(57)【要約】  エンドセリン−１を結合し、非機能的複合体を形成することができる融合ポリペプチド（該融合ポリペプチドのアミノ酸配列を含む）が提供される。該融合ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結され、エンドセリン−１アンタゴニスト（エンドセリン−１スポンジ）として機能する二量体を形成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が配列番号１のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項３】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が配列番号２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項３に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項５】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が配列番号３のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項７】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が配列番号４のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項９】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が配列番号５のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項１１】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が配列番号６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項１３】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が請求項１に記載の１以上のＥＴＡ受容体リガンド結合ドメインを含む、ポリペプチド。
【請求項１４】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が配列番号７のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項１６】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が配列番号８のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項１８】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が配列番号９のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項２０】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が請求項１６に記載の１以上のＥＴＢ受容体リガンド結合ドメインを含む、ポリペプチド。
【請求項２１】
エンドセリン−１を結合し、請求項１、３、５、７、９、１１、１４、１６又は１８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドの多量体を含む非機能性複合体を形成することができる組成物。
【請求項２２】
前記多量体が二量体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項２、４、６、８、１０、１２、１５、１７又は１９のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２４】
発現制御配列に作動可能に連結した、請求項２、４、６、８、１０、１２、１５、１７又は１９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の説明
背景：
エンドセリン-1は、多様な範囲の細胞によって合成及び分泌される血管作用性のペプチドであり、それゆえ多種多様な標的組織のシグナル伝達イベントに関連する(Nelsonら、2003)。エンドセリン-1は、生理機能において重要な役割を果たす。しかし、高いレベルでは、エンドセリン-1が病理を誘発し、そうであるから宿主における、神経変性障害、心血管疾患、並びに子癇前症のような妊娠における障害を含む、様々な疾患に関係している(Jain、2013、Jainら、2012)。これらの疾患の重要な特徴が上昇したエンドセリン-1（endotheiin-1）レベルであるとすれば、治療的介入の1つの戦略案は、上昇したレベルのエンドセリン-1を標的にすることである。この目的のために、エンドセリン-1（endotheiin-1）を結合し、非機能性複合体を形成することができる融合ポリペプチドが、エンドセリン-1アンタゴニストとして役立つ。エンドセリン-1スポンジと呼ばれる、これらのエンドセリン-1アンタゴニストを構築するには、ヒトIgG1のFc部分に、エンドセリン-1受容体（複数可）リガンド結合ドメインを融合する必要がある。
【背景技術】
【０００２】
エンドセリン-1は、Gタンパク質共役受容体スーパーファミリーに属する、2つの非常に相同な細胞表面タンパク質である、エンドセリンA (ETA)及びエンドセリンB(ETB)受容体に結合することによって、効果を発揮する(Karet and Davenport 1994)。2つの受容体は、一次構造において約60%の類似性を有し(Nelsonら、2003)、即ち、両方の受容体は、互いに高いポリペプチド配列の同一性を示す。それにもかかわらず、2つの受容体は、リガンド結合ドメインに基づくリガンドの結合選択性において明確な違いを示す。
【発明の概要】
【０００３】
発明の概要
本発明の目的は、エンドセリン-1が関連する疾患又は病気の治療において有用であるエンドセリン-1アンタゴニストを産生することである。
発明の別の目的は、エンドセリン-1が関連する疾患又は病気の治療用の、開示されたエンドセリン-1アンタゴニストの使用である。例えば、本明細書に記載されたエンドセリン-1アンタゴニストは、子癇前症、心血管疾患又は神経変性障害の治療用に使用し得る。
本発明の別の目的は、それぞれが異なる配列を有するが、いずれもその受容体（複数可）へのエンドセリン-1の結合をブロックすることができ、従ってエンドセリン-1アンタゴニストとして機能する、エンドセリン-1スポンジと呼ばれる、幾つかの特異的なエンドセリン-1アンタゴニストの構築である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図面の説明
【図１】ETA受容体リガンド結合ドメイン。
【図２】ETB受容体リガンド結合ドメイン。
【図３】ETA受容体リガンド結合ドメインに基づくET-1スポンジの設計案。
【図４】ETB受容体リガンド結合ドメインに基づくET-1スポンジの設計案。
【図５】ETA及びETB受容体のリガンド結合ドメインに基づくET-1スポンジの設計案。
【図６−１】図6A）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ECL2、ICL3、ECL3及びC末端を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号1。
【図６−２】図6B）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ECL2、ICL3、ECL3及びC末端を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号1。
【図６−３】図6C）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ECL2、ICL3、ECL3及びC末端を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号1。
【図７−１】図7A）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ECL2、ICL3 (16アミノ酸)、ECL3及びC末端 (8アミノ酸)を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号2。
【図７−２】図7B）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ECL2、ICL3 (16アミノ酸)、ECL3及びC末端 (8アミノ酸)を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号2。
【図７−３】図7C）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ECL2、ICL3 (16アミノ酸)、ECL3及びC末端 (8アミノ酸)を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号2。
【図８−１】図8A）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ECL2、ICL3及びC末端を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号3。
【図８−２】図8B）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ECL2、ICL3及びC末端を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号3。
【図８−３】図8C）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ECL2、ICL3及びC末端を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号3。
【図９−１】図9A）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ECL2、ICL3(16アミノ酸)及びC末端(8アミノ酸)を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号4。
【図９−２】図9B）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ECL2、ICL3(16アミノ酸)及びC末端(8アミノ酸)を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号4。
【図９−３】図9C）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ECL2、ICL3(16アミノ酸)及びC末端(8アミノ酸)を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号4。
【図１０−１】図10A）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ICL3、ECL3及びC末端を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号5。
【図１０−２】図10B）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ICL3、ECL3及びC末端を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号5。
【図１０−３】図10C）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ICL3、ECL3及びC末端を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号5。
【図１１−１】図11A）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ICL3 (16アミノ酸)、ECL3及びC末端(8アミノ酸)を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号6。
【図１１−２】図11B）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ICL3 (16アミノ酸)、ECL3及びC末端(8アミノ酸)を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号6。
【図１１−３】図11C）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ECL1、ICL3 (16アミノ酸)、ECL3及びC末端(8アミノ酸)を含むETA受容体 (ETAR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号6。
【図１２−１】図12A）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ICL1及びC末端を含むETB受容体 (ETBR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号7。
【図１２−２】図12B）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ICL1及びC末端を含むETB受容体 (ETBR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号7。
【図１３−１】図13A）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ICL1、TM2+3及びC末端を含むETB受容体 (ETBR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号8。
【図１３−２】図13B）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ICL1、TM2+3及びC末端を含むETB受容体 (ETBR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号8。
【図１３−３】図13C）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端、ICL1、TM2+3及びC末端を含むETB受容体 (ETBR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号8。
【図１４−１】図14A）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端及びICL1を含むETB受容体 (ETBR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号9。
【図１４−２】図14B）ヒトIgG1のFc部分に融合した、N末端及びICL1を含むETB受容体 (ETBR)リガンド結合ドメインを含む、配列番号9。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
ETA受容体に対するエンドセリン-1の結合：
ETA受容体に対するエンドセリン-1の結合は、ETA受容体N末端ループ、細胞外ループ1 (ECL1)、細胞外ループ2 (ECL2)、細胞内ループ3 (ICL3)、細胞外ループ3 (ECL3)及びC末端ドメインを必要とすると考えられる (Adachiら、1993)。これらのETA受容体リガンド結合ドメインのアミノ酸配列を図1に示す。
【０００６】
ECL1中の5アミノ酸配列 (140 - Lys Leu LeuAla Gly - 144)は、リガンドの結合に必要である最も重要な要素として関連している。更に、ECL2及びECL3の両方（隣接する膜貫通領域を含む）は、リガンド選択において重要な役割を果たすことが見出された。
【０００７】
Orryら (2000)はまた、ET-1が、N末端受容体ドメイン及び2つの異なる細胞外ループの両方と接触するという、ET-1ペプチドとETA受容体との相互作用のモデルを構築した。
【０００８】
更に、7番目の膜貫通領域に近接して位置するC末端の8アミノ酸残基、及び3番目の細胞内ループ内のC末端の16アミノ酸残基は、エンドセリン-1の結合に重要である(Adachiら、1993)。
【０００９】
ETB受容体へのエンドセリン-1の結合：
ETB受容体へのエンドセリン-1の結合は、N末端ドメインのPro93と、ETB受容体の1番目の細胞内ループ内のCys131との間の39アミノ酸を必要とする (Klammtら 2007)。更に、近接する細胞質テール内の12アミノ酸（Ser390〜Leu401）は、活性のある形態で、リガンド結合部位を維持するために必要である(Wadaら、1994)。
【００１０】
更に、膜貫通ドメイン2及び3 (TM2+3)内に位置する60アミノ酸の配列（Ile138〜Ile197）はまた、リガンドの結合に重要であるかも知れないことが示唆されている。これらのETB受容体リガンド結合ドメインのアミノ酸配列を図2に示す。
【００１１】
エンドセリン-1スポンジの構築：
１．エンドセリン-1スポンジは、上述のETA受容体リガンド結合ドメインを融合して、融合ポリペプチドにすることによって、構築し得、それは、その結果、ヒトlgG1のFc部分に融合され得る(図3)。
2．エンドセリン-1スポンジは、上述のETB受容体リガンド結合ドメインを融合して、融合ポリペプチドにすることによって、構築し得、それは、その結果、ヒトlgG1のFc部分に融合され得る(図4)。
3．エンドセリン-1スポンジは、ETA受容体リガンド結合ドメインと直列にしたETB受容体リガンド結合ドメインを融合して、融合ポリペプチドにすることによって、構築し得、それは、その結果、ヒトlgG1のFc部分に融合され得る(図5)。
【００１２】
本発明は、ヒトlgG1のFc部分に融合した、以下：
a) ETA受容体リガンド結合ドメイン
b) ETB受容体リガンド結合ドメイン
を含む、エンドセリン-1を結合し、非機能性複合体を形成することができる、融合ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年6月12日(2016.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が図６Ａ〜Ｃのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項３】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が図７Ａ〜Ｃのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項３に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項５】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が図８Ａ〜Ｃのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項７】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が図９Ａ〜Ｃのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項９】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が図１０Ａ〜Ｃのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項１１】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が図１１Ａ〜Ｃのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項１３】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が請求項１に記載の１以上のＥＴＡ受容体リガンド結合ドメイン又はその部分を含む、ポリペプチド。
【請求項１４】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が図１２Ａ〜Ｂのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項１６】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が図１３Ａ〜Ｃのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項１８】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる、多量体を形成する融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が図１４Ａ〜Ｂのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載の融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項２０】
エンドセリン−１を結合し、非機能性複合体を形成することができる融合ポリペプチドであって、ポリペプチド分子が請求項１６に記載の１以上のＥＴＢ受容体リガンド結合ドメイン又はその部分を含む、ポリペプチド。
【請求項２１】
エンドセリン−１を結合し、請求項１、３、５、７、９、１１、１４、１６又は１８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドの多量体を含む非機能性複合体を形成することができる組成物。
【請求項２２】
前記多量体が二量体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項２、４、６、８、１０、１２、１５、１７又は１９のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２４】
発現制御配列に作動可能に連結した、請求項２、４、６、８、１０、１２、１５、１７又は１９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【国際調査報告】
2019502762.tif 000032
2019502762.tif 000033
2019502762.tif 000034