(57)【要約】  低分子量ＳＤＰ断片などのシルク由来タンパク質（ＳＤＰ）を使用して創傷治癒を増進する方法が本明細書中に記載される。低分子量ＳＤＰ断片などのＳＤＰ断片を含む、角膜創傷、皮膚創傷、外科切開、熱傷、および皮膚潰瘍などの創傷の治療用の組成物も記載される。
2019519596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
創傷または傷跡を治療するための方法であって、
シルクフィブロイン由来タンパク質（ＳＤＰ）断片の複数がアミド（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基を末端に持つ、前記ＳＤＰ断片の組成物を創傷のある生体動物組織に適用することによって、前記創傷または傷跡を治療することを含む、方法。
【請求項２】
前記組成物が、セリン、グリシン、およびアラニンをあわせたアミノ酸含有量に関して天然シルクフィブロインとは少なくとも４％異なる一次アミノ酸配列を有するＳＤＰ断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、天然シルクフィブロインと比べて４０％を超えて減少したセリン含有量を有するＳＤＰ断片を含み、前記セリン含有量が少なくとも約５％である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
フィブロインのシルクフィブロインタンパク質重鎖とシルクフィブロインタンパク質軽鎖との間のシステインのジスルフィド結合が還元または除去されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、天然シルクフィブロインと比べて増進した水溶液中での安定性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＳＤＰ断片が、カイコのシルク、スパイダーシルク、または遺伝子操作されたシルクに由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＤＰタンパク質断片がＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉに由来する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、約３０ｋＤａから６０ｋＤａの間の平均分子量を有するＳＤＰ断片を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントが、約１００ｋＤａ未満、約８０ｋＤａ未満、約６０ｋＤａ未満、約５０ｋＤａ未満、約３０ｋＤａ未満、または約１０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントが、約１００ｋＤａ未満、約８０ｋＤａ未満、約６０ｋＤａ未満、約５０ｋＤａ未満、約３０ｋＤａ未満、または約１０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質断片の少なくとも７５パーセントが、約３０ｋＤａから６０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質断片の少なくとも９０パーセントが、約３０ｋＤａから６０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質断片の少なくとも７５パーセントが、約１０ｋＤａから３０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質断片の少なくとも９０パーセントが、約１０ｋＤａから３０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質断片の少なくとも５０パーセントが、約６０ｋＤａより大きい分子量を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＤＰ断片が、前記組織中の細胞の遊走および増殖を促進して前記創傷を閉鎖する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記創傷が、眼創傷、外科的創傷、切開、皮膚潰瘍、または擦過傷である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記眼創傷が眼状態によって引き起こされたものであり、かつ前記眼状態が、角膜潰瘍、角膜びらん、角膜擦過傷、角膜変性症、角膜穿孔、角膜の傷跡、上皮欠陥、角結膜炎、特発性ぶどう膜炎、角膜移植、ドライアイ症候群、加齢黄斑変性、糖尿病性眼症、眼瞼炎、緑内障、眼の高血圧、術後の眼痛および炎症、後眼部新血管形成、増殖性硝子体網膜症、サイトメガロウイルス網膜炎、眼内炎、脈絡膜新生血管膜、血管閉塞性疾患、アレルギー性眼疾患、腫瘍、網膜色素変性症、眼感染症、強膜炎、下垂症、縮瞳、眼痛、散瞳、神経痛、瘢痕性の眼表面疾患、眼感染症、炎症性眼疾患、眼表面疾患、角膜疾患、網膜疾患、全身性疾患の眼での発現、遺伝性の眼状態、眼腫瘍、眼内圧力の増加、疱疹性感染症、翼状片または強膜腫瘍、眼表面で持続する創傷、屈折矯正角膜切開術後の眼痛および炎症、角膜の熱的または化学的熱傷、強膜創傷、または円錐角膜および結膜創傷である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＳＤＰ断片が、前記創傷中の細胞におけるトランスフォーミング増殖ベータ因子シグナル伝達を増加させる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
創傷または傷跡を治療するための組成物であって、
シルクフィブロイン由来タンパク質（ＳＤＰ）断片を含み、前記ＳＤＰ断片の複数がアミド（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基を末端に持つ、組成物。
【請求項２１】
前記ＳＤＰ断片が、セリン、グリシン、およびアラニンをあわせたアミノ酸含有量に関して天然シルクフィブロインとは少なくとも４％異なる一次アミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＳＤＰ断片が、天然シルクフィブロインと比べて４０％を超えて減少したセリン含有量を有し、前記セリン含有量が少なくとも約５％である、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントが約１００ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＳＤＰ断片が、前記組織中の細胞の遊走および増殖を促進して前記創傷を閉鎖する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
水溶液、懸濁液、分散液、膏薬、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、噴霧剤、またはペーストに製剤化されている、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
薬学的担体を含む、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記薬学的担体が、リン酸緩衝生理食塩水、フィルム、ファイバー、泡、ヒドロゲル、マトリックス、三次元スキャフォールド、ミクロ粒子、ナノ粒子、ポリマー、またはマットである、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＳＤＰ断片が基体に取り付けられている、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記基体が、角膜移植片、創傷ドレッシング、コンタクトレンズ、組織、組織移植片、または分解性材料である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
創傷を治療するための組成物を製造する方法であって、
フィブロイン由来タンパク質断片の第１の組成物からフィブロイン由来タンパク質断片の第２の組成物を分離することを含み、前記第２の組成物中の前記フィブロイン由来タンパク質断片が、前記第１の組成物中の前記フィブロイン由来タンパク質断片よりも小さい平均分子量を有し、
前記第１の組成物中の前記タンパク質断片が、セリン、グリシン、およびアラニンをあわせたアミノ酸含有量に関して天然フィブロインとは少なくとも４％異なる一次アミノ酸配列を有し、
前記第１の組成物中の前記タンパク質断片の複数がアミド（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基を末端に持ち、
前記第１の組成物が、天然フィブロインと比べて４０％を超えて減少したセリン含有量を有し、前記セリン含有量が少なくとも約５％である、方法。
【請求項３１】
前記第２の組成物中の前記タンパク質断片の少なくとも７５パーセントが約１００ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の組成物が遠心分離機によって前記第１の組成物から分離される、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の組成物が、
上昇した圧力においてフィブロイン水溶液を加熱することを含む方法であって、
前記フィブロイン水溶液が少なくとも８Ｍの濃度の臭化リチウムを含み、かつ
前記フィブロイン水溶液が、少なくとも約１０ＰＳＩの圧力下で少なくとも約２０分間少なくとも約１０５℃（２２１°Ｆ）に加熱され、
それによって前記第１の組成物を提供する方法によって調製され、前記第１の組成物が、８．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、かつ前記第１の組成物が、１０％ｗ／ｗ水溶液として５ｃＰ未満の水性粘度を有する、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１６年４月８日に出願された米国仮出願シリアル番号第６２／３２０１７７号に対する優先権を主張し、該仮出願の内容は、参照することによりその全体が組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の補助金の表明
本発明は、米国国立科学財団によって授与された助成金番号第ＤＧＥ−１１４４１５３号および助成金番号第１１５２５６１号、ならびに米国陸軍によって授与された助成金番号第Ａ１５１−０６１−０１０７号の下での政府の支援により為された。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
角膜上皮の創傷治癒は、角膜上皮の再生およびリモデリングを対象とする複雑かつダイナミックな修復プロセスに依拠し、角膜の高度に規則的かつ組織化された組織構成の正しい復元、その眼の完全性および透過性を維持して眼が正常な視覚を与えるのを確実にするために必須である。損傷後の角膜の欠陥の再上皮化は、創傷表面を覆うための正しく接着した基底上皮細胞シートの集団的遊走、およびそれに続く、むき出しになった区画を埋めて非角化重層上皮を再生するための上皮細胞の増殖および分化の増加を伴う。遊走、増殖、細胞骨格再編成、および接着などの創傷治癒プロセスを通じて鍵となる上皮細胞の挙動の統合は、シグナル伝達事象の組織化されたカスケードによって推進され、損傷部位への様々な成長因子およびサイトカインの放出によって刺激され、眼表面の効率的かつ効果的な修復にとって必須である。しかしながら、重篤な外傷は、角膜の天然に存在する再生特性による正常上皮表面の復元を不可能にし、したがってその決定的に重要な障壁機能の再構築をできなくさせ得る。したがって、創傷治癒の加速を促進し、かつ不適切な角膜上皮再生の問題を軽減するための新規の生体用材料および療法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
低分子量ＳＤＰなどのシルク由来タンパク質（ＳＤＰ）を使用する創傷治癒を増進する方法が本明細書中に記載される。低分子量ＳＤＰなどのＳＤＰを含む、角膜創傷および皮膚創傷、または傷跡などの創傷の治療用組成物もまた記載される。一部の実施形態では、本明細書中で提供される組成物は、創傷治癒を促進するために効果的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある特定の実施形態では、それを必要とする対象に低分子量ＳＤＰを含む組成物を投与することを含む、創傷を治療するための方法が本明細書中に記載される。一部の実施形態では、創傷または傷跡を治療するための方法が本明細書中で提供される。一部の実施形態では、本明細書中で提供する方法は、創傷がある生体動物組織にシルク由来タンパク質（ＳＤＰ）断片の組成物を適用することを含む。一部の実施形態では、組成物は、角膜創傷または皮膚創傷に局所適用されて、創傷の外側表面を覆う。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片は、セリン、グリシン、およびアラニンを合わせたアミノ酸含有量に関して天然フィブロインとは少なくとも４％異なる一次アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の複数はアミド（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基を末端に持つ。一部の実施形態では、本明細書中で提供する組成物は、天然フィブロインと比べて４０％を超えて減少したセリン含有量を有し、セリン含有量が少なくとも約５％である。一部の実施形態では、フィブロインのフィブロインタンパク質重鎖とフィブロインタンパク質軽鎖との間のシステインのジスルフィド結合は、還元または除去されている。一部の実施形態では、本明細書中で提供する組成物は、増進した水溶液中での安定性を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片は、カイコのシルク、スパイダーシルク、または遺伝子操作されたシルクに由来する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉに由来する。
【０００６】
ある特定の実施形態では、本明細書中で提供する組成物は、約３０ｋＤａから６０ｋＤａの間の平均分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは、約１００ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片は、約１００ｋＤａ未満の分子量を有し、組織中の細胞の遊走および増殖を促進して創傷を閉鎖する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは、約１００ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは、約８０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは、約８０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは、約６０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片は、約６０ｋＤａ未満の分子量を有し、組織中の細胞の遊走および増殖を促進して創傷を閉鎖する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは、約６０ｋＤａ未満の分子量を有し、組織中の細胞の遊走および増殖を促進して創傷を閉鎖する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは、約５０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは、約５０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは、約３０ｋＤａから６０ｋＤａの間の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは、約３０ｋＤａから６０ｋＤａの間の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは、約３０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは、約３０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは、約１０ｋＤａから３０ｋＤａの間の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは、約１０ｋＤａから３０ｋＤａの間の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは、約１０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは、約１０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも５０パーセントは、約６０ｋＤａより大きい分子量を有する。場合によっては、ＳＤＰ断片は、創傷中の細胞におけるトランスフォーミング増殖ベータ因子シグナル伝達を増加させる。
【０００７】
一部の実施形態では、本明細書中で提供する組成物を用いて治療するための創傷は、眼創傷、外科的創傷、切開、または擦過傷である。場合によっては、創傷は、角膜潰瘍、角膜びらん、角膜擦過傷、角膜変性症、角膜穿孔、角膜の傷跡、上皮欠陥、角結膜炎、特発性ぶどう膜炎、角膜移植、ドライアイ症候群、加齢黄斑変性、糖尿病性眼症、眼瞼炎、緑内障、眼の高血圧、術後の眼痛および炎症、後眼部新血管形成、増殖性硝子体網膜症、サイトメガロウイルス網膜炎、眼内炎、脈絡膜新生血管膜、血管閉塞性疾患、アレルギー性眼疾患、腫瘍、網膜色素変性症、眼感染症、強膜炎、下垂症、縮瞳、眼痛、散瞳、神経痛、瘢痕性の眼表面疾患、眼感染症、炎症性眼疾患、眼表面疾患、角膜疾患、網膜疾患、全身性疾患の眼での発現、遺伝性の眼状態、眼腫瘍、眼内圧力の増加、疱疹性感染症、翼状片（ｐｔｙｒｉｇｉｕｍ）もしくは強膜腫瘍、眼表面で持続する創傷、屈折矯正角膜切開術後（ｐｏｓｔ−ｐｈｏｔｏｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｋｅｒａｔｏｔｏｍｙ）の眼痛および炎症、角膜の熱的もしくは化学的熱傷、強膜創傷、または円錐角膜および結膜創傷などの眼状態によって引き起こされた眼創傷である。
【０００８】
創傷または傷跡を治療するための組成物が本明細書中で提供される。一部の実施形態では、そのような組成物は、セリン、グリシン、およびアラニンをあわせたアミノ酸含有量に関して天然フィブロインとは少なくとも４％異なる一次アミノ酸配列を有するＳＤＰ断片を含む。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の複数は、アミド（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基を末端に持つ。一部の実施形態では、本明細書中で提供する組成物は、天然フィブロインと比べて４０％を超えて減少したセリン含有量を有し、セリン含有量が少なくとも約５％であるＳＤＰ断片を含む。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは、約１００ｋＤａ未満の分子量を有し、組織中の細胞の遊走および増殖を促進して創傷を閉鎖する。一部の実施形態では、本明細書中で提供する組成物は、薬学的担体を含む。一部の実施形態では、薬学的担体は、リン酸緩衝生理食塩水、フィルム、ファイバー、泡、ヒドロゲル、マトリックス、三次元スキャフォールド、ミクロ粒子、ナノ粒子、ポリマー、またはマットである。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片は、基体に取り付けられている。一部の実施形態では、基体は、角膜移植片、創傷ドレッシング、コンタクトレンズ、組織、組織移植片、または分解性材料である。
【０００９】
創傷を治療するための組成物を製造する方法が本明細書中で提供される。一部の実施形態では、方法は、ＳＤＰ断片の第１の組成物からＳＤＰ断片の第２の組成物を分離することを含む。一部の実施形態では、第２の組成物中のＳＤＰ断片は、第１の組成物中のＳＤＰ断片より低い平均分子量を有する。一部の実施形態では、第１の組成物中のＳＤＰ断片は、セリン、グリシン、およびアラニンをあわせたアミノ酸含有量に関して天然フィブロインとは少なくとも４％異なる一次アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第１の組成物中のＳＤＰ断片の複数は、アミド（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基を末端に持つ。一部の実施形態では、第１の組成物中のＳＤＰ断片は、天然フィブロインと比べて４０％を超えて減少したセリン含有量を有する。一部の実施形態では、セリン含有量は少なくとも約５％である。一部の実施形態では、第２の組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは、約１００ｋＤａ未満の分子量を有し、組織中の細胞の遊走および増殖を促進して創傷を閉鎖する。一部の実施形態では、第２の組成物は、遠心分離機によって第１の組成物から分離される。一部の実施形態では、第１の組成物は、上昇した圧力においてフィブロイン水溶液を加熱することを含む方法によって調製される。一部の実施形態では、フィブロイン水溶液は、少なくとも８Ｍの濃度の臭化リチウムを含む。一部の実施形態では、フィブロイン水溶液は、少なくとも約１０ＰＳＩの圧力下で少なくとも約２０分間少なくとも約１０５℃（２２１°Ｆ）に加熱されて、第１の組成物を提供する。一部の実施形態では、第１の組成物は、８．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、かつ第１の組成物は、１０％ｗ／ｗ水溶液として５ｃＰ未満の水性粘度を有する。
【００１０】
一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰは１００ｋＤａ未満である。一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰは８０ｋＤａ未満である。一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰは、組成物中の全ＳＤＰの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多くである。一部の実施形態では、組成物は、高分子量ＳＤＰを含まない。一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰは、カイコのシルク、スパイダーシルク、または遺伝子操作されたシルクに由来する。一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰは、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉに由来する。一部の実施形態では、創傷は、眼創傷、外科的創傷、切開、または擦過傷である。一部の実施形態では、創傷は角膜創傷である。一部の実施形態では、対象は眼状態を有する。一部の実施形態では、眼状態は、角膜潰瘍、角膜びらん、角膜擦過傷、角膜変性症、角膜穿孔、角膜の傷跡、上皮欠陥、角結膜炎、特発性ぶどう膜炎、角膜移植、ドライアイ症候群、加齢黄斑変性（ＡＭＤ、湿性または乾性）、糖尿病性眼状態、眼瞼炎、緑内障、眼の高血圧、術後の眼痛および炎症、後眼部新血管形成（ＰＳＮＶ）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、サイトメガロウイルス網膜炎（ＣＭＶ）、眼内炎、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）、血管閉塞性疾患、アレルギー性眼疾患、腫瘍、網膜色素変性症、眼感染症、強膜炎、下垂症、縮瞳、眼痛、散瞳、神経痛、瘢痕性の眼表面疾患、眼感染症、炎症性眼疾患、眼表面疾患、角膜疾患、網膜疾患、全身性疾患の眼での発現、遺伝性の眼状態、眼腫瘍、眼内圧力の増加、疱疹性感染症、翼状片（強膜腫瘍）、眼表面で持続する創傷、屈折矯正角膜切開術後の眼痛および炎症、角膜の熱的または化学的熱傷、強膜創傷、円錐角膜および結膜創傷からなる群から選択される。一部の実施形態では、眼状態は、加齢、自己免疫状態、外傷、感染症、変性障害、内皮ジストロフィー、および／または外科手術によって引き起こされる。
【００１１】
ある特定の実施形態では、低分子量ＳＤＰおよび薬学的に許容される担体を含む組成物が本明細書中に記載される。一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰは１００ｋＤａ未満である。一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰは８０ｋＤａ未満である。一部の実施形態では、担体はリン酸緩衝生理食塩水である。一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰは、組成物中の全ＳＤＰの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多くである。一部の実施形態では、組成物は、高分子量ＳＤＰを含まない。一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰは、カイコのシルク、スパイダーシルク、または遺伝子操作されたシルクに由来する。一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰは、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉに由来する。一部の実施形態では、担体は、フィルム、ファイバー、泡、ヒドロゲル、マトリックス、メッシュ、三次元スキャフォールド、ミクロ粒子、ナノ粒子  ポリマー、またはマットである。一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰは、基体に取り付けられている。一部の実施形態では、基体は角膜移植片である。一部の実施形態では、基体は創傷ドレッシングまたはコンタクトレンズである。一部の実施形態では、基体は組織移植片である。一部の実施形態では、基体は、対象への投与後に分解する。
【００１２】
低分子量ＳＤＰ断片もしくは高分子量ＳＤＰ断片またはこれらの組合せを含む組成物が本明細書中で提供される。低分子量ＳＤＰ断片は、細胞の増殖、遊走、および創傷閉鎖速度を増加させることができる。一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰ断片は、炎症性の創傷の治療において使用される。場合によっては、一部の実施形態では、それは低分子量ＳＤＰ断片の組成物を適用して創傷治癒を早めるために有用である。一部の実施形態では、これらの場合は、戦争中に戦場で負った創傷、痛みから解放されるために迅速な治癒を望む比較的健常な人における外科的創傷、または高感染性区画内で負った創傷を含む。高分子量ＳＤＰ断片は、基底膜への細胞接着を増加させること、または基底膜の形成を助けることができる。場合によっては、それは、化膿している１つもしくは複数の慢性創傷、または糖尿病性潰瘍もしくは皮膚熱傷などの治癒が困難な創傷のために高分子量ＳＤＰ断片の組成物を適用するために有用である。低分子量ＳＤＰ断片が創傷閉鎖速度に関与する場合、高分子量ＳＤＰ断片は、創傷閉鎖の質に関与することができる。場合によっては、選択された低分子量ＳＤＰ断片および高分子量ＳＤＰ断片の組成物は、最適な創傷治癒の速度および質のために適用される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＳＤＰ溶液および先行技術のシルクフィブロイン（ＰＡＳＦ）溶液の両方の生成のための鍵となる処理ステップを説明するフローチャートを示す。ＳＤＰの製造方法は、ＰＡＳＦ溶液の製造方法の間には行われない、長期的に溶液安定性を増進するための追加のステップ（中央のイタリック体）を含有する。
【図２】図２は、安定なＳＤＰ溶液（試料１、左、実施例１に記載の方法によって製造）およびＰＡＳＦ溶液（試料２、右、標準的な加水分解条件によって製造）についてのローレンス安定性試験の結果を示す写真を示す。目視検査により、試料１はゲル化していない安定な水溶液である一方、試料２はゲル化し、したがって安定な水溶液でないことが明らかとなる。
【図３】図３は、ＳＤＰ溶液への水性シルクフィブロインタンパク質の処理媒介性改変を示すゲルの写真を示す。写真は、ＳＤＰ溶液（レーン３、オートクレーブあり）およびＰＡＳＦ溶液（レーン２、オートクレーブなし）を対比した分子量（ＭＷ）分布を示す。タンパク質標準ラダー（レーン１）および関連する質量（レーン１の左の数字）をＭＷの基準として与えている。レーン２の２３〜２６ｋＤａにある目立ったＭＷバンドは注目に値し、オートクレーブ処理後に完全になくなっており、フィブロイン軽鎖の分解がＳＤＰタンパク質材料の増進した安定性に寄与することを説明する。また、オートクレーブ後のフィブロインタンパク質のＭＷ範囲（レーン３）において明らかなシフトが観察され、ＳＤＰ材料組成物への天然シルクフィブロインタンパク質の改変を説明する。
【図４】図４Ａ−Ｂは、（Ａ）ＳＤＰ溶液材料はゲル化しないが、（Ｂ）ＰＡＳＦ溶液材料は超音波処理後２時間以内にゲル化したことを実証する画像を示す。
【図５】図５は、様々な分子量範囲分布の再生ＳＤＰ溶液のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）解析を示す。ＳＤＰ水溶液を（Ｂ）高分子量ＳＤＰ断片および（Ｃ）低分子量ＳＤＰ断片に分別し、それらの分子量分布を（Ｅ）未分別ＳＤＰ溶液と比較した。（Ａ、Ｄ）分子量タンパク質マーカー。
【図６】図６は、可溶性ＳＤＰがｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト角膜縁上皮（ＨＣＬＥ）細胞の遊走を促進することを説明する。濃度を増加させた異なるＭＷのＳＤＰ（未分別ＳＦ（Ｕｎｆｒ．ＳＦ）＝未分別ＳＤＰ；高ＭＷ  ＳＦ＝高分子量ＳＤＰ；低ＭＷ  ＳＦ＝低分子量ＳＤＰ）で処理したＨＣＬＥ細胞の単一細胞遊走速度の平均を示す要約グラフである（＊＊＊ｐ＜０．０５ｖｓ．対照；＃ｐ＜０．０５ｖｓ．未分別ＳＦ；αｐ＜０．０５ｖｓ．高ＭＷ  ＳＦ（１ｍｇ／ｍｌ）；βｐ＜０．０５ｖｓ．高ＭＷ  ＳＦ（２ｍｇ／ｍｌ）、φｐ＜０．０５ｖｓ．高ＭＷ  ＳＦ（４ｍｇ／ｍｌ）；Ｎ＝３、ｎ＝１００）。
【図７】図７は、ＳＤＰがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＣＬＥ細胞の増殖および生存能力を増進することを示す。濃度を増加させた異なるＭＷのＳＤＰ溶液の存在下で１２時間培養した細胞に対して行ったＭＴＴ生存能力アッセイの要約グラフである。（＊＊＊ｐ＜０．０５ｖｓ．対照；＃ｐ＜０．０５ｖｓ．未分別ＳＦ；αｐ＜０．０５ｖｓ．高ＭＷ  ＳＦ（１ｍｇ／ｍｌ）；βｐ＜０．０５ｖｓ．高ＭＷ  ＳＦ（２ｍｇ／ｍｌ）；φｐ＜０．０５ｖｓ．高ＭＷ  ＳＦ（４ｍｇ／ｍｌ）；Ｎ＝３、ｎ＝３）。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、低分子量ＳＤＰ断片がｉｎ  ｖｉｔｒｏで擦過傷閉鎖を増進することを説明する。図８Ａは創傷治癒アッセイからの代表的な画像であり、細胞の増殖および無細胞領域（輪郭を白く描いた）への遊走が低分子量ＳＤＰの存在下で有意に加速されたことを実証する。図８Ｂは、擦過傷アッセイの間の示した時点における創傷閉鎖パーセントを説明する要約の棒グラフである（＊＊＊ｐ＜０．０５ｖｓ．対照；＃ｐ＜０．０５ｖｓ．未分別ＳＦ；†ｐ＜０．０５ｖｓ．高ＭＷ  ＳＦ；Ｎ＝３、ｎ＝３）。
【図９】図９は、高流動せん断力への曝露後に残った接着ＨＣＬＥ細胞の数の有意な増加を実証する要約のグラフを示し、これは細胞を高ＭＷ  ＳＤＰで処理した時の細胞−基体接着強度の増強を示している。（＊＊＊ｐ＜０．０５ｖｓ．対照；＃ｐ＜０．０５ｖｓ．未分別ＳＦ；†ｐ＜０．０５ｖｓ．高ＭＷ  ＳＦ；Ｎ＝３、ｎ＝１００）。
【図１０】図１０は、ＳＤＰが焦点結合のクラスター化を促進することによって細胞接着を増進することを説明する。ＰＢＳ処理賦形剤中（対照）、および未分別ＳＦ（陽性対照）、低ＭＷ  ＳＦ、または高ＭＷ  ＳＦの存在下で培養したＨＣＬＥ細胞の代表的な画像。未分別ＳＦまたは高ＭＷ  ＳＦで処理した細胞は、細胞接着の点を示す細胞膜に沿ったビンキュリン（緑色）染色の増加を呈する（核＝青色）。細胞の外周に沿ったビンキュリンのクラスター化は、全ての他の処理群と比較して高ＭＷ  ＳＦ処理でより顕著であった。
【図１１】図１１Ａは、代表的な位相コントラスト像が高ＭＷ  ＳＤＰの存在下でＨＣＬＥ細胞の広がりの増加を実証することを説明する。図１１Ｂは、異なるＭＷのＳＤＰ溶液、またはＰＢＳ処理賦形剤（対照）の存在下で、スパース（個々の細胞）またはコンフルエント（細胞シート）に培養したＨＣＬＥ細胞の平均表面積を表す要約のグラフである。（＊＊＊ｐ＜０．０５ｖｓ．対照；＃ｐ＜０．０５ｖｓ．未分別ＳＦ；†ｐ＜０．０５ｖｓ．高ＭＷ  ＳＦ；Ｎ＝３、ｎ＝１００）。
【図１２】図１２は、異なるＭＷのＳＤＰ溶液、またはＰＢＳ賦形剤処理（対照）の存在下で培養したＨＣＬＥ細胞における遺伝子のＴＧＦβファミリーの相対発現のＱ−ＰＣＲを説明する。（＊＊ｐ＜０．０５ｖｓ．対照；＃ｐ＜０．０５ｖｓ．未分別ＳＦ；†ｐ＜０．０５ｖｓ．低ＭＷ  ＳＦ；Ｎ＝３、ｎ＝１００）。
【図１３】図１３Ａおよび図１３Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞遊走および擦過傷閉鎖に対する低分子量シルクの効果は、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤の存在下で減弱されることを説明する。図１３Ａは、擦過傷治癒アッセイからの代表的な画像である。図１３Ｂは、擦過傷治癒アッセイの間の示した時点における創傷閉鎖パーセントを説明する要約の棒グラフである（＊＊＊ｐ＜０．０５ｖｓ．対照；†ｐ＜０．０５ｖｓ．低ＭＷ  ＳＦ；＃ｐ＜０．０５ｖｓ．対照（＋ＳＢ４３１５４２）；Ｎ＝３、ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
創傷を治療するためのＳＤＰに由来するタンパク質組成物が本明細書中で提供される。場合によっては、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、米国特許出願公開番号第２０１６／００９６８７８号（参照することによりその開示の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されたタンパク質組成物を含み得る、またはそれに由来し得る。本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、増進された水溶液中での溶解性および安定性を有し得る。本明細書中で提供するＳＤＰ組成物を製造する方法は、フィブロインタンパク質重鎖とフィブロインタンパク質軽鎖との間のシステインのジスルフィド結合が還元または除去されるように天然フィブロインの一次アミノ酸配列を改変することを含み得る。さらに、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、天然フィブロインタンパク質と比べて４０％を超えて減少したセリン含有量を有することができ、かつタンパク質の平均分子量は約１００ｋＤａ未満である。一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、以下に限定されないが角膜創傷、皮膚創傷、外科切開、熱傷、または皮膚潰瘍（例えば、糖尿病性皮膚潰瘍）などの創傷の治療のために用いられる。
【００１５】
定義
以下の定義は、本明細書および請求項の明確かつ一貫した理解を提供するために含めたものである。本明細書中で使用する場合、記載した用語は以下の意味を有する。本明細書において使用される全ての他の用語および語句は、当業者が理解する通常の意味を有する。そのような通常の意味は、Ｈａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  １４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｒ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、２００１年などの技術辞典を参照することによって得られ得る。
【００１６】
本明細書中の「一実施形態」、「実施形態」などへの言及は、記載した実施形態が特定の態様、特性、構造、部分、または特徴を含むことができるが、あらゆる実施形態がその態様、特性、構造、部分、または特徴を必ずしも含みはしないことを示す。さらに、そのような語句は、必ずしもそうではないが、本明細書のその他の部分において言及した同じ実施形態を参照することができる。さらに、特定の態様、特性、構造、部分、または特徴が実施形態と結び付けて記載される場合、明示的に記載されていようとそうでなかろうと、そのような態様、特性、構造、部分、または特徴をその他の実施形態と関係させるまたは結び付けることは当業者の知識の範囲内である。
【００１７】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り、複数への言及を包含する。したがって、例えば、「成分」への言及は、複数のそのような成分を包含し、よって成分Ｘは複数の成分Ｘを包含する。請求項は任意選択の構成要素を除外するように記述できることがさらに留意される。そのため、この記述は、本明細書中に記載する任意の構成要素、および／または請求項の構成要件の記載もしくは「否定的」限定の使用と関連して、「単独で」、「のみ」、「以外」などの排他的な学術用語の使用のための先行詞として働くことが意図される。
【００１８】
「および／または」という用語は、この用語が関連する項目のいずれか１つ、項目の任意の組合せ、または項目の全てを意味する。「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」という語句は、特にその使用される文脈において読まれた時に、当業者に容易に理解される。例えば、これらの語句は、１、２、３、４、５、６、１０、１００、または記載した下限より約１０倍、１００倍、もしくは１０００倍高い任意の上限を意味することができる。
【００１９】
「約」という用語は、明記した値の±５％、±１０％、±２０％、または±２５％のバリエーションを指すことができる。例えば、「約５０」パーセントは、一部の実施形態では、４５〜５５パーセントのバリエーションを有することができる。整数範囲の場合、「約」という用語は、範囲の各端に記載した整数より１もしくは２だけ大きいおよび／または小さい整数を包含することができる。本明細書中で別段の記載をしない限り、「約」という用語は、個々の成分、構成要素、組成、または実施形態の機能性の観点で同等である、記載した範囲に近い値（例えば質量パーセント）を包含することを意図する。約という用語はまた、この段落において上述したような記載した範囲の終点を修飾することができる。
【００２０】
当業者によって理解されるように、成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表現するものなどの全ての数は、おおよそのものであり、全ての場合に「約」という用語によって任意選択で修飾されるものと理解される。これらの値は、本明細書中に記載する教示を利用して当業者が得ようとする所望の特性に応じて変化し得る。そのような値は各々の試験測定値において見られる標準偏差に必ずしも起因しない変動を内在的に含有することも理解される。
【００２１】
当業者によって理解されるように、任意のおよび全ての目的のために、特に記述による説明を提供する観点において、本明細書中に記載する全ての範囲はまた、任意のおよび全ての可能な部分的範囲およびその部分的範囲の組合せ、ならびに該範囲を構成する個々の値、特に整数値を包含する。記載した範囲（例えば、質量パーセントまたは炭素基）は、範囲内の各特定の値、整数、少数、または素性を包含する。任意の挙げた範囲は、同じ範囲が少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、または１０等分に分割されることを十分に説明し、可能にするものと容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書中に論じる各範囲は、３分割の下部、中部、および上部などに容易に分割することができる。これも当業者によって理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」、「より多い」、「またはより多い」などの全ての言い回しは、記載した数を包含し、かつそのような用語は、上に論じたような部分的範囲に順次分割できる範囲を指す。同様にまた、本明細書中に記載する全ての比は、より大きい比に含まれる全ての部分比を包含する。したがって、基、置換基、および範囲について記載する特定の値は単に実例を挙げて説明するためであり、その他の定義された値または基および置換基について定義された範囲内のその他の値を除外しない。
【００２２】
マーカッシュ群などの一般的な方法でメンバーが一緒にグループ化されている場合、発明は挙げた群全体を総体として包含するだけでなく、群の各メンバーを個々におよび元となる群の全ての可能な部分群を包含することも当業者は容易に認識するであろう。さらに、全ての目的のために、元となる群だけでなく、元となる群の１つまたは複数の群メンバーを欠いた群を発明は包含する。したがって、記載した群の任意の１つまたは複数のメンバーの明示的な除外を発明は想定する。したがって、条件は任意の開示されたカテゴリーまたは実施形態に該当することができ、それによって、記載した構成要素、種、または実施形態の任意の１つまたは複数は、例えば明示的な否定的限定において使用するために、そのようなカテゴリーまたは実施形態から除外することができる。
【００２３】
「接触させる」という用語は、例えば、例えば溶液中、反応混合物中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、またはｉｎ  ｖｉｖｏで、生理学的反応、化学反応、または物理的変化をもたらすための、触れる行為、接触させること、または細胞もしくは分子レベルなどですぐ近くもしくは近くに持ってくることを指す。
【００２４】
治療に適用される場合、「有効量」とは、疾患、障害、および／または状態を治療するため、または記載した効果をもたらすために効果的な量をいう。例えば、有効量は、治療されている状態または症状の進行または重篤度を減少させるために効果的な量であり得る。治療有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。「有効量」という用語は、例えば、宿主において疾患もしくは障害を治療もしくは予防するためまたは疾患または障害の症状を治療するために効果的な、本明細書中に記載する組成物の量または本明細書中に記載するペプチドの組合せの量を包含することを意図する。したがって、「有効量」は、一般に、所望の効果を提供する量を意味する。
【００２５】
製法および調製に適用される場合、「有効量」とは、反応混合物中で製造物を形成するために必要な量などの、記載した効果をもたらすために効果的な量をいう。有効量の決定は、特に本明細書中に提供する詳細な開示を考慮すれば、通常、当業者の能力の範囲内である。「有効量」という用語は、例えば、反応混合物中で所望の製造物を形成するために効果的な、本明細書中に記載する化合物もしくは試薬の量、または本明細書中に記載する化合物もしくは試薬の組合せの量、または本明細書中に記載する製法に関する条件を包含することを意図する。したがって、「有効量」は、一般に、記載した所望の効果を提供する量を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、「シルクフィブロイン」という用語は、カイコフィブロインおよび昆虫またはクモのシルクプロテインを包含する。例えば、Ｌｕｃａｓら、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．１３巻、１０７号（１９５８年）を参照。任意の種類のシルクフィブロインを使用することができる。Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどのカイコによって産生されたシルクフィブロインは、最も一般的であり、地球に優しい再生可能な資源である。例えば、シルクフィブロインは、Ｂ．ｍｏｒｉの繭からセリシンを抽出することによって得ることができる。また、オーガニックのカイコ繭が市販されている。しかしながら、スパイダーシルク（例えば、Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓから得られる）、細菌、酵母、哺乳動物細胞、トランスジェニック動物、またはトランスジェニック植物に由来するシルクなどのトランスジェニックシルク、遺伝子操作されたシルク（例えば、ＷＯ９７／０８３１５、米国特許第５，２４５，０１２号を参照）、およびこれらの変異体などの、使用できる多くの異なるシルクが存在する。
【００２７】
例示的なシルクフィブロインは、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのカイコ繭に由来する。タンパク質フィブロインは、約３５０〜４００ｋＤａの分子量の重鎖および約２５ｋＤａの分子量の軽鎖を含み、重鎖および軽鎖はジスルフィド結合によって互いに連結されている。重鎖および軽鎖の一次配列は当該技術分野で公知である。フィブロインタンパク質鎖は、親水性のＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメイン、ならびに溶液中の周囲の分子との立体相互作用と静電相互作用との混合を可能とする疎水性／親水性アミノ酸配列の交互のブロックを有する。低濃度希釈（１％またはそれ未満）において、フィブロインタンパク質分子は、広がったタンパク質鎖の形態をとることが公知であり、溶液中ですぐには凝集しない。フィブロインタンパク質は、ＨＡ、ＰＥＧ、グリセリン、およびＣＭＣなどの水和分子との混和性が高く、生体適合性が高いことが分かっており、また酵素作用を通じて体内に自然に取り込まれ、分解される。本明細書中でＰＡＳＦとも称される天然フィブロインは当該技術分野で公知であり、例えばＤａｉｔｈａｎｋａｒら（Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年、４巻、１１５〜１２１頁）に記載されている。
【００２８】
「シルク由来タンパク質」（ＳＤＰ）および「フィブロイン由来タンパク質」という用語は本明細書中で交換可能に使用される。これらの材料は、熱、圧力、および高濃度の比重の大きい塩の溶液を伴う本明細書中に記載する製法によって調製される。したがって、「シルク由来」および「フィブロイン由来」とは、本明細書中に記載する構造的、化学的、および物理的性質を有するタンパク質組成物とするためにシルクフィブロインタンパク質を改変する製法の出発材料をいう。
【００２９】
概要
本明細書中に記載する研究では、角膜上皮細胞の挙動に影響を与え、創傷治癒応答に関与する生物学的プロセスを増進するＳＤＰ断片の能力が、溶液形態で送達されるシルクプロテインの断片サイズに依存することの実証に成功した。この研究は、生体用材料としてのシルクフィブロインの汎用性は、最終のシルク製品の形成に必要な様々な製法の様式および枠組みに大きく影響されることが公知である該タンパク質の化学的および分子的特質から生じることを立証する。シルクフィブロインに基づく生体用材料の調製の最初のステップは、シルクファイバーから夾雑物のセリシンタンパク質コーティングを除去するための熱およびｐＨ変化などの強い変性因子に依拠するデガミング処理を通じて、原料のカイコ繭からシルクファイバーを抽出することである。続いて、精製されたファイバーを濃酸、無機塩、フッ素化有機溶媒、およびイオン液体などの強いカオトロピック剤を使用して可溶化して、タンパク質結晶構造を安定化させる強い水素結合を壊し、再生シルクフィブロイン溶液と呼ばれるものを製造し、該溶液から、様々な材料形式を作ることができる。結果として、デガミングおよび分解処理の間に苛酷な変性条件へとシルクフィブロインタンパク質を曝露することによる分子間の水素結合およびまたは／ファンデルワールス結合の破壊は、そのペプチド分子構造の断片化および崩壊を生じさせ、最終的に再生シルクフィブロイン溶液の分子量分布に影響を与え、その生体機能材料の特性の有意な変化に繋がる。
【００３０】
先行する研究は、シルクフィブロインタンパク質構造における処理誘発性の断片化と、シルクをフィルムスキャフォールド材料として使用した時の機械的強度、分解速度、熱安定性、および生体適合性などの生体用材料特性の変化との間の関係性を確立することに主に集中してきた。
【００３１】
細胞培養物への補助として加えた時に、低分子量ＳＤＰは、細胞の遊走速度および増殖の有意な増加を刺激した。対照的に、高分子量ＳＤＰでの処理は、細胞移動度を有意に阻害したが、細胞の増殖および生存能力に対するいかなる効果も実証しなかった。さらに、創傷治癒応答の増強に繋がる角膜上皮細胞挙動のＳＤＰ刺激における分子量依存的な相違は、創傷閉鎖を評価するために使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ上皮擦過傷モデルにおいてさらに著明であった。低分子量ＳＤＰで処理したＨＣＬＥ細胞は、より遅い細胞の遊走および増殖の結果として創傷閉鎖速度の有意な減少を示した高分子量シルクで処理した細胞と比べた時に、創傷閉鎖速度の有意な加速を示し、より迅速に創傷区画全体を占拠した。これらの結果は、ＳＤＰの生体機能特性ならびに細胞の増殖および遊走の刺激を通じて創傷治癒を増進するその能力に対するタンパク質分子量の意義を暗示する。
【００３２】
角膜上皮の創傷治癒には、シグナル伝達機構の組織化されたカスケードによって推進される鍵となる生物学的プロセスおよび上皮細胞の挙動の統合が必要とされる。ＴＧＦβサイトカインファミリー、および、正常な生理的条件下の哺乳動物角膜上皮において発現されるが損傷後に有意に上方調節される複雑な一群の多機能タンパク質を含むそれらの受容体は、角膜上皮の維持および創傷治癒の間に関与する様々な事象の公知の調節因子である。ＴＧＦβシグナル伝達の減少または阻害は、角膜創傷の修復の遅延を生じさせ、したがって創傷治癒プロセスの間の細胞の遊走および増殖の調節における重要な内因性因子であることが研究により示されている。本研究では、低分子量シルクでの処理は、ＴＧＦβ２アイソフォームの発現のロバストな増加を引き起こし、細胞の遊走、増殖、および創傷閉鎖において観察された増強とよく合致している。さらに、高分子量シルクでの処理は、ＴＧＦβの全てのアイソフォームの発現の有意な下方調節を生じさせ、細胞の遊走、増殖、および擦過傷閉鎖の観察された減少はＴＧＦβの発現およびシグナル伝達に対する阻害性効果に帰することができることを示唆する。
【００３３】
擦過傷閉鎖に対する低分子量ＳＤＰの効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ擦過アッセイの間にＨＣＬＥ細胞におけるＴＧＦβシグナル伝達経路を破壊するために使用されたＴＧＦβＲＩ特異的阻害剤の存在下で部分的に減弱された。基本条件の間にＴＧＦβシグナル伝達を阻害した時にも細胞遊走および創傷閉鎖は減弱され、ＳＤＰの刺激性効果の減少にもかかわらず、低分子量シルクで処理された阻害細胞の創傷閉鎖速度は、阻害剤単独で処理された対照細胞よりなおも早かった。これは、ＳＤＰはＴＧＦβシグナル伝達の活性化を通じて細胞の遊走および増殖を少なくとも部分的に刺激しているが、ＴＧＦβシグナル伝達経路が阻害された時に角膜上皮細胞の挙動を調節し、細胞遊走を増加させることができる複数のシグナル伝達経路を活性化している可能性が最も高いことを示唆する。角膜の創傷治癒に関与する遺伝子の発現を刺激するＳＤＰの能力を評価したところ、ＴＧＦβの発現に対する断片サイズの効果は有意であった。低分子量シルクはＴＧＦβ２の発現をロバストに増加させたが、高分子量シルクは効果を有意に下方調節した。さらには、創傷閉鎖の間のＴＧＦβＲＩ阻害剤の使用により、低分子量ＳＤＰはＴＧＦβ媒介性のシグナル伝達を通じて細胞の増殖および遊走の増加を刺激することが明らかとなった。本明細書中に記載する研究の結果はＳＤＰの創傷治癒効果をさらに特徴付け、またその生体機能特性がそのタンパク質構造の化学的および分子的特質に依拠する程度を明らかにする。したがって、これらの結果は、眼創傷、皮膚創傷、および傷跡などの創傷の組織の再生および修復を向上させるための低分子量ＳＤＰの使用を実証する。
【００３４】
例示的な実施形態では、ＳＤＰ断片を含む本明細書中で提供する組成物は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉカイコフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０５７９０）に由来する。一部の実施形態では、ＳＤＰ断片は、クモなどのその他の昆虫由来のシルクに関連するその他の例示的なフィブロインに由来し、本明細書中で提供する組成物中に含まれるものとして想定される。下記の表１は、シルクを産生する種およびシルクプロテインの例示的なリストを提供する。
【００３５】
表１：シルクを産生する種およびシルクプロテインの例示的なリスト（Ｂｉｎｉら（２００３年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５巻（１号）：２７〜４０頁より採録）
【００３６】
Ａ．カイコ
【表１】
2019519596.tif 000003
【００３７】
Ｂ．クモ
【表２】
2019519596.tif 000004
【００３８】
一部の例では、フィブロインは、天然の供給源から単離されるか、または遺伝子操作された細胞からｉｎ  ｖｉｖｏで産生される。
【００３９】
ＳＤＰ組成物の調製
本明細書中に記載するＳＤＰ組成物は、水溶液中の天然フィブロインと比べて増進した安定性を有し得る。本明細書中で提供するＳＤＰ組成物（これは本明細書中でＳＤＰとも称される）によって達成される増進した安定性は、材料が天然／ＰＡＳＦタンパク質（本明細書中でＰＡＳＦと称される）よりも有意に長く溶液中に残存することを可能とする。本明細書中で提供するＳＤＰ材料の増進した安定性は、凝集、沈降、またはゲル化を行わずに高濃度のＳＤＰ溶液を調製することも可能とする。点眼薬などの商業用途またはタンパク質が溶液中に可溶であることを必要とする用途において、増進した安定性は、タンパク質の凝集を減少させることによって、製造物の好適に長い貯蔵寿命および品質の向上を提供することができる。溶液中で起こり得るタンパク質の凝集は、特定の用途にとって製造物の望ましい性能に負の影響を及ぼし得る。溶液中で高構成（ｈｉｇｈ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）にＳＤＰを濃縮する能力（５０％ｗ／ｖを超えてまたは＞５００ｍｇ／ｍＬ）は、そのまま使用できるまたはいくつもの用途のために希釈できる有用な標準溶液をストックするために著しく有利である。そのような用途の例は、タンパク質補助剤または添加物としての、本明細書中で提供するものなどの眼科用製剤中または創傷への適用用の局所製剤中の成分としてのＳＤＰ断片の使用である。
【００４０】
本明細書中に記載するように、天然フィブロインタンパク質の一次アミノ酸配列をＳＤＰ材料へと改造することは、分子の凝集しやすさを減少させることによって水溶液中でのその安定性を増強した。凝集は最終的にゲル形成に繋がる。天然フィブロインの改造において、セリンおよびシステインアミノ酸の両方が高熱および脱水条件の存在下で切断される。同様に、Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６４年、８６巻、１２０６頁）は、デヒドロアラニン（ＤＨＡ）中間体が溶液中のセリンおよびシステインから形成されることを実証した。ヒドリドシフトが起こって水の除去を誘発する、本明細書中に記載するような５０〜５５％ｗ／ｖ  ＬｉＢｒ溶液などの強い脱水溶媒系が存在する時に、アミノ酸分解はさらに推進される。分解反応は水酸化物イオン（例えば、ｐＨ７．５〜ｐＨ１１）の存在下で起こることができ、この水酸化物イオンはＤＨＡ中間体の切断をさらに推進する。この切断は、アミド、ピルボイルペプチド、およびＬｉＢｒを形成する。一つの実行可能な化学的機構をセリンアミノ酸の場合についてスキーム１に概要を述べるが、このスキームはシステインアミノ酸にも適用できる。さらなる加水分解切断によるＰＡＳＦタンパク質のセリンおよびシステインアミノ酸のＤＨＡ中間体への化学的変化は、ＳＤＰ製造物の増進した溶液安定性に繋がる。
【００４１】
スキーム１．  セリンおよびシステイン分解の基礎となる化学反応を詳述する図解。分解は、脱水性高塩濃度環境の存在下でのヒドリドシフト反応から形成されるＤＨＡ中間体の産生によって推進される。次いで、塩基性溶媒環境内でのＳＮ２反応を通じてＤＨＡの分解が達成される。
【００４２】
【化１】
2019519596.tif 000005
【００４３】
上記で論じたこの切断反応は、生じるペプチドの高分子特性に著しく影響することができ、それにより安定化ＳＤＰ材料の水溶液を生じる。Ｇｒｅｖｉｎｇら（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１２年、１３巻（３号）：６７６〜６８２頁）により記載されたように、フィブロインの初期タンパク質凝集は、システインアミノ酸における天然フィブロインの重鎖および軽鎖の相互作用によって掻き立てられると考えられている。フィブロインタンパク質の軽鎖および重鎖内のシステインアミノ酸は、ジスルフィド結合を通じて互いに相互作用する。これらのジスルフィド架橋は、フィブロインタンパク質の凝集およびゲルネットワークの綿状沈殿に参加する。天然フィブロイン軽鎖が存在しない場合、タンパク質は凝集しやすさが有意に低い。したがって、本明細書中に記載する製法は、システイン含有量を減少させ、したがってジスルフィド結合形成能力を減少または除去することによって、ジスルフィド結合を形成する天然フィブロイン軽鎖の能力を効果的に減少させることができる。この機構を通じて、本明細書中に記載する改造的製法は、システインに由来する凝集を形成する能力を減少または除去することによって、溶液中に生じるＳＤＰを機能的に安定化させる。
【００４４】
凝集誘発性のジスルフィド架橋に加えて、シルクフィブロインの綿状構造へのさらなる凝集の受けやすさは、Ｍａｙｅｎら（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１５年、１９７巻：１０〜１７頁）により記載されたようなタンパク質のアミノ酸化学によっても推進される。シルクフィブロインのセリン、アラニン、およびグリシンアミノ酸配列の分子モデリングにより、セリンの存在が、隣接するフィブロインタンパク質鎖部分の間に水素結合を作るより大きな傾向を通じて初期タンパク質−タンパク質相互作用を増進させることが示された。該モデルは、セリンの減少ならびにアラニンおよびグリシンの増加は、タンパク質の凝集の最初の傾向を減少させることを実証する。分子モデリングの観察により、フィブロインタンパク質の天然のアミノ酸化学を変えることによって、水溶液中でより高い安定性を有する材料が生成され得ることが示される。
【００４５】
増進した安定性に到達するための一つの戦略は、タンパク質からヒドロキシル基などの荷電官能基を取り除くことである。ヒドロキシル基の比較的高い電気陰性度に起因して、この化学は、利用可能な水素原子との水素結合および正荷電アミノ酸基との非特異的電荷相互作用の両方を推進することができる。天然フィブロインタンパク質の含有量のほぼ１２％が、ヒドロキシル官能基を有するセリンから構成される。したがって、水素結合を促進するヒドロキシル基の利用を減少させることによって、溶液中での全体的なタンパク質安定性は増進される。本明細書中に記載する製法は、セリン含有量を効果的に減少させ、かつアラニンおよびグリシンの相対的含有量を増加させることによって、水素結合を作るために利用可能なヒドロキシル基の数を取り除く。本明細書中に記載する製法は、長期間、生じるＳＤＰを溶液中で機能的に安定化させる。一部の実施形態では、溶液中のＳＤＰは、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも１．５年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、またはより長い間、安定化される。
【００４６】
システインおよびセリン部分の減少に加えて、タンパク質溶液を安定化させるために溶媒の電荷相互作用が重要である。最初のタンパク質の綿状沈殿後に、ゲル化プロセスは、天然フィブロイン重鎖の間のより緊密な結合を推進し続け、それにより重鎖の疎水性ブロックの間の分子内および分子間でのベータシート形成に繋がると考えられる。有意なベータシート形成が一旦起こると、フィブロイン溶液はゲルに遷移する。溶液がゲルに遷移するにつれ、フィブロインは不溶性となり、もはや溶液に基づく製造物として有用ではない。ゲル化を防止するために、ＳＤＰ溶液のｐＨを高アルカリ度（例えば、７．５より高いｐＨ）へと上げて安定性を増進することができる。結果として、上昇したｐＨは、溶液中のＳＤＰ分子の周りに原子価のシールドを形成する追加の遊離ヒドロキシル基を産生させる。形成された原子価のシールドはゼータ電位を生成するように作用し、このゼータ電位は、水素結合または非特異的な荷電および／もしくは疎水性相互作用に由来するタンパク質−タンパク質相互作用を減少させることによってタンパク質を安定化させる。フィブロイン転移製法は、この機構およびその他を通じて処理されたＳＤＰを溶液中で機能的に安定化させる。
【００４７】
一部の実施形態では、ＳＤＰ断片は以下の製法によって調製される：
１．蛹材料を取り除き、温水中で事前にすすぐことによって、シルク繭を調製する。
２．高い水温（通常、９５℃またはそれより高い）、アルカリ性ｐＨの水中で繭を洗浄することによって、ゴム状のセリシンタンパク質から天然フィブロインタンパク質ファイバーを抽出する。
３．抽出したフィブロインファイバーを乾燥した後、ベータシート間の水素結合を無効にする溶媒系を使用して溶解する。２０％ｗ／ｖシルクフィブロインタンパク質の５４％  ＬｉＢｒ水溶液はこの無効化ステップに効果的である。
４．ＬｉＢｒ溶液中に溶解したフィブロインタンパク質をオートクレーブ環境（約１２１℃［約２５０°Ｆ］、約１５〜１７ＰＳＩの圧力、温度で約３０分間）中で処理する。
５．次いで、熱処理したフィブロインタンパク質およびＬｉＢｒ溶液を透析して溶液からリチウムおよび臭化物イオンを除去する。製法中のこの時点で材料はＳＤＰへと化学的に転換されている。
６．次いで、透析したＳＤＰをろ過して、あらゆる非溶解の凝集物および夾雑的なバイオバーデンを除去する。
【００４８】
図１に図式的に示すように、現行のシルクフィブロイン溶液の製造のために使用される製法とは明確に異なる製法を使用してＳＤＰ溶液は製造される。顕著なことに、溶液中のＬｉＢｒと合わせながらのシルクフィブロインタンパク質のオートクレーブ処理は、化学的な遷移を開始させて、安定化されたＳＤＰ材料を製造する。フィブロインタンパク質はＬｉＢｒ溶液中に溶解され、可溶化された天然フィブロインタンパク質の水素結合および静電相互作用を無効化する。これにより、タンパク質は溶液中で特定の二次構造確認（secondary structure confirmations）を持たないままとなる。結果として、フィブロインタンパク質鎖内の共有結合を加水分解するために必要な熱力学的エネルギーは、加水分解切断を開始させるための最も低いエネルギー要求となる。
【００４９】
一実施形態では、温度は、１５〜１７ＰＳＩのオートクレーブ条件において３０分間１２１℃に設定される。しかしながら、様々な実施形態では、様々な程度にＳＤＰ材料を安定化させるために処理条件は改変される。その他の実施形態では、塩化カルシウムなどのその他のまたは追加のハロゲン化物塩、およびチオシアン酸ナトリウム、尿素、塩酸グアニジン、および１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノールなどの有機剤、硝酸カルシウムおよび１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリドなどの追加の強イオン性液体溶液添加剤、またはこれらの組合せなどの、追加のタンパク質可溶化剤が製法において使用される。
【００５０】
ＳＤＰ組成物
本明細書中で提供するＳＤＰ組成物はシルクフィブロインに由来し、増進された水溶液中での溶解性および安定性を有する。一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、上昇した圧力においてフィブロイン水溶液を加熱することを含む製法によって調製される。フィブロイン水溶液は、少なくとも８Ｍの濃度の臭化リチウムを含む。フィブロイン水溶液は、少なくとも約１０ＰＳＩの圧力下で少なくとも約２０分間少なくとも約１０５℃（２２１ｏＦ）に加熱されて、タンパク質組成物を提供する。タンパク質組成物のポリペプチドは８．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、かつタンパク質組成物は、１０％ｗ／ｗ水溶液として５ｃＰ未満の水性粘度を有する。
【００５１】
場合によっては、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、上昇した圧力においてフィブロイン水溶液を加熱することを含む製法によって調製され、ここでフィブロイン水溶液は９〜１０Ｍの濃度の臭化リチウムを含み、かつフィブロイン水溶液は、約１５ＰＳＩから約２０ＰＳＩの圧力下で少なくとも約２０分間約１１５℃（２３９ｏＦ）から約１２５℃（２５７ｏＦ）の範囲内の温度に加熱されて、タンパク質組成物を提供する。タンパク質組成物は６．５％未満のセリンアミノ酸残基を含むことができ、かつタンパク質組成物は、１５％ｗ／ｗ水溶液として１０ｃＰ未満の水性粘度を有することができる。
【００５２】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、増進した水溶液中での安定性を有することができ、ここでＳＤＰ組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン、およびアラニンの含有量を合わせた差に関して天然フィブロインとは少なくとも少なくとも４％異なり（ＳＤＰ対ＰＡＳＦ）、フィブロインタンパク質重鎖とフィブロインタンパク質軽鎖との間のシステインのジスルフィド結合が還元または除去されており、かつ組成物が天然フィブロインタンパク質と比べて２５％を超えて減少したセリン含有量を有する。ＳＤＰ組成物の平均分子量は、約１００ｋＤａ未満かつ約２５ｋＤａより大きいものであり得る。
【００５３】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、増進した水溶液での安定性を有し、ここでＳＤＰ組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン、およびアラニンの含有量を合わせた差に関して天然フィブロインとは少なくとも少なくとも６％異なり、フィブロインタンパク質重鎖とフィブロインタンパク質軽鎖との間のシステインのジスルフィド結合が還元または除去されており、かつ組成物が天然フィブロインタンパク質と比べて４０％を超えて減少したセリン含有量を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰ組成物の平均分子量は、約９６ｋＤａ未満かつ約２５ｋＤａより大きいものであり得る。
【００５４】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、増進した水溶液中での安定性を有し、ここでＳＤＰ組成物の一次アミノ酸配列が天然シルクフィブロインから改変されており、フィブロインタンパク質重鎖とフィブロインタンパク質軽鎖との間のシステインのジスルフィド結合が還元または除去されており、ＳＤＰ組成物の平均分子量が、約１００ｋＤａ未満かつ約２５ｋＤａより大きいものであり、かつＳＤＰ組成物が超音波処理の５秒後に少なくとも２時間、０．２５未満の５５０ｎｍでの光学吸光度を維持する。例えば、タンパク質組成物の５％ｗ／ｗ溶液は、本明細書中に記載する超音波処理のために使用される標準的条件である、１０Ｈｚおよび２０％の振幅での超音波処理の５秒後に０．１未満の５５０ｎｍでの光学吸光度を維持することができる。
【００５５】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、増進した水溶液中での安定性を有し、ここでＳＤＰ組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン、およびアラニンの含有量を合わせた差に関して天然フィブロインとは少なくとも少なくとも５％異なるように天然シルクフィブロインから改変されており、フィブロインタンパク質重鎖とフィブロインタンパク質軽鎖との間のシステインのジスルフィド結合が還元または除去されており、ＳＤＰ組成物の平均分子量が、約９６ｋＤａ未満かつ約２５ｋＤａより大きいものであり、かつＳＤＰ組成物が超音波処理の５秒後に少なくとも２時間、０．２未満の５５０ｎｍでの光学吸光度を維持する。
【００５６】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、例えば透析および／または濾過によって、乾燥粉末またはフィルムとして単離および／または精製されている。あるいは、一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、安定な水溶液として単離および／または精製されている。一部の実施形態では、ＳＤＰ組成物は、眼科用製剤または皮膚創傷もしくは傷跡への適用のための局所製剤などの治療的製剤として使用するために改変することができる。
【００５７】
様々な実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物中に見られるＳＤＰのアミノ酸組成は、セリン、グリシン、およびアラニンを合わせた含有量に関して、少なくとも、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも５％、または少なくとも５．５％、または少なくとも６％、天然フィブロインのアミノ酸組成とは異なり得る。
【００５８】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、天然フィブロインタンパク質のセリン含有量と比べて、２５％を超えて、３０％を超えて、３５％を超えて、４０％を超えて、または４５％を超えて減少したセリン含有量を有し得る。
【００５９】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物の平均分子量は、約１００ｋＤａ未満、約９８ｋＤａ未満、約９６ｋＤａ未満、約９５ｋＤａ未満、約９０ｋＤａ未満、約８５ｋＤａ未満、約８０ｋＤａ未満、約７５ｋＤａ未満、または約７０ｋＤａ未満である。様々な実施形態では、ＳＤＰ組成物の平均分子量は、約３０ｋＤａより大きい、約３５ｋＤａより大きい、約４０ｋＤａより大きい、約５０ｋＤａより大きい、約６０ｋＤａより大きい、または約７０ｋＤａより大きい。したがって、一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物の（質量平均の）平均分子量は、約３０ｋＤａから約１００ｋＤａ、約３０ｋＤａから約９６ｋＤａ、約３０ｋＤａから約９０ｋＤａ、約３５ｋＤａから約８０ｋＤａ、約３５ｋＤａから約７０ｋＤａ、約４０ｋＤａから約６０ｋＤａである。様々な実施形態では、ＳＤＰ組成物の平均分子量は、約６０ｋＤａから約８０ｋＤａ、約５０ｋＤａから約７０ｋＤａ、約４０ｋＤａから約６０ｋＤａ、約３０ｋＤａから約５０ｋＤａ、約３５ｋＤａから約４５ｋＤａ、または約４０ｋＤａから約４３ｋＤａである。
【００６０】
様々な実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、１０％ｗ／ｗ水溶液として４ｃＰ未満の水性粘度を有し得る。場合によっては、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、２４％ｗ／ｗ水溶液として１０ｃＰ未満の水性粘度を有し得る。
【００６１】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、目視検査によって観察可能ないかなる沈殿もなしに、４０％ｗ／ｗで水に溶解できる。
【００６２】
場合によっては、本明細書中で提供するある特定のＳＤＰ組成物は、１０％ｗ／ｗまでの濃度において、タンパク質組成物の水溶液を超音波処理した時にゲル化しない。場合によっては、本明細書中で提供するある特定のＳＤＰ組成物は、１５％ｗ／ｗまで、２０％ｗ／ｗまで、２５％ｗ／ｗまで、３０％ｗ／ｗまで、３５％ｗ／ｗまで、または４０％ｗ／ｗまでの濃度において、タンパク質組成物の水溶液を超音波処理した時にゲル化しない。
【００６３】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、８％未満のセリンアミノ酸残基を含む。場合によっては、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、７．５％未満のセリンアミノ酸残基、７％未満のセリンアミノ酸残基、６．５％未満のセリンアミノ酸残基、または６％未満のセリンアミノ酸残基を含む。
【００６４】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、タンパク質組成物の全アミノ酸含有量に対して４６．５％より多くのグリシンアミノ酸を含む。場合によっては、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、４７％より多くのグリシンアミノ酸、４７．５％より多くのグリシンアミノ酸、または４８％より多くのグリシンアミノ酸を含む。
【００６５】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、タンパク質組成物の全アミノ酸含有量に対して３０％より多くのグリシンアミノ酸を含む。場合によっては、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、３０．５％より多くのグリシンアミノ酸、３１％より多くのグリシンアミノ酸、または３１．５％より多くのグリシンアミノ酸を含む。
【００６６】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、薄いフィルムへの乾燥後に完全に再溶解できる。様々な実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、水溶液中でベータシートタンパク質構造を欠き得る。場合によっては、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、超音波処理の少なくとも５秒後に０．２５未満の５５０ｎｍでの水溶液中の光学吸光度を維持し得る。
【００６７】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、水と組み合わされている。場合によっては、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、１０％ｗ／ｗの濃度、または１５％ｗ／ｗ、２０％ｗ／ｗ、２５％ｗ／ｗ、３０％ｗ／ｗ、３５％ｗ／ｗ、もしくは４０％ｗ／ｗなどのさらに高い濃度において、水中に完全に溶解し得る。一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、例えば、透析、濾過、またはこれらの組合せによって単離および精製されている。
【００６８】
様々な実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、例えば、タンパク質組成物を含まない対応する組成物の広がりと比べて、タンパク質組成物および眼科用製剤成分を含む水溶液の広がりを増進し得る。この増進された広がりは、２倍より大きい、または３倍より大きい水溶液の表面積の増加を生じさせ得る。
【００６９】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、２０％ｗ／ｖまで、３０％ｗ／ｖまで、または４０％ｗ／ｖまでの濃度においてゲルを形成しない。場合によっては、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、少なくとも９．８ｃＰの粘度まで溶液中に残存し得る。
【００７０】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、ＳＤＰ組成物のアミノ酸の少なくとも約４７．５％を含むグリシン−アラニン−グリシン−アラニン（ＧＡＧＡ）のアミノ酸セグメントを有する。場合によってはまた、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、タンパク質組成物のアミノ酸の少なくとも約４８％、少なくとも約４８．５％、少なくとも約４９％、少なくとも約４９．５％、または少なくとも約５０％を含むＧＡＧＡアミノ酸セグメントを有する。
【００７１】
様々な実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、ＳＤＰ組成物のアミノ酸の少なくとも約５９％を含むグリシン−アラニン（ＧＡ）のアミノ酸セグメントを有する。場合によってはまた、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、タンパク質組成物のアミノ酸の少なくとも約５９．５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６０．５％、少なくとも約６１％、または少なくとも約６１．５％を含むＧＡアミノ酸セグメントを有し得る。
【００７２】
場合によっては、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、セリン、グリシン、およびアラニンの含有量を合わせた差に関して天然フィブロインとは少なくとも少なくとも６％異なる一次アミノ酸配列を有することができ、約１００ｋＤａ未満の平均分子量であり、かつ超音波処理の５秒後に少なくとも２時間、０．２５未満の５５０ｎｍでの光学吸光度を維持し得る。したがって、例えば、本明細書中で提供する特定のＳＤＰ組成物は、増進した水溶液中での安定性を有することができ、ここでＳＤＰ組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン、およびアラニンの含有量を合わせた差に関して天然フィブロインとは少なくとも少なくとも６％異なり、フィブロインタンパク質重鎖とフィブロインタンパク質軽鎖との間のシステインのジスルフィド結合が還元または除去されており、組成物が、天然フィブロインタンパク質と比べて４０％を超えて減少したセリン含有量を有し、かつＳＤＰ組成物の平均分子量が約９６ｋＤａ未満である。
【００７３】
場合によっては、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、増進した水溶液中での安定性を有することができ、ここでＳＤＰ組成物の一次アミノ酸配列が天然シルクフィブロインから改変されており、フィブロインタンパク質重鎖とフィブロインタンパク質軽鎖との間のシステインのジスルフィド結合が還元または除去されており、約１００ｋＤａ未満の平均分子量であり、かつ超音波処理の５秒後に少なくとも２時間、０．２５未満の５５０ｎｍでの光学吸光度を維持する。一つの特定の実施形態では、ＳＤＰ組成物の一次アミノ酸配列は、セリン、グリシン、およびアラニンの含有量を合わせた差に関して天然フィブロインとは少なくとも少なくとも５％異なるように天然シルクフィブロインから改変されており、ＳＤＰ組成物の平均分子量は約９６ｋＤａ未満であり、かつＳＤＰ組成物は、超音波処理の５秒後に少なくとも２時間、０．２未満の５５０ｎｍでの光学吸光度を維持する。
【００７４】
したがって、一つの特定の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、増進した水溶液中での安定性を有し、ここでＳＤＰ組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン、およびアラニンの含有量を合わせた差に関して天然フィブロインとは少なくとも少なくとも５％異なるように天然シルクフィブロインから改変されており、フィブロインタンパク質重鎖とフィブロインタンパク質軽鎖との間のシステインのジスルフィド結合が還元または除去されており、ＳＤＰ組成物の平均分子量が約９６ｋＤａ未満であり、かつＳＤＰ組成物が、超音波処理の５秒後に少なくとも２時間、０．２未満の５５０ｎｍでの光学吸光度を維持する。
【００７５】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、上昇した圧力においてフィブロイン水溶液を加熱することを含む製法によって調製され、ここでフィブロイン水溶液が、少なくとも８Ｍの濃度の臭化リチウムを含み、かつフィブロイン水溶液が、少なくとも約１０ＰＳＩの圧力下で少なくとも約２０分間少なくとも約１０５℃（２２１ｏＦ）に加熱されて、タンパク質組成物を提供し、タンパク質組成物が、８．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、かつタンパク質組成物が、１０％ｗ／ｗ水溶液として５ｃＰ未満の水性粘度を有する。したがって、ＳＤＰ組成物を調製する方法も本明細書中で提供される。本明細書中で提供するＳＤＰ組成物を調製する方法は、本明細書中に記載する処理ステップの１つまたは複数を含み得る。
【００７６】
場合によっては、本明細書中で提供する調製方法は、約８．５Ｍから約１１Ｍの間の濃度を有する臭化リチウムを使用することができる。一部の実施形態では、臭化リチウムの濃度は、約９Ｍから約１０Ｍ、または約９．５Ｍから約１０Ｍである。
【００７７】
一部の実施形態では、臭化リチウムを含有するフィブロイン水溶液は、少なくとも約１０７℃（２２５ｏＦ）、少なくとも約１１０℃（２３０ｏＦ）、少なくとも約１１３℃（２３５ｏＦ）、少なくとも約１１５℃（２３９ｏＦ）、または少なくとも約１２０℃（２４８ｏＦ）に加熱される。
【００７８】
一部の実施形態では、臭化リチウムを含有するフィブロイン水溶液は、少なくとも約１２ＰＳＩ、少なくとも約１４ＰＳＩ、少なくとも約１５ＰＳＩ、または少なくとも約１６ＰＳＩ、約１８ＰＳＩまで、または約２０ＰＳＩまでの圧力下で加熱される。
【００７９】
一部の実施形態では、臭化リチウムを含有するフィブロイン水溶液は、少なくとも約２０分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、または少なくとも約１時間、数（例えば、１２〜２４）時間まで、加熱される。
【００８０】
一部の実施形態では、タンパク質組成物は、１０％ｗ／ｗ水溶液として４ｃＰ未満の水性粘度を有する。様々な実施形態では、タンパク質組成物は、２４％ｗ／ｗ水溶液として１０ｃＰ未満の水性粘度を有する。
【００８１】
一部の実施形態では、タンパク質組成物は、観察可能な沈殿なしに４０％ｗ／ｗで水中に溶解される。
【００８２】
一部の実施形態では、フィブロインはセリシンから分離されている。
【００８３】
一部の実施形態では、臭化リチウムは、精製されたタンパク質組成物を提供するためにタンパク質組成物から除去されている。様々な実施形態では、タンパク質組成物は、例えば、透析、濾過、またはこれらの組合せによって単離および精製されている。
【００８４】
様々な実施形態では、タンパク質組成物は、１０％ｗ／ｗまで、１５％ｗ／ｗまで、２０％ｗ／ｗまで、２５％ｗ／ｗまで、３０％ｗ／ｗまで、３５％ｗ／ｗまで、または４０％ｗ／ｗまでの濃度において、組成物の水溶液を超音波処理した時にゲル化しない。
【００８５】
追加の実施形態では、タンパク質組成物は、上記した特性、ならびにセリン、グリシン、およびアラニンの含有量に関して上記したアミノ酸組成を有する。
【００８６】
様々な実施形態では、タンパク質組成物は、薄いフィルムとして乾燥後に再溶解する。タンパク質組成物は、溶液中でベータシートタンパク質構造を欠くものであり得る。タンパク質組成物は、超音波処理の少なくとも５秒後に５５０ｎｍにおいて０．２５未満の溶液中での光学吸光度を維持し得る。
【００８７】
一つの特定の実施形態では、本発明は、上昇した圧力においてフィブロイン水溶液を加熱することを含む製法によって調製されたタンパク質組成物を提供し、ここでフィブロイン水溶液が、９〜１０Ｍの濃度の臭化リチウムを含み、かつフィブロイン水溶液が、約１５ＰＳＩから約２０ＰＳＩの圧力下で少なくとも約３０分間、約１１５℃（２３９ｏＦ）から約１２５℃（２５７ｏＦ）の範囲内の温度に加熱されて、タンパク質組成物を提供し、タンパク質組成物が、６．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、かつタンパク質組成物が、１５％ｗ／ｗ水溶液として１０ｃＰ未満の水性粘度を有する。
【００８８】
一部の実施形態では、天然シルクフィブロインタンパク質とは化学的に異なるＳＤＰ組成物が提供される。ＳＤＰは、増進した水溶液中での安定性を有する。一部の実施形態では、ＳＤＰは、例えば、本明細書中に記載するタンパク質組成物、例えばタンパク質組成物水溶液を有する眼科用成分を形成するための方法において使用され得る。溶液は、約０．０１％から約９２％ｗ／ｖのＳＤＰを含み得る。一部の実施形態では、溶液は、約８％から約９９．９％ｗ／ｖの水である。
【００８９】
一部の実施形態では、タンパク質の平均分子量が、先行技術の方法を使用して製造されるシルクフィブロインについての約１００〜２００ｋＤａから、本明細書中に記載するＳＤＰ材料についての約３０〜９０ｋＤａまたは約３０〜５０ｋＤａへと減少するように、フィブロインタンパク質の加水分解、アミノ酸分解、またはこれらの組合せを誘発する方法が提供される。一部の実施形態では、生じるポリペプチドは、本明細書中に記載する範囲を平均とする様々な分子量のペプチドのランダムな組合せである。加えて、一部の実施形態では、アミノ酸化学は、標準的なアッセイ法によって検出不可能なレベルへとシステイン含有量を減少させることによって変化される。例えば、一部の実施形態では、セリン含有量は、天然フィブロインで見られるレベルから５０％を超えて減少しており、これは、標準的なアッセイ法による決定で、アラニンおよびグリシンの全含有量の５％（相対的なアミノ酸含有量）の増加を生じさせ得る。方法は、標準的なドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の電気泳動法を使用して試料を流した時にも、フィブロイン軽鎖タンパク質を処理後に識別できないタンパク質組成物を提供し得る。さらには、生じるＳＤＰ材料は、処理後に最小限のベータシートタンパク質二次構造を形成するか、またはそれを全く形成しない一方、先行技術の方法を使用して製造されたシルクフィブロイン溶液は、有意な量のベータシート二次構造を形成する。一実施形態では、ＳＤＰ材料は、４０〜６０％ｗ／ｖの臭化リチウム（ＬｉＢｒ）溶液の存在下、オートクレーブ条件またはオートクレーブ様条件（すなわち、約１２０℃および１４〜１８ＰＳＩ）の下でシルクフィブロインファイバーを処理することによって調製される。
【００９０】
一部の実施形態では、ヒトまたは哺乳動物におけるドライアイ症候群の治療用の眼科用組成物が提供される。一部の実施形態では、本明細書中で提供する組成物は、ドライアイ症候群の治療に効果的な量のＳＤＰを含む水溶液である。例えば、水溶液は、約０．０１質量％から約８０質量％のＳＤＰを含み得る。その他の実施形態では、水溶液は、約０．１質量％から約１０質量％、または約０．５質量％から約２質量％のＳＤＰを含む。ある特定の具体的な実施形態では、眼科用組成物は、約０．０５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．１％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．２％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．２５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．７５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約１％ｗ／ｖのＳＤＰ、約１．５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約２％ｗ／ｖのＳＤＰ、約２．５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約８％ｗ／ｖのＳＤＰ、または約１０％ｗ／ｖのＳＤＰを含む。
【００９１】
様々な実施形態では、眼科用製剤は、水溶液中に粘滑剤、緩衝剤、および／または安定化剤などの追加の成分を含む。一部の実施形態では、粘滑剤は、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストラン、ゼラチン、ポリオール、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール（ＰＧ）、ヒプロメロース、グリセリン、ポリソルベート８０、ポリビニルアルコール、またはポビドンである。一部の実施形態では、粘滑剤は、例えば、約０．０１質量％から約１０質量％、または約０．２質量％から約２質量％で存在する。一つの特定の実施形態では、粘滑剤はＨＡである。様々な実施形態では、ＨＡは、製剤の約０．２質量％で存在する。
【００９２】
一部の実施形態では、眼科用製剤の緩衝剤または安定化剤は、リン酸緩衝生理食塩水、ホウ酸緩衝生理食塩水、クエン酸緩衝生理食塩水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化亜鉛、塩酸、水酸化ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、またはこれらの組合せである。
【００９３】
眼科用製剤は、有効量の抗菌性防腐剤をさらに含み得る。一部の実施形態では、抗菌性防腐剤は、例えば、過ホウ酸ナトリウム、ポリクオタリウム−１（polyquaterium-1）（例えば、ポリクワッド（登録商標）防腐剤）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、亜塩素酸ナトリウム、ブリモニジン、ブリモニジンプリテ（brimonidine purite）、ポレキシトニウム（polexitonium）、またはこれらの組合せである。
【００９４】
眼科用製剤は、有効量の血管収縮剤、抗ヒスタミン剤、またはこれらの組合せも含み得る。一部の実施形態では、血管収縮剤または抗ヒスタミン剤は、塩酸ナファゾリン、塩酸エフェドリン、塩酸フェニレフリン、塩酸テトラヒドロゾリン、マレイン酸フェニラミン、またはこれらの組合せである。
【００９５】
一実施形態では、眼科用製剤は、水および１つまたは複数の眼科用成分と組み合わせて、本明細書中に記載するような有効量のＳＤＰ断片を含む。一部の実施形態では、眼科用成分は、例えば、ａ）ポリビニルアルコール；ｂ）ＰＥＧ−４００およびヒアルロン酸；ｃ）ＰＥＧ−４００およびプロピレングリコール、ｄ）ＣＭＣおよびグリセリン；ｅ）プロピレングリコールおよびグリセリン；ｆ）グリセリン、ヒプロメロース、およびＰＥＧ−４００；または上記成分の任意の１つまたは複数の組合せである。一部の実施形態では、眼科用製剤は、ＨＰ−グアー（HP-guar）、ホウ酸塩、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化亜鉛などの１つまたは複数の不活性成分を含む。一部の実施形態では、眼科用製剤は、亜塩素酸ナトリウム（Ｐｕｒｉｔｅ（登録商標）防腐剤（ＮａＣｌＯ２）、ポリクワッド、ＢＡＫ、ＥＤＴＡ、ソルビン酸、ベンジルアルコールなどの１つまたは複数の眼科用防腐剤を含む。一部の実施形態では、眼科用成分、不活性成分、および防腐剤は、約０．２５％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、２％、２．５％、もしくは５％など、または上述の値の任意の２つの間の範囲など、約０．１％〜約５％ｗ／ｖにおいて含まれる。
【００９６】
したがって、増進した水溶液中での安定性を有し、天然フィブロインの一次アミノ酸配列が天然シルクフィブロインから改変されており、フィブロインタンパク質重鎖とフィブロインタンパク質軽鎖との間のシステインのジスルフィド結合が還元または除去されており、天然フィブロインタンパク質と比べて４０％を超えて減少したセリン含有量を有し、かつシルク由来タンパク質の平均分子量が約９６ｋＤａ未満である、ＳＤＰ組成物が本明細書中で提供される。
【００９７】
水および上述したような有効量のＳＤＰを含む、ヒトまたは哺乳動物における眼障害の治療用の眼科用製剤が本明細書中で提供される。水、１つまたは複数の緩衝剤および安定化剤、ならびに上述したような有効量のＳＤＰを含む、ヒトまたは哺乳動物における目の治療として使用するための眼科用組成物が本明細書中で提供される。
【００９８】
ＳＤＰは水中での安定性が高く、貯蔵寿命の溶液安定性は、溶液中の天然シルクフィブロインの２倍より高い。例えば、ＳＤＰは水中での安定性が高く、貯蔵寿命の溶液安定性は、溶液中の天然シルクフィブロインと比べて１０倍より高い。水溶液中にある時にＳＤＰ材料は、５％（５０ｍｇ／ｍＬ）濃度において溶液の超音波処理の際にゲル化しない。その他の実施形態では、水溶液中にある時にＳＤＰ材料は、１０％（１００ｍｇ／ｍＬ）濃度において溶液の超音波処理の際にゲル化しない。
【００９９】
ＳＤＰ材料は、天然シルクフィブロインタンパク質と比べた時に５０％を超えて減少したフィブロイン軽鎖を有し得る。ＳＤＰ材料は、約８％未満の相対的なアミノ酸含有量のセリンアミノ酸含有量、または約６％未満の相対的なアミノ酸含有量のセリンアミノ酸含有量を有し得る。
【０１００】
ＳＤＰ材料は、約４６．５％を上回るグリシンアミノ酸含有量を有し得る。ＳＤＰ材料は、約３０％を上回るまたは約３０．５％を上回るアラニンアミノ酸含有量を有し得る。ＳＤＰ材料は、例えばタンパク質組成物の加水分解されたポリペプチドのＨＰＬＣ分析による決定で、検出可能なシステインアミノ酸含有量を有しないものであり得る。
【０１０１】
ＳＤＰ材料は、例えば下記実施例８に記載するＦＴＩＲ分析による決定で、天然シルクフィブロインタンパク質と比べて、９０％少ない、９５％少ない、または９８％少ないベータシートタンパク質二次構造を形成し得る。
【０１０２】
上述したような有効量のＳＤＰ材料、および緩衝剤または安定化剤を含む水溶液を含む、ヒトまたは哺乳動物における眼治療として使用するための眼科用組成物が本明細書中で提供される。
【０１０３】
本明細書中に記載するような増進した安定性を有する有効量のＳＤＰ材料を含む水溶液を含む、ヒトまたは哺乳動物における眼障害の治療用の眼科用製剤が本明細書中で提供される。
【０１０４】
眼科用成分をＳＤＰ組成物と合わせることを含む、シルクプロテインを用いて例えば眼科用組成物を形成するための方法が本明細書中で提供される。
【０１０５】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、皮膚創傷または傷跡の局所治療用に製剤化されている。本明細書中に開示する局所医薬製剤は、任意の好適な方法で製剤化される。任意の好適な技術、担体、および／または医薬品添加物が、本明細書中に開示するＳＤＰ断片と共に使用するために想定される。
【０１０６】
一部の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物は、水溶液、懸濁液、分散液、膏薬、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、噴霧剤、またはペーストとして製剤化されている。一部の実施形態では、ＳＤＰ組成物は、以下に限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水、フィルム、ファイバー、泡、ヒドロゲル、マトリックス、三次元スキャフォールド、ミクロ粒子、ナノ粒子、ポリマー、またはマットなどの薬学的担体を含む。一部の実施形態では、タンパク質断片は、角膜移植片、創傷ドレッシング、コンタクトレンズ、組織、組織移植片、または分解性材料などの基体に取り付けられている。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、創傷ドレッシングと共に（またはそれを介して）投与される、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物の局所製剤が本明細書中に開示される。創傷ドレッシングとしては、以下に限定されないが、ガーゼ、透明フィルムドレッシング、ヒドロゲル、ポリウレタンフォームドレッシング、ヒドロコロイド、およびアルギネートが挙げられる。ある特定の例では、創傷ドレッシングは創傷治癒を促進する。一部の例では、創傷ドレッシングは、創傷治癒の異常を低減または阻害する。
【０１０８】
ある特定の例では、皮膚病変の治療において、多くの場合、病変にドレッシングを接触させることは損傷組織をかき乱し得る。皮膚の多くの区画を伴う熱傷表面病変などの創傷にとって、多くのドレッシングの除去は大きな痛みを引き起こすことがあり、多くの場合、部分的に治癒した創傷の少なくとも一部分を再び開き得る。一部の例では、本明細書中に記載する局所製剤は、罹患区画へと液体として適用され、液体は罹患区画においてフィルムとしてゲル化する。一部の例では、フィルムは水溶性フィルムであり、水または穏やかな水性洗浄剤を用いて除去することができ、創傷ドレッシングの除去に付随する痛みおよび不快感を回避する。ある特定の例では、本明細書中に記載する局所製剤は、ポリアルキルオキサゾリンで作られた軟質フィルムを含む皮膚フィルムである。一部の例では、フィルムは、ポリアルキルオキサゾリンで作られた構造層、およびフィルムを所定の場所に保持する感圧性接着層を有する。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、パッチを介して投与される、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物の局所製剤が本明細書中に開示される。一部の実施形態では、本明細書中に開示する局所ＳＤＰ製剤は、ポリマー中または接着剤中に溶解および／または分散されている。一部の実施形態では、本明細書中に開示するフィルム、パッチは、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物の連続的な、律動的な、またはオンデマンドの送達のために構築されている。
【０１１０】
一部の例では、本明細書中に記載する局所製剤は感圧接着剤（例えば、ポリアルキルオキサゾリンポリマー）を含み、皮膚の罹患区画への接着フィルムの適用を可能とする。
【０１１１】
一部の実施形態では、本明細書中に開示する製剤および組成物は、皮膚ペイントとして投与される。本明細書中で使用する場合、ペイント（フィルムフォーマーとしても公知である）は、溶媒、モノマーまたはポリマー、活性剤、および任意選択の１つまたは複数の薬学的に許容される医薬品添加物から構成される溶液である。組織への適用後に溶媒は蒸発して、モノマーまたはポリマー、および活性剤から構成される薄いコーティングを残す。コーティングは活性剤を保護し、それを適用部位に固定化された状態で維持する。これは、失われ得る活性剤の量を減少させ、これに対応して個体の皮膚の罹患区画へと送達される量を増加させる。非限定的な例として、ペイントは、コロジオン（例えば、柔軟性コロジオン（Flexible Collodion）、ＵＳＰ）、ならびにサッカリドシロキサンコポリマーおよび架橋剤を含む溶液を含む。コロジオンは、ピロキシリン（ニトロセルロース）を含有するエチルエーテル／エタノール溶液である。適用後にエチルエーテル／エタノール溶液は蒸発してピロキシリンの薄いフィルムを残す。サッカリドシロキサンコポリマーを含む溶液中で、溶媒の蒸発がサッカリドシロキサンコポリマーの架橋を開始させた後に、サッカリドシロキサンコポリマーはコーティングを形成する。
【０１１２】
ある特定の例では、製剤は、水中油Ｗエマルションまたは油中水エマルション中に分散した本明細書中で提供するＳＤＰ組成物を含む半固体（例えば、軟固体または濃厚液）製剤である。ある特定の例では、組成物は流体エマルション（例えば、水中油エマルションまたは油中水エマルション）である。一部の実施形態では、ローションおよび／またはクリームの疎水性成分は、動物（例えば、ラノリン、タラ肝油、およびアンバーグリス）、植物（例えば、サフラワー油、ヒマシ油、ココナッツ油、綿実油、メンヘーデン油、パーム核油、パーム油、ピーナッツ油、大豆油、菜種油、亜麻仁油、米ぬか油、パイン油、ゴマ油、またはひまわり種子油）、または石油（例えば、鉱油、または石油ゼリー）に由来する。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、本明細書中に記載する局所製剤は、任意選択で、制御放出粒子、脂質複合体、リポソーム、ナノ粒子、ミクロスフェア、ミクロ粒子、ナノカプセル、または皮膚への局所送達を増進もしくは促進するその他の剤の中に組み込まれた、ＳＤＰ組成物を含む。薬品のための従来のマイクロカプセル化法の例は、米国特許第３，７３７，３３７号に示されており、該文献は参照することによりそのような開示について本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
一部の例では、本明細書中に記載する局所製剤はリポソーム製剤である。リポソームは、水性緩衝液をリン脂質と有機溶媒との混合物中に導入することによって調製され、有機溶媒はその後、減圧下での蒸発により除去される。リポソーム製剤の例はＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９７８年、７５巻、４１９４〜９８頁に記載されており、該文献は参照することによりそのような開示について本明細書に組み込まれる。リポソームは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって粒径にしたがって分別される。リポソームのサブフラクションは、光子相関分光法（ＰＣＳ）によって粒径に関してさらに分別される。リポソームの脂質含有量を分析するために酵素アッセイ（例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）アッセイ）が使用される。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、担体を含む、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物の局所製剤が本明細書中に開示される。好適な担体としては、水、ヒアルロナン、コラーゲン、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレン−グリコール、グリセロール、クレモフォールなど）、植物油（オリーブ油など）、注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、脂肪油（例えば、ゴマ油）、および合成の脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が挙げられる。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、透過促進剤を含む、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物の局所製剤が本明細書中に開示される。透過促進剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル、ラウレス−９、ドデシル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＬＥ）、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ノニルフェノキシポリエチレン（ＮＰ−ＰＯＥ）、ポリソルベート、グリココール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロジヒドロフシド酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、オレイン酸、カプリル酸、モノおよびジグリセリド、ラウリン酸、アシルコリン、カプリル酸、アシルカルニチン、カプリン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、クエン酸、サリチル酸塩、ＤＭＳＯ、デシルメチルスルホキシド、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、プロパンジオール、およびジエチレングリコールモノエチルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書中に記載する局所製剤は、全身曝露が最小となるように設計されており、例えば少量の透過促進剤を含む。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、ゲル化剤（または増粘剤）を含む、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物の局所製剤が本明細書中に開示される。一部の実施形態では、本明細書中に開示する局所製剤は、約０．１％から約５％、約０．１％から約３％、または約０．２５％から約２％のゲル化剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、本明細書中に開示する局所製剤の粘度は、約１００から約５００，０００ｃＰ、約１００ｃＰから約１，０００ｃＰ、約５００ｃＰから約１５００ｃＰ、約１０００ｃＰから約３０００ｃＰ、約２０００ｃＰから約８，０００ｃＰ、約４，０００ｃＰから約１０，０００ｃＰ、約１０，０００ｃＰから約５０，０００ｃＰの範囲内である。ゲル局所製剤の調製に使用するための好適なゲル化剤としては、セルロース、セルロース誘導体、セルロースエーテル（例えば、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロシキメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロシキプロピルセルロース、メチルセルロース）、グアーガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、アルギネート（例えば、アルギン酸）、ケイ酸塩、デンプン、トラガカント、カルボキシビニルポリマー、カラギーナン、パラフィン、ワセリン、アカシア（アラビアゴム）、寒天、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、アルギン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ヒバマタ、ベントナイト、カルボマー、カラギーナン、カーボポール、キサンタン、セルロース、微結晶性セルロース（ＭＣＣ）、セラトニア、コンドラス、デキストロース、ファーセレラン、ゼラチン、ガッチゴム、グアーガム、ヘクトライト、ラクトース、スクロース、マルトデキストリン、マンニトール、ソルビトール、蜂蜜、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、カラヤゴム、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ２００〜４５００）、トラガカントゴム、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、エチルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、オキシポリゼラチン、ペクチン、ポリゲリン、ポビドン、炭酸プロピレン、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）、ポリ（メトキシエチルメタクリレート）、ポリ（メトキシエトキシエチルメタクリレート）、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、二酸化ケイ素、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ポビドン）、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
ゲルは、単相系または二相系を含む。単相ゲルは、分布した高分子と液体との間に見掛けの境界線が存在しないように液体全体に均一に分布した有機高分子からなる。一部の単相ゲルは、合成高分子（例えば、カルボマー）または天然ゴム（例えば、トラガカント）から調製される。一部の実施形態では、単相ゲルは、一般に水性であるが、アルコールおよび油を使用しても作られる。二相ゲルは、離散した小粒子のネットワークからなる。
【０１１９】
ゲルはまた、疎水性または親水性として分類することができる。ある特定の実施形態では、疎水性ゲルの基材は、コロイダルシリカ、またはアルミニウム石鹸もしくは亜鉛石鹸を用いてゲル化したポリエチレンまたは脂肪油と共に液体パラフィンからなる。対照的に、疎水性ゲルの基材は、通常、好適なゲル化剤（例えば、トラガカント、デンプン、セルロース誘導体、カルボキシビニルポリマー、およびケイ酸マグネシウムアルミニウム）を用いてゲル化した水、グリセロール、またはプロピレングリコールからなる。
【０１２０】
皮膚への適用によりフィルムとなる液体およびゲルとして適用される製剤において使用するために好適な剤としては、水溶液中に組み込まれた時に熱可逆性ゲルを形成することが公知であるポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンから構成されるポリマーが挙げられるが、これに限定されない。これらのポリマーは、体温に近い温度で液体状態からゲル状態へと変化する能力を有し、したがって、罹患区画へとゲルおよび／またはフィルムとして適用される有用な製剤が可能となる。体温においてゲル化し、本明細書中に記載するゲルおよび／またはフィルムにおいて使用されるポリマーの例としては、ポロキサマー（例えば、酸化エチレンおよび酸化プロピレンのブロックコポリマーである、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ  Ｆ６８（登録商標）、Ｆ８８（登録商標）、Ｆ１０８（登録商標）、およびＦ１２７（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。液体状態からゲル状態への相転移は、溶液中のポリマー濃度および成分に依存する。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、皮膚軟化剤を含む、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物の局所製剤が本明細書中に開示される。皮膚軟化剤としては、ヒマシ油エステル、ココアバターエステル、サフラワー油エステル、綿実油エステル、コーン油エステル、オリーブ油エステル、タラ肝油エステル、アーモンド油エステル、アボカド油エステル、パーム油エステル、ゴマ油エステル、スクアレンエステル、キクイ油エステル（kikui oil esters）、大豆油エステル、アセチル化モノグリセリド、エトキシル化モノステアリン酸グリセリル、ラウリン酸ヘキシル、ラウリン酸イソヘキシル、パルミチン酸イソヘキシル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸メチル、デシルオレイン酸塩、オレイン酸イソデシル、ステアリン酸ヘキサデシル  ステアリン酸デシル、イソステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸メチル、アジピン酸ジイソプロピル、アジピン酸ジイソヘキシル、アジピン酸ジヘキシルデシル、セバシン酸ジイソプロピル、乳酸ラウリル、乳酸ミリストイル、および乳酸セチル、オレイルミリステート、ステアリン酸オレイル、およびオレイン酸オレイル、ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、ヒドロキシステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リシノール酸、アラキドン酸、ベヘン酸、エルカ酸、ラウリルアルコール、ミリストイルアルコール、セチルアルコール、ヘキサデシルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ヒドロシキステアリルアルコール、オレイルアルコール、リシノレイルアルコール、ベヘニルアルコール、エルシルアルコール、２−オクチルドデカニルアルコール、ラノリンおよびラノリン誘導体、蜜蝋、鯨蝋、ミリスチン酸ミリストイル、ステアリン酸ステアリル、カルナバ蝋、キャンデリラ蝋、レシチン、およびコレステロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、本明細書中で提供するＳＤＰ組成物を含む局所製剤は、例として、擦傷剤、吸収剤、固化防止剤、収斂剤、精油、フレグランス、皮膚コンディショニング剤、皮膚治癒剤、皮膚保護剤（例えば、日焼け止め、または紫外線吸収剤または散乱剤）、皮膚緩和剤、またはこれらの組合せなどの、追加の医薬品添加物を含む。
【０１２３】
以下の実施例は、上記発明を実例を挙げて説明することを意図するものであり、その範囲を狭めるものと解するべきではない。実施例は本発明が実施され得る多くのその他の方法を示唆することを当業者は容易に認識するであろう。本発明の範囲内に留まりながら多数の変形および改良が為され得ることが理解されるべきである。
【実施例】
【０１２４】
実施例１：ＳＤＰの調製およびローレンス安定性試験
材料．  カイコ繭はタジマ商事株式会社（日本）より入手した。臭化リチウム（ＬｉＢｒ）はＦＭＣ  Ｌｉｔｈｉｕｍ，Ｉｎｃ．（ＮＣ）より入手した。オートクレーブはＴｕｔｔｎａｕｅｒ  Ｌｔｄ．（ＮＹ）より入手した。３，５００Ｄａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）の透析膜はＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（ＭＡ）より入手した。Ｏａｋｔｏｎ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（Ｂｒ−）ダブルジャンクションイオン選択性電極はＩＳＥ，Ｏａｋｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＩＬ）より入手した。
【０１２５】
処理．  ＳＤＰおよびＰＡＳＦの２つの試料を図１に示すように調製した。簡潔に述べれば、蛹なしのカットしたカイコ繭（３〜５カット／繭）を、０．３質量％のＮａＣＯ３を含有する９５℃に熱した脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）中に１グラムの繭あたり２３３ｍＬの水で沈めることによってＳＤＰを製造した。繭をこの溶液中で７５分間攪拌してセリシンを溶解させることにより、それをシルクファイバーから分離させた。その後に繭を同様の希釈のｄｉＨ２Ｏ中で４回、各すすぎあたり２０分間洗浄して、洗浄したシルクファイバーから残留セリシンを除去した。次いで、ファイバーを６０℃の対流オーブン中で２時間乾燥させ、重さを量り、抽出したファイバー１グラムあたり４×ＬｉＢｒの体積比で水中の５４質量％  ＬｉＢｒ中に溶解させた。この溶液に蓋をした後、６０℃の対流オーブン中で２時間温めて、抽出したファイバーの溶解を促進した。次いで、溶液をオートクレーブ中に置き、滅菌条件（１２１℃、１７ＰＳＩ、９０〜１００％の湿度）に３０分間曝露してフィブロインの転移を促進した。生じた溶液を室温まで冷却させた後、ｄｉＨ２Ｏを用いて５％フィブロインまで希釈し、３，５００ＤａのＭＷＣＯ膜を使用して透析してＬｉＢｒ塩を除去した。Ｏａｋｔｏｎ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（Ｂｒ−）ダブルジャンクションイオン選択性電極上で読み取った加水分解されたフィブロイン溶液中での決定でＢｒ−イオンが１ｐｐｍ未満になるまで、ｄｉＨ２Ｏ中で複数回の交換を行った。次いで、１〜５μｍの気孔率フィルター、続いて０．２μｍポリッシングフィルターを通す濾過を使用して溶液をさらに濾過した。この生成物を図２において「ＳＤＰ溶液」と称している。
【０１２６】
「対照」シルクフィブロイン溶液を図１に示すように調製して、図２に示す「ＰＡＳＦ溶液」を得た。オートクレーブステップを除いて、上記と同じ処理を行った。各試料からのサンプリング容量（５ｍＬ）を別個の２０ｍＬガラスビーカーに入れ、ホイルでビーカーに封をした。次いで試料をローレンス安定性試験に供した。
【０１２７】
オートクレーブチャンバー内にタンパク質試験水溶液（５％ｗ／ｖ、５０ｍｇ／ｍＬ）を置くことによってローレンス安定性試験を行った。次いで、１２１℃、１７ＰＳＩ、３０分間、９７〜１００％の湿度のサイクルでオートクレーブを作動させる。サイクルの完了後、溶液を冷却させた後、オートクレーブチャンバーから取り除く。次いで、溶液を揺すって、溶液のゲル化挙動を観察する。約１０秒間の揺す振りの際に溶液がゲル化していたら、試料はローレンス安定性試験に不合格である。試験の不合格は、材料がタンパク質溶液として本来的に不安定であることを示す。
【０１２８】
ＳＤＰ溶液およびＰＡＳＦ溶液の両方に対してローレンス安定性試験を行った。ＰＡＳＦ溶液試料は直ちにゲル化し、したがってローレンス安定性試験に不合格であった。反対に、ＳＤＰ溶液試料は無期限に溶液のままであり、したがってローレンス安定性試験に合格した。ゲル化しないことは、ＳＤＰ溶液の製造が上記した図１に示すオートクレーブ処理ステップを組み込んでいたという事実に起因し得る。異なる試験結果の画像（非ゲル化対ゲル化）を図２に示す。
【０１２９】
実施例２：ＳＤＰの分子量の特性解析
可溶化したタンパク質の分子量分布に対する処理の効果を評価するために、タンパク質を分子量によって分離するポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にＳＤＰ溶液およびＰＡＳＦ溶液を供した。具体的には、１５μｇの各試料をドデシル硫酸ナトリウムおよびジチオトレイトール（Ｂｉｏｒａｄ  Ｉｎｃ．、ＣＡ）を含有するランニングバッファーと混合して、任意の二次フォールディング構造およびジスルフィド結合をそれぞれ取り除いた。次いで混合物を７０℃に５分間加熱した。Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝塩を含有するプレキャストした４〜１２％ポリアクリルアミドグラジエントゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）に混合物を２．５〜２００ｋＤａの分子量ラダー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）と共にロードした後、ＢｉｏＲａｄ  ＰｏｗｅｒＰａｃ  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｕｐｐｌｙ（ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．、ＣＡ）上の１２０Ｖ電場に９０分間曝露した。次いでゲルを取り除き、クマシーブルー色素中に１２時間置いてタンパク質を染色した後、ｄｉＨ２Ｏ中で６時間洗浄した。次いで、ゲルをＢｉｏｒａｄ  ＧＳ−８００  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｄｅｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．、ＣＡ）でスキャンした。
【０１３０】
生じたゲルを図３に示す。ＳＤＰ溶液を調製するために用いた処理が平均分子量を１５０〜２００ｋＤａから８０ｋＤａ未満へと大きくシフトさせたことを結果は示している（図３）。分子量のシフトは、元々の天然フィブロインの一次構造および／または二次構造の転移を明確に示す。加えて、フィブロインのフィブロイン軽鎖は、オートクレーブ処理後のＳＤＰ中に存在せず（先行技術のフィブロインのレーン２の２３〜２６ｋＤａに見える）、タンパク質のフィブロイン軽鎖部分が処理によって分解または除去されたことを示している。これらの結果は、オートクレーブ処理が天然フィブロインタンパク質を天然フィブロインタンパク質より小さいペプチド断片を有する新たな材料に転移させたことを実証している。処理はさらに、フィブロイン軽鎖を分解／改変する。これらの転移は、これらの化学的変化の結果として増進した溶液安定性を有するＳＤＰ材料を生じさせる。
【０１３１】
実施例３：ＳＤＰの安定性研究
先行技術のフィブロインの安定性と比べて、生じるＳＤＰの安定性に対するオートクレーブ処理の機能的影響力をさらに決定するために、シルクフィブロインタンパク質のゲル化のよく特徴付けられたモデルを模倣するためにＷａｎｇら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８年、２９巻（８号）：１０５４〜１０６４頁）の方法を使用して試料を分析した。両方の試料（０．５ｍＬ、ＳＤＰおよびＰＡＳＦ）を１．７ｍＬの透明な遠心チューブに加え、超音波処理（２０％の振幅、１０Ｈｚ、１５秒）に供した。次いで、溶液を含有する透明チューブをゲル化のスクリーニングとしてゲル形成について視覚的にモニタリングした。
【０１３２】
図４Ａに示すように、ＳＤＰ溶液試料はゲルを形成しなかった。超音波処理の３ヶ月後でさえ、ＳＤＰ試料は溶液のままであり、目視検査による判定でタンパク質の凝集がなかった。ＰＡＳＦ溶液試料は超音波処理後に迅速に（２時間以内）ゲル化した。生じたゲル化ＰＡＳＦを図４Ｂに示す。これらの結果は、オートクレーブ処理が先行技術のフィブロインを新たな材料に転移させ、生じたＳＤＰ材料に安定性を誘発することをさらに示す。
【０１３３】
実施例４：創傷の治療
重篤な外傷性の角膜損傷により、天然に存在する創傷治癒プロセスでは正常な角膜上皮を回復するのに不十分となり、永久的な視覚障害を生じることがある。ＳＤＰは角膜の創傷治癒を有意に増進することが示されているが、ＳＤＰの有益な効果の機構的基礎を理解し、創傷治癒特性に関与するタンパク質の化学的および分子的特質を特徴付けるための研究はほとんど為されていない。本明細書において記載したように、高分子量および低分子量のＳＤＰ断片を上記のＳＤＰ組成物から単離し、創傷治癒プロセスに関与する可能性がある角膜上皮細胞の挙動を調節するＳＤＰの能力に対するタンパク質断片サイズの影響の評価および特徴解析を行った。
【０１３４】
細胞培養物に加えた時に、低分子量ＳＤＰ断片は細胞の遊走、増殖を有意に増加させ、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏでの擦過傷閉鎖速度を早めることが分かった。一部の実施形態では、低分子量のＳＤＰ断片は、約１００ｋＤａ未満、約９０ｋＤａ未満、約８０ｋＤａ未満、約７０ｋＤａ未満、約６０ｋＤａ未満、約５０ｋＤａ未満、約４０ｋＤａ未満、約３０ｋＤａ未満、約２０ｋＤａ未満、または約１０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、再生されたＳＤＰ組成物から単離されたタンパク質断片組成物は、約３０ｋＤａから６０ｋＤａの間の平均分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは約１００ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは約１００ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは約８０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは約８０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは約６０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは約６０ｋＤａ未満の分子量を有し、組織中の細胞の遊走および増殖を促進して創傷を閉鎖する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは約５０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは約５０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは約３０ｋＤａから６０ｋＤａの間の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは約３０ｋＤａから６０ｋＤａの間の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは約３０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは約３０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは約１０ｋＤａから３０ｋＤａの間の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは約１０ｋＤａから３０ｋＤａの間の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも７５パーセントは約１０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも９０パーセントは約１０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも５０パーセントは約６０ｋＤａより大きい分子量を有する。
【０１３５】
対照的に、高分子量シルクは細胞の増殖および生存能力に対していかなる効果も有しなかったが、細胞遊走および創傷閉鎖を有意に減少させ、かつ細胞と基体との接着もしくはその基底膜への細胞接着または基底膜形成を有意に増加させることが分かった。一部の実施形態では、高分子量のＳＤＰ断片は、約３０ｋＤａより大きい、約４０ｋＤａより大きい、約５０ｋＤａより大きい、６０ｋＤａ、約７０ｋＤａより大きい、約８０ｋＤａより大きい、約９０ｋＤａより大きい、または約１００ｋＤａより大きい分子量を有する。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物中のＳＤＰ断片の少なくとも５０パーセントは、約６０ｋＤａより大きい分子量を有する。
【０１３６】
低分子量ＳＤＰ断片は、創傷が治癒または閉鎖する速度に影響する。高分子量ＳＤＰ断片は、創傷がどのように治癒または閉鎖するのか（例えば、創傷プロファイル）に影響するようである。一部の実施形態では、低分子量ＳＤＰ断片および高分子量ＳＤＰ断片の両方を含有するタンパク質断片組成物が、創傷を治療するために使用される。一部の実施形態では、タンパク質断片組成物は、約６０ｋＤａ未満の分子量を有する約５０％のＳＤＰ断片および約６０ｋＤａより大きい分子量を有する約５０％のＳＤＰ断片を含有する。
【０１３７】
一部の状況では、創傷を正確に治癒するよりも創傷を迅速に治癒することが望まれ、これは例えば、手術後（例えば、屈折矯正手術後）に痛みを減少させることを望む健常人、損傷した軍人、感染症が流行している区画内の人などである。一部の実施形態では、これらの状況において、タンパク質断片組成物は、高分子量ＳＤＰ断片を含有するよりも多くの低分子量ＳＤＰ断片を含有する。例えば、一部の実施形態では、タンパク質断片組成物は、６０ｋＤａ未満の分子量を有する約７５％のＳＤＰ断片および６０ｋＤａより多くの分子量を有する約２５％のＳＤＰ断片を含有する。
【０１３８】
一部の実施形態では、創傷の種類もまた、創傷を治療するために高分子量ＳＤＰ断片を使用するのか、それとも低分子量ＳＤＰ断片を使用するのかを規定する。低分子量ＳＤＰ断片は抗炎症特性を有し、低分子量ＳＤＰ断片を用いて化膿する創傷を治療することができる。一部の創傷は、基底膜への細胞接着または基底膜形成への集中を必要とする。そのような創傷の一部の例としては、皮膚熱傷および糖尿病性潰瘍が挙げられる。これらの状況において、一部の実施形態では、タンパク質断片組成物は、低分子量ＳＤＰ断片を含有するよりも多くの高分子量ＳＤＰ断片を含有する。例えば、一部の実施形態では、タンパク質断片組成物は、６０ｋＤａより大きい分子量を有する約７５％のＳＤＰ断片および６０ｋＤａ未満の分子量を有する約２５％のＳＤＰ断片を含有する。
【０１３９】
いかなる理論によっても縛られるものではないが、そのような作用は、焦点結合のクラスター化およびアクチン細胞骨格の再編成を通じたもののようである。さらに、低分子量シルクはＴＧＦβ２の発現を上方調節することが分かったが、一方で全てのＴＧＦβアイソフォームの発現は高分子量シルクによって有意に下方調節される。加えて、擦過傷閉鎖に対する低分子量ＳＤＰの効果は、ＴＧＦβＲＩ特異的阻害剤の存在下で部分的に減弱され、ＴＧＦβ媒介性のシグナル伝達がヒト角膜縁上皮（ＨＣＬＥ）細胞の遊走および増殖に対するＳＤＰの刺激性効果に部分的に寄与することを示唆する。これらの発見は、ＳＤＰの生体機能的および創傷治癒の特性がそのタンパク質構造の化学的および分子的特質に依拠する程度を実証する。
【０１４０】
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのカイコ繭に由来するシルクフィブロインタンパク質は、制御可能な材料特性および様々な生体材料形式に加工できる能力という望ましいセットにより、組織工学および再生医療用途のために選択されてきた。先行研究により、シルクフィブロインに基づく材料は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用された時に高い生体適合性、制御された分解性、および内因性の非免疫原性および非炎症特性を呈し、したがって広範な生物医学用途において使用するためのその他のバイオポリマーに対して多数の利点を提供することが報告されている。さらに、我々の以前の研究努力により、再生シルクフィブロインタンパク質溶液は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの角膜上皮細胞の増殖、遊走、接着を刺激し、かつｉｎ  ｖｉｖｏウサギ角膜創傷治癒モデルにおいて眼表面に治療適用された時に組織再生を促進して、増進した角膜の創傷治癒応答に繋がることが示されており、眼表面修復用途のためのその使用が実証されている。
【０１４１】
再生シルクフィブロインは、組織再生を増進するための治療剤としての使用に成功しているが、シルクフィブロインを使用する改良方法を提供するために、分子レベルでその生体機能特性を理解する必要がある。研究努力により、生体用材料としてのシルクの汎用性は、フィブロインタンパク質の化学的および分子的特質に由来し、それは原料のカイコ繭から再生シルクフィブロイン溶液を調製するために使用する処理方法に大きく影響され得ることが実証されている。苛酷な変性条件へのシルクフィブロインタンパク質の曝露は、タンパク質の固有の分子構造に影響し、再生シルクフィブロイン溶液の分子量分布の差異に繋がる。その機械的特性、生体適合性、タンパク質分解に対する分解性、および熱安定性に対するシルクフィブロインの分子量分布の効果が研究により報告されているが、シルクフィブロインの創傷治癒特性に対する分子量分布の効果は詳細には研究されていない。
【０１４２】
本明細書中で提供する実施例では、創傷治癒プロセスに関与する角膜上皮細胞の挙動を調節するＳＤＰの能力に対する分子量分布の影響を評価し、特徴付けた。上皮細胞の挙動に対するシルクプロテインの断片サイズの影響を調べるために、遠心フィルターを使用して再生ＳＤＰ溶液を高分子量および低分子量のＳＤＰ断片に分別した。タイムラプスイメージングを使用して、異なる分子量サイズのシルク断片の存在下で培養したＨＣＬＥ細胞の遊走を追跡した。上皮細胞の増殖に対するＳＤＰタンパク質の分子量の効果をＭＴＴ比色生存能力アッセイを使用して評価した。
【０１４３】
さらに、上皮細胞−基体接着を刺激するＳＤＰの能力に対するタンパク質断片サイズの効果を、並列プレートフローチャンバーシステムおよび焦点結合タンパク質ビンキュリンの免疫蛍光染色を使用して評価した。次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ擦過アッセイを使用して角膜擦過傷をモデル化し、コンフルエントなＨＣＬＥ細胞シートを部分的にむき出しにした後、異なる分子量のＳＤＰ断片で処理して、擦過閉鎖の間のＳＤＰの創傷治癒特性に対する効果を評価した。角膜上皮の創傷治癒プロセスにおいて決定的に重要な役割を果たすことに関与するサイトカイントランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）の遺伝子発現に対するフィブロイン分子量の影響を定量ＰＣＲを使用して評価した。最後に、ＳＤＰの創傷治癒効果の基盤をなす分子経路を解明するために、ＴＧＦβ−Ｒ特異的阻害剤でＨＣＬＥ細胞を処理してＴＧＦβシグナル伝達経路を破壊した。
【０１４４】
研究の結果により、ＳＤＰの分子量とＳＤＰに基づく材料の挙動および性能に対するその影響との間のよく定義された関係性が示唆された。例えば、本発明者は、ＳＤＰ断片サイズとその創傷治癒特性の差異との間の関連を実証した。したがって、ＳＤＰをその断片サイズにしたがって眼表面の再生用の生体用材料として使用する方法が提供される。
【０１４５】
実施例５：ＳＤＰタンパク質溶液の分別および分子量分布
１００、５０、３０、および１０ｋＤａのＭＷカットオフのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５ｍＬ遠心フィルター（ＥＭＤ−ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＭＡ、ＵＳＡ）を利用する一連の遠心分離ステップを通じて再生ＳＤＰ溶液の分別を達成した。分別されたＳＤＰ溶液の分子量範囲を評価するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してＳＤＰタンパク質の電気泳動移動度を可視化し、未分別ＳＤＰ溶液と比較した（図５）。おおよそ３００ｋＤａから３０ｋＤａの間の分子量範囲に位置する大きいスメアによって立証されるように、未分別ＳＤＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、溶液内のＳＤＰタンパク質の広い分子量分布を示した。しかしながら、再生ＳＤＰ溶液の分別は、高分子量および低分子量のＳＤＰタンパク質溶液を産生した。未分別ＳＤＰ溶液と比べた場合、高分子量溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥはおおよそ３００ｋＤａから１００ｋＤａの間の範囲の分子量分布を示すスメアを生じた一方、低分子量溶液は、大多数が３０ｋＤａの範囲内の分子量分布を示すスメアを生じ、したがって高分子量および低分子量のＳＤＰタンパク質溶液へのＳＤＰの分別が確認された。
【０１４６】
実施例６：ＳＤＰ溶液の分別
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのカイコ繭に由来する５０ｍｇ／ｍＬのＳＤＰ水溶液はＳｉｌｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＭＮ）の好意により提供され、以下に記載する全ての研究に利用した。１００、５０、３０、および１０ｋＤａのＭＷカットオフでＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５ｍＬ遠心濾過器（ＥＭＤ−ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してＳＤＰ断片の分別を達成した。簡潔に述べれば、１５ｍＬの４０ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＰストック溶液を１００ｋＤａのＭＷカットオフの遠心濾過器に加え、１００ｋＤａおよびそれより高いＭＷのＳＤＰ断片の単離のために４，０００×ｇで３０分間の遠心沈降を行った。単離された濃縮物を回収した後、濾液を５０ｋＤａのＭＷカットオフの遠心濾過器に移し、４，０００×ｇで３０分間の遠心沈降を再び行うことにより約５０ｋＤａのＭＷのＳＤＰ断片を単離した。単離された濃縮物を回収した後、濾液を３０ｋＤａのＭＷカットオフの遠心濾過器に移し、４，０００×ｇで３０分間の遠心沈降を再び行うことにより約３０ｋＤａのＭＷのＳＤＰ断片を単離した。単離された濃縮物を回収した後、濾液を１０ｋＤａのＭＷカットオフの遠心濾過器に移し、４，０００×ｇで３０分間の遠心沈降を再び行うことにより約１０ｋＤａのＭＷのＳＤＰ断片を単離した。各ＭＷカットオフから回収した濃縮物を５ｍＬのｄＨ２Ｏで個々に６回洗浄し、各濃縮物について各々のＭＷカットオフのフィルターサイズの遠心濾過器を使用して４，０００×ｇで３０分間再び遠心沈降を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルーＲ−２５０染色（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用してＳＤＰ断片の分別を検証した。
【０１４７】
上皮細胞の挙動の調節に対するＳＤＰタンパク質分子量分布の効果を、最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏ上皮細胞遊走アッセイを使用して調べた。細胞株の高度に特徴付けられた歴史およびＳＤＰなどの新たな生体用材料を用いて研究する時の信頼性に基づいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のための信頼できる細胞モデルとしてＨＣＬＥ細胞を選択した。我々の以前の研究努力は、４ｍｇ／ｍＬの未分別ＳＤＰ溶液で細胞を処理した時の上皮細胞の遊走および増殖の増加、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの擦過傷閉鎖の加速の実証に成功し、したがって、本研究を通じてそれをＳＤＰの刺激性効果の陽性対照として使用した。
【０１４８】
実施例７：擦過傷閉鎖アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの創傷閉鎖に対するＳＤＰタンパク質の断片サイズの効果を決定するために、ＨＣＬＥ細胞を用いる擦過傷アッセイを使用した。ＨＣＬＥ細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２で２４ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ、ＵＳＡ）に播種し、Ｋ−ＳＦＭ培地中で２４時間インキュベートしてコンフルエントな細胞単層を形成させた。Ｋ−ＳＦＭ培地を除去しコンフルエントな細胞シートを１００μｌピペットの先端で引っかくことによって傷付けて、細胞が無いむき出しの区画を作った。擦過傷を作ったＨＣＬＥ細胞を１×ＰＢＳで洗浄して、あらゆる細胞断片または剥がれた細胞を除去した後、濃度を増加させた（１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、および４ｍｇ／ｍＬ）高分子量または低分子量のＳＤＰタンパク質溶液を含有する新鮮なＫ−ＳＦＭ培地中で２０時間インキュベートした。それぞれ陽性対照および陰性対照として４ｍｇ／ｍＬの未分別ＳＤＰタンパク質溶液またはＰＢＳ賦形剤を含有する新鮮なＫ−ＳＦＭ培地で細胞を処理した。顕微鏡の２４ウェルプレートマイクロインキュベーター（ＰｅＣｏｎ、ＧｍｂＨ；Ｍ２４  Ｓ１）を使用して細胞遊走をモニターした。１０×対物レンズ、１．６×Ｏｐｔｏ  Ｖａｒ．を有するＺｅｉｓｓ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＡＧ）および位相コントラストフィルターを使用してアッセイの経過の間の創傷閉鎖を順次分析した。顕微鏡のＭａｒｋ−ａｎｄ−Ｆｉｎｄ機能を使用して各ウェル内の選択位置を記憶し、むき出しの表面に沿った複数の区画をキャプチャーした。タイムラプス位相コントラストイメージングを利用して、ＡｘｉｏＣａｍ単一チャンネルカメラおよびＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＡＧ）を用いて２０時間のインキュベーション期間にわたって１５分毎にフレームを録画した。
【０１４９】
同じ創傷面積の創傷が比較されたことを確実にするために、各ウェル内の複数の位置についてＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して創傷の面積を追跡および測定した。ウェル内の各位置のタイムラプス画像を解析し、創傷面積を測定してアッセイの経過全体を通じて数個の時点における創傷閉鎖のパーセンテージを決定した。創傷が完全に治癒した時点を記録した。高分子量または低分子量のＳＤＰ断片での処理に応答したＨＣＬＥ細胞による創傷閉鎖を、未分別ＳＤＰ溶液で、およびＰＢＳ賦形剤の対照で処理した細胞のそれと比較した。
【０１５０】
部分的にむき出しにして角膜擦過傷をモデル化したコンフルエントなＨＣＬＥ細胞シートを使用して、眼表面の創傷治癒の間の角膜上皮細胞の挙動をｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣した。その後、高分子量および低分子量ならびに未分別（陽性対照）のＳＤＰ溶液の非存在下または存在下で細胞を処理した後、所定の時点におけるむき出しの空間内への細胞の被覆を測定することによって上皮の成長および遊走速度を算出した（図８Ａ）。低分子量ＳＤＰは創傷閉鎖を刺激するようである。未分別ＳＤＰでの処理は、対照細胞と比べて１６時間で４０％の創傷閉鎖の増加を示した。細胞を低分子量ＳＤＰで処理した時に創傷治癒速度はさらに増進され、対照細胞および未分別シルクで処理した細胞と比べて１６時間でそれぞれ５０％および１０％を超える創傷閉鎖の増加を生じた。上皮細胞の遊走および増殖の減少を実証した以前の実験と同様に、対照細胞および低分子量シルクで処理した細胞と比べて１６時間でそれぞれ２０％および５０％の創傷閉鎖の減少があったことに立証されるように、高分子量シルクでの処理は、案の定、擦過閉鎖時間の有意な減少を生じた（図８Ｂ）。
【０１５１】
実施例８：ＨＣＬＥ細胞の遊走
ＨＣＬＥ細胞を１×１０４細胞／ｃｍ２で２４ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ、ＵＳＡ）に播種し、Ｋ−ＳＦＭ培地中で２４時間インキュベートした。次いで、Ｋ−ＳＦＭ培地を除去し、濃度を増加させた（１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、および４ｍｇ／ｍＬ）高分子量または低分子量ＳＤＰのタンパク質溶液を含有する新鮮なＫ−ＳＦＭ培地で細胞を２０時間処理した。それぞれ陽性対照および陰性対照として４ｍｇ／ｍＬの未分別ＳＤＰ溶液またはＰＢＳ賦形剤を含有する新鮮なＫ−ＳＦＭ培地で細胞を処理した。顕微鏡の２４ウェルプレートマイクロインキュベーター（ＰｅＣｏｎ、ＧｍｂＨ；Ｍ２４  Ｓ１）、１０×対物レンズ、１．６×Ｏｐｔｏ  Ｖａｒ．を有するＺｅｉｓｓ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＡＧ）および位相コントラストフィルターを使用して細胞の遊走をモニターした。顕微鏡のＭａｒｋ−ａｎｄ−Ｆｉｎｄ機能を使用して各ウェル内の選択位置を記憶し、複数の区画をキャプチャーした。タイムラプス位相コントラストイメージングを利用して、ＡｘｉｏＣａｍ単一チャンネルカメラおよびＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＡＧ）を用いて２０時間のインキュベーション期間にわたって１５分毎にフレームを録画した。
【０１５２】
個々のタイムラプス動画について、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア中の「トラッキング」パッケージを使用して単一細胞の遊走および個々のＨＣＬＥ細胞の遊走経路を解析した。各群から無作為にサンプリングした細胞を各ウェル内の代表的な位置から追跡し、ソフトウェアにより単一細胞の遊走速度の平均測定値を集めた。
【０１５３】
濃度を増加させた高分子量および低分子量ならびに未分別（陽性対照）のＳＤＰ溶液の非存在下または存在下でＨＣＬＥ細胞を培養した。細胞追跡ソフトウェアを利用して単一細胞の運動性を評価し、各群から無作為に選択した細胞の平均遊走速度を比較した（図６）。低分子量ＳＤＰは上皮細胞の遊走を刺激するようである。予想の通り、４ｍｇ／ｍＬの未分別ＳＤＰで処理した細胞は、対照細胞と比べて平均細胞遊走速度の４０％の増加を示した。しかしながら、興味深いことに、全ての濃度の高分子量ＳＤＰタンパク質での処理は、対照細胞と比べた時に細胞遊走速度の５０％の減少を生じ、未分別シルクで処理した細胞と比べて細胞遊走速度の６０％の減少を生じた。顕著なことに、細胞遊走速度の用量依存的な増加を示す結果によって立証されるように、低分子量ＳＤＰタンパク質での処理は反対の効果を実証した。４ｍｇ／ｍＬの低分子量ＳＤＰタンパク質で処理した細胞は、賦形剤対照および未分別シルクで処理した細胞と比べてそれぞれ約８０％および２０％の細胞遊走速度の増加を示した。さらに、４ｍｇ／ｍＬの低分子量シルクでの処理は、同じ濃度の高分子量シルクで処理した細胞と比べて２００％の細胞遊走速度の増加を生じた。
【０１５４】
実施例９：上皮細胞の生存能力アッセイ
濃度を増加させた（１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、および４ｍｇ／ｍＬ）高分子量または低分子量のＳＤＰタンパク質溶液の存在下でＨＣＬＥ細胞を３×１０３細胞／ｃｍ２の細胞播種密度で９６ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ、ＵＳＡ）中で培養した。それぞれ陽性対照および陰性対照として４ｍｇ／ｍＬの未分別ＳＤＰ溶液またはＰＢＳ賦形剤で細胞を処理した。次いで、我々の以前の研究から創傷治癒の最大の影響力がｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された継続期間である治療から１２時間後に、製造業者の説明書にしたがって培養物をＭＴＴ比色アッセイに供した。簡潔に述べれば、５０μｌのＭＴＴストック溶液（５ｍｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を５００μｌの新鮮な培地を含有する培養物に加え、暗闇中で４時間３７℃でインキュベートした。培地を吸引した後、２００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を加え、十分に混合してホルマザンを放出させた。Ｂｉｏｍｅｋプレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、生じた溶液の５４０ｎｍでの吸光度を記録した。細胞を含まない培養培地を含有するウェルを陰性対照とした。
【０１５５】
分子量も上皮細胞の増殖に対するＳＤＰの効果への影響において役割を果たすのかどうかを評価するための研究を行った。我々の以前の研究の間に創傷治癒の最大の増加がｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された継続期間である１２時間、濃度を増加させた高分子量および低分子量ならびに未分別（陽性対照）のＳＤＰ溶液の非存在下または存在下で、同様の数のＨＣＬＥ細胞を培養した。次いで、培養物をＭＴＴ比色代謝アッセイに供して、細胞数の差を評価した（図７）。低分子量ＳＤＰは上皮細胞の増殖を刺激する。我々の以前の研究努力の結果を裏付けて、４ｍｇ／ｍＬの未分別シルクでの処理は、対照細胞と比べて３０％を超えて細胞増殖を増進した。驚くべきことに、全ての濃度の高分子量ＳＤＰで処理した細胞は、対照細胞と比べて細胞増殖のいかなる増加または減少も示さなかった。しかしながら、細胞を低分子量ＳＤＰで処理した時に、用量依存的に細胞増殖が有意に増加した。４ｍｇ／ｍＬの低分子量ＳＤＰ溶液で処理した細胞は、対照細胞および未分別シルクで処理した細胞と比べて、それぞれ４５％および１０％の細胞増殖の増強を示した。さらに、高分子量ＳＤＰで処理した細胞と比べた時に細胞増殖は５０％を超えて高かった。
【０１５６】
実施例１０：細胞基体接着アッセイ
３５ｍｍの細胞培養皿に３×１０５細胞／皿でＨＣＬＥ細胞を播種した。この細胞播種密度は、最小の細胞−細胞接触の形成で適切な表面被覆を確実にするために選択した。細胞を終夜インキュベートして基体への最適な細胞接着を確実にした。
【０１５７】
細胞を播種した皿の培地を除去し、４ｍｇ／ｍＬの異なるＳＤＰタンパク質溶液（高分子量、低分子量、または未分別）またはＰＢＳ賦形剤対照を含む新鮮なＫ−ＳＦＭを加え、細胞を終夜インキュベートした。インキュベーション後に並列プレートフローチャンバーセル（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して細胞基体接着を評価した。チャンバー内のフローチャンネルは５ｍｍの幅（ｗ）、０．１ｍｍの高さ（ｈ）、および４８．２ｍｍの長さ（ｌ）の寸法を有していた。細胞を播種した皿から培地を吸引し、フローチャンバーを細胞の上に置いた。ＰＢＳを３７℃に温めて、約０．８ｃｐの見掛けの流体粘度（μ）とした。注射器ポンプを使用して５２．２ｍｌ／分の体積流量（Ｑ）でＰＢＳを送達し、チャンネル内に連続的な一次元の層状の流体流れを作った。壁せん断応力は以前に記載されたようにして決定した。送達された流体せん断応力は以下の式：
τｗ＝６μＱ／ｂ（ｈ２）
によって定義される。
【０１５８】
チャンネル幅（ｂ）およびチャンネル高さ（ｈ）は、細胞上に置かれたフローチャンバーのデッキに取り付けられたシリコーンガスケットの寸法によって定められる固定された変数である。層状の流体状態を作るためにフローチャンネルを通じて注入するＰＢＳを３７℃に保って、アッセイの全過程を通じて一定の約０．８ｃｐの見掛けの流体粘度（μ）を与える。したがって、送達される壁せん断応力（τｗ）は、注射器ポンプによって注入されるＰＢＳの体積流量（Ｑ）のみの関数のままとなる。細胞を１分間、９８．４Ｐａの壁せん断応力に供し、３０〜４０細胞の細胞カウントの解析区画を、アッセイの経過の間、１０×対物レンズを有するＺｅｉｓｓ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＡＧ）および位相コントラストフィルターでイメージングした。
【０１５９】
ＡｘｉｏＣａｍ単一チャンネルカメラおよびＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＡＧ）を使用して細胞の画像をキャプチャーした。解析の区画内の接着細胞の総数を流れの始まりの前および後に決定した。異なるＳＤＰタンパク質溶液で処理した細胞の細胞接着を評価し、対照としてＰＢＳ緩衝液（処理賦形剤）で処理した細胞と比較した。
【０１６０】
高分子量および低分子量ならびに未分別のＳＤＰ溶液の非存在下または存在下でＨＣＬＥ細胞を培養し、以前に記載されたように、層状の流体フローチャンバーを利用して、流体せん断を受けた時の脱着に対する細胞の抵抗を評価および定量化した（図９）。高分子量ＳＤＰは、焦点結合複合体の編成および上皮細胞の細胞骨格の再アライメントを通じて上皮細胞−基体接着を促進するようである。連続的な一次元の流体せん断を受けた時に、非フィブロイン処理（対照）細胞の保持は約７５％であった。予想された通り、４ｍｇ／ｍＬの未分別ＳＤＰの追加は、９０％を超えるまで細胞保持を有意に増加させた。
【０１６１】
興味深いことに、高分子量ＳＤＰで細胞を処理した時に細胞保持はさらに５％増加し、細胞−マトリックス接着の向上を示した。しかしながら、興味深いことに、未分別シルクおよび高分子量シルクで処理した細胞と比べてそれぞれ１４％および１８％の細胞保持の減少によって立証されるように、細胞接着は低分子量ＳＤＰの追加によって向上しなかった。さらには、高せん断に供された時の低分子量シルクで処理した細胞の細胞脱着プロファイルおよび細胞保持は、対照細胞でのものと統計的に差がなかった。
【０１６２】
実施例１１：ＨＣＬＥの免疫蛍光染色およびイメージング
ＨＣＬＥ細胞を４ｍｇ／ｍＬの異なるＳＤＰタンパク質溶液（高分子量、低分子量、または未分別）またはＰＢＳ賦形剤対照の存在下で終夜培養し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて１５分間固定した後、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）および０．０５％非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含有するＰＢＳ中で１時間、再加水した。固定化後、５０μｌの一次抗体溶液（抗ビンキュリン、１：４００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を室温で１時間加えた。対照として適切なアイソタイプマッチの非特異的ＩｇＧを使用して、試料を１時間二次抗体と共にインキュベートした。また、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ファロイジン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて試料を染色した。ＰＢＳでの洗浄後、ＤＡＰＩを含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて試料をマウントした。１０×および４０×の両方の対物レンズと共にＯｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＡＧ）を使用して蛍光染色を可視化した。ＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｍデジタルカメラ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＡＧ）およびＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ４．０ソフトウェアを使用して、ＤＡＰＩ、ＧＦＰ、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄフィルターチャンネルを使用して０．２５μｍのスライスで単一およびｚスタックの画像（４５〜６０層の範囲）をキャプチャーした。３Ｄ  Ｈｕｙｇｅｎｓ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＢＶ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して各ｚスタックに対してデコンボリューションを行った。
【０１６３】
免疫蛍光染色およびビンキュリンのイメージングを使用して、高分子量および低分子量ならびに未分別のＳＤＰ溶液の存在下または非存在下で培養したＨＣＬＥ細胞中の焦点結合サブユニットの形成および配置を可視化および評価した（図１０）。ＰＢＳ賦形剤（対照）および低分子量シルクでの処理は、基底膜表面に沿ったビンキュリンの分散した配置を生じた。しかしながら、対照的に、細胞の外周に沿ったビンキュリンのクラスター化および凝集が未分別シルクで処理した細胞において起こり、また、以前の実験の間に細胞接着を最も増進することが示された高分子量シルクで細胞を処理した時に有意に増加した。
【０１６４】
実施例１２：細胞の広がりおよび細胞骨格再編成
４ｍｇ／ｍＬの異なるＳＤＰタンパク質溶液（高分子量、低分子量、または未分別）またはＰＢＳ賦形剤対照の存在下で終夜培養したＨＣＬＥ細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて１５分間固定した後、０．５％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）および０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含有するＰＢＳ中で１時間再加水した。固定化後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ファロイジン（１：４０、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて２０分間、試料を染色した。ＰＢＳでの洗浄後、ＤＡＰＩを含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（商標）Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて試料をマウントした。１０×の対物レンズと共にＯｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＡＧ）を使用して蛍光染色を可視化した。ＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｍデジタルカメラ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＡＧ）およびＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ４．０ソフトウェアを使用して、ＤＡＰＩおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄフィルターチャンネルを使用して０．２５μｍのスライスで単一およびｚスタックの画像（４５〜６０層の範囲）をキャプチャーした。３Ｄ  Ｈｕｙｇｅｎｓ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＢＶ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して各ｚスタックに対してデコンボリューションを行った。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｖｅｒ．１．４８、ＮＩＨ）を使用してスパース（疎）およびコンフルエント（密）の両方の条件下での細胞の表面積を測定し、異なるＳＤＰ断片による刺激に応答した細胞の広がりの変化を評価した。
【０１６５】
異なる分子量のＳＤＰ溶液での処理に応答して細胞質の変化が起こったかどうかを判定するために、ＨＣＬＥ細胞を低密度で二次元表面上にプレートして創傷区画付近の環境を模倣し、または高密度でプレートして正常な眼表面上に存在するようなコンフルエントなインタクトな単層を形成させ、その後にＰＢＳ賦形剤（対照）または高分子量および低分子量ならびに未分別のＳＤＰ溶液で処理した。次いで、処理した細胞の細胞表面積を測定し、細胞の広がりを評価した（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。コンパクトな細胞シート中の細胞は、広がりのためのより多くの空間を有するより低い密度で培養された細胞と比べた時に、より小さい平均表面積を有していた。しかしながら、低いおよび高い細胞密度の両方について、未分別ＳＤＰとのインキュベーションは細胞表面積のロバストな増加を刺激し、また、細胞を高分子量シルクで処理した時に細胞の広がりの程度はさらに増加した。興味深いことに、低分子量シルクでの処理は、非フィブロイン処理（対照）細胞と比べた時に細胞の広がりにおいていかなる有意な増加も生じず、観察された細胞応答は分子量依存的であった。
【０１６６】
実施例１３：ＲＮＡの単離および定量ＰＣＲ
ＨＣＬＥ細胞を３５ｍｍ皿中に６×１０５細胞／皿で播種し、４ｍｇ／ｍＬの異なるＳＤＰタンパク質溶液（高分子量、低分子量、または未分別）またはＰＢＳ賦形剤対照の存在下で１２時間培養した。次いで、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してトータルＲＮＡを抽出し、Ｗｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｏｌｌｅｇｅのＧｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙにおいてＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＮａｎｏｄｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用してＲＮＡの完全性および量を確認した。その後、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して各試料からの４５０ｎｇのトータルＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および以下の特異的プライマーセット：
ｈＴＧＦＡ−Ｆｗ：ＴＴＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧ（配列番号１）
ｈＴＧＦＡ−Ｒｖ：ＧＣＡＣＡＣＡＴＧＴＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧ（配列番号２）
ｈＴＧＦＢ１  Ｆｗ：ＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＡＣＧ（配列番号３）
ｈＴＧＦＢ１−Ｒｖ：ＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧ（配列番号４）
ｈＴＧＦＢ２  Ｆｗ：ＧＴＴＣＡＧＡＧＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴＧＣ（配列番号５）
ｈＴＧＦＢ２−Ｒｖ：ＴＣＡＧＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧ（配列番号６）
ｈＴＧＦＢ３−Ｆｗ：ＡＴＧＡＧＣＡＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡＣＡＧ（配列番号７）
ｈＴＧＦＢ３−Ｒｖ：ＧＧＡＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＣ（配列番号８）
を使用してＳｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で定量ＰＣＲを実行した。
【０１６７】
ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して候補遺伝子の発現を正規化した。２（−ΔΔＣｔ）法を使用して相対定量を行った。
【０１６８】
実施例１４：ＳＤＰ誘発性の創傷閉鎖におけるＴＧＦβシグナル伝達の役割
ＳＤＰ誘発性の創傷閉鎖におけるＴＧＦβシグナル伝達の可能な関与を評価するために、ＴＧＦβＲＩ特異的阻害剤（５μＭ、ＳＢ４３１５４２、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ、ＭＯ）を使用して創傷閉鎖の間のＨＣＬＥ細胞におけるＴＧＦβシグナル伝達経路を阻害した。ＨＣＬＥ細胞を２４ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ、ＵＳＡ）に５×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、Ｋ−ＳＦＭ培地中で２４時間インキュベートしてコンフルエントな細胞単層を形成させた。次いで、以前に記載されたように、低分子量ＳＤＰタンパク質溶液またはＰＢＳ賦形剤の存在下、５μＭのＴＧＦβＲＩ特異的阻害剤ＳＢ４３１５４２ありまたはなしで擦過アッセイを行い、ＳＤＰ誘発性の細胞遊走および創傷治癒の加速の間のＴＧＦβ媒介性のシグナル伝達の役割を解明した。実験群のいずれかがＳＤＰの分子量の違いによって影響されるかどうかを明らかにするため、および異なる処理群と対照群との間の細胞応答の統計的に有意な変化を同定するために、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ検定を行った。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してＰ値を算出した。
【０１６９】
ＱＰＣＲを行い、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の遺伝子発現を解析した（図１２）。ＳＤＰはＴＧＦβ遺伝子の発現に影響するようである。低分子量ＳＤＰでの処理は、非フィブロイン処理（対照）細胞および未分別シルクで処理した細胞と比べて、ＴＧＦβ２遺伝子の発現の２倍を超える増加および１．７５倍の増加をそれぞれ引き起こした。未分別シルクまたは低分子シルクのいずれかでの処理は、ＴＧＦβ１遺伝子の発現の有意な変化を生じなかったが、ＴＧＦβ３遺伝子の発現は低分子量シルクにより有意に増加した。さらに、ＳＤＰの刺激性効果の分子量依存性は、細胞を高分子量シルクで処理した時の全ての遺伝子の遺伝子発現の有意な減少によりさらに例証された。
【０１７０】
５μＭのＴＧＦβＲＩ特異的阻害剤ＳＢ４３１５４２の存在下または非存在下、ＰＢＳ賦形剤（対照）または低分子量ＳＤＰで処理したＨＣＬＥ細胞を使用して擦過アッセイを行った。ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤は、低分子量ＳＤＰ誘発性の細胞遊走および創傷閉鎖を防止するようである。細胞遊走の低分子量ＳＤＰ刺激はＴＧＦβシグナル伝達の阻害によって減弱されたことを結果は実証する（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。ＳＢ４３１５４２の存在下で低分子量シルクで処理した細胞は、ＳＢ４３１５４２なしで低分子量シルクで処理した細胞と比べて、治癒速度の有意な減少および１６時間での創傷閉鎖の約２０％の減少を示した。非フィブロイン処理細胞へのＳＢ４３１５４２の添加も、ＳＢ４３１５４２なしでの非フィブロイン処理細胞と比べて細胞遊走および創傷閉鎖速度を低下させたことを注記することは重要である。
【０１７１】
実施例１５
創傷治療組成物の試料を調製する。分子量にしたがってシルク由来フィブロインタンパク質組成物からタンパク質断片を単離する。約６０ｋＤａ未満のものなどの低分子量のタンパク質断片の第１の加水分解産物が形成される。約６０ｋＤａより大きいものなどの高分子量のタンパク質断片の第２の加水分解産物が形成される。約６０ｋＤａ未満のタンパク質断片と約６０ｋＤａより大きいタンパク質断片との混合物について、タンパク質断片の第３の加水分解産物が第１の加水分解産物および第２の加水分解産物から形成される。各加水分解産物は、水、少なくとも１つの緩衝系（例えば、ＰＢＳ、クエン酸塩、ホウ酸塩）、少なくとも１つの防腐剤、少なくとも１つの追加の医薬品添加物（安定化剤、塩）を含む。
【０１７２】
第１の加水分解産物は、健常患者（例えば、屈折矯正手術後）の外科的創傷に適用される。創傷は、創傷閉鎖速度および患者の快適度および痛みの評価について経時的にモニターされる。
【０１７３】
第２の加水分解産物は、慢性創傷、糖尿病性潰瘍、または熱傷創傷に適用される。創傷は創傷閉鎖についてモニターされる。
【０１７４】
第３の加水分解産物は、任意の創傷に適用される。創傷は創傷閉鎖の速度および質についてモニターされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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