質が、ＣＮＳ細胞における脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）発現を増加させるが、一方で、突然変異したｈｔｔタンパク質は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の下方制御へと導き、不十分な神経栄養支持およびニューロン細胞死をもたらす（Ｚｕｃｃａｔｏら、２００１年）。
【０１８６】
前臨床モデルにおけるＣｅｌｌａｖｉｔａ  ｈＩＤＰＳＣの使用
以前の刊行物では、ＨＤの異なる化学モデル（キノリン酸、ＱＡ；３−ニトロプロピオン酸、３−ＮＰ）および遺伝モデル（Ｒ６／２−Ｊ２；Ｎ１７１−８２Ｑ、Ｒ６／２）が使用された。本発明者らは、非限定的な例において、３−ＮＰの全身投与による古典的なＨＤ様症状誘導モデルを使用した。前臨床安全評価の第１の目標は、１）ヒトにおける初期安全用量およびその後の用量漸増スキームを同定すること；２）毒性およびこのような毒性が可逆的であるかどうかについての潜在的な標的臓器を同定すること；３）臨床モニタリングの安全性パラメーターを同定すること；４）ラット脳におけるＩＤＰＳＣを同定することである。
【０１８７】
本発明者らの研究におけるＨＤは、クレブスサイクルと複合体ＩＩの両方を阻害するコハク酸デヒドロゲナーゼの不可逆的阻害剤である３−ＮＰで誘発され、ラットと霊長類の両方に対する３−ＮＰの全身投与は、二次的な興奮毒性機構の結果である選択的線条病変を生じさせ得る［９５−９６］。これらの病変は、ＨＤ患者において観察される多数の運動症状および神経病理学的症状を正確に再現する。３−ＮＰの全身投与は、線条体ＮＡＤＰＨ−ジアホラーゼおよび大きなコリン作動性ニューロンの差別的な回避をもたらし、電子伝達鎖の線条体ＧＡＢＡ作動性ニューロン活性の著しい喪失を伴う。
【０１８８】
本発明者らは、前臨床試験において、体重が３００ｇ〜３５０ｇの３カ月齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラットを用いた。ＨＤは、２０ｍｇ／ｋｇの３−ＮＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を４日間、毎日腹腔内注射して誘導された。ヒトＩＤＰＳＣは、Ｋｅｒｋｉｓおよび同僚（２００６年）のために既に確立されたプロトコールに従って単離された。細胞は継代４まで拡大増殖させた。細胞は、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、およびＣＤ７３などのＭＳＣマーカー；ＣＤ１４６などの周皮細胞マーカー；ならびにＣＤ２７１などの神経堤幹細胞マーカーに対して免疫陽性であった。細胞は、ＣＤ４５（血液細胞マーカー）およびＨＬＡ  ＩＩ（主要組織適合性複合体：ヒト白血球抗原クラスＩＩ分子）に対して陰性であった。全ての手法は、神経系疾患を専門とする獣医師の存在下および監督下で開発された。
【０１８９】
Ａ．ＨＤの３−ＮＰで誘導された実験ラットモデルにおけるｈＩＤＰＳＣの短期作用
線条体および他の脳区画におけるＩＤＰＳＣの追跡および生体内分布を観察するために、それらを先にＶｙｂｒａｎｔ（緑色染料、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ；Ｖ１２８８３）で染色した。３−ＮＰ酸によるＨＤ誘導の２４時間後、計１×１０６個のＩＤＰＳＣを静脈内（尾静脈）に移植し、４日後（パイロット研究）または３５日後（群Ｉ試験）に動物を安楽死させた。組織学的および免疫組織化学的分析のために脳を収集した（図１５および１６）。
【０１９０】
３−ＮＰによって誘導された神経変性のプロセス、および実験群のこのプロセスにおけるＩＤＰＳＣ移植の効果を評価するために、図１７における広範囲のバイオマーカーを使用した。
【０１９１】
結果：パイロット研究
図１８は、線条体および皮質実質組織全体にわたるｈＩＤＰＳＣ生着を実証する。組織は、特異的抗ヒト細胞核抗体（茶色）および抗ｈＩＤＰＳＣ抗体（緑色）を用いて免疫組織化学によって評価された。ｈＩＤＰＳＣは、ヒトＭＳＣのマーカーであるＣＤ７３（赤色）と同時局在し、結果として黄色となる。（２）茶色で免疫染色された線条体ＧＡＢＡ作動性ニューロンによって記された神経発生誘導に及ぼす影響、ならびに（３）高倍率で示されるＤＡニューロンバーストは、線条体のニューロンにおける受容体Ｄ２（茶色）の発現を示した一方、（４）コラーゲン１は、ＨＤ様線条の病変の模倣である３−ＮＰ−によって傷害を受けた領域を茶色で示す。
【０１９２】
３−ＮＰ酸でＨＤを誘導した後、マウスは、ヒトのＨＤ症状と同様の機能的および解剖学的特徴を示した：
１．ほとんどの動物は線条体に病変を有していた。
２．３−ＮＰを受けた全ての動物は体重の減少を示し、嗜眠性であり、ＨＤ誘発の４日後に抑うつ症状を示した。
３．ＩＤＰＳＣ移植の４日後、ＩＤＰＳＣで処置された動物と対照群（処置されていない）の間に体重に有意差はなかった
４．両群とも、嗜眠性および抑うつ行動を示した。
５．ＩＤＰＳＣ移植の４日後、それらは前脳−線条体の皮質下部分全体に分布した（図１９）。
【０１９３】
その時点で、ｈＩＤＰＳＣは、抗ＩＤＰＳＣ抗体ＣＤ７３およびＣＤ１０５の二重陽性免疫染色を示し、移植の４日後には、ほとんどの細胞がまだ未分化であることを示した。ｈＩＤＰＳＣは、主に線条体の実質に局在し、毛細血管に近かった（図２０）。
【０１９４】
したがって、３−ＮＰによって誘導されたＨＤラットにおいてＩＶ経由で移植されたＩＤＰＳＣは、ＢＢＢを通過して、病変領域に移動することができた。これらの細胞は、実質におよび毛細血管周辺に有意な生着を示した。移植の４日後、細胞はまだ未分化である；しかしながら、ニューロン様形態を呈するいくつかのヒト細胞も観察された。
【０１９５】
結果：群Ｉの研究
研究の目的は、ＩＶ注射の３０日後にラット脳におけるＩＤＰＳＣを同定することであった。ＩＤＰＳＣ注射の３０日後に、ＩＤＰＳＣは、皮質で、主に毛細血管に近い線条体、脳周皮細胞の典型的な局在に観察された（図２１）。ラット脳から得られた追加の連続切断は、実質に局在するＩＤＰＳＣの形態のようなニューロンを示す（図２２）。意外なことに、ＩＤＰＳＣは、成熟脳におけるニューロンの幹細胞ニッチと考えられる脳室下帯（ＳＶＺ）において見出された（図２３）。得られた他の驚くべき予想外の結果は、ｈＩＤＰＳＣ移植を受けたラットにおけるＤＡＲＰＰ３２陽性ニューロンの頑強な生成である。対照的に、これは対照群では観察されなかった（図２４）。ドーパミンおよびｃＡＭＰ調節性のリン酸化タンパク質であるＭｒ３２ｋＤａ（ＤＡＲＰＰ−３２）は、最初に、線条体におけるドーパミンおよびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の主要標的として同定されたことに注目することが重要である。ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の状態の調節は、種々の神経伝達物質、神経調節物質、神経ペプチドおよびステロイドホルモンを介して、複数の脳領域において、ドーパミン受容体ニューロンに到達する情報を統合する機構を提供する（Ｓｖｅｎｎｉｎｇｓｓｏｎら、２００４年）。ＨＤは、重度の線条体Ｄ１およびＤ２受容体喪失と関連し、最近、モデルマウスにおけるハンチントン病の病理学について感度の高い尺度としてのドーパミン受容体Ｄ２の調節不全（Ｃｒｏｏｋら、２０１２年；Ｃｈｅｎら、２０１３年）について報告されたことを考慮して、したがって、本発明者らは、このマーカーを用いて、３−ＮＰによって誘導されたラットにおけるＩＤＰＳＣの可能な効果を評価した。驚くべきことに、本発明者らは、未処置群と比較してＩＤＰＳＣを受けたラットにおいて受容体Ｄ２発現の有意差を観察したが、受容体Ｄ２細胞の発現のいくらかは対照動物の線条体で観察することができる。したがって、本発明者らは、このタンパク質発現について３つのスコアシステムを示唆しており（図２５）、これも定量化することができる。
【０１９６】
Ｂ．ＨＤの３−ＮＰで誘導された実験ラットモデルにおけるｈＩＤＰＳＣの長期作用
本発明者らは、次の実験デザイン（図２６）に続き、いくつかのＩＤＰＳＣ移植および細胞数の増加を目的とした２つの新しい実験（群ＩＩおよびＩＩＩ）を行った。観察された臨床マーカーには、体重減少および運動機能の低下の程度が含まれた。運動機能の低下の程度は、ＨＤにおける筋ジストロフィー、嗜眠、後肢の衰弱、腹側および側臥位の亢進、またはｉｎｄｈのアップレギュレーション（すなわち運動能力不足の上方制御）を検出することによって決定することができる。図２７は、運動機能の低下を評価するためのスコアリングシステムの例を示す。ＨＤの誘導後に研究された全ての動物の臨床評価を表９に示す。図２８〜３１は、パイロット研究、第ＩＩ群研究、および第ＩＩＩ群研究における動物の体重変化（chance）を示す。長期間の研究では、ＩＤＰＳＣで処置した動物は、未処置の動物よりも体重が多かった。
【０１９７】
【表９】
2019510758.tif 000010
【０１９８】
実施例１１．ハンチントン病の３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）ラットモデル
倫理的な問題
全ての研究は、ブラジルのサンパウロにあるサンパウロ大学の核およびエネルギー研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｅ  Ｐｅｓｑｕｉｓａｓ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｒｅｓ−ＩＰＥＮ）の倫理委員会によって承認された。実験動物の管理、ケアおよび取り扱いに関するプロトコールは、ブラジルの現在の全ての法律ならびに国際的に認知された規範およびプロトコールに準拠している。実験動物を扱うスタッフは全て、スタッフ研究者／技術者として正式に認可され、現在のブラジルの規制に従って実験的科学目的で動物を使用する上で適切に訓練されていた。
【０１９９】
主な目標
この研究群は、ハンチントン病の３−ＮＰ化学モデルにおけるｈＩＤＰＳＣの神経保護および／または神経組織リモデリング効果を試験した。
【０２００】
動物モデル
ミトコンドリア毒素３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）の全身投与は、げっ歯類および非ヒト霊長類におけるハンチントン病の化学モデルとして役立ち、潜在的な薬物療法を試験するために使用されている。３−ＮＰは、主に線条体、ならびにさらにはＧＡＢＡ作動性の中型の棘状突起ニューロンおよび棘状介在ニューロンにおいて細胞死を引き起こす不可逆的なミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）阻害剤である。血液脳関門を通過するその能力のために、３−ＮＰは全身投与され、線条体または全線条体（entire corpus striatum）の選択的神経変性を引き起こすことができる。薬物レジメンに応じて、３−ＮＰ投与は、ハンチントン病の異なる段階をシミュレートすることができる。２つの３−ＮＰ服用の腹腔内注射は、疾患の初期段階においてマウスにおける過剰運動症状へと導き、一方で、４回以上の服用は、疾患の後期段階で低活動をもたらす（Ｂｅａｌら、１９９３年；Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔら、１９９５年；Ｙａｎｇら、２００８年；Ｂｏｒｌｏｇａｎら、１９９７年）。
【０２０１】
３−ＮＰ処置動物（化学モデル）は、トランスジェニックと比較した場合、重大な制限があることに留意すべきである。３−ＮＰモデルでは、線条体病変は、正常な内因性ニューロン先駆体の存在、および一定の神経変性を提供する遺伝的背景の不存在のために１０〜１２日後に自然に再生することができる。したがって、自然な神経再生の前に、実験群と対照群の間の運動および機能改善における差異を観察することができる。
【０２０２】
ｈＩＤＰＳＣ移植の簡単なプロトコール
体重３５０〜４５０ｇのＬｅｗｉｓラット（ｎ＝１２４）に４日間、１日１回、２０ｍｇ／ｋｇの３−ＮＰを腹腔内（ＩＰ）に注射した。動物を明／暗サイクル下で１２時間保持し、食物および水を自由に摂取させた。ラットに３−ＮＰをＩＰ注射して、脳損傷を誘導した。次に、それらを麻酔し、それぞれ、０．３５×１０６個および３．５×１０６個／ｋｇに対応する、２５０μｌの生理食塩水中でそれぞれ１×１０６個の１回もしくは３回のいずれかの用量で、または１動物あたり３００μｌの生理食塩水ｈＩＤＰＳＣ中の１×１０７個を尾静脈に注射した。複数の用量を３０日間隔で投与した（図３２）。
【０２０３】
各処置群は、生理食塩水のみを受けた対照群（「未処置」）と対にした。したがって、動物を表１０に示すように５つの群に分けた。
【０２０４】
【表１０】
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【０２０５】
機能的分析
半定量的な神経学的スケール
歩行能力は、Ｌｕｄｏｌｐｈら（１９９１年）から適応された定量的神経学的スケールを用いて、各実験群について、１人の盲検観察者によって週に２回、評価された。このスケールは、平らな木製表面上でのラットの歩行行動（スコア０〜４）を以下のように測定する：０：正常な行動；１：一般的な遅さ；２：不協和および歩行異常；３：上肢の麻痺または障害、移動できない；および４：横になった姿勢から離れることができない。
【０２０６】
ベースライン時に、両群の全てのラット（３０）は、３ＮＰで処置する前に顕著な歩行異常を伴わない正常な行動を示し、したがってスコア０を受けた。３ＮＰ誘導の最後の３ＮＰ投与（４日）終了時に、全７６匹のラットは一般的な遅さを示した（スコア１）；２匹は移動が困難であることを示した（スコア２）；２０匹のラットは、前肢および後肢の障害に起因する運動不能を示した（スコア３）；２４匹のラットは横臥を示し、結果として死亡した（スコア４）。ＨＩＤＰＳＣ移植の２４時間後、３ＮＰ＋ｈＩＤＰＳＣ（両方の服用）で処置されたラットは、３ＮＰで処置されたラットと比較して良好に機能した。しかしながら、ｈＩＤＰＳＣ移植の５日後、ラットは、ＨＤＰＳＣ移植後、より良好な改善を示した。計２７匹のラットが正常スコア（スコア０）を示した。さらに、２０匹のラットはスコア１を示し、３匹がスコア２を示し、２匹がスコア３を示し、ラットはＨＩＤＰＳＣ移植の４日後にスコア４を示さなかった（表１２）。対照群（３ＮＰ＋生理食塩水）である３８匹のラットはスコア１を示したが、１匹のラットはスコア２を示し、５匹のラットはスコア３を示し、１匹のラットはスコア４を示した（表１１）。
【０２０７】
【表１１】
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【０２０８】
【表１２】
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【０２０９】
表１３は、３ＮＰ処置後（投与の４日後）、３ＮＰ誘導の１日後および５日後、ならびにＨＩＤＰＳＣ移植後の対照群（３ＮＰ＋生理食塩水）およびｈＩＤＰＳＣ群（３ＮＰ＋ｈＩＤＰＳＣ移植）の神経学的スコアを示す。歩行異常のない正常な行動（スコア０）；一般的な遅さ（スコア１）；不協和および歩行異常（スコア２）；後肢または前肢のいずれかを動かすことができない（スコア３）；ならびに横になった姿勢から離れることができない。この最後の群は、最終的に死亡した（スコア４）。群１＝処置＝単回投与で１×１０６個のｈＩＤＰＳＣ；群２＝処置＝３回の投与で１×１０６個のｈＩＤＰＳＣ；群３＝処置＝単回投与で１×１０７個のｈＩＤＰＳＣ；群４＝処置＝３回の投与で１×１０７個のｈＩＤＰＳＣ。
【０２１０】
【表１３−１】
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【０２１１】
【表１３−２】
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【０２１２】
【表１３−３】
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【０２１３】
組織病理学的および免疫組織学的分析
組織病理学的および免疫組織学的分析は、ｈＩＤＰＳＣ注射の７、３０、および９０日後に実施した；動物を４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中で調製される、０．１ｍｏｌ／Ｌ）で灌流した。組織断片は、減少するエタノールシリーズ（７５、９５、および１００％）で脱水し、０．１％クレシルバイオレットによるニッスル染色を用いて染色した。ラット脳におけるｈＩＤＰＳＣの存在を決定するために、２つの抗体、例えば、抗ヒト核および抗ｈＩＤＰＳＣ（１：１０００、Ａｂｃａｍ  Ｐｌｃ）を使用した。ｈＩＤＰＳＣの神経保護および神経回復効果を評価するために、抗ＧＡＢＡ作動性の中型棘状ニューロンＤＡＲＰＰ３２（１：１０００、Ａｂｃａｍ  Ｐｌｃ）、ドーパミンＤ２（１：８００）、およびＢＤＮＦ（１：５００）抗体を使用した。
【０２１４】
ラット脳におけるｈＩＰＤＳＣ生着
この研究の最も関連性のある所見の１つは、ｈＩＤＰＳＣが皮質および線条体（corpus striatum）において検出され、血液脳関門を通過して損傷の部位に移動することができたことであった（図３３）。図３３において、光切断は、異なる焦点深度（Ａ１〜Ａ４）で、Ｖｙｂｒａｎｔ（緑色）で染色されたＩＤＰＳＣの存在を示し、核はＰＩ（赤色）で染色されている。細胞は、毛細血管優勢の会合および異なる形態学的タイプ：ニューロン様細胞および周皮細胞を示す。Ａ２、Ａ３およびＡ４で、毛細血管に沿った異なる位置の２つの周皮細胞が観察され得、両方とも類似の形態を示す。Ａ４で、軸索の塞栓症が示されている。ニューロン核は明るく、核小体を有し、周皮細胞の核との相違は、強く染色され、観察することができる。青色は共焦点顕微鏡の人工的な色である。顕微鏡観察は落射蛍光＋デジタル干渉コントラスト（ＤＩＣ）を有し、スケールバー＝１０μｍであった。
【０２１５】
さらに、ｈＩＤＰＳＣ投与の４日後、いくつかの細胞は特異的ＭＳＣ抗体（抗ＣＤ７３および抗ＣＤ１０５）に対して陽性であり、これは、その時点でまだ一部の細胞が未分化であることを示した（図３４）。それにもかかわらず、ｈＩＤＰＳＣ由来のニューロン様細胞および周皮細胞（微小血管由来の血管周囲細胞）はまた、同じ期間に観察された（図３３）。
【０２１６】
図３４において、光学カットは、ＩＤＰＳＣがＶｙｂｒａｎｔ（緑色）で染色され、抗ＩＤＰＳＣ抗体と陽性に反応した（赤色）ことを示す。両方の重畳により黄色が生成される。この細胞は、毛細血管の局在化に近いことを示している。ＭＳＣの２つのマーカーを使用した：ＣＤ７３およびＣＤ１０５は、ＩＤＰＳＣと陽性反応を示した。落射蛍光＋デジタル干渉コントラスト（ＤＩＣ）を有する共焦点顕微鏡を使用した。スケールバー＝Ａ＝５μｍ；Ｂ＝１０μｍ；Ｃ＝２０μｍ；Ｄ＝５μｍである。
【０２１７】
ｈＩＤＰＳＣ移植の３０日後、皮質に少数のｈＩＤＰＳＣが観察され、毛細血管に沿って線条体（corpus striatum）に多数の細胞が観察された（図３５）。ラットの脳から得られた連続カットは、実質に局在するＩＤＰＳＣのニューロン様形態を示す（図３５）。さらに、ニューロン様細胞および線維芽細胞様細胞も観察され、ｈＩＤＰＳＣが分化を受けることが確認された（図３６）。意外なことに、ＩＤＰＳＣは、成熟脳におけるニューロンの幹細胞ニッチと考えられる脳室下帯（ＳＶＺ）においても見出された（図３５）。
【０２１８】
神経保護および神経再生効果
３−ＮＰ誘導した線条体病変は、ニッスル染色およびＤＡＲＰＰ３２発現を用いてニューロン喪失により決定された（それぞれ図３７および図３８）。ニッスル染色は、脳および脊髄のニューロン構造を同定するために使用され（図３７）、一方で、ＤＡＲＰＰ３２は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいて発現され、健康な哺乳動物の線条体によく見られる細胞骨格マーカーである（図３８）。これら２つのマーカーを用いて、線条体（corpus striatum）におけるニューロン喪失を以下のようにスコアリングした：
・スコア１（重度）：重度のニューロン喪失、中央線条体に細胞がほとんどないかまたは全くない側方線条体における分解の領域、ＤＡＲＰＰ３２免疫染色の喪失を伴う；
・スコア２（中等度）：「暗いニューロン」（死んだまたはアポトーシスニューロン）および少数のＤＡＲＰＰ３２＋細胞を有する中等度のニューロン喪失；ならびに
・スコア３（軽度）：ニューロン喪失および強いＤＡＲＰＰ３２免疫染色なし（Ｖｉｓら、２００１年）。
【０２１９】
３−ＮＰ処置動物は、対照（３−ＮＰおよびｈＩＤＰＳＣなし）と比較して、線条体で完全または部分的なニューロン喪失を示した。２つの実験群（処置および未処置）は、対照と比較して線条体でのニューロン喪失について異なるスコアを示した。しかしながら、形態計測による組織学的分析は、ほとんどのｈＩＤＰＳＣ処置動物がスコア３および２を有し、一方で、ほとんどの未処置動物（３−ＮＰ＋生理食塩水）がニューロン喪失スコア２および１を有することを表した（図３８）。可視的に萎縮を有する動物はいなかった（図３７および図３８）。
【０２２０】
図３９は、ｈＩＤＰＳＣ後のラットの線条体におけるニューロン増殖を示す。ｈＩＤＰＳＣの投与は、（Ａ）ニッスル染色、および（Ｂ）ＤＡＲＰＰ３２発現によって、ｈＩＤＰＳＣ処置動物において神経回復効果をもたらした。（Ｃ）対照と比較して、ｈＩＤＰＳＣ投与後のニューロン回復を示す動物の数。ほとんどのｈＩＤＰＳＣ処置動物（３−ＮＰ＋ｈＩＤＰＳＣ）はスコア３および２（中等度および軽度）を有し、一方で、未処置動物（３ＮＰ＋生理食塩水）はスコア２および１（重度および中等度）を有した。
【０２２１】
本発明者らはまた、ＤＡＲＰＰ３２発現が、ニューロン再生を示す未処置動物（図４０）よりもｈＩＤＰＳＣ処置動物においてより高いことを観察した。図４０における光学カットは、ニューロンがＤＡＲＰＰ３２と正に反応したことを示す。
【０２２２】
ドーパミン受容体Ｄ２の調節不全は、モデルマウスにおけるＨＤ病理学の感度の高い測定であることが報告されている（Ｃｒｏｏｋら、２０１２年）。ｈＩＤＰＳＣ移植を受けたラットにおいて、ＤＡＲＰＰ３２陽性ニューロンの頑強な生成に関して驚くべき予期しない結果が得られた。対照的に、これは対照群では観察されなかった（図３８）。ドーパミンおよびｃＡＭＰ調節性のニューロンリン酸化タンパク質（ＤＡＲＰＰ−３２）は、最初に線条体におけるドーパミンおよびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の主要標的として同定されたことに注目することが重要である。ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の状態の調節は、種々の神経伝達物質、神経調節物質、神経ペプチドおよびステロイドホルモンを介して、複数の脳領域において、ドーパミン受容体ニューロンに到達する情報を統合する機構を提供する（Ｓｖｅｎｎｉｎｇｓｓｏｎら、２００４年）。ＨＤは、重度の線条体Ｄ１およびＤ２受容体喪失と関連付けられ、最近、モデルマウスにおけるハンチントン病病理の感度の高い測定としてのドーパミン受容体Ｄ２の調節不全（Ｃｒｏｏｋら、２０１２年；Ｃｈｅｎら、２０１３年）が報告されていることを考慮して、したがって、本発明者らは、このマーカーを用いて、３−ＮＰ誘導ラットにおけるＩＤＰＳＣの可能な影響を評価した。
【０２２３】
驚くべきことに、本発明者らは、未処置群と比較してＩＤＰＳＣを受けたラットの受容体Ｄ２発現に有意差があることを観察し、受容体Ｄ２細胞の発現の少数は対照動物の線条体で観察することができる（図４１）。
【０２２４】
ＢＤＮＦのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの低下は、ＨＤ患者の小脳、尾状核被殻、線条体、および大脳皮質で観察されている（Ａｄａｃｈｉら、２０１４年）。現在の研究では、ＢＤＮＦ発現は、ｈＩＤＰＳＣ投与の７および３０日後、ｈＩＤＰＳＣ処置動物の線条体、尾状核、被殻および脳室下帯において観察された（図４０）。脳室下帯におけるＢＤＮＦ発現は、ｈＩＤＰＳＣが神経発生を促進することを示す。未処置動物（３−ＮＰ＋生理食塩水）ではＢＤＮＦ発現は観察されなかった。
【０２２５】
ｈＩＤＰＳＣの共局在化は、運動ニューロンマーカーＤＡＲＲＰ３２を用いて観察され、これはｈＩＤＰＳＣが成熟ニューロンに分化することを示唆した。ＤＡＲＰＰ３２発現は、ＨＤのこの３−ＮＰモデルにおいて、ｈＩＤＰＳＣ投与の３０日後、ｈＩＤＰＳＣ処置動物の線条体において検出された（図４１）。これらのデータは、ｈＩＤＰＳＣがインビボでＧＡＢＡ作動性棘状ニューロンに分化することを示している。線条体における神経伝達物質および神経調節物質シグナルの統合は、基底核の機能に中心的な役割を果たすことに留意すべきである。さらに、ＤＡＲＰＰ３２は、ドーパミンおよびグルタミン酸に応答するＧＡＢＡ作動性の中型棘状ニューロンの統合における主要なプレーヤーである（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００６年）。
【０２２６】
組織学的および免疫組織化学的分析は、ｈＩＤＰＳＣが血液脳関門を通過し、線条体および皮質を含む、ＨＤによって影響される異なる領域に達することができることを表した。形態計測による組織学的分析は、ほとんどのｈＩＤＰＳＣ処置動物が、未処置動物（３−ＮＰ＋生理食塩水）と比較して線条体で軽度のニューロン喪失を示すことを表した。さらに、ｈＩＤＰＳＣは、ハンチントン病において下方制御されるＢＤＮＦ、ＤＡＲＰＰ３２、およびＤ２受容体発現の上方制御によって明らかにされるように、神経保護および神経回復効果を示した（Ｖａｎ  Ｄｅｌｌｅｎら、２０００年；ＣｒｏｏｋおよびＨｏｕｓｍａｎ、２０１２年）。
【０２２７】
【表１４】
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【０２２８】
安全性
以下の生理学的パラメーター：体重および飼料および水分摂取量を、処置動物および未処置動物について実験期間中に記録した。ｈＩＤＰＳＣ処置動物の中では３−ＮＰ注射されたラットより死亡が少なく、これはｈＩＤＰＳＣ投与が安全であることを示した。さらに、結果は、ｈＩＤＰＳＣ投与は、３−ＮＰの神経毒性作用から動物を保護することにより全生存期間を改善したことを示唆している（表１４）。表１４．生存対死亡動物の数。
【０２２９】
ｈＩＤＰＳＣの安全性を評価する主要な研究は、ＨＤ研究の３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）ラットモデルであった。この研究では、２つの異なる細胞用量が注入された：それぞれ１×１０６および１×１０７細胞／移植または３×１０６細胞／ｋｇおよび３×１０７細胞／ｋｇ。３−ＮＰ処置ラットは、１カ月間隔で、細胞の１回のＩＶ注射または計３回のＩＶ注射を受けた。
【０２３０】
３×１０６細胞／ｋｇを受けた３−ＮＰ誘導動物において７匹が死亡し、３×１０７細胞／ｋｇを受けた動物において５匹が死亡した。プラセボ群（細胞移植なしで誘導された３−ＮＰ）では、同数（１２匹）の動物が死亡した。死亡した全てのラットは、非常に重度の疾患発現を示した；３−ＮＰ投与から５日以内に死亡した。反復的なｈＩＤＰＳＣ用量では、さらなる死亡は生じなかった。これらのデータに基づいて、全ての早期死亡の推定原因は３−ＮＰ毒性であった。反復的なｈＩＤＰＳＣ移植後に死亡は生じなかったため、これはｈＩＤＰＳＣ移植の安全性を支持する（表１４）。
【０２３１】
ハンチントン病の患者は、しばしば、十分なまたは高いエネルギー摂取にもかかわらず、進行性の体重減少を示す。体重減少は、エネルギー代謝の低下によって引き起こされる３−ＮＰ神経毒性の指標となり得る（Ｓａｙｄｏｆｆら、２００３年；Ｃｏｌｌｅら、２０１３年）。３−ＮＰ投与の４日後、３−ＮＰ処置動物において著しい体重減少は観察されなかった。しかしながら、ｈＤＰＳＣ移植の３０日後、ｈＤＰＳＣ群（１×１０６細胞用量）は、未処置群（３ＮＰ）と比較して著しい体重増加を示した。したがって、ｈＩＤＰＳＣは体重減少を減弱させた（ｐ＝０．０１）（図４２）。
【０２３２】
ＨＤは、臨床的に衰弱性の疾患であり、疾患の進行を停止または逆行させるための利用可能な治療法がない。ＨＤを治療するために多数の治療法が遭遇する大きな障害の１つは、それが神経変性障害であり、標的化された全身送達薬物の一部がそれらの標的に到達することができないことである；脳への薬剤の通過は、血液脳関門（ＢＢＢ）によって制御される。ＢＢＢは、循環血液を、神経系を囲む細胞外液から単離する高度に選択的な透過性障壁である。したがって、細胞ベースの治療法による治療は、細胞が一般的にＢＢＢを通過しないため、ＢＢＢをバイパスする局在化送達（すなわち、選択的透過性障壁介した注入）を必要とすると考えられる。
【０２３３】
広範な研究は、ｈＩＤＰＳＣが間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の属性を有し、免疫調節因子および神経栄養因子を分泌することができることを示す。さらに、検証されたＨＤラットモデルにおける組織学的および免疫組織化学的分析は、ｈＩＤＰＳＣがＢＢＢを通過し、線条体および皮質を含む、ＨＤによって影響される異なる領域に達することができることを表す。形態計測による組織学的分析は、ほとんどのｈＩＤＰＳＣ処置動物が、未処置動物と比較して線条体において軽度ニューロン喪失を示すことを表す。さらに、ｈＩＤＰＳＣは、ハンチントン病において下方制御されるＢＤＮＦ、ＤＡＲＰＰ３２、およびＤ２受容体発現を上方制御することによって、神経保護および神経回復効果を示す（Ｖａｎ  Ｄｅｌｌｅｎら、２０００年；ＣｒｏｏｋおよびＨｏｕｓｍａｎ、２０１２年）。
【０２３４】
最後に、ｈＩＤＰＳＣの安全性プロファイルを評価する研究は、それらが奇形腫を形成せず、染色体異常を示さず、ヒト／マウスキメラを形成することができることを示す。研究は、ｈＩＤＰＳＣがＨＤの治療において安全であり、有効であることを示唆しているため、本発明者らは、ＨＤを治療するためにｈＩＤＰＳＣを使用することを提案する。
【０２３５】
実施例１２．脳におけるｈＩＤＰＳＣの神経保護効果。全身投与（静脈内経路）後のラットＨＤモデル（３−ＮＰによって誘導される）のＢＤＮＦ発現におけるｈＩＤＰＳＣの短期および長期効果
導入
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などの神経栄養因子は、中枢神経系ニューロン機能の本質的な寄与因子である。ＢＤＮＦは、ニューロンの生存および増殖に重要な役割を果たし、神経伝達物質の調節物質として機能し、学習および記憶に不可欠であるニューロンの可塑性に関与する。ＢＤＮＦはまた、神経系におけるニューロンの分化、成熟、および生存を支持し、神経保護効果を示す。ＢＤＮＦは、神経幹細胞（ＮＳＣ）からの新しいニューロンの増殖を刺激し、制御する。ハンチントン病では、ＢＤＮＦレベルの減少がニューロン喪失と関連付けられる。研究は、罹患した脳におけるそれらの利用可能性の低下を示し、したがって、それらは神経障害、特にＨＤにおいて重要な役割を果たすことを示唆している。非病理学的条件下では、ＢＤＮＦは、皮質、黒質緻密部、扁桃体、および視床において合成される。これらの領域は全て、線条体にＢＤＮＦを供給する。ＨＤでは、線条体におけるＢＤＮＦの欠損は、大脳皮質におけるＢＤＮＦ遺伝子転写の低下またはＢＤＮＦ小胞輸送の低下（またはその両方）によるものであり得る。ＨＤで観察されるＢＤＮＦ発現の減少は、ドーパミン作動性ニューロン機能を損ない、これはＨＤ運動障害に関連付けられ得る。結果として、多数の研究は、ＢＤＮＦレベルの上昇がＨＤ（１−７）の治療に役立ち得るかどうかを調べるために行われている。
【０２３６】
材料および方法
化学ＨＤモデル。体重３５０〜４５０のＬｅｗｉｓラットに、２０ｍｇ／ｋｇの３ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）を腹腔内（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に１日１回、４日間注射した。動物を明／暗サイクル下で１２時間保持し、食物および水を自由に摂取させた。ラットに３−ＮＰを注射して脳損傷を誘導した。３ＮＰ投与後、ＢＤＮＦ発現の低下は、皮質、海馬および線条体で起こる。
【０２３７】
ｈＩＤＰＳＣ移植。動物を麻酔し、２００μＬのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中の１×１０６個のｈＩＤＰＳＣを尾静脈に１回投薬で静脈内注射した。対照動物は、同じ経路に従うだけで２００μＬのＰＢＳを受けた。
【０２３８】
免疫組織化学  ＢＤＮＦの発現は、抗ヒト抗ＢＤＮＦ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体および免疫組織化学アッセイを用いて分析された。３−ＮＰで誘導され、ｈＩＤＰＳＣまたはプラセボで処置されたＨＤ動物は、細胞移植の４日後および３０日後に屠殺され、脳を単離し、それぞれの脳室を解剖し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに封入した。パラフィンスライドを、常法を用いて脱パラフィン化した。次に、スライドを水酸化アンモニア（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに１０分間インキュベートし、蒸留水中でそれぞれ５分間、４回洗浄した。スライドの抗原賦活は、９５℃に設定した水浴中で３５分間、クエン酸ナトリウムのｐＨ６．０緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて行われた。スライドを過酸化水素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５分間ブロックし、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１：５００に希釈されたウサギのポリクローナル抗ヒトＢＤＮＦ抗体（Ｎ−２０）とともに４℃で一晩インキュベートした。次に、スライドをそれぞれ５分間、ＰＢＳで３回リンスし、ＰＢＳ中に１：１００に希釈された抗ウサギＡＰ（ＳＣ−２０５７）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ、Ｕ．Ｓ．Ａからの両方の抗体）を室温で４０分間添加した。その後、スライドをそれぞれ５分間、ＰＢＳ中で３回洗浄した。最後に、Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄシステム（Ａｂｃａｍ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を適用して、茶色染色を生じさせた。免疫染色された切片をヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で対比染色し、光学顕微鏡（Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ；Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）下で観察した。
【０２３９】
結果
ｈＩＤＰＳＣ移植の短期効果：ラットにおける３−ＮＰによるＨＤ誘導の直後およびｈＩＤＰＳＣ移植の４日後のＢＤＮＦの発現
図４３は、ＮＳＣニッチとして公知である、ラット皮質（図４３の１ａおよび１ｂ）および線条体（図４３の１ｅおよび１ｆ）の多数のＢＤＮＦ陽性細胞（ここで、およびさらに茶色）を示す。これらの細胞のうちのいくつかは、海馬で観察される（図４３の１ｃおよび１ｄ）。しかしながら、これらの細胞は、成熟ニューロンではなく、ニューロン前駆体と同様の形態を示した。生理食塩水（ＰＢＳ）を受けた３−ＮＰ処置動物は、いずれのＢＤＮＦ分泌細胞を示さなかった（図４３の２ａ〜２ｆ）。
【０２４０】
ｈＩＤＰＳＣ移植の長期効果：ラットにおける３−ＮＰによるＨＤ誘導の直後およびｈＩＤＰＳＣ移植の３０日後のＢＤＮＦの発現
図４４は、ＢＤＮＦを分泌する皮質中の形態学的に成熟した多数のニューロンを示す（図４４の１ａおよび１ｂ）。海馬では、ＢＤＮＦ分泌細胞も存在し（図４４の１ｃおよび１ｄ）、ＢＤＮＦ発現細胞の多くが線条体で観察された（図４４の１ｅおよび１ｆ）。対照群では、ＢＤＮＦ分泌はまだ観察されなかった（図４４の２ａ〜２ｆ）。
【０２４１】
結論
本研究では、多数の細胞によるＢＤＮＦの発現が、皮質および線条体で検出されたが、少なくとも１０匹の動物によって構成された４つの群の海馬において少数の細胞にのみ検出された。２つの群は、３−ＮＰ動物によって構成され、ＢＤＮＦ発現は、ｈＩＤＰＳＣ移植の４日後（図４３）および３０日後（図４４）に分析された。２つの対象群は、ＰＢＳのみを受けた３−ＮＰ動物によって構成され、それぞれ４日後（図４３）および３０日後（図４４）に分析された。これらのデータは、移植直後の３−ＮＰ処置されたラットの脳における内因性ラット幹細胞によるＢＤＮＦ発現誘導を介して作用するｈＩＤＰＳＣの神経保護効果を示唆し、この効果は、生存および内在性ラットＮＳＣの成熟ニューロンへの分化に影響を及ぼした。さらに、ｈＩＤＰＳＣの移植は、移植の３０日後にニューロン再生をもたらす（図４４）
以前の研究は、線条体のＢＤＮＦ欠如をＨＤ病因と密接に結びつけている。現在、ＨＤを治療するために開発された薬物は、症状を改善することができるが、疾患の進行を遅延させない。したがって、線条体における線条体ＢＤＮＦレベルの回復は、ＨＤにおいて治療可能性を有し得る。実施例１０および１１はまた、ｈＩＤＰＳＣ処置されたＨＤ動物においても改善された行動表現型を示す。この結果は、ＢＤＮＦ発現が、ＨＤ患者において観察された機能的欠損を克服し得ることを支持する６、７。
【０２４２】
実施例１３．イヌにおける多発性硬化症様のイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）病の獣医学的処置
イヌにおけるＣＤＶは、多発性硬化症の病因と類似した病因を有する、明確に定義されたウイルス誘導による脱髄モデルである。本明細書中に開示されている実施例に示される機能的回復は、ＩＤＰＳＣが、Ｃｅｌｌａｖｉｔａ法によって培養されたｈＩＤＰＳＣにおいて、シュワン細胞のマーカーであるｐ７５ニューロトロフィン受容体の発現に関する、本発明者らの以前の開示と相関するＣＤＶ病態生理学的条件下で神経膠形成を誘導し、および／または機能的回復をもたらすための免疫保護機構を誘導することを示唆する。試験された２０匹以上のイヌについては、表の結果を参照されたい。（類似の回復結果はここでは示さないが、麻疹様ウイルス性疾患に類似した症状からＩＤＰＳＣによって首尾よく治療された数頭の馬に見出された）。
【０２４３】
以下の表１５は、ほとんどの患者が症状回復を有することを簡潔に示す。１人の患者だけが全く効果がなかった。２回目の移植後、ほとんどの患者は回復の徴候を示したが、一部の患者は、１回目の移植後に既に回復の傾向が示された。９０％以上が３回目の移植後に部分的な回復を示した。３回目の移植後、約５０％が完全な回復を示した。
【０２４４】
【表１５−１】
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【０２４５】
【表１５−２】
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【０２４６】
【表１６】
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【０２４７】
実施例１４．後期集団法によるｈＩＤＰＳＣ−ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）生成物の多重採取された臓器および組織外植片培養物の産業規模拡大のためのバッチ放出プロセス
命名法
ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）は、最終製剤前のバルク材料である。ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）は、薬物原料（Drug Substance）（ＤＳ）と呼ばれる。ＩＶ注入のためのＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）は、薬物製品（ＤＰ）と呼ばれる。ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）原料のためのプロセスは、ドナーのスクリーニングおよび試験で開始し、細胞ストックの最終処方および凍結保存の前に終了する。薬物製品の調製は、追加の賦形剤を含むＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）原料の製剤化を伴う。
【０２４８】
一般的な特性
一実施形態では、ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）は、多重採取臓器および組織外植片培養物を用いて得られた、ＣＤ１３、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ７３、ＣＤ２９（インテグリンｂ−１）、ＣＤ４４、およびネスチンなどの神経堤／間葉幹／前駆細胞マーカーを発現する幹細胞である（Ｋｅｒｋｉｓら、２００９年；Ｋｅｒｋｉｓら、２００６年）。
【０２４９】
別の実施形態では、ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）は、ＭＳＣ細胞の全ての基本特性を有するＭＳＣ様細胞である。細胞は、国際細胞治療学会の間葉および組織幹細胞委員会によって確立された多分化能間葉間質細胞を規定する最小限の基準に従って定義される。この定義には、標準的な培養条件下で維持される場合にプラスチックに接着し、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現し、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲ表面分子の発現を欠き、インビトロで骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞に分化する能力を有する（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、２００６年）。
【０２５０】
研究製品ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）の製造方法
６〜１２歳の子供の健康な歯だけが、Ｃｅｌｌａｖｉｔａ（商標）の培養に使用され得る。子供の法律上の保護者は、子どもの健康に関する適格性アンケートに回答し、欧州委員会のドナー適格性ガイドライン（委員会指令２００６／１７／ＥＣ）の勧告に従って、感染症を検出するための血清検査のために血液試料を収集する。強制的な検査には、ＨＩＶ−１および−２（抗ＨＩＶ−１および−２）、ＨＴＬＶ−１および−２、ＨＢＶ（特にＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｃ）、ＨＣＶ（特に抗ＨＣＶ−Ａｂ）、梅毒トレポネーマ（梅毒）のための試験（委員会指令２００６／１７／ＥＣ）が含まれる。
【０２５１】
自然喪失または外科的抽出後、齲歯などの歯科疾患のない健康な歯のみが収集される。不必要な検査を避けるために、歯が、培養（細胞培養の２週間後に研究室で決定されたプロセス）のために生きている歯髄を有するドナーのみが、ドナー適格性試験（採血）のためにセンターに戻るよう求められる。
【０２５２】
歯の収集、容器、輸送
自然な剥離の直後に、歯は、１５ｍＬの滅菌遠心チューブ中のＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）および５００ｍＭゲンタマイシンで構成された３ｍＬの滅菌輸送溶液に浸漬される。歯は４℃で保存され、４８〜７２時間以内に処置される。
【０２５３】
歯髄単離および洗浄手法
健康な対象由来の新たに剥離した乳歯は、５０％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（１００単位／ｍＬのペニシリン、１００単位／ｍＬのストレプトマイシン）および５０％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含有する滅菌溶液中で繰り返し洗浄される。歯髄は、滅菌針を用いて歯から取り出される。
【０２５４】
ｈＩＤＰＳＣ幹細胞の拡大増殖のための原料としての生存可能な歯髄の選択
新たに得られた歯髄（ＤＰ）は、３％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（１００単位／ｍＬのペニシリン、１００単位／ｍＬのストレプトマイシン）を含有する溶液中で洗浄される。歯髄の初期播種および生存率検査は、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００単位／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、および２ｍＭの非必須アミノ酸が補充された歯髄維持培地酸中で行われる。この手法は、通常最大で１週間かかる。ＤＰが生存可能であると見なされると、ＤＰは採取され、ｈＩＤＰＳＣは継代される。得られたｈＩＤＰＳＣは、将来の臨床研究のためにＧＴＰ条件下で凍結保存される。
【０２５５】
提案された生成プロセスの説明
１つの態様では、生成プロセスは、図４８に示されるステップを含み、これは、ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）単離およびバッチ製剤の初期プロセスを実証している。垂直経路は、初期集団ｈＩＤＰＳＣ（５回の採取前に歯髄から単離される）および後期集団−ｈＩＤＰＳＣ（５回の採取後に歯髄から単離される）の歯髄機械的移動（採取物）のプロセスを示す。水平経路は、細胞が反復継代によって置換された場合の細胞培養の伝統的な酵素的方法を示す。最終的なバッチ生成物は、歯髄採取物および継代（５回以下）から得られたｈＩＤＰＳＣの合計である。
【０２５６】
別の態様では、生成プロセスは、図４８および／または図４９に示されるステップを含む。生成プロセスには、ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）単離およびバッチ形成が含まれる。垂直経路は、５回の採取前に歯髄（ＤＰ）から単離された初期集団−ｈＩＤＰＳＣ、および５ＤＰの採取後にＤＰから単離された後期集団−ｈＩＤＰＳＣのためのＤＰ機械的移動（採取）のプロセスを示す；水平経路は、細胞が反復継代によって置換された場合に、細胞培養の伝統的な酵素的方法を示す。最終バッチ−生成物は、ＤＰ採取物および継代（５回以下）から得られたｈＩＤＰＳＣの合計である。
【０２５７】
ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）の生成は、ＧＭＰ規則に準拠した最先端のクリーンルーム施設で行われる。一実施形態では、この生成プロセスは、図５０に概略を示したステップに従う。
【０２５８】
ｈＩＤＰＳＣ採取
歯髄外植片の周囲にｈＩＤＰＳＣの半コンフルエントなコロニー形成が検出されると、ＤＰは、ＤＰ維持培地中での継続的な増殖のために新しい細胞培養容器に移される。
【０２５９】
ｈＩＤＰＳＣ継代
ｈＩＤＰＳＣを滅菌ＰＢＳで洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ溶液で除去し、遠心分離する。ペレットをＤＰ維持培地中に再懸濁させ、その後、組織培養フラスコに播種する（継代１−Ｐ１）。細胞が約８０％のコンフルエントに達した場合、それらは新しいフラスコに継代される（継代２−Ｐ２）。細胞を加湿５％のＣＯ２インキュベーター中でインキュベートする。
【０２６０】
凍結前の安全性試験
Ｐ５由来のｈＩＤＰＳＣは、無菌性およびマイコプラズマ検査のための細胞馴化培地を収集するために、少なくとも３〜５日間、培養物中に維持される。
・無菌試験は、ＩＳＯ、ＧＭＰ認証方法によって実施される。
・マイコプラズマ検査は、社内のＲＴ−ＰＣＲ試験（ＥＺ−ＰＣＲ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いて、およびＩＳＯ、ＧＭＰ認定によって行われる。
【０２６１】
凍結保存
ｈＩＤＰＳＣ凍結プロトコールは、標準的な凍結保存プロトコールに適合させる−Ｐ５由来のｈＩＤＰＳＣは、９０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯ（ＧＭＰ／ＵＳ製薬グレード）で構成される１ｍＬの凍結培地を含有する２ｍＬ凍結保存バイアルに移される。１バイアルあたり１×１０６細胞を凍結保存する。
【０２６２】
凍結保存バイアルは、イソプロピルアルコールで充填されたＮａｌｇｅｎｅ  Ｃｒｙｏ  １ｏＣ凍結容器内に置かれ、一晩、−８０℃に置かれる。その後、バイアルを液体窒素貯蔵タンクの気相に移し、それらの場所を記録する。
【０２６３】
材料の制御
表１７は、材料の制御に使用されるプロセスを示す。
【０２６４】
【表１７】
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【０２６５】
実施例１５．インビボ腫瘍原性
奇形腫の形成は、任意の多能性細胞、例えば、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞（ＥＳおよびｉＰＳ細胞）の多能性を決定する上で本質的なツールである。Ｇｒｏｐｐら（２０１２年）によって記載されたプロトコールから適合されたプロトコールは、細胞の奇形腫形成能力の評価に用いられた。本明細書に記載されている方法は、免疫不全マウスへの、規定された数の未分化マウスまたはヒトのＥＳおよびｉＰＳ細胞ならびにマトリゲルの皮下同時移植に基づく。使用した新規方法は、マウスＥＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞の１０６細胞（１０５細胞を使用したＧｒｏｐｐら（２０１２年）とは異なる）を使用した場合、高い再現性および効率であることが示された。症例の１００％において、奇形腫形成が、多数の動物および長期の追跡調査（最大６カ月）で観察された。この方法はまた、乳歯の歯髄、臍帯、および脂肪組織に由来するものなどの他の成人ＭＳＣ型の生体安全性を評価するために使用された。
【０２６６】
本発明者らは、ｈＩＤＰＳＣ由来の誘導多能性幹細胞の誘導を観察した。ｈＩＤＰＳＣ由来のｉＰＳ細胞の多能性は、奇形腫形成により試験され、一方で、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞およびｈＩＤＰＳＣは対照として使用された。ＥＳ細胞の奇形腫生成のための日常的なプロトコールを用いた（Ｈｅｎｔｚｅら、２００９年）。このプロトコールに従い、各系統の１０６個の細胞：ｈＩＤＰＳＣ−ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞およびｈＩＤＰＳＣを４週齢の雄性ＳＣＩＤの後肢筋肉に接種した。ｈＩＤＰＳＣ−ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞を接種された動物では、奇形腫形成が３カ月後に観察された。しかしながら、この研究で陰性対照として使用され、１０匹の動物に接種されたｈＩＤＰＳＣは、３カ月後および６カ月後の追跡のいずれにおいても奇形腫を生成しなかった。これらの動物のうちの５匹は、１年中、生存を維持し、この時期の後でさえ、奇形腫形成は観察されなかった。
【０２６７】
組織学的には、多能性幹細胞における奇形腫形成は、３つの胚葉に由来する組織の発生を必要とする。成人／間葉系幹細胞について、移植部位における正常組織の完全性の変化が考慮された。６カ月後、ｈＩＤＰＳＣを接種され、奇形腫を生じなかった動物を死亡させ、動物の脳、肺、腎臓、脾臓、および肝臓の組織学的標本を分析した。ｈＩＤＰＳＣからのＤＮＡの存在は、上記の全ての臓器において確認されたが、腫瘍形成およびいずれの形態学的変化も観察されなかった。このように、本発明者らは、腫瘍形成および免疫拒絶反応の危険性に関する治験製品ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）による細胞再生の安全性を確立した。
【０２６８】
さらに、脊髄損傷、頭蓋骨欠損、全辺縁幹細胞欠損症（ＴＬＳＣＤ）、筋ジストロフィー、および大腿骨頭骨壊死（ＯＮＦＨ）の動物モデルにおけるｈＩＤＰＳＣを用いた前述の研究に示されるように、奇形腫形成および／または免疫拒絶反応の危険性は観察されなかった（Ｃｏｓｔａら、２００８年；Ｋｅｒｋｉｓら、２００８年；Ｍｏｎｔｅｉｒｏら、２００９年；Ｇｏｍｅｓら、２０１０年；Ｆｅｉｔｏｓａら、２０１０年；Ａｌｍｅｉｄａら、２０１１年）。
【０２６９】
図５１は、治験製品ＣＥＬＬＡＶＩＴＡ（商標）（幹細胞）の安全性を支持する、既に公開されている追加の前臨床試験を要約する。
実施例１６．奇形腫アッセイの主な基準
本発明者らは、奇形腫アッセイのための次の基準を評価した：感度および定量性；最終的な細胞数および単一細胞懸濁液の生産；多能性細胞マーカーおよび核型における発現に関して研究された細胞の免疫表現型決定；マトリゲルと一緒に研究細胞の同時移植。細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下（ｓ．ｃ）移植し、奇形腫の発生を簡単に監視できるようにした。
【０２７０】
腫瘍の発生を４カ月（約１６週間）から監視した。奇形腫の組織学的基準は、多能性細胞の三胚葉に由来する細胞への分化である。このような研究は、通常、病理学者によって行われた。
【０２７１】
成人／間葉系幹細胞では、細胞の注射部位における正常な組織の完全性に対する任意のタイプまたは変化が考慮された。
奇形腫基準の適用
Ａ．実験システム（単数または複数）：
ａ．マウス胚性幹細胞
ｂ．マウス３Ｔ３線維芽細胞、恒久的マウス細胞株Ｂａｌｂｃ  ３Ｔ３細胞株、クローンＡ３１
ｃ．ヒトｉＰＳ−ＩＤＰＳＣ
ｄ．ヒトＥＳ細胞
ｅ．ヒトＩＤＰＳＣ
本発明者らは、本発明者らによって確立された様々なマウスＥＳ細胞株の多能性を特徴付け、ならびに２５回以上の高継代でＥＳ細胞の多能性を確認するため、およびマウスＥＳ細胞株から得られたサブクローンの特徴付けるために、多様な研究において上記方法を使用した（Ｓｕｋｏｙａｎら、２００２年；Ｃａｒｔａら、２００６年；Ｋｅｒｋｉｓら、２００７年；Ｌａｖａｇｎｏｌｌｉら、２００７年；Ｈａｙｓｈｉら、２０１０年）。
【０２７２】
さらに、この方法は、本発明者らのグループのより最近の刊行物（Ｂｅｌｔｒａｏ−Ｂｒａｇａら、２０１１年）において、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）に由来するｉＰＳ細胞の多能性を特徴付けるために使用された。この刊行物では、ヒトＩＤＰＳＣをｉＰＳ−ＩＤＰＳＣの対照として使用した。本発明者らは、ｉＰＳ−ＩＤＰＳＣが、３つの胚層全てに由来する組織を有する立派な奇形腫を形成し、一方で、ｈＩＤＰＳＣは、任意のタイプの奇形腫または任意の他のタイプの新生物を生成することができなかったことを示した。さらに、ｉＰＳ−ＩＤＰＳＣは核内にＮａｎｏｇを発現し、ｈＩＤＰＳＣは核内に発現させなかった。
【０２７３】
結果
未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）集団を単離するために使用される培養物のような、開示された多重採取外植片は、正常な核型および幹細胞に特徴的な拡大増殖速度を維持しながら、少なくとも１５回の継代中に、胚性幹細胞マーカーＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１、ならびにいくつかの間葉系幹細胞マーカーの発現をもたらす。これらのマーカーの発現は、これらの細胞から得られたサブクローンにおいて維持された。さらに、インビトロで、これらの細胞は、化学的に規定された培養条件下で、平滑筋および骨格筋、ニューロン、軟骨および骨への均一な分化を受けるように誘導することができる。ＩＤＰＳＣは、細胞小器官に乏しい小さなサイズおよび細胞質を有するが、典型的な間葉系線維芽様の形態を呈するナイーブな多能性細胞と異なることを言及することは重要である。したがって、ＩＤＰＳＣは、上皮タイプのものであるＥＳおよびｉＰＳ細胞とは対照的に、間葉系タイプのものである。ＭＳＣとＥＳまたはｉＰＳ細胞の間の主な相違点は、ＭＳＣが移動して、プラスチックのアンカーリングを行い、細胞外マトリックスを合成し、細胞接合がない細胞であるという点である。
【０２７４】
Ｂ．実験システム：
ａ．初期継代（ｎ＝１０）および後期継代（ｎ＝１０）でのＩＤＰＳＣの３つの異なる初代培養
ｂ．ヒト初代線維芽細胞
さらに、この方法は、多能性マーカーも発現する骨髄、肝臓、卵黄嚢、尿嚢および羊水由来のイヌ胎児幹細胞を用いて検証した。
【０２７５】
ＩＤＰＳＣは、多能性マーカーを発現する可変数の幹細胞（細胞の１〜２５％）を有するＭＳＣ集団によって構成される（Ｌｉｚｉｅｒら、２０１２年）。これらの細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝２０）に移植し、腫瘍の発生を４カ月（約１６週間）から監視した。細胞注入部位における正常な組織の完全性に関するあらゆるタイプの変化を考慮した。このプロトコールは、特に、ＩＤＰＳＣの２０％が多能性マーカーを発現することに基づいて計算された、使用された細胞の数に関してＩＤＰＳＣ集団に適合された。ＥＳおよびｉＰＳ細胞を用いた本発明者らの以前の試験では、本発明者らは１０６細胞を使用し、一方で、ＩＤＰＳＣおよび対照細胞の奇形発生を試験するために、５×１０６細胞を使用した。４カ月後、肉眼的に腫瘍が観察されない場合でさえ、マウスを屠殺し、脳、肺、腎臓、脾臓、肝臓などの様々な臓器から凍結切片を得、病理学者によって分析した。
【０２７６】
全ての研究された臓器内のＩＤＰＳＣのＤＮＡの存在が見出されたが、腫瘍形成もいずれの形態学的変化も観察されなかった。
参考文献
【０２７７】
【表１８−１】
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【０２７８】
【表１８−２】
2019510758.tif 000023
【０２７９】
【表１８−３】
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【０２８０】
【表１８−４】
2019510758.tif 000025
【０２８１】
【表１８−５】
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【０２８２】
【表１８−６】
2019510758.tif 000027
【図１】
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【図２−１】
2019510758.tif 000029
【図２−２】
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【図３−１】
2019510758.tif 000031
【図３−２】
2019510758.tif 000032
【図３−３】
2019510758.tif 000033
【図４−１】
2019510758.tif 000034
【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３５−４】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図３９−３】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【国際調査報告】
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2019510758.tif 000111
2019510758.tif 000112