(57)【要約】  本発明は、増強されたＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）型トランスポゾン及び転移の方法に関する。特に、本発明は、ＩＲ／ＤＲに左側及び右側に隣接されたカーゴ核酸を含むポリヌクレオチドに関し、特定の配列を有するＩＲ／ＤＲは、ＳＢトランスポザーゼタンパク質により認識され、該ポリヌクレオチドは細胞のＤＮＡ内に組み込まれ得る。また、本発明は、該ポリヌクレオチドと、ＦＡＣＴ複合体の要素を欠失できる転移の補助因子、又はＨ、Ｓ、Ｖ及びＬを含む群から選択されるカテプシンの阻害剤、又はＨＳＰ９０を欠失若しくは阻害できる補助因子、又はＧ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ若しくはＧ２／Ｍの細胞周期で細胞を一時停止する因子、又はＰＣＮＡのユビキチン化を阻害する因子等、又はこれらの要素がノックダウン若しくは阻害された細胞又は上記細胞周期で一時停止された細胞等の更なる要素とを含む核酸を転移するキットに関する。【選択図】図１
2019509066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆向き反復配列／直列反復配列（ＩＲ／ＤＲ）に左側及び右側に隣接されたカーゴ核酸を含むトランスポゾンを含むポリヌクレオチド又はその相補的ポリヌクレオチドであって、
（ｉ）前記トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼタンパク質によって移動可能であり、
（ｉｉ）前記左側のＩＲ／ＤＲは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む外側の左側ＤＲモチーフと、配列番号２のヌクレオチド配列を含む内側の左側ＤＲモチーフとを含み、
（ｉｉｉ）前記右側のＩＲ／ＤＲは、配列番号１のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含む外側の右側ＤＲモチーフと、配列番号２のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含む内側の右側ＤＲモチーフとを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記外側の左側ＤＲモチーフは、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記外側の右側ＤＲモチーフは、配列番号４のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記内側の左側ＤＲモチーフは、配列番号５のヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記内側の右側ＤＲモチーフは、配列番号６のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含む、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記左側のＩＲ／ＤＲは、前記外側の左側ＤＲモチーフと前記内側の左側ＤＲモチーフとの間に、配列番号７のヌクレオチド配列を含むエンハンサーとして機能可能なＨＤＲ領域を含み、
任意に前記右側のＩＲ／ＤＲは、前記ＨＤＲ領域の逆相補鎖を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記左側のＩＲ／ＤＲは、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記右側のＩＲ／ＤＲは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群から選択される逆相補鎖ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記カーゴ核酸は、プロモーターに作動可能に連結されたオープンリーディングフレームを含み、
前記オープンリーディングフレームは、好ましくはＴ細胞受容体コンストラクト又はその断片をコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
（ｉ）アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス、レトロウィルス、単純ヘルペスウィルス、バキュロウィルス、エプスタイン−バールウィルス及びポックスウィルスベクターを含む群から選択されるウィルスベクター、又は、
（ｉｉ）プラスミド、ミニサークル、ｐＦＡＲベクター若しくはウィロソームを含む群から選択される非ウィルスベクター、
からなる群から選択されるベクターである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
核酸を転移するためのキットであって、
（ｉ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）（ａ）Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼタンパク質、又は（ｂ）Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼタンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉｉ）任意に、
（Ａ）ＳＳＲＰ１及びＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６からなる群から選択されるＦＡＣＴ複合体の要素を欠失できる補助因子、
（Ｂ）Ｈ、Ｓ、Ｖ及びＬを含む群から選択されるカテプシン阻害剤、
（Ｃ）ＨＳＰ９０を欠失又は阻害できる補助因子、
（Ｄ）Ｇ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ若しくはＧ２／Ｍの細胞周期で細胞を一時停止する因子、
（Ｅ）ＰＣＮＡのユビキチン化を阻害する因子、
（Ｆ）ＡＴＲの濃度及び／若しくはシグナリングを増大できる因子
の群から選択される少なくとも１つの補助因子、又は、
（ＡＡ）前記ＦＡＣＴ複合体の要素がノックダウンされた、
（ＢＢ）前記カテプシンがノックダウンされた、
（ＣＣ）前記ＨＳＰ９０がノックダウンされた、
（ＤＤ）前記細胞周期がＧ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ若しくはＧ２／Ｍで一時停止された、
（ＥＥ）ＰＣＮＡのユビキチン化が阻害された、及び／又は、
（ＦＦ）ＡＴＲの濃度及び／若しくはシグナリングが増大された、細胞と、を含み、
前記補助因子は、小分子、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む群から選択される、キット。
【請求項１０】
組換え核酸を生成する方法であって、
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼの認識配列を含む標的核酸を請求項９に記載のキットの要素に接触することを含む、方法。
【請求項１１】
トランスフェクト細胞を生成する方法であって、
請求項９に記載のキットの要素を前記細胞に導入することを含み、好ましくは細胞にエレクトロポレーションを行うことを含む、方法。
【請求項１２】
前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、活動亢進性トランスポザーゼＳＢ１００Ｘである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載のキット又は請求項１０若しくは１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含み、
好ましくは、請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む養子Ｔ細胞移植に適するＴ細胞である、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の宿主細胞を含む医薬組成物。
【請求項１５】
組換えポリペプチド、又はＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン等のトランスポゾンの転移による組換えポリペプチドを含む組換え細胞を調製するための、補助因子又は細胞の使用であって、
前記補助因子は、
（Ａ）ＳＳＲＰ１及びＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６からなる群から選択されるＦＡＣＴ複合体の要素を欠失できる補助因子、
（Ｂ）Ｈ、Ｓ、Ｖ及びＬを含む群から選択されるカテプシン阻害剤、
（Ｃ）ＨＳＰ９０を欠失又は阻害できる補助因子、
（Ｄ）Ｇ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ若しくはＧ２／Ｍの細胞周期で細胞を一時停止する因子、
（Ｅ）ＰＣＮＡのユビキチン化を阻害する因子、
（Ｆ）ＡＴＲの濃度及び／若しくはシグナリングを増大できる因子、
の群から選択される少なくとも１つの補助因子であり、
前記補助因子は、好ましくはＦＡＣＴ複合体の要素を欠失できる補助因子であり、
前記補助因子は、小分子、抗体、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む群から選択され、
前記細胞は、
（ＡＡ）前記ＦＡＣＴ複合体の要素がノックダウンされた、
（ＢＢ）前記カテプシンがノックダウンされた、
（ＣＣ）前記ＨＳＰ９０がノックダウンされた、
（ＤＤ）前記細胞周期がＧ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ若しくはＧ２／Ｍで一時停止された、
（ＥＥ）ＰＣＮＡのユビキチン化が阻害された、及び／又は、
（ＦＦ）ＡＴＲの濃度及び／若しくはシグナリングが増大された、細胞であり、
前記トランスポゾンは、好ましくは請求項１〜８のいずれか１項にポリペプチドである、使用。
【請求項１６】
組換えポリヌクレオチド、又はＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン等のトランスポゾンの転移による組換えポリヌクレオチドを含む組換え細胞を生成するための方法であって、
（Ａ）ＳＳＲＰ１及びＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６からなる群から選択されるＦＡＣＴ複合体の要素を欠失できる補助因子、
（Ｂ）Ｈ、Ｓ、Ｖ及びＬを含む群から選択されるカテプシン阻害剤、
（Ｃ）ＨＳＰ９０を欠失又は阻害できる補助因子、
（Ｄ）Ｇ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ若しくはＧ２／Ｍの細胞周期で細胞を一時停止する因子、
（Ｅ）ＰＣＮＡのユビキチン化を阻害する因子、並びに、
（Ｆ）ＡＴＲの濃度及び／若しくはシグナリングを増大できる因子、
からなる群から選択される補助因子を細胞に導入することと、
前記細胞内で転移を誘導することと、を含み、又は、
（ＡＡ）前記ＦＡＣＴ複合体の要素がノックダウンされた、
（ＢＢ）前記カテプシンがノックダウンされた、
（ＣＣ）前記ＨＳＰ９０がノックダウンされた、
（ＤＤ）前記細胞周期がＧ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ若しくはＧ２／Ｍで一時停止された、
（ＥＥ）ＰＣＮＡのユビキチン化が阻害された、及び／又は、
（ＦＦ）ＡＴＲの濃度及び／若しくはシグナリングが増大された、細胞を誘導する又は該細胞内で転移を誘導すること、を含み、
前記トランスポゾンは、好ましくは、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであり、
前記補助因子は、好ましくはＦＡＣＴ複合体の要素を欠失できる補助因子であり、
前記補助因子は、小分子、抗体、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増強型Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ型トランスポゾン及び転移（transposition）の方法に関する。特に、本発明は、逆向き反復配列／直列反復配列（ＩＲ／ＤＲ）に左右に隣接されたカーゴ核酸を含むポリヌクレオチドに関し、特定の配列を有するＩＲ／ＤＲは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼタンパク質により認識され、そのポリヌクレオチドは、細胞のＤＮＡ内に組み込まれることが可能である。また、本発明は、上記ポリヌクレオチド、及びＦＡＣＴ（facilitates chromatin transcription）複合体の要素、すなわちＳＳＲＰ１及び／若しくはＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６、若しくはＨ、Ｓ、Ｖ及びＬを含む群から選択されるカテプシンの阻害剤を欠失できる転移の補助因子、又はＨＳＰ９０を欠失又は阻害できる補助因子、又はＧ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ若しくはＧ２／Ｍの細胞周期における細胞周期を一時的に停止する因子、又はＰＣＮＡのユビキチン化を阻害する因子、又はこれらの要素がノックダウン若しくは阻害され、若しくは上記いずれかの細胞周期で一時停止された細胞等の更なる要素を含む核酸を転移するためのキットに関する。代替又は追加で、そのキットは、転移の補助因子として、ＡＴＲの濃度及び／若しくはシグナリングを増大できる因子、又はＡＴＲの濃度及び／若しくはシグナリングが増大された細胞を含み得る。さらに、本発明は、上記トランスポゾンポリヌクレオチドを用いた方法、宿主細胞及び医薬組成物を提供する。また、それは、例えば遺伝子組み換えされた核酸又は細胞を調整するための、転移効率を増大するためのトランスポゾンの補助因子又は特定の細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ組換えは、本質的に、遠いＤＮＡサイトの破損及び連結に関連する。真核生物において最もよく研究された組換え機構は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え（脊椎動物における適応免疫系のイムノグロブリンのレパートリーを生成する転移様のプロセス）、並びにｍａｒｉｎｅｒ及びＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ転移可能エレメントの転移を含む。これらの組換え反応は、リコンビナーゼタンパク質とリコンビナーゼが結合して組換えを実行する特定のＤＮＡサイトとの２つの主要な機能的要素を必要とする。ＤＤＥ配列（Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸）を含む保存性が高い触媒ドメインは、一般に、多くのリコンビナーゼを特徴付ける。バクテリアのＩＳエレメント、ＤＮＡトランスポゾンのＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒファミリー、ヒト免疫不全ウィルスインテグラーゼ、又はＶ（Ｄ）Ｊ組換えのＲＡＧ１リコンビナーゼを含むこのＤＤＥスーパーファミリーは、原核生物からヒトにまで広く及ぶ。真核生物における転移機構についての我々の理解は、種々のリコンビナーゼの結晶構造の決定された数の増加により徐々に深くなっている。それでも、触媒ドメインにより行われる共有の化学反応にかかわらず、異なるエレメントがどのように反応を処理するかという重要な差異がある。全てのＤＤＥリコンビナーゼは、トランスポゾンの末端での一本鎖切断を含む組換え反応を開始するが(Mizuuchi K, et al., 1992. J Biol Chem., 267: 21273-6; Hickman AB,et al., 2014. Cell, 158: 353-67.)、第２の鎖の処理が異なり得る。第２の鎖の切断は、多くの場合ヘアピン中間体を介して達成されるが、ｍａｒｉｎｅｒエレメント及びＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙでは異なり(Dawson A and Finnegan DJ, 2003. Mol Cell. 11: 225-35; Izsvak Z, etal., 2004. Mol Cell, 13: 279-90.)、二本鎖切断がリコンビナーゼによる２回の連続する加水分解の結果として起こる(Richardson JM, et al., 2006. Embo J., 25: 1324-34; Richardson JM,et al., 2009. Cell, 138: 1096-108.)。
【０００３】
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）を含むＴｃｌ／ｍａｒｉｎｅｒスーパーファミリーのメンバーは、集中的に研究された真核生物のエレメントである。ＳＢは、脊椎動物のゲノムを操作するために不可欠の遺伝子ツールとなった。ｍａｒｉｎｅｒ及びＳＢの両方は、トランスポゾンのサイズに感受性があり、大きいエレメントを野生型と比較して低い頻度で転移する。そのような類似性にもかかわらず、ｍａｒｉｎｅｒ及びＳＢの転移は、顕著な差異を有すると考えられる。トランスポゾンの末端の対合を実行するための方法及びそのような対合のための要件を含む規制も、リコンビナーゼ間で異なる。ｍａｒｉｎｅｒは、それぞれのトランスポゾン末端における一つのトランスポゾン結合サイトを含む短いＴＩＲを有するが(Rosenzweig B, et al., 1983. Nucleic Acids Res, 11: 4201-9; Tosi LRand Beverley SM, 2000. Nucleic Acids Res., 28: 784-90.)、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）は、それぞれのトランスポゾン末端において２つのトランスポザーゼ結合サイト（直列反復配列で表される）を有するトランスポゾンの間接反復配列／直列反復配列（ＩＲ／ＤＲ）サブファミリーに属する(Franz G and Savakis C, 1991. Nucleic Acids Res, 19: 6646; Izsvak Z,et al., 1995. Mol Gen Genet. 247: 312-22; Ivics Z, et al., 1997. Cell, 91:501-10; Miskey C, et al., 2003. Nucleic Acids Res, 31: 6873-81; Plasterk RH, etal., 1999. Trends Genet, 15: 326-32)（図１Ａ）。左のＩＲは、ＳＢ転移におけるエンハンサーとして作用する追加のモチーフ（ＨＤＲ）を含む(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem,  277: 34581-8.)。ＩＲ／ＤＲがＳＢ転移の絶対条件であるとの報告にもかかわらず (Izsvak Z, et al., 2000. J Mol Biol, 302: 93-102.)、転移プロセスにおけるその役割については不可解である。
【０００４】
ＳＢトランスポゾンの種々の変異体は、本技術分野において周知である(WO 98/40510, US 8,227,432, Cui  et al., 2002.Structure-function analysis of the inverted terminal repeats of the SleepingBeauty transposon". J. Mol. Biol. 318 (5): 1221-1235; Izsvak et al. 2000.Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformationin vertebrates. J. Mol. Biol. 302 (1): 93-102)。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを含む商業的に入手可能なプラスミドは、以下に示される。
pT(https://www.addgene.org/26555/sequences/#depositor-partial)、
pT2(https://www.addgene.org/26557/sequences/#depositor-full)、又は
pT3(Yant SR, et al. Mutational analysis of the N-terminal DNA-binding domain ofsleeping beauty transposase: critical residues for DNA binding andhyperactivity in mammalian cells. Mol Cell Biol. 2004 Oct;24(20):9239-47.)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
それでも、本分野において、増大された効率を有するトランスポゾン、増強型トランスポゾンシステム、キット及び方法の必要性がある。この問題は、本発明者により解決された。本発明は、特許請求の範囲及び明細書に記載される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
特に、本発明は、左右に逆向き反復配列／直列反復配列（ＩＲ／ＤＲ）によって隣接されたカーゴ核酸を含むトランスポゾンを含むポリヌクレオチドを提供し、
（ｉ）上記トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼタンパク質により動作され、
（ｉｉ）左側のＩＲ／ＤＲは、左側の外側において配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＲモチーフを含み、左側の内側において配列番号２のヌクレオチド配列を含むＤＲモチーフを含み、
（ｉｉｉ）右側のＩＲ／ＤＲは、右側の外側において配列番号１のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含むＤＲモチーフを含み、右側の内側において配列番号２のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含むＤＲモチーフを含む。
【０００７】
また、本発明は、特にポリヌクレオチドが一本鎖の場合に相補的ポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
ＳＢトランスポゾンのＩＲ／ＤＲ構造の役割を解明する目的で、本発明者らは、インビボ、インビトロ及びインシリコのアプローチを組み合わせた。彼らは、トランスポゾンのＩＲ／ＤＲ構造と、厳しく規制され、整理されたトランスポゾンの末端におけるＤＮＡ−タンパク質複合体のアセンブリに寄与するトランスポザーゼのＤＮＡ−タンパク質及びタンパク質−タンパク質相互作用表面との間の組織化された相互作用を発見した。彼らは、ｍａｒｉｎｅｒトランスポゾン（Ｈｓｍａｒｌ）と比較して、ＳＢでは、単一末端転移（single ended transposition）といった異常発生頻度が顕著に低いことを証明した。従って、ＩＲ／ＤＲ複合体構造は、異常な転移を抑制することによって、両方の転移可能エレメント及び宿主細胞ゲノムを再配列から保護するために発生され得る。
【０００９】
本発明者らは、トランスポゾン及びトランスポザーゼを小さい機能的ドメインに分け、ＳＢの転移プロセスにおけるそれらの寄与について研究した。それぞれの試験は、以下の実施例の項に示される。それらの試験の過程で、本発明者らは、本発明の新規の増強型ＩＲ／ＤＲ配列、特により高い転移率を示す新規のＤＲモチーフを含むトランスポゾンを開発した。要するに、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポザーゼのＰＡＩドメインに結合することを促進する配列が、転移効率のために同定され、試験された。驚くべきことに、より高い結合親和性を有するいくつかの配列、特に本明細書に記載された本発明のポリヌクレオチド配列だけが、転移効率の増大を引き起こした。
【００１０】
本発明の外側のＤＲ（１４ＤＲ又は外側１４ＤＲとも言う）は、配列番号１の配列（左側の外側ＤＲ）、又はその逆向き配列若しくは逆相補鎖（右側の外側ＤＲ）を有する。このコンセンサス配列における２つの可変位置は、好ましい実施形態において、左側の外側ＤＲと右側の外側ＤＲとの間で異なる。特に、左側の外側ＤＲにおいて、ＹはＴであってもよい及び／又はＷはＡであってもよい。好ましくは、ＹはＴであり、ＷはＡである。特に、右側の外側ＤＲにおいて、ＹはＣであってもよい及び／又はＷはＴであってもよい。好ましくは、ＹはＣであり、ＷはＴである。従って、好ましくは、左側の外側ＤＲモチーフは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む及び／又は右側の外側ＤＲモチーフは、配列番号４のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含む。最も好ましくは、左側の外側ＤＲモチーフは、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、右側の外側ＤＲモチーフは、配列番号４のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含む。
【００１１】
（表１）
表１：外側ＤＲ（米国特許第８２２７４３２号の配列番号３又は４に対する差異は太字で示され、新規の位置は、太字で且つ下線により示される。Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｗ＝Ａ／Ｔ）
2019509066.tif 000003
【００１２】
本発明の内側のＤＲ（１２ＤＲ又は内側１２ＤＲとも言う）は、配列番号２の配列（左側の内側ＤＲ）、又はその逆向き配列若しくは逆相補鎖（右側の内側ＤＲ）を有する。このコンセンサス配列における３つの可変位置は、好ましい実施形態において、左側の内側ＤＲと右側の内側ＤＲとの間で異なる。好ましくは、左側の内側ＤＲにおいて、ＹはＴである及び／又は右側の内側ＤＲにおいて、ＹはＣである。好ましくは、左側の内側ＤＲにおいてＹはＴであり、右側の内側ＤＲにおいてＹはＣである。ＶはＡ、Ｇ又はＣであってもよいが、好ましくは、ＶはＣである。ＫはＧ又はＴであってもよく、好ましくは、ＫはＧである。従って、一実施形態において、左側の内側ＤＲにおいてＹはＴであり、ＶはＣであり、ＫはＧである（配列番号５）、及び／又は右側の内側ＤＲにおいてＹはＣであり、ＶはＣであり、ＫはＧである（配列番号６）。最も好ましくは、左側の内側ＤＲモチーフは配列番号５のヌクレオチド配列を含み、内側の右側ＤＲモチーフは配列番号６のヌクレオチド配列の逆相補鎖を含む。
【００１３】
（表２）
表２：内側ＤＲ（米国特許第８２２７４３２号の配列番号３又は４に対する差異は太字で示され、新規の位置は、太字で且つ下線により示される。Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｖ＝Ａ／Ｇ／Ｃ（好ましくはＣ）、Ｋ＝Ｇ／Ｔ（好ましくはＧ））
2019509066.tif 000004
【００１４】
さらに、本発明者らは、本発明のＤＲ配列のＰＡＩ結合領域も増強型ＨＤＲ領域を提供することを発見した。従って、本発明は、本発明のトランスポゾンを含むポリヌクレオチドも提供し、その左側のＩＲ／ＤＲは、外側ＤＲと内側ＤＲとの間に配列番号７のヌクレオチド配列を含むエンハンサーとして機能できるＨＤＲ領域を含む。ＶはＡ、Ｇ若しくはＣであってもよく、好ましくはＣであり、及び／又はＫはＧ若しくはＴであってもよく、好ましくは、ＫはＧである。好ましくは、ＶはＣであり、ＫはＧである。任意に、上記トランスポゾンの右側のＩＲ／ＤＲは、上記ＨＤＲ領域の逆相補鎖をさらに含む。
配列番号７  ＨＤＲ  ＧＴＫＴＡ  ＣＡＫＡＣＡＳＤ
Ｋ＝Ｇ／Ｔ
Ｓ＝Ｃ／Ｇ
Ｄ＝Ａ／Ｔ／Ｇ
【００１５】
この好ましいＨＤＲは、内側ＤＲのＰＡＩ結合領域に対応する。
【００１６】
直列反復配列を囲う配列もトランスポゾンの転移効率において重要な役割を果たすことが、先行技術において周知である。例えば、トランスポゾンは、外側ＤＲと内側ＤＲとの間のヌクレオチド数が約１３５〜１９６、好ましくは１５５〜１７６の場合に、最も効率が高く移動する。
【００１７】
本発明のＩＲ／ＤＲのために適するフレームワーク配列は、ｐＴ、ｐＴ２又はｐＴ３トランスポゾンから周知の配列に対応し得る。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において記載される配列番号１及び２の配列を全て含み、好ましくは、これらの周知のフレームワーク領域又は同等のフレームワーク領域の状況下でこれらの配列を含む。
【００１９】
従って、本発明はポリヌクレオチドを提供し、左側のＩＲ／ＤＲは、配列番号８及び配列番号９、又はその配列に対して９０％以上の配列同一性を有する、好ましくはそれらの配列の一つに対して９５％以上の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、又は最も好ましくは配列番号８及び９を含む群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
また、本発明はポリヌクレオチドを提供し、右側のＩＲ／ＤＲは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３、並びにそれらの配列のうちの１つに対して９０％以上の配列同一性、好ましくはその配列に対して９５％以上の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、又は最も好ましくは配列番号１０、１１、１２及び１３を含む群から選択される逆相補鎖ヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
（表３）
表３：好ましいＩＲ／ＤＲ配列
ＨＤＲを含むｐＴ４の左側ＩＲ／ＤＲ：
2019509066.tif 000005
配列番号８     
TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAATTGTKTACAKACASDTTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
ＨＤＲを含むｐＴ５の左側ＩＲ／ＤＲ：
2019509066.tif 000006
配列番号９
TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAATTGTKTACAKACASDTTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
ＨＤＲを含まないｐＴ４の右側ＩＲ／ＤＲ（右側ＩＲ／ＤＲは所定の配列の逆相補鎖を含む）：
2019509066.tif 000007
配列番号１０
TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCGAGTAAAGATTCCCTGTCTTAAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
ＨＤＲを含まないｐＴ５の右側ＩＲ／ＤＲ（右側ＩＲ／ＤＲは所定の配列の逆相補鎖を含む）：
2019509066.tif 000008
配列番号１１
TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCTAGTAAAAATTCCCTGTCTTAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
ＨＤＲを含むｐＴ４の右側ＩＲ／ＤＲ（右側ＩＲ／ＤＲは所定の配列の逆相補鎖を含む）：
2019509066.tif 000009
配列番号１２
TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCGAGTAAAGATTCCCTGTCTTAAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATGTKTACAKACASDTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
ＨＤＲを含むｐＴ５の右側ＩＲ／ＤＲ（右側ＩＲ／ＤＲは所定の配列の逆相補鎖を含む）：
2019509066.tif 000010
配列番号１３
TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCTAGTAAAAATTCCCTGTCTTAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATGTKTACAKACASDTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT
Ｙ＝Ｃ／Ｔ、好ましくは、Ｙは左側ＤＲにおいてＴであり、右側ＤＲにおいてＣである。
Ｗ＝Ａ／Ｔ、好ましくは、Ｗは左側ＤＲにおいてＡであり、右側ＤＲにおいてＴである。
Ｖ＝Ａ／Ｇ／Ｃ、好ましくは、ＶはＣである。
Ｋ＝Ｇ／Ｔ、好ましくは、ＫはＧである。
Ｓ＝Ｃ／Ｇ、
Ｄ＝Ａ／Ｔ／Ｇ。
最も好ましくは、Ｙは左側ＤＲにおいてＴであり、右側ＤＲにおいてＣであり、Ｗは左側ＤＲにおいてＡであり、右側ＤＲにおいてＴであり、ＶはＣであり、ＳはＣであり、ＤはＧであり、ＫはＧである。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドの好ましい実施形態において、左側ＩＲ／ＤＲは配列番号８のヌクレオチド配列を含み、右側ＩＲ／ＤＲは配列番号１０又は配列番号１２の逆相補鎖ヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチドにおいて、フレームワーク領域はｐＴに対応し、本発明のポリヌクレオチドではｐＴ４と示される。
【００２３】
他の好ましい実施形態において、左側ＩＲ／ＤＲは配列番号９のヌクレオチド配列を含み、右側ＩＲ／ＤＲは配列番号１１又は配列番号１３の逆相補鎖ヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチドにおいて、フレームワーク領域はｐＴ２に対応し、本発明のポリヌクレオチドではｐＴ５と示される。
【００２４】
本発明のトランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼタンパク質により移動され得る。従って、上記トランスポゾンは、例えばベクター等のドナーポリペプチドから切り取り、例えば細胞のゲノムＤＮＡ又は染色体外ＤＮＡといった標的サイト内に結合できる。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。それは、二本鎖若しくは一本鎖、又はそれらの組合せであってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖であってもよく、例えばそれらはレトロウィルスベクター等の一本鎖に結合されてもよい。典型的には、本発明のポリヌクレオチドは二本鎖であろう。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドは、線状又は環状であってもよい。好ましくは、それは環状型である。スーパーコイル状プラスミド型が特に高い転移効率を有することが示されている。環状型において、最適な効率のために、左側ＩＲ／ＤＲの５’末端は、例えば約３００ｂｐ以上であるスペーサーによって右側ＩＲ／ＤＲの３’末端から分離されている。
【００２６】
上記ポリヌクレオチドは、
（ｉ）アデノウィ得うる、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス、レトロウィルス、単純ヘルペスウィルス、バキュロウィルス、エプスタイン‐バールウィルス及びポックスウィルスベクターを含む群から選択されるウィルスベクター、又は
（ｉｉ）プラスミド、ミニサークル、ｐＦＡＲコンストラクト若しくはウィロソームを含む群から選択される非ウィルスベクター
からなる群から選択されるベクターであってもよい。
【００２７】
ミニサークルは、非本質的原核生物ベクター部分からほとんど又は完全に分離された小分子環状プラスミド誘導体である。特に、ミニサークルは、抗生物質耐性又はＯＲＩ等の細菌遺伝子をコードするＤＮＡを含まない。本発明のミニサークルＤＮＡは、Kay et al., 2010, Nature Biotechnology 28, 1287-1289に従って調製され得る。そのバックボーン（すなわちカーゴを含まない）は、２ｋｂ未満又は１ｋｂ未満、例えば約５４０〜５８０ｂｐ、好ましくは約５６０ｂｐであることが好ましい。また、ベクターは、例えばMarie et al, 2010, J Gen Med 12(4), 323-332に記載のｐＦＡＲベクター（抗生物質耐性マーカーを含まないプラスミド）であってもよい。
【００２８】
また、適切なベクターは、Narayanavari  et al., 2017, Crit Rev Biochem Mol Biol. 52(1):18-44;Richter et al., 2016, Blood 128(18):2206-2217; Boehme, et al., 2016. Mol TherNucleic Acids 5, e337; 又は Yant et al., 2002, NatBiotechnol 20, 999-1005に記載されている。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、カーゴ核酸を含む。任意に、カーゴ核酸は、プロモーターに作動可能に連結されたオープンリーディングフレームを含み、そのオープンリーディングフレームは、例えばＴ細胞受容体コンストラクト又はその断片をコードしていてもよい。代替的又は追加的に、カーゴ核酸は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードする配列を含んでもよい。オープンリーディングフレームは、代替的又は追加的に、例えば抗生物質耐性遺伝子、酵素又は蛍光タンパク質といったマーカーをコードしてもよい。また、本発明のトランスポゾンは、挿入変異に適し得る。
【００３０】
また、本発明は核酸を転移するためのキットを提供し、そのキットは、
（ｉ）本発明のポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）（ａ）ＳＢトランスポザーゼタンパク質、又は（ｂ）ＳＢトランスポザーゼタンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉｉ）（Ａ）ＳＳＲＰ１及びＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６からなる群から選択されるＦＡＣＴ複合体の要素を欠失できる補助因子、
（Ｂ）Ｆ、Ｈ、Ｌ、Ｓ及びＶ（例えばＥ６４Ｄ）を含む群から選択されるカテプシンの阻害剤、
（Ｃ）ＨＳＰ９０（ＨＳＰＡＡ１）を欠失又は阻害できる補助因子、ゲルダナマイシン、ラジシコール又は１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンを含む群から選択される阻害剤、
（Ｄ）細胞周期Ｇ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ又はＧ２／Ｍで細胞を一時的に停止する因子、
（Ｅ）ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）のユビキチン化を阻害する因子、並びに、
（Ｆ）ＡＴＲ（毛細血管拡張性小脳失調症及びＲａｄ３関連タンパク質）の濃度及び／若しくはシグナリングを増大できる因子、
を含む群から選択される少なくとも１つの補助因子と、を含み、
上記補助因子は、小分子、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ、又は、以下の特徴を有する細胞から選択される。
（ＡＡ）上記ＦＡＣＴ複合体の要素、
（ＢＢ）上記カテプシン、及び／若しくは、
（ＣＣ）上記ＨＳＰ９０（ＨＳＰＡＡ１）がノックダウンされている、
（ＤＤ）細胞周期がＧ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ若しくはＧ２／Ｍで一時的に停止されている、
（ＥＥ）ＰＣＮＡのユビキチン化が阻害されている、並びに／又は
（ＦＦ）ＡＴＲの濃度及び／若しくはシグナリングが増大されている。
【００３１】
トランスポゾン及びＳＢトランスポザーゼタンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、特にＳＢトランスポダーゼタンパク質をコードする核酸がＤＮＡである場合、同一のベクター又は異なるベクターに配置されてもよい。ＳＢトランスポザーゼタンパク質をコードする核酸がＲＮＡの場合、トランスポゾンを含むポリヌクレオチドは典型的にＤＮＡ、好ましくは環状、最も好ましくはスーパーコイル型のＤＮＡである。多くの場合、トランスポゾンを含むポリヌクレオチドはＤＮＡ、好ましくは環状、最も好ましくはスーパーコイル型のＤＮＡであり、ＳＢトランスポザーゼはタンパク質であろう。
【００３２】
任意に、上記キットは、適切な緩衝液若しくは細胞培養液、並びに／又は細胞にトランスフェクションする及び／若しくは組換え核酸を生成するための説明書をさらに含む。転移は、例えばGoryshin et al., 1998, JBC 273, 7367-7374により教示された方法に従って、インビトロで行われ得る。しかしながら、通常、転移は、細胞内、典型的には細胞培養液中又はエクスビボで起こる。過排卵する女性への移植後の単一細胞接合子をマイクロインジェクションすることが可能である。さらに、転移は、ＳＢ−ウィルスベクターハイブリッドの組合せ（例えばhybrid SB-adeno such as Zhang et al, 2013 PLoS One 8(10):e75344）、又はエレクトロポレーション若しくはナノ粒子による輸送によってインビボで起こり得る。
【００３３】
本発明の全ての実施形態において、ＳＢトランスポザーゼは、例えば米国特許第８２２７４３２Ｂ２に開示されたＳＢトランスポザーゼ、又はＳＢ１０（Ivics et al., 1997, Cell 91:501-510）であってもよい。好ましくは、本発明を通して、それは活動亢進性トランスポザーゼＳＢ１００Ｘ(Mates L1, et al. Molecular evolution of a novel hyperactiveSleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.Nat Genet. 2009 Jun;41(6):753-61)である。
【００３４】
本発明者らは、さらに驚くべきことに、少なくとも１つの上記補助因子が転移中に存在する場合、特に、（Ａ）ＦＡＣＴ複合体の要素を欠失できる補助因子、（Ｂ）Ｆ、Ｈ、Ｌ、Ｓ及びＶを含む群から選択されるリソソームカテプシンの阻害剤、（Ｃ）ＨＳＰ９０を欠失できる補助因子、（Ｄ）Ｇ０／Ｇ１、Ｇ１／Ｓ若しくはＧ２／Ｍの細胞周期で細胞を一時的に停止する因子、（Ｅ）ＰＣＮＡのユビキチン化を阻害する因子、又は（Ｆ）ＡＴＲの濃度及び／若しくはシグナリングを増大できる因子が存在する場合、転移の効率が顕著に増大することを発見した。
【００３５】
哺乳動物細胞において、ＳＳＲＰ１及びＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６は、ヘテロダイマーとして存在し、ＦＡＣＴ（Facilitates chromatin transcription）複合体の要素である。ＦＡＣＴ複合体は、ＤＮＡ複製及び修復等の種々の処理に関連する。アフリカツメガエルにおけるＦＡＣＴホモログの欠失は、不完全な複製を引き起こし(Orphanides et al., 1999, Nature 400:284-288)、従ってそれは複製において役割を有することを示す。さらに、ＦＡＣＴ複合体は、ＰＡＲＰ１及びＲＰＡ等のＤＮＡ損傷の修復処置に関連するタンパク質と相互作用し得ることも示されている(Huang et al., 2006, Nucleic Acids Res. 34:2398-2407; VanDenmark etal., 2006, Mol Cell. 22:363-374; Solinger et al., 2002, Mol Cell. 10:1175-1188)。近年、ＳＳＲＰ１の欠失が、相同組換え活性の増大、及びＨ２ＡＸ及びＲａｄ５１の局在形成の増加を引き起こすことが示されている。興味深いことに、ＳＳＲＰ１がインビトロにおいてＲａｄ５４と物理的に相互作用でき、Ｒａｄ５４により促進されるＨＪｓのＢＭ活性を機能的に阻害できることも示されている(Kumari et al., 2009, J Cell Biochem. 108:508-518)。
【００３６】
従って、ＦＡＣＴ複合体の要素を欠失できる少なくとも１つの補助因子は、ＳＳＲＰ１及び／又はＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６を欠失できる。欠失は、問題の要素、特にＦＡＣＴ複合体の要素がトランスポザーゼ及び／又はトランスポゾンとの相互作用に十分に利用可能でない結果を起こす。これは、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉によって適切な細胞株においてノックダウンすることにより、又は例えばＳＳＲＰ１若しくはＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６に対する適切な抗体を用いてＦＡＣＴ複合体の要素を捕捉することにより、欠失された要素、例えばＦＡＣＴ複合体の要素の濃度を低減することにより達成され得る。
【００３７】
好ましくは、補助因子は、小分子、抗体、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む群から選択される。小分子は、約８００ｇ／ｍｏｌ以下の活性因子であってもよい。例えば、Ｅ６４Ｄ等のカテプシン阻害剤が用いられ得る。ゲルダナマイシン、ラジシコール又は１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン等のＨＳＰ９０阻害剤が、代替的又は追加的に用いられ得る。
【００３８】
本発明者らは、ＳＵＰＴ１６Ｈの欠失は、転移を強く増大することを引き起こすことを示し、従ってそれは好ましい。
【００３９】
例えば、ＳＳＲＰ１及び／又はＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６といった問題の要素を欠失できる補助因子は、例えば以下に記載される結合アッセイ又は転移アッセイにより同定され得る。ＳＳＲＰ１又はＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６の濃度を低減できるｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、当業者が調製でき、商業的に入手可能である。プレデザインされ、販売されている合成ｓｉＲＮＡ(siGENOME, SMARTpool)が(Dharmacon, GEhealthcareから)入手された。ｓｕｐｔ１６Ｈ遺伝子(cat.No. M-009517-00-0005)及びｓｓｒｐ１(cat. No. M-011783-01-0005)のいずれかを標的にするｓｉＲＮＡは、jetPEITMトランスフェクションシステムを用いてＨｅｋ２９３Ｔにトランスフェクションされた。陰性対照として、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ(cat. No. D-001206-14-05)が用いられた。ｍｉＲＮＡによるノックダウンのために、遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡ（表５）が合成され(Eurofins)、最終的にトランスフェクションの前にｍｉＲＮＡベクターにクローニングされた。
【００４０】
ＦＡＣＴ複合体の両方の要素は欠失され得るが、本発明者らはそれらの要素のうちの１つの欠失が、例えば約５０の因子によって顕著に転移の効率を増大するのに既に十分であることを示した。これは、例えば非活動亢進性ＳＢ１０及びＳＢ１００Ｘを用いる転移の両方に当てはまる。
【００４１】
ＦＡＣＴ複合体の少なくとも１つの要素の欠失は、本発明のトランスポゾン（例えばｐＴ４又はｐＴ５）、及び他のトランスポゾン、特にＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、例えばｐＴ、ｐＴ２又はｐＴ３等のＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンの転移効率を増大する。
【００４２】
トランスポザーゼにより活性化された転写変化を監視するために、ゲノム全域にわたる転写研究が行われた(HeLa, Affymetrix)。トランスクリプトームの分析は、いくつかの宿主でコードされた遺伝子がトランスポザーゼの存在下で異なって制御されることを明らかにした。アップレギュレートされたタンパク質のリストは、ＨＳＡＰ２、別名ＨＳＰ７０−２及びカテプシンファミリーのいくつかのメンバーを含む（図６Ａ）。ヒートショックタンパク質ＨＳＰ７０の変異体であるＨＳＰＡ２はストレス応答タンパク質のメンバーであるが、カテプシンはリソソームプロテアーゼであり、哺乳動物の細胞抗体において重要な役割を有する。予備的結果は、ＨＳＰ９０（ＨＳＰ９０ＡＡ１）を阻害する又はカテプシン活性を阻害する（図６Ｂ）ことによるストレス応答の調節がＳＢ転移を改善することを示す。さらに、細胞ストレス応答を低減することによりアポトーシスシグナリングの誘導が緩和され、細胞の生存率が改善する。
【００４３】
本発明者らは、例えば本明細書に記載された本発明のトランスポゾンのＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ又はｐＴ２等の従来のＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを介した転移がＡＴＲシグナリングを必要とすることをさらに示した（実施例２及び図７）。従って、ＡＴＲの濃度及び／又はシグナリング、好ましくは濃度を増大できる因子は、本発明のキットに有利に含まれ得る。好ましくは、その因子はＡＴＲの発現を増大する。そのような因子は、例えばｍＲＮＡ等のＡＴＲをコードするポリヌクレオチドであってもよい。また、ＡＴＲをコードするポリヌクレオチドは、例えば細胞のゲノム内に組み込まれるのに適する型のＤＮＡであってもよい。代替的に、ＡＴＲは、本発明のポリヌクレオチドにコードされ、好ましくは左右の逆向き反復配列／直列反復配列に隣接された領域の外側にコードされ得る。その因子は、タンパク質としてのＡＴＲであってもよい。ＡＴＲの濃度及び／又はシグナリングが増大される細胞はそのような因子を含むことが好ましい。好ましくは、ＡＴＲの発現は増大される。これに関連し、その増大は、ＡＴＲの濃度又はシグナリングがそのような因子の追加により影響されない細胞との比較に関連する。
【００４４】
代替的に、ＡＴＲの濃度及び／又はシグナリング、好ましくはシグナリングを減少できる因子は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙの活性の制御が望まれる場合、例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙの活性が負の方向に制御されるような陰性対照として本発明のキットに含まれ得る。ＡＴＲの濃度を低減できる因子はｍｉＲＮＡであってもよい。ＡＴＲのシグナリングを低減できる因子はカフェインであってもよい。
【００４５】
従って、本発明は、組換えポリヌクレオチド、又はトランスポゾン、好ましくはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンの転移による組換えポリヌクレオチドを含む組換え細胞を、例えばＦＡＣＴ複合体の要素を欠失できる補助因子といった少なくとも１つの上記補助因子又は因子の存在下で調製する方法を提供する。補助因子又は因子は、好ましくはインビトロ又はエクスビボで細胞内に導入され得る。
【００４６】
また、本発明は、組換えポリヌクレオチド、又はトランスポゾン、好ましくはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンの転移による組換えポリヌクレオチドを含む組換え細胞を例えばＦＡＣＴ複合体の要素を欠失できる補助因子といった少なくとも１つの上記補助因子又は因子の使用を提供し、これにおいて、転移効率は上記補助因子又は因子が無い条件と比較して顕著に増大する。好ましくは、転移は少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍又は少なくとも約５０倍増大する。
【００４７】
また、本発明は、ＳＳＲＰ１及び／又はＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６のノックダウン細胞（ΔＳＳＲＰ１又はΔＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６）、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞に基づく（ＨＥＫ２９３ＴΔＳＳＲＰ１及びＨＥＫ２９３ＴΔＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＰＴ１６）細胞株を提供し、転移、好ましくはｐＴ２等のＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを用いた転移による組換えポリヌクレオチド又は組換え細胞を生成するためのそれらの使用を提供する。ＨＳＰ９０及び／若しくはカテプシンのノックダウン細胞株、並びに／又はＰＣＮＡのユビキチン化が阻害された及び／若しくは細胞周期が上記段階のいずれかで停止された細胞が用いられ得る。そのような細胞株は、本発明のキット等の転移キットの要素であってもよい。そのような細胞株は、高い転移効率を達成するために用いられ得る。好ましくは、そのようなノックダウン細胞は安定発現株である。
【００４８】
本発明のノックダウン細胞株は、ＦＡＣＴ複合体の要素の濃度が低減するように変異された細胞株であってもよい。そのような低減は、遺伝子改変を通じて、又は遺伝子又はｍＲＮＡ転写物に相補的配列を有する短いＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチド等の試薬による処理により起こり得る。ＤＮＡの遺伝子改変が行われた場合、安定的なノックダウンとなる。遺伝子発現の変更がｍＲＮＡに結合する又は遺伝子に一時的に結合するオリゴヌクレオチドにより引き起こされる場合、これは、染色体ＤＮＡを変更しない遺伝子発現の一時的な変更を引き起こし、これは一過性ノックダウンと呼ばれる。
【００４９】
一過性ノックダウンにおいて、このオリゴヌクレオチドの活性遺伝子又はその転写物への結合は、種々のプロセスを通って発現の低減を引き起こす。結合は、（例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はＲＮａｓｅ−Ｈ依存的アンチセンスによる）転写の阻害（遺伝子との結合の場合）、ｍＲＮＡ転写物の分解を通して起こり得る、又は（例えばモルフォリノオリゴ又は他のＲＮａｓｅ−Ｈ非依存的アンチセンスによる）ｍＲＮＡの翻訳、ｍｉＲＮＡを含む他の機能性ＲＮＡの成熟のために用いられるプレｍＲＮＡのスプライシングサイト若しくはヌクレアーゼの切断サイトの阻害を通して起こり得る(Wikipedia)。
【００５０】
本発明における好ましいノックダウン方法は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）であり、それはｍＲＮＡ分解によって遺伝子をサイレンシングする手段である。この方法による遺伝子ノックダウンは、小分子の二本鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞質に導入することにより達成される。小分子干渉ＲＮＡは、細胞内部で生じてもよく、又は外部から細胞内に導入されてもよい。細胞内に導入されると、外因性ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）により処理される。ｓｉＲＮＡは、サイレンシングされる標的ｍＲＮＡに相補的であり、ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡを位置決めするためのテンプレートとしてｓｉＲＮＡを用いる。ＲＩＳＣが標的ｍＲＮＡに配置した後に、ＲＮＡはリボヌクレアーゼにより切断される。ｓｉＲＮＡは細胞株内に恒常的に発現されてもよく、又は例えばエレクトロポレーションによるトランスフェクションのために他の要素と同時に導入されてもよい。
【００５１】
従って、ノックダウンのために用いられる方法に依存して、細胞はＦＡＣＴ複合体の要素を欠失できる補助因子を含んでもよい。また、本発明は、組換えポリヌクレオチド、又はＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン等のトランスポゾンの転移による組換えポリヌクレオチドを含む組換え細胞を調製するための方法を提供し、トランスポゾンは、好ましくは例えばトランスポザーゼ（タンパク質若しくは核酸型）及びトランスポゾンが導入されることによりＦＡＣＴ複合体の要素はノックダウンされた細胞において転移を誘導することを含む本明細書に記載された本発明のトランスポゾンである。また、本発明は、例えば組換えポリヌクレオチド又はＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン等のトランスポゾンの転移による組換えポリヌクレオチドを含む組換え細胞の調製のための、ＦＡＣＴ複合体の要素がノックダウンされた細胞の使用を提供し、好ましくは、トランスポゾンは本発明のトランスポゾンである。
【００５２】
また、本発明は、本発明のノックダウン細胞を含む生物（特にマウス又はラット等の非ヒト生物）、及び、好ましくはｐＴ４若しくはｐＴ５のＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンの転移によりトランスフェクションされた生物を生成するためのそれの使用を提供する。
【００５３】
また、本発明は、本発明のキットの要素を、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼの認識配列を含む標的核酸に接触させることを含む、組換え核酸を生成するための方法を提供する。
【００５４】
また、本発明は、トランスフェクションされた細胞を生成する方法を提供し、その方法は、本発明のキットの要素をその細胞内導入することを含む。好ましくは、その方法は、細胞にエレクトロポレーションをすることを含む。本発明の方法は、インビトロ又はインビボ、好ましくはインビトロで行われ得る。
【００５５】
また、本発明のポリヌクレオチド及び／又はキットは、例えば宿主としてチャイニーズハムスターの卵巣細胞を用いた組換えタンパク質の大規模生成のための細胞プール（すなわち組換え細胞のポリクローナル培養体）及びクローン細胞株の生成のために用いられ得る。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、依然として、バイオ医薬、特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、二重特異性抗体及びＦｃ融合タンパク質の製造のための最も一般的な宿主である。従って、本発明は、タンパク質、例えば抗体又は二重特異性抗体若しくはＦｃ融合タンパク質等のその誘導体の生成のためのプロセスを提供し、それは、好ましくは本発明のキットを用いて、上記タンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドを例えばエレクトロポレーションでＣＨＯ細胞等の宿主細胞に導入するステップを含み、上記タンパク質は単離される。
【００５６】
また、本発明は、トランスポゾンを含む本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、宿主細胞は、本発明のトランスポゾンを含む養子Ｔ細胞移植に適するＴ細胞であり、カーゴ核酸はトランスジェニックＴＣＲコンストラクト又はその断片である、及び／又は少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする。
【００５７】
さらに、本発明は、本発明の宿主細胞を含む医薬組成物を提供する。例えば、宿主細胞が腫瘍抗原反応性トランスジェニックＴ細胞コンストラクトを発現する場合、医薬組成物は、癌を治療する方法に用いられ得る。他の実施形態において、（例えばそれらは感染細胞を標的とする適切なＴＣＲコンストラクトを発現するＴ細胞であるため）本発明の宿主細胞は、例えばウィルス性又は細菌性疾患といった伝染病の治療に適する。
【００５８】
さらに、本発明は、特許請求の範囲を限定することを意図しない実施例において示され、また説明される。本明細書において引用される全ての文献は、完全に組み込まれる。他の部分で明示的に述べない限り、「１つ（Ａ）」は「少なくとも１つ」と理解されることを意味する。「約」は＋／−１０％を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】Ｍａｒｉｎｅｒ／Ｔｃ１及びＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ転移可能エレメントの構造を示す。（Ａ）ｍａｒｉｎｅｒにおいて、トランスポザーゼのコーディング配列（灰色のバー）は、末端の逆向き反復配列（ＩＲ）により隣接され、ＩＲはＩＲ毎に単一の認識モチーフを含む。（Ｂ）Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙにおいて、ＩＲ／ＤＲエレメントがより長い末端ＩＲ（矢印）を有し、ＩＲ毎に２つの認識シグナル配列を含み、直列反復配列型（ＤＲ）において２度繰り返される。左側のＩＲは、追加的に、転移のエンハンサーとして機能するモチーフ（ＨＤＲ）を含む。
【図２Ａ】ＣＡＳＴｉｎｇによるＳＢトランスポザーゼの最適結合サイトの選択を示す。ＣＡＳＴｉｎｇ方法のフローチャートである。
【図２Ｂ】６度のＣＡＳＴｉｎｇサイクルにより選択されたオリゴヌクレオチドを配列決定し、ＳＢトランスポザーゼの完全（ＰＡＩＲＥＤ）ＤＮＡ結合ドメインＮ１２３(Ivics Z, et al., 1997. Cell, 91: 501-10)を用いてゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）で試験した。結合親和性をＳＢの左側ＩＲの１４ＤＲモチーフと比較した。ＣｐｘはＤＮＡ−タンパク質複合体であり、ｆｒｅｅは遊離ＤＮＡプローブの位置である（右パネル）。
【図２Ｃ】図２Ｂに示す複合体を定量し、関連する基質結合親和性値を算出した。
【図２Ｄ】ＣＡＳＴｉｎｇ方法により選択された最適な結合サイトの配列アライメントである。ＲＥＤの結合領域はイタリック体で示され、ＡＴフック結合のヌクレオチドはボックスで囲われ、ＰＡＩの結合領域は大文字で示されている。配列をＳＢトランスポゾンの左側ＩＲの１２ＤＲ（左パネル）又は１４ＤＲ（右パネル）の野生型モチーフに対してアライメントした。同一性スコアを以下に示す。同一のヌクレオチドの背景に色付けをした（黒色：５０％以上、灰色：５０％以下）。野生型モチーフの２０％及び７０％が、それぞれＲＥＤ及びＰＡＩの野生型モチーフのＣＡＳＴｉｎｇによって回復した。ＥＭＳＡ（図３）に用いられる選択された最適結合サイトにスターで印を付けた。ＷＴ            １２ＤＲ：配列番号１４    １４ＤＲ：配列番号１５ＣＡＳＴ−１      １２ＤＲ：配列番号１６          １４ＤＲ：配列番号１７ＣＡＳＴ−２      １２ＤＲ：配列番号１８          １４ＤＲ：配列番号１９ＣＡＳＴ−３      １２ＤＲ：配列番号２０          １４ＤＲ：配列番号２１ＣＡＳＴ−４      １２ＤＲ：配列番号２２          １４ＤＲ：配列番号２３ＣＡＳＴ−５      １２ＤＲ：配列番号２４          １４ＤＲ：配列番号２５ＣＡＳＴ−６      １２ＤＲ：配列番号２６          １４ＤＲ：配列番号２７ＣＡＳＴ−７      １２ＤＲ：配列番号２８          １４ＤＲ：配列番号２９ＣＡＳＴ−８      １２ＤＲ：配列番号３０          １４ＤＲ：配列番号３１ＣＡＳＴ−９      １２ＤＲ：配列番号３２          １４ＤＲ：配列番号３３ＣＡＳＴ−１０  １２ＤＲ：配列番号３４    １４ＤＲ：配列番号３５ＣＡＳＴ−１１  １２ＤＲ：配列番号３６    １４ＤＲ：配列番号３７ＣＡＳＴ−１２  １２ＤＲ：配列番号３８    １４ＤＲ：配列番号３９ＣＡＳＴ−２０  １２ＤＲ：配列番号４０    １４ＤＲ：配列番号３１
【図３Ａ】１２ＤＲと１４ＤＲとの間の区別は、ＳＢトランスポザーゼのＤＮＡ結合ドメインのＲＥＤサブドメインに関する。左側の逆向き反復配列（ＩＲ）の１４（外側）ＤＲ（配列番号３２）及び１２（内側）ＤＲ（配列番号３３）のアライメントを示す。フットプリント法(Ivics Z, et al., 1997. Cell, 91: 501-10)により同定されたＤＮＡ−タンパク質相互作用に関するヌクレオチドを上側に示し、非同定ヌクレオチドをイタリック体で示す。ＰＡＩ（白丸）又はＲＥＤ（黒丸）サブドメインにより認識されるヌクレオチド。及びＡＴフック（囲まれている）を示す(Izsvak Z, et al., 2002. Chem,  277: 34581-8.)。ＲＡＧ１の「７量体」及び「９量体」モチーフに類似するヌクレオチドを黒四角で強調している(Hesse, JE et al., 1989. Genes Development, 3: 1053-61)。モチーフ間のスペーサーの長さは、内側及び外側ＤＲにおいてそれぞれ１２又は１４である。
【図３Ｂ】ＲＥＤ（Ｎ５８〜１２３、黒丸）、ＰＡＩ（Ｎ１〜５７、白丸）又は完全Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメイン（ＰＡＩ＋ＲＥＤ）のＤＮＡ結合特性をＥＭＳＡにより試験した。パネル３Ｂａ及び３Ｂｂにおいて、１２ＤＲ（黒色）、１４ＤＲ（灰色）又は１２＋ＡＡＤＲ（点線黒色）に対応するラベル化オリゴヌクレオチドをＤＮＡ基質として用いた。予測される核タンパク質複合体の概要を示す。完全Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメイン（ＰＡＩＲＥＤ、Ｎ１２３）と形成される複合体を、サイズマーカー（〜２×ＲＥＤ）として用いた。複合体を、４％（パネル３Ｂａ）又は６％（パネル３Ｂｂ及び３Ｂｃ）ネイティブゲルで分離した。
【図３Ｃ】化学的架橋剤である２ｍＭのＢＳ３の存在下におけるＲＥＤサブドメインのオリゴマー化を示す。複合体を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗ＳＢトランスポザーゼポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行った。複合体（ヒスチジンタグを含む）の予想分子量は以下の通りである。Ｍ（ＲＥＤモノマー）が８．５ｋＤａであり、Ｄ（ＲＥＤダイマー）が１７ｋＤａであり、Ｔ（ＲＥＤテトラマー）が３４ｋＤａである。
【図４】内側ＤＲにおける増強された結合親和性は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ転移に関連する。左側に種々のｎｅｏ標識された変異トランスポゾンコンストラクトを示す。右側にそれぞれの転移活性を、野生型トランスポゾン（コンストラクト１）を１００％として、それと比較して示す。（Ａ）ＰＡＩ（黒四角）又はＲＥＤ（灰四角）認識モチーフを、ＣＡＳＴｉｎｇ試験により選択された高親和性結合サイト（ＣＡＳＴ−５）に変更することにより、複合ＤＲを作製した（ＰＡＩ認識モチーフをスターで示し、ＲＥＤ認識モチーフをストリップで示す）。（Ｂ）ＣＡＳＴ−５配列（配列番号２４又は２５）を、ＰＡＩ認識モチーフのみを置き換えるために用い、ＤＲの残りを野生型とした。
【図５Ａ】ＲＮＡ干渉により生成した安定ノックダウン細胞株での転移アッセイを示す。ノックダウンコンストラクトを有する細胞の濃縮である。Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞がトランスフェクトされず、詳細は実施例の項に示すようにレトロウィルスベクターＭＰＳＶ−ＬＴＲ-イントロン-トランケートされたｈＮＧＦＲ-ＷＰＲＥ-ｍｉＲＮＡ-ＬＴＲを用いて形質導入され、ｍｉＲＮＡは以下の通りであり、いずれの宿主遺伝子をも標的としないコンストラクトが陰性参照（スクランブル）として用いられ、又は２１ヌクレオチド（ｎｔ）を有し、ｓｓｒｐ１若しくはｓｕｐｔ１６Ｈを特異的に標的とするｍｉＲＮＡコンストラクトが用いられた。形質導入されたＨｅｋ２９３Ｔ細胞の表面ＮＧＦＲ発現を、フローサイトメトリー（形質導入後）により監視した（ｘ軸）。ｙ軸は非染色である。ｍｉＲＮＡを発現する細胞を濃縮するために、細胞をＦＡＣＳでソーティングし、再度分析下（ソーティング後）。データは、ｍｉＲＮＡがＦＡＣＴ複合体の要素を欠失する場合に、ＮＧＦＲの増大した発現を示す。
【図５Ｂ】ｍｉＲＮＡのノックダウン効率をｍｉＲＮＡ濃縮細胞からｑＰＣＲにより測定した。バーの上の括弧内に示された数字は、ノックダウンの％を示す。
【図５Ｃ】ノックダウン細胞株における転移アッセイである。ｐＣＭＶ−ＳＢ１０＆ｐＴ２Ｂ−Ｐｕｒｏ、又はｐＣＭＶ−ＬａｃＺ＆ｐＴ２Ｂ−Ｐｕｒｏ、又はｐＣＭＶ−ＳＢ１００ｘ＆ｐＴ２Ｂ−Ｐｕｒｏがトランスフェクションされたピューロマイシン耐性のＨｅｋ２９３Ｔ細胞の染色されたコロニーを含むペトリ皿を示す。
【図５Ｄ】ｓｉＲＮＡの一過性トランスフェクションを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の転移アッセイを示す。ｓｉＲＮＡはｓｓｒｐ１又はｓｕｐｔ１６Ｈを標的とする。いずれの遺伝子も標的としないスクランブルｒｉＲＮＡが陰性参照として用いられている。ｐＣＭＶ−ＳＢ１０＆ｐＴ２Ｂ−Ｐｕｒｏ、又はｐＣＭＶ−ＬａｃＺ＆ｐＴ２Ｂ−Ｐｕｒｏ、又はｐＣＭＶ−ＳＢ１００ｘ＆ｐＴ２Ｂ−Ｐｕｒｏがトランスフェクションされたピューロマイシン耐性のＨｅｋ２９３Ｔ細胞の染色されたコロニーを含むペトリ皿を示す。
【図６Ａ】ＳＢ転移におけるＥ６４Ｄ（カテプシン、システインプロテアーゼ及びカルパインの阻害剤）の効果を示す。転移アッセイを示す（２０μＭ、右側；参照、左側）。カテプシンに対するＲＮＡｉのアプローチは、類似の改善が得られることが期待される。
【図６Ｂ】トランスポザーゼの存在下における宿主遺伝子の異なる発現を示す（ＨｅＬａ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。ダウンレギュレートされた宿主遺伝子（右側）、アップレギュレートされた宿主遺伝子（左側）を示す。カテプシン（ＣＴｓ）はポリペプチドを分解し、基質特異性により区別される（ＣＴＳＨ、ＣＴＳＦ、ＣＴＳ２）。
【図７Ａ】カフェイン処理がＳＢ転移を阻害する。ＨｅＬａ細胞に、ＡＴＲシグナリング阻害剤のカフェイン（４ｍＭ）を処理すると同時に、トランスポゾン（２５０ｎｇのｐＴ２Ｂ−Ｐｕｒｏ）、及びトランスポザーゼ（２５ｎｇのｐＣＭＶ−ＳＢ１００ｘ）又はＤ３トランスポザーゼ（２５ｎｇの触媒的に不活性のｐＣＭＶ−ＳＢ１００ｘ）プラスミドをトランスフェクションした。細胞をその処理の２４時間後に回収し、コロニーフォーミングアッセイ、細胞周期分析及びウェスタンブロットを行った。（ｉ）はコロニーフォーミングアッセイの結果を示す棒グラフである。（ｉｉ）は未処理及びカフェイン処理した細胞におけるＳＢトランスポザーゼの発現レベルを示すウェスタンブロットである。チューブリンの発現レベルをローディングコントロールとして示す。＊はＰ＞０．０５（有意とみなさない）であり、＊＊＊はＰ＜０．００１である（一元配置分散分析、テューキー・クラマー多重比較ポストテスト）。
【図７Ｂ】ＡＴＲ欠損細胞がＳＢ転移において欠陥があることを示す。ＳＢ転移を、誘導的方法でＡＴＲ又はＡＴＲｋｄ（ＡＴＲのドミナントネガティブキナーゼ非活性アレル）を発現する安定細胞株で観察した。ＡＴＲ野生型及びＡＴＲｋｄ細胞のコロニーフォーミングアッセイの結果を棒グラフに示す。ＡＴＲが機能しない細胞で転移に顕著に影響した。
【実施例】
【００６０】
＜実施例１＞
［結果］
（ＳＢトランスポザーゼのＰＡＩサブドメインは、主要な基質の接触を仲介する）
ＩＲ／ＤＲのＤＲは、複合構造を有し、複合ＤＮＡ結合ドメインにより認識される。ＳＢトランスポザーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ＰＡＸファミリーの転写因子への類似に基づいて、ＰＡＩ及びＲＥＤと呼ばれる２つのへリックス−ターン−へリックス（ＨＴＨ）モチーフからなる(Izsvak Z, et al., 2002J Biol Chem, 277: 34581-8.; Czerny T, et al.,1993. Genes Dev.,  7: 2048-61.)。両方のサブドメインは、配列特異性ＤＮＡ結合に関連し、ＰＡＩは、ＤＲで示される二分のトランスポザーゼ結合サイトの３’部分に結合し、ＲＥＤは５’部分に相互作用する(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8)。ＤＮＡ結合に加えて、ＰＡＩはタンパク質−タンパク質相互作用干渉性を有することが以前に示されている(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem,  277: 34581-8.)。特に、トランスポゾンの末端におけるＤＲ（外側ＤＲ）は２ｂｐ長い（図１の１４ＤＲ対１２ＤＲ）ので、ＳＢの４つのＤＲは同一でない。
【００６１】
ＳＢのＰＡＩＲＥＤドメインにより占められた結合サイトは決定されているが(Ivics Z, et al., 1997. Cell, 91: 501-10)、フットプリント法の試験は基質認識の動態に関して有益でない。同時にＰＡＩ及びＲＥＤ結合モチーフが認識されるだろうか。その回答のために、本発明者は、ＤＮＡ結合タンパク質の最適結合サイトを同定するために元々開発されたＣＡＳＴｉｎｇアプローチ(Wright et al., 1991. Mol Cell Biol. 11:4104-10)を用いた（図２Ａ）。ＣＡＳＴｉｎｇは、親和性精製及びＰＣＲ増幅によってＤＮＡ配列の配列濃縮に基づいて、好適に複合体ライブラリーの外の結合配列を選択する。ＣＡＳＴｉｎｇアプローチは、（ｉ）高親和性結合サイトを同定するために、及び（ｉｉ）複合ＤＮＡ結合ドメインによる主要な基質認識に好適に関連される配列モチーフを位置付けるために用いられる。ＳＢトランスポザーゼ結合のフットプリントデータ(Ivics Z, et al., 1997. Cell, 91: 501-10)に基づいて、３５ｂｐランダムオリゴヌクレオチドライブラリーを結合条件で全長トランスポザーゼに曝露した。６度のＣＡＳＴｉｎｇサイクル後に選択されたオリゴヌクレオチドを配列決定し、トランスポザーゼの完全（ＰＡＩＲＥＤ）ＤＮＡ結合ドメインを用いたゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）で試験した。ＣＡＳＴｉｎｇ方法で選択された配列は、野生型１４ＤＲ配列と比較して８倍に至る強さで結合した（図２Ｂ及び２Ｃ）。奇妙にも、ＣＡＳＴｉｎｇで選択された高親和性結合サイトは、野生型ＤＲに限定的な類似性のみを有し、ＰＡＩ認識モチーフに主に集中して同一性を有した（図２Ｄ）。従って、ＰＡＩサブドメインは主要な基質認識を特定すると考えられるが(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8; Carpentier CE,et al., 2014. Prot Sci. 23:23-33)、ＲＥＤはこのプロセスにわずかに関わる。ＣＡＳＴｉｎｇ法により捕捉された配列は、ＰＡＩ及びＲＥＤのＤＮＡ相互作用が異なる機能を有し、ＲＥＤによるタンパク質−ＤＮＡ相互作用は、反応の後の方のステップで起こり得ることを提示する。さらに、ＣＡＳＴｉｎｇで選択されたＤＲは、１２ＤＲ型でも１４ＤＲ型でもなく、トランスポゾンとトランスポザーゼとの「最初の接触」において内側１２ＤＲと外側１４ＤＲとの顕著な差異が無いことを提示する。
【００６２】
（ＳＢトランスポザーゼのＲＥＤサブドメインは１２ＤＲと１４ＤＲとの区別を仲介する）
ＲＥＤ又はＰＡＩにより認識される配列は、１２ＤＲと１４ＤＲとで異なる（図３Ａ）。特に、ＲＥＤ結合は、１２ＤＲと１４ＤＲとの２塩基対の差異でオーバーラップし(Izsvak Z, et al., 2002. Chem, 277: 34581-8.)（図３Ａ）、ＲＥＤがトランスポゾンの末端から離れて位置するＤＲ（１２ＤＲ）又は近くに位置するＤＲ（１４ＤＲ）を識別するのに関連し得ることを提案する。この仮定を試験するために、１２ＤＲ及び１４ＤＲで示される二本鎖オリゴヌクレオチドについて、ＳＢトランスポザーゼのＰＡＩ（１〜５７ａａ）又はＲＥＤ（５８〜１２３ａａ）サブドメインを用いて、ＥＭＳＡを行った。図３Ｂ（レーン３、５及び６）に示すように、ＰＡＩは両方のＤＲに同様に結合した（図３Ｂ、レーン２、７、８及び１３）。これに対して、ＲＥＤは１２ＤＲに対して明らかに好適であり（図３Ｂ、レーン３、５及び６）、１４ＤＲ基質を用いた場合では顕著な結合は検出されなかった（図３Ｂ、レーン１２）。従って、ＲＥＤは、１２ＤＲと１４ＤＲとを明確に区別でき、それは、配列の変化又は長さの差異を認識することにより起こり得る。これらの可能性を区別するために、１４ＤＲと同一の長さを有するように２ヌクレオチドを埋めた１２ＤＲ様オリゴヌクレオチドを用いてＥＭＳＡを繰り返した。１２ＤＲへの２ヌクレオチドの組み込みは、ＲＥＤによる特異的ＤＮＡ結合を無効にしたが、ＰＡＩによる左側の結合には影響が無かった（図３Ｂ、下部、レーン８）。これらの結果は、明らかに、ＲＥＤが配列ではなく、長さによって内側ＤＲと外側ＤＲとを区別することを示す。上記データは、内側（１２ＤＲ）と外側（１４ＤＲ）とのトランスポザーゼ結合サイトの選択的認識が１２ＤＲと１４ＤＲとの長さの差異により導かれ、また、それはＳＢトランスポザーゼのＲＥＤサブドメインにより認識されるといった仮説を支持する。奇妙にも、ＲＥＤは、この試験条件において逆向き反復配列の末端に配置された１４ＤＲを認識する。
【００６３】
（１２／１４ＤＲの区別に加えて、ＲＥＤはタンパク質−タンパク質相互作用に関連する）
ＰＡＩ及びＲＥＤサブドメインは類似のサイズであるが（それぞれ５７及び６６アミノ酸）、それらの核タンパク質複合体は、ＥＭＳＡにおいて異なる移動をする（図３Ｂ）。移動性に基づいて、ＰＡＩは、モノマーとして１２ＤＲ及び１４ＤＲの両方に結合すると考えられる。これに対して、類似の条件を用いて、ＲＥＤと１２ＤＲとの間に形成されたドミナント核タンパク質複合体はゆっくりと移動し、これは、ＲＥＤの２つの分子を含む複合体に一致する（図３Ｂ、レーン３、５及び６）。特に、ＲＥＤモノマーにより形成された複合体は、結合反応において（２０倍以上）低減したタンパク質濃度が検出された。この結果は、ＲＥＤが１２ＤＲに結合するのに容易にダイマーを形成することを提示し、ＰＡＩと同様に、ＲＥＤは、タンパク質−ＤＮＡ及びタンパク質−タンパク質相互作用に関連することを提示する。ＲＥＤがタンパク質−タンパク質相互作用表面を有するか否かを試験するために、ＲＥＤペプチドに化学的架橋を施した後にウェスタンブロットを行った。ＲＥＤの二量体、四量体及びそれ以上の多量体構造に対応するバンドを、ＤＮＡ基質の存在（図３Ｃ）又は非存在下（図示せず）で同定した。これらの結果は、ＰＡＩと同様に(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem,  277: 34581-8.)、ＲＥＤサブドメインがホモ二量体化できることを示す。要するに、ＰＡＩ(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.)及びＲＥＤサブドメインの両方は、タンパク質−タンパク質相互作用表面を有するが、ＰＡＩでなくＲＥＤのみが単一のＤＮＡ基質にあたり二量体を形成する。
【００６４】
（ＩＲ／ＤＲは、「要求されたアセンブリ」プロセスを管理する）
結合サイトの親和性の変更は、ＳＢトランスポゾンの転移の際に起こる要求されたアセンブリプロセスを促し得る。従って、１２ＤＲ及び／又は１４ＤＲモチーフをＣＡＳＴｉｎｇで選択された高親和性結合サイトに置き換えて一連のトランスポゾンの型を構築し（図４Ａ）、その種々のコンストラクトに対して転移アッセイを行った。驚くべきことに、高親和性ＣＡＳＴ−５配列で野生型モチーフを置換すると、転移頻度は改善しなかった。それどころか、１２ＤＲ又は１４ＤＲのいずれかをＣＡＳＴ−５モチーフに置換すると、それぞれ野生型の活性の６５％及び３％の活性となった（図４Ａ）。同様に、４つ全てのＤＲをＣＡＳＴ−５に変更すると、転移が負に影響し（２．２％）、いずれかのＤＲ位置での増強されたＤＮＡ結合親和性はＳＢ転移を抑制し得ることを提示する。代替的に、転移におけるＣＡＳＴ−５の負の影響は、少なくとも部分的に、ＰＡＩ結合の好適な選択のための原因となり、ＲＥＤの機能を抑制する。実際に、ＣＡＳＴ配列は、内側と外側との位置を区別する能力を含んで（図２）、ＲＥＤ相互作用に準最適となると予想される。２つのシナリオを区別するために、我々は、ＣＡＳＴ−５をＰＡＩのみ置換し、他はＤＲ野生型（ｗｔ）を維持したＣＡＳＴ−５／ｗｔを生成した。再度、我々は、種々の組合せでの転移におけるハイブリッドモチーフの影響を試験した。高親和性のＣＡＳＴ−５／ｗｔハイブリッドモチーフは、外側と、組み合わせられた内側／外側の位置とにおいて、転移に負の影響を与えた。しかしながら、内側の位置で１２ＤＲを置換した場合は、ＣＡＳＴ−５／ｗｔモチーフは明らかに転移を改善した（１３０％）（図４Ｂ）。
【００６５】
「高親和性」試験は、ＳＢ転移の以下の機能を明らかにした。第１に、ＲＥＤ−１４ＤＲ相互作用はＥＭＳＡにより検出されなかったが、転移反応の後期で転移に必要となる。第２に、外側のＤＲ又は４つ全てのＤＲで結合活性を増強することは、転移に負に影響を及ぼし、内側と外側との位置のＤＲのＤＮＡ結合親和性が自由に変更されないことを示す。基質認識は、反応の異なる段階で明確に定義された段階で起こると考えられ、ＩＲ／ＤＲ構造により指向される。このプロセスの間、ＰＡＩ及びＲＥＤサブドメインは、ＤＮＡ−タンパク質及びタンパク質−タンパク質相互作用に関連する複数のタスクを実行することが予想される。
【００６６】
最後に、転移は、内側の位置（１２ＤＲ）におけるＰＡＩの結合親和性を増強することにより改善され得る。特に、その増強は、最適化された結合親和性に直接に比例せず、ＩＲ／ＤＲ構造は、急激な変化を許容しない細かく制御されたプロセスを管理することを示す。それにもかかわらず、分子展開的アプローチの組合せにおいてＩＲ／ＤＲ構造の役割を解明する試みは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙの転移反応を顕著に改善することを解明できた。
【００６７】
（ＦＡＣＴ複合体の要素の欠失は転移効率を増大する）
（ＳＢ１０が関連する）転移における顕著な増強は、ＲＮＡ干渉により生成された安定的ノックダウンＨＥＫ２９３Ｔ細胞のノックダウンで観察された（図５の左欄参照）。同様に、約５０％の増強がＳＢ１００Ｘを用いて見られた（図５の右欄）。また、ＳＵＰＴ１６Ｈのノックダウンは、転移の増大を引き起こし、対応するスクランブルＲＮＡｉは転移に顕著な影響を及ぼさなかった。ＳＵＰＴ１６Ｈの欠失は、最も強い影響を引き起こす。
【００６８】
ＳＰＴ１６又はＳＵＰＴ１６Ｈの欠失のための商業的に入手可能なｓｉＲＮＡを一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における転移アッセイは、安定的ノックダウン細胞株を用いて観察された結果を確認した（図６）。
【００６９】
［材料及び方法］
（プラスミドコンストラクト）
ヘキサヒスチジンタグが付けられたＳＢ  ＤＮＡ結合ドメインのサブドメインとしてのＰＡＩ、ＲＥＤ及びＮ１２３のそれぞれを発現する原核生物ベクターｐＥＴ−２１ａ／Ｎ５７、ｐＥＴ−２１ａ／５８−１２３及びｐＥＴ−２１ａ／Ｎ１２３は、以前に説明されている(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.)。ＨｅＬａ細胞におけるＳＢトランスポザーゼの発現のために、ｐＣＭＶ−ＳＢ１０(Ivics et al., 1997, Cell 91:501-510)及びｐＣＭＶ−ＳＢＤ３（Ｄ３）、ＳＢの触媒的変異体（Ｅ２７８Ｄ）が用いられた。インビボアッセイにおけるドナープラスミドとして以下のコンストラクトが用いられる：以前に記載されたｐＴ／ｎｅｏ(Ivics et al., 1997, Cell 91:501-510)。
【００７０】
（タンパク質の発現及び精製）
Ｈｉｓタグ化ＰＡＩ及びＲＥＤサブドメインの発現及び精製は、Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.に記載されているように行った。
【００７１】
（ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ））
１２ＤＲ又は１４ＤＲに対応する二本鎖オリゴヌクレオチドを、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ及びＫｌｅｎｏｗ断片を用いて末端標識した。左側ＩＲを含むＤＮＡプローブは、ｐＴ／ｎｅｏのＥｃｏＲＩ断片であり、［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰで末端標識される。Ｋｌｅｎｏｗ反応後、標識化されたＤＮＡを製造者の説明書通りにＭｉｃｒｏＳｐｉｎＧ−２５カラムで精製した。結合反応液は、総量１０μｌ中に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴを含み、２００００〜５００００ｃｐｍの標識化ＤＮＡプローブ及び種々の濃度のタンパク質（図に記載）を加え、氷上で１０分間、インキュベートした。３μｌのローディングダイ（５０％グリセロール及びブロモフェノールブルー含有）を加えた後に、サンプルを４％又は６％ポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動をＴｒｉｓ−グリシンバッファｐＨ８．３で、２５ｍＡ、２〜３時間行った。ゲルをＢＩＯ−ＲＡＤ社のゲルドライヤーを用いて４５分間乾燥させた。ゲルを一晩中曝露した後、ＦｕｊｉｆｉｌｍＦＬＡ−３０００を用いてスキャンし、ＡＩＤＡプログラムで分析した。
【００７２】
実施例で用いたプローブの配列は以下の通りである。
１４ＤＲ：
Ｓ  ５’−ＡＣＡＴＡＣＡＣＴＴＡＡＧＴＧＴＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＴＧＧ−３’（配列番号７９）
ＡＳ  ５’−ＧＡＣＴＣＣＡＡＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＧＡＡＧＴＴＴＡＣＡＴＡＣＡＣＴＴＡＡＧＴＧＴＡＴＧＴ−３’（配列番号８０）
１２ＤＲ：
Ｓ  ５’−ＡＣＡＴＡＣＡＴＴＡＧＴＧＴＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＣＴＧＴＴＧＧ−３’（配列番号８１）
ＡＳ  ５’−ＧＡＣＴＣＣＡＡＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＴＴＴＡＣＡＴＡＣＡＣＴＡＡＴＧＴＡＴＧＴ−３’（配列番号８２）
ＣＡＳＴ−２  Ｓ  ５’−ａｃａｔａｃａｃｃｃｔｇｇｔｇｔａｔｇｔａａａｇａｔｃｇｇａｃｇｇｃｃｇｇｔｔｇｇ−３’（配列番号３４）
ＡＳ  ５’−ｇａｃｔｃｃａａｃｃｇｇｃｃｇｔｃｃｇａｔｃｔｔｔａｃａｔａｃａｃｃａｇｇｇｔｇｔａｔｇｔ−３’（配列番号３５）
ＣＡＳＴ−５  Ｓ  ５’−ａｃａｔａｃａｇｇｃｇｃｇｔｇｔａｔｇｔａｃａｃｔｔｇｇｇｇｔｃｇｔｃａｃｔｔｇｇ−３’（配列番号３６）
ＡＳ  ５’−ｇａｃｔｃｃａａｇｔｇａｃｇａｃｃｃｃａａｇｔｇｔａｃａｔａｃａｃｇｃｇｃｃｔｇｔａｔｇｔ−３’（配列番号３７）
ＣＡＳＴ−９  Ｓ  ５’−ａｃａｔａｃａｇｃａｃｃａｔｇｔａｃｔｔａａａｔｃｔｃｔｇａｃｃｔｇｇｇｃｔｔｇｇ−３’（配列番号３８）
ＡＳ  ５’−ｇａｃｔｃｃａａｇｃｃｃａｇｇｔｃａｇａｇａｔｔｔａａｇｔａｃａｔｇｇｔｇｃｔｇｔａｔｇｔ−３’（配列番号３９）
ＣＡＳＴ−２０  Ｓ  ５’−ａｃａｔａｃａｃｇｔａａｇｔｇｔａｃａｔａｃｔｇｔｇｔａｃａｃａａａｇａｃｔｔｇｇ−３’（配列番号４０）
ＡＳ  ５’−ｇａｃｔｃｃａａｇｔｃｔｔｔｇｔｇｔａｃａｃａｇｔａｔｇｔａｃａｃｔｔａｃｇｔｇｔａｔｇｔ−３’（配列番号４１）
【００７３】
（化学的架橋）
反応は、製造者の推奨に従って、ビス（スルホスクシンイミジル）基質（ＢＳ３、Pierce Biotechnology, USA）を用いて行った。タンパク質（３μＭ）を、最終体積が１５μｌの２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ及び２．５ｍＭのＢＳ３において、氷上で２時間インキュベートした。最終濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加え、室温で１０分間インキュベートすることにより、反応を停止させた。その後、Ｌａｅｍｌｉバッファ（１２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％のＳＤＳ、１０％のβ−メルカプトエタノール、２５％のグリセロール及びブロモフェノールブルー）を加え、サンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、ポリクローナル抗ＳＢ抗体（R&D Systems, USA）及び抗ヤギＩｇＧ(PierceBiotechnology, USA)を用いたウェスタンブロットによって分析した。
【００７４】
（ＣＡＳＴｉｎｇ試験）
Wright, Binderet al. (1991) に記載された方法に基づいて、ＣＡＳＴｉｎｇを行った。ランダムの３５ｂｐ長のコアを含むオリゴヌクレオチドＳＢ−ＤＯＬ：５’−ＧＣＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＣＴ  （Ｎ）３５  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  Ｃ  -３’（配列番号４２）を合成し、コアに隣接する配列に相補的なプライマーを用いたＰＣＲ反応で二本鎖を作製した。０．１５μｇの精製Ｈｉｓタグ化ＳＢトランスポザーゼ（ＳＢＦｌ−６Ｈ）(Izsvak Z, et al., 2002. J Biol Chem,  277: 34581-8.)と共に２μｇの上記オリゴヌクレオチドを１時間インキュベートして形成された核タンパク質複合体を、Ｎｉ−ＮＴＡレジン(QIAGEN)を用いて回収した。結合されたオリゴヌクレオチドを広範な洗浄ステップにより濃縮した。選択されたオリゴヌクレオチドを抽出し、プライマーＡ：５’−  ＧＣＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＴＴＡ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＧＧＴ  Ｇ  -３’（配列番号４３）及びプライマーＢ：５’−  ＧＣＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＣＴ  -３’（配列番号４４）により増幅し、その方法の特異性を増大するために追加のＣＡＳＴｉｎｇサイクルを行った。６度目のサイクルから得られたオリゴヌクレオチドを配列決定し、結合及び転移の試験を行った。
【００７５】
（細胞培養）
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清Ｇｏｌｄ（ＦＣＳ Ｇｏｌｄ）(PAA, Germany)及び１％抗真菌性抗生物質(Invitrogen,Germany)を含むＤＭＥＭ(GIBCO BRL, Germany)で増殖させた。トランスフェクションの１日前に細胞を６ウェルプレートに播種した。ｊｅｔＰＥＩＲＧＤトランスフェクション試薬(Polyplus Transfection, France)を用いて、Qiagenで精製されたＤＮＡ (Qiaprep spin miniprep kit,Qiagen)を細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後に、細胞を除去（excision）アッセイのために回収し、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８(Biochrom, Germany)を用いた選択のために、１０ｃｍプレートに播種した。選択の３週間後に、Ivics et al., Cell 1997に記載されたようにコロニーを染色し、カウントした。
【００７６】
（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン除去アッセイ）
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンのプラスミドからゲノムへの転移の際の除去効率を決定するために、我々は、ｐＣＭＶ（ＣＡＴ）−ＧＦＰ／Ｔ２ｎｅｏと呼ばれるＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベースのレポーターをクローニングした。詳細には、まず、ＣＭＶプロモーターにより制御されるＧＦＰのオープンリーディングフレームを、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。続いて、選択遺伝子ｎｅｏ（ＳＶ４０により作動）を含むｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを、ＧＦＰのＯＲＦにおけるＴＡサイトにクローニングした。
【００７７】
除去効率におけるｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンの内部配列の効果を評価するために、９７７ｂｐ及び１６５４ｂｐの配列（部分的なＳＶ４０−ｎｅｏを含む）をそれぞれ元の除去レポーターから切り出し、短い内部配列（それぞれ１２６０ｂｐ及び５８３ｂｐ）を含む２つの代替の除去レポーターをクローニングした。
【００７８】
３つのトランスポゾンコンストラクトをQiagen plasmid midi kitを用いて精製した。精製されたプラスミドＤＮＡを、製造者による説明書に従ってｊｅｔＰＥＩ(Polyplus transfection, 哺乳動物細胞用)を用いて、トランスポザーゼ発現プラスミドｐＣＭＶ（ＣＡＴ）ＳＢ１００Ｘ(Mates L, et al. Molecular evolution of a novel hyperactive SleepingBeauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. NatGenet. 2009 Jun;41(6):753-61.)と共にＨｅＬａ細胞内にトランスフェクションした。３日後にＧＦＰ陽性細胞の数をＦＡＣＳにより推定した。
【００７９】
（クローニング）
変異されたＳＢトランスポゾン末端をＰＣＲ介在突然変異誘発により生成した。プライマー配列及びクローニング方法を表４に要約した。
【００８０】
（表４）
2019509066.tif 000011
【００８１】
（ＦＡＣＴ複合体の要素の欠失が転移効率を増大する）
表５に記載された標的マイクロＲＮＡを用いてｍｉＲＮＡコンストラクトを生成した。安定的ノックダウン細胞株を構築するために、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞に対して上記マイクロＲＮＡコンストラクトを用いて形質導入した。
【００８２】
ｓｓｒｐ１及びｓｕｐｔ１６Ｈの安定的ノックダウン細胞株のために、下記要素を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ベースベクターを用いた。
ＭＰＳＶ−ＬＴＲ-Ｉｎｔｒｏｎ-ｔｒｕｎｃａｔｅｄｈＮＧＦＲ-ＷＰＲＥ-ｍｉＲＮＡ−ＬＴＲ
骨髄増殖性腫瘍ウィルス（ＭＰＳＶ）；マウスの長い末端反復（ＬＴＲ）；トランケート型ヒト神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）；ウッドチャック肝炎ウィルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ｗＰＲＥ）；標的（ｓｓｒｐ１又はｓｕｐｔ１６Ｈ）を含むマウスｍｉＲ１５５のコア配列のセンス及びアンチセンス配列。
【００８３】
抗ＮＧＦＲ抗体による細胞の染色によってマイクロＲＮＡの発現を監視した。マイクロＲＮＡを有する細胞の濃縮のために、細胞に対してＦＡＣＳのソート及び培養を行った。ノックダウン効率の分析のために、濃縮細胞群に対してＲＮＡ単離をし、続いてｃＤＮＡ合成を行った。標的遺伝子の発現レベルを、遺伝子特異的プライマー（表６に示す）を用いたｑＰＣＲによって監視した。
【００８４】
前設計され、販売されている合成ｓｉＲＮＡ(siGENOME, SMARTpool)を入手した(Dharmacon,GEhealthcare)。ｓｕｐｔ１６Ｈ遺伝子(cat. No. M-009517-00-0005)及びｓｓｒｐ１(cat. No. M-011783-01-0005)のいずれかを標的とするｓｉＲＮＡを、ｊｅｔＰＥＩＴＭトランスフェクションシステムを用いてＨｅｋ２９３Ｔにトランスフェクションした。陰性対照として、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ(cat. No. D-001206-14-05)を用いた。２４時間後に、細胞に転移のためのそれぞれのプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後に、トランスフェクションされた細胞に対してトリプシン処理し、カウントし、ピューロマイシン選択をした。選択の１週間後に、コロニーに対して１０％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで１５分間固定し、メチレンブルーを含むＰＢＳで３０分間染色し、脱イオン化水で広範に洗浄し、風乾し、撮影した。
【００８５】
以前に公開されているように(IvicsZ, et al., 1997. Cell, 91: 501-10)、転移アッセイを行った。その結果を図５及び図６に示す。
【００８６】
（表５）
表５：ノックダウンのためのｍｉＲＮＡ配列
2019509066.tif 000012
【００８７】
（表６）
表６：プライマー
2019509066.tif 000013
【００８８】
＜実施例２＞
ＤＮＡ−ＰＫｃｓ及びＡＴＭ活性の両方が有効なＳＢ転移に必要であることが、以前から示されている(Izsvak et al., 2004, Mol Cell 13(2):279-90)。ＤＮＡ−ＰＫｃｓ及びＡＴＭと同様に、ＡＴＲもホスファチジルイノシトール３キナーゼ様キナーゼ（ＰＩＫＫ）ファミリーに属し、チェックポイントシグナリング及び修復に関連する。ＡＴＲは、複製の際のＤＮＡ損傷により特異的に活性化される(Lupardus et al., 2002, Genes Dev 16(18):2327-32)。カフェインは、ＡＴＭ、ＡＴＲ及びｍＴＯＲ（ＰＩＫＫメンバー）の阻害剤であるが、ＤＮＡ−ＰＫＣｓは異なる(Sarkaria et al., 1999, Cancer Res. 59(17):4375-82)。本発明者らは、カフェイン処理下で（４ｍＭ）、標準転移アッセイを用いてＳＢ転移を試験した。
【００８９】
コントロールと比較してカフェイン処理をした場合は、転移の頻度が約５０％低減した（図７Ａ）。ＡＴＲシグナリングが有効なＳＢ転移に特異的に必要とされるか否かを解明するために、ＡＴＲの機能を制御できる安定ＴＥＴ誘導細胞株を用いた。誘導できる条件下において(Cliby et al., 1998, EMBO J. 17(1):159-69)、ＡＴＲ（野生型）又はＡＴＲｋｄ（ＡＴＲのドミナントネガティブキナーゼ不活性アレル）を発現する安定細胞株でＳＢ転移を監視した。ＡＴＲの触媒性が無いＡＴＲｋｄの発現は、ドミナントネガティブ効果としてＡＴＲの活性を無効にする(Cliby et al., 1998)。ＡＴＲ無効化細胞において、ＡＴＲは複製停止を解決するシグナルカスケードを開始できない。ＡＴＲ及びＡＴＲｋｄを誘導し、２つの細胞株に対してゲノム転移アッセイを行った。その結果、ＡＴＲ無効化細胞において、７５％以下低減された転移が示され、ＡＴＲがＳＢ転移に必須であることが示された（図７Ｂ）。さらに、ＡＴＲｋｄ誘導細胞において、停止された複製フォークの蓄積にもかかわらず、転移の誘導が観察されず、完全なＡＴＲシグナリングが転移の引き金に必要となり得ることを提示する。
【図１】
2019509066.tif 000014
【図２Ａ】
2019509066.tif 000015
【図２Ｂ】
2019509066.tif 000016
【図２Ｃ】
2019509066.tif 000017
【図２Ｄ】
2019509066.tif 000018
【図３Ａ】
2019509066.tif 000019
【図３Ｂ】
2019509066.tif 000020
【図３Ｃ】
2019509066.tif 000021
【図４】
2019509066.tif 000022
【図５Ａ】
2019509066.tif 000023
【図５Ｂ】
2019509066.tif 000024
【図５Ｃ】
2019509066.tif 000025
【図５Ｄ】
2019509066.tif 000026
【図６Ａ】
2019509066.tif 000027
【図６Ｂ】
2019509066.tif 000028
【図７Ａ】
2019509066.tif 000029
【図７Ｂ】
2019509066.tif 000030
2019509066.tif 000031
【配列表】
2019509066000001.app
【国際調査報告】
2019509066.tif 000032
2019509066.tif 000033
2019509066.tif 000034
2019509066.tif 000035
2019509066.tif 000036