(57)【要約】本明細書は、抗第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ結合性構築物、例えば、抗体およびそれらの抗原結合性断片を提供する。関連のポリペプチド、コンジュゲートおよびキットも提供される。本発明は、サンプル中の第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを検出する方法で使用することができる。例示的な実施形態において、結合性構築物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合し、アミノ酸配列、配列番号２を含むＷＴ第ＩＸ因子に結合しない、抗体またはその抗原結合性断片である。
2019527033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、アミノ酸配列（配列番号２）を含む野生型（ＷＴ）第ＩＸ因子に結合しない、抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
配列番号１のエピトープと結合し、前記エピトープは、アミノ酸配列ＤＲＡＴＣＬＬＳＴＫＦＴ（配列番号３）内の線状エピトープである、請求項１に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項３】
配列番号１のエピトープに結合し、前記エピトープは、アミノ酸配列ＬＶＤＲＡＴＣＬＬＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨ（配列番号５）のフォールディングされた構造のコンフォメーショナルエピトープであり、任意選択で前記フォールディングされた構造は、ジスルフィド架橋を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項４】
ＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴ（配列番号１４）またはＬＶＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨ（配列番号１５）のアミノ酸配列に結合しない、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項５】
約１００ｎＭまたはそれ未満のＫＤで前記第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合する、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項６】
約２５〜約７５ｎＭの範囲のＫＤで前記第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、任意選択で、約５０ｎＭ〜約６０ｎＭの範囲のＫＤで前記第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合する、請求項５に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項７】
ヒト血漿を含むサンプル中の前記第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子に結合せず、任意選択で、前記サンプルは、少なくとももしくは約５％、少なくとももしくは約１０％、または少なくとももしくは約２０％のヒト血漿を含み、前記サンプルは、少なくともまたは約５μｇ／ｍＬのＷＴ第ＩＸ因子を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項８】
第ＩＩ因子ポリペプチドまたは第Ｘ因子ポリペプチドに結合せず、任意選択で、第ＩＩ因子にも第Ｘ因子にも結合しない、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項９】
ＦａｂまたはＦａｂ２’抗体断片である、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項１０】
単一特異性である、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項１１】
完全にヒトのものである、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項１２】
二価である、前述請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項１３】
二量体化されたＦａｂ断片または二量体化されたＦａｂミニ抗体を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項１４】
リンカーを介した二量体化されたＦａｂ断片である、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項１５】
（ｉ）ＳＳＹＡＩＳ（配列番号６）；ＧＩＶＰＡＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号７）；ＳＷＧＶＩＳＦＡＹ（配列番号８）；ＲＡＳＱＤＩＳＳＹＬＮ（配列番号９）；ＡＡＳＮＬＱＳ（配列番号１０）；およびＭＱＹＤＳＬＰＦＴＦ（配列番号１１）のアミノ酸配列、あるいは（ｉｉ）配列番号２４もしくは配列番号２５または配列番号２４および２５のアミノ酸配列あるいは（ｉｉｉ）配列番号２６もしくは配列番号２７または配列番号２６および２７のアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項１６】
配列番号６〜１１の各々を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、任意選択で、（ｉ）配列番号６〜１１の各々の間に、１つもしくは複数のアミノ酸が存在し、ならびに／または（ｉｉ）前記ポリペプチドは、任意選択で、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１２）を含むＦＬＡＧタグおよび／もしくはＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３）を含むヘキサＨｉｓタグをさらに含み、任意選択で、前記ＦＬＡＧタグおよび／または前記ヘキサＨｉｓタグは、前記ポリペプチドのＣ末端に配置されている、ポリペプチド。
【請求項１７】
任意選択で、ポリマー、炭水化物、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および検出剤からなる群より選択される異種成分にコンジュゲートした、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片もしくはポリペプチドを含むコンジュゲート。
【請求項１８】
前記抗体または抗原結合性断片もしくはポリペプチドが、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ラテックスまたは制御多孔質ガラスにコンジュゲートされている、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
前記抗体または抗原結合性断片もしくはポリペプチドが、フルオロフォア、発色団、放射性同位体、酵素標識、またはビオチンにコンジュゲートされている、請求項１７または１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
請求項１４に記載のポリペプチドのホモ二量体を含み、任意選択で、前記二量体の前記ポリペプチドは、へリックス−ターン−へリックス構造を介して連結されている、請求項１７から１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、またはそれらの断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２３】
請求項２１に記載の核酸または請求項２２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
（ｉ）請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片、請求項１６に記載のポリペプチド、請求項１７から２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項２１に記載の核酸、請求項２２に記載のベクター、および／または請求項２３に記載の宿主細胞、および任意選択で使用のための指示、ならびに任意選択で（ｉｉ）（ｉ）の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、もしくはコンジュゲートに結合する二次抗体を含む、キット。
【請求項２５】
固体支持体をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記抗体、抗原結合性断片、ポリペプチドまたはコンジュゲートが、前記固体支持体上にプレコーティングされている、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記固体支持体が、ポリマービーズ、マイクロタイタープレート、膜、またはフィルターである、請求項２５または２６に記載のキット。
【請求項２８】
約１００ｎｇまたはそれより多く、約１５０ｎｇまたはそれより多く、約２００ｎｇまたはそれより多く、約５００ｎｇまたはそれより多くの前記抗原結合性断片を含む溶液でプレコーティングされた固体支持体を含む、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
ヒト血漿、もしくはその希釈された画分、および／またはヒト組織もしくはその細胞を含む、ヒトから得られた生体サンプルと混合された、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物であって、任意選択で、検出剤を含む組成物。
【請求項３０】
ヒト血漿タンパク質を含む、ヒトから得られた生体サンプルと混合された、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物であって、前記ヒト血漿タンパク質の少なくとも１つは、第ＩＸ因子、またはそのバリアント、第ＩＩ因子、および第Ｘ因子からなる群より選択され、任意選択で、前記組成物は検出剤を含む、組成物。
【請求項３１】
サンプル中の第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを検出するための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片、請求項１６に記載のポリペプチド、請求項１７から２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項２１に記載の核酸、請求項２２に記載のベクター、請求項２３に記載の宿主細胞、および／または請求項２４から２７のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項３２】
被験体から得られたサンプル中の第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを検出する方法であって、（ｉ）前記サンプルを、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片、請求項１６に記載のポリペプチド、または請求項１７から２０のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させて、前記第ＩＸ因子Ｐａｄｕａと、前記抗体、抗原結合性断片、ポリペプチドまたはコンジュゲートとを含む複合体を形成するステップ、および（ｉｉ）前記サンプル中の前記複合体を検出するステップを含む、方法。
【請求項３３】
前記抗体または抗原結合性断片もしくはポリペプチドが、検出剤および／または固体支持体にコンジュゲートされているか、あるいは前記コンジュゲートが、検出剤を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記サンプルを、検出剤を含む二次抗体と接触させるステップを含み、前記二次抗体は、前記抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートに結合する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記複合体を検出するステップが、前記検出剤のシグナルを検出することを含む、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記シグナルが、酵素活性、結合活性および／または色素形成活性である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、または血漿サンプルである、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記被験体が、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａをコードするヌクレオチド配列を含むベクターで処置されている、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
本明細書に記載の結合性構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この特許出願は、米国特許法§１１９（ｅ）にしたがって、２０１６年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３３７，１１８号および２０１６年５月２４日に出願された同第６２／３４０，８３４号（これらの両方は、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
明細書と同時に提出され、２０１６年５月１６日に作成された「５０５７３＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と名付けられた２８，８０４バイトのＡＣＩＩ（テキスト）ファイルと識別されたコンピューター読取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子治療は、血友病のための将来的な処置選択肢として大いに有望である。ある臨床試験では、重度の血友病Ｂを有する被験体は、成熟ペプチド配列の３３８位（またはプレプロタンパク質配列の３８４位）におけるＡｒｇからＬｅｕの単一のアミノ酸置換を有するＦＩＸの機能亢進性のバリアントである第ＩＸ因子（ＦＩＸ）Ｐａｄｕａをコードするアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターで処置される。導入遺伝子産物（ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ）の特異的な検出は、因子置き換えの成功を評価するのに有用であると予想される。しかしながら、一部の患者は第ＩＸ因子の交差反応物質（ＣＲＭ）を有することから、処置された患者におけるＦＩＸ  Ｐａｄｕａの特異的な検出は課題を残している。一部のＣＲＭ陽性（ＣＲＭ＋）患者は、例えば野生型（ＷＴ）第ＩＸ因子を発現するが、この因子は現在利用可能なＦＩＸ  Ｐａｄｕａ結合剤と交差反応することから、ＦＩＸ  ＰａｄｕａがこのようなＣＲＭ＋患者によって発現されるかどうかを決定することが難しくなっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書は、野生型ＦＩＸへの交差反応性を伴うことなくＦＩＸ  Ｐａｄｕａ（ＦＩＸｐ）を特異的に認識する結合性構築物を提供する。例示的な実施形態において、結合性構築物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合し、アミノ酸配列、配列番号２を含むＷＴ第ＩＸ因子に結合しない、抗体またはその抗原結合性断片である。例示的な実施形態において、結合性構築物は、配列番号６〜１１の各々を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、任意選択で、（ｉ）配列番号６〜１１の各々の間に、１つもしくは複数のアミノ酸が存在し、ならびに／または（ｉｉ）ポリペプチドは、任意選択で、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１２）を含むＦＬＡＧタグおよび／もしくはＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３）を含むヘキサＨｉｓタグをさらに含み、任意選択で、ＦＬＡＧタグおよび／またはヘキサＨｉｓタグは、ポリペプチドのＣ末端に配置されている、ポリペプチドである。例示的な実施形態において、結合性構築物は、（ｉ）免疫グロブリン重鎖の定常領域、（ｉｉ）免疫グロブリン軽鎖の定常領域、または（ｉｉｉ）免疫グロブリン重鎖の定常領域および免疫グロブリン軽鎖の定常領域の両方にコンジュゲートした本明細書に記載される抗原結合性断片を含むコンジュゲートである。例示的な実施形態において、結合性構築物は、異種成分に連結またはコンジュゲートした本明細書に記載される抗体または抗原結合性断片を含むコンジュゲートである。例示的な態様において、コンジュゲートは、ポリマー、炭水化物、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または検出剤にコンジュゲートした本明細書に記載される抗体または抗原結合性断片を含む。
【０００５】
加えて、本明細書に記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、またはそれらの断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。核酸を含むベクターおよび核酸またはベクターを含む宿主細胞が、さらに提供される。
【０００６】
本明細書は、関連するキットも、提供する。例示的な実施形態において、キットは、本明細書に記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、核酸、ベクター、宿主細胞、またはそれらの組み合わせ、および任意選択で使用のための指示を含む。例示的な態様において、キットはまた、固体支持体も含み、任意選択で、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはコンジュゲートは、固体支持体上にプレコーティングされている。例示的な態様において、キットはまた、キット中に提供される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはコンジュゲートに結合する二次抗体も含む。
【０００７】
本発明はさらに、生体サンプル、例えばヒトから得られた生体サンプルと混合された、本明細書に記載される抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートを含む組成物を提供する。例示的な態様において、生体サンプルは、ヒト血漿、またはその希釈された画分、および／またはヒト組織もしくはその細胞を含む。例示的な態様において、生体サンプルは、ヒト血漿タンパク質を含み、ヒト血漿タンパク質の少なくとも１つは、第ＩＸ因子、第ＩＩ因子、および第Ｘ因子、ならびにそれらのバリアントからなる群より選択される。任意選択で、組成物は、検出剤を含む。
【０００８】
本明細書で提供されるこのような結合性構築物は、例えば、サンプル、例えば野生型ＦＩＸを含む、例えば臨床または前臨床サンプル中のＦＩＸ  Ｐａｄｕａの、一義的または特異的な検出を可能にする検出方法において有用である。したがって、本明細書は、被験体から得られたサンプル中の配列番号１のアミノ酸配列を含む第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを検出する方法を提供する。例示的な実施形態において、本方法は、（ｉ）サンプルを、結合性構築物（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合性断片、ポリペプチドまたはコンジュゲート）と接触させて、ＦＩＸｐと結合性構築物とを含む複合体、例えば免疫複合体を形成すること、および（ｉｉ）サンプル中の複合体を検出することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＷＴ第ＩＸ因子およびＦＩＸ  Ｐａｄｕａのアミノ酸配列の略図を表す。
【００１０】
【図２】図２は、５μｇ／ｍｌのＢＣ１（Ｚ軸に最も近い（すなわち左側の）青色のバー）、１μｇ／ｍｌのＢＣ１（青色のバーの右の赤色のバー）、０．２μｇ／ｍｌのＢＣ１（赤色のバーに隣接する緑色のバー）または０．０４μｇ／ｍｌのＢＣ１でコーティングされたＮｉ２＋プレートに対する、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａの（左のパネル）またはＷＴ第ＩＸ因子（右のパネル）の結合シグナルのグラフを表す。
【００１１】
【図３】図３は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａの示された濃度に対する、ＭａｘｉＳｏｒｐプレート上にコーティングされたＢＣ１（三角形）、ＢＣ２（ひし形）、またはＢＣ３（四角形）の結合シグナルのグラフを表す。
【００１２】
【図４】図４は、５μｇ／ｍｌのＷＴ第ＩＸ因子を含有しベンズアミジンを含まない５％ヒト血漿溶液中のＦＩＸ  Ｐａｄｕａの示された濃度に対するＢＣ１の結合シグナルのグラフを表す。
【００１３】
【図５】図５は、２％のＢＳＡ／ＰＢＳ（ひし形）、５０ｍＭのベンズアミジンを含有する５％血漿溶液（四角形）、５０ｍＭのベンズアミジンを含有する１０％血漿溶液（三角形）、または５０ｍＭのベンズアミジンを含有する２０％血漿溶液（×）中の、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａの示された濃度に対するＢＣ１の結合シグナルのグラフを表す。
【００１４】
【図６】図６は、ＷＴ第ＩＸ因子および５０ｍＭのベンズアミジンを含む２０％（ｖ／ｖ）血漿溶液中の、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａの示された濃度に対するＢＣ１（四角形）、ＢＣ２（三角形）、ＢＣ４（ひし形）、または陰性対照（×）の結合シグナルのグラフを表す。
【００１５】
【図７】図７は、凝固因子：ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ（ひし形）；第ＩＩ因子（四角形）；および第Ｘ因子（三角形）の示された濃度に対する、ＢＣ１（左のパネル）およびＢＣ４（右のパネル）の結合シグナルの２つのグラフを表す。
【００１６】
【図８】図８は、ＷＴ第ＩＸ因子（ひし形）またはＦＩＸ  Ｐａｄｕａ（四角形）の示された濃度（μｇ／ｍｌ）に対する、ＢＣ５（左のパネル）およびＢＣ６（右のパネル）の結合シグナルの２つのグラフを表す。
【００１７】
【図９】図９は、実施例２に記載されるＥＬＩＳＡの構成要素の略図を表す。
【００１８】
【図１０】図１０は、実施例１に記載されるＥＬＩＳＡの構成要素の略図を表す。
【００１９】
【図１１】図１１は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａを含有するサンプル（丸）または参照ヒト血漿サンプル（ひし形）を使用したＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡの濃度−応答曲線のグラフを表す。
【００２０】
【図１２】図１２は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａの示された量の６つの標準（標準Ｄ１〜Ｄ６）を使用したＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡの較正曲線のグラフを表す。
【００２１】
【図１３】図１３は、緩衝液または正常な血漿もしくはＦＩＸ欠乏血漿中のＦＩＸ  Ｐａｄｕａを使用したＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡの希釈−応答曲線のグラフを表す。
【００２２】
【図１４】図１４は、クエン酸塩加サル血漿サンプルを使用したＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡの希釈−応答曲線のグラフを表す。
【００２３】
【図１５】図１５は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａを発現するＡＡＶ２／８ウイルスベクターで処置した後の、ＦＩＸ交差反応物質を有する被験体（ＣＲＭ＋）のサンプルの凝固活性およびタンパク質測定のグラフを表す。
【００２４】
【図１６】図１６は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａを発現するＡＡＶ２／８ウイルスベクターで処置した後の、ＦＩＸ交差反応物質を有する第２の被験体（ＣＲＭ＋）のサンプルの凝固活性およびタンパク質測定のグラフを表す。
【００２５】
【図１７】図１７は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａを発現するＡＡＶ２／８ウイルスベクターで処置した後の、ＦＩＸ交差反応物質を有しない被験体（ＣＲＭ＋）のサンプルの凝固活性およびタンパク質測定のグラフを表す。
【００２６】
【図１８】図１８は、ＦＩＸ濃度の関数としてのシグナルのグラフを表し、シグナルは、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ特異的な色素形成活性アッセイによって生成される。
【００２７】
【図１９】図１９は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ特異的なＦａｂの生成に関する戦略の略図、ならびに使用されたパニングおよびブロッキングペプチドの配列を表す（ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ中のＬ３３８は、赤色と囲みで示され、ＦＩＸ  ｗｔ中のＲ３３８は、緑色と囲みで示される）。
【００２８】
【図２０】図２０は、精製されたミニ抗体（二価Ｆａｂ）の概略的な構造を表す。
【００２９】
【図２１】図２１Ａは、ブタＦＩＸａのＸ線構造を表し、Ａｒｇ３３８がブタＦＩＸａの重鎖の表面上に配置されていることを実証し、図２１Ｂは、ヒトＦＩＸ  Ｐａｄｕａのスキームを表し、Ｌｅｕ３３８を実証する。
【００３０】
【図２２】図２２は、精製されたＦａｂはＦＩＸ  Ｐａｄｕａに特異的に結合し、ＦＩＸ  ｗｔ抗原に特異的に結合しないことを実証するグラフを表す。図２２は、ｗｔおよびＰａｄｕａ抗原に対する精製された二価ＦａｂからのＥＬＩＳＡのグラフを表す。異なるパニング戦略から得られた二価Ｆａｂを、ｗｔおよびＰａｄｕａペプチドならびにタンパク質に対する特異性に関して試験した。結果は、バックグラウンドに対する倍率増加（ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ）として表され（図２２Ａ）、図２２Ｂは、ＥＬＩＳＡセットアップのスキームを示す。カラムの順番は、凡例に記載のものと同じである（すなわち、Ａｂ４２のカラムは、左側である）。詳細について、実施例５における方法の説明を参照されたい。
【００３１】
【図２３】図２３は、精製された二価Ｆａｂが２０％のヒト血漿マトリクス中のＦＩＸ  ｗｔに対して交差反応性を示さないことを実証するグラフを表す。図２３は、２０％血漿の存在下での精製された二価ＦａｂのＥＬＩＳＡのグラフを表す。（図２３Ａ）精製された二価Ｆａｂをコーティングし、５μｇ／ｍＬのＦＩＸ  ｗｔを含有し、示されたＰａｄｕａ  ＦＩＸ濃度を有する２０％のヒト血漿と共にインキュベートした。ＨＲＰ標識ポリクローナルヤギ抗ＦＩＸ抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて検出を実行した。（図２３Ｂ）ＥＬＩＳＡセットアップのスキーム。線は、凡例と同じ順番である。
【００３２】
【図２４】図２４は、選択された候補Ａｂ４２の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を実証するグラフを表す。（図２４Ａ）Ｈｉｓタグを有するミニ抗体Ａｂ４２は、ＮＴＡ−ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップにおいて、ＫＤ＝５９ｎＭ（ｋａ：４．３×１０４  １／Ｍｓ；ｋｄ：０．００２５３１  １／秒）でＦＩＸ  Ｐａｄｕａと結合するが（図２４Ｂ）、ＦＩＸ  ｗｔとは結合しない。点線は、生データを表し、一方で実線は、フィッティングしたデータを示す。線は、凡例と同じ順番である。
【００３３】
【図２５】図２５は、イムノアッセイの図解を表す。
【００３４】
【図２６】図２６は、精製されたＦＩＸｐサンプルに関して得られた濃度−応答曲線によって表されるアッセイの選択性を実証するグラフを表し、５μｇ／ｍＬの正常なＦＩＸ濃度を有する新鮮凍結参照血漿調製物は、アッセイの選択性を実証する。ヒト血漿は、本質的に応答を示さなかった。
【００３５】
【図２７】図２７は、０．８５〜２７．１ｎｇのＦＩＸｐ／ｍＬの範囲の６ポイントの較正曲線のグラフを表し、十分な線形性を有していた。それらの正確度は、相関係数ｒ、低い方の相対合計誤差（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｏｔａｌ  ｅｒｒｏｒ）（ＲＴＥ）、およびバックフィッティング（ｂａｃｋ−ｆｉｔｔｉｎｇ）アプローチの結果によって実証された。
【００３６】
【図２８】図２８は、正常なおよびＦＩＸ欠乏血漿における並行して行った研究を実証する一組のグラフを表す。ＦＩＸｐをスパイクした血漿の希釈−応答曲線の傾きは、緩衝液希釈系列で得られた傾きと＜５％異なっていたことから、血漿のマトリクスはアッセイの性能に影響を与えなかったことが示される。
【００３７】
【図２９】図２９は、ＥＬＩＳＡの感受性に対するＣａ２＋の影響を実証するグラフを表す。Ｃａ２＋によって生じた明らかな感受性の増加が示され、これは、ポリクローナル検出抗体およびＦＩＸのＣａ依存性ＥＧＦドメインによって引き起こされた可能性が極めて高い。
【００３８】
【図３０】図３０は、フェーズ１／２試験でＡＡＶ２／８ウイルスベクターで処置された第１の患者由来のクエン酸塩加血漿サンプルの分析を実証する一組のグラフを表す。第１の患者から得られた血漿サンプルはＦＩＸ交差反応物質陽性（ＣＲＭ＋）であった。
【００３９】
【図３１】図３１は、フェーズ１／２試験でＡＡＶ２／８ウイルスベクターで処置された第２の患者由来のクエン酸塩加血漿サンプルの分析を実証する一組のグラフを表す。第２の患者から得られた血漿サンプルはＦＩＸ交差反応物質陽性（ＣＲＭ＋）であった。
【００４０】
【図３２】図３２は、フェーズ１／２試験でＡＡＶ２／８ウイルスベクターで処置された第３の患者由来のクエン酸塩加血漿サンプルの分析を実証する一組のグラフを表す。第３の患者から得られた血漿サンプルはＦＩＸ交差反応物質陽性（ＣＲＭ＋）でなかった。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書は、野生型ＦＩＸに対して最小の交差反応性で、またはそれに対する交差反応性がなくＦＩＸ  Ｐａｄｕａを特異的に認識する結合性構築物を提供する。例示的な態様において、結合性構築物は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合し、野生型（ＷＴ）第ＩＸ因子に結合しない。例示的な態様において、結合性構築物は、ＷＴ第ＩＸ因子の存在下で、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合する（ＷＴ第ＩＸ因子に結合しない）。例示的な態様において、結合性構築物は、類似したまたは同じ条件下で、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合し、１つのＷＴ第ＩＸ因子、ならびに第ＩＩ因子および第Ｘ因子の一方もしくは両方、またはそれらの他のあらゆる変異したもしくは改変された形態（ＦＩＸ  Ｐａｄｕａを除く）に結合しない。例示的な態様において、結合性構築物は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合し、第ＩＩ因子にも第Ｘ因子にも結合しない。例示的な態様において、結合性構築物は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子、第ＩＩ因子および第Ｘ因子のどれにも結合しない。例示的な態様において、結合性構築物は、ＷＴ第ＩＸ因子、第ＩＩ因子および第Ｘ因子の存在下で、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合する（ＷＴ第ＩＸ因子、第ＩＩ因子および第Ｘ因子に結合しない）。例示的な実施形態において、結合性構築物は、ヒト血漿中に存在するレベルのＷＴ第ＩＸ因子、第ＩＩ因子、および第Ｘ因子を含む溶液中に存在する場合でも、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａのエピトープ（配列番号１）に結合する。
【００４２】
エピトープ
「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、結合性構築物で結合するＦＩＸ  Ｐａｄｕａの領域またはその中の領域を意味する。一部の実施形態において、エピトープは、線状エピトープである。「線状エピトープ」は、本明細書で使用される場合、結合性構築物で結合するＦＩＸ  Ｐａｄｕａの領域またはその中の領域であって、その領域が、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａのアミノ酸配列の連続するアミノ酸で構成される、領域を指す。第ＩＸ因子Ｐａｄｕａの一次構造において、線状エピトープのアミノ酸は、互いに隣接している。したがって、線状エピトープは、抗原、すなわちＦＩＸ  Ｐａｄｕａのアミノ酸配列の断片または一部である。
【００４３】
他の例示的な実施形態において、エピトープは、コンフォメーショナルエピトープまたは構造エピトープである。「コンフォメーショナルエピトープ」または「構造エピトープ」は、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａがその適切にフォールディングされた状態にある場合、互いに近接して配置されたアミノ酸で構成されるエピトープを意味する。線状エピトープとは異なり、コンフォメーショナルエピトープまたは構造エピトープのアミノ酸は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａの一次構造（すなわち、アミノ酸配列）において必ずしも互いに隣接していなくてもよい。コンフォメーショナルエピトープまたは構造エピトープは、必ずしも抗原（ＦＩＸｐ）のアミノ酸配列の連続するアミノ酸で構成されていなくてもよい。
【００４４】
例示的な実施形態において、結合性構築物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＦＩＸ  Ｐａｄｕａのエピトープに結合し、このエピトープは、配列番号１のアミノ酸配列内の線状エピトープである。例示的な態様において、線状エピトープは、ＤＲＡＴＣＬＬＳＴＫＦＴ（配列番号３）のアミノ酸配列内である。例示的な態様において、線状エピトープは、配列番号３の少なくともＬ−Ｌを含む。例示的な実施形態において、結合性構築物は、ＷＴ第ＩＸ因子、第ＩＩ因子、および／または第Ｘ因子の存在下でも、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａの線状エピトープに結合する。例示的な実施形態において、結合性構築物は、５μｇ／ｍＬのＷＴ第ＩＸ因子の存在下でも、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａのエピトープに結合する。例示的な実施形態において、結合性構築物は、５μｇ／ｍＬのＷＴ第ＩＸ因子の存在下および２０％のヒト血漿マトリクス中でも、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａのエピトープに結合する。
【００４５】
例示的な態様において、結合性構築物は、ＷＴ  ＦＩＸのエピトープに結合しない。例示的な態様において、結合性構築物は、配列番号２内、またはＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴ（配列番号１４）内、もしくはＬＶＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨ（配列番号１５）内のエピトープに結合しない。例示的な態様において、結合性構築物は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合性構築物が結合する場合と類似したまたは同じ条件下で、ＷＴ  ＦＩＸのエピトープに結合しない。例示的な態様において、結合性構築物は、ＷＴ  ＦＩＸの正常な血漿レベルを含む溶液中にある場合、ＷＴ  ＦＩＸのエピトープに結合しない。例示的な態様において、結合性構築物は、５μｇ／ｍＬのＷＴ  ＦＩＸを含む溶液（例えば、緩衝液）（例えば、約５μｇ／ｍＬのＷＴ  ＦＩＸを含むヒト血漿マトリクス）中にある場合、ＷＴ  ＦＩＸのエピトープに結合しない。
【００４６】
例示的な実施形態において、結合性構築物は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａのエピトープ（配列番号１）に結合し、このエピトープは、アミノ酸配列ＬＶＤＲＡＴＣＬＬＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨ（配列番号５）のフォールディングされた構造のコンフォメーショナルエピトープである。例示的な実施形態において、結合性構築物は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａのエピトープ（配列番号１）に結合し、このエピトープは、アミノ酸配列ＬＶＤＲＡＴＣＬＬＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨ（配列番号５）のフォールディングされた構造のコンフォメーショナルエピトープであり、フォールディングされた構造は、ジスルフィド架橋を含む。例示的な実施形態において、結合性構築物は、ＷＴ第ＩＸ因子、第ＩＩ因子、および／または第Ｘ因子の存在下でも、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａのコンフォメーショナルエピトープに結合する。例示的な実施形態において、結合性構築物は、５μｇ／ｍＬのＷＴ第ＩＸ因子の存在下でも、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａのエピトープに結合する。
【００４７】
親和性およびアビディティ
本明細書で提供される結合性構築物は、非共有結合および可逆的な方式で、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合する。例示的な実施形態において、結合性構築物のＦＩＸ  Ｐａｄｕａへの結合強度は、結合性構築物の結合部位とエピトープとの相互作用の強度の尺度であるその親和性に関して記載される場合がある。例示的な態様において、本明細書で提供される結合性構築物は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対して高い親和性を有し、したがって、低い親和性の結合性構築物より短い期間でより多くの量のＦＩＸ  Ｐａｄｕａと結合すると予想される。例示的な態様において、結合性構築物は、少なくとも１０５ｍｏｌ−１、少なくとも１０６ｍｏｌ−１、少なくとも１０７ｍｏｌ−１、少なくとも１０８ｍｏｌ−１、少なくとも１０９ｍｏｌ−１、または少なくとも１０１０ｍｏｌ−１の平衡会合定数、ＫＡを有する。例示的な態様では、本明細書において提供される結合性構築物は、ヒト血漿中でＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対して高い親和性を呈する。例示的な態様では、結合性構築物は、ヒト血漿を含むサンプル中で、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子に結合しない。例示的な態様では、結合性構築物は、少なくともまたは約５％のヒト血漿（例えば、５％のヒト血漿マトリックス）を含むサンプル中で、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子に結合しない。例示的な態様では、結合性構築物は、少なくともまたは約１０％のヒト血漿（例えば、１０％のヒト血漿マトリックス）を含むサンプル中で、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子に結合しない。例示的な態様では、結合性構築物は、少なくともまたは約２０％のヒト血漿（例えば、２０％のヒト血漿マトリックス）を含むサンプル中で、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子に結合しない。例示的な態様では、結合性構築物は、少なくともまたは約５％〜約４０％、約１０％〜約３０％、または約１５％〜約２０％のヒト血漿を含むサンプル中で、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子に結合しない。例示的な態様では、結合性構築物は、実質的な量のＷＴ第ＩＸ因子がサンプル中に存在する場合でさえ第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合する。例示的な態様では、結合性構築物は、ある量のヒト血漿（例えば、少なくともまたは約５％のヒト血漿、少なくともまたは約１０％のヒト血漿、少なくともまたは約２０％のヒト血漿）、および少なくともまたは約１μｇ／ｍＬのＷＴ第ＩＸ因子、または少なくともまたは約２．５μｇ／ｍＬのＷＴ第ＩＸ因子、または少なくともまたは約５μｇ／ｍＬのＴ第ＩＸ因子、または少なくともまたは約１０μｇ／ｍＬのＷＴ第ＩＸ因子を含むサンプル中で、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子に結合しない。例示的な態様では、結合性構築物は、これらに限定されないが第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、および第ＸＩＩＩ因子を含む他の凝血因子を含むサンプル中で、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子に結合しない。例示的な態様では、結合性構築物は、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子に結合せず、第ＩＩ因子または第Ｘ因子にさらに結合しない。例示的な態様では、結合性構築物は、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子に結合せず、第ＩＩ因子にも第Ｘ因子にもさらに結合しない。
【００４８】
例示的な実施形態において、結合性構築物のＦＩＸ  Ｐａｄｕａへの結合強度は、その感受性に関して記載される場合がある。ＫＤは、平衡解離定数であり、これは、結合性構築物とＦＩＸ  Ｐａｄｕａとの間のｋｏｆｆ／ｋｏｎの比である。ＫＤおよびＫＡは、反比例している。ＫＤ値は、結合性構築物の濃度（特定の実験に必要な結合性構築物の量）に関し、したがってＫＤ値がより低ければ（濃度がより低ければ）、結合性構築物の親和性はより高い。例示的な態様において、結合性構築物のＦＩＸ  Ｐａｄｕａへの結合強度は、ＫＤに関して記載される場合がある。例示的な態様では、本明細書において提供される結合性構築物のＦＩＸｐ対するＫＤは、約１．０ｘ１０−６またはそれ未満、約１．０ｘ１０−７またはそれ未満、約１．０ｘ１０−８またはそれ未満、約１．０ｘ１０−９またはそれ未満、約１．０ｘ１０−１０またはそれ未満である。例示的な態様では、本明細書において提供される結合性構築物のＫＤは、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、ピコモル濃度、またはフェムトモル濃度である。例示的な態様では、本明細書において提供される結合性構築物のＫＤは、約１０−４〜１０−６または１０−７〜１０−９または１０−１０〜１０−１２または１０−１３〜１０−１５の範囲内である。例示的な態様では、本明細書において提供される結合性構築物のＫＤは、約１００ｎＭまたはそれ未満である。ある特定の態様では、本明細書において提供される結合性構築物のＫＤは、約２０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約２５ｎＭ〜約９５ｎＭ、約３０ｎＭ〜約９０ｎＭ、約３５ｎＭ〜約８５ｎＭ、約４０ｎＭ〜約８０ｎＭ、約４５ｎＭ〜約７５ｎＭ、約５０ｎＭ〜約７０ｎＭ、または約５５ｎＭ〜約６５ｎＭである。例示的な態様では、結合性構築物のＫＤは、約２５ｎＭ〜約７５ｎＭの範囲内である。例示的な態様では、結合性構築物のＫＤは、約５０ｎＭ〜約６０ｎＭの範囲内である。例示的な態様では、結合性構築物のＫＤは、約５６ｎＭである。
【００４９】
アビディティは、抗体−抗原複合体の全体的な強度の尺度を与える。アビディティは、３つの主要なパラメーター：結合性構築物のエピトープに対する親和性、結合性構築物とＦＩＸ  Ｐａｄｕａの両方の原子価、および相互作用するパーツの構造上の配置に依存する。結合性構築物の原子価（抗原結合部位の数）がより多いほど、結合できる抗原（ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ）の量はより多くなる。例示的な態様において、結合性構築物は、ＦＩＸｐに対して強いアビディティを有する。例示的な態様において、結合性構築物は、多価である。例示的な態様において、結合性構築物は、二価である。
【００５０】
構造
本明細書に記載される結合性構築物は、多数の構造の１つを有するように操作されていてもよい。例示的な態様において、本明細書で提供される結合性構築物は、抗体またはその抗原結合性断片の構造を有する。例示的な態様において、本明細書で提供される結合性構築物は、抗体に基づく構造または抗体に由来する構造を有する。例示的な態様において、本明細書で提供される結合性構築物は、合成抗体模倣体、操作されたタンパク質、またはアプタマーの構造、例えば、本明細書に記載される構造およびＭｃＥｎａｎｅｙら、「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１３６巻（５２号）：１８０３４〜１８０４３頁（２０１４年）；ＢｉｎｚおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６巻（４号）：４５９〜６９頁（２００５年）；およびＲｏｑｕｅら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  ２０巻（３号）：６３９〜５４頁（２００４年）に記載の構造を有する。
【００５１】
抗体および抗原結合性断片
例示的な実施形態において、結合性構築物は、抗体である。抗体は、どのようなタイプの抗体であってもよく、すなわち、当該分野において公知の免疫グロブリンであってもよい。例示的な実施形態において、抗体は、クラスまたはアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭの抗体である。例示的な実施形態において、本明細書に記載される抗体は、１つまたは複数のアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、および／またはミュー重鎖を含む。例示的な実施形態において、本明細書に記載される抗体は、１つまたは複数のカッパまたは軽鎖を含む。例示的な態様において、抗体は、ＩｇＧ抗体であり、任意選択で、４つのヒトサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の１つである。
【００５２】
一部の実施形態において、抗体はまた、モノクローナル抗体である。他の実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００５３】
一部の実施形態において、抗体は、天然に存在する抗体、例えば、哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどから単離および／または精製された抗体に構造的に類似しているかまたはそれ由来である。これに関して、抗体は、哺乳動物抗体、例えば、マウス抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ヒト抗体などとみなされる場合もある。例示的な態様において、抗体は、哺乳動物抗体のみの配列を含む。このような抗体を産生する方法は当該分野において公知であり、その一部は、本明細書の「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｆｕｃｔｉｏｎ」というタイトルのセクションにおいてさらに説明される。例示的な態様において、結合性構築物は、完全ヒト抗体であるか、または非ヒト抗体の配列を含まない。
【００５４】
一部の実施形態において、抗体は、遺伝学的に操作された抗体であり、天然に存在しない。例示的な実施形態において、抗体は、単鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒューマニア化（ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ）抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体などである。遺伝子工学技術はまた、非ヒト供給源から完全ヒト抗体を作製する能力も提供する。
【００５５】
一部の態様において、遺伝学的に操作された抗体は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに特異的な単鎖抗体（ＳＣＡ）である。ＳＣＡを作製する方法は当該分野において公知である。例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９巻：１６５〜１６９頁（１９９１年）を参照されたい。
【００５６】
一部の態様において、抗体は、キメラ抗体である。用語「キメラ抗体」は、本明細書において、１つの種からの定常ドメインと第２の種からの可変ドメインとを含有する抗体、またはより一般的には、少なくとも２つの種からのアミノ酸配列のストレッチを含有する抗体を指すものとして使用される。特定の態様において、キメラ抗体は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合する。
【００５７】
一部の態様において、抗体は、ヒト化抗体である。用語「ヒト化」は、抗体に関して使用される場合、元の供給源の抗体より本物のヒト抗体に類似した構造および免疫学的な機能を有するように操作された非ヒト供給源からの少なくともＣＤＲ領域を有する抗体を指す。例えば、ヒト化は、非ヒト抗体、例えばマウス抗体からのＣＤＲをヒト抗体にグラフト化することを含んでいてもよい。ヒト化はまた、非ヒト配列をよりヒト配列に類似させるための選択されたアミノ酸置換を含んでいてもよい。
【００５８】
本明細書における用語「キメラまたはヒト化」の使用は、相互排他的であることを意味せず、それよりもむしろ、さらにヒト化されたキメラ抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体を包含することを意味する。文脈上別段の指示がない限り、キメラ抗体（の特性、使用、試験など）に関する記述はヒト化抗体にも適用され、ヒト化抗体に関する記述はキメラ抗体にも関係する。同様に、文脈上指示がない限り、このような記述はまた、抗体およびこのような抗体の抗原結合性断片にも適用可能であることが理解されるものとする。
【００５９】
一部の態様において、抗体は、ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体である。ヒューマニア化テクノロジーは、非ヒト抗体を操作されたヒト抗体に変換するための、ＫａｌｏＢｉｏｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の所有権のある方法である。Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体は、高親和性を有し、ヒト生殖細胞系抗体配列に高度な類似性を有する。例えば、Ｔｏｍａｓｅｖｉｃら、Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ３２巻：２２３〜２３５頁（２０１４年）を参照されたい。
【００６０】
一部の態様において、抗体は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに特異的なＣＤＲグラフト化抗体である。ＣＤＲグラフト化抗体を作製する方法は、当該分野において公知である。例えば、参照によりその全体が組み入れられるＬｏ、Ｂｅｎｎｙ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２４８巻（２００４年）を参照されたい。
【００６１】
例示的な実施形態において、抗体は、二重特異性、三重特異性、または多重特異性になるように操作され、抗体は、２つまたはそれより多くの別個の抗原結合領域を含む。一部の態様において、抗体は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに特異的な二重特異性または三重特異性抗体である。二重特異性または三重特異性抗体を作製する方法は、当該分野において公知である。例えば、ＭａｒｖｉｎおよびＺｈｕ、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ２６巻：６４９〜６５８頁（２００５年）および米国特許第６，５５１，５９２号を参照されたい。例示的な態様において、結合性構築物は、第１のＦＩＸ  Ｐａｄｕａのエピトープおよび第２のＦＩＸ  Ｐａｄｕａのエピトープに特異的な二重特異性の抗原結合性構築物である。例示的な実施形態において、抗体は、クアドローマ、ヘテロ二量体二重特異性抗体、二重特異性抗体の融合体、二重特異性抗体断片、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）、または多重特異性抗体である。例示的な実施形態において、抗体は、二価、三価、または多価になるように操作されている。例えば、Ｃｕｅｓｔａら、「Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｗｈｅｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｓｕｒｐａｓｓｅｓ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８巻、３５５〜３６２頁（２０１０年）；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ」Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３巻、１１２６〜１１３６頁（２００５年）；Ｃｈａｎら、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ」Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０巻、３０１〜３１６頁（２０１０年）；Ｂｙｒｎｅら、「Ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１巻、６２１〜６３２頁（２０１３年）を参照されたい。一部の実施形態において、抗体は、単量体の形態であり、一方で他の実施形態において、抗体は、１つまたは複数の抗体（例えば、それらのそれぞれは第１の抗体の同じエピトープを認識する）にコンジュゲートされている。したがって、一部の態様において、抗体は、二量体、ポリマー、オリゴマー、または多量体の形態である。
【００６２】
例示的な態様において、結合性構築物は、抗体の抗原結合性断片であるか、または抗体の抗原結合性断片を含む。抗原結合性断片（また本明細書では「抗原結合部分」とも称される）は、本明細書に記載される抗体のいずれかの抗原結合性断片であってもよい。抗原結合性断片は、少なくとも１つの抗原結合部位を有する抗体のあらゆる部分であってもよく、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一特異性もしくは二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、一価ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、二重特異性のダイアボディ、三重特異性のトリアボディ、ミニボディ、またはＩｇＮＡＲの断片（例えば、Ｖ−ＮＡＲ）、またはｈｃＩｇＧの断片（例えば、ＶｈＨ）、またはビス−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ発現ライブラリーによって発現される断片などである。例示的な態様において、抗原結合性断片は、ドメイン抗体、ＶｈＨドメイン、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメインなどである。しかしながら、本開示の抗体断片は、これらの例示的なタイプの抗体断片に限定されない。例示的な態様において、結合性構築物は、Ｆａｂ断片を含む。例示的な態様において、結合性構築物は、２つのＦａｂ断片を含む。例示的な態様において、結合性構築物は、リンカーを介して接続された２つのＦａｂ断片を含む。例示的な態様において、結合性構築物は、２つのＦａｂ断片を含むミニボディを含むかまたはそのようなミニボディである。例示的な態様において、結合性構築物は、リンカーを介して繋がれた２つのＦａｂ断片を含むミニボディを含むかまたはそのようなミニボディである。ミニボディは、当該分野において公知である。例えば、Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６巻：３０５５〜３０６１頁（１９９６年）を参照されたい。例示的な態様において、結合性構築物は、任意選択でアルカリホスファターゼドメインを含む、リンカーを介して繋がれた２つのＦａｂ断片を含むミニボディを含むか、またはそのようなミニボディである。
【００６３】
ドメイン抗体は、抗体の機能的な結合単位を含み、抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応していてもよい。ドメイン抗体は、およそ１３ｋＤａの分子量、または完全抗体のおよそ１０分の１の分子量を有していてもよい。ドメイン抗体は、本明細書に記載されるものなどの完全抗体に由来するものでもよい。
【００６４】
結合性構築物は、一部の実施形態において、単量体またはポリマー、二重特異性または三重特異性、二価または三価である。例示的な態様において、本明細書で提供される結合性構築物は、単一特異性である。例示的な態様において、本明細書で提供される結合性構築物は、二重特異性である。例示的な態様において、本明細書で提供される結合性構築物は、完全にヒトのものである。例示的な態様において、結合性構築物は、２つのＦａｂ断片を含み、二価である。例示的な態様において、結合性構築物は、構造が同一な２つのＦａｂ断片のホモ二量体である。したがって、例示的な態様において、結合性構築物は、二価であるが、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対して単一特異性である。例示的な態様において、ホモ二量体は、へリックス−ターン−へリックスモチーフを介して二量体化されている。例示的な態様において、結合性構築物は、構造が同一な２つのＦａｂミニ抗体のホモ二量体である。したがって、例示的な態様において、結合性構築物は、二価であるが、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対して単一特異性である。例示的な態様において、２つのＦａｂミニ抗体のホモ二量体は、アルカリホスファターゼドメインを介して二量体化されている。
【００６５】
抗体分子の抗原結合性またはイディオタイプを含有する抗体断片は、当該分野において公知の技術によって生成することができる。例えば、このような断片としては、これらに限定されないが、抗体分子のペプシン消化によって生成することができるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することができるＦａｂ’断片；および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生成することができる２つのＦａｂ’断片が挙げられる。
【００６６】
単鎖可変領域断片（ｓＦｖ）抗体断片は、合成ペプチドを介して抗体軽鎖のＶドメインに連結された抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインを含む短縮されたＦａｂ断片からなり、これは、慣例的な組換えＤＮＡテクノロジー技術を使用して生成することができる（例えば、上記のＪａｎｅｗａｙらを参照）。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡテクノロジーによって調製することができる（例えば、Ｒｅｉｔｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７巻、６９７〜７０４頁（１９９４年）を参照）。
【００６７】
組換え抗体断片、例えばｓｃＦｖはまた、異なる標的抗原に高い結合アビディティおよび特異性を有する安定な多量体のオリゴマーに組み立てられるように操作されていてもよい。このようなダイアボディ（二量体）、トリアボディ（三量体）またはテトラボディ（四量体）は当該分野において周知である。例えば、Ｋｏｒｔｔら、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．  ２００１  １８巻：９５〜１０８頁、（２００１年）およびＴｏｄｏｒｏｖｓｋａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２４８巻：４７〜６６頁、（２００１年）を参照されたい。
【００６８】
二重特異性抗体（ｂｓｃＡｂ）は、組換え方法を使用してグリシン−セリンリンカーを介して繋がれた２つの単鎖Ｆｖ断片を含む分子である。例示的な実施形態において、目的の２つの抗体のＶ軽鎖（ＶＬ）およびＶ重鎖（ＶＨ）ドメインは、標準的なＰＣＲ方法を使用して単離される。次いで、２ステップの融合ＰＣＲで、各ハイブリドーマから得られたＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡを繋ぎ合わせて単鎖断片を形成する。二重特異性の融合タンパク質は、類似の方式で調製される。二重特異性の単鎖抗体および二重特異性の融合タンパク質は、本発明の開示の範囲内に含まれる抗体物質である。例示的な二重特異性抗体は、米国特許出願公開第２００５−０２８２２３３号Ａ１および国際特許出願公開ＷＯ２００５／０８７８１２号で教示されており、これら両方の出願はそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６９】
例示的な実施形態において、結合性構築物は、同じ標的抗原分子上の２つの異なるオーバーラップしていないエピトープに結合する能力を有する、二重パラトープの（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）抗体またはその二重パラトープの抗原結合性断片である。同じ細胞表面標的に同時に結合することによって、二重パラトープの抗体およびその二重パラトープの抗原結合性断片は、結合アビディティの強化をもたらし、標的を発現する細胞にのみ優先的な（強い）結合を生じさせて、それにより、抗体選択性の微調整を可能にする。二重パラトープの抗体またはその二重パラトープの抗原結合性断片は、同じ標的分子上の２つの異なるエピトープに同時に結合することによって、親抗体（または抗原結合性断片）を単独で、または組み合わせて使用しても達成し得ない新しい官能性を獲得することも可能になるかもしれないことが実証されている。例示的な態様において、本明細書で提供される結合性構築物は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対して二重パラトープのものである。
【００７０】
例示的な実施形態において、抗原結合性断片は、二重特異性、三重特異性、または多重特異性になるように操作されている。例示的な態様において、抗原結合性断片は、２つまたはそれより多くの別個の抗原結合性領域を含む。一部の態様において、抗原結合性断片は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａおよび少なくとも１つの他の抗原に特異的な二重特異性または三重特異性抗体である。例示的な態様において、結合性構築物は、第１のＦＩＸ  Ｐａｄｕａのエピトープおよび第２のＦＩＸ  Ｐａｄｕａのエピトープに特異的な二重特異性の抗原結合性断片である。例示的な実施形態において、抗原結合性断片は、二価、三価、または多価になるように操作されている。例示的な実施形態において、結合性構築物は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対して単一特異性を有する二価のＦａｂ断片である。一部の実施形態において、抗原結合性断片は、単量体の形態であり、一方で他の実施形態において、抗原結合性断片は、１つまたは複数の抗原結合性断片（例えば、それらのそれぞれは、第１の抗原結合性断片の同じエピトープを認識する）にコンジュゲートされている。したがって、一部の態様において、抗原結合性断片は、二量体化、重合、オリゴマー化、または多量体化されている。例示的な態様において、結合性構築物は、二量体化されたＦａｂ断片である。例示的な態様において、結合性構築物は、完全にヒトの二量体化されたＦａｂ断片である。例示的な態様において、結合性構築物は、へリックス−ターン−へリックスモチーフを介して二量体化されている。例示的な実施形態において、抗原結合性断片は、二価、三価、または多価になるように操作されている。例示的な実施形態において、結合性構築物は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対して単一特異性の二量体化された二価Ｆａｂ断片であり、ここで結合性構築物は、へリックス−ターン−へリックスモチーフを介して二量体化されている。
【００７１】
例示的な態様において、結合性構築物、例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、ＳＳＹＡＩＳ（配列番号６）；ＧＩＶＰＡＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号７）；ＳＷＧＶＩＳＦＡＹ（配列番号８）；ＲＡＳＱＤＩＳＳＹＬＮ（配列番号９）；ＡＡＳＮＬＱＳ（配列番号１０）；およびＭＱＹＤＳＬＰＦＴＦ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、配列番号６〜１１の各々の間に、１つまたは複数のアミノ酸が存在する。例示的な態様において、結合性構築物、例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２４もしくは配列番号２５または配列番号２４および２５の両方の配列を含む。例示的な態様において、結合性構築物、例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２６もしくは配列番号２７または配列番号２６および２７の両方の配列を含む。例示的な態様において、結合性構築物、例えば、抗体またはその抗原結合性断片のアミノ酸配列は、例えば、リンカー、発現タグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質など）の追加の配列を含む。例示的な態様において、結合性構築物、例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、Ｈｉｓタグおよび／またはＦＬＡＧタグの配列を含む。例示的な態様において、ＦＬＡＧタグは、配列番号１２の配列を含む。例示的な態様において、Ｈｉｓタグは、配列番号１３の配列を含む。例示的な態様において、結合性構築物、例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、リンカーを含む。例示的な態様において、結合性構築物、例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、合成二重へリックスループへリックスモチーフ、例えばＨａｙｌｏｃｋら、Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．  ４８巻（２号）：４６１〜４７０頁（２０１６年）またはＷａｎｇら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７８巻：９９７〜１００４頁（２００６年）に記載されるものを含む。例示的な態様において、結合性構築物、例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、定常抗体ドメインを含む。このような抗体ドメインは、Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６巻：３０５５〜３０６１頁（１９９６年）およびＭｃＧｒｅｇｏｒら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏ  ３１巻：２１９〜２２６頁（１９９４年）に記載されている。例示的な態様において、結合性構築物、例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、細菌のアルカリホスファターゼドメイン、例えば上記のＷａｎｇら（２００６年）に記載されるものを含む。例示的な態様において、結合性構築物、例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２８もしくは配列番号２７または配列番号２８および２７の両方の配列を含む。
【００７２】
アプタマー
一部の実施形態において、結合性構築物は、抗体の類似体である。一部の態様において、結合性構築物は、アプタマーである。近年のコンビナトリアル科学の分野における進歩により、所与の標的に高い親和性および特異性を有する短いポリマー配列（例えば、オリゴ核酸またはペプチド分子）が同定されてきた。例えば、ＳＥＬＥＸテクノロジーは、哺乳動物抗体に匹敵する結合特性を有するＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーを同定するのに使用されてきており、免疫学の分野は、無数の化合物に結合する抗体または抗体断片を生成し単離しており、ファージディスプレイは、非常に好都合な結合特性を有する新しいペプチド配列を発見するのに利用されている。これらの分子進化技術の成功に基づいて、任意の標的分子にも結合する分子を作り出すことができることは確かである。相補的な塩基対合を含まない短い領域から作り出されたヘアピンループを利用することが多いアプタマーや、ループ化された超可変領域のコンビナトリアルアレンジメント、および直鎖状ペプチドファージディスプレイの結果と比較して改善された結果を示した環状ペプチドを利用する新しいファージディスプレイライブラリーを利用する天然由来の抗体の場合と同様に、ループ構造は、所望の結合属性を提供することに関連することが多い。アプタマーについてより詳細には、概して、Ｇｏｌｄ，  Ｌ．、Ｓｉｎｇｅｒ，  Ｂ．、Ｈｅ，  Ｙ．  Ｙ．、Ｂｒｏｄｙ．  Ｅ．、「Ａｐｔａｍｅｒｓ  Ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ」、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７４巻：５〜１３頁（２０００年）を参照されたい。アプタマーを生成するための関連技術は、参照によりその全体が組み入れられる米国特許第６，６９９，８４３号に見出すことができる。
【００７３】
抗体または抗原結合性断片の産生方法
抗体の好適な作製方法は、当該分野において公知である。例えば、標準的なハイブリドーマ方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８年）、およびＣＡ．  Ｊａｎｅｗａｙら（編）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（２００１年））に記載されている。
【００７４】
簡単に述べれば、ポリクローナル抗体は、本開示のポリペプチドを含む免疫原で動物を免疫化し、その免疫化された動物から抗血清を収集することによって調製される。抗血清産生には広範な動物種を使用することができる。一部の態様において、抗抗血清の産生に使用される動物は、非ヒト動物、例えばウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウマなどである。ウサギは血液量が比較的多いことから、ウサギがポリクローナル抗体の産生のために好ましい選択である。選択されるＦＩＸ  Ｐａｄｕａエピトープとの免疫反応性を有するポリクローナル抗血清を生成するための例示的な方法において、ウサギ免疫化のために、フロイント完全アジュバント中で、５０μｇのＦＩＸ  Ｐａｄｕａ抗原を乳化する。例えば２１日の間隔で、ブーストのために、フロイント不完全アジュバント中で、５０μｇのエピトープを乳化する。抗体を生成させた後、単に動物を放血させ全血から血清サンプルを調製することによって、ポリクローナル抗血清を得ることができる。
【００７５】
本開示の方法で使用するためのモノクローナル抗体は、培養物中の連続細胞株によって抗体分子の産生をもたらすあらゆる技術を使用して調製することができる。このような技術としては、これらに限定されないが、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって元々説明されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻：４９５〜４９７頁、１９７５年）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４巻：７２頁、１９８３年；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８０巻：２０２６〜２０３０頁、１９８３年）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．、７７〜９６頁、（１９８５年）が挙げられる。
【００７６】
簡単に述べれば、例示的な実施形態において、モノクローナル抗体を生成するために、マウスに組換えＦＩＸ  Ｐａｄｕａを定期的に注射し、それに対する抗体を生じさせる（例えば、１０〜２０μｇをフロイント完全アジュバント中で乳化する）。マウスに、ＰＢＳ中のＦＩＸ  Ｐａｄｕａの最終的な融合前ブーストを与え、４日後にマウスを屠殺し、その脾臓を取り出す。脾臓を１０ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０中に入れ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＲＰＭＩ）が補充された無血清ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｎａｄａ）中に浸した２枚のガラス顕微鏡スライドの艶消しの端部の間で脾臓を磨り潰すことによって、単一細胞の懸濁物を形成する。細胞懸濁物を、滅菌された７０メッシュのＮｉｔｅｘセルストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）に通過させて濾過し、２００ｇで５分間遠心分離し、ペレットを２０ｍｌの無血清ＲＰＭＩ中に再懸濁することによって２回洗浄する。３匹のナイーブＢａｌｂ／ｃマウスから採取した脾細胞を、類似の方式で調製し、対照として使用する。融合の前に、１１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ中で対数期で３日間維持したＮＳ−１骨髄腫細胞（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）を２００ｇで５分遠心分離し、ペレットを２回洗浄する。
【００７７】
脾臓細胞（１×１０８個）を２．０×１０７個のＮＳ−１細胞と合わせ、遠心分離し、上清を吸引する。細胞ペレットを軽く叩くことによってチューブから取り外し、１ｍｌの３７℃のＰＥＧ１５００（５０％、７５ｍＭのＨｅｐｅｓ中、ｐＨ８．０）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を撹拌しながら１分にわたり添加し、続いて７ｍｌの無血清ＲＰＭＩを７分にわたり添加する。追加の８ｍｌのＲＰＭＩを添加し、細胞を２００ｇで１０分遠心分離する。上清を捨てた後、ペレットを、１５％ＦＢＳ、１００μＭナトリウムヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン（ＨＡＴ）（Ｇｉｂｃｏ）、２５ユニット／ｍｌのＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および脾細胞１．５×１０６個／ｍｌを含有する２００ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁し、１０個のＣｏｒｎｉｎｇの平底９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｎ．Ｙ．）にプレーティングする。
【００７８】
融合後の２、４、および６日目に、融合プレートのウェルから１００μｌの培地を取り出し、新しい培地で交換する。８日目、ＥＬＩＳＡによって融合体をスクリーニングし、以下のようにＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合するマウスＩｇＧの存在に関して試験する。Ｉｍｍｕｌｏｎ４プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）を、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５で希釈した１００ｎｇ／ウェルのＥＧＦＲで、３７℃で２時間コーティングする。コーティング溶液を吸引し、２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液（ＣＭＦ−ＰＢＳで希釈した０．５％魚皮ゼラチン（Ｓｉｇｍａ））を添加し、３７℃で３０分インキュベートする。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、５０μｌの培養上清を添加する。３７℃で３０分間インキュベートし、上述したように洗浄した後、ＰＢＳＴ中１：３５００で希釈した５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（ｆｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐａ．）を添加する。上述したようにプレートをインキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、ｐＨ４．５の１００ｍＭクエン酸塩中の、１ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）および０．１μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２からなる１００μｌの基質を添加する。５０μｌの１５％Ｈ２ＳＯ４を添加することによって５分後に呈色反応を止める。プレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）でＡ４９０を読み取る。
【００７９】
選択された融合ウェルを、９６ウェルプレートへの希釈によって２回クローニングし、５日後に１ウェル当たりのコロニーの数を可視的にスコア付けする。ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体を、Ｉｓｏｓｔｒｉｐシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）を使用してアイソタイプに分類する。
【００８０】
ハイブリドーマ技術を採用する場合、骨髄腫細胞株を使用することができる。このようなハイブリドーマを産生する融合手順での使用に適した細胞株は、好ましくは抗体非産生性であり、高い融合効率を有し、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）の増殖だけを支持するある特定の選択培地でそれらが増殖できないように酵素が欠失している。例えば、免疫化された動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／１５ＸＸ０  Ｂｕｌを使用してもよく；ラットの場合、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０を使用してもよく；細胞融合に関して、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６が全て有用である。
【００８１】
宿主の種に応じて、様々なアジュバントを使用して、免疫応答を増加させることができる。このようなアジュバントとしては、これらに限定されないが、フロイント、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、ならびに表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、およびジニトロフェノールが挙げられる。ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍは、有用なヒトアジュバントの可能性がある。
【００８２】
代替として、他の方法、例えばＥＢＶ−ハイブリドーマ方法（ＨａｓｋａｒｄおよびＡｒｃｈｅｒ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７４巻（２号）、３６１〜６７頁（１９８４年）、およびＲｏｄｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１巻、１４０〜６７頁（１９８６年））、およびバクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１２７５〜８１頁（１９８９年）を参照）が当該分野において公知である。さらに、非ヒト動物で抗体を産生する方法は、例えば、米国特許５，５４５，８０６、５，５６９，８２５、および５，７１４，３５２、ならびに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号Ａｌに記載されている。
【００８３】
抗体はまた、Ｏｒｌａｎｄｉら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６巻：３８３３〜３８３７頁；１９８９年）、およびＷｉｎｔｅｒ  ＧおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（Ｎａｔｕｒｅ  ３４９巻：２９３〜２９９頁、１９９１年）で開示されたように、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてリンパ球集団中での産生を誘導することによって、または組換え免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによっても産生することができる。抗体または抗原結合性断片の全配列が公知の場合、組換えタンパク質を産生する方法を採用することができる。例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５巻（２号）：１３５〜１４６頁（２００８年）を参照されたい。
【００８４】
またファージディスプレイも、本発明の開示の抗体を生成するのに使用することができる。これに関して、抗体の抗原結合性可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリーは、標準的な分子生物学および組換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１年）を参照）。所望の特異性を有する可変領域をコードするファージは、所望の抗原への特異的な結合に関して選択され、選択された可変ドメインを含む完全なまたは部分的な抗体が再構成される。再構成された抗体をコードする核酸配列は、細胞によってモノクローナル抗体の特徴を有する抗体が分泌されるように、好適な細胞株、例えばハイブリドーマ産生に使用される骨髄腫細胞に導入される（例えば、上記のＪａｎｅｗａｙら、上記のＨｕｓｅら、および米国特許６，２６５，１５０を参照）。関連の方法は、米国特許第５，４０３，４８４；米国特許第５，５７１，６９８；米国特許第５，８３７，５００；米国特許第５，７０２，８９２にも記載されている。技術は、米国特許第５，７８０，２７９；米国特許第５，８２１，０４７；米国特許第５，８２４，５２０；米国特許第５，８５５，８８５；米国特許第５，８５８，６５７；米国特許第５，８７１，９０７；米国特許第５，９６９，１０８；米国特許第６，０５７，０９８；および米国特許第６，２２５，４４７に記載されている。
【００８５】
抗体は、特定の重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックであるトランスジェニックマウスによって産生することができる。このような方法は当該分野において公知であり、例えば米国特許第５，５４５，８０６号および同５，５６９，８２５号、ならびに上記のＪａｎｅｗａｙらに記載されている。
【００８６】
ヒト化抗体を生成するための方法は当該分野において周知であり、例えば、上記のＪａｎｅｗａｙら、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号、欧州特許第０２３９４００号Ｂ１、および英国特許第２１８８６３８号で詳細に記載されている。ヒト化抗体はまた、米国特許第５，６３９，６４１号およびＰｅｄｅｒｓｅｎら、Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ、２３５巻、９５９〜９７３頁（１９９４年）に記載された抗体リサーフェイシングテクノロジー（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用しても生成することができる。好ましいキメラまたはヒト化抗体は、ヒト定常領域を有し、抗体の可変領域、または少なくともＣＤＲは、非ヒト種由来である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は当該分野において周知である。（米国特許第５，５８５，０８９号、および同第５，６９３，７６２号を参照）。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源からそのフレームワーク領域に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、Ｊｏｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻：５２２〜５２５頁、１９８６年）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁、１９８８年）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９巻：１５３４〜１５３６頁、１９８８年）に記載された方法を使用して、げっ歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域の代わりに使用することによって実行することができる。操作された抗体を調製するための非常に多くの技術が、例えば、ＯｗｅｎｓおよびＹｏｕｎｇ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、１６８巻：１４９〜１６５頁（１９９４年）に記載されている。次いでさらなる変化を抗体のフレームワークに導入して、親和性または免疫原性をモジュレートすることができる。
【００８７】
「キメラ抗体」の産生のために開発された技術である、適切な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを使用することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２巻：６０４〜６０８頁（１９８４年）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４巻：４５２〜４５４頁（１９８５年））。代替として、単鎖抗体の産生に関して記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、ＥＧＦＲまたはＨＳＰ９０特異的な単鎖抗体を産生するように適合させることができる。
【００８８】
同様に、ＣＤＲを含む組成物は、当該分野において公知のＣＤＲを単離するための技術を使用して生成される。相補性決定領域は、６つのポリペプチドループ（重鎖または軽鎖可変領域の各々につき、３つのループ）を特徴とする。ＣＤＲにおけるアミノ酸位置は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、（１９８３年）によって定義される。例えば、ヒト抗体の超可変領域は、概して、重鎖および軽鎖可変領域の残基２８〜３５、４９〜５９、および残基９２〜１０３で見出されるものと定義される（ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９６年））。またマウスＣＤＲも、概ねこれらのアミノ酸残基に見出されている。当該分野において、ＣＤＲ領域は、上述されたこれらのおよその残基の数個のアミノ酸内に見出され得ることが理解されている。免疫グロブリン可変領域も、ＣＤＲを取り囲む４つの「フレームワーク」領域（ＦＲ１〜４）からなる。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で高度に保存されており、ヒト配列とマウス配列との間でも保存されている。
【００８９】
モノクローナル抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の１つ、２つ、および／または３つのＣＤＲを含む組成物が生成される。ヌクレオチドおよびポリペプチド配列をクローニングおよび発現するための技術は、当該分野で十分に確立されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９年）を参照）。増幅させたＣＤＲ配列を、適切な発現ベクターにライゲートさせる。１つ、２つ、３つ、４つ、５つおよび／または６つのクローニングしたＣＤＲを含むベクターは、任意選択で、ＣＤＲに連結された追加のポリペプチドをコードする領域を含有する。
【００９０】
マウス抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）は、１２００種を超えるヒトＶＨ配列および１０００種を超えるＶＬ配列を含むヒト抗体可変配列の大きいデータベースから選択される互換性のあるヒトフレームワーク領域を置換することによってヒト化される。比較に使用される抗体配列のデータベースは、Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．  Ｒ．  ＭａｒｔｉｎのＫａｂａｔＭａｎウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｕｂｉｃ．ｒｄｇ．ａｃ．ｕｋ／ａｂｓ／）からダウンロードされる。ＣＤＲを同定するためのＫａｂａｔの方法は、あらゆるヒト抗体からおよそのＣＤＲおよびフレームワーク領域を描き、類似性に関してマウス抗体の配列と比較してＣＤＲおよびＦＲを決定するための手段を提供する。高い全体的なフレームワークのマッチング、類似のＣＤＲ長さ、および正規の残基およびＶＨ／ＶＬ接触残基の最小のミスマッチに基づき、最もマッチしたヒトＶＨおよびＶＬ配列が選択される。マウス配列に最も類似したヒトフレームワーク領域が、マウスＣＤＲ間に挿入される。代替として、マウスフレームワーク領域は、ヒト抗体のフレームワーク領域により厳密に似ているネイティブのフレームワーク領域の全てまたは一部のアミノ酸置換を行うことによって改変されていてもよい。
【００９１】
加えて、本発明の開示で使用するための抗体を生成するための他の有用な技術は、合理的設計タイプのアプローチを使用する技術であり得る。合理的設計の目的は、それらが相互作用する生物学的に活性なポリペプチドの構造的な類似体または化合物（アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、ペプチドミメティク（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、結合パートナーなど）を産生することである。１つのアプローチでは、抗体またはそのエピトープ結合断片の３次元構造を生成することになる。これは、Ｘ線結晶学、コンピューターモデリングによって、または両方のアプローチの組み合わせによって達成することができる。代替アプローチである「アラニンスキャン」は、分子中の残基をアラニンでランダムに置き換え、それにより生じる機能に対する効果を決定することを含む。
【００９２】
化学的に構築された二重特異性抗体は、例えばヘテロ二官能性試薬であるスクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）−プロピオネート（ＳＰＤＰ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）などの化学物質を用いて異種ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を化学的に架橋することによって調製することができる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、無傷の抗体をパパインまたはペプシンでそれぞれ消化することによって、無傷の抗体から得ることができる（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６０巻：１６８６〜７０１頁（１９８４年）；Ｔｉｔｕｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８巻：４０１８〜２２頁（１９８７年））。
【００９３】
どのように抗体が産生されたかにかかわらずＦＩＸ  Ｐａｄｕａのエピトープに結合する能力に関して抗体を試験する方法は、当該分野において公知であり、あらゆる抗体−抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、表面プラズモン共鳴、および競合阻害アッセイなどが挙げられる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、下記、および米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号を参照）。
【００９４】
ポリペプチド
配列番号６〜１１の各々を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドが、本明細書においてさらに提供される。ポリペプチドは、ＦＩＸｐに結合し、ＷＴ  ＦＩＸに結合せず、例えば、ポリペプチドは、ＷＴ  ＦＩＸの存在下でも、任意選択で、他の凝固因子、例えば第ＩＩ因子および第Ｘ因子の存在下でも、ＦＩＸｐにのみ結合する。例示的な態様において、ポリペプチドは、少なくとも５％、少なくとも１０％または少なくとも２０％のヒト血漿を含むサンプル中のＦＩＸｐに結合する。例示的な態様において、配列番号６〜１１の各々の間に、１つまたは複数のアミノ酸が存在する。例示的な態様において、ポリペプチドは、配列番号２４もしくは配列番号２５または配列番号２４および２５の両方の配列を含む。例示的な態様において、ポリペプチドは、配列番号２６もしくは配列番号２７または配列番号２６および２７の両方の配列を含む。例示的な態様において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、リンカー、発現タグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質など）の追加の配列を含む。例示的な態様において、ポリペプチドは、Ｈｉｓタグおよび／またはＦＬＡＧタグの配列を含む。例示的な態様において、ＦＬＡＧタグは、配列番号１２の配列を含む。例示的な態様において、Ｈｉｓタグは、配列番号１３の配列を含む。例示的な態様において、ポリペプチドは、リンカーを含む。例示的な態様において、ポリペプチドは、合成二重へリックスループへリックスモチーフの配列、例えばＨａｙｌｏｃｋら、Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．  ４８巻（２号）：４６１〜４７０頁（２０１６年）またはＷａｎｇら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７８巻：９９７〜１００４頁（２００６年）に記載されるものを含む。例示的な態様において、ポリペプチドは、定常抗体ドメインの配列を含む。このような抗体ドメインは、Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６巻：３０５５〜３０６１頁（１９９６年）およびＭｃＧｒｅｇｏｒら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏ  ３１巻：２１９〜２２６頁（１９９４年）に記載されている。例示的な態様において、ポリペプチドは、細菌のアルカリホスファターゼドメイン、例えば上記のＷａｎｇら（２００６年）に記載されるものを含む。例示的な態様において、ポリペプチドは、配列番号２８もしくは配列番号２７または配列番号２８および２７の両方の配列を含む。
【００９５】
コンジュゲート
本明細書に記載される結合性構築物は、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、もしくはリン酸化によって、または酸付加塩、アミド、エステル、特にＣ末端エステル、およびＮ−アシル誘導体を作り出すことによって改変することができる。また結合性構築物は、他の成分と共有結合または非共有結合複合体、すなわちコンジュゲートを形成することによって誘導体が作り出されるように改変することもできる。共有結合した複合体は、結合性構築物を含むアミノ酸の側鎖上の官能基に、またはＮもしくはＣ末端で化学成分を連結することによって調製することができる。
【００９６】
一部の実施形態において、本開示の結合性構築物は、第２の成分（例えば、異種成分）に付着される、連結される、繋がれる、またはコンジュゲートされ、得られた生成物は、コンジュゲートである。したがって、本明細書は、異種成分に（共有結合で、または非共有結合によって）連結された本明細書に記載される結合性構築物を含むコンジュゲートを提供する。本明細書で使用される場合、用語「異種成分」は、本発明の結合性構築物と異なるあらゆる分子（化学的もしくは生化学、天然に存在する、または非コード化）を指す。例示的な異種成分としては、これらに限定されないが、ポリマー、炭水化物、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、治療剤（例えば、細胞傷害剤、サイトカイン）、診断剤または検出剤が挙げられる。
【００９７】
一部の実施形態において、結合性構築物は、様々な異種成分で化学修飾される。一部の実施形態において、化学修飾は、本明細書で論じられるような追加の所望の特徴を付与する。化学修飾は、一部の態様において、様々な異なる形態、例えば異種ペプチド、多糖類、脂質、放射性同位体、非標準的なアミノ酸残基および核酸、金属キレート、ならびに様々な細胞傷害剤などの形態をとる。
【００９８】
一部の実施形態において、結合性構築物は、様々な特性、例えば、溶解度および／または安定性および／または半減期の増加、タンパク質分解による切断に対する耐性、クリアランスのモジュレーション、特定の細胞または組織タイプへの標的化を付与するために、異種ペプチドに融合される。一部の実施形態において、結合性構築物は、ＩｇＧまたは他の免疫グロブリンのＦｃドメインに連結される。一部の実施形態において、結合性構築物は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）に融合されている。ＦｃまたはＡＰ融合構築物を作製するための方法は、国際特許公開ＷＯ０２／０６０９５０号に見出される。結合性構築物を、特異的な特性（例えば、半減期、バイオアベイラビリティ）を有するタンパク質ドメインと融合させることによって、これらの特性を本発明の結合性構築物に付与することが可能である。
【００９９】
結合性構築物は、検出剤（例えば、検出可能な標識またはレポーター基）、これらに限定されないが、放射性標識、蛍光標識、酵素（例えば、熱量測定または蛍光測定的な反応を触媒する酵素）、基質、固体マトリクス、または担体（例えば、ビオチンまたはアビジン）などにコンジュゲートさせることができる。例示的な態様において、蛍光標識は、ローダミン色素、フルオレセイン色素および／またはシアニン色素を含む。例示的な実施形態において、蛍光標識は、一組の色素、例えば、ローダミン色素、ＴＡＭＲＡ、およびフルオレセイン色素、ＦＡＭを含む。別の実施形態において、蛍光標識は、オレゴングリーン４８８、フルオレセイン−ＥＸ（Ｆｌｉｔｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＥＸ）、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンレッド−Ｘ、リサミンローダミンＢ、カルセイン、フルオレセイン、ローダミン、１つまたは複数のＢＯＤＩＰＹ色素、テキサスレッド、オレゴングリーン５１４、および１つまたは複数のＡｌｅｘａ  Ｆｈｉｏｒからなる群より２つもしくはそれより多くの色素を選択することによって形成された一組の蛍光色素を含む。代表的なＢＯＤＩＰＹ色素としては、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０およびＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５が挙げられる。代表的なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒとしては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０および７９０が挙げられる。例示的な態様において、蛍光標識は、オレゴングリーン４８８、フルオレセイン−ＥＸ、ＦＩＴＣ、ローダミンレッド−Ｘ、リサミンローダミンＢ、カルセイン、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹＳ、およびテキサスレッド、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第１１版（２０１０年）に開示されているものの１つまたは複数を含む。例示的な態様において、検出可能な標識は、放射性同位体、発色団、フルオロフォア、蛍光色素、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、リンカー分子または他の成分もしくは化合物から選択され、これらは、検出可能なシグナル（例えば、放射能、蛍光、色）を放出するか、または標識がその基質に曝露された後に検出可能なシグナルを放出するかのいずれかである。様々な検出可能な標識／基質対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識化するための方法、および標識化された二次抗体を使用して抗原を検出するための方法は、当該分野において周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９９年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。
【０１００】
一部の実施形態において、結合性構築物は、リンカーの非存在下で、異種成分に直接繋がれている。代替の態様において、結合性構築物は、１つまたは複数のリンカーを介して、異種成分に間接的に接続されている。直接的に繋ぎ合わされているかまたはリンカーを介して間接的に繋ぎ合わされているかにかかわらず、結合性構築物は、共有結合（例えば、ペプチド、エステル、アミド、またはスルフヒドリル結合）もしくは非共有結合（例えば、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス結合、静電またはイオン性相互作用を介して）、またはそれらの組み合わせを介して接続されていてもよい。本発明の結合性構築物および異種成分は、当該分野において公知のあらゆる手段を介して接続されていてもよく、これらに限定されないが、本発明のいずれかのリンカーを介して接続されていてもよい。
【０１０１】
本明細書に記載される結合性構築物の特定の残基は、異種成分が付着する可能性がある例示的な部位を表す。例えば、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＮ末端残基、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏは、異種成分が付着する可能性がある部位を表す。一部の態様において、残基（またはその部分）は、異種成分を付着させる前に、１つもしくは複数の薬剤および／または化学物質で活性化される。
【０１０２】
二官能性の薬剤での誘導体化は、水不溶性の支持マトリクスに結合性構築物を架橋するのに有用である。このような誘導体化はまた、結合性構築物中で隣接する結合エレメントを接続し、または結合エレメントを異種ペプチド、例えばＦｃ断片に接続することができるリンカーを提供する場合もある。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル、例えばジスクシンイミジルエステル、例えば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、および二官能性マレイミド、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどが挙げられる。例えばメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することが可能な光活性化可能な中間体を生じる。代替として、タンパク質固定のために、反応性水不溶性マトリクス、例えば臭化シアンで活性化される炭水化物、ならびに参照により本明細書に組み入れられる米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；および同第４，３３０，４４０号に記載される反応性基質が採用される。
【０１０３】
一般的に、化学的な誘導体化は、タンパク質を異種成分、例えば活性化されたポリマー分子と反応させるのに使用されるあらゆる好適な条件下で実行することができる。ポリペプチドの化学的な誘導体を調製するための方法は、一般的に、（ａ）結合性構築物を、結合性構築物が１つまたは複数のポリマー分子に付着するようになる条件下で、異種成分、例えば活性化されたポリマー分子（例えばポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させるステップ、および（ｂ）反応生成物を得るステップを含むであろう。最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づき決定されるであろう。例えば、ポリマー分子：タンパク質の比率が大きいほど、付着したポリマー分子の量がより多くなる。一部の実施形態において、化合物は、アミノ末端に単一のポリマー分子成分を有していてもよい。（例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照）。
【０１０４】
本明細書で開示された誘導体化された結合性構築物は、誘導体化されていない分子と比較して、追加の活性、強化もしくは低減された生物活性、または他の特徴、例えば増加もしくは減少した半減期を有していてもよい。
【０１０５】
コンジュゲート：Ｆｃ融合体
ヒトＩｇＧのＦｃ領域などの置換基の場合、融合体は、本発明の結合性構築物に直接融合させる、または介在配列を介して融合させてもよい。例えば、ヒトＩｇＧヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を、結合性構築物のＮ末端またはＣ末端のいずれかで融合させて、Ｆｃ領域を付着させることができる。得られたＦｃ融合構築物は、プロテインＡアフィニティーカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）による精製を可能にする。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、融合していない対応物より実質的に大きい半減期を呈し得る。Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であってもよく、または優れた特徴、例えば、治療または診断のクオリティー、循環時間、凝集の低減のために改変されてもよい。上述したように、一部の実施形態において、結合性構築物は、免疫グロブリンまたはその部分（例えば、可変領域、ＣＤＲ、またはＦｃ領域）にコンジュゲートしており、例えば融合している。免疫グロブリン（Ｉｇ）の公知のタイプとしては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭが挙げられる。Ｆｃ領域は、Ｉｇ重鎖のＣ末端領域であり、これは、再利用（これは、延長した半減期をもたらす）、抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの活動を行うＦｃ受容体への結合に関与する。
【０１０６】
例えば、一部の定義によれば、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から重鎖のＣ末端に伸長する。「ヒンジ領域」は、一般的に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０に伸長する（他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、システイン結合に関与するシステインを整列することによってＩｇＧ１配列と整列することができる）。ＩｇＧのＦｃ領域は、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインは通常、アミノ酸２３１からアミノ酸３４１に伸長する。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ３ドメインは通常、アミノ酸３４２から４４７に伸長する。免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片もしくは領域のアミノ酸の番号付けに対してなされた言及は全て、Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄに基づく。関連する実施形態において、Ｆｃ領域は、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖、例えばＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２およびＣＨ３領域、またはＩｇＥのＣＨ３およびＣＨ４領域に由来する、１つまたは複数のネイティブのまたは改変された定常領域を含んでいてもよい。
【０１０７】
好適な異種成分は、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン配列の部分を含む。ＦｃＲｎは、サルベージ受容体であり、免疫グロブリンを再利用し、それを血液の循環に戻すことに関与する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶学に基づき説明されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２巻：３７９頁）。Ｆｃの主要なＦｃＲｎとの接触領域は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの接合部に近い。Ｆｃ−ＦｃＲｎの接触は、全て単一のＩｇ重鎖内である。主要な接触部位としては、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６が挙げられる。
【０１０８】
アミノ酸改変は、免疫グロブリンのＦｃ領域になされてもよい。このようなバリアントＦｃ領域は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（残基３４２〜４４７）中に少なくとも１つのアミノ酸改変、および／またはＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（残基２３１〜３４１）中に少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。ＦｃＲｎに対する親和性の増加を付与すると考えられる変異としては、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａが挙げられる（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６巻：６５９１頁）。他の変異は、ＦｃＲｎへの親和性を有意に低減させずに、Ｆｃ領域のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、および／またはＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減させることができる。例えば、Ｆｃ領域の２９７位におけるＡｌａまたは別のアミノ酸でのＡｓｎの置換は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除去し、免疫原性の低減とそれに伴うＦｃ領域の半減期の延長、加えてＦｃγＲへの結合の低減をもたらす可能性がある（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら、１９９５年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６０巻：８４７頁；Ｆｒｉｅｎｄら、１９９９年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８巻：１６３２頁；Ｓｈｉｅｌｄｓら、１９９５年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６巻：６５９１頁）。ＦｃγＲへの結合を低減させるＩｇＧ１の２３３〜２３６位におけるアミノ酸改変がなされている（ＷａｒｄおよびＧｈｅｔｉｅ  １９９５年、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２巻：７７頁およびＡｒｍｏｕｒら、１９９９年、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９巻：２６１３頁）。一部の例示的なアミノ酸置換は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許７，３５５，００８および７，３８１，４０８に記載されている。
【０１０９】
異種成分：ポリマー、炭水化物、および脂質
例示的な実施形態において、異種成分は、ポリマーである。ポリマーは、分岐状であっても、または非分岐状であってもよい。ポリマーは、どのような分子量を有していてもよい。一部の実施形態において、ポリマーは、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの間の平均分子量を有する（用語「約」は、水溶性ポリマーの調製物において、一部の分子が、述べられた分子量より高いか多少低い重さを有することを示す）。ポリマーの平均分子量は、一部の態様において、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの間、約１２ｋＤａ〜約４０ｋＤａの間、または約２０ｋＤａ〜約３５ｋＤａの間である。
【０１１０】
一部の実施形態において、ポリマーは、重合度を制御できるように、単一の反応性基、例えばアシル化の場合は活性エステル、またはアルキル化の場合はアルデヒドを有するように改変される。一部の実施形態において、ポリマーは、それが付着するタンパク質が水性環境、例えば生理学的な環境で沈殿しないように、水溶性である。一部の実施形態において、例えば組成物が治療的用途で使用される場合、ポリマーは、薬学的に許容されるものである。加えて、一部の態様において、ポリマーは、ポリマーの混合物、例えばコポリマー、ブロックコポリマーである。
【０１１１】
一部の実施形態において、ポリマーは、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレンおよびその誘導体、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート（ｔｅｒｅｐｔｈａｌａｔｅ）など、アクリル酸およびメタクリル酸エステルのポリマー、例えば、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、およびポリ（アクリル酸オクタデシル）など、ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリ（酢酸ビニル）、およびポリビニルピロリドンなど、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそれらのコポリマー、セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、およびセルロース硫酸ナトリウム塩など、ポリプロピレン、ポリエチレン、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、およびポリ（フタル酸エチレン）など、ならびにポリスチレンからなる群より選択される。
【０１１２】
一部の態様において、ポリマーは、生分解性ポリマー、例えば合成生分解性ポリマー（例えば、乳酸とグリコール酸とのポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、およびポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン））、ならびに天然生分解性ポリマー（例えば、アルギネートおよび他の多糖類、例えばデキストランおよびセルロースなど、コラーゲン、それらの化学誘導体（化学基、例えばアルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者によって慣例的になされる他の改変）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質（例えば、ゼイン、ならびに他のプロラミンおよび疎水性タンパク質））、加えてそれらのあらゆるコポリマーまたは混合物である。一般的に、これらの材料は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける酵素加水分解または水分への曝露のいずれかによる、表面またはバルクの浸食によって分解する。
【０１１３】
一部の態様において、ポリマーは、生体接着性ポリマー、例えば、その教示が本明細書に組み入れられるＨ．  Ｓ．  Ｓａｗｈｎｅｙ、Ｃ．  Ｐ．  ＰａｔｈａｋおよびＪ．  Ａ．  ＨｕｂｂｅｌｌによるＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９３年、２６巻、５８１〜５８７頁で記載された生体内分解性ヒドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン（ｇｌｕｔｉｎ）、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、およびポリ（アクリル酸オクタデシル）などである。
【０１１４】
一部の実施形態において、ポリマーは、水溶性ポリマーまたは親水性ポリマーである。好適な水溶性ポリマーは、当該分野において公知であり、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Ｋｌｕｃｅｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Ｍｅｔｈｏｃｅｌ）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ｅｔｈｏｃｅｌ）、ヒドロキシエチルセルロース、様々なアルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース、様々なセルロースエーテル、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ポリメタクリル酸ヒドロキシアルキル、メタクリル酸ヒドロキシメチル、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸のナトリウムおよびカルシウム塩（ｓｏｄｉｕｍ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、メタクリル酸カリウムジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ならびにそれらの誘導体、塩、および組み合わせが挙げられる。一部の態様において、水溶性ポリマーまたはそれらの混合物としては、これらに限定されないが、Ｎ−結合型またはＯ−結合型炭水化物、糖、ホスフェート、炭水化物；糖；ホスフェート；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、タンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態、例えばモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールなど）；モノメトキシポリエチレングリコール；デキストラン（例えば、低分子量デキストラン、例えば約６ｋＤのもの）、セルロース；セルロース；他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコールが挙げられる。また、本発明は、共有結合で付着した多量体を調製するのに使用できる二官能性の架橋分子も包含する。
【０１１５】
本明細書での使用のための特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは、本明細書で使用される場合、他のタンパク質を誘導体化するのに使用できるＰＥＧの形態のいずれかを包含することを意味し、例えばモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールなどである。ＰＥＧは、広範な分子量で入手可能な直鎖状または分岐状の中性ポリエーテルであり、水とほとんどの有機溶媒に可溶性である。ＰＥＧは、水中に存在する場合、主としてその高い動的な鎖の移動性と親水性の性質によって、他のタンパク質またはポリマーの表面に付着したときに水のシェルまたは水和層（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｓｐｈｅｒｅ）を作り出すことから、他のポリマーまたはペプチドを排除するのに有効である。ＰＥＧは、非毒性、非免疫原性であり、食品医薬品局によって内部での消費に承認されている。
【０１１６】
ペグ化化合物を調製するための方法は、（ａ）化合物が１つまたは複数のＰＥＧ基に付着するようになる条件下で、化合物をポリエチレングリコール（例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させるステップ、および（ｂ）反応生成物を得るステップを含んでいてもよい。一般的に、アシル化反応のための最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定されるであろう。例えば、ＰＥＧ：化合物の比が大きいほど、ポリペグ化生成物のパーセンテージがより大きくなる。一部の実施形態において、結合性構築物は、Ｎ末端に単一のＰＥＧ成分を有する。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，２３４，７８４号を参照されたい。
【０１１７】
一部の実施形態において、異種成分は、炭水化物である。一部の実施形態において、炭水化物は、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナンである。
【０１１８】
一部の実施形態において、異種成分は、脂質である。一部の実施形態において、脂質は、脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、一、二、三置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質、サッカロリピド（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、またはポリケチド、油、ワックス、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質である。
【０１１９】
異種成分：治療剤
一部の実施形態において、異種成分は、治療剤である。治療剤は、当該分野において公知のもののいずれでもよい。本明細書において企図される治療剤の例としては、これらに限定されないが、天然の酵素、天然供給源由来のタンパク質、組換えタンパク質、天然のペプチド、合成ペプチド、環状ペプチド、抗体、受容体アゴニスト、細胞傷害剤、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）、ベータ−アドレナリン遮断剤、カルシウムチャネル遮断薬、冠血管拡張薬、強心配糖体、抗不整脈薬、心臓交感神経様作用薬（ｃａｒｄｉａｃ  ｓｙｍｐａｔｈｏｍｅｍｅｔｉｃ）、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、利尿薬、変力物質、コレステロールおよびトリグリセリド降下剤、胆汁酸金属イオン封鎖剤、フィブラート、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル（ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔｅｒｙｌ）（ＨＭＧ）−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ナイアシン誘導体、抗アドレナリン作動薬、アルファ−アドレナリン遮断剤、中枢作用性抗アドレナリン作動薬、血管拡張薬、カリウム保持剤、チアジドおよび関連薬剤、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、末梢血管拡張薬、抗アンドロゲン剤、エストロゲン、抗生物質、レチノイド、インスリンおよび類似体、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、ビグアニド、メグリチニド、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン（ｔｈｉｚａｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）、アンドロゲン、プロゲストゲン、骨代謝調節薬、下垂体前葉ホルモン、視床下部ホルモン、下垂体後葉ホルモン、ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニスト、排卵刺激剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、抗甲状腺剤、甲状腺ホルモン、膨張性物質（ｂｕｌｋ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、緩下剤、蠕動抑制薬（ａｎｔｉｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ）、フローラ調節剤、腸内吸着剤、腸内抗感染薬、食欲増進薬（ａｎｔｉａｎｏｒｅｘｉｃ）、抗悪液質薬（ａｎｔｉｃａｃｈｅｘｉｃ）、抗過食薬（ａｎｔｉｂｕｌｉｍｉｃ）、食欲抑制薬、抗肥満剤、制酸薬、上部消化管剤、抗コリン剤、アミノサリチル酸誘導体、生体応答調整物質、コルチコステロイド、鎮痙薬、５−ＨＴ４部分アゴニスト、抗ヒスタミン剤、カンナビノイド、ドーパミンアンタゴニスト、セロトニンアンタゴニスト、細胞保護剤、ヒスタミンＨ２−受容体アンタゴニスト、粘膜保護剤、プロトンポンプ阻害剤、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ除菌療法、赤血球産生刺激因子、造血剤、貧血剤、ヘパリン、抗線維素溶解剤、止血薬、血液凝固因子、アデノシン二リン酸阻害剤、糖タンパク質受容体阻害剤、フィブリノーゲン−血小板結合阻害剤、トロンボキサン−Ａ２阻害剤、プラスミノゲン活性化因子、抗血栓剤、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、コルチコステロイド、選択的免疫抑制剤、抗真菌剤、予防療法に関与する薬物、ＡＩＤＳ関連感染、サイトメガロウイルス、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド類似体逆転写酵素（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｅ）阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、貧血、カポジ肉腫、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド（ｇｌｙｃｏｐｏｐｔｉｄｅ）、リンコサミド、マクロライド（ｍａｃｒｏｌｉｅｓ）、オキサゾリジノン、ペニシリン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、トリメトプリムおよび誘導体、テトラサイクリン、駆虫薬、抗アメーバ薬（ａｍｅｂｉｃｉｅｓ）、ビグアニド、キナアルカロイド、葉酸アンタゴニスト、キノリン誘導体、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ療法、ヒドラジド、イミダゾール、トリアゾール、ニトロイミダゾール（ｎｉｔｒｏｉｍｉｄｚａｏｌｅ）、環状アミン、ノイラミニダーゼ阻害剤、ヌクレオシド、ホスフェート結合因子、コリンエステラーゼ阻害剤、補助療法、バルビツール酸塩および誘導体、ベンゾジアゼピン、ガンマアミノ酪酸誘導体、ヒダントイン誘導体、イミノスチルベン誘導体、スクシンイミド誘導体、抗痙攣薬、麦角アルカロイド、抗片頭痛薬（ａｎｔｉｍｉｇｒａｎｅ）調製物、生体応答調整物質、カルバミン酸エステル（ｃａｒｂａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｅａｔｅｒ）、三環式誘導体、脱分極剤、非脱分極剤、神経筋麻痺剤（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、ＣＮＳ刺激剤、ドーパミン作動性試薬、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、ＣＯＭＴ阻害剤、スルホン酸アルキル、エチレンイミン、イミダゾテトラジン、ナイトロジェンマスタード類似体、ニトロソウレア、白金含有化合物、代謝拮抗物質、プリン類似体、ピリミジン類似体、尿素誘導体、アントラサイクリン（ａｎｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン誘導体、エピポドフィロトキシン、タキサン、ビンカアルカロイドおよび類似体、抗アンドロゲン剤、抗エストロゲン薬、非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤抗新生物薬、アザスピロデカンジオン誘導体、抗不安薬、刺激剤、モノアミン（ｍｏｎｏａｍｉｎｄ）再取り込み阻害剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、抗うつ薬、ベンゾイソオキサゾール誘導体、ブチロフェノン誘導体、ジベンゾジアゼピン誘導体、ジベンゾチアゼピン誘導体、ジフェニルブチルピペリジン誘導体、フェノチアジン、チエノベンゾジアゼピン誘導体、チオキサンテン誘導体、アレルゲン抽出物、非ステロイド系薬剤、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、キサンチン、エンドセリン受容体アンタゴニスト、プロスタグランジン、肺サーファクタント、粘液溶解剤、抗有糸分裂剤、尿酸排泄薬（ｕｒｉｃｏｓｕｒｉｃ）、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、メテナミン（ｍｅｔｈｅａｍｉｎｅ）塩、ニトロフラン誘導体、キノロン、平滑筋弛緩薬、副交感神経作動薬、ハロゲン化炭化水素、アミノ安息香酸のエステル、アミド（例えばリドカイン、塩酸アルチカイン、塩酸ブピバカイン）、解熱剤、催眠薬（ｈｙｎｏｔｉｃ）および鎮静剤、シクロピロロン、ピラゾロピリミジン、非ステロイド性抗炎症薬、オピオイド、パラ−アミノフェノール誘導体、アルコールデヒドロゲナーゼ阻害剤、ヘパリンアンタゴニスト、吸着剤、催吐薬、オピオイドアンタゴニスト、コリンエステラーゼ再活性化因子、ニコチン補充療法、ビタミンＡ類似体およびアンタゴニスト、ビタミンＢ類似体およびアンタゴニスト、ビタミンＣ類似体およびアンタゴニスト、ビタミンＤ類似体およびアンタゴニスト、ビタミンＥ類似体およびアンタゴニスト、ビタミンＫ類似体およびアンタゴニスト��挙げられる。
【０１２０】
コンジュゲート：検出剤
例示的な実施形態において、結合性構築物は、検出剤にコンジュゲートされている。例示的な実施形態において、検出剤は、酵素活性、放射能、色素形成活性、および／または結合活性に基づき検出可能な（測定可能な）シグナルを放出することが可能である。例示的な実施形態において、シグナルは、放射性、色素形成、比色、蛍光定量的、化学発光、強化された化学発光、直接的な蛍光、時間分解蛍光、直接的な化学発光、リン光性、酵素によるものか、またはマイクロもしくはナノ粒子、ストレプトアビジン／アビジン−ビオチンおよびプロテインＡの結合に基づく。例示的な実施形態において、検出剤は、酵素、放射性同位体、ＤＮＡレポーター、色素形成もしくは蛍光発生レポーター、または電気化学発光タグを含む。例示的な態様において、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ、またはベータ−ガラクトシダーゼである。例示的な態様において、酵素は、ある特定の試薬に曝露されると、化学発光または光の発生を引き起こす。例示的な態様において、放射性同位体は、Ｉ１２５である。例示的な態様において、ＤＮＡレポーターは、ＤＮＡプローブである。例示的な態様において、蛍光発生レポーターは、フィコエリトリン（ＰＥ）、例えば、Ｂ−ＰＥ、Ｒ−ＰＥ、またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。
【０１２１】
コンジュゲート：二量体および多量体
一部の実施形態において、結合性構築物は、１つより多くの本発明の結合性構築物が一緒に連結されている二量体または多量体として提供される。一部の態様において、二量体は、一緒に連結された同じタイプの（例えば、同じ構造の）２つの結合性構築物を含むホモ二量体である。代替の態様において、二量体は、互いに構造的に異なる２つの本発明の結合性構築物を含むヘテロ二量体である。一部の態様において、多量体は、各結合性構築物が同じタイプ（例えば、同じ構造）を有する、本発明の１つより多くの結合性構築物を含むホモ多量体である。代替の態様において、多量体は、１つより多くの本発明の結合性構築物を含むヘテロ多量体であり、ここでヘテロ多量体の少なくとも２つの結合性構築物が、その他のものと構造的に異なっている。例示的な態様において、結合性構築物は、２つのＦａｂ断片の二量体、例えばホモ二量体を含み、各Ｆａｂ断片は、ＦＩＸｐに結合し、ＷＴ  ＦＩＸに結合せず、例えば、ＷＴ  ＦＩＸの存在下でも、またはヒト血漿を含むサンプル中でも、ＦＩＸｐに結合する。例示的な態様において、２つのＦａｂ断片を含むホモ二量体は、二価であるが、ＦＩＸｐに対して単一特異性である。例示的な態様において、ホモ二量体の各Ｆａｂ断片は、配列番号６〜１１のアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、配列番号６〜１１のそれぞれの間に、１つまたは複数のアミノ酸が存在する。例示的な態様において、ホモ二量体の各Ｆａｂ断片は、配列番号２４もしくは配列番号２５または配列番号２４および２５の両方の配列を含む。例示的な態様において、ホモ二量体の各Ｆａｂ断片は、配列番号２６もしくは配列番号２７または配列番号２６および２７の両方の配列を含む。
【０１２２】
結合性構築物の２つまたはそれより多くは、当業者公知の標準的な連結剤（ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）および手順を使用して一緒に連結させることができる。ある特定の実施形態において、２つの（またはそれより多くの）結合性構築物を接続するリンカーは、当該分野において公知のリンカーである。一部の実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合である。例えば、二量体の各単量体は、それぞれジスルフィド結合の形成に参加するスルフヒドリルおよび硫黄原子を含んでいてもよい。一部の実施形態において、リンカーは、へリックス−ターン−へリックスモチーフである。例示的な態様において、二量体の各単量体は、へリックス−ターン−へリックスモチーフを介して接続されている。例示的な態様において、二量体の各単量体は、アルカリホスファターゼドメインを介して接続されている。
【０１２３】
例示的な態様において、２つのＦａｂ断片を含むホモ二量体は、２つのＦａｂ断片を接続するリンカーを含む。例示的な態様において、ホモ二量体は、合成二重へリックスループへリックスモチーフを含み、例えばＨａｙｌｏｃｋら、Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．  ４８巻（２号）：４６１〜４７０頁（２０１６年）またはＷａｎｇら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７８巻：９９７〜１００４頁（２００６年）に記載されるものを含む。例示的な態様において、ホモ二量体は、定常抗体ドメインを含む。このような抗体ドメインは、Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６巻：３０５５〜３０６１頁（１９９６年）およびＭｃＧｒｅｇｏｒら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏ  ３１巻：２１９〜２２６頁（１９９４年）に記載されている。例示的な態様において、ホモ二量体は、細菌のアルカリホスファターゼドメイン、例えば上記のＷａｎｇら（２００６年）に記載されるものを含む。例示的な態様において、ホモ二量体は、配列番号２８もしくは配列番号２７または配列番号２８および２７の両方の配列を含む。
【０１２４】
核酸
さらに本明細書において、本明細書に記載される結合性構築物（例えば、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはコンジュゲート）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。「核酸」は、本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸分子」を含み、一般的にはＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味し、これらは、一本鎖または二本鎖の合成のものかまたは天然供給源から得られた（例えば、単離および／または精製された）ものであってもよく、これらは、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有していてもよく、改変されていないオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見出されるホスホジエステルの代わりに、天然、非天然または変更されたヌクレオチド間の連結、例えばホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）連結またはホスホロチオエート連結を含有していてもよい。核酸は、いかなる挿入、欠失、逆位、および／または置換も含まないことが一般的に好ましい。しかしながら、一部の場合において、本明細書で論じられるように、核酸が、１つまたは複数の挿入、欠失、逆位、および／または置換を含むことが好適な場合がある。
【０１２５】
好ましくは、本発明の核酸は、組換え体である。用語「組換え体」は、本明細書で使用される場合、（ｉ）天然または合成の核酸セグメントを生きた細胞中で複製可能な核酸分子に繋ぎ合わせることによって、生きた細胞の外側で構築される分子、または（ｉｉ）上記の（ｉ）に記載されたものの複製から生じる分子を指す。本明細書での目的に応じて、複製は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製またはｉｎ  ｖｉｖｏでの複製であり得る。
【０１２６】
核酸は、当該分野において公知の手順を使用した化学合成および／または酵素によるライゲーション反応に基づき構築することができる。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋら、および上記Ａｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチドを使用して、または分子の生物学的安定性を増加させる、またはハイブリダイゼーションで形成された二重鎖（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）の物理的安定性を増加させるように設計された様々に改変されたヌクレオチドを使用して化学的に合成することができる。核酸を生成するのに使用できる改変されたヌクレオチドの例としては、これらに限定されないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン（ｔｈｉｏｕｒｉｄｍｅ）、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル（ｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｔｉｌ）、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。代替として、本発明の核酸の１つまたは複数は、例えばＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）およびＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）などの会社から購入することもできる。
【０１２７】
一部の態様において、核酸は、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはコンジュゲートの一部のみをコードする。例えば、コンジュゲートがアミノ酸を含まず、したがって核酸によってコードされていないポリマーを含む場合、核酸は、核酸によってコードされ得るコンジュゲートの一部のみをコードする。例示的な実施形態において、核酸は、配列番号６〜１１の各々を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。例示的な態様において、核酸は、配列番号６〜１１の各々を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、配列番号６〜１１の各々の間に、１つまたは複数のアミノ酸が存在する。例示的な態様において、核酸は、発現タグ、例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１２）を含むＦＬＡＧタグ、および／またはＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３）を含むヘキサＨｉｓタグをさらに含むポリペプチドをコードする。
【０１２８】
核酸は、例えば、本発明の結合性構築物の組換え産生方法において有用である。
【０１２９】
組換え発現ベクター
本発明の核酸は、組換え発現ベクター、または「ベクター」に組み込むことができる。これに関して、本発明は、本発明の核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターまたは「ベクター」を提供する。本明細書での目的のために、用語「組換え発現ベクター」または「ベクター」は、構築物がｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでおり、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現させるのに十分な条件下でベクターを細胞と接触させる場合、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を許容する、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物を意味する。本発明のベクターは、全体としては天然に存在しない。しかしながら、ベクターの一部が天然に存在する可能性がある。本発明の組換え発現ベクターは、あらゆるタイプのヌクレオチド、これらに限定されないが、ＤＮＡおよびＲＮＡなどを含んでいてもよく、これらは、一本鎖または二本鎖の合成のものかまたは部分的に天然供給源から得られたものであってもよく、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有していてもよい。組換え発現ベクターは、天然に存在するもしくは天然に存在しないヌクレオチド間連結、または両方のタイプの連結を含んでいてもよい。好ましくは、変更されたヌクレオチドまたは天然に存在しないヌクレオチド間連結は、ベクターの転写または複製を妨げない。
【０１３０】
本発明の組換え発現ベクターは、あらゆる好適な組換え発現ベクターであってもよく、あらゆる好適な宿主を形質転換またはトランスフェクトするのに使用することができる。好適なベクターとしては、増殖および拡大増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）もしくは発現またはその両方のために設計されたもの、例えばプラスミドおよびウイルスなどが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏＩＩａ、ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）からなる群より選択することができる。また、バクテリオファージベクター、例えばλＧＴＩＯ、λＧＴｌ１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、およびλＮＭｌ１４９も使用することができる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩＯｌ、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。好ましくは、組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターである。
【０１３１】
本発明の組換え発現ベクターは、例えば上記のＳａｍｂｒｏｏｋら、および上記のＡｕｓｕｂｅｌらに記載される標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製することができる。環状または直鎖状の発現ベクターの構築物は、原核または真核宿主細胞で機能的な複製系を含有するように調製することができる。複製系は、例えば、ＣｏＩＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどの由来であってもよい。
【０１３２】
望ましくは、組換え発現ベクターは、調節配列、例えば転写および翻訳開始および終止コドンなどを含み、このような配列は、ベクターが導入されることになる宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的であり、必要に応じてベクターがＤＮＡベースかまたはＲＮＡベースであるかどうかが考慮される。
【０１３３】
組換え発現ベクターは、ポリペプチド（それらの機能的な部分および機能的なバリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的な、もしくはハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結したネイティブまたは標準的なプロモーターを含んでいてもよい。プロモーターの選択、例えば、強いか、弱いか、誘導性であるか、組織特異的であるか、および発生特異的であるかは、当業者の通常の技量の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることも当業者の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびマウス幹細胞ウイルスの末端反復に見出されるプロモーターであり得る。
【０１３４】
本発明の組換え発現ベクターは、一過性発現、安定な発現のいずれか、またはその両方のために設計することができる。また組換え発現ベクターは、構成的発現または誘導性発現のために作製することもできる。さらに、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製することができる。
【０１３５】
宿主細胞
本発明はさらに、本明細書に記載される核酸または組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。用語「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、本発明の組換え発現ベクターを含有および発現するあらゆるタイプの細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞、例えば、植物、動物、真菌、もしくは藻類であってもよいし、または原核細胞、例えば、細菌もしくは原生動物であってもよい。宿主細胞は、培養細胞であってもよいし、または初代細胞、すなわち生物、例えばヒトから直接的に単離されたものでもよい。宿主細胞は、接着細胞であってもよいし、または懸濁細胞、すなわち懸濁物中で増殖する細胞であってもよい。好適な宿主細胞は、当該分野において公知であり、例えば、ＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが挙げられる。組換え発現ベクターを増幅または複製する目的の場合、宿主細胞は、好ましくは原核細胞であり、例えばＤＨ５α細胞である。組換えポリペプチドを産生する目的の場合、宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、例えばＣＨＯ細胞である。
【０１３６】
キット
本明細書は、本発明の開示の結合性構築物のいずれか１つまたは複数を含むキットを提供する。例示的な実施形態において、キットは、本明細書に記載される、抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドもしくはコンジュゲートもしくは核酸もしくはベクターもしくは宿主細胞、または前述のもののいずれかの組み合わせを含む。例示的な態様において、結合性構築物は、キット中に予め決定された量または濃度で提供される。例えば、キットは、サンプル中のＦＩＸ  Ｐａｄｕａを検出するための予め決定された量の結合性構築物を含む検出キットであり得る。例示的な実施形態において、キット中、本発明の開示の結合性構築物の１つまたは複数は、水溶液中に提供される。例示的な態様において、水溶液は、ドライアイス上で最終使用者に提供される。一部の態様において、水溶液は、キットの他の構成要素から別々にして最終使用者に提供される。例示的な実施形態において、本発明の開示の結合性構築物は、キット中、凍結乾燥または他のフリーズドライした形態で提供される。例示的な態様において、本発明の開示の結合性構築物は、キット中、凍結したまたは低温保存した形態で提供される。例示的な態様において、キット中に提供される抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートの濃度は、約１〜１０μｇ／ｍＬまたは約１〜５μｇ／ｍＬである。例示的な態様において、キット中に提供される抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートの濃度は、約１．５μｇ／ｍＬから約２．０μｇ／ｍＬである。
【０１３７】
例示的な態様において、キットは、固体支持体を含み、例示的な態様において、抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートは、固体支持体上にプレコーティングされている。例示的な態様において、キットは、チューブ、ディッシュ、フラスコ、バッグ、プレート（例えば、マイクロタイタープレート）、膜、フィルター、ビーズ、ファイバー、プローブなどからなる群より選択される固体支持体を含む。例示的な態様において、固体支持体は、ポリマーで作製されている。例示的な態様において、固体支持体は、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ラテックス、または制御多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）で作製されている。例示的な態様において、固体支持体は、アガロースで作製されている。例示的な態様において、固体支持体は、二フッ化ポリビニル（ＰＶＤＦ）、ニトロセルロース、ナイロン６６、ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース、または紙で作製されている。例示的な態様において、膜は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）、Ｐｒｏｔｒａｎ（登録商標）、ＱｕｉｃｋＤｒａｗ（登録商標）、Ｗｅｓｔｒａｎ（登録商標）、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）またはＨｙｂｏｎｄ（登録商標）膜（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の１つである。例示的な態様において、固体支持体は、ポリマービーズ、マイクロタイタープレート、膜またはフィルターである。例示的な態様において、キットは、約１００ｎｇもしくはそれより多く、約１５０ｎｇもしくはそれより多く、約２００ｎｇもしくはそれより多く、約５００ｎｇもしくはそれより多くの抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートを含む溶液でプレコーティングされた固体支持体を含む。ある特定の態様において、キットは、約５０ｎｇ〜約５５０ｎｇ、約１００ｎｇ〜約５００ｎｇ、約１２５ｎｇ〜約４００ｎｇ、約１５０ｎｇ〜約３５０ｎｇ、約１７５ｎｇ〜約３００ｎｇ、もしくは約２００ｎｇ〜約２５０ｎｇの抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートを含む溶液でプレコーティングされた固体支持体を含む。ある特定の態様において、キットは、約１００ｎｇ〜約１５０ｎｇ、約１５０ｎｇ〜約２００ｎｇ、約２００ｎｇ〜約５００ｎｇの抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートを含む溶液でプレコーティングされた固体支持体を含む。例示的な態様において、キットは、事前にアリコートにされた量の抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートを含む固体支持体を含む。例示的な態様において、キットは、マイクロタイタープレートを含み、マイクロタイタープレートの各ウェルは、約１〜１０μｇ／ｍＬまたは約１〜５μｇ／ｍＬの抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートを含む溶液を約１００μＬ〜約５００μＬ含む溶液を含む。例示的な態様において、キットは、マイクロタイタープレートを含み、マイクロタイタープレートの各ウェルは、約２．５μｇ／ｍＬの抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートを含む溶液を約１００μＬ〜約５００μＬを含む溶液を含む。
【０１３８】
例示的な態様において、キットは、本明細書に記載される検出方法で使用される追加の試薬、基質、溶媒、緩衝液、希釈剤などを含む。例示的な態様において、追加の構成要素のいずれか１つまたは複数は、キット中に、予め決定された量で、例えば検出アッセイに必要な好適な量で提供される。例示的な態様において、キットは、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合する抗体、抗原結合性断片、ポリペプチドまたはコンジュゲートに結合する二次抗体を含む。例示的な態様において、二次抗体は、検出剤を含む。例示的な実施形態において、検出剤は、酵素、放射性同位体、ＤＮＡレポーター、色素形成もしくは蛍光発生レポーター、または電気化学発光タグを含む。検出剤は、本明細書に記載される検出剤のいずれかであってもよい。例示的な態様において、二次抗体またはＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合する抗体、抗原結合性断片、ポリペプチドまたはコンジュゲートは、検出剤に付着している。
【０１３９】
組成物
本明細書は、本発明の開示の結合性構築物のいずれか１つまたは複数を含む組成物を提供する。例示的な態様において、組成物は、検出剤と混合された本明細書に記載される結合性構築物を含む。例示的な態様において、検出剤は、本明細書に記載されるあらゆる検出剤である。「コンジュゲート：検出剤」というタイトルのセクションを参照されたい。
【０１４０】
例示的な態様において、組成物は、被験体から得られた生体サンプルと混合された、本明細書に記載される結合性構築物を含む。例示的な態様において、生体サンプルは、本明細書に記載されるあらゆる生体サンプルである。「サンプル」というタイトルのセクションを参照されたい。例示的な態様において、組成物は、ヒト血漿、またはその希釈された画分を含む生体サンプルと混合された、本明細書に記載される抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートを含む。例示的な態様において、組成物は、ヒト組織またはその細胞を含む生体サンプルと混合された、本明細書に記載される抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートを含む。例示的な態様において、生体サンプルは、肝臓組織を含む。例示的な態様において、組成物は、検出剤をさらに含む。
【０１４１】
サンプル、例えば、ヒト血漿タンパク質を含む生体サンプルと混合された、本発明の開示の結合性構築物のいずれか１つまたは複数を含む組成物が、本明細書においてさらに提供される。例示的な態様において、組成物は、第ＩＸ因子、第ＩＩ因子、および第Ｘ因子、ならびにそれらのバリアントからなる群より選択されるヒト血漿タンパク質の少なくとも１つと混合された、本明細書に記載される抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートを含む。例示的な態様において、組成物は、検出剤をさらに含む。
【０１４２】
検出方法
本明細書で提供される結合性構築物は、例えば、サンプル、例えばＦＩＸ  ＰａｄｕａおよびＷＴ  ＦＩＸを含む臨床サンプル中のＦＩＸ  Ｐａｄｕａの、一義的または特異的な検出を可能にする検出方法において有用である。結合性構築物は、当該分野において公知のあらゆる抗体ベースのアッセイもしくは技術またはあらゆるイムノアッセイ、例えば、これらに限定されないが、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、磁気イムノアッセイ（ＭＩＡ）、免疫細胞化学的（ＩＣＣ）アッセイ、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、免疫蛍光アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、酵素増幅イムノアッセイ、ラジオバインディングアッセイ（ｒａｄｉｏｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ドットブロット、フローサイトメトリー、リアルタイム免疫定量ＰＣＲ、タンパク質マイクロアレイなどにおいて使用することができる。例えば、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  （第４版）；Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ，  ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｗｉｌｄ編，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｌｔｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）２０１３年、ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）２０１２年、およびＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＤｉａｍａｎｄｉｓおよびＣｈｒｉｓｔｏｐｏｌｏｕｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６年を参照されたい。
【０１４３】
したがって、本明細書は、サンプル中の第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを検出するための、本明細書に記載される結合性構築物（例えば、抗体もしくは抗原結合性断片、ポリペプチド、またはコンジュゲート）、核酸、ベクター、宿主細胞、および／またはキットの使用を提供する。例示的な態様において、サンプルは、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａをコードする核酸を含む発現ベクターが投与された被験体から得られた生体サンプルである。例えば、様々な実施形態において、被験体は、出血障害に罹っており、第ＩＸ因子補充療法を受けており、この療法は、任意選択で、異種第ＩＸ因子Ｐａｄｕａをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の発現によって達成される。
【０１４４】
本明細書は、被験体から得られたサンプル中の第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを検出する方法も提供する。例示的な実施形態において、本方法は、（ｉ）サンプルを、本明細書に記載される結合性構築物（例えば、抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲート）と接触させて、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａと、結合性構築物（例えば、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはコンジュゲート）とを含む複合体（例えば、免疫複合体）を形成すること、および（ｉｉ）複合体を検出することを含む。
【０１４５】
例示的な実施形態において、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【０１４６】
例示的な実施形態において、複合体を検出することは、検出剤のシグナルを検出することを含む。例示的な実施形態において、シグナルは、酵素活性、放射能、色素形成活性、および／または結合活性に基づく。例示的な実施形態において、シグナルは、放射性、色素形成、比色、蛍光定量的、化学発光、強化された化学発光、直接的な蛍光、時間分解蛍光、直接的な化学発光、リン光性、酵素によるものか、またはマイクロまたはナノ粒子、ストレプトアビジン／アビジン−ビオチンおよびプロテインＡの結合に基づく。例示的な実施形態において、検出剤は、酵素、放射性同位体、ＤＮＡレポーター、色素形成または蛍光発生レポーター、電気化学発光タグを含む。例示的な実施形態において、複合体を検出することは、表面プラズモン共鳴を行い、複合体を検出すること、または電極で抵抗の変化（ＦＩＸ  Ｐａｄｕａが抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはコンジュゲートに結合する場合の）を測定することを含む。Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｄｉａｚら、「Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ  Ａｕ／Ｃｏ／Ａｕ  ｎａｎｏｓａｎｄｗｉｃｈｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｓｍａｌｌ  ４巻（２号）：２０２〜５頁（２００８年）およびＴｓｅｋｅｎｉｓ（２００８年）。「Ｌａｂｅｌ−ｌｅｓｓ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｙｅｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂａｓｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｎ  ａｃ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ．」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８０巻（６号）：２０５８〜６２頁（２００８年）を参照されたい。例示的な態様において、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ、またはベータ−ガラクトシダーゼである。例示的な態様において、酵素は、それらを化学発光させるまたは光を発生させる試薬に曝露される。例示的な態様において、放射性同位体は、Ｉ１２５である。例示的な態様において、ＤＮＡレポーターは、ＤＮＡプローブである。例えば、Ｒａｊｋｏｖｉｃ、「Ｉｍｍｕｎｏｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ  ｉｎ  ｆｏｏｄｓ．」Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７２巻（１０号）：６５９３〜９頁（２００６年）；およびＧｏｆｆｌｏｔ  「Ｉｍｍｕｎｏ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５巻（３号）：２４１〜５８頁（２００４年）を参照されたい。例示的な態様において、蛍光発生レポーターは、フィコエリトリン（ＰＥ）例えば、Ｂ−ＰＥ、Ｒ−ＰＥ、またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。
【０１４７】
例示的な実施形態において、抗体または抗原結合性断片もしくはポリペプチドは、検出剤にコンジュゲートされている。例示的な実施形態において、コンジュゲートは、検出剤を含む。例示的な実施形態において、抗体または抗原結合性断片もしくはポリペプチドは、検出剤にコンジュゲートしていないか、またはコンジュゲートは、検出剤を含まない。このような例示的な実施形態において、本方法は、サンプルを、検出剤を含む二次抗体と接触させることを含み、ここで二次抗体は、抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートに結合する。二次抗体は、あらゆるアイソタイプまたはクラスのあらゆる抗体であってもよく、ただし、二次抗体は、抗ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ抗体、それらの抗原結合性断片、ポリペプチドまたはコンジュゲートに結合することを条件とする。
【０１４８】
例示的な実施形態において、抗体または抗原結合性断片もしくはポリペプチドは、固体支持体にコンジュゲートされている。例示的な実施形態において、コンジュゲートは、固体支持体を含む。例えば、固体支持体は、チューブ、ディッシュ、フラスコ、バッグ、プレート（例えば、マイクロタイタープレート）、膜、フィルター、ビーズ、ファイバー、プローブなどからなる群より選択される。例示的な態様において、固体支持体は、ポリマーで作製されている。例示的な態様において、固体支持体は、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ラテックス、または制御多孔質ガラスで作製されている。例示的な態様において、固体支持体は、アガロースで作製されている。例示的な態様において、固体支持体は、二フッ化ポリビニル（ＰＶＤＦ）、ニトロセルロース、ナイロン６６、ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース、または紙で作製されている。例示的な態様において、膜は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）、Ｐｒｏｔｒａｎ（登録商標）、ＱｕｉｃｋＤｒａｗ（登録商標）、Ｗｅｓｔｒａｎ（登録商標）、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）またはＨｙｂｏｎｄ（登録商標）膜（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の１つである。例示的な態様において、固体支持体は、ポリマービーズ、磁気または常磁性ビーズ、マイクロタイタープレート、膜またはフィルターである。
【０１４９】
被験体
例示的な実施形態において、本明細書で言及される被験体は、哺乳動物、これらに限定されないが、げっ歯目の哺乳動物、例えばマウスおよびハムスター、ならびにウサギ目の哺乳動物、例えばウサギ、食肉目に属する哺乳動物、例えばネコ（Ｆｅｌｉｎｅ）（ネコ）およびイヌ（Ｃａｎｉｎｅ）（イヌ）、偶蹄目に属する哺乳動物、例えばウシ（Ｂｏｖｉｎｅ）（ウシ）およびブタ（Ｓｗｉｎｅ）（ブタ）、またはウマ目（Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）の哺乳動物、例えばウマ（Ｅｑｕｉｎｅ）（ウマ）などである。一部の態様において、哺乳動物は、霊長目、マーモセット科（Ｃｅｂｏｉｄ）、またはサル（Ｓｉｍｏｉｄ）（サル）の目に属するか、または類人猿目（ヒトおよび大型類人猿）に属する。例示的な態様において、哺乳動物は、ヒトである。例示的な態様において、ヒト被験体は、成人、例えば１８歳またはそれより上の成人、または若年層である。例示的な態様において、被験体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＦＩＸ  Ｐａｄｕａをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターが投与されている。例示的な態様において、被験体は、出血障害を有する。例示的な態様において、被験体は、被験体の血液が適切に凝固しない出血障害を有する。例示的な態様において、被験体は、第ＩＸ因子、例えば、ＷＴ第ＩＸ因子の発現の欠如またはその低い発現レベルを有する。例示的な態様において、被験体は、第ＩＸ因子をコードする遺伝子中に変異を有する。例示的な態様において、被験体は、血友病、例えば、血友病Ｂ（またクリスマス病としても公知）に罹っている。例示的な態様において、被験体は、正常より高い凝固活性を呈する。例示的な態様において、被験体は、天然に存在するＦＩＸ  Ｐａｄｕａを有し、例えば、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａの発現を引き起こす遺伝子変異を有する。
【０１５０】
サンプル
例示的な実施形態において、本明細書で言及されるサンプルは、１種または複数の体液、例えばヒト体液を含む生体サンプルである。例示的な態様において、サンプルは、体液、これらに限定されないが、被験体から得られた、血液、血漿、血清、リンパ液、母乳、唾液、粘液（ｍｕｃｏｕｓ）、精液、膣分泌物、細胞抽出物、炎症液（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｆｌｕｉｄ）、脳脊髄液、便、硝子体液、または尿などを含む。例示的な態様において、サンプルは、血液、血漿、または血清を含む。例示的な態様において、サンプルは、血液、血漿、または血清から調製される。例示的な態様において、サンプルは、血液、血漿、または血清の画分である。例示的な態様において、サンプルは、血液サンプル、血漿サンプル、または血清サンプルである。例示的な態様において、サンプルは、血液またはその画分（例えば、血漿、血清）を含む。例示的な態様において、サンプルは、血漿を含むかまたは血漿である。
【０１５１】
例示的な態様において、サンプルは、ヒト組織サンプルである。例示的な態様において、ヒト組織サンプルは、筋肉組織、上皮組織、結合組織、または神経組織を含む。例示的な態様において、ヒト組織サンプルは、骨組織を含む。例示的な態様において、ヒト組織サンプルは、心臓組織、脾臓組織、リンパ節組織、脳組織、脊髄組織、神経組織、耳、鼻もしくは目の組織、乳房組織、皮下組織、乳腺組織、骨髄組織、リンパ組織、上咽頭組織、喉頭組織、気管組織、気管支（ｂｒｏｃｈｕｓ）組織、肺組織、皮膚組織、唾液腺組織、舌もしくは口からの組織、中咽頭組織、咽喉頭（ｌａｒｎｇｏｐｈａｒｙｎｘ）組織、食道組織、胃組織、小腸組織、虫垂組織、結腸組織、直腸組織、肛門組織、肝臓組織、胆道組織、膵臓組織、胆嚢組織、腎臓組織、尿管組織、膀胱組織、尿道組織、子宮組織、膣組織、外陰組織、卵巣組織、胎盤組織、陰嚢組織、陰茎組織、前立腺組織、睾丸組織、精嚢組織、下垂体組織、松果体組織、甲状腺組織、副甲状腺組織、副腎組織、またはランゲルハンス島組織を含む。例示的な態様において、ヒト組織サンプルは、肝臓組織または脾臓組織または腎臓組織を含む。例示的な態様において、ヒト組織サンプルは、肝臓組織を含む。
【０１５２】
以下の実施例は本発明を単に例証するために記載されたものであり、その範囲を限定するためでは決してない。
【実施例】
【０１５３】
（実施例１）
この実施例は、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を作製する方法を実証するものである。
【０１５４】
ファージディスプレイ方法を使用して、候補の特異的ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ結合性構築物を選択した。３３８位に単一のアミノ酸置換を含む直鎖状ペプチド、３３８位に単一のアミノ酸置換を含む構造ペプチド、または全長組換えＦＩＸ  Ｐａｄｕａを使用してファージライブラリーをスクリーニングし、候補を捕捉した。３回のパニングを、野生型ＦＩＸ配列と競合させて、および競合させずに行って、数種の候補結合性構築物を同定した。ＢＩＡＣＯＲＥおよびＥＬＩＳＡ実験を実行して、得られた候補の特異性および親和性を決定した。
【０１５５】
配列ＤＲＡＴＣＬＬＳＴＫＦＴを含む直鎖状ペプチドを有する１つの候補（ＢＣ１と称する）を得て、配列ＬＶＤＲＡＴＣＬＬＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨを含む構造ペプチドを有する２つの候補（ＢＣ２およびＢＣ３と称する）を得た。ＦＩＸ  Ｐａｄｕａと交互になった直鎖状ペプチドまたは構造ペプチドを含むペプチドを有するさらに別の候補（ＢＣ４）を得た。
【０１５６】
スクリーニングアッセイにより、候補がＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合することが実証された。ＢＣ２およびＢＣ３の場合、野生型ＦＩＸに対する結合シグナル（バックグラウンドに対する倍率）は１１未満であったが、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対する結合シグナル（バックグラウンドに対する倍率）は７１より高かった。ＢＣ１の場合、野生型ＦＩＸに対する結合シグナル（バックグラウンドに対する倍率）は１であったが、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対する結合シグナルはほぼ２００であった。第２のセットのスクリーニングアッセイにおいて、野生型ＦＩＸに対する結合シグナルは、ＢＣ１、ＢＣ２、およびＢＣ３の各々に関して１またはそれ未満であったが、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対するＢＣ１、ＢＣ２、およびＢＣ３に関する結合シグナルはそれぞれ７０、３０、および１０であった。ＢＣ４について、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対する結合シグナルは３６より高かったが、野生型ＦＩＸに対するシグナルは約１であったことが実証された。
【０１５７】
ＢＣ１のＦＩＸ  Ｐａｄｕａへの結合を、ＢＣ１のコーティング濃度に加えてＦＩＸ  Ｐａｄｕａの濃度を変化させたＮｉ２＋プレート上のＥＬＩＳＡによって試験した。試験されたＢＣ１およびＦＩＸ  Ｐａｄｕａの濃度は、０．０４μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および５μｇ／ｍｌであった。ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対するＢＣ１の結合シグナルをｗｔ  ＦＩＸ対照と比較した。試験された各濃度において、ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＢＣ１への結合はＷＴ  ＦＩＸのＢＣ１への結合より大きかった（図２）。
【０１５８】
野生型ＦＩＸの存在下におけるＢＣ１、ＢＣ２、およびＢＣ３のＦＩＸ  Ｐａｄｕａへの結合を、ＥＬＩＳＡによって試験した（図１０で示した通り）。ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを５μｇ／ｍＬのＢＣ１、ＢＣ２、またはＢＣ３でコーティングし、コーティングされたプレートに、様々な濃度のＦＩＸ  Ｐａｄｕａおよび５μｇ／ｍＬの野生型ＦＩＸを含有する溶液を添加した。試験したＦＩＸ  Ｐａｄｕａ濃度は、０μｇ／ｍＬ、０．１５６μｇ／ｍＬ、０．３１３μｇ／ｍＬ、０．６２５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、および１０μｇ／ｍＬであった。図３で示されるように、ＢＣ１は、ＷＴ第ＩＸ因子の存在下でもＦＩＸ  Ｐａｄｕａに強い親和性を示す。ＢＣ１は、５μｇ／ｍＬのＷＴ第ＩＸ因子の存在下で最大の感受性を示した。
【０１５９】
５％のヒト血漿および５μｇ／ｍＬのＷＴ第ＩＸ因子の存在下におけるＢＣ１の様々な濃度のＦＩＸ  Ｐａｄｕａへの結合を、ＥＬＩＳＡによって試験した（図１０で示した通り）。図４で示されるように、ＦＩＸ  ＰａｄｕａへのＢＣ１の結合は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａの濃度が増加するにつれて、ＷＴ第ＩＸ因子および他の血漿タンパク質の存在下でも増加する。ＦＩＸ  Ｐａｄｕａは、２５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌまで様々であった。
【０１６０】
５０ｍＭのベンズアミジンを含有する様々な％血漿溶液中でのＢＣ１のＦＩＸ  Ｐａｄｕａへの結合を、ＥＬＩＳＡによって試験した（図１０で示した通り）。溶液は、５％、１０％、または２０％（ｖ／ｖ）血漿であった。図５で示されるように、ＢＣ１は、２０％血漿溶液中３．１３ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲でＦＩＸ  Ｐａｄｕａを検出することができた。
【０１６１】
５μｇ／ｍＬのＷＴ第ＩＸ因子を含有する２０％のヒト血漿の存在下におけるＢＣ１、ＢＣ２、およびＢＣ４のＦＩＸ  Ｐａｄｕａへの結合をＥＬＩＳＡによって試験した。このアッセイに使用されたＦＩＸ  Ｐａｄｕａの濃度は、０、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０、１００および２００ｎｇ／ｍｌであった。図６で示されるように、ＢＣ１は最大の感受性を呈したが、ＢＣ２は、最も低い感受性を呈し、５μｇ／ｍＬのＷＴ第ＩＸ因子を含有する２０％のヒト血漿サンプル中でＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合できなかった。ＢＣ４のＦＩＸ  Ｐａｄｕａへの結合能力は、ＢＣ１の結合能力より低いことが実証された（図６）。ＢＣ２のように、ＢＣ３も、２０％のヒト血漿を含有するサンプル中でＦＩＸ  Ｐａｄｕａ特異的な検出抗体として機能しなかった（データ示さず）。
【０１６２】
ＢＣ１およびＢＣ４の他の凝固因子への結合を、ＥＬＩＳＡによって試験した。具体的には、ＢＣ１またはＢＣ４の第ＩＩ因子および第Ｘ因子への結合を試験した。図７で示されるように、ＢＣ１の結合は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに高度に特異的であったが、これは第ＩＩ因子または第Ｘ因子に対する交差反応性がないことを示し、それに対してＢＣ４は、対照的に、第ＩＩ因子に対するわずかな交差反応性が実証された。
【０１６３】
ＢＣ１の結合はＦＩＸ  Ｐａｄｕａに特異的であった。対照的に、２つの他の結合性構築物（ＢＣ５およびＢＣ６）を構造ペプチドを使用したファージディスプレイ（ｐｈａｓｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）によって作製した。図８で示されるように、ＷＴ  ＦＩＸへの有意な結合が実証されたことから、ＢＣ５およびＢＣ６の結合はＦＩＸ  Ｐａｄｕａに特異的ではなかった。
【０１６４】
ＢＣ１のＫＤ値をＢｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴により決定した。ＢＣ１のＫＤは５６ｎＭであった。ＢＣ１は、他の候補に比べてＦＩＸ  Ｐａｄｕａへの最大の親和性を示した。この値は、市販の抗体のＫＤ（Ｍ）値より優れているとまでは言わないまでもそれに類似している。例えば、市販のシートの抗ヒト野生型ＦＩＸ抗体のＫＤ（Ｍ）値は、３．１１×１０−９である。
【０１６５】
ＢＣ１の重鎖および軽鎖のＣＤＲの配列をＰＣＲによって決定し、続いて配列を翻訳し、配列は以下である：
【表１】
2019527033.tif 000003
【０１６６】
直鎖状ペプチドを用いて得られたＢＣ１は、独特で特異的なＦＩＸ  Ｐａｄｕａ結合をもたらし、この活性が確認された。ＢＣ１は約３ｎｇ／ｍＬ血漿の検出限界を呈し、高度に上昇した（＞５μｇ／ｍＬ）濃度でも野生型ＦＩＸに対する交差反応性がないことを示した。
【０１６７】
これらのデータは、高度に特異的な抗ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ抗体が生成されたことを裏付けるものである。この抗体は、ヒト血漿サンプル中のＦＩＸ  Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子、第ＩＩ因子および第Ｘ因子のどれにも結合しない。これらのデータは、この抗体が、例えば野生型ＦＩＸとＦＩＸ  Ｐａｄｕａ抗原レベルとの間を選択的に区別する臨床アッセイの開発に使用することができることを裏付けるものである。
【０１６８】
（実施例２）
この実施例は、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を使用する方法を実証する。
【０１６９】
新たに開発した第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ（ＦＩＸｐ）に特異的に結合する抗体（ＢＣ１）のＦａｂ断片を、標準的な条件を使用して９６ウェルマイクロプレート上に２μｇ／ｍＬでコーティングした。検出系として、市販のビオチン化ポリクローナルヒツジ抗ヒトＦＩＸ  ＩｇＧおよびストレプトアビジンペルオキシダーゼを使用した。図９に、アッセイ構成要素の略図を示す。
【０１７０】
アッセイの較正を、２７．１〜０．８５ｎｇ／ｍＬのＦＩＸｐの濃度範囲を網羅するＦＩＸｐ調製物を用いて６ポイントの較正曲線を作成することによって達成した。患者のサンプルを、５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、１０ｍＭのベンズアミジン、１０ｍＭのＣａＣｌ２および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ緩衝液で希釈した。
【０１７１】
正常ヒト血漿または精製されたヒトＦＩＸは、ＦＩＸｐ特異的なＥＬＩＳＡにおいてシグナルを示さなかった。正確な較正曲線を得た。１／１０に希釈した正常ヒト血漿にスパイクしたＦＩＸｐは、緩衝液中のアッセイ標準で得られたものに類似する希釈応答曲線（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｕｒｖｅ）で許容できる回復を示した。重要なことに、ＦＩＸｐをコードする発現ベクターで処置された６人の患者のサンプルの分析は、時間をわたって高度に類似したＦＩＸｐタンパク質およびＦＩＸ活性曲線を実証し、交差反応物質陽性（ＣＲＭ＋）患者のサンプルは、ＣＲＭ−患者と比較してＦＩＸｐタンパク質のシグナルが増加しなかったことを示したことから、アッセイの特異性が示された。
【０１７２】
ＦＩＸｐ特異的なＥＬＩＳＡは、ＦＩＸｐタンパク質の測定による処置転帰（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅ）の追加のモニタリングを可能にする。
【０１７３】
（実施例３）
この実施例は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに選択的なＥＬＩＳＡおよびヒト血漿サンプルを試験するためのＥＬＩＳＡの使用を実証する。
【０１７４】
ＢＣ１の調製物（０．９４ｍｇ／ｍＬ）を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３−Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．５で１／５００に希釈し、１００μＬ／ウェルで、０〜＋１０℃で一晩インキュベートすることによってＭａｘｉｓｏｒｐ  Ｆ９６プレートのウェルに結合させた。サンプルおよび試薬の希釈、ならびにプレートのブロッキングに使用した希釈緩衝液（ＤＢ）は、５ｍｇ／ｍＬビオチン非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０ｍＭのＣａ２＋、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＥＩＡグレード）および１０ｍＭのベンズアミジンを含有する、０．１ＭのＨｅｐｅｓ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２であった。コーティング後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、ウェルを、２００μＬのＤＢ／ウェルと室温で６０分間（ＲＴ、１８から２６℃）インキュベートすることによって、ブロッキングした。ブロッキングするステップを、洗浄することによって終結させた。次いで標準／サンプルの希釈物をローディングし、連続的な１＋１の希釈系列をプレート上で直接調製した。希釈物（１００μＬ／ウェル）をプレートと共に室温で６０分間インキュベートした。次いでプレートを再度洗浄し、Ｆ９−１０３０Ａ（ＣｏａＣｈｒｏｍ）から調製されたビオチン化ポリクローナルヒツジ抗ヒトＦＩＸ検出抗体を添加した（１００μＬ／ウェル；作業用希釈  １／５００）。室温で６０分間インキュベートした後、プレートを再度洗浄し、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を添加し（１００μＬ／ウェル；希釈  １／４，０００）、室温で３０分間インキュベートした。最後の徹底的な洗浄手順の後、結合したペルオキシダーゼ活性を、すぐ使用できるペルオキシダーゼ基質であるＳｕｒｅＢｌｕｅで測定し、３Ｎ硫酸で反応を止めた。次いでプレートを、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、６２０ｎｍで得られた結果を減算して４５０ｎｍで測定した。
【０１７５】
図１１は、５μｇ／ｍＬのＷＴ  ＦＩＸ濃度で精製されたヒトＦＩＸ  Ｐａｄｕａ調製物および新鮮凍結対照血漿調製物（ＣＲＹＯＣｈｅｃｋ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）に関して得られた濃度−応答曲線を示す。
【０１７６】
２９〜０．９１ｎｇ／ｍＬの範囲を網羅する組換えヒトＦＩＸ  Ｐａｄｕａ濃度に関して得られた用量応答曲線は、正確度、精度および線形性に関して容認された要件を満たしており、したがってサンプルの外插に適切であるとみなされた。特に、ｌｏｇ−ｌｏｇ回帰曲線の相関係数は０．９９８５であり、平均の正確度は１０１．４％であり、精度は７．０％であった。正確度および精度を、較正曲線の６つの濃度に関して測定されたシグナルをバックフィッティングすることによって計算した。さらにデータから、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに関して、このアプローチの絶対特異性が示された。５μｇ／ｍＬの正常血漿濃度でＦＩＸ  ｗｔを含有し、１／１０の最小限の希釈を使用して測定されたヒト参照血漿は、いかなるシグナルも惹起しなかった。
【０１７７】
ＥＬＩＳＡを上述したようにして行った。較正曲線を、別の組換えヒトＦＩＸ  Ｐａｄｕａ調製物を使用して、５４２．４２μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で得た。タンパク質１ｍｇ当たり２３１０ＩＵの比凝固活性は、この調製物を、過剰に活性なＦＩＸ  Ｐａｄｕａバリアントとして明らかに分類した。連続的な希釈系列は１／２０，０００〜１／６４０，０００の範囲であり、２７．１〜０．８５ｎｇ／ｍＬのＦＩＸ濃度範囲を定義した。図１２は、ブランクで補正した平均シグナルの対数と、６つのアッセイ標準のＦＩＸ濃度との間の線形回帰曲線として得られた平均較正曲線を示す。挿入図は、バックフィッティングしたアッセイキャリブレータＤ１〜Ｄ６とそれらそれぞれの名目上の濃度との一致を示す。ＦＩＸ  Ｐａｄｕａの較正曲線は、２７．１〜０．８５ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で優れた線形性を示した。較正曲線は、平均相関係数ｒ＝０．９９９２（範囲：０．９９８６〜０．９９９６）によって示され、較正曲線の個々のポイントにつき計算されたバックフィッティングした濃度によって裏付けられ、範囲全体にわたり期待されたものより９％未満異なっていた（範囲：９１．１％〜１０８．６％）。これらのバックフィッティングデータは容易に、リガンド結合アッセイの好適な較正曲線を同定するための、生物学的な分析方法の検証に関するＥＭＡガイドラインによって定義された要件を満たした。較正曲線の相対合計誤差（ＲＴＥ）は低かった。具体的には、ＲＴＥは、較正曲線標準のブランクで補正した平均の光学密度（ＯＤ）をバックフィッティングすることによって計算された。得られた濃度を、それらの希釈度をかけることによって正規化した。この時点で、アッセイ標準の名目上の濃度とバックフィッティングアプローチによって決定された平均濃度との間の絶対差の合計、およびこの平均濃度の二重の標準偏差としてＲＴＥを計算した。さらに、傾きの低いＲＳＤは、これらの曲線が、臨床の場で使用しようとするアッセイに必要な再現性で得ることができたことを実証した。
【０１７８】
ＥＬＩＳＡを上述したようにして行った。正常新鮮凍結ヒト血漿およびＦＩＸ欠乏血漿にＦＩＸ  Ｐａｄｕａをスパイクした。スパイクした２つの血漿調製物の希釈系列を１／１０の希釈から開始した。図１３は、緩衝液で得られたものと比較した２つの血漿サンプルの希釈−応答曲線を示す。ＦＩＸ  Ｐａｄｕａをスパイクした血漿サンプルに関して得られた希釈−応答曲線の傾きは、緩衝液希釈系列に関して得られたものとは５％未満異なっていた。これは、血漿マトリクスがアッセイの性能に影響を与えなかったことを示す。
【０１７９】
また従来のポリクローナル抗ヒトＦＩＸ抗体は、ヒトＦＩＸとサルＦＩＸとの間の高い配列相同性のために、カニクイザルＦＩＸにも結合する（内部データ）。それゆえに、ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡの選択性をクエン酸塩加サル血漿のマトリクスに関してもチェックした。具体的には、雌および雄のクエン酸塩加サル血漿サンプルにＦＩＸ  Ｐａｄｕａをスパイクし、１／１０の最小限の希釈で希釈系列を開始して測定した。図１４は、緩衝液で得られたものと比較した２つの血漿サンプルの希釈−応答曲線を示す。
【０１８０】
ＦＩＸ  Ｐａｄｕａをスパイクした血漿サンプルに関して得られた希釈−応答曲線の傾きは、緩衝液希釈系列に関して得られたものとは４％未満異なっていた。これは、クエン酸塩加サル血漿マトリクスがアッセイの性能に影響を与えなかったことを示す。さらに、スパイクしたＦＩＸ  Ｐａｄｕａの濃度の回復は、雌および雄血漿サンプルそれぞれで９１．３％および１０３．１％であった。
【０１８１】
ＦＩＸ  Ｐａｄｕａを発現するＡＡＶ２／８ウイルスベクターで処置した後のフェーズ１／２臨床試験におけるＦＩＸ交差反応物質を含む被験体（ＣＲＭ＋）からのクエン酸塩加血漿サンプル中のＦＩＸ  Ｐａｄｕａの測定を実行した。被験体からの血漿サンプルを使用して、ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡを上述したようにして行った。被験体から得られた血漿サンプルを使用したＦＩＸ凝固活性およびＦＩＸ抗原測定を、標準的な方法を使用することによって実行した。図１５は、フェーズ１／２臨床試験からの被験体から得られた血漿サンプルに行われたＦＩＸ活性およびＦＩＸタンパク質測定の結果を示し、それによれば１Ｕ／ｍＬに近いＦＩＸ抗原の濃度が常に実証されたが、ＦＩＸ活性は定量下限未満であった。このデータは、被験体が、ＣＲＭ＋、すなわち従来のＦＩＸ  ＥＬＩＳＡでは測定可能な凝固不活性ＦＩＸタンパク質を示すと認定するものであった。ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡのｎｇ／ｍＬで得られた結果を、活性の変換の場合はアッセイ標準の比活性（２３１０ＩＵ／ｍｇ）、および抗原の変換の場合は５μｇ／ｍＬの正常ヒトＦＩＸ濃度を使用して活性および抗原単位に変換した。
【０１８２】
ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡデータは、ＦＩＸ活性データに類似するものであったことから、測定されたＦＩＸ活性はＦＩＸ  Ｐａｄｕａの発現に依存していたことが証明された。対照的に、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ特異的なＥＬＩＳＡで測定されたＦＩＸ抗原濃度は、標準的なＥＬＩＳＡで得られたものより明らかに低かったことから、ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡはＣＲＭ＋材料とＦＩＸ  Ｐａｄｕａとの間の識別を可能にしたことが実証された。
【０１８３】
ＦＩＸ  Ｐａｄｕａを発現するＡＡＶ２／８ウイルスベクターで処置した後のフェーズ１／２臨床試験におけるＦＩＸ交差反応物質を含む第２の被験体（ＣＲＭ＋）からのクエン酸塩加血漿サンプル中のＦＩＸ  Ｐａｄｕａの測定を実行した。第２の被験体からの血漿サンプルを使用して、ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡを上述したようにして行った。第２の被験体から得られた血漿サンプルを使用したＦＩＸ凝固活性およびＦＩＸ抗原測定を、標準的な方法を使用することによって実行した。図１６は、第２の被験体から得られた血漿サンプルに行われたＦＩＸ活性およびＦＩＸタンパク質測定の結果を示し、それによれば０．８Ｕ／ｍＬに近いＦＩＸ抗原の濃度が常に実証されたが、ＦＩＸ活性は定量下限未満であった。このデータは、被験体が、ＣＲＭ＋、すなわち従来のＦＩＸ  ＥＬＩＳＡでは測定可能な凝固不活性ＦＩＸタンパク質を示すと認定するものであった。ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡのｎｇ／ｍＬで得られた結果を、活性の変換の場合はアッセイ標準の比活性（２３１０ＩＵ／ｍｇ）、および抗原の変換の場合は５μｇ／ｍＬの正常ヒトＦＩＸ濃度を使用して活性および抗原単位に変換した。
【０１８４】
ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡデータは、ＦＩＸ活性データに類似するものであったことから、測定されたＦＩＸ活性はＦＩＸ  Ｐａｄｕａの発現に依存していたことが証明された。対照的に、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ特異的なＥＬＩＳＡで測定されたＦＩＸ抗原濃度は、標準的なＥＬＩＳＡで得られたものより明らかに低かったことから、ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡはＣＲＭ＋材料とＦＩＸ  Ｐａｄｕａとの間の識別を可能にしたことが実証された。
【０１８５】
ＦＩＸ  Ｐａｄｕａを発現するＡＡＶ２／８ウイルスベクターで処置した後のフェーズ１／２臨床試験におけるＦＩＸ  ＣＲＭ＋のない被験体からのクエン酸塩加血漿サンプル中のＦＩＸ  Ｐａｄｕａの測定を実行した。ＦＩＸ  ＣＲＭ＋のない被験体からの血漿サンプルを使用して、ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡを上述したようにして行った。ＦＩＸ  ＣＲＭ＋のない被験体からの血漿サンプルを使用したＦＩＸ凝固活性およびＦＩＸ抗原測定を、標準的な方法を使用することによって実行した。図１７は、ＣＲＭ＋のないことを常に実証した被験体から得られた血漿サンプルに行われたＦＩＸ活性およびＦＩＸタンパク質測定の結果を示す。ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡのｎｇ／ｍＬで得られた結果を、活性の変換の場合はアッセイ標準の比活性（２３１０ＩＵ／ｍｇ）、および抗原の変換の場合は５μｇ／ｍＬの正常ヒトＦＩＸ濃度を使用して活性および抗原単位に変換した。ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡデータは、ＦＩＸ活性およびＦＩＸタンパク質データに類似するものであったことから、測定されたＦＩＸ活性はＦＩＸ  Ｐａｄｕａの発現に依存していたことが証明された。
【０１８６】
（実施例４）
ＢＣ１を使用してＦＩＸ色素形成活性アッセイも開発した。ＦＩＸ  Ｐａｄｕａを、プレートに結合したＢＣ１に結合させることによってサンプルマトリクスから選択的に精製した。徹底的に洗浄することによってヒトＦＩＸ野生型を含む未結合のサンプル構成要素を除去し、その後、マイクロプレートのウェル上で色素形成第ＩＸ因子試験２２１８０６（Ｈｙｐｈｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄ）を行った。サンプルを上述した希釈緩衝液で希釈した。図１８は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａおよび正常参照血漿調製物に関して得られた用量応答−曲線を示す。
【０１８７】
ＦＩＸ  Ｐａｄｕａは、直線状の濃度−応答曲線を示したが、約１Ｕ／ｍＬのＦＩＸ濃度を有する正常参照血漿濃度は、いかなる測定可能なシグナルも示さなかった。これらのデータは、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ比活性アッセイを説明するアプローチの実行可能性を実証し、同時にその特異性を確認した。
【０１８８】
（実施例５）
以下は、ＦＩＸ野生型とＦＩＸ  Ｐａｄｕａバリアントとを識別する抗体の単離を説明する。
【０１８９】
ＦＩＸ  Ｐａｄｕａは、単一のアミノ酸交換（ＦＩＸ  Ｒ３３８Ｌ）を有する野生型ＦＩＸの天然に存在する機能亢進性バリアントである。血友病Ｂ遺伝子治療に関するＦＩＸ  Ｐａｄｕａの有用性が前臨床モデルですでに示されており、現在のところ臨床フェーズ１／２プログラムで調査中である。治療成功の評価は、主としてＦＩＸ  Ｐａｄｕａ導入遺伝子発現の決定に頼っているが、これは、野生型ＦＩＸとＦＩＸ  Ｐａｄｕａとを識別する抗体の欠如によって妨げられる。野生型ＦＩＸへの交差反応性を伴わずにＦＩＸ  Ｐａｄｕａを特異的に認識する抗体は、臨床サンプル中のＦＩＸ  Ｐａｄｕａを一義的に検出するアッセイの開発を可能にする。ファージディスプレイ方法を使用して、特異的ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ結合剤を選択した。ファージライブラリーを、３３８位に単一のアミノ酸置換を含む直鎖状および構造ペプチド、ならびに全長組換えＦＩＸ  Ｐａｄｕａを用いてスクリーニングした。３回のパニングを、野生型ＦＩＸ配列と競合させて、および競合させずに行って、数種の結合剤を同定した。ＢＩＡＣＯＲＥ（表面プラズモン共鳴）およびＥＬＩＳＡ実験を実行して、得られた抗体の特異性および親和性を決定した。まず異なるファージディスプレイパニング経路から様々な抗体を同定した。直鎖状ペプチド経路から生成した抗体は、独特で特異的なＦＩＸ  Ｐａｄｕａ結合を示した。選択された抗体は、約３ｎｇ／ｍＬ血漿の検出限界を有し、高度に上昇した（＞５０μｇ／ｍＬ）濃度でも野生型ＦＩＸに対する交差反応性がないことを示した。高度に特異的な抗ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ抗体は、野生型ＦＩＸとＦＩＸ  Ｐａｄｕａ抗原レベルとの間を選択的に区別する臨床アッセイの開発に使用することができる。
【０１９０】
導入：
【０１９１】
ＦＩＸ  Ｐａｄｕａは、単一のアミノ酸交換（ＦＩＸ  Ｒ３３８Ｌ）を有するＦＩＸ野生型（ｗｔ）の天然に存在する機能亢進性バリアントである。この機能獲得型変異は、正常なＦＩＸと比較して、比凝固活性の８〜１０倍の増加をもたらす。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、組換えＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌは、組換えＦＩＸ野生型の凝固活性より５〜１０倍高い比凝固活性を有していた［１］。血友病Ｂ遺伝子治療に関するＦＩＸ  Ｐａｄｕａの有用性が前臨床モデルですでに示されており、現在のところ臨床フェーズ１／２試験で調査中である。治療成功の評価は、主としてＦＩＸ  Ｐａｄｕａ導入遺伝子発現の決定に頼っているが、これは、ＦＩＸ  ｗｔとＦＩＸ  Ｐａｄｕａとを識別する抗体の欠如によって妨げられる。
【０１９２】
この研究の目的は、ＦＩＸ野生型への交差反応性を伴わずにＦＩＸ  Ｐａｄｕａと特異的に結合する抗体を生成して、臨床サンプル中でのＦＩＸ  ｗｔの存在下におけるＦＩＸ  Ｐａｄｕａの検出を可能にすることであった。
【０１９３】
以下は、この研究で行われた方法を説明する。
【０１９４】
抗Ｐａｄｕａ  ＦＩＸ特異的抗体の生成：抗体（二価Ｆａｂ）を、ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリーおよびＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）テクノロジーに基づくファージディスプレイテクノロジーによって生成した。４つの異なるアプローチを適用して、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに特異的な抗体を単離した（図１９）。２つは、固体または液体（ビーズ）相アッセイのいずれかにおいて３３８位に単一のアミノ酸置換を含むペプチドを用いて実行された。第３および第４の戦略は、全長活性ＦＩＸ  Ｐａｄｕａタンパク質を含んでいた。適した陰性対照（ｗｔペプチドまたはＦＩＸ  ｗｔ）を含む各戦略につき３回のパニングを実行した。固有の陽性クローンのＦａｂを産生し、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ抗原への特異的結合に関して試験した。ＥＬＩＳＡの場合、抗原［５μｇ／ｍＬ］をコーティングし、Ｆａｂ断片［２μｇ／ｍＬ］と共にインキュベートし、続いて抗ＦａｂＡＰコンジュゲートで検出した。
【０１９５】
血漿ＥＬＩＳＡ：ＦａｂをＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート［５μｇ／ｍＬ］上にコーティングし、ＰＢＳ緩衝液中に希釈した２０％のヒト血漿に加えて５０ｍＭのベンズアミジンと共にインキュベートした。血漿に５μｇ／ｍＬのｒＦＩＸ  ｗｔおよび増加する濃度のｒＦＩＸ  Ｐａｄｕａ（ＨＥＫ２９３で所内生産）をスパイクした。ＨＲＰで標識化したポリクローナルヤギ抗ＦＩＸ抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）を使用して検出を行った。
【０１９６】
ＢｉａＣｏｒｅ：全ての実験を、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２００機器およびニッケルでコーティングされたバイオセンサーチップ（ＮＴＡ−チップ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実行した。機器をまず、ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液で３回プライミングし、フローセル１（ＦＣ１）を、未改変でありＦａｂリガンドが欠如した参照フローセルとして使用した。約５００ＲＵのＦＩＸ  Ｐａｄｕａ特異的Ａｂ４２の固定には、フローセル２（ＦＣ２）を使用した。リガンド濃度は、１００〜６．２５ｎＭの範囲であった。
【０１９７】
この研究の結果は、後述される。
【０１９８】
ブタｗｔ  ＦＩＸの構造分析から、単一のＰａｄｕａ改変（Ｒ３３８Ｌ）はタンパク質の表面に位置しており［２］（図２１）、したがって、高度に特異的な抗体の生成に好適なエピトープであることが明らかになった。精製された二価Ｆａｂを、ＥＬＩＳＡによって、２０％のヒト血漿中での抗原の特異性（図２２）およびＦＩＸ  ｗｔに対する交差反応性に関して試験した（図２３）。５μｇ／ｍＬの、スパイクしたＦＩＸ  ｗｔを含有する２０％血漿マトリクス中、４つの単離された二価Ｆａｂのうち２つのみ（Ａｂ４２およびＡｂ７６）が、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに特異的に結合した。Ａｂ４２のみが、ヒトＦＩＩおよびヒトＦＸに対していかなる交差反応性も示さなかった（データ示さず）。
【０１９９】
これらのデータに基づき、ファージディスプレイテクノロジーを使用して高度に特異的な抗ＦＩＸ  Ｐａｄｕａミニ抗体Ａｂ４２が生成されたことが結論付けられた。選択された候補は、ＦＩＸ野生型または他の一般的な血液因子タンパク質、例えばＦＩＩまたはＦＸに対する交差反応性を示さない。ＦＩＸ  Ｐａｄｕａへの有効な結合は、ヒト血漿マトリクス（２０％）中およびＦＩＸ  ｗｔの一般的な濃度の存在下で示された。ミニ抗体Ａｂ４２は、臨床フェーズ１／２試験中に処置された患者からの血漿中におけるＦＩＸ  Ｐａｄｕａ分析に現在使用されている（以下を参照）。
【０２００】
上述した研究において、以下の参考文献：（１）Ｓｉｍｉｏｎｉら、Ｘ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｐａｄｕａ）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００９年；３６１巻：１６７１〜５頁；および（２）Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒら、Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｏｔｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸａ：ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｘａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｉｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９５年１０月１０日；９２巻（２１号）：９７９６〜８００頁が引用される。
【０２０１】
以下は、血友病Ｂ遺伝子治療のモニタリングのためのＦＩＸ  Ｐａｄｕａ特異的イムノアッセイの開発および適用を説明する。
【０２０２】
遺伝子治療は、血友病の将来的な処置選択肢として大きな見込みがある。ある臨床フェーズ１／２試験では、ＡＡＶ２／８ウイルスベクターを使用して、重度の血友病Ｂを有する被験体において、単一のアミノ酸交換（Ｒ３３８Ｌ）を有するＦＩＸの機能亢進性バリアントであるＦＩＸ  Ｐａｄｕａ（ＦＩＸｐ）を発現させる。導入遺伝子産物の特異的な検出は、治療の成功の評価にとって重要であるが、ＦＩＸ交差反応物質を有する患者（ＣＲＭ＋）では問題がある。ＦＩＸｐ特異的なＥＬＩＳＡの開発、およびＦＩＸ  Ｐａｄｕａを発現するＡＡＶ２／８ウイルスベクターで処置した後の血友病Ｂ患者の血漿中で発現されるＦＩＸｐを測定するためのこのアッセイの適用。新たに開発したＦＩＸｐ特異的な結合抗体のＦａｂ断片を、標準的な条件を使用して９６ウェルマイクロプレートに２μｇ／ｍＬでコーティングした。検出系として、ビオチン化ポリクローナルヒツジ抗ヒトＦＩＸＩｇＧおよびストレプトアビジンペルオキシダーゼを使用した。アッセイの較正を、２７．１〜０．８５ｎｇ／ｍＬのＦＩＸｐ濃度範囲を網羅するＦＩＸｐ調製物を用いて６ポイントの較正曲線を生成することによって達成した。患者のサンプルを、５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、１０ｍＭのベンズアミジン、１０ｍＭのＣａＣｌ２および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ緩衝液で希釈した。正常ヒト血漿または精製されたヒトＦＩＸは、ＦＩＸｐ特異的なＥＬＩＳＡにおいてシグナルを示さなかった。正確な較正曲線を得た。１／１０希釈した正常ヒト血漿にスパイクしたＦＩＸｐは、緩衝液中のアッセイ標準で得られたものに類似する希釈応答曲線で許容できる回復を示した。重要なことに、ＦＩＸｐをコードするＡＡＶで処置された６人の患者のサンプルの分析は、時間をわたって高度に類似したＦＩＸｐタンパク質およびＦＩＸ活性曲線を実証し、ＣＲＭ＋患者のサンプルは、ＣＲＭ−患者と比較してＦＩＸｐタンパク質のシグナルの増加を示さなかったことから、アッセイの特異性が示された。ＦＩＸｐ特異的なＥＬＩＳＡは、ＦＩＸｐタンパク質の測定による処置転帰の追加のモニタリングを可能にする。これは、このアプローチの実行可能性を実証する最初のデータを表す。
【０２０３】
導入：
【０２０４】
遺伝子治療は、血友病の将来的な処置選択肢として大きな見込みがある［１］。ある臨床フェーズ１／２試験では、ＡＡＶ２／８ウイルスベクターを使用して、重度の血友病Ｂを有する被験体において、単一のアミノ酸交換（Ｒ３３８Ｌ）を有するＦＩＸの機能亢進性バリアントであるＦＩＸ  Ｐａｄｕａ（ＦＩＸｐ）［２］を発現させる。導入遺伝子産物の特異的な検出は、治療の成功の評価にとって重要であるが、ＦＩＸ交差反応物質を有する患者（ＣＲＭ＋）では問題がある。
【０２０５】
図２５は、この研究に記載される方法（アッセイ）の原理を描写する。抗ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ  Ｆａｂをマイクロプレートウェルにコーティングして、サンプルからＦＩＸ  Ｐａｄｕａを選択的に捕捉する。洗浄ステップの後、未結合のサンプル化合物を除去し、所内のビオチン化ポリクローナルヒツジ抗ＦＩＸＩｇＧおよびストレプトアビジンペルオキシダーゼを使用して結合したＦＩＸ  Ｐａｄｕａを検出する。結合したＨＲＰ活性は、すぐ使用できるＨＲＰ基質であるＳｕｒｅＢｌｕｅを使用して測定される。
【０２０６】
以下は、この研究で行われた方法を説明する。
【０２０７】
ＥＬＩＳＡ手順：Ｆａｂ調製物Ａｂ４２（０．９４ｍｇ／ｍＬ）を、０．１ＭのＮａＨＣＯ３−Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．５で１／５００に希釈し、１００μＬ／ウェルで０〜＋１０℃で一晩インキュベートすることによってＭａｘｉｓｏｒｐ  Ｆ９６プレートのウェルに結合させた。サンプルおよび試薬の希釈およびプレートのブロッキングに使用された希釈緩衝液（ＤＢ）は、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２、５ｍｇ／ｍＬビオチン非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０ｍＭのＣａ２＋、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＥＩＡグレード）、および１０ｍＭのベンズアミジンを含有していた。コーティング後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄した。次いで、ウェルを、２００μＬのＤＢ／ウェルと室温（ＲＴ）で６０分間インキュベートすることによってブロッキングした。ブロッキングするステップを、洗浄することによって終結させた。次いで、標準／サンプルの希釈物をローディングし、連続的な１＋１の希釈系列をプレート上で直接調製した。希釈物（１００μＬ／ウェル）を室温で６０分間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、Ｆ９−１０３０Ａ（Ａ−Ｃｏａ）から調製されたビオチン化ポリクローナルヒツジ抗ヒトＦＩＸ検出抗体を添加した（１００μＬ／ウェル；希釈  １１５００）。室温で６０分間インキュベートした後、プレートを再度洗浄し、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を添加し（１００μＬ／ウェル：希釈  １／４，０００）、室温で３０分間インキュベートした。最終的な洗浄手順の後、結合したペルオキシダーゼ活性を、すぐ使用できるペルオキシダーゼ基質であるＳｕｒｅＢｌｕｅ（ＫＰＬ）を用いて測定し、３Ｎ硫酸で反応を止めた。次いでプレートを、６２０ｎｍで得られた結果を減算して４５０ｎｍで測定した。精製された組換えＦＩＸ  Ｐａｄｕａ（ＦＩＸｐ）調製物を用いて較正曲線を構築し、５４２．４μｇ／ｍＬのタンパク質濃度を実証した。タンパク質１ｍｇ当たり２，３１０ＩＵの比凝固活性は、この調製物を、過剰に活性なＦＩＸ  Ｐａｄｕａバリアントとして明らかに分類した。連続的な希釈系列は、１／２０，０００から１／６４０，０００の範囲であり、２７．１〜０．８５ｎｇ／ｍＬのＦＩＸ濃度範囲を定義した。
【０２０８】
この研究の結果は、下記および図面で説明される。ＦＩＸ凝固活性およびＦＩＸ抗原測定を、確立された標準的な方法を適用して実行し、クエン酸塩加血漿サンプルも、ＥＬＩＳＡを用いたＦＩＸ  Ｐａｄｕａタンパク質の特異的な測定に供した。ｎｇ／ｍＬで得られたＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡの結果を活性および抗原単位に変換した。具体的には、ＦＩＸｐ  ＥＬＩＳＡのためのアッセイ標準として適用された、ＦＩＸ  ２，３１０ＩＵ／ｍｇの組換え精製されたＦＩＸ  Ｐａｄｕａ調製物の比活性を使用して、活性単位を計算し、一方で抗原血漿単位への変換は、５μｇ／ｍＬの正常ＦＩＸ血漿濃度に基づいた。図２６〜２９はそれぞれ、正常およびＦＩＸ欠乏血漿におけるアッセイの選択性、較正曲線、並行して行った研究、およびＥＬＩＳＡの感受性に対するカルシウムの影響を実証する
【０２０９】
血漿サンプルを、ＡＡＶ２／８ウイルスベクターで処置された患者から得た。図３０〜３２は、３人の患者から得られたサンプル中のＦＩＸ  Ｐａｄｕａの活性および発現を実証する。被験体０５−００１から得られた血漿サンプルは、一貫して１Ｕ／ｍＬに近いＦＩＸ抗原濃度を示したが、ＦＩＸ活性は定量下限未満であった。このデータは、ＦＩＸ交差反応物質の存在（ＣＲＭ＋）、すなわち凝固不活性ＦＩＸタンパク質が、従来のＦＩＸ  ＥＬＩＳＡで測定可能であることを明らかにした。ＦＩＸｐ  ＥＬＩＳＡデータは、ＦＩＸ活性データに類似するものであったことから、測定されたＦＩＸ活性はＦＩＸ  Ｐａｄｕａの発現に依存することが実証された。対照的に、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ特異的なＥＬＩＳＡで測定されたＦＩＸ抗原濃度は、標準的なＥＬＩＳＡで得られたものより明らかに低かったことから、ＦＩＸ  ＰａｄｕａのＥＬＩＳＡはＣＲＭ＋材料とＦＩＸ  Ｐａｄｕａとの間の識別を可能にしたことが実証された。被験体１０−００５からのサンプルで、より低いＣＲＭ＋レベルにもかかわらず類似のデータが見出されたが、被験体０３−００４からのサンプルはＣＲＭ＋を含有せず、結果として２つのＥＬＩＳＡシステムでも類似する時間対濃度曲線が得られた。
【０２１０】
これらのデータから、ＦＩＸｐの捕捉のために高度に特異的なＦａｂ断片の使用に基づくＦＩＸ  Ｐａｄｕａ特異的なＥＬＩＳＡは、ＦＩＸｐの測定による処置転帰の追加のモニタリングを可能にすることが結論付けられた。これらは、このアプローチの実行可能性を実証する最初のデータである。
【０２１１】
上述した研究において、以下の参考文献：［１］Ｓｉｍｉｏｎｉ  Ｐら（２００９年）：ＮＥＪＭ  ３６１巻、１６７１〜１６７５頁。Ｘ−Ｌｉｎｋｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  （Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｐａｄｕａ）；［２］Ｃｒｕｄｅｌｅ  ＪＭら（２０１５年）。Ｂｌｏｏｄ  １２５巻：１５５３〜１５６１頁が引用される。ＦＩＸ−ＰａｄｕａのＡＡＶ肝臓発現は、血友病Ｂのイヌおよびマウスにおいて血栓形成性を増加させることなくＦＩＸ阻害剤を妨害し根絶する。本明細書の実施形態は、以下のようにも記載することができる：
１．  配列番号１のアミノ酸配列を含む第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、アミノ酸配列（配列番号２）を含む野生型（ＷＴ）第ＩＸ因子に結合しない、抗体またはその抗原結合性断片。
２．  配列番号１のエピトープと結合し、エピトープは、アミノ酸配列ＤＲＡＴＣＬＬＳＴＫＦＴ（配列番号３）内の線状エピトープである、実施形態１に記載の抗体または抗原結合性断片。
３．  配列番号１のエピトープに結合し、エピトープは、アミノ酸配列ＬＶＤＲＡＴＣＬＬＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨ（配列番号５）のフォールディングされた構造のコンフォメーショナルエピトープである、実施形態１に記載の抗体または抗原結合性断片。
４．  フォールディングされた構造が、ジスルフィド架橋を含む、実施形態１または３に記載の抗体または抗原結合性断片。
５．  ＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴ（配列番号１４）またはＬＶＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨ（配列番号１５）のアミノ酸配列に結合しない、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
６．  約１００ｎＭまたはそれ未満のＫＤで第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合する、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
７．  約２５〜約７５ｎＭの範囲のＫＤで第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合する、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
８．  約５０ｎＭ〜約６０ｎＭの範囲のＫＤで第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合する、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
９．  約２０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約２５ｎＭ〜約９５ｎＭ、約３０ｎＭ〜約９０ｎＭ、約３５ｎＭ〜約８５ｎＭ、約４０ｎＭ〜約８０ｎＭ、約４５ｎＭ〜約７５ｎＭ、約５０ｎＭ〜約７０ｎＭ、または約５５ｎＭ〜約６５ｎＭの範囲のＫＤで第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合する、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
１０．  ヒト血漿を含むサンプル中の第ＩＸ因子Ｐａｄｕａに結合し、ＷＴ第ＩＸ因子に結合せず、任意選択で、サンプルは、少なくとももしくは約５％、少なくとももしくは約１０％、または少なくとももしくは約２０％のヒト血漿を含み、サンプルは、少なくともまたは約５μｇ／ｍＬのＷＴ第ＩＸ因子を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
１１．  第ＩＩ因子ポリペプチドまたは第Ｘ因子ポリペプチドに結合しない、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
１２．抗体または抗原結合性断片が、第ＩＩ因子にも第Ｘ因子にも結合しない、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
１３．ＦａｂまたはＦａｂ２’抗体断片である、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
１４．単一特異性である、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
１５．完全にヒトのものである、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
１６．二価である、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
１７．二価であるが、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａに対して単一特異性である、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
１８．二量体化されたＦａｂ断片または二量体化されたＦａｂミニ抗体を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
１９．リンカーを介して二量体化されたＦａｂ断片である、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
２０．  （ｉ）ＳＳＹＡＩＳ（配列番号６）；ＧＩＶＰＡＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号７）；ＳＷＧＶＩＳＦＡＹ（配列番号８）；ＲＡＳＱＤＩＳＳＹＬＮ（配列番号９）；ＡＡＳＮＬＱＳ（配列番号１０）；およびＭＱＹＤＳＬＰＦＴＦ（配列番号１１）のアミノ酸配列、あるいは（ｉｉ）配列番号２４もしくは配列番号２５または配列番号２４および２５のアミノ酸配列あるいは（ｉｉｉ）配列番号２６もしくは配列番号２７または配列番号２６および２７のアミノ酸配列を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片。
２１．  配列番号６〜１１の各々を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、任意選択で、（ｉ）配列番号６〜１１の各々の間に、１つもしくは複数のアミノ酸が存在し、ならびに／または（ｉｉ）ポリペプチドは、任意選択で、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１２）を含むＦＬＡＧタグおよび／もしくはＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３）を含むヘキサＨｉｓタグをさらに含む、ポリペプチド。
２２．  ＦＬＡＧタグおよび／またはヘキサＨｉｓタグは、ポリペプチドのＣ末端に配置されている、実施形態２１に記載のポリペプチド。
２３．  異種成分にコンジュゲートした、前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片もしくはポリペプチドを含むコンジュゲート。
２４．  異種成分が、ポリマー、炭水化物、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および検出剤からなる群より選択される、実施形態２３に記載のコンジュゲート。
２５．  抗体または抗原結合性断片もしくはポリペプチドが、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ラテックスまたは制御多孔質ガラスにコンジュゲートされている、実施形態２３または２４に記載のコンジュゲート。
２６．  抗体または抗原結合性断片もしくはポリペプチドが、フルオロフォア、発色団、放射性同位体、酵素標識、またはビオチンにコンジュゲートされている、実施形態２３から２５のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
２７．  実施形態１９に記載のポリペプチドのホモ二量体を含む、実施形態２３から２６のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
２８．  二量体のポリペプチドは、へリックス−ターン−へリックス構造を介して連結されている、実施形態２７のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
２９．  前述の実施形態のいずれか１つに記載の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、コンジュゲート、またはそれらの断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
３０．  実施形態２９に記載の核酸を含むベクター。
３１．  実施形態２９に記載の核酸または実施形態３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
３２．  実施形態１から２０のいずれか１つに記載の抗体もしくは抗原結合性断片、実施形態２１または２２に記載のポリペプチド、実施形態２３から２８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態２９に記載の核酸、実施形態３０に記載のベクター、および／または実施形態３１に記載の宿主細胞を含む、キット。
３３．  抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、もしくはコンジュゲートに結合する二次抗体をさらに含む、実施形態３２に記載のキット。
３４．  固体支持体をさらに含む、実施形態３２または３３に記載のキット。
３５．  抗体、抗原結合性断片、ポリペプチドまたはコンジュゲートが、固体支持体上にプレコーティングされている、実施形態３２から３４のいずれか１つに記載のキット。
３６．  固体支持体が、ポリマービーズ、マイクロタイタープレート、膜、またはフィルターである、実施形態３４または３５に記載のキット。
３７．  約１００ｎｇまたはそれより多く、約１５０ｎｇまたはそれより多く、約２００ｎｇまたはそれより多く、約５００ｎｇまたはそれより多くの抗原結合性断片を含む溶液でプレコーティングされた固体支持体を含む、実施形態３５または３６に記載のキット。
３８．  使用のための指示をさらに含む、実施形態３２から３７のいずれか１つに記載のキット。
３９．  ヒト血漿、もしくはその希釈された画分、および／またはヒト組織もしくはその細胞を含む、ヒトから得られた生体サンプルと混合された、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物であって、任意選択で、検出剤を含む組成物。
４０．  ヒト血漿タンパク質を含む、ヒトから得られた生体サンプルと混合された、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物であって、ヒト血漿タンパク質の少なくとも１つは、第ＩＸ因子、第ＩＸ因子のバリアント、第ＩＩ因子、第ＩＩ因子のバリアント、第Ｘ因子および第Ｘ因子のバリアントからなる群より選択される、組成物。
４１．  検出剤を含む、実施形態４０に記載の組成物。
４２．  サンプル中の第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを検出するための、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片、実施形態２１または２２に記載のポリペプチド、実施形態２３から２８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、実施形態２９に記載の核酸、実施形態３０に記載のベクター、実施形態３１に記載の宿主細胞、および／または実施形態３２から３８のいずれか１つに記載のキットの使用。
４３．  被験体から得られたサンプル中の第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを検出する方法であって、（ｉ）サンプルを、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合性断片、実施形態２１または２２に記載のポリペプチド、または実施形態２３から２８のいずれか１つに記載のコンジュゲートと接触させて、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａと、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチドまたはコンジュゲートとを含む複合体を形成するステップ、および（ｉｉ）サンプル中の複合体を検出するステップを含む、方法。
４４．  抗体または抗原結合性断片もしくはポリペプチドが、検出剤および／または固体支持体にコンジュゲートされているか、あるいはコンジュゲートが、検出剤を含む、実施形態４３に記載の方法。
４５．  サンプルを、検出剤を含む二次抗体と接触させるステップを含み、二次抗体は、抗体もしくは抗原結合性断片もしくはポリペプチドまたはコンジュゲートに結合する、実施形態４３または４４に記載の方法。
４６．  複合体を検出するステップが、検出剤のシグナルを検出することを含む、実施形態４３から３５のいずれか１つに記載の方法。
４７．  シグナルが、酵素活性、結合活性および／または色素形成活性である、実施形態４６に記載の方法。
４８．  サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、または血漿サンプルである、実施形態４３から４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．  被験体が、第ＩＸ因子Ｐａｄｕａをコードするヌクレオチド配列を含むベクターで処置されている、実施形態４３から４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．  本明細書に記載の結合性構築物。
【０２１２】
本明細書において引用された、刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個別具体的に参照により組み入れられることが示されたのと同程度に、さらに本明細書にその全体が記載されたのと同程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１３】
用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」ならびに類似の指示対象の使用は、本開示を記載する場合（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）、本明細書において別段の指定がない限り、またはそれ以外の方式で文脈上明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方を包含すると解釈されるものとする。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する」は、別段の言及がない限り、包括的な用語（すなわち、「これらに限定されないが、〜を含む」を意味すること）として解釈されるものとする。
【０２１４】
本明細書における値の範囲の詳述は、範囲に含まれるそれぞれ別個の値および各上下限値を個々に述べる簡略的な方法として役立つことが単に意図され、本明細書において別段の指定がない限り、各別個の値および上下限値は、それが本明細書で個々に列挙されたのと同等に明細書に組み入れられる。
【０２１５】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において別段の指定がない限り、またはそれ以外の方式で文脈上明らかに矛盾しない限り、あらゆる好適な順番で実行することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる実施例、または例示的な言語（例えば、「例えば、など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、開示をより明確にし、別段の主張がない限り、本開示の範囲に限定を設けないことが単に意図される。明細書中の言語は、いずれの特許請求されていない要素も本開示の実施に必須であることを示すものと解釈されるべきではない。
【０２１６】
本開示の好ましい実施形態は、本開示を行うことに関して本発明者らが認識する最良の形態を含めて本明細書に記載される。そのような好ましい実施形態のバリエーションは、前述の記載を読めば当業者にとって明白になり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてこのようなバリエーションを採用することを予測しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されたものとは別の方式で本開示が実施されることを意図している。したがって、本開示は、適用法で認められるようにここに添付された特許請求の範囲で列挙された主題の全ての改変および均等物を含む。さらに、上述された要素のあらゆる可能なバリエーションでのあらゆる組み合わせが、本明細書において別段の指定がない限り、またはそれ以外の方式で文脈上明らかに矛盾しない限り、本開示によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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