(57)【要約】  本開示は、２つの抗原に結合する二重特異性タンパク質、並びにこの組成物、使用、及び作製する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４０に結合することができ、メソテリンに結合することができる二重特異性結合タンパク質であって、式（ＩＩ）：
ｓｃＦｖＸ−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ    （ＩＩ）
の２つのポリペプチドを含み、
Ｌはポリペプチドリンカーであり、
Ｈはヒンジ領域であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、
ｓｃＦｖＸ及びｓｃＦｖＹはそれぞれ独立して単鎖可変断片であり、
ｓｃＦｖＸは第１の抗原に特異的に結合し、
ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合し、
２つの抗原のうちの一方はＣＤ４０であり、他方はメソテリンである、二重特異性結合タンパク質。
【請求項２】
ｓｃＦｖＸ−が式（Ｖ）又は（ＶＩ）：
ＶＨＸ−ＬＸ−ＶＬＸ−  （Ｖ）、
ＶＬＸ−ＬＸ−ＶＨＸ−  （ＶＩ）
の構造を有し、
ＶＨＸは可変重鎖であり、ＶＬＸは可変軽鎖であり、ＬＸはポリペプチドリンカーである、請求項１に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３】
−ｓｃＦｖＹが式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）：
−ＶＬＹ−ＬＹ−ＶＨＹ  （ＶＩＩ）、
−ＶＨＹ−ＬＹ−ＶＬＹ  （ＶＩＩＩ）
の構造を有し、
ＶＨＹは可変重鎖であり、ＶＬＹは可変軽鎖であり、ＬＹはポリペプチドリンカーである、請求項１又は２に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４】
Ｌが、配列番号２５１及び２５３〜２６２のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５】
ＬＸ及びＬＹがそれぞれ配列番号３０１〜３０６のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項２又は３に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６】
ＣＤ４０に結合するｓｃＦｖが、配列番号２５に従ったＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２６に従ったＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２７に従ったＣＤＲ−Ｈ３を有するＶＨ並びに配列番号５５に従ったＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５６に従ったＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号５７に従ったＣＤＲ−Ｌ３を有するＶＬを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７】
ＣＤ４０に結合するｓｃＦｖが、配列番号１７〜２３のうちのいずれか１つに従ったＶＨ及び配列番号４４〜５１のうちのいずれか１つに従ったＶＬを含む、請求項６に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項８】
ＣＤ４０に結合するｓｃＦｖが、配列番号１７に従ったＶＨ及び配列番号４４に従ったＶＬを含む、請求項７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項９】
ＣＤ４０に結合するｓｃＦｖが、配列番号１８に従ったＶＨ及び配列番号４４に従ったＶＬを含む、請求項７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１０】
ＣＤ４０に結合するｓｃＦｖが、配列番号１７に従ったＶＨ及び配列番号４９に従ったＶＬを含む、請求項７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１１】
ＣＤ４０に結合するｓｃＦｖが、配列番号１７に従ったＶＨ及び配列番号５０に従ったＶＬを含む、請求項７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１２】
メソテリンに結合するｓｃＦｖが、配列番号２４１に従ったＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２４２に従ったＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２４３に従ったＣＤＲ−Ｈ３を有するＶＨ並びに配列番号２４４に従ったＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２４５に従ったＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号２４６に従ったＣＤＲ−Ｌ３を有するＶＬを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１３】
メソテリンに結合するｓｃＦｖが、配列番号１０７〜１２８のうちのいずれか１つに従ったＶＨ及び配列番号１３６〜１４２のうちのいずれか１つに従ったＶＬを含む、請求項１２に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１４】
メソテリンに結合するｓｃＦｖが、配列番号１２０に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含む、請求項１３に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１５】
メソテリンに結合するｓｃＦｖが、配列番号１２０に従ったＶＨ及び配列番号１４１に従ったＶＬを含む、請求項１３に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１６】
メソテリンに結合するｓｃＦｖが、配列番号１２９に従ったＶＨ及び配列番号１４３に従ったＶＬを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１７】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４０５、４０６、４０７、４０８、４１２、４１９、４２０及び４２１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１８】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４０５のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１９】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４０６のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２０】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４０７のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２１】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４０８のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２２】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４１２のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２３】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４１９のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２４】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４２０のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２５】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４２１のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２７】
がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜２５のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、又は請求項２６に記載の医薬組成物を投与することを含み、任意選択的にがんは固形腫瘍である、方法。
【請求項２８】
４−１ＢＢに結合することができ、前立腺特異的膜抗原に結合することができる二重特異性結合タンパク質であって、式（ＩＩ）：
ｓｃＦｖＸ−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ    （ＩＩ）
の２つのポリペプチドを含み、
Ｌはポリペプチドリンカーであり、
Ｈはヒンジ領域であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、
ｓｃＦｖＸ及びｓｃＦｖＹはそれぞれ独立して単鎖可変断片であり、
ｓｃＦｖＸは第１の抗原に特異的に結合し、
ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合し、
２つの抗原のうちの一方は４−１ＢＢであり、他方は前立腺特異的膜抗原である、二重特異性結合タンパク質。
【請求項２９】
ｓｃＦｖＸ−が式（Ｖ）又は（ＶＩ）：
ＶＨＸ−ＬＸ−ＶＬＸ−  （Ｖ）、
ＶＬＸ−ＬＸ−ＶＨＸ−  （ＶＩ）
の構造を有し、
ＶＨＸは可変重鎖であり、ＶＬＸは可変軽鎖であり、ＬＸはポリペプチドリンカーである、請求項２８に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３０】
−ｓｃＦｖＹが式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）：
−ＶＬＹ−ＬＹ−ＶＨＹ  （ＶＩＩ）、
−ＶＨＹ−ＬＹ−ＶＬＹ  （ＶＩＩＩ）
の構造を有し、
ＶＨＹは可変重鎖であり、ＶＬＹは可変軽鎖であり、ＬＹはポリペプチドリンカーである、請求項２８又は２９に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３１】
Ｌが、配列番号２５１及び２５３〜２６２のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３２】
ＬＸ及びＬＹがそれぞれ配列番号３０１〜３０６のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項２９又は３０に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３３】
４−１ＢＢに結合するｓｃＦｖが、配列番号２８０に従ったＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２８１に従ったＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２８２に従ったＣＤＲ−Ｈ３を有するＶＨ並びに配列番号２８３に従ったＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２８４に従ったＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号２８５に従ったＣＤＲ−Ｌ３を有するＶＬを含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３４】
４−１ＢＢに結合するｓｃＦｖが、配列番号６９〜７２のうちのいずれか１つに従ったＶＨ及び配列番号８９〜９５のうちのいずれか１つに従ったＶＬを含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３５】
４−１ＢＢに結合するｓｃＦｖが、配列番号６９に従ったＶＨ及び配列番号８９に従ったＶＬを含む、請求項３４に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３６】
４−１ＢＢに結合するｓｃＦｖが、配列番号７１に従ったＶＨ及び配列番号９４に従ったＶＬを含む、請求項３４に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３７】
前立腺特異的膜抗原に結合するｓｃＦｖが、配列番号１９１〜１９７のうちのいずれか１つに従ったＶＨ及び配列番号２０１〜２０７のうちのいずれか１つに従ったＶＬを含む、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３８】
前立腺特異的膜抗原に結合するｓｃＦｖが、配列番号１９２に従ったＶＨ及び配列番号２０２に従ったＶＬを含む、請求項３７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３９】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４４５〜４４８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４０】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４４６のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４１】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４４７のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４２】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４４８のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４３】
請求項２８〜４２のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４４】
がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に請求項２８〜４２のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、又は請求項４３に記載の医薬組成物を投与することを含み、任意選択的にがんは固形腫瘍である、方法。
【請求項４５】
ＣＤ４０に結合することができ、メソテリンに結合することができる二重特異性結合タンパク質であって、式（ＩＩＩ）：
Ｆａｂ−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ    （ＩＩＩ）
の２つのポリペプチドを含み、
Ｌはポリペプチドリンカーであり、
Ｈはヒンジ領域であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、
Ｆａｂは断片抗原結合領域であり、
ｓｃＦｖＹは単鎖可変断片であり、
Ｆａｂは第１の抗原に特異的に結合し、
ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合し、
第１の抗原がメソテリンであり、第２の抗原がＣＤ４０である、二重特異性結合タンパク質。
【請求項４６】
−ｓｃＦｖＹが式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）：
−ＶＬＹ−ＬＹ−ＶＨＹ  （ＶＩＩ）、
−ＶＨＹ−ＬＹ−ＶＬＹ  （ＶＩＩＩ）
の構造を有し、
ＶＨＹは可変重鎖であり、ＶＬＹは可変軽鎖であり、ＬＹはポリペプチドリンカーである、請求項４５に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４７】
Ｌが、配列番号２５１及び２５３〜２６２のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項４５又は４６に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４８】
ＬＹが配列番号３０１〜３０６のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項４６に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４９】
ＣＤ４０に結合するｓｃＦｖが、配列番号２５に従ったＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２６に従ったＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号２７に従ったＣＤＲ−Ｈ３を有するＶＨ並びに配列番号５５に従ったＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５６に従ったＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号５７に従ったＣＤＲ−Ｌ３を有するＶＬを含む、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５０】
ＣＤ４０に結合するｓｃＦｖが、配列番号１７〜２３のうちのいずれか１つに従ったＶＨ及び配列番号４４〜５１のうちのいずれか１つに従ったＶＬを含む、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５１】
ＣＤ４０に結合するｓｃＦｖが、配列番号１７に従ったＶＨ及び配列番号４４に従ったＶＬを含む、請求項５０に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５２】
ＣＤ４０に結合するｓｃＦｖが、配列番号２２に従ったＶＨ及び配列番号４８に従ったＶＬを含む、請求項５０に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５３】
ＣＤ４０に結合するｓｃＦｖが、配列番号２３に従ったＶＨ及び配列番号４９に従ったＶＬを含む、請求項５０に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５４】
メソテリンに結合するＦａｂが、配列番号１０７〜１２９のうちのいずれか１つに従ったＶＨ及び配列番号１３６〜１４３のうちのいずれか１つに従ったＶＬを含む、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５５】
メソテリンに結合するＦａｂが、配列番号１２０に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含む、請求項５４に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５６】
メソテリンに結合するＦａｂが、配列番号１２９に従ったＶＨ及び配列番号１４３に従ったＶＬを含む、請求項５４に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５７】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号３５１〜３７０のうちのいずれか１つの重鎖アミノ酸配列及び配列番号３７１又は３７２の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項４５〜５６のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５８】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号３５９の重鎖アミノ酸配列及び配列番号３７１の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５９】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号３６０の重鎖アミノ酸配列及び配列番号３７１の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６０】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号３６９の重鎖アミノ酸配列及び配列番号３７２の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６１】
２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号３７０の重鎖アミノ酸配列及び配列番号３７２の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６２】
請求項４５〜６１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項６３】
がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に請求項４５〜６１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、又は請求項６２に記載の医薬組成物を投与することを含み、任意選択的にがんは固形腫瘍である、方法。
【請求項６４】
式（Ｉ）：
Ｘ−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ    （Ｉ）
の２つのポリペプチドを含み、
ＸはｓｃＦｖＸ又はＦａｂ領域であり、
Ｘは第１の抗原に特異的に結合し、ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合し、
Ｈはヒンジ領域であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、
Ｌはポリペプチドリンカーであり、
ｓｃＦｖＸ及びｓｃＦｖＹはそれぞれ独立して単鎖可変断片であり、
２つの抗原のうちの一方は免疫調節タンパク質であり、他方は腫瘍抗原であり、
二重特異性結合タンパク質は当該免疫調節タンパク質を活性化する、二重特異性結合タンパク質。
【請求項６５】
免疫調節タンパク質が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリータンパク質及びＣＤ２８ファミリータンパク質から選択される１つである、請求項６４に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６６】
免疫調節タンパク質が、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＴＮＦＲ２、ＩＣＯＳ、ＴＲＡＩＬＲ１及びＴＲＡＩＬＲ２から選択される、請求項６４又は６５に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６７】
腫瘍抗原が細胞表面腫瘍抗原である、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６８】
腫瘍抗原が、脳がん、乳がん、胃がん、肺がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん及び前立腺がん由来である、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６９】
腫瘍抗原が、メソテリン、ネクチン４、表皮成長因子受容体、前立腺特異的膜抗原及びＢ７−Ｈ４から選択される、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７０】
ＸがｓｃＦｖＸである、請求項６４〜６９のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７１】
第１の抗原が免疫調節タンパク質であり、第２の抗原が腫瘍抗原である、請求項７０に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７２】
Ｌが、配列番号２５１及び２５３〜２６２のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項６４〜７１のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７３】
請求項６４〜７２のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項７４】
がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に請求項６４〜７２のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、又は請求項７３に記載の医薬組成物を投与することを含み、任意選択的にがんは固形腫瘍である、方法。
【請求項７５】
請求項１〜２５、２８〜４２、４５〜６１、及び６４〜７２のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７６】
請求項７４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７７】
請求項７６に記載のベクターで形質転換された原核宿主細胞。
【請求項７８】
請求項７６に記載のベクターで形質転換された真核宿主細胞。
【請求項７９】
請求項７５に記載の核酸を発現するように操作された真核宿主細胞。
【請求項８０】
哺乳動物宿主細胞である、請求項７９に記載の真核宿主細胞。
【請求項８１】
（ａ）請求項７８又は請求項７９の宿主細胞を培養すること及び（ｂ）タンパク質を回収することを含む、二重特異性結合タンパク質を産生する方法。
【請求項８２】
免疫系を活性化する方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜２５、２８〜４２、４５〜６１、及び６４〜７２のいずれか一項に記載の二重特異性結合タンパク質、又は請求項２６、４３、６２及び７３のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での、２０１６年５月２７日に出願された米国特許仮出願第６２／３４２，３９３号及び２０１６年１０月３１日に出願された米国特許仮出願第６２／４１４，８９７号の優先権を主張するものであり、両方の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的にすでに提出されており、参照によりその全体が組み込まれている配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年５月１７日に作成されたが、３８１４９３−２８４ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは６７４，４４９バイトである。
【０００３】
本出願は、とりわけ、新規の二重特異性結合タンパク質、その新しいタンパク質を含む組成物、そのタンパク質をコードする核酸、及びそのタンパク質を作製及び使用する方法に関係する。
【背景技術】
【０００４】
がん治療は、手術、放射線、及び化学療法を含む、広範囲な治療アプローチを含む。種々のアプローチはがんを処置するために医師が利用できる処置の幅広い選択を与えるが、既存の治療法は、正常で健康な細胞よりもがん細胞のほうを標的にする選択性の欠如及び処置に対するがんによる抵抗性の発現のようないくつかの不利に悩まされている。
【０００５】
標的治療に基づく最近のアプローチは、正常な細胞よりもがん細胞の細胞プロセスを優先的に妨害するが、放射線処置のような非標的治療と比べて副作用の少ない化学療法レジメンを生み出してきた。
【０００６】
がん免疫療法は、特に、宿主の免疫系のＴ細胞を活性化してがん細胞の増殖を妨げる又はがん細胞を死滅させる薬剤の開発は、既存の標準治療を補完する有望な治療アプローチとして登場してきた。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２７巻、４３９〜４４９頁（２０１５）参照。そのような免疫療法アプローチは、免疫系を調節してがん細胞を死滅させるのに使用される抗体の開発を含む。例えば、抗ＰＤ−１ブロッキング抗体ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））及びニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））は、切除不能な又は転移性黒色腫及び転移性非小細胞肺がんのような疾患を処置するのに米国及び欧州連合で承認されている。ＣＴＬＡ−４のような免疫抑制タンパク質を阻害する努力により、トレメリムマブ及びイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））のような抗ＣＴＬＡ−４抗体が開発され臨床評価されてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２７巻、４３９〜４４９頁（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
既存の治療標準ケアを補完する代替アプローチ及び追加のがん処置の必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、２つの抗原に特異的に結合することができる二重特異性結合タンパク質を提供する。結合タンパク質は一般に、免疫グロブリンの可変軽鎖及び可変重鎖領域又はドメインに対応する可変軽鎖及び可変重鎖領域又はドメインを含む。結合タンパク質の少なくとも１つの抗原結合部分は、当技術分野ではｓｃＦｖとして知られる単鎖フォーマットにある。一部の実施形態では、その他の抗原結合部分はＩｇＧを含む。他の実施形態では、その他の抗原結合部分はｓｃＦｖを含む。
【００１０】
したがって、二重特異性結合タンパク質は、ジスルフィド結合を介して互いに連結された２つのポリペプチドを含むことが可能であり、それぞれのポリペプチドはそのそれぞれのＮ及びＣ終端に第１のｓｃＦｖ領域及び第２のｓｃＦｖ領域を含む。２つのｓｃＦｖ領域は異なる抗原に特異的に結合する。それぞれのポリペプチドの第１と第２のｓｃＦｖ領域の間には、免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む配列がある。
【００１１】
代わりに、二重特異性結合タンパク質は、ｓｃＦｖ領域がそれぞれのＣＨ３ドメインのＣ終末端に連結されているＩｇＧを含むことが可能である。この場合、ＩｇＧのＦａｂ領域の可変重鎖及び軽鎖は１つの抗原に特異的に結合し、Ｃ終端ｓｃＦｖ領域は第２の抗原に特異的に結合する異なる可変重鎖及び軽鎖を含む。
【００１２】
上述のように、二重特異性結合タンパク質は２つのドメインを介して２つの異なる抗原に結合することが可能であり、１つはＮ終末端で抗原Ｘに結合し、もう１つはＣ終末端で抗原Ｙに結合する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、例えば、免疫受容体を活性化する免疫調節タンパク質の第１のドメイン、及び腫瘍抗原の第２のドメインに結合する。一特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、第１のドメインを介して結合することによりＣＤ４０を刺激し、第２のドメインを介して腫瘍抗原メソテリンに結合する。別の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、第１のドメインを介して結合することにより４−１ＢＢを刺激し、第２のドメインを介してメソテリンに結合する。そのような場合、二重特異性結合タンパク質は、腫瘍微小環境において免疫応答の標的特異的活性化を提供する。腫瘍微小環境における免疫調節タンパク質のそのような条件的活性化は全身毒性を回避し、免疫学的抗がん剤のより高度な投与及びより広い適用が潜在的に可能になる。
【００１３】
一実施形態では、二重特異性結合タンパク質は式（Ｉ）：
Ｘ−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ  （Ｉ）
の２つのポリペプチドを含み、
ＸはｓｃＦｖＸ又はＦａｂ領域であり、Ｘは第１の抗原に特異的に結合し、ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合し、
Ｈはヒンジ領域であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、
ｓｃＦｖＸ及びｓｃＦｖＹはそれぞれ独立して単鎖可変断片であり、
Ｌはポリペプチドリンカーである。
一部の実施形態では、２つの抗原のうちの１つは免疫調節タンパク質であり、もう１つは腫瘍抗原である。一部の実施形態では、ＸがＦａｂ領域である場合、第１の抗原は腫瘍抗原であり、第２の抗原は免疫調節タンパク質である。一部の実施形態では、ＸがＦａｂ領域である場合、第１の抗原は免疫調節タンパク質であり、第２の抗原は腫瘍抗原である。
【００１４】
二重特異性結合タンパク質に組み込まれているＶＨ及びＶＬ鎖は、既存の抗体、新たに生成された抗体、並びにＶＨ及びＶＬ鎖ライブラリーを含む、複数の供給源に由来していてもよい。二重特異性結合タンパク質に組み込まれてもよいＶＨ及びＶＬ鎖の特定の例示的な実施形態、並びにＣＤ４０又は４−１ＢＢのような免疫調節タンパク質、及びメソテリン、ネクチン−４、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｂ７−Ｈ４、又は表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のような腫瘍抗原への結合について基準抗体と競合する二重特異性結合タンパク質の特定の例示的な実施形態は、詳細な説明のセクションに提供されている。
【００１５】
本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、核酸を含むベクターと同様に、本明細書に提供されている。さらに、開示されているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された原核及び真核宿主細胞、並びに、ヌクレオチド配列を発現するように操作された真核（哺乳動物のような）宿主細胞が本明細書で提供される。宿主細胞を培養しポリペプチドを回収することによる、ポリペプチドを産生する方法も提供され、下の詳細な説明でさらに論じられる。
【００１６】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質を含む組成物を提供する。組成物は一般には、本明細書に記載される１つ以上の二重特異性結合タンパク質、及び／又はその塩、及び１つ以上の賦形剤、担体若しくは希釈剤を含む。
【００１７】
二重特異性タンパク質は、免疫調節タンパク質及び腫瘍抗原のような２つの抗原に特異的に結合し、腫瘍微小環境内の免疫細胞を活性化して抗腫瘍活性を達成する。したがって、本開示は、固形腫瘍があると診断されたヒト対象のような対象を処置する方法を提供する。方法は一般に、治療効果を与えるのに効果的な量の本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質を対象に投与することを含む。対象は、新たに診断された、再発した、又は再発し抵抗性でもよいいくつかの固形腫瘍のいずれか１つを有すると診断されてもよい。二重特異性結合タンパク質は典型的には、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で静脈内注入として投与される。二重特異性結合タンパク質は典型的には、週２回、週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、５週間毎に１回、６週間毎に１回、７週間毎に１回、又は８週間毎に１回静脈内注入として投与される。
【００１８】
二重特異性結合タンパク質は、単一治療剤（単剤療法）とされて投与されてもよく、又は、典型的には固形腫瘍の処置のために使用される治療剤であるが必ずしもそうである必要はない他の治療剤に対する補助療法として、若しくはこれらと併用して、投与されてもよい。治療剤は典型的には、その承認された用量、投与経路、及び投与回数で使用されることになるが、より低い投与量で使用されてもよい。
【００１９】
二重特異性結合タンパク質は、静脈内注入及び／又は注射、腫瘍内注射、並びに皮下注射を含むがこれらに限定されない、種々の投与経路又は様式を介して投与されてもよい。当技術分野では周知であるように、投与される量は、投与経路、投薬スケジュール、処置されるがんの段階、並びに患者の年齢及び体重のような他のパラメータに依拠することになる。治療効果をもたらすと予測される特定の例示的な投薬スケジュールは詳細な説明で提供される。
【００２０】
本明細書に提示されているデータに基づいて、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質は、固形腫瘍があると診断された対象に治療効果をもたらすと予想される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】本開示の二重特異性結合タンパク質フォーマットの描写を示す。ｓｃＦｖ領域を有する本開示の二重特異性結合タンパク質の例示的な実施形態を表す。
【図１Ｂ】本開示の二重特異性結合タンパク質フォーマットの描写を示す。ＩｇＧ領域及びｓｃＦｖ領域を有する本開示の二重特異性結合タンパク質の例示的な実施形態を表す。
【図２Ａ】腫瘍抗原の存在下で免疫調節タンパク質を標的にする場合、条件的活性化を与えない二重特異性結合タンパク質の描写を表す。二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）を表す。
【図２Ｂ】腫瘍抗原の存在下で免疫調節タンパク質を標的にする場合、条件的活性化を与えない二重特異性結合タンパク質の描写を表す。交差している二重可変ドメインタンパク質（ＣＯ−ＤＶＤ）を表す。
【図３Ａ】抗ＣＤ４０抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を、太字で示す。マウス抗ヒトＣＤ４０抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ｍｕＡｂ１〜ｍｕＡｂ３を示す。
【図３Ｂ】抗ＣＤ４０抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を、太字で示す。マウス抗ヒトＣＤ４０抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ｍｕＡｂ４〜ｍｕＡｂ７を示す。
【図３Ｃ】抗ＣＤ４０抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を、太字で示す。マウス抗ヒトＣＤ４０抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ｍｕＡｂ８〜ｍｕＡｂ１０を示す。
【図３Ｄ】抗ＣＤ４０抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を、太字で示す。ヒト化抗ヒトＣＤ４０抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ｍｕＡｂ６及びｍｕＡｂ８に由来する抗体を示す。
【図３Ｅ】抗ＣＤ４０抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を、太字で示す。ヒト化抗ヒトＣＤ４０抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ｍｕＡｂ８及びｍｕＡｂ９に由来する抗体を示す。
【図３Ｆ】抗ＣＤ４０抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を、太字で示す。ヒト化抗ヒトＣＤ４０抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ｍｕＡｂ９に由来する抗体を示す。
【図３Ｇ】抗ＣＤ４０抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を、太字で示す。ヒト化抗ヒトＣＤ４０抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ｍｕＡｂ９に由来するさらなる抗体を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅは、抗メソテリン抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。抗メソテリン抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。ＨｕＡｂ１７及びＨｕＡＭ１〜ＨｕＡＭ４までの配列を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｅは、抗メソテリン抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。抗メソテリン抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。ＨｕＡＭ５〜ＨｕＡＭ９までの配列を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｅは、抗メソテリン抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。抗メソテリン抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。ＨｕＡＭ１１〜ＨｕＡＭ１８までの配列を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｅは、抗メソテリン抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。抗メソテリン抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。ＨｕＡＭ１９、ＨｕＡＭ２１及びＨｕＡＭ１５変異体からの配列を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、抗メソテリン抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。抗メソテリン抗体可変ドメインの典型的なアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。ＭＳＬＮ７６９２３及びＨｕＡＭ１５変異体からの配列を示す。
【図５Ａ】異なるがん細胞株における、漸増量のＣＡ１２５の存在下での抗メソテリン抗体ＨｕＡＭ５、ＨｕＡＭ１１及びＨｕＡＭ１６の結合を示す。ＯＶＣＡＲ−３卵巣がん細胞の結果を表す。
【図５Ｂ】異なるがん細胞株における、漸増量のＣＡ１２５の存在下での抗メソテリン抗体ＨｕＡＭ５、ＨｕＡＭ１１及びＨｕＡＭ１６の結合を示す。ＳＷ１９９０膵がん細胞の結果を表す。
【図５Ｃ】異なるがん細胞株における、漸増量のＣＡ１２５の存在下での抗メソテリン抗体ＨｕＡＭ５、ＨｕＡＭ１１及びＨｕＡＭ１６の結合を示す。ＳＮ１２Ｃ腎臓がん細胞の結果を表す。
【図６Ａ】異なる細胞株における、可溶性ＣＡ１２５の有無における、異なる濃度の抗メソテリン抗体ＨｕＡＭ５、ＨｕＡＭ１１及びＨｕＡＭ１６の結合曲線を表す。メソテリンを発現する２９３細胞の結果を表す。
【図６Ｂ】異なる細胞株における、可溶性ＣＡ１２５の有無における、異なる濃度の抗メソテリン抗体ＨｕＡＭ５、ＨｕＡＭ１１及びＨｕＡＭ１６の結合曲線を表す。ＯＶＣＡＲ−３卵巣がん細胞の結果を表す。
【図７Ａ】例示的な抗４−１ＢＢ抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ラットのＴＡＢＢＹ１０１〜ＴＡＢＢＹ１０３の配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。
【図７Ｂ】例示的な抗４−１ＢＢ抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ラットのＴＡＢＢＹ１０４〜ＴＡＢＢＹ１０６の配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。
【図７Ｃ】例示的な抗４−１ＢＢ抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ラットのＴＡＢＢＹ１０７及びＴＡＢＢＹ１０８の配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。
【図７Ｄ】例示的な抗４−１ＢＢ抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ヒト化抗体の配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。
【図７Ｅ】例示的な抗４−１ＢＢ抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。さらなるヒト化抗体を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。
【図７Ｆ】例示的な抗４−１ＢＢ抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。マウスのＴＡＢＢＹ１．１〜ＴＡＢＢＹ５の配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。
【図７Ｇ】例示的な抗４−１ＢＢ抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。マウスのＴＡＢＢＹ６〜ＴＡＢＢＹ１０の配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。
【図８Ａ】例示的なＣＤ４０及びメソテリンに対する二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。ＬＢ−１及びｈ２４を示す。ＣＤ４０のＣＤＲを太字で示し、メソテリンのＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図８Ｂ】例示的なＣＤ４０及びメソテリンに対する二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。ｈ２６及びＢ３７を示す。ＣＤ４０のＣＤＲを太字で示し、メソテリンのＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図８Ｃ】例示的なＣＤ４０及びメソテリンに対する二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｂ３８及びＢ３９を示す。ＣＤ４０のＣＤＲを太字で示し、メソテリンのＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図８Ｄ】例示的なＣＤ４０及びメソテリンに対する二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｂ４０及びＢ４１を示す。ＣＤ４０のＣＤＲを太字で示し、メソテリンのＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図８Ｅ】例示的なＣＤ４０及びメソテリンに対する二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｂ４２及びＢ４３を示す。ＣＤ４０のＣＤＲを太字で示し、メソテリンのＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図８Ｆ】例示的なＣＤ４０及びメソテリンに対する二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｂ４４及びＢ４５を示す。ＣＤ４０のＣＤＲを太字で示し、メソテリンのＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図８Ｇ】例示的なＣＤ４０及びメソテリンに対する二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｂ４６及びＶ６−２を示す。ＣＤ４０のＣＤＲを太字で示し、メソテリンのＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図８Ｈ】例示的なＣＤ４０及びメソテリンに対する二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｖ６−５及びＶ６−６を示す。ＣＤ４０のＣＤＲを太字で示し、メソテリンのＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図８Ｉ】４−１ＢＢ及びメソテリンに対する例示的な二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。ｈｕ１０６ＭＳＬＮ−１及びｈｕ１０６ＭＳＬＮ−２を示す。４−１ＢＢ  ＣＤＲを太字で示し、メソテリンＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図８Ｊ】４−１ＢＢ及びメソテリンに対する例示的な二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。ｈｕ１０６ＭＳＬＮ−３及びｈｕ１０６ＭＳＬＮ−４を示す。４−１ＢＢ  ＣＤＲを太字で示し、メソテリンＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図８Ｋ】４−１ＢＢ及びメソテリンに対する例示的な二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。ｈｕ１０６ＭＳＬＮ−５及びｈｕ１０６ＭＳＬＮ−６を示す。４−１ＢＢ  ＣＤＲを太字で示し、メソテリンＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図８Ｌ】４−１ＢＢ及びメソテリンに対する例示的な二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。ｈｕ１０７ＭＳＬＮ−１及びｈｕ１０７ＭＳＬＮ−２を示す。４−１ＢＢ  ＣＤＲを太字で示し、メソテリンＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図８Ｍ】４−１ＢＢ及びメソテリンに対する例示的な二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。ｈｕ１０７ＭＳＬＮ−３及びｈｕ１０７ＭＳＬＮ−４を示す。４−１ＢＢ  ＣＤＲを太字で示し、メソテリンＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図９Ａ】メソテリンの存在下における、本開示の二重特異性結合タンパク質による免疫細胞（それぞれ樹状細胞及びＢ細胞）の活性化を表す。黒のバーは、メソテリンのないＨＥＫ２９３細胞（「２９３Ｓ」）と共培養した免疫細胞の結果を表し、白のバーは、細胞表面にヒトメソテリンを発現するＨＥＫ２９３細胞（「２９３Ｓ  ｈｕＭＳＬＮ」）と共培養した免疫細胞の結果を表す。樹状細胞（ＤＣ）のＩＬ−１２ｐ７０レベル（ｙ軸）を示す。
【図９Ｂ】メソテリンの存在下における、本開示の二重特異性結合タンパク質による免疫細胞（それぞれ樹状細胞及びＢ細胞）の活性化を表す。黒のバーは、メソテリンのないＨＥＫ２９３細胞（「２９３Ｓ」）と共培養した免疫細胞の結果を表し、白のバーは、細胞表面にヒトメソテリンを発現するＨＥＫ２９３細胞（「２９３Ｓ  ｈｕＭＳＬＮ」）と共培養した免疫細胞の結果を表す。ｙ軸で毎分カウント数（ＣＰＭ）におけるＢ細胞増殖を示す。
【図１０Ａ】免疫調節性タンパク質ＣＤ４０又は４−１ＢＢ、並びに腫瘍抗原ネクチン−４、ＥＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ４又はＰＳＭＡに対する抗体可変ドメイン又は対応する二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。ネクチン−４、ＥＧＦＲ又はＰＳＭＡに対する例示的な抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ＣＤＲアミノ酸配列を太字で示す。
【図１０Ｂ】免疫調節性タンパク質ＣＤ４０又は４−１ＢＢ、並びに腫瘍抗原ネクチン−４、ＥＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ４又はＰＳＭＡに対する抗体可変ドメイン又は対応する二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。ＣＤ４０及びネクチン−４と結合する例示的な二重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表す。ＣＤ４０のＣＤＲを太字で示し、ネクチン−４のＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図１０Ｃ】免疫調節性タンパク質ＣＤ４０又は４−１ＢＢ、並びに腫瘍抗原ネクチン−４、ＥＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ４又はＰＳＭＡに対する抗体可変ドメイン又は対応する二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。ＣＤ４０及びＰＳＭＡと結合する例示的な二重特異性結合タンパク質Ｒ８９及びＲ９０のアミノ酸配列を表す。ＣＤ４０のＣＤＲを太字で示し、腫瘍抗原のＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図１０Ｄ】免疫調節性タンパク質ＣＤ４０又は４−１ＢＢ、並びに腫瘍抗原ネクチン−４、ＥＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ４又はＰＳＭＡに対する抗体可変ドメイン又は対応する二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。ＣＤ４０及びＥＧＦＲと結合する例示的な二重特異性結合タンパク質Ａ１６及びＡ１７のアミノ酸配列を表す。ＣＤ４０のＣＤＲを太字で示し、腫瘍抗原のＣＤＲを太字下線で示し、定常領域をイタリック点線下線で示す。
【図１０Ｅ】免疫調節性タンパク質ＣＤ４０又は４−１ＢＢ、並びに腫瘍抗原ネクチン−４、ＥＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ４又はＰＳＭＡに対する抗体可変ドメイン又は対応する二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｂ７−Ｈ４に対する例示的なマウス及びヒト化抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。マウス１８２．１９．１、ヒト化１８２．１９．１及びマウス１８２．１７．１を示す。ＣＤＲのアミノ酸配列を太字で示す。
【図１０Ｆ】免疫調節性タンパク質ＣＤ４０又は４−１ＢＢ、並びに腫瘍抗原ネクチン−４、ＥＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ４又はＰＳＭＡに対する抗体可変ドメイン又は対応する二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｂ７−Ｈ４に対する例示的なマウス及びヒト化抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。マウス１８２．１０．２１、並びに１８２．１７．１、１８２．１９．１及び１８２．１０．２１のヒト化バージョンを示す。ＣＤＲのアミノ酸配列を太字で示す。
【図１０Ｇ】免疫調節性タンパク質ＣＤ４０又は４−１ＢＢ、並びに腫瘍抗原ネクチン−４、ＥＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ４又はＰＳＭＡに対する抗体可変ドメイン又は対応する二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｂ７−Ｈ４に対する例示的なマウス及びヒト化抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。マウス１８１．２３．１、並びに１８２．１０．２１及び１８１．２３．１のヒト化バージョンを示す。ＣＤＲのアミノ酸配列を太字で示す。
【図１０Ｈ】免疫調節性タンパク質ＣＤ４０又は４−１ＢＢ、並びに腫瘍抗原ネクチン−４、ＥＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ４又はＰＳＭＡに対する抗体可変ドメイン又は対応する二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。４−１ＢＢ及びＢ７−Ｈ４と結合する例示的な二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｈｕ１０６Ｂ７Ｈ４−１及びＨｕ１０６Ｂ７Ｈ４−２を示す。４−１ＢＢのＣＤＲを太字で示し、Ｂ７−Ｈ４のＣＤＲを太字下線で示す。
【図１０Ｉ】免疫調節性タンパク質ＣＤ４０又は４−１ＢＢ、並びに腫瘍抗原ネクチン−４、ＥＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ４又はＰＳＭＡに対する抗体可変ドメイン又は対応する二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。４−１ＢＢ及びＢ７−Ｈ４と結合する例示的な二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。Ｈｕ１０６Ｂ７Ｈ４−３及びＨｕ１０６Ｂ７Ｈ４−４を示す。４−１ＢＢのＣＤＲを太字で示し、Ｂ７−Ｈ４のＣＤＲを太字下線で示す。
【図１０Ｊ】免疫調節性タンパク質ＣＤ４０又は４−１ＢＢ、並びに腫瘍抗原ネクチン−４、ＥＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ４又はＰＳＭＡに対する抗体可変ドメイン又は対応する二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。ＰＳＭＡに対する例示的な抗体可変ドメインのアミノ酸配列を表す。ＣＤＲのアミノ酸配列を太字で示す。
【図１０Ｋ】免疫調節性タンパク質ＣＤ４０又は４−１ＢＢ、並びに腫瘍抗原ネクチン−４、ＥＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ４又はＰＳＭＡに対する抗体可変ドメイン又は対応する二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。ＰＳＭＡに対する抗体可変ドメインのさらなる配列を表す。ＣＤＲのアミノ酸配列を太字で示す。
【図１０Ｌ】免疫調節性タンパク質ＣＤ４０又は４−１ＢＢ、並びに腫瘍抗原ネクチン−４、ＥＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ４又はＰＳＭＡに対する抗体可変ドメイン又は対応する二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。４−１ＢＢ及びＰＳＭＡと結合する例示的な二重特異性タンパク質のアミノ酸配列を表す。４−１ＢＢのＣＤＲを太字で示し、ＰＳＭＡのＣＤＲを太字下線で示す。
【図１１Ａ】ＣＤ４０、及びネクチン−４又はＰＳＭＡと結合する二重特異性結合タンパク質の、Ｂ細胞を含む各種の共培養における効果を表す。ＣＤ４０及びネクチン−４と結合する二重特異性タンパク質Ｒ８７の、Ｂ細胞単独培養（上グラフ）、ＨＥＫ２９３細胞（中グラフ）とのＢ細胞の共培養、及びネクチン−４を発現するＨＥＫ２９３細胞とのＢ細胞の共培養（下グラフ）、における、アイソタイプ対照、抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ６−１又は抗ネクチン−４抗体６６．３と比較した効果を表す。
【図１１Ｂ】ＣＤ４０、及びネクチン−４又はＰＳＭＡと結合する二重特異性結合タンパク質の、Ｂ細胞を含む各種の共培養における効果を表す。ＣＤ４０及びＰＳＭＡと結合する二重特異性タンパク質Ｒ８９の、４Ｔ１細胞と培養したＢ細胞（上グラフ）、及びＰＳＭＡを発現する４Ｔ１細胞とのＢ細胞の共培養（下グラフ）における、アイソタイプ対照、抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ６−１又は抗ＰＳＭＡ抗体ＳＡＭ３．１と比較した効果を表す。
【図１２Ａ】ＦＡＣＳアッセイにおける、４−１ＢＢ及びメソテリンと結合する二重特異性結合タンパク質の効果を表す。ｈｕ１０６ＭＳＬＮ−１〜ｈｕ１０６ＭＳＬＮ−４の効果を示す。グラフは、４−１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞（上グラフ）、又はメソテリンを発現するＨＥＫ２９３細胞（下グラフ）の存在下での結合を示す。
【図１２Ｂ】ＦＡＣＳアッセイにおける、４−１ＢＢ及びメソテリンと結合する二重特異性結合タンパク質の効果を表す。ｈｕ１０７ＭＳＬＮ−１〜ｈｕ１０７ＭＳＬＮ−４の効果を示す。グラフは、４−１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞（上グラフ）、又はメソテリンを発現するＨＥＫ２９３細胞（下グラフ）の存在下での結合を示す。
【図１３】ＮＦ−κＢによって、引き起こされるルシフェラーゼ遺伝子発現により測定される、メソテリンと結合する４−１ＢＢ二重特異性タンパク質のアゴニスト活性を表す。上グラフは、Ｆｃクロスリンカーの存在下での、４−１ＢＢをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に対する効果を表し、下グラフは、Ｆｃクロスリンカーなしでの効果を表す。
【図１４Ａ】細胞表面メソテリンの有無における、ＨＥＫ２９３細胞の存在下での、メソテリンと結合する４−１ＢＢ二重特異性タンパク質の活性を表す。上グラフは、メソテリンを発現するＨＥＫ２９３細胞における効果を表し、下グラフは、モックトランスフェクト体のＨＥＫ２９３細胞における効果を表す。ｈｕ１０６ＭＳＬＮ−１〜ｈｕ１０６ＭＳＬＮ−４の効果を示す。
【図１４Ｂ】細胞表面メソテリンの有無における、ＨＥＫ２９３細胞の存在下での、メソテリンと結合する４−１ＢＢ二重特異性タンパク質の活性を表す。上グラフは、メソテリンを発現するＨＥＫ２９３細胞における効果を表し、下グラフは、モックトランスフェクト体のＨＥＫ２９３細胞における効果を表す。ｈｕ１０７ＭＳＬＮ−１〜ｈｕ１０７ＭＳＬＮ−４の効果を示す。
【図１５Ａ】本開示の４−１ＢＢ及びメソテリンと結合する二重特異性結合タンパク質による、条件的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を表す。メソテリンを発現するＣＴ２６細胞の存在下での（上グラフ）、又はメソテリンのないＣＴ２６細胞の存在下での（下グラフ）、毎分カウント数（ｃｐｍ）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞増殖効果を示す。
【図１５Ｂ】本開示の４−１ＢＢ及びメソテリンと結合する二重特異性結合タンパク質による、条件的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を表す。メソテリンを発現するＣＴ２６細胞の存在下での（上グラフ）、又はメソテリンのないＣＴ２６細胞の存在下での（下グラフ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのインターフェロンγ分泌を示す。
【図１５Ｃ】本開示の４−１ＢＢ及びメソテリンと結合する二重特異性結合タンパク質による、条件的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を表す。メソテリンを発現するＰＣ３細胞（上グラフ）又はＰＣ３細胞（下グラフ）の存在における、ＣＤ８＋Ｔ細胞からインターフェロンγ分泌に対する二重特異性タンパク質投与の効果を示す。
【図１５Ｄ】４−１ＢＢ及びＰＳＭＡと結合する式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質の効果を示す。マウスＰＳＭＡを発現するＣＴ２６細胞（上グラフ）又はマウス４−１ＢＢを発現するＨＥＫ２９３細胞（下グラフ）の存在下での結合を示す、ＦＡＣＳアッセイにおける、例示的な二重特異性タンパク質の効果を示す。
【図１５Ｅ】４−１ＢＢ及びＰＳＭＡと結合する式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質の効果を示す。細胞表面ＰＳＭＡの有無における、ＣＴ２６細胞の存在下での、例示的な二重特異性タンパク質ＮＦκＢの活性化により測定されるアゴニスト活性を示し、上グラフは、マウスＰＳＭＡを発現するＣＴ２６細胞における効果を表し、下グラフは、モックトランスフェクト体のＣＴ２６細胞における効果を表す。
【図１６】図１６は、ＤＣ及びＴ細胞と、メソテリンを発現するＰＣ３腫瘍細胞との共培養における、アイソタイプ対照抗体と比較した、ＣＤ４０及びメソテリンと結合する式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質の効果を示す。
【図１７Ａ】ＣＤ４０、及びメソテリン（「ＭＳＬＮ」）、ＰＳＭＡ又はネクチン−４と結合する式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質のマウスＰＣ３がん細胞モデルにおける効果を示す。メソテリンを発現するＰＣ３腫瘍における二重特異性結合タンパク質ｈ２４の効果（上グラフ）、及びＰＳＭＡを発現するＰＣ３腫瘍における二重特異性結合タンパク質Ｒ８９の効果（下グラフ）を示す。
【図１７Ｂ】ＣＤ４０、及びメソテリン（「ＭＳＬＮ」）、ＰＳＭＡ又はネクチン−４と結合する式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質のマウスＰＣ３がん細胞モデルにおける効果を示す。ネクチン−４を発現するＰＣ３腫瘍における二重特異性結合タンパク質Ｒ８７の効果（上グラフ）、及びメソテリン発現のないＰＣ３腫瘍における二重特異性結合タンパク質ｈ２４の効果（下グラフ）を示す。
【図１８】抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０及び二重特異性結合タンパク質ＬＢ−１の、メソテリンを発現する４Ｔ１同系腫瘍（「４Ｔ１  ＭＳＬＮ」）を担持するマウスの腫瘍体積に対する効果を示す。
【図１９】抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０、抗メソテリン抗体ＭＯＲ０６６２６又は二重特異性結合タンパク質ＬＢ−１の投与による、メソテリンを発現する４Ｔ１同系腫瘍を担持するマウスの肝酵素ＡＬＴレベル（ｍｇ／ｄＬ）に対する効果を表す。
【図２０】５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０  ｍＩｇＧ１（「１Ｃ１０」）、マウスＩｇＧ１（「アイソタイプ」）及び二重特異性結合タンパク質ＬＢ−１（「ＬＢ−１」）の投与後のマウスにおける、サイトカインであるインターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦａ」）、ケラチノサイト化学誘引物質（「ＫＣ」）、インターフェロンガンマにより誘発されたタンパク質１０（「ＩＰ−１０」）及びインターフェロンガンマ（「ＭＩＧ」）により誘導されるモノカインのレベルに対する効果を表す。
【図２１】図２１は、ＣＴ２６−ＰＳＭＡ腫瘍を担持する同系免疫適格Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍体積上の抗−４−１ＢＢ抗体、抗−４−１ＢＢ抗ＰＳＭＡ結合タンパク質又はアイソタイプ対照の繰り返し投与の効果を表す。ｍｕＩｇＧ１定常領域及びＴ２５２Ｍ突然変異を有する抗−４−１ＢＢ抗体ｈｕ１０６−１（「ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１  Ｔ２５２Ｍ」）、二重特異性結合タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３若しくはＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４、又はアイソタイプ対照ＴＩＢ１９１  ｍＩｇＧ１を、計３回投与した。投与は、矢印で示されるように接種後１８、２０及び２２日目に実施した。ｙ軸は、腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、ｘ軸は、接種後の日数を示す。
【図２２Ａ】ＣＴ２６−ＰＳＭＡ腫瘍を担持する同系免疫適格性Ｂａｌｂ／ｃマウスへの、抗−４−１ＢＢ抗体、抗−４−１ＢＢ抗ＰＳＭＡ結合タンパク質又はアイソタイプ対照の反復投与の後の個々の動物の腫瘍体積を表す。ＴＩＢ１９１  ｍＩｇＧ１（上グラフ）及び抗−４−１ＢＢ抗体ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１  Ｔ２５２Ｍ（下グラフ）を投与した動物におけるデータを示す。抗−４−１ＢＢ抗ＰＳＭＡ結合タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３（上グラフ）及びＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４（下グラフ）を投与した動物におけるデータを示す。矢印で示すように、接種後１８、２０及び２２日目に投与を行った。ｙ軸は、腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、ｘ軸は、接種後の日数を示す。
【図２２Ｂ】ＣＴ２６−ＰＳＭＡ腫瘍を担持する同系免疫適格性Ｂａｌｂ／ｃマウスへの、抗−４−１ＢＢ抗体、抗−４−１ＢＢ抗ＰＳＭＡ結合タンパク質又はアイソタイプ対照の反復投与の後の個々の動物の腫瘍体積を表す。抗−４−１ＢＢ抗ＰＳＭＡ結合タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３（上グラフ）及びＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４（下グラフ）を投与した動物におけるデータを示す。矢印で示すように、接種後１８、２０及び２２日目に投与を行った。ｙ軸は、腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、ｘ軸は、接種後の日数を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ＣＴ２６−ＰＳＭＡ腫瘍を担持する同系免疫適格性Ｂａｌｂ／ｃマウスへの、抗−４−１ＢＢ抗体、抗−４−１ＢＢ抗ＰＳＭＡ結合タンパク質又はアイソタイプ対照の繰り返し投与後の、血清中サイトカインレベルを表す。単球化学誘引物質であるタンパク質−１（「ＭＣＰ−１」、上グラフ）、及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」、下グラフ）の血清中レベルを示す。ｙ軸は、血清サイトカインレベル（ｐｇ／ｍＬ）を示し、ｘ軸は、対照抗体ＴＩＢ１９１  ｍＩｇＧ１、抗−４−１ＢＢ抗体ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１  Ｔ２５２Ｍ、結合タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３又はＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ＣＴ２６−ＰＳＭＡ腫瘍を担持する同系免疫適格性Ｂａｌｂ／ｃマウスへの、抗−４−１ＢＢ抗体、抗−４−１ＢＢ抗ＰＳＭＡ結合タンパク質又はアイソタイプ対照の繰り返し投与後の、血清中サイトカインレベルを表す。インターロイキン−６（「ＩＬ−６」、上グラフ）及びケラチノサイト化学誘引物質（「ＫＣ」、下グラフ）の血清中レベルを示す。ｙ軸は、血清サイトカインレベル（ｐｇ／ｍＬ）を示し、ｘ軸は、対照抗体ＴＩＢ１９１  ｍＩｇＧ１、抗−４−１ＢＢ抗体ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１  Ｔ２５２Ｍ、結合タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３又はＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４を示す。
【図２３Ｃ】ＣＴ２６−ＰＳＭＡ腫瘍を担持する同系免疫適格性Ｂａｌｂ／ｃマウスへの抗−４−１ＢＢ抗体、抗−４−１ＢＢ抗ＰＳＭＡ結合タンパク質又はアイソタイプ対照の繰り返し投与後の、マウス肝臓試料におけるＣＤ４５＋染色を表す。ｙ軸は、％ＣＤ４５＋染色を示し、ｘ軸は、対照抗体ＴＩＢ１９１  ｍＩｇＧ１、抗−４−１ＢＢ抗体ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１  Ｔ２５２Ｍ、結合タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３又はＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
７．詳細な説明
７．１．略語
本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質及びポリヌクレオチドは、多くの実施形態で、そのそれぞれのポリペプチド又はポリヌクレオチド配列として記載されている。他の方法で指示されていなければ、ポリペプチド配列はＮ→Ｃ方向で、ポリヌクレオチド配列は５’→３’方向で提供される。ポリペプチド配列では、下の表１に記されるように、遺伝子にコードされたアミノ酸を表す従来の３文字又は１文字略語が使用されている。
【００２３】
【表１】
2019519223.tif 000002
【００２４】
ある特定の配列は、ある特定のクラス（例えば、脂肪族、疎水性等）に属するアミノ酸残基を特定する構造式により定義される。遺伝子にコードされたアミノ酸が属し、本明細書で使用される種々のクラスは、下の表２に記されている。一部のアミノ酸は１つよりも多いクラスに属していてもよい。システインはスルフヒドリル基を含有し、プロリンは立体構造的に制約されており、クラスに割り当てられていない。
【００２５】
【表２】
2019519223.tif 000003
【００２６】
７．２．定義
本明細書において他の方法で定義されていなければ、本開示に関連して使用される科学及び専門用語は、当業者が一般に理解している意味を有する。
【００２７】
本明細書で使用されるように、結合タンパク質アミノ酸の番号付けは、他の方法で指示されていなければ、Ｋａｂａｔ  ＥＵ命名法に従って行われる。
【００２８】
７．３．二重特異性結合タンパク質
７．３．１．二重特異性フォーマット
理解を助けるため、二重特異性結合タンパク質の２つの例示的な実施形態が図１Ａ〜１Ｂに例示されている。図１Ａに関しては、１つの例示的な実施形態はジスルフィド結合（１７）を介して互いに連結された２つのポリペプチドを含む。それぞれのポリペプチドは、ＶＨ領域（１０ａ又は１０ｂ）及びそれぞれのポリペプチドリンカー（１２ａ又は１２ｂ）により互いに連結されたそれぞれのＶＬ領域（１４ａ又は１４ｂ）を含む。ＶＨ１０ａ、ＶＬ１４ａ及びリンカー１２ａは、一緒になって単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を構成し、本明細書ではｓｃＦｖａと呼ばれる。同様に、ＶＨ１０ｂ、ＶＬ１４ｂ及びリンカー１２ｂがｓｃＦｖｂを構成する。ＶＬ領域（１４ａ又は１４ｂ）はヒンジ領域（それぞれ１６ａ又は１６ｂ）に融合しており、ヒンジ領域は今度はＦｃ領域に融合し、Ｆｃ領域はＣＨ３ドメイン（それぞれ２０ａ又は２０ｂ）に融合しているＣＨ２ドメイン（それぞれ１８ａ又は１８ｂ）を含む。ｓｃＦｖａＸ又はｓｃＦｖｂＸ領域は同じ又は異なる抗原に結合してもよいが、多くの実施形態では同じ抗原に結合する。図示されるように、ｓｃＦｖａＸ及びｓｃＦｖｂＸは第１の抗原（抗原Ｘ）に特異的に結合する。
【００２９】
図１Ａの結合タンパク質は第２のｓｃＦｖ、ｓｃＦｖＹを含み、これは可変鎖リンカー（それぞれ２６ａ又は２６ｂ）を介して互いに連結された第２のＶＬ領域（２４ａ又は２４ｂ）（すなわち、ＶＬＹ）及び第２のＶＨ領域（それぞれ２８ａ又は２８ｂ）（すなわち、ＶＨＹ）を含む。一緒になってＶＨ２８ａ、可変鎖リンカー２６ａ、及びＶＬ２４ａはｓｃＦｖ、ｓｃＦｖａＹを構成し、これはリンカー２２ａを介してＣＨ３ドメイン２０ａのＣ終末端に結合している。同様に、ＶＨ２８ｂ、可変鎖リンカー２６ｂ、及びＶＬ２４ｂはｓｃＦｖｂＹを構成し、これはリンカー２２ｂによりＣＨ３ドメイン２０ｂのＣ終端に結合している。２つの部分ｓｃＦｖａＹ及びｓｃＦｖｂＹは同じ又は異なる抗原に結合してもよいが、多くの実施形態では同じ抗原に結合する。一部の実施形態では、ｓｃＦｖａＹ及びｓｃＦｖｂＹは第２の抗原（抗原Ｙ）に特異的に結合する。
【００３０】
図１Ｂに言及すると、別の例示的な実施形態は、それぞれのＣＨ３ドメイン２０ａ又は２０ｂのＣ終末端でリンカー２２ａ又は２２ｂを介してそれぞれｓｃＦｖに連結しているＩｇＧを含む。ＩｇＧ部分は２つのＶＨ（１０ａ又は１０ｂ）及び２つのＶＬ（１４ａ又は１４ｂ）ドメインを含み、それぞれがその対応するＣＨ１（３０ａ又は３０ｂ）及びＣＬ（３２ａ又は３２ｂ）領域に結合している。当技術分野では公知のように、ＩｇＧ  ＣＨ１領域（３０ａ又は３０ｂ）は対応するヒンジ（それぞれ１６ａ又は１６ｂ）に結合しており、このヒンジはＦｃ領域に融合して、Ｆｃ領域はＣＨ３ドメイン（２０ａ又は２０ｂ）に融合しているＣＨ２ドメイン（１８ａ又は１８ｂ）を含む。ＣＨ３ドメイン２０ａ又は２０ｂのＣ終端のそれぞれにはリンカー２２ａ又は２２ｂがあり、それぞれｓｃＦｖのＶＬ２４ａ又は２４ｂに連結している。次に、ＶＬ２４ａ又は２４ｂはリンカー２６ａ又は２６ｂを介してそれぞれＶＨ２８ａ又は２８ｂに連結している。
【００３１】
Ｆａｂドメインを構成しているＣＨ１領域３０ａ及び３０ｂ、並びにＣＬ領域３２ａ及び３２ｂは独立してＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４領域でもよい。ＣＨ１領域３０ａ及び３０ｂは同じでも異なっていてもよいが、多くの実施形態では、同じである。同様に、ＣＬ領域３２ａ及び３２ｂは同じでも異なっていてもよいが、多くの実施形態では同じである。
【００３２】
それぞれＶＬ及びＶＨ領域を連結しているリンカー１２ａ又は１２ｂは、同じでも異なっていてもよいが、大半の実施形態では同じである。同様に、リンカー２６ａ又は２６ｂは同じでも異なっていてもよいが、大半の実施形態では、同じであり、リンカー１２ａ又は１２ｂと同じでもよい。一部の実施形態では、リンカー１２ａ又は１２ｂは同じである。一部の実施形態では、リンカー２６ａ又は２６ｂは同じである。ＶＨとＶＬ鎖を連結するのに有用なリンカーの特定の配列は後のセクションで提供される。
【００３３】
上の図１Ａに記すように、ｓｃＦｖａＸ及びｓｃＦｖｂＸは第１の抗原（抗原Ｘ）に特異的に結合する。結合特異性、並びに親和性はＶＨ鎖（１０ａ又は１０ｂ）（すなわち、ＶＨＸ）及びＶＬ鎖（それぞれ１４ａ又は１４ｂ）（すなわち、ＶＬＸ）により分け与えられる。本開示の結合タンパク質及び図１Ａに表されている特定の実施形態では、ＶＨ１４ａ及び１４ｂを含むそれぞれのＣＤＲは、全体のＶＨ鎖と同様に、同じでも異なっていてもよい。特定の実施形態では、ＶＨ１４ａ及び１４ｂは同じであり、ＶＬ１０ａ及び１０ｂは同じである。
【００３４】
同様に、ｓｃＦｖａＹ及びｓｃＦｖｂＹは第２の抗原（抗原Ｙ）に特異的に結合する。結合特異性、並びに親和性はＶＨ鎖（２８ａ又は２８ｂ）（すなわち、ＶＨＹ）及びＶＬ鎖（それぞれ２４ａ又は２４ｂ）（すなわち、ＶＬＹ）により分け与えられる。本開示の結合タンパク質並びに図１Ａ及び１Ｂに表されている特定の実施形態では、ＶＨ２８ａ及び２８ｂを含むそれぞれのＣＤＲは、全体のＶＨ鎖と同様に、同じでも異なっていてもよい。特定の実施形態では、ＶＨ２８ａ及び２８ｂは同じであり、ＶＬ２４ａ及び２４ｂは同じである。
【００３５】
当技術分野では公知のように、それぞれのＶＨ鎖は本明細書では（Ｎ→Ｃ順に）ＶＨＣＤＲ＃１、ＶＨＣＤＲ＃２及びＶＨＣＤＲ＃３と呼ばれる３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有し、それぞれのＶＬ鎖は本明細書では（Ｎ→Ｃ順に）ＶＬＣＤＲ＃１、ＶＬＣＤＲ＃２及びＶＬＣＤＲ＃３と呼ばれる３つのＣＤＲを有する。目的の特定の抗原に結合するのに有用である特定の例示的なＣＤＲ、ＶＨ及びＶＬ配列は後のセクションで提供される。
【００３６】
本開示の二重特異性結合タンパク質、例えば、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質を構成するｓｃＦｖ領域は、一緒になって抗原に特異的に結合するＶＨ及びＶＬ領域を含む。二重特異性結合タンパク質に組み込まれているＶＨ及びＶＬ領域並びにＣＤＲは、既存の抗体、新たに生成された抗体、ＶＨ及びＶＬ鎖ライブラリー、ＣＤＲライブラリー又は合成配列を含む複数の供給源に由来していてもよい。ｓｃＦｖ内のＶＨ及びＶＬ鎖は、ＶＨ及びＶＬ領域の抗原結合特性を著しく妨げないポリペプチドリンカーにより連結されている。ｓｃＦｖ領域はＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨ配向（Ｎ→Ｃ方向）を有することが可能であり、配向はｓｃＦｖＸ及びｓｃＦｖＹの間で同じでも異なっていてもよい。したがって、ＮとＣ終端の両方にｓｃＦｖ領域を含む二重特異性結合タンパク質では、可変鎖の配向は、ＶＨＸ−ＶＬＸ及びＶＬＹ−ＶＨＹ；ＶＨＸ−ＶＬＸ及びＶＨＹ−ＶＬＹ；ＶＬＸ−ＶＨＸ及びＶＬＹ−ＶＨＹ；又はＶＬＸ−ＶＨＸ及びＶＨＹ−ＶＬＹであり得る。上記及び図１Ａに図示される例では、二重特異性結合タンパク質は、ＶＨＸ−ＶＬＸ及びＶＬＹ−ＶＨＹの可変鎖配向を有するポリペプチドを含む。
【００３７】
本開示の一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は条件的活性化を示し、これにより二重特異性結合タンパク質は、細胞表面腫瘍抗原の存在下では免疫調節タンパク質の活性化を与え、細胞表面腫瘍抗原の非存在下では与える免疫調節タンパク質の活性化は減少する、最小になる又はゼロになる。これとは対照的に、図２Ａ〜２Ｂに示される二重特異性結合タンパク質は条件的活性化を与えない。図２Ａは一実施形態を二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）フォーマットで表し、そこでは２つの可変領域１及び２が、２つの抗原に特異的に結合するが、ＩｇＧ定常領域との融合に先立って縦に並んで連結している。図２Ｂは、クロスオーバー二重可変ドメイン（ＣＯ−ＤＶＤ）の二重特異性タンパク質を示しており、そこでは可変領域１及び２が、２つの抗原に特異的に結合するが、より長いリンカー領域により縦に並んで連結され、ＩｇＧ定常領域にも融合している。
【００３８】
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、単鎖可変断片ＶＨ鎖をＶＬ鎖と連結させるリンカーを含み、リンカーはそれぞれの例で独立して、下の表の配列のうちの１つから選択される配列に対応する配列を有する。
【００３９】
【表３】
2019519223.tif 000004
【００４０】
単鎖可変断片ＶＨ鎖をＶＬ鎖と連結させるリンカーは、発現、可溶性、安定性（例えば、より低い凝集レベル、より低い凝集速度、より高い融解温度、及び／又はより長い血漿半減期により測定した場合）及び／又は本開示の二重特異性結合タンパク質の力価を増加させるように選択してもよい。
【００４１】
当技術分野では公知のように、ヒンジ領域１６ａ及び１６ｂは可変領域１４ａ及び１４ｂをそれぞれＣＨ２ドメインの１８ａ及び１８ｂに連結する。当技術分野では公知である変異ヒンジ領域同様に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ヒンジ領域を使用してもよい。
【００４２】
ある特定の特徴を最適化するために、本開示の二重特異性結合タンパク質においてヒンジ領域変異体を使用することが可能である。実例では、断片化及び／又は凝集のレベル又は速度を低減するためにヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒンジ領域内の１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を導入することが可能である。そのような改変は、例えば、Ｃｏｈｅｎ、Ｓ．Ｌ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１２９（２２）、６９７６〜６９７７頁（２００７）により記載されている。特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、変異ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４、例えば、アミノ酸置換Ｃ２１９Ｓ及び／又はＣ２２０Ｓを含むＩｇＧ１又はＩｇＧ２ヒンジ領域を含む。米国特許出願公開第２０１０／０２２６９２５号参照。別の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。
【００４３】
本明細書で使用されるように、「定常領域」は抗体及びアロタイプの天然の定常領域又はヒトＩｇＧ１におけるＤ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍ、若しくはＡ４３１Ｇ等の天然の変異体を含む。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ、ＭＡｂｓ、１（４）：３３２〜３３８頁（Ｊｕｌ−Ａｕｇ  ２００９）参照。軽鎖定常領域はカッパ（κ）軽鎖領域又はラムダ（λ）領域でもよい。λ軽鎖領域は既知のサブタイプ、例えば、λ１、λ２、λ３又はλ４のいずれか１つが可能である。一部の実施形態では、λ軽鎖領域は、対応する野生型配列と比べた場合、Ｃ終端残基切断を有する。例えば、Ｓｈｅｎら、ＭＡｂｓ、５（３）：４１８〜４３１頁（２０１３年５月〜６月）参照。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体はカッパ（κ）軽鎖領域を含む。
【００４４】
ＩｇＧの断片結晶化可能（Ｆｃ）領域では標準的なことであるように、ＣＨ２ドメイン１８ａ及び１８ｂはそのそれぞれＣＨ３ドメイン２０ａ及び２０ｂと融合している。当技術分野では公知である変異定常領域同様に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４定常領域由来のＣＨ３領域を使用してもよく、同じでも異なっていてもよいが、多くの実施形態では同じである。
【００４５】
例示的な定常領域変異体は「突然変異体３」（米国特許第５，８３４，５９７号の図４に示されている）と一致しており、残基２３４及び２３７（ＥＵ番号付けを使用）はアラニンで置換されている。突然変異体３（「Ｍ３」としても知られる）変異体はいくつかのアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ２で使用可能である。
【００４６】
Ｓ２２８Ｐを持つ（すなわち、セリン残基がプロリンで置換されている）別の例示的な定常領域変異体はＩｇＧ４で使用可能である。Ａｎｇａｌ、Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３０、１０５〜１０８頁（１９９３）及びＢｌｏｏｍ、Ｊ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６：４０７〜５１４頁（１９９７）参照。
【００４７】
本開示の二重特異性結合タンパク質は、その配列が少なくとも１つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能を変更するように改変されているタンパク質であってもよい。例えば、一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、非改変結合タンパク質と比べて、１つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能を低減する（例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）への結合が低減されている）ように改変されてもよい。ＦｃγＲ結合は、結合タンパク質の免疫グロブリン定常領域セグメント、特にＦｃγＲ相互作用に必要な領域を突然変異させることにより、低減してもよい（例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３〜１４９１頁；及びＬｕｎｄら、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７〜２６６２頁参照）。ＦｃγＲ結合を低減すれば、オプソニン作用、食作用及び抗原依存性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）のようなＦｃγＲ相互作用を利用する他のエフェクター機能も低減することができる。
【００４８】
本開示の二重特異性結合タンパク質は、対応する野生型ＣＨ２又はＦｃ領域の結合と比べて、ＦｃγＲＩＩＢへの結合を増大させる及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減するアミノ酸置換を含む改変（又は変異）ＣＨ２ドメイン又は全Ｆｃドメインを含むことが可能である。本開示の結合タンパク質は、モノマー又はマルチマー（例えば、ダイマー又はテトラマー）であってもよく、それぞれのモノマー単位は１つ以上のＣＨ２又はＦｃドメインを含む。変異ＣＨ２又は変異Ｆｃドメインは、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３７７２５３号に記載されている。変異ＣＨ２又は変異Ｆｃドメインは典型的には、２６３位、２６６位、２７３位、及び３０５位に１つ以上の置換を含み、Ｆｃドメインでの残基の番号付けはＫａｂａｔでと同じＥＵインデックスの番号付けである。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、野生型ＣＨ２ドメインと比べて、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５Ｋ及びＶ３０５Ｗから選択される１つ以上の置換を含む。特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインの１つ以上の置換は、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインと比べて、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ及びＶ２７３Ｙから選択される。例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインの１つ以上の置換はＶ２７３Ｅが可能である。別の特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、アミノ酸置換Ｖ２６３Ｌを含む変異ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む。
【００４９】
対応する野生型ＣＨ２又はＦｃ領域の結合と比べて、ＦｃγＲＩＩＢへの結合を増大させ得る及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減し得る変異ＣＨ２又は変異Ｆｃドメインの他の例は、Ｓ２６７Ｅ又はＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦのようなＶｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９（５）、１０３５〜１０４３頁（２０１３）に見られるものを含む。
【００５０】
本開示の二重特異性結合タンパク質は、例えば、ＦｃＲｎ相互作用に関与する特定の領域で免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異することにより、新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対するその結合親和性を増加する又は減少する改変を含んでいてもよい（例えば、国際公開第２００５／１２３７８０号参照）。特定の実施形態では、ＩｇＧクラスの二重特異性結合タンパク質は、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４及び４２８のうちの少なくとも１つが、単独で又は２５０と４２８位で、若しくは２５０と３１４位で、若しくは３１４と４２８位で、若しくは２５０、３１４と４２８位でなどその任意の組合せで置換されるように突然変異され、２５０と４２８位での置換は特定の組合せである。２５０位では、置換アミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、又はチロシンを含むがこれらに限定されないスレオニン以外のいかなるアミノ酸残基でもよい。３１４位では、置換アミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、又はチロシンを含むがこれらに限定されないロイシン以外のいかなるアミノ酸残基でもよい。４２８位では、置換アミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、又はチロシンを含むがこれらに限定されないメチオニン以外のいかなるアミノ酸残基でもよい。Ｆｃエフェクター機能を改変することが知られている例示的な置換は、Ｆｃ置換Ｍ４２８Ｉであり、これはＦｃ置換Ｔ２５０Ｑと組み合わせて起こることが可能である。適切なアミノ酸置換の追加の特定の組合せは、米国特許第７，２１７，７９７号の表１に同定されている。そのような突然変異はＦｃＲｎへの結合を増大させ、これにより二重特異性結合タンパク質は分解から保護され、その半減期が増す。
【００５１】
ＣＨ３ドメイン２０ａ及び２０ｂをそのそれぞれの可変鎖２４ａ及び２４ｂと連結させるポリペプチドリンカー２２ａ及び２２ｂは、定常領域をｓｃＦｖＹに融合させるように選択してもよく、同じであっても又は異なっていてもよいが、大半の実施形態では同じである。Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインを単鎖可変断片を含む可変領域に連結させるリンカーは、発現、可溶性、安定性（例えば、より低い断片化レベル、より低い断片化速度、より低い凝集レベル、より低い凝集速度、より高い融解温度、及び／又はより長い血漿半減期により測定した場合）及び／又は本開示の二重特異性結合タンパク質の力価を増加させるように選択してもよい。Ｆｃ領域をポリペプチドの他の機能的な部分に連結させるリンカーは、例えば、米国特許出願公開第２０１４／００４４７１１号に開示されている。実例となるリンカーは、当技術分野では、例えば、Ｓｈａｎ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９年；１６２：６５８９〜６５９５頁で知られている。
【００５２】
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、Ｆｃ領域を可変領域と連結させるリンカーを含み、リンカーは以下の表の配列のうちの１つから選択される配列に対応する配列を有する。
【００５３】
【表４】
2019519223.tif 000005
【００５４】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、式（Ｉ）：
Ｘ−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ    （Ｉ）
の２つのポリペプチドを含み、
ＸはｓｃＦｖＸ又はＦａｂ領域であり、Ｘは第１の抗原に特異的に結合し、ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合し、
Ｈはヒンジ領域であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、
ｓｃＦｖＸ及びｓｃＦｖＹはそれぞれ独立して単鎖可変断片であり、
Ｌはポリペプチドリンカーである。
一部の実施形態では、２つの抗原のうちの一方は免疫調節タンパク質であり、他方は腫瘍抗原である。一部の実施形態では、ＸがＦａｂ領域である場合、第１の抗原は腫瘍抗原であり、第２の抗原は免疫調節タンパク質である。他の実施形態では、ＸがＦａｂ領域である場合、第１の抗原は免疫調節タンパク質であり、第２の抗原は腫瘍抗原である。一部の実施形態では、Ｌは、配列番号２５１及び２５３〜２６２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【００５５】
一部の実施形態では、ＸはｓｃＦｖＸである。他の実施形態では、ＸはＦａｂ領域である。
【００５６】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖＸは式（Ｖ）又は（ＶＩ）：
ＶＨＸ−ＬＸ−ＶＬＸ−  （Ｖ）、
ＶＬＸ−ＬＸ−ＶＨＸ−  （ＶＩ）、
の構造を有し、
ＶＨＸは可変重鎖であり、ＶＬＸは可変軽鎖であり、ＬＸはポリペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ＬＸは配列番号３０１〜３０６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【００５７】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖＹは式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）：
−ＶＬＹ−ＬＹ−ＶＨＹ  （ＶＩＩ）、
−ＶＨＹ−ＬＹ−ＶＬＹ  （ＶＩＩＩ）、
の構造を有し、
ＶＨＹは可変重鎖であり、ＶＬＹは可変軽鎖であり、ＬＹはポリペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ＬＹは配列番号３０１〜３０６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【００５８】
一部の実施形態では、下に記載される、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質は、式（ＩＩ）の２つのポリペプチド、式（ＩＩＩ）の２つのポリペプチド、又は式（ＩＶ）の２つのポリペプチドを含む。
【００５９】
実施形態では、本明細書では、式（ＩＩ）：
ｓｃＦｖＸ−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ    （ＩＩ）
のポリペプチドが提供され、
Ｌはポリペプチドリンカーであり、
Ｈはヒンジ領域であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、
ｓｃＦｖＸ及びｓｃＦｖＹはそれぞれ独立して単鎖可変断片であり、
ｓｃＦｖＸは第１の抗原に特異的に結合し、
ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合し、
２つの抗原のうちの一方は免疫調節タンパク質であり、他方は腫瘍抗原である。一部の実施形態では、Ｌは、配列番号２５１及び２５３〜２６２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【００６０】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖＸは式（Ｖ）又は（ＶＩ）：
ＶＨＸ−ＬＸ−ＶＬＸ−  （Ｖ）、
ＶＬＸ−ＬＸ−ＶＨＸ−  （ＶＩ）、
の構造を有し、
ＶＨＸは可変重鎖であり、ＶＬＸは可変軽鎖であり、ＬＸはポリペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ＬＸは配列番号３０１〜３０６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【００６１】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖＹは式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）：
−ＶＬＹ−ＬＹ−ＶＨＹ  （ＶＩＩ）、
−ＶＨＹ−ＬＹ−ＶＬＹ  （ＶＩＩＩ）、
の構造を有し、
ＶＨＹは可変重鎖であり、ＶＬＹは可変軽鎖であり、ＬＹはポリペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ＬＹは配列番号３０１〜３０６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【００６２】
別の態様では、式（ＩＩＩ）：
Ｆａｂ−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ    （ＩＩＩ）
のポリペプチドが提供され、
Ｌはポリペプチドリンカーであり、
Ｈはヒンジ領域であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、
Ｆａｂは断片抗原結合領域であり、
ｓｃＦｖＹは単鎖可変断片であり、
Ｆａｂは第１の抗原に特異的に結合し、
ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合する。
【００６３】
一部の実施形態では、第１の抗原が腫瘍抗原であり、第２の抗原が免疫調節タンパク質である。一部の実施形態では、第１の抗原が免疫調節タンパク質であり、第２の抗原が腫瘍抗原である。一部の実施形態では、Ｌは、配列番号２５１及び２５３〜２６２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【００６４】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖＹが式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）：
−ＶＬＹ−ＬＹ−ＶＨＹ  （ＶＩＩ）、
−ＶＨＹ−ＬＹ−ＶＬＹ  （ＶＩＩＩ）、
の構造を有し、
ＶＨＹは可変重鎖であり、ＶＬＹは可変軽鎖であり、ＬＹはポリペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ＬＹは配列番号３０１〜３０６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【００６５】
別の態様では、式（ＩＶ）：
ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ    （ＩＶ）
のポリペプチドが提供され、
Ｌはポリペプチドリンカーであり、
ＶＨ−ＣＨ１は、ＶＬ−ＣＬを含むペプチドと組み合わされた場合には、第１の抗原に特異的に結合し、
ＣＨ１はＣＨ１定常ドメインであり、
ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、
ＶＨは可変重鎖であり、
ＶＬは可変軽鎖であり、
Ｈはヒンジ領域であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、
ｓｃＦｖＹは単鎖可変断片であり、
ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合する。
【００６６】
一部の実施形態では、第１の抗原が腫瘍抗原であり、第２の抗原が免疫調節タンパク質である。一部の実施形態では、第１の抗原が免疫調節タンパク質であり、第２の抗原が腫瘍抗原である。一部の実施形態では、Ｌは、配列番号２５１及び２５３〜２６２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【００６７】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖＹは式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）：
−ＶＬＹ−ＬＹ−ＶＨＹ  （ＶＩＩ）、
−ＶＨＹ−ＬＹ−ＶＬＹ  （ＶＩＩＩ）、
の構造を有し、
ＶＨＹは可変重鎖であり、ＶＬＹは可変軽鎖であり、ＬＹはポリペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ＬＹは配列番号３０１〜３０６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【００６８】
本開示の二重特異性結合タンパク質は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等を含むがこれらに限定されない、遺伝的に操作された及び／又は事実上他の方法で改変されたモノクローナル抗体の断片又は部分を含んでもよい。種々の実施形態では、結合タンパク質は免疫グロブリンの定常領域のすべて又は一部を含む。一部の実施形態では、定常領域は、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）及びＩｇＭから選択されるアイソタイプである。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、１つ以上のアイソタイプ由来の１つ以上の定常領域を含む。実例では、二重特異性結合タンパク質は、ヒンジ及びＩｇＧ１由来のＣＨ２領域及びＩｇＧ４由来のＣＨ３領域を含んでもよい。特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４定常領域を含む。
【００６９】
本開示の二重特異性結合タンパク質は誘導体化されてもよい。誘導体化された結合タンパク質は典型的には、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連鎖により改変される。数多くの化学修飾のいずれでも、特異的化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含むがこれらに限定されない既知の技法により実行してもよい。さらに、誘導体は１つ以上の非天然アミノ酸を含有していてもよい。例えば、Ｗｏｌｆｓｏｎ、２００６年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３（１０）：１０１１〜２頁参照。
【００７０】
本開示の二重特異性結合タンパク質は、例えば、Ｊｕｎｇ  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：９、９５９〜９６６頁；Ｙａｚａｋｉら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．１７（５）：４８１〜９頁；及び米国特許出願公開第２００７／０２８０９３１号に記載されるように、１つ以上のそのＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸が挿入されていてもよい。
【００７１】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は図８Ａ〜８Ｈに示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１９、４２０及び４２１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４１１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４１９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４２０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
【００７２】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は図８Ｉ〜８Ｍに示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４３１〜４４０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４３１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４３４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４３７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４３９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４４０のアミノ酸配列を含む。
【００７３】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は図１０Ｂ〜１０Ｄに示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４１３〜４１８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４１６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４１７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４１８のアミノ酸配列を含む。
【００７４】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は図１０Ｈ〜１０Ｉに示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４４１〜４４４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４４４のアミノ酸配列を含む。
【００７５】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は図１０Ｌに示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４４５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４４６のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
二重特異性結合タンパク質がＦａｂ領域及びｓｃＦｖ領域を含む場合、結合タンパク質は２つのポリペプチド、例えば、式（ＩＩＩ）のポリペプチドを含み、それぞれが２つのアミノ酸配列：重鎖、例えば、式（ＩＶ）のポリペプチドにジスルフィド架橋により共有結合された軽鎖、例えば、ＶＬ−ＣＬを含むペプチド、を含む。一部の実施形態では、軽鎖はカッパ軽鎖定常領域を含む。他の実施形態では、軽鎖はラムダ軽鎖定常領域を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖は配列番号３７１又は３７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖配列は配列番号３５１〜３７０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００７７】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７１に従った軽鎖及び配列番号３５１に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７１に従った軽鎖及び配列番号３５２に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７１に従った軽鎖及び配列番号３５３に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７１に従った軽鎖及び配列番号３５４に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７１に従った軽鎖及び配列番号３５５に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７１に従った軽鎖及び配列番号３５６に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７１に従った軽鎖及び配列番号３５７に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７１に従った軽鎖及び配列番号３５８に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７１に従った軽鎖及び配列番号３５９に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７１に従った軽鎖及び配列番号３６０に従った重鎖を含む。
【００７８】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７２に従った軽鎖及び配列番号３６１に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７２に従った軽鎖及び配列番号３６２に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７２に従った軽鎖及び配列番号３６３に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７２に従った軽鎖及び配列番号３６４に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７２に従った軽鎖及び配列番号３６５に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７２に従った軽鎖及び配列番号３６６に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７２に従った軽鎖及び配列番号３６７に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７２に従った軽鎖及び配列番号３６８に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７２に従った軽鎖及び配列番号３６９に従った重鎖を含む。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号３７２に従った軽鎖及び配列番号３７０に従った重鎖を含む。
【００７９】
二重特異性結合タンパク質は２つの異なる抗原に結合することが可能である。一部の実施形態では、所望の生物学的応答、例えば、生化学的シグナルの調節（例えば、増加又は減少）をもたらすには両方の抗原の存在が必要である。そのような実施形態では、両方の抗原が存在する場合、生物学的応答は選択された生物学的環境、例えば、腫瘍微小環境でもたらされる。一部の実施形態では、生化学的シグナルは選択的生物学的効果、例えば、腫瘍微小環境における免疫系の選択的活性化を提供する。一部の実施形態では、生化学的シグナルの調節は全身毒性のより大きな回避をもたらす。
【００８０】
本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質は一般的には、ヒト抗原に特異的に結合する。他の種由来、例えば、マウス又はサル、例えば、カニクイザル由来の抗原への交差反応性結合は、生物活性について動物モデルで試験する能力のような利点を提供することがある。そのような動物モデル試験を使用して、特性、例えば、生物活性と比べて有利な薬物動態について選択するために二重特異性結合タンパク質をスクリーニングしてもよい。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質はカニクイザル抗原に結合する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質はマウス抗原に結合する。
【００８１】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて結合について基準抗体と競合する。基準抗体は第１の抗原又は第２の抗原に結合することが可能である。一部の実施形態では、基準抗体は本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つである。一部の実施形態では、基準抗体は本明細書に記載される抗体のヒト化又はヒトバージョンである。
【００８２】
競合についてのアッセイは、放射性物質標識免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイ、及び表面プラズモン共鳴アッセイを含むがこれらに限定されない。
【００８３】
基準抗体と試験結合タンパク質（種又はアイソタイプに関係なく）との間の抗体競合アッセイを行う際には、先ず、基準をそれに続く同定を可能にするフルオロフォア、ビオチン又は酵素的（又は放射性でも）標識のような検出可能な標識で標識することができる。この場合、目的の抗原（すなわち、第１の抗原又は第２の抗原）を発現している細胞は非標識試験結合タンパク質と一緒にインキュベートされ、標識された基準抗体が添加され、結合している標識の強度が測定される。試験結合タンパク質が重複したエピトープに結合することにより標識された基準抗体と競合する場合、強度は試験結合タンパク質なしで実行される対照反応と比べて減少することになる。
【００８４】
このアッセイの特定の実施形態では、アッセイ条件（例えば、特定の細胞密度）下で最大結合の８０％（「ｃｏｎｃ８０％」）をもたらす標識された基準抗体の濃度が先ず決定され、競合アッセイは非標識試験結合タンパク質の１０×ｃｏｎｃ８０％及び標識された基準抗体のｃｏｎｃ８０％で実行される。
【００８５】
本明細書に記載される競合アッセイでの結合阻害は阻害定数、又はＫｉとして表すことが可能であり、この定数は以下の式に従って計算され：
Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［基準Ａｂ濃度］／Ｋｄ）、
ＩＣ５０は基準抗体の結合の５０％減少をもたらす試験結合タンパク質の濃度及びＫｄは基準抗体の解離定数、すなわち、目的の抗原に対するその親和性の尺度である。本明細書に開示される結合タンパク質と競合する抗体は、本明細書に記載されるアッセイ条件下で１０ｐＭ〜１０００ｎＭのＫｉを有することが可能である。
【００８６】
種々の実施形態では、試験結合タンパク質は、使用される特定のアッセイ条件下で最大結合の８０％である基準抗体濃度及び基準抗体濃度の１０倍の試験結合タンパク質濃度で、基準抗体の結合を少なくとも約２０％又はそれよりも多く、例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくはそれよりもはるかに多く、又は前述の値のいずれかの間の範囲に及ぶ百分率減少させる場合、基準抗体と競合するとみなされる。
【００８７】
試験結合タンパク質が目的の抗原への結合について本明細書に記載される基準抗体と競合するのかどうかを評価するのに有用な特定のアッセイ及びアッセイ条件は、実施例３に提供されている。抗体競合は、セクション８．３．３．３の４−１ＢＢリガンド競合を決定するために記載される方法に類似する様式で決定することが可能である。
【００８８】
上で論じたように、本開示の二重特異性結合タンパク質は、２つの異なる抗原に結合し、１つの抗原をもう一方の抗原の存在下で条件的に活性化することが可能である。一実施形態では、二重特異性結合タンパク質は免疫調節タンパク質に結合して、例えば、免疫受容体及び腫瘍抗原を活性化する。一特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、腫瘍抗原メソテリンと結合しているとＣＤ４０を刺激し、メソテリンの非存在下ではＣＤ４０刺激活性の低減を示す。別の特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、腫瘍抗原メソテリンと結合していると４−１ＢＢを刺激し、メソテリンの非存在下では４−１ＢＢ刺激活性の低減を示す。別の特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、腫瘍抗原Ｂ７−Ｈ４と結合していると４−１ＢＢを刺激し、Ｂ７−Ｈ４の非存在下では４−１ＢＢ刺激活性の低減を示す。そのような場合、二重特異性結合タンパク質は、腫瘍微小環境において免疫応答の標的特異的条件的活性化を提供する。例えば、本明細書に記載される二重特異性タンパク質を使用して、腫瘍細胞に対して免疫学的応答の標的特異的条件的活性化を開始し固形腫瘍があると診断された対象を処置することが可能である。
【００８９】
条件的活性化を決定するアッセイは、当技術分野では公知である。免疫調節タンパク質及び腫瘍抗原に結合する二重特異性タンパク質を用いた実例では、条件的活性化は、免疫調節タンパク質活性を腫瘍抗原と及び腫瘍抗原なしで比較することにより決定してもよい。そのような場合、条件的活性化は、例えば、その非存在と比べた腫瘍抗原の存在下での活性化の増加により、決定される。一部の実施形態では、免疫調節タンパク質活性は、その非存在と比べた腫瘍抗原の存在下では６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８０、１００、２００、４００、５００、７００、８００又は１０００倍又はそれよりも大きいなどの、少なくとも約５倍の活性の増加である。一部の実施形態では、免疫調節タンパク質活性は、その非存在と比べた腫瘍抗原の存在下では５０００、２０００、１０００、８００、６００、５００、３００、２００又は１００倍又はそれよりも低いなどの、約１００００倍未満の活性の増加である。ある特定の実施形態では、アッセイはセクション８．１．２に記載されるアッセイである。他の実施形態では、アッセイはセクション８．３．３に記載されるアッセイである。
【００９０】
７．３．２．免疫調節結合タンパク質
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質、例えば、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）及びＣＤ２８ファミリータンパク質から選択される免疫調節タンパク質に選択的に結合する。ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質は、ＣＤ２７（Ｓ１５２、Ｔｐ５５、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー７）、ＣＤ３０、ＣＤ４０（ｐ５０、Ｂｐ５０）、ＣＤ９５、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＲ２、ＡＴＡＲ）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＩＬＡ、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー９）、ＴＲＡＩＬＲ１（ＣＤ１２０ａ、ＤＲ４、Ａｐｏ２、ＣＤ２６１、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー１０ａ）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ２Ａ、ＴＲＩＣＫＢ、ＣＤ２６２、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー１０ｂ）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂ）及びＴＡＣＩ（ＣＤ２６７）を含むがこれらに限定されない。ＣＤ２８受容体ファミリーメンバーはＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４を含むがこれらに限定されない。一特定の実施形態では、免疫調節タンパク質はＣＤ４０である。別の特定の実施形態では、免疫調節タンパク質は４−１ＢＢである。
【００９１】
実例となる実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０でありＸがｓｃＦｖＸである場合、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＸ及び腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０でありＸがｓｃＦｖＸである場合、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質は腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖＸ及びＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質が４−１ＢＢでありＸがｓｃＦｖＸである場合、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質は４−１ＢＢに結合するｓｃＦｖＸ及び腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質が４−１ＢＢでありＸがｓｃＦｖＸである場合、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質は腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖＸ及び４−１ＢＢに結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０でありＸがＦａｂである場合、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質は腫瘍抗原に結合するＦａｂ及びＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＹを含む。
【００９２】
実例となる実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０である場合、式（ＩＩ）のポリペプチドはＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＸ及び腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０である場合、式（ＩＩ）のポリペプチドは腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖＸ及びＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質が４−１ＢＢである場合、式（ＩＩ）のポリペプチドは４−１ＢＢに結合するｓｃＦｖＸ及び腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質が４−１ＢＢである場合、式（ＩＩ）のポリペプチドは腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖＸ及び４−１ＢＢに結合するｓｃＦｖＹを含む。
【００９３】
実例となる実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０である場合、式（ＩＩＩ）のポリペプチドは腫瘍抗原に結合するＦａｂ及びＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質が４−１ＢＢである場合、式（ＩＩＩ）のポリペプチドは腫瘍抗原に結合するＦａｂ及び４−１ＢＢに結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質が４−１ＢＢである場合、式（ＩＩＩ）のポリペプチドは４−１ＢＢに結合するＦａｂ及び腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖＹを含む。
【００９４】
実例となる実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０である場合、式（ＩＶ）のポリペプチドは、ＶＬ−ＣＬを含むペプチドと組み合わされていると、腫瘍抗原に結合するＶＨ−ＣＨ１及びＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質が４−１ＢＢである場合、式（ＩＶ）のポリペプチドは、ＶＬ−ＣＬを含むペプチドと組み合わされていると、腫瘍抗原に結合するＶＨ−ＣＨ１及び４−１ＢＢに結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質が４−１ＢＢである場合、式（ＩＶ）のポリペプチドは、ＶＬ−ＣＬを含むペプチドと組み合わされていると、４−１ＢＢに結合するＶＨ−ＣＨ１及び腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖＹを含む。
【００９５】
一部の使用では、免疫調節タンパク質に対する親和性のある二重特異性結合タンパク質を有するのが望ましい。治療的使用のようなある特定の使用では、少なくとも約３０００ｎＭの親和性、例えば、ＫＤが望ましい。特定の親和性が望ましい適用では、二重特異性結合タンパク質は、少なくとも約３０００ｎＭ、又はそれよりもはるかに高い、例えば、少なくとも約２０００ｎＭ、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ又はそれよりも多い親和性で免疫調節タンパク質に特異的に結合する。一部の実施形態では、免疫調節タンパク質に対するＫＤは、前述の値のうちの任意の２つにより境界を示される範囲、例えば、１０〜３０００、５０〜３０００、１００〜２０００、１〜１０００、２０〜２０００、３０〜３０００、又は約１００〜３０００ｎＭのような約１〜約５０００ｎＭである。
【００９６】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＣＤ４０を発現している細胞上でヒトＣＤ４０（配列番号２７１）への結合について基準抗体と競合する。基準抗体は本明細書に記載される又は当技術分野で公知の抗ＣＤ４０抗体のいずれであってもよい。一部の実施形態では、基準抗体は表１〜４に提供される抗体である。特定の実施形態では、基準抗体は抗体ＡＤ１６３．９．３（「ｍｕＡｂ１」）；抗体ＡＤ１６６．４．４（「ｍｕＡｂ２」）；抗体ＡＤ１７５．１４．１１（「ｍｕＡｂ３」）；抗体ＡＤ１６３．１０．７（「ｍｕＡｂ４」）；抗体ＡＤ１６５．１．２（「ｍｕＡｂ５」）；抗体ＡＤ１６３．１６２．１（「ｍｕＡｂ６」）；抗体ＡＤ１６３．２７．１２（「ｍｕＡｂ７」）；抗体ＡＤ１６３．７．２（「ｍｕＡｂ８」）；抗体ＡＤ１６４．１４．６（「ｍｕＡｂ９」）；及び抗体ＡＤ１６４．７６．２（「ｍｕＡｂ１０」）から選択される。一部の実施形態では、基準抗体は表１〜４に提供される抗体のヒト化バージョンである。一部の実施形態では、基準抗体は、ｍｕＡｂ１、ｍｕＡｂ１、ｍｕＡｂ２、ｍｕＡｂ３、ｍｕＡｂ４、ｍｕＡｂ５、ｍｕＡｂ６、ｍｕＡｂ７、ｍｕＡｂ８、ｍｕＡｂ９又はｍｕＡｂ１０のヒト化バージョンである。特定の実施形態では、基準抗体は、配列番号３１０又は３１１に従った重鎖及び配列番号３２０に従った軽鎖を有するｈｕＡｂ９−５である。別の特定の実施形態では、基準抗体は、配列番号３１２又は３１３に従った重鎖及び配列番号３２０に従った軽鎖を有するｈｕＡｂ９−５  Ｖ２７３Ｅである。別の特定の実施形態では、基準抗体は、配列番号３１４又は３１５に従った重鎖及び配列番号３２０に従った軽鎖を有するｈｕＡｂ９−５  Ｖ２７３Ｙである。別の特定の実施形態では、基準抗体は、配列番号３１２又は３１３に従った重鎖及び配列番号３２１に従った軽鎖を有するｈｕＡｂ９  Ａ２Ｉである。別の特定の実施形態では、基準抗体は、配列番号３１２又は３１３に従った重鎖及び配列番号３２２に従った軽鎖を有するｈｕＡｂ９  Ａ２Ｖである。
【００９７】
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択されるＶＨ配列を含む免疫調節タンパク質結合領域を含み：
【００９８】
【表５】
2019519223.tif 000006
2019519223.tif 000007
2019519223.tif 000008
対応するＶＬ配列のアミノ酸配列は以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択される：
【００９９】
【表６】
2019519223.tif 000009
2019519223.tif 000010
2019519223.tif 000011
【０１００】
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質、例えば、式（Ｉ）のタンパク質は、ヒトへの投与に適している。特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、ヒト化免疫調節タンパク質結合ドメインを含む。別の特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択されるＶＨ配列を含む免疫調節タンパク質結合領域を含み：
【０１０１】
【表７】
2019519223.tif 000012
2019519223.tif 000013
対応するＶＬのアミノ酸配列は以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択される：
【０１０２】
【表８】
2019519223.tif 000014
2019519223.tif 000015
【０１０３】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、以下のＣＤＲのアミノ酸配列を有するＣＤ４０結合ドメインを有する：
【０１０４】
【表９】
2019519223.tif 000016
【０１０５】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１０に従ったＶＨ及び配列番号４１に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１に従ったＶＨ及び配列番号４１に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１２に従ったＶＨ及び配列番号４１に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１３に従ったＶＨ及び配列番号４２に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１４に従ったＶＨ及び配列番号４２に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１５に従ったＶＨ及び配列番号４２に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１６に従ったＶＨ及び配列番号４３に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１７に従ったＶＨ及び配列番号４３に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１８に従ったＶＨ及び配列番号４３に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１６に従ったＶＨ及び配列番号４４に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１７に従ったＶＨ及び配列番号４４に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１７に従ったＶＨ及び配列番号４９に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１７に従ったＶＨ及び配列番号５０に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１７に従ったＶＨ及び配列番号５１に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１８に従ったＶＨ及び配列番号４４に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２２に従ったＶＨ及び配列番号４８に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２２に従ったＶＨ及び配列番号４９に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２３に従ったＶＨ及び配列番号４８に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２３に従ったＶＨ及び配列番号４９に従ったＶＬを含むＣＤ４０結合ドメインを有する。
【０１０６】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて４−１ＢＢを発現している細胞上でヒト４−１ＢＢ（配列番号２７３）への結合について基準抗体と競合する。基準抗体は本明細書に記載される又は当技術分野で公知の抗４−１ＢＢ抗体のいずれであってもよい。特定の実施形態では、基準抗体は、抗体ＴＡＢＢＹ１０１（「ＴＡＢＢＹ１０１」）、抗体ＴＡＢＢＹ１０２（「ＴＡＢＢＹ１０２」）、抗体ＴＡＢＢＹ１０３（「ＴＡＢＢＹ１０３」）、抗体ＴＡＢＢＹ１０４（「ＴＡＢＢＹ１０４」）、抗体ＴＡＢＢＹ１０５（「ＴＡＢＢＹ１０５」）、抗体ＴＡＢＢＹ１０６（「ＴＡＢＢＹ１０６」）、抗体ＴＡＢＢＹ１０７（「ＴＡＢＢＹ１０７」）、抗体ＴＡＢＢＹ１０８（「ＴＡＢＢＹ１０８」）、抗体ＴＡＢＢＹ１．１（「ＴＡＢＢＹ１．１」）、抗体ＴＡＢＢＹ３（「ＴＡＢＢＹ３」）、抗体ＴＡＢＢＹ５（「ＴＡＢＢＹ５」）、抗体ＴＡＢＢＹ６（「ＴＡＢＢＹ６」）、抗体ＴＡＢＢＹ９（「ＴＡＢＢＹ９」）、及び抗体ＴＡＢＢＹ１０（「ＴＡＢＢＹ１０」）から選択される。一実施形態では、基準抗体はＴＡＢＢＹ１０６である。別の実施形態では、基準抗体はＴＡＢＢＹ１０７である。一部の実施形態では、基準抗体はＴＡＢＢＹ１０６、ＴＡＢＢＹ１０７又はＴＡＢＢＹ１０８のヒト化バージョンである。特定の実施形態では、基準抗体は、配列番号３３０又は３３１に従った重鎖及び配列番号３３４に従った軽鎖を有するｈｕ１０６−１−ｈＩｇＧ１である。別の特定の実施形態では、基準抗体は、配列番号３３２又は３３３に従った重鎖及び配列番号３３５に従った軽鎖を有するｈｕ１０７−１−ｈＩｇＧ１である。
【０１０７】
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択されるＶＨ配列を含む免疫調節結合領域を含み：
【０１０８】
【表１０】
2019519223.tif 000017
2019519223.tif 000018
対応するＶＬ配列のアミノ酸配列は以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択される：
【０１０９】
【表１１】
2019519223.tif 000019
2019519223.tif 000020
【０１１０】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６１に従ったＶＨ及び配列番号８１に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６２に従ったＶＨ及び配列番号８２に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６３に従ったＶＨ及び配列番号８３に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６４に従ったＶＨ及び配列番号８４に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６５に従ったＶＨ及び配列番号８５に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６６に従ったＶＨ及び配列番号８６に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６７に従ったＶＨ及び配列番号８７に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６８に従ったＶＨ及び配列番号８８に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。
【０１１１】
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択されるＶＨ配列を含む免疫調節結合領域を含み：
【０１１２】
【表１２】
2019519223.tif 000021
2019519223.tif 000022
対応するＶＬ配列のアミノ酸配列は以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択される：
【０１１３】
【表１３】
2019519223.tif 000023
【０１１４】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７３に従ったＶＨ及び配列番号９６に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７４に従ったＶＨ及び配列番号９７に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７５に従ったＶＨ及び配列番号９８に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７６に従ったＶＨ及び配列番号９９に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７７に従ったＶＨ及び配列番号１００に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７８に従ったＶＨ及び配列番号１０１に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。
【０１１５】
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質、例えば、式（Ｉ）のタンパク質は、ヒトへの投与に適している。特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、ヒト化免疫調節タンパク質結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択されるＶＨ配列を含む免疫調節タンパク質結合領域を含み：
【０１１６】
【表１４】
2019519223.tif 000024
対応するＶＬ配列のアミノ酸配列は以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択される：
【０１１７】
【表１５】
2019519223.tif 000025
2019519223.tif 000026
【０１１８】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、以下のＣＤＲのアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ結合ドメインを有する：
【０１１９】
【表１６】
2019519223.tif 000027
【０１２０】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６９〜７２のうちのいずれか１つに従ったＶＨ及び配列番号８９〜９５のうちのいずれか１つに従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６９に従ったＶＨ及び配列番号８９に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６９に従ったＶＨ及び配列番号９０に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７０に従ったＶＨ及び配列番号９０に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６９に従ったＶＨ及び配列番号９１に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６９に従ったＶＨ及び配列番号９２に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号６９に従ったＶＨ及び配列番号９３に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７０に従ったＶＨ及び配列番号８９に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７０に従ったＶＨ及び配列番号９１に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７０に従ったＶＨ及び配列番号９２に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７０に従ったＶＨ及び配列番号９３に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７１に従ったＶＨ及び配列番号９４に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７１に従ったＶＨ及び配列番号９５に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７２に従ったＶＨ及び配列番号９４に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号７２に従ったＶＨ及び配列番号９５に従ったＶＬを含む４−１ＢＢ結合ドメインを有する。
【０１２１】
本明細書のセクション７．３．２に記載される免疫調節結合領域のＶＨ又はＶＬ配列のある特定の突然変異は、本開示の範囲内の二重特異性結合タンパク質を提供することを、当業者であれば理解すると考えられる。突然変異は、免疫調節タンパク質に対する有意な活性は保持しつつ、本明細書に開示されるＶＨ又はＶＬ配列からのアミノ酸置換、付加、又は欠失を含んでいてもよい。したがって、一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、セクション７．３．２に示されるＶＨ配列のうちのいずれか１つに少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％配列同一性を有するＶＨ配列を含む。二重特異性結合タンパク質は、セクション７．３．２に示されるＶＨ配列のうちのいずれか１つと比べて、８つまで、７つまで、６つまで、５つまで、４つまで、３つまで又は２つまでの突然変異を有するＶＨ配列を含むことが可能である。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、セクション７．３．２に示されるＶＨ配列のうちのいずれか１つと比べて、５若しくはそれよりも少ない、４若しくはそれよりも少ない、３若しくはそれよりも少ない又は２若しくはそれよりも少ない突然変異を有するＶＨ配列を含むことが可能である。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、セクション７．３．２に示されるＶＬ配列のうちのいずれか１つに少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有するＶＬ配列を含む。二重特異性結合タンパク質は、セクション７．３．２に示されるＶＬ配列のうちのいずれか１つと比べて、８つまで、７つまで、６つまで、５つまで、４つまで、３つまで又は２つまでの突然変異を有するＶＬ配列を含むことが可能である。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、セクション７．３．２に示されるＶＬ配列のうちのいずれか１つと比べて、５若しくはそれよりも少ない、４若しくはそれよりも少ない、３若しくはそれよりも少ない又は２若しくはそれよりも少ない突然変異を有するＶＬ配列を含むことが可能である。
【０１２２】
７．３．３．腫瘍抗原結合タンパク質
別の態様では、本開示の二重特異性結合タンパク質は腫瘍抗原に選択的に結合する。細胞表面腫瘍抗原は、本明細書に記載される固形腫瘍のうちのいずれかを含む、固形腫瘍の細胞膜上で発現される。適切な腫瘍抗原は、ＣＳＦ１Ｒ、Ｌｙ８６、ＭＳ４Ａ７、ＣＤ７４、ＣＣＲ５、ＣＯＬ７Ａ１、ＬＯＸ、ＬＲＲＣ１５、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＴＧＦＢＲ１、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＥＧＬＮ、ＩＦＩ６、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＰＤＫ１、ＣＡＤＭ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＫＲＴ３３Ａ、ＬＵＭ、ＷＮＴ５Ａ、ＭＭＰ１４、ＣＤＣＰ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＡＤＧＲＥ１、ＭＨＣ−クラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１９５、ＣＡ−５４９、カテプシン−Ｄ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲ、ＥＮＯ２、ＡＬＰＰ、ＰＬＰ１、ＤＬＬ３、ＳＬＣ３４Ａ２、ＰＴＫ７、Ｂ７−Ｈ３、ＬＩＶ−１、ＳＴＥＡＰ１、ＴＡＣＳＴＤ２、ＧＰＮＭＢ、５Ｔ４、ＣＤ１４２、ＴＩＭ１、ＣＤＨ３、ＬＧＲ５、ＬＹＰＤ３、ＴＧＤＦ１、Ｂ７−Ｈ４、メソテリン、ネクチン−４及びＰＳＭＡを含む。特定の実施形態では、腫瘍抗原はメソテリン、Ｂ７−Ｈ４、ネクチン−４、ＰＳＭＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦＲから選択される。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原はメソテリン、Ｂ７−Ｈ４、ネクチン−４、ＰＳＭＡ及びＥＧＦＲから選択される。
【０１２３】
一部の使用では、腫瘍抗原に対して高親和性の二重特異性結合タンパク質を有することが望ましい。治療的使用のようなある特定の使用では、少なくとも約１００ｎＭの親和性、例えば、ＫＤが望ましい。特定の親和性が望まれる適用では、二重特異性結合タンパク質は、少なくとも約１００ｎＭ又はそれよりもはるかに高い、例えば、少なくとも約９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ又はそれよりも大きい親和性で腫瘍抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、腫瘍抗原に対するＫＤは、前述の値のうちの任意の２つにより境界を示される範囲、例えば、１〜１００、０．１〜５０、２〜９０又は約０．１〜８０ｎＭのような約０．１〜約１００ｎＭである。
【０１２４】
特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０に対して親和性を有しこれを刺激し、メソテリンに対して高親和性を有する。別の特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０に対して親和性を有しこれを刺激し、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対して高親和性を有する。さらに別の特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０に対して親和性を有しこれを刺激し、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して高親和性を有する。追加の特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０に対して親和性を有しこれを刺激し、ネクチン−４に対して高親和性を有する。別の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質は４−１ＢＢに対して親和性を有しこれを刺激し、メソテリンに対して高親和性を有する。別の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質は４−１ＢＢに対して親和性を有しこれを刺激し、Ｂ７−Ｈ４に対して高親和性を有する。別の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質は４−１ＢＢに対して親和性を有しこれを刺激し、ＰＳＭＡに対して高親和性を有する。
【０１２５】
免疫調節タンパク質及び腫瘍抗原に結合する結合タンパク質の親和性は、例えば、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴又は蛍光偏光アッセイのような当技術分野で周知の又は本明細書に記載される技法を使用して決定することが可能である。
【０１２６】
特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０及びメソテリンに結合する。別の特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０及び前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する。さらに別の特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０及び表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する。追加の特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０及びネクチン−４に結合する。別の特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は４−１ＢＢ及びメソテリンに結合する。別の特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は４−１ＢＢ及びＢ７−Ｈ４に結合する。さらに別の特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は４−１ＢＢ及びＰＳＭＡに結合する。
【０１２７】
実例となる実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０でありＸがｓｃＦｖＸである場合、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＸ及びメソテリンに結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０でありＸがｓｃＦｖＸである場合、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質はメソテリンに結合するｓｃＦｖＸ及びＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０でありＸがＦａｂである場合、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質はメソテリンに結合するＦａｂ及びＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＹを含む。
【０１２８】
実例となる実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０である場合、式（ＩＩ）のポリペプチドはＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＸ及びメソテリンに結合するｓｃＦｖＹを含む。ある特定の実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０である場合、式（ＩＩ）のポリペプチドはメソテリンに結合するｓｃＦｖＸ及びＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＹを含む。
【０１２９】
実例となる実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０である場合、式（ＩＩＩ）のポリペプチドはメソテリンに結合するＦａｂ及びＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＹを含む。
【０１３０】
実例となる実施形態では、免疫調節タンパク質がＣＤ４０である場合、式（ＩＶ）のポリペプチドは、ＶＬ−ＣＬを含むペプチドと組み合わされると、メソテリンに結合するＶＨ−ＣＨ１及びＣＤ４０に結合するｓｃＦｖＹを含む。
【０１３１】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてメソテリンを発現している細胞上でヒトメソテリンへの結合について基準抗体と競合する。基準抗体は本明細書に記載される又は当技術分野で公知の抗メソテリン抗体のいずれであってもよい。一部の実施形態では、基準抗体は表２−１で提供される抗体である。特定の実施形態では、基準抗体は、抗体ＨｕＡｂ１７（「ＨｕＡｂ１７」）；抗体ＨｕＡＭ１（「ＨｕＡＭ１」）；抗体ＨｕＡＭ２（「ＨｕＡＭ２」）；抗体ＨｕＡＭ３（「ＨｕＡＭ３」）；抗体ＨｕＡＭ４（「ＨｕＡＭ４」）；抗体ＨｕＡＭ５（「ＨｕＡＭ５」）；抗体ＨｕＡＭ６（「ＨｕＡＭ６」）；抗体ＨｕＡＭ７（「ＨｕＡＭ７」）；抗体ＨｕＡＭ８（「ＨｕＡＭ８」）；抗体ＨｕＡＭ９（「ＨｕＡＭ９」）；抗体ＨｕＡＭ１１（「ＨｕＡＭ１１」）；抗体ＨｕＡＭ１２（「ＨｕＡＭ１２」）；抗体ＨｕＡＭ１３（「ＨｕＡＭ１３」）；抗体ＨｕＡＭ１４（「ＨｕＡＭ１４」）；抗体ＨｕＡＭ１５（「ＨｕＡＭ１５」）；抗体ＨｕＡＭ１７（「ＨｕＡＭ１７」）；抗体ＨｕＡＭ１８（「ＨｕＡＭ１８」）；抗体ＨｕＡＭ１９（「ＨｕＡＭ１９」）；及び抗体ＨｕＡＭ２１（「ＨｕＡＭ２１」）から選択される。特定の実施形態では、基準抗体はＨｕＡＭ１５である。
【０１３２】
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質、例えば、式（Ｉ）のタンパク質はヒトへの投与に適している。特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質はヒト腫瘍抗原結合ドメインを含む。別の特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択されるＶＨ配列を含む腫瘍抗原結合領域を含み：
【０１３３】
【表１７】
2019519223.tif 000028
2019519223.tif 000029
2019519223.tif 000030
対応するＶＬ配列のアミノ酸配列は以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択される：
【０１３４】
【表１８】
2019519223.tif 000031
2019519223.tif 000032
【０１３５】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、以下のＣＤＲのアミノ酸配列を有するメソテリン結合ドメインを有する：
【０１３６】
【表１９】
2019519223.tif 000033
【０１３７】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１０７に従ったＶＨ及び配列番号１３６に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１０８に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１０９に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１０に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１１に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１２に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１３に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１４に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１５に従ったＶＨ及び配列番号１３８に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１６に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１７に従ったＶＨ及び配列番号１３９に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１８に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１９に従ったＶＨ及び配列番号１３９に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１７に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１２０に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１１９に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１２０に従ったＶＨ及び配列番号１４１に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１２１に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１２２に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１２３に従ったＶＨ及び配列番号１４０に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１２４に従ったＶＨ及び配列番号１３７に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１２９に従ったＶＨ及び配列番号１４３に従ったＶＬを含むメソテリン結合ドメインを有する。
【０１３８】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてネクチン−４を発現している細胞上でヒトネクチン−４への結合について基準抗体と競合する。基準抗体は本明細書に記載される又は当技術分野で公知の抗ネクチン−４抗体のいずれであってもよい。
【０１３９】
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、以下のＶＨ配列（ＣＤＲ配列は太字）：
【０１４０】
【表２０】
2019519223.tif 000034
及び以下のＶＬ配列（ＣＤＲ配列は太字）：
【０１４１】
【表２１】
2019519223.tif 000035
を含むネクチン−４結合領域を含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて表皮成長因子受容体を発現している細胞上でヒト表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）への結合について基準抗体と競合する。基準抗体は本明細書に記載される又は当技術分野で公知の抗ＥＧＦＲ抗体のいずれであってもよい。
【０１４３】
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、以下のＶＨ配列（ＣＤＲ配列は太字）：
【０１４４】
【表２２】
2019519223.tif 000036
及び以下のＶＬ配列（ＣＤＲ配列は太字）：
【０１４５】
【表２３】
2019519223.tif 000037
を含むＥＧＦＲ結合領域を含む。
【０１４６】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて前立腺特異的膜抗原を発現している細胞上でヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）への結合について基準抗体と競合する。基準抗体は本明細書に記載される又は当技術分野で公知の抗ＰＳＭＡ抗体のいずれであってもよい。一部の実施形態では、基準抗体は本明細書に記載される抗ＰＳＭＡ抗体、例えば、図１０Ａ、１０Ｊ及び１０Ｋに示されるＶＨ及びＶＬ配列を有する抗体のヒト化バージョンである。
【０１４７】
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択されるＶＨ配列を含むＰＳＭＡ結合領域を含み：
【０１４８】
【表２４】
2019519223.tif 000038
2019519223.tif 000039
対応するＶＬ配列のアミノ酸配列は以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択される：
【０１４９】
【表２５】
2019519223.tif 000040
2019519223.tif 000041
【０１５０】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１９１に従ったＶＨ及び配列番号２０１に従ったＶＬを含むＰＳＭＡ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１９２に従ったＶＨ及び配列番号２０２に従ったＶＬを含むＰＳＭＡ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１９３に従ったＶＨ及び配列番号２０３に従ったＶＬを含むＰＳＭＡ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１９４に従ったＶＨ及び配列番号２０４に従ったＶＬを含むＰＳＭＡ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１９５に従ったＶＨ及び配列番号２０５に従ったＶＬを含むＰＳＭＡ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１９６に従ったＶＨ及び配列番号２０６に従ったＶＬを含むＰＳＭＡ結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号１９７に従ったＶＨ及び配列番号２０７に従ったＶＬを含むＰＳＭＡ結合ドメインを有する。
【０１５１】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＢ７−Ｈ４を発現している細胞上でＢ７−Ｈ４への結合について基準抗体と競合する。基準抗体は本明細書に記載される又は当技術分野で公知の抗Ｂ７−Ｈ４抗体のいずれであってもよい。一部の実施形態では、基準抗体は本明細書に記載される抗Ｂ７−Ｈ４抗体、例えば、図１０Ｅ〜１０Ｇに示されるＶＨ及びＶＬ配列を有する抗体のヒト化バージョンである。
【０１５２】
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合タンパク質は、以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択されるＶＨ配列を含むＢ７−Ｈ４結合領域を含み：
【０１５３】
【表２６】
2019519223.tif 000042
2019519223.tif 000043
対応するＶＬ配列のアミノ酸配列は以下の配列（ＣＤＲ配列は太字）から選択される：
【０１５４】
【表２７】
2019519223.tif 000044
2019519223.tif 000045
【０１５５】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２１１に従ったＶＨ及び配列番号２２１に従ったＶＬを含むＢ７−Ｈ４結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２１２に従ったＶＨ及び配列番号２２２に従ったＶＬを含むＢ７−Ｈ４結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２１６に従ったＶＨ及び配列番号２２５に従ったＶＬを含むＢ７−Ｈ４結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２１８に従ったＶＨ及び配列番号２２８に従ったＶＬを含むＢ７−Ｈ４結合ドメインを有する。
【０１５６】
一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２１３、２１４、２１５、２１７又は２１９に従ったＶＨ及び配列番号２２３、２２４、２２６、２２７、２２９又は２３０に従ったＶＬを含むＢ７−Ｈ４結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２１３に従ったＶＨ及び配列番号２２３に従ったＶＬを含むＢ７−Ｈ４結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２１４に従ったＶＨ及び配列番号２２４に従ったＶＬを含むＢ７−Ｈ４結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２１５に従ったＶＨ及び配列番号２２３に従ったＶＬを含むＢ７−Ｈ４結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２１７に従ったＶＨ及び配列番号２２６に従ったＶＬを含むＢ７−Ｈ４結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２１７に従ったＶＨ及び配列番号２２７に従ったＶＬを含むＢ７−Ｈ４結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２１９に従ったＶＨ及び配列番号２２９に従ったＶＬを含むＢ７−Ｈ４結合ドメインを有する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号２１９に従ったＶＨ及び配列番号２３０に従ったＶＬを含むＢ７−Ｈ４結合ドメインを有する。
【０１５７】
本明細書のセクション７．３．３に記載される腫瘍抗原結合領域のＶＨ又はＶＬ配列のある特定の突然変異は、本開示の範囲内の二重特異性結合タンパク質を提供することを、当業者であれば理解すると考えられる。突然変異は、腫瘍抗原に対する有意な活性は保持しつつ本明細書に開示されるＶＨ又はＶＬ配列からのアミノ酸置換、付加、又は欠失を含んでいてもよい。したがって、一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、セクション７．３．３に示されるＶＨ配列のうちのいずれか１つに少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％配列同一性を有するＶＨ配列を含む。二重特異性結合タンパク質は、セクション７．３．３に示されるＶＨ配列のうちのいずれか１つと比べて、８つまで、７つまで、６つまで、５つまで、４つまで、３つまで又は２つまでの突然変異を有するＶＨ配列を含むことが可能である。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、セクション７．３．３に示されるＶＨ配列のうちのいずれか１つと比べて、５つ若しくはそれよりも少ない、４つ若しくはそれよりも少ない、３つ若しくはそれよりも少ない又は２つ若しくはそれよりも少ない突然変異を有するＶＨ配列を含むことが可能である。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、セクション７．３．３に示されるＶＬ配列のうちのいずれか１つに少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有するＶＬ配列を含む。二重特異性結合タンパク質は、セクション７．３．３に示されるＶＬ配列のうちのいずれか１つと比べて、８つまで、７つまで、６つまで、５つまで、４つまで、３つまで又は２つまでの突然変異を有するＶＬ配列を含むことが可能である。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、セクション７．３．３に示されるＶＬ配列のうちのいずれか１つと比べて、５つ若しくはそれよりも少ない、４つ若しくはそれよりも少ない、３つ若しくはそれよりも少ない又は２つ若しくはそれよりも少ない突然変異を有するＶＬ配列を含むことが可能である。
【０１５８】
二重特異性結合タンパク質の追加の翻訳後修飾はグリコシル化を含んでいてもよい。一般的な二分岐複合体は、２つのＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、３つのマンノース並びにα−６マンノース及びα−３マンノースにβ−１，２連結して２つのアンテナを形成する２つのＧｌｃＮＡｃ残基を有するコア構造で構成されることが可能である。１つ以上のフコース（Ｆｕｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、高マンノースグリカンＭａｎ−５又はＭａｎ−９、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ、及びＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）又はＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）残基を含むシアル酸をコアに結合させてもよい。Ｎ結合型グリコフォームは、Ｇ０（コア二分岐グリコシル化構造を有するタンパク質）、Ｇ０Ｆ（フコシル化Ｇ０）、Ｇ０Ｆ  ＧｌｃＮＡｃ、Ｇ１（１つのガラクトース残基のあるコアグリコシル化構造を有するタンパク質）、Ｇ１Ｆ（フコシル化Ｇ１）、Ｇ２（２つのガラクトース残基のあるコアグリコシル化構造を有するタンパク質）、及び／又はＧ２Ｆ（フコシル化Ｇ２）を含んでいてもよい。
【０１５９】
７．４．核酸及び発現系
本開示は、二重特異性結合タンパク質、このポリペプチド断片又は成分の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子をコードする核酸分子、このような核酸を含むベクター、並びに本開示の二重特異性結合タンパク質を産生することができる宿主細胞を包含する。
【０１６０】
本開示の二重特異性結合タンパク質は宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現により調製することが可能である。結合タンパク質を組換え的に発現するために、宿主細胞は、軽鎖及び／又は重鎖が宿主細胞で発現され、任意選択的に、宿主細胞が培養されている培地に分泌され、その培地から結合タンパク質が回収できるように、結合タンパク質の免疫グロブリン軽鎖及び／又は重鎖をコードするＤＮＡ断片を保有する１つ以上の組換え発現ベクターでトランスフェクトされる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、ｅｄｓ．、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９８９年）及び米国特許第４，８１６，３９７号に記載される方法論のような標準組換えＤＮＡ方法論を使用して、結合タンパク質重鎖及び／又は軽鎖遺伝子を入手し、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、ベクターを宿主細胞に導入する。
【０１６１】
そのような二重特異性結合タンパク質をコードする核酸を生成するために、軽鎖及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を先ず入手する。これらのＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、軽鎖及び重鎖可変配列をコードする生殖系列ＤＮＡ又はｃＤＮＡの増幅及び改変により得ることが可能である。ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は当技術分野では公知である（例えば、ｔｈｅ「ＶＢＡＳＥ」ｈｕｍａｎ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅ参照。；Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２Ｔ：１１６〜１９８頁；及びＣｏｘら、１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７〜８３６頁も参照。これらのそれぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６２】
二重特異性結合タンパク質関連ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られた後は、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を完全長結合タンパク質鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準組換えＤＮＡ技法によりさらに操作することが可能である。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨコードＤＮＡ断片は、結合タンパク質定常領域又は柔軟なリンカーのような別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。本文脈で使用される用語「作動可能に連結される」は、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームに残るように２つのＤＮＡ断片が結合されることを意味するように意図されている。
【０１６３】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨコードＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択的に、ＣＨ４）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長重鎖遺伝子に変換することが可能である。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野では公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準ＰＣＲ増幅により得ることが可能である。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であってもよいが、ある特定の実施形態では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子では、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することが可能である。
【０１６４】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬコードＤＮＡを軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することが可能である。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野では公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準ＰＣＲ増幅により得ることが可能である。軽鎖定常領域はカッパ又はラムダ定常領域であってもよいが、ある特定の実施形態では、カッパ定常領域である。ｓｃＦｖ遺伝子を作り出すため、ＶＨ及びＶＬ配列が近接している一本鎖タンパク質として発現することが可能であり、ＶＬ及びＶＨ領域が柔軟なリンカーで結合されているように、ＶＨ及びＶＬコードＤＮＡ断片は、柔軟なリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４〜Ｓｅｒ）３（配列番号３０１）をコードする別の断片に作動可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３頁；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４頁参照）。
【０１６５】
本開示の二重特異性結合タンパク質を発現するため、上記のようにして得られた部分的に又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、発現ベクター中に挿入される。この文脈では、用語「作動可能に連結される」は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が結合タンパク質遺伝子の転写及び翻訳を調節するというその意図された機能を果たすように、結合タンパク質遺伝子がベクター内にライゲートされることを意味することが意図されている。発現ベクター及び発現制御配列は使用される発現宿主細胞に適合するように選ばれる。存在する場合は、結合タンパク質軽鎖遺伝子、及び結合タンパク質重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入することが可能であり、又は、さらに典型的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。
【０１６６】
二重特異性結合タンパク質遺伝子は標準的方法（例えば、結合タンパク質遺伝子断片及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション又は制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。二重特異性結合タンパク質関連軽鎖又は重鎖配列の挿入に先立って、発現ベクターはすでに結合タンパク質定常領域配列を保有していてもよい。例えば、二重特異性結合タンパク質関連ＶＨ及びＶＬ配列を完全長結合タンパク質遺伝子に変換する１つのアプローチは、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント（複数可）に作動可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、それぞれ重鎖定常及び軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクターに二重特異性結合タンパク質関連ＶＨ及びＶＬ配列を挿入することである。さらに又は代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの結合タンパク質鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしていてもよい。結合タンパク質鎖遺伝子は、シグナルペプチドが結合タンパク質鎖遺伝子のアミノ終端にインフレームで連結されるように、ベクター内にクローニングすることが可能である。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。
【０１６７】
結合タンパク質鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞での結合タンパク質鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び結合タンパク質鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図されている。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０年に記載されている。調節配列の選択を含む、発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存する可能性があることは、当業者であれば認識するであろう。哺乳動物宿主細胞発現に適した調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーのような）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーのような）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーのような、哺乳動物細胞で高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントを含む。ウイルス調節エレメント、及びその配列のさらなる記載は、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号、及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号参照。
【０１６８】
二重特異性結合タンパク質鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子のような追加の配列を保有することが可能である。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、すべてＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，６３４，６６５号及び米国特許第５，１７９，０１７号参照）。例えば、典型的には選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートのような薬物に対する抵抗性を与える。適切な選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅と一緒にＤＨＦＲ宿主細胞で使用するために）及びネオ遺伝子（Ｇ４１８選択のために）を含む。軽鎖及び重鎖の発現では、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は標準技法により宿主細胞内にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、外因性ＤＮＡの原核又は真核宿主細胞内への導入のために一般的に使用される多種多様な技法、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等を包含することが意図されている。
【０１６９】
本開示の二重特異性結合タンパク質は原核又は真核宿主細胞で発現させることが可能である。ある特定の実施形態では、結合タンパク質の発現は、適切に折り畳まれ免疫的に活性な結合タンパク質を最適に分泌する真核細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞で実施される。本開示の組換え結合タンパク質を発現するための例となる哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含む、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６〜４２２０頁に記載される、ＤＨＦＲ選択可能マーカーと一緒に使用される、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、１９８２年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１〜６２１頁に記載される）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞を含む。結合タンパク質遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されている場合、二重特異性結合タンパク質は、宿主細胞での二重特異性結合タンパク質の発現又は宿主細胞が培養されている培養培地への結合タンパク質の分泌を可能にするのに十分な期間宿主細胞を培養することにより産生される。結合タンパク質は、標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収することが可能である。宿主細胞を使用して、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子のような無傷の結合タンパク質の部分を産生することも可能である。上記手順の変動は本開示の範囲内であることは理解されている。例えば、本開示の二重特異性結合タンパク質の軽鎖又は重鎖（しかし、両方ではない）をコードするＤＮＡで宿主細胞をトランスフェクトするのが望ましいこともある。
【０１７０】
組換えＤＮＡ技術を使用すれば、免疫調節タンパク質及び／又は腫瘍抗原に結合するのに必要ではない軽鎖及び重鎖のどちらか又は両方をコードするＤＮＡの一部又はすべてを取り除くことも可能である。そのような切断されたＤＮＡ分子から発現される分子も本開示の結合タンパク質は包含する。
【０１７１】
本開示の二重特異性結合タンパク質の組換え発現では、宿主細胞は、本開示の２つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターで同時トランスフェクトすることが可能である。２つのベクターは同一の選択可能マーカーを含有することが可能である、又は２つのベクターはそれぞれが別々の選択可能マーカーを含有することが可能である。代わりに、重鎖と軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一ベクターを使用することが可能である。
【０１７２】
核酸が二重特異性結合タンパク質の１つ以上の部分をコードした後、例えば、異なるＣＤＲ配列を有する結合タンパク質、Ｆｃ受容体に対する親和性が低減された結合タンパク質、又は異なるサブクラスの結合タンパク質をコードする核酸を生成するために、さらなる変更又は突然変異をコード配列に導入することが可能である。
【０１７３】
本開示の二重特異性結合タンパク質は化学合成により（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２ｎｄ  ｅｄ．、１９８４年  Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．に記載される方法により）産生することも可能である。無細胞プラットフォームを使用して変異結合タンパク質を生成することも可能である（例えば、Ｃｈｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ  Ｎｏ．２、２００１年（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及びＭｕｒｒａｙら、２０１３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７：４２０〜４２６頁参照）。
【０１７４】
７．５．二重特異性結合タンパク質の精製
本開示のポリペプチドが組換え発現により産生された後は、タンパク質の精製について当技術分野で公知のいかなる方法によっても、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインＡ又はプロテインＧ選択後の抗原に対する親和性により、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）により、又はタンパク質の精製のための他のいかなる標準技法でも、若しくはこの技法の任意の組合せによってタンパク質を精製することが可能である。さらに、本開示のポリペプチド又はこの断片は、精製を促進するために本明細書に記載される又は本技術分野では他の方法で知られている異種ポリペプチド配列に融合することが可能である。ポリペプチドはモノマーとして、又はダイマーとして、例えば、２つのポリペプチドを含む二重特異性結合タンパク質として精製してもよい。例えば、ポリペプチドは清澄、プロテインＡクロマトグラフィー及びウイルス不活化を含む一連のステップにより精製してもよい。
【０１７５】
単離された後は、二重特異性結合タンパク質は、必要に応じて、例えば、高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ、ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８０年）参照）、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のような脂肪族架橋アガロース媒体を用いて）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（例えば、ＣａＰｕｒｅ−ＨＡ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ）又はＣＨＴ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ＴｙｐｅＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）支持体を使用して）又はゲル濾過クロマトグラフィー（例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して）によりさらに精製することが可能である。当技術分野で公知の種々のクロマトグラフィー技法、例えば、フロースルー又は結合溶離モード勾配溶離を使用して二重特異性結合タンパク質の調製物を精製することが可能である。特定の実施形態では、ＣＤ４０及びメソテリンに結合する二重特異性結合タンパク質は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより精製され、ｐＨは６．７±０．１に維持される。
【０１７６】
本開示の二重特異性結合タンパク質は、例えば、活性炭濾過、膜濾過（例えば、ポリエーテルスルホンのような多孔質親水性ポリマーを通す無菌濾過、Ｑ膜濾過又はＳ膜濾過）を含む１つ以上の濾過を通して精製してもよい。例えば、活性炭濾過は、活性炭内の大きな表面積又はポアサイズを使用して水流から不純物を吸着する。Ｑ膜濾過は、高負電荷種を保持するためその表面で第四級アンモニウムイオンを担持する陰イオン交換膜を使用する。これとは対照的に、Ｓ膜濾過は硫酸イオンを担持する陽イオン交換膜を使用して高正電荷不純物を保持する。
【０１７７】
ナノフィルトレーション及びダイアフィルトレーションのような標準最終仕上げ技法、又は任意の最終仕上げ技法の連続での任意の組合せは、精製された二重特異性結合タンパク質を提供する追加の精製のために使用してもよい。
７．６．医薬組成物
本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質は、タンパク質並びに１つ以上の担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む組成物の形態であってもよい。組成物は、獣医使用又はヒトでの医薬品使用のためのような特定の使用のために処方してもよい。組成物（例えば、乾燥粉末、液体製剤等）並びに使用される賦形剤、希釈剤及び／又は担体の形態は、結合タンパク質の意図される使用及び治療的使用では、投与様式に依存することになる。
【０１７８】
治療的使用では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む無菌医薬組成物の一部として供給されてもよい。この組成物はいかなる適切な形態でも可能である（組成物を対象、例えば、ヒト対象、すなわち、患者に投与する所望の方法に応じて）。医薬組成物は、経口的に、経皮的に、皮下に、鼻腔内に、静脈内に、筋肉内に、腫瘍内に、くも膜下腔内に、局所的に又は局在的になどの種々の経路により対象に投与することが可能である。いかなる場合でも投与にもっとも適した経路は、特定の二重特異性結合タンパク質、対象、並びに疾患の性質及び重症度並びに対象の身体的状態に依存することになる。典型的には、医薬組成物は静脈内に又は皮下に投与されることになる。
【０１７９】
医薬組成物は、１用量当たり所定量の本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質を含有する単位剤形で都合よく提示することが可能である。単位用量に含まれる結合タンパク質の量は、処置されている疾患、並びに当技術分野で周知の他の要因に依存することになる。そのような単位投与量は、単回投与に適した量の結合タンパク質を含有する凍結乾燥ドライ粉末の形態、又は液体の形態でもよい。乾燥粉末単位剤形は、注射器、適切な量の希釈剤及び／又は投与に有用な他の成分と一緒にキットに包装してもよい。液体の形態での単位投与量は、単回投与に適した量の結合タンパク質が予め充填された注射器の形態で都合よく供給されてもよい。
【０１８０】
医薬組成物は複数回投与に適した量の二重特異性結合タンパク質を含有するバルク形態で供給されてもよい。
【０１８１】
医薬組成物は、所望の純度を有する二重特異性結合タンパク質を当技術分野で典型的に用いられる任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤（このすべてが本明細書では「担体」と呼ばれる）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、及び他の種々の添加剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液として貯蔵用に調製してもよい。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｓｏｌ、ｅｄ．１９８０年）参照。そのような添加剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに無毒であるべきである。
【０１８２】
７．７．使用方法
７．７．１．治療効果
すでに論じたように、種々の固形腫瘍では、１つ以上の腫瘍抗原が腫瘍細胞の表面で発現されるが、非がん細胞の表面では発現されない又は最小限で発現される。本明細書に提供されるデータでは、免疫調節タンパク質を刺激し細胞表面腫瘍抗原に結合する本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏでこれらの固形腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を発揮することが示されている。したがって、二重特異性結合タンパク質及び／又は二重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物は、治療的に使用して固形腫瘍を処置してもよい。
【０１８３】
一般に、方法は、固形腫瘍を持つヒト患者に、免疫調節タンパク質を刺激し細胞表面腫瘍抗原に結合して治療効果を与える有効量の二重特異性結合タンパク質を投与することを含む。結合タンパク質で治療することができる固形腫瘍は、副腎がん、膀胱がん、骨がん、脳がん（例えば、神経膠腫）、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん（例えば、非扁平上皮非小細胞肺がん、肺腺癌、中皮腫のような非小細胞肺がん）、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫）、黒色腫（例えば、進行期悪性黒色腫）、口腔がん、卵巣がん（例えば、プラチナ製剤抵抗性卵巣がん、卵管がん、原発性腹膜がん）、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、皮膚がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん及び膣がんを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、固形腫瘍は脳がん、乳がん、胃がん、肺がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん及び前立腺がんから選択される。がんは、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞で構成されていてもよく、がんは腫瘍抗原を発現しない腫瘍細胞で構成されていてもよく、又はがんはその一部が腫瘍抗原を発現しその一部が腫瘍抗原を発現しない腫瘍細胞で構成されていてもよい。一部の実施形態では、固形腫瘍は、臨床的有用性を与えることで知られている標準療法（例えば、プラチナベースの治療）を受けて、又はその逆で標準療法を用いて処置することができない（例えば、患者は標準療法での活性成分にアレルギー性である）患者において進んでしまった進行固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、メソテリンに結合している二重特異性タンパク質を使用して、臨床的有用性を与えることで知られている標準療法を受けて、又はその逆で標準療法を用いて処置することができない患者において進んでしまったメソテリン陽性進行固形腫瘍を処置する。ある特定の実施形態では、メソテリンに結合している二重特異性タンパク質を使用して、肺腺癌、中皮腫、膵臓がん又は卵巣がんを処置する。ある特定の実施形態では、メソテリンに結合している二重特異性タンパク質を使用して、非扁平上皮非小細胞肺がん、中皮腫、膵臓がん又は卵巣がんを処置する。ある特定の実施形態では、メソテリンに結合している二重特異性タンパク質を使用して、臨床的有用性を与えることで知られている標準療法を受けて、又はその逆で標準療法を用いて処置することができない患者において進んでしまった局所的に進行した又は転移性疾患のある卵巣がんを処置する。ある特定の実施形態では、メソテリンに結合している二重特異性タンパク質を使用して、臨床的有用性を与えることで知られている標準療法を受けて、又はその逆で標準療法を用いて処置することができない患者において進んでしまった局所的に進行した又は転移性疾患のある非小細胞肺がんを処置する。ある特定の実施形態では、メソテリンに結合している二重特異性タンパク質を使用して、プラチナベースの療法（又はそれぞれＥＧＦＲ活性化若しくはＴＫ活性化突然変異、又はＡＬＫ再構成を含有する腫瘍に対して上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、チロシンキナーゼ（ＴＫ）阻害剤、若しくは未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤）を受けた後に進んでしまった局所的に進行した又は転移性疾患のある非扁平上皮非小細胞肺がんを処置する。ある特定の実施形態では、メソテリンに結合している二重特異性タンパク質を使用して、単剤としての抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストモノクローナル抗体のような免疫療法を、化学療法と組み合わせて、又は抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体と組み合わせて受けた後に進んでしまった局所的に進行した又は転移性疾患のある非扁平上皮非小細胞肺がんを処置する。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲに結合している二重特異性タンパク質を使用して、結腸直腸がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、又は神経膠芽腫を処置する。ある特定の実施形態では、ＰＳＭＡに結合している二重特異性タンパク質を使用して前立腺がんを処置する。ある特定の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４に結合している二重特異性タンパク質を使用して、乳がん又は卵巣がんを処置する。
【０１８４】
がんは新たに診断され処置を受けていなくてもよく、又は抵抗性である、再発している、難治性である、若しくは再発して難治性である、若しくは固形腫瘍の転移形態であってもよい。マウス異種移植モデル（図１７Ａ〜１７Ｂ）での並びにマウス同系腫瘍モデル（図１８）でのｉｎ  ｖｉｖｏデータでは、二重特異性結合タンパク質が有意な抗腫瘍効果を示すことが明らかにされている。さらに、図１９及び２０の生化学バイオマーカーは、二重特異性結合タンパク質を投与すると、同じ用量の公知のマウス抗体１Ｃ１０と比べて肝毒性が低減しサイトカイン放出が低下していることを示している。
【０１８５】
上で論じたように、本開示の二重特異性結合タンパク質は免疫応答を活性化する。したがって、免疫系が変化している患者は処置から排除してもよい。一部の実施形態では、以下の基準：（１）過去２年以内の活動性の又は予め確認された自己免疫疾患（炎症性腸疾患、セリアック病、ウェゲナー症候群を含むがこれらの限定されない）（小児アトピー又は喘息、白斑、脱毛症、橋本症候群、グレーブス病又は全身処置を必要としない乾癬に罹っている（過去２年以内に）対象は排除されない）；（２）原発性免疫不全症、骨髄移植、慢性リンパ性白血病、臓器移植又は結核の以前の臨床診断の病歴；（３）凝固障害又は血小板異常の病歴；（４）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）についての確認された陽性試験結果又は慢性若しくは活動性Ｂ型若しくはＣ型肝炎に罹った対象（Ｂ型又はＣ型肝炎の病歴がある対象で抗ウイルス療法後治癒が確認されている対象は登録してもよい）；（５）免疫療法（ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１に向けられた薬剤を含むがこれらに限定されない）中、前のグレード≧３免疫媒介神経毒性又は間質性肺炎、又は３カ月以内に回復していない又は無症候性になっていない免疫療法中、他の任意の前のグレード≧３免疫媒介有害イベント；（６）二重特異性結合タンパク質の最初の投与に先立つ２８日以内に生、弱毒ワクチンを受けた、のうちの１つ以上を満たした後の患者は排除される。
【０１８６】
本開示の二重特異性結合タンパク質は単独で（単剤療法）或いは他の抗がん治療及び／又は標的若しくは非標的抗がん剤を補助して又はこれと一緒に投与してもよい。二重特異性結合タンパク質単剤療法として投与される場合、１つ以上の二重特異性結合タンパク質を使用してもよい。投与されるのが単剤療法としてであれ又は他の療法若しくは薬剤を補助して若しくはこれと一緒にであれ、全体の処置レジメンが治療効果をもたらすような量の二重特異性結合タンパク質が投与される。
【０１８７】
治療効果とは、患者においてがんを処置するために二重特異性結合タンパク質を使用すれば、治療せず（それが適切な場合）又は既知の標準治療と比べて実証された任意の臨床有用性がもたらされることを意味する。臨床有用性は、当業者であれば知っているいかなる方法によっても評価することが可能である。一実施形態では、臨床有用性は奏効率（ＯＲＲ）（ＲＥＣＩＳＴバージョン１．２を使用して決定される）、奏効期間（ＤＯＲ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び／又は全生存期間（ＯＳ）に基づいて評価される。一部の実施形態では、完全奏効は治療効果を示す。一部の実施形態では、部分奏効は治療効果を示す。一部の実施形態では、安定な疾患は治療効果を示す。一部の実施形態では、全生存期間の増加は治療効果を示す。一部の実施形態では、治療効果は疾患進行までの時間の改善及び／又は症状若しくは生活の質の改善を構成してもよい。他の実施形態では、治療効果は疾病管理期間の増加ではなく、むしろ症状の負荷が著しく低減して生活の質が改善されると言い換えられる。当業者には明らかになるように、治療効果は、二重特異性結合タンパク質を単独で（単剤療法）或いは他の抗がん治療及び／又は標的若しくは非標的抗がん剤を補助して又はこれと一緒に使用して観察してもよい。
【０１８８】
典型的には、治療効果は、がんに対する新たな処置の奏効を測定するよう設計された標準臨床試験を使用して評価される。本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質の治療効果を評価するため、以下の試験：（１）固形癌効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）バージョン１．１、（２）免疫関連ＲＥＣＩＳＴ（ｉｒＲＥＣＩＳＴ）、（３）米国東海岸癌臨床試験グループ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス、（４）免疫関連奏効基準（ｉｒＲＣ）、（５）腫瘍抗原の評価により評価可能な疾患、（６）検証された患者報告アウトカムスケール、並びに／又は（７）全生存期間及び無増悪生存期間についてのカプランーマイヤー法のうちの１つ又は組合せを使用することが可能である。
【０１８９】
腫瘍負荷の変化についての評価は、がん治療薬の臨床評価の重要な特長である。腫瘍縮小（客観的奏効）と疾患進行の発現までの時間の両方ががん臨床試験では重要なエンドポイントである。標準化された奏効基準はＲＥＣＩＳＴ（固形癌効果判定基準）として知られるが、２０００年に発表された。最新版（ＲＥＣＩＳＴ１．１）は２００９年に発表された。ＲＥＣＩＳＴ基準は典型的には、客観的奏効が主要研究エンドポイントである臨床試験において並びに安定な疾患、腫瘍進行又は進行分析までの時間の評価が企てられる試験で使用される。なぜならば、これらの評価基準は解剖学的腫瘍負荷の評価及び試験の過程中のその変化に基づいているからである。表３は、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質のような研究薬への客観的腫瘍奏効を判定するのに使用される奏効基準の定義を与えている。
【０１９０】
【表２８】
2019519223.tif 000046
【０１９１】
本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質の治療効果を決定するのに使用することが可能な二次評価基準は、奏効率（ＯＲＲ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、全生存期間（ＯＳ）、奏効期間（ＤＯＲ）及び奏効の深さ（ＤｐＲ）を含む。ＯＲＲは完全奏効（ＣＲ）又は部分奏効（ＰＲ）を達成する参加者の割合として定義される。ＰＦＳは、どちらが先に起ころうとも、二重特異性結合タンパク質の最初の服用日付から疾患進行又は死亡までの時間と定義される。ＯＳは、がんのような疾患についての診断又は処置の開始の日付から、その疾患に罹っていると診断された患者がまだ生存している時間の長さとして定義される。ＤＯＲは、参加者の最初のＣＲ又はＰＲから疾患進行の時までの時間として定義される。ＤｐＲは、ベースライン腫瘍量と比べた最大奏効点で観察される腫瘍縮小の百分率として定義される。ＯＲＲとＰＦＳの両方の臨床エンドポイントは上に記載されるＲＥＣＩＳＴ１．１基準に基づいて決定することが可能である。
【０１９２】
免疫療法処置を受けているがん患者に特異的である臨床評価のために使用してもよい追加の基準は、標準化免疫関連ＲＥＣＩＳＴ（ｉｒＲＥＣＩＳＴ）基準を含む。例えば、Ｎｉｓｈｉｎｏ、Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．、８４（７）、１２５９〜１２６８頁（２０１５年７月）参照。これらのガイドラインは潜在的免疫調節効果を考慮して上のＲＥＣＩＳＴ１．１基準を修正した。表４は、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質のような免疫調節薬物への客観的腫瘍奏効を判定するのに使用される奏効基準の定義を与えている。
【０１９３】
【表２９】
2019519223.tif 000047
【０１９４】
表５に示されているパフォーマンスステータスのＥＣＯＧスケールを使用して、一人で身のまわりのことをする能力、日常活動及び身体能力の点から患者の機能レベルを記述する。このスケールは、現在ではＥＣＯＧ−ＡＣＲＩＮ癌研究グループの一部になっている、米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）により開発され、１９８２年に公表された。
【０１９５】
【表３０】
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【０１９６】
抗体ベースのがん治療のような免疫療法薬に対する奏効を十分に特徴付け決定するのに使用することが可能な別のセットの基準は免疫関連奏効基準（ｉｒＲＣ）であり、これは２００９年に固形腫瘍の測定のために開発され、２０１３年に更新された。例えば、Ｗｏｌｃｈｏｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９年；１５（２３）：７４１２〜７４２０頁及びＮｉｓｈｉｎｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３年；１９（１４）：３９３６〜３９４３頁参照。最新のｉｒＲＣ基準は典型的には、腫瘍負荷に対する本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質のような免疫療法薬の効果を評価するのに使用され、表６に従って奏効を定義する。
【０１９７】
【表３１】
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【０１９８】
固形腫瘍を処置するために本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質の使用から生じる１つの例示的な治療効果は、投与されるのが単剤療法としてであれ又は他の療法若しくは薬剤を補助して若しくはこれと一緒にであれ、完全奏効である。固形腫瘍を処置するために本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質の使用から生じる別の例示的な治療効果は、投与されるのが単剤療法としてであれ又は他の療法若しくは薬剤を補助して若しくはこれと一緒にであれ、部分奏効である。
【０１９９】
検証された患者報告アウトカムスケールを使用して、特定の報告システムを通じてそれぞれの患者により提供される奏効を表示することも可能である。焦点を合わせた疾患であることよりもむしろ、そのようなアウトカムスケールは、慢性状態を管理しつつ保持された機能に関係する。検証された患者報告アウトカムスケールの１つの非限定的例は、米国国立衛生研究所が出したＰＲＯＭＩＳ（登録商標）（Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｄ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）である。例えば、成人がん患者向けのＰＲＯＭＩＳ（登録商標）身体機能文書は、上肢（例えば、器用さ）、下肢（例えば、歩行又は可動性）及び中心部（例えば、首、後方可動性）の機能についての自己申告力を評価することが可能であり、使い走りのようなルーチンな日常活動を含む。
【０２００】
カプランーマイヤー曲線（Ｋａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｓｔａｔ．Ａｓｓｏｃ．１９５８年；５３（２８２）：４５７〜４８１頁）を使用して、標準治療と比べて二重特異性結合タンパク質療法を受けているがん患者について全生存期間及び無増悪生存期間を評価することも可能である。
【０２０１】
７．７．２．補助的療法
二重特異性結合タンパク質は、抗がん特性を有する他の薬剤又は処置を補助して若しくはこれと一緒に、使用してもよい。補助的に使用される場合、二重特異性結合タンパク質及び他の薬剤（複数可）は単一組合せ医薬製剤に一緒に処方してもよいし、又は単一調整投与レジメンで又は異なる投与レジメンで、別々に処方し投与してもよい。二重特異性結合タンパク質を補助して又はこれと一緒に投与される薬剤は典型的には、結合タンパク質と他の薬剤が互いに悪影響を及ぼさないように、二重特異性結合タンパク質に相補的活性を有することになる。
【０２０２】
二重特異性結合タンパク質を補助して又はこれと一緒に投与してもよい薬剤は、アルキル化剤、血管新生抑制剤、抗体、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、細胞増殖阻害剤、抗ウイルス剤、オーロラキナーゼ阻害剤、アポトーシス促進物質（例えば、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤）、細胞死受容体経路の活性化剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＢｉＴＥ（Ｂｉ−特異的Ｔ細胞エンゲイジャー）抗体、抗体薬物コンジュゲート、生物学的応答修飾物質、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、ＤＶＤ、白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＥｒｂＢ２）受容体阻害剤、成長因子阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）−９０阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ホルモン療法、免疫薬（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、アポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）の阻害剤、挿入抗生物質、キナーゼ阻害剤、キネシン阻害剤、Ｊａｋ２阻害剤、ラパマイシン（ｍＴｏｒ）阻害剤の哺乳動物標的、マイクロＲＮＡ、マイトジェン活性化細胞外シグナル制御キナーゼ阻害剤、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ポリＡＤＰ（アデノシン二リン酸）リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、プラチナ化学療法剤、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤（例えば、イブルチニブ、アカラブルチニブ）、ポロ様キナーゼ（Ｐｌｋ）阻害剤、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド／三角筋植物性アルカロイド、低分子阻害リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、トポイソメラーゼ阻害剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤、並びにこれらの薬剤の１つ以上の組合せを含むがこれらに限定されない。
【０２０３】
免疫薬の例は、インターフェロン、免疫チェックポイント阻害剤及び他の免疫増強剤を含むがこれらに限定されない。インターフェロンはインターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ−１ａ、アクティミューン（登録商標）（インターフェロンガンマ−１ｂ）又はインターフェロンガンマ−ｎ１、この組合せ等を含む。免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１（例えば、ペンブロリズマブ及びニボルマブ）、ＰＤ−Ｌ１（例えば、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ及びＭＰＤＬ３２８０Ａ）、及びＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４、例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ）を標的にする抗体を含む。免疫増強剤はＴ細胞を活性化する抗ＯＸ４０アゴニスト抗体を含む。
【０２０４】
二重特異性結合タンパク質を使用して、放射線療法の有効性を増強してもよい。放射線療法の例は、体外照射療法、内照射療法（すなわち、密封小線源治療）及び全身放射線療法を含む。
【０２０５】
７．８．投与量及び投与レジメン
投与される二重特異性結合タンパク質の量は、処置される固形腫瘍の特定のタイプ、処置されている固形腫瘍の段階、投与様式、投与回数、所望の治療効果並びに患者の年齢、体重及び他の特徴等のような他のパラメータを含むがこれらに限定されない種々の要因に依存することになる。投与の特定の様式及び回数での治療効果をもたらすのに有効な投与量の決定は当業者の能力内である。
【０２０６】
治療効果をもたらすのに有効な投与量は最初にｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデル又は臨床試験から評価してもよい。多種多様の疾患に対する適切な動物モデルは当技術分野では公知である。
【０２０７】
本明細書に開示される二重特異性結合タンパク質は、処置を受ける状態に適しているいかなる経路によっても投与することができる。二重特異性結合タンパク質は典型的には、非経口的に、すなわち、注入、皮下、筋肉内、静脈内（ＩＶ）、皮内、くも膜下腔内、急速投与、腫瘍内注射又は硬膜外に投与されることになる（Ｓｈｉｒｅら、２００４年、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９３（６）：１３９０〜１４０２頁）。一実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、バイアル中凍結乾燥粉末として提供される。投与に先立って、凍結乾燥粉末は減菌注射用蒸留水（ＳＷＦＩ）又は他の適切な媒体で再構成され、二重特異性結合タンパク質を含有する溶液を提供する。こうして得られた再構成溶液は生理食塩水又は他の適切な媒体でさらに希釈され、７日毎に２回、７日毎に１回、１４日毎に１回、２１日毎に１回、２８日毎に１回、３５日毎に１回、４２日毎に１回、４９日毎に１回又は５６日毎に１回ＩＶ注入を介して投与される。一部の実施形態では、最初のサイクルでは、注入は９０分かけて行われる。一部の実施形態では、それに続く注入は６０分かける。
【０２０８】
一部の実施形態では、ＣＤ４０を刺激する抗メソテリン二重特異性結合タンパク質は２つのポリペプチドを含み、それぞれが配列番号４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１９、４２０及び４２１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０２０９】
一例示的実施形態では、ＣＤ４０を刺激する抗メソテリン二重特異性結合タンパク質は、２８日毎に１回０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、又は５．０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０２１０】
別の例示的実施形態では、ＣＤ４０を刺激する抗メソテリン二重特異性結合タンパク質は、２１日毎に１回０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、又は５．０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０２１１】
さらに別の例示的実施形態では、ＣＤ４０を刺激する抗メソテリン二重特異性結合タンパク質は、１４日毎に１回０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、又は５．０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０２１２】
さらに別の例示的実施形態では、ＣＤ４０を刺激する抗メソテリン二重特異性結合タンパク質は、７日毎に１回０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、又は５．０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０２１３】
他の化学療法剤などの他の薬剤を補助して又はこれと一緒に投与される場合、二重特異性結合タンパク質はもう一方の薬剤（複数可）と同じスケジュールで又は異なるスケジュールで投与してもよい。同じスケジュールで投与される場合、二重特異性結合タンパク質はもう一方の薬剤の前に、後で又はと同時に投与してもよい。二重特異性結合タンパク質が標準治療を補助して又はこれと一緒に投与される一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は標準療法の開始に先立って、例えば、標準治療の開始の１日、数日、１週間、数週間、１カ月又は数カ月さえ前に始めてもよい。
【０２１４】
一例示的実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、非小細胞肺がんを処置するためにニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））を補助して使用される。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０及びメソテリンに結合する。特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１９、４２０及び４２１のうちのいずれか１つであり、例えば、二重特異性結合タンパク質は列挙された配列番号から選択されるのと同じアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含む。二重特異性結合タンパク質は、１４日毎に１回０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、又は５．０ｍｇ／ｋｇでＩＶ注入を介して投与される。ニボルマブは、２週間毎に１回６０分かけて３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入により投与される。補助的二重特異性結合タンパク質／ニボルマブ療法は、疾患進行まで又は患者が疾患進行にもはや耐えられなくなるまで続けられる。
【０２１５】
別の例示的実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、非小細胞肺がんを処置するためにニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））を補助して使用される。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０及びメソテリンに結合する。特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１９、４２０及び４２１のうちのいずれか１つであり、例えば、二重特異性結合タンパク質は列挙された配列番号から選択されるのと同じアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含む。二重特異性結合タンパク質は、２１日毎に１回０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、又は５．０ｍｇ／ｋｇでＩＶ注入を介して投与される。ニボルマブは、２週間毎に１回６０分かけて３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入により投与される。補助的二重特異性結合タンパク質／ニボルマブ療法は、疾患進行まで又は患者が疾患進行にもはや耐えられなくなるまで続けられる。
【０２１６】
別の例示的実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、非小細胞肺がんを処置するためにニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））を補助して使用される。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０及びメソテリンに結合する。特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１９、４２０及び４２１のうちのいずれか１つであり、例えば、二重特異性結合タンパク質は列挙された配列番号から選択されるのと同じアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含む。二重特異性結合タンパク質は、２８日毎に１回０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、又は５．０ｍｇ／ｋｇでＩＶ注入を介して投与される。ニボルマブは、２週間毎に１回６０分かけて３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入により投与される。補助的二重特異性結合タンパク質／ニボルマブ療法は、疾患進行まで又は患者が疾患進行にもはや耐えられなくなるまで続けられる。
【０２１７】
別の例示的実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、非小細胞肺がんを処置するためにペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））を補助して使用される。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０及びメソテリンに結合する。特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１９、４２０及び４２１のうちのいずれか１つであり、例えば、二重特異性結合タンパク質は列挙された配列番号から選択されるのと同じアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含む。二重特異性結合タンパク質は、１４日毎に１回０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、又は５．０ｍｇ／ｋｇでＩＶ注入を介して投与される。ペンブロリズマブは、３週間毎に１回３０分かけて２ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入により投与される。補助的二重特異性結合タンパク質／ペンブロリズマブ療法は、疾患進行まで又は患者が疾患進行にもはや耐えられなくなるまで続けられる。
【０２１８】
別の例示的実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、非小細胞肺がんを処置するためにペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））を補助して使用される。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０及びメソテリンに結合する。特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１９、４２０及び４２１のうちのいずれか１つであり、例えば、二重特異性結合タンパク質は列挙された配列番号から選択されるのと同じアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含む。二重特異性結合タンパク質は、２１日毎に１回０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、又は５．０ｍｇ／ｋｇでＩＶ注入を介して投与される。ペンブロリズマブは、３週間毎に１回３０分かけて２ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入により投与される。補助的二重特異性結合タンパク質／ペンブロリズマブ療法は、疾患進行まで又は患者が疾患進行にもはや耐えられなくなるまで続けられる。
【０２１９】
別の例示的実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、非小細胞肺がんを処置するためにペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））を補助して使用される。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質はＣＤ４０及びメソテリンに結合する。特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、配列番号４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１９、４２０及び４２１のうちのいずれか１つであり、例えば、二重特異性結合タンパク質は列挙された配列番号から選択されるのと同じアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドを含む。二重特異性結合タンパク質は、２８日毎に１回０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、又は５．０ｍｇ／ｋｇでＩＶ注入を介して投与される。ペンブロリズマブは、３週間毎に１回３０分かけて２ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入により投与される。補助的二重特異性結合タンパク質／ペンブロリズマブ療法は、疾患進行まで又は患者が疾患進行にもはや耐えられなくなるまで続けられる。
【０２２０】
当業者であれば認識することになるように、上に記載される種々の薬剤についての推奨される投与量は、患者応答を最適化し治療効果を最大にするように調整する必要がある場合がある。
【実施例】
【０２２１】
８．実施例
以下の実施例では、本願明細書において記載される二重特異性結合タンパク質の例示的な実施形態の特定の特徴及び特性を強調するが、それらは説明を目的とするものであり、限定を目的とするものではない。
【０２２２】
［実施例１］
抗ＣＤ４０抗体の生成及び特徴付け
８．１．１．  マウス抗ヒトＣＤ４０ハイブリドーマの生成
ヒトＣＤ４０を過剰発現するマウス３Ｔ１２細胞でＢａｌｂ／Ｃマウス又はＳＪＬマウスを腹膜内免疫感作することにより、モノクローナル抗体を生成した。脾臓を回収し、脾細胞を複数の骨髄腫細胞株ＮＳ０と融合させた。アミノプテリンを用いてハイブリドーマを選択した。アゴニスト活性を有する抗ＣＤ４０抗体を発現する選択したハイブリドーマをスクリーニング及びサブクローニングして、個々のクローンを単離した。
【０２２３】
８．１．２．  ＣＤ４０アッセイ
アゴニスト活性を有する抗体をスクリーニングするため、ＮＦ−ｋＢ経路刺激、単球活性化、ＤＣ活性化及びヒトＣＤ４０リガンド（配列番号２７２）（ＣＤ４０Ｌ）競合を含む機能的アッセイのパネルを開発した。これらのアッセイにおいて、抗ヒトＣＤ４０  Ｇ２８−５（マウスＩｇＧ１）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を陽性対照として、アイソタイプマッチマウス抗体（ｍｕＩｇＧ１）を陰性対照として含めた。
【０２２４】
８．１．２．１．  ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）  ＣＤ４０  ＮＦ−κＢレポーターアッセイ
ヒトＣＤ４０及びＮＦ−κＢレポーター遺伝子を安定して発現するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）  ２９３  ＣＤ４０細胞株（ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ社）を、３０μｇ／ｍＬのブラスチシジン及び１００μｇ／ｍＬのゼオシンで補充したＤＭＥＭ、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で維持した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）  ＣＤ４０細胞表面上のＣＤ４０の活性化は、シグナル伝達カスケードを引き起こし、ＮＦ−κＢの活性化、及びそれに続く胎生期アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の分泌をもたらす。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）  ＣＤ４０細胞２．５×１０５／ｍＬとアゴニスト抗ＣＤ４０を含むハイブリドーマ上清とのインキュベーションにより、ＳＥＡＰの産生が刺激されるが、これは酵素的比色アッセイで測定できる。したがって、ＳＥＡＰのレベルは、ハイブリドーマ上清中の抗ＣＤ４０の活性に対応するものであった。
【０２２５】
８．１．２．２．  単球活性化アッセイ
単球活性アッセイは、単核球細胞株ＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ細胞（ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ社）を使用して実施した。この細胞株は、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１誘導可能なＳＥＡＰレポーター遺伝子を安定的に発現するものであり、これを１０％の熱不活化ＦＢＳ及び２００μｇ／ｍＬのゼオシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。アッセイにおいて、５×１０５／ｍＬのＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ細胞を、最初に４０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγで２４時間プライミングし、その後、さらに２４時間試験試料とインキュベートした。アゴニスト抗ＣＤ４０で誘導されたＳＥＡＰ活性を酵素アッセイでモニタリングした。スクリーニングの結果及び例示的な活性を表１−１に要約する。
【０２２６】
８．１．２．３．  初代ＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０産生アッセイ
また、抗ＣＤ４０クローンを、単球由来の樹状細胞（ｍｏＤＣ）を活性化させるそれらの能力についてスクリーニングした。活性化をＩＬ−１２ｐ７０産生によりモニタリングした。簡潔には、等量のＰＢＳで希釈した、健常なヒトドナーからの全血を、フリットの下でＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（１５ｍＬ）を含むＬｅｕｃｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ社）チューブに添加した。次に血液を中断なく１５分間、１，０００ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、室温で５分間、１，３００ｒｐｍで遠心分離し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。培養培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％熱不活化ＦＢＳ）中に細胞を再懸濁した。その後単球をＳｔｅｍＣｅｌｌからの富化キットを用いてＰＢＭＣから単離し、３７℃で６日間、５％のＣＯ２にて、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４で補充したＳｔｅｍＳｅｐ無血清培地において培養した。新鮮なＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を３日目に培養液に添加し、ＤＣ分化を維持した。６日間の培養後、単球由来の未成熟ＤＣをＦＡＣＳ分析に供して、未成熟ＤＣの表現型：Ｌｉｎ−、ＣＤ８０／ＣＤ８６＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１１ｃ＋を確認した。未成熟ｍｏＤＣをＩＦＮγでプライミングし、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４で補充したＳｔｅｍＳｅｐ無血清培地中で４８時間、抗ＣＤ４０を含む試料で刺激した。培養上清を回収し、市販のＥＬＩＳＡキットでＩＬ−１２ｐ７０産生をアッセイした。スクリーニングの結果及び代表的な活性を表１−１に要約する。
【０２２７】
【表３２】
2019519223.tif 000050
【０２２８】
８．１．３．  マウス抗ＣＤ４０抗体の可変領域の配列決定及びヒト化
ＡＤ１６３．９．３、ＡＤ１６６．４．４、ＡＤ１７５．１４．１１、ＡＤ１６３．１０．７、ＡＤ１６５．１．２、ＡＤ１６３．１６２．１、ＡＤ１６３．２７．１２、ＡＤ１６３．７．２、ＡＤ１６４．１４．６及びＡＤ１６４．７６．３の１０種のモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡ配列（表１−２）をそれぞれ、標準的なＰＣＲ技術を使用してハイブリドーマからクローニングし、標準的なＤＮＡ配列決定技術を使用して配列決定した。全アミノ酸配列を図３Ａ〜３Ｃに示す。
【０２２９】
【表３３】
2019519223.tif 000051
【０２３０】
Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９；８６：１００２９〜１００３３頁）に概説されるように抗体Ｖ領域のヒト化を実施し、得られた抗体の配列を表１−３に要約する。ＣＤＲの標準構造は、Ｈｕａｎｇら（Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５；３６：３５〜４２頁）に従い決定した。同じ又は最も類似するＣＤＲ標準構造を有するヒト生殖系列の可変配列を同定し、適切なヒトＶＨ、ＶＬ及びＪセグメント配列を選択して、抗ＣＤ４０可変領域のフレームワークとした。コンピュータモデルがＣＤＲとの顕著な接触を示唆したフレームワーク位置において、マウス抗ＣＤ４０Ｖ領域のアミノ酸を、元のヒトフレームワークアミノ酸で置換した（逆突然変異）。全アミノ酸配列を図３Ｄ〜３Ｇに示す。
【０２３１】
【表３４】
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【０２３２】
抗ＣＤ４０クローンＡＤ１６３．１６２．１を、上記の方法に従いヒト化した。ＡＤ１６３．１６２．１のヒト化されたバージョンは、ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ６−２及びｈｕＡｂ６−３であった。抗体ｈｕＡｂ６−１は、フレームワーク逆突然変異Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ及びＡ７１Ｖを有するＶＨ（配列番号１０）を有した。抗体ｈｕＡｂ６−２は、フレームワーク逆突然変異Ｍ４８Ｉ及びＡ７１Ｖを有するＶＨ（配列番号１１）を有した。抗体ｈｕＡｂ６−３はフレームワーク逆突然変異Ｍ４８Ｉ及びＡ７１Ｖを有するＶＨ（配列番号１２）、並びに、ヒト生殖系列配列との同一性を向上させるための、ＶＨのＣＤＲの生殖系列変化Ｎ６０Ａ、Ｋ６４Ｑ及びＤ６５Ｇを有した。抗体ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ６−２及びｈｕＡｂ６−３は、フレームワーク逆突然変異Ａ４３Ｓ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ及びＦ７１Ｙを有するＶＬ（配列番号４１）を有した。
【０２３３】
抗ＣＤ４０クローン１６３．７．２のヒト化されたバージョンは、ｈｕＡｂ８−１、ｈｕＡｂ８−２及びｈｕＡｂ８−３（図３Ｄ及び３Ｅ）であった。抗体ｈｕＡｂ８−１は、フレームワーク逆突然変異Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｖ、Ｋ７３Ｒ、Ｙ９１Ｆ及びＲ９４Ｓを有するＶＨ（配列番号１３）を有した。抗体ｈｕＡｂ８−２は、フレームワーク逆突然変異Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｖ、Ｋ７３Ｒ、Ｙ９１Ｆ及びＲ９４Ｓを有するＶＨ（配列番号１４）、並びにＶＨのＣＤＲのＣ５９Ｓ突然変異を有した。抗体ｈｕＡｂ８−３は、フレームワーク逆突然変異Ｍ４８Ｉ、Ａ７１Ｖ及びＲ９４Ｓを有するＶＨ（配列番号１５）を有した。抗体ｈｕＡｂ８−１、ｈｕＡｂ８−２及びｈｕＡｂ８−３はすべて、フレームワーク逆突然変異Ａ４３Ｓ及びＹ８７Ｆを有するＶＬ（配列番号４２）を有した。
【０２３４】
抗ＣＤ４０クローンＡＤ１６４．１４．６をヒト化して、ｈｕＡｂ９−１、ｈｕＡｂ９−２、ｈｕＡｂ９−３、ｈｕＡｂ９−４、ｈｕＡｂ９−５及びｈｕＡｂ９−６とした。抗体ｈｕＡｂ９−１及びｈｕＡｂ９−４は、フレームワーク逆突然変異Ｉ４８Ｍ、Ｖ６７Ｉ及びＶ７１Ｒを有するＶＨ（配列番号１６）を示した。抗体ｈｕＡｂ９−２及びｈｕＡｂ９−５は、フレームワーク逆突然変異Ｉ４８Ｍ及びＶ７１Ｒを有するＶＨ（配列番号１７）を有した。抗体ｈｕＡｂ９−３及びｈｕＡｂ９−６は、フレームワーク逆突然変異Ｉ４８Ｍ及びＶ７１Ｒを有するＶＨ（配列番号１８）、並びに、ヒト生殖系列配列との同一性を向上させるための、さらなる２つのＣＤＲ生殖系列変化Ｔ３０Ｓ及びＮ６５Ｓを有した。抗体ｈｕＡｂ９−１、ｈｕＡｂ９−２及びｈｕＡｂ９−３は、フレームワーク逆突然変異Ｉ２Ａ、Ｙ３６Ｆ及びＹ８７Ｆを有するＶＬ（配列番号４３）を有した。抗体ｈｕＡｂ９−４、ｈｕＡｂ９−５及びｈｕＡｂ９−６は、フレームワーク逆突然変異Ｉ２Ａを有するＶＬ（配列番号４４）を有した。
【０２３５】
クローンＡＤ１６４．１４．６にさらに、ＶＬのフレームワーク逆突然変異Ｉ２Ａを復帰させることにより、軽鎖の第２位に存在するシグナルペプチド切断部位を除去した。フレームワーク突然変異Ａ２Ｉ及びＡ２Ｖをそれぞれ含む抗体ｈｕＡｂ９  Ａ２Ｉ（配列番号５０）及びｈｕＡｂ９  Ａ２Ｖ（配列番号５１）では、望ましくない切断産物の形成が防止された。
【０２３６】
本実施例では、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びカッパ軽鎖定常領域を有するヒト化抗体が生成された。ヒトＩｇＧ１重鎖のタンパク質発現後、翻訳後プロセシングにより、Ｃ末端リシンが部分的に切断され得る。したがって、ｈｕＡｂ９−５は、配列番号３１０又は３１１に従った重鎖、及び配列番号３２０に従った軽鎖を有した。それぞれ配列番号３１２又は３１３、及び配列番号３１４又は３１５に従った重鎖に対応する、重鎖定常領域にＶ２７３Ｅ及びＶ２７３Ｙアミノ酸突然変異を有し、配列番号３２０に従った軽鎖を有する抗体ｈｕＡｂ９−５も産生された。ヒトＩｇＧ１  Ｖ２７３Ｅ重鎖定常領域を有する抗体ｈｕＡｂ９  Ａ２Ｉ及びｈｕＡｂ９  Ａ２Ｖが生成された。したがって、ｈｕＡｂ９  Ａ２Ｉは、配列番号３１２又は３１３に従った重鎖、及び配列番号３２１に従った軽鎖を有した。同様に、ｈｕＡｂ９  Ａ２Ｖは、配列番号３１２又は３１３に従った重鎖、及び配列番号３２２に従った軽鎖を有した。
【０２３７】
８．１．４．  ＮＦ−κＢ活性化、ＣＤ４０結合動態、種間交差反応性及びヒト化抗体のエピトープクラス
本発明のヒト化抗ＣＤ４０抗体によるＮＦ−κＢ活性化を、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）  ２９３  ＣＤ４０  ＮＦκＢレポーター細胞において評価した。活性化は、ＯＤ６５５で測定されるＳＥＡＰ（分泌型胎生期アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子活性として表した。測定された最大ＯＤ６５５、及び最大半量の活性化のための濃度（ＥＣ５０）を表１−４に要約する。
【０２３８】
【表３５】
2019519223.tif 000053
【０２３９】
本発明のヒト化抗ＣＤ４０抗体の結合親和性を、表面プラスモン共鳴及びＦＡＣＳ分析の両方により解析した。
【０２４０】
ＣＤ４０の結合動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置による表面プラスモン共鳴アッセイにより分析した（表１−５）。簡潔には、ヤギ抗マウスＦｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ社）又はヤギ抗ヒトＦｃ（Ｐｉｅｒｃｅ社）をＣＭ５センサーチップに固定化し、次に試験表面上で抗ＣＤ４０抗体を捕捉した。その後、可溶化形態のヒトＣＤ４０（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＭａｒｔ社）又はカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ４０（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＭａｒｔ社）の細胞外ドメインを注入し、結合及び解離を測定した。
【０２４１】
表面プラスモン共鳴のデータは、ヒト化ｈｕＡｂ８−１及びｈｕＡｂ９−５抗体が、それぞれ、それらの親クローンＡＤ１６３．７．２又はクローンＡＤ１６４．１４．６と同等の結合親和性（ＫＤ）を保持し、ヒト及びカニクイザルＣＤ４０への同等の結合を示したことを示すものであった（表１−５）。
【０２４２】
【表３６】
2019519223.tif 000054
【０２４３】
ヒト又はカニクイザルＣＤ４０で安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞、並びに、カニクイザル又はヒトＰＢＭＣに由来するＢ細胞の細胞表面ＣＤ４０へのヒト化抗ＣＤ４０抗体の結合についても評価した。ヒト化抗ＣＤ４０抗体を、氷上で１５分間、ＨＥＫ２９３トランスフェクト体とインキュベートし、蛍光コンジュゲート抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）により結合を検出した。細胞のＦＡＣＳ分析により、ヒト化抗体がヒト及びカニクイザルＣＤ４０安定細胞株と結合することが確認された。マウス又はイヌのＣＤ４０で行った実験では、結合は観察されなかった。
【０２４４】
また、抗ＣＤ４０抗体の、ヒト及びカニクイザルのＣＤ４０を発現する初代細胞と結合するそれらの能力について評価した。蛍光色素ＣＦ６４０Ｒとコンジュゲートした抗ＣＤ４０抗体と、ヒト又はカニクイザル血液から単離したＰＢＭＣをインキュベートした。ＦＡＣＳ分析後、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）ソフトウェアによりデータを分析した。これらの結果は、ヒト化抗体が、ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣの両方に由来する初代ＣＤ４０陽性細胞に結合することを証明するものであった。
【０２４５】
プレートに結合したヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号２７２）への抗ＣＤ４０及びＣＤ４０複合体の結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイにより、本発明のヒト化抗体のエピトープ分類を確認した。漸増量のヒト化抗ＣＤ４０抗体又はヒトＩｇＧ１対照抗体を、１μｇ／ｍＬのＣＤ４０−ｈｕＦｃ融合タンパク質とインキュベートし、ＣＤ４０Ｌコーティングしたプレートに添加した。未コーティングのプレートからのシグナルをバックグラウンドとして定めた。ヒト化抗体ｈｕＡｂ８−３及びｈｕＡｂ８−１は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの相互作用をブロックしたが、ｈｕＡｂ６−１及びｈｕＡｂ６−２は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの相互作用への影響が僅かであった。ｈｕＡｂ９−５及びｈｕＡｂ９−６のデータは、これらの抗体がＣＤ４０ＬへのＣＤ４０の結合を増強することを示唆するものであった。
【０２４６】
８．１．５．  抗ＣＤ４０抗体のＦｃ領域の修飾によるＦｃγＲＩＩＢ結合の増強
ＣＤ４０の高いアゴニスト活性は、Ｆｃ領域を修飾してＦｃγＲＩＩＢ結合を増強することにより実現できる（Ｌｉ及びＲａｖｅｔｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１；３３３：１０３０〜１０３４頁、及びＷｈｉｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１１；１８７：１７５４〜１７６３頁）。ヒトＩｇＧ１定常領域における２７３位での２つの突然変異、Ｖ２７３Ｅ及びＶ２７３Ｙをヒト化抗ＣＤ４０抗体に導入した。Ｆｃγレセプターに対する結合へのＦｃ突然変異の影響は、ＦＡＣＳ分析及び抗体依存的細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）によりモニタリングした。
【０２４７】
漸増量の抗ＣＤ４０ヒトＩｇＧ１抗体及びそれらのＦｃ変異体を、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、及びＦ又はＶ多形のいずれかを有するＦｃγＲＩＩＩＡのような種々のヒトＦｃγ受容体を安定的に発現するＣＨＯ細胞とインキュベートした。蛍光コンジュゲート抗ヒトＦ（ａｂ’）２特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）により結合を検出した。突然変異Ｖ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低下させる一方、ＦｃγＲＩＩＢへの結合を維持又は増強した。
【０２４８】
ヒト化抗ＣＤ４０抗体のＦｃ変異体のＡＤＣＣは、標準的なプロトコル（Ｌａｗら、２００５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：８３３１〜８頁）を使用して測定した。突然変異Ｖ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙは、ＣＤ４０を発現する細胞における、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃにより媒介されるＡＤＣＣ活性を低減した。
【０２４９】
８．１．６．  Ｆｃ修飾を有する抗ヒトＣＤ４０のｉｎ  ｖｉｔｒｏアゴニスト活性
抗ＣＤ４０  Ｆｃ変異体のアゴニスト活性は、Ｂ細胞増殖を刺激するそれらの能力、ＤＣによるＩＬ−１２ｐ７０産生、並びに同種異系ＤＣ及びＴ細胞の混合培養におけるＩＦＮγ産生について評価した。
【０２５０】
８．１．６．１．  Ｂ細胞増殖
Ｂ細胞富化キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により、ネガティブセレクションを介してヒトＢ細胞を富化した。精製したＢ細胞を、ウェル当たり５×１０５／ｍＬ、ＡＩＭ−Ｖ無血清培地（ＧＩＢＣＯ社）中２００μＬで９６ウェルプレートに播種した。連続希釈した抗ＣＤ４０抗体を添加し、６日間Ｂ細胞と培養した。培養の最終１６時間において、Ｈ３ＴｄＲの１μＣｉを各ウェルの培養液に添加し、Ｂ細胞の増殖をＨ３ＴｄＲ取り込みにより決定した。Ｈ３ＴｄＲ取り込みに関連する放射能を、分当たりのカウント（ＣＰＭ）としてシンチレーションカウンターで記録した。対応するヒトＩｇＧ１野生型抗体と比較して、抗ＣＤ４０ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ変異体Ｖ２７３Ｅ及びＶ２７３Ｙは、増強されたＢ細胞活性化を示した。
【０２５１】
８．１．６．２．  ＤＣ  ＩＬ−１２ｐ７０産生
最初にヒトＰＢＭＣから精製された単球から未成熟ＤＣを誘導し、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦで処理した。ＩＦＮγによるプライミングの後、抗ＣＤ４０抗体によりＤＣ成熟及びＩＬ−１２ｐ７０産生を誘導した。抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ８−１及びｈｕＡｂ９−５の野生型ヒトＩｇＧ１バージョンは、ＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０の産生を刺激する強力な活性を示した。Ｖ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙ突然変異バージョンのＦｃでは、ＤＣを活性化する効力が維持されたか又は増強された。
【０２５２】
８．１．６．３．  同種異系ＤＣとＴ細胞との共培養
上記の方法を使用した単球に由来する樹状細胞（５×１０３個）を、異なるドナーから精製した１×１０５個のＴ細胞と混合した。各種の量の、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域又はＦｃ変異体のいずれかを担持する抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ８−１、ｈｕＡｂ９−５を、ＤＣ及びＴ細胞の共培養液に添加した。４日間のインキュベーション後、上清を回収し、ＩＦＮγをＥＬＩＳＡで測定した。
【０２５３】
抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ８−１及びｈｕＡｂ９−５は、自己由来ＤＣ及びＴ細胞の共培養において、ＩＦＮγの産生を増加させた。ＩＦＮγの産生は、Ｔ細胞の活性化及び潜在的なＴ細胞媒介細胞毒性を表す。ＨｕＡｂ９−５及びｈｕＡｂ８−１は、Ｔ細胞の刺激においてｈｕＡｂ６−１より強力であった。
【０２５４】
８．１．７．  抗ヒトＣＤ４０抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
野生型ヒトＩｇＧ１及びＦｃ変異体を有するヒト化抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ８−１及びｈｕＡｂ９−５を、前立腺がん異種移植、ＰＣ３を担持するＮＳＧマウスにおける腫瘍増殖を阻害するそれらの能力について評価した。
【０２５５】
ＰＣ３細胞（１×１０６）、精製されたＴ細胞（５×１０５）及び自己由来ＤＣ（１×１０５）の混合物をＮＳＧマウスの皮下に接種した。抗ＣＤ４０抗体又は対照抗体を、２ｍｇ／ｋｇで、接種直後に腹膜内に単回投与で注入した。カリパス定規で腫瘍体積を一日おきに測定した。ｈｕＡｂ６−１、ｈｕＡｂ８−１、ｈｕＡｂ９−５、及び対応するＶ２７３Ｅ又はＶ２７３ＹのＦｃ変異体を含む抗ＣＤ４０抗体は、ＰＣ３腫瘍の増殖を阻害した。
【０２５６】
［実施例２］
抗メソテリン抗体の生成及び特徴付け
８．２．１．  完全ヒト抗ヒトメソテリン抗体の生成
ｉｎ  ｖｉｔｒｏＲＮＡディスプレイ技術（Ｈｓｅｈ、Ｃ−Ｍ．、Ｋｕｔｓｋｏｖａ、Ｙ．Ａ．及びＭｅｍｍｏｔｔ、Ｊ．Ｅ．、米国特許出願第２０１０／０１０５５６９号）及びその後の親和性成熟を通じて抗メソテリン抗体ＨｕＡｂ１７を得ることにより、完全ヒト抗メソテリン抗体を生成した。
【０２５７】
配列アラインメントにより、メソテリン抗体ＨｕＡｂ１７がヒト生殖系列ＶＨ１−４６／ＪＨ４及びＩＧＬＶ３−１／Ｊｋ２と最も高い同一性を有することが示された。メソテリンに対するＨｕＡｂ１７の親和性を高めるため、ＩｇＢＬＡＳＴデータベース中の他のヒト抗体配列から、高頻度で突然変異を有し、生殖系列ＶＨ１−４６及びＩＧＬＶ３−１に高い同一性を有するＣＤＲ残基を同定した。次に、対応するＨｕＡｂ１７  ＣＤＲ残基を、これらの高頻度の突然変異を有するＣＤＲ位置で低い縮重を有するプライマーを用いたＰＣＲにより、限定的な突然変異導入に供して、表面へのディスプレイに適するｓｃＦｖフォーマットにおける３つの抗体ライブラリーを作製した。第１のライブラリーは、ＶＨ  ＣＤＲ＃１及びＶＨ  ＣＤＲ＃２における残基３０、３１、３３、３４、５０、５３、５６及び５８（カバット番号付け）において、第２のライブラリーは、ＶＨ  ＣＤＲ＃３における残基９５〜１００ｄにおいて、第３のライブラリーは３つのＶＬ  ＣＤＲにおける残基２７、３０、３１、３３、５２、５３及び９３〜９６において、突然変異を含んでいた。ＨｕＡｂ１７をヒト生殖系列のフレームワーク配列により近く適合させるさらなる突然変異のため、ＶＨのＤ２７Ｙ及びＶ５５Ｇの位置でバイナリー縮重（ｂｉｎａｒｙ  ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）を導入した。また、以下の位置は生殖系列のものであった：ＶＨの位置１３、３７、７４、７６、８２ａ、８４、９１及び９４、並びにＶＬの位置２０及び１００。ＨｕＡｂ１７ライブラリーを示し、磁気次いで蛍光活性化セルソーティングにより、低濃度のビオチン化メソテリンを排除する選択を行った。親のＨｕＡｂ１７及びその親和性成熟変異体を表２−１に列挙する。各クローンの重鎖又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図４Ａ〜４Ｅに示す。
【０２５８】
【表３７】
2019519223.tif 000055
【０２５９】
８．２．２．  完全ヒト抗メソテリン抗体のメソテリン結合動態及び種間交差反応性
上記の方法を使用して、表面プラスモン共鳴により、完全ヒト抗メソテリン抗体を、ヒト及びカニクイザルメソテリンへの結合親和性について測定した。ヒト抗メソテリン親抗体ＨｕＡｂ１７及びその親和性成熟変異体の、ヒト及びカニクイザルメソテリンに対する結合動態を、表２−２に要約する。
【０２６０】
【表３８】
2019519223.tif 000056
【０２６１】
８．２．３．  ＣＡ１２５の存在下での親和性成熟ヒト抗メソテリンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合
メソテリンは、中皮腫、卵巣がん及び膵がんを含むいくつかの固形腫瘍にて高発現し、しばしば他の腫瘍抗原であるＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）と共に同時発現される。メソテリンは、ＣＡ１２５と相互作用して細胞接着を媒介し得ることが報告されている（Ｒｕｍｐ  Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４，２７９：９１９０〜９１９８頁）。本願明細書に記載の抗メソテリン抗体が、腫瘍中のＣＡ１２５で富化された微小環境においてメソテリンと結合できるか否かを決定するため、内因性ＣＡ１２５発現の有無において腫瘍細胞株に対する抗メソテリン親和性成熟変異体の結合を測定した。
【０２６２】
卵巣がん細胞株であるＯＶＣＡＲ３、膵がん細胞株であるＳＷ１９９０及び腎臓がん細胞株であるＳＮ１２Ｃに対する抗メソテリン親和性成熟変異体の結合を、ＦＡＣＳによって測定した。ＯＶＣＡＲ３及びＳＷ１９９０の両方はＣＡ１２５を発現するが、ＳＮ１２Ｃ細胞におけるＣＡ１２５発現は検出されなかった。ＳＮ１２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３に対する最大結合及び最大半量結合の濃度を表２−３に要約するが、これは、内因性のメソテリン発現と共に、ＣＡ１２５の発現を有するか（ＣＡ１２５＋）又は有さない（ＣＡ１２５−）、メソテリン陽性の腫瘍細胞株に対する、ヒト抗メソテリン親和性成熟抗体の結合動態を示す。
【０２６３】
【表３９】
2019519223.tif 000057
【０２６４】
抗メソテリン抗体の結合に対する可溶性ＣＡ１２５の影響を測定するため、漸増量の可溶性ＣＡ１２５でプレインキュベートしたがん細胞に、最適下の濃度（０．５μｇ／ｍＬ）の抗体を添加した。ＣＡ１２５の存在下での抗体のメソテリン結合は、ヤギ抗ヒト蛍光コンジュゲート二次抗体により検出した。図５Ａ〜５Ｃに表すように、代表的な抗メソテリン親和性成熟変異体は、漸増量の可溶性ＣＡ１２５の存在下で、種々の腫瘍細胞株に対する一貫した結合を示した。抗メソテリン親和性成熟変異体の、ＯＶＣＡＲ３細胞に対する、及びメソテリンを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞に対する結合曲線は、可溶性ＣＡ１２５の存在においても顕著にシフトしなかった（図６Ａ〜６Ｂ）。
【０２６５】
［実施例３］
抗４−１ＢＢ抗体の生成及び特徴付け
８．３．１．  ラット及びマウスハイブリドーマ技術による抗４−１ＢＢ抗体
当技術分野で公知の方法（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ，１９９８））に従いラット及びマウスを免疫感作した。組換えマウス４−１ＢＢ−ＥＣＤ−ヒトＦｃ融合体又はマウス４−１ＢＢ−ＥＣＤ−ｈｉｓタンパク質を免疫原として使用した。ヒト及びマウス４−１ＢＢを発現するヒト細胞株を使用して、抗血清力価の決定、及び抗原特異的抗体のスクリーニングを行った。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの後足の膝に対し、注入当たり動物当たり１０μｇのタンパク質を含む用量で免疫感作し、初回及び追加免疫感作のいずれも、Ｇｅｒｂｕ  ＭＭアジュバント（Ｃｏｏｐｅｒ−Ｃａｓｅｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）の存在下で行った。対する種の４−１ＢＢに対する免疫応答を増強するため、最終追加免疫において、ヒト及びマウスの４−１ＢＢ−ＥＣＤ−ｈｉｓタンパク質の混合物でさらに動物を追加免疫した。
【０２６６】
８．３．２．  ハイブリドーマへの融合及びスクリーニング
マウス骨髄腫細胞株であるＮＳ０細胞を培養して、融合の直前に対数増殖期に到達させた。膝窩部及び鼠径部のリンパ節を各マウスから切除し、単一の細胞の懸濁液を無菌的に調製した。当技術分野で公知の方法（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９８）、Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７頁（１９７５）、ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  （Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳ）ＥＣＭ  ２００１  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｍａｎｕａｌ）に従いリンパ球を骨髄腫細胞と融合させた。融合後のハイブリット細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ＨＡＴ培地と共に９６ウェルプレートに分注した。生存するハイブリドーマのコロニーからの上清を、組換え型ヒト４−１ＢＢ又はマウス４−１ＢＢを発現するヒト細胞株を使用した細胞ベースのスクリーニングに供した。
【０２６７】
ヒット株を増殖させ、ヒト４−１ＢＢ、カニクイザル４−１ＢＢ及びマウス４−１ＢＢを発現するヒト細胞株、並びに検出用のヤギ抗ラットＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）又はヤギ抗マウス抗ＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を使用したＦＡＣＳにより結合特異性を確認した。選択したヒット株を、ＭｏＦｌｏ（ベックマン社）を使用して９６ウェル細胞培養プレートにウェル当たり１個の細胞を播いてサブクローニングし、細胞株の単クローン性を担保した。得られたコロニーを、ヒト４−１ＢＢタンパク質、カニクイザル４−１ＢＢ又はマウス４−１ＢＢを発現するヒト細胞株を使用したＦＡＣＳにより特異性に関してスクリーニングした。各モノクローナル抗体のアイソタイプは、ラットモノクローナルアイソタイピングキット（Ｓｅｒｏｔｅｃ社）又はマウスアイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して決定した。目的の抗体を産生するハイブリドーマクローンを精製し、表面プラスモン共鳴、効力（ＮＦκＢレポーターアッセイ）及びリガンド競合（ＥＬＩＳＡ）により、親和性に関してさらに特徴付けを行った。例示的なマウス抗体ＴＡＢＢＹ１．１〜ＴＡＢＢＹ１０、又はラット抗体ＴＡＢＢＹ１０１〜ＴＡＢＢＹ１０８のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列を、図７Ａ〜７Ｃ及び７Ｆ〜７Ｇに示す。
【０２６８】
８．３．３．  ４−１ＢＢアッセイ
８．３．３．１．  ４−１ＢＢ  ＮＦ−κＢレポーター
ｐＬｅｎｔｉ−ＮＦκＢ−ルシフェラーゼベクターで予め形質導入したＨＥＫ２９３細胞に対し、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して、ヒト、カニクイザル又はマウス４−１ＢＢタンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトした。レポーター細胞表面上の４−１ＢＢの活性化は、ＮＦ−κＢの活性化、及びその後ルシフェラーゼの発現をもたらすシグナル伝達カスケードを引き起こす。細胞を解凍し、５×１０５細胞／ｍＬで再懸濁し、５０μＬ／ウェル（ウェル当たり２５，０００個の細胞）で、９６ウェル型の白色／透明底板（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）に直接プレーティングした。滴定の際、精製された抗体調製物を、５０μＬ／ウェルで、３０、１０、３．３３、１．１１、０．３７又は０．１２μｇ／ｍＬで添加し、これを２回行った。クロスリンカーを、５０μＬ／ウェルで、１２０、４０、１３．３３、４．４４、１．４８又は０．４９μｇ／ｍＬ又は培地となるよう添加し、これを２回行った。以下の試薬をクロスリンカーとして使用した：ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）又はヤギ抗ラットＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）。組換え型のヒト（Ａｂｂｖｉｅ社、６μｇ／ｍＬ）若しくはマウス（Ｒ＆Ｄ社、６μｇ／ｍＬ）の４−１ＢＢリガンド、ＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ社、６０ｎｇ／ｍＬ）又は増殖培地を、各細胞株における最大及び最小のルシフェラーゼ活性のための対照ウェルに添加した。アッセイプレートを３７℃で一晩インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を、７５μＬ／ウェルでＢｒｉｔｅＬｉｔｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）の相対発光（ＲＬＵ）として測定した。以下の通りリガンド活性のパーセントとしてデータをプロットした：
相対活性（％）＝（（試料のＲＬＵ−培地のＲＬＵ）／（リガンドのＲＬＵ−培地のＲＬＵ））×１００。
【０２６９】
８．３．３．２．  ４−１ＢＢ  ＦＡＣＳ結合
試験抗体の種特異性及び相対的な結合親和性を測定するため、膜上に４−１ＢＢを外因的に発現する細胞株を生成した。ヒト、カニクイザル又はマウス４−１ＢＢタンパク質を発現するプラスミドでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。安定的に高発現する細胞集団をＭｏＦｌｏソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ社）でソーティングし、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＤＭＥＭ、１０％のウシ胎児血清で維持した。アッセイの際、細胞をトリプシンで分離させ、５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、５０μＬ／ウェル（２５０，０００個の細胞／ウェル）で５００μＬのポリプロピレンプレート（Ｎｕｎｃ社）に移した。試験抗体を、２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２、０．１５６、０．０７８、０．０３９、０．０１９５、０．００９７６μｇ／ｍＬ（５０μＬ／ウェル、１回）でアッセイプレートの適切なウェルに添加し、２０分間室温でインキュベートした。ウェル当たり２５０μＬ／ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で細胞を２回洗浄した。ＰＥ標識した検出用抗体を、ストック液の１：２５０希釈で５０μＬ／ウェルで添加し、室温で２０分間インキュベートした。以下の検出用抗体を使用した：ヤギ抗ラットＩｇＧ−ＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）又はヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）。細胞を１回洗浄し、１％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）上でプレートを蛍光分析した。
【０２７０】
８．３．３．３．  ４−１ＢＢ  リガンド競合
４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）との結合の競合に関する抗４−１ＢＢ抗体の能力を評価するため、ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。Ｉｍｍｕｎｌｏｎ  ４プレート（Ｄｙｎａｔｅｃ社）を室温で一晩、炭酸−重炭酸バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ社）中のヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ社）０．５μｇ／ｍＬでコーティングした。プレートを洗浄し、マウス（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）又はヒト（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）４−１ＢＢ−Ｆｃタンパク質のいずれかを０．２μｇ／ｍＬで添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、試験抗体を１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６、０．０７８、０．０３９、０．０１９５、０．００９７６又は０μｇ／ｍＬで添加し、これを２回行い、室温で１時間インキュベートした。次に溶液をウェルから除去した。ヒト４−１ＢＢＬ（配列番号２７４）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、０．０２μｇ／ｍＬ）又はマウス４−１ＢＢＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、０．０４μｇ／ｍＬ）のいずれかをそれぞれのウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ビオチン化抗ヒト４−１ＢＢＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）又はビオチン化マウス抗４−１ＢＢＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）試薬のいずれかを０．０５μｇ／ｍＬで添加してアッセイプレートにおける４−１ＢＢＬの存在を検出した。プレートを洗浄し、１：５０００希釈したアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を用いて、室温で３０分間インキュベートすることにより、複合体を検出した。プレートを洗浄し、ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢｉｏＦｘ社）を１００μＬ／ウェルで各ウェルに添加した。５分間の培養後、ＴＭＢ  Ｓｔｏｐバッファー（ＢｉｏＦｘ社）を５０μＬ／ウェルで添加した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて、６５０ｎＭでプレートを読み取った。以下の通り最大結合パーセント（４−１ＢＢＬ）としてデータをプロットした：
最大結合％＝（試料のＯＤ６５０）／（０μｇ／ｍＬ抗体のＯＤ６５０）×１００。
【０２７１】
８．３．３．４．  クロスリンカーによるＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイ
Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ遠心分離により、バフィーコートからヒトＰＢＭＣを精製し、次にＣＤ８＋Ｔ細胞ネガティブセレクションキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用してＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから精製した。ＣＤ８＋Ｔ細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に再懸濁した。またこの培地において抗体を調製した。９６ウェルの平底プレートを、インキュベータ内で２時間、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍＬのＯＫＴ３  １００μＬでコーティングし、プレートをＡＩＭ−Ｖで２回洗浄した。プレートに、５０μＬの４−１ＢＢ抗体（３０μｇ／ｍＬ又は所望の濃度勾配）及び５０μＬヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的抗体（１２０μｇ／ｍＬ又は使用した４−１ＢＢ抗体の４倍量）と共に、５０μＬのＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０５）を添加した。プレートを７２時間インキュベートし、その後、５０μＬの上清をＬｕｍｉｎｅｘによるサイトカイン分析用に採取した。プレートに、ウェル当たり５０μＬのＡＩＭ−Ｖ／０．５μＣｉ３Ｈを添加し、混合液を６時間インキュベートし、チミジン取り込み（増殖）を測定した。
【０２７２】
あるいは、クロスリンカーとしてＣＨＯＫ１−ＦｃγＲトランスフェクト体又はＰＣ３−ＭＳＬＮを用いて、照射を受けた細胞（２×１０４／ウェル）を実験の前日に完全培地中９６ウェルプレートに添加した。ＣＤ８＋Ｔ細胞及び抗体勾配を、ＡＩＭ−Ｖ培地中に調製した。ウェル中の培地を、１００μＬ  ＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０５／ウェル）、及び１μｇ／ｍＬのＯＫＴ３を含む１００μＬ  ４−１ＢＢ抗体で置換した。プレートをインキュベートし、サイトカイン放出及び増殖の解析は上記のように実施した。
【０２７３】
８．３．４．  ラット抗４−１ＢＢ抗体の結合データ
４−１ＢＢに対する例示的な抗体を生成し、対応するＶＨ及びＶＬ配列のアミノ酸配列を図７Ａ〜７Ｃに示す。
【０２７４】
表３−１の表面プラスモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）により示されるように、ラット抗体ＴＡＢＢＹ１０１〜ＴＡＢＢＹ１０８はいずれもマウス４−１ＢＢへの結合を示した。
【０２７５】
【表４０】
2019519223.tif 000058
【０２７６】
さらに、マウス抗体ＴＡＢＢＹ１．１〜ＴＡＢＢＹ１０は、表３−２のＢｉａｃｏｒｅの結果で示されるように、ヒト４−１ＢＢへの結合を示した。
【０２７７】
【表４１】
2019519223.tif 000059
【０２７８】
内因性のヒト４−１ＢＢに対する例示的な抗体の結合、並びにそれらのそれぞれのＥＣ５０を、実施例１の記載と同様の表面プラスモン共鳴分析で決定した。表３−３は、４−１ＢＢ抗体ＴＡＢＢＹ１０６−ｒＩｇＧ１及びＴＡＢＢＹ１０７−ｒＩｇＧ１（すなわち、ラットＩｇＧ１定常領域、並びにそれぞれラムダ及びカッパ軽鎖を有する）が文献記載の４−１ＢＢ抗体３Ｈ３及び１Ｄ８とは異なる結合プロファイルを示したことを示す。３Ｈ３及び１Ｄ８とは対照的に、本開示の抗体は、ヒト４−１ＢＢへの結合を示した。さらに、４−１ＢＢ抗体ＴＡＢＢＹ１０６−ｒＩｇＧ１及びＴＡＢＢＹ１０７−ｒＩｇＧ１は、マウス４−１ＢＢと結合した。
【０２７９】
【表４２】
2019519223.tif 000060
【０２８０】
さらに、例示的な４−１ＢＢマウス抗体ＴＡＢＢＹ１０６−ｒＩｇＧ１及びＴＡＢＢＹ１０７−ｒＩｇＧ１もまた、文献記載の４−１ＢＢ抗体３Ｈ３及び１Ｄ８とは異なり、カニクイザル４−１ＢＢと結合する。この結果を表３〜表４に要約する。
【０２８１】
【表４３】
2019519223.tif 000061
【０２８２】
ラット抗体ＴＡＢＢＹ１０１〜ＴＡＢＢＹ１０８を、上記のＢｉａｃｏｒｅアッセイに従い、ヒト４−１ＢＢに対するヒト４−１ＢＢリガンドとの競合結合に関して試験した。いずれの抗体も、ヒト４−１ＢＢに対する結合についてヒト４−１ＢＢリガンドと競合しなかった。
【０２８３】
［実施例４］
ＣＤ４０及びメソテリンと結合する二重特異性結合タンパク質の設計及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
８．４．１．  理論及び分子設計
腫瘍を標的とする抗ＣＤ４０結合タンパク質は、理想的には、腫瘍細胞の膜に存在する腫瘍抗原と結合し、ＣＤ４０を活性化するものである。腫瘍抗原への結合は、ＣＤ４０多量体化を活性化し、下流のシグナル伝達を開始するための架橋をもたらし得る。腫瘍抗原が存在しないとき、かかる結合タンパク質は、ＣＤ４０アゴニスト活性が最低となるはずである。該結合タンパク質は、細胞表面腫瘍抗原に結合すると、ＣＤ４０アゴニスト活性を増加させる。この目的で、種々の二重特異性結合タンパク質フォーマットを試験した。
【０２８４】
１つのフォーマットは、二重可変ドメイン免疫クロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）（図２Ａ）であり、それはタンデムに２つの可変（Ｖ）ドメインを含み、それらがリンカーで連結され、その下流に従来の抗体の定常領域を有する。ＣＤ４０／腫瘍抗原ＤＶＤ−Ｉｇの構築において、腫瘍抗原に対するＶドメインは、外側ドメインの、分子中のアミノ（Ｎ）末端に配置し、一方、ＣＤ４０に対するＶドメインは内側ドメインに配置した。ＤＶＤ−Ｉｇ内の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）上の２つのＶドメインは、ＧＳリンカー、すなわちＶＨではＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３４６）、ＶＬではＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号３４７）で、又は、抗体中に天然に存在するヒンジ領域に基づき設計した（Ｗｕ，Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５：１２９０〜１２９７頁（２００７））ロング（Ｌ）又はショート（Ｓ）リンカーで結合した。リンカーは、以前に記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂら、ｍＡｂｓ、５（３）：３５８〜３６３頁（２０１３））。重鎖のロングリンカーは、アミノ酸配列ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号３４２）を有し、ショートリンカーは、配列ＡＳＴＫＧＰ（配列番号３４３）を有する。軽鎖のロングリンカーは、アミノ酸配列ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号３４４）を有し、ショートリンカーは、配列ＴＶＡＡＰ（配列番号３４５）を有する。したがって、ＤＶＤタンパク質は可変重鎖及び可変軽鎖のリンカーの組合せにより記載することができ、例えば「ＬＳ」は、可変重鎖「ロング」リンカーと可変軽鎖「ショート」リンカーを含む。
【０２８５】
これらより、各々異なるリンカーの組合せ（ＤＶＤ−ＬＬ、ＤＶＤ−ＬＳ、ＤＶＤ−ＳＬ、ＤＶＤ−ＳＳ、ＤＶＤ−ＧＳ）を有するＤＶＤ結合タンパク質のパネルを、抗ＣＤ４０ドメインではｈｕＡｂ８−１又はｈｕＡｂ９−５から適合させたＶＨ及びＶＬを有し、抗ＭＳＬＮドメインでは抗ＭＳＬＮ抗体ＨｕＡＭ１５から適合させたＶＨ及びＶＬを有するヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ１  Ｖ２７３Ｅ定常領域上に生成した。
【０２８６】
図２Ｂの構造に従ったＣＯ−ＤＶＤ二重特異性タンパク質は、国際公開パンフレット（ＷＯ２０１３／１０１９７２、ＣＯ−ＤＶＤに関する論述）に従い構築してもよい。
【０２８７】
試験した第３の二重特異性フォーマットは、図１Ａに示す式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質である。このフォーマットにおいて、抗体可変ドメインは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（ＶＨ及びＶＬドメインがフレキシブルリンカーにより連結された抗原結合性ドメイン）として表した。１つのｓｃＦｖを分子のＮ末端に位置させ、ヒンジを経て、ＩｇＧ定常領域のＣＨ２領域及びＣＨ３領域を続かせた。第２のｓｃＦｖは、ＣＨ３領域とｓｃＦｖを連結するリンカー（配列番号２５１）を経て、Ｃ末端に配置した。ＣＤ４０及び腫瘍抗原に対するｓｃＦｖをＮ末端又はＣ末端のいずれかに配置した。
【０２８８】
式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ１のＶ２７３Ｅ又はＶ２７３Ｙ定常領域（表４−１）のアミノ（Ｎ）又はカルボキシル（Ｃ）末端のいずれかにＣＤ４０  ｓｃＦｖを配置させた形で生成した。表４−１の結合タンパク質のアミノ酸配列を図８Ａ〜８Ｇに示す。
【０２８９】
【表４４】
2019519223.tif 000062
【０２９０】
８．４．２．  ＣＤ４０二重特異性結合タンパク質のメソテリン依存的活性の評価
条件的活性化を有する分子を、メソテリンの存在下で選択的に活性を示し、それが存在しないときは低いか又は最小の活性を示すよう設計した。本実施例のために、メソテリンの存在下での活性が、メソテリン非存在下と比較して、効力及び規模において、少なくとも５倍の増強を示すはずである。
【０２９１】
メソテリン依存的な条件的活性を有する分子を同定するため、種々のフォーマットの二重特異性結合タンパク質を、ＣＤ４０及びＭＳＬＮ標的への結合を最初に試験した。その後、ＣＤ４０／メソテリン二重特異性結合タンパク質を、メソテリンを発現するＨＥＫ２９３細胞又はメソテリンを発現しない親２９３細胞と共培養したときの、それらのＢ細胞及び樹状細胞を活性化する能力について評価した。上述の通り、Ｂ細胞の活性化をＢ細胞の増殖によりモニタリングし、ＤＣ活性化をＩＬ−１２ｐ７０産生によりモニタリングした。さらに、細胞表面活性化マーカー（、例えばＣＤ２３、ＣＤ８３及びＣＤ８６に関しても、Ｂ細胞及びＤＣに対するフローサイトメトリーによりモニタリングした。これらの実験において、抗ＣＤ４０抗体を陽性対照として使用し、陰性対照としてアイソタイプのマッチしたｈＩｇＧを使用した。
【０２９２】
上で論じたように構築したＤＶＤ−Ｉｇ二重特異性タンパク質であるＤＶＤ−ＬＬ、ＤＶＤ−ＬＳ、ＤＶＤ−ＳＬ、ＤＶＤ−ＳＳ及びＤＶＤ−ＧＳを、ＣＤ４０又はＭＳＬＮとの結合に関して最初に試験し、結合アッセイにおいて結合親和性を示した。ＤＶＤ−Ｉｇ分子を、メソテリン陽性細胞の有無における、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫細胞活性化に関して試験した。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のいずれも、メソテリン依存的なＢ細胞又は樹状細胞活性化を示さなかった。メソテリンの存在下では、これらの分子はほとんど又は全く活性を示さなかった。
【０２９３】
上で論じたようにＣＤ４０及びメソテリンに特異的な可変ドメインを有するが、抗メソテリン結合を顕著に示さない、例示的なＣＯ−ＤＶＤ二重特異性タンパク質を構築した。
【０２９４】
表４−１に記載の式（Ｉ）のいくつかの二重特異性結合タンパク質は、ＣＤ４０及びＭＳＬＮの両方への結合を示し（表４−２）、ＤＣ及びＢ細胞のＭＳＬＮ依存的なＣＤ４０活性化を示すそれらの能力について評価した。式（Ｉ）の二重特異性タンパク質は、メソテリンなしのＨＥＫ２９３細胞と共培養したＤＣからのＩＬ−１２ｐ７０放出をほとんど刺激しなかった一方、同じタンパク質でも、メソテリンを発現するＨＥＫ２９３細胞と共培養したＤＣでは、ＩＬ−１２ｐ７０の放出が顕著に刺激された（図９Ａ）。同様に、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質は、Ｂ細胞をＨＥＫ２９３親細胞と共培養したとき、陰性対照のヒトＩｇＧにより測定されるＢ細胞増殖の刺激活性が最小であった。式（Ｉ）のタンパク質は、メソテリン発現ＨＥＫ２９３細胞と共培養したとき、抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ８−１又はｈｕＡｂ９−５（図９Ｂ）と比較してＢ細胞の増殖を顕著に刺激した。
【０２９５】
【表４５】
2019519223.tif 000063
【０２９６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、免疫細胞における式（Ｉ）の例示的な二重特異性結合タンパク質、Ｂ４０（配列番号４０６）の活性化増強についての概要を表４−３に示す。Ｂ４０は、細胞表面ＭＳＬＮに対する結合後、活性化マーカー（ＣＤ２３及びＣＤ８６）及びＢ細胞増殖の誘導により測定されるＢ細胞活性化を誘導し、また、インターロイキン（ＩＬ）−１２ｐ７０及びＣＤ８３発現により測定される、単球から誘導された樹状細胞（ｍｏＤＣ）の活性化を誘導した。ＭＳＬＮの非存在下で、Ｂ４０はＢ細胞活性化の誘導においてかなり強力ではなく、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ９  Ａ２Ｉと比較して、ｍｏＤＣに対し検出可能な影響を及ぼさなかった。例えば、Ｂ細胞アッセイで見られるように、ＣＤ８６アッセイのリードアウトから、二重特異性結合タンパク質Ｂ４０は、メソテリン非存在下のＢ細胞（「−ＭＳＬＮ」）（メソテリンＥＣ５０＝１．４ｎＭ）から、細胞表面にメソテリンを発現するＨＥＫ２９３細胞と共培養したＢ細胞（「＋ＭＳＬＮ」）（メソテリンＥＣ５０＝０．０３５ｎＭ）に向かって、ＥＣ５０の低減を示した。同様に、単球誘導樹状細胞（「ｍｏＤＣ」）においも、いずれのアッセイのリードアウトからも、メソテリンのＥＣ５０は、メソテリン非存在下での検出不能（すなわち活性測定値得られず）から、メソテリンを発現するＨＥＫ２９３細胞の存在下でのナノモル濃度以下の効力（ＥＣ５０＝０．１５ｎＭ（ＣＤ８３）及びＥＣ５０＝０．４４ｎＭ（ＩＬ−１２ｐ７０））に至るものであった。
【０２９７】
【表４６】
2019519223.tif 000064
【０２９８】
式（Ｉ）のさらに例示的な二重特異性結合タンパク質を構築し、評価した。タンパク質の可変ドメイン構造を表４−４に示す。例示的なタンパク質Ｖ６−２（配列番号４１９）、Ｖ６−５（配列番号４２０）及びＶ６−６（配列番号４２１）は、図８Ｇ〜８Ｈに示すように、全長アミノ酸配列を有した。さらに、タンパク質Ｖ６−３、Ｖ６−７、Ｖ６−１１及びＶ６−１４を構成する各２つのポリペプチドの配列は、それぞれ、配列番号４２２〜４２５に従ったアミノ酸配列であった。実例においては、ｓｃＦｖＸ及びｓｃＦｖＹの可変鎖の配向（Ｎ→Ｃ方向）は示す通りであり、各場合におけるｓｃＦｖＹと定常領域との間のリンカーは、配列番号２６２のものであった。さらに、ＣＨ２の定常ドメインは、Ｖ２６３Ｌ又はＶ２７３Ｅ置換を有するＩｇＧ１変異体であった。
【０２９９】
【表４７】
2019519223.tif 000065
2019519223.tif 000066
【０３００】
メソテリン及びＣＤ４０と結合する例示的な二重特異性タンパク質の結合データは、表４−５及び表４−６に示すように表面プラスモン共鳴で測定した。結合タンパク質Ｖ５−３、Ｖ６−６及びＶ６−８は、ＣＤ４０及びヒト又はカニクイザル由来のメソテリンへの結合を示した。
【０３０１】
【表４８】
2019519223.tif 000067
【０３０２】
【表４９】
2019519223.tif 000068
【０３０３】
細胞表面にメソテリンを発現するＨＥＫ２９３細胞との共培養での、実施例１に記載の樹状細胞アッセイにおける、式（Ｉ）の例示的な二重特異性タンパク質によるＣＤ４０の条件的活性化の結果を表４−７に示す。二重特異性結合タンパク質Ｖ６−２、Ｖ６−５及びＶ６−６は、ＩＬ−１２ｐ７０の産生で測定される、メソテリンの存在下での樹状細胞の活性化を示した。
【０３０４】
【表５０】
2019519223.tif 000069
【０３０５】
８．４．３．  Ｆａｂ及びｓｃＦｖ領域を有する二重特異性結合タンパク質の設計及び生成
図１Ｂに示されるフォーマットと同様、Ｆａｂ領域及びｓｃＦｖ領域を有する式（Ｉ）の例示的な二重特異性結合タンパク質を調製し、評価した（表４−８）。Ｆａｂ領域は、メソテリン抗体ＨｕＡＭ１５（タンパク質ＣＦ１〜ＣＦ１０）及びＭＳＬＮ７６９２３（タンパク質ＣＦ１１〜ＣＦ２０）に由来した。ＣＨ２定常領域の変異体Ｖ２７３Ｅ及びＶ２６３Ｌの両方を調製した。すべての場合において、ＣＤ４０抗体に由来するｓｃＦｖ領域の方向はＶＨ→ＶＬ（Ｎ→Ｃ方向）であり、Ｆｃ領域からｓｃＦｖの間のリンカーは配列番号２６２であった。したがって、下記の表４−８に示すタンパク質ＣＦ１〜ＣＦ２０の重鎖は、それぞれ、配列番号３５１〜３７０に従ったアミノ酸配列を含んだ。ＣＦ１〜ＣＦ１０の対応する軽鎖は、配列番号３７１に従った配列を、ＣＦ１１〜ＣＦ２０では配列番号３７２に従った配列を含んだ。
【０３０６】
【表５１】
2019519223.tif 000070
【０３０７】
メソテリンと結合するＦａｂ領域及びＣＤ４０と結合するｓｃＦｖ領域を有する二重特異性タンパク質の表面プラスモン共鳴を使用して、例示的な結合データを測定した。ヒトＣＤ４０及びヒトメソテリンのデータを表４−９に、カニクイザル及びカニクイザルメソテリンのＣＤ４０のデータを表４−１０に示す。タンパク質ＣＦ１、ＣＦ３及びＣＦ１９は、ヒトＣＤ４０及びヒトメソテリンの両方に対する顕著な結合親和性をもたらす（ＫＤ＜４．０×１０−７Ｍ）。これら３つのタンパク質はまた、カニクイザルＣＤ４０に対する顕著な結合をももたらす（ＫＤ＜１．５×１０−７Ｍ）。さらに、ＨｕＡＭ１５から誘導される二重特異性結合タンパク質（ＣＦ１及びＣＦ３）は、カニクイザルメソテリンと顕著に結合する一方で（ＫＤ≦２．９×１０−１０Ｍ）、抗体ＭＳＬＮ７６９２３に由来する可変領域を有するＣＦ１９タンパク質は、カニクイザルメソテリンと結合しないか、又は弱い結合を示すのみであった。
【０３０８】
【表５２】
2019519223.tif 000071
【０３０９】
【表５３】
2019519223.tif 000072
【０３１０】
Ｆａｂ領域及びｓｃＦｖ領域を有する例示的な二重特異性結合タンパク質はまた、樹状細胞の細胞表面メソテリンの存在下で、ＣＤ４０の条件的活性化を示す。表４−１１は、メソテリンＦａｂ領域及びＣＤ４０  ｓｃＦｖ領域を有するこれらの例示的な二重特異性結合タンパク質から得られたデータを要約し、ここでは樹状細胞のメソテリン依存的な活性化が示されている。二重特異性結合タンパク質ＣＦ１、ＣＦ３、ＣＦ４、ＣＦ５及びＣＦ９は、ＩＬ−１２ｐ７０の産生で測定される通り、樹状細胞の条件的活性化を示す。
【０３１１】
【表５４】
2019519223.tif 000073
【０３１２】
［実施例５］
例示的なＣＤ４０／メソテリン二重特異性結合タンパク質の生産及び精製
本願明細書に記載の、例えば配列番号４０１〜４１２のいずれか一つの、ＣＤ４０及びメソテリンと結合する式（Ｉ）の例示的な二重特異性結合タンパク質の生産及び精製において、以下のプロトコルが適用できる。細胞バンクの凍結バイアルを解凍し、増殖培地で希釈し、遠心分離して凍結保存培地を除去する。次に細胞を、６ｍＭのグルタミン（Ｇｌｎ）で補充した新鮮な増殖培地ＧＩＡ−１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇｉｂｃｏ製の化学的に規定された培地）中に再懸濁する。細胞懸濁液を３６℃、５％のＣＯ２下で培養する。１１０Ｌのシードバイオリアクターへの接種に充分なバイオマスに、適切なサイズの細胞培養容器に、所定の間隔で新鮮な培地を添加し、体積を調整する。所定の生細胞密度において、シードバイオリアクターの培養液を使用して、３０００Ｌのショートフィル式（ｓｈｏｒｔ−ｆｉｌｌ）バイオリアクターに接種する。シード及びショートフィル式バイオリアクターのいずれにおいても、温度及びＤＯをそれぞれ３６℃及び４０％の設定で制御する。さらに、両バイオリアクターにおいて、ｐＨ６．９の設定を、ＣＯ２又は水酸化ナトリウムの添加により維持する。所定の生細胞密度に達するまで、培養液をショートフィル段階に維持する。
【０３１３】
３０００Ｌのバイオリアクターにおいて生産的培養を、フェドバッチプロセスとして実施する。生産培地（６ｍＭのＧｌｎで補充したＧＩＡ−１）をショートフィル培養液に添加して、生産段階を開始する。３６℃の設定温度から開始し、次に所定の条件で３３℃へ移行させる。ＤＯは４０％の設定に維持する。ｐＨ６．９の設定は、ＣＯ２又は水酸化ナトリウムの添加により維持する。泡の軽減のために必要に応じて消泡剤を添加する。
【０３１４】
所定の生細胞密度において、流加培地（１．５×ＪＣＬ−５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇｉｂｃｏ製の化学的に規定された流加培地）を、所定のフィーディング計画に従って、所定の量で、バイオリアクターにボーラス添加する。またグルコース濃度が所定の濃度以下に低下したときは、生産バイオリアクターに、４０％のグルコースフィード溶液を添加する。細胞生存率が≦７０％に達するか、又は生産バイオリアクター段階の開始後１４日に達するときのいずれか早いときに、生産バイオリアクター産物の回収を開始する。
【０３１５】
粗細胞培養液の回収では、清澄化、プロテインＡクロマトグラフィー、ウイルス不活化、Ｑメンブレン濾過及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行う。次に、部分的に精製された材料を、ナノ濾過、限外濾過及びダイアフィルトレーションによりさらに精製して、医薬賦形剤の添加によって製剤化される原薬を得る。次に該原薬を瓶詰めにし、保存する。
【０３１６】
粗細胞培養液を冷却し、次に連続ディスクスタック遠心機で加圧する。遠心処理物を、遠心機から、デプスフィルター及びＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２研磨フィルター中に直接流動させる。培養液の処理後、デプスフィルター及びファイナルフィルターを緩衝溶液で洗浄して、結合したタンパク質を回収する。合わせた濾液を回収し、２℃〜１２℃で保存する。
【０３１７】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラムを用いて、プロテインＡクロマトグラフィーを実施する。使用前に、平衡化バッファーを使用してＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム上で貯蔵後のすすぎ工程を実施する。カラムを平衡化し、冷却後の清張な回収物をカラム上に直接ロードする。１サイクル当たりの典型的なカラムへのロード量は、樹脂１リットル当たり４０ｇ生成物である。ロードの後、カラムを２回洗浄し、次に５０ｍＭ  酢酸、ｐＨ３．０で溶出する。溶出液の回収の開始及び終了は、ＯＤに基づき行う。サイクル間に、カラムを平衡化バッファーにより溶出後洗浄及び再生を行い、次のサイクルに備え、平衡化前に、０．２Ｍの水酸化ナトリウムにより再生後洗浄を行う。
【０３１８】
リン酸を使用してプロテインＡ溶出液のｐＨを３．５±０．１に調整し、３０〜６０分間維持する。ウイルス不活化プロテインＡ溶出液を、アルギニン及びトリスで中和する。次に、材料をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｘ０ＨＣフィルター及びＣＲ４０活性炭フィルターを順に、次にＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２フィルターを通過させる。Ｑメンブレンフィルターを、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２フィルターの次に直列に配置する。第２のＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２を、Ｑメンブレンの次に直列に配置する。ロード終了後、フィルターを≧１２８ＣＶのＱメンブレンバッファーで洗浄して、フィルター上に残留するいかなる生成物も回収する。Ｑ濾過及び洗浄液を回収し、２℃〜２５℃で保存する。
【０３１９】
ＣａＰｕｒｅヒドロキシアパタイトカラムを結合溶離モードで操作する。カラムを１０ｍＭのリン酸ナトリウムにより、２００ｃｍ／時間の線流速で、５カラム体積で、ｐＨ６．７に平衡化する。二重特異性結合タンパク質を含むＱフィルターのフロースルーをプールし、１００ｃｍ／時間で、約３０ｇ／Ｌの量でカラム上に直接ロードする。ロード後、３カラム体積の平衡バッファーでカラムを洗浄し、次に２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１１４ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出バッファー、ｐＨ６．７で溶出する。
【０３２０】
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２  ０．１μｍプレフィルター、続いてＰｌａｎｏｖａ  ２０  Ｎウイルスフィルターを使用してナノ濾過を実施する。一連のフィルターを注射用水及び１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．７で洗浄し、続いて生成物のウイルス濾過を行う。次にヒドロキシアパタイトカラム溶出液を、一連のフィルター内にポンプで通し、Ｐｌａｎｏｖａフィルターにおいて１４ｐｓｉｇの吸入圧とする。
【０３２１】
ナノ濾過液を標的濃度に濃縮し、次に１０通過量のダイアフィルトレーションバッファー、１０ｍＭのリン酸、ｐＨ７．５により、１８℃〜２５℃の温度で３０ｋＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ３  Ｕｌｔｒａｃｅｌ再生セルロース膜を用いるダイアフィルトレーションを行う。ダイアフィルトレーション後、残留物を回収し、システムをダイアフィルトレーションバッファーですすぐ。次に残留物を賦形溶液で希釈して、最終的な製剤とする。
【０３２２】
［実施例６］
ＣＤ４０及び他の腫瘍抗原と結合する式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質の設計及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
さらなる腫瘍抗原に対する結合ドメインを、式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質によるＣＤ４０活性化能について評価した。腫瘍抗原ネクチン−４（クローン６６．３）、ＰＳＭＡ（クローンＳＡＭ３．１）及びＥＧＦＲ（クローンＧ３０Ｙ）に対するドメインを使用して、ＣＤ４０／ネクチン−４、ＣＤ４０／ＰＳＭＡ及びＣＤ４０／ＥＧＦＲ二重特異性結合タンパク質を、それぞれ構築した。いずれの場合も、二重特異性分子内のＣＤ４０ドメインを、抗ヒトＣＤ４０ヒト化抗体ｈｕＡｂ６−１（クローンＡＤ１６３．１６２．１）から適合させた（表６−１）。いずれの例も、ＣＤ４０ドメインはｈｕＡｂ６−１のＶＨ→ＶＬ方向であり、ＣＨ３ドメインをｓｃＦｖに結合させるリンカーは配列番号２５１を含み、定常領域はＶ２７３Ｙ置換を有するヒトＩｇＧ１から誘導されている。ｓｃＦｖ内の腫瘍抗原可変ドメインの方向を（Ｎ→Ｃ方向で）示す。表６−１のアミノ酸配列を図１０Ｂ〜１０Ｄに示す。
【０３２３】
【表５５】
2019519223.tif 000074
【０３２４】
式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質の実例において、ＣＤ４０及びネクチン−４と結合する例示的な結合タンパク質Ｒ８７（図１１Ａ）、並びにＣＤ４０及びＰＳＭＡと結合する例示的な二重特異性タンパク質Ｒ８９（図１１Ｂ）では、Ｂ細胞活性化の増強が観察される。図１１Ａは、Ｂ細胞単独（上グラフ）と、又はＨＥＫ２９３細胞と培養したＢ細胞（中グラフ）とインキュベートしたとき、Ｒ８７が、アイソタイプがマッチする陰性対照と同様、Ｂ細胞増殖の誘導が最小であることを図示する。ネクチン−４を発現するＨＥＫ２９３細胞と共にＢ細胞を培養したとき（下グラフ）、Ｒ８７は、抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ６−１で刺激した場合よりも顕著に高いレベルでＢ細胞増殖を増強した。同様に、図１１Ｂにおいて、Ｒ８９は、ＰＳＭＡｎで４Ｔ１細胞と共培養においてＢ細胞をほとんど又は全く増殖させなかったが、ＰＳＭＡを発現する４Ｔ１細胞とＢ細胞を共培養したとき、Ｂ細胞増殖を顕著に増強した。
【０３２５】
［実施例７］
４−１ＢＢ及び腫瘍抗原と結合する式（Ｉ）の二重特異性タンパク質の設計及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
抗４−１ＢＢラット抗体ＴＡＢＢＹ１０６及びＴＡＢＢＹ１０７を、当技術分野で公知の方法に従いヒト化して、図７Ｄ〜７Ｅに示す可変重鎖及び軽鎖を有するヒト化抗体を得た。Ｑｕｅｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９；８６：１００２９〜１００３３頁）に記載の構造誘導法（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｇｕｉｄｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して抗体可変領域をヒト化した。齧歯類ＣＤＲ領域のアクセプターとして使用されるヒトＶ領域のフレームワークを配列ホモロジーに基づき選択し、可変領域のホモロジーモデルをインシリコで構築した。ＣＤＲ領域と接触すると予測されるＶ領域内のアミノ酸を、場所が異なる齧歯類抗体の対応する残基で置換した。
【０３２６】
抗体ｈｕ１０６−１は配列番号６９のＶＨ及び配列番号８９のＶＬを有し、一方、ｈｕ１０７−１は配列番号７１のＶＨ及び配列番号９４のＶＬを有する。ｈｕ１０６−１及びｈｕ１０７−１はいずれも、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を有するヒトＩｇＧ１定常領域を示す。ヒト化ｈｕ１０７−１は、実施例３に記載されるように、ラットＴＡＢＢＹ１０７と比較して、表面プラスモン共鳴において同様の結合プロファイルを示した（表７−１）。
【０３２７】
【表５６】
2019519223.tif 000075
【０３２８】
４−１ＢＢ及びメソテリンと結合する例示的な式（Ｉ）のタンパク質を、ヒト化抗４−１ＢＢ抗体のＶＨ及びＶＬ、並びに上で論じた抗メソテリン抗体のアミノ酸配列から生成した。例示的な結合タンパク質のアミノ酸配列を図８Ｉ〜８Ｍに示す。
【０３２９】
ヒト化４−１ＢＢ及びヒト化されたＭＳＬＮ結合領域を含む式（Ｉ）の二重特異性タンパク質における表面プラスモン共鳴を使用、例示的な結合データを決定した（表７−２）。ヒト、カニクイザル及びマウス４−１ＢＢに対する交差反応性、並びにヒトメソテリンとの結合性が保持されていた。
【０３３０】
【表５７】
2019519223.tif 000076
【０３３１】
例示的な結合タンパク質の内因性のヒト４−１ＢＢ及びメソテリンに対する結合活性、並びにそれらのそれぞれのＥＣ５０を、ヒト４−１ＢＢ又はメソテリンでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞への、０．０５ｎＭ、０．１４ｎＭ、０．４ｎＭ、１．２ｎＭ、３．７ｎＭ、１１ｎＭ、３３ｎＭ及び１００ｎＭの試験結合タンパク質濃度を使用したＦＡＣＳ結合により示した。ヒト４−１ＢＢ（上グラフ）又はメソテリン（下グラフ）を発現するＨＥＫ２９３細胞を使用した（図１２Ａ−１２Ｂ）。ｈｕ１０６−１のＶＨ及びＶＬを共有し、ｈｕＩｇＧ１定常領域が異なる抗４−１ＢＢ抗体ｈｕ１０６  ＩｇＧ１又はｈｕ１０６  Ｖ２７３Ｅ（上部左の「１０６．１ｘ１ｘ」、それぞれヒトＩｇＧ１又はｈｕＩｇＧ１  Ｖ２７３Ｅ変異体のいずれかを有する）、又は、ｈｕ１０７−１のＶＨ及びＶＬを共有し、ｈｕＩｇＧ１定常領域が異なるｈｕ１０７  Ｖ２７３Ｅ（下グラフの「１０７．１ｘ１ｘ」、ｈｕＩｇＧ１  Ｖ２７３Ｅを有する）、又はメソテリン抗体ＨｕＡＭ１５（上部右）を対照として使用した。４−１ＢＢ及びメソテリンにより、本開示の例示的な結合タンパク質は、所望の標的への結合を示す。
【０３３２】
ＮＦ−κＢにより作動するヒト４−１ＢＢ及びルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、４−１ＢＢ及びメソテリンに結合する式（Ｉ）の例示的な二重特異性結合タンパク質は、Ｆｃクロスリンカーの存在下においてのみ４−１ＢＢアゴニスト活性による４−１ＢＢ受容体のクラスタリングを補助することを示し（上グラフ）、Ｆｃクロスリンカー、ヤギ抗ヒトＦｃγ抗体の非存在下では活性を示さなかった（下グラフ）（図１３）。実施例３に記載される４−１ＢＢ  ＮＦ−κＢレポーターッセイに従い、ＮＦ−κＢ  ＨＥＫ２９３細胞アッセイを実施した。
【０３３３】
４−１ＢＢ及びメソテリンと結合する式（Ｉ）の例示的な二重特異性結合タンパク質は、細胞表面のヒトメソテリンに依存的なＮＦ−κＢの活性化を示す。図１４Ａ〜１４Ｂに示すように、二重特異性結合タンパク質は、細胞表面メソテリンを発現するＨＥＫ２９３細胞においてＮＦ−κＢの活性化を示した一方（上グラフ）、モックトランスフェクト体で処理したＨＥＫ２９３では、二重特異性結合タンパク質を投与してもほとんど活性化が観察されなかった（下グラフ）。
【０３３４】
さらに、４−１ＢＢ及びメソテリンと結合する式（Ｉ）の例示的な二重特異性結合タンパク質はまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞の４−１ＢＢにより媒介される特異的な活性化を誘導できる。図１５Ａ〜１５Ｂに示すように、実施例３に記載されるアッセイに従い、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞増殖（図１５Ａ）又はインターフェロン−ガンマ産生（図１５Ｂ）により測定した結果、メソテリンを発現するＣＴ２６細胞の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞は条件的活性化を示すが、メソテリンを発現しないＣＴ２６細胞を含む共培養では示されない。同様に、４−１ＢＢ及びメソテリンと結合する二重特異性タンパク質により、メソテリンを発現するＰＣ３細胞の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞は刺激されたが（上グラフ）、ＰＣ３細胞単独ではされなかった（下グラフ）（図１５Ｃ）。
【０３３５】
４−１ＢＢ及びＰＳＭＡと結合する式（Ｉ）の例示的な二重特異性タンパク質は、ヒト化抗４−１ＢＢ抗体のＶＨ及びＶＬ、並びにマウス抗ＰＳＭＡ抗体のアミノ酸配列から得た。抗ＰＳＭＡ抗体のアミノ酸配列を図１０Ａ、１０Ｊ及び１０Ｋに、例示的な結合タンパク質のそれを図１０Ｌに示す。
【０３３６】
式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質は、４−１ＢＢ及びＰＳＭＡの両方と結合し、細胞表面のマウスＰＳＭＡ依存的なＮＦ−κＢの活性化を示した。図１５Ｄ〜１５Ｅに示すように、二重特異性結合タンパク質は、細胞表面ＰＳＭＡを発現するＨＥＫ２９３細胞においてＮＦ−κＢを活性化した（図１５Ｄ）。さらに、ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−１及びｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−２は、ＰＳＭＡを発現するＣＴ２６細胞の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞における活性化を示したが、ＰＳＭＡを発現しないＣＴ２６細胞を含む共培養では示さなかった（図１５Ｅ）。
【０３３７】
４−１ＢＢ及びＢ７−Ｈ４と結合する式（Ｉ）の例示的な二重特異性タンパク質は、ヒト化抗４−１ＢＢ抗体のＶＨ及びＶＬ、並びに抗Ｂ７−Ｈ４抗体のアミノ酸配列から得た。抗Ｂ７−Ｈ４抗体のアミノ酸配列を図１０Ｅ〜１０Ｇに、例示的な結合タンパク質のそれを図１０Ｈ〜１０Ｉに示す。
【０３３８】
図２Ａに従ったＤＶＤ−Ｉｇフォーマットの二重特異性結合タンパク質を、ｈｕ１０６−１の４−１ＢＢ可変ドメイン及びＨｕＡＭ１５のメソテリンドメインから得た。しかしながら、４−１ＢＢ  ＤＶＤ−Ｉｇ二重特異性タンパク質は、上記の式（Ｉ）の二重特異性結合タンパク質とは異なり、ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養したメソテリンを発現するＣＴ２６細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の条件的活性化を示さなかった。
【０３３９】
［実施例８］
ＣＤ４０／腫瘍抗原二重特異性タンパク質は、がん細胞培養株においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性を示す
式（Ｉ）の例示的な二重特異性結合タンパク質は、培養液中の腫瘍細胞の死滅を媒介する条件的免疫活性化を示した。実施したアッセイでは、例示的なＣＤ４０／ＭＳＬＮ二重特異性結合タンパク質が、ヒト自己由来ｍｏＤＣを刺激してＴ細胞を、ＭＳＬＮを発現する腫瘍細胞株を死滅させるように作動する能力を試験した。このアッセイにおいて、ＭＳＬＮ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を安定的に発現するＰＣ３腫瘍細胞を、自己由来ＤＣ及びＴ細胞と共に培養し、対照分子又は二重特異性分子で処理した。４日間の処理後に、生細胞を緑色の蛍光に基づき定量した。図１６に示す通り、アイソタイプがマッチする陰性対照抗体と比較して、ＣＤ４０及びメソテリンと結合する例示的な二重特異性結合タンパク質で処理した培養液では、生細胞数が少なく、これは式（Ｉ）のＣＤ４０／ＭＳＬＮ二重特異性結合タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性を示したことを示唆する。
【０３４０】
［実施例９］
ＣＤ４０／腫瘍抗原二重特異性タンパク質は、がん予防モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す
ＣＤ４０及び腫瘍抗原に結合する式（Ｉ）の二重特異性タンパク質が、がん予防動物モデルにおいて細胞表面腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞の増殖を防止することが示された。例示的な二重特異性結合タンパク質を、同系腫瘍抗原を発現するＰＣ３異種移植腫瘍の増殖を阻害する能力について評価した。精製Ｔ細胞（５×１０５）と、自己由来ＤＣ（１×１０５）と、ＰＣ３−ＭＳＬＮ、ＰＣ３−ネクチン−４又はＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞（１×１０６）との混合物を、ＮＳＧマウスの皮下に接種した。１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０抗体又は対照抗体、又は１ｍｇ／ｋｇの式（Ｉ）の二重特異性タンパク質の単回投与量を、接種直後に腹膜内に注入した。カリパス定規を用いて腫瘍体積を一日おきに測定した。各データポイントは、８匹の動物群の腫瘍体積の平均を表す。
【０３４１】
図１７Ａ〜１７Ｂに示すように、アイソタイプ対照と比較して、ＣＤ４０及びメソテリン（ＭＳＬＮ）、ＰＳＭＡ又はネクチン−４のいずれかに結合する例示的な結合タンパク質は、それぞれの細胞表面抗原を発現するＰＣ３ヒト前立腺がん腫瘍の増殖をより強力に防止する効果を示した。ＭＳＬＮを発現するＰＣ３細胞（図１７Ａ、上グラフ）、及びネクチン−４を発現するＰＣ３細胞（図１７Ｂ、上グラフ）の両方のモデルにおいて、二重特異性タンパク質ｈ２４及びＲ８７は、それぞれ、抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ６−１と比較して、より高い、又は同等の抗腫瘍活性を示した。ＣＤ４０及びＰＳＭＡと結合する二重特異性タンパク質Ｂ８９は、その対応する抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ６−１により観察される場合よりも高い抗腫瘍活性を示した（図１７Ａ、下グラフ）。対照的に、メソテリンを発現しないＰＣ３細胞において（図１７Ｂ、下グラフ）、二重特異性結合タンパク質ｈ２４は、アイソタイプ対照抗体と統計学的に有意に異なる効果を示さなかった。
【０３４２】
［実施例１０］
例示的なＣＤ４０／メソテリン二重特異性タンパク質の、マウス同系腫瘍モデルにおける評価
ＣＤ４０／ＭＳＬＮ二重特異性タンパク質が治療ウインドウを増強できるか否かを試験するため、マウスＣＤ４０及びＭＳＬＮを標的とする概念実証用の式（Ｉ）の分子ＬＢ−１を産生した。ＬＢ−１は、１Ｃ１０（マウスＣＤ４０と結合するアゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体）に由来するＮ末端ｓｃＦｖ（ＶＨ→ＶＬ）、続いてマウスＩｇＧ１ヒンジ、重鎖ＣＨ２／ＣＨ３、及び抗ＭＳＬＮモノクローナル抗体クローンＭＯＲ０６６２６（米国特許出願第２０１１／００２７２６８号を参照）に由来し、ヒト及びマウスＭＳＬＮの両方に対する交差反応性を有するＣ末端ｓｃＦｖドメイン（ＶＨ→ＶＬ）を含む。ＬＢ−１のアミノ酸配列（配列番号４００）を図８Ａに示す。
【０３４３】
マウス二重特異性式（Ｉ）タンパク質ＬＢ−１の結合データを表１０−１に要約する。ＬＢ−１は、抗体１Ｃ１０及びマウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１）を有するＭＯＲ０６６２６それぞれと比較して、ＣＤ４０及びメソテリンへの結合において若干のＥＣ５０の減弱を示す一方で、標的ごとの最大結合量を維持していた。
【０３４４】
【表５８】
2019519223.tif 000077
【０３４５】
８．１０．１．  ＣＤ４０／メソテリン二重特異性タンパク質ＬＢ−１は、マウス同系腫瘍モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す
ＭＳＬＮ（４Ｔ１−ＭＳＬＮ）を安定的に発現するマウス腫瘍細胞株４Ｔ１を使用して、同系免疫適格Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて腫瘍を確立させた。式（Ｉ）の例示的な二重特異性結合タンパク質ＬＢ−１の効果及び毒性を、４Ｔ１−ＭＳＬＮ同系マウスモデルにおける抗ＣＤ４０  １Ｃ１０  ｍＩｇＧ１と比較した。４Ｔ１−ＭＳＬＮ腫瘍（５０ｍｍ３）を担持するマウスを、以下の８群にランダム化した：５ｍｇ／ｋｇのマウスアイソタイプ対照群、５ｍｇ／ｋｇの抗ＭＳＬＮ抗体ＭＯＲ０６６２６  ｍＩｇＧ１群、並びに、抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０  ｍＩｇＧ１及び二重特異性タンパク質ＬＢ−１の各々１．２５、２．５及び５ｍｇ／ｋｇの３つの投与群。ランダム化から３週間にわたる１ｑｗ（すなわち週１回の投与）で投与を開始した。血液試料を２回目の投与後２４時間で採取し、ＡＬＴレベルに関してＶｅｔＳｃａｎ分析に供した。血清サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）サイトカインマルチプレックスアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で測定した。
【０３４６】
抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０  ｍＩｇＧ１及び二重特異性結合タンパク質ＬＢ−１の両方が、用量依存的に４Ｔ１−ＭＳＬＮ腫瘍の増殖を阻害し、一方、抗ＭＳＬＮ抗体ＭＯＲ０６６２６  ｍＩｇＧ１は、抗体アイソタイプと同様の抗腫瘍活性であった（図１８）。５ｍｇ／ｋｇの投与量では、二重特異性結合タンパク質ＬＢ−１及び抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０  ｍＩｇＧ１は、アイソタイプ対照と比較して腫瘍増殖の顕著に高い阻害を示した。
【０３４７】
８．１０．２．  ＣＤ４０／メソテリン二重特異性タンパク質ＬＢ−１は、文献記載の抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０と比較してｉｎ  ｖｉｖｏ毒性の低減を示す
上記の実験において、細胞表面メソテリンの存在下でＣＤ４０を活性化した例示的な二重特異性タンパク質ＬＢ−１は、同じ投与量の抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０と比較して、肝臓毒性の改善を示した。抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０は、５ｍｇ／ｋｇの有効投与量レベルにおいて、血液中における肝酵素アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の高いレベルにより示されるように、肝臓毒性を誘導した。同じ投与量レベルで、二重特異性の式（Ｉ）分子ＬＢ−１は、血液中におけるＡＬＴを上昇させずに、抗腫瘍効果を奏した。図１９に示す通り、二重特異性タンパク質ＬＢ−１は、抗体１Ｃ１０の場合にマウスの肝臓において高いＡＬＴレベルとなる５ｍｇ／ｋｇにおいて、低い肝臓毒性を示す。
【０３４８】
さらに、二重特異性結合タンパク質ＬＢ−１は、各々５ｍｇ／ｋｇで、同じ投与量の抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０の投与において示される高い血清サイトカインレベルを示さなかった。図２０に示す通り、ＬＢ−１又は対照マウスＩｇＧ１の投与と比較して、１Ｃ１０では、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及びＴＮＦ−アルファ（「ＴＮＦａ」）（左）、並びにケラチノサイト化学誘引物質（ＫＣ）、インターフェロンγにより誘導されるタンパク質１０（ＩＰ−１０）及びインターフェロンγにより誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）（右）、の高いサイトカインレベルが観察された。
【０３４９】
さらなる薬力学的分析は、抗ＣＤ４０抗体１Ｃ１０及び二重特異性タンパク質ＬＢ−１の両方が、循環するＢ細胞を活性化させる一方で、ＬＢ−１が血液中では強力ではなく、その活性がリンパ節を排出する腫瘍に局在化されることが示唆された。さらに、二重特異性タンパク質ＬＢ−１は、おそらく抗原提示細胞の腫瘍局在的な活性化のため腫瘍特異的なＴ細胞応答を増強した（データ示さず）。
【０３５０】
［実施例１１］
Ｂａｌｂ／ｃマウス腫瘍モデルにおける例示的な４−１ＢＢ／ＰＳＭＡ二重特異性タンパク質の評価
式（Ｉ）の例示的な二重特異性タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３（配列番号４４７）及びＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４（配列番号４４８）は、各々マウス４−１ＢＢ及びＰＳＭＡの両方への結合を示した。そのため、標的エンゲージメントを示すｉｎ  ｖｉｖｏ実験のためのさらなる評価用にこれらを選択した。８．３．３．２節に記載のアッセイに従い得られた４−１ＢＢ  ＦＡＣＳ結合データを下記の表１１−１に要約する。ｍｕＩｇＧ１定常領域を有する抗４−１ＢＢ抗体ｈｕ１０６−１（「ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１」）及び定常領域にＴ２５２Ｍを有するｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１（「ｈｕ１０６−１  Ｔ２５２Ｍ  ｍＩｇＧ１」）、並びに抗４−１ＢＢ結合タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３及びＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４はいずれも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて約１ｎＭの結合を示した。
【０３５１】
【表５９】
2019519223.tif 000078
【０３５２】
タンパク質の精製を単純化することのみを目的として、ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１  Ｔ２５２Ｍ、Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３及びＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４をすべて、ＣＨ２ドメインにＴ２５２Ｍアミノ酸置換を導入して、プロテインＡに対する親和性を増強させた。Ｎａｇａｏｋａ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、ｖｏｌ．１６（４）、２４３〜２４５頁（２００３）を参照。Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４は、結合タンパク質中にさらなるアミノ酸置換Ｎ２９７Ａを有する点で、Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３と異なった。この突然変異は、マウスＦｃγＲに対する抗ＣＤ３抗体の結合を低下させることが、これまでに示されている。Ｃｈａｏ，ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ、ｖｏｌ．３８、７６〜９２頁（２００９）を参照。上記の表１１−１におけるｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１とｈｕ１０６−１  Ｔ２５２Ｍ  ｍＩｇＧ１との比較により例証されるように、当該突然変異はＦＡＣＳによる４−１ＢＢ結合に対する効果が僅かであった。
【０３５３】
プロトタイプの４−１ＢＢ及びＰＳＭＡと結合する二重特異性タンパク質はまた、ＦＡＣＳで測定される抗ＰＳＭＡ特性を示し、それを下記の表１１−２に要約する。二重特異性タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３及びＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４のＰＳＭＡ結合活性は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ二重突然変異（「ｍＩｇＧ２ａ  ＡＡ」）を有するマウスＩｇＧ２ａアイソタイプを有するＰＳＭＡ抗体ＳＡＭ１０３のそれと同等であった。
【０３５４】
【表６０】
2019519223.tif 000079
【０３５５】
ＰＳＭＡを安定的に発現するマウス腫瘍細胞株ＣＴ２６（ＣＴ２６−ＰＳＭＡ）を使用して、同系免疫適格Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍を確立させた。式（Ｉ）の例示的な二重特異性結合タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３及びＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４の効果及び毒性を、ＣＴ２６−ＰＳＭＡ同系マウスモデルにおける抗４−１ＢＢ抗体ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１  Ｔ２５２Ｍと比較した。ＣＴ２６−ＰＳＭＡ腫瘍（１００ｍｍ３）を担持するマウスを、以下の群（群当たりｎ＝８）にランダム化した：１０ｍｇ／ｋｇのマウスアイソタイプ対照群、１０ｍｇ／ｋｇの抗４−１ＢＢ抗体ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１  Ｔ２５２Ｍ、並びにそれぞれ１０．７ｍｇ／ｋｇ（二重特異性タンパク質の高い分子量を考慮）の二重特異性タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３及びＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４の群。抗体又は結合タンパク質の投与は、接種後１８、２０及び２２日目に合計３回行った。血液試料を、３回目の投与後２４時間において採取し、ＡＬＴレベルに関してＶｅｔＳｃａｎ分析に供した。血清サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）サイトカインマルチプレックスアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で測定した。
【０３５６】
１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ抗体ＴＩＢ１９１  ｍＩｇＧ１の３回の投与後、ＣＴ２６−ＰＳＭＡ腫瘍は、腫瘍増殖速度の顕著な変化なく増殖を続けた（図２１）。対照的に、抗４−１ＢＢ抗体ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１  Ｔ２５２Ｍにより、又は二重特異性結合タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３若しくはＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４により処理されたマウスの群はいずれも、アイソタイプによる処理と比較して、腫瘍増殖速度の減少により測定されるｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示した。個々の動物からのデータは、アイソタイプ処理を受けた動物ではいずれも効果がなかったが（図２２Ａ、上グラフ）、抗体ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１  Ｔ２５２Ｍ（図２２Ａ、下グラフ）又は二重特異性タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３（図２２Ｂ、上グラフ）で処理したマウスでは、腫瘍増殖速度が低減したことを示した。さらに、８匹の動物のうち６匹は、二重特異性タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４による処理後、腫瘍増殖速度の減弱を示した（図２２Ｂ、下グラフ）。
【０３５７】
炎症誘導性サイトカイン放出を、単球化学誘引物質タンパク質−１（「ＭＣＰ−１」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）及びケラチノサイト化学誘引物質（「ＫＣ」）の、抗体又は結合タンパク質の３回目及び最後の投与後の血清中レベルによって測定した（図２３Ａ及び２３Ｂ）。血清中のＭＣＰ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６及びＫＣのレベルは、抗体ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１  Ｔ２５２Ｍの処理と比較して、二重特異性タンパク質Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３又はＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４の処理後はより低かった。これらの炎症誘導性サイトカインの場合、二重特異性タンパク質処理後の血清中サイトカインレベルは、アイソタイプによる処理後の血清中サイトカインレベルと同等であった。
【０３５８】
マウスの肝臓試料を、潜在的な肝臓毒性の兆候としてのＣＤ４５＋免疫細胞浸潤について評価した。マウスから肝臓試料を回収し、１０％のホルマリンで一晩固定して、処理及びパラフィンブロックへの包埋を行った。スライドをブロックから薄切し、免疫組織化学により、ラット抗マウスＣＤ４５  Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社、＃５５０５３９）で染色した。染色したスライドをスキャンし、各スキャン画像中のＣＤ４５陽性の免疫細胞を、ＨＡＬＯ画像解析（Ｉｎｄｉｃａ  Ｌａｂｓ、Ｃｏｒｒａｌｅｓ、ＮＭ、米国）により定量した。
【０３５９】
肝臓（群当たりｎ＝７〜９）を２６日目に回収して、毒性の指標となる免疫細胞浸潤を評価した。抗体ｈｕ１０６−１  ｍＩｇＧ１  Ｔ２５２Ｍで処理した群と比較して、Ｈｕ１０６ｍＰＳＭＡ−３及びＨｕ１０６ｍＰＳＭＡ−４（図２３Ｃ）で処理したマウスの肝臓では、ＣＤ４５＋免疫細胞浸潤が減少していた。
【０３６０】
９．実施形態
１．式（Ｉ）：
Ｘ−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ    （Ｉ）
の２つのポリペプチドを含み、
ＸはｓｃＦｖＸ又はＦａｂ領域であり、Ｘは第１の抗原に特異的に結合し、ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合し、Ｈはヒンジ領域であり、Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、Ｌはポリペプチドリンカーであり、ｓｃＦｖＸ及びｓｃＦｖＹはそれぞれ独立して単鎖可変断片であり、２つの抗原のうちの一方は免疫調節タンパク質であり、他方は腫瘍抗原である、二重特異性結合タンパク質。
【０３６１】
２．免疫調節タンパク質が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリータンパク質及びＣＤ２８ファミリータンパク質から選択されるタンパク質である、実施形態１の二重特異性結合タンパク質。
【０３６２】
３．免疫調節タンパク質が、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＴＮＦＲ２、ＩＣＯＳ、ＴＲＡＩＬＲ１及びＴＲＡＩＬＲ２から選択される、実施形態１又は２の二重特異性結合タンパク質。
【０３６３】
４．腫瘍抗原が細胞表面腫瘍抗原である、実施形態１〜３のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質。
【０３６４】
５．腫瘍抗原が、脳がん、乳がん、胃がん、肺がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん及び前立腺がん由来である、実施形態１〜４のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質。
【０３６５】
６．腫瘍抗原が、メソテリン、ネクチン４、表皮成長因子受容体、前立腺特異的膜抗原及びＢ７−Ｈ４から選択される、実施形態１〜５のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質。
【０３６６】
７．ＸがｓｃＦｖＸである、実施形態１〜６のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質。
【０３６７】
８．第１の抗原が免疫調節タンパク質であり第２の抗原が腫瘍抗原である、実施形態７の二重特異性結合タンパク質。
【０３６８】
９．ｓｃＦｖＸ又はｓｃＦｖＹのいずれかが、
【０３６９】
【表６１】
2019519223.tif 000080
2019519223.tif 000081
から選択されるＶＨ領域及び
【０３７０】
【表６２】
2019519223.tif 000082
2019519223.tif 000083
から選択されるＶＬ領域を含む、実施形態７又は８の二重特異性結合タンパク質。
【０３７１】
１０．ｓｃＦｖＸ又はｓｃＦｖＹのいずれかが、
【０３７２】
【表６３】
2019519223.tif 000084
2019519223.tif 000085
から選択されるＶＨ領域及び
【０３７３】
【表６４】
2019519223.tif 000086
から選択されるＶＬ領域を含む、実施形態７又は８の二重特異性結合タンパク質。
【０３７４】
１１．ｓｃＦｖＸ又はｓｃＦｖＹのいずれかが、
【０３７５】
【表６５】
2019519223.tif 000087
2019519223.tif 000088
から選択されるＶＨ領域及び
【０３７６】
【表６６】
2019519223.tif 000089
から選択されるＶＬ領域を含む、実施形態７〜１０のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質。
【０３７７】
１２．２つのポリペプチドがそれぞれ配列番号４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１９、４２０及び４２１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１１のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質。
【０３７８】
１３．式（ＩＩ）：ｓｃＦｖＸ−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ    （ＩＩ）
のポリペプチドであって、
Ｌはポリペプチドリンカーであり、Ｈはヒンジ領域であり、Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、ｓｃＦｖＸ及びｓｃＦｖＹはそれぞれ独立して単鎖可変断片であり、ｓｃＦｖＸは第１の抗原に特異的に結合し、ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合し、２つの抗原のうちの一方は免疫調節タンパク質であり、他方は腫瘍抗原である、ポリペプチド。
【０３７９】
１４．第１の抗原が免疫調節タンパク質であり第２の抗原が腫瘍抗原である、実施形態１３のポリペプチド。
【０３８０】
１５．免疫調節タンパク質がＣＤ４０又は４−１ＢＢである、実施形態１３又は１４のポリペプチド。
【０３８１】
１６．腫瘍抗原が、メソテリン、ネクチン４、表皮成長因子受容体、前立腺特異的膜抗原及びＢ７−Ｈ４から選択される、実施形態１３〜１５のいずれか１つのポリペプチド。
【０３８２】
１７．ｓｃＦｖＸ−が式（Ｖ）又は（ＶＩ）：
ＶＨＸ−ＬＸ−ＶＬＸ−  （Ｖ）、
ＶＬＸ−ＬＸ−ＶＨＸ−  （ＶＩ）
の構造を有し、
ＶＨＸは可変重鎖であり、ＶＬＸは可変軽鎖であり、ＬＸはポリペプチドリンカーである、実施形態１３〜１６のいずれか１つのポリペプチド。
【０３８３】
１８．−ｓｃＦｖＹが式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）：
−ＶＬＹ−ＬＹ−ＶＨＹ  （ＶＩＩ）、
−ＶＨＹ−ＬＹ−ＶＬＹ  （ＶＩＩＩ）
の構造を有し、
ＶＨＹは可変重鎖であり、ＶＬＹは可変軽鎖であり、ＬＹはポリペプチドリンカーである、実施形態１３〜１７のいずれか１つのポリペプチド。
【０３８４】
１９．ｓｃＦｖＸ−が式（Ｖ）の構造を有し、−ｓｃＦｖＹが式（ＶＩＩ）の構造を有する、実施形態１３〜１８のいずれか１つのポリペプチド。
【０３８５】
２０．ＶＨＸのアミノ酸配列が
【０３８６】
【化１】
2019519223.tif 000090
であり、ＶＬＸのアミノ酸配列が
【０３８７】
【化２】
2019519223.tif 000091
である、実施形態１３〜１９のいずれか１つのポリペプチド。
【０３８８】
２１．ＶＨＹのアミノ酸配列が
【０３８９】
【化３】
2019519223.tif 000092
であり、ＶＬＹのアミノ酸配列が
【０３９０】
【化４】
2019519223.tif 000093
である、実施形態１３〜２０のいずれか１つのポリペプチド。
【０３９１】
２２．Ｌが
【０３９２】
【化５】
2019519223.tif 000094
を含むアミノ酸配列を有する、実施形態１３〜２１のいずれか１つのポリペプチド。
【０３９３】
２３．ＬＸ及びＬＹがそれぞれ
【０３９４】
【化６】
2019519223.tif 000095
を含むアミノ酸配列を有する、実施形態１３〜２２のいずれか１つのポリペプチド。
【０３９５】
２４．式（ＩＩＩ）：
Ｆａｂ−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ    （ＩＩＩ）
のポリペプチドであって、
Ｌはポリペプチドリンカーであり、Ｈはヒンジ領域であり、Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、Ｆａｂは断片抗原結合領域であり、ｓｃＦｖＹは単鎖可変断片であり、Ｆａｂは第１の抗原に特異的に結合し、ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原が腫瘍抗原であり、第２の抗原が免疫調節タンパク質である、ポリペプチド。
【０３９６】
２５．式（ＩＶ）
ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−Ｆｃ−Ｌ−ｓｃＦｖＹ    （ＩＶ）
のポリペプチドであって、
Ｌはポリペプチドリンカーであり、ＶＨ−ＣＨ１はＶＬ−ＣＬを含むペプチドと組み合わされた場合、第１の抗原に特異的に結合し、ＣＨ１はＣＨ１定常ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｈはヒンジ領域であり、Ｆｃは免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を含み、ＶＨは可変重鎖であり、ＶＬは可変軽鎖であり、ｓｃＦｖＹは単鎖可変断片であり、ｓｃＦｖＹは第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原は腫瘍抗原であり第２の抗原は免疫調節タンパク質である、ポリペプチド。
【０３９７】
２６．−ｓｃＦｖＹが式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）：
−ＶＬＹ−ＬＹ−ＶＨＹ  （ＶＩＩ）、
−ＶＨＹ−ＬＹ−ＶＬＹ  （ＶＩＩＩ）、
の構造を有し、
ＶＨＹは可変重鎖であり、ＶＬＹは可変軽鎖であり、ＬＹはポリペプチドリンカーである、実施形態２４又は２５のポリペプチド。
【０３９８】
２７．ＶＨＹのアミノ酸配列が
【０３９９】
【化７】
2019519223.tif 000096
であり、ＶＬＹのアミノ酸配列が
【０４００】
【化８】
2019519223.tif 000097
である、実施形態２６のポリペプチド。
【０４０１】
２８．Ｌが
【０４０２】
【化９】
2019519223.tif 000098
を含むアミノ酸配列を有する、実施形態２６又は２７のポリペプチド。
【０４０３】
２９．ＬＹが
【０４０４】
【化１０】
2019519223.tif 000099
を含むアミノ酸配列を有する、実施形態２６〜２８のいずれか１つのポリペプチド。
【０４０５】
３０．ＦｃがＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４由来のＣＨ２領域を含む、実施形態１〜２９のいずれか１つのポリペプチド。
【０４０６】
３１．ＣＨ２領域がアミノ酸置換Ｖ２６３Ｌ又はＶ２７３Ｅを含む変異ヒトＩｇＧ１である、実施形態３０のポリペプチド。
【０４０７】
３２．Ｈがアミノ酸置換Ｃ２２０Ｓを含む変異ＩｇＧ１ヒンジである、実施形態１〜３１のいずれか１つのポリペプチド。
【０４０８】
３３．Ｆｃがアミノ酸置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍを含む、実施形態１〜３２のいずれか１つのポリペプチド。
【０４０９】
３４．実施形態１〜１２のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【０４１０】
３５．実施形態１〜１２のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【０４１１】
３６．実施形態３５の核酸を含むベクター。
【０４１２】
３７．実施形態３６のベクターで形質転換された原核宿主細胞。
【０４１３】
３８．実施形態３６のベクターで形質転換された真核宿主細胞。
【０４１４】
３９．実施形態３５の核酸を発現するように操作された真核宿主細胞。
【０４１５】
４０．哺乳動物宿主細胞である実施形態３９の真核宿主細胞。
【０４１６】
４１．（ａ）実施形態３８又は実施形態３９の宿主細胞を培養すること及び（ｂ）タンパク質を回収することを含む、二重特異性結合タンパク質を産生する方法。
【０４１７】
４２．免疫系を活性化する方法であって、それを必要とする患者に実施形態１〜１２のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質又は実施形態３４に従った医薬組成物を投与することを含む、方法。
【０４１８】
４３．がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に実施形態１〜１２のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質又は実施形態３４に従った医薬組成物を投与することを含む、方法。
【０４１９】
本出願に引用されるすべての刊行物、特許、特許出願及び他の文書は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文書があらゆる目的のために参照により組み込まれるように個々に指示されている場合と同じ程度にあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【０４２０】
様々な特定の実施形態が図示され説明されてきたが、本発明（複数可）の精神と範囲から逸脱することなく様々な変更が可能であることは認識されるであろう。
【図１Ａ】
2019519223.tif 000100
【図１Ｂ】
2019519223.tif 000101
【図２Ａ】
2019519223.tif 000102
【図２Ｂ】
2019519223.tif 000103
【図３Ａ】
2019519223.tif 000104
【図３Ｂ】
2019519223.tif 000105
【図３Ｃ】
2019519223.tif 000106
【図３Ｄ】
2019519223.tif 000107
【図３Ｅ】
2019519223.tif 000108
【図３Ｆ】
2019519223.tif 000109
【図３Ｇ】
2019519223.tif 000110
【図４Ａ】
2019519223.tif 000111
【図４Ｂ】
2019519223.tif 000112
【図４Ｃ】
2019519223.tif 000113
【図４Ｄ】
2019519223.tif 000114
【図４Ｅ】
2019519223.tif 000115
【図５Ａ】
2019519223.tif 000116
【図５Ｂ】
2019519223.tif 000117
【図５Ｃ】
2019519223.tif 000118
【図６Ａ】
2019519223.tif 000119
【図６Ｂ】
2019519223.tif 000120
【図７Ａ】
2019519223.tif 000121
【図７Ｂ】
2019519223.tif 000122
【図７Ｃ】
2019519223.tif 000123
【図７Ｄ】
2019519223.tif 000124
【図７Ｅ】
2019519223.tif 000125
【図７Ｆ】
2019519223.tif 000126
【図７Ｇ】
2019519223.tif 000127
【図８Ａ】
2019519223.tif 000128
【図８Ｂ】
2019519223.tif 000129
【図８Ｃ】
2019519223.tif 000130
【図８Ｄ】
2019519223.tif 000131
【図８Ｅ】
2019519223.tif 000132
【図８Ｆ】
2019519223.tif 000133
【図８Ｇ】
2019519223.tif 000134
【図８Ｈ】
2019519223.tif 000135
【図８Ｉ】
2019519223.tif 000136
【図８Ｊ】
2019519223.tif 000137
【図８Ｋ】
2019519223.tif 000138
【図８Ｌ】
2019519223.tif 000139
【図８Ｍ】
2019519223.tif 000140
【図９Ａ】
2019519223.tif 000141
【図９Ｂ】
2019519223.tif 000142
【図１０Ａ】
2019519223.tif 000143
【図１０Ｂ】
2019519223.tif 000144
【図１０Ｃ】
2019519223.tif 000145
【図１０Ｄ】
2019519223.tif 000146
【図１０Ｅ】
2019519223.tif 000147
【図１０Ｆ】
2019519223.tif 000148
【図１０Ｇ】
2019519223.tif 000149
【図１０Ｈ】
2019519223.tif 000150
【図１０Ｉ】
2019519223.tif 000151
【図１０Ｊ】
2019519223.tif 000152
【図１０Ｋ】
2019519223.tif 000153
【図１０Ｌ】
2019519223.tif 000154
【図１１Ａ】
2019519223.tif 000155
【図１１Ｂ】
2019519223.tif 000156
【図１２Ａ】
2019519223.tif 000157
【図１２Ｂ】
2019519223.tif 000158
【図１３】
2019519223.tif 000159
【図１４Ａ】
2019519223.tif 000160
【図１４Ｂ】
2019519223.tif 000161
【図１５Ａ】
2019519223.tif 000162
【図１５Ｂ】
2019519223.tif 000163
【図１５Ｃ】
2019519223.tif 000164
【図１５Ｄ】
2019519223.tif 000165
【図１５Ｅ】
2019519223.tif 000166
【図１６】
2019519223.tif 000167
【図１７Ａ】
2019519223.tif 000168
【図１７Ｂ】
2019519223.tif 000169
【図１８】
2019519223.tif 000170
【図１９】
2019519223.tif 000171
【図２０】
2019519223.tif 000172
【図２１】
2019519223.tif 000173
【図２２Ａ】
2019519223.tif 000174
【図２２Ｂ】
2019519223.tif 000175
【図２３Ａ】
2019519223.tif 000176
【図２３Ｂ】
2019519223.tif 000177
【図２３Ｃ】
2019519223.tif 000178
【配列表】
2019519223000001.app
【国際調査報告】
2019519223.tif 000179
2019519223.tif 000180
2019519223.tif 000181
2019519223.tif 000182
2019519223.tif 000183
2019519223.tif 000184
2019519223.tif 000185
2019519223.tif 000186
2019519223.tif 000187