(57)【要約】  本発明は、抗ＴＩＭ−３抗体および抗体組成物ならびに患者における免疫増強のための、例えば、癌の処置のための、それらの使用に関する。
2019519199.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体が、ヒトＴＩＭ−３への結合について重鎖および軽鎖可変ドメインが以下のアミノ酸配列を含む抗体と競合するか、または重鎖および軽鎖可変ドメインが以下のアミノ酸配列を含む抗体と同じヒトＴＩＭ−３のエピトープに結合する、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分：
ａ）それぞれ配列番号１５および４；
ｂ）それぞれ配列番号３および４；
ｃ）それぞれ配列番号２８および２９；
ｄ）それぞれ配列番号３８および３９；
ｅ）それぞれ配列番号４８および４９；
ｆ）それぞれ配列番号５８および５９；
ｇ）それぞれ配列番号６８および６９；
ｈ）それぞれ配列番号７８および７９；
ｉ）それぞれ配列番号８８および８９；
ｊ）それぞれ配列番号９８および９９；
ｋ）それぞれ配列番号１０８および１０９；
ｌ）それぞれ配列番号１１８および１１９；
ｍ）それぞれ配列番号１２８および１２９；
ｎ）それぞれ配列番号１３８および１３９；
ｏ）それぞれ配列番号１４８および１４９；
ｐ）それぞれ配列番号１５８および１５９；
ｑ）それぞれ配列番号１６８および１６９；
ｒ）それぞれ配列番号１７８および１７９；
ｓ）それぞれ配列番号１８８および１８９；
ｔ）それぞれ配列番号１９８および１９９；
ｕ）それぞれ配列番号２０８および２０９；
ｖ）それぞれ配列番号２１８および２１９；または
ｗ）それぞれ配列番号２２８および２２９。
【請求項２】
該抗ＴＩＭ−３抗体が、
ａ）その重鎖相補性決定領域（Ｈ−ＣＤＲ）１−３および軽鎖相補性決定領域（Ｌ−ＣＤＲ）１−３が、それぞれ配列番号７−１２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号１５または３のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｃ）その重鎖（ＨＣ）が、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号２５、２３または２４のアミノ酸配列を含むか、または（ｉｉ）配列番号３および５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）その軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）その軽鎖（ＬＣ）が、配列番号４および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）そのＶＨが、配列番号１５または３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そのＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）そのＶＨが、配列番号１５または３のアミノ酸配列を含み、そのＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、抗体；または
ｈ）そのＨＣが、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号２５、２３または２４のアミノ酸配列を含むか、または（ｉｉ）配列番号３および５のアミノ酸配列を含み；かつ、そのＬＣが、配列番号４および６のアミノ酸配列を含む、抗体
である、請求項１に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体が、以下のアミノ酸配列のＨ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３を含む、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分：
ａ）それぞれ配列番号７−１２；
ｂ）それぞれ配列番号３０−３５；
ｃ）それぞれ配列番号４０−４５；
ｄ）それぞれ配列番号５０−５５；
ｅ）それぞれ配列番号６０−６５；
ｆ）それぞれ配列番号７０−７５；
ｇ）それぞれ配列番号８０−８５；
ｈ）それぞれ配列番号９０−９５；
ｉ）それぞれ配列番号１００−１０５；
ｊ）それぞれ配列番号１１０−１１５；
ｋ）それぞれ配列番号１２０−１２５；
ｌ）それぞれ配列番号１３０−１３５；
ｍ）それぞれ配列番号１４０−１４５；
ｎ）それぞれ配列番号１５０−１５５；
ｏ）それぞれ配列番号１６０−１６５；
ｐ）それぞれ配列番号１７０−１７５；
ｑ）それぞれ配列番号１８０−１８５；
ｒ）それぞれ配列番号１９０−１９５；
ｓ）それぞれ配列番号２００−２０５；
ｔ）それぞれ配列番号２１０−２１５；
ｕ）それぞれ配列番号２２０−２２５；または
ｖ）それぞれ配列番号２３０−２３５。
【請求項４】
抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体が、以下のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するＶＨおよびＶＬを含む、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分：
ａ）それぞれ配列番号１５および４；
ｂ）それぞれ配列番号３および４；
ｃ）それぞれ配列番号２８および２９；
ｄ）それぞれ配列番号３８および３９；
ｅ）それぞれ配列番号４８および４９；
ｆ）それぞれ配列番号５８および５９；
ｇ）それぞれ配列番号６８および６９；
ｈ）それぞれ配列番号７８および７９；
ｉ）それぞれ配列番号８８および８９；
ｊ）それぞれ配列番号９８および９９；
ｋ）それぞれ配列番号１０８および１０９；
ｌ）それぞれ配列番号１１８および１１９；
ｍ）それぞれ配列番号１２８および１２９；
ｎ）それぞれ配列番号１３８および１３９；
ｏ）それぞれ配列番号１４８および１４９；
ｐ）それぞれ配列番号１５８および１５９；
ｑ）それぞれ配列番号１６８および１６９；
ｒ）それぞれ配列番号１７８および１７９；
ｓ）それぞれ配列番号１８８および１８９；
ｔ）それぞれ配列番号１９８および１９９；
ｕ）それぞれ配列番号２０８および２０９；
ｖ）それぞれ配列番号２１８および２１９；または
ｗ）それぞれ配列番号２２８および２２９。
【請求項５】
抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体が、その可変ドメインが以下のアミノ酸配列を有するＨＣおよびＬＣを含む、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分：
ａ）それぞれ配列番号１５および４；
ｂ）それぞれ配列番号３および４；
ｃ）それぞれ配列番号２８および２９；
ｄ）それぞれ配列番号３８および３９；
ｅ）それぞれ配列番号４８および４９；
ｆ）それぞれ配列番号５８および５９；
ｇ）それぞれ配列番号６８および６９；
ｈ）それぞれ配列番号７８および７９；
ｉ）それぞれ配列番号８８および８９；
ｊ）それぞれ配列番号９８および９９；
ｋ）それぞれ配列番号１０８および１０９；
ｌ）それぞれ配列番号１１８および１１９；
ｍ）それぞれ配列番号１２８および１２９；
ｎ）それぞれ配列番号１３８および１３９；
ｏ）それぞれ配列番号１４８および１４９；
ｐ）それぞれ配列番号１５８および１５９；
ｑ）それぞれ配列番号１６８および１６９；
ｒ）それぞれ配列番号１７８および１７９；
ｓ）それぞれ配列番号１８８および１８９；
ｔ）それぞれ配列番号１９８および１９９；
ｕ）それぞれ配列番号２０８および２０９；
ｖ）それぞれ配列番号２１８および２１９；または
ｗ）それぞれ配列番号２２８および２２９。
【請求項６】
該ＨＣおよびＬＣが、以下のアミノ酸配列をさらに含む、請求項５に記載の抗ＴＩＭ−３抗体：
ａ）それぞれ配列番号５および６；
ｂ）それぞれ配列番号２５および６；
ｃ）それぞれ配列番号２３および６；または
ｄ）それぞれ配列番号２４および６。
【請求項７】
抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体が、それぞれ配列番号７−１２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３を含む、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体が、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
配列番号１５および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４および６のアミノ酸配列を含むＬＣを含む、抗ＴＩＭ−３抗体。
【請求項１０】
アミノ酸残基Ｆ６１およびＩ１１７を含むヒトＴＩＭ−３上のエピトープに結合する、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
該エピトープがＴＩＭ−３アミノ酸残基Ｒ６９をさらに含む、請求項１０に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
該エピトープが、ＴＩＭ−３アミノ酸残基Ｐ５０、Ｅ６２、Ｍ１１８およびＤ１２０をさらに含む、請求項１０に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
該エピトープが、ＴＩＭ−３アミノ酸残基Ｖ６０およびＧ６４をさらに含む、請求項１２に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
アミノ酸残基Ｐ５０、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｇ６４、Ｒ６９、Ｉ１１７、Ｍ１１８およびＤ１２０を含むヒトＴＩＭ−３上のエピトープに結合する、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
アミノ酸残基Ｆ６１、Ｒ６９およびＩ１１７を含むヒトＴＩＭ−３上のエピトープに結合する、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
アミノ酸残基Ｐ５０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｉ１１７、Ｍ１１８およびＤ１２０を含むヒトＴＩＭ−３上のエピトープに結合する、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
アミノ酸残基６２−６７を含むヒトＴＩＭ−３上のエピトープに結合する、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
アミノ酸残基１１４−１１７を含むヒトＴＩＭ−３上のエピトープに結合する、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１９】
抗体がヒトＩｇＧ抗体である、請求項１から５、７、８および１０から１８のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ−３抗体。
【請求項２０】
抗体が、ＦＣ領域内に少なくとも１つの変異を含む、請求項１９に記載の抗ＴＩＭ−３抗体。
【請求項２１】
ＩＭＧＴの番号付けスキームにより番号付けされた、重鎖アミノ酸の位置２２８、２３３、２３４および２３５の１つ以上に変異を含む、請求項２０に記載の抗ＴＩＭ−３抗体。
【請求項２２】
位置２３４および２３５のアミノ酸残基の一方または両方がＡｌａに変異し、および／または位置２２８のアミノ酸残基がＰｒｏに変異している、請求項２１に記載の抗ＴＩＭ−３抗体。
【請求項２３】
以下の特性の少なくとも１つを有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分：
ａ）表面プラズモン共鳴により測定される２３ｎＭ以下のＫＤでヒトＴＩＭ−３に結合する；
ｂ）表面プラズモン共鳴により測定される２２ｎＭ以下のＫＤでカニクイザルＴＩＭ−３に結合する；
ｃ）ＥＬＩＳＡにより測定される１．２ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＴＩＭ−３に結合する；
ｄ）ＥＬＩＳＡにより測定される４６ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザルＴＩＭ−３に結合する；
ｅ）一方向混合リンパ球反応アッセイにおいてＩＦＮ−γ分泌を増加させる；
ｆ）二方向混合リンパ球反応アッセイにおいてＩＦＮ−γ分泌を増加させる；
ｇ）一方向混合リンパ球反応アッセイにおいてＴＮＦ−α分泌を増加させる；
ｈ）樹状細胞からのＴＮＦ−α分泌を増加させる；および
ｉ）ＴＩＭ−３とホスファチジルセリンとの相互作用を阻害する。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
化学療法剤、抗腫瘍剤、抗血管形成剤、チロシンキナーゼ阻害剤またはＴＩＭ−３経路阻害剤をさらに含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の、重鎖をコードするヌクレオチド配列、または軽鎖をコードするヌクレオチド配列、または両方を含む、単離された核酸分子。
【請求項２７】
発現制御配列をさらに含む、請求項２６に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項２８】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の、重鎖をコードするヌクレオチド配列、および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
【請求項２９】
抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分を作製する方法であって、請求項２８に記載の宿主細胞を提供し、該抗体またはその部分の発現に好適な条件下で該宿主細胞を培養し、そして得られた抗体またはその抗原結合部分を単離することを含む、作製方法。
【請求項３０】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ−３抗体の抗原結合部分および別の異なる抗体の抗原結合部分を有する、二重特異性結合分子。
【請求項３１】
患者において免疫を増強する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分、請求項２４または２５に記載の医薬組成物、あるいは請求項３０に記載の二重特異性結合分子を投与することを含む、免疫増強方法。
【請求項３２】
癌患者を処置する方法であって、該患者に、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分、請求項２４または２５に記載の医薬組成物、あるいは請求項３０に記載の二重特異性結合分子を投与することを含む、処置方法。
【請求項３３】
該患者に、化学療法剤、抗腫瘍剤、抗血管形成剤、チロシンキナーゼ阻害剤またはＴＩＭ−３経路阻害剤を投与することをさらに含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
それを必要とする患者における、免疫を増強するための医薬の製造を目的とする、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分、あるいは請求項３０に記載の二重特異性結合分子の、使用。
【請求項３５】
癌患者の処置のための医薬の製造を目的とする、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分、あるいは請求項３０に記載の二重特異性結合分子の、使用。
【請求項３６】
該医薬が、化学療法剤、抗腫瘍剤、抗血管形成剤、チロシンキナーゼ阻害剤またはＴＩＭ−３経路阻害剤をさらに含む、請求項３４または３５に記載の使用。
【請求項３７】
それを必要とする患者における免疫増強において使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分、あるいは請求項３０に記載の二重特異性結合分子。
【請求項３８】
癌患者の処置における使用のための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分、あるいは請求項３０に記載の二重特異性結合分子。
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載の使用のための抗体、抗原結合部分または二重特異性結合分子であって、該抗体、抗原結合部分または二重特異性結合分子が、化学療法剤、抗腫瘍剤、抗血管形成剤、チロシンキナーゼ阻害剤またはＴＩＭ−３経路阻害剤と共に投与される、抗体、その抗原結合部分または二重特異性結合分子。
【請求項４０】
癌が、皮膚、肺、腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟組織、造血組織、頭頸部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮または膵臓に由来する、請求項３２または３３に記載の方法；請求項３５または３６に記載の使用；または、請求項３８または３９に記載の抗体、その部分または二重特異性結合分子。
【請求項４１】
患者が、白血病、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫を有する、請求項４０に記載の方法；使用；または、抗体、その部分または二重特異性結合分子。
【請求項４２】
患者が固形腫瘍を有する、請求項４０に記載の方法；使用；または、抗体、その部分または二重特異性結合分子。
【請求項４３】
患者が、黒色腫、非小細胞肺癌、結腸直癌または腎細胞癌を有する、請求項４０に記載の方法；使用；または、抗体、その部分または二重特異性結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月１２日に出願された米国特許出願６２／３２１，４７６に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体を、引用により本明細書中に包含させる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その内容全体が引用により本明細書中に包含される配列表を含む。２０１７年３月２８日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、022675WO053.txtというファイル名であり、サイズは１５０，６９８バイトである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＨＡＶＣＲ２（Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２）またはＣＤ３６６としても知られる、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン含有分子３）は、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメインタンパク質ファミリーのメンバーである。ＴＩＭ−３は、ヒトにおいてＨａｖｃｒ２遺伝子によりコードされ、膜遠位のＩｇＶドメインおよび膜近位のムチンドメインを有する３３ｋＤａのタイプＩの糖タンパク質である。それは、細胞内ドメイン内に５つのＴｙｒ残基の保存された領域を含み、それらはリガンド結合の際にリン酸化される。ＴＩＭ−３は、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む免疫系の獲得免疫群および自然免疫群の両方に由来するある範囲の種々の細胞により発現される。ＴＩＭ−３発現は、天然のＴ細胞では低いが、Ｔ細胞活性化により高度に上方制御されるようになる。Ｔ細胞とは対照的に、樹状細胞、ＮＫ細胞および単球のような自然免疫細胞は、ＴＩＭ−３の高い基礎的発現を有する。ＴＩＭ−３は、ほとんど無差別に、ガレクチン−９、ホスファチジルセリン、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＨＭＧＢ−１を含むいくつかのリガンドと結合するが、これらのリガンドの正確な役割は現在のところ知られていない。
【０００４】
ＴＩＭ−３はチェックポイント阻害物質であることが示唆されており、例えば、ＰＤ−１と同様の様式でＴ細胞活性化またはサイトカイン分泌の抑制に直接介在するという考えを支持するやや少数の証拠がある。さらに、ＰＤ−１とは対照的に、ＴＩＭ−３は、自然免疫系の細胞、特に樹状細胞の調節に何らかの役割を果たすように思われる。腫瘍免疫におけるＴＩＭ−３およびその役割に関する機能的データの大部分は、種々の抗体を用いたインビボ試験により得られる。これらの試験のほとんどでは、抗体の証明不備のため、ＴＩＭ−３抗体の効果に、リガンド結合の阻害または標的へのアゴニスト効果が介在するかどうかは明らかではない。
【０００５】
その免疫応答調節特性の観点から、ＴＩＭ−３は、癌および自己免疫疾患の処置を含む、免疫療法の潜在的な標的として研究されている。現在、１つの抗ＴＩＭ−３抗体が臨床開発中であるが、承認された抗ＴＩＭ−３抗体は現在のところ存在しない。
【０００６】
免疫調節剤としてのＴＩＭ−３の重要な役割に鑑みて、ＴＩＭ−３を標的として、癌および特定の免疫系の障害を処置するための、新規かつ改善された免疫療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＴＩＭ−３を標的とする新規の組換え抗体、ならびに１以上のこれらの抗体、例えば、ＴＩＭ−３に対する活性を介して、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）およびＴ細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞）などの種々の免疫細胞を活性化する抗ＴＩＭ−３抗体、ならびに当該抗体を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、患者の免疫を増強するための、ならびに皮膚、肺、腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟組織、造血組織、頭頸部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮および膵臓などの組織由来の癌の処置のための、抗体および医薬組成物の使用に関する。抗体処置を含む、かかる癌に対する現在利用可能な処置と比較して、本発明の抗体は、単独で、または別の免疫チェックポイントタンパク質を標的とする抗体のような別の癌処置剤と組み合わせて、優れた臨床効果を提供できることが企図される。
【０００８】
ある態様において、本発明は、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで、該抗ＴＩＭ−３抗体は、本明細書中、抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５、１５０８６．１７１４４、２０１３１、２０２９３、１５１０５、１５１０７、１５１０９、１５１７４、１５１７５、１５２６０、１５２８４、１５２９９、１５３５３、１５３５４、１７２４４、１７２４５、１９３２４、１９４１６、１９５６８、２０１８５、２０３００、２０３６２または２０６２１と称される抗体、あるいはこれらの何れかの変異体であり、ここで、該変異体は、例えば、該抗体の抗原結合特異性を損なうことなく、該抗体と比べて最小のアミノ酸変化（例えば、フレームワーク領域内であってもよい、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸変化）を含んでいてよい。
【０００９】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、ヒトＴＩＭ−３への結合について抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５、１５０８６．１７１４４、２０１３１、２０２９３、１５１０５、１５１０７、１５１０９、１５１７４、１５１７５、１５２６０、１５２８４、１５２９９、１５３５３、１５３５４、１７２４４、１７２４５、１９３２４、１９４１６、１９５６８、２０１８５、２０３００、２０３６２および２０６２１のいずれか１つと競合し、または抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５、１５０８６．１７１４４、２０１３１、２０２９３、１５１０５、１５１０７、１５１０９、１５１７４、１５１７５、１５２６０、１５２８４、１５２９９、１５３５３、１５３５４、１７２４４、１７２４５、１９３２４、１９４１６、１９５６８、２０１８５、２０３００、２０３６２および２０６２１のいずれか１つと同じヒトＴＩＭ−３のエピトープに結合する。
【００１０】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号９、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、１３２、１４２、１５２、１６２、１７２、１８２、１９２、２０２、２１２、２２２または２３２のＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ３を含む。
【００１１】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、それぞれ配列番号７−９、３０−３２、４０−４２、５０−５２、６０−６２、７０−７２、８０−８２、９０−９２、１００−１０２、１１０−１１２、１２０−１２２、１３０−１３２、１４０−１４２、１５０−１５２、１６０−１６２、１７０−１７２、１８０−１８２、１９０−１９２、２００−２０２、２１０−２１２、２２０−２２２または２３０−２３２のＨ−ＣＤＲ１−３配列を含むＨ−ＣＤＲ１−３を含む。
【００１２】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号３、１５、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１０８、１１８、１２８、１３８、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、１９８、２０８、２１８または２２８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する。
【００１３】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号３、１５、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１０８、１１８、１２８、１３８、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、１９８、２０８、２１８または２２８を含むＶＨを有する。
【００１４】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号３、１５、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１０８、１１８、１２８、１３８、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、１９８、２０８、２１８または２２８のＶＨアミノ酸配列ならびに配列番号５または配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列の重鎖定常領域（ＣＨ）を含む重鎖（ＨＣ）を有する。
【００１５】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号１２、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、１０５、１１５、１２５、１３５、１４５、１５５、１６５、１７５、１８５、１９５、２０５、２１５、２２５または２３５のＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＬ−ＣＤＲ３を含む。
【００１６】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、それぞれ配列番号１０−１２、３３−３５、４３−４５、５３−５５、６３−６５、７３−７５、８３−８５、９３−９５、１０３−１０５、１１３−１１５、１２３−１２５、１３３−１３５、１４３−１４５、１５３−１５５、１６３−１６５、１７３−１７５、１８３−１８５、１９３−１９５、２０３−２０５、２１３−２１５、２２３−２２５または２３３−２３５のＬ−ＣＤＲ１−３配列を含むＬ−ＣＤＲ１−３を含む。
【００１７】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号４、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１１９、１２９、１３９、１４９、１５９、１６９、１７９、１８９、１９９、２０９、２１９または２２９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一の配列を有するＶＬを有する。
【００１８】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号４、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１１９、１２９、１３９、１４９、１５９、１６９、１７９、１８９、１９９、２０９、２１９または２２９のＶＬアミノ酸配列を含むＶＬを有する。
【００１９】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号４、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１１９、１２９、１３９、１４９、１５９、１６９、１７９、１８９、１９９、２０９、２１９または２２９のＶＬアミノ酸配列および配列番号６の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）を有する。
【００２０】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、上記の重鎖配列のいずれかおよび上記の軽鎖配列のいずれかを含む。
【００２１】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、それぞれ配列番号９および１２、３２および３５、４２および４５、５２および５５、６２および６５、７２および７５、８２および８５、９２および９５、１０２および１０５、１１２および１１５、１２２および１２５、１３２および１３５、１４２および１４５、１５２および１５５、１６２および１６５、１７２および１７５、１８２および１８５、１９２および１９５、２０２および２０５、２１２および２１５、２２２および２２５、ならびに２３２および２３５の、Ｈ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ３を含む。
【００２２】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、それぞれ配列番号７−１２、３０−３５、４０−４５、５０−５５、６０−６５、７０−７５、８０−８５、９０−９５、１００−１０５、１１０−１１５、１２０−１２５、１３０−１３５、１４０−１４５、１５０−１５５、１６０−１６５、１７０−１７５、１８０−１８５、１９０−１９５、２００−２０５、２１０−２１５、２２０−２２５、または２３０−２３５の、Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３配列を含む、Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３を含む。
【００２３】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号３、１５、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１０８、１１８、１２８、１３８、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、１９８、２０８、２１８または２２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一の配列を有するＶＨ、ならびに配列番号４、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１１９、１２９、１３９、１４９、１５９、１６９、１７９、１８９、１９９、２０９、２１９または２２９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一の配列を有するＶＬを有する。
【００２４】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号３、１５、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１０８、１１８、１２８、１３８、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、１９８、２０８、２１８または２２８のアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号４、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１１９、１２９、１３９、１４９、１５９、１６９、１７９、１８９、１９９、２０９、２１９または２２９のアミノ酸配列を含むＶＬを有する。
【００２５】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号４、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１１９、１２９、１３９、１４９、１５９、１６９、１７９、１８９、１９９、２０９、２１９または２２９のアミノ酸配列および配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣ；ならびに、（ｉ）配列番号３、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１０８、１１８、１２８、１３８、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、１９８、２０８、２１８または２２８のアミノ酸配列および配列番号５のアミノ酸配列、あるいは（ｉｉ）配列番号１５、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１０８、１１８、１２８、１３８、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、１９８、２０８、２１８または２２８のアミノ酸配列および配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列を含むＨＣ、を有する。
【００２６】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、以下のＨ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３アミノ酸配列を含む：
ａ）それぞれ配列番号７−１２；
ｂ）それぞれ配列番号３０−３５；
ｃ）それぞれ配列番号４０−４５；
ｄ）それぞれ配列番号５０−５５；
ｅ）それぞれ配列番号６０−６５；
ｆ）それぞれ配列番号７０−７５；
ｇ）それぞれ配列番号８０−８５；
ｈ）それぞれ配列番号９０−９５；
ｉ）それぞれ配列番号１００−１０５；
ｊ）それぞれ配列番号１１０−１１５；
ｋ）それぞれ配列番号１２０−１２５；
ｌ）それぞれ配列番号１３０−１３５；
ｍ）それぞれ配列番号１４０−１４５；
ｎ）それぞれ配列番号１５０−１５５；
ｏ）それぞれ配列番号１６０−１６５；
ｐ）それぞれ配列番号１７０−１７５；
ｑ）それぞれ配列番号１８０−１８５；
ｒ）それぞれ配列番号１９０−１９５；
ｓ）それぞれ配列番号２００−２０５；
ｔ）それぞれ配列番号２１０−２１５；
ｕ）それぞれ配列番号２２０−２２５；または
ｖ）それぞれ配列番号２３０−２３５。
【００２７】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＴＩＭ−３への結合について、以下のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合し、または以下のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変ドメインを有する抗体と同じヒトＴＩＭ−３のエピトープに結合する：
ａ）それぞれ配列番号３および４；
ｂ）それぞれ配列番号１５および４；
ｃ）それぞれ配列番号２８および２９；
ｄ）それぞれ配列番号３８および３９；
ｅ）それぞれ配列番号４８および４９；
ｆ）それぞれ配列番号５８および５９；
ｇ）それぞれ配列番号６８および６９；
ｈ）それぞれ配列番号７８および７９；
ｉ）それぞれ配列番号８８および８９；
ｊ）それぞれ配列番号９８および９９；
ｋ）それぞれ配列番号１０８および１０９；
ｌ）それぞれ配列番号１１８および１１９；
ｍ）それぞれ配列番号１２８および１２９；
ｎ）それぞれ配列番号１３８および１３９；
ｏ）それぞれ配列番号１４８および１４９；
ｐ）それぞれ配列番号１５８および１５９；
ｑ）それぞれ配列番号１６８および１６９；
ｒ）それぞれ配列番号１７８および１７９；
ｓ）それぞれ配列番号１８８および１８９；
ｔ）それぞれ配列番号１９８および１９９；
ｕ）それぞれ配列番号２０８および２０９；
ｖ）それぞれ配列番号２１８および２１９；または
ｗ）それぞれ配列番号２２８および２２９。
【００２８】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、以下のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む：
ａ）それぞれ配列番号３および４；
ｂ）それぞれ配列番号１５および４；
ｃ）それぞれ配列番号２８および２９；
ｄ）それぞれ配列番号３８および３９；
ｅ）それぞれ配列番号４８および４９；
ｆ）それぞれ配列番号５８および５９；
ｇ）それぞれ配列番号６８および６９；
ｈ）それぞれ配列番号７８および７９；
ｉ）それぞれ配列番号８８および８９；
ｊ）それぞれ配列番号９８および９９；
ｋ）それぞれ配列番号１０８および１０９；
ｌ）それぞれ配列番号１１８および１１９；
ｍ）それぞれ配列番号１２８および１２９；
ｎ）それぞれ配列番号１３８および１３９；
ｏ）それぞれ配列番号１４８および１４９；
ｐ）それぞれ配列番号１５８および１５９；
ｑ）それぞれ配列番号１６８および１６９；
ｒ）それぞれ配列番号１７８および１７９；
ｓ）それぞれ配列番号１８８および１８９；
ｔ）それぞれ配列番号１９８および１９９；
ｕ）それぞれ配列番号２０８および２０９；
ｖ）それぞれ配列番号２１８および２１９；または
ｗ）それぞれ配列番号２２８および２２９。
【００２９】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、以下のアミノ酸配列を有する可変ドメインを有する重鎖および軽鎖を含む：
ａ）それぞれ配列番号３および４；
ｂ）それぞれ配列番号１５および４；
ｃ）それぞれ配列番号２８および２９；
ｄ）それぞれ配列番号３８および３９；
ｅ）それぞれ配列番号４８および４９；
ｆ）それぞれ配列番号５８および５９；
ｇ）それぞれ配列番号６８および６９；
ｈ）それぞれ配列番号７８および７９；
ｉ）それぞれ配列番号８８および８９；
ｊ）それぞれ配列番号９８および９９；
ｋ）それぞれ配列番号１０８および１０９；
ｌ）それぞれ配列番号１１８および１１９；
ｍ）それぞれ配列番号１２８および１２９；
ｎ）それぞれ配列番号１３８および１３９；
ｏ）それぞれ配列番号１４８および１４９；
ｐ）それぞれ配列番号１５８および１５９；
ｑ）それぞれ配列番号１６８および１６９；
ｒ）それぞれ配列番号１７８および１７９；
ｓ）それぞれ配列番号１８８および１８９；
ｔ）それぞれ配列番号１９８および１９９；
ｕ）それぞれ配列番号２０８および２０９；
ｖ）それぞれ配列番号２１８および２１９；または
ｗ）それぞれ配列番号２２８および２２９。
【００３０】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体は、以下を含む：
ａ）配列番号３および５のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）ならびに配列番号４および６のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）;
ｂ）配列番号２８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号３８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号３９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号４８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号５８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号５９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｆ）配列番号６８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号６９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｇ）配列番号７８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号７９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｈ）配列番号８８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号８９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｉ）配列番号９８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号９９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｊ）配列番号１０８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１０９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｋ）配列番号１１８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１１９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｌ）配列番号１２８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１２９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｍ）配列番号１３８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１３９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｎ）配列番号１４８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１４９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｏ）配列番号１５８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１５９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｐ）配列番号１６８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１６９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｑ）配列番号１７８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１７９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｒ）配列番号１８８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１８９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｓ）配列番号１９８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１９９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｔ）配列番号２０８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２０９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｕ）配列番号２１８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２１９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；または
ｖ）配列番号２２８および５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２２９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ。
【００３１】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体は、以下を含む：
ａ）配列番号１５および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｂ）配列番号２８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ;
ｃ）配列番号３８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号３９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号４８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号５８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号５９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｆ）配列番号６８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号６９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｇ）配列番号７８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号７９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｈ）配列番号８８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号８９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｉ）配列番号９８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号９９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｊ）配列番号１０８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１０９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
Ｋ）配列番号１１８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１１９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｌ）配列番号１２８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１２９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｍ）配列番号１３８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１３９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｎ）配列番号１４８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１４９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｏ）配列番号１５８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１５９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｐ）配列番号１６８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１６９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｑ）配列番号１７８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１７９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｒ）配列番号１８８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１８９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｓ）配列番号１９８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１９９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｔ）配列番号２０８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２０９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｕ）配列番号２１８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２１９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；または
ｖ）配列番号２２８および２３のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２２９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ。
【００３２】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体は、以下を含む：
ａ）配列番号１５および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｂ）配列番号２８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号３８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号３９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号４８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号５８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号５９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｆ）配列番号６８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号６９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｇ）配列番号７８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号７９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｈ）配列番号８８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号８９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｉ）配列番号９８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号９９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｊ）配列番号１０８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１０９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｋ）配列番号１１８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１１９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｌ）配列番号１２８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１２９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｍ）配列番号１３８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１３９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｎ）配列番号１４８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１４９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｏ）配列番号１５８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１５９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｐ）配列番号１６８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１６９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｑ）配列番号１７８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１７９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｒ）配列番号１８８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１８９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｓ）配列番号１９８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１９９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｔ）配列番号２０８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２０９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｕ）配列番号２１８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２１９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；または
ｖ）配列番号２２８および２４のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２２９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ。
【００３３】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体は、以下を含む：
ａ）配列番号１５および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｂ）配列番号２８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号３８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号３９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号４８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号５８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号５９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｆ）配列番号６８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号６９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｇ）配列番号７８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号７９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｈ）配列番号８８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号８９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｉ）配列番号９８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号９９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｊ）配列番号１０８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１０９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｋ）配列番号１１８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１１９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｌ）配列番号１２８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１２９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｍ）配列番号１３８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１３９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｎ）配列番号１４８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１４９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｏ）配列番号１５８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１５９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｐ）配列番号１６８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１６９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｑ）配列番号１７８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１７９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｒ）配列番号１８８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１８９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｓ）配列番号１９８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１９９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｔ）配列番号２０８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２０９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｕ）配列番号２１８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２１９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ；または
ｖ）配列番号２２８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２２９および６のアミノ酸配列を含むＬＣ。
【００３４】
ある態様において、本発明は、それぞれ配列番号７−１２のアミノ酸配列を含むＨ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３を含む、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３５】
ある態様において、本発明は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３６】
特定の態様において、本発明は、配列番号１５および２５のアミノ酸配列を含む重鎖ならびに配列番号４および６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ＴＩＭ−３抗体を提供する。
【００３７】
本発明はまた、配列番号２３６のアミノ酸残基Ｆ６１およびＩ１１７を含むＴＩＭ−３のエピトープに結合する抗ＴＩＭ−３抗体（例えば、抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５、１５０８６．１７１４４、２０２９３または２０１３１）またはその抗原結合部分を提供する。ある態様において、エピトープはさらに、アミノ酸残基Ｒ６９を含む（例えば、抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５、１５０８６．１７１４４または２０２９３）。他の態様において、エピトープはさらに、Ｐ５０、Ｅ６２、Ｍ１１８およびＤ１２０を含み（例えば、抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５、１５０８６．１７１４４または２０１３１）、またさらに、アミノ酸残基Ｒ６９、Ｖ６０およびＧ６４を含んでいてよい（例えば、抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５、または１５０８６．１７１４４）。
【００３８】
特定の態様において、抗体またはその部分は、配列番号２３６のアミノ酸残基Ｐ５０、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｇ６４、Ｒ６９、Ｉ１１７、Ｍ１１８およびＤ１２０（例えば、抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５または１５０８６．１７１４４）、配列番号２３６のアミノ酸残基Ｆ６１、Ｒ６９およびＩ１１７（例えば、抗体２０２９３）、または配列番号２３６のアミノ酸残基Ｐ５０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｉ１１７、Ｍ１１８およびＤ１２０（例えば、抗体２０１３１）を含むＴＩＭ−３のエピトープに結合する。
【００３９】
本発明はまた、配列番号２３６のアミノ酸残基６２−６７を含むＴＩＭ−３のエピトープに結合するモノクローナル抗体（例えば、抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５、１５０８６．１７１４４または２０２９３）またはその抗原結合部分を提供する。さらに、本発明は、配列番号２３６のアミノ酸残基１１４−１１７を含むＴＩＭ−３のエピトープに結合するモノクローナル抗体（例えば、抗体２０１３１）またはその抗原結合部分を提供する。
【００４０】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体はＩｇＧ抗体、例えばヒトＩｇＧ抗体である。ある態様において、抗体は、ＦＣ領域内に少なくとも１つの変異を含む。特定の態様において、抗体は、ＩＭＧＴの番号付けスキームに従って番号付けされている、重鎖アミノ酸位置２２８、２３３、２３４および２３５の１つまたはそれ以上における変異を含む。例えば、位置２３４および２３５のアミノ酸残基の一方または両方は、Ａｌａに変異されていてよく、および／または位置２２８のアミノ酸残基は、Ｐｒｏに変異されていてよい。
【００４１】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、以下の特性の少なくとも１つを有する：
ａ）表面プラズモン共鳴により測定される２３ｎＭ以下のＫＤでヒトＴＩＭ−３に結合する；
ｂ）表面プラズモン共鳴により測定される２２ｎＭ以下のＫＤでカニクイザルＴＩＭ−３に結合する；
ｃ）ＥＬＩＳＡにより測定される１．２ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＴＩＭ−３に結合する；
ｄ）ＥＬＩＳＡにより測定される４６ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザルＴＩＭ−３に結合する;
ｅ）一方向混合リンパ球反応アッセイにおいてＩＦＮ−γ分泌を増加させる；
ｆ）二方向混合リンパ球反応アッセイにおいてＩＦＮ−γ分泌を増加させる；
ｇ）一方向混合リンパ球反応アッセイにおいてＴＮＦ−α分泌を増加させる；
ｈ）樹状細胞からのＴＮＦ−α分泌を増加させる；および
ｉ）ＴＩＭ−３とホスファチジルセリンの相互作用を阻害する。
【００４２】
そのような抗体の例としては、抗体１５０８６．１５０８６（少なくとも特性ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｇおよびｈを有する）；抗体１５０８６．１７１４５（少なくとも特性ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｇ、ｈおよびｉを有する）、抗体１５０８６．１６８３７または１５０８６．１７１４４（少なくとも特性ａ、ｃおよびｄを有する）、抗体２０２９３または２０１３１（少なくとも特性ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｈを有する）、抗体２０３６２（少なくとも特性ｃ、ｅ、ｆおよびｈを有する）、ならびに抗体１９３２４、１９４１６、１９５６８、２０１８５、２０３００または２０６２１（少なくとも特性ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｈを有する）が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、上記の特性の全てを有する。ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、少なくとも特性ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｇおよびｈを有する。ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、少なくとも特性ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｇ、ｈおよびｉを有する。ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分は、少なくとも特性ａ、ｃおよびｄを有する。ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、少なくとも特性ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｈを有する。ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、少なくとも特性ｃ、ｅ、ｆおよびｈを有する。ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、少なくとも特性ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｈを有する。
【００４３】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、ＮＫ細胞の活性を増加させる。ある態様において、この活性はＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）により介在される。
【００４４】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、ＴＩＭ−３への結合について、ＡＢＴＩＭ３と競合しない（ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１５／１１７００２参照）、および／またはｍＡｂ１５と競合しない（ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１６／１１１９４７参照）。ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、ＡＢＴＩＭ３および／またはｍＡＢ１５と同じエピトープに結合しない；例えば、本発明の抗体またはその部分は、ＡＢＴＩＭ３および／またはｍＡｂ１５によって結合されない、ＴＩＭ−３上の１以上の残基に結合する。
【００４５】
他の側面において、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つの抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分および薬学的に許容される賦形剤を含む、要すればさらなる治療剤、例えば化学療法剤、抗腫瘍剤、抗血管形成剤、チロシンキナーゼ阻害剤またはＴＩＭ−３経路阻害剤を含んでいてよい、医薬組成物を提供する。
【００４６】
本発明はさらに、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分の、重鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、あるいは両方を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００４７】
本発明はまた、かかる単離された核酸分子を含むベクターであって、要すればさらに発現制御配列を含んでいてよいベクターを提供する。
【００４８】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体の、重鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、あるいは両方を含む、宿主細胞を提供する。
【００４９】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の作製方法であって、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の、重鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、および軽鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供し、該宿主細胞を抗体またはその部分の発現に適する条件下で培養し、そして得られた抗体またはその部分を単離することを含む、方法を提供する。
【００５０】
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体の抗原結合部分および別の異なる抗体、例えば別の抗ＴＩＭ−３抗体（例えば、本明細書に記載の別の抗ＴＩＭ−３抗体）あるいはその活性が癌のような病状に介在する異なるタンパク質、例えば別の免疫チェックポイントタンパク質、癌抗原もしくは別の細胞表面分子を標的とする抗体、例えば別の異なる抗体の抗原結合部分を有する、多重特異性（例えば二重特異性）結合分子を提供する。
【００５１】
本発明はまた、患者（例えば、ヒト患者）において免疫を増強するための方法であって、該患者に本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分または多重特異性（例えば、二重特異性）結合分子を投与することを含む方法を提供する。
【００５２】
本発明はさらに、患者（例えば、ヒト患者）において癌を処置する方法であって、該患者に本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分または多重特異性（例えば、二重特異性）結合分子を投与することを含む方法を提供する。ある態様において、癌は、皮膚、肺、腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟組織、造血組織、頭頸部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮および膵臓からなる群より選択される組織に由来する。ある態様において、患者は、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）、ホジキンリンパ腫、または非ホジキンリンパ腫を有する。ある態様において、患者は、固形腫瘍（例えば、進行性または転移性固形腫瘍）を有する。ある態様において、患者は、黒色腫、非小細胞肺癌、結腸直腸癌または腎細胞癌腫を有する。ある態様において、該方法はさらに、化学療法剤、抗腫瘍剤、抗血管形成剤、チロシンキナーゼ阻害剤、および／またはＴＩＭ−３経路阻害剤を投与することをさらに含む。
【００５３】
本発明はさらに、上記の処置における使用；上記の処置のための医薬としての、該抗体、抗原結合部分または多重特異性結合分子の使用；ならびに、上記の処置、すなわち、該患者の免疫系を増強する必要のあるヒト患者の処置および上記の癌のうち１つのようなヒト癌患者の処置のための医薬の製造を目的とする、該抗体、抗原結合部分または多重特異性結合分子の使用を目的とする、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分または多重特異性（例えば、二重特異性）結合分子を提供する。本発明はまた、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分または多重特異性（例えば、二重特異性）結合分子を含む製品、ならびに該製品の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるＩＦＮ−γ産生についての抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４の用量応答曲線を示す。
【図２】図２は、一方向ＭＬＲアッセイにおけるＴＮＦ−α産生についての抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４の用量−反応曲線を示す。
【図３】図３は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅの電気化学発光サイトカインアッセイを用いてＴＮＦ−αレベルとして測定される、抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４の精製された樹状細胞サブセットへの影響を示す。
【図４】図４は、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体ならびに陽性対照抗ＴＩＭ−３抗体および２つの陰性対照抗体の存在下での、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ）陽性（アポトーシス）細胞へのＴＩＭ−３−Ｆｃ結合を示す。Ａ：本発明の抗ＴＩＭ−３抗体［１５０８６．１７１４５］；Ｂ：陰性対照非遮断抗ＴＩＭ−３抗体［１５３３８．１５３３８］；Ｃ：対照抗ＴＩＭ−３抗体［１８５７１．１８５７１］；Ｄ：陰性対照抗ＰＤ−１抗体Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペムブロリズマブ）。
【図５】図５は、一方向ＭＬＲアッセイにおけるＩＦＮ−γ産生についての、９個の抗ＴＩＭ−３抗体の用量応答曲線を示す。
【図６】図６は、二方向ＭＬＲアッセイにおけるＩＦＮについての１０個の抗ＴＩＭ−３抗体の用量応答曲線を示す。抗体１５０８６．１７１４５は、“１５０８６”と示されている。
【図７】図７は、２人の独立したドナーからの単球由来の樹状細胞におけるＴＮＦ−α産生についての９個の抗ＴＩＭ−３抗体の用量応答曲線を示す。
【図８】図８は、１８個の抗ＴＩＭ−３抗体のパネルの結合競合分析によって同定されたエピトープ基（エピトープビン（bin））の概要を示す。黒色の線で結ばれた円で囲まれた抗体は、両方の方向における交差遮断活性を示す。四角で囲まれた抗体は、抗体が溶液中で試験されたときのみ、一方向性の遮断を示す。破線は、抗体が固定化されている場合のみ、一方向性の遮断を示す。抗体は、他の抗ＴＩＭ−３抗体との競合パターンに従ってグループ分けされる。抗体１５０８６．１７１４５は、“１５０８６”と示されている。
【図９】図９は、ヒトＴＩＭ−３ ＩｇＶドメイン（ＰＤＢ ５Ｆ７１）の構造上の抗体エピトープの位置を示す。ヒトＴＩＭ−３ ＩｇＶドメインの描写（cartoon）は、３つの異なる向きで示され、ホスファチジルセリン結合部位の位置が示されている。マッピングされたエピトープの位置は、各抗体のＴＩＭ−３空間充填モデル上に暗色で示されている。Ｆａｂフラグメント１５０８６は“１５０８６”として示され、Ｆａｂフラグメント２０２９３は“２０２９３”として示されている。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
発明の詳細な説明
本発明は、癌患者などのヒト患者における免疫系の増強のために使用され得る新規の抗ヒトＴＩＭ−３抗体を提供する。特に断らない限り、本明細書で用いる“ＴＩＭ−３”は、ヒトＴＩＭ−３を意味する。ヒトＴＩＭ−３ポリペプチド配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８ＴＤＱ０（ＨＡＶＲ２＿ＨＵＭＡＮ）の下で利用可能であり、本明細書中、配列番号２３６として示されている。
【００５６】
本明細書で用いる用語“抗体”（Ａｂ）または“免疫グロブリン”（Ｉｇ）は、ジスルフィド結合によって互い結合されている、２つの重（Ｈ）鎖（約５０−７０ｋＤａ）および２つの軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤａ）を含む四量体を意味する。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬドメインは、“フレームワーク領域”（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在する（interspersed）“相補性決定領域”（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化することができる。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲ（重鎖のＣＤＲを本明細書中、Ｈ−ＣＤＲと記載する；軽鎖のＣＤＲを本明細書中、Ｌ−ＣＤＲと記載する）および４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシル末端に以下の順で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖または軽鎖におけるアミノ酸番号の割り当ては、ＩＭＧＴ(登録商標)の定義（Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55−77 (2003）)；または、Ｋａｂａｔの定義、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 および 1991)）； Chothia ＆ Lesk, J. Mol. Biol. 196:901−917 (1987); または Chothia et al., Nature 342:878−883 (1989）に従って行われ得る。
【００５７】
用語“組換え抗体”とは、該抗体をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む細胞または細胞株から発現される抗体を意味し、ここで、該ヌクレオチド配列（複数可）は、天然にはその細胞と関連していない。
【００５８】
用語“単離されたタンパク質”、“単離されたポリペプチド”または“単離された抗体”は、その起源または派生供給源に基づいて、（１）その天然状態でそれに付随する天然関連成分と結合していない、（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、および／または（４）天然には存在しない、タンパク質、ポリペプチドまたは抗体を意味する。従って、化学的に合成されたか、またはそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然関連成分から“単離”されていてよい。タンパク質はまた、当該分野で周知のタンパク質精製技術を用いる単離によって、天然関連成分を実質的に含まなくされ得る。
【００５９】
本明細書で用いる用語“生殖系列”は、それらが生殖細胞を経由して親から子孫に渡される、抗体遺伝子および遺伝子セグメントのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を意味する。生殖系列配列は、Ｂ細胞成熟の過程において組換えおよび超変異（hyper−mutation）事象によって改変されている成熟Ｂ細胞における抗体をコードするヌクレオチド配列と区別される。特定の生殖系列配列を利用する抗体は、生殖系列ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と整列するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有し、それは他の何れかの生殖系列ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列より密接に特定する。
【００６０】
用語“親和性”は、抗原と抗体の間の誘引力の尺度を意味する。抗原に対する抗体の内因性の誘引性は、一般的には、特定の抗体−抗原相互作用の結合親和性平衡定数（ＫＤ）として表される。抗体は、ＫＤが≦１ｍＭ、好ましくは≦１００ｎＭのとき、抗原に特異的に結合すると言われる。ＫＤ結合親和性定数は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ(商標)）または例えばＢｉｏ−ＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ（商標)ＸＰＲ３６ ＳＰＲシステムまたはＯｃｔｅｔ(商標)システムを用いるバイオレイヤー干渉法（Bio−Layer Interferometry）により、測定することができる。
【００６１】
用語“ｋｏｆｆ”は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を意味する。ｋｏｆｆ解離速度定数は、例えばＯｃｔｅｔ(商標)システムを用いてバイオレイヤー干渉法により測定することができる。
【００６２】
本明細書で用いる用語“エピトープ”は、抗体または二重特異性結合分子などの関連分子に特異的に結合する抗原の一部分（決定基）を意味する。エピトープ決定基は、一般的に、アミノ酸または炭水化物または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、一般的に、特定の三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。エピトープは“直線状”または“立体的”であってよい。直線状エピトープでは、タンパク質（例えば、抗原）と相互作用分子（抗体など）との間の相互作用点の全てが、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に生じる。立体的エピトープでは、相互作用点は、アミノ酸の一次配列において互いに離れたタンパク質上のアミノ酸残基に渡って生じる。抗原上の所望のエピトープが決定されると、当技術分野で周知の技術を用いて、そのエピトープに対する抗体を作製することが可能となる。例えば、直線状エピトープに対する抗体は、例えば、該直線状エピトープのアミノ酸残基を有するペプチドを用いて動物を免疫化することにより、作製することができる。立体的エピトープに対する抗体は、例えば、該立体的エピトープの関連アミノ酸残基を含むミニドメイン（mini-domain）を用いて動物を免疫化することにより、作製することができる。特定のエピトープに対する抗体もまた、例えば、目的の標的分子またはその関連する部分（例えば、ＴＩＭ−３のＥＣＤ）を用いて動物を免疫化し、その後該エピトープへの結合についてスクリーニングすることにより、作製することができる。
【００６３】
当業者は、競合アッセイ、エピトープ・ビニングおよびアラニンスキャニングを含むが、これらに限定されない、当該分野で公知の方法を用いて、抗体が本発明の抗ＴＩＭ−３抗体と同じエピトープに結合するかどうか、または本発明の抗ＴＩＭ−３抗体と結合について競合するかどうかを、決定することができる。ある態様において、試験抗体および本発明の抗ＴＩＭ−３抗体は、ＴＩＭ−３上の少なくとも１つの共通する残基（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個の共通する残基）に結合する。さらなる態様において、ＴＩＭ−３上の接触（contact）残基は、試験抗体と本発明の抗ＴＩＭ−３抗体との間で完全に同一である。一態様において、当業者は、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体を飽和条件下でＴＩＭ−３に結合させて、試験抗体のＴＩＭ−３に結合する能力を測定することができる。試験抗体が対照抗ＴＩＭ−３抗体と同時にＴＩＭ−３に結合することができる場合、該試験抗体は、対照抗ＴＩＭ−３抗体とは異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が同時にＴＩＭ−３に結合することができない場合は、該試験抗体は、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体が結合するエピトープと同じエピトープ、重複するエピトープ、またはそれに近接するエピトープに結合する。この試験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ(商標)、バイオレイヤー干渉法またはフローサイトメトリーを用いて行うことができる。抗ＴＩＭ−３抗体が別の抗ＴＩＭ−３抗体と交差競合するかどうかを試験するために、当業者は、二方向での、すなわち、既知の抗体が試験抗体を阻害するかどうか、および試験抗体が既知の抗体を阻害するかどうかを決定する、上記の競合法を使用することができる。かかる交差競合試験は、ＩＢＩＳ ＭＸ９６ ＳＰＲ 装置またはＯｃｔｅｔ(商標)を用いて実施され得る。
【００６４】
特定の場合には、標的エピトープに対する結合親和性を改善するために１またはそれ以上のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることも望ましいであろう。これは“親和性成熟（affinity maturation）”として知られている。種々の親和性成熟方法が当技術分野において公知であり、例えばBurks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)に記載されたインビトロスキャニング飽和突然変異誘発、およびWu et al.  Proc Natl Acad Sci USA 95:6037-6042 (1998)に記載の段階的インビトロ親和性成熟法が挙げられる。
【００６５】
本明細書で用いる用語、抗体の“抗原結合部分”（または、単に“抗体部分”）は、抗原（例えば、ヒトＴＩＭ−３またはその一部）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１またはそれ以上の部分または断片を意味する。全長抗体の特定の断片が、抗体の抗原結合機能を果たし得ることが示されている。用語“抗原結合部分”に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片：ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；および、（ｖｉ）抗原に特異的に結合することが可能な単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の二つのドメインＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらを一本鎖タンパク質として作製することを可能にする合成ペプチドリンカーにより、組換え法を用いて結合させることができ、そこで、ＶＬおよびＶＨドメインは対になり一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する。ＶＨおよび／またはＶＬを含む抗原結合分子もまた本発明の範囲内である。ＶＨの場合、分子はまた、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３領域の１またはそれ以上を含んでいてもよい。かかる単鎖抗体もまた、用語、抗体の“抗原結合部分”に包含されることが意図される。ダイアボディのような単鎖抗体の他の形態もまた包含される。ダイアボディは二価の二重特異性抗体であり、ここで、ＶＨおよびＶＬドメインは、単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いて、該ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させて２つの抗原結合部位を作り出す。
【００６６】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片のような抗体の部分は、完全長抗体のパパイン消化またはペプシン消化などの従来技術を用いて、完全長抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体の部分および免疫接着分子は、例えば本明細書に記載の、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。
【００６７】
抗ＴＩＭ−３抗体のクラス（アイソタイプ）およびサブクラスは、当技術分野で公知の何れかの方法により決定することができる。一般的に、抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いて決定することができる。かかる抗体は、市販されている。クラスおよびサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットならびに他の技術により決定することができる。あるいは、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常領域の全部または一部を配列決定し、免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの既知のアミノ酸配列とそのアミノ酸配列を比較し、そして抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによって決定することができる。
【００６８】
抗体配列の所定の位置における特定のアミノ酸残基を示すとき、例えば、“３５Ｓ”の表示は、位置および残基を意味し、すなわち、この場合、セリン残基（Ｓ）が配列の位置３５に存在することを示す。同様に、例えば、“１３Ｑ＋３５Ｓ”の表示は、それぞれの位置における２つの残基を意味する。
【００６９】
特に断らない限り、本明細書において言及される全ての抗体アミノ酸残基番号は、ＩＭＧＴ（登録商標）の番号付けスキームによるものである。
【００７０】
抗ＴＩＭ−３抗体
本発明は、ＴＩＭ−３に対する抗体、およびその抗原結合部分を提供する。特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、ヒトイディオタイプを有する抗体を作製することができるトランスジェニックラットから作製されるヒト抗体である。
【００７１】
本発明の新規の抗ＴＩＭ−３抗体の利点は、それらが樹状細胞を強力に活性化できることである（例えば、実施例４を参照のこと）。特定の理論はともかく、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体は、樹状細胞の活性化を介してＴ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）を刺激することができると考えられる。さらに、本出願は、イソ型ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の抗ＴＩＭ−３抗体が高レベルの活性を有する一方で、イソ型ＩｇＧ４またはＩｇＧ１−ＬＡＬＡの抗体は、非機能性または低機能性であることを初めて示している（例えば、実施例３および４を参照のこと）。特定の理論はともかく、本発明者らのデータは、Ｆｃ受容体を介してＴＩＭ−３を架橋することができる抗ＴＩＭ−３抗体が、免疫系の特に強力なアクティベーターであることを示唆する。例えば、本発明の抗ＴＩＭ−３ ＩｇＧ２抗体は、樹状細胞上に見出されるＦｃγＲ２Ａに結合することができ、樹状細胞上のＴＩＭ−３分子を架橋することによって樹状細胞を活性化すると考えられる。
【００７２】
本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体は、５ケタの番号、例えば“２０１３１”、または１０ケタの番号、例えば“１５０８６．１６８３７”のいずれかで示され得る。最初の５ケタが同じ１０ケタの番号は、同じ親抗体に由来しており、例えば抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５、１５０８６．１７１４４の場合がそれに当たる。同じ６個のＣＤＲを共有するそのような抗体は、同じかまたは実質的に同じ標的結合特性を有すると予期される。本発明で提供されるタンパク質配列およびＤＮＡ配列から明らかなように、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４変異体は、親１５０８６抗体（“１５０８６．１５０８６”）と比べてＶＨ配列において単一のアミノ酸相違を有し、すなわち位置６においてＱではなくＥを有するが、ＶＬアミノ酸配列は同一である。これらの変異体は、主にそれらの抗体フォーマット／サブクラスによって異なることも明らかであり、すなわち：
１５０８６．１５０８６：ＩｇＧ１
１５０８６．１６８３７：ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ
１５０８６．１７１４５：ＩｇＧ２
１５０８６．１７１４４：ＩｇＧ４である。
【００７３】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号７−９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号３および５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１０−１２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号４および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号７−１２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号３および５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号４および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００７４】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号７−９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号１５および２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１０−１２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号４および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号７−１２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号１５および２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号４および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００７５】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号７−９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号２３または２４のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１０−１２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号４および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号７−１２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号２３または２４のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号４および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００７６】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号３０−３２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号３３−３５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号２９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号３０−３５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号２９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００７７】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号４０−４２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号３８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号３８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号４３−４５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号３９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号３９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号４０−４５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号３９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号３８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号３９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００７８】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号５０−５２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号４８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号５３−５５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号４９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号５０−５５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号４８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号４９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００７９】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号６０−６２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号５８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号６３−６５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号５９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号６０−６５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号５８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号５９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００８０】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号７０−７２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号６８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号６８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号７３−７５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号６９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号６９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号７０−７５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号６９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号６８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号６９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００８１】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号８０−８２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号７８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号７８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号８３−８５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号７９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号７９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号８０−８５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号７８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号７９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号７８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号７９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００８２】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号９０−９２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号８８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号８８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号８８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号９３−９５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号８９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号８９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号８９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号９０−９５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号８８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号８９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号８８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号８９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号８８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号８９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００８３】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１００−１０２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号９８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号９８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１０３−１０５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号９９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号９９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号９９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１００−１０５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号９９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号９８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号９９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号９８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号９９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００８４】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１１０−１１２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１０８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号１０８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１１３−１１５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号１０９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号１０９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号１０９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１１０−１１５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号１０８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号１０９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号１０８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号１０９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号１０８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号１０９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００８５】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１２０−１２２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号１１８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１２３−１２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号１１９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１２０−１２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号１１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号１１８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号１１８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号１１９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００８６】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１３０−１３２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号１２８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１３３−１３５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号１２９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号１２９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１３０−１３５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号１２９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号１２８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号１２８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号１２９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００８７】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１４０−１４２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号１３８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１４３−１４５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号１３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号１３９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１４０−１４５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号１３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号１３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号１３８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号１３８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号１３９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００８８】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１５０−１５２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号１４８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１５３−１５５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号１４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号１４９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１５０−１５５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号１４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号１４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号１４８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号１４８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号１４９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００８９】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１６０−１６２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号１５８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１６３−１６５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号１５９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号１５９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１６０−１６５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号１５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号１５９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号１５８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号１５８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号１５９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００９０】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１７０−１７２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１６８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号１６８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１７３−１７５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号１６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号１６９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１７０−１７５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号１６８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号１６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号１６８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号１６８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号１６９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００９１】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１８０−１８２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１７８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号１７８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１８３−１８５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号１７９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号１７９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１８０−１８５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号１７８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号１７９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号１７８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号１７８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号１７９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００９２】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１９０−１９２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１８８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号１８８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号１８８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１９３−１９５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号１８９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号１８９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号１９０−１９５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号１８８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号１８９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号１８８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号１８８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号１８９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００９３】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号２００−２０２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１９８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号１９８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号２０３−２０５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号１９９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号１９９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号１９９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号２００−２０５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号１９８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号１９９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号１９８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号１９９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号１９８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号１９９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００９４】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号２１０−２１２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号２０８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号２０８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号２０８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号２１３−２１５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号２０９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号２０９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号２１０−２１５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号２０８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号２０９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号２０８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号２０８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号２０９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００９５】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号２２０−２２２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号２１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号２１８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号２１８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号２２３−２２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号２１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号２１９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号２１９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号２２０−２２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号２１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号２１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号２１８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号２１９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号２１８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号２１９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００９６】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、以下からなる群より選択される：
ａ）Ｈ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号２３０−２３２のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号２２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｃ）ＶＨが、配列番号２２８のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）重鎖（ＨＣ）が、配列番号２２８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）Ｌ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号２３３−２３５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｆ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号２２９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｇ）ＶＬが、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｈ）軽鎖（ＬＣ）が、配列番号２２９および６のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１−３およびＬ−ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号２３０−２３５のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｊ）ＶＨが、配列番号２２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＶＬが、配列番号２２９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗体；
ｋ）ＶＨが、配列番号２２８のアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに
ｌ）ＨＣが、配列番号２２８のアミノ酸配列および配列番号５、２３、２４または２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣが、配列番号２２９および６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【００９７】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＴＩＭ−３への結合について、ＩｇＧ１フォーマットを有する抗体１５０８６．１５０８６、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡフォーマットを有する抗体１５０８６．１６８３７、ＩｇＧ２フォーマットを有する抗体１５０８６．１７１４５、またはＩｇＧ４フォーマットを有する抗体１５０８６．１７１４４と競合するか、あるいはこれらの抗体と同じヒトＴＩＭ−３のエピトープに結合する。ある態様において、本発明の抗体はＩｇＧである。ある態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４フォーマットを有する。
【００９８】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＴＩＭ−３への結合について、抗体２０１３１、２０２９３、１５１０５、１５１０７、１５１０９、１５１７４、１５１７５、１５２６０、１５２８４、１５２９９、１５３５３、１５３５４、１７２４４、１７２４５、１９３２４、１９４１６、１９５６８、２０１８５、２０３００、２０３６２または２０６２１と競合するか、あるいはこれらの抗体と同じヒトＴＩＭ−３のエピトープに結合する。ある態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４フォーマットを有する。
【００９９】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＴＩＭ−３への結合について、以下の実施例１２に定義される、エピトープビン１由来の抗体（対照抗体ｍＡｂ １５）、ビン２由来の抗体（例えば、抗体１５１０５および１５１０７）ならびにビン８由来の抗体（例えば、抗体１５１７４および１５１７５）のいずれかまたは全てと競合しないか、あるいはこれらの抗体と同じヒトＴＩＭ−３のエピトープに結合しない。
【０１００】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＴＩＭ−３への結合について、以下の実施例１２に定義される、エピトープビン２由来の抗体（例えば、抗体１５１０５および１５１０７）ならびにビン８由来の抗体（例えば、抗体１５１７４および１５１７５）のいずれかまたは全てと競合しないか、あるいはこれらの抗体と同じヒトＴＩＭ−３のエピトープに結合しない。
【０１０１】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＴＩＭ−３への結合について、以下の実施例１２に定義される、エピトープビン２由来の抗体（例えば、抗体１５１０５および１５１０７）のいずれかまたは全てと競合しないか、あるいはこれらの抗体と同じヒトＴＩＭ−３のエピトープに結合しない。
【０１０２】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、ヒトＴＩＭ−３への結合について、重鎖（Ｈ）ＣＤＲ１−３および軽鎖（Ｌ）ＣＤＲ１−３が、それぞれ配列番号７−１２、３０−３５、４０−４５、５０−５５、６０−６５、７０−７５、８０−８５、９０−９５、１００−１０５、１１０−１１５、１２０−１２５、１３０−１３５、１４０−１４５、１５０−１５５、１６０−１６５、１７０−１７５、１８０−１８５、１９０−１９５、２００−２０５、２１０−２１５、２２０−２２５または２３０−２３５を含む抗体と競合するか、あるいはこれらの抗体と同じヒトＴＩＭ−３のエピトープに結合する。
【０１０３】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分は、配列番号３、１５、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１０８、１１８、１２８、１３８、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、１９８、２０８、２１８または２２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、例えば、該配列と少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する。
【０１０４】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号３、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１０８、１１８、１２８、１３８、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、１９８、２０８、２１８または２２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、例えば該配列と少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびに、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、例えば該配列と少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖定常領域（ＣＨ）を有する。
【０１０５】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号３、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１０８、１１８、１２８、１３８、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、１９８、２０８、２１８または２２８のＶＨアミノ酸配列ならびに配列番号５のＣＨアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）を有する。
【０１０６】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号１５、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１０８、１１８、１２８、１３８、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、１９８、２０８、２１８または２２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、例えば該配列と少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびに、配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、例えば該配列と少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖定常領域（ＣＨ）を有する。特定の態様において、該ＣＨは、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、例えば該配列と少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１０７】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号１５、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１０８、１１８、１２８、１３８、１４８、１５８、１６８、１７８、１８８、１９８、２０８、２１８または２２８のＶＨアミノ酸配列ならびに配列番号２３、２４または２５のＣＨアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）を有する。特定の態様において、重鎖は、配列番号２５のＣＨアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号４、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１１９、１２９、１３９、１４９、１５９、１６９、１７９、１８９、１９９、２０９、２１９または２２９のＶＬアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、例えば該配列と少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する。
【０１０９】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号４、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１１９、１２９、１３９、１４９、１５９、１６９、１７９、１８９、１９９、２０９、２１９または２２９のＶＬアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、例えば該配列と少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；ならびに、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、例えば該配列と少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）を有する。
【０１１０】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、配列番号４、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１１９、１２９、１３９、１４９、１５９、１６９、１７９、１８９、１９９、２０９、２１９または２２９のＶＬアミノ酸配列ならびに配列番号６のＣＬアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）を有する。
【０１１１】
ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、上記の重鎖のいずれか１つおよび上記の軽鎖のいずれか１つを含む。
【０１１２】
ある態様において、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分のいずれかは、ガレクチン−９、ＣＥＡＣＡＭ１、ＨＭＧＢ−１およびホスファチジルセリンなどのリガンドのＴＩＭ−３への結合を阻害し得る。
【０１１３】
一態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の投与は、樹状細胞を活性化し、その成熟を引き起こし、それによりそのＴ細胞を刺激する能力を形成し得る。特定の理論はともかく、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体は、ＴＩＭ−３樹状細胞アクティベーターとして機能し、樹状細胞に対するその効果は、Ｔ細胞を刺激する働きをすることであると考えられる。従って、腫瘍関連環境では、抗ＴＩＭ−３抗体は、腫瘍関連樹状細胞の成熟および活性化を引き起こし、結果として腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化をもたらし得る。
【０１１４】
ある態様において、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分のいずれかは、少なくとも１００、少なくとも５０、少なくとも４０、少なくとも３０、少なくとも２５、少なくとも２０、少なくとも１５、少なくとも１０、少なくとも９、少なくとも８、少なくとも７、または少なくとも６ｎＭのＫＤでヒトＴＩＭ−３に結合し得る。ある態様において、ＫＤは、表面プラズモン共鳴を用いて決定される。
【０１１５】
ある態様において、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分のいずれかは、少なくとも１００、少なくとも５０、少なくとも４０、少なくとも３０、少なくとも２５、少なくとも２４、少なくとも２３、少なくとも２２、少なくとも２１または少なくとも２０ｎＭのＫＤでカニクイザルＴＩＭ−３に結合し得る。ある態様において、ＫＤは、表面プラズモン共鳴を用いて決定される。
【０１１６】
ある態様において、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分のいずれかは、ＥＣ５０≦２、１．５、１、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１５ｎＭのヒトＴＩＭ−３に対する親和性(avidity)を有し得る。ある態様において、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分のいずれかは、ＥＣ５０≦８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、１．５、１、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１５ｎＭのカニクイザルＴＩＭ−３に対する親和性を有し得る。
【０１１７】
一態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の投与は、Ｔ細胞を直接活性化し得る。
【０１１８】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２３６の以下の残基：Ｐ５０、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｇ６４、Ｒ６９、Ｉ１１７、Ｍ１１８およびＤ１２０の、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または少なくとも９つ）を含む、ＴＩＭ−３のエピトープに結合する。上記の残基の何れかの組合せを有するエピトープが意図される。
【０１１９】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２３６の残基６２−６７および／または１１４−１１７を含むＴＩＭ−３のエピトープに結合する。ある態様において、抗体またはその部分は、配列番号２３６の残基６２−６７（またはその断片、例えば１、２、３、４または５残基の断片）に結合する（例えば、抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５、１５０８６．１７１４４および２０２９３）。ある態様において、抗体またはその部分は、配列番号２３６の残基１１４−１１７（またはその断片、例えば１、２または３残基の断片）に結合する（例えば、抗体２０１３１）。上記の残基の何れかの組合せを有するエピトープも意図される。
【０１２０】
本明細書に記載の方法により得られる抗ＴＩＭ−３抗体のクラスは、別のクラスまたはサブクラスに変更またはスイッチすることができる。本発明の一側面では、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子は、それが、ＣＬまたはＣＨをコードする核酸配列を含まないように、当技術分野で周知の方法を用いて単離される。次いで、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子は、免疫グロブリン分子の異なるクラスから、それぞれＣＬまたはＣＨをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。これは、上記の通り、ＣＬまたはＣＨ鎖を含むベクターまたは核酸分子を用いて達成することができる。例えば、元はＩｇＭであった抗ＴＩＭ−３抗体は、ＩｇＧにクラススイッチすることができる。さらに、クラススイッチは、別のＩｇＧサブクラスに変換するために、例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換するために使用されてもよい。κ軽鎖定常領域は、λ軽鎖定常領域に変更されてよい。所望のＩｇアイソタイプを有する本発明の抗体を産生するための好ましい製造法は、抗ＴＩＭ−３抗体の重鎖をコードする核酸分子および抗ＴＩＭ−３抗体の軽鎖をコードする核酸分子を単離する工程、重鎖の可変ドメインを得る工程、重鎖の可変ドメインを所望のアイソタイプの重鎖の定常ドメインとライゲーションする工程、細胞において軽鎖およびライゲートした重鎖を発現させる工程、ならびに所望のアイソタイプを有する抗ＴＩＭ−３抗体を回収する工程を含む。
【０１２１】
本発明の抗ＴＩＭ−３抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ分子であり得るが、一般的には、ＩｇＧアイソタイプであり、例えばＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。一態様において、抗体はＩｇＧ１である。別の態様において、抗体はＩｇＧ２である。
【０１２２】
一態様において、抗ＴＩＭ−３抗体は、Ｆｃ領域に少なくとも１つの変異を含み得る。多くの種々のＦｃ変異が知られており、これらの変異はエフェクター機能を提供する。例えば、多くの場合、例えばリガンド／受容体相互作用が望ましくない場合または抗体−薬剤複合体の場合に、エフェクター機能を低下させる、または欠失させることが望ましい。エフェクター機能を低下させるために変異させるのに有利であり得るＦｃ領域のアミノ酸の位置には、位置２２８、２３３、２３４および２３５の１以上が含まれ、ここで、アミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）の番号付けスキームに従って番号付けされている。
【０１２３】
一態様において、位置２３４および２３５のアミノ酸残基の一方または両方を、例えば、ＬｅｕからＡｌａへ変異させることができる（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）。これらの変異は、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のエフェクター機能を低下させる。これに加えて、またはこれに代えて、位置２２８のアミノ酸残基は、例えばＰｒｏに変異されてよい。別の態様において、位置２３３のアミノ酸残基は、例えばＰｒｏに変異されてよく、位置２３４のアミノ酸残基は、例えばＶａｌに変異されてよく、および／または位置２３５のアミノ酸残基は、例えばＡｌａに変異されてよい。アミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）の番号付けスキームに従って番号付けされている。
【０１２４】
別の態様において、抗体がＩｇＧ４サブクラスである場合、それは、変異Ｓ２２８Ｐを含んでいてよく、すなわち、位置２２８にプロリンを有していてよい（ここで、アミノ酸の位置は、Ｅｕ ＩＭＧＴ（登録商標）の番号付けスキームに従って番号付けされている）。この変異は、望ましくないＦａｂアーム交換を減少させることが知られている(Angal et al., Mol Immunol. 30:105−8 (1993))。
【０１２５】
ある態様において、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、該抗体または抗体部分と１以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合によって形成される、大きな免疫接着分子の一部であってよい。そのような免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93−101 (1995)）、ならびに二価およびビオチニル化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047−1058 (1994)）が含まれる。他の例には、目的の抗原に特異的に結合する免疫接着分子にするために、抗体由来の１以上のＣＤＲが共有結合または非共有結合により分子内に組み込まれている場合が含まれる。このような態様では、ＣＤＲ（複数可）は、より大きなポリペプチド鎖の一部として組み込まれ得る、共有結合的に別のポリペプチド鎖に連結され得る、または非共有結合的に組み込まれ得る。
【０１２６】
別の態様において、融合抗体または免疫接着分子は、別のポリペプチドに連結された本発明の抗ＴＩＭ−３抗体の全部または一部を含んで作製され得る。ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体の可変ドメインのみがポリペプチドに連結されている。ある態様において、抗ＴＩＭ−３抗体のＶＨおよびＶＬドメインが、互いに相互作用して抗原結合部位を形成するように、抗ＴＩＭ−３抗体のＶＨドメインは、第一のポリペプチドに連結されており、一方、抗ＴＩＭ−３抗体のＶＬドメインは、第一のポリペプチドと結合する第二のポリペプチドに連結されている。別の好ましい態様において、ＶＨドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用することができるように、リンカーによってＶＬドメインから分離されている（例えば、一本鎖抗体）。ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体は、その後、目的のポリペプチドに連結される。さらに、融合抗体は、２（またはそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結されて作製され得る。これは、単一のポリペプチド鎖上に二価もしくは多価抗体を作製したい場合、または二重特異性抗体を作製したい場合に有用である。
【０１２７】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片は、フレキシブルリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結されており、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列は、フレキシブルリンカーにより結合されたＶＬおよびＶＨドメインを有する、連続した一本鎖タンパク質として発現され得る。例えば、Bird et al., Science 242:423−426 (1988)；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879−5883 (1988)；および、McCafferty et al., Nature 348:552−554 (1990)を参照。単鎖抗体は、１つのＶＨおよびＶＬが用いられる場合、一価であり、２つのＶＨおよびＶＬが用いられる場合、二価であり、または３以上のＶＨおよびＶＬが用いられる場合、多価であり得る。二重特異性または多価抗体は、例えば、ヒトＴＩＭ−３および別の分子に特異的に結合するように作製され得る。
【０１２８】
他の態様において、他の改変抗体は、抗ＴＩＭ−３抗体をコードする核酸分子を用いて製造され得る。例えば、“カッパボディ”（Ill et al., Protein Eng. 10:949−57 (1997)）、“ミニボディ”（Martin et al., EMBO J.  13:5303−9 (1994)）、“ダイアボディ”（Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444−6448 (1993))、または“一本鎖分子(Janusins)” (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655−3659 (1991) および Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51−52 (1992)）を、明細書の教示に従って標準的な分子生物学的技術を用いて製造することができる。
【０１２９】
本発明の抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分は、誘導体化するか、または別の分子（例えば、別のペプチドもしくはタンパク質）に連結され得る。一般的に、抗体またはその部分は、ＴＩＭ−３結合が誘導体化または標識によって悪影響を受けないように誘導体化される。従って、本発明の抗体および抗体部分は、本明細書に記載のヒト抗ＴＩＭ−３抗体の無傷の形態および改変型の両方を含むことが意図される。例えば、本発明の抗体または抗体部分は、別の抗体（例えば、二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出試薬、医薬品、ならびに／あるいは別の分子（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなど）と該抗体または抗体部分との結合を仲介し得るタンパク質またはペプチドなどの、１または複数の他の分子化合物に（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合またはその他によって）機能的に連結され得る。
【０１３０】
誘導体化抗体の１つのタイプは、（例えば、二重特異性抗体を作製するために、同じ種類または異なる種類の）２以上の抗体を架橋することによって作製される。好適な架橋リンカーは、適当なスペーサーで分離された２つの区別できる反応性基を有するヘテロ二官能性であるもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性であるもの（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）が含まれる。このようなリンカーは、例えば、Pierce Chemical Company、Rockford、ILから入手可能である。
【０１３１】
抗ＴＩＭ−３抗体はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチル基、または炭水化物基などの化学基で誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するのに、例えば血清半減期を増加させるのに有用である。
【０１３２】
本発明の抗体はまた標識されてもよい。本明細書で用いる用語“標識”または“標識した”は、抗体における別の分子の挿入を意味する。一態様において、標識は、例えば、放射標識したアミノ酸の挿入、または標識アビジン（例えば、光学的方法または熱量測定法により検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合などの、検出可能マーカーである。別の態様において、標識またはマーカーは、治療用の、例えば薬物複合体または毒素であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が当技術分野で公知であり、用いられ得る。ポリペプチドの標識の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、蛍光ランタニド）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、ガドリニウムキレートなどの磁性剤、毒素、例えば百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン（emetine）、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールならびにピューロマイシン、およびそのアナログまたはホモログ。ある態様において、標識は、可能性のある立体障害を減ずるために様々な長さのスペースアームにより結合される。
【０１３３】
ある態様において、本発明の抗体は、中性形態（両性イオン形態を含む）または正もしくは負に帯電した種として存在し得る。ある態様において、抗体は、薬学的に許容される塩を形成する対イオンと複合体を形成することができる。
【０１３４】
用語“薬学的に許容される塩”は、対イオンが薬学的に許容される無機および有機の酸および塩基から誘導される、１または複数の抗体および１または複数の対イオンを含む複合体を意味する。
【０１３５】
二重特異性結合分子
さらなる側面において、本発明は、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体の結合特異性および別の抗ＴＩＭ−３抗体（例えば、本明細書に記載の別の抗ＴＩＭ−３抗体）の結合特異性を有する二重特異性結合分子、あるいはそれらの活性が癌のような病状に介在する、別の免疫チェックポイントタンパク質、癌抗原もしくは別の細胞表面分子などの異なるタンパク質を標的とする抗体を提供する。そのような二重特異性結合分子は、当技術分野で公知であり、種々のタイプの二重特異性結合分子の例は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【０１３６】
核酸分子およびベクター
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を提供する。ある態様において、異なる核酸分子は、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードする。他の態様において、同じ核酸分子は、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードする。
【０１３７】
特に断らない限り、ヌクレオチド配列への言及は、その相補体を包含する。従って、特定の配列を有する核酸への言及は、その相補的配列を有するその相補鎖を包含すると理解されるべきである。本明細書で言及される用語“ポリヌクレオチド”は、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形態、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、あるいはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾された形態を意味する。この用語は、一本鎖および二本鎖形態を含む。
【０１３８】
本発明はまた、本明細書に記載の１以上のヌクレオチド配列と、例えば、配列番号３、４、７−１２、１５、２８−３５、３８−４５、４８−５５、５８−６５、６８−７５、７８−８５、８８−９５、９８−１０５、１０８−１１５、１１８−１２５、１２８−１３５、１３８−１４５、１４８−１５５、１５８−１６５、１６８−１７５、１７８−１８５、１８８−１９５、１９８−２０５、２０８−２１５、２１８−２２５および２２８−２３５からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列も提供する。核酸配列において、用語“配列同一性パーセント”は、最大一致のために整列させたとき、同じである２つの配列中の残基を意味する。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、一般的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができ、当技術分野で公知の多数の異なるアルゴリズムがある。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Wisconsin Package Version 10．0（Genetics Computer Group（GCG），Madison，Wisconsin）におけるプログラムであるＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較され得る。例えば、プログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含むＦＡＳＴＡは、クエリー配列と検索配列と間の最適なオーバーラップの領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Pearson, Methods Enzymol. 183:63−98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185−219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227−258 (1996);および、Pearson, J. Mol. Biol. 276:71−84 (1998)；引用により本明細書に包含させる）。特に断らない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムのデフォルトのパラメータが使用される。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、引用により本明細書に包含される、そのデフォルトパラメーター（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭファクター）を用いてＦＡＳＴＡを使用して、またはＧＣＧバージョン６．１中に提供されているようなそのデフォルトパラメーターを用いてＧａｐを使用して、決定され得る。
【０１３９】
一側面において、本発明は、配列番号１、２、１３、１４、２６、２７、３６、３７、４６、４７、５６、５７、６６、６７、７６、７７、８６、８７、９６、９７、１０６、１０７、１１６、１１７、１２６、１２７、１３６、１３７、１４６、１４７、１５６、１５７、１６６、１６７、１７６、１７７、１８６、１８７、１９６、１９７、２０６、２０７、２１６、２１７、２２６および２２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本発明はまた、該ヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【０１４０】
上記の態様のいずれかにおいて、核酸分子は単離されてよい。本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子は、そのような抗体または部分を産生する供給源から単離され得る。種々の態様において、核酸分子は、ヒトＴＩＭ−３抗原で免疫した動物から単離された抗ＴＩＭ−３抗体を発現するＢ細胞から、またはそのようなＢ細胞から産生された不死化細胞から単離される。抗体をコードする核酸を単離する方法は当技術分野において周知である。ｍＲＮＡを単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニングにおいて使用するためのｃＤＮＡを作製するために使用することができる。ある態様において、本発明の核酸分子は、単離よりむしろ合成され得る。
【０１４１】
ある態様において、本発明の核酸分子は、任意の供給源由来の重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合された、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分由来のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。同様に、本発明の核酸分子は、任意の供給源由来の軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合された本発明の抗ＴＩＭ−３抗体または抗原結合部分由来のＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１４２】
本発明のさらなる側面において、重鎖（ＶＨ）および／または軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインをコードする核酸分子は、完全長抗体遺伝子に“変換”され得る。一態様において、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする核酸分子は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント（複数可）に作動可能に連結され、および／またはＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、重鎖定常（ＣＨ）または軽鎖定常（ＣＬ）ドメインのアミノ酸配列を既にコードする発現ベクター中に挿入することにより完全長抗体遺伝子に変換される。別の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子は、標準的な分子生物学的技術を用いて、ＣＨおよび／またはＣＬドメインをコードする核酸分子にＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子を結合させること、例えばライゲーションすることにより、全長抗体遺伝子に変換される。その後、完全長の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子は、それらが導入された細胞から発現させることができ、抗ＴＩＭ−３抗体が単離される。
【０１４３】
核酸分子は、抗ＴＩＭ−３抗体を組換え的に大量に発現させるために使用されてもよい。本明細書に記載の通り、核酸分子はまた、例えばキメラ抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体、免疫接着分子、ダイアボディ、突然変異抗体および抗体誘導体を産生するために使用されてもよい。
【０１４４】
別の態様において、本発明の核酸分子は、特定の抗体配列に対するプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用される。例えば、核酸は、診断方法におけるプローブとして、またはとりわけ抗ＴＩＭ−３抗体の可変ドメインをコードするさらなる核酸分子を単離するために使用され得るＤＮＡの領域を増幅するためのＰＣＲプライマーとして使用することができる。ある態様において、核酸分子はオリゴヌクレオチドである。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、目的の抗体の重鎖および軽鎖の高度可変ドメインに由来する。ある態様において、本明細書に記載の通り、オリゴヌクレオチドは、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の１以上のＣＤＲの全部または一部をコードする。
【０１４５】
別の態様において、核酸分子およびベクターは、突然変異した抗ＴＩＭ−３抗体を作製するために使用されてもよい。抗体は、例えば抗体の結合特性を変化させるために、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて変異させてもよい。例えば、突然変異は、抗ＴＩＭ−３抗体のＫＤを増加または減少させる、ｋｏｆｆを増加または減少させる、あるいは抗体の結合特異性を変えるために、ＣＤＲ領域の１以上に行われ得る。別の態様において、１以上の変異は、本発明のモノクローナル抗体において生殖細胞系と比べて変化されていることが知られているアミノ酸残基で行われる。変異は、可変ドメインのＣＤＲ領域またはフレームワーク領域において、または定常領域において行うことができる。好ましい態様において、変異は可変ドメインにおいて行われる。ある態様において、１以上の変異は、本発明の抗体またはその抗原結合部分の可変ドメインのＣＤＲ領域またはフレームワーク領域において生殖細胞系と比べて変化されていることが知られているアミノ酸残基で行われる。
【０１４６】
別の態様において、フレームワーク領域（複数可）を、得られたフレームワーク領域（複数可）が対応する生殖細胞系遺伝子のアミノ酸配列を有するように変異させる。突然変異は、抗ＴＩＭ−３抗体の半減期を増加させるためにフレームワーク領域または定常領域において行われ得る。例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／０９５６０を参照のこと。フレームワーク領域または定常領域における変異はまた、抗体の免疫原性を変化させることもでき、および／または別の分子への共有結合もしくは非共有結合のための部位を提供することもできる。本発明によれば、単鎖抗体は、可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域のいずれか１以上において、または定常領域において変異を有していてもよい。
【０１４７】
さらなる側面において、本発明は、本明細書に記載の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の鎖の一方または両方を発現するのに好適なベクターを提供する。本明細書で用いる用語“ベクター”は、それが連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を意味する。ある態様において、ベクターは、プラスミド、すなわち、さらなるＤＮＡセグメントを連結することができるＤＮＡの環状の二本鎖部分である。ある態様において、ベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結することができるウイルスベクターである。ある態様において、ベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、それらが導入される宿主細胞内で自己複製可能である。他の態様では、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書中、“組換え発現ベクター”（または、単に“発現ベクター”）と呼ばれる。
【０１４８】
本発明は、本発明の抗ＴＩＭ−３Ｔ抗体またはその抗原結合部分の重鎖、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の軽鎖、あるいは本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖の両方をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はさらに、融合タンパク質、改変型抗体、抗体断片およびそのプローブをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。
【０１４９】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分は、遺伝子が、転写および翻訳調節配列のような必要な発現調節配列に作動可能に連結されるように、上記で得られた、部分的または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、植物ウイルス、例えばカリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなど、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソーム等が挙げられる。抗体コーディング配列は、ベクター内の転写および翻訳調節配列が、該抗体コーディング配列の転写および翻訳を調節するそれらの意図された機能を果たすように、ベクターに連結され得る。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択され得る。抗体軽鎖コーディング配列および抗体重鎖コーディング配列は別々のベクターに挿入されてよく、また同じもしくは異なる発現調節配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結され得る。一態様において、両コーディング配列は、同じ発現ベクターに挿入され、同じ発現調節配列（例えば、共通のプロモーター）に、または別個の同一の発現調節配列（例えば、プロモーター）に、または異なる発現調節配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結され得る。抗体コーディング配列は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入され得る。
【０１５０】
便利なベクターは、上記の通り、任意のＶＨまたはＶＬ配列が容易に挿入および発現され得るように操作された適切な制限部位を有する、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターにおいて、ＨＣコーディング遺伝子およびＬＣコーディング遺伝子は、関連するｍＲＮＡを安定化することによって全体的な抗体タンパク質収量を増加させ得るイントロン配列を含み得る。イントロン配列は、ＲＮＡスプライシングが起こる場所を決定するスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位に隣接している。イントロン配列の位置は、複数のイントロンが用いられるとき、抗体鎖の可変領域または定常領域のいずれか、あるいは可変領域および定常領域の両方に存在し得る。ポリアデニル化および転写終結は、コーディング領域の下流の天然の染色体上の部位で生じ得る。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクター内にクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０１５１】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を担持し得る。当業者が認めるように、発現ベクターの設計は、調節配列の選択を含め、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの因子に左右され得る。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を目的とするウイルス要素、例えば、レトロウイルスＬＴＲに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス、（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマおよび強力な哺乳動物プロモーター、例えば天然の免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターが挙げられる。ウイルス性調節要素およびその配列のさらなる記述について、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、同第４，５１０，２４５号および同第４，９６８，６１５号を参照のこと。プロモーターおよびベクターの記載を含む、植物における抗体の発現方法、ならびに植物の形質転換は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，５１７，５２９号を参照のこと。細菌細胞または真菌細胞、例えば、酵母細胞におけるポリペプチドの発現法もまた、当技術分野で周知である。
【０１５２】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子などのさらなる配列を有していてもよい。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、一般的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。例えば、選択可能マーカー遺伝子には、（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するための）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、（Ｇ４１８選択用の）ｎｅｏ遺伝子、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子が含まれる。
【０１５３】
本明細書中で用いる用語“発現調節配列”は、それらが連結されるコーディング配列の発現およびプロセシングをもたらすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現調節配列は、適当な転写開始配列、終止配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに、所望により、タンパク質分泌を増強する配列を含む。このような調節配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような調節配列は、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む。真核生物では、一般に、このような調節配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語“調節配列”は、最低でも、その存在が発現およびプロセシングに必須である成分を含むことを意図しており、また、その存在が有利である追加成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列もまた含まれ得る。
【０１５４】
宿主細胞ならびに抗体および抗体組成物の産生方法
本発明のさらなる側面は、本発明の抗体組成物ならびに抗体およびその抗原結合部分を産生する方法に関する。本発明のこの側面の一態様は、抗体を発現し得る組換え宿主細胞を提供し、抗体の発現に適した条件下で該宿主細胞を培養し、そして得られた抗体を単離することを含む、本明細書で定義される抗体を産生するための方法に関する。そのような組換え宿主細胞におけるそのような発現によって産生される抗体は、本明細書中、“組換え抗体”と言われる。本発明はまた、そのような宿主細胞の子孫細胞、およびそれにより産生される抗体を提供する。
【０１５５】
本明細書で用いる用語“組換え宿主細胞”（または、単に“宿主細胞”）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を意味する。本発明は、例えば、上記の本発明のベクターを含み得る宿主細胞を提供する。本発明はまた、例えば、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分の、重鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、あるいはその両方、を含む、宿主細胞を提供する。“組換え宿主細胞”および“宿主細胞”は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も意味することが理解されるべきである。突然変異または環境的影響によって、続く世代で特定の修飾が起こりうるため、こうした子孫は、実際、親細胞と同一でない可能性もあるが、なお、本明細書で用いる用語“宿主細胞”の範囲内に含まれる。
【０１５６】
抗ＴＩＭ−３抗体をコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含むベクターは、好適な哺乳動物細胞、植物細胞、細菌細胞または酵母宿主細胞のトランスフェクションに使用され得る。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための何れか公知の方法によって行うことができる。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は当技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチド（複数可）の封入、および核へのＤＮＡの直接的マイクロインジェクションが含まれる。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入することができる。細胞を形質転換する方法は当技術分野で周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号を参照のこと。植物細胞を形質転換する方法は当技術分野で知られており、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換、微粒子銃形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、およびウイルス形質転換が含まれる。細菌および酵母細胞を形質転換する方法も当技術分野で周知である。
【０１５７】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野において周知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、２９３フリースタイル細胞（Invitrogen）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および多数の他の細胞株が含まれる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有するかを決定することよって選択される。使用することができる他の細胞株は、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞などの昆虫細胞株である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入するとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生されるか、または、より好ましくは、宿主細胞が増殖する培養培地中に抗体を分泌させる。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。植物宿主細胞には、例えば、タバコ、シロイヌナズナ、ウキクサ、トウモロコシ、小麦、ジャガイモなどが含まれ、細菌宿主細胞としては、大腸菌およびストレプトミセス種が含まれる。酵母宿主細胞には、分裂酵母、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）およびピキア酵母が含まれる。
【０１５８】
さらに、その産生細胞株からの本発明の抗体またはその抗原結合部分の発現は、公知の多数の技術を用いて増強することができる。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、ＥＰ特許０２１６８４６号、同第０２５６０５５号、同第０３２３９９７号および同第０３３８８４１号に関連して、全体または部分的に議論されている。
【０１５９】
異なる細胞株によってまたはトランスジェニック動物において発現される抗体は、互いに異なるグリコシル化パターンを有することが多い。しかしながら、本明細書において提供される核酸分子によってコードされるか、または本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む抗体は全て、抗体のグリコシル化状態に関わらず、本発明の一部であり、より一般的には、翻訳後修飾（複数可）の有無に関わらず、本発明の一部である。
【０１６０】
医薬組成物
本発明の別の面は、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分、二重特異性結合分子、あるいは本発明の抗ＴＩＭ−３抗体組成物を有効成分として（または、唯一の有効成分として）含む医薬組成物である。医薬組成物は、本明細書に記載のとおり、任意の抗ＴＩＭ−３抗体組成物、二重特異性結合分子、あるいは抗体またはその抗原結合部分を含み得る。ある態様において、組成物は、ＴＩＭ−３関連障害（例えば、ＴＩＭ−３またはそのリガンドのいずれかの過剰発現または過剰活性化により特徴付けられる障害）および／または癌の改善、予防および／または処置を目的とする。ある態様において、組成物は、免疫系の活性化を目的とする。ある態様において、組成物は、皮膚、肺、腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟組織、造血組織、頭頸部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮および膵臓などの組織に由来する癌の改善、予防および／または処置を目的とする。
【０１６１】
一般的に、本発明の抗体またはその抗原結合部分あるいは本発明の二重特異性結合分子は、例えば、以下に記載の通り、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤（複数可）と共に製剤として投与されるのに適している。
【０１６２】
本発明の医薬組成物は、１つまたは複数の本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその結合部分、あるいは二重特異性結合分子、例えば、１つまたは２つの抗ＴＩＭ−３抗体またはその結合部分あるいは二重特異性結合分子を含み得る。一態様において、組成物は、単一の本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその結合部分を含む。
【０１６３】
別の態様において、医薬組成物は、少なくとも１つの抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分、例えば、１つの抗ＴＩＭ−３抗体または部分、あるいは１つの二重特異性結合分子、ならびに１つまたは複数の関連する細胞表面受容体、例えば、１つまたは複数の癌関連受容体を標的とする１つまたは複数のさらなる抗体を含み得る。
【０１６４】
用語“賦形剤”は、本発明の化合物以外の任意の成分を記載するために本明細書中で用いられる。賦形剤（複数可）の選択は、特定の投与様式、溶解性および安定性に対する賦形剤の影響、ならびに剤形の性質などの要因に多分に依存する。本明細書で用いる、“薬学的に許容される賦形剤”には、生理学的に適合性である任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容される賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせがある。多くの場合、例えば、組成物中にマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどの、糖類、ポリアルコールなどの等張剤を含むことが好ましい。薬学的に許容される物質のさらなる例は、抗体の貯蔵寿命または有効性を向上させる、湿潤剤、または湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤もしくは緩衝剤などの少量の補助物質である。
【０１６５】
本発明の医薬組成物およびその製造方法は、当業者には容易に明らかであろう。このような組成物およびそれらの製造方法は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995）に見いだされ得る。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ（適正製造基準）条件下で製造される。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、単一単位用量として、または複数の単一単位用量として、バルク中に調製され、包装され、または販売され得る。本明細書で用いる“単位用量”は、所定量の有効成分を含む医薬組成物の個別の量である。有効成分の量は、一般的に、対象に投与され得る有効成分の投与量に等しいか、またはそのような投与量の都合のよい画分、例えば、半分または３分の１のような用量である。
【０１６７】
当技術分野で許容されるペプチド、タンパク質または抗体を投与するための任意の方法は、本発明の抗体および抗原結合部分に適切に使用することができる。
【０１６８】
本発明の医薬組成物は、一般的に、非経腸投与に適する。本明細書で用いる、医薬組成物の“非経腸投与”には、対象の組織の物理的なブリーチングにより特徴づけられる任意の投与経路、および組織内のブリーチ（breach）を経て医薬組成物を投与する経路が含まれ、これにより、一般的に、血流、筋肉内または内臓への直接投与がもたらされる。従って、非経腸投与には、組成物の注射による、外科的切開を介して組成物を適用することによる、組織貫通非外科的創傷を通しての組成物の適用などによる、医薬組成物の投与が含まれるが、これらに限定されない。特に、非経腸投与は、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内および滑液嚢内注射または点滴；ならびに、腎臓透析注入技術が含まれるように意図されるが、これらに限定されない。局所灌流もまた意図される。特定の態様には、静脈内および皮下経路が含まれる。
【０１６９】
非経腸投与に適する医薬組成物の製剤は、一般的に、滅菌水または滅菌等張生理食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わせて有効成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で調製、包装または販売され得る。注射用製剤は、例えばアンプルまたは防腐剤を含む多用量容器のように、単位投与量形態で調製、包装、または販売され得る。非経腸投与のための製剤としては、油性または水性ビークル中の懸濁液、溶液、エマルジョン、ペーストなどが挙げられるが、これらに限定されない。かかる製剤はさらに、懸濁剤、安定化剤、または分散剤を含むが、これらに限定されない、１以上の追加の成分を含んでもよい。非経腸投与のための製剤の一態様において、有効成分は、再構成される組成物の非経腸投与前に適当なビークル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）で再構成するための乾燥（すなわち、粉末または顆粒）形態で提供される。非経腸製剤はまた、塩、炭水化物および緩衝剤などの賦形剤を含有していてよい水溶液（好ましくはｐＨ３から９）を含むが、いくつかの用途のために、それらがより好適に無菌の非水性溶液として製剤され得るか、または滅菌された発熱物質を含まない水などの適当なビークルと共に使用される乾燥形態として製剤され得る。非経腸投与形態の例としては、滅菌水溶液の溶液または懸濁液、例えば、水性プロピレングリコールまたはデキストロース溶液が挙げられる。所望であれば、このような投与量形態は、適当に緩衝され得る。有用である他の非経腸的に投与可能な製剤には、微結晶形態の有効成分を含むもの、またはリポソーム調製物中に有効成分を含むものが含まれる。非経腸投与のための製剤は、即時型および／または調節型の放出がなされるように製剤することができる。放出調節製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的指向性放出、およびプログラム放出が含まれる。
【０１７０】
例えば、一側面において、滅菌注射用溶液は、上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに適切な溶媒中に必要量で、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分、二重特異性結合分子あるいは抗ＴＩＭ−３抗体組成物を組み込み、必要に応じて濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上記に列挙したものから必要な他の成分を含む滅菌ビークル中に有効化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分の粉末に加えて、予め濾過滅菌したその溶液からの任意のさらなる所望の成分が得られる、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、また、分散液の場合には必要とされる粒度を維持することによって、また、界面活性剤を使用することによって、維持することができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、その組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩やゼラチンを含めることによって、および／または放出調節コーティング（例えば、徐放性コーティング）を用いることによって行うことができる。
【０１７１】
本発明の抗体はまた、鼻腔内に投与される、または吸入によって投与することができ、一般的には、乾燥粉末吸入器から乾燥粉末の形態（混合物として、単独で、または混合成分粒子として、例えば、好適な薬学的に許容される賦形剤と混合した形態）で、適当な噴射剤を使用してまたは使用せずに、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは微細な霧を生成するために電気流体力学を用いるアトマイザー）からのエアロゾルスプレーとして、またはネブライザーとして、または、点鼻液として投与され得る。
【０１７２】
加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、またはネブライザーは、一般的に、例えば、分散剤、可溶化剤または有効成分の放出を延長するのに好適な薬剤、溶媒としての噴射剤（複数可）を含む、本発明の抗体の溶液または懸濁液を含む。
【０１７３】
乾燥粉末または懸濁液製剤における使用に先立って、薬剤製品は、一般的に、吸入による送達に適した大きさ（一般的には５ミクロン未満）に微粉化される。これは、スパイラルジェットミリング、流動床ジェットミリング、ナノ粒子を形成するための超臨界流体プロセシング、高圧均質化、または噴霧乾燥などの任意の適切な粉砕方法によって行うことができる。
【０１７４】
吸入器または吹き入れ器(insufflator)において使用するためのカプセル剤、ブリスター剤およびカートリッジ剤は、本発明の化合物、適当な粉末ベースおよび性能改質剤（performance modifier）の粉末ミックスを含有するように製剤化することができる。
【０１７５】
細かい霧を発生するための電気流体力学を用いるアトマイザーにおいて使用するのに適している溶液製剤は、１動作につき好適な用量の本発明の抗体を含有することができ、作動容量は、１μｌから１００μｌまで変化してよい。
【０１７６】
吸入／鼻腔内投与を目的とする本発明の製剤には、メントールおよびレボメントールなどの適当な香味剤、またはサッカリンもしくはサッカリンナトリウムなどの甘味剤を添加することができる。
【０１７７】
吸入／鼻腔内投与のための製剤は、即時型放出および／または調節型放出であるように製剤化することができる。放出調節製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出およびプログラム放出が含まれる。
【０１７８】
乾燥粉末吸入器およびエアロゾルの場合に、投与量単位は、計量された量を送達するバルブによって決定される。本発明による単位は、一般的には、本発明の抗体の計量された用量、または“一吹き（puff）”を投与するように設計される。全体の１日用量は、一般的には単回用量で投与されるか、またはより通常には、１日を通して分割用量として投与される。
【０１７９】
本発明の抗体および抗体部分はまた、経口投与用に製剤され得る。経口投与は、化合物が胃腸管に入るように嚥下を、および／または化合物が口から直接、血流に入るように、頬、舌または舌下投与を含んでもよい。
【０１８０】
経口投与に適する製剤には、錠剤などの固体、半固体および液体系；多成分粒子もしくはナノ粒子、液体または粉末を含有する軟質または硬質カプセル；ロゼンジ（液体充填を包含）；チューイング剤；ゲル；迅速分散性の投与形態；フィルム；卵形剤；スプレー；ならびに頬／粘膜接着パッチが包含される。
【０１８１】
液体製剤には、懸濁剤、液剤、シロップおよびエリキシルが包含される。このような製剤を、軟質または硬質カプセル（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース製）中の充填剤として使用することもでき、一般的には、担体、例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロースまたは適切な油、ならびに１種または複数の乳化剤および／または懸濁化剤を含む。液体製剤はまた、固体、例えばサシェからの再構成により調製することもできる。
【０１８２】
本発明の抗体および組成物の治療的使用
一側面において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体およびその抗原結合部分、抗ＴＩＭ−３組成物および二重特異性結合分子は、それを必要とするヒトにおける免疫系の増強または活性化に使用される。ある態様において、患者は、ＴＩＭ−３またはそのリガンドのいずれかの過剰発現または過剰活性化により特徴付けられる状態を有する。ある態様において、患者は免疫抑制されている。ある態様において、抗体またはその抗原結合部分、組成物、あるいは二重特異性結合分子は、癌、例えば、皮膚、肺、腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟組織、造血組織、頭頸部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮および膵臓などの組織に由来する癌、ならびにＴＩＭ−３活性に依存する癌もしくは他の病状、および／または患者が、ガレクチン−９、ホスファチジルセリン、ＣＥＡＣＡＭ−１および／またはＨＭＧＢ−１を発現しているまたは過剰発現している癌もしくは他の病状、の処置に使用するためのものである。本発明の抗ＴＩＭ−３抗体、その抗原結合部分、抗ＴＩＭ−３抗体組成物、および／または二重特異性結合分子により処置される癌には、例えば、黒色腫、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）、および固形腫瘍（例えば、進行性または転移性固形腫瘍）が含まれ得る。
【０１８３】
ある態様において、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体、抗原結合部分、抗ＴＩＭ−３組成物、および／または二重特異性結合分子により処置される癌には、例えば、黒色腫（例えば、進行性または転移性黒色腫）、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、腎細胞癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、膠芽腫、神経膠腫、扁平上皮肺癌、小細胞肺癌、肝細胞癌、膀胱癌、上部尿路癌、食道癌、食道胃接合部癌、胃癌、肝臓癌、直腸癌、結腸直腸癌腫、多発性骨髄腫、肉腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、鼻咽頭癌、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、小リンパ球性リンパ腫、卵巣癌、消化器癌、原発性腹膜癌、卵管癌、尿路上皮癌、ＨＴＬＶ関連Ｔ細胞白血病／リンパ腫、前立腺癌、尿生殖器癌、髄膜腫、副腎皮質癌、神経膠肉腫、線維肉腫、腎癌、乳癌、膵臓癌、子宮内膜癌、基底細胞上皮腫（skin basal cell cancer）、虫垂癌、胆管癌、唾液腺癌、進行性メルケル細胞癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、中皮腫、および固形腫瘍が含まれ得る。
【０１８４】
ある態様において、抗体またはその抗原結合部分、組成物、あるいは二重特異性結合分子は、ウイルスおよび／または病原体感染の処置において、例えば、病原体が宿主免疫応答を阻害する場合に使用するためのものである。
【０１８５】
“処置する(treat)”、“処置(treating)”および“処置(treatment)”は、生物学的障害および／またはその付随する症状の少なくとも１つを緩和または抑止する方法を意味する。本明細書で用いる、疾患、障害または病状の“軽減”は、該疾患、障害、または病状の症状の重症度および／または発生頻度を低下させることを意味する。さらに、本明細書での“処置(treatment)”への言及は、治癒的、緩和的および予防的処置への言及を含む。
【０１８６】
“治療的有効量”とは、処置される障害の症状の１以上をある程度に軽減し得るとき、投与される治療薬の量を意味する。治療的有効量の抗癌治療剤は、例えば、腫瘍の縮小、生存率の増加、癌細胞の排除、疾患の進行の遅延、転移の消失（reversal of metastasis）、または医療従事者が望む他の臨床的エンドポイントをもたらし得る。
【０１８７】
本発明の抗体組成物または抗体またはその抗原結合部分は、単独で、または１以上の他の薬物もしくは抗体（またはそれらの任意の組み合わせなど）と組み合わせて投与され得る。したがって、以下に詳述するように、本発明の医薬組成物、方法および使用はまた、他の活性剤との組み合わせ（同時投与）の態様を包含する。
【０１８８】
本発明の抗体組成物、抗体およびその抗原結合部分、および二重特異性結合分子と１またはそれ以上の他の治療剤との組合せへの言及にて、本明細書で用いる用語“共投与（co−administration、co−administered）”および“併用投与”は、以下を意味し、言及し、および包含することを意図する：
− 処置を必要とする患者への、本発明の抗体組成物／抗体／抗原結合部分／二重特異性結合分子および治療剤（複数可）のこのような組み合わせの同時投与であって、かかる成分が単一投与形態に共に製剤されるとき、該患者に実質的に同時に該成分が放出される、同時投与
− 処置を必要とする患者への、本発明の抗体組成物／抗体／抗原結合部分および治療剤（複数可）のこのような組み合わせの実質的同時投与であって、かかる成分が互いに別個の投与形態に分離して製剤されるとき、該患者に実質的に同時に投与されることにより、該患者に実質的に同時に該成分が放出される、同時投与
− 処置を必要とする患者への、本発明の抗体組成物／抗体／抗原結合部分／二重特異性結合分子および治療剤（複数可）のこのような組み合わせの連続投与であって、かかる成分が、互いに別個の投与量形態に分離して製剤されるとき、各投与間に有意な時間間隔で該患者に連続で投与されることにより、該患者に実質的に異なる時間に該成分が放出される、連続投与；および、
− 処置を必要とする患者への、本発明の抗体組成物／抗体／抗原結合部分／二重特異性結合分子および治療剤（複数可）のこのような組み合わせの連続投与であって、かかる成分が単一投与形態に共に製剤されるとき、該成分が制御された様式で放出されることにより、それらが該患者に同時に、連続して、ならびに／または同時におよび／または異なる時間に重複して放出される、ここで、各成分（part）は、同一または異なる経路のいずれかによって投与されてよい、連続投与。
【０１８９】
本発明の抗体組成物、抗体およびその抗原結合部分、ならびに二重特異性結合分子は、単独の治療法として、すなわち、追加の治療的処置を伴わず投与され得る。あるいは、本発明の抗体組成物および抗体およびその抗原結合部分を用いた処置は、少なくとも１つの追加の治療的処置（併用療法）を含んでいてよい。ある態様において、該抗体組成物または抗体またはその抗原結合部分は同時投与され得るか、または癌を処置するための別の薬物／薬剤と共に製剤され得る。追加の治療的処置は、例えば、化学療法剤、抗腫瘍剤、または抗血管形成剤、別の抗癌抗体、および／または放射線療法を含み得る。
【０１９０】
本発明の抗体組成物、抗体、または抗原結合部分、あるいは二重特異性結合分子と癌細胞の最終分化を誘導することが知られている薬剤との組合せにより、効果をさらに向上させることができる。そのような化合物は、例えば、レチノイン酸、トランスレチノイン酸、シスレチノイン酸、フェニル酪酸、神経増殖因子、ジメチルスルホキシド、活性型ビタミンＤ３、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート、ヘキサメチレン−ビス−アセトアミド、トランスフォーミング増殖因子−ベータ、酪酸、サイクリックＡＭＰ、およびベスナリノンからなる群より選択され得る。ある態様において、化合物は、レチノイン酸、フェニル酪酸、オールトランスレチノイン酸および活性型ビタミンＤからなる群より選択される。
【０１９１】
本発明の抗ＴＩＭ−３抗体組成物、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分、あるいは二重特異性結合分子、および少なくとも１種の他の薬剤（例えば、化学療法剤、抗新生物剤、または抗血管形成剤）を含む医薬品は、癌療法において、同時、個別または連続投与のための併用処置として使用され得る。他の薬剤としては、問題の特定の癌の処置に適する任意の薬剤、例えば、アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチンおよび／またはオキサリプラチンなどの白金誘導体；植物アルカロイド(alkoid)、例えばパクリタキセル、ドセタキセルおよび／またはイリノテカン；抗腫瘍抗生物質、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシン(luteomycin)および／またはマイトマイシン；トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤；ならびに／または、代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシルおよび／または他のフルオロピリミジンからなる群より選択される薬物であり得る。
【０１９２】
本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分、二重特異性結合分子、あるいは抗ＴＩＭ−３抗体組成物はまた、ワクチン、サイトカイン、酵素阻害剤およびＴ細胞療法などの他の抗癌療法と組み合わせて用いることもできる。ワクチンの場合、それは、例えば、処置される癌に関連する１以上の抗原を含むタンパク質、ペプチドまたはＤＮＡワクチンであり得るか、あるいは抗原とともに樹状細胞を含むワクチンであり得る。適当なサイトカインとしては、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。抗癌活性を有する１種の酵素阻害剤の例は、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、例えば１−メチル−Ｄ−トリプトファン（１−Ｄ−ＭＴ）である。養子Ｔ細胞療法とは、腫瘍を認識して攻撃するために患者自身のＴ細胞を増殖または改変すること伴う種々の免疫療法技術を意味する。
【０１９３】
また、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合部分、二重特異性結合分子、あるいは抗ＴＩＭ−３抗体組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に関連する補助療法において使用され得ることも考えられる。これらは、受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインと相互作用し、細胞内Ｍｇ−ＡＴＰ結合部位に関して競合することによりリガンド誘導性受容体リン酸化を阻害する、合成の、主にキナゾリン由来の低分子量分子である。
【０１９４】
ある態様において、抗体組成物、二重特異性結合分子、あるいは抗体またはその抗原結合部分は、Ａ２ＡＲ、ＢＬＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ５５、ＣＤ７３、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＣＴＬＡ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ガレクチン−９、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＬＡＧ−３、ＮＫＧ２Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦＲ−ｂｅｔａ、ＴＮＦＲ２、ＶＩＳＴＡおよび／または２Ｂ４の発現または活性を媒介する薬剤を含むが、これに限定されない、免疫系の活性化を媒介する別の薬物／薬剤と組み合わせて用いられ得る。ある態様において、薬剤は、上記の分子のうち１つに結合する抗体または抗原結合断片である。
【０１９５】
ある側面において、本発明の抗体および抗原結合部分、組成物、ならびに二重特異性結合分子は、ＴＩＭ−３または１以上のそのリガンドを標的とし得る、ＴＩＭ−３経路の別の阻害剤と組み合わせて投与され得る。かかる阻害剤の例としては、ＴＩＭ−３リガンドおよび／またはガレクチン−９、ＨＭＧＢ−１、ホスファチジルセリン脂質、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＩＬＲＡ１−６もしくはＬＩＬＲＢ１−５などの共受容体を標的とする、他の抗ＴＩＭ−３抗体および抗体が挙げられる。
【０１９６】
本発明の抗体組成物、二重特異性結合分子ならびに抗体およびその抗原結合部分は、上記の通り処置法において使用することができ、上記の通り処置に用するためのものであってよく、および／または、上記の通り処置のための医薬の製造における使用のためのものであってよいことが理解される。
【０１９７】
用量および投与経路
本発明の抗体組成物は、問題の病状の処置に有効な量で、すなわち所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で投与され得る。治療的有効量は、処置される特定の病状、患者の年齢、性別および体重などの因子、ならびに抗体が単独処置剤として投与されるか、または１もしくはそれ以上の付加的な抗癌処置剤と組み合わせて投与されるかによって異なり得る。
【０１９８】
投与量レジメンは、最適な所望の応答を提供するために調整され得る。例えば単回ボーラスとして投与されるか、いくつかの分割用量を経時的に投与されるか、または治療対象の緊急性によって指示される否定的に増減されてよい投与量で投与され得る。投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与量単位形態で非経腸組成物を製剤することがとりわけ有利である。本明細書で用いる、投与量単位形態とは、処置される患者／対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位；必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の有効化合物を含む各単位、を意味する。本発明の投与量単位形態の仕様は、一般的に、（ａ）化学療法剤の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためのそのような有効化合物の調合の技術分野に固有の制限に左右され、それらに直接依存する。
【０１９９】
従って、当業者は本明細書で提供される開示に基づいて、用量および投与レジメンが療法の技術分野において周知の方法に従って調整されることを理解しているであろう。すなわち、最大耐用量は容易に確立することができ、患者に検出可能な治療的利益をもたらす有効量も決定することができ、それぞれの薬剤を投与して検出可能な治療的利益を患者に提供するための時間的要素も決定することができる。従って、本明細書において特定の用量および投与レジメンが例示されるが、これらの例は本発明の実施において患者に提供することができる用量および投与レジメンを一切制限しない。
【０２００】
投与量の値は緩和すべき病状のタイプおよび重篤度によって変わってよく、１回量または複数回用量が含まれ得ることが特記されるべきである。さらに、いかなる特定の対象についても、具体的な投与量レジメンは個々の要求およびその組成物を投与するまたはその組成物の投与を監督する者の専門的な判断に従って時間の経過に伴って調整されるべきであること、ならびに本明細書に記載の投与量範囲は例示でしかなく、具体的な組成物の範囲または使用態様を制限することを意図していないことは理解されるべきである。さらに、本発明の組成物を用いる投与量レジメンは、疾患の種類、患者の年齢、体重、性別および医学的状態、病状の重篤度、投与経路、ならびに用いる特定の抗体を含む種々の因子に基づき得る。従って、投与量レジメンは広範に変化し得るが、標準的な方法を用いて常套的に決定することができる。例えば、用量は、薬物動態学的または薬力学的パラメータに基づいて調整することができ、それには毒性作用および／または臨床検査値のような臨床作用が含まれ得る。従って、本発明は当業者により決定されるような患者内の用量の段階的増大を包含する。適当な投与量およびレジメンの決定は関連する技術分野において周知であり、当業者は一旦本明細書で開示される教示を提供されればそれが包含されることを理解し得る。
【０２０１】
本発明の抗体組成物の好適な用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内であると考えられる。抗体組成物は、例えば、少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも４ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、および例えば最大５０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大３０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大２０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大１５ｍｇ／ｋｇまでの投与量で投与され得る。投与は、通常は好適な間隔で、例えば週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回、担当医師が適切と判断する期間に亘って繰り返され、担当医師は場合により必要に応じて用量を増減させ得る。
【０２０２】
腫瘍治療のための有効量は、患者において疾患の進行を安定化させる、および／または症状を改善する、好ましくは、例えば腫瘍サイズを縮小することによって、疾患の進行を止めるその能力によって測定され得る。癌を阻害する本発明の抗体、抗原結合部分、二重特異性結合分子または組成物の能力は、例えば実施例に記載の通り、インビトロアッセイによって、ならびにヒト腫瘍における効果を予測する好適な動物モデルにおいて評価され得る。好適な投与量レジメンは、個々の特定状況において最適の治療応答を提供するために選択され、例えば単回ボーラスとしてまたは持続点滴として、および場合によりそれぞれの症例の緊急性によって指示される投与量の調整を伴って投与され得る。
【０２０３】
診断的使用および組成物
本発明の抗体または抗原結合部分はまた、診断的方法において有用である（例えば、インビトロ、エクスビボ）。例えば、抗体およびその部分は、患者からのサンプル（例えば、組織サンプル、または炎症性滲出液、血液、血清、腸液、唾液もしくは尿のような体液サンプル）中のＴＩＭ−３のレベルを検出および／または測定するために使用可能である。好適な検出および測定方法としては、フローサイトメトリー、酵素免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光分析法、放射免疫アッセイ、および免疫組織学のような免疫学的方法が挙げられる。本発明はさらに、本明細書に記載の抗体および抗原結合部分を含む複数部分のキット（例えば、診断用キット）を包含する。
【０２０４】
本明細書において他に定義しない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験においても用いることができるが、例示的な方法および材料は、以下に記載される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。
【０２０５】
一般的に、本明細書に記載されている、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬品および医薬品化学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、ならびにそれらの技術は、よく知られており、当技術分野で一般的に使用されている。当該技術分野において一般的に達成されるよう、または本明細書に記載されるように、酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って行われる。
【０２０６】
さらに、必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書および態様の全体を通して、用語“有する(have)”および“含む(comprise)”、または変形“有する(has)”、“有する(having)”、“含む(comprises)”または“含む(comprising)”は、記載された整数または整数の群の包含を意味すると理解されるが、他の整数または整数の群を除外するものではない。
【０２０７】
本明細書で言及する全ての刊行物および他の文献は、その内容全体が引用により本明細書中に包含される。多数の文献が本明細書中に引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれかが当該技術分野における共通の一般知識の一部分を形成するという承認を構成するものではない。
【０２０８】
本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみの目的であり、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２０９】
実施例
実施例１：ラットＢ細胞からの抗ＴＩＭ−３抗体のクローニング
この実施例は、本発明の抗ヒトＴＩＭ−３抗体を作製するために用いられる方法を記載する。抗体のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列もまた提供する。
【０２１０】
材料および方法
本発明の抗ＴＩＭ−３抗体は、完全なヒトイディオタイプを有する抗体を産生するＯＭＴ（Open Monoclonal Technology, Inc.）からのラット株である、ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）ラット由来の抗体レパートリーから単離された（Osborn et al., J Immunol. 190(4):1481−90 (2013)）。単一細胞選別抗体を分泌するＢ細胞（ＡＳＣ）からのラット由来の抗体遺伝子のクローニングは、Symplex（商標）抗体ディスカバリー技術（Meijer et al., J Mol Biol 358(3):764−72 (2006)）の手段により実施した。
【０２１１】
免疫化したＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）ラット由来の単一細胞選別Ｂ細胞から、Symplex（商標）抗体ライブラリーを調製した。このライブラリーは、各選別されたＢ細胞について同族のＶＨおよびＶＬをコードする対（ペア）を含んでいた。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２フォーマットの完全ヒト免疫グロブリンをコードする抗体レパートリー構築物をＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクションして、細胞上清をハイスループットスクリーニング法で結合特性についてスクリーニングした。スクリーニングヒットをＤＮＡ配列決定によって分析し、抗体をコードするＤＮＡ配列を抽出した。選択された抗体クローンを発現させて、以下に記載のように機能を試験した。表１は、抗体クローン１５０８６．１５０８６の重鎖および軽鎖可変ドメイン核酸配列を示す。表２は、該抗体クローンの重鎖および軽鎖アミノ酸配列を示し、表４は、重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を示す。表３は、ＩｇＧ１重鎖定常領域およびκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。
【０２１２】
抗体をコードするｃＤＮＡ断片のＳｙｍｐｌｅｘ（商標）クローニングにおける縮重プライマーの使用により、重鎖および軽鎖のアミノ末端における多数のミスセンス突然変異が、特定の抗体（例えば、抗体１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４）について修正された。表５は、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５または１５０８６．１７１４４（これらの３つの変異体は、アイソタイプ亜型が異なるが、同一の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有する）と称される最適化抗体由来のＤＮＡレベルで重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を示す。最適化プロセスとしては、アミノ末端修正を生殖系列配列と一致させること、ならびにコドン使用の最適化が挙げられる。ヒト生殖系列配列と一致させるための標的は、重鎖可変ドメインについてはＩＧＨＶ４−３１、軽鎖可変ドメインについてはＩＧＫＶ３−１１であった。
【０２１３】
異なるエピトープビンを規定するさらなる抗体が同定された。これらの抗体の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を、表９および１０に示す。さらなる機能的抗体が同定され、これらの重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を、表１２および１３に示す。
【０２１４】
結果
表１は、Ｓｙｍｐｌｅｘ（商標）でクローン化された抗体１５０８６．１５０８６をコードするＤＮＡ配列を示す。
【表１】
2019519199.tif 000003
【０２１５】
表２は、元のＳｙｍｐｌｅｘ（商標）でクローン化された抗体１５０８６．１５０８６の推定タンパク質配列を示す。ＣＤＲは、太字かつイタリック体で示される。
【表２】
2019519199.tif 000004
【０２１６】
表３は、重鎖および軽鎖定常領域を示す。
【表３】
2019519199.tif 000005
【０２１７】
表４は、抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４によって共有される重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す。本明細書中のＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２について、ＩＭＧＴ（登録商標）の定義に従って決定された。重鎖および軽鎖ＣＤＲ３については、本明細書中の定義は、ＩＭＧＴ−ＣＤＲ３の上流の１つの余分のアミノ酸残基（Ｃｙｓ）および下流の１つの余分のアミノ酸残基（ＶＨ ＣＤＲ３についてはＴｒｐ、ＶＬ ＣＤＲ３についてはＰｈｅ）を含む。
【表４】
2019519199.tif 000006
【０２１８】
表５は、抗体１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４によって共有される重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする最適化されたＤＮＡ配列を示す。
【表５】
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【０２１９】
表６は、抗体１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４によって共有される推定重鎖および軽鎖可変ドメインタンパク質配列を示す。ＣＤＲは、太字かつイタリック体で示される。ＶＬタンパク質配列は、非最適化ＶＬタンパク質配列と同じであることが特記される。
【表６】
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【０２２０】
表７は、異なるイソ型フォーマットにおける抗体定常領域をコードするＤＮＡ配列を示す。
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
2019519199.tif 000013
【表１２】
2019519199.tif 000014
【表１３】
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【０２２１】
表８は、異なるイソ型フォーマットにおける抗体定常領域のタンパク質配列を示す。
【表１４】
2019519199.tif 000016
【０２２２】
表９は、エピトープビニングに用いられる抗ＴＩＭ−３抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を示す。
【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
2019519199.tif 000019
【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
2019519199.tif 000023
【０２２３】
表１０は、エピトープビニングに用いられる抗ＴＩＭ−３抗体の推定重鎖および軽鎖可変ドメインタンパク質配列を示す。ＣＤＲは、太字かつイタリック体で示される。
【表２２】
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【表２３】
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【０２２４】
表１１は、抗ＴＩＭ−３ビニング抗体のＣＤＲを示す。ＣＤＲの配列番号は、各配列の下に示されている。本明細書中のＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２について、ＩＭＧＴ（登録商標）の定義に従って決定した。重鎖および軽鎖ＣＤＲ３については、本明細書中の定義は、ＩＭＧＴ−ＣＤＲ３の上流の１つの余分なアミノ酸残基（Ｃｙｓ）および下流の１つの余分なアミノ酸残基（ＶＨ ＣＤＲ３についてはＴｒｐ、ＶＬ ＣＤＲ３についてはＰｈｅ）を含む。
【表２４】
2019519199.tif 000026
【０２２５】
表１２は、機能的抗体として同定されたさらなる抗ＴＩＭ−３抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を示す。機能的抗体２０１３１および２０２９３の配列は上記の表９に示されている。
【表２５】
2019519199.tif 000027
【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【０２２６】
表１３は、機能的抗体として同定されたさらなる抗ＴＩＭ−３抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインの推定タンパク質配列を示す。ＣＤＲは、太字かつイタリック体で示される。機能的抗体２０１３１および２０２９３の配列は上記の表１０に示されている。
【表２９】
2019519199.tif 000031
【０２２７】
表１４は、さらなる機能的抗ＴＩＭ−３抗体のＣＤＲを示す。ＣＤＲの配列番号は各配列の下に示されている。本明細書中のＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２について、ＩＭＧＴ（登録商標）の定義に従って決定した。重鎖および軽鎖ＣＤＲ３については、本明細書中の定義は、ＩＭＧＴ−ＣＤＲ３の上流の１つの余分なアミノ酸残基（Ｃｙｓ）および下流の１つの余分なアミノ酸残基（ＶＨ ＣＤＲ３についてはＴｒｐ、ＶＬ ＣＤＲ３についてはＰｈｅ）を含む。機能的抗体２０１３１および２０２９３の配列は、上記の表１１に示されている。
【表３０】
2019519199.tif 000032
【０２２８】
実施例２：抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４の結合速度分析
本実施例は、抗体１５０８６．１５０８６（ＩｇＧ１）、１５０８６．１６８３７（ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ）、１５０８６．１７１４５（ＩｇＧ２）および１５０８６．１７１４４（ＩｇＧ４ （Ｓ２２８Ｐ））の結合親和性が、約１９−２３ｎＭのＫＤ値で顕著に類似した結合親和性を示したことを実証する。“ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ”は、重鎖における“ＬＡＬＡ”突然変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｅｕ番号付けスキーム（Edelman et al., Proc. Natl. Acad. USA 63:78−85 (1969)）に従って番号付けされた）の存在を意味し、それは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のエフェクター機能を低下させることが知られている（Armour et al., Eur J Immunol. 29(8):2613−24 (1999)；Hezareh et al., J Virol. 75(24):12161−68 (2001)；および、Hessel et al., Nature 449(7158):101−104 (2007)）。
【０２２９】
材料および方法
結合速度分析は、Ｉｂｉｓ ＭＸ９６ ＳＰＲ装置（IBIS Technologies、The Netherlands）と組み合わせた連続フローマイクロスピッター（CFM、Wasatch Microfluidics、Salt Lake City、US）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により行った。表面プラズモン共鳴イメージング分析を、Ｇ−ａ−ｈｕ−ＩｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）ＳＰＲセンサ（Ssens BV、The Netherlands）で行った。抗ＴＩＭ−３抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４を、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４）中で０．１５μｇ／ｍｌに希釈した。抗体を、連続フローマイクロスポッターを用いてＧ−ａ−ｈｕ−ＩｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）上に１５分間スポットした。スポッティング後、ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）をＩＢＩＳ ＭＸ９６バイオセンサ中に置き、いわゆる動的滴定シリーズ（Karlsson et al., Anal Biochem. 349(1):136−47 (2006)）を適用することにより動態分析を実施し、ここで、各抗原注射後に表面再生ステップを適用することなく、単量体ヒトＴＩＭ−３ ＥＣＤ抗原（Acro Biosystems）を２ｎＭから１００ｎＭの漸増濃度で注射した。抗原結合（association）を５分間行い、抗原解離を４５分間行った。記録された結合応答を、結合速度（オンレート）定数（ｋｏｎまたはｋａ）、解離速度（オフレート）定数（ｋｏｆｆまたはｋｄ）および親和性定数（ＫＤ）の計算のためにスクラバー２ソフトウェアを用いた単純なラングミュア１：１結合モデルに適合させた。
【０２３０】
結果
ＩＢＩＳシステムで実施された反応速度測定は、４つの異なるイソ型フォーマットの抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４が全て、１９−２３ｎＭの範囲のＫＤ値で顕著に築地する結合速度を有することを示した（表１５）。
【０２３１】
【表３１】
2019519199.tif 000033
【０２３２】
実施例３：抗ＴＩＭ−３抗体のインビトロ機能評価
ＩｇＧ１サブクラスにおける複数のユニークなｍＡｂのパネルを上記のようにクローニングし（実施例１）、機能的活性について、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて単一濃度（２５ｕｇ／ｍｌ）でスクリーニングした。最も機能的な抗ＴＩＭ−３抗体（１５０８６．１５０８６）を、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（１５０８６．１６８３７）、ＩｇＧ２（１５０８６．１７１４５）およびＩｇＧ４（１５０８６．１７１４４）サブクラスに再フォーマットした。
【０２３３】
本実施例は、一方向ＭＬＲアッセイにおいて用量依存性サイトカイン分泌を誘導することによって抗ＴＩＭ−３抗体の種々のＩｇＧサブクラスのインビトロでの機能的活性を実証する。
【０２３４】
材料および方法
一方向ＭＬＲアッセイにおいて、２人の異なる健康なドナーから単離された樹状細胞（ＤＣ）およびＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）Ｔ細胞を共培養して、同種異系（アロ）抗原特異的反応を誘発させ、結果として、サイトカイン産生およびＴ細胞活性化／増殖をもたらす。樹状細胞を、２０ｎｇ／ｍｌの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および２０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−４（ＩＬ−４）を添加して６日間培養することによりＣＤ１４＋単球から分化させ、健常なドナー試料由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞と１：１０の比で混合した。５日間培養後、上清を回収し、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αレベルをＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅの電気化学発光サイトカインアッセイを用いて測定した。このアッセイは、検出抗体に複合体化された電気化学発光標識（ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ）を用いる。電流をプレート電極に印加すると、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識によって光が放射され、光強度が測定されて試料中のサイトカインを定量する。
【０２３５】
結果
抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４の一方向ＭＬＲアッセイにおける用量反応曲線を、図１および２に示す。用量反応曲線は、５０ｕｇ／ｍｌの初期濃度で抗体の２回(two-fold)滴定により作製した。グラフ上の各点は３回の反復の平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【０２３６】
抗体１５０８６．１５０８６および１５０８６．１７１４５（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２変異体）は、同様の機能性を示し、一方向ＭＬＲアッセイにおいてＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方で用量依存的な増加を誘導した。抗体１５０８６．１７１４４（ＩｇＧ４変異体）は、２つの最高濃度でのみ反応を誘導したが、抗体１５０８６．１６８３７（ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ変異体）の機能性は観察されなかった。
【０２３７】
実施例４：精製された細胞サブセットでの抗ＴＩＭ−３抗体の効果
ＴＩＭ−３は、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞およびＣＤ８＋（ＣＤ８陽性）細胞傷害性Ｔ細胞により選択的に発現されることが最初に報告され、Ｔ細胞応答の負の調節因子であることが実証された。続いて、樹状細胞、単球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上でＴＩＭ−３が内因性に高度に発現されることが発見された（Freeman et al., Immunol Rev 235:172−89 (2010); Kuchroo et al., Nat Rev Immunol 8:577−580 (2008); Anderson et al., Science 318:1141−1143 (2007);および、Da Silva et al., Cancer Immunol Res 2:410−422 (2014)）。この実施例は、抗ＴＩＭ−３抗体によるＴＩＭ−３のライゲーション（連結）が、樹状細胞に直接的に効果を有してＴＮＦ−α分泌の増加をもたらす方法を示す。
【０２３８】
材料および方法
ＰＢＭＣ、天然ＣＤ４＋Ｔ細胞および天然ＣＤ８＋細胞を、健康なドナー試料から単離した。３つの個々の健康なドナー由来の樹状細胞を、実施例３に記載の通りに作製した。単離した細胞サブセットを、１０ｕｇ／ｍｌの示された抗体と共に５日間インキュベートし、ＴＮＦ−αレベルをＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ電気化学発光サイトカインアッセイを用いて測定した。
【０２３９】
結果
抗体１５０８６．１５０８６、１５０８６．１６８３７、１５０８６．１７１４５および１５０８６．１７１４４の精製細胞サブセットに対する直接的効果を図３に示し、ここで、各バーは、５回の反復の平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表している。結果は、抗ＴＩＭ−３抗体のＩｇＧ１（１５０８６．１５０８６）またはＩｇＧ２（１５０８６．１７１４５）変異体の存在が、３つ全てのドナー由来の樹状細胞からのＴＮＦ−α分泌を増加させることを実証する。同様の効果が、複数のＴＩＭ−３発現細胞サブセット（例えば、単球およびＮＫ細胞）を含むＰＢＭＣ集団において観察された。ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（１５０８６．１６８３７）およびＩｇＧ４（１５０８６．１７１４４）変異体は、ＴＮＦ−α分泌に対して最小限の効果しか有さなかった。試験した抗体はいずれも、天然ＣＤ４＋Ｔ細胞または天然ＣＤ８＋Ｔ細胞に影響を及ぼさなかった。
【０２４０】
実施例５：ホスファチジルセリンを遮断する（blocking）活性についての抗ＴＩＭ−３抗体のフローサイトメトリー分析
この実施例は、表面ホスファチジルセリン−陽性アポトーシス細胞および蛍光色素標識可溶性ＴＩＭ−３を用いてフローサイトメトリー競合アッセイを実施することにより、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体［１５０８６．１７１４５］のホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ）を遮断する活性について試験する方法を示す。
【０２４１】
材料および方法
ホスファチジルセリンを遮断する活性は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞が、スタウロスポリン（Streptomyces sp., Sigma−Aldrich、USA提供）処理によってアポトーシスを起こすように誘導される細胞ベースのアッセイにおいて試験された。アポトーシスの間、ＰｔｄＳは、原形質膜の細胞質面から細胞表面に移行して、フローサイトメトリーによって分析されるＲ−ＰＥ−標識ヒトＴＩＭ−３−Ｆｃキメラタンパク質の結合を可能にする。Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｒ−フィコエリスリン結合キット（Innova Biosciences、UK）を用いて、市販の組換えＴＩＭ−３−Ｆｃキメラタンパク質（R&D Systems、USA）をＲ−ＰＥに結合させた。試験する各抗体濃度について、２５μｌのＴＩＭ−３−ＰＥ希釈液（約０．３３μｇのＴＩＭ−３−Ｆｃに相当する）を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ 結合緩衝液（BD Pharmingen（商標）、USA）中、２５μｌの抗体（２０μｇ／ｍｌの終濃度で開始）と混合し、室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートして、その後に細胞に添加した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、１μＭのスタウロスポリンの存在下で２時間培養し、ＲＴ結合緩衝液で１回洗浄し、各試験について、５０μｌの結合緩衝液中、２ｘ１０５細胞を、抗体／ＴＩＭ−３−ＰＥミックスと併せた。ＲＴで１５分間インキュベーション後、１００μｌの結合緩衝液を添加し、細胞を遠心分離によって沈降させ、ペレットを、捕捉のために１００μｌの結合緩衝液に再懸濁させた。ＴＩＭ−３−ＰＥのアポトーシス細胞への結合を、ＰＥ蛍光（ＭＦＩ）を検出するフローサイトメトリーによって定量した。並行して、スタウロスポリン処理した細胞上のＰｔｄＳの表面曝露を、アネキシン（Annexin）Ｖ−ＰＥ染色（PE Annexin Ｖ アポトーシス検出キットＩ、BD Pharmingen（商標））によって確認した。抗ＰＤ−１抗体であるＫｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペムブロリズマブ；Merck & Co., Inc.）を、ＴＩＭ−３−結合／ＰｔｄＳ−遮断の陰性対照として用いて、抗ＴＩＭ−３対照抗体ＡＢＴＩＭ３［１８５７１．１８５７１］（ＷＯ２０１５／１１７００２Ａ１；Novartis AG）を、ＴＩＭ−３−結合／ＰｔｄＳ−遮断の陽性対照として用いた。さらに、既に非遮断抗体として同定された異なる抗ＴＩＭ−３抗体［１５３３８．１５３３８］も、ＰｔｄＳ遮断の陰性対照として用いた。
【０２４２】
結果
競合実験の結果を図４に示す。抗ＴＩＭ−３抗体［１５０８６．１７１４５］は、可溶性ＴＩＭ−３−Ｆｃと細胞提示ＰｔｄＳとの相互作用を用量依存的に阻害することができる（図４Ａ）。３．１２５μｇ／ｍｌでは、それは、ＴＩＭ−３−ＦcのＰｔｄＳ陽性細胞への結合を、非遮断抗ＴＩＭ−３抗体［１５３３８．１５３３８］の存在下で検出された結合の２％まで遮断する（図４Ｂ）。対照抗ＴＩＭ−３抗体［１８５７１．１８５７１］は、同じ濃度で３．２％まで結合を遮断することができた（図４Ｃ）。陰性対照抗ＰＤ−１抗体Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）の結果を、図４Ｄに示す。
【０２４３】
実施例６：抗ＴＩＭ−３対照抗体類縁体のクローニング
抗ＴＩＭ−３抗体ＡＢＴＩＭ３およびｍＡｂ１５の対照類縁体を、本明細書のいくつかの実施例で用いる。対照類縁体は下記のように作製された。
【０２４４】
ＡＢＴＩＭ３およびｍＡｂ１５の重鎖および軽鎖可変ドメインアミノ酸配列は、以下の表１６に示す特許出願から得られた。可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）断片のアミノ酸配列を、ヒトコドン使用頻度を有するＤＮＡ配列に逆翻訳した。その後、対応するＤＮＡ断片を合成し、一定のヒト重鎖定常領域（４つの異なるイソ型フォーマットのうち、いずれか１つ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ１−ＬＡＬＡ、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）あるいはヒトκ軽鎖定常領域を含む発現ベクターにクローニングして、完全長の抗体重鎖および軽鎖配列を得た。ＩｇＧ４変異体におけるＦａｂアーム交換を防ぐために、位置２８８（ＥＵ番号付け）のセリン残基を、プロリンで置換した（Angal et al., Mol. Immunol. 30:105−108 (1993)）。ＣＨＯ細胞に、標準的なタンパク質発現系を用いて、得られた発現プラスミドをトランスフェクトした。抗体発現後、対応する抗体上清を、標準的なプロテインＡ精製カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
【０２４５】
【表３２】
2019519199.tif 000034
【０２４６】
実施例７：一方向ＭＬＲアッセイにおけるさらなる抗ＴＩＭ−３抗体のインビトロ機能評価
この実施例は、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＩＦＮ−γの用量依存的分泌を誘導することにより、９つのさらなる抗ＴＩＭ−３抗体のインビトロ機能活性を実証する。
【０２４７】
材料および方法
一方向ＭＬＲアッセイは、上記の実施例３に記載の通りに行った。まとめると、樹状細胞（ＤＣ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、示された抗体の存在下で５日間共培養した。５日間培養後、上清を回収し、ＩＦＮ−γレベルを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ電気化学発光ＩＦＮ−γアッセイを用いて測定した。
【０２４８】
結果
９つのさらなる抗ＴＩＭ−３抗体の用量反応曲線を図５に示す。９つの抗体全てが、このアッセイにおいてＩＦＮ−γレベルの用量依存的増加を誘導した。注目すべきことに、対照抗体ＡＢＴＩＭ３およびｍＡｂ１５の効果は観察されなかった。用量反応曲線を、１００μｇ／ｍｌの出発濃度の抗体を２回滴定することによって作製した。グラフの各点は、３回の反復の平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【０２４９】
実施例８：二方向ＭＬＲアッセイにおけるさらなる抗ＴＩＭ−３抗体のインビトロ機能評価
この実施例は、二方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＩＦＮ−γの用量依存的分泌を誘導することによって、１０個の抗ＴＩＭ−３抗体のインビトロ機能活性を実証する。
【０２５０】
材料および方法
二方向ＭＬＲアッセイにおいて、２つの異なる健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を共培養し、同種異系特異的反応を誘発して、結果としてサイトカイン産生およびＴ細胞活性化／増殖をもたらした。２つの異なるドナー由来のＰＢＭＣを１：１の比で混合した。５日間培養後、上清を回収し、ＩＦＮ−γレベルを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ電気化学発光サイトカインアッセイを用いて測定した。
【０２５１】
結果
１０個の抗ＴＩＭ−３抗体の用量反応曲線を図６に示す。抗ＴＩＭ−３抗体の全てが、このアッセイにおいてＩＦＮ−γレベルの用量依存的増加を誘導した。注目すべきことに、対照抗体ＡＢＴＩＭ３およびｍＡｂ１５の効果は観察されなかった。用量反応曲線を、１００μｇ／ｍｌの出発濃度の抗体を２回滴定することによって作製した。グラフの各点は、３回の反復の平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【０２５２】
実施例９：樹状細胞アッセイにおけるさらなる抗ＴＩＭ−３抗体のインビトロ機能評価
この実施例は、単球由来樹状細胞からのＴＮＦ−αの用量依存的分泌を誘導することによって、９つの抗ＴＩＭ−３抗体のインビトロ機能活性を実証する。
【０２５３】
材料および方法
ＣＤ１４＋単球を、健康なドナー材料由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。樹状細胞（ＤＣ）を、２０ｎｇ／ｍｌの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および２０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−４（ＩＬ−４）と共に６日間培養することにより、ＣＤ１４＋単球から分化させた。単球由来樹状細胞を集め、示された抗体の存在下で５日間培養した。５日間培養後、上清を回収し、ＴＮＦ−αレベルを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ電気化学発光サイトカインアッセイを用いて測定した。
【０２５４】
結果
９つのさらなる抗ＴＩＭ−３抗体の用量反応曲線を図７に示す。９つの抗ＴＩＭ−３抗体の全てが、２つの独立したドナーにおいて単球由来樹状細胞からのＴＮＦ−αレベルの用量依存的増加を誘導した。注目すべきことに、対照抗体ＡＢＴＩＭ３およびｍＡｂ１５の効果は観察されなかった。用量反応曲線を、１００μｇ／ｍｌの出発濃度の抗体を２回滴定することによって作製した。グラフの各点は、３回の反復の平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【０２５５】
実施例１０：ヒトおよびカニクイザルのＴＩＭ−３の抗体親和性の測定
この実施例は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、ヒトおよびカニクイザルのＴＩＭ−３細胞外ドメインに対する抗ＴＩＭ−３ Ｆａｂフラグメントの結合親和性を実証する。
【０２５６】
材料および方法
結合速度分析を、ＩＢＩＳ ＭＸ９６ ＳＰＲ装置（IBIS Technologies、The Netherlands）と組み合わせた連続フローマイクロスポッター（CFM、Wasatch Microfluidics、Salt Lake City、US）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって行った。
【０２５７】
抗ＴＩＭ−３ Ｆａｂ断片を、標準的な酵素切断キット（Genovis、Sweden）を用いて、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡフォーマット中の選択された抗体の修正された配列変異体から作製した。Ｆａｂ断片は、Ｆａｂ［抗体番号］として標識される。Ｆａｂ１５０８６に用いられる重鎖可変ドメインアミノ酸配列は、配列番号７に示される修正された配列である。ヒトおよびカニクイザルＴＩＭ−３の細胞外ドメインをコードするＴＩＭ−３ ｃＤＮＡを合成し、ＣＭＶプロモーターおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（ＡＡ Ｐ１０１−Ｋ３３０）を含むベクターにクローニングして、ＩｇＧ１ Ｆｃのクローン化されたＴＩＭ−３ ＥＣＤへのＣ末端結合をもたらす。ＴＩＭ−３ Ｆｃ融合構築物は、標準的なＰＣＲおよびエンジニアリング技術によって作製され、タンパク質を、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現システムを用いて２ｍｌの培養液中で一時的に発現させた。ヒトＴＩＭ−３ Ｆｃ融合構築物を９日後に回収し、上清を、ＳＰＲにより抗ＴＩＭ−３ Ｆａｂフラグメントへの結合親和性について試験した。抗原を、標準的な手順を用いて精製し、Ｇ−ａ−ｈｕ−ＩｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）（Ssens BV、The Netherlands）上で１５分間、連続フローマイクロスピッター（CFM、Wasatch Microfluidics、Salt Lake City、US）を用いて捕捉した。スポッティング後、ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）をIBIS ＭＸ９６バイオセンサに配置し、残りの捕捉部位をブロックして、捕捉したタンパク質を、ＦｉｘＩＴキット（Ssens BV、The Netherlands）を用いて表面に固定した。反応速度分析を、いわゆる反応速度滴定シリーズ（Karlsson R. 2006）を適用することによって行い、ここで、本発明の抗体の単量体Ｆａｂ断片を、各Ｆａｂ注入後に表面再生ステップを適用することなく、１ｎＭから１００ｎＭの漸増濃度で注入した。Ｆａｂ連結（association）を１５分間行い、抗原解離を１５分間おこなった。記録された結合応答を、結合速度（オンレート）定数（ｋｏｎまたはｋａ）、解離速度（オフレート）定数（ｋｏｆｆまたはｋｄ）および親和性定数（ＫＤ）の計算のためにスクラバー２ソフトウェアを用いた単純なラングミュア１：１結合モデルに適合させた。
【０２５８】
結果
親和性測定の結果は、Ｆａｂ １５０８６、Ｆａｂ ２０２９３およびＦａｂ ２０１３１ならびに２つの対照抗体が、異なる親和性でヒトおよびカニクイザルのＴＩＭ−３に結合することを実証する。詳細な結合速度を以下の表１７に示す。
【０２５９】
【表３３】
2019519199.tif 000035
【０２６０】
実施例１１：ヒトおよびカニクイザルＴＩＭ−３ ＥＣＤに対する抗体結合のＥＬＩＳＡ測定
この実施例は、ＥＬＩＳＡによって測定した、ヒトおよびカニクイザルＴＩＭ−３ ＥＣＤに対する抗ＴＩＭ−３抗体の結合能を実証する。
【０２６１】
材料および方法
抗体‐抗原結合を、１μｇ／ｍｌのコーティングしたＴＩＭ−３ Ｆｃ 融合抗原を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。ヒトおよびカニクイザル抗原は、Sino Biologicalsから入手した。抗ＴＩＭ−３抗体を、２回連続滴定で１５０μg／ｍｌ（１０００ｎＭ）から開始して異なる濃度でコーティングした抗原と共にインキュベートした。洗浄後、結合した抗体をＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）複合２次抗体によって検出した。
【０２６２】
結果
ＥＬＩＳＡは、評価された抗体の全てが、ヒトおよびカニクイザルのＴＩＭ−３ ＥＣＤの両方に結合可能であることを実証した。最大結合の半分を生じる抗ＴＩＭ−３抗体の濃度（ＥＣ５０）が報告されている。全ての試験された抗体が、約１ｎＭ以下のＥＣ５０値でヒトＴＩＭ−３に結合したが、カニクイザルＴＩＭ−３への結合においてははるかに多くの変異体が観察された（表１８）。抗体２０１３１、２０１８５、２０２９３およびＡＢＴＩＭ３のようないくつかの抗体が、ヒトおよびカニクイザルＴＩＭ−３の両方に同一の結合を示した。抗体１９３２４、１９４１６、１９５６８および２０３００のような他の抗体は、カニクイザルＴＩＭ−３に中程度の結合を示したが、抗体２０３６２、２０６２１および１５０８６．１７１４５は、カニクイザルＴＩＭ−３に対して弱い交差反応性を示した（１００倍を超えるＥＣ５０の低下）。最も低いカニクイザルＴＩＭ−３交差反応性を示す抗体の結合曲線は、ＥＬＩＳＡ評価において最も高い濃度で試験したとき、明らかに抗原への飽和結合を示した。
【０２６３】
【表３４】
2019519199.tif 000036
【０２６４】
実施例１２：抗ＴＩＭ−３抗体のエピトープビニング
この実施例は、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体を、対形成の競合パターンに基づいてエピトープビンに分類する方法を説明する。異なるエピトープビンに属する抗体は、ＴＩＭ−３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）上の異なるエピトープを認識する。
【０２６５】
材料および方法
対形成された抗体競合の試験を、ＩＢＩＳ ＭＸ９６ ＳＰＲ装置（IBIS Technologies、The Netherlands）と組み合わせた連続フローμスピッター（ＣＦＭ）（Wasatch Microfluidics、US）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析により行った。表面プラズモン共鳴イメージング分析を、Ｇ−ａ−ｈｕ−ＩｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）ＳＰＲセンサ（Ssens BV、The Netherlands）上で行った。合計１６個のヒト抗ＴＩＭ−３ ＩｇＧ２抗体および２つのＩｇＧ４対照抗体（ＡＢＴＩＭ３およびｍＡｂ１５）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）（ｐＨ７．０）中で１５μｇ／ｍｌに希釈した。連続フローマイクロスポッターを用いて１５分間スポッティングすることにより、抗Ｆｃセンサ表面上に抗体を捕捉した。スポッティング後、ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）を、ＩＢＩＳ ＭＸ９６バイオセンサに配置し、残りの抗Ｆｃ部位を、３０μｇ／ｍｌの非特異的ヒトＩｇＧ１の添加によりブロックした。捕捉抗体をＦｉｘＩｔキット（Ssens BV、The Netherlands）を用いて表面に結合させた。センサ調製後、抗体競合分析を、固定化された抗体が２００ｎＭの可溶性の一価のＴＩＭ−３抗原（Acro Biosystems、China）に結合し、次いで、別の抗ＴＩＭ−３抗体との結合についてプローブ化する、古典的なサンドイッチアッセイを用いて行った。次に、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液中で１５μｇ／ｍｌに希釈した１８個の抗ＴＩＭ−３抗体のそれぞれの個々の注入を、抗体競合パターンを確立するために行った。各競合サイクルの後、センサ表面を、１００ｍＭ Ｈ３ＰＯ４緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて再生した。
【０２６６】
結果
１８個の抗ＴＩＭ−３抗体の競合パターンを図８に示す。抗体ｍＡｂ１５（ｂｉｎ１）、１５１０５および１５１０７（ｂｉｎ２）、１５２６０およびＡＢＴＩＭ３（ｂｉｎ３）、１７２４４（ｂｉｎ７）、ならびに１５１７４および１５１７５（ｂｉｎ８）は、本明細書に記載の細胞ベースのＭＬＲアッセイにおいて機能的な活性を示さなかったが、異なるエピトープを認識したために含まれていた。ＴＩＭ−３結合が、これらの抗体がセンサ表面に捕捉されたとき（単方向遮断のとき）顕著に減少したため、Ｂｉｎ８抗体は溶液中でのみ試験した。従って、これらの抗体は、四角で表される。機能的抗ＴＩＭ−３抗体は、３つの交差競合エピトープビン（ｂｉｎ４，５および６）に結合することが見出された。エピトープビン４に属する機能的抗体には、抗体２０６２１、２０２９３、１９５６８、２０３６２、１５０８６．１７１４５および１９４１６が含まれた。これらの抗体は、相互に、およびエピトープビン３、５、６および７由来の抗体を交差遮断(cross-block)した。エピトープビン５に属する機能的抗体には、抗体２０１３１および２０１８５が含まれた。これらの抗体は、互いに、およびエピトープビン３、４、６および７由来の抗体を交差遮断した。さらに、２０１３１および２０１８５はまた、それらがセンサ表面上に捕捉されたときのみ（単方向遮断のとき、破線）、ｍＡｂ１５が結合するのを妨げた。最後に、エピトープビン６に属する機能的抗体には、抗体１９３２４および２０３００が含まれた。これらの抗体は、互いに、およびビン２由来の抗体を除く全ての他の抗体を交差遮断した。
【０２６７】
エピトープビン４、５および６由来の機能性抗体は、各ビニンググループが、パネル中の他の抗ＴＩＭ−３抗体と比べてユニークな競合パターンを有することから、対照抗体ＡＢＴＩＭ３（ビン３）およびｍＡｂ１５（ビン１）とは異なる結合エピトープである（図１）ことが、上記の結果から推論され得る。
【０２６８】
実施例１３：ＴＩＭ−３突然変異誘発による抗ＴＩＭ−３抗体のエピトープマッピング
抗体エピトープは、一般的に、直線状エピトープ（連続エピトープとも称される）または立体的エピトープ（不連続エピトープとも称される）として特徴付けることができる。直線状エピトープは、単一の連続アミノ酸配列に基づいて定義されるが、立体的エピトープは、多くのより小さい不連続な直線状配列または単一の接触（contact）残基から構成され得る。抗体と抗原との間の分子間タンパク質界面でクラスター化する接触残基の集合はまた、ホットスポットとも称される（Moreira et. al., Proteins 68(4):803−12 (2007)）。ほとんどのＢ細胞エピトープは、１５−２２アミノ酸残基の平均エピトープ長であって、そのうち２−５アミノ酸が結合に最も貢献し（Sivalingam and Shepherd、上記）、本質的に不連続であることが現在広く認められている（Sivalingam and Shepherd, Mol Immunol. 51(3−4):304−9 (2012)）、Kringelum et al., Mol Immunol。53(1−2):24−34 (2013))。
【０２６９】
２９個の異なるＴＩＭ−３変異体に結合親和性をランク付けすることにより、この実施例は、Ｆａｂ１５０８６、Ｆａｂ２０２９３およびＦａｂ２０１３１の結合エピトープが、対照抗体ＡＢＴＩＭ３およびｍＡｂ１５に認識されるエピトープとは異なる直線状エピトープおよびホットスポットに分けることができる方法を示す。
【０２７０】
材料および方法
ヒトＴＩＭ−３受容体は、１８１個のアミノ酸の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（残基２２−２０２）、続いて膜貫通ドメイン（残基２０３−２２３）および細胞質ドメイン（残基２２４−３０１）からなる。ＴＩＭ−３は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、ＥＣＤは、ムチンドメインおよびＩｇＶドメインの２つのドメインからなる。ＩｇＶドメインは、一方の側にＧＦＣＣ’β鎖、反対側にＢＥＤβ鎖を有する２つのβシートに配置された７つの逆平行β鎖の相互作用から作製された２層のβサンドイッチを含む。２つのβシートは、残基Ｃ５４‐Ｃ１２３の間のジスルフィド結合によって安定化される。ヒトＴＩＭ−３ ＩｇＶ（ＰＤＢ ５Ｆ７１）について結晶構造が利用可能である。ＴＩＭ−３ ＩｇＶドメインは、他のＩｇＶドメインと同様にＡ鎖を有しないが、２つのさらなるジスルフィド結合（Ｃ５８−Ｃ６３およびＣ５２−Ｃ１１０）を有して、その位置でＣＣ’ループおよびＦＧループを近接して有して、ホスファチジルセリン（ＰＳ）リガンド結合に独特の結合溝（cleft）を形成している。ＰＳリガンドと複合体を形成するマウスＴＩＭ−３の結晶構造が存在し（３ＫＡＡ）、ＣＣ’ループおよびＦＧループに対するリガンド結合接触が実証される。
【０２７１】
ＴＩＭ−３のいくつかのリガンドおよび／またはＴＩＭ−３の共受容体が同定されており、それらには、ＨＭＧＢ−１、ガレクチン−９、ＣＥＡＣＡＭ−１およびホスファチジルセリンが含まれる（Chiba et al., Nat. Immunology 13(9):832−42 (2012)、Li et al., Hepatology 56(4):1342−51 (2012)、DeKruyff et al., J Immunology 184(4):1918−30 (2010)、Das et al., Immunol Rev. 276(1):97−111 (2017))。
【０２７２】
ヒトＴＩＭ−３およびオーソログのタンパク質配列を、ＵｎｉＰｒｏｔからダウンロードした；ヒト（Ｑ８ＴＤＱ０；配列番号２３６）、カニクイザル（Macaca fascicularis、Ｇ７Ｐ６Ｑ７；配列番号２３７）、マウス（Mus musculus、Ｑ８ＶＩＭ０；配列番号２３８）およびラット（Rattus norvegicus、Ｐ０Ｃ０Ｋ５；配列番号２３９）。これらの配列を表２３に示す。異なる細胞外ＴＩＭ−３アミノ酸配列間の配列同一性を以下の表１９に示す。
【０２７３】
【表３５】
2019519199.tif 000037
【０２７４】
結晶構造およびアミノ酸配列から、表面露出アミノ酸残基を同定し、８２個の個々のアラニン置換をヒトＴＩＭ−３ＥＣＤ（アラニンスキャンニング）で設計した。
【０２７５】
天然ヒトＴＩＭ−３構造との関連で直線状エピトープをマッピングするために、４７個のキメラタンパク質が、ヒトＴＩＭ−３ ＥＣＤ配列中の１０個のアミノ酸を５個のアミノ酸が重複するセグメント中でマウス配列に連続的に交換し、クリティカルループ（critical loop）中でラットおよびカニクイザルバージョンを補充して、作製した。配列交換は、アミノ酸２２−１９９にまたがるヒトＴＩＭ−３の細胞外ドメインで行った。
【０２７６】
ヒトＴＩＭ−３の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを合成し、ＣＭＶプロモーターおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（ＡＡ Ｐ１０１−Ｋ３３０）を含むベクターにクローニングして、ＩｇＧ１ Ｆｃのクローン化したＴＩＭ−３ ＥＣＤへのＣ末端融合をもたらした。変異させたヒトＴＩＭ−３ Ｆｃ融合構築物を、標準的ＰＣＲおよびエンジニアリング技術により作製し、タンパク質を、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現システムを用いて２ｍｌ培養液中で一過的に発現させた。ヒトＴＩＭ−３ Ｆｃ融合構築物を集め、精製して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により抗ＴＩＭ−３ Ｆａｂフラグメントへの結合親和性について試験した。ＴＩＭ−３融合タンパク質を、連続フローマイクロスポッター（CFM、Wasatch Microfluidics、Salt Lake City、US）を用いて１５分間、Ｇ−ａ−ｈｕ−ＩｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）（Ssens BV、The Netherlands）上に固定化した。スポッティング後、ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）をIBIS ＭＸ９６バイオセンサに配置し、捕捉したタンパク質を、ＦｉｘＩＴキット（Ssens BV、The Netherlands）を用いて表面に固定した。反応速度分析を、いわゆる反応速度滴定シリーズ（Karlsson R. 2006）を適用することによって行い、ここで、本発明の抗体の単量体Ｆａｂ断片を、各Ｆａｂ注入後に表面再生ステップを適用することなく、１ｎＭから１００ｎＭの漸増濃度で注入した。Ｆａｂ連結（association）を１５分間行い、抗原解離を１５分間おこなった。記録された結合応答を、結合速度（オンレート）定数（ｋｏｎまたはｋａ）、解離速度（オフレート）定数（ｋｏｆｆまたはｋｄ）および親和性定数（ＫＤ）の計算のためにスクラバー２ソフトウェアを用いた単純なラングミュア１：１結合モデルに適合させた。
【０２７７】
結果
抗ＴＩＭ−３ Ｆａｂ １５０８６、２０２９３、２０１３１ならびに対照類縁体ＡＢＴＩＭ３およびｍＡｂ１５の結合親和性を、ＴＩＭ−３変異構築物に対する結合の変化に関して評価した。
【０２７８】
突然変異したＴＩＭ−３構築物に対するＦａｂ断片の結合親和性を、ＫＤ変異体／ＫＤ野生型の比として表した（正規化結合親和性）。表２０および２１は、異なる結果をもたらしたキメラタンパク質およびアラニン変異体を示す。少なくとも５倍の親和性低下を、突然変異したＴＩＭ−３構築物への結合親和性の減少を検出するためのカットオフ基準として用いた。いくつかの例において、特定のＦａｂに対して結合が検出されなかった。これらの構築物はＮＢ（結合なし）として記載した。
【０２７９】
分析は、抗ＴＩＭ−３ Ｆａｂ １５０８６、２０２９３および２０１３１の結合エピトープが、対照抗体ＡＢＴＩＭ３およびｍＡｂ１５と比較して明らかに異なることを示した。１５０８６および２０２９３は、リガンド結合ループＣＣ’およびＦＧに近い位置６２−６７に挿入されたマウス配列を有するキメラタンパク質には結合しなかったが、対照ＡＢＴＩＭ３には結合した（表２０）。ＴＩＭ−３上の１５０８６のエピトープは、アラニンスキャニングから明らかなように、Ｐ５０、Ｖ６０、Ｆ６１、Ｅ６２、Ｇ６４、Ｒ６９およびＦＧループ残基Ｉ１１７、Ｍ１１８、Ｄ１２０を含むこのアミノ酸配列を超えて延びていた（表２１）。Ｆａｂ ２０２９３は、残基Ｍ１１８およびＤ１２０が、アラニンに突然変異したときにのみ、１５０８６への結合に影響を与えたことを除いて、１５０８６と顕著に類似したエピトープを有していた。Ｆａｂ ２０１３１は、残基１１４−１１７のＦＧループに存在する異なるエピトープに結合することが見出され、これは、残基１１８、１２０、またＣＣ’残基Ｆ６１およびＥ６２を含むようにアラニンスキャンニングによって延長された。１５０８６、２０２９３および２０１３１に共通して、位置Ｆ６１のアラニン突然変異に対する感受性であるのに対し、２つの対照抗体はどちらも感受性を示さなかった。対照抗体ｍＡｂ１５は、１５０８６および２０２９３と同様に、位置６２−６７で変異した配列に結合しなかったが、ｍＡｂ１５のエピトープは、この抗体が位置７４−８５の配列をマウスに交換された２つのさらなる構築物に結合しなかったため、明らかに異なった。抗体ＡＢＴＩＭ３は、これらのタンパク質に対する変化した結合親和性によって証明されるように、位置２２−２８、１０７−１４４および１２３−１２８で突然変異した直線状構築物によって定義される異なるエピトープを明らかに示した（表２０）。エピトープマッピングによる発見のまとめを、以下の表２２に示し、エピトープをＴＩＭ−３ ＩｇＶドメインの表面上にマッピングする方法の分子モデルを図９に示す。
【０２８０】
まとめると、本発明者らは、３つのＦａｂ １５０８６、２０２９３および２０１３１が、ＴＩＭ−３ ＩｇＶドメインの上部で、独特であるが部分的に重複するエピトープを認識することを、１２９個のＴＩＭ−３変異体のパネルへの結合を分析することによって分子レベルで示した。この発見は、３つの抗体全てが、ＴＩＭ−３ ＩｇＶドメイン上の機能的表面を共に構成する重複交差競合エピトープに結合することを示すエピトープビニング分析（実施例１２）と一致する。これらのエピトープは、ホスファチジルセリン結合部位、ならびにＨＭＧＢ−１およびＣＥＡＣＡＭ１結合に必須であるアミノ酸Ｅ６２と明らかに重複するが（Chiba et al., Nat. Immunology 13(9):832−42 (2012)、Das et al., Immunol Rev. 276(1):97−111 (2017)）、一方、２つの対照抗体は、ＩｇＶドメインの中央部分（ｍＡｂ１５）およびＩｇＶドメインの他方の側（ＡＢＴＩＭ３）により多く位置するエピトープを有する。結果は、ｍＡｂ１５およびＡＢＴＩＭ３が、ＴＩＭ−３に同時に結合することができることを示すエピトープビニングデータと一致する（実施例１２）。１５０８６、２０２９３および２０１３１のエピトープ位置に基づいて、各抗体は、ＴＩＭ３リガンド（ホスファチジルセリン、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＨＭＧＢ−１）の結合を遮断することができると予測される。
【０２８１】
【表３６】
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【０２８２】
【表３７】
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【０２８３】
【表３８】
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【０２８４】
【表３９】
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【０２８５】
【表４０】
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【０２８６】
【表４１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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