(57)【要約】  本発明は、少なくとも２つの可溶性融合タンパク質を含む可溶性融合タンパク質複合体を特色とする。例えば、第１の融合タンパク質は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド又はその機能性フラグメントに共有結合された抗ＣＤ−３抗体である。第２の融合タンパク質は、疾患抗原を認識する結合ドメインを含み、このドメインは可溶性インターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα）ポリペプチド又はその機能性フラグメントに共有結合される。第１及び第２の融合タンパク質のうち１つ又はそれらの両方は、免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能性フラグメントをさらに含み、第１の融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインは、第２の融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する。本発明は、本発明の複合体を作製する方法及び使用する方法をさらに提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの可溶性融合タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、
ここで、第１の融合タンパク質が、（ｂ）インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインに共有結合された（ａ）第１の結合ドメインを含み、
第２の融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインに融合された（ｄ）可溶性ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）に共有結合された（ｃ）第２の結合ドメインを含み、
前記第１及び第２の結合ドメインのうち１つが抗ＣＤ３抗体を含み、他の結合ドメインが抗原特異的結合ドメインを含み、前記第１の融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインが第２の融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する、少なくとも２つの可溶性融合タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項２】
前記ＩＬ−１５ポリペプチドが、Ｎ７２Ｄ突然変異を含むＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項３】
前記抗ＣＤ３抗体が、ポリペプチドリンカー配列によって免疫グロブリン重鎖可変ドメインに共有結合された免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項４】
前記第１の融合タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項５】
前記抗原特異的結合ドメインが抗ＣＤ２０抗体を含む、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項６】
前記抗ＣＤ２０抗体が、ポリペプチドリンカー配列によって免疫グロブリン重鎖可変ドメインに共有結合された免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む、請求項５に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項７】
前記第２の融合タンパク質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項８】
請求項１に記載の第２の可溶性融合タンパク質複合体に共有結合された請求項１に記載の第１の可溶性融合タンパク質複合体を含む、可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項９】
前記第１の可溶性融合タンパク質複合体が、前記第１の可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインを前記第２の可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインに連結するジスルフィド結合によって、前記第２の可溶性融合タンパク質複合体に共有結合される、請求項８に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１０】
前記核酸配列が、配列番号１に示される配列を含む、請求項４に記載の前記第１の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１１】
前記核酸配列が、前記融合タンパク質をコードする配列に制御可能に連結されたプロモーター、翻訳開始シグナル、及びリーダー配列をさらに含む、請求項１０に記載の核酸配列。
【請求項１２】
前記核酸配列が配列番号３に示される配列を含む、請求項７に記載の前記第２の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１３】
前記核酸配列が、前記融合タンパク質をコードする配列に制御可能に連結されたプロモーター、翻訳開始シグナル、及びリーダー配列をさらに含む、請求項１２に記載の核酸配列。
【請求項１４】
請求項１１及び／又は請求項１２に記載の前記核酸配列を含む、ＤＮＡベクター。
【請求項１５】
前記抗原特異的結合ドメインが疾患抗原を認識する、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１６】
前記疾患抗原が、新生物、感染症、又は自己免疫疾患と関連する、請求項１５に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１７】
標的細胞を死滅される方法であって、
ａ）複数の細胞を請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させる工程であって、ここで、前記複数の細胞が、請求項１のＩＬ−１５ドメインによって認識される前記ＩＬ−１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）鎖を持つ免疫細胞、請求項１の前記抗ＣＤ３抗体によって認識されるＣＤ３を持つ免疫細胞、又は請求項１に記載の前記Ｆｃドメインによって認識されるＦｃ受容体鎖を持つ免疫細胞、及び請求項１に記載の前記抗原特異的結合ドメインによって認識される抗原を持つ前記標的細胞をさらに含む工程、
ｂ）前記標的細胞上の抗原と、前記免疫細胞上の前記ＩＬ−１５Ｒ、ＣＤ３、又はＦｃ受容体鎖との間に、前記免疫細胞を結合して活性化するのに十分な、特異的結合複合体（ブリッジ）を形成する工程、並びに
ｃ）前記結合活性化免疫細胞によって前記標的細胞を死滅させる工程、
を含む、標的細胞を死滅される方法。
【請求項１８】
前記標的細胞が、腫瘍細胞、感染した細胞、又は自己免疫疾患関連細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗原特異的結合ドメインが抗ＣＤ２０抗体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
被験体において免疫応答を賦活する方法であって、有効量の請求項１〜１６のいずれか一項のいずれか一項に記載の前記可溶性融合タンパク質複合体を前記被験体に投与することを含む、被験体において免疫応答を賦活する方法。
【請求項２１】
被験体において新生物、感染症又は自己免疫疾患を治療する方法であって、請求項１〜１６に記載の前記可溶性融合タンパク質複合体を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする前記被験体に投与して、前記新生物、感染症又は自己免疫疾患を治療することを含む、被験体において新生物、感染症又は自己免疫疾患を治療する方法
【請求項２２】
前記新生物が、膠芽腫、前立腺癌、血液癌、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮癌／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃癌及び食道癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、並びに頭頚部扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記有効量が約１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇの前記融合タンパク質複合体である、請求項２１〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記融合タンパク質複合体が少なくとも１週間に１回投与される、請求項２１〜２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記医薬組成物が、全身、局所、静脈内、皮下、又は腫瘍内に投与される、請求項２１〜２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記融合タンパク質複合体が前記被験体における免疫応答を誘導する、請求項２１〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記融合タンパク質複合体が、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の血清レベルを増加する、請求項２１〜２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記融合タンパク質複合体が、前記新生物、感染症又は自己免疫疾患と関連する細胞に対するＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞応答を賦活する、請求項２１〜２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもと、２０１６年９月２０日付で出願された米国特許仮出願第６２／３９７，２３６号、及び２０１６年５月２７日付で出願された米国特許仮出願第６２／３４２，３１１号の優先権の利益を主張する国際特許出願であり、いずれの出願もそれらの全体を参照することにより本明細書の一部を成す。
【０００２】
本発明は、概して多量体融合分子の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書に記載される発明以前には、非特異的免疫活性と関連する副作用を伴わずに治療利益を提供するため、疾患部位に対する様々なエフェクター分子を標的とするための新たな戦略を開発することが急務であった。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、少なくとも一部は、多重特異性タンパク質がエフェクターＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化し、それらの疾患細胞に対する活性を標的とすることにより、疾患特異的傷害性をもたらすという驚くべき発見に基づく。本発明では、疾患抗原を認識する１つの結合ドメインと、Ｔ細胞上のＣＤ３を認識する第２の結合ドメインとを有する多重特異性タンパク質が提供される。例示的な疾患抗原は、新生物、感染症又は自己免疫疾患と関係する。具体的には、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質及び抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質を含むタンパク質複合体が本明細書に記載される。この複合体は、抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂドメインによりＢ細胞リンパ腫を認識し、ＩＬ−１５活性によりＮＫ細胞及びＴ細胞の応答を誘導し、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂドメインによりＴ細胞応答を活性化し、Ｆｃ結合ドメインにより抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を賦活する。
【０００５】
少なくとも２つの可溶性融合タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体が提供される。例えば、第１の融合タンパク質は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドに共有結合された第１の結合ドメインを含む。第２の融合タンパク質は、疾患抗原を認識する第２の結合ドメインを含み、このドメインは、免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）に共有結合される。第１又は第２の結合ドメインのうち１つは、抗ＣＤ３抗体を含み、別の結合ドメインは抗原特異的結合ドメインを含む。融合タンパク質の例示的な抗原特異的結合ドメインとして、抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。例えば、第２の融合タンパク質は、ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合に共有結合された抗ＣＤ２０抗体を含む。第１の融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインは、第２の融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して、可溶性融合タンパク質複合体を形成する。代替的には、第１の融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）に共有結合された抗ＣＤ３抗体を含むのに対し、第２の融合タンパク質は、共有結合された疾患抗原、及び変異インターロイキン１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドを認識する結合ドメインを含む。幾つかの場合、ＩＬ−１５ポリペプチドは、Ｎ７２Ｄ突然変異（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）を含むＩＬ−１５変異体を含む。
【０００６】
幾つかの場合、抗ＣＤ３抗体は単鎖抗体を含み、ここで、ポリペプチドリンカー配列によって、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが免疫グロブリン重鎖可変ドメインに共有結合される。同様に、幾つかの場合、疾患抗原を認識する結合ドメイン、例えば抗ＣＤ−２０抗体は、ポリペプチドリンカー配列によって免疫グロブリン重鎖可変ドメインに共有結合された免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む単鎖抗体である。
【０００７】
例示的な第１の融合タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。例示的な第２の融合タンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。第１の融合タンパク質をコードする例示的な核酸配列は、配列番号１に示される配列を含む。第２の融合タンパク質をコードする例示的な核酸配列は、配列番号３に示される配列を含む。或る１つの態様では、核酸配列は、融合タンパク質をコードする配列に制御可能に連結された、プロモーター、翻訳開始シグナル、及びリーダー配列をさらに含む。
【０００８】
また、本明細書に記載される核酸配列を含むＤＮＡベクターが提供される。例えば、核酸配列は複製、発現又はそれらの両方に対するベクター中に存在する。
【０００９】
また、第２の可溶性融合タンパク質複合体に共有結合された第１の可溶性融合タンパク質複合体を含む、可溶性融合タンパク質複合体が提供される。例えば、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、多量体化、例えば二量体化、三量体化、或いは多量体化（例えば、四重複合体、五重複合体等）される。例えば、多量体はホモマルチマー又はヘテロマルチマーである。可溶性融合タンパク質複合体は、共有結合、例えばジスルフィド結合、化学架橋剤によって連結される。幾つかの場合、１つの可溶性融合タンパク質は、第１の可溶性融合タンパク質のＦｃドメインを第２の可溶性融合タンパク質のＦｃドメインにつなぐジスルフィド結合によって別の可溶性融合タンパク質に共有結合で連結される。
【００１０】
Ｆｃドメイン又はその機能性フラグメントとして、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン、ＩｇＡ  Ｆｃドメイン、ＩｇＤ  Ｆｃドメイン、ＩｇＥ  Ｆｃドメイン及びＩｇＭ  Ｆｃドメインからなる群から選択されたＦｃドメイン；又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。任意に、Ｆｃドメインは、変更された補体若しくはＦｃ受容体の結合特性、又は変更された二量体化若しくはグルコシル化のプロファイルを有するＦｃドメインをもたらす、アミノ酸変化を含む。アミノ酸変化は、変更された補体若しくはＦｃ受容体の結合語句性、又は変更された二量体化若しくはグルコシル化のプロファイルを有するＦｃドメインを生じるためのアミノ酸変化は、当該技術分野で知られている。例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２の２３４位及び２３５位（抗体コンセンサス配列に基づくナンバリング）におけるロイシン残基（すなわち、…Ｐ  Ｅ  Ｌ  Ｌ  Ｇ  Ｇ…）のアラニン残基（すなわち、…Ｐ  Ｅ  Ａ  Ａ  Ｇ  Ｇ…）による置換は、Ｆｃガンマ受容体結合の喪失をもたらすのに対し、ＩｇＧ１  ＣＨ２の３２２位（抗体コンセンサス配列に基づくナンバリング）におけるリジン残基（すなわち、…Ｋ  Ｃ  Ｋ  Ｓ  Ｌ…）のアラニン残基（すなわち、…Ｋ  Ｃ  Ａ  Ｓ  Ｌ…）による置換は、補体活性化の喪失をもたらす。幾つかの例では、かかる突然変異が併用される。
【００１１】
幾つかの態様では、第１の生物学的に活性なポリペプチドは、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５ポリペプチド（又はその機能性フラグメント）に共有結合される。同様に、第２の生物学的に活性なポリペプチドは、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能性フラグメント）に共有結合される。任意に、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能性フラグメント）は、ポリペプチドリンカー配列によってＦｃドメイン（又はその機能性フラグメント）に共有結合でされる。ポリペプチドリンカー配列はそれぞれ独立して選択され得る。任意に、ポリペプチドリンカー配列は同一である。代替的には、それらは異なる。
【００１２】
任意に、本発明の可溶性融合タンパク質複合体が提供され、ここで、可溶性融合タンパク質の少なくとも１つは検出可能な標識を含む。検出可能な標識として、限定されないが、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素又はその触媒的に活性なフラグメント、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、又は蛍光性、リン光性、若しくは化学発光性の分子、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００１３】
本発明は、本発明の可溶性融合タンパク質複合体を作製する方法を提供する。上記方法は、以下の工程を含む：ａ）第１の融合タンパク質をコードする適切な対照配列を有するＤＮＡベクターを第１の宿主細胞に導入する工程、ｂ）細胞又は培地中に第１の融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で培地において第１の宿主細胞を培養する工程；ｃ）宿主細胞又は培地から第１の融合タンパク質を精製する工程、ｄ）第２の融合タンパク質をコードする適切な対照配列を含むＤＮＡベクターを第２の宿主細胞を導入する工程、ｅ）細胞又は培地中に第２の融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で培地において第２の宿主細胞を培養する工程；及びｆ）宿主細胞又は培地から第２の融合タンパク質を精製する工程、及びｇ）第１の融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２の融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の結合を可能とするのに十分な条件下で第１及び第２の融合タンパク質を混合して、可溶性融合タンパク質複合体の形成させる工程。
【００１４】
幾つかの場合、上記方法は、上記発現ベクターから発現されたポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能とするのに十分な条件下で第１及び第２の融合タンパク質を混合することをさらに含む。
【００１５】
代替的には、本発明の可溶性融合タンパク質複合体を作製する方法は、ａ）第１の融合タンパク質をコードする適切な対象配列を含むＤＮＡベクター、及び第２の融合タンパク質をコードする適切な対照配列を含むＤＮＡベクターを宿主細胞に導入する工程、ｂ）細胞又は培地中に融合タンパク質を発現し、第１の融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２の融合タンパク質のＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の会合を可能として可溶性融合タンパク質複合体を形成させるのに十分な条件下で培地において宿主細胞を培養する工程、及びｃ）可溶性融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製する工程、によって行われる。
【００１６】
或る１つの態様では、上記方法は、発現ベクターから発現されるポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能とするのに十分な条件下で第１及び第２の融合タンパク質を混合することをさらに含む。
【００１７】
また、可溶性融合タンパク質複合体を作製する方法であって、ａ）第１及び第２の融合タンパク質をコードする適切な対照配列を有するＤＮＡベクターを宿主細胞に導入する工程、ｂ）細胞又は培地中に融合タンパク質を発現し、第１の融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２の融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の会合を可能として可溶性融合タンパク質複合体を形成させる、及びポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能とするのに十分な条件下で培地において宿主細胞を培養する工程、ｃ）宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製する工程、を含む方法が提供される。
【００１８】
任意に、上記方法は、発現ベクターから発現されたポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能とするのに十分な条件下で、第１及び第２の融合タンパク質を混合することをさらに含む。
【００１９】
被験体において新生物、感染症、又は自己免疫疾患を治療する方法は、可溶性抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：疾患抗原特異的ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与して、新生物、感染症、又は自己免疫疾患を治療することにより行われ得る。例えば、被験体においてＢ細胞リンパ腫又はＢ細胞媒介自己免疫疾患を治療する方法は、可溶性抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質複合体（２Ｂ８Ｔ３Ｍ）を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与して、リンパ腫又は自己免疫疾患を治療することにより行われる。例示的な抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。例示的な抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。好ましくは、上記融合タンパク質複合体は、被験体において免疫応答を誘導する。
【００２０】
本明細書に記載される治療に適した新生物として、膠芽腫、前立腺癌、血液癌、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎の細胞癌腫、乳癌、胃及び食道癌、膵臓癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、及び卵巣癌、非小細胞肺癌、並びに頭頚部扁平上皮癌が挙げられる。本明細書に記載される方法を使用する治療に対する例示的な感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染症である。また、本明細書に記載される方法は細菌感染症（例えばグラム陽性菌又はグラム陰性菌細菌）を治療するのに有用である（Ｏｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．５２６：１２４−３１）。本明細書に記載される方法を使用する治療に対する例示的な自己免疫疾患は、Ｂ細胞によって媒介される自己免疫疾患である。かかる自己免疫疾患として、関節リウマチ、多発性硬化症、特発性血小板減少症、ＩｇＭ媒介多発性ニューロパチー、第ＶＩＩＩ因子欠損症、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、炎症性筋炎、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎、ＡＮＣＡ関連脈管炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、自己免疫性貧血、赤血球系無形成症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、エバンス症候群、脈管炎（例えば、多発血管炎を伴う肉芽腫症、以前はウェゲナー肉芽腫症）、水疱性皮膚傷害（例えば天疱瘡、類天疱瘡）、Ｉ型糖尿病、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎及びドヴィック病、グレーブス眼症ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ−ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ−１７、自己免疫性膵炎、眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ−ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ−１９、及びＩＧｇ４関連疾患が挙げられる。
【００２１】
上記融合タンパク質複合体を含む医薬組成物は、有効量で投与される。例えば、上記医薬組成物の有効量は、約１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、例えば１μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、８５μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、９５μｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇである。代替的には、ＡＬＴ−８０３は、固定用量又は体表面積（すなわち１ｍ２当たり）に基づいて投与される。
【００２２】
上記融合タンパク質複合体を含む医薬組成物は、少なくとも１ヶ月に１回、例えば、１ヶ月に２回、１週間に１回、１週間に２回、１日に１回、１日に２回、８時間毎、４時間毎、２時間毎、又は毎時間投与される。上記医薬組成物に対する好適な投与様式として、全身投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腫瘍内投与、吸入、及び腹腔内投与が挙げられる。
【００２３】
好ましくは、上記融合タンパク質は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の血清レベルを増加させ、及び／又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞、並びにＮＫ細胞を賦活して、被験体において疾患細胞又は腫瘍細胞を死滅させる。例えば、上記融合タンパク質は、上記新生物、感染症、又は自己免疫疾患と関連する細胞に対するＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞の応答を賦活する。
【００２４】
本発明の可溶性融合タンパク質複合体の特定の態様では、ＩＬ−１５ポリペプチドは、天然ＩＬ−１５ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するＩＬ−１５変異体である。ヒトＩＬ−１５ポリペプチドは、本明細書において、ｈｕＩＬ−１５、ｈＩＬ−１５、ｈｕＩＬ−１５、ｈＩＬ−１５、ＩＬ−１５野生型（ｗｔ）と称され、それらの変異体は本来のアミノ酸、成熟配列におけるその位置、及び変異体アミノ酸を使用して称される。例えば、ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄは、７２位におけるＮのＤへの置換を含むヒトＩＬ−１５を指す。或る１つの態様では、ＩＬ−１５変異体は、例えば天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比較したＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する結合活性の増加によって実証されるように、ＩＬ−１５アゴニストとして機能する。代替的には、ＩＬ−１５変異体は、例えば天然ＩＬ−１５ポリペプチドと比較したＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する結合活性の減少によって実証されるように、ＩＬ−１５アンタゴニストとして機能する。
【００２５】
標的細胞を死滅させる方法は、ａ）複数の細胞と、本発明の可溶性融合タンパク質複合体とを接触させる工程であって、複数の細胞が、抗ＣＤ３抗体によって認識されるＣＤ３を持つ免疫細胞、例えば抗ＣＤ３単鎖抗体、及びＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、又はＦｃドメインによって認識されるＦｃ受容体鎖を持つ免疫細胞、及び抗原特異的ｓｃＡｂ等の結合ドメインによって認識される抗原を持つ標的疾患細胞をさらに含む工程、ｂ）免疫細胞を結合し、活性化させるのに十分な、抗原発現疾患細胞とＣＤ３、ＩＬ−１５Ｒ又はＦｃ受容体発現免疫細胞との間の特異的結合複合体（ブリッジ）を形成する工程、ｃ）結合活性化免疫細胞によって標的疾患細胞を死滅させる工程、によって行われる。例えば、標的疾患細胞は、腫瘍細胞、自己免疫疾患関連細胞、例えば自己免疫Ｂ細胞、又は感染細胞、例えば、ウイルスに感染した細胞である。例えば、抗原特異的結合ドメインは抗ＣＤ−２０抗体を含む。
【００２６】
また、疾患細胞が疾患関連抗原を発現する患者において疾患を予防又は治療する方法であって、ａ）ｓｃＡｂ等の疾患抗原特異的結合ドメインを有する本発明の可溶性融合タンパク質複合体を患者に投与する工程、ｂ）免疫細胞を局在化させるのに十分な、抗原発現疾患細胞とＣＤ３、ＩＬ−１５Ｒ又はＦｃ受容体発現免疫細胞との間の特異的結合複合体（ブリッジ）を形成する工程、及びｃ）患者において疾患を予防又は治療するのに十分な疾患細胞を損傷させる又は死滅させる工程、を含む方法を提供する。
【００２７】
また、本発明は、疾患細胞が疾患関連抗原を発現する患者において、疾患を予防又は治療する方法であって、ａ）ＣＤ３、ＩＬ−１５Ｒ鎖、又はＦｃ受容体鎖を持つ免疫細胞と、疾患抗原特異的結合ドメインを含む本発明の可溶性融合タンパク質複合体とを混合する工程、ｂ）患者に免疫細胞融合タンパク質複合体混合物を投与する工程；ｃ）免疫細胞を局在化させるのに十分な、抗原発現疾患細胞とＣＤ３、ＩＬ−１５Ｒ又はＦｃ受容体発現免疫細胞との間に特異的結合複合体（ブリッジ）を形成する工程、ｄ）患者において疾患を予防又は治療するのに十分な疾患細胞を損傷又は死滅させる工程、を含む方法を提供する。
【００２８】
本発明は、有効量の本発明の可溶性融合タンパク質複合体を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物において免疫応答を賦活する方法を提供する。また、本発明は、有効量の本発明のいずれか１つの可溶性融合タンパク質複合体を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物において免疫応答を抑制する方法を提供する。
【００２９】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参照文献：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びａｎｄ  Ｈａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。本明細書で使用される以下の用語は、別段の指示がない限り、以下にそれらについて記載される意味を有する。
【００３０】
「薬剤、剤」によって、ペプチド、核酸分子又は低分子化合物を意味する。例示的な治療薬は２Ｂ８Ｔ３Ｍである。
【００３１】
「２Ｂ８Ｔ３Ｍ」によって、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃを含む複合体を意味する。
【００３２】
「改善する」によって、疾患の発症又は進行を減少する、抑制する、減ずる、減らす、停止する、又は安定化することを意味する。
【００３３】
「類縁体」によって、同一でないが、類似した機能的又は構造的な特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類縁体は、対応する天然ポリペプチドの生物学的活性を保持しながら、天然起源のポリペプチドと比較して類縁体の機能を増強する特定の生化学的修飾を有する。かかる生化学的修飾は、例えば、リガンド結合を変更することなく、類縁体のプロテアーゼ抵抗性、膜透過性、又は半減期を増加し得る。類縁体は、非天然アミノ酸を含み得る。
【００３４】
「結合ドメイン」又は「抗原特異的結合ドメイン」の用語は、抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、又は当該技術分野で知られている他の抗原特異的ポリペプチドを包含することが意図される。
【００３５】
本発明は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、抗体又はかかる抗体のフラグメントを含む。また、ヒト化抗体等のキメラ抗体が本発明に含まれる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から該ヒト化抗体に導入された１以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、ヒト抗体の対応する領域に代えて齧歯類の相補性決定領域の一部を用いることにより、本明細書に記載される方法を使用して行われ得る。
【００３６】
「抗体」又は「免疫グロブリン」の用語は、ポルクローナルとモノクローナルの抗体の両方を包含することが意図される。好ましい抗体は、抗原と反応性のモノクローナル抗体である。また、「抗体」の用語は、抗原と反応性の２以上の抗体の混合物（例えば、抗原と反応性の異なる種類のモノクローナル抗体のカクテル）を包含することが意図される。「抗体」の用語は、抗体全体、その生物学的に機能性のフラグメント、単鎖抗体、及び２以上の種に由来する部分を含むキメラ抗体等の遺伝子改変抗体、二重特異性抗体、抗体コンジュゲート、ヒト化及びヒト抗体を包含することがさらに意図される。同様に使用され得る生物学的に機能性の抗体フラグメントは、抗原に結合するのに十分な抗体に由来するそれらのペプチドフラグメントである。本明細書で使用される「抗体」は、抗体全体と並んで目的のエピトープ、抗原、又は抗原性フラグメントに結合可能な任意の抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）を含むことを意味する。
【００３７】
「に結合する、に結合すること」によって、その分子に対して物理化学的な親和性を有することを意味する。
【００３８】
「検出する」は、検出される分析物の存在、欠如又は量を同定することを指す。
【００３９】
「疾患」によって、細胞、組織又は臓器の正常機能を損傷する又はそれを妨げる任意の状態又は障害を意味する。疾患の例として、新生物、自己免疫疾患及びウイルス感染症が挙げられる。
【００４０】
製剤又は製剤の成分の「有効量」及び「治療的有効量」の用語によって、単独で又は組み合わされて、所望の効果を提供するのに十分な量の製剤又は成分を意味する。例えば、「有効量の」によって、単独で又は組み合わされて、治療されていない患者と比較して疾患症状の改善に必要とされる化合物の量を意味する。疾患の治療的処置に対して本発明の実施に使用される活性化合物（複数の場合がある）の有効量は、投与様式、被験体の年齢、体重、及び健康全般に応じて変化する。最終的には、主治医又は獣医が適正量及び投与計画を決定する。かかる量は、「有効量」と称される。
【００４１】
「フラグメント」によって、ポリペプチド又は核酸分子の部分を意味する。この部分は、好ましくは参照核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を含む。例えば、フラグメントは、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、又は１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、又は１０００個のヌクレオチド又はアミノ酸を含み得る。しかしながら、本発明は、また、全長ポリペプチド及び核酸の所望の生物学的活性をそれぞれ示す限り、ポリペプチド及び核酸のフラグメントを含む。ほとんどあらゆる長さの核酸フラグメントが利用される。例えば、約１００００、約５０００、約３０００、約２０００、約１０００、約５００、約２００、約１００、約５０（全ての中間の長さを含む）の塩基対の長さの全長を有する実例となるポリヌクレオチドセグメントが本発明の多くの実施に含まれる。同様に、ほとんどあらゆる長さのポリペプチドフラグメントが利用される。例えば、約１００００、約５０００、約３０００、約２０００、約１０００、約５００、約２００、約１００、約５０（全ての中間の長さを含む）のアミノ酸長を有する実例となるポリペプチドセグメントが本発明の多くの実施に含まれる。
【００４２】
「単離された」、「精製された」、又は「生物学的に純粋な」の用語は、様々な程度まで、その天然の状態で見られるように通常伴う成分を含まない材料を指す。「単離株」は、本来の供給源又は環境からの分離された程度を意味する。「精製する」は、単離よりも高度な分離の程度を意味する。
【００４３】
「精製された」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、任意の不純物がタンパク質の生物学的特性に物質的に影響を与えず、他の不利な結果をもたらさないように、十分に他の材料を含まない。すなわち、組み換えＤＮＡ技術によって産生された場合にそれが細胞物質、ウイルス物質又は培養培地を、又は化学合成された場合に化学前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まなければ、本発明の核酸又はペプチドが精製される。純度及び均一性は、典型的には、分析化学技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法、又は高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。「精製された」の用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル中に一本のバンドを生じることを意味し得る。修飾、例えばリン酸化又はグリコシル化に供することが可能なタンパク質に対して、異なる修飾は、別々に精製され得る、異なる単離されたタンパク質を生じ得る。
【００４４】
同様に、「実質的に純粋な」によって、生来それに伴う成分から分離されたヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。典型的には、ヌクレオチド又はポリペプチドは、少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、さらには９９重量％のヌクレオチド及びポリペプチドが、天然ではそれらと関連するタンパク質及び天然起源の有機分子を含まない場合、実質的に純粋である。
【００４５】
「単離された核酸」によって、その核酸が由来する生体の天然ゲノム中にそれに隣接する遺伝子を含まない核酸を意味する。上記用語は、例えば、（ａ）天然起源のゲノムＤＮＡ分子の一部であるが、それが天然に生じる生体のゲノム中の分子のその一部に隣接する両方の核酸配列によって隣接しないＤＮＡ；（ｂ）得られた分子が任意の天然起源ベクター又はゲノムＤＮＡと同一ではないような方法で、ベクター、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノムのフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生されたフラグメント、又は制限酵素断片等の別々の分子；及び（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換えヌクレオチド配列を包含する。本発明による単離された核酸分子は、合成により産生された分子と並んで、化学的に変更された及び／又は修飾された骨格を有する任意の核酸をさらに含む。例えば、単離された核酸は、精製されたｃＤＮＡ又はＲＮＡのポリヌクレオチドである。単離された核酸分子もまた、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子を含む。
【００４６】
「単離されたポリペプチド」によって、天然にそれに伴う成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、上記ポリペプチドは、タンパク質及びそれと天然に関連する天然起源の有機分子を含まない場合に、少なくとも６０重量％で単離される。好ましくは、上記調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％が本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然起源からの抽出により、かかるポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現により、又は上記タンパク質を化学合成することにより得られてもよい。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析によって測定され得る。
【００４７】
「マーカー」によって、発現レベルにおける変更、又は疾患若しくは障害と関連する活性を有する任意のタンパク質又はポリヌクレオチドを意味する。
【００４８】
「新生物」によって、過剰な増殖又はアポトーシスの減少を特徴とする疾患又は障害を意味する。本発明が使用され得る実例としての新生物として、限定されないが、白血病（例えば急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、及び肉腫及び癌腫等の固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌（ｎｉｌｅ  ｄｕｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫）が挙げられる。特定の実施形態では、新生物は、多発性骨髄腫、β細胞リンパ腫、尿路上皮／膀胱癌又は黒色腫である。本明細書で使用されるように、「薬剤を得ること」における「得ること」は、その薬剤を合成すること、購入すること、そうでなければ取得することを含む。
【００４９】
「減少する」によって、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％の負の変更を意味する。
【００５０】
「参照」によって、標準又は対照の条件を意味される。
【００５１】
「参照配列」は、配列比較に対する基準として使用される定義された配列である。参照配列は、指定される配列のサブセット又はその全体であってもよく、例えば、全長ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列のセグメント、又は完全なｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列であってもよい。ポリペプチドについて、参照ポリペプチド配列の長さは、一般的には、少なくとも約１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５個のアミノ酸、より一層好ましくは３５個のアミノ酸約、約５０個のアミノ酸、又は約１００個のアミノ酸。核酸について、参照核酸配列の長さは一般的には、少なくとも約５０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５個のヌクレオチド、より一層好ましくは１００個のヌクレオチド、若しくは約３００のヌクレオチド、又はそのあたりの若しくはそれらの間の任意の整数である。
【００５２】
「特異的に結合する」によって、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、例えば天然に本発明のポリペプチドを含む試料中の他の分子、実質的に認識し結合しない化合物又は抗体を意味する。
【００５３】
本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチド又はそのフラグメントをコードする任意の核酸分子を含む。かかる核酸分子は、内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示す。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一本の鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチド又はそのフラグメントをコードする任意の核酸分子を含む。かかる核酸分子は内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示す。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一本鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズ」によって、様々なストリンジェンシーの条件下で、相補性ポリヌクレオチド配列間（例えば、本明細書に記載される遺伝子）二本鎖分子を形成するペア、又はその部分を意味する（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。
【００５４】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常は、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、好ましくは約５００ｍＭ未満のＮａＣｌ及び５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び２５ｍＭのクエン酸三ナトリウムとなる。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの不在下で得ることができ、一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２度の温度を含む。ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、及び担体ＤＮＡを包含又は除外等の変動する追加のパラメーターが、当業者によく知られている。様々なレベルのストリンジェンシーは、これらの様々な条件を必要に応じて併せることにより遂行される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び１％ＳＤＳ中、３０℃で起こる。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、及び１００．ｍｕ．ｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で起こる。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、及び２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中、４２℃で起こる。これらの条件に対する有用な変化は、当業者に容易に明らかとなる。
【００５５】
ほとんどの適用について、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もまた、ストリンジェンシーが異なる。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度及び温度によって規定され得る。上のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度の減少又は温度の上昇によって増加され得る。例えば、洗浄工程に対してストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、最も好ましくは約１５ｍＭ未満のＮａＣｌ及び１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムとなる。洗浄工程に対するストリンジェントな温度条件として、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、より一層好ましくは少なくとも約６８℃の温度が挙げられる。好ましい実施形態では、洗浄工程は、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳにおいて、２５℃で起こる。より好ましい実施形態では、洗浄工程は、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳにおいて、４２℃で起こる。より好ましい実施形態では、洗浄工程は１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳにおいて、６８℃で起こる。これらの条件に対する追加の変化は、当業者に容易に明らかとなる。ハイブリダイゼーション技術は当業者によく知られており、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載される。
【００５６】
「実質的に同一」によって、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ）、又は核酸配列（例えば、本明細書に記載される核酸酸配列のいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチド又は核酸分子を意味する。好ましくは、かかる配列は、比較に使用される配列に対するアミノ酸レベル又は核酸レベルで、少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、より好ましくは９０％、９５％、又はさらには９９％同一である。
【００５７】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、７７５  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｒｉｖｅ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ；Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３１７５  Ｓｔａｌｅｙ  Ｒｄ．Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して測定される。かかるソフトウェアは、様々な置換、欠失、及び／又は他の修飾に対するホモロジーの程度を割り当てることによって同一又は類似の配列を一致させる。保存的置換は、典型的には以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を特定するための例示的なアプローチにおいて、ｅ−３〜ｅ−１００の確立スコアが密接に関連する配列を示す、ＢＬＡＳＴプログラムが使用され得る。
【００５８】
「被験体」によって、限定されないが、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコ等のヒト又は非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物を意味する。被験体は、好ましくは、かかる治療を必要とする哺乳動物、例えば、Ｂ細胞リンパ腫と診断された、又はそれに罹患しやすい被験体である。哺乳動物は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマと並んで、家畜又は食用（ｆｏｏｄ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ）に育てられる動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、ヤギである。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００５９】
本明細書において提供される範囲は、その範囲内の全ての値に対する簡略表記であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０からなる群からの任意の数字、数字の組み合わせ、又は部分範囲を含むと理解される。
【００６０】
本明細書に使用される「治療する」及び「治療」の用語は、症状の重症度及び／又は頻度の減少、症状及び／又はそれらの根本的な原因の排除、及び／又は損傷の改善若しくは治療を果たすような、有害な状態、障害、又は疾患に悩まされる臨床的に症候性の固体に対する薬剤又は製剤の投与を指す。排除されないが、障害又は状態の治療は、それと関連する障害、状態、又は症状が完全に排除されることを必要としないことが理解される。
【００６１】
「予防する」及び「予防」の用語は、特定の有害な状態、障害、又は疾患に罹患しやすい又はそれらになりやすい臨床的に無症候性の固体に対する薬剤又は組成物の投与を指し、したがって、症状の発症及び／又はそれらの根本的な原因の予防に関する。
【００６２】
具体的に述べられていないか、又は文脈から明らかでない限り、「又は」の用語は包括的と理解される。具体的に述べられていない、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」の用語は単数又は複数と理解される。
【００６３】
具体的に述べられていないか、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「約」の用語は、当該技術分野における通常の許容誤差の範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内と理解される。約は、述べられる値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％以内と理解され得る。文脈から明確でない限り、本明細書に提供される全ての数値は、約の用語で修飾される。
【００６４】
本明細書における変数の任意の定義における化学基の一覧の詳説は、任意の単一の基又は列挙される基の組み合わせとしてのその変数の定義を含む。本明細書における変数又は態様に対する実施形態の詳説は、任意の単一の実施形態、又は任意の他の実施形態若しくはその部分との組み合わせとしてその実施形態を含む。
【００６５】
本明細書に提供される任意の組成物又は方法は、本明細書に提供される他の組成物及び方法のいずれか１以上と併用され得る。
【００６６】
「含む」、「含有する、含む」又は「を特徴とする」と同義である「含む」の移行用語は、包含的又は無制限であり、追加の列挙されなかった要素又は方法の工程を排除しない。対照的に、移行句「からなる」は、特許請求の範囲で指定されていないいかなる要素、工程、又は原料も排除する。「から本質的になる」の移行句は、特許請求の範囲を、本発明の特許請求の範囲の指定される材料又は工程、「及び基本的な新規の特徴（複数の場合がある）に物質的に影響を与えないもの」に限定する。
【００６７】
本発明の他の特徴及び利点は、その好ましい実施形態の以下の記載、及び特許請求の範囲から明らかとなる。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似する、又はそれと等価な方法及び材料が本発明の実施又は試験において使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。本明細書で引用される全ての公開された外国の特許及び特許出願は、参照することにより本明細書の一部を成す。
【００６８】
本明細書で引用されるアクセッション番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩの寄託は、参照することにより本明細書の一部を成す。本明細書で引用される全ての他の公開された参照文献、文書、原稿、及び科学文献は参照することにより本明細書の一部をなす。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法及び実施例は、解説に過ぎず、限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、Ｔ３分子（Ｔ３Ｍ）、多鎖融合ポリペプチド及び疾患細胞に対するその免疫媒介効果を図示する概要図である。
【図２】図２は、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１のＦｃ融合タンパク質を含む、２Ｂ８Ｔ３Ｍ複合体、並びにＣＤ２０抗原を発現する疾患細胞に対するその免疫媒介効果を図示する概要図である。
【図３】図３は、ジスルフィド結合の還元後のＴ３Ｍ複合体の硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す写真である。右レーン：２Ｂ８Ｔ３Ｍ（３μｇ）；左レーン：マーカー。
【図４】図４Ａは、Ｆｃ受容体を持つ細胞株に対する２Ｂ８Ｔ３Ｍの結合活性を説明する線グラフである。図４Ｂは、ＩＬ−１５の受容体を持つ細胞株に対する２Ｂ８Ｔ３Ｍの結合活性を示す線グラフである。
【図５】図５Ａは、ＣＤ２０を持つヒトリンパ球に対する２Ｂ８Ｔ３Ｍの結合活性を示す線グラフである。図５Ｂは、ＣＤ３を持つヒトリンパ球に対する２Ｂ８Ｔ３Ｍの結合活性を示す線グラフである。図５Ｃは、ＩＬ−１５受容体を持つヒトリンパ球に対する２Ｂ８Ｔ３Ｍの結合活性を示す線グラフである。
【図６】図６は、２Ｂ８Ｔ３Ｍ、２Ｂ８Ｔ２Ｍ及びＡＬＴ−８０３によって媒介されるＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖を説明する線グラフである。
【図７】図７は、２Ｂ８Ｔ２Ｍ又は２Ｂ８Ｔ３Ｍによって誘導されたＤａｕｄｉ−Ｂ細胞リンパ腫に対するヒト免疫細胞の傷害性を説明する棒グラフである。
【図８】図８は、２Ｂ８Ｔ２Ｍ又は２Ｂ８Ｔ３Ｍによって誘導されたヒト免疫細胞からのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）放出を示す棒グラフである。
【図９】図９Ａ〜図９Ｃは、２Ｂ８Ｔ２Ｍ融合タンパク質の構造及び特性評価を示す。図９Ａは、２Ｂ８の単鎖成分の構成を含む２Ｂ８Ｔ２Ｍ複合体の概要図である。図９Ｂは、還元条件下における精製された２Ｂ８Ｔ２Ｍ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。レーン：（１）ＭＷマーカー、（２）２Ｂ８Ｔ２Ｍ。図９Ｃは、２Ｂ８Ｔ２Ｍタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｃは、２Ｂ８Ｔ２ＭのＢ細胞結合を示す。フローサイトメトリーによる２Ｂ８Ｔ２Ｍの標的特異的結合活性の分析。１０分間、０．１ｍＬの最終容量で１ｍｇ／ｍＬにて、リツキシマブ、２Ｂ８Ｔ２Ｍ又はアイソタイプ対照としてのヒトＩｇＧにヒトＰＢＭＣ（５×１０５／試験）を添加した。２μｇ／試料のＦＩＴＣ複合化リツキシマブ（図１０Ａ）又はＦＩＴＣ複合化２Ｂ８Ｔ２Ｍ（図１０Ｂ）、及び５μｇ／試料のＰＥ複合化ＨＬＡ−ＤＲで３０分間、反応を染色した。図１０Ｃは、ヒト組織球性リンパ腫Ｕ−９３７細胞をＦＩＴＣ複合化したリツキシマブ、２Ｂ８Ｔ２Ｍ又は２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ突然変異体で３０分間染色した後、フローサイトメトリーによってＦｃ受容体の結合活性について分析したグラフである。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｂは、２Ｂ８Ｔ２ＭがＣＤＣ及びアポトーシスを誘導することを示す。図１１Ａは、Ｄａｕｄｉ細胞（３×１０５／試験）を様々な濃度の２Ｂ８Ｔ２Ｍ、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ突然変異体、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎ突然変異体、及び陽性対照としてのリツキシマブと３７℃で２時間、補体（正常ヒト血清）の存在下でインキュベートした。ヨウ化プロピジウムを添加し、フローサイトメトリーによって分析した。死細胞のパーセンテージは、ヨウ化プロピジウム陽性細胞のパーセンテージを示す。（ｎ＝３）。図１１ＢはＤａｕｄｉ細胞を２Ｂ８Ｔ２Ｍ、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎ、又はリツキシマブと３７℃で３日間インキュベートしたグラフである。Ｄａｕｄｉ細胞は、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖで染色され、細胞死のパーセンテージをフローサイトメトリーによって特定した。データは平均±ＳＥを表す。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｄは、リツキシマブ及び２Ｂ８Ｔ２ＭのＡＤＣＣ活性を示す。Ｄａｕｄｉ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識化し、新鮮なヒトＰＢＭＣ（図１２Ａ、ｎ＝５）又は精製されたＮＫ細胞（図１２Ｂ、ｎ＝２名のドナー）をエフェクター細胞として使用した。指定の濃度のリツキシマブ又は２Ｂ８Ｔ２Ｍと共に、指定のエフェクター：標的比でエフェクター細胞をＶｉｏｌｅｔ標識化標的細胞と共に蒔いた。標的細胞の生存率を、フローサイトメトリーを使用するヨウ化プロピジウム陽性、Ｖｉｏｌｅｔ標識化Ｄａｕｄｉ細胞の分析によってＰＢＭＣについて２日目（図１２Ａ）、又はＮＫ細胞について２日目（図１２Ｂ）に評価した。死Ｄａｕｄｉ細胞のパーセンテージは、ヨウ化プロピジウム陽性細胞を示す。＊は、２Ｂ８Ｔ２Ｍと比較したｐ＜０．０１（１０ｎＭ）及びｐ＜０．０５（１ｎＭ）を示す。値は平均±ＳＥを表す。図１２Ｃ〜図１２Ｄは、ヒトＰＢＭＣ（５×１０６）を２Ｂ８Ｔ２Ｍと共に２ｍＬのＲＰＭＩ−１０において２日間インキュベートしたグラフである。２Ｂ８Ｔ２Ｍ活性化ＰＢＭＣを抗ＮＫｐ４６（図１２Ｃ、ＮＫ細胞）又は抗ＣＤ８（図１２Ｄ及びＣＤ８＋Ｔ細胞）で染色した後、細胞内グランザイムＢ及びパーフォリンの染色を行った。活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞によるグランザイムＢ及びパーフォリンの発現レベルをフローサイトメトリーによって特定した。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｆは、対照としてのリツキシマブによる、２Ｂ８Ｔ２ＭのＰＥＴ画像化データの定量的分析を示す。図１３Ａ及び図１３Ｄは、６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−２Ｂ８Ｔ２Ｍ及び６４Ｃｕ−ＮＯＴＡリツキシマブの注射後の種々の時間点（０．５時間、６時間、３０時間及び７０時間）における連続二次元投影ＰＥＴ画像を示す。図１３Ｂ及び図１３Ｅは、ＰＥＴ画像化データに基づいて、主な臓器に対する組織１グラム当たりのパーセント注入量（％ＩＤ／ｇ）を計算する関心領域の分析を種々の時間点に行ったグラフである。図１３Ｃ及び図１３Ｆは、マウスを安楽死させ、主な臓器／組織を収集し、計量したグラフである。２Ｂ８Ｔ２Ｍ及びリツキシマブの組織生体内分布を、ガンマカウンターを使用して特定した。データは、１群当たり４匹のマウスの代表である（平均±ＳＤ）。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｄは、２Ｂ８Ｔ２Ｍによって誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の拡大を示す。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識化された富化同系Ｔ細胞（１×１０７／マウス）をＣ５７ＢＬ／６雌性レシピエント（ｎ＝５匹又は６匹／群）に養子移植した。移植から２日後、２Ｂ８Ｔ２Ｍ（５ｍｇ／ｋｇ）、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ（５ｍｇ／ｋｇ）、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎ（５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＬ−１５（０．０５６ｍｇ／ｋｇ）及びＰＢＳを静脈内注射した。図１４Ａ〜図１４Ｂ、５日目に採取した脾臓細胞は、フローサイトメトリーによって分析するため、Ｔ細胞に対して抗ＣＤ４、抗ＣＤ８（図１４Ａ）ＮＫ細胞に対して抗ＮＫ１．１（図１４Ｂ）で染色される。図１４Ｃは、細胞分裂がＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔの蛍光強度に基づいて示される（最も明るい細胞は増殖していないことを示す）グラフである。図１４Ｄは、増殖細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析したグラフである。ｐ＞０．０５：ＩＬ−１５対２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎ及び２Ｂ８Ｔ２Ｍ対２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ；他の群間でｐ＜０．０１。データは平均±ＳＤを表す。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｅは、２Ｂ８Ｔ２Ｍで治療した癌を持つマウスの生存の延長、及び２Ｂ８Ｔ２Ｍ抗腫瘍活性の効能を示す。図１５Ａは、１×１０７個のＤａｕｄｉ細胞／マウスの静脈内注射後、Ｄａｕｄｉ  Ｂリンパ腫を持つマウスを３つの治療群（ｎ＝６）に無作為化し、接種から１５日後及び１８日後に１０ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ（▲）、５ｍｇ／ｋｇの２Ｂ８Ｔ２Ｍ（●）、及びＰＢＳ（■）ビヒクル対照で治療したグラフである。ＰＢＳ対リツキシマブ：ｐ＝０．００１；リツキシマブ対２Ｂ８Ｔ２Ｍ：ｐ＝０．００６。図１５Ｂ〜図１５Ｄは、Ｄａｕｄｉ  Ｂリンパ腫を持つマウスを治療群に無作為化し、図１５Ａのように、１０ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ（ｎ＝７）、０．２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１２．８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６／投薬レベル）の２Ｂ８Ｔ２Ｍ、及びＰＢＳ（ｎ＝７）ビヒクル対照で治療した。マウスを安楽死させ、第２の治療から４日後に骨髄及び脾臓の細胞を採取した。図１５Ｂは、骨髄中のＤａｕｄｉ細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを使用してＨＬＡ−ＤＲ染色によって特定したグラフである。図１５Ｃは、脾臓中のＮＫ細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを使用してＮＫｐ４６染色によって特定したグラフである。図１５Ｄは、骨髄中のＮＫ細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを使用してＮＫｐ４６染色によって特定したグラフである。図１５Ｅは、Ｄａｕｄｉ  Ｂリンパ腫を持つＳＣＩＤベージュマウスを３つの治療群に無作為化し、接種から１３日後及び１６日後に１０ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ（ｎ＝８）、５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）の２Ｂ８Ｔ２Ｍ、及びＰＢＳ（ｎ＝８）ビヒクル対照で治療したグラフである。マウスを安楽死させ、第２の治療から４日後に骨髄細胞を採取した。骨髄中のＤａｕｄｉ細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを使用してＨＬＡ−ＤＲ染色によって特定した。データは平均±ＳＤを表す。図１５Ｂ〜図１５Ｅ、＊はＰＢＳと比較したｐ＜０．０１を示す。†はリツキシマブと比較したｐ＜０．０１を示す。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｂは、２Ｂ８Ｔ２Ｍの種々の変異タンパク質の抗腫瘍機能の比較を示す。図１６Ａは、１×１０７個のＤａｕｄｉ細胞／マウスの静脈内注射後、Ｄａｕｄｉ  Ｂリンパ腫を持つＳＣＩＤマウスを４つの治療群（ｎ＝８）に無作為化し、図１５のように、５ｍｇ／ｋｇの２Ｂ８Ｔ２Ｍ、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎ及びビヒクル対照としてのＰＢＳで治療したグラフである。マウスを安楽死させ、第２の治療から４日後に骨髄細胞を採取した。図１５のように、骨髄中のＤａｕｄｉ細胞のパーセンテージを特定した。図１６Ｂは、グラフである。Ｄａｕｄｉ  Ｂリンパ腫を持つＳＣＩＤマウスを２つの治療群（ｎ＝１０）に無作為化し、接種から１８日後及び２１日後に５ｍｇ／ｋｇの２Ｂ８Ｔ２Ｍ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／Ｃ２６４ｓｃＴＣＲ  ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃで治療したグラフである。全てのマウスを安楽死させ、骨髄細胞を第２の治療から４日後に採取した。図１５のように、骨髄中のＤａｕｄｉ細胞のパーセンテージを特定した。＊はＰＢＳと比較したｐ＜０．０１を示し、§は２Ｂ８Ｔ２Ｍと比較したｐ＜０．０５を示す。データは平均±ＳＤを表す。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｂは、カニクイザルにおける２Ｂ８Ｔ２ＭによるＢ細胞枯渇を示す。研究は、各群４匹の雄性動物を含む３群のカニクイザルからなった。動物を静脈内注射の５ｍｇ／ｋｇの２Ｂ８Ｔ２Ｍ、１０ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ及びＰＢＳビヒクル対照で治療した。同じ治療を３日後に繰り返した。Ｂ細胞分析（図１７Ａ）用の血液試料を、治療前、第１の治療から１日（２４時間）後、第１の治療から３日後及び第２の治療前、第１の治療４日後（第２の治療から２４時間後）、５日後及び７日後に得た。全てのカニクイザルを第１の治療から７日後に安楽死させ、脾臓及び腸間膜リンパ節（ＬＮ）細胞をフローサイトメトリーによるＢ細胞分析（図１７Ｂ）のため採取した。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本発明は、少なくとも一部は、多重特異性タンパク質複合体がエフェクターＴ細胞を活性化し、疾患細胞に対するそれらの活性を標的とすることによって疾患特異的傷害性をもたらすという驚くべき発見に基づく。本明細書には、疾患抗原（例えば、ＣＤ２０）を認識する１つの結合ドメイン、及びＴ細胞上のＣＤ３を認識する第２の結合ドメインを有する多重特異的タンパク質複合体が提供される。かかるタンパク質複合体は、被験体における新生物、感染症、又は自己免疫疾患を治療する方法において実用性を有する（図１）。具体的には、以下に詳述されるように、可溶性抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ複合体（「抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ−抗−ＣＤ２０  ｓｃＡｂ  Ｔ３Ｍ」又は「２Ｂ８Ｔ３Ｍ」）がＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞を賦活して腫瘍標的細胞を死滅させた（図２）。また、２Ｂ８Ｔ３Ｍは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞からのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の放出を賦活した。したがって、本明細書において、２Ｂ８Ｔ３Ｍを特色とする組成物、並びに新生物（例えばＢ細胞リンパ腫及び慢性リンパ球性白血病）に対する免疫応答の増強ため及び自己免疫疾患（例えば免疫性及び血栓性の血小板減少性紫斑病、及び関節リウマチ）を治療するため、Ｂ細胞を枯渇させるためにかかる組成物を使用する方法が提供される。
【００７１】
本明細書に記載されるように、宿主免疫の認識及び応答に対して疾患細胞を標的化する能力を有するタンパク質の使用は、癌、感染症及び自己免疫疾患を治療するための有効な戦略である。米国特許第８，５０７，２２２号（参照することにより本明細書の一部を成す）に記載されるように、ＩＬ−１５及びＩＬ−１５受容体αのドメインを含むタンパク質スキャフォルドは、疾患細胞上及び免疫細胞の受容体上の抗原を認識することができる多重特異性タンパク質を生成するために使用されている。米国特許第８，５０７，２２２号の実施例１５を参照されたい。疾患関連抗原及びＣＤ３を認識する結合ドメインに連結されたＩＬ−１５及びＩＬ−１５受容体αを含む、可溶性多重特異性タンパク質複合体の生成が本明細書に記載される。例えば、抗原特異的結合ドメインは、Ｂ細胞性リンパ腫の上のヒトＣＤ２０を認識する単鎖抗体（ｓｃＡｂ）であり、ＣＤ３認識ドメインはヒトＣＤ３に特異的なｓｃＡｂである。
【００７２】
幾つか場合には、抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂは、キメラモノクローナル抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブの可変鎖に由来する。例えば、抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ配列は、可動性リンカー配列によって連結されたリツキシマブ抗体の重鎖及び軽鎖のＶドメインのコーディング領域を含む。代替的には、当該技術分野で知られている他の抗ＣＤ２０  Ａｂに由来する結合ドメインを使用してもよい。
【００７３】
幾つかの場合には、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂは、ネズミ科モノクローナル抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３の可変鎖に由来する。例えば、抗ヒトＣＤ３  ｓｃＡｂ配列は、可動性リンカー配列によって連結されたＯＫＴ３抗体の重鎖及び軽鎖のＶドメインのコーディング領域を含む。代替的には、当該技術分野で知られている他の抗ＣＤ３  Ａｂに由来する結合ドメインを使用し得る。
【００７４】
疾患抗原及びＣＤ３を認識する結合ドメインは、結合活性が維持される限り、追加のリンカー配列を伴って、又はそれを伴わずに、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５受容体αタンパク質のＮ末端又はＣ末端のいずれかに連結される。抗ＣＤ３  ｓｃＡｂドメインは、ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄスーパーアゴニストタンパク質（ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）のＮ末端に連結されることが好ましい。代替的には、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂドメインはヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質のＣ末端に連結される。抗原特異的結合ドメインは、ヒトＩＬ−１５受容体αｓｕｓｈｉドメイン（ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ）のＮ末端に連結されることが好ましい。幾つか場合に、本発明の多重特異性タンパク質複合体は、免疫細胞上のＣＤ１６受容体のタンパク質二量体化及び認識に対するＩｇＧ  Ｆｃドメインをさらに含む。かかるドメインは、標的細胞に対して抗体依存細胞性細胞毒素（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の賦活を媒介する。幾つかの例では、増強された又は減少されたＣＤ１６結合活性を有するＦｃドメインを使用することが有用である。或る１つの態様では、Ｆｃドメインは、ＡＤＣＣ活性を減少させるが、ジスルフィド結合二量体を形成する能力を保持するアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）（Ｆｃコンセンサス配列に基づく数）を含む。
【００７５】
インターロイキン−１５
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）は、エフェクターＮＫ細胞及びＣＤ８＋メモリーＴ細胞の発生、増殖及び活性化に重要なサイトカインである。ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）に結合し、エフェクター細胞上のＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体β−コモンγ鎖（ＩＬ−１５Ｒβγｃ）複合体に対してトランスで提示される。ＩＬ−１５及びＩＬ−２は、ＩＬ−１５Ｒβγｃへの結合、並びにＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５の経路によるシグナルを共有する。しかしながら、ＩＬ−２と異なり、ＩＬ−１５はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）細胞の維持を支持せず、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞死を誘導せず、これは、多発性骨髄腫に対するＩＬ−２の治療活性をし得る作用である。さらに、ＩＬ−１５はエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞に対して抗アポトーシスシグナルを提供することが知られている唯一のサイトカインである。ＩＬ−１５は、単独又はＩＬ−１５Ｒαとの複合体として投与され、実験動物モデルにおいて確立された固形腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を示し、したがって、癌を治療し得る最も有望な免疫療法薬の１つとして同定された。
【００７６】
ＩＬ−１５に基づく癌治療の臨床開発を促進するため、ＩＬ−１５と比較して増加した生物学的活性を有するＩＬ−１５突然変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）を同定した（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８３：３５９８−３６０７，２００９）。このＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）の薬物動態及び生物学的活性を、スーパーアゴニスト複合体が、ｉｎ  ｖｉｖｏで天然サイトカイン少なくとも２５倍の活性を有するように、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合複合体（ＡＬＴ−８０３）を作製することによってさらに改善した（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，５６：８０４−８１０，２０１１）。
【００７７】
抗原特異的結合ドメイン
抗原特異的結合ドメインは、疾患細胞上の標的に特異的に結合するポリペプチドからなる。代替的には、これらのドメインは、腫瘍成長を支持する間質細胞上の標的等の病気の状態を支持する他の細胞上の標的、又は疾患媒介免疫抑制を支持する免疫細胞上の標的に結合し得る。抗原特異的結合ドメインとして、当該技術分野で知られている、抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、ミニボディ、ナノボディ、ペプチボディ、又は様々な他の抗体模倣物（アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、アトリマー（ａｔｒｉｍｅｒ）、ＣＴＬＡ４に基づく分子、アドネクチン、アンチカリン、クニッツドメインに基づくタンパク質、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ノッティン（ｋｎｏｔｔｉｎ）、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、ダーピン（ｄａｒｐｉｎ）、アフィボディ、アフィリン、モノボディ及びアルマジロ反復タンパク質に基づくタンパク質（Ｗｅｉｄｌｅ，ＵＨ，ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ＆Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １０：１５５−１６８））が挙げられる。
【００７８】
特定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインに対する抗原は、細胞表面受容体又はリガンドを含む。さらなる実施形態では、抗原は、ＣＤ抗原、サイトカイン若しくはケモカインレセプター若しくはリガンド、増殖因子受容体若しくはリガンド、組織因子、細胞接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、陽性／陰性共同刺激受容体若しくはリガンド、細胞死受容体若しくはリガンド、腫瘍関連抗原、又は抗原をコードするウイルスを含む。
【００７９】
抗原特異的結合ドメインは、腫瘍細胞上の抗原に結合することができることが好ましい。腫瘍特異的結合ドメインは、癌を有する患者の治療に対して承認された抗体に由来してもよく、リツキシマブ、オファツムマブ及びオビヌツズマブ（抗ＣＤ２０  Ａｂ）；トラスツズマブ及びペルツズマブ（抗ＨＥＲ２  Ａｂ）；セツキシマブ及びパニツムマブ（抗ＥＧＦＲ  Ａｂ）；並びにアレムツズマブ（抗ＣＤ５２  Ａｂ）が挙げられる。同様に、ＣＤ２０（９０Ｙ標識化イブリツモマブチウクセタン、１３１Ｉ標識化トシツモマブ）、ＨＥＲ２（ａｄｏ−ラスツズマブ  エムタンシン）、ＣＤ３０（ブレンツキシマブベドチン）及びＣＤ３３（ジェムツツマブ  オゾガミシン）に特異的な承認された抗体エフェクター分子コンジュゲートに由来する結合ドメインを使用してもよい（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸ，Ｍｅｌｌｍａｎ  Ｉ．２０１３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：１１９２）。
【００８０】
さらに、本発明の好ましい結合ドメインは、当該技術分野で知られている様々な他の腫瘍特異抗体ドメインを含んでいてもよい。癌の治療に対する抗体及びそれらの各標的として、限定されないが、ニボルマブ（抗ＰＤ−１  Ａｂ）、ＴＡ９９（抗ｇｐ７５）、３Ｆ８（抗ＧＤ２）、８Ｈ９（抗−Ｂ７−Ｈ３）、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）（ＣＡ１２５治療（模倣））、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、アラシズマブペゴール（ａｌａｃｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）（抗ＶＥＧＦＲ２）、アルツモマブペンテタート（ａｌｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）（抗ＣＥＡ）、アマツキシマブ（抗メソセリン）、ＡＭＥ−１３３（抗ＣＤ２０）、アナツモマブマフェナトックス（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ  ｍａｆｅｎａｔｏｘ）（抗−ＴＡＧ−７２）、アポリツマブ（ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗−ＨＬＡ−ＤＲ）、アルシツモマブ（ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＥＡ）、バビツキシマブ（抗フォスファチジルセリン）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＤ２２）、ベリムマブ（抗ＢＡＦＦ）、ベシレソマブ（ＣＥＡ抗関連抗原）、ベバシズマブ（抗−ＶＥＧＦ−Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（抗ＣＤ４４  ｖ６）、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＤ１９）、ＢＭＳ−６６３５１３（抗ＣＤ１３７）、ブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）（抗ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８））、カンツズマブメルタンシン（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（抗ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラブタンシン（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ  ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）（抗ＭＵＣ１）、カプロマブペンチタイド（ｃａｐｒｏｍａｂ  ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）（抗前立腺癌細胞）、カルルマブ（ｃａｒｌｕｍａｂ）（抗ＭＣＰ−１）、カツマキソマブ（ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）（抗ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、ｃＢＲ９６−ドキソルビシン免疫複合体（抗−ルイス−Ｙ抗原）、ＣＣ４９（抗−ＴＡＧ−７２）、セデリツマブ（ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ４）、Ｃｈ．１４．１８（抗ＧＤ２）、ｃｈ−ＴＮＴ（抗ＤＮＡ関連抗原）、シタツズマブボダトックス（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ  ｂｏｇａｔｏｘ）（抗ＥｐＣＡＭ）、シクツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）（抗−ＩＧＦ−１受容体）、クリバツズマブテトラキセタン（ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）（抗ＭＵＣ１）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）（抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＣＰ−８７０８９３（抗ＣＤ４０）、ダセツズマブ（抗ＣＤ４０）、ダクリズマブ（ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２５）、ダロツズマブ（ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）（インスリン拮抗薬状の増殖因子Ｉ受容体）、ダラツムマブ（ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ３８（環状ＡＤＰリボース加水分解酵素））、デムシズマブ（ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）（抗ＤＬＬ４）、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）（抗Ｂリンパ腫細胞）、ドロジツマブ（ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）（抗ＤＲ５）、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）（抗ＨＥＲ３）、デュシジツマブ（ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）（抗ＩＬＧＦ２）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）（抗ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）（抗ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＳＬＡＭＦ７）、エルシリモマブ（ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）（抗−ＩＬ−６）、エナバツズマブ（ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＴＷＥＡＫ受容体）、エノチクマブ（ｅｎｏｔｉｃｕｍａｂ）（抗ＤＬＬ４）、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗５ＡＣ）、エピツモシツマブキセタン（ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ  ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）（抗エピシアリン）、エプラツズマブ（ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）（抗インテグリンαｖβ３）、ファラリモマブ（ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）（抗インターフェロン受容体）、ファルレツズマブ（ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）（抗葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（抗ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＨＧＦ）、フィギツムマブ（ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＩＧＦ−１受容体）、フランボツマブ（ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）（抗ＴＹＲＰ１（糖タンパク質７５））、フレソリムマブ（ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＧＦβ）、フツキシマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＥＧＦＲ）、ガリキシマブ（ｇａｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ８０）、ガニツマブ（ｇａｎｉｔｕｍａｂ）（抗−ＩＧＦ−Ｉ）、ジェムツツマブオゾガミシン（抗ＣＤ３３）、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）（抗炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ））、グレンバツムマブベドチン（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）（抗ＧＰＮＭＢ）、グセルクマブ（ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）（抗ＩＬ１３）、イバリズマブ（ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ４）、イブリツモマブチウクセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）（抗ＣＤ２０）、イクルクマブ（ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）（抗−ＶＥＧＦＲ−１）、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）（ＣＡ１２５治療）、ＩＭＡＢ３６２（抗ＣＬＤＮ１８．２）、ＩＭＣ−ＣＳ４（抗ＣＳＦ１Ｒ）、ＩＭＣ−ＴＲ１（ＴＧＦβＲＩＩ）、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＥＧＦＲ）、インクラクマブ（ｉｎｃｌａｃｕｍａｂ）（抗セレクチンＰ）、インダツキシマブラブタンシン（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ  ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）（抗ＳＤＣ１）、イノツズマブオゾガマイシン（ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）（抗ＣＤ２２）、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ５１）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ１５２）、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８））、ＫＭ３０６５（抗ＣＤ２０）、ＫＷ−０７６１（抗ＣＤ１９４）、ＬＹ２８７５３５８（抗ＭＥＴ）ラベツズマブ（ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＥＡ）、ランブロリズマブ（ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＰＤＣＤ１）、レクサツムマブ（ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）（抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、リンツズマブ（ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ３３）、リリルマブ（ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）（抗ＫＩＲ２Ｄ）、ロルボツズマブメルタンシン（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（抗ＣＤ５６）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ４０）、ルミリキシマブｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ（抗ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体））、マパツムマブ（ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、マルジェツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ（抗ｃｈ４Ｄ５）、マツズマブ（ｍａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＥＧＦＲ）、マブリリムマブ（ｍａｖｒｉｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＧＭＣＳＦ受容体α鎖）、ミラツズマブ（ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ７４）、ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）（抗−ＴＡＧ−７２）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＣＲ４）モキセツモマブパスドトクス（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）（抗ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトクス（ｎａｃｏｌｏｍａｂ  ｔａｆｅｎａｔｏｘ）（抗Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブエスタフェナトクス（ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ  ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）（抗５Ｔ４）、ナルナツマブ（ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）（抗ＲＯＮ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＥＧＦＲ）、ネスバクマブ（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）（抗アンジオポエチン２）、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）（抗ＩｇＧ４）、ノフェツモマブメルペンタン（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ  ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）、オクレリズマブ（ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）（抗−ＰＤＧＦ−Ｒα）、オナルツズマブ（ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）（抗ｃ−ＭＥＴ）、オンツキシズマブ（ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）（抗ＴＥＭ１）、オポルツズマブモナトクス（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ  ｍｏｎａｔｏｘ）（抗ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）（ＣＡ１２５治療）、オトレルツズマブ（ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ３７）、パンコマブ（ｐａｎｋｏｍａｂ）（ＭＵＣ１の抗腫瘍特異的グリコシル化）、パルサツズマブ（ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＥＧＦＬ７）、パスコリズマブ（ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＬ−４）、パトリツマブ（ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）（抗ＨＥＲ３）、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＭＵＣ１）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピディリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＰＤ−１）、ピナツズマブベドチン（ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）（抗ＣＤ２２）、ピンツモマブ（ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）（抗腺癌抗原）、ポラツズマブベドチン（ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ（抗ＣＤ７９Ｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）（抗ビメンチン）ＰＲＯ１３１９２１（抗ＣＤ２０）、クイリズマブ（ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＧＨＥ）、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）（抗Ｎ−グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）（抗フィブロネクチンエキ���トラドメイン−Ｂ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）（抗ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＨＧＦ）、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）（抗−ＩＧＦ−１受容体）、ロレデュマブ（ｒｏｌｅｄｕｍａｂ）（抗ＲＨＤ）ロベリズマブ（ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ（抗ＣＤ１１＆ＣＤ１８）、サマリズマブ（ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２００）、サツモマブペンデチド（ｓａｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）（抗−ＴＡＧ−７２）、セリバンツマブ（ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）（抗ＥＲＢＢ３）ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ（抗ＣＤ１９）、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ（抗ＣＤ３３）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＦＡＰ）、シルツキマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）（抗−ＩＬ−６）、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）（抗ＥｐＣＡＭ）、ソンツズマブ（ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）（抗ｅｐｉｓｉａｌｉｎ）タバルマブ（ｔａｂａｌｕｍａｂ）（抗ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）（抗α−フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトクス（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｐｔｏｘ）（抗ＣＤ１９）、テリモマブアリトクス（ｔｅｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）、テナツモマブ（ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）（抗テネイシンＣ）、テネリキシマブ（ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ４０）、テプロツムマブ（ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ２２１）、ＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８）、チシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）（抗−ＣＴＬＡ−４）、チガツズマブ（ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）（抗−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＴＮＸ−６５０（抗−ＩＬ−１３）、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＳ２０）、トベツマブ（ｔｏｖｅｔｕｍａｂ）（抗ＣＤ１４０ａ）、ＴＲＢＳ０７（抗ＧＤ２）、トレガリズマブ（ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ４）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）（抗−ＣＴＬＡ−４）、ＴＲＵ−０１６（抗ＣＤ３７）、ツコツズマブセルモロイキン（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ  ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ（抗ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、ウレルマブ（ｕｒｅｌｕｍａｂ）（抗−４−１ＢＢ）、バンチクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）（抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体）、バパリキシマブ（ｖａｐａｌｉｘｉｍａ
ｂ）（抗ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１））、バテリズマブ（ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＴＧＡ２）、ベルツズマブ（ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、ベセンクマブ（ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）（抗ＮＲＰ１）、ビシリズマブ（ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ３）、ボロシキシマブ（ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）（抗インテグリンα５β１）、ボルセツズマブマホドチン（ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ  ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）（抗ＣＤ７０）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）（抗腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、ザルツムマブ（ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＥＧＦＲ）、ザノリムマブ（ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ４）、ザツキシマブ（ｚａｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＨＥＲ１）、ジラリムマブ（ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ１４７（ベイシジン））、ＲＧ７６３６（抗ＥＴＢＲ）、ＲＧ７４５８（抗ＭＵＣ１６）、ＲＧ７５９９（抗ＮａＰｉ２ｂ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（抗−ＰＤ−Ｌ１）、ＲＧ７４５０（抗ＳＴＥＡＰ１）及びＧＤＣ−０１９９（抗−Ｂｃｌ−２）が挙げられる。
【００８１】
本発明（例えばＴＣＲドメイン）に有用な他の抗体ドメイン又は腫瘍標的結合タンパク質として、限定されないが、以下の抗原に結合するものが挙げられる（注、指定の癌適応症は非限定的な例を表す）：アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、アネキシンＡｌ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６、様々な癌）、ＣＡ１２５（卵巣癌）、ＣＡ１５−３（癌腫）、ＣＡ１９−９（癌腫）、Ｌ６（癌腫）、ルイスＹ（癌腫）、ルイスＸ（癌腫）、アルファフェトプロテイン（癌腫）、ＣＡ２４２（結腸直腸癌）、胎盤アルカリフォスファターゼ（癌腫）、前立腺特異的抗原（前立腺）、前立腺酸性ホスファターゼ（前立腺）、表皮増殖因子（癌腫）、ＣＤ２（ホジキン病、ＮＨＬリンパ腫、多発性骨髄腫）、ＣＤ３イプシロン（Ｔ細胞リンパ腫、肺癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、自己免疫疾患、悪性腹水）、ＣＤ１９（Ｂ細胞悪性腫瘍）、ＣＤ２０（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞腫瘍、自己免疫疾患）、ＣＤ２１（Ｂ細胞リンパ腫）、ＣＤ２２（白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ＳＬＥ）、ＣＤ３０（ホジキンリンパ腫）、ＣＤ３３（白血病、自己免疫疾患）、ＣＤ３８（多発性骨髄腫）、ＣＤ４０（リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５１（転移性黒色腫、肉腫）、ＣＤ５２（白血病）、ＣＤ５６（小細胞肺癌、卵巣癌、メルケル細胞癌及び液性腫瘍、多発性骨髄腫）、ＣＤ６６ｅ（癌腫）、ＣＤ７０（転移性腎細胞癌及び非ホジキンリンパ腫）、ＣＤ７４（多発性骨髄腫）、ＣＤ８０（リンパ腫）、ＣＤ９８（癌腫）、ＣＤ１２３（白血病）、ムチン（癌腫）、ＣＤ２２１（固形腫瘍）、ＣＤ２２７（乳癌、卵巣癌）、ＣＤ２６２（ＮＳＣＬＣ及び他の癌）、ＣＤ３０９（卵巣癌）、ＣＤ３２６（固形腫瘍）、ＣＥＡＣＡＭ３（結腸直腸癌、胃癌）、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅ）（乳癌、結腸直腸癌及び肺癌）、ＤＬＬ４（Ａ−ｌｉｋｅ−４）、ＥＧＦＲ（様々な癌）、ＣＴＬＡ４（黒色腫）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ  １８４、ヘム腫瘍学、固形腫瘍）、エンドグリン（ＣＤ１０５、固形腫瘍）、ＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子、膀胱癌、頭頚部癌、結腸癌、ＮＨＬ前立腺癌、及び卵巣癌）、ＥＲＢＢ２（肺癌、乳癌、前立腺癌）、ＦＣＧＲ１（自己免疫疾患）、ＦＯＬＲ（葉酸受容体、卵巣癌）、ＦＧＦＲ（癌腫）、ＧＤ２ガングリオシド（癌腫）、Ｇ−２８（細胞表面抗原糖脂質、黒色腫）、ＧＤ３イデオタイプ（癌腫）、熱ショックタンパク質（癌腫）、ＨＥＲ１（肺癌、胃癌）、ＨＥＲ２（胸癌、肺癌及び卵巣癌）、ＨＬＡ−ＤＲ１０（ＮＨＬ）、ＨＬＡ−ＤＲＢ（ＮＨＬ、Ｂ細胞白血病）、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピン（癌腫）、ＩＧＦ１Ｒ（固形腫瘍、白血病）、ＩＬ−２受容体（Ｔ細胞白血病及びリンパ腫）、ＩＬ−６Ｒ（多発性骨髄腫、ＲＡ、カストルマン病、ＩＬ６依存性腫瘍）、インテグリン（ανβ３、α５β１、α６β４、α１１β３、α５β５、ανβ５、様々な癌に対して）、ＭＡＧＥ−１（癌腫）、ＭＡＧＥ−２（癌腫）、ＭＡＧＥ−３（癌腫）、ＭＡＧＥ４（癌腫）、抗トランスフェリンレセプター（癌腫）、ｐ９７（黒色腫）、ＭＳ４Ａ１（膜貫通４−ドメインサブファミリーＡメンバー１、非ホジキンＢ細胞リンパ腫、白血病）、ＭＵＣ１（乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、気管支癌及び消化器癌）ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）（卵巣癌）、ＣＥＡ（結腸直腸癌）、ｇｐ１００（黒色腫）、ＭＡＲＴＩ（黒色腫）、ＭＰＧ（黒色腫）、ＭＳ４Ａ１（膜貫通４−ドメインサブファミリーＡ、小細胞肺癌、ＮＨＬ、ヌクレオリン、Ｎｅｕ癌遺伝子産物（癌腫）、Ｐ２１（癌腫）、ｎｅｃｔｉｎ−４（癌腫）、抗−（Ｎ−グルコイルノイラミン酸のパラトープ、乳癌、黒色腫癌）、ＰＬＡＰ様精巣アルカリフォスファターゼ（卵巣癌、精巣癌）、ＰＳＭＡ（前立腺腫瘍）、ＰＳＡ（前立腺）、ＲＯＢ０４、ＴＡＧ７２（腫瘍関連糖タンパク質７２、ＡＭＬ、胃癌、結腸直腸癌、卵巣癌）、Ｔ細胞膜貫通型タンパク質（癌）、Ｔｉｅ（ＣＤ２０２ｂ）、組織因子、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｂ、癌腫）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｂ、多発性骨髄腫、ＮＨＬ、他の癌、ＲＡ及びＳＬＥ）、ＴＰＢＧ（栄養膜糖タンパク質、腎細胞癌腫）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体１、リンパ腫、ＮＨＬ、結腸直腸癌、肺癌）ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６、黒色腫）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−２（ＣＤ３０９）（様々な癌）。他の幾つかの腫瘍関連抗原標的が総説されている（Ｇｅｒｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ，ｍＡｂｓ  ２００９  １：２４７−２５３；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  ５４：１８７−２０７，Ｆｒａｎｋｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０００，１５：４５９−７６，Ｇｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；１１９：４２１−４７５，Ｐａｒｍｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  １７８：１９７５−９）。これらの抗原の例として分化のクラスタが挙げられる（ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤｌ  ｌａＣＤｌ  ｌｂ、ＣＤｌ  ｌｃ、ＣＤ１２ｗ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤｗｌ７、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４）ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７９、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ１００、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２０、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１５６、ＣＤ１５８、ＣＤ１６３、ＣＤ１６６、ＣＤ１６８、ＣＤ１８４、ＣＤｗｌ８６、ＣＤ１９５、ＣＤ２０２（ａ、ｂ）、ＣＤ２０９、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７１、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、アネキシン  Ａｌ、ヌクレオリン、エンドグリン（ＣＤ１０５）���ＲＯＢ０４、アミノペプチダーゼＮ、−ｌｉｋｅ−４（ＤＬＬ４）、ＶＥＧＦＲ−２（ＣＤ３０９）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）、Ｔｉｅ２、Ｂ７−Ｈ３、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、イデオタイプ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３、非変異体（ｎｏｎｍｕｔａｎｔ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ突然変異体、ｇｐ１００、ｐ５３突然変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ  ｌ、  ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシルＧＭｌ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａｌ、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰＩＢ  Ｉ、ＰＬＡＣｌ、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ  ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−β、ＭＡＤ−ＣＴ−２、及びＦｏｓ関連抗原１。
【００８２】
さらに、本発明の好ましい結合ドメインは、当該技術分野で知られている、抗原対して特異的な結合ドメイン、及び感染細胞と関連するエピトープ標的を含む。かかる標的は、限定されないが、以下の目的とする感染性抗原に由来するものが挙げられる：ＨＩＶウイルス（特にＨＩＶエンベロープスパイク及び／又はｇｐ１２０及びｇｐ４１のエピトープに由来する抗原）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、イコバクテリアム・テュバーキュローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、レジュネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、インフルエンザＢ（−ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ライム病スピロヘータ（Ｌｙｍｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、単純ヘルペスウイルスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｐａｒｖｏ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓ）、呼吸器多核体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、はしかウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血球ウイルス、エプスタインバーウイルス、マウス白血病ウイルス、おたふくかぜウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳腺腫瘍ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、トリパノソーマ・ランゲル（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ）、トリパノソーマ・クルーズ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ・ロデシエンセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ）、トリパノソーマ・ブルース（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ウシバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）、アイメリア  テネラ（Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、回施糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、リーシュマニア・トピカ、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、タイレリア・パルバ、胞状条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ）、テニア・オウィス（Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、エキノコックス・グラニュロサス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）メソセストイド・コルチ（Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ）、マイコプラズマ・アルスリチジス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、Ｍ．ハイオライニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、Ｍ  アルギニニ（Ｍ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、アコレプラズマ・レイドロウイ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）、Ｍ．サリバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）及びＭ．ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。
【００８３】
他の実施形態では、結合ドメインは免疫チェックポイント分子又はそのリガンドに特異的であり、免疫のチェックポイント抑制活性の阻害剤として、又は免疫チェックポイント刺激活性のアゴニストとして作用する。かかる免疫チェックポイント分子及びリガンドとして、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１３７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＤＯ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１５５、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＧＨＴ、ＬＡＩＲ−１、Ｓｉｇｌｅｃｓ及びＡ２ａＲが挙げられる（Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ．２０１２．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２−２６４，Ｔｈａｖｅｎｔｈｉｒａｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｓ１２：００４）。さらに、本発明の好ましい抗体ドメインとして、イピリムマブ及びトレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＴＳＲ−０４２、ＡＮＢ０１１、ＡＭＰ−５１４及びＡＭＰ−２２４（リガンド−Ｆｃ融合）（抗ＰＤ１）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＥＤＩ０６８０、及びＢＭＳ−９３６５５６９（抗ＰＤＬ１）、ＭＥＤＩ６４６９（抗ＯＸ４０アゴニスト）、ＢＭＳ−９８６０１６、ＩＭＰ７０１、ＩＭＰ７３１及びＩＭＰ３２１（抗ＬＡＧ３）が挙げられる。
【００８４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
Ｔ細胞は、他の免疫細胞型（多形核細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）と共に免疫系の細胞成分を構成する細胞のサブグループである。生理学的条件下では、Ｔ細胞は、免疫監視及び外来抗原の排除において機能を果たす。しかしながら、病的状況下では、Ｔ細胞が疾患の原因及びその伝播において主な役割を果たしているという有力な証拠が存在する。これらの疾患では、中枢であろうと末梢であろうと、Ｔ細胞の免疫寛容の崩壊が自己免疫疾患を引き起こす基本的なプロセスである。
【００８５】
ＴＣＲ複合体は、少なくとも７個の膜貫通タンパク質で構成される。ジスルフィド結合した（αβ又はγδ）ヘテロ二量体は、単一型抗原認識単位を形成するが、一方で、ε鎖、γ鎖、δ鎖、ζ鎖及びη鎖からなる、ＣＤ３の不変鎖は、Ｔ細胞の活性化及び細胞性免疫応答の発生をもたらすシグナル伝達経路に結合するリガンドのカップリングを担う。ＴＣＲ鎖の遺伝子の多様性にもかかわらず、２つの構造特徴は、既知のサブユニット全てに共通する。第一に、それらは、恐らくはα−へリックス型の単一の膜貫通全域ドメインを有する膜貫通タンパク質である。第二に、全てのＴＣＲ鎖は、予想される膜貫通ドメイン内に荷電アミノ酸を持つという珍しい特徴を有する。不変鎖は、マウスとヒトの間で保存されて単一の負の電荷を有し、また不変鎖は１つ（ＴＣＲ−β）又は２つ（ＴＣＲ−α）の正電荷を持つ。ＴＣＲ−αの膜貫通配列は、多くの種において高度に保存されているため、系統発生学的に重要な機能的役割を果たす可能性がある。親水性アミノ酸であるアルギニン及びリジンを含むオクタペプチド配列は、これらの種間で同一である。
【００８６】
Ｔ細胞応答は、ＴＣＲに結合する抗原によって調節される。１つの型のＴＣＲは、免疫グロブリンの可変（Ｖ）及び定常（Ｃ）領域に類似するα鎖及びβ鎖からなる膜結合型ヘテロ二量体である。ＴＣＲα鎖は、共有結合されたＶ−α鎖及びＣ−α鎖を含むが、β鎖は、Ｃ−β鎖に共有結合されたＶ−β鎖を含む。Ｖ−α鎖及びＶ−β鎖は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（ヒトにおいてはＨＬＡ複合体として知られている）と関連して超抗原又は抗原を結合することができるポケット又は間隙を形成する。Ｄａｖｉｓ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３：５３７（１９８５）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｐａｕｌ  Ｅｄ．Ｒｓｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＴＤ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照されたい。
【００８７】
また、ＴＣＲ鎖の細胞外ドメイン（αβ又はγδ）も細胞表面での発現のため、異種性膜貫通領域に融合するように操作され得る。かかるＴＣＲは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ、及び／又はキメラ活性化受容体（ＣＡＲ）膜貫通性若しくは活性化ドメインへの融合を含み得る。また、ＴＣＲは、αβ鎖又はγδ連鎖の１以上の抗原結合ドメインを含む可溶性タンパク質であってもよい。かかるＴＣＲは、ＴＣＲ定常ドメインを含む、又はそれを含まないＴＣＲ可変ドメイン又はその機能フラグメントを含み得る。可溶性ＴＣＲは、二量体又は一本鎖の分子である。
【００８８】
Ｆｃドメイン
本発明のタンパク質複合体は、Ｆｃドメインを含み得る。例えば、２Ｂ８Ｔ３Ｍは、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合複合体を含む。様々なサイトカイン及び可溶性受容体等の別のタンパク質のドメインとＩｇＧのＦｃ領域を併せ持つ融合タンパク質が報告されている（例えば、Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１，１９８９；Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：５２−６０，１９９６）；米国特許第５，１１６，９６４号、及び同第５，５４１，０８７号を参照されたい）。プロトタイプ融合タンパク質は、ＩｇＧ  Ｆｃのヒンジ領域中のシステイン残基によって連結されるホモ二量体タンパク質であり、重鎖可変ドメイン及びＣＨｌドメイン、並びに軽鎖のないＩｇＧ分子に類似する分子を生じる。Ｆｃドメインを含む融合タンパク質の二量体の性質は、他の分子との高次相互作用（すなわち二価又は二重特異性の結合）の提供において有利となり得る。構造の相同性により、Ｆｃ融合タンパク質は、同様のアイソタイプを持つヒトＩｇＧのそれに匹敵するｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態学プロファイルを示す。ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ヒト血液中で最も豊富なタンパク質の１つであり、それらの循環半減期は２１日間に達し得る。ＩＬ−１５又はＩＬ−１５融合タンパク質の循環半減期を延長させるため、及び／又はその生物学的活性を増加させるため。ヒト重鎖ＩｇＧタンパク質のＦｃ部分に共有結合によって連結されたＩＬ−１５Ｒαに非共有結合によって結合されたＩＬ−１５ドメインを含む融合タンパク質複合体（例えば２Ｂ８Ｔ３Ｍ）が本明細書に記載される。
【００８９】
「Ｆｃ」の用語は、Ｆｃ受容体と称される細胞表面受容体及び補体系の幾つかのタンパク質と相互作用する抗体の定常領域である、フラグメント結晶化可能領域を指す。かかる「Ｆｃ」は二量体形態である。天然のＦｃの本来の免疫グロブリン供給源は、好ましくはヒト起源であり、免疫グロブリンのいずれかであってもよいが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃ’は、共有結合的な（すなわち、ジスルフィド結合）及び、非共有結合的な会合によって二量体又は多量体の形態へと結合され得る単量体ポリペプチドで構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１個〜４個の範囲である。天然Ｆｃの１つの例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１−９を参照されたい）。本明細書で使用される「天然Ｆｃ」は、モノマー、二量体及び多量体の形態の総称である。プロテインＡ、プロテインＧ、様々なＦｃ受容体及び補体タンパク質に対する結合部位を含むＦｃドメイン。幾つかの実施形態では、複合体のＦｃドメインは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は、抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）を媒介するためにＦｃ受容体と相互作用することができる。他の適用では、複合体は、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰを効果的に媒介することができないＦｃドメイン（例えばＩｇＧ４  Ｆｃ）を含む。
【００９０】
幾つかの実施形態では、「Ｆｃ変異体」の用語は、天然Ｆｃから修飾されるが、なおもサルベージ受容体、ＦｃＲｎに対する結合部位を含む、分子又は配列を指す。国際出願第ＷＯ９７／３４６３１号及びＷＯ９６／３２４７８号は、例示的Ｆｃ変異体と並んで、サルベージ受容体との相互作用を記載し、それらは参照により本明細書の一部を成す。したがって、「Ｆｃ変異体」の用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子又は配列を含む。さらに、天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要とされない構造的特徴及び生物学的活性を提供する部位を含むことから、それらの部位は除去され得る。したがって、特定の実施形態では、「Ｆｃ変異体」の用語は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合（３）選択された宿主細胞での発現によるＮ末端不均質性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、（７）抗体依存細胞性細胞毒素（ＡＤＣＣ）又は（８）抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）に影響する又は関与する１以上の天然Ｆｃ部位又は残基を変更する分子又は配列を含む。かかる変更は、これらのＦｃ特性の任意の１以上を増加又は減少し得る。Ｆｃ変異体は、以下にさらに詳細に記載される。
【００９１】
「Ｆｃドメイン」の用語は、天然Ｆｃ及びＦｃ変異体分子、及び上に定義される配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃの同様に、「Ｆｃドメイン」の用語は、抗体全体から消化されるか、又は組み換え遺伝子発現若しくは他の手段によって産生されるかにかかわらず、単量体又は多量体の形態の分子を含む。
【００９２】
融合タンパク質複合体
本発明は、融合タンパク質複合体（図１）を提供する。幾つかの場合、第１の融合タンパク質は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）又はその機能性フラグメント共有結合された第１の生物学的に活性なポリペプチドを含み、第２の融合タンパク質は、可溶性インターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα）ポリペプチド又はその機能性フラグメントに共有結合された第２の生物学的に活性なポリペプチドを含み、ここで、第１の融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインは、第２の融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する。また、本発明の融合タンパク質複合体は、第１及び第２の融合タンパク質のうちの１つ又はそれらの両方に連結された免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能性フラグメントを含む。融合タンパク質に連結されたＦｃドメインは、相互作用して融合タンパク質複合体を形成することが好ましい。かかる複合体は、免疫グロブリンＦｃドメイン間のジスルフィド結合によって安定化され得る。或る１つの態様では、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５ポリペプチド、ＩＬ−１５変異体又はその機能性フラグメント、及び可溶性ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド又はその機能性フラグメントを含み、ここで、ＩＬ−１５ポリペプチド及びＩＬ−１５Ｒαポリペプチドのうちの１つ又はそれらの両方が、免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能性フラグメントをさらに含む。
【００９３】
特定の例では、第１及び第２のうちの１つ又はそれらの両方の生物学的に活性なポリペプチドは、抗体又はその機能性フラグメントを含む。例えば、生物学的に活性なポリペプチドの１つは、第１の可溶性抗−ＣＤ３単鎖抗体又はその機能性フラグメントを含む。別の例では、他の又は第２の生物学的に活性なポリペプチドは、疾患抗原特異的抗体又はその機能性フラグメントを含む。或る１つの実施形態では、本発明は、可溶性抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質複合体を含む２Ｂ８Ｔ３Ｍを提供する。この複合体では、ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄドメイン及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは相互作用し、２つの抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質上のｈｕＩｇＧ１  Ｆｃドメインは多重鎖融合タンパク質複合体を形成する（例えば、図２を参照されたい）。
【００９４】
本明細書で使用される「生物学的に活性なポリペプチド」又は「エフェクター分子」の用語は、本明細書に記載される所望の効果をもたらすことができる、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド等のアミノ酸配列；糖又は多糖；脂質又は糖脂質、糖タンパク質、若しくはリポタンパク質を意味する。また、エフェクター分子は、化学物質を含む。また、生物学的活性又はエフェクターのタンパク質、ポリペプチド、若しくはペプチドをコードするエフェクター分子の核酸が意図される。したがって、好適な分子として、調節因子、酵素、抗体、又は薬物と並んでＤＮＡ、ＲＮＡ、及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子は天然起源のものであってもよく、又は例えば、組み換え又は化学合成によって既知の成分から合成され得て、異種由来の成分を含有することもできる。生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子は、一般に、遠心分離法又はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等の標準的な分子サイズ決定技術によって判定される、約０．１ＫＤ〜１００ＫＤ、又はこれよりも大きく、最大約１０００ＫＤ、好ましくは約０．１ＫＤ、０．２ＫＤ、０．５ＫＤ、１ＫＤ、２ＫＤ、５ＫＤ、１０ＫＤ、２０ＫＤ、３０ＫＤ、及び５０ＫＤの間である。本発明の所望の効果は、限定されないが、例えば、結合活性が増大した融合タンパク質複合体を形成させること、標的細胞を死滅させること、（例えば細胞増殖又は細胞死のいずれか誘導するため）、疾患を予防又は治療する際に免疫応答を開始すること、又は診断目的で検出分子として作用することが挙げられる。かかる検出のため、アッセイ、例えば、一連の、細胞を培養して増殖させる工程、該細胞を本発明の融合複合体と接触させる工程、その後、該融合複合体が細胞のさらなる発生を阻害するかどうかを評価する工程を含むアッセイが使用され得る。
【００９５】
本発明の融合タンパク質複合体をエフェクター分子に共有結合させることにより、多くの顕著な利益が提供される。既知の構造を有するペプチドを含む、単一エフェクター分子を含有する、本発明の融合タンパク質複合体を作製することができる。さらに、多様なエフェクター分子を同様のＤＮＡベクターで産生することができる。すなわち、感染細胞又は疾患細胞の認識のため、種々のエフェクター分子のライブラリを融合タンパク質複合体に連結させることができる。さらに、治療に応用するため、被験体に本発明の融合タンパク質複合体を投与するのではなく、融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡベクターを、該融合タンパク質複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ発現のため投与することができる。かかる方法は、典型的には組み換えタンパク質の作製と関連する費用のかかる精製工程を回避し、従来のアプローチと関連する抗原の取り込み及びプロセッシングの複雑さを回避することができる。
【００９６】
上記したように、本明細書に開示される融合タンパク質の成分、例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメイン若しくは他の生物学的に活性な分子、及び任意のペプチドリンカー等のエフェクター分子を、融合タンパク質が意図された機能を有する限り、ほぼいかなる様式でも構築することができる。特に、融合タンパク質の各成分を、望ましい場合は、少なくとも１つの好適なペプチドリンカー配列によって、別の成分との距離をあけて配置することができる。さらに、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質の修飾、同定、及び／又は精製を容易にするためにタグを含み得る。より具体的な融合タンパク質が、下記の実施例に記載される。
【００９７】
リンカー
また、本発明の融合複合体は、好ましくは、ＩＬ−１５ドメイン又はＩＬ−１５Ｒαドメインと生物学的に活性なポリペプチドとの間に置かれた可動性リンカー配列を含む。リンカー配列は、ＩＬ−１５ドメイン又はＩＬ−１５Ｒαドメインの両ドメインの機能的活性を可能とするため、それらのドメインに対して生物学的に活性なポリペプチドの有効な配置ができるようにすべきである。
【００９８】
特定の場合、可溶性融合タンパク質複合体はリンカーを有し、ここでは、第１の生物学的に活性なポリペプチドが、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５（又はその機能性フラグメント）に共有結合されている。別の態様では、本明細書に記載されている可溶性融合タンパク質複合体はリンカーを有し、ここでは第２の生物学的に活性なポリペプチドが、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能性フラグメント）に共有結合さている。
【００９９】
リンカー配列は、提示抗原を認識するためにＴＣＲ分子の結合溝、又は抗原認識用の抗体分子の結合ドメインを効果的に配置することができるペプチドを生じさせるヌクレオチド配列によってコードされていることが好ましい。本明細書で使用される「生物学的に活性なポリペプチドをＩＬ−１５ドメイン又はＩＬ−１５Ｒαドメインに対して効果的に配置すること」の句、又はその他同様の句は、ＩＬ−１５ドメイン又はＩＬ−１５Ｒαドメインが互いに相互作用してタンパク質複合体を形成することができるように、ＩＬ−１５ドメイン又はＩＬ−１５Ｒαドメインに連結された生物学的に活性なポリペプチドを配置することを意味する。例えば、ＩＬ−１５ドメイン又はＩＬ−１５Ｒαドメインは、免疫細胞と相互作用して、免疫応答を開始若しくは阻害するか、又は細胞発生を阻害若しくは賦活できるよう効果的に配置されている。
【０１００】
また、本発明の融合複合体は、好ましくは、ＩＬ−１５ドメイン又はＩＬ−１５Ｒαドメインと、免疫グロブリンＦｃドメインとの間に置かれた可動性リンカー配列を含む。リンカー配列は、各ドメインの機能的活性を可能とするため、Ｆｃドメイン、生物学的に活性なポリペプチド、及びＩＬ−１５ドメイン又はＩＬ−１５Ｒαドメインの有効な配置を可能としなければならない。例えば、Ｆｃドメインは、正確な融合タンパク質複合体の形成、及び／又は免疫細胞上のＦｃ受容体若しくは補体系のタンパク質との相互作用を可能として、オプソニン作用、溶菌、肥満細胞、好塩基球及びエオシン好性細胞の脱顆粒反応、並びに他のＦｃ受容体依存性プロセス；補体活性化経路の活性化；並びに融合タンパク質複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増強を含むＦｃ媒介作用を賦活するように有効に配置される。
【０１０１】
また、リンカー配列を使用して、生物学的に活性なポリペプチドの２以上のポリペプチドを連結し、所望の機能的活性を有する一本鎖分子を生成することができる。
【０１０２】
リンカー配列は、好ましくは約７個〜２０個のアミノ酸、より好ましくは約１０個〜２０個のアミノ酸を含む。リンカー配列は、好ましくは、生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子を単一の望ましくない立体構造で保持しないように可動性である。リンカー配列を使用して、例えば、認識部位を融合分子から距離をあけて配置することができる。具体的には、ペプチドリンカー配列を、生物学的に活性なポリペプチドとエフェクター分子との間に配置して、例えば、それらを化学的に架橋して分子の柔軟性を与えることができる。リンカーは、柔軟性を与えるために、例えば、グリシン、アラニン及びセリン等の低分子側鎖を有するアミノ酸を主に含む。好ましくは、リンカー配列の約８０％又は９０％、又はそれ以上がグリシン残基、アラニン残基、又はセリン残基を含み、特にグリシン残基及びセリン残基を含む
【０１０３】
抗体の可変領域をうまく連結するために用いられてきた多くの可動性リンカー設計のいずれかを含有する、様々なリンカー配列を用いることもできる（Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２：９７−１０５を参照されたい）。
【０１０４】
薬学的治療薬
本発明は、治療薬としての使用に対する融合タンパク質複合体を含む医薬組成物を提供する。或る１つの態様では、本発明の融合タンパク質複合体は、全身投与され、例えば、生理的食塩水等の薬学的に許容可能なバッファー中に製剤化される。好ましい投与経路として、例えば、患者において継続的、持続的又は有効なレベルの組成物を提供する、膀胱への滴下注入、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、又は皮内の注入が挙げられる。ヒト患者又は他の動物の治療は、生理学的に許容可能な担体において、本明細書で識別される治療的有効量の治療薬を使用して行われる。好適な担体及びそれらの製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載される。投与される治療剤の量は、投与様式、患者の年齢及び体重、並びに新生物の臨床症状に応じて変化する。一般的には、量は、新生物、自己免疫疾患、又は感染性疾患と関連する他の疾患の治療で使用される他の薬剤について使用される量の範囲となるが、特定の例では、化合物の特異性が増加しているため、より少ない量が必要とされる。化合物は、当業者に知られている方法によって特定される、被験体の免疫応答を増強する、又は新生物、感染細胞若しくは自己免疫細胞の増殖、生存若しくは侵入を減少させる投薬量で投与される。
【０１０５】
医薬組成物の製剤化
新生物、感染性又は自己免疫疾患の治療に対する本発明の融合タンパク質複合体の投与は、他の成分と併せて、上記新生物、感染性又は自己免疫疾患の改善、縮小、又は安定化に有効な治療薬の濃度をもたらす任意の好適な手段による。本発明の融合タンパク質複合体は、任意の好適な担体物質中に任意の適正量で含まれ得て、一般に、組成物の総重量の１重量％〜９５重量％の量で存在する。上記組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、小胞内、腫瘍内、腹腔内）投与経路に適した剤形で提供され得る。例えば、医薬組成物は、従来の薬学的な慣行に従って製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００  ａｎｄ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０１０６】
当業者が当該技術分野において慣例であると認識するように、動物モデルと比較して、ヒトに対する投与量を修飾するため、ヒト投与量は、ＳＣＩＤマウス又は非ヒト霊長類で使用される化合物の量から推定することにより最初に決定される。例えば、投与量は、約１μｇ化合物／体重ｋｇ〜約５０００ｍｇ化合物／ｋｇ体重；又は約５ｍｇ／体重ｋｇ〜約４０００ｍｇ／体重ｋｇ、又は約１０ｍｇ／体重ｋｇ〜約３０００ｍｇ／体重ｋｇ；又は約５０ｍｇ／体重ｋｇ〜約２０００ｍｇ／体重ｋｇ；又は約１００ｍｇ／体重ｋｇ〜約１０００ｍｇ／体重ｋｇ；又は約１５０ｍｇ／体重ｋｇ〜約５００ｍｇ／体重ｋｇの間で変化し得る。例えば、上記用量は、約１ｍｇ／体重ｋｇ、５ｍｇ／体重ｋｇ、１０ｍｇ／体重ｋｇ、２５ｍｇ／体重ｋｇ、５０ｍｇ／体重ｋｇ、７５ｍｇ／体重ｋｇ、１００ｍｇ／体重ｋｇ、１５０ｍｇ／体重ｋｇ、２００ｍｇ／体重ｋｇ、２５０ｍｇ／体重ｋｇ、３００ｍｇ／体重ｋｇ、３５０ｍｇ／体重ｋｇ、４００ｍｇ／体重ｋｇ、４５０ｍｇ／体重ｋｇ、５００ｍｇ／体重ｋｇ、５５０ｍｇ／体重ｋｇ、６００ｍｇ／体重ｋｇ、６５０ｍｇ／体重ｋｇ、７００ｍｇ／体重ｋｇ、７５０ｍｇ／体重ｋｇ、８００ｍｇ／体重ｋｇ、８５０ｍｇ／体重ｋｇ、９００ｍｇ／体重ｋｇ、９５０ｍｇ／体重ｋｇ、１０００ｍｇ／体重ｋｇ、１０５０ｍｇ／体重ｋｇ、１１００ｍｇ／体重ｋｇ、１１５０ｍｇ／体重ｋｇ、１２００ｍｇ／体重ｋｇ、１２５０ｍｇ／体重ｋｇ、１３００ｍｇ／体重ｋｇ、１３５０ｍｇ／体重ｋｇ、１４００ｍｇ／体重ｋｇ、１４５０ｍｇ／体重ｋｇ、１５００ｍｇ／体重ｋｇ、１６００ｍｇ／体重ｋｇ、１７００ｍｇ／体重ｋｇ、１８００ｍｇ／体重ｋｇ、１９００ｍｇ／体重ｋｇ、２０００ｍｇ／体重ｋｇ、２５００ｍｇ／体重ｋｇ、３０００ｍｇ／体重ｋｇ、３５００ｍｇ／体重ｋｇ、４０００ｍｇ／体重ｋｇ、４５００又は５０００ｍｇ／体重ｋｇである。代替的には、上記用量は、約５ｍｇ化合物／体重ｋｇ〜約２０ｍｇ化合物／体重ｋｇの範囲にある。別の例では、上記用量は、約８ｍｇ／体重ｋｇ、１０ｍｇ／体重ｋｇ、１２ｍｇ／体重ｋｇ、１４ｍｇ／体重ｋｇ、１６ｍｇ／体重ｋｇ又は１８ｍｇ／体重ｋｇである。２Ｂ８Ｔ３Ｍは、０．５ｍｇ／ｋｇ〜薬１０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）で投与されることが好ましい。もちろん、かかる治療プロトコルにおいて慣例的に行われるように、初期の臨床試験の結果及び特定の患者の要求に応じて、この投与量は上方又は下方に調整され得る。
【０１０７】
医薬組成物は、適切な添加剤と共に、投与に際して、制御された方法で治療薬を放出する医薬組成物に製剤化される。例として、単一又は複数の単位の錠剤又はカプセルの組成物、油剤、懸濁液、エマルジョン、マイクロカプセル、ミクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、及びリポソームが挙げられる。２Ｂ８Ｔ３Ｍは、非経口投与に適した賦形剤中で製剤化されることが好ましい。
【０１０８】
非経口組成物
本発明の融合タンパク質複合体を含む医薬組成物は、剤形、製剤において（皮下、静脈内、筋肉内、腫瘍内、小胞内、腹腔内の）注射、輸液若しくは移植によって、又は従来の無毒な薬学的に許容可能な担体及びアジュバントを含む好適な送達デバイス若しくはインプラントによって非経口的に投与される。かかる組成物の製剤及び調製物は、医薬製剤分野の当業者によく知られている。製剤は、上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙに見ることができる。
【０１０９】
非経口的使用に対する本発明の融合タンパク質複合体を含む組成物は、ユニット剤形において（例えば１回用量のアンプルにおいて）提供される。代替的には、上記組成物は、幾つかの用量を含むバイアルにおいて提供され、そこには好適な防腐剤が添加されてもよい（以下を参照されたい）。上記組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、輸液器具又は移植用の送達デバイスの形態であるか、又は使用前に水若しくは別の好適なビヒクルで再構成される乾燥粉末として提示されている。新生物、感染性又は自己免疫疾患を減少させるか改善する活性剤とは別に、上記組成物は、好適な非経口的に許容可能な担体及び／又は添加剤を含む。活性な治療薬（複数の場合がある）は、ミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、制御放出用のリポソームに組み込まれてもよい。さらに、上記組成物は、懸濁剤、安定剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、及び／又は分散剤を含んでもよい。
【０１１０】
上に示されるように、本発明の融合タンパク質複合体を含む医薬組成物は、無菌注射に適した形態であってもよい。かかる組成物を作製するため、好適な活性治療薬（複数の場合がある）を非経口的に許容可能な液体ビヒクルに溶解又は懸濁させる。使用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒は、水適正量の塩酸、水酸化ナトリウムの添加によって好適なｐＨに調整された水、又は好適なバッファー、１，３−ブタンジオール、リンガー溶液、及び等張食塩水及びデキストロース溶液である。また、水性製剤は、１以上の防腐剤（例えばメチル、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸）を含んでもよい。化合物の１つが水にかろうじて又はわずかに可溶性である場合、溶解促進剤又は可溶化剤を添加してもよく、又は溶媒が１０重量／重量％〜６０重量／重量％のポリエチレングリコールを含んでもよい。
【０１１１】
本発明は、本明細書の式の化合物を含む、治療的有効量の医薬組成物を被験体（例えば、ヒト等の哺乳動物）に対して投与することを含む、新生物、感染性若しくは自己免疫の疾患、又はそれらの症状を治療する方法を提供する。したがって、或る１つの実施形態は、新生物、感染性若しくは自己免疫の疾患、又はそれらの症状に苦しむ、又はそれらにかかりやすい被験体を治療する方法である。上記方法は、上記疾患若しくは障害、又はそれらの症状を治療するのに十分な本明細書の化合物の有効量の量を、疾患又は障害が治療されるような条件下で、哺乳動物に投与する工程を含む。
【０１１２】
本明細書の方法は、かかる効果をもたらすため、被験体（かかる治療が必要であると識別された被験体を含む）に対して、有効量の本明細書に記載される化合物又は本明細書に記載される組成物を投与することを含む。かかる治療を必要とする被験体の識別は、被験体又は医療専門家の判断であり、又は主観的（例えば、意見）又は客観的（例えば、検査又は診断方法によって測定可能）であってもよい。
【０１１３】
本発明の治療方法（予防的治療を含む）は、一般に、本明細書の式の化合物等の治療的有効量の本明細書の化合物を、それを必要とする、哺乳動物、特にヒトを含む被験体（例えば、動物、ヒト）に投与することを含む。かかる治療は、新生物、感染症、自己免疫疾患、障害、又はその症状に苦しむ、それを有している、それにかかりやすい、又はそのリスクがある被験体、特にヒトに好適に投与される。「リスクがある」それらの被験体の判断は、診断検査、又は被験体若しくは医療従事者の意見（例えば遺伝子検査、酵素又はタンパク質のマーカー（マーカー（本明細書に定義される）家族歴等）によって客観的に又は主観的な判断によって行われ得る。本発明の融合タンパク質複合体は、免疫応答の増加が望まれる任意の他の治療に使用され得る。
【０１１４】
また、本発明は、治療の進行をモニターする方法を提供する。上記方法は、診断マーカー（マーカー）（例えば、本明細書の化合物によって調節される本明細書に描かれる任意の標的、タンパク質、又はそれらの指標等）又は診断用の測定（例えばスクリーン、アッセイ）のレベルを、新生物と関連する障害又はその症状に苦しむ又はそれにかかりやすい被験体において特定する工程を含み、ここで、該被験体は、疾患又はその症状を治療するのに十分な治療的有効量の本明細書の化合物が投与されている。上記方法で特定されたマーカーのレベルを、健康な正常対照又は他の悩まされている患者のいずれかにおけるマーカーの既知のレベルと比較して、その被験体の疾患状態を確立する。幾つかの場合には、被験体におけるマーカーの第２のレベルを、第１のレベルの特定よりも後に特定し、２つのレベルを比較して一連の疾患又は治療の有効性をモニターする。特定の態様では、被験体におけるマーカーの予備治療レベルは、本発明による治療の開始に先立って特定され、その後、治療開始後に治療の効能を特定するため、このマーカーの予備治療レベルを、被験体のマーカーのレベルと比較することができる。
【０１１５】
併用療法
任意に、本発明の融合タンパク質複合体を他の標準的治療と組み合わせて投与する；かかる方法は、当業者に知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載される。望ましい場合には、本発明の融合タンパク質複合体を、限定されないが免疫療法、治療用抗体、標的化療法、外科手術、放射線療法、又は化学療法を含む任意の従来の抗新生物療法と組み合わせて適用する。
【０１１６】
キット又は薬学的システム
本発明の融合タンパク質複合体を含む医薬組成物は、新生物、感染症、又は自己免疫疾患の改善における使用に対するキット又は薬学的システムに組み立てられてもよい。本発明のこの態様によるキット又は薬学的システムは、厳格に閉じられたバイアル、チューブ、アンプル、ボトル等の１以上の容器手段を有する、箱、カートン、チューブ等のキャリア手段を備える。また、本発明のキット又は薬学的システムは、本発明の融合タンパク質複合体の使用について関連する指示書を備えてもよい。
【０１１７】
組み換えタンパク質発現
一般に、本発明の融合タンパク質複合体（例えば２Ｂ８Ｔ３Ｍの成分）の作製は、本明細書に開示される手順、及び認知された組み換えＤＮＡ技術によって遂行され得る。
【０１１８】
一般に、組み換えポリペプチドは、好適な発現ビヒクル中のポリペプチドをコードする配列又はそのフラグメントの全て又は一部で好適な宿主細胞を形質転換することによって産生される。分子生物学の分野の当業者は、組み換えタンパク質を産生するため使用され得る種々様々な発現系のいずれかが使用され得ることを理解するであろう。使用される的確な宿主細胞は、本発明に決定的ではない。組み換えポリペプチドは、実質的には任意の真核生物宿主（例えばサッカロミセス・セレビシエ、昆虫細胞、例えばＳｆ２１細胞、又は哺乳動物細胞、例えばＮＩＨ  ３Ｔ３、Ｈｅｌａ、或いは好ましくはＣＯＳ細胞）において産生され得る。かかる細胞は、幅広い供給源から入手可能である（例えば、メリーランド州ロックランドのｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；また、例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９７を参照されたい）。トランスフェクションの方法及び発現ビヒクルの選択は、選択される宿主系に依存する。形質転換方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載され；発現ビヒクルは、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｕｐｐ．１９８７）に提供されるものから選択され得る。
【０１１９】
組み換えポリペプチドの産生に対して、様々な発現ベクター系が存在する。かかるポリペプチドを産生するのに有用な発現ベクターとして、限定されないが、エピソーム及びウイルス由来のベクター例えば、細菌性プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来酵母エピソーム由来、挿入因子由来、酵母染色体エレメント由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０等のパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス等のウイルスに由来するベクター、及びそれらの組み合わせに由来するベクターが挙げられる。
【０１２０】
一旦、組み換えポリペプチドが発現されれば、例えば、親和性クロマトグラフィーを使用して該ポリペプチドが単離される。或る１つの例では、ポリペプチドに対して産生された（本明細書に記載されるように産生された）抗体を、カラムに付着させて、組み換えポリペプチドを単離するために使用してもよい。親和性クロマトグラフィーに先立って、ポリペプチドを持つ細胞の溶解又は分画を標準的な方法によって行ってもよい（例えば、上記Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，を参照されたい）。一旦単離されると、組み換えタンパク質は、所望に応じて、例えば高速液体クロマトグラフィーによってさらに精製され得る（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．，Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８０を参照されたい）。
【０１２１】
本発明で使用されるように、本発明の生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子として、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメイン等の因子、又は酵素との他の生物学的に活性なタンパク質が挙げられる。また、生物学的に活性なポリペプチドとして、非タンパク質毒素、細胞傷害剤、化学療法剤、検出可能な標識、放射性物質等の他の化合物とのコンジュゲートが挙げられる。
【０１２２】
本発明に係るサイトカインは、他の細胞に作用し、細胞性免疫の多くの多重効果のいずれかに関与している細胞によって産生される因子のいずれかによって規定される。サイトカインの例として、限定されないが、ＩＬ−２ファミリー、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１、ＩＬ−１７、ＴＧＦサイトカインファミリー、及びＴＮＦサイトカインファミリー、並びにＩＬ−１〜ＩＬ−３５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、並びにＴＮＦβが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
本発明の１つの態様では、第１の融合タンパク質は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメイン又はその機能性フラグメントに共有結合した第１の生物学的に活性なポリペプチドを含む。ＩＬ−１５は、Ｔ細胞の活性化及び増殖に影響するサイトカインである。免疫細胞の活性化及び増殖に影響を及ぼす場合のＩＬ−１５の活性は、幾つかの点でＩＬ−２に類似するが、基本的な相違点は、既によく特徴付けられている（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ  Ａ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５９５−６０１）。
【０１２４】
本発明の別の態様において、第１の融合タンパク質は、ＩＬ−１５変異体（本明細書でＩＬ−１５突然変異体とも称される）であるインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメインを含む。ＩＬ−１５変異体は、天然（又は野生型）のＩＬ−１５タンパク質とは異なるアミノ酸配列を含むことが好ましい。ＩＬ−１５変異体は、好ましくは、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドを結合して、ＩＬ−１５のアゴニスト又はアンタゴニストとして機能する。アゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体は、スーパーアゴニスト活性を有することが好ましい。ＩＬ−１５変異体は、ＩＬ−１５Ｒαとの会合とは無関係に、ＩＬ−１５のアゴニスト又はアンタゴニストとして機能し得る。ＩＬ−１５アゴニストは、野生型ＩＬ−１５と比較して、それに匹敵する又はそれよりも高い生物学的活性によって例示される。ＩＬ−１５のアンタゴニストは、野生型ＩＬ−１５と比較して生物学的活性の減少によって、又はＩＬ−１５媒介応答を阻害する能力によって例示される。幾つかの例では、ＩＬ−１５変異体は、高い活性又は低い活性で、ＩＬ−１５Ｒβγｃ受容体に結合する。幾つかの場合に、ＩＬ−１５変異体の配列は、天然ＩＬ−２配列と比較して、少なくとも１個のアミノ酸が変化しており、例えば、置換又は欠失しており、かかる変化が、ＩＬ−１５のアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性をもたらす。アミノ酸の置換／欠失は、ＩＬ−１５Ｒβ及び／又はγＣと相互作用するＩＬ−１５のドメインに存在することが好ましい。より好ましくは、アミノ酸の置換／欠失は、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドに対する結合にも、ＩＬ−１５変異体を産生する能力にも影響しない。ＩＬ−１５変異体を生じさせるのに適したアミノ酸の置換／欠失は、本明細書に記載されるように、推定上の若しくは既知のＩＬ−１５構造に基づいて、既知の構造を有するＩＬ−２等の相同分子とＩＬ−１５との比較に基づいて、合理的若しくはランダムな突然変異誘発及び機能的アッセイによって、又は他の化学的方法によって同定され得る。さらに、好適なアミノ酸置換は、保存的又は非保存的な変化であってもよく、さらなるアミノ酸の挿入であってもよい。本発明のＩＬ−１５変異体は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の６位、８位、１０位、６１位、６５位、７２位、９２位、１０１位、１０４位、１０５位、１０８位、１０９位、１１１位又は１１２位において１個又は２個以上のアミノ酸置換／欠失を含む。特に、Ｄ８Ｎ（「Ｄ８」はアミノ酸及び天然成熟ヒトＩＬ−１５配列の残基の位置を指し、「Ｎ」はＩＬ−１５変異体おいてその位置で置換されたアミノ酸残基を指す）、Ｉ６Ｓ、Ｄ８Ａ、Ｄ６１Ａ、Ｎ６５Ａ、Ｎ７２Ｒ、Ｖ１０４Ｐ又はＱ１０８Ａの置換は、アンタゴニスト活性を有するＩＬ−１５変態をもたらし、Ｎ７２Ｄ置換はアゴニスト化性を有するＩＬ−１５変異体をもたらす。
【０１２５】
ケモカインは、サイトカインと同様、別の細胞に曝露されると、細胞性免疫の多くの多重効果のいずれかを担う任意の化学的な因子又は分子と定義される。好適なケモカインとして、限定されないが、ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ、及びＣＸ３Ｃのケモカインファミリー、並びにＣＣＬ−１〜ＣＣＬ−２８、ＣＸＣ−１〜ＣＸＣ−１７、ＸＣＬ−１、ＸＣＬ−２、ＣＸ３ＣＬ１、ＭＩＰ−１ｂ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、及びＲａｎｔｅｓが挙げられる。
【０１２６】
増殖因子として、特定の細胞に曝露された場合に、影響を受ける細胞の増殖及び／又は分化を誘導する任意の分子が挙げられる。増殖因子としては、タンパク質及び化学分子を含みそれらの一部は、以下を含む：ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ヒト増殖因子、及び幹細胞増殖因子。さらなる増殖因子は、本明細書に記載される用途にも適している。
【０１２７】
毒素又は細胞傷害性物質として、細胞に曝露された場合に、致死的効果又は増殖阻害効果を有する任意の物質が挙げられる。より具体的には、エフェクター分子は、例えば、植物又は細菌起源の細胞毒素、例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、又はゲロニンであってもよい。かかる毒素の生物学的に活性なフラグメントは、当該技術分野でよく知られており、例えば、ＤＴのＡ鎖及びリシンＡ鎖等が挙げられる。さらに、上記毒素は、細胞表面上で活性を有する物質、例えば、ホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼＣ）であってもよい。
【０１２８】
さらに、エフェクター分子は、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、アドリアマイシン、ブレオマイシン、又はシスプラスチン等の化学療法薬であってもよい。
【０１２９】
さらに、エフェクター分子は、診断又は画像研究に適した検出可能に標識された分子であってもよい。かかる標識として、ビオチン若しくはストレプトアビジン／アビジン、検出可能なナノ粒子若しくは結晶、酵素若しくはその触媒活性フラグメント、緑色蛍光タンパク質、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、サイクローム、テキサスレッド、若しくは量子ドット等の蛍光標識；放射性核種、例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、レニウム−１８８若しくはビスマス−２１２；リン光分子若しくは化学発光分子、又はＧｄに基づく若しくは常磁性金属イオンに基づく造影剤等のＰＥＴ、超音波、若しくはＭＲＩによって検出可能な標識が挙げられるエフェクター又はタグを含むタンパク質の作製及び使用に関する開示については、例えば、Ｍｏｓｋａｕｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１５７０９（１９８９）；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ４７，６４１，１９８６；Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１，３３１，（１９９２）；“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｔｏｘｉｎｓ”Ｏｌｓｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，２５，３５５（１９８２）；公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２９３５０号；公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０４６８９号；公開ＰＣＴ出願第ＷＯ２００５０４６４４９号、及び米国特許第５，６２０，９３９号を参照されたい。
【０１３０】
共有結合したＩＬ−１５ドメイン及びＩＬ−１５Ｒαドメインを含むタンパク質融合体又はコンジュゲート複合体は、幾つかの重要な用途を有する。例えば、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂを及び抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂを含むタンパク質融合体又はコンジュゲート複合体を利用して、特定の細胞、例えば、ＣＤ２０受容体を発現するＢ細胞リンパ腫、及びＣＤ３受容体を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞にＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を送達することができる。したがって、上記タンパク質融合体又はコンジュゲート複合体は、リガンドを含む細胞を選択的に損傷するか、又は死滅させる手段を提供する。タンパク質融合体又はコンジュゲート複合体によって損傷又は死滅させることが可能な細胞又は組織の例として、１以上のリガンドを発現する腫瘍、及びウイルス感染細胞若しくは細菌感染細胞が挙げられる。損傷又は死滅させられやすい細胞又は組織は、本明細書に開示される方法によって容易にアッセイすることができる。
【０１３１】
本発明のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαポリペプチドは、アミノ酸配列において、天然起源のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα分子、例えばヒト、マウス若しくは他の齧歯類、又は他の哺乳動物のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα分子に対して適切に対応する。これらのポリペプチドの配列及びコーディング核酸は、文献において既知であり、ヒトインターロイキン１５（ＩＬ−１５）ｍＲＮＡ−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１４４０７．１（参照することにより本明細書の一部を成す）、ハツカネズミインターロイキン１５（ＩＬ−１５）ｍＲＮＡ−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１４３３２．１（参照することにより本明細書の一部を成す）、ヒトインターロイキン１５受容体α鎖前駆物質（ＩＬ−１５ＲＡ）ｍＲＮＡ−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ３１６２８．１（参照することにより本明細書の一部を成す）、ハツカネズミインターロイキン１５受容体（α鎖）−ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ０９５９８２．１（参照することにより本明細書の一部を成す）を含む。
【０１３２】
幾つかの設定では、例えば、ｓｃ抗体の結合価を増加させるため、本発明のタンパク質融合複合体又はコンジュゲート複合体を多価にすることが有用な可能性がある。特に、融合タンパク質複合体のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαドメイン間の相互作用は、多価複合体を生成する手段を提供する。さらに、例えば、標準的なビオチン−ストレプトアビジン標識技術を使用して、又はラテックスビーズ等の適切な固体支持体に複合化させて、１つのタンパク質と４つのタンパク質（異同を問わない）の間を共有結合的又は非共有結合的に共に連結することにより、多価の融合タンパク質を作製することができる。化学的架橋タンパク質（例えば、デンドリマーに対する架橋）もまた好適な多価の種である。例えば、タンパク質は、ビオチン化ＢｉｒＡタグの等の修飾可能なタグ配列、又はＣｙｓ又はＨｉｓ等の化学反応性側鎖を有するアミノ酸残基をコードする配列を含めることによって改変され得る。かかるアミノ酸タグ又は化学反応性アミノ酸を、融合タンパク質中の様々な位置、好ましくは生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子の活性部位から離れた位置に配置してもよい。例えば、可溶性融合タンパク質のＣ末端を、タグ、又はかかる反応性アミノ酸（複数の場合がある）を含む他の融合タンパク質に共有結合させることができる。２以上の融合タンパク質を、好適なデンドリマー又は他のナノ粒子に化学的に結合させて多価性分子を得るために、好適な側鎖を含めることができる。デンドリマーは、その表面の数ある様々な官能基のいずれかを有することができる、合成化学ポリマーである（Ｄ．Ｔｏｍａｌｉａ，Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，２６：９１：１０１（１９９３））。本発明よる使用に対する例示的なデンドリマーとして、例えばＥ９スターバーストポリアミンデンドリマー及びＥ９コンバスト（ｃｏｍｂｕｓｔ）ポリアミンデンドリマーが挙げられ、これらは、システイン残基を結合することができる。例示的なナノ粒子として、リポソーム、コア−シェル粒子又はＰＬＧＡ系粒子が挙げられる。
【０１３３】
別の態様では、融合タンパク質複合体の１つ又は両方のポリペプチドは免疫グロブリンドメインを含む。代替的には、タンパク質結合ドメイン−ＩＬ−１５融合タンパク質は、免疫グロブリンドメインに連結され得る。好ましい免疫グロブリンドメインは、他の免疫グロブリンドメインと相互作用して、上に提供されるような多重鎖タンパク質を形成させる領域を含む。例えば、免疫グロブリン重鎖領域（ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３）は安定して相互作用し、Ｆｃ領域を作り出すことができる。また、Ｆｃドメインを含む好ましい免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体若しくは補体タンパク質の結合活性を含むエフェクター機能及び／又はグリコシル化部位を有する領域も含む。幾つかの態様では、融合タンパク質複合体の免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体若しくは補体の結合活性、又はグリコシル化若しくは二量体化を減少する又は増大する突然変異を含有することにより、得られるタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼす。例えば、Ｆｃ受容体に対する結合を減少する突然変異を含有する免疫グロブリンドメインを使用して、Ｆｃ受容体を持つ細胞に対して結合活性のより低い本発明の融合タンパク質を生成することができ、それは特定の抗原を認識又は検出するように設計された試薬に有利な可能性がある。
【０１３４】
核酸及びベクター
本発明は、本発明の融合タンパク質（例えば、２Ｂ８Ｔ３Ｍの成分）をコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列を提供する。ＤＮＡ配列は、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、又はエピソーム等の染色体外での複製に適したベクターによって担持されることが好ましい。特に、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターを使用して、本明細書に記載される調製法を促進させることができ、相当量の融合タンパク質を得ることができる。上記ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コーディング配列の転写及び翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入され得る。様々な宿主−ベクター系を利用して、タンパク質コーディング配列を発現させることができる。これらは、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母等の微生物、又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡで形質転換された細菌等を含む。利用する宿主−ベクター系に応じて、多くの好適な転写因子及び翻訳因子のいずれかを使用することができる。上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，を参照されたい。
【０１３５】
本発明は、可溶性融合タンパク質複合体を作製する方法を含み、該方法は、第１及び第２の融合タンパク質をコードする本明細書に記載されるＤＮＡベクターを宿主細胞に導入すること、融合タンパク質を細胞又は培地中で発現させ、第１の融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインと、第２の融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインとの間で会合させて、可溶性融合タンパク質複合体を形成させるのに十分な条件下で、宿主細胞を培地中で培養すること、宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製することを含む。
【０１３６】
一般的に、本発明による好ましいＤＮＡベクターは、エフェクター分子をコードする配列に制御可能に連結された、生物学的に活性なポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を導入するための第１のクローニング部位を５’から３’の方向に含む、ホスホジエステル結合によって連結されるヌクレオチド配列を含む。
【０１３７】
ＤＮＡベクターによってコードされる融合タンパク質成分を、カセット形式で提供することができる。「カセット」の用語は、標準的な組み換え方法によって、角成分を別の成分に容易に置換することができることを意味する。特に、コードされた融合複合体を、血清型を生じさせる能力を有する可能性がある又はその能力を有する病原体に対して使用する場合には、カセット形式で設計されたＤＮＡベクターが特に望ましい。
【０１３８】
融合タンパク質複合体をコードするベクターを作製するため、好適なリガーゼを使用して、生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列を、エフェクターペプチドをコードする配列に連結させる。好適な細胞株等の天然の供給源からＤＮＡを単離するか、又は既知の合成方法、例えばリン酸トリエステル法によって、提示ペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）を参照されたい。また、合成オリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製され得る。生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子は、一旦単離されると、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は当該技術分野において知られている他の手段によって増幅され得る。生物学的に活性なポリペプチド遺伝子を増幅するための好適なＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物に制限酵素認識部位を付加し得る。ＰＣＲ産物は、エフェクターペプチドのスプライス部位、及び生物学的に活性なポリペプチド−エフェクター融合タンパク質を適正に発現し、分泌するのに必要なリーダー配列を含むことが好ましい。また、ＰＣＲ産物は、リンカー配列をコードする配列、又はかかる配列をライゲーションするための制限酵素部位を含むことが好ましい。
【０１３９】
本明細書に記載される融合タンパク質は、好ましくは、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって産生される。例えば、一旦、生物学的に活性なポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が単離されれば、エフェクターポリペプチドをコードする別のＤＮＡ分子に配列をライゲートすることができる。生物学的に活性なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、直接エフェクターペプチドをコードするＤＮＡ配列につながれてもよく、より典型的には、本明細書で検討されるリンカー配列をコードするＤＮＡ配列が生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列とエフェクターペプチドをコードする配列との間に置かれて、好適なライゲースを使用して接合されてもよい。得られるハイブリッドＤＮＡ分子は、好適な宿主細胞において発現されて、融合タンパク質複合体を産生し得る。ＤＮＡ分子は、ライゲーションの後にコードされるポリペプチドの翻訳フレームが変更されないように、５’から３’の方向で互いにライゲートされる（すなわち、ＤＮＡ分子が互いにインフレームでライゲートされる）。得られるＤＮＡ分子はインフレームの融合タンパク質をコードする。
【０１４０】
また他のヌクレオチド配列を、遺伝子コンストラクトに含むことができる。例えば、エフェクターペプチドに融合された生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列の発現を制御するプロモーター配列、又は細胞表面又は培養培地に対して融合タンパク質を先導するリーダー配列をコンストラクトに含めるか、又はそれらはコンストラクトが挿入される発現ベクター中に存在してもよい。免疫グロブリン又はＣＭＶのプロモーターが特に好ましい。
【０１４１】
生物学上活性な変異体ポリペプチド、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα又はＦｃドメインのコーディング配列を得る際、当業者は、ポリペプチドが、生物学的活性を喪失又は減少することなく、特定のアミノ酸置換、付加、欠失、及び翻訳後飾によって改変され得ることを認識する。特に、保存的アミノ酸置換、すなわち、同様のサイズ、電荷、極性及び構造の別のアミノ酸に対する１個のアミノ酸の置換は、恐らく著しくタンパク質機能を変更しないことがよく知られている。タンパク質の構成要素である２０種の標準的なアミノ酸は、以下の４つの群の保存的アミノ酸に大まかに分類される：非極性（疎水性）群は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びバリンを含む；極性（非荷電、中性）群は、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン及びチロシンを含む；正に帯電した（塩基性）群は、アルギニン、ヒスチジン及びリジンを含む；及び、負帯電した（酸性）群は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。タンパク質において同じ群内の別のアミノ酸への１個のアミノ酸置換は、恐らくタンパク質の生物学的活性に有害な作用を有しない。他の例では、アミノ酸位置への修飾を行って、タンパク質の生物学的活性を減少させる又は増強することができる。かかる変化は、無作為に導入され得るか、又は標的とされる残基（複数の場合がある）の既知の若しくは推定される構造的又は機能的な特性に基づく部位特異的な突然変異導入によって導入され得る。変異体タンパク質の発現に続いて、結合又は機能性アッセイを使用して、改変に起因する生物学的活性の変化が容易に評価され得る。
【０１４２】
ヌクレオチド配列間の相同性は、ＤＮＡハイブリダイゼーション分析によって特定され、ここで、二本鎖ＤＮＡハイブリッドの安定性は、生じる塩基対合の程度に依存する。高温及び／又は低塩含有量の条件は、ハイブリッドの安定性を減少し、選択される程度よりも低い相同性を有する配列のアニーリングを防止するため変化され得る。例えば、約５５％のＧ−Ｃ含有量を有する配列に対して、４０℃〜５０℃、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムバッファー）及び０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、約６０％〜７０の相同性を示し、５０℃〜６５℃、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、約８２％〜９７％の相同性を示し、５２℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は約９９％〜１００％の相同性を示す。また、ヌクレオチド及びアミノ酸の配列を比較するため（及び相同性の程度を測定するため）の幅広いコンピュータープログラムが利用可能であり、商業的に入手可能、及び無料の両方のソフトウェアの供給元を提供する一覧はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）に見られる。容易に入手可能な配列比較及び多重配列アラインメントアルゴリズムは、それぞれ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷプログラムである。ＢＬＡＳＴは、ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能であり、ＣｌｕｓｔａｌＷは２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ．で利用可能である。
【０１４３】
融合タンパク質の成分は、それぞれがその意図される機能を実施することができる限り、ほぼ任意の順番で体系化され得る。例えば、或る１つの実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは、エフェクター分子のＣ末端又はＮ末端に位置する。
【０１４４】
本発明の好ましいエフェクター分子は、それらのドメインに対して意図される機能に貢献するサイズを有する。本発明のエフェクター分子は、よく知られている化学的架橋法を含む様々な方法によって作製され、生物学的に活性なポリペプチドに対して融合され得る。例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ−ＤａｙのＭｅａｎｓ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，Ｒ．Ｅ．（１９７４）を参照されたい。また、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  ＰｒｅｓｓのＳ．Ｓ．Ｗｏｎｇ（１９９１）も参照されたい。しかしながら、一般的には、インフレーム融合タンパク質を作製するための組み換え操作を使用することが好ましい。
【０１４５】
上に述べたように、本発明によれば、融合分子又は共役分子は、幾つかの方法で体系化され得る。例示的な立体配置では、生物学的に活性なポリペプチドのＣ末端は、エフェクター分子のＮ末端に制御可能に連結される。所望の場合、その連結は、組み換え法によって達成され得る。しかしながら、別の立体配置では、生物学的に活性なポリペプチドのＮ末端はエフェクター分子のＣ末端に連結される。
【０１４６】
代替的には、又はさらには、１以上の追加のエフェクター分子が、生物学的に活性なポリペプチドに挿入され得るか、又は必要に応じて複合体に共役され得る。
【０１４７】
ベクター及び発現
多くの戦略は、本発明の融合タンパク質複合体（例えば２Ｂ８Ｔ３Ｍ）の成分を発現するために使用され得る。例えば、本発明の融合タンパク質複合体の１以上の成分をコードするコンストラクトを、制限酵素を使用してコンストラクトを挿入するための切れ目を作った後にライゲーションして、好適なベクターに組み込むことができる。遺伝子コンストラクトをコードするベクターは、その後、融合タンパク質の発現のため好適な宿主に導入される。概論的には、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。好適なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関連する因子に経験的に基づいて行われ得る。例えば、ベクターは、利用される宿主と適合性であり、適切なレプリコンを有していなければならない。また、ベクターは、発現される融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列を収容することができなければならない。好適な宿主細胞として、真核生物及び原核細胞が挙げられ、好ましくは、容易に形質転換することができ、培養培地において急速な成長を示すことができる細胞が好ましい。具体的には、好ましい宿主細胞として、Ｅ．コリ、バチルス・サブチリス等の原核生物、及び動物細胞及び酵母株、例えばＳ．セレビジエ等の真核生物が挙げられる。哺乳動物は、一般的には好ましく、特にＪ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−Ｏ、又はＣＨＯが好ましい。他の好適な宿主として、例えば、Ｓｆ９等の昆虫細胞が挙げられる。従来の培養条件が採用される。上記Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。その後、安定な形質転換又はトランスフェクトされた細胞株を選択することができる。本発明の融合タンパク質複合体を発現する細胞は、既知の手順によって特定され得る。例えば、免疫グロブリンに連結された融合タンパク質の発現は、連結された免疫グロブリンに対して特異的なＥＬＩＳＡ及び／又は免疫ブロッティングによって判断され得る。ＩＬ−１５ドメイン又はＩＬ−１５Ｒαドメインに連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を検出するための他の方法は、実施例に開示される。
【０１４８】
上に一般的に言及されるように、宿主細胞は、所望の融合タンパク質をコードする核酸を増やすための調製目的で使用され得る。したがって、宿主細胞として、具体的に融合タンパク質の産生が意図される、原核生物又は真核細胞が挙げられる。したがって、宿主細胞として、具体的には、融合体をコードする核酸を増やすことができる、酵母、ハエ、蠕虫、植物、カエル、哺乳動物細の胞及び器官が挙げられる。使用され得る哺乳動物細胞株の非限定的な例として、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））、又はＳＰ２若しくはＮＳＯのような骨髄腫細胞（Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３（Ｂ）：３（１９８１））が挙げられる。
【０１４９】
所望の融合タンパク質複合体（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｓ）をコードする核酸を増やすことができる宿主細胞は、昆虫（例えばＳｐ．フルギペルダ）、酵母（Ｆｌｅｅｒ，Ｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（５）：４８６４９６（１９９２）によって概論的に再検討されるように、例えば、Ｓ．セレビジエ、Ｓ．ポンべ、Ｐ．パトリス、Ｋ．ラクティス、Ｈ．ポリモルファ）、真菌細胞及び植物細胞を含めて、同様に非哺乳動物真核細胞を包含するまた、Ｅ．コリ及びバチルス等の特定の原核生物が意図される。
【０１５０】
所望の融合タンパク質をコードする核酸は、細胞をトランスフェクトする標準的な技術によって宿主細胞へと導入され得る「トランスフェクトする」又は「トランスフェクション」の用語は、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、ウイルス形質導入及び／又は統合を含む、核酸を宿主細胞に導入するための全ての従来技術を包含することが意図される。宿主細胞をトランスフェクトする好適な方法は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．及び他の実験室用の教科書に見ることができる。
【０１５１】
様々なプロモーター（転写開始制御領域）が本発明により使用され得る。適切なプロモーターの選択は、提案される発現宿主に依存する。異種性の供給源に由来するプロモーターは、それらが選択される宿主において機能的である限り、使用され得る。
【０１５２】
また、プロモーター選択は、ペプチド又はタンパク質の産生の所望の効率及びレベルに依存する。ｔａｃ等の誘導性プロモーターは、Ｅ．コリにおいてタンパク質発現のレベルを劇的に増加させるためにしばしば使用される。タンパク質の過剰発現は宿主細胞に有害な場合がある。結果的に、宿主細胞生育が制限される可能性がある。誘導性プロモーターシステムの使用は、宿主細胞が遺伝子発現の誘導に先立って許容可能な密度で培養されることを可能にし、その結果、より高い生成物の収率を促進する。
【０１５３】
様々なシグナル配列は、本発明に従って使用され得る。生物学的に活性なポリペプチドコーディング配列に相同性のシグナル配列が使用され得る。代替的には、発現宿主における効率的な分泌及びプロセッシングのため選択されるか又は設計されるシグナル配列も使用され得る。例えば、好適なシグナル配列／宿主細胞対は、Ｂ．サブチリスにおける分泌に対するＢ．サブチリスｓａｃＢシグナル配列、及びサッカロミセス・セレビシエのα−接合因子、又はＰ．パトリス分泌に対するＰ．パトリス酸性ホスファターゼｐｏｈＩシグナル配列を含む。シグナル配列は、シグナルペプチターゼ切断部位をコードする配列によって、又はブリッジが下流のＴＣＲ配列の正確なリーディングフレームを保証する、通常１０個よりも少ないコドンからなる短いヌクレオチドブリッジによってタンパク質コーディング配列へ直接連結され得る。
【０１５４】
転写及び翻訳を増強する要素は、真核生物のタンパク質発現系において同定されている。例えば、異種性プロモーターのいずれかの側にカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター１０００  ｂｐを配置することは、植物細胞で１０倍〜４００倍、転写のレベルを上昇させ得る。また、発現コンストラクトは、適切な翻訳開始配列を含まなければならない。正確な翻訳開始のため発現コンストラクトがＫｏｚａｋコンセンサス配列を含むように改変することは、翻訳のレベルを１０倍増加し得る。
【０１５５】
マーカーが目的の遺伝子と異なる部位で統合し得るように、選択マーカーがしばしば使用され、該選択マーカーは発現コンストラクトの一部であってもよく、又はそれから分離され得る（例えば、発現ベクターによって運ばれる）。例は、抗生物質耐性を与えるマーカー、（例えば、ｂｌａは、Ｅ．コリ宿主細胞に対してアンピシリンに対する抵抗を与え、ｎｐｔＩＩは、多様な原核生物及び真核細胞に対するカナマイシン抵抗を与える）、又は宿主が最少培地上で成長することを可能にするマーカーが挙げられる。（例えば、ＨＩＳ４はＰ．パトリス又はＨｉｓ−Ｓ．セレビジエがヒスチジン不在下で成長することを可能とする）。選択性マーカーは、独立した該マーカーの発現を可能とするため、それ自身の転写及び翻訳の開始領域、並びに終了調節領域を有する。抗生物質耐性がマーカーとして使用される場合、選択に対する抗生物質の濃度は、抗生物質に応じて変化し、一般的には、培地１ｍＬ当たり１０μｇ〜６００μｇの抗生物質の範囲である。
【０１５６】
発現コンストラクトは、既知の組み換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）を利用することによって構築される。制限酵素消化及びライゲーションは、ＤＮＡの２つのフラグメントを連結するために使用される基本的な工程である。ＤＮＡ断片の端部はライゲーションに先立って修飾を必要とする場合があり、これは、オーバーハングの充填により、ヌクレアーゼ（例えばＥｘｏＩＩＩ）によりフラグメント末端部分を欠失させることにより、部位特異的突然変異誘発によって、又は、ＰＣＲによる新たな塩基対の付加によって遂行され得る。ポリリンカー及びアダプターは、選択されたフラグメントの接合を促進するために使用され得る。発現コンストラクトは、典型的には、Ｅ．コリの制限、ライゲーション及び形質転換の繰り返しを使用する段階で構築される。発現コンストラクトの構築に適した多数のクローニングベクターが当該技術分野で知られており（λＺＡＰ及びｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ−１、カリフォルニア州ラホヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、ｐＥＴ、ウィスコンシン州マディソンのＮｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９に引用される）、特定の選択は本発明とって重大ではない。クローニングベクターの選択は、宿主細胞への発現コンストラクトの導入について選択された遺伝子導入システムによって影響を受ける。各段階の終わりに、得られたコンストラクトを制限、ＤＮＡ配列、ハイブリダイゼーション及びＰＣＲデンシメトリー分析によって分析してもよい。
【０１５７】
発現コンストラクトは、直鎖若しくは環状のいずれかのクローニングベクターコンストラクトとして宿主に形質転換され得るか、又はクローニングベクターから除去され得て、そのまま若しくは送達ベクターに導入されて使用され得る。送達ベクターが、選択された宿主細胞型において発現コンストラクトの導入及び維持を促進する。発現コンストラクトは、多くの既知の遺伝子導入システム（例えば天然コンピテンス、化学的に媒介される形質転換、プロトプラスト形質転換、電気穿孔、微粒子銃形質転換、トランスフェクション、又は接合）によって宿主細胞に導入される（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。選択された遺伝子導入システムは、使用される宿主細胞及びベクター系に依存する。
【０１５８】
例えば、発現コンストラクトは、プロトプラスト形質転換又は電気穿孔によってＳ．セレビジエ細胞へと導入され得る。Ｓ．セレビジエの電気穿孔は容易に遂行され、スフェロプラスト形質転換に匹敵する形質転換率をもたらす。
【０１５９】
本発明は、目的の融合タンパク質を単離する生産プロセスをさらに提供する。上記プロセスでは、調節配列に制御可能に連結された目的のタンパク質をコードする核酸が導入された宿主細胞（例えば酵母、菌類、昆虫、細菌又は動物の細胞）を、培養培地において生産規模で成長させて、目的の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激する。その後、目的の融合タンパク質を採取した宿主細胞又は培養培地から単離する。標準的なタンパク質精製技術は、培地又は採取された細胞から目的のタンパク質を単離するために使用され得る。特に、精製技術は、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター又は発酵槽を含む、様々な実施により大規模に所望の（すなわち少なくともミリグラム量で）融合タンパク質を発現させ、精製するために使用することができる。
【０１６０】
発現されたタンパク質融合複合体は、既知の方法によって単離し、精製され得る。典型的に、培養培地は遠心分離機又は濾過され、次いで、上清を親和性又は免疫親和性クロマトグラフィー、例えばプロテインＡ若しくはプロテインＧ親和性クロマトグラフィー、又は発現された融合複合体を結合するモノクローナル抗体の使用を含む免疫親和性プロトコルによって精製する。本発明の融合タンパク質は、既知の技術の適切な組み合わせによって分離され、精製され得る。これらの方法として、例えば、塩沈澱及び溶媒沈澱等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等の分子量の差を利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィー等の電荷の差を利用する方法、親和性クロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、及び等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法、Ｎｉ−ＮＴＡ等の金属アフィニティーカラムが挙げられる。これらの方法に関する開示について、全般的には、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０１６１】
本発明の融合タンパク質は、実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、融合タンパク質は、天然にそれ付随する細胞置換物質（ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ）から単離され、したがって、融合タンパク質は、好ましくは少なくとも８０％、又は９０％〜９５％の均一性（重量／重量）で存在する。少なくとも９８〜９９％の均一性（重量／重量）を有する融合タンパク質は、多くの医薬、臨床的及び研究の用途に対して最も好ましい。一旦、融合タンパク質が実質的に精製された場合、治療適用に対して汚染物質を実質的に含んではならない。一旦、部分的に又は本質的な純度に精製されたならば、可溶性タンパク質は治療に使用され得るか、又は本明細書に開示されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏでの実施に使用され得る。実質的な純度は、クロマトグラフィー及びゲル電気泳動等の様々な標準的な技術によって特定され得る。
【０１６２】
本発明の融合タンパク質複合体は、癌性の若しくは感染した様々な細胞、又は１以上の疾患に感染するようになり得る細胞を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適している。
【０１６３】
ヒトインターロイキン１５（ｈｕＩＬ−１５）は、抗原提示細胞上に発現されたヒトＩＬ−１５受容体α連鎖（ｈｕＩＬ−１５Ｒα）によって免疫エフェクター細胞に対してトランス提示される。主として、ＩＬ−１５Ｒαは、細胞外ｓｕｓｈｉドメイン（ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ）により、高い親和性（３８ｐＭ）でｈｕＩＬ−１５を結合する。本明細書に記載されるように、ｈｕＩＬ−１５ドメイン及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕドメインはマルチドメイン融合複合体を構築するためのスキャフォルドとして使用され得る。
【０１６４】
ＩｇＧドメイン、特にＦｃフラグメントは、承認された生物学的薬物を含む、多くの治療用分子に対する二量体のスキャフォルドとしての使用に成功した。例えば、エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに連結された可溶性ヒトｐ７５腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）受容体（ｓＴＮＦＲ）の二量体である。この二量体化は、エタネルセプトが、単量体ＴＮＦＲよりもＴＮＦ−α活性の阻害において最大１０００倍強力となることを可能にし、単量体形態よりも５倍長い結成半減期を有する融合体を提供する。結果として、エタネルセプトは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＮＦ−αの炎症促進活性の中和に有効であり、多くの異なる自己免疫適用症に対する患者のアウトカムを改善する。
【０１６５】
また、その二量体化活性に加えて、Ｆｃフラグメントは、補体活性化及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、食細胞及び樹状細胞上に提示されたＦｃγ受容体都の相互作用により、細胞傷害性エフェクター機能を提供する。抗癌治療用抗体及び他の抗体ドメインＦｃ融合タンパク質に関して、これらの活性は、動物腫瘍モデル及び癌患者において観察される効能に重要な役割を果たす可能性がある。しかしながら、これらの細胞傷害性エフェクター応答は、多くの治療的用途において十分でない可能性がある。したがって、Ｆｃドメインのエフェクター活性に対する改善及び拡大、並びに標的化治療分子による疾患部位に対して、Ｔ細胞活性を含む細胞溶解性免疫応答を誘引する他の手段の開発において相当な関心があった。従来のハイブリドーマ融合技術によって生成された製品の質及び量を改善するため、二重特異性抗体を形成するためにＩｇＧドメインをスキャフォルドとして使用した。これらの方法は他のスキャフォルドの欠点を回避するが、臨床的開発及び使用を支持するのに十分なレベルに哺乳動物細胞において二重特異性抗体を産生するのは困難であった。
【０１６６】
ヒト由来免疫賦活性多量体スキャフォルドを開発しようとして、ヒトＩＬ−１５（ｈｕＩＬ−１５）及びＩＬ−１５受容体ドメインを使用した。ｈｕＩＬ−１５は、高い結合親和性（平衡解離定数（ＫＤ）約１０−１１Ｍ）でｈｕＩＬ−１５受容体α鎖（ｈｕＩＬ−１５Ｒα）と会合する、サイトカインの小さな４つのαヘリックスバンドルファミリーのメンバーである。得られた複合体は、その後、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の表面に提示されたヒトＩＬ−２／１５受容体β／コモンγ鎖（ｈｕＩＬ−１５ＲβγＣ）複合体にトランス提示される。このサイトカイン／受容体相互作用は、エフェクター細胞及びＮＫ細胞の拡大をもたらし、それは、ウイルス感染細胞及び悪性細胞を根絶するのに重要な役割を果たす。通常は、ｈｕＩＬ−１５及びｈｕＩＬ−１５Ｒαは樹状細胞において同時生産されて、その後、分泌され、細胞表面上でヘテロ二量体分子として提示される複合体を細胞内で形成する。したがって、ｈｕＩＬ−１５とｈｕＩＬ−１５Ｒαの相互作用の特徴は、これらの鎖間結合ドメインが、ヒト由来免疫賦活性スキャフォルドとしてはたらき、標的特異的結合が可能な可溶性二量体分子を作製することを示唆した。
【０１６７】
以下に詳細に記載されるように、２Ｂ８Ｔ３Ｍを作製するため、ｈｕＩＬ−１５：ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ−系スキャフォルドを使用した。二量体融合タンパク質複合体は、それらのｈｕＩＬ−１５ドメイン及び結合ドメインの免疫賦活性及び標的特異性の生物学的活性を保持し、ｈｕＩＬ−１５及びｈｕＩＬ−１５Ｒαの付加が融合ドメインの空間的配置を著しく変更せず、サイトカイン活性に影響を与えずに、適切な程度の構造的柔軟性を提供したことを示した。したがって、分子の全体的な結合親和性を増加させるため、２Ｂ８Ｔ３Ｍ等の多価融合複合体を形成するためにこのスキャフォルドを使用することができる可能性がある。可溶性融合タンパク質は、組み換えＣＨＯ細胞培養において比較的高いレベルで産生され（広範囲な細胞株スクリーニング又は最適化をせずに、細胞培養上清中、１リットル当たりのｍｇ）、細胞培養上清から容易に精製することができた。
【０１６８】
本発明の実施は、別段の指定がない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を利用し、それらは当業者の理解範囲に含まれる。かかる技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）等の文献に十分に説明される。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生に適用可能であり、それら自体が、本発明の作製及び実施において考慮され得る。特に、特定の実施形態に対して有用な技術は、以下の欄で検討される。
【０１６９】
以下の実施例は、当業者に対して、本発明のアッセイ、スクリーニング、及び治療方法をどのようにして作製し、使用するかの完全な開示及び説明を提供するように述べられ、本発明者らが彼らの発明であるとする範囲を限定することを意図するものではない。
【０１７０】
リンパ腫
リンパ腫は、Ｂリンパ球又はＴリンパ球が正常細胞より速く分割するか、意図されるより長く生きている場合に生じる血液癌の一種である。例えば、Ｂ細胞リンパ腫はホジキンリンパ腫及びほとんどの非ホジキンリンパ腫の両方を含む。Ｂ細胞性リンパ腫はＣＤ２０を発現する。
【０１７１】
リンパ腫は、リンパ節、脾臓、骨髄、血液又は他の臓器において発症し得る。これらの悪性細胞は、リンパ節の肥大、すなわち、リンパ球系細胞の固形腫瘍を提示するリンパ節からしばしば始まる。リンパ腫は、リンパ節生検、リンパ節の部分的又は全部の切除により、顕微鏡下で検査されて、確定診断される。この検査は、リンパ腫を示す可能性がある組織病理学の特徴を明らかにし得る。治療は化学療法、放射線療法及び／又は骨髄移植を含み得る。
【実施例】
【０１７２】
実施例１：Ｔ３融合タンパク質の作製及び精製
以下に詳細に記載されるように、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃを含むタンパク質複合体を作製した。この複合体は、抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂドメインによってＢ細胞リンパ腫を認識し、ＩＬ−１５活性によってＮＫ細胞及びＴ細胞の反応を誘導し、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂドメインによってＴ細胞応答を活性化し、Ｆｃ結合ドメインによってＡＤＣＣ及びＣＤＣを賦活する（図２）。
【０１７３】
具体的には、単鎖抗ヒトＣＤ３抗体をｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ鎖に連結してコンストラクトを作製した。抗ヒトＣＤ３単鎖抗体（抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ）配列は、可動性リンカーによって連結されたＯＫＴ３抗体の重鎖ドメイン及び軽鎖Ｖドメインのコーディング領域を含む。幾つかの場合では、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂはｈｕＩＬ−１５Ｎ７２ＤのＣ末端に連結される。他の場合では、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂはｈｕＩＬ−１５Ｎ７２ＤのＮ末端に連結される。ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２ＤのＮ末端に連結された抗ＣＤ３  ｓｃＡｂを含むコンストラクトの核酸及びタンパク質配列を以下に示す。
【０１７４】
抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄコンストラクト（シグナルペプチド配列及び停止コドンを含む）の核酸配列は、以下の通り（配列番号１）である：
【０１７５】
（シグナルペプチド）
2019519227.tif 000003
【０１７６】
（抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ（ＯＫＴ３  ＶＬリンカーＶＨ  ｓｃＦｖ））
2019519227.tif 000004
【０１７７】
（リンカー）
2019519227.tif 000005
【０１７８】
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019519227.tif 000006
【０１７９】
抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質（シグナルペプチド配列を含む）のアミノ酸配列は、以下の通り（配列番号２）である：
【０１８０】
（シグナルペプチド）
2019519227.tif 000007
【０１８１】
（抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ（ＯＫＴ３  ＶＬリンカーＶＨ  ｓｃＦｖ））
2019519227.tif 000008
【０１８２】
（リンカー）
2019519227.tif 000009
【０１８３】
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019519227.tif 000010
【０１８４】
上記配列を、以前（米国特許第８，５０７，２２２号、実施例１及び２、参照することにより本明細書の一部を成す）に記載される発現ベクターへとクローニングし、発現ベクターをＣＨＯ細胞に形質導入した。また、細胞を抗抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃコンストラクトを発現するベクターで形質導入した（米国特許第８，５０７，２２２号、実施例１８、参照することにより本明細書の一部を成す）。
【０１８５】
抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃコンストラクト（リーダー配列を含む）の核酸配列は、以下の通り（配列番号３）である：
【０１８６】
（リーダー配列）
2019519227.tif 000011
【０１８７】
（抗ＣＤ２０軽鎖Ｖドメイン）
2019519227.tif 000012
【０１８８】
（リンカー）
2019519227.tif 000013
【０１８９】
（抗ＣＤ２０重鎖Ｖドメイン）
2019519227.tif 000014
【０１９０】
（ヒトＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン）
2019519227.tif 000015
【０１９１】
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019519227.tif 000016
【０１９２】
成熟抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質（リーダー配列を含む）のアミノ酸配列は、以下の通り（配列番号４）である：
【０１９３】
（抗ＣＤ２０軽鎖Ｖドメイン）
2019519227.tif 000017
【０１９４】
（リンカー）
2019519227.tif 000018
【０１９５】
（抗ＣＤ２０重鎖Ｖドメイン）
2019519227.tif 000019
【０１９６】
（ヒトＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン）
2019519227.tif 000020
【０１９７】
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019519227.tif 000021
【０１９８】
例示的なＩＬ−１５Ｎ７２Ｄアミノ酸配列（リーダーペプチドを含む）を以下に提供する（配列番号５）：
【０１９９】
（リーダーペプチド）
2019519227.tif 000022
【０２００】
（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019519227.tif 000023
【０２０１】
幾つかの場合、リーダーペプチドは成熟ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄポリペプチドから切断される。
【０２０２】
例示的なＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃアミノ酸配列（リーダーペプチドを含む）を以下に提供する（配列番号６）：
【０２０３】
（リーダーペプチド）
2019519227.tif 000024
【０２０４】
（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）
2019519227.tif 000025
【０２０５】
（ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃドメイン））
2019519227.tif 000026
【０２０６】
幾つかの場合、成熟ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質はリーダー配列を欠く。
【０２０７】
ＣＨＯ細胞における２つのコンストラクトの共発現は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用してＣＨＯ細胞培養上清から精製された可溶性抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ複合体（抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ−抗−ＣＤ２０  ｓｃＡｂ  Ｔ３Ｍ；２Ｂ８Ｔ３Ｍと称される）の形成及び分泌を可能とした。精製されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図３に示す。約６０ｋＤａ及び約４０ｋＤａにおいて可溶性抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄのタンパク質にそれぞれ対応するバンドが観察された。
【０２０８】
実施例２：Ｔ３分子の結合活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性評価
ＥＬＩＳＡに基づく方法は、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ複合体の形成を確認した。或る１つの例では、上記融合タンパク質複合体は、捕捉抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、及び検出抗体であるビオチン化抗ヒトＩＬ−１５抗体（ＢＡＭ  ２４７、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるｈｕＩｇＧ１／ｈｕＩＬ−１５特異的ＥＬＩＳＡを使用して検出された。
【０２０９】
さらに、Ｆｃ受容体、ＩＬ−１５βγ受容体、ＣＤ３及びＣＤ２０に対する複合体の結合は、受容体を持つ細胞を使用するフローサイトメトリーによって評価された。これらの研究では、Ｆｃ受容体陽性Ｕ９３７及びＩＬ−１５Ｒβγ−陽性３２Ｄβ細胞（５×１０５細胞／試験）を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ−抗−ＣＤ２０  ｓｃＡｂ  Ｔ３Ｍ（１００μＬ中の４μｇ／試験）で染色した。図３に示されるように、フローサイトメトリー分析は、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ−抗−ＣＤ２０  ｓｃＡｂ  Ｔ３Ｍ複合体（２Ｂ８Ｔ３Ｍ）のＵ９３７細胞及び３２Ｄβ細胞への結合を実証した。この結合の特異性を、Ｆｃドメイン（抗ＣＤ２０Ａｂ：リツキシマブ）、又はＩＬ−１５ドメイン（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ＩＬ−１５Ｒ−Ｆｃ：ＡＬＴ−８０３）を含有する非標識化ブロッキング試薬（８０μｇ／試験）を細胞染色アッセイに添加することによって試験した（図３）。「ＡＬＴ−８０３」によって二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質に非共有結合的に会合したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含む複合体を意味し、ここで、その複合体は免疫賦活活性を示す（例えば、参照することにより本明細書の一部を成す。米国特許出願第１３／７６９，１７９号を参照されたい）。これらの試薬は、Ｆｃ受容体陽性Ｕ９３７及びＩＬ−１５Ｒβγ−陽性３２Ｄβ細胞のＦＩＴＣ−２Ｂ８Ｔ３Ｍ特異的染色を減少した（図４）。
【０２１０】
上記複合体が受容体を持つヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を結合し得るかどうかを次に判定した。ヒトＰＢＭＣ（５×１０５細胞／試験）をブロッキング試薬（５０μｇ／試験）：ＣＤ２０結合を阻止するリツキサン、ＣＤ３結合を阻止するｃＯＫＴ３（キメラＯＫＴ３  Ａｂ）、及びＩＬ−１５受容体結合を阻止するＡＬＴ−８０３を含む及び含まないＦＩＴＣ標識化２Ｂ８Ｔ３Ｍ（１４０μＬ中の２μｇ／試験）で染色した。適切な抗体による染色は、ＰＢＭＣ集団において、ＣＤ２０を持つＨＬＡ−ＤＲ＋Ｂ細胞、ＣＤ３を持つＣＤ８＋Ｔ細胞及びＩＬ−１５Ｒを持つＣＤ１６＋ＮＫ細胞を同定した。各場合において、これらの細胞に対するＦＩＴＣ標識化２Ｂ８Ｔ３Ｍ複合体による特異的結合は、陽性染色及びブロッキング試薬による阻害によって観察された（図５）。
【０２１１】
実施例３：Ｔ３Ｍの生物学的活性の特性評価
ＩＬ−１５Ｒβγ陽性３２Ｄβ細胞の増殖に基づくＩＬ−１５生理活性アッセイを、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ−抗−ＣＤ２０  ｓｃＡｂ  Ｔ３Ｍ複合体（２Ｂ８Ｔ３Ｍ）を用いて行った。１×１０４細胞／ウェルのＩＬ−１５依存性細胞を、量が増加する２Ｂ８Ｔ３Ｍを含有する２００μＬのＲＰＭＩ：１０％ＦＢＳ培地において３７℃でインキュベートした。３日後、ＷＳＴ−１（水溶性テトラゾリウム塩）増殖試薬（１０μＬ／ウェル）を添加した。４時間後、４５０ｎｍで吸光度を測定し、代謝的に活性な細胞によるＷＳＴ−１の可溶性ホルムアザン色素への切断に基づいて細胞増殖を判断した。ＡＬＴ−８０３及び抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ  Ｔ２Ｍ複合体（２Ｂ８Ｔ２Ｍ）の生理活性を陽性対照として評価した。「２Ｂ８Ｔ２Ｍ」によって、可溶性抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ複合体を意味する（例えば、参照することにより本明細書の一部を成す米国特許第８，５０７，２２２号を参照されたい）。図６に示されるように、２Ｂ８Ｔ３Ｍは３２Ｄβ細胞の細胞増殖を促進するでき、それによりＩＬ−１５活性を実証する。２Ｂ８Ｔ３Ｍの活性は、恐らくＩＬ−１５Ｎ７２Ｄドメインへの抗ＣＤ３  ｓｃＡｂの結合に起因して２Ｂ８Ｔ２Ｍの活性よりわずかに低かったが、ＡＬＴ−８０３の活性よりも著しく低かった。
【０２１２】
実施例４：Ｔ３Ｍ複合体の抗腫瘍活性
抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ−抗−ＣＤ２０  ｓｃＡｂ  Ｔ３Ｍ複合体が、ＣＤ３媒介Ｔ細胞活性化を介して、ＣＤ２０＋腫瘍細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）を死滅させることができるかどうかを次に判定した。ヒト末梢血単核細胞をドナー血液のバフィーコートから単離した。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴ細胞をナイロンウールカラム上に細胞を通過させることにより濃縮した。ＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞を、ＭＡＣＳカラムを使用する磁気ビーズ分離によって精製した。ヒト免疫エフェクター細胞（１×１０６細胞／ウェル）をＶｉｏｌｅｔ  ＣｅｌｌＴｒａｃｅ標識化Ｄａｕｄｉ細胞（２×１０５細胞／ウェル）（Ｅ：Ｔ＝５：１）、及び様々な濃度の抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ−抗−ＣＤ２０  ｓｃＡｂ  Ｔ３Ｍ複合体と混合した。対照として、ＣＤ３認識を欠く、可溶性抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ複合体（抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ  Ｔ２Ｍ）を使用した。３７℃でのＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ培地中の２０時間のインキュベーションの後、細胞を採取し、最終濃度１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ血球計を使用するフローサイトメトリーによって細胞を分析した。Ｄａｕｄｉ標的細胞をｖｉｏｌｅｔ標識化細胞として同定し、死亡した標的細胞はｖｉｏｌｅｔ  ＰＩ染色細胞であった。死亡したＤａｕｄｉ細胞の割合をＣＤ２０標的特異的傷害性の尺度として特定した。
【０２１３】
図７に示されるように、抗ＣＤ３  ｓｃＡｂ−抗−ＣＤ２０  ｓｃＡｂ  Ｔ３Ｍ（２Ｂ８Ｔ３Ｍ）複合体、及び抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ  Ｔ２Ｍ（２Ｂ８Ｔ２Ｍ）複合体はいずれも、ヒトＰＢＭＣ及びＴ細胞＋ＮＫ細胞による強力なＣＤ２０細胞特異的傷害性を媒介することができた。しかしながら、予想外なことに、２Ｂ８Ｔ３ＭはＣＤ８＋Ｔ、また、より低い程度にＣＤ４＋Ｔ細胞を賦活して、２Ｂ８Ｔ２Ｍに匹敵するレベルよりも効果的にＤａｕｄｉ細胞を死滅させることができた。これらの結果は、２Ｂ８Ｔ３Ｍが腫瘍細胞に対するＣＤ３陽性Ｔ細胞の傷害性を効果的に増強することができることを確認した。
【０２１４】
これらのヒト免疫細胞−Ｄａｕｄｉ細胞培養物におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）放出に基づく免疫活性化のレベルをＥＬＩＳＡによって判定した。図８に示されるように、予想外に、１０ｎＭの２Ｂ８Ｔ３Ｍは２Ｂ８Ｔ２ＭよりもヒトＰＢＭＣ、並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞からより効果的にＩＦＮ−γの放出を賦活することができ、ＣＤ３結合ドメインを介する免疫細胞の活性化を実証した。
【０２１５】
本明細書に提示されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果に基づいて、抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ  Ｔ３Ｍ分子は、標準的な異種移植片腫瘍モデルにおいてヒトリンパ種細胞に対する免疫応答を賦活し、抗腫瘍活性を呈する（例えば、Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１４：３８６４；Ｇｉｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５：３９７２；及びＸｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１０；１１５：２８６４−２８７１を参照されたい。）
【０２１６】
ｓｃＡｂ又は抗体認識ドメインを含む同様のＴ３Ｍコンストラクトは、他のＣＤ抗原、サイトカイン又はケモカイン受容体又はリガンド、成長因子レセプター又はリガンド、細胞接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、陽性／陰性の共刺激受容体又はリガンド、細胞死受容体又はリガンド、腫瘍関連抗原、ウイルスにコードされた及び細菌にコードされた抗原、及び細菌特異的抗原に特異的な抗体配列を用いて容易に作製され得る。特に関心があるのはＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１５２、ＣＤ１４７、ＣＤ２２１、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＣＥＡ、ＯＸ４０リガンド、ｃＭｅｔ、組織因子、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＬ７、ＦＧＦＲ、ＩＬ−６受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＧＤ２、ＣＡ１２５、ＥｐＣａｍ、細胞死受容体５、ＭＵＣ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ、Ｔｒａｉｌ  Ｒ２、葉酸受容体、アンジオポエチン−２、αｖβ３インテグリン受容体、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、及び本明細書に記載される他の疾患標的の抗原、に対する疾患特異的結合ドメイン（例えばｓｃＡｂｓ）を有するＴ３Ｍである。ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＣ、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ及び他のウイルスに由来するウイルス性抗原に対する抗体ドメイン、特にＨＩＶエンベロープスパイク及び／又はｇｐ１２０及びｇｐ４１のエピトープを認識するものにも関心がある。かかる抗体ドメインは、当該技術分野で知られている配列から作製され得るか、又は当該技術分野で知られている様々な供給源（すなわち脊椎動物宿主又は細胞、コンビナトリアルライブラリー、無作為合成ライブラリ又は計算論的モデリング等）から新たに単離される。
【０２１７】
実施例５：抗体とのＡＬＴ−８０３（ＩＬ−１５スーパーアゴニスト）の新規な融合は、抗原特異的抗腫瘍性反応を実証する
インターロイキン（ＩＬ）−１５、及びその受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）は、抗原提示細胞上に共発現され、ＩＬ−２ＲβγＣを持つ免疫細胞へのＩＬ−１５のトランス提示及びエフェクター免疫応答の賦活を可能とする。ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）と細胞外のＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）との間の高親和性相互作用は、多価疾患標的化複合体設計に対する機能的スキャフォルドを作り出すのに利用できることが先に報告された。ＡＬＴ−８０３としても知られるＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃ複合体は、ＩｇＧ１のＦｃドメインへＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕを融合させることにより構築された多量体複合体である。ＡＬＴ−８０３は、強力な抗腫瘍免疫治療薬として開発され、臨床試験にあるＩＬ−１５スーパーアゴニスト複合体である。腫瘍を治療するモノクローナル抗体であるリツキシマブの４本の単鎖に融合されたＡＬＴ−８０３スキャフォルドを使用する、新規な融合分子である２Ｂ８Ｔ２Ｍの作製が本明細書に記載される。この分子は、その腫瘍細胞上のＣＤ２０分子の認識、免疫エフェクター細胞上に提示されたＩＬ−２ＲβγＣによる賦活、並びにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びマクロファージ上のＦｃγ受容体に対する結合によって、三重特異的結合活性を示す。２Ｂ８Ｔ２Ｍは、ＮＫ細胞を活性化して抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を増強し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介し、Ｂリンパ腫細胞のアポトーシスを誘導する。リツキシマブと比較した場合、２Ｂ８Ｔ２Ｍは、異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおいて著しくより強い抗腫瘍活性を示し、より効率的にカニクイザルにおいてＢ細胞を枯渇させる。したがって、ＡＬＴ−８０３を、多特異性の標的化されたＩＬ−１５に基づく免疫治療薬を作り出すため、機能的スキャフォルドとして改変することができ、治療用抗体の抗腫瘍活性及び臨床効果を改善するための新規なプラットフォームとしての役割を果たす可能性がある。
【０２１８】
４つのヘリックスのコモンγ鎖（γＣ）サイトカインである、インターロイキン（ＩＬ）−１５は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の発生、増殖及び活性化に極めて重要な因子である（１、２）。ＩＬ−１５は、抗原提示細胞によってそのα鎖受容体（ＩＬ−１５Ｒα）と共発現され、その２つのタンパク質は細胞表面上に複合体を形成して、それがＩＬ−２ＲβγＣ複合体を持つＮＫ細胞及びＴ細胞にトランス提示される（２）。ＩＬ−１５は高い親和性でＩＬ−１５Ｒαに結合し、ＩＬ−１５Ｒαは、シャペロン及び立体配座安定化物質として機能して、ＩＬ−１５とＩＬ−２ＲβγＣの間の相互作用を増強する（２）。ＩＬ−１５変異体は、アミノ酸７２においてアスパラギンのアスパラギン酸への突然変異を持つと同定され（Ｎ７２Ｄ）、免疫細胞上のＩＬ−２ＲβγＣに優れた結合、及び免疫賦活性活性の増加を示す（３）。先の研究は、このＩＬ−１５変異体が、ＩｇＧ１  Ｆｃと融合した可溶性ＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインと会合すると（ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃ）、二量体複合体ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃを形成することができ（ＡＬＴ−８０３と示される）、また該二量体複合体は、天然ＩＬ−１５と比較して、ＩＬ−２ＲβγＣ複合体に対する結合活性の増加、ＮＫ細胞及びＴ細胞を賦活する能力の増強を示し、より長い生物学的半減期を有する（４）。様々な動物モデルにおいて、ＡＬＴ−８０３は、免疫系の強力な免疫部活物質として作用する。免疫系の固有の及び養子のアームを同時に活性化して、新生物チャレンジに対して迅速且つ長期間持続する両方の保護応答を誘発することができる（５）。さらに、チェックポイント遮断又は治療用抗体と組み合わせたＡＬＴ−８０３は、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍負荷の減少及び生存の延長に有効である（６、７）。ＡＬＴ−８０３に基づく分子を疾患との戦いにおいてより特異的でより効率的にするため、ＡＬＴ−８０３を、それをＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質及びＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃタンパク質のＮ末端で単鎖抗体（ｓｃＦｖ）と遺伝学的に融合することにより、標的化免疫治療薬に変換した。この研究では、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖを標的認識ドメインとして使用して、ＡＬＴ−８０３が疾患標的化免疫賦活性分子を作る多目的で機能的なスキャフォルドであることを実証した。また、この新規な単一の融合タンパク質アプローチは、抗ＣＤ２０治療用抗体、リツキシマブの抗体依存細胞性細胞毒素（ＡＤＣＣ）及びアポトーシス機能を改善することが分かった。
【０２１９】
ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒαスキャフォルドを使用する多機能タンパク質複合体の作製
生物学的に活性な融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５タンパク質及びＩＬ−１５ＲαＳｕタンパク質のＮ末端をｐ５３（２６４−２７２）特異的キメラ単鎖ＴＣＲ（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ）に融合させることにより、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５ＲαＳｕスキャフォルドを使用して生成され得ることが以前に示された（８）。したがって、ＡＬＴ−８０３（すなわち、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃ複合体）がタンパク質スキャフォルドとして機能して、多重特異性ＩＬ−１５系標的化免疫治療剤を作り出すことができたと仮定された。これを試験するため、リツキシマブの重鎖及び軽鎖の可変領域をｓｃＦｖに変換し（ｓｃ２Ｂ８）（９）、ＡＬＴ−８０３のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質及びＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃタンパク質のＮ末端にｓｃ２Ｂ８を遺伝学的に融合した。ＩＬ−１５Ｎ７２ＤドメインとＩＬ−１５ＲαＳｕドメインの間の高い結合親和性に基づいて、融合タンパク質は、ｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄとｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃの間ヘテロ二量体複合体を形成し得ると予想された。さらに、ｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃは、Ｆｃドメインによって提供されるジスルフィド結合を使用して共有結合二量体を形成すると予想された。したがって、この新規な融合タンパク質複合体（２Ｂ８Ｔ２Ｍと示す）は、２つのｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び２つのｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃのタンパク質からなると予想された（図９Ａ）。ＣＨＯ細胞への融合タンパク質発現ベクターの安定した同時トランスフェクションの後、可溶性２Ｂ８Ｔ２Ｍが容易に産生され、１０ｍｇ／リットル〜４０ｍｇ／リットルの範囲で細胞培養上清から精製された。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した場合、精製された調製物は、約４０ｋＤａ及び約６０ｋＤａで移動した２つのタンパク質からなり（図９Ｂ）、それぞれ、ｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄに対する３８ｋＤａ及びｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃに対する５９ｋＤａの予想された分子量に対応した。さらに、多量体融合タンパク質複合体の形成はサイズ排除クロマトグラフィーによって確認され、２Ｂ８Ｔ２Ｍの分子量がタンパク質サイズ標準に基づいて１６２ｋＤａであることを示した（図９Ｃ）。２Ｂ８Ｔ２Ｍに加えて、同様の融合タンパク質複合体は、減少させられたＦｃ受容体結合活性（２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ）を伴う突然変異体Ｆｃドメイン（１０）、又はＩＬ−２Ｒβを結合することができない突然変異体ＩＬ−１５ドメイン（２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎ）のいずれかを含んで生成された。種々のターゲッティングドメイン（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ（８））で構成された追加の融合タンパク質複合体（ｃ２６４Ｔ２Ｍと表示される）は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質及びＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃタンパク質のＮ末端に遺伝学的に融合された。２Ｂ８Ｔ２Ｍの生物学的活性におけるＦｃ、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｓｃ２Ｂ８のドメインの役割を特定するため、これらの複合体は対照としての役割を果たした。
【０２２０】
２Ｂ８Ｔ２Ｍは、ＣＤ２０結合、Ｆｃ受容体結合及びＩＬ−１５生物学的活性を保持する
ＣＤ２０結合特性を確認するため、ＦＩＴＣ標識化された２Ｂ８Ｔ２Ｍ及びリツキシマブを生成し、ヒトＨＬＡ−ＤＲ＋Ｂ細胞を染色するために使用した。結果は、ヒトＢ細胞が、ＦＩＴＣ標識化２Ｂ８Ｔ２Ｍ（図１０Ｂ）と並んで、ＦＩＴＣ標識化リツキシマブ（図１０Ａ）を結合することができたことを示した。対照的に、これらの分子に対するＣＤ２０特異的結合活性は、非標識化リツキシマブ及び非標識化２Ｂ８Ｔ２Ｍによって阻止されたが、非特異的ヒトＩｇＧによっては阻止されなかった。これらの知見は、２Ｂ８Ｔ２ＭがリツキシマブのＣＤ２０特異的結合活性を保持することを実証する。同様に、その細胞表面上にＣＤ２０又はＩＬ−２ＲβγＣではなくＦｃ受容体を持つヒト組織球性リンパ腫Ｕ９３７細胞株を使用して、フローサイトメトリーにより２Ｂ８Ｔ２ＭのＦｃ受容体結合を評価した。図１０Ｃに示されるように、２Ｂ８Ｔ２Ｍ及びリツキシマブは、いずれもＵ９３７細胞に結合することができたのに対し、Ｆｃ突然変異体２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ複合体は２Ｂ８Ｔ２Ｍに対する結合の減少を示した。
【０２２１】
先の報告では、ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｓｃＴＣＲ−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−１５ＲαＳｕの融合複合体は、ＩＬ−１５と比較して減少したレベルではあるが、ＩＬ−１５の生物学的活性を保持することが示された（３、８）。このより低い活性は、融合ｓｃＴＣＲドメインとＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−２ＲβγＣの相互作用の間の立体障害に起因すると仮定される。２Ｂ８Ｔ２ＭのＩＬ−１５生物学的活性を評価するため、先に記載されるように（３）、ＩＬ−１５依存性細胞株３２Ｄβ使用した。結果は、２Ｂ８Ｔ２Ｍが３２Ｄβ細胞の増殖を支持したが、天然ＩＬ−１５又はＡＬＴ−８０３と比較して著しく低い活性を示したことを実証した（２Ｂ８Ｔ２Ｍ：ＥＣ５０＝８８９ｐＭ、対ＩＬ−１５：ＥＣ５０＝３４ｐＭ、及び対ＡＬＴ−８０３：ＥＣ５０＝１４ｐＭ）。総合すれば、これらの所見は、２Ｂ８Ｔ２ＭがリツキシマブのＣＤ２０及びＦｃ受容体の結合能力と同様に、ＩＬ−１５生物学的活性も保持することを実証する。
【０２２２】
２Ｂ８Ｔ２Ｍは、ＣＤ２０＋Ｂリンパ腫細胞の直接のアポトーシスと同様に補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介することができる
抗ＣＤ２０抗体は、それらのＣＤ２０との別個の複合体を形成し、Ｂ細胞に対する種々の機能性活性を媒介する能力に基づいて、Ｉ型（リツキシマブ様）及びＩＩ型（トシツモマブ様）の２つのクラスに分けられた（１０）。Ｂ細胞へのＩ型抗体結合は、再分布及び脂質ラフとへのＣＤ２０の密集をもたらし、より強いＣ１ｑ結合及びＣＤＣの強力な誘導に結び付くが、それは低レベルの直接的な抗体媒介細胞死（すなわち、アポトーシス活性）に過ぎない（１０）。対照的に、ＩＩ型抗体は脂質ラフト中でＣＤ２０を安定化しないため、Ｉ型抗体と比較して減少したＣＤＣを示すが、これらの抗体はリソソーム細胞死を強力に誘導する。リツキシマブは、より高いＣＤＣ活性を示すが、トシツモマブ等のＩＩ型抗ＣＤ２０ｍＡｂよりもＢリンパ腫細胞のアポトーシスを誘導する能力が低い、Ｉ型抗ＣＤ２０  ｍＡｂである（１１）。２Ｂ８Ｔ２Ｍはリツキシマブと同じ結合ドメインを有し、同様の特性を有すると予想される。これを調べるため、ＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞に対してＣＤＣを媒介する２Ｂ８Ｔ２Ｍの能力を評価した。図１１Ａに示されるように、２Ｂ８Ｔ２Ｍ（又はＩＬ−１５突然変異体２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎ複合体）とインキュベートされた場合、Ｄａｕｄｉ細胞をヒト補体因子の存在下で溶解した。Ｆｃ突然変異体２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ複合体は、２Ｂ８Ｔ２Ｍより少ないＣＤＣの活性を示し、それは、このＦｃ突然変異体ドメインを含む抗体に対してより低いＣＤＣ活性を示す先の結果に基づいて予想される（１０）。したがって、２Ｂ８Ｔ２ＭはＣＤＣ活性を示したが、リツキシマブよりも低いレベルであった。２Ｂ８Ｔ２Ｍのアポトーシス促進活性を評価するため、２Ｂ８Ｔ２Ｍを含有する培地中で培養されたＤａｕｄｉ細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色を使用してアポトーシスについて分析した。驚いたことに、０．４ｎＭ〜１０ｎＭの濃度範囲において、２Ｂ８Ｔ２ＭがＤａｕｄｉ細胞のアポトーシスの誘導に有効であってことが分かった（図１１Ｂ）。対照的に、Ｄａｕｄｉ細胞に対して匹敵するアポトーシス活性を誘導するには、６００倍超高い濃度のリツキシマブ（すなわち２５０ｎＭ）が必要であった。また、この活性も、Ｆｃ突然変異体２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ及びＩＬ−１５突然変異体２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎ複合体で観察されたが（図１１Ｂ）、ｃ２６４Ｔ２Ｍでは観察されず、活性はＣＤ２０結合に依存性であったことを示した。あわせると、これらの所見は、２Ｂ８Ｔ２ＭがＩ型及びＩＩ型のような抗ＣＤ２０抗体の両方の特徴を呈することを示す。
【０２２３】
２Ｂ８Ｔ２Ｍはリツキシマブと比較して、優れた抗体依存細胞性細胞毒素（ＡＤＣＣ）を示す
Ｉ型及びＩＩ型のｍＡｂはいずれも、Ｂリンパ種細胞株に対して効率的なＦｃ依存性ＡＤＣＣを証明するようにみえる（１１）。しかしながら、２Ｂ８Ｔ２Ｍは、ＡＬＴ−８０３による従来の研究（７）によって支持されるように、ＩＬ−１５媒介免疫細胞活性化によってこの活性をさらに増大し得る。したがって、ＣＤ２０＋Ｂリンパ腫細胞に対してＡＤＣＣを方向付ける２Ｂ８Ｔ２Ｍ及びリツキシマブの能力を比較した。これを評価するために、最初にエフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用し、Ｄａｕｄｉ細胞を標的細胞として使用した。図１２Ａに示されるように、２Ｂ８Ｔ２Ｍは、Ｄａｕｄｉ細胞に対するＰＢＭＣによるＡＤＣＣの誘導において、リツキシマブより著しく有効であった。機能性Ｆｃを含まない他のＴ２Ｍ複合体（２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ）、生物学的に活性なＩＬ−１５（２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎ）、又はＣＤ２０結合能（ｃ２６４Ｔ２Ｍ）を使用することにより、２Ｂ８Ｔ２Ｍの増強されたＡＤＣＣ活性は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ突然変異体の活性と同様に（図１２Ａ）、一部は、抗ＣＤ２０及びＦｃ結合ドメインの各々に依存したことがさらに実証された。どの免疫細胞サブセットがＡＤＣＣにおいて役割を果たすのかを調べるため、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を補完し、同じアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。予想通り、結果は、ＮＫ細胞が、ＰＢＭＣのＡＤＣＣ活性に対する主な寄与体であるのに対し、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞は小さい或いは無視できるほどの役割を担う（図１２Ｂ）。さらに、リツキシマブと比較した場合、Ｄａｕｄｉ細胞に対する全ての細胞サブセットによって、２Ｂ８Ｔ２Ｍがより強いＡＤＣＣを誘導した。
【０２２４】
ヒト免疫細胞の可能性のある傷害性に対する２Ｂ８Ｔ２Ｍの効果をさらに評価するため、ドナーＰＢＭＣを２Ｂ８Ｔ２Ｍ及びグランザイムＢを含有する培地において言培養し、パーフォリンレベルをフローサイトメトリーによって評価した。２Ｂ８Ｔ２Ｍは、ＮＫ細胞においてグランザイムＢ及びパーフォリンの発現を上方制御し（図１２Ｃ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるグランザイムＢ発現（図１２Ｄ）は濃度依存的様式であった。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるパーフォリン発現は、２００ｎＭの２Ｂ８Ｔ２Ｍの添加よりもわずかに高いに過ぎなかった（図１２Ｄ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞によって上方制御されるグランザイムＢ及びパーフォリンは、無視できるほどであるか、存在しなかった。
【０２２５】
２Ｂ８Ｔ２Ｍの薬物動態及び生体内分布の視覚的及び定量的な尺度
６４Ｃｕ標識化２Ｂ８Ｔ２Ｍ及び６４Ｃｕ標識化リツキシマブの全身分布及び薬物動態の視覚的及び定量的な尺度として、連続する非侵入性ＰＥＴスキャンを使用した。６４Ｃｕ−ＩＬ−１５と比較した６４Ｃｕ標識化ＡＬＴ−８０３を投与したマウスの先の生体内分布の研究は、別個の薬物動態学的プロファイルを示し、腎経路による６４Ｃｕ−ＩＬ−１５の急速なクリアランスを実証するのに対し、ＡＬＴ−８０３クリアランスは肝臓において生じたが、リンパ器官では少なくとも７０時間保持された（１２）。この研究では、６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−２Ｂ８Ｔ２Ｍは肝胆道経路と腎経路の両方によってマウス身体から除去され、腎臓取り込みは低かった（図１３Ａ〜図１３Ｃ）。リンパ節における６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−２Ｂ８Ｔ２Ｍの取り込みは、以前に６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ＡＬＴ−８０３で観察されたもの（１２）に匹敵し、それは、これらの融合タンパク質の両方に対する高いＩＬ−１５受容体標的化効率を実証した。注射から（ｐ．ｉ．）６時間後に、６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−２Ｂ８Ｔ２Ｍのリンパ節取り込みは、マウスにおけるＡＬＴ−８０３（１８時間）と比較して相対的により長い循環半減期（１８４時間）のため（４）、１グラムの組織当たり４．２±０．５パーセントの注射用量（％ＩＤ／ｇ）で持続したままであり、注射から７０時間後であっても５．３±１．３％ＩＤ／ｇであった。比較のため、６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｍａｂ）は、異なる生体内分布プロファイルを有する６４Ｃｕ−２Ｂ８Ｔ２Ｍより長い血液循環を示した。６４Ｃｕ−ＮＯＴＡリツキシマブのリンパ節取り込みはより低かった（注射から６時間後、３．５±０．２％ＩＤ／ｇ、及び注射から７０時間後、４．１±０．８％ＩＤ／ｇ；図１３Ｂ）のに対し、血液及び筋肉における取り込みはより高かったものの、より高いバックグラウンドシグナルを生成した（図１３Ｄ〜図１３Ｆ）。この結果は、ＡＬＴ−８０３タンパク質スキャフォルドが、リンパ組織に対して２Ｂ８Ｔ２Ｍを優先的に送達するビヒクルを提供することを示唆する。
【０２２６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は２Ｂ８Ｔ２Ｍによって誘導される
先の研究は、ＡＬＴ−８０３複合体が、ＩＬ−１５と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏで著しくより強い免疫細胞賦活を示すことを実証した（４）。ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−１５、及び他のＴ２Ｍ複合体とｉｎ  ｖｉｖｏで比較した２Ｂ８Ｔ２Ｍの免疫賦活性活性を評価するためＣＤ３＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を単離し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識した。富化された、ｖｉｏｌｅｔ標識化ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を静脈内でＣ５７ＢＬ／６雌性マウスに養子移植し、そのマスをＰＢＳ対照、２Ｂ８Ｔ２Ｍ、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎ、ＡＬＴ−８０３、又はモル等価用量の遊離ＩＬ−１５のいずれかで移植後２日目に処理した。移植から５日後、マウス脾臓においてｖｉｏｌｅｔ陽性細胞をフローサイトメトリーによって評価した。図１４Ａに示されるように、２Ｂ８Ｔ２Ｍ治療マウスは、ＩＬ−１５又はＰＢＳで治療したマウスよりも脾臓において有意に高い（ｐ＜０．００１）割合のＣＤ８＋Ｔ細胞を示したが、ＡＬＴ−８０３治療群よりも有意少ないＣＤ８＋Ｔ細胞を示した（ｐ＜０．００１）。２Ｂ８Ｔ２Ｍを受けたマウスもまた、ＩＬ−１５又はＰＢＳで治療したマウスと比較して、脾臓においてより多い割合のＮＫ細胞を示した（ｐ＜０．００１；図１４Ｂ）。ＩＬ−１５又はＰＢＳで治療したマウスと比較して、脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージは、２Ｂ８Ｔ２Ｍで治療したマウスにおいて比較的減少された（図１４Ａ）。Ｆｃ突然変異体２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡによるマウスの治療は、２Ｂ８Ｔ２Ｍ治療群で見られるように、脾臓における養子移植されたＮＫ細胞及びＣＤ８＋細胞の同じパーセンテージの増加を示したのに対し、ＩＬ−１５突然変異体、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎによる治療は同様の効果を示さなかった。この結果は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄドメインがこれらの免疫細胞のサブセットにおける変化を担ったことを示した。
【０２２７】
レシピエントマウスの脾臓におけるドナーＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖をさらに調べた。図１４Ｃ及び図１４Ｄに示されるように、２Ｂ８Ｔ２Ｍにぃおる治療は、ＩＬ−１５又はＰＢＳによる治療と比較した養子移植された細胞の増殖の増加をもたらしたが、２Ｂ８Ｔ２Ｍ治療後の増殖は、後のＡＬＴ−８０３治療よりも低かった。脾臓の免疫細胞サブセットに対する効果と一致して、Ｆｃ突然変異体２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡは２Ｂ８Ｔ２Ｍに対して同様の免疫増殖性活性を有したのに対し、ＩＬ−１５突然変異体、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎによる治療は、養子移植されたリンパ球のわずかなｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖をもたらしたか、増殖がなかった。
【０２２８】
リツキシマブと比較したＳＣＩＤマウスにおけるＤａｕｄｉ  Ｂリンパ腫に対する２Ｂ８Ｔ２Ｍの優れた効能
２Ｂ８Ｔ２Ｍ及びリツキシマブの全体的なｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を比較するため、Ｄａｕｄｉ  Ｂリンパ腫／ＳＣＩＤマウスモデルを使用した。Ｄａｕｄｉ細胞（１×１０７）を雌性ＳＣＩＤマウスに静脈内注射し、接種から１５日後、骨髄における腫瘍細胞の存在を、ＰＥ複合化抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用するフローサイトメトリーによって確認した（すなわち、２匹のマウスが骨髄において０．５％及び２．８％のＤａｕｄｉ細胞を示した）。残りのＤａｕｄｉ細胞を持つマウスを３群に無作為化し、１５日目及び１８日目に１０ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ（非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者に対する臨床用量３７５ｍｇ／ｍ２当量）、５ｍｇ／ｋｇの２Ｂ８Ｔ２Ｍ又はビヒクル対照としてのＰＢＳで治療した。後脚麻痺を生存エンドポイントとして本研究に使用した。図１５Ａに示されるように、ＰＢＳ、リツキシマブ、及び２Ｂ８Ｔ２Ｍで治療されたマウス対するメジアン生存時間治療は、それぞれ、２７日間、３５日間、及び４２日間であった。リツキシマブが、ＰＢＳ対照群と比較してＤａｕｄｉ細胞を持つマウスの生存を有意に改善した（ｐ＝０．００１）のに対し、２Ｂ８Ｔ２Ｍ治療はリツキシマブと比較して生存をさらに延長した（ｐ＝０．００６）、
【０２２９】
フォローアップの用量応答研究では、Ｄａｕｄｉを持つマウスを６群に無作為化し、接種から１５日後及び１８日後に１０ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ；１２．８（１０ｍｇ／ｋｇのリツキシマブに対してモル当量）、５、１、又は０．２ｍｇ／ｋｇの２Ｂ８Ｔ２Ｍ；又はビヒクル対照としてのＰＢＳで治療した。２２日目にフローサイトメトリーによって骨髄中のＤａｕｄｉ腫瘍負荷を特定した。図１５Ｂに示されるように、リツキシマブで治療されたマウスの骨髄中のＤａｕｄｉ細胞のパーセンテージは、ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった（ｐ＝０．００３）。さらに１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ又は１２．８ｍｇ／ｋｇの２Ｂ８Ｔ２Ｍによるマウスの治療は、リツキシマブ（ｐ＜０．０１）又はＰＢＳ治療群（ｐ＜０．００１）で観察されたよりも、骨髄中の有意に低いＤａｕｄｉ腫瘍負荷をもたらしたのに対し、骨髄Ｄａｕｄｉ細胞の同等の減少が０．２ｍｇ／ｋｇの２Ｂ８Ｔ２Ｍ及びリツキシマブで治療された群（ｐ＝０．２４）で見られた。Ｄａｕｄｉ細胞に加えて、骨髄及び脾臓におけるＮＫ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって評価した。図１５Ｃ及び図１５Ｄに示されるように、リツキシマブ及びＰＢＳで治療されたマウスの骨髄においてＮＫ細胞パーのセンテージに差はなかった。しかしながら、全ての用量の２Ｂ８Ｔ２Ｍ治療マウスは、骨髄及び脾臓において、ＰＢＳ対照マウスと比較して、有意に高い割合のＮＫ細胞を示した（ｐ＜０．０５）。ＮＫ細胞レベルの増加は、２Ｂ８Ｔ２Ｍの強力な抗腫瘍活性に対して大きく寄与している可能性がある。ＮＫ細胞が２Ｂ８Ｔ２Ｍの抗腫瘍活性にとって不可欠かどうか評価するため、同様の動物研究を、ＳＣＩＤマウスと比較して、ＮＫ細胞活性が遺伝的に縮小されているＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスで行った（図１５Ｅ）。Ｄａｕｄｉを持つＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスを３つの治療群に無作為化し、１０ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ、５ｍｇ／ｋｇの２Ｂ８Ｔ２Ｍ、又はビヒクル対照としてのＰＢＳで治療した。驚いたことに、Ｄａｕｄｉ細胞のパーセンテージは、対照と比較して、２Ｂ８Ｔ２Ｍ治療マウス及びリツキシマブ治療マウスの骨髄においてなおも有意に低く（ｐ＜０．０１）、ＮＫ細胞が２Ｂ８Ｔ２Ｍ又はリツキシマブの抗腫瘍活性に必須ではないことを示した。これは、２Ｂ８Ｔ２ＭがＡＤＣＣによって抗腫瘍活性を誘導しながら、この融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性はそのアポトーシス効果、及びＮＫ細胞活性が縮小されたマウスにおける腫瘍細胞に対するＣＤＣによって保持されることをさらに示唆する。また、マクロファージ及び好中球も、ＡＤＣＣ及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）機能を示すと知られている（１３）。マクロファージ及び好中球がＳＣＩＤマウスにおけるこの融合タンパク質の抗腫瘍活性に寄与する可能性がある。さらに、このモデルにおける２Ｂ８Ｔ２Ｍの効能がＤａｕｄｉ  ＳＣＩＤマウスモデルにおける効能よりも減少されることから、ＮＫ細胞が２Ｂ８Ｔ２Ｍの抗腫瘍活性の増大に役割を果たす可能性がある。
【０２３０】
ＳＣＩＤマウスにおけるＤａｕｄｉ  Ｂリンパ腫に対する２Ｂ８Ｔ２Ｍの様々なドメインの抗腫瘍活性
２Ｂ８Ｔ２Ｍの種々のドメインの機能を詳細に調べるため、２Ｂ８Ｔ２Ｍ、Ｆｃ突然変異体２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ及びＩＬ−１５突然変異体２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎの抗腫瘍活性を、Ｄａｕｄｉ  Ｂリンパ腫／ＳＣＩＤマウスモデルにおいて比較した。図１６Ａに示されるように、５ｍｇ／ｋｇで投与された全ての試験薬は、ＰＢＳ治療群と比較して、骨髄におけるＤａｕｄｉ腫瘍負荷を著しく減少させた。さらに、Ｆｃ突然変異体２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ及びＩＬ−１５突然変異体２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎは、２Ｂ８Ｔ２Ｍよりも骨髄におけるＤａｕｄｉ腫瘍負荷減少させることにそれほど有効ではなかった（ｐ＜０．０５）。さらに、ｃ２６４Ｔ２Ｍを別々の実験において非ターゲッティング対照複合体として使用し、２Ｂ８Ｔ２Ｍよりも骨髄におけるＤａｕｄｉ細胞パーセンテージを減少させることにそれほど有効ではないと分かった（図１６Ｂ）。総合すれば、これらの所見は、ＩＬ−１５媒介免疫活性化、Ｆｃドメイン活性、及びＣＤ２０の２Ｂ８特異的ターゲティングが、いずれもＤａｕｄｉ  Ｂリンパ腫に対する２Ｂ８Ｔ２Ｍの有効なｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性に対する重要な寄与体であったことを示した。
【０２３１】
カニクイザルにおける２Ｂ８Ｔ２ＭによるＢ細胞枯渇
Ｄａｕｄｉ  Ｂリンパ腫／ＳＣＩＤマウスモデルにおける２Ｂ８Ｔ２Ｍに関する効能研究に続いて、２Ｂ８Ｔ２ＭがＢ細胞を消耗する能力をカニクイザルでさらに調査した。０日目及び３日目に動物（ｎ＝４／群）に５ｍｇ／ｋｇの２Ｂ８Ｔ２Ｍ、１０ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ、又はビヒクル対照としてのＰＢＳを静脈内注射した後、７日目に安楽死させた。脾臓及び腸間膜リンパ節を収集し、フローサイトメトリーによってＢ細胞及び他のリンパ球サブセットのレベルについて評価した。また、末梢血中のＢ細胞パーセンテージの変化を、投薬前、並びに１日目（第１の投薬後２４時間）、３日目（第２の投薬前）、４日目（第２の投薬後２４時間）、５日目、及び７日目に採取した試料を使用して特定した。図１７Ａ図１７Ｂに示されるように、末梢血中のＢ細胞は、第１の投薬の１日後に２Ｂ８Ｔ２Ｍ治療群と及びリツキシマブ治療群の両方で効果的に枯渇された。第２の投薬に続いて、２Ｂ８Ｔ２Ｍで治療した動物の末梢血中のＢ細胞レベルは、リツキシマブで治療された動物と比較してさらに減少されたが、この効果は必ずしも、統計学的有意だとは限らなかった（４日目にｐ＝０．００４、５日目にｐ＝０．０５１及び７日目にｐ＝０．０６７）。興味深いことに、２Ｂ８Ｔ２Ｍで治療されたサルのリンパ節中のＢ細胞のパーセンテージは、ＰＢＳで治療群より著しく低かった。しかしながら、リツキシマブ治療群とＰＢＳ治療群との間に有意差はなかった。２Ｂ８Ｔ２Ｍによる治療は、推測上は免疫細胞の増殖及び輸送に対するＩＬ−１５Ｎ７２Ｄドメインの免疫賦活性効果に起因して、リンパ節ＮＫ細胞のパーセンテージの著しい増加（２．４倍対対照）、並びに血液ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞（それぞれ、０．８倍及び０．５倍対対照）及び脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（０．４倍対対照）のパーセンテージの減少をもたらした。対照的に、リツキシマブ治療は、脾臓のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞パーセンテージの１．４倍〜１．８倍の増加をもたらし（ｐ＜０．０５）、Ｂ細胞喪失に対する補整効果の可能性がある。著しい有害作用は２Ｂ８Ｔ２Ｍ治療群又はリツキシマブ治療群のいずれでも観察されなかった。
【０２３２】
腫瘍細胞上の特異性抗原を認識するモノクローナル（ｍＡｂｓ）が現在癌治療として使用される。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％超で発現されるＣＤ２０抗原を標的化するリツキシマブは、１０年以上に亘って患者における使用に成功している。抗ＣＤ２０ｍＡｂｓの作用機構は、標的細胞のアポトーシス、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び食作用を含む（１４）。ｍＡｂｓの抗腫瘍活性は主にＡＤＣＣにより、それは、エフェクター細胞の活性化を増強するアジュバント療法でさらに改善され得る。ＩＬ−１５は、ＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞の強力な賦活因子及び活性化因子であり、ｍＡｂｓと組み合わされてＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣを増強し得る、台頭しつつある癌免疫治療剤である（１５）。ＩＬ−１５スーパーアゴニスト、ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ突然変異体の複合体、及び二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃ融合タンパク質が作られた。ＡＬＴ−８０３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで優れた活性を示す。ＩＬ−１５と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮ７２Ｄ突然変異はＩＬ−１５の生物学的活性を約５倍増加させ、さらにＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃ複合体はＩＬ−１５の活性を約２５倍増強する（３、４）。また、ＡＬＴ−８０３は、天然ＩＬ−１５よりも、免疫細胞表面に提示されたＩＬ−２ＲβγＣ複合体とのより大きな結合活性、実質的により長い結成半減期、並びにリンパ組織におけるより良好な分布及び保持を有する（３、４、１２）。強力な免疫賦活性及び抗腫瘍特性を示すことにより、ＡＬＴ−８０３は、単剤として又は他の治療法と組み合わせていずれかで動物モデルにおける様々な腫瘍に対して有効な薬剤である（５、６）。例えば、ＡＬＴ−８０３賦活は、Ｂ細胞リンパ腫細胞株又は初代濾胞性リンパ腫細胞に対するヒトＮＫ細胞によるリツキシマブ媒介ＡＤＣＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで著しく増加させた。さらに、２つの異なるＢ細胞リンパ腫マウスモデルにおいて、抗ＣＤ２０  ｍＡｂ治療に対するＡＬＴ−８０３の添加は、腫瘍細胞負荷の著しい減少、及び生存の増加を提供した（７）。その結果、ＡＬＴ−８０３は、現在、固体及び血液学的な悪性腫瘍に対する複数の臨床試験にある。（同種異系幹細胞移植後の血液系悪性腫瘍の再発、難治性多発性骨髄腫、及び無痛性非ホジキンリンパ腫；それぞれＮＣＴ０１８８５８９７、ＮＣＴ０２０９９５３９及びＮＣＴ０２３８４９５４）。本明細書に記載される研究では、ＡＬＴ−８０３が、新規の多価抗原特異性免疫治療的複合体複合体の作製のための多目的なタンパク質スキャフォルドとして修飾され得ることをさらに実証した。２Ｂ８Ｔ２Ｍと称される標的化免疫治療薬が構築された。この融合タンパク質は、リツキシマブ及びＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃの認識ドメインからなり、アポトーシス促進活性及びｉｎ  ｖｉｖｏ免疫細胞賦活を示しながら、Ｂリンパ腫に対してＡＤＣＣ及びＣＤＣを媒介することができる。したがって、単一分子としての２Ｂ８Ｔ２Ｍ複合体は、ＡＬＴ−８０３の免疫賦活性特性に加えてリツキシマブの抗ＣＤ２０特性を保持する。リツキシマブと比較した場合、２Ｂ８Ｔ２Ｍは改善された抗腫瘍活性を実証し、Ｄａｕｄｉ  Ｂリンパ腫を持つＳＣＩＤマウスの延長された生存をもたらす。さらに、２Ｂ８Ｔ２Ｍ治療ＳＣＩＤマウスにおけるＮＫ細胞の割合の増加は、ＮＫ細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの２Ｂ８Ｔ２Ｍの増強された抗腫瘍活性において極めて重要な役割を果たすことを示唆する。ＮＫ細胞が２Ｂ８Ｔ２Ｍの抗腫瘍活性にとって不可欠かどうかをさらに評価するため、ＮＫ細胞が欠乏しているＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅ  ＳＣＩＤマウスで同様の動物研究を行った。驚いたことに、Ｄａｕｄｉ細胞パーセンテージは、ビヒクル対照と比較して、２Ｂ８Ｔ２Ｍ−治療ＳＣＩＤマウスの骨髄においてなおも著しく低くかった。これは、減少したＮＫ細胞活性を有するマウスにおけるそのアポトーシスの作用及びＣＤＣによってこの融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性が保持され得ることを示唆する。マクロファージ及び好中球もＡＤＣＣ機能を示すと知られている（１３）。マクロファージ及び好中球が、ＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスにおけるこの融合タンパク質に対するＮＫ細胞のＡＤＣＣ機能を置き換えることができる可能性がある。ＳＣＩＤマウス研究による結果と異なり、ＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスにおける２Ｂ８Ｔ２Ｍとリツキシマブの間の抗腫瘍活性に著しい差はない。したがって、ＮＫ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで２Ｂ８Ｔ２Ｍ抗腫瘍活性を増強した。これが、ＮＫ細胞集団を拡大した及び／又はＮＫ細胞のＡＤＣＣ機能を上方制御した、２Ｂ８Ｔ２ＭのＩＬ−１５成分の結果であると考えられる。
【０２３３】
抗ＣＤ２０  ｍＡｂｓはＮＨＬの治療では効果的に使用された。Ｉ型及びＩＩ型の抗ＣＤ２０抗体は、各々、ＣＤ２０＋細胞に対するＡＤＣＣ及び食作用を媒介するため、ＦｃＲ発現細胞を誘引することができる（１６）。重要なことには、Ｉ型及びＩＩ型の抗体はいずれも、様々なＣＤ２０＋Ｂ−リンパ腫又はＢ細胞媒介自己免疫疾患に対するそれらの活性に基づく臨床的な使用に対して承認されている（１７、１８）。この研究で示されるように、２Ｂ８Ｔ２Ｍは増強されたアポトーシス活性を示しながら、ＣＤ２０＋標的細胞に対するリツキシマブ様のＣＤＣを保持する。これらの知見は、２Ｂ８Ｔ２Ｍが、強力なＮＫ細胞エフェクター反応に対するＩＬ−１５に基づく免疫賦活性活性によるＡＤＣＣの強い増強に加えて、Ｉ型及びＩＩ型の両方の抗ＣＤ２０抗体の機能的利点を持つことを示す。２Ｂ８Ｔ２Ｍのアポトーシス促進活性は、ＦｃＲ結合又はＩＬ−１５活性に対してではなく、ＣＤ２０結合ドメインに依存する。先の研究は、化学架橋されたリツキシマブホモ二量体及び組み換え四量体リツキシマブｓｃＦｖ−Ｉｇ融合体が単量体リツキシマブよりも優れたＢリンパ腫細胞に対するアポトーシス誘導活性を有することを示した（１９、２０）。また、これらの結果は、リツキシマブと比較された２Ｂ８Ｔ２Ｍの増強されたアポトーシス促進活性が、ＣＤ２０＋細胞に対してその多価結合能に起因する可能性があることを示唆する。
【０２３４】
ＡＬＴ−８０３は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導して増殖させ、ＮＫＧ２Ｄを上方制御し、ＩＦＮ−γを分泌させ、抗原刺激（５、２１）の不在下で悪性細胞を死滅させる能力を獲得する。本明細書に提示される結果は、ＣＤ２０特異的複合体（２Ｂ８Ｔ２Ｍ）がＡＬＴ−８０３の特有の能力を保持することを示す。例えば、養子免疫細胞移植実験は、２Ｂ８Ｔ２ＭがメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の拡大を促進したことを示した。したがって、ＡＬＴ−８０３と比較して、ｓｃＦｖドメインは相対的なＩＬ−１５活性をほぼ６０倍低下させたが、２Ｂ８Ｔ２Ｍの抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖドメインはメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞上のＡＬＴ−８０３成分の生物学的効果を変更しなかった。２Ｂ８Ｔ２ＭのＩＬ−１５活性の減少は、同様の効果が他のＩＬ−１５融合（３、８）で見られたことから、ＩＬ−２ＲβγＣに対するＩＬ−１５Ｎ７２Ｄの結合ドメインに影響する抗ＣＤ２０単鎖Ａｂの立体障害による可能性がある。これらの融合分子のより低いＩＬ−１５活性は、一般にこの種の分子の臨床的有用性を増強し得る。抗体のＡＤＣＣ有効性の決定的要因のうちの１つが、濃度であり、標的細胞上のその結合密度に影響することが示された（２２）。これらの融合分子のより低いＩＬ−１５活性は、望ましくない免疫関連全身毒性を誘導することのない有効なＡＤＣＣのため、潜在的により高い用量レベルでのそれらの投与を可能にし得る。この研究においてネズミ科と非ヒト霊長類モデルの両方で示される２Ｂ８Ｔ２ＭのＡＤＣＣ依存性の効能及び良好な耐用性を示す安全性プロファイルは、この点を実証し、これらの分子の臨床上の有用性を支持する。
【０２３５】
天然のＩＬ−１５による比較生体内分布研究では、ＡＬＴ−８０３は、マウスのリンパ器官に分布され、より良好に保持された（１２）。同様に、２Ｂ８Ｔ２Ｍ生体内分布データは、少なくとも７０時間に亘り、リンパ組織における取り込み及び保持を示す。非ヒト霊長類におけるＣＤ４０＋Ｂ細胞枯渇研究では、より低用量レベルの２Ｂ８Ｔ２Ｍは、特にリンパ節においてリツキシマブより効果的であったことが分かった。また、２Ｂ８Ｔ２Ｍ治療は、対照と比較して、リンパ節のＮＫ細胞のパーセンテージの著しい増加を誘導した。２Ｂ８Ｔ２Ｍはリンパ組織において保持され、ＩＬ−１５成分によってかなりの期間に亘ってＴ細胞及びＮＫ細胞を潜在的に刺激すると考えられるのに対し、リツキシマブはこの活性を欠く。パーフォリン及びグランザイムＢの誘導に起因する可能性がある（２３）このＮＫ細胞の刺激は、Ｂ細胞に対するＡＤＣＣを著しく増強し得る。したがって、これらの融合分子は、Ｂ細胞リンパ腫に対して特に有効な可能性がある。
【０２３６】
また、治療抗体のＡＤＣＣは、「ワクチン効果」によって癌細胞上に提示される標的抗原に対する適応的免疫応答を誘導することが実証された（１４、２４〜２６）。この効果はＦｃ依存性であり、再チャレンジに続く腫瘍拒絶によって宿主に永続的なメモリー応答を提供する（２７）。２Ｂ８Ｔ２Ｍの成分であるＩＬ−１５は、エフェクター及びメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の発達に必要なサイトカインである。したがって、２Ｂ８Ｔ２Ｍ分子のＩＬ−１５成分は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を活性化することにより、標的抗原に対して治療抗体単独より強い「ワクチン効果」を可能とし得る。また、ＡＬＴ−８０３スキャフォルドは、リツキシマブ結合ドメインのリンパ組織保持を増強したことに注目すべきである。したがって、ＡＬＴ−８０３スキャフォルドは、免疫系活性化のためリンパ器官に対して融合成分を送達するためのビヒクルとなり得る。
【０２３７】
これらの研究は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃに基づく足場分子が抗体、接着分子又は他の受容体に由来する複数の標的認識ドメインに融合される可能性がある。適切な標的ドメインにより、得られる複合体は、様々な免疫のエフェクター細胞の接合を促進し、特異的な標的を提示する癌細胞又はウイルス感染細胞を含む標的細胞の破壊を媒介することができた。複合体のＩＬ−１５ドメインは、エフェクター細胞の増殖及び傷害性を支持するため、免疫賦活性活性を提供し得た。また、この単一の融合タンパク質アプローチは、併用免疫療法を使用する複雑な治療レジメンの必要をなくすであろう。したがって、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃスキャフォルド複合体は、癌及び感染症に対する標的化免疫治療薬としてのＩＬ−１５の有望な可能性を利用するための特有の機会を提供し得る。
【０２３８】
以下の実験手順を、この実施例に利用した。
【０２３９】
マウス及び細胞株
ＦＯＸ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−Ｐｒｋｄｃ−ｓｃｉｄ）、ＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅ（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＬｙｓｔｂｇ−Ｊ）及びＣ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄマウス（６週齢〜８週齢の雌Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＡｌｔｏｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅの動物施設で飼育した。全ての動物研究を、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に承認されたプロトコルのもと、国立衛生研究所（ＮＩＨ）動物ケアガイドラインに従って行った。
【０２４０】
ヒトＤａｕｄｉ  Ｂリンパ腫細胞株を米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ）から購入し、完全Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）−１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２にて、慣例に従って培養した。これらの研究での使用に先立って、２０１４年及び２０１５年に、細胞増殖形態学（リンパ芽球）、生育特性、フローサイトメトリーによるヒトＣＤ２０の均一な発現の表現型、及びＡＤＣＣに対する抗ＣＤ２０ｍＡｂオプソニン化標的として機能性であることを確認することで、Ｄａｕｄｉ細胞であることを証明した。ＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞（３）を、（メリーランド州フレデリックの国立癌研究所、Ｄｒ．Ｊ．Ｙｏｖａｎｄｉｃｈの善意により提供された）１ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５で補足した完全イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）において培養した。
【０２４１】
ｓｃ２Ｂ８融合コンストラクトの作製
可溶性単鎖２ドメイン抗ＣＤ２０  ｍＡｂコンストラクト（ｓｃ２Ｂ８）を作製するため、２Ｂ８  ｍＡｂ軽鎖及び重鎖のＶ遺伝子セグメントを２Ｂ８ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ）からクローニングした。ＶＬ遺伝子セグメントをリンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３によってＶＨ遺伝子セグメントの５’末端に融合させた。ｓｃ２Ｂ８遺伝子を、以下を含むＩＬ−１５変異タンパク質配列の５’末端に融合した：（１）ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）、（２）ＩＬ−１５アンタゴニスト（ＩＬ−１５Ｄ８Ｎ）、また同様に、以前に記載される融合コンストラクト（ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃ）の５’末端（３）。ＦｃＲ結合不全変異タンパク質を作製するため、ｓｃ２Ｂ８を、そのｈＩｇＧ１重鎖アミノ酸２３４及び２３５がロイシンからアラニンへと突然変異された（１０）ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃ−ＬＡへ融合した。可溶性単鎖３ドメインＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ（キメラヒトｐ５３（２６４−２７２）特異的単鎖ＴＣＲ）もまた、先に記載の通りに作製された（３、８）。ｓｃ２Ｂ８融合体と同様に、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃのコンストラクトを作製するため、ｃ２６４ｓｃＴＣＲをＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃに融合させた。得られたｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃ（２Ｂ８Ｔ２Ｍ）、ｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５Ｄ８Ｎ：ｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃ（２Ｂ８Ｔ２Ｍ−Ｄ８Ｎ）、ｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ｓｃ２Ｂ８−ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃ−ＬＡ（２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡ）、及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃ（ｃ２６４Ｔ２Ｍ）の遺伝子をｐＭＳＧＶレトロウイルスベクターにおいて発現させた（２８）。
【０２４２】
融合タンパク質の産生及び精製
様々なコンストラクトを含む発現ベクターを、ＡＴＣＣ由来のＣＨＯ細胞へトランスフェクトした後、適切な抗生物質を含有する培地において選択した。融合タンパク質の産生のため、組み換えＣＨＯ細胞を、３７℃にて血清不含限定培地（ＳＦＭ４ＣＨＯ、ユタ州ローガンのＨｙｃｌｏｎｅ）中で成長させた。培養物の生存細胞密度が最大に達すると、可溶性複合体の蓄積のため、インキュベーション温度を１０日間〜１４日間に亘って３０℃に下げた。免疫親和性プロテインＡクロマトグラフィーによって、融合タンパク質を組み換えＣＨＯ細胞培養物上清から精製した。試料充填に先立って、カラムを５カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄し、５ＣＶの０．１Ｎ  ＮａＯＨで１時間消毒し、次いで７ＣＶの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化した。上清を２ｍＬ／分でカラムに充填し、その後、カラムを８ＣＶの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄し、続いて７ＣＶの洗浄バッファー（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）で洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去した。その後、タンパク質を０．２Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で溶出させ、収集されたピーク画分のｐＨを２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を使用して直ちに中和した。上記調製物を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濃縮器（３０ｋＤａのカットオフ、マサチューセッツ州ビレリカのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、バッファーをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に交換した。精製された融合タンパク質内の凝集塊をサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。精製融合タンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１２％Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓゲル）を還元した後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を行うことにより分析した。２Ｂ８Ｔ２Ｍ分子の均一性をサイズ排除クロマトグラフィーによって特性評価した。融合タンパク質は少なくとも１２ヶ月間に亘って４℃で安定であった（データは示していない）。
【０２４３】
フローサイトメトリー分析
２Ｂ８Ｔ２ＭのＣＤ２０結合特性を確認するため、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦＩＴＣ標識化された２Ｂ８Ｔ２Ｍ又はリツキシマブで染色し、結合特異性を非標識化２Ｂ８Ｔ２Ｍ又はリツキシマブ出ブロッキングすることにより実証した。２Ｂ８Ｔ２ＭＦｃ受容体結合を確認するため、ヒトヒト組織球性リンパ腫Ｕ９３７細胞株（ＡＴＣＣ）を、ＦＩＴＣ標識化された２Ｂ８Ｔ２Ｍ、リツキシマブ又は２Ｂ８Ｔ２Ｍ−ＬＡで染色した。染色されたＰＢＭＣ及びＵ９３７細胞を、ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅで分析した。
【０２４４】
細胞増殖アッセイ
以前に記載される通り（３、８）に、３２Ｄβ細胞の増殖を測定した。簡潔には、３２Ｄβ細胞（１×１０４細胞／ウェル）を融合タンパク質と３７℃で４８時間インキュベートした。細胞増殖試薬であるＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を少なくとも４時間の間添加した。ＷＳＴ−１の着色されたホルムアザン色素への変換を４５０ｎｍでの吸光度測定によって判断した。Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用し、用量反応曲線に基づいてＥＣ５０を決定した。
【０２４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ傷害性アッセイ
ＣＤＣアッセイ−Ｄａｕｄｉ細胞を、２Ｂ８Ｔ２Ｍ、その変異タンパク質又はリツキシマブの存在下、３７℃で２時間に亘りＲＰＭＩ−１０中でインキュベートした。補体反応のため正常ヒト血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。Ｄａｕｄｉ細胞の生存率をヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）染色により特定し、ＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅで分析した。
【０２４６】
ＡＤＣＣアッセイ
製造業者の指示に従って、Ｄａｕｄｉ細胞はＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識化され、標的細胞としての役割を果たした。新鮮なヒトＰＢＭＣ又はＭＡＣＳ精製ＮＫ細胞を血液バフィーコート（ＯｎｅＢｌｏｏｄ）から単離し、エフェクター細胞として使用した。２Ｂ８Ｔ２Ｍ、その変異タンパク質又はリツキシマブの存在下で指定のエフェクター：標的比でエフェクター細胞をＤａｕｄｉ細胞ト混合した。３７℃、５％ＣＯ２での２日間〜３日間のインキュベーションの後、Ｄａｕｄｉ細胞生存率をヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）染色によって評価し、ＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅで分析した。
【０２４７】
アポトーシスアッセイ
Ｄａｕｄｉ細胞を２Ｂ８Ｔ２Ｍ、その変異タンパク質又はリツキシマブの存在下で３７℃にて３日間、ＲＰＭＩ−１０においてインキュベートした。３日目にＤａｕｄｉ細胞をＦＩＴＣ複合Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、パーセントアポトーシスＤａｕｄｉ細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅで分析した。
【０２４８】
陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージング及び組織生体内分布の研究
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０ＭＢｑ〜１５ＭＢｑの６４Ｃｕ標識化２Ｂ８Ｔ２Ｍ及び６４Ｃｕ−ＮＯＴＡリツキシマブを静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。Ｉｎｖｅｏｎ  ｍｉｃｒｏＰＥＴ／ｍｉｃｒｏＣＴ齧歯類モデルスキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して、注射後の様々な時間点で麻酔をかけた動物に対して静的ＰＥＴスキャンを行った。組織１グラム当たりのパーセント注入用量（％ＩＤ／ｇ）を計算するため、データ取得、画像再構築、及び目的領域の分析を先に記載される（２９、３０）通りに行った。各組織における放射活性を、ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定し、％ＩＤ／ｇとして提示する。
【０２４９】
腫瘍モデル
１×１０７個のＤａｕｄｉ細胞／マウスの静脈内注射の後、癌を持つＦＯＸ  Ｃｈａｓｅ  ＳＣＩＤマウス又はＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスを生存エンドポイントとしての役割を果たす後脚麻痺について詳しくモニターした。骨髄中のＤａｕｄｉ細胞の割合を、ＰＥ複合化抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ）によって特定した。
【０２５０】
Ｔ細胞標識化及び養子免疫細胞移植
ドナーＣ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄマウスの脾臓及びリンパ節に由来するＣＤ３＋富化細胞（ＣＤ３濃縮カラム、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造業者の指示に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識化した。研究０日目（ＳＤ０）に１×１０７個のＶｉｏｌｅｔ標識化細胞を同系Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄマウスに養子移植した。ＳＤ２に、静脈内注射でマウスを試験物質で治療した。ＳＤ５に脾臓を採取し、ドナーリンパ球増殖（Ｖｉｏｌｅｔ標識化）及びリンパ球サブセットの組成についてフローサイトメトリーによって分析した。
【０２５１】
カニクイザルの研究
雄性カニクイザル（２．２０ｋｇ〜２．８５ｋｇ、２歳〜３歳）は、Ｙｕｎｎａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｉｍａｔｅ，Ｉｎｃ．（中国、昆明）によって提供された。この研究は、Ｙｕｎｎａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｉｍａｔｅ，Ｉｎｃ．のＩＡＣＵＣによって承認された研究計画に従って行われた。研究の０日目及び３日目に５ｍｇ／ｋｇの２Ｂ８Ｔ２Ｍ、１０ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ、及び治療対照としての役割を果たすＰＢＳを静脈内投与した。７日目にカニクイサルを安楽死させ、免疫細胞分析のため脾臓及び腸間膜リンパ節を採取し、処理した。血液試料を投薬前、１日目（投薬後２４時間）、３日目（投薬後２）、４日目（投薬後２４時間）、５日目及び７日目に採取した。
【０２５２】
データ分析
生存データをカプラン−マイヤー法を使用して分析した。連続変数の比較をスチューデントｔ検定又は分散分析（両側）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４）を使用して行った。ｐ値≦０．０５を有意とした。
【０２５３】
以下の参照文献を本実施例において引用した。
参照文献
１．Ｆｅｈｎｉｇｅｒ，Ｔ．Ａ．，ａｎｄ  Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｍ．Ａ．（２００１）Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １５：ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ  ９７，１４−３２
２．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．（２００６）Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，５９５−６０１
３．Ｚｈｕ，Ｘ．，Ｍａｒｃｕｓ，Ｗ．Ｄ．，Ｘｕ，Ｗ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｉ．，Ｈａｎ，Ｋ．，Ｅｇａｎ，Ｊ．Ｏ．，Ｙｏｖａｎｄｉｃｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｒｈｏｄｅ，Ｐ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｈ．Ｃ．（２００９）Ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３，３５９８−３６０７
４．Ｈａｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｚｈｕ，Ｘ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｊｅｎｇ，Ｅ．，Ｋｏｎｇ，Ｌ．，Ｙｏｖａｎｄｉｃｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｖｙａｓ，Ｖ．Ｖ．，Ｍａｒｃｕｓ，Ｗ．Ｄ．，Ｃｈａｖａｉｌｌａｚ，Ｐ．Ａ．，Ｒｏｍｅｒｏ，Ｃ．Ａ．，Ｒｈｏｄｅ，Ｐ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｈ．Ｃ．（２０１１）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ５６，８０４−８１０
５．Ｘｕ，Ｗ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｚｈｕ，Ｘ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ａ．Ｃ．，Ｋｏｎｇ，Ｌ．，Ｊｅｎｇ，Ｅ．Ｋ．，Ｈａｎ，Ｋ．，Ｍａｒｃｕｓ，Ｗ．Ｄ．，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｒｈｏｄｅ，Ｐ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｈ．Ｃ．（２０１３）Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ−ｏｆ−ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａＳｕ／Ｆｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７３，３０７５−３０８６
６．Ｍａｔｈｉｏｓ，Ｄ．，Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｋ．，Ｍａｒｃｕｓ，Ｗ．Ｄ．，Ａｌｔｅｒ，Ｓ．，Ｒｈｏｄｅ，Ｐ．Ｒ．，Ｊｅｎｇ，Ｅ．Ｋ．，Ｗｏｎｇ，Ｈ．Ｃ．，Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｌｉｍ，Ｍ．（２０１６）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１５  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ＡＬＴ−８０３  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｄｕｒａｂｌｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｏｄｅｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １３８，１８７−１９４
７．Ｒｏｓａｒｉｏ，Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｋｏｎｇ，Ｌ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｌ．Ｉ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｓ．Ｅ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｈａｎ，Ｋ．，Ｊｅｎｇ，Ｅ．Ｋ．，Ｒｈｏｄｅ，Ｐ．Ｒ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｃｈａｐｐｅ，Ｔ．，Ｊｅｗｅｌｌ，Ｂ．Ａ．，Ｋｅｐｐｅｌ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｈａｈ，Ｋ．，Ｈｅｓｓ，Ｂ．，Ｒｏｍｅｅ，Ｒ．，Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｃａｓｈｅｎ，Ａ．Ｆ．，Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，Ｗｏｎｇ，Ｈ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｆｅｈｎｉｇｅｒ，Ｔ．Ａ．（２０１６）Ｔｈｅ  ＩＬ−１５−Ｂａｓｅｄ  ＡＬＴ−８０３  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ−Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，５９６−６０８
８．Ｗｏｎｇ，Ｒ．Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｚｈｕ，Ｘ．，Ｙｏｕ，Ｌ．，Ｋｏｎｇ，Ｌ．，Ｈａｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｉ．，Ｃｈａｖａｉｌｌａｚ，Ｐ．Ａ．，Ｊｉｎ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｒｈｏｄｅ，Ｐ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｈ．Ｃ．（２０１１）Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２４，３７３−３８３
９．Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｕｓｕｄａ，Ｓ．，Ｏｋａｂｅ，Ｍ．，Ｍｉｙａｋｏｄａ，Ｈ．，Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｍ．，Ｈａｎａｏｋａ，Ｈ．，Ｔｅｓｈｉｇａｗａｒａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｎｉｗａ，Ｏ．（２００７）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  ２Ｂ８  ａｎｄ  ｃ２Ｂ８（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ３１，２９−４０
１０．Ｈｅｓｓｅｌｌ，Ａ．Ｊ．，Ｈａｎｇａｒｔｎｅｒ，Ｌ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｍ．，Ｈａｖｅｎｉｔｈ，Ｃ．Ｅ．，Ｂｅｕｒｓｋｅｎｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｂａｋｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｌａｎｉｇａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｌａｎｄｕｃｃｉ，Ｇ．，Ｆｏｒｔｈａｌ，Ｄ．Ｎ．，Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．Ｗ．，Ｍａｒｘ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．（２００７）Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４９，１０１−１０４
１１．Ｂｅｅｒｓ，Ｓ．Ａ．，Ｃｈａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．（２０１０）ＣＤ２０  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ４７，１０７−１１４
１２．Ｒｈｏｄｅ，Ｐ．Ｒ．，Ｅｇａｎ，Ｊ．Ｏ．，Ｘｕ，Ｗ．，Ｈｏｎｇ，Ｈ．，Ｗｅｂｂ，Ｇ．Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｚｈｕ，Ｘ．，Ｗｅｎ，Ｊ．，Ｙｏｕ，Ｌ．，Ｋｏｎｇ，Ｌ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ａ．Ｃ．，Ｈａｎ，Ｋ．，Ｓｈｉ，Ｓ．，Ａｌｔｅｒ，Ｓ．，Ｓａｃｈａ，Ｊ．Ｂ．，Ｊｅｎｇ，Ｅ．Ｋ．，Ｃａｉ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｈ．Ｃ．（２０１６）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘ，ＡＬＴ−８０３，ｔｏ  ＩＬ１５  ａｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４，４９−６０
１３．Ｓｉｐｓ，Ｍ．，Ｋｒｙｋｂａｅｖａ，Ｍ．，Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ，Ｔ．Ｊ．，Ｇｈｅｂｒｅｍｉｃｈａｅｌ，Ｍ．，Ｂｏｗｍａｎ，Ｂ．Ａ．，Ｄｕｇａｓｔ，Ａ．Ｓ．，Ｂｏｅｓｃｈ，Ａ．Ｗ．，Ｓｔｒｅｅｃｋ，Ｈ．，Ｋｗｏｎ，Ｄ．Ｓ．，Ａｃｋｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｓｕｓｃｏｖｉｃｈ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｒｏｕｃｋａｅｒｔ，Ｐ．，Ｓｃｈａｃｋｅｒ，Ｔ．Ｗ．，ａｎｄ  Ａｌｔｅｒ，Ｇ．（２０１６）Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ＨＩＶ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
１４．Ａｂｅｓ，Ｒ．，Ｇｅｌｉｚｅ，Ｅ．，Ｆｒｉｄｍａｎ，Ｗ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｔｅｉｌｌａｕｄ，Ｊ．Ｌ．（２０１０）Ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｂｌｏｏｄ  １１６，９２６−９３４
１５．Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｅｒｂｅ，Ａ．Ｋ．，Ｈａｎｋ，Ｊ．Ａ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｚ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｏｎｄｅｌ，Ｐ．Ｍ．（２０１５）ＮＫ  Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，３６８
１６．ｖａｎ  Ｍｅｅｒｔｅｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ，Ａ．（２０１０）ＣＤ２０−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ４７，１９９−２１０
１７．Ｇｏｅｄｅ，Ｖ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｋ．，Ｂｕｓｃｈ，Ｒ．，Ｅｎｇｅｌｋｅ，Ａ．，Ｅｉｃｈｈｏｒｓｔ，Ｂ．，Ｗｅｎｄｔｎｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈａｇｏｒｏｖａ，Ｔ．，ｄｅ  ｌａ  Ｓｅｒｎａ，Ｊ．，Ｄｉｌｈｕｙｄｙ，Ｍ．Ｓ．，Ｉｌｌｍｅｒ，Ｔ．，Ｏｐａｔ，Ｓ．，Ｏｗｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓａｍｏｙｌｏｖａ，Ｏ．，Ｋｒｅｕｚｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｓｔｉｌｇｅｎｂａｕｅｒ，Ｓ．，Ｄｏｈｎｅｒ，Ｈ．，Ｌａｎｇｅｒａｋ，Ａ．Ｗ．，Ｒｉｔｇｅｎ，Ｍ．，Ｋｎｅｂａ，Ｍ．，Ａｓｉｋａｎｉｕｓ，Ｅ．，Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，Ｋ．，Ｗｅｎｇｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈａｌｌｅｋ，Ｍ．（２０１４）Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＣＬＬ  ａｎｄ  ｃｏｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３７０，１１０１−１１１０
１８．Ｈｉｌｌｍｅｎ，Ｐ．，Ｒｏｂａｋ，Ｔ．，Ｊａｎｓｓｅｎｓ，Ａ．，Ｂａｂｕ，Ｋ．Ｇ．，Ｋｌｏｃｚｋｏ，Ｊ．，Ｇｒｏｓｉｃｋｉ，Ｓ．，Ｄｏｕｂｅｋ，Ｍ．，Ｐａｎａｇｉｏｔｉｄｉｓ，Ｐ．，Ｋｉｍｂｙ，Ｅ．，Ｓｃｈｕｈ，Ａ．，Ｐｅｔｔｉｔｔ，Ａ．Ｒ．，Ｂｏｙｄ，Ｔ．，Ｍｏｎｔｉｌｌｏ，Ｍ．，Ｇｕｐｔａ，Ｉ．Ｖ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｏ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｉ．，Ｃａｒｅｙ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｎ．，Ｌｉｓｂｙ，Ｓ．，ＭｃＫｅｏｗｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｏｆｆｎｅｒ，Ｆ．（２０１５）Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ  ｐｌｕｓ  ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ  ｖｅｒｓｕｓ  ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ  ａｌｏｎｅ  ｉｎ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ（ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴ  １）：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ，ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ  ｐｈａｓｅ  ３  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）３８５，１８７３−１８８３
１９．Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍ．Ａ．，Ｂｒｉｇｈｔ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．（２００１）Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ  ｏｆ  Ｒｉｔｕｘａｎ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０）ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ａｎｄ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ．Ｂｌｏｏｄ  ９７，１３９２−１３９８
２０．Ｌｉ，Ｂ．，Ｓｈｉ，Ｓ．，Ｑｉａｎ，Ｗ．，Ｚｈａｏ，Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｄ．，Ｈｏｕ，Ｓ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．，Ｄａｉ，Ｊ．，Ｚｈａｏ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｇｕｏ，Ｙ．（２００８）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８，２４００−２４０８
２１．Ｗｏｎｇ，Ｈ．Ｃ．，Ｊｅｎｇ，Ｅ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅ，Ｐ．Ｒ．（２０１３）Ｔｈｅ  ＩＬ−１５−ｂａｓｅｄ  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ  ＡＬＴ−８０３  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｎａｔｅ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２，ｅ２６４４２
２２．Ｓｍａｌｌｓ−Ｍａｎｔｅｙ，Ａ．，Ｄｏｒｉａ−Ｒｏｓｅ，Ｎ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｒ．，Ｐａｔａｍａｗｅｎｕ，Ａ．，Ｍｉｇｕｅｌｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｋｏ，Ｓ．Ｙ．，Ｈａｌｌａｈａｎ，Ｃ．Ｗ．，Ｗｏｎｇ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｙｏｕ，Ｌ．，Ｓｃｈｅｉｄ，Ｊ．，Ｋａｐｐｅｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｏｃｈｓｅｎｂａｕｅｒ，Ｃ．，Ｎａｂｅｌ，Ｇ．Ｊ．，Ｍａｓｃｏｌａ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｏｎｎｏｒｓ，Ｍ．（２０１２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ＩｇＧ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８６，８６７２−８６８０
２３．Ｓｅａｙ，Ｋ．，Ｃｈｕｒｃｈ，Ｃ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．Ｈ．，Ｄｅｎｅｒｏｆｆ，Ｋ．，Ｏｃｈｓｅｎｂａｕｅｒ，Ｃ．，Ｋａｐｐｅｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｊｅｎｇ，Ｅ．Ｋ．，Ｗｏｎｇ，Ｈ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｈ．（２０１５）Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  Ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ  Ｐｏｔｅｎｔｌｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ａｃｕｔｅ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ＨＩＶ−１  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８９，６２６４−６２７４
２４．Ｚｈｕ，Ｅ．Ｆ．，Ｇａｉ，Ｓ．Ａ．，Ｏｐｅｌ，Ｃ．Ｆ．，Ｋｗａｎ，Ｂ．Ｈ．，Ｓｕｒａｎａ，Ｒ．，Ｍｉｈｍ，Ｍ．Ｃ．，Ｋａｕｋｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｏｙｎｉｈａｎ，Ｋ．Ｄ．，Ａｎｇｅｌｉｎｉ，Ａ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．，Ｙａｆｆｅ，Ｍ．Ｂ．，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．，Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．（２０１５）Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ＩＬ−２．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ２７，４８９−５０１
２５．Ｐａｒｋ，Ｓ．，Ｊｉａｎｇ，Ｚ．，Ｍｏｒｔｅｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，Ｄｅｎｇ，Ｌ．，Ｒａｄｋｅｖｉｃｈ−Ｂｒｏｗｎ，Ｏ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，Ｓａｔｔａｒ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｎ．Ｋ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｔａｎｇ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｆｕ，Ｙ．Ｘ．（２０１０）Ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｂｏｔｈ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １８，１６０−１７０
２６．Ｈｉｌｃｈｅｙ，Ｓ．Ｐ．，Ｈｙｒｉｅｎ，Ｏ．，Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ａ．Ｍ．，Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｆ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ｉ．，Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｊｒ．，Ｂａｎｋｅｒｔ，Ｒ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｈ．（２００９）Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｄｉｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ：ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ａ“ｖａｃｃｉｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔ”ｏｆ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．Ｂｌｏｏｄ  １１３，３８０９−３８１２
２７．ＤｉＬｉｌｌｏ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０１５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｆｃ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  Ｄｒｉｖｅｓ  ａｎ  Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  Ｖａｃｃｉｎａｌ  Ｅｆｆｅｃｔ．Ｃｅｌｌ  １６１，１０３５−１０４５
２８．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｍ．Ｓ．，Ｙｕ，Ｙ．Ｙ．，Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｚ．，Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｆ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｊ．，Ｈａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．，Ｍｏａｙｅｒｉ，Ｍ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．（２００５）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａ  ＴＣＲ  ｇｅｎｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍａｒｋｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｏｎｖｅｙｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １６，４５７−４７２
２９．Ｓｈｉ，Ｓ．，Ｏｒｂａｙ，Ｈ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｇｒａｖｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｎａｙａｋ，Ｔ．Ｒ．，Ｈｏｎｇ，Ｈ．，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｒ．，Ｌｕｏ，Ｈ．，Ｇｏｅｌ，Ｓ．，Ｔｈｅｕｅｒ，Ｃ．Ｐ．，Ｎｉｃｋｌｅｓ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｃａｉ，Ｗ．（２０１５）ＰＥＴ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ａｂｄｏｍｉｎａｌ  Ａｏｒｔｉｃ  Ａｎｅｕｒｙｓｍ  ｗｉｔｈ  ６４Ｃｕ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉ−ＣＤ１０５  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆａｂ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５６，９２７−９３２
３０．Ｓｈｉ，Ｓ．，Ｈｏｎｇ，Ｈ．，Ｏｒｂａｙ，Ｈ．，Ｇｒａｖｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｏｈｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｎｉｃｋｌｅｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｗｏｎｇ，Ｈ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｃａｉ，Ｗ．（２０１５）ＩｍｍｕｎｏＰＥＴ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ４２，１２９５−１３０３
【０２５４】
他の実施形態
本発明はその詳細な記述に関連して記載されるが、先の記述は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を解説することを意図と、限定するものではない。他の態様、利点、及び修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲に含まれる。
【０２５５】
本明細書で参照される特許及び化学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用される全ての米国特許及び公開又は未公開の米国特許出願は、参照することにより本明細書の一部を成す。本明細書で引用される全ての公開された外国の特許及び特許出願は、参照することにより本明細書の一部を成す。本明細書で引用されるアクセッション番号によって示されるＧｅｎＢａｎｋ及びＮＣＢＩの寄託、参照することにより本明細書の一部を成す。本明細書で引用される全ての他の公開された参照文献、文書、原稿及び科学文献は、参照することにより本明細書の一部を成す。
【０２５６】
本発明は、特に、その好ましい実施形態を参照して示され、記載されているが、形態及び詳細における様々な変更が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、本発明において行われ得ることが当業者に理解される。
【図１】
2019519227.tif 000027
【図２】
2019519227.tif 000028
【図３】
2019519227.tif 000029
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2019519227.tif 000035
【図１０】
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【図１１】
2019519227.tif 000037
【図１２−１】
2019519227.tif 000038
【図１２−２】
2019519227.tif 000039
【図１３−１】
2019519227.tif 000040
【図１３−２】
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【図１４−１】
2019519227.tif 000042
【図１４−２】
2019519227.tif 000043
【図１５−１】
2019519227.tif 000044
【図１５−２】
2019519227.tif 000045
【図１６】
2019519227.tif 000046
【図１７】
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【配列表】
2019519227000001.app
【国際調査報告】
2019519227.tif 000048
2019519227.tif 000049