(57)【要約】  本出願は、形質細胞様樹状細胞の活性化が腫瘍の環境において関与する腫瘍であって、前記形質細胞様樹状細胞が腫瘍の原因でない、腫瘍の発症予防又は療法における使用のための抗CD303タンパク質抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の微小環境における形質細胞様樹状細胞の活性化が関与する腫瘍の予防又は治療における使用のための、CD303タンパク質に対する抗体、特に、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であって、前記形質細胞様樹状細胞が腫瘍の発生に関与しない、抗体。
【請求項２】
形質細胞様樹状細胞が、免疫抑制及び/又は免疫寛容誘発の特性を示す、請求項1に規定の使用のための、CD303タンパク質に対する抗体。
【請求項３】
形質細胞様樹状細胞の活性化が関与する腫瘍が、固形腫瘍又は造血器腫瘍であり、
前記固形腫瘍が、特に、前記腫瘍の微小環境内への形質細胞様樹状細胞の浸潤が関与し、好ましくは、頭頚部の腫瘍、メラノーマ、泌尿生殖器がん、乳がんの群に属し、
前記造血器腫瘍が、好ましくは、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、特に、T細胞白血病からなる群に属する、
請求項1又は2に規定の使用のための、CD303タンパク質に対する抗体。
【請求項４】
マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、特に、キメラ抗体、好ましくは、マウス/ヒトのキメラ抗体又はヒト-マカクのキメラ抗体から選択されるキメラ抗体のうちから選択される、請求項1から3のいずれか一項に規定の使用のための、CD303タンパク質に対する抗体。
【請求項５】
65%以下である低いフコース含有量、及び/又は30%以上であるオリゴマンノース型N-グリカン含有量、及び/又は50%以上であるガラクトース含有量を有する、請求項1から4のいずれか一項に規定の使用のための、CD303タンパク質に対する抗体。
【請求項６】
Fab、F(ab')2、Fd、scFv、scFv二量体、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディから選択される、請求項1から5のいずれか一項に規定の使用のための定義に従う、CD303タンパク質に対する抗体の断片。
【請求項７】
-  放射性同位元素、特に、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32から選択される放射性同位元素、
-  非放射性金属、
-  毒素、特に、リシン、アブリン、ジフテリア毒素から選択される毒素、
-  核酸、特に、アンチセンスRNAから選択される核酸、
-  酵素、特に、リボヌクレアーゼ、ビオチン、アビジン又はストレプトアビジンから選択される酵素、
-  細胞傷害剤、特に、
-  葉酸代謝拮抗剤、より特定すると、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、
-  抗プリン物質、より特定すると、クラドリビン、フルダラビン、アザチオプリン、メルカプトプリン、5-フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、
-  トポイソメラーゼI及びIIの阻害剤、
-  アルキル化剤及び関連の薬剤、より特定すると、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、カルムスチン、ホテムスチン、マイトマイシンC、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、
-  インターカレート剤、
-  アントラサイクリン、より特定すると、ダウノルビシン、ドキソルビシン及び塩酸塩、エピルビシン、イダルビシン、ブレオマイシンから選択されるアントラサイクリン、
-  タキサン、
-  チロシンキナーゼの特定の阻害剤、イマチニブ、エルロチニブ
のうちから選択される細胞傷害剤
のうちから選択される生理活性分子とコンジュゲートしている、請求項1から6のいずれか一項に規定の使用のための定義に従う、CD303タンパク質に対する抗体又はその断片。
【請求項８】
少なくとも1つの抗がん剤、特に、化学的な抗がん剤及び/又は免疫療法において使用される抗がん剤と組み合わせて使用される、請求項1から7のいずれか一項に規定の使用のための定義に従う、CD303タンパク質に対する抗体又はその断片。
【請求項９】
前記化学的な抗がん剤が、抗代謝剤、アルキル化剤、インターカレート剤、又は有糸分裂紡錘体に対する作用を有する分子のうちから選択され、好ましくは、
-  前記抗代謝剤が、
-  葉酸代謝拮抗剤、特に、メトトレキセート、ラルチトレキセド及びペメトレキセド、
-  抗プリン物質、特に、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、クラドリビン及びフルダラビン、
-  抗ピリジン物質、特に、5-フルオロウラシル、テガフールウラシル、シタラビン及びカペシタビン、並びに
-  抗代謝物質、特に、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシウレア及びゲムシタビン
のうちから選択され、
-  前記アルキル化剤が、
-  ナイトロジェンマスタード類、特に、クロラムブシル、メルファラン、クロルメチン、メタクロロエタミン、エストラムスチン、イホスファミド及びシクロホスファミド、
-  ニトロソウレア類、特に、ホテムスチン、ロムスチン、カルムスチン、ストレプトゾシン、
-  有機白金化合物、特に、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチン、
-  エチレンイミン類、特に、チオテパ及びアルトレタミン、
-  トリアゼン、特に、プロカルバジン、テモゾロミド及びダカルバジン、
-  アルキル化剤、特に、ブスルファン、マイトマイシンC及びピポブロマン
のうちから選択され、
-  前記インターカレート剤が、
-  カンプトテシン誘導体、特に、イリノテカン及びトポテカン、
-  アントラサイクリン、特に、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン及びイダルビシン、
-  インターカレート剤、特に、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、アクチノマイシンD、ダクチノマイシン、エトポシド及びブレオマイシン
のうちから選択され、
-  有糸分裂紡錘体に対する作用を有する前記分子が、
-  ビンカアルカロイド又はスピンドル毒、特に、ビノレルビン、ビンデシン、ビンクリスチン及びビンブラスチン、
-  タキソイド又は紡錘体微小管安定化剤、特に、パクリタキセル及びドセタキセル、
-  チロシンキナーゼ阻害剤、特に、ダサチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ソラフェニブ及びスニチニブ
のうちから選択される、
請求項1から8のいずれか一項に規定の使用のための定義に従う、CD303タンパク質に対する抗体又はその断片。
【請求項１０】
免疫療法において使用される前記抗がん剤が、標的の腫瘍に特異的な抗体、抗CD123抗体、又はTLRアゴニストである、請求項8に規定の使用のための定義に従う、CD303タンパク質に対する抗体又はその断片。
【請求項１１】
前記抗体又は前記断片の前記使用と前記抗がん剤の前記使用とが、同時であり、別個であり、又は時間を経てずらして行われる、請求項8又は9に規定の使用のための定義に従う、CD303タンパク質に対する抗体又はその断片。
【請求項１２】
前記使用が放射線療法と連動する、請求項1から11のいずれか一項に規定の使用のための定義に従う、CD303タンパク質に対する抗体又はその断片。
【請求項１３】
前記予防又は前記治療が、形質細胞様樹状細胞の枯渇を示す患者、又は形質細胞様樹状細胞の枯渇を必要とするか若しくは形質細胞様樹状細胞の枯渇が必須である患者において作用する、請求項1から12のいずれか一項に規定の使用のための定義に従う、CD303タンパク質に対する抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質に対する抗体の、特に、関連のある病態の治療における療法のための新たな使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
膜タンパク質に対する抗膜タンパク質抗体の使用は、先行技術においてすでに開示されている。
【０００３】
欧州特許出願EP1783141は、例えば、患者において免疫応答を誘発することを可能にする組成物を開示しており、前記組成物は、抗CD303抗体を用いてあらかじめ処理されている、抗原(腫瘍、ウイルス、細菌等)を発現する樹状細胞を含む。これは、細胞療法による治療からなる。
【０００４】
特許出願WO2006/037247は、特定の自己免疫疾患、すなわち、乾癬の治療に関する、CD303タンパク質に対するモノクローナル抗体の使用を開示している。
【０００５】
Nestleら(Nestleら、2005年、J.Exp.Med、202巻、1号:135〜143頁)は、乾癬の治療に関して、CD303タンパク質に対する抗体を、治療の目的で静脈内注射することができることを教示している。
【０００６】
Blombergら(Blombergら、2003年、Arthritis and Rheumatism、48巻、9号:2524〜2532頁)は、自己免疫性疾患、すなわち、エリテマトーデスに関する、タンパク質CD303に対する抗体の使用を教示している。著者らは、前記抗体はインターフェロンα(IFN-α)の生成を阻害することが可能であることを示している。
【０００７】
特許出願WO01/36487は、CD303タンパク質に対するモノクローナル抗体、特に、クローンであるAC144、AD5-13A11及びAD5-4B8並びに由来の断片を開示している。更に、この出願は、ウイルス感染、自己免疫性疾患及び腫瘍等の病態の治療に関する、モノクローナル抗体の使用も記載している。しかし、この出願は、CD303タンパク質に対する抗体の間接的な作用を活用することによる病態又は疾患の治療のいずれの具体例も開示していない。
【０００８】
また、国際特許出願WO2012/080642も、発症予防又は療法に関して、CD303タンパク質に対する抗体を使用して、形質細胞様樹状細胞が原因であると考えられるCD4+/CD56+表現型の造血器腫瘍を治療することを開示している。
【０００９】
形質細胞様樹状細胞は、CD56+となる追加のマーカーの獲得時に形成されるようなCD4+/CD56+表現型の造血器腫瘍の原因であり得る。このことが、それらがCD4+/CD56+造血器腫瘍と呼ばれている理由である。したがって、そのような腫瘍は、形質細胞様樹状細胞に関連して腫瘍が発生すると生じる。
【００１０】
しかし、形質細胞様樹状細胞が、全ての型の腫瘍の原因であるとは限らない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】EP1783141
【特許文献２】WO2006/037247
【特許文献３】WO01/36487
【特許文献４】WO2012/080642
【特許文献５】WO00/42072
【特許文献６】WO2004/029207
【特許文献７】WO2004/063351
【特許文献８】WO2004/074455
【特許文献９】WO02/060919
【特許文献１０】WO2010/045193
【特許文献１１】WO2010/106180
【特許文献１２】WO99/51642
【特許文献１３】WO2011/114063
【特許文献１４】WO2007/048077
【特許文献１５】EP1176195A1
【特許文献１６】WO01/77181
【特許文献１７】WO2012/041768
【特許文献１８】WO2008/028686
【特許文献１９】WO00/26357
【特許文献２０】WO90/04036
【特許文献２１】WO95/17085
【特許文献２２】WO01/26455
【特許文献２３】WO2004/050847
【特許文献２４】WO2005/033281
【特許文献２５】WO2007/106078
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Nestleら、2005年、J.Exp.Med、202巻、1号:135〜143頁
【非特許文献２】Blombergら、2003年、Arthritis and Rheumatism、48巻、9号:2524〜2532頁
【非特許文献３】Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991)
【非特許文献４】Manipulating the Mouse Embryo、A Laboratory Manual、Second edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)
【非特許文献５】Gene Targeting、A Practical Approach、IRL Press at Oxford University Press(1993)
【非特許文献６】Maeda Tら、Int J Hematol.、2005年2月、81(2):148〜54頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって実際に、形質細胞様樹状細胞が原因でない腫瘍、特に、形質細胞様樹状細胞による追加のマーカー、例として、CD56+の獲得に原因が関連しない腫瘍を処置する療法を見出す必要性がある。
【００１４】
このことが、本発明の1つの目標が、形質細胞様樹状細胞が原因でない腫瘍、特に、形質細胞様樹状細胞による追加のマーカーの獲得に原因が関連しない腫瘍を予防及び/又は治療することを可能にする、腫瘍を処置する療法を提供することの理由である。
【００１５】
このことが、本発明の1つの目標が、形質細胞様樹状細胞に関連する腫瘍の発生に由来しない腫瘍を予防及び/又は治療することの理由である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、本発明は、形質細胞様樹状細胞が原因でない腫瘍の予防及び/又は治療のための、膜タンパク質に対する抗体の新たな使用に関する。
【００１７】
本発明はまた、膜タンパク質に対する抗膜タンパク質抗体の混合物を含む新規の組成物、並びに形質細胞様樹状細胞が原因でない腫瘍の予防及び/又は治療のための、その使用にも関する。
【００１８】
本発明はまた、抗がん剤の新たな使用にも関する。
【００１９】
本発明は、膜タンパク質、特に、CD303タンパク質に対する抗膜タンパク質抗体を、形質細胞様樹状細胞によるマーカーの獲得が原因でない腫瘍の予防及び/又は治療、換言すると、形質細胞様樹状細胞に関連する腫瘍の発生に由来しない腫瘍の予防及び/又は治療のために使用することができることを発明者らが予想外に見出したことに基づく。
【００２０】
したがって、本発明は、先行技術とは明確に区別される、というのは、本発明は、腫瘍を予防及び/又は治療するために、形質細胞様樹状細胞を、CD303タンパク質に対する抗体の細胞傷害作用により除去するが、これらの形質細胞様樹状細胞は、腫瘍の発生には関与しないからである。実際に、形質細胞様樹状細胞は、腫瘍の原因ではないが、にもかかわらず、腫瘍細胞の成長及びそれらの生存を、例えば、免疫抑制及び/又は免疫寛容誘発の特性を発揮することによって促進することができる。したがって、このことは、単独療法において従来から使用されている抗がん性医薬/抗がん剤の有効性の阻害又は低下をもたらす恐れがある。したがって、本発明の場合、タンパク質CD303に対する抗体は、腫瘍の治療に対して間接的な作用を有し、すなわち、タンパク質CD303に対する抗体は、腫瘍の微小環境における形質細胞様樹状細胞を減少させ、それにより、腫瘍の微小環境において、形質細胞様樹状細胞の免疫抑制及び/又は免疫寛容誘発の特性を減少させ、好都合には、排除することを可能にする。したがって、本発明によれば、CD303タンパク質に対する抗体は、抗がん剤(例えば、抗腫瘍抗原抗体)の作用を促進、刺激又は強化することができ、それらの抗体と抗がん剤とを、同時、別個又は経時的に順を追って使用することができる。本発明に従う、CD303タンパク質に対する抗体はまた、抗体と共に使用することができる抗がん剤との相乗作用も有し得る。
【００２１】
したがって、第1の態様では、本発明は、腫瘍の微小環境における形質細胞様樹状細胞の活性化が関与する腫瘍の予防及び/又は治療における使用のための、CD303タンパク質に対する抗体であって、前記形質細胞様樹状細胞が腫瘍の発生に関与しない、抗体に関する。
【００２２】
用語「抗体」は、免疫グロブリン、すなわち、獲得免疫応答に関与する4つの鎖から構成されるタンパク質、又は免疫グロブリンの断片を言及するために使用される。免疫グロブリンは、当業者に周知であり、2つの二量体の集合体からなり、二量体はそれぞれ、重鎖及び軽鎖から構成される。軽鎖と重鎖とが2つのシステイン間のジスルフィド結合により結合することによって、多量体性の複合体が組み立てられ、2つの重鎖自体もまた、2つのジスルフィド結合により相互に接続している。
【００２３】
重鎖及び軽鎖のそれぞれが、定常領域及び可変領域から構成される。抗体を作り上げる鎖の集合体により、Y形状をとる特徴的な三次元構造を画定することが可能になり、この場合、
-  Yの基部は、補体及びFc受容体が認識するFc定常領域に対応し、
-  Yのアームの末端はそれぞれ、特異的な抗原により認識される、集合体の軽鎖及び重鎖の可変領域に対応する。
【００２４】
より正確には、各軽鎖が、可変領域(VL)及び定常領域(CL)から構成される。各重鎖が、可変領域(VH)、並びに3つの定常ドメイン、すなわち、CH1、CH2及びCH3から構成される定常領域から構成される。Fcドメインは、CH2ドメイン及びCH3ドメインで構成される。
【００２５】
軽鎖及び重鎖の可変領域は、抗原の認識を決定する3つのドメイン(CDR領域、すなわち、相補性決定領域)から構成され、これらのドメインを、4つのフレームワークドメイン(FR、すなわち、フレームワーク領域)が囲む。可変領域は三次元に折り畳まれ、その結果、3つのCDRが、当該タンパク質の同じ側上で曝露され、特定の確とした抗原を認識する、特異的な構造の形成を可能にする。
【００２６】
本明細書に記載する抗体は、単離され、精製されており、自然の抗体とは異なる。これらの抗体は成熟しており、換言すると、これらの抗体は、抗原認識を可能にする、特殊な目的に即した(ad hoc)三次元構造を有し、抗原認識に必須の翻訳後修飾の全てを有する。
【００２７】
本発明によれば、「CD303タンパク質に対する抗体」は、「抗CD303」抗体を指すと理解される。
【００２８】
用語「CD303タンパク質」は、BDCA-タンパク質2として以前から公知のタンパク質を指すと理解される。このタンパク質は、形質細胞様樹状細胞の表面上に特異的に発現し、C型レクチンに属するII型タンパク質である。換言すると、ヒトCD303抗原(又はCD303タンパク質)は、C型レクチンドメインファミリー4メンバーCであり、CLEC4(すなわち、「C型レクチンドメインファミリー4、メンバーC」);DLEC;HECL;BDCA-2;CLECSF7;CLECSF11;又はPRO34150としてもまた公知である(遺伝子CLEC4についてのEntrezGeneサイトを参照されたい)。CD303タンパク質は、213個のアミノ酸のII型膜貫通糖タンパク質であり、いずれの明らかなシグナル伝達モチーフも欠く、短い細胞質ドメイン(アミノ酸1〜21)、膜貫通領域(アミノ酸22〜41)、ネックドメイン(アミノ酸42〜82)、及び細胞外炭水化物認識ドメイン(CRD、すなわち、「炭水化物認識ドメイン」;アミノ酸83〜213)を含む(Dzionekら、2001年)。このタンパク質をコードするmRNAの配列は、2002年2月14日のそのバージョンを、Genbankデータベースにおいて、アクセッション番号AF293615.1の下に見出すことができ(配列番号129)、かつアミノ酸の配列は、2002年2月14日のそのバージョンに、Genbankデータベースにおいて、アクセッション番号AAL37036.1の下でアクセス可能である(配列番号130)。
【００２９】
用語「形質細胞様樹状細胞」は、DC2としてもまた公知の、樹状細胞の亜集団を指すと理解される。形質細胞様樹状細胞は、細胞系譜(Lin)マーカー(CD3-、CD19-、CD20-、CD14-、CD56-)、HLA-DR+、CD11c-、CD123+及びCD45RA+により特徴付けられる。これらの細胞はまた、表現型によっても特徴付けられており、すなわち、それらは、CD4マーカー及びCD303マーカー、並びにBDCA-4マーカーを発現する。それらは、リンパ系臓器中に存在し、また、血中も循環している。形質細胞様樹状細胞は、ウイルス感染の存在下でI型IFNを分泌する能力を有する。
【００３０】
用語「前記腫瘍の微小環境における形質細胞様樹状細胞の活性化」は、特異的な確としたサイトカイン、特に、クラスIインターフェロンの増殖及び分泌並びに形質細胞様細胞の表現型的及び形態学的な変化を活性化させる作用を示す種々の機構を指すことが理解される。
【００３１】
形質細胞様樹状細胞はまた、特に、腫瘍の微小環境内で、例えば、調節性Tリンパ球細胞(Treg)の分化の誘発により、免疫抑制性の環境を誘発することによって、腫瘍細胞の成長及び生存を促進することもできる。したがってまた、用語「前記腫瘍の微小環境における形質細胞様樹状細胞の活性化」は、形質細胞様樹状細胞が腫瘍に対して示すことができる免疫抑制及び/又は免疫寛容誘発の特性を指すとも理解される。
【００３２】
用語「前記形質細胞様樹状細胞が腫瘍の発生に関与しない」は、本発明に従う腫瘍は、形質細胞様樹状細胞が関与する、腫瘍の発生に関連しないことを意味する。より正確には、本発明に従う腫瘍は、形質細胞様樹状細胞による追加のマーカー、例として、CD56の獲得に関連しない。
【００３３】
用語「予防」は、腫瘍のin situでの拡大増殖の阻止であり、又は実際には、腫瘍であって、それらの微小環境中に形質細胞様樹状細胞がすでに浸潤している腫瘍からの転移の発生の阻止であると理解されたい。
【００３４】
本発明の特定の一態様では、形質細胞様樹状細胞は、免疫抑制及び/又は免疫寛容誘発の特性を示す。
【００３５】
用語「免疫抑制性の特性」は、腫瘍の微小環境において樹状細胞が免疫抑制を発揮し、維持する特性を指すと理解される。
【００３６】
用語「免疫寛容誘発の特性」は、形質細胞様樹状細胞が免疫応答を誘発しないことを意味する。
【００３７】
本発明の特定の一態様では、形質細胞様樹状細胞の活性化が関与する腫瘍は、固形腫瘍又は造血器腫瘍である。
【００３８】
用語「固形腫瘍」は、細胞の過剰な増殖(multiplication)の結果として生じる細胞塊を指すと理解される。固形腫瘍は、任意の組織、特に、皮膚、粘膜、骨又は臓器等中で発生し得る。固形腫瘍は、2つの群、すなわち、癌腫及び肉腫に識別することができる。
【００３９】
癌腫は、(皮膚、粘膜又は腺中に存在する)上皮細胞に由来し、これが関与するがんは、例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腸がん等である。
【００４０】
肉腫は、結合組織の細胞に由来し、これが関与するがんは、例えば、骨がん、軟骨がん等である。
【００４１】
用語「造血器腫瘍」は、血液の系統の細胞若しくは造血細胞が関与する腫瘍、又は造血臓器、すなわち、血液細胞の発生に関与する、造血発生が可能な臓器に影響を及ぼす腫瘍を指す。造血臓器は、骨髄、並びにリンパ系組織を形成する臓器(例えば、胸腺、神経節及び脾臓)である。造血器腫瘍はまた、血液学的悪性腫瘍としても公知であり得る。
【００４２】
本発明の特定の一態様では、固形腫瘍に、前記腫瘍の微小環境における形質細胞様樹状細胞の浸潤が関与し、固形腫瘍は、好ましくは、頭頚部の腫瘍、メラノーマ、泌尿生殖器がん、乳がんの群に属する。
【００４３】
用語「固形腫瘍に、前記腫瘍の微小環境における形質細胞様樹状細胞による浸潤が関与する」は、形質細胞様樹状細胞が腫瘍部位に動員されることを意味する。腫瘍部位に動員された形質細胞様樹状細胞は、特定の免疫抑制及び/又は免疫寛容誘発の特性を示す。腫瘍の微小環境内へ浸潤した形質細胞様樹状細胞はまた、調節性Tリンパ球細胞の分化を誘発すること、及び/又は腫瘍部位へのこれら調節性Tリンパ球細胞の浸潤を誘発することもできる。
【００４４】
用語「頭頚部の腫瘍」は、口腔、咽頭、上咽頭、喉頭、鼻腔、副鼻腔又は唾液腺のがんを指すと理解される。
【００４５】
用語「メラノーマ」は、メラニン形成細胞として公知の皮膚細胞から発生する悪性腫瘍を指すと理解される。4つの主要な型の、皮膚のメラノーマ、すなわち、表在拡大型メラノーマ、結節型メラノーマ、Dubreuilhメラノーマ又は悪性黒子型メラノーマ、及び末端黒子型メラノーマが存在する。
【００４６】
用語「泌尿生殖器がん」は、雄中の泌尿生殖路又は雌性器官のがんを指すと理解される。これが関与するがんは、例えば、前立腺がん、精巣がん、陰茎がん、子宮内膜がん、外陰部及び膣のがん、子宮がん、子宮頚部がん、卵巣がん、腎臓がん、膀胱がんである。
【００４７】
用語「乳がん」は、非侵襲性(In Situにおける腺管癌(DCIS)/乳管内癌)であれ、侵襲性であれ、乳腺のがんを指すと理解される。
【００４８】
本発明の特定の一態様では、造血器腫瘍は、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、特に、T細胞白血病からなる群に属する。
【００４９】
用語「多発性骨髄腫」は、骨髄中での異常な形質細胞の増殖(multiplication)により特徴付けられる骨髄の疾患/障害を指すと理解される。
【００５０】
用語「リンパ腫」は、二次リンパ系臓器(リンパ節、脾臓等)中で血液細胞が異常に増殖する腫瘍を指すと理解される。
【００５１】
用語「白血病」は、血中で血液細胞が異常に増殖する腫瘍を指すと理解される。
【００５２】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。
【００５３】
用語「モノクローナル」は、CD303中の1つのユニークなエピトープのみを認識する抗体を指し、ポリクローナル抗体とは異なると理解され、ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体の混合物に対応し、したがって、同じ所与のタンパク質上の複数のエピトープを認識することができる。
【００５４】
用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、同一のかつユニークな抗原特異性を示す抗体分子を含む組成物を指すと理解される。組成物中に存在する抗体分子は、それらの翻訳後修飾に関して、特に、それらのグリコシル化構造又は等電点に関して異なる可能性が高いが、全てが、同じ配列の重鎖及び軽鎖によりコードされており、したがって、翻訳後修飾の前にはいずれも、同じタンパク質配列を有する。にもかかわらず、翻訳後修飾(例えば、重鎖C末端のリジンの切断、アスパラギン残基の脱アミド化及び/又はアスパルテート残基の異性化)に関連する、タンパク質配列の特定の差が、組成物中に存在する多様な異なる抗体分子間に存在し得る。
【００５５】
本発明のモノクローナル抗体は、当業者に周知の技法、特に、細胞融合の技法、重鎖及び軽鎖の配列をクローニングする技法、ファージディスプレイ又はリボゾームディスプレイの技法、ヒト免疫グロブリンのレパートリーを有するマウスを免疫化し、特殊な目的に即した細胞中、又はトランスジェニック動物中で発現させることによって得ることができる。
【００５６】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体のうちから選択される。
【００５７】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗体は、キメラ抗体、好ましくは、マウス/ヒトのキメラ抗体又はヒト-マカクのキメラ抗体から選択されるキメラ抗体である。
【００５８】
本発明の特定の一態様では、本発明に従う抗体、その機能性の断片又は誘導体は、好都合には、キメラ抗体又はヒト化抗体、特に、重鎖及び軽鎖の定常領域がヒト起源であるキメラ抗体である。
【００５９】
用語「マウス抗体」は、重鎖及び軽鎖を構成する核酸配列が、核酸の一致がマウスB細胞のゲノム中に見出される配列に対応する抗体を指すと理解される。したがって、この抗体は、その生成を可能にする細胞の起源が何であろうと、マウスのアミノ酸配列から構成される。例えば、マカクザル細胞中で発現させたマウスの抗体の配列は、マウス抗体を提供する。
【００６０】
上記の定義を、ヒト抗体に準用する。
【００６１】
用語「キメラ抗体」は、当該抗体を構成する各軽鎖配列及び/又は各重鎖配列が、少なくとも2つの異なる動物に由来するハイブリッドの配列を含むか又はそうした配列からなる、単離抗体を指すと理解される。特に、本発明のキメラ抗体は、ヒト/マカクザル又はヒト/マウスのハイブリッドであり、このことは、軽鎖及び重鎖の配列の1つの領域が、マカク又はマウスの免疫グロブリンの配列に由来し、前記重鎖及び前記軽鎖の残りの配列が、1つ、又はことによると、複数のヒト免疫グロブリンの配列に由来することを意味する。用語「キメラ抗体」はまた、所与の種の抗体から生来由来する(軽鎖及び重鎖の)可変領域を、前記所与の種にとって異種の種の抗体の軽鎖及び重鎖の定常領域と組み合わせて含有する抗体を指すとも理解される。好都合には、本発明に従う医薬生成物としての使用のためのモノクローナル抗体組成物が、キメラのモノクローナル抗体を含む場合、この組成物は、ヒト定常領域を含む。非ヒト抗体から開始して、当業者に周知の遺伝子組換えの技法を使用して、キメラ抗体を調製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖について、プロモーター及び非ヒト抗体の可変領域をコードする配列及びヒト抗体の定常領域をコードする配列を含む組換えDNAをクローニングすることによって、キメラ抗体を調製することができる。キメラ抗体を調製するための方法について、例えば、文献Verhoeynら、1988年を参照することができるであろう。
【００６２】
用語「ヒト化抗体」は、CDR以外の重鎖及び軽鎖の配列が、ヒト起源の1つ又は複数の抗体に対応する配列で交換されている、非ヒト動物に由来する抗体を指すと理解される。したがって、抗体は、ヒト配列から圧倒的に構成されるが、CDRがもたらす、抗原に対するその特異性は、別の種に由来する。用語「ヒト化抗体」はまた、非ヒト抗体に由来するCDR領域を含有し、抗体分子のその他の部分は、1つ(又は複数)のヒト抗体に由来する抗体を指すとも理解される。更に、(FRと呼ばれている)フレームワークセグメントの残基のうちのいくつかを、結合親和性を保持するように改変することもできる(Jonesら、1986年、Verhoeyenら、1988年、Riechmannら、1988年)。本発明に従うヒト化抗体は、当業者に公知の技法、例として、以下の技術、すなわち、「CDRグラフト化」、「表面改質(resurfacing)」、「SuperHumanisation」、「Human string content」、「FRライブラリー」、「誘導選択(Guided selection)」、「FRシャフリング」及び「Humaneering」により調製することができ、これらは、Almagroら、2008年による総説論文に要約されている。
【００６３】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗体は、ヒトCD303抗原(配列番号130)の外部ドメインに対するモノクローナル抗体又はその機能性の断片若しくは誘導体であり、
a)ヒトCD303抗原に対する結合について、
i)重鎖可変領域が配列番号43の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号48の配列を含む抗体;
ii)重鎖可変領域が配列番号44の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号49の配列を含む抗体;
iii)重鎖可変領域が配列番号45の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号50の配列を含む抗体;
iv)重鎖可変領域が配列番号46の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号51の配列を含む抗体;
v)重鎖可変領域が配列番号47の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号52の配列を含む抗体
のうちから選択される少なくとも1つの抗体と競合すること、並びに
b)軽鎖及び重鎖の定常領域が、マウス以外の種に由来する定常領域であること
を特徴とする。
【００６４】
好都合には、重鎖が、3つのCDR-H(IMGT命名法に従う、重鎖CDR)であって、以下のアミノ酸配列又は以下の配列に対して少なくとも80%の同一性を示す配列を有するCDR-Hを含み、軽鎖が、3つのCDR-L(IMGT命名法に従う、軽鎖CDR)であって、以下のアミノ酸配列又は以下の配列に対して少なくとも80%の同一性を示す配列を有するCDR-Lを含み、以下の配列とは、
i)CDR1-H-ファミリー1:配列番号1、CDR2-H-ファミリー1:配列番号2、CDR3-H-ファミリー1:配列番号3、CDR1-L-ファミリー1:配列番号4、CDR2-L-ファミリー1:配列番号5、CDR3-L-ファミリー1:配列番号6、又は
ii)CDR1-H-ファミリー2:配列番号7、CDR2-H-ファミリー2:配列番号8、CDR3-H-ファミリー2:配列番号9、CDR1-L-ファミリー2:配列番号10、CDR2-L-ファミリー2:配列番号11、CDR3-L-ファミリー2:配列番号12
である。
【００６５】
用語「少なくとも80%の同一性」は、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及び100%の同一性の程度を意味する。
【００６６】
下記のTable 1(表1)に、本発明に従って使用することができる2つのファミリーの抗体の、CDR-IMGTのアミノ酸配列を要約する。
【００６７】
【表１】
2019502690.tif 000002
【００６８】
好都合には、本発明に従う抗体、その機能性の断片又は誘導体の重鎖は、3つのCDR-H(IMGT命名法に従う、重鎖CDR)であって、以下のアミノ酸配列又は以下の配列に対して少なくとも80%の同一性を示す配列を有するCDR-Hを含み、軽鎖は、3つのCDR-L(IMGT命名法に従う、軽鎖CDR)であって、以下のアミノ酸配列又は以下の配列に対して少なくとも80%の同一性を示す配列を有するCDR-Lを含み、以下の配列とは、
i) CDR1-H-122A2:配列番号13、CDR2-H-122A2:配列番号14、CDR3-H-122A2:配列番号15、CDR1-L-122A2:配列番号16、CDR2-L-122A2:配列番号17、CDR3-L-122A2:配列番号18;
ii) CDR1-H-102E9:配列番号19、CDR2-H-102E9:配列番号20、CDR3-H-102E9:配列番号21、CDR1-L-102E9:配列番号22、CDR2 L-102E9:配列番号23、CDR3-L-102E9:配列番号24;
iii) CDR1-H-104C12:配列番号25、CDR2-H-104C12:配列番号26、CDR3-H-104C12:配列番号27、CDR1-L-104C12:配列番号28、CDR2 L-104C12:配列番号29、CDR3-L-104C12:配列番号30;
iv) CDR1-H-114D11:配列番号31、CDR2-H-114D11:配列番号32、CDR3-H-114D11:配列番号33、CDR1-L-114D11:配列番号34、CDR2 L-114D11:配列番号35、CDR3-L-114D11:配列番号36;又は
v) CDR1-H-104E10:配列番号37、CDR2-H-104E10:配列番号38、CDR3-H-104E10:配列番号39、CDR1-L-104E10:配列番号40、CDR2-L-104E10:配列番号41、CDR3-L-104E10:配列番号42
である。
【００６９】
好都合には、本発明に従う抗体、その機能性の断片又は誘導体の重鎖は、配列番号43〜47から選択される配列又は配列番号43〜47のうちの1つに対して少なくとも80%の同一性を示す配列を有する可変領域を含む。
【００７０】
加えて又は代わって、本発明に従う抗体、その機能性の断片又は誘導体の軽鎖は、配列番号48〜52から選択される配列又は配列番号48〜52のうちの1つに対して少なくとも80%の同一性を示す配列を有する可変領域を含む。
【００７１】
好ましい一実施形態では、本発明に従う抗体、その機能性の断片又は誘導体は、可変領域が、以下のアミノ酸配列又は以下の配列に対して少なくとも80%の同一性を示す配列を有する重鎖及び軽鎖を有し、以下の配列とは、
i)抗体122A2:重鎖:配列番号43、軽鎖:配列番号48、
ii)抗体102E9:重鎖:配列番号44、軽鎖:配列番号49、
iii)抗体104C12:重鎖:配列番号45、軽鎖:配列番号50、
iv)抗体114D11:重鎖:配列番号46、軽鎖:配列番号51、又は
v)抗体104E10:重鎖:配列番号47、軽鎖:配列番号52
である。
【００７２】
ここで、下記のTable 2(表2)に、本発明に従う異なる抗体が使用する、マウスのVH、JH並びにVL及びJLの遺伝子セグメント、更に、同一性のパーセントを要約する。
【００７３】
【表２】
2019502690.tif 000003
【００７４】
ここで、下記のTable 3(表3)に、本発明に従って、発明者らが生成した抗CD303抗体のCDR並びに重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を要約する。
【００７５】
【表３Ａ】
2019502690.tif 000004
【００７６】
【表３Ｂ】
2019502690.tif 000005
【００７７】
【表３Ｃ】
2019502690.tif 000006
【００７８】
【表３Ｄ】
2019502690.tif 000007
【００７９】
【表３Ｅ】
2019502690.tif 000008
【００８０】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための、前記キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体は、重鎖可変領域が、配列番号43の配列又は前記配列番号43に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号48の配列又は前記配列番号48に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体122A2)。
【００８１】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための、前記キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体は、重鎖可変領域が、配列番号44の配列又は前記配列番号44に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号49の配列又は前記配列番号49に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体102E9)。
【００８２】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための、前記キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体は、重鎖可変領域が、配列番号45の配列又は前記配列番号45に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号50の配列又は前記配列番号50に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104C12)。
【００８３】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための、前記キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体は、重鎖可変領域が、配列番号46の配列又は前記配列番号46に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号51の配列又は前記配列番号51に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体114D11)。
【００８４】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための、前記キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体は、重鎖可変領域が、配列番号47の配列又は前記配列番号47に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号52の配列又は前記配列番号52に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104E10)。
【００８５】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための、前記キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体は、重鎖が、配列番号55の配列又は前記配列番号55に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号60の配列又は前記配列番号60に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体122A2)。
【００８６】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための、前記キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体は、重鎖が、配列番号56の配列又は前記配列番号56に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号61の配列又は前記配列番号61に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体102E9)。
【００８７】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための、前記キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体は、重鎖が、配列番号57の配列又は前記配列番号57に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号62の配列又は前記配列番号62に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104C12)。
【００８８】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための、前記キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体は、重鎖が、配列番号58の配列又は前記配列番号58に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号63の配列又は前記配列番号63に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体114D11)。
【００８９】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための、前記キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体は、重鎖が、配列番号59の配列又は前記配列番号59に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号64の配列又は前記配列番号64に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104E10)。
【００９０】
当業者に周知の任意の適切なアルゴリズム、例として、Needleman及びWunschのアルゴリズム、1970年を使用することによって、本発明の開示の文脈で言及する同一性パーセントを、比較しようとする配列の全体的なアラインメント、換言すると、それらの全体を全長にわたり検討する配列のアラインメントに基づいて決定する。当業者に周知の任意の適切なソフトウエア、例えば、10.0に等しいパラメータ「Gap open」、0.5に等しいパラメータ「Gap extend」、及び「BLOSUM62」行列を使用するソフトウエアアプリケーションneedleを使用して、この配列比較を実施することができる。ソフトウエアアプリケーションneedleは、例えば、ウェブサイトebi.ac.uk上の「Align」の名の下で利用可能である。
【００９１】
本発明に従って使用することができる抗体のCDR又は可変領域が、本明細書上記及び配列表に記載するアミノ酸配列(参照配列)のうちの1つに対して100%同一であるわけではないが、1つのそのような参照配列に対して、少なくとも80%、好ましくは、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を示すアミノ酸配列を有する場合、こうしたCDR又は可変領域は、参照配列に関して、挿入、欠失又は置換を有し得る。置換の場合、こうした置換は、好ましくは、「同等」のアミノ酸、換言すると、構造が、元々のアミノ酸の構造に類似し、したがって、当該抗体の生物学的活性が改変される可能性がほとんど又は全くない任意のアミノ酸により行われる。そのような置換の例を、以下のTable 4(表4)に提示する。
【００９２】
【表４】
2019502690.tif 000009
【００９３】
抗体は、それらの定常領域の性質に従って、いくつかのアイソタイプであり得、すなわち、γ、α、μ、ε及びδ定常領域はそれぞれ、免疫グロブリンIgG、IgA、IgM、IgE及びIgDに対応する。好都合には、医薬生成物として使用する組成物中に存在するモノクローナル抗体は、本発明に関しては、アイソタイプIgGである。実際に、このアイソタイプが、最も多くの数の個体(ヒト)において、「抗体依存性細胞傷害性」(ADCC)活性を発生させる能力を示す。γ定常領域は、いくつかのサブタイプ、すなわち、γ1、γ2、γ3(これら3つの型の定常領域は、ヒトの補体に結合する特徴を示す)、及びγ4を含み、したがって、サブアイソタイプIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を作り出す。好都合には、医薬生成物として使用する組成物中に存在するモノクローナル抗体は、本発明に関しては、アイソタイプIgG1又はIgG3、好ましくは、IgG1である。
【００９４】
本発明に従って使用することができる抗体のFc断片は、本明細書上記で定義したように、自然のFc断片であってもよく、又は実のところ、多様な様式で改変されているが、ただし、機能性のFcR結合性ドメイン(IgGについては、Fcガンマ受容体(FcγR))、好ましくは、機能性のFcRn結合性ドメインを含む。改変形態は、Fc断片の特定の部分の欠失を含むことができるが、ただし、機能性のFcR結合性ドメイン(IgGについては、Fcガンマ受容体(FcγR))、好ましくは、機能性のFcRn結合性ドメインを含有する。改変形態はまた、抗体の生物学的特性に影響を及ぼすことが可能である多様なアミノ酸の置換も含むことができるが、ただし、機能性のFcR結合性ドメイン、好ましくは、機能性のFcRn結合性ドメインを含有する。特に、抗体がIgGである場合には、抗体は、文献WO00/42072、Shieldsら、2001年、Lazarら、2006年、WO2004/029207、WO2004/063351及びWO2004/074455の記載に従って、FcγRIIIa(CD16A)受容体に対する結合性を増加させるように設計した突然変異を含むことができる。また、例えば、Shieldsら、2001年、Dall'Acquaら、2002年、Hintonら、2004年、Dall'Acquaら、2006年(a)、WO00/42072、WO02/060919、WO2010/045193又はWO2010/106180の記載に従って、受容体FcRnに対する結合性の増加、したがって、in vivoでの半減期の延長を可能にする突然変異をもたらすこともできる。その他の突然変異、例として、補体タンパク質に対する結合性を減少又は増加させる能力をもたらす突然変異があり、したがって、CDC応答を提示させること又は提示させないことができる(文献WO99/51642、WO2004/074455、Idusogieら、2001年、Dall'Acquaら、2006年(b)及びMooreら、2010年を参照されたい)。
【００９５】
本発明の特定の一態様では、使用することができる好ましい突然変異は、FcRnに対する結合性を増加させ、したがって、in vivoでの半減期を延長させる能力をもたらす突然変異を含むもの、したがって、文献WO2010/106180の記載に従って、それらのFc断片中に突然変異の以下の組合せを含む突然変異であり、以下の組合せとは、
-  N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y、
-  P230S/N315D/M428L/N434Y、
-  E294del/T307P/N434Y、
-  T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y、
-  V259I/N315D/N434Y、又は
-  T256N/A378V/S383N/N434Y
であり、
この場合、Fc領域中のアミノ酸についての番号付けシステムは、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991)に記載されているEUインデックスにおけるものであり、この文献は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００９６】
用語「EUインデックス」又は「KabatのEUインデックス」は、ヒトIgG1抗体におけるアミノ酸残基の番号付けを指すと理解される。
【００９７】
本発明の別の態様では、本発明に従って使用することができる抗体のFc断片は、
G316D、K326E、N315D、N361H、P396L、T350A、V284L、V323I、P352S、A378V、Y436H、V266M、N421T、G385R、K326T、H435R、K447N、N434K、K334N、V397M、E283G、A378T、F423L、A431V、F423S、N325S、P343S、K290E、S375R、F405V、K322E、K340E、N389S、F243I、T307P、N389T、S442F、K248E、Y349H、N286I、T359A、S383R、K334R、T394P、V259A、T393A、P352L、Q418P、V302A、L398P、F423P、S442P、V363I、S383N、S254F、K320E、G402D、I253F、V284A、A431T、N315H、Y319H、C226Y、F405L、T393I、N434S、R255W、A287T、N286Y、A231V、K274R、V308G、K414R、M428T、E345G、F243L、P247T、Q362R、S440N、Y278H、D312G、V262A、V305A、K246R、V308I、E380G、N276S、K439Q、S267G、F423Y、A231T、K320R、L410R、K320M、V412M、T307N、T366A、P230S、Y349S、A339T、K246E、K274E、A231P、I336T、S298N、L234P、S267N、V263A、E333G、V308A、K439R、K392R、S440G、V397I、I336V、Y373D、K288E、L309P、P227S、V379A、K288R、K320T、V282A、I377T、N421S及びC261R
のうちから選択される少なくとも1つの突然変異を担持し、
番号付けシステムは、Kabatの記載に従うEUインデックスのシステム又は同等のシステムである。
【００９８】
本発明の別の態様では、使用することができる抗体のFc断片は、2つの突然変異の少なくとも1つの組合せを担持し、前記組合せは、
(i)307N、326E、326T、334N、334R、352L、378V、378T、394P、396L、397M及び421Tのうちから選択される突然変異、並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P、及び447Nのうちから選択される少なくとも1つの突然変異
から選択され、
番号付けシステムは、Kabatの記載に従うEUインデックスのシステム又は同等のシステムであり、ただし、突然変異(i)は、突然変異(ii)と同じアミノ酸上では生じない。
【００９９】
好ましくは、本発明に従って使用することができる抗体の突然変異させたFc断片は、補体C1qに対する親和性の増加を示し、2つの突然変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せは、
i)378V、378T、396L、421T、334R及び326Eのうちから選択される1つの突然変異、並びに
ii)361H、290E、316D、248E、410R、421T、334R、394P、307P、447N、378V、284L、421T、396L、286I、315D及び397mのうちから選択される少なくとも1つの突然変異
を含み、
番号付けシステムは、Kabatの記載に従うEUインデックスのシステム又は同等のシステムであり、ただし、突然変異(i)は、突然変異(ii)と同じアミノ酸上では生じない。
【０１００】
好ましくは、本発明に従って使用することができる抗体の突然変異させたFc断片は、受容体FcγRIIIa(CD16A)に対する親和性の増加を示し、2つの突然変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せは、
i)378V、326E、397M、334N及び334Nのうちから選択される1つの突然変異、並びに
ii)316D、397M、334N、248E、231V、246R、336T、421T、361H、366A、439R、290E、394P、307P、378V、378T、286I、286Y及び298Nのうちから選択される少なくとも1つの突然変異
を含み、
番号付けシステムは、Kabatの記載に従うEUインデックスのシステム又は同等のシステムであり、ただし、突然変異(i)は、突然変異(ii)と同じアミノ酸上では生じない。
【０１０１】
好ましくは、本発明に従って使用することができる抗体の突然変異させたFc断片は、受容体FcγRIIa(CD32A)に対する親和性の増加を示し、2つの突然変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せは、
i)378V、326E、397M、307N、394P、326T、396L及び334Nのうちから選択される1つの突然変異、並びに
ii)316D、334R、334N、323I、231V、246R、336T、378T、286Y、286I、352S、383R、359A、421T、361H、315D、366A、290E、307P及び439Rのうちから選択される少なくとも1つの突然変異
を含み、
番号付けシステムは、Kabatの記載に従うEUインデックスのシステム又は同等のシステムであり、ただし、突然変異(i)は、突然変異(ii)と同じアミノ酸上では生じない。
【０１０２】
好ましくは、本発明に従って使用することができる抗体の突然変異させたFc断片は、3つの突然変異の少なくとも1つの組合せを含み、前記組合せは、
(i)326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N及び394Pのうちから選択される1つの突然変異、並びに
(ii)226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P及び447Nのうちから選択される少なくとも2つの突然変異
を含み、
番号付けシステムは、Kabatの記載に従うEUインデックスのシステム又は同等のシステムであり、ただし、突然変異(i)は、突然変異(ii)と同じアミノ酸上では生じない。
【０１０３】
本発明に従う使用のための抗体、その機能性の断片又は誘導体は、ヒト定常領域を有するキメラであるか又は実のところヒト化されており、好都合には、配列番号53のアミノ酸配列を有するヒトの重鎖定常領域を含む。加えて又は代わって、本発明に従う使用のための抗体、その機能性の断片又は誘導体は、ヒト定常領域を有するキメラであるか又は実のところヒト化されており、好都合には、配列番号54のアミノ酸配列を有するヒトの軽鎖定常領域を含む。IgG1アイソタイプのヒトの重鎖定常領域又は軽鎖定常領域の好ましい配列、すなわち、配列番号53及び配列番号54を、下記のTable 5(表5)に提示する。
【０１０４】
【表５】
2019502690.tif 000010
【０１０５】
したがって、本発明に従う使用のための抗体、それらの機能性の断片又は誘導体の重鎖及び軽鎖は、好都合には、下記のTable 6(表6)に記載する配列を含む。
【０１０６】
【表６】
2019502690.tif 000011
【０１０７】
本発明に従う使用のための抗体、その機能性の断片又は誘導体の重鎖及び/又は軽鎖は、好都合には、配列番号65の配列(MRWSWIFLLLLSITSANA)の異種のシグナルペプチド(シグナルペプチドMB7)を少なくとも1つ更に含む。実際に、このペプチドは、高等真核細胞系における組換えタンパク質の発現及び分泌を改善する能力をもたらすことが示されている(WO2011/114063を参照されたい)。したがって、本発明に従う使用のための抗体、それらの機能性の断片又は誘導体の重鎖は、好都合には、配列番号66〜70の配列のうちから選択されるアミノ酸配列を含み、これらは、シグナルペプチドMB7(配列番号65)のアミノ酸配列と本発明に従う抗体のVH領域のアミノ酸配列(配列番号43〜47)のうちの1つとの間の、N末端からC末端への融合体からなる。加えて又は代わって、本発明に従う使用のための抗体、それらの機能性の断片又は誘導体の軽鎖は、好都合には、配列番号71〜75の配列から選択されるアミノ酸配列を含み、これらは、シグナルペプチドMB7(配列番号65)のアミノ酸配列と本発明に従う抗体のVL領域のアミノ酸配列(配列番号48〜52)のうちの1つとの間の、N末端からC末端への融合体からなる。重鎖及び軽鎖の好ましい定常領域を付加することによって、本発明に従う使用のための抗体の好ましい完全なアミノ酸配列を得ることが可能になり、これらを、下記のTable 7(表7)に記載する。
【０１０８】
【表７】
2019502690.tif 000012
【０１０９】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗体は、65%以下である低いフコース含有量を有する。
【０１１０】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗体は、30%以上であるオリゴマンノース型N-グリカン含有量を有する。
【０１１１】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗体は、50%以上であるガラクトース含有量を有する。
【０１１２】
本発明の目的では、抗体、その機能性の断片又は誘導体は、好都合には、65%以下である低いフコース含有量を有する。
【０１１３】
用語「フコース含有量」は、各抗体のそれぞれの重鎖のFc領域のAsn297残基につながるN-グリカン内のフコシル化された形態のパーセントを指す。
【０１１４】
用語「低いフコース含有量」は、65%以下であるフコース含有量を指す。実のところ、抗体組成物のフコース含有量が、この組成物の、FcγRIIIを介して強力なADCC応答を誘発する能力において、極めて重要な役割を果たすことが現在公知である。
【０１１５】
好都合には、フコース含有量は、65%以下であり、好ましくは、60%以下、55%以下若しくは50%以下であり、又は45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、25%以下若しくは20%以下でさえある。しかし、フコース含有量は、皆無である必要はなく、例えば、5%以上、10%以上、15%以上又は20%以上であり得る。フコース含有量は、例えば、5%〜65%の間、5%〜60%の間、5%〜55%の間、5%〜50%の間、5%〜45%の間、5%〜40%の間、5%〜35%の間、5%〜30%の間、5%〜25%の間、5%〜20%の間、10%〜65%の間、10%〜60%の間、10%〜55%の間、10%〜50%の間、10%〜45%の間、10%〜40%の間、10%〜35%の間、10%〜30%の間、10%〜25%の間、10%〜20%の間、15%〜65%の間、15%〜60%の間、15%〜55%の間、15%〜50%の間、15%〜45%の間、15%〜40%の間、15%〜35%の間、15%〜30%の間、15%〜25%の間、15%〜20%の間、20%〜65%の間、20%〜60%の間、20%〜55%の間、20%〜50%の間、20%〜45%の間、20%〜40%の間、20%〜35%の間、20%〜30%の間、20%〜25%の間であり得る。
【０１１６】
更に、本発明に従う抗体、その機能性の断片又は誘導体は、低いフコース含有量を有するならば、異なる型のグリコシル化(オリゴマンノース型N-グリカン、又は二分岐の複合型のN-グリカン(これらは、二分性N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基若しくは二分岐の複合型のN-グリカンの場合のcfガラクトース残基の変動する比率を有する))も有し得る。したがって、多様な異なるグリコシル化阻害剤、例として、α1,2-マンノシダーゼI阻害剤(例として、デオキシマンノジリマイシン若しくは「DMM」)又はα-グルコシダーゼ阻害剤(例として、カスタノスペルミン若しくは「Cs」)の存在下で培養することによってか、或いは実のところ、CHO細胞系Lec1中で抗体を生成することによって、オリゴマンノース型N-グリカンを得ることができる。トランスジェニックヤギの乳汁中に生成させることによってもまた、抗体が得られ、この場合、多数のN-グリカンがオリゴマンノース型であり、1つ又は2つのガラクトースを有し、二分性GlcNAc及びシアル酸を有さない、フコシル化された、二分岐の複合形態が少数形成される(G1F又はG2F)(WO2007/048077を参照されたい)。二分岐の複合型のN-グリカンは、ほとんどの哺乳動物細胞中で得ることができるが、また、グリコシル化の機構が改変されている細菌、酵母又は植物中でも得ることができる。フコース含有量を制限するために、Fc断片に結合しているGlcNAc上へのフコースの付加に関与する酵素1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)の低い活性を生来示す細胞系、例として、YB2/0細胞系、アヒル胚細胞系EB66(登録商標)、ラットヘパトーマ細胞系H4-II-E(DSM ACC3129)及びH4-II-Es(DSM ACC3130)、又は細胞系NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)及びNM H9D8-E6Q12(DSM ACC 2856)を使用することができる。過小発現又は過剰発現が低いフコース含有量をもたらす、その他の遺伝子の突然変異系、例として、CHO系Lec13、すなわち、GDP-フコースの合成の減少を示す、CHO細胞系の突然変異体もまた、使用することができる。また、目的の細胞系を選択し、N-グリカンのフコシル化経路に関与するタンパク質(特に、FUT8(Yamane-Ohnukiら、2004年を参照されたい)があるが、また、GMD、すなわち、GDP-フコースの輸送に関与する遺伝子(Kandaら、2007年を参照されたい)もある)の発現を、(特に、干渉RNAの使用又は目的のタンパク質を発現する遺伝子の突然変異若しくは欠失により)減少又は消滅させることも可能である。別の選択肢は、目的の細胞系を選択し、N-グリカンのフコシル化を何らかの様式で妨げるタンパク質、例として、タンパク質GnTIII(β(1,4)-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼIII)を過剰発現させることからなる。特に、低いフコシル化されたN-グリカンを有する抗体は、とりわけ、
-  YB2/0(EP1176195A1、WO01/77181、Shinkawaら、2003年を参照されたい)、CHO Lec13(Schieldら、2002年を参照されたい)、EB66(登録商標)(Olivierら、2010年)、ラットヘパトーマ細胞系H4-II-E(DSM ACC3129)、H4-II-Es(DSM ACC3130)(WO2012/041768を参照されたい)、並びにヒト細胞系NM-H9D8(DSM ACC2806)、NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)及びNM H9D8-E6Q12(DSM ACC 2856)(WO2008/028686)中での生成、
-  FUT8(Moriら、2004年、Suzukiら、2007年、Cardarelliら、2009年、Cardarelliら、2010年、Herbstら、2010年)、又はGMD(ゴルジ体中のGDP-フコースの輸送体をコードする遺伝子、Imai-Nishiyaら、2007年を参照されたい)に対する低分子干渉RNAの存在下における野生型CHO細胞系中での生成、
-  1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子の2つの対立遺伝子が欠失している(Yamane-Ohnukiら、2004年)、又はゴルジ体中のGDP-フコースの輸送体をコードするGMD遺伝子の2つの対立遺伝子が欠失している(Kandaら、2007年)CHO細胞系中での生成、
-  GnTIII(β(1,4)-N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼIII)酵素をコードする遺伝子を遺伝子導入により過剰発現させた(Umanaら、1999年)CHO細胞系中での生成(この場合、低いフコシル化に加えて、得られるN-グリカンは、二分性GlcNAcの高い含有量により特徴付けられる)、
-  低分子干渉RNAの使用によって、β1,2-キシロース残基及びα1,3-フコースの残基の含有量を強力に低下させたトランスジェニック植物(ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana))(Forthalら、2010年)中での生成
により得られた。
【０１１７】
オリゴマンノース型N-グリカンは、二分岐の複合型のN-グリカンと比較して、in vivoでの半減期の低下を示す。結果として、好都合には、本発明に従う抗体は、それらのFc断片のN-グリコシル化部位上に、上記の定義に従う低いフコース含有量を有する二分岐の複合型のグリカン構造を有する。
【０１１８】
特に、本発明に従うモノクローナル抗体は、60%超であるG0+G1+G0F+G1Fのグリコフォームの含有量、及び上記の定義に従う低いフコース含有量を有し得る。また、本発明のモノクローナル抗体は、65%超であるG0+G1+G0F+G1Fのグリコフォームの含有量、及び上記の定義に従う低いフコース含有量も有し得る。また、本発明のモノクローナル抗体は、70%超であるG0+G1+G0F+G1Fのグリコフォームの含有量、及び上記の定義に従う低いフコース含有量も有し得る。また、本発明のモノクローナル抗体は、75%超であるG0+G1+G0F+G1Fのグリコフォームの含有量、及び上記の定義に従う低いフコース含有量も有し得る。また、本発明のモノクローナル抗体は、80%超であるG0+G1+G0F+G1Fのグリコフォームの含有量、及び上記の定義に従う低いフコース含有量も有し得る。また、本発明のモノクローナル抗体は、60%超、65%超、70%超、75%超又は80%超であるG0+G1+G0F+G1Fのグリコフォームの含有量、及び50%未満であるG0F+G1Fのグリコフォームの含有量も有し得る。ここで、グリコフォームG0、G1、G0F及びG1Fは、下記の定義に従う。
【０１１９】
【化１】
2019502690.tif 000013
【０１２０】
そのような抗体組成物は、特に、YB2/0、CHO Lec13、FUT8又はGMDに対する低分子干渉RNAの存在下で培養される野生型CHO細胞系、1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子の2つの対立遺伝子又はゴルジ体中のGDP-フコースの輸送体をコードするGMD遺伝子の2つの対立遺伝子が欠失しているCHO細胞系中での生成により得ることができる。
【０１２１】
しかし、別の実施形態では、本発明に従う抗体、その機能性の断片又は誘導体は、高いオリゴマンノース型N-グリカン含有量を有する。
【０１２２】
用語「オリゴマンノース型N-グリカン」は、2つのN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基(それらのうちの1つは、抗体のFc領域のAsn297残基に結合している)及び3つのマンノース残基で構成される五糖コアに、1〜6つの追加のマンノースが補充されており、これら追加のマンノースが、五糖コアの末端のマンノース残基に結合している、N-グリカンを指すと理解される。オリゴマンノース型N-グリカンは、フコシル化されていない。
【０１２３】
用語「オリゴマンノース型N-グリカン含有量」は、各抗体のそれぞれの重鎖のFc断片のAsn297残基につながるN-グリカン内のオリゴマンノース形態のパーセントを指す。用語「高いオリゴマンノース型N-グリカン含有量」は、30%以上、好都合には、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上であり、又は95%以上でさえあるオリゴマンノース型N-グリカン含有量を指す。
【０１２４】
本発明に従う抗体、その機能性の断片又は誘導体は、低いフコース含有量に加えて又は代わって、高いガラクトース含有量を有する。
【０１２５】
抗体の「ガラクトース含有量」又は「ガラクトシル化レベル」という用語は、抗体が放出したN-グリカンの分析用クロマトグラムから、以下の式:
ガラクトース含有量=
【０１２６】
【数１】
2019502690.tif 000014
【０１２７】
に従って計算されるパーセントを指し、
式中、
-  「n」は、クロマトグラム上で、例えば、順相高速液体クロマトグラフィーのスペクトル(NP HPLC)を用いて分析されたN-グリカンのピークの数を示し、
-  「Galの数」は、ピークに対応する、グリカンの分岐上のガラクトースの数を示し、
-  「Aの数」は、ピークに対応する、グリカン形態のN-アセチル-グルコサミンの分岐の数を示し、
-  「%相対表面積」は、対応するピーク下の面積のパーセントである。
【０１２８】
用語「高いガラクトース含有量」は、30%以上であり、好都合には、50%以上であり、好都合には、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上であり、又は100%にさえ等しいガラクトース含有量を指す。
【０１２９】
本発明はまた、使用ための上記の定義に従う、CD303タンパク質に対する抗体断片にも関する。
【０１３０】
用語「断片」は、断片Fab、F(ab')2、Fd、scFv、scFv二量体、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディを指す。
【０１３１】
用語「Fab」は、約50,000ダルトンの分子量を有し、抗原結合活性を示す抗体断片を指す。Fabはおよそ、ジスルフィド結合により連結している、重鎖のN末端側の半分と軽鎖全体とから構成されている。特に、IgGを、プロテアーゼ、すなわち、パパインを用いて処理することによって、Fabを得ることができる。
【０１３２】
用語「F(ab')2」は、抗原結合活性を示す、約100,000ダルトンの断片を指す。F(ab')2は、上記に記載した、2つのFab断片が、ジスルフィド結合を介して結合している状態に対応する。IgGを、プロテアーゼ、すなわち、ペプシンを用いて処理することによって、F(ab')2を得ることができる。
【０１３３】
用語「Fd」は、Fab断片中に含まれる重鎖の部分に対応する。したがって、Fd断片は、VHドメインとCH1ドメインとにより形成される。
【０１３４】
用語「scFv」(単鎖Fv)は、VLドメイン及びVHドメインをコードする遺伝子並びにこれらのドメインを結合させることを意図するペプチドをコードする配列を使用することによって合成したVH:VLのポリペプチドを示す。本発明に従うscFvは、適切な立体構造に、例えば、遺伝子組換えの適切な技法を使用することによって維持されるCDRを含む。
【０１３５】
用語「scFv二量体」は、ペプチド結合により一緒になって結合している2つのscFv分子を指すと理解される。
【０１３６】
scFvはまた、多量体構造(二量体:「ダイアボディ」、三量体:「トリアボディ」、四量体:「テトラボディ」)の開発のためのベースのモジュールとして使用することもできる。
【０１３７】
用語「ダイアボディ」は、scFv二量体を指すと理解される。断片のこの二量体は、親抗体が保有する二重の結合価を維持することが可能である特性を示す。ダイアボディは、二価であり、それが結合する抗原2つが、同一の抗原であるか又は異なる抗原であるかどうかに応じて、単一特異性又は二重特異性となる。
【０１３８】
用語「トリアボディ」は、scFvの三価の組合せを指すと理解される。したがって、トリアボディは、同一の又は異なる抗原3つに結合することができる。
【０１３９】
用語「テトラボディ」は、scFvの四価の組合せを指すと理解される。テトラボディは、同一の又は異なる抗原4つに結合することができる。
【０１４０】
本発明の特定の一態様では、上記で言及した使用のための前記抗体又は前記断片は、
-  放射性同位元素、特に、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32から選択される放射性同位元素、
-  非放射性金属、
-  毒素、特に、リシン、アブリン、ジフテリア毒素から選択される毒素、
-  核酸、特に、アンチセンスRNAから選択される核酸、
-  酵素、リボヌクレアーゼ、ビオチン、アビジン又はストレプトアビジンから選択される酵素、
-  細胞傷害剤、特に、
-  葉酸代謝拮抗剤、より特定すると、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、
-  抗プリン物質、より特定すると、クラドリビン、フルダラビン、アザチオプリン、メルカプトプリン、5-フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、
-  トポイソメラーゼI及びIIの阻害剤、
-  アルキル化剤及び関連の薬剤、より特定すると、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、カルムスチン、ホテムスチン、マイトマイシンC、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンのうちから選択されるアルキル化剤及び関連の薬剤、
-  インターカレート剤、
-  アントラサイクリン、より特定すると、ダウノルビシン、ドキソルビシン及び塩酸塩、エピルビシン、イダルビシン、ブレオマイシンから選択されるアントラサイクリン、
-  タキサン、
-  チロシンキナーゼの特定の阻害剤、イマチニブ、エルロチニブ
のうちから選択される細胞傷害剤
のうちから選択される生理活性分子とコンジュゲートしている。
【０１４１】
本発明はまた、上記に記載した本発明に従う抗体、その機能性の断片又は誘導体の重鎖及び/又は軽鎖をコードする(核酸配列又はヌクレオチド配列としてもまた公知の)核酸にも関する。特定のアミノ酸配列をコードする、遺伝暗号の縮重に起因する異なる核酸配列は全て、本発明の範囲に属する。特に、本発明に従う核酸の配列は、目的の宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物中でその発現を促進するように最適化されている場合がある。実のところ、一般に、(メチオニン及びトリプトファンを除き)同じアミノ酸をコードする、3つのヌクレオチドの組合せがいくつかあり、これらを同義的コドンと呼ぶ。しかし、一般に、これらの組合せのうちのいくつかが、細胞又は所与の生物により優先的に使用される(このことを、遺伝暗号/コドンの使用の偏りと呼ぶ)。こうした選好は、とりわけ、生成が行われる生物又は細胞が由来する生物に依存する。したがって、1つ又は複数の生物に由来するタンパク質を、異種の生物又はそのような異種の生物の細胞中で生成する場合には、当該タンパク質をコードする核酸配列を、異種の生物の好ましいコドンを主として使用するような様式に改変するのが有用である場合がある。多様な異なる種が好むコドンの使用に関する文献から、データが入手可能であり、当業者であれば、いかにして生物中又は異種の生物の細胞中での所与のタンパク質の発現を最適化するかを知っている。
【０１４２】
本発明に従う核酸は、好都合には、下記のTable 8(表8)の記載に従う配列番号86〜95の配列のうちの少なくとも1つを含み、これらの配列は、本発明に従う抗体のVH領域及びVL領域のアミノ酸配列をコードし、種ラット(Rattus norvegicus)の細胞中での発現のために最適化されている。
【０１４３】
【表８Ａ】
2019502690.tif 000015
【０１４４】
【表８Ｂ】
2019502690.tif 000016
【０１４５】
【表８Ｃ】
2019502690.tif 000017
【０１４６】
【表８Ｄ】
2019502690.tif 000018
【０１４７】
【表８Ｅ】
2019502690.tif 000019
【０１４８】
重鎖定常領域又は軽鎖定常領域をコードする好ましい核酸配列もまた、種ラット(Rattus norvegicus)の細胞中での発現のために最適化されており、それらは、好ましくは、下記のTable 9(表9)に記載する配列である。
【０１４９】
【表９Ａ】
2019502690.tif 000020
【０１５０】
【表９Ｂ】
2019502690.tif 000021
【０１５１】
したがって、本発明に従う抗体の重鎖及び/又は軽鎖をコードする核酸は、好ましくは、下記のTable 10(表10)に記載する核酸配列のうちの少なくとも1つを含み、これは、
-  本発明に従う好ましい抗体のVH領域をコードする配列番号86〜90の配列のうちの1つ、及びヒトの好ましい重鎖定常領域をコードする配列番号96の配列、又は
-  本発明に従う好ましい抗体のVL領域をコードする配列番号91〜95の配列のうちの1つ、及びヒトの好ましい軽鎖定常領域をコードする配列番号97の配列
の5'から3'への融合体からなる。
【０１５２】
【表１０】
2019502690.tif 000022
【０１５３】
本発明に従う抗体、その機能性の断片又は誘導体の重鎖及び/又は軽鎖をコードする核酸は、好都合には、異種のシグナルペプチドMB7(MRWSWIFLLLLSITSANA、配列番号65)をコードする核酸配列、特に、配列番号108(ATGAGGTGGTCCTGGATCTTCCTGCTGCTGCTGAGCATCACCAGCGCCAACGCC)の核酸配列を含む。実際に、このペプチドは、高等真核細胞系における組換えタンパク質の発現及び分泌を改善する能力をもたらすことが示されている(WO2011/114063を参照されたい)。したがって、本発明に従う抗体、それらの機能性の断片又は誘導体の重鎖をコードする核酸は、好都合には、配列番号109〜113の配列から選択される核酸配列を含み、これは、シグナルペプチドMB7をコードする核酸配列(配列番号108)及び本発明に従う抗体のVH領域をコードする核酸配列(配列番号86〜90)のうちの1つの5'から3'への融合体からなる。加えて又は代わって、本発明に従う抗体、それらの機能性の断片又は誘導体の軽鎖をコードする核酸は、好都合には、配列番号114〜118の配列から選択される核酸配列を含み、これは、シグナルペプチドMB7をコードする核酸配列(配列番号108)の、本発明に従う抗体のVL領域の核酸配列(配列番号91〜95)のうちの1つとの5'から3'への融合体からなる。重鎖及び軽鎖の好ましい定常領域を付加することによって、本発明に従う抗体の好ましい完全なアミノ酸配列が得られ、これらを、下記のTable 11(表11)に記載する。
【０１５４】
【表１１】
2019502690.tif 000023
【０１５５】
本発明の特定の一態様では、上記で言及した使用のための前記抗体又は前記断片は、少なくとも1つの抗がん剤と組み合わせて使用される。
【０１５６】
本発明の特定の一態様では、前記抗がん剤は、化学的な抗がん剤及び/又は免疫療法において使用される抗がん剤である。
【０１５７】
本発明の特定の一態様では、前記化学的な抗がん剤は、抗代謝剤、アルキル化剤、インターカレート剤、又は有糸分裂紡錘体に対する作用を有する分子のうちから選択される。
【０１５８】
本発明の特定の一態様では、前記抗代謝剤は、
-  葉酸代謝拮抗剤、特に、メトトレキセート、ラルチトレキセド及びペメトレキセド、
-  抗プリン物質、特に、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、クラドリビン及びフルダラビン、
-  抗ピリジン物質、特に、5-フルオロウラシル、テガフールウラシル、シタラビン及びカペシタビン、並びに
-  抗代謝物質、特に、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシウレア及びゲムシタビン
のうちから選択される。
【０１５９】
本発明の特定の一態様では、前記アルキル化剤は、
-  ナイトロジェンマスタード類、特に、クロラムブシル、メルファラン、クロルメチン、メタクロロエタミン、エストラムスチン、イホスファミド及びシクロホスファミド、
-  ニトロソウレア類、特に、ホテムスチン、ロムスチン、カルムスチン、ストレプトゾシン、
-  有機白金化合物、特に、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチン、
-  エチレンイミン類、特に、チオテパ及びアルトレタミン、
-  トリアゼン、特に、プロカルバジン、テモゾロミド及びダカルバジン、
-  アルキル化剤、特に、ブスルファン、マイトマイシンC及びピポブロマン
のうちから選択される。
【０１６０】
本発明の特定の一態様では、前記インターカレート剤は、
-  カンプトテシン誘導体、特に、イリノテカン及びトポテカン
-  アントラサイクリン、特に、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン及びイダルビシン、
-  インターカレート剤、特に、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、アクチノマイシンD、ダクチノマイシン、エトポシド及びブレオマイシン
のうちから選択される。
【０１６１】
本発明の特定の一態様では、有糸分裂紡錘体に対する作用を有する分子は、
-  ビンカアルカロイド又はスピンドル毒、特に、ビノレルビン、ビンデシン、ビンクリスチン及びビンブラスチン、
-  タキソイド又は紡錘体微小管安定化剤、特に、パクリタキセル及びドセタキセル、
-  チロシンキナーゼ阻害剤、特に、ダサチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ソラフェニブ及びスニチニブ
のうちから選択される。
【０１６２】
上記で言及した分子は、例を指し示す目的でのみ提供し、本発明の範囲を制限する意図はない。上記で言及した化合物は、それぞれの国際一般名称(INN)に対応し、当業者であれば、多様な関連のある供給元が提供する、対応する市販の商品名を容易に見出すことができるであろう。
【０１６３】
本発明の特定の一態様では、免疫療法において使用される前記抗がん剤は、標的の腫瘍に対して特異性を示す抗体、すなわち、標的の腫瘍に特異的な抗体、抗CD123抗体、又はTLRアゴニストである。
【０１６４】
別の特定の態様では、本発明に従う、CD303タンパク質に対する抗体は、抗CD123抗体及び/TLRアゴニストと組み合わせて使用される。
【０１６５】
別の特定の態様では、本発明に従う、CD303タンパク質に対する抗体は、抗CD123抗体及びTLRアゴニストと組み合わせて使用される。
【０１６６】
用語「標的の腫瘍に特異的な抗体」は、予防又は治療しようとする腫瘍に対して特異性を示すマーカーに対する抗体を指すと理解される。
【０１６７】
「抗CD123抗体」は、CD123(又はIL-3Rα)に対する抗体である。そのような抗体は、例えば、Miltenyi Biotec社から、項目参照番号AC145の下で市販されている。
【０１６８】
用語「TLRアゴニスト」は、トール様受容体のアゴニスト、特に、TLR7及びTLR9のアゴニストを指す。TLR7アゴニストは、例えば、イミキモドであり、TLR9アゴニストは、例えば、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpGODN)である。
【０１６９】
本発明の特定の一態様では、前記抗体又は前記断片の前記使用と前記抗がん剤の前記使用とは、同時であり、別個であり、又は時間を経てずらして行われる。
【０１７０】
本発明の特定の一態様では、前記抗体又は前記断片の前記使用は、前記抗がん剤の前記使用と同時である。
【０１７１】
本発明の特定の一態様では、前記抗体又は前記断片の前記使用は、前記抗がん剤の前記使用に対して順次である。
【０１７２】
本発明の特定の一態様では、前記抗体又は前記断片の前記使用は、前記抗がん剤の前記使用の前である。
【０１７３】
本発明の特定の一態様では、本発明に従う、CD303タンパク質に対する前記抗体の使用は、前記抗CD123抗体及び前記TLRアゴニストの使用と同時である。
【０１７４】
本発明の特定の一態様では、本発明に従う、CD303タンパク質に対する前記抗体の使用は、前記抗CD123抗体及び前記TLRアゴニストの使用に対して順次である。そのような事例では、前記抗CD123抗体の使用は、前記TLRアゴニストの使用に対して順次、同時又は前であり得る。
【０１７５】
本発明の特定の一態様では、本発明に従う、CD303タンパク質に対する前記抗体の使用は、前記抗CD123抗体及び前記TLRアゴニストの使用の前である。そのような事例では、前記抗CD123抗体の使用は、前記TLRアゴニストの使用に対して順次、同時又は前であり得る。
【０１７６】
本発明の特定の一態様では、前記抗体又は前記断片の前記使用は、放射線療法と連動する。
【０１７７】
本発明の特定の一態様では、前記抗体又は前記断片と前記抗がん剤とは、放射線療法と連動する。
【０１７８】
本発明の特定の一態様では、前記予防又は前記治療は、形質細胞様樹状細胞の枯渇を示す患者において作用する。
【０１７９】
用語「形質細胞様樹状細胞の枯渇を示す患者」は、形質細胞様樹状細胞の数が前の治療により低下している患者を指すと理解される。また、この用語を使用して、形質細胞様樹状細胞の数がさらなる治療により低下するであろう患者も指す。したがってまた、この用語は、形質細胞様樹状細胞の枯渇を必要とするか又は形質細胞様樹状細胞の枯渇が必須である患者、換言すると、CD303タンパク質に対する抗体が、腫瘍の微小環境の形質細胞様樹状細胞を排除するように、腫瘍に対して間接的に作用するであろう患者も指す。したがって、そのような患者において、CD303タンパク質に対する抗体は、抗がん剤の作用を促進、刺激又は強化するか、又は前記抗がん剤との相乗作用さえ示す。
【０１８０】
別の態様では、本発明はまた、本発明に従う少なくとも1つの核酸、又は本発明に従うベクターを含む宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物にも関する。
【０１８１】
本発明の特定の一態様では、CD303タンパク質に対する抗体は、遺伝子組換え現象により、とりわけ、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物中で生成する。
【０１８２】
本発明の特定の一態様では、前記抗がん剤は、遺伝子組換え現象により、特に、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物中で生成する。
【０１８３】
本発明の特定の一態様では、CD303タンパク質に対する抗体及び前記抗がん剤は、遺伝子組換え現象により、特に、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック植物中で生成する。
【０１８４】
宿主細胞は、原核生物又は真核生物起源であり得、特に、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母又は哺乳動物細胞から選択することができる。次いで、宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、本発明に従う抗体、機能性の断片又は誘導体を生成することができる。特に、本発明に従う抗体、その機能性の断片又は誘導体の重鎖及び軽鎖の発現ベクターによる、細胞系の形質転換、及び得られた多様な異なる細胞クローンの分離により、本発明に従う宿主細胞を得ることができる。形質転換される細胞系は、好ましくは、真核生物起源であり、特に、昆虫細胞、植物細胞、酵母又は哺乳動物細胞から選択することができる。抗体の生成に適切である細胞系には、特に、SP2/0;YB2/0;IR983F;Namalwaヒト骨髄腫;PERC6;CHO細胞系、特に、CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHO Pro-5、CHO dhfr-、又はFUT8遺伝子及び/若しくはGMD遺伝子をコードする両方の対立遺伝子が欠失しているCHO細胞系;Wil-2;ジャーカット;ベロ;MoIt-4;COS-7;293-HEK;BHK;K6H6;NSO;SP2/0-Ag14、P3X63Ag8.653、胚性アヒル細胞系EB66(登録商標)(Valneva);ラット肝細胞腫系H4-II-E(DSM ACC3129)及びH4-II-Es(DSM ACC3130)(WO2012/041768を参照されたい)、NM-H9D8(DSM ACC2806)、NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)及びNM H9D8-E6Q12(DSM ACC 2856)(WO2008/028686を参照されたい)から選択される細胞系が含まれる。
【０１８５】
目的の遺伝子(ここでは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする再構成された遺伝子)を受精卵内に直接注入すること(Gordonら、1980年)によって、本発明に従うトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。また、キメラ凝集法又はキメラ注入法により、目的の遺伝子(ここでは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする再構成された遺伝子)を胚性幹細胞内に導入し、動物を調製することによって、トランスジェニック非ヒト動物を得ることもできる(Manipulating the Mouse Embryo、A Laboratory Manual、Second edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994);Gene Targeting、A Practical Approach、IRL Press at Oxford University Press(1993)を参照されたい)。また、目的の遺伝子(ここでは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする再構成された遺伝子)が導入されている核を、除核した卵内に移植するクローニングの技法(Ryanら、1997年;Cibelliら、1998年、WO00/26357)により、トランスジェニック非ヒト動物を得ることもできる。目的の抗体を生成するトランスジェニック非ヒト動物は、上記の方法により調製することができる。次いで、抗体を、トランスジェニック動物中に蓄積させ、とりわけ、動物の乳汁又は卵から収集することができる。トランスジェニック非ヒト動物の乳汁中に抗体を生成するための調製方法が、とりわけ、WO90/04036、WO95/17085、WO01/26455、WO2004/050847、WO2005/033281、WO2007/048077に記載されている。乳汁から目的のタンパク質を精製するための方法もまた公知である(WO01/26455、WO2007/106078を参照されたい)。目的のトランスジェニック非ヒト動物には、とりわけ、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、ウシ科の動物(とりわけ、ウシ)及び家禽(とりわけ、ニワトリ)が含まれる。
【０１８６】
本発明に従うトランスジェニック植物は、抗体の生成が可能である任意の植物から選択することができる。すでに、多数の抗体がトランスジェニック植物中で生成されるに至っており、目的の抗体を発現するトランスジェニック植物を得、抗体を回収するのに必要な技術は、当業者に周知である(Stogerら、2002年、Fisherら、2003年、Maら、2003年、Schillbergら、2005年を参照されたい)。また、(キシロースを有さない)自然のヒト抗体のグリコシル化に類似するが、加えて、若干のフコシル化も有するグリコシル化を得るために、植物中で得られるグリコシル化に、例えば、低分子干渉RNAによって影響を及ぼすことも可能である(Forthalら、2010年)。
【０１８７】
第2の態様では、本発明は、タンパク質CD303に対する抗体又は前記抗体の断片を少なくとも2つ、及び抗がん剤を少なくとも1つ含む組成物に関する。そのような組成物は、CD303タンパク質に対する抗体と少なくとも1つの抗がん剤との混合物からなる。
【０１８８】
本発明の特定の一態様では、前記組成物は、少なくとも2つの抗がん剤を含む。
【０１８９】
本発明はまた、タンパク質CD303に対する少なくとも1つの抗体又は前記抗体の断片、及び少なくとも2つの抗がん剤を含む組成物にも関し得る。
【０１９０】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。
【０１９１】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される。
【０１９２】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、好ましくは、マウス/ヒトのキメラ抗体又はヒト/マカクのキメラ抗体から選択されるキメラ抗体である。
【０１９３】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、ヒトCD303抗原(配列番号130)の外部ドメインに対するモノクローナル抗体又はその機能性の断片若しくは誘導体であり、
c)ヒトCD303抗原に対する結合について、
vi)重鎖可変領域が配列番号43の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号48の配列を含む抗体、
vii)重鎖可変領域が配列番号44の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号49の配列を含む抗体、
viii)重鎖可変領域が配列番号45の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号50の配列を含む抗体、
ix)重鎖可変領域が配列番号46の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号51の配列を含む抗体、
x)重鎖可変領域が配列番号47の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号52の配列を含む抗体
のうちから選択される少なくとも1つの抗体と競合すること、並びに
d)軽鎖及び重鎖の定常領域が、マウス以外の種に由来する定常領域であること
を特徴とする。
【０１９４】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号43の配列又は前記配列番号43に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号48の配列又は前記配列番号48に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体122A2)。
【０１９５】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号44の配列又は前記配列番号44に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号49の配列又は前記配列番号49に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体102E9)。
【０１９６】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号45の配列又は前記配列番号45に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号50の配列又は前記配列番号50に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104C12)。
【０１９７】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号46の配列又は前記配列番号46に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号51の配列又は前記配列番号51に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体114D11)。
【０１９８】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号47の配列又は前記配列番号47に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号52の配列又は前記配列番号52に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104E10)。
【０１９９】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号55の配列又は前記配列番号55に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号60の配列又は前記配列番号60に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体122A2)。
【０２００】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号56の配列又は前記配列番号56に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号61の配列又は前記配列番号61に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体102E9)。
【０２０１】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号57の配列又は前記配列番号57に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号62の配列又は前記配列番号62に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104C12)。
【０２０２】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号58の配列又は前記配列番号58に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号63の配列又は前記配列番号63に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体114D11)。
【０２０３】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号59の配列又は前記配列番号59に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号64の配列又は前記配列番号64に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104E10)。
【０２０４】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、65%以下である低いフコース含有量を有する。
【０２０５】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、30%以上であるオリゴマンノース型N-グリカン含有量を有する。
【０２０６】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の抗体は、50%以上であるガラクトース含有量を有する。
【０２０７】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の断片は、Fab、F(ab')2、Fd、scFv、scFv二量体、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディから選択される。
【０２０８】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の前記抗体又は前記断片は、
-  放射性同位元素、特に、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32から選択される放射性同位元素、
-  非放射性金属、
-  毒素、特に、リシン、アブリン、ジフテリア毒素から選択される毒素、
-  核酸、特に、アンチセンスRNAから選択される核酸、
-  酵素、特に、リボヌクレアーゼ、ビオチン、アビジン又はストレプトアビジンから選択される酵素、
-  細胞傷害剤、特に、
-  葉酸代謝拮抗剤、より特定すると、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、
-  抗プリン物質、より特定すると、クラドリビン、フルダラビン、アザチオプリン、メルカプトプリン、5-フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、
-  トポイソメラーゼI及びIIの阻害剤、
-  アルキル化剤及び関連の薬剤、より特定すると、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、カルムスチン、ホテムスチン、マイトマイシンC、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンのうちから選択されるアルキル化剤及び関連の薬剤、
-  インターカレート剤、
-  アントラサイクリン、特に、ダウノルビシン、ドキソルビシン及び塩酸塩、エピルビシン、イダルビシン、ブレオマイシン、
-  タキサン、
-  チロシンキナーゼの特定の阻害剤、より特定すると、イマチニブ、エルロチニブ
のうちから選択される細胞傷害剤
のうちから選択される生理活性分子とコンジュゲートしている。
【０２０９】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の前記抗がん剤は、化学的な抗がん剤及び/又は免疫療法において使用される抗がん剤である。
【０２１０】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の前記化学的な抗がん剤は、抗代謝剤、アルキル化剤、インターカレート剤、又は有糸分裂紡錘体に対する作用を有する分子から選択される。
【０２１１】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の前記抗代謝剤は、
-  葉酸代謝拮抗剤、特に、メトトレキセート、ラルチトレキセド及びペメトレキセド、
-  抗プリン物質、特に、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、クラドリビン及びフルダラビン、
-  抗ピリジン物質、特に、5-フルオロウラシル、テガフールウラシル、シタラビン及びカペシタビン、並びに
-  抗代謝物質、特に、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシウレア及びゲムシタビン
のうちから選択される。
【０２１２】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の前記アルキル化剤は、
-  ナイトロジェンマスタード類、特に、クロラムブシル、メルファラン、クロルメチン、メタクロロエタミン、エストラムスチン、イホスファミド及びシクロホスファミド、
-  ニトロソウレア類、特に、ホテムスチン、ロムスチン、カルムスチン、ストレプトゾシン、
-  有機白金化合物、特に、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチン、
-  エチレンイミン類、特に、チオテパ及びアルトレタミン、
-  トリアゼン、特に、プロカルバジン、テモゾロミド及びダカルバジン、
-  アルキル化剤、特に、ブスルファン、マイトマイシンC及びピポブロマン
のうちから選択される。
【０２１３】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の前記インターカレート剤は、
-  カンプトテシン誘導体、特に、イリノテカン及びトポテカン
-  アントラサイクリン、特に、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン及びイダルビシン、
-  インターカレート剤、特に、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、アクチノマイシンD、ダクチノマイシン、エトポシド及びブレオマイシン
のうちから選択される。
【０２１４】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の有糸分裂紡錘体に対する作用を有する分子は、
-  ビンカアルカロイド又はスピンドル毒、特に、ビノレルビン、ビンデシン、ビンクリスチン及びビンブラスチン、
-  タキソイド又は紡錘体微小管安定化剤、特に、パクリタキセル及びドセタキセル、
-  チロシンキナーゼ阻害剤、特に、ダサチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ソラフェニブ及びスニチニブ
のうちから選択される。
【０２１５】
本発明の特定の一態様では、免疫療法において使用される、前記組成物中の前記抗がん剤は、標的の腫瘍に特異的な抗体、抗CD123抗体、又はTLRアゴニストである。
【０２１６】
本発明の特定の一態様では、免疫療法において使用される、前記組成物中の前記抗がん剤は、抗CD123抗体及びTLRアゴニストである。
【０２１７】
第3の態様では、本発明は、腫瘍の微小環境における形質細胞様樹状細胞の活性化が関与する腫瘍の予防又は治療における使用のための、タンパク質CD303に対する抗体又は前記抗体の断片を少なくとも2つ、及び抗がん剤を少なくとも1つ含む組成物に関する。
【０２１８】
本発明はまた、腫瘍の微小環境における形質細胞様樹状細胞の活性化が関与する腫瘍の予防又は治療における使用のための、CD303タンパク質に対する少なくとも1つの抗体又は前記抗体の断片、及び少なくとも2つの抗がん剤を含む組成物にも関する。
【０２１９】
本発明の特定の一態様では、これまでにも上記で指し示したように、前記形質細胞様樹状細胞は、腫瘍の原因ではない。
【０２２０】
本発明の特定の一態様では、これまでにも上記で指し示したように、形質細胞様樹状細胞の活性化が関与する前記腫瘍は、固形腫瘍、特に、それらの微小環境における形質細胞様樹状細胞の浸潤が関与する固形腫瘍、又は造血器腫瘍である。
【０２２１】
本発明の特定の一態様では、これまでにも上記で指し示したように、固形腫瘍は、頭頚部の腫瘍、メラノーマ、泌尿生殖器がん、乳がんの群に属する。
【０２２２】
本発明の特定の一態様では、これまでにも上記で指し示したように、造血器腫瘍は、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、特に、T細胞白血病からなる群に属する。
【０２２３】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。
【０２２４】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体のうちから選択される。
【０２２５】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記抗体は、キメラ抗体、好ましくは、マウス/ヒトのキメラ抗体又はヒト-マカクのキメラ抗体のうちから選択されるキメラ抗体である。
【０２２６】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の抗体は、ヒトCD303抗原(配列番号130)の外部ドメインに対するモノクローナル抗体又はその機能性の断片若しくは誘導体であり、
e)ヒトCD303抗原に対する結合について、
xi)重鎖可変領域が配列番号43の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号48の配列を含む抗体、
xii)重鎖可変領域が配列番号44の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号49の配列を含む抗体、
xiii)重鎖可変領域が配列番号45の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号50の配列を含む抗体、
xiv)重鎖可変領域が配列番号46の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号51の配列を含む抗体、
xv)重鎖可変領域が配列番号47の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号52の配列を含む抗体
のうちから選択される少なくとも1つの抗体と競合すること、並びに
f)軽鎖及び重鎖の定常領域が、マウス以外の種に由来する定常領域であること
を特徴とする。
【０２２７】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号43の配列又は前記配列番号43に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号48の配列又は前記配列番号48に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体122A2)。
【０２２８】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号44の配列又は前記配列番号44に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号49の配列又は前記配列番号49に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体102E9)。
【０２２９】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号45の配列又は前記配列番号45に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号50の配列又は前記配列番号50に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104C12)。
【０２３０】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号46の配列又は前記配列番号46に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号51の配列又は前記配列番号51に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体114D11)。
【０２３１】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号47の配列又は前記配列番号47に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号52の配列又は前記配列番号52に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104E10)。
【０２３２】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号55の配列又は前記配列番号55に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号60の配列又は前記配列番号60に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体122A2)。
【０２３３】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号56の配列又は前記配列番号56に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号61の配列又は前記配列番号61に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体102E9)。
【０２３４】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号57の配列又は前記配列番号57に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号62の配列又は前記配列番号62に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104C12)。
【０２３５】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号58の配列又は前記配列番号58に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号63の配列又は前記配列番号63に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体114D11)。
【０２３６】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号59の配列又は前記配列番号59に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号64の配列又は前記配列番号64に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104E10)。
【０２３７】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記抗体は、65%以下である低いフコース含有量を有する。
【０２３８】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記抗体は、30%以上であるオリゴマンノース型N-グリカン含有量を有する。
【０２３９】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記抗体は、50%以上であるガラクトース含有量を有する。
【０２４０】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記抗体は、抗体断片である。
【０２４１】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記断片は、Fab、F(ab')2、Fd、scFv、scFv二量体、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディから選択される。
【０２４２】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記抗体又は前記断片は、
-  放射性同位元素、特に、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32から選択される放射性同位元素、
-  非放射性金属、
-  毒素、特に、リシン、アブリン、ジフテリア毒素から選択される毒素、
-  核酸、特に、アンチセンスRNAから選択される核酸、
-  酵素、特に、リボヌクレアーゼ、ビオチン、アビジン又はストレプトアビジンから選択される酵素、
-  細胞傷害剤、特に、
-  葉酸代謝拮抗剤、より特定すると、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、
-  抗プリン物質、より特定すると、クラドリビン、フルダラビン、アザチオプリン、メルカプトプリン、5-フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビンから選択される抗プリン物質、
-  トポイソメラーゼI及びIIの阻害剤、
-  アルキル化剤及び関連の薬剤、より特定すると、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、カルムスチン、ホテムスチン、マイトマイシンC、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンのうちから選択されるアルキル化剤及び関連の薬剤、
-  インターカレート剤、
-  アントラサイクリン、特に、ダウノルビシン、ドキソルビシン及び塩酸塩、エピルビシン、イダルビシン、ブレオマイシン、
-  タキサン、
-  チロシンキナーゼの特定の阻害剤、より特定すると、イマチニブ、エルロチニブ
のうちから選択される細胞傷害剤
のうちから選択される生理活性分子とコンジュゲートしている。
【０２４３】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記抗がん剤は、化学的な抗がん剤及び/又は免疫療法において使用される抗がん剤である。
【０２４４】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記化学的な抗がん剤は、抗代謝剤、アルキル化剤、インターカレート剤、又は有糸分裂紡錘体に対する作用を有する分子から選択される。
【０２４５】
本発明の特定の一態様では、上記の使用ための前記組成物中の前記抗代謝剤は、
-  葉酸代謝拮抗剤、特に、メトトレキセート、ラルチトレキセド及びペメトレキセド、
-  抗プリン物質、特に、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、クラドリビン及びフルダラビン、
-  抗ピリジン物質、特に、5-フルオロウラシル、テガフールウラシル、シタラビン及びカペシタビン、並びに
-  抗代謝物質、特に、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシウレア及びゲムシタビンのうちから選択される。
【０２４６】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記アルキル化剤は、
-  ナイトロジェンマスタード類、特に、クロラムブシル、メルファラン、クロルメチン、メタクロロエタミン、エストラムスチン、イホスファミド及びシクロホスファミド、
-  ニトロソウレア類、特に、ホテムスチン、ロムスチン、カルムスチン、ストレプトゾシン、
-  有機白金化合物、特に、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチン、
-  エチレンイミン類、特に、チオテパ及びアルトレタミン、
-  トリアゼン、特に、プロカルバジン、テモゾロミド及びダカルバジン、
-  アルキル化剤、特に、ブスルファン、マイトマイシンC及びピポブロマン
のうちから選択される。
【０２４７】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の前記インターカレート剤は、
-  カンプトテシン誘導体、特に、イリノテカン及びトポテカン
-  アントラサイクリン、特に、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン及びイダルビシン、
-  インターカレート剤、特に、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、アクチノマイシンD、ダクチノマイシン、エトポシド及びブレオマイシン
のうちから選択される。
【０２４８】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の有糸分裂紡錘体に対する作用を有する前記分子は、
-  ビンカアルカロイド又はスピンドル毒、特に、ビノレルビン、ビンデシン、ビンクリスチン及びビンブラスチン、
-  タキソイド又は紡錘体微小管安定化剤、特に、パクリタキセル及びドセタキセル、
-  チロシンキナーゼ阻害剤、特に、ダサチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ソラフェニブ及びスニチニブのうちから選択される。
【０２４９】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の免疫療法において使用される前記抗がん剤は、標的の腫瘍に特異的な抗体、抗CD123抗体、又はTLRアゴニストである。
【０２５０】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記組成物中の免疫療法において使用される前記抗がん剤は、抗CD123抗体及びTLRアゴニストである。
【０２５１】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の前記抗体又は前記断片の使用と前記組成物中の前記抗がん剤の前記使用とは、同時であり、別個であり、又は時間を経てずらして行われる。
【０２５２】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の前記抗体又は前記断片の使用と前記組成物中の前記抗がん剤の使用とは、同時である。
【０２５３】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の前記抗体又は前記断片の使用と前記組成物中の前記抗がん剤の使用とは、順次である。
【０２５４】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中の前記抗体又は前記断片の使用は、前記組成物中の前記抗がん剤の使用の前である。
【０２５５】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中のCD303タンパク質に対する前記抗体の使用は、前記抗CD123抗体及び前記TLRアゴニストの使用と同時である。
【０２５６】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中のCD303タンパク質に対する前記抗体の使用は、前記抗CD123抗体及び前記TLRアゴニストの使用に対して順次である。そのような事例では、前記抗CD123抗体の使用は、前記TLRアゴニストの使用に対して順次、同時又は前であり得る。
【０２５７】
本発明の特定の一態様では、前記組成物中のCD303タンパク質に対する前記抗体の使用は、前記抗CD123抗体及び前記TLRアゴニストの使用の前である。そのような事例では、前記抗CD123抗体の使用は、前記TLRアゴニストの使用に対して順次、同時又は前であり得る。
【０２５８】
本発明の特定の一態様では、上記前記組成物の使用は、放射線療法と連動する。
【０２５９】
本発明の特定の一態様では、腫瘍の微小環境における形質細胞様樹状細胞の活性化が関与する腫瘍の予防又は治療のための上記前記組成物の使用は、形質細胞様樹状細胞の枯渇を示す患者、又は形質細胞様樹状細胞の枯渇を必要とするか若しくは形質細胞様樹状細胞の枯渇が必須である患者において作用する。
【０２６０】
第4の態様では、本発明は、形質細胞様樹状細胞の枯渇を示す患者、又は形質細胞様樹状細胞の枯渇を必要とするか若しくは形質細胞様樹状細胞の枯渇が必須である患者における腫瘍の予防又は治療に関する使用のための抗がん剤に関する。
【０２６１】
本発明の特定の一態様では、形質細胞様樹状細胞の枯渇を示す患者における前記腫瘍は、微小環境における形質細胞様樹状細胞の活性化が関与する腫瘍であり、この場合、前記形質細胞様樹状細胞は、腫瘍の原因ではない。
【０２６２】
本発明の特定の一態様では、これまでにも上記で指し示したように、形質細胞様樹状細胞の活性化が関与する前記腫瘍は、固形腫瘍、特に、それらの微小環境における形質細胞様樹状細胞の浸潤が関与する固形腫瘍、又は造血器腫瘍である。
【０２６３】
本発明の特定の一態様では、これまでにも上記で指し示したように、固形腫瘍は、頭頚部の腫瘍、メラノーマ、泌尿生殖器がん、乳がんの群に属する。
【０２６４】
本発明の特定の一態様では、これまでにも上記で指し示したように、造血器腫瘍は、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、特に、T細胞白血病からなるtc群に属する。
【０２６５】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤は、化学的な抗がん剤及び/又は免疫療法において使用される抗がん剤である。
【０２６６】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記化学的な抗がん剤は、抗代謝剤、アルキル化剤、インターカレート剤、又は有糸分裂紡錘体に対する作用を有する分子から選択される。
【０２６７】
本発明の特定の一態様では、抗代謝剤である、上記の使用のための前記抗がん剤は、
-  葉酸代謝拮抗剤、特に、メトトレキセート、ラルチトレキセド及びペメトレキセド、
-  抗プリン物質、特に、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、クラドリビン及びフルダラビン、
-  抗ピリジン物質、特に、5-フルオロウラシル、テガフールウラシル、シタラビン及びカペシタビン、並びに
-  抗代謝物質、特に、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシウレア及びゲムシタビン
のうちから選択される。
【０２６８】
本発明の特定の一態様では、アルキル化剤である、その上記の使用ための前記抗がん剤は、
-  ナイトロジェンマスタード類、特に、クロラムブシル、メルファラン、クロルメチン、メタクロロエタミン、エストラムスチン、イホスファミド及びシクロホスファミド、
-  ニトロソウレア類、特に、ホテムスチン、ロムスチン、カルムスチン、ストレプトゾシン、
-  有機白金化合物、特に、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチン、
-  エチレンイミン類、特に、チオテパ及びアルトレタミン、
-  トリアゼン、特に、プロカルバジン、テモゾロミド及びダカルバジン、
-  アルキル化剤、特に、ブスルファン、マイトマイシンC及びピポブロマン
のうちから選択される。
【０２６９】
本発明の特定の一態様では、インターカレート剤である、上記の使用のための前記抗がん剤は、
-  カンプトテシン誘導体、特に、イリノテカン及びトポテカン、
-  アントラサイクリン、特に、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン及びイダルビシン、
-  インターカレート剤、特に、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、アクチノマイシンD、ダクチノマイシン、エトポシド及びブレオマイシン
のうちから選択される。
【０２７０】
本発明の特定の一態様では、有糸分裂紡錘体に対する作用を有する分子である、上記の使用のための前記抗がん剤は、
-  ビンカアルカロイド又はスピンドル毒、特に、ビノレルビン、ビンデシン、ビンクリスチン及びビンブラスチン、
-  タキソイド又は紡錘体微小管安定化剤、特に、パクリタキセル及びドセタキセル、
-  チロシンキナーゼ阻害剤、特に、ダサチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ソラフェニブ及びスニチニブ
のうちから選択される。
【０２７１】
本発明の特定の一態様では、免疫療法において使用される、上記の使用のための前記抗がん剤は、標的の腫瘍に特異的な抗体、抗CD123抗体、又はTLRアゴニストから選択される。
【０２７２】
本発明の特定の一態様では、免疫療法において使用される、上記の使用のための前記抗がん剤は、抗CD123抗体及びTLRアゴニストである。
【０２７３】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤は、CD303タンパク質に対するモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体、又はその断片、特に、65%以下である低いフコース含有量、及び/又は30%以上であるオリゴマンノース型N-グリカン含有量、及び/又は50%以上であるガラクトース含有量を有する抗体と組み合わせて使用される。
【０２７４】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択され、好ましくは、マウス/ヒトのキメラ抗体又はヒト-マカクのキメラ抗体のうちから選択されるキメラ抗体である。
【０２７５】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体は、ヒトCD303抗原(配列番号130)の外部ドメインに対するモノクローナル抗体又はその機能性の断片若しくは誘導体であり、
g)ヒトCD303抗原に対する結合について、
xvi)重鎖可変領域が配列番号43の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号48の配列を含む抗体、
xvii)重鎖可変領域が配列番号44の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号49の配列を含む抗体、
xviii)重鎖可変領域が配列番号45の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号50の配列を含む抗体、
xix)重鎖可変領域が配列番号46の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号51の配列を含む抗体、
xx)重鎖可変領域が配列番号47の配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号52の配列を含む抗体
のうちから選択される少なくとも1つの抗体と競合すること、並びに
h)軽鎖及び重鎖の定常領域が、マウス以外の種に由来する定常領域であること
を特徴とする。
【０２７６】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号43の配列又は前記配列番号43に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号48の配列又は前記配列番号48に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体122A2)。
【０２７７】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号44の配列又は前記配列番号44に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号49の配列又は前記配列番号49に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体102E9)。
【０２７８】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号45の配列又は前記配列番号45に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号50の配列又は前記配列番号50に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104C12)。
【０２７９】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号46の配列又は前記配列番号46に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号51の配列又は前記配列番号51に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体114D11)。
【０２８０】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖可変領域が、配列番号47の配列又は前記配列番号47に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖可変領域が、配列番号52の配列又は前記配列番号52に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示される抗体である(抗体104E10)。
【０２８１】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号55の配列又は前記配列番号55に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号60の配列又は前記配列番号60に対して少なくとも80%の同一性を示す配列より示される抗体である(抗体122A2)。
【０２８２】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号56の配列又は前記配列番号56に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号61の配列又は前記配列番号61に対して少なくとも80%の同一性を示す配列より示される抗体である(抗体102E9)。
【０２８３】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号57の配列又は前記配列番号57に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号62の配列又は前記配列番号62に対して少なくとも80%の同一性を示す配列より示される抗体である(抗体104C12)。
【０２８４】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号58の配列又は前記配列番号58に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号63の配列又は前記配列番号63に対して少なくとも80%の同一性を示す配列より示される抗体である(抗体114D11)。
【０２８５】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、それらの機能性の断片若しくは誘導体であり、重鎖が、配列番号59の配列又は前記配列番号59に対して少なくとも80%の同一性を示す配列により示され、軽鎖が、配列番号64の配列又は前記配列番号64に対して少なくとも80%の同一性を示す配列より示される抗体である(抗体104E10)。
【０２８６】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤と組み合わせて使用される、CD303タンパク質に対する抗体又はその断片は、
-  放射性同位元素、特に、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32から選択される放射性同位元素、
-  非放射性金属、
-  毒素、特に、リシン、アブリン、ジフテリア毒素から選択される毒素、
-  核酸、特に、アンチセンスRNAから選択される核酸、
-  酵素、特に、リボヌクレアーゼ、ビオチン、アビジン又はストレプトアビジンから選択される酵素、
-  細胞傷害剤、特に、
-  葉酸代謝拮抗剤、より特定すると、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド;
-  抗プリン物質、より特定すると、クラドリビン、フルダラビン、アザチオプリン、メルカプトプリン、5-フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、
-  トポイソメラーゼI及びIIの阻害剤、
-  アルキル化剤及び関連の薬剤、より特定すると、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、カルムスチン、ホテムスチン、マイトマイシンC、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、
-  インターカレート剤、
-  アントラサイクリン、より特定すると、ダウノルビシン、ドキソルビシン及び塩酸塩、エピルビシン、イダルビシン、ブレオマイシンから選択されるアントラサイクリン、
-  タキサン、
-  チロシンキナーゼの特定の阻害剤、より特定すると、イマチニブ、エルロチニブ
のうちから選択される細胞傷害剤
のうちから選択される生理活性分子とコンジュゲートしている。
【０２８７】
本発明の特定の一態様では、前記抗がん剤と前記抗体又は前記断片との上記の使用は、同時であり、別個であり、又は時間を経てずらして行われる。
【０２８８】
本発明の特定の一態様では、前記抗体又は前記断片の上記の使用は、前記抗CD123抗体及び前記TLRアゴニストの使用と同時である。
【０２８９】
本発明の特定の一態様では、前記抗体又は前記断片の上記の使用は、前記抗CD123抗体及び前記TLRアゴニストの使用に対して順次である。そのような事例では、前記抗CD123抗体の使用は、前記TLRアゴニストの使用に対して順次、同時又は前であり得る。
【０２９０】
本発明の特定の一態様では、前記抗体又は前記断片の上記の使用は、前記抗CD123抗体及び前記TLRアゴニストの使用の前である。そのような事例では、前記抗CD123抗体の使用は、前記TLRアゴニストの使用に対して順次、同時又は前であり得る。
【０２９１】
本発明の特定の一態様では、上記の使用のための前記抗がん剤は、放射線療法と組み合わせて使用される。
【０２９２】
以下の実施例及び図により、本発明がより良好に例証されるであろう。ここでは、下記の実施例により、本発明の目的を明らかにすること、及び好都合な実施形態を例証することを目指すのであって、いかなる場合であっても、本発明の範囲を制限する意図はない。
【図面の簡単な説明】
【０２９３】
【図１Ａ】キメラ抗体122A2についての、発現ベクターのマップである。
【図１Ｂ】キメラ抗体102E9についての、発現ベクターのマップである。
【図１Ｃ】キメラ抗体104C12についての、発現ベクターのマップである。
【図１Ｄ】キメラ抗体114D11についての、発現ベクターのマップである。
【図１Ｅ】キメラ抗体104E10についての、発現ベクターのマップである。
【図２Ａ】本発明に従う抗体の抗原結合性を示すグラフである。本発明に従う抗体により、抗体の異なる濃度(対数単位で示す)で標識されたFcガンマ鎖-CD303ジャーカット細胞の平均蛍光強度(MFI)を示す。
【図２Ｂ】本発明に従う抗体の抗原結合性を示すグラフである。本発明に従うキメラ抗体により、抗体の異なる濃度(対数単位で示す)で標識されたCAL-1細胞(BPDCN患者から確立された細胞系)の平均蛍光強度(MFI)を示す。
【図３】FcγRIIIa(CD16A)結合性を示すグラフである。本発明に従う抗体のCD16結合性を、フィコエリトリンにカップリングさせたマウス抗CD16抗体3G8を使用する競合実験において研究した。CD16に対する、抗CD16である3G8の結合性(平均蛍光強度の値)を、添加する本発明に従う抗体の漸増濃度(μg/mL)の関数として測定した。
【図４】Fcガンマ鎖-CD303ジャーカット細胞に関して、本発明に従う抗体が誘発したADCC活性を示すグラフである。本発明に従うキメラ抗体が誘発した、Fcガンマ鎖-CD303ジャーカット標的細胞の、ADCCによる溶解のパーセント(実施例2の定義に従う%溶解)を、抗体の濃度(ng/mL、対数目盛り)の関数として示す。
【図５】5人のドナーに関する全血試験における、抗体122A2が誘発した、NF-3C8細胞の枯渇を示すグラフである。横座標は、実施した6つの試験、すなわち、BPDCN(芽球性形質細胞様樹状細胞新生物)を有する患者の血液を模倣するために、NF-3C8細胞が添加してある5人の健常ドナーの全血に対して、対照の抗体を用いて実施した試験、及び抗体122A2を用いて実施した5つの試験を示す。縦座標は、NF-3C8細胞の枯渇のパーセントを示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０２９４】
(実施例1)
5つのキメラ抗体の調製及び構造
IgG1型のマウス可変領域及びヒト定常領域を有するキメラのモノクローナル抗体5つを生成し、それらの構造を特徴付けた。
【０２９５】
材料及び方法
マウスハイブリドーマから得られた重鎖及び軽鎖の配列決定
各ハイブリドーマから得られた全RNAを、Macherey-Nagel社製の(カラム精製の)NucleoSpin RNA IIキットを使用して抽出した。
【０２９６】
mRNAを、cDNAに変換し、抗体の重鎖及び軽鎖を、GeneRacerキット(Invitrogen社)を使用して増幅し、M13ベクター中にクローニングした。次いで、M13ベクターにより、細菌を形質転換し、M13の配列に陽性のクローンについて配列決定を行った。
【０２９７】
重鎖のVH、DH、JHセグメント並びに軽鎖のVL及びJLセグメントの決定
重鎖及び軽鎖が使用する可変部であるV及びJセグメント、並びに重鎖及び軽鎖のCDRの配列を、以下のアドレス:http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgiにおいて入手可能な、IMGTのDomain Gap Alignツール(Ehrenmannら、2010年及びEhrenmannら、2011年を参照されたい)を使用することによって決定した。
【０２９８】
キメラ抗体のための発現ベクターの構築
5つのマウス抗体の、可変領域であるVH及びVLの配列を、種ラット(Rattus norvegicus)に由来する、コドンの優先的な使用について最適化した。更に、異種のシグナルペプチドMB7をコードする配列も、各抗体の、可変領域であるVH又はVLをコードする配列の5'末端に導入した。
【０２９９】
ヒト定常部の配列を、ヒト抗アカゲザルD抗体(T125)を発現させるための発現ベクターCHK622-21から、H鎖(IgG1m1.17)についてはApaI/AscIを用い、カッパ鎖についてはDraIII/XbaIを用いて消化することによって抽出した。
【０３００】
最後に、同じ所与の鎖の可変部及び定常部を、一般的なHKgenEFssベクターKAPA T4 DNAリガーゼを用いるライゲーションにより同時に導入した。
【０３０１】
結果
5つの抗体の重鎖のVH、DH、JHセグメント並びに軽鎖のVL及びJLセグメントに関するデータを、上記のTable 2(表2)に示す。
-  ファミリー1の抗体(122A2及び104C12)2つは、同じVHセグメント(IGHV1S137*01)の使用、並びに同じファミリーのVLセグメント(IGKV10-96*01/IGKV10-96*02)及びJLセグメント(IGKJ1*01/IGKJ1*02)の使用を共有し、このことを、下記のTable 12(表12)に示し、したがって、これら2つの抗体は、類似の構造を有し、
-  ファミリー2の抗体(102E9、114D11及び104E10)3つは、同じVH、JH、VL及びJLセグメントの使用を共有し、このことを、下記のTable 12(表12)に示し、したがって、これら3つの抗体は、類似の構造を有する
ことが認められる。
【０３０２】
【表１２】
2019502690.tif 000024
【０３０３】
更に、5つの抗体のCDR及び可変領域のアミノ酸配列に関するデータも、上記のTable 3(表3)に示す。
-  ファミリー1の抗体(122A2及び104C12)2つは、同じCDR1-H配列及びCDR2-L配列を有し、更に、極めて類似するCDR2-H配列、CDR1-L配列及びCDR3-L配列も有し(差は、1又は2つのアミノ酸に過ぎない)、CDR3-H配列でさえ、高い相同性を有し(11個のアミノ酸中5つが共通する)、このことを、下記のTable 13(表13)に示し、その点により、これら2つの抗体は、非常に類似する構造を有することが確認され、
-  ファミリー2の抗体(102E9、114D11及び104E10)3つは、同じCDR2-L配列を有し、更に、極めて類似するCDR1-H配列、CDR2-H配列、CDR1-L配列及びCDR3-L配列も有し(差は、1つのアミノ酸に過ぎない)、CDR3-H配列でさえ、高い相同性を有し(14個のアミノ酸のうち12個が共通する)、このことを、下記のTable 13(表13)に示し、その点により、これら3つの抗体は、真に極めて類似する構造を有することが確認される
ことが認められる。
【０３０４】
【表１３】
2019502690.tif 000025
【０３０５】
5つの抗体の定常領域のアミノ酸配列に関するデータを、上記に示したTable 5(表5)に示す。
【０３０６】
更に、各抗体の可変領域であるVH及びVLの核酸配列、並びに定常領域の核酸配列も、上記のTable 8(表8)及びTable 9(表9)に示す。最後に、5つの抗体についての発現ベクターのマップを、図1A〜図1Eに示す。
【０３０７】
結論
IgG1型のマウス可変領域及びヒト定常領域を有し、CD303抗原に対して作られているキメラのモノクローナル抗体5つを生成し、それらの構造を特徴付けた。2つの抗体(122A2及び104C12)は、類似の構造を有し、抗体のサブファミリー(ファミリー1)を形成し、また、その他の3つの抗体(102E9、114D11及び104E10)も、構造上非常に類似し、別の抗体のサブファミリー(ファミリー2)を形成することが判明している。
【０３０８】
次いで、これらの抗体を、それらの生物学的特性に関して特徴付けた(実施例2を参照されたい)。
【０３０９】
(実施例2)
5つのキメラ抗体の生物学的特性
実施例1で生成した、IgG1型のマウス可変領域及びヒト定常領域を有し、CD303抗原に対して作られているキメラのモノクローナル抗体5つを、多様な生物学的特性について試験した。
【０３１０】
材料及び方法
抗原結合性
CD303+細胞(Fcガンマ鎖-CD303ジャーカット及びCAL-1)に対する結合性
Fcガンマ鎖-CD303ジャーカット細胞(又はCAL-1細胞:Maeda Tら、Int J Hematol.、2005年2月、81(2):148〜54頁)、及び抗体を、希釈液(PBS+1%のFCS)中で調製する。
【０３１１】
1×105個の細胞を、多様な濃度(最終濃度、0〜40μg/mL)の100μLの抗体(抗CD303又は陰性対照)と共に4℃で30分間インキュベートする。
【０３１２】
抗体を、希釈液を用いて洗浄した後に、フィコエリトリン(PE)にカップリングさせたヤギ抗マウスIgG F(ab')2断片を(1:100で希釈した100μLの希釈液として)4℃で45分間かけて添加することによって可視化する。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー(FC500、Beckman Coulter社)により分析する。
【０３１３】
FcγRIIIa(CD16a)結合性
NK細胞を、抹消血単核球(PBMC)から単離し、次いで、種々の濃度(0〜100μg/mL)の試験する抗体と共にインキュベートし、これを、10μL/試験の、フィコエリトリンにカップリングさせたマウス抗体(3G8-PE、Beckman Coulter社)と共に同時にインキュベートした。
【０３１４】
洗浄の後に、NK細胞が発現するCD16に対する3G8-PEの結合性を、フローサイトメトリーにより評価した。平均蛍光強度(MFI)の値を、パーセントとして、すなわち、100%を3G8-PE抗体を単独で用いて得られる値として、0%を3G8-PEの非存在下で得られる値として表現する。
【０３１５】
IC50値(3G8結合の50%阻害を誘発するのに必要な抗CD303抗体の濃度)を、PRISMソフトウエアを使用して計算する。
【０３１６】
ADCC
Fcガンマ鎖-CD303ジャーカット細胞(35,000個の細胞/ウエル)を、96ウエル平底プレート中で、NK細胞及び漸増濃度の抗CD303抗体と共に37℃で4時間インキュベートする。インキュベーションの後に、上清を収集する。溶解した標的細胞が上清中に放出した、細胞内の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)酵素を定量化する(Cytotoxicity Detectionキット(LDH)、Roche Diagnostics社)ことによって、抗CD303抗体が誘発した標的細胞の溶解を発色により測定する。
【０３１７】
溶解のパーセントを、以下の式、すなわち、
%溶解=[(ER-SR)/(100-SR)]-[(NC-SR)/(100-SR)]
(式中、ER及びSRはそれぞれ、LDHの実験による放出(ER)及び自発的放出(SR)を示し、NCは、NK細胞の自然の細胞傷害性を示す)
に従って計算する。
【０３１８】
結果(%溶解)を、抗体の希釈係数の関数として表現する。それぞれの抗体について、「50%活性」値は、この抗体について得られたプラトー値の50%を誘発するのに必要な、抗体の希釈係数に対応する。この値を、PRISMソフトウエアを用いて計算した。
【０３１９】
結果
抗原結合性
Fcガンマ鎖-CD303ジャーカット細胞に対する結合性
本発明に従う抗体の、Fcガンマ鎖-CD303ジャーカット細胞上のそれらのCD303抗原に対する結合性についての試験結果を、図2A及び下記のTable 14(表14)に示す。
【０３２０】
【表１４】
2019502690.tif 000026
【０３２１】
用量-応答のモデル化の後に計算した、これらの相対的なKdの結果及びB最大の値により、抗体を2つの群、すなわち、同等である104C12(B最大:MFI=27.7;Kd=0.17μg/mL)及び122A2(B最大:MFI=26.2;Kd=0.13μg/mL)の抗体を含有する第1の群、並びに114D11(B最大:MFI=24.7;Kd=3.9μg/mL)、104E10(B最大:MFI=23.7;Kd=6μg/mL)及び102E9(B最大:MFI=24.9;Kd=3.8μg/mL)の抗体を含有する第2の群に分類することが可能になり、第1の群の抗体は、第2の群の抗体よりも高い相対親和性を示す。
【０３２２】
これらの結果は、生成したキメラ抗体は全て、ジャーカット細胞の表面上に発現する、これらの抗体が特異性を示すCD303抗原に効率的に結合することを示している。
【０３２３】
CAL-1細胞に対する結合性
本発明に従う抗体の、CAL-1細胞上のそれらのCD303抗原に対する結合性についての試験結果を、図2B及び下記のTable 15(表15)に示す。
【０３２４】
【表１５】
2019502690.tif 000027
【０３２５】
用量-応答のモデル化の後に計算した、これらの相対的なKdの結果及びB最大の値により、抗体を2つの群、すなわち、同等である104C12(B最大: MFI=29.02 Kd=0.34μg/mL)及び122A2(B最大:MFI=25.2 Kd=0.20μg/mL)の抗体を含有する第1の群、並びに114D11(B最大:MFI=30.1;Kd=1.7μg/mL)、104E10(B最大:MFI=29.2;Kd=1.93μg/mL)及び102E9(B最大:MFI=30.47;Kd=1.81μg/mL)の抗体を含有する第2の群に分類することが可能になり、第1の群の抗体は、第2の群の抗体よりも高い相対親和性を示す。
【０３２６】
これらの結果は、ジャーカット-CD303細胞に対する結合性についての結果と顕著に相関する。
【０３２７】
FcγRIIIa(CD16a)結合性
FcγRIIIa(CD16a)に対する結合性についての試験結果を、図3に示し、これらの結果は、本発明に従うキメラ抗体は全て、最適化された結合親和性でCD16aに効率的に結合することが可能であることを示している。それらは、18.08〜45.02μg/mLの範囲であり、18μg/mL未満でさえあるIC50値を有し、この値は、CHO細胞中で生成された抗体(Rituxan)のIC50値を下回り、このことを、下記のTable 16(表16)に示す。
【０３２８】
【表１６】
2019502690.tif 000028
【０３２９】
ADCC
ADCCの試験結果を、図4及び下記のTable 17(表17)に示す。
【０３３０】
【表１７】
2019502690.tif 000029
【０３３１】
これらの結果は、5つの抗CD303キメラ抗体が、ジャーカット-CD303細胞の溶解を(約40%のE最大で)誘発することを示している。104C12(EC50:0.21ng/mL)、122A2(EC50:0.16ng/mL)、114D11(EC50:3.6ng/mL)、102C9(EC50:3.4ng/mL)及び104E10(EC50:8.3ng/mL)についてのEC50値から、高い親和性を有する抗体は、より低い親和性を有する抗体よりも、ADCCに関して有効であることが示唆される。
【０３３２】
(実施例3)
全血中の細胞の枯渇についての試験
NF-3C8細胞を枯渇させる、(実施例1で示した)抗体122A2の能力を、全血中で試験した。
【０３３３】
材料及び方法
NF-3C8細胞は、BPDCN(芽球性形質細胞様樹状細胞新生物)を有する患者に由来する細胞である。これらの細胞を、Maeda Tら(Int J Hematol.、2005年2月、81(2):148〜54頁)の記載に従って、FcεRIのガンマ鎖を生来発現する開始細胞系CAL-1から生成した。CD303によるこの系のトランスフェクションの後に、3C8系を、それらの表面上の40,000個及び50,000個のCD303抗原の安定な発現について選択した。
【０３３４】
全血試験
ex vivoにおける条件下でBPDCN患者の血液を模倣するために、1μg/mLの抗体122A2(「Ch122A2mAb」)又は対照の抗体(「対照」)を有する無菌の試験管中の、健常ドナーに由来する100μLの全血に、(抗凝固薬:ヘパリンリチウムの存在下で)500個のNF-3C8細胞/μLを添加し、次いで、37℃で一晩インキュベートした。
【０３３５】
抗原の特異性及び認識
一晩にわたるインキュベーションの後に、CD3-FITC(抗CD3抗体、例として、項目参照番号:A07746、Beckman Coulter社製)、CD123PE(抗CD123抗体、例として、項目参照番号:130-090-899、Miltenyi Biotec社製)、CD56-PC5(抗CD56抗体、例として、項目参照番号:A07789、Beckman Coulter社製)を用いて、細胞を、試験管中で直接染色し、4℃で20分間インキュベートした。赤血球を除去するために、Q-PREP Workstation and IMMUNOPREP Reagent System(Beckman Coulter社)を用いて、試験管を処理した。続いて、フローサイトメトリー(FC500、Beckman Coulter社)により、細胞を研究した。
【０３３６】
フローサイトメトリーを使用することによって、NF-3C8細胞の枯渇を、参照細胞として使用するCD3+細胞のパーセントと比較するCD123+CD56+細胞のパーセントに基づいて定量化した。
【０３３７】
結果を、NF-3C8細胞の枯渇のパーセントとして示す。対照の抗体は、0%の枯渇に対応する。
【０３３８】
枯渇のパーセントを、
-  第1のステップ:NF-3C8対CD3の%:
X=(NF-3C8 CD56+CD123+の数)/(CD3+細胞の数)*100
-  第2のステップ:枯渇の%:
100-(「Ch122A2 mAb」のX/「対照」のX)*100
に従って計算した。
【０３３９】
結果
全血試験の結果を、図5及び下記のTable 18(表18)に示す。
【０３４０】
【表１８】
2019502690.tif 000030
【０３４１】
これらの結果は、抗体「Ch.122A2mAb」は、37℃における16時間のインキュベーションの後に、5人の健常ドナーから得られた血液試料中で、NF-3C8細胞の枯渇を相互に独立して誘発することを示している。対照的に、対照の抗体は、枯渇を誘発しない。
【０３４２】
したがって、これらの結果は、抗体122A2は、NF-3C8細胞の枯渇を誘発することが可能であることを示している。
【０３４３】
(実施例4)
腫瘍抗原に対する抗体がもたらす、ADCC活性及び貪食作用に対するpDCの排除の影響
研究の原理
pDC(形質細胞様樹状細胞)は、調節性T細胞の、とりわけ、ICOS/ICOSL相互作用による分化に関与する。こうして分化した調節性T細胞は、免疫系のその他の細胞、特に、NK細胞の機能に対して、免疫抑制の機構を発揮し、これは、細胞と細胞との接触を介して生じるが、また、免疫調節性サイトカイン、例として、IL-10、IL-35及びTGF-βの分泌を介しても生じる。
【０３４４】
したがって、カスケード作用によって、pDCの活性化が関与する腫瘍に対して特異性を示す抗がん剤の活性に対するpDCの排除の影響をin situで研究することが可能になる。特に、pDCを標的にする抗CD303抗体の保護効果を、腫瘍環境におけるサイトカインIL-10及びTGF-βの低下又は排除と、腫瘍に対して特異性を示す、投与される抗がん剤(例えば、抗固形腫瘍抗原抗体)のエフェクター機能に対するその影響との相関研究により実証することができる。実のところ、このモデルによれば、pDCを枯渇させる抗CD303抗体により、調節性T細胞の免疫抑制作用が制限され、それにより、それらのT細胞からのIL-10及びTGF-βの分泌が制限される。IL-10及びTGF-βの分泌がこのように制限されることは、NK細胞のADCCの改善と相関し、したがって、このことにより、抗腫瘍抗原抗体、例えば、抗固形腫瘍抗原抗体の抗がん作用に対する抗CD303抗体の間接的な賦活効果の妥当性が確認される。
【０３４５】
1.抗腫瘍抗原抗体のADCC活性に対するIL-10及びTGF-βの作用
一方では、pDCの活性化が関与する腫瘍に関して、又は他方では、pDCを排除することによって、ADCCを試験するために、エフェクターNK細胞及び漸増濃度の腫瘍抗原特異的抗体を有する96ウエル平底プレート中で、腫瘍抗原提示細胞(35,000個の細胞/ウエル)を、IL-10(5及び50ng/mL)、TGF-β(5及び50ng/mL)、又はIL-10+TGF-β(サイトカインのそれぞれについて、5及び50ng/mL)の存在下又は非存在下において37℃で16時間インキュベートする。インキュベーションの後に、上清を収集する。
【０３４６】
溶解した標的細胞が上清中に放出した、細胞内の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)酵素を定量化する(Cytotoxicity Detectionキット(LDH)、Roche Diagnostics社)ことによって、抗がん抗体が誘発した標的細胞の溶解を発色により測定する。
【０３４７】
溶解のパーセントを、以下の式、すなわち、
%溶解=[(ER-SR)/(100-SR)]-[(NC-SR)/(100-SR)]
(式中、ER及びSRはそれぞれ、LDHの実験による放出(ER)及び自発的放出(SR)を示し、NCは、NK細胞の自然の細胞傷害性を示す)
に従って計算する。
【０３４８】
結果(%溶解)を、抗体の希釈係数の関数として表現する。それぞれの抗体について、「50%活性」値は、この抗体について得られたプラトー値の50%を誘発するのに必要な、抗体の希釈係数に対応する。この値は、PRISMソフトウエアを用いて計算することができる。
【０３４９】
結論
カスケード作用によれば、サイトカインIL-10及び/又はTGF-βの非存在下で観察可能な溶解のパーセントと、これらの同じサイトカインの存在下で観察可能な溶解のパーセントとを比較すると、腫瘍部位において存在するpDCの枯渇の影響を評価することが可能になる。したがって、抗CD303抗体は、抗がん抗体の作用の間接的な強化を可能にすることを実証することができる。
【０３５０】
2.抗腫瘍抗原抗体が誘発する貪食作用に対するIL-10及びTGF-βの作用
RPMI1640+10%のFBS(ウシ胎仔血清)+50ng/mLのM-CSF中で、単核球を、CD16+マクロファージ(M2様)に2日間にわたり48時間かけて分化させる。
【０３５１】
腫瘍抗原を発現する細胞、及びマクロファージをそれぞれ、PKH-67(緑色蛍光)及びPKH-26(赤色蛍光)を用いて標識する。
【０３５２】
腫瘍抗原を発現する細胞を、この抗原に対して特異性を示す10μg/mLの抗体又は無関係な抗体を用いてオプソニン化し、次いで、マクロファージと共に(1,105個の各細胞/ウエル)、異なる濃度のIL-10(5及び50ng/mL)単独、TGF-β(5及び50ng/mL)単独、及びIL-10+TGF-β(5及び50ng/mL)の非存在下又は存在下でインキュベートする。
【０３５３】
37℃における3時間インキュベーションの後に、細胞を、計数チャンバー(Malassez式)上に置き、蛍光顕微鏡を用いて観察する。
【０３５４】
腫瘍細胞を含有するマクロファージの数(少なくとも100個のマクロファージ)を計数することによって、貪食作用のパーセントを評価する。
【０３５５】
結論
カスケード作用によれば、サイトカインIL-10及び/又はTGF-βの非存在下で観察可能な貪食作用のパーセントと、これらの同じサイトカインの存在下で観察可能な貪食作用のパーセントとを比較すると、腫瘍部位において存在するpDCの枯渇の影響を評価することが可能になる。したがって、抗CD303抗体は、抗がん抗体の作用の間接的な強化を可能にすることを実証することができる。
【０３５６】
(実施例5)
調節性T細胞(Treg)の活性化に対する抗CD303抗体の作用
1.PBMC中でのTreg細胞の表現型及び拡大増殖に対する抗CD303の役割
単核球(PBMC)を、抗凝血剤上に収集した血液のチューブから単離する。Treg細胞を、3つのマーカー、すなわち、CD4、CD25及びFox P3に基づくフローサイトメトリーによって同定し、表現型により特徴付ける。
【０３５７】
多様な異なる量(1ng〜10μg/mL)の抗CD303抗体を、IL-2(500U/ml)の存在下で、PBMCに添加する。Tregの数及びその表現型を、経時的に(1〜4日かけて)モニターする。
【０３５８】
同じ条件下で、T細胞の増殖を賦活するために抗CD3/抗CD28を用いてコートしたビーズを添加して、4:1の比のTreg/ビーズを得る、これは、Tregの活性化を調べ、確認するためである。
【０３５９】
結論
したがって、抗CD303抗体は、pDCの非存在下では、調節性T細胞の拡大増殖及び免疫抑制性の表現型に対して直接的な影響をもたらさないことを実証することができる。
【０３６０】
2.pDCの存在下における、精製したTreg細胞の表現型及び拡大増殖に対する抗CD303の役割
PBMCから、Treg細胞(CD4+、CD25+)を、二段階、すなわち、CD4陰性細胞(マーカーCD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ及びCD235aについて陽性の細胞)の枯渇、及びそれに続く、CD25+細胞の陽性選択を行う方法を使用することによって精製した。
【０３６１】
精製したpDC、又はpDC系、例えば、Maeda Tら、Int J Hematol.、2005年2月;81(2):148〜54頁に記載されている方法に従って得たもの(例として、CAL-1系又はNF-3C8系)を添加して、Treg/pDCの100、10及び1の比を得る。多様な異なる量(1ng〜10μg/mL)の抗CD303抗体を、IL-2(500U/ml)の存在下で、Treg/pDCの混合物に添加する。Tregの数及びその表現型を、経時的に(1〜4日かけて)モニターする。
【０３６２】
同じ条件下で、T細胞の増殖を賦活するために抗CD3/抗CD28を用いてコートしたビーズを添加して、4:1の比のTreg/ビーズを得る、これは、Tregの活性化を調べ、確認するためである。
【０３６３】
Tregに対して直接もたらされる抗CD303の(中性であることが予測される)影響を確認するように、pDCの非存在下の陰性対照を確立する。
【０３６４】
結論
抗CD303抗体の投与の後に、精製したTreg細胞のpDCの存在下における拡大増殖及び分化を数日にわたり観察することによって、抗CD303の投与が、pDCの免疫抑制性の特性の低下又は抑制/排除において有効であることを示すための手段を提供することができる。
【０３６５】
(実施例6)
固形がんの治療における、in vivoでの抗CD303抗体を介するヒトpDCの枯渇
1.ヒトの病的な状況の再現性のある研究モデルの生成
固形がんを処置する療法における抗CD303抗体の作用を研究するために、「ヒト化腫瘍マウスモデル」(HTM)使用することができる。このモデルの特徴は、成熟したヒト免疫系の発生、及びヒト造血幹細胞と共にあらかじめ同時移植してあるヒト固形がん細胞の成長である。
【０３６６】
好都合なことに、このモデルにより、in vivoにおける条件の再現性と関連のあるいくつかの要素、すなわち、表面上に標的のCD303を単独で発現するヒトpDCの存在、ヒトTreg細胞の浸潤の存在、抗腫瘍抗体及び免疫適格性マウス宿主(ADCC活性のためのNK型エフェクター細胞)が標的にする分子である標的の腫瘍抗原を表面に発現するヒト腫瘍細胞の存在を一緒にもたらすことが可能になる。
【０３６７】
手短に述べると、NOD-scid IL2Rγ欠損マウス(NSG)を、例えば、Laboratoires Jackson社から得、病原体を含有しない、特化した建物中で飼育することができる。固形腫瘍抗原を特異的に発現し、バイオルミネセンスによるモニタリングのためのルシフェラーゼを発現する3×106個の腫瘍細胞の存在下にある新生仔に、生後の最初の48時間の間に、(1Gyで)照射し、その3時間後に、臍帯血(CB)から単離した2.5×105個のヒトCD34+細胞を肝臓内注射により移植する。
【０３６８】
2.抗CD303抗体の活性を試験するために使用することができる方法
腫瘍がバイオルミネセンス(IVIS)により目に見えるようになった際に、HTMマウスの治療を、20mg/kgの抗腫瘍抗原抗体を用いて腹腔経路から毎週行い、抗CD303抗体を30mg/kgの用量で静脈内から3日に1回行う。
【０３６９】
治療の有効性のモニタリングを、バイオルミネセンスを利用して実施し、腫瘍が存在しない状態の動物の生存及び生存率をモニターする。研究の過程の間、血液試料を採取して、この腫瘍に関する、pDCの枯渇に対する抗CD303抗体の有効性を確保する。
【０３７０】
したがって、試験する異なる条件は、好都合には、以下の条件、すなわち、
1.HTM+抗腫瘍抗原
2.HTM+抗CD303
3.HTM+抗腫瘍抗原+抗CD303
4.HTM+対照のアイソタイプ
である(1群当たり10匹の動物)。
【０３７１】
結論
好都合なことに、マウスモデルHTMを使用して、抗固形腫瘍剤、すなわち、抗腫瘍抗原抗体の効果に対する、抗CD303抗体の投与の間接的な作用を、in vivoにおける生理的な状況を再現する条件下で、特に、上記の条件3の下で得られた結果を、一方では、条件1の下で得られた結果と、他方では、条件2の下で得られた結果と比較することによって評価することができる。
【０３７２】
したがって、このモデルは有用であり、その理由は、利益、好都合には、固形腫瘍において、抗CD303抗体を、抗腫瘍抗原抗体の投与と組み合わせて投与することの相乗効果を評価することが可能になるからである。
【図１Ａｅｔ１Ｂ】
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【図１Ｃｅｔ１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａｅｔ２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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