(57)【要約】【解決手段】標的特異的量子ドットナノデバイスを用いて癌を含む病気を検出及び治療するための組成物及び方法が記載されている。幾つかの態様では、複数の標的特異性を有するナノ粒子コンジュゲートが提供され、ナノ粒子コンジュゲートは、各々が少なくとも２つの異なる標的特異的リガンドに化学的にコンジュゲートしている複数の表面修飾水溶性量子ドット（ＱＤ）ナノ粒子を含む。【選択図】図４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の標的特異性を有するナノ粒子コンジュゲート（ナノデバイス）であって、
複数の表面修飾水溶性量子ドット（ＱＤ）ナノ粒子を備えており、
各表面修飾水溶性量子ドットは、少なくとも２つの異なる標的特異的リガンドに化学的にコンジュゲートされている、ナノデバイス。
【請求項２】
前記少なくとも２つの異なる標的特異的リガンドのうちの少なくとも１つが、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、並びにＲＡＮＫリガンドからなる群から選択される標的に特異的である、請求項１に記載のナノデバイス。
【請求項３】
少なくとも１つの標的特異的リガンドが、ＥＧＦＲに向けられたモノクローナル抗体である、請求項２に記載のナノデバイス。
【請求項４】
少なくとも１つの標的特異的リガンドが、ＰＤ−Ｌ１に向けられたモノクローナル抗体である、請求項２に記載のナノデバイス。
【請求項５】
前記表面改質水溶性ＱＤナノ粒子が、少なくとも２つのリガンドに化学的にコンジュゲートされ、前記少なくとも２つのリガンドの１つはＥＧＲＦとの結合に特異的であり、前記少なくとも２つのリガンドの１つはＰＤ−Ｌ１との結合に特異的である、請求項２に記載のナノデバイス。
【請求項６】
前記表面改質水溶性ＱＤナノ粒子が、セツキシマブ及びアテゾリズマブを含む少なくとも２つのリガンドに化学的にコンジュゲートされている、請求項５に記載のナノデバイス。
【請求項７】
前記表面改質非毒性水溶性ＱＤナノ粒子は、カドミウムフリーであって、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＡｌＰ、ＡｌＳ、ＡｌＡｓ、ＡｌＳｂ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＡｇＩｎＳ２、ＡｇＩｎＳ２／ＺｎＳ、Ｓｉ、Ｇｅ、並びにそれらの合金及びドープされた誘導体からなる複数の材料の群から選択される半導体材料を含む、請求項１乃至６の何れかに記載のナノデバイス。
【請求項８】
前記カドミウムフリー表面改質非毒性水溶性ＱＤナノ粒子が、前記複数の材料の１つから形成されたコアと、前記複数の材料の別の１つから形成された複数のシェルとを含む、請求項７に記載のナノデバイス。
【請求項９】
前記カドミウムフリー表面改質非毒性水溶性ＱＤナノ粒子がコア／マルチシェルＱＤである、請求項８に記載のナノデバイス。
【請求項１０】
前記表面修飾水溶性量子ドット（ＱＤ）ナノ粒子が、リガンド相互作用剤及び表面修飾リガンドを含む、請求項１乃至６の何れかに記載のナノデバイス。
【請求項１１】
前記表面修飾ＱＤナノ粒子が、ヘキサメトキシメチルメラミンを含む溶液中でＱＤへの前記リガンド相互作用剤及び前記表面修飾リガンドを化学的に付加することによって形成される、請求項１０に記載のナノデバイス。
【請求項１２】
前記リガンド相互作用剤が、Ｃ８−２０脂肪酸及びそのエステルである、請求項１０に記載のナノデバイス。
【請求項１３】
前記表面改質リガンドがモノメトキシポリエチレンオキシドである、請求項１０に記載のナノデバイス。
【請求項１４】
ナノデバイスの少なくとも２つの集団を含むナノ粒子コンジュゲート（ナノデバイス）の混合物であって、
第１の標的特異的抗体で誘導体化された表面修飾水溶性量子ドット（ＱＤ）ナノ粒子を含む第１の標的特異的集団と、
第２の標的特異的抗体で誘導体化された表面修飾水溶性量子ドット（ＱＤ）ナノ粒子を含む第２の標的特異的集団と、
を含む混合物。
【請求項１５】
前記第１の標的特異的抗体がＥＧＦＲに特異的であり、前記第２の標的特異的抗体がＰＤ−Ｌ１に特異的である、請求項１４に記載の混合物。
【請求項１６】
腫瘍細胞によって過剰発現される細胞表面部に向けられる抗体に化学的に結合された非毒性水溶性量子ドット（ＱＤ）ナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲートを投与することによって、腫瘍細胞の細胞死、腫瘍縮小及び蛍光標識を同時に誘導する方法。
【請求項１７】
前記細胞表面部が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍が膵臓腫瘍である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
量子ドット（ＱＤ）ナノ粒子に結合した２つの又は３つ以上の異なる治療用抗体から構成されるナノ粒子コンジュゲート（ナノデバイス）であって、
前記２つの又は３つ以上の異なる治療用抗体は異なる標的特異性を有する、ナノデバイス。
【請求項２０】
前記ＱＤナノ粒子が、ＥＧＦＲに向けられた抗体とＰＤ−Ｌ１に向けられた抗体と化学的にコンジュゲートしている、請求項１９に記載のナノデバイス。
【請求項２１】
生物学的部分を検出する又は治療的に調節する方法において、
標的特異的誘導体化カドミウムフリー水溶性量子ドット（ＱＤ）を含む組成物を生物学的標的と物理的に相互作用させる工程であって、前記カドミウムフリー水溶性量子ドットは、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、スルホネート、ホスフェート、アジド、アリル、シリル及びＰＥＧ鎖からなる群から選択された１又は複数の官能基を含むように、メラミン架橋剤ヘキサメトキシメチルメラミン（ＨＭＭＭ）を用いて表面改質されており、更に、複数の異なる標的特異的リガンドを用いて前記１又は複数の官能基を介して誘導体化されている、工程と、
前記ＱＤに励起波長の光を適用して、前記標的特異的誘導体化カドミウムフリー水溶性ＱＤからの放射を促す工程と、
前記組成物と前記生物学的標的の間の相互作用のスペクトル放出を記録及び／又は画像化する工程と、
を含む、方法。
【請求項２２】
前記リガンドが、抗体、ストレプトアビジン、核酸、脂質、糖、薬物分子、タンパク質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群のうちの１又は複数から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出が、血管形成、腫瘍境界、腫瘍転移、インビボでの診断、及びリンパ節進行のうちの１又は複数を画像化及び検出するために使用される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出が、免疫化学、免疫蛍光、ＤＮＡ配列分析、蛍光共鳴エネルギー移動、フローサイトメトリ、蛍光活性化細胞選別、及びハイスループットスクリーニングのうちの１又は複数において使用される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の異なる標的特異的リガンドが、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、並びにＲＡＮＫリガンドからなる群から選択される標的に対する特異性を有するリガンドである、請求項２１乃至２４の何れかに記載の方法。
【請求項２６】
各集団が異なる標的特異性を有する複数のリガンド集団で誘導体化されたカドミウムフリー水溶性量子ドットを含むマルチリガンドナノデバイス。
【請求項２７】
少なくとも１つの標的特異的抗体リガンドと、ストレプトアビジン、核酸、脂質、糖類、薬物分子、タンパク質、ペプチド、及びアミノ酸から選択される更なるリガンドとを含んでおり、前記抗体リガンドは、前記更なるリガンドを送達するための標的リガンドとして作用する、請求項２６に記載のマルチリガンドナノデバイス。
【請求項２８】
少なくとも２つの標的特異的抗体リガンドを含んでおり、そのうちの少なくとも１つは、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、並びにＲＡＮＫリガンドからなる群から選択される標的に対する特異性を有するリガンドである、請求項２６に記載のマルチリガンドナノデバイス。
【請求項２９】
癌を検出及び処置するための医薬として使用するために製造されたマルチリガンドナノデバイスであって、
複数のリガンド集団で誘導体化されたカドミウムフリーの水溶性量子ドット（ＱＤ）を含んでおり、各リガンド集団は、癌細胞に過剰発現する異なる標的に対する特異性を有する、マルチリガンドナノデバイス。
【請求項３０】
低侵襲内視鏡検査又は腹腔鏡検査による術前診断又は術中診断に利用される、請求項２９に記載のマルチリガンドナノデバイス。
【請求項３１】
循環系又は腹部内への注入と、正常細胞に対して腫瘍細胞内での集中とに適している、請求項２９又は３０に記載のマルチリガンドナノデバイス。
【請求項３２】
モノメトキシポリエチレンオキシドで表面改質することによって、循環系又は腹部内への注入と、正常細胞に対して腫瘍細胞内での集中とに適している、請求項３１に記載のマルチリガンドナノデバイス。
【請求項３３】
内視鏡的に又は腹腔鏡的に適用されるＱＤ励起光源に曝すことによって、集中したマルチリガンドナノデバイスを蛍光発光させることができ、蛍光は撮像カメラによって検出可能である、請求項２９又は請求項３０に記載のマルチリガンドナノデバイス。
【請求項３４】
前記癌細胞に過剰発現する異なる標的は、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、並びにＲＡＮＫリガンドから選択される、請求項２９又は請求項３０に記載のマルチリガンドナノデバイス。
【請求項３５】
前記癌細胞に過剰発現する異なる標的がＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１である、請求項３４に記載のマルチリガンドナノデバイス。
【請求項３６】
前記カドミウムフリー水溶性量子ドットが少なくとも５０％の量子収率を有する、請求項２９又は請求項３０に記載のマルチリガンドナノデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の参照＞
本願は、２０１６年１１月１５日に出願された米国仮出願第６２／４２２，４８０号と、２０１６年１１月１６日に出願された米国仮出願第６２／４２２，７１４号とに基づく優先権を主張し、それらの両方は、参照によって全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は概して、コンジュゲートされた（conjugated）量子ドットナノ粒子を用いた癌の検出及び治療のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の範囲を限定することなく、その背景は、腫瘍組織の検出及び処置のための既存の標的部分（targeting moieties）に関連して記載されている。米国疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によって発表された最近の数字は、世界中の多くの国で主要な死因として癌が心臓血管系疾患（ＣＶＤ）を超えていることを示している。腫瘍は、増殖の潜伏期間を過ぎると増殖して指数関数的に広がることが知られている。癌の早期診断及び治療は、特に膵癌及び脳腫瘍のような予後が好ましくない癌において、生存率及び寛解の主たる決定因子である。これらのうち、膵癌は非常に致死性が高く、生存率を改善するために有効な診断的及び治療的ストラテジーが依然として早急に必要とされている。膵外分泌腺の癌は、主として認識可能な症状の表れが遅いため、最も壊滅的な癌の１つである。最も一般的に診断された癌の９番目又は１０番目に過ぎないものの、米国では、膵癌が癌による死亡の４番目に多い死因である。２０１６年現在、膵癌の５年生存率は僅か７％である。未治療の膵癌の生存期間中央値は、診断から３ヶ月である。外科手術は依然として一番の治療法であるが、外科手術を適切な選択肢とする局所性疾患を呈する患者の割合は極めて僅かである。膵臓腫瘍のステージング清潔手術は、腫瘍の柔らかく切除不可能な性質のために困難である。
【０００４】
膵癌についての現在の画像化手法は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを使用した、播種性疾患を有する高リスク群についてのプレスクリーニングに基づいている。そして、高リスク群は、超音波内視鏡検査（ＥＵＳ、腔内超音波内視鏡検査）又はＸ線（内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ））を使用して、膵嚢胞について更に検査される。これらの手法は両方とも、特異性の欠如と誤った解釈の率が高いこととに悩まされている。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、ＣＴ及び超音波のような撮像装置は、間接的であって、適切な切除を可能にするであろう正確な境界画定能力を欠いている。内視鏡装置は、標識なしでは特定の細胞型を検出することができない。
【０００５】
外科医が、視覚化が困難である小さな残存腫瘍病巣（tumour deposits）を同定して除去することを支援するために、蛍光イメージングを使用することに新たな関心が持たれている。例えば、「Nguyen QT, Tsien RY. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation--a new cutting edge. Nat Rev Cancer. 13(9) (2013) 653-62」と、「Saccomano M et al.  Preclinical evaluation of near-infrared (NIR) fluorescently labeled cetuximab as a potential tool for fluorescence-guided surgery, Int. J Cancer 139 (10) (2016) 2277-89」とを参照のこと。加えて、膵腫瘍のステージングと外科的切除は困難である。問題なことに、蛍光染料は、迅速なクリアランス、速い退色、速い代謝分解及び低いシグナル強度による制約を受けている。
【０００６】
以上のことから、本発明者には、改良された腫瘍特異的組成物が必要とされていることが明らかであった。
【発明の概要】
【０００７】
幾つかの実施形態では、複数の標的特異性を有するナノ粒子コンジュゲート（ナノデバイス）が提供される。幾つかの態様では、コンジュゲートは、複数の表面修飾された水溶性量子ドット（ＱＤ）ナノ粒子を含んでおり、ナノ粒子の各々は、少なくとも２つの異なる標的特異的リガンドに化学的にコンジュゲートされている。幾つかの実施形態では、標的特異的リガンドは、腫瘍で過剰発現するタンパク質及び炭水化物を含む標的部分への結合に特異的なリガンドを含む。
【０００８】
幾つかの実施形態では、標的は、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、並びにＲＡＮＫリガンドのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、表面改質水溶性ＱＤナノ粒子は、ＥＧＲＦ及びＰＤ−Ｌ１を含む標的に対して特異性を有する少なくとも２つのリガンドに化学的にコンジュゲートされている。ＥＧＲＦに対する標的特異性を有するリガンドの例には、モノクローナル抗体セツキシマブが挙げられる。ＰＤ−Ｌ１に対する標的特異性を有するリガンドの例には、モノクローナル抗体アテゾリズマブが挙げられる。
【０００９】
他の実施形態では、少なくとも２つのナノデバイス集団を含むナノ粒子コンジュゲート（ナノデバイス）の混合物が提供され、第１の集団は、表面修飾水溶性ＱＤナノ粒子に結合した第１の標的に対する第１の治療用抗体を含んでおり、第２の集団は、表面修飾水溶性ＱＤナノ粒子に結合した第２の標的に対する第２の治療用抗体を含んでいる。標的特異的抗体は、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、並びにＲＡＮＫリガンドを含む、腫瘍で過剰発現する標的タンパク質及び炭水化物に特異的であってよい。
【００１０】
幾つかの実施形態において、表面改質された非毒性の水溶性ＱＤナノ粒子は、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＡｌＰ、ＡｌＳ、ＡｌＡｓ、ＡｌＳｂ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＡｇＩｎＳ２、ＡｇＩｎＳ２／ＺｎＳ、Ｓｉ、Ｇｅ、並びにそれら合金及びそのドープされた誘導体からなる材料の群から選択される半導体材料を含むカドミウムフリーＱＤナノ粒子を含んでいる。ナノ粒子は、上記材料のうちの１つから形成されたコアと、上記材料のうちの別の材料の１又は複数のシェルとを備えているか、或いは、コア／マルチシェルＱＤであってよい。幾つかの態様では、表面改質された水溶性ＱＤナノ粒子は、リガンド相互作用剤及び表面改質リガンドを含む。幾つかの実施形態では、表面改質されたカドミウムフリーＱＤナノ粒子は、ヘキサメトキシメチルメラミンを含む溶液中のＱＤに、リガンド相互作用剤及び表面改質リガンドを化学的に付加することによって形成される。幾つかの実施形態では、溶液は非極性溶媒を含む。幾つかの実施形態では、非極性溶媒はトルエンである。幾つかの実施形態では、リガンド相互作用剤は、Ｃ８−２０脂肪酸又はそのエステルである。表面改質リガンドは、幾つかの態様ではモノメトキシポリエチレンオキシドである。
【００１１】
非毒性の水溶性ＱＤナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲートを投与することによって、細胞死、腫瘍収縮、及び腫瘍細胞の蛍光標識を同時に誘導する方法も提供される。ナノ粒子は、腫瘍細胞で過剰発現する細胞表面受容体の外部ドメインに対するモノクローナル抗体に化学的にコンジュゲートされている。幾つかの態様において、細胞表面受容体は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）であり、腫瘍は膵臓腫瘍である。
【００１２】
生物学的部分を検出する又は治療的に調節する方法が提供され、当該方法は、標的特異的誘導体化カドミウムフリー水溶性ＱＤを含む組成物を生物学的標的と物理的に相互作用させる工程であって、カドミウムフリー水溶性量子ドットは、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、スルホネート、ホスフェート、アジド、アリル、シリル及びＰＥＧ鎖からなる群から選択された１つ以上の官能基を含むように、メラミン架橋剤ヘキサメトキシメチルメラミン（ＨＭＭＭ）を用いて表面改質されており、更に、１又は複数種以上の官能基を介して複数の異なる標的特異的リガンドを用いて誘導体化されている、工程と、ＱＤに励起波長の光を適用して、標的特異的誘導体化カドミウムフリー水溶性ＱＤからの放射を促す工程と、組成物と生物学的標的の間の相互作用のスペクトル放出を記録及び／又は画像化する工程と、を含んでいる。標的特異的誘導体化カドミウムフリー水溶性ＱＤによる治療的調節は、一重項酸素及び／又は熱の発生を含むＱＤからのスペクトル放出によってもたらされてよい。
【００１３】
幾つかの態様では、リガンドは、抗体、ストレプトアビジン、核酸、脂質、糖、薬物分子、タンパク質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群のうちの１又は複数から選択される。幾つかの態様では、検出は、血管形成、腫瘍境界、腫瘍転移、インビボでの診断、及びリンパ節進行のうちの１又は複数を画像化及び検出するために使用されるが、その他の態様では、検出は、免疫化学、免疫蛍光、ＤＮＡ配列分析、蛍光共鳴エネルギー移動、フローサイトメトリ、蛍光活性化細胞選別、及びハイスループットスクリーニングのうちの１又は複数において使用される。幾つかの態様では、リガンドの少なくとも１つは、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、並びにＲＡＮＫリガンドからなる群から選択される標的に対する特異性を有するリガンドである。幾つかの態様では、少なくとも１つの標的特異的抗体リガンドと、ストレプトアビジン、核酸、脂質、糖類、薬物分子、タンパク質、ペプチド、アミノ酸から選択される更なるリガンドとを有するマルチリガンドナノデバイスが提供され、抗体リガンドは更なるリガンドを送達するための標的リガンドとして作用する。
【００１４】
ある実施形態では、各集団が異なる標的特異性を有する少なくとも２つのリガンド集団で誘導体化されたカドミウムフリー水溶性ＱＤを含むマルチリガンドナノデバイスがもたらされる。幾つかの形態では、マルチリガンドナノデバイスは、少なくとも１つの標的特異的抗体リガンドと、ストレプトアビジン、核酸、脂質、糖類、薬物分子、タンパク質、ペプチド、及びアミノ酸から選択される更なるリガンドとを含んでおり、抗体リガンドは、前記更なるリガンドを送達するための標的リガンドとして作用する。幾つかの形態では、マルチリガンドナノデバイスは、少なくとも２つの標的特異的抗体リガンドを含んでおり、そのうちの少なくとも１つは、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、並びにＲＡＮＫリガンドからなる群から選択される標的に対する特異性を有するリガンドである。
【００１５】
幾つかの実施形態では、マルチリガンドナノデバイスは癌を検出及び治療するための医薬として使用するために製造され、当該デバイスは、低侵襲内視鏡検査又は腹腔鏡検査を用いた術前又は術中診断で利用される。特定の実施形態では、マルチリガンドナノデバイスは、循環系又は腹部内への注射と、正常細胞に対する腫瘍細胞での集中に適している。ある実施形態では、マルチリガンドナノデバイスは、モノメトキシポリエチレンオキシドを用いた表面修飾によって、正常細胞に対する腫瘍細胞での集中に適している。内視鏡的又は腹腔鏡的に適用されるＱＤ励起光源に曝すことで、集まったマルチリガンドナノデバイスを蛍光発光させることができ、蛍光は、撮像カメラによって検出可能である。誘導された蛍光による検出に加えて、その蛍光は、一重項酸素及び／又は熱の発生を含むＱＤからのスペクトル放出による治療的調節を提供するために利用されてよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
特徴及び利点を含めて本発明をより完全に理解するために、以下の添付の図面と併せて本発明の詳細な説明が参照される。
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す（スケールバーは５ｎｍに対応）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＴＥＭから得られたナノ粒子のサイズ分布を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いた表面処理水溶性ナノ粒子の流体力学的サイズを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、４０５ｎｍで励起した水溶性ナノ粒子の水溶液（１ｍＭ）のフォトルミネセンス発光スペクトルを示す。
【００１８】
【図２】図２は、カドミウムフリーＱＤの表面改質プロセスの一実施形態を示す。
【００１９】
【図３】図３は、表面修飾水溶性ＱＤを有するＳＡＶコンジュゲートの生成プロセスの一実施形態を示す。
【００２０】
【図４Ａ】図４Ａは、マルチリガンドナノデバイス及び癌細胞に対する作用機構の概略図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本明細書に開示される一実施形態による抗ＥＧＦＲナノデバイス及び癌細胞に対する作用機構の概略図を示す。
【００２１】
【図５】図５は、生体内親和性（in vivo compatible）水分散性カドミウムフリーＱＤナノ粒子のインビボでの視覚化が容易であることの実証を示す。３０μｇの生体内親和性水分散性カドミウムフリーＱＤナノ粒子を、麻酔下でヌードマウスの足に皮下注射した。ＱＤナノ粒子（非標的）は、腋窩リンパ節（輝点）に移動し、単純な蛍光画像化システムによって容易に検出された。
【００２２】
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、赤色の生体内親和性水分散性カドミウムフリーＱＤナノ粒子が、抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ（トラスツズマブ、ハーセプチン（登録商標））にコンジュゲートしたことを実証する。図６Ａでは、抗ＨＥＲ２  ｍＡｂにコンジュゲートした赤色の生体内親和性水分散性カドミウムフリーＱＤナノ粒子を用いて、ＨＥＲ２陽性４Ｔ１細胞を処置した。図６Ｂは、対照Ｈｅｒ２陰性４Ｔ１細胞による同じ処置を示す。
【００２３】
【図７】図７は、ＱＤ−ストレプトアビジン（streptavidin）コンジュゲートの開発に成功したことを実証する。このケースでは、赤色及び緑色の両方の生体内親和性水分散性カドミウムフリーＱＤナノ粒子をストレプトアビジンにコンジュゲートさせて、ビオチン化ポリマー球を染色するために使用した。
【００２４】
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、生体内親和性水分散性カドミウムフリーＱＤが非特異的に結合しないことを保証するために行われた実験結果を示す。図８Ａは、精製ＨＥＲ−２を予め点在させたストリップに、異なる濃度のハーセプチン（登録商標）ＱＤコンジュゲートを加えた結果を示す。図８Ｂは、精製ＨＥＲ−２を予め点在させたストリップに、異なる濃度の非官能化生体内親和性水分散性カドミウムフリーＱＤを加えた結果を示す。
【００２５】
【図９】図９は、ドットブロットストリップに点在するＨＥＲ−２の希釈系列と、その後のハーセプチン（登録商標）ＱＤコンジュゲートでの検出結果を示す。
【００２６】
【図１０】図１０Ａ及び図１０Ｂは、標的部分有り無しの場合について、生体内親和性水分散性カドミウムフリーＱＤをＳＫ−ＢＲ−３細胞株に結合させた結果を示す。図１０Ａは、非官能化生体内親和性水分散性カドミウムフリーＱＤでＳＫ−ＢＲ−３細胞を処置した結果を示す。図１０Ｂは、トラスツズマブ官能化生体内親和性水分散性カドミウムフリーＱＤでＳＫ−ＢＲ−３細胞を処置した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
機能性ナノテクノロジー及び分子療法の最近の台頭は、新規でより効率的な医学的アプローチへの道を切り開いている。本明細書で提供される実施形態は、腫瘍の標的部分にコンジュゲートされた、安全性及び生体適合性が高いプロファイルを特徴とする蛍光量子ドットナノ粒子（ＱＤ）をもたらし、そのコンジュゲートは、治療的及び診断的用途の両方を有する。ＱＤは、光学特性に優れた蛍光半導体ナノ粒子である。それらは、（インドシアニングリーン（ＩＣＧ）のような）従来の蛍光染料よりも、約２０倍明るく輝き、何倍も光安定性がある。重要なことには、ＱＤの滞留時間は、それらの化学的性質及びナノサイズに起因してより長い。ＱＤは、遙かに強い光強度を吸収及び放出することができるので、検出の容易さを改善する。ＱＤはまた、放射の調整可能性をもたらし、自己蛍光干渉からの最小限のバックグラウンドで空間イメージングが可能になる。別の利点は、小さな染料とは異なり、各ＱＤは、複数の結合タグを備えることができ、多重特異性ナノデバイスを構成できることである。多重特異性ナノデバイスは、最大の結合確率、ひいては最高の検出効率を有する二重又は三重特異性ナノデバイスなどであるが、これらに限定されない。
【００２８】
ＱＤの独特の特性は、インビトロ診断及びインビボ診断、臨床イメージング、標的薬物送達、並びに光線力学療法において未だに満たされていない要求を満たす幾つかの医学的用途を可能にする。故に、コンジュゲートは、癌の画像化及び処置に有用な多様な特性を有する「セラノスティック（theranostic）」ナノデバイスである。幾つかの実施形態では、開示されたセラノスティックナノデバイスは、癌の術前、術中、及び術後の検出及び処置に使用される撮像能力及び処置能力を有する。これらのデバイスは、現在、外科的切除が治癒の唯一の見込みをもたらす癌の処置における使用に特に適している。腺癌等の幾つかの癌は、比較的ゆっくり増殖するので、急速に分裂する細胞を標的とする化学療法及び放射線療法に対して耐性がある。可能性のある治療的アプローチは、転移性になる前に腺癌を外科的に除去することである。問題なのは、膵外分泌腺の癌のようなある種の癌は、しばしば診断時に転移性であることである。これと相まって、切除中に腫瘍組織を正常組織と区別することが困難であり、腫瘍組織がその場に残ってしまう。
【００２９】
ステージングの困難性、多くの患者で推定される蔓延、及び切除手順の困難性に部分的に基づいて、現在、英国の膵癌患者の僅か８％のみが外科的切除を受けている。現在、膵癌の１０年生存率は、＜１％である。膵癌の治療において極めて必要とされているのは、小さな転移を含む癌性組織を術中に同定して除去する能力である。
【００３０】
適切な切除を支援するのに十分な腫瘍細胞のインビボ標識及び同定を提供するための努力が行われてきたが、小分子染料、有機染料及びカーボンブラックインクは、特異性に欠けており、全ての周囲を素早く染色する傾向がある。最近、有機染料（フルオレセイン又はインドシアニングリーン（ＩＣＧ））を用いた蛍光イメージングが導入された。蛍光染料は選択性を改善することができるが、それらの急速なクリアランス、速い退色、速い代謝分解及び低いシグナル強度の制限を受ける。例えば、「Condeelis J and Weissleder R. In Vivo Imaging in Cancer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010, 2:a003848」を参照のこと。本発明者は、より完全な切除を支援する理想的な術中診断ツールもまた、残りの細胞に対して直接的な殺腫瘍性モダリティをもたらすであろうと理解した。
【００３１】
既存の技術の欠点を理解して、本発明者は、癌細胞において過剰発現する標的分子に選択的なセラノスティックナノデバイスを提供することを企て、最初に膵癌細胞に焦点を当てた。そのような標的分子の一つは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である。ＥＧＦＲ、別名ＨＥＲ１は、ｅｒｂＢ受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーである細胞表面分子である。ＥＧＦの結合後、ＥＧＦＲは、ホモ二量体化（又は、他のｅｒｂＢファミリーのメンバーとヘテロ二量体化）し、シグナル伝達は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）／ＡＫＴ経路及びマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ経路を通して開始される。ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１を介した細胞シグナル伝達は、腫瘍増殖、血管形成、転移、アポトーシスの回避を促進する。ＥＧＦＲは、頭頸部癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌及び膵癌を含む幾つかの悪性腫瘍において過剰発現している。ＥＧＦＲは、癌治療のための有望な標的であることから、ＥＧＦＲに結合してＥＧＦリガンドの結合をブロックするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が開発された。そのようなｍＡｂの１つは、ヒト−マウスキメラ抗体セツキシマブ（商品名ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）でＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙによって販売されている）である。セツキシマブは、特定の化学療法レジメンと共に、ＥＧＦＲ陽性結腸直腸癌とある種の頭頸部癌の治療とについてＦＤＡ承認を受けている。
【００３２】
ＥＧＦＲはまた、膵癌の診断及び治療のために同定された標的でもある。ＥＧＦＲは、約７０％の患者において膵臓腫瘍細胞によって過剰発現し、このような過剰発現は芳しくない予後と関連している。これに基づいて、セツキシマブの使用によるＥＧＦＲの標的化が膵癌において研究されてきた。残念ながら、第ＩＩ相試験及び第ＩＩＩ相試験は、単独で又は細胞毒性薬と組み合わせた進行性膵癌におけるセツキシマブ治療の有効性を、相変わらず示していない。「Luedke, E., et al. Monoclonal Antibody Therapy of Pancreatic Cancer with Cetuximab: Potential for Immune Modulation. J Immunother. 35 (5) (2012) 367 - 373」を参照のこと。セツキシマブの単独投与に加えて、セツキシマブコンジュゲートの使用が試みられている。このような目的のために、セツキシマブは、細胞傷害剤ゲムシタビンと共誘導体化されている約５ｎｍの金ナノ粒子を送達するための標的化剤として使用されてきた。「Patra, CR, et al. Targeted Delivery of Gemcitabine to Pancreatic Adenocarcinoma: Using Cetuximab as a Targeting Agent. Cancer Res 68(6) (2008) 1970 - 1978」を参照のこと。Ｐａｔｒａの研究では、金ナノ粒子は、容易に合成且つ特徴付けられる無毒の誘導可能な（derivatizable）媒体として使用された。しかしながら、金粒子キャリアは有効な診断特性を有しておらず、金ナノ粒子の体内分布は、死後に行わなければならず、術後使用の可能性を排除している。
【００３３】
本明細書で提供される幾つかの実施例では、標的癌は膵癌である。何故ならば、それは、大抵の場合致死的であることから、有効な診断及び治療戦略が、生存率を改善するために緊急に必要とされているからである。更に、膵腫瘍病巣のステージング精密手術は、それらの柔らかく切除不可能な性質のために困難である。幾つかの実施形態では、ナノデバイスは、生体適合性且つ非毒性の蛍光量子ドットナノ粒子（ＱＤ）と抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂとのコンジュゲートとして設計される。他の実施形態では、生体適合性且つ非毒性の蛍光ＱＤと抗ＰＤ−Ｌ１チェックポイントｍＡｂ（anti-PD-L1 checkpoint mAb）とのコンジュゲートがもたらされる。更なる実施形態では、多価ＱＤナノ粒子が、ＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１に対する複合特異性と併せて提供される。抗ＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１を用いて例示された概念は、関連するｍＡｂ又はそれらの誘導体を用いることによって、他の種類の癌を標的化に適用できる。
【００３４】
ある実施形態では、非毒性の水溶性ＱＤは、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメインに対する抗体に化学的に付与されている。セツキシマブは、現在ＦＤＡにより承認されているそのような抗体の１つであって、頭頸部の局所又は領域進行扁平上皮癌、大腸癌、及び肺癌の治療に必要とされている。多くの研究はまた、膵癌やその他の多くのＥＧＦＲの発現が高い癌におけるセツキシマブの使用を検討している。
【００３５】
故に、ある実施形態では、非毒性且つ水溶性（生体適合性）であるＱＤが合成されて、表面に、コンジュゲーション可能な官能基（ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、アジド、アルキン）を備えている。例示的なある実施形態では、水溶性非毒性ＱＤは、カルボキシル官能化されているか又はカルボキシル官能化される。 ＣＯＯＨ−ＱＤは、水溶性１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いるカルボジイミド連結技術を用いて、セツキシマブのような腫瘍標的抗体のアミン末端に連結される。カルボキシル官能化ＱＤは、ＥＤＣと混合して、活性Ｏ−アシルイソ尿素中間体を形成し、当該中間体は、その後、反応混合物中のモノクローナル抗体上の第一級アミノ基からの求核攻撃によって置換される。所望であれば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのスルホ誘導体（ｓｕｌｆｏ−ＨＳ）が、第一級アミン含有抗体との反応中に加えられる。ｓｕｌｆｏ−ＨＳの添加により、ＥＤＣは、ＮＨＳをカルボキシルに結合し、ＮＨＳエステルを形成する。当該ＮＨＳエステルは、Ｏ−アシルイソ尿素中間体よりも安定である一方で、生理学的ｐＨで第一級アミンへの効率的なコンジュゲーションを可能にする。 何れの場合でも、結果は、ＱＤと抗体との間の共有結合である。鈴木−宮浦クロスカップリング（ＳＭＣＣ）のような他の化学反応、又はアルデヒドベースの反応が代わりに使用されてよい。
【００３６】
図４Ａ及び図４Ｂに示されているように、この実施形態の原理は、セツキシマブのような抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂが腫瘍のＥＧＦＲに特異的に結合して阻害する能力を利用し、蛍光ＱＤとのコンジュゲーションによって特異的標識として使用することである。作製された（ＱＤ−セツキシマブ）剤は４つの異なる機能を有する。
・術中に腫瘍組織を同定するためのＱＤの蛍光特性に起因した腫瘍標識化。
・ＥＧＦＲへのセツキシマブの結合によるＥＧＦＲ阻害。
・コンジュゲートのナノサイズによるＥＰＲ（Enhanced Permeability and Retention）効果に起因した相乗的な（synergized）腫瘍取込み。
・ＱＤの機能に起因した腫瘍光線療法効果であって、細胞の自殺カスケード（アポトーシス）を引き起し得る熱として一重項酸素を生成するか又はエネルギーを凝縮させる。
【００３７】
上記の４つの作用の組合せは相乗効果をもたらして、ＥＧＦＲ発現癌について非常に効率的な治療を提供し、セツキシマブ治療単独によるよりも副作用が低い可能性があると考えられる。
【００３８】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用について以下に詳細に説明するが、本発明は、多種多様な具体的な状況で使用できる適用可能な多くの発明概念を提供することを理解のこと。本明細書で説明した幾つかの実施形態は、本発明を作製及び使用するための特定の方法の単なる例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３９】
省略形：本明細書では、以下の省略形が使用される。
ＣＡ１２５：癌抗原１２５（ＣＡ１２５）は、ムチン１６（ＭＵＣ１６）としても知られている。
ＣＡ１９−９：炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、別名、癌抗原１９−９又はシアル化ルイス（ａ）抗原。
ＣＤ２０：ＣＤ２０は、ＭＳ４Ａ１遺伝子によってコードされ、初期Ｂ細胞又は形質細胞ではなくＢ細胞の表面に発現する活性グリコシル化（activated-glycosylated）リンタンパク質である。
ＣＤ２５：ＣＤ２５は、インターロイキン２受容体α鎖（ＩＬ２ＲＡ）タンパク質である。
ＣＤ３０：別名、ＴＮＦＲＳＦ８は、腫瘍壊死因子受容体ファミリータンパク質である。
ＣＤ３３：別名、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン３（ＳＩＧＬＥＣ−３）。
ＣＤ５２：分化抗原群５３。別名、ケンブリッジ病理学（Cambridge Pathology）抗原−１（Ｃａｍｐａｔｈ−１抗原）。
ＣＤ７３：分化抗原群７３。別名、エクト−５’−ヌクレオチダーゼ（ＮＴ５Ｅ）。
ＣＤ１０９：分化抗原群１０９。グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合糖タンパク質であって、トランスフォーミング増殖因子β結合に関与する。
ＣＥＡ：癌胎児性抗原
ＣＴＬＡ−４：細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４。
ＥＧＦＲ：上皮成長因子受容体。別名、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ又はＨＥＲ１）は、ｅｒｂＢ受容体チロシンキナーゼファミリーに属する。
ＨＥＲ２：ヒト上皮成長因子受容体２
ＰＤ−Ｌ１：プログラム化デスリガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）。分化抗原群２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７ホモログ（homolog）１（Ｂ７−Ｈ１）としても知られている。
ＱＤ：量子ドット
ＱＹ：量子収量
ＲＡＮＫ：核因子κＢの受容体活性化因子
ＳＬＮ：センチネルリンパ節
ＶＥＧＦ−Ａ：血管内皮成長因子Ａ
【００４０】
（ＲＡＮＫ）リガンド（又はＲＡＮＫＬ）は、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ＴＮＦ関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）、及び破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）としても知られている。
【００４１】
「備えている」（及び、その任意の形態、例えば「備える」）、「有している」（及びその任意の形態、例えば「有する」）、「含んでいる」（及びその任意の形態、例えば「含む」）、「含有している」（及びその任意の形態、例えば「含有する」）は、包括的又はオープンエンドであって、列挙されていない更なる要素又は工程を除外しない。
【００４２】
本明細書では、用語「抗体」は、無傷の免疫グロブリン分子と、その部分、フラグメント、及び誘導体とを含んでおり、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｓｃ、ＣＤＲ、又は、キメラ抗体を含む抗原又はエピトープに結合できる抗体の任意の部分が含まれ、キメラ抗体は、二重特異性であるか、又は、抗体に由来する抗原結合ドメインと、別のタイプのポリペプチドとを組み合わせる。故に、用語「抗体」は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と、キメラ抗体と、ヒト化抗体と、公知技術によって提供されるそれらのフラグメント、部分、領域又は誘導体とを含んでおり、当該公知技術には、酵素的開裂及び組換え技術が含まれるが、これらに限定されない。本明細書では、用語「抗体」は、重鎖抗体の単一のモノマー可変抗体ドメイン（monomeric variable antibody domain）（ＶＨ）を有する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及びそのフラグメントも含んでいる。ｓｄＡｂは、可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを欠いており、ラクダ科動物（ＶＨＨ）及び軟骨魚類（ＶＮＡＲ）に天然に見られ、ラマでｓｄＡｂに結合する特異的抗原を開発した製薬会社Ａｂｌｙｎｘによって、時にナノボディ（Nanobody）と称される。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られるものとしての抗体の特徴を示しており、特定の方法による抗体の生成を要するものと解釈されるべきではない。
【００４３】
本明細書では、化合物「グアイフェネシン」は以下の化学構造を有する。
【化１】
2019537609.tif 000003
【００４４】
本明細書では、化合物「サリチル酸」は以下の化学構造を有する。
【化２】
2019537609.tif 000004
【００４５】
コア及びコア−シェルナノ粒子を合成する方法は、例えば、所有者を同じくする米国特許第７，８６７，５５６号、第７，８６７，５５７号、第７，８０３，４２３号、第７，５８８，８２８号、及び第６，３７９，６３５号に開示されている。前述の特許の各々の内容は、その全体が参照により本明細書の一部となる。米国特許第９，１１５，０９７号、第８，０６２，７０３号、第７，９８５，４４６号、第７，８０３，４２３号、及び第７，５８８，８２８号、並びに米国特許公開第２０１０／０２８３００５号、第２０１４／０２６４１９６号、第２０１４／０２７７２９７号、及び第２０１４／０３７０６９０号は、それらの各々の全体が本明細書の一部となる。これら引用文献には、大量の高品質単分散ＱＤを製造する方法が記載されている。
【００４６】
媒体に対するナノ粒子の適合性と、凝集、光酸化及び／又はクエンチングについてのナノ粒子の受け易さとは、主にナノ粒子の表面組成によって媒介される。任意のコア、コア−シェル又はコア／マルチシェルナノ粒子の最終的な無機表面原子の周りの配位は不完全なことがあり、表面に反応性が高いダングリングボンドを有し、これは粒子の凝集をもたらし得る。この問題は、本明細書でキャッピングリガンド又はキャッピング剤と呼ばれる保護有機基で、ベアな表面原子を不動態化する（キャッピングする）ことによって克服される。粒子のキャッピング又は不動態化は、粒子の凝集を防ぐだけでなく、周囲の化学的環境から粒子を保護し、コア材料の場合には、粒子に電子的安定化（不動態化）をもたらす。キャッピングリガンドは通常、粒子の最も外側の無機層の表面金属原子に結合したルイス塩基である。キャッピングリガンドの性質は、特定の媒体に対するナノ粒子の適合性を大きく左右する。
【００４７】
多くのＱＤ材料では、キャッピングリガンドは疎水性である（例えば、アルキルチオール、脂肪酸、アルキルホスフィンやアルキルホスフィンオキシドなど）。故に、ナノ粒子は通常、ナノ粒子の合成及び単離後に、トルエンなどの疎水性溶媒中に分散される。このようにキャッピングされたナノ粒子は通常、極性がより高い媒体には分散しない。ＱＤの表面修飾が望まれる場合に最も広く使用されている手法は、リガンド交換として知られている。親油性リガンド分子は、コア合成及び／又はシェル形成手順中にナノ粒子の表面に配位し、続いて、極性／荷電リガンド化合物と交換されてよい。別の表面修飾ストラテジーは、極性／荷電分子又はポリマー分子を、ナノ粒子の表面に既に配位しているリガンド分子とインターカレートさせることである。しかしながら、ある種のリガンド交換及びインターカレーション手法は、水性媒体に対してナノ粒子をより相溶性にする一方で、対応する未修飾ナノ粒子よりもフォトルミネセンス量子収率（ＱＹ）が低い、及び／又はサイズが実質的に大きい材料をもたらすことがある。問題なことに、本明細書に開示されるセラノスティック目的のためには、ＱＤは、カドミウム、鉛やヒ素などの有毒な重金属を実質的に含まないこと（例えば、カドミウム、鉛、ヒ素などの重金属が５重量％未満、具体的には、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、０．０１重量％未満）、或いは、カドミウム、鉛、ヒ素などの重金属を含まないことが好ましい。カドミウム、鉛及びヒ素を含まないナノ粒子の例には、例えば、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＡｌＰ、ＡｌＳ、ＡｌＡｓ、ＡｌＳｂ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＡｇＩｎＳ２、ＡｇＩｎＳ２／ＺｎＳ、Ｓｉ、Ｇｅ、それらの合金やドープされた誘導体のような半導体材料を含むナノ粒子、特に、これらの材料のうちの１つの材料のコアと、これらの材料のうちの別の材料の１又は複数のシェルとを含むナノ粒子が挙げられる。
【００４８】
ナノ粒子の表面における欠陥とダングリングボンドで起こる非放射電子−正孔再結合のために、単一の半導体材料、例えば、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＩｎＰ、ＧａＮなどを含むナノ粒子のＱＹは、比較的低いことがあることに留意のこと。これらの問題に少なくとも部分的に対処するために、ナノ粒子のコアは、コアの材料とは異なる材料、例えば、「コア」とは異なる半導体材料の１又は複数の層（本明細書では「シェル」とも呼ばれる）で少なくとも部分的にコーティングされてよい。１又は複数のシェルに含まれる材料は、周期律表の２乃至１６族の１又は複数のイオンを含んでよい。ナノ粒子が２つ以上のシェルを有する場合には、各シェルは異なる材料から形成されてもよい。例示的なコア／シェル材料では、コアは、先に特定された材料の１つから形成されており、シェルは、バンドギャップエネルギーがより大きく、格子寸法がコア材料と同様な半導体材料を含む。例示的なシェル材料としては、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ及びＧａＮが挙げられるが、これらに限定されない。マルチシェルナノ粒子の一例には、ＩｎＰ／ＺｎＳ／ＺｎＯがある。コア内における表面状態から離れた電荷キャリアの閉込めは、安定性がより高くてＱＹがより高いナノ粒子を提供する。
【００４９】
しかしながら、有毒な重金属を含まないＱＤは望ましい一方で、カドミウムフリーなＱＤの表面を改質することは特に困難であることが分かっている。上記のリガンド交換法のような方法がカドミウムフリーＱＤの表面を改質するために使用されると、カドミウムフリーＱＤは容易に劣化する。例えば、カドミウムフリーのＱＤの表面を改質する試みは、そのようなナノ粒子の量子ドットＱＹの著しい減少を引き起こすことが観察されている。本明細書に開示されるインビボ用途のためには、高いＱＹを有する表面修飾されたカドミウムフリーのＱＤが必要とされる。本発明の目的のために、カドミウムフリーＱＤに言及する場合、２０％未満のＱＹは非常に低いと見なされ、３０％未満のＱＹは低いと見なされ、３０〜４０％のＱＹは中程度と見なされ、４０％を超えるＱＹは高いと見なされ、５０％を超えるＱＹは非常に高いと見なされる。
【００５０】
本明細書に開示される高ＱＹカドミウムフリー水分散性ＱＤは、約４０％を超えるＱＹを有する。特定の生体内実施形態では、重金属を含まない半導体インジウム系ＱＤ、又はインジウム及び／又はリンを含有するＱＤが好ましい。
【００５１】
幾つかの実施形態では、非毒性ＱＤナノ粒子は表面修飾されて、水溶性にされて、且つ、それらをリガンド相互作用剤に曝すことによって誘導体化する表面部分を有しており、リガンド相互作用剤とＱＤの表面との会合をもたらすことを可能にする。リガンド相互作用剤は、以下に記載するように、鎖部分と、連結／架橋剤に対して特異的な親和性又はそれとの反応性を有する官能基とを含んでよい。鎖部分は、例えば、アルカン鎖であってよい。官能基の例には、チオ基、ヒドロキシル基、カルボキサミド基、エステル基やカルボキシル基などの求核基が挙げられる。リガンド相互作用剤はまた、ＱＤの表面に対して親和性を有する部分を含んでも含まなくてもよい。そのような部分の例には、チオール、アミン、カルボキシル基やホスフィンが挙げられる。リガンド相互作用基がそのような部分を含まない場合、リガンド相互作用基は、キャッピングリガンドとインターカレートすることによってナノ粒子の表面と会合してよい。リガンド相互作用剤の例には、例えばミリスチン酸イソプロピルのようなＣ８−２０脂肪酸及びそのエステルが含まれる。
【００５２】
リガンド相互作用剤は、単にナノ粒子の合成に使用されるプロセスの結果としてＱＤナノ粒子と会合してよく、ナノ粒子を更なる量のリガンド相互作用剤に曝す必要性を無くすことに留意のこと。このような場合、更なるリガンド相互作用剤をナノ粒子と会合させる必要はないかもしれない。代替的に又は追加で、ナノ粒子が合成及び単離された後に、ＱＤナノ粒子をリガンド相互作用剤に曝してもよい。例えば、ナノ粒子は、リガンド相互作用剤を含む溶液中にて、一定期間インキュベートされてよい。そのようなインキュベーション、又はインキュベーション期間の一部は、高温であってよく、リガンド相互作用剤とナノ粒子の表面との会合が促進する。リガンド相互作用剤をナノ粒子の表面と会合させた後に、ＱＤナノ粒子は、連結／架橋剤及び表面修飾リガンドに曝される。連結／架橋剤は、リガンド相互作用剤の基に対して、また、表面修飾リガンドに対して特異的な親和性を有する官能基を含んでいる。リガンド相互作用剤−ナノ粒子会合複合体は、連結／架橋剤及び表面修飾リガンドに順次曝される。例えば、ナノ粒子は、架橋／架橋剤にある期間曝されて架橋をもたらし、その後、表面修飾リガンドに曝されて、それをナノ粒子のリガンドシェルへと組み込んでよい。或いは、ナノ粒子は、結合／架橋剤と表面修飾リガンドとの混合物に曝されてよく、よって、単一の工程で架橋されて、表面修飾リガンドが組み込まれる。
【００５３】
以下の実施例は、開示を完全にするため、本発明の組成物及び複合物を製造する方法を説明するため、並びに組成物の特定の特徴を示すために記載されている。これらの実施例は、本発明の範囲又は教示を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００５４】
[実施例１  非毒性量子ドットの合成]
分子シーディングプロセスを使用して、非毒性ＱＤを生成した。概要を説明すると、５００〜７００ｎｍの範囲で発光する非官能化インジウム系ＱＤの調製を以下のようにして行った。ジブチルエステル（約１００ｍｌ）及びミリスチン酸（ＭＡ）（１０．０６ｇ）を三つ口フラスコに入れて、真空下で約７０℃で１時間脱気した。この期間の後、窒素を導入し、そして温度を約９０℃に上げた。約４．７ｇのＺｎＳ分子クラスタ［Ｅｔ３ＮＨ］４［Ｚｎ１０Ｓ４（ＳＰｈ）１６］を加え、混合物を約４５分間撹拌した。次に、温度を約１００℃に上げて、続いてＩｎ（ＭＡ）３（１Ｍ、１５ｍｌ）を滴下し、続いてトリメチルシリルホスフィン（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、１５ｍｌ）を滴下した。反応混合物を撹拌しながら温度を約１４０℃に上げた。１４０℃で、ジ−ｎ−ブチルセバケートエステルに溶解させたミリスチン酸インジウム（Ｉｎ（ＭＡ）３）（１Ｍ、３５ｍｌ）（５分間撹拌したままにした）と、ジ−ｎ−ブチルセバケートエステルに溶解させた（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、３５ｍｌ）を更に滴下した。その後、温度をゆっくりと１８０℃に上げて、Ｉｎ（ＭＡ）３（１Ｍ、５５ｍｌ）、続いて（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、４０ｍｌ）を更に滴下した。このようにして前駆体を添加することで、発光極大が５００ｎｍから７２０ｎｍまで徐々に増加するインジウム系粒子を作製した。所望の発光極大が得られた時点で反応を停止し、反応温度で半時間撹拌し続けた。この期間の後、混合物を約４日間（反応温度よりも約２０乃〜４０℃低い温度で）アニールした。この段階でＵＶランプも使用して、アニーリングを促進した。
【００５５】
カニューレ法を用いて、乾燥脱気メタノール（約２００ｍｌ）の添加により粒子を単離した。沈殿物を沈殿させ、次に、フィルタスティックを用いてカニューレを介してメタノールを除去した。乾燥脱気クロロホルム（約１０ｍｌ）を加えて固体を洗浄した。真空下で１日間固体を乾燥させた。この手法により、ＺｎＳ分子クラスタにインジウム系ナノ粒子が形成された。更なる処理において、結果として得られたインジウム系ナノ粒子の量子収率は、希フッ酸（ＨＦ）中で洗浄することによって更に増加した。インジウム系コア材料の量子収率は、約２５％〜５０％の範囲であった。
【００５６】
ＺｎＳシェルの成長：ＨＦエッチングしたインジウム系コア粒子の２０ｍｌ部を三つ口フラスコ内で乾燥させた。１．３ｇのミリスチン酸及び２０ｍｌのジ−ｎ−ブチルセバケートエステルを添えて、３０分間脱気した。溶液を２００℃に加熱して、２ｍｌの１Ｍ（ＴＭＳ）２Ｓを（７．９３ｍｌ／時の速度で）滴加した。この添加が完了した後、溶液を２分間放置し、次に１．２ｇの無水酢酸亜鉛を加えた。２００℃で１時間溶液を保持して、次に室温に冷却した。４０ｍｌの無水脱気メタノールを添加して遠心分離することで、得られた粒子を単離した。上澄み液を捨てて、残った固体に３０ｍｌの無水脱気ヘキサンを加えた。 溶液を５時間静置し、次に再度遠心分離した。上澄み液を集めて、残った固体を捨てた。最終的な非官能化インジウム系ＱＤナノ粒子材料の量子収率は、有機溶媒中で約６０％〜９０％の範囲であった。
【００５７】
［実施例２  水溶性の表面修飾ＱＤ］
メラミンヘキサメトキシメチルメラミン（ＨＭＭＭ）修飾蛍光ナノ粒子を、インビトロ及びインビボで生物学的標的を検出及び／又は調整するためのナノプローブとして生成及び使用するための方法の一実施形態が、本実施例で提供される。独特なメラミンベースのコーティングは、優れた生体適合性と、低毒性と、非常に低い非特異的結合とを示す。これらの独特の作用により、インビトロとインビボの両方で幅広い生物医学的用途が可能になる。
【００５８】
適切な水溶性ＱＤの調製の一例を以下に示す。実施例１に記載されており、コア材料としてインジウム及びリンを含む合金と、Ｚｎ含有シェルとを有しており、６０８ｎｍで赤色発光する２００ｍｇのカドミウムフリーＱＤナノ粒子を、ミリスチン酸イソプロピル（１００マイクロリットル）と共にトルエン（１ｍｌ）中に分散させた。ミリスチン酸イソプロピルは、リガンド相互作用剤として含まれる。５０℃で約１〜２分間混合物を加熱し、次に室温で１５時間ゆっくりと振とうした。ヘキサメトキシメチルメラミン（ＨＭＭＭ）（ＣＹＭＥＬ  ３０３、Ｃｙｔｅｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ウェストパターソン）（４００ｍｇ）、モノメトキシポリエチレンオキシド（ＣＨ３−Ｏ−ＰＥＧ２０００−ＯＨ）（４００ｍｇ）、及びサリチル酸（５０ｍｇ）のトルエン溶液（４ｍｌ）をナノ粒子分散系に加えた。サリチル酸は、官能化反応に用いられ、触媒、架橋剤、及びＣＯＯＨの供給源として３つの役割を果たす。ＯＨ基に関するＨＭＭＭの選好性に部分的に起因して、サリチル酸によって提供される多くのＣＯＯＨ基は、架橋後もＱＤ上で利用可能なままである。
【００５９】
ＨＭＭＭは、以下の構造を有するメラミンベースの連結剤／架橋剤である。
【化３】
2019537609.tif 000005
【００６０】
ＨＭＭＭは、酸触媒反応で反応して、アミド、カルボキシル基、ヒドロキシル基、及びチオールなどの様々な官能基を架橋できる。
【００６１】
混合物を脱気し、電磁撹拌機で３００ｒｐｍで撹拌しながら、最初の１時間は１３０℃で、次に１４０℃で３時間還流した。最初の１時間の間、窒素流をフラスコに通過させて、ＨＭＭＭと求核基の反応によって発生した揮発性副生成物を確実に除去した。混合物を室温に冷却して、不活性ガス下で保存した。表面修飾ナノ粒子は、未修飾ナノ粒子と比較して、蛍光量子収率がほとんど又は全く損なわれず、発光ピーク又は半値全幅（ＦＷＨＭ）値の変化がないことを示した。表面修飾ナノ粒子のアリコートを真空下で乾燥させて、脱イオン水を残留物に添加した。表面修飾ナノ粒子は、水性媒体によく分散し、常に分散したままであった。対照的に、未修飾ナノ粒子は水性媒体中に懸濁しなかった。上記手順による表面修飾ナノ粒子の蛍光ＱＹは、約４７である。
【００６２】
別の実施形態では、６０８ｎｍで赤色発光するカドミウムフリー量子ドットナノ粒子（２００ｍｇ）を、コレステロール（７１．５ｍｇ）と共にトルエン（１ｍｌ）に分散させた。５０℃で約１〜２分間混合物を加熱し、次に室温で１５時間ゆっくりと振とうした。ＨＭＭＭ（Ｃｙｍｅｌ ３０３）（４００ｍｇ）、モノメトキシポリエチレンオキシド（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ２０００−ＯＨ）（４００ｍｇ）、グアイフェネシン（１００ｍｇ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（２ｍＬ）及びサリチル酸（５０ｍｇ）のトルエン溶液（４ｍｌ）を、ナノ粒子分散系に加えた。混合物を脱気して、磁気撹拌機で３００ｒｐｍで撹拌しながら、１４０℃で４時間還流した。先の手順と同様に、最初の１時間の間に窒素流をフラスコに通過させて、ＨＭＭＭと求核基の反応によって発生した揮発性副生成物を確実に除去した。混合物を室温に冷却し、不活性ガス下で保存した。表面修飾ナノ粒子のアリコートを真空下で乾燥させ、脱イオン水を残留物に加えた。１００ｍＭのＫＯＨ溶液を用いて、溶液のｐＨを６．５に調整し、Ａｍｉｃｏｎフィルタ（３０ｋＤ）を用いた３サイクルの限外濾過により、過剰な未反応物質を除去した。最終水溶液は、使用するまで冷蔵保存された。
【００６３】
得られたナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析は、ナノ粒子の低電子密度特性に起因して難しかった。図１Ａ及び図１Ｂは、ナノ粒子の典型的なサンプルの典型的なＴＥＭ画像及びサイズ分布を示す。ＪＥＯＬ２０１０分析ＴＥＭを用いてＴＥＭ画像を得た。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  μＶシステムを使用して動的光散乱（ＤＬＳ）を測定することによって流体力学的粒径を決定した。水性緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ６ｍＭ、ｐＨ７．８）中にナノ粒子を分散させた。実施例２に基づいて生成された表面処理水溶性粒子の平均流体力学的粒径は、１２．２ｎｍであり、標準偏差は０．２９ｎｍである（図１Ｃ）。図１Ｄは、蒸留水中における表面処理ナノ粒子のフォトルミネセンス発光スペクトルを示し、ピーク発光は、６１５ｎｍである。光ファイバＣＣＤ分光計（ＵＳＢ４０００、オーシャンオプティクス社）を用いて、ＱＤのフォトルミネセンス発光スペクトルを記録した。ＱＹ測定のために、積分球を組み込んだ分光計を使用した。量子収率（ＱＹ）は、当該分野において良く知られた用語である。それは、吸収光子数で割った放出光子数をパーセントで表している。それは、染料標準（dye standard）に対して、積分球を組み込んだ分光計で測定される。図２は、生成過程と得られた表面改質ＱＤとを示す。
【００６４】
水溶性を増大させるようにナノ粒子を修飾する伝統的な方法（例えば、メルカプト官能化水溶性リガンドとのリガンド交換）は、ナノ粒子を水溶性にする温和な条件下では効果がないことに注目すべきである。熱及び超音波処理などの過酷な条件下では、フラクションは水溶性になり、非常に低いＱＹ（＜２０％）を有する。対照的に、本方法は、４０％を超える高い又は非常に高い量子収率を有する水溶性ナノ粒子を提供する。この実施例のように調製された表面修飾ナノ粒子はまた、エタノール、プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、ブタノール、トリプロピルメチルメタクリレート、メチルメタクリレートを含む他の極性溶媒によく分散し、常に分散したままである。
【００６５】
［実施例３  ＱＤセラノスティックデバイス］
インビボ用途のためには、必要とされない限り、低い毒性プロフィールを有するＱＤが望ましい。ある実施形態では、カドミウム、鉛、及びヒ素などの重金属を含まない低毒性ＱＤが提供されて、膵癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、胃癌、脳腫瘍、前立腺癌及び食道癌を含む癌の画像誘導手術に使用される。
【００６６】
ＱＤ特有の性質は、未だに達成されていないインビトロ診断及びインビボ診断、臨床イメージング、標的薬物送達、及び光線力学療法を含む幾つかの潜在的な医学的用途を可能にする。ＱＤの医療応用に関する大きな懸念の１つは、カドミウム、鉛、ヒ素などの有毒重金属を含むＱＤに研究の大部分が集中していることであった。本明細書に記載の生体適合性で水溶性の重金属を含まないＱＤは、インビトロ及びインビボの両方で医療用途に安全に使用できる。幾つかの実施形態では、（完全ＩｇＧ２抗体の寸法サイズの範囲内である）１０乃至２０ｎｍの流体力学的サイズを有する生体内適合性の水分散性カドミウムフリーＱＤが提供される。ある実施形態では、生体内適合性の水分散性カドミウムフリーＱＤは、本明細書の実施例１及び実施例２に記載の手順に従って製造される。幾つかの実施形態では、生体内適合性の水分散性カドミウムフリーＱＤは、カルボキシル官能化されており、更には、１又は複数のリガンド結合部で誘導体化されている。
【００６７】
本明細書に開示される生体内適合性水分散性カドミウムフリーＱＤを用いたインビトロ及びインビボの毒物学的研究は、それらが、市販のカドミウム系ＱＤよりも細胞毒性が少なくとも２０倍少なく、毒性の徴候は、動物モデルでは有効用量の複数倍においても観察されなかったことを示した。更に、本明細書で提供される生体内適合性水分散性カドミウムフリーＱＤナノ粒子は、溶血作用も補体Ｃ３活性化も示しておらず、好ましい臨床適合性プロファイルを示している。
【００６８】
多くの癌はリンパ系を介して転移することから、リンパ節転移の存在は、黒色腫、乳癌、結腸癌、肺癌及び卵巣癌を含む多くの癌における重要な予後マーカーである。センチネルリンパ節（ＳＬＮ）は、腫瘍の部位からのリンパ排液を受け取る最初のリンパ節として特徴付けられる。乳癌細胞は腋窩にあるリンパ節（ＬＮ）に広がる可能性が最も高いため、腋窩リンパ節（ＡＬＮ）の正確な評価は、（早期）乳癌患者における生存及び再発を最も予知する指標である。
【００６９】
ＳＬＮマッピングのマーカーとして評価される場合において、３０μｇ用量の非官能化生体内適合性水分散性カドミウムフリーＱＤ粒子（不動粒子）を、麻酔下でヌードマウスの足に皮下注射し、簡単なイメージングシステムを使用して腋窩リンパ節の位置を検出できることが示された。図５に示すように、重金属フリー／カドミウムフリー生体適合性ＱＤナノ粒子は、皮下注射後の局所リンパ節のエクスビボイメージングによるリンパ節のマッピングに使用できる。誘導結合プラズマ質量分析による元素分析に基づくフォトルミネセンスイメージング及び化学抽出測定を使用すると、腋窩及び胸部の局所リンパ節に迅速且つ選択的にＱＤが蓄積することが示された。加えて、ＱＤフォトルミネセンス寿命イメージング顕微鏡法は、生物系におけるそれらのフォトルミネセンス特性に対する最小の変動を示した。
【００７０】
本明細書で提供される生体内適合性水分散性カドミウムフリーＱＤ粒子を、カルボジイミドカップリングを使用して、ストレプトアビジンや抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体トラスツズマブのようなタンパク質にコンジュゲートすることができ、ＱＤコンジュゲートは、標的基質（例えば、ＨＥＲ２受容体保有細胞）の特異的標識を示したことも実証された。
【００７１】
生体内適合性の水分散性カドミウムフリーＱＤとストレプトアビジンの共有結合：
実施例２で引用した水溶性の官能基化ＱＤを、カルボジイミドの化学的作用を用いてストレプトアビジン（ＳＡＶ）に共有結合させて、表面ＣＯＯＨ基をＳＡＶ分子のアミン末端と結合させた。例えば、以下のプロトコルを使用して、６３３ｎｍ放射水溶性ＱＤをＳＡＶにコンジュゲートした。
【００７２】
ある実施形態では、エッペンドルフチューブにおいて、０．５ｍｇ（５０μｌ）の水溶性ナノ粒子を１００μｌのＭＥＳ活性化緩衝液と混合させた。ＭＥＳ緩衝液は、ｐＨ４．０の２５ｍＭ脱イオン水溶液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ヘミナトリウム塩（ＭＥＳ）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）として調製される。次に、１００μｌの新たなＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１０ｍｇ／ｍｌ溶液で添加して、十分に混合して、室温で５分間放置した。予め湿らせたＮａｎｏＳｅｐ３００Ｋフィルタに混合物を移し、２００μｌのＭＥＳ活性化緩衝液を添加し、卓上マイクロ遠心分離機（約２０００ｇ）を用いて濾過ユニットを５０００ｒｐｍ／２０分で回転させた。溜まったドットを５０μｌの活性化緩衝液に再分散させて、１×ＰＢＳ中にある０．５ｍｇのＳＡＶを含むエッペンドルフチューブに移した。それらをよく混ぜて、室温で１０分間インキュベートし、次に冷蔵庫（４乃至６℃）内に一晩放置した。Ｎａｎｏｓｅｐ３００Ｋフィルタ及びＰＢＳ緩衝液を用いた限外濾過を３サイクル行って、過剰のＳＡＶを除去した。遠心分離の各サイクルは５０００ｒｐｍで２０分間であって、最終残渣を約４００μｌのＰＢＳを用いて再分散させた。精製ＱＤ−ＳＡＶコンジュゲートの生成は図３に示されている。
【００７３】
別の実施形態では、エッペンドルフチューブにおいて、１．２ｍｇのカルボキシル官能化水溶性量子ドットを、ｐＨ４．５の１００μｌのＭＥＳ活性化緩衝液（即ち、２５μｌの５０ｍｇ／ｍｌストックを１００μｌのＭＥＳに）と混合させた。これに、３３μｌの新たなＥＤＣ溶液（脱イオン水における３０ｍｇ／ｍｌストック、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて、溶液を混ぜた。これに４μｌの新たなｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（１００ｍｇ／ｍｌストック、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、脱イオン水中）を加えて、溶液を混ぜた。ＮａｎｏＳｅｐ３００Ｋフィルタ（ＰＡＬＬ  ＮａｎｏＳｅｐ  ３００Ｋ  Ｏｍｅｇａ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒｓ）を１００μｌのＭＥＳで予め湿らせた。ＭＥＳ／ＥＤＣ／Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ／ＱＤ溶液を、ＮａｎｏＳｅｐ３００Ｋフィルタに加えて、ＭＥＳで５００μｌまで満たした。５０００ｒｐｍ／１５分で フィルタを遠心分離した。溜まったドットを、５０μｌの活性化緩衝液に再分散させ、５μｌのストレプトアビジン溶液（ＳＡＶ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＨＥＰＥＳにおけるＳＡＶの１ｍｇ／１００μｌストック、２５ｍＭの脱イオン水、ｐＨ７．４）と２０μｌのＨＥＰＥＳを含むエッペンドルフチューブに移した。溶液をよく混ぜて、室温で一晩（約１６乃至１８時間）インキュベートした。
【００７４】
その溶液を、１６μｌの６−アミノカプロン酸溶液（１９．７ｍｇ／１００ｍＭ）でクエンチした。予め湿らせたＮａｎｏｓｅｐ３００Ｋフィルタ（１００μｌの１×ＰＢＳ）に溶液を移して、１×ＰＢＳで５００μｌのラインまで満たした。Ｎａｎｏｓｅｐ３００Ｋフィルタと１×ＰＢＳ緩衝液を用いた限外濾過を３サイクル行って、過剰なＳＡＶを除去した。遠心分離の各サイクルは、５０００ｒｐｍで２０分間であり、各サイクル後に約４００μｌの１×ＰＢＳで再分散させた。最終濃縮物を１００μｌのＰＢＳに再分散させた。活性の検証は、１０μｌのビオチン化球（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  １０ミクロン）を５μｌのＳＡＶ−ＱＤコンジュゲートと混合して行った。これに８５μｌの１×ＰＢＳを加え、混合物を振とうしながら１時間放置し、続いて１ｍｌの１×ＰＢＳを加えて、１０００ｒｐｍ／５分で遠心分離した。
【００７５】
検出系の機能を実証するために、調製したＱＤ−ＳＡＶコンジュゲートを用いてポリスチレン球の表面上のビオチン分子を検出した。エッペンドルフチューブにおいて、１０μｌのビオチン球（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  １％、約７ミクロン）を、上述したように調製した１０μｌのコンジュゲートと混合し、室温で３０分間インキュベートし、その後、１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、マイクロ遠心分離機（２０００ｒｐｍ／５分）を用いてペレット化した。最終的な球は、紫色のシングルバンドパス励起フィルタを備えた蛍光顕微鏡（オリンパス  ＢＸ５１）を使用して観察された。図７に示されるように、ＳＡＶ−ＱＤコンジュゲートは、ビオチン球の表面に特異的に結合している。このケースでは、赤色及び緑色の両方で発光する生体内適合性の水分散性カドミウムフリーＱＤナノ粒子をストレプトアビジンにコンジュゲートさせて、ビオチン化ポリマー球を染色するために使用した。同じ方法で処理した場合におけるビオチン化されていないプレーンな球体は、染色を示しておらず、ＱＤの結合は特異的であって、ＱＤナノ粒子のＳＡＶの機能性に起因することを示していた。
【００７６】
生体内適合性の水分散性カドミウムフリーＱＤとトラスツズマブの共有結合：
エッペンドルフチューブにいいて、１．２ｍｇのカルボキシル官能化水溶性ＱＤを１００μｌのＭＥＳ活性化緩衝液（即ち、２５μｌの５０ｍｇ／ｍｌストックを１００μｌのＭＥＳに）と混合させた。ＭＥＳ緩衝液は、ｐＨ４．５の２５ｍＭ脱イオン水溶液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ヘミナトリウム塩（ＭＥＳ）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）として調製される。これに、３３μｌの新たなＥＤＣ溶液（脱イオン水における３０ｍｇ／ｍｌストック、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて、混ぜた。これに、４μｌの新たなｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（１００ｍｇ／ｍｌストック、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、脱イオン水中）を添加し、溶液を混ぜた。ＮａｎｏＳｅｐ３００Ｋフィルタ（ＰＡＬＬ  ＮａｎｏＳｅｐ  ３００Ｋ  Ｏｍｅｇａ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒｓ）を１００μｌのＭＥＳで予め湿らせた。ＭＥＳ／ＥＤＣ／Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ／ＱＤ溶液をＮａｎｏＳｅｐ３００Ｋフィルタに添加し、５００μｌまでＭＥＳで満たした。５０００ｒｐｍ／１５分でフィルタを遠心分離した。溜まったドットを５０μｌの活性化緩衝液に再分散させて、１０μｌのトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、ＨＥＰＥＳ緩衝液の２５ｍＭ溶液における１００ｍｇ／ｍｌストック、ｐＨ８．５）と４０μｌのＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ８．５とを含むエッペンドルフチューブに移した。溶液を十分に混ぜて、室温で一晩（約１６乃至１８時間）インキュベートした。１６μｌの６−アミノカプロン酸（６ＡＣ）（１９．７ｍｇ／１００ｍＭ）で溶液をクエンチした。第一級アミンを有する他の化合物を用いてクエンチを代替的に行うことができるであろうが、この実施形態では、ＣＯＯＨを有しており、製品のコロイド安定性を維持できることから６ＡＣが選択されたことに留意のこと。予め湿らせたＮａｎｏｓｅｐ３００Ｋフィルタ（１００μｌの１×ＰＢＳ）に溶液を移し、１×ＰＢＳで５００μｌのラインまで満たした。Ｎａｎｏｓｅｐ３００Ｋフィルタと１×ＰＢＳ緩衝液を用いた限外濾過を３サイクル行って、過剰なＳＡＶを除去した。遠心分離の各サイクルは、５０００ｒｐｍで２０分間であって、各サイクル後に約４００μｌの１×ＰＢＳで再分散させた。最終濃縮物を１００μｌのＰＢＳに再分散させた。 図６Ａ及び図６Ｂは、ＨＥＲ２を発現する細胞に結合して同定する抗ＨＥＲ２ｍＡｂ（トラスツズマブ、ハーセプチン（登録商標））にコンジュゲートされた赤色ナノ粒子を実証する。図６Ａでは、抗ＨＥＲ２ｍＡｂにコンジュゲートされた赤色ナノ粒子を用いて、ＨＥＲ２陽性４Ｔ１細胞が処置された。図６Ｂは、対照ＨＥＲ２陰性４Ｔ１細胞を用いた同じ処置を示し、明るい蛍光はほとんど見られない。
【００７７】
生体内適合性水分散性カドミウムフリーＱＤが非特異的に結合しないことを確認するための実験が行われた。図８Ａ及び図８Ｂに結果を示す実験では、ドットブロットを行った。まず、濃度が０．１５ｍｇ／ｍｌである精製ＨＥＲ２のアリコート（１μｌ）を、２つのストリップの各々にて３つのスポットに垂直に点在させた。図８Ａは、精製ＨＥＲ２を予め点在させたストリップに異なる濃度のハーセプチン（登録商標）ＱＤコンジュゲートを添加した結果を示す：ｉ．そのままのハーセプチン（登録商標）ＱＤコンジュゲート、ｉｉ．ハーセプチン（登録商標）ＱＤコンジュゲートの１／１０希釈、ｉｉｉ．ハーセプチン（登録商標）ＱＤコンジュゲートの１／１００希釈。図８Ｂは、精製ＨＥＲ２を予め点在させたストリップに、濃度が異なる非官能化生体内適合性水分散性カドミウムフリーＱＤを添加した結果を示す。ドットブロット実験の結果は、ハーセプチンにコンジュゲートされたＱＤがＨＥＲ２に結合して、ストリップを励起光に暴露することによって蛍光が誘導されると、比較的高い希釈度でも容易に検出できることを示した。先にＨＥＲ２を点在させなかったストリップは、コンジュゲートされていないＱＤによる結合を起こさなかった。図９は、ドットブロットストリップに点在するＨＥＲ２の希釈系列の結果を示す。その結果は、ドットブロットストリップに点在する僅か７．５ｎｇのＨＥＲ２が、ハーセプチン（登録商標）ＱＤコンジュゲートとのインキュベーション後に容易に検出できることを示した。
【００７８】
図１０Ａ及び図１０Ｂは、標的部分がある場合とない場合における、生体内適合性水分散性カドミウムフリーのＱＤをＳＫ−ＢＲ−３細胞系に結合させた結果を示している。ＳＫ−ＢＲ−３系は、ＨＥＲ２を過剰発現するヒト乳癌細胞系である。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０％ＦＣＳを伴うＭｃＣｏｙの改変培地で培養し、６３０ｎｍで蛍光を発する５０μｇ／ｍＬの不動又はトラスツズマブ官能化カドミウムフリーＱＤで一晩処理した。細胞を可視化するために使用された励起源は、発光帯域幅が広い水銀アーク灯（Ｏｓｒａｍ  ＨＢＯ５０Ｗ／ＡＣ  Ｌ１ショートアーク、２０００ルーメン）とＤＡＰＩ光フィルタキューブ（励起帯域は３８０乃至４５０ｎｍ）であった。染色後の細胞をオリンパスＢＸ５１蛍光顕微鏡で視覚化した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で核を対比染色した。図１０Ａは、非官能化生体内適合性水分散性カドミウムフリーＱＤでＳＫ−ＢＲ−３細胞を処理した結果を示す。図１０Ｂは、トラスツズマブ官能化生体内適合性水分散性カドミウムフリーＱＤでＳＫ−ＢＲ−３細胞を処理した結果を示しており、抗ＨＥＲ２で官能化されるとＱＤの取り込みが大幅に向上したことを示す。
【００７９】
［実施例４  膵癌に対するマルチリガンドセラノスティックナノデバイス］
複数のリガンドを選択する理由は、腫瘍細胞に関連する受容体の広範囲な標的化を可能にすることである。幾つかの実施形態では、複数のリガンドの特異性は、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、及びＲＡＮＫリガンドからなる群より選択された標的との結合に特異的な少なくとも１つのリガンドを含む。
【００８０】
ある特定の実施形態では、腫瘍は膵癌である。上述したように、膵臓腫瘍の約７０％がＥＧＦＲを発現しており、これは、ＰＤ−Ｌ１を発現する約８０％と重複している。
【００８１】
活性化細胞傷害性Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄細胞は、プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）受容体と呼ばれる細胞表面受容体を発現する。ＰＤ−１は、免疫チェックポイント受容体であって、これらの細胞による細胞活性の活性化又は阻害を調節する。ＰＤ−１受容体には、プログラム細胞死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）及びプログラム細胞死リガンド−２（ＰＤ−Ｌ２）という２つのリガンドがある。ＰＤ−Ｌ１は、分化抗原群２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）としても知られている。標的細胞上のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２が活性化Ｔ細胞上のＰＤ−１受容体と係わり合って、ＩＬ−２産生及びＴ細胞増殖のＴＣＲ媒介活性化を阻害することで、Ｔ細胞に不活性化シグナルが送られる。通常、細胞傷害性Ｔ細胞上のＰＤ−１と標的細胞上のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２との間の相互作用は、妊娠中の免疫系を抑制して、自己免疫疾患を予防するのに有用であり得る。しかしながら、腫瘍細胞は、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現させることでこの経路を利用して、Ｔ細胞媒介性の抗腫瘍反応を阻害する。腫瘍浸潤性免疫細胞はまた、ＰＤ−Ｌ１を発現させ、腫瘍微小環境において活性化Ｔ細胞の阻害をもたらす可能性がある。
【００８２】
ＰＤ−Ｌ１を発現させるそれらの膵臓腫瘍のうち、２０％はＰＤ−Ｌ１発現の高アップレギュレーションを有しており、これらの腫瘍は侵襲性と再発性が高い傾向がある。故に、ある実施形態では、二重特異性ナノデバイスが提供されて、ＱＤに基づいて、ＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１を発現させる癌の検出及び処置がなされる。このナノデバイスは、２つの免疫療法用モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ及び抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂに水溶性蛍光ＱＤを組み合わせたものである。
【００８３】
ある実施形態では、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂはセツキシマブであり、抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂはアテゾリズマブである。図４Ａは、マルチリガンドナノデバイス及び癌細胞に対する作用機構の概略図を示す。そのようなマルチリガンドデバイスの生成においては、セツキシマブ及びアテゾリズマブのような所望の量の選択された抗体を混合して、次に、標準的なＥＤＣ化学反応を用いてカルボキシル官能化ＱＤと反応させる。鈴木−宮浦クロスカップリング（ＳＭＣＣ）又はアルデヒドを用いた反応などの他の化学反応も同様に使用できる。
【００８４】
セツキシマブ及びアテゾリズマブの両方を利用することは、全ての膵癌性病巣に対するナノデバイスの標的化の広範性を確実にし、癌の広がり内での不均一性を克服するだろう。ある実施形態では、マルチリガンドナノデバイスは、低侵襲内視鏡検査による術前診断に利用される。他の実施形態においては、マルチリガンドデバイスは、術中及び術後における検出追跡剤として利用される。この手法において非毒性の水溶性ＱＤを使用することは、それらの明るさ及び光安定性だけでなく、少なくとも２つの異なる標的分子の結合を可能にするためにも有用であって、これは通常の標識色素を用いることでは達成できない特徴である。
【００８５】
幾つかの実施形態では、マルチリガンドナノデバイスが提供されて、低侵襲性分子イメージングと低リスク及び高リスク膵癌の検出とを支援して、不要な外科的切除を減らす一方で早期診断と治療がもたらされる。
【００８６】
そのような実施形態では、マルチリガンドナノデバイスは、循環系又は腹部に注入されて、想定された腫瘍に集まる。腹腔鏡検査装置は、ＱＤの蛍光を誘導するための光源と撮像カメラとを含んでおり、腹部に導入される。前駆病変の臨床的検出及び適切な管理は、膵癌による死亡率を低下させる重要なストラテジーである。本明細書に開示されるナノデバイスの更なる利点は、小さい染料とは異なり、光線力学療法が適用できることである。インビボでのＱＤの励起は、官能化ＱＤが結合した細胞の誘導アポトーシスをもたらす。
【００８７】
本発明のデバイス及び方法は、他の種類の悪性腫瘍に使用されて、癌治療のために利用可能な選択肢の数が増やされてよい。各ＱＤは、２つ以上の特異的結合タグを備えて、マルチリガンドナノデバイスを形成してよく、当該デバイスには、最大の結合確率、故に最高の検出効率を有する二重特異性又は三重特異性ナノデバイスが含まれるが、これらに限定されない。ＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１が過剰発現する膵癌及びその他の癌を対象とする本明細書に記載のナノデバイスの同じ概念を、関連ｍＡｂ又はそれらの誘導体を使用することによって、他の種類の癌を標的とするために使用できる。
【００８８】
他の実施形態において、少なくとも１つの標的特異的リガンドは、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、テロメラーゼタンパク質及びサブユニット、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ１０９、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＴＬＡ−４、及びＲＡＮＫリガンドからなる群から選択された標的に特異的である。
【００８９】
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）はまた、ＣＤ３４０、癌原遺伝子Ｎｅｕ、又はＥＲＢＢ２としても知られており、上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーである。ＥＲＢＢ２遺伝子は、乳癌、子宮癌、胃癌、胃癌及び唾液腺癌を含む多くの癌において過剰発現している。モノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））は現在、ＨＥＲ２陽性乳癌の治療に使用されている。
【００９０】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）細胞表面アンカー（cell-surface-anchored）糖タンパク質であって、ＣＤ６６ａ−ｆのメンバーとして免疫学的に特徴付けられている。ＣＥＡ分子は細胞接着に関与しており、通常、出生後には産生されないことから、健康な成人には非常に低いレベルで存在する。ＣＥＡレベルは、結腸直腸癌において特に上昇するが、胃癌、膵癌、肺癌、乳癌及び甲状腺髄様癌においても上昇することがある。
【００９１】
炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、別名、癌抗原１９−９又はシアル化ルイス（ａ）抗原は、細胞間認識に関与するＣＡ１９−９抗体で検出されるシアリル−ルイスＡ炭水化物抗原であって、結腸直腸癌及び膵癌を含む進行性胃腸癌に関連している。
【００９２】
癌抗原１２５（ＣＡ１２５）は、ムチン１６（ＭＵＣ１６）としても知られており、転移を可能にする細胞間相互作用に関与しており、癌の中でもとりわけ卵巣癌のバイオマーカーである。
【００９３】
ＣＤ２０、分化抗原群２０は、ＭＳ４Ａ１遺伝子によってコードされ、初期のプロＢ細胞又は形質細胞ではなくてＢ細胞の表面に発現する活性化グリコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は、とりわけＢ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、及び黒色腫幹細胞によって発現される。Ｂ細胞リンパ腫及び白血病の治療に使用される多数のモノクローナル抗体は、リツキシマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、及びトシツモマブを含むＣＤ２０に向けられている。
【００９４】
ＣＤ２５、分化抗原群２５は、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞並びに他の特定の細胞上に存在するインターロイキン−２受容体アルファ鎖（ＩＬ２ＲＡ）タンパク質であって、ほとんどのＢ細胞腫瘍、幾つかの急性非リンパ球性白血病、神経芽細胞腫、及び肥満細胞症において、そして腫瘍浸潤リンパ球によって発現される。ヒト化モノクローナル抗体、ダクリズマブはＣＤ２５を標的としているが、現在では、多発性硬化症に対してのみＦＤＡ承認を受けている。
【００９５】
ＣＤ３０、分化抗原群３０、別名、ＴＮＦＲＳＦ８は、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞によって発現される腫瘍壊死因子受容体ファミリータンパク質である。ＣＤ３０は、未分化大細胞型リンパ腫及び胚性癌腫によって発現される。ヒト化モノクローナル抗体、ブレンツキシマブは、ホジキンリンパ腫及び全身性未分化大細胞型リンパ腫の治療薬としてＦＤＡに承認されている。
【００９６】
ＣＤ３３、分化抗原群３３、別名シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン３（ＳＩＧＬＥＣ−３）は、骨髄単球由来細胞の接着分子であって、細胞へのシアル酸依存的結合を媒介し、アルファ−２，６−結合シアル酸に優先的に結合する。ヒト化モノクローナル抗体ゲムツズマブは、ＣＤ３３に結合する。ゲムツズマブとカリケアマイシン細胞傷害剤オゾガマイシンの併用は、急性リンパ性白血病の治療に用いられる。
【００９７】
ＣＤ５２、分化抗原群５２、別名ケンブリッジ病理学抗原−１（Ｃａｍｐａｔｈ−１抗原）は小細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ５２は、幾つかの種類のリンパ腫に関連しており、モノクローナル抗体アレムツズマブで標的化される。
【００９８】
ＣＤ７３、分化抗原群７３、別名エクト−５'−ヌクレオチダーゼ（ＮＴ５Ｅ）は、ほとんどの組織に見られる７０ｋＤａの細胞表面酵素であるが、結腸癌、肺癌、膵癌及び卵巣癌を含む腫瘍細胞ではアップレギュレートされているようであり、そこで抗腫瘍Ｔ細胞応答を損なうように働く。
【００９９】
ＣＤ１０９、分化抗原群１０９は、トランスフォーミング増殖因子β結合に関与するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合糖タンパク質である。ＣＤ１０９は通常、血小板、活性化Ｔ細胞、及び内皮細胞の細胞表面に見られるが、ＣＤ３４＋急性骨髄性白血病細胞によって発現され、膵管癌細胞によって過剰発現される。
【０１００】
血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）は、血液増殖の主要な誘発物質であって、器官再構築及び創傷治癒の間に成人において発現する。しかしながら、ＶＥＧＦはまた、腫瘍血管形成、糖尿病性網膜症、及び加齢黄斑変性症において病原性である。ヒト化モノクローナル抗体ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））は、結腸癌、肺癌、神経膠芽腫及び腎細胞癌に加えて、老化関連黄斑変性の治療に使用される。
【０１０１】
細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、別名ＣＤ１５２は、免疫応答をダウンレギュレーションする免疫チェックポイントタンパク質受容体である。モノクローナル抗体イピリムマブは、ＣＴＬＡ−４に結合することによって免疫系を活性化し、黒色腫の再治療においてＦＤＡ承認されており、他の癌の治療について臨床試験が進行中である。
【０１０２】
核因子カッパＢ（ＲＡＮＫ）リガンド（又はＲＡＮＫＬ）の受容体活性化剤は、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ＴＮＦ関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）や破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）としても知られている。
【０１０３】
マルチリガンドナノデバイスとしては、限定ではないが、ＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１特異性を含む二重特異性ナノデバイスが挙げられ、その利点は、以下のように要約できる：
・ＱＤの蛍光特性による極度の腫瘍標識付けと、２つ以上の異なる結合タグによる官能化による高いタグ付け確率。
・ＥＧＦＲへのセツキシマブの結合によるＥＧＦＲの阻害と、活性化Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１媒介ダウンレギュレーションの阻害。
・コンジュゲートのナノサイズによってもたらされるＥＰＲ（Enhanced Permeability and Retention）効果による相乗的な腫瘍取込み。
・ＱＤの機能に起因した腫瘍光線療法効果であって、細胞の自殺カスケード（アポトーシス）を引き起し得る熱として一重項酸素を生成するか又はエネルギーを凝縮させる。
【０１０４】
上記の４つの作用の組合せは相乗効果をもたらすと考えられ、ＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１発現癌の非常に効率的な処置と、より少ない用量のＱＤ結合セツキシマブ及びアテゾリズマブが送達されることによってより低い副作用とをもたらし得る。
【０１０５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が本明細書に記載されているかのように、参照によって本明細書の一部となる。例示的な実施形態を参照して本発明を説明したが、この説明は、限定的な意味で解釈されることを意図していない。例示的な実施形態の様々な変更及び組合せは、本発明のその他の実施形態と同様に、説明を参照すれば当業者には明らかであろう。故に、添付の特許請求の範囲は、そのような変更及び拡張を包含することを意図している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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