(57)【要約】  ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質およびそのＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質またはそのＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体）との組合せを投与することを含む、癌の治療においてその融合タンパク質を使用する方法が、本明細書に提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
（ａ）ペプチドリンカーを介して互いに共有結合している３つのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）サブユニット、またはその断片を含む単鎖融合物（ｓｃＣＤ４０Ｌ）；および
（ｂ）Ｆｃ単量体
を含み、
前記ｓｃＣＤ４０Ｌは、ペプチドリンカーを介して前記Ｆｃ単量体に共有結合している融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＣＤ４０Ｌサブユニットが、配列番号３と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
１つ以上のＣＤ４０Ｌサブユニットが、７４位におけるＴｒｐ残基を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
７４位における前記Ｔｒｐ残基が、Ｃ→Ｗ置換である、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
１つ以上のＣＤ４０Ｌサブユニットが、ヒトＣＤ４０Ｌ配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ｓｃＣＤ４０Ｌが、前記Ｆｃ単量体のＮ末端またはＣ末端に結合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記Ｆｃ単量体が、ヒンジ領域を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記Ｆｃ単量体が、ヒトＦｃ配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記Ｆｃ単量体が、ヒトＩｇＧ４アミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ＣＤ４０Ｌサブユニット、またはその断片に共有結合している前記ペプチドリンカーが、約９〜約２０アミノ酸を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＣＤ４０Ｌサブユニット、またはその断片に共有結合している前記ペプチドリンカーが、約９〜約１５アミノ酸を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＣＤ４０Ｌサブユニット、またはその断片に共有結合している前記ペプチドリンカーが、９アミノ酸を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ペプチドリンカーが、１つ以上のグリシン（Ｇｌｙ）またはセリン（Ｓｅｒ）残基を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記リンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号５）（式中、ｎは、２、３、および４から選択される正の整数である）；（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号６）（式中、ｎは、３、４、および５から選択される）；Ｇｌｙ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号７）（式中、ｎは、２、３、および４から選択される）；またはＧｌｙ（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）ｎ（配列番号８）（式中、ｎは、３、４、５、および６から選択される）である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記リンカーが、配列番号４または配列番号２である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記ｓｃＣＤ４０Ｌが、ＣＤ４０Ｌホモ三量体にフォールドする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ＣＤ４０Ｌサブユニットと前記Ｆｃ単量体との比が、３：１である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
融合タンパク質であって、
単鎖融合物であって、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のＣＤ４０Ｌサブユニットを含み、配列番号２のアミノ酸配列を有する第１のペプチドリンカーに共有結合しており、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２のＣＤ４０Ｌサブユニットに共有結合しており、配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のペプチドリンカーに共有結合しており、配列番号３のアミノ酸配列を有する第３のＣＤ４０Ｌサブユニットに共有結合しており、配列番号４のアミノ酸配列を有する第３のペプチドリンカーに共有結合しており、Ｆｃポリペプチドに共有結合している単鎖融合物を含む融合タンパク質。
【請求項１９】
配列番号９；配列番号１０；または配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
単離融合タンパク質が、約２１℃以上における少なくとも３日間で約１０％未満の凝集率を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記単離融合タンパク質が、約２１℃における少なくとも７日間以上で約１％未満の凝集率を有する、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記単離融合タンパク質が、約４５℃における少なくとも３日間以上で約１０％未満の凝集率を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
２つの融合タンパク質を含む二量体であって、それぞれの融合タンパク質は、
（ａ）ペプチドリンカーを介して互いに共有結合している３つのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）サブユニット、またはその断片を含む単鎖融合物（ｓｃＣＤ４０Ｌ）；および
（ｂ）Ｆｃ単量体
を含み、
前記ｓｃＣＤ４０Ｌは、ペプチドリンカーを介して前記Ｆｃ単量体に共有結合しており、前記Ｆｃ単量体の相互作用を介して形成される二量体。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質から選択される２つの融合タンパク質を含み、前記Ｆｃ単量体の相互作用を介して形成される二量体。
【請求項２５】
前記ＣＤ４０ポリペプチドを、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質または二量体と接触させることを含む、ＣＤ４０ポリペプチドを活性化させる方法。
【請求項２６】
前記融合タンパク質または二量体が、最大６つのＣＤ４０ポリペプチドに結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＤ４０ポリペプチドが、細胞上に存在する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、対象中に存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、ＣＤ４０ポリペプチドを発現する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、抗原提示細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、または樹状細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
対象に、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の単離融合タンパク質または二量体を投与することを含む、対象において抗腫瘍免疫応答を向上させる方法。
【請求項３２】
前記対象が、癌を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
対象に、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の単離融合タンパク質または二量体および１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法。
【請求項３４】
前記１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４アンタゴニストを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４アンタゴニストが、抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、デュルバルマブであり、前記抗ＣＴＬＡ−４抗体が、トレメリムマブである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；配列番号２１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗ＣＴＬＡ−４抗体が、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗ＣＴＬＡ−４抗体が、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
免疫応答および抗癌応答の１つ以上を向上させる、請求項２５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
腫瘍微小環境の免疫抑制を低減させる、請求項２５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の単離融合タンパク質をコードする核酸分子を含むポリヌクレオチド。
【請求項４４】
請求項４３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４５】
請求項４４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４６】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の単離融合タンパク質を発現する、請求項４５に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
（ａ）請求項４６に記載の宿主細胞を培養すること；および（ｂ）融合タンパク質または二量体を単離することを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質または二量体を作製する方法。
【請求項４８】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の単離融合タンパク質、請求項４３に記載のポリヌクレオチド、請求項４４に記載のベクター、または請求項４５もしくは４６に記載の宿主細胞を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１６年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／３３６，１２９号明細書の利益を主張する。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、２０１７年５月１１日に作成され、４１，５４７バイトのサイズを有する表題「ＣＤ４０Ｆ−１００−ＷＯ−ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」のテキストファイルとして本出願と同時に提出された配列表を参照により組み込む。
【背景技術】
【０００３】
癌は、依然として主な世界的な健康的負担である。癌の治療の進展にもかかわらず、特に、既存の治療法に耐性である進行性疾患または癌を有する患者のための、より有効であり、低毒性の治療法の満たされていない医学的要求が依然として存在する。
【０００４】
腫瘍制御における免疫系、特にＴ細胞媒介毒性の役割は、十分に認識されている。Ｔ細胞が、癌患者において疾患の初期および後期の両方で腫瘍成長および生存を制御するという山のような証拠が存在する。しかしながら、腫瘍特異的Ｔ細胞応答は、癌患者において増加および持続することが困難である。
【０００５】
今日、顕著な注目を集めているＴ細胞経路としては、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２）およびプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ１またはＣＤ２７４としても公知）を介するシグナリングが挙げられる。しかしながら、近年、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）が腫瘍制御についての媒介因子として関心を集めている。
【０００６】
ＣＤ４０Ｌは、主として活性化Ｔ細胞（例として、Ｔｈ０、Ｔｈ１、およびＴｈ２サブタイプ）上で発現されるＴＮＦファミリー分子のメンバーであり、このファミリーの他のメンバーと同様にホモ三量体を形成する。さらに、ＣＤ４０Ｌは、肥満細胞、ならびに活性化好塩基球および好酸球上で発現されることも見出されている。ＣＤ４０Ｌは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でその受容体ＣＤ４０に結合し、標的細胞タイプに応じて多くの効果をもたらす。一般に、ＣＤ４０Ｌは共刺激分子の役割を担い、ＡＰＣ上のＭＨＣ分子によるＴ細胞受容体刺激に伴うＡＰＣ中での活性化を誘導する。
【０００７】
癌および他の疾患を撲滅する方針の開発において過去十年間にわたりなされた重要な進展にかかわらず、進行性、難治性および転移性疾患を有する患者は、限定された臨床選択を有する。化学療法、放射線照射、および高用量化学療法は、用量制限的になっている。依然として、特に、既存の治療薬に耐性である進行性疾患または癌を有する患者のための、より良好な治療効力、より長い臨床利益、および改善された安全性プロファイルを有する新たな低毒性法および治療薬のかなりの満たされていない要求が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
一態様において、本発明は、ペプチドリンカーを介して互いに共有結合している３つのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）サブユニット、またはその断片の単鎖融合物（ｓｃＣＤ４０Ｌ）；およびＦｃ単量体を含む融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）であって、ｓｃＣＤ４０Ｌは、ペプチドリンカーを介してＦｃ単量体に共有結合している融合タンパク質を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、２つの融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）の二量体であって、それぞれの融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して互いに共有結合している３つのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）サブユニット、またはその断片の単鎖融合物（ｓｃＣＤ４０Ｌ）；およびＦｃ単量体を含み、ｓｃＣＤ４０Ｌは、ペプチドリンカーを介してＦｃ単量体に共有結合しており、Ｆｃ単量体の相互作用を介して形成される二量体を提供する。
【００１０】
具体的な態様において、本発明は、融合タンパク質であって、単鎖融合物であって、Ｎ末端からＣ末端に向かって、アミノ酸配列：
【化１】
2019523636.tif 000002
を有する第１のＣＤ４０Ｌサブユニットを含み、
アミノ酸配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２）
を有する第１のペプチドリンカーに共有結合しており、
アミノ酸配列：
【化２】
2019523636.tif 000003
を有する第２のＣＤ４０Ｌサブユニットに共有結合しており、
アミノ酸配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２）
を有する第２のペプチドリンカーに共有結合しており、
アミノ酸配列：
【化３】
2019523636.tif 000004
を有する第３のＣＤ４０Ｌサブユニットに共有結合しており、
アミノ酸配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４）
を有する第３のペプチドリンカーに共有結合している単鎖融合物を含み、
Ｆｃポリペプチドに共有結合している融合タンパク質を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４０ポリペプチドを、本明細書に記載の任意の態様による単離融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）と接触させることを含む、ＣＤ４０ポリペプチドを活性化させる方法を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、対象に、本明細書に記載の任意の態様による単離融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）を投与することを含む、対象において抗腫瘍免疫応答を向上させる方法を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、対象に、本明細書に記載の任意の態様による単離融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）、および場合により、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法を提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の任意の態様による融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）をコードする核酸分子を含有するポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
関連態様において、本発明は、本明細書に記載の任意の態様によるポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
【００１６】
別の関連態様において、本発明は、本明細書に記載の任意の態様によるベクターを含有する宿主細胞、例として、本明細書に記載の任意の態様による単離融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）を発現する宿主細胞を提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の任意の態様による宿主細胞を培養すること；および融合タンパク質を単離することを含む、本明細書に記載の任意の態様による融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）を作製する方法を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の任意の態様の単離融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を含有するキットを提供する。
【００１９】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）は、ＣＤ４０に結合し、それを活性化させる（例えば、ＣＤ４０アゴニスト）。種々の実施形態において、ｓｃＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０Ｌホモ三量体にフォールドする。種々の実施形態において、単離融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）は、二量体である。種々の実施形態において、ＣＤ４０ＬサブユニットとＦｃ単量体との比は、３：１である。種々の実施形態において、単離融合タンパク質は、約２１℃以上における少なくとも３日間の約１０％未満の凝集率を有する。種々の実施形態において、単離融合タンパク質は、約２１℃における少なくとも７日間以上の約１％未満の凝集率を有する。
【００２０】
ある実施形態において、単離融合タンパク質は、約４５℃における少なくとも３日間以上の約１０％未満の凝集率を有する。
【００２１】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質またはＣＤ４０Ｌサブユニットは、
【化４】
2019523636.tif 000005
と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２２】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、１つ以上のＣＤ４０Ｌサブユニットは、７４位におけるＴｒｐ残基（例えば、全長膜結合ＣＤ４０Ｌの１９４位におけるＣ→Ｗ置換に対応する）を有する。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、１つ以上のＣＤ４０Ｌサブユニットは、ヒトＣＤ４０Ｌ配列を有する。
【００２３】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、ｓｃＣＤ４０Ｌは、Ｆｃ単量体のＮ末端またはＣ末端に結合している。ある実施形態において、Ｆｃ単量体は、ヒンジ領域を含有する。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、Ｆｃ単量体は、ヒトＦｃ配列（例えば、ＩｇＧ４アミノ酸配列）を含む。
【００２４】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、ＣＤ４０Ｌサブユニット、またはその断片に共有結合しているペプチドリンカーは、約９〜約２０アミノ酸を含有する。
【００２５】
ある実施形態において、ＣＤ４０Ｌサブユニット、またはその断片に共有結合しているペプチドリンカーは、約９〜約１５アミノ酸を含有する。特定の実施形態において、ＣＤ４０Ｌサブユニット、またはその断片に共有結合しているペプチドリンカーは、９アミノ酸を含有する。
【００２６】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、ペプチドリンカーは、１つ以上のグリシン（Ｇｌｙ）またはセリン（Ｓｅｒ）アミノ酸残基を含有する。種々の実施形態において、ＣＤ４０Ｌサブユニット間のリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号５）（式中、ｎは、２、３、および４から選択される正の整数である）；（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号６）（式中、ｎは、３、４、および５から選択される）；Ｇｌｙ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号７）（式中、ｎは、２、３、および４から選択される）；またはＧｌｙ（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）ｎ（配列番号８）（式中、ｎは、３、４、５、および６から選択される）である。特定の実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２）である。
【００２７】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）は、アミノ酸配列：
【化５】
2019523636.tif 000006
【化６】
2019523636.tif 000007
または
【化７】
2019523636.tif 000008
を含有する。
【００２８】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、融合タンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質）は、最大６つのＣＤ４０ポリペプチドに結合する。種々の実施形態において、ＣＤ４０ポリペプチドは、細胞上に存在する。種々の実施形態において、細胞は、ＣＤ４０ポリペプチドを発現する。ある実施形態において、細胞は、抗原提示細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、または樹状細胞である。種々の実施形態において、細胞は、対象中に存在する。ある実施形態において、対象は、癌を有する。
【００２９】
本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４アンタゴニストを含む。種々の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、抗体である。ある実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、デュルバルマブである。ある実施形態において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、トレメリムマブである。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、免疫応答および／または抗癌応答を向上させる。本明細書に記載の任意の態様の種々の実施形態において、腫瘍微小環境の免疫抑制を低減させる。
【００３０】
定義
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。以下の参照文献は、当業者に本発明において使用される用語の多くの一般的定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書において使用される以下の用語は、特に規定のない限り、以下においてそれらに属する意味を有する。
【００３１】
「抗腫瘍活性」は、腫瘍細胞の増殖または生存を低減させ、または安定化させる任意の生物学的活性を意味する。一実施形態において、抗腫瘍活性は、抗腫瘍免疫応答である。
【００３２】
「免疫調節剤」は、免疫応答（例えば、抗腫瘍免疫応答）を向上させる薬剤を意味する。本発明の例示的な免疫調節剤としては、抗体、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、およびその断片、ならびにタンパク質、例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質、またはその断片が挙げられる。
【００３３】
「ＣＤ４０Ｌポリペプチド」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００００６５と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＣＤ４０結合活性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。用語「ＣＤ４０Ｌ」は、全長ＣＤ４０Ｌおよび可溶性断片、例えば、タンパク質分解から生じるＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン形態、ならびにＣＤ４０Ｌの単量体形態およびオリゴマー形態、例えば、三量体ＣＤ４０Ｌの両方を指す。ヒトＣＤ４０Ｌの膜結合および可溶性形態のアミノ酸配列を以下に示す：
ＣＤ４０Ｌ  ｓｐ｜Ｐ２９９６５｜ＣＤ４０Ｌ＿ヒト−膜結合形態（配列番号１２）
細胞質ドメイン＝１−２０；シグナルアンカーＩＩ型膜タンパク質領域＝２１−４６；可溶性形態＝１１３−２６１
【化８】
2019523636.tif 000009
ＣＤ４０Ｌ−可溶性形態（配列番号１３）
【化９】
2019523636.tif 000010
【００３４】
「ＣＤ４０Ｌ核酸分子」は、ＣＤ４０Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的ＣＤ４０Ｌ核酸分子配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００００７４において提供される。
【００３５】
「ＣＤ４０ポリペプチド」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２４１と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＣＤ４０Ｌ結合活性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。例示的なＣＤ４０アミノ酸配列は、以下に提供される（配列番号１４）：
【化１０】
2019523636.tif 000011
【００３６】
「ＣＤ４０核酸分子」は、ＣＤ４０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＣＤ４０核酸分子配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２５０において提供される。
【００３７】
「ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２５４６３５と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＰＤ−１およびＣＤ８０結合活性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。例示的なＰＤ−Ｌ１アミノ酸配列は、以下に提供される（配列番号１５）：
【化１１】
2019523636.tif 000012
【００３８】
「ＰＤ−Ｌ１核酸分子」は、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的ＰＤ−Ｌ１な核酸分子配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２６７７０６において提供される。
【００３９】
「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」は、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを選択的に結合する抗体を意味する。例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３００３４５５９号明細書／米国特許第８７７９１０８号明細書および米国特許出願公開第２０１４０３５６３５３号明細書において記載されている。デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）は、例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）およびＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。
【００４０】
デュルバルマブＶＬ（配列番号１６）
【化１２】
2019523636.tif 000013
【００４１】
デュルバルマブＶＨ（配列番号１７）
【化１３】
2019523636.tif 000014
【００４２】
デュルバルマブＶＨ  ＣＤＲ１（配列番号１８）
ＧＦＴＦＳＲＹＷＭＳ
【００４３】
デュルバルマブＶＨ  ＣＤＲ２（配列番号１９）
ＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ
【００４４】
デュルバルマブＶＨ  ＣＤＲ３（配列番号２０）
ＥＧＧＷＦＧＥＬＡＦＤＹ
【００４５】
デュルバルマブＶＬ  ＣＤＲ１（配列番号２１）
ＲＡＳＱＲＶＳＳＳＹＬＡ
【００４６】
デュルバルマブＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号２２）
ＤＡＳＳＲＡＴ
【００４７】
デュルバルマブＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号２３）
ＱＱＹＧＳＬＰＷＴ
【００４８】
「ＰＤ−１ポリペプチド」は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５００９と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、ＰＤ−Ｌ１結合活性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。例示的なＰＤ−１アミノ酸配列は、以下に提供される（配列番号２４）：
【化１４】
2019523636.tif 000015
【００４９】
「ＰＤ−１核酸分子」は、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＰＤ−１核酸分子配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５０１８において提供される。
【００５０】
「ＣＴＬＡ−４ポリペプチド」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ０７４７３．１と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有し、Ｔ細胞阻害活性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。例示的なＣＴＬＡ−４アミノ酸配列は、以下に提供される（配列番号２５）：
【化１５】
2019523636.tif 000016
【００５１】
「ＣＴＬＡ−４核酸分子」は、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＣＴＬＡ−４核酸分子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４１２０．１において提供される。
【００５２】
「抗ＣＴＬＡ−４抗体」は、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドに選択的に結合する抗体を意味する。例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６８２，７３６号明細書；同第７，１０９，００３号明細書；同第７，１２３，２８１号明細書；同第７，４１１，０５７号明細書；同第７，８２４，６７９号明細書；同第８，１４３，３７９号明細書；同第７，８０７，７９７号明細書；および同第８，４９１，８９５号明細書（トレメリムマブは、その中で１１．２．１である）において記載されている。トレメリムマブは、例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体である。トレメリムマブ配列は、以下に提供される。
【００５３】
トレメリムマブ  米国特許第６，６８２，７３６号明細書
【００５４】
トレメリムマブＶＬ（配列番号２６）
【化１６】
2019523636.tif 000017
【００５５】
トレメリムマブＶＨ（配列番号２７）
【化１７】
2019523636.tif 000018
【００５６】
トレメリムマブＶＨ  ＣＤＲ１（配列番号２８）
ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ
【００５７】
トレメリムマブＶＨ  ＣＤＲ２（配列番号２９）
ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶ
【００５８】
トレメリムマブＶＨ  ＣＤＲ３（配列番号３０）
ＤＰＲＧＡＴＬＹＹＹＹＹＧＭＤＶ
【００５９】
トレメリムマブＶＬ  ＣＤＲ１（配列番号３１）
ＲＡＳＱＳＩＮＳＹＬＤ
【００６０】
トレメリムマブＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号３２）
ＡＡＳＳＬＱＳ
【００６１】
トレメリムマブＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号３３）
ＱＱＹＹＳＴＰＦＴ
【００６２】
本開示において使用される用語「抗体」は、インビトロで産生されるかインビボで産生されるかにかかわらず、免疫グロブリンまたはその断片もしくは誘導体を指し、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。この用語は、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的、多特異的、非特異的、ヒト化、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、およびグラフト抗体を含む。「インタクト抗体」におけるように用語「インタクト」により特に修飾されない限り、本開示の目的のため、用語「抗体」は、抗原結合機能、すなわち、例えば、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、および他の抗体断片も含む。典型的には、このような断片は、抗原結合ドメインを含む。
【００６３】
用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合断片」、および「結合断片」は、抗体および抗原間の特異的結合を担うアミノ酸を含む抗体分子の一部を指す。抗原が大型である例において、抗原結合ドメインは、抗原の一部にのみ結合し得る。抗原結合ドメインとの特異的相互作用を担う抗原分子の一部は、「エピトープ」または「抗原決定基」と称される。抗原結合ドメインは、典型的には抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むが、必ずしも、その両方を含まなければならないわけでない。例えば、いわゆるＦｄ抗体断片は、ＶＨドメインからのみなるが、依然として、インタクト抗体のいくらかの抗原結合機能を保持する。
【００６４】
抗体の結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクト抗体の酵素的もしくは化学的開裂により産生される。結合断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖抗体が挙げられる。「二重特異的」または「二機能性」抗体以外の抗体は、同一のその結合部位のそれぞれを有すると理解される。酵素パパインによる抗体の消化は、「Ｆａｂ」断片としても公知の２つの同一の抗原結合断片、および抗原結合活性を有さないが、結晶化能を有する「Ｆｃ」断片をもたらす。酵素ペプシンによる抗体の消化は、抗体分子の２つのアームが依然として結合したままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原の架橋能を有する。本明細書において使用される「Ｆｖ」は、抗原認識部位および抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小断片を指す。本明細書において使用される「Ｆａｂ」は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のＣＨＩドメインを含む抗体の断片を指す。
【００６５】
用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体を指す。本発明の抗体は、限定されるものではないが、全天然抗体、二重特異的抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチド、および非慣用抗体を含む。
【００６６】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する」および「有する」などは、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有し得、「挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得；「〜から本質的になる」または「本質的になる」は、同様に、米国特許法において帰属する意味を有し、その用語は、無制約であり、記述される基礎的または新規特徴が記述されるそれを超える存在により変化しない限り、記述されるそれを超える存在を許容するが、先行技術の実施形態を除外する。
【００６７】
本明細書において使用される用語「測定する」、「評価する」、「アッセイする」、「計測する」および「検出する」は、定量および定性的測定の両方を指し、したがって、用語「測定する」は、「アッセイする」、「計測する」などと本明細書において互換的に使用される。定量的測定が意図される場合、分析物の「量を測定する」という語句などが使用される。定性的および／または定量的測定が意図される場合、分析物の「レベルを測定する」または分析物を「検出する」という語句が使用される。
【００６８】
本明細書において使用される用語「Ｆｃドメイン」ドメインは、抗体定常領域の一部を指す。慣習的に、用語Ｆｃドメインは、抗体のペアになったＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域を包含するプロテアーゼ（例えば、パパイン）開裂産物を指す。本開示に関して、用語ＦｃドメインまたはＦｃは、産生の手段にかかわらず、免疫グロブリンポリペプチドのＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域の全部または一部を含む任意のポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）を指す。
【００６９】
「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」は、同一のポリペプチド中に天然には存在しない２つ以上の異なるポリペプチドまたはその活性断片を含むポリペプチドを意味する。種々の実施形態において、２つ以上の異なるポリペプチドは、一緒に作動可能に共有結合しており、例えば、化学結合またはペプチド結合もしくはペプチドリンカーによりインフレームで融合している。
【００７０】
２つ以上の核酸またはポリペプチドに関する用語「同一」または「同一性」パーセントは、配列同一性の一部としていかなる保存アミノ酸置換も考慮せずに最大対応について比較およびアライン（必要に応じてギャップを導入）して同一であり、または同一である規定の割合のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または下位配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視調査により計測することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用することができる種々のアルゴリズムおよびソフトウェアは、当分野において公知である（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：５８７３−５８７７において修正され、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）に組み込まれるＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２２６４−２２６８参照。ある実施形態において、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載のとおり使用することができる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用することができる。
【００７１】
用語「単離」は、その天然環境中に存在する他の要素を実質的に有さない分子を指す。例えば、単離タンパク質は、それが由来する細胞または組織資源からの細胞材料も他のタンパク質も実質的に有さない。用語「単離」は、単離タンパク質が医薬組成物として投与することができるほど十分に純粋であり、または少なくとも７０〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、より好ましくは、少なくとも８０〜９０％（ｗ／ｗ）純粋、いっそうより好ましくは、９０〜９５％純粋；最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）純粋である調製物も指す。
【００７２】
「参照」は、比較標準を意味する。
【００７３】
「特異的に結合する」は、試料、例えば、生物学的試料中の分子（例えば、ＣＤ４０ポリペプチド）を認識し、それに結合するが、他の分子を実質的に認識せず、それに結合しない薬剤（例えば、ＣＤ４０Ｌ）を意味する。例えば、特異的に結合する２つの分子は、生理学的条件下で比較的安定である複合体を形成する。特異的結合は、高い親和性および低から中程度のキャパシティを特徴とし、それは通常、中程度から高いキャパシティで低い親和性を有する非特異的結合と区別される。
【００７４】
「対象」は、哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコを意味する。
【００７５】
本明細書において提供される範囲は、その範囲内の値の全てについての短縮形であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または下位範囲を含むと理解される。
【００７６】
本明細書において使用される用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療」などは、障害および／またはそれに伴う症状の低減または改善を指す。除外されるものではないが、障害または病態の治療は、その障害、病態またはそれに伴う症状が完全に消散することを要求しないことが認識される。
【００７７】
特に記述されない限り、または文脈から明らかでない場合、本明細書において使用される用語「または」は、包括的であることが理解される。特に記述されない限り、または文脈から明らかでない場合、本明細書において使用される用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、単数形または複数形であることが理解される。
【００７８】
さらに、本明細書において使用される「および／または」は、他方を含め、または含めない、２つの規定の特徴部または構成要素のそれぞれの具体的開示と解釈すべきである。したがって、本明細書の語句、例えば、「Ａおよび／またはＢ」において使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、語句、例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」において使用される用語「および／または」は、以下の実施形態のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
【００７９】
特に記述のない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される用語「約」は、当分野における通常の許容範囲内、例えば、平均値の２標準偏差内として理解される。約は、記述値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％，または０．０１％内として理解することができる。特に文脈から明確でない限り、本明細書において提供される全ての数値は、約という用語により修飾される。
【００８０】
本明細書における可変部の任意の定義中の化学基の列記の記述は、列記される基の任意の単一基または組合せとしてのその可変部の定義を含む。本明細書における可変部または態様についての実施形態の記述は、任意の単一実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せのその実施形態を含む。
【００８１】
本明細書において提供される任意の組成物または方法は、本明細書において提供される他の組成物および方法のいずれかの１つ以上と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ヒトアミノ酸配列を含む本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の略図を示す。示されるとおり、ＭＥＤＩ５０８３  ＣＤ４０Ｌ−ＦＰは、３×ＣＤ４０Ｌサブユニットの単鎖融合物＋ＩｇＧ４ＰＦｃ（１４８ｋＤａ）、９−ＧｌｙＳｅｒリンカー領域、および開発用に突然変異させた残基１９４（非対合Ｃｙｓ）を含む。サブユニット間リンカー：配列番号２。
【図２】１日目（上段左）、３日目（上段右）、および７日目（下段左）における４５℃におけるＣ１９４Ｗ置換（全長膜結合ＣＤ４０Ｌアミノ酸配列に対する）を含むＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質ｓｃＣＤ４０Ｌ−ＩｇＧ４Ｐ−ＦＰ７についての安定性データを示す一連の代表的な高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）のクロマトグラムである。
【図３】ＮＦκＢルシフェラーゼアッセイにより計測されたＭＥＤＩ５０８３の安定性試料生物活性を示すグラフである。
【図４】ＨｕＣＤ４０  ２９３ＨＥＫ  ＮＦκＢ  ｃ３細胞モデル中のＭＥＤＩ５０８３およびヒトＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照と参照されるＣＤ４０Ｌ−ＦＰ７の生物活性評価を示すグラフである。
【図５】Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ  ＮＦκＢ／ＡＰ−１  Ｂ細胞細胞モデル中のＭＥＤＩ５０８３およびヒトＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照と参照されるＣＤ４０Ｌ−ＦＰ７の生物活性評価を示すグラフである。
【図６】ＭＥＤＩ５０８３がヒトプライマリーＢ細胞増殖を刺激したことを示すグラフである。
【図７】ＭＥＤＩ５０８３がヒト単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）を活性させ、成熟させたことを示すグラフのセットである。活性化は、マーカーＣＤ８０（上段左）、ＣＤ８３（上段中央）、およびＣＤ８６（上段右）の増加により示された。成熟は、マーカーＨＬＡ−ＡＢＣ（下段左）およびＨＬＡ−ＤＲ（下段中央）の増加により示された。
【図８】ＭＥＤＩ５０８３が、ヒト単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）中でＴｈ１サイトカイン／ケモカイン応答を誘導したことを示すグラフのセットである。ＩＬ１２ｐ７０（上段左）、ＩＦＮγ（上段中央）、ＴＮＦ−α（上段右）、ＩＬ−８（下段中央）、およびＩＬ−１０（下段右）の分泌の増加を示す。ＩＬ−１β（下段左）の分泌の増加は観察されなかった。
【図９】ＭＥＤＩ５０８３がｍＤＣ活性化および成熟を介して用量依存的にＴ細胞増殖をドライブしたことを示す蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムのセットである。ヒトＣＤ４＋（上段行）およびＣＤ８＋（中段行）リンパ球のインビトロ増殖を、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）希釈を用いるフローサイトメトリーによりモニタリングした。
【図１０】ＭＥＤＩ５０８３がヒト抑制性（Ｍ２）：刺激性（Ｍ１）マクロファージ比を、免疫刺激表現型にシフトさせたことを示すグラフのセットである。
【図１１】ヒト単球由来マクロファージＭ１／Ｍ２分極化を示すグラフのセットである。
【図１２】ＭＥＤＩ５０８３がヒトＣＤ４０について高度に特異的であることを示すグラフである。
【図１３】マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰが低応答腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍活性を有したことを示す一連のグラフである。それぞれの処理群からの平均腫瘍容積を左側にプロットし、個々のマウスの応答をグラフ上で右側にプロットする。
【図１４】Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍モデルにおけるマウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰのα−ＰＤ−Ｌ１との組合せの抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図１５】Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍モデルにおけるマウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰのα−ＰＤ−Ｌ１との組合せの抗腫瘍活性を示す一連のグラフである。個々のマウスの応答をグラフ上にプロットする。
【図１６】Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍モデルにおけるマウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰのα−ＣＴＬＡ−４との組合せの抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図１７】Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍モデルにおけるマウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰのα−ＣＴＬＡ−４との組合せの抗腫瘍活性を示す一連のグラフである。個々のマウスの応答をグラフ上にプロットする。
【図１８】マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰのα−ＰＤ−Ｌ１との組合せがＢ１６−Ｆ１０腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を停止させたことを示すグラフである。
【図１９】マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰのα−ＰＤ−Ｌ１およびα−ＣＴＬＡ４の１つ以上との組合せの抗腫瘍活性を示す一連のグラフである。
【図２０】Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍モデルにおけるマウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰのα−ＰＤ−１との組合せの抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図２１】Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍モデルにおけるマウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰのα−ＰＤ−１との組合せの抗腫瘍活性を示す一連のグラフである。個々のマウスの応答をグラフ上にプロットする。
【図２２】マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰがＢ１６−Ｆ１０腫瘍モデルにおいて血清サイトカイン／ケモカイン分泌を誘導したことを示す一連のグラフである。ＩＦＮγ（上段左）、ＴＮＦ−α（上段右）、ＩＬ１２（下段左）およびＫＣ／ＧＲＯ（下段右）のレベル増加は、２回目の投与（Ｔ１）の２４時間後に観察された。
【図２３】マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰがＢ１６−Ｆ１０腫瘍モデルにおいて血清サイトカイン／ケモカイン分泌を誘導したことを示す一連のグラフである。ＩＦＮγ（上段左）、ＴＮＦ−α（上段右）、ＩＬ１２（下段左）およびＫＣ／ＧＲＯ（下段右）のレベル増加は、４回目の投与（Ｔ２）の２４時間後に観察された。
【図２４】マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰがマウスにおいて腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化およびＰＤ−Ｌ１発現を増加させたことを示す一連のグラフである。
【図２５】マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰがマウスにおいて脾臓骨髄細胞成熟およびＢ細胞活性化をドライブしたことを示すグラフである。
【図２６】マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ−ＦＰがマウスにおいてＴＨ１サイトカインおよびＣＸＣＬ−１ケモカイン分泌を誘導したことを示す一連のグラフである。
【図２７】サルにおけるＭＥＤＩ５０８３単回投与後のＢ細胞活性化およびトラフィッキングを説明するための薬物動態および薬力学（ＰＫ−ＰＤ）モデルを示す一連のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
本発明は、３つのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）およびＦｃポリペプチドを含む融合タンパク質（ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ）を特徴とする。一態様において、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して結合している３つのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）サブユニットの単鎖融合物およびＦｃ単量体を含む。ＣＤ４０Ｌサブユニット間の９アミノ酸以上の長さを有するペプチドリンカーが、安定性を保持し、および／またはそのような融合タンパク質の凝集を引き起こさないことが見出された。これは、８アミノ酸長を超えるペプチドリンカーを介して結合している場合に凝集する傾向がある他のＴＮＦファミリーリガンドと対照的である。したがって、本発明は、少なくとも部分的にはそれらの発見に基づく。
【００８４】
本発明はまた、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＭＥＤＩ５０８３）を含む、癌の治療に有用な組成物および方法を特徴とする。種々の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＭＥＤＩ５０８３）は、免疫チェックポイント阻害剤、例として、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の１つ以上との組合せで投与する。本明細書において以下に報告されるとおり、それらの薬剤による処理はマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍容積を低減させ、および／または腫瘍成長を遅延させた。
【００８５】
ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質
本発明は、ペプチドリンカーを介して互いに共有結合している３つのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）サブユニット、またはその断片の単鎖融合物（ｓｃＣＤ４０Ｌ）およびペプチドリンカーを介してｓｃＣＤ４０Ｌに共有結合しているＦｃ単量体を含むＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。種々の態様において、融合タンパク質の３つのＣＤ４０Ｌサブユニットは、ペプチドリンカーがあるＣＤ４０ＬサブユニットのＣ末端を別のＣＤ４０ＬサブユニットのＮ末端に連結するように配列している。したがって、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ペプチドリンカーを介して第２のＣＤ４０ＬサブユニットのＮ末端に連結している第１のＣＤ４０ＬサブユニットのＣ末端および第３のＣＤ４０ＬサブユニットのＮ末端に連結している第２のＣＤ４０ＬサブユニットのＣ末端を含む一部分を含む。種々の実施形態において、３つのＣＤ４０Ｌサブユニットの単鎖融合物は、Ｃ末端またはＮ末端においてペプチドリンカーを介してＦｃポリペプチドに連結している。すなわち、ＦｃポリペプチドのＮ末端のＮ末端は、３つのＣＤ４０Ｌサブユニットの単鎖融合物の第３のＣＤ４０ＬサブユニットのＣ末端に連結しており、またはＦｃポリペプチドのＣ末端は、３つのＣＤ４０Ｌサブユニットの単鎖融合物の第１のＣＤ４０ＬサブユニットのＮ末端に連結している。
【００８６】
ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４、ＣＤ４０リガンド、ｇｐ３９またはＴＢＡＭとしても公知）は、３３ｋＤａのＩＩ型膜糖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９９６５）である。さらに、より短い１８ｋＤａのＣＤ４０Ｌ可溶性形態が存在する（ｓＣＤ４０Ｌまたは可溶性ＣＤ４０Ｌとしても公知）。ＣＤ４０Ｌのこれらの可溶性形態は、膜結合タンパク質のタンパク質分解プロセシングにより生成されるが、可溶性種の細胞活性は、より高次のオリゴマー化（例えば、三量体化）の不存在下で弱い。ＣＤ４０ＬはＣＤ４０に結合し、それを活性化させる。種々の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＤ４０Ｌ三量体に自己集合する３つのＣＤ４０Ｌサブユニットの領域を含む。一態様において、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＤ４０に結合し、少なくとも１つのＣＤ４０媒介活性を刺激し得る多量体形態に集合する。種々の実施形態において、ＣＤ４０Ｌサブユニットは、ヒトＣＤ４０Ｌからのアミノ酸配列を有する。追加のＣＤ４０Ｌホモログとしては、マウス、ニワトリ、アカゲザル、カニクイザル、ラット、およびウサギからのものが挙げられる。ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質中のＣＤ４０Ｌサブユニットの組合せは、ホモ型でもヘテロ型でもよい。一部の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質中の全てのＣＤ４０Ｌサブユニットのアミノ酸配列は、同一である。他の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質中のＣＤ４０Ｌサブユニットの少なくとも２つのアミノ酸配列は、異なる。
【００８７】
本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、抗体（例えば、ＩｇＧ）のドメインまたは断片、例として、限定されるものではないが、Ｆｃドメインに融合しているＣＤ４０Ｌ三量体を含む。具体的な実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃドメインに融合しているＣＤ４０Ｌ三量体を含む。一部の実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃドメインを介して二量体化する。ある実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｃドメインのアミノ酸配列を有する。ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｃは、２２８位（ＥＵナンバリングに従う）におけるヒンジ領域中のセリン−プロリン置換を含有するＩｇＧ４断片結晶化可能ガンマ（Ｆｃγ）ドメインである。ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｃ中のセリン−プロリン置換は安定性を促進し、完全な重鎖間ジスルフィド結合形成を付与し、および／または「半抗体交換（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）」を介して二量体の組換えを防止する（Ｎｉｒｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２３（１）：１１９−１２４；．Ａａｌｂｅｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ３９（４）：４６９−４７７）。特定の実施形態において、ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｃドメインのアミノ酸配列は、ヒト配列である。Ｆｃ領域のバリアント（例えば、アミノ酸置換および／または付加および／または欠失）が、抗体のエフェクター機能を向上または縮小させることは当分野において公知である。したがって、ある実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の機能的特性を変化させるためのＦｃ領域中で作製された１つ以上の変更を有するＦｃドメインを含む。ある実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、少なくとも１つのＦｃγＲ媒介エフェクター機能を低減または排除させるためのＦｃ領域中で作製された１つ以上の変更を有するＦｃドメインを含む。
【００８８】
種々の態様において、本開示は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスによりナンバリングされる２２８および２３５からなる群から選択される１つ以上の位置における少なくとも１つの改変を含むＩｇＧ４  Ｆｃを有するＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。さらに別の具体的な態様において、Ｆｃ領域はＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、バリアントアミノ酸は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスによりナンバリングされる２２８Ｐ、２３５Ｅおよび２３５Ｙの１つ以上である。
【００８９】
本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質中のＣＤ４０ＬサブユニットおよびＦｃポリペプチドは、ポリペプチドリンカーにより連結しており、それぞれのリンカーは、少なくとも２つのポリペプチドまたはサブユニットに融合している。ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質中のリンカーの組合せは、ホモ型でもヘテロ型でもよい。一部の実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質中に存在する全てのペプチドリンカーのアミノ酸配列は、同一である。他の実施形態において、本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質中に存在するペプチドリンカーの少なくとも２つのアミノ酸配列は、異なる。リンカーポリペプチドは、２つ以上の単量体サブユニットを、それらが所望の活性を保持するようにそれらが互いに対して正確な立体構造を取るように結合させるために適切な長さを有するべきである。新規結合融合ポリペプチド中にポリペプチドを連結するための天然存在および人工ペプチドリンカーの使用は、文献において周知である。したがって、２つ以上の単量体サブユニットを融合するリンカーは、天然リンカー、人工リンカー、またはその組合せである。
【００９０】
本明細書に記載のとおり、ＣＤ４０Ｌサブユニット間の９アミノ酸以上の長さを有するペプチドリンカーが、そのような融合タンパク質の安定性を保持し、および／またはその凝集を引き起こさなかったことが見出された。したがって、ポリペプチドリンカーは、９〜約２０アミノ酸残基、９〜約１５アミノ酸残基、または９アミノ酸残基を含む。ポリペプチドリンカー中の包含のために選択されるアミノ酸残基は、本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の活性も機能も顕著に干渉しない特性を示すべきである。したがって、ポリペプチドリンカーは、全体的に見ると、本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の活性または機能と不一致の電荷を示すべきでなく、内部フォールディングを干渉すべきでなく、結合を深刻に妨害する単量体サブユニットの１つ以上の中のアミノ酸残基との結合または他の相互作用を形成すべきでもない。
【００９１】
種々の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、立体構造的フレキシビリティを保有する。好適なフレキシブルリンカーとしては、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基の組合せ（ＧｌｙとＳｅｒとの比は、≧１である）を有するものが挙げられる。一部の実施形態において、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｘ）ｎ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含み、Ｘは、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）またはバリン（Ｖ）であり、ｎは、正の整数である。ある実施形態において、ポリペプチドリンカー配列は、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）ｎ（配列番号６）、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）ｎ（配列番号５）、Ｇ（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ）ｎ（配列番号７）、（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ）ｎ（配列番号３５）、または（Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ）ｎ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含み、ｎは、正の整数である。一部の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、本質的に非構造化の天然または人工ポリペプチド（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６−１１９０，２００９参照；Ｓｉｃｋｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：Ｄ７８６−９３，２００７も参照）である。
【００９２】
ある実施形態において、ＣＤ４０Ｌサブユニット間のリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号５）（式中、ｎは、２、３、および４から選択される正の整数である）；（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号６）（式中、ｎは、３、４、および５から選択される）；Ｇｌｙ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号７）（式中、ｎは、２、３、および４から選択される）；またはＧｌｙ（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）ｎ（配列番号８）（式中、ｎは、３、４、５、および６から選択される）である。ある実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２）である。
【００９３】
ある実施形態において、ＣＤ４０Ｌ  Ｆｃ融合タンパク質は、単鎖融合物であって、Ｎ末端からＣ末端に向かって、アミノ酸配列：
【化１８】
2019523636.tif 000019
を含む第１のＣＤ４０Ｌサブユニットを含み、
アミノ酸配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２）
を有する第１のペプチドリンカーに共有結合しており、
アミノ酸配列：
【化１９】
2019523636.tif 000020
を有する第２のＣＤ４０Ｌサブユニットに共有結合しており、
アミノ酸配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２）
を有する第２のペプチドリンカーに共有結合しており、
アミノ酸配列：
【化２０】
2019523636.tif 000021
を有する第３のＣＤ４０Ｌサブユニットに共有結合しており、
アミノ酸配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４）
を有する第３のペプチドリンカーに共有結合している単鎖融合物を含有し、
Ｆｃポリペプチドに共有結合している。
【００９４】
特定の実施形態において、ＣＤ４０Ｌ  Ｆｃ融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列の１つを含み、またはそれからなる：
【化２１】
2019523636.tif 000022
【化２２】
2019523636.tif 000023
または
【化２３】
2019523636.tif 000024
【００９５】
抗腫瘍療法
本明細書において、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＭＥＤＩ５０８３）を単独で、または免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／または抗ＰＤ−１抗体、またはそれらの抗原結合断片）との組合せで投与することを含む、癌を治療する方法が提供される。本明細書において示されるとおり、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＭＥＤＩ５０８３）を単独で、または抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＰＤ−１抗体との組合せで投与することは、マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍容積の低減をもたらした。ある態様において、固形腫瘍を呈する患者に、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＭＥＤＩ５０８３）を単独で、または抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＰＤ−１抗体との組合せで投与する。
【００９６】
癌療法による治療は、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＭＥＤＩ５０８３）単独、または抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＰＤ−１抗体との組合せを含み、例えば、癌の進行速度の低減、腫瘍成長の遅滞もしくは安定化、腫瘍の縮小、および／または腫瘍退縮を含む。一部の態様において、腫瘍成長の低減または遅滞は、統計的に有意であり得る。腫瘍成長の低減は、ベースラインにおける患者の腫瘍成長との比較により、予測腫瘍成長に対して、大きな患者集団に基づく予測腫瘍成長に対して、または対照集団の腫瘍成長に対して計測することができる。他の実施形態において、本発明の方法は、生存率を増加させる。
【００９７】
癌療法の施与に対する臨床応答は、臨床医に公知の診断技術、例として、限定されるものではないが、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャン、ｘ線イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析、組織診、肉眼所見および血液化学検査、例として、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびクロマトグラフィーにより検出可能な変化を使用して評価することができる。
【００９８】
Ｔ細胞調節経路
Ｔ細胞が、癌患者において疾患の初期および後期の両方で腫瘍成長および生存を制御するという山のような証拠が存在する。しかしながら、腫瘍特異的Ｔ細胞応答は、癌患者において増加および持続することが困難である。
【００９９】
顕著な注目を集めているＴ細胞調節経路は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２）およびプログラム細胞死リガンド１（Ｂ７Ｈ−１またはＣＤ２７４としても公知のＰＤ−Ｌ１）を介してシグナリングする。
【０１００】
ＣＴＬＡ−４は活性化Ｔ細胞上で発現され、ＣＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化後のチェック時におけるＴ細胞応答を維持するための共阻害因子として機能する。ＣＴＬＡ−４は、ＴＣＲエンゲージメント後の未感作および記憶Ｔ細胞の早期活性化の振幅を調節し、抗腫瘍免疫および自己免疫の両方に影響を及ぼす中心阻害経路の一部になると考えられる。ＣＴＬＡ−４はＴ細胞上で発現され、そのリガンドであるＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）の発現は、主として抗原提示細胞、Ｔ細胞および他の免疫媒介細胞に限定される。ＣＴＬＡ−４シグナリング経路を遮断する拮抗性抗ＣＴＬＡ−４抗体は、Ｔ細胞活性化を向上させると報告されている。１つのそのような抗体イピリムマブは、転移性黒色腫の治療のためにＦＤＡにより２０１１年に承認された。別の抗ＣＴＬＡ−４抗体であるトレメリムマブは、進行性黒色腫の治療について第ＩＩＩ相試験において試験されたが、その当時の標準治療（テモゾロミドまたはダカルバジン）と比較して患者の全生存率を有意には増加させなかった。
【０１０１】
ＰＤ−Ｌ１も、Ｔ細胞活性化の制御に関与する受容体およびリガンドの複合体系の一部である。正常組織において、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞、骨髄由来肥満細胞、および種々の非造血細胞上で発現される。その正常機能は、その２つの受容体：プログラム細胞死１（ＰＤ−１またはＣＤ２７９としても公知）およびＣＤ８０（Ｂ７−１またはＢ７．１としても公知）との相互作用を介してＴ細胞活性化と寛容との間の平衡を調節することである。ＰＤ−Ｌ１は腫瘍によっても発現され、腫瘍が宿主免疫系による検知および排除を回避するのに役立つように複数部位において作用する。ＰＤ−Ｌ１は、広範囲の癌において高頻度で発現される。一部の癌において、ＰＤ−Ｌ１の発現は、生存率の低減および不都合な予後に関連している。ＰＤ−Ｌ１とその受容体（例えば、ＰＤ−１）との間の相互作用を遮断する抗体は、ＰＤ−Ｌ１依存性免疫抑制効果を緩和し、インビトロでの抗腫瘍Ｔ細胞の細胞傷害性活性を向上させ得る。
【０１０２】
ＣＤ４０Ｌは、主として活性化Ｔ細胞（例として、Ｔｈ０、Ｔｈ１、およびＴｈ２サブタイプ）上で発現される分子のＴＮＦファミリー分子のメンバーであり、このファミリーの他のメンバーと同様にホモ三量体を形成する。さらに、ＣＤ４０Ｌは、肥満細胞、ならびに活性化好塩基球および好酸球上で発現されることも見出されている。ＣＤ４０Ｌは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でその受容体ＣＤ４０に結合し、標的細胞タイプに応じて多くの効果をもたらす。一般に、ＣＤ４０Ｌは共刺激分子の役割を担い、ＡＰＣ上のＭＨＣ分子によるＴ細胞受容体刺激に伴うＡＰＣ中での活性化を誘導する。
【０１０３】
ＣＤ４０Ｌによる受容体ＣＤ４０を介するシグナリングは、ＣＤ４０担持細胞の活性化および最適なＴ細胞プライミングをもたらすイベントのカスケードをイニシエートする。より具体的には、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との間のコグネート相互作用が、抗体分泌細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の分化を促進する（Ｂｕｒｋｌｙ，Ｉｎ  Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．，Ｖｏｌ．４８９．，Ｄ．Ｍ．Ｍｏｎｒｏｅ，Ｕ．Ｈｅｄｎｅｒ，Ｍ．Ｒ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ．Ｎｅｇｒｉｅｒ，Ｇ．Ｆ．Ｓａｖｉｄｇｅ，ａｎｄ  Ｇ．Ｃ．Ｉ．Ｗｈｉｔｅ，ｅｄｓ．Ｋｌｏｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００１，ｐ．１３５）。さらに、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との間の相互作用は、マクロファージおよび樹状細胞の活性化ならびにナチュラルキラー細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球の生成を介する細胞媒介免疫を促進する（Ｂｕｒｋｌｙ、前掲参照）。
【０１０４】
単鎖Ｆｃ融合タンパク質
本発明の単鎖ＣＤ４０Ｌ  Ｆｃ融合タンパク質は、安定性および生物活性を実証した。本明細書に記載のとおり、ＣＤ４０Ｌ安定性および活性は、少なくとも部分的に、本発明のＣＤ４０Ｌ  Ｆｃ融合タンパク質中で使用されるリンカーの長さに起因した。このことは、驚くべきことであり、予測されなかった。それというのも、８アミノ酸長を超えるペプチドリンカーを使用した場合、他のＴＮＦリガンドＦｃ融合タンパク質が生成されたが、凝集する傾向があったためである。本発明のＣＤ４０Ｌ  Ｆｃ融合タンパク質はまた、単鎖Ｆｃタンパク質の他の特徴部および利点を提供する。
【０１０５】
ＴＮＦリガンドファミリーの天然存在可溶性サイトカインメンバーが、ホモ三量体としてその生物活性を示すことは公知である。しかしながら、ＴＮＦリガンドの三量体複合体は、それらの単量体の解離を介して変性する傾向があり、組換え単量体単位から調製することが困難である。単量体へのホモ三量体の解離を防止するため、ＴＮＦリガンドの少なくとも３つの単量体を、ペプチドリンカーによりそれらのＣ末端およびＮ末端を介して互いに共有結合させて「単鎖（ｓｃ）」分子を形成させる。したがって、分子全体（２つのペプチドリンカーを有するＴＮＦリガンドファミリーのメンバーの少なくとも３つの単量体）は、単量体への解離がもはや生じ得ないように単一タンパク質ストランドからなる。
【０１０６】
さらに、本発明の単鎖融合タンパク質中におけるように、ＦｃドメインへのＴＮＦリガンドの融合を使用して二量体化三量体を得ることができる。可溶性ドメインの二量体化は、ジスルフィド架橋を介する２つのＦｃドメインの集合により達成される。細胞または隣接細胞上での単鎖ＴＮＦリガンドの局所濃縮は、それらの融合タンパク質生物活性を増加させる潜在性を有する。
【０１０７】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体
デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）は、ＰＤ−Ｌ１について選択的であり、ＰＤ−１およびＣＤ８０受容体へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断する例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。デュルバルマブは、インビトロでのヒトＴ細胞活性化のＰＤ−Ｌ１媒介抑制を緩和し得、Ｔ細胞依存性機序を介してゼノグラフトモデルにおける腫瘍成長を阻害する。
【０１０８】
本明細書において提供される方法において使用されるデュルバルマブ（またはその断片）に関する情報は、開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７９，１０８号明細書に見出すことができる。デュルバルマブの断片結晶化可能（Ｆｃ）ドメインは、補体成分Ｃ１ｑおよび抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）の媒介を担うＦｃγ受容体への結合を低減させるＩｇＧ１重鎖の定常ドメイン中の三重突然変異を含有する。
【０１０９】
本明細書において提供される方法において使用されるデュルバルマブおよびその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖または重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。具体的な態様において、本明細書において提供される方法において使用されるデュルバルマブまたはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。具体的な態様において、本明細書において提供される方法において使用されるデュルバルマブまたはその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、本明細書において上記に示されるＫａｂａｔ定義のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域は、本明細書において上記に示されるＫａｂａｔ定義のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。当業者は、当業者に公知のＣｈｏｔｈｉａ定義、Ａｂｍ定義または他のＣＤＲ定義を容易に識別することができる。具体的な態様において、本明細書において提供される方法において使用されるデュルバルマブまたはその抗原結合断片は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７９，１０８号明細書に開示される２．１４Ｈ９ＯＰＴ抗体の可変重鎖および可変軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０１１０】
抗ＣＴＬＡ−４抗体
ＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４活性を特異的に阻害する抗体は、抗腫瘍免疫応答の向上に有用である。本明細書において提供される方法において使用されるトレメリムマブ（またはその抗原結合断片）に関する情報は、開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，６８２，７３６号明細書（その中では１１．２．１と称される）に見出すことができる。トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６、ＣＰ−６７５、ＣＰ−６７５２０６およびチシリムマブとしても公知）は、ＣＴＬＡ−４について高度に選択性であり、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）へのＣＴＬＡ−４の結合を遮断するヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体である。トレメリムマブは、インビトロでの免疫活性化をもたらすことが示されており、トレメリムマブにより治療された一部の患者が腫瘍退縮を示している。
【０１１１】
本明細書において提供される方法において使用されるトレメリムマブは、重鎖および軽鎖または重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。具体的な態様において、本明細書において提供される方法において使用されるトレメリムマブまたはその抗原結合断片は、本明細書において上記で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および本明細書において上記で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。具体的な態様において、本明細書において提供される方法において使用されるトレメリムマブまたはその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、本明細書において上記で示されるＫａｂａｔ定義のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域は、本明細書において上記で示されるＫａｂａｔ定義のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。当業者は、当業者に公知のＣｈｏｔｈｉａ定義、Ａｂｍ定義または他のＣＤＲ定義を容易に識別することができる。具体的な態様において、本明細書において提供される方法において使用されるトレメリムマブまたはその抗原結合断片は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，６８２，７３６号明細書に開示される１１．２．１抗体の可変重鎖および可変軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０１１２】
他の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、米国特許出願公開第２００７０２４３１８４号明細書に記載されている。一実施形態において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＭＤＸ−０１０；ＢＭＳ−７３４０１６とも称されるイピリムマブである。
【０１１３】
抗体
ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１に選択的に結合し、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１の結合または活性化を阻害する抗体は、本発明の方法において有用である。
【０１１４】
一般に、抗体は、例えば、慣習的なハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９９）、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、または抗体、ライブラリーを用いて実施されるファージディスプレイ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７）を使用して作製することができる。他の抗体産生技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８も参照。本発明は、いずれかの特定の入手源、起源種、産生方法に限定されるものではない。
【０１１５】
免疫グロブリンとしても公知のインタクト抗体は、典型的にはそれぞれ約２５ｋＤａの２つの軽（Ｌ）鎖およびそれぞれ約５０ｋＤａの２つの重（Ｈ）鎖から構成される四量体グリコシル化タンパク質である。λ鎖およびκ鎖と命名されている２つのタイプの軽鎖が抗体中で見出される。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは５つの主要なクラス：Ａ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＭに割り当てることができ、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分類することができる。
【０１１６】
様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置が、当分野において周知である。抗体構造の総説については、Ｈａｒｌｏｗら、前掲参照。簡潔に述べると、それぞれの軽鎖は、１つのＮ末端可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）から構成される。それぞれの重鎖は、１つのＮ末端可変ドメイン（ＶＨ）、３または４つの定常ドメイン（ＣＨ）、および１つのヒンジ領域から構成される。ＶＨに最も近位のＣＨドメインは、ＣＨ１と命名されている。ＶＨおよびＶＬドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変配列の３つの領域についての足場を形成するフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）と呼ばれる比較的保存された配列の４つの領域からなる。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を担う残基のほとんどを含有する。３つのＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される。重鎖上のＣＤＲ構成成分はＨ１、Ｈ２およびＨ３と称される一方、軽鎖上のＣＤＲ構成成分はそれに合わせてＬ１、Ｌ２およびＬ３と称される。ＣＤＲ３、特にＨ３は、抗原結合ドメイン内の分子多様性の最大の起源である。例えば、Ｈ３は、２アミノ酸残基ほど短いこともあり、または２６アミノ酸残基を超えることもある。
【０１１７】
Ｆａｂ断片（抗原結合断片）は、定常領域間のジスルフィド結合により共有結合しているＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬドメインからなる。Ｆｖ中の非共有結合ＶＨおよびＶＬドメインが宿主細胞中で共発現された場合に解離する傾向を克服するため、いわゆる単鎖（ｓｃ）Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を構築することができる。ｓｃＦｖにおいては、フレキシブルであり、適切に長いポリペプチドはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に、またはＶＬのＣ末端をＶＨのＮ末端へ結合させる。最も一般的には１５残基（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドがリンカーとして使用されるが、他のリンカーも当分野において公知である。
【０１１８】
抗体多様性は、可変領域をコードする複数の生殖系列遺伝子のコンビナトリアルアセンブリおよび種々の体細胞イベントの結果である。体細胞イベントとしては、完全ＶＨ領域を作製するための多様性（Ｄ）を有する可変遺伝子セグメントと結合（Ｊ）遺伝子セグメントとの組換え、および完全ＶＬ領域を作製するための可変遺伝子および結合遺伝子セグメントの組換えが挙げられる。組換えプロセス自体は不正確であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部におけるアミノ酸の損失または付加をもたらす。これらの多様性の機序は、抗原曝露前に発達中のＢ細胞中で発生する。抗原刺激後、Ｂ細胞中で発現された抗体遺伝子は体細胞突然変異を受ける。
【０１１９】
生殖系列遺伝子セグメントの推定数、それらのセグメントのランダム組換えおよびランダムＶＨ−ＶＬ対合に基づくと、最大１．６×１０７個の異なる抗体が産生され得る（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３）。抗体多様性（例えば、体細胞突然変異）に寄与する他のプロセスを考慮した場合、１×１０１０よりも多くの異なる抗体が潜在的に生成され得ると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９５）。抗体多様性には多くのプロセスが関与するため、独立して生成された抗体がＣＤＲの同一またはさらには実質的に類似するアミノ酸配列を有する可能性は極めて低い。
【０１２０】
本明細書において、例示的な抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−Ｌ１  ＣＤＲの配列が提供される。ＣＤＲを担持するための構造は、一般に、ＣＤＲが天然存在ＶＨおよびＶＬのＣＤＲに対応する場所に位置する抗体重鎖または軽鎖またはその一部である。免疫グロブリン可変ドメインの構造および場所は、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１に記載のとおり決定することができる。
【０１２１】
本発明の抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−Ｌ１）は、抗体定常領域またはその一部を場合により含み得る。例えば、ＶＬドメインは、そのＣ末端においてヒトＣκまたはＣλ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに付着している場合がある。同様に、ＶＨドメインをベースとする特異的抗原結合ドメインは任意の抗体アイソトープ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭ、ならびにアイソトープサブクラス、例として、限定されるものではないが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部に付着している場合がある。
【０１２２】
当業者は、本発明の抗体は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１と若干異なるタンパク質を検出、計測および阻害するために使用することができることを認識する。抗体は、標的タンパク質が本明細書に記載の連続アミノ酸の少なくとも１００、８０、６０、４０または２０の任意の配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上同一である配列を含む限り、結合の特異性を保持すると予測される。同一性パーセントは、標準的なアラインメントアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７のアルゴリズムなどにより決定される。
【０１２３】
配列相同性分析に加えて、エピトープマッピング（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６参照）ならびに二次および三次構造分析を実施して、開示された抗体および抗原とのそれらの複合体により推定される特異的３Ｄ構造を同定することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、Ｘ線結晶構造解析（Ｅｎｇｓｔｏｍ（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，１１：７−１３）および本出願に開示の抗体の仮想表現のコンピュータモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）が挙げられる。
【０１２４】
誘導体
本発明のポリペプチド（例えば、ＣＤ４０Ｌ）および抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−Ｌ１）は、それらの標的に特異的に結合する能力を保持するそれらの配列のバリアントを含み得る。このようなバリアントは、当業者により当分野において周知の技術を使用してそれらのポリペプチドまたは抗体の配列から誘導することができる。例えば、アミノ酸置換、欠失または付加は、ＦＲ中および／またはＣＤＲ中で作製することができる。ＦＲ中の変化は通常、抗体の安定性および免疫原性を改善するために設計される一方、ＣＤＲ中の変化は典型的には抗体のその標的についての親和性を増加させるために設計される。ＦＲのバリアントとしては、天然存在免疫グロブリンアロタイプも挙げられる。このような親和性を増加させる変化は、ＣＤＲを変更し、抗体のその標的についての親和性を試験することを含む定型的技術によって実験的に測定することができる。例えば、保存的アミノ酸置換は、開示のＣＤＲのいずれか１つの中に作製することができる。種々の変更は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，１９９５に記載の方法に従って作製することができる。これらとしては、限定されるものではないが、配列内で機能的に同等のアミノ酸残基をコードし、したがって「サイレント」変化を産生する様々なコドンの置換により変更されるヌクレオチド配列が挙げられる。例えば、非極性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性天然アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【０１２５】
本発明のポリペプチドおよび／または抗体の誘導体およびアナログは、当分野において周知の種々の技術、例として、組換え法および合成法（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、およびＢｏｄａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により産生することができる。
【０１２６】
一実施形態において、本発明のＶＨドメインのアミノ酸配列バリアントであるＶＨドメインを作製する方法は、本明細書に開示のＶＨドメインのアミノ酸配列中で１つ以上のアミノ酸を付加し、欠失させ、置換し、または挿入するステップ、場合により、このように提供されたＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組み合わせるステップ、およびＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの１つもしくは複数の組合せを抗原への特異的結合について試験するステップを含む。本明細書に開示のＶＬドメインの１つ以上の配列バリアントを１つ以上のＶＨドメインと組み合わせる類似の方法を用いることができる。
【０１２７】
類似のシャッフリングまたはコンビナトリアル技術もＳｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：３８９−３９１）により開示されており、その著者はβ−ラクタマーゼ遺伝子に関連する技術について記載しているが、そのアプローチは抗体の生成に使用することができることを観察している。
【０１２８】
さらなる実施形態において、１つ以上の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を使用して本明細書に開示の配列に由来する１つ以上の配列を担持する新規なＶＨまたはＶＬ領域を生成することができる。１つのそのような技術であるエラープローンＰＣＲは、Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：３５７６−３５８０）により記載されている。
【０１２９】
使用することができる別の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲに突然変異誘発を指向することである。このような技術は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）９１：３８０９−３８１３）およびＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２６３：５５１−５６７）により開示されている。
【０１３０】
同様に、１つ以上、または３つ全てのＣＤＲは、ＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーにグラフトすることができ、これらは次いでＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ１について特異的な抗原結合断片についてスクリーニングされる。
【０１３１】
免疫グロブリン可変ドメインの一部は、本明細書に実質的に記載のＣＤＲの少なくとも１つ、および場合により、本明細書に記載のｓｃＦｖ断片からの介在フレームワーク領域を含む。この一部はＦＲ１およびＦＲ４のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含み得、その５０％はＦＲ１のＣ末端５０％およびＦＲ４のＮ末端５０％である。可変ドメインの実質的部分のＮ末端またはＣ末端における追加の残基は、通常、天然存在可変ドメイン領域に関連しない残基であり得る。例えば、組換えＤＮＡ技術による抗体の構築は、クローニングまたは他の操作ステップを容易にするために導入されたリンカーによりコードされるＮ末端またはＣ末端残基の導入をもたらし得る。他の操作ステップとしては、免疫グロブリン重鎖定常領域、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディの産生における）または下記でより詳細に考察されるタンパク性標識を含むさらなるタンパク質配列に可変ドメインを結合させるためのリンカーの導入が挙げられる。
【０１３２】
当業者は、本発明の抗体がＶＬまたはＶＨドメインのいずれかからの単一ＣＤＲのみを含有する抗原結合断片を含み得ることを認識する。単鎖特異的結合ドメインのいずれか１つは、例えば、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１に結合し得る２ドメイン特異的抗原結合断片を形成し得る相補的ドメインについてスクリーニングするために使用することができる。
【０１３３】
本明細書に記載の本発明の抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−Ｌ１）は、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（アルブミン、別の抗体など）に結合させることができる。例えば、抗体は、化学的架橋結合により、または組換え法により結合させることができる。抗体は、種々の非タンパク性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの１つに、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書；または同第４，１７９，３３７号明細書に記載の様式で結合させることもできる。抗体は、例えば、それらの循環半減期を増加させるためにポリマーへの共有結合コンジュゲーションにより化学的に修飾することができる。例示的なポリマーおよびそれらに付着させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６号明細書；同第４，１７９，３３７号明細書；同第４，４９５，２８５号明細書および同第４，６０９，５４６号明細書にも示されている。
【０１３４】
本明細書に開示の抗体は、天然パターンと異なるグリコシル化パターンを有するように変更することもできる。例えば、１つ以上の炭水化物部分を欠失させることができ、および／または１つ以上のグリコシル化部位を元の抗体に付加することができる。本明細書に開示の抗体へのグリコシル化部位の付加は、当分野において公知のグリコシル化部位コンセンサス配列を含有するようにアミノ酸配列を変更することにより達成することができる。抗体上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、抗体のアミノ酸残基へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによるものである。このような方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレット、およびＡｐｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：２５９−３０６に記載されている。抗体からの任意の炭水化物部分の除去は、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２；およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１ならびにＴｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０により記載されているとおり化学的または酵素的に達成することができる。抗体は、検出可能、または機能的標識によりタグ付けすることもできる。検出可能標識としては、慣用の化学反応を使用してさらに抗体に付着させることもできる放射性標識、例えば、１３１Ｉまたは９９Ｔｃが挙げられる。検出可能標識としては、酵素標識、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼも挙げられる。検出可能な標識としては、化学的部分、例えば、特異的コグネート検出可能部分、例えば、標識アビジンへの結合を介して検出することができるビオチンがさらに挙げられる。
【０１３５】
ＣＤＲ配列が本明細書に記載のＣＤＲ配列とごくわずかにのみ異なる抗体は、本発明の範囲内に包含される。典型的には、アミノ酸は、類似の電荷、疎水性、または立体化学的特徴を有する関連アミノ酸により置換される。このような置換は、当業者の通常の技能の範囲内である。ＣＤＲとは異なり、ＦＲには抗体の結合特性に有害な影響を及ぼすことなくより実質的な変化を作製することができる。ＦＲへの変化としては、限定されるものではないが、非ヒト由来物のヒト化または抗原接触もしくは結合部位の安定化に重要なあるフレームワーク残基の遺伝子操作、例えば、定常領域のクラスまたはサブクラスの変化、例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書および同第５，６４８，２６０号明細書ならびにＬｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７−２６６２およびＭｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９−３２４に記載のとおり、エフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体結合を変更させ得る規定のアミノ酸残基の変化、または定常領域が由来する種の変化が挙げられる。
【０１３６】
当業者は、上記の改変は全く排他的ではないこと、および多くの他の改変が本開示の教示に照らして当業者には明白であることを認識する。
【０１３７】
併用療法
本発明の組合せ、例えば、本明細書において提供されるとおり、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質単独、または免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／または抗ＰＤ−１抗体、またはそれらの抗原結合断片）との組合せを使用する固形腫瘍を有する患者の治療は、相加効果または相乗効果をもたらし得る。本明細書において使用される用語「相乗」は、治療物の組合せ（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＣＴＬＡ−４抗体、および抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せ）を指す。
【０１３８】
一部の実施形態において、治療物の組合せ（例えば、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＣＴＬＡ−４抗体、および抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せ）の相乗効果は、固形腫瘍を有する患者への低用量の治療剤の１つ以上の使用および／または前記治療剤の低頻度の投与を許容し得る。例えば、低用量の治療剤を利用し、および／または前記療物を低頻度で投与する能力は、固形腫瘍の治療において前記治療物の効力を低減させずに対象への前記治療物の投与に伴う毒性を低減させる潜在性を有する。
【０１３９】
併用療法において、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＣＴＬＡ−４抗体、および抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せを、１つ以上の別個の投与において１回の投与で一緒に投与することができる。さらに、相乗効果は、固形腫瘍の管理、治療または改善における治療剤の改善された効力をもたらし得る。治療剤の組合せの相乗効果は、任意の単剤療法の使用に伴う有害または不所望な副作用を回避し、または低減させ得る。
【０１４０】
ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の産生
本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の組換え発現は、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要求する。ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得たら、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の産生用ベクターを、当分野において周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術により産生することができる。したがって、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が提供される。当業者に周知の方法を使用して、ＣＤ４０ＬまたはＦｃポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に結合している本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
【０１４１】
発現ベクターを慣用の技術により宿主細胞に移し、次いで形質移入細胞を慣用の技術により培養して本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質を産生する。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に結合している本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。好適な宿主細胞としては、限定されるものではないが、微生物、例えば、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））が挙げられる。
【０１４２】
種々の宿主−発現ベクター系を利用して本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させることができる。このような宿主−発現系は、目的のコード配列を産生し、続いて精製することができるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換または形質移入された場合に本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質をインサイチュで発現し得る細胞も表す。これらとしては、限定されるものではないが、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された微生物、例えば、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳＯ、および３Ｔ３細胞）が挙げられる。本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質を組換え発現により産生したら、それをタンパク質精製分野において公知の任意の方法により精製することができる。
【０１４３】
ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質特性および活性のアッセイ
単離され、または多量体の一部としての本発明のＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ単量体サブユニットの安定性は、当分野において周知の技術、例えば、熱（Ｔｍ）およびカオトロピック変性（例えば、尿素、またはグアニジン塩による処理）、プロテアーゼ処理（例えば、サーモリシンによる処理）またはタンパク質安定性を測定するための別の当分野において承認された方法により容易に計測することができる。タンパク質安定性を計測するために使用される技術の包括的概説は、例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”および“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．２００７に見出すことができる。
【０１４４】
ＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性および他の結合特性は、当分野において公知の種々のインビトロアッセイ法、例として、例えば、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはカイネティクス（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析）、および他の方法、例えば、間接的結合アッセイ、競合結合アッセイ、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）により測定することができる。これらのおよび他の方法は、試験される構成成分の１つ以上の上の標識を利用し、および／または種々の検出方法、例として、限定されるものではないが、発色、蛍光、発光、または同位体標識を用い得る。結合親和性およびカイネティクスの詳細な説明は、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）に見出すことができる。
【０１４５】
ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の機能または活性を測定する追加のインビトロおよびインビボ方法は、本明細書に記載される。これらのアッセイを使用して免疫応答の１つ以上（例えば、Ｔ細胞機能および記憶Ｂ細胞活性化または増殖、樹状細胞成熟または活性化、Ｔｈ１サイトカインまたはケモカイン応答、単球由来マクロファージＭ１／Ｍ２分極化、抗原提示および／または腫瘍微小環境の免疫抑制の１つ以上）を測定することができる。インビボでは、抗癌または抗腫瘍活性をアッセイするための種々の動物モデル、例として、例えば、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍マウスモデルが当分野において公知である。薬物動態および薬力学特性をアッセイする追加の方法も周知である。
【０１４６】
キット
本発明は、抗腫瘍活性を向上させるためのキットを提供する。種々の実施形態において、キットは、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＭＥＤＩ５０８３）を含む。キットは、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、トレメリムマブ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、デュルバルマブ）、および／または抗ＰＤ−１抗体を含む追加の治療組成物を含み得る。
【０１４７】
一部の実施形態において、キットは、治療組成物を含有する無菌容器を含み；そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスターパック、または当分野において公知の他の好適な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または医薬品の保持に好適な他の材料から作製することができる。
【０１４８】
必要に応じて、キットは、本発明の治療組合せを投与するための説明書をさらに含む。特定の実施形態において、説明書は、下記：治療剤の説明；抗腫瘍活性を向上させるための投与スケジュールおよび投与；安全上の注意；警告；適応症；禁忌；過量摂取に関する情報；有害反応；動物薬理学；臨床試験および／または参考文献の少なくとも１つを含む。説明書は、（存在する場合）容器上に直接的に、または容器に貼り付けられたラベルとして、または容器中もしくは容器とともに供給される別個のシート、パンフレット、カードもしくはホルダーとして印刷されていてよい。
【０１４９】
本発明の実施は、特に示されない限り、当業者の知識範囲内に明確に含まれる分子生物学（例として、組換え技術）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用の技術を用いる。このような技術は、文献、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” ADDIN ENRfu “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）に十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本発明の作製および実施において考慮することができる。特定の実施形態に特に有用な技術を以下のセクションにおいて考察する。
【０１５０】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法の作製方法および使用方法についての完全な開示および説明を当業者に提供するように提示するものであり、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１５１】
本発明を目下、以下の実施例を参照して記載する。これらの実施例は、説明的なものにすぎず、本発明は決してそれらの実施例に限定されるものと解釈すべきでなく、本明細書において提供される教示の結果として明らかになる任意のおよび全ての変法を包含するものと解釈すべきである。
【０１５２】
実施例１
ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃの生成および安定性試験
ＣＤ４０Ｌは、共刺激分子の役割を担い、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でその受容体ＣＤ４０に結合し、標的細胞タイプに応じて多くの効果、例として、Ｂ細胞活性化および抗腫瘍抗体免疫応答の提示、マクロファージおよび樹状細胞の活性化、ならびにナチュラルキラー細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球の生成をもたらす。
【０１５３】
ペプチドリンカーを介して結合している３つのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）サブユニットの単鎖融合物およびＦｃ単量体（ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｃ）を含む融合タンパク質（ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ）を構築した（図１）。ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ＩｇＧ４Ｐ−ＦＰ６（ＭＥＤＩ５０８３）、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ＩｇＧ４Ｐ−ＦＰ７、およびネズミサロゲート（ＦＰ５様、マウスＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａ  Ｆｃ）を含んだ。ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ構築物の物理的特性を試験し、類似することが観察された（表１）。
【０１５４】
【表１】
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【０１５５】
安定性データを以下のプロトコルに従って作成した。試料をＰＢＳ中で５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、室温および４５℃においてインキュベートした。試料を高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により、変動時点（例えば、１、３、７日目など）において試験した。ＦＰ７  Ｃ１９４Ｗについての代表的なＨＰＳＥＣクロマトグラムを図２に示す。ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ構築物についての安定性データは、室温における最大７日間の経時的な最小の変化および４５℃における経時的な凝集増加を示した（表２）。
【０１５６】
【表２】
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【０１５７】
安定性プログラムのＦＰ６の試料を、本明細書に記載のとおりＨＥＫ２９３ヒトＣＤ４０  ＮＦκＢルシフェラーゼレポーター系中の生物活性について試験した。ＮＦκＢルシフェラーゼアッセイにより計測されたＭＥＤＩ５０８３の安定性試料生物活性は、曲線の全体的形状およびパラメータならびに特に予測される１００〜２００ｐＭ範囲のスコアのＩＣ５０値の両方において対照試料と同等であった（図３）。
【０１５８】
実施例２
ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質ＣＤ４０Ｌ−ＦＰ７は、ＣＤ４０Ｌ生物活性を有する
ＦＰ６  ＣＤ４０Ｌ融合タンパク質（ＭＥＤＩ５０８３）は、免疫系細胞、例えば、Ｂ細胞および樹状細胞において表面結合ヒトＣＤ４０を介する結合およびシグナリングを介して生物学的活性を付与する。ＣＤ４０Ｌ融合タンパク質ＦＰ７のＣＤ４０媒介活性を測定するため、ＨＥＫ２９３  ＣＤ４０  ＮＦκＢ−Ｌｕｃ細胞系およびＲａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ  ＮＦκＢ／ＡＰ−１レポーターＢリンパ球系を使用した。
【０１５９】
ヒトＣＤ４０およびＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター系により形質移入されたヒトＨＥＫ細胞またはＮＦκＢ／ＡＰ−１レポーター系により形質移入されたＲａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞を使用する迅速で簡易なサロゲートアッセイが開発された。この試験において、ＦＰ７  ＣＤ４０Ｌ融合タンパク質（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）の活性をＭＥＤＩ５０８３（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）およびアイソタイプ対照（アイソタイプヒトＩｇＧ４；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）に対して評価した。ＦＰ７  ＣＤ４０ＬおよびＭＥＤＩ５０８３を２倍および１倍薬物希釈スキームに従って調製した。２倍薬物については、以下の希釈スキームを使用した：２００ｎＭ、６６．７ｎＭ、２２．２ｎＭ、７．４ｎＭ、２．５ｎＭ、８２３ｐＭ、２７４ｐＭ、９２ｐＭ、３１ｐＭ、１０ｐＭ、３．４ｐＭ、および０ｐＭ。１倍薬物については、以下の希釈スキームを使用した：１００ｎＭ、３３．４ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．３ｎＭ、４１２ｐＭ、１３７ｐＭ、４６ｐＭ、１５ｐＭ、５ｐＭ、１．７ｐＭ、０ｐＭ。
【０１６０】
材料および方法
Ｈｕ  ＣＤ４０  ＨＥＫ生物活性アッセイプロトコル
Ｈｕ  ＣＤ４０  ２９３ＨＥＫ  ＮＦκＢ  ｃ３細胞を、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）＋１０％の熱不活化ＦＢＳ（ＨＩ−ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）およびＰｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ）中で維持した。細胞は接着性であり、コンフルエンシーが増加するにつれて細胞の積層または島を形成する傾向がある。７５％のコンフルエンシーに達したときに細胞を分けた。細胞を回収するため、培地を吸引し、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（５ｍＬ；ＧＩＢＣＯ）を添加し、細胞層をロッキングしてコートした。トリプシンを除去し、培地（１０ｍＬ）を添加し、細胞を撹拌により取り出した。回収した細胞をＤＭＥＭ＋２％のＨＩ−ＦＢＳ中で５×１０５個の細胞／ｍＬに調整し、平底ポリＤ−ＬリジンＢｉｏｃｏａｔ９６ウェルプレート（５×１０４個の細胞／ウェル；Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに添加し（１００μＬ）、３７℃のインキュベーター中で２４時間配置した。インキュベーション後、培地をプレートから吸引した。１００μＬの１倍薬物をそれぞれのウェルに慎重に添加し（例えば、ウェルの側面に沿って下方に添加）、留意して細胞の剥離を最小化した。細胞を３７℃のインキュベーターに２４時間戻した。ルシフェラーゼ試薬（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ基質；Ｐｒｏｍｅｇａ）を調製し、室温に平衡化させておき、それぞれのウェルに添加した（１００μＬ）。細胞および試薬を十分混合して完全な細胞溶解を確保し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｖｉｓｉｏｎ−０２ルミノメータープレートリーダー上で直ちに読み取った。
【０１６１】
Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ生物活性アッセイプロトコル
Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ  ＮＦκＢ／ＡＰ−１レポーターＢリンパ球（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をＩＭＤＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ）＋１０％のＨＩ−ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ）およびＺｅｏｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）培地中で維持した。細胞は非接着性であり、培養物を５×１０５個の細胞／ｍＬにおいてイニシエートし、６×１０６個／ｍＬ未満に保持した。−１日目、細胞をＩＭＤＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０％のＨＩ−ＦＢＳおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｚｅｏ不含）培地中に分けた。細胞を回収し、４×１０６個の細胞／ｍＬに調整し、平底９６ウェルプレート（４×１０５個の細胞／ウェル；Ｆａｌｃｏｎ）のウェルに添加した（１００μＬ）。１００μＬのＺｅｏ不含培地中の２倍薬物をそれぞれのウェルに添加し、細胞を３７℃のインキュベーター中で２４時間配置した。Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞からの上清（４０μＬ）を平底９６ウェルプレートのウェルに移した。ＡＰ−１  ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ試薬（１００ｍＬの滅菌水中に溶解させた１パウチ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を調製し、ＡＰ−１  ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ試薬（１６０μＬ）をそれぞれのウェルに添加した。細胞およびＡＰ−１  ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ試薬を含有するプレートを３７℃のインキュベーター中で最大１時間配置し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５分光光度計上で６５５ｎｍにおいて読み取った。
【０１６２】
ＣＤ４０Ｌ−ＦＰ７は、両方のレポーター細胞系アッセイにおいてＭＥＤＩ５０８３と同等の生物学的活性を示した（図４および５ならびに表３および４）。ＣＤ４０Ｌ−ＦＰ７融合タンパク質中のＣＤ４０Ｌサブユニットは、９アミノ酸ＧｌｙＳｅｒペプチドリンカーを介して結合している。驚くべきことに、他の単鎖ＴＮＦリガンド−Ｆｃ融合タンパク質に対して増加したリンカー長（＞８アミノ酸）を有するにもかかわらず、９アミノ酸のリンカー長はＣＤ４０Ｌ活性を低減させず、ＣＤ４０Ｌ−ＦＰ７融合タンパク質の凝集は見られなかった。ヒトＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照ＮＩＰ−２２８は、いずれのレポーターアッセイにおいてもバックグラウンドと比べて活性を示さなかった。Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅレポーターアッセイについては、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ  ＡＰ−１検出培地との６０分間の（図５）および３０分間のインキュベーションは類似の曲線を示した。しかしながら、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ  ＡＰ−１検出培地との６０分間のインキュベーションは、３０分間よりも大きなダイナミックレンジをもたらした。別の実験において、ＭＥＤＩ５０８３は、ヒトプライマリーＢ細胞増殖を刺激した（図６）。したがって、これらの実験は、ＭＥＤＩ５０８３が生物活性を有し、適応免疫を活性化させ得ることを示した。
【０１６３】
【表３】
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【０１６４】
【表４】
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【０１６５】
実施例３
ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質ＭＥＤＩ５０８３は、ヒト単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）を活性化させた
ＭＥＤＩ５０８３は、免疫系細胞、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞およびマクロファージ中で受容体ＣＤ４０を介して生物学的活性を付与する。ＣＤ４０Ｌアクチベーターは、それぞれＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡにより検出可能な樹状細胞中の細胞表面活性化マーカーおよび炎症性サイトカイン分泌を増加させることが示されている。この試験は、ＭＥＤＩ５０８３によるＭｏＤＣの前処理がヒトＭｏＤＣ中での応答を向上させるか否かを決定するために設計した。
【０１６６】
材料および方法
ＭｏＤＣイニシエーションおよび培養
ヒト単球（例えば、新鮮単離物）を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（両方１００ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が補給されたＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ１６４０＋グルタミン培地；ＧＩＢＣＯ）＋１０％の熱不活化ＦＢＳ（ＨＩ−ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）（＝ｃＲＰＭＩ）中で６日間培養し、４８時間ごとにサイトカインを再供給した。６日後、単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）（接着の損失および細胞膜の突出の外観を特徴とする）を計数し、ｃＲＰＭＩ中で１×１０６個／ｍＬに調整した。６日目、ＦＡＣＳ（ＭＡＣＳＱＵＡＮＴ  Ｐｉｐｐｅｎ）によりそれぞれのドナーからの１×１０６ｍＬのアリコートに対して特徴付けを実施した。
【０１６７】
ＭｏＤＣ薬物処理および活性化
それぞれのドナーについて、ｃＲＰＭＩ中のＭｏＤＣ（１００μＬ）を９６ウェルプレート（ウェル当たり１×１０５個の細胞）のウェルに添加した。ＭＥＤＩ５０８３（１：３希釈）のｃＲＰＭＩ中の薬物原液（４倍）を生成して１００ｎＭ〜１５ｐＭの範囲のＦＰ６の最終濃度を得た。４倍薬物については、以下の希釈スキームを使用した：２００ｎＭ、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２ｎＭ、４００ｐＭ、１４０ｐＭ、４６ｐＭ、１５ｐＭ、０ｐＭ。アイソタイプ対照（１００ｎＭ）を薬物なし（０ｐＭ）に使用した。さらに、組合せウェル中で添加すべき薬物の固定濃度のため、ｃＲＰＭＩ中の４倍薬物原液を生成して４ｎＭのＭＥＤＩ５０８３の最終濃度を得た。４倍薬物（５０μＬ）および５０μＬのｃＲＰＭＩを単一薬物処理ウェルに添加した。２４時間後、上清（１３０μＬ）を回収し、標識９６ウェルプレートに移し、後続のサイトカイン分析（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α）のために冷凍した。細胞をＦＡＣＳにより処理した。
【０１６８】
細胞外ＦＡＣＳ染色プロトコル：表現型／機能パネル
２４時間後、ＭｏＤＣ細胞はプレートに接着した。ＤＰＢＳ  ｗ／ｏ  Ｃａ／Ｍｇ（ＤＰＢＳ；ＧＩＢＣＯ）（２００μＬ）をウェルに添加し、１，５００ｒｐｍにおいて５分間スピンして洗浄した。予め加温したＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（１００μＬ；ＧＩＢＣＯ）を添加し、細胞を３７℃において１５分間配置した。ＦＡＣＳ緩衝液（５％のＨＩ−ＦＢＳおよび０．１％のアジ化ナトリウム（ＳＩＧＭＡ）が補給されたＤＰＢＳ）を添加し、細胞を２回洗浄した。細胞を３０μＬの１０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ中で再懸濁させ、ＲＴにおいて１０分間インキュベートした。この間にＭｏＤＣを補正プレートに添加し、適切な抗体を添加した。ＦＡＣＳ緩衝液＋アジド中の抗体マスターミックス（１００μＬ）およびＦＭＯ（フルオレセンス・マイナス・ワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ））対照を添加し、細胞を４℃において２０分間インキュベートした。細胞表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）に対する抗体を使用した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により２回洗浄し、次いでＦＡＣＳ緩衝液（１００μＬ）中で再懸濁させ、試料をフローサイトメーター上で取得した。データをＦｌｏｗ  Ｊｏ  ｖ９上で分析した。
【０１６９】
ＭＥＤＩ５０８３は、抗原提示に関連する高レベルの細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６、ならびに活性化抗原のＣＤ８３を誘導した（図７および表５参照）。
【０１７０】
【表５】
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【０１７１】
高レベルの追加の細胞表面マーカー、例として、活性化抗原であるＣＤ４０およびＰＤ−Ｌ１、ならびにリンパ節ホーミングＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１受容体ＣＣＲ７も観察された。全てのＭｏＤＣ細胞表面マーカーの発現は用量応答的に増加し、３．７〜１１．１ｎＭの間でプラトーになったが、発現されるＣＤ４０は高濃度において下方調節されるように見られた。したがって、ＭＥＤＩ５０８３は、ヒト単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）を活性化および成熟させ得た。これらの実験は、ＭＥＤＩ５０８３が先天免疫を活性化させ得ることを実証する。
【０１７２】
ＭＥＤＩ５０８３は、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０の分泌の用量依存的増加を誘導した（図８）。ＩＬ−８分泌は最初は誘導されたが、３．７μＭ以上の用量において阻害された。ＭＥＤＩ５０８３についてＩＬ−１βに対する影響は観察されなかった。別の実験において、ＭＥＤＩ５０８３によるｍＤＣ活性化および成熟は、Ｔ細胞増殖を用量依存的にドライブした（図９）。したがって、ＭＥＤＩ５０８３は、ヒトＭｏＤＣにおいてＴｈ１サイトカイン／ケモカイン応答を誘導し得、Ｔ細胞増殖をドライブし得た。これらの実験は、ＭＥＤＩ５０８３が先天および適応免疫応答を補う潜在性を有することを示す。
【０１７３】
実施例４
ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質ＭＥＤＩ５０８３は、ヒトマクロファージ分極化を活性化させた。
単球は極度に可塑性であり、インビトロで炎症促進性Ｍ１表現型またはサプレッサー／創傷治癒Ｍ２表現型のいずれかを有するマクロファージに分化され得る。Ｍ１マクロファージはＰＤＬ１高／ＣＤ８０高／ＣＤ４０高／ＨＬＡ−ＤＲ高／ＣＤ２０６低／ＣＤ１６３低／ＣＤ１４低である一方、Ｍ２マクロファージはＰＤＬ１低／ＣＤ８０低／ＣＤ４０低／ＨＬＡ−ＤＲ低／ＣＤ２０６高／ＣＤ１６３高／ＣＤ１４高である。さらに、Ｍ１マクロファージは炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３を産生する一方、Ｍ２マクロファージは抑制性サイトカインＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを産生する。腫瘍環境において、Ｍ２マクロファージは癌抗原に対する免疫応答を抑制し得る。Ｍ１表現型への分極化の切り替えはこの効果を覆し、腫瘍退縮を可能とし得た。この実験は、Ｍ１およびＭ２分極化マクロファージに対するヒトＣＤ４０Ｌ／ヒトＩｇＧ４融合タンパク質のＭＥＤＩ５０８３の効果を評価するために設計した。
【０１７４】
材料および方法
単球取扱および分極化プロトコル（Ｍｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃａｎ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７９：ｐ３０５−３１４）
実験における使用のために２人のドナーからの新鮮単離ヒト単球（Ａｌｌｃｅｌｌｓ）（Ｄ１：８３６７；Ｄ２：８３７５）を得た。細胞計数を実施し、細胞アリコート（１×１０６個）を０日目／休止期単球ＦＡＣＳベースラインのために取り出した。残留細胞を２つの等しいアリコートに分け、細胞をスピンダウンし（１，５００ｒｐｍ、５分間）、半量をＭ１培地（１０％の熱不活化ＦＢＳ（ＨＩ−ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）、Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ）および５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が補給されたＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ１６４０＋グルタミン培地；ＧＩＢＣＯ））（＝ｃＲＰＭＩ）中で再懸濁させ、半量をＭ２培地（ｃＲＰＭＩ＋５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））中で再懸濁させた。アリコート（２ｍＬ）を６ウェルプレートのウェルに移し、プレートを３７℃において６日間インキュベートし、新鮮単離サイトカインを２日ごとに添加した。無血清培地中の付着ステップは公開プロトコルから除外した。サイトカインを添加するごとに、細胞形態に着目し、それを記録した。
【０１７５】
６日後、マクロファージはＭ１またはＭ２のいずれかに分極化した。活性化刺激の添加は、特徴的なサイトカインの分泌および細胞表面マーカーの上方調節をもたらした。この試験のため、活性化を３つの手法で実施した：
【０１７６】
（ａ）標準的活性化物（５０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（ＬＰＳ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４；ＳＩＧＭＡ）＋２０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＭ１プレートに、および２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）＋２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＭ２プレートに）を６日目に添加し、２４時間後に蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析および上清の回収を行う。
【０１７７】
（ｂ）標準的活性化物＋ＭＥＤＩ５０８３（４ｎＭ；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）またはアイソタイプ対照（４ｎＭ；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）の同時添加物を６日目に添加し、２４時間後にＦＡＣＳ分析および上清の回収を行う。
【０１７８】
（ｃ）標準的活性化物を６日目に添加し、２４時間後（７日目）にＭＥＤＩ５０８３（４ｎＭ；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）またはアイソタイプ対照（４ｎＭ；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）を添加し、さらに２４時間後にＦＡＣＳ分析および上清の回収を行う。
【０１７９】
回収時において、上清（５００μＬ）を取り出し、ＭＳＤによる後続のサイトカイン分析（ヒトＴＨ１／ＴＨ２  １０プレックスプレートＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−β）のために冷凍した。
【０１８０】
残留培地を吸引し、プレートをＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ  ｗ／ｏ  Ｃａ／Ｍｇ；ＧＩＢＣＯ）により１回洗浄し、予め加温したＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ解離緩衝液（０．５ｍＬ；ＧＩＢＣＯ）をそれぞれのウェルに添加した。細胞を３７℃のインキュベーター中で２０分間配置し、プレートをタップしてマクロファージを遊離させ、ｃＲＰＭＩ（２ｍＬ）を添加し、５ｍＬピペットを使用して激しく吸引して細胞を回収した。この手順に続き、ウェルを細胞の取り出しについて顕微鏡下で確認した。細胞をスピンダウンし、ｃＲＰＭＩ中で１×１０６個の細胞／ｍＬに調整し、ＦＡＣＳのために処理した。
【０１８１】
細胞外ＦＡＣＳ染色プロトコル（４Ｃ）
細胞（２×１０５個）を丸底９６ウェルプレートのウェルに添加し、１５００ｒｐｍにおいて５分間スピンダウンした。ＦＡＣＳ緩衝液（５％のＨＩ−ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）および０．１％のアジ化ナトリウム（ＳＩＧＭＡ）が補給されたＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ  ｗ／ｏ  Ｃａ／Ｍｇ；ＧＩＢＣＯ））を添加し（２００μＬ）、細胞を１回洗浄した。細胞を５０μＬの１：４のＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）Ｆｃ受容体ブロック剤中で再懸濁させ、室温において１０分間インキュベートした。抗体パネルマスターミックス（１００μＬ）をウェルに添加し、細胞を４℃において２０分間インキュベートした。細胞表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）に対する抗体を使用した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（１００μＬ）中で再懸濁させ、試料をＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター上で取得した。データをＦｌｏｗ  Ｊｏ  ｖ９上で分析した。
【０１８２】
ＧＭ−ＣＳＦ中で６日後、マクロファージをＭ０−Ｍ１と称する。ＩＦＮ−γおよびＬＰＳによる２４時間の活性化は、完全なＭ１分極化をもたらす。同様に、Ｍ−ＣＳＦ中で６日後、マクロファージをＭ０−Ｍ２と称し、ＩＬ−４およびＩＬ−１０による２４時間の活性化は、完全なＭ２分極化をもたらす。重要なことに、６日後（活性化前）、顕微鏡下で観察した場合、Ｍ０−Ｍ１マクロファージは古典的な扁平パンケーキ状形態を有し、Ｍ０−Ｍ２マクロファージは古典的な接着紡錘様細胞を有した。Ｍ２マクロファージにおいて、２４時間の活性化段階におけるＭＥＤＩ５０８３（４ｎＭ）の包含は、Ｍ１マーカーを増加させ、Ｍ２マーカーを減少させ、Ｍ２からＭ１に分極化をシフトした（図１０、斜線陰影バー；図１１）。したがって、これらの実験はＭＥＤＩ５０８３が免疫抑制を逆行させ得ることを示した。
【０１８３】
実施例５
ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質ＭＥＤＩ５０８３はＣＤ４０に特異的に結合した
ＦＰ６（ＭＥＤＩ５０８３）の作用方式は、主にＣＤ４０発現抗原提示細胞（樹状細胞、Ｂ細胞、単球およびマクロファージ）の活性化を介するものである。ＦＰ６は他のＴＮＦ受容体サブファミリータンパク質、例えば、ＧＩＴＲ、ＴＲＡＩＬおよびＯＸ４０に結合せず、種特異的である（マウスモデルにおいては機能しない）。
【０１８４】
ＦＰ６（ＭＥＤＩ５０８３）のヒトＣＤ４０特異性を評価するための簡易ＥＬＩＳＡを開発した。簡易ＥＬＩＳＡベースプロトコルを開発する早期の試みは、より特異的な抗ヒトＩｇＧ４二次試薬を使用し、使用される受容体／Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ構成成分への非特異的結合を迂回してアッセイ特異性を管理する必要性を実証した。さらに、有効なより低い濃度の受容体および一次試薬を決定した。本試験において、より特異的な二次試薬を評価した。
【０１８５】
材料および方法
ＴＮＦ受容体結合アッセイ
Ｆｃ構成成分を有さないＴＲＡＩＬを除き、組換えＦｃキメラ受容体（５０μＬの５μｇ／ｍＬ）をプレート上にコーティングし（１時間、３７℃）、次いで洗浄ステップ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎにより３回）を行った。組換え受容体は、ｒｈＣＤ４０（ｈＩｇＧ１  Ｆｃ）；ｒｍＣＤ４０（ｈＩｇＧ１  Ｆｃ）；ｒｈＧＩＴＲ（ｈＩｇＧ１  Ｆｃ）；ｒｈＴＲＡＩＬ；ｒｈＯＸ４０（ｈＩｇＧ１  Ｆｃ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだ。組換え受容体単独（一次試薬なし）を対照として使用してＦｃ−ＨＲＰ二次試薬への直接的結合を確認した。プレートをＰＢＳ中４％のミルクによりブロッキングし（１時間、３７℃）、次いで洗浄ステップ（ＰＢＳにより２回）を行った。プレートを、例えば、新鮮分離により作製した１％のＢＳＡ  ＰＢＳ中の一次試薬（５０μＬの２０ｎＭ）とインキュベートし（１時間、３７℃）、次いで洗浄ステップ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎにより４回）を行った。一次試薬は、ＦＰ６（ｈＩｇＧ４  Ｆｃ）およびアイソタイプ対照として使用されるヒトＩｇＧ４抗体を含んだ。プレートを、ＰＢＳ中４％ミルクで二次試薬ＨＲＰコンジュゲート抗Ｆｃ（１００μＬの１：２５０００）とインキュベートし、次いで洗浄ステップ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎにより４回）を行った。ＨＲＰコンジュゲート抗Ｆｃを調製するため、マウス抗ヒトＩｇＧ４（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号ＭＡ１−３４４３７）の１：４原液を４％のミルク中で作製し、１：５０００に希釈し、０．５ｍｇ／ｍＬを１：２５０００において使用した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を添加した（１００μＬ／ウェル）。添加前の１５分以内に等量のＲＴ溶液Ａを溶液Ｂ（ＴＭＢ基質試薬キット；ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡカタログ番号３５５５２１４）に添加することによりＴＭＢ溶液を作製した。反応物を室温において１５分間インキュベートし、光から保護した。ＨＲＰ活性を有するウェルは青色に変色した。停止溶液（２Ｎの硫酸；１００μＬ）を添加し、青色に変色していたウェルは鮮黄色に変色した。プレートをプレートリーダー上で４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０１８６】
ＦＰ６（ＭＥＤＩ５０８３）ＥＬＩＳＡアッセイは、ヒトＣＤ４０についての高い特異性について十分に機能した（図１２）。他のヒトＴＮＦ受容体ファミリーメンバー、例えば、ＧＩＴＲ、ＴＲＡＩＬおよびＯＸ４０から低いバックグラウンドシグナルが生じ、このことは、ＦＰ６が他のヒトＴＮＦ受容体ファミリーメンバー、例えば、ＧＩＴＲ、ＴＲＡＩＬおよびＯＸ４０と比べてヒトＣＤ４０についての高い特異性を実証することを示した。したがって、ヒトＣＤ４０についてのＦＰ６の特異性の評価のための簡易ＥＬＩＳＡを開発した。
【０１８７】
このＥＬＩＳＡアッセイにおける重要な構成成分は、高度に特異的な抗ヒトＩｇＧ４二次試薬である。ＦＰ６特異的ＥＬＩＳＡの生成における早期の試みは、ＦＰ６についての標的として使用される受容体Ｆｃ融合タンパク質のヒトＦｃ領域に結合するより広い反応性抗ヒトＩｇＧ二次試薬を使用し、偽陽性シグナルをもたらした。
【０１８８】
本明細書に記載の実験のまとめは、ＭＥＤＩ５０８３がインビトロでＣＤ４０に特異的に結合し、免疫応答の重要な構成成分を活性化させたことを示す（表６）。
【０１８９】
【表６】
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【０１９０】
実施例６
ＭＥＤＩ５０８３マウスサロゲートのＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰは、マウス腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を有した。
【０１９１】
インビボでマウスにおいてＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の効果を試験するため、ＭＥＤＩ５０８３のネズミサロゲートのＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰを構築した。ＭＥＤＩ５０８３と同様に、ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｆｃポリペプチドに連結しているペプチドリンカーを介して連結している３×ＣＤ４０Ｌサブユニットの単鎖融合物を含む。しかしながら、ＭＥＤＩ５０８３中のヒトＣＤ４０ＬサブユニットおよびヒトＩｇＧ４Ｐの代わりに、ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰは、マウスＣＤ４０ＬサブユニットおよびマウスＩｇＧ１  Ｆｃを含む。さらに、ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰにおいて、マウスＣＤ４０Ｌサブユニット間のサブユニット間リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２）と比較してＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号３７）である。
【０１９２】
マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ  ＦＰを、Ｂ１６−Ｆ１０同系マウスモデルにおいて試験した。ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰは、アイソタイプおよび非処理対照と比較してＢ１６−Ｆ１０マウスモデルにおいて腫瘍容積を減少させ、および／または腫瘍成長を遅延させた（図１３）。さらに、ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰにより処理されたマウスは、有意な体重損失も他の観察可能な効果も有さなかった。したがって、ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰは、低応答腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍活性を示した。
【０１９３】
マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ  ＦＰを、Ｂ１６−Ｆ１０同系マウスモデルにおいて抗ＰＤ−Ｌ１との組合せで試験した。ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰの抗ＰＤ−Ｌ１との組合せは、抗ＰＤ−Ｌ１単独ならびにアイソタイプおよび非処理対照と比較してＢ１６−Ｆ１０マウスモデルの個々のマウスにおいて腫瘍容積を減少させ、および／または腫瘍成長を遅延させた（図１４および１５）。
【０１９４】
マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ  ＦＰを、Ｂ１６−Ｆ１０同系マウスモデルにおいて抗ＣＴＬＡ−４との組合せで試験した。ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰの抗ＣＴＬＡ−４との組合せは、抗ＣＴＬＡ−４単独ならびにアイソタイプおよび非処理対照と比較してＢ１６−Ｆ１０マウスモデルの個々のマウスにおいて腫瘍容積を減少させ、および／または腫瘍成長を遅延させた（図１６および１７）。
【０１９５】
マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ  ＦＰを、Ｂ１６−Ｆ１０同系マウスモデルにおいて抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４との組合せで試験した。ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰの抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４との組合せは、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４の組合せまたはＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰと抗ＰＤ−Ｌ１もしくは抗ＣＴＬＡ−４のいずれかとの組合せと比較してＢ１６−Ｆ１０マウスモデルの個々のマウスにおいて腫瘍容積を減少させ、および／または腫瘍成長を遅延させた（図１８および１９）。
【０１９６】
マウスサロゲートＣＤ４０Ｌ  ＦＰを、Ｂ１６−Ｆ１０同系マウスモデルにおいて抗ＰＤ−１との組合せで試験した。ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰの抗ＰＤ−１との組合せは、抗ＰＤ−１単独ならびにアイソタイプおよび非処理対照と比較してＢ１６−Ｆ１０マウスモデルの個々のマウスにおいて腫瘍容積を減少させ、および／または腫瘍成長を遅延させた（図２０および２１）。
【０１９７】
さらに、ｍｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰ、抗ＰＤＬ−１、抗ＣＴＬＡ−４、もしくは抗ＰＤ１単独、またはｍｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰの抗ＰＤＬ−１、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４もしくは抗ＰＤＬ−１および抗ＣＴＬＡ４との組合せにより処理されたＢ１６−Ｆ１０腫瘍担持マウスから血清を回収した。２および４回目の処理の２４時間後における血清サイトカインレベルを、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙマルチプレックスアッセイキットにより計測した。ｍｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰ単独または抗ＰＤＬ−１、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４もしくは抗ＰＤＬ−１および抗ＣＴＬＡ４との組合せによる処理は、２回目の処理の２４時間後（図２２）および４回目の処理の２４時間後（図２３）に抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４、および抗ＰＤ−１単独ならびにアイソタイプおよび非処理対照と比較して上昇したレベルのＴＨ１サイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ１２およびＫＣ／ＧＲＯ  Ｔ１を誘導した。しかしながら、２回目の処理の２４時間後でも４回目の処理の２４時間後でもＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、またはＩＬ−１０の変化は観察されなかった（データ示さず）。
【０１９８】
したがって、ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰの抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４単独または抗ＰＤ−Ｌ１もしくは抗ＰＤ１との組合せは、低応答腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍活性を示した。これらのデータは、ＭＥＤＩ５０８３の免疫チェックポイント阻害剤との組合せの有用性を実証する。
【０１９９】
実施例７
ＭＥＤＩ５０８３マウスサロゲートのＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰは、マウスにおいて免疫応答を活性化させた
【０２００】
マウスサロゲートＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰの効果を理解するため、Ｂ１６−Ｆ１０マウスにおける免疫応答を試験した。ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰは、非処理およびアイソタイプ対照と比較してマウスにおいて腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化およびＰＤ−Ｌ１発現を増加させた（図２４）。ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰを投与されたマウスは、対照マウスと比較して増加した総ＣＤ８＋Ｔ細胞および増加した割合のＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋；ＣＤ８＋、グランザイムＢ＋；およびＰＤ−Ｌ１＋Ｔ細胞を有した。脾臓において、ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰは、非処理およびアイソタイプ対照と比較してＢ１６−Ｆ１０マウスにおいて骨髄細胞成熟およびＢ細胞活性化をドライブした（図２５）。ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰは、Ｂ１６−Ｆ１０マウスにおいてＴＨ１サイトカインおよびＣＸＣＬ−１ケモカイン分泌も誘導した（図２６）。ＭｕＣＤ４０Ｌ−ＦＰを投与されたマウスは、対照マウスと比較して増加したＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、およびＣＸＣＬ１分泌を有した。
【０２０１】
実施例８
サルにおけるＭＥＤＩ５０８３薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）試験
【０２０２】
霊長類におけるＭＥＤＩ５０８３の効果を理解するため、薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）試験をサルにおいて実施した。ＭＥＤＩ５０８３が同一の作用機序を有するＣＤ４０に対するアゴニストｍＡｂを用いた公開データ（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）に基づき０．３ｍｇ／ｋｇの開始用量を使用した。公開抗ＣＤ４０ｍＡｂについてのＭＴＤは、０．２ｍｇ／ｋｇであった。当量のカニクイザルＭＴＤは、ヒトＭＴＤの３倍；０．６ｍｇ／ｋｇである。０．３ｍｇ／ｋｇ以下の用量は、カニクイザルにおいて安全な開始用量であると予測された。単回投与ＰＫ／ＰＤ毒性試験は、試験用量のいずれにおいても毒性を示さなかった（表７）。
【０２０３】
【表７】
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【０２０４】
この投与経路は、それらが提案されたヒトにおける投与経路と一致し、適切な血清レベルを提供し、薬力学効果に関連すると予測されるため、選択した。
【０２０５】
血液（０．５〜１．０ｍｌ）を投与４時間後に回収した。血液を、特異的モノクローナル抗体を用いて分析してＢ細胞（例として、活性化Ｂ細胞）、Ｔ細胞（Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および樹状細胞を検出した。相対細胞数（割合）を得、総リンパ球計数値を同日に測定した。下位集団の絶対数を相対数および総数から計算した。血液試料をＫｉ６７免疫染色にも使用した。血清は、サイトカインの分析、薬物動態分析および評価、ならびに抗薬物抗体（ＡＤＡ）試験に使用した。
【０２０６】
ＰＫ−ＰＤモデルを作成してサルにおけるＭＥＤＩ５０８３単回投与後のＢ細胞活性化およびトラフィッキングを説明した（図２７）。試験からのＰＫ結果を以下に列記する：ＣＬ＝４０５ｍＬ／日／ｋｇ；Ｖｃ＝１３７ｍＬ／ｋｇ；Ｖｐ＝１２２ｍＬ／ｋｇ；Ｖｍａｘ＝４９６μｇ／日；Ｖｍａｘ＝４９６μｇ／日；およびＫｍ＝０．０２６μｇ／ｍＬ。試験からのＰＤ結果を以下に列記する：Ｒ０＝１；Ｓｍａｘ＝６．３２／日；Ｋｏｕｔ＝８．１３／日；およびＥＣ５０＝０．０８μｇ／ｍＬ。ＭＥＤＩ５０８３は非線形ＰＫを示し、対象における血清半減期は２．７〜１８時間の範囲であった。興味深いことに、ＳＣ投与されたＭＥＤＩ５０３８は、ＩＶ投与された場合よりも長い半減期を有した（３０ｍｇ／ｋｇ：ＩＶ  Ｔ１／２：６時間；ＳＣ  Ｔ１／２：１８時間）。Ｂ細胞活性化についてのＥＣ５０は、０．０８μｇ／ｍＬ（約５０ｐＭ）であり、それはインビトロでのＥＣ５０と一致した。ＭＥＤＩ５０３８は、Ｂ細胞トラフィッキングについての半減期が、Ｂ細胞活性化についての半減期の２時間と比較して３６時間であったため、長期ＰＤ効果を示した。ＭＥＤＩ５０３８は、サルにおいてＴ細胞増殖（ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞Ｋｉ６７）も活性化させた（３０ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ、７日間において観察されたＰＤ）。
【０２０７】
他の実施形態
上記の記載から、本明細書に記載の本発明に対して変形および改変を行ってそれを種々の使用法および条件に適合させることができることが明らかである。このような実施形態も、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０２０８】
本明細書における可変部の任意の定義中の要素の列記の記述は、列記要素の任意の単一要素または組合せ（または下位組合せ）としてのその可変部の定義を含む。本明細書における実施形態の記述は、任意の単一の実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せのその実施形態を含む。
【０２０９】
本明細書において挙げられる全ての特許および刊行物は、それぞれの独立特許および刊行物が参照により組み込まれることが具体的および個別的に示されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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