(57)【要約】本発明は、免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強する方法に関する。詳しくは、本発明は、処置レジメンの一部として被験体に投与される免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強する方法であって、薬学的有効量のＳＫ１阻害剤を免疫チェックポイント阻害剤と組合せて被験体に投与することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置レジメンの一部として被験体に投与される免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強する方法であって、薬学的有効量のＳＫ１阻害剤を免疫チェックポイント阻害剤と組合せて被験体に投与することを含む方法。
【請求項２】
癌の処置を必要とする被験体において癌を処置する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤とＳＫ１阻害剤との治療上有効な組合せを被験体に投与することを含む方法であって、この併用投与により、免疫チェックポイント阻害剤単独の投与と比べて治療有効性の増強が得られる方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法であって、被験体が、悪性新生物；癌腫；未分化癌；巨細胞及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；石灰化上皮癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌と胆管癌の混合型；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ中の腺癌；家族性大腸ポリポーシス腺癌；固形癌；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺癌（branchiolo-alveolar adenocarcinoma）；乳頭腺癌；色素嫌性癌；好酸球癌；好酸性腺癌；好塩基球癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭及び濾胞腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌（endometroid carcinoma）；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘液性類表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；ムチン性嚢胞腺腫；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；乳房パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜腫瘍；悪性顆粒膜細胞腫；悪性神経芽細胞腫（roblastoma）；セルトリ細胞癌；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞腫；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性メラノーマ；メラニン欠乏性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑中の悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胚性癌；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺種；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管外皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽腫；原始神経外胚葉腫瘍（primitive neuroectodermal）；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性小リンパ球性リンパ腫；悪性びまん性大細胞型リンパ腫；悪性濾胞性リンパ腫；菌状息肉腫；その他の特定されている非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；及び有毛細胞白血病からなる群より選択される癌に罹患している方法。
【請求項４】
被験体が、メラノーマに罹患している、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
被験体が、ＢＲＡＦ阻害剤に耐性のメラノーマに罹患している、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
被験体が、メラノーマに罹患して血漿デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が上昇している、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
癌が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤が低いことを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
ＳＫ１阻害剤が、以下：
【化３】
2019509261.tif 000005
からなる群より選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
ＳＫ１阻害剤が、Ｎ’−［（２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）メチリデン］−３−（ナフタレン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボヒドラジドである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１０】
ＳＫ１阻害剤が、ＳＫ１発現の阻害剤である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１１】
免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、及び抗Ｂ７Ｈ６抗体からなる群より選択される抗体である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１２】
癌の処置を必要とする被験体において癌を処置する方法であって、ｉ）被験体から得られた腫瘍組織試料中のＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を定量すること、ii）工程ｉ）で定量された密度を所定の基準値と比較すること、及びiii）工程ｉ）で定量された密度が所定の基準値より低い場合に、免疫チェックポイント阻害剤とＳＫ１阻害剤との治療上有効な組合せを被験体に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫システムが癌を検出及び排除する能力は、１００年以上前に最初に提唱された。それ以来、腫瘍関連抗原に対して反応性のＴ細胞が、多くの異なる種類の癌を有する患者の血液中に検出され、癌と闘う免疫系の役割を示唆している。しかし、腫瘍は、腫瘍の微小環境を操作し、免疫抑制を推進することによって宿主免疫を回避することができるが、これは、患者が癌細胞を完全に排除するために充分に強力な免疫応答を開始できないことを意味する。免疫療法の目的は、抗腫瘍免疫応答を回復又は増強することである。腫瘍免疫学の理解の高まりによって、免疫チェックポイントタンパク質として知られている細胞表面分子の一群を含む、新しい免疫系アプローチのための新規な標的が同定されてきた。詳しくは、ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ）又はＰＤ−１（ニボルマブ、ペンブロリズマブ）を阻害するモノクローナル抗体は、転移性メラノーマの処置において有意な有効性を実証しており、このため高い応答率及び長期にわたる腫瘍制御を促進する。有望な結果にもかかわらず、約４０％の患者は治療反応を示さず、反応者のかなりの割合が処置導入後２年以内に腫瘍再発を経験する。更には、ＢＲＡＦ及びチェックポイント阻害剤を併用した最近の臨床試験では、ＢＲＡＦ変異メラノーマ患者の肝毒性が高いことが明らかになった。したがって、免疫チェックポイント阻害剤の効力を高めるために、新規な治療方策の開発が急務である。
【０００３】
セラミド、セラミド １−リン酸、スフィンゴシン、及びスフィンゴシン １−リン酸（Ｓ１Ｐ）を含むスフィンゴ脂質代謝物は、細胞運動性、分化、増殖及び生存、更には血管新生、炎症及び免疫を調節する、生理活性シグナル伝達分子として出現した。最近、メラノーマ細胞におけるＳ１Ｐの産生が増加していることが実証された（２、３）。この生理活性スフィンゴ脂質代謝物は、主にスフィンゴシンキナーゼ１（ＳＫ１）によって産生され、そして、母斑と比較してヒトメラノーマ腫瘍において過剰発現される（２）。多くの腫瘍において、Ｓ１Ｐは、細胞内二次メッセンジャーとして、並びに／又は癌細胞及びそれらの周囲の微小環境の両方で発現するＧタンパク質共役受容体ファミリー（Ｓ１ＰＲ１〜５）の刺激を介して、発癌シグナルを伝達する（４、５）。メラノーマ腫瘍において、癌細胞におけるＳ１Ｐ産生の調節異常は、腫瘍微小環境における線維性応答を引き起こし、次にメラノーマ細胞移動を刺激する（２）。更に、Ｓ１Ｐ受容体モジュレーターＦＴＹ７２０でマウスを処置すると、Ｓ１ＰＲ１を内部で封鎖することによって細胞をＳ１Ｐ活性化に対して無反応にし、腫瘍血管新生を阻害することによってメラノーマの進行を抑制した（６）。これらの知見は、腫瘍−間質相互作用におけるＳ１ＰＲを介したメラノーマ細胞排出Ｓ１Ｐのパラクリン作用を説明する。しかしながら、最近の研究は、ＳＫ１／Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ軸が炎症関連癌発症において不可欠の役割を果たすことを実証している（７）。実際に、ＳＫ１又はＳ１ＰＲ１のｓｈＲＮＡベースのダウンレギュレーションは、転写因子ＳＴＡＴ３の持続的活性化及び炎症性サイトカインのレベルをブロックし、炎症のマウスモデルにおける癌進行を抑制することが明らかになっている（８、９）。更に、Ｓ１Ｐは、リンパ球及び他の造血細胞の輸送及びエフェクター機能に寄与する（１０）。しかしながら、先行技術は、ＳＫ１阻害が免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強し得ることを示唆していない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要約：
本発明は、免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強する方法に関する。詳しくは、本発明は請求の範囲によって定義される。
【０００５】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、スフィンゴ脂質代謝の妨害が、前臨床メラノーマモデルにおける腫瘍進行を効率的に損ない、免疫チェックポイント阻害剤で得られる抗腫瘍免疫応答を増強することを実証した。詳しくは、本発明者らは、ＳＫ１ダウンレギュレーションが腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び活性化を増強することを観察した。非常に興味深いことは、メラノーマにおけるＳＫ１ノックダウンがＣＤ８＋ＴＩＬ上のＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１の発現を増強するという知見であるが、これらは両方ともＴ細胞活性化時にアップレギュレートされ、Ｔ細胞活性化時に強力な負のフィードバックループを発揮する。後者の観察は、メラノーマＳＫ１がＣＤ８＋Ｔ細胞依存性免疫応答を損なうことを初めて明らかにする。しかし、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４の両方のアップレギュレーションは、後の時点で観察されるＳＫ１ノックダウンを受けてのメラノーマ免疫回避に関与している可能性が高い。よって、メラノーマＳＫ１を標的とすることは、全腫瘍退縮を誘発するのに充分である可能性は低い。まとめると、データによって、本発明者らはＳＫ１阻害と免疫チェックポイントの阻害との組合せを調査するよう、そして前記組合せが相乗的抗癌免疫応答を提供することを実証するよう促された。
【０００６】
したがって、本発明の第１の目的は、癌に罹患している患者の腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び活性化を増強する方法であって、治療有効量のＳＫ１阻害剤を患者に投与することを含む方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書に使用されるとき、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」という用語は、当該分野においてその一般的な意味を有し、それらの表面上にＣＤ８を発現するＴ細胞のサブセットのことをいう。これらは、ＭＨＣクラスＩ拘束性であり、細胞傷害性Ｔ細胞として機能する。「ＣＤ８＋Ｔ細胞」はまた、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔキラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、又はキラーＴ細胞とも呼ばれる。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ拘束性相互作用における結合認識要素である。本明細書に使用されるとき、「腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞」という用語は、血流を離れて腫瘍中に移動した、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞のプールのことをいう。
【０００８】
本発明の更なる目的は、処置レジメンの一部として被験体に投与される免疫チェックポイント阻害剤の効力を増強する方法であって、薬学的有効量のＳＫ１阻害剤を免疫チェックポイント阻害剤と組合せて被験体に投与することを含む方法に関する。
【０００９】
本明細書に使用されるとき、「免疫チェックポイントタンパク質」という用語は、当該分野においてその一般的な意味を有し、シグナルを強める（刺激性チェックポイント分子）か、シグナルを弱める（阻害性チェックポイント分子）かのいずれかである、Ｔ細胞によって発現される分子のことをいう。免疫チェックポイント分子は、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１依存性経路と同様の免疫チェックポイント経路を構成することが当該分野において認識されている（例えば、Pardoll, 2012. Nature Rev Cancer 12:252-264; Mellman et al., 2011. Nature 480:480- 489を参照のこと）。阻害性チェックポイント分子の例は、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２７７、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３及びＶＩＳＴＡを含む。アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）は、腫瘍微小環境が比較的高いレベルのアデノシンを有し、Ａ２ＡＲの活性化を介して負の免疫フィードバックループを導くため、癌治療における重要なチェックポイントと見なされる。ＣＤ２７６とも呼ばれるＢ７−Ｈ３は、もともと共刺激性分子であると理解されていたが、現在は共阻害性分子とみなされている。ＶＴＣＮ１とも呼ばれるＢ７−Ｈ４は、腫瘍細胞及び腫瘍関連マクロファージによって発現され、腫瘍回避において役割を果たす。ＣＤ２７２とも呼ばれるＢ及びＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）は、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルスエントリメディエーター（Herpesvirus Entry Mediator））のリガンドである。ＢＴＬＡの細胞表面発現は、ナイーブ細胞からエフェクター細胞表現型へのヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の分化の間に徐々にダウンレギュレートされるが、腫瘍特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は高レベルのＢＴＬＡを発現する。ＣＴＬＡ−４、即ち、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（またＣＤ１５２とも呼ばれる）は、Ｔｒｅｇ細胞上で過剰発現されて、Ｔ細胞増殖を制御する働きをする。ＩＤＯ、即ち、インドールアミン ２，３−ジオキシゲナーゼは、関連する免疫阻害性酵素であるトリプトファン異化酵素である。別の重要な分子は、ＴＤＯ、即ち、トリプトファン ２，３−ジオキシゲナーゼである。ＩＤＯは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を抑制し、Ｔｒｅｇ及び骨髄由来サプレッサー細胞を生成及び活性化し、そして腫瘍血管新生を促進することが知られている。ＫＩＲ、即ち、キラー細胞免疫グロブリン様受容体は、ナチュラルキラー細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の受容体である。ＬＡＧ３、即ち、リンパ球活性化遺伝子−３は、Ｔｒｅｇに対する作用により、更にはＣＤ８＋Ｔ細胞に対する直接作用によって免疫応答を抑制するように働く。ＰＤ−１、即ち、プログラム死１（ＰＤ−１）受容体は、２種のリガンドであるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２を有する。このチェックポイントは、２０１４年９月にＦＤＡ承認を得た、Merck & Co.のメラノーマ薬であるKeytrudaの標的である。ＰＤ−１を標的とする利点は、これが腫瘍微小環境における免疫機能を回復することができることである。Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３の略語であるＴＩＭ−３は、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現し、Ｔｈ１及びＴｈ１７サイトカインを調節する。ＴＩＭ−３は、そのリガンドであるガレクチン−９との相互作用により細胞��を誘発することにより、Ｔｈ１／Ｔｃ１機能の負の調節因子として作用する。Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサーの略語であるＶＩＳＴＡは、主として造血細胞上で発現されるため、腫瘍内の白血球上でのＶＩＳＴＡの一貫した発現により、広い範囲の固形腫瘍にわたってＶＩＳＴＡ遮断が有効である可能性がある。
【００１０】
本明細書に使用されるとき、「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、当該分野においてその一般的な意味を有し、免疫阻害性チェックポイントタンパク質の機能を阻害する任意の化合物のことをいう。阻害は、機能の低下及び完全な遮断を含む。好ましい免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質を特異的に認識する抗体である。幾つかの免疫チェックポイント阻害剤が知られており、これらの既知の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤と同様に、代替免疫チェックポイント阻害剤が（近い）将来に開発されよう。免疫チェックポイント阻害剤には、ペプチド、抗体、核酸分子及び小分子が含まれる。詳しくは、本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、被験体におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、移動、持続性及び／又は細胞傷害活性を、そして特に被験体のＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤を増強するために投与される。
【００１１】
よって、「免疫チェックポイントの効力を増強する」という表現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、移動、持続性及び／又は細胞傷害活性を増強する免疫チェックポイント阻害剤の能力を増大させるＳＫ１阻害剤の能力のことをいう。
【００１２】
本明細書に使用されるとき、「処置」又は「処置する」という用語は、疾患に罹る危険性のある患者又は疾患に罹っている疑いがある患者、更には病気であるか、又は疾患若しくは内科症状に罹患していると診断された患者の処置を含む、予防的又は防止的処置並びに治癒的又は疾患改善処置の両方のことをいい、そして臨床的再発の抑制が含まれる。処置は、ある障害若しくは再発性障害の１つ以上の症状を防止、治癒、その発症の遅延、その重症度の軽減若しくは改善するために、又はそのような処置の非存在下で予想される期間を超えて被験体の生存期間を延長させるために、ある内科障害を有するか、又は最終的にはその障害を得るかもしれない被験体に行われてよい。「治療レジメン」とは、病気の処置のパターン、例えば、治療中に用いられる投薬のパターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含んでよい。「導入レジメン」又は「導入期間」という語句は、疾患の初期処置に用いられる治療レジメン（又は治療レジメンの一部）のことをいう。導入レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間中に高レベルの薬物を患者に提供することである。導入レジメンは、医師が維持レジメンの間に採用するであろうよりも多い用量の薬物を投与すること、医師が維持レジメンの間に薬物を投与するであろうよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る「負荷レジメン」を（一部又は全体において）採用することができる。「維持レジメン」又は「維持期間」という語句は、病気の処置中に患者を維持するために、例えば、患者を長期間（数ヶ月又は数年）にわたって寛解状態に保つために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）のことをいう。維持レジメンは、持続的療法（例えば、一定間隔、例えば、毎週、毎月、毎年などで薬物を投与すること）又は間欠的療法（例えば、断続的処置、間欠的処置、再発時の処置、又は特定の予め定められた基準［例えば、疼痛、疾患の兆候など］の達成時の処置）を採用することができる。
【００１３】
幾つかの実施態様において、被験体は癌に罹患している。本明細書に使用されるとき、「癌」という用語は、当該分野においてその一般的な意味を有し、固形腫瘍及び血液由来腫瘍を含むが、これらに限定されない。癌という用語は、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液及び血管の疾患を含む。「癌」という用語は更に、原発性及び転移性癌の両方を包含する。本発明の方法及び組成物によって処置され得る癌の例は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮からの癌細胞を含むが、これらに限定されない。加えて、癌は、具体的には以下の組織型であってもよいが、これらに限定されない：悪性新生物；癌腫；未分化癌；巨細胞及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；石灰化上皮癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌と胆管癌の混合型；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ中の腺癌；家族性大腸ポリポーシス腺癌；固形癌；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺癌（branchiolo-alveolar adenocarcinoma）；乳頭腺癌；色素嫌性癌；好酸球癌；好酸性腺癌；好塩基球癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭及び濾胞腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌（endometroid carcinoma）；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘液性類表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；ムチン性嚢胞腺腫；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；乳房パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜腫瘍；悪性顆粒膜細胞腫；悪性神経芽細胞腫（roblastoma）；セルトリ細胞癌；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞腫；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性メラノーマ；メラニン欠乏性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑中の悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胚性癌；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺種；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管外皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽腫；原始神経外胚葉腫瘍（primitive neuroectodermal）；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性小リンパ球性リンパ腫；悪性びまん性大細胞型リンパ腫；悪性濾胞性リンパ腫；菌状息肉腫；その他の特定されている非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；及び有毛細胞白血病。
【００１４】
幾つかの実施態様において、被験体は、メラノーマに罹患している。本明細書に使用されるとき、「メラノーマ」とは、皮膚及び他の臓器のメラノサイト系から生じる腫瘍の増殖を特徴とする症状のことをいう。大部分のメラノサイトは皮膚に存在するが、髄膜、消化管、リンパ節及び眼にも見られる。メラノーマが皮膚に発生すると、皮膚メラノーマと呼ばれる。メラノーマはまた、眼に発生することもあり、眼又は眼内メラノーマと呼ばれる。メラノーマは、髄膜、消化管、リンパ節又はメラノサイトが見られる他の領域ではめったに発生しない。メラノーマの４０〜６０％は、セリン−トレオニンプロテインキナーゼＢ−ＲＡＦ（ＢＲＡＦ）をコードする遺伝子に活性化突然変異を有する。メラノーマで観察されるＢＲＡＦ突然変異のうち、９０％超がコドン６００にあり、そのうち９０％超がバリンの代わりにグルタミン酸の置換をもたらす単一ヌクレオチド突然変異（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）である。
【００１５】
幾つかの実施態様において、被験体は、ＢＲＡＦ阻害剤に耐性のメラノーマに罹患している。本明細書に使用されるとき、「耐性」という用語は、メラノーマの繰り返し発生又はメラノーマの進行のことをいい、その疾患が前記発生又は進行の前に治癒したかどうかとは無関係である。本明細書に使用されるとき、「ＢＲＡＦ阻害剤」という用語は、ＢＲＡＦキナーゼ又は突然変異ＢＲＡＦキナーゼ活性（１種以上のセリン−トレオニンプロテインキナーゼＢ−ＲＡＦ（ＢＲＡＦ）の突然変異型（例えば、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）を阻害することができる薬剤のことをいう。したがって、「ＢＲＡＦ阻害剤」という用語は、その範囲内に、ＢＲＡＦ又はその変異型を阻害することができる化合物；あるいはＢＲＡＦのＶ６００突然変異型を阻害することができる化合物を包含する。ＢＲＡＦ阻害剤の例は、ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ、Bayer）、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２、Plexxikon、ＲＧ７２０４、ＲＯ５１８５４２６、Hofmann-LaRoche）、ＧＤＣ−０８７９（GlaxoSmithKline）、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１ １８４３６、GlaxoSmithKline）、ＰＬＸ４７２０（Hofmann-LaRoche）、ＢＭＳ−９０８６６２（ＸＬ２８１、Bristol-Myers Squibb）、ＬＧＸ８１８（Novartis）、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４、Hofmann-LaRoche）、ＡＲＱ−７３６（ArQule）、ＤＰ−４９７８（Deciphera）又はＲＡＦ２６５（Novartis）を含むが、これらに限定されない。
【００１６】
幾つかの実施態様において、被験体は、メラノーマに罹患して血漿乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が上昇している。血漿ＬＤＨは、それが陰性対照、即ち、同種の健常な哺乳動物に典型的に見られる血漿ＬＤＨレベルを超える場合、本発明の方法により「上昇した」と見なすことができる。典型的には、血漿ＬＤＨは、それが約２１２IU/mLを超える場合、「上昇した」と見なすことができる。好ましくは、血漿ＬＤＨは、それが約２５０IU/mLを超える場合、「上昇した」と見なされる。より好ましくは、血漿ＬＤＨは、それが約２８７IU/mLを超える場合、「上昇した」と見なされる。
【００１７】
したがって、本発明の更なる目的は、癌の処置を必要とする被験体において癌を処置する方法であって、免疫チェックポイント阻害剤とＳＫ１阻害剤との治療上有効な組合せを被験体に投与することを含むが、この併用投与により、免疫チェックポイント阻害剤単独の投与と比べて治療有効性の増強が得られる方法に関する。
【００１８】
本明細書に使用されるとき、癌に対して「治療有効性の増強」という表現は、癌細胞又は固形腫瘍の増殖の減速又は縮小、あるいは癌細胞の総数又は全身腫瘍組織量の減少のことをいう。よって「治療成績の改善」又は「治療有効性の増強」は、任意の臨床的に許容し得る基準によって患者の症状に改善があることを意味し、これは例えば、腫瘍サイズの減少、腫瘍進行までの時間の増大、無進行生存期間の増大、全生存期間の増大、平均余命の増大、又は生活の質の改善を含む。詳しくは、「改善」又は「増強」とは、治療成績又は有効性の臨床的に許容し得る任意の指標の１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、又は１００％超の改善又は増強のことをいう。本明細書に使用されるとき、「と比べて」という表現は、ＳＫ１阻害剤と共に免疫チェックポイント阻害剤を含む組合せ組成物の活性及び／又は有効性を免疫チェックポイント阻害剤単独の活性及び／又は有効性と比較するという文脈で使用する場合、当業者には同等であることが知られている量を用いた比較のことをいう。
【００１９】
詳しくは、本発明の方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤が低いことを特徴とする癌の処置に特に適している。典型的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞の前記腫瘍浸潤は、当該分野における任意の従来法によって決定される。例えば、前記決定は、被験体から得られた腫瘍試料中のＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を定量することを含む。
【００２０】
本明細書に使用されるとき、「腫瘍組織試料」という用語は、患者由来の任意組織の腫瘍試料を意味する。前記組織試料は、インビトロ評価の目的で得られる。幾つかの実施態様において、腫瘍試料は、患者から切除された腫瘍に由来し得る。幾つかの実施態様において、腫瘍試料は、患者の原発腫瘍で行われたか、又は患者の原発腫瘍から離れた転移性試料で行われた生検に由来し得る。例えば、結腸直腸癌に冒された患者の腸で行われた内視鏡的生検。幾つかの実施態様において、腫瘍組織試料は、（ｉ）広範囲の原発腫瘍（全体として）、（ii）腫瘍の中心からの組織試料、（iii）腫瘍を直接取り囲む組織からの組織試料（この組織は、更に具体的には腫瘍の「侵襲的辺縁部」と呼ばれることがある）、（iv）腫瘍に近接したリンパ様島、（ｖ）腫瘍に最近接した位置にあるリンパ節、（vi）手術前に採取された腫瘍組織試料（例えば、処置後の患者の追跡調査のため）、及び（vii）遠隔転移を包含する。本明細書に使用されるとき、「侵襲的辺縁部」は、当該分野においてその一般的な意味を有し、腫瘍を取り囲む細胞環境のことをいう。幾つかの実施態様において、腫瘍組織試料は、腫瘍の中心に由来するか、腫瘍の侵襲的辺縁部に由来するか、又は最も近いリンパ節に由来するかにかかわらず、腫瘍中心から、又は腫瘍を取り囲む侵襲的辺縁部から除去された組織片又は組織薄片を包含し、これには、外科的腫瘍切除後のもの、又は生検のための組織試料の採取後のもの、更には特に組織学的若しくは免疫組織化学的方法によるか、フローサイトメトリー法によるか、又は遺伝子若しくはタンパク質発現解析（ゲノム解析及びプロテオーム解析を含む）の方法による、１種又は数種の生物学的マーカーの定量のための組織試料の採取後のものが含まれる。当然ながら、腫瘍組織試料は、種々の周知の採取後の前処理及び保存手法（例えば、固定、保存、凍結など）に付すことができる。試料は、新鮮であっても、凍結されても、固定されても（例えば、ホルマリン固定）、又は包埋されても（例えば、パラフィン包埋）よい。
【００２１】
幾つかの実施態様において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の密度の定量は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）によって決定される。例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の密度の定量は、腫瘍組織試料を、前記細胞の細胞表面マーカーに特異的な結合パートナー（例えば、抗体）と接触させることによって行われる。典型的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞の密度の定量は、腫瘍組織試料をＣＤ８に特異的な結合パートナー（例えば、抗体）と接触させることによって行われる。典型的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞の密度は、組織試料の表面積１単位当たりに計数されるこれらの細胞の数として、例えば、腫瘍組織試料の表面積cm２又はmm２当たりに計数される細胞数として表される。幾つかの実施態様において、細胞密度はまた、試料１体積単位当たりの細胞数として、例えば、腫瘍組織試料cm３当たりの細胞数として表すことができる。幾つかの実施態様において、細胞密度はまた、全細胞（１００％に設定）当たりの特定細胞の割合からなってもよい。免疫組織化学法は、典型的には、以下の工程を含む：ｉ）腫瘍組織試料をホルマリンで固定すること、ii）前記腫瘍組織試料をパラフィンに包埋すること、iii）前記腫瘍組織試料を染色のために切片に切り分けること、iv）前記切片をマーカーに特異的な結合パートナーとインキュベートすること、ｖ）前記切片を洗浄すること、vi）前記切片を、典型的にはビオチン化された二次抗体とインキュベートすること、及びvii）典型的にはアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体により、抗原−抗体複合体を明らかにすること。したがって、腫瘍組織試料を最初に結合パートナーとインキュベートする。洗浄後、目的のマーカーに結合した標識抗体は、標識抗体が担う標識の種類、例えば、放射性、蛍光又は酵素標識に応じて、適切な手法によって明らかにされる。複数の標識を同時に行うことができる。あるいは、本発明の方法は、増幅系（染色シグナルを強化するため）及び酵素分子に結合した二次抗体を使用することができる。そのような結合した二次抗体は、例えば、Dako、EnVisionシステムから市販されている。対比染色法を使用することができる（例えば、H&E、DAPI、Hoechst）。他の染色方法は、自動、半自動又は手動システムを含む、当業者に明らかであるような任意の適切な方法又はシステムを用いて達成され得る。例えば、１種以上の標識を抗体に結合させることにより、標的タンパク質（即ち、マーカー）の検出を可能にすることができる。例示的な標識には、放射性同位体、フルオロフォア、リガンド、化学発光剤、酵素、及びこれらの組合せが含まれる。幾つかの実施態様において、標識は量子ドットである。一次及び／又は二次親和性リガンドにコンジュゲートすることができる標識の非限定例は、蛍光色素又は金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレスカミン）、発色団色素（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミナル（luminal）、イミダゾール）及び生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）を含む。種々の他の有用な蛍光剤及び発色団は、Stryer L (1968) Science 162:526-533 及び Brand L and Gohlke J R (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868に記載されている。親和性リガンドはまた、酵素（例えば、西洋ワサビペルオ��シダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ラクタマーゼ）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ）及び粒子（例えば、金）で標識することもできる。異なる種類の標識は、種々の化学、例えば、アミン反応又はチオール反応を用いて、親和性リガンドにコンジュゲートすることができる。しかし、アミン及びチオール以外の反応性基、例えば、アルデヒド、カルボン酸及びグルタミンを使用することができる。目的のタンパク質を検出するための種々の酵素的染色法が、当該分野において公知である。例えば、酵素的相互作用は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼのような様々な酵素、又はＤＡＢ、ＡＥＣ若しくはFast Redのような様々な発色剤を使用して可視化することができる。他の例において、抗体は、標識結合パートナー又は抗体を介して検出され得るペプチド又はタンパク質にコンジュゲートすることができる。間接的なＩＨＣアッセイにおいて、第１の結合パートナー（これは標識されていないため）の結合を検出するために二次抗体又は第２の結合パートナーが必要である。得られた染色標本は、検出可能なシグナルを観察するため、及び染色のデジタル画像のような画像を取得するためのシステムを用いて、それぞれ画像化される。画像取得のための方法は、当業者には周知である。例えば、一旦試料が染色されると、染色又はバイオマーカー標識を検出するために、例えば、正立又は倒立型光学顕微鏡、走査型共焦点顕微鏡、カメラ、走査型又はトンネル型電子顕微鏡、走査型（canning）プローブ顕微鏡及び赤外線イメージング検出器のような、任意の光学的又は非光学的な撮像装置を使用することができる。幾つかの例において、画像をデジタル的に取り込むことができる。次に、得られた画像を使用して、試料中のマーカーの量を定量的又は半定量的に決定することができる。免疫組織化学法での使用に適した種々の自動試料処理、走査及び分析システムが当該分野で利用可能である。このようなシステムには、自動染色及び顕微鏡走査、コンピュータ化画像解析、連続切片比較（試料の向き及びサイズの変動を調節するため）、デジタル報告作成、並びに試料のアーカイビング及び追跡（組織切片が配置されるスライドなど）が含まれ得る。従来の光学顕微鏡とデジタル画像処理システムとを組合せて、細胞及び組織（免疫染色試料を含む）の定量分析を行うための、細胞イメージングシステムは市販されている。例えば、ＣＡＳ−２００システム（Becton, Dickinson & Co.）を参照のこと。詳しくは、検出は手動で、又はコンピュータプロセッサ及びソフトウェアを含む画像処理技術によって行うことができる。このようなソフトウェアを用いると、当業者に知られている手順を使用して、例えば、染色の質又は染色強度を含む要因に基づいて、例えば、画像を構成、較正、標準化及び／又は検証することができる（例えば、米国特許出願公開第20100136549号を参照のこと）。試料の染色強度に基づいて、画像を定量的又は半定量的に分析及び採点することができる。定量的又は半定量的組織化学法とは、組織化学法を受けた試料を走査及び採点して、特定のバイオマーカー（即ち、マーカー）の存在を同定及び定量する方法のことをいう。定量的又は半定量的方法は、染��密度若しくは染色量を検出するためのイメージングソフトウェアを、又は訓練された操作者が数値的に結果をランク付けする人間の目によって染色を検出する方法を利用することができる。例えば、ピクセル数アルゴリズム（例えば、Aperio Spectrum Software、Automated QUantitatative Analysisプラットフォーム（AQUA（登録商標）プラットフォーム）、及び染色度を測定又は定量若しくは半定量する他の標準法；例えば、米国特許第8,023,714号；米国特許第7,257,268号；米国特許第7,219,016号；米国特許第7,646,905号；米国特許出願公開第20100136549号及び20110111435号；Camp et al. (2002) Nature Medicine, 8:1323-1327；Bacus et al. (1997) Analyt Quant Cytol Histol, 19:316-328を参照のこと）を用いて、画像を定量解析することができる。全染色面積の合計に対する強い陽性染色（褐色染色など）の比を計算して採点することができる。検出されたバイオマーカー（即ち、マーカー）の量は定量化され、陽性ピクセル及び／又はスコアの割合として与えられる。例えば、量は、陽性ピクセルの割合として定量化することができる。幾つかの例において、量は、染色面積の割合、例えば、陽性ピクセルの割合として定量化される。例えば、試料は、全染色面積と比較したとき、少なくとも、又は少なくとも約、又は約０、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれより多い陽性ピクセルを有することができる。幾つかの実施態様において、試料の組織化学染色の強度又は量の数値表示であり、そして試料中に存在する標的バイオマーカー（例えば、マーカー）の量を表す、スコアが試料に与えられる。光学密度又は面積百分率値に、例えば、整数の尺度に調整されたスコアを与えることができる。よって、幾つかの実施態様において、本発明の方法は、以下に存する工程を含む：ｉ）マーカー（例えば、上記の抗体）と選択的に相互作用することができる結合パートナーを使用することにより自動スライド染色システムによって得られる組織切片の１つ以上の免疫染色薄片を提供する工程、ii）高解像度走査キャプチャーによって工程ａのスライドのデジタル化を進める工程、iii）デジタル像上で組織切片の薄片を検出する工程、iv）同じ表面を有する均一に分布したユニットを有するサイズ基準格子を提供する工程（前記格子は分析される組織切片のサイズに適合している）、並びにｖ）各ユニットの染色細胞の強度を検出、定量及び測定し、それによって各ユニットの染色細胞の数又は密度が評価される工程。
【００２２】
幾つかの実施態様において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞密度は、全腫瘍組織試料において決定されるか、腫瘍組織試料の侵襲的辺縁部若しくは中心部において決定されるか、又は腫瘍組織試料の中心部と侵襲的辺縁部の両方で決定される。
【００２３】
したがって、本発明の更なる目的は、癌の処置を必要とする被験体において癌を処置する方法であって、ｉ）被験体から得られた腫瘍組織試料中のＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を定量すること、ii）工程ｉ）で定量された密度を所定の基準値と比較すること、及びiii）工程ｉ）で定量された密度が所定の基準値より低い場合に、免疫チェックポイント阻害剤とＳＫ１阻害剤との治療上有効な組合せを被験体に投与することを含む方法に関する。
【００２４】
典型的には、所定の基準値は、被験体の生存期間と相関する。当業者であれば、ＯＳ生存期間が、一般に、ある種の癌を特定の期間にわたって生存する人の割合に基づいており、その割合として表されることを認識するであろう。癌の統計は、しばしば５年全生存率を使用する。一般に、ＯＳ率は、癌生存者が５年後に依然として処置を受けているかどうか、又は無癌状態になった（寛解を達成した）かどうかを特定しない。ＤＳＦは、より具体的な情報を提供しており、寛解を達成する特定の癌を有する人の数である。また、無進行生存（ＰＦＳ）率（依然として癌を有するが、その疾患が進行していない人の数）には、処置にある程度成功している可能性があるが、癌が完全に消失していない人が含まれる。本明細書に使用されるとき、「短い生存期間」という表現は、患者が、前記癌に罹患している患者の一般集団において観察される中央値（又は平均）よりも低い生存期間を有することを示す。患者が短い生存期間を有する場合、患者が「不良な予後」を有することを意味する。逆に、「長い生存期間」という表現は、前記癌に罹患している患者の一般集団において観察される中央値（又は平均）よりも高い生存期間を有することを示す。患者が長い生存期間を有する場合、患者が「良好な予後」を有することを意味する。
【００２５】
幾つかの実施態様において、所定の値は、閾値又はカットオフ値である。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的に、経験的に、又は理論的に決定することができる。閾値はまた、当業者には認識されるであろうとおり、既存の実験的及び／又は臨床的条件に基づいて任意に選択することができる。例えば、適切に保存された病歴の患者試料における細胞密度の遡及的測定を、所定の基準値を確立する際に使用してもよい。閾値は、試験の機能及びベネフィット／リスクのバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床的帰結）によって、最適な感度及び特異度を得るために決定される必要がある。典型的には、最適な感度及び特異度（そして閾値）は、実験データに基づく受信者動作特性（Receiver Operating Characteristic）（ＲＯＣ）曲線を用いて決定することができる。例えば、基準群におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を定量した後、試験される試料中の測定密度の統計的処理のためにアルゴリズム解析を使用することができ、よって試料分類のために有意性を有する分類標準を得ることができる。ＲＯＣ曲線の完全な名称は、受信者動作特性（receiver operation characteristic）曲線としても知られている、受信者動作特性（receiver operator characteristic）曲線である。これは主に臨床生化学的診断検査に使用される。ＲＯＣ曲線は、真の陽性率（感度）と偽陽性率（１−特異度）の連続変数を反映する、包括的な指標である。これは、画像合成法により感度と特異度との間の関係を明らかにする。一連の異なるカットオフ値（閾値又は臨界値、診断検査の正常結果と異常結果の間の境界値）を連続変数として設定して、一連の感度と特異度の値を計算する。次に、感度を垂直座標として使用し、そして特異度を水平座標として使用して、曲線を描く。曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいほど、診断の精度は高くなる。ＲＯＣ曲線上では、座標図のはるか左上に最も近い点は、高感度値と高特異度値の両方を有する臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は、１．０と０．５の間である。ＡＵＣ＞０．５である場合、ＡＵＣが１に近づくにつれて診断結果がどんどん良くなる。ＡＵＣが０．５と０．７の間である場合、精度は低い。ＡＵＣが０．７と０．９の間である場合、精度は中程度である。ＡＵＣが０．９より大きい場合、精度はかなり高い。このアルゴリズム法は、好ましくはコンピュータで行われる。当該分野における既存のソフトウェア又はシステム（MedCalc 9.2.0.1医療統計ソフトウェア、SPSS 9.0、ROCPOWER.SAS、DESIGNROC.FOR、MULTIREADER POWER.SAS、CREATE-ROC.SAS、GB STAT VI0.0（Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, Md., USA）など）は、ＲＯＣ曲線の描画に使用することができる。
【００２６】
幾つかの実施態様において、所定の基準値は、以下の工程を含む方法を実施することによって決定される：ａ）目的の癌に罹患している被験体からの腫瘍組織試料の採取物を提供する工程；ｂ）工程ａ）で提供された各腫瘍組織試料について、対応する患者の実際の臨床転帰（即ち、無病生存（ＤＦＳ）期間及び／又は全生存（ＯＳ）期間）に関する情報を提供する工程；ｃ）連続した任意の定量値を提供する工程；ｄ）工程ａ）で提供された採取物に含まれる各腫瘍組織試料についてＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を定量する工程；ｅ）前記腫瘍組織試料を工程ｃ）で提供された１つの特定の任意の定量値についてそれぞれ２群：（ｉ）前記連続した定量値に含まれる前記任意の定量値よりも低いレベルの定量値を示す腫瘍組織試料を含む第１群；と（ii）前記連続した定量値に含まれる前記任意の定量値より高い前記レベルの定量値を示す腫瘍組織試料を含む第２群；とに分類する工程であって、それによって２群の腫瘍組織試料が前記特定の定量値について得られ、各群の腫瘍組織試料が別々に列挙される工程；ｆ）（ｉ）工程ｅ）で得られた定量値と、（ii）工程ｆ）で定義された第１群及び第２群に含まれる腫瘍組織試料が由来する患者の実際の臨床転帰との間の統計的有意性を計算する工程；ｇ）工程ｄ）で提供された任意の定量値が全て試験されるまで、工程ｆ）及びｇ）を繰り返す工程；ｈ）工程ｇ）で最も高い統計的有意性（最も有意）が計算された任意の定量値からなるように前記所定の基準値を設定する工程。例えば、患者１００人の腫瘍組織試料１００個について、ＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を評価した。試料１００個は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の密度によりランク付けされる。試料１は最高密度を有し、そして試料１００は最低密度を有する。最初の群分けは、一方に試料番号１と他方に他の試料９９個との２つのサブセットを提供する。次の群分けは、一方に試料１及び２、そして他方に残りの試料９８個を提供し、これを最後の群分け：一方に試料１〜９９、そして他方に試料番号１００まで続ける。対応する癌患者の実際の臨床転帰に関する情報により、２つのサブセットの９９群のそれぞれについてKaplan Meier曲線を作成する。また、９９群のそれぞれについて、両方のサブセット間のｐ値を計算した。次に、最小ｐ値の基準に基づく識別が最強であるように、所定の基準値が選択される。換言すれば、ｐ値が最小である両方のサブセット間の境界に対応するＣＤ８＋Ｔ細胞の密度が、所定の基準値と見なされる。注目すべきは、所定の基準値が必ずしも細胞密度の中央値ではないことである。よって幾つかの実施態様において、所定の基準値は、患者のＤＦＳ及びＯＳに関する不良な予後と良好な予後との識別を可能にする。実際には、単一の任意の定量値だけでなく、ある範囲の連続する任意の定量値について、高い統計的有意性値（例えば、低いＰ値）が一般に得られる。よって、本発明の１つの代替実施態様において、明白な所定の基準値を使用する代わりに、ある範囲の値が提供される。したがって、最小の統計的有意性値（有意性の最小閾値、例えば、最大閾値Ｐ値）は任意に設定され、工程ｇ）で計算された統計的有意性値がより高い（より有意な、例えば、より低いＰ値）、ある範囲の複数の任意の定��値が保持され、そのためある範囲の定量値が提供される。この定量値の範囲は、上記のような「カットオフ」値を含む。例えば、この「カットオフ」値の特定の実施態様によれば、転帰は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を、同定された値の範囲と比較することによって決定することができる。よって幾つかの実施態様において、カットオフ値は、ある範囲の定量値、例えば、最も高い統計的有意性値が見い出される定量値（例えば、一般には見い出される最小ｐ値）を中心とする範囲の定量値からなる。
【００２７】
本発明の更なる目的は、癌の処置を必要とする患者において癌を処置する方法であって、患者に治療有効量のＳＫ−１阻害剤を癌ワクチンと組合せて投与することを含む方法に関する。
【００２８】
本明細書に使用されるとき、「癌ワクチン」という用語は、当該分野においてその一般的な意味を有し、少なくとも１つの癌抗原に対して能動免疫を誘導することができる組成物のことをいう。癌ワクチンは、抗体の産生か、又は単に特定の細胞、詳しくは、抗原提示細胞、Ｔリンパ球（詳しくは、Ｔ−ＣＤ８＋細胞）及びＢリンパ球の活性化をもたらすことができる。癌ワクチンは、予防目的又は治療目的又はその両方のための組成物であり得る。本明細書に使用されるとき、「抗原」という用語は、抗体によって、又はＭＨＣ分子によりプロセシング及び提示される場合、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって特異的に結合されることが可能な分子のことをいう。「抗原」という用語は、本明細書に使用されるとき、Ｔ細胞エピトープをも包含する。抗原は更に、免疫系によって認識されることができるか、並びに／又はＢリンパ球及び／若しくはＴリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答及び／若しくは細胞性免疫応答を誘導することができる。抗原は、１つ以上のエピトープ又は抗原性部位（Ｂ−及びＴ−エピトープ）を有することができる。本明細書に使用されるとき、「癌抗原」という用語は、腫瘍組織に特有の抗原のことをいう。癌ワクチンには多数の種類がある。癌ワクチンの非限定的な例には、腫瘍細胞ワクチン、抗原ワクチン、樹状細胞ワクチン、ＤＮＡワクチン、及びベクターに基づくワクチンが含まれる。
【００２９】
典型的には、本発明の癌ワクチンは、腫瘍関連抗原（「ＴＡＡ」）又は腫瘍関連抗原をコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を含む。数多くの腫瘍関連抗原が当該分野において公知である。例示的な腫瘍関連抗原は、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、ＢＡＧＥ、β−カテニン、Ｂｅｌｌ  ２、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＣＡ−１２５、ＣＡＳＰ−８／ＦＬＩＣＥ、カテプシン類、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３，ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ｃ−ｍｙｃ、Ｃｏｘ−２、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ａ、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、ＧＡＧＥファミリー、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２、ＧｎＲＨ、ＧｎＴＶ、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌｌ７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐｌ５、ｇｐ７５／ＴＲＰ−１、ｈＣＧ、ヘパラナーゼ（heparanse）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＭＴＶ、Ｈｓｐ７０、ｈＴＥＲＴ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒ、ｉＮＯＳ、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、ＭＡＧＥファミリー、マンマグロビン、ＭＡＰ−１７、メランＡ／ＭＡＲＴ−１、メソテリン、ＭＩＣ Ａ Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐｌ５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦ、ｕＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポエチン（progenipoientin）、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、チモシン−β−１５、ＴＮＦ−α、ＴＹＲＰ−１、ＴＹＲＰ−２、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ、ＺＡＧ、ｐｌ６ＩＮＫ４、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含むが、これらに限定されない。
【００３０】
幾つかの実施態様において、ワクチンはＤＮＡワクチンである。被験体に注入することができる特定のＤＮＡを含有するようにベクターを設計することができ、これが細胞にＤＮＡを取り込ませる。一旦細胞がＤＮＡを取り込むと、ＤＮＡは細胞に特定の抗原を作るようにプログラムし、これが次に所望の免疫応答を誘発することができる。
【００３１】
幾つかの実施態様において、ワクチンは、癌抗原をコードするか又は発現する組換えウイルスからなる。幾つかの実施態様において、組換えウイルスは、腫瘍抗原を発現するポックスウイルスであり、より詳しくはワクシニアウイルス、改変ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara）（ＭＶＡ）ウイルス、又はＭＶＡ−ＢＮのような（しかし、これらに限定されない）オルトポックスウイルスである。ワクシニアウイルス株の例は、Temple of Heaven、Copenhagen、Paris、Budapest、Dairen、Gam、ＭＲＩＶＰ、Per、Tashkent、ＴＢＫ、Tom、Bern、Patwadangar、ＢＩＥＭ、Ｂ−１５、Lister、ＥＭ−６３、New York City Board of Health、Elstree、Ikeda及びＷＲ株である。好ましいワクシニアウイルス（Ｗ）株は、Wyeth（ＤＲＹＶＡＸ）株（米国特許第7,410,644号）である。別の好ましいＷ株は、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である（Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12: 1032-40）。別の好ましいＷ株は、ＭＶＡ−ＢＮである。本発明の実施に有用であり、ブダペスト条約の要件に準拠して寄託されているＭＶＡウイルス株の例は、European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdomに寄託番号ECACC 94012707で１９９４年１月２７日に寄託されたＭＶＡ５７２株、及びECACC 00120707の下で２０００年１２月７日に寄託されたＭＶＡ５７５株である。European Collection of Cell Cultures (ECACC)に２０００年８月３０日に番号V00083008の下で寄託されたＭＶＡ−ＢＮ及びその誘導体は、更なる例示的株である。幾つかの実施態様において、本発明は、癌治療のための組換えオルトポックスウイルス類、好ましくはワクシニアウイルス（Ｗ）、Wyeth株、ＡＣＡＭ１０００、ＡＣＡＭ２０００、ＭＶＡ又はＭＶＡ−ＢＮの使用を包含する。組換えオルトポックスウイルス類は、異種配列をオルトポックスウイルスに挿入することによって作成される。幾つかの実施態様において、腫瘍抗原を発現する組換えポックスウイルスは、限定されないが、鶏痘ウイルスのようなアビポックスウイルスである。「アビポックスウイルス」という用語は、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、ジュンコ痘ウイルス（Uncopoxvirus）、マイナ痘ウイルス（Mynahpoxvirus）、鳩痘ウイルス、オウム痘ウイルス、ウズラ痘ウイルス、クジャク痘ウイルス、ペンギン痘ウイルス、スズメ痘ウイルス（Sparrowpoxviras）、ムクドリ痘ウイルス（Starlingpoxviras）及びシチメンチョウ痘ウイルス（Turkeypoxviras）のような任意のアビポックスウイルスのことをいう。好ましいアビポックスウイルス類は、カナリア痘ウイルス及び鶏痘ウイルスである。
【００３２】
幾つかの実施態様において、ワクチン組成物は、選択された抗原を提示する抗原提示細胞の少なくとも１つの集団を含む。抗原提示細胞（又は刺激細胞）は、典型的にはその表面にＭＨＣクラスＩ又はII分子を有しており、１つの実施態様において、それ自体がＭＨＣクラスＩ又はII分子に選択抗原を収載することは実質的に不可能である。好ましくは、抗原提示細胞は樹状細胞である。適切には、樹状細胞は、目的の抗原（例えば、ペプチド）でパルス処理した自己樹状細胞である。腫瘍関連抗原由来のペプチドでパルス処理した自己樹状細胞を使用するＴ細胞療法は、Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380 及び Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278に開示されている。よって、幾つかの実施態様において、少なくとも１つの抗原提示細胞を含有するワクチン組成物は、１つ以上の抗原性ペプチドでパルス処理又は１つ以上の抗原性ペプチドを収載されている。代替法として、抗原提示細胞は、抗原性ペプチドをコードする発現構築物を含む。ポリヌクレオチドは、任意の適切なポリヌクレオチドであってもよく、樹状細胞に形質導入することができ、そしてペプチドの提示及び免疫応答の誘導をもたらすことが好ましい。
【００３３】
幾つかの実施態様において、ワクチン組成物は、１種以上のアジュバントを含む。アジュバントは、免疫応答（例えば、抗原に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞及びヘルパーＴ（ＴＨ）細胞が介在する免疫応答）を非特異的に増強するか又は強める物質であり、よって本発明の医薬品に有用であると考えられよう。適切なアジュバントは、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、AMPLIVAX（登録商標）、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラジェリン又はフラジェリン由来のＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ALDARA（登録商標））、レシキモド、ImuFact IMP321、ＩＬ−２、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１のようなインターロイキン類、インターフェロン−α若しくは−β、又はそれらのペグ化誘導体、IS Patch、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭｓ、JuvImmune（登録商標）、LipoVac、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、モノホスホリルリピッドＡ、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、油中水型及び水中油型エマルジョン、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、PepTel（登録商標）ベクターシステム、ポリ（ラクチドコグリコリド）［ＰＬＧ］系及びデキストラン微粒子、タラクトフェリン（talactoferrin）ＳＲＬ１７２、ビロソーム類及び他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β−グルカン、Pam3Cys、Aquila's ＱＳ２１スティミュロン（stimulon）（サポニン、マイコバクテリア抽出物及び合成細菌細胞壁模倣物に由来する）、並びに他の独自のアジュバント（Ribi's Detox、Quil、又はSuperfosなど）を含むが、これらに限定されない。フロイント又はＧＭ−ＣＳＦのようなアジュバントが好ましい。樹状細胞に特異的な幾つかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びその調製法は以前に記載されている（Allison and Krummel, 1995）。また、サイトカイン類を使用してもよい。幾つかのサイトカインは、リンパ組織への樹状細胞移動に影響を及ぼし（例えば、ＴＮＦ−）、Ｔリンパ球に対する効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速し（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１及びＩＬ−４）（米国特許第5,849,589号、具体的にその全体が参照により本明細書に取り込まれる）、そして免疫アジュバントとして作用する（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）（Gabrilovich et al., 1996）ことに直接関連付けられている。
【００３４】
本発明の更なる目的は、１つ以上の癌抗原に対する免疫応答を誘導するための、前記１つ以上の癌抗原と一緒に免疫アジュバントを含む癌ワクチンであって、免疫アジュバントがＳＫ−１阻害剤である癌ワクチンに関する。
【００３５】
「スフィンゴシンキナーゼ−１」又は「ＳＫ１」という用語は、スフィンゴシンのスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）への変換を触媒する酵素、即ち、スフィンゴシンをＳ１Ｐにリン酸化する酵素のことをいう。ＳＫ１の特性及び活性、例えば、ＳＫ１のタンパク質配列、ＳＫ１の構造特性、ＳＫ１の生化学的特性、及びＳＫ１の調節は、Taha et al.（2006, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 39(2): 113-131）に記載されている。よって本明細書に使用されるとき、「ＳＫ１阻害剤」という用語は、ＳＫ１の発現又は活性を阻害することができる任意の化合物のことをいう。本明細書に使用されるとき、「ＳＫ１活性」という用語は、例えば、時間的、部位的又は分布的な態様を含む、ＳＫ１の産生、放出、発現、機能、作用、相互作用又は調節のことをいう。ＳＫ１の活性は、修飾、例えば、ＳＫ１ポリペプチドの共有結合又は非共有結合修飾、ＳＫ１が他の物質に対して誘導する共有結合又は非共有結合修飾、ＳＫ１ポリペプチドの分布の変化、及びＳＫ１が他の物質の分布に対して誘導する変化を含む。ＳＫ１活性の任意の態様を評価することができる。当業者に公知の方法及び技術は、種々の参考文献、例えば、Ausubel et al., ed., Current Protocols in MoI. Biology, New York: John Wiley & Sons, 1990; Sambrook et al., MoI. Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, N. Y. (1989) に見い出すことができる。評価することができるＳＫ１活性の例は、ＳＫ１ポリペプチドの結合分子への結合活性；翻訳後修飾又は標的遺伝子の安定性に及ぼすＳＫ１ポリペプチドの効果；ＳＫ１タンパク質のレベル；ＳＫ１ ｍＲＮＡのレベル；又はＳＫ１修飾、例えば、リン酸化、アセチル化、メチル化、カルボキシル化若しくはグリコシル化のレベルを含む。結合分子とは、ＳＫ１が結合することができる任意の分子、例えば、核酸、例えば、ＤＮＡ調節領域、タンパク質、代謝物、ペプチド模倣物、非ペプチド模倣物、抗体、又は任意の他の種類のリガンドを意味する。結合は、例えば、電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）によるか、酵母又は哺乳動物のツーハイブリッド又はスリーハイブリッドアッセイによるか、ジメチルスフィンゴシン光親和性標識又はビオチン−ＳＫ１結合との競合により、示すことができる。ＳＫ１による標的遺伝子のトランス活性化は、例えば、標的遺伝子のプロモーターがレポーター遺伝子、例えば、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼに連結され、ＳＫ１発現ベクターと同時トランスフェクトされる、一過性トランスフェクションアッセイで決定することができる。ＳＫ１タンパク質、ｍＲＮＡ又は修飾のレベルは、例えば、試料、例えば、組織試料、例えば、血管の内皮細胞、血液又はリンパ器官からのＴ及びＢリンパ球、心臓、筋肉又は骨関節中で測定することができる。幾つかの実施態様において、評価はインビトロで行われる；他の実施態様において、評価はインビボで行われる。
【００３６】
ＳＫ１阻害剤は、当業者には周知である。例えば、当業者は、以下の特許公報から容易にこのような阻害剤を同定することができる：WO2003105840、WO2006138660、WO2010033701、WO2010078247、WO2010127093、WO2011020116、WO2011072791、WO2012069852、WO2013119946、WO2014118556及びWO2014157382。
【００３７】
幾つかの実施態様において、ＳＫ１阻害剤は、以下からなる群より選択される：３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸イソプロピルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸シクロプロピルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（２−エチルスルファニル−エチル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸フェニルアミド；アダマンタン−１−カルボン酸（４−ヒドロキシ−フェニル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（４−ヒドロキシ−フェニル）−アミド；酢酸４−｛［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボニル］−アミノ｝−フェニルエステル；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（２，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（３−ヒドロキシメチル−フェニル）−アミド；アダマンタン−１−カルボン酸（４−シアノメチル−フェニル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（４−シアノメチル−フェニル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸ベンジルアミド；３−（４−クロロ（Cliloro）−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸４−tert−ブチル−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸４−メチルスルファニル−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸３−トリフルオロメチル−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸４−トリフルオロメチル−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸３，５−ビス−トリフルオロメチル−ベンジルアミド（benκylamide）；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸３−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸２−フルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸３，５−ジフルオロ−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸３，４−ジフルオロ−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸３，４，５−トリフルオロ−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸３−クロロ−４−フルオロ−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸４−フルオロ−３−トリフルオロメチル−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸２−クロロ−４−フルオロ−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸４−クロロ−３−トリフルオロメチル−ベンジルアミド（benΣylamide）；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸３−アミノメチル−２，４，５，６−テトラクロロ−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダ���ンタン−１−カルボン酸［１−（４−クロロ−フェニル）−エチル］−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸［１−（４−ブロモ−フェニル）−エチル］−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸４−メタンスルホニル−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸４−ジメチルアミノ−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸４−トリフルオロメトキシ−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸３−トリフルオロメトキシ−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸４−フェノキシ−ベンジルアミド；アダマンタン−１−カルボン酸３，４−ジヒドロキシ−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸３，４−ジヒドロキシ−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸フェネチル−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸［２−（４−フルオロ−フェニル）−エチル］−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸［２−（４−ブロモ−フェニル）−エチル］−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸［２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−エチル］−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸４−フェノキシ−ベンジルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸［２−（３−ブロモ−４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド；アダマンタン−１−カルボン酸［２−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−エチル］−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸［２−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−エチル］−アミド；
３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（２−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−エチル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸［２−（３−フェノキシ−フェニル）−エチル］−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸［２−（４−フェノキシ−フェニル）−エチル］−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（３−フェニル−プロピル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（ビフェニル−４−イルメチル）−アミド；アダマンタン−１−カルボン酸（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（３−tert−ブチルアミノ−プロピル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（３−ピロリジン−１−イル−プロピル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸［３−（２−オキソ−ピロリジン−１−イル）−プロピル］−アミド；アダマンタン−１−カルボン酸［２−（１−メチル−ピロリジン−２−イル）−エチル］−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸［２−（１−メチル−ピロリジン−２−イル）−エチル］−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（２−ピペラジン−１−イル−エチル（etliyl））−アミド；アダマンタン−１−カルボン酸（ピリジン−４−イルメチル）−アミド；３−（４−フルオロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（ピリジン−４−イルメチル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン（adarnantane）−１−カルボン酸（ピリジン−４−イルメチル）−アミド；アダマンタン−１−カルボン酸（ピリジン−４−イルメチル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（２−ピリジン−４−イル−エチル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル（pb.enyl））−アダマンタン−１−カルボン酸（２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−アミド；３−（４−クロロ（Cliloro）−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（９−エチル−９Ｈ−カルバゾール−３−イル）−アミド；アダマンタン−１−カルボン酸［４−（４−クロロ−フェニル）−チアゾール−２−イル］−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸［４−（４−クロロ−フェニル）−チアゾール−２−イル］−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カル���ン酸ベンゾチアゾール−２−イルアミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（５−クロロ−ベンゾオキサゾール−２−イル）−アミド；３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−カルボン酸（９Ｈ−プリン−６−イル）−アミド；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−イソプロピル−アミン；４−｛［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−アミノ｝−フェノール；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）−アミン；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−（２−フルオロ−４−トリフルオロメチル（trifluoromemyl）−ベンジル）−アミン；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−（４−フルオロ−３−トリフルオロメチル−ベンジル）−アミン；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−（４−トリフルオロメトキシ−ベンジル）−アミン；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−［２−（３−フェノキシ−フェニル）−エチル］−アミン；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−アミン；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル（yhnethyl）］−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−アミン；Ｎ−tert−ブチル−Ｎ’−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−プロパン−１，３−ジアミン；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−（３−ピロリジン−１−イル−プロピル）−アミン；
［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−［２−（１−メチル−ピロリジン−２−イル）−エチル］−アミン；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミン；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−ピリジン−４−イルメチル−アミン；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−（９−エチル−９Ｈ−カルバゾール−３−イル）−アミン；［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イルメチル］−［５−（４−クロロ−フェニル）−チアゾール−２−イル］−アミン；１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチルアミン；｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−イソプロピル−アミン；フェニル−［１−（３−フェニル−アダマンタン−１−イル）−エチル］−アミン；｛１−［３−（４−フルオロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−フェニル−アミン；｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−フェニル−アミン（ainine）；（１−アダマンタン−１−イル−エチル）−ベンジル−アミン；ベンジル−［１−（３−フェニル−アダマンタン−１−イル）−エチル］−アミン；ベンジル−｛１−［３−（４−フルオロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−アミン；ベンジル−｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−アミン；（４−tert−ブチル−ベンジル）−｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−アミン；［１−（４−ブロモ−フェニル）−エチル］−｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−アミン；（１−アダマンタン−１−イル−エチル）−［２−（４−ブロモ−フェニル）−エチル］−アミン；［２−（４−ブロモ−フェニル）−エチル］−｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−アミン；（１−アダマンタン−１−イル−エチル）−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−アミン；（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−［１−（３−フェニル−アダマンタン−１−イル）−エチル］−アミン；｛１−［３−（４−フルオロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−アミン；｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−アミン；｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−アミン；｛１−［３−（フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−ピリジン−４−イルメチル−アミン；｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−（６−クロロ−ピリジン−３−イルメチル）−アミン；｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−（２−ピリジン−４−イル−エチル）−アミン；｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマン��ン−１−イル］−エチル｝−（３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル）−アミン；｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−（２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−アミン；｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−（９−エチル−９Ｈ−カルバゾール−３−イル）−アミン；｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−（９−エチル−９Ｈ−カルバゾール−３−イルメチル）−アミン；９−エチル−９Ｈ−カルバゾール−３−カルボン酸｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−アミド；１−｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素；１−｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチル−フェニル）−尿素；（４−ブロモ−チオフェン−２−イルメチル）−｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−アミン；及び｛１−［３−（４−クロロ−フェニル）−アダマンタン−１−イル］−エチル｝−（４−フェニル−チオフェン−２−イルメチル）−アミン。
【００３８】
幾つかの実施態様において、本発明のＳＫ１阻害剤は、以下からなる群より選択される：
【化１】
2019509261.tif 000002
【００３９】
幾つかの実施態様において、ＳＫ１阻害剤は、下記式：
【化２】
2019509261.tif 000003
で示される、Ｎ’−［（２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）メチリデン］−３−（ナフタレン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボヒドラジドである。
【００４０】
幾つかの実施態様において、ＳＫ１阻害剤はＳＫ１発現の阻害剤である。「発現の阻害剤」とは、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然又は合成の化合物のことをいう。本発明の好ましい実施態様において、前記遺伝子発現の阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムである。例えば、アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＫ１ ｍＲＮＡに結合し、そしてタンパク質翻訳を妨げるか、又はｍＲＮＡ分解を増加させることにより、ＳＫ１ ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするように作用し、それによって細胞内でのＳＫ１のレベル、ひいては活性を低下させるであろう。例えば、少なくとも約１５塩基の、そしてＳＫ１をコードするｍＲＮＡ転写配列の固有の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、従来のホスホジエステル法によって合成することができる。配列が既知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用する方法は、当該分野において周知である（例えば、米国特許第6,566,135号、第6,566,131号、第6,365,354号、第6,410,323号、第6,107,091号、第6,046,321号、及び第5,981,732号を参照のこと）。阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）はまた、本発明における使用のための発現の阻害剤としても機能し得る。ＳＫ１遺伝子発現が特異的に阻害されるように（即ち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクター若しくは構築物に被験体又は細胞を接触させることによって、ＳＫ１遺伝子発現を減少させることができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びリボザイムは、インビボで、単独で又はベクターと共同して送達することができる。その最も広い意味において、「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイム核酸の細胞及び典型的にはＳＫ１を発現する細胞への移入を容易にすることができる任意のビヒクルである。典型的には、ベクターは、ベクターの非存在下で生じるであろう分解の程度と比べると低下した分解を伴って核酸を細胞に輸送する。一般に、本発明に有用なベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は取り込みによって操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス又は細菌源に由来する他のビヒクルを含むが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、好ましい種類のベクターであり、以下のウイルス由来の核酸配列を含むが、これらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；並びにレトロウイルスのようなＲＮＡウイルス。命名されていないが当業者には知られている他のベクターを容易に採用することができよう。
【００４１】
幾つかの実施態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、及び抗Ｂ７Ｈ６抗体からなる群より選択される抗体である。
【００４２】
本明細書に使用されるとき、「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すためにこうして使用され、そしてこの用語は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢｓ）、ＴａｎｄＡｂｓ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、線状抗体、ミニボディ（minibodies）、ダイアボディ（diabodies）、二重特異性抗体断片、バイボディ（bibody）、トリボディ（tribody）（ｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合体、それぞれ二重特異性又は三重特異性）；ｓｃ−ダイアボディ；κ（λ）ボディ（ｓｃＦｖ−ＣＬ融合体）；ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Bispecific T-cell Engager）、Ｔ細胞を引き付けるｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ−Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性フォーマット）；ＳＩＰ（低分子免疫タンパク質（small immunoprotein）、一種のミニボディ）；ＳＭＩＰ（「小モジュラー免疫薬（small modular immunopharmaceutical）」ｓｃＦｖ−Ｆｃ二量体）；ＤＡＲＴ（ｄｓ−安定化ダイアボディ「二重親和性リターゲティング（Dual Affinity ReTargeting）」）；１つ以上のＣＤＲを含む小型抗体模倣物などのような抗原結合ドメインを含む抗体断片を含む。種々の抗体ベースの構築物及び断片を調製及び使用するための技術は当該分野において周知である（具体的に参照により本明細書に取り込まれる、Kabat et al., 1991を参照のこと）。ダイアボディは、詳しくは、EP 404,097及びWO 93/11161に更に記載されており；一方、線状抗体は、Zapata et al. (1995)に更に記載されている。抗体は、従来法を用いて断片化することができる。例えば、抗体をペプシンで処理することによりＦ（ａｂ’）２断片を生成することができる。得られたＦ（ａｂ’）２断片は、ジスルフィド架橋を還元するように処理して、Ｆａｂ’断片を生成することができる。パパイン分解によって、Ｆａｂ断片を形成させることができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂｓ、ＴａｎｄＡｂｓ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片並びに他の断片もまた、組換え技術によって合成することができるか、又は化学的に合成することができる。抗体断片を産生する技術は周知であり、当該分野において報告されている。例えば、Beckman et al., 2006; Holliger & Hudson, 2005; Le Gall et al., 2004; Reff & Heard, 2001 ; Reiter et al., 1996; 及びYoung et al., 1995のそれぞれは、有効な抗体断片の産生を更に記載しており可能にしている。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は一本鎖抗体である。本明細書に使用されるとき、「単一ドメイン抗体」という用語は、当該分野においてその一般的な意味を有し、軽鎖が天然に存在しないラクダ科哺乳動物に見い出され得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインのことをいう。そのような単一ドメイン抗体はまた「ナノボディ（nanobody）（登録商標）」である。（単一）ドメイン抗体の一般的な説明についてはまた、上記の先行技術、更にはEP 0 368 684、Ward et al. (Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6), Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490;及び WO 06/030220, WO 06/003388が参照される。
【００４３】
幾つかの実施態様において、抗体はヒト化抗体である。本明細書に使用されるとき、「ヒト化」は、ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸の幾つか、大部分又は全てがヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸で置換されている抗体を説明する。ヒト化の方法は、米国特許第4,816,567号、第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号及び第5,859,205号（これらは参照により本明細書に取り込まれる）に記載されているものを含むが、これらに限定されない。
【００４４】
幾つかの実施態様において、抗体は完全ヒト型抗体である。完全ヒト型モノクローナル抗体もまた、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分について遺伝子導入したマウスを免疫付与することによって調製することができる。例えば、米国特許第5,591,669号、第5,598,369号、第5,545,806号、第5,545,807号、第6,150,584号及びそこに引用された参考文献（これらの内容は参照により本明細書に取り込まれる）を参照のこと。これらの動物は、内因性（例えば、マウス）抗体の産生に機能的欠損が存在するように遺伝子組換えされている。動物は更に、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むように改変されるため、これらの動物を免疫付与すると、目的の抗原に対する完全ヒト型抗体が産生されよう。これらのマウス（例えば、XenoMouse（Abgenix）、HuMAbマウス（Medarex / GenPharm））の免疫付与後、モノクローナル抗体を標準的なハイブリドーマ技術により調製することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するため、ヒトに投与した場合、ヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）反応を引き起こさないであろう。ヒト抗体を産生するためのインビトロ法も存在する。これらは、ファージディスプレイ技術（米国特許第5,565,332号及び第5,573,905号）及びインビトロでのヒトＢ細胞の刺激（米国特許第5,229,275号及び第5,567,610号）を含む。これらの特許の内容は、参照により本明細書に取り込まれる。
【００４５】
幾つかの実施態様において、抗体はヒト重鎖定常領域配列を含むが、これらが結合するＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させず、そして好ましくは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するＦｃ部分を含まない。本明細書に使用されるとき、ＣＤ８＋Ｔ細胞に関して「枯渇」という用語は、試料中又は被験体中に存在するＣＤ８＋Ｔ細胞の数に悪影響を与えるように、死滅、排除、溶解させることができるか、又はこのような死滅、排除若しくは溶解を誘導することができるプロセス、方法、又は化合物を意味する。「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」及び「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖のＣ末端断片、例えば、約アミノ酸（ａａ）２３０〜約ａａ４５０のヒトγ重鎖、若しくは他の種類の抗体重鎖（例えば、ヒト抗体のα、δ、ε及びμ）におけるその対応する配列、又はそれらの天然に存在するアロタイプのことをいう。特に断りない限り、免疫グロブリンのために一般に認められているKabatのアミノ酸番号付けが、この開示を通して使用されている（Kabat et al. (1991 ) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MDを参照のこと）。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇を直接的又は間接的に導くことはない（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞数の１０％、２０％、５０％、６０％又はそれ超の排除又は減少を導かない）。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、ＦｃｇＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドに実質的に結合することができるＦｃドメインを含まない。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、Ｆｃドメインを欠く（例えば、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを欠く）か、又はＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、一本鎖抗体断片、又は複数の異なる抗体断片を含む多特異的抗体からなるか、又はこれらを含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、毒性部分に結合していない。幾つかの実施態様において、抗体がＣ２ｑ結合を変化させるか、及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低下若しくは消失するように、アミノ酸残基から選択される１個以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することができる。このアプローチは、ldusogie et al.による米国特許第6,194,551号に更に詳細に記載されている。
【００４６】
抗ＣＴＬＡ−４抗体の例は、米国特許第5,811,097号；第5,811,097号；第5,855,887号；第6,051,227号；第6,207,157号；第6,682,736号；第6,984,720号；及び第7,605,238号に記載されている。１つの抗ＣＴＬＡ−４抗体は、トレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）である。幾つかの実施態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＣＴＬＡ−４に結合する完全ヒト型モノクローナルＩｇＧ抗体であるイピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ−Ｄ０１０としても知られている）である。
【００４７】
ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１抗体の例は、米国特許第7,488,802号；第7,943,743号；第8,008,449号；第8,168,757号；第8,217,149号、及びＰＣＴ公開特許出願 WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400、及びWO2011161699に記載されている。幾つかの実施態様において、ＰＤ−１ブロッカーは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。特定の他の実施態様において、ＰＤ−１ブロッカーは、抗ＰＤ−１抗体及び類似の結合タンパク質を含むが、これらは、ＰＤ−１に結合して、そのリガンドのＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２によりＰＤ−１の活性化をブロックする完全ヒト型ＩｇＧ４抗体であるニボルマブ（ＭＤＸ １１０６、ＢＭＳ ９３６５５８、ＯＮＯ ４５３８）；ＰＤ−１に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体であるラムブロリズマブ（lambrolizumab）（ＭＫ−３４７５又はＳＣＨ ９００４７５）；ＰＤ−１に結合するヒト化抗体であるＣＴ−０１１；Ｂ７−ＤＣの融合タンパク質であるＡＭＰ−２２４；抗体Ｆｃ部分；ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）遮断のためのＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５−０１）などである。
【００４８】
他の免疫チェックポイント阻害剤は、可溶性Ｉｇ融合タンパク質であるＩＭＰ３２１（Brignone et al., 2007, J. Immunol. 179:4202-4211）のようなリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）阻害剤を含む。他の免疫チェックポイント阻害剤は、Ｂ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４阻害剤のようなＢ７阻害剤を含む。詳しくは、抗Ｂ７−Ｈ３抗体のＭＧＡ２７１（Loo et al., 2012, Clin. Cancer Res. July 15 (18) 3834）。また、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３）阻害剤（Fourcade et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2175-86 及び Sakuishi et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2187-94）が含まれる。本明細書に使用されるとき、「ＴＩＭ−３」という用語は、当該分野においてその一般的な意味を有し、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子３のことをいう。ＴＩＭ−３の天然リガンドは、ガレクチン９（Ｇａｌ９）である。したがって、「ＴＩＭ−３阻害剤」という用語は、本明細書に使用されるとき、ＴＩＭ−３の機能を阻害することができる化合物、物質又は組成物のことをいう。例えば、この阻害剤は、ＴＩＭ−３の発現若しくは活性を阻害するか、ＴＩＭ−３シグナル伝達経路を調節若しくはブロックするか、及び／又はＴＩＭ−３のガレクチン−９への結合をブロックすることができる。ＴＩＭ−３に特異性を有する抗体は、当該分野において周知であり、典型的にはWO2011155607、WO2013006490及びWO2010117057に記載されているものである。
【００４９】
幾つかの実施態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＩＤＯ阻害剤である。ＩＤＯ阻害剤の例は、WO 2014150677に記載されている。ＩＤＯ阻害剤の例は、１−メチル−トリプトファン（ＩＭＴ）、β−（３−ベンゾフラニル）−アラニン、β−（３−ベンゾ（ｂ）チエニル）−アラニン、６−ニトロ−トリプトファン、６−フルオロ−トリプトファン、４−メチル−トリプトファン、５−メチルトリプトファン、６−メチル−トリプトファン、５−メトキシ−トリプトファン、５−ヒドロキシ−トリプトファン、インドール−３−カルビノール、３，３’−ジインドリルメタン、没食子酸エピガロカテキン、５−Ｂｒ−４−Ｃｌ−インドキシル１，３−ジアセタート、９−ビニルカルバゾール、アセメタシン、５−ブロモ−トリプトファン、５−ブロモインドキシルジアセタート、３−アミノ−ナフトエ酸（naphtoic acid）、ピロリジンジチオカルバマート、４−フェニルイミダゾール、ブラシニン誘導体、チオヒダントイン誘導体、β−カルボリン誘導体又はブラッシレキシン誘導体を含むが、これらに限定されない。好ましくは、ＩＤＯ阻害剤は、１−メチル−トリプトファン、β−（３−ベンゾフラニル）−アラニン、６−ニトロ−Ｌ−トリプトファン、３−アミノ−ナフトエ酸（naphtoic acid）及びβ−［３−ベンゾ（ｂ）チエニル］−アラニン又はこれらの誘導体若しくはプロドラッグから選択される。
【００５０】
本明細書に使用されるとき、「同時投与」という用語は、ＳＫ１阻害剤と免疫チェックポイント阻害剤との組合せが同じ患者に投与されるプロセスを意味する。ＳＫ１阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、同時に、本質的に同時に、又は連続的に投与されてよい。投与が連続的に行われる場合、ＳＫ１阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤の前に投与される。ＳＫ１阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、同じビヒクルを用いて投与される必要はない。ＳＫ１阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、１回以上投与されてもよく、組合せの各成分の投与回数は、同じであっても異なっていてもよい。更に、ＳＫ１阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、同じ部位に投与される必要はない。
【００５１】
本明細書に使用されるとき、「治療上有効な組合せ」という用語は、疾患（例えば、癌）を処置するのに充分な量又は用量の免疫チェックポイント阻害剤と一緒になった、ある量又は用量のＳＫ１阻害剤のことをいう。所与の治療上有効な組合せにおけるＳＫ１阻害剤の量は、異なる個体及び異なる腫瘍型について異なり得、そして組合せに含まれる１種以上の追加の薬剤又は処置に依存するだろう。「治療有効量」は、「治療転帰の改善」が得られるように、当業者によって日常的に採用される手順を用いて決定される。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の一日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されよう。任意の特定の被験体に対する特定の治療有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；採用される特定の化合物の活性；採用される特定の組成物；被験体の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食生活；投与時間、投与経路、及び採用される特定の化合物の排泄速度；処置の継続時間；採用される特定のポリペプチドと組合せるか又は同時に使用される薬物；並びに医学分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルより低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、充分に当該分野の技能の範囲内である。しかしながら、生成物の１日投与量は、１日当たり成人１人当たり０．０１〜１，０００mgの広い範囲にわたって変化させることができる。典型的には、組成物は、処置される被験体への投与量の対症的調整のために、活性成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgを含有する。医薬品は、典型的には活性成分約０．０１mg〜約５００mg、好ましくは活性成分１mg〜約１００mgを含有する。薬物の有効量は、通常０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重/日、特に約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重/日の投与量レベルで供給される。
【００５２】
本発明によれば、ＳＫ１阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、医薬組成物の形態で被験体に投与される。典型的には、ＳＫ１阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、治療用組成物を形成するために、薬学的に許容し得る賦形剤、及び場合により徐放性マトリックス（生分解性ポリマーなど）と組合せることができる。「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」とは、必要に応じて、哺乳動物、特にヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性の又は他の厄介な反応を生成しない分子実体及び組成物のことをいう。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤とは、任意の種類の非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤補助剤のことをいう。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物において、活性成分は、単独又は別の活性成分と組合せて、単位投与形態で、従来の薬学的支援物との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、粉末剤、顆粒剤及び経口懸濁剤又は液剤のような経口経路形態；舌下及び口腔内投与形態；エアロゾル、インプラント、皮下（subcutaneous）、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下（subdermal）、経皮、髄腔内及び鼻腔内投与形態並びに直腸投与形態を含む。典型的には、医薬組成物は、注射することができる製剤用の、薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、詳しくは、等張性の無菌の生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウムなど、又はこのようなの塩の混合物）であっても、又は乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であってもよいが、後者は、場合に応じて、滅菌水又は生理食塩水の添加により注射液剤の構成が可能になる。注射用途に適した医薬形態は、無菌水溶液剤又は分散剤；ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌の注射液剤又は分散剤の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、そして注射器使用が容易である程度に流動性でなければならない。これは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して守られなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として本発明の化合物を含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散剤もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存料を含有する。ＳＫ１阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤は、中性又は塩の形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、これは無機酸（例えば、塩酸又はリン酸など）と、又は有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は第二鉄の水酸化物など）から、及び有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することもできる。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒体であることができる。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散剤の場合には必要とされる粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によって達成できる。無菌注射液剤は、必要量の活性化合物を上に列挙した幾つかの他の成分と共に適切な溶媒に組み込み、必要に応じて、次に濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、基本的な分散媒体と上に列挙したものからの必要な他の成分とを含む無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射液剤の調製用の無菌粉末の場合には、典型的な調製方法は、活性成分プラス任意の追加の所望の成分の粉末を、予め無菌濾過されたその溶液から生成する、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。直接注射用のより濃縮された又は高度に濃縮された液剤の調製も考慮され、ここで、ＤＭＳＯの溶媒としての使用を想定すると、非常に迅速な浸透がもたらされ、高濃度の活性薬剤を小さな腫瘍領域に送達する。製剤により、液剤は、用量製剤（dosage formulation）に適合するやり方で、かつ治療上有効であるような量で投与されよう。製剤は、上記の注射液剤の種類のような種々の剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども採用することができる。水性液剤での非経口投与には、例えば、液剤を必要ならば適切に緩衝すべきであり、液体希釈剤を先ず充分な生理食塩水又はグルコースで等張性にする。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、採用し得る無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者には公知であろう。投与量の幾分の変動は、処置される被験体の症状に応じて必然的に生じよう。いずれにせよ、投与の責任者は、個々の被験体のための適切な用量を決定するであろう。
【００５３】
本発明は、以下の図面及び実施例により更に説明されよう。しかし、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＳＫ１のダウンレギュレーションは、マウスにおけるメラノーマ腫瘍発生を減少させる。（Ａ）対照（ｓｈＣｔｒｌ）又は２つのＳＫ１標的ｓｈＲＮＡ：ｓｈＳＫ１及びｓｈＳＫ１（２）で安定にトランスフェクトしたYumm細胞で、ＳＫ１酵素活性を測定した。ｓｈＳＫ１でトランスフェクトした細胞における酵素活性（pmol/分/mgタンパク質として計算）をｓｈＣｔｒｌ細胞の活性と比較する。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。（Ｂ〜Ｄ）野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ及びＣ）又はＣＤ８欠損マウス（Ｄ）の真皮に、ｓｈＣｔｒｌ又はｓｈＳＫ１ Yumm細胞（３．１０５）を注入した。腫瘍体積を指示日（Ｂ及びＤ）又は実験終了時（Ｃ、２６日目）に決定した。増殖プロフィールは、腫瘍体積の平均±ＳＥＭとして示され、少なくとも２回の独立した実験を代表している。（Ｂ及びＣ ｎ＝１２／群、Ｄ ｎ＝８／群）。マンホイットニー検定を用いて試料を比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２Ａ】ＳＫ１のダウンレギュレーションは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び活性化を増加させ、逆にＴｒｅｇを減少させる。ｓｈＣｔｒｌ又はｓｈＳＫ１ Yummマウスメラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに注入して、ＴＩＬをフローサイトメトリーを用いて１１日目に分析した。（Ａ）１１日目の腫瘍におけるＣＤ８＋、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋（Ｔｒｅｇ）及びＦｏｘｐ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合並びにＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。（Ｂ及びＣ）Ｋｉ６７、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４を発現するＣＤ８＋（Ｂ）及びＴｒｅｇ細胞（Ｃ）の比率を評価した。各記号は、独立した腫瘍（ｎ＝９マウス／群）を表す。結果は、少なくとも２回の独立した実験を代表している。マンホイットニー検定を用いて試料を比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２Ｂ】ＳＫ１のダウンレギュレーションは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び活性化を増加させ、逆にＴｒｅｇを減少させる。ｓｈＣｔｒｌ又はｓｈＳＫ１ Yummマウスメラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに注入して、ＴＩＬをフローサイトメトリーを用いて１１日目に分析した。（Ａ）１１日目の腫瘍におけるＣＤ８＋、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋（Ｔｒｅｇ）及びＦｏｘｐ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合並びにＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。（Ｂ及びＣ）Ｋｉ６７、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４を発現するＣＤ８＋（Ｂ）及びＴｒｅｇ細胞（Ｃ）の比率を評価した。各記号は、独立した腫瘍（ｎ＝９マウス／群）を表す。結果は、少なくとも２回の独立した実験を代表している。マンホイットニー検定を用いて試料を比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２Ｃ】ＳＫ１のダウンレギュレーションは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び活性化を増加させ、逆にＴｒｅｇを減少させる。ｓｈＣｔｒｌ又はｓｈＳＫ１ Yummマウスメラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに注入して、ＴＩＬをフローサイトメトリーを用いて１１日目に分析した。（Ａ）１１日目の腫瘍におけるＣＤ８＋、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋（Ｔｒｅｇ）及びＦｏｘｐ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合並びにＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比。（Ｂ及びＣ）Ｋｉ６７、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４を発現するＣＤ８＋（Ｂ）及びＴｒｅｇ細胞（Ｃ）の比率を評価した。各記号は、独立した腫瘍（ｎ＝９マウス／群）を表す。結果は、少なくとも２回の独立した実験を代表している。マンホイットニー検定を用いて試料を比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３Ａ】腫瘍細胞におけるＳＫ１のダウンレギュレーションは、抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤ−１療法の有効性を増強する。０日目にマウスに３．１０５ ｓｈＣｔｒｌ又はｓｈＳＫ１ Yumm細胞を負荷し、次に対照抗体（上のパネル）、α−ＣＴＬＡ−４（７、１０及び１３日目）又は／及びα−ＰＤ−１（５、７及び１０日目）で処置した。（Ａ及びＢ）各腫瘍について個々の曲線が描かれる（ｎ＝６〜１１マウス／群）。挿入：数字は、２５日目の無腫瘍マウスの割合を示す。（Ｃ）累積生存曲線（ログランク検定：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｄ）１１日目の腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、テューキー（Tukey）ボックス（ｎ＝１０／群）として表される。結果は、少なくとも２回の独立した実験を代表している。マンホイットニー検定を用いて試料を比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３Ｂ】腫瘍細胞におけるＳＫ１のダウンレギュレーションは、抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤ−１療法の有効性を増強する。０日目にマウスに３．１０５ ｓｈＣｔｒｌ又はｓｈＳＫ１ Yumm細胞を負荷し、次に対照抗体（上のパネル）、α−ＣＴＬＡ−４（７、１０及び１３日目）又は／及びα−ＰＤ−１（５、７及び１０日目）で処置した。（Ａ及びＢ）各腫瘍について個々の曲線が描かれる（ｎ＝６〜１１マウス／群）。挿入：数字は、２５日目の無腫瘍マウスの割合を示す。（Ｃ）累積生存曲線（ログランク検定：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｄ）１１日目の腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、テューキー（Tukey）ボックス（ｎ＝１０／群）として表される。結果は、少なくとも２回の独立した実験を代表している。マンホイットニー検定を用いて試料を比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３Ｃ】腫瘍細胞におけるＳＫ１のダウンレギュレーションは、抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤ−１療法の有効性を増強する。０日目にマウスに３．１０５ ｓｈＣｔｒｌ又はｓｈＳＫ１ Yumm細胞を負荷し、次に対照抗体（上のパネル）、α−ＣＴＬＡ−４（７、１０及び１３日目）又は／及びα−ＰＤ−１（５、７及び１０日目）で処置した。（Ａ及びＢ）各腫瘍について個々の曲線が描かれる（ｎ＝６〜１１マウス／群）。挿入：数字は、２５日目の無腫瘍マウスの割合を示す。（Ｃ）累積生存曲線（ログランク検定：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｄ）１１日目の腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、テューキー（Tukey）ボックス（ｎ＝１０／群）として表される。結果は、少なくとも２回の独立した実験を代表している。マンホイットニー検定を用いて試料を比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３Ｄ】腫瘍細胞におけるＳＫ１のダウンレギュレーションは、抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤ−１療法の有効性を増強する。０日目にマウスに３．１０５ ｓｈＣｔｒｌ又はｓｈＳＫ１ Yumm細胞を負荷し、次に対照抗体（上のパネル）、α−ＣＴＬＡ−４（７、１０及び１３日目）又は／及びα−ＰＤ−１（５、７及び１０日目）で処置した。（Ａ及びＢ）各腫瘍について個々の曲線が描かれる（ｎ＝６〜１１マウス／群）。挿入：数字は、２５日目の無腫瘍マウスの割合を示す。（Ｃ）累積生存曲線（ログランク検定：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｄ）１１日目の腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、テューキー（Tukey）ボックス（ｎ＝１０／群）として表される。結果は、少なくとも２回の独立した実験を代表している。マンホイットニー検定を用いて試料を比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４】ＳＫ１の薬理学的阻害は、ＣＴＬＡ−４遮断と相乗作用してメラノーマ腫瘍を根絶させる。０日目にマウスに３．１０５のトランスフェクトされていないYumm細胞を負荷し、次に５、７、１０、１３及び１５日目にＳＫＩ−Ｉで処置したか、又は処置しなかった。対照抗体又はα−ＣＴＬＡ−４を７、１０及び１３日目に注入した。（Ａ）指示日に個々の腫瘍について決定された腫瘍体積が描かれる（ｎ＝６マウス／群）。挿入：数字は、３０日目の無腫瘍マウスの割合を示す。（Ｂ）累積生存曲線（ログランク検定：＊ｐ＜０．０５）。
【図５】ＳＫ１の薬理学的阻害は、抗ＰＤ−１遮断と相乗作用してメラノーマ及び結腸癌における腫瘍増殖を減少させる。（Ａ）０日目にマウスに３．１０５のトランスフェクトされていないYumm細胞を負荷し、次に５、７、１０、１３及び１５日目にＳＫＩ−Ｉで処置したか、又は処置しなかった。対照抗体又はα−ＰＤ−１を５、７及び１０日目に注入した（ｎ＝１１〜１２マウス／群）。（Ｂ）０日目にマウスに３．１０５ ＭＣ３８細胞を接種し、次に５、７、１０、１３及び１５日目にＳＫＩ−Ｉで処置したか、又は処置しなかった。対照抗体又はα−ＰＤ−１を７及び１０日目に注入した（ｎ＝４〜６マウス／群）。指示日に腫瘍体積（各群について平均±ＳＥＭ）を決定した。マンホイットニー検定を用いて試料を比較した。＊ｐ＜０．０５。
【実施例】
【００５５】
材料及び方法
細胞培養
ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異、Ｐｔｅｎ及びＣｄｋｎ２ａ欠損を有するYummマウスメラノーマ細胞［１］は、S.Tartare-Deckert博士（INSERM U1065 Nice, France）のご厚意により提供された。Yumm細胞を３７℃の加湿雰囲気中、５％ ＣＯ２の存在下、３％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＯｐｔｉＭＥＭ培地中で単層として増殖させた。細胞株の確実性を保証するために、Yumm細胞株を限られた継代数で使用し、メランＡ／ＭＡＲＴ１のようなメラノサイト系統タンパク質の発現について日常的に試験した。ＭＣ３８細胞は、T. ChardesとA. Pelegrin両博士（INSERM U1194, Montpellier, France）のご厚意により提供され、１０％ ＦＣＳ、２mM グルタミン、０．１mM 非必須アミノ酸、１mM ピルビン酸ナトリウム及び１０mM Ｈｅｐｅｓを含有するＤＭＥＭ中で培養された。
【００５６】
細胞トランスフェクション
Yumm細胞を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ空ベクターと、ＳＫ１ ｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＫ１又はｓｈＳＫ１（２））プラスミド（ThermoscientificのｓｈＲＮＡ）又は対照の非標的ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｔｒｌ）プラスミド（ｐＬＫ０１、Addgene）とで１：１０の比で同時トランスフェクトした。要するに、Ｔ２５細胞培養フラスコに細胞５００，０００個を播種した。プラスミドを無血清ＯｐｔｉＭＥＭ（Thermofisher）培地に希釈した。Lipofectamine 2000試薬（Invitrogen）を製造業者の取扱説明書により使用して、ｓｈＲＮＡオリゴマー １０μｇで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を０．４mg/ml Ｇ４１８及び１．５μg/ml ピューロマイシンで選択し、ＧＦＰ発現細胞をＦＡＣＳにより選別した。安定なトランスフェクタントを、１μg/ml ピューロマイシンを含有する培地中で維持した；実験には、ピューロマイシンを含まない培地で細胞を培養した。
【００５７】
ＳＫ１酵素アッセイ
ＳＫ１活性は、若干の変更を加えて報告（Lavieu, Scarlatti et al. 2008）されたように決定された。
【００５８】
マウスにおける腫瘍細胞の注射及び処置
動物実験は、国内及び国際指針により行われ、我々のプロトコールは、Regional Ethics Committee of Midi-Pyreneesによって承認された。７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Charles River, L’Arbresle, France）の側腹に３．１０５のYumm細胞株（トランスフェクトされていない、ｓｈＣｔｒｌ、ｓｈＳＫ１又はｓｈＳＫ１（２））を皮内注射した。ＣＤ８欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、J. van Meerwijk教授（INSERM U1043, Toulouse, France）から寄贈された。腫瘍体積は、報告（Albinet, Bats et al. 2014）されたとおり指示日にキャリパーを用いて算出された。ｓｈＣｔｒｌ又はｓｈＳＫ１ Yumm細胞を含む組合せ実験のために、マウスにその右側腹で０日目に３．１０５細胞を皮内（i.d.）負荷した。次にマウスに、抗ＣＴＬＡ−４（Ｄ７に２００μg/マウス、並びにＤ１０及びＤ１３に１００μg/マウス）、及び／又は抗ＰＤ−１若しくはアイソタイプ対照抗体（Ｄ５、Ｄ７及びＤ１０に２００μg/マウス）を３回腹腔内注射した。２〜３日毎に腫瘍体積を測定した。抗ＣＴＬＡ−４（９Ｈ１０）、抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）及びアイソタイプ対照（２Ａ３）をBioXcellから購入した。
【００５９】
Yumm又はＭＣ３８細胞移植の５日後、ＳＫＩ−Ｉ処置には、ＤＭＳＯ（１０％）、クレモフォール（Cremophor）（５％）、トゥイーン（Tween）−８０（５％）及びグルコース（８０％）の混合物５０μl中の５０mg/kg ＳＫＩ−Ｉ（Ｎ’−［（２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）メチリデン］−３−（ナフタレン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボヒドラジド、エナミン）でマウスを処置したか、又はしなかった（腹腔内）。マウスに、７、１０、１３及び１５日目にＳＫＩ−Ｉの追加処置を行った。Yumm腫瘍を有するマウスに、上記のように抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤ−１又は対照抗体を腹腔内注射した。ＭＣ３８腫瘍では、マウスに抗ＰＤ−１（Ｄ７及びＤ１０に１００μg/マウス）を２回腹腔内注射した。
【００６０】
腫瘍における白血球含量の分析
Yumm細胞（３．１０５）をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮内注射した。１１日目に、マウスを殺処分し、腫瘍を採取して、マウス腫瘍分離（Mouse Tumor Dissociation）キット及びGentleMacs（Miltenyi）で分解した。細胞を計数し、指示抗体及びLIVE/DEAD反応性色素（Invitrogen）で染色して、次にフローサイトメトリー分析（BD LSRFortessa X-20）に付した。分析は、生存細胞に制限され、抗マウスＣＤ４５（BD Biosciences）、抗マウスＴｈｙ１（Biolegend）、抗マウスＣＤ８（Biolegend）、抗マウスＣＤ４（BD Biosciences）、抗マウスＦｏｘｐ３（eBioscience）、抗マウスＫｉ−６７（BD Bioscience）、抗マウスＰＤ−１（eBioscience）又は抗マウスＣＴＬＡ−４（eBioscience）を用いて実施された。アイソタイプ対照は、BD Biosciences、Biolegend又はeBioscience製であった。
【００６１】
統計解析
GraphPad Prism（GraphPad Software, San Diego, CA）を用いてデータを解析した。結果は平均±ＳＥＭとして表される。群間の統計的比較にスチューデントｔ検定を用い、ｐ＜０．０５（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）の場合に差を統計学的に有意と見なした。腫瘍生存データをカプラン・マイヤー法で解析した。ログランク検定を用いて、単変量解析で異なるサブグループの生存曲線を比較した。
【００６２】
結果
ＳＫ１ダウンレギュレーションは腫瘍増殖を減少させ、メラノーマに対する抗腫瘍応答を増強する
メラノーマの同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるＳＫ１の効果を評価するために、我々は、ＢｒａｆＶ６００Ｅ／＋；Ｐｔｅｎ−／−；ＣＤＫＮ２Ａ−／−マウスから樹立された移植可能な腫瘍細胞株（Yumm細胞）を使用した（Pencheva, Buss et al. 2014）。ＳｈＲＮＡ介在性サイレンシング技術を用いて、我々は、安定なＳＫ１ノックダウンYumm細胞を生成した。我々は、２つのピューロマイシン耐性細胞株：ｓｈＳＫ１及びｓｈＳＫ１（２）を得たが、これらはＳＫ１の酵素活性の著しい低下を示した（約６０％阻害）（図１Ａ）。次に、Yumm細胞（ＳＫ１ノックダウン又はＳＫ１に関してノックダウンしていない（ｓｈＣｔｒｌ））をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮内注射して、腫瘍増殖をモニターした。ｓｈＳＫ１及びｓｈＳＫ１（２） Yumm細胞の腫瘍増殖は、ｓｈＣｔｒｌ Yumm細胞の腫瘍増殖よりも有意に低かった（図１Ｂ及びＣ）。興味深いことに、ＳｈＳＫ１細胞を注射したＷＴマウスにおいて１１日目以降に腫瘍退縮が観察されたが、これは抗メラノーマ免疫応答の増加を反映し得る。しかしながら、この効果は、長期間持続する免疫応答を得るには充分ではなかったようであり、免疫回避機序によると推定される。重要なことに、ＳＫ１ノックダウンは、ＣＤ８欠損マウスにおけるYummメラノーマ増殖を障害できなかった（図１Ｄ）。
【００６３】
ＳＫ１ダウンレギュレーションが腫瘍内リンパ球浸潤の組成に及ぼす影響を評価するため、我々は１１日目に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を分析した。興味深いことは、ＳＫ１ダウンレギュレーションがＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を増加させ、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を減少させて、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の４倍増加をもたらすという知見であった（図２Ａ）。更には、ＴＩＬ増殖（Ｋｉ６７発現をモニターすることによって評価される）及び活性化（ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４発現によって評価される）の分析により、ＳＫ１ノックダウンがＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び活性化を有意に増加させ（図２Ｂ）、逆に、Ｔｒｅｇ増殖並びにＣＴＬＡ−４発現を減少させる（図２Ｃ）ことが明らかになった。
【００６４】
ＳＫ１ダウンレギュレーションは、免疫療法に対する応答を改善する
ＳＫ１ダウンレギュレーションが腫瘍活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加と関連していると仮定して、我々は、ＳＫ１阻害が免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ、例えば、抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１）の有効性を改善し得るという仮説を立てた。図３に示されるように、抗ＣＴＬＡ−４又は／及び抗ＰＤ−１処置単独では樹立Yumm腫瘍に及ぼす限定効果はあったが（図３Ａ）、ＳＫ１サイレンシングは、抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤ−１処置に対する応答を劇的に増強し、そのため、それぞれ動物の１００％及び６７％で腫瘍拒絶に至った（図３Ｂ）。更には、ＳＫ１ダウンレギュレーションは全生存率を有意に改善した（図３Ｃ）。実際、この組合せ（ＩＣＩ＋ＳＫ１サイレンシング）は、治療を中止して２ヶ月後に、それぞれ抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１で処置したマウスの１００％及び４２％において永続的な治癒を誘導したため、これは有効な免疫記憶の確立を示唆していた。興味深いことに、長期生存マウスの中で、２回目のメラノーマ細胞注射時に腫瘍を発症したマウスは皆無であり、マウスがこのメラノーマ細胞株に対して完全にワクチン接種で予防されたことを示している（データは示していない）。ＩＣＩに対する応答のこの増強は、腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加と関連していた（図３Ｄ）。注目すべきことに、Yumm ＳｈＳＫ１＋抗ＣＴＬＡ−４群（倍率変化＝１６）の腫瘍では、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比が顕著に増加しており、これは、この組合せを使用した場合に観察された全腫瘍退縮を説明することができる。
【００６５】
免疫チェックポイント遮断とＳＫ１薬理学的阻害との相乗的な抗癌免疫応答。
ＳＫ１ダウンレギュレーション及びＩＣＩに基づく併用療法の効力を更に確認するために、我々は、ＳＫ１の薬理学的阻害剤であるＳＫＩ−Ｉを使用した（French, Schrecengost et al. 2003）。我々のデータは、ＣＴＬＡ−４遮断単独では腫瘍拒絶を全くもたらすことはなかったが、ＳＫＩ−Ｉ＋抗ＣＴＬＡ−４の組合せは相乗効果が大きく、マウスの６７％で全拒絶をもたらし（図４Ａ）、全生存率を改善した（図４Ｂ）ことを明らかにしている。抗ＰＤ−１による我々の観察を確認するために、Yumm腫瘍を有するマウスを、抗ＰＤ−１と組合せたか又は組合せなかったＳＫＩ−Ｉで処置した。図５Ａに示されるとおり、ＳＫＩ−Ｉは抗ＰＤ−１の有効性を増強した。
【００６６】
重要なことに、この効果はまた、ＭＣ３８結腸癌を接種したマウスにおいても観察された（図５Ｂ）。
まとめると、我々のデータは、免疫チェックポイント遮断を発癌性ＳＫ１／Ｓ１Ｐ経路を調節する薬剤と組合せることにより、より大きな治療の成功が達成されることを示している。スフィンゴ脂質代謝を妨害することは、メラノーマにおける、更には他の癌型における治療的介入のための新規な手段の開発を促進する可能性がある。
【００６７】
先行技術文献：
本出願を通して、本発明が関係する技術水準を種々の参考文献が記載している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に取り込まれる。
【表１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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