(57)【要約】本明細書で開示される技術の局面は、核酸（例えば、免疫レセプターおよび免疫グロブリンをコードする核酸）を調製および分析する方法に関する。いくつかの実施形態において、（例えば、次世代シーケンシングを使用する）配列分析用の核酸を調製するための方法が、本明細書で提供される。本明細書で提供される方法は、いくつかの実施形態において、免疫レセプターおよび免疫グロブリンをコードする核酸配列の多様な状況を含む免疫レパートリーを表す配列を含め、核酸調製物中で超低頻度核酸バリアント（例えば、スプライスバリアント、融合物、一ヌクレオチドバリアント、挿入および欠失、コピー数バリアント、体細胞組換えされた免疫レセプター遺伝子座に由来するｍＲＮＡ、および発現レベルバリアント）を検出するために有用である。
2019537439.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
（ａ）標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする捕捉部分改変プライマーとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；
（ｂ）ハイブリダイズした捕捉部分改変プライマーによってプライムされかつ該核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応を行う工程；
（ｃ）該第１鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第２鎖合成反応を行って、捕捉部分を含む２本鎖核酸を生成する工程；
（ｄ）アダプター核酸を該２本鎖核酸にライゲーションして、該捕捉部分を含むライゲーション生成物を生成する工程；
（ｅ）該ライゲーション生成物と該捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程；および
（ｆ）該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分を含む標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該捕捉したライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで該標的特異的プライマーは、該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程、
を包含する方法。
【請求項２】
（ｇ）前記標的特異的プライマーの５’テール部分の相補的配列に特異的にアニールする３’部分を含むテールプライマーおよび前記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第２のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｆ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該テールプライマーは、該標的特異的プライマーの相補的配列に特異的にアニールしない５’部分を含む工程、
をさらに包含する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記テールプライマーの５’部分は、サンプルインデックス領域、分子バーコード領域、およびシーケンシングプライマー部位領域のうちの少なくとも１つを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｄ）は、前記アダプター核酸、前記２本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該２本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該２本鎖核酸と合わされた該アダプター核酸は、二重鎖部分およびオーバーハング配列を含み、ここで該オーバーハング配列は、該２本鎖核酸の３’末端におけるオーバーハング配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前述の請求項のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｄ）は、前記アダプター核酸、前記２本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該２本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該２本鎖核酸と合わされた該アダプター核酸は、１本鎖である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記捕捉部分改変プライマーは、少なくとも１つの捕捉部分改変ヌクレオチドを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記捕捉部分改変プライマーは、捕捉部分に付着した第２の化学カップリング基に結合するように構成された第１の化学カップリング基を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記捕捉部分はビオチン部分である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ビオチン部分は、ビオチン−トリエチレングリコール、ビス−ビオチン、光切断性ビオチン、デスチオビオチン、デスチオビオチン−トリエチレングリコール、またはアジ化ビオチンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記結合パートナーは、ストレプトアビジンである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ストレプトアビジンは、基材に付着している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基材は固体表面を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記固体表面は、常磁性ビーズを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｄ）の後でかつ工程（ｅ）の前に洗浄工程をさらに包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｅ）の後でかつ工程（ｆ）の前に：
ｉ）前記捕捉部分を含む前記２本鎖核酸を、常磁性基材上に固定化する工程；および
ｉｉ）該固定化した２本鎖核酸を洗浄する工程、
をさらに包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程ｉｉ）の後に：
ｉｉｉ）前記洗浄した固定化２本鎖核酸を前記常磁性基材から放出する工程、
をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）の後でかつ工程（ｄ）の前に、前記２本鎖核酸を５’リン酸化する工程をさらに包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）の後でかつ工程（ｄ）の前に、前記２本鎖核酸を末端修復して、平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程をさらに包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記平滑末端化した２本鎖核酸の３’末端に１またはこれより多くのヌクレオチドを付加する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１またはこれより多くのヌクレオチドは、デオキシアデノシンヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アダプター核酸は、前記平滑末端化した２本鎖核酸の３’末端に付加した前記１またはこれより多くのヌクレオチドに相補的な１またはこれより多くのヌクレオチドを含む３’末端においてヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記アダプター核酸の３’末端における前記ヌクレオチド配列は、１またはこれより多くのデオキシチミジンヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アダプター核酸は、前記３’末端において前記ヌクレオチド配列を含む増幅鎖にアニールしたブロッキング鎖をさらに含み、該３’末端における該ヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列がオーバーハング配列を形成するように不対化される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
末端修復後に、
ｉ）前記捕捉部分を含む前記２本鎖核酸を、常磁性基材上に固定化する工程；
ｉｉ）該固定化した２本鎖核酸を洗浄する工程；および
ｉｉｉ）該洗浄した固定化２本鎖核酸を該常磁性基材から放出する工程、
をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
末端修復後に、
ｉ）前記捕捉部分を含む前記２本鎖核酸を、常磁性基材上に固定化する工程；および
ｉｉ）該固定化した２本鎖核酸を洗浄する工程、
をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
末端修復の後でかつ工程ｉ）の前に、洗浄工程をさらに包含する、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ｈ）工程（ｇ）の増幅生成物を常磁性基材上に固定化する工程；
（ｉ）該固定化した増幅生成物を洗浄する工程；および
（ｊ）該洗浄した固定化増幅生成物を該常磁性基材から放出する工程、
をさらに包含する、いずれか１項の請求項２〜２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｇ）の後でかつ工程（ｈ）の前に、洗浄工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｄ）において、前記２本鎖核酸は、クラウディング剤の存在下で前記アダプター核酸にライゲーションされる、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｂ）の後でかつ工程（ｃ）の前に、前記核酸分子とリボヌクレアーゼ酵素とを接触させる工程をさらに包含する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２鎖合成反応は、前記前記第１鎖合成反応の生成物にハイブリダイズした前記核酸分子のフラグメントによってプライムされる、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２鎖合成は、複数のランダムプライマーを使用してランダムにプライムされる、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数のランダムプライマーは、６塩基長〜１５塩基長の間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸分子はｍＲＮＡを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸分子は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはこれらの混合物を含むサンプルから得られる、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルは、Ｔ細胞悪性腫瘍またはＢ細胞悪性腫瘍を有するかまたは有すると疑われる被験体から得られる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞悪性腫瘍または前記Ｂ細胞悪性腫瘍は、リンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプルは、移植を受けた被験体または移植を受ける予定の被験体から得られる、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルは、処置に対する免疫応答が評価されている最中である被験体から得られる、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記サンプルは、白血球悪性腫瘍を有するか、または有すると疑われる被験体から得られる、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記被験体はヒトである、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記被験体は脊索動物である、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸分子は、白血球を含むサンプルから得られる、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的ヌクレオチド配列は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）遺伝子またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）遺伝子の一部に相当するヌクレオチド配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記捕捉部分改変プライマーは、免疫レセプター遺伝子または免疫グロブリン遺伝子に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記捕捉部分改変プライマーは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の下流にある定常領域に特異的にアニールする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記標的特異的プライマーは、ＣＤＲ３の下流にある定常領域またはＪセグメントに特異的にアニールする、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的特異的プライマーは、定常領域とＪセグメントとの間に形成されるエキソン−エキソン接合部に特異的にアニールし、ここで該エキソン−エキソン接合部は、ＣＤＲ３の下流にある、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーは同じである、請求項２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーは異なる、請求項２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２のアダプタープライマーは、前記第１のアダプタープライマーに対してネスト化される、請求項２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
（ａ）既知の標的ヌクレオチド配列および未知の標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と、該既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする捕捉部分改変プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；
（ｂ）ハイブリダイズした捕捉部分改変プライマーによってプライムされかつ該核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応を行う工程；
（ｃ）該核酸分子のフラグメントによってプライムされかつ該第１鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第２鎖合成反応を行って、捕捉部分を含む２本鎖核酸を生成する工程；
（ｄ）該２本鎖核酸を末端修復して、該捕捉部分を含む平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程；
（ｅ）アダプター核酸を該平滑末端化した２本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該ライゲーション生成物は、該アダプター核酸および該捕捉部分に隣接した該未知の標的ヌクレオチド配列を含む工程；
（ｆ）該ライゲーション生成物と該捕捉部分の固定化した結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程；
（ｇ）該既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分を含む標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで該標的特異的プライマーは、該既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程；
（ｈ）該標的特異的プライマーの５’テール部分の相補的配列に特異的にアニールするテールプライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第２のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｇ）の増幅生成物を増幅する工程；ならびに
（ｉ）工程（ｈ）の増幅生成物を洗浄する工程、
を包含する方法。
【請求項５３】
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
（ａ）標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；
（ｂ）ハイブリダイズした第１の標的特異的プライマーによってプライムされかつ該核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応を行う工程；
（ｃ）該核酸分子のハイブリダイズしたフラグメントによってプライムされかつ該第１鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第２鎖合成反応を行って、２本鎖核酸を生成する工程；
（ｄ）アダプター核酸を該２本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程；
（ｅ）該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分を含む第２の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで該第２の標的特異的プライマーは、該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程；ならびに
（ｆ）該第２の標的特異的プライマーの５’テール部分の相補的配列に特異的にアニールする３’部分を含むテールプライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第２のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｅ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該テールプライマーは、該第２の標的特異的プライマーの相補的配列に特異的にアニールしない５’部分を含む工程、
を包含する方法。
【請求項５４】
前記第１の標的特異的プライマーは、捕捉部分を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
工程（ｄ）の後でかつ工程（ｅ）の前に、前記ライゲーション生成物と該捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１鎖合成反応は、捕捉部分改変ヌクレオチドの少なくとも１つのタイプを使用して行われ、該第１鎖合成反応の生成物は、少なくとも１つの捕捉部分を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
工程（ｄ）の後でかつ工程（ｅ）の前に、前記ライゲーション生成物と前記少なくとも１つの捕捉部分の固定化された結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
工程（ｃ）の後でかつ工程（ｄ）の前に、前記２本鎖核酸と前記少なくとも１つの捕捉部分の固定化された結合パートナーとを接触させることによって、該２本鎖核酸を捕捉する工程をさらに包含する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
サンプル中の免疫レパートリーを決定する方法であって、該方法は、
（ａ）免疫レセプターおよび免疫グロブリンのうちの少なくとも一方をコードする核酸分子を含むサンプルを得る工程；
（ｂ）該サンプルからの該核酸分子と該核酸分子の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；
（ｃ）ハイブリダイズした第１の標的特異的プライマーによってプライムされかつ該核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応を行う工程；
（ｄ）該第１鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第２鎖合成反応を行って、２本鎖核酸を生成する工程；
（ｅ）アダプター核酸を該２本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程；
（ｆ）該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分を含む第２の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで該第２の標的特異的プライマーは、該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程；
（ｇ）該第２の標的特異的プライマーの５’テール部分の相補的配列に特異的にアニールする３’部分を含むテールプライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第２のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｆ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該テールプライマーは、該第２の標的特異的プライマーの相補的配列に特異的にアニールしない５’部分を含む工程；ならびに
（ｈ）第１のおよび第２のシーケンシングプライマーを使用して、工程（ｇ）の増幅生成物をシーケンシングする工程、
を包含する方法。
【請求項６０】
前記免疫レセプターはＴＣＲを含み、前記免疫グロブリンはＢＣＲを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記標的ヌクレオチド配列は、遺伝的に組み換えた配列に相当する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記サンプルは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはこれらの混合物を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記サンプルは被験体から得られる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記被験体はヒトである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
（ａ）標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーとを、プライマーがハイブリダイズした核酸分子を生成する条件下で接触させる工程；
（ｂ）該プライマーがハイブリダイズした核酸分子と、該核酸分子に相補的である第１鎖へと組み込むための複数のタイプのヌクレオチドとを接触させる工程であって、ここで該複数のタイプのヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、捕捉部分を含む工程；
（ｃ）該プライマーがハイブリダイズした核酸分子の該第１の標的特異的プライマーによってプライムされかつ該プライマーがハイブリダイズした核酸分子の該核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応を行う工程であって、ここで該第１鎖合成反応の生成物は、少なくとも１つの捕捉部分を含む工程；
（ｄ）該核酸分子のフラグメントによってプライムされかつ該第１鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第２鎖合成反応を行って、該少なくとも１つの捕捉部分を含む２本鎖核酸を生成する工程；
（ｅ）アダプター核酸を該２本鎖核酸にライゲーションして、該少なくとも１つの捕捉部分を含むライゲーション生成物を生成する工程；ならびに
（ｆ）該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分を含む第２の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで該第２の標的特異的プライマーは、該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程、
を包含する方法。
【請求項６６】
工程（ｅ）の後でかつ工程（ｆ）の前に、前記ライゲーション生成物と前記捕捉部分の固定化された結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
工程（ｄ）の後でかつ工程（ｅ）の前に、前記２本鎖核酸と前記捕捉部分の固定化された結合パートナーとを接触させることによって、該２本鎖核酸を捕捉する工程をさらに包含する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
（ａ）標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と、ハイブリダイゼーション条件下で該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分および該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む捕捉部分改変プライマーとを、接触させる工程；
（ｂ）ハイブリダイズした捕捉部分改変プライマーによってプライムされかつ該核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応を行う工程；
（ｃ）該第１鎖合成反応の生成物と複数のランダムプライマーとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで該複数のランダムプライマーの各々は、共通配列を含む非ランダム５’テール部分を含む工程；
（ｄ）該複数のランダムプライマーのうちの少なくとも１つによってプライムされかつ該第１鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第２鎖合成反応を行って、該捕捉部分を含む２本鎖核酸を生成する工程；
（ｅ）該２本鎖核酸と該捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、該捕捉部分を含む２本鎖核酸を捕捉する工程；
（ｆ）第１のテールプライマーおよび該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該２本鎖核酸を増幅する工程であって、ここで該第１のテールプライマーは、該共通配列の相補体に特異的にアニールする３’部分および該共通配列の相補体に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程；ならびに
（ｇ）第２の標的特異的プライマーおよび該第１のテールプライマーの５’テール部分の相補体に特異的にアニールする第２のテールプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｆ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該第２の標的特異的プライマーは、該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分および該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１６年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６２／４１６，６７７号の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張し、この出願は、その全体が参照によって本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本明細書で記載される技術は、分析用の核酸分子の調製において有用な方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
適応免疫系は、非常に専門化された全身の細胞および病原体増殖を排除または防止することを目的としたプロセスから構成される。Ｔ細胞およびＢ細胞は、それらの抗原レセプター遺伝子座の遺伝的組換えおよび体細胞変異を通じて抗原結合分子の広い多様性を生成することによって適応免疫応答を駆動する適応免疫系の主な細胞構成成分と見做され得る。未成熟Ｔ細胞およびＢ細胞は、選択的プロセスを受けて、主として自己反応性を欠く集団を生じる。抗原結合分子（例えば、Ｔ細胞レセプターおよび免疫グロブリン）のこの最初のレパートリーを用意して、ナイーブＴ細胞およびＢ細胞は、身体全体を循環し、そこでそれら細胞は、抗原と接触した状態になり得る。
【０００４】
コグネート抗原への曝露の際に、および十分な共刺激シグナルとともに、抗原特異的Ｔ細胞またはＢ細胞は、活性化されて増殖し、Ｂ細胞の場合には、それらの免疫レセプター遺伝子座のさらなる配列編集を（例えば、体細胞超変異および／またはさらなる組換えを通じて）受け得る。
【０００５】
これらの選択的プロセスの結果として、個々のサンプル中の結合特異性のレパートリーは、過去の抗原曝露の履歴を提供し得、同様に、固有のレパートリー能力および制限の情報を与える。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本明細書で開示される技術の局面は、核酸を調製および分析するための方法に関する。本明細書で提供される方法は、いくつかの実施形態において、免疫レセプターおよび免疫グロブリンをコードする核酸配列の多様な状況を含む免疫レパートリーを表す配列を含め、核酸調製物中で超低頻度核酸バリアント（例えば、スプライスバリアント、融合物、一ヌクレオチドバリアント、挿入および欠失、コピー数バリアント、体細胞組換えされた免疫レセプター遺伝子座に由来するｍＲＮＡ、および発現レベルバリアント）を検出するために有用である。本明細書で提供される方法は、いくつかの実施形態において、以前に起こっている組換えおよび／またはスプライシング事象を反映する転写された核酸に相当するヌクレオチド配列を有する核酸分子を富化するライゲーションベースの捕捉を包含する。いくつかの実施形態において、特有の分子捕捉は、個体（例えば、腫瘍を有する個体または免疫が障害された個体）から抽出された核酸に関する従来の方法を超えて非常に改善している。いくつかの実施形態において、捕捉効率は、個体（例えば、腫瘍を有する個体または免疫が障害された個体）から抽出された核酸に関する従来の方法と比較して少なくとも倍加される。いくつかの実施形態において、改善された深度は、改善されたフロントエンド捕捉化学現象の結果として達成される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、シーケンシングを介してＲＮＡ免疫レパートリーを評価するために有用である。いくつかの実施形態において、（例えば、次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を使用する）配列分析用の核酸サンプルの調製において有用な方法および組成物は、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される技術は、核酸配列を決定する方法に関する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法および組成物は、シーケンシング前に１またはこれより多くの標的ヌクレオチド配列を含む核酸を富化することに関する。いくつかの局面において、本開示は、第１の核酸鎖を合成するために捕捉部分改変プライマーの使用を包含するか、または１またはこれより多くの捕捉部分改変ヌクレオチドを核酸に付加する工程を包含する、核酸を（例えば、シーケンシング分析において使用するために）調製するための方法を提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、上記方法は、アダプター核酸を上記核酸にライゲーションする工程をさらに包含し、上記核酸に対して、上記捕捉部分改変プライマーが、ライゲーション生成物を生成するために上記核酸の第１鎖を合成するにあたって使用されている。いくつかの実施形態において、上記方法は、アダプター核酸を、上記捕捉部分改変ヌクレオチドが付加された核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ライゲーション生成物と上記捕捉部分改変プライマーの捕捉部分の結合パートナーまたは上記捕捉部分改変ヌクレオチドの捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、上記ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本開示は、分析用の核酸を調製する方法であって、上記方法は、（ａ）標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする捕捉部分改変プライマーとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイズした捕捉部分改変プライマーによってプライムされかつ上記核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応を行う工程；（ｃ）上記第１鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第２鎖合成反応を行って、捕捉部分を含む２本鎖核酸を生成する工程；（ｄ）アダプター核酸を上記２本鎖核酸にライゲーションして、上記捕捉部分を含むライゲーション生成物を生成する工程；（ｅ）上記ライゲーション生成物と上記捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、上記ライゲーション生成物を捕捉する工程；および（ｆ）上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分を含む標的特異的プライマーおよび上記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、上記捕捉したライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで上記標的特異的プライマーは、上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程、を包含する方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、（ｇ）上記標的特異的プライマーの５’テール部分の相補的配列に特異的にアニールする３’部分を含むテールプライマーおよび上記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第２のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｆ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで上記テールプライマーは、上記標的特異的プライマーの相補的配列に特異的にアニールしない５’部分を含む工程、をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記テールプライマーの５’部分は、サンプルインデックス領域、ＰＣＲプライマー結合領域、分子バーコード領域、およびシーケンシングプライマー部位領域のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、上記第１のアダプタープライマーおよび上記第２のアダプタープライマーは同じである。例えば、いくつかの実施形態において、上記第１のおよび第２のアダプタープライマーは、同じヌクレオチド配列からなる。いくつかの実施形態において、上記第１のアダプタープライマーおよび上記第２のアダプタープライマーは異なる（例えば、異なるヌクレオチド配列からなる、および／または１またはこれより多くの異なる部分を含む）。いくつかの実施形態において、上記第２のアダプタープライマーは、上記第１のアダプタープライマーに対してネスト化される。いくつかの実施形態において、上記第２のアダプタープライマーは、上記第１のアダプタープライマーに対してネスト化されない。
【００１１】
いくつかの実施形態において、工程（ｄ）は、上記アダプター核酸、上記２本鎖核酸、およびリガーゼを、上記リガーゼが上記アダプター核酸を上記２本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで上記２本鎖核酸と合わされた上記アダプター核酸は、二重鎖部分およびオーバーハング配列を含み、ここで上記オーバーハング配列は、上記２本鎖核酸の３’末端におけるオーバーハング配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、上記アダプター核酸は、サンプルインデックス領域、ＰＣＲプライマー結合領域、分子バーコード領域（例えば、入力分子を特有に同定する領域）、およびシーケンシングプライマー部位領域のうちの少なくとも１つを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、工程（ｄ）は、上記アダプター核酸、上記２本鎖核酸、およびリガーゼを、上記リガーゼが上記アダプター核酸を上記２本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで上記２本鎖核酸と合わされた上記アダプター核酸は、１本鎖である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、上記捕捉部分改変プライマーは、少なくとも１つの捕捉部分改変ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、上記捕捉部分改変プライマーは、捕捉部分に付着した第２の化学カップリング基に結合するように構成された第１の化学カップリング基を含む。いくつかの実施形態において、上記捕捉部分はビオチン部分である。いくつかの実施形態において、上記ビオチン部分は、ビオチン−トリエチレングリコール、ビス−ビオチン、光切断性ビオチン、デスチオビオチン、デスチオビオチン−トリエチレングリコール、またはアジ化ビオチンを含む。いくつかの実施形態において、上記補足部分の上記結合パートナーは、ストレプトアビジンである。いくつかの実施形態において、上記ストレプトアビジンは、基材に付着している。いくつかの実施形態において、上記基材は固体表面を含む。いくつかの実施形態において、上記固体表面は、常磁性ビーズを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、上記捕捉したライゲーション生成物を上記捕捉部分の結合パートナーから放出する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記捕捉されたライゲーション生成物は、化学的試薬と接触させることおよび／または熱を適用することによって、上記捕捉部分の結合パートナーから放出される。いくつかの実施形態において、上記化学的試薬は、塩基または塩基性溶液である。いくつかの実施形態において、上記化学的試薬は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含む。いくつかの実施形態において、接触させることが、２種の溶液（例えば、塩基を含む溶液および洗浄した固定化核酸を含む溶液）を混合する工程、固体を溶液に添加する工程、または溶液を固体に添加する工程を包含し得ることは、認識されるべきである。いくつかの実施形態において、上記捕捉したライゲーション生成物は、ＮａＯＨと接触させることおよび加熱すること（例えば、室温より高く（例えば、２５〜９０℃、２５〜７０℃、２５〜５０℃、３５〜６５℃、３５〜４５℃、３０〜４０℃、４０〜５０℃の範囲の温度）加熱すること）によって、上記捕捉部分の結合パートナーから放出される。いくつかの実施形態において、上記捕捉したライゲーション生成物は、上記捕捉部分の結合パートナーに、例えば、分析用のさらなる調製のために結合したままである。いくつかの実施形態において、上記捕捉したライゲーション生成物は、分析用のさらなる調製の前に、上記捕捉部分の結合パートナーから放出される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、工程（ｄ）の後でかつ工程（ｅ）の前に洗浄工程をさらに包含する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、工程（ｅ）の後でかつ工程（ｆ）の前に：  ｉ）上記捕捉部分を含む上記２本鎖核酸を常磁性基材上に固定化する工程；およびｉｉ）その固定化した２本鎖核酸を洗浄する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、工程ｉｉ）の後に：  ｉｉｉ）上記洗浄した固定化２本鎖核酸を上記常磁性基材から放出する工程をさらに包含する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、工程（ｃ）の後でかつ工程（ｄ）の前に、上記２本鎖核酸を５’リン酸化する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、５’リン酸化する工程は、上記２本鎖核酸の鎖の５’末端においてホスフェート基を生成する工程を包含する。例えば、いくつかの実施形態において、ホスフェート基は、上記鎖の５’末端において（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼの作用を介して）ヒドロキシル基に付加され得る。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、工程（ｃ）の後でかつ工程（ｄ）の前に、上記２本鎖核酸を末端修復して、平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、末端修復は、平滑末端化を含む。いくつかの実施形態において、平滑末端化は、末端の不対ヌクレオチド（例えば、オーバーハング配列）を、上記２本鎖核酸の鎖から除去することによって達成される。例えば、いくつかの実施形態において、末端の不対ヌクレオチドは、２本鎖核酸の鎖から、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（例えば、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）を使用する（例えば、末端ホスホジエステル結合を加水分解し、それによって、上記オーバーハングの１塩基を一度に除去するために）ことによって除去され得る。いくつかの実施形態において、平滑末端化は、ヌクレオチド三リン酸の存在下で、重合酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）で凹んだ末端を埋めることによって達成される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、上記平滑末端化した２本鎖核酸の３’末端に１またはこれより多くのヌクレオチドを付加する（例えば、ライゲーティングする、テイリングする（tailing））工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記１またはこれより多くのヌクレオチドは、デオキシアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態において、上記方法は、上記２本鎖核酸の３’末端を、（例えば、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを使用して）ｄＡテール付加する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記アダプター核酸は、上記平滑末端化した２本鎖核酸の３’末端に付加した上記１またはこれより多くのヌクレオチドに相補的な１またはこれより多くのヌクレオチドを含む３’末端においてヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、上記アダプター核酸の３’末端における上記ヌクレオチド配列は、１またはこれより多くのデオキシチミジンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、上記アダプター核酸は、上記３’末端において上記ヌクレオチド配列を含む増幅鎖にアニールしたブロッキング鎖をさらに含み、上記３’末端における上記ヌクレオチド配列は、上記ヌクレオチド配列がオーバーハング配列を形成するように不対化される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上記方法は、末端修復の後に：ｉ）上記捕捉部分を含む上記２本鎖核酸を常磁性基材上に固定化する工程；ｉｉ）上記固定化した２本鎖核酸を洗浄する工程；およびｉｉｉ）上記洗浄した固定化２本鎖核酸を上記常磁性基材から放出する工程をさらに包含する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、上記方法は、末端修復の後に：ｉ）上記捕捉部分を含む上記２本鎖核酸を常磁性基材上に固定化する工程；およびｉｉ）上記固定化した２本鎖核酸を洗浄する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、末端修復の後でかつ工程ｉ）の前に、洗浄工程をさらに包含する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、（ｈ）工程（ｇ）の増幅生成物を常磁性基材上に固定化する工程；（ｉ）上記固定化した増幅生成物を洗浄する工程；および（ｊ）上記洗浄した固定化増幅生成物を上記常磁性基材から放出する工程、をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、工程（ｇ）の後でかつ工程（ｈ）の前に、洗浄工程をさらに包含する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、工程（ｄ）では、上記２本鎖核酸は、クラウディング剤の存在下で、上記アダプター核酸にライゲーションされる。いくつかの実施形態において、上記クラウディング剤は、ライゲーション混合物のうちの５％〜５０％を表す量のポリエチレングリコールである。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、工程（ｂ）の後でかつ工程（ｃ）の前に、上記核酸分子とリボヌクレアーゼ酵素とを接触させる工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記リボヌクレアーゼ酵素は、フラグメントが上記第１鎖合成反応の生成物にアニールしたままであるように、上記核酸分子の一部を分解する。いくつかの実施形態において、上記第２鎖合成反応は、上記第１鎖合成反応の生成物にハイブリダイズした上記核酸分子のフラグメントによってプライムされる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、上記第２鎖合成は、複数のランダムプライマーを使用してランダムにプライムされる。いくつかの実施形態において、上記複数のランダムプライマーは、６塩基長〜１５塩基長の間である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記核酸分子は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、上記核酸分子は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはこれらの混合物を含むサンプルから得られる。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、１もしくはこれより多くのＴ細胞、１もしくはこれより多くのＢ細胞、またはこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、Ｔ細胞およびＢ細胞の混合物を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞およびＢ細胞の上記混合物は、１またはこれより多くの非血球タイプをさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞およびＢ細胞の上記混合物は、白血球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、組織球、樹状細胞、マスト細胞、ミクログリアなど）のうちの１またはこれより多くのタイプをさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上記サンプルは、Ｔ細胞悪性腫瘍もしくはＢ細胞悪性腫瘍を有するか、または有すると疑われる被験体から得られる。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、リンパ腫または白血病（例えば、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ性白血病）を有するか、または有すると疑われる被験体から得られる。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、固形腫瘍（例えば、肉腫、癌腫、リンパ腫、または非悪性免疫細胞を含んでいても含んでいなくてもよい非リンパ系起源の任意の腫瘍）を有するか、または有すると疑われる被験体から得られる。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、移植を受けた被験体または移植を受ける予定の被験体から得られる。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、処置に対する免疫応答が評価されている最中である被験体から得られる。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、白血球悪性腫瘍を有するか、または有すると疑われる被験体から得られる。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、自己免疫状態を有するか、または有すると疑われる被験体から得られる。例えば、いくつかの実施形態において、上記免疫状態は、自己反応性Ｔ細胞、自己反応性Ｂ細胞、またはこれらの組み合わせによって駆動される任意の状態である。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、Ｔ細胞悪性腫瘍および／またはＢ細胞悪性腫瘍（例えば、リンパ腫およびそのサブタイプ、多発性骨髄腫など）を有するか、または有すると疑われる被験体から得られる。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、固形腫瘍を有する被験体から得られる。いくつかの実施形態において、上記被験体はヒトである。いくつかの実施形態において、上記被験体は脊索動物である。いくつかの実施形態において、上記核酸分子は、白血球を含むサンプルから得られる。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）遺伝子またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）遺伝子の一部に相当するヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、上記捕捉部分改変プライマーは、免疫レセプター遺伝子または免疫グロブリン遺伝子に相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、上記捕捉部分改変プライマーは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の下流にある定常領域に特異的にアニールする。いくつかの実施形態において、上記標的特異的プライマーは、ＣＤＲ３の下流にある定常領域またはＪセグメントに特異的にアニールする。いくつかの実施形態において、上記標的特異的プライマーは、定常領域とＪセグメントとの間に形成されるエキソン−エキソン接合部に特異的にアニールし、ここで上記エキソン−エキソン接合部は、ＣＤＲ３の下流にある。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本開示は、分析用の核酸を調製する方法であって、上記方法は、（ａ）既知の標的ヌクレオチド配列および未知の標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と、上記既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする捕捉部分改変プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイズした捕捉部分改変プライマーによってプライムされかつ上記核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応を行う工程；（ｃ）上記核酸分子のフラグメントによってプライムされかつ上記第１鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第２鎖合成反応を行って、捕捉部分を含む２本鎖核酸を生成する工程；（ｄ）上記２本鎖核酸を末端修復して、上記捕捉部分を含む平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程；（ｅ）アダプター核酸を上記平滑末端化した２本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで上記ライゲーション生成物は、上記アダプター核酸および上記捕捉部分に隣接した上記未知の標的ヌクレオチド配列を含む工程；（ｆ）上記ライゲーション生成物と上記捕捉部分の固定化した結合パートナーとを接触させることによって、上記ライゲーション生成物を捕捉する工程；（ｇ）上記既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分を含む標的特異的プライマーおよび上記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、上記ライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで上記標的特異的プライマーは、上記既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程；ならびに（ｈ）上記標的特異的プライマーの５’テール部分の相補的配列に特異的にアニールするテールプライマーおよび上記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第２のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｇ）の増幅生成物を増幅する工程、を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、工程（ｅ）の後でかつ工程（ｆ）の前に、上記ライゲーション生成物を洗浄する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、工程（ｆ）の後でかつ工程（ｇ）の前に、捕捉したライゲーション生成物を洗浄する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、（ｉ）工程（ｈ）の増幅生成物を洗浄する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｃ）の第２鎖合成反応は、上記核酸分子を含むサンプルに存在する任意の核酸フラグメントによってプライムされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、上記サンプルは、相補鎖から解離し上記混合物内に存在する異なる鎖に再度アニールし得る核酸の複雑な混合物を含む。
【００３０】
いくつかの局面において、本開示は、分析用の核酸を調製する方法であって、上記方法は、（ａ）標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイズした第１の標的特異的プライマーによってプライムされかつ上記核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応を行う工程；（ｃ）上記核酸分子のハイブリダイズしたフラグメント（例えば、ハイブリダイズした一部またはハイブリダイズした一部分）によってプライムされかつ上記第１鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第２鎖合成反応を行って、２本鎖核酸を生成する工程；（ｄ）アダプター核酸を上記２本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程；（ｅ）上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分を含む第２の標的特異的プライマーおよび上記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、上記ライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで上記第２の標的特異的プライマーは、上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程；ならびに（ｆ）上記第２の標的特異的プライマーの５’テール部分の相補的配列に特異的にアニールする３’部分を含むテールプライマーおよび上記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第２のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｅ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで上記テールプライマーは、上記第２の標的特異的プライマーの相補的配列に特異的にアニールしない５’部分を含む工程、を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、工程（ｃ）の第２鎖合成反応は、上記核酸分子を含むサンプルに存在する任意の核酸フラグメントによってプライムされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、上記サンプルは、相補鎖から解離し上記混合物内に存在する異なる鎖に再度アニールし得る核酸の複雑な混合物を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上記第１の標的特異的プライマーは、捕捉部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、工程（ｄ）の後でかつ工程（ｅ）の前に、上記ライゲーション生成物と上記捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、上記ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、上記第１鎖合成反応は、捕捉部分改変ヌクレオチドの少なくとも１つのタイプを使用して行われ、上記第１鎖合成反応の生成物は、少なくとも１つの捕捉部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、工程（ｄ）の後でかつ工程（ｅ）の前に、上記ライゲーション生成物と上記少なくとも１つの捕捉部分の固定化された結合パートナーとを接触させることによって、上記ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、工程（ｃ）の後でかつ工程（ｄ）の前に、上記２本鎖核酸と上記少なくとも１つの捕捉部分の固定化された結合パートナーとを接触させることによって、上記２本鎖核酸を捕捉する工程をさらに包含する。
【００３４】
いくつかの局面において、本開示は、サンプル中の免疫レパートリーを決定する方法であって、上記方法は、（ａ）免疫レセプターおよび免疫グロブリンのうちの少なくとも一方をコードする核酸分子を含むサンプルを得る工程；（ｂ）上記サンプルからの上記核酸分子と上記核酸分子の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーとをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；（ｃ）ハイブリダイズした第１の標的特異的プライマーによってプライムされかつ上記核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応を行う工程；（ｄ）上記第１鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第２鎖合成反応を行って、２本鎖核酸を生成する工程；（ｅ）アダプター核酸を上記２本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程；ならびに（ｆ）上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分を含む第２の標的特異的プライマーおよび上記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、上記ライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで上記第２の標的特異的プライマーは、上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程；（ｇ）上記第２の標的特異的プライマーの５’テール部分の相補的配列に特異的にアニールする３’部分を含むテールプライマーおよび上記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第２のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｆ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで上記テールプライマーは、上記第２の標的特異的プライマーの相補的配列に特異的にアニールしない５’部分を含む工程；ならびに（ｈ）第１のおよび第２のシーケンシングプライマーを使用して、工程（ｇ）の増幅生成物をシーケンシングする工程、を包含する方法を提供する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、上記免疫レセプターは、ＴＣＲを含む。いくつかの実施形態において、上記免疫グロブリンは、ＢＣＲを含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、遺伝的に組換えられた配列に相当する。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、ＴＣＲ遺伝子座（例えば、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、またはＴＣＲＤ）のうちの少なくとも１つに相当する。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、ＢＣＲ遺伝子座（例えば、ＩＧＨ、ＩＧＫ、またはＩＧＬ）のうちの少なくとも１つに相当する。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、被験体から得られる。いくつかの実施形態において、上記被験体はヒトである。いくつかの実施形態において、上記被験体は齧歯類である。例えば、いくつかの実施形態において、上記被験体は、マウス、ラット、アレチネズミ、ハムスター、モルモット、チンチラ、リス、またはいずれかのこのような齧歯類のヒト化形態（例えば、ヒトＴＣＲおよび／またはヒトＢＣＲを発現する齧歯類）である。
【００３６】
いくつかの局面において、本開示は、分析用の核酸を調製する方法であって、上記方法は、（ａ）標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーとを、プライマーがハイブリダイズした核酸分子を生成する条件下で接触させる工程；（ｂ）上記プライマーがハイブリダイズした核酸分子と、上記核酸分子に相補的である第１鎖へと組み込むための複数のタイプのヌクレオチドとを接触させる工程であって、ここで上記複数のタイプのヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、捕捉部分を含む工程；（ｃ）上記プライマーがハイブリダイズした核酸分子の上記第１の標的特異的プライマーによってプライムされかつ上記プライマーがハイブリダイズした核酸分子の上記核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応を行う工程であって、ここで上記第１鎖合成反応の生成物は、少なくとも１つの捕捉部分を含む工程；（ｄ）上記核酸分子のフラグメントによってプライムされかつ上記第１鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第２鎖合成反応を行って、上記少なくとも１つの捕捉部分を含む２本鎖核酸を生成する工程；（ｅ）アダプター核酸を上記２本鎖核酸にライゲーションして、上記少なくとも１つの捕捉部分を含むライゲーション生成物を生成する工程；ならびに（ｆ）上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分を含む第２の標的特異的プライマーおよび上記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、上記ライゲーション生成物を増幅する工程であって、ここで上記第２の標的特異的プライマーは、上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程、を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、工程（ｄ）の第２鎖合成反応は、上記核酸分子を含むサンプルに存在する任意の核酸フラグメントによってプライムされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、上記サンプルは、相補鎖から解離し上記混合物内に存在する異なる鎖に再度アニールし得る核酸の複雑な混合物を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、工程（ｅ）の後でかつ工程（ｆ）の前に、上記ライゲーション生成物と上記捕捉部分の固定化された結合パートナーとを接触させることによって、上記ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、工程（ｄ）の後でかつ工程（ｅ）の前に、上記２本鎖核酸と上記捕捉部分の固定化された結合パートナーとを接触させることによって、上記２本鎖核酸を捕捉する工程をさらに包含する。
【００３９】
いくつかの局面において、本開示は、分析用の核酸を調製する方法であって、上記方法は、（ａ）標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と、ハイブリダイゼーション条件下で上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分および上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む捕捉部分改変プライマーとを、接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイズした捕捉部分改変プライマーによってプライムされかつ上記核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応を行う工程；（ｃ）上記第１鎖合成反応の生成物と複数のランダムプライマーとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで上記複数のランダムプライマーの各々は、共通配列を含む非ランダム５’テール部分を含む工程；（ｄ）上記複数のランダムプライマーのうちの少なくとも１つによってプライムされかつ上記第１鎖合成反応の生成物をテンプレートとして使用する第２鎖合成反応を行って、上記捕捉部分を含む２本鎖核酸を生成する工程；（ｅ）上記２本鎖核酸と上記捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、上記捕捉部分を含む２本鎖核酸を捕捉する工程；（ｆ）第１のテールプライマーおよび上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、上記２本鎖核酸を増幅する工程であって、ここで上記第１のテールプライマーは、上記共通配列の相補体に特異的にアニールする３’部分および上記共通配列の相補体に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程；ならびに（ｇ）第２の標的特異的プライマー  上記第１のテールプライマーの５’テール部分の相補体に特異的にアニールする第２のテールプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｆ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで上記第２の標的特異的プライマーは、上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分および上記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む工程、を包含する方法を提供する。
【００４０】
本開示の他の利点および新規な特徴は、添付の図面とともに考慮される場合に、本発明の種々の非限定的実施形態の以下の詳細な説明から明らかになる。本明細書および参考として援用される文献が矛盾するおよび／または一致しない開示を含む場合には、本明細書が優先するものとする。
【００４１】
本発明の非限定的実施形態は、添付の図面を参照して例示によって記載される。図面は、模式図であり、一定の縮尺で描かれることは意図されない。明瞭にする目的で、あらゆる構成要素があらゆる図においても表示されているわけではなく、当業者に本発明を理解させるために図示が必要でない場合には、本発明の各実施形態のあらゆる構成要素が示されるわけではない。図面において：
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、捕捉部分改変プライマーを使用して分析用の核酸分子を調製するためのストラテジーの図示である。
【００４３】
【図２】図２は、捕捉部分改変ヌクレオチドを使用して分析用の核酸分子を調製するためのストラテジーの図示である。
【００４４】
【図３】図３は、捕捉部分改変プライマーまたは捕捉部分改変ヌクレオチドのいずれかを使用する核酸調製ストラテジーの比較を図示する。
【００４５】
【図４】図４は、投入量に関して複製物間のクローン型重複を示す図である。全サンプルの共通部分（ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ）は、６６の重複するクローン型を生じる。
【００４６】
【図５】図５は、複製サンプルのペアワイズ分析がそのアッセイの高度に再現性のある性質を示すことを図示するチャートである。
【００４７】
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、全クローン間の比較（図６Ａ）および重複するクローン間の比較（図６Ｂ）を示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、全クローン間の比較（図６Ａ）および重複するクローン間の比較（図６Ｂ）を示す。
【００４８】
【図７】図７は、投入量が観察の複雑性および多様性を決めることを図示し、サンプルサイズに関する多様性は上に示され、Ｓｈａｎｎｏｎ多様度指数を示すチャートは、下に示される。
【００４９】
【図８】図８は、高度に再現性のあるかつ定量的なクローン追跡を示すグラフである。
【００５０】
【図９】図９は、希釈にわたるクローン追跡が独立した実験間で高度に再現性があることを図示する。
【００５１】
【図１０】図１０は、Ｊｕｒｋａｔサンプル希釈シリーズを使用する実験内再現性を示すグラフである。
【００５２】
【図１１】図１１は、Ｊｕｒｋａｔサンプル希釈シリーズを使用する実験間再現性を示すグラフである。
【００５３】
【図１２】図１２は、概してＴ細胞レセプタープライマー位置を示す模式図（縮尺どおりに示されていない）である。
【００５４】
【図１３】図１３は、概して免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）プライマー位置を示す模式図（縮尺どおりに示されていない）である。
【００５５】
【図１４】図１４は、逆転写酵素（ＲＴ）プライマーの構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
詳細な説明
とりわけ、本開示は、免疫レパートリー分析用の核酸ライブラリーの調製に関する改善された技術を提供する。本明細書で記載されるように、既知の標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）は、標的特異的プライマーと接触され、その核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成反応において伸長される。いくつかの実施形態において、その第１鎖合成反応は、その第１鎖合成反応の生成物が捕捉部分を含むように行われ得、その捕捉部分の結合パートナーは、その生成物を捕捉する（例えば、単離する）ために使用され得る。よって、本開示の局面は、その標的核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）を含む初期投入物に相補的である第１鎖合成の生成物を富化するために有用な技術を提供する。
【００５７】
いくつかの局面において、本開示は、ライブラリー調製の間に標的核酸分子（例えば、ＲＮＡ）から合成される第１鎖への捕捉部分の組み込みが、標的ヌクレオチド配列を含む核酸を富化する間に非標的核酸の存在を最小限にするという認識に関する。このことは、免疫レパートリーシーケンシング用の核酸ライブラリーを調製する場合に、特に有利であり得る。例えば、ＴＣＲおよびＢＣＲゲノム配列は全ての細胞に存在するが、そのＴＣＲおよびＢＣＲ  ｍＲＮＡは、それぞれ、Ｔ細胞およびＢ細胞において発現されるに過ぎない。免疫レパートリーの評価は、システムに存在する配列状況を評価するために処理（例えば、組換え、スプライシングなど）した後に、これらの遺伝子を分析することに依拠する。よって、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される技術は、組み換えられた免疫遺伝子座から発現されるｍＲＮＡの選択的捕捉を可能にする。例えば、本明細書で記載されるように、第１鎖が標的核酸から直接合成される場合、その捕捉部分は、非標的核酸持ち越しを最小限にしながら所望の生成物の富化を可能にする。
【００５８】
いくつかの局面において、本開示は、分析用の核酸を調製するための方法を提供し、上記方法は、捕捉部分改変プライマーおよびテンプレートとしての標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子を使用する第１の核酸鎖を合成する工程、アダプター核酸をその第１の核酸鎖にライゲーションする工程、ならびにそのアダプターがライゲーションされた第１の核酸鎖をその捕捉部分の結合パートナーで捕捉する工程を包含する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、その捕捉部分改変プライマーは、ビオチン部分改変プライマーである。この方法の説明は、図１に示され、これは、ビオチン部分改変プライマーを包含する方法の非限定的な例を提供する。この実施形態において、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）は、ビオチン部分を含むように改変されたＤＮＡプライマーとアニールされる。そのビオチン部分改変プライマーは、第１鎖合成反応において伸長されて、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを生成する。そのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのうちのＲＮＡは、リボヌクレアーゼの作用を介して分解に供され、そのＤＮＡにアニールしたままであるＲＮＡフラグメントは、２本鎖ｃＤＮＡを生成するために第２鎖合成反応においてプライマーとして働く。いくつかの実施形態において、その第２鎖合成反応は、その核酸分子を含むサンプルに存在する任意の核酸フラグメントによってプライムされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、そのサンプルは、相補鎖から解離しその混合物内に存在する異なる鎖に再度アニールし得る核酸の複雑な混合物を含む。その２本鎖ｃＤＮＡは、ライゲーション反応に適した３’オーバーハングを生成するために、末端修復およびｄＡテール付加に供される。アダプター核酸をその２本鎖ｃＤＮＡへとライゲーションした後、これらのライブラリー分子は、ストレプトアビジン被覆基材（例えば、常磁性基材）を使用してライゲーションされていないアダプターから捕捉されるか、または単離される。
【００６０】
いくつかの実施形態において、その捕捉後に、その基材に固定化した、捕捉されたアダプターがライゲーションされた２本鎖ｃＤＮＡの第１のＰＣＲ増幅ラウンドが行われる。さらに他の実施形態において、その捕捉した、アダプターがライゲーションされた２本鎖ｃＤＮＡは、第１のＰＣＲラウンドの前に、その常磁性基材から溶離される。常磁性基材からの捕捉した、アダプターがライゲーションされた核酸の溶離は、例示であって限定ではないが、化学的試薬および／または加熱を使用して行われ得る。いくつかの実施形態において、その化学的試薬は、塩基（例えば、ＮａＯＨ）である。いくつかの実施形態において、捕捉した、アダプターがライゲーションされた２本鎖ｃＤＮＡは、低濃度（例えば、１Ｍ未満、０．５Ｍ未満、０．１Ｍ未満、０．０５Ｍ未満、０．０１Ｍ未満、０．００１Ｍ未満、０．０００１Ｍ未満）のＮａＯＨで溶離される。いくつかの実施形態において、捕捉した、アダプターがライゲーションされた２本鎖ｃＤＮＡは、低濃度のＮａＯＨおよび加熱で溶離される。
【００６１】
その固定化したかまたは溶離した、アダプターがライゲーションされた２本鎖ｃＤＮＡは、そのアダプターの相補体にアニールする第１のアダプタープライマーおよび標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズしかつ共通配列を含むハイブリダイズしないテール領域を有する標的特異的プライマーを使用する第１のＰＣＲ増幅ラウンドに供される。このようにして、その第１のアダプタープライマーは、その標的特異的プライマーによって生成される鎖をプライムオフする。第２のＰＣＲ増幅ラウンドは、その共通配列の相補体にアニールするテールプライマーおよびそのアダプターの相補体にアニールする第２のアダプタープライマーを使用して行われる。示されるように、そのテールプライマーは、インデックス１バーコードプライマーを含む。いくつかの実施形態において、そのテールプライマーは、インデックス２バーコードプライマーを含み得。いくつかの実施形態において、そのアダプター核酸は、インデックス１プライマーを含み、そのテールプライマーは、インデックス２プライマーを含む。
【００６２】
いくつかの局面において、本開示は、分析用の核酸を調製するための方法を提供し、上記方法は、プライマーがハイブリダイズした標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子と、新たに合成された鎖への組み込みのための捕捉部分改変ヌクレオチドとを接触させる工程、その混合物を伸長条件に供して、少なくとも１つの捕捉部分改変ヌクレオチドを含む第１の核酸鎖を合成する工程、アダプター核酸をその第１の核酸鎖にライゲーションする工程、ならびにそのアダプターがライゲーションされた第１の核酸鎖をその捕捉部分の結合パートナーで捕捉する工程。
【００６３】
いくつかの実施形態において、その捕捉部分改変ヌクレオチドの捕捉部分は、ビオチン部分である。例えば、図２は、ビオチン改変ヌクレオチドの使用を包含する方法の非限定的実施形態を示す。この実施形態において、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＤＮＡプライマーとアニールされる。第１鎖合成反応は、ビオチン化ヌクレオチドを使用して行われて、ビオチン化ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを生成する。そのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのうちのＲＮＡは、リボヌクレアーゼの作用を介して分解に供され、そのＤＮＡにアニールしたままであるＲＮＡフラグメントは、第２鎖合成反応においてプライマーとして働いて、２本鎖ｃＤＮＡを生成する。いくつかの実施形態において、その第２鎖合成反応は、その核酸分子を含むサンプルに存在する任意の核酸フラグメントによってプライムされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、そのサンプルは、相補鎖から解離しその混合物内に存在する異なる鎖に再度アニールし得る核酸の複雑な混合物を含む。その２本鎖ｃＤＮＡは、ライゲーション反応に適した３’オーバーハングを生成するために、末端修復およびｄＡテール付加に供される。アダプター核酸をその２本鎖ｃＤＮＡにライゲーションした後に、これらのライブラリー分子は、ライゲーションしていないアダプターから、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズを使用して捕捉されるかまたは単離される。
【００６４】
前述において記載されるように、本開示の局面は、調製プロセスの間に生成される核酸生成物を捕捉するために捕捉部分の使用を包含し得る、分析用の核酸分子を調製するための技術を提供する。図３は、捕捉部分を使用する核酸調製のための異なるストラテジーを比較する図である。捕捉部分改変プライマーを使用して捕捉部分を核酸生成物へと組み込む第１のプロセス３１０（例えば、図１に図示されるとおり）および捕捉部分改変ヌクレオチドを使用して捕捉部分を核酸生成物へと組み込む第２のプロセス３２０（例えば、図２に図示されるとおり）のための選択された調製工程が、示される。第１のプロセス３１０および第２のプロセス３２０の各々では、核酸分子は、プライマーハイブリダイゼーション（工程ｉ））を促進する条件下で標的特異的プライマーに曝される。示されるように、その第１のプロセス３１０の標的特異的プライマーは、捕捉部分改変プライマー３１２である一方で、その第２のプロセス３２０の標的特異的プライマーは、捕捉部分改変を含まない第１の標的特異的プライマー３２２を利用する。
【００６５】
プライマーハイブリダイゼーション後に、第１鎖合成反応（工程ｉｉ））は、その核酸分子をテンプレートとして使用して、新たに合成された第１鎖３１６への組み込みのために、複数のタイプのヌクレオチド３１４を使用して、その第１のプロセス３１０において行われる。比較によって、第１鎖合成反応（工程ｉｉ））は、複数のタイプのヌクレオチド３２４を使用して、第２のプロセス３２０において行われ、その複数のタイプのヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、捕捉部分改変ヌクレオチドである。例示であって限定ではないが、Ｃヌクレオチドは、捕捉部分改変を有すると示される。このようにして、その核酸分子をテンプレートとして使用する第１鎖合成の間に、その捕捉部分改変ヌクレオチドは、その核酸分子におけるＧヌクレオチドに相補的な位置において、新たに合成された第１鎖３２６へと組み込まれる。
【００６６】
第１のプロセス３１０または第２のプロセス３２０のうちのいずれかにおける第１鎖合成の後に、その捕捉部分を含む核酸は必要に応じて、その核酸に対してさらなる改変を包含するさらなる処理（工程ｉｉｉ））に供される。さらなる処理の例としては、第２鎖合成、末端修復、アダプターライゲーション、および本明細書の他の箇所で記載される他の処理工程が挙げられ得るが、これらに限定されない。その第１のプロセス３１０または第２のプロセス３２０において選択肢的なさらなる処理後に、その捕捉部分を含む核酸生成物は、いずれかのプロセスから生成された核酸生成物を捕捉する目的で、その捕捉部分の結合パートナーと接触される（工程ｉｖ））。示されるように、生成物捕捉は、その捕捉部分の結合パートナー３５２を使用して行われ得、この結合パートナーは必要に応じて、基材３５４に固定化され得る。その基材３５４が常磁性基材である場合、その核酸生成物は、磁場３５６への曝露によって単離され得る。
【００６７】
いくつかの局面において、本開示は、免疫レパートリーの分析用の核酸ライブラリーを調製するための方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、その核酸ライブラリーは、免疫レセプター（例えば、ＴＣＲ）、免疫グロブリン（例えば、ＢＣＲ）、またはこれらの混合物をコードする核酸配列を含むサンプルから調製される。
【００６８】
免疫レパートリー
適応免疫系は特有の抗原結合分子を発現する細胞のクローン性拡大によって一部機能するので、各Ｔ細胞またはＢ細胞クローンの合計存在量の変化を正確に測定することは、適応免疫応答のダイナミクスの理解にとって重要である。ハイスループットシーケンシングにおける進歩を利用して、広大なＴＣＲおよびＢＣＲレパートリーをプロファイルする分子免疫学の新たな分野が近年出現してきた。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される技術は、免疫細胞クローン型を分析するために有用である。
【００６９】
本明細書で記載される場合、「クローン型（ｃｌｏｎｏｔｙｐｅ）」とは、免疫レセプター鎖またはその一部をコードする１またはこれより多くの遺伝子の再配列プロセスの間に生じる成功裡に組換えられるヌクレオチド配列をいう。いくつかの実施形態において、「成功裡に組換えられたヌクレオチド配列（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、ｍＲＮＡによって構成され、かつ遺伝的組換えを受けて特有のクローン型を生じるヌクレオチド配列をいう。よって、いくつかの実施形態において、本開示で提供される技術は、ｍＲＮＡとして発現されるが、それ自体はＩＲ再配列ではないＩＲ遺伝子座の成功裡の再配列を検出するために有用であり得る。いくつかの実施形態において、クローン型とは、単一レセプター鎖をコードするｍＲＮＡに相当するヌクレオチド配列をいう。いくつかの実施形態において、本開示で提供される技術は、１またはこれより多くの体細胞超変異を検出するために有用であり得る。いくつかの実施形態において、本開示で提供される技術は、ＴＣＲおよび／またはＢＣＲアイソタイプ（例えば、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｍ  ＩｇＨアイソタイプ、ならびにその選択されたサブクラス）を検出するために有用であり得る。いくつかの実施形態において、クローン型は、Ｔ細胞またはＢ細胞の組換えられたヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、クローン型は、ＴＣＲもしくはＢＣＲ、またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、クローン型は、ＩｇＨのＶＤＪ再配列、ＩｇＨのＤＪ再配列、ＩｇＫのＶＪ再配列、ＩｇＬのＶＪ再配列、ＴＣＲβのＶＤＪ再配列、ＴＣＲβのＤＪ再配列、ＴＣＲαのＶＪ再配列、ＴＣＲγのＶＪ再配列、ＴＣＲδのＶＤＪ再配列、ＴＣＲδのＶＤ再配列、κ欠失エレメント（ＫＤＥ）再配列などの全てまたは一部をコードし得る。いくつかの実施形態において、クローン型は、これらが由来する免疫分子の多様性を表すかまたは反映するために十分長い配列を有する。よって、いくつかの実施形態において、クローン型は、長さが広く変動し得る。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、クローン型プロファイルを決定するために有用である。
【００７０】
本明細書で記載される場合、「クローン型プロファイル（ｃｌｏｎｏｔｙｐｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ）」とは、リンパ球の集団に由来する別個のクローン型の列挙およびそれらの相対的存在量に言及する。いくつかの実施形態において、そのリンパ球の集団は、組織サンプルから得られる。クローン型プロファイルは、「免疫レパートリー（ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」という免疫学の概念に関する。いくつかの実施形態において、クローン型プロファイルは、再配列された免疫レセプターコード核酸の広く種々の列挙および存在量を含み、これら免疫レセプターコード核酸は、リンパ球の選択されたサブセット（例えば、組織浸潤リンパ球、免疫表現型サブセットなど）に由来し得るか、または完全免疫レセプターと比較して、低減した多様性を有する免疫レセプターの一部をコードし得る。いくつかの実施形態において、クローン型プロファイルは、少なくとも１０３の別個のクローン型、少なくとも１０４の別個のクローン型、少なくとも１０５の別個のクローン型、少なくとも１０６の別個のクローン型、または少なくとも１０７の別個のクローン型を含み得る。いくつかの実施形態において、クローン型プロファイルは、約１〜５００，０００の間の別個のクローン型を含み得る。いくつかの実施形態において、クローン型は、約１〜１，０００，０００の間の別個のクローン型（例えば、約１〜約１００，０００の間、約１００，０００〜約２００，０００の間、約２００，０００〜約３００，０００の間、約３００，０００〜約４００，０００の間、約４００，０００〜約５００，０００の間、約５００，０００〜約６００，０００の間、約６００，０００〜約７００，０００の間、約７００，０００〜約８００，０００の間、約８００，０００〜約９００，０００の間、約９００，０００〜約１，０００，０００の間の別個のクローン型）を含み得る。いくつかの実施形態において、このようなクローン型プロファイルは、その別個のクローン型の各々の存在量または相対的頻度をさらに含み得る。一局面において、クローン型プロファイルは、個体のリンパ球の集団において、ＴＣＲもしくはＢＣＲ、またはこれらのフラグメントを、それぞれコードする別個の組換えられたヌクレオチド配列（とそれらの存在量）のセットであり、ここでそのセットのヌクレオチド配列は、その集団のリンパ球の実質的に全てに関して、別個のリンパ球またはそれらのクローン亜集団と１対１対応を有する。一局面において、クローン型を規定する核酸セグメントは、それらの多様性（例えば、そのセットの中の別個の核酸配列の数）が、個体における実質的にあらゆるＴ細胞もしくはＢ細胞またはそれらのクローンがこのようなレパートリーの特有の核酸配列を有するほどに十分大きくあるように選択される。すなわち、サンプルの好ましくは各異なるクローンが、異なるクローン型を有する。他の局面において、レパートリーに相当するリンパ球の集団は、循環するＢ細胞であってもよいし、循環するＴ細胞であってもよいし、前述の集団のうちのいずれかの亜集団（ＣＤ４＋  Ｔ細胞、またはＣＤ８＋  Ｔ細胞、または細胞表面マーカーによって規定される他の亜集団などが挙げられるが、これらに限定されない）で���ってもよい。いくつかの実施形態において、このような亜集団は、特定の組織（例えば、骨髄、またはリンパ節など）からサンプルを採取することによって、またはサンプル（例えば、末梢血）から、１もしくはこれより多くの細胞表面マーカー、サイズ、形態などに基づいて細胞をソートもしくは富化することによって、獲得され得る。なお他の局面において、レパートリーに相当するリンパ球の集団は、疾患組織（例えば、腫瘍組織、感染組織など）に由来し得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲおよび／もしくはＢＣＲ鎖またはこれらのフラグメントに相当する核酸を含むクローン型プロファイルは、約１〜約２５、約２５〜約５０、約５０〜約１００、約１１〜約２５０、約２５０〜約５００、約５００〜約１０００、約１０００〜約２５００、約２５００〜約５０００、約５０００〜約７５００、約７５００〜約１００００、約１００００〜約２５０００、約２５０００〜約５００００、約５００００〜約１０００００、約１０００００〜約２５００００、約２５００００〜約５０００００、約５０００００〜約７５００００、約７５００００〜約１００００００の範囲において多くの別個のヌクレオチド配列を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態において、クローン型プロファイルは、ＢＣＲ（例えば、ＩｇＨ鎖）のＶ（Ｄ）Ｊ領域の実質的に全てのセグメントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。一局面において、「実質的に全て（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ａｌｌ）」とは、本明細書で使用される場合、０．０００１％以上、０．０００５％以上、０．００１％以上、０．００５％以上、０．０１％以上、０．０５％以上、もしくは０．１％以上の相対的存在量を有するあらゆるセグメントを意味する；または別の局面において、「実質的に全て」は、本明細書で使用される場合、０．０００１％以上の相対的存在量を有するあらゆるセグメントを意味する。いくつかの実施形態において、Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントの全てが表されるわけではない。別の実施形態において、クローン型プロファイルは、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲδ鎖）のＶ（Ｄ）Ｊ領域の実質的に全てのセグメントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。別の実施形態において、クローン型プロファイルは、１〜２５、１〜５０、１〜１００、１〜２００、１〜３００、１〜４００、１〜４５０、１〜５００、２５〜１００、２５〜２００、２５〜３００、２５〜４００、２５〜４５０、２５〜５００、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜４５０、１００〜５００、２００〜３００、２００〜４００、２００〜４５０、２００〜５００、３００〜４００、３００〜４５０、３００〜５００、４００〜４５０、４００〜５００、４５０〜５００、またはこれより多くのヌクレオチドの範囲の長さを有し、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲδ鎖）のＶ、Ｄ、およびＪ領域のセグメントを含むヌクレオチド配列のセットを含む。別の実施形態において、クローン型プロファイルは、１〜２５、１〜５０、１〜１００、１〜２００、１〜３００、１〜４００、１〜４５０、１〜５００、２５〜１００、２５〜２００、２５〜３００、２５〜４００、２５〜４５０、２５〜５００、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜４５０、１００〜５００、２００〜３００、２００〜４００、２００〜４５０、２００〜５００、３００〜４００、３００〜４５０、３００〜５００、４００〜４５０、４００〜５００、４５０〜５００、またはこれより多くのヌクレオチドの範囲の長さを有し、ＢＣＲ（例えば、ＩｇＨ鎖）のＶ、Ｄ、およびＪ領域のセグメントを含むヌクレオチド配列のセットを含む。別の実施形態において、クローン型プロファイルは、別個のＢＣＲ（例えば、ＩｇＨ鎖、ＩｇＫ鎖、ＩｇＬ鎖）を発現するリンパ球の数に実質的に等しい多くの別個のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、クローン型プロファイルは、別個のＴＣＲ（例えば、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲγ鎖）を発現するリンパ球の数に実質的に等しい多くの別個のヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態において、「実質的に等しい（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」とは、９９％の確率で、クローン型プロファイルが、個体の集団のあらゆるリンパ球が有するかまたは発現するＢＣＲ（例えば、ＩｇＨ、ＩｇＫ、ＩｇＬ）もしくはＴＣＲ（例えば、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、ＴＣＲα、ＴＣＲγ）またはこれらの一部をコードするヌクレオチド配列を含むことを意味する。さらに別の実施形態において、「実質的に等しい」とは、９９％の確率で、ヌクレオチド配列のレパートリーが、サンプルに存在するあらゆるリンパ球が有するかまたは発現するＢＣＲ（例えば、ＩｇＨ、ＩｇＫ、ＩｇＬ）もしくはＴＣＲ（例えば、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、ＴＣＲα、ＴＣＲγ）またはこれらの一部をコードするヌクレオチド配列を含むことを意味する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、クローン型プロファイルは、免疫細胞（これは、広く種々の組織に存在する）のサンプルから得られる。いくつかの実施形態において、目的の免疫細胞としては、Ｔ細胞および／またはＢ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）としては、例えば、ＴＣＲを発現する細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞（Ｂリンパ球）としては、例えば、ＢＣＲを発現する細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞としては、ヘルパーＴ細胞（エフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、メモリーＴ細胞、および調節性Ｔ細胞（これらは、細胞表面マーカーによって区別され得る）が挙げられる。いくつかの実施形態において、免疫細胞のサンプルはまた、Ｂ細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞としては、例えば、プラズマＢ細胞、メモリーＢ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ２細胞、辺縁帯Ｂ細胞、および濾胞性Ｂ細胞が挙げられる。Ｂ細胞は、免疫グロブリン（本明細書で抗体またはＢ細胞レセプターともいわれる）を発現し得る。
【００７３】
Ｔ細胞レセプター
適応免疫系は、潜在的病原体の母集団を認識するために十分な多様性を有するＴ細胞およびＢ細胞抗原レセプター（例えば、適応免疫レセプター）のレパートリーを生成するためにいくつかのストラテジーを使用する。Ｔ細胞が、種々のがんまたは感染性生物と関連する抗原の母集団を認識する能力は、そのＴＣＲによって与えられ、このＴＣＲは、ＴＣＲＡ遺伝子座に由来するα（アルファ）鎖およびＴＣＲＢ遺伝子座に由来するβ（ベータ）鎖のヘテロダイマー、またはＴＣＲＧ遺伝子座に由来するγ（ガンマ）鎖およびＴＣＲＤ遺伝子座に由来するδ（デルタ）鎖のヘテロダイマーである。これらの鎖を構成するタンパク質は、ＤＮＡによってコードされ、これはリンパ様細胞において、そのＴＣＲのおびただしい多様性を生成するために、特有の再配列機構を使用する。このマルチサブユニット免疫認識レセプターは、ＣＤ３複合体と関連し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩタンパク質のいずれかによって提示されるペプチドに結合する。そのＡＰＣ上の抗原性ペプチドへのＴＣＲの結合は、Ｔ細胞活性化における中心的な事象であり、これは、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の接触点の免疫学的シナプスにおいて起こる。
【００７４】
各ＴＣＲペプチドは、可変性相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域を含む。αβＴ細胞の配列多様性は主に、α鎖およびβ鎖可変ドメインの第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）ループのアミノ酸配列によって決定され、その多様性は、それぞれ、β鎖遺伝子座における可変性（Ｖβ）と多様性（Ｄβ）と接合（Ｊβ）遺伝子セグメントとの間の、およびα鎖遺伝子座における類似のＪαとＪα遺伝子セグメントとの間の組換えの結果である。ＴＣＲα鎖およびβ鎖遺伝子座における多数のこのような遺伝子セグメントの存在は、多数の別個のＣＤＲ３配列がコードされることを可能にする。ＣＤＲ３配列多様性は、ＴＣＲ遺伝子再配列のプロセスの間にＶβ−Ｄβ、Ｄβ−Ｊβ、およびＶα−Ｊα接合部においてヌクレオチドの独立した付加および欠失によってさらに増大される。この点では、免疫適格性は、ＴＣＲの多様性に由来する。
【００７５】
γδ  ＴＣＲヘテロダイマーは、このヘテロダイマーが先天的免疫系と密に相互作用するレセプターをコードし、非ＨＬＡ依存性様式で抗原を認識するという点でαβ  ＴＣＲとの区別を示す。ＴＣＲ  γδは、発生の初期で発現され、特殊な解剖学的分布、特有の病原体および低分子特異性、ならびに先天的および適応性細胞相互作用の広い範囲を有する。ＴＣＲγ  ＶおよびＪセグメント発現の偏ったパターンは、個体発生の早期に確立される。結論として、成体組織における多様なＴＣＲγレパートリーは、病原体および毒性分子への環境的曝露による刺激後の広範な末梢拡大の結果である。
【００７６】
ＴＣＲの多様性を生成するためのプロセスは、免疫グロブリンに関して記載されるものと同様である。ＴＣＲ  α鎖は、ＶＪ組換えによって生成される一方で、β鎖は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えによって生成される。同様に、ＴＣＲ  γ鎖の生成は、ＶＪ組換えを包含する一方で、ＴＣＲ  δ鎖の生成は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えによって起こる。これら特定の領域（α鎖またはγ鎖についてはＶおよびＪ、βまたはδ鎖に関してはＶ  ＤおよびＪ）の共通部分は、抗原−ＭＨＣ認識にとって重要であるＣＤＲ３領域に相当する。それは、ＴＣＲ結合レパートリーの説明となるパリンドロームの、ならびにランダムＮヌクレオチドおよびＰヌクレオチドの付加とともに、この領域でのセグメントの特有の組み合わせである。さらに、そのＣＤＲ３領域は、νβ遺伝子の３’領域における第２の保存されたシステインで始まり、Ιβ遺伝子の５’領域によってコードされる保存されたフェニルアラニンで終わる。従って、増幅された配列は、その保存されたシステインの位置を特定するために、介在ペプチド配列を得るために、およびサンプル中の各特有のクローンの数を表にまとめるために、情報的に翻訳され得る。
【００７７】
Ｂ細胞レパートリー
免疫グロブリン（Ｉｇ）（本明細書ではＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）ともいわれる）は、Ｈ２Ｌ２構造を形成する４種のポリペプチド鎖（ＩＧＨ遺伝子座に由来する２つの重鎖（Ｈ鎖）およびＩＧＫ遺伝子座もしくはＩＧＬ遺伝子座のいずれかに由来する２つの軽鎖（Ｌ鎖）からなるＢ細胞によって発現されるタンパク質である。Ｈ鎖およびＬ鎖は各々、抗原認識に関与する３つのＣＤＲ、ならびにフレームワーク領域およびＴＣＲに類似の定常ドメインを含む。ＩｇのＨ鎖は最初に、ＩＧＭまたはＩＧＤ定常領域エキソンのいずれかを使用する膜結合アイソフォームとして発現され、抗原認識後に、その定常領域がいくつかのさらなるアイソタイプ（ＩＧＧ、ＩＧＥおよびＩＧＡを含む）へとクラススイッチされ得る。ＴＣＲと同様に、個体内のナイーブＩｇの多様性は主に、超可変ＣＤＲによって決定される。ＴＣＲＢと同様に、Ｈ鎖のＣＤＲ３ドメインは、ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントのコンビナトリアル接合によって作られる。超可変ドメイン配列多様性は、Ｉｇ遺伝子再配列のプロセスの間に、ＶＨ−ＤＨ、ＤＨ−ＪＨ、およびＶＨ−ＪＨ接合部におけるヌクレオチドの独立した付加および欠失によってさらに増大される。ＴＣＲとは別個に、Ｉｇ配列多様性は、ナイーブＢ細胞が最初に抗原を認識した後に、その再配列されたＩＧ遺伝子全体を通じた体細胞超変異（ＳＨＭ）によってさらに増大される。ＳＨＭのプロセスは、ＣＤＲ３に制限されず、従って、フレームワーク領域、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２において、ならびに体細胞再配列された（ｓｏｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）ＣＤＲ３において、生殖細胞系統配列に変化を導入し得る。
【００７８】
いくつかの局面において、本明細書で記載される方法において分析されるＤＮＡおよびＲＮＡは、定常領域（α、δ、ε、γまたはμ）を有する重鎖免疫グロブリン（ＩｇＨ）または定常領域（λまたはκ）を有する軽鎖免疫グロブリン（ＩｇＫまたはＩｇＬ）をコードする配列に相当し得る。各抗体は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖を有する。各鎖は、定常領域（Ｃ）および可変領域から構成される。重鎖に関しては、その可変領域は、可変性（Ｖ）、多様性（Ｄ）、および接合（Ｊ）セグメントから構成される。これらのセグメントの各タイプをコードするいくつかの別個の配列は、ゲノムに存在する。特定のＶＤＪ組換え事象は、Ｂ細胞の発生の間に起こり、その細胞に特定の重鎖を生成させる。その軽鎖における多様性は、Ｄ領域が存在しないので、ＶＪ組換えのみが存在することを除いて、類似の様式で生成される。体細胞変異はしばしば、いくつかのヌクレオチドの付加または欠失を引き起こし、Ｂ細胞によって生成される重鎖および軽鎖の多様性をさらに増大させて、組換えの部位の近くで起こる。次いで、Ｂ細胞によって生成される抗体の考えられる多様性は、その異なる重鎖および軽鎖の積である。その重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原認識（または結合）領域または部位を形成するために寄与する。同じエピトープに対して特異的な応答が高まられた後に起こり得る体細胞超変異というプロセスが、この多様性に加えられる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、抗体は、Ｂ系統細胞において組換えられたゲノムＩｇ配列によって生成される。免疫グロブリン軽鎖は、κ遺伝子またはλ遺伝子のいずれかに由来する。そのλ遺伝子は、４つの定常性（Ｃ）遺伝子およびおよそ３０の可変性（Ｖ）遺伝子から構成される。対照的に、そのκ遺伝子は、１つのＣ遺伝子および２５０のＶ遺伝子から構成される。その重鎖遺伝子ファミリーは、数百のＶ遺伝子、１５のＤ遺伝子、および４つの接合（Ｊ）遺伝子から構成される。Ｂ細胞分化の間の体細胞組換えは、重鎖において１つのＶ−Ｄ−Ｊ組み合わせおよびκ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかにおいて１つのＶ−Ｊ組み合わせをランダムに選択する。非常に多くの遺伝子が存在することから、数百万もの特有の組み合わせが可能である。そのＶ遺伝子はまた、組換え後に体細胞超変異を受け、さらなる多様性を生成する。この根底にある複雑性にも拘わらず、保存された配列を標的化する数ダースのプライマーを使用して、いくつかの多重化反応において、完全重鎖および軽鎖相補体をシーケンシングすることが可能である。
【００８０】
免疫レパートリー分析
いくつかの局面において、本明細書で記載される技術は、目的の状態の存在を決定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、目的の状態の存在の決定は、診断適用に関連し得、ここで被験体は、その状態を有するかまたは有すると疑われる。いくつかの実施形態において、目的の状態の存在の決定は、防止的処置の目的で推測的測定に有用であり得る。いくつかの実施形態において、免疫レパートリーの分析は、目的の状態の存在を示し得る。例えば、いくつかの実施形態において、がんの病歴は、１またはこれより多くのがん抗原に結合する免疫レセプター配列の存在下で反映され得る。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患の存在は、自己抗原に結合する免疫レセプター配列の存在下で反映され得る。いくつかの実施形態において、自己免疫に関する状態は、本明細書で記載される技術を使用して、特定の時点で評価され得るかまたはある期間にわたって追跡され得る。いくつかの実施形態において、自己免疫に関する状態としては、多発性硬化症（ＭＳ）、セリアック病、１型糖尿病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、アジソン病、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎、多発性筋炎（ＰＭ）、および皮膚筋炎（ＤＭ）が挙げられる。よって、いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、状態の処置が適切であるか否かを決定するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、悪性Ｔ細胞およびＢ細胞の存在量は、特定のＣＤＲ３配列を介して経時的に追跡され得る。
【００８１】
いくつかの局面において、本開示によって提供される方法は、最適な治療的処置を決定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、最適な治療的処置は、サンプル中の免疫レパートリーを分析し、そしてその情報に基づいて、標的化した免疫応答を刺激または抑制するために最適であると同時に、望ましくない毒性を最小限にする適切な治療、用量または処置モダリティーを選択することによって、決定され得る。いくつかの実施形態において、処置は、有効な活性を提供すると同時に、望ましくない毒性を最小限にする処置の選択によって最適化される。例えば、いくつかの実施形態において、被験体（例えば、患者）は、自己免疫疾患に直接関連する免疫レパートリーに関して評価され得、全身性または標的化された免疫抑制レジメンが、その情報に基づいて選択され得る。
【００８２】
いくつかの局面において、本開示によって提供される技術は、被験体における状態の進行を評価するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、免疫レパートリーの分析は、状態の進行、停滞、または退縮を評価するために使用され得る。このような実施形態において、その免疫レパートリーは有利なことには、状態を処置するにあたって治療剤の有効性を評価するために、その治療剤での処置の前、その間、および／またはその後に評価され得る。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、疾患経路（例えば、発がん経路、炎症経路など）にそって最速の変化を検出するために、ならびに／または種々の治療的介入および防止的介入の有効性をモニターするために、有用であり得る。
【００８３】
いくつかの局面において、本明細書で開示される方法はまた、免疫系の細胞に対する薬剤の効果を分析するために利用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、１またはこれより多くの試験化合物への曝露後の免疫レパートリーにおける変化の分析は、個体に対するその試験化合物の効果を分析するために行われ得る。このような実施形態において、これらの分析は、多数の目的のために、例えば、免疫抑制治療または免疫増強治療の開発において、有用であり得る。いくつかの実施形態において、潜在的な治療価値に関して分析されるべき薬剤は、任意の化合物、低分子、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、または治療的使用に適した他の薬剤であり得る。いくつかの実施形態において、試験は、免疫レパートリーに対する効果を決定するために、例えば、動物モデルを使用してインビボで行われる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、免疫レパートリーの分析は、生物における抗原チャレンジの効果を決定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、核酸は、生物を抗原でチャレンジした後に（例えば、ワクチン接種後に）、その生物から得られる。いくつかの実施形態において、核酸は、生物を抗原でチャレンジする前に、その生物から得られる。いくつかの実施形態において、チャレンジ前後に存在する免疫レパートリーの多様性を比較することは、そのチャレンジに対するその生物の応答の分析を補助し得る。
【００８５】
捕捉部分
本明細書で記載される技術の局面は、目的の分子（例えば、核酸、ライゲーション生成物など）を単離するための捕捉部分の使用に関する。本明細書で使用される場合、「捕捉部分（ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｏｉｅｔｙ）」とは、その目的の分子を捕捉する（例えば、単離する／精製する）目的で、結合パートナーと選択的に相互作用するように構成される部分をいう。
【００８６】
捕捉部分およびその捕捉部分の結合パートナーは、任意の適切な結合対を含み得る。いくつかの実施形態において、結合対は、共有結合または非共有結合を通じて選択的に相互作用し得る。いくつかの実施形態において、結合対は、ハイブリダイゼーション、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、またはこれらの力の任意の組み合わせによって選択的に相互作用し得る。いくつかの実施形態において、捕捉部分および／または結合パートナーは、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、イノシン、アビジン、ＧＳＴ配列、改変ＧＳＴ配列、ビオチンリガーゼ認識（ＢｉＴａｇ）配列、Ｓタグ、ＳＮＡＰタグ、エンテロキナーゼ部位、トロンビン部位、抗体もしくは抗体ドメイン、抗体フラグメント、抗原、レセプター、レセプタードメイン、レセプターフラグメント、またはこれらの組み合わせを含み得る。
【００８７】
いくつかの実施形態において、捕捉部分は、ビオチン部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される技術は、分析用の核酸サンプルを調製するにあたって有用である。よって、いくつかの実施形態において、核酸分子は、ビオチン捕捉部分を含む。いくつかの実施形態において、その核酸分子は、ビオチン部分を含む少なくとも１個の捕捉部分改変ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、その捕捉部分改変ヌクレオチドは、式（Ｉ）の一般構造：
【化１】
2019537439.tif 000003
を含む。
【００８８】
式（Ｉ）に示されるように、捕捉部分改変ヌクレオチドは、ヌクレオチドの核塩基に付着したビオチン部分を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、そのビオチン部分は、ビオチン−トリエチレングリコール、ビス−ビオチン、光切断性ビオチン、デスチオビオチン、デスチオビオチン−トリエチレングリコール、またはアジ化ビオチンを含む。捕捉部分改変ヌクレオチドの非限定的な例は、表１に示される。
【００８９】
【表１−１】
2019537439.tif 000004
【表１−２】
2019537439.tif 000005
【表１−３】
2019537439.tif 000006
【表１−４】
2019537439.tif 000007
【００９０】
いくつかの実施形態において、捕捉部分改変ヌクレオチドは、その捕捉部分とそのヌクレオチドの核塩基との間にリンカーを含む。いくつかの実施形態において、その捕捉部分は、任意の適切な長さのリンカーを介して、その核塩基に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、その捕捉部分は、長さが５〜２０個の原子のリンカーを介して、その核塩基に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、そのリンカーは、脂肪族鎖を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、−（ＣＨ２）ｎ−を含み、ここでｎは、１〜２０の整数（両端の値を含む）である。いくつかの実施形態において、ｎは、１〜１０の整数（両端の値を含む）である。ある種の実施形態において、リンカーは、ヘテロ脂肪族鎖を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリエチレングリコール部分を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリプロピレングリコール部分を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−を含み、ここでｎは、１〜２０の整数（両端の値を含む）である。いくつかの実施形態において、リンカーは、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−を含み、ここでｎは、１〜１０の整数（両端の値を含む）である。ある種の実施形態において、リンカーは、１またはこれより多くのアリーレンを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、１またはこれより多くのフェニレン（例えば、パラ置換されたフェニレン）を含む。ある種の実施形態において、リンカーは、キラル中心を含む。ある種の実施形態において、リンカーは、１またはこれより多くのホスフェート、脂肪族鎖、ヘテロ脂肪族鎖、および１またはこれより多くのアミド（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−）を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、捕捉部分改変ヌクレオチドは、ビオチン−ｎ−ｄＮＴＰであり、ここでｎは、そのビオチン部分のカルボニル基とそのＮＴＰの核塩基上の付着位置との間のリンカー原子の数を表す５〜２０の整数である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、結合パートナーは、不溶性支持体に付着される。従って、いくつかの実施形態において、その目的の分子は、捕捉部分と不溶性支持体に付着された捕捉部分の結合パートナーとの間で形成される選択的結合相互作用を通じて、その不溶性支持体上に固定化され得る。
【００９３】
いくつかの実施形態において、その不溶性支持体は、ビーズまたは他の固体表面を含む。例えば、いくつかの実施形態において、そのビーズは、常磁性ビーズである。単離するためにビーズを使用することは、当該分野で周知であり、任意の適切なビーズ単離法が、本明細書で記載される技術とともに使用され得る。いくつかの実施形態において、ビーズは、目的の分子がそのビーズに付着され得、そのビーズが洗浄されて、そのビーズに付着しなかった溶液構成要素を除去し得、精製および単離を可能にするという点で、単離に有用であり得る。いくつかの実施形態において、そのビーズは、サイズ、密度、または誘電特性、イオン特性、および磁性特性のような特性に基づいて、その溶液中の他の構成要素から分離され得る。
【００９４】
いくつかの実施形態において、その不溶性支持体は、磁性ビーズである。ビーズの使用は、誘導体化された核酸捕捉部分が、遠心分離もしくは濾過によって、または磁性ビーズの場合には、磁場の印加によって、反応混合物から分離されることを可能にする。いくつかの実施形態において、磁性ビーズは、溶液へと導入、混合、除去、および磁場を使用して放出され得る。いくつかの実施形態において、磁性ビーズを利用するプロセスは、自動化され得る。いくつかの実施形態において、そのビーズは、周知の化学現象を使用して官能化されて、捕捉部分の結合パートナーを付着させるために適した官能化を有する表面を提供し得る。その捕捉部分の結合を可能にするための表面の誘導体化は、当該分野で従来からのものである。例えば、ストレプトアビジンでの表面の被覆は、ビオチン化捕捉部分の結合を可能にする。ストレプトアビジンでの表面の被覆は、例えば、米国特許第５，３７４，５２４号（Ｍｉｌｌｅｒ）に記載されている。いくつかの実施形態において、ビーズ以外の固体表面が使用され得る。いくつかの実施形態において、その固体表面は、平らな表面（例えば、ハイブリダイゼーションマイクロアレイのために使用されるもの）であり得るか、またはその固体表面は、分離カラムを充填したものであり得る。
【００９５】
いくつかの実施形態において、捕捉部分の結合パートナーは、その捕捉部分を結合する前に、同時に、または後に、不溶性支持体に付着され得る。いくつかの実施形態において、捕捉部分とその捕捉部分の結合パートナーとを、両方が溶液中に存在する間に接触させることは、好ましいことであり得る。このような実施形態において、その捕捉部分：結合パートナー複合体は、次いで、その複合体と適切に誘導体化された表面とを接触させることによって、不溶性支持体上に固定化され得る。従って、いくつかの実施形態において、その目的の分子は、その目的の分子に付着した捕捉部分とその捕捉部分の結合パートナーとの間で形成される複合体を通じて単離され得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、その捕捉部分をヌクレオチドの核塩基に付着させることは、望ましいことであり得る。この様式では、その３’末端は、アダプター核酸に必要に応じてライゲーションされるように遊離のままである一方で、その捕捉部分は、結合パートナーによって捕捉されるために利用可能である。いくつかの実施形態において、その捕捉部分改変ヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、およびシトシン、またはこれらの誘導体からなる群より選択される核塩基を含む。例えば、いくつかの実施形態において、その捕捉部分改変ヌクレオチドは、アデニン核塩基またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、その捕捉部分は、５位、６位、７位または８位においてアデニン核塩基またはその誘導体へと共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、その捕捉部分は、７位においてアデニン核塩基へと共有結合的に連結される。アデニン環の番号付けスキームは、式（ＩＩ）に示される：
【化２】
2019537439.tif 000008
【００９７】
いくつかの実施形態において、捕捉部分に付着される核塩基上の１またはこれより多くの位置を改変することは、望ましいことであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、アデニン核塩基の７位は、炭素原子である。しかし、さらなる共有結合を形成し得る任意の原子（例えば、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓなど）が捕捉部分の付着のために適した核塩基上の位置へと置換され得ることは、認識されるべきである。いくつかの実施形態において、そのアダプターをライゲーションしたフラグメントを捕捉した後に、そのライブラリーは、標的ヌクレオチド配列を富化するために増幅に供される。
【００９８】
分析用の核酸の調製
本開示の局面は、既知の標的ヌクレオチド配列（例えば、免疫レセプターの既知の標的ヌクレオチド配列）に連続したヌクレオチド配列を決定する改善された方法を提供する。旧来のシーケンシング法は、配列情報を無作為に（例えば、「ショットガン（ｓｈｏｔｇｕｎ）」シーケンシング）、またはプライマーをデザインするために使用される２つの既知の配列の間で生成する。対照的に、本明細書で開示される方法のうちのある種のものは、いくつかの実施形態において、高レベルの特異性および感度で既知の配列のうちの１つの領域の上流または下流にあるヌクレオチド配列を決定する（例えば、シーケンシングする）ことを可能にする。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される技術は、核酸サンプルからの標的ヌクレオチド配列の富化を可能にする。いくつかの実施形態において、その核酸サンプルは、ゲノムＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、その核酸サンプルは、ｃＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、標的核酸にアニールする捕捉部分改変プライマーを使用する第１鎖合成反応を行い、プライマーとしてその標的核酸のフラグメントを使用する第２鎖合成反応を行うことによって、調製され得る。
【０１００】
サンプル精製
いくつかの実施形態において、標的核酸および／またはその増幅生成物は、１つの方法のうちの任意の適切な工程の前および／または後で、酵素、プライマー、または緩衝液構成要素から単離され得る。核酸を単離するための任意の適切な方法が、使用され得る。いくつかの実施形態において、その単離は、固相可逆的固定法（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ））クリーンアップを含み得る。ＳＰＲＩクリーンアップのための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  −  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（カタログ番号Ａ６３８８０、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；  Ｂｒｅａ，  ＣＡ））。いくつかの実施形態において、酵素は、加熱処理によって不活性化され得る。いくつかの実施形態において、非標識ｄＮＴＰは、酵素処理によって除去される。いくつかの実施形態において、クリーンアップ工程（例えば、ＳＰＲＩクリーンアップ）は、伸長しなかったプライマーまたは過剰なプライマー（例えば、捕捉部分改変プライマー、標的特異的プライマー、アダプタープライマーなど）を除去するために行われる。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、ＳＰＲＩクリーンアップは、ＤＮＡに結合する常磁性ビーズの使用に関する。例えば、いくつかの実施形態において、ＳＰＲＩクリーンアップは、磁鉄鉱の薄い層（これは、ビーズを常磁性にする）によって囲まれたポリスチレンコアを有するビーズを利用する（すなわち、ビーズは、磁場に曝した場合にのみ凝集する）。いくつかの実施形態において、そのビーズは、ＤＮＡ結合のために荷電した基を提供するカルボキシル基を含む分子によって被覆される。いくつかの実施形態において、ＳＰＲＩクリーンアップは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および塩（これらはクラウディング剤として一緒に働いて、そのビーズを活性化してＤＮＡを可逆的に結合する）の存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ＳＰＲＩは、ＤＮＡサンプルと常磁性ビーズとを混合する工程およびそのビーズをそのＤＮＡに結合させる工程、磁場を印加して、そのＤＮＡに結合したビーズを凝集させる工程、そのビーズをエタノール（例えば、７０％  エタノール）ですすぐ工程、ならびにそのＤＮＡをその常磁性ビーズから溶離する工程を包含する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ハイブリダイズしなかったプライマーは、適切な方法（例えば、精製、消化など）を使用して核酸調製物から除去され得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）は、調製物からプライマーを除去するために使用される。いくつかの実施形態において、このようなヌクレアーゼは、プライマー消化後に熱不活性化される。そのヌクレアーゼが一旦不活性化されると、プライマーのさらなるセットが、さらなる増幅反応を行うために、他の適切な構成要素（例えば、酵素、緩衝液）と一緒に添加され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法の工程は、必要に応じて、間にあるサンプル精製工程を含む。いくつかの実施形態において、サンプル精製工程は、洗浄工程を含む。いくつかの実施形態において、サンプル精製工程は、ＳＰＲＩクリーンアップ（例えば、ＡＭＰｕｒｅ）を含む。例えば、分析用の核酸を調製するための方法は、（ｉ）基材に固定化した核酸を洗浄する工程；および（ｉｉ）その洗浄した固定化核酸をその常磁性基材または表面から放出する工程を包含し得る。
【０１０４】
核酸アダプター
本明細書で使用される場合、用語「アダプター核酸（ａｄａｐｔｅｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」、「核酸アダプター（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｄａｐｔｅｒ）」または「アダプター（ａｄａｐｔｅｒ）」とは、標的ヌクレオチド配列の増幅および／またはシーケンシングの間に有用な１またはこれより多くの要素を提供する、その標的ヌクレオチド配列を含む核酸にライゲーションされ得る核酸分子をいう。いくつかの実施形態において、アダプターは、１本鎖である。いくつかの実施形態において、アダプターは、２本鎖である。いくつかの実施形態において、２本鎖アダプターは、第１のライゲーション可能な二重鎖末端および第２の不対末端を含む。いくつかの実施形態において、アダプターは、増幅鎖およびブロッキング鎖を含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、５’不対部分および３’二重鎖部分を含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、３’オーバーハングをさらに含む。いくつかの実施形態において、その３’オーバーハングは、３’Ｔオーバーハングである。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、第１のおよび第２のアダプタープライマーと同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのアダプターのブロッキング鎖は、５’二重鎖部分および伸長不能な３’部分を含む。いくつかの実施形態において、そのブロッキング鎖は、３’不対部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖およびそのブロッキング鎖の二重鎖部分は、実質的に相補的であり、そしてその二重鎖部分は、ライゲーション温度においてにおいて二重鎖形態を保持するために十分な長さである。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、第１のおよび第２のアダプタープライマーと同一のヌクレオチド配列を含む増幅鎖の一部は、少なくとも部分的に、その増幅鎖の５’不対部分によって含まれ得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、そのアダプターは、「Ｙ」形状を有し得る、すなわち、その第２の不対末端は、増幅鎖の５’不対部分およびブロッキング鎖の３’部分を含む。そのブロッキング鎖の３’不対部分は、その増幅鎖の５’不対部分より短くてもよいし、長くてもよいし、長さが等しくてもよい。いくつかの実施形態において、そのブロッキング鎖の３’不対部分は、その増幅鎖の５’不対部分より短い可能性がある。Ｙ形状のアダプターは、そのブロッキング鎖の不対部分がＰＣＲレジメンの間の３’伸長に左右されないという利点を有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、そのアダプターのブロッキング鎖は、その増幅鎖の５’不対部分に実質的に相補的でない３’不対部分をさらに含み得る；ここでそのブロッキング鎖の３’不対部分は、プライマーのうちのいずれにも実質的に相補的でないか、または実質的に同一でない。いくつかの実施形態において、そのブロッキング鎖は、その増幅鎖の５’不対部分にアニーリング温度で特異的にアニールしない３’不対部分をさらに含み得る；ここでそのブロッキング鎖の３’不対部分は、プライマーまたはその相補体のうちのいずれにも、アニーリング温度で特異的にアニールしない。いくつかの実施形態において、アダプター核酸は、最低でも、多重化のためのサンプルインデックス配列を含む。しかし、いくつかの実施形態において、そのアダプター核酸は、ランダム分子バーコードをさらに含む。
【０１０８】
伸長および増幅
本開示の局面は、１またはこれより多くの伸長反応（例えば、第１鎖合成、第２鎖合成）および／または１またはこれより多くの増幅ラウンドを含み得る技術に関する。本明細書で記載されるように、伸長反応および増幅は、１またはこれより多くの標的特異的プライマーを使用して行われ得る。
【０１０９】
本明細書で記載される場合、「標的特異的プライマー（ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）」とは、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を含むプライマーをいう。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、第１鎖合成反応をプライムするために使用される。例えば、いくつかの実施形態において、その標的特異的プライマーは、標的ヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ分子にアニールする逆転写酵素プライマーである。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるように、捕捉部分改変プライマーは、第１鎖合成反応をプライムするために使用され得る標的特異的プライマーである。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、増幅反応をプライムするために使用される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、その標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分を含む標的特異的プライマーを使用する増幅工程を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、１より多くの工程において標的特異的プライマー（例えば、同一または異なる標的特異的プライマー）の使用を含み得る方法を提供する。
【０１１０】
よって、本明細書で記載される方法のいくつかの実施形態において、用語、標的特異的プライマーが１より多くの工程において出現し、別個のプライマーをいう場合、さらなる用語法が、明確にするために含められ得る。例えば、いくつかの実施形態において、初期標的特異的プライマーは、第１鎖合成反応において使用されて、異種類の標的特異的プライマーを使用してその後に増幅されるｃＤＮＡを生成し得る。このような実施形態において、その初期標的特異的プライマーは、「捕捉部分改変プライマー（ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｏｉｅｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）といわれ得る一方で、後者の標的特異的プライマーは、「標的特異的プライマー」といわれ得る。あるいは、いくつかの実施形態において、その初期標的特異的プライマーおよび後者の標的特異的プライマーは、それぞれ、「第１の（ｆｉｒｓｔ）」および「第２の（ｓｅｃｏｎｄ）」標的特異的プライマーといわれ得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、その用語「第１の」、「第２の」、「第３の（ｔｈｉｒｄ）」などの使用は、相対的に使用され得、その結果、これらの用語は、記載されている技術の状況に依存して，プライマーの異なるクラスに言及し得ることは、認識されるべきである。例えば、いくつかの実施形態において、標的特異的逆転写酵素プライマーは、ｍＲＮＡ分子とともに使用されて、ｃＤＮＡを生成し、これはさらに、さらなる標的特異的プライマーを使用してＰＣＲ反応に供される。このような実施形態において、その標的特異的逆転写酵素プライマーは、「第１の標的特異的プライマー（ｆｉｒｓｔ  ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）といわれ得、既知の標的配列に結合するその後のＰＣＲプライマーは、「第２の標的特異的プライマー（ｓｅｃｏｎｄ  ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）」、および「第３の標的特異的プライマー（ｔｈｉｒｄ  ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）」などといわれる。いくつかの実施形態において、複数のランダム逆転写酵素プライマーは、ｍＲＮＡ分子とともに使用されて、ｃＤＮＡを生成し、これはさらに、標的特異的プライマーを使用するＰＣＲ反応に供される。このような実施形態において、その複数のランダムプライマーは、「標的特異的（ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」とはいわれない；よって、その後のＰＣＲ反応が標的特異的プライマーを利用する場合、用語「第１の標的特異的プライマー」、「第２の標的特異的プライマー」などは、別個の反応に従って（例えば、シーケンシング用の核酸を調製するための方法において）使用され得る。
【０１１２】
いくつかの局面において、本開示は、第１の標的特異的プライマー（例えば、捕捉部分改変プライマー）を使用する第１鎖合成反応を行う工程を包含し得る方法を提供する。いくつかの実施形態において、第１の増幅ラウンドは、第２の標的特異的プライマー（例えば、標的特異的プライマー）および第１のアダプタープライマーを使用して行われる。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、「標的特異的プライマー」は、適切なアニーリング条件下で、核酸分子（例えば、テンプレート核酸）の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールし得る核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、順序を示す用語（例えば、第１、第２、第３）は、マルチ工程の方法の異なる工程において使用される、一方の標的特異的プライマーをもう一方から区別するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、第２の標的特異的プライマーは、第１の標的特異的プライマーの使用を包含する以前の第１鎖合成を含むプロセスにおいて、増幅反応において使用するための標的特異的プライマーである。このような実施形態において、増幅の間に、その第２の標的特異的プライマーは、そのテンプレートに相補的である鎖を生成し、この相補鎖は、第１のアダプタープライマーとハイブリダイズされ得る。
【０１１４】
本明細書で記載される場合、「アダプタープライマー（ａｄａｐｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）」とは、適切なアニーリング条件下で、アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールし得る核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アダプタープライマー（例えば、第１のアダプタープライマー）は、そのアダプターのうちの少なくとも一部と同一であり、それは、標的特異的プライマー（例えば、第２の標的特異的プライマー）によって生成される相補鎖とアニールして、増幅が進むことを可能にする。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、第１の増幅工程の第１のＰＣＲ増幅サイクルでは、第２の標的特異的プライマーは、標的ヌクレオチド配列を含む核酸のテンプレート鎖に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、その第２の標的特異的プライマーがデザインされた配向に依存して、その標的ヌクレオチド配列の上流または下流にある配列は、そのテンプレート鎖に相補的な鎖として合成される。いくつかの実施形態において、ＰＣＲの伸長相の間に、テンプレート鎖の５’末端がライゲーションされたアダプターで終結する場合、その新たに合成された相補鎖の３’末端は、第１のアダプタープライマーとハイブリダイズし得る配列を含む。その後のＰＣＲ増幅サイクルでは、その第２の標的特異的プライマーおよびその第１のアダプタープライマーの両方が、その標的核酸配列の適切な鎖に特異的にアニールし得、その既知のヌクレオチド標的配列とそのアダプターとの間の配列は、増幅され得る。いくつかの実施形態において、第２の標的特異的プライマーは、その標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールしない５’テール部分を含む。例えば、いくつかの実施形態において、５’テール部分は、その後の伸長反応に（例えば、増幅の間に）プライマー結合部位を提供する領域を含み得る。いくつかの実施形態において、第２の増幅ラウンドは、テールプライマーおよび第２のアダプタープライマーを使用して行われる。
【０１１６】
本明細書で記載される場合、「テールプライマー（ｔａｉｌ  ｐｒｉｍｅｒ）」とは、適切なアニーリング条件下で、先の増幅工程から生じるアンプリコンによって含まれる標的特異的プライマー（例えば、第２の標的特異的プライマー）の５’テール部分の相補的配列に特異的にアニールし得る３’部分を含む核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、テールプライマーは、その標的特異的プライマーの５’テール部分の相補的配列に特異的にアニールしない５’部分を含む。いくつかの実施形態において、そのテールプライマーの５’部分は、サンプルインデックス領域、ＰＣＲプライマー結合領域、分子バーコード領域、およびシーケンシングプライマー部位領域のうちの少なくとも１つを含む。テールプライマーは概して、本明細書で記載される場合、第２のＰＣＲラウンドにおいて使用されるプライマーに関するが、この用語が、先の反応において使用されるプライマーの５’テール部分に相補的である配列とハイブリダイズする任意のプライマーをいうために使用され得ることは、認識されるべきである。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、アダプタープライマー（例えば、第２のアダプタープライマー）は、そのアダプターのうちの少なくとも一部と同一であり、そしてそれは、そのテールプライマーによって生成された相補鎖にアニールして、増幅が進むことを可能にする。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、第２のアダプタープライマーは、第１のアダプタープライマーに対してネスト化される。いくつかの実施形態において、ネスト化したアダプタープライマーを使用すると、増幅可能である（例えば、ブリッジＰＣＲまたはエマルジョンＰＣＲの間に）が、シーケンシングできない（半ネスト化法の間に生じ得る状況）最終アンプリコンを生成する可能性を排除する。他の状況において、シーケンシングプライマーと同一のプライマーを使用する半ネスト化アプローチは、第１のＰＣＲ工程から第２のＰＣＲ工程への望ましくない増幅生成物の持ち越しを生じ得、最終的には、人工シーケンシングリードを生じる。いくつかの実施形態において、第２のアダプタープライマーは、第１のアダプタープライマーに関して少なくとも１ヌクレオチド、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはこれより多くのヌクレオチドがネスト化される。いくつかの実施形態において、第２のアダプタープライマーは、約５ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドが、約１０ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドが、約１５ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドが、または約２０個もしくはこれより多くのヌクレオチドが第１のアダプタープライマーに関してネスト化される。
【０１１９】
他の局面の中でも、本明細書で記載される技術は、１またはこれより多くのネスト化プライマーの使用を包含し得る。いくつかの実施形態において、ネスト化プライマーを使用すると、予測外のプライマー結合部位の増幅に起因して、ＰＣＲ生成物における非特異的に結合が低減し得る。本明細書で使用される場合、用語「ネスト化される（ｎｅｓｔｅｄ）」は、１つのプライマー対の１つのプライマーのアニーリング部位と別のプライマー対の別のプライマーのアニーリング部位との間の位置的関係性を記載するために使用される。例えば、いくつかの実施形態において、第２のプライマーは、１個、２個、３個またはこれより多くのヌクレオチドが第１のプライマーに対してネスト化され、このことは、１個、２個、３個またはこれより多くのヌクレオチドがフレームシフトされるそのテンプレート鎖上の部位にその第２のプライマーが結合することを意味する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、標的特異的プライマー（例えば、第２の標的特異的プライマー）は、標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分およびその標的ヌクレオチド配列にアニールしない５’テールを含む。いくつかの実施形態において、その５’テールは、テ−ルプライマーの３’部分と同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、反応中に存在する多数のプライマー（例えば、１もしくはこれより多くの標的特異的プライマーおよび／または１もしくはこれより多くのアダプタープライマー）は、同一の５’テール配列部分を含み得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、５’テールは、ＧＣリッチ配列であり得る。いくつかの実施形態において、５’テール配列は、少なくとも５０％  ＧＣ含量、少なくとも５５％
ＧＣ含量、少なくとも６０％  ＧＣ含量、少なくとも６５％  ＧＣ含量、少なくとも７０％  ＧＣ含量、少なくとも７５％  ＧＣ含量、少なくとも８０％  ＧＣ含量、またはより高いＧＣ含量を含み得る。いくつかの実施形態において、５’テール配列は、少なくとも６０％  ＧＣ含量を含み得る。いくつかの実施形態において、５’テール配列は、少なくとも６５％  ＧＣ含量を含み得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、第１の増幅ラウンドは、５’テールを含む第２の標的特異的プライマー、第１のアダプタープライマー、およびさらなるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、そのさらなるプライマーは、その第２の標的特異的プライマーの５’テールと同一の３’部分を含む。いくつかの実施形態において、そのさらなるプライマーは、バーコード、インデックス、アダプター配列、またはシーケンシングプライマー部位を含み得るハイブリダイゼーション配列の５’側にさらなる配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのさらなるプライマーは、包括的なシーケンシングアダプター／インデックスプライマーである。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、２種の標的特異的プライマー（例えば、その第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、その標的核酸の同じ鎖に実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、その既知の標的配列に特異的にアニールするその第１のおよび第２の標的特異的プライマーの一部は、合計で、その既知の標的ヌクレオチド配列の少なくとも２０個の特有の塩基、例えば、２０個もしくはこれより多くの特有の塩基、２５個もしくはこれより多くの特有の塩基、３０個もしくはこれより多くの特有の塩基、３５個もしくはこれより多くの特有の塩基、４０個もしくはこれより多くの特有の塩基、または５０個もしくはこれより多くの特有の塩基を含み得る。いくつかの実施形態において、その既知の標的配列に特異的にアニールするその第１のおよび第２の標的特異的プライマーの一部は、合計で、その既知の標的ヌクレオチド配列の少なくとも３０個の特有の塩基を含み得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、その第１のアダプタープライマーは、そのアダプターの増幅鎖の約２０個の最も５’側の塩基と同一の核酸配列を含み得、その第２のアダプタープライマーは、そのアダプターの増幅鎖の約３０個の塩基と同一の核酸配列と、その増幅鎖の５’末端の３’側にある少なくとも１個のヌクレオチドである５’塩基とを含み得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、アダプターをライゲーションした核酸（例えば、ライゲーション生成物）は、最小限である。このような実施形態において、第１のアダプタープライマーが使用され得、これは、その３’末端においてアダプター核酸配列の一部、および次いで、その５’末端にシーケンサーにとって重要なさらなる情報を含む。このような実施形態において、第２のアダプタープライマーが使用され得、これは、その３’末端において、その第１のアダプタープライマーの５’末端を含む。このような実施形態において、その第２のアダプタープライマーはまた、その５’末端においてシーケンシングを可能にするヌクレオチド配列を有し得る。このような実施形態において、ＰＣＲを使用して、シーケンサー適合性であるライブラリーを生成することは、可能である。
【０１２６】
プライマー
一般に、目的の配列（例えば、標的配列またはアダプター配列）に相補的である配列を含むプライマーは、相補的配列のみからなり得るか、またはその目的の配列に相補的でないさらなる配列（例えば、テール配列、アダプター配列、インデックス配列など）をも含み得るかのいずれかである。いくつかの実施形態において、プライマーは、非ヌクレオチド部分（例えば、捕捉部分など）をも含み得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、プライマー（例えば、第１のおよび第２の標的特異的プライマー、第１のおよび第２のアダプタープライマー、テールプライマー、捕捉部分改変プライマー）を、これらが、約６１〜７２℃、例えば、約６１〜６９℃、約６３〜６９℃、約６３〜６７℃、約６４〜６６℃のアニーリング温度において、これらの相補的配列に特異的にアニールするように、デザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが７２℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが７０℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが６８℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが約６５℃のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、容器温度を（例えば、種々の温度範囲の間でサイクリングすることによって）変更して、プライマーアニーリングを促進するように構成される。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列）に特異的にアニールする標的特異的プライマーの一部は、約６１〜７２℃、例えば、約６１〜６９℃、約６３〜６９℃、約６３〜６７℃、約６４〜６６℃の温度で特異的にアニールする。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする標的特異的プライマーの一部は、約６５℃の温度で、ＰＣＲ緩衝液中で特異的にアニールする。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるプライマー（例えば、ランダムプライマー、標的特異的プライマー）は、逆転写酵素プライマーを含む。いくつかの実施形態において、逆転写酵素プライマーは、ｍＲＮＡ分子に、約５０〜５２℃、約５１〜５３℃、約５２〜５４℃、約５３〜５５℃、約５４〜５６℃、約５５〜５７℃、約５６〜５８℃、約５７〜５９℃、約５８〜６０℃の温度において特異的にアニールする。例えば、いくつかの実施形態において、逆転写酵素プライマーは、約５３℃、約５３．５℃、約５４℃、約５４．５℃、約５６℃のアニーリング温度を有する。いくつかの実施形態において、逆転写酵素プライマーは、１またはこれより多くの捕捉部分（例えば、本明細書で記載されるとおり）を含む。いくつかの実施形態において、その１またはこれより多くの捕捉部分は、そのプライマー核酸の５’末端において、逆転写酵素プライマーに付着され得る。いくつかの実施形態において、逆転写酵素プライマーは、最も５’側の塩基を、その隣の最も５’側から２番目の塩基に連結するホスホロチオエート結合を含む。
【０１３０】
核酸伸長、増幅、およびＰＣＲ
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、伸長レジメンまたは工程を含む。このような実施形態において、伸長は、１つまたはこれより多くのハイブリダイズしたランダムプライマーから、プライマーがテンプレートに関してハイブリダイズされる核酸分子を使用して、進み得る。伸長工程は、本明細書で記載される。いくつかの実施形態において、１つまたはこれより多くのランダムプライマーは、サンプル中の核酸の実質的に全てにハイブリダイズし得、そのうちの多くは、標的ヌクレオチド配列を含まなくてもよい。よって、いくつかの実施形態において、ランダムプライマーの伸長は、標的ヌクレオチド配列を含まないテンプレートとのハイブリダイゼーションに起因して起こり得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅レジメンを包含し得る（１つまたはこれより多くの増幅サイクルを包含する）。本明細書で記載される方法の増幅工程は、各々ＰＣＲ増幅レジメンを、すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅サイクルのセットを含み得る。本明細書で使用される場合、用語「増幅レジメン（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｍｅｎ）」とは、目的の核酸を特異的に増幅する（その存在量を増大させる）プロセスをいう。いくつかの実施形態において、指数関数的増幅は、以前のポリメラーゼ伸長の生成物が連続する伸長ラウンドにわたってテンプレートとして働く場合に起こる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従うＰＣＲ増幅レジメンは、少なくとも１回、およびいくつかの場合には、少なくとも５回またはこれより多くの反復サイクルを含み得る。いくつかの実施形態において、各反復サイクルは、１）鎖分離（例えば、熱変性）；２）テンプレート分子へのオリゴヌクレオチドプライマーアニーリング；および３）そのアニールしたプライマーの核酸ポリメラーゼ伸長という工程を含み得る。これらの工程の各々に関与する任意の適切な条件および時間が使用され得ることは、認識されるべきである。いくつかの実施形態において、選択される条件および時間は、長さ、配列の内容、融解温度、二次構造特徴、または反応において使用される核酸テンプレートおよび／もしくはプライマーに関する他の因子に依存し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法に従う増幅レジメンは、サーマルサイクラー（そのうちの多くは市販されている）で行われる。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、線形的増幅を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、ネスト化プライマーを使用して行われる増幅工程は、線形的増幅を使用して行われ得る。いくつかの実施形態において、増幅は、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）を使用して行われ得る。例えば、いくつかの実施形態において、増幅は、Ｔ７媒介性ＮＡＳＢＡ反応を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、核酸伸長反応は、核酸ポリメラーゼの使用を包含する。本明細書で使用される場合、語句「核酸ポリメラーゼ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」とは、ヌクレオシド三リン酸のテンプレート依存性重合を触媒して、テンプレート核酸配列に相補的なプライマー伸長生成物を形成する酵素をいう。核酸ポリメラーゼ酵素は、アニールしたプライマーの３’末端における合成を開始し、そのテンプレートの５’末端に向かう方向で進む。多くの核酸ポリメラーゼは、当該分野で公知であり、市販されている。核酸ポリメラーゼのうちの１グループは、熱安定性である。すなわち、それらは、相補的な核酸のアニールした鎖を変性させるために十分な温度（例えば、９４℃、または時にはより高い）に供された後に機能を保持する。増幅のためのプロトコルの非限定的な例は、以下の条件下でポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｔａｑ、ＶｅｒａＳｅｑ）を使用することを包含する：９８℃で３０秒間、続いて、以下を含む１４〜２２回のサイクル（９８℃で１０秒間での融解、続いて、６８℃で３０秒間のアニーリング、続いて、７２℃で３分間の伸長、続いて、４℃での反応の保持）。しかし、他の適切な反応条件が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、アニーリング／伸長温度は、塩濃度における差異を考慮するために調節され得る（例えば、より高い塩濃度に対して３℃高い）。いくつかの実施形態において、例えば、９８℃から６５℃への傾斜率を（例えば、１℃／秒、０．５℃／秒、０．２８℃／秒、０．１℃／秒またはよりゆっくりと）遅らせることは、より多重化したサンプル中でプライマー性能および適用範囲の均一性を改善する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、容器温度を（例えば、種々の温度範囲の間でサイクルさせ、制御された上昇率または下降率を有することによって）変更して、増幅を促進するように構成される。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、その酵素がテンプレート依存性伸長を行う条件下で使用される。いくつかの実施形態において、その核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＶｅｒａＳｅｑ  ＵＬｔｒａポリメラーゼ、ＶｅｒａＳｅｑ  ＨＦ  ２．０ポリメラーゼ、ＥｎｚＳｃｒｉｐｔ、または別の適切なポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素ではない。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレートに対して作用する。いくつかの実施形態において、その核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレートに対して作用する。いくつかの実施形態において、伸長反応は、相補的なＤＮＡ分子を生成するために、ＲＮＡに対して行われる逆転写を包含する（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、マウスのモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ＨＩＶ−２逆転写酵素、または別の適切な逆転写酵素である。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、核酸増幅反応は、反応混合物の加熱を概して要する鎖分離工程を包含するサイクルを要する。本明細書で使用される場合、用語「鎖分離（ｓｔｒａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）」または「鎖を分離する（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｎｄ）」とは、相補的な２本鎖分子が、オリゴヌクレオチドプライマーにアニールするために利用可能な２本の単一の鎖へと分離されるようにする核酸サンプルの処理を意味する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法に従う鎖分離は、核酸サンプルをその融解点（Ｔｍ）を上回って加熱することによって達成される。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼに適した反応調製物における核酸分子を含むサンプルに関しては、９４℃への加熱は、鎖分離を達成するために十分である。いくつかの実施形態において、適切な反応調製物は、１種またはこれより多くの塩（例えば、１〜１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、少なくとも１種の緩衝化剤（例えば、１〜２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、およびキャリア（例えば、０．０１〜０．５％  ＢＳＡ）を含む。適切な緩衝液の非限定的な例は、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、０．５〜３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．１％  ＢＳＡを含む。適切な緩衝液のさらなる非限定的な例は、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ８．８）、０．５〜５ｍＭ（例えば、およそ０．５ｍＭ、およそ１ｍＭ、およそ２ｍＭ、およそ３ｍＭ、およそ４ｍＭ、およそ５ｍＭ）  ＭｇＣｌ２、および０．１％  ＢＳＡを含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、核酸増幅は、標的核酸に特徴的な鎖を有する核酸テンプレートにプライマーをアニールさせることを包含する。いくつかの実施形態において、標的核酸の鎖は、テンプレート核酸として働き得る。本明細書で使用される場合、用語「アニールする（ａｎｎｅａｌ）とは、２つの核酸の間での１つまたはこれより多くの相補的塩基対の形成をいう。いくつかの実施形態において、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）は、２つの相補的または実質的に相補的な核酸鎖が一緒にハイブリダイズすることを要する。いくつかの実施形態において、伸長反応の状況では、アニーリングは、テンプレート依存性ポリメラーゼ酵素のプライマー伸長基質が形成されるように、テンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーションを要する。いくつかの実施形態において、アニーリング（例えば、プライマーと核酸テンプレートとの間）の条件は、プライマーの長さおよび配列に基づいて変動し得る。いくつかの実施形態において、アニーリングの条件は、プライマーのＴｍ（例えば、計算されたＴｍ）に基づく。いくつかの実施形態において、伸長レジメンのアニーリング工程は、鎖分離工程後の温度を、プライマーのＴｍ（例えば、計算されたＴｍ）に基づく温度へと、このようなアニーリングを可能にするために十分な時間にわたって低下させることを要する。いくつかの実施形態において、Ｔｍは、多くのアルゴリズム（例えば、ＯＬＩＧＯＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｃ．  Ｃｏｌｏｒａｄｏ）プライマーデザインソフトウェアおよびＶＥＮＴＲＯ  ＮＴＩＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）プライマーデザインソフトウェアおよびインターネット上で入手可能なプログラム（Ｐｒｉｍｅｒ３、Ｏｌｉｇｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ、およびＮｅｔＰｒｉｍｅｒ（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ；  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ；およびワールドワイドウェブ上で（例えば、ａｔ  ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｎｅｔｐｒｉｍｅｒ／ｎｅｔｐｒｌａｕｎｃｈ／Ｈｅｌｐ／ｘｎｅｔｐｒｌａｕｎｃｈ．ｈｔｍｌにおいて）無料で入手可能なものが挙げられる）のうちのいずれかを使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、プライマーのＴｍは、以下の式を使用して計算され得る（これは、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒソフトウェアによって使用され、Ｆｒｉｅｉｒ，ら  ＰＮＡＳ  １９８６  ８３：９３７３−９３７７（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）により詳細に記載される）。
【数１】
2019537439.tif 000009
ここで：ΔＨは，ヘリックス形成のエンタルピーであり；ΔＳは、ヘリックス形成のエントロピーであり；Ｒは、モル気体定数（１．９８７ｃａｌ／℃×ｍｏｌ）であり；Ｃは、核酸濃度であり；そして［Ｋ＋］は、塩濃度である。大部分の増幅レジメンに関して、アニーリング温度は、推定Ｔｍより約５℃低いように選択されるが、例えば、推定Ｔｍより５℃より大きく低い温度（例えば、６℃低い、８℃低い、１０℃低い、またはより低い）であり得るように、Ｔｍにより近く、Ｔｍを上回る温度（例えば、推定Ｔｍより１℃〜５℃の間または低い、推定Ｔｍより１℃〜５℃の間高い）が使用され得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度がＴｍに近いほど、アニーリングはより特異的になる。いくつかの実施形態において、伸長反応の間（例えば、ＰＣＲ増幅レジメンの状況内で）プライマーアニーリングに使用される時間は、少なくとも部分的に、反応の容積に基づいて決定される（例えば、容積が大きいほど、より長い時間を要する）。いくつかの実施形態において、伸長反応の間に（例えば、ＰＣＲ増幅レジメンの状況内で）プライマーアニーリングに使用される時間は、少なくとも部分的に、プライマーおよびテンプレート濃度に基づいて決定される（例えば、テンプレートに対するプライマーの相対的濃度が高いほど、より低い相対的濃度より、より短い時間を要する）。いくつかの実施形態において、容積および相対的プライマー／テンプレート濃度に依存して、伸長反応における（例えば、増幅レジメンの状況内での）プライマーアニーリング工程は、１秒〜５分、１０秒〜２分、または３０秒〜２分の範囲内であり得る。本明細書で使用される場合、「実質的にアニールする（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ａｎｎｅａｌ）」とは、相補的塩基対が、ＰＣＲ増幅レジメンの状況において使用される場合に、特異的に増幅された生成物の検出可能なレベルを生じるために十分である２つの核酸の間で形成する程度を指す。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、用語「ポリメラーゼ伸長（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）とは、核酸ポリメラーゼによる、核酸テンプレートにアニールされるプライマーの３’末端への少なくとも１個の相補的ヌクレオチドのテンプレート依存性付加をいう。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長は、例えば、テンプレートの全長に相当するヌクレオチドまでおよびそれを含む１個より多くのヌクレオチドを付加する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長の条件は、少なくとも部分的に、使用されるポリメラーゼが何であるかに基づく。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長に使用されるテンプレートは、その酵素の既知の活性特性に基づく。アニーリング温度がその酵素の至適温度を下回るいくつかの実施形態において、より低い伸長温度を使用することは、許容可能であり得る。いくつかの実施形態において、酵素は、それらの至適伸長温度より下で少なくとも部分的活性を保持し得る。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長（例えば、Ｔａｑポリメラーゼおよびその改変体のような熱安定性ポリメラーゼで行われる）は、６５℃〜７５℃または６８℃〜７２℃で行われる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、ＰＣＲ増幅レジメンの各サイクルにおいて核酸テンプレートにアニールされるプライマーのポリメラーゼ伸長を要する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長は、比較的強い鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して行われる。いくつかの実施形態において、強い鎖置換を有するポリメラーゼは、融合物（例えば、５’融合物）を検出する目的で核酸を調製するために有用である。いくつかの実施形態において、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）は、長いライブラリーフラグメントを生成するために有用である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、プライマー伸長は、アニールしたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を可能にする条件下で行われる。本明細書で使用される場合、用語「伸長生成物が生成されるようにアニールしたオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｐｅｒｍｉｔ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｎｅａｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｃｈ  ｔｈａｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｒｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）」とは、核酸ポリメラーゼがプライマー伸長を触媒する条件のセット（例えば、温度、塩および補因子濃度、ｐＨ、ならびに酵素濃度）をいう。いくつかの実施形態において、このような条件は、少なくとも部分的に、使用されている核酸ポリメラーゼに基づく。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、適切な反応調製物中でプライマー伸長反応を行い得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、適切な反応調製物は、１つまたはこれより多くの塩（例えば、１〜１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、少なくとも１つの緩衝化剤（例えば、１〜２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、キャリア（例えば、０．０１〜０．５％  ＢＳＡ）、および１つまたはこれより多くのＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰの各々が１０〜２００μＭ）を含む。条件の非限定的なセットは、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）がプライマー伸長を触媒する７２℃において５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、０．５〜３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  各ｄＮＴＰ、および０．１％  ＢＳＡである。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、適切な反応調製物は、１種またはこれより多くの塩（例えば、１〜１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．５〜５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、少なくとも１種の緩衝化剤（例えば、１〜２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、キャリア（例えば、０．０１〜０．５％  ＢＳＡ）、および１またはこれより多くのＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰの各々が５０〜３５０μＭ）を含む。条件の非限定的なセットは、７２℃において、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ８．８）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  各ｄＮＴＰ、および０．１％  ＢＳＡであり、このセットの下で、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）がプライマー伸長を触媒する。条件のさらなる非限定的なセットは、７２℃において、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ８．８）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２６６μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＣＴＰ、１３３μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、および０．１％  ＢＳＡであり、このセットの下で、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）がプライマー伸長を触媒する。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、開始および伸長の条件は、適切な緩衝液中に、１種、２種、３種または４種の種々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰから選択される）および重合誘導剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在を含み得る。いくつかの実施形態において、「緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）」とは、溶媒（例えば、水性溶媒）に加えて、ｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす適切な補因子および試薬を含み得る。いくつかの実施形態において、その２種、３種または４種の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸は、等モルの、またはおよそ等モルの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、その２種、３種または４種の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸は、その技術の特定の実行に適していると経験的に決定された異なる濃度で存在する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、核酸増幅は、５回まで、１０まで、２０まで、３０まで、４０まで、またはこれより多くのラウンド（サイクル）の増幅を要する。いくつかの実施形態において、核酸増幅は、長さが５サイクル〜２０サイクルのＰＣＲ増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、増幅工程は、長さが１０サイクル〜２０サイクルのＰＣＲ増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、各増幅工程は、長さが１２サイクル〜１６サイクルのＰＣＲ増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、７０℃未満であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、７２℃未満であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、約６５℃であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、約６１〜約７２℃であり得る。
【０１４２】
種々の実施形態において、本明細書で記載される方法および組成物は、本明細書で記載されるプライマーのタイプのうちの１つまたはこれより多くを用いてＰＣＲ増幅レジメンを行うことに関する。本明細書で使用される場合、「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」とは、核酸テンプレートに特異的にアニーリングし、テンプレート依存性ポリメラーゼの基質として働く３’末端を提供して、そのテンプレートに相補的な伸長生成物を生成し得るオリゴヌクレオチドをいう。いくつかの実施形態において、プライマーは、プライマーおよびその相補体がアニールして２つの鎖を形成し得るようにする１本鎖である。本明細書に記載される方法および組成物に従うプライマーは、長さが３００ヌクレオチド以下であり、例えば、３００以下、または２５０、または２００、または１５０、または１００、または９０、または８０、または７０、または６０、または５０、または４０、または３０、またはこれより少ない、または２０もしくはこれより少ない、または１５もしくはこれより少ないが、長さが少なくとも６ヌクレオチドであるハイブリダイゼーション配列（例えば、核酸テンプレートとアニールする配列）を含み得る。いくつかの実施形態において、プライマーのハイブリダイゼーション配列は、長さが６〜５０ヌクレオチド、長さが６〜３５ヌクレオチド、長さが６〜２０ヌクレオチド、長さが１０〜２５ヌクレオチドであり得る。
【０１４３】
任意の適切な方法が、オリゴヌクレオチドおよびプライマーを合成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、市販の供給源は、本明細書で記載される方法および組成物における使用のためのプライマーを提供するために適したオリゴヌクレオチド合成サービス（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ  Ｃｕｓｔｏｍ  ＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，  ＩＡ）からの特注のＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏ）を提供する。
【０１４４】
標的核酸
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸（ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」、「標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」および「標的ヌクレオチド配列を含む核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、目的の核酸分子（例えば、分析されるべき核酸）をいう。いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知のまたは所定のヌクレオチド配列）および決定されるべき隣接するヌクレオチド配列（これは、未知の配列といわれ得る）の両方を含む。標的核酸は、任意の適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、２本鎖である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ゲノムＤＮＡまたは染色体ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、１本鎖である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｃｆＤＮＡ、ｃｆＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）を含む。
【０１４５】
本明細書で記載される方法における使用に適したシーケンシング法のうちの多くは、数十から数百のヌクレオチド塩基の至適リード長でのシーケンシング実行を提供する（例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙは、２００〜４００ｂｐのリード長を生成し得る）。例えば、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡによって含まれる標的核酸は、この至適リード長より実質的に長い核酸分子によって含まれ得る。第２の増幅工程から生じる増幅された核酸部分が特定のシーケンシング技術における使用のための適切な長さ（例えば、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ）のものであるために、その既知の標的ヌクレオチド配列とアダプターがライゲーションされ得る標的核酸の末端との間の平均距離は、選択された技術の至適リード長に可能な限り近くであるべきである。例えば、所定のシーケンシング技術の至適リード長が２００ｂｐである場合、本明細書で記載される方法に従って増幅される核酸分子は、約４００ｂｐまたはこれより短い平均長を有するべきである。しかし、いくつかの実施形態において、核酸分子が長さ４００ｂｐを超える場合に本明細書で記載される技術が実行され得ることは、認識されるべきである。例えば、いくつかの実施形態において、核酸フラグメントは、およそ４００個またはこれより多くのヌクレオチド、５００個またはこれより多くのヌクレオチド、６００個またはこれより多くのヌクレオチド、７００個またはこれより多くのヌクレオチド、８００個またはこれより多くのヌクレオチド、９００個またはこれより多くのヌクレオチド、１０００個またはこれより多くのヌクレオチド、１５００個またはこれより多くのヌクレオチド、２０００個またはこれより多くのヌクレオチド、２５００個またはこれより多くのヌクレオチド、３０００個またはこれより多くのヌクレオチド、４０００個またはこれより多くのヌクレオチド、５０００個またはこれより多くのヌクレオチド、１００００個またはこれより多くのヌクレオチドであり得る。
【０１４６】
例えば、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡによって含まれる標的核酸は、任意の所望のサイズのフラグメントを生成するために、剪断され得る（例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得る）。機械的剪断プロセスの非限定的な例としては、超音波処理、ネブライゼーション、およびＣｏｖａｒｉｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）から市販されるＡＦＡＴＭ剪断技術が挙げられる。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡによって含まれる標的核酸は、超音波処理によって機械的に剪断され得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、その標的核酸がＲＮＡによって含まれる場合、そのサンプルは、ＤＮＡテンプレートを生成するために逆転写酵素レジメンに供され得る。いくつかの実施形態において、次いで、そのＤＮＡテンプレートは、剪断され得る。いくつかの実施形態において、そのＤＮＡテンプレートは、剪断されない。例えば、いくつかの実施形態において、逆転写酵素レジメンの間に使用されるプライマーの濃度は、生成物ｃＤＮＡが適切な「フラグメント化（ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ）」された長さのものであるように調節され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、逆転写酵素レジメンを行う前に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡを含むサンプルは、新鮮なまたは分解された標本のいずれかから抽出された全核酸を使用して；ｃＤＮＡシーケンシングのためにゲノムＤＮＡを除去する必要性なしに；ｃＤＮＡシーケンシングのためにリボソームＲＮＡを枯渇させる必要性なしに；工程のうちのいずれかにおける機械的剪断または酵素による剪断の必要性もなしに；ランダムヘキサマーを使用して２本鎖ｃＤＮＡ合成のためにＲＮＡを供することによって；およびその核酸を末端修復、リン酸化、およびアデニル化に供することによって、本明細書で記載される方法において使用され得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列は、遺伝子再編成によって含まれ得る。本明細書で記載される方法は、遺伝子再編成の存在および／または何であるかを決定するために適合される。なぜならその遺伝子再編成の半分のみが何であるかが、先に決定されなければならないからである（すなわち、遺伝子特異的プライマーによって標的化されるべき遺伝子再編成の半分）。いくつかの実施形態において、その遺伝子再編成は、発がん遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、その遺伝子再編成は、融合発がん遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、その遺伝子再編成は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え生成物を含み得る。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、用語「既知の標的ヌクレオチド配列（ｋｎｏｗｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「標的ヌクレオチド配列（ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、その配列（例えば、その核酸が何であるかおよびその核酸のヌクレオチド塩基の順序）が既知である標的核酸の一部をいう。例えば、いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列は、既知であるかまたはその核酸の隣接する未知の配列のインターロゲーションより先に決定された核酸のヌクレオチド配列である。既知の標的ヌクレオチド配列は、任意の適切な長さであり得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列）は、１０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、３０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、４０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、５０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、１００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、２００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、３００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、４００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、５００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、６００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、７００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、８００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、９００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、１０００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、１５００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、２０００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、２５００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、３０００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、４０００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、５０００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、１００００個もしくはこれより多くのヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列）は、１０〜１００個のヌクレオチド、１０〜５００個のヌクレオチド、１０〜１０００個のヌクレオチド、１００〜５００個のヌクレオチド、１００〜１０００個のヌクレオチド、５００〜１０００個のヌクレオチド、５００〜５０００個のヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、方法は、核酸の連続する（または隣接する）部分の配列を決定するために、本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、用語「に連続するヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｔｏ）」とは、別のヌクレオチド配列（例えば、既知のヌクレオチド配列）の直ぐ上流または下流にある核酸分子（例えば、標的核酸）のヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列は、任意の適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列は、１ｋｂまたはこれより短いヌクレオチド配列、例えば、１ｋｂまたはこれより短いヌクレオチド配列、７５０ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、５００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、４００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、３００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、２００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、１００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列を含む。サンプルが既知の標的ヌクレオチド配列を含む種々の標的核酸（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列が、そのゲノムに、または別個の同一でない染色体上に何度も出現する細胞）を含むいくつかの実施形態において、その既知の標的ヌクレオチド配列「に連続するヌクレオチド配列」を含む多数の配列が存在し得る。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列（またはそのヌクレオチド配列）を決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ａ（ｏｒ  ｔｈｅ）  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、核酸のヌクレオチド塩基が何であるかおよびその相対的位置を決定することを指す。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、既知の標的核酸は、遺伝子再編成から生じる融合配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、遺伝子再編成の存在および／または何であるかを決定するために適している。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成の１つの部分が何であるかは、先に既知であり（例えば、遺伝子特異的プライマーによって標的化されるべき遺伝子再編成の一部）、他の部分の配列は、本明細書で開示される方法を使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、発がん遺伝子を要し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、融合発がん遺伝子を含み得る。
【０１５３】
分子バーコードおよびインデックス配列
いくつかの実施形態において、プライマーおよび／またはアダプターは、識別子配列（例えば、バーコード、インデックス）、シーケンシングプライマーハイブリダイゼーション配列（例えば、Ｒｄ１）、およびアダプター配列のようなさらなる配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、次世代シーケンシングシステムとともに使用される配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａベースのシーケンシング技術のためのＰ５およびＰ７配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング技術と適合性のＰ１およびＡである。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本明細書で使用される場合、「バーコード（ｂａｒｃｏｄｅ）」、「分子バーコード（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｒｃｏｄｅ）」、および「分子バーコードタグ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｒｃｏｄｅ  ｔａｇ）」とは、交換可能に使用され得、そして一般に、その特定の核酸に関する識別子として有用であるアダプター核酸（その特定の核酸にアダプター核酸がライゲーションされる）の領域を指す。いくつかの実施形態において、分子バーコードは、その核酸に関して特有の識別子を提供するランダム化した核酸配列（その核酸に対してそのランダム化した核酸配列がライゲーションされる）を含む。いくつかの実施形態において、分子バーコードは、特有のフラグメントを同定し、サンプルに由来するシーケンシングリードを「重複削除する（ｄｅ−ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）」ために使用され得る。いくつかの実施形態において、分子バーコードは、ＰＣＲ重複を同定および除去するために使用され得る。いくつかの実施形態において、分子バーコードは、長さが２〜２５ヌクレオチド、長さが２〜１５ヌクレオチド、長さが２〜１０ヌクレオチド、長さが２〜６ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、分子バーコードは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、分子バーコードは、８個のヌクレオチドを含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本明細書で使用される場合、「インデックス（ｉｎｄｅｘ）」、「インデックス配列（ｉｎｄｅｘ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「インデックス領域（ｉｎｄｅｘ  ｒｅｇｉｏｎ）」、および「サンプルインデックス（ｓａｍｐｌｅ  ｉｎｄｅｘ）」とは、交換可能に使用され得、そして一般に、そのライゲーションされた核酸が属する集団に関する識別子として有用であるアダプター核酸の領域を指す。いくつかの実施形態において、インデックスは、共通するライブラリーに属する配列の集まりを同定するために使用され得る固定された核酸配列を含む。例えば、インデックスは、核酸に対応するサンプルを同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、インデックスは、例えば、共有されるかまたは共通する特性（例えば、ライブラリーの他の核酸の間で共通する）に関連する核酸の供給源識別子、位置識別子、日付もしくは時間識別子（例えば、サンプリングまたは処理の日付もしくは時間）、または他の識別子として使用され得る。いくつかの実施形態において、このようなインデックス配列は、核酸の集団に存在する核酸の異なる局面を同定するために有用である。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、標的核酸に関する供給源または位置識別子を提供し得る。例えば、インデックス配列は、核酸が得られる患者を同定するように働き得る。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、１つの反応（例えば、１つのフローセルで行われる）での多数の異なるサンプルのシーケンシングを可能にする。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、個々のシーケンシング反応を検出する目的で配列イメージャーを配向するために使用され得る。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、長さが２〜２５ヌクレオチド、長さが２〜１５ヌクレオチド、長さが２〜１０ヌクレオチド、長さが２〜６ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、インデックスは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、テール付加ランダムプライマーの集団が、本明細書で記載される方法に従って使用される場合、多数の区別可能な増幅生成物は、増幅後に存在し得る。いくつかの実施形態において、テール付加ランダムプライマーは、サンプルの核酸分子全体を通じて種々の位置においてハイブリダイズするので、標的特異的プライマーのセットは、１回より多くのハイブリダイゼーション事象によって作られる伸長生成物をハイブリダイズ（および増幅）し得る。例えば、１つのテール付加ランダムプライマーは、標的特異的プライマーハイブリダイゼーション部位から第１の距離（例えば、１００ヌクレオチド）においてハイブリダイズし得、別のテール付加ランダムプライマーは、標的特異的プライマーハイブリダイゼーション部位から第２の距離（例えば、２００ヌクレオチド）においてハイブリダイズし得、それによって、２つの増幅生成物（例えば、約１００ｂｐを含む第１の増幅生成物および約２００ｂｐを含む第２の増幅生成物）を生じ得る。いくつかの実施形態において、これらの多数の増幅生成物は各々、次世代シーケンシング技術を使用してシーケンシングされ得る。いくつかの実施形態において、これらの多数の増幅生成物のシーケンシングは、増幅またはシーケンシングプロセスの間に導入される配列エラーを検出するために互いと比較され得る多数の重なり合う配列リードを提供することから有利である。いくつかの実施形態において、個々の増幅生成物（例えば、単一の分子に由来する）が整列され得、それらが特定の塩基において存在する配列の中で異なる場合、ＰＣＲおよび／またはシーケンシングのアーチファクトまたはエラーが存在し得る。
【０１５７】
ＤＮＡ剪断／フラグメント化
本明細書で記載される核酸分子は、任意の所望のサイズのフラグメントを生成するために、剪断され得る（例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得るか、ネブライザーにより剪断され得る）。機械的剪断プロセスの非限定的な例としては、超音波処理、ネブライゼーション、およびＣｏｖａｒｉｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）から市販されるＡＦＡＴＭ剪断技術が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸は、超音波処理によって機械的に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、剪断も消化もされない。いくつかの実施形態において、調製工程の核酸生成物（例えば、伸長生成物、増幅生成物）は、剪断も酵素消化もされない。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、標的核酸配列がＲＮＡを含む場合、そのサンプルは、ＤＮＡテンプレートを生成するために逆転写酵素レジメンに供され得、次いで、そのＤＮＡテンプレートは、剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、逆転写酵素レジメンを行う前に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡを含むサンプルは、新鮮なまたは分解された標本のいずれかから抽出された全核酸を使用して；ｃＤＮＡシーケンシングのためにゲノムＤＮＡを除去する必要性なしに；ｃＤＮＡシーケンシングのためにリボソームＲＮＡを枯渇させる必要性なしに；工程のうちのいずれかにおける機械的剪断または酵素による剪断の必要性もなしに；ランダムヘキサマーを使用して２本鎖ｃＤＮＡ合成のためにＲＮＡを供することによって、本明細書で記載される方法において使用され得る。
【０１５９】
シーケンシング
いくつかの局面において、本明細書で記載される技術は、オリゴヌクレオチドシーケンシングのために核酸サンプルを富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングは、次世代シーケンシング法によって行われ得る。本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」とは、数千から数百万のシーケンシング反応を並行して行いかつ読み取ることに起因して、従来のシーケンシング法（例えば、サンガーシーケンシング法）で可能な速度を上回る速度でオリゴヌクレオチドをシーケンシングする能力を有するオリゴヌクレオチドシーケンシング技術をいう。次世代シーケンシング法／プラットフォームの非限定的な例としては、以下が挙げられる：大規模並行シグネチャーシーケンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；４５４パイロシーケンシング（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）；固相可逆的ダイターミネーターシーケンシング（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ，  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ）；ＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；イオン半導体シーケンシング（Ｉｏｎ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＩＯＮ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）；ＤＮＡナノボールシーケンシング（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）；ならびにＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎ  Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能な技術。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングプライマーは、選択された次世代シーケンシング法と適合性の部分を含み得る。次世代シーケンシング技術およびその制約、ならびに関連したシーケンシングプライマーのデザインパラメーターは、当該分野で周知である（例えば、Ｓｈｅｎｄｕｒｅら，「Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００８，  ｖｏｌ．  ２６，  Ｎｏ．  １０，  １１３５−１１４５；Ｍａｒｄｉｓ，  「Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００７，  ｖｏｌ．  ２４，  Ｎｏ．  ３，  ｐｐ．  １３３−１４１；  Ｓｕら，  「Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ，  ２０１１，  １１（３）：３３３−４３；Ｚｈａｎｇら，  「Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ」，  Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ２０１１，  ３８（３）：９５−１０９；（Ｎｙｒｅｎ，  Ｐ．ら  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０８：  １７１７５（１９９３）；  Ｂｅｎｔｌｅｙ，  Ｄ．  Ｒ．  Ｃｕｒｒ  ���ｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  １６：５４５−５２（２００６）；  Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ，  Ｒ．  Ｌ．ら，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｔｏｄａｙ  １３：５６９−７７（２００８）；米国特許第７，２８２，３３７号；米国特許第７，２７９，５６３号；米国特許第７，２２６，７２０号；米国特許第７，２２０，５４９号；米国特許第７，１６９，５６０号；米国特許第６，８１８，３９５号；米国特許第６，９１１，３４５号；米国公開番号２００６／０２５２０７７；同２００７／００７０３４９；および同２００７００７０３４９を参照のこと；これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される）。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、そのシーケンシング工程は、第１のおよび第２のシーケンシングプライマーの使用に依拠する。いくつかの実施形態において、その第１のおよび第２のシーケンシングプライマーは、本明細書で記載されるとおりの次世代シーケンシング法と適合性であるように選択される。
【０１６１】
シーケンシングリードをゲノムおよび／またはｃＤＮＡ配列の既知の配列データベースに整列させるための方法は、当該分野で周知であり、ソフトウェアは、このプロセスのために市販される。いくつかの実施形態において、それらの全体において、野生型配列データベースにマッピングされないリード（より小さいシーケンシングプライマーおよび／またはアダプターヌクレオチド配列）は、ゲノム再編成または大きなインデル変異であり得る。いくつかの実施形態において、ゲノム中の多数の位置にマッピングされる配列を含むリード（より小さいシーケンシングプライマーおよび／またはアダプターヌクレオチド配列）は、ゲノム再編成であり得る。いくつかの実施形態において、連続する配列、または「コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）」に重なり合うリードのデノボアセンブリが構築され得、シーケンシングリードのアラインメントにおいて利用され得る。いくつかの実施形態において、公にアクセス可能なゲノミクスデータベースに依拠しないホットスポット参照が利用され得る。
【０１６２】
サンプル
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、標的核酸、標的ヌクレオチド配列を含む核酸）は、適切なサンプル（例えば、食品サンプル、環境サンプル、生物学的サンプル、例えば、血液サンプルなど）中に存在するかまたはこれらサンプルから得られる。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、被験体から得られる生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは、被験体から得られる診断サンプルであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、タンパク質、細胞、流体、生物学的流体、保存剤、および／または他の物質をさらに含み得る。非限定的な例によれば、サンプルは、口内スワブ、血液、血清、血漿、喀痰、脳脊髄液、尿、涙液、肺胞単離物、胸膜液、心膜液、嚢胞液、腫瘍組織、組織、生検物、唾液、吸引物、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、切除物または生検物によって得られ得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、そのサンプルは、遺伝子変化（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）と関連する疾患（例えば、がんまたは遺伝性疾患）の処置の必要性のある被験体から得られ得る。いくつかの実施形態において、既知の標的配列は、疾患関連遺伝子に存在する。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、サンプルは、がんの処置の必要性のある被験体から得られる。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、腫瘍細胞の集団、例えば、少なくとも１個の腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、腫瘍生検物（非処理の生検組織物または処理生検組織物（例えば、ホルマリン固定および／またはパラフィン包埋した生検組織）が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、そのサンプルは、新たに集められる。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、本明細書で記載される方法および組成物において使用される前に貯蔵される。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、非処理サンプルである。本明細書で使用される場合、「非処理サンプル（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｓａｍｐｌｅ）」とは、溶液中での希釈および／または懸濁を除いて、いかなる事前のサンプル事前処理をも有しなかった生物学的サンプルをいう。いくつかの実施形態において、サンプルは、被験体から得られ、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に保存または処理される。非限定的な例によれば、サンプルは、パラフィンワックス中に包埋され得るか、冷蔵され得るか、または凍結され得る。凍結サンプルは、本明細書で記載される方法および組成物に従って、核酸の存在を決定する前に融解され得る。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、処理された（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｏｒ  ｔｒｅａｔｅｄ）サンプルであり得る。サンプルを処理する（ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）ための例示的な方法としては、遠心分離、濾過、超音波処理、ホモジナイゼーション、加熱、凍結および融解、保存剤（例えば、抗凝固剤またはヌクレアーゼインヒビター）との接触、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、サンプルは、化学的および／または生物学的試薬で処理され得る。化学的および／または生物学的試薬は、処理および／または貯蔵の間に、サンプルの安定性またはそのサンプルによって含まれる核酸を保護および／または維持するために使用され得る。さらに、または代わりに、化学的および／または生物学的試薬は、そのサンプルの他の構成要素から核酸を放出するために使用され得る。非限定的な例によれば、血液サンプルは、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に、抗凝固剤で処理され得る。核酸分析のためのサンプルの処理、保存、または処理に適切な方法およびプロセスは、本明細書で開示される方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、清澄にした流体サンプルであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、その清澄にされる流体サンプルを含む上清の低速遠心分離（例えば、３，０００×ｇまたはこれより小さい）および収集によって清澄にされ得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、サンプル中に存在する核酸は、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に単離され得るか、富化され得るか、または精製され得る。サンプルから核酸を単離、富化、または精製するために適した方法は、使用され得る。例えば、ゲノムＤＮＡを種々のサンプルタイプから単離するためのキットは、市販されている（例えば、カタログ番号５１１０４、５１３０４、５６５０４、および５６４０４；  Ｑｉａｇｅｎ；  Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，  ＭＤ）。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、例えば、標的核酸のシーケンシングの前に、標的核酸を富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、富化されるべき標的核酸の一方の末端の配列は、シーケンシングの前には知られていない。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、次世代シーケンシング技術を使用してヌクレオチド配列を決定する前に、特定のヌクレオチド配列を富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、特定のヌクレオチド配列を富化するための方法は、ハイブリダイゼーション富化を含まない。
【０１６８】
標的遺伝子および治療適用
本開示の局面は、免疫系の遺伝的分析において有用であり得る。しかし、本明細書で記載される技術が任意の標的遺伝子または目的の核酸に適用され得ることは、認識されるべきである。  本明細書で記載される技術のいくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列の決定は、疾患の処置と直接関連する情報を提供し得る。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、疾患を処置することを補助するために使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、遺伝的変化と関連する疾患の処置の必要性のある被験体に由来し得る。いくつかの実施形態において、既知の標的配列は、疾患関連遺伝子、例えば、発がん遺伝子の配列である。いくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列および／またはその既知のオリゴヌクレオチド標的配列は、疾患に関連する変異または遺伝的異常（例えば、ＳＮＰ、挿入、欠失、および／または遺伝子再編成）を含み得る。いくつかの実施形態において、サンプル中に存在する既知の標的配列に連続する配列および／または既知の標的配列は、遺伝子再編成生成物の配列を含んだ。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、発がん遺伝子、例えば、融合発がん遺伝子であり得る。
【０１６９】
がんのある種の処置は、ある種の発がん遺伝子を含む腫瘍に対して特に有効である。例えば、所定の融合発がん遺伝子の作用または発現を標的化する処置薬剤は、その融合発がん遺伝子を含む腫瘍に対して有効であり得るが、その融合発がん遺伝子を欠く腫瘍に対しては有効でない。本明細書で記載される方法は、発がん遺伝子状態（例えば、変異、ＳＮＰ、および／または再編成）を明らかにする特定の配列の決定を促進し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、隣接する領域の配列が既知である場合に、特定の配列の決定をさらに可能にし得る。例えば、本明細書で記載される方法は、精密な位置および／または再編成パートナーが、本明細書で記載される方法が行われる前に既知ではない既知の遺伝子（例えば、発がん遺伝子）を要する遺伝子再編成の存在および何であるかを決定し得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、被験体は、（例えば、標的化がん治療であるＥＧＦＲ−ＴＫＩを用いた）肺がんの処置の必要性がある。いくつかの実施形態において、例えば、そのサンプルが、肺がんの処置の必要性のある被験体から得られる場合、その既知の標的配列は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、およびＲＥＴの群から選択される遺伝子に由来する配列を含み得る。よって、いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、またはＲＥＴを含む融合物を生じる。ＡＬＫ、ＲＯＳ１、またはＲＥＴを含む遺伝子再編成の非限定的な例は、例えば、以下に記載される：Ｓｏｄａら  Ｎａｔｕｒｅ  ２００７  ４４８５６１−６：  Ｒｉｋｏｖａら  Ｃｅｌｌ  ２００７  １３１：１１９０−１２０３；  Ｋｏｈｎｏら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２  １８：３７５−７；  Ｔａｋｏｕｃｈｉら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２  １８：３７８−８１；これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される。しかし、再編成に関与する第２の遺伝子の遺伝子再編成の精密な位置および何であるかが予め既知でなくてもよいことは、認識されるべきである。よって、本明細書で記載される方法において、このような再編成の存在および何であるかは、遺伝子再編成に関与する第２の遺伝子の再編成の位置または何であるかを知る必要なしに検出され得る。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、その既知の標的配列は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、およびＲＥＴの群から選択される遺伝子に由来する配列を含み得る。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍から得られるサンプル中のＡＬＫの遺伝子再編成の存在は、その腫瘍が以下からなる群より選択される処置での処置に影響を受けやすいことを示し得る：ＡＬＫインヒビター；ＥＧＦＲ；クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４１０６６）；ＡＰ２６１１３；ＬＤＫ３７８；３−３９；ＡＦ８０２；ＩＰＩ−５０４；ＡＳＰ３０２６；ＡＰ−２６１１３；Ｘ−３９６；ＧＳＫ−１８３８７０５Ａ；ＣＨ５４２４８０２；ＡＬＫキナーゼ活性のジアミノおよびアミノピリミジンインヒビター（例えば、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４およびＰＦ−０２３４１０６６（例えば、Ｇａｌｋｉｎら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ２００７，  １０４：２７０−２７５；  Ｚｏｕら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ２００７，  ６７：４４０８−４４１７；  Ｈａｌｌｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｐａｌｍｅｒ  Ｆ１０００  Ｍｅｄ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１１  ３：２１；  Ｓａｋａｍｏｔｏら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０１１  １９：６７９−６９０；およびＷＯ  ０４／０７９３２６で開示される分子を参照のこと）。前述の参考文献の全ては、それらの全体において本明細書に参考として援用される。ＡＬＫインヒビターは、ＡＬＫまたはその一部の発現および／またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤（ＡＬＫまたはその一部の発現および／または活性を低減する例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む）を含み得る。本明細書で使用される場合「未分化リンパ腫キナーゼ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｋｉｎａｓｅ）」または「ＡＬＫ」とは、代表的には野生型形態におけるニューロン調節に関与する膜貫通チロシンキナーゼ（ｔｙＲＯＳ１ｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）をいう。ＡＬＫ遺伝子およびｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、多くの種（ヒトを含む）に関して公知である（例えば、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２３８の下で註釈されるとおり）。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍から得られるサンプル中のＲＯＳ１の遺伝子再編成の存在は、腫瘍がＲＯＳ１インヒビターおよび上記で記載されるとおりのＡＬＫインヒビター（例えば、ククリゾチニブ）からなる群より選択される処置での処置に影響を受けやすいことを示し得る。ＲＯＳ１インヒビターは、ＲＯＳ１またはその一部の発現および／またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤（ＲＯＳ１またはその一部の発現および／または活性を低減する、例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む）を含み得る。本明細書で使用される場合「ｃ−ｒｏｓ発癌遺伝子１（ｃ−ｒｏｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １）」または「ＲＯＳ１」（当該分野ではｒｏｓ−１ともいわれる）とは、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓサブファミリーの膜貫通チロシンキナーゼを指し、これは、ＰＴＰＮ６と相互作用する。ＲＯＳ１遺伝子およびｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、多くの種（ヒトを含む）に関して公知である（例えば、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６０９８の下で註釈されるとおり）。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍から得られるサンプル中のＲＥＴの遺伝子再編成の存在は、その腫瘍が以下からなる群より選択される処置での処置に影響を受けやすいことを示し得る：ＲＥＴインヒビター；ＤＰ−２４９０、ＤＰ−３６３６、ＳＵ５４１６；ＢＡＹ  ４３−９００６、ＢＡＹ  ７３−４５０６（レゴラフェニブ）、ＺＤ６４７４、ＮＶＰ−ＡＳＴ４８７、ソラフェニブ、ＲＰＩ−１、ＸＬ１８４、バンデタニブ、スニチニブ、イマチニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、モテサニブ、ゲフィチニブ、およびウィザフェリンＡ（例えば、Ｓａｍａｄｉら，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２０１０  １４８：１２２８−３６；  Ｃｕｃｃｕｒｕら，  ＪＮＣＩ  ２００４  １３：１００６−１０１４；  Ａｋｅｎｏ−Ｓｔｕａｒｔら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００７  ６７：６９５６；  Ｇｒａｚｍａら，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０  ２８：１５ｓ  ５５５９；  Ｍｏｌｏｇｎｉら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２００６  ３７：１９９−２１２；  Ｃａｌｍｏｍａｇｎｏら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ＮＣＩ  ２００６  ９８：３２６−３３４；  Ｍｏｌｏｇｎｉ，  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１１  １８：１６２−１７５；ならびにＷＯ  ０６／０３４８３３で開示される化合物；米国特許公開２０１１／０２０１５９８および米国特許第８，０６７，４３４号で開示される化合物を参照のこと）。前述の参考文献の全ては、それらの全体において本明細書に参考として援用される。ＲＥＴインヒビターは、ＲＥＴまたはその一部の発現および／またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤（ＲＥＴまたはその一部の発現および／または活性を低減する、例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む）を含み得る。本明細書で使用される場合、「トランスフェクションの間に再編成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」または「ＲＥＴ」とは、神経堤発生に関与し、グリア細胞由来神経栄養因子ファミリーシグナル伝達分子を認識するカドヘリンスーパーファミリーのレセプターチロシンキナーゼをいう。ＲＥＴ遺伝子およびｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、多くの種（ヒトを含む）に関して公知である（例えば、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５９７９の下で註釈されるとおり）。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、その既知の標的配列は、表２から選択される遺伝子を含み得る。
【０１７６】
【表２−１】
2019537439.tif 000010
【表２−２】
2019537439.tif 000011
【表２−３】
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【表２−４】
2019537439.tif 000013
【表２−５】
2019537439.tif 000014
【０１７７】
本明細書で記載される方法の適用のさらなる非限定的な例としては、造血悪性腫瘍マーカーおよびその一団の検出（例えば、リンパ腫および白血病においてゲノム再編成を検出するものが挙げられる）、肉腫関連ゲノム再編成およびその一団の検出；ならびにリンパ腫検査のためのＩＧＨ／ＴＣＲ遺伝子再編成およびその一団の検出が挙げられる。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、例えば、がんを有するまたはがんを有すると診断された被験体を、がんの処置で処置することに関する。がんを有する被験体は、がんを診断するための現在の方法を使用して医師によって同定され得る。例えば、肺がんの状態を特徴付けかつ診断を補助する、肺がんの症状および／または合併症は、当該分野で周知であり、呼吸の虚弱（ｗｅａｋ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、鎖骨上リンパ節腫脹、肺の異常音、胸部を軽くたたいた場合の濁音（ｄｕｌｌｎｅｓｓ）および胸痛が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、肺がんの診断を補助し得る検査としては、ｘ線、高レベルのある種の物質（例えば、カルシウム）に関する血液検査、ＣＴスキャン、および腫瘍生検が挙げられるが、これらに限定されない。肺がんの家族歴、または肺がんのリスク因子への曝露（例えば、喫煙または煙および／もしくは空気汚染への曝露）はまた、被験体が肺がんを有するようであるか否かを決定するか、または肺がんの診断を行うことを補助し得る。
【０１７９】
がんとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：癌腫（腺がん、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、白血病、扁平細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、消化管がん、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、膠芽腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、脳のがん（膠芽腫および髄芽腫が挙げられる）が挙げられる）；乳がん、子宮頚がん、絨毛がん；結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、子宮内膜がん；食道がん、胃がん；種々のタイプの頭頚部がん、上皮内新生物（ボーエン病およびパジェット病が挙げられる）；血液新生物（急性リンパ性白血病および骨髄性白血病が挙げられる）；カポジ肉腫、ヘアリーセル白血病；慢性骨髄性白血病、ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；腎臓がん（例えば、腎細胞がん）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、リンパ腫（ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫が挙げられる）；肝臓がん（例えば、肝臓癌腫および肝細胞がん）、メル血細胞がん、黒色腫、多発性骨髄腫；神経芽腫；口腔がん（扁平上皮がんが挙げられる）；卵巣がん（上皮細胞に由来するものが挙げられる）、肉腫（平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫（ｆｉｂＲＯＳ１ａｒｃｏｍａ）、および骨肉腫が挙げられる）；膵臓がん；皮膚がん（黒色腫、間質細胞、胚細胞および間葉系細胞が挙げられる）；前立腺がん（ｐＲＯＳ１ｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、直腸がん；外陰部がん（ｖｕｌｖａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、腎がん（腺癌を含む）；精巣がん（胚細胞腫瘍（例えば、精上皮腫、非精上皮腫（奇形腫、絨毛がん）、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍が挙げられる）；甲状腺がん（甲状腺腺がんおよび髄様がんを含む）；食道がん、唾液腺がん、およびウィルムス腫瘍。いくつかの実施形態において、そのがんは、肺がんであり得る。
【０１８０】
多重方法
本明細書で記載される方法は、多重形式で使用され得る。本明細書で記載される方法の実施形態において、多重適用は、１つまたはこれより多くの既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列を決定することを含み得る。本明細書で使用される場合、「多重増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、１つまたはこれより多くの反応容器において１より多くの標的核酸の同時増幅を包含するプロセスをいう。いくつかの実施形態において、方法は、プライマーの１つまたはこれより多くのセットを使用して、多重増幅生成物の配列のその後の決定を包含する。多重とは、約２〜１，０００個の間の異なる標的配列を１つの反応において検出することを指し得る。しかし、いくつかの実施形態において、多重とは、１つの反応での約１，０００〜１０，０００の間の異なる標的配列の検出に指し得る。いくつかの実施形態において、多重とは、１つの反応での約１０，０００〜１００，０００の間の異なる標的配列の検出を指し得る。本明細書で使用される場合、多重とは、２〜１，０００の間の任意の範囲、例えば、５〜５００個、２５〜１，０００個、または１０〜１００個などの間の異なる標的配列を１つの反応において検出することを言う。ＰＣＲに当てはまる場合の用語「多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）」とは、同じＰＣＲ反応において少なくとも２個の異なる標的配列に特異的なプライマーが存在することを示唆する。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、サンプル中の標的核酸、またはサンプルの別個の部分は、複数のプライマー（例えば、複数の第１のおよび第２の標的特異的プライマー）で増幅され得る。いくつかの実施形態において、その複数のプライマー（例えば、複数の第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、１つの反応混合物中に存在し得る。例えば、多数の増幅生成物は、同じ反応混合物中で生成され得る。いくつかの実施形態において、その複数のプライマー（例えば、第１のおよび第２の標的特異的プライマーの複数のセット）は、別個の遺伝子によって含まれる既知の標的配列に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２セットのプライマー（例えば、少なくとも２セットの第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、既知の標的配列の異なる部分に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２セットのプライマー（例えば、少なくとも２セットの第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、１つの遺伝子によって含まれる既知の標的配列の異なる部分に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２セットのプライマー（例えば、少なくとも２セットの第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、既知の標的配列を含む遺伝子の異なるエキソンに特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、その複数のプライマー（例えば、第１の標的特異的プライマー）は、同一の５’タグ配列部分を含み得る。
【０１８２】
本明細書で記載される方法の実施形態において、多重適用は、１つのシーケンシング反応またはシーケンシング実行において多数のサンプル中の１つまたはこれより多くの既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列を決定する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、多数のサンプルは、異なる起源のもの、例えば、異なる組織および／または異なる被験体に由来するものであり得る。このような実施形態において、プライマー（例えば、テール付加ランダムプライマー）は、バーコード部分をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、特有のバーコード部分を有するプライマー（例えば、テール付加ランダムプライマー）は、各サンプルに添加され得、その中の核酸にライゲーションされ得る；そのサンプルはその後、プールされ得る。このような実施形態において、増幅生成物の各得られたシーケンシングリードは、増幅生成物が由来するテンプレート核酸を含むサンプルを同定するバーコードを含む。
【実施例】
【０１８３】
以下の実施例は、本発明のある種の局面を含め、本明細書で記載されるある種の実施形態を例証することが意図されるが、本発明の全範囲を例示するわけではない。
【０１８４】
実施例１：  核酸サンプル調製
分析用の核酸サンプルを調製するための方法を図示するプロトコルの一例は、図１に示される。
【０１８５】
ビオチン化レセプター特異的プライマーを、サンプルＲＮＡとアニールさせる。サーマルサイクラーを、６５℃に加熱し、精製された全核酸またはＲＮＡ（２０〜２５０ｎｇ）を、レセプター特異的プライマーと合わせる前に氷上にある間に、ヌクレアーゼ非含有水と合わせる。次いで、そのサンプルを、サーマルサイクラーへと移し、加熱したふた（≧１００℃）を用いて６５℃において５分間インキュベートし、次いで、４℃で保持する。一旦終了した後、そのサンプルを氷上に少なくとも２分間置く。
【０１８６】
アニーリング後、その第１鎖ｃＤＮＡを、逆転写酵素の作用によるレセプター特異的プライマーの伸長によって合成して、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを生成する。そのサンプルを、加熱したふた（≧１００℃）付きのサーマルサイクラーの中で、５０℃において３０分間、続いて、８０℃において２０分間インキュベートし、次いで、４℃で保持する。
【０１８７】
その得られたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を、リボヌクレアーゼの作用を介して部分的に分解し、これを、第２鎖合成反応のためのプライマーとして働くその第１鎖にアニールされるＲＮＡフラグメントを後ろに残す。その第２鎖ｃＤＮＡを、ＤＮＡ  ＰｏｌＩとのインキュベーション後に、加熱したふた（≧１００℃）付きのサーマルサイクラーの中で、１６℃において６０分間、続いて、７５℃において２０分間合成し、次いで、４℃で保持する。
【０１８８】
その２本鎖ｃＤＮＡサンプルを、末端修復に供して、そのｃＤＮＡを平滑末端化し、その５’末端をリン酸化する。この工程では、過剰なＴ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを、十分なｄＮＴＰとともにそのサンプルに添加し、サーマルサイクラー（加熱したふたなし）の中で、２５℃において３０分間インキュベートさせた。そのＤＮＡを、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）  ＸＰビーズ（２．５×）を使用するクリーンアップ工程に供する。そのビーズを、ボルテックスすることによって完全に再懸濁し、各反応に混合しながら添加して、均質な混合物を担保する。次いで、その反応を、５分間、室温（２０〜２５℃）においてインキュベートする。次いで、そのチューブを遠心分離し、チューブ壁に対してそのビーズが完全にペレットにされることを担保するように、４分間磁石上に置く。その上清を、ビーズペレットを乱すことなく廃棄し、より大きな倍率を必要に応じて使用して、そのビーズを再度ペレットにする。そのビーズを、上清を廃棄する前に磁石上になおある間に、７０％  エタノールで３０秒間洗浄する。その洗浄を２回反復する。最終洗浄後に、その認識できる上清の残余部分を完全に除去し、そのビーズを５分間、室温においてふたを開けたままにして乾燥させる。このことが核酸の全体的な収量を有意に減少させるほどには、そのビーズを過剰に乾燥するべきではない。そのビーズを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で再懸濁することによって、そのＤＮＡを溶離する。次いで、そのチューブを磁石の上に戻して２分間置く。
【０１８９】
第１のライゲーション工程では、その精製したＤＮＡを次いで、加熱したふた（≧１００℃）付きのサーマルサイクラーの中で１５分間、３７℃においてインキュベートする間に、ｄＡＭＰをそのＤＮＡ鎖の３’末端上に組み込むｄＡテール付加反応に供し、次いで、４℃で保持する。次いで、その反応を遠心分離し、氷上に置く。
【０１９０】
そのＡテール付加後に、そのサンプルを、上記の同じ手順に従ってＡＭＰｕｒｅ（登録商標）  ＸＰビーズ（２．５×）を使用して清浄にする。そのＤＮＡを、ヌクレアーゼ非含有水を使用して溶離する。
【０１９１】
第２のライゲーション工程では、特有のヌクレオチド配列または分子バーコード（ＭＢＣ）を、サーマルサイクラー（加熱したふたなし）の中で１５分間、２５℃においてインキュベートした後に、ＤＮＡリガーゼの作用を介してそのＤＮＡにライゲーションし、次いで、４℃で保持する。次いで、そのサンプルを、ストレプトアビジン被覆ビーズを使用して精製する。そのサンプルを、磁石の上に１分間またはそのビーズがペレットになるまで置く。その上清を、そのビーズペレットを乱すことなくピペットを使用して除去する。次いで、そのビーズを、ライゲーションクリーンアップ緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８））中で再懸濁する。そのライゲーションしたＤＮＡ生成物（５０μＬ）を、ライゲーションクリーンアップビーズ（合計１００μＬに対して５０μＬ）と混合し、その反応物を、室温において５分間インキュベートし、続いて、混合し、さらに５分間インキュベートする。そのサンプルを遠心分離し、そのビーズがチューブ壁に対して完全にペレットにされることを担保するように、磁石の上に１分間置く。その上清を、そのビーズを乱すことなく廃棄し、そのビーズをライゲーション緩衝液で洗浄し、磁石の上に１分間置く。そのスラリーがいったん清浄にされた後に、その上清を廃棄する。次いで、そのビーズを、緩衝液で２回洗浄し、次いで、ヌクレアーゼ非含有水で１回洗浄する。次いで、そのＭＢＣアダプターが結合したビーズを、第１のＰＣＲ工程に関する構成要素の別個の混合物へと移す。
【０１９２】
第１のＰＣＲラウンドを、第１の遺伝子特異的プライマーおよび第１のアダプタープライマーを使用して行う。その反応を氷上で維持し、その後、加熱したふた（≧１００℃）付きのサーマルサイクラーの中で、表３に記載されるプログラムを使用して第１のＰＣＲを行う。その反応がいったん４度に達した後、その反応物を短時間遠心分離し、氷上に置く。
【０１９３】
【表３】
2019537439.tif 000015
【０１９４】
次いで、そのＰＣＲ反応を、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）  ＸＰビーズ（１．２×）を使用して清浄にし、５分間、室温（２０〜２５℃）においてインキュベートする。次いで、そのチューブを短時間遠心分離し、そのビーズがチューブ壁に対して完全にペレットにされることを担保するように、磁石の上に４分間置く。その上清を、そのビーズペレットを乱すことなく廃棄する。次いで、そのチューブを、磁石上に残っている間に、７０％  エタノールで３０秒間洗浄する。その洗浄を２回反復する。最終洗浄後に、その上清をピペットで除去し、そのチューブを３分間、室温において乾燥させる。このことが核酸の全体的な収量を有意に減少させるほどには、そのビーズを過剰に乾燥するべきではない。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中でそのビーズを再懸濁することによって、そのＤＮＡを溶離する。次いで、そのチューブを、磁石の上に２分間置き、その後、その上清を第２のＰＣＲ工程のための構成要素の別個の混合物に移す。
【０１９５】
第２のＰＣＲラウンドは、第２の遺伝子特異的プライマーおよび第２のアダプタープライマーを使用して行われる。その第２のＰＣＲ工程は、Ｐ７−テールを組み込み、このテールは、図１に示されるように、その第２の遺伝子特異的プライマーの５’テール付加した領域として組み込まれる。インデックス１（Ｐ７）タグの配列を表４に示す。
【０１９６】
【表４】
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【０１９７】
その第１のＰＣＲから精製したライブラリーＤＮＡを、その第２の遺伝子特異的プライマーおよび第２のアダプタープライマー、ならびにＰＣＲ構成要素と混合し、その第２のＰＣＲを、表５に記載されるプログラムを使用して、加熱したふた（≧１００℃）付きのサーマルサイクラーの中で行う。反応がいったん４℃に達した後に、その反応物を短時間遠心分離し、氷上に置く。
【０１９８】
【表５】
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【０１９９】
次いで、そのＰＣＲ反応を、第１のＰＣＲ反応において概説した同じ手順に従って、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）  ＸＰビーズ（１．２×）を使用して清浄にする。そのビーズを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で再懸濁し、磁石の上で２分間インキュベートすることによって、そのＤＮＡを溶離する。次いで、そのライブラリータグ化ＤＮＡを、貯蔵、定量、または正規化およびシーケンシングのために新たなＰＣＲチューブに移す。
【０２００】
実施例２：多様性および再現性
シーケンシング情報を、上記で記載される方法を使用する反復実験にわたって、種々の投入量（２５ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、４００ｎｇ、８００ｎｇ、および１６００ｎｇ）のサンプルから得た。図４に示されるように、反復実験間のクローン型重複は、投入量とともに増大する。複製サンプルのペアワイズ分析を、２５６，０００リードからのデータを使用してさらに行った。その結果（これは、そのアッセイの非常に再現性のある性質を示した）は、図５において８００ｎｇおよび１６００ｎｇの投入サンプルに関して示される。図６Ａおよび６Ｂは、全クローン（図６Ａ）  対  重複するクローン（図６Ｂ）の完全なサイドバイサイド分析（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を示す。図７は、多様性  対  サンプルサイズのプロット（上）および投入サイズによるＳｈａｎｎｏｎ多様度指数のチャート（下）を示し、これらは、投入量が、観察の複雑性および多様性を決めることを示す。
【０２０１】
図８〜１０に示されるように、Ｊｕｒｋａｔ希釈シリーズを使用して、実験内および実験間の再現性を試験した。ＴＣＲα：βレセプターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株を、健康なドナー末梢血リンパ球（ＰＢＬ）  ＲＮＡに添加し、Ｔ細胞レセプターβ鎖（ＴＲＢ）検出の限界を決定し、実験間アッセイバリエーションを評価した。ＰＢＬ  ＲＮＡへのＪｕｒｋａｔ全ＲＮＡの段階希釈を、二連において、１：１０希釈〜１：１０，０００［ｎｇ  Ｊｕｒｋａｔ／（ｎｇ  Ｊｕｒｋａｔ  ＋  ｎｇ  ＰＢＬ）］の範囲で行った。
【０２０２】
その段階希釈物を、１つの希釈あたり２つのアリコートに分け、そのライブラリーを調製し、シーケンシングした。図１１の結果は、両方の実験間の強い相関を示す。
【０２０３】
全ライブラリーを、６００，０００に対して正規化し、重複排除し、誤差を較正した。その予測頻度を、１：１０希釈物のクローン型頻度に１０をかけて、その得られた数字をそれぞれの希釈係数で除算することによって決定した（例えば、係数＝０．５（１：１０希釈）×１０＝５．５／希釈係数＝所定の希釈係数に関する実験的頻度）。
【０２０４】
実施例３：プライマー
図１２は、ＴＣＲ（β／γ）レパートリーの分析に関するＦＦＰＥ最適化ストラテジーを示す。示されるように、逆転写酵素（ＲＴ）プライマー結合部位は、定常ドメインエキソンの５’領域に相当する。その第１のＰＣＲ遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を、Ｊセグメントの３’領域またはＪセグメント：Ｃエキソンの共通部分にわたる領域のいずれかに相当する領域に結合させるためにデザインする。そのＲＴプライマーの５’末端からＣＤＲ３の５’末端までの平均距離は、１００塩基対未満である。プライマーのパネルを、ＴＣＲ（β／γ）およびＴＣＲ（α／δ）の免疫レパートリーシーケンシングのためにデザインし、それぞれ、表６および表７に列挙した。
【０２０５】
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【０２０６】
【表７】
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【０２０７】
そのＢＣＲ  ＩｇＨプライマーパネルは、ＴＣＲパネルと比較して、クローン型（ＣＤＲ３）同定の他にいくつかのさらなる要件を有する。なぜならそのＩｇＨパネルは、そのアイソタイプ（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｍ）を決定し、サブクラスを選択するからである。そのクローンが体細胞超変異を受けたか否かもまた、決定する（Ｖセグメント分析）。そのＩｇＨプライマー位置を、図１３に示す。そのＲＴプライマーおよび第１のＰＣＲ遺伝子特異的プライマーは、それぞれのアイソタイプ定常領域のＣＨ１エキソンに相当する領域に結合して、選択されたアイソタイプサブクラスを区別する。プライマーのパネルを、ＢＣＲ（ＩｇＨ）およびＢＣＲ（ＩｇＫ／ＩｇＬ）の免疫レパートリーシーケンシングのためにデザインし、それぞれ、表８および表９に列挙した。
【０２０８】
【表８−１】
2019537439.tif 000022
【表８−２】
2019537439.tif 000023
【表８−３】
2019537439.tif 000024
【表８−４】
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【０２０９】
【表９−１】
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【表９−２】
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【０２１０】
表６〜９の中のＲＴプライマーのヌクレオチド配列は代わりに、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）命名法に従う表記法で示される改変とともに列挙される（ここで「＊」は、配列中の「＊」の前にあるヌクレオチドと「＊」の後ろにあるヌクレオチドとの間のホスホロチオエート結合を示し、「／５２−Ｂｉｏ／」は、５’二重ビオチン部分を示す）。図１４は、最も５’側の塩基（「Ａ」）と最も５’側から２番目の塩基（「Ｃ」）との間のホスホロチオエート結合とともに、最も５’側の塩基に連結した５’二重ビオチン部分を有するＲＴプライマーの一例を示す。その二重ビオチン部分は、ＲＴの生成物の選択を可能にし、より高い捕捉効率を担保する。しかし、１個のビオチンを使用することも可能である。ホスホロチオエート連結は、そのビオチン含有塩基が除去されないことを担保するために、エキソヌクレアーゼによる分解を防止する。
【０２１１】
均等物
いくつかの発明の実施形態は、本明細書で記載および例証されてきたが、当業者は、その機能を行うならびに／または結果および／もしくは本明細書で記載される利点のうちの１つもしくはこれより多くを得るための、種々の他の手段および／または指示を容易に想定し得、このようなバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内にあると見做される。より一般には、当業者は、本明細書で記載される全てのパラメーター、寸法、物質、および構成が、例示的であることが意味され、その実際のパラメーター、寸法、物質、および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の適用に依存することを容易に認識する。当業者は、慣用的に過ぎない実験を使用して、本明細書で記載される発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。従って、前述の実施形態が例示によって提示されるに過ぎず、そして添付の請求項およびその均等物の範囲内で、本発明の実施形態が具体的に記載されかつ請求項に記載されるとおりのもの以外の方法で実施され得ることは、理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書で記載される各個々の特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法に関する。さらに、２つまたはこれより多くのこのような特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法が相互に矛盾しなければ、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０２１２】
全ての定義（本明細書で定義され使用されるとおり）は、辞書の定義、参考として援用される文書中の定義、および／またはその定義された用語の通常の意味に優先すると理解されるべきである。
【０２１３】
本明細書で開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される、いくつかの場合には、その文書の全体を包含し得る主題に関して参考として援用される。
【０２１４】
不定冠詞「１つの、ある（ａ）」および「１つの、ある（ａｎ）」は、本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、そうでないことが明確に示されなければ、「少なくとも１」を意味することが理解されるべきである。
【０２１５】
語句「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、そのように結合された要素のうちの「いずれかまたは両方（ｅｉｔｈｅｒ  ｏｒ  ｂｏｔｈ）」、すなわち、いくつかの場合には結合的に存在し、他の場合には分離して存在する要素を意味することが理解されるべきである。「および／または」とともに列挙される多数の要素は、同じ様式で、すなわち、そのように結合されたその要素のうちの「１またはこれより多く」と解釈されるべきである。他の要素は、必要に応じて、具体的に識別されるそれら要素に関連しようが関連しまいが、その「および／または」節によって具体的に識別される要素以外に存在し得る。従って、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような制約のない文言とともに使用される場合、一実施形態において、Ａのみ（必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態において、Ｂのみ（必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態においてＡおよびＢの両方（必要に応じて、他の要素を含む）；などを言及し得る。
【０２１６】
本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、「または（ｏｒ）」は、上記で定義されるとおりの「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストの中で項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち、多くの要素または要素のリストのうちの少なくとも１（しかし１より多くを含む）、そして必要に応じて、さらなる列挙されない項目をも包含すると解釈されるものとする。そうでないことが明確に示される用語のみ、例えば、「のうちの１のみ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」もしくは「のうちの正確に１（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」、または請求項において使用される場合に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、多くの要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含に言及する。一般に、用語「または」は、本明細書で使用される場合、排他的な用語（例えば、「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「のうちの１（ｏｎｅ  ｏｆ）」、「のうちの１のみ」、または「のうちの正確に１」が先行する時に排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない（ｏｎｅ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｏｔｈ）」を示すと解釈されるに過ぎないものとする。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、特許請求の範囲において使用される場合、特許法の分野で使用されるとおりのその通常の意味を有するものとする。
【０２１７】
本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、１つまたはこれより多くの要素のリストへの言及において語句「少なくとも１（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）とは、要素のリスト中にある要素のうちのいずれか１つまたはこれより多くから選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列挙される各要素およびあらゆる要素のうちの少なくとも１を必ずしも含むわけではなく、要素のリスト中にある要素の任意の組み合わせを排除しない。この定義はまた、具体的に識別されるそれら要素に関連しようが関連しまいが、要素のリスト（これに対して文言「少なくとも１」が指す）内で具体的に識別される要素以外の要素が必要に応じて存在し得ることを可能にする。従って、非限定的な例としては、「ＡおよびＢのうちの少なくとも一方（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」（または、等しくは、「ＡまたはＢのうちの少なくとも一方（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」、または、等しくは、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも一方（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｂ）」は、一実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）ＡであってＢは存在しない（および必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）に；別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）Ｂであって、Ａは存在しない（および必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）Ａ、および少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）Ｂ（および必要に応じて、他の要素を含む）；などを指し得る。
【０２１８】
そうでないと明らかに示されなければ、１より多くの工程または行為を含む本明細書で請求項に記載される任意の方法において、その方法の工程または行為の順序は、その方法の工程または行為が記載される順序に必ずしも限定されないことはまた、理解されるべきである。
【０２１９】
請求項において、上記の明細書においても同様に、全ての移行句（例えば、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」などは、制約がないこと、すなわち、が挙げられるが、これらに限定されないことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる」および「から本質的になる」のみが、米国特許審査基準２１１１．０３節に示されるように、それぞれ、制約のあるまたは半制約の移行句であるものとする。制限のない移行句（例えば、「含む、包含する」）を使用するこの文書中で記載される実施形態が、代替の実施形態において、その制限のない移行句によって記載される「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」の特徴としても企図されることは、認識されるべきである。例えば、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」を記載する場合、本開示はまた、代替の実施形態、「ＡおよびＢからなる組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」を企図する。
【図１】
2019537439.tif 000028
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2019537439.tif 000034
【図７】
2019537439.tif 000035
【図８】
2019537439.tif 000036
【図９】
2019537439.tif 000037
【図１０】
2019537439.tif 000038
【図１１】
2019537439.tif 000039
【図１２】
2019537439.tif 000040
【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2019537439000001.app
【国際調査報告】
2019537439.tif 000043
2019537439.tif 000044