(57)【要約】  本開示は、植物においてRNA又はポリペプチド分子を発現させるために植物にトランスフェクトする方法を提供する。特に、低減したPOLQの発現及び/又は活性を有する植物に、ランダム組込み事象を低減するためにトランスフェクトする。本開示は、本明細書において開示される方法によって作製された、トランスフェクトされた植物及び植物子孫を更に提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞におけるトランスフェクトされた核酸分子のランダム組込みを低減する方法であって、植物細胞に核酸分子をトランスフェクトする工程であって、前記植物細胞においてPOLQの発現及び/又は活性が、野生型植物細胞と比較して低減している、工程を含む方法。
【請求項２】
植物細胞に核酸分子をトランスフェクトする方法であって、植物細胞に核酸分子をトランスフェクトする工程であって、前記植物細胞においてPOLQの発現及び/又は活性が、野生型植物細胞と比較して低減している、工程を含む方法。
【請求項３】
植物細胞においてRNA分子又はポリペプチドを発現させる方法であって、植物細胞に前記RNA分子又はポリペプチドをコードする核酸分子をトランスフェクトする工程であって、前記植物細胞においてPOLQの発現及び/又は活性が、野生型植物細胞と比較して低減している、工程を含む方法。
【請求項４】
RNA分子又はポリペプチドを発現する植物を作製する方法であって、前記RNA分子又はポリペプチドをコードする核酸分子を植物細胞にトランスフェクトする工程であって、前記植物細胞においてPOLQの発現及び/又は活性が、野生型植物細胞と比較して低減している、工程と、前記植物細胞から植物を作製する工程とを含む方法。
【請求項５】
前記核酸分子が植物細胞に一過性にトランスフェクトされる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸分子が、植物細胞の染色体における部位特異的遺伝的組換え又は相同組換えを介して組み込まれる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記植物細胞が、POLQ遺伝子によってコードされるmRNA前駆体に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はPOLQ遺伝子によってコードされるmRNAに対して特異的な二重鎖RNAi分子を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
植物細胞が、POLQの発現及び/又は活性が、野生型遺伝子と比較して少なくとも70%低減するように1個又は複数の変異POLQアレルを有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記植物細胞がシロイヌナズナではない、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記トランスフェクトされた核酸分子を含む、請求項4から9のいずれか一項に規定される方法によって作製される植物。
【請求項１１】
前記核酸分子を含む、請求項10に規定される植物の子孫。
【請求項１２】
植物又は植物細胞であって、前記植物又は植物細胞においてPOLQの発現及び/又は活性が、野生型植物細胞と比較して低減しており、前記植物又は植物細胞がシロイヌナズナではない、植物又は植物細胞。
【請求項１３】
請求項12に記載される植物又は植物細胞を作製する方法であって、植物若しくは植物細胞において1つ若しくは複数のPOLQアレルに変異導入する工程、又は植物若しくは植物細胞にPOLQ阻害性核酸分子若しくはPOLQ結合分子を提供する工程を含む方法。
【請求項１４】
RNA分子又はポリペプチドを発現する植物を作製するための、請求項12に記載されるか、請求項13に規定されるように作製される植物又は植物細胞の使用であって、前記RNA分子又はポリペプチドをコードする核酸分子が植物細胞の染色体に組み込まれていない、植物又は植物細胞の使用。
【請求項１５】
RNA分子又はポリペプチドを発現する植物を作製するための、請求項12に記載されるか、請求項13に規定されるように作製される植物又は植物細胞の使用であって、前記RNA分子又はポリペプチドをコードする核酸分子が、部位特異的遺伝的組換え又は相同組換えを介して植物細胞の染色体に組み込まれている、植物又は植物細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、植物においてRNA又はポリペプチド分子を発現させるために植物にトランスフェクトする方法を提供する。特に、低減したPOLQの発現及び/又は活性を有する植物に、ランダム組込み事象を低減するためにトランスフェクトする。本開示は、本明細書において開示される方法によって作製された、トランスフェクトされた植物及び植物子孫を更に提供する。
【背景技術】
【０００２】
トランスフェクションによる植物の遺伝子組換えは、増加した収量、病害抵抗性及び有害生物抵抗性、増加した栄養成長のバイオマス、除草剤耐性、栄養価、干ばつ及びストレスへの耐性、並びに色素沈着及び成長等の園芸性、並びに作物改良のための他の農業特性のような形質における改変を可能にする。更に、植物の遺伝子組換えは、組換えタンパク質の発現のためのシステムとして用いられてきている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】US20140130207
【特許文献２】WO2003027261
【特許文献３】米国特許第5,563,055号
【特許文献４】EP-B 176 112
【特許文献５】米国特許出願公開第20110092572号
【特許文献６】米国特許出願公開第20100234451号
【特許文献７】米国特許第6,423,885号
【特許文献８】米国特許第5,034,323号
【特許文献９】米国特許第6,326,527号
【特許文献１０】米国特許第6,452,067号
【特許文献１１】米国特許第6,573,099号
【特許文献１２】米国特許第6,753,139号
【特許文献１３】米国特許第6,777,588号
【特許文献１４】WO97/01952
【特許文献１５】WO98/53083
【特許文献１６】WO99/32619
【特許文献１７】WO98/36083
【特許文献１８】米国特許出願公開第20030175965号
【特許文献１９】米国特許出願公開第20030175783号
【特許文献２０】米国特許出願公開第20040214330号
【特許文献２１】米国特許出願公開第20030180945号
【特許文献２２】米国特許第7,229,829号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】An等、Biosci Biotechnol Biochem.2003Dec;67(12):2674〜7頁
【非特許文献２】Khatodia等、Frontiers in Plant Science 2016 7: article 506
【非特許文献３】Ma等、FEBS Journal 2014 5186〜5193頁
【非特許文献４】Becker、D.等、1992、New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border、Plant Mol. Biol. 20:1195〜1197頁
【非特許文献５】Bevan,M. W.、1984、Binary Agrobacterium vectors for plant transformation、Nucl. Acid. Res.12:8711〜8721頁
【非特許文献６】Transgenic Plants、Vol.1、Engineering and Utilization、eds.:Kung及びR. Wu、Academic Press、1993、S.15〜38頁のVectors for Gene Transfer in Higher Plants
【非特許文献７】DeBlock等、(1987)EMBO J. 6:2513〜2518頁
【非特許文献８】DeBlock等、(1989)Plant Physiol. 91:691〜704頁
【非特許文献９】Fromm等、(1990)8:833〜839頁
【非特許文献１０】Gordon-Kamm等、(1990)2:603〜618頁
【非特許文献１１】Paszkowski等、EMBO J. 3:2717〜2722頁(1984)
【非特許文献１２】Potrykus等、Mol. Gen. Genet. 199:169〜177頁(1985)
【非特許文献１３】Reich等、Biotechnology 4:1001〜1004頁(1986)
【非特許文献１４】Klein等、Nature 327:70〜73頁(1987)
【非特許文献１５】Chen及びWinans、1991、J. Bacteriol. 173: 1139〜1144頁
【非特許文献１６】Scheeren-Groot等、1994、J. Bacteriol. 176:6418〜6246頁
【非特許文献１７】Yousefzadeh及びWood DNA Repair 2013 12:1〜9頁
【非特許文献１８】Inagaki等、Plant Cell 18 (4)、879〜892頁(2006)
【非特許文献１９】PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, M、Gelfand, D.、Sninsky, J.、及びWhite, T.編)、Academic Press、San Diego(1990)
【非特許文献２０】Fernandez-Vidal等、2014 Nature Communications 5
【非特許文献２１】Hogg等、Nucleic Acids Res. 2012年3月;40(6):2611〜2622頁
【非特許文献２２】Kent等、Nat Struct Mol Biol. 2015年3月;22(3):230〜237頁
【非特許文献２３】Zhan等、Nat Struct Mol Biol. 2015年4月;22(4): 304〜311頁
【非特許文献２４】Yousefzadeh及びWood、DNA Repair、Volume 12、Issue 10、2013、871頁
【非特許文献２５】Li等、2001、Plant J 27:235〜242頁
【非特許文献２６】McCallum等、2000、Nat Biotechnol 18:455〜457頁
【非特許文献２７】Belahj等、Plant Methods 9:39、2013
【非特許文献２８】http://tools.genome-engineering.org、Ren等
【非特許文献２９】Lowder等、Plant Physiology 2015 169:971〜985頁
【非特許文献３０】Belhaj等、2013 Plant Methods 9:39頁
【非特許文献３１】Ceccaldi等、Nature. 2015年2月12日、518(7538):258〜262頁
【非特許文献３２】Baulcombe、Curr. Opin. Plant Biol. 2:109〜113頁(1999)
【非特許文献３３】Lu等、Methods 30:296〜303頁(2003)
【非特許文献３４】Ratcliff等、The Plant Journal 25:237〜245頁(2001)
【非特許文献３５】http://signal.salk.eduにおけるSIGnALウェブサイト
【非特許文献３６】Hanin等、Plant J 2001
【非特許文献３７】Fauser等、Plant J 79:348〜359頁(2014)
【非特許文献３８】Li等、2013 Nat Biotechnol 31:688〜691頁
【非特許文献３９】Voytas 2013 Annu Rev Plant Biol 64:327〜350頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在では、植物への核酸のトランスフェクションは、当該技術分野において公知である多くの異なる方法によって実施できる一般的な実践である。しかしながら、現状のトランスフェクション法の1つの欠点は、宿主のゲノムにおける比較的多数のランダムDNA組込み事象の発生である。ランダム組込みは、宿主生物に対し、予測不能及び/又は有害な効果を有する可能性がある。更に、DNAの植物ゲノムへの組込みは、特に遺伝子組換え(GMO)植物が環境問題及び政治問題を引き起こす場合、必ずしも望ましいとは限らない。したがって、植物において導入遺伝子を発現させるための改善されたシステムを開発する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の一態様は、植物細胞におけるトランスフェクトされた核酸分子のランダム組込みを低減する方法であって、植物細胞に核酸分子を提供する工程であって、前記植物細胞においてPOLQの発現及び/又は活性が低減している、工程を含む方法を提供する。
【０００７】
本開示の更なる態様は、核酸分子を植物細胞にトランスフェクトする方法であって、植物細胞に核酸分子を提供する工程であって、前記植物細胞においてPOLQの発現及び/又は活性が低減している、工程を含む方法を提供する。
【０００８】
好ましい実施形態において、方法はジーンターゲッティングにおいて使用される。特に、方法は、遺伝的組換え(genetic recombination)を介し、ゲノム内の特異的な部位にDNA配列を有する植物細胞を作製するためのものである。
【０００９】
本開示の更なる態様は、植物細胞においてRNA分子又はポリペプチドを発現させる方法であって、植物細胞に前記RNA分子又はポリペプチドをコードする核酸分子を提供する工程であって、前記宿主細胞においてPOLQの発現及び/又は活性が低減している、工程を含む方法を提供する。
【００１０】
本開示の更なる態様は、RNA分子又はポリペプチドを発現させる植物を作製する方法であって、前記RNA分子又はポリペプチドをコードする核酸分子を植物細胞に提供する工程であって、前記植物細胞においてPOLQの発現及び/又は活性が低減している、工程と、前記植物細胞から植物を作製する工程とを含む方法を提供する。
【００１１】
好ましくは、核酸分子は、低減したPolQの発現及び/又は活性を有する植物細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、核酸分子は植物細胞に一過性にトランスフェクトされる。好ましくは、核酸は、植物発現カセットを含む。好ましくは、植物発現カセットは、ポリペプチド又はRNA分子及び、発現を駆動するための制御配列をコードする核酸配列を含む。好ましくは、核酸はヌクレアーゼである。好ましくは、核酸はCrispr/Casシステムの成分(component)である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、遺伝的組換えを介して(又はむしろ部位特異的遺伝的組換え若しくは相同組換えを介して)、植物細胞の染色体の特異的な部位に組み込まれる。好ましくは、そのような安定的な組込みは、異種のポリペプチド又はRNA分子の発現をもたらす。いくつかの実施形態において、組込みは、相同組換えの結果である。いくつかの実施形態において、そのような安定的な組込みは、内在性遺伝子を破壊又は改変する。いくつかの実施形態において、組込みは、部位特異的組換えの結果である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、前記植物細胞は、POLQ遺伝子によってコードされるmRNA前駆体に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はPOLQ遺伝子によってコードされるmRNAに対して特異的な二重鎖RNAi分子を含む。いくつかの実施形態において、植物細胞は変異したPOLQ遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、植物細胞はPOLQ遺伝子のノックアウトを有する。
【００１４】
本開示の更なる態様は、本明細書に開示される方法によって作製される植物及びその子孫(種子を含む)を提供する。好ましくは、前記植物及び子孫は、遺伝的組換え(すなわち部位特異的組込みかつランダム組込みではない)を介してゲノムに安定的に組み込まれた核酸分子を含む。
【００１５】
上述のいくつかの実施形態において、前記植物細胞は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ではない。
【００１６】
本開示の更なる態様は、植物又は植物細胞においてPOLQの発現及び/又は活性が低減しており、前記植物又は植物細胞がシロイヌナズナではない、植物又は植物細胞を提供する。本開示は、核酸分子をトランスフェクトするための前記植物及び細胞の使用を更に提供する。
【００１７】
本開示の更なる態様は、RNA分子又はポリペプチドを発現させる植物を作製するための低減したPOLQの発現及び/又は活性を有する植物又は植物細胞の使用であって、a)前記RNA分子又はポリペプチドをコードする核酸分子が植物細胞染色体に組み込まれていないか、又はb)前記RNA分子又はポリペプチドをコードする核酸分子が部位特異的遺伝的組換え又は相同組換えを介して植物細胞染色体に組み込まれている、使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】polθ欠損植物は、フローラルディップ形質転換によるT-DNA組込みを受けにくいことを示す図である。a、フローラルディップ形質転換の戦略:(1)顕花性(flowering)のシロイヌナズナ植物を、アグロバクテリウム(Agrobacterium)細胞を含有する懸濁液に浸漬し、その後、(2)植物に種子を形成させる。(3)わずかな割合がトランスジェニックとなっている可能性がある種子(黄色として描写)を、(4)適切な除草剤を選別マーカーとして含有する固体培地上に播種する。b.、除草剤ホスフィノトリシン(PPT)を含有するプレートの代表的な画像であり、その上で野生型(左)及びteb-5(右)の種子をフローラルディップ形質転換後に回収するものを示す。選別マーカーを含有するT-DNAが安定的に組み込まれた形質転換した植物は、PPT抵抗性である。c、フローラルディップ実験は、2つの異なる非病原化(disarmed)アグロバクテリウム株を用いて実施した:バイナリーベクターpCAMBIA1301を補ったLBA1100、及びバイナリーベクターpSDM3900を補ったAGL1。d、発生中の長角果においてACT11プロモーター(青)の制御下でイントロン含有GUSレポーター遺伝子(gusA)を一過性に発現する発生中の胚の代表的な画像。
【図２】Polθは、根の形質転換が媒介するシロイヌナズナの遺伝子組換えに必要であることを示す図である。a、根の形質転換の戦略。種子を液体培養中で発芽し(1)10日齢のシロイヌナズナ(A. thaliana)小植物から根を採取し、固体培地上で2〜3日間前培養して、アグロバクテリウム細胞と共培養する(2)。除草剤PPTを含有する固体培地上でカルス/シュートを形成させ、3週間後に新鮮なプレートに移し、その上ではT-DNAを安定的に組込み、それによって抵抗性マーカーを獲得したシュートが成長し続けることができる(3)。b、除草剤ホスフィノトリシン(PPT)を含有するプレートの代表的な画像であり、その上で野生型(左)及びteb-5(右)の根が成長し、シュート形成を可能にした。野生型のシュート(左パネル)は、PPT抵抗性を獲得し、安定的なT-DNA組込みを示し、一方で、teb-5のシュート(右パネル)は、衰退している。c、T-DNA-植物ゲノムジャンクションを回復するTAIL-PCRは、ほとんどが野生型のカルス(上側パネル)の産物をもたらし、一方でteb-5のカルスは、TAIL-PCRにおいてまったく産物をもたらさなかった(下側パネル)。d、矢印が、アグロバクテリウムによってイントロン含有GUSレポーター遺伝子を含有するT-DNAの1つ又は複数を送達しているGUS陽性スポットを示す、野生型の根の外植体。e、外植体当たりのGUS陽性スポットを、野生型Col-0、teb-2、及びteb-5について計数した。実験当たり少なくとも100個の根の外植体が計数された。f、T-DNAの安定的な組込みを示す若芽の形成を野生型Col-0、teb-2、及びteb-5について計数した。
【図３】フィラーDNAは、最小限に対形成したT-DNA-Arabidopsisのゲノム分子のPolθ依存的伸長を反映することを示す図である。a、T-DNAの組込みにおけるPolθの提唱された作用: PolθによるDNA合成は、1端がT-DNAによって提供され、他端がシロイヌナズナのゲノムによって提供される、最小限に対形成した3'突出DNA末端を安定化する。T-DNA-ゲノムジャンクションは2つの型のうちの1つである:約57%のシーケンスされたジャンクションはフィラーDNAを含有し、一方で約43%のシーケンスされたアレルはフィラーを含まない。b、最長共通部分文字列(LCS)分析の略図。各フィラー(青色)について、フィラーと標的配列との間の配列同一性の可能性がある最長のストレッチを決定する。c、6〜40ntのサイズのフィラーを有するT-DNAについてのLCSのヒートマップ表示。左のパネルにおいて、疑似ランダム確率がプロットされ(アプローチについては方法セクションを参照)、一方で中央のパネルが完全なデータセットを反映し、ここで検索間隔が、インサート内の160bpのT-DNA配列(ジャンクションから開始)と、プラスミドDNAであるT-DNAの元の隣接部分の120bpとである、T-DNA挿入(ジャンクションに対して-120bp〜+160bp)の両側のシロイヌナズナのゲノム配列からなる。右のパネルは、確率上のデータの差次(data-over-probability differential)を示し、したがってこれは、過剰存在(黄色から赤色)及び過少存在(ライトブルーからダークブルー)を可視化する。この差次的ヒートマップから、それらの同種のフィラーが、確率に対して10倍を超えて過剰存在するT-DNA組込みの割合が48.2%であると決定される。d、cで決定されるような下位カテゴリ(n=1,653)を、組込み部位に対する位置をプロットするために使用する(5bpのビンサイズ)。e、配列相同性の度合いを可視化するために、ジャンクション近傍において、フィラー含有ジャンクションがそれらの同種のフィラーマッチング配列に対してプロットされている、フィラー含有T-DNAジャンクションのヒートマップ表示。f、配列相同性の度合いが、T-DNAとシロイヌナズナのゲノムとの間で決定されている、フィラーを含まないT-DNA組込みジャンクションのヒートマップ表示。
【図４ａ】T-DNA組込みのモデルを示す図である。a、T-DNAが、3'末端で優先的に捕捉され、そこでpolθが最小限の塩基対形成によるプライミングから伸長できる。続けて起こる、ゲノムによる5'末端の捕捉が、ゲノム中の単一のT-DNA挿入をもたらす(左図)。しかしながら、多くの場合(63%)、二重の組込みが観察され、ここで両方のT-DNAが逆方向にあり、植物ゲノムによるT-DNAの3'末端の優先的な捕捉を示す。
【図４ｂ】T-DNAの3'末端の捕捉の後、プライミング、伸長、及びプライマー-テンプレートスイッチングの反復するサイクルが、複数のテンプレートの挿入を有するパッチワークのフィラーを有するT-DNA挿入をもたらすであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
一般的に、植物における遺伝子組換えは、多くが非相同であり、むしろ導入されたDNAが、染色体の任意の位置にランダムに挿入される。ランダム組込みは、導入されたDNAが、例えば内在性遺伝子の発現を破壊する場合、有害な効果を有する可能性がある。更に、ランダムに組み込まれたDNAにコードされるRNA又はタンパク質の発現は、組込みの部位と組込みの数との両方の事象が発現に影響を及ぼし得るため、部位特異的組込みと比べて予測できない。本明細書において開示される方法の目的の一つは、トランスフェクトされたDNAのランダム組込みを低減(排除又は回避を含む)又は排除することである。方法の更なる目的は、ジーンターゲッティングの有効な方法を提供することである。
【００２０】
いくつかの例において、DNAの一過性トランスフェクションのみが植物において望まれる。(安定的な)遺伝子組換え植物の使用を回避又は制限するための、例えば環境又は政治の理由が存在する場合がある。更に、いくつかの状況において、所望の発現は、短時間だけ必要とされる場合がある。本明細書において開示される方法の目的の一つは、対象の核酸分子が一過性にのみトランスフェクトされるか、又は、むしろ対象の核酸分子が植物染色体中に挿入されない方法及び植物を提供することである。好ましい実施形態において、トランスフェクトされる核酸は、ヌクレアーゼ又はCrispr/Casシステムの成分である。
【００２１】
本開示の一態様は、対象の核酸分子を植物にトランスフェクトする方法を提供する。トランスフェクトされる植物細胞は、対象のRNA又はポリペプチドを発現させるのに使用することができる。植物は、そのようなトランスフェクトされた植物細胞から生成してもよい。トランスフェクトされた核酸分子のランダム組込みを低減する方法が提供される。
【００２２】
本明細書において開示される方法は、植物細胞に核酸分子を提供する工程であって、植物細胞におけるPOLQ発現が低減している、工程を含む。実施例において実証されるように、低減したPOLQ発現を有する植物へのトランスフェクションは、トランスフェクトされた核酸分子のランダム組込みの排除をもたらす。
【００２３】
いくつかの実施形態において、対象のRNA又はポリペプチドの一過性発現の方法が好ましい。他の実施形態において、遺伝的組換えを介した核酸分子の安定的な部位特異的組込みの方法が好ましい。一過性発現は、宿主の染色体に組み込まれていないが、独立して機能する核酸分子の発現を指す。安定的な組込みは、共有結合による宿主DNAへの核酸の組込みを指す。「遺伝的組換え」は、所定の部位特異的な位置における選択された核酸のゲノムへの導入を可能にし、相同組換えと部位特異的組換えとの両方を含む。
【００２４】
好ましくは、対象の核酸は非相同組換えを介して挿入されない。本明細書において開示される方法は、対象の核酸が植物細胞染色体に組み込まれていない(すなわち、一過性トランスフェクション)か、又は部位特異的遺伝的組換え若しくは相同組換えを介して植物細胞の染色体中に組み込まれる、細胞及び植物を作製するものとして記載される。本明細書において開示される方法を実施するとき、当業者なら、少ない割合の植物細胞が、対象の核酸が非相同組換えを介して挿入されて作製される可能性があることを理解するべきである。しかしながら、当業者はそのような植物細胞を容易に同定及び無視することができる。
【００２５】
任意の好適な核酸分子を植物細胞にトランスフェクトするのに使用できる。DNAは好ましくは核酸分子であるが、RNAトランスフェクションもまた、本発明によって包含される。例えば、An等は、シロイヌナズナにおけるRNAトランスフェクション法を記載する(An等、Biosci Biotechnol Biochem.2003Dec;67(12):2674〜7頁)。
【００２６】
好ましくは、核酸分子は、ポリペプチド又はRNA分子(例えば、ポリペプチドをコードするRNA若しくは非コードRNA、例えば、長い非コードRNA、マイクロRNA、tRNA、リボソームRNA、snoRNA等)をコードする核酸配列を含む。対象の核酸分子は、植物の殺虫剤抵抗性、病害抵抗性、除草剤抵抗性、栄養素及びセルロース含有量、非生物的ストレス抵抗性、収量増強遺伝子、干ばつ耐性遺伝子、寒冷耐性遺伝子、抗生物質抵抗性、及びマーカー遺伝子に影響を及ぼすものを含む。例えば、US20140130207は、有害生物及び病原体に対する抵抗性をもたらすために、植物において発現させることができるRNAi分子を記載する。
【００２７】
好ましくはトランスフェクトされる核酸分子は異種性である。本明細書において使用されるとき、異種核酸(又は異種遺伝子)は、例えば別の種由来の核酸のような、植物において通常見られない核酸を含む。異種核酸はまた、何らかの方法(例えば変異した、複数コピーで追加された、固有ではないプロモーター又はエンハンサー配列に連結する等)で改変されている生物に固有のポリヌクレオチドを含む。異種植物遺伝子は、異種遺伝子によってコードされるタンパク質若しくは染色体中の植物遺伝子配列に付随していることが天然では見出されないか、又は天然に見られない染色体の部分に付随しているプロモーター(例えば、遺伝子が通常発現していない座位において遺伝子が発現している)のような制御エレメントを含むヌクレオチド配列に異種配列が典型的に連結されている点において、内在性植物遺伝子と区別できる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、トランスフェクトされる核酸分子はヌクレアーゼである。好ましいヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、transcription activator様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化等間隔短鎖回分リピート(CRISPR)ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びニッキングエンドヌクレアーゼを含む。そのようなヌクレアーゼは、遺伝子又はゲノムの編集方法において有用であり得る。
【００２９】
好ましくは、トランスフェクトされた核酸分子は、Casヌクレアーゼ及び/又はガイド核酸のように、Crispr/Casシステムの一部である。当業者に公知であるように、Crispr/Casシステムが遺伝子編集に使用できる。このシステムを用いて、遺伝子を、編集、変異導入、置換、又はノックアウトをすることができる。Crispr/Casはまた、転写活性ドメインに融合した改変「デッド」Casタンパク質を用いて遺伝子発現を調整するのに使用できる(Crispr技術についての最近の総説として例えば、Khatodia等、Frontiers in Plant Science 2016 7: article 506、及びMa等、FEBS Journal 2014 5186〜5193頁を参照)。
【００３０】
本発明の好ましい方法において、Casタンパク質をコードする核酸分子をトランスフェクトする。Casタンパク質は、I型、II型、III型、IV型、V型、又はVI型のCasタンパク質であり得る。Casタンパク質は、1つ又は風数のドメインを含み得る。ドメインの非限定的例は、ガイド核酸認識及び/又は結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン(例えばDNase又は RNaseドメイン、RuvC、HNH)、DNA結合ドメイン、RNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質-タンパク質相互作用ドメイン、並びに二量体化ドメインを含む。ガイド核酸認識及び/又は結合ドメインは、ガイド核酸と相互作用できる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、1つ又は複数の変異を含み、ニッカーゼ又は「デッド」酵素(すなわち触媒活性を欠いたヌクレアーゼドメイン)をもたらし得る。
【００３１】
好ましいCasタンパク質は、c2c1、C2c2、c2c3、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cash、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9 (Csn1 or Csx12)、Cas10、Cas10d、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、及びCul966、並びにそれらの相同体又は改変バージョンを含む。
【００３２】
本発明の好ましい方法において、Crispr標的化配列をトランスフェクトする。そのような配列は当業者に公知であり、gRNA(ガイドRNA)、crRNA、tracrRNA、及びsgRNAを含む。Crispr標的化配列は宿主植物ゲノムにおいて相補的配列に結合し、それぞれの部位へとCasタンパク質を標的化する。
【００３３】
POLQの発現及び/又は活性の低減した植物細胞におけるCrispr/Casシステムのトランスフェクションは、植物ゲノムへのCrispr/Casの成分のランダムな挿入を低減する。理論に束縛されるものではないが、Crispr成分の一過性トランスフェクションは、Crispr/Casシステムのオフターゲット効果を低減し、かつ/又は特異性を増加する。他の実施形態において、本開示は、Crisprの成分(例えばCas酵素)が、部位特異的遺伝的組換え又は相同組換えを介して安定的にトランスフェクトされている植物の作製方法を提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、方法は、核酸分子の一過性トランスフェクションを提供する。好ましくは、一過性トランスフェクションのための核酸分子は、植物発現カセットを含む。好適な植物発現カセットは、転写物をコードする核酸配列へと作動可能に連結する、5'及び3'の制御配列を含む。用語「作動可能に連結する」は、一方の機能が他方によって調節される、単一の核酸フラグメント上の核酸配列に付随していることを指す。例えば、プロモーターがコード配列に作動可能に連結するのは、それがコード配列の発現を調節することができるとき(すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にあること)である。
【００３５】
好ましくは、植物発現カセットは、植物において発現を駆動するプロモーターと、ポリアデニル化シグナルとを含む。核酸配列の発現のための例示的なプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター(Odell等、1985)、CaMV 19S(Lawton等、1987)、nos(Ebert等、1987)、Adh(Walker等、1987)、スクロースシンターゼ(Yang及びRussell、1990)、a-チューブリン、アクチン(Wang等、1992)、cab(Sullivan等、1989)、PEPCase(Hudspeth and Grula、1989)又はR遺伝子複合体と関連するもの(Chandler等、1989)のような植物プロモーターを含む。根細胞プロモーター(Conkling等、1990)のような組織特異的プロモーター、及び組織特異的エンハンサー(Fromm等、1986)もまた使用できる。植物発現ベクターの例は、Becker、D.等、1992、New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border、Plant Mol. Biol. 20:1195〜1197頁、及びBevan,M. W.、1984、Binary Agrobacterium vectors for plant transformation、Nucl. Acid. Res.12:8711〜8721頁、並びにTransgenic Plants、Vol.1、Engineering and Utilization、eds.:Kung及びR. Wu、Academic Press、1993、S.15〜38頁のVectors for Gene Transfer in Higher Plantsに詳述されるものを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、方法は、遺伝的組換えを介した核酸分子の安定的な部位特異的組込みを提供する。部位特異的組込みは、ゲノム中の核酸配列に依存したゲノムの規定された領域における組込みを指す。これはランダム組込みとは異なる。一実施形態において、核酸は、相同組換えを介して植物ゲノムへと組み込まれる。相同組換えを誘導するための好適な方法及びベクターは公知である。例えば、相同組換えベクターは、内在性の植物配列と相同である核酸配列がその5'及び3'の末端に隣接している対象の核酸分子を含んで調製することができる。相同組換えは、例えば、染色体上の野生型遺伝子を、無関係の新規遺伝子、野生型遺伝子の不活化又は改変バージョン(新規アレル)と置き換えるために使用できる。相同組換えはまた、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化等間隔短鎖回分リピート(CRISPR)ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びニッキングエンドヌクレアーゼのようなヌクレアーゼによって誘導され得る。
【００３７】
例えば、核酸は、内在性ポリペプチド又はRNA分子の変異形態をコードし得る。変異は、機能獲得又は機能喪失(例えば不活化変異)であり得る。いくつかの実施形態において、核酸は、例えば、第1の領域、第2の領域、及び第3の領域を含み得る。第1及び第3の領域は、対象の遺伝子と実施質的に相同である。第2の領域は、内在性遺伝子の変異形態を含み得るか、又は、例えばマーカーをコードし得る。好ましくは、マーカーは、ポジティブ選別マーカー、例えば薬物抵抗性遺伝子、表面マーカーをコードする遺伝子、蛍光マーカーをコードする遺伝子、又はβ-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子である。植物のための好適な相同組換え方法及びベクターは、当該技術分野において公知であり、例えば、WO2003027261に記載される。
【００３８】
一実施形態において、核酸は、部位特異的組換えを介して植物ゲノムへと組み込まれる。Cre/loxシステム、Flp/FRTシステム、及びR/RSシステムを含むいくつかの部位特異的組換え系が植物において試験されてきている。リコンビナーゼは、それらの2つ組換え部位間の組換えを促進することによってそれらの効果を発揮する。creの場合、組換え部位はLox部位であり、Flpの場合、組換え部位はFrt部位である。これらの組換え部位は、非対称配列によって分離された反転回文を含む。同一の線状DNA分子上の平行に配置された(いわゆる「直接反復」)標的部位間の組換えは、介在DNA配列の環状分子としての切除をもたらす。それらのゲノムに安定的な認識配列(例えばFRT、lox、又はRS部位)を有する植物及び植物細胞は、本明細書に開示される方法において、それぞれの認識配列によって隣接された対象の核酸分子を、適切なリコンビナーゼ(例えば、Flp、Cre、又はRリコンビナーゼ)と一緒にトランスフェクトするのに使用できる。トランスフェクションは、核酸分子の安定的な組込みをもたらす。
【００３９】
一過性又は安定的なトランスフェクションのいずれかのために、選別可能又はスクリーニング可能なマーカーを、トランスフェクトする核酸分子中に含めることができる。「マーカー遺伝子」は、マーカータンパク質を発現する細胞に異なる表現型を与え、したがってトランスフェクトされた細胞を、マーカーを有さない細胞から識別することを可能にする遺伝子である。そのような遺伝子は、マーカーが化学的手段によって、すなわち、選別剤(例えば、除草剤、抗生物質等)の使用を通じて「選別」することができる形質をもたらすかどうか、又は観察若しくは試験によって、すなわち「スクリーニング」によって同定することができる単純な形質(例えば緑色蛍光タンパク質)であるかどうかに応じて、選別可能又はスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードすることができる。選別可能なマーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(NEO)及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HPT)をコードするもののような抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、並びに除草剤化合物に対する抵抗性を与える遺伝子を含む。除草剤抵抗性遺伝子は、除草剤に感受性ではない改変標的タンパク質、又は植物において除草剤を、それが作用する前に分解若しくは解毒する酵素を一般的にコードする。(DeBlock等、(1987)EMBO J. 6:2513〜2518頁、DeBlock等、(1989)Plant Physiol. 91:691〜704頁、Fromm等、(1990)8:833〜839頁、Gordon-Kamm等、(1990)2:603〜618頁を参照)例えば、グリホサート又はスルホニルウレアの除草剤に対する抵抗性は、変異標的酵素である、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸シンターゼ(EPSPS)及びアセト乳酸シンターゼ(ALS)をコードする遺伝子を用いることによって獲得されてきている。好適なマーカータンパク質の多くの例は、当該技術分野において公知であり、本発明の実施において用いることができる。本方法の好ましい実施形態において、トランスフェクトされた植物細胞又はそれらの再生された植物は、選別可能又はスクリーニング可能なマーカーの存在についてスクリーニングされる。
【００４０】
「トランスフェクション」は、植物細胞へと核酸を導入するプロセスとして本明細書で定義され、用語「形質転換」を含む。植物細胞及び植物の部分は、単一細胞、並びに花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、苗条、及び種子からの組織、並びに花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、苗条、若枝、台木、種子、プロトプラスト、カルス等を含む。トランスフェクションは、当該技術分野において周知の様々な方法を用いて、自然又は人工的な条件下で起こり得る。好適な方法は、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、及び微粒子銃(particle bombardment)を含む。これらの技術の例は、Paszkowski等、EMBO J. 3:2717〜2722頁(1984)、Potrykus等、Mol. Gen. Genet. 199:169〜177頁(1985)、Reich等、Biotechnology 4:1001〜1004頁(1986)及びKlein等、Nature 327:70〜73頁(1987)によって記載される。トランスフェクションは、物理的若しくは化学的方法、又はウイルス感染による核酸の植物細胞への導入を含む。しかしながら、このプロセスが、異種交配又は交雑による核酸の導入を含まないことは、当業者にとって明らかである。
【００４１】
トランスフェクトされた細胞を、当該技術分野に公知の標準的な技術を用いて植物全体に再生することができる。インビトロで培養される植物細胞、組織、又は器官にトランスフェクトすることに加えて、全体の生植物にもまたトランスフェクトすることができる。アグロバクテリウム媒介輸送は、DNAを植物全体の組織に導入できるので、植物細胞に遺伝子を導入するための広範に適用可能なシステムである。好適なプロセスは、苗、葉、根、子葉等のアグロバクテリウム懸濁液中の浸漬を含み、これは、真空浸透によって増強することができ、更にはいくつかの植物について、顕花植物のアグロバクテリウム溶液(フローラルディップ)中への浸漬と後に続く形質転換した配偶子の交配によって増強することができる。
【００４２】
選別又はスクリーニングによって好ましく同定され、再生を助ける適切な培地において培養される成功裏にトランスフェクトされた細胞は、次に、植物へと再生させられる。「再生」は、植物細胞(例えば植物プロトプラスト又は外植体)から植物を成長させるプロセスを指し、そのような方法は当該技術分野において周知である。
【００４３】
好ましい実施形態において、対象の核酸分子は、アグロバクテリウムT-DNAシステムを介してトランスフェクトされる。好適なアグロバクテリウム株は、LBA4404、EHA101、C58、EHA105、AGL1、又はGV3101を含む。T-DNAは、改変されたTiプラスミド又はTiプラスミド(腫瘍誘導プラスミド)に由来する人工ベクターであってよく、本明細書においてまとめて「T-DNAベクター」と呼ばれる。Tiプラスミドは、T-DNA領域及びvir(病原性(virulence))領域を含む環状DNA分子である。内在性T-DNA領域は、オーキシン(aux)、サイトカイニン(cyt)、及びオピン(ocs)の生合成のための遺伝子を含み、左右の境界と隣接する。境界は、24塩基対の不完全な直接反復である。病原性領域の遺伝子は、植物細胞へのT-DNAの輸送を担う。例えば、VirD2エンドヌクレアーゼは、VirD1の助けを借りてT-DNAの境界を切断し、T-DNAの一本鎖コピーを放出し、これは、VirBによって植物細胞へと輸送されるT鎖であり、輸送システムをコードする。VirE2タンパク質は宿主細胞においてT鎖に結合し、複合体は、植物細胞核へと入る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、対象の核酸は、TiプラスミドのT-DNA領域に挿入される。好ましくは、Tiプラスミドのaux、cyt、及びocs遺伝子は、除去されている(すなわち、プラスミドは「非病原化」されている)。
【００４５】
いくつかの実施形態において、Tiプラスミドに由来する人工ベクターが使用される。植物細胞にDNAを導入するためのアグロバクテリウム媒介植物組込みベクターの使用は、当該技術分野において周知である。例えば、方法は、Fraley等、(1985)、Rogers等、(1987)及び米国特許第5,563,055号に記載され、参照によりその全てが本明細書に具体的に組み込まれる。いくつかの実施形態において、Tiプラスミドの1つ又は複数の遺伝子は、形質転換効率を増加させるために変異導入される。例えば、変異体又はキメラ化のvirA若しくは virG遺伝子の存在により、vir遺伝子の発現及び/又はその誘導が改変されているアグロバクテリウム株である(例えば、Chen及びWinans、1991、J. Bacteriol. 173: 1139〜1144頁、並びにScheeren-Groot等、1994、J. Bacteriol. 176:6418〜6246頁)。別の実施形態において、アグロバクテリウム株は、pTiBo542に由来するスーパーvirG遺伝子のような追加のvirG遺伝子コピーを含むことができる。
【００４６】
好ましい実施形態において、T-DNAバイナリーシステムが使用される。バイナリーシステムにおいて、vir遺伝子はT-DNAの植物細胞への輸送に必要であり、T-DNAが別個のプラスミド上にある。「バイナリープラスミド」は、左右がT-DNA境界配列に隣接する対象の核酸、及び、好ましくは植物マーカーを含む。バイナリープラスミドはまた、通常は、大腸菌(E.col)とアグロバクテリウムとの両方における複製を可能にするための1つ又は複数の複製起点、及び細菌の選別マーカーを含む。「ヘルパープラスミド」は、Tiプラスミド由来のvir遺伝子を含む。T-DNAバイナリーシステムベクターは市販されている。T領域がアグロバクテリウム株の染色体上に位置するバイナリーベクターシステムはまた開示されている(例えば、EP-B 176 112を参照)。
【００４７】
本明細書に開示される本方法の好ましい実施形態において、本方法は、核酸分子を有する植物細胞を提供し、前記分子は、アグロバクテリウムT-DNA配列由来の右側の境界配列(RB)、及びアグロバクテリウムT-DNA配列由来の左側の境界配列(LB)に隣接される対象の核酸配列を含む。本明細書において説明されるように、核酸分子は更に、植物における、及び/又はマーカー遺伝子の発現を駆動するための制御配列を含んでもよい。好ましくは、Tiプラスミドに由来するvirドメインはまた、本方法において提供される。virドメインは、上述の同一の核酸分子上に存在してもよく、又は、別個のベクター、例えばヘルパープラスミドによって提供されてもよい。Tiプラスミドに由来する全体のvirドメインが必須ではないことは当業者には明らかである。
【００４８】
理論に束縛されるものではないが、本発明者等は、一本鎖非保護T-DNAの3'末端(左の境界)は、通常、ランダム組込みを導くPOLQ媒介修復反応の基質であると考えている。植物細胞におけるPOLQの低減は、T-DNAのランダム組込みを低減又は排除するが、一方で、遺伝的組換え及び一過性発現は影響を受けないままである。したがって、POLQの低減は、非保護の3'末端を有する一本鎖DNAの核における存在をもたらすように任意の核酸の源を植物細胞にトランスフェクトするとき、ランダム組込みを低減又は排除すると予想される。
【００４９】
原理的に全ての植物をトランスフェクションに使用できる。好ましいトランスジェニック植物は、例えば、カエデ科(Aceraceae)、ウルシ科(Anacardiaceae)、セリ科(Apiaceae)、キク科(Asteraceae)、アブラナ科(Brassicaceae)、サボテン科(Cactaceae)、ウリ科(Cucurbitaceae)、トウダイグサ科(Euphorbiaceae)、マメ科(Fabaceae)、アオイ科(Malvaceae)、スイレン科(Nymphaeaceae)、ケシ科(Papaveraceae,)、バラ科(Rosaceae)、ヤナギ科(Salicaceae)、ナス科(Solanaceae)、ヤシ科(Arecaceae)、パイナップル科(Bromeliaceae)、カヤツリグサ科(Cyperaceae)、アヤメ科(Iridaceae)、ユリ科(Liliaceae,)、ラン科(Orchidaceae)、リンドウ科(Gentianaceae)、シソ科(Labiaceae)、モクレン科(Magnoliaceae)、キンポウゲ科(Ranunculaceae)、スイカズラ科(Carifolaceae)、アカネ科(Rubiaceae)、ゴマノハグサ科(Scrophulariaceae)、ナデシコ科(Caryophyllaceae)、ツツジ科(Ericaceae)、タデ科(Polygonaceae)、スミレ科(Violaceae)、イグサ科(Juncaceae)又はイネ科(Poaceae)から、及び好ましくはセリ科、キク科、アブラナ科、ウリ科、マメ科、ケシ科、バラ科、ナス科、ユリ科又はイネ科の群から択される植物から選択される。好ましいものは、そのうちのいくつかのみを言及すると、ワタ、カンタロープ、アカチコリ、パパイヤ、プラム、ピーナッツ、ナタネ、キャノーラ、ヒマワリ、ベニバナ、オリーブ、ゴマ、ヘーゼルナッツ、アーモンド、アボカド、月桂樹、カボチャ(pumpkin)/カボチャ(squash)、亜麻仁、大豆、ピスタチオ、ルリジサ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ソルガム及びキビ、ライコムギ、コメ、オオムギ、キャッサバ、ジャガイモ、サトウダイコン、ナス、アルファルファ、並びに、多年草及び飼料植物、油ヤシ、野菜(アブラナ、根野菜、塊茎野菜、鞘野菜、果実野菜、タマネギ野菜、葉野菜及び茎野菜)、ソバ、キクイモ、ソラマメ、ベッチ、レンズマメ、インゲンマメ、ルピナス、クローバー、及びムラサキウマゴヤシの属群から有利に選択される植物等の作物植物である。好ましくは、植物は、トウモロコシ、ナタネ、キャノーラ、ワタ、ジャガイモ、ダイズ、サトウダイコン、カボチャ(squash)、カンタロープ、コメ、アマ、アカチコリ、パパイヤ、アルファルファ、又はコムギである。最も好ましい植物は、トウモロコシ、ワタ、ダイズ、キャノーラ、及びコメである。好ましい実施形態において、植物細胞は、シロイヌナズナではない。
【００５０】
全ての多細胞真核生物のように、植物は、POLQ(Polθ)遺伝子によってコードされるポリメラーゼシータを発現する。本開示において、POLQ及びポリメラーゼシータは、交換可能に使用される。POLQは、植物において約800残基を有する中心ドメイン、及びDNAポリメラーゼの「A」ファミリーに属するポリメラーゼドメインを含む(例えば、Yousefzadeh及びWood DNA Repair 2013 12:1〜9頁を参照)。ポリメラーゼドメインは5つの「モチーフ」を含む(Yousefzadeh及びWoodの図2Aを参照)。植物間の配列相同性は、これらの領域、特にモチーフ2、5、及び6に特に保存される。
【００５１】
植物由来の例示的なPOLQ配列は、シロイヌナズナ由来の「ヘリカーゼ及びポリメラーゼ含有タンパク質TEBICHI」である。2154アミノ酸のタンパク質配列は、受託番号BAD93700.1でNCBIデータベースに見出されるであろう。TEBICHI配列はまた、Inagaki等(Plant Cell 18 (4)、879〜892頁(2006))に公開される。他の植物のPOLQ遺伝子もまた、例えば、シロイヌナズナ由来のPOLQ配列によってBLASTアライメント検索を実行することによって同定され得る。例えば、以下の例示的な植物由来のPOLQ遺伝子がNCBIデータベースに以下の受託番号で列挙される:
コメOryza sativa: XP_015619406
ジャガイモSolanum tuberosum: XP_006356662
ダイズGlycine max: XP_003545584
サトウダイコンBeta vulgaris: XP_010667709
トマトSolanum lycopersum: XP_010325163
バナナMusa acuminata  配列番号: ref|XM_009385225.1|
リンゴMalus x domestica:  配列番号: ref|XM_008380001.1|
ブドウVitis vinifera  配列番号: ref|XM_010650232.1|
ナタネBrassica napus  配列番号: ref|XM_013882859.1|
オレンジCitrus x sinensis  配列番号: ref|XM_006476088.2|
トウモロコシZea mays  配列番号: AQK40086
【００５２】
データベースの類似性検索に使用できるプログラムのBLASTファミリーは以下を含む:ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのBLASTN、タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのBLASTX、タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのBLASTP、ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのTBLASTN、及びヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのTBLASTX。
【００５３】
代替的に、特定の植物種由来のPOLQ遺伝子を同定するために、標準的な分子技術を使用できる。例えば、TEBICHI配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを、所望の植物種由来のcDNA又はゲノムDNAのライブラリーにおいて所望のポリヌクレオチドを同定するために使用できる。対象の植物種中の相同遺伝子を単離するために、ゲノムDNA又はcDNAの配列とハイブリダイズするのにプローブを使用できる。
【００５４】
代替的に、POLQ遺伝子を、日常的な増幅技術を用いて核酸試料から簡便に増幅することができる。例えば、mRNAから、cDNAから、ゲノムライブラリーから、又はcDNAライブラリーから、直接、遺伝子の配列を増幅するのにPCRを使用できる。PCR及び他のインビトロ増幅方法はまた、例えば、発現させるタンパク質をコードする核酸配列のクローニング、試料中の所望のmRNAの存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸の作製、核酸のシーケンシング、又は他の目的のために有用であり得る。植物細胞におけるPOLQを同定するための適切なプライマー及びプローブは、TEBICHI配列に基づいて作製できる。PCRの一般的な概要について、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, M、Gelfand, D.、Sninsky, J.、及びWhite, T.編)、Academic Press、San Diego(1990)を参照できる。
【００５５】
本明細書において記載される方法において使用される植物細胞中において、POLQの発現及び/又は活性が低減している。POLQ発現の低減は、核酸又はタンパク質のレベルで起こり得る。好ましくは、機能的なPOLQの発現量は、対応する野生型植物細胞と比較して、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は100%低減している。好ましくは、発現及び/又は活性は、対応する野生型植物細胞と比較して少なくとも50%低減し、より好ましくは、発現及び/又は活性は、少なくとも70%低減している。
【００５６】
いくつかの実施形態において、POLQの発現は、POLQ核酸の発現を測定することによって決定する。好適な方法は、RT-PCR、定量的PCR、ノーザンブロッティング、遺伝子シーケンシング、特にRNAシーケンシング、及び遺伝子発現プロファイリング技術、例えばマイクロアレイを含む。好ましい実施形態において、発現は、POLQタンパク質のレベルを測定することによって決定できる。好適な方法は、ELISA、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、プロテオーム、及び質量分析を含む。好ましくは、POLQの発現は、イムノアッセイにおいて決定される。好適なイムノアッセイは、例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着測定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、沈降反応、凝集アッセイ(例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集反応アッセイ等)、補体結合アッセイ、免疫蛍光測定法、プロテインAアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、POLQの活性は、DNA、DNA特にクロマチンに結合するPOLQの能力を指す。そのような活性は、Fernandez-Vidal等、2014 Nature Communications 5に記載されるように、POLQ抗体によるイムノブロットしたクロマチン画分のような、当業者に公知の任意の方法によって測定することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、POLQの活性はポリメラーゼとして作用するその能力を指す。そのような活性は、例えば、Hogg等、Nucleic Acids Res. 2012年3月;40(6):2611〜2622頁に記載されるプライマー伸長アッセイにおいて、Kent等、Nat Struct Mol Biol. 2015年3月;22(3):230〜237頁に記載されるようなMMEJアッセイによって測定できる。Zhan等(Nat Struct Mol Biol. 2015年4月;22(4): 304〜311頁)は、POLQの活性を測定するための更なるアッセイを記載する。当業者に明らかなように、POLQの活性における低減は、同一の生物からの野生型POLQの活性と比較した活性の低減を指す。
【００５９】
POLQの下方制御は、遺伝子を破壊する変異の導入によって、POLQの発現を減少させることによって、発現を完全に損なうことによって、又は遺伝子産物を機能しなくすることによって達成され得る。例えば、変異は、点変異、挿入、又は欠失であり得、変異は、POLQ遺伝子のコード部分(例えばPOLQエクソン中)又は非コード部分(例えばPOLQのプロモーター領域中)に位置し得る。Yousefzadeh及びWood(DNA Repair、Volume 12、Issue 10、2013、871頁)は、POLQファミリーメンバーの構造比較を提供し、触媒ドメインの位置について論ずる。好ましい変異は、Yousefzadeh及びWoodの図2に描写されるようなPOLQのポリメラーゼドメインを破壊し、これは参照により本明細書に組み込まれる。好ましくは、POLQ変異は、野生型遺伝子と比較して少なくとも50%発現及び/又は活性を低減する。
【００６０】
POLQ遺伝子における変異は、ランダム変異導入法、例えば放射線照射、ランダムDNA組込み(例えばトランスポゾン又はT-DNAを介する)、又は化学変異原を用いることによるものを含む、当業者に周知の任意の方法によって達成できる。更に、ある特定の態様において、POLQ遺伝子は、部位特異的変異導入のアプローチを用いて変異導入できる。いくつかの実施形態において、POLQ遺伝子は、相同組換えベクター又は標的化ヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、transcription activator様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化等間隔短鎖回分リピート(CRISPR)ヌクレアーゼ、又はメガヌクレアーゼを用いて変異導入又は破壊される。好ましくは、CRISPR/Casシステムが使用される。これらの方法は、当該技術分野において公知であり、当業者は、そのような方法が本開示に照らして適切であると認識することができるであろう。特定の変異アレルをスクリーニングするためのいくつかの技術は公知であり、例えばDeleteagene(Delete-a-gene;Li等、2001、Plant J 27:235〜242頁)では高速中性子変異導入により作製した欠失変異についてスクリーニングするためにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを使用し、TILLING(ゲノム中の標的化誘発局所損傷((targeted induced local lesions in genomes);McCallum等、2000、Nat Biotechnol 18:455〜457頁)は、EMS誘発点変異を同定する等である。
【００６１】
好ましい実施形態において、植物細胞は、変異したPOLQ遺伝子を有し、好ましくは両方のアレルが変異している。好ましい実施形態において、変異は「ノックアウト」アレルであり、すなわち、機能性のタンパク質が産生されない。
【００６２】
いくつかの実施形態において、CRISPR/CasシステムがPOLQの発現又は活性を低減するのに使用される。CRISPR/Casシステムは、II型の原核生物CRISPR(クラスター化等間隔短鎖回分リピート)の適応免疫系由来のRNAにガイドされたCas9ヌクレアーゼに基づく(例えばBelahj等、Plant Methods 9:39、2013を参照)。このシステムは3つの成分を含む: Cas9タンパク質、crRNA、及びtracrRNA。crRNA及びtracrRNAは、通常は、gRNA(ガイドRNA)と呼ばれる単一のRNA分子として提供される。ガイドRNAは、U6又はU3のような核内低分子RNAプロモーターを用いて発現できる。Cas9の植物コドン最適化バージョンもまた、記載されてきており、構成的プロモーター(例えば35Sプロモーター)、又は組織特異的若しくは誘導可能なプロモーターのいずれかによって植物中に発現させることができる。
【００６３】
このシステムは、gRNAを介して特定のゲノム座位へとCas9を標的化することを含む。gRNAの標準的な長さは20bpであるが、植物の座位を標的化するためには19〜22bpを使用することができる。gRNAは、標的配列、この場合POLQ遺伝子に結合するように設計される。結合部位は、標的化されるDNAにPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)配列が続くように選択される。化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)由来のCas9タンパク質であるSpCas9は、NGGという短いPAM認識配列を有するため、このシステムにおいてしばしば使用される。したがって、SpCas9が使用される場合、好適なgRNAはPOLQゲノム座位を配列(N)19〜22NGGについてスクリーニングすることによって設計できる。好適な標的部位を同定するためのオンラインのCRISPR設計ツールもまた利用可能である(http://tools.genome-engineering.org、Ren等)。
【００６４】
植物において変異を導入するためのCRISPR/Cas9システムの使用に関する更なる情報は、Lowder等、Plant Physiology 2015 169:971〜985頁、及びBelhaj等、2013 Plant Methods 9:39頁に見出すことができる。
【００６５】
POLQの発現における低減はまた、「阻害性核酸分子」を用いて達成することができ、その細胞における存在は、配列特異的な様式でその標的遺伝子の分解、又はその機能、転写、若しくは翻訳の阻害を引き起こす。例示的な核酸分子は、アプタマー、siRNA、人工マイクロRNA、干渉RNA又はRNAi、dsRNA、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、前記核酸分子をコードするDNA発現カセットを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)は、一般に、標的mRNAに結合することによってそれらの標的を阻害し、リボソームを妨害することによって発現を立体的に遮断する。AONはまた、標的のmRNAに結合し、したがってRNase Hの基質となり得るDNA-RNAハイブリッドを形成することによってそれらの標的を阻害することができる。AONはまた、2つ以上のオリゴヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド模倣物、又はそれらの領域若しくは部分の複合体構造として作製することができる。そのよう化合物はまた、当該技術分野においてハイブリッド又はアプタマーと呼ばれてきている。そのようなアプタマーの設計及び修正方法は、例えば、米国特許出願公開第20110092572号及び米国特許出願公開第20100234451号に記載されている。AONは典型的には12〜80の間、好ましくは15〜40の間の核酸塩基を含む。好ましくは、AONは、少なくとも8核酸塩基の、標的のmRNAと100%の相補性を有する、ストレッチを含む。
【００６７】
別の方法において、核酸は、mRNAの発現に影響を与えるリボザイム又は触媒性RNAへと転写され得る。米国特許第6,423,885号を参照。リボザイムは、標的RNAと特異的に対形成して特異的な位置でホスホジエステル骨格を切断し、それによって標的RNAを機能的に不活化するよう設計できる。異種核酸は特定のmRNA転写物を切断し、それによってポリペプチドの発現を防ぐよう設計したリポザイムをコードすることができる。ハンマーヘッドリボザイムは、標的mRNAと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって規定される位置においてmRNAを切断する。
【００６８】
好ましくは、核酸分子は、POLQ遺伝子によってコードされるmRNAに特異的な二重鎖RNAi分子である。好ましくは、分子は逆方向反復構造において抑制されるPOLQ遺伝子のフラグメントを含む。逆方向反復は、しばしばイントロンであるスペーサーによって分離される。RNAiコンストラクトは、好適なプロモーターによって駆動され、植物中にトランスフェクトされる。導入遺伝子の転写は、二重鎖ヘアピンRNAを形成するためにそれ自身へと折り返されるRNA分子をもたらす。この二重鎖RNA構造は、植物によって認識され、低分子干渉RNA(siRNA)と呼ばれる小型RNA(約21ヌクレオチド長)へと切断される。siRNAは、タンパク質複合体(RISC)と会合し、標的遺伝子のmRNAの直接的な分解をもたらす。制御領域及び転写終結配列に作動可能に連結され、二重鎖RNAを形成できるRNAへと転写される転写終結配列を含むコンストラクトは、形質転換され得る。遺伝子の発現を阻害するためにRNAiを用いる方法は、当業者に公知である。例えば、米国特許第5,034,323号、同第6,326,527号、同第6,452,067号、同第6,573,099号、同第6,753,139号、及び同第6,777,588号を参照のこと。WO97/01952、WO98/53083、WO99/32619、WO98/36083、及び米国特許出願公開第20030175965号、同第20030175783号、同第20040214330号、及び同第20030180945号もまた参照のこと。ヒトPOLQに対するsiRNAは、Ceccaldi等、Nature. 2015年2月12日、518(7538):258〜262頁に記載されている。
【００６９】
ウイルス誘発性の遺伝子抑制(VIGS)技術は、RNAi技術の改変であり、植物の内在性の抗ウイルス防御を利用する。宿主DNAのフラグメントを含有する組換えVIGSウイルスによる植物の感染は、標的遺伝子の転写後の遺伝子抑制をもたらす。一実施形態において、VIGSシステムに基づいたタバコ茎えそウイルス(TRV)を使用できる。VIGSシステムに基づいたタバコ茎えそウイルスは、例えば、Baulcombe、Curr. Opin. Plant Biol. 2:109〜113頁(1999)、Lu等、Methods 30:296〜303頁(2003)、Ratcliff等、The Plant Journal 25:237〜245頁(2001)、及び米国特許第7,229,829号に記載される。
【００７０】
いくつかの実施形態において、POLQの活性は、植物細胞のPOLQ結合分子を提供することによって低減される。好ましくは、POLQの活性は、対応する野生型植物細胞と比較して、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は100%低減している。好ましくは、POLQ結合分子は、POLQに結合し、その酵素活性及び/又はそのDNAに結合する能力を阻害する。
【００７１】
好ましくは、POLQ結合分子は小分子である。更なる結合剤は、抗体、並びに非免疫グロブリン結合剤、例えばファージディスプレイ由来のペプチド結合因子、及び抗体模倣物、例えばアフィボディ、テトラネクチン(CTLD)、アドネクチン(モノボディ)、アンチカリン、DARPin(アンキリン)、アビマー(avimer)、iMab、ミクロボディ、ペプチドアプタマー、Kunitzドメイン、アプタマー、及びアフィリンを含む。用語「抗体」は、例えば、天然に存在するものと天然に存在しない抗体の両方、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、キメラ抗体及び完全合成抗体、並びにそれらのフラグメント、例えば、Fab'、F(ab')2、Fv若しくはFabフラグメント、又は他の抗原認識免疫グロブリンフラグメント等を含む。
【００７２】
好ましくは、POLQ結合分子はPOLQ抗体又はその抗原結合フラグメントである。POLQを認識する抗体は、市販されている(例えば、TEBICHIタンパク質を用いて作製されたAbmart社製のX3-Q588V7[ABX]を参照)。
【００７３】
特定のエピトープに結合する抗体は、当該技術分野において公知の方法によって作製できる。例えば、ポリクローナル抗体は、哺乳動物(例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ)を免疫する従来の方法によって作製できる。次いで、ポリクローナル抗体は、免疫された動物の血清中に含有され、標準的な手順(例えばアフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィー)を用いて単離できる。モノクローナル抗体は、動物の免疫の従来の方法によって作製でき、対象のモノクローナル抗体を産生する血漿B細胞の単離及びミエローマ細胞との融合が後に続く(例えば、Mishell等、1980を参照)。エピトープの認識についてのスクリーニングは、ELISA技術、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光、免疫組織化学、及びウェスタンブロッティングを含む標準的なイムノアッセイ法を用いて実施できる(Ausubel等、1992)。抗体ファージディスプレイのような抗体選別のインビトロの方法もまた抗体を作製するのに使用できる(例えば、Schirrmann等、2011を参照)。好ましくは、核への移行を増大するために核移行シグナルを抗体に付加する。
【００７４】
本開示はまた、天然に存在しない植物又は植物細胞であって、本明細書において開示されるように、前記植物又は植物細胞においてPOLQの発現及び/又は活性が低減しており、前記植物又は植物細胞がシロイヌナズナではない、天然に存在しない植物又は植物細胞を包含する。好ましい実施形態において、植物又は植物細胞は、本明細書において記載されるようなPOLQ「阻害性核酸分子」を発現する。好ましい実施形態において、植物又は植物細胞は、本明細書において記載されるような変異したPOLQ遺伝子を有する。前記植物及び植物細胞は、本明細書において開示される方法を実行するのに有用である。したがって、本開示はまた、対象の核酸分子をトランスフェクトするための植物又は植物細胞の使用を包含する。
【００７５】
本開示はまた、本明細書において開示される方法によって作製される植物細胞及び植物を包含する。前記植物及び植物細胞は、それらが核酸分子を含むが、それらのゲノムは、限定されているか又は核酸のランダムな組換え事象がないので、有益である。好ましい実施形態において、前記植物細胞及び植物は、本明細書において記載されるように低減したPOLQの発現及び/又は活性を有する。
【００７６】
本開示はまた、本明細書において開示される方法によって作製される植物の子孫を包含する。本明細書において使用されるとき、用語「子孫」は、本明細書において記載される方法に従って調製される任意の世代の親植物からのオフスプリング(種子を含む)を指し、子孫は対象の核酸分子を含む。
【００７７】
定義
本明細書において使用されるとき、「含む」及びその語形変化は、その単語に続く項目が含まれるが、具体的に述べられていない項目が排除されないことを意味するその非限定的な概念で使用される。更に、動詞「〜からなる」は、「本質的に〜からなる」と置き換えることができ、本明細書において定義されるような化合物又は付加的な化合物が具体的に同定されるもの以外の更なる成分を含むことができ、前記更なる成分が、本発明の独自の性質を改変することがないことを意味する。
【００７８】
冠詞「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、本明細書において、冠詞の文法的な対象の、1又は1を超えるもの(すなわち、少なくとも1)を指すために使用される。例として、「an element」は、1つの要素又は1つを超える要素を意味する。
【００７９】
本明細書において引用される全ての特許及び文献の参照は、参照によりそれらの全てが本明細書に組み込まれる。
【００８０】
本明細書において使用されるとき、相同組換え(homologous recombination、HR)は、非損傷のテンプレート(通常は姉妹染色分体)を用いるエラーのない切断修復を指す。
【００８１】
本明細書において使用されるとき、HDR(相同駆動の修復(homology-driven repair))は、テンプレートを用いる直接修復への相同配列の使用をより広範に指す。切断はまた、それが相同配列に隣接されている場合修復され得、この場合、修復モードは、一本鎖アニーリング(single-strand annealing)についてSSAと呼ばれ、この結果はエラープローンである。
【００８２】
HR、HDR、又はSSAではない全ての他の修復は、通常、末端結合(end joining)(EJ)と呼ばれる。EJは、直接的修復のために相同性を使用しないので、それはもともと、非相同末端結合(non-homologous end-joining)(NHEJ)と呼ばれていた。最初に発見され、最も知られたEJ経路は、とりわけ、タンパク質KU70及びKU80並びにLIG4を必要とし、NHEJ又は古典的(classical)NHEJ(cNHEJ)と呼ばれる。cNHEJ(cNHEJを欠損した細胞において顕在化する)とは異なるEJは、「代替的」EJ又はalt-EJと呼ばれる。この型のEJは、修復産物のジャンクションにおいて同一の塩基のセグメントをしばしば提示するので、マイクロホモロジー媒介性EJ又はMMEJとも呼ばれてきている。
【００８３】
本明細書において使用されるとき、TMEJ(polシータ媒介性EJ)は、当該技術分野において受け入れられる、POLQによって媒介される修復を指す。理論に束縛されるものではないが、本発明者等は、多くのalt-EJ修復が、実際にTMEJ媒介性であると提案する。
本発明は以下の実施例において更に説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定せず、単に本発明を明確にするために役立つ。
【実施例】
【００８４】
(実施例1)
T-DNAトランスフェクション
背景
アグロバクテリウム・ツメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)は双子葉植物におけるクラウンゴール病の病因である。病原体のDNAの一片であるT-DNAは、植物細胞に輸送され、そこで、ゲノムに組み込み、これは生物界間の遺伝的伝達の例となる。T-DNA上に位置する遺伝子は、細菌が炭素と窒素の供給源として使うことができる栄養素を合成する腫瘍細胞に植物細胞を形質転換し、したがってそれ自体にとって生態学的なニッチを作り出す2。この病原体のDNAを伝送する能力は、外来遺伝子の植物への挿入手段として、バイオテクノロジーにおいて徹底的に研究されてきている。現在、アグロバクテリウムと植物細胞との間での相互作用、及びT-DNAの宿主ゲノムへの組込みを導くプロセスについて多くが知られているが、組込みの実際のメカニズムは未知のままである1。すでに20年前に、アグロバクテリウムが宿主の二重鎖切断(DSB)修復酵素を利用してT-DNA組込みを触媒すると仮説が立てられており、別のDSB修復経路の重要なタンパク質の遺伝的調査を導いた3。標準の非相同末端結合及び相同組換えの因子は、それらのT-DNA組込みへの関与について調査されてきたが、限定され、かつ変動する結果をもたらした4〜7。異なる経路を組み合せて機能しなくしたときでさえ、T-DNA組込みは可能なままであり8、9、未だ同定されていない未知の経路の関与を示唆した。
【００８５】
組込みのメカニズムに迫る手がかりとなる、T-DNA組込みの1つの可能性がある情報的に価値がある特徴は、T-DNA組込み部位にしばしば見出される、いわゆる「フィラー(filler)DNA」である一種のゲノムの傷痕である。フィラーDNAは、組込み部位のすぐ隣に存在する配列と同一のストレッチをしばしば含有するDNA配列の挿入である10、11。本発明者等はT-DNA組込み事象におけるフィラーDNAの構成と、線虫シー・エレガンス(C. elegans)及びハエ、キイロショウジョウバエ(D. melanogaster)におけるエラープローン(error-prone)DSB修復の産物との驚くべき類似点に着目した。これらの種において、複製関連の及びヌクレアーゼ誘発のDSBは、Aファミリーポリメラーゼシータ(Polθ)に決定的に依存する代替的な末端結合経路によって修復でき、ある場合においては、結果としてのフィラー様挿入を伴う12〜14。この特徴的なPolθ媒介末端結合の特徴は、哺乳動物細胞にもまたDNA挿入が修復部位において見出すことができるので、進化的に保存されている15、16。Polθをコードする遺伝子は、全ての多細胞真核生物のゲノムにおいて見出すことができ、それはモデル植物であるシロイヌナズナを含み、そこでは遺伝子はTebichiと呼ばれる17、18。
【００８６】
Polθが植物において、かつ事実上T-DNA組込みを触媒することにおいて、フィラーDNA合成を担うのかどうかという疑問に対処するために、本発明者等は、野生型(Col-0)植物及びPolθの2つのノックアウトアレル(teb-5及びteb-217)を、フローラルディップ形質転換によって形質転換した。本発明者等は、野生型Col-0植物の形質転換が通常通り起きたが、teb-2及びteb-5の植物からは単一の形質転換体が回復できなかったことを見出だした(図1a〜c)。
【００８７】
これらの結果が、アグロバクテリウムが雌性配偶体(形質転換の標的細胞)に浸透して到達するのを防ぐ明らかではない形態学的な花の欠陥に起因するという可能性を排除するために、本発明者等は、これらの細胞におけるT-DNAの一過性発現をアッセイした。この目的のために、本発明者等は、胚珠/発育している種子において発現する、ACT11プロモーターの制御下でマーカーGUS::イントロンを発現するT-DNAを使用した19、20。アグロバクテリウムの感染の際、本発明者等は、野生型及びPolθ変異植物におけるT-DNA媒介の一過性発現が区別できないことを見出だした(図1)。したがって、T-DNAは、標的組織の核に到達できるが、その組込みについては機能的なPolθに完全に依存する。
【００８８】
根細胞におけるT-DNA組込みは、花におけるT-DNA組込みとは異なり得ることが以前に示唆されている21。シロイヌナズナの花の形質転換では何千ものT-DNA-植物ゲノムジャンクションが利用可能であるが、根の形質転換を介して得られる形質転換では限られた数のみが決定されており、先験的な予測は不可能である。したがって、本発明者等は、Col-0及びpolθ欠損の根を、除草剤ホスフィノトリシン(PPT)に対する抵抗性をもたらすT-DNAを送達するアグロバクテリウム株で感染し、PPTを含有する選別プレート上の緑色の苗条の形成を安定的な組込みのためのマーカーとして使用した。予想通り、本発明者等は、Col-0において約80%の成功裏の形質転換を見出だしたが、polθ欠損の根の形質転換の頻度は、大幅に低減しており(図2a〜b、f)、実際、853のカルスのうち、全てが緑色の苗条を発生させなかった。非選別条件におけるカルスからの苗条の再生は、polθ欠損の根において損なわれていなかった。感染したpolθ欠損の根がカルスを確かに形成したが、これらは成長せず、数週間後に衰退し、カルスの形成が非組込みのT-DNAの一過性発現に起因し得ることを示唆することに、本発明者等は注目した。実際、T-DNAをクローニングし、検証することを目的とするTAIL-PCRアッセイは、感染したCol-0カルスから抽出したDNAにおいてのみ産物を生じ、感染したteb-5カルスからは生じなかった(図2c)。polθ欠損の根におけるT-DNA送達及び一過性発現の能力を確かめるために、本発明者等は、感染したteb-2及びteb-5の根におけるGUS::イントロン遺伝子をコードするT-DNAの成功裏の発現を示した(図2d〜e)。これらのデータから、本発明者等は、根細胞の形質転換のために、花の配偶子の場合と同様に、成功裏のT-DNAの組込みは機能的なpolθに依存すると結論付ける。
【００８９】
T-DNAは、細菌のVirD2タンパク質がその5'末端に共有結合した一本鎖DNA(ssDNA)分子として植物細胞に送達される1。この末端をT-DNAの右の境界(RB)と呼ぶ。T-DNAの3'末端である左の境界(LB)は、保護されておらず、それをpolθ媒介の修復反応の優れた基質とし、インビトロにおけるpolθによるDNA合成は、2つの最小限に対形成した3'の突出DNA末端を安定化する22。物理的なゲノム切断の修復におけるその実証された役割と共に、polθの生化学的特性は、植物ゲノムへのT-DNA組込みに対する非常に単純なメカニズム、自発的なゲノムDSBの修復におけるT-DNAの偶発性の捕捉を提示する(図3a)。polθ変異植物のDSB誘発剤に対する過度の感受性17は、ゲノム切断の修復におけるpolθの顕著な役割を支持する。T-DNA捕捉部位として作用する内在性DSBの裏付けとして、電離放射線又はエンドヌクレアーゼの異所性の発現のいずれかによるゲノムに対する更なるDNA損傷を与えることが、T-DNAの組込みを刺激及び誘導することを見出した23、24。
【００９０】
インビボにおけるpolθの作用の特徴を調査するために、本発明者等は、この作用の10,000を超える産物:野生型植物細胞におけるフローラルディップを介した組込みから生じるT-DNA/植物ゲノムジャンクションを体系的に分析した11。全ての組込み事象のおよそ70%において、一方又は両方のジャンクションがフィラーDNAを含有し、それは多くが未知の起源のものである。厳しい基準を用いた最近の調査は、16%のフィラーの起源を、ゲノムの隣接部又はT-DNAそれ自体のいずれかの10kbのT-DNA挿入内に位置する配列にマッピングした11。しかしながら、より初期の報告は、フィラーが、異なる起源の複数のより小さなセグメントの構成であるという分子パッチワークを反映するかもしれないという手がかりを提供してきている10。本発明者等は、フィラーと対象の配列との間の同一性の最も長い可能性があるストレッチを決定する、最長共通部分文字列(LCS)戦略を用いて約5,000のフィラーの集まりを体系的に分析した(図3b)。本発明者等はフィラーの約60%が、ジャンクションの100bp内のDNAに対し少なくとも1つの合致を有することを見出す。これらの約20%において、本発明者等は、他の隣接位置にマッピングされる更なるストレッチを同定した。フィラー合成に使用されるテンプレートは、主にジャンクションに近く(図3b〜d)、T-DNAと植物ゲノムの両方が使用される(図3d)。多くのフィラーが容易に追跡できる複数のストレッチを有する複合的な構成を有するが、未知の起源のヌクレオチドによってしばしば割り込まれている。これらのセグメントの配列の配置から、polθが1回又は複数のサイクルのプライマー-テンプレートスイッチングを可能にすることによって修復を促進できるとする提案がインビトロ検証される。このようなプライマー-テンプレートスイッチングは、解消を刺激する補完的な末端の生成を助け得る特徴である。フィラーが実際にプライマー-テンプレート相互作用によって刺激されるかどうかを確かめるために、本発明者等は、ジャンクション近傍において、フィラー含有ジャンクションがそれらの同種のフィラーマッチング配列に対してプロットされている、ヒートマップを作成した。このアプローチは、ジャンクションを生成する予想された3'末端、すなわちプライマーと、
フィラー合成に使用されるテンプレートのすぐ上流の配列との間の配列同一性の度合いを可視化する。解釈における可能性があるあいまいさを避けるために、本発明者等は分析を、フィラーが隣接部中にたった一つの連続一致を有する事例(n=589)のみに限定した。本発明者等は実際に、マッチング塩基の広範な過剰存在を見出だす(図3e)。66%のフィラーは、少なくとも1つのヌクレオチドプライマーを有し、57%が少なくとも2つのプライマーとテンプレートとの間の一致を含有し、47%が3'末端における3つのプライミングヌクレオチドを有する。まとめると、これらの結果はi)フィラーDNAは、T-DNAの3'末端と最小限に塩基対形成するか、又はその逆である、ゲノム切断の3'末端を伸長するpolθ産物であること、及びii)このポリメラーゼのプライマー-テンプレートスイッチング能力が、フィラーの複合的な構成の原因であることを示唆する。
【００９１】
興味深いことに、フィラーを含まないT-DNAジャンクション(これらもまたその形成にpolθを必要とする)のマイクロホモロジーの程度を表すヒートマップが、フィラー含有ジャンクションのプライマー-テンプレートヒートマップと非常に類似する(図3e、f)。この概念は、DSB修復におけるマイクロホモロジーが非相補的ssDNA鎖の対形成においてわずかに増加した安定性を反映するのではなく、むしろ、少数の相補的塩基に対して対形成する3'末端を優先的に伸長するポリメラーゼの生化学的性質を反映するという考えを裏付ける。
【００９２】
まとめると、本発明者等の結果は、植物ゲノムへのT-DNA組込みについての概念的に単純なメカニズムを導く。つまり、植物のpolθ媒介修復経路は、ゲノム切断の末端を繋ぎ合わせる代わりに、末端を外来性に提供されるT-DNA分子と繋ぎ合わせる。結果は、生殖細胞及び体細胞において同様である。多くのT-DNA組込み(63%)は、逆方向反復構造を有し、そのいずれかの側において、植物ゲノムがT-DNAの3'LBに付着し、T-DNAの3'末端が優先的な基質であることを支持する。polθの最小限に対形成した3'末端を伸長する能力は、T-DNAの左の境界の植物ゲノムへの付着についてメカニズム的な説明を提供し、そのプライマー-テンプレートスイッチングに対するその寛容性は、パッチワークフィラーの存在を説明する(図4を参照)。T-DNAの5'の右の境界がいかに植物ゲノム(単一コピーの組込みについて)又は別のT-DNAの5'の境界(逆方向反復方向について)のいずれかへと連結されるかについては、あまり明らかではない。しかしながら、RB-T-DNA/植物ゲノムジャンクションの詳細な分析は、非常に類似する付着のメカニズムを示唆し、ここでも同様に、polθの作用を示すフィラーが見出される。ゲノムによるT-DNAの3'末端の捕捉又は未だ未知のメカニズムのいずれかによって開始される一本鎖T-DNAの二重鎖構造への転換がこの反応を進める可能性がある25、26。興味深い概念は、いずれかの側においてT-DNAの3'末端を捕捉するDSBが、共有結合する細菌のVirD2タンパク質によって5'切除活性から保護されているというものである。解消が起きるためには、この5'末端は、様々なDNA処理酵素における変異を有する植物における低減した組込み効率を説明するかもしれない更なる酵素処理を必要とする可能性がある4〜9。
【００９３】
植物におけるT-DNAの組込みのメカニズムの理解を提供することから離れて、本発明者等のデータは、トランスジェニック作物の開発のバイオテクノロジーの戦略に多大な影響を有し、polθを標的化することは、ジーンターゲッティングアプローチにおける望まれないランダム組込みを完全になくし、一方で、これまで検討されたように全ての種においてpolθがHRに必要とされないので、HRに影響を与えない。シロイヌナズナ配偶体及び根におけるT-DNA組込みに関するpolθに対する完全な依存性は、コメ、トマト、イチゴ、又はタバコのような作物種を含む全ての研究された高等植物におけるT-DNA組込みにおけるpolθの特性の十分な出現と共に、広範な用途を提示する27〜30。
【００９４】
方法
植物株及び成長条件
挿入変異の情報は、http://signal.salk.eduにおけるSIGnALウェブサイトから取得した。teb-5(SALK_018851)及びteb-2(SALK_035610)は、SALK T-DNAコレクション31より取得した。teb-5及びteb-2アレルは、以前に記載されてきている17。植物は土壌上で16時間明所/8時間暗所のサイクルにおいて20℃で成長した。
【００９５】
フローラルディップ形質転換
野生型(エコタイプCol-0)及び変異のシロイヌナズナ植物を、バイナリーベクターpCAMBIA1301を内部に持つ非病原化アグロバクテリウム株LBA110032を用いて、以前に記載されたフローラルディップ法33によって形質転換した。トランスジェニック種子を、スクロースを欠き、100μg/mLのニスタチン、100μg/mLのチメンチン(全ての残存するAgrobacteriumを殺傷し、感染を防ぐため)、及び組込み事象を選別するための15μg/mLのハイグロマイシンを補充したMA土壌培地上で選別した。代替的に、植物は、バイナリーベクターpSDM390035を内部に持つA. ツメファシエンス (A. tumefaciens)株、AglI34を用いて形質転換した。トランスジェニック種子を、スクロースを含まず、100μg/mLのニスタチン、100μg/mLのチメンチン(全ての残存するAgrobacteriumを殺傷し、感染を防ぐため)、及び組込み事象を選別するための15μg/mLのホスフィノトリシンを補充したMA土壌培地上で選別した。一過性の事象を検出するために、ACT11プロモーターを含有するCol-0ゲノムからの850bpのフラグメントを、安定的な組込みのマーカーとそのプロモーターを除去したバイナリーベクターpCAMBIA1301へとクローニングすることによって作製されたpCAMBIA1301_ACT11(配列は要望により入手可能である)を内部に持つアグロバクテリウム株AglIを用いて、顕花植物をフローラルディップに供した。6日後、花を採取し、1mMのK3Fe(CN)6及び1mMのK4Fe(CN)6、10mMのNa2EDTA、0.1%のSDS、0.1%のTriton X-100、並びに2mMのX-glucを含有するリン酸バッファー(pH=7.3)中で一晩染色した。後に、70%エタノールを用いて花を透明化した。
【００９６】
根の形質転換
根の形質転換は、以前に記載されたとおり36に、バイナリーベクターpCAMBIA3301を内部に持つ非病原化A. ツメファシエンス 株LBA110032を用いて、野生型(Col-0)、及び変異のシロイヌナズナ植物において実施した。共培養の2日後、根の外植体の一部を1mMのK3Fe(CN)6及び1mMのK4Fe(CN)6、10mMのNa2EDTA、0.1%のSDS、0.1%のTriton X-100、並びに2mMのX-glucを含有するリン酸バッファー(pH=7.3)中ですぐに染色し、根の外植体の残りを、形質転換の選別のための10μg/mLのPPT、並びに残存するAgrobacteriumを殺傷するための500μg/mLのカルベニシリン及び100μg/mLのバンコマイシンを含有する土壌培地へと移した。
【００９７】
挿入ジャンクションの増幅
植物物質を液体N2のもと、TissueLyser (Retch社、Haan Germany)中で粉末へと破壊した。DNAを以前記載されるとおりに単離した37。1μLの単離したDNAを20μLの全容量でのPCRに使用した。Taqポリメラーゼ及びバッファーは社内で作製した。T-DNAゲノムジャンクションを、縮重プライマーAD2(NGTCGASWGANAWGAA)38、及び特異的なネステッドプライマーを用いて、TAIL-PCR38によって単離した。
【００９８】
【表１】
2019509053.tif 000002
【００９９】
T-DNAのゲノム挿入の決定
全てのT-DNAの組込みの確認配列は、ENA/GenBank(受託番号LN484267〜LN515397)11よりダウンロードされた。T-DNA挿入ジャンクションを決定するために、各々の配列とシロイヌナズナ参照ゲノム(TAIR10)及び関連するバイナリープラスミドとの間でMegaBLAST検索を実施した。T-DNAが3'領域に存在する配列について、配列の逆相補性が更に分析された。高品質にシーケンシングされたジャンクションに焦点を当てるため、本発明者等は、T-DNAの3'末端、及び5'ゲノム領域が、その対応する最良のBLASTヒットと完全な一致(20bp以上、ミスマッチが全くない、ギャップがない)を示す配列のみを含めた。T-DNA及びゲノムBLASTのヒットが重複しない配列は、フィラーの組込みであるとして示したが、重複する又は繋ぎ合わされたBLASTヒットを有する配列は、非フィラーの組込みであるとして示した。情報価値を有さない塩基を含有するフィラーを除去した。これらのフィルターを適用した後、10,616のT-DNA挿入事象が更なる分析のために残された。
【０１００】
フィラーの起源
フィラーの起源を決定するために、本発明者等は最長共通部分文字列(LCS)アルゴリズムを用いた。アルゴリズムは、フィラー(クエリー)と別の配列(対象)との間の最長の共通の配列を決定する。各フィラー(6bp以上、及び40bp以下)について、本発明者等は、そのそれぞれの最良のBLASTヒットによって決定されたT-DNAゲノムジャンクションの位置と比較して、T-DNAとシロイヌナズナの参照ゲノムの両方において、両方の鎖の方向で、LCSを決定した。本発明者等は、T-DNAプラスミド配列と両方向でジャンクションから25〜6,400塩基離れた参照ゲノムとを検索した。見出されたLCSの長さの過剰存在を計算するために、本発明者等は、DNA配列における所与のフィラーのある長さのLCSを発見する疑似ランダム確率を決定した。この目的のために、本発明者等は各フィラーの対象のDNAをシャッフルし、LCSについて検索した(各フィラーについて10〜100回)。疑似ランダムのLCSの長さの確率分布は、各フィラーのサイズ(6bp以上及び40bp以下)について作製された。確率分布と実際に見出されたLCSのサイズとの間の過剰存在は、確率分布の右の尾部のLCSの長さを有するフィラーの画分マイナス予測されたフィラーの画分として計算される。本発明者等は、そのLCSの長さの実際の分布が、確率よりも少なくとも10倍大きかったとき、個別のフィラーを過剰存在するものとしてマークした。
【０１０１】
フィラーが、T-DNAの起源のプラスミドを起源とするかどうかを決定するために、LCSが13bp以上の長さである場合にのみ位置を使用するということを追加して、LCSを使用した。シロイヌナズナゲノムにおける可能性があるフィラーの起源を同定するために、10-4のカットオフE値でBLASTを使用した。
【０１０２】
(実施例2)
相同組換え
実施例1は、T-DNAの安定的なランダム組込みには、機能的なPolθが必要であることを実証する。本実施例は、相同組換えを介する安定的な組込みは機能的なPolθが必要でないことを実証する。
【０１０３】
内在性のシロイヌナズナの座位、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(PPO)と相同の約6kbを含有するT-DNAコンストラクトを調製する。相同領域は2つの点変異を含有し、それらはPPO座位での相同組換えを介する組込みの際に除草剤ブタフェニシルに対する抵抗性を与える(変異の説明について、Hanin等、Plant J 2001を参照)。更に、T-DNAはCas9酵素(シロイヌナズナコドン最適化Cas9-AteCas9 (Fauser等、Plant J 79:348〜359頁(2014))、及びCas9酵素をPPO座位へと誘導するガイドRNAをコードする。Cas9の発現はユビキチンプロモーターによって駆動され、ガイドRNAは、U6(AtU6)プロモーターの制御下にある。
【０１０４】
野生型(Col-0)植物及びPolθの2つのノックアウトアレル(teb-5及びteb-217)をフローラルディップ形質転換によって形質転換する。相同組換えを介するT-DNAの安定的な組込みは、ブタフェニシルに対する抵抗性によって測定する。野生型とPolθ変異の植物との間での部位特異的座位における安定的な組込みのレベルは類似するであろう。
【０１０５】
(実施例3)
線状化プラスミドのトランスフェクション
内在性のシロイヌナズナの座位、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(PPO)と相同の約6Kbを含有するプラスミドを調製する。相同領域は2つの点変異を含有し、それらはPPO座位での相同組換えを介する組込みの際に除草剤ブタフェニシルに対する抵抗性を与える(変異の説明について、Hanin等、Plant J 2001を参照)。更に、プラスミドはCas9酵素(シロイヌナズナコドン最適化Cas9-AteCas9(Fauser等、Plant J 79:348〜359頁(2014))、及びCas9酵素をPPO座位へと誘導するガイドRNAをコードする。Cas9の発現はユビキチンプロモーターの制御下にあり、ガイドRNAは、U6(AtU6)プロモーターの制御下にある。プラスミドはまた、独自の制限部位を含有する。プラスミドは適切な制限部位による消化によって線状化される。
【０１０６】
プロトプラストは、WT及びPolθ欠損植物(teb-5及びteb-2)から調製され、標準的なPEG形質転換プロトコールによって線状化プラスミドをプロトプラストへと軽質転換する。相同組換えを介した安定的な組込み事象について選別するために、コロニーをブタフェニシル含有培地中で維持する。野生型とPolθ変異の植物との間での部位特異的座位における安定的な組込みのレベルは類似するであろう。
【０１０７】
(実施例4)
トマト植物へのトランスフェクション
本実施例は、作物植物、すなわちトマト(Solanum lycopersum)におけるランダム組込みの低減を実証していく。トマト由来のPOLQ遺伝子は、Tebichi配列を用いるBLAST検索に基づいてNCBIデータベースから受託番号XP_010325163として同定された。
【０１０８】
Polθ欠損トマト変異体は、CRISPRを用いてPolθ座位を標的化すること、及び次世代においてホモ接合変異体を作るために自家受粉することによって作製される。手短に、T-DNAコンストラクトは、カナマイシン選別可能なマーカー、Cas9酵素(植物コドン最適化Cas9-pcoCas9(Li等、2013 Nat Biotechnol 31:688〜691頁))、及びCas9酵素をPOLQ座位へと誘導するガイドRNAをコードして調製される。Cas9の発現は35Sプロモーターの制御下にあり、ガイドRNAは、U3(AtU3)プロモーターの制御下にある。トマト子葉外植体は、アグロバクテリウム懸濁液中への浸漬によって形質転換され、カナマイシン抵抗性について選別され、POLQ変異体をスクリーニングする。小植物は、Surveyorアッセイ(Voytas 2013 Annu Rev Plant Biol 64:327〜350頁)を用いてPOLQ変異についてスクリーニングされ、POLQにおける不活性化変異を含有する小植物を、成長させ、かつ自家受粉させて次世代のホモ接合変異体を作製する。
【０１０９】
POLQのランダム組込みへの影響を、野生型トマト植物及びPolθ欠損トマト変異体において実施される腫瘍アッセイを用いて実証する。手短に、アグロバクテリウムを野生型トマト植物及びpolθ欠損トマト植物の茎の穴に挿入する。ランダム組込みを、腫瘍形成を測定することによって測定する。WTトマト植物は、ランダム組込み事象を示す腫瘍を発達させるであろうが、一方でpolθ欠損トマト植物は腫瘍を発達させないであろう。
【０１１０】
(実施例5)
polQ欠損作物植物の作製
1つ又は複数のpolQ遺伝子における変異(例えば1つ又は複数の相同遺伝子において)を有する作物植物、例えばコムギ、ダイズ、コメ、ワタ、トウモロコシ、又はアブラナ属の植物が同定されるか、又は(ランダム)変異導入若しくは標的化ノックアウトを介して(例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、Crispr/Cas9、Crispr/Cpf1等のような配列特異的ヌクレアーゼを用いて)作製される。PolQの発現及び/又は活性における低減は、Q-PCR、ウェスタンブロッティング等によって確認される。
【０１１１】
作物植物、例えば、コムギ、ダイズ、コメ、ワタ、又はアブラナ属の植物を、polQ阻害性核酸分子、又はpolQ結合分子をコードする(例えば、polQヘアピンRNA抗体等をコードし、構成的又は誘導可能なプロモーターに制御下にある)コンストラクトによって形質転換する。PolQの発現及び/又は活性における低減は、Q-PCR、ウェスタンブロッティング等によって確認される。
【０１１２】
(実施例6)
polQ欠損作物植物への選別可能マーカー遺伝子のトランスフェクション
低減したPolQの発現を有する実施例5の植物、及び対応する野生型のpolQの発現を有する植物を、当該技術分野において周知の方法によって、アグロバクテリウムを用いて選別可能なマーカー遺伝子(例えば、bar、gus)で形質転換する。
【０１１３】
形質転換体は、選別可能なマーカー遺伝子の発現についてスクリーニングする。低減したpolQの発現を有する形質転換体は、選別可能なマーカー遺伝子の一過性発現を示し、一方で、野生型のpolQの発現を有する形質転換体は、選別可能なマーカー遺伝子の安定的な発現を示す。
【０１１４】
選別可能なマーカー遺伝子のゲノム組込みは、例えば、野生型の又は低減したpolQの発現を有する形質転換した植物より単離したゲノムDNAのサザンブロッティングを介して評価する。選別可能なマーカー遺伝子の存在は、polQ野生型植物のゲノムDNAにおいて検出できるが、低減したpolQの発現を有する植物は、選別可能なマーカー遺伝子のわずか又は全くないゲノム組込みを示す。
【０１１５】
(実施例7)
polQ欠損作物植物における相同組換えを介した標的化挿入
実施例5のPolQ欠損植物、及び野生型polQの発現を有する対応する植物を、相同組換えを介した標的化組込みのための対象の核酸で形質転換する。対象の核酸は、ゲノムの標的部位におけるゲノムDNAに相同な配列を含む。任意選択で、植物を、相同組換えを増強するために標的部位におけるDNA切断を誘発することができる配列特異的ヌクレアーゼのための発現コンストラクトと共に共形質転換する。植物を、対象の核酸の組込みについて、例えばサザンブロッティング又はPCRによってスクリーニングする。野生型PolQの発現を有する植物は、対象の核酸のランダム挿入、及び標的部位における相同組換えを介した標的化挿入を示す。低減したpolQの発現を有する植物は、わずか又は全くない対象の核酸のランダム挿入を示すが、標的部位における対象の核酸の相同組換えを介する標的化挿入を確かに示す。
【０１１６】
[参考文献]
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2019509053.tif 000004
2019509053.tif 000005
2019509053.tif 000006
2019509053.tif 000007
【図１】
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【図２】
2019509053.tif 000009
【図３】
2019509053.tif 000010
【図４ａ】
2019509053.tif 000011
【図４ｂ】
2019509053.tif 000012
【配列表】
2019509053000001.app
【国際調査報告】
2019509053.tif 000013
2019509053.tif 000014
2019509053.tif 000015