(57)【要約】還元剤、プロテアーゼ、温度、及び低ｐＨ環境による変性及び分解に対して安定したペプチドが開示される。こうしたペプチドを含む医薬組成物及びペプチドの使用、ペプチド−活性薬剤コンジュゲート、並びにペプチド−検出可能物質コンジュゲートも開示される。ペプチド組成物、ペプチドコンジュゲート組成物、及び医薬組成物は、経口送達、及び身体の様々なコンパートメントへの送達などの多様な送達経路のために製剤化することができる。本開示のペプチドは安定しており、そのような送達後に、向上した薬物動態を呈示する。
2019529380.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的組織にペプチドを送達する方法であって、前記方法が、
前記ペプチドを被験者に投与するステップと；
前記ペプチドを前記標的組織に送達するステップと
を含み、ここで、前記ペプチドが、以下の特徴：
（ａ）１０ｍＭからの濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｂ）１０ｍＭの濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｃ）５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｄ）５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｅ）人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｆ）１．０５のｐＨ及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｇ）５００Ｕ／ｍｌのペプシン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴと人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の組合せ（ＳＰＴＤ）並びに少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｈ）少なくとも７０℃に対する少なくとも６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｉ）少なくとも１００℃に対する少なくとも６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；又は
（ｊ）口腔、胃、小腸、若しくは大腸を通過後に、前記ペプチドの少なくとも１０％がインタクトなままである
の少なくとも１つを有する方法。
【請求項２】
標的組織にペプチドを送達する方法であって、前記方法が、
前記ペプチドを被験者に投与するステップと；
前記ペプチドを前記標的組織に送達するステップと
を含み、ここで、前記ペプチドが、以下の特徴：
（ａ）５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｂ）５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｃ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｄ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｅ）人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｆ）１〜２、２〜３、３〜４、若しくは４〜５のｐＨ及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｇ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌのペプシン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴと人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の組合せ並びに少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｈ）少なくとも７０℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｉ）少なくとも１００℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；又は
（ｊ）口腔、胃、小腸、若しくは大腸を通過後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである
の少なくとも１つを有する方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の２つ以上を有する、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の３つ以上を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の４つ以上を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の５つ以上を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の６つ以上を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の７つ以上を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の８つ以上を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の全てを有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが、少なくとも７５℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、インタクトなままである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、モチーフを含み、前記モチーフは、Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｘが、任意のアミノ酸であるか、又は存在しない、請求項１２に記載のモチーフ。
【請求項１４】
前記ペプチドが、ノッテッドペプチドである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが、６個以上のシステイン残基を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが、システイン残基の間に形成される３つ以上のジスルフィド架橋を含み、前記ジスルフィド架橋の１つが、２つの他のジスルフィド架橋により形成されるループを通過する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドが、複数のジスルフィド架橋を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドが、シスチン高密度ペプチド（ＣＤＰ）である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＤＰが、独立した折り畳みドメインを含み、前記独立した折り畳みドメインは、少なくとも６システインの高密度を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＤＰが、前記細胞表面に輸出されるか、又は分泌される、請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＤＰが、システイン１と４、２と５、及び３と６の間にジスルフィド結合を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＤＰが、システイン１と３、２と５、及び４と６の間にジスルフィド結合を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＤＰが、システイン１と４、２と６、及び３と５の間にジスルフィド結合を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＤＰが、システイン１と５、２と４、及び３と６の間にジスルフィド結合を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＤＰが、システイン１と６、２と４、及び３と５の間にジスルフィド結合を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＤＰが、非ノッテッドＣＤＰである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記非ノッテッドＣＤＰが、システイン１と６、２と５、及び３と４の間にジスルフィド結合を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
前記ペプチドが、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖジスルフィド結合、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合、及びＣｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合のトポロジーを含み、ここで、前記Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合は、前記Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖジスルフィド結合及び前記Ｃｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合を含む巨大環を通過する、請求項１１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘシステイン−システイン結合は、ノッティングシステインである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ペプチドが、ヒッチンであり、前記ヒッチンは、前記Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｙジスルフィド結合が、システイン１とシステイン４の間にあり、前記Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合が、システイン２とシステイン５の間にあり、前記Ｃｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合が、システイン３とシステイン６の間にあるトポロジーを含む、請求項２８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｌ配置であるか、又は、前記ノッテッドペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｄ配置である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ペプチドが、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、又は少なくとも８１アミノ酸残基長である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
任意の１若しくは複数個のＫ残基が、Ｒ残基で置換されているか、又は、任意の１若しくは複数個のＲ残基が、Ｋ残基で置換されている、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチドが、少なくとも１個の別のペプチドを含む多量体構造に配列される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチドが、配列番号１６７〜配列番号１７１のいずれか１つを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドが、配列番号１７２〜配列番号１７６のいずれか１つのいずれか１つを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドが、配列番号１〜配列番号８３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドが、配列番号１〜配列番号８３のいずれか１つを含む、請求項１〜３４又は３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ペプチドが、配列番号８４〜配列番号１６６のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ペプチドが、配列番号８４〜配列番号１６６のいずれか１つを含む、請求項１〜３４又は３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ペプチドが、配列番号３１、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号５７、配列番号７７、又は配列番号７８のいずれか１つを含む、請求項１〜３４又は３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ペプチドが、配列番号２７、配列番号３１、又は配列番号５７のいずれか１つを含む、請求項１〜３４又は３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ペプチドが、配列番号２９、配列番号４、配列番号７９、又は配列番号８０のいずれか１つを含む、請求項１〜３４又は３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ペプチドが、配列番号２６、配列番号８１、配列番号８２、又は配列番号８３のいずれか１つを含む、請求項１〜３４又は３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ペプチドが、配列番号２のいずれか１つを含む、請求項１〜３４又は３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ペプチドが、配列番号３１のいずれか１つを含む、請求項１〜３４又は３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ペプチドが、Ｃｍａｘに到達する０．５〜１２時間の平均Ｔｍａｘを示す、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
経口経路により前記被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、血清中０．１％〜１０％の前記ペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
経口経路により前記被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、血清中０．１％未満の前記ペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
非経口経路により被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、血清中１０％〜１００％の前記ペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、被験者において０．１時間〜１６８時間の平均ｔ１／２を達成する、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、０．５〜１００Ｌ／時間のペプチドの平均クリアランス（ＣＬ）を達成する、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、前記被験者において２００〜２０，０００ｍＬの平均分布容積（Ｖｄ）を達成する、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ペプチドが、酸化条件への３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ペプチドが、２未満のｐＨへの３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ペプチドが、前記胃腸管の通過後にインタクトなままである、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ペプチドが、Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、又は２−メルカプトエタノールに対する曝露後にインタクトなままである、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ペプチドが、キモトリプシン、血清プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システイニルプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、エラスターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、シトクロムＰ４５０酵素、カルボキシペプチダーゼ、又はカテプシンへの曝露後にインタクトなままである、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも６０％、６５％若しくは７５％相対湿度と共に、少なくとも２５℃、３０℃、若しくは４０℃の温度に対する少なくとも３、６、１２、１８、２４、３６、又は４８ヶ月間の曝露後に、前記ペプチドの９０〜１００％がインタクトなままである、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ペプチドが、被験者への経口投与、吸入、鼻内投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、滑液嚢内投与、膣内投与、直腸投与、肺投与、眼への投与、口腔投与、舌下投与、髄腔内投与、又はこれらの任意の組合せの後に前記特徴を呈示する、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記被験者が、ヒトである、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記被験者が、ヒト以外の動物である、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ペプチドの少なくとも１つの残基が、化学修飾を含む、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記化学修飾が、前記ペプチドのＮ末端の遮断である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記化学修飾が、メチル化、アセチル化、又はアシル化である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記化学修飾が、１若しくは複数個のリシン残基又はその類似体のメチル化、前記Ｎ末端のメチル化、又は１若しくは複数個のリシン残基又はその類似体のメチル化及び前記Ｎ末端のメチル化を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記ペプチドが、アシル付加物に連結される、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ペプチドが、活性薬剤に連結される、請求項１〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記活性薬剤が、前記ペプチドのＮ末端又はＣ末端で前記ペプチドと融合される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記活性薬剤が、Ｆｃドメインである、請求項６８〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
Ｆｃドメインと融合した前記ペプチドが、連続した配列を含む、請求項６８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の活性薬剤が、前記ペプチドに連結される、請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ペプチドが、切断可能なリンカーを介して前記活性薬剤に連結される、請求項６８〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ペプチドが、前記ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のεアミンで、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、又はＣ末端で、リンカーにより前記活性薬剤に連結される、請求項６８〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ペプチドが、非天然アミノ酸をさらに含み、前記非天然アミノ酸は、別のアミノ酸の挿入、付加、又は置換物である、請求項１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ペプチドが、前記非天然アミノ酸で、リンカーにより前記活性薬剤に連結される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記リンカーが、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、又は炭素−窒素結合を含む、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記切断可能なリンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、又はβ−グルクロニダーゼの切断部位を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記ペプチドが、切断不可能なリンカーを介して前記活性薬剤に連結される、請求項６８〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記活性薬剤が、以下：ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学物質、蛍光団、金属、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症薬、免疫モジュレータ、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法薬、細胞傷害性物質、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、バイオポリマー、多糖、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルココルチコイド、抗サイトカイン剤、鎮痛剤、デンドリマー、脂肪酸、Ｆｃ領域、シデロカリン、又はこれらの組合せである、請求項６８〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ペプチドが、検出可能な物質に連結される、請求項１〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記検出可能な物質が、前記ペプチドのＮ末端又はＣ末端で前記ペプチドと融合される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の検出可能な物質が、前記ペプチドに連結される、請求項８１〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記ペプチドが、切断可能なリンカーを介して前記検出可能な物質に連結される、請求項８１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記ペプチドが、前記ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のεアミンで、内部アスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、又はＣ末端で、リンカーにより前記検出可能な物質に連結される、請求項８１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記ペプチドが、前記非天然アミノ酸で、リンカーにより前記検出可能な物質に連結される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８７】
前記リンカーが、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、又は炭素−窒素結合を含む、請求項８５〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記切断可能なリンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、又はβ−グルクロニダーゼの切断部位を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
前記ペプチドが、切断不可能なリンカーを介して前記検出可能な物質に連結される、請求項８１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記検出可能な物質が、以下：蛍光団、近赤外色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、又は放射性核種キレート剤である、請求項８１〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記検出可能な物質が、蛍光色素である、請求項８１〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記ペプチドが、経口投与される、請求項１〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記被験者が、ある状態を有する、請求項１〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記状態が、胃腸感染又は慢性胃腸疾患である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記胃腸感染が、細菌感染、原核生物感染、又は真菌感染である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記慢性胃腸疾患が、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、胃食道逆流症、潰瘍性大腸炎又は便秘である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記状態が、癌である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記癌が、大腸癌、胃癌、又は食道癌である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記ペプチドが、前記状態を治療するために投与される、請求項９３〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記状態が、炎症、癌、退歩、発育異常、遺伝病、裂傷、感染症、外傷、リウマチ性疾患、免疫系障害、腎臓疾患、肺病、加齢による症状、変性脳疾患、変性身体疾患、小児疾患、肝臓疾患、肺疾患、膵臓症状、又は胃腸症状である、請求項９３〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記腎臓疾患が、急性腎障害又は慢性腎臓疾患である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ペプチドが、胃腸症状を治療するために経口投与により送達される、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ペプチドが、非胃腸症状を治療するために経口投与により送達される、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ペプチドが、経口投与により送達されて、軟骨に向かう、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ペプチドが、経口投与により送達されて、腎臓又は腎近位尿細管に向かう、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ペプチドが、経口投与により送達されて、腫瘍に向かうか、又は腫瘍中に蓄積する、請求項１〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ペプチドが、疾患領域、組織、構造、又は細胞を検出するために投与される、請求項１〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
ペプチドが、前記細胞に進入する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ペプチドが、細胞内で活性である、請求項１〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記投与ステップの後、前記組成物の以下の特徴：
（ａ）血漿中のインタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｂ）胃中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｃ）胃腸管中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｄ）結腸中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｅ）糞便中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｆ）尿中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｇ）軟骨中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｈ）血漿中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均Ｃｍａｘ；
（ｉ）前記Ｃｍａｘに到達する平均Ｔｍａｘ；
（ｊ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の曲線下平均面積（ＡＵＣ）；
（ｋ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均バイオアベイラビリティ；
（ｌ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均ｔ１／２；
（ｍ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均クリアランス（ＣＬ）；又は
（ｎ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均分布容積（Ｖｄ）
の１つを前記被験者において測定する、請求項１〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
以下の特徴：
（ａ）１０ｍＭからの濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｂ）１０ｍＭの濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｃ）５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｄ）５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｅ）人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｆ）１．０５のｐＨ及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｇ）５００Ｕ／ｍｌのペプシン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴと人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の組合せ（ＳＰＴＤ）並びに少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｈ）少なくとも７０℃に対する少なくとも６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｉ）少なくとも１００℃に対する少なくとも６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；又は
（ｊ）口腔、胃、小腸、若しくは大腸を通過後に、前記ペプチドの少なくとも１０％がインタクトなままである
の少なくとも１つを有するペプチド。
【請求項１１２】
以下の特徴：
（ａ）５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｂ）５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｃ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｄ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｅ）人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｆ）１〜２、２〜３、３〜４、若しくは４〜５のｐＨ及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｇ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌのペプシン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴと人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の組合せ（ＳＰＴＤ）並びに少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｈ）少なくとも７０℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｉ）少なくとも１００℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；又は
（ｊ）口腔、胃、小腸、若しくは大腸を通過後に、前記ペプチドの少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである
の少なくとも１つを有するペプチド。
【請求項１１３】
前記ペプチドが、非天然のペプチドである、請求項１１１〜１１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１１４】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の２つ以上を有する、請求項１１１〜１１３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１１５】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の３つ以上を有する、請求項１１１〜１１４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１１６】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の４つ以上を有する、請求項１１１〜１１５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１１７】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の５つ以上を有する、請求項１１１〜１１６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１１８】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の６つ以上を有する、請求項１１１〜１１７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１１９】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の７つ以上を有する、請求項１１１〜１１８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２０】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の８つ以上を有する、請求項１１１〜１１９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２１】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の全てを有する、請求項１１１〜１２０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２２】
前記ペプチドが、少なくとも７５℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、インタクトなままである、請求項１１１〜１２１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２３】
前記ペプチドが、モチーフを含み、前記モチーフは、Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項１１１〜１２２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２４】
Ｘが、任意のアミノ酸であるか、又は存在しない、請求項１２３に記載のモチーフ。
【請求項１２５】
前記ペプチドが、ノッテッドペプチドである、請求項１１１〜１２４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２６】
前記ペプチドが、６個以上のシステイン残基を含む、請求項１１１〜１２５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２７】
前記ペプチドが、システイン残基の間に形成される３つ以上のジスルフィド架橋を含み、前記ジスルフィド架橋の１つが、２つの他のジスルフィド架橋により形成されるループを通過する、請求項１１１〜１２６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２８】
前記ペプチドが、複数のジスルフィド架橋を含む、請求項１１１〜１２７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２９】
前記ペプチドが、シスチン高密度ペプチド（ＣＤＰ）である、請求項１１１〜１２８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１３０】
前記ＣＤＰが、独立した折り畳みドメインを含み、前記独立した折り畳みドメインは、少なくとも６システインの高密度を含む、請求項１２９に記載のペプチド。
【請求項１３１】
前記ＣＤＰが、前記細胞表面に輸出されるか、又は分泌される、請求項１２９〜１３０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１３２】
前記ＣＤＰが、システイン１と４、２と５、及び３と６の間にジスルフィド結合を含む、請求項１２９〜１３０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１３３】
前記ＣＤＰが、システイン１と３、２と５、及び４と６の間にジスルフィド結合を含む、請求項１２９〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ＣＤＰが、システイン１と４、２と６、及び３と５の間にジスルフィド結合を含む、請求項１２９〜１３０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１３５】
前記ＣＤＰが、システイン１と５、２と４、及び３と６の間にジスルフィド結合を含む、請求項１２９〜１３０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１３６】
前記ＣＤＰが、システイン１と６、２と４、及び３と５の間にジスルフィド結合を含む、請求項１２９〜１３０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１３７】
前記ＣＤＰが、非ノッテッドＣＤＰである、請求項１２９に記載のペプチド。
【請求項１３８】
前記非ノッテッドＣＤＰが、システイン１と６、２と５、及び３と４の間にジスルフィド結合を含む、請求項１３８に記載のペプチド。
【請求項１３９】
前記ペプチドが、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖジスルフィド結合、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合、及びＣｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合のトポロジーを含み、ここで、前記Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合は、前記Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖジスルフィド結合及び前記Ｃｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合を含む巨大環を通過する、請求項１１１〜１３８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４０】
前記Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘシステイン−システイン結合が、ノッティングシステインである、請求項１３９に記載のペプチド。
【請求項１４１】
前記ペプチドが、ヒッチンであり、前記ヒッチンは、前記Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｙジスルフィド結合が、システイン１とシステイン４の間にあり、前記Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合が、システイン２とシステイン５の間にあり、前記Ｃｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合が、システイン３とシステイン６の間にあるトポロジーを含む、請求項１３９〜１４０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４２】
前記ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｌ配置であるか、又は、前記ノッテッドペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｄ配置である、請求項１１１〜１４１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４３】
前記ペプチドが、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、又は少なくとも８１アミノ酸残基長である、請求項１１１〜１４２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４４】
任意の１若しくは複数個のＫ残基が、Ｒ残基で置換されているか、又は、任意の１若しくは複数個のＲ残基が、Ｋ残基で置換されている、請求項１１１〜１４３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４５】
前記ペプチドが、少なくとも１個の別のペプチドを含む多量体構造に配列される、請求項１１１〜１４４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４６】
前記ペプチドが、配列番号１６７〜配列番号１７１のいずれか１つを含む、請求項１１１〜１４５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４７】
前記ペプチドが、配列番号１７２〜配列番号１７６のいずれか１つのいずれか１つを含む、請求項１１１〜１４５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４８】
前記ペプチドが、配列番号１〜配列番号８３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む、請求項１１１〜１４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記ペプチドが、配列番号１〜配列番号８３のいずれか１つを含む、請求項１１１〜１４５又は１４８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５０】
前記ペプチドが、配列番号８４〜配列番号１６６のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む、請求項１１１〜１４５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５１】
前記ペプチドが、配列番号８４〜配列番号１６６のいずれか１つを含む、請求項１１１〜１４５又は１５０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５２】
前記ペプチドが、配列番号３１、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号５７、配列番号７７、又は配列番号７８のいずれか１つを含む、請求項１１１〜１４５又は１４８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５３】
前記ペプチドが、配列番号２７、配列番号３１、又は配列番号５７のいずれか１つを含む、請求項１１１〜１４５又は１４８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５４】
前記ペプチドが、配列番号２９、配列番号４、配列番号７９、又は配列番号８０のいずれか１つを含む、請求項１１１〜１４５又は１４８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５５】
前記ペプチドが、配列番号２６、配列番号８１、配列番号８２、又は配列番号８３のいずれか１つを含む、請求項１１１〜１４５又は１４８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５６】
前記ペプチドが、配列番号２のいずれか１つを含む、請求項１１１〜１４５又は１４８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５７】
前記ペプチドが、配列番号３１のいずれか１つを含む、請求項１１１〜１４５又は１４８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５８】
前記ペプチドが、Ｃｍａｘに到達する０．５〜１２時間の平均Ｔｍａｘを示す、請求項１１１〜１５７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５９】
経口経路により前記被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、血清中０．１％〜１０％の前記ペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する、請求項１１１〜１５８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６０】
経口経路により前記被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、血清中０．１％未満の前記ペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する、請求項１１１〜１５９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６１】
非経口経路により被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、血清中１０％〜１００％の前記ペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する、請求項１１１〜１６０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６２】
被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、前記被験者において０．１時間〜１６８時間の平均ｔ１／２を達成する、請求項１１１〜１６１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６３】
前記被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、０．５〜１００Ｌ／時間のペプチドの平均クリアランス（ＣＬ）を達成する、請求項１１１〜１６２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６４】
前記被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、前記被験者において２００〜２０，０００ｍＬの平均分布容積（Ｖｄ）を達成する、請求項１１１〜１６３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６５】
前記ペプチドが、酸化条件への３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１１１〜１６４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６６】
前記ペプチドが、２未満のｐＨへの３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１１１〜１６５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６７】
前記ペプチドが、胃腸管の通過後にインタクトなままである、請求項１１１〜１６６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６８】
前記ペプチドが、Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、又は２−メルカプトエタノールに対する曝露後にインタクトなままである、請求項１１１〜１６７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６９】
前記ペプチドが、キモトリプシン、血清プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システイニルプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、エラスターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、シトクロムＰ４５０酵素、カルボキシペプチダーゼ、又はカテプシンへの曝露後にインタクトなままである、請求項１１１〜１６８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１７０】
少なくとも６０％、６５％若しくは７５％相対湿度と共に、少なくとも２５℃、３０℃、若しくは４０℃の温度に対する少なくとも３、６、１２、１８、２４、３６、又は４８ヶ月間の曝露後に、前記ペプチドの９０〜１００％がインタクトなままである、請求項１１１〜１６９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１７１】
前記ペプチドが、被験者への経口投与、吸入、鼻内投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、滑液嚢内投与、膣内投与、直腸投与、肺投与、眼への投与、口腔投与、舌下投与、髄腔内投与、又はこれらの任意の組合せの後に前記特徴を呈示する、請求項１１１〜１７０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１７２】
前記被験者が、ヒトである、請求項１１１〜１７１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１７３】
前記被験者が、ヒト以外の動物である、請求項１１１〜１７２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１７４】
前記ペプチドの少なくとも１つの残基が、化学修飾を含む、請求項１１１〜１７３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１７５】
前記化学修飾が、前記ペプチドのＮ末端の遮断である、請求項１７４に記載のペプチド。
【請求項１７６】
前記化学修飾が、メチル化、アセチル化、又はアシル化である、請求項１７４に記載のペプチド。
【請求項１７７】
前記化学修飾が、１若しくは複数個のリシン残基又はその類似体のメチル化、前記Ｎ末端のメチル化、又は１若しくは複数個のリシン残基又はその類似体のメチル化及び前記Ｎ末端のメチル化を含む、請求項１７４に記載のペプチド。
【請求項１７８】
前記ペプチドが、アシル付加物に連結される、請求項１１１〜１７７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１７９】
前記ペプチドが、活性薬剤に連結される、請求項１１１〜１７８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１８０】
前記活性薬剤が、前記ペプチドのＮ末端又はＣ末端で前記ペプチドと融合される、請求項１７９に記載のペプチド。
【請求項１８１】
前記活性薬剤が、Ｆｃドメインである、請求項１７９〜１８０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１８２】
Ｆｃドメインと融合した前記ペプチドが、連続した配列を含む、請求項１７９〜１８１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１８３】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の活性薬剤が、前記ペプチドに連結される、請求項１７９〜１８２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１８４】
前記ペプチドが、切断可能なリンカーを介して前記活性薬剤に連結される、請求項１７９〜１８３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１８５】
前記ペプチドが、前記ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のεアミンで、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、又はＣ末端で、リンカーにより前記活性薬剤に連結される、請求項１７９〜１８４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１８６】
前記ペプチドが、非天然アミノ酸をさらに含み、前記非天然アミノ酸は、別のアミノ酸の挿入、付加、又は置換物である、請求項１〜１８５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１８７】
前記ペプチドが、前記非天然アミノ酸で、リンカーにより前記活性薬剤に連結される、請求項１８６に記載のペプチド。
【請求項１８８】
前記リンカーが、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、又は炭素−窒素結合を含む、請求項１８５〜１８７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１８９】
前記切断可能なリンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、又はβ−グルクロニダーゼの切断部位を含む、請求項１８４に記載のペプチド。
【請求項１９０】
前記ペプチドが、切断不可能なリンカーを介して前記活性薬剤に連結される、請求項１７９〜１８３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１９１】
前記活性薬剤が、以下：ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学物質、蛍光団、金属、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症薬、免疫モジュレータ、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法薬、細胞傷害性物質、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、バイオポリマー、多糖、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルココルチコイド、抗サイトカイン剤、鎮痛剤、デンドリマー、脂肪酸、Ｆｃ領域、シデロカリン、又はこれらの組合せである、請求項１７９〜１９０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１９２】
前記ペプチドが、検出可能な物質に連結される、請求項１１１〜１９１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１９３】
前記検出可能な物質が、前記ペプチドのＮ末端又はＣ末端で前記ペプチドと融合される、請求項１９２に記載のペプチド。
【請求項１９４】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の検出可能な物質が、前記ペプチドに連結される、請求項１９２〜１９３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１９５】
前記ペプチドが、切断可能なリンカーを介して前記検出可能な物質に連結される、請求項１９２〜１９４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１９６】
前記ペプチドが、前記ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のεアミンで、内部アスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、又はＣ末端で、リンカーにより前記検出可能な物質に連結される、請求項１９２〜１９５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１９７】
前記ペプチドが、前記非天然アミノ酸で、リンカーにより前記検出可能な物質に連結される、請求項１８６に記載のペプチド。
【請求項１９８】
前記リンカーが、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、又は炭素−窒素結合を含む、請求項１９６〜１９７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１９９】
前記切断可能なリンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、又はβ−グルクロニダーゼの切断部位を含む、請求項１９５に記載のペプチド。
【請求項２００】
前記ペプチドが、切断不可能なリンカーを介して前記検出可能な物質に連結される、請求項１９２〜１９４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２０１】
前記検出可能な物質が、以下：蛍光団、近赤外色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、又は放射性核種キレート剤である、請求項１９２〜２００のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２０２】
前記検出可能な物質が、蛍光色素である、請求項１９２〜２０１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２０３】
前記ペプチドが、経口投与される、請求項１１１〜２０２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２０４】
前記被験者が、ある状態を有する、請求項１１１〜２０３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２０５】
前記状態が、胃腸感染又は慢性胃腸疾患である、請求項２０４に記載のペプチド。
【請求項２０６】
前記胃腸感染が、細菌感染、原核生物感染、又は真菌感染である、請求項２０５に記載のペプチド。
【請求項２０７】
前記慢性胃腸疾患が、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、胃食道逆流症、潰瘍性大腸炎又は便秘である、請求項２０５に記載のペプチド。
【請求項２０８】
前記状態が、癌である、請求項２０４に記載のペプチド。
【請求項２０９】
前記癌が、大腸癌、胃癌、又は食道癌である、請求項２０８に記載のペプチド。
【請求項２１０】
前記ペプチドが、前記状態を治療するために投与される、請求項１〜２０９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２１１】
前記状態が、炎症、癌、退歩、発育異常、遺伝病、裂傷、感染症、外傷、リウマチ性疾患、免疫系障害、腎臓疾患、肺病、加齢による症状、変性脳疾患、変性身体疾患、小児疾患、肝臓疾患、肺疾患、膵臓症状、又は胃腸症状である、請求項２０４〜２１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２１２】
前記腎臓疾患が、急性腎障害又は慢性腎臓疾患である、請求項２１１に記載のペプチド。
【請求項２１３】
前記ペプチドが、胃腸症状を治療するために経口投与により送達される、請求項１１１〜２１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２１４】
前記ペプチドが、非胃腸症状を治療するために経口投与により送達される、請求項１１１〜２１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２１５】
前記ペプチドが、経口投与により送達されて、軟骨に向かう、請求項１１１〜２１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２１６】
前記ペプチドが、経口投与により送達されて、腎臓又は腎近位尿細管に向かう、請求項１１１〜２１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２１７】
前記ペプチドが、経口投与により送達されて、腫瘍に向かうか、又は腫瘍中に蓄積する、請求項１１１〜２１６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２１８】
前記ペプチドが、疾患領域、組織、構造、又は細胞を検出するために投与される、請求項１１１〜２１７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２１９】
ペプチドが、前記細胞に進入する、請求項１１１〜２１８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２２０】
前記ペプチドが、細胞内で活性である、請求項１１１〜２１９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２２１】
前記ペプチドを投与した後、前記組成物の以下の特徴：
（ａ）血漿中のインタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｂ）胃中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｃ）胃腸管中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｄ）結腸中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｅ）糞便中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｆ）尿中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｇ）軟骨中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｈ）血漿中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均Ｃｍａｘ；
（ｉ）前記Ｃｍａｘに到達する平均Ｔｍａｘ；
（ｊ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の曲線下平均面積（ＡＵＣ）；
（ｋ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均バイオアベイラビリティ；
（ｌ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均ｔ１／２；
（ｍ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均クリアランス（ＣＬ）；又は
（ｎ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均分布容積（Ｖｄ）
の１つを前記被験者において測定する、請求項２１０〜２２０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２２２】
薬剤に連結されたペプチドを含むペプチドコンジュゲートであって、前記ペプチドが、以下の特徴：
（ａ）１０ｍＭからの濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｂ）１０ｍＭの濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｃ）５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｄ）５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｅ）人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｆ）１．０５のｐＨ及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｇ）５００Ｕ／ｍｌのペプシン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴと人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の組合せ（ＳＰＴＤ）並びに少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｈ）少なくとも７０℃に対する少なくとも６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；
（ｉ）少なくとも１００℃に対する少なくとも６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；又は
（ｊ）口腔、胃、小腸、若しくは大腸を通過後に、前記ペプチドの少なくとも１０％がインタクトなままである
の少なくとも１つを有するペプチドコンジュゲート。
【請求項２２３】
薬剤に連結されたペプチドを含むペプチドコンジュゲートであって、前記ペプチドが、以下の特徴：
（ａ）５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｂ）５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｃ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｄ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｅ）人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｆ）１〜２、２〜３、３〜４、若しくは４〜５のｐＨ及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｇ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌのペプシン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴと人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の組合せ（ＳＰＴＤ）並びに少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｈ）少なくとも７０℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；
（ｉ）少なくとも１００℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、前記ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；又は
（ｊ）口腔、胃、小腸、若しくは大腸を通過後に、前記ペプチドの少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである
の少なくとも１つを有するペプチドコンジュゲート。
【請求項２２４】
前記ペプチドが、非天然のペプチドである、請求項２２２〜２２３のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２２５】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の２つ以上を有する、請求項２２２〜２２４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２２６】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の３つ以上を有する、請求項２２２〜２２５のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２２７】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の４つ以上を有する、請求項２２２〜２２６のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２２８】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の５つ以上を有する、請求項２２２〜２２７のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２２９】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の６つ以上を有する、請求項２２２〜２２８のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２３０】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の７つ以上を有する、請求項２２２〜２２９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２３１】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の８つ以上を有する、請求項２２２〜２３０のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２３２】
前記ペプチドが、前記特徴（ａ）〜（ｊ）の全てを有する、請求項２２２〜２３１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２３３】
前記ペプチドが、少なくとも７５℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、インタクトなままである、請求項２２２〜２３２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２３４】
前記ペプチドが、モチーフを含み、前記モチーフは、Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項２２２〜２３４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２３５】
Ｘが、任意のアミノ酸であるか、又は存在しない、請求項２３４に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２３６】
前記ペプチドが、ノッテッドペプチドである、請求項２２２〜２３５のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２３７】
前記ペプチドが、６個以上のシステイン残基を含む、請求項２２２〜２３６のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２３８】
前記ペプチドが、システイン残基の間に形成される３つ以上のジスルフィド架橋を含み、前記ジスルフィド架橋の１つが、２つの他のジスルフィド架橋により形成されるループを通過する、請求項２２２〜２３７のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２３９】
前記ペプチドが、複数のジスルフィド架橋を含む、請求項２２２〜２３８のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２４０】
前記ペプチドが、シスチン高密度ペプチド（ＣＤＰ）である、請求項２２２〜２３９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２４１】
前記ＣＤＰが、独立した折り畳みドメインを含み、前記独立した折り畳みドメインは、少なくとも６システインの高密度を含む、請求項２４０に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２４２】
前記ＣＤＰが、前記細胞表面に輸出されるか、又は分泌される、請求項２４０〜２４１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２４３】
前記ＣＤＰが、システイン１と４、２と５、及び３と６の間にジスルフィド結合を含む、請求項２４０〜２４１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２４４】
前記ＣＤＰが、システイン１と３、２と５、及び４と６の間にジスルフィド結合を含む、請求項２４０〜２４１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２４５】
前記ＣＤＰが、システイン１と４、２と６、及び３と５の間にジスルフィド結合を含む、請求項２４０〜２４１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２４６】
前記ＣＤＰが、システイン１と５、２と４、及び３と６の間にジスルフィド結合を含む、請求項２４０〜２４１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２４７】
前記ＣＤＰが、システイン１と６、２と４、及び３と５の間にジスルフィド結合を含む、請求項２４０〜２４１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２４８】
前記ＣＤＰが、非ノッテッドＣＤＰである、請求項２４０〜２４１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２４９】
前記非ノッテッドＣＤＰが、システイン１と６、２と５、及び３と４の間にジスルフィド結合を含む、請求項２４８に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２５０】
前記ペプチドが、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖジスルフィド結合、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合、及びＣｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合のトポロジーを含み、ここで、前記Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合は、前記Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖジスルフィド結合及び前記Ｃｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合を含む巨大環を通過する、請求項２２２〜２４９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２５１】
前記Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘシステイン−システイン結合は、ノッティングシステインである、請求項２５０に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２５２】
前記ノッテッドペプチドが、ヒッチンであり、前記ヒッチンは、前記Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｙジスルフィド結合が、システイン１とシステイン４の間にあり、前記Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合が、システイン２とシステイン５の間にあり、前記Ｃｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合が、システイン３とシステイン６の間にあるトポロジーを含む、請求項２４９〜２５０のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２５３】
前記ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｌ配置であるか、又は、前記ノッテッドペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｄ配置である、請求項２２２〜２５２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２５４】
前記ペプチドが、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、又は少なくとも８１アミノ酸残基長である、請求項２２２〜２５３のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２５５】
任意の１若しくは複数個のＫ残基が、Ｒ残基で置換されているか、又は、任意の１若しくは複数個のＲ残基が、Ｋ残基で置換されている、請求項２２２〜２５４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２５６】
前記ペプチドが、少なくとも１個の別のペプチドを含む多量体構造に配列される、請求項２２２〜２５５のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２５７】
前記ペプチドが、配列番号１６７〜配列番号１７１のいずれか１つを含む、請求項２２２〜２５６のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２５８】
前記ペプチドが、配列番号１７２〜配列番号１７６のいずれか１つのいずれか１つを含む、請求項２２２〜２５６のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２５９】
前記ペプチドが、配列番号１〜配列番号８３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む、請求項２２２〜２５６のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２６０】
前記ペプチドが、配列番号１〜配列番号８３のいずれか１つを含む、請求項２２２〜２５６又は２５９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２６１】
前記ペプチドが、配列番号８４〜配列番号１６６のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む、請求項２２２〜２５６のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２６２】
前記ペプチドが、配列番号８４〜配列番号１６６のいずれか１つを含む、請求項２２２〜２５６又は２６１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２６３】
前記ペプチドが、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号５７、配列番号３１、配列番号７７、又は配列番号７８のいずれか１つを含む、請求項２２２〜２５６又は２５９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２６４】
前記ペプチドが、配列番号２７、配列番号３１、又は配列番号５７のいずれか１つを含む、請求項２２２〜２５６又は２５９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２６５】
前記ペプチドが、配列番号２９、配列番号４、配列番号７９、又は配列番号８０のいずれか１つを含む、請求項２２２〜２５６又は２５９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２６６】
前記ペプチドが、配列番号２６、配列番号８１、配列番号８２、又は配列番号８３のいずれか１つを含む、請求項２２２〜２５６又は２５９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２６７】
前記ペプチドが、配列番号２のいずれか１つを含む、請求項２２２〜２５６又は２５９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２６８】
前記ペプチドが、配列番号３１のいずれか１つを含む、請求項２２２〜２５６又は２５９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２６９】
前記ペプチドが、Ｃｍａｘに到達する０．５〜１２時間の平均Ｔｍａｘを示す、請求項２２２〜２６８のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２７０】
経口経路により前記被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、血清中０．１％〜１０％の前記ペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する、請求項２２２〜２６９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２７１】
経口経路により前記被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、血清中０．１％未満の前記ペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する、請求項２２２〜２７０のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２７２】
非経口経路により被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、血清中１０％〜１００％の前記ペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する、請求項２２２〜２７１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２７３】
前記被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、被験者において０．１時間〜１６８時間の平均ｔ１／２を達成する、請求項２２２〜２７２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２７４】
前記被験者に前記ペプチドを投与した後、前記ペプチドが、０．５〜１００Ｌ／時間のペプチドの平均クリアランス（ＣＬ）を達成する、請求項２２２〜２７３のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２７５】
前記被験者にペプチドを投与した後、前記ペプチドが、前記被験者において２００〜２０，０００ｍＬの平均分布容積（Ｖｄ）を達成する、請求項２２２〜２７４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２７６】
前記ペプチドが、酸化条件への３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項２２２〜２７５のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２７７】
前記ペプチドが、２未満のｐＨへの３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項２２２〜２７６のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２７８】
前記ペプチドが、胃腸管の通過後にインタクトなままである、請求項２２２〜２７７のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２７９】
前記ペプチドが、Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、又は２−メルカプトエタノールに対する曝露後にインタクトなままである、請求項２２２〜２７８のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２８０】
前記ペプチドが、キモトリプシン、血清プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システイニルプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、エラスターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、シトクロムＰ４５０酵素、カルボキシペプチダーゼ、又はカテプシンへの曝露後にインタクトなままである、請求項２２２〜２７９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２８１】
少なくとも６０％、６５％若しくは７５％相対湿度と共に、少なくとも２５℃、３０℃、若しくは４０℃の温度に対する少なくとも３、６、１２、１８、２４、３６、又は４８ヶ月間の曝露後に、前記ペプチドの９０〜１００％がインタクトなままである、請求項２２２〜２８０のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２８２】
前記ペプチドが、被験者への経口投与、吸入、鼻内投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、滑液嚢内投与、膣内投与、直腸投与、肺投与、眼への投与、口腔投与、舌下投与、髄腔内投与、又はこれらの任意の組合せの後に前記特徴を呈示する、請求項２２２〜２８１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２８３】
前記被験者が、ヒトである、請求項２２２〜２８２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２８４】
前記被験者が、ヒト以外の動物である、請求項２２２〜２８３のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２８５】
前記ペプチドの少なくとも１つの残基が、化学修飾を含む、請求項２２２〜２８４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２８６】
前記化学修飾が、前記ペプチドのＮ末端の遮断である、請求項２８５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２８７】
前記化学修飾が、メチル化、アセチル化、又はアシル化である、請求項２８５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２８８】
前記化学修飾が、１若しくは複数個のリシン残基又はその類似体のメチル化、前記Ｎ末端のメチル化、又は１若しくは複数個のリシン残基又はその類似体のメチル化及び前記Ｎ末端のメチル化を含む、請求項２８５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２８９】
前記ペプチドが、アシル付加物に連結される、請求項２２２〜２８８のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２９０】
前記薬剤は、活性薬剤である、請求項２２２〜２８９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２９１】
前記活性薬剤が、前記ペプチドのＮ末端又はＣ末端で前記ペプチドと融合される、請求項２９０に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２９２】
前記活性薬剤が、Ｆｃドメインである、請求項２９０〜２９１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２９３】
Ｆｃドメインと融合した前記ペプチドが、連続した配列を含む、請求項２９０〜２９２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２９４】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の活性薬剤が、前記ペプチドに連結される、請求項２９０〜２９３のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２９５】
前記ペプチドが、切断可能なリンカーを介して前記活性薬剤に連結される、請求項２９０〜２９４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２９６】
前記ペプチドが、前記ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のεアミンで、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、又はＣ末端で、リンカーにより前記活性薬剤に連結される、請求項２９０〜２９５のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２９７】
前記ペプチドが、非天然アミノ酸をさらに含み、前記非天然アミノ酸は、別のアミノ酸の挿入、付加、又は置換物である、請求項２２２〜２９６いずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２９８】
前記ペプチドが、前記非天然アミノ酸で、リンカーにより前記活性薬剤に連結される、請求項２９７に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項２９９】
前記リンカーが、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、又は炭素−窒素結合を含む、請求項２９６〜２９８のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３００】
前記切断可能なリンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、又はβ−グルクロニダーゼの切断部位を含む、請求項２９５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３０１】
前記ペプチドが、切断不可能なリンカーを介して前記活性薬剤に連結される、請求項２２２〜２９４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３０２】
前記活性薬剤が、以下：ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学物質、蛍光団、金属、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症薬、免疫モジュレータ、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法薬、細胞傷害性物質、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、バイオポリマー、多糖、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルココルチコイド、抗サイトカイン剤、鎮痛剤、デンドリマー、脂肪酸、Ｆｃ領域、シデロカリン、又はこれらの組合せである、請求項２２２〜３０１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３０３】
前記薬剤は、検出可能な物質である、請求項２２２〜３０２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３０４】
前記検出可能な物質が、前記ペプチドのＮ末端又はＣ末端で前記ペプチドと融合される、請求項３０３に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３０５】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の検出可能な物質が、前記ペプチドに連結される、請求項３０３〜３０４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３０６】
前記ペプチドが、切断可能なリンカーを介して前記検出可能な物質に連結される、請求項３０３〜３０５のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３０７】
前記ペプチドが、前記ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のεアミンで、内部アスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、又はＣ末端で、リンカーにより前記検出可能な物質に連結される、請求項３０３〜３０６のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３０８】
前記ペプチドが、前記非天然アミノ酸で、リンカーにより前記検出可能な物質に連結される、請求項２９７に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３０９】
前記リンカーが、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、又は炭素−窒素結合を含む、請求項３０７〜３０８のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３１０】
前記切断可能なリンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、又はβ−グルクロニダーゼの切断部位を含む、請求項３０６に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３１１】
前記ペプチドが、切断不可能なリンカーを介して前記検出可能な物質に連結される、請求項３０３〜３０５のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３１２】
前記検出可能な物質が、以下：蛍光団、近赤外色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、又は放射性核種キレート剤である、請求項３０３〜３１１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３１３】
前記検出可能な物質が、蛍光色素である、請求項３０３〜３１２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３１４】
前記ペプチドが、経口投与される、請求項２２２〜３１３のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３１５】
前記被験者が、ある状態を有する、請求項２２２〜３１４のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３１６】
前記状態が、胃腸感染又は慢性胃腸疾患である、請求項３１５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３１７】
前記胃腸感染が、細菌感染、原核生物感染、又は真菌感染である、請求項３１６に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３１８】
前記慢性胃腸疾患が、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、胃食道逆流症、潰瘍性大腸炎又は便秘である、請求項３１６に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３１９】
前記状態が、癌である、請求項３１５に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３２０】
前記癌が、大腸癌、胃癌、又は食道癌である、請求項３１９に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３２１】
前記ペプチドコンジュゲートが、前記状態を治療するために投与される、請求項３１５〜３２０のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３２２】
前記状態が、炎症、癌、退歩、発育異常、遺伝病、裂傷、感染症、外傷、リウマチ性疾患、免疫系障害、腎臓疾患、肺病、加齢による症状、変性脳疾患、変性身体疾患、小児疾患、肝臓疾患、肺疾患、膵臓症状、又は胃腸症状である、請求項３１５〜３２１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３２３】
前記腎臓疾患が、急性腎障害又は慢性腎臓疾患である、請求項３２２に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３２４】
前記ペプチドコンジュゲートが、胃腸症状を治療するために、経口投与により送達される、請求項３１５〜３２２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３２５】
前記ペプチドコンジュゲートが、非胃腸症状を治療するために、経口投与により送達される、請求項３１５〜３２２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３２６】
前記ペプチドコンジュゲートが、経口投与により送達されて、軟骨に向かう、請求項３１５〜３２２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３２７】
前記ペプチドコンジュゲートが、経口投与により送達されて、腎臓又は腎近位尿細管に向かう、請求項３１５〜３２２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３２８】
前記ペプチドコンジュゲートが、経口投与により送達されて、腫瘍に向かうか、又は腫瘍中に蓄積する、請求項３１５〜３２７のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３２９】
前記ペプチドコンジュゲートが、疾患領域、組織、構造、又は細胞を検出するために投与される、請求項２２２〜３２８のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３３０】
前記ペプチドコンジュゲートが、前記細胞に進入する、請求項２２２〜３２９のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３３１】
前記ペプチドコンジュゲートが、疾患領域、組織、構造、又は細胞を検出するために投与される、請求項２２２〜３３０のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３３２】
前記ペプチドコンジュゲートが、細胞内で活性である、請求項２２２〜３３１のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３３３】
投与した後、前記組成物の以下の特徴：
（ａ）血漿中のインタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｂ）胃中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｃ）胃腸管中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｄ）結腸中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｅ）糞便中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｆ）尿中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｇ）軟骨中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片；
（ｈ）血漿中の前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均Ｃｍａｘ；
（ｉ）前記Ｃｍａｘに到達する平均Ｔｍａｘ；
（ｊ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の曲線下平均面積（ＡＵＣ）；
（ｋ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均バイオアベイラビリティ；
（ｌ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均ｔ１／２；
（ｍ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均クリアランス（ＣＬ）；又は
（ｎ）前記被験者における前記インタクトなペプチド若しくはその断片の平均分布容積（Ｖｄ）
の１つを前記被験者において測定する、請求項２２２〜３３２のいずれか１項に記載のペプチドコンジュゲート。
【請求項３３４】
請求項１１１〜３３３のいずれか１項に記載の組成物又はその塩と、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３３５】
前記医薬組成物が、被験者への投与のために製剤化される、請求項３３４に記載の医薬組成物。
【請求項３３６】
前記医薬組成物が、吸入、鼻内投与、経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、滑液嚢内投与、又はこれらの任意の組合せのために製剤化される、請求項３３４〜３３５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３３７】
前記医薬組成物が、透過促進剤をさらに含む、請求項３３４〜３３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３３８】
前記透過促進剤が、経口吸収を増大する、請求項３３７に記載の医薬組成物。
【請求項３３９】
前記透過促進剤が、ＳＮＡＣ、５−ＣＮＡＣ、カプリル酸ナトリウム、芳香族アルコール、ＥＤＴＡ、アルキル硫酸ナトリウム、又はクエン酸塩である、請求項３３４〜３３８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３４０】
前記医薬組成物が、バッファーを用いて製剤化される、請求項３３４〜３３９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３４１】
前記医薬組成物が、経口送達用の腸溶コーティング内で送達される、請求項３３４〜３４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３４２】
請求項１１１〜３３３のいずれか１項に記載の組成物又は請求項３３４〜３４１のいずれか１項に記載の医薬組成物を被験者に投与する方法。
【請求項３４３】
前記組成物又は医薬組成物が、吸入、鼻内、経口、局所、静脈内、皮下、関節内、筋肉内投与、腹腔内、滑液嚢内、膣経路、直腸経路、肺経路、眼内経路、口腔、舌下、髄腔内、又はこれらの任意の組合せにより投与される、請求項３４２に記載の方法。
【請求項３４４】
請求項１〜１１０のいずれか１項に記載のペプチドを組換え発現により作製する方法。
【請求項３４５】
請求項１〜１１０のいずれか１項に記載のペプチドを化学合成により作製する方法。
【請求項３４６】
請求項１１１〜２２１のいずれか１項に記載のペプチドを組換え発現により作製する方法。
【請求項３４７】
請求項１１１〜２２１のいずれか１項に記載のペプチドを化学合成により作製する方法。
【請求項３４８】
請求項２２２〜３３３のいずれか１項に記載のペプチドを組換え発現により作製する方法。
【請求項３４９】
請求項２２２〜３３３のいずれか１項に記載のペプチドを化学合成により作製する方法。
【請求項３５０】
請求項１〜３３３のいずれか１項に記載のペプチド又は請求項３３４〜３４３のいずれか１項に記載の医薬組成物を製造する方法であって、前記ペプチドが、製造工程中に、より安定している方法。
【請求項３５１】
前記ペプチドが、前記製造工程中に、プロテアーゼによる分解を受けにくい、請求項３５０に記載の方法。
【請求項３５２】
前記製造が、組換え発現又は精製である、請求項３５０〜３５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５３】
前記製造によって、高純度のペプチドが得られる、請求項３５０〜３５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５４】
前記製造によって、より多くのペプチドが得られる、請求項３５０〜３５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５５】
前記製造によって、より長い貯蔵寿命のペプチドが得られる、請求項３５０〜３５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５６】
前記製造によって、高い貯蔵温度で安定したペプチドが得られる、請求項３５０〜３５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５７】
前記高い貯蔵温度が、２５℃、３０℃、又は４０℃である、請求項３５６に記載の方法。
【請求項３５８】
前記ペプチドが、５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５９】
前記ペプチドが、５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１１２〜２２２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３６０】
前記ペプチドが、５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項２２３〜３３３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３６１】
前記ペプチドが、５０Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６２】
前記ペプチドが、５０Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１１２〜２２２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３６３】
前記ペプチドが、５０Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項２２３〜３３３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３６４】
前記ペプチドが、５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６５】
前記ペプチドが、５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１１２〜２２２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３６６】
前記ペプチドが、５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項２２３〜３３３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３６７】
前記ペプチドが、５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６８】
前記ペプチドが、５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１１２〜２２２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３６９】
前記ペプチドが、５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項２２３〜３３３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３７０】
前記ペプチドが、５０Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７１】
前記ペプチドが、５０Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項１１２〜２２２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項３７２】
前記ペプチドが、５０Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである、請求項２２３〜３３３のいずれか１項に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１６年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３８５，９０８号明細書、２０１６年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４３２，４８７号明細書、２０１７年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／４４７，８６９号明細書、及び２０１７年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／５１０，７１０号明細書の利益を主張し、これらの出願の開示内容は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド及びタンパク質は、特異的及び非特異的機構によって、身体内で分解され得る。還元性の生体環境は、ジスルフィド架橋を切断することにより、タンパク質及びペプチドの変性を引き起こし得る。様々な臓器又は細胞コンパートメントにおいて優勢なプロテアーゼなどの酵素は、ペプチド結合を切断することにより、ペプチド及びタンパク質を消化することができる。様々な臓器及び細胞コンパートメントにおける低ｐＨ環境は、タンパク質及びペプチドの変性を促進することができる。その結果、ペプチド及びタンパク質治療薬は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与後に重大な安定性の問題に直面する。ペプチド及びタンパク質の安定性の低さは、薬物動態の低下と共に効力の低減を招き得る。さらに、ペプチド及びタンパク質の熱及び溶液安定性の低さは、変性及び／又は沈殿を引き起こし得るため、貯蔵寿命が短くなるか、又は冷却などの特別な貯蔵方法が必要となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
様々な態様では、本開示は、標的組織にペプチドを送達する方法を提供し、この方法は、ペプチドを被験者に投与するステップと；ペプチドを標的組織に送達するステップとを含み、ここで、ペプチドは、以下の特徴の少なくとも１つを有する：（ａ）１０ｍＭからの濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｂ）１０ｍＭの濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｃ）５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｄ）５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｅ）人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｆ）１．０５のｐＨ及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｇ）５００Ｕ／ｍｌのペプシン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴと人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の組合せ（ＳＰＴＤ）並びに少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｈ）少なくとも７０℃に対する少なくとも６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｉ）少なくとも１００℃に対する少なくとも６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；又は（ｊ）口腔、胃、小腸、若しくは大腸を通過後に、ペプチドの少なくとも１０％がインタクトなままである。
【０００４】
様々な態様では、本開示は、標的組織にペプチドを送達する方法を提供し、この方法は、ペプチドを被験者に投与するステップと；ペプチドを標的組織に送達するステップとを含み、ここで、ペプチドは、以下の特徴の少なくとも１つを有する：（ａ）５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｂ）５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｃ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｄ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｅ）人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｆ）１〜２、２〜３、３〜４、若しくは４〜５のｐＨ及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｇ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌのペプシン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴと人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の組合せ並びに少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｈ）��なくとも７０℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｉ）少なくとも１００℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；又は（ｊ）口腔、胃、小腸、若しくは大腸を通過後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである。
【０００５】
いくつかの態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の２つ以上を有する。別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の３つ以上を有する。また別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の４つ以上を有する。さらに別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の５つ以上を有する。さらにまた別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の６つ以上を有する。別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の７つ以上を有する。また別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の８つ以上を有する。さらに別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の全てを有する。
【０００６】
いくつかの態様では、ペプチドは、少なくとも７５℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、インタクトなままである。いくつかの態様では、ペプチドは、モチーフを含み、このモチーフは、Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。別の態様では、Ｘは、任意のアミノ酸であるか、又は存在しない。いくつかの態様では、ペプチドは、ノッテッドペプチドである。いくつかの態様では、ペプチドは、６個以上のシステイン残基を含む。
【０００７】
別の態様では、ペプチドは、システイン残基の間に形成される３つ以上のジスルフィド架橋を含み、ジスルフィド架橋の１つが、２つの他のジスルフィド架橋により形成されるループを通過する。いくつかの態様では、ペプチドは、複数のジスルフィド架橋を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、シスチン高密度ペプチド（ＣＤＰ）である。別の態様では、ＣＤＰは、独立した折り畳みドメインを含み、この独立した折り畳みドメインは、少なくとも６システインの高密度を含む。
【０００８】
いくつかの態様では、ＣＤＰは、細胞表面に輸出されるか、又は分泌される。いくつかの態様では、ＣＤＰは、システイン１と４、２と５、及び３と６の間にジスルフィド結合を含む。他の態様では、ＣＤＰは、システイン１と３、２と５、及び４と６の間にジスルフィド結合を含む。また別の態様では、ＣＤＰは、システイン１と４、２と６、及び３と５の間にジスルフィド結合を含む。
【０００９】
他の態様では、ＣＤＰは、システイン１と５、２と４、及び３と６の間にジスルフィド結合を含む。また別の態様では、ＣＤＰは、システイン１と６、２と４、及び３と５の間にジスルフィド結合を含む。
【００１０】
他の態様では、ＣＤＰは、非ノッテッドＣＤＰである。いくつかの態様では、非ノッテッドＣＤＰは、システイン１と６、２と５、及び３と４の間にジスルフィド結合を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖジスルフィド結合、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合、及びＣｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合のトポロジーを含み、ここで、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合は、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖジスルフィド結合及びＣｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合を含む巨大環を通過する。いくつかの態様では、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘシステイン−システイン結合は、ノッティングシステインである。
【００１１】
いくつかの態様では、ペプチドは、ヒッチン（ｈｉｔｃｈｉｎ）であり、このヒッチンは、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｙジスルフィド結合が、システイン１とシステイン４の間にあり、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合が、システイン２とシステイン５の間にあり、Ｃｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合が、システイン３とシステイン６の間にあるトポロジーを含む。
【００１２】
いくつかの態様では、ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基は、Ｌ配置であるか、又は、ノッテッドペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｄ配置である。いくつかの態様では、ペプチドは、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、又は少なくとも８１アミノ酸残基長である。
【００１３】
いくつかの態様では、任意の１若しくは複数個のＫ残基が、Ｒ残基で置換されているか、又は、任意の１若しくは複数個のＲ残基が、Ｋ残基で置換されている。別の態様では、ペプチドは、少なくとも１個の他のペプチドを含む多量体構造に配列される。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号１６７〜配列番号１７１のいずれか１つを含む。他の態様では、ペプチドは、配列番号１７２〜配列番号１７６のいずれか１つのいずれか１つを含む。
【００１４】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号８３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む。別の態様では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号８３のいずれか１つを含む。
【００１５】
他の態様では、ペプチドは、配列番号８４〜配列番号１６６のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む。別の態様では、ペプチドは、配列番号８４〜配列番号１６６のいずれか１つを含む。
【００１６】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号３１、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号５７、配列番号７７、又は配列番号７８のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号２７、配列番号３１、又は配列番号５７のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号２９、配列番号４、配列番号７９、又は配列番号８０のいずれか１つを含む。他の態様では、ペプチドは、配列番号２６、配列番号８１、配列番号８２、又は配列番号８３のいずれか１つを含む。
【００１７】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号２のいずれか１つを含む。他の態様では、ペプチドは、配列番号３１のいずれか１つを含む。
【００１８】
いくつかの態様では、ペプチドは、Ｃｍａｘに到達する０．５〜１２時間の平均Ｔｍａｘを示す。いくつかの態様では、ペプチドは、経口経路により被験者にペプチドを投与した後、血清中０．１％〜１０％のペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する。他の態様では、ペプチドは、経口経路により被験者にペプチドを投与した後、血清中０．１％未満のペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する。
【００１９】
他の態様では、ペプチドは、非経口経路により被験者にペプチドを投与した後、血清中１０％〜１００％のペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する。いくつかの態様では、ペプチドは、被験者にペプチドを投与した後、被験者において０．１時間〜１６８時間の平均ｔ１／２を達成する。いくつかの態様では、ペプチドは、被験者にペプチドを投与した後、０．５〜１００Ｌ／時間のペプチドの平均クリアランス（ＣＬ）を達成する。いくつかの態様では、ペプチドは、被験者にペプチドを投与した後、被験者において２００〜２０，０００ｍＬの平均分布容積（Ｖｄ）を達成する。
【００２０】
いくつかの態様では、ペプチドは、酸化条件への３０分間の曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、ペプチドは、２未満のｐＨへの３０分間の曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、ペプチドは、胃腸管の通過後にインタクトなままである。いくつかの態様では、ペプチドは、Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、又は２−メルカプトエタノールに対する曝露後にインタクトなままである。
【００２１】
いくつかの態様では、ペプチドは、キモトリプシン、血清プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システイニルプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、エラスターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、シトクロムＰ４５０酵素、カルボキシペプチダーゼ、又はカテプシンへの曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、少なくとも６０％、６５％若しくは７５％相対湿度と共に、少なくとも２５℃、３０℃、若しくは４０℃の温度に対する少なくとも３、６、１２、１８、２４、３６、又は４８ヶ月間の曝露後に、ペプチドの９０〜１００％がインタクトなままである。
【００２２】
いくつかの態様では、ペプチドは、被験者への経口投与、吸入、鼻内投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、滑液嚢内投与、膣内投与、直腸投与、肺投与、眼への投与、口腔投与、舌下投与、髄腔内投与、又はこれらの任意の組合せの後に上記の特徴を呈示する。
【００２３】
別の態様では、被験者はヒトである。また別の態様では、被験者は、ヒト以外の動物である。いくつかの態様では、ペプチドの少なくとも１つの残基は、化学修飾を含む。別の態様では、化学修飾は、ペプチドのＮ末端の遮断である。また別の態様では、化学修飾は、メチル化、アセチル化、又はアシル化である。
【００２４】
いくつかの態様では、化学修飾は、１若しくは複数個のリシン残基又はその類似体のメチル化、Ｎ末端のメチル化、又は１若しくは複数個のリシン残基又はその類似体のメチル化及びＮ末端のメチル化を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、アシル付加物に連結される。
【００２５】
いくつかの態様では、ペプチドは、活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、活性薬剤は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端でペプチドと融合される。別の態様では、活性薬剤は、Ｆｃドメインである。また別の態様では、Ｆｃドメインと融合したペプチドは、連続した配列を含む。
【００２６】
別の態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の活性薬剤が、ペプチドに連結される。いくつかの態様では、ペプチドは、切断可能なリンカーを介して活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、ペプチドは、ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のεアミンで、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、又はＣ末端で、リンカーにより活性薬剤に連結される。
【００２７】
いくつかの態様では、ペプチドは、非天然アミノ酸をさらに含み、この非天然アミノ酸は、別のアミノ酸の挿入、付加、又は置換物である。いくつかの態様では、ペプチドは、非天然アミノ酸で、リンカーにより活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、又は炭素−窒素結合を含む。いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、又はβ−グルクロニダーゼの切断部位を含む。
【００２８】
他の態様では、ペプチドは、切断不可能なリンカーを介して活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、活性薬剤は、以下：ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学物質、蛍光団、金属、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症薬、免疫モジュレータ、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法薬、細胞傷害性物質、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、バイオポリマー、多糖、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルココルチコイド、抗サイトカイン剤、鎮痛剤、デンドリマー、脂肪酸、Ｆｃ領域、シデロカリン、又はこれらの組合せである。
【００２９】
いくつかの態様では、ペプチドは、検出可能な物質に連結される。いくつかの態様では、検出可能な物質は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端でペプチドと融合される。別の態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の検出可能な物質が、ペプチドに連結される。
【００３０】
いくつかの態様では、ペプチドは、切断可能なリンカーを介して検出可能な物質に連結される。いくつかの態様では、ペプチドは、ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のεアミンで、内部アスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、又はＣ末端で、リンカーにより検出可能な物質に連結される。いくつかの態様では、ペプチドは、非天然アミノ酸で、リンカーにより検出可能な物質に連結される。いくつかの態様では、リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、又は炭素−窒素結合を含む。
【００３１】
別の態様では、切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、又はβ−グルクロニダーゼの切断部位を含む。
【００３２】
いくつかの態様では、ペプチドは、切断不可能なリンカーを介して検出可能な物質に連結される。いくつかの態様では、検出可能な物質は、以下：蛍光団、近赤外色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、又は放射性核種キレート剤である。いくつかの態様では、検出可能な物質は、蛍光色素である。
【００３３】
いくつかの態様では、ペプチドは、経口投与される。いくつかの態様では、被験者は、ある状態を有する。
【００３４】
別の態様では、この状態は、胃腸感染又は慢性胃腸疾患である。いくつかの態様では、胃腸感染は、細菌感染、原核生物感染、又は真菌感染である。いくつかの態様では、慢性胃腸疾患は、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、胃食道逆流症、潰瘍性大腸炎又は便秘である。
【００３５】
他の態様では、状態は、癌である。いくつかの態様では、癌は、大腸癌、胃癌、又は食道癌である。
【００３６】
いくつかの態様では、ペプチドは、状態を治療するために投与される。別の態様では、状態は、炎症、癌、退歩、発育異常、遺伝病、裂傷、感染症、外傷、リウマチ性疾患、免疫系障害、腎臓疾患、肺病、加齢による症状、変性脳疾患、変性身体疾患、小児疾患、肝臓疾患、肺疾患、膵臓症状、又は胃腸症状である。いくつかの態様では、腎臓疾患は、急性腎障害又は慢性腎臓疾患である。いくつかの態様では、ペプチドは、胃腸症状を治療するために経口投与により送達される。
【００３７】
他の態様では、ペプチドは、非胃腸症状を治療するために経口投与により送達される。いくつかの態様では、ペプチドは、経口投与により送達されて、軟骨に向かう。他の態様では、ペプチドは、経口投与により送達されて、腎臓又は腎近位尿細管に向かう。いくつかの態様では、ペプチドは、経口投与により送達されて、腫瘍に向かうか、又は腫瘍中に蓄積する。いくつかの態様では、ペプチドは、疾患領域、組織、構造、又は細胞を検出するために投与される。
【００３８】
いくつかの態様では、ペプチドは、細胞に進入する。いくつかの態様では、ペプチドは、細胞内で活性である。いくつかの態様では、投与後、組成物の以下の特徴の１つを被験者において測定する：（ａ）血漿中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｂ）胃中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｃ）胃腸管中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｄ）結腸中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｅ）糞便中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｆ）尿中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｇ）軟骨中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｈ）血漿中のインタクトなペプチド若しくはその断片の平均Ｃｍａｘ；（ｉ）Ｃｍａｘに到達する平均Ｔｍａｘ；（ｊ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の曲線下平均面積（ＡＵＣ）；（ｋ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の平均バイオアベイラビリティ；（ｌ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の平均ｔ１／２；（ｍ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の平均クリアランス（ＣＬ）；又は（ｎ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の平均分布容積（Ｖｄ）。
【００３９】
様々な態様において、本開示は、以下の特徴の少なくとも１つを有するペプチドを提供する：（ａ）１０ｍＭからの濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｂ）１０ｍＭからの濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｃ）５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｄ）５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％が、インタクトなままである；（ｅ）人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｆ）１．０５のｐＨ及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｇ）５００Ｕ／ｍｌのペプシン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴと人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の組合せ（ＳＰＴＤ）並びに少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｈ）少なくとも７０℃に対する少なくとも６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｉ）少なくとも１００℃に対する少なくとも６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；又は（ｊ）口腔、胃、小腸、若しくは大腸を通過後に、ペプチドの少なくとも１０％が、インタクトなままである。
【００４０】
様々な態様では、本開示は、以下の特徴の少なくとも１つを有するペプチドを提供する：（ａ）５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｂ）５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｃ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｄ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｅ）人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｆ）１〜２、２〜３、３〜４、若しくは４〜５のｐＨ及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｇ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌのペプシン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴと人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の組合せ（ＳＰＴＤ）並びに少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｈ）少なくとも７０℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７��％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｉ）少なくとも１００℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；又は（ｊ）口腔、胃、小腸、若しくは大腸を通過後に、ペプチドの少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである。
【００４１】
いくつかの態様では、ペプチドは、非天然ペプチドである。いくつかの態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の２つ以上を有する。別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の３つ以上を有する。また別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の４つ以上を有する。さらに別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の５つ以上を有する。さらにまた別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の６つ以上を有する。別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の７つ以上を有する。また別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の８つ以上を有する。さらに別の態様では、ペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の全てを有する。
【００４２】
いくつかの態様では、ペプチドは、少なくとも７５℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、インタクトなままである。いくつかの態様では、ペプチドは、モチーフを含み、このモチーフは、Ｃｙｓ−Ｘ［０〜１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０〜１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０〜１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０〜１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０〜１５］−Ｃｙｓを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。別の態様では、Ｘは、任意のアミノ酸であるか、又は存在しない。いくつかの態様では、ペプチドは、ノッテッドペプチドである。いくつかの態様では、ペプチドは、６個以上のシステイン残基を含む。
【００４３】
別の態様では、ペプチドは、システイン残基の間に形成される３つ以上のジスルフィド架橋を含み、ジスルフィド架橋の１つが、２つの他のジスルフィド架橋により形成されるループを通過する。いくつかの態様では、ペプチドは、複数のジスルフィド架橋を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、シスチン高密度ペプチド（ＣＤＰ）である。いくつかの態様では、ＣＤＰは、独立した折り畳みドメインを含み、この独立した折り畳みドメインは、少なくとも６システインという高密度を含む。
【００４４】
いくつかの態様では、ＣＤＰは、細胞表面に輸出されるか、又は分泌される。いくつかの態様では、ＣＤＰは、システイン１と４、２と５、及び３と６の間にジスルフィド結合を含む。他の態様では、ＣＤＰは、システイン１と３、２と５、及び４と６の間にジスルフィド結合を含む。また別の態様では、ＣＤＰは、システイン１と４、２と６、及び３と５の間にジスルフィド結合を含む。
【００４５】
他の態様では、ＣＤＰは、システイン１と５、２と４、及び３と６の間にジスルフィド結合を含む。また別の態様では、ＣＤＰは、システイン１と６、２と４、及び３と５の間にジスルフィド結合を含む。
【００４６】
他の態様では、ＣＤＰは、非ノッテッドＣＤＰである。いくつかの態様では、非ノッテッドＣＤＰは、システイン１と６、２と５、及び３と４の間にジスルフィド結合を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖジスルフィド結合、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合、及びＣｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合のトポロジーを含み、ここで、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合は、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖジスルフィド結合及びＣｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合を含む巨大環を通過する。いくつかの態様では、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘシステイン−システイン結合は、ノッティングシステインである。
【００４７】
いくつかの態様では、ペプチドは、ヒッチンであり、このヒッチンは、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｙジスルフィド結合が、システイン１とシステイン４の間にあり、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合が、システイン２とシステイン５の間にあり、Ｃｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合が、システイン３とシステイン６の間にあるトポロジーを含む。
【００４８】
いくつかの態様では、ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基は、Ｌ配置であるか、又は、ノッテッドペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｄ配置である。いくつかの態様では、ペプチドは、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、又は少なくとも８１アミノ酸残基長である。
【００４９】
いくつかの態様では、任意の１若しくは複数個のＫ残基が、Ｒ残基で置換されているか、又は、任意の１若しくは複数個のＲ残基が、Ｋ残基で置換されている。いくつかの態様では、ペプチドは、少なくとも１個の他のペプチドを含む多量体構造に配列される。
【００５０】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号１６７〜配列番号１７１のいずれか１つを含む。他の態様では、ペプチドは、配列番号１７２〜配列番号１７６のいずれか１つのいずれか１つを含む。
【００５１】
また別の態様では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号８３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む。別の態様では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号８３のいずれか１つを含む。
【００５２】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号８４〜配列番号１６６のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む。別の態様では、ペプチドは、配列番号８４〜配列番号１６６のいずれか１つを含む。
【００５３】
他の態様では、ペプチドは、配列番号３１、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号５７、配列番号７７、又は配列番号７８のいずれか１つを含む。他の態様では、ペプチドは、配列番号２７、配列番号３１、又は配列番号５７のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号２９、配列番号４、配列番号７９、又は配列番号８０のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号２６、配列番号８１、配列番号８２、又は配列番号８３のいずれか１つを含む。
【００５４】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号２のいずれか１つを含む。他の態様では、ペプチドは、配列番号３１のいずれか１つを含む。
【００５５】
いくつかの態様では、ペプチドは、Ｃｍａｘに到達する０．５〜１２時間の平均Ｔｍａｘを示す。いくつかの態様では、ペプチドは、経口経路により被験者にペプチドを投与した後、血清中０．１％〜１０％のペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する。他の態様では、ペプチドは、経口経路により被験者にペプチドを投与した後、血清中０．１％未満のペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する。また別の態様では、ペプチドは、非経口経路により被験者にペプチドを投与した後、血清中１０％〜１００％のペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する。
【００５６】
いくつかの態様では、ペプチドは、被験者にペプチドを投与した後、被験者において０．１時間〜１６８時間の平均ｔ１／２を達成する。いくつかの態様では、ペプチドは、被験者にペプチドを投与した後、０．５〜１００Ｌ／時間のペプチドの平均クリアランス（ＣＬ）を達成する。いくつかの態様では、ペプチドは、被験者にペプチドを投与した後、被験者において２００〜２０，０００ｍＬの平均分布容積（Ｖｄ）を達成する。
【００５７】
いくつかの態様では、ペプチドは、酸化条件への３０分間の曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、ペプチドは、２未満のｐＨに対する３０分間の曝露後にインタクトなままである。別の態様では、ペプチドは、胃腸管を通過後にインタクトなままである。
【００５８】
いくつかの態様では、ペプチドは、Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、又は２−メルカプトエタノールに対する曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、ペプチドは、キモトリプシン、血清プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システイニルプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、エラスターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、シトクロムＰ４５０酵素、カルボキシペプチダーゼ、又はカテプシンに対する曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、少なくとも６０％、６５％若しくは７５％相対湿度と共に、少なくとも２５℃、３０℃、若しくは４０℃の温度に対する少なくとも３、６、１２、１８、２４、３６、又は４８ヶ月間の曝露後に、ペプチドの９０〜１００％がインタクトなままである。
【００５９】
いくつかの態様では、ペプチドは、被験者への経口投与、吸入、鼻内投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、滑液嚢内投与、膣内投与、直腸投与、肺投与、眼への投与、口腔投与、舌下投与、髄腔内投与、又はこれらの任意の組合せの後に上記の特徴を呈示する。
【００６０】
別の態様では、被験者はヒトである。また別の態様では、被験者は、ヒト以外の動物である。
【００６１】
いくつかの態様では、ペプチドの少なくとも１つの残基は、化学修飾を含む。別の態様では、化学修飾は、ペプチドのＮ末端の遮断である。さらに別の態様では、化学修飾は、メチル化、アセチル化、又はアシル化である。いくつかの態様では、化学修飾は、１若しくは複数個のリシン残基又はその類似体のメチル化、Ｎ末端のメチル化、又は１若しくは複数個のリシン残基又はその類似体のメチル化及びＮ末端のメチル化を含む。
【００６２】
いくつかの態様では、ペプチドは、アシル付加物に連結される。いくつかの態様では、ペプチドは、活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、活性薬剤は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端でペプチドと融合される。いくつかの態様では、活性薬剤は、Ｆｃドメインである。別の態様では、Ｆｃドメインと融合されたペプチドは、連続した配列を含む。
【００６３】
別の態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の活性薬剤が、ペプチドに連結される。いくつかの態様では、ペプチドは、切断可能なリンカーを介して活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、ペプチドは、ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のεアミンで、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、又はＣ末端で、リンカーにより活性薬剤に連結される。
【００６４】
いくつかの態様では、ペプチドは、非天然アミノ酸をさらに含み、この非天然アミノ酸は、別のアミノ酸の挿入、付加、又は置換物である。いくつかの態様では、ペプチドは、非天然アミノ酸で、リンカーにより活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、又は炭素−窒素結合を含む。いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、又はβ−グルクロニダーゼの切断部位を含む。
【００６５】
他の態様では、ペプチドは、切断不可能なリンカーを介して活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、活性薬剤は、以下：ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学物質、蛍光団、金属、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症薬、免疫モジュレータ、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法薬、細胞毒性剤、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、バイオポリマー、多糖、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルココルチコイド、抗サイトカイン剤、鎮痛剤、デンドリマー、脂肪酸、Ｆｃ領域、シデロカリン、又はこれらの組合せである。
【００６６】
いくつかの態様では、ペプチドは、検出可能な物質に連結される。いくつかの態様では、検出可能な物質は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端でペプチドと融合される。いくつかの態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の検出可能な物質が、ペプチドに連結される。
【００６７】
他の態様では、ペプチドは、切断可能なリンカーを介して検出可能な物質に連結される。いくつかの態様では、ペプチドは、ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のεアミンで、内部アスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、又はＣ末端で、リンカーにより検出可能な物質に連結される。いくつかの態様では、ペプチドは、非天然アミノ酸で、リンカーにより検出可能な物質に連結される。いくつかの態様では、リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、又は炭素−窒素結合を含む。いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、又はβ−グルクロニダーゼの切断部位を含む。
【００６８】
他の態様では、ペプチドは、切断不可能なリンカーを介して検出可能な物質に連結される。いくつかの態様では、検出可能な物質は、以下：蛍光団、近赤外色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、又は放射性核種キレート剤である。いくつかの態様では、検出可能な物質は、蛍光色素である。
【００６９】
いくつかの態様では、ペプチドは、経口投与される。いくつかの態様では、被験者は、ある状態を有する。いくつかの態様では、この状態は、胃腸感染又は慢性胃腸疾患である。他の態様では、胃腸感染は、細菌感染、原核生物感染、又は真菌感染である。いくつかの態様では、慢性胃腸疾患は、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、胃食道逆流症、潰瘍性大腸炎又は便秘である。
【００７０】
他の態様では、状態は、癌である。別の態様では、癌は、大腸癌、胃癌、又は食道癌である。いくつかの態様では、ペプチドは、状態を治療するために投与される。いくつかの態様では、上記の状態は、炎症、癌、退歩、発育異常、遺伝病、裂傷、感染症、外傷、リウマチ性疾患、免疫系障害、腎臓疾患、肺病、加齢による症状、変性脳疾患、変性身体疾患、小児疾患、肝臓疾患、肺疾患、膵臓疾患、又は胃腸症状である。
【００７１】
いくつかの態様では、腎臓疾患は、急性腎障害又は慢性腎臓病である。いくつかの態様では、ペプチドは、胃腸症状を治療するために経口投与により送達される。他の態様では、ペプチドは、非胃腸症状を治療するために経口投与により送達される。また別の態様では、ペプチドは、経口投与により送達されて、軟骨に向かう。いくつかの態様では、ペプチドは、経口投与により送達されて、腎臓又は腎近位尿細管に向かう。いくつかの態様では、ペプチドは、経口投与により送達されて、腫瘍に向かうか、又は腫瘍中に蓄積する。
【００７２】
いくつかの態様では、ペプチドは、疾患領域、組織、構造、又は細胞を検出するために投与される。いくつかの態様では、ペプチドは、細胞に進入する。いくつかの態様では、ペプチドは、細胞内で活性である。いくつかの態様では、ペプチドが投与された後、組成物の以下の特徴の１つを被験者において測定する：（ａ）血漿中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｂ）胃中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｃ）胃腸管中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｄ）結腸中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｅ）糞便中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｆ）尿中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｇ）軟骨中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｈ）血漿中のインタクトなペプチド若しくはその断片の平均Ｃｍａｘ；（ｉ）Ｃｍａｘに到達する平均Ｔｍａｘ；（ｊ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の曲線下平均面積（ＡＵＣ）；（ｋ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の平均バイオアベイラビリティ；（ｌ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の平均ｔ１／２；（ｍ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の平均クリアランス（ＣＬ）；又は（ｎ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の平均分布容積（Ｖｄ）。
【００７３】
様々な態様において、本開示は、薬剤に連結したペプチドを含むペプチドコンジュゲートを提供し、ここで、ペプチドは、以下の特徴の少なくとも１つを有する：（ａ）１０ｍＭからの濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｂ）１０ｍＭからの濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｃ）５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％が、インタクトなままである；（ｄ）５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｅ）人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｆ）１．０５のｐＨ及び少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｇ）５００Ｕ／ｍｌのペプシン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴと人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の組合せ（ＳＰＴＤ）並びに少なくとも２３℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｈ）少なくとも７０℃に対する少なくとも６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；（ｉ）少なくとも１００℃に対する少なくとも６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％がインタクトなままである；又は（ｊ）口腔、胃、小腸、若しくは大腸を通過後に、ペプチドの少なくとも１０％がインタクトなままである。
【００７４】
様々な態様では、本開示は、薬剤に連結したペプチドを含むペプチドコンジュゲートを提供し、ここで、ペプチドは、以下の特徴の少なくとも１つを有する：（ａ）５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｂ）５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）に対する及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｃ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｄ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｅ）人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｆ）１〜２、２〜３、３〜４、若しくは４〜５のｐＨ及び少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｇ）０．５Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌのペプシン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴと人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の組合せ（ＳＰＴＤ）並びに少なくとも２３℃、３７℃、若しくは３９℃の温度に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｈ）少なくとも７０℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３��、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；（ｉ）少なくとも１００℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、ペプチドの少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである；又は（ｊ）口腔、胃、小腸、若しくは大腸を通過後に、ペプチドの少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、若しくは９９％がインタクトなままである。
【００７５】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、非天然ペプチドである。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の２つ以上を有する。別の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の３つ以上を有する。また別の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の４つ以上を有する。さらに別の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の５つ以上を有する。さらにまた別の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の６つ以上を有する。また別の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の７つ以上を有する。また別の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の８つ以上を有する。さらに別の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、特徴（ａ）〜（ｊ）の全てを有する。
【００７６】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、少なくとも７５℃に対する少なくとも５、１０、１５、２０、３０、若しくは６０分間の曝露後に、インタクトなままである。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、モチーフを含み、このモチーフは、Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。別の態様では、Ｘは、任意のアミノ酸であるか、又は存在しない。いくつかの態様では、ペペプチドコンジュゲートのプチドは、ノッテッドペプチドである。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、６つ以上のシステイン残基を含む。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、システイン残基の間に形成される３つ以上のジスルフィド架橋を含み、ジスルフィド架橋の１つが、２つの他のジスルフィド架橋により形成されるループを通過する。
【００７７】
別の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、複数のジスルフィド架橋を含む。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、シスチン高密度ペプチド（ＣＤＰ）である。いくつかの態様では、ＣＤＰは、独立した折り畳みドメインを含み、この独立した折り畳みドメインは、少なくとも６システインという高密度を含む。いくつかの態様では、ＣＤＰは、細胞表面に輸出されるか、又は分泌される。
【００７８】
いくつかの態様では、ＣＤＰは、システイン１と４、２と５、及び３と６の間にジスルフィド結合を含む。他の態様では、ＣＤＰは、システイン１と３、２と５、及び４と６の間にジスルフィド結合を含む。また別の態様では、ＣＤＰは、システイン１と４、２と６、及び３と５の間にジスルフィド結合を含む。いくつかの態様では、ＣＤＰは、システイン１と５、２と４、及び３と６の間にジスルフィド結合を含む。また別の態様では、ＣＤＰは、システイン１と６、２と４、及び３と５の間にジスルフィド結合を含む。
【００７９】
他の態様では、ＣＤＰは、非ノッテッドＣＤＰである。いくつかの態様では、非ノッテッドＣＤＰは、システイン１と６、２と５、及び３と４の間にジスルフィド結合を含む。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖジスルフィド結合、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合、及びＣｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合のトポロジーを含み、ここで、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合は、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖジスルフィド結合及びＣｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合を含む巨大環を通過する。いくつかの態様では、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘシステイン−システイン結合は、ノッティングシステインである。
【００８０】
いくつかの態様では、ノッテッドペプチドは、ヒッチンであり、このヒッチンは、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｙジスルフィド結合が、システイン１とシステイン４の間にあり、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘジスルフィド結合が、システイン２とシステイン５の間にあり、Ｃｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合が、システイン３とシステイン６の間にあるトポロジーを含む。
【００８１】
いくつかの態様では、ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基は、Ｌ配置であるか、又は、ノッテッドペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｄ配置である。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、又は少なくとも８１アミノ酸残基長である。いくつかの態様では、任意の１若しくは複数個のＫ残基が、Ｒ残基で置換されているか、又は、任意の１若しくは複数個のＲ残基が、Ｋ残基で置換されている。
【００８２】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、少なくとも１個の他のペプチドを含む多量体構造に配列される。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、配列番号１６７〜配列番号１７１のいずれか１つを含む。他の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、配列番号１７２〜配列番号１７６のいずれか１つのいずれか１つを含む。
【００８３】
他の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、配列番号１〜配列番号８３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む。別の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、配列番号１〜配列番号８３のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、配列番号８４〜配列番号１６６のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を含む。別の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、配列番号８４〜配列番号１６６のいずれか１つを含む。
【００８４】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号５７、配列番号３１、配列番号７７、又は配列番号７８のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、配列番号２７、配列番号３１、又は配列番号５７のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、配列番号２９、配列番号４、配列番号７９、又は配列番号８０のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、配列番号２６、配列番号８１、配列番号８２、又は配列番号８３のいずれか１つを含む。
【００８５】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、配列番号２のいずれか１つを含む。他の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、配列番号３１のいずれか１つを含む。
【００８６】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、Ｃｍａｘに到達する０．５〜１２時間の平均Ｔｍａｘを示す。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、経口経路により被験者にペプチドを投与した後、血清中０．１％〜１０％のペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する。他の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、経口経路により被験者にペプチドを投与した後、血清中０．１％未満のペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する。また別の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、非経口経路により被験者にペプチドを投与した後、血清中１０％〜１００％のペプチドの平均バイオアベイラビリティを達成する。
【００８７】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、被験者にペプチドを投与した後、被験者において０．１時間〜１６８時間の平均ｔ１／２を達成する。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、被験者にペプチドを投与した後、０．５〜１００Ｌ／時間のペプチドの平均クリアランス（ＣＬ）を達成する。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、被験者にペプチドを投与した後、被験者において２００〜２０，０００ｍＬの平均分布容積（Ｖｄ）を達成する。
【００８８】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、酸化条件への３０分間の曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、２未満のｐＨに対する３０分間の曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、胃腸管を通過後にインタクトなままである。
【００８９】
別の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、又は２−メルカプトエタノールに対する曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、キモトリプシン、血清プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システイニルプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、エラスターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、シトクロムＰ４５０酵素、カルボキシペプチダーゼ、又はカテプシンに対する曝露後にインタクトなままである。
【００９０】
いくつかの態様では、少なくとも６０％、６５％若しくは７５％の相対湿度と共に、少なくとも２５℃、３０℃、若しくは４０℃の温度に対する少なくとも３、６、１２、１８、２４、３６、又は４８ヶ月間の曝露後に、ペプチドコンジュゲートのペプチドの９０〜１００％がインタクトなままである。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、被験者への経口投与、吸入、鼻内投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、滑液嚢内投与、膣内投与、直腸投与、肺投与、眼への投与、口腔投与、舌下投与、髄腔内投与、又はこれらの任意の組合せの後に上記の特徴を呈示する。
【００９１】
別の態様では、被験者はヒトである。また別の態様では、被験者は、ヒト以外の動物である。
【００９２】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドの少なくとも１個の残基は、化学修飾を含む。別の態様では、化学修飾は、ペプチドのＮ末端の遮断である。さらに別の態様では、化学修飾は、メチル化、アセチル化、又はアシル化である。いくつかの態様では、化学修飾は、１若しくは複数個のリシン残基又はその類似体のメチル化、Ｎ末端のメチル化、又は１若しくは複数個のリシン残基又はその類似体のメチル化及びＮ末端のメチル化を含む。
【００９３】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、アシル付加物に連結される。いくつかの態様では、薬剤は、活性薬剤である。いくつかの態様では、活性薬剤は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端で、ペプチドコンジュゲートのペプチドと融合される。
【００９４】
別の態様では、活性薬剤は、Ｆｃドメインである。また別の態様では、Ｆｃドメインと融合したペプチドコンジュゲートのペプチドは、連続した配列を含む。いくつかの態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の活性薬剤が、ペプチドコンジュゲートのペプチドに連結される。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、切断可能なリンカーを介して活性薬剤に連結される。
【００９５】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のεアミンで、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、又はＣ末端で、リンカーにより活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、非天然アミノ酸をさらに含み、これらの非天然アミノ酸は、別のアミノ酸の挿入、付加、又は置換物である。
【００９６】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートは、非天然アミノ酸で、リンカーにより活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、又は炭素−窒素結合を含む。別の態様では、切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、又はβ−グルクロニダーゼの切断部位を含む。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、切断不可能なリンカーを介して活性薬剤に連結される。
【００９７】
いくつかの態様では、活性薬剤は、以下：ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学物質、蛍光団、金属、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症薬、免疫モジュレータ、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法薬、細胞毒性剤、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、バイオポリマー、多糖、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルココルチコイド、抗サイトカイン剤、鎮痛剤、デンドリマー、脂肪酸、Ｆｃ領域、シデロカリン、又はこれらの組合せである。
【００９８】
いくつかの態様では、薬剤は、検出可能な物質である。別の態様では、検出可能な物質は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端で、ペプチドコンジュゲートのペプチドと融合される。いくつかの態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の検出可能な物質が、ペプチドコンジュゲートのペプチドに連結される。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、切断可能なリンカーを介して検出可能な物質に連結される。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、ペプチドのＮ末端で、内部リシン残基のεアミンで、内部アスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のカルボン酸で、又はＣ末端で、リンカーにより検出可能な物質に連結される。
【００９９】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、非天然アミノ酸で、リンカーにより活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、又は炭素−窒素結合を含む。いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、又はβ−グルクロニダーゼの切断部位を含む。
【０１００】
他の態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、切断不可能なリンカーを介して検出可能な物質に連結される。いくつかの態様では、検出可能な物質は、以下：蛍光団、近赤外色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、放射性同位体、又は放射性核種キレート剤である。いくつかの態様では、検出可能な物質は、蛍光色素である。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートのペプチドは、経口投与される。いくつかの態様では、被験者は、ある状態を有する。
【０１０１】
別の態様では、上記の状態は、胃腸感染又は慢性胃腸疾患である。いくつかの態様では、胃腸感染は、細菌感染、原核生物感染、又は真菌感染である。いくつかの態様では、慢性胃腸疾患は、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、胃食道逆流症、潰瘍性大腸炎又は便秘である。
【０１０２】
他の態様では、上記の状態は、癌である。いくつかの態様では、癌は、大腸癌、胃癌、又は食道癌である。いくつかの態様では、上記の状態を治療するために、ペプチドコンジュゲートが投与される。
【０１０３】
いくつかの態様では、上記の状態は、炎症、癌、退歩、発育異常、遺伝病、裂傷、感染症、外傷、リウマチ性疾患、免疫系障害、腎臓疾患、肺病、加齢による症状、変性脳疾患、変性身体疾患、小児疾患、肝臓疾患、肺疾患、膵臓疾患、又は胃腸症状である。いくつかの態様では、腎臓疾患は、急性腎障害又は慢性腎臓疾患である。
【０１０４】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートは、胃腸症状を治療するために経口投与により送達される。他の態様では、ペプチドコンジュゲートは、非胃腸症状を治療するために経口投与により送達される。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートは、経口投与により送達されて、軟骨に向かう。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートは、経口投与により送達されて、腎臓又は腎近位尿細管に向かう。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートは、経口投与により送達されて、腫瘍に向かうか、又は腫瘍中に蓄積する。
【０１０５】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートは、疾患領域、組織、構造、又は細胞を検出するために投与される。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートは、細胞に進入する。いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートは、疾患領域、組織、構造、又は細胞を検出するために投与される。
【０１０６】
いくつかの態様では、ペプチドコンジュゲートは、細胞内で活性である。いくつかの態様では、投与後、組成物の以下の特徴の１つを被験者において測定する：（ａ）血漿中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｂ）胃中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｃ）胃腸管中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｄ）結腸中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｅ）糞便中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｆ）尿中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｇ）軟骨中のインタクトなペプチド若しくはその断片；（ｈ）血漿中のインタクトなペプチド若しくはその断片の平均Ｃｍａｘ；（ｉ）Ｃｍａｘに到達する平均Ｔｍａｘ；（ｊ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の曲線下平均面積（ＡＵＣ）；（ｋ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の平均バイオアベイラビリティ；（ｌ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の平均ｔ１／２；（ｍ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の平均クリアランス（ＣＬ）；又は（ｎ）被験者におけるインタクトなペプチド若しくはその断片の平均分布容積（Ｖｄ）。
【０１０７】
様々な態様において、本開示は、前述の組成物のいずれかの組成物又はその塩と、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、医薬組成物は、被験者への投与のために製剤化される。いくつかの態様では、医薬組成物は、吸入、鼻内投与、経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、滑液嚢内投与、又はこれらの任意の組合せのために製剤化される。
【０１０８】
いくつかの態様では、医薬組成物は、透過促進剤をさらに含む。いくつかの態様では、透過促進剤は、経口吸収を増大する。いくつかの態様では、透過促進剤は、ＳＮＡＣ、５−ＣＮＡＣ、カプリル酸ナトリウム、芳香族アルコール、ＥＤＴＡ、アルキル硫酸ナトリウム、又はクエン酸塩である。いくつかの態様では、医薬組成物は、バッファーを用いて製剤化される。別の態様では、医薬組成物は、経口送達用の腸溶コーティング内で送達される。
【０１０９】
様々な態様において、本開示は、前述の組成物のいずれか１つ又は前述の医薬組成物のいずれか１つを被験者に投与する方法を提供する。いずれかの態様では、組成物又は医薬組成物は、吸入、鼻内、経口、局所、静脈内、皮下、関節内、筋肉内投与、腹腔内、滑液嚢内、膣経路、直腸経路、肺経路、眼内経路、口腔、舌下、髄腔内、又はこれらの組合せにより投与される。
【０１１０】
様々な態様において、本開示は、前述のペプチド又はペプチドコンジュゲートのいずれか１つのペプチドを組換え発現により作製する方法を提供する。
【０１１１】
様々な態様において、本開示は、前述のペプチド又はペプチドコンジュゲートのいずれか１つのペプチドを化学合成により作製する方法を提供する。
【０１１２】
様々な態様において、本開示は、前述のペプチドのいずれか１つ又は前述の医薬組成物のいずれか１つを製造する方法を提供し、ここで、ペプチドは、製造工程中に、より安定している。いくつかの態様では、ペプチドは、製造工程中に、プロテアーゼによる分解を受けにくい。いくつかの態様では、製造は、組換え発現又は精製である。いくつかの態様では、製造によって、高純度のペプチドが得られる。別の態様では、製造によって、より多くのペプチドが得られる。いくつかの態様では、製造によって、より長い貯蔵寿命のペプチドが得られる。いくつかの態様では、製造によって、高い貯蔵温度で安定したペプチドが得られる。別の態様では、高い貯蔵温度は、２５℃、３０℃、又は４０℃である。
【０１１３】
いくつかの態様では、前述のペプチド又はペプチドコンジュゲートのいずれか１つは、５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、前述のペプチド又はペプチドコンジュゲートのいずれか１つは、５０Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、前述のペプチド又はペプチドコンジュゲートのいずれか１つは、５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、前述のペプチド又はペプチドコンジュゲートのいずれか１つは、５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである。いくつかの態様では、前述のペプチド又はペプチドコンジュゲートのいずれか１つは、５０Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３７℃の温度に対する少なくとも３０分間の曝露後にインタクトなままである。
【０１１４】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳しく記載する。本発明の特徴及び利点については、本発明の原理が使用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、並びに添付の図面を参照にして、さらによく理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】人工胃液、ペプシン、Ｔｒｉｓ、及びＤＴＴ（ＳＰＴＤ）、ｐＨ１．０５の人工胃液（ＳＧＦ）と５００Ｕ／ｍｌのペプシン（Ｐ）、ＳＧＦ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、並びに非還元（ＮＲ）条件を含む様々な溶液中に懸濁させた１２．５μｇの配列番号２のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。１．５分及び２．２５分に認められるピークは、ＤＴＴであった（ペプチドではない）。
【図２】人工胃液、ペプシン、Ｔｒｉｓ、及びＤＴＴ（ＳＰＴＤ）、ｐＨ１．０５の人工胃液（ＳＧＦ）と５００Ｕ／ｍｌのペプシン（Ｐ）、ＳＧＦ、ＤＴＴ、並びに非還元（ＮＲ）条件を含む様々な溶液中に懸濁させた１２．５μｇの配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３】人工胃液、ペプシン、Ｔｒｉｓ、及びＤＴＴ（ＳＰＴＤ）、ｐＨ１．０５の人工胃液（ＳＧＦ）と５００Ｕ／ｍｌのペプシン（Ｐ）、ＳＧＦ、ＤＴＴ、並びに非還元（ＮＲ）条件を含む様々な溶液中に懸濁させた１２．５μｇの配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４】２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ中５００Ｕ／ｍｌのトリプシン（Ｔ）、５μｇのダイズトリプシン阻害剤（Ｉ）及び１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）のＨＰＬＣクロマトグラム、並びに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ、Ｉ）、ＤＴＴ、並びに非還元（ＮＲ）条件を含む様々な溶液中に懸濁させた１２．５μｇの配列番号１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図５】２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ中５００Ｕ／ｍｌのトリプシン、５μｇのダイズトリプシン阻害剤及び１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）のＨＰＬＣクロマトグラム、並びに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ、Ｉ）、ＤＴＴ、並びに非還元（ＮＲ）条件を含む様々な溶液中に懸濁させた１２．５μｇの配列番号２のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図６】マウスへのペプチド投与後の血漿中の配列番号２７の放射性標識ペプチド（配列番号２７−ｒ）の濃度を示す。（図６Ａ）２０ｎｍｏｌの配列番号２７の放射性標識ペプチド（配列番号２７−ｒ）の静脈内（ＩＶ）投与、及び１００ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの経口（ＰＯ）投与後に、液体シンチレーション計数を用いて１４Ｃシグナルを測定することにより定量された、ペプチドの血漿中濃度を示す。１４Ｃの送達線量は、静脈内投与の場合は４．８μＣｉであり、経口投与の場合は２４μＣｉであった。調べた時点は、０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間を含み、各時点で３匹のマウスを調べた。（図６Ｂ）２０ｎｍｏｌの配列番号２７の放射性標識ペプチド（配列番号２７−ｒ）の静脈内（ＩＶ）投与、及び１００ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの経口（ＰＯ）投与後に、液体シンチレーション計数を用いて１４Ｃシグナルを測定することにより定量された、血漿中で回収された投与されたペプチド用量のパーセントを示す。１４Ｃの送達線量は、静脈内投与の場合は４．８μＣｉであり、経口投与の場合は２４μＣｉであった。調べた時点は、０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間を含み、各時点で３匹のマウスを調べた。（図６Ｃ）１００ｎｍｏｌの配列番号２７の放射性標識ペプチド（配列番号２７−ｒ）の強制経口投与後に、タンデムＨＰＬＣ及び液体シンチレーション計数により測定された血漿中のペプチド及びペプチド断片ピークの強度を示す。１４Ｃの送達線量は、経口投与の場合、２４μＣｉであった。調べた時点は、０．５、１、及び３時間を含んだ。
【図７】マウスへのペプチド投与後の尿中の配列番号２７の放射性標識ペプチド（配列番号２７−ｒ）の濃度を示す。（図７Ａ）２０ｎｍｏｌの配列番号２７の放射性標識ペプチド（配列番号２７−ｒ）の静脈内（ＩＶ）投与、及び１００ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの経口（ＰＯ）投与後に、液体シンチレーション計数を用いて１４Ｃシグナルを測定することにより定量された、尿中のペプチド濃度を示す。１４Ｃの送達線量は、静脈内投与の場合は４．８μＣｉであり、経口投与の場合は２４μＣｉであった。調べた時点は、０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間を含み、各時点で３匹のマウスを調べた。（図７Ｂ）１００ｎｍｏｌの配列番号２７の放射性標識ペプチド（配列番号２７−ｒ）の強制経口投与後に、タンデムＨＰＬＣ及び液体シンチレーション計数により測定された尿中のペプチド及びペプチド断片ピークの強度を示す。１４Ｃの送達線量は、経口投与の場合、２４μＣｉであった。調べた時点は、０．５、１、３、８、２４、及び４８時間を含んだ。
【図８】マウスへのペプチド投与後の糞中の配列番号２７の放射性標識ペプチド（配列番号２７−ｒ）の濃度を示す。（図８Ａ）２０ｎｍｏｌの配列番号２７（配列番号２７−ｒ）の放射性標識ペプチドの静脈内（ＩＶ）投与、及び１００ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの経口（ＰＯ）投与後に、液体シンチレーション計数を用いて１４Ｃシグナルを測定することにより定量された、糞中のペプチド濃度を示す。１４Ｃの送達線量は、静脈内投与の場合は４．８μＣｉであり、経口投与の場合は２４μＣｉであった。調べた時点は、０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間を含み、各時点で３匹のマウスを調べた。（図８Ｂ）１００ｎｍｏｌの配列番号２７の放射性標識ペプチド（配列番号２７−ｒ）の強制経口投与後に、タンデムＨＰＬＣ及び液体シンチレーション計数により測定された糞中のペプチド及びペプチド断片ピークの強度を示す。１４Ｃの送達線量は、経口投与の場合、２４μＣｉであった。調べた時点は、３及び８時間を含んだ。
【図９】還元剤及び／又はプロテイナーゼへの曝露後の２つのペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（図９Ａ）ＰＢＳ中の配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図９Ｂ）ＤＴＴのＰＢＳ溶液中の配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図９Ｃ）５０Ｕトリプシン及び１ｍｇ／ｍｌ阻害剤のＰＢＳ溶液中の配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図９Ｄ）５０Ｕトリプシン、１ｍｇ／ｍｌ阻害剤、及びＤＴＴのＰＢＳ溶液中の配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図９Ｅ）ＰＢＳ中の配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図９Ｆ）ＤＴＴのＰＢＳ溶液中の配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図９Ｇ）５０Ｕトリプシン及び１ｍｇ／ｍｌ阻害剤のＰＢＳ溶液中の配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図９Ｈ）５０Ｕトリプシン、１ｍｇ／ｍｌ阻害剤、及びＤＴＴのＰＢＳ溶液中の配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図１０】還元剤、プロテイナーゼ、及び／又は人工胃液条件への曝露後の２つのペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（図１０Ａ）ＰＢＳ中でインキュベートした配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１０Ｂ）ＤＴＴのＰＢＳ溶液中でインキュベートした配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１０Ｃ）人工胃液（ＳＧＦ）中でインキュベートした配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１０Ｄ）５００ＵペプシンのＳＧＦ溶液中でインキュベートした配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１０Ｅ）５００Ｕペプシン、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、及びＤＴＴのＳＧＦ溶液中でインキュベートした配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１０Ｆ）ＰＢＳ中でインキュベートした配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１０Ｇ）ＤＴＴのＰＢＳ溶液中でインキュベートした配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１０Ｈ）人工胃液（ＳＧＦ）中でインキュベートした配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１０Ｉ）５００ＵペプシンのＳＧＦ溶液中でインキュベートした配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１０Ｊ）５００Ｕペプシン、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、及びＤＴＴのＳＧＦ溶液中でインキュベートした配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図１１】酸化、還元、及び酸性条件を含む様々な条件への曝露後、並びにプロテイナーゼへの曝露後の配列番号３１のペプチド及び配列番号１７７の陰性対照ペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（図１１Ａ）還元及び酸性条件下での配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１１Ｂ）５００Ｕペプシン（５０００Ｕ／ｍｌ）中の１０ｍＭ  ＤＴＴ、５００Ｕペプシン（５０００Ｕ／ｍｌ）、５０Ｕ（５００Ｕ／ｍｌ）トリプシン中の１０ｍＭ  ＤＴＴ、及び５０Ｕ（５００Ｕ／ｍｌ）トリプシンを含む、還元剤とプロテアーゼの様々な組合せの下での配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１１Ｃ）５００Ｕペプシン、５０Ｕトリプシン、ｐＨ１．０５の人工胃液（ＳＧＦ）中の非還元（ＮＲ）条件、及びＮＲ（酸化条件）を含む、様々なプロテアーゼ条件下での配列番号１７７の陰性対照ペプチドのペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図１２】室温、７０℃、又は１００℃で１時間のインキュベーション後の、非還元（ＮＲ）条件での配列番号３、配列番号２３及び配列番号２５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（図１２Ａ）室温、７０℃、又は１００℃で１時間のインキュベーション後の、ＮＲ条件での配列番号３のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１２Ｂ）室温、７０℃、又は１００℃で１時間のインキュベーション後の、ＮＲ条件での配列番号２３のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。（図１２Ｃ）室温、７０℃、又は１００℃で１時間のインキュベーション後の、ＮＲ条件での配列番号２５のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図１３】非還元（ＮＲ）条件及び還元（Ｒ）条件での配列番号４３、４４、及び４５のペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣトレースを示す。（図１３Ａ）非還元（ＮＲ）条件又は還元（Ｒ）条件での配列番号４３の可溶性ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。（図１３Ｂ）非還元条件又は還元条件での配列番号４３のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（図１３Ｃ）非還元（ＮＲ）条件又は還元（Ｒ）条件での配列番号４４の可溶性ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。（図１３Ｄ）非還元条件又は還元条件での配列番号４４のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（図１３Ｅ）非還元（ＮＲ）条件又は還元（Ｒ）条件での配列番号４５の可溶性ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。（図１３Ｆ）非還元（ＮＲ）条件又は還元（Ｒ）条件での配列番号４５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１４】還元剤の存在下での配列番号３９及び配列番号４３のペプチドの安定性を示す。（図１４Ａ）非還元（ＮＲ）条件又は１０ｍＭ  ＤＴＴ還元（Ｒ）条件での配列番号４３のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。例示的な質量分析ピークプロファイルを差し込み図に示す。（図１４Ｂ）１０ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）中でのインキュベーションを伴う、又は伴わない配列番号３９及び配列番号４３のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１５】還元剤への曝露後の配列番号３９及び配列番号４３のペプチドの安定性を示す。各ペプチドを細胞表面に発現させ、ＳＤＧＦ−配列番号４３又は配列番号３９を発現する細胞を還元剤に曝露した後、標的タンパク質との結合について各ペプチドを試験した。ＳＤＧＦは、表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬベクターである。（図１５Ａ）ＳＤＧＦ−配列番号３９（ＧＦＰ）でトランスフェクトし、ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、又は１０ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）中で５分間インキュベートした後、２０ｎＭビオチン化標的タンパク質による染色、続いて洗浄後、２０ｎＭ  ＡＦ６４７−ストレプトアビジンとのインキュベーションに付したＨＥＫ２９３懸濁細胞の結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。（図１５Ｂ）ＳＤＧＦ−配列番号４４（ＧＦＰ）でトランスフェクトし、ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、又は１０ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）中で５分間インキュベートした後、２０ｎＭビオチン化標的タンパク質による染色、続いて洗浄後、２０ｎＭ  ＡＦ６４７−ストレプトアビジンとのインキュベーションに付したＨＥＫ２９３懸濁細胞の結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。（図１５Ｃ）図１５Ａ及び図１５Ｂに示す「スライス」ゲート内に含まれる細胞のＡＦ６４７平均蛍光強度（ＭＦＩ）の定量を示す。
【図１６】配列番号４３のペプチドのプロテアーゼ耐性を示す。（図１６Ａ）５００Ｕトリプシン（Ｔ）とのインキュベーション後、トリプシン阻害剤（Ｉ）でクエンチングしてから、非還元（ＮＲ）条件又は１０ｍＭ  ＤＴＴを用いた還元（Ｒ）条件下に置いた配列番号４３のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＳＤＰＲは、表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターの変異体であるが、ストーク内の全ての塩基性及び芳香族残基は、トリプシン／キモトリプシン切断を阻止するために除去され、６ｘＨｉｓタグがペプチドのＣ末端に付加されている。（図１６Ｂ）プロテアーゼ感受性ＳＤＰＲ−ＳＫペプチドでトランスフェクトした後、０又は４０μｇ／ｍｌのトリプシンで２０分間処理し、ＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色したＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを示す。（図１６Ｃ）ＳＤＰＲ−配列番号４３ペプチドでトランスフェクトした後、０又は４０μｇ／ｍｌのトリプシンで２０分間処理し、ＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色したＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを示す。（図１６Ｄ）ＳＤＰＲ−ＳＫペプチドでトランスフェクトした後、０又は４０μｇ／ｍｌのキモトリプシンで２０分間処理し、ＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色したＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを示す。（図１６Ｅ）プロテアーゼ感受性ＳＤＰＲ−配列番号４３ペプチドでトランスフェクトした後、０又は４０μｇ／ｍｌのトリプシンで２０分間処理し、ＡＦ６４７抗６ｘＨＩＳ抗体で染色したＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを示す。（図１６Ｆ）いずれも様々な濃度のトリプシンと一緒にインキュベートした、ＳＤＰＲ−ＳＫペプチドでトランスフェクトした細胞と、ＳＤＰＲ−配列番号４３のペプチドでトランスフェクトした細胞を比較するフローサイトメトリーデータの定量を示す。（図１６Ｇ）いずれも様々な濃度のキモトリプシンにより処理した、ＳＤＰＲ−ＳＫペプチドでトランスフェクトした細胞と、ＳＤＰＲ−配列番号４３ペプチドでトランスフェクトした細胞を比較するフローサイトメトリーデータの定量を示す。
【図１７】配列番号４３及び配列番号４３の変異体が、極度の高温で安定していることを示す。（図１７Ａ）配列番号４３の円偏光二色性スペクトルを示し、これは、構造が、αヘリックス要素で独占されていること、この二次構造シグネチャーが、９５℃でのインキュベーション前及び後で同一であることを明らかにする。差し込み図：２０℃〜９５℃までの加熱中、２２０ｎｍでの相対楕円率。（図１７Ｂ）配列番号４４の円偏光二色性スペクトルを示し、これは、構造が、αヘリックス要素で独占されていること、この二次構造シグネチャーが、９５℃でのインキュベーション前及び後で類似していることを明らかにする。差し込み図：２０℃〜９５℃までの加熱中、２２０ｎｍでの相対楕円率。（図１７Ｃ）配列番号４５の円偏光二色性スペクトルを示し、これは、構造が、αヘリックス要素で独占されていること、この二次構造シグネチャーが、９５℃でのインキュベーション前及び後で同一であることを明らかにする。差し込み図：２０℃〜９５℃での加熱中、２２０ｎｍでの相対楕円率。（図１７Ｄ）ペプチドのＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ融解アッセイを示す。２０℃〜９５℃での加熱中、相対蛍光単位（ｄＲＦＵ／ｄｔｅｍｐ）の変化の勾配が示される。ヒトシデロカリン（ＨｕＳｃｎ）は、そのＲＦＵ対温度勾配のピークによって解釈されるように、７９℃の予測融点を示した。逆に、試験した３つのペプチド（配列番号４３、配列番号４４、及び配列番号４５）については、融点を決定することができなかった。
【図１８】非還元（ＮＲ）条件（実線トレース）又は１０ｍＭ  ＤＴＴ還元（Ｒ）条件（破線で示すトレース）下でのペプチドの高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）トレースを示す。
【図１９】７５℃で１時間（実線トレース）又は１００℃で１時間（破線で示すトレース）のインキュベーション後の本開示の様々なペプチドの高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）トレースを示す。
【図２０】ペプシン消化後のペプチドの高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）トレースを示す。実線トレースは、アルカリ性ｐＨでクエンチングされ、非還元条件下で実施されたペプチドとペプシンの反応を示す。破線トレースは、アルカリ性ｐＨでクエンチングされ、還元条件下で実施したペプチドとペプシンの反応を示す。
【図２１】トリプシン消化後のペプチドの高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）トレースを示す。実線トレースは、過剰量のトリプシン阻害剤を用いて中性ｐＨでクエンチングされ、非還元条件下で実施されたペプチドとトリプシンの反応を示す。破線トレースは、過剰量のトリプシン阻害剤を用いて中性ｐＨでクエンチングされ、還元条件下で実施されたペプチドとトリプシンの反応を示す。
【図２２】開示の様々なペプチドの円偏光二色性結果を示す。
【図２３】ｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水、又はｐＨ４のリン酸緩衝食塩水中でのインキュベーション後の配列番号２７のペプチドの円偏光二色性分析を示す。
【図２４】ｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水、又はｐＨ４のリン酸緩衝食塩水中でのインキュベーション後の配列番号３７のペプチドの円偏光二色性分析を示す。
【図２５】構造に基づくシスチン高密度ペプチド（ＣＤＰ）分類スキームを示す。（図２５Ａ）３シスチンコアにおいて１〜６の順に番号付けられたシスチン高密度ペプチド（ＣＤＰ）中のシステインを示し、これによって、１５の理論上考えられるシスチン共有結合（ジスルフィド結合）が得られる。６つのシステインを２つ１組で連結する１５の理論上考えられるジスルフィド結合を示すが、これは、最初のジスルフィド結合の場合、５つの考えられる組合せにより構成される（Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２（１−２）、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ３（１−３）、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ４（１−４）、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ５（１−５）、及びＣｙｓ１−Ｃｙｓ６（１−６）；Ｎ末端からＣ末端の順で番号付け）。残るジスルフィド結合において続く組合せを下の列に示す。２０１７年４月現在、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋは、７７１のＣＤＰを含むが、これは、４２２のノッテッドＣＤＰ、３シスチンを有する１９９の非ノッテッドＣＤＰ、４以上のシステインを有する１５０の非ノッテッドＣＤＰを含む。どの３シスチンが、フォーカス、コアサブセットを構成するかを明確にするためのノッティング要素がないため、４以上のシスチンを有する１５０の非ノッテッドＣＤＰのジスルフィド結合として、６２１のノッテッドＣＤＰと、非ノッテッド３シスチンＣＤＰのクラス分布のパーセンテージを括弧内に示す。Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ４、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ５、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ６（１−４、２−５、３−６）ジスルフィド結合パターンは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに寄託された、実験により決定されたＣＤＰ構造中に最も一般的に認められた（そのうちの３０９のペプチドは、２９５がノッテッド、１４が非ノッテッドであった）。反対に、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ６、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ３、Ｃｙｓ４−Ｃｙｓ５（１−６、２−３、４−５）パターンは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋにおいて、実験により決定されたＣＤＰ構造に存在しなかった。（図２５Ｂ）全体的なシステイン高密度ペプチド（ＣＤＰ）スキームを示し、これは、システイン密度（ＣＤＰに対する成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ））、擬似ノッティング（ＣＤＰのノッテッドＣＤＰサブセット）、並びにシスチン共有結合（ジスルフィド結合）クラス及びノッティングトポロジーに基づくタイプ分類の関係を表す。一般的なジスルフィド結合パターンを四角の中にまとめるが、これは、既知ノッテッドＣＤＰ構造のうち、１５の考えられるジスルフィド結合パターンの５つしか認められなかったことを明示している。ジスルフィド結合／トポロジーの例示的概略図（丸で囲んだ数字は、システインを示し；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋで認められる数は、括弧内に示す）を、カノニカルシャンキン、ヒッチン、及びノッティン、並びに最も単純な非ノッテッドＣＤＰタイプ、（Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ６、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ５、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ４（１−６、２−５、３−４）；右上）について描く。２０１７年４月現在、ＰＤＢで認められるタイプのみを示す。（図２５Ｃ）各ジスルフィド結合分類タイプにおける７７１のＣＤＰ構造の分布を示す。ノッテッドタイプは、白いバーで、非ノッテッドクラスは、斜線の入ったバーで示す。
【図２６−１】表面ディスプレイペプチド折り畳みアッセイを用いて同定される安定したペプチドの同定を示す。（図２６Ａ）安定したペプチドを同定するためにスクリーニングした全ライブラリーの分類学的多様性を示す。この円グラフでは、３００超のライブラリーメンバーを有するクラスにのみ特に名称を記載した。（図２６Ｂ）ドットプロットであり、このプロットは、ｘ軸が、非処理のペプチドを含む表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターを形質導入した細胞の表面にディスプレイされたタンパク質含量を示し、ｙ軸が、トリプシンで処理したペプチドを含む表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターを形質導入した細胞の表面にディスプレイされるタンパク質含量を、非処理表面タンパク質含量のパーセンテージとして示す。ドットプロットは、表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターに初めクローン化された約１０，０００ペプチドのうち、読取り存在量閾値を超えた計約４，３００ペプチドを表す。サンプルを二分する対角線は、「高タンパク質含量及び／又はトリプシン耐性」ペプチドと「低タンパク質含量及び／又はトリプシン感受性」ペプチドとの間のカットオフを画定する。分泌タンパク質としてさらに発現されたペプチドは、ＨＰＬＣにより、１〜２ピーク（丸）、３＋ピーク（四角）、０ピーク（菱形）、又はＨＰＬＣデータなし（十字）により分類した。折り畳み良好のペプチドは、右上象限に出現し、折り畳み不良のペプチドは、左下象限に出現する。（図２６Ｃ）ＨＰＬＣにより分類される（０ピーク；３＋ピーク：又は１〜２ピーク）試験分泌タンパク質（図２６Ｂから）の分解を示す棒グラフである。ペプチドは、ペプチドカテゴリー：全ペプチド；高タンパク質含量／トリプシン耐性（高含量／トリプシン耐性）を有するペプチド；及び低タンパク質含量／トリプシン感受性（低含量／トリプシン感受性）を有するペプチドにより分類した。表面折り畳みとＨＰＬＣ分類（３＋及び０ピークを合わせて１群にする）との関係は、非常に有意であった。（図２６Ｄ）ネイティブ（薄い線）又は還元（濃い線）条件下の本開示の様々なペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。各「プロット」のペプチド配列を図２６Ｅに示す。（図２６Ｅ）ＨＰＬＣにより試験した各ペプチドの表を示し、このＨＰＬＣクロマトグラムは、図２６Ｄに示す。この表は、プロット番号、観察されたＨＰＬＣピークの数、タンパク質含量、トリプシン耐性、配列番号、及び配列を示す。
【図２６−２】表面ディスプレイペプチド折り畳みアッセイを用いて同定される安定したペプチドの同定を示す。（図２６Ａ）安定したペプチドを同定するためにスクリーニングした全ライブラリーの分類学的多様性を示す。この円グラフでは、３００超のライブラリーメンバーを有するクラスにのみ特に名称を記載した。（図２６Ｂ）ドットプロットであり、このプロットは、ｘ軸が、非処理のペプチドを含む表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターを形質導入した細胞の表面にディスプレイされたタンパク質含量を示し、ｙ軸が、トリプシンで処理したペプチドを含む表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターを形質導入した細胞の表面にディスプレイされるタンパク質含量を、非処理表面タンパク質含量のパーセンテージとして示す。ドットプロットは、表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターに初めクローン化された約１０，０００ペプチドのうち、読取り存在量閾値を超えた計約４，３００ペプチドを表す。サンプルを二分する対角線は、「高タンパク質含量及び／又はトリプシン耐性」ペプチドと「低タンパク質含量及び／又はトリプシン感受性」ペプチドとの間のカットオフを画定する。分泌タンパク質としてさらに発現されたペプチドは、ＨＰＬＣにより、１〜２ピーク（丸）、３＋ピーク（四角）、０ピーク（菱形）、又はＨＰＬＣデータなし（十字）により分類した。折り畳み良好のペプチドは、右上象限に出現し、折り畳み不良のペプチドは、左下象限に出現する。（図２６Ｃ）ＨＰＬＣにより分類される（０ピーク；３＋ピーク：又は１〜２ピーク）試験分泌タンパク質（図２６Ｂから）の分解を示す棒グラフである。ペプチドは、ペプチドカテゴリー：全ペプチド；高タンパク質含量／トリプシン耐性（高含量／トリプシン耐性）を有するペプチド；及び低タンパク質含量／トリプシン感受性（低含量／トリプシン感受性）を有するペプチドにより分類した。表面折り畳みとＨＰＬＣ分類（３＋及び０ピークを合わせて１群にする）との関係は、非常に有意であった。（図２６Ｄ）ネイティブ（薄い線）又は還元（濃い線）条件下の本開示の様々なペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。各「プロット」のペプチド配列を図２６Ｅに示す。（図２６Ｅ）ＨＰＬＣにより試験した各ペプチドの表を示し、このＨＰＬＣクロマトグラムは、図２６Ｄに示す。この表は、プロット番号、観察されたＨＰＬＣピークの数、タンパク質含量、トリプシン耐性、配列番号、及び配列を示す。
【図２７】還元、ペプシン、及び７５℃及び１００℃などの高温に対して高度に耐性であった６つのヒッチンペプチド、並びにこれらの条件に対して高度に耐性ではなかった９つのヒッチンペプチドの配列アラインメント及び分析を示す。（図２７Ａ）還元、ペプシン、及び高温に対して高度に耐性ではなかったペプチドをコードする配列番号３、配列番号８、配列番号３０、配列番号５、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１８、及び配列番号５６の配列アラインメントを示す。（図２７Ｂ）還元、ペプシン、及び７５℃及び１００℃などの高温に対して高度に耐性であったペプチドをコードする、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、及び配列番号５７の配列アラインメントを示す。（図２７Ｃ）図２７Ｂからの配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、及び配列番号５７の配列分析を示す。（図２７Ｄ）図２７Ｂからの配列番号２７、配列番号５７、及び配列番号２４の配列アラインメントを示す。還元、ペプシン、及び７５℃及び１００℃などの高温に対して高度に耐性であったペプチドのこのサブセットを「サブタイプＡ」と呼ぶ。保存構造プロリンアミノ酸残基を丸で囲む。（図２７Ｅ）図２７Ｄからの丸で囲んだ保存構造プロリンアミノ酸残基を含む、サブタイプＡ  配列番号２７、配列番号５７、及び配列番号２４の配列分析を示す。（図２７Ｆ）図２７Ｂからの配列番号６、配列番号１０、及び配列番号１２の配列アラインメントを示す。還元、ペプシン、及び７５℃及び１００℃などの高温に対して高度に耐性であったペプチドのこのサブセットは、「サブタイプＢ」と呼ぶ。保存構造プロリンアミノ酸残基を丸で囲む。（図２７Ｇ）図２７Ｆからの丸で囲んだ保存構造プロリンアミノ酸残基を含む、サブタイプＢ  配列番号６、配列番号１０、及び配列番号１２の配列分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１６】
本開示は、安定性が向上した還元及びプロテアーゼ耐性ペプチドを同定するための組成物及び方法に関する。本開示は、さらに、被験者に対する還元及びプロテアーゼ耐性ペプチドの組成物並びにその使用方法にも関し、これは、経口投与、非経口投与、及び肺、鼻領域、口腔領域、関節、皮膚、膣組織、直腸組織、眼組織、及び胃腸（ＧＩ）管の領域などの身体の様々なコンパートメントへのペプチドの送達を含む。本開示は、また、エンドソーム、リソソーム、及び細胞質ゾルなどの様々な細胞コンパートメントへのペプチドの送達にも関する。
【０１１７】
ペプチド及びタンパク質薬剤の安定性は、薬物動態において重要な役割を果たすことができ、最終的に治療薬の使用及び効力に影響を及ぼし得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与後、ペプチドは、ペプチドを消化しようとする多種のプロテアーゼ、ジスルフィド結合を還元して、三次構造を破壊しようとする還元剤、並びに折り畳まれたペプチド及びタンパク質の変性を促進する低ｐＨ環境をはじめとする、苛酷な生物学的条件に直面し得る。プロテアーゼ、還元剤、及び低ｐＨ環境による分解に対して安定したペプチド治療薬は、優れた生体分布、高いバイオアベイラビリティ、長い生体半減期、身体及び細胞の特定のコンパートメント内の活性、及び最適な全体的薬物動態のために、増加又は多様化した用途及び優れた効果を有し得る。本開示のペプチドは、プロテアーゼによる分解に対する耐性、並びに還元剤及び低ｐＨ環境の存在下での安定性という特徴を示すことができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、経口投与後に、安定性の改善を示すいくつかの特徴を有することを証明することができる。ペプチドはまた、治療、診断、イメージング、及び他の適用のための活性薬剤に連結させることも可能である。
【０１１８】
本開示の別の態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態が図示及び説明される以下の詳細な説明から当業者には明らかであろう。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、全て、本開示から逸脱することなく、そのいくつか細部を様々な点で改変することが可能である。従って、図面及び説明は、本来例示的なものとして考えるべきであり、限定的ではない。
【０１１９】
本明細書で使用されるように、天然のＬ−鏡像体アミノ酸の略語は、慣例的であり、次の通りである：アラニン（Ａ、Ａｌａ）；アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）；システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）；グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）；グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）；リシン（Ｋ、Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）；セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）；チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；バリン（Ｖ、Ｖａｌ）。典型的に、Ｘａａは、任意のアミノ酸を示し得る。一部の実施形態では、Ｘは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、又はアルギニン（Ｒ）であってよい。
【０１２０】
本開示の一部の実施形態は、任意の標準若しくは非標準アミノ酸又はその類似体のＤ−アミノ酸残基を考慮する。アミノ酸配列を一連の３文字又は１文字アミノ酸略語として表示する場合、標準的な使用及び慣例に従って、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシ末端方向である。
【０１２１】
ペプチド
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、生理学的に関連する還元剤である、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）などの還元条件に対して耐性のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載するペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで若しくは製造工程中に、トリプシン、ペプシン、キモトリプシンなどのプロテアーゼ、又はペプチドの安定性に関連する他のプロテアーゼによるタンパク質分解に対して耐性である。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ＧＳＨ還元条件下で耐性である以外に、ＤＴＴなど、より強力な還元剤でも部分的に耐性である。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、３０℃、４０℃、７５℃、又は１００℃などの高温に対して耐性である。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）曝露などのタンパク質を変性させ得る他の条件に対して耐性である。一部の実施形態では、安定性が向上したペプチドは、ノッテッドペプチド、シスチン高密度ペプチド、若しくはノッティンであるか、又はシスチン高密度ペプチド、ノッティン、若しくはノッテッドペプチドに由来する。他の実施形態では、安定性が向上したペプチドは、ノッテッドペプチドではなく、ノッテッドペプチドに由来するものでもないが、それでも尚、タンパク質分解に対する耐性及び／又は還元条件に対する耐性などの、向上した安定性を有する。
【０１２２】
ノッティンは、ノッテッドペプチドの１クラスであり、長さが約１１〜８１アミノ酸で、多くの場合、コンパクトな構造に折り畳まれている。ノッティンは、一般に、いくつかの分子内ジスルフィド架橋を特徴とする複雑な三次構造にアセンブルされ、β鎖、αへリックス、及び他の二次構造を含み得る。ジスルフィド結合の存在は、いくつかのノッティンに顕著な環境安定性を賦与することができ、これにより、これらのノッティンは、極端な温度及びｐＨに耐えることができ、さらに、血流及び消化系のものなどのタンパク質分解酵素に対して耐性となることができる。ノッティンの剛性も、それらが、「エントロピーペナルティ」（フロッピーペプチドが標的と結合する際に引き起こす）を受けることなく、標的に結合することを可能にする。例えば、結合は、ペプチドが標的と結合して複合体を形成するときに起こるエントロピーの損失により悪影響を受ける。従って、「エントロピーペナルティ」は、結合に対する有害な作用であり、結合時に起こるエントロピー損失が大きいほど、「エントロピーペナルティ」は大きくなる。さらに、柔軟な非結合分子は、複合体を形成するとき、複合体内で結合した際の柔軟性の喪失のために、強固な構造の分子よりも多くのエントロピーを失う。しかし、非結合分子の剛性も、一般に、分子が形成することができる複合体の数を制限することにより、特異性を高める。ノッテッドペプチドは、抗体様親和性により標的と結合することができる。ノッティンの配列構造及び配列同一性又は相同性をさらに詳しく調べることにより、あらゆる種類の動物及び植物において、それらが、収斂進化により発生したことが判明している。動物では、ノッティンは、毒液、例えば、クモ及びサソリの毒液に見出すことができ、それらは、イオンチャネルの調節に関与していた。植物のノッティンタンパク質は、動物のタンパク質分解酵素を阻害するか、又は抗菌活性を有し得るが、このことは、ノッティンが、植物のネイティブ防御で機能し得ることを示唆している。
【０１２３】
本開示は、これらのノッテッドペプチドを含むか、又はそれらに由来し得るペプチドを提供する。本明細書で使用するように、「ノッテッドペプチド」は、「ノッティン」及び「オプチド」という用語と置き換え可能であり得る。また、他のジスルフィド含有ペプチドのうち、「ヒッチン」も、本開示の目的のために、「ノッテッドペプチド」と考えることができる。
【０１２４】
本開示のペプチドは、システインアミノ酸残基を含んでもよい。いくつかのケースでは、ペプチドは、少なくとも６システインアミノ酸残基を有する。いくつかのケースでは、ペプチドは、少なくとも４システインアミノ酸残基を有する。いくつかのケースでは、ペプチドは、少なくとも８システインアミノ酸残基を有する。他のケースでは、ペプチドは、少なくとも１０システインアミノ酸残基、少なくとも１２システインアミノ酸残基、少なくとも１４システインアミノ酸残基、又は少なくとも１６システインアミノ酸残基を有する。
【０１２５】
ノッテッドペプチドは、ジスルフィド架橋を含み得る。ノッテッドペプチドは、残基の５％以上が、分子内ジスルフィド結合又はシスチンを形成するシステインアミノ酸残基であり得るペプチドであってよい。ノッテッドペプチドは、少なくとも３つの分子内ジスルフィド結合を含むペプチドであってよい。ジスルフィド結合ペプチドは、薬物スカフォールドであってよい。一部の実施形態では、ジスルフィド架橋は、ノットを形成する。ジスルフィド架橋は、システインアミノ酸残基同士の間、例えば、システインアミノ酸残基１と４、２と５、及び３と６の間に形成され得る。いくつかのケースでは、ジスルフィド架橋は、他の２つのジスルフィド架橋により形成されるループを通過して、例えば、ノットを形成する。他のケースでは、ジスルフィド架橋は、いずれか２つのシステイン残基の間に形成され得る。
【０１２６】
本開示は、カノニカルノッティンではないペプチドも含み得る。これらのペプチドのいくつかは、本明細書で記載されるように、ヒッチンであるか、又はカノニカルノッティンと比較して別のジスルフィド共有結合トポロジーを含み得る。タンパク質は、より単純なペプチドからサイズにより識別することができる。一部の実施形態では、ペプチドは、約５０残基未満の長さを含み得る。一部の実施形態では、ペプチドは、十分に充填された疎水性コアによって達成され得る安定な構造を形成する上で十分な共同相互作用が欠如しているために、明確な３次元構造に折り畳まれない。いくつかの例外として、複数の密に充填されたジスルフィド共有結合のコア周辺に交互に組織化するペプチドを挙げることができ、これは、Ｗｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているように、極端な温度、化学、及びタンパク質分解安定性を付与し得る（Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，１４（３）：１３７−４６（２００６）），Ｇｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３２（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１５６−９（２００４）），Ｒｅｉｎｗａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１７（１１）：１２５３３−５２（２０１２）），Ｋｏｌｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ，１７（３８）：４３２９−３６（２０１１）），Ｋｏｌｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，９（５）：６０８−１４（２００９）），Ｋｌｉｎｔｚｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，３４：１４３−１５０（２０１６）），及びＧｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ，１７（３８）：４２９４−３０７（２０１１））。重要なことには、複数のジスルフィド共有結合を含むペプチド、又はシステイン高密度ペプチドの全てが、こうした高レベルの安定性を有するとは限らないことである。こうしたペプチドの典型として、ノッティン（本開示に記載のように）とも呼ばれる「阻害剤シスチンノッテッドペプチド」、密接に関連する「環状シスチンノッテッドペプチド」（シクロチドとして知られる）を挙げることができるが、これらはいずれも、少なくとも３つのシスチンのコアを有し得る。例として、イモガイ、クモ、及びサソリ由来の毒液毒素；植物由来のプロテアーゼ阻害剤；並びに抗菌ディフェンシンを挙げることができる。ノッティン及びシクロチドは、位相幾何学的に擬似ノッテッドである可能性があり、１つのシスチンが、他の２つのシスチン及び相互連結バックボーンにより形成された巨大環を交差して通過する。さらに、タンパク質は、Ｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１５（５）：６８１−９４（２００１）及びＩｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＢＳ  Ｊ，２７８（２２）：４３０４−２２（２０１１））に記載されているように、シスチン−ノッテッドサブドメイン、例えば、成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）も組み込むことができる。しかし、ＧＦＣＫシスチン−ノッテッド要素は、タンパク質の折り畳みを独占しておらず、これは、ノッティン及びシクロチドとは異なり、通常の疎水性コアを含み得る。一部の実施形態では、このクラスの分子を定義する最小の共通要素は、少なく���も３シスチンの高密度を有する独立の折り畳みドメインを構成する短い配列であってよい。この分類は、「シスチン高密度ペプチド」（ＣＤＰ）と呼ばれ、ＧＦＣＫと同様にシスチンノッテッド要素を含む大型タンパク質とは区別される。
【０１２７】
ＣＤＰは、ノッテッドトポロジーを有し、ＣＤＰ画定モチーフ：６個以上のシステインアミノ酸残基（若しくは少なくとも３個のシスチン）を含み得る配列を含むものとして定義することができ、細胞質タンパク質若しくはドメイン、ジンクフィンガータンパク質、又はＧＦＣＫとして認識可能ではない可能性があり、システインアミノ酸残基の制約分布を含み得ると共に、Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ−Ｘ［０−１５］−Ｃｙｓ（Ｘは、任意のアミノ酸残基である）であってよく、モチーフ結合システインアミノ酸残基同士の間が１３〜８１残基長であってよい。例えば、候補ＣＤＰをＳｉｇｎａｌＰ（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３４０：７８３−７９５（２００４））などの認識可能なリーダペプチドを含む配列中に埋め込むことができ、分泌若しくは内在性膜タンパク質として注釈をつけてもよいし、又は特定のシスチンを含有することを実験により証明することもでき、これを用いて、ペプチド中のシスチンの形成を確認することにより、そのペプチドをＣＤＰとして分類することができる。ＣＤＰは、より大型のタンパク質、又はタンデム配列中に埋め込むことができ、これらは、独立のフォールディング単位を含み得る。最小「システイン密度」が、少なくとも１２％のシステインアミノ酸残基含有率を有する配列となり得る、最小「システイン密度」の別の基準によって、出現する疎水性コアを伴う小型タンパク質から、優勢なシスチンコアを有するＤＣＰを区別することができる。この閾値ＣＤＰ画定システイン密度は、全タンパク質について観察される平均より約１０倍高くなり得る（Ｍｏｕｒａ，Ａ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ，８Ｉｅ７７３１９（２０１３）；Ｔｈｅ  ＵｎｉＰｒｏｔＣ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４５：Ｄ１５８−Ｄ１６９（２０１７））。２０１７年４月現在、ＰＤＢには７７１の実験的に決定された構造があったが、これは、配列に基づく定義を満たし得る。
【０１２８】
第１レベルのＣＤＰ分類は、図２５Ａに示すジスルフィド結合により決定することができる。３−シスチンコア／ノッティング要素における１から６の順のシスチン番号付けによって、１５の理論上考えられるジスルフィド結合クラスを得ることができ、大部分のＧＦＣＫ及び典型的なノッティンノッテッドＣＤＰは、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ４、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ５、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ６ジスルフィド結合クラス（１−４、２−５、３−６）に属し、これは、「カノニカル」ジスルフィド結合クラスと呼ぶことができる。寄託されたノッテッドＣＤＰ構造（多様な形態を含む）には、４つの他のジスルフィド結合クラスが認められる。さらに、図２５Ｂに示すように、３つのシスチンを含む他の非ノッテッドＣＤＰに、９つの他のジスルフィド結合クラスを認めることができる。Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ６、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ３、Ｃｙｓ４−Ｃｙｓ５ジスルフィド結合クラス（１−６、２−３、４−５）は、いずれの天然のＣＤＰにも認められないであろうが、完全に合成の設計ＣＤＰには見出すことができる（例えば、５ＪＩ４．ｐｄｂ（Ｂｈａｒｄｗａｊ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ，５３８：３２９−３３５（２０１６））。４つ以上のシスチンを含む非ノッテッドＣＤＰは、３シスチンのフォーカスサブユニットを画定することができず、ノッティング要素の不存在下で同様に番号付けすることができないため、同等のジスルフィド結合クラスに割り当てることはできないが、一緒に個別のＣＤＰタイプにまとめることができ、これは、タイプ「ｚ」と呼ばれ得る。
【０１２９】
第２レベルのＣＤＰ分類は、シスチントポロジーに基づいて行うことができ、図２５Ｂに示すように、ノッティング要素を含む３つのコアシスチンに焦点を当て、それ以外の付属シスチンを無視して、どのシスチンが、折り畳みを擬似ノッティングし得るかとして定義することができる。コアジスルフィド結合を表すためにＣｙｓｕ−Ｃｙｓｖ、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘ、Ｃｙｓｙ−Ｃｙｓｚ（ｕ−ｖ、ｗ−ｘ、ｙ−ｚ）として示されるいずれのジスルフィド結合クラスにおいても、３つの理論上のトポロジーが存在し得るが、それらの各々は、ｕ−ｖ、ｗ−ｘ、［ｙ−ｚ］と表示される異なるノッティングシスチンを有し、ここで、ノッティングシスチンは、角括弧内に示す。ＣＤＰジスルフィド結合クラスの知識及びその対応するノッティングトポロジーは、図２５Ｂに示すように、構造に基づくノッテッドＣＤＰタイプを示し得る。３シスチンを含む非ノッテッドＣＤＰは、Ｃｙｓｕ−Ｃｙｓｖ、Ｃｙｓｗ−Ｃｙｓｘ、Ｃｙｓｙ−Ｃｙｓｚジスルフィド結合クラス（ｕ−ｖ、ｗ−ｘ、ｙ−ｚ）によってのみ表すことができ、４以上のシスチンを含む非ノッテッドＣＤＰは、「ｚ」と表すことができる。この命名法を用いれば、典型的なノッティンは、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ４、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ５、［Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ６］ノッテッドＣＤＰ（１−４、２−５、［３−６］）のタイプとして分類することができ、これは、ＧＦＣＫに認められる［Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ４］、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ５、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ６トポロジー（［１−４］、２−５、３−６）とは、共通のジスルフィド結合にもかかわらず、異なり得る。このノッテッドＣＤＰジスルフィド結合クラスにおいて、第２の最も一般的に認められるトポロジータイプは、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ４、［Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ５］、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ６（１−４、［２−５］、３−６）であり得る。第３のトポロジータイプは、このジスルフィド結合クラスにおけるＧＦＣＫ様トポロジー：［Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ４］、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ５、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ６（［１−４］、２−５、３−６）であり得る。ノッティンの命名に続き、タイプ１−４、［２−５］、３−６ノッテッドＣＤＰを「ヒッチン」と呼び、タイプ［１−４］、２−５、３−６ＧＦＣＫを「シャンク」（シャンクは、ロープの長さを短縮するために用いられるノットのタイプであり得る）と呼び、また、稀なタイプである［１−４］、２−５、３−６ノッテッドＣＤＰを「シャンキン」と呼ぶことができる。記載されるはるかに少数のノッテッドＣＤＰ構造が、非カノニカルジスルフィド結合クラスであるが、図２５Ｂに示すように、９つの別のノッテッドＣＤＰタイプの例が報告されている。様々なジスルフィド結合クラス及びタイプにおける７７１のＣＤＰの分布は、図２５Ｃ（非ノッテッドＣＤＰ：黒、及びノッテッドＣＤＰ：赤）に示すように、ノッティン、ｚ−クラス、及びヒッチンで優勢であった。提案されるこのスキームは、起源生物、配列相同性、又は機能アノテーションとは独立に、ＣＤＰの構造分類及び比較のための明瞭な方法を提供し得る。利点としては、「ディフェンシン」のように、広範に適用されるアノテーションの回避を挙げることができ、ディフェンシンは、システインが豊富なカチオン性抗菌宿主防御ペプチドを意味し得るが、これは、多くのヒッチン及びノッティンをはじめとする、多種多様な構造的に異なるノッテッド及び非ノッテッドＣＤＰタイプも包含し得る。
【０１３０】
本開示のペプチドは、限定されないが、ノッティン、ヒッチン、又は他のＣＤＰ、並びにノッテッドではないペプチドを含み得る。システインの密度及びノットの任意の存在は、変性、還元、プロテアーゼ、及び他の構造分解に対する耐性を付与し得るが、ノット又は高シスチン密度を有するペプチドは、そうした分解に対してまちまちの耐性を有する可能性があり、いくつかのペプチドは、はるかに安定し、且つ耐性が高くなり得る。本開示のペプチドは、１つ又は複数の化学的若しくは物理的分解経路に対して、より耐性が高くなり得る。
【０１３１】
一部の実施形態では、本開示のペプチドの三次構造及び静電気が安定性に影響を及ぼし得る。構造分析又は電荷分布の分析は、生物製剤において重要な残基を予測するための戦略となり得る。例えば、安定した本開示の数種のペプチドは、上で「ヒッチン」と定義した構造クラスに分類することができ、これらは、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ４、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ５、及びＣｙｓ３−Ｃｙｓ６同士のジスルフィド結合の特性を共有することができる。３つのジスルフィド結合（Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ４、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ５、及びＣｙｓ３−Ｃｙｓ６）によりノッティングされたペプチドの折り畳みトポロジーは、ジスルフィドの３次元配置に基づく構造ファミリーに分解され得る。ノッティンは、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ４及びＣｙｓ２−Ｃｙｓ５ジスルフィド結合により形成される巨大環を通過するＣ３−Ｃ６ジスルフィド結合を有し得る。ヒッチンは、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ４及びＣｙｓ３−Ｃｙｓ６ジスルフィド結合により形成される巨大環を通過するＣｙｓ２−Ｃｙｓ５ジスルフィド結合を有し得る。その他の構造ファミリーは、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ５及びＣｙｓ３−Ｃｙｓ６ジスルフィド結合により形成される巨大環を通過するＣｙｓ１−Ｃｙｓ４ジスルフィド結合を有し得る。これらのシステイン残基で保存されたジスルフィド結合を有する「ヒッチン」クラスペプチドの変異体、一次配列同一性、及び／又は構造相同性は、高い生物学的安定性を有し得る他の潜在的なノッティンペプチド候補を同定又は予測する方法となり得る。
【０１３２】
本開示は、さらに、例えば、別のペプチドを作製するための出発点として用いることができるペプチドスカフォールドを含む。一部の実施形態では、これらのスカフォールドは、様々なノッテッドペプチドから得ることができる。特定の実施形態では、ノッテッドペプチドは、いくつかの分子内ジスルフィド架橋を特徴とする複雑な三次構造にアセンブルすることができ、これは、任意選択で、β鎖、並びにαヘリックスなどの他の二次構造を含んでもよい。例えば、ノッテッドペプチドは、ジスルフィドノットを介したジスルフィドを特徴とする小型のジスルフィドリッチタンパク質を含み得る。このノットは、例えば、１つのジスルフィド架橋が、他の２つのジスルフィド及び相互連結バックボーンにより形成された巨大環と交差するときに得られる。一部の実施形態では、ノッテッドペプチドは、成長因子システインノット又は阻害因子システインノットを含み得る。考えられる他のペプチド構造としては、βシートなしで２つのジスルフィド架橋により連結される２つの平行ヘリックスを有するペプチド（例えば、ヘフトキシン）を挙げることができる。
【０１３３】
ノッテッドペプチドは、Ｌ配置の少なくとも１個のアミノ酸残基を含み得る。ノッテッドペプチドは、Ｄ配置の少なくとも１個のアミノ酸残基を含み得る。一部の実施形態では、ノッテッドペプチドは、１５〜４０アミノ酸残基長である。他の実施形態では、ノッテッドペプチドは、１１〜５７アミノ酸残基長である。また別の実施形態では、ノッテッドペプチドは、１１〜８１アミノ酸残基長である。別の実施形態では、ノッテッドペプチドは、２０アミノ酸残基長である。
【０１３４】
こうした種類のペプチドは、毒素又は毒液に存在する、又はそれらに関連することが知られているタンパク質のクラスから得ることができる。いくつかのケースでは、ペプチドは、サソリ又はクモに関連する毒素若しくは毒液から得ることができる。ペプチドは、様々な属及び種のサソリ及びクモの毒素及び毒液から得ることができる。例えば、ペプチドは、レイウルス・キンケストリアツス・ヘブラエウス（Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ  ｈｅｂｒａｅｕｓ）、ブツス・オクシタヌス・ツネタヌス（Ｂｕｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｔａｎｕｓ  ｔｕｎｅｔａｎｕｓ）、ホッテントッタ・ジュダイクス（Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａ  ｊｕｄａｉｃｕｓ）、メソブツス・ヨーペウス（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ  ｅｕｐｅｕｓ）、ブツス・オクシタヌス・イスラエリス（Ｂｕｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｔａｎｕｓ  ｉｓｒａｅｌｉｓ）、ハドルルス・ゲルチ（Ｈａｄｒｕｒｕｓ  ｇｅｒｔｓｃｈｉ）、アンドロクトヌス・アウストラリス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、セントルロイデス・ノキシウス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｎｏｘｉｕｓ）、ヘテロメトルス・ラオチクス（Ｈｅｔｅｒｏｍｅｔｒｕｓ  ｌａｏｔｉｃｕｓ）、オピストフタルムス・カリナツス（Ｏｐｉｓｔｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ）、ハプロペルマ・シュミドチ（Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｓｃｈｍｉｄｔｉ）、マダラサソリ（Ｉｓｏｍｅｔｒｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｕｓ）、ハプロペルマ・フウェヌム（Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｈｕｗｅｎｕｍ）、ハプロペルマ・ハイナヌム（Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｈａｉｎａｎｕｍ）、ハプロペルマ・シュミドチ（Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｓｃｈｍｉｄｔｉ）、アメリカ・タナグモ（Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ  ａｐｅｒｔａ）、ブルーマウンテン・ジョウゴグモ（Ｈａｙｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａ）、セレノコスミア・フウェナ（Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａ  ｈｕｗｅｎａ）、アシダカグモ（Ｈｅｔｅｒｏｐｏｄａ  ｖｅｎａｔｏｒｉａ）、チリアン・コモン・タランチュラ（Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ  ｒｏｓｅａ）、オルニトクトヌス・フウェナ（Ｏｒｎｉｔｈｏｃｔｏｎｕｓ  ｈｕｗｅｎａ）、ブルーマウンテン・ジョウゴグモ（Ｈａｙｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａ）、シドニー・ジョウゴグモ（Ａｔｒａｘ  ｒｏｂｕｓｔｕｓ）、アメリカ・タナグモ（Ａｎｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ  ａｐｅｒｔａ）、トリニダードシェブロン（Ｐｓａｌｍｏｐｏｅｕｓ  ｃａｍｂｒｉｄｇｅｉ）、ハドロニッケ・インフェンサ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｉｎｆｅｎｓａ）、メガネヤチグモ（Ｐａｒａｃｏｅｌｏｔｅｓ  ｌｕｃｔｏｓｕｓ）、若しくはキロブラキス・ジンザオ（Ｃｈｉｌｏｂｒａｃｈｙｓ  ｊｉｎｇｚｈａｏ）、又は別の好適な属若しくは種のサソリ若しくはクモの毒液又は毒素から得ることができる。さらに別の例として、ペプチドは、ダイオウサソリ（Ｐａｎｄｉｎｕｓ  ｉｍｐｅｒａｔｏｒ）、ヒノモトサソリ（Ｌｙｃｈａｓ  ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）、ハドルルス・ゲルチ（Ｈａｄｒｕｒｕｓ  ｇｅｒｔｓｃｈｉ）、ケントルロイデス・エレガンス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、オオクロケブカジョウゴグモ（Ｍａｃｒｏｔｈｅｌｅ  ｇｉｇａｓ）、ケントルロイデス・リンピダス・リンピダス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｌｉｍｐｉｄｕｓ  ｌｉｍｐｉｄｕｓ）、インディアンレッドサソリ（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ  ｔａｍｕｌｕｓ）、ニシアフリカイチゴ（Ｐｅｎｔａｄｉｐｌａｎｄｒａ  ｂｒａｚｚｅａｎａ）、アフガンダイオウサソリ（Ｈｅｔｅｒｏｍｅｔｒｕｓ  ｆｕｌｖｉｐｅｓ）、又はカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）から得ることができる。いくつかのケースでは、ペプチドは、キョクトウサソリ（Ｂｕｔｈｕｓ  ｍａｒｔｅｎｓｉｉ  Ｋａｒｓｈ）（サソリ）毒素から得ることができる。一部の実施形態では、ペプチドは、ｐｆａｍ００５４５３：Ｔｏｘｉｎ＿６クラスのメンバーから得ることができる。
【０１３５】
他の実施形態では、本開示は、ノッティン由来ではないペプチドを提供する。これらの実施形態では、ペプチドは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ技術及び／若しくはランダム突然変異誘発技術を用いて、設計又は操作することができる。例えば、配列番号３９〜配列番号４５のペプチド及び配列番号１２２〜配列番号１２８のペプチドは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ技術及び突然変異誘発方法を用いて設計又は操作された。生理学的に関連する還元剤、ＧＳＨを用いた実験によって、配列番号３９、配列番号４３、配列番号１２２、及び配列番号１２６のペプチドが、ＧＳＨ還元条件に対して耐性であることを証明された。より強力な還元剤であるＤＴＴを用いた実験では、配列番号４３〜配列番号４５及び配列番号１２６〜配列番号１２８のペプチドが、ＤＴＴ還元条件に対して部分的に耐性であることが明らかにされた。トリプシン又はキモトリプシンを用いた実験によって、配列番号４３及び配列番号１２６のペプチドが、トリプシン及びキモトリプシンに部分的に耐性であることが証明された。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、非天然であってよい。非天然とは、その天然の形態で、自然界に生じないか、又は存在しない品目を意味し得る。
【０１３６】
表１に、本開示で使用するための例示的なペプチドを列記する。
【０１３７】
【表１−１】
2019529380.tif 000003
【０１３８】
【表１−２】
2019529380.tif 000004
【０１３９】
【表１−３】
2019529380.tif 000005
【０１４０】
【表１−４】
2019529380.tif 000006
【０１４１】
【表１−５】
2019529380.tif 000007
【０１４２】
【表１−６】
2019529380.tif 000008
【０１４３】
一部の実施形態では、ペプチドは、ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＣＸ８Ｘ９ＳＸ１０Ｘ１１ＣＸ１２Ｘ１３Ｘ１４ＣＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＧＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＣＸ２４ＮＸ２５Ｘ２６ＣＸ２７ＣＸ２８Ｘ２９Ｘ３０（配列番号１６７）
（Ｘ１は、Ｇ、Ｑ、Ｖ、又は無であってよく；Ｘ２は、Ｖ、Ｒ、Ｋ、又は無であってよく；Ｘ３は、Ｐ、Ｉ、Ｆ、又は無であってよく；Ｘ４は、Ｉ、Ｔ、又はＬであってよく；Ｘ５は、Ｎ、Ｄ、Ｐ、又はＳであってよく；Ｘ６は、Ｖ、Ｉ、又はＮであってよく；Ｘ７は、Ｋ、Ｒ、又はＳであってよく；Ｘ８は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、又はＴであってよく；Ｘ９は、Ｇ、Ｉ、Ｈ、Ｎ、又はＡであってよく；Ｘ１０は、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｓ、又はＹであってよく；Ｘ１１は、Ｄ、Ｑ、又はＥであってよく；Ｘ１２は、Ｌ、Ｉ、Ｆ、又はＷであってよく；Ｘ１３は、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ１４は、Ｐ、Ｖ、又はＨであってよく；Ｘ１５は、Ｒ、Ｋ又はＩであってよく；Ｘ１６は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｓ、又はＱであってよく；Ｘ１７は、Ａ、Ｉ、Ｒ、Ｋ、又はＭであってよく；Ｘ１８は、無又はＦであってよく；Ｘ１９は、Ｍ、Ｋ、Ｒ、又はＴであってよく；Ｘ２０は、Ｒ、Ｋ、Ｔ、又はＰであってよく；Ｘ２１は、Ｆ、Ｎ、又はＡであってよく；Ｘ２２は、Ｇ又はＡであってよく；Ｘ２３は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ２４は、Ｉ、Ｍ、又はＶであってよく；Ｘ２５は、Ｓ、Ｇ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ２６は、Ｋ、Ｒ、又はＬであってよく；Ｘ２７は、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ２８は、Ｔ、Ｙ、又はＦであってよく；Ｘ２９は、Ｐ、Ｓ、又は無であってよく；Ｘ３０は、無、Ｋ、又はＲであってよい）
を含む配列を有し得る。一部の実施形態では、ペプチドは、ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３ＩＸ４ＶＸ５ＣＸ６Ｘ７ＳＸ８ＱＣＬＸ９ＰＣＸ５Ｘ１０ＡＧＭＸ５ＦＧＸ５ＣＸ１１ＮＧＸ５ＣＸ１２ＣＴＰＸ１３（配列番号１６８）
（Ｘ１は、Ｇ、Ｑ、Ｖ、又は無であってよく；Ｘ２は、Ｖ、Ｒ、Ｋ、又は無であってよく；Ｘ３は、Ｐ、Ｉ、Ｆ、又は無であってよく；Ｘ４は、Ｎ、Ｄ、Ｐ、又はＳであってよく；Ｘ５は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ６は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、又はＴであってよく；Ｘ７は、Ｇ、Ｉ、Ｈ、Ｎ、又はＡであってよく；Ｘ８は、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｓ、又はＹであってよく；Ｘ９は、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、又はＲであってよく；Ｘ１０は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｓ、又はＱであってよく；Ｘ１１は、Ｉ、Ｍ、又はＶであってよく；Ｘ１２は、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、又はＲであってよく；Ｘ１３は、無、Ｋ、又はＲであってよい）
を含む配列を有し得る。一部の実施形態では、ペプチドは、ＧＳＧＶＸ１ＩＮＶＸ２ＣＸ２Ｘ３ＳＸ２Ｘ４ＣＬＸ５ＰＣＸ２Ｘ２ＡＧＭＸ２ＦＧＸ２ＣＸ６ＮＸ７Ｘ２ＣＨＣＴＰＸ８（配列番号１６９）
（Ｘ１は、Ｐ又はＩであってよく；Ｘ２は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ３は、Ｇ又はＩであってよく；Ｘ４は、Ｄ又はＱであってよく；Ｘ５は、Ｄ又はＥであってよく；Ｘ６は、Ｉ又はＭであってよく；Ｘ７は、Ｓ又はＧであってよく；Ｘ８は、無、Ｋ、又はＲであってよい）
を含む配列を有し得る。一部の実施形態では、ペプチドは、ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３ＩＸ４ＶＸ５ＣＸ６Ｘ７ＳＸ８Ｘ９ＣＬＸ１０ＰＣＸ６Ｘ１１ＡＧＭＲＦＧＸ６ＣＸ１２ＮＸ１３Ｘ６ＣＸ１４ＣＴＰＸ６（配列番号１７０）
（Ｘ１は、Ｇ又はＶであってよく；Ｘ２は、Ｖ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ３は、Ｐ、Ｉ、又は無であってよく；Ｘ４は、Ｎ又はＰであってよく；Ｘ５は、Ｋ、Ｓ、又はＲであってよく；Ｘ６は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ７は、Ｇ、Ｉ、又はＨであってよく；Ｘ８は、Ｒ、Ｇ、又はＫであってよく；Ｘ９は、Ｑ又はＤであってよく；Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、又はＲであってよく；Ｘ１１は、Ｋ、Ｄ、又はＲであってよく；Ｘ１２は、Ｍ又はＩであってよく；Ｘ１３は、Ｇ又はＳであってよく；Ｘ１４は、Ｈ又はＤであってよい）
を含む配列を有し得る。一部の実施形態では、ペプチドは、ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＣＸ８Ｘ９ＳＸ１０Ｘ１１ＣＸ１２ＰＸ１３ＣＸ１４Ｘ１５Ｘ１６ＦＧＸ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１ＣＸ２２ＮＸ２３Ｘ２４ＣＸ２５ＣＸ２６Ｘ２７（配列番号１７１）
（Ｘ１は、Ｑ又は無であってよく；Ｘ２は、Ｋ、Ｒ、又は無であってよく；Ｘ３は、Ｉ、Ｐ、又はＦであってよく；Ｘ４は、Ｔ又はＬであってよく；Ｘ５は、Ｄ又はＳであってよく；Ｘ６は、Ｎ、Ｉ、又はＶであってよく；Ｘ７は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ８は、Ｎ、Ｓ、又はＴであってよく；Ｘ９は、Ｎ、Ａ、又はＧであってよく；Ｘ１０は、Ｓ、Ｙ、Ｋ、又はＲであってよく；Ｘ１１は、Ｑ又はＥであってよく；Ｘ１２は、Ｉ、Ｆ、又はＷであってよく；Ｘ１３は、Ｖ又はＨであってよく；Ｘ１４は、Ｋ、Ｉ、又はＲであってよく；Ｘ１５は、Ｒ、Ｓ、Ｑ、又はＫであってよく；Ｘ１６は、Ｉ、Ｒ、Ｍ、又はＫであってよく；Ｘ１７は、Ｋ、Ｔ、又はＲであってよく；Ｘ１８は、Ｒ、Ｔ、Ｐ、又はＫであってよく；Ｘ１９は、Ｎ又はＡであってよく；Ｘ２０は、Ｇ又はＡであってよく；Ｘ２１は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ２２は、Ｉ、Ｖ、又はＭであってよく；Ｘ２３は、Ｇ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ２４は、Ｋ、Ｌ、又はＲであってよく；Ｘ２５は、Ｙ、Ｄ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ２６は、Ｙ又はＦであってよく；Ｘ２７は、Ｐ、Ｓ、又は無であってよい）
を含む配列を有し得る。
【０１４４】
一部の実施形態では、ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＣＸ８Ｘ９ＳＸ１０Ｘ１１ＣＸ１２Ｘ１３Ｘ１４ＣＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＧＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＣＸ２４ＮＸ２５Ｘ２６ＣＸ２７ＣＸ２８Ｘ２９Ｘ３０（配列番号１７２）
（Ｘ１は、Ｇ、Ｑ、Ｖ、又は無であってよく；Ｘ２は、Ｖ、Ｒ、Ｋ、又は無であってよく；Ｘ３は、Ｐ、Ｉ、Ｆ、又は無であってよく；Ｘ４は、Ｉ、Ｔ、又はＬであってよく；Ｘ５は、Ｎ、Ｄ、Ｐ、又はＳであってよく；Ｘ６は、Ｖ、Ｉ、又はＮであってよく；Ｘ７は、Ｋ、Ｒ、又はＳであってよく；Ｘ８は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、又はＴであってよく；Ｘ９は、Ｇ、Ｉ、Ｈ、Ｎ、又はＡであってよく；Ｘ１０は、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｓ、又はＹであってよく；Ｘ１１は、Ｄ、Ｑ、又はＥであってよく；Ｘ１２は、Ｌ、Ｉ、Ｆ、又はＷであってよく；Ｘ１３は、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ１４は、Ｐ、Ｖ、又はＨであってよく；Ｘ１５は、Ｒ、Ｋ又はＩであってよく；Ｘ１６は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｓ、又はＱであってよく；Ｘ１７は、Ａ、Ｉ、Ｒ、Ｋ、又はＭであってよく；Ｘ１８は、無又はＦであってよく；Ｘ１９は、Ｍ、Ｋ、Ｒ、又はＴであってよく；Ｘ２０は、Ｒ、Ｋ、Ｔ、又はＰであってよく；Ｘ２１は、Ｆ、Ｎ、又はＡであってよく；Ｘ２２は、Ｇ又はＡであってよく；Ｘ２３は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ２４は、Ｉ、Ｍ、又はＶであってよく；Ｘ２５は、Ｓ、Ｇ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ２６は、Ｋ、Ｒ、又はＬであってよく；Ｘ２７は、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ２８は、Ｔ、Ｙ、又はＦであってよく；Ｘ２９は、Ｐ、Ｓ、又は無であってよく；Ｘ３０は、無、Ｋ、又はＲであってよい）
を含む配列を有し得る。
【０１４５】
一部の実施形態では、ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＩＸ４ＶＸ５ＣＸ６Ｘ７ＳＸ８ＱＣＬＸ９ＰＣＸ５Ｘ１０ＡＧＭＸ５ＦＧＸ５ＣＸ１１ＮＧＸ５ＣＸ１２ＣＴＰＸ１３（配列番号１７３）
（Ｘ１は、Ｇ、Ｑ、Ｖ、又は無であってよく；Ｘ２は、Ｖ、Ｒ、Ｋ、又は無であってよく；Ｘ３は、Ｐ、Ｉ、Ｆ、又は無であってよく；Ｘ４は、Ｎ、Ｄ、Ｐ、又はＳであってよく；Ｘ５は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ６は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、又はＴであってよく；Ｘ７は、Ｇ、Ｉ、Ｈ、Ｎ、又はＡであってよく；Ｘ８は、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｓ、又はＹであってよく；Ｘ９は、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、又はＲであってよく；Ｘ１０は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｓ、又はＱであってよく；Ｘ１１は、Ｉ、Ｍ、又はＶであってよく；Ｘ１２は、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、又はＲであってよく；Ｘ１３は、無、Ｋ、又はＲであってよい）
を含む配列を有し得る。一部の実施形態では、ペプチドは、ＧＶＸ１ＩＮＶＸ２ＣＸ２Ｘ３ＳＸ２Ｘ４ＣＬＸ５ＰＣＸ２Ｘ２ＡＧＭＸ２ＦＧＸ２ＣＸ６ＮＸ７Ｘ２ＣＨＣＴＰＸ８（配列番号１７４）
（Ｘ１は、Ｐ又はＩであってよく；Ｘ２は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ３は、Ｇ又はＩであってよく；Ｘ４は、Ｄ又はＱであってよく；Ｘ５は、Ｄ又はＥであってよく；Ｘ６は、Ｉ又はＭであってよく；Ｘ７は、Ｓ又はＧであってよく；Ｘ８は、無、Ｋ、又はＲであってよい）
を含む配列を有し得る。一部の実施形態では、ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＩＸ４ＶＸ５ＣＸ６Ｘ７ＳＸ８Ｘ９ＣＬＸ１０ＰＣＸ６Ｘ１１ＡＧＭＲＦＧＸ６ＣＸ１２ＮＸ１３Ｘ６ＣＸ１４ＣＴＰＸ６（配列番号１７５）
（Ｘ１は、Ｇ又はＶであってよく；Ｘ２は、Ｖ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ３は、Ｐ、Ｉ、又は無であってよく；Ｘ４は、Ｎ又はＰであってよく；Ｘ５は、Ｋ、Ｓ、又はＲであってよく；Ｘ６は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ７は、Ｇ、Ｉ、又はＨであってよく；Ｘ８は、Ｒ、Ｇ、又はＫであってよく；Ｘ９は、Ｑ又はＤであってよく；Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、又はＲであってよく；Ｘ１１は、Ｋ、Ｄ、又はＲであってよく；Ｘ１２は、Ｍ又はＩであってよく；Ｘ１３は、Ｇ又はＳであってよく；Ｘ１４は、Ｈ又はＤであってよい）
を含む配列を有し得る。一部の実施形態では、ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＣＸ８Ｘ９ＳＸ１０Ｘ１１ＣＸ１２ＰＸ１３ＣＸ１４Ｘ１５Ｘ１６ＦＧＸ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１ＣＸ２２ＮＸ２３Ｘ２４ＣＸ２５ＣＸ２６Ｘ２７（配列番号１７６）
（Ｘ１は、Ｑ又は無であってよく；Ｘ２は、Ｋ、Ｒ、又は無であってよく；Ｘ３は、Ｉ、Ｐ、又はＦであってよく；Ｘ４は、Ｔ又はＬであってよく；Ｘ５は、Ｄ又はＳであってよく；Ｘ６は、Ｎ、Ｉ、又はＶであってよく；Ｘ７は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ８は、Ｎ、Ｓ、又はＴであってよく；Ｘ９は、Ｎ、Ａ、又はＧであってよく；Ｘ１０は、Ｓ、Ｙ、Ｋ、又はＲであってよく；Ｘ１１は、Ｑ又はＥであってよく；Ｘ１２は、Ｉ、Ｆ、又はＷであってよく；Ｘ１３は、Ｖ又はＨであってよく；Ｘ１４は、Ｋ、Ｉ、又はＲであってよく；Ｘ１５は、Ｒ、Ｓ、Ｑ、又はＫであってよく；Ｘ１６は、Ｉ、Ｒ、Ｍ、又はＫであってよく；Ｘ１７は、Ｋ、Ｔ、又はＲであってよく；Ｘ１８は、Ｒ、Ｔ、Ｐ、又はＫであってよく；Ｘ１９は、Ｎ又はＡであってよく；Ｘ２０は、Ｇ又はＡであってよく；Ｘ２１は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ２２は、Ｉ、Ｖ、又はＭであってよく；Ｘ２３は、Ｇ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ２４は、Ｋ、Ｌ、又はＲであってよく；Ｘ２５は、Ｙ、Ｄ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ２６は、Ｙ又はＦであってよく；Ｘ２７は、Ｐ、Ｓ、又は無であってよい）
を含む配列を有し得る。
【０１４６】
一部の実施形態では、配列番号１６７〜配列番号１７１又は配列番号１７２〜配列番号１７６のいずれか１つは、還元耐性であり得る。一部の実施形態では、配列番号１６７〜配列番号１７１又は配列番号１７２〜配列番号１７６のいずれか１つは、１又は複数種のペプチダーゼに対しても耐性であり得る。一部の実施形態では、配列番号１６７〜配列番号１７１又は配列番号１７２〜配列番号１７６のいずれか１つは、高温に対しても耐性であり得る。一部の実施形態では、配列番号１６９〜配列番号１７４のいずれか１つは、トリプシン耐性であり得る。
【０１４７】
一部の実施形態では、ペプチド内のジスルフィド結合の数は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６であってよい。
【０１４８】
一部の事例では、ペプチドは、１個のリシン残基のみ含有してもよいし、又はリシン残基を全く含有しなくてもよい。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも２個のリシン残基を含む。いくつかの事例では、ペプチド中のリシン残基の一部又は全部がアルギニン残基で置換される。いくつかの事例では、ペプチド中のメチオニン残基の一部又は全部が、ロイシン又はイソロイシンで置換される。ペプチド中のトリプトファン残基の一部又は全部をフェニルアラニン又はチロシンで置換することもできる。いくつかの事例では、ペプチド中のアスパラギン残基の一部又は全部が、グルタミンで置換される。一部の実施形態では、アスパラギン酸残基の一部又は全部が、グルタミン酸残基で置換される。いくつかのケースでは、ペプチドのＮ末端が、例えば、アセチル基などにより、遮断される。これに代わり、又は組み合わせて、いくつかの事例では、ペプチドのＣ末端が、アミド基などにより、遮断される。一部の実施形態では、ペプチドは、遊離アミンでのメチル化により修飾される。例えば、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元的メチル化の使用により完全なメチル化を達成することができる。
【０１４９】
一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４０に示されるように、ロイシン−Ｘ１−Ｘ２−ロイシン−フェニルアラニン（「ＬＸ１Ｘ２ＬＦ」、配列番号１７８）（Ｘ１及びＸ２は、任意のアミノ酸残基であってよい）の配列モチーフ、又はその変異体を含む。他の実施形態では、核酸、ベクター、プラスミド、又はドナーＤＮＡは、本開示のペプチド、その変異体又は断片をコードする配列を含む。
【０１５０】
いくつかのケースでは、最初の２つのＮ末端アミノ酸は、配列番号１〜配列番号８３若しくは配列番号１６７〜配列番号１７１に示されるように、ＧＳであるか、又は、配列番号８４〜配列番号１６６若しくは配列番号１７２〜配列番号１７６に示されるように、こうしたＮ末端アミノ酸（ＧＳ）は存在しないか、又は任意の他の１若しくは２個のアミノ酸で置換されてもよい。いくつかのケースでは、最初の２つのＮ末端アミノ酸は、配列番号１〜配列番号８３若しくは配列番号１６７〜配列番号１７１に示されるように、ＧＳであるか、又は、配列番号８４〜配列番号１６６若しくは配列番号１７２〜配列番号１７６に示されるように、こうしたＮ末端アミノ酸（ＧＳ）は存在しないか、又はアミノ酸ＧＧで置換されてもよい。
【０１５１】
いくつかのケースでは、ペプチドのＣ末端Ａｒｇ残基は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌなどの別の残基に修飾される。例えば、ペプチドのＣ末端Ａｒｇ残基は、Ｉｌｅに修飾される。あるいは、ペプチドのＣ末端Ａｒｇ残基は、任意の非天然アミノ酸に修飾される。この修飾は、重要な水素結合の維持を依然として可能にしながら、治療中を含め、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの発現、合成、プロセシング、貯蔵中のＣ末端残基の切断を予防することができる。重要な水素結合は、初期折り畳み核形成中に形成される水素結合であってよく、これは、初期ヘアピンの形成に重要である。
【０１５２】
いくつかのケースでは、ペプチドは、配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つの配列を含む。ペプチドは、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６残基長、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、又は少なくとも８１残基長の、配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つの連続した断片を含む断片であってもよく、ここで、ペプチド断片は、ペプチドの任意の部分から選択される。一部の実施形態では、ペプチド配列は、別のアミノ酸によって隣接されている。１又は複数個の別のアミノ酸が、例えば、所望のｉｎ  ｖｉｖｏ電荷、等電点、化学結合部位、安定性、又は生理学的特性をペプチドに付与することができる。
【０１５３】
本開示のペプチドは、負荷電アミノ酸残基をさらに含んでもよい。いくつかのケースでは、ペプチドは、２個以下の負アミノ酸残基を有する。別のケースでは、ペプチドは、４個以下の負アミノ酸残基、３個以下の負アミノ酸残基、又は１個以下の負アミノ酸残基を有する。負アミノ酸残基は、任意の負荷電アミノ酸残基から選択することができる。負アミノ酸残基は、Ｅ若しくはＤのいずれか、又はＥとＤ両方の組合せから選択することができる。
【０１５４】
本開示のペプチドは、塩基性アミノ酸残基をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、生理的ｐＨでの電荷を高めるために、塩基性残基をペプチド配列に付加する。付加された塩基性残基は、任意の塩基性アミノ酸であってよい。付加される塩基性残基は、Ｋ若しくはＲ、又はＫ若しくはＲの組合せから選択することができる。
【０１５５】
一部の実施形態では、ペプチドは、酸性領域及び塩基性領域を含む電荷分布を有する。酸性領域は、ナブ（ｎｕｂ）である。ナブは、ペプチドの３次元構造から延びるペプチドの１部分である。塩基性領域は、パッチである。パッチは、ペプチドの３次元構造のいずれの明確なトポロジー特徴も示さないペプチドの１部分である。別の実施形態では、ノッテッドペプチドは、６個以上の塩基性残基及び２個以下の酸性残基であってよい。
【０１５６】
本開示のペプチドは、正荷電アミノ酸残基をさらに含んでもよい。いくつかのケースでは、ペプチドは、少なくとも１個の正荷電残基を有する。いくつかのケースでは、ペプチドは、少なくとも２個の正荷電残基を有する。いくつかのケースでは、ペプチドは、少なくとも３個の正荷電残基を有する。別のケースでは、ペプチドは、少なくとも４個の正荷電残基、少なくとも５個の正荷電残基、少なくとも６個の正荷電残基、少なくとも７個の正荷電残基、少なくとも８個の正荷電残基、又は少なくとも９個の正荷電残基を有する。正荷電残基は、任意の正荷電アミノ酸残基から選択することができるが、一部の実施形態では、正荷電残基は、Ｋ、若しくはＲのいずれか、又はＫ及びＲ両方の組合せから選択される。
【０１５７】
本開示のペプチドは、中性アミノ酸残基をさらに含んでもよい。いくつかのケースでは、ペプチドは、３５個以下の中性アミノ酸残基を有する。別の実施形態では、ペプチドは、８１個以下の中性アミノ酸残基、７０個以下の中性アミノ酸残基、６０個以下の中性アミノ酸残基、５０個以下の中性アミノ酸残基、４０個以下の中性アミノ酸残基、３６個以下の中性アミノ酸残基、３３個以下の中性アミノ酸残基、３０個以下の中性アミノ酸残基、２５個以下の中性アミノ酸残基、又は１０個以下の中性アミノ酸残基を有する。
【０１５８】
本開示のペプチドは、負アミノ酸残基をさらに含んでもよい。いくつかのケースでは、ペプチドは、６個以下の負アミノ酸残基、５個以下の負アミノ酸残基、４個以下の負アミノ酸残基、３個以下の負アミノ酸残基、２個以下の負アミノ酸残基、又は１個以下の負アミノ酸残基を有する。負アミノ酸残基は、任意の中性荷電アミノ酸残基から選択することができるが、一部の実施形態では、負アミノ酸残基は、Ｅ、若しくはＤのいずれか、又はＥ及びＤ両方の組合せから選択される。
【０１５９】
生理的ｐＨで、ペプチドは、例えば、−５、−４、−３、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、又は＋５の正味電荷を有し得る。正味電荷がゼロのとき、ペプチドは、非荷電であるか、又は双性イオン性であり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、１つ以上のジスルフィド結合を含み、生理的ｐＨで正の正味電荷を有しており、ここで、正味電荷は、＋０．５以下、＋１以下、＋１．５以下、＋２以下、＋２．５以下、＋３以下、＋３．５以下、＋４以下、＋４．５以下、＋５以下、＋５．５以下、＋６以下、＋６．５以下、＋７以下、＋７．５以下、＋８以下、＋８．５以下、＋９又は＋９．５未満、＋１０以下であってよい。一部の実施形態では、ペプチドは、生理的ｐＨで負の正味電荷を有しており、ここで、正味電荷は、−０．５以下、−１以下、−１．５以下、−２以下、−２．５以下、−３以下、−３．５以下、−４以下、−４．５以下、−５以下、−５．５以下、−６以下、−６．５以下、−７以下、−７．５以下、−８以下、−８．５以下、−９又は−９．５未満、−１０以下であってよい。いくつかのケースでは、ペプチド内の１若しくは複数の突然変異の操作によって、生理的ｐＨで、改変された等電点、電荷、表面電荷、又はレオロジーを備えたペプチドが得られる。サソリ又はクモに由来するペプチドの突然変異のこうした操作は、例えば、正味電荷を１、２、３、４、若しくは５低減するか、または正味電荷を１、２、３、４、若しくは５増加することによって、複合体の正味電荷を変更することができる。このようなケースでは、操作された突然変異は、ペプチドが、インタクトなまま胃腸管を通過する能力、血清若しくは身体の他のコンパートメント中で、より長い半減期を有する能力、又は細胞内環境で二次若しくは三次構造を維持する能力を促進することができる。ペプチドのレオロジー及び効力を改善するための好適なアミノ酸修飾は、保存的変異又は非保存的変異を含み得る。ペプチドは、ペプチドが由来する毒液若しくは毒素、成分の配列と比較して、多くとも１つのアミノ酸変異、多くとも２つのアミノ酸変異、多くとも３つのアミノ酸変異、多くとも４つのアミノ酸変異、多くとも５つのアミノ酸変異、多くとも６つのアミノ酸変異、多くとも７つのアミノ酸変異、多くとも８つのアミノ酸変異、多くとも９つのアミノ酸変異、多くとも１０のアミノ酸変異、又はそれ以外の好適な数のアミノ酸変異を含み得る。一部の実施形態では、変異は、ジスルフィド結合の間の単一ループ内であってもよいし、又は複数のループ内であってもよい。他の実施形態では、変異は、薬物動態若しくは生体内分布特性を改善するか、又は生物活性を付加、増強、若しくは低減することができる。その他のケースでは、ペプチド、又はその機能性断片は、ペプチドが由来する毒液、毒素、若しくは天然成分の配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異、少なくとも２つのアミノ酸変異、少なくとも３つのアミノ酸変異、少なくとも４つのアミノ酸変異、少なくとも５つのアミノ酸変異、少なくとも６つのアミノ酸変異、少なくとも７つのアミノ酸変異、少なくとも８つのアミノ酸変異、少なくとも９つのアミノ酸変異、少なくとも１０のアミノ酸変異、又はそれ以外の好適な数のアミノ酸変異を含む。一部の実施形態では、変異は、生理的ｐＨで所望の電荷又は安定性を有するペプチドを提供するために、ペプチド内で操作することができる。
【０１６０】
一般に、ＮＭＲ溶液構造、Ｘ線結晶構造、並びに関連構造ホモログの一次構造配列アラインメントを使用して、特定の生物学的機能を維持しながら、折り畳み、安定性、及び／又は製造可能性を改善し得る変異戦略を形作ることができる。これらを使用して、構造的に相同のスカフォールドの１群の３Ｄファーマコフォアを予測すると共に、改善された特性を備えるキメラを作製するために関連タンパク質の可能な移植領域を予測することができる。ホモログを生成するための一般的な戦略としては、タンパク質の荷電表面パッチの同定、重要なアミノ酸位置及びループの変異、並びに配列の試験を挙げることができる。この戦略を用いて、改善された特性を有するペプチドを設計する、又は折り畳み及び製造可能性を困難にする有害な変異を修正することができる。これらの重要なアミノ酸位置及びループは保持しながら、ペプチドの機能、ホーミング、及び活性を改善、変更、除去、若しくは別に修飾するために、ペプチド配列の他の残基を変異させることができる。本開示のいくつかのペプチドの結晶構造は解明されており、それを用いて、本明細書に記載のように、ペプチド機能を修飾することができる。
【０１６１】
また、ＴＥＰＩＴＯＰＥ及びＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎにより予測される免疫原性情報などの免疫原性情報に基づいて、改善されたペプチドを作製することもできる。ＴＥＰＩＴＯＰＥは、位置特異的スコアリングマトリックスを用いて、ペプチドが、５１の異なるＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合するか否かについての予測法則を提供する計算論的アプローチであり、ＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎは、ＴＥＰＩＴＯＰＥを用いて、ポケット類似性に基づく未知の結合特異性を有するＨＬＡ−ＤＲ分子に対して既知の結合特異性を有するＨＬＡ−ＤＲ分子から補外する方法である。例えば、ＴＥＰＩＴＯＰＥ及びＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎを使用して、改善された安定性を有するペプチドの免疫原性を決定することができる。免疫原性が高いペプチドと免疫原性が低いペプチドとの比較によって、免疫原性が低減した安定な変異体を設計するための操作戦略を誘導することができる。
【０１６２】
さらに、２つ以上のペプチドの一次配列と三次配列の比較を用いて、ペプチドを改善するために活用することができる配列及び３Ｄ折り畳みパターンを明らかにすると共に、これらのペプチドの生物活性を説明することができる。例えば、還元耐性又はプロテアーゼ耐性である２つの異なるペプチドスカフォールドを比較することにより、耐性及び安定性が改善された変異体を設計するなどの操作戦略を誘導することができる保存的ファーマコフォアの同定を達成することができる。
【０１６３】
本開示はまた、本明細書に記載する様々なペプチドの多量体も包含する。多量体の例として、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体などが挙げられる。多量体は、複数の同一サブユニットから形成されるホモマー又は複数の異なるサブユニットから形成されるヘテロマーであってよい。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも１つの別のペプチド、又は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれ以上の別のペプチドと一緒に多量体構造に配置される。特定の実施形態では、多量体構造のペプチドは、各々同じ配列を有する。別の実施形態では、多量体構造のペプチドの一部若しくは全部は、異なる配列を有する。
【０１６４】
本開示はさらに、例えば、別のペプチドを作製するための出発点として使用することができるペプチドスカフォールドも提供する。一部の実施形態では、これらのスカフォールドは、様々なノッテッドペプチド又はノッティンから得ることができる。スカフォールドのためのいくつかの好適なペプチドとして、限定されないが、クロロトキシン、ブラゼイン、サーキュリン、ストレクリスプ、ハナトキシン、ミドキン、ヘフトキシン、ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤、バブルタンパク質、アトラクチン、α−ＧＩ、α−ＧＩＤ、μ−ＰＩＩＩＡ、ω−ＭＶＩＩＡ、ω−ＣＶＩＤ、χ−ＭｒＩＡ、ρ−ＴＩＡ、コナントキンＧ、コンツラキンＧ、ＧｓＭＴｘ４、マルガトキシン、ｓｈＫ、毒素Ｋ、及びＥＧＦエピレグリンコアを含み得る。
【０１６５】
２つ以上のペプチドは、ある程度の配列同一性又は相同性を有し得、ｉｎ  ｖｉｖｏで類似の特性を有し得る。例えば、ペプチドは、配列番号１〜配列番号１６６のペプチドのいずれか１つとある程度の配列同一性又は相同性を有し得る。いくつかのケースでは、１つまたは複数の本開示のペプチドは、最大約２０％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約２５％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約３０％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約３５％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約４０％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約４５％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約５０％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約５５％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約６０％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約６５％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約７０％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約７５％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約８０％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約８５％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約９０％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約９５％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約９６％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約９７％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約９８％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約９９％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約９９．５％のペアワイズ配列同一性又は相同性、最大約９９．９％のペアワイズ配列同一性又は相同性を有し得る。２つ以上のペプチド同士の相同性を決定するために、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅ、又は別の好適な方法若しくはアルゴリズムなどの様々な方法及びソフトウエアプログラムを使用することができる。
【０１６６】
２つの生物学的配列（タンパク質若しくは核酸）同士の機能的、構造的及び／又は進化的関係を示し得る類似性の領域を見出すために、ペアワイズ配列アラインメントを用いる。対照的に、多重配列アラインメント（ＭＳＡ）は、３つ以上の生物学的配列のアラインメントである。ＭＳＡ適用のアウトプットから、相同性を推定することができ、配列同士の進化的関係を評価することができる。当業者であれば、本明細書で使用されるとき、「配列相同性」及び「配列同一性」及び「配列同一性パーセント（％）」及び「配列相同性パーセント（％）」は、置き換え可能に使用され、場合に応じて、参照ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列に対する配列関連性又は変化を意味することを理解するであろう。
【０１６７】
いくつかの事例では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つ又はその機能性断片である。別の実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つに対して９９％、９５％、９０％、８５％、若しくは８０％の配列同一性又は相同性を有するペプチド又はその断片をさらに含む。
【０１６８】
別の事例では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つに対して相同的なペプチド又はその機能性断片である。「相同的な」という用語は、本明細書では、配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つの配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは９５％超の配列同一性又は相同性を有するペプチド又はその機能性断片を意味するために使用される。
【０１６９】
さらに別の事例では、配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つのペプチドの変異型核酸分子は、コードされたペプチドアミノ酸配列と、配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つのアミノ酸配列との配列同一性又は相同性の決定、又は核酸ハイブリダイゼーションアッセイのいずれかによって同定することができる。こうしたペプチド変異体は、（１）洗浄ストリンジェンシーが、５５〜６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．５×〜２×ＳＳＣと同等である、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つのヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズしたままであり、且つ（２）配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは９５％超の配列同一性又は相同性を有するペプチドをコードする核酸分子を含み得る。あるいは、配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つのペプチドの変異体は、（１）洗浄ストリンジェンシーが、５０〜６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．１×〜０．２×ＳＳＣと同等である、高度にストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つのヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズしたままであり、且つ（２）配列番号１〜配列番号１６６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは９５％超の配列同一性又は相同性を有するペプチドをコードする核酸分子として特徴付けされ得る。
【０１７０】
配列同一性又は相同性パーセントは、従来の方法によって決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３（１９８６），及びＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９９２）を参照されたい。手短には、ギャップ開始ペナルティ：１０、ギャップ伸長ペナルティ：１、及びＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（同上）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを用いて、アラインメントスコアを最適化するように、２つのアミノ酸配列をアラインメントする。次に、配列同一性又は相同性を以下のように計算する：［同一マッチの総数］／［長い方の配列の長さと、２つの配列をアラインメントするために長い方の配列に導入されたギャップの数］）（１００）。
【０１７１】
さらに、２つのアミノ酸配列をアラインメントするために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがある。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示するペプチドのアミノ酸配列と、ペプチド変異体のアミノ酸配列によって共有される配列同一性又は相同性のレベルを調べるために好適なタンパク質アラインメント法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）、並びにＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）により記載されている。手短には、ＦＡＳＴＡは第１に、保存的アミノ酸置換、挿入、若しくは欠失を考慮せずに、クエリー配列（例えば、配列番号１）と、最も高い密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１の場合）又はペアの同一性（ｋｔｕｐ＝２の場合）を有する試験配列によって共有される領域を見出すことにより、配列類似性を特徴付ける。次に、アミノ酸置換マトリックスを用いて、全てのペア形成アミノ酸の類似性を比較することにより、最も高い密度の同一性を有する１０の領域を再スコアリングした後、最も高いスコアに寄与する残基だけを含むように、領域の末端を「トリミング」する。「カットオフ」値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予め決定された式により計算される）よりも大きいスコアを有する複数の領域がある場合、トリミングされた初期領域を調べることにより、これらの領域を結合して、ギャップと共に近似アラインメントを形成することができるか否かを決定する。最後に、２つのアミノ酸配列の最も高いスコアリング領域を、アミノ酸の挿入及び欠失を可能にするＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４（１９７０）；Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｓｉａｍ  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２６：７８７（１９７４））の改変を用いてアラインメントする。ＦＡＳＴＡ解析の例示的なパラメータは、以下：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝１、及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメータは、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２  ｏｆ  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を改変することにより、ＦＡＳＴＡプログラムに導入することができる。
【０１７２】
また、ＦＡＳＴＡは、上記に開示した比を用いて核酸分子の配列同一性又は相同性を決定するために使用することもできる。ヌクレオチド配列比較のために、ｋｔｕｐ値は、１〜６、好ましくは３〜６の範囲であってよく、最も好ましくは３であり、他のパラメータは前述の通りである。
【０１７３】
「保存的アミノ酸置換」である一般的なアミノ酸のいくつかの例を下記群の各々におけるアミノ酸同士の置換により例示する：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（３）セリン及びトレオニン、（４）アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩、（５）グルタミン及びアスパラギン、並びに（６）リシン、アルギニン及びヒスチジン。ＢＬＯＳＵＭ６２表は、タンパク質配列セグメントの約２，０００のローカル多重アラインメントから得られたアミノ酸置換マトリックスであり、５００を超える群の関連タンパク質の高度に保存された領域を表している（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９９２））。従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列に導入することができる保存的アミノ酸置換を定義することができる。化学的特性（上で述べた通り）だけに基づいてアミノ酸置換を設計することは可能だが、「保存的アミノ酸置換」という表現は、好ましくは、−１より大きいＢＬＯＳＵＭ６２値で表される置換を指す。例えば、置換が、０、１、２、又は３のＢＬＯＳＵＭ６２値を特徴とする場合、アミノ酸置換は保存的である。この系によれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２、又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値を特徴とするが、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値を特徴とする。
【０１７４】
構造完全性を維持するために重要な領域又はドメイン内にあるアミノ酸残基の決定を決定することができる。これらの領域内で、多かれ少なかれ変化に対して耐性であり、しかも、分子の三次構造全体を維持し得る特定の残基を決定することができる。配列構造を解析する方法として、限定されないが、高度アミノ酸若しくはヌクレオチド同一性又は相同性を有する複数の配列のアラインメントと利用可能なソフトウエア（例えば、ｔｈｅ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ．ＲＴＭ．ｖｉｅｗｅｒ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ；ＭＳＩ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を用いたコンピュータ解析、二次構造特性、バイナリーパターン、相補的パッキング及び埋込み型極性相互作用（Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３７２−６（１９９５）ａｎｄ  Ｃｏｒｄｅｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：３−１０（１９９６））が挙げられる。一般に、分子に対する修飾を設計する、又は特定の断片を同定する場合、構造の決定は、典型的に、修飾分子の活性を評価することにより達成することができる。
【０１７５】
化学的修飾
１つまたは複数の様々な方法でペプチドを化学的に修飾することができる。一部の実施形態では、機能を付加する、機能を欠失させる、又はｉｎ  ｖｉｖｏ挙動を修飾するために、ペプチドを変異させることができる。他のペプチド（例えば、Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０３，ｐ．２２３−２５１，２０１２に記載されているものなど）からの活性要素を含有するように、ジスルフィド結合間の１つまたは複数のループを修飾又は置換することができる。さらに、半減期を延長する、ｉｎ  ｖｉｖｏで結合挙動を改変、付加若しくは欠失させる、新たなターゲティング機能を追加する、表面電荷及び疎水性を改変する、又は共役部位を賦与するために、アミノ酸を変異させることもできる。Ｎ−メチル化は、本開示のペプチドに実施可能なメチル化の１例である。一部の実施形態では、ペプチドは、遊離アミンに対するメチル化によって修飾される。例えば、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元性メチル化の使用によって、完全なメチル化を達成することができる。
【０１７６】
化学的修飾は、例えば、ペプチドの半減期を延長するか、又は生体内分布若しくは薬物動態プロフィールを変化させ得る。化学的修飾は、ポリマー、ポリエステル、ポリエチレングリコール、バイオポリマー、ポリアミノ酸、脂肪酸、デンドリマー、Ｆｃ領域、パルミテート若しくはミリストレートなどの単純な飽和炭素鎖、又はアルブミンを含み得る。ポリアミノ酸としては、例えば、反復単一アミノ酸を含むポリアミノ酸配列（例えば、ポリグリシン）、並びにパターンに従っても従わなくてもよい混合型ポリアミノ酸配列を含むポリアミノ酸配列（例えば、ｇｌｙ−ａｌａ−ｇｌｙ−ａｌａ）、又はこれらの任意の組合せを挙げることができる。
【０１７７】
本開示のペプチドは、修飾がペプチドの安定性及び／又は半減期を増大するように、修飾することができる。Ｎ−末端、Ｃ−末端、又は内部アミノ酸などに対する、疎水性部分の結合を用いて、本開示のペプチドの半減期を延長することができる。また、ペプチドの腸管透過性又は細胞透過性を増大若しくは低減するように、ペプチドを修飾することもできる。本開示のペプチドは、例えば、血清半減期に作用し得る翻訳後修飾（例えば、メチル化及び／又はアミド化及び／又はグリコシル化）を含んでもよい。一部の実施形態では、単純な炭素鎖を（例えば、ミリストイル化及び／若しくはパルミチル化により）融合タンパク質又はペプチドに共役させることができる。単純な炭素鎖は、融合タンパク質又はペプチドを非共役材料から容易に分離可能にすることができる。例えば、非共役材料から融合タンパク質又はペプチドを分離するために使用することができる方法として、限定されないが、溶媒抽出及び逆相クロマトグラフィーが挙げられる。親油性部分は、血清アルブミンに対する可逆的結合によって、半減期を延長することができる。共役部分は、例えば、血清アルブミンとの可逆的結合によってペプチドの半減期を延長する親油性部分であってよい。一部の実施形態では、親油性部分は、コレステロール、又はコレステン、コレスタン、コレスタジエン及びオキシステロールなどのコレステロール誘導体であってよい。一部の実施形態では、ペプチドをミリスチン酸（テトラドデカン酸）又はその誘導体に共役させることができる。別の実施形態では、本開示のペプチドを半減期改変剤に結合（例えば、共役）することができる。半減期改変剤の例として、限定されないが、以下：ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、双性イオン性水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含有する水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸、又はアルブミンに結合する分子が挙げられる。
【０１７８】
一部の実施形態では、配列番号１〜配列番号８３又は配列番号１６７〜配列番号１７１の最初の２つのＮ−末端アミノ酸（ＧＳ）は、別の分子に対する共役若しくは融合を促進するために、さらには、そうした共役若しくは融合分子からのペプチドの切断を促進するために、スペーサ又はリンカーの役割を果たす。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質又はペプチドを、例えば、ペプチドの特性を改変するか、又は特性に変化をもたらし得る他の部分に共役させることができる。
【０１７９】
活性薬剤ペプチドコンジュゲート
本開示のペプチドは、腫瘍、並びに癌、脳疾患及び障害、軟骨障害、皮膚障害、肺障害、胃腸疾患及び障害、膣粘膜疾患、眼疾患、口腔疾患、又は他の粘膜疾患若しくは障害の治療に使用される薬剤と、共役又は融合させることができる。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載するペプチドを、機能性能力を賦与する活性薬剤などの別の分子に融合させる。活性薬剤の配列と一緒にペプチドの配列を含有するベクターの発現によって、ペプチドを活性薬剤と融合することができる。様々な実施形態では、ペプチドの配列と活性薬剤の配列は、同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＧ）から発現させることができる。様々な実施形態では、ペプチドの配列と活性薬剤の配列は、連続した配列を含んでもよい。ペプチドと活性薬剤は、個別に発現された場合のそれらの機能性能力と比較して、同様の機能性能力を融合ペプチド中でも各々保持し得る。特定の実施形態では、活性薬剤の例として、他のペプチドが含まれ得る。
【０１８０】
別の例として、特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、機能性能力を賦与する活性薬剤などの別の分子に結合される。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の活性薬剤をペプチドに連結させることができる。複数のリシン残基及び／又はＮ−末端との共役、又は複数の活性薬剤と、ポリマー若しくはデンドリマーなどのスカフォールドを連結した後、その薬剤−スカフォールドをペプチドに結合するなどの方法（例えば、Ｙｕｒｋｏｖｅｔｓｋｉｙ，Ａ．Ｖ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７５（１６）：３３６５−７２（２０１５）に記載のものなど）により、複数の活性薬剤を結合させることができる。活性薬剤の例として、限定されないが、以下のものが挙げられる：ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体フラグメント、アプタマー、サイトカイン、インターフェロン、ホルモン、酵素、成長因子、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＣＤ抗原、ケモカイン、神経伝達物質、イオンチャネル阻害剤、イオンチャネル活性剤、Ｇタンパク質共役受容体阻害剤、Ｇタンパク質共役受容体活性剤、化学薬剤、放射線増感剤、放射線防護体、放射性核種、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症薬、免疫モジュレータ、補体固定ペプチド若しくはタンパク質、腫瘍壊死因子阻害剤、腫瘍壊死因子活性剤、腫瘍壊死因子受容体ファミリーアゴニスト、腫瘍壊死受容体アンタゴニスト、Ｔｉｍ−３阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法薬、細胞傷害性分子、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、バイオポリマー、多糖、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ポリエチレングリコール、脂質、デンドリマー、脂肪酸、若しくはＦｃ領域、又はそれらの活性断片若しくは修飾物。一部の実施形態では、ペプチドは、例えば、直接又はリンカーを介して、活性薬剤に共有結合若しくは非共有結合される。例えば、用いることができる細胞傷害性分子としては、アウリスタチン、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ドロスタチン、アウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＤ、ＤＭＩ、ＤＭ４、メイタンシノイド、メイタンシン、カリケアミシン、Ｎ−アセチル−γ−カリケアミシン、ピロロベンゾジアゼピン、ＰＢＤ二量体、ドキソルビシン、ビンカアルカロイド（４−デアセチルビンブラスチン）、デュオカルマイシン、マッシュルームアマトキシンの環状オクタペプチド類似体、エポチロン、及びアントラサイクリン、ＣＣ−１０６５、タキサン、パクリタキセル、カバジタキセル、ドセタキセル、ＳＮ−３８、イリノテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、白金化合物、シスプラチン、メトトレキサート、及びＢＡＣＥ阻害剤が挙げられる。活性薬剤のその他の例は、ＭｃＣｏｍｂｓ，Ｊ．Ｒ．，ＡＡＰＳ  Ｊ，１７（２）：３３９−５１（２０１５），Ｄ���ｃｒｙ，Ｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（２０１３），及びＳｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．３２（１１）：３５４１−３５７１（２０１５）に記載されている。本明細書に記載の実施形態に使用するのに好適な例示的リンカーについては、以下にさらに詳しく述べる。
【０１８１】
抗体−薬物コンジュゲート（例えば、Ａｄｃｅｔｒｉｓ、Ｋａｄｃｙｌａ、Ｍｙｌｏｔａｒｇ）と比較して、いくつかの態様では、本明細書に記載の活性薬剤に共役したペプチドは、そのサイズが比較的小さいために固形腫瘍への優れた透過を発揮し得る。特定の態様では、本明細書に記載の活性薬剤に共役したペプチドは、抗体−薬物コンジュゲートと比較して、異なる用量又は高い用量の活性薬剤を担持することができる。また別の態様では、本明細書に記載の活性薬剤に共役したペプチドは、抗体−薬物コンジュゲートと比較して、規定薬物比率の優れた部位特異的送達を達成することができる。他の態様では、ペプチドは、有機溶媒（水に加えて）中での溶媒和を受けやすく、これによって、薬物（往々にして低水溶性である）の溶媒和及び共役の、より多くの合成経路及びより高い共役収率、ペプチドに共役する薬物のより高い比率（抗体と比較して）を可能にし、且つ／又は共役工程中の凝集体／高分子量種の形成を低減することができる。さらには、そうでなければ短い配列に存在しない残基、又は非天然アミノ酸の含有により、ユニークなアミノ酸残基をペプチドに導入して、ペプチドに対する部位特異的共役を可能にすることもできる。
【０１８２】
本開示のペプチド又は融合ペプチドは、例えば、組織若しくは体液からのペプチド回収のためのアフィニティハンドル（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈａｎｄｌｅ）を提供するなど、他の役割を果たし得る別の部分（例えば、ビオチン）に共役させることもできる。例えば、本開示のペプチド又は融合ペプチドは、ビオチンに共役させることもできる。半減期の延長に加えて、ビオチンは、組織又は別の位置からのペプチド又は融合ペプチド回収のためのアフィニティハンドルとしても作用し得る。一部の実施形態では、検出可能な標識及びアフィニティハンドルの両方として作用し得る蛍光ビオチンコンジュゲートを使用することができる。市販の蛍光ビオチンコンジュゲートの非限定的な例として、以下のものを挙げることができる：Ａｔｔｏ  ４２５−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｔｔｏ  ４８８−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｔｔｏ  ５２０−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｔｔｏ−５５０  Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｔｔｏ  ５６５−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｔｔｏ  ５９０−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｔｔｏ  ６１０−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｔｔｏ  ６２０−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｔｔｏ  ６５５−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｔｔｏ  ６８０−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｔｔｏ  ７００−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｔｔｏ  ７２５−Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｔｔｏ  ７４０−Ｂｉｏｔｉｎ、フルオレセインビオチン、ビオチン−４−フルオレセイン、ビオチン−（５−フルオレセイン）コンジュゲート、及びビオチン−Ｂ−フィコエリスリン、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８ビオシチン、Ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５４９、ルシファー・イエロー・カダベリン・ビオチン（ｌｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ  ｂｉｏｔｉｎ）−Ｘ、ルシファー・イエロー・ビオシチン（Ｌｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ  ｂｉｏｃｙｔｉｎ）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ）４８８ビオシチン、ビオチン−ローダミン及びテトラメチルローダミンビオシチン。いくつかの他の例では、コンジュゲートは、化学発光化合物、コロイド金属、発光化合物、酵素、放射性同位体、及び常磁性標識を含んでもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、別の分子に結合してもよい。例えば、ペプチド配列を別の活性薬剤（例えば、小分子、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、アプタマー、サイトカイン、成長因子、神経伝達物質、これらの物質いずれかの活性断片若しくは修飾物、蛍光団、放射性同位体、放射性核種キレート剤、アシル付加物、化学リンカー、又は糖）に結合させることもできる。一部の実施形態では、ペプチドを活性薬剤に融合、又は共有若しくは非共有結合させることができる。
【０１８３】
加えて、毒素又は毒液ノッティンタンパク質由来の２つ以上のペプチド配列が、特定のペプチドに存在してもよいし、又はそれと融合させてもよい。様々な技術により、ペプチドを生体物質中に組み込むことができる。ペプチドは、アミド結合といった共有結合の形成などの化学変換により組み込むことができる。ペプチドは、例えば、固相又は溶液相ペプチド合成により組み込むことができる。ペプチドは、生体分子をコードする核酸配列を調製することによって組み込むことができ、ここで、核酸配列は、ペプチドをコードする部分配列を含む。この部分配列は、生体分子をコードする配列に加えて存在してもよいし、又は生体分子をコードする配列の部分配列を置換するために用いてもよい。
【０１８４】
検出可能物質ペプチドコンジュゲート
イメージング、研究、治療薬、画像診断法（ｔｈｅｒａｎｏｔｉｃｓ）、医薬品、化学療法、キレーション療法、標的薬物送達、及び放射線療法で使用される薬剤とペプチドを共役させることができる。一部の実施形態では、蛍光団、近赤外色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、金属、放射性同位体、色素、放射性核種キレート剤、又はイメージングに使用することができる別の好適な材料などの検出可能な物質とペプチドを共役、若しくは融合させる。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種の検出可能な物質をペプチドに連結させることができる。放射性同位体の非限定的な例として、α放射体、β放射体、陽電子放射体、及びγ放射体が挙げられる。一部の実施形態では、金属又は放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユーロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、及びイットリウムからなる群から選択される。一部の実施形態では、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、又はイットリウムである。一部の実施形態では、放射性同位体は、アクチニウム−２２５又は鉛−２１２である。一部の実施形態では、近赤外色素は、生体組織及び体液によって容易にクエンチングされない。一部の実施形態では、蛍光団は、６５０ｎｍ〜４０００ｎｍの波長で電磁放射を放出する蛍光剤であり、こうした放射を用いてそのような物質を検出する。本開示で共役分子として使用することができる蛍光色素の非限定的な例として、ＤｙＬｉｇｈｔ−６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ−７５０、ＶｉｖｏＴａｇ−７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ−８００、ＩＲＤｙｅ−８００、ＶｉｖｏＴａｇ−６８０、Ｃｙ５．５、又はインドシアニングリーン（ＩＣＧ）が挙げられる。一部の実施形態では、近赤外色素は、シアニン色素（例えば、Ｃｙ７、Ｃｙ５．５、及び、Ｃｙ５）を含有することが多い。本開示で共役分子として使用される蛍光色素のさらに別の非限定的な例として、以下のものが挙げられる：アクラジンオレンジ若しくはイエロー、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７９０、７５０、７００、６８０、６６０、及び６４７）及びそれらの任意の誘導体、７−アクチノマイシンＤ、８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸、ＡＴＴＯ色素及びそれらの任意の誘導体、オーラミン−ローダミン染色剤及びその任意の誘導体、ベンサントロン、ビマン、９−１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、５，１２−ビス（フェニルエチニル）ナフタセン、ビスベンズイミド、ブレインボー（ｂｒａｉｎｂｏｗ）、カルセイン、カルボジフルオレセイン及びその任意の誘導体、１−クロロ−９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン及びその任意の誘導体、ＤＡＰＩ、ＤｉＯＣ６、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒｓ及びその任意の誘導体、エピコッコノン、エチジウムブロマイド、ＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２、Ｆｌｕｏ色素及びその任意の誘導体、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅ及びその任意の誘導体、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ及びその任意の誘導体、Ｆｕｒａ及びその任意の誘導体、ＧｅｌＧｒｅｅｎ及びその任意の誘導体、ＧｅｌＲｅｄ及びその任意の誘導体、蛍光タンパク質及びそれらの任意の誘導体、ｍアイソフォームタンパク質及びそれらの任意の誘導体（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙなど）、ヘタメチン色素及びその任意の誘導体、ｈｏｅｓｃｈｓｔ染色剤、イミノクマリン、インディアンイエロー、インド−１及びその任意の誘導体、ラウルダン、ルシファーイエロー及びその任意の誘導体、ルシフェリン及びその任意の誘導体、ルシフェラーゼ及びその任意の誘導体、メルコシアニン及びその任意の誘導体、ナイル（ｎｉｌｅ）色素及びその任意の誘導体、ペリレン、フロキシン、フィコ色素及びその任意の誘導体、ヨウ化プロピウム、ピラニン、ローダミン及びその任意の誘導体、ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ、ＲｏＧＦＰ、ルブレン、スチルベン及びそれらの任意の誘導体、スルホローダミン及びその任意の誘導体、ＳＹＢＲ及びその任意の誘導体、シナプト−ｐＨルオリン、テトラフェニルブタジエン、テトラナトリウムｔｒｉｓ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｔｉｔａｎ  Ｙｅｌｌｏｗ、ＴＳＱ、ウンベリフェロン、ビオラントロン、黄色蛍光タンパク質及びＹＯＹＯ−１。他の好適な蛍光色素として、限定されないが、以下のものが挙げられる：蛍光及び蛍光色素（例えば、蛍光イソチオシアニン若しくはＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン若しくはＦＡＭなど）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィコエリスリン、エリスロシン、エオシン、ローダミン色素（例えば、カルボキシテトラメチル−ローダミン若しくはＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）など）、クマリン及びクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）など）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｙｅ（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４など）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ、ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＲＥＤ、ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＧＲＥＥＮ、シアニン色素（例えば、ＣＹ−３、Ｃｙ−５、ＣＹ−３．５、ＣＹ−５．５など）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ色素（例えば、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６８０など）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、Ｂ���ＤＩＰＹ  ６５０／６６５など）、ＩＲＤｙｅ（例えば、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ  ７００、ＩＲＤ  ８００など）など。さらに別の好適な検出可能な物質は、米国特許第１４／５６１７７号明細書に記載されている。放射性同位体の非限定的な例として、α放射体、β放射体、陽電子放射体、及びγ放射体が挙げられる。一部の実施形態では、金属又は放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユーロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、及びイットリウムからなる群から選択される。一部の実施形態では、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、又はイットリウムである。一部の実施形態では、放射性同位体は、アクチニウム−２２５又は鉛−２１２である。
【０１８５】
ペプチドを放射線増感剤又は光増感剤に共役させることもできる。放射線増感剤の例として、限定されないが、以下：ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−１９９、ＷＥＨＩ−５３９、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、エタニダゾール、ミソニダゾール、チラパザミン、及び核酸塩基誘導体（例えば、５−フルオロデオキシウリジンなどのハロゲン化プリン若しくはピリミジン）が挙げられる。光増感剤の例として、限定されないが、以下のものが挙げられる：光を当てると熱を生じる蛍光分子若しくはビーズ、ナノ粒子、ポルヒリン及びポルヒリン誘導体（例えば、クロリン、バクテリオクロリン、イソバクテリオクロリン、フタロシアニン、及びナフタロシアニン）、メタロポルフィリン、メタロフタロシアニン、アンゲリシン、カルコゲナピリリウム色素、クロロフィル、クマリン、フラビン並びにアロキサジン及びリボフラビンなどの関連化合物、フレレン、フェオホルビド、ピロフェオホルビド、シアニン（例えば、メロシアニン５４０）、フェオフィチン、サフィリン、テキサフィリン、プルプリン、ポリフィセン、フェノチアジニウム、メチレンブルー誘導体、ナフタルイミド、ナイルブルー誘導体、キノン、ペリレンキノン（例えば、ヒペリシン、ヒポクレリン、及びセルコスポリン）、ソラレン、キノン、レチノイド、ローダミン、チオフェン、ベルジン、キサンテン色素（例えば、エオシン、エリスロシン、ローズベンガル）、ポリフィリンの二量体及びオリゴマー形態、並びに５−アミノレブリン酸などのプロドラッグ。有利には、このアプローチは、治療薬（例えば、薬剤）と電磁気エネルギー（例えば、放射線又は光）の両方を同時に用いた、疾患細胞（例えば、癌細胞）の高度に特異的なターゲティングを可能にする。一部の実施形態では、ペプチドを薬剤と融合させるか、又は薬剤に共有結合させる、又は例えば直接若しくはリンカーを介して非共有結合させる。本明細書に記載の実施形態での使用に好適な例示的リンカーについては、以下にさらに詳しく述べる。
【０１８６】
リンカー
本開示のペプチドは、小分子、第２のペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、蛍光団、放射性同位体、放射性核種キレート剤、ポリマー、バイオポリマー、脂肪酸、アシル付加物、化学リンカー、若しくは糖又は本明細書に記載される他の活性薬剤若しくは検出可能な物質などの別の部分（例えば、活性薬剤若しくは検出可能な物質）と、リンカーを介して、又はリンカーの非存在下で直接結合することができる。リンカーの非存在下で、例えば、活性薬剤若しくは検出可能な物質をペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合させて、活性薬剤若しくは検出可能な物質との融合ペプチドを生成することができる。他の実施形態では、還元性アルキル化を介したペプチド融合物により結合を達成することができる。
【０１８７】
直接結合は、ペプチドと他の分子の１領域の共有結合によっても可能である。例えば、活性薬剤若しくは検出可能な物質をペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合させて、活性薬剤若しくは検出可能な物質との融合ペプチドを生成することができる。別の例として、ペプチドのＮ末端又はＣ末端と活性薬剤若しくは検出可能な物質との間に、ペプチドリンカーを挿入することができ、ここで、ペプチドリンカーは、１〜３０アミノ酸残基であってよく、（ＧＧＧＳ）Ｘ（Ｘは、１〜７の任意の整数であり得る）を含み得る。別の例として、ペプチドをＮ末端、内部リジン、グルタミン酸、若しくはアスパラギン酸残基で、又はＣ末端で、リンカーにより、他の分子のアミノ酸配列の末端に結合することができる。結合が内部リジン残基でなされる場合、他の分子は、内部リジン残基のεアミンでペプチドに連結することができる。いくつかの別の例では、リジン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基、又はグルタミン酸残基の側鎖などの側鎖により、ペプチドを他の分子に結合することができる。リンカーは、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カルバメート結合、カーボネート結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、巨大環、オキシム結合、チオエステル結合、チオエーテル結合  ヒドラゾン結合、炭素−炭素単一、二重、若しくは三重結合、ジスルフィド結合、２つのシステイン間の２炭素架橋、２つのシステイン間の３炭素架橋、又はチオエーテル結合であってよい。また別の実施形態では、ペプチドは、非天然アミノ酸を含み、非天然アミノ酸は、挿入物、付加物、若しくは別のアミノ酸の置換物であってもよく、ペプチドは、非天然アミノ酸でリンカーにより活性薬剤に連結することができる。一部の実施形態では、開示されるペプチド自体の類似領域（例えば、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カルバメート結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、巨大環、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素−炭素単一、二重、若しくは三重結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、又は本明細書に記載の他のリンカーを介した、アミノ酸配列の末端、リジン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基、若しくはグルタミン酸残基の側鎖などのアミノ酸側鎖）を用いて、他の分子に連結することができる。
【０１８８】
リンカーを介した結合は、他の分子とペプチド間へのリンカー部分の組込みを含む。ペプチドと他の分子の両方をリンカーに共有結合することができる。リンカーは、切断可能、切断不可能、自壊的、親水性、又は疎水性のいずれであってもよい。リンカーは、少なくとも２つの官能基、他の分子に結合したもの、及びペプチドに結合したもの、並びに２つの官能基間の連結部分を有する。いくつかのリンカー例が、Ｊａｉｎ，Ｎ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．３２（１１）：３５２６−４０（２０１５），Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｓ．Ｏ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ．１９（１０）：１９６０−３（２００８），Ｐｉｌｌｏｗ，Ｔ．Ｈ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．５７（１９）：７８９０−９（２０１４），Ｄｏｒｙｗａｌｋｓａ，Ｍ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ．２６（４）：６５０−９（２０１５），Ｋｅｌｌｏｇｇ，Ｂ．Ａ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ．２２（４）：７１７−２７（２０１１），及びＺｈａｏ，Ｒ．Ｙ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．５４（１０）：３６０６−２３（２０１１）に記載されている。
【０１８９】
結合用の官能基の非限定的な例として、例えば、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カーボネート結合、カルバメート結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、巨大環、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素−炭素単一、二重、若しくは三重結合、ジスルフィド結合又はチオエーテル結合を形成することができる官能基を挙げることができる。こうした結合を形成することができる官能基の非限定的な例として、以下のものが挙げられる：アミノ基；カルボキシル基；アルデヒド基；アジド基；アルキン及びアルケン基；ケトン；ヒドラジド；ヒドラジン；酸性フッ化物、塩化物、臭化物、及びヨウ化物などの酸性ハロゲン化物；対称、混合、及び環状無水物を含む、酸性無水物；炭酸塩；シアノ、スクシンイミジル、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルなどの脱離基に結合したカルボニル官能基；マレイミド；加水分解するように設計されたマレイミド基を含有するリンカー；マレイミドカプロイル；ＭＣＣ（［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）；Ｎ−エチルマレイミド；マレイミドアルカン；ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＣ；ＤＵＢＡ（デュオカルマイシンヒドロキシベンザミド−アザインドールリンカー）；ＳＭＣＣスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート；ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）；ＳＰＤＢ  Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート；スルホ−ＳＰＤＢ  Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート；ＳＰＰ  Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート；ジチオピリジルマレイミド（ＤＴＭ）；ヒドロキシルアミン、ビニル−ハロ基；ハロアセタミド基；ブロモアセタミド；ヒドロキシ基；スルフヒドリル基；並びに例えば、ハロゲン化物、メシレート、トシレート、トリフレート、エポキシド、リン酸エステル、硫酸エステル、及びベシレートなどのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリル、若しくはベンジル脱離基を有する分子。
【０１９０】
連結部分の非限定的な例として、以下：アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ポリエーテル、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリペプチド、切断可能なペプチド、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８に記載されているような他のペプチドリンカー、βグルクロニダーゼにより切断可能なリンカー、カテプシン又はカテプシンＢ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｓ、Ｃ、Ｋ、Ｏ、Ｆ、Ｖ、Ｘ、若しくはＷにより切断可能なリンカー、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル、グルクロニド−ＭＡＢＣ、アミノベンジルカルバメート、Ｄ−アミノ酸、及びポリアミンを挙げることができ、これらのいずれも、非置換であるか、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、シアノ基、アジド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホンアミド基、カルボキシル基、カルボキサルデヒド基、イミン基、アルキル基、ハロ−アルキル基、アルケニル基、ハロ−アルケニル基、アルキニル基、ハロ−アルキニル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アラルキル基、アリールアルコキシ基、ヘテロシクリル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバメート基、アミド基、ウレタン基、エポキシド、荷電基、双性イオン基、及びエステル基などの任意の数の置換基で置換されている。分子を互いに連結する反応の他の非限定的な例として、クリックケミストリー、銅フリークリックケミストリー、ＨＩＰＳライゲーション反応、シュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）ライゲーション反応、及びヒドラジン−イソ−Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒが挙げられる。
【０１９１】
リンカーの非限定的な例として、以下のものが挙げられる：
【化１】
2019529380.tif 000009
（各ｎは、独立に、０〜約１，０００；１〜約１，０００；０〜約５００；１〜約５００；０〜約２５０；１〜約２５０；０〜約２００；１〜約２００；０〜約１５０；１〜約１５０；０〜約１００；１〜約１００；０〜約５０；１〜約５０；０〜約４０；１〜約４０；０〜約３０；１〜約３０；０〜約２５；１〜約２５；０〜約２０；１〜約２０；０〜約１５；１〜約１５；０〜約１０；１〜約１０；０〜約５；又は１〜約５である）。一部の実施形態では、各ｎは、独立に、０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、又は約５０である。一部の実施形態では、ｍは、１〜約１，０００；１〜約５００；１〜約２５０；１〜約２００；１〜約１５０；１〜約１００；１〜約５０；１〜約４０；１〜約３０；１〜約２５；１〜約２０；１〜約１５；１〜約１０；又は１〜約５である。一部の実施形態では、ｍは、０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、又は約５０である。又はＪａｉｎ，Ｎ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．３２（１１）：３５２６−４０（２０１５）又はＤｕｃｒｙ，Ｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（２０１３）に開示されているいずれかのリンカー。
【０１９２】
いくつかのケースでは、リンカーは、コハク酸リンカーであってよく、２つのメチレン炭素を間に含むエステル結合又はアミド結合を介して、薬物をペプチドに結合することができる。他のケースでは、リンカーは、ヒドロキシヘキサン酸又は乳酸などのヒドロキシル基とカルボン酸の両方を有する任意のリンカーであってよい。
【０１９３】
一部の実施形態では、リンカーは、非修飾形態の活性薬剤を放出することができる。他の実施形態では、活性薬剤は、化学修飾により放出することができる。また別の実施形態では、異化によって、リンカー及び／又はペプチドの部分に依然として連結している活性薬剤を放出することができる。
【０１９４】
リンカーは、切断不可能なリンカー又は切断可能なリンカーであってよい。一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、血清アルブミン上の遊離チオールに対する共役部分の交換により、共役部分をゆっくりと放出することができる。一部の実施形態では、切断可能なリンカーの使用によって、例えば、それを必要とする被験者への投与後、ペプチドからの共役部分（例えば、治療薬）の放出が可能になる。他の実施形態では、切断可能なリンカーの使用によって、ペプチドからの共役治療薬の放出が可能になる。いくつかのケースでは、リンカーは、切断可能な酵素、例えば、バリン−シトルリンリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、自壊的部分を含む。他の実施形態では、リンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、トロンビン、カテプシン、ペプチダーゼ、又はβ−グルクロニダーゼ用の切断部位などの特定のプロテアーゼ用の１つ若しくは複数の切断部位を含む。これに代わり、又は組み合わせて、リンカーは、ｐＨ、還元、又は加水分解などの他の機構によって切断可能である。
【０１９５】
リンカーの加水分解又は還元の速度は、用途に応じて微調整又は変更することができる。例えば、非障害性エステルを有するリンカーの加水分解速度は、エステルカルボニルに隣接して嵩高い基を有するリンカーの加水分解よりも高くなり得る。嵩高い基は、メチル基、エチル基、フェニル基、環、若しくはイソプロピル基、又は立体的嵩高さをもたらす任意の基であってよい。いくつかのケースでは、立体的嵩高さは、例えば、薬剤自体により、例えば、そのカルボン酸を介して共役される場合、ケトロラックによって、もたらされ得る。リンカーの加水分解速度は、標的位置でのコンジュゲートの滞留時間に応じて調整することができる。例えば、ペプチドが、腫瘍、又は脳から比較的急速に排出される場合、急速に加水分解するようにリンカーを調整することができる。ペプチドが、標的位置で、より長い滞留時間を有する場合には、より低速の加水分解速度が活性薬剤の持続的な送達を可能にし得る。“Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ”Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１５，５，１２０２３  Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．は、加水分解速度の変更の１例を提供する。
【０１９６】
結晶構造
一部の実施形態では、所与のペプチドにおいて各原子を空間的にマッピングするために、本開示の任意のペプチドの結晶構造を解明することができる。ペプチドの結晶構造の解明により、アミノ酸の空間配向、配置、及び相互作用に関する情報を得ることができる。従って、一部の実施形態では、ペプチドの結晶構造は、折り畳み、安定性、機能若しくは生物活性を維持するために、折り畳まれたペプチドの変異、保存的、又はその表面に対して内部若しくは外部であり得る残基を見出す、あるいは、結合特異性若しくは強度に影響を与え得る活性薬剤との共役部位又はそれに対する修飾部位を見出す際に、安定性に役割を果たす可能性がある保存的構造要素に関する情報を提供することができる。この情報は、ペプチドの他の局面を変化させながら、所望の機能（還元耐性など）を保存する変異体を設計することを可能にし得る。例えば、下記のペプチドの結晶構造が解明され、これによって各ペプチドの３次元折り畳み結晶構造を明らかにすることができる：配列番号３、配列番号２７、配列番号２２、配列番号３４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号２０、配列番号５１、及び配列番号４７。配列番号１０については、２つの異なる結晶構造が形成される可能性があり、一方の結晶構造は、１つの対称単位格子内に１６の独立した分子を含むことができ、また他方の結晶構造は、４つの分子を含むことができ、ここで、配列番号１０のペプチドは、これらの形成された結晶構造の両方の非共有結合を介して互いに相互作用していた。当業者であれば、各結晶構造及び基本的な座標データに原理を適用して、保存的な内部残基を見出すか、又は構造全体に影響を及ぼす可能性なしに、どの残基を修飾することができるかを決定することができる。その結晶構造に基づくペプチド及びノッテッドペプチドの一般的配列に関するこの情報を使用して、本開示のペプチドの特定の特性、例えば、限定されないが、開示される配列の安定した変異体を作製することを目的とする修飾安定性及び／又は様々な薬剤及び条件に対する耐性、生物学的活性の増強、製造可能性の最適化、並びにペプチドを活性薬剤若しくは検出可能な物質と共役若しくは連結させるための最適部位の決定を向上させることができる。
【０１９７】
送達スカフォールドとしてのペプチド
特定の実施形態では、本開示の任意のペプチドを活性薬剤の送達スカフォールドとして使用することができる。本開示のペプチドは、こうした環境におけるペプチドの高い安定性のために、様々な生物学的環境に対する活性薬剤の送達スカフォールドとして使用することができ、これによって、こうした生物学的環境内へのアクセス及びそこでの疾患の治療が可能になる。例えば、配列番号１〜配列番号１６６のいずれのペプチドも、低ｐＨの生物学的環境、プロテアーゼが豊富な環境、酸性環境、還元性環境、及び／又は様々な温度の環境において安定的であり得る。こうした生物学的環境は、胃腸（ＧＩ）管（限定されないが、口腔、鼻腔、喉、食道、胃、小腸、大腸、及び直腸を含む）、肺、皮膚、軟骨、膣粘膜、若しくは鼻粘膜、又はリソソーム、エンドソーム、若しくは細胞質ゾルなどの細胞コンパートメント内で見出され得る。従って、本開示のペプチドを送達スカフォールドとして用いることは、他のペプチドを分解し得る様々な生理的環境への治療薬の送達に有利となり得る。
【０１９８】
ペプチド安定性
本開示のペプチドは、様々な生物学的条件下で安定的であり得る。例えば、配列番号１〜配列番号１６６の任意のペプチドは、還元剤、プロテアーゼ、酸化条件、高温条件、又は酸性条件に対して耐性を呈示し得る。
【０１９９】
いくつかのケースでは、生体分子（ペプチド及びタンパク質など）は、治療機能をもたらし得るが、こうした治療機能は、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境により引き起こされる不安定性によって低下するか、又は妨害される（Ｍｏｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  １０１：１０８−２１（２０１６），Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １３（９）：６５５−７２（２０１４），Ｂｒｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ（１１）：１４４３−６７（２０１３），Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２４（１）：６３−９２（２００７），Ｈａｍｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  １９（３）：１６５−７７（２００５））。例えば、ＧＩ管は、低ｐＨ（例えば、ｐＨ約１）の領域、還元性環境、又はペプチド及びタンパク質を分解することができるプロテアーゼが豊富な環境を含み得る。口腔、眼、肺、鼻腔、関節、皮膚、膣管、粘膜、及び血清といった身体の他の部位におけるタンパク質分解活性も、機能的に活性のペプチド及びポリペプチドの送達に対して障害となり得る。さらに、血清中のペプチドの半減期は、一部にはプロテアーゼのために非常に短く、それによって、ペプチドは、適正な投与レジメンを投与する場合、あまりに急速に分解されるため、持続的な治療効果を達成することができない可能性がある。同様に、リソソームなどの細胞コンパートメント内でのタンパク質分解活性並びにリソソーム及び細胞質ゾル内の還元活性もペプチド及びタンパク質を分解し得るため、これらが細胞内標的に対して治療機能を提供することは不可能となり得る。従って、還元剤、プロテアーゼ、及び低ｐＨに対して耐性のペプチドが、向上した治療効果を提供し得る、又はｉｎ  ｖｉｖｏで同時製剤化した、若しくは共役した活性薬剤の治療効力を増強し得る。
【０２００】
加えて、薬物の経口送達は、この投与方法により提示される機能的に活性のペプチド及びポリペプチドの送達に対する障害にもかかわらず、身体の特定部位（例えば、結腸癌などのＧＩ管の疾患、過敏性腸疾患、感染症、代謝障害、及び便秘など）をターゲティングするために、有益となり得る。例えば、薬剤の経口送達は、非経口送達と比較して、患者が摂取するのに好都合な剤形を提供することによってコンプライアンスを高め得る。経口送達は、治療濃度域が大きい治療レジメンで有用となり得る。従って、還元剤、プロテアーゼ、及び低ｐＨに対して耐性のペプチドは、その治療機能を無効にすることなく、ペプチドの経口送達を可能にし得る。ペプチド及びタンパク質は、ＧＩ管によってあまりにも急速に分解され得るため、経口送達後に治療活性を発揮することができなくなる可能性がある。そのため、ＧＩ管内の条件に対して耐性のペプチドを、経口投与が可能な生物活性ペプチド治療薬として使用することができる。
【０２０１】
さらに、本明細書に記載のように、本開示のペプチドの特性又は特徴は、多様な生理的若しくは環境条件に対して耐性であり得る。この耐性によって、吸入、鼻内、経口、局所、静脈内、皮下、関節内、筋肉内投与、腹腔内、滑液嚢内、膣経路、直腸経路、肺経路、眼経路（限定されないが、局所、角膜、及び硝子体内）、口腔、舌下、髄腔内、又はこれらの任意の組合せを介した投与が可能となり得る。
【０２０２】
還元剤に対するペプチド耐性。本開示のペプチドは、１又は複数のシステインを含有し得るが、これらは、ペプチドの折り畳まれた状態の保存に不可欠となり得るジスルフィド架橋に参加することができる。還元剤を含む生物学的環境へのペプチドの曝露によって、ペプチドの変性と、機能性及び生物活性の喪失が起こりうる。例えば、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）は、身体及び細胞の多くの部位に存在し得る還元剤であり、ジスルフィド結合を還元することができる。別の例として、経口投与後に胃腸管上皮を通過するペプチドの輸送中に、ペプチドは還元された状態となり得る。ペプチドは、ＧＩ管の様々な部分への曝露時に還元状態となり得る。ＧＩ管は、還元性環境であり得るため、ジスルフィド結合を有する治療薬分子が最適な治療効果を発揮する能力を、ジスルフィド結合の還元によって阻害する可能性がある。さらに、ペプチドは、エンドソーム若しくはリソソームによる内在化後、又は細胞質ゾル、若しくはその他の細胞コンパートメント内など、細胞内への進入時にも還元され得る。ジスルフィド結合の還元及びペプチドの変性は、機能性の喪失を招くか、又はバイオアベイラビリティ、ピーク血漿濃度、生物活性、及び半減期などの重要な薬物動態パラメータに影響を及ぼし得る。ジスルフィド結合の還元はまた、プロテアーゼによる後の分解に対するペプチドの感受性増加によって機能性の喪失も招き、その結果、投与後にインタクトなペプチドの急速な喪失が起こり得る。一部の実施形態では、還元に対して耐性のペプチドは、容易に還元されるペプチドと比較して、インタクトな状態を維持することができるため、身体の多様なコンパートメント及び細胞内で、より長時間にわたり機能的活性を賦与することができる。
【０２０３】
特定の実施形態では、本開示のペプチドを還元剤に対する耐性の特徴について分析して、安定したペプチドを見出すことができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．００００１Ｍ〜０．０００１Ｍ、０．０００１Ｍ〜０．００１Ｍ、０．００１Ｍ〜０．０１Ｍ、０．０１Ｍ〜０．０５Ｍ、０．０５Ｍ〜０．１Ｍなどの様々なモル濃度の還元剤に１５分以上曝露された後、インタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、ペプチド安定性を決定するために使用する還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエタノール、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、又はこれらの任意の組合せであってよい。一部の実施形態では、還元剤への曝露後、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％のペプチドがインタクトなままである。
【０２０４】
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１ｍＭ〜１０ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１０ｍＭ〜１００ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１ｍＭ〜１０ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１０ｍＭ〜１００ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも３０℃の温度に、１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも４０℃の温度に、１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１ｍＭ〜１０ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１０��Ｍ〜１００ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１ｍＭ〜１０ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１０ｍＭ〜１００ｍＭ  ＤＴＴ及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。
【０２０５】
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１ｍＭ〜１０ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１０ｍＭ〜１００ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１ｍＭ〜１０ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１０ｍＭ〜１００ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも３０℃の温度に、１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも４０℃の温度に、１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１ｍＭ〜１０ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１０��Ｍ〜１００ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１ｍＭ〜１０ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１０ｍＭ〜１００ｍＭ  ＧＳＨ及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。
【０２０６】
プロテアーゼに対するペプチドの耐性。本開示のペプチドの安定性は、プロテアーゼによる分解に対する耐性によって決定することができる。ペプチダーゼ又はプロテイナーゼとも呼ばれるプロテアーゼは、隣接するアミノ酸同士の結合を切断することによってペプチド及びタンパク質を分解することができる酵素である。特定のアミノ酸をターゲティングする特異性を備えたプロテアーゼのファミリーとして、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、及びアスパラギンプロテアーゼを挙げることができる。加えて、メタロプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、シトクロムＰ４５０酵素、及びカテプシンも、ペプチド及びタンパク質を消化することができる。プロテアーゼは、血液、粘膜、肺、皮膚、ＧＩ管、口腔、鼻、眼、及び細胞のコンパートメント内に高濃度で存在し得る。また、関節リウマチ及び他の免疫障害などの様々な疾患にはプロテアーゼの調節異常が存在し得る。プロテアーゼによる分解は、治療薬分子のバイオアベイラビリティ、生体内分布、半減期、及び生物活性を低減する可能性があり、それによって、これらの分子は、その治療機能を実施することができなくなる。一部の実施形態では、プロテアーゼに対して耐性のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで適正に耐容される濃度で治療活性を良好に賦与することができる。
【０２０７】
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、あらゆるクラスのプロテアーゼによる分解に耐えうる。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、ペプシン（胃に存在し得る）、トリプシン（十二指腸に存在し得る）、血清プロテアーゼ、又はこれらの任意の組合せによる分解に耐える。一部の実施形態では、ペプチド安定性を決定するために用いられるプロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、又はこれらの任意の組合せであってよい。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、肺プロテアーゼ（例えば、セリン、システイニル、及びアスパルチルプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、好中球エラスターゼ、α−１抗トリプシン、分泌ロイコプロテアーゼ阻害剤、及びエラフィン）、又はこれらの任意の組合せによる分解に耐えることができる。一部の実施形態では、プロテアーゼへの曝露後に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％のペプチドがインタクトなままである。
【０２０８】
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５０Ｕ／ｍｌ〜５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５００Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５０Ｕ／ｍｌ〜５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５００Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５０Ｕ／ｍｌ〜５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５００Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５０Ｕ／ｍｌ〜５００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５００Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のペプシン及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。
【０２０９】
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５０Ｕ／ｍｌ〜５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５００Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５０Ｕ／ｍｌ〜５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５００Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５０Ｕ／ｍｌ〜５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５００Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５０Ｕ／ｍｌ〜５００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、５００Ｕ／ｍｌ〜５０００Ｕ／ｍｌの濃度のトリプシン及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。
【０２１０】
酸性条件下でのペプチドの安定性。本開示のペプチドは、酸性の生物学的環境に投与することができる。例えば、経口投与の後、ペプチドは、胃及び胃腸（ＧＩ）管の胃液中で酸性環境条件を経験し得る。胃のｐＨは、約１〜４であり、ＧＩ管のｐＨは、上部ＧＩ管から結腸に向かって酸性から正常な生理的ｐＨまで変動する。さらに、膣、後期エンドソーム、及びリソソームも、ｐＨ７未満などの酸性ｐＨ値を有し得る。これらの酸性条件は、折り畳み不全状態へとペプチド及びタンパク質の変性を引き起こし得る。ペプチド及びタンパク質の変性は、後に他の酵素による消化に対する感受性の増大、並びにペプチドの生物活性の喪失を招き得る。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、酸性条件及び酸性条件をシミュレートするバッファー中で、変性及び分解に耐えることができる。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、１未満のｐＨ、２未満のｐＨ、３未満のｐＨ、４未満のｐＨ、５未満のｐＨ、６未満のｐＨ、７未満のｐＨ、若しくは８未満のｐＨのバッファー中で変性又は分解に耐えることができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、１〜３のｐＨでインタクトなままである。特定の実施形態では、１未満のｐＨ、２未満のｐＨ、３未満のｐＨ、４未満のｐＨ、５未満のｐＨ、６未満のｐＨ、７未満のｐＨ、若しくは８未満のｐＨのバッファーへの曝露後に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、ｐＨ１〜３のバッファーへの曝露後に、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、又は少なくとも９０％〜１００％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、本開示のペプチドは、人工胃液（ｐＨ１〜２）中での変性又は分解に対して耐性となり得る。一部の実施形態では、人工胃液への曝露後に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％のペプチドがインタクトなままである。一部の実施形態では、ペプチドの安定性を決定するために、人工胃液などの低ｐＨ溶液を使用することができる。
【０２１１】
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ０．５〜ｐＨ２及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ２〜ｐＨ５及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ５〜ｐＨ６、トリプシン及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ６〜ｐＨ８及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ０．５〜ｐＨ２及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ２〜ｐＨ５及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ５〜ｐＨ６、トリプシン及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ６〜ｐＨ８及び少なくとも３０℃の温度に、１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ０．５〜ｐＨ２及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ２〜ｐＨ５及び少なくとも４０℃の温度に、１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ５〜ｐＨ６及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ６〜ｐＨ８及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ０．５〜ｐＨ２及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ２〜ｐＨ５及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ５〜ｐＨ６及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ６〜ｐＨ８及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。
【０２１２】
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ＳＧＦ及び少なくとも２３℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ＳＧＦ及び少なくとも３０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ＳＧＦ及び少なくとも４０℃の温度に、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、ＳＧＦ及び少なくとも３７℃の温度に、少なくとも０．５時間、１時間、８時間、１６時間、２４時間、３６時間、又は４８時間にわたって曝露された後、少なくとも７０％がインタクトな状態を維持することができる。
【０２１３】
高温でのペプチドの安定性。本開示のペプチドは、高温の生物学的環境に投与することができる。例えば、経口投与後、ペプチドは、身体内で高温を経験し得る。身体の温度は、３６℃〜４０℃の範囲で変動し得る。高温は、折り畳み不全状態へとペプチド及びタンパク質の変性を引き起こし得る。ペプチド及びタンパク質の変性は、後に他の酵素による消化に対する感受性の増大、並びにペプチドの生物活性の喪失を招き得る。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、２５℃〜１００℃の温度でインタクトな状態を維持することができる。高温は、より高速なペプチドの分解を引き起こし得る。より高温での安定性は、冷却設備の利用が限られる熱帯環境又は地域でのペプチドの貯蔵を可能にし得る。さらに、より高温での安定性は、より効率的な室温貯蔵も可能にし得る。特定の実施形態では、２５℃に６ヶ月〜５年間曝露後、５％〜１００％のペプチドが、インタクトな状態を維持することができる。７０℃に１５分〜１時間曝露後、５％〜１００％のペプチドが、インタクトな状態を維持することができる。１００℃に１５分〜１時間曝露後、５％〜１００％のペプチドが、インタクトな状態を維持することができる。別の実施形態では、２５℃に少なくとも６ヶ月〜５年間曝露後、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、７０℃に１５分〜１時間曝露後、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、１００℃に１５分〜１時間曝露後、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、２５℃に少なくとも６ヶ月〜５年間曝露後、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、３０℃に少なくとも６ヶ月〜５年間曝露後、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、４０℃に少なくとも６ヶ月〜５年間曝露後、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、３７℃に０．５時間〜４８時間曝露後、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、３７℃に、少なくとも０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、３６時間、又は４８時間曝露後、少なくとも１０％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、３７℃に、少なくとも０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、３６時間、又は４８時間曝露後、少なくとも１％のペプチドがインタクトなままである。他の実施形態では、口腔、胃、小腸、又は大腸を通過後、少なくとも１０％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、口腔、胃、小腸、又は大腸を通過後、少なくとも１％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、口腔、胃、小腸、又は大腸を通過後、少なくとも５０％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、口腔、胃、小腸、又は大腸を通過後、少なくとも１％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、口腔、胃、小腸、又は大腸を通過後、少なくとも２０％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、口腔、胃、小腸、又は大腸を通過後、少なくとも７０％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、口腔、胃、小腸、又は大腸を通過後、少なくとも７５％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、口腔、胃、小腸、又は大腸を通過後、少なくとも９０％のペプチドがインタクトなままである。別の実施形態では、口腔、胃、小腸、又は大腸を通過後、少なくとも９５％のペプチドがインタクトなままである。
【０２１４】
ペプチドの薬物動態
本開示のペプチドのいずれかの薬物動態は、様々な投与経路でのペプチドの投与後に決定することができる。例えば、本開示のペプチドの薬物動態パラメータは、静脈内、皮下、筋肉内、直腸、エアゾール、非経口、眼内、肺、経皮、膣、眼、鼻、経口、舌下、吸入、真皮、髄腔内、鼻内、腹腔内、口腔、滑液嚢内、又は局所投与後に定量することができる。本開示のペプチドは、放射性標識又は蛍光団などの追跡物質を用いて分析することができる。例えば、本開示の放射性標識ペプチドを様々な投与経路を介して投与することができる。血漿、尿、糞、いずれかの臓器、皮膚、筋肉、及びその他の組織などの各種生体サンプル中のペプチド濃度又は用量回収は、ＨＰＬＣ、蛍光検出技術（ＴＥＣＡＮ定量、フローサイトメトリー、ｉＶＩＳ）、又は液体シンチレーション計数をはじめとする多様な方法を用いて決定することができる。
【０２１５】
本明細書に記載する方法及び組成物は、被験者に対する任意の経路でのペプチド投与の薬物動態に関する。薬物動態は、例えば、コンパートメントモデル又は非コンパートメント方法などの方法及びモデルを用いて説明することができる。コンパートメントモデルとして、限定されないが、モノコンパートメントモデル、２コンパートメントモデル、マルチコンパートメントモデルなどが挙げられる。モデルは、様々なコンパートメントに区分されることが多く、対応するスキームで表すことができる。例えば、１つのスキームは、吸収、分布、代謝及び排泄（ＡＤＭＥ）スキームである。別の例として、もう１つのスキームは、遊離、吸収、分布、代謝及び排泄（ＬＡＤＭＥ）スキームである。いくつかの態様では、代謝及び排泄を、消失コンパートメントと呼ばれる１つのコンパートメントに分類することができる。例えば、遊離は、送達系からの組成物の活性部分の遊離を含み、吸収は、被験者による組成物の活性部分の吸収を含み、分布は、血漿を介して、異なる組織への組成物の分布を含み、代謝は、組成物の代謝又は不活性化を含み、最後に排泄は、組成物又は組成物の代謝産物の排泄又は消失を含む。被験者に静脈内投与された組成物は、多相薬物動態プロフィールに付すことができ、これは、限定されないが、組織分布及び代謝／排泄の局面を含み得る。このように、組成物の血漿若しくは血清中濃度の減少は、往々にして、例えば、α相及びβ相を含む二相であり、時としてγ、δ又は他の相が観察される。
【０２１６】
薬物動態は、被験者へのペプチドの投与に関連する少なくとも１つのパラメータを決定するステップを含む。いくつかの態様では、パラメータは、少なくとも用量（Ｄ）、投与間隔（τ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、最大濃度（Ｃｍａｘ）、次の用量が投与されるまでに達成される最小濃度（Ｃｍｉｎ）、最小時間（Ｔｍｉｎ）、Ｃｍａｘに到達するまでの最大時間（Ｔｍａｘ）、分布容積（Ｖｄ）、定常状態分布容積（Ｖｓｓ）、０時点での外挿濃度（Ｃ０）、定常状態濃度（Ｃｓｓ）、消失速度定数（ｋｅ）、注入速度（ｋｉｎ）、クリアランス（ＣＬ）、バイオアベイラビリティ（ｆ）、変動（％ＰＴＦ）及び消失半減期（ｔ１／２）を含む。
【０２１７】
特定の実施形態では、配列番号１〜配列番号１６６のいずれのペプチドも、経口投与後に最適な薬物動態パラメータを示す。別の実施形態では、配列番号１〜配列番号１６６のいずれのペプチドも、経口投与、吸入、鼻内投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、滑液嚢内、又はこれらの任意の組合せを含む、任意の経路の投与後に最適な薬物動態パラメータを示す。
【０２１８】
一部の実施形態では、配列番号１〜配列番号１６６のいずれのペプチドも、以下を呈示する：経口経路により被験者にペプチドを投与した後の被験者において、Ｃｍａｘに到達する０．５〜１２時間、若しくは１〜４８時間の平均Ｔｍａｘ、血清中０．１％〜１０％の平均バイオアベイラビリティ、ＧＩ管への送達の場合には被験者への経口投与後に、血清中０．１％未満の平均バイオアベイラビリティ、非経口投与後に血清中１０〜１００％の平均アベイラビリティ、被験者にペプチドを投与した後の被験者において、０．１〜１６８時間、又は０．２５〜４８時間の平均ｔ１／２、被験者にペプチドを投与した後のペプチドの０．５〜１００Ｌ／時又は０．５〜５０Ｌ／時の平均クリアランス（ＣＬ）、被験者にペプチドを全身投与した後の被験者において、２００〜２０，０００ｍＬの平均分布容積（Ｖｄ）、又は任意選択で全身取込みなし、これらのいずれかの組合せ。
【０２１９】
製造方法
本明細書に記載のペプチドの組換え発現のために、様々な発現ベクター／宿主系を使用することができる。こうした系の非限定的な例として、以下のものが挙げられる：本明細書に記載のペプチド若しくはペプチド融合タンパク質／キメラタンパク質をコードする核酸配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物、前述の核酸配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、前述の核酸配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ））に感染させた昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＭＶ）に感染させた、若しくは前述の核酸配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、又は組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ））に感染させた動物細胞系、例えば、前述の核酸配列の複数のコピーを含有するように操作され、安定増幅される（例えば、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ、ＣＨＯ／グルタミンシンテターゼ）か、若しくは二重微小染色体（例えば、マウス細胞株）で不安定増幅された細胞系。ジスルフィド結合形成及びペプチドの折り畳みは、発現の最中又は発現後、又はその両方で起こり得る。
【０２２０】
本明細書に記載する１つまたは複数のペプチドを発現するように、宿主細胞を改変することができる。宿主細胞は、原核、真核、又は昆虫細胞であってよい。いくつかのケースでは、宿主細胞は、挿入された配列の発現を調節することができ、又は所望される特定の様式で遺伝子若しくはタンパク質産物を修飾及びプロセシングすることができる。例えば、特定のプロモータからの発現は、特定の誘導物質（例えば、メタロチオニンプロモータの場合、亜鉛及びカドミウムイオン）の存在下で増大させることができる。いくつかのケースでは、ペプチド産物の修飾（例えば、リン酸化）及びプロセシング（例えば、切断）は、ペプチドの機能にとって重要となり得る。宿主細胞は、ペプチドの翻訳後プロセシング及び修飾のために特徴的且つ特異的な機構を備えることができる。いくつかのケースでは、ペプチドを発現するために用いられる宿主細胞は、最少量のタンパク質分解酵素を分泌する。
【０２２１】
細胞又はウイルスベースのサンプルの場合、精製前に生物を処理して、標的ポリペプチドを保存及び／又は放出することができる。一部の実施形態では、固定剤を用いて細胞を固定する。一部の実施形態では、細胞を溶解する。細胞材料は、かなりの割合の細胞を破壊せず、しかも、細胞材料の表面から、及び／又は細胞同士の隙間からタンパク質を除去する方法で処理することができる。例えば、細胞内空間及び／又は植物細胞壁中に位置するタンパク質を除去するために、細胞材料を液体バッファーに浸漬する、又は植物材料の場合には、真空に付すことができる。細胞材料が、微生物の場合、微生物培地からタンパク質を抽出することができる。あるいは、ペプチドを封入体に充填することができる。封入体は、培地中の細胞成分からさらに分離することもできる。一部の実施形態では、細胞は破壊されない。細胞又はウイルスによって提示される細胞又はウイルスペプチドは、インタクトな細胞若しくはウイルス粒子の結合及び／又は精製に使用することができる。組換え系以外にも、タンパク質及びペプチド合成で使用される様々な既知の技術を用いて、抽出前に無細胞系でペプチドを合成することもできる。
【０２２２】
いくつかのケースでは、宿主細胞は、薬物の結合点を有するペプチドを産生する。結合点は、リシン残基、Ｎ末端、システイン残基、システインジスルフィド結合、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸残基、Ｃ末端、若しくは非天然アミノ酸を含み得る。
【０２２３】
さらに、固相ペプチド合成、又は溶液相ペプチド合成などの合成によりペプチドを生成することもできる。ペプチド合成は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ケミストリー又はブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）ケミストリーによって実施することができる。ペプチドは、合成の最中若しくは合成後、又はその両方で折り畳まれ得る（ジスルフィド結合の形成）。合成又は組換えによりペプチド断片を生成することができる。次に、酵素又は合成によってペプチド断片を結合することができる。
【０２２４】
他の態様では、本開示のペプチドは、従来の固相化学合成技術によって、例えば、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ及びＰ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ編集の“Ｆｍｏｃ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）に従って、調製することができる。
【０２２５】
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、製造中に、より安定であり得る。例えば、本開示のペプチドは、組換え発現及び精製中に、より安定であるため、製造工程中に存在するプロテアーゼによる分解速度の低下、より高純度のペプチド、より高収量のペプチド、又はこれらのいずれかの組合せが達成することができる。一部の実施形態では、製造、貯蔵、及び流通中の高温及び低温での分解に対しても、より安定であり得る。例えば、一部の実施形態では、本開示のペプチドは、２５℃、３０℃、３５℃、又は４０℃で安定であり得る。他の実施形態では、本開示のペプチドは、７０℃以上で安定であり得る。一部の実施形態では、１００℃以上で安定であり得る。
【０２２６】
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％、６５％又は７５％相対湿度と共に少なくとも２５℃、３０℃、又は４０℃の温度に対して、少なくとも３、６、１２、１８、２４、３６、若しくは４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％相対湿度と共に少なくとも２５℃の温度に対して、３ヶ月〜４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％相対湿度と共に少なくとも２５℃の温度に対して、３ヶ月〜１２ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％相対湿度と共に少なくとも２５℃の温度に対して、１２ヶ月〜２４ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６５％相対湿度と共に少なくとも２５℃の温度に対して、３ヶ月〜４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６５％相対湿度と共に少なくとも２５℃の温度に対して、３ヶ月〜１２ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６５％相対湿度と共に少なくとも２５℃の温度に対して、１２ヶ月〜２４ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも７０％相対湿度と共に少なくとも２５℃の温度に対して、３ヶ月〜４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも７０％相対湿度と共に少なくとも２５℃の温度に対して、３ヶ月〜１２ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも７０％相対湿度と共に少なくとも２５℃の温度に対して、１２ヶ月〜２４ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。
【０２２７】
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％相対湿度と共に少なくとも２３℃の温度に対して、３ヶ月〜４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％相対湿度と共に少なくとも２３℃の温度に対して、３ヶ月〜１２ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％相対湿度と共に少なくとも２３℃の温度に対して、１２ヶ月〜２４ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６５％相対湿度と共に少なくとも２３℃の温度に対して、３ヶ月〜４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６５％相対湿度と共に少なくとも２３℃の温度に対して、３ヶ月〜１２ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６５％相対湿度と共に少なくとも２３℃の温度に対して、１２ヶ月〜２４ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも７０％相対湿度と共に少なくとも２３℃の温度に対して、３ヶ月〜４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも７０％相対湿度と共に少なくとも２３℃の温度に対して、３ヶ月〜１２ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも７０％相対湿度と共に少なくとも２３℃の温度に対して、１２ヶ月〜２４ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。
【０２２８】
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％相対湿度と共に少なくとも３０℃の温度に対して、３ヶ月〜４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％相対湿度と共に少なくとも３０℃の温度に対して、３ヶ月〜１２ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％相対湿度と共に少なくとも３０℃の温度に対して、１２ヶ月〜２４ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６５％相対湿度と共に少なくとも３０℃の温度に対して、３ヶ月〜４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６５％相対湿度と共に少なくとも３０℃の温度に対して、３ヶ月〜１２ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６５％相対湿度と共に少なくとも３０℃の温度に対して、１２ヶ月〜２４ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも７０％相対湿度と共に少なくとも３０℃の温度に対して、３ヶ月〜４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも７０％相対湿度と共に少なくとも３０℃の温度に対して、３ヶ月〜１２ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも７０％相対湿度と共に少なくとも３０℃の温度に対して、１２ヶ月〜２４ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。
【０２２９】
一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％相対湿度と共に少なくとも４０℃の温度に対して、３ヶ月〜４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％相対湿度と共に少なくとも４０℃の温度に対して、３ヶ月〜１２ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６０％相対湿度と共に少なくとも４０℃の温度に対して、１２ヶ月〜２４ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６５％相対湿度と共に少なくとも４０℃の温度に対して、３ヶ月〜４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６５％相対湿度と共に少なくとも４０℃の温度に対して、３ヶ月〜１２ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも６５％相対湿度と共に少なくとも４０℃の温度に対して、１２ヶ月〜２４ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも７０％相対湿度と共に少なくとも４０℃の温度に対して、３ヶ月〜４８ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも７０％相対湿度と共に少なくとも４０℃の温度に対して、３ヶ月〜１２ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。一部の実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも７０％相対湿度と共に少なくとも４０℃の温度に対して、１２ヶ月〜２４ヶ月間の曝露後にインタクトな状態を維持することができる。
【０２３０】
ペプチドの医薬組成物
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載する任意のペプチドと、担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増調剤、抗酸化剤、可溶化剤、クエン酸を含むバッファー、オスモライト、塩類、界面活性剤、アミノ酸、封入剤、増量剤、凍結保護剤、粘着剤、遅延放出剤、腸溶性コーティング、及び／又は賦形剤などの他の化学成分との組合せであってよい。医薬組成物は、本明細書に記載のペプチドの生物への投与を容易にする。医薬組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、直腸、エアゾール、非経口、眼内、肺、経皮、膣、眼、鼻、経口、舌下、吸入、真皮、髄腔内、鼻内、口腔、関節内、滑液嚢内、又は局所投与などの様々な形態及び経路により、医薬組成物として治療有効量で投与することができる。医薬組成物は、例えば、本明細書に記載のペプチドの臓器への直接注射を介して、任意選択で、生分解性マトリックス、熱ゲル化剤、及び水性及び非水性溶剤を含むデポーを用いて、局所又は全身に投与することができる。
【０２３１】
ボーラス注射又は連続注入のために、非経口注射を製剤化することができる。医薬組成物は、滅菌懸濁液、油性若しくは水性ビヒクル中の溶液又は乳剤として非経口注射に好適な形態であってよく、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの配合剤を含有してもよい。非経口投与用の医薬製剤は、水溶性形態における本明細書に記載のペプチドの水溶液を含む。本明細書に記載のペプチドの懸濁液は、油性注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒又はビヒクルとして、ゴマ油などの脂肪油、Ｎ−メチルピロリドン、プロピレングリコール、グリセロール、アルコール、脂肪酸若しくはω−３−脂肪酸、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、リポソーム、ミセル、若しくは混合ミセルが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を高める物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、又はデキストランを含有し得る。懸濁液は、可溶性を高め、及び／又は本明細書に記載のペプチドの凝集を低減して、高濃度の溶液の調製を可能にする好適な安定化剤若しくは物質を含有してもよい。あるいは、本明細書に記載のペプチドは凍結乾燥してもよいし、又は粉末状にしてもよく、これらは、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌発熱性物質除去蒸留水、５％デキストロース水溶液、等張性食塩水、又は緩衝溶液を用いて再構成する。一部の実施形態では、精製ペプチドを静脈内投与する。
【０２３２】
本開示のペプチドは、外科手術中に、例えば、脳若しくは脳組織又は癌細胞などの臓器、又は臓器組織若しくは細胞に直接適用することができる。本明細書に記載する組換えペプチドは、局所投与することができ、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、バーム、クリーム、及び軟骨などの局所投与可能な各種組成物に製剤化することができる。こうした医薬組成物は、可溶化剤、安定化剤、強度増強剤、バッファー及び防腐剤を含有してもよい。
【０２３３】
本明細書に記載する治療又は使用方法を実施する際、免疫系に影響する状態に罹患した被験者に、治療有効量の本明細書に記載の本明細書に記載のペプチドを医薬組成物として投与することができる。一部の実施形態では、被験者は、ヒトなどの哺乳動物である。治療有効量は、疾患の重症度、被験者の年齢及び相対的健康状態、使用する化合物の効力、及びその他の要因に応じて大きく変動し得る。
【０２３４】
医薬品として使用可能な製剤に活性化合物を調製するのを容易にする賦形剤及び補助剤を含む、１又は複数種の生理学的に許容される担体を使用して、医薬組成物を製剤化することができる。製剤化は、選択した投与経路に応じて改変することができる。本明細書に記載のペプチドを含む医薬組成物は、例えば、組換え系中でペプチドの発現、ペプチドの精製、ペプチドの凍結乾燥、混合、溶解、顆粒化、ドラジェ製造、粉末化、乳化、カプセル化、閉じ込め、又は圧縮工程により、製造することができる。医薬組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤、及び遊離塩基若しくは薬学的に許容される塩形態として本明細書に記載される化合物を含み得る。
【０２３５】
本明細書に記載される化合物を含む本明細書に記載のペプチドを調製する方法は、１種又は複数の不活性の、薬学的に許容される賦形剤若しくは担体と共に本明細書に記載のペプチドを製剤化して、固体、半固体、又は液体組成物を形成するステップを含む。固体組成物として、例えば、粉末、錠剤、分散性顆粒、カプセル、カシェ、及び座薬が挙げられる。これらの組成物は、さらに、湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及びその他の薬学的に許容される添加剤などの非毒性の補助物質を含有してもよい。
【０２３６】
薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例は、例えば、以下：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）に見出すことができ、これらの各々は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０２３７】
医薬組成物は、さらに、透過又は吸収促進剤（Ａｕｎｇｓｔ  ｅｔ  ａｌ．ＡＡＰＳ  Ｊ．１４（１）：１０−８．（２０１２）及びＭｏｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  １０１：１０８−２１．（２０１６））を含んでもよい。透過促進剤は、ＧＩ管から全身循環への分子の取り込みを促進することができる。透過促進剤としては、以下のものを挙げることができる：中鎖脂肪酸の塩、カプリン酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸（ＳＮＡＣ）、Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸（５−ＣＮＡＣ）、フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、及びフェニルアルコールなどの親水性芳香族アルコール、キトサン、アルキルグリコシド、ドデシル−２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピオン酸塩（ＤＤＡＩＰＰ）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びクエン酸などの二価カチオンのキレート剤、アルキル硫酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、レシチンを基材とする、又は胆汁塩由来の物質、例えば、デオキシコール酸塩。
【０２３８】
組成物は、また、ダイズトリプシン阻害剤、アプロチニン、グリココール酸ナトリウム、カモスタットメシレート、バシトラシン、又はシクロペンタデカラクロンをはじめとするプロテアーゼ阻害剤を含んでもよい。
【０２３９】
医薬組成物は、さらに、胃腸（ＧＩ）管の特定の部分に薬剤を放出するための賦形剤を含んでもよい。例えば、限定されないが、賦形剤は、腸溶性コーティング（例えば、脂肪酸、蝋、シェラック、プラスチック、及び植物繊維）、アクリル酸メチル−メタクリル酸コポリマー、酢酸／フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸／コハク酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸／コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（酢酸／コハク酸ヒプロメロース）、酢酸／フタル酸ポリビニル（ＰＶＡＰ）、メタクリル酸メチル−メタクリル酸コポリマー、シェラック、トリメリト酸酢酸セルロース、アルギニン酸ナトリウム、又はゼインであってよい。
【０２４０】
治療でのペプチドの使用
一部の実施形態では、本方法は、有効量の本明細書に記載のペプチドを、それが必要な被験者に投与するステップを含む。
【０２４１】
一実施形態では、本方法は、有効量の本明細書に記載のペプチドを、それが必要な被験者に投与するステップを含む。
【０２４２】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、治療対象である疾患又は状態の症状の１つ若しくは複数をある程度まで軽減することができる、投与される薬剤若しくは化合物の十分な量を指す。結果は、疾患の徴候、症状、若しくは原因の軽減及び／又は改善、あるいは、生物系のいずれか他の所望の改変であってよい。こうした薬剤又は化合物を含有する組成物は、予防、増強、及び／又は治療的処置のために投与され得る。任意の個々のケースで適切な「有効」量は、用量漸増試験などの技法を用いて決定することができる。
【０２４３】
本開示の方法、組成物、及びキットは、ある状態の症状を予防、治療、停止、反転、又は改善する方法を含み得る。治療は、被験者（例えば、疾患又は状態に罹患した個体、飼育動物、野生動物、若しくは実験動物）を本開示のペプチドで治療するステップを含む。疾患は、癌又は腫瘍であってよい。疾患を治療する場合、ペプチドを腫瘍又は癌細胞と接触させてもよい。被験者はヒトであってもよい。被験者は、ヒト；ヒト以外の霊長類、例えば、チンパンジー、並びに他の種の類人猿及びサルなど；畜牛、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜；ウサギ、イヌ及びネコなどの飼育動物；ラット、マウス及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物でもよい。被験者は、あらゆる年齢であってよい。被験者は、例えば、高齢者、成人、青年、少年、小児、幼児、乳児、及び子宮内の胎児であってよい。
【０２４４】
治療は、疾患の臨床的発症前に被験者に提供することもできる。治療は、疾患の臨床的発症後に被験者に提供してもよい。治療は、疾患の臨床的発症から１日、１週間、６ヶ月、１２ヶ月、又は２年若しくはそれ以上後に被験者に提供してよい。治療は、疾患の臨床的発症から１日超、１週間超、１ヶ月超、６ヶ月超、１２ヶ月超、又は２年以上にわたって被験者に提供してよい。治療は、疾患の臨床的発症から１日未満、１週間未満、１ヶ月未満、６ヶ月未満、１２ヶ月未満、又は２年未満にわたって被験者に提供してよい。さらに、治療は、臨床試験においてヒトを治療することも含み得る。治療は、本開示全体を通して記載される医薬組成物の１つまたは複数などの医薬組成物を被験者に投与するステップを含み得る。治療は、１日１回の投与を含み得る。治療は、静脈内、皮下、筋肉内、吸入、皮膚、局所、関節内注射、経口、舌下、髄腔内、経皮、鼻内、腹膜経路、脳に直接（例えば、脳内脳室経路を介して）、又は関節に直接（例えば、局所、関節内注射経路を介して）のいずれかにより、本開示のペプチドを被験者に投与するステップを含み得る。治療は、静脈内、皮下、筋肉内、吸入、関節内注射、皮膚、局所、経口、髄腔内、経皮、鼻内、非経口、経口、腹膜経路、鼻、舌下、癌組織に直接、又は軟骨付近に直接のいずれかにより、ペプチド−活性薬剤複合体を被験者に投与するステップを含み得る。
【０２４５】
一部の実施形態では、配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するペプチド−活性薬剤コンジュゲートなどのいずれかのペプチド誘導体又はペプチドコンジュゲートを使用して、身体若しくは組織の１領域又は細胞内コンパートメントの障害を治療することができる。特定の実施形態では、ペプチドは、活性薬剤の送達スカフォールドとして用いることができる。例えば、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを用いて、胃腸（ＧＩ）管、肺、皮膚、軟骨、膣粘膜、又は鼻粘膜の障害にアクセスし、治療することができる。低ｐＨ、プロテアーゼ豊富な環境、酸性環境、還元性環境、又は様々な温度の環境をはじめとする多様な生物学的環境における高い安定性のために、本開示のペプチドを用いて、これらの障害にアクセスし、治療することができる。
【０２４６】
配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するいずれかのペプチド誘導体又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを使用して、上部ＧＩ疾患及び癌（例えば、喉、口腔、食道癌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、腺肉腫、口腔内悪性メラノーマ、頭部、頸部癌、若しくは肉腫）を治療することができる。配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するいずれかのペプチド誘導体又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを使用して、食道、胃、小腸、十二指腸、大腸、及びＧＩ管の他の部分の疾患を治療することができる。こうした疾患として、クローン病、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、大腸癌及び胃癌などの癌、胃食道逆流症、潰瘍性大腸炎、便秘、オピオイド誘発性便秘、並びにヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に起因する感染症などの感染症が挙げられる。
【０２４７】
配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するいずれかのペプチド誘導体又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを使用して、上部ＧＩ疾患及び癌（例えば、喉、口腔、食道癌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、腺肉腫、口腔内悪性メラノーマ、頭部、頸部癌、若しくは肉腫）を診断又はイメージングすることができる。配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するいずれかのペプチド誘導体又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを使用して、食道、胃、小腸、十二指腸、大腸、及びＧＩ管の他の部分の疾患を診断又はイメージングすることができる。こうした疾患として、クローン病、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、大腸癌及び胃癌などの癌、胃食道逆流症、潰瘍性大腸炎、便秘、オピオイド誘発性便秘などが挙げられる。
【０２４８】
配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するいずれかのペプチド誘導体又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを使用して、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び肺気腫などの上部慢性炎症性肺疾患を治療することができ、これらの疾患は、正常レベルより高い肺プロテアーゼ（例えば、好中球エラスターゼ、α−１アンチトリプシン、分泌ロイコプロテアーゼ阻害剤、又はエラフィン）を特徴とする。
【０２４９】
配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するいずれかのペプチド誘導体又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを使用して、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び肺気腫などの上部慢性炎症性肺疾患を診断又はイメージングすることができ、これらは、正常レベルより高い肺プロテアーゼ（例えば、好中球エラスターゼ、α−１アンチトリプシン、分泌ロイコプロテアーゼ阻害剤、又はエラフィン）を特徴とする。
【０２５０】
配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するいずれかのペプチド誘導体又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを使用して、アカンソアメーバ（ａｓａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）性角膜炎、眼瞼炎、ＣＭＶ網膜炎、結膜炎、角膜上皮剥離、ドライアイ症候群、眼部ヘルペス、真菌性角膜炎、トラコーマ、眼内炎、涙道狭窄、ブドウ膜炎、シェーグレン症候群、麦粒腫、眼ヒストプラスマ症候群、真菌症、トキソプラズマ症、クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、淋病、細菌性角膜炎、結核、ハンセン病、梅毒、Ｂ型肝炎、又は単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ−ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、若しくはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）に起因する感染症などの眼の疾患、障害、又は感染症を治療することができる。
【０２５１】
配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するいずれかのペプチド誘導体又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを使用して、アカンソアメーバ（ａｓａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）性角膜炎、眼瞼炎、ＣＭＶ網膜炎、結膜炎、角膜上皮剥離、ドライアイ症候群、眼部ヘルペス、真菌性角膜炎、トラコーマ、眼内炎、涙道狭窄、ブドウ膜炎、シェーグレン症候群、麦粒腫、眼ヒストプラスマ症候群、真菌症、トキソプラズマ症、クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、淋病、細菌性角膜炎、結核、ハンセン病、梅毒、Ｂ型肝炎、又は単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ−ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、若しくはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）に起因する感染症などの眼の疾患を診断又はイメージングすることができる。
【０２５２】
配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するいずれかのペプチド誘導体又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを使用して、粘膜感染、細菌性膣症、膣炎、酵母感染、クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、淋病、骨盤内炎症性疾患、性器ヘルペス、好気性膣炎、並びに以下：カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、ガーデネラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、レンサ球菌属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、アクチノバクテリア属種（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）、アナエロコッカス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、アクチノマイセス・ナエスランディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）、バクテロイデス・ウレリティカス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、クロストリジウム目種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ  ｓｐｐ）、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）、エガセラ属種（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｓｐｐ）、エガセラ・レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ）、ユーバクテリウム属種（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、レプトトリキア属種（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ）、レプトトリキア・アムニオニイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ａｍｎｉｏｎｉｉ）、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｓｐｐ）、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・パルバム（Ｍｙｃｏｐｌａｍａｓ  ｐａｒｖｕｍ）、ペプトコッカス属種（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、ペプトニフィラス属種（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ）、ペプトストレプトコッカス属種（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、ペプトストレプトコッカス・アネロビウス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｅｒｏｂｉｕｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・ビビア属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａ  ｓｐｐ）、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、スラッキア属種（Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐｐ）、スネシア・サンギネジェンス（Ｓｎｅａｔｈｉａ  ｓａｎｇｕｉｎｅｇｅｎｓ）、タンネレラ・フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔ���ｉａ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、又はベイロネラ・パルブーラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ）に起因する感染症などの膣疾患を治療することができる。活性薬剤は、クリンダマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、フルコナゾール、ミコナゾール、テルコナゾール、ヒドロコルチゾン、又はチオコナゾールであってよい。
【０２５３】
配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するいずれかのペプチド誘導体又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを使用して、粘膜感染、細菌性膣症、膣炎、酵母感染、クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、淋病、骨盤内炎症性疾患、性器ヘルペス、好気性膣炎、並びに以下：カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、ガーデネラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、レンサ球菌属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、アクチノバクテリア属種（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）、アナエロコッカス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、アクチノマイセス・ナエスランディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）、バクテロイデス・ウレリティカス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、クロストリジウム目種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ  ｓｐｐ）、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）、エガセラ属種（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｓｐｐ）、エガセラ・レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ）、ユーバクテリウム属種（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、レプトトリキア属種（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ）、レプトトリキア・アムニオニイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ａｍｎｉｏｎｉｉ）、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｓｐｐ）、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐｐ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・パルバム（Ｍｙｃｏｐｌａｍａｓ  ｐａｒｖｕｍ）、ペプトコッカス属種（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、ペプトニフィラス属種（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ）、ペプトストレプトコッカス属種（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、ペプトストレプトコッカス・アネロビウス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｅｒｏｂｉｕｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・ビビア属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａ  ｓｐｐ）、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、プレボデラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、スラッキア属種（Ｓｌａｃｋｉａ  ｓｐｐ）、スネシア・サンギネジェンス（Ｓｎｅａｔｈｉａ  ｓａｎｇｕｉｎｅｇｅｎｓ）、タンネレラ・フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔ���ｉａ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、又はベイロネラ・パルブーラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ）に起因する感染症などの膣疾患を治療することができる。
【０２５４】
配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するいずれかのペプチド誘導体又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを使用して、鵞口瘡、ヘルパンギーナ、梅毒、淋病、急性壊死性潰瘍性歯肉炎、結核、頸部顔面放線菌症、ヒストプラスマ症、カンジダ症、粘膜類天疱瘡、多形性紅斑、尋常性天疱瘡、扁平苔癬、アフタ性潰瘍、若しくはベーチェット症候群、又は以下：単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）１型若しくは２型、ヘルペス・ラビアレス（Ｈｅｒｐｅｓ  ｌａｂｉａｌｅｓ）、帯状疱疹ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ）、エプスタイン・バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ−ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、コクサッキーウイルスＡ（ｃｏｘｓａｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ａ）、コクサッキーウイルスＢ（ｃｏｘｓａｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ｂ）、若しくはエコーウイルス（ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）に起因する感染症などの口腔疾患若しくは感染症を治療することができる。
【０２５５】
配列番号１〜配列番号１６６のいずれかの配列を含むペプチド、及び本明細書に記載するいずれかのペプチド誘導体又はペプチド−検出可能物質コンジュゲートを使用して、鵞口瘡、ヘルパンギーナ、梅毒、淋病、急性壊死性潰瘍性歯肉炎、結核、頸部顔面放線菌症、ヒストプラスマ症、カンジダ症、粘膜類天疱瘡、多形性紅斑、尋常性天疱瘡、扁平苔癬、アフタ性潰瘍、若しくはベーチェット症候群、又は以下：単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）１型若しくは２型、ヘルペス・ラビアレス（Ｈｅｒｐｅｓ  ｌａｂｉａｌｅｓ）、帯状疱疹ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ）、エプスタイン・バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ−ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、コクサッキーウイルスＡ（ｃｏｘｓａｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ａ）、コクサッキーウイルスＢ（ｃｏｘｓａｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ｂ）、若しくはエコーウイルス（ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）に起因する感染症などの口腔疾患若しくは感染症を診断又はイメージングすることができる。
【０２５６】
治療用途では、既に疾患又は状態に罹患している被験者に、疾患若しくは状態の症状を治癒するか、又は少なくとも部分的に停止する、あるいは、状態を治癒、回復、改善、又は軽減するのに十分な量で、組成物を投与することができる。本明細書に記載されるこのようなペプチドは、状態を予防する（全体若しくは部分のいずれかで）、状態の発生、罹患、若しくは増悪の可能性を軽減するために、投与することもできる。この使用に有効な量は、疾患又は状態の重症度及び経過、以前の治療法、被験者の健康状態、体重、薬剤に対する応答、並びに治療医師の計算に応じて変動し得る。
【０２５７】
本明細書に記載される複数のペプチドを任意の順で、又は同時に投与することができる。いくつかのケースでは、毒素又は毒液に由来するペプチドの複数の機能性断片を任意の順で、又は同時に投与することができる。同時に投与する場合、本明細書に記載の複数のペプチドは、静脈内注射のように１回の単一化形態で、又は順次静脈内投与などの複数回形態で提供することができる。
【０２５８】
本開示のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを用いて治療することができる軟骨疾患又は状態の種類には、炎症、疼痛管理、抗感染、疼痛緩和、抗サイトカイン、癌、外傷、退歩、遺伝的基礎、再モデル化（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）、過形成などが含まれ得る。本開示のペプチドを用いて治療することができる軟骨疾患又は状態の例として、以下のものが挙げられる：肋膜炎、椎間板ヘルニア、再発性多発性軟骨炎、関節軟骨の外傷、あらゆる様式のリウマチ性疾患（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ若しくは「狼瘡（Ｌｕｐｕｓ）」）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、変形性関節症、痛風など）、ヘルニア形成、軟骨無形成症、良性若しくは非癌性軟骨腫、悪性若しくは癌性軟骨肉腫、軟骨形成不全、膝蓋軟骨軟化症、肋軟骨炎、強直母趾、股関節唇損傷、離断性骨軟骨炎、軟骨発育不全、半月板損傷、鳩胸、漏斗胸、軟骨疾患、軟骨軟化症、多発性軟骨炎、再発性多発性軟骨炎、骨頭すべり症、離断性骨軟骨炎、軟骨発育不全、肋膜炎、軟骨膜炎、骨軟骨腫、変形性膝関節症、変形性指関節症、変形性手関節症、変形性股関節症、変形性脊椎症、軟骨軟化症、変形性関節症への感受性、変形性足関節症、脊椎症、二次性軟骨肉腫、骨関節症に見られる小さく且つ不安定な小結節、骨軟骨症、原発性軟骨肉腫、軟骨障害、強皮症、コラーゲン異常症、軟骨発育不全、ティーツェ症候群、フランソワの皮膚軟骨角膜ジストロフィー、多発性骨端異形成症１、多発性骨端異形成症２、多発性骨端異形成症３，多発性骨端異形成症４、多発性骨端異形成症５、精神遅滞・筋力低下・骨変化を伴う骨化耳軟骨、骨膜性軟骨肉腫、手根足根骨軟骨腫症、軟骨無形成症、遺伝性軟骨腫症ＩＩ型、遺伝性軟骨腫症、軟骨発育不全−性分化疾患、軟骨腫、脊索腫、骨発生不全症１型、骨発生不全症ＩＩＩ型、骨発生不全症２型、濃化軟骨無形成症、家族性指骨関節症、軟骨骨形成不全−腎炎、眼角開離を伴う鼻翼軟骨欠損症、鼻翼軟骨形成不全−欠損症−眼角開離、ピエール・ロバン症候群−胎児性軟骨発育不全、脊椎不全性内軟骨腫症（Ｄｙｓｓｐｏｎｄｙｌｏｅｎｃｈｏｎｄｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、領域性軟骨無形成症−腹筋異形成症、離断性骨軟骨炎、家族性関節軟骨石灰化症、気管気管支軟化症、軟骨炎、軟骨骨形成不全、ジェキア・コズロウスキー骨格系統疾患、軟骨形成不全、頭蓋骨関節症、ティーツェ症候群、股関節異形成症−外軟骨腫（ｅｃｃｈｏｎｄｒｏｍａｔａ）、ベッセル・ハーゲン病、軟骨腫症（良性）、内軟骨腫症（良性）、アパタイト結晶沈着による軟骨石灰化症、Ｍｅｙｅｎｂｕｒｇ  Ａｌｔｈｅｒｒ  Ｕｅｈｌｉｎｇｅｒ症候群、内軟骨腫症−小人症−難聴、骨端板早期閉鎖（例えば、小人症、外傷、壮年期ざ瘡、若しくはＡＣＬ修復のためのレチノイド療法などの療法に起因する）、アストレー・ケンダル症候群、滑膜骨軟骨腫症、発育遅延と黒色表皮腫を伴う重度の軟骨無形成症、軟骨石灰化症、Ｓｔａｎｅｓｃｕ症候群、家族性離断性骨軟骨炎、軟骨無形成症１Ａ型、軟骨無形成症２型、軟骨無形成症、ランガー・サルジノ（Ｌａｎｇｅｒ−Ｓａｌｄｉｎｏ）型、軟骨無形成症１Ｂ型、軟骨無形成症１Ａ及び１Ｂ型、ＩＩ型軟骨無形成症−軟��低発生症、軟骨無形成症、軟骨無形成症３型、軟骨無形成症４型、軟骨石灰化症１型、軟骨石灰化症２型、家族性関節軟骨石灰化症、捻曲性骨異形成症、繊維軟骨形成症、軟骨低形成症、ケウテル（Ｋｅｕｔｅｌ）症候群、マフッチ（Ｍａｆｆｕｃｃｉ）症候群、骨関節炎への感受性６、骨関節炎への感受性５、骨関節炎への感受性４、骨関節炎への感受性３、骨関節炎への感受性２、骨関節炎への感受性１、偽軟骨無形成症、カリフラワー耳、肋軟骨炎、成長板骨折、漏斗胸、化膿性関節炎、痛風、偽性痛風（ピロリン酸カルシウム結晶沈着症若しくはＣＰＰＤ）、痛風性関節炎、関節若しくは関節付近の細菌性、ウイルス性、若しくは真菌性感染症、滑液包炎、腱炎、関節症、又は別の軟骨又は関節疾患若しくは状態。
【０２５９】
本開示のペプチド−検出可能物質コンジュゲートを用いて診断又はイメージングすることができる軟骨疾患又は状態の種類には、炎症、疼痛管理、抗感染、疼痛緩和、抗サイトカイン、癌、外傷、退歩、遺伝的基礎、再モデル化（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）、過形成などが含まれ得る。本開示のペプチドを用いて治療することができる軟骨疾患又は状態の例として、以下のものが挙げられる：肋膜炎、椎間板ヘルニア、再発性多発性軟骨炎、関節軟骨の外傷、あらゆる様式のリウマチ性疾患（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ若しくは「狼瘡（Ｌｕｐｕｓ）」）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、変形性関節症、痛風など）、ヘルニア形成、軟骨無形成症、良性若しくは非癌性軟骨腫、悪性若しくは癌性軟骨肉腫、軟骨形成不全、膝蓋軟骨軟化症、肋軟骨炎、強直母趾、股関節唇損傷、離断性骨軟骨炎、軟骨発育不全、半月板損傷、鳩胸、漏斗胸、軟骨疾患、軟骨軟化症、多発性軟骨炎、再発性多発性軟骨炎、骨頭すべり症、離断性骨軟骨炎、軟骨発育不全、肋膜炎、軟骨膜炎、骨軟骨腫、変形性膝関節症、変形性指関節症、変形性手関節症、変形性股関節症、変形性脊椎症、軟骨軟化症、変形性関節症への感受性、変形性足関節症、脊椎症、二次性軟骨肉腫、骨関節症に見られる小さく且つ不安定な小結節、骨軟骨症、原発性軟骨肉腫、軟骨障害、強皮症、コラーゲン異常症、軟骨発育不全、ティーツェ症候群、フランソワの皮膚軟骨角膜ジストロフィー、多発性骨端異形成症１、多発性骨端異形成症２、多発性骨端異形成症３，多発性骨端異形成症４、多発性骨端異形成症５、精神遅滞・筋力低下・骨変化を伴う骨化耳軟骨、骨膜性軟骨肉腫、手根足根骨軟骨腫症、軟骨無形成症、遺伝性軟骨腫症ＩＩ型、遺伝性軟骨腫症、軟骨発育不全−性分化疾患、軟骨腫、脊索腫、骨発生不全症１型、骨発生不全症ＩＩＩ型、骨発生不全症２型、濃化軟骨無形成症、家族性指骨関節症、軟骨骨形成不全−腎炎、眼角開離を伴う鼻翼軟骨欠損症、鼻翼軟骨形成不全−欠損症−眼角開離、ピエール・ロバン症候群−胎児性軟骨発育不全、脊椎不全性内軟骨腫症（Ｄｙｓｓｐｏｎｄｙｌｏｅｎｃｈｏｎｄｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、領域性軟骨無形成症−腹筋異形成症、離断性骨軟骨炎、家族性関節軟骨石灰化症、気管気管支軟化症、軟骨炎、軟骨骨形成不全、ジェキア・コズロウスキー骨格系統疾患、軟骨形成不全、頭蓋骨関節症、ティーツェ症候群、股関節異形成症−外軟骨腫（ｅｃｃｈｏｎｄｒｏｍａｔａ）、ベッセル・ハーゲン病、軟骨腫症（良性）、内軟骨腫症（良性）、アパタイト結晶沈着による軟骨石灰化症、Ｍｅｙｅｎｂｕｒｇ  Ａｌｔｈｅｒｒ  Ｕｅｈｌｉｎｇｅｒ症候群、内軟骨腫症−小人症−難聴、骨端板早期閉鎖（例えば、小人症、外傷、壮年期ざ瘡、若しくはＡＣＬ修復のためのレチノイド療法などの療法に起因する）、アストレー・ケンダル症候群、滑膜骨軟骨腫症、発育遅延と黒色表皮腫を伴う重度の軟骨無形成症、軟骨石灰化症、Ｓｔａｎｅｓｃｕ症候群、家族性離断性骨軟骨炎、軟骨無形成症１Ａ型、軟骨無形成症２型、軟骨無形成症、ランガー・サルジノ（Ｌａｎｇｅｒ−Ｓａｌｄｉｎｏ）型、軟骨無形成症１Ｂ型、軟骨無形成症１Ａ及び１Ｂ型、ＩＩ型軟骨無形��症−軟骨低発生症、軟骨無形成症、軟骨無形成症３型、軟骨無形成症４型、軟骨石灰化症１型、軟骨石灰化症２型、家族性関節軟骨石灰化症、捻曲性骨異形成症、繊維軟骨形成症、軟骨低形成症、ケウテル（Ｋｅｕｔｅｌ）症候群、マフッチ（Ｍａｆｆｕｃｃｉ）症候群、骨関節炎への感受性６、骨関節炎への感受性５、骨関節炎への感受性４、骨関節炎への感受性３、骨関節炎への感受性２、骨関節炎への感受性１、偽軟骨無形成症、カリフラワー耳、肋軟骨炎、成長板骨折、漏斗胸、化膿性関節炎、痛風、偽性痛風（ピロリン酸カルシウム結晶沈着症若しくはＣＰＰＤ）、痛風性関節炎、関節若しくは関節付近の細菌性、ウイルス性、若しくは真菌性感染症、滑液包炎、腱炎、関節症、又は別の軟骨又は関節疾患若しくは状態。
【０２６０】
一部の実施形態では、関節炎を患う関節をターゲティングするために、本開示のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを被験者に投与することができる。他の実施形態では、関節炎を患う関節を治療するために、本開示のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを被験者に投与することができる。
【０２６１】
一部の実施形態では、関節炎を患う関節を診断又はイメージングするために、本開示のペプチド又はペプチド−検出可能物質コンジュゲートを被験者に投与することができる。
【０２６２】
一部の実施形態では、軟骨肉腫を治療するために、本開示のペプチドを使用することができる。軟骨肉腫は、軟骨生成細胞の癌であり、多くの場合、骨及び関節に見出される。これは、骨及び軟組織肉腫のファミリーに属する。特定の実施形態では、軟骨肉腫を有する被験者をイメージング及び診断又はターゲティング及び治療するために、本開示のペプチド、ペプチド−活性薬剤コンジュゲート、又はペプチド−検出可能物質コンジュゲートの投与を使用することができる。被験者は、ヒト又は動物でもよい。
【０２６３】
一部の実施形態では、本開示のペプチドを１種又は複数種の治療薬と共役させる。別の実施形態では、治療薬は、限定されないが、以下：例えば、グルココルチコイド、コルチコステロイドなどの抗炎症薬、例えば、コラゲナーゼ阻害剤又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（即ち、ＭＭＰ−１３阻害剤）などのプロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、ビタミン（例えば、ビタミンＤ）、及び抗生物質、抗ウイルス剤、若しくは抗真菌剤、スタチン、及び免疫モジュレータから選択される化学療法薬、抗癌剤、又は抗癌薬剤である。他の実施形態では、治療薬は、任意の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である。ＮＳＡＩＤは、ケトロラク、インドメタシン、エトドラク、若しくはトレメチンなどの任意の複素環式酢酸誘導体、ナプロキセンなどの任意のプロピオン酸誘導体、任意のエノール酸誘導体、任意のアントラニリル酸誘導体、セレコキシブなどの任意の選択的ＣＯＸ−２誘導体、任意のスルホンアニリド、任意のサリチル酸塩、アセクロフェナク、ナブメトン、スリンダク、ジクロフェナク、又はイブプロフェンであってよい。他の実施形態では、治療薬は、デキサメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、コルチゾン、プレドニゾン、レドニゾロン、トリアムシノロンヘキサセトニド、又はメチルプレドニゾロンなどの任意のステロイドである。一部の実施形態では、治療は、デキサメタゾン−ペプチドコンジュゲートとＮＳＡＩＤの両方を患者に投与する治療のように、前述した治療薬のいずれかとペプチド−活性薬剤コンジュゲートの組合せを投与するステップから成る。軟骨をターゲティングする本開示のペプチド及びペプチド−活性薬剤コンジュゲートを用いて、本明細書に記載の疾患状態、例えば、裂傷、外傷（即ち、スポーツ外傷）、遺伝因子、退歩、菲薄化（ｔｈｉｎｎｉｎｇ）、炎症、癌又はその他の軟骨の疾患若しくは状態を含む疾患若しくは状態を治療する、あるいは、中でもこれらの疾患を治療するために治療活性物質をターゲティングすることができる。その他のケースでは、本開示のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを用いて、外傷性破裂、離開、肋軟骨炎、椎間板ヘルニア、再発性及び非再発性多発性軟骨炎、関節軟骨に対する外傷、骨関節炎、関節炎又は軟骨無形成症を治療することができる。いくつかのケースでは、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを用いて、軟骨細胞中への拡散により軟骨と接触させた後、抗腫瘍機能、標的毒性をもたらし、転移を阻害するなどによって、軟骨の癌、例えば、良性軟骨腫又は悪性軟骨肉腫をターゲティングすることができる。加えて、ペプチド−検出可能物質コンジュゲートを用いて、他の病変の中でも腫瘍及び転移をはじめとする、こうした軟骨病変を標識、検出、又はイメージングすることができ、そうした病変は、様々な外科的技術によって除去することができる。
【０２６４】
軟骨をターゲティングする本開示のペプチドを用いて、本明細書に記載の軟骨外傷若しくは障害、又はいずれか他の軟骨若しくは関節状態に関連する疼痛を治療又は管理することができる。このペプチドは、直接使用してもよいし、又は活性剤、ペプチド、若しくは分子の担体として使用することもできる。例えば、イオンチャネルは疼痛に関連しており、関節炎などの病態で活性化され得ることから、疼痛を軽減するために、イオンチャネルと相互作用するペプチドを直接使用することができる。別の実施形態では、抗炎症活性を有する活性薬剤にペプチドを共役させ、この場合、ペプチドは、疼痛を軽減する活性薬剤の局所送達のための担体として作用する。
【０２６５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、被験者の軟骨症状を治療する方法、配列番号３〜配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２９〜配列番号３１、又はそのいずれかの断片を含む、治療有効量のペプチドを被験者に投与するステップを含む方法を提供する。
【０２６６】
胃腸疾患へのペプチドの使用
本開示のペプチドを用いて、胃腸（ＧＩ）疾患、障害、又は感染症を治療することができる。配列番号１〜配列番号１６６のペプチドのいずれか１つを用いて、胃腸疾患、障害、又は感染症を治療することができる。
【０２６７】
本開示のペプチドを用いて、胃腸（ＧＩ）疾患、障害、又は感染症を診断又はイメージングすることができる。配列番号１〜配列番号１４６のペプチドのいずれか１つを用いて、胃腸疾患、障害、又は感染症を診断又はイメージングすることができる。
【０２６８】
例えば、配列番号１〜配列番号１６６のペプチドのいずれか１つを単独で、又は活性薬剤とのコンジュゲートとして経口投与することによって、胃腸疾患、障害、又は感染症を治療又は予防することができる。配列番号１〜配列番号１６６のペプチドのいずれか１つを、検出可能な物質とのコンジュゲートとして経口投与することによって、胃腸疾患、障害、又は感染症を診断又はイメージングすることができる。
【０２６９】
ペプチドは、組換えにより発現させるか、又は化学的に合成することができる。一部の実施形態では、ペプチドを活性薬剤若しくは検出可能な物質と融合するか、又は化学的に共役させて、ペプチド−活性薬剤コンジュゲート又はペプチド−検出可能物質コンジュゲートを生成することができる。
【０２７０】
本開示のペプチドは、ＧＩ管の環境に見出されるプロテアーゼ、低ｐＨ、及び／又は還元条件に対して耐性となり得るため、本開示のペプチドは、治療効果を有する、組織をターゲティングする、組織若しくは細胞中に蓄積する、活性薬剤を送達する、受容体若しくは酵素若しくはイオンチャネルに結合する、これらを中和若しくは刺激する、生物学的経路を活性化若しくは遮断する、イメージングを可能にする、又は別の治療若しくは診断作用を有する上で十分に長期間にわたりＧＩ管中でインタクトな状態を維持することができる。例えば、低ｐＨ及びペプシンに対して耐性のノッテッドペプチドであるリナクロチドは、経口投与することができ、腸管腔内で分解される前に、（便秘又は慢性突発性便秘を伴う過敏性腸症候群の治療のために）胃腸管内のグアニレートシクラーゼ−Ｃを刺激することができる。その結果、リノクラチドは、血漿中に有意に全身吸収されないため、全身性副作用が回避される（ＬｉｎｚｅｓｓのＦＤＡ標識（２０１２承認）を参照）。リナクロチドと同様に、ＧＩ管の疾患を治療するために本開示のペプチドを使用することができる。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、ＧＩ感染症、又はＧＩ癌を予防若しくは治療するために経口投与することができる。例えば、ペプチド及び／又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを用いて、下記の胃腸疾患、癌、障害若しくは感染症のいずれか１つを治療することができる：ノロウイルス（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、腸管寄生虫（例えば、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｙｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、クロストリジウム・ペプトコッカス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ギョウチュウ（ｐｉｎｗｏｒｍ）、糞線虫症（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｉａｓｉｓ）、ヒトマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、クリプトスポリジウム・パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍ）、サイクロスポーラ・カエタネンシス（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）、広節裂頭条虫（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｌａｔｕｍ）、カイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ、若しくは無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の志賀毒素産生性（Ｓｈｉｇａ  ｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）（ＳＴＥＣ）株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１４５、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１２１：Ｈ１９を含む）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌食中毒（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｆｏｏｄ  ｐｏｉ���ｏｎｉｎｇ）、腸チフス（Ｔｙｐｈｏｉｄ  ｆｅｖｅｒ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）に起因する感染症、分泌性下痢若しくは水様下痢を引き起こし得る腸管細菌（例えば、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、ＥＴＥＣ（腸管毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ）））、ＥＰＥＣ（腸管病原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ））、血性下痢若しくは赤痢を引き起こし得る浸潤性／組織損傷性腸管病原体（例えば、ＥＩＥＣ（腸管侵入性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ））、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐｐ）、ＥＨＥＣ（腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｍｏｒｈａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ）））、並びに遅細菌感染性病原体（例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ））、バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、シクロスポラ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ）、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｐｓｏｒｉｄｉａ）、トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃｉａ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、プレジオモナス属種（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｐ）、ノーウォークウイルス（ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓ）、アストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、カリシウイルス（ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓｅｓ）、若しくはパルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）の感染症；軟性下疳（ｃｈａｎｃｏｒｏｉｄ）；鼠径部肉芽腫；肛門癌；家族性大腸腺腫症；ブラマー棚；カルチノイド；消化器腫瘍；十二指腸癌；食道癌；家族性大腸腺腫症；ガードナー症候群；胃リンパ腫；消化管間質腫瘍；虫垂杯細胞カルチノイド；肝芽腫；炎症性骨髄芽球性腫瘍；膵管内乳頭粘液性腫瘍；若年性ポリポーシス症候群；クルーケンベルグ腫瘍；形成性胃炎（ｌｉｎｉｔｉｓ  ｐｌａｓｔｉｃａ）；ＭＡＬＴリンパ腫；食道胃接合部腺癌；小腸癌；扁桃癌；結腸癌；直腸癌；胃癌；間質腫瘍；脂肪腫；新生血管腫；カルチノイド症候群；胃腸カルチノイド腫瘍；腺癌；肉腫；胃腸間質腫瘍；胆管癌；大腸癌；鼻咽頭癌；口腔咽頭癌；口腔癌；下咽頭癌；炎症性腸疾患；過敏性腸症候群；便秘；下痢；感染症；潰瘍；疼痛；代謝障害；肥満；免疫不全；自己免疫疾患；吐気；嘔吐；腫脹；運動障害；アカラシア；胃運動機能不全；胃弱；出血；胃食道逆流症；バレット食道；胃腸炎；幽門狭窄；貧血；悪性貧血���クローン病；潰瘍性大腸炎；腸炎（ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓ）；虚血性大腸炎；放射線大腸炎；ポリープ；腸炎（ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）；セリアック病；吸収不良；虫垂炎；大腸炎；憩室炎；痔核；裂肛；肛門周囲膿瘍；痔瘻；憩室症；酸の逆流；ヒルシュスプルング病；大便失禁；周期性嘔吐症候群；ダンピング症候群；胆石；ガス；胃炎；胃腸出血；鼠径ヘルニア；メネトリエ病；消化性潰瘍；肝臓病；膵炎；小腸症候群；ウイルス性胃腸炎；ウィップル病；ゾリンジャー・エリソン症候群；及び直腸炎。
【０２７１】
一部の実施形態では、プロバイオティクス又は共生細菌を遺伝子操作することにより、ＧＩ疾患治療に使用する本開示のペプチドを生成することができる。一部の実施形態では、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを食品に添加することができる。別の実施形態では、ペプチド、ペプチド−活性薬剤コンジュゲート、又はペプチドを発現する遺伝子操作プロバイオティクス若しくは共生細菌を通常のプロバイオティクスと同様に丸薬として摂取することができる。従って、本開示の安定なペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、極端な条件（例えば、温度）下でのＧＩ疾患の継続中の予防又は治療を提供することができ、追加の貯蔵設備を必要としない環境で使用することができる。これは、容易に利用可能な冷却設備が不足している発展途上国での使用、又は軍隊による使用に有利となり得る。
【０２７２】
胃腸疾患、障害又は感染症を治療するために用いることができるペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、配列番号１〜配列番号１６６のいずれかのペプチドと融合又は化学的に共役した下記の活性薬剤のいずれか１つを含み得る：抗生物質（例えば、クリダマイシン、フシジン酸、ムプリオシン、オリタバンシン、テジゾリド、チゲサイクリン、アミノグリシド（例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ロンコサミド、クリンカマイシン（ｃｌｉｎｃａｍｙｃｉｎ）、リンコマイシン）、アンサマイシン（例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシマイシン）、カバペネム（例えば、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスチン、メロペネム）、キノリン／フルオルキノロン（例えば、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、ロメフロキサシン）、ピペラシリン／トザオバタム（ｔｚａｏｂａｔａｍ）、チカルシリン／クラブラン酸、アモキシシリン／クラブラン酸塩、アンピシリン／スルバクタム、ストレプトグラミン、セファロスポリン（例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セフレキシン、セファクター（ｃｅｆａｃｔｏｒ）、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアゾン、セフェピム、セフタロリンフォサミル、セフトビプロール）、グリコペプチド（例えば、テイコファニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン）、レペプチド（例えば、ダプトマイシン）、マクロライド（例えば、アジスロマイシン、クラリソマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン）、モノバクタム（例えば、アズトレオナム）、ニトロフラン（例えば、フラゾリドン、ニトロフラントイン）、オキサゾリジノン（例えば、リンゾリド、ポシゾリド、ラデゾリド、トレゾリド）、ペニシリン（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アゾロシリン、カルベンシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルコキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサイリン、ペニシリンｇ、テモシリン、チカルシリン）、ポリペプチド（例えば、バシチトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ）、スルホンアミド（例えば、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニリミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、スルホンアミドクリソイジン）、テトラサイクリン（例えば、デムクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン）、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、シクロセリン、エタンブトール、エチオナミド（ｅｔｈｉｏｎａｍｅｄｅ）、イソニアジド、ピリアジンアミド、リファンピシン、ストレプトマイシン（ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｃｉｎ）、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン（ｆｏｓｏｍｙｃｉｎ）、メトロニダゾール、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、チアンフェニコール、トリメトプリム、広域スペクトルペニシリン（例えば、チカラシリン、ピペラシリン）、ニトロフラントイン、抗寄生虫剤（例えば、ニタゾキサニド、メラルソプロール、エフロリニチン、メトロニダゾール、メベンダゾール、プラジカンテル、チオベンダゾール、イベルメクチン、チニダゾール、ミルテホシン、ピランテルパモ酸塩、チアベンダゾール、ジエチルカルバミジン、ニクロサミド、アルベンダゾール、リファンピン、アムホテイシンＢ）、抗真菌薬（例えば、フマギリン、アムホテリシンＢ、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン、ナタマイシン（ｎａｔａｙｃｉｎ）、ナイスタチン、リモシジン、ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルイコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、アルバコナゾール、エフェイナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テロナゾール、ボリコナゾール、アバファンギン、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン、アニデュラファンギン、カプソファンギン、ミカファンギン、オーロン、安息香酸、シクロピロックス、フルシトシン、グリセオフルビン、ハロプロギン、トルナフタート（ｔｏｌｎａｆｒｔａｔｅ）、ウンデシレン酸、クリスタルバイオレット、ペルーバルサム（ｂａｌｓａｍ  ｏｆ  Ｐｅｒｕ））、抗ウイルス剤（例えば、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アマンダジン、アンプレナビル、アンプリゲン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、バラビル、シドホビル、コンビビル、ドルテグラビル、ダルナビル、デラビルジン、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンズ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、エコリエベル（ｅｃｏｌｉｅｖｅｒ）、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホソネット、融合阻害剤、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル（ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサビル（ｎｅｘａｖｉｒ）、ニタゾキサニド、ヌクレオシド類似体、ノビル（ｎｏｖｉｒ）、オセルタミビル、ペルグインテロン（ｐｅｒｇｉｎｔｅｒｏｎｅ）α−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、プドフィロトキシン（ｐｄｏｄｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ラルテグラビル、逆転写酵素阻害剤、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン（ｐｙｒａｍｉｄｉｎｅ）、サキナビル、ソホスブビル、スタブジン、テラプレビル、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、ジドブジン）、抗炎症薬（例えば、ナプロキセン、ジクロフェナク、イブプロフェン、インドメタシン、ピロキシカム、ナブメトン、エドドラク、セレコキシブ、スリンダク、オキサプロジン、メロキシカム、アスピリン、フェノプロフェン、ジフルニサル、トルメチン、ケトロラク、フルルビプロフェン、メフェナミン酸、ケトプロフェン、サルサレート、バルデコキシブ、ロキソプロフェン、フェニルブタゾン）、免疫モジュレータ（例えば、アザチオルピオピン、メルカプトプリン、メトトレキサート、アレファセプト、アナキンラ、セルトリズマブペゴール、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ）、癌治療薬（例えば、アクチノマイシン、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドキシフルリジン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素（ｈｙｒｏｘｙｕｒｅａ）、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、胃運動性モジュレータ（例えば、ベンザミド、シサプリド、ドンペリドン、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｏｍｙｃｉｎ）、イトプリド、モサプリド、メトクロプラミド、プルカロプリド、レンザプリド、テガセロド、ミテムシナル、レボスルピリド、シニタプリド）、止瀉薬（例えば、アタパルジャイト、次サリチル酸ビスマス、クロフェレマー、ジアライド（ｄｉａｒａｉｄ）、ジアソルブ（ｄｉａｓｏｒｂ）、ジフェノキシラートｈｃｌ／アトロピン、ジフェノキシレートｈｃｌ／アトロピン、イモジウム、ｋ−ｐｅｋ、カオペクテート、ロモチル、ロノックス（ｌｏｎｏｘ）、ロペラミド、ロペラミド／シメチコン、マロックス（ｍａｌｌｏｘ）、モトフェン、ミテシ（ｍｙｔｅｓｉ）、ネオジアラル、オクトレトイド、オピウム・パレゴリック、アヘンチンキ、パレゴリック、リフキシミン、サンドスタチン、キシファキサン）、便秘薬（イナクロチド、ラクツロース、ルビプロストン、プレカナチド、ポリエチレングリコール）、又はイオンチャネルモジュレータ。
【０２７３】
胃腸疾患、障害又は感染症（上記に開示した通り）を治療するために用いることができるペプチド−検出可能物質コンジュゲートは、配列番号１〜配列番号１６６のいずれかのペプチドと融合若しくは化学的に共役した、本明細書に開示されるいずれかの検出可能な物質又は下記の検出可能な物質：イメージング剤、蛍光色素、若しくは放射性同位体を含み得る。
【０２７４】
他の材料は、経口投与後に腸粘膜内での滞留時間を増加するために、ペプチド、ペプチド−活性薬剤コンジュゲート、又はペプチド−検出可能物質コンジュゲートと共役させる、又は一緒に製剤化（錠剤若しくはカプセルなどとして）することもできる。例えば、粘膜接着性ポリマーを、ペプチド、ペプチド−活性薬剤コンジュゲート、又はペプチド−検出可能物質コンジュゲートと共役させることができる。粘膜接着性ポリマーとしては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、並びにエチルセルロース及び微結晶性セルロース（ＭＣＣ）などの不溶性セルロース誘導体、ポリアクリレート、デンプン、キトサン、又はＣｈａｔｕｒｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ａｄｖ  Ｐｈａｒｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｒｅｓ．，２（４）：２１５−２２２（２０１１））に記載されている任意のポリマーが挙げられる。さらに、粘膜接着性ポリマーとして、以下のものも挙げることができる：Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）、Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｐｈｉｌ（登録商標）、アルギニン酸ナトリウム、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロース、ポロキサマー、又はＹｕ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  ｏｆ  ｄａｓ  Ｎｅｖｅｓ，Ｊｏｓｅ，ａｎｄ  Ｂｒｕｎｏ  Ｓａｒｍｅｎｔｏ，ｅｄｓ．Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，２０１４に記載されているいずれかのポリマー。一部の実施形態では、粘膜接着性ポリマーとさらに結合させたペプチド及び／又はペプチド−活性薬剤コンジュゲート及び／又はペプチド−検出可能物質コンジュゲートは、ペプチドポリマー及び／又はペプチド−活性薬剤−ポリマーコンジュゲート及び／又はペプチド−検出可能物質−ポリマーコンジュゲートの粘膜接着性を増強し得る。胃腸管内の滞留時間を延長することによって、これらの粘膜接着性ポリマーは、胃腸疾患、障害、及び感染症を治療、診断又はイメージングするために、ペプチド、ペプチド−活性薬剤コンジュゲート、及びペプチド−検出可能物質コンジュゲートの持続的治療効果を促進することができる。加えて、本開示のペプチド、ペプチド−活性薬剤コンジュゲート、若しくはペプチド−検出可能物質コンジュゲートは、例えば、ポリマーコーティング若しくは当技術分野で公知の他の製剤化を用いて、ペプチド、ペプチド−活性薬剤コンジュゲート、若しくはペプチド−検出可能物質コンジュゲートのＧＩ管の特定の部分に対する送達、又はＧＩ管の特定の部分への活性薬剤若しくは検出可能な物質の放出をターゲティングするように、製剤化することができる。
【０２７５】
共役活性薬剤の崩壊及び／又は分解を低減するように本開示の任意のペプチド又はペプチド−コンジュゲートを修飾することもでき、これによって、低ｐＨ若しくは腸内酵素に対して感受性の活性薬剤の分解を阻止することができる。例えば、一部の実施形態では、結腸の疾患を治療するために、ペプチド−活性薬剤コンジュゲートを投与することができる。結腸の疾患の治療の場合、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、小腸若しくは胃での活性薬剤の早期放出を防止するために、限定されないが、ポリマーコーティングを含む座薬、錠剤、若しくはカプセルとして、又は本明細書に記載する通り、若しくは当技術分野で公知のいずれかの製剤として製剤化することができ、これによって、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、それが結腸に到達するまでインタクトな状態を維持することができる。あるいは、結腸に特異的な酵素若しくは条件により切断することができるペプチド−活性薬剤コンジュゲートを活性薬剤にリンカーを介して連結することも可能であり、これによっても、小腸又は胃での活性薬剤の早期放出を防止することができる。
【０２７６】
ペプチドキット
一態様では、本明細書に記載のペプチドは、キットとして提供することができる。別の実施形態では、本明細書に記載のペプチドコンジュゲートは、キットとして提供することができる。別の実施形態では、キットは、本明細書に記載のペプチドをコードするアミノ酸、ベクター、宿主生物、及び指示マニュアルを含む。一部の実施形態では、キットは、ペプチドの使用又は投与に関する指示書きを含む。
【実施例】
【０２７７】
以下の実施例は、本開示のいくつかの態様をさらに詳しく説明するために加えられるものであり、本発明の範囲を限定するために使用されるべきではない。
【０２７８】
実施例１
ペプチドの製造
この実施例では、本明細書に記載のペプチドの製造を説明する。ノッティンタンパク質に由来するペプチドは、公開されている方法を用いて、哺乳動物細胞培養で生成した。（Ａ．Ｄ．Ｂａｎｄａｒａｎａｙｋｅ，Ｃ．Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｂ．Ｙ．Ｒｙｕ，Ｍ．Ｂｒａｕｌｔ，Ｒ．Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ，Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ．２０１１．Ｄａｅｄａｌｕｓ：ａ  ｒｏｂｕｓｔ，ｔｕｒｎｋｅｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｃｉｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．（３９）２１，ｅ１４３）。
【０２７９】
ペプチド配列をＤＮＡに逆翻訳し、合成した後、標準的な分子生物学技術を用いて、シデロカリンと同じフレーム内でクローン化した。（Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．２０１２  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ．）。得られた構築物をレンチウイルスにパッケージし、ＨＥＫ−２９３細胞に形質導入し、増殖させ、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により単離し、タバコエッチ病ウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼで切断した後、逆相クロマトグラフィーにより均質になるまで精製した。精製後、各ペプチドを凍結乾燥させ、凍結状態で保存した。
【０２８０】
実施例２
哺乳動物発現系を用いたペプチド発現
この実施例では、哺乳動物発現系を用いたペプチドの発現を説明する。Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｎｏｖ；３９（２１）：ｅ１４３に記載されている方法に従ってペプチドを発現させた。タバコエッチ病ウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼを用いてペプチドをシデロカリンから切断し、アセトニトリル及び０．１％ＴＦＡの勾配を用いる疎水性カラム上のＦＰＬＣによって精製した。次に、ペプチドを凍結乾燥させ、凍結状態で保存した。
【０２８１】
実施例３
ペプチド放射性標識
この実施例では、ペプチドの放射性標識を説明する。標準的な技術（例えば、Ｊｅｎｔｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５４（１１）：４３５９−６５．１９７９に記載されているものなど）によって、いくつかのペプチドを１４Ｃホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元的メチル化により放射性標識した。Ｎ末端でアミノ酸「Ｇ」及び「Ｓ」を有するように、配列を設計した。Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖ９１：１９８３  ｐ．５７０及びＪＢＣ  ２５４（１１）：１９７９  ｐ．４３５９を参照されたい。過剰量のホルムアルデヒドを用いて、完全なメチル化（全ての遊離アミンのジメチル化）を促進した。標識ペプチドをＳｔｒａｔａ−Ｘカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ８Ｂ−Ｓ１００−ＡＡＫ）での固相抽出により単離して、５％メタノールを含む水ですすいだ後、２％ギ酸を含むメタノール中で回収した。続いて、穏やかな加熱と窒素ガスの蒸気を用いたブローダウン蒸発器内で溶媒を除去した。
【０２８２】
実施例４
ペプシン、低ｐＨ、及び／又は還元に対するペプチド耐性
この実施例では、ペプシンによる酵素的分解、ＤＴＴによる還元、又は低ｐＨでの分解に対するペプチド耐性を証明する。まず、ペプチドを５００ｕｌのｄｄＨ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌのストック濃度まで懸濁させた。ストック溶液からの１２．５ｕｇのペプチドをＰＢＳ中のＤＴＴの１０ｍＭ溶液に添加することにより、反応物を調製し、室温で３０分間インキュベートさせた。人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）中の５００Ｕ／ｍｌペプシンを用いて又はなしで、１２．５μｇのペプチドと一緒に他の反応物を調製し、３７．５℃で３０分間インキュベートした。一部の反応物を最終濃度１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基及び１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）でクエンチングした。一部の反応物は、人工胃液、ペプシン、Ｔｒｉｓ、及びＤＴＴを含む前述の成分の全部（ＳＰＴＤと呼ぶ）を用いて実施した。Ｃ−１８  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０Ｂカラムを備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０ＨＰＬＣを用いて、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）をサンプルについて実施した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡを含む水）及び溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）の移動相を用いた勾配法により、サンプルを分析した。溶媒Ｂは、移動相の５％〜４５％から１０分にわたって増加した。２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度でペプチドを検出した。
【０２８３】
図１は、ＳＰＴＤ、人工胃液（ＳＧＦ）とペプシン（Ｐ）、ＳＧＦのみ、ＤＴＴのみ、及び非還元ペプチド（出発ペプチド、ＤＴＴ、ＳＧＦ、又はＰでの処理なし）を含む様々な溶液中の配列番号２のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図２は、ＳＰＴＤ人工胃液（ＳＧＦ）とペプシン（Ｐ）、ＳＧＦのみ、ＤＴＴのみ、及び非還元ペプチドを含む様々な溶液中の配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図３は、ＳＰＴＤ人工胃液（ＳＧＦ）とペプシン（Ｐ）、ＳＧＦのみ、ＤＴＴのみ、及び非還元ペプチドを含む様々な溶液中の配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【０２８４】
図１は、ＳＰＴＤ、人工胃液（ＳＧＦ）（ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）と５００Ｕ／ｍｌペプシン（Ｐ）、ＳＧＦ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、及び非還元（ＮＲ）条件を含む様々な溶液中に懸濁させた配列番号２のペプチド１２．５μｇのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。６．５分付近のピークは、配列番号２のインタクトなペプチドであり、１．５分付近のピークは、ＤＴＴであり、２．５分付近のピークは、酸化ＤＴＴであった。配列番号２のペプチドピークは、ＮＲクロマトグラムと同様に、ＤＴＴ及びＳＧＦクロマトグラムにおいて６．５分付近に存在することがわかったが、これは、ペプチドが、ＤＴＴ及び低ｐＨとのインキュベーション後であっても、インタクトなままであることを示している。インタクトなペプチドピークは、ＳＰＴＤクロマトグラムにも存在し、これは、ペプチドが、ＤＴＴを含むＳＧＦ中のペプチド分解に対して耐性であることを示している。図２は、ＳＰＴＤ、人工胃液（ＳＧＦ）（ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）と５００Ｕ／ｍｌペプシン（Ｐ）、ＳＧＦ、ＤＴＴ、及び非還元（ＮＲ）条件を含む様々な溶液中に懸濁させた配列番号２７のペプチド１２．５μｇのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図３は、ＳＰＴＤ、人工胃液（ＳＧＦ）（ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）と５００Ｕ／ｍｌペプシン（Ｐ）、ＳＧＦ、ＤＴＴ、及び非還元（ＮＲ）条件を含む様々な溶液中に懸濁させた配列番号３１のペプチド１２．５μｇのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。インタクトなペプチドは、ＮＲクロマトグラムに示されるように、６．５及び６．７５分付近で観測された。インタクトなペプチドピークは、ＤＴＴ、ＳＧＦ、ＳＧＦとＰ、及びＳＰＴＤクロマトグラムにおいて不変のままであったが、これは、配列番号２７及び配列番号３１のペプチドが、前述の還元、低ｐＨ、又は酵素が豊富な条件に対して高度に耐性であることを示している。
【０２８５】
実施例５
トリプシン消化、ペプシン消化、還元及び／又は高温に対するペプチドの耐性
この実施例では、トリプシン消化、ペプシン消化、ＤＴＴによる還元、及び高温での分解に対するペプチド耐性を証明する。まず、ペプチドを５００μｌのｄｄＨ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌのストック濃度まで懸濁させた。ストック溶液からの１２．５μｇのペプチドをＰＢＳ中のＤＴＴの１０ｍＭ溶液に添加することにより、反応物を調製し、室温で３０分間インキュベートさせた。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／７５ｍＭ  ＮａＣｌバッファー（ｐＨ７．０）中の１２．５μｇのペプチド及び５００Ｕ／ｍｌトリプシンを用いて、他の反応物を調製し、３７．５℃で３０分間インキュベートした。次に、これらの反応物を５μｇのダイズトリプシン阻害剤（Ｉ）で、いくつかのケースでは、１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）でクエンチングした。Ｃ−１８  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０Ｂカラムを備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０ＨＰＬＣを用いて、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）をサンプルに対して実施した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡを含む水）及び溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）の移動相を用いた勾配法により、サンプルを分析した。溶媒Ｂは、移動相の５％〜４５％から１０分にわたって増加した。ペプシン消化に対する耐性を試験するために、人工胃液（ＳＧＦ；ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）中、５００Ｕ／ｍｌペプシンと一緒に又はなしで、１２．５μｇのペプチドを用いて反応物を調製し、３７．５℃で３０分間インキュベートした。温度に対する耐性を試験するために、０．５ｍＭ  ＰＢＳ中で、ペプチドを７０℃、７５℃、又は１００℃で１時間にわたりインキュベートし、ペレット化した後、上清をＨＰＬＣにより分析した。
【０２８６】
図４は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５μｇのダイズトリプシン阻害剤（Ｉ）及び１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５００Ｕ／ｍｌトリプシン（Ｔ）のＨＰＬＣクロマトグラム並びに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ、Ｉ）、ＤＴＴ、及び非還元（ＮＲ）条件（出発ペプチド、ＤＴＴ、Ｔ、又はＩでの処理なし）を含む様々な溶液中に懸濁させた１２．５μｇの配列番号１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＤＴＴ自体は、１．５分及び２．５分（還元及び酸化）付近で溶出した。ＮＲトレースは、インタクトなペプチドが６．５分付近で溶出したことを示す。ＤＴＴ処理ペプチドクロマトグラムは、６．５分付近に最小のインタクトなペプチドと、７．２５分付近に還元ペプチドの新たなピークを示す。トリプシン処理ペプチドクロマトグラムもまた、６．５分付近にいくらかのインタクトなペプチド、並びに分解産物を意味する様々な新しいピークを示す。これは、配列番号１のペプチドが、トリプシンによる分解に対して部分的に耐性であるが、これらの条件下でのＤＴＴ処理に対しては耐性ではないことを示している。図５は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ中５００Ｕ／ｍｌトリプシン、５μｇのダイズトリプシン阻害剤及び１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）のＨＰＬＣクロマトグラム、並びに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ、Ｉ）、ＤＴＴ、及び非還元（ＮＲ）条件を含む様々な溶液中に懸濁させた１２．５μｇの配列番号２のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＤＴＴ及びＴとのインキュベーションから６．５分後にインタクトなペプチドが溶出したが、これは、配列番号２のペプチドが、ＤＴＴによる還元及びトリプシンによる消化に対して高度に耐性であることを示すものである。
【０２８７】
表２は、本開示のペプチド及び様々な条件下でのそれらの安定性の概要を示す。
【０２８８】
【表２−１】
2019529380.tif 000010
【０２８９】
【表２−２】
2019529380.tif 000011
【０２９０】
【表２−３】
2019529380.tif 000012
【０２９１】
表２のデータに示されるように、試験した本開示のペプチドは、プロテアーゼ、還元、及び高温に対して様々な耐性を示す。ペプチドは、各条件について高、中、又は低として分類した。低として分類されるペプチドは、処理ペプチドのＨＰＬＣピークの大部分（７５％超）が非処理ペプチドのＨＰＬＣピークと比較して消失したことを示す。例えば、ペプチドを１００℃で処理した後、ペプチドのＨＰＬＣピークが、１００℃で非処理のペプチドのＨＰＬＣピークと比較してほとんど存在しない場合、そのペプチドは、低、即ち、１００℃に対して低い耐性を有するものとして分類される。ペプチドを還元条件で処理した後、還元条件で非処理のペプチドのＨＰＬＣピークと重複するＨＰＬＣピークが全くないか、又は極めて小さい場合、そのペプチドは、低、即ち、還元条件に対して低い耐性を有するものとして分類される。中として分類されるペプチドは、非処理ペプチドのＨＰＬＣピークと比較して、処理ペプチドのＨＰＬＣピークの約半分（２５％〜７５％）が消失したことを示す。高として分類されるペプチドは、非処理ペプチドのＨＰＬＣピークと比較して、処理ペプチドのＨＰＬＣピークの大部分（少なくとも７５％）が依然として存在することを示す。
【０２９２】
試験した条件は、かなり攻撃的であり、これらは多くの場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ又は製造、取り扱い、輸送、及び貯蔵中に遭遇し得るものより高い濃度若しくは温度であったことを意味する。例えば、１０ｍＭ  ＤＴＴは、グルタチオンなどの天然の還元剤により生み出される、多くのｉｎ  ｖｉｖｏ位置に存在する還元性環境よりもはるかに高い還元性環境であり、１００℃（又は４０℃でさえも）は、室温が薬剤の流通に望ましい貯蔵温度である、典型的な貯蔵温度（室温）、並びに冷却設備が広範に利用可能ではない温帯地域及び地理的地域における貯蔵よりもはるかに高い温度である。従って、「低」耐性を示したペプチドであっても、医療用途で現在使用されている（且つ本開示の対象ではない）多くの薬剤又はペプチドよりもはるかに高い程度までこうした条件による分解に耐えることができるであろう。同様に、「低」耐性を示したペプチドであっても、その意図される用途の必要に応じて、分解に適切に耐えることができるであろう。さらには、こうした条件に対して本開示のペプチドが示す耐性は、生理的条件下での送達スカフォールドとして使用するためのこれらのペプチドの有用性、従って、医療用途についてのそれらの有用性を示し得る。
【０２９３】
７５℃で試験したペプチドの全てが７５℃でのインキュベーション（多くの他のペプチド及びタンパク質を分解し得る）に対して高度に耐性であったが、１００℃でのインキュベーションに対しては、試験した全てのペプチドが高度に耐性というわけではなかった。同様に、プロテアーゼ又は還元条件に対しても、試験した全てのペプチドが高度に耐性というわけではなかった。さらに具体的には、試験した２１のペプチドは、１００℃に対して高度に耐性であり、試験した３８のペプチドがペプシンに対して高度に耐性であり、試験した７つのペプチドがＤＴＴ還元に対して高度に耐性であり、また、試験した８つのペプチドが、トリプシンに対して高度に耐性であった。加えて、多くの異なる分解条件に対する耐性にはペプチド間で差があった。より具体的には、ＤＴＴ還元に対して高度に耐性であった５つのペプチドは、ペプシン、７５℃、及び１００℃に対しても高度に耐性であったが、トリプシンに対しても高度に耐性であったのは、これらのペプチドのうち３つだけであった。さらに、ペプチドの耐性の程度は、そのＣＤＰ分類又はそれらが由来する生物によるものではなかった。例えば、１００℃に対して高度に耐性のペプチドのサブセットと１００℃に対して高度に耐性ではないペプチドのサブセットの両方が、ヒッチン、ノッティン、又はその他のタンパク質スカフォールドとして分類することができるペプチドを含み、それらは、サソリ、クモ、及びヒトをはじめとする多様な異種に由来した。これらのデータは、ノッテッドペプチド又はその他のシスチン高密度ペプチドの全てが、こうした多様な条件に対して同様に耐性であるわけではないことを示している。
【０２９４】
最も高い耐性データを有するペプチドをさらに分析した。これらは、還元、ペプシン、７５℃、及び１００℃に対して高度に耐性であった５つのペプチドを含んだ。加えて、ペプシン、７５℃、及び１００℃に対して高度に耐性であり、且つＤＴＴ及びトリプシンの両方に対しては中度に耐性であった配列番号１２のペプチドもさらに分析した。配列番号１２は、最も高い耐性のサブセットを示しており、また、他の５つの高度に耐性ペプチドと共通の耐性を有するが、異なるトポロジー（ノッチン）及びジスルフィド結合パターンを有する配列番号１７とは対照的に、他の５つの高度に耐性のペプチドと配列及びトポロジー（ヒッチン）類似性を有することからさらなる分析のために選択した。高度の耐性特性を示したさらに別のペプチドは、配列番号３１及び配列番号３であった。さらに試験した６つのペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、及び配列番号５７の配列を含むペプチドであり、これらは全てヒッチンであった。図２７は、還元、ペプシン、７５℃、及び１００℃に対して高度に耐性であったこれらの６つのヒッチンペプチドと、還元、ペプシン、トリプシン、７５℃、及び１００℃に対して高度に耐性ではなかった９つの他のヒッチンペプチドの配列アラインメントを示す。図２７Ａは、還元  ペプシン、トリプシン、７５℃、及び１００℃に対して耐性ではなかったペプチドをコードする、配列番号３、配列番号８、配列番号３０、配列番号５、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１８、及び配列番号５６の配列アラインメントを示す。図２７Ｂは、還元、ペプシン、７５℃、及び１００℃に対して高度に耐性であったペプチドをコードする、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、及び配列番号５７の配列アラインメントを示す。＊は、配列番号１２のペプチドが、還元に対してのみ中程度に耐性であったことを示す。図２７Ｃは、図２７Ｂの配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、及び配列番号５７の配列分析である。図２７Ｃは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、及び配列番号５７の各位置にどのアミノ酸が存在するかを明らかにする。例えば、１位には、全てのペプチド配列がＧアミノ酸残基を含み；２位には、全てペプチド配列がＳアミノ酸残基を含み；３位には、全てのペプチド配列が、Ｇ、Ｑ、若しくはＶアミノ酸のいずれかを含むか、又は無であり；４位には、全てのペプチド配列が、Ｖ、Ｒ、若しくはＫアミノ酸を含むか、又は無である。図２７Ｂからの配列全体を通した各位置のアミノ酸残基を図２７Ｃに示す。図２７Ａを調べると、高度に耐性ではないペプチド配列の各々が、１つまたは複数の位置で図２７Ｃに示すアミノ酸とは相違することがわかる。図２７Ｃにまとめたアミノ酸残基に由来し得る１つの配列は、配列番号１６５であり、これも、配列内のＫ及びＲアミノ酸残基の交換を可能にする（配列番号２７及び配列番号３１は、Ｋ及びＲアミノ酸残基が交換可能であることを示している）：
ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＣＸ８Ｘ９ＳＸ１０Ｘ１１ＣＸ１２Ｘ１３Ｘ１４ＣＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＧＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＣＸ２４ＮＸ２５Ｘ２６ＣＸ２７ＣＸ２８Ｘ２９Ｘ３０（配列番号１６７）
（Ｘ１は、Ｇ、Ｑ、Ｖ、又は無であってよく；Ｘ２は、Ｖ、Ｒ、Ｋ、又は無であってよく；Ｘ３は、Ｐ、Ｉ、Ｆ、又は無であってよく；Ｘ４は、Ｉ、Ｔ、又はＬであってよく；Ｘ５は、Ｎ、Ｄ、Ｐ、又はＳであってよく；Ｘ６は、Ｖ、Ｉ、又はＮであってよく；Ｘ７は、Ｋ、Ｒ、又はＳであってよく；Ｘ８は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、又はＴであってよく；Ｘ９は、Ｇ、Ｉ、Ｈ、Ｎ、又はＡであってよく；Ｘ１０は、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｓ、又はＹであってよく；Ｘ１１は、Ｄ、Ｑ、又はＥであってよく；Ｘ１２は、Ｌ、Ｉ、Ｆ、又はＷであってよく；Ｘ１３は、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ１４は、Ｐ、Ｖ、又はＨであってよく；Ｘ１５は、Ｒ、Ｋ又はＩであってよく；Ｘ１６は、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｓ、又はＱであってよく；Ｘ１７は、Ａ、Ｉ、Ｒ、Ｋ、又はＭであってよく；Ｘ１８は、無又はＦであってよく；Ｘ１９は、Ｍ、Ｋ、Ｒ、又はＴであってよく；Ｘ２０は、Ｒ、Ｋ、Ｔ、又はＰであってよく；Ｘ２１は、Ｆ、Ｎ、又はＡであってよく；Ｘ２２は、Ｇ又はＡであってよく；Ｘ２３は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ２４は、Ｉ、Ｍ、又はＶであってよく；Ｘ２５は、Ｓ、Ｇ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ２６は、Ｋ、Ｒ、又はＬであってよく；Ｘ２７は、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ２８は、Ｔ、Ｙ、又はＦであってよく；Ｘ２９は、Ｐ、Ｓ、又は無であってよく；Ｘ３０は、無、Ｋ、又はＲであってよい）。さらに、配列番号１６８は、図２７Ｃにまとめた、より高頻度のアミノ酸残基から作製することができる。トリプシンに対しても高度に耐性であったペプチドの配列、配列番号２７及び配列番号５７のアラインメント及び分析を使用して、配列番号１６９を作製した。配列番号１６７及び配列番号１６８は、一般にペプチドを分解することになる還元、ペプシン、７５℃、及び１００℃に対して特に耐性であるペプチドの配列を表している。Ｎ末端ＧＳが除去されると、配列番号１６７−配列番号１６９のペプチドにより、トリプシン、ペプシン、７５℃、及び１００℃に対する同様の耐性が呈示される。これに加えて、配列番号１６９は、トリプシンに対しても特に耐性であるペプチドの配列を表している。
【０２９５】
図２７Ｄ〜２７Ｇは、図２７Ｂの高度に耐性の配列におけるさらに別の保存的特徴を示す。これらの配列は全て、ノッテッドペプチドにおける第２システインと第３システイン（即ち、Ｃｙｓ２とＣｙｓ３）の間に保存的プロリンアミノ酸を、上記システイン間の第２アミノ酸又は上記システイン間の第３アミノ酸のいずれかとして含有する。これらの保存的プロリンは、図２７Ｄ〜２７Ｇにおいて丸で囲まれている。プロリンアミノ酸は、その側鎖が、α−アミノ基を含有する５員環を形成するユニークなアミノ酸である。この環状の性質によって、プロリン残基は、ペプチドに構造的剛性を付与することができる。従って、プロリン残基は、ペプチドがその位置で利用可能な立体構造を制約することができ、例えば、プロリン残基及びその位置は、ペプチドが特定の制約された立体構造を有することを強制することができ、その立体構造が、化学（還元）、酵素的切断、及び熱ストレスによる分解からペプチドを安定化させることができる。ＤＴＴがペプチドのシスチンをシステインに還元することが可能であっても、シスチン結合は、ペプチドの制約立体構造の結果生じたその近接性によって自発的に改善することができるように、ペプチドを構造的に規制することができる。また、ペプチドの立体構造は、ＤＴＴがシステインに十分接近することを立体的に妨害することもできる。こうした立体構造制約も、酵素による分解又は熱ストレスによる変性に対する耐性を同様に賦与し得る。
【０２９６】
図２７Ｄは、図２７Ｂの配列番号２７、配列番号５７、及び配列番号２４の配列アラインメントを示す。還元、ペプシン、並びに７５℃及び１００℃などの高温に対して高度に耐性であったこのペプチドのサブセットを「サブタイプＡ」と呼ぶ。保存的構造プロリンアミノ酸残基は丸で囲まれ、これは、サブタイプＡペプチドが、Ｃｙｓ２とＣｙｓ３の間の第３の位置にプロリンアミノ酸を含有することを示している。
【０２９７】
図２７Ｅは、図２７Ｄからの、丸で囲まれた保存的構造のプロリンアミノ酸残基を含むサブタイプＡ配列番号２７、配列番号５７、及び配列番号２４の配列分析を示す。この分析は、以下：
ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３ＩＸ４ＶＸ５ＣＸ６Ｘ７ＳＸ８Ｘ９ＣＬＸ１０ＰＣＸ６Ｘ１１ＡＧＭＲＦＧＸ６ＣＸ１２ＮＸ１３Ｘ６ＣＸ１４ＣＴＰＸ６（配列番号１７０）
（Ｘ１は、Ｇ又はＶであってよく；Ｘ２は、Ｖ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ３は、Ｐ、Ｉ、又は無であってよく；Ｘ４は、Ｎ又はＰであってよく；Ｘ５は、Ｋ、Ｓ、又はＲであってよく；Ｘ６は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ７は、Ｇ、Ｉ、又はＨであってよく；Ｘ８は、Ｒ、Ｇ、又はＫであってよく；Ｘ９は、Ｑ又はＤであってよく；Ｘ１０は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、又はＲであってよく；Ｘ１１は、Ｋ、Ｄ、又はＲであってよく；Ｘ１２は、Ｍ又はＩであってよく；Ｘ１３は、Ｇ又はＳであってよく；Ｘ１４は、Ｈ又はＤであってよい）
を含む、複数の条件に対して耐性（例えば、還元、ペプシン、７５℃、及び１００℃に対して高度に耐性）であり得るペプチド配列を提示する。
【０２９８】
図２７Ｆは、図２７Ｂの配列番号６、配列番号１０、及び配列番号１２の配列アラインメントを示す。還元、ペプシン、並びに７５℃及び１００℃などの高温に対して高度に耐性であったこのペプチドのサブセットを「サブタイプＢ」と呼ぶ。保存的構造プロリンアミノ酸残基は丸で囲まれ、これは、サブタイプＢペプチドが、Ｃｙｓ２とＣｙｓ３の間の第２の位置にプロリンアミノ酸を含有することを示している。
【０２９９】
図２７Ｇは、図２７Ｆからの、丸で囲まれた保存的構造のプロリンアミノ酸残基を含むサブタイプＢ配列番号６、配列番号１０、及び配列番号１２の配列分析を示す。この分析は、以下：
ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＣＸ８Ｘ９ＳＸ１０Ｘ１１ＣＸ１２ＰＸ１３ＣＸ１４Ｘ１５Ｘ１６ＦＧＸ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１ＣＸ２２ＮＸ２３Ｘ２４ＣＸ２５ＣＸ２６Ｘ２７（配列番号１７１）
（Ｘ１は、Ｑ又は無であってよく；Ｘ２は、Ｋ、Ｒ、又は無であってよく；Ｘ３は、Ｉ、Ｐ、又はＦであってよく；Ｘ４は、Ｔ又はＬであってよく；Ｘ５は、Ｄ又はＳであってよく；Ｘ６は、Ｎ、Ｉ、又はＶであってよく；Ｘ７は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ８は、Ｎ、Ｓ、又はＴであってよく；Ｘ９は、Ｎ、Ａ、又はＧであってよく；Ｘ１０は、Ｓ、Ｙ、Ｋ、又はＲであってよく；Ｘ１１は、Ｑ又はＥであってよく；Ｘ１２は、Ｉ、Ｆ、又はＷであってよく；Ｘ１３は、Ｖ又はＨであってよく；Ｘ１４は、Ｋ、Ｉ、又はＲであってよく；Ｘ１５は、Ｒ、Ｓ、Ｑ、又はＫであってよく；Ｘ１６は、Ｉ、Ｒ、Ｍ、又はＫであってよく；Ｘ１７は、Ｋ、Ｔ、又はＲであってよく；Ｘ１８は、Ｒ、Ｔ、Ｐ、又はＫであってよく；Ｘ１９は、Ｎ又はＡであってよく；Ｘ２０は、Ｇ又はＡであってよく；Ｘ２１は、Ｋ又はＲであってよく；Ｘ２２は、Ｉ、Ｖ、又はＭであってよく；Ｘ２３は、Ｇ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ２４は、Ｋ、Ｌ、又はＲであってよく；Ｘ２５は、Ｙ、Ｄ、Ｒ、又はＫであってよく；Ｘ２６は、Ｙ又はＦであってよく；Ｘ２７は、Ｐ、Ｓ、又は無であってよい）
を含む、複数の条件に対して耐性（例えば、還元、ペプシン、７５℃、及び１００℃に対して高度に耐性）であり得るペプチド配列を提示する。Ｎ末端ＧＳが除去されると、配列番号１７０〜配列番号１７１のペプチドにより、トリプシン、ペプシン、７５℃、及び１００℃に対する同様の耐性が呈示される。
【０３００】
さらに、ペプチドの安定なスカフォールドの作製は、上記配列における保存的アミノ酸に基づいてペプチドを修飾及び変異させることにより達成される。
【０３０１】
実施例６
ペプチドの経口投与
この実施例は、本開示のペプチドの経口及び静脈内投与について説明する。データは、経口ペプチド投与の結果を示し、これは、ＧＩ管を通過するインタクトなペプチドの移動及び糞便中の存在を含む。配列番号２７のペプチドを実施例４に記載した方法で放射性標識した後、６〜８週齢の雌Ｈａｒｌａｎ無胸腺ヌードマウスに静脈内又は経口投与した。配列番号２７の放射性標識ペプチド（配列番号２７−ｒ）は、４．８μＣｉ／２０ｎｍｏｌの用量で静脈内（ＩＶ）投与した。配列番号２７−ｒは、２４μＣｉ／１００ｎｍｏｌの用量で強制給餌により経口（ＰＯ）投与した。様々な時点でＣＯ２窒息によりマウスを安楽死させ、血液、尿、及び糞を含む体液を収集した。ＲＰ−ＨＰＬＣ及び液体シンチレーション計数によりサンプルを分析して、血漿、尿、及び糞中で回収された放射線及び／又はインタクトなペプチドの濃度若しくは薬量を定量した。尿は、ＣＯ２窒息直後に腹部触診により採取した。血液は、ＣＯ２窒息直後に心臓穿刺により採取した後、遠心分離して血漿を分離した。糞は、ＣＯ２窒息前又は後のいずれかに結腸の触診により採取した。サンプルをＨＰＬＣにより分析して、血漿、尿、及び糞中で回収されたインタクトなペプチドの濃度又は薬量を定量した。ＨＰＬＣ分析の場合、尿サンプルをまず水中に１：２０の比で希釈し、血漿サンプルを水中に１：５の比で希釈した。糞サンプルをＴｒｉｓバッファー中に溶解させ、遠心分離して、不溶性画分を除去した後、上清を水中に１：１の比で希釈した。
【０３０２】
表３は、試験設計の概要を示す。
【０３０３】
【表３】
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【０３０４】
図６は、マウスへの投与後の血漿中の配列番号２７−ｒの濃度を示す。図６Ａは、液体シンチレーション計数を用いて１４Ｃシグナルを測定することにより定量される、２０ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの静脈内（ＩＶ）投与及び１００ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの経口（ＰＯ）投与後の血漿中のペプチドの濃度を示す。１４Ｃの送達用量は、静脈内投与の場合は４．８μＣｉであり、経口投与の場合は２４μＣｉであった。試験した時点は、０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間を含み、各々の時点で３匹のマウスを調べた。図６Ｂは、液体シンチレーション計数を用いて１４Ｃシグナルを測定することにより定量される、２０ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの静脈内（ＩＶ）投与及び１００ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの経口（ＰＯ）投与後の様々な時点で血漿中に回収された投与ペプチド用量のパーセントを示す。１４Ｃの送達用量は、静脈内投与の場合は４．８μＣｉであり、経口投与の場合は２４μＣｉであった。試験した時点は、０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間を含み、各々の時点で３匹のマウスを調べた。図６Ｃは、１００ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの強制給餌による経口投与後のタンデムＨＰＬＣ及び液体シンチレーション計数により測定される、血漿中ペプチド及びペプチド断片ピークの強度を示す。１４Ｃの送達用量は、経口投与の場合、２４μＣｉであった。試験した時点は、０．５、１、及び３時間を含んだ。これらのデータから、投与されたペプチドからの放射性シグナルの検出は、少なくとも５０時間まで血漿中に存在したこと、並びに血漿中の放射線が、ＩＶ投与量の１０％近く、またＰＯ投与量の１％近くであったことがわかった。インタクトなペプチドは、ＨＰＬＣにおいて６分近くで溶出することが予想されたが、放射性標識したＮ末端Ｇｌｙ残基などの切断された断片は、１分近くで溶出し得る。従って、放射線により検出された血漿中のペプチドのほぼ全ては、投与したペプチドの断片によるものであった。
【０３０５】
図７は、マウスへのペプチドの投与後の尿中の配列番号２７−ｒの濃度を示す。図７Ａは、液体シンチレーション計数を用いて１４Ｃシグナルを測定することにより定量される、２０ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの静脈内（ＩＶ）投与及び１００ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの経口（ＰＯ）投与後の尿中のペプチドの濃度を示す。１４Ｃの送達用量は、静脈内投与の場合、４．８μＣｉであり、経口投与の場合は２４μＣｉであった。試験した時点は、０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間を含み、各々の時点で３匹のマウスを調べた。図７Ｂは、１００ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの強制給餌による経口投与後のタンデムＨＰＬＣ及び液体シンチレーション計数によって測定される、尿中のペプチド及びペプチド断片ピークの強度を示す。１４Ｃの送達用量は、経口投与の場合、２４μＣｉであった。試験した時点は、０．５、１、３、８、２４、及び４８時間を含んだ。これらのデータは、投与されたペプチドからの幾分の放射線が、尿中で検出されたことを示したが、これは、投与されたペプチドの断片に由来し得るものであった。
【０３０６】
図８は、マウスへのペプチドの投与後の糞中の配列番号２７−ｒの濃度を示す。図８Ａは、液体シンチレーション計数を用いて１４Ｃシグナルを測定することにより定量される、２０ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの静脈内（ＩＶ）投与及び１００ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの経口（ＰＯ）投与後の糞中のペプチドの濃度を示す。１４Ｃの送達用量は、静脈内投与の場合、４．８μＣｉであり、経口投与の場合は２４μＣｉであった。試験した時点は、０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間を含み、各々の時点で３匹のマウスを調べた。図８Ｂは、１００ｎｍｏｌの配列番号２７−ｒの強制給餌による経口投与後のタンデムＨＰＬＣ及び液体シンチレーション計数によって測定される、糞中のペプチド及びペプチド断片ピークの強度を示す。１４Ｃの送達用量は、経口投与の場合、２４μＣｉであった。試験した時点は、３及び８時間を含んだ。このデータは、経口投与後の糞中にインタクトな配列番号２７−ｒが検出されたことを明らかにし、これは、一部のインタクトなペプチドが、ＧＩ管を通して移動したことを示している。
【０３０７】
実施例７
生物学的条件下でのペプチド安定性
この実施例は、還元剤、プロテアーゼ、酸化条件、酸性条件、及び人工胃液の存在下を含む、生物学的条件下でのペプチドの安定性を例証する。この実施例は、ペプチドの直鎖化バージョンに対して、システインノッテッド三次構造のペプチドの安定性を比較するデータも示す。様々なペプチドを５００μｌのｄｄＨ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌのストック濃度まで懸濁させた。次に、これを反応条件に合わせて希釈することにより、有害な緩衝作用を防止した。１２．５μｇのペプチドを溶液中に溶解させて、いくつかのサンプルでは、さらに、ＤＴＴの１０ｍＭ溶液、人工胃液（ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）、５００Ｕペプシン（５０００Ｕ／ｍｌのペプシン）、５０Ｕトリプシン（５００Ｕ／ｍｌのトリプシン）及び１ｍｇ／ｍｌ阻害剤のＰＢＳ溶液を含む、又はこれらの条件のいずれかの組合せに懸濁させて、反応物を調製した。全てのプロテアーゼ反応物は、室温で３０分間インキュベートした後、クエンチングした。ペプシン反応物は、Ｔｒｉｓ塩基を最終濃度０．０７５Ｍまで添加することによりクエンチングした。トリプシン反応物は、過剰量のダイズトリプシン阻害剤を添加することによりクエンチングした。Ｃ−１８  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０Ｂカラムを備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０ＨＰＬＣを用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣをサンプルに対し実施した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡを含む水）及び溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）の移動相を用いた勾配法により、サンプルを分析した。溶媒Ｂは、移動相の５％〜４５％から１０分にわたって増加した。
【０３０８】
図９は、還元剤及び／又はプロテイナーゼへの曝露後の２つのペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図９Ａは、ＰＢＳ中の配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図９Ｂは、ＤＴＴのＰＢＳ溶液中の配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図９Ｃは、５０Ｕトリプシン（５００Ｕ／ｍｌのトリプシン）及び１ｍｇ／ｍｌ阻害剤のＰＢＳ溶液中の配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図９Ｄは、５０Ｕトリプシン（５００Ｕ／ｍｌのトリプシン）、１ｍｇ／ｍｌ阻害剤、及びＤＴＴのＰＢＳ溶液中の配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図９Ｅは、ＰＢＳ中の配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図９Ｆは、ＤＴＴのＰＢＳ溶液中の配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図９Ｇは、５０Ｕトリプシン（５００Ｕ／ｍｌのトリプシン）及び１ｍｇ／ｍｌ阻害剤のＰＢＳ溶液中の配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図９Ｈは、５０Ｕトリプシン（５００Ｕ／ｍｌのトリプシン）、１ｍｇ／ｍｌ阻害剤、及びＤＴＴのＰＢＳ溶液中の配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。ペプチドの溶出時間及び主ピークのサイズは、図９Ａと比較して図９Ｂ〜Ｄで、又は図９Ｅと比較して、図９Ｆ〜Ｈで有意に変化しなかったが、これは、配列番号２７及び配列番号３１のペプチドが、インタクトなままであり、トリプシン又はＤＴＴでの処理によって分解又は還元されなかったことを示している。
【０３０９】
図１０は、還元剤、プロテイナーゼ、及び／又は人工胃液条件への曝露後の２つのペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１０Ａは、ＰＢＳ中でインキュベートした配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図１０Ｂは、ＤＴＴのＰＢＳ溶液中でインキュベートした配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図１０Ｃは、人工胃液（ＳＧＦ）中でインキュベートした配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図１０Ｄは、５００Ｕペプシン（５０００Ｕ／ｍｌのペプシン）のＳＧＦ溶液中でインキュベートした配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図１０Ｅは、５００Ｕペプシン（５０００Ｕ／ｍｌのペプシン）、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、及びＤＴＴのＳＧＦ溶液中でインキュベートした配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図１０Ｆは、ＰＢＳ中でインキュベートした配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図１０Ｇは、ＤＴＴのＰＢＳ溶液中でインキュベートした配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図１０Ｈは、人工胃液（ＳＧＦ）中でインキュベートした配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図１０Ｉは、５００Ｕペプシン（５０００Ｕ／ｍｌのペプシン）のＳＧＦ溶液中でインキュベートした配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図１０Ｊは、５００Ｕペプシン（５０００Ｕ／ｍｌのペプシン）、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、及びＤＴＴのＳＧＦ溶液中でインキュベートした配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。ペプチドの溶出時間及び主ピークのサイズは、図１０Ａと比較して図１０Ｂ〜Ｅで、又は図１０Ｆと比較して、図１０Ｇ〜Ｊで有意に変化しなかったが、これは、配列番号２７及び配列番号３１のペプチドが、インタクトなままであり、ＤＴＴ、ｐＨ１のＳＧＦ、又はペプシンとのインキュベーションによって分解又は還元されなかったことを示している。
【０３１０】
図１１は、酸化、還元、及び酸性条件を含む様々な条件への曝露後、並びにプロテイナーゼへの曝露後の配列番号３１のペプチド及び陰性対照ペプチドＧＳＧＶＰＩＮＶＲＳＲＧＳＲＤＳＬＤＰＳＲＲＡＧＭＲＦＧＲＳＩＮＳＲＳＨＳＴＰ（配列番号１７７）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。配列番号１７７の陰性対照ペプチドは、配列番号３１のペプチドと同じ配列であるが、全てのシステイン残基がセリン残基に変異され、これによって、配列番号３１のペプチドのシステイン−ノッテッド三次構造が排除され、代わりに直鎖化ペプチド配列が形成される。図１１Ａは、酸性（ＳＧＦ  ｐＨ１）、還元（ＤＴＴ）、及び非還元（ＮＲ）条件（酸化）下での配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。ＮＲクロマトグラムに認められるように、インタクトなペプチドは、６．７５分付近で溶出し、ＤＴＴは、１．７５分及び２．７５分付近で溶出した。図１１Ａに示されるように、６．７５分付近の主ピークは、ＤＴＴ又はＳＧＦへの曝露後に存在し、それ以外に有意なピークは観察されなかった。このことから、配列番号３１のペプチドが、インタクトであり、ＤＴＴ又はｐＨ１のＳＧＦへの曝露による分解又は還元に対して耐性であることがわかった。図１１Ｂは、５００Ｕペプシン（５０００Ｕ／ｍｌのペプシン）中の１０ｍＭ  ＤＴＴ、５００Ｕペプシン（５０００Ｕ／ｍｌのペプシン）、５０Ｕトリプシン（５００Ｕ／ｍｌのトリプシン）中の１０ｍＭ  ＤＴＴ、及び５０Ｕトリプシン（５００Ｕ／ｍｌのトリプシン）を含む、還元剤及びプロテアーゼの様々な組合せの下での配列番号３１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。全てのクロマトグラムにおいて６．７５分付近に、同様の溶出時間及び強度で、インタクトペプチドのピークが存在し、これは、配列番号３１のペプチドが、ＤＴＴを含む、又は含まないペプシン及びトリプシンによる分解に対して耐性であったことを示す。図１１Ｃは、５００Ｕペプシン（５０００Ｕ／ｍｌのペプシン）中、５０Ｕトリプシン（５００Ｕ／ｍｌのトリプシン）中、ｐＨ１．０５の人工胃液（ＳＧＦ）中の非還元（ＮＲ）、及びＮＲを含む様々なプロテアーゼ条件下での配列番号１７７のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。配列番号１７７のペプチドは、ＮＲ及びＳＧＦサンプル中、７．５分付近で同様の主ペプチドピークを有するが、これは、ペプチドが、ＳＧＦとインキュベートしたとき、安定していたことを示す。しかし、トリプシン又はペプシンとのインキュベーション後では、７．５分付近の低レベルの主ピーク、及びクロマトグラムにおける多数の新しいピークの出現から明らかにされるように、ペプチドは酵素により分解された。配列番号１７７の陰性対照ペプチドは、トリプシン及びペプシンによる分解に対して耐性ではなかったが、配列番号３１のペプチドは、これらの酵素による分解に対して非常に安定していた。配列番号３１のペプチドにおけるシステイン残基の存在及びノッテッド三次構造の保存は、この特定の配列について酵素分解に対する耐性を付与する上で重要であった。
【０３１１】
実施例８
セリンプロテアーゼ耐性についてのペプチドのスクリーニング
この実施例は、分解耐性についての、本開示のペプチド（配列番号１〜配列番号１６６）のいずれか１つのスクリーニングを説明する。本開示のペプチドは、組換えにより発現させるか、又は化学的に合成する。本開示のペプチドを水中に懸濁させる。反応物をセリンプロテアーゼと一緒に調製する。反応物を３７．５℃で３０分間インキュベートする。セリンプロテアーゼ阻害剤で反応物をクエンチングする。サンプルを逆相ＨＰＬＣ又は円二色性などの他の方法により分析し、これによってペプチドの二次構造の変化を検出する。
【０３１２】
本開示のペプチドをセリンプロテアーゼに対する分解について分析する。セリンプロテアーゼ耐性ペプチドを見出すために、ＨＰＬＣクロマトグラム及びペプチドピークの分析を実施する。セリンプロテアーゼ耐性ペプチドは、セリンプロテアーゼへの曝露後、そのＨＰＬＣクロマトグラムに、比較的小さい変化を有することがわかる。
【０３１３】
ペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３１、又は配列番号５７のペプチドのいずれか１つであってよい。
【０３１４】
実施例９
ペプチドの経口送達
この実施例は、本開示のペプチド（配列番号１〜配列番号１６６）のいずれか１つの経口送達を説明する。本開示のペプチドは、組換えにより発現させるか、又は化学的に合成する。本開示のペプチドを製剤化し、被験者に経口投与する。ペプチドは、医薬組成物として製剤化することができる。被験者は、動物又はヒトであってよい。ペプチドは、固体分散体中で、プロバイオティクスに遺伝子コードして、舌下剤として、ロリポップ若しくはロゼンジとして、液体中、懸濁液中、乳剤中で、カプセル、錠剤、若しくは粉剤中で、又は半固体分散体中で、強制経口投与により送達する。ペプチドは、安定性及び／又は透過を改善する他の薬剤、例えば、バッファー、プロテアーゼ阻害剤、及び透過促進剤などと一緒に製剤化することができる。腸壁を介した血流への取り込みを改善するように、腸壁を介した血流への取り込みを回避するように、又は腸内の滞留を長くするように、ペプチドを製剤化することができる。酵素による変性、還元、又は切断に対する向上した安定性及び耐性が、経口投与後のペプチドにより呈示される。その結果、ペプチドは、急速に分解されて、効果を失うのではなく、むしろ標的に作用して、治療効果を発揮するのに十分長い間安定している。ペプチドにより治療効果が発揮される。
【０３１５】
ペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３１、又は配列番号５７のペプチドのいずれか１つであってよい。
【０３１６】
実施例１０
経口投与されたペプチドの生体分布及びバイオアベイラビリティの決定
この実施例は、本開示のペプチド（配列番号１〜配列番号１６６）のいずれか１つの経口投与後の生体分布及びバイオアベイラビリティの決定を説明する。本開示のペプチドは、組換えにより発現させるか、又は化学的に合成する。ペプチドを蛍光標識又は放射性標識で標識した後、被験者に経口投与する。被験者は、動物又はヒトであってよい。
【０３１７】
様々な時点で、血液、尿、糞、脳、軟骨、関節、癌組織、感染組織又は膿瘍、骨髄、肝臓、筋肉、腎臓、胎盤又は胎児組織から生体サンプルを採取する。インタクトなペプチド又はペプチド断片の検出のためにサンプルを分析し、様々な体液又はサンプル中のインタクトなペプチド又はペプチド断片に関連するシグナルを経時的に定量する。
【０３１８】
ペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３１、又は配列番号５７のペプチドのいずれか１つであってよい。
【０３１９】
実施例１１
胃腸（ＧＩ）障害の治療
この実施例は、本開示のペプチド又はペプチドコンジュゲート（配列番号１〜配列番号１６６）を用いた胃腸（ＧＩ）障害の治療を説明する。本開示のペプチドは、組換えにより発現させるか、又は化学的に合成する。ペプチド自体を治療薬として投与するか、又は抗生物質（例えば、カルバペネム、ペニシリン、キノリン、フルオルキノリンなど）、化学療法薬、抗アポトーシス剤（例えば、ＢＣＬ２阻害剤）、老化細胞死誘導薬、又は抗炎症薬（例えば、ステロイド）といった活性薬剤に共役させることができる。本開示のペプチド又はペプチドコンジュゲートを製剤化し、被験者に経口投与する。ペプチドは、医薬組成物として製剤化することができる。被験者は、動物又はヒトであってよい。
【０３２０】
大腸癌、炎症性腸疾患、便秘、クローン病、狼瘡、又は過敏性腸症候群を治療するために、腸に到達する有効量のインタクトなペプチド又はペプチドコンジュゲートを投与する。
【０３２１】
酵素による変性、還元、若しくは切断に対する向上した安定性及び耐性が、経口投与後のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートにより呈示される。その結果、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、急速に分解されて、効果を失うのではなく、むしろ、活性薬剤を標的に送達する、又はそれに作用して、治療効果を発揮するのに十分長い間安定している。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートにより治療効果が発揮されて、胃腸疾患が軽減される。
【０３２２】
ペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３１、又は配列番号５７のペプチドのいずれか１つであってよい。
【０３２３】
実施例１２
送達スカフォールドのペプチド
この実施例は、送達スカフォールドとしての本開示のペプチド（配列番号１〜配列番号１６６）の使用を説明する。本開示のペプチドは、組換えにより発現させるか、又は化学的に合成した後、遺伝子融合又は化学共役によって活性薬剤に融合させる。ペプチドコンジュゲートをそれが必要な被験者に投与する。被験者は、ヒト又はヒト以外の動物でもよい。ペプチドコンジュゲートは、医薬組成物として製剤化することができる。
【０３２４】
ペプチド送達スカフォールドを用いて、胃腸管、皮膚、軟骨、膣粘膜、又は鼻粘膜などの身体の組織若しくは領域、又はリソソーム、エンドソーム、若しくは細胞質ゾルなどの細胞コンパートメントに活性薬剤を送達する。酵素による変性、還元、若しくは切断に対する向上した安定性及び耐性が、経口投与後のペプチド送達スカフォールド−活性薬剤コンジュゲートにより呈示される。その結果、ペプチド送達スカフォールド−活性薬剤コンジュゲートは、急速に分解されて、効果を失うのではなく、むしろ、治療効果を発揮するために、身体の組織、領域、又は前述の細胞コンパートメントの１つに活性薬剤を送達する、若しくはそこに蓄積して、標的に作用するのに十分長い間安定している。ペプチド送達スカフォールド−活性薬剤コンジュゲートにより治療効果が発揮されて、標的疾患が軽減される。
【０３２５】
ペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３１、又は配列番号５７のペプチドのいずれか１つであってよい。
【０３２６】
実施例１３
温度安定性ペプチド
この実施例は、高温でのペプチド安定性を例証する。まず、ペプチドを５００μｌのｄｄＨ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌのストック濃度まで懸濁させた。ストック溶液からの６．２５μｌのペプチドを９５μｌのｄｄＨ２Ｏと一緒に添加することにより、反応物を調製し、サーモサイクラー内で、室温、７０℃、又は１００℃で１時間インキュベートした。次に、Ｃ−１８  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０Ｂカラムを備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０ＨＰＬＣを用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣをサンプルについて実施した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡを含む水）及び溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）の移動相を用いた勾配法により、サンプルを分析した。溶媒Ｂは、移動相の５％〜４５％から１０分にわたって増加した。
【０３２７】
図１２Ａは、室温、７０℃、又は１００℃で１時間にわたるインキュベーション後のＮＲ条件下での配列番号３のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図１２Ｂは、室温、７０℃、又は１００℃で１時間にわたるインキュベーション後のＮＲ条件下での配列番号２３のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図１２Ｃは、室温、７０℃、又は１００℃で１時間にわたるインキュベーション後のＮＲ条件下での配列番号２５のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。
【０３２８】
７０℃で１時間にわたるインキュベーション後、配列番号３、配列番号２３、及び配列番号２５のペプチドは、非処理（ＮＲ、非還元）サンプルとほぼ同じＨＰＬＣ溶出時間及びピーク高さを呈示したが、これは、ペプチドが、熱誘導性分解に対して耐性であったことを示す。１００℃で１時間のインキュベーション後、配列番号３、配列番号２３、及び配列番号２５のペプチドは、本来の溶出時間に溶出したペプチド量の減少により明示されるように、様々な程度の分解を被った。
【０３２９】
図１９は、７５℃で１時間（実線）又は１００℃で１時間（破線）のインキュベーション後の本開示の様々なペプチドの高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）トレースを示す。図からわかるように、試験した４６のペプチドのうち、１７（例えば、配列番号１７及び配列番号４５のペプチドなど）が１００℃での分解に対して耐性であった。
【０３３０】
実施例１４
還元条件下でのペプチド安定性
この実施例は、還元条件下での設計又は操作ペプチドの安定性を説明する。細胞内の１種若しくは複数種の標的タンパク質（例えば、核内のタンパク質など）と相互作用するように設計又は操作されたペプチドを細胞の細胞質ゾルコンパートメント内で還元条件に曝露する。従って、本開示のペプチドが、還元条件下で安定性を呈示することは有利である。本開示のペプチドの安定性を１０ｍＭ  ＤＴＴ及び１０ｍＭ  ＧＳＨ中で試験した。ＧＳＨは、細胞内条件下でペプチド安定性を試験する上で、より生理学的に適切な還元剤である。ペプチド−標的タンパク質相互作用の１例は、ＴＥＡＤタンパク質に結合するペプチドである。
【０３３１】
図１４Ｂに示すように、配列番号３９及び配列番号４３のペプチドをＧＳＨ下で還元条件、即ち、細胞質ゾルコンパートメント内の還元性環境のより代表的な還元剤に曝露したとき、非還元ペプチドと比較してＨＰＬＣにより観察されるように、いずれのペプチドも有意にシフトしたピークを示さなかったため、配列番号３９及び配列番号４３の両方が、ＧＳＨ還元条件に対して耐性であった。図１４Ａに示すように、１０ｍＭ  ＤＴＴなどの、より強力な還元条件下では、配列番号４３のペプチドは、ＤＴＴ還元に対して部分的に耐性であった。図１４Ａの差し込み図に示すように、ＤＴＴ還元条件下での配列番号４３のペプチドのインライン質量分析は、非還元ペプチドの約６Ｄａ以内の断片を明らかにし、これにより、配列番号４４のペプチドがＤＴＴ中の還元に対して部分的に耐性であることを実証した。図１３Ｂ、１３Ｄ、及び図１３Ｆに示すように、配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５のペプチドもそれぞれＤＴＴ還元条件に対して部分的に耐性であった。
【０３３２】
さらに、その標的（例えば、ＴＥＡＤタンパク質）に対するペプチドの結合活性が、還元条件への曝露により影響されるか否かを評価するために、本開示の設計又は操作されたペプチドを試験した。配列番号３９を含む表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクター（ＳＤＧＦ−配列番号３９）又は配列番号４３を含むＳＤＧＦベクター（ＳＤＧＦ−配列番号４３）構築物で、ＨＥＫ−２９３Ｔ懸濁細胞をトランスフェクトした。培養物を２日間増殖させた後、１０ｍＭ  ＧＳＨ又は１０ｍＭ  ＤＴＴ中でインキュベートした。最後に、標的タンパク質に対するペプチドの結合活性を評価するために、細胞をビオチン化標的タンパク質で染色した。図１５は、還元剤への曝露後の配列番号３９及び配列番号４３のペプチドの安定性を示す。各ペプチドを細胞表面上に発現させ、配列番号４３又は配列番号３９を発現する細胞を還元剤に曝露した後、標的タンパク質に対する結合について試験した。図１５Ａは、ＳＤＧＦ−配列番号３９（ＧＦＰ）でトランスフェクトし、ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、又は１０ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）中に５分間インキュベートした後、２０ｎＭビオチン化標的タンパク質及び２０ｎＭ  ＡＦ６４７−ストレプトアビジンによる染色に付したＨＥＫ−２９３懸濁細胞の結合を示すフローサイトメトリープロットを表示する。図１５Ｂは、ＳＤＧＦ−配列番号４３（ＧＦＰ）でトランスフェクトし、ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、又は１０ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）中に５分間インキュベートした後、２０ｎＭビオチン化標的タンパク質及び２０ｎＭ  ＡＦ６４７−ストレプトアビジンによる染色に付したＨＥＫ−２９３懸濁細胞の結合を示すフローサイトメトリープロットを表示する。図１５Ｃは、図１５Ａ及び図１５Ｂに示す「スライス」ゲート内に入る細胞のＡＦ６４７平均蛍光強度（ＭＦＩ）の定量を示す。結合アッセイの結果から、配列番号３９のペプチドをディスプレイする細胞が、ＤＴＴ処理後の標的タンパク質との結合に部分的喪失を示し、またＧＳＨ処理後に標的タンパク質との結合に全く喪失を示さないことがわかった。さらに、結合アッセイの結果から、配列番号４３のペプチドをディスプレイする細胞が、ＤＴＴ若しくはＧＳＨのいずれを還元剤として使用したかにかかわらず、標的タンパク質との結合に全く喪失を示さないことも判明した。言い換えれば、配列番号３９及び配列番号４３のペプチドは、ＧＳＨによる還元に対して耐性であった。
【０３３３】
図１８は、非還元（ＮＲ）条件（実線）又は１０ｍＭ  ＤＴＴ還元（Ｒ）条件（破線）下でのペプチドの高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）トレースを示す。本開示の様々な配列の凍結乾燥ペプチドをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に０．５ｍＭのストック濃度で懸濁させた後、１０ｍＭ  ＤＴＴと一緒に、又はなしで、ＰＢＳ中に０．０１５ｍＭの最終濃度まで希釈させた。サンプルを室温で３０分間インキュベートさせた後、ＨＰＬＣ−逆相クロマトグラフ（ＲＰＣ）による分析を行った。図からわかるように、試験した４６のペプチドのうち、５つ（配列番号５及び配列番号４５のペプチドなど）が還元に対して耐性であった。
【０３３４】
実施例１５
プロテアーゼに対するペプチド安定性
この実施例は、プロテアーゼに対する本開示のペプチドの安定性を例証する。腫瘍環境は一般に、高い量のプロテアーゼを含有する。さらに、タンパク質分解（プロテアーゼによる分解又は切断）に対する耐性は、ペプチドが分解されて、ＭＨＣにより免疫系にディスプレイされる可能性を低減する。加えて、タンパク質分解に対する耐性は、投与されてから腫瘍に輸送されるまでの血清中のペプチド半減期を延長し得る。従って、本開示のペプチドが、プロテアーゼによる分解に対して耐性であることは有利である。
【０３３５】
可溶性ペプチドを５００Ｕ／ｍＬブタトリプシンに曝露した後、ＨＰＬＣにより分析した。また、ＳＤＰＲディスプレイペプチドを用いても、プロテアーゼ耐性を評価した。ＳＤＰＲベクターは、表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターと類似しているが、Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを含み、ストーク上の塩基性又は芳香族アミノ酸残基は全て除去されている。次に、ペプチドをディスプレイする細胞をトリプシン又はキモトリプシンと一緒にインキュベートし、続いて１０ｍＭ  ＤＴＴ中でのインキュベーション、及び抗６ｘＨｉｓ蛍光団標識抗体による染色によって、プロテアーゼ耐性を試験した。ペプチドが切断されていなければ、これらは、Ｈｉｓタグを保持し、抗体によって染色される。対照のプロテアーゼ感受性ノッティンペプチド（ＳＫ）を陽性対照として使用した。ペプチドをディスプレイする細胞を最大４０μｇ／ｍｌのトリプシン又はキモトリプシンで処理した。
【０３３６】
図１６は、配列番号４３のペプチドのプロテアーゼ耐性を示す。図１６Ａは、５００Ｕトリプシン（Ｔ）とのインキュベーション後の配列番号４３のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示し、これをトリプシン阻害剤（Ｉ）でクエンチングした後、非還元（ＮＲ）条件又は１０ｍＭ  ＤＴＴによる還元（ＮＲ）条件下に置いた。その後、産物をＨＰＬＣに付した。クロマトグラムは、トリプシンを含まない実験で観察されたものと類似している（しかし、同一ではない）と思われる。
【０３３７】
ペプチドの機能、即ち、結合活性に対するプロテアーゼ処理又は還元条件の影響を決定するために、様々な結合若しくは機能性アッセイを実施することができる。機能性結合アッセイの１例は、細胞表面ディスプレイ方法であり、この場合、ペプチドのＮ末端で、ストーク若しくはリンカー配列を用いて、膜貫通ドメインに結合されたペプチドをコードした配列を含むＳＤＰＲベクターを発現するように、細胞を操作した。ペプチド構築物を発現した細胞は、細胞表面にペプチドをディスプレイし、これらは、ＧＦＰ蛍光について陽性であった。細胞表面に提示されたペプチドを標的タンパク質との相互作用について試験した。試験した標的タンパク質の１例は、ＴＥＡＤタンパク質であった。ペプチド自体の外側の配列内でのトリプシン／キモトリプシン切断を防止するために、ペプチドと膜貫通ドメインとの間のリンカー又はストーク配列内の塩基性若しくは芳香族残基を全て除去した。ペプチドのプロテアーゼ及び／又は還元耐性を評価（抗６ｘＨｉｓの染色によって達成することができる）するために、ペプチド構築物のＣ末端にも６ｘＨｉｓタグを付加した。様々な実施形態において、この構築物を用いた実験では、構築物を発現する細胞をトリプシン又はキモトリプシンなどの、プロテアーゼと一緒にインキュベートした後、還元剤による処理に付すことができる。プロテアーゼ及び還元剤による処理の後、還元及び／又はプロテアーゼの処理によるタンパク質分解によって生成したあらゆる直鎖化ペプチド産物若しくは分解産物を、６ｘＨｉｓタグに対する染色によって検出又は分析することができる。例えば、ペプチドは、還元剤の存在下で直鎖化する可能性があり、これによってペプチドはタンパク質分解に対してより感受性となり得るか、又は還元耐性ペプチドがプロテアーゼによって切断され得る。ペプチド骨格中の単一の切断事象の存在によって、直鎖化され、ディスプレイされたペプチドが生じ、これは、Ｃ末端上の６ｘＨｉｓタグを喪失する恐れがあり、そうしたペプチドを含む細胞に６ｘＨｉｓタグに対する染色を喪失させ得る。
【０３３８】
図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、及び図１６Ｅは、ＳＤＰＲ構築物にクローン化したプロテアーゼ感受性ノッティンペプチドＳＫ（ＳＤＰＲ−ＳＫ）、又はＳＤＰＲ構築物にクローン化した配列番号４３のいずれかでトランスフェクトしてから、０若しくは４０μｇ／ｍｌのトリプシン又はキモトリプシンで２０分間処理した後、ＡＦ６４７抗６ｘＨｉｓ抗体で染色したＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリー分析を示す。抗６ｘＨＩＳシグナルの喪失は、ペプチド不安定化又は分解を示す。図１６Ｂ及び図１６Ｄは、プロテアーゼ感受性ＳＤＰＲ−ＳＫペプチドでトランスフェクトしてから、０若しくは４０μｇ／ｍｌのトリプシン又はキモトリプシンで２０分間処理した後、ＡＦ６４７抗６ｘＨｉｓ抗体で染色したＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを示す。トリプシン又はキモトリプシンで処理した後の染色の喪失は、細胞をＡｌｅｘａ６４７共役抗６ｘＨｉｓ抗体で染色した場合、ＡＰＣシグナルの減少として視覚化された。図１６Ｃは、ＳＤＰＲ−配列番号４３ペプチドでトランスフェクトしてから、０若しくは４０μｇ／ｍｌのトリプシンで２０分間処理した後、ＡＦ６４７抗６ｘＨｉｓ抗体で染色したＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを示す。図１６Ｅは、ＳＤＰＲ−配列番号４３ペプチドでトランスフェクトしてから、０若しくは４０μｇ／ｍｌのキモトリプシンで２０分間処理した後、ＡＦ６４７抗６ｘＨｉｓ抗体で染色したＨＥＫ−２９３懸濁細胞のフローサイトメトリープロットを示す。図１６Ｆは、いずれも様々な濃度のトリプシンで処理した、ＳＤＰＲ−ＳＫペプチドトランスフェクト細胞とＳＤＰＲ−配列番号４３ペプチドトランスフェクト細胞を比較するフローサイトメトリーデータの定量化を表示する。図１６Ｇは、いずれも様々な濃度のキモトリプシンで処理した、ＳＤＰＲ−ＳＫペプチドトランスフェクト細胞とＳＤＰＲ−配列番号４３ペプチドトランスフェクト細胞を比較するフローサイトメトリーデータの定量化を表示する。プロテアーゼへの曝露の結果から、配列番号４３のペプチドが、トリプシン及びキモトリプシンなどのプロテアーゼによる切断に対して部分的に耐性であることがわかった。
【０３３９】
図２０は、ペプシン消化後のペプチドの高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）トレースを表示する。実線のトレースは、アルカリ性ｐＨでクエンチングされ、非還元条件下で実施されたペプチドとペプシンの反応を示す。破線のトレースは、アルカリ性ｐＨでクエンチングされ、還元条件下で実施されたペプチドとペプシンの反応を示す。アッセイは、５ｍｇのブタペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ７０１２）を１ｍＬの低温Ｈ２Ｏ中で再構成することによって実施した。各反応条件が５０Ｕのペプシンを含有するように、４μｌの上記ストック溶液を各反応物に添加した。ペプシンは、酵素活性のために低ｐＨ環境を必要とする可能性があるため、人工胃液（ＳＧＦ）（ｐＨ１．０５；０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）の溶液を調製した。２つの反応条件を用意した：１つは、消化後に１０ｍＭ  ＤＴＴでペプチドを還元するもの（還元条件）、もう１つは、消化後にペプチドを還元しないもの（非還元条件）であった。９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ  Ｖプレート内で、３μｌのストック濃度０．５ｍＭのペプチドを７８μｌのＳＧＦに添加し、次に、４μｌの新鮮な５ｍｇ／ｍｌペプシンを各ペプチド反応物に添加した後、各サンプルを入念に混合した。シェーカ内で、サンプルを３７．５℃で３０分間インキュベートした。消化後、消化を阻害するために、１５μｌの０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ１０．６）を各サンプルに添加した。還元条件として１０ｍＭ  ＤＴＴをサンプルに添加するか、又は非還元条件として添加しなかった。ＨＰＬＣ分析をＡｇｌｉｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステムで実施した。元の１００μｌのサンプルのうち９０μｌを、５％〜４５％ＡＣＮ勾配を備えるＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０Ｂカラムに１０分でロードした。合計ＨＰＬＣラン時間は、１６．２５分であった。図２０に示す実験還元トレース（破線）を図１８の対照還元トレース（破線）と比較することにより、タンパク質分解を決定した。図からわかるように、試験した４６のペプチドのうち、２９（例えば、配列番号２９及び配列番号４５のペプチドなど）が、ペプシン消化に対して耐性であった。
【０３４０】
図２１は、トリプシン消化後のペプチドの高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）トレースを示す。実線のトレースは、過剰量のトリプシン阻害剤を用いて中性ｐＨでクエンチングされ、非還元条件下で実施されたペプチド及びトリプシンの反応を示す。破線のトレースは、過剰量のトリプシン阻害剤を用いて中性ｐＨでクエンチングされ、還元条件下で実施されたペプチド及びトリプシンの反応を示す。１ｍｇのブタトリプトシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ６５６７）を１ｍＬの１ｍＭ  ＨＣｌ中で再構成することにより、アッセイを実施した。トリプシンを１０，０００ｕ／ｍＬの濃度で供給したが、これにより、５μｌのストック溶液は、各反応物中５０Ｕのトリプシンンの使用に相当した。ダイズトリプシン阻害剤（ＳＡ  Ｔ９１２８）をＨ２Ｏ中１ｍｇ／ｍＬで調製した。２つのペプチド反応物を調製した：１つは、消化後に１０ｍＭ  ＤＴＴで還元されたペプチドを含み（還元条件）、もう１つは、消化後に還元されていないペプチドを含んだ（非還元条件）。９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ  Ｖプレート内で、３μｌのストック濃度の０．５ｍＭのペプチドを含有する反応物を８７μｌの１×ＰＢＳに添加した。５μｌの１ｍｇ／ｍｌトリプシンを添加した後、シェーカ内で、サンプルを３７．５℃で３０分間インキュベートした。消化後、５μｌの１ｍｇ／ｍｌ阻害剤を各反応物に添加して、トリプシン消化を阻害した。還元条件として１０ｍＭ  ＤＴＴをサンプルに添加するか、又は非還元条件としてＤＴＴを添加しなかった。ＨＰＬＣ分析をＡｇｌｉｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステムで実施した。元の１００μｌのサンプルのうち９０μｌを、５％〜４５％ＡＣＮ勾配を備えるＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０Ｂカラムに１０分でロードした。合計ラン時間は、１６．２５分であった。図２１に示す実験還元トレース（破線）を図１８の対照還元トレース（破線）と比較することにより、タンパク質分解を決定した。図からわかるように、試験した４６のペプチドのうち、配列番号２７及び配列番号５７のペプチドだけが、ペプシン消化に対して十分に耐性であった。
【０３４１】
実施例１６
円二色性を用いた高温でのペプチド安定性の決定
この実施例は、本開示のペプチドが、極端な高温で安定していることを証明する。タンパク質二次構造は、円二色性（ＣＤ）を用いて評価した。１．０ｍｍ光路長のセルを用いるＪａｓｃｏ  Ｊ−７２０Ｗ分光偏光計によりＣＤスペクトルを測定した。１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）中のタンパク質サンプルは、２５〜３０μＭタンパク質濃度であった。２６０〜１９０ｎＭの波長範囲でサンプルを分析した。データは、相対楕円率［θ］；（ｍｄｅｇ）を単位として表した。タンパク質の熱安定性を決定するために、２０℃〜９５℃まで勾配２℃／分の漸増にサンプルを付した。安定性及びタンパク質変性をαヘリックス及びβシート二次構造についてそれぞれ２２０及び２１５でモニターした。データは、相対楕円率［θ］を単位として表し、ｍｄｅｇで記録した。配列番号４３及びその点突然変異体の場合、９５℃までの加熱時に、αヘリックス独占構造に変化は観察されなかった。図１７Ａは、配列番号４３のＣＤスペクトルから、構造がαヘリックス要素によって独占されたこと、並びにこの二次構造シグネチャーが、９５℃でのインキュベーション前と後で同一であったことが実証されたことを示す。差し込み図は、２０℃〜９５℃に加熱中の２２０ｎｍでの相対楕円率を示す。図１７Ｂは、配列番号４４の円二色性スペクトルから、構造がαヘリックス要素によって独占されたこと、並びにこの二次構造シグネチャーが、９５℃でのインキュベーション前と後で同一であったことが実証されたことを示す。差し込み図は、２０℃〜９５℃に加熱中の２２０ｎｍでの相対楕円率を示す。図１７Ｃは、配列番号４５の円二色性スペクトルから、構造がαヘリックス要素によって独占されたこと、並びにこの二次構造シグネチャーが、９５℃でのインキュベーション前と後で類似していたことが実証されたことを示す。ここでも、差し込み図は、２０℃〜９５℃に加熱中の２２０ｎｍでの相対楕円率を示す。さらに、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ  ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてタンパク質の変性をモニターすることにより、タンパク質融解温度（Ｔｍ）の決定を実施した。手短には、２０μＬ総量のＰＢＳバッファー中０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質サンプルを２μＬの１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ  ｄｙｅと混合した。ＣＦＸ９６  Ｄｅｅｐ  Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を備えるＣ１０００  Ｔｏｕｃｈ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて、タンパク質変性後の疎水性タンパク質コア中への色素インターカレーションをアッセイした。サンプルを毎分０．５℃の漸増で２０℃〜９５℃まで加熱し、各時点で５秒の保持段階を置いた後、蛍光読み取りを行った。Ｔｍは、相対蛍光単位（ＲＦＵ）の導関数を分析することにより計算した。図１７Ｄは、ペプチドのＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ融解アッセイを表示する。ヒトシデロカリン（ＨｕＳｃｎ）は、その温度勾配に対するＲＦＵのピークにより解釈されるように、７９℃という予想融解温度を示した。反対に、試験した３つのペプチド（配列番号４３、配列番号４４、及び配列番号４５）については、融解温度を決定することができなかった。従って、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ熱シフトアッセイは、タンパク質変性のエビデンスを全く示さなかったことから、配列番号４３及びその点変異体は、高温で安定していることが証明された。
【０３４２】
実施例１７
円二色性を用いた様々なｐＨバッファー中のペプチド構造及び安定性の決定
この実施例は、円二色性を用いて、中性、変性、及び酸性ｐＨでのペプチド安定性の決定を説明する。タンパク質二次構造は、円二色性（ＣＤ）を用いて評価した。
【０３４３】
１．０ｍｍ光路長のセルを用いるＪａｓｃｏ  Ｊ−７２０Ｗ分光偏光計によりＣＤスペクトルを測定した。凍結乾燥したペプチドサンプルを超純水に再懸濁させた。２０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加した２０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）、又はｐＨ４のリン酸緩衝食塩水でペプチドを希釈することにより、ＣＤランを実施した。ペプチドは、濃度１５〜２５μＭまで希釈した。データは、全モル楕円率［θ］；（ｄｅｇ  ｃｍ２ｄｍｏｌ−１）を単位として示す。
【０３４４】
図２２は、本開示の様々なペプチドのＣＤ結果を表示し、これらのペプチドの二次構造の要素を示す。例えば、ＣＤから、本開示のペプチドが、折り畳みのタイプは異なる可能性があるが、それでも、これらの多くが安定的であり得ることがわかる。
【０３４５】
円二色性によりペプチドをＰＢＳ中で分析したところ、これらの結果は二次構造を明らかにしている。さらに、配列番号１０、配列番号３、配列番号２９、配列番号２７、配列番号２４、配列番号５５、配列番号３０、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１８、配列番号５４、配列番号５６、又は配列番号５７のペプチドの遠紫外ＣＤスペクトルを用いて、ヒッチンとしてのそのトポロジーを分類した。
【０３４６】
図２３は、ｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水又はｐＨ４のリン酸緩衝食塩水中でのインキュベーション後の配列番号２７のペプチドの円二色性分析を示す。ＣＤの結果から、配列番号２７のペプチドが試験した全ての条件でその二次構造の大部分を保持することが明らかにされ、これは、これらの条件下でのペプチドの安定性を示している。
【０３４７】
図２４は、ｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水又はｐＨ４のリン酸緩衝食塩水中でのインキュベーション後の配列番号３７のペプチドの円二色性分析を示す。ＣＤの結果から、配列番号３７のペプチドは、ｐＨ７．２及びｐＨ４の条件でその二次構造を保持するが、１％ＳＤＳ（デタージェント）を添加すると、二次構造を喪失することが判明した。従って、配列番号３７のペプチドは、図２３に示す配列番号２７のペプチドと比較して、ＳＤＳの三次構造を維持することはできないため、配列番号３７のペプチドは、安定的ではないと考えられる。
【０３４８】
さらに、これらの結果は、配列番号２７などのいくつかのペプチドが、折り畳みにおいて頑健であり、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのストレスに対して耐性であることを示している。
【０３４９】
実施例１８
適正な細胞表面折り畳み、可溶性タンパク質折り畳み、及びトリプシン耐性を呈示するペプチドの相関
この実施例は、ペプチドの細胞表面折り畳み、可溶性タンパク質折り畳み、及びトリプシン耐性の間の相関を明らかにする。細胞表面で、及び可溶性タンパク質としてそれらの折り畳み構造を評価することによって、安定性に優れたペプチドを決定した。さらに、折り畳み構造は、トリプシン耐性の向上にも寄与した。１０，０００近いペプチドが、システインリッチとして、５０アミノ基長内で６、８、若しくは１０システインを含むものとして、並びにノッティン、ディフェンシン、又は他のタイプのペプチドとして同定された。これらのペプチドを優れた折り畳み安定性について分類し、スクリーニングした。
【０３５０】
図２６は、表面ディスプレイペプチド折り畳みアッセイを用いて見出された安定なペプチドの同定を示す。ペプチドは、２９３Ｆ細胞の表面にディスプレイされた。図２６Ａは、安定なペプチドを見出すためにスクリーニングした全ライブラリーの分類群多様性を示す。この円グラフでは、３００を超えるライブラリーメンバーを含むクラスのみ具体的に名称を付けている。図２６Ｂは、ドットプロットを表示し、ｘ軸には、非処理ペプチドを含む表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターで形質導入された細胞の表面にディスプレイされるタンパク質含量を示し、ｙ軸には、トリプシンで処理したペプチドを含む表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターで形質導入された細胞の表面にディスプレイされるタンパク質含量を非処理表面タンパク質含量のパーセンテージとして示す。ドットプロットは、最初に表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターにクローン化された約１０，０００ペプチドのうち、読取り存在量閾値を超えた計約４，３００ペプチドを表示する。サンプルを二分する対角線は、「高タンパク質含量及び／又はトリプシン耐性」ペプチドと「低タンパク質含量及び／又はトリプシン感受性」ペプチドとの間のカットオフを画定し、これは、折り畳み良好（高含量／トリプシン耐性）又は折り畳み不良（低含量／トリプシン感受性）としてペプチドを分類するために使用した。ペプチドは、さらに分泌タンパク質としても発現され、ＨＰＬＣにより、１〜２ピーク（丸）、３＋ピーク（四角）、又は０ピーク（菱形）により分類した。クロマトグラムで観察されるピークの数は、ペプチドの折り畳みと相関しており、この場合、１〜２ピークを有するペプチドは良好に折り畳まれ、３＋ピークを有するペプチドは折り畳みが不良であり、ピークが０のペプチドは、ペプチドが認められなかったことを意味し、従って、折り畳みが不良であると推定された。十字は、ＨＰＬＣクロマトグラムデータが生成されなかったペプチドを示す。大きなＸは、図２６ＤのＨＰＬＣクロマトグラム及び図２６Ｅの表に示されるペプチドである。折り畳み良好のペプチドは、右上象限に出現し、折り畳み不良のペプチドは、左下象限に出現する。可溶性ペプチドのハイスループット表面ディスプレイアッセイ及びＨＰＬＣ分析の両方からのデータを互いに比較して、一致性スコアを生成した。例えば、表面ディスプレイペプチド折り畳みアッセイプロット（図２６Ｂ参照）の右上象限にある表面ディスプレイペプチド（良好に折り畳まれたことを示す）及びＨＰＬＣ分析（図２６Ｄを参照）により可溶性ペプチドとして生成された１〜２のピーク（これも、良好に折り畳まれたことを示す）は、一致した挙動を呈示する（いずれの結果も、ペプチドが良好に折り畳まれていることを示した）。同様に、表面ディスプレイペプチド折り畳みアッセイの左下象限にある表面ディスプレイペプチド（折り畳みが不良であることを示す）及びＨＰＬＣ分析により生成された３＋若しくは０ピーク（これも、折り畳みが不良であることを示す）は、一致した挙動を呈示する（両方の結果とも、ペプチドが折り畳み不良であることを示した）。ＨＰＬＣ分類をシャッフルし、一致性スコアリングを百万回超反復することによって、一致スコアによるペプチド折り畳み評価の統計学的有意性を計算した。ペプチドの実際の一致性スコアは、反復毎のシャッフルスコアより高く、Ｐ＜１×１０−６が得られ、これは、ペプチドが可溶性ペプチドであるとき、表面ディスプレイペプチド折り畳みアッセイが、適正に折り畳まれ得るペプチドを見出し得ることを示している。
【０３５１】
図２６Ｃは、ＨＰＬＣにより分類した（０ピーク；３＋ピーク；又は１〜２ピーク）試験分泌タンパク質（図２６Ｂからの）の分解を示す棒グラフを表示する。ペプチドは、ペプチドカテゴリーにより分類した：全ペプチド；高タンパク質含量／トリプシン耐性（高含量／トリプシン耐性）を有するペプチド；及び低タンパク質含量／トリプシン感受性（低含量／トリプシン感受性）を有するペプチド。表面折り畳みとＨＰＬＣ分類（３＋ピークと０ピークを合わせて、１群にする）との間の相関は非常に有意であった。
【０３５２】
図２６Ｄは、ネイティブ（薄い線）又は還元（濃い線）条件下での本開示の様々なペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。各「プロット」のペプチド配列を図２６Ｅに示す。図２６Ｅは、ＨＰＬＣにより試験した各ペプチドの表を示し、そのＨＰＬＣクロマトグラムを図２６Ｄに示す。表には、プロット番号、観察されたＨＰＬＣピークの数、タンパク質含量、トリプシン耐性、配列番号、及び配列を掲載する。高タンパク質含量（任意の単位、ハイスループットシーケンシング及びフローサイトメトリーデータから計算）は、有意な量のペプチドが、トリプトシンへの曝露後も、細胞表面に存在し続けたことを示している。より高いトリプシン耐性（非処理ペプチドに認められた含量のパーセントとしてのトリプシン処理ペプチドのタンパク質含量）は、酵素による切断に対して優れた耐性を呈示したペプチド配列を示す。
【０３５３】
トリプシン耐性値は、ハイスループットシーケンシングアッセイから取得し、この場合、ペプチドを含む表面ディスプレイＧＦＰ  ＦａｓＬ（ＳＤＧＦ）ベクターで形質導入した細胞をトリプトシンで処理するか、又は処理しないまま、フローサイトメトリーにより、ペプチド表面存在量に基づいて４つのチューブの１つに分類した（各ペプチドは、ペプチドのＣ末端にタグ付けされたＨｉｓタグを含み、Ｈｉｓタグに特異的な蛍光標識抗体により検出した）。処理別の４つのサンプル中の蛍光の量（相対蛍光単位（ＲＦＵ））を記録し、分類されたサンプルをディープシーケンシングした。４つの分類されたサンプルからの配列データにおける所与のペプチドの分布を合わせて、ペプチドを発現する細胞の蛍光を推定した。蛍光は、非処理及び処理条件下でのペプチドの表面存在量（タンパク質含量）と相関する。従って、高タンパク質含量は、ペプチドの良好な発現を意味し、タンパク質含量が、非処理群と処理群の間で類似した場合も、トリプシン耐性であるとみなした。
【０３５４】
実施例１９
炎症性腸疾患の治療
この実施例は、本開示のいずれかのペプチド（配列番号１〜配列番号１６６）又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによる炎症性腸疾患の治療を示す。目的のペプチドは、組換えにより発現させるか、あるいは単独で、又は活性薬剤との融合物若しくはコンジュゲートとして化学的に合成する。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、それが必要な被験者に経口投与する。それが必要な被験者は、ヒト又はヒト以外の動物である。それが必要な被験者は、炎症性腸疾患を有する。ペプチド−活性薬剤コンジュゲートの場合、活性薬剤は、ステロイド又は免疫調節薬、例えば、プレドニゾン、ブデソニド、アザチプリン、若しくはメトトレキサートである。例えば、イオンチャネルに作用する、又は炎症性腸疾患の病理に関与するプロテアーゼを阻害する（例えば、セリンプロテアーゼ、ユビキチンプロテアソーム系阻害剤）などによって、抗炎症又は免疫調節活性を有するように、ペプチド自体を修飾することもできる。あるいは、ＴＮＦ阻害剤活性を有するように、ペプチド自体を修飾することもできる。
【０３５５】
経口投与後のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによって、酵素による変性、還元、又は切断に対する向上した安定性及び耐性が呈示される。その結果、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、急速に分解されて、効果を失うのではなく、むしろ、活性薬剤を標的に送達する、又はそれに作用して、治療効果を発揮するのに十分長い間安定している。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートにより治療効果が発揮されて、炎症性腸疾患が軽減される。
【０３５６】
ペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３１、又は配列番号５７のペプチドのいずれか１つであってよい。
【０３５７】
実施例２０
クローン病の治療
この実施例は、本開示のいずれかのペプチド（配列番号１〜配列番号１６６）又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによるクローン病の治療を示す。目的のペプチドは、組換えにより発現させるか、あるいは単独で、又は活性薬剤との融合物若しくはコンジュゲートとして化学的に合成する。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、それが必要な被験者に経口投与する。それが必要な被験者は、ヒト又はヒト以外の動物である。それが必要な被験者は、クローン病を有する。ペプチド−活性薬剤コンジュゲートの場合、活性薬剤は、ステロイド又は免疫調節薬、例えば、プレドニゾン、ブデソニド、アザチプリン、若しくはメトトレキサートである。例えば、ＴＲＰＣ６イオンチャネルを調節する働きをする、又はプロテアーゼ活性若しくはＴＮＦ活性を阻害する働きをすることによって、抗炎症又は免疫調節活性を有するように、ペプチド自体を修飾することもできる。
【０３５８】
経口投与後のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによって、酵素による変性、還元、又は切断に対する向上した安定性及び耐性が呈示される。その結果、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、急速に分解されて効果を失うのではなく、むしろ、活性薬剤を標的に送達する、又はそれに作用して、治療効果を発揮するのに十分長い間安定している。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートにより治療効果が発揮されて、クローン病が軽減される。
【０３５９】
ペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３１、又は配列番号５７のペプチドのいずれか１つであってよい。
【０３６０】
実施例２１
結腸癌の治療
この実施例は、本開示のいずれかのペプチド（配列番号１〜配列番号１６６）又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによる結腸癌の治療を示す。目的のペプチドは、組換えにより発現させるか、あるいは単独で、又は活性薬剤との融合物若しくはコンジュゲートとして化学的に合成する。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、それが必要な被験者に経口投与する。それが必要な被験者は、ヒト又はヒト以外の動物である。それが必要な被験者は、結腸癌を有する。ペプチド−活性薬剤コンジュゲートの場合、活性薬剤は、フルオルウラシル、ゲムシタビン、又はマホスファミド（シクロホスファミドプロドラッグ）などの任意の抗癌剤である。抗癌活性を有するように、ペプチド自体を修飾することができる。
【０３６１】
経口投与後のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによって、酵素による変性、還元、又は切断に対する向上した安定性及び耐性が呈示される。その結果、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、急速に分解されて効果を失うのではなく、むしろ、活性薬剤を標的に送達する、又はそれに作用して、治療効果を発揮するのに十分長い間安定している。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートにより治療効果が発揮されて、結腸癌が治療される。
【０３６２】
ペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３１、又は配列番号５７のペプチドのいずれか１つであってよい。
【０３６３】
実施例２２
腸内病原体の治療
この実施例は、本開示のいずれかのペプチド（配列番号１〜配列番号１６６）又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによる腸内病原体の治療を示す。目的のペプチドは、組換えにより発現させるか、あるいは単独で、又は活性薬剤との融合物若しくはコンジュゲートとして化学的に合成する。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、それが必要な被験者に経口投与する。それが必要な被験者は、ヒト又はヒト以外の動物である。それが必要な被験者は、胃腸管に感染する細菌、ウイルス、寄生虫、若しくは別の生物などの腸内病原体を有する。ペプチド−活性薬剤コンジュゲートの場合、活性薬剤は、カルバペネム、ペニシリン、キノリン、フルオロキノロン、アミノグリコシド、アモキシシリン、若しくはテトラサイクリンなどの任意の抗生物質、任意の抗菌剤、任意の抗寄生虫剤、又は任意の抗ウイルス剤である。細菌（例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、若しくはカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ））、ウイルス、寄生虫、又は腸に感染する別の生物などの腸内病原体に対して、例えば、プロトンポンプ阻害薬の調節など、抗菌活性を有するように、ペプチド自体を修飾することができる。
【０３６４】
経口投与後のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによって、酵素による変性、還元、又は切断に対する向上した安定性及び耐性が呈示される。その結果、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、急速に分解されて効果を失うのではなく、むしろ、活性薬剤を標的に送達する、又はそれに作用して、治療効果を発揮するのに十分長い間安定している。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートにより治療効果が発揮されて、腸内病原体に起因する疾患が軽減される。
【０３６５】
ペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３１、又は配列番号５７のペプチドのいずれか１つであってよい。
【０３６６】
実施例２３
グアニリルシクラーゼＣを発現する癌の治療
この実施例は、本開示のいずれかのペプチド（配列番号１〜配列番号１６６）又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによる、結腸直腸癌及び上部消化管腺癌など、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）を発現する癌の治療を示す。目的のペプチドは、組換えにより発現させるか、あるいは単独で、又は活性薬剤との融合物若しくはコンジュゲートとして化学的に合成する。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、それが必要な被験者に経口投与する。それが必要な被験者は、ヒト又はヒト以外の動物である。それが必要な被験者は、ＧＣＣを発現する癌を有する。癌のＧＣＣは、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートのペプチドによって結合される。あるいは、ＧＣＣに結合するように、ペプチド自体を修飾することができる。ペプチド−活性薬剤コンジュゲートの場合、活性薬剤は、イリノテカン、カペシタビン、オキサリプラチン、フルオロウラシル、ロイコボリン、又はレゴラフェニブなどの化学療法薬である。
【０３６７】
経口投与後のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによって、酵素による変性、還元、又は切断に対する向上した安定性及び耐性が呈示される。その結果、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、急速に分解されて効果を失うのではなく、むしろ、活性薬剤を標的に送達する、又はそれに作用して、治療効果を発揮するのに十分長い間安定している。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートにより治療効果が発揮されて、ＧＣＣを発現する癌が治療される。
【０３６８】
ペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３１、又は配列番号５７のペプチドのいずれか１つであってよい。
【０３６９】
実施例２４
過敏性腸症候群を治療するためのイオンチャネルの作動作用及び拮抗作用
この実施例は、本開示のいずれかのペプチド（配列番号１〜配列番号１６６）又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートを用いて、胃腸管のイオンチャネルを刺激又は中和することによる過敏性腸症の治療を示す。目的のペプチドは、組換えにより発現させるか、あるいは単独で、又は活性薬剤との融合物若しくはコンジュゲートとして化学的に合成する。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、それが必要な被験者に経口投与する。それが必要な被験者は、ヒト又はヒト以外の動物である。それが必要な被験者は、過敏性腸症候群を有する。胃腸管内の電位開口型ナトリウム（ＮａＶ）イオンチャネル、カルシウム（ＣａＶ）イオンチャネル、カリウム（ＫＶ、ＫＣａ）イオンチャネル、塩素（Ｃｌ−）イオンチャネル、非選択性イオンチャネル（一過性受容体受容器電位（ＴＲＰ））、塩素チャネル２型（ＣｌＣ−２）３イオンチャネル、又は嚢胞性繊維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）塩素チャネルが、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによって刺激又は中和される（（Ｂｅｙｄｅｒ，Ａ．，Ｔｈｅｒａｐ  Ａｄｖ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，５（１）：５−２１（２０１２）；Ｊｕｎ，Ｊ．Ｙ．．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｍｏｔｉｌ．，１９（３）：２７７−８（２０１３）。あるいは、これらのイオンチャネルに結合するように、ペプチド自体を修飾する。
【０３７０】
経口投与後のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによって、酵素による変性、還元、又は切断に対する向上した安定性及び耐性が呈示される。その結果、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、急速に分解されて効果を失うのではなく、むしろ、活性薬剤を標的に送達する、又はそれに作用して、治療効果を発揮するのに十分長い間安定している。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートにより治療効果が発揮されて、過敏性腸症が治療される。
【０３７１】
ペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３１、又は配列番号５７のペプチドのいずれか１つであってよい。
【０３７２】
実施例２５
操作された耐性ペプチド
この実施例は、腫瘍に向かい、且つ／又は抗菌特性を有するように、本開示のペプチドを操作することについて説明する。腫瘍ホーミング及び／又は抗菌特性をペプチド中に設計するためのスカフォールドとして使用する上で本明細書に開示するようにそれが耐性であることから、配列番号２７、配列番号５７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号３１のペプチドを選択する。次に、ペプチドを腫瘍ホーミングなどのホーミング特性及び／又は抗菌特性を有するように、ペプチドを操作する。さらに、温度安定性、プロテアーゼ耐性、及び／又は還元耐性などのその耐性を維持するように、ペプチドを操作する。ペプチドの操作は、合理的設計、コンピュータ支援設計、又は腫瘍への結合を増大するために、及び／又はその耐性を維持しながら、抗菌特性を増大するために、コンピュータソフトウェア若しくは研究者により選択されたアミノ酸で、ネイティブアミノ酸を置換するランダム突然変異誘発によって達成される。上記又は関連技術を用いた進化の反復ラウンドを使用して、耐性並びに腫瘍ホーミング及び／又は抗菌特性の両方を有するペプチドを操作する。次に、操作されたペプチドを、定量全身オートラジオグラフィー若しくは液体シンチレーションを用いて、腫瘍担持マウスにおける腫瘍との結合親和性及びｉｎ  ｖｉｖｏ生体分布について、並びに／又は細菌増殖停止アッセイ（例えば、微生物と一緒にペプチドを培養し、微生物死若しくは増殖停止を分析する）を用いて、抗菌特性、及び本明細書に記載される耐性について試験する。操作ペプチドは、治療薬そのものとして使用するか、又は操作ペプチド−活性薬剤コンジュゲートの形態で活性薬剤と一緒に使用する。操作ペプチド又は操作ペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、それが必要な被験者に経口投与する。それが必要な被験者は、ヒト又はヒト以外の動物である。
【０３７３】
経口投与後の操作ペプチド又は操作ペプチド−活性薬剤コンジュゲートによって、酵素による変性、還元、又は切断に対する向上した安定性及び耐性、並びに向上した腫瘍ホーミング及び／又は向上した抗菌特性が呈示される。その結果、操作ペプチド又は操作ペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、急速に分解されて効果を失うのではなく、むしろ、活性薬剤を標的に送達する、又はそれに作用して、治療効果を発揮するのに十分長い間安定し、腫瘍を標的とする及び／又は抗菌特性を呈示することができる。操作ペプチド又は操作ペプチド−活性薬剤コンジュゲートにより治療効果が発揮されて、疾患が治療される。
【０３７４】
実施例２６
ペプチドへの耐性の移植
この実施例は、本開示のペプチドの耐性をペプチドに移植することについて説明する。選択したノッティン（例えば、２００，０００超の同定されたネイティブノッティンのライブラリーから選択される）を本発明のペプチドベースの治療薬のスカフォールドとして使用する。温度安定性、プロテアーゼ耐性、及び／又は還元耐性などの少なくとも１つの向上した耐性を有するように、ペプチドを移植する。移植片は、向上した耐性を付与する配列番号２７、配列番号５７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、及び配列番号１２の保存的アミノ酸を基材とし、ペプチドへの移植片の配置は、ペプチドが、耐性を取得するように、コンピュータソフトウェア若しくは研究者により選択されたアミノ酸で、ネイティブアミノ酸を置換するコンピュータ設計によって達成される。次に、得られた移植ペプチドを、本明細書に記載のように耐性について試験する。その後、向上した耐性を備えた移植ペプチドを治療薬として、又は本開示のいずれかの治療用途に使用する。
【０３７５】
あるいは、ペプチドがプロテアーゼにより切断されることになる場合、ペプチドを変異させて、切断を阻止することもできる。例えば、特定の位置でトリプシンによりペプチドが切断される場合、ペプチドのその特定の位置を除去するか、又はリシン若しくはアルギニンに変異させて、トリプシン切断を阻止する。
【０３７６】
実施例２７
耐性ペプチド変異体の増殖
この実施例は、さらに別の安定ペプチドスカフォールドを作製するために本明細書に開示される高度にストレス耐性のペプチドの修飾若しくは突然変異に従い、ノッテッドペプチドのアミノ酸を増強若しくは修飾することによって、ストレスに対してより耐性となる（例えば、還元耐性、プロテアーゼ耐性、低ｐＨ耐性、及び／又は高温耐性）ように、ノッテッドペプチドを最適化することを示す。
【０３７７】
より低い耐性のペプチドを、「サブタイプＡ」構造に基づく、より耐性のペプチドに変換するための基本原理を図２７Ｄ及び図２７Ｅに示す。例えば、配列番号５６においてアミノ酸６位のＴｈｒアミノ酸をＩｌｅアミノ酸に置換して、以下：
ＧＳＧＶＰＩＤＶＫＣＲＧＳＰＱＣＩＱＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ（配列番号７４）
のアミノ酸配列を含む配列番号５６の変異ペプチドを作製するか、又はアミノ酸１７位のＩｌｅアミノ酸をＬｅｕアミノ酸にさらに置換して、以下：
ＧＳＧＶＰＩＤＶＫＣＲＧＳＰＱＣＬＱＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ（配列番号７５）
のアミノ酸配列を含む配列番号５６の変異ペプチドを作製する。
【０３７８】
従って、図２７Ｄのより高い耐性のペプチドと類似するペプチド（例えば、配列番号５６）をより高い耐性のペプチドと一致するように変異させると、得られた変異ペプチド（例えば、配列番号７４及び配列番号７５）の耐性が向上する。さらに、３次元モデル化及び結晶構造データから、図２７Ｄのより高い耐性のペプチドと類似するペプチドのアミノ酸６位でのＩｌｅアミノ酸置換が、同ペプチドの一方の末端に位置し、これが、シスチンへのアクセスを立体的に制約するゲートウェイとして作用して、シスチンを分解から保護し得ることが判明し、従って、Ｔｈｒアミノ酸をＩｌｅアミノ酸に変更すると、その耐性が増大することもわかる。加えて、アミノ酸２７位のＬｅｕアミノ酸は、図２７Ｄ及び図２７Ｅの全てのペプチドで保存されて、シスチンと隣接している。従って、図２７Ｄのペプチドと類似するペプチドの耐性は、これが、このＬｅｕアミノ酸への変異を含む場合、増大する。（アミノ酸位置の番号は、図２７の配列アラインメントに基づくことに留意されたい。）
【０３７９】
より低い耐性のペプチドを、「サブタイプＢ」構造に基づく、より高い耐性のペプチドに変換する基本原理を図２７Ｆ及び図２７Ｇに示す。例えば、配列番号３７において、アミノ酸６位のＩｌｅアミノ酸をＴｈｒアミノ酸に、アミノ酸２３位のＡｌａアミノ酸をＡｒｇアミノ酸に、並びにアミノ酸２４位のＩｌｅアミノ酸をアミノ酸３７位のＰｈｅアミノ酸に置換して、以下：ＧＳＶＦＴＮＶＫＣＲＧＳＰＥＣＬＰＫＣＫＥＲＦＧＫＳＡＧＫＣＭＮＧＫＣＫＣＹＰ（配列番号７６）のアミノ酸配列を含む配列番号３７の変異ペプチドを作製する。（アミノ酸位置の番号は、図２７の配列アラインメントに基づくことに留意されたい。）
【０３８０】
従って、図２７Ｇのより高い耐性のペプチドと類似するペプチド（例えば、配列番号３７）をより高い耐性のペプチドと一致するように変異させると、得られた変異ペプチド（例えば、配列番号７６）の耐性が向上する。さらに、３次元モデル化及び結晶構造データから、図２７Ｇのより高い耐性のペプチドと類似するペプチドのアミノ酸６位でのＴｈｒアミノ酸置換、アミノ酸２３位のＡｒｇアミノ酸アミノ酸置換、及びアミノ酸２４位のＰｈｅアミノ酸置換が、ペプチドの一方の末端に位置し、これが、シスチンへのアクセスを立体的に制約するゲートウェイとして作用して、シスチンを分解から保護し得ることが判明し、従って、これら３つのアミノ酸置換によって、その耐性が増大することもわかる。
【０３８１】
実施例２８
製造、貯蔵、及び流通のためのペプチドの安定性
この実施例は、製造、貯蔵、及び／又は凍結若しくは冷却なしで流通される場合の本開示のペプチド（配列番号１〜配列番号１６６）の安定性を明らかにする。目的のペプチドは、組換えにより発現させるか、又は化学的に合成する。ペプチドは貯蔵され、及び／又は凍結若しくは冷却なしで流通される。ペプチドは、貯蔵及び／又は流通中に、２０℃、２５℃、３０℃、４０℃、４５℃、５０℃、７０℃、若しくは１００℃に曝露される。ペプチドは、流通及び／又は使用までに、１日、１週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、又は４年にわたって貯蔵される。いくつかのケースでは、ペプチドは、６０〜７５％又はそれ以上の相対湿度に曝露される。貯蔵及び／又は流通後、ペプチドの分解は最小限であり、これは、少なくとも７０％のペプチドがインタクトなままであることを意味する。さらに、ペプチドは、アッセイした場合、少なくとも９０％若しくは９５％純度、又は少なくとも９０％若しくは９５％効力を維持する。ペプチドは、それが必要な被験者に投与される。それが必要な被験者は、ヒト又はヒト以外の動物である。
【０３８２】
製造、貯蔵、及び／又は流通後、投与後のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートによって、酵素による変性、還元、又は切断に対する向上した安定性及び耐性が呈示される。その結果、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、急速に分解されて効果を失うのではなく、むしろ、活性薬剤を標的に送達する、又はそれに作用して、治療効果を発揮するのに十分長い間安定している。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートにより治療効果が発揮されて、標的疾患が治療される。従って、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、製剤の純度及び効力を維持しながら、室温若しくはそれより高温で貯蔵されるため、投与までに継続的な低温管理の必要がなくなる。
【０３８３】
ペプチドは、配列番号２７、配列番号２４、配列番号６、配列番号１０、配列番号３１、又は配列番号５７のペプチドのいずれか１つであってよい。
【０３８４】
実施例２９
解明されたペプチドの結晶構造
この実施例は、配列番号３、配列番号２７、配列番号２２、配列番号３４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号２０、配列番号５１、及び配列番号４７のペプチドを含むペプチドホモログの解明された結晶構造を示す。各ペプチドについて、ペプチドを８０ｍｇ／ｍＬの標的濃度で再懸濁させた。Ｎｅｘｔａｌ  ＪＣＳＧ＋、ＰＥＧｓ、及び（ＮＨ４）２ＳＯ４ファクトリアル・スイート（ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｓｕｉｔｅｓ）（Ｑｉａｇｅｎ）並びにサブミクロリットルロボット工学（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ｍｏｓｑｕｉｔｏ）を使用してセットアップした、１：１タンパク質溶液：レザバー溶液シッティングドロップと用いた蒸気拡散法により、結晶化スクリーニングを室温で実施した。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｂｅｒｋｌｅｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）にて、Ｒｉｇａｋｕ  ＭｉｃｒｏＭａｘ−００７  ＨＦ  ｈｏｍｅ  ｓｏｕｒｃｅ又はビームライン５．０．１を用いて、単一結晶から回析データを収集した。ＲＣＳＢ  ＰＤＢ（Ｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８（１）：２３５−４２（２０００））からのホモロガス構造を検索モデルとして用いるＣＣＰ４プログラムスイート（Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６７（Ｐｔ  ４）：２３５−４２（２０１１））のＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，４０（Ｐｔ  ４）：６５８−６７４（２００７））を使用する分子置換（ＭＲ）、又はＣｕＫα線を用いて異常シグナルを最大化し、ＳＨＥＬＸ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｍ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６６（Ｐｔ  ４）：４７９−８５（２０１０））でイオウ部分構造を決定するイオウ単波長異常分散法（ｓＳＡＤ）（Ｌｉｕ，Ｑ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６９（Ｐｔ  ７）：１３１４−３２（２０１３））のいずれかによって、初期位相を決定した。ｓＳＡＤ位相決定の場合、１°振幅内に１８０°の交互ファイ回転を有する５°ウェッジによってデータを収集することにより、バイフィット対（Ｂｉｊｖｏｅｔ  ｐａｉｒ）測定を最適化した。ＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２７６：３０７−３２６（１９９７））を用いて、データを整理及びスケーリングした。ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｅｌｙ，Ｐ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６０（Ｐｔ  １２  Ｐｔ  １）：２１２６−３２（２００４））及びＲＥＦＭＡＣ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，５３（Ｐｔ  ３）：２４０−５５（１９９７））を用いて、モデル構築及び精密化の反復サイクルを実施した。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ（Ｄａｖｉｓ，Ｉ．Ｗ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３５（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３７５−８３（２００７））を用いて、構造検��を実施した。
【０３８５】
同様に、前述した方法を用いて、配列番号１〜配列番号２、配列番号４〜配列番号９、配列番号１１、配列番号１４〜配列番号１９；配列番号２１、配列番号２３〜配列番号２６；配列番号２８〜配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８〜配列番号４６、配列番号４８〜配列番号５０、及び配列番号５２〜配列番号１６６のペプチドのいずれか１つの結晶構造を解明する。
【０３８６】
実施例３０
ペプチド−活性薬剤コンジュゲート
この実施例は、配列番号３１のペプチドを用いて、ペプチド−活性薬剤コンジュゲートの合成を説明する。配列番号３１のペプチドは、組換えにより発現させるか、あるいは単独で、又は活性薬剤との融合物若しくはコンジュゲートとして化学的に合成される。配列番号３１のペプチド又はペプチド活性薬剤コンジュゲートの配列番号３１のペプチドは、イオンチャネルを調節する、抗菌特性を有する、及び／又は腫瘍細胞を殺傷するように、設計される。配列番号３１のペプチド又はペプチド活性薬剤コンジュゲートは経口投与される。
【０３８７】
酵素による変性、還元、若しくは切断に対する向上した安定性及び耐性が、経口投与後のペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートにより呈示される。その結果、ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートは、急速に分解されて、効果を失うのではなく、むしろ、活性薬剤を標的に送達する、又はそれに作用して、治療効果を発揮するのに十分長い間安定している。ペプチド又はペプチド−活性薬剤コンジュゲートにより治療効果が発揮されて、疾患が軽減される。
【０３８８】
本発明の好ましい実施形態を示し、説明してきたが、当業者には、こうした実施形態があくまで例として提供されることは明らかであろう。これにより、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、及び代替が当業者によって想起されるであろう。本明細書に記載する本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明の実施に際して使用され得ることは理解すべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を明確にすること、また、この特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの同等物がそれにより包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月22日(2019.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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