(57)【要約】  本発明は、式ＩＩＩの化合物、それらの誘導体、及び、それらを含有する、中枢神経系及び血管系の病気、特に認知低下を伴う神経変性疾患、酸化ストレスに関連する病気、ミトコンドリア機能不全に関連する病気、パーキンソン病、及び神経障害性疼痛、老化に関連する病的過程をも治療するための医薬組成物に関する。2019519600.tif 000009
2019519600.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤として使用するための、式ＩＩＩの化合物、その塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、プロドラッグ。
【化１】
2019519600.tif 000008
【請求項２】
１種以上の医薬的に許容可能な賦形剤と組み合わせて、式ＩＩＩの化合物が、請求項１に記載のその塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、プロドラッグを含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項３】
中枢神経系及び脈管神経系の病気の治療用の、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
中枢神経系及び脈管神経系の病気の治療用の薬剤の製造用の、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
中枢神経系及び脈管神経系の病気の治療用の薬剤の製造用の、請求項１に記載の式ＩＩＩの化合物の使用。
【請求項６】
神経変性疾患の治療用の薬剤の製造用の、請求項３に記載の式ＩＩＩの化合物の使用。
【請求項７】
パーキンソン病の治療用の請求項４に記載の薬剤の製造のための式ＩＩＩの化合物の使用。
【請求項８】
神経障害性疼痛の治療用の請求項４に記載の薬剤の製造のための式ＩＩＩの化合物の使用。
【請求項９】
異なるタイプの認知症の治療用の請求項４に記載の薬剤の製造のための式ＩＩＩの化合物の使用。
【請求項１０】
アルツハイマー病の治療用の請求項７に記載の薬剤の製造のための式ＩＩＩの化合物の使用。
【請求項１１】
血管性認知症の治療用の請求項７に記載の薬剤の製造のための式ＩＩＩの化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
記述
発明の分野
本発明は、老化に関連する病的過程又は望まない酸化を持つ、認知低下に関連する病気又は神経変性疾患の予防及び／又は治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性は、認知症、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）及び神経障害性疼痛（ＮＰ）などの神経系疾患の多くの病気に共通のトピックである。これらの病気は破壊的であり、及び、それらを管理するのは高価であり、及び、現在の治療は不十分である。この問題の緊急性のため、老化に関するこれらの病気の発生率は、生じている人口構造の変化に起因して急速に増大しているという事実を、我々は付け加える。
【０００３】
世界の人口の進行する高齢化は、神経変性疾患及び老人性認知症の増加という望まない結果を引き起こす。世界中で、４６８０万人の人々が、認知症を持って生きていると推定される。この数は、２０３０年には７４７０万人及び２０５０年には１億３１５０万人と、２０年ごとにほとんど２倍に増加するだろうと推定される。認知症は、莫大な経済的影響をも有する。今日、認知症の世界的なコストの推定値は、８１８０億ＵＳＤであり、２０１８までに１兆ドルの病気になるであろうし、これは、患者及びそれらの親族及び世話人の両方の生活の質に対する途方もない影響を与える(Alzheimer’s Disease International. World Alzheimer Report 2015. London: Alzheimer’s Disease International; 2015)。
【０００４】
これら全ての中で、ＡＤが最も一般的であり、約３５００万の人々が当該病気に苦しんでおり、そして、その発生率は、人口の平均年齢と歩調をそろえて、次の３０年間で著しく増加するであろうと推定される(Reitz, C.; Brayne, C.; Mayeux, R. Epidemiology of Alzheimer’s disease. Nat. Rev. Neurol., 2011, 7, 137-152) (Reitz, C.; Mayeux, R. Alzheimer’s disease: Epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem. Pharmacol., 2014, 88, 640-651)。
【０００５】
ＡＤは、ゆっくりとしたペースで進行する認知機能の喪失及び記憶障害につながる脳の神経変性疾患であり、攻撃性及び憂鬱などの挙動変化をしばしば伴う(Querfurth, H.W.; LaFerla, F.M. Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med., 2010, 362, 329-344)。その最終段階では、患者は寝たきりになり、失禁して介護に依存し、これらは、家族にとって非常に高価なものとなる。平均すると、診断後９年で死亡する(Citron M. (2004). Strategies for disease modification in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5(9): 677-85)。一日中の介護及び他のサービスを要求するこの病気に苦しむ多数の人々は、医療資源、財源及び人的資源にひどく影響するであろう(Suh Y.H. and Checler F. (2002). Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-15 synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease. Pharmacol Rev. 54(3): 469-525). Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-15 synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease. Pharmacol Rev. 54(3): 469-525)。それ故に、これは、増大する医療懸念である。
ＡＤは、皮質連合野の関わりによるものとされる失認（物体、人々、音、形及び／又はにおいを認識する能力）、統合運動障害（運動低下の欠如で意図的な身ぶり及び特定の  動きを調整及び実行する上での身体障害）、及び嚥下障害（発話及び会話  理解力の低下を伴う言語障害）と共に記憶障害によって特徴づけられるプロトタイプ皮質認知症である(Crook R.et al. (1998). A variant of Alzheimer's disease with spastic paraparesis and unusual plaques due to deletion of exon 9 of presenilin 1. Nat Med. 4(4): 452-5) (Houlden H., Baker M., et al. (2000)。痙攣性の５不全対麻痺及び綿花様の斑を持つ変型アルツハイマー病は、例外的に高いアミロイドβ濃度につながるＰＳ−１突然変異に起因する。Ann Neurol. 48(5): 806-8) (Kwok J.B., Taddei K., et al. (1997).早期発症アルツハイマー病家系における２つの新規なプレセニリン−１突然変異、及び、新規な表現型を持つプレセニリン−１突然変異の関連性の予備的証拠。Neuroreport. 8(6): 1537-42) (Verkkoniemi A., Kalimo H., et al. (2001). Variant Alzheimer disease with spastic paraparesis: neuropathological phenotype. J Neuropathol Exp Neurol. 60(5): 483-92).
【０００６】
当該病気は多因子で異質だけれども、それは、ベータアミロイド凝集体及び神経原線維濃縮体の沈着、コリン作動性ニューロンの大量のロスなどの特定の共通の特徴を有する(Huang, Y.; Mucke, L. Alzheimer Mechanisms and Therapeutic Strategies. Cell, 2012, 148, 1204-1222)。
【０００７】
ＡＤの化学的病理学は、パーキンソン病（ＰＤ）との多くの類似点を示す：酸化ストレス、ミトコンドリア複合体Ｉの低減した活性、増加した過酸化脂質。これらの類似点は、病気の進行する性質、死にかけているニューロンの周りの反応性の小膠細胞の増殖、酸化ストレス及び炎症プロセスをも含む。
【０００８】
医薬産業によってなされる大きな投資にもかかわらず、ＡＤ用の有効な治療はほとんど、実際には全く存在しない。
【０００９】
現在認可されている薬が患者によって利益をほとんど提供しないということを我々が考えたとすれば、当該病気を治療するための新薬を得るために、今日異なる戦略がフォローされている。これらの薬は、当該病気のいくつかの症状を一時的に（最良の場合では１年）遅らせるが、それらはその展開を予防しない。
【００１０】
たとえ最初にＡＤがコリン作動性欠乏のみに関連したとしても、ドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン及びグルタメートなどの他の神経伝達物質がＡＤでは低減しているか又は無秩序であるということが示された。現在、ＡＤ病原論において最も研究された神経伝達物質は、コリン作動性であり及びグルタミン酸作動性である(Palmer, AM; Gershon, S. Is the neuronal basis of Alzheimer's disease cholinergic or glutamatergic? FASEB J 1990, 4, 2745-52)。
【００１１】
現在のＡＤ治療選択肢は、ドネペジル、ガランタミン又はリバスティグミンなどの薬でのアセチルコリンエステラーゼの抑制に基づくか、又は、グルタメート受容体、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート）に敵対するメマンチンの能力に基づく。これらの薬の低い成功率に起因して、新型の研究が始まった。(Bartus, RT, Dean, RL 3rd; Beer, B; Lippa, AS The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science 1982, 217, 408-14) (Terry, A.V. Jr.; Buccafusco, J.J. The cholinergic hypothesis of age and Alzheimer's disease-related cognitive deficits: recent challenges and their implications for novel drug development. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003, 306, 821-827) (van Marum, R. J. Current and future therapy in Alzheimer's disease. Fundam. Clin. Pharmacol., 2008, 22, 265-274)
【００１２】
ＡＤのコリン作動性仮説に従って、中枢神経系（ＣＮＳ）でのコリン作動性機能の喪失は、ＡＤに関連する認知機能不全に著しく寄与する(Bartus, R.; Dean, R.; Beer, B.; Lippa, A. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science, 1982, 217, 408-414)。また、コリン作動性の枯渇、アミロイド形成及びＴａｕリン酸化反応の間の関係がたとえ複雑でも、コリン作動性の減少はアミロイド生産を増加し得るし、それはＴａｕタンパク質のリン酸化反応を引き起こし得ると思われる。他方では、ＡＤのグルタミン酸作動性の仮説は、グルタメートと関連する興奮毒性メカニズムが、退化及び細胞死につながるＮＭＤＡ受容体を伴うことを確立する(Bleich S, Romer K, Wiltfang J, Komhuber J. Glutamate and the glutamate receptor system: a target for drug action. Int J Geriatr Psychiatry 2003, 18,S33-40)。ＮＭＤＡ受容体を通すシナプス刺激は、学習及び記憶の機能にとっては重要だが、過剰のグルタメートは、興奮毒性及び神経変性を引き起こし得る(Michaels RL, Rothman SM Glutamate neurotoxicity in vitro: antagonist pharmacology and intracellular calcium concentrations. J Neurosci 1990 10, 283-92)。
【００１３】
このシナリオでは、治療戦略は、グルタメート誘発神経変性との対照の能力があるＮＭＤＡ受容体拮抗薬と、コリン作動性トーンを改善する能力があるＡＣｈｅ酵素阻害剤との組合せによって、両方のシステムの障害を実行すべきである。それにもかかわらず、この組合せの治療は、いくつかの欠点を提示する。別個の薬の投与に直面することに加えて、ＡＤに苦しむ高齢の患者及びそれらを世話する人々にとっての追加の問題を形成する何かがあり、それぞれの薬の異なる薬物動力学は、異なる薬力学で影響し得る。実際には、診療所は、２つの異なるＡＤＭＥ（投与分布代謝排泄）カーブの組合せた治療の管理に直面するであろう。
【００１４】
２つの薬物療法の組合せに対する代替の及び革新的なアプローチは、複合的な薬理的標的に作用可能な薬、いわゆる多標的薬（ＭＴＤ）である。
【００１５】
単純な化合物で同時に２つ以上のタンパク質に作用する戦略は、優れた治療効果を提供し得る(Cavalli A, Bolognesi ML, Minarini A, Rosini M, Tumiatti V, Recanatini M, Melchiorre C. Multi-target-directed ligands to combat neurodegenerative diseases J Med Chem 2008, 51, 347-72) (Zimmerman GR, Lehar J, Keith CT. Multi-target therapeutics; when the whole is greater than the sum of the parts. Drug Discov Today 2007, 12, 34-42) (Morphy R, Ranlovic, Z. Fragments, network biology and designing multiple ligands. Drug Discov Today 2007, 12, 156-60)。これは、混合又は多成分薬物療法でのＭＴＤｓの使用によって提供される潜在的な利益の数によって、説明され得る。混合でのＭＴＤｓの利点は、以下のように要約し得る：１）単純な化合物の薬物動力学が混合のそれよりもかなり容易であることをもし予測するならば、臨床開発の不確実性を低減すること、異なる生物学的利用能、薬物動力学及び代謝の問題を克服すること；２）薬力学安全性；３）複合的な治療の標的を抑制する相乗効果に起因する有効性の増加、及び４）混合薬を消費する副次効果の減少による安全性の増加（薬−薬相互作用に起因リスクの低減）；これは、同じ代謝酵素用の異なる薬の競合がそれらの毒性に影響する薬代謝に特に関連する。
【００１６】
別のもう１つの重要な利点は、承諾の改善された可能性を持つ簡略化された治療体制であり、これは、高齢のアルツハイマー患者及び彼らの世話人にとって特に重要である(Small, G, Dubois B A review of compliance to treatment in Alzheimer's disease: potential benefits of a transdermal patch. Curr Med Res Opin 2007, 23, 2705-13)。これに関して、重要な側面は、アルツハイマー患者が、しばしば関連し得る高血圧症、血管系の病気及び糖尿病を含む広範囲の病状（併存疾患）を受けやすいということである。それ故に、老年人口において多医薬使用に関連する問題は、重要であると近年認識されてきた。これらの問題は、薬相互作用から主として成り、慢性的な疾患及び臓器障害の共存に起因してこの人口ではより頻繁に起こることである。老年人口においては特に、それら単独では安全な２つの薬が、組合せた時にも安全であることは、想定できない。薬治療にとって高齢は予測できないリスク要因であるから、同時に投与する薬の数もできるだけ多く低減すべきである(Turnheim, K. When drug therapy gets old: pharmacokinetics and pharmacodynamics in the elderly. Exp. Geront. 2006, 38, 843-853)。ＭＴＤｓは、組合せで強く有利に働くので、高齢では、多機能薬間の相互作用の複雑さに関する治療、併存疾患、変更薬力学感受性及び薬物動力学の変化がある。ＭＴＤｓの臨床的使用は、治療体制をも簡略化できる(Youdim, M.B., and Buccafusco, JJ (2005) CNS Targets for multi-functional drugs in the treatment of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases J. Neural Transm 112, 519-537)。所定の薬物療法体制での承諾は、有効な治療では必須である。不承諾は一般的な問題を表すが、これは、アルツハイマー患者及び彼らの世話人にとって挑戦である(Small, G, Dubois B A review of compliance to treatment in Alzheimer’s disease: potential benefits of a transdermal patch. Curr Med Res Opin 2007, 23, 2705-13)。その結果、複合的な標的に作用する薬での簡略化された治療体制は、治療への忠実な支持を増加できる。言及される全ての従来の利点が、混合薬では必ずしも有効ではない。
【００１７】
神経変性疾患に伴う基本プロセスは元来、多要因的であるという事実への視野を特に持つと、複合的な標的用のリガンド１戦略は、複雑な神経系疾患の治療用の新しい候補を開発するための革新的なアプローチである(Cavalli A, Bolognesi ML, Minarini A, Rosini M, Tumiatti V, Recanatini M, Melchiorre C. Multi-target-directed ligands to combat neurodegenerative diseases J Med Chem 2008, 51, 347-72)。そのような戦略は、アルツハイマー病及び他の神経変性疾患において暗黙の神経変性プロセスにおいて協同する複合的な標的に１つの単一の化合物が作用でき、それ故に、相互作用している病原性ルート間の望まない代償を予見するであろう、いう概念に基づいている。しかし、ＭＴＤｓは、薬の組合せの使用に対する代替の運用を表すことができる。大部分の神経変性メカニズムは多くの神経疾患によって分けられるので、これらのＭＴＤｓは、他の病気用の薬物療法としても使用できる。
【００１８】
虚血性脳卒中の世界負担は、出血性脳卒中よりもほぼ４倍大きい。現在の証拠では、２５〜３０％の虚血性脳卒中生存者は、即座の又は遅れた血管系の認知低下又は血管性認知症を発現することが示唆される。脳卒中傷害後の認知症は、全てのタイプの認知疾患を含み得る。脳卒中後の死亡のリスクは減少したので、脳の影響及び認知低下を有する脳卒中生存者の数は増加した(R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015)。
【００１９】
脳卒中後の認知症は、それが血管系か、神経変性か、又はその２つのプロセスの組合せを含むか否かは別として、脳卒中傷害後に生じている全てのタイプの認知症を定義する臨床的存在であると考えられている。それは、神経変性病理と同様に大血管及び小血管の病気の変化する組合せと共に複雑な病因を伴う(R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015)。
【００２０】
次々と起きる虚血性傷害について我々が持っている知識から、それは高度に異種遺伝子型の一連の複雑な事象から成ることを我々は知っており(R. Brouns, P.P. De Deyn, The complexity of neurobiological processes in acute ischemic stroke, Clin. Neurol. Neurosurg. 111 (2009) 483-495)、初期の低灌流の事象後の数分から数日及び数週で展開する。主要な事象は、中断した血流に起因するエネルギー不足、興奮毒性、カルシウム過負荷、酸化ストレス、血液脳関門機能不全、微小血管の損傷、止血活性化、炎症及び免疫反応に関する傷害及びニューロン、グリア及び内皮細胞のレベルでの細胞死を含む。数日後に起こり得る微小血管の傷害及びヘマトセファリックバリアーの崩壊は、血管原性浮腫につながり、大出血をも引き起こし得る。同時に、損傷を限定するために及び結果を改善するために脈管形成を含む複雑な範囲の修復及び改造反応を、組織は、受け得る。これらの事象は、柔組織が不可逆的に傷害されてそれによって認知機能不全に寄与するように、老化脳では切り捨てられる(R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015)。
【００２１】
実験的研究では、虚血性障害後の細胞の死亡は壊死に高度に帰因することが示唆される。それにもかかわらず、近年の開発では、ニューロン死亡は、ハイブリッドメカニズムによるものと同様にアポトーシスによって著しく起こることが示される(R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016)）。
【００２２】
神経炎症及び免疫抑制は、脳卒中、老化及び感染症にも関連する。これは、おそらく、脳卒中後の認知機能に対する損傷効果を有する(B.W. McColl, S.M. Allan, N.J. Rothwell, Systemic inflammation and stroke: aetiology, pathology and targets for therapy, Biochem. Soc. Trans. 35 (2007) 1163-1165) (C. Meisel, A. Meisel, Suppressing immunosuppression after stroke, N. Engl. J. Med. 365 (2011) 2134-2136) (W. Swardfager, D.A. Winer, N. Herrmann, S. Winer, K.L. Lanctot, Interleukin-17 in post-stroke neurodegeneration, Neurosci. Biobehav. Rev. 37 (2013) 436-447)。
【００２３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、休息及び平衡への変更における震え、硬直、遅い動き、運動機能不全の症状を伴う神経変性疾患である。当該病気が進行すると、多くの患者は、心配、憂鬱、便秘及び認知症を含む非運動的症状を展開する。これらの特徴は、圧縮一部黒質物質（the compact nigra pars matter）におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失及びドーパミン線条体含有量の大きな減少によるものとされる(Gauthier, 1982)。
【００２４】
ドーパミン作動性ニューロン死亡が７０〜８０％の閾値を超えてそして線条神経末端の喪失が５０〜６０％を超えた後にＰＤの臨床的徴候が現われる(Agid, 1991)。
【００２５】
ＰＤの発現メカニズムに関する研究では、圧縮一部黒質物質におけるドーパミン作動性ニューロン喪失はミトコンドリア複合体Ｉの欠乏に関することが、示された(Jenner 1998)。
パーキンソン症状を軽減する薬がたとえ存在したとしても、これらの薬の慢性的な使用は、ＰＤの進行を予防するのに有効ではなく、そして、それは、副次効果を弱らせることに関連してきた。それ故に、それは、変性の進行を遅らせるか又は停止さえもする神経保護療法を開発するのに大変興味深い。
【００２６】
不運にも、神経保護療法の開発は、ＰＤなどの変性神経系疾患の病原論の制限された知識によって妨げられてきた。パーキンソン病の神経の劣化の原因である病因及び病原論は、依然として未知である。いくつかのラインの証拠は、小膠細胞の活性化の理論をサポートし、そして、炎症プロセスは、進行するニューロン退化につながる次々と起きる事象に伴なわれる(Kreutzgber, GW, 1996 Trends Neurosci, 19:312-318)。活性化小膠細胞は、パーキンソン病患者の黒質物質における退化のニューロンの近傍に存在する(McGeer, PL et al, 1988, Neurology, 38:1285-1291)。
【００２７】
伝統的なＰＤ治療のコースは、レボドパ（Ｌ−ＤＯＰＡ）及びカルビドーパなどのドーパミン作用薬の投与である。アマンタジン及びカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの阻害剤などの他の薬剤が、ドーパミンを置き換えるか又はその劣化を抑制するかの明確な目的で、共通して処方される(N. L. Diaz, C. H. Waters, Expert Rev Neurother 9, 1781 (Dec 1, 2009)。
【００２８】
そのような薬剤は患者の症状を典型的に改善する一方で、それらは、副次効果である運動障害に対して、経時的に耐性な及び／又は有効であるとは必ずしも限らない(A. H. Schapira et al., European Journal of Neurology 16, 1090 (2009))。別のもう１つの厄介な問題は、毎日の治療が、耐え難い負担となって薬物療法に対する患者の忠実な支持を減少させ得るという事実である。それ故に、今日では、皮膚パッチを介して皮膚を通しての解放のため及びミニポンプを配置する（例えば、空腸内、皮下）ことによってドーパミン作用薬の連続的な注入を提供する能力がある薬解放の新しいシステムに、強調が置かれている(A. H. Schapira et al., European Journal of Neurology 16, 1090 (2009))。そのような薬及びそれらの解放システムの展開を持ってしてさえも、いくらかのパーキンソン病患者は、それにもかかわらず、十分な苦痛の軽減を依然として受けない(N. L. Diaz, C. H. Waters, Expert Rev Neurother 9, 1781 (Dec 1, 2009)。
【００２９】
ミトコンドリア病気の実験的モデルは、電子伝達系（１）で伴う酵素の抑制を典型的に伴う。多くの神経変性疾患は、ミトコンドリア機能不全（２−５）に関連するということも報告されてきた。ミトコンドリア呼吸鎖におけるＩ、ＩＩ及びＩＶ複合体の欠陥が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病及び筋萎縮性側索硬化症において検出されてきた（６−９）。
【００３０】
いくつかのラインの証拠では、パーキンソン病は、エネルギー生産の不足につながるミトコンドリア機能不全及びフリーラジカルを伴う病気であることが意味される（１０−１１）。増加した酸化損傷、ドーパミン枯渇、タンパク質の窒化、鉄の蓄積、アポトーシス及びタンパク質の付加は、パーキンソン病の特徴である（１２−１４）。
【００３１】
複合的な疫学的研究では、慢性的な痛みは、個々の健康、健康及び社会サービスへの重大な影響を伴う高度に一般的なものであることが示される(Torrance N, Smith BH. Bennett MI, Lee AJ. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. J Pain 2006; 7:281-289) (Treede RD, Jensen TS, Campbell JN, Cruccu G, Dostrovsky JO, Griffin JW, Hansson P, Hughes R, Nurmikko T, Serra J. Redefinition of neuropathic pain and a grading system for clinical use: consensus statement on clinical and research diagnostic criteria. Neurology 2008; 70:1630-1635)。神経障害性内容を持つ慢性的な痛みは一般的な人口の約７〜８％に影響し、その治療に有効な治療はまだ満足できないということが、特に推定されてきた(Torrance N, Smith BH. Bennett MI, Lee AJ. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. J Pain 2006; 7:281-289) (van Hecke O, Austin SK, Khan RA, Smith BH, Torrance N. Neuropathic pain in the general population: a systematic review of epidemiological studies. Pain 2014; 155:654-62) (Bennett MI, Rayment C, Hjermstad M, Aass N, Caraceni A, Kaasa S. Prevalence and aetiology of neuropathic pain in cancer patients: A systematic review. Pain 2012; 153:359-365)。ＮＰは、神経変性の症状と考えられ、その後、それは、その開始を予防してその進行を制御してこれらの慢性的な痛み症状の確立につながる神経の傷害にさえ戻るための戦略としての神経保護と考えるのが論理的である(Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662)。神経保護は、病的ストレス（外傷性、有毒な、虚血性又は代謝性事象）という面においてニューロン生存又はそれらの機能を維持する方法を含む。それ故に、今日、最も末梢及び中枢ＮＰ神経障害（苦痛の糖尿病の神経障害、末端の多発性神経障害、ＨＩＶ及び抗レトロウイルスの治療による知覚末端、化学療法によって誘発される末梢神経障害、ヘルペス後神経痛、ＭＳ痛み及び脳卒中後の痛み、など）の治療が、その見込みに向って向けられている(Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662) (Flatters SJL, Bennett GJ. Studies of peripheral sensory nerves in paclitaxel-induced painful peripheral neuropathy: Evidence for mitochondrial dysfunction. Pain 2006; 122: 245-257) (Jaggi AS, Singh N. Mechanisms in cancer-chemotherapeutic drugs-induced peripheral neuropathy. Toxicology 2012; 291:1-9)。グルタミン酸作動性の機能不全、ニトロ酸化ストレス、ミトコンドリア機能不全、アポトーシス、栄養要因、神経炎症及び、神経変性によって誘発される損傷のない線維の変化に関する特別な焦点が存在する(Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662) (DeLeo JA, Sorkin LS, Watkins LR, editors. Immune and glial regulation of pain. Seattle: IASP Press; 2007) (Park ES, Gao X, Chung JM, Chung K. Levels of mitochondrial reactive oxygen species increase in rat neuropathic spinal dorsal horn neurons. Neuroscience Letters 2006; 391:108-111)。生物学者の概算が、ＡＴＰに依存する神経障害における電子伝達系の関与に基づく痛みの新規な治療の開発において示唆されてきた(Joseph EK, Levine JD. Mitochondrial electron transport in models of neuropathic and inflammatory pain. Pain 2006; 121:105-114) (Joseph EK, Levine JD. Multiple PKCε-dependent mechanisms mediating mechanical hyperalgesia. Pain 2010; 150:17-21)。機械的な痛覚過敏の��導における神経成長因子（ＮＧＦ）のミトコンドリア依存性も、報告された(Chu C, Levine E, Gear RW, Bogen O, Levine JD. Mitochondrial dependence of nerve growth factor-induced mechanical hyperalgesia. Pain 2011; 152:1832-1837)。
【００３２】
これらの考えに従うと、神経線維の連続性が中断した時に起こるワーラー変性（ＷＤ）のプロセスにおいて伴う複合的な免疫のメディエータが、ＮＰの薬治療用の新しい標的として提案された(Debovy P. Wallerian degeneration and peripheral nerve conditions for both axonal regeneration and neuropathic pain induction. Annals of Anatomy 2011; 193: 267-275) (Lingor P,  Koch JC,  Tonges L, Bahr M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res 2012; 349:289-311)。神経免疫活性化、小膠細胞−ニューロンシグナル伝達及び酸化ストレスによって果たされる役割も、神経傷害後の伝達の補強において認識された(Berger JV, Knaepen L, Janssen SPM, Jaken RJP, Marcus MAE, Joosten EAJ, Deumens R. Cellular and molecular insights into neuropathy-induced pain hypersensitivity for mechanism-based treatment approaches. Brain Research Reviews 2011; 67: 282-310) (De Leo J.A, Tawfik VL, La Croix-Fralish ML. The tetrapartite synapse: Path to CNS sensitization and chronic pain. Pain 2006;122:17-21) (Austin PJ, Moalem-Taylor G. The neuro-immune balance in neuropathic pain: Involvement of inflammatory immune cells, immune-like glial cells and cytokines Journal of Neuroimmunology 2010; 229:26-50) (Salvemini D, Little JW, Doyle T, Neumann WL. Roles of reactive oxygen and nitrogen species in pain. Free Radical Biology &Medicine 2011;51:951-966)。その結果、神経保護及び特にＮＰ治療用の神経炎症に向って向けられた革新的な戦略が、研究開発ステージで今日見出される(Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662) (Stavniichuk R, Drel VR, Shevalye H, Maksimchyk Y, Kuchmerovska TM, Nadler JL, Obrosova IG. Baicalein alleviates diabetic peripheral neuropathy through inhibition of oxidative-nitrosative stress and p38 MAPK activation. Experimental Neurology 2011; 203:106-113)。
【００３３】
老化及び神経系及び精神系疾患は、神経細胞の死亡及び損傷を引き起こす。頻繁な及び関連した神経系障害の中で、我々は、数ある中で、ニューロン退化、虚血、炎症、免疫反応、精神的外傷及びがんを含む。これらの結果として、神経細胞は、数分又は数時間で死ぬことがあり、又は、それらは、神経変性を活性化して最終的には細胞死にも終る損傷状態で初期の障害を切り抜けて生きることができる。
【００３４】
炎症、グルタミン酸作動性の神経毒症状、増加する鉄及び酸化窒素、内因性の抗酸化物質の枯渇、栄養要因の表現の低減、アポトーシス促進性のタンパク質の表現及びユビキチンプロテアソームシステムの機能不全を含む複雑な範囲の有毒な反応がニューロンの死亡につながるように、パーキンソン病、アルツハイマー病及び他の神経変性疾患における神経変性は、多因子のようである。
【００３５】
可能な基本的運動を熟練して感受性にする上での神経系の重要性を仮定すると、神経系を保護するための治療武器を見出す興味が存在する。
【００３６】
神経保護は、神経系、その細胞、構造及び機能を保存、回復、治癒又は再生することに向けられる(Vajda et al 2002, J Clin Neurosci 9:4-8)。神経保護の１つの目的は、神経系の元の障害の効果を予防する又は最小限にすることであり、又は、軸索、ニューロン、シナプシス及び樹状突起における傷害を引き起こす内因性又は外因性の有害なプロセスの結果を予防する又は最小限にすることである。
【００３７】
神経保護は、慢性的な神経変性疾患（アルツハイマー、パーキンソン）の結果としてのニューロン傷害又はＣＮＳ退化に対して保護するために使用されるメカニズム及び戦略である。神経保護の目的は、ＣＮＳへの傷害後の機能不全／死亡を限定すること、及び、影響を受けない神経の機能という結果になる脳中の細胞の相互作用の最も大きな潜在的なインテグリティーを維持するのを試みることである。
【００３８】
神経保護の概念は、急性の神経系状態と同様に慢性的な脳病気にも適用された。ただし、ＣＮＳを損傷する基本的メカニズムのいくつかがこれらの状態と同様であるという条件で。神経変性疾患は、ＡＤ、ＰＤ、ハンチントン病及び筋萎縮性側索硬化症を含む。神経保護は、これらの状態の治療で使用される薬作用メカニズムとして考えられた。
【００３９】
神経組織への損傷（傷害）のメカニズムの多くが同様ならば、研究されている又は有効な広い範囲の神経保護生成物が存在し、いくらかの生成物は、１つよりも多い病気のために潜在的に使用できる。神経保護効果を持つ生成物は、下記のカテゴリーに分類される：フリーラジカルの誘拐犯、抗興奮毒性物質、アポトーシス（プログラム細胞死）の阻害剤、抗炎症剤、神経栄養要因、キレート化金属イオン、イオンチャネルモジュレーター及び遺伝子治療。
【００４０】
酸素フリーラジカルは、細胞膜の過酸化脂質及び最終的には神経変性疾患における細胞死という結果になるＤＮＡ損傷及び酵素の不活性化、タンパク質の変性に関連することが、例証された。
【００４１】
動物及びヒトモデルの両方で実施された研究では、脳の代謝及び酸化防止剤プロテクターメカニズムによって発生した酸化体種間の平衡の喪失は、前記防御システムがそれらの有効性を減少させて破られる時に、いわゆる酸化ストレスを産む、ということが示される。この酸化ストレスは、加齢に伴って増加し、そして、ニューロンミトコンドリア機能不全に多分関連するＡＤ病原論の根本的原因の中に見出される(Neurobiol. Aging 2007, 28, 1009-1014)。我々は、酸化防止剤特性を持つ生成物が、皮質ニューロンの培養におけるＣａ２ホメオスタシスへの変化と同様にアミロイドペプチドによって誘発されるアポトーシスを予防する能力があることも、知っている(Life Sci. 2000, 66, 1879-1892). 66, 1879-1892)。その結果、酸素化フリーラジカルなどの毒性傷害のための神経保護能力を持つ、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）又はブチリルコリンエステラーゼ（ＢｕＣｈＥ）阻害剤の大きな必要性が存在し、前記化合物は、ＡＤ、ＰＤ又はハンチントン病などの神経変性疾患の治療において大きな医療の重要性を有するであろう。
【００４２】
一般的に言って、治療戦略は、提案された障害の単一の要因の調節に頻繁に基づく。前記治療は非常に制限された動物；モデルでは有益であることを我々は観察できるけれども、遺伝学的に多様な人口における障害の過酷さの更に変化する程度を含むより複雑なヒト疾患において、それらがそれら自身を有効であることは、あまり示しそうにない(Faden and Stoica 2007.; Arch Neurol 64:794-800)。大きな範囲で、酸化ストレス、ミトコンドリア機能不全、添加されたタンパク質、アポトーシス及び炎症などのニューロン死亡の推定されるメカニズムを仮定すると(Youdim, M.B., and Buccafusco, JJ (2005) CNS Targets for multi-functional drugs in the treatment of Alzheimer’s and Parkinson's diseases J. Neural Transm 112, 519-537)、それらは、変化するほど複雑であり、我々は、障害の複合的なメカニズムへの多目的効果を有する単一の化合物を望むであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００４３】
発明の簡単な記述
その化学構造によってキューバ特許ＣＵ２３８７９の文書に記述される化合物（３−エトキシカルボニル−２−メチル−４−（２−ニトロフェニル）−４，１１−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［２，３−ｂ］［１，５］ベンゾジアゼピン）（ＪＭ−２０）は、中枢神経系に関連する心臓血管系の、脳血管系の及び他の病気に対する効果を有し得る。
驚くべきことに、研究者は、化合物ＪＭ−２０が、好ましくは異なるタイプの認知症、パーキンソン病及び痛みなどの病気の治療用にＣＮＳへの著しい治療効果を有することを発見した。
それ故に、本発明の本質は、異なるタイプの認知症、パーキンソン病及び痛みなどの病気の治療で優先的に使用されるべきＪＭ−２０及びその化学生成物の使用に基づく。
【００４４】
ＪＭ−２０は、ベンゾジアゼピンの生成物であり、そして、ベンゾジアゼピンは認知症を引き起こすことが広く報告された(Huber-Geismann, F, 1994) (Rosenberg, P. B. 2015). (Shash, D., T. Kurth, et al. 2015) (Zhong, G., Y. Wang, et al. 2015))。しかし、予想外に、ＪＭ−２０は、異なるタイプの認知症を改善する。
ＪＭ−２０の潜在的な有用性が文献に報告されたという事実にもかかわらず、認知症、パーキンソン病及び神経障害性疼痛などの神経変性疾患における治療薬としての潜在性は、確立されなかった。
本発明の追加の側面として、一般式ＩＩＩの化合物（ＪＭ−２０）、その塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、生理的に試験されたプロドラッグは、提案されている薬組成物に含まれる賦形剤として今後認識される化学的に不活性で無毒の少なくとも１つのビヒクル剤、希釈剤及び／又はキャリヤーと混合して投与できる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
図面の簡単な記述
【図１】図１．化合物ＩＩａ及びＩＩｂの合成。
【図２】図２．ＩＩａからの化合物ＩＩＩの合成。
【図３】図３．ＩＩｂからの化合物ＩＩＩの合成。
【図４】図４．ＪＭ２０の異性体型。
【図５】図５．化合物ＩＩＩ及びそのハロゲン水和物を得る。
【図６】図６．ＪＭ−２０（ＩＩＩｃ）からフマル酸塩を得る。
【図７】図７．ＪＭ−２０（ＩＩＩｄ）からリン酸塩を得る。
【図８】図８．ＪＭ−２０（ＩＩＩｆ）から硫酸塩を得る。
【図９】図９：特に取得及び整理のプロセスにおける短期及び長期の空間記憶に対するＪＭ−２０の効果。
【図１０】図１０：短期の記憶研究を完結した後の、スコポラミンで治療されたラットにおける脳の組織のミトコンドリア機能不全に対するＪＭ−２０の効果。
【図１１】図１１：長期の記憶研究を完結した後の、スコポラミンで治療されたラットにおける脳の組織のミトコンドリア機能不全に対するＪＭ−２０の効果。
【図１２】図１２：アルミニウムによって誘発される異なるタイプの記憶の喪失に対するＪＭ−２０の効果。
【図１３】図１３：ベータアミロイド２５−３５ペプチドオリゴマーによって製造された細胞の生存率への損傷に対するＪＭ−２０の効果。
【図１４】図１４．ＪＭ−２０は、ベータアミロイド２５−３５ペプチドオリゴマーによって誘発される記憶障害を戻す。
【図１５】図１５：ラットの総頚動脈の一時的閉塞によって誘発される認知低下に対するＪＭ−２０の効果。
【図１６】図１６：７日間の治療後のオスのウィスターラットにおける６−ＯＨＤＡによって誘発される損傷に対するＪＭ−２０の神経保護効果。
【図１７Ａ】図１７Ａ：ラットの前足の足底表面に５％ホルマリンを注入した後のなめること／かむことの挙動に対するＪＭ−２０の効果。
【図１７Ｂ】図１７Ｂ．ラットの前足の足底表面に５％ホルマリンを注入した後のなめること／かむことの挙動に対するＪＭ−２０の効果の時間経過。
【図１８】図１８：５％ホルマリン試験のフェーズＩＩに対するＪＭ−２０の抗過剰侵害受容（antihypernociceptive）効果に対するフルマゼニルでの前処理の影響。
【図１９】図１９：外科後１４日のＣＣＩラットの同側の前足における機械的な異痛に対するＪＭ−２０の効果。
【図２０】図２０：Ｆｒｅｙの電子で刺激した時に前足引っ込み応答を測定することによって決定されたＣＣＩラットの同側の前足の機械的な過剰侵害受容（hypernociception）の強度に対するＪＭ−２０の効果。
【図２１】図２１．伝統的なRandal Selito or SH Ferreira試験への修正によって前足への定圧への機械的な過剰侵害受容に対するビヒクル（ＣＭＣ、０．０５％）又はＪＭ−２０（２０ｍｇ／Ｋｇ、１０ｍＬ／Ｋｇ、ｐ．ｏ．）の効果。
【図２２】図２２：外科後１４日でＣＣＩによって誘発される組織学的変化（ワーラー変性）に関する７日後ＣＣＩでスタートする７日間で繰り返し用量でＪＭ−２０での処理の効果。
【図２３】図２３：酸化窒素濃度の指示薬としての硝酸塩の脊髄濃度に対するＪＭ−２０の効果。
【図２４ＡＢ】図２４：ラットにおいてカラギーナンによって誘発される腹膜炎症反応に対するＪＭ−２０の効果（５００μｇ／空洞）。Ａ．白血球ローリング、及びＢ．腸間膜の血管系の内皮細胞へのそれらの付着。
【図２４ＣＤ】図２４．カラギーナンによって誘発される腹膜炎症反応に対するＪＭ−２０の効果（５００μｇ／空洞）。Ｃ．腹膜空洞に向かう白血球の移行、及びＤ．血管系の浸透性。
【図２４Ｅ】図２４Ｅ：カラギーナン注入後４時間での腹膜液中の腫瘍壊死要因（ＴＮＦα）の濃度に対するＪＭ−２０の効果。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明の詳細な記述
薬組成物は、いかなる液体、固体又は半固体組成物を提供し、それらは、経口的に、頬咽頭の、舌下の、パレンタル、例えば：筋肉内の、静脈内の、皮内の又は皮下、局部的な、経皮的な、気管、気管支の、鼻の、肺の、直腸の又は投与他の適切なやり方で、投与できる。
【００４７】
記述の薬組成物は、各々のフォーミュラで適切な賦形剤を含むであろう。配合物は、技術水準で集めた方法を使用して慣例的に調製される。賦形剤は、それらが投与されるであろうやり方に従って選択されたそれらの薬の形態で選択される。
【００４８】
一般式ＩＩＩの化合物（ＪＭ−２０）、その塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、プロドラッグは、ヒトへのその投与のために、医薬的に許容可能な形態の用量で含有でき、それらは、以下に提示のこれらの形態を含むがそれらに制限されない：錠剤（舌下の、コーティングされた及び噛むことができるものを含む）、ハードな及びソフトなカプセル（マイクロカプセル、ナノ粒子及びペレットを含む）、溶液（経口ドロップ、シロップ）、非経口液、経皮貼布、インプラント及び他の遅延システム、軟膏（クリーム及びジェル）、鼻のスプレー、粘膜接着剤、座薬、懸濁、食品に添加されるべき又は再構成されるべき粉末、本発明に含まれる他の形態の用量。
【００４９】
最新技術の公知の技術プロセスを使用して、ＪＭ−２０、その塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、プロドラッグは、自然の又は合成の起源の有機及び無機の性質で構成されている補助液体、固体又は半固体物質などの賦形剤とそれらを混合して、それらの投与に適合させた用量形態で配合できる。それらのいくつかは、以下の物を含み：充填固体、希釈剤、接合剤、溶媒、エマルジョン、潤滑剤、粉砕剤、滑り剤、人工香味料、着色剤、色素、ポリマー、甘味料、可塑化、吸収可能性、浸透可能性、界面活性剤、共界面活性剤、専門的な油及び／又は緩衝システムであり、それらは、活性な化合物又は物理的な、化学及び／又は生物学的な安定性のあるそれらの生理的に許容可能な塩を与える。
【００５０】
他の補助物質の使用に対する制限なしで一般式ＩＩＩの化合物又はその生成物を含有する用量の形態の配合物で使用されるいくつかの賦形剤は：デンプン、ラクトース、セルロース及びその生成物、スクロース、ソルビトール、マンニトール及び他の糖類、滑石粉、コロイド状二酸化ケイ素、カーボネート、酸化マグネシウム、リン酸カルシウム、二酸化チタン、ポリビニルピロリドン、ポビドン、ゼラチン、ラクト−タンパク質、クエン酸塩、酒石酸塩、アルギナート、デキストラン、エチルセルロース、シクロデキストリン、シリコーンエラストマー、ポリソルベート、アミロペクチン、パラベン、動物及び植物油、プロピレングリコール、滅菌水、グリセロールなどの一価又は多価アルコール、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン及びポリエチレングリコールワックスである（数ある中で）。
【００５１】
本発明による一般式ＩＩＩ又はその塩、鏡像異性体形態及び酸化還元生成物を含有するカプセル又は再構成されるべき粉末、ペレット、ナノ粒子、マイクロ顆粒、錠剤などの固体経口の形態の用量が、即座の又は修正された解放のために使用できる。
【００５２】
本発明に従って選択された薬の形態は、それらの活性な医薬成分として、一般式ＩＩＩ又はその塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、プロドラッグ調剤、微結晶性セルロース、コーンスターチ、クロスポビドンとの混合物を含有する錠剤であり、流動床において完全なプロセスで乾燥されてステアリン酸マグネシウム及び滑石粉と混合される粒を形成するために溶解したポリビニルピロリドン及びラウリル硫酸ナトリウムを添加し、そして、その後、錠剤は、その製造用の回転パンチシステムを使用して製造され、最終的に、錠剤は、ヒドロキシルプロピルセルロース、ポリエチレングリコール４０００、二酸化チタン及び着色剤懸濁液でコーティングされる。
【００５３】
錠剤をコーティングすることによって、我々は、上品な仕上がった外観を実現し、我々は、不愉快な味を避ける；これは、メチルアクリル酸、エチルセルロース、メチルヒドロキシルプロピルセルロースのコポリマー又は他のポリマーなどの風味マスキング剤で実現される。錠剤は、低用量で作用しているという条件で、錠剤を得るフェーズの工程を減少してそして直接圧縮用の賦形剤を使用する直接圧縮法及び上述した湿式造粒法の両方によって、得ることができる。
【００５４】
錠剤は解放を修正でき、そして、それらは、ポリエチレンオキサイド、ヒドロキシルプロピルセルロース２９１０、ステアリン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、赤酸化第一鉄、酢酸セルロース、ポリエチレングリコール３３５０及びオパドライなどの賦形剤を使用して、マイクロ顆粒、ナノ粒子又はマトリックスシステムで、一般式ＩＩＩ又はその生成物を含有できる。
【００５５】
本発明によれば、薬組成物は、その解放プロファイルを制御してそれによって修正された解放（即座の、遅らせた又は制御された）形態の用量を得るために、浸透できて生分解性で水に不溶性の医薬的に許容可能なポリマーを含有できる。これらのポリマーは、本発明で言及されるいかなる他の形態の用量に含まれる他の賦形剤との混合物、顆粒、錠剤、又はペレットにおける解放マトリックスとして、ナノ粒子を得る際にカプセル、マイクロ顆粒、錠剤を被覆するために使用できる。
【００５６】
経口投与のために、他の適切な医薬組成物は、ハードなカプセル、ソフトなカプセル及び医薬粉末であり、一般式ＩＩＩの化合物又はその塩、鏡像異性体形態及びその生理的に許容可能な酸化還元の生成物は、例えば、錠剤用に記述されるものなどの固体形態で共通に使用される賦形剤と活性な医薬成分との混合物を内部に含有するハードなゼラチン又はセルロースカプセルの形態で、投薬できる；前記混合物は、乾燥ルート、湿式造粒、押出し、ペレット化、マイクロカプセル化又はマイクロタブ用量によって得ることができる。ソフトなゼラチンカプセルでの用量では、我々は、従来の製造方法を使用し、それらは、一般式ＩＩＩの化合物又はその塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、プロドラッグを、植物油、グリース又はそれらの形成のために適切な他の同様なビヒクルと混合して調製できる。
【００５７】
医薬粉末の場合は、これらは、一般式ＩＩＩ（ＪＭ−２０）化合物又はその塩、鏡像異性体形態及びその生理的に許容可能なプロドラッグの生成物と、フィラー、懸濁剤、甘味料、風味剤及び保存料との単純な混合物によって製造できる。けれども本発明は、粉末の綿密な仕上げにおいて、１００℃−１５０℃の間の入口温度及び５０℃−９０℃の間の出口温度での噴霧化乾燥方法をも使用し、数ある中で、デキストラン、ポリエチレングリコール４０００及びラウリル硫酸ナトリウムなどの賦形剤を使用し、溶液中の有機体中へのその適切な取込みのための活性な医薬成分の溶解性を改善し、又は、ジュースなどの食品にそれを添加する。
【００５８】
直腸投与では、一般式ＩＩＩの化合物（ＪＭ−２０）又はその塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、生理的に許容可能なプロドラッグは、座薬、発泡体又は直腸のマイクロ浣腸溶液として投薬でき、それらは、中性の固体脂肪（Ｗｉｔｅｓｐｏｌ  ４５）の基剤又はその配合物用に適切ないくつかの他の同様なビヒクル（；ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート２０、乳化剤ワックス、無水物コロイドシリコーン、メタ重亜硫酸ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、メチルパラヒドロキシルベンゾエート、リン酸ナトリウム、マクロゴール３００、グリセリン、水、プロパン、イソブテン及びｎ−ブタン）と活性な化合物との混合物を含有できる。
【００５９】
液体の経口投与では、一般式ＩＩＩの化合物（ＪＭ−２０）又はその塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、生理的に許容可能なプロドラッグは、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、及び／又はポリエチレングリコール、数ある中で、カルボキシルメチルセルロース又は他の増粘剤の混合物などの医薬的に許容可能なビヒクルを有する懸濁液、濃縮ドロップ、エリキシル剤、又はシロップとして配合できる；それは、着色剤、風味剤、甘味料（スクラロース、アスパルテーム、シクラメート、ステビア）及び保存料（パラベン、ベンゾエート）を含有できる。これらの液体用量は、使用される前に適切な希釈剤で粉末医薬組成物を再構成することを基準として調製できる。
【００６０】
非経口投与では、一般式ＩＩＩの化合物（ＪＭ−２０）又はその塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、生理的に許容可能なプロドラッグは、注入可能な溶液として配合できる。これらの溶液は、安定化、保存及び／又は緩衝成分を含有できる。
【００６１】
本発明では、活性な医薬成分は、９６％エタノール溶液、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、安息香酸、安息香酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、注入用の水の中にある；ポリエチレングリコール４００、クエン酸ナトリウム及びクエン酸などの他の賦形剤も使用できる。
【００６２】
一般式ＩＩＩの化合物（ＪＭ  ２０）又はその塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、生理的に許容可能なプロドラッグを含有する非経口投与用の溶液は、モニトール、ポリソルベート８０、塩化ナトリウムなどの補助物質の使用を含む、使用される前に適切な希釈剤で乾燥医薬組成物（凍結乾燥）を再構成することによっても、調製できる。
【００６３】
皮下投与では、一般式ＩＩＩの化合物（ＪＭ  ２０）又はその塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、生理的に許容可能なプロドラッグは、ペレットをまとめるために他の医薬使用ポリマーを使用できるとしても、シリコーンエラストマー及び無水物コロイドシリコーンなどの補助物質を使用してインプラントとして投薬できる。
【００６４】
経皮的投与では、一般式ＩＩＩの化合物（ＪＭ  ２０）又はその塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、生理的に許容可能なプロドラッグは、パッチとして配合できる；この場合は、活性な医薬成分は、（１２．７５ｃｍ２の表面積で１５ｍｇ／日の名目上の解放速度で）取り外し可能なシートの内部に、アクリルコポリマー、エタノール、軽流動パラフィン、イソプロピルパルミテート、ポリエチレンテレフタレート、エチレン酢酸ビニル溶液及びシリコーンの層サポート中に含有される。
【００６５】
実現例
この例は、タイプＩＩＩの最終の生成物を得るために要求される合成中間体の一部である、４−（２’ニトロフェニル）−５−カルボニルエトキシ−２−メチル−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）ピリジン（Ｉ）及び対応するｏ−クロロホルミル１，４−ジヒドロピリジン誘導体（ＩＩ）の合成を例証する。
化合物ＩＩは、乾燥ジメチルホルムアミド中でのオキシ塩化リンを介してＩの変質を基準として得られ、それらの混合物は、その後、３〜９倍の割合で、ジクロロメタン又はクロロホルム中でのＩの溶解に添加され、そして、２０−６０℃の間の温度で１５−２０時間撹拌される（図１）。
【００６６】
得られる生成物は、その後、基本的加水分解、クロロホルム又はジクロロメタンでの後の抽出、洗浄及び乾燥の方法による精製に、かける。
化合物Ｉは、１つの単一の工程で多成分反応によって得られ、ここで、我々は、等モルの量で、溶解剤として酢酸中で２−ニトロベンゼンアルデヒド、メルドラム酸、アセト酢酸エチル及び酢酸アンモニウムを混合し、そして、７−１０時間還流反応を受ける。その後、混合物は水上に注がれ、得られる沈澱物はエタノール再結晶の方法によって精製される。
【００６７】
この例は化合物ＩＩＩの合成を例証する。
先に得られた化合物ＩＩａ又はＩＩｂは、使用される試薬の状態次第で、異なる塩を形成して調製されることができる化合物ＩＩＩ（ＪＭ−２０）を得るために、無水エタノール中でオルトフェニレンジアミンとの反応を受ける。
【００６８】
ＩＩａから化合物ＩＩＩを得る
化合物ＩＩＩ（ＪＭ−２０）を得るために、我々は、化合物ＩＩａのエタノール溶液からスタートし、我々は、撹拌しながら溶解剤としての無水エタノール中に等モル量のオルトフェニレンジアミンを添加する。等モル又はより多い量（１〜２当量）のトリエチルアミン（図２、方法Ａ）が、反応混合物に添加され、制御された滴下によって及び反応混合物を連続的に撹拌することによって、十分な量（１〜１．５当量）の水酸化ナトリウム溶解が添加されるか又は撹拌が維持される（図２、方法Ｂ）。
【００６９】
ＩＩｂから化合物ＩＩＩを得る
化合物ＩＩＩ（ＪＭ−２０）を得るために、我々は、エタノール溶解中の化合物ＩＩｂでスタートし、我々は、撹拌しながら溶解剤としての無水エタノール中に等モル量のオルトフェニレンジアミンを添加する。等モル又はより多い量（１〜２当量）のトリエチルアミン（図３、方法Ａ）が、反応混合物に添加され、制御された滴下によって及び反応混合物を連続的に撹拌することによって、十分な量（１〜１．５当量）の水酸化ナトリウム溶解が添加されるか又は撹拌が維持される（図３、方法Ｂ）。
化合物ＪＭ２０の異性体構造は、図４に示される。
【００７０】
ハロゲン水和物タイプの塩として化合物ＩＩＩを得る
ＩＩＩの対応するクロロハイドレート又はブロモハイドレート塩（ＪＭ−２０のハロゲン水和物）が、触媒の使用ありで又はなしで、それぞれＩＩａ又はＩＩｂから得られる。対応する水素酸が適切な触媒量（５−２５％モル）で添加される時、触媒作用プロセスが起こり、反応時間を減少させて反応収率をわずかに増加させる（図５）。
【００７１】
ＪＭ２０（ＩＩＩａ）クロロハイドレートが、ＩＩａから適切に得られ、そして、適切な  量のＨＣｌが添加される時、反応触媒作用が起こる。ＪＭ−２０化合物は、ＩＩｂからブロモハイドレート（ＩＩＩｂ）としても得ることもでき（図５）、塩化物よりも良好な突き出た基である臭化物の特徴を持ち、分子内の求核置換の反応が促進され、急速及び効率的な反応となってブロモハイドレートとしてＪＭ−２０を得るという結果になる。
【００７２】
フマル酸塩として化合物ＩＩＩを得る
２−５時間の磁気撹拌で、ＩＩＩａ又はＩＩＩｂの溶解にフマル酸１ナトリウムを添加して、その後に適切な量のエタノールを添加して沈殿させて、ＪＭ−２０（ＩＩＩｃ）フマル酸塩が、クロロハイドレート又はブロモハイドレートから得られる（図６）。
ＩＩＩｃフマル酸塩に対応する沈澱物は、好適に濾過されて洗浄され、精製されて、その後、低減圧力で制御された温度乾燥器中に置かれる。
【００７３】
リン酸塩の形態で化合物ＩＩＩを得る
ＪＭ−２０（ＩＩＩｄ）リン酸塩は、撹拌しながら、エタノール溶液中でＩＩＩａ又はＩＩＩｂにリン酸を添加することによって又は反応の開始時に等モル量のリン酸を添加することによって、ＩＩａ又はＩＩｂから、上記と同様のプロセスによって、得ることができる（図７）。
【００７４】
硫酸塩の形態で化合物ＩＩＩを得る
ＪＭ−２０（ＩＩＩｆ）硫酸塩は、図８に示すように、ＩＩＩａ又はＩＩＩｂハロゲン水和物を基準として又はＩＩａ又はＩＩｂから得ることができる。
【００７５】
錠剤の形態の配合物を得る
各々の１２０．００ｍｇ錠剤は、以下を含有する：
【表１】
2019519600.tif 000003
【００７６】
技術プロセスの簡単な記述：
１．２０−メッシュを通して有効成分、コーンスターチ及びラクトースをふるいにかける。
２．処方で確立された量に従って配合物の全ての成分の重さを計る。
３．凝集素溶液では、蒸気ジャケットを持つ金属容器の中に、水及びクラスＣエチルアルコールの混合物を注ぎ、ポリビニルピロリドンを添加し、そして、完全に溶解するまで振とうする。
４．有効成分、コーンスターチ及びラクトース（内相の成分）でミキサーをロードする。１５分間の混合。
５．蠕動ポンプを使用してゆっくりと凝集素溶液を添加し、水及びクラスＣエチルアルコール（１：１）を使用して要求される僅かな程度の湿り気を完結する（必要なら）。低速でミル中で研磨。
６．流動床中で粒を乾燥。１０分後、代表的なサンプルの粒を取り出し、脱顆粒し、そして、その残留湿度を試験する；前記湿度は、０．８〜１．２％の間で登録すべき。
７．乾燥粒と潤滑剤とを１０分間混合する。
８．高速回転機中で、平らで斜めに切ってありそして溝付６．４ｍｍ直径（１／４  ＰＢＲ）のダイスを使用して混合物を圧縮し、下記のパラメーターを有する錠剤を得る：
質量：１２０．０ｍｇ±１０％
高さ：２．６±０．１０ｍｍ
硬度：４．０±１ＫｇＦ
破砕性：１％未満
【００７７】
経口ドロップ形態用の配合物を得る
各ｍＬ（２０滴）は、以下を含有する：
【表２】
2019519600.tif 000004
【００７８】
技術プロセスの簡単な記述：
１．生成物を製造するときに精製水の導電率及びｐＨを測定する。
２．反応器中にプロピレングリコールを注ぐ。
３．適切な容量を持つ補助ステンレス鋼レシピエント中で精製水中にサッカリンナトリウムを溶解する。
４．Ｋｏｌｌｉｄｏｎ  ２５を組込み、少しずつそれを散乱させ、全体的に分散するまで少なくとも３０分間撹拌する。
５．撹拌して調製品に熱をかけ、４０−５０℃の間の温度を３０分間保つ。
６．先の工程の結果物に有効成分を少量組込み、一定の撹拌を３０分間保つ。
７．熱を除去し、そして、調製物が部屋温度：３０±２℃を達成するように待つ。
８．適切な容量を持つ補助ガラス又はステンレス鋼レシピエント中でクラスＣエチルアルコールにメチルパラベン及びプロピレングリコールを溶解し、全体的に溶解するまでそれを絶えず撹拌する。
９．先の工程の結果物に、可溶性の液体イチゴ風味を付加し、完全に均質になるまで撹拌する。
１０．反応器タンク中に先の工程の結果物をゆっくりと組込み、絶えず及び強くそれを撹拌する。
１１．適切な容量を持つガラス又はステンレス鋼レシピエント中にクエン酸及び脱水クエン酸ナトリウムを溶解し、完全に溶解するまで各添加後にそれを撹拌する。
１２．反応器タンク中に先の工程の結果物をゆっくりと組込み、絶えず及び強くそれを撹拌する。
１３．正しい容量を有するガラス又はステンレス鋼レシピエント中で精製水にＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ．アシッドレッドを溶解し、全体的に溶解するまでそれを撹拌し、調製物を組込む。
１４．水と一緒に事前に決められた量をすくい取る。均一になるするまで撹拌する。
１５．ｐＨが４．０−６．０間隔で維持される試験をする。
１６．最終の濾過をする；官能特徴を試験する。
１７．１５．０±１．０ｍＬの溶液で、琥珀色のガラスビン×１５ｍＬ中に最終の調製物をビンにとり、適切に蓋をして、油状の生成物用のドリップリディーサーを有するトップを使用する。
【００７９】
注入可能な配合物を得る：
各バルブ（２ｍＬ）のＪＭ−２０は以下を含有する：
【表３】
2019519600.tif 000005
【００８０】
１．殺菌後に反応器が完全に乾燥していることをチェックする；もしもそうでないなら、脱水アルコールでそれをすすぎ落とす。
２．ｐＨを調節するための１Ｎ塩酸の溶液を調製する。
３．反応器に脱水アルコール及びＣｒｅｍｏｆｏｒ  ＥＬＰの一部を添加する。４２０ｒｐｍで混合する。
４．有効成分の重さを計り、脱水アルコールの一部を、それを含有するビーカーに添加する；ガラス撹拌機でそれを分散させ、反応器に添加する；全ての有効成分が一掃されて全ての脱水アルコールを使い切るまでこの操作を繰り返す。
５．有効成分が全体的に溶解するまで４２０ｒｐｍで６０分間反応器中の撹拌を維持する。
６．Ｃｒｅｍｏｆｏｒ  ＥＬＰの残りを添加し、脱水アルコールで残余を一掃し、４２０ｒｐｍで１０分間それを撹拌する・
７．溶液のｐＨを決定し、５．０−６．０の間に１Ｎ塩酸でそれを調節する。
８．脱水アルコールを添加することによって、溶液の容積を完結する。４２０ｒｐｍで５分間撹拌する。
９．１０ｍＬの溶液を取り、プロセス制御用の実験室に送る（評価及びｐＨ）。
１０．充填及び窒化処理システムの正しい組立をチェックする。
１１．the Sartobran P MidiCapsフィルターのインテグリティー試験を運転、脱水アルコールで（０．４５＋０．２μｍ）気孔率。
１２．プロセス  制御が一旦仕上がったら、０．４５μｍ＋０．２μｍ気孔率Sartobran Pフィルターカートリッジを通して溶液を推進するために窒素（０．７−１．０バール）を使用して反応器を加圧する。バルブを満たしてシールし、２．２ｍＬの溶液の用量を作る。
【００８１】
認知症モデルでの記憶研究
試薬
全ての試薬は、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)から購入した。ＪＭ−２０は、the Faculty of Chemistry of the University of Havanaで有機合成実験室によって提案された研究のために十分な量が投与された。
【００８２】
異なる研究では、ＪＭ−２０は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０．０５％中に懸濁されて、経口的に投与された。スコポラミン臭化物は、０．９％生理食塩水溶液中に溶解されて、腹腔内に投与された（１ｍｇ／ｋｇ、４ｍＬ／Ｋｇの重さ）。塩化アルミニウムが、実験の対象用に共通の飲料水中に溶解されて、１ヶ月間慢性的な形態で５００ｍｇ／Ｋｇペソ用量で経口的に投与され、一方で、挙動研究が実施された。ベータアミロイドペプチド（２５−３５）がオリゴマー化されて、製造者の標準に従って可溶性にされて、右大脳半球中に５ｕＬ中に１００ｐｍｏｌｓで脳室内の手段を介して投与された。
【００８３】
実験動物。倫理的な考慮。
スコポラミン及びアルミニウムモデルに対応するインビボ実験は、ウィスターラット（オス、２３０−２６０ｇ）を使用した。一方で、ベータアミロイドモデルに対応するインビボ実験は、ＯＦ−１マウス（オス、２５−３０ｇ）を使用した。全ての動物は、the National Laboratory Animal Production Center (CENPALAB, Mayabeque, Cuba)から来た。それらの到着後、それらは、７日間実験室状態への適合を受けた。それらは、４５−５５％相対湿度、制御温度（２２±２℃）で交互の１２時間サイクルの明暗下に維持され、それらは、要求に応じて自由に水及び食品が与えられた。全ての挙動研究は、制御された状態の光とノイズレベル下で０９：００〜１７：００の間に実施された。この研究で報告された動物での全ての手順は、動物実験用に確立された国家規則に従って及び実験室動物のケアのための国際委員会によって認可された判定基準に従ってなされた。
【００８４】
実験設計
プロトコル１：スコポラミンによって誘発される記憶障害に対するＪＭ−２０効果の評価
我々は、スコポラミンの急性腹腔内投与によって影響された、短期及び長期の記憶の取得及び整理のプロセスに対するＪＭ−２０の３つの用量（２、４及び８ｍｇ／ｋｇ）のプロテクター効果を調査した。この目的では、ＪＭ−２０は、４つの独立の試験において、短期及び長期の両方の記憶の取得及び整理のプロセス又は影響の前に、投与された。
【００８５】
各々の試験において、我々は、無作為に選択された対象の６つの実験的グループを形成した（ｎ＝１０、グループ当り）：健康な対照グループ（ＣＭＣ及び生理食塩水）；ＪＭ−２０非損傷グループ（ＪＭ−２０  ８ｍｇ／ｋｇ）；スコポラミングループ（ＣＭＣ及びスコポラミン  １ｍｇ／ｋｇ）；ＪＭ−２０−スコポラミン（ＪＭ−２０  ２ｍｇ／ｋｇ及びスコポラミン  １ｍｇ／ｋｇ）、（ＪＭ−２０  ４ｍｇ／ｋｇ及びスコポラミン  １ｍｇ／ｋｇ）及び（ＪＭ−２０  ８ｍｇ／ｋｇ及びスコポラミン  １ｍｇ／ｋｇ）グループ。
記憶に対する効果は、短期及び長期の記憶を取得して整理する（強固にする）プロセスの独立の研究に適切な実験設計を使用して、新規な物体を認識する試験及び強制的な交替Ｙ迷路試験によって、評価された。
【００８６】
挙動研究の最後に、我々は、脳の組織を基準として異なるインビボ研究を実施した。我々は、異なる酸化ストレスマーカー、ミトコンドリア機能、アセチルコリンエステラーゼＡｃｈＥ酵素の活性のレベル、及び記憶及び学習のプロセスにおいて密接に伴う脳の領域中のニューロン及び軸索生存率の組織学的パラメーターに対するＪＭ−２０の効果を研究した。
【００８７】
プロトコル２：塩化アルミニウムによって誘発される記憶障害に対するＪＭ−２０効果の評価
我々は、スコポラミンの急性腹腔内投与によって影響される異なるタイプの記憶に対するＪＭ−２０の２つの用量（２及び８ｍｇ／ｋｇ）のプロテクター効果を調査した。この目的では、ＪＭ−２０は、塩化アルミニウム（５００ｍｇ／ｋｇ）の投与の開始に続いて１５日から挙動研究の最後まで投与された。我々は、以下の３つのタイプの記憶に対するＪＭ−２０及び塩化アルミニウムの効果を評価した：モーリスの水迷路試験及びＴ−迷路試験による空間記憶；新規な物体認識試験による新規性の認識；及び受動回避試験による感情の連想記憶。
【００８８】
無作為に選択された対象の５つの実験的グループが、形成された（ｎ＝１０、グループ当り）：健康な対照グループ（ＣＭＣ及び水）；非損傷ＪＭ−２０−グループ（ＪＭ−２０  ８ｍｇ／ｋｇ及び水）；アルミニウム（ＣＭＣ及び塩化アルミニウム  ５００ｍｇ／ｋｇ）グループ；ＪＭ−２０−アルミニウム（ＪＭ−２０  ２ｍｇ／ｋｇ及びアルミニウム  ５００ｍｇ／ｋｇ）、及び（ＪＭ−２０  ８ｍｇ／ｋｇ及びアルミニウム  ５００ｍｇ／ｋｇ）グループ。
挙動研究の結論で、我々は、脳の組織に関する異なるインビボ研究を実施した。我々は、異なる酸化ストレスマーカー、ミトコンドリア機能性及びアセチルコリンエステラーゼＡｃｈＥ酵素の活性のレベルに対するＪＭ−２０の効果を研究した。
【００８９】
プロトコル３：ベータアミロイド２５−３５ペプチドオリゴマーによって誘発される損傷に対するＪＭ−２０効果の評価
最初に、我々は、１ｕＭ濃度のベータアミロイド２５−２５ペプチドオリゴマーにかけたＰＣ１２細胞のラインの細胞の生存率に対するＪＭ−２０の効果を評価した。このインビトロの試験は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で可溶性にされた３つの濃度のＪＭ−２０（３．１２５、６．２５及び１２．５ｕＭ）の効果を評価した。６つの実験グループが形成された：治療されない対照グループ（ＮＴ）；ビヒクルグループ（ＤＭＳＯ）；ベータアミロイドグループ（Ａβ  １μＭ）；ＪＭ−２０−ベータアミロイド（ＪＭ−２０  ３．１２５＋Ａβ  １μＭ）、（ＪＭ−２０  ６．２５＋Ａβ  １μＭ）及び（ＪＭ−２０  １２．５＋Ａβ  １μＭ）グループ。
【００９０】
その後、我々は、ＯＦ−１マウスに関するインビボ研究を実施した。我々は、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ重量の用量で経口的に、１０日の間にＡβ（１００ｐｍｏｌｓ）の脳室内に投与後７日投与されたベータアミロイドオリゴマーによって誘発される記憶障害に対するＪＭ−２０の効果を評価した。我々は、５つの実験グループを形成した：健康な対照グループ（Ｓｈａｍ）；非損傷ＪＭ−２０グループ（Ｓｈａｍ＋ＪＭ−２０  ３０ｍｇ／ｋｇ）；ベータアミロイドグループ（Ａβ  １００ｐｍｏｌ＋ＣＭＣ）；ＪＭ−２０−ベータアミロイド（ＪＭ−２０  １０ｍｇ／ｋｇ＋Ａβ  １００ｐｍｏｌ）及び（ＪＭ−２０  ３０ｍｇ／ｋｇ＋Ａβ  １００ｐｍｏｌ）グループ。
【００９１】
挙動研究
Ｙ迷路．自発的交替
空間記憶に対するＪＭ−２０の効果が、Ｙ迷路強制交替試験（２０）によって評価された。迷路は、中央プラットホーム上に１２０°の角度で３つのアーム（５５×２０×２０ｃｍ）を持つプラスチックから形成された。試験は、２つのセッションで実施した。第１の学習フェーズでは、我々は、トレーニングフェーズを実施し、その間では、各々のラットは、中央プラットホーム上に置かれ、１０分間迷路のアーム（Ａ及びＣ）を自由に探究できるようにし、その一方で、第３のアーム（Ｂ）は、遮断され続けた。各々のアームの中に入ることは、いかなるアームの内部の４つの先端の中に入ることと考えられた。１０分間アーム中に入ることが、後に分析されるために連続してビデオ記録された。評価フェーズは、ラットが５分間自由にＹ迷路アームを探究できるようにして１つは先に遮断されたものを含むことに存する。５分間アーム中に入ることが、後に分析されるために連続して記録された。この試験は、新しいアーム（Ｂ）中に入る数を評価した。そこでは、このアームの中に入るパーセンテージは、研究されている動物中の良好な記憶と直接に比例する。アームＢの中に正しく入るパーセンテージは、下記の方程式：正しく入る％＝（Ｂの中に入る数）／（３つのアームの中に入る合計）×１００で示されるように、合計の潜在的な交替から実施された交替の割合を基準として計算された。各々の試験後、迷路は、嗅覚手掛かりの存在を低減するために、４０％エタノール溶液できれいにされた。
【００９２】
物体認識
認識された新規な物体の記憶に対するＪＭ−２０の効果が、物体認識試験によって評価された。この試験は、オープンフィールド中で２日連続で実施された。第１日目には、動物は、フィールドに適合させ、２つのセクションでは、それらは３分間ボックスを探究させた。第２日目には、各々５分の２つのステージによる学習評価でトレーニングが実施され、以後、それぞれ、トレーニング（Ｅ）及び試験フェーズ（Ｐ）として処理された。Ｅステージの間に、ラットには、Ｆａｍｉｌｉａｒ（Ｆ）物体と呼ばれる２つの同一の物体が与えられた。３０分後、Ｐステージがスタートし、ラットは、Ｆａｍｉｌｉａｒ物体Ｆ及び新規な物体（Ｎ）にさらされた。試験は、各々の物体で各々の動物によって取られた調査の時間によって定義される、物体の調査を分析するために、記録された。物体ＦとＮとの間の識別の割合は、ＩＤ＝（Ｎ−Ｆ）／（Ｎ＋Ｆ）として計算された。
【００９３】
モーリスの水迷路
モーリスの水迷路は、円形のタンク（１．５２ｍの直径、０．６０ｍの深さ）中で少し修正したVorhees y Williams (21)によって記述されるように実施された。５日のトレーニングが実施され、日当り４つのセクションで、６日目は学習評価のためであった。動物は、全てのトレーニングセクションの間に、変わらない位置で固定された隠れたプラットホームの場所を決める仕方を学ぶべきであった。実験全体の間で、いくつかの外部の手掛かりが配置されて、固定した位置に保たれた。各々のトレーニングセッションでは、動物は、それらが最長時間１分以内でプラットホームを見つけるまで、４つの出口サイトの１つで、タンクの壁に面した、水中に配置された。評価の日に、プラットホームが除去された。我々は、トレーニングトライアルにおけるエスケイプの待ち時間（動物がプラットホームを見つけるのにかかった時間）、学習評価用試験の間にプラットホームのクオドラントに動物がとどまった時間及びプラットホームサイトが見つかるまでにカバーされた距離を、定量化した。
【００９４】
受動回避
受動回避試験が、少し修正したＫｏｈａｒａ及び協力者（２２）によって記述された方法論に基づいて、実施された。我々は、２つのチャンバーから成る受動回避装置（ＵＧＯ  Ｂａｓｉｌｅ）を使用し、その１つは点灯され（３０×３０×３０ｃｍ）そして１つは暗く（１０×２０×１２ｃｍ）、裁断機の形態のアクセスドアによって接続された。暗いチャンバーは、電気回路を備えていた。
試験は、２日連続で２つのステージで実施された。第１日目には、各々のラットは、点灯しているチャンバー中に１０秒間置かれ、その後、チャンバー間のドアが開かれ、ラットは、最長時間９０秒の間に自由に探究できるようにした。ラットが暗いチャンバーに一旦入ると、アクセスドアが閉まり、ラットは、５秒間１ｍＡの電荷を受けた。第２日目には、暗いチャンバー中に入る待ち時間は、最長時間３００秒で測定された。
【００９５】
ミトコンドリア機能性の研究
脳のミトコンドリアを単離
ミトコンドリアは、差動遠心分離によって単離された。動物は、骨頭切除術によって犠牲にされ、それらの脳は、即座に除去されて、で、スクロース７５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＥＧＴＡ  １ｍｍｏｌ／／Ｌ、マンニトール２２５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＢＳＡ  ０．１％及びＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２、４℃を含有する５０ｍＬ単離バッファー中にカットされ、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｎ中で均質化された。それによって得られた懸濁は、２０００ｇで３分間遠心分離され、浮遊した物質は、１２０００ｇで８分間遠心分離された。沈澱物は、１０％で２０ｕＬジギトニンをも含有する１０ｍＬの単離バッファー中に再懸濁され、これは、１２０００ｇで１０分間遠心分離された。ミトコンドリア沈澱物は、ＥＧＴＡなしの単離バッファー中に懸濁され、それは、１２０００ｇで１０分間遠心分離され、浮遊した物質は処置されて、それは、ＥＧＴＡなしの単離バッファーで穏やかに洗浄された。標準のパターンとしてウシ血清アルブミンを使用してタンパク質の濃度を決定するために、ｍｉｃｒｏＬｏｗｒｙ法が使用された(Mirandola et al., 2010)。
ミトコンドリアは、ＫＣｌ  １３０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２  １ｍｍｏｌ／Ｌ及びＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、リン酸塩  ２ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ  ７．４の培地中でインキュベートされた。ミトコンドリア（１ｍｇタンパク質／ｍＬ）は、５ｍｍｏｌ／Ｌ及びロテノン２．５μｍｏｌ／Ｌコハク酸カリウムのエネルギーを与えられた。
【００９６】
ミトコンドリア膜電位
４９５／５８６ｎｍ（励起／発光）でPOLARstar Omega (Germany)蛍光分光光度計で蛍光マーカーのサフラニンＯ（１０μＭ）を使用して及びPOLARstar Omega (Germany)蛍光分光光度計を使用して、ミトコンドリア膜電位が決定された。
【００９７】
ミトコンドリア膨潤
POLARstar Omega (Germany)蛍光分光光度計を使用して及びＣａ２＋２００μｍｏｌ／Ｌの存在下に、標準の培地中にインキュベートされたミトコンドリアの懸濁の５４０ｎｍでの見かけの吸光度の減少によって、ミトコンドリア膨潤がモニターされた。
【００９８】
反応性の酸素種の生成
５６３／５８７ｎｍ（励起／発光）で１ＵＩ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ及び蛍光マーカーとしてAmplex red (Molecular Probes, OR, Eugene)を使用する蛍光分光測定法によって、反応性の酸素種（ＲＯＳ）が決定された。
【００９９】
酵素及びレドックス状態試験のための脳の組織の調製
ラットが骨頭切除術によって犠牲にされ；それらの脳は、除去されて、そして、脳の脳半球の両方の海馬及び前前頭皮質という２つの領域に分離するために直ちに解剖された（２３）。これらの領域は、１：１０（ｐ：ｖ）の割合で、リン酸ナトリウム緩衝溶液（０．１ｍＭ、ｐＨ７．４：ＮａＣｌ  ０．１３Ｍ、ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ、ＫＨ２ＰＯ４  １３６．０４Ｍ、Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．００１６Ｍ）中に均質化されて、それらは、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離（Ｇｅｒｍａｎｙ、５４２４Ｒ）で２０分間６，０００ｇで遠心分離された。脳の構造のホモジネートの比率は、それらが使用されるまで、−８０℃で保存された。それらのタンパク質濃度が、参照としてウシ血清アルブミンを使用して、POLARstar Omega (Germany)でＬｏｗｒｙ法（２４）によって、決定された。
【０１００】
アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性
抽出された海馬及び前前頭皮質のホモジネートに存在するＡＣｈＥ酵素の活性が、わずかに修正した（２６）Ｅｌｌｍａｎ（２５）によって記述された方法を使用して分光光度法で測定された。試験は、２００μＬの最終の容積で、９６−ウェルシート上で実施された。反応培地は、１４０μＬのエルマン試薬、５０μＬのホモジネート及び１０μＬの２０ｍＭヨウ素添加アセチルチオコリン（ＡｃＳＣｈ）溶液を含有し、それは、３７℃で１分間インキュベートされた。POLARstar Omega (Germany)蛍光分光光度計で１分間隔で２０分間４０５ｎｍでの吸光度が測定された。酵素活性が計算され、タンパク質ｍｇ当り１分で加水分解された（ＡｃＳＣｈ）のμｍｏｌｓとして表現された。
【０１０１】
レドックス状態及び酸化損傷パラメーターの研究
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性
ＳＯＤ酵素活性は、ピロガロール酸化方法（２７）を使用して決定された。試薬混合物は、２．８ｍＬのＴｒｉｓ  ０．２Ｍ−ＨＣｌ  ０．２Ｍ（ｐＨ８．２）の溶液、０．０５ｍＬ  ＥＤＴＡ  ６０ｍＭ、０．１ｍＬのホモジネート及び０．０５ｍＬのピロガロール溶液７．３７ｍＭで構成された。POLARstar Omega (Germany)蛍光分光光度計で１分間４２０ｎｍの吸光度が測定された。結果は、タンパク質ｍｇ当りの酵素活性の単位として表現され、１分で１μｍｏｌの基質の転化に触媒作用を及ぼす酵素の量として酵素活性の１単位と考える。
【０１０２】
カタラーゼ（ＣＡＴ）活性
ＣＡＴ酵素活性は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の分解を基準として決定された（２８）。試薬混合物は、０．９ｍＬのリン酸塩緩衝（ｐＨ７．０）、０．１ｍＬの脳組織ホモジネート及び０．５ｍＬのＨ２Ｏ２（５０ｍＭ）で構成された。POLARstar Omega (Germany)蛍光分光光度計で１０及び７０秒で２４０ｎｍの吸光度が測定された。結果は、タンパク質ｍｇ当り１分当り分解したＨ２Ｏ２のμｍｏｌｓとして表現された。
【０１０３】
低減したグルテーション（ＧＳＨ）レベル
ＧＳＨレベルは、いくつかの修正をしたＥｌｌｍａｎ（２９）によって記述された方法論に続いて推定された。トレイに、我々は、０．３７５ｍＬのリン酸塩緩衝（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）、０．１ｍＬのホモジネート及び０．０２５ｍＬの５．５’−ジチオ−ビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）／アセトン（０．６ｍＭ）溶液を添加した。POLARstar Omega (Germany)蛍光分光光度計で４１２ｎｍの吸光度が測定された。結果は、形成されるクロモフォーのモル吸光係数（１．３６×１０４（モル／Ｌ）−１ｃｍ−１）を使用して計算された。結果は、タンパク質ｍｇ当りのＧＳＨｎｍｏｌｓとして表現された。
【０１０４】
過酸化脂質レベル
過酸化脂質レベルは、チオバルビツール酸（３０）との反応から形成されるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を検出することによって、定量化された。試薬培地は、３５０μＬのトリクロロ酢酸：チオバルビツール尿酸：塩酸の混合物、１００μＬの脳組織ホモジネート及び５０μＬのジ−ｔｅｒ−ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）によって形成された。混合物は、ＴＡＬＢＯＹＳ（ＵＳＡ）振動撹拌機中で均質化され、１００℃のＧｒａｎｔ  ＯＬＳ２００（ＵＳＡ）恒温槽水浴中に５分間置かれた。その後、それは、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離（Ｇｅｒｍａｎｙ、５４２４Ｒ）で１０分間３，０００ｒｐｍで遠心分離された。脳組織中の過酸化脂質の生成物として形成されたＭＤＡは、チオバルビツール尿酸と反応し、POLARstar Omega (Germany)蛍光分光光度計で５３５ｎｍで分光測光法によって決定された着色した化合物を生産する。ＭＤＡ濃度は、形成された着色した化合物のモル吸光係数（１．５６×１０５Ｍ−１ｃｍ−１）を考慮して、そして、下記の方程式に従って計算された：
Ｃ＝Ｄ．Ｏ  ×  １０４ｎＭ
1.56
ここで、Ｃは、決定されるべきＭＤＡ濃度であり、Ｄ．Ｏは、検出された吸光度である。結果は、タンパク質ｍｇ当りＭＤＡナノモルとして表現された。
【０１０５】
組織学的研究
スコポラミンの急性腹腔内投与に起因する障害の組織学的評価が、海馬及び前前頭皮質の領域で、実施された。我々は、各々の脳の領域を識別するために、ラット脳の解剖学的記述を持つthe Paxinos and Watson Atlas (31)を使用し、それらは、各々の領域の最初の３つのカットをいつも取って、クラウンセクション４μｍ厚さでヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）の色合いのために処理された。脳半球の両方が、Leica (Microsystems, Germany)光学顕微鏡で観察された。ニューロン損傷が、ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３ゾーン及び海馬歯状回で評価され、萎縮症、核核濃縮、暗い細胞質着色又はニューロンの欠如が、退化マーカーとして考えられた。さらに、我々は、軸索萎縮症と同様に部分的に又は全体的に脱髄した軸索の外観に特に基づいて、軸索損傷を計算し、それは、研究された各々の領域又は各々のスライドに存在する合計軸索のパーセンテージとして表現された。前前頭皮質のレベルでの組織学的損傷の分析を実施して、我々は、各々の脳の脳半球の３つの固定した領域で影響されたニューロン及び軸索の平均数をカウントし、それは、各々の領域における合計と比較して損傷したニューロン／軸索のパーセンテージとして表現された。
【０１０６】
統計的分析
得られた結果の分析及び統計的処理では、我々は、the GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., USA.)プログラムを使用した。データは、平均±ＥＥＭ（標準の平均エラー）として表現され、我々は、その正規性及び等分散性をチェックした。単純な分類変動分析（ＡＮＯＶＡ）が実施され、その後に、異なる実験的グループの比較をするために複合的な比較のためのＴｕｋｅｙ試験が実施された。ｐ＜０．０５のＡ値が、統計的に有意であると考えられた。
【０１０７】
結果は、図９〜図１４に示される。
【０１０８】
図９は、短期及び長期の空間記憶に対する、特に取得及び整理のプロセスにおける、ＪＭ−２０の効果を示す。データは、自発的交替のパーセンテージの平均±ＤＥ（ｎ＝７、グループ当り）として表現される。統計的分析では、我々は、ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ多重比較試験を実施した。異なる文字は、ｐ＜０．０５でそれら自身の間を区別する。
【０１０９】
図１０は、短期の記憶研究の完結後に、スコポラミンで処理されたラット中の脳の組織のミトコンドリア機能不全に対するＪＭ−２０の効果を示す。異なる用量のＪＭ−２０が、スコポラミンの投与よりも１時間前に経口的に投与された。スコポラミンの投与後１時間で脳ミトコンドリアが単離され、我々は、膜電位（Ａ）、Ｈ２Ｏ２発生（Ｂ）、ミトコンドリア膨潤（Ｃ）及びミトコンドリアへのカルシウム流入（Ｄ）を評価した。バーは、平均±ＥＥＭ（ｎ＝１０）を表す。異なる文字は、グループ間の相違を示す：ｐ＜０，０５、ANOVA and post hoc Tukeyによる。（Ａ）：＊＊＊，ｐ＝０．０００９、（Ｂ）：＊＊，ｐ＝０．００３４、ビヒクル／スコポラミン１ｍｇ／Ｋｇグループに関して、ANOVA and post hoc Tukeyグループによる。
【０１１０】
図１１は、長期の記憶研究の完結後に、スコポラミンで処理されたラット中の脳の組織のミトコンドリア機能不全に対するＪＭ−２０の効果を示す。異なる用量のＪＭ−２０が、スコポラミンの投与よりも１時間前に経口的に投与された。スコポラミンの投与後２４時間で脳ミトコンドリアが単離され、我々は、膜電位（Ａ）、Ｈ２Ｏ２発生（Ｂ）、ミトコンドリア膨潤（Ｃ）を評価した。バーは、平均±ＥＥＭ（ｎ＝１０）を表す。＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊，ｐ＜０．０１  ｙ＊，ｐ＜０．０５、ビヒクル／スコポラミングループ１ｍｇ／Ｋｇに関して、ANOVA and post hoc Tukeyによる。
【０１１１】
図１２は、アルミニウムによって誘発される異なるタイプの記憶の喪失に対するＪＭ−２０の効果を示す。Ａ）新規な物体試験の認識、新規な物体認識記憶；Ｂ）受動回避試験、感情的な連想記憶；Ｃ）Ｙ迷路試験、空間作用記憶；Ｄ）モーリスの水迷路空間参照記憶。バーは、平均±ＥＥＭを表す。異なる文字は、グループ間の相違を示す：ｐ＜０．０５、ANOVA and post hoc Tukeyによる。＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊，＜０．０１  ｙ＊，＜０．０５、アルミニウム５００ｍｇ／Ｋｇで処理されたグループに関する比較、ANOVA and post hoc Tukeyグループによる。
【０１１２】
図１４は、ベータアミロイド２５−３５ペプチドオリゴマーによって誘発される記憶障害をＪＭ−２０が如何にして戻すかを示す。ＪＭ−２０は、ベータアミロイドの投与に続いて７日投与された。バーは、平均±ＥＥＭを表す；比較が、ベータアミロイドで処理されたグループでなされる＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊，ｐ＜０．０１  ｙ＊，ｐ＜０．０５  ANOVA and post hoc Tukeyグループによる。
【０１１３】
血管性認知症
血管性認知症のモデルとして、動物（スイスオスの白子マウス）が、２０分間、総頚動脈の一時的閉塞にかけられ、モーリスの水迷路試験によって認知低下が評価された。
【０１１４】
結果が、図１５に示される。
【０１１５】
図１５は、ラットの総頚動脈の一時的閉塞によって誘発される認知低下に対するＪＭ−２０の効果を示す。動物には、再潅流後に１回、４ｍｇ／Ｋｇの経口の用量が投与された。データは、平均±ＤＥ（ｎ＝８、グループ当り）として表現される。統計的分析では、我々は、ANOVA and Tukey多重比較試験を実施した。＊ｐ＜０．０１は、処理なしでの虚血性動物に関して有意な相違を表す。
【０１１６】
６−ヒドロキシドーパミン注入によるSustantia nigra pars compactaの片側性障害
材料及び方法
実験動物
the National Laboratory Animal Production Center (CENPALAB), Havana, Cubaから来た、実験のスタート時に２００〜２５０グラムの間の重さのオスの成体ウィスターラットが使用された。動物は、the Center for the Research and Development of Medicines (CIDEM)にて、１２時間周期の明暗下及び任意に食品と水が供給されて、平均温度２３℃（２２±２℃）でプラスチック半透明のボックス中で、保たれた。
【０１１７】
倫理的な考慮
この研究では、動物を使用する実験用の倫理学コードにて確立された標準に留意した。我々は、認識された繁殖センターで動物を取得することによって、動物の遺伝的信頼性を保証した。この手順は、遺伝学的に汚染された動物の使用を避ける。生物学的な見地から、研究の遺伝的な質の重要性は、いかなる他の場所での実験結果が再現できるという事実にあり、そこでは、それらは、繰り返すことができ、そして、倫理的な見地から、最少の数の動物が使用される必要があるということが確保される。
【０１１８】
研究の間、動物は、最良の可能な適応状態に保たれた。それらは、２３℃の温度に保たれ、それによって、熱帯（２２±２℃）用にセットされたコミットメント範囲内にあった。高温は動物にとってストレスを引き起こし、３８℃超の温度はそれらの死亡を引き起こし得るということを我々が心に留めておくなら、温度制御は重要である。光周性は、約２４時間周期の生化学的な及びホルモンのリズムを直接に及び／又は間接に制御するので、それらがさらされる明暗の時間は、１２時間持続された。
【０１１９】
化合物の投与
損傷を引き起こした後２４時間、７日間毎日、ＪＭ−２０が、３つの異なる用量で投与された：１０、２０及び４０ｍｇ／Ｋｇ。カニューレで胃内に、０．０５％でカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）中に化合物が調製された。５つの実験グループが存在する：グループＩ（ビヒクル／アスコルビン酸入りの生理食塩水、ｎ＝６）、グループＩＩ（６−ＯＨＤＡに影響された動物、ｎ＝８）、グループＩＩＩ（６−ＯＨＤＡに影響されて１０ｍｇ／Ｋｇ  ＪＭ−２０で共同治療された動物、ｎ＝８）、グループＩＶ（６−ＯＨＤＡに影響されて２０ｍｇ／Ｋｇ  ＪＭ−２０で共同治療された動物、ｎ＝８）及びグループＶ（６−ＯＨＤＡに影響されて４０ｍｇ／Ｋｇ  ＪＭ−２０で共同治療された動物、ｎ＝８）。全ての挙動研究は７日実施された。
【０１２０】
データ処理
統計的分析が、the GraphPadPrism Version.5.01.2007パッケージでなされた。結果は、治療されない対照細胞と比較した生命力のパーセンテージの平均±ＳＥＭを示す。すべての場合において、変動分析がなされ（ＯｎｅＷａｙ  ＡＮＯＶＡ）、次にＤｕｎｅｔ試験（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ５）がなされ、実験で使用された対照に関してｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）  ｙ  ｐ＜０．００１（＊＊＊）の有意レベルを持つ有意な相違を決定した。実験で得られた全ての値を様々な対照と及びお互いに対して比較するために、我々は、ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）  ｙ  ｐ＜０．００１（＊＊＊）の有意レベルでＴｕｋｅｙ試験（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ５）を実施した。
【０１２１】
ラット用に設計された実験モデルにおける障害方法
ラットにおける６−ヒドロキシドーパミン注入によるSustantia nigra pars compactaの片側性障害
線条体（脳右半球）の片側性ドーパミン作動性除神経へ進む目的で、ラットが、抱水クロラール［０．４ｇ／ｋｇの重量、i.p., Merck (Darmstadt, Germany)］で麻酔され、定位手術用に設計されたフレーム中に置かれ(Stoelting Instruments, USA.)、そこでは、それらは、生理食塩水溶液神経毒６−ＯＨＤＡ−ＨＢｒ（８μｇ／３μＬ、酸化防止剤として０．２ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸をも含有する）が、右のsubstantia nigra pars compactaに注入された(Pavon Fuentes, Nancy (2007) Efecto de la inactivacion de los receptores dopaminergicos D2 y de la manipulacion del nucleo subtalamico sobre la conducta motora en modelos de hemiparkinsonismo en roedores. Doctor en Ciencias de una Especialidad, Universidad de Ciencias Medicas de La Habana)。表１に言及されるように、the Paxinos and Watson Atlas [Paxinos,G. and Watson,C., The rat brain in stereotaxic coordenates.2nd the Academic Press. New York, 1986]に従って基準点としてブレグマをとって、座標が計算された。
【０１２２】
【表４】
2019519600.tif 000006
【０１２３】
一旦置かれると、注入が終了した後５分間原位置でとどまり、Ｍａｎｉｌｔｏｎシリンジ（３μｌ）で、１μｌ／分の流速で神経毒がゆっくりと注入された。
【０１２４】
ＩＶ．挙動試験
Ａ．シリンダー試験
この試験では、ラットは、２０ｃｍの直径で３０ｃｍの高さの透明なアクリルシリンダーの内部に配置され、動物は端面に到着できなかった。知らない場所にラットが配置された時に、円筒型の形は、それらのバック先端を持つ壁の垂直的調査の生得的行動に有利に働く。(Chan, H.,Paur,H.,Vernon,A.C.,Zabarsky,V.,Datla,K.P.,Croucher,M.J.,Dexter,D.T., 2010. Neuroprotection and functional recovery associated with decreased microglial activation following selective activation of mGluR2/3 receptors in a rodent model of Parkinson's disease. ParkinsonsDis.pii,190450).動物の配置後、右の又は左の又は両方の前足に動物が接触した数が、レシピエントの壁上に動物当り合計２０回の接触まで定量化される。
【０１２５】
６−ＯＨＤＡで片側性に影響された動物は、より小さい程度で影響に対側性である前足を使用する傾向があり、我々のケースでは左の前足である。各々の動物によって示された非対称性のパーセンテージが、下記の式によって定量化される(Roof RL, Schielke GP, Ren X, Hall ED (2001) A comparison of long-term functional outcome after 2 middle cerebral artery occlusion models in rats. Stroke 32: 2648-2657)。
【０１２６】
【表５】
2019519600.tif 000007
【０１２７】
探究活性
動物の垂直的探究活性を評価するために、我々は、探究活性試験を使用した；動物は、透明なプレキシグラスキュービクル、４１×４１×３３（ｈ）ｃｍ中に置かれる(UGO BASILE, MultipleActivityCage Cat. No. 47420。データ出力は、52050-04 Data Acquisition Software Package (Windows（登録商標）based)によって管理される。水平的／垂直的検出システムが正しく添えられるように、スチール溝を持つ４つの垂直的スチールバーを有する黒いプレキシグラスから製造された丈夫な基板上に、キュービクルが支持される。センサーは、形状又はむしろ垂直的調査によって動物の動きを登録する能力があるＩＲ発光システムである。データは、コンピューター上にモニターされる。動物は、ボックスの中央に配置され、それを探究できる。ボックスは、５分間低い照明を有して環境騒音及び研究者から隔離された部屋の中に置かれる。ボックス中のセンサーの光ビームが中断される時、動物がボックスの壁に垂直的に探究する回数を、研究者はとる(Cools, A. R., R. Brachten, D. Heeren, A. Willemen, and B. Ellenbroek, 1990. Search after neurobiological profile of individual-specific features of Wistar rats. Brain Res. Bull. 24: 49-69)。
結果は、図１６に示される。
【０１２８】
図１６は、７日の処理後のオスのウィスターラット中の６−ＯＨＤＡによって誘発される損傷に対するＪＭ−２０の神経保護効果を示す。（Ａ）％非対称性（シリンダー試験）の減少；ＪＭ−２０で処理された動物は、処理なしの損傷した動物と比較して、運動損傷の減少を示した。（Ｂ）損傷への前足対側性の使用の増加、及び（Ｃ）損傷した動物及びＪＭ−２０（４０及び２０ｍｇ／Ｋｇ）の両方用量で処理されたものにおける、同側の前足の使用の標準値（５０％〜）。（Ｄ）ＪＭ−２０で処理された動物は、それらの垂直的調査が増加し、治療されない損傷した動物に関して４０ｍｇ／Ｋｇの用量とは統計的に異なった。
【０１２９】
持続性疼痛
我々は、ラットにおいて持続性疼痛モデル（５％ホルマリン試験）で痛みに関する挙動に対するＪＭ−２０（１０、２０、４０ｍｇ／Ｋｇ、ｐ．ｏ）の効果を研究した。(Dubuisson D, Dennis SG. The formalin test: a quantitative study of the analgesic effects of morphine, meperidine and brain-stem stimulation in rats and cats. Pain 1977;4:161-174)。
結果は、図１７Ａ、図１７Ｂ及び図１８に示される。
【０１３０】
図１７Ａは、ラットの前足の足底表面上に５％ホルマリンを注入した後になめること／かむことの挙動に対するＪＭ−２０（１０−４０ｍｇ／Ｋｇ、１０ｍＬ／Ｋｇ、ｐ．ｏ．）、ジアゼパム１０ｍｇ／Ｋｇ又はビヒクル（ＣＭＣ、０．０５％）の効果を示す。データは、フェーズＩ（０−５分）、待ち時間（５−１５分）及びフェーズＩＩ（１５−４５分）又はホルマリン試験の間になめること／かむこと±ＥＥＭの時間の累積平均として示され、グループ当りｎ＝７、＊＊＊ｐ＜０．００１は、ビヒクルで処理された対照グループに関して有意な相違を表す（１つのルートではＡＮＯＶＡ、その後にDunnett's a posteriori）。
【０１３１】
図１７Ｂは、ラットの前足の足底表面上に５％ホルマリンを注入した後になめること／かむことの挙動に対するＪＭ−２０（１０−４０ｍｇ／Ｋｇ、１０ｍＬ／Ｋｇ、ｐ．ｏ．）、ジアゼパム１０ｍｇ／Ｋｇ又はビヒクル（ＣＭＣ、０．０５％）の効果の時間経過を示す。データは、４５分の試験の間になめること／かむことの時間（／５分／秒）±ＥＥＭの平均として示される、グループ当りｎ＝７。
【０１３２】
図１８は、５％ホルマリン試験のフェーズＩＩに関するＪＭ−２０の抗過剰侵害受容効果に対するフルマゼニル（１０ｍｇ／Ｋｇ、ｉ．ｐ）での動物の前処理の影響を示す。各々のカラムは、平均±ＥＥＭとしてグループ当り６〜１０の動物の反応時間を表す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、処理グループと対照グループ（ビヒクルのみ）との間の統計的相違を表す，・・・・Ｐ＜０．０５は、フルマゼニルの存在下又は不存在下でのジアゼパムで処理されたグループ間の統計的相違を表す、≠Ｐ＜０．０５は、フルマゼニルの存在下又は不存在下でのＪＭ−２０で処理されたグループ間の統計的相違を表す。
【０１３３】
神経障害性疼痛
我々は、ＮＰモデル、坐骨神経モデル（ＣＣＩ）の慢性的な圧縮に対するＪＭ−２０の効果を研究した。(Bennett MI, Rayment C, Hjermstad M, Aass N, Caraceni A, Kaasa S. Prevalence and aetiology of neuropathic pain in cancer patients: A systematic review. Pain 2012; 153:359-365)
結果は、図１９〜図２３に示される。
【０１３４】
図１９は、Ｆｒｅｙのフィラメント刺激での前足引っ込み応答を測定することによって決定された、外科後１４日のＣＣＩラットの同側の前足の機械的な異痛に対するＪＭ−２０（２０ｍｇ／Ｋｇ、１０ｍＬ／Ｋｇ、ｐ．ｏ．）又はビヒクル（ＣＭＣ、０．０５％）の効果を示す。データは、反応閾値の５０％の平均±ＥＥＭとして示される、グループ当りｎ＝７。異なる文字は、グループ間の有意な相違を表す（１つのルートではＡＮＯＶＡ、その後にBonferronni’s a posteriori）。
【０１３５】
図２０は、Ｆｒｅｙの電子で刺激された時の前足引っ込み応答を測定することによって決定されたＣＣＩラットの同側の前足の機械的な過剰侵害受容の強度に対するＪＭ−２０（２０／Ｋｇ、１０ｍＬ／Ｋｇ、ｐ．ｏ．）又はビヒクル（ＣＭＣ、０．５％）の効果を示す。データは、３つの時間測定の平均０から異なる時間間隔の３つの測定の平均を差し引くことを基準として計算されたグラムでの逃避の閾値相違（Δ）の平均±ＥＥＭとして示される、グループ当りｎ＝７    ＊＊ｐ＜０．０１は、ビヒクルで処理された対照グループに関して有意な相違を表す、＃ｐ＜０．０５は、Ｓｈａｍ  ＣＣＩグループに関して有意な相違を表す（１つのルートではＡＮＯＶＡ、その後にBonferronni’s a posteriori）。
【０１３６】
図２１は、伝統的なRandal Selito or SH Ferreira試験を修正したものによって、前足上への定圧への機械的な過剰侵害受容に対するＪＭ−２０（２０ｍｇ／Ｋｇ、１０ｍＬ／Ｋｇ、ｐ．ｏ．）又はビヒクル（ＣＭＣ、０．０５％）の効果を示す。データは、時間測定０から異なる時間間隔の測定を差し引くことによって計算された反応時間の相違（Δ）の平均±ＥＥＭとして示される、グループ当りｎ＝７  ＊ｐ＜０．０５は、ビヒクルで処理された対照グループに関して有意な相違を表す、＃＃ｐ＜０．０１は、Ｓｈａｍ  ＣＣＩグループに関して有意な相違を表す（１つのルートではＡＮＯＶＡ、その後にBonferronni’s a posteriori）。
【０１３７】
図２２は、外科後１４日でＣＣＩによって誘発される組織学的変化（ワーラー変性）に関する７日後ＣＣＩでスタートする７日間で繰り返し用量でＪＭ−２０（２０ｍｇ／Ｋｇ、ｐ．ｏ）での処理の効果を示す。Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ、ＣＣＩ  Ｓｈａｍラット、ＪＭ−２０で処理したＣＣＩ及びビヒクルで処理したものの障害への坐骨神経５ｍｍ末端の縦のセクションを示す（Ｈ／Ｅ着色）。我々は、ｓｈａｍ−ＣＣＩと比較してそれらのミエリン鞘に関連する軸索の整然とした配置の喪失及びマクロファージの侵入及びＳｃｈａｗａｎｎ細胞の増殖の結果としてｓｈａｍ操作動物と相対的に比較されたＣＣＩ動物における細胞質の増加を観察できる。矢印は、ミエリンオボイドを含有するＳｃｈａｗａｎｎ細胞の多くの消化チャンバーの１つを示す（赤みを帯びた楕円の塊）。Ｄ、Ｅ、Ｆは、同じ動物からのセクションを示すが、それらは、ミエリン色合い用の特定の技術であるルクソール・ファスト・ブルー（ＬＦＢ）技術によって着色されている。Ｂ及びＥ：ＣＣＩによって誘発される神経線維の破壊の低減及び細胞の数の増加及びＪＭ−２０で処理された動物のミエリン鞘の劣化、特にこの最後の効果はＥに特定される。
【０１３８】
図２３は、酸化窒素濃度の指示薬としての硝酸塩の脊髄濃度に対するＪＭ−２０（２０ｍｇ／Ｋｇ、１０ｍＬ／Ｋｇ、ｐ．ｏ．）又はビヒクル（ＣＭＣ、０．０５％）の効果を示す。平均±ＥＥＭとして示されたデータＩ、グループ当りｎ＝７、＊＊＊ｐ＜０．００１は、ビヒクルで処理された対照グループに関して有意な相違を表す、＃＃＃ｐ＜０．００１は、Ｓｈａｍ  ＣＣＩグループに関して有意な相違を表す（１つのルートではＡＮＯＶＡ、その後にBonferronni’s a posteriori）。
【０１３９】
カラギーナン誘発腹膜炎
その後、我々は、これらの状態でＪＭ−２０の潜在的な消炎活性を探究するために、齧歯動物におけるＣＡ誘発腹膜炎モデルでの異なる実験を設計した。
結果は、図２４Ａ−Ｅに示される。
【０１４０】
図２４は、ラットにおいてカラギーナンによって誘発される腹膜炎症反応（５００μｇ／空洞）に対するＪＭ−２０（２０ｍｇ／Ｋｇ、１０ｍＬ／Ｋｇ、ｐ．ｏ．）又はビヒクル（ＣＭＣ、０．０５％）の効果を示す。Ａ．白血球ローリング及びＢ．腸間膜における血管系内皮細胞へのそれらの付着が、炎症の誘導後４時間生体内顕微鏡によって決定された。Ｃ．腹膜空洞に向かう白血球の移行及びＤ．血管系の浸透性（μｇ／ｍＬ）が、４時間後ＣＡで決定された。Ｅ．カラギーナン注入後４時間で腹膜液における腫瘍壊死要因（ＴＮＦα）の濃度に対する効果。データは、平均±ＥＥＭとして示される、グループ当りｎ＝６、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１は、ビヒクルで処理された対照グループに関して有意な相違を表す、＃＃＃ｐ＜０．００１、＃＃ｐ＜０．０１は、腹腔内生理食塩水溶液での対照に関して有意な相違を表す（各々のそれぞれのケースで、１つのルートではＡＮＯＶＡ、その後にNewman-Keuls or Bonferronni’s a posteriori）。
【図１】
2019519600.tif 000010
【図２】
2019519600.tif 000011
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2019519600.tif 000019
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2019519600.tif 000023
【図１６】
2019519600.tif 000024
【図１７Ａ】
2019519600.tif 000025
【図１７Ｂ】
2019519600.tif 000026
【図１８】
2019519600.tif 000027
【図１９】
2019519600.tif 000028
【図２０】
2019519600.tif 000029
【図２１】
2019519600.tif 000030
【図２２】
2019519600.tif 000031
【図２３】
2019519600.tif 000032
【図２４ＡＢ】
2019519600.tif 000033
【図２４ＣＤ】
2019519600.tif 000034
【図２４Ｅ】
2019519600.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月7日(2019.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系及び脈管神経系の病気の治療に使用するための式ＩＩＩの化合物であって、前記病気がパーキンソン病である、前記の化合物。
【化１】
2019519600.tif 000036
【請求項２】
中枢神経系及び脈管神経系の病気の治療に使用するための式ＩＩＩの化合物であって、前記病気が神経障害性疼痛である、前記の化合物。
【請求項３】
中枢神経系及び脈管神経系の病気の治療に使用するための式ＩＩＩの化合物であって、前記病気が認知症である、前記の化合物。
【請求項４】
中枢神経系及び脈管神経系の病気の治療に使用するための式ＩＩＩの化合物であって、前記病気がアルツハイマー病である、前記の化合物。
【請求項５】
中枢神経系及び脈管神経系の病気の治療に使用するための式ＩＩＩの化合物であって、前記病気が血管性認知症である、前記の化合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
図２４は、ラットにおいてカラギーナンによって誘発される腹膜炎症反応（５００μｇ／空洞）に対するＪＭ−２０（２０ｍｇ／Ｋｇ、１０ｍＬ／Ｋｇ、ｐ．ｏ．）又はビヒクル（ＣＭＣ、０．０５％）の効果を示す。Ａ．白血球ローリング及びＢ．腸間膜における血管系内皮細胞へのそれらの付着が、炎症の誘導後４時間生体内顕微鏡によって決定された。Ｃ．腹膜空洞に向かう白血球の移行及びＤ．血管系の浸透性（μｇ／ｍＬ）が、４時間後ＣＡで決定された。Ｅ．カラギーナン注入後４時間で腹膜液における腫瘍壊死要因（ＴＮＦα）の濃度に対する効果。データは、平均±ＥＥＭとして示される、グループ当りｎ＝６、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１は、ビヒクルで処理された対照グループに関して有意な相違を表す、＃＃＃ｐ＜０．００１、＃＃ｐ＜０．０１は、腹腔内生理食塩水溶液での対照に関して有意な相違を表す（各々のそれぞれのケースで、１つのルートではＡＮＯＶＡ、その後にNewman-Keuls or Bonferronni’s a posteriori）。
本発明に関連して、以下の内容を更に開示する。
［１］
薬剤として使用するための、式ＩＩＩの化合物、その塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、プロドラッグ。
【化１】
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［２］
１種以上の医薬的に許容可能な賦形剤と組み合わせて、式ＩＩＩの化合物が、［１］に記載のその塩、水和物、結晶形、鏡像異性体、異性体、代謝産物、プロドラッグを含むことを特徴とする、医薬組成物。
［３］
中枢神経系及び脈管神経系の病気の治療用の、［２］に記載の医薬組成物。
［４］
中枢神経系及び脈管神経系の病気の治療用の薬剤の製造用の、［２］に記載の医薬組成物。
［５］
中枢神経系及び脈管神経系の病気の治療用の薬剤の製造用の、［１］に記載の式ＩＩＩの化合物の使用。
［６］
神経変性疾患の治療用の薬剤の製造用の、［３］に記載の式ＩＩＩの化合物の使用。
［７］
パーキンソン病の治療用の［４］に記載の薬剤の製造のための式ＩＩＩの化合物の使用。
［８］
神経障害性疼痛の治療用の［４］に記載の薬剤の製造のための式ＩＩＩの化合物の使用。
［９］
異なるタイプの認知症の治療用の［４］に記載の薬剤の製造のための式ＩＩＩの化合物の使用。
［１０］
アルツハイマー病の治療用の［７］に記載の薬剤の製造のための式ＩＩＩの化合物の使用。
［１１］
血管性認知症の治療用の［７］に記載の薬剤の製造のための式ＩＩＩの化合物の使用。
【国際調査報告】
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