(57)【要約】  本発明は、活性化されていない産物を本質的に含まない活性化クロストリジウム神経毒を生産する方法、このようなものを含む組成物および療法におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化クロストリジウム神経毒を生産するための方法であって、単鎖クロストリジウム神経毒の少なくとも90％が二本鎖クロストリジウム神経毒に変換されるまで、単鎖クロストリジウム神経毒を、活性化酵素と接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記活性化酵素が、トリプシンである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記トリプシンが、ウシトリプシンであり、前記ウシトリプシンが、配列番号1に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記ウシトリプシンが、ウシ膵臓から得られた天然トリプシンおよび組換えウシトリプシンから選択される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記単鎖クロストリジウム神経毒を、ウシトリプシンと接触させる前記工程が、5から7.5の間の、好ましくは、6から7の間のpHで、例えば、およそ6.5のpHで実施される、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
単鎖クロストリジウム神経毒を、前記ウシトリプシンと接触させる工程が、室温で6から7の間のpHで15から25時間の持続時間実施され、前記ウシトリプシンの濃度が、1mgのクロストリジウム神経毒あたり0.5から3μgの間である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
切断型クロストリジウム神経毒を除去する工程をさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
切断型クロストリジウム神経毒を除去する前記工程が、前記活性化クロストリジウム神経毒を、混合様式クロマトグラフィー樹脂と接触させることを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記クロストリジウム神経毒が、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GおよびTeNTから選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記クロストリジウム神経毒が、野生型ボツリヌス神経毒と比較して修飾されたボツリヌス神経毒、例えば、突然変異クロストリジウム神経毒、キメラクロストリジウム神経毒または再標的化クロストリジウム神経毒である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記クロストリジウム神経毒が、BoNT/E活性化ループを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記クロストリジウム神経毒がBoNT/Eである、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記単鎖クロストリジウム神経毒が、異種宿主細胞において、好ましくは、大腸菌(E.coli)において、前記単鎖クロストリジウム神経毒をコードする遺伝子を発現させることによって得られる、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1から13のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、活性二本鎖クロストリジウム神経毒。
【請求項１５】
請求項14に記載の活性二本鎖クロストリジウム神経毒を含む医薬組成物であって、単鎖クロストリジウム神経毒を本質的に含まない、医薬組成物。
【請求項１６】
療法において使用するための、例えば、眼科的(ophtalmological)障害、運動障害、耳鼻咽喉科障害、胃腸障害、泌尿生殖器障害、皮膚科障害、疼痛障害、炎症性障害、分泌障害、呼吸器障害、肥大性障害、関節障害、内分泌障害、自己免疫疾患、増殖性疾患、外傷性損傷を治療するための、獣医学的使用のための、請求項15に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
化粧品または審美用品における、請求項15に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化されていない産物を本質的に含まない活性化クロストリジウム神経毒を生産する方法、このようなものを含む組成物および療法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム属(Clostridia)の細菌は、高度に強力な特異的なタンパク質毒素を産生し、これは、送達されるニューロンおよびその他の細胞を毒することができる。このようなクロストリジウム毒素の例として、C.テタニ(tetani)によって(TeNT)、およびC.ボツリヌス(botulinum)血清型A〜Gによって産生される神経毒(BoNT)ならびにC.バラティ(baratii)およびC.ブチリカム(butyricum)によって産生されるものが挙げられる。
【０００３】
クロストリジウム神経毒のうちいくつかは、公知の毒素の中で最も強力な毒素である。例として、ボツリヌス神経毒は、血清型に応じて0.5〜5ng/kgの範囲のマウスの半致死量(LD50)値を有する。破傷風毒素およびボツリヌス毒素の両方とも、冒されたニューロンの機能、具体的には、神経伝達物質の放出を阻害することによって作用する。ボツリヌス毒素は、神経筋接合部で作用し、末梢神経系においてコリン作動性伝達を阻害するが、破傷風毒素は、中枢神経系において作用する。
【０００４】
天然では、クロストリジウム神経毒は、単鎖ポリペプチドとして合成され、これがタンパク質切断事象によって翻訳後修飾されて、ジスルフィド結合によって一緒に連結された2つのポリペプチド鎖を形成する。切断は、鎖間ジスルフィド結合を提供するシステイン残基間に位置する、活性化部位と呼ばれることが多い特定の切断部位で起こる。神経毒の最も活性な形態は、この二本鎖形態である。2つの鎖は、およそ100kDaの分子量を有する重鎖(H鎖)およびおよそ50kDaの分子量を有する軽鎖(L鎖)と呼ばれる。H鎖は、N末端転位置成分(HNドメイン)およびC末端ターゲッティング成分(HCドメイン)を含む。切断部位は、L鎖および転位置ドメイン成分の間に位置する。HCドメインのその標的ニューロンとの結合およびエンドソームによる結合された毒素の細胞への内部移行後、HNドメインは、L鎖をエンドソーム膜を横断してサイトゾル中に転位置し、L鎖は、プロテアーゼ機能を提供する(非細胞傷害性プロテアーゼとしても知られる)。
【０００５】
非細胞傷害性プロテアーゼは、SNAREタンパク質として知られる細胞内輸送タンパク質(例えば、SNAP-25、VAMPまたはシンタキシン)をタンパク分解性に切断することによって作用する-Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと。頭字語SNAREは、可溶性NSF付着受容体(Soluble NSF Attachment Receptor)に由来し、ここで、NSFは、N-エチルマレイミド感受性因子を意味する。SNAREタンパク質は、細胞内小胞融合に、従って、細胞からの小胞輸送による分子の分泌に不可欠である。プロテアーゼ機能は、亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性であり、SNAREタンパク質に対して高い基質特異性を示す。したがって、ひとたび所望の標的細胞に送達されると、非細胞傷害性プロテアーゼは、標的細胞からの細胞性分泌を阻害可能である。クロストリジウム神経毒のL鎖プロテアーゼは、SNAREタンパク質を切断する非細胞傷害性プロテアーゼである。
【０００６】
SNAREタンパク質の遍在性を考慮して、ボツリヌス毒素などのクロストリジウム神経毒は、広範な療法において成功裏に使用されてきた。
【０００７】
例として、本発明者らは、いくつかの治療的および美容的または審美的適用においてニューロンの伝達を阻害するための、ボツリヌス神経毒(BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FおよびBoNT/Gならびにテタヌス神経毒(TeNT)などのクロストリジウム神経毒の使用を説明する、William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004) に言及する-例えば、市販のボツリヌス毒素製品は、現在、限局性痙縮、上肢痙縮、下肢痙縮、頸部ジストニア、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、腋窩の発汗過多、慢性片頭痛、神経因性排尿筋活動過剰、眉間の皴および重度の外眼角の皴を含む適応症の治療薬として承認されている。さらに、クロストリジウム神経毒療法は、神経筋障害を治療するために(US6,872,397を参照のこと)、子宮障害を治療するために(US2004/0175399を参照のこと)、潰瘍および胃食道逆流症を治療するために(US2004/0086531を参照のこと)、ジストニアを治療するために(US6,319,505を参照のこと)、眼の障害を治療するために(US2004/0234532を参照のこと)、眼瞼痙攣を治療するために(US2004/0151740を参照のこと)、斜視を治療するために(US2004/0126396を参照のこと)、疼痛を治療するために(US6,869,610、US6,641,820、US6,464,986およびUS6,113,915を参照のこと)、線維筋痛症を治療するために(US6,623,742、US2004/0062776を参照のこと)、腰痛を治療するために(US2004/0037852を参照のこと)、筋傷害を治療するために(US6,423,319を参照のこと)、副鼻腔炎性頭痛を治療するために(US6,838,434を参照のこと)、緊張性頭痛を治療するために(US6,776,992を参照のこと)、頭痛を治療するために(US6,458,365を参照のこと)、片頭痛疼痛の低減のために(US5,714,469を参照のこと)、心血管疾患を治療するために(US6,767,544を参照のこと)、パーキンソン病などの神経疾患を治療するために(US6,620,415、US6,306,403を参照のこと)、精神神経疾患を治療するために(US2004/0180061、US2003/0211121を参照のこと)、内分泌障害を治療するために(US6,827,931を参照のこと)、甲状腺障害を治療するために(US6,740,321を参照のこと)、コリン作動性に影響を受けた汗腺の障害を治療するために(US6,683,049を参照のこと)、糖尿病を治療するために(US6,337,075、US6,416,765を参照のこと)、膵臓障害を治療するために(US6,261,572、US6,143,306を参照のこと)、骨腫瘍などの癌を治療するために(US6,565,870、US6,368,605、US6,139,845、US2005/0031648を参照のこと)、耳の障害を治療するために(US6,358,926、US6,265,379を参照のこと)、胃腸筋肉障害およびその他の平滑筋機能不全などの自律神経性障害を治療するために(US5,437,291を参照のこと)、皮膚細胞増殖性障害と関連する皮膚病変を治療するために(US5,670,484を参照のこと)、神経性炎症性障害の管理のために(US6,063,768を参照のこと)、脱毛を減少させ、発毛を刺激するために(US6,299,893を参照のこと)、下向きに曲がった口を治療するために(US6,358,917を参照のこと)、食欲を低減するために(US2004/40253274を参照のこと)、歯科治療および処置のために(US2004/0115139を参照のこと)、神経筋障害および状態を治療するために(US2002/0010138を参照のこと)、種々の障害および状態および関連する疼痛を治療するために(US2004/0013692を参照のこと)、喘息およびCOPDなどの粘液分泌過多に起因する状態を治療するために(WO00/10598を参照のこと)ならびに炎症、内分泌状態、外分泌状態、免疫学的状態、心血管の状態、骨の状態などの非神経性状態を治療す���ために(WO01/21213を参照のこと)記載されている。上記の刊行物のすべては、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０００８】
ヒトおよびその他の哺乳動物の治療的および美容的処置における、クロストリジウム神経毒(例えば、BoNTおよびTeNT)などの非細胞傷害性プロテアーゼの使用は、これらの毒素の特性から利益を受け得る疾患および病気の絶えず広がる範囲へと拡大すると予測される。
【０００９】
伝統的に、クロストリジウム神経毒の製造は、C.ボツリヌス(botulinum)菌の培養と、それに続くクロストリジウム神経毒複合体の単離および精製によって実施される。しかし、C.ボツリヌス(botulinum)は、胞子形成菌であり、従って、大腸菌(E.coli)などの細菌の培養には必要ではない専門的な培養装置および施設を必要とする。したがって、クロストリジウム神経毒の増大する使用は、クロストリジウム神経毒を生産および精製するための代替の及び/又は改善された方法の必要性につながった。
【００１０】
クロストリジウム神経毒は、最初に、単鎖ポリペプチドとして発現される。十分に活性であるために、単鎖形態は、二本鎖形態に変換されなければならず、これは、軽鎖および重鎖の間に位置する部位(「活性化ループ(activation loop)」)でのタンパク質切断を必要とする。クロストリジウム神経毒のin vitro活性化は、適したプロテアーゼの添加によって達成され得る。しかし、十分な活性化が達成される前に、活性化ループの外側の部位で不要なタンパク質分解活性が頻繁に起こり、望ましくない「切断型(truncated)」(または「過剰活性化された(overactivated)」)産物の形成をもたらすことが当技術分野で頻発する問題である。このような産物の形成は、活性化二本鎖クロストリジウム神経毒が、医薬製剤として使用されるために意図される場合には、高度に純粋な機能的な調製物が必要とされるので特に問題となる。
【００１１】
問題に対する公開された解決策は、BoNTアミノ酸配列のいくつかの形態の配列修飾を必要とし、例として、活性化ループ内の特定のプロテアーゼ認識部位の挿入、それによるその配列の変更が挙げられる。
【００１２】
例えば、WO0114570には、BoNTタンパク質をコードする組換え核酸分子が記載されている。しかし、WO0114570の核酸分子は、天然切断部位を非天然切断部位と置換するように修飾されている。したがって、WO0114570の方法はまた、非天然切断部位の挿入が最適BoNT発現にとって必要であることを教示する。
【００１３】
US20080103098には、二本鎖形態で組換えBoNTタンパク質を生産するための方法であって、大腸菌(E.coli)宿主細胞における組換え核酸構築物の発現を含む方法が記載されている。しかし、前記方法は、神経毒のループドメインへの特定の非天然(すなわち、非クロストリジウム)ペンタペプチド配列の挿入を必要とする。挿入されたペンタペプチド配列は、細胞溶解の際に内因性大腸菌(E.coli)プロテアーゼによって切断される活性化切断部位を形成する。したがって、US20080103098の方法は、最適BoNT発現を達成するために、BoNT配列は、非天然切断部位の挿入によって修飾されなければならないことを教示する。
【００１４】
WO2010094463には、タンパク分解性にプロセシングされていない及び/又は部分プロセシングされたBoNTに対する抗体の使用を必要とする、プロセシングされていない、または部分プロセシングされたBoNTからプロセシングされたBoNTを分離するためのプロセスが記載されている。
【００１５】
WO2012020057に記載される別のアプローチは、軽鎖および重鎖の間への、プロテアーゼ切断部位と隣接している、物理化学的特性を付与する修飾されたリンカーの挿入に基づいている。リンカーの物理化学的特性は、プロセシングされた(活性化された)BoNTから、部分プロセシングされたまたはプロセシングされていないBoNTの分離を可能にしなくてはならないなどである。
【００１６】
したがって、当技術分野では、外因性配列の挿入によらない、全長活性化クロストリジウム神経毒の本質的に純粋な、生物学的に活性な調製物を生産するための方法が必要である。本発明は、クロストリジウム神経毒アミノ酸配列を修飾する必要性を避ける、または精製タグを使用する特許請求の範囲において明記されるような新規方法を提供することによってこの問題を解決する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】WO01/14570号公報
【特許文献２】WO2010/094463号公報
【発明の概要】
【００１８】
第1の態様によれば、本発明は、活性化クロストリジウム神経毒を生産するための方法であって、単鎖クロストリジウム神経毒ポリペプチドの少なくとも90％が二本鎖形態に変換されるまで、単鎖クロストリジウム神経毒を、活性化酵素と接触させることを含む方法を提供する。
【００１９】
第2の態様において、本発明は、本発明の方法によって得られる活性二本鎖クロストリジウム神経毒を提供する。
【００２０】
第3の態様では、本発明は、単鎖クロストリジウム神経毒を本質的に含まない本発明の活性二本鎖クロストリジウム神経毒を含む医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、反直観的アプローチによるクロストリジウム神経毒の生物学的に活性な全長の本質的に純粋な調製物の製造のための方法に関する。
【００２２】
クロストリジウム神経毒の本質的に純粋な調製物を生産するという問題に対する直観的解決策は、最小量の切断型産物が形成されるように活性化プロセスの条件を調整することである。しかし、本発明者らは、このようなアプローチを使用することは、ある割合の切断されていない(活性化されていない)ままのクロストリジウム神経毒をもたらすことを見い出した。言い換えれば、このようなプロセスは、全長活性化クロストリジウム神経毒産物、全長の活性化されていない(単鎖)クロストリジウム神経毒産物、および切断型クロストリジウム神経毒産物の混合物をもたらす。これに関して、全長の活性化されていないおよび切断型活性化産物は望ましくなく、活性化二本鎖クロストリジウム神経毒が医薬製剤として使用するために意図される場合には一層さらにそうであることを注記することは重要である。したがって、このような望ましくない産物は、製造プロセスのその後の工程の間に除去されなければならない。
【００２３】
本発明者らは、全長活性化クロストリジウム神経毒(二本鎖)を、全長の活性化されていないクロストリジウム神経毒(単鎖)から分離することは極めて困難であることをさらに見い出した。
【００２４】
本発明者らは、驚くべきことに、活性化工程が、全長の活性化されていない産物が本質的に残らない後期段階に進行することを可能にすることによって、その後の精製工程において不要な副産物(過剰活性化された、または切断型産物)を除去することをより容易にすることを見い出した。
【００２５】
理論に捉われようとは思わないが、全長活性化クロストリジウム・ボツリヌス(clostridial botulinum)毒素を、全長の活性化されていないボツリヌス毒素から分離することに関して遭遇される困難は、全長活性化ボツリヌス毒素と全長の活性化されていないボツリヌス毒素の間の不十分な利用可能な物理化学的相違によると仮定される。不要な切断型クロストリジウム神経毒副産物は、産物間の一次アミノ酸配列の変化のために、活性化全長クロストリジウム神経毒と比較してより大きな物理化学的相違を有することがさらに仮定される。これらのより大きな物理化学的相違は、全長活性化クロストリジウム神経毒の分離を達成し、療法において使用するのに適した本質的に純粋な産物を得るために、当技術分野で公知の精製技術、例えば、カラムクロマトグラフィーによって利用することができる。
【００２６】
したがって、第1の態様において、活性化クロストリジウム神経毒を生産するための方法であって、単鎖クロストリジウム神経毒ポリペプチドの90％超が二本鎖形態に変換されるまで、単鎖クロストリジウム神経毒を活性化酵素と接触させることを含む方法が提供される。
【００２７】
好ましくは、単鎖クロストリジウム神経毒を、単鎖クロストリジウム神経毒ポリペプチドの95％超が、二本鎖形態に変換されるまで活性化酵素と接触させる。より好ましくは、単鎖クロストリジウム神経毒を、単鎖クロストリジウム神経毒ポリペプチドの96％超、97％超、98％超、99％超、99.5％超、99.9％超または100％が二本鎖形態に変換されるまで活性化酵素と接触させる。
【００２８】
用語「活性クロストリジウム神経毒」とは、本明細書において、標的細胞と結合し、前記細胞中に内部移行され、前記細胞からの神経伝達物質のSNARE駆動性分泌を阻害することが可能であるクロストリジウム神経毒を指す。クロストリジウム神経毒の生物活性のレベルは、クロストリジウム神経毒が二本鎖(または「活性化された」)形態にある場合に、単鎖形態にある場合よりもかなり高いことは当技術分野で周知である。したがって、生物学的に活性なクロストリジウム神経毒は、好ましくは、二本鎖(または「活性化された」)クロストリジウム神経毒である。
【００２９】
用語「活性化」とは、本明細書において、単鎖クロストリジウム神経毒ポリペプチドの二本鎖(または活性)形態への変換を指す。
【００３０】
「活性化酵素」(または「活性化プロテアーゼ」)とは、本明細書において、十分に活性な二本鎖クロストリジウム神経毒(または「活性化クロストリジウム神経毒」)の形成を可能にするなどのために、クロストリジウム神経毒軽鎖と重鎖の間に位置する部位(当技術分野で、「活性化ループ」と呼ばれる)で単鎖クロストリジウム神経毒を切断可能であるエンドペプチダーゼを意味する。
【００３１】
本発明に適した活性化酵素の例として、トリプシン、Lys-C、Lys-Nおよびアルギニルエンドペプチダーゼ(エンドプロテアーゼArg-C、LeR)などのシステイン、セリンおよびメタロプロテアーゼファミリーのメンバーならびに出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とするEP2524963A1に開示されるような活性BoNT加水分解酵素が挙げられる。
【００３２】
好ましい実施形態では、活性化酵素は、トリプシンである。
【００３３】
最も好ましい実施形態では、活性化酵素は、ウシトリプシンである。
【００３４】
本発明者らは、実際、ウシトリプシンは、その他の供給源のトリプシン、例えば、ブタトリプシンよりも、ボツリヌス神経毒を活性化するのに適していることを見い出した。実際、本発明者らは、ウシトリプシンを用いた場合、完全活性化は、ブタトリプシンが使用される場合と比較して、極めて少ない望ましくない切断型産物の発生を伴って達成され得ることを見い出した。
【００３５】
ブタトリプシンアミノ酸配列は、最もよく使用される組換えGMP等級トリプシン配列であり、この目的のための明らかなトリプシン供給源であると思われるという事実を鑑みると、これは本発明者らにとって驚くべき知見となった。実際、療法において使用されるように運命づけられたGMP等級クロストリジウム神経毒の製造のためには、GMP等級の動物不含原材料を使用することが望ましい。
【００３６】
好ましい実施形態では、活性化酵素は、GMP等級トリプシン、より好ましくは、GMP等級ウシトリプシン、より好ましくは、さらにGMP等級組換えウシトリプシンなどのGMP等級酵素である。「GMP等級」とは、GMP(優良医薬品製造基準(Good Manufacturing Practices))製造における使用に適している品質基準に、およびトレーサビリティーを有して製造されることを意味する。
【００３７】
好ましい実施形態では、活性化酵素は、ウシ膵臓(TPCK処理または非TPCK処理)から得られた天然トリプシンまたは組換えウシトリプシンなどのウシトリプシンである。
【００３８】
本発明によれば、ウシトリプシンは、配列番号1(UniProtKB受託番号P00760)に対して、少なくとも90％、例えば、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％の同一性を有するタンパク質である。
【００３９】
ウシトリプシンは、任意の適した供給源から得ることが可能である場合もあり、例えば、Applied Biotechnology Institute(TrypZean(登録商標))から市販されている。あるいは、ウシトリプシンは、配列番号1と少なくとも90％の同一性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列の組換え発現によって得ることができる。
【００４０】
本発明者らはまた、BoNT/Eの活性化ループに対するウシトリプシンの特異性は、pH6〜7あたりでより高いことを見い出した。トリプシンの性能は、約pH8で最適であると当技術分野で広く知られているので、この結果は予期しないものであった。
【００４１】
好ましい実施形態では、単鎖クロストリジウム神経毒をウシトリプシンと接触させる工程を、5から7.5の間、好ましくは、6から7の間のpHで、例えば、およそ6.5のpHで実施する。
【００４２】
単鎖クロストリジウム神経毒を、活性化酵素、好ましくは、トリプシンと接触させる工程は、10〜50時間の期間、好ましくは、15から30時間の持続時間、例えば、約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30時間実施することが好ましい。
【００４３】
単鎖クロストリジウム神経毒を、トリプシンと接触させる工程は、室温(または周囲温度)であることが好ましい。室温は、通常、16から27℃の間、好ましくは、18から25℃の間、例えば、約18、19、20、21、22、23、24または25℃である。
【００４４】
トリプシンの濃度は、通常、1mgのクロストリジウム神経毒あたり0.5から50μgの間、好ましくは、1mgのクロストリジウム神経毒あたり1から20μgの間、より好ましくは、1mgのクロストリジウム神経毒あたり2から10μgの間、例えば、1mgのクロストリジウム神経毒あたり約2、3、4、5、6、7、8、9または10μgのトリプシンである。
【００４５】
トリプシンの濃度は、USP(米国薬局方)単位で表わすことができ、この場合には、通常、1mgのクロストリジウム神経毒あたり1から500USP単位の間、好ましくは、1mgのクロストリジウム神経毒あたり3から100USP単位の間、より好ましくは、1mgのクロストリジウム神経毒あたり5から50USP単位の間、例えば、1mgのクロストリジウム神経毒あたり約5、7.5、10、12.5、15、20、25、30、35、40、45または50USP単位のトリプシンである。
【００４６】
好ましい実施形態によれば、単鎖クロストリジウム神経毒を、トリプシンと接触させる工程は、室温で6から7の間のpHで、1mgのクロストリジウム神経毒あたり1から20μgの間の濃度のウシトリプシンを用いて、15から30時間の持続時間実施する。
【００４７】
別の好ましい実施形態によれば、単鎖クロストリジウム神経毒を、トリプシンと接触させる工程は、室温で、6から7の間のpHで、1mgのクロストリジウム神経毒あたり3から100USP単位の間の濃度のウシトリプシンを用いて、15から30時間の持続時間実施する。
【００４８】
本発明の実施形態によれば、方法は、切断型(過剰活性化された)クロストリジウム神経毒、特に、切断型二本鎖クロストリジウム神経毒を除去する工程をさらに含む。
【００４９】
用語「切断型二本鎖クロストリジウム神経毒」(または「不要な副産物」または「過剰活性化されたクロストリジウム神経毒」)とは、2つ以上の部位での、及び/又は活性化ループの外側の部位での単鎖ボツリヌス神経毒の切断から得られた産物を指す。
【００５０】
このような工程は、例えば、得られた二本鎖クロストリジウム神経毒を、適したクロマトグラフィー樹脂と接触させることによって実施できる。適したクロマトグラフィー樹脂の一例として、混合様式クロマトグラフィー樹脂(mixed mode chromatography resin)がある。適した混合様式クロマトグラフィー樹脂の一例として、セラミックハイドロキシアパタイト(CHT)II型40ミクロン樹脂(BioRad)がある。
【００５１】
多数の異なる種類のクロストリジウム神経毒が、本発明において使用するのに適している。したがって、本発明との関連において、用語「クロストリジウム神経毒」(または「クロストリジウム毒素」)は、C.ボツリヌス(botulinum)によって産生される毒素(ボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、FおよびG)、C.テタニ(tetani)によって産生される毒素(テタヌス神経毒)、C.ブチリカム(butyricum)によって産生される毒素(ボツリヌス神経毒血清型E)およびC.バラティ(baratii)によって産生される毒素(ボツリヌス神経毒血清型F)ならびに修飾されたクロストリジウム神経毒または前記のいずれかに由来する誘導体を包含する。用語「クロストリジウム神経毒」はまた、天然に存在するボツリヌス神経毒ハイブリッド、モザイクおよびキメラを包含する。
【００５２】
したがって、一実施形態では、本発明のクロストリジウム神経毒または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、クロストリジウム・ボツリヌス(Clostridia botulinum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridia tetani)、クロストリジウム・バラティ(Clostridia baratii)およびC.ブチリカム(butyricum)からなる群から選択される1つ以上のクロストリジウム属(Clostridia)から取得可能である場合もある。
【００５３】
ボツリヌス神経毒(BoNT)は、BoNT自体と複合体を形成しているいくつかのアクセサリータンパク質からなる大きなタンパク質複合体の形態でC.ボツリヌスによって産生される。現在、7種の異なるクラスのボツリヌス神経毒、すなわち、ボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、FおよびGがあり、そのすべてが、同様の構造および作用様式を共有する。異なるBoNT血清型は、特異的な中和抗血清による不活性化に基づいて区別することができ、血清型によるこのような分類は、アミノ酸レベルでの配列同一性百分率と相関している。所与の血清型のBoNTタンパク質は、アミノ酸配列同一性百分率に基づいて異なる亜型にさらに分けられる。
【００５４】
適宜、本発明のクロストリジウム神経毒または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、ボツリヌス神経毒(BoNT)、好ましくは、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FおよびBoNT/Gからなる群から選択される1つ以上のBoNTであり得る。
【００５５】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Aであり得る。参照BoNT/A配列は、UniProtKB受託番号P10845(配列番号2)を有する。
【００５６】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Bであり得る。参照BoNT/B配列は、UniProtKB受託番号P10844(配列番号3)を有する。
【００５７】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Cであり得る。参照BoNT/C1配列は、UniProtKB受託番号P18640(配列番号4)を有する。
【００５８】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Dであり得る。参照BoNT/D配列は、UniProtKB受託番号P19321(配列番号5)を有する。
【００５９】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Eであり得る。参照BoNT/E配列は、UniParc I.D UPI00000010A3(配列番号6)を有する。
【００６０】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Fであり得る。参照BoNT/F配列は、UniProtKB受託番号YP_001390123(配列番号7)を有する。
【００６１】
別の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Gであり得る。参照BoNT/G配列は、UniProtKB受託番号Q60393(配列番号8)を有する。
【００６２】
一実施形態では、クロストリジウム神経毒は、TeNTであり得る。参照TeNT配列は、UniProtKB受託番号P04958(配列番号9)を有する。
【００６３】
一実施形態では、本発明のクロストリジウム神経毒または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、BoNT/E活性化ループを含む。BONT/E活性化ループは、配列番号10:「CKNIVSVKGIRKSIC」(配列番号6のアミノ酸残基C412〜C426に対応する)を含むと定義され得る、または1、2、3、4もしくは5つのアミノ酸残基挿入、欠失もしくは置換によって配列番号10とは異なっている配列を含むと定義され得る。
【００６４】
一実施形態では、BONT/E活性化ループは、配列番号10からなる配列を有する。別の実施形態では、BONT/E活性化ループは、1つのアミノ酸残基挿入、欠失または置換によって配列番号10とは異なっている配列を有する。別の実施形態では、BONT/E活性化ループは、2つのアミノ酸残基挿入、欠失または置換によって配列番号10とは異なっている配列を有する。別の実施形態では、BONT/E活性化ループは、3つのアミノ酸残基挿入、欠失または置換によって配列番号10とは異なっている配列を有する。別の実施形態では、BONT/E活性化ループは、4つのアミノ酸残基挿入、欠失または置換によって配列番号10とは異なっている配列を有する。別の実施形態では、BONT/E活性化ループは、5つのアミノ酸残基挿入、欠失または置換によって配列番号10とは異なっている配列を有する。
【００６５】
好ましい実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/E、例えば、配列番号6に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％同一であるアミノ酸配列を有するBoNT/Eである。
【００６６】
用語「クロストリジウム神経毒」はまた、修飾クロストリジウム神経毒およびその誘導体を包含するものとし、以下に記載されるものを含むがそれに限定されない。修飾クロストリジウム神経毒または誘導体は、クロストリジウム神経毒の天然(非修飾)形態と比較して、修飾されている1個以上のアミノ酸を含有し得る、またはクロストリジウム神経毒の天然(非修飾)形態には存在しない1個以上の挿入されたアミノ酸を含有し得る、またはクロストリジウム神経毒の天然(非修飾)形態と比較して、1個以上の欠失されたアミノ酸を有し得る。例として、修飾クロストリジウム神経毒は、天然(非修飾)クロストリジウム神経毒配列に対して、1つ以上のドメイン中に修飾されたアミノ酸配列を有し得る。このような修飾は、神経毒の機能面、例えば、生物活性または生物学的持続(biological persistence)を修飾し得る。
【００６７】
修飾クロストリジウム神経毒は、重鎖のアミノ酸配列中に1つ以上の修飾を有してもよく(修飾HCドメインなど)、前記修飾重鎖は、天然(非修飾)クロストリジウム神経毒よりも高いまたは低い親和性で、標的神経細胞と結合する。HCドメイン中のこのような修飾は、標的神経細胞のガングリオシド受容体及び/又はタンパク質受容体との結合を変更する、HCドメインのガングリオシド結合部位中に、またはタンパク質(SV2またはシナプトタグミン)結合部位中に修飾する残基を含み得る。このような修飾クロストリジウム神経毒の例は、WO2006/027207およびWO2006/114308に記載されており、それらの両方ともその全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
修飾クロストリジウム神経毒は、軽鎖のアミノ酸配列中に1つ以上の修飾、例えば、修飾LCのSNAREタンパク質特異性を変更または修飾し得る基質結合または触媒ドメイン中の修飾を有し得る。このような修飾クロストリジウム神経毒の例は、WO2010/120766およびUS2011/0318385に記載されており、それらの両方ともその全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
修飾クロストリジウム神経毒は、修飾クロストリジウム神経毒の生物活性及び/又は生物学的持続を増大または低減する1つ以上の修飾を含み得る。
【００７０】
用語「クロストリジウム神経毒」は、キメラ(またはハイブリッド)クロストリジウム神経毒を包含するものとする。キメラクロストリジウム神経毒は、ある種のクロストリジウム神経毒またはその亜型に由来する軽鎖の少なくとも一部および別のクロストリジウム神経毒または亜型に由来する重鎖の少なくとも一部を含む。
【００７１】
一実施形態では、キメラクロストリジウム神経毒は、あるタイプのクロストリジウム神経毒または亜型に由来する軽鎖全体および別のクロストリジウム神経毒のタイプまたは亜型に由来する重鎖を含有し得る。別の実施形態では、キメラクロストリジウム神経毒は、あるタイプのクロストリジウム神経毒または亜型の重鎖の一部(例えば、結合ドメイン)を含有し、重鎖の別の部分は、別のクロストリジウム神経毒のタイプまたは亜型に由来し得る。同様にまたはあるいは、治療要素は、異なるクロストリジウム神経毒のタイプまたは亜型に由来する軽鎖部分を含み得る。このようなハイブリッドまたはキメラクロストリジウム神経毒は、例えば、このようなクロストリジウム神経毒の治療上の利点を、所与のクロストリジウム神経毒亜型に対して免疫学的に耐性である患者に、所与のクロストリジウム神経毒重鎖結合ドメインに対して平均より低い濃度の受容体を有し得る患者に、または膜もしくは小胞毒素基質(例えば、SNAP-25、VAMPおよびシンタキシン)のプロテアーゼ耐性変異体を有し得る患者に届ける手段として有用である。ハイブリッドおよびキメラクロストリジウム神経毒は、US8,071,110に、およびGB1607901.4(まだ公開されていない)に記載されており、これらの刊行物は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、一実施形態では、本発明の方法または使用に従う精製のためのクロストリジウム神経毒は、改変クロストリジウム神経毒であってもよく、適宜、改変キメラクロストリジウム神経毒であってもよい。
【００７２】
用語「クロストリジウム神経毒」とは、再標的化クロストリジウム神経毒を包含するものとする。再標的化クロストリジウム神経毒では、クロストリジウム神経毒は、ターゲティング部分(TM)として知られる外因性リガンドを含むように修飾される。TMは、所望の標的細胞に対する結合特異性を提供するように選択され、再標的化プロセスの一部として、クロストリジウム神経毒の天然結合部分(例えば、HCドメインまたはHCCドメイン)が除去され得る。再標的化技術は、例えば、EP-B-0689459、WO1994/021300、EP-B-0939818、US6,461,617、US7,192,596、WO1998/007864、EP-B-0826051、US5,989,545、US6,395,513、US6,962,703、WO1996/033273、EP-B-0996468、US7,052,702、WO1999/017806、EP-B-1107794、US6,632,440、WO2000/010598、WO2001/21213、WO2006/059093、WO2000/62814、WO2000/04926、WO1993/15766、WO2000/61192およびWO1999/58571に記載されており、それらのすべては、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、一実施形態では、本発明において使用するための改変クロストリジウム神経毒は、改変された再標的化クロストリジウム神経毒であり得る。
【００７３】
本発明はまた、「破壊性切断部位」を含むクロストリジウム神経毒の使用も包含する。前記クロストリジウム神経毒では、非天然プロテアーゼ切断部位は、選択された位置でクロストリジウム神経毒中に組み込まれ、その結果、前記部位での切断は、クロストリジウム神経毒の活性を低減するか、または不活性化する。破壊性プロテアーゼ切断部位は、クロストリジウム神経毒が、投与後に、非標的位置に移動する事象において、局所プロテアーゼによる切断に対して感受性であり得る。適した非天然プロテアーゼ切断部位として、上記のものが挙げられる。破壊性切断部位を含むクロストリジウム神経毒は、WO2010/094905およびWO2002/044199に記載されており、それらの両方ともその全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
好ましい実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、天然に存在するクロストリジウム神経毒複合体中に存在する複合体形成タンパク質を含まない。
【００７５】
一実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、配列番号2、3、4、5、6、7、8もしくは9として示されるポリペプチド配列またはそれらに対して少なくとも65％もしくは70％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。
【００７６】
一実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、配列番号2、3、4、5、6、7、8もしくは9として示されるポリペプチド配列またはそれらに対して少なくとも75％もしくは80％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。
【００７７】
一実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、配列番号2、3、4、5、6、7、8もしくは9として示されるポリペプチド配列またはそれらに対して少なくとも85％もしくは90％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。
【００７８】
一実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、配列番号2、3、4、5、6、7、8もしくは9として示されるポリペプチド配列またはそれらに対して少なくとも95％もしくは99％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。
【００７９】
好ましい実施形態では、本発明の、または本発明において使用するためのクロストリジウム神経毒は、配列番号6として示されるポリペプチド配列またはそれらに対して少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【００８０】
2種以上の核酸またはアミノ酸配列間の「配列同一性パーセント」は、複数の配列によって共有される同一位置の数の関数である。したがって、同一性％は、ヌクレオチド/アミノ酸の総数によって除され、100が乗じられた、同一ヌクレオチド/アミノ酸の数として算出され得る。配列同一性％の算出はまた、2種以上の配列のアラインメントを最適化するために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さも考慮し得る。2種以上の配列間の配列比較および同一性パーセントの決定を、当業者によく知られるBLASTなどの特定の数学的アルゴリズムを使用して実施できる。
【００８１】
一実施形態では、本発明において使用するための単鎖クロストリジウム神経毒は、細菌、昆虫、酵母、微生物、哺乳動物もしくは植物細胞などの異種宿主細胞において、または無細胞系において単鎖クロストリジウム神経毒をコードする遺伝子を発現させることによって得られる。異種宿主細胞は、大腸菌(E.coli)であることが好ましい。
【００８２】
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって取得可能な活性二本鎖クロストリジウム神経毒を提供する。
【００８３】
別の態様では、本発明は、本発明の活性二本鎖クロストリジウム神経毒を含む医薬組成物を提供し、前記組成物は、単鎖クロストリジウム神経毒を本質的に含まない。
【００８４】
用語「本質的に純粋な」または「本質的に含まない」とは、本明細書において、望ましくない混入物(または副産物)のレベルが、10％未満、例えば、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満または0.1％未満であることを意味する。
【００８５】
好ましい実施形態実施形態では、本発明の医薬組成物は、10％未満、例えば、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満または0.1％未満の単鎖クロストリジウム神経毒を含む。
【００８６】
より好ましい一実施形態では、本発明の医薬組成物は、10％未満、例えば、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満または0.1％未満の切断型(過剰活性化された)クロストリジウム神経毒をさらに含む。
【００８７】
好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、5％未満の単鎖クロストリジウム神経毒および5％未満の切断型二本鎖クロストリジウム神経毒を含む。
【００８８】
より好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、1％未満の単鎖クロストリジウム神経毒および1％未満の切断型二本鎖クロストリジウム神経毒を含む。
【００８９】
より好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、0.1％未満の単鎖クロストリジウム神経毒および0.1％未満の切断型二本鎖クロストリジウム神経毒を含む。
【００９０】
単鎖、二本鎖および切断型二本鎖クロストリジウム神経毒の相対量は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、SDS-PAGEとそれに続いてデンシトメトリー解析を使用して相対量を決定することによって(実施例1を参照のこと)、キャピラリー電気泳動によって、または純度の評価のためのUPLC(Ultra-Performance Liquid Chromatography(超高性能液体クロマトグラフィー))法(サイズ排除、イオン交換、逆相、疎水性相互作用クロマトグラフィー)によって評価できる。
【００９１】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、療法において使用するためのものである。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、筋肉障害、神経筋障害、神経学的障害、眼科的(ophtalmological)障害、疼痛障害、心理学的障害、関節障害、炎症性障害、内分泌障害および泌尿器系障害から選択される疾患、状態または症候群を治療または予防するために使用できる、例えば、
・眼瞼痙攣、斜視(拘束性または筋原性斜視を含む)、弱視、動揺視、保護性眼瞼下垂、角膜保護のための治療的眼瞼下垂、眼振、内斜視(estropia)、複視、眼瞼内反、眼瞼後退、眼窩筋疾患、眼球斜位、付随するミスアライメント、付随しないミスアライメント、原発性または続発性内斜視または外斜視、核間性眼筋麻痺、斜偏位、デュアン斜偏位および上部眼瞼後退からなる群から選択される眼科的障害、
・片側顔面痙攣、斜頸、小児のまたは成体の痙攣性(例えば、脳性麻痺、脳卒中後、多発性硬化症、外傷性脳傷害または脊髄損傷患者における)、特発性局所性ジストニア、筋肉硬直、書痙、手のジストニア、第VI神経麻痺、顎口腔ジストニア、頭部振戦、遅発性ジスキネジア、遅発性ジストニア、職業性筋痙攣(ミュージシャンの筋痙攣を含む)、顔面神経麻痺、顎閉鎖痙攣、顔面痙攣、共同運動、振戦、原発性筆記時振戦、ミオクロヌス、全身硬直症候群、足のジストニア、顔面麻痺、痛みを伴う腕と動く指症候群、チック障害、ジストニア性チック、トゥレット症候群、神経性筋強直症、下顎の震え、外直筋麻痺、ジストニア性の足の反転、顎ジストニア、ウサギ症候群、小脳振戦、第III神経麻痺、口蓋ミオクロヌス、アカシジア(akasthesia)、筋肉筋痙攣、第IV神経麻痺、すくみ足、伸筋体幹ジストニア、顔面神経麻痺後共同運動、続発性ジストニア、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、てんかん、オフピリオドジストニア、頭テタヌス、ミオキミアおよび良性筋痙攣繊維束化症候群を含む運動障害、
・痙攣性発声障害、耳の障害、難聴、耳のクリック音(ear click)、耳鳴、回転性めまい、メニエール病、蝸牛神経機能不全、吃音、輪状咽頭嚥下障害、歯ぎしり、慢性吸入における喉頭の閉鎖、声帯ヒダ肉芽腫、心室ジストニア、心室発声障害、変異的発声障害、開口障害、いびき、音声振戦、誤嚥、舌突出ジストニア、口蓋振戦、唇の咬傷、および喉頭ジストニア、ファーストバイト症候群を含む耳鼻咽喉科障害、
・アカラシア、肛門裂傷、便秘、顎関節機能不全、オディ括約筋機能不全、持続性オディ括約筋圧上昇、腸筋障害、恥骨直腸症候群、アニスム、幽門痙攣、胆嚢機能不全、胃腸または食道運動性機能不全、びまん性食道痙攣および胃不全麻痺を含む胃腸障害、
・排尿筋括約筋共同運動障害、排尿筋過反射、神経因性膀胱機能不全(例、パーキンソン病、脊髄損傷、脳卒中または多発性硬化症患者における)、過活性膀胱、神経原性排尿筋過活性、膀胱痙縮、尿失禁、尿貯留、肥大化膀胱頸部、排尿障害、間質性膀胱炎、腟痙、子宮内膜症、骨盤痛、前立腺肥大(良性前立腺肥大症)、前立腺痛、前立腺癌および持続勃起症を含む泌尿生殖器障害、
・皮膚細胞増殖性障害、皮膚創傷、乾癬、酒さ、ざ瘡を含む皮膚科学的障害、フォックス・フォアダイス症候群またはヘイリー・ヘイリー病などの稀な遺伝性皮膚障害、ケロイドおよび肥厚性瘢痕整復、毛穴の縮小、皮膚の炎症状態、皮膚の有痛性炎症状態、
・背痛(上部背痛、下部背痛)、筋筋膜疼痛、緊張性頭痛、線維筋痛症、有痛性症候群、筋肉痛、片頭痛、むち打ち症、関節痛、術後疼痛、筋痙攣を伴わない疼痛および平滑筋障害を伴う疼痛を含む疼痛障害、
・膵炎、神経原性炎症性障害(痛風、腱炎、滑液包炎、皮膚筋炎および強直性脊椎炎を含む)を含む炎症性障害、
・過剰な腺分泌、多汗症(腋窩多汗症、手掌多汗症およびフライ症候群を含む)、唾液分泌過多、流涎、臭汗症、粘液過剰分泌、過剰流涙、ホロクリン腺機能不全、過剰な皮脂分泌などの分泌障害、
・鼻炎(アレルギー性鼻炎を含む)、COPD、喘息および結核を含む呼吸障害、
・筋肉拡大、咬筋肥大、先端巨大症および筋肉痛を伴う神経原性脛骨前側肥大を含む肥大性障害、
・テニス肘(または肘の上顆炎(epicondilytis))、関節の炎症、股関節炎、変形性関節症、肩の回旋筋嚢の病理、関節リウマチおよび手根管症候群を含む関節障害、
・2型糖尿病、高グルカゴン血症(hyperglucagonism)、高インスリン症、低インスリン症、高カルシウム血症、低カルシウム血症、甲状腺障害(グレーブス病、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症および甲状腺機能低下症を含む)、上皮小体障害(副甲状腺機能亢進および副甲状腺機能低下症を含む)、Gushing症候群および肥満症のような内分泌障害、
・全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患、
・パラガングリオーマ腫瘍、前立腺癌および骨腫瘍を含む増殖性疾患、
・スポーツ損傷、筋肉損傷、腱創傷および骨折を含む外傷性損傷、ならびに
・獣医学的使用(例えば、哺乳動物の固定、ウマ疝痛、腹痛、動物アカラシアまたは動物筋痙縮)。例えば、皮膚の皴、特に、顔の皴線、眼の輪郭の皴、眉間の皴線などの顔面の皴、下向きに曲がった口を治療または予防するための化粧品または審美用品における本発明の医薬組成物の使用もまた、本発明の態様である。
【００９３】
本発明の医薬組成物はまた、審美用医薬において(すなわち、美容的外観を改善するために)、特に、皮膚の皴、特に、顔の皴線、眼の輪郭の皴、眉間の皴線などの顔面の皴、下向きに曲がった口、首の皴(広頸筋のバンド)、下顎の皴(オトガイ筋、橙皮状皮膚、窪んだ下顎)、前頭部の線、「かすり傷のある皮膚」の皴、鼻腔リフト治療または睡眠線(sleep lines)を治療または予防するために使用できる。
【００９４】
特に断りのない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994) およびHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、当業者に、本開示において使用される用語の多くの一般的な辞書を提供する。
【００９５】
本開示は、本明細書において開示される例示的方法および材料に制限されず、本明細書において記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施形態の実施または試験において使用することができる。数的範囲は、範囲を規定する数字を含む。特に断りのない限り、それぞれ、任意の核酸配列は、5’から3’方向に左から右に書かれており、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右に書かれている。
【００９６】
本明細書において提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって有することができる本開示の種々の態様または実施形態の制限ではない。したがって、直下に定義される用語は、本明細書を全体として参照することによってより十分に定義される。
【００９７】
アミノ酸は、アミノ酸の名称、三文字略語または一文字略語を使用して、本明細書において言及される。
【００９８】
本明細書において、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び/又は用語「タンパク質」と同義である。いくつかの例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。いくつかの例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
【００９９】
用語「タンパク質」とは、本明細書において、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含む。
【０１００】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において同義的に使用される。本開示および特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の一文字および三文字コードが使用され得る。IUPACIUB合同委員会生化学命名法(Joint Commission on Biochemical Nomenclature)(JCBN)に準拠して定義されるようなアミノ酸の3文字コード。また、ポリペプチドは、遺伝暗号の縮重のために2種以上のヌクレオチド配列によってコードされ得るということも理解される。
【０１０１】
用語のその他の定義は、本明細書を通じて現れ得る。例示的実施形態がより詳細に記載される前に、本開示は、記載される特定の実施形態に制限されず、そのようなものとして、当然、変わり得るということが理解される。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、本明細書において使用される技術用語は、単に、特定の実施形態を記載する目的のためであって、制限であるように意図されないということも理解されるべきである。
【０１０２】
値の範囲が提供される場合には、その範囲の上限と下限の間の介在する値も各々、下限の単位の1/10まで、文脈が別に明確に示さない限り、具体的に開示されるということが理解される。明記された範囲中の任意の明記された値または介在する値と、その明記された範囲中の任意のその他の明記されたまたは介在する値の間のより小さい範囲は各々、本開示内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、範囲中に独立に含まれ得る、または排除され得、両限界がより小さい範囲中に含まれない場合または両限界が含まれる場合もいずれも各範囲は、本開示内に包含され、明記された範囲中の任意の具体的に排除される限界の支配下にある。明記された範囲が、限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を排除する範囲も、本開示中に含まれる。
【０１０３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「1つの(a)」「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈が別に明確に示さない限り、複数の言及を含むということは注記しなくてはならない。したがって、例えば、「1つのクロストリジウム神経毒」への言及は、複数のこのような候補薬剤を含み、「そのクロストリジウム神経毒」への言及は、1つ以上のクロストリジウム神経毒および当業者に公知のその等価物などへの言及を含む。
【０１０４】
本明細書において論じられる刊行物は、単に、本願の出願日の前のその開示のために提供される。本明細書において、このような刊行物が、本明細書に添付される特許請求の範囲の先行技術を構成するということの承認と解釈されるべきではない。
【０１０５】
本発明を、単に例として、以下の図面および実施例を参照して以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して、単に例として以下に説明する:
【図１】図1は、pH8および0.55mg/mLのタンパク質濃度で、活性化されていないボツリヌス神経毒サンプルを、0.3および0.4μg/mLのそれぞれの最終濃度の組換えブタトリプシン(Roche)と共に20℃でインキュベーションした後の、全長活性化ボツリヌス神経毒(エンドネガティブ(endonegative))および切断型活性化ボツリヌス神経毒重鎖の相対量を示す図である。サンプルを、SDS-PAGEによる解析のために回収した。各SDS-PAGEサンプルをデンシトメトリーによって解析した。
【図２】図2は、単鎖エンドネガティブボツリヌス神経毒E(0.55mg/mL)を、種々の濃度のウシトリプシン(Sigma-Aldrich)を用いて20℃で8時間のインキュベーションによりpH8.0で活性化した後に、還元条件下で行ったSDS-PAGEによる解析を示す図である(レーン1:分子量マーカー、レーン2:-20℃対照;レーン3:+20℃対照;レーン4:0.2μg/mLトリプシン、レーン5:0.4μg/mLトリプシン、レーン6:0.6μg/mLトリプシン、レーン7:0.8μg/mLトリプシン、レーン8:1.0μg/mLトリプシン)。
【図３】図3は、組換えウシトリプシンを用いて、pH6.5、7.0、7.5および7.8で、20℃で16時間のインキュベーションにより活性化した後の、エンドネガティブボツリヌス神経毒E重鎖(HC)、軽鎖(LC)および切断型重鎖(tHC)のそれぞれの百分率を示す図である(神経毒濃度: 0.55mg/mL、組換えウシトリプシン(Sigma-Aldrich)濃度:1.5μg/mL)。サンプルをデンシトメトリーによって還元条件下でのSDS-PAGEによって解析した。
【図４】図4は、切断型二本鎖ボツリヌス神経毒からの全長二本鎖ボツリヌス神経毒E(エンドネガティブ)の分離が、ウシトリプシンを用いる活性化とセラミックハイドロキシアパタイトII型クロマトグラフィーカラムを使用する分離後に達成され得ることを示す図である。カラムからの全長二本鎖ボツリヌス神経毒および切断型二本鎖ボツリヌス神経毒の溶出を、オンラインA280nm読み取りによってモニタリングし、全長二本鎖ボツリヌス神経毒のみを含有する選択された画分をプールし、還元条件および非還元条件下でのSDS-PAGEによって解析した。
【図５】図5は、BoNT/A-UniProtKB受託番号P10845(配列番号2)のタンパク質配列を示す図である。
【図６】図6は、BoNT/B-UniProtKB受託番号P10844(配列番号3)のタンパク質配列を示す図である。
【図７】図7は、BoNT/C-UniProtKB受託番号P18640(配列番号4)のタンパク質配列を示す図である。
【図８】図8は、BoNT/D-UniProtKB受託番号P19321(配列番号5)のタンパク質配列を示す図である。
【図９】図9は、BoNT/E-UniParc I.D UPI00000010A3(配列番号6)のタンパク質配列を示す図である。
【図１０】図10は、BoNT/F-UniProtKB受託番号YP_001390123(配列番号7)のタンパク質配列を示す図である。
【図１１】図11は、BoNT/G-UniProtKB受託番号Q60393(配列番号8)のタンパク質配列を示す図である。
【図１２】図12は、TeNT-UniProtKB受託番号P04958(配列番号9)のタンパク質配列を示す図である。
【図１３】図13は、ウシトリプシン(配列番号1)のタンパク質配列を示す図である。
【実施例】
【０１０７】
上記の明細書において記載されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および趣旨から逸脱することない、本発明の記載される方法および系の種々の改変および変法は、当業者に明らかであろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、特許請求されるような本発明は、このような特定の実施形態に過度に制限されてはならないということは理解されなくてはならない。実際、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連する技術分野の当業者にとって明らかである本発明を実施するための記載された様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【０１０８】
[実施例1]
【０１０９】
pH8および0.55mg/mLのタンパク質濃度の単鎖ボツリヌス神経毒E(エンドネガティブ)サンプルを、20℃で、0.3および0.4μg/mLの最終濃度の組換えブタトリプシン(Roche)とともにインキュベートした。サンプルを、30分毎に6時間まで、その後60分毎に9時間まで還元条件下でのSDS-PAGEによる解析のために回収した。各SDS-PAGEサンプルを、デンシトメトリーによって解析して、全長二本鎖ボツリヌス神経毒、切断型二本鎖ボツリヌス神経毒重鎖および単鎖ボツリヌス神経毒の相対量を決定した。次いで、全長二本鎖ボツリヌス神経毒および切断型二本鎖ボツリヌス神経毒の値をチャートにプロットした(図1)。ブタトリプシンと接触された場合は、ボツリヌス神経毒の完全活性化が達成される前に、切断型二本鎖ボツリヌス神経毒が生じる。
【０１１０】
[実施例2]
【０１１１】
種々の濃度のウシトリプシンを用いる活性化
【０１１２】
pH8および0.55mg/mLのタンパク質濃度の単鎖ボツリヌス神経毒E(エンドネガティブ)サンプルを、20℃で、それぞれ、0.2、0.4、0.6、0.8および1.0μg/mLの最終濃度のウシトリプシン(Sigma-Aldrich)とともにインキュベートした。8時間後に、サンプルを還元条件下でのSDS-PAGEによる解析のために回収した。図2に示される結果は、完全活性化が達成される前に、各サンプルにおいて重鎖末端切断が観察されたことを示す。
【０１１３】
[実施例3]
【０１１４】
種々のpHでウシトリプシンを用いる活性化
【０１１５】
pH6.5、7.0、7.5および7.8の、0.55mg/mLのタンパク質濃度を有する単鎖ボツリヌス神経毒E(エンドネガティブ)サンプルを、20℃で、1.5μg/mLの最終濃度の組換えウシトリプシン(Sigma-Aldrich)とともにインキュベートした。16時間後に、サンプルを還元条件下でのSDS-PAGEによる解析のために回収した。各SDS-PAGEサンプルを、デンシトメトリーによって解析して、切断型二本鎖ボツリヌス神経毒重鎖の相対量を決定した。結果は、図3および表1に示されている。切断型二本鎖ボツリヌス神経毒形成は、pHが高いほどより容易に生じる。
【０１１６】
【表１】
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【０１１７】
[実施例4]
【０１１８】
ウシトリプシンを用いる活性化後の活性化神経毒の精製
【０１１９】
78.57μgのTrypzean(ウシトリプシン)とともに20℃で18時間インキュベートすることによって活性化されている、エンドネガティブBoNT/Eを含有する26mgの総タンパク質を、5mLセラミックハイドロキシアパタイトII型カラムにアプライした。カラムを結合バッファー(25mMリン酸ナトリウム、pH6.5)で洗浄し、次いで、結合バッファーおよび溶出バッファー(500mMリン酸ナトリウムpH6.5)を使用して直線勾配でリン酸ナトリウム濃度を漸増する35カラム容積にわたって溶出し、2.5mL画分を集めた。カラムからの全長二本鎖ボツリヌス神経毒および切断型二本鎖ボツリヌス神経毒の溶出を、オンラインA280nm読み取りによってモニタリングし、全長二本鎖ボツリヌス神経毒のみを含有する選択された画分をプールし、還元条件および非還元条件下でのSDS-PAGEによって解析した(図4)。
【０１２０】
[実施例5]
【０１２１】
全長活性化ボツリヌス神経毒E調製
【０１２２】
ボツリヌス神経毒Eの種菌である大腸菌(E.coli)培養物を、種子バンクバイアルを解凍することおよび100mLの改変Terrific Broth(mTB)を含有する振盪フラスコに播種することによって調製した。次いで、フラスコを振盪インキュベーター中、25℃で17時間インキュベートした。種菌培養物を使用して、各々1LのmTBを含有する5つの振盪フラスコに播種した。細胞を振盪インキュベーター中、37℃で対数増殖期までに培養し、培養物の温度を16℃に低下させ、培養物を、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を0.1mMの最終濃度まで添加することによって誘導した。細胞を、ホローファイバーメンブレンを使用するタンジェンシャルフロー濾過(TFF)によって誘導の20時間後に回収した。培養物を最初に5倍濃縮し、次いで、5容積の溶解バッファー(100mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl、1.3M(NH4)2SO4、pH7.8)を用いてダイアフィルトレーションした。
【０１２３】
得られた細胞ペーストスラリーを、機械的細胞破壊器に2回通すことによってホモジナイズした。不溶性細胞片を遠心分離によって沈降させ、上清を回収し、ブチルセファロース4FF(GE Lifesciences)を詰めて結合バッファー(100mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl、1.25M(NH4)2SO4、pH7.8)を用いて洗浄したカラムにアプライした。結合および溶出(100mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl、pH7.8)バッファーの以下の混合物を用いる3段階勾配を使用してカラムから活性化されていないボツリヌス神経毒Eを溶出し、工程2において産物を溶出した。
【０１２４】
工程1: 88％ローディングバッファー、12％溶出バッファー
工程2: 58％ローディングバッファー、42％溶出バッファー
工程3: 100％溶出バッファー
【０１２５】
工程2から得た材料を、ホローファイバーメンブレンを使用するTFFによっておよそ2倍濃縮し、次いで、10容積の25mMリン酸ナトリウムpH6.5バッファーを用いてダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション後、保持液中の任意の不溶性材料を遠心分離によって沈降させ、上清を、ネガティブクロマトグラフィー工程においてQセファロースHP(GE Lifesciences)を詰めたカラムにアプライした。活性化されていないボツリヌス神経毒を含有するフロースルーを集め、25mMリン酸ナトリウムpH6.5を用いてカラムを洗浄して産物回収を最大化した。
【０１２６】
次いで、フロースルーを、25mMリン酸ナトリウムpH6.5を用いて0.5mg/mlの総タンパク質濃度に希釈し、7.27USP単位/mL組換えウシトリプシン(TrypZean(登録商標))とともに室温で21時間インキュベートした。インキュベーション後、次いで、活性化ボツリヌス神経毒Eを、セラミックハイドロキシアパタイトII型カラムにアプライし、カラムを結合バッファー(25mMリン酸ナトリウムpH6.5)を用いて洗浄した。活性化ボツリヌス神経毒を、結合バッファーおよび溶出バッファー(500mMリン酸ナトリウムpH6.5)を使用する直線勾配を用いてカラムから溶出した。
【０１２７】
全長活性化ボツリヌス神経毒を含有する画分をプールし、ネガティブクロマトグラフィー工程において、ベンズアミジンセファロースFF(high-sub)(GE Lifesciences)を詰めたカラムにアプライした。全長活性化ボツリヌス神経毒を含有するフロースルーを集め、カラムをローディングバッファー(110mMリン酸ナトリウム、pH6.5)を用いて洗浄して、産物回収を最大化した。フロースルーを、ホローファイバーカートリッジを使用するTFFによって、最終貯蔵バッファー（5容積の25mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl、pH6.5）に対してダイアフィルトレーションした。
【符号の説明】
【０１２８】
[図1A、図1B]
% Activation and tHC as % of Total HC: 活性化の％および総HCの％としてのtHC
Botulinum neurotoxin contacted with 0.3 μg/mL Trypsin: 0.3μg/mLのトリプシンと接触されたボツリヌス神経毒
Botulinum neurotoxin contacted with 0.4 μg/mL Trypsin: 0.4μg/mLのトリプシンと接触されたボツリヌス神経毒
% Full-length, activated BoNT: 全長活性化BoNT％
% Truncated, activated BoNT: 切断型活性化BoNT％
Time (hrs): 時間(時間)
[図3]
Average percentage by densitometry (%): デンシトメトリーによる平均百分率(％)
16 hrs 1.5μg/ml TrypZean: 16時間 1.5μg/ml TrypZean
[図4]
Full-length, activated botulinum neurotoxin: 全長活性化ボツリヌス神経毒
Truncated, activated botulinum neurotoxin: 切断型活性化ボツリヌス神経毒
SDS-PAGE analysis of pooled fractions containing full-length, activated botulinum neurotoxin: 全長活性化ボツリヌス神経毒を含有するプールされた画分のSDS-PAGE解析
Lane 1 - MW marker: レーン1 - MWマーカー
Lane 2 - full-length, activated botulinum neurotoxin under non-reduced conditions: レーン2 - 非還元条件下での全長活性化ボツリヌス神経毒
Lane 3 - full-length, activated botulinum neurotoxin light and heavy chains under reducing conditions: レーン3 - 還元条件下での全長活性化ボツリヌス神経毒軽鎖および重鎖
【図１】
2019531698.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019531698.tif 000017
2019531698.tif 000018
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