(57)【要約】先天性リポジストロフィー（ＮＰＳＣＬ）を伴う新生児早老症候群をモデル化する、前記Ｆｂｎ１遺伝子に変異を含む非ヒト動物が提供される。このような非ヒト動物モデルを作製する方法もまた提供される。非ヒト動物モデルは、ＮＰＳＣＬの抑制もしくは低減またはＮＰＳＣＬ様症状の改善における活性について化合物をスクリーニングすることに、あるいは、ＮＰＳＣＬの促進もしくは悪化において潜在に有害な活性について化合物をスクリーニングすることに、ならびにＮＰＳＣＬの機序ならびに潜在的に新しい治療及び診断標的についての洞察を提供するために、使用することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムが変異を含むフィブリリン−１（Ｆｂｎ１）遺伝子を含む非ヒト哺乳動物であって、前記遺伝子の発現が、前記非ヒト哺乳動物に新生児早老症候群の１つ以上の先天性リポジストロフィー様症状を発症させるＣ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質をもたらす、前記非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記非ヒト哺乳動物が、前記変異についてヘテロ接合型である、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記Ｆｂｎ１遺伝子が、前記非ヒト哺乳動物に対して内因性のＦｂｎ１プロモーターを含む、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記変異が、フレームシフト変異である、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
前記変異が、早期終止コドンをもたらす、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
前記早期終止コドンが、前記Ｆｂｎ１遺伝子の最後から２番目のエクソンまたは最終エクソンに存在する、請求項５に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
前記早期終止コドンが、前記Ｆｂｎ１遺伝子の最終エクソン内であるか、または最後のエクソン−エクソン接合部の約５５塩基対未満上流にある、請求項６に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
前記変異が、最後から２番目のエクソンがスキップされるようになるスプライス部位変異である、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
前記変異が、最後のコードエクソンに早期終止コドンを生じる、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
前記変異が、フリンファミリーのプロタンパク質転換酵素に対する塩基性アミノ酸認識配列を破壊する、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
前記変異が、プロフィブリリン−１のアスプロシンのＣ末端切断産物の破壊または除去をもたらす、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が、正荷電Ｃ末端を有する、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が、配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質のアミノ酸２７００〜２７９０、アミノ酸２７１０〜２７８０、アミノ酸２７２０〜２７７０、アミノ酸２７３０〜２７６０、またはアミノ酸２７３７〜２７５５の位置に相当する位置で切断される、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】
前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、前記最後のアミノ酸が配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質のアミノ酸２７３７、アミノ酸２７３８、またはアミノ酸２７５５に対応する位置に存在するように、前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が切断される、請求項１３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１５】
前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が、配列番号８、４２、４３、４５、４６、または４７に記載の配列からなるＣ末端を有する、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１６】
前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、前記最後のアミノ酸が配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質のアミノ酸２７３７に対応する位置に存在するように、前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が切断され、且つ、前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質の前記Ｃ末端が配列番号４３または４６に記載の配列からなる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１７】
前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、前記最後のアミノ酸が配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質のアミノ酸２７３８に対応する位置に存在するように、前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が切断され、且つ、前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質の前記Ｃ末端が配列番号８または４５に記載の配列からなる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１８】
前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、前記最後のアミノ酸が配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質のアミノ酸２７５５に対応する位置に存在するように、前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が切断され、且つ、前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質の前記Ｃ末端が配列番号４２または４７に記載の配列からなる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１９】
前記変異が、最後から２番目のエクソンに存在する、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２０】
前記変異した最後から２番目のエクソンが配列番号２６、２７、または２８と最適にアラインされる時、前記Ｆｂｎ１遺伝子の前記変異した最後から２番目のエクソンが、配列番号２５に記載の野生型マウスＦｂｎ１の最後から２番目のエクソン配列に対して、配列番号２６、２７、または２８における変異に対応する変異を含む、請求項１９に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２１】
前記Ｆｂｎ１遺伝子の全部または一部が、欠失しており、且つオーソログヒトＦＢＮ１遺伝子配列と置換されている、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２２】
前記変異が、オーソログヒトＦＢＮ１遺伝子配列に位置する、請求項２１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２３】
前記オーソログヒトＦＢＮ１遺伝子配列が、内因性非ヒト哺乳動物Ｆｂｎ１遺伝子座に位置する、請求項２１または２２に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２４】
前記変異したＦｂｎ１遺伝子によりコードされた前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が、配列番号３１、３２、または３３に記載の配列からなる、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２５】
前記非ヒト哺乳動物が、齧歯動物である、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２６】
前記齧歯動物が、ラットまたはマウスである、請求項２５に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２７】
前記齧歯動物が、マウスである、請求項２６に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２８】
前記変異が、−１フレームシフトを引き起こして、エクソン６４の３’末端またはエクソン６５の５’末端に早期終止コドンをもたらす、前記内因性マウスＦｂｎ１遺伝子のエクソン６４における挿入または欠失を含む、請求項２７に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項２９】
前記変異が、−１フレームシフトを引き起こして、エクソン６５の５’末端に早期終止コドンをもたらす、エクソン６４における挿入を含む、請求項２８に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３０】
前記変異を含む前記Ｆｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時、前記挿入が配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８１７９位に対応する位置及び８１８０位に対応する位置の間に存在し、及び／または前記変異を含む前記Ｆｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時、前記早期終止コドンが配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８２４１位に対応する位置に存在する、請求項２９に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３１】
前記変異が、−１フレームシフトを引き起こして、エクソン６４の３’末端に早期終止コドンをもたらす、エクソン６４における挿入または欠失を含む、請求項２８に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３２】
前記変異を含む前記Ｆｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時、前記変異が配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８２０９位に対応する位置及び８２１０位に対応する位置の間に挿入を含み、及び／または前記変異を含む前記Ｆｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時、前記早期終止コドンが配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８２１４位に対応する位置に存在する、請求項３１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３３】
前記変異を含む前記Ｆｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時、前記変異が配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８１６１位に対応する位置で開始する欠失を含み、及び／または前記変異を含む前記Ｆｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時、前記早期終止コドンが配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列中の８２１４位に対応する位置に存在する、請求項３１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３４】
前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質が、正荷電Ｃ末端を有する、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３５】
症状が、以下の：体重の減少、除脂肪量の減少、体脂肪量の減少、体重で正規化された白色脂肪組織の減少、体重で正規化された褐色脂肪組織の保存を伴う白色脂肪組織の減少、体脂肪率の減少、体重で正規化された摂食量の増加、及び後弯の増加、のうちの１つ以上を含む、先行請求項のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３６】
前記非ヒト哺乳動物が、以下の：代謝率の増加、インスリン感受性の改善、正常な耐糖能、正常な血清中コレステロールレベル、正常な血清中トリグリセリドレベル、及び正常な血清中非エステル化脂肪酸レベル、のうちの１つ以上を有する、請求項３４に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３７】
前記症状が、体重で正規化された白色脂肪組織の減少、ならびに、インスリン感受性の改善、正常な耐糖能、正常な血清中コレステロールレベル、正常な血清中トリグリセリドレベル、及び正常な血清中非エステル化脂肪酸レベルのうちの少なくとも１つを含む、請求項３５に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３８】
前記症状が、体重で正規化された白色脂肪組織の減少及びインスリン感受性の改善を含む、請求項３６に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物を作製する方法であって、
（ａ）１細胞期胚ではない非ヒト哺乳動物多能性細胞のゲノムを、
（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質、及び
（ｉｉ）前記Ｆｂｎ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする第１のガイドＲＮＡ、と接触させること、を含み、前記Ｆｂｎ１遺伝子が、前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質をもたらす前記変異を含むように改変され、
さらに、前記方法が、（ｂ）前記改変非ヒト哺乳動物多能性細胞を、宿主胚に導入すること、及び
（ｃ）前記宿主胚を代理母に移植して、前記Ｆｂｎ１遺伝子が前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質をもたらす前記変異を含むように改変される遺伝子改変Ｆ０世代非ヒト哺乳動物を産生すること、を含み、前記変異が、前記Ｆ０世代非ヒト哺乳動物の先天性リポジストロフィー様症状を生じる、前記方法。
【請求項４０】
前記多能性細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト哺乳動物の１細胞期胚の前記ゲノムを、
（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質、及び
（ｉｉ）前記Ｆｂｎ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする第１のガイドＲＮＡ、と接触させること、を含み、前記Ｆｂｎ１遺伝子が、前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質をもたらす前記変異を含むように改変され；
さらに、方法が、（ｂ）前記改変非ヒト哺乳動物１細胞期胚を代理母に移植して、前記Ｆｂｎ１遺伝子が前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質をもたらす前記変異を含むように改変される遺伝子改変Ｆ０世代非ヒト哺乳動物を産生すること、を含み、前記変異が、前記Ｆ０世代非ヒト哺乳動物の先天性リポジストロフィー様症状を生じる、前記方法。
【請求項４２】
ステップ（ａ）が、前記Ｆｂｎ１遺伝子の前記標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする第２のガイドＲＮＡと、前記非ヒト哺乳動物多能性細胞または前記非ヒト１細胞期胚の前記ゲノムを接触させることをさらに含む、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が、ステップ（ａ）の後に、且つステップ（ｂ）の前に、改変非ヒト哺乳動物多能性細胞または改変非ヒト哺乳動物１細胞期胚を選択することをさらに含み、前記改変非ヒト哺乳動物多能性細胞または改変非ヒト１細胞期胚が、前記Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質をもたらす前記変異についてヘテロ接合型である、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記接触ステップ（ａ）が、前記標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイゼーションする５’ホモロジーアーム及び前記標的ゲノム遺伝子座で３’標的配列にハイブリダイゼーションする３’ホモロジーアームを含む外因性修復テンプレートと、前記ゲノムを接触させることをさらに含む、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記外因性修復テンプレートが、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームに隣接する核酸インサートをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸インサートが、前記標的ゲノム遺伝子座に相同またはオーソロガスである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記外因性修復テンプレートが、長さが約５０ヌクレオチド〜約１ｋｂである、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記外因性修復テンプレートが、長さが約８０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記外因性修復テンプレートが、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
先天性リポジストロフィー様症状を改善するための活性について化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１〜３８のいずれか１項に記載の対象非ヒト哺乳動物を、前記化合物と接触させること、及び
（ｂ）前記化合物と接触していない対照非ヒト哺乳動物に対して、前記対象非ヒト哺乳動物の先天性リポジストロフィー様症状の存在を決定すること、を含み、前記対照非ヒト哺乳動物が、前記対象非ヒト哺乳動物と同じＦｂｎ１変異を含み、
先天性リポジストロフィー様症状を改善するための活性が、前記対照非ヒト哺乳動物と比較した、前記対象非ヒト哺乳動物における先天性リポジストロフィー様症状の出現の減少により同定される、前記方法。
【請求項５１】
前記症状が、以下の：体重の減少、除脂肪量の減少、体脂肪量の減少、体重で正規化された白色脂肪組織の減少、体重で正規化された褐色脂肪組織の保存を伴う白色脂肪組織の減少、体脂肪率の減少、体重で正規化された摂食量の増加、及び後弯の増加、のうちの１つ以上を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記症状が、体重で正規化された白色脂肪組織の減少を含む、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１６年７月２９日に出願された米国特許出願第６２／３６８，９２４号の利益を主張するものであり、これは、あらゆる目的のために全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
ＥＦＳ  Ｗｅｂを介してテキストファイルとして提出された配列表への言及
５０００４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔファイルに記載の配列表は、１８４キロバイトであり、２０１７年７月２８日に作成され、本明細書で参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ヒトのフィブリリン−１（ＦＢＮ１）遺伝子において、３０００を超える変異が臨床的に同定されている。これらの変異は、Ｉ型フィブリリン疾患（ｆｉｂｒｉｌｌｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）、マルファン症候群、ＭＡＳＳ症候群、孤発性水晶体偏位症候群、胸部大動脈瘤、Ｗｅｉｌｌ−Ｍａｒｃｈｅｓａｎｉ症候群、幸福顔貌骨異形成症及び先端短肢異形成症、硬皮症候群、ならびに先天性リポジストロフィーを伴う新生児早老症候群（ＮＰＳＣＬ）を含む様々な状態と関連している。現在利用可能な、ＦＢＮ１変異を有するように操作されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＮＰＳＣＬの症状を適切に反映していない。
【発明の概要】
【０００４】
先天性リポジストロフィーを伴う新生児早老症候群をモデル化するための方法及び組成物が提供される。一態様では、本発明は、ゲノムが変異を含むフィブリリン−１（Ｆｂｎ１）遺伝子を含む非ヒト哺乳動物を提供し、遺伝子の発現は、非ヒト哺乳動物に新生児早老症候群の１つ以上の先天性リポジストロフィー様症状を発症させるＣ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質をもたらす。任意に、非ヒト哺乳動物は、変異についてヘテロ接合型である。任意に、Ｆｂｎ１遺伝子は、非ヒト哺乳動物に対して内因性であるＦｂｎ１プロモーターを含む。任意に、変異は、フレームシフト変異である。
【０００５】
一部の非ヒト哺乳動物では、変異は、早期終止コドンをもたらす。任意に、早期終止コドンは、Ｆｂｎ１遺伝子の最後から２番目のエクソンまたは最終エクソンに存在する。任意に、早期終止コドンは、最終エクソンに存在するか、またはＦｂｎ１遺伝子の最後のエクソン−エクソン接合部の約５５塩基対未満上流に存在する。任意に、早期終止コドンは、Ｆｂｎ１遺伝子の最後のエクソン−エクソン接合部の約５５塩基対未満上流に存在する。任意に、早期終止コドンは、最終エクソンに存在するか、またはＦｂｎ１遺伝子の最後のエクソン−エクソン接合部の約２０塩基対未満上流に存在する。任意に、変異は、最後から２番目のエクソンがスキップされるようになるスプライス部位変異である。任意に、変異は、最後のコードエクソンに早期終止コドンをもたらす。
【０００６】
一部の非ヒト哺乳動物では、変異は、フリンファミリーのプロタンパク質転換酵素に対する塩基性アミノ酸認識配列を破壊する。一部の非ヒト哺乳動物では、変異は、プロフィブリリン−１のアスプロシンＣ末端切断産物の除去をもたらす。一部の非ヒト哺乳動物では、変異は、プロフィブリリン−１のアスプロシンＣ末端切断産物の破壊をもたらす。一部の非ヒト哺乳動物では、早期終止コドンは、正荷電Ｃ末端を有するコードタンパク質をもたらす。
【０００７】
一部の非ヒト哺乳動物では、コードタンパク質（すなわち、Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質）は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質のアミノ酸２７００〜２７９０、アミノ酸２７１０〜２７８０、アミノ酸２７２０〜２７７０、アミノ酸２７３０〜２７６０、またはアミノ酸２７３７〜２７５５の位置に対応する位置で切断される。任意に、コードタンパク質は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、最後のアミノ酸が配列番号３０のアミノ酸２７３７、アミノ酸２７３８、またはアミノ酸２７５５に対応する位置に存在するように切断される。
【０００８】
一部の非ヒト哺乳動物では、コードタンパク質（すなわち、Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質）は、配列番号８、４２、または４３に記載の配列からなるＣ末端を有する。一部の非ヒト哺乳動物では、コードタンパク質は、配列番号８、４２、４３、４５、４６、または４７に記載の配列からなるＣ末端を有する。任意に、コードタンパク質は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、最後のアミノ酸が配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質のアミノ酸２７３７に対応する位置に存在するように切断され、コードタンパク質のＣ末端は、配列番号４３に記載の配列からなる。任意に、コードタンパク質は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、最後のアミノ酸が配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質のアミノ酸２７３７に対応する位置に存在するように切断され、コードタンパク質のＣ末端は、配列番号４３または４６に記載の配列からなる。任意に、コードタンパク質は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、最後のアミノ酸が配列番号３０のアミノ酸２７３８に対応する位置に存在するように切断され、コードタンパク質のＣ末端は、配列番号８に記載の配列からなる。任意に、コードタンパク質は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、最後のアミノ酸が配列番号３０のアミノ酸２７３８に対応する位置に存在するように切断され、コードタンパク質のＣ末端は、配列番号８または４５に記載の配列からなる。任意に、コードタンパク質は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、最後のアミノ酸が配列番号３０のアミノ酸２７５５に対応する位置に存在するように切断され、コードタンパク質のＣ末端は、配列番号４２に記載の配列からなる。任意に、コードタンパク質は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、最後のアミノ酸が配列番号３０のアミノ酸２７５５に対応する位置に存在するように切断され、コードタンパク質のＣ末端は、配列番号４２または４７に記載の配列からなる。
【０００９】
一部の非ヒト哺乳動物では、Ｆｂｎ１遺伝子は、最後から２番目のエクソンに変異を含む。任意に、Ｆｂｎ１遺伝子の最後から２番目のエクソンは、最後から２番目のエクソンが配列番号２６、２７、または２８と最適にアラインされる時、配列番号２５に記載の野生型マウスＦｂｎ１の最後から２番目のエクソン配列に対して、配列番号２６、２７、または２８における変異に相当する変異を含む。
【００１０】
一部の非ヒト哺乳動物では、Ｆｂｎ１遺伝子の全部または一部を欠失させており、オーソログヒトＦＢＮ１遺伝子配列と置換している。任意に、コードタンパク質のＣ末端切断をもたらす変異は、オーソログヒトＦＢＮ１遺伝子配列に位置する。任意に、オーソログヒトＦＢＮ１遺伝子配列は、内因性非ヒト哺乳動物Ｆｂｎ１遺伝子座に位置する。
【００１１】
一部の非ヒト哺乳動物では、変異Ｆｂｎ１遺伝子によりコードされたタンパク質は、配列番号３１、３２、または３３に記載の配列からなる。
【００１２】
一部の非ヒト哺乳動物では、哺乳動物は、齧歯動物である。任意に、齧歯動物は、ラットまたはマウスである。
【００１３】
一部の非ヒト哺乳動物では、哺乳動物は、マウスである。一部の非ヒト哺乳動物またはマウスでは、変異は、−１フレームシフトを引き起こして、エクソン６４の３’末端またはエクソン６５の５’末端に早期終止コドンをもたらす、内因性マウスＦｂｎ１遺伝子のエクソン６４における挿入または欠失を含む。任意に、変異は、−１フレームシフトを引き起こして、エクソン６５の５’末端に早期終止コドンをもたらす、エクソン６４における挿入を含む。任意に、挿入は、変異を含むＦｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時、配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８１７９位に対応する位置及び８１８０位に対応する位置の間に存在し、及び／または早期終止コドンは、変異を含むＦｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時、配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８２４１位に対応する位置に存在する。任意に、変異は、−１フレームシフトを引き起こして、エクソン６４の３’末端に早期終止コドンをもたらす、エクソン６４における挿入または欠失を含む。任意に、変異は、変異を含むＦｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時、配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８２０９位に対応する位置及び８２１０位に対応する位置の間に挿入を含み、及び／または早期終止コドンは、変異を含むＦｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時、配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８２１４位に対応する位置に存在する。任意に、変異は、変異を含むＦｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時、配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８１６１位に対応する位置で開始する挿入を含み、及び／または早期終止コドンは、変異を含むＦｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時、配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８２１４位に対応する位置に存在する。任意に、Ｃ末端切断型Ｆｂｎ１タンパク質は、正荷電Ｃ末端を有する。
【００１４】
一部の非ヒト哺乳動物では、症状は、以下の：体重の減少、除脂肪体重の減少、体脂肪量の減少、体脂肪率の減少、体重で正規化された摂食量の増加、及び後弯の増加、のうちの１つ以上を含む。一部の非ヒト哺乳動物では、症状は、以下の：体重の減少、除脂肪量の減少、体脂肪量の減少、体重で正規化された白色脂肪組織の減少、体重で正規化された褐色脂肪組織の保存を伴う白色脂肪組織の減少、体脂肪率の減少、体重で正規化された摂食量の増加、及び後弯の増加、のうちの１つ以上を含む。任意に、非ヒト哺乳動物は、以下の：正常な耐糖能、正常な血清中コレステロールレベル、正常な血清中トリグリセリドレベル、及び正常な血清中非エステル化脂肪酸レベル、のうちの１つ以上を有する。任意に、非ヒト哺乳動物は、以下の：代謝率の増加、インスリン感受性の改善、正常な耐糖能、正常な血清中コレステロールレベル、正常な血清中トリグリセリドレベル、及び正常な血清中非エステル化脂肪酸レベル、のうちの１つ以上を有する。任意に、症状は、体脂肪量の減少及び体脂肪率の減少のうちの少なくとも１つ、ならびに正常な耐糖能、正常な血清中コレステロールレベル、正常な血清中トリグリセリドレベル、及び正常な血清中非エステル化脂肪酸レベルのうちの少なくとも１つを含む。任意に、症状は、体脂肪量の減少、体脂肪率の減少、正常な耐糖能、正常な血清中コレステロールレベル、正常な血清中トリグリセリドレベル、及び正常な血清中非エステル化脂肪酸レベルを含む。任意に、症状は、体重で正規化された白色脂肪組織の減少、ならびに、インスリン感受性の改善、正常な耐糖能、正常な血清中コレステロールレベル、正常な血清中トリグリセリドレベル、及び正常な血清中非エステル化脂肪酸レベルのうちの少なくとも１つを含む。任意に、症状は、体重で正規化された白色脂肪組織の減少及びインスリン感受性の改善を含む。
【００１５】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の非ヒト哺乳動物のいずれかを作製する方法を提供し、方法は、（ａ）１細胞期胚ではない非ヒト哺乳動物多能性細胞のゲノムを、（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質、及び、（ｉｉ）Ｆｂｎ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする第１のガイドＲＮＡ、と接触させること、を含み、Ｆｂｎ１遺伝子は、コードタンパク質のＣ末端切断をもたらす変異を含むように改変され；さらに、方法が、（ｂ）改変非ヒト哺乳動物多能性細胞を、宿主胚に導入すること、及び（ｃ）宿主胚を代理母に移植して、Ｆｂｎ１遺伝子がコードタンパク質のＣ末端切断をもたらす変異を含むように改変される遺伝子改変Ｆ０世代非ヒト哺乳動物を産生すること、を含み、変異は、Ｆ０世代非ヒト哺乳動物の先天性リポジストロフィー様症状を生じる。任意に、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【００１６】
一部の方法では、ステップ（ａ）は、非ヒト哺乳動物多能性細胞のゲノムを、Ｆｂｎ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする第２のガイドＲＮＡと接触させることをさらに含む。一部の方法では、方法は、ステップ（ａ）の後に、且つステップ（ｂ）の前に、改変非ヒト哺乳動物多能性細胞を選択することをさらに含み、改変非ヒト哺乳動物多能性細胞は、コードタンパク質のＣ末端切断をもたらす変異についてヘテロ接合型である。
【００１７】
一部の方法では、接触ステップ（ａ）は、標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイゼーションする５’ホモロジーアーム及び標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイゼーションする３’ホモロジーアームを含む外因性修復テンプレートと、ゲノムを接触させることをさらに含む。任意に、外因性修復テンプレートは、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームに隣接する核酸インサートをさらに含む。任意に、核酸インサートは、前記標的ゲノム遺伝子座に相同またはオーソロガスである。任意に、外因性修復テンプレートは、長さが約５０ヌクレオチド〜約１ｋｂである。任意に、外因性修復テンプレートは、長さが約８０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドである。任意に、外因性修復テンプレートは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。
【００１８】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の非ヒト哺乳動物のいずれかを作製する方法を提供し、方法は、（ａ）非ヒト哺乳動物の１細胞期胚のゲノムを、（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質、及び、（ｉｉ）Ｆｂｎ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする第１のガイドＲＮＡ、と接触させること、を含み、Ｆｂｎ１遺伝子は、コードタンパク質のＣ末端切断をもたらす変異を含むように改変され；さらに、方法は、（ｂ）改変非ヒト哺乳動物の１細胞期胚を代理母に移植して、Ｆｂｎ１遺伝子がコードタンパク質のＣ末端切断をもたらす変異を含むように改変される遺伝子改変Ｆ０世代非ヒト哺乳動物を産生すること、を含み、変異は、Ｆ０世代非ヒト哺乳動物の先天性リポジストロフィー様症状を生じる。
【００１９】
一部の方法では、ステップ（ａ）は、Ｆｂｎ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする第２のガイドＲＮＡと、非ヒト１細胞期胚のゲノムを接触させることをさらに含む。一部の方法では、方法は、ステップ（ａ）の後に、且つステップ（ｂ）の前に、改変非ヒト哺乳動物１細胞期胚を選択することをさらに含み、改変非ヒト１細胞期胚は、コードタンパク質のＣ末端切断をもたらす変異についてヘテロ接合型である。
【００２０】
一部の方法では、接触ステップ（ａ）は、標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイゼーションする５’ホモロジーアーム及び標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイゼーションする３’ホモロジーアームを含む外因性修復テンプレートと、ゲノムを接触させることをさらに含む。任意に、外因性修復テンプレートは、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームに隣接する核酸インサートをさらに含む。任意に、核酸インサートは、前記標的ゲノム遺伝子座に相同またはオーソロガスである。任意に、外因性修復テンプレートは、長さが約５０ヌクレオチド〜約１ｋｂである。任意に、外因性修復テンプレートは、長さが約８０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドである。任意に、外因性修復テンプレートは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。
【００２１】
別の態様では、本発明は、先天性リポジストロフィー様症状を改善するための活性について化合物をスクリーニングする方法を提供し、方法は、（ａ）上記の対象非ヒト哺乳動物を、化合物と接触させること；及び（ｂ）化合物と接触していない対照非ヒト哺乳動物に対して、対象非ヒト哺乳動物の先天性リポジストロフィー様症状の存在を決定すること、を含み、対照非ヒト哺乳動物は、対象非ヒト哺乳動物と同じＦｂｎ１変異を含み、先天性リポジストロフィー様症状を改善するための活性が、対照非ヒト哺乳動物と比較した、対象非ヒト哺乳動物における先天性リポジストロフィー様症状の出現の減少により同定される。
【００２２】
一部の方法では、症状は、以下の：体重の減少、除脂肪量の減少、体脂肪量の減少、体脂肪率の減少、体重で正規化された摂食量の増加、及び後弯の増加、のうちの１つ以上を含む。任意に、症状は、体脂肪量の減少及び体脂肪率の減少のうちの少なくとも１つを含む。任意に、症状は、体脂肪量の減少及び体脂肪率の減少を含む。一部の方法では、症状は、以下の：体重の減少、除脂肪量の減少、体脂肪量の減少、体重で正規化された白色脂肪組織の減少、体重で正規化された褐色脂肪組織の保存を伴う白色脂肪組織の減少、体脂肪率の減少、体重で正規化された摂食量の増加、及び後弯の増加、のうちの１つ以上を含む。任意に、症状は、体重で正規化された白色脂肪組織の減少を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】野生型ヒトＦＢＮ１遺伝子の最後から２番目のエクソンの領域のヌクレオチド配列（及びコードされたアミノ酸配列）、ならびに、先天性リポジストロフィーを伴う新生児早老症候群と関連する変異型ヒトＦＢＮ１遺伝子多様体、野生型マウスＦｂｎ１遺伝子、及び操作されたマウスＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５０１の対応する領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。「Ｒ」及び「Ｓ」の間のアミノ酸配列におけるフォワードスラッシュは、フリン切断部位を示す。
【図２】操作されたマウスＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５０１について、ヘテロ接合型またはホモ接合型の雄及び雌のＦ０ファウンダーマウスの生存率を示す。
【図３】野生型ヒトＦＢＮ１遺伝子の最後から２番目のエクソンの領域のヌクレオチド配列（及びコードされたアミノ酸配列）、ならびに、先天性リポジストロフィーを伴う新生児早老症候群と関連する変異型ヒトＦＢＮ１遺伝子多様体、野生型マウスＦｂｎ１遺伝子、及び操作されたマウスＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５０２の対応する領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。図３は、予想されるＭＡＩＤ８５０２多様体及び生成されたＭＡＩＤ８５２０多様体に対するマウスＦｂｎ１遺伝子の最後から２番目のエクソン中の領域のコードされたアミノ酸配列を示す。「Ｒ」及び「Ｓ」の間のアミノ酸配列におけるフォワードスラッシュは、フリン切断部位を示す。
【図４】操作されたマウスＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０についてヘテロ接合型の雄野生型マウス及びＦ１世代マウスに対する、体重で正規化された週毎の摂餌量を示す。
【図５】操作されたマウスＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０についてヘテロ接合型の３ヶ月齢の雄のＦ１雄野生型マウス及び３ヶ月齢のＦ１雄マウスを示す。
【図６】野生型雄マウス、野生型雌マウス、ならびに、改変マウスＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０についてヘテロ接合型の雄及び雌マウスを含む、年齢別のＦ１マウスの体重を示す。
【図７】脊柱後弯のｕＣＴ画像を示す野生型雌マウス（図７Ａ及び７Ｂ）ならびにＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウス（図７Ｃ〜７Ｅ）の骨格を示す。
【図８】体重及び体脂肪量に関するアッセイを示す。図８Ａは、２１％の脂肪改良食餌または６０％の高脂肪食餌のいずれかを摂取中の野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの体重を示す。図８Ｂは、ＥＣＨＯＭＲＩ（商標）で測定される場合の２１％の脂肪改良食餌または６０％の高脂肪食餌のいずれかを摂取中の野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの体脂肪量（体脂肪量のグラム及び体脂肪量の百分率）を示す。図８Ｃは、ＥＣＨＯＭＲＩ（商標）で測定される場合の２１％の脂肪改良食餌または６０％の高脂肪食餌のいずれかにおける、野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの除脂肪量（除脂肪量のグラム及び除脂肪量の百分率）を示す。全てのマウスは３１週齢であった。スキャン時のマウスは、２２週間の６０％の高脂肪食餌を摂取中であった。アスタリスクは、独立ｔ検定によりｐ＜０．０００１を示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、雄マウスにおける血糖恒常性に関連するアッセイを示す。図９Ａは、固形食餌を摂取中の雄野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの体重を示す。図９Ｂは、固形食餌を摂取中の雄野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの一晩の空腹時血糖を示す。図９Ｃは、固形食餌を摂取中の雄野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの経口耐糖能を示す。図９Ｄ〜９Ｆは雌マウスの血糖恒常性に関するアッセイを示す。図９Ｄは、固形食餌を摂取中の雌野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの体重を示す。図９Ｅは、固形食餌を摂取中の雌野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの一晩の空腹時血糖を示す。図９Ｆは、固形食餌を摂取中の雌野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの経口耐糖能を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、雄マウスの循環脂質に関するアッセイを示す。図１０Ａは、固形食餌を摂取中の雄野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの血清中コレステロールレベルを示す。図１０Ｂは、固形食餌を摂取中の雄野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスのトリグリセリドレベルを示す。図１０Ｃは、固形食餌を摂取中の雄野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ−Ｃ）レベルを示す。図１０Ｄ〜１０Ｆは、雌マウスの循環脂質に関するアッセイを示す。図１０Ｄは、固形食餌を摂取中の雌野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの血清中コレステロールレベルを示す。図１０Ｅは、固形食餌を摂取中の雌野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスのトリグリセリドレベルを示す。図１０Ｆは、固形食餌を摂取中の雌野生型マウス及びＦｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ−Ｃ）レベルを示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｇは、体重に対する終末期の肝臓及び脂肪パッドの重量を示す。図１１Ａは、固形食餌を摂取中の３４週齢の雌Ｆｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスの体重を示す。図１１Ｂ〜１１Ｄは、各群の生肝臓重量、褐色脂肪組織重量（ＢＡＴ）、及び内臓白色脂肪組織重量（ＷＡＴ）を示す。図１１Ｅ〜１１Ｇは、体重に対する終末期の肝臓及び脂肪パッドの重量を、体重の割合として示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｈは、６０％の高脂肪食餌を１２週間摂取中の雌Ｆｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスのＣｏｌｕｍｂｉａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＯｘｙｍａｘのＣＬＡＭＳシステムからの代謝ケージデータを示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄは、６０％の高脂肪食餌を２０週間摂取中の雌性Ｆｂｎ１遺伝子多様性ＭＡＩＤ８５２０ヘテロ接合型マウスのインスリン抵抗性試験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本明細書で互換的に使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、コードされたアミノ酸及びコードされていないアミノ酸、ならびに化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸を含む任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を含む。この用語は、改変ペプチド骨格を有するポリペプチドなどの、改変されているポリマーも含む。
【００２５】
タンパク質は、「Ｎ末端」及び「Ｃ末端」を有すると言われている。「Ｎ末端」という用語は、遊離アミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸で終端されたタンパク質またはポリペプチドの開始に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で終端されたアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端に関する。
【００２６】
本明細書で互換的に使用される「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらのアナログもしくは改変バージョンを含む、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを含む。それらは、一本鎖、二本鎖、及び多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、及びプリン塩基、ピリミジン塩、または他の天然の、化学的に改変された、生化学的に改変された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。
【００２７】
１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩がホスホジエステル結合を介して一方向に隣接する３’酸素に結合するようなオリゴヌクレオチドを生成するように、モノヌクレオチドが反応するので、核酸は、「５’末端」及び「３’末端」を有すると言われている。オリゴヌクレオチドの末端は、５’リン酸塩がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩に連結されていない場合、「３’末端」と呼ばれる。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部に存在するとしても、５’及び３’末端を有するとも言われ得る。線状または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、別個の要素は、「上流」または「下流」の５’または３’要素であると呼ばれる。
【００２８】
「野生型」という用語は、（変異型、病変した、改変した等とは対照的に）正常な状態または文脈に見られるような構造及び／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子及びポリペプチドは多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
【００２９】
タンパク質及び核酸に関する「単離された」という用語は、タンパク質及びポリヌクレオチドの実質的に純粋調製物以下の、ｉｎ  ｓｉｔｕで通常存在し得る他の細菌、ウイルス、または細胞構成要素に関して比較的精製されているタンパク質及び核酸を含む。「単離された」という用語は、天然に存在する対応物を含まないか、化学的に合成され、それにより他のタンパク質もしくは核酸でほぼ汚染されていないか、またはそれらに自然に付随するほとんどの他の細胞構成要素（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、または細胞構成要素）から分離もしくは精製されているタンパク質及び核酸も含む。
【００３０】
「外因性」分子または配列は、その形態では細胞内に通常存在しない分子または配列を含む。通常の存在は、細胞の特定の発生段階及び環境条件に関する存在を含む。外因性分子または配列は、例えば、ヒト化バージョンの内因性配列などの、変異バージョンの細胞内の対応する内因性配列を含み得るか、または細胞内であるが異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列を含み得る。対照的に、内因性分子または配列は、特定の環境条件下、特定発生段階の特定の細胞にその形態で通常存在する分子または配列を含む。
【００３１】
「コドン最適化」は一般に、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置換することにより、特定の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在する核酸配列と比較した場合、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または任意の他の宿主細胞を含む、所与の原核生物細胞または真核生物細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変することができる。コドン使用表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能である。これらの表は、様々な方法で適用することができる。あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＮａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２９２を参照のこと。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピューターアルゴリズム（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅを参照のこと）もまた利用可能である。
【００３２】
「遺伝子座」という用語は、遺伝子の特定の場所（もしくは有意な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列、または生物のゲノムの染色体上の位置を指す。例えば、「Ｆｂｎ１遺伝子座」は、Ｆｂｎ１遺伝子の特定の場所、Ｆｂｎ１  ＤＮＡ配列、Ｆｂｎ１をコードする配列、またはこのような配列がどこに存在するかに関して同定されている生物のゲノムの染色体上のＦｂｎ１位置を指してもよい。「Ｆｂｎ１遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’及び／または３’ＵＴＲ、またはそれらの組み合わせを含む、Ｆｂｎ１遺伝子の調節エレメントを含んでもよい。
【００３３】
「遺伝子」という用語は、産物（例えば、ＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物）をコードする染色体のＤＮＡ配列を指し、遺伝子が全長ｍＲＮＡ（５’及び３’非翻訳配列を含む）に対応するように、非コードイントロンで遮断されたコード領域ならびに５’及び３’末端の両方のコード領域に隣接して位置する配列を含む。「遺伝子」という用語は、制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位、サイレンサー、インシュレーター配列、及びマトリックス結合領域を含む他の非コード配列も含む。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接する（例えば、１０ｋｂ以内）か、または離れた部位にあってもよく、それらは、遺伝子の転写及び翻訳のレベルまたは速度に影響を与える。
【００３４】
「対立遺伝子」という用語は、多様体形態の遺伝子を指す。一部の遺伝子は、染色体上の同じ位置、または遺伝子座に位置する様々な異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各ペアは、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座における２つの同一の対立遺伝子が存在する場合、ホモ接合型として、２つの対立遺伝子が異なる場合、ヘテロ接合型として記載される。
【００３５】
「プロモーター」は、特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始するように、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを導くことが可能なＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの制御領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示のプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。
【００３６】
「動作可能な結合」または「作動可能に連結されている」は、両方の構成要素が正常に機能し且つ構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つにもたらされる機能を媒介することができるという可能性を許容するように、２つ以上の構成要素（例えば、プロモーター及び別の配列要素）の並置を含む。例えば、プロモーターが１つ以上の転写制御因子の有無に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結することができる。作動可能な連結は、互いに隣接しているか、またはトランスで作用するこのような配列を含み得る（例えば、制御配列は、コード配列の転写を制御するために離れて作用することができる）。
【００３７】
核酸の「相補性」は、核酸の１つの鎖のヌクレオチド配列が、核酸塩基基の方向に起因して、対向する核酸鎖上の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡの相補的塩基は通常、Ｔに対するＡ及びＧに対するＣである。ＲＮＡでは、それらは通常、Ｇに対するＣ及びＡに対するＵである。相補性は、完全または実質的／十分であり得る。２つの核酸間の完全な相補性は、２つの核酸が、二重鎖の全ての塩基がワトソン−クリック対合により相補的塩基に結合する二重鎖を形成し得ることを意味する。「実質的」または「十分な」相補性は、１つの鎖の配列が対向鎖の配列に完全及び／または完全に相補的ではないが、ハイブリダイゼーション条件（例えば塩濃度及び温度）の設定で、十分な結合が２つの鎖の塩基間に生じて、安定なハイブリッド複合体を形成することを意味する。このような条件は、配列及び標準的な数学的計算を使用して、ハイブリダイゼーションされた鎖のＴｍ（融解温度）を予測することにより、または日常的な方法を使用するＴｍの経験的決定により、予測することができる。Ｔｍは、２つの核酸鎖間に形成されたハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性している（すなわち、二本鎖核酸分子の集団が半分一本鎖に解離する）温度を含む。Ｔｍより低い温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成が有利であるが、Ｔｍより高い温度では、ハイブリダイゼーション複合体中の鎖の融解または分離が有利である。Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を使用することにより、１ＭのＮａＣｌ水溶液中の既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸に対して推定され得る。但し、他の既知のＴｍ計算が、核酸構造特性を考慮に入れている。
【００３８】
「ハイブリダイゼーション条件」は、相補鎖相互作用及び水素結合により、１つの核酸鎖が２つ目の核酸鎖に結合して、ハイブリダイゼーション複合体を生成する累積的環境を含む。このような条件は、核酸を含有する水溶液または有機溶液の化学的構成成分及びそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、及び混合物の温度を含む。インキュベーション時間の長さまたは反応チャンバの寸法などの他の要因が、環境に寄与し得る。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．１．９０−１．９１，９．４７−９．５１，１  １．４７−１１．５７（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）を参照のこと。
【００３９】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とする。但し、塩基間のミスマッチが可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに好適な条件は、当該技術分野で周知の変数である、核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対する融解温度（Ｔｍ）の値が大きい。相補性の短いストレッチを有する核酸間のハイブリダイゼーション（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、または１８以下のヌクレオチドにわたって相補性）の場合、ミスマッチの位置が重要となる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上掲、１１．７−１１．８を参照のこと）。通常は、ハイブリダイゼーション可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイゼーション可能な核酸についての例示的な最小長は、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、及び少なくとも約３０ヌクレオチドを含む。さらに、温度及び洗浄液塩濃度は、相補性領域の長さ及び相補性の程度などの要因に従って必要に応じて調整してもよい。
【００４０】
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイゼーション可能であるためにその標的核酸の配列と１００％相補的である必要はない。さらに、ポリヌクレオチドは、介在するまたは隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）に関与しないように、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイゼーションし得る。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的とする標的核酸配列内の標的領域と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、２０ヌクレオチドのうちの１８ヌクレオチドが標的領域に相補的であり、従って、特異的にハイブリダイゼーションするであろうｇＲＮＡは、９０％の相補性を表すであろう。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドとクラスター化または分散していてもよく、互いにまたは相補的ヌクレオチドと隣接している必要はない。
【００４１】
核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間のパーセント相補性は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）を使用するデフォルト設定を使用する、ＢＬＡＳＴプログラム（基本ローカルアライメント検索ツール）及び当該分野で既知のＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）を通常使用して、または、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を使用することにより、決定することができる。
【００４２】
本明細書で提供される方法及び組成物は、様々な異なる構成要素を用いる。本明細書を通して、いくつかの構成成分が活性な多様体及びフラグメントを有することができると認識される。このような構成成分は、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びガイドＲＮＡを含む。これらの構成成分のそれぞれに対する生物学的活性は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【００４３】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインされる場合、同じである２つの配列の残基について言及する。タンパク質に関して配列同一性の百分率が使用される時に、同一ではない残基位置は、アミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、それ故、分子の機能的特性を変更しない場合、保存的アミノ酸置換とは異なることが多いことが理解される。配列が保存的置換において異なる時、パーセント配列同一性を上方に調整して、置換の保存的性質を修正し得る。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われている。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。通常、これは、完全なミスマッチではなく部分的ミスマッチとして保存的置換をスコアリングすることを含み、それにより、配列同一性百分率を増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、且つ非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は０〜１のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー）で実行されるように計算される。
【００４４】
「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウで最適にアラインされた２つの配列を比較することにより決定された値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加または欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、追加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、及び結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることにより計算される。
【００４５】
別途記載のない限り、配列同一性／類似性値は、以下のパラメータ：ＧＡＰ重み５０及び長さ重み３ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列の％同一性及び％類似性；ＧＡＰ重み８及び長さ重み２ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列の％同一性及び％類似性を使用するＧＡＰバージョン１０、またはその同等の任意プログラムを使用して得られる値を含む。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０により生成された対応するアラインメントと比較した時に、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致及び同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。
【００４６】
共有エピトープを指すために本明細書で使用される「実質的な同一性」という用語は、対応する位置に同一の残基を含有する配列を含む。例えば、２つの配列は、対応する残基の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が適切なストレッチの残基にわたって同一である場合、実質的に同一であると考えることができる。適切なストレッチは、例えば、完全な配列とし得るか、または、少なくとも５、１０、１５、もしくはそれ以上の残基とし得る。
【００４７】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換を含む。同様に、保存的置換の例としては、アルギニン及びリシンの間、グルタミン及びアスパラギンの間、またはグリシン及びセリンの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換を含む。さらに、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基の、別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基の、別の酸性残基との置換は、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、もしくはメチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリシンなどの極性（親水性）残基との置換、及び／または、極性残基の非極性残基との置換が挙げられる。代表的なアミノ酸の分類を以下にまとめる。
【表３】
2019523009.tif 000003
【００４８】
「相同な」配列（例えば、核酸配列）は、既知の参照配列と同一または実質的に類似のいずれかである配列を含む。つまり、それは、既知の参照配列と例えば少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。相同な配列は、例えば、オーソログ配列及びパラログの配列を含み得る。相同な遺伝子は、例えば、種分化事象（オルソログの遺伝子）または遺伝子重複事象（パラログの遺伝子）のいずれかを介して、共通の先祖ＤＮＡ配列に通常由来する。「オルソログの」遺伝子は、種分化により共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子を含む。オーソログは通常、進化の間で同じ機能を保持する。「パラログの」遺伝子は、ゲノム内の重複で関連する遺伝子を含む。パラログは、進化の間で新しい機能を進化させ得る。
【００４９】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的環境、及び人工的環境（例えば試験管）内で起こるプロセスまたは反応を含む。「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、自然環境（例えば、細胞または生物または身体）及び自然環境内で起こるプロセスまたは反応を含む。「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、個体の身体から取り出された細胞、及びこのような細胞内で起こるプロセスまたは反応を含む。
【００５０】
１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含んでもよい。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独でまたは他の成分と組み合わせて含有してもよい。
【００５１】
値の範囲の表記は、範囲内のまたは範囲を規定する全ての整数、及び範囲内の整数により規定された全ての部分範囲を含む。
【００５２】
文脈から別途明らかでない限り、「約」という用語は、記載された値の測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
【００５３】
単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の言及を含む。例えば、「１つのＣａｓ９タンパク質」または「少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質」という用語は、それらの混合物を含む複数のＣａｓ９タンパク質を含み得る。
【００５４】
統計的に有意は、ｐ≦０．０５を意味する。
【００５５】
（発明を実施するための形態）
Ｉ．概要
本発明は、先天性リポジストロフィーを伴う新生児早老症候群（ＮＰＳＣＬ）をモデル化するための、Ｆｂｎ１遺伝子における変異を含む非ヒト動物を提供する。このような非ヒト動物モデルを作製する方法もまた提供される。非ヒト動物モデルは、ＮＰＳＣＬの抑制もしくは低減またはＮＰＳＣＬ様症状の改善における活性について化合物をスクリーニングすることに、あるいは、ＮＰＳＣＬの促進もしくは悪化において潜在に有害な活性について化合物をスクリーニングすることに、ならびにＮＰＳＣＬの機序ならびに潜在的に新しい治療及び診断標的についての洞察を提供するために、使用することができる。
【００５６】
ＩＩ．先天性リポジストロフィーを伴う新生児早老症候群の非ヒト動物モデル
Ｆｂｎ１遺伝子に変異を含む非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどの非ヒト哺乳動物）が本明細書に提供される。このような非ヒト動物は、先天性リポジストロフィーを伴う新生児早老症候群（ＮＰＳＣＬ）をモデル化し、ＮＰＳＣＬ様症状（例えば、先天性リポジストロフィー様症状）を示す。
【００５７】
Ａ．先天性リポジストロフィーを伴う新生児早老症候群（ＮＰＳＣＬ）。
新生児早老症候群（ＮＰＳ）は、主に顔及び四肢に影響を及ぼす先天性の部分的リポジストロフィーを特徴とする。あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＯ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎ．Ａ．１４３Ａ：１４２１−１４３０。先天性リポジストロフィーを伴う新生児早老症候群（ＮＰＳＣＬ）、マルファン様−早老症候群、またはマルファン様−早老症−リポジストロフィー（ＭＰＬ）症候群とも呼ばれる。それは、主に顔及び四肢に影響を及ぼす皮下脂肪組織の低減による先天性の極端な薄さを特徴とする。Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｏｎａｔｏｌｏｇｙ  ５０：１０２−１０９及びＯ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎ．Ａ．１４３Ａ：１４２１−１４３０（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。表現型は通常、出生時及び出生前でさえも、皮下脂肪の不足に起因する薄い皮膚及び目立った脈管構造を伴う子宮内発育遅延として明らかである。Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）。患者は、全ての年齢で、肥満度指数（ＢＭＩ）で、年齢に対して標準以下のいくつかの標準偏差を示す。Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）。ＮＰＳ患者は、顔面形成異常の特徴及び皮下脂肪の低減に起因して早老症のように見えるが、白内障、毛髪の早期白髪化、またはインスリン抵抗性などの真の早老症の通常の特徴を有さない。Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）。患者は正常な空腹時血漿中グルコース及びインスリンレベルを有し得、それらは、正常なインスリン感受性及びグルコース処理を有することを示唆する。Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）。
【００５８】
ＮＰＳＣＬ患者の主要な特徴としては、（１）先天性リポジストロフィー、（２）体重増加と不均衡な直線的発育の促進を伴う早産、及び（３）明確な顔の特徴を伴う早老症の外観、が挙げられる。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＴａｋｅｎｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ｐａｒｔ  Ａ  １６１Ａ：３０５７−３０６２を参照のこと。Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．は、以下の：子宮内発育遅延及び／または早産、老年の顔の外観及び出生時の減少した皮下脂肪、ならびに進行性マルファン様特徴、を含むマルファン様−早老症表現型を報告している。大動脈の付け根の拡張、異所性水晶体及び硬膜拡張症は、時間の経過と共に現れ得る。発達のマイルストーン及び知性は、正常であるように見える。あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＪａｃｑｕｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．５７（５）：２０３−２３４。
【００５９】
ヒトＮＰＳＣＬ患者で観察される表現型は、多くのリポジストロフィー症候群とは異なり、内臓脂肪組織がないにもかかわらず血糖恒常性及び循環脂質に関して正常な代謝プロファイルである。ヒトＮＰＳＣＬ患者は、白色脂肪組織の喪失にもかかわらず、正常な血糖恒常性を有する。
【００６０】
本明細書に開示の非ヒト動物モデルは、ＮＰＳＣＬ様症状（例えば、先天性リポジストロフィー様症状）を示す。このような症状は、例えば、以下の：体重の減少、除脂肪量の減少、体脂肪量の減少、（例えば、体重で正規化された）白色脂肪組織の減少、（例えば、体重で正規化された）褐色脂肪組織の保存を伴う白色脂肪組織の減少、体脂肪率の減少、体重で正規化された摂食量の増加、及び後弯の増加、のうちの１つ以上を含み得る。このような症状は、例えば、以下の：体重の減少、除脂肪量の減少、体脂肪量の減少、体脂肪率の減少、体重で正規化された摂食量の増加、及び後弯の増加、のうちの１つ以上を含み得る。このような症状は、以下の：代謝率の増加、インスリン感受性の改善、正常な耐糖能、正常な血清中コレステロールレベル、正常な血清中トリグリセリドレベル、及び正常な血清中非エステル化脂肪酸レベル、のうちの１つ以上と共に存在し得る。あるいは、このような症状は、以下の：正常な耐糖能、正常な血清中コレステロールレベル、正常な血清中トリグリセリドレベル、及び正常な血清中非エステル化脂肪酸レベル、のうちの１つ以上と共に存在し得る。例えば、症状は、体脂肪量の減少及び体脂肪率の減少のうちの少なくとも１つ、ならびに正常な耐糖能、正常な血清中コレステロールレベル、正常な血清中トリグリセリドレベル、及び正常な血清中非エステル化脂肪酸レベルのうちの少なくとも１つを含み得る。あるいは、症状は、体脂肪量の減少、体脂肪率の減少、正常な耐糖能、正常な血清中コレステロールレベル、正常な血清中トリグリセリドレベル、及び正常な血清中非エステル化脂肪酸レベルを含み得る。可能な他の表現型は、肝臓重量の減少、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）重量の減少、内臓白色脂肪組織（ＷＡＴ）重量の減少、体重で正規化されたＷＡＴ重量の減少、体重で正規化された代謝率の上昇、エネルギー消費の増加、耐糖能の改善、及び高脂肪食餌を摂食中のインスリン感受性の改善のうちの１つ以上を含む。例えば、症状は、代謝率の改善、インスリン感受性の改善、正常な耐糖能、正常な血清中コレステロールレベル、正常な血清中トリグリセリドレベル、及び正常な血清中非エステル化脂肪酸レベルのうちの少なくとも１つと共に、体重で正規化された白色脂肪組織の減少（例えば、褐色脂肪組織の保存を伴う）を含み得る。例えば、症状は、インスリン感受性の改善と共に、体重で正規化された白色脂肪組織の減少（例えば、褐色脂肪組織の保存を伴う）を含み得る。
【００６１】
減少または増加は、統計的に有意であり得る。例えば、減少または増加は、対照野生型非ヒト動物と比較して少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％であり得る。
【００６２】
Ｂ．Ｆｂｎ１変異
ＮＰＳＣＬは、ヒトのＦＢＮ１遺伝子の変異と関連している。例えば、Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ｐａｒｔ  Ａ  １６１Ａ：３０５７−３０６２；Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ．１５２Ａ（１１）：２７４９−２７５５；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ  １５５Ａ（４）：７１７−７２０；Ｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（２０１１）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ．１５５Ａ（４）；７２１−７２４；Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．５７（５）：２０３−２３４；及びＲｏｍｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６５（３）：５６６−５７９（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。ＦＢＮ１は、弾性及び非弾性細胞外マトリックスにおけるミクロフィブリルの主な構成成分である構造糖タンパク質フィブリリン−１をコードする６５のコードエクソン（合計６６のエクソン）を有する２３０ｋｂの遺伝子である。プロフィブリリン−１は、２８７１アミノ酸長のプロタンパク質として翻訳され、これは、プロテアーゼフリンによりＣ末端で切断される。これは、成熟フィブリリン−１（細胞外マトリックス構成成分）に加えて、１４０アミノ酸長のＣ末端切断産物（すなわち、アスプロシン）を生成する。例示的なヒトフィブリリン−１配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３５５５５が割り当てられる。
【００６３】
ＦＢＮ１遺伝子において３０００を超える変異が臨床的に同定されている。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２６１：ｅ１−ｅ４及びｗｗｗ．ｕｍｄ／ｂｅ／ＦＢＮ１／（これらのそれぞれは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。これらの変異は、Ｉ型フィブリリン疾患、マルファン症候群、ＭＡＳＳ症候群、孤発性水晶体偏位症候群、胸部大動脈瘤、Ｗｅｉｌｌ−Ｍａｒｃｈｅｓａｎｉ症候群、幸福顔貌骨異形成症及び先端短肢異形成症、硬皮症候群、ならびに先天性リポジストロフィーを伴う新生児早老症候群を含む様々な状態と関連している。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＤａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ（２０１２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１０７（４）：６３５−６４７を参照のこと。これらのうちの最も一般的なものは、眼内、心臓血管、及び骨格の症状を含む常染色体優性マルファン症候群である。Ｌｏｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４７（７）：４７６−４８５及びＪａｃｑｕｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．５７（５）：２０３−２３４（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。典型的なマルファン症候群の変異は、限られた遺伝子型−表現型の関係でＦＢＮ１遺伝子中に点在している。例えば、Ｆａｉｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８１（３）：４５４−４６６及びＪａｃｑｕｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．５７（５）：２０３−２３４（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【００６４】
本明細書に開示の非ヒト動物モデルのＮＰＳＣＬは、非ヒト動物においてＮＰＳＣＬ様症状（例えば、先天性リポジストロフィー様症状）を生じるＦｂｎ１遺伝子の変異を含む。変異は、非ヒト動物の内因性Ｆｂｎ１遺伝子に存在し得る。あるいは、非ヒト動物は、内因性Ｆｂｎ１遺伝子の全てまたは一部が欠失しており、ヒトＦＢＮ１遺伝子由来の対応するオーソログ配列または非ヒト霊長類などの他の哺乳動物由来の他のオーソログ配列で置換されているヒト化Ｆｂｎ１遺伝子座を含み得る。オーソログ配列による置換は、オーソログ配列からの変異を導入する特定のエクソンまたはイントロンにおいて生じ得る。置換はまた、全エクソン、または全エクソン及びイントロン、あるいは全エクソン、イントロン、及び制御配列を含むフランキング配列の置換とし得る。オーソログ配列による置換の程度に応じて、プロモーターなどの制御配列は、内因性であるか、または置換オーソログ配列が供給し得る。
【００６５】
好ましくは、非ヒト動物は、変異についてヘテロ接合型である。好ましくは、変異は、コードタンパク質のＣ末端切断をもたらす。例えば、変異は、フレームシフトを引き起こし得る。フレームシフト変異は、参照配列と比較して翻訳が別のフレームにシフトする、翻訳開始コドン（スタートコドン）及び終止コドン（ストップコドン）の間の配列変化である。例えば、リーディングフレームは、５’方向に１ヌクレオチドシフト（−１フレームシフト）するか、または３’方向に１ヌクレオチドシフト（＋１フレームシフト）することができる。フレームシフト変異を有する遺伝子によりコードされるタンパク質は、Ｎ末端からフレームシフト変異までの野生型遺伝子によりコードされるタンパク質と同一であるが、その点以外は異なる。このようなフレームシフトは、早期終止コドンをもたらし得る。このような早期コドンは、例えば、最後から２番目のエクソンまたは最後のエクソンとし得る。任意に、早期終止コドンは、最後のエクソン−エクソン接合部の約１００塩基対未満上流または約５５塩基対未満上流に存在する。例えば、早期終止コドンは、最後から２番目のコードエクソン内のエクソン−エクソン接合部の約１００塩基対未満、９０塩基対、８０塩基対、７０塩基対、６０塩基対、５５塩基対、５０塩基対、４０塩基対、３０塩基対、２５塩基対、または２０塩基対上流に存在し得る。あるいは、早期終止コドンは、（例えば、最後から２番目のコードエクソンのスキップをもたらすスプライス部位変異の結果として）最後のコードエクソンに存在し得る。任意に、早期終止コドンは、最後のコードエクソン（例えば、マウスＦｂｎ１のエクソン６５）内に存在するか、または最後から２番目のエクソン（例えば、マウスＦｂｎ１のエクソン６４）に存在し、早期終止コドンが最後から２番目のエクソンに存在する場合、それは、最後のエクソン−エクソン接合部の約５５塩基対未満（例えば、１９塩基対などの約２０塩基対未満）上流に存在する。任意に、早期コドンが最後のコードエクソン内に存在する場合、それは、最後のエクソン−エクソン接合部の約１００塩基対未満、９０塩基対、８０塩基対、７０塩基対、６０塩基対、５５塩基対、５０塩基対、４０塩基対、３０塩基対、２５塩基対、２０塩基対、１５塩基対、または１０塩基対（例えば、９塩基対）下流に存在する。任意に、早期終止コドンは、変異を含むＦｂｎ１遺伝子が配列番号２０に最適にアラインされる時に、配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８１５０位及び８３００位、８１６０位及び８２９０位、８１７０位及び８２８０位、８１８０位及び８２７０位、８１９０位及び８２６０位、８２００位及び８２５０位、８２１０位及び８３００位、８２１０位及び８２９０位、８２１０位及び８２８０位、８２１０位及び８２７０位、８２１０位及び８２６０位、８２１０位及び８２５０位、８２００位及び８３００位、８２００位及び８２９０位、８２００位及び８２８０位、８２００位及び８２７０位、８２００位及び８２６０位、８２００位及び８２５０位、８１５０位及び８２４５位、８１６０位及び８２４５位、８１７０位及び８２４５位、８１８０位及び８２４５位、８１９０位及び８２４５位、８２００位及び８２４５位、８１５０位及び８２５０位、８１６０位及び８２５０位、８１７０位及び８２５０位、８１８０位及び８２５０位、８１９０位及び８２５０位、８２００位及び８２５０位、または８２１０位及び８２４５位に対応する位置の間に存在する。
【００６６】
早期終止コドンは、正荷電Ｃ末端を有する切断型タンパク質をもたらし得る。一般的な２０のアミノ酸のうち、５つは、荷電することができる側鎖を有する。ｐＨ＝７では、２つは、負に荷電し（アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ））、３つは、正に荷電する（リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ））。一部の場合では、早期終止コドンは、極度に正に荷電したＣ末端を有する切断型タンパク質（例えば、ＥＴＥＫＨＫＲＮ（配列番号３４））をもたらし得る。あるいは、早期終止コドンは、あまり正に荷電していないＣ末端を有する切断型タンパク質（例えば、ＩＳＬＲＱＫＰＭ（配列番号３５））をもたらし得る。
【００６７】
任意に、変異は、フリンファミリーのプロタンパク質転換酵素に対する塩基性アミノ酸認識配列（ＲＧＲＫＲＲ（配列番号３６））を破壊する。例えば、変異は、フリン認識配列の上流で切断されたタンパク質をもたらし得るか、フリン認識配列を変異させ得るか、またはフリン認識配列の上流でフレームシフトをもたらし得る。任意に、変異は、フリンファミリーのプロタンパク質転換酵素に対する塩基性アミノ酸認識配列の１００塩基対以内に存在する。例えば、変異は、フリン認識配列の約９０塩基対、８０塩基対、７０塩基対、６０塩基対、５０塩基対、４０塩基対、または３０塩基対以内に存在し得る。一例として、このような変異は、最後から２番目のエクソンまたは最後のエクソンにフレームシフトをもたらす、ヌクレオチドの挿入または欠失を含み得る。別の例として、このような変異は、最後から２番目のエクソンのスキップをもたらすドナースプライス部位変異、及び最後のエクソンに早期終止コドンをもたらす後続のフレームシフトを含み得る。
【００６８】
一部の非ヒト動物では、変異は、プロフィブリリン−１のＣ末端切断産物（すなわち、アスプロシン）の破壊または除去（例えば、ヘテロ接合型除去）をもたらす。Ｃ末端切断産物の破壊または除去は、例えば、フリンファミリーのプロタンパク質転換酵素に対する塩基性アミノ酸認識配列の破壊から生じ得る。あるいは、Ｃ末端切断産物の破壊または除去は、例えば、Ｃ末端切断産物が切断されるように早期終止コドンを生成する変異から生じ得る。アスプロシンの破壊は、アスプロシンの産生の減少または活性の減少したアスプロシンの産生のいずれかをもたらす。一部の非ヒト動物では、Ｆｂｎ１遺伝子は、最後から２番目のエクソンに変異を含む。例えば、Ｆｂｎ１遺伝子の最後から２番目のエクソンは、最後から２番目のエクソンが配列番号２６、２７、または２８と最適にアラインメントされる時に、野生型マウスＦｂｎ１（配列番号２５）の最後から２番目のエクソンと比較して、配列番号２６、２７、または２８の変異（それぞれＭＡＩＤ対立遺伝子８５０１、８５２０、及び８５０２の最後から２番目のエクソン）に対応する変異を含み得る。
【００６９】
一部の非ヒト動物では、配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質の変異Ｆｂｎ１遺伝子によりコードされるＦｂｎ１タンパク質は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインメントされる時に、アミノ酸２７１０〜２７８０、アミノ酸２７２０〜２７７０、アミノ酸２７３０〜２７６０、またはアミノ酸２７３７〜２７５５の位置に対応する位置で切断される。例えば、コードタンパク質は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインメントされる時に、最後のアミノ酸が配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質のアミノ酸２７３７、アミノ酸２７３８、またはアミノ酸２７５５に対応する位置に存在するように切断することができる。同様に、コードタンパク質は、最後のアミノ酸が本明細書に記載のＭＡＩＤ  ８５０１、８５０２、及び８５２０Ｆｂｎ１多様体によりコードされる切断型Ｆｂｎ１タンパク質の最後のアミノ酸に対応する位置に存在するように切断することができる。
【００７０】
別の例として、コードタンパク質は、配列番号８、４２、もしくは４３に記載の配列からなるＣ末端を有し得、またはコードタンパク質は、本明細書に記載のＭＡＩＤ  ８５０１、８５０２、及び８５２０Ｆｂｎ１多様体によりコードされるタンパク質のＣ末端に対応するＣ末端を有し得る。例えば、コードタンパク質は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、最後のアミノ酸が配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質のアミノ酸２７３７に対応する位置に存在するように切断することができ、コードタンパク質のＣ末端は、配列番号４３に記載の配列からなる。別の例として、コードタンパク質は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、最後のアミノ酸が配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質のアミノ酸２７３８に対応する位置に存在するように切断することができ、コードタンパク質のＣ末端は、配列番号８に記載の配列からなる。別の例として、コードタンパク質は、コードタンパク質が配列番号３０と最適にアラインされる時、最後のアミノ酸が配列番号３０に記載の野生型マウスＦｂｎ１タンパク質のアミノ酸２７５５に対応する位置に存在するように切断することができ、コードタンパク質のＣ末端は、配列番号４２に記載の配列からなる。例示的な切断型Ｆｂｎ１タンパク質としては、配列番号３１、３２、及び３３が挙げられる。
【００７１】
Ｆｂｎ１遺伝子は、Ｆｂｎ１タンパク質をコードする既知の任意の遺伝子、例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ及びＧｅｎＢａｎｋデータベースに記載のものを指し、Ｆｂｎ１タンパク質は、このようなデータベースまたは野生型配列と少なくとも９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有する別の方法に記載されているようなこれらのタンパク質の多様体を含み、このような遺伝子のハイブリッドを含み、本明細書にさらに記載されるようなＮＰＳＣＬ様症状（例えば、先天性リポジストロフィー様症状）を生ずる変異により改変されたこのような任意の遺伝子またはこのような遺伝子のハイブリッドを含む。任意の変更が、ＮＰＳＣＬ様症状を生じるように変異した残基以外に存在する場合、変更は、好ましくは、コード配列に影響を及ぼさないか、または、変更がコード配列に影響を及ぼす場合、好ましくは、保存的置換を導入することによりそのようにする。
【００７２】
本明細書に開示の非ヒト動物の一部では、内因性Ｆｂｎ１遺伝子は、ＮＰＳＣＬ様症状を生じるように変異させる。例示的なマウスフィブリリン−１配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００７９９３．２またはＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６１５５４が割り当てられる。例示的なラットフィブリリン−１配列は、アクセッション番号ＮＭ＿０３１８２５．１またはＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＷＵＨ８が割り当てられる。他の例示的なフィブリリン−１配列としては、アクセッション番号ＮＭ＿００１００１７７１．１（ブタ）、ＮＭ＿００１２８７０８５．１（イヌ）、及びＮＭ＿１７４０５３．２（ウシ）が挙げられる。マウスＦｂｎ１遺伝子は、１５ｑ１５−ｑ２１．１の第１５染色体の長腕に位置する。あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＭｅｇｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：３４６−３５１。ヒトＦＢＮ１と同様に、それは、６５のエクソンに高度にフラグメント化されている非常に大きな遺伝子である。あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＰｅｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：９６１−９６８。
【００７３】
内因性Ｆｂｎ１遺伝子のこのような変異は、本明細書の他の箇所に開示されるように、ＮＰＳＣＬと診断された患者のヒトＦＢＮ１遺伝子において同定された変異と一致し得る。内因性Ｆｂｎ１遺伝子（またはタンパク質）の残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）は、特定の比較ウィンドウで最大の一致が得られるように２つの配列（例えば、Ｆｂｎ１コード配列）を最適にアラインすることにより、ヒトＦＢＮ１遺伝子（またはタンパク質）の残基と一致すると判定することができ、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド（またはアミノ酸）配列の一部は、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較した場合、２つの配列の最適なアラインメントが得られるように、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい（例えば、配列同一性及び相補性に関して本明細書の他の箇所にある考察を参照のこと）。２つの残基は、最適にアラインされる時に同じ位置に位置する場合に、それらは対応する。
【００７４】
ＮＰＳＣＬ様症状を生じるマウスＦｂｎ１遺伝子の変異の具体例は、ｃ．８２０７＿８２０８ｉｎｓ１ｂｐ（参照配列ＮＭ＿００７９９３．２または参照配列  配列番号２０）である。本明細書に開示の一部の非ヒト動物は、Ｆｂｎ１遺伝子がＮＭ＿００７９３３．２または配列番号２０と最適にアラインされる時、ＮＭ＿００７９９３．２または配列番号２０のｃ．８２０７＿８２０８ｉｎｓ１ｂｐに対応する変異を有するＦｂｎ１遺伝子を含む。ＮＰＳＣＬ様症状を生じ得るマウスＦｂｎ１遺伝子配列内の変異の具体例は、配列番号２０（マウスＷＴ  Ｆｂｎ１  ｃＤＮＡ）に対する配列番号２１、２２、もしくは２３の変異、または配列番号２５（ＷＴ  Ｆｂｎ１  ｃＤＮＡの最後から２番目のエクソン）に対する配列番号２６、２７、もしくは２８の変異である。ＮＰＳＣＬ様症状を生じ得る変異マウスＦｂｎ１タンパク質の具体例は、配列番号３１、３２、及び３３である。
【００７５】
本明細書に開示の他の非ヒト動物では、内因性Ｆｂｎ１遺伝子の全部または一部が欠失しており、ヒトＦｂｎ１遺伝子由来の対応する配列と置換されている。例えば、ヒトＦｂｎ１遺伝子配列は、内因性Ｆｂｎ１遺伝子座に位置し得る（すなわち、内因性Ｆｂｎ１遺伝子座の全部または一部がヒト化されている）。このような非ヒト動物では、ヒトＦＢＮ１遺伝子の対応する配列は、ＮＰＳＣＬ様症状を生じる変異を含み得る。例示的なヒトＦＢＮ１  ｃＤＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿０００１３８．３が割り当てられ、例示的なヒトフィブリリン−１タンパク質配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ３５５５５が割り当てられる。ヒトＦＢＮ１遺伝子中の特定の変異位置は、本明細書で言及される場合、ＦＢＮ１  ｃＤＮＡＮ  Ｍ＿０００１３８．３（Ｅｎｓｅｍｂｌ転写産物ＦＢＮ１−２０１＝ＥＮＳＴ０００００３１６６２３）に関するものである。同様に、ヒトＦＢＮ１遺伝子イントロンまたはエクソンは、本明細書で言及される場合、参照配列ＮＭ＿０００１３８．３及びＥＮＳＴ０００００３１６６２３に関するものであり、エクソン番号付けは、ＡＴＧ開始コドンの局在化に従ってエクソン２から開始する（すなわち、エクソン番号付けは、最初のコードエクソンから開始する）。変異位置の番号付けは、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（ヒトゲノム変異学会）（ＨＧＶＳ）の配列多様体命名法（ｖａｒｎｏｍｅｎ．ｈｇｖｓ．ｏｒｇ）に基づいている。接頭辞「ｃ」は、参照配列が（タンパク質コード転写物に基づく）コードＤＮＡ参照配列であることを示す。番号は、「ＡＴＧ」翻訳開始（スタート）コドンの「Ａ」の「ｃ．１」で開始し、翻訳終止（ストップ）コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）の最後のヌクレオチドで終わる。イントロンの５’末端のヌクレオチドが、すぐ上流のエクソンの最後のヌクレオチドに対して番号付けされ、「＋」（プラス）及びイントロンまでの位置が続く（例えば、ｃ．８７＋１）。イントロンの３’末端のヌクレオチド、すぐ下流のエクソンの最初のヌクレオチドに対して番号付けされ、「−」（マイナス）及びイントロンからの位置が続く（例えば、ｃ．８８−３）。参照配列と比較した場合、１つのヌクレオチドが他の１つのヌクレオチドにより置き換えられる置換変異は、「接頭辞」「位置置換」「参照ヌクレオチド」＞「新規ヌクレオチド」の形式である（例えば、ｃ．１２３Ａ＞Ｇは、参照配列がコードＤＮＡ参照配列及び参照配列の１２３位の「Ａ」が「Ｇ」で置換されていることを示す）。参照配列と比較した場合、１つ以上のヌクレオチドが存在しない欠失変異は、「接頭辞」「削除された位置（複数可）」「ｄｅｌ」の形式である（例えば、ｃ．１２３＿１２７ｄｅｌは、コードＤＮＡ参照配列の１２３〜１２７位のヌクレオチドが欠失されていることを示す）。参照配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドが挿入され、挿入が５’直近の配列のコピーではない挿入変異は、「接頭辞」、「フランキングする位置」、「ｉｎｓ」、「挿入された配列」の形式である（例えば、ｃ．１２３＿１２４ｉｎｓＡＧＣは、配列ＡＧＣがコードＤＮＡ参照配列の１２３〜１２４位に挿入されることを示す）。参照配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドが１つ以上の他のヌクレオチドにより置換されている（且つ変異が置換、反転、または変換ではない）挿入／欠失（挿入欠失）変異は、「接頭辞」「欠失した位置（複数可）「ｄｅｌｉｎｓ」「挿入された配列」の形式である（例えば、ｃ．１２３＿１２７ｄｅｌｉｎｓＡＧは、１２３〜１２７位の配列が欠失しており、コードＤＮＡ参照配列の配列「ＡＧ」と置換されている）。
【００７６】
好ましくは、変異は、ヒトＦＢＮ１配列と最適にアラインされる時に、ヒトＦＢＮ１配列におけるｃ．８１００〜ｃ．８３００もしくはｃ．８１５０〜ｃ．８２５０、または非ヒトＦｂｎ１配列における対応する位置に存在する。ヒトＦＢＮ１遺伝子における例示的な変異としては、フレームシフトをもたらすヌクレオチドの挿入または欠失が挙げられる。例えば、Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ｐａｒｔ  Ａ  １６１Ａ：３０５７−３０６２；Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ．１５２Ａ（１１）：２７４９−２７５５；及びＧｏｌｄｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ  １５５Ａ（４）：７１７−７２０（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。ヒトＦＢＮ１遺伝子におけるこのような変異の一例は、ｃ．８１５５＿８１５６ｄｅｌである。これは、コードエクソン６４（最後から２番目のエクソン）における２つの塩基対の欠失であり、これは、ｐ．Ｌｙｓ２７１９の１７コドン下流の、後続の早期終止コドンを伴うフレームシフトを引き起こす。例えば、Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ．１５２Ａ（１１）：２７４９−２７５５を参照のこと。同じ早期終止コドンをもたらすフレームシフトをもたらす、ヒトＦＢＮ１遺伝子のこのような変異の別の例は、ｃ．８１５６＿８１７５ｄｅｌである。例えば、Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ  １５５Ａ（４）：７１７−７２０を参照のこと。同じ早期終止コドンをもたらすフレームシフトをもたらすヒトＦＢＮ１遺伝子のこのような変異の別の例は、ｃ．８１７５＿８１８２ｄｅｌである。例えば、Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ｐａｒｔ  Ａ  １６１Ａ：３０５７−３０６２を参照のこと。コードエクソン６４に早期終止コドンをもたらすヒトＦＢＮ１遺伝子のこのような変異の別の例は、ｃ．８２０６＿８２０７ｉｎｓＡである。例えば、Ｒｏｍｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６５（３）：５６６−５７９を参照のこと。本明細書に記載の非ヒト動物は、Ｆｂｎ１遺伝子配列がアクセッション番号ＮＭ＿０００１３８．３に記載のｃＤＮＡ配列に対応するヒトＦＢＮ１遺伝子と最適にアラインされる時に、これらの変異のいずれかに対応する変異を有するＦｂｎ１遺伝子を含み得る。
【００７７】
ヒトＦＢＮ１遺伝子における他の例示的な変異としては、最後から２番目のエクソン（エクソン６４）のスキップ及び最後のエクソン（エクソン６５）に早期終止コドンをもたらす後続のフレームシフトをもたらすドナースプライス部位変異が挙げられる。例えば、Ｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（２０１１）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ．１５５Ａ（４）：７２１−７２４及びＪａｃｑｕｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．５７（５）：２０３−２３４（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。ヒトＦＢＮ１遺伝子のこのような変異の一例は、ｃ．８２２６＋１Ｇ＞Ａである。例えば、Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．５７（５）：２０３−２３４を参照のこと。ヒトＦＢＮ１遺伝子のこのような変異の別の例は、ｃ．８２２６＋１Ｇ＞Ｔである。例えば、Ｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（２０１１）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ．１５５Ａ（４）：７２１−７２４及びＲｏｍｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６５（３）：５６６−５７９を参照のこと。これらの変異は、イントロン６４のスプライス供与部位に影響を及ぼして、高度に保存されたＧＴジヌクレオチドを変化させ、コードエクソン６４のスキップ及びＣ末端フリン切断部位が変更される切断型プロフィブリリン−１の合成を可能にする安定なｍＲＮＡの産生をもたらす。エクソン６４をスキップすると、コードエクソン６５の初めにフレームシフト及び９番目の下流コドンでの早期終止コドンの生成をもたらす。
【００７８】
本明細書に記載の非ヒト動物は、Ｆｂｎ１遺伝子配列がアクセッション番号ＮＭ＿０００１３８．３に記載のｃＤＮＡ配列に対応するヒトＦＢＮ１遺伝子配列と最適にアラインされる時に、これらの変異のいずれかに対応する変異を有するＦｂｎ１遺伝子を含み得る。同様に、本明細書に記載の非ヒト動物は、変異型Ｆｂｎ１遺伝子が本明細書に記載の任意の変異型ヒトＦＢＮ１遺伝子のいずれかによりコードされたヒトＦＢＮ１タンパク質のいずれかに対応するＦｂｎ１タンパク質をコードするように変異を有するＦｂｎ１遺伝子を含み得る。同様に、コードタンパク質は、最後のアミノ酸が本明細書に記載の変異型ヒトＦＢＮ１遺伝子のいずれかによりコードされた切断型Ｆｂｎ１タンパク質の最後のアミノ酸に対応する位置に存在するように切断することができ、及び／または、本明細書に記載の変異型ヒトＦＢＮ１遺伝子のいずれかによりコードされた切断型Ｆｂｎ１タンパク質のＣ末端と同一であるＣ末端を有し得る。
【００７９】
特定の例示的な変異型Ｆｂｎ１対立遺伝子は、変異型マウスＦｂｎ１対立遺伝子である。例えば、変異型マウスＦｂｎ１対立遺伝子の変異は、−１フレームシフトを引き起こして、最後から２番目のエクソン（エクソン６４）の３’末端またはＦｂｎ１の最終エクソン（エクソン６５）の５’末端に早期終止コドンをもたらす、最後から２番目のエクソン（エクソン６４）における挿入または欠失を含み得る。
【００８０】
一例として、この変異は、実施例２に記載の及び配列番号２２に記載のＭＡＩＤ８５２０対立遺伝子のように、−１フレームシフトを引き起こして、エクソン６５の５’末端に早期終止コドンをもたらす、エクソン６４における挿入または欠失を含み得る。任意に、挿入または欠失は、変異を含むＦｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時に、配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８２４１位に対応する位置の上流に存在し（例えば、８１７９位に対応する位置及び８１８０位に対応する位置の間の挿入）、及び／または、早期終止コドンは、変異を含むＦｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時に、配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８２４１位に対応する位置に存在する。
【００８１】
別の例として、変異は、実施例１に記載の及び配列番号２１に記載のＭＡＩＤ８５０１対立遺伝子または実施例２に記載の及び配列番号２３に記載のＭＡＩＤ８５０２対立遺伝子のように、−１フレームシフトを引き起こして、最後から２番目のエクソン（エクソン６４）の３’末端に早期終止コドンをもたらす、最後から２番目のエクソン（エクソン６４）における挿入または欠失を含み得る。任意に、挿入または欠失は、変異を含むＦｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時に、配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８２１４位に対応する位置の上流に存在し（例えば、８２０９位に対応する位置及び８２１０位に対応する位置の間の挿入、もしくは８１６１位に対応する位置で開始する欠失）、及び／または、早期終止コドンは、変異を含むＦｂｎ１遺伝子が配列番号２０と最適にアラインされる時に、配列番号２０に記載の野生型マウスＦｂｎ１コード配列の８２１４位に対応する位置に存在する。
【００８２】
１つの例示的な変異型マウスＦｂｎ１対立遺伝子は、実施例１に記載の、及び配列番号２１に記載のＭＡＩＤ８５０１対立遺伝子である。ＭＡＩＤ８５０１対立遺伝子によりコードされたタンパク質は、配列番号３１に記載されている。参照配列としてＮＭ＿００７９９３．２を使用すると、この変異型Ｆｂｎ１対立遺伝子中の変異は、ｃ．８２１３＿８２１４ｄｅｌｉｎｓＡＣＴである。ｃ．８２１２及び８２１３の間にＡを挿入すること、ならびに、ｃ．８２１４でＧ＞Ｔ置換を行うことにより生成されたこの変異は、エクソン６４及び６５の間の境界の１９ヌクレオチド上流の、Ｆｂｎ１の最後から２番目のエクソン（エクソン６４）に早期終止コドンをもたらす。変異は、最後から２番目のエクソンから最後の５０ヌクレオチド（最後の２４ヌクレオチド）の範囲内に存在し、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）を免れて、変異型切断型プロフィブリリンタンパク質の発現をもたらすと予測される。
【００８３】
別の例示的なマウス対立遺伝子は、実施例２に記載の及び配列番号２３に記載のＭＡＩＤ８５０２対立遺伝子である。ＭＡＩＤ８５０２対立遺伝子によりコードされたタンパク質は、配列番号３３に記載されている。これは、ヒトｃ．８１５５＿８１５６ｄｅｌ  Ｆｂｎ１対立遺伝子に対応する変異型Ｆｂｎ１対立遺伝子であり、これは、ｐ．Ｌｙｓ２７１９の１７コドン下流の、後続の早期終止コドンを伴うフレームシフトを引き起こす、コードエクソン６４（最後から２番目のエクソン）における２塩基対の欠失を有する。ＭＡＩＤ８５０２対立遺伝子では、２つの塩基対の欠失は、エクソン６４及び６５の間の境界の７１ヌクレオチド上流に存在する。この変異は、エクソン６４及び６５の間の境界の１９ヌクレオチド上流の、マウスＦｂｎ１の最後から２番目のエクソン（エクソン６４）に早期終止コドンをもたらす。
【００８４】
別の例示的なマウス対立遺伝子は、実施例２に記載の及び配列番号２２に記載のＭＡＩＤ８５２０対立遺伝子である。ＭＡＩＤ８５２０対立遺伝子によりコードされたタンパク質は、配列番号３２に記載されている。参照配列としてＮＭ＿００７９９３．２を使用すると、この変異型Ｆｂｎ１対立遺伝子中の変異は、８１７９＿８１８０ｉｎｓＡＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣである。この変異は、エクソン６４及び６５の間の境界の５４ヌクレオチド上流の、最後から２番目のエクソン（エクソン６４）に、２５−ｂｐ挿入（配列番号４４に記載の挿入配列）を通して生成された。それは、マウスＦｂｎ１の最後から２番目のエクソン（エクソン６４）にフレームシフトをもたらす。この変異は、エクソン６４及び６５の間の境界の９ヌクレオチド下流の、マウスＦｂｎ１の最終エクソン（エクソン６５）に早期終止コドンをもたらす。
【００８５】
上記の例示的なマウスＦｂｎ１対立遺伝子のそれぞれは、マウスＦｂｎ１遺伝子の最後から２番目のエクソン（エクソン６４）にフレームシフト変異をもたらす。各フレームシフト変異は、マウスＦｂｎ１遺伝子中の最後から２番目のエクソン（エクソン６４）の３’末端内か、または最終エクソン（エクソン６５）の５’末端内のいずれかに早期終止コドンをもたらす。各変異は、早期終止コドンをもたらすので、各変異は、プロフィブリリン−１のＣ末端開裂産物（すなわち、アスプロシン）を破壊または除去する。その理由は、Ｃ末端開裂産物が、産生される場合、同様に必然的に切断されることになるからである。加えて、上記の例示的なマウスＦｂｎ１対立遺伝子のそれぞれは、アスパラギン酸及びグルタミン酸に対して、リシン、アルギニン、及びヒスチジンがより多数であることに起因して、正荷電Ｃ末端をもたらす。ＭＡＩＤ８５０１、ＭＡＩＤ８５０２、及びＭＡＩＤ８５２０対立遺伝子によりコードされたＦｂｎ１タンパク質の最後の１４アミノ酸は、それぞれ、配列番号４５、４６、及び４７に記載されている。
【００８６】
Ｃ．非ヒト動物
本明細書に開示のように、任意の好適な非ヒト動物が、ＮＰＳＣＬのモデルとして使用することができる。このような非ヒト動物は、好ましくは、齧歯動物（例えば、ラット、マウス、及びハムスター）などの哺乳動物である。他の非ヒト哺乳動物としては、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄牛、シカ、バイソン、家畜（例えば、雌牛、早期去勢牛などのウシ種；ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種；ならびにブタ及びイノシシなどブタ種）が挙げられる。「非ヒト」という用語は、ヒトを除外する。
【００８７】
本明細書に開示の非ヒト動物モデルに用いられるマウスは、例えば、１２９株、Ｃ５７ＢＬ／６株、ＢＡＬＢ／ｃ株、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ株、１２９及びＣ５７ＢＬ／６株の混合物、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６株の混合物、１２９及びＢＡＬＢ／ｃ株の混合物、ならびにＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、及び１２９株の混合物を含む、任意の株に由来し得る。例えば、マウスは、ＢＡＬＢ／ｃ株に少なくとも部分的に由来し得る（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ株に少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％由来する、またはＢＡＬＢ／ｃ株に約２５％、約５０％、約７５％、または約１００％に由来する）。一例では、マウスは、５０％のＢＡＬＢ／ｃ、２５％のＣ５７ＢＬ／６、及び２５％の１２９を含む株を有する。あるいは、マウスは、ＢＡＬＢ／ｃを除外する株または株の組み合わせを含み得る。
【００８８】
１２９株の例としては、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、及び１２９Ｔ２が挙げられる。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＦｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０（８）：８３６を参照のこと。Ｃ５７ＢＬ株の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。本明細書で提供される非ヒト動物モデルに用いられるマウスは、また、上述の１２９株及び上述のＣ５７ＢＬ／６株の混合物（例えば、５０％の１２９及び５０％のＣ５７ＢＬ／６）にも由来し得る。同様に、本明細書で提供される非ヒト動物モデルに用いられるマウスは、上述の１２９株の混合物または上述のＢＬ／６株の混合物（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）株）に由来し得る。
【００８９】
本明細書で提供される非ヒト動物モデルに用いられるラットは、例えば、ＡＣＩラット株、ダークアグーチ（ＤＡ）ラット株、Ｗｉｓｔａｒラット株、ＬＥＡラット株、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット株、またはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット株を含む任意のラット株に由来し得る。ラットは、上記で引用した２つ以上の株の混合物に由来する株にも由来し得る。例えば、ラットは、ＤＡ株またはＡＣＩ株に由来し得る。ＡＣＩラット株は、白い腹部及び足ならびにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有する黒アグーチを有することを特徴とする。このような株は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。ダークアグーチ（ＤＡ）ラット株は、アグーチコート及びＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴とする。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。一部の場合では、ラットは、同系交配のラット株に由来する。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１を参照のこと。
【００９０】
ＩＩ．先天性リポジストロフィーを伴う新生児早老症候群の動物モデルの生成
Ａ．細胞におけるＦｂｎ１変異の生成
ヌクレアーゼ物質及び／または外因性修復テンプレートの使用により、細胞（例えば、多能性細胞または１細胞期胚）内のゲノムのＦｂｎ１遺伝子を改変するための種々の方法が提供される。方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで生じ得る。ヌクレアーゼ物質は、単独で、または外因性修復テンプレートと組み合わせて使用することができる。あるいは、外因性修復テンプレートは、単独で、またはヌクレアーゼ物質と組み合わせて使用することができる。
【００９１】
二本鎖破断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、及び相同組み換え（ＨＲ）を介して生じる。あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＫａｓｐａｒｅｋ  ＆  Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６−８９７を参照のこと。ＮＨＥＪは、相同テンプレートを必要とせずに、破断末端を、互いにまたは外因性配列に直接ライゲーションすることによる、核酸における二本鎖破断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非連続配列のライゲーションは多くの場合、二本鎖破断部位の近くの欠失、挿入、または転座をもたらし得る。
【００９２】
外因性修復テンプレートにより媒介される標的核酸（例えば、Ｆｂｎ１遺伝子）の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み得る。例えば、ＮＨＥＪは、外因性修復テンプレートの末端との破断末端の直接ライゲーションを介して、外因性修復テンプレートの標的インテグレーションももたらし得る（すなわち、ＮＨＥＪベースの捕捉）。このようなＮＨＥＪ媒介標的インテグレーションは、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路が（例えば、非分裂細胞、初代細胞、及び相同性ベースのＤＮＡ修復を不十分に実施する細胞において）容易に使用できない場合、外因性修復テンプレートの挿入について好ましい可能性がある。加えて、相同性指向修復とは対照的に、（Ｃａｓ媒介切断により生成されたオーバーハングを超えて）切断部位に隣接する広い領域の配列同一性に関する知識は必要ではなく、これは、ゲノム配列の知識が限られているゲノムを有する生物への標的挿入を試みる時に、有益である可能性がある。インテグレーションは、外因性修復テンプレート及び切断されたゲノム配列の間の平滑末端のライゲーションを介して、または切断されたゲノム配列のＣａｓタンパク質により生成されたものと適合するオーバーハングに隣接する外因性修復テンプレートを使用する（すなわち、５’もしくは３’を有する）突出末端のライゲーションを介して、進行し得る。例えば、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、及びＭａｒｅｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２３（３）：５３９−５４６（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。平滑末端がライゲーションされる場合、標的及び／またはドナーの切除は、フラグメント結合に必要とされるマイクロホモロジーの生成領域に必要とされ得、これは、標的配列に望ましくない変更を生成し得る。
【００９３】
修復は、相同性指向修復（ＨＤＲ）または相同組み換え（ＨＲ）を介して生じ得る。ＨＤＲまたはＨＲは、ヌクレオチド配列相同性を必要とすることができる核酸修復の形成を含み、「ターゲット」分子（すなわち、二本鎖破断を経験したもの）の修復のためのテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらす。特定の理論に束縛されることを望まないが、このような導入は、分解された標的及びドナーの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、及び／または標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される合成依存鎖アニーリング、及び／または関連プロセスを含み得る。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的ＤＮＡにインテグレートされる。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５３：９１０−９１８；Ｍａｎｄａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４５７６８：１−９；及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０−５３２（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【００９４】
ゲノムにおけるＦｂｎ１遺伝子への標的遺伝子改変は、Ｆｂｎ１遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイゼーションする５’ホモロジーアーム及びＦｂｎ１遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイゼーションする３’相同性を含む外因性修復テンプレートと、細胞を接触させることにより生成することができる。外因性修復テンプレートは、Ｆｂｎ１遺伝子に対する標的遺伝子改変を生成するために、標的ゲノム遺伝子座と組み換え得る。このような方法は、例えば、コードタンパク質のＣ末端切断をもたらす変異を含むように改変されたＦｂｎ１遺伝子をもたらし得る。外因性修復テンプレートの例は、本明細書の他の箇所に開示されている。
【００９５】
ゲノムにおけるＦｂｎ１遺伝子への標的遺伝子改変は、Ｆｂｎ１遺伝子内の標的ゲノム遺伝子座の認識配列に、１つ以上のニックまたは二本鎖破断を誘導するヌクレアーゼ物質と、細胞を接触させることにより生成することもできる。このような方法は、例えば、コードタンパク質のＣ末端切断をもたらす変異を含むように改変されたＦｂｎ１遺伝子をもたらし得る。方法に使用することができるヌクレアーゼ物質の例及び変形形態は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【００９６】
例えば、ゲノムにおけるＦｂｎ１遺伝子への標的遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質及びＦｂｎ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の１つ以上のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする１つ以上のガイドＲＮＡと、細胞を接触させることにより生成することができる。例えば、このような方法は、Ｃａｓタンパク質及びＦｂｎ１遺伝子内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションするガイドＲＮＡと、細胞を接触させることを含み得る。Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡは、複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡ認識配列を切断する。Ｃａｓ９タンパク質による切断は、（例えば、Ｃａｓ９タンパク質がニッカーゼである場合）二本鎖破断または一本鎖破断を生成することができる。このような方法は、例えば、コードタンパク質のＣ末端切断をもたらす変異を含むように改変されたＦｂｎ１遺伝子をもたらし得る。方法に使用することができるＣａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡの例及び変形形態は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【００９７】
任意に、細胞は、Ｆｂｎ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の追加のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする１つ以上の追加のガイドＲＮＡとさらに接触させることができる。接合体を１つ以上の追加のガイドＲＮＡ（例えば、第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする第２のガイドＲＮＡ）と接触させることにより、Ｃａｓタンパク質による切断は、（例えば、Ｃａｓタンパク質がニッカーゼである場合）２つ以上の二本鎖破断または２つ以上の一本鎖破断を生成することができる。
【００９８】
任意に、細胞は、さらに、Ｆｂｎ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座と組み換えて、標的遺伝子改変を生じる１つ以上の外因性修復テンプレートと接触させることができる。方法に使用することができる外因性修復テンプレートの例及び変形形態は、本明細書の他の箇所に開示されている。
【００９９】
Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ（複数可）、及び外因性修復テンプレート（複数可）は、本明細書の他の箇所に記載されるような任意の形態且つ任意の手段で、細胞に導入することができ、ＣＡＳタンパク質、ガイドＲＮＡ（複数可）、及び外因性修復テンプレート（複数可）の全てまたは一部は、任意の組み合わせで同時または逐次的に導入することができる。
【０１００】
このような一部の方法では、外因性修復テンプレートによる標的核酸（例えば、Ｆｂｎ１遺伝子）の修復は、相同性指向修復（ＨＤＲ）を介して生じる。相同性指向修復は、Ｃａｓタンパク質がＦｂｎ１遺伝子のＤＮＡの両方の鎖を切断して二本鎖破断を生成する時か、Ｃａｓタンパク質が標的核酸のＤＮＡの１つの鎖を切断して一本鎖破断を生成するニッカーゼである時か、またはＣａｓニッカーゼを使用して２つの補われたニックにより形成された二本鎖破断を生成する時に、生じ得る。このような方法では、外因性修復テンプレートは、５’及び３’標的配列に対応する５’及び３’ホモロジーアームを含む。ガイドＲＮＡ認識配列（複数可）または切断部位（複数可）は、５’標的配列に隣接するか、３’標的配列に隣接するか、５’標的配列及び３’標的配列の両方に隣接するか、または５’標的配列にも３’標的配列にも隣接しない可能性がある。任意に、外因性修復テンプレートは、５’及び３’ホモロジーアームに隣接した核酸インサートをさらに含み得、核酸インサートは、５’及び３’標的配列の間に挿入される。例えば、核酸インサートは、野生型非ヒト動物Ｆｂｎ１配列と比較した時に、１つ以上の改変を含み得るか、またはそれは、野生型ヒトＦＢＮ１配列と比較した時に、１つ以上の改変を含むヒトＦＢＮ１コード配列の全部または一部を含み得る。核酸インサートが存在しない場合、外因性修復テンプレートは、５’及び３’標的配列の間のゲノム配列を欠失させるように機能し得る。外因性修復テンプレートの例は、本明細書の他の箇所に開示されている。
【０１０１】
あるいは、外因性修復テンプレートにより媒介されるＦｂｎ１遺伝子の修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介ライゲーションを介して生じ得る。このような方法では、外因性修復テンプレートの少なくとも１つの末端は、Ｆｂｎ１遺伝子のＣａｓ媒介切断により生成される少なくとも１つのオーバーハングに相補的である短い一本鎖領域を含む。外因性修復テンプレートの相補的末端は、核酸インサートに隣接し得る。例えば、外因性修復テンプレートの各末端は、Ｆｂｎ１遺伝子のＣａｓ媒介切断により生成されるオーバーハングに相補的である短い一本鎖領域を含み得、外因性修復テンプレートのこれらの相補的領域は、核酸インサートに隣接し得る。例えば、核酸インサートは、野生型非ヒト動物Ｆｂｎ１配列と比較した時に、１つ以上の改変を含み得るか、またはそれは、野生型ヒトＦＢＮ１配列と比較した時に、１つ以上の改変を含むヒトＦＢＮ１コード配列の全部または一部を含み得る。
【０１０２】
オーバーハング（すなわち、付着末端）は、Ｃａｓ媒介切断により生成される二本鎖破断の平滑末端の切除により生成することができる。このような切除は、フラグメント結合に必要とされるマイクロホモロジーの領域を生じさせ得るが、これは、Ｆｂｎ１遺伝子の望ましくないまたは制御不可能な改変を生成し得る。あるいは、このようなオーバーハングは、対になったＣａｓニッカーゼを使用することにより生成することができる。例えば、細胞を、ＤＮＡの対向鎖を切断する第１及び第２のニッカーゼと接触させることができ、それにより、ゲノムは、ダブルニッキングにより改変される。これは、細胞を第１のＣａｓタンパク質ニッカーゼ、Ｆｂｎ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする第１のガイドＲＮＡ、第２のＣａｓタンパク質ニッカーゼ、及びＦｂｎ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする第２のガイドＲＮＡと接触させることにより達成することができる。第１のＣａｓタンパク質及び第１のガイドＲＮＡは、第１の複合体を形成し、第２のＣａｓタンパク質及び第２のガイドＲＮＡは、第２の複合体を形成する。第１のＣａｓタンパク質ニッカーゼは、第１のガイドＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第１の鎖を切断し、第２のＣａｓタンパク質ニッカーゼは、第２のガイドＲＮＡ認識配列内のゲノムＤＮＡの第２の鎖を切断し、任意に、外因性修復テンプレートは、標的遺伝子改変を生じさせるように、Ｆｂｎ１遺伝子の標的ゲノム遺伝子座で組み換えする。
【０１０３】
第１のニッカーゼは、ゲノムＤＮＡの第１の鎖（すなわち、相補鎖）を切断することができ、第２のニッカーゼは、ゲノムＤＮＡの第２の鎖（すなわち、非相補鎖）を切断することができる。第１及び第２のニッカーゼは、例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインの触媒残基を変異させること（例えば、本明細書の他の箇所に記載のＤ１０Ａ変異）、またはＣａｓ９のＨＮＨドメインの触媒残基を変異させること（例えば、本明細書の他の箇所に記載のＨ８４０Ａ変異）により生成することができる。このような方法では、ダブルニッキングは、付着末端（すなわち、オーバーハング）を有する二本鎖破断を作成するために用いることができる。第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列は、ＤＮＡの第１及び第２の鎖上に第１及び第２のニッカーゼにより生成されたニックが二本鎖破断を生成するように切断部位を生成するように配置することができる。オーバーハングは、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列内のニックが補われる時、生成される。オフセットウィンドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐまたはそれ以上とし得る。例えば、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５４：１３８０−１３８９；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：８３３−８３８；及びＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１：３９９−４０４を参照のこと。
【０１０４】
Ｂ．ヌクレアーゼ物質
所望の認識配列へのニックまたは二本鎖破断を誘導する任意のヌクレアーゼ物質は、本明細書に開示の方法及び組成物に使用することができる。天然に存在するまたは天然ヌクレアーゼ物質は、ヌクレアーゼ物質が所望の認識配列においてニックまたは二本鎖破断を誘導する限り用いることができる。あるいは、改変または操作されたヌクレアーゼ物質を使用することができる。「操作されたヌクレアーゼ物質」は、所望の認識配列においてニックまたは二本鎖破断を特異的に認識及び誘導するように天然型から操作された（改変または誘導された）ヌクレアーゼを含む。従って、操作されたヌクレアーゼ物質は、天然の、天然に存在するヌクレアーゼ物質から誘導することができ、またはそれは、人工的に生成もしくは合成することができる。操作されたヌクレアーゼは、認識配列のニックまたは二本鎖破断を誘導することができ、例えば、認識配列は、天然の（未操作または未改変）ヌクレアーゼ物質により認識されている配列ではない。ヌクレアーゼ物質の改変は、タンパク質切断剤のわずか１アミノ酸、または核酸切断剤の１ヌクレオチドとし得る。認識配列または他のＤＮＡにおいてニックまたは二本鎖破断を産生することは、本明細書では、認識配列または他のＤＮＡを「切断すること（ｃｕｔｔｉｎｇ）」または「切断すること（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」と称することができる。
【０１０５】
ヌクレアーゼ物質の活性多様体及びフラグメント（すなわち、操作されたヌクレアーゼ物質）もまた提供される。このような活性多様体は、天然ヌクレアーゼ物質と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含み得、活性多様体は、所望の認識配列で切断し、従って、ニックまたは二本鎖破断誘導活性を保持する。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ物質のいずれかは、天然のエンドヌクレアーゼ配列から改変することができ、天然ヌクレアーゼ物質により認識されなかった認識配列にニックまたは二本鎖破断を認識及び誘導するように設計することができる。従って、一部の操作されたヌクレアーゼは、対応する天然のヌクレアーゼ物質認識配列とは異なる認識配列でニックまたは二本鎖破断を誘導する特異性を有する。ニックまたは二本鎖破断誘導活性についてのアッセイは、既知であり、一般に、認識配列を含有するＤＮＡ基質上のエンドヌクレアーゼの全体的な活性及び特異性を測定する。
【０１０６】
「ヌクレアーゼ物質に対する認識配列」という用語は、ニックまたは二本鎖破断がヌクレアーゼ物質により誘導されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレアーゼ物質に対する認識配列は、細胞に対し内因性（または固有）であり得るか、または認識配列は、細胞に対し外因性であり得る。細胞に対し外因性である認識配列は、細胞のゲノムに天然に存在しない。認識配列は、標的遺伝子座に配置されることが望まれる目的のポリヌクレオチドに対しても外因性であり得る。一部の場合では、認識配列は、宿主細胞のゲノムに一度だけ存在する。
【０１０７】
例示された認識配列の活性多様体及びフラグメントもまた提供される。このような活性多様体は、所与の認識配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含み得、活性多様体は、生物学的活性を保持し、従って、配列特異的に、ヌクレアーゼ物質により認識及び切断されることが可能である。ヌクレアーゼ物質による認識配列の二本鎖破断を測定するためのアッセイは、当該技術分野で既知である（例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｑＰＣＲ  ａｓｓａｙ，Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４７６：２９５−３０７）。
【０１０８】
認識配列の長さは、変動し得、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対の場合に約３０〜３６ｂｐ（すなわち、各ＺＦＮの場合に約１５〜１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の場合に約３６ｂｐ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの場合に約２０ｂｐである認識配列を含む。
【０１０９】
ヌクレアーゼ物質の認識配列は、標的ゲノム遺伝子座のどこかに、またはその近傍に、配置することができる。認識配列は、遺伝子（例えば、Ｆｂｎ１遺伝子）のコード領域内に、または遺伝子の発現に影響を及ぼす制御領域内に位置し得る。ヌクレアーゼ物質の認識配列は、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、制御領域、または任意の非タンパク質コード領域に位置し得る。
【０１１０】
本明細書に開示の種々の方法及び組成物に用いることができる１種のヌクレアーゼ物質は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノム中の特定の標的配列で二本鎖破断を行うために使用することができる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに、天然のまたは操作され転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能的部分を融合することにより生成される。独特のモジュールＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、任意の所与のＤＮＡ認識特異性を潜在的に有するタンパク質の設計が可能になる。従って、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特異的なＤＮＡ標的部位を認識するように操作することができ、従って、所望の標的配列で二本鎖破断を行うために使用することができる。ＷＯ２０１０／０７９４３０；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７（５０：２１６１７−２１６２２；Ｓｃｈｏｌｚｅ  ＆  Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  １：４２８−４３２；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６：７５７−７６１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９（１）：３５９−３７２；及びＭｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：１４３−１４８（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０１１１】
好適なＴＡＬヌクレアーゼの例、及び好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製する方法は、例えば、ＵＳ２０１１／０２３９３１５Ａ１、ＵＳ２０１１／０２６９２３４Ａ１、ＵＳ２０１１／０１４５９４０Ａ１、ＵＳ２００３／０２３２４１０Ａ１、ＵＳ２００５／０２０８４８９Ａ１、ＵＳ２００５／００２６１５７Ａ１、ＵＳ２００５／００６４４７４Ａ１、ＵＳ２００６／０１８８９８７Ａ１、及びＵＳ２００６／００６３２３１Ａ１に開示され、これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる。種々の実施形態では、例えば、目的のゲノム遺伝子座の標的核酸配列で、またはその近傍で切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、標的核酸配列は、外因性修復テンプレートにより改変されるべき配列に、またはその近くに存在する。本明細書で提供される種々の方法及び組成物と共に使用するのに適するＴＡＬヌクレアーゼは、本明細書の他の箇所に記載されるように、外因性修復テンプレートにより改変されるべき標的核酸配列で、またはその近くで結合するように具体的に設計されたものを含む。
【０１１２】
一部のＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、２つの超可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３〜３５のＴＡＬリピートを含む。一部のＴＡＬＥＮでは、ヌクレアーゼ物質は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ物質は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含み得、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結され、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２〜２０塩基対）のスペーサー配列により隔てられている標的ＤＮＡ配列の各鎖の２つの連続的な標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは、標的配列で二本鎖破断をもたらす活性ヌクレアーゼを生成する。
【０１１３】
本明細書に開示の種々の方法及び組成物に用いることができるヌクレアーゼ物質の別の例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一部のＺＦＮでは、ＺＦＮの各モノマーは、３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは、３ｂｐのサブサイトに結合する。他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ物質は、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮを含み得、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結され、第１及び第２のＺＦＮは、約５〜７ｂｐのスペーサーにより隔てられている標的ＤＮＡ配列の各鎖の２つの連続的な標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは、二量体化して二本鎖破断をもたらす活性ヌクレアーゼを生成する。例えば、ＵＳ２００６／０２４６５６７；ＵＳ２００８／０１８２３３２；ＵＳ２００２／００８１６１４；ＵＳ２００３／００２１７７６；ＷＯ２００２／０５７３０８Ａ２；ＵＳ２０１３／０１２３４８４；ＵＳ２０１０／０２９１０４８；ＷＯ２０１１／０１７２９３Ａ２；及びＧａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１（７）：３９７−４０５（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０１１４】
本明細書に開示の種々の方法及び組成物に用いることができる別の種類のヌクレアーゼ物質は、メガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、保存された配列モチーフに基づいて４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−Ｈ、及びＨｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリーに分類されている。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びホスホジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、それらの長い認識配列及びそれらのＤＮＡ基質における一部の配列多型を許容することで有名である。メガヌクレアーゼドメイン、構造、及び機能は、既知である。例えば、Ｇｕｈａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３８：１９９−２４８；Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：９６０−９６９；Ｊｕｒｉｃａ  ａｎｄ  Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５５：１３０４−１３２６；Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６）Ｑ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３８：４９−９５；及びＭｏｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：７６４を参照のこと。一部の例では、天然に存在する多様体及び／または操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。動力学、補因子相互作用、発現、最適条件、及び／または認識配列特異性が既知であり、活性についてスクリーニングするための方法が既知である。例えば、Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３４：９９３−１００８；Ｓｅｌｉｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３８７０−３８７９；Ｓｕｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１；Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：４７９１−４８００；Ｃｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１７８；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：ｅ１４９；Ｇｒｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ２９；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｚｈａｏ（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：ｅ１５４；ＷＯ２００５／１０５９８９；ＷＯ２００３／０７８６１９；ＷＯ２００６／０９７８５４；ＷＯ２００６／０９７８５３；ＷＯ２００６／０９７７８４；及びＷＯ２００４／０３１３４６（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０１１５】
例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃＩＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ、またはその任意の活性多様体もしくはフラグメントを含む任意のメガヌクレアーゼを使用することができる。
【０１１６】
メガヌクレアーゼは、例えば、１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識し得る。一部の場合では、メガヌクレアーゼは、ゲノムにおいて完全に一致した１つ標的配列を認識する。
【０１１７】
一部のメガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。１種のホーミングヌクレアーゼは、例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、及びＩ−Ｄｍｏｌを含む、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼである。
【０１１８】
好適なヌクレアーゼ物質は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型エンドヌクレアーゼを含む制限エンドヌクレアーゼも含む。Ｉ型及びＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特異的な認識配列を認識するが、通常は、切断部位（認識配列）から数百塩基対離れて存在し得るヌクレアーゼ結合部位からの可変位置で切断する。ＩＩ型システムでは、制限活性は、任意のメチラーゼ活性に依存せず、切断は通常、結合部位内で、またはその近傍の特定の部位で生じる。ほとんどのＩＩ型酵素は、パリンドローム配列を切断する。しかし、ＩＩａ型酵素は、非パリンドローム認識配列を認識し、認識配列の外側で切断し、ＩＩｂ型酵素は、認識配列の外側の両方の部位で配列を２回切断し、ＩＩｓ型酵素は、非対称認識配列を認識し、片側で且つ認識配列から約１〜２０ヌクレオチドの規定された距離で切断する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的とする。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：１８０５−１８１２；及びＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ｉｎ  Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ  ＩＩ，ｐｐ．７６１−７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）にさらに記載及び分類され、これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる。
【０１１９】
本明細書に記載の方法及び組成物に使用される他の好適なヌクレアーゼ物質は、本明細書の他の場所に記載されているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含む。
【０１２０】
ヌクレアーゼ物質は、当該技術分野に既知の任意の手段により細胞に導入されてもよい。ヌクレアーゼ物質をコードするポリペプチドは、細胞に直接導入されてもよい。あるいは、ヌクレアーゼ物質をコードするポリヌクレオチドを、細胞に導入することができる。ヌクレアーゼ物質をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入される時、ヌクレアーゼ物質は、細胞内で、一過性で、条件付きで、または構成的に発現させることができる。例えば、ヌクレアーゼ物質をコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含有することができ、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結することができる。このようなプロモーターは、本明細書の他の箇所でさらに詳細に考察されている。あるいは、ヌクレアーゼ物質は、ヌクレアーゼ物質をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入することができる。
【０１２１】
ヌクレアーゼ物質をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定的にインテグレートすることができ、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ヌクレアーゼ物質をコードするポリヌクレオチドは、標的化ベクター中に、またはインサートポリヌクレオチドを含む標的化ベクターから分離されるベクターもしくはプラスミド中に存在し得る。
【０１２２】
ヌクレアーゼ物質が、ヌクレアーゼ物質をコードするポリヌクレオチドの導入により細胞に提供される時、ヌクレアーゼ物質をコードするこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ物質をコードする天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、目的の細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変することができる。例えば、ヌクレアーゼ物質をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較した場合、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または目的の他の任意の宿主細胞を含む、目的の所与の原核または真核細胞のより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変することができる。
【０１２３】
Ｃ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム
本明細書に開示の方法は、細胞内のゲノムを改変するために、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムまたはこのようなシステムの構成要素を利用し得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、転写物及びＣａｓ遺伝子の発現に関与するか、またはその活性を導く他の要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型システムとし得る。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば、Ｖ型システム（例えば、サブタイプＶ−ＡまたはサブタイプＶ−Ｂ）とし得る。本明細書に開示の方法及び組成物は、核酸の部位特異的切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体化したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによりＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用い得る。
【０１２４】
本明細書に開示の方法に使用されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、天然に存在しない。「天然に存在しない」システムは、天然に存在する段階から変更もしくは変異させる、それらが事実上天然に関連する少なくとも１つの他の構成要素が少なくとも実質上ない、またはそれらが天然に関連しない少なくとも１つの他の構成要素と関連する、システムの１つ以上の構成要素などの、人の手の関与を示すものを含む。例えば、一部のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、天然には一緒に生じないｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ複合体を用いる。
【０１２５】
（１）Ｃａｓタンパク質
Ｃａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、以下により詳細に記載される）と相互作用し得る少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及び他のドメインも含み得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の破断を含む核酸切断のための触媒活性を有する。切断は、平滑末端または付着末端を生成し得、それは、一本鎖または二本鎖とし得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は通常、平滑切断産物を生成するであろう。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は、５−ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する切断産物をもたらす可能性があり、切断は、非標的鎖上のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後ろで、且つ標的鎖上の２３番目の後ろで生じる。Ｃａｓタンパク質は、Ｆｂｎ１遺伝子の二本鎖破断（例えば、平滑末端を有する二本鎖破断）を生成するための完全な切断活性を有し得るか、またはそれは、Ｆｂｎ１遺伝子の一本鎖破断を生成するニッカーゼとし得る。
【０１２６】
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６、ならびにそのホモログまたは改変バージョンが挙げられる。
【０１２７】
好ましくは、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＣａｓ９タンパク質に由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムからのものであり、通常、保存されたアーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、及び４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａ��ｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、またはＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーのさらなる例は、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３に記載される。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられる）が好ましい酵素である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられる）が別の好ましい酵素である。
【０１２８】
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  １からのＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニン富化クラスターとの対応物を伴うＣａｓ９の対応するドメインと相同のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかし、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠損しており、ＲｕｖＣ様ドメインは、それがＨＮＨドメインを含む長いインサートを含有するＣａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１配列において隣接している。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  １６３（３）：７５９−７７１を参照のこと。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＣ２０１７  １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ  ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ｑ７Ｑ２が割り当てられる）は、好ましい酵素である。
【０１２９】
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、事実上生じるもの）、改変Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質多様体）、または野生型もしくは改変Ｃａｓタンパク質のフラグメントとし得る。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または改変Ｃａｓタンパク質の活性多様体またはフラグメントとし得る。活性多様体またはフラグメントは、野生型もしくは改変Ｃａｓタンパク質またはそれらの部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含み得、活性多様体は、所望の切断部位で切断し、これ以降、ニック誘導または二本鎖破断誘導活性を保持する能力を保持する。ニック誘導または二本鎖破断誘導活性についてのアッセイは、既知であり、一般に、切断部位を含有するＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性及び特異性を測定する。
【０１３０】
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、及び酵素活性のうちの１つ以上を増加または減少させるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質は、安定性などのタンパク質の他の任意の活性または特性を変えるために改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインを修飾、欠失、もしくは不活化することができるか、またはＣａｓタンパク質は、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するために、もしくはＣａｓタンパク質の活性を最適化（例えば、増強もしくは低減）するために、切断することができる。
【０１３１】
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は一般に、おそらく、二量体配置で標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインはそれぞれ、ＤＮＡにおける二本鎖破断を行う二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断し得る。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＪｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１を参照のこと。
【０１３２】
ヌクレアーゼドメインの一方または両方は、それらがもはや機能的ではないか、またはヌクレアーゼ活性の低減を有するように、欠失または変異させることができる。ヌクレアーゼドメインの１つが、欠失または変異している場合、得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、ニッカーゼと呼ぶことができ、二本鎖ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列で一本鎖破断を生じさせることができるが、二本鎖破断を生じない（すなわち、それは、相補鎖または非相補鎖を切断することができるが、両方を切断することができない）。ヌクレアーゼドメインの両方が欠失または変異している場合、得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力の低減を有するであろう（例えば、ヌクレアーゼヌルＣａｓタンパク質）。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位でのアスパラギン酸塩からアラニンへの）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインのＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位でヒスチジンからアラニンへ）またはＨ８４０Ａ（アミノ酸８４０位のヒスチジンからアラニンへ）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例としては、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９への対応する変異が挙げられる。例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９：９２７５−９２８２及びＷＯ２０１３／１４１６８０（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。このような変異は、部位特異的変異導入、ＰＣＲ媒介変異導入、または全遺伝子合成などの方法を使用して生成することができる。ニッカーゼを生成する他の変異の例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２及びＷＯ２０１３／１４２５７８に見出すことができ、これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる。
【０１３３】
Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、切断ドメイン、エピジェネティック改変ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写リプレッサードメインに融合させることができる。あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照のこと。ＣＡＳタンパク質は、安定性の増加または減少を提供する異種ポリペプチドに融合させることもできる。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の内部に位置し得る。
【０１３４】
Ｃａｓ融合タンパク質の例は、細胞内局在をもたらす異種ポリペプチドに融合したＣａｓタンパク質である。このような異種ポリペプチドは、例えば、核を標的とするＳＶ４０  ＮＬＳ、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどの１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＬａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１−５１０５を参照のこと。このような細胞内局在化シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内のどこかに位置し得る。ＮＬＳは、塩基性アミノ酸のストレッチを含み得、単節型配列または双節型配列とし得る。
【０１３５】
Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ドメインに作動可能に連結することもできる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来し得る。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照のこと。細胞透過ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内のどこかに位置し得る。
【０１３６】
Ｃａｓタンパク質は、追跡または精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結することもできる。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、単量体アザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン色蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、橙赤色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。
【０１３７】
Ｃａｓ９タンパク質は、外因性修復テンプレートまたは標識核酸に連結することもできる。このような連結（すなわち、物理的連結）は、共有相互作用または非共有相互作用を介して達成することができ、連結は、直接的である（例えば、タンパク質上のシステインまたはリシン残基の修飾またはインテイン修飾により達成することができる直接融合または化学的コンジュゲートを介する）ことができるか、あるいはストレプトアビジンまたはアプタマーなどの１つ以上の介在するリンカーまたはアダプター分子を介して達成することができる。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５（１）：４１−５５；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（４６）：８８１９−８８２２；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ａｎｄ  Ｄｉｘｏｎ（２００９）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２（１０）：１３２８−１３３２；Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１０（９）：１５５１−１５５７；及びＫｈａｔｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０（１４）：４５３２−４５３９（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。タンパク質−核酸コンジュゲートを合成するための非共有方策は、ビオチン−ストレプトアビジン及びニッケル−ヒスチジン法を含む。共有結合タンパク質−核酸コンジュゲートは、多種多様の化学作用を使用して適切に官能化された核酸及びタンパク質を連結することにより合成することができる。これらの化学作用の一部は、オリゴヌクレオチドのタンパク質表面上のアミノ酸残基（例えば、リシンアミンまたはシステインチオール）への直接結合を含むが、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾、または触媒性もしくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質の核酸への共有結合のための方法は、例えば、オリゴヌクレオチドのタンパク質リシンまたはシステイン残基への化学的架橋、タンパク質ライゲーションの発現、化学酵素的方法、及び光アプタマーの使用を含み得る。外因性修復テンプレートまたは標識核酸は、Ｃ末端、Ｎ末端、またはＣａｓ９タンパク質内の内部領域に連結することができる。好ましくは、外因性修復テンプレートまたは標識核酸は、Ｃａｓ９タンパク質のＣ末端またはＮ末端に連結される。同様に、Ｃａｓ９タンパク質は、外因性修復テンプレートもしくは標識核酸内の５’末端、３’末端、または内部領域に連結することができる。つまり、外因性修復テンプレートまたは標識核酸は、任意の向き及び極性で連結することができる。好ましくは、Ｃａｓ９タンパク質は、外因性修復テンプレートまたは標識核酸の５’末端または３’末端に連結される。
【０１３８】
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合化されたＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供することができる。任意に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または目的の他の任意の宿主細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞に導入される時に、ＣＡＳタンパク質は、細胞において一過性で、条件付きで、または構成的に発現させることができる。
【０１３９】
Ｃａｓタンパク質をコード核酸は、細胞のゲノムに安定的にインテグレートすることができ、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物においてプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物は、目的の遺伝子または他の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現に向けることが可能であり、且つこのような目的の核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核酸インサートを含む標的化ベクター及び／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターに存在し得る。あるいは、それは、核酸インサートを含む標的化ベクターから分離しており、及び／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターから分離しているベクターまたはプラスミドに存在し得る。発現構築物に使用することができるプロモーターは、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、または接合体のうちの１つ以上において活性なプロモーターを含む。このようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターとし得る。任意に、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質及び他方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向性プロモーターとし得る。このような双方向性プロモーターは、（１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、及びＴＡＴＡボックスを含有する完全な従来の一方向性Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、ならびに、（２）逆方向にＤＳＥの５’末端に融合されたＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを含む第２の基本Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、で構成され得る。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥは、ＰＳＥ、及びＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、逆方向の転写がＵ６プロモーターに由来するＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを付加することにより制御されるハイブリッドプロモーターを生成することにより、双方向性にすることができる。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照のこと。Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡをコードする遺伝子を発現する双方向性プロモーターの使用は同時に、送達を容易にするためのコンパクトな発現カセットの生成を可能にする。
【０１４０】
（２）ガイドＲＮＡ
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、且つＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡ（例えば、Ｆｂｎ１遺伝子）内の特定の場所への標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント：「ＤＮＡ標的化セグメント」及び「タンパク質結合セグメント」を含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡにおけるヌクレオチドの連続したストレッチなどの分子のセクションまたは領域を含む。一部のｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子：「アクチベーターＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び「ターゲッターＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を含む。他のｇＲＮＡは、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれ得る単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）である。例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、及びＷＯ２０１４／１３１８３３（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。Ｃａｓ９の場合、例えば、単一ガイドＲＮＡは、（例えば、リンカーを介して）ｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含み得る。Ｃｐｆ１の場合、例えば、ｃｒＲＮＡのみが、切断を達成するのに必要とされる。「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、二分子ｇＲＮＡ及び単分子ｇＲＮＡの両方を含む。
【０１４１】
例示的な二分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「足場」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）及びｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチの両方を含む。
【０１４２】
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチに相補的であり、これとハイブリダイゼーションして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡの二重鎖を形成する。そのようなものであるから、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言うことができる。
【０１４３】
ｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡを形成するためにハイブリダイゼーションする。ｃｒＲＮＡのみが必要とされる系では、ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡとし得る。ｃｒＲＮＡはさらに、ガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。細胞内の改変に使用される場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的であるように設計することができる。例えば、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７−２２９；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３−２３９；及びＣｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−８２３（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０１４４】
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡの配列（すなわち、ガイドＲＮＡ認識配列）に相補的なヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対）を介して、配列特異的な方法で、標的ＤＮＡ（例えば、Ｆｂｎ１遺伝子）と相互作用する。そのようなものであるから、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、変動し得、ｇＲＮＡ及び標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の場所を決定する。主題のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイゼーションするように改変することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム及び生物に応じて異なるが、多くの場合、２１〜４６ヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）が隣接した２１〜７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含有する（例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３を参照のこと）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは、３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは、３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、これとハイブリダイゼーションし、これは、次々、Ｃａｓタンパク質と結合する。
【０１４５】
ＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、または少なくとも約４０ヌクレオチドの長さを有することができる。このようなＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、または約１２ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド（例えば、約１７ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、または約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド）とし得る。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１６／００２４５２３を参照のこと。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、代表的なＤＮＡ標的セグメントは、長さが１６〜２０ヌクレオチドまたは長さが１７〜２０ヌクレオチドである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９場合、代表的なＤＮＡ標的化セグメントは、長さが２１〜２３ヌクレオチドである。Ｃｐｆ１の場合、代表的なＤＮＡ標的化セグメントは、長さが少なくとも１６ヌクレオチドまたは長さが少なくとも１８ヌクレオチドである。
【０１４６】
ＴｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び様々な長さであり得る。それらは、一次転写産物または処理された形態を含み得る。例えば、（単一ガイドＲＮＡの一部として、または２分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）ｔｒａｃｒＲＮＡは、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全部または一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０以上、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、もしくはそれ以上のヌクレオチド）を含むか、またはこれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、及び６５ヌクレオチドのバージョンを含む。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７１：６０２−６０７；ＷＯ２０１４／０９３６６１（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、＋４８、＋５４、＋６７、及び＋８５バージョンのｓｇＲＮＡ内に見られるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれていることを示す。全ての目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＵＳ８，６９７，３５９を参照のこと。
【０１４７】
標的ＤＮＡ内のＤＮＡ標的配列及びガイドＲＮＡ認識配列の間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）とし得る。標的ＤＮＡ内のＤＮＡ標的配列及びガイドＲＮＡ認識配列の間の相補性パーセントは、約２０連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％とし得る。一例として、標的ＤＮＡ内のＤＮＡ標的配列及びガイドＲＮＡ認識配列の間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の５’末端にある１４連続ヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの部分にわたって限りなく０％である。この場合では、ＤＮＡ標的配列は、長さが１４ヌクレオチドであると考えることができる。別の例として、標的ＤＮＡ内のＤＮＡ標的配列及びガイドＲＮＡ認識配列の間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の５’末端にある７連続ヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの部分にわたって限りなく０％である。この場合では、ＤＮＡ標的配列は、長さが７ヌクレオチドであると考えることができる。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的配列内の少なくとも１７ヌクレオチドが、標的ＤＮＡに相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化配列は、長さが２０ヌクレオチドとし得、標的ＤＮＡ（ガイドＲＮＡ認識配列）との１、２、または３つのミスマッチを含み得る。好ましくは、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ＤＮＡ標的化配列の５’末端にあるか、またはミスマッチは、ＰＡＭ配列から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９塩基対離れている）。
【０１４８】
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的なヌクレオチドの２つのストレッチを含み得る。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成するためにハイブリダイゼーションする。主題のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ標的セグメントを介して、結合Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に導く。
【０１４９】
ガイドＲＮＡは、さらなる望ましい特徴（例えば、改変または制御された安定性；細胞内標的化；蛍光標識を用いる追跡；タンパク質またはタンパク質複合体に対する結合部位など）を提供する改変または配列を含み得る。このような改変の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニラートキャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）；（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質複合体による制御された安定性及び／または制御されたアクセシビリティを可能にする）リボスイッチ配列；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する改変または配列；追跡（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）を提供する改変または配列；タンパク質（例えば、転写アクチベーター、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）に対する結合部位を提供する改変または配列；ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１５０】
ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供することができる。例えば、ｇＲＮＡは、２分子（別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）または１分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとしてのＲＮＡの形態で、任意に、Ｃａｓタンパク質との複合体の形態で、提供することができる。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により調製することができる（例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０及びＷＯ２０１４／０６５５９６（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）。ガイドＲＮＡは、化学合成により調製することもできる。
【０１５１】
ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供することもできる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または別々のＲＮＡ分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードし得る。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、またはそれぞれｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別々のＤＮＡ分子として提供することができる。
【０１５２】
ｇＲＮＡがＤＮＡの形態で提供される時、ｇＲＮＡは、細胞において一過性で、条件付きで、または構成的に発現させることができる。ｇＲＮＡｓをコードするＤＮＡが、細胞のゲノムに安定的にインテグレートすることができ、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物のプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、外因性修復テンプレートを含むベクター及び／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターに存在し得る。あるいは、それは、外因性修復テンプレートを含むベクター及び／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターから分離するベクターまたはプラスミドに存在し得る。このような発現構築物に使用することができるプロモーターは、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、または接合体のうちの１つ以上において活性なプロモーターを含む。このようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターとし得る。このようなプロモーターはまた、例えば、双方向性プロモーターとし得る。好適なプロモーターの具体例は、ヒトＵ６プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。
【０１５３】
（３）ガイドＲＮＡ認識配列
「ガイドＲＮＡ認識配列」という用語は、結合に十分な条件が存在するという条件で、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合するであろう標的ＤＮＡ（例えば、Ｆｂｎ１遺伝子）に存在する核酸配列を含む。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列は、ガイドＲＮＡが相補性を有するように設計される配列を含み、ガイドＲＮＡ認識配列及びＤＮＡ標的化配列の間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全な相補性は、必ずしも必要ではない。但し、ハイブリダイゼーションを引き起こし、且つＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在する。ガイドＲＮＡ認識配列は、以下により詳細に記載されるＣａｓタンパク質の切断部位も含む。ガイドＲＮＡ認識配列は、例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体などの、細胞の核もしくは細胞質中に、または細胞の小器官内に、位置し得る任意のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１５４】
標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列は、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡにより標的とする（すなわち、これにより結合するか、またはこれとハイブリダイゼーションするか、またはこれに相補的である）ことができる。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件は、細胞に通常存在する生理学的条件を含む。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野において既知である（例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）を参照のこと）。ＣＡＳタンパク質またはｇＲＮＡと相補的であり、且つ、これらとハイブリダイゼーションする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と呼ぶことができ、「相補鎖」と相補的である（且つ、それ故、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡと相補的でない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「テンプレート鎖」と呼ぶことができる。
【０１５５】
Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列の内側または外側の部位で核酸を切断し得る。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖破断または二本鎖破断を生成する核酸の位置を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体（ガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイゼーションし、且つＣａｓタンパク質と複合体を形成したｇＲＮＡを含む）の形成は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列の、またはその近傍（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対以内）の鎖の一方または両方の切断をもたらし得る。切断部位がｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する核酸配列の外側にある場合、切断部位は依然として「ガイドＲＮＡ認識配列」内に存在すると考えられる。切断部位は、１つの鎖上のみに、または核酸の両方の鎖上に存在し得る。切断部位は、（平滑末端を生成する）核酸の両方の鎖上の同じ位置に存在し得るか、または各鎖上の異なる部位に存在し得る（付着末端（すなわち、オーバーハング）を生成する）。付着末端は、例えば、２つのＣａｓタンパク質を使用することにより生成することができ、これらのそれぞれは、異なる鎖上の異なる切断部位に一本鎖破断を生成して、それにより、二本鎖破断を生成する。例えば、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖破断を生じ得、第２のニッカーゼは、オーバーハング配列が生じるようにｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖破断を生じ得る。一部の場合では、第１の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列は、第２の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列から、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対離れている。
【０１５６】
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的切断は、標的ＤＮＡ内において、（ｉ）ｇＲＮＡ及び標的ＤＮＡの間の塩基対相補性、及び（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフ、の両方により決定される場所で生じ得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡ認識配列に隣接し得る。任意に、ガイドＲＮＡ認識配列は、３’末端上でＰＡＭに隣接することができる。あるいは、ガイドＲＮＡ認識配列は、５’末端上でＰＡＭに隣接することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の約１〜約１０または約２〜約５塩基対（例えば、３塩基対）上流または下流に存在し得る。（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９または密接に関連するＣａｓ９が使用される）一部の場合では、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−Ｎ１ＧＧ−３’とすることができ、Ｎ１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの非相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列の３’近くに存在する。そのようなものであるから、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＮ２−３’であり、Ｎ２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列の５’のすぐ近くに存在する。このような一部の場合では、Ｎ１及びＮ２は、相補的であり得、Ｎ１−Ｎ２塩基対は、任意の塩基対（例えば、Ｎ１＝Ｃ及びＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝Ｇ及びＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝Ａ及びＮ２＝Ｔ；またはＮ１＝Ｔ、ならびにＮ２＝Ａ）とし得る。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号１４６）またはＮＮＧＲＲ（配列番号１４７）とし得、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴとし得、Ｒは、ＧまたはＡとし得る。一部の場合（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）では、ＰＡＭ配列は、５’末端の上流に存在し得、５’−ＴＴＮ−３’の配列を有し得る。
【０１５７】
ガイドＲＮＡ認識配列の例としては、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと相補的なＤＮＡ配列、またはＰＡＭ配列に加えて、このようなＤＮＡ配列が挙げられる。例えば、標的モチーフは、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号３９）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号４０）などのＣａｓ９タンパク質で認識されたＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドＤＮＡ配列とし得る（例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＷＯ２０１４／１６５８２５を参照のこと）。５’末端のグアニンは、細胞のＲＮＡポリメラーゼによる転写を容易にし得る。ガイドＲＮＡ認識配列の他の例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を容易にするために、５’末端に２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号４１）を含み得る。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＷＯ２０１４／０６５５９６を参照のこと。５’ＧまたはＧＧ及び３’ＧＧまたはＮＧＧを含む他のガイドＲＮＡ認識配列は、配列番号３９〜４１の、長さが４〜２２ヌクレオチドを有し得る。さらに、他のガイドＲＮＡ認識配列は、配列番号３９〜４１の、長さが１４〜２０ヌクレオチドを有し得る。
【０１５８】
ガイドＲＮＡ認識配列は、細胞に対して内因性または外因性の任意の核酸配列とし得る。ガイドＲＮＡ認識配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列もしくは非コード配列（例えば、制御配列）とすることができるか、または両方を含み得る。
【０１５９】
Ｄ．外因性修復テンプレート
本明細書に開示の方法及び組成物は、ヌクレアーゼ物質を用いるＦｂｎ１遺伝子の切断後に、Ｆｂｎ１遺伝子を改変する外因性修復テンプレートを利用し得る。例えば、細胞は、１細胞期胚とし得、外因性修復テンプレートは、長さが５ｋｂ未満とし得る。１細胞期胚以外の細胞型では、外因性修復テンプレート（例えば、標的化ベクター）は、より長いものとし得る。例えば、１細胞期胚以外の細胞型では、外因性修復テンプレートは、本明細書の他の箇所に記載されているように、大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）（例えば、少なくとも１０ｋｂの長さを有するか、または合計が少なくとも１０ｋｂの５’及び３’ホモロジーアームを有する標的化ベクター）とし得る。ヌクレアーゼ物質と組み合わせて外因性修復テンプレートを使用することは、相同性指向修復を促進することによりＦｂｎ１遺伝子内に、より正確な改変をもたらし得る。
【０１６０】
このような方法では、ヌクレアーゼ物質は、一本鎖破断（ニック）または二本鎖破断を生成するためにＦｂｎ１遺伝子を切断し、外因性修復テンプレートは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介ライゲーションを介し、または相同性指向修復事象により、Ｆｂｎ１遺伝子を組み換える。任意に、外因性修復テンプレートを用いる修復は、ヌクレアーゼ切断部位を除去または破壊し、従って、標的とされている対立遺伝子は、ヌクレアーゼ物質により再標的化することができない。
【０１６１】
外因性修復テンプレートは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得、それらは、一本鎖または二本鎖とし得、それらは、線状または環状形態をとり得る。例えば、外因性修復テンプレートは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）とし得る。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＹｏｓｈｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１０４３１を参照のこと。例示的な外因性修復テンプレートは、長さが約５０〜約５ｋｂヌクレオチド、長さが約５０〜約３ｋｂヌクレオチド、または長さが約５０〜約１，０００ヌクレオチドである。他の例示的な外因性修復テンプレートは、長さが約４０〜約２００ヌクレオチドである。例えば、外因性修復テンプレートは、長さが約５０〜約６０、約６０〜約７０、約７０〜約８０、約８０〜約９０、約９０〜約１００、約１００〜約１１０、約１１０〜約１２０、約１２０〜約１３０、約１３０〜約１４０、約１４０〜約１５０、約１５０〜約１６０、約１６０〜約１７０、約１７０〜約１８０、約１８０〜約１９０、または約１９０〜約２００ヌクレオチドとし得る。あるいは、外因性修復テンプレートは、長さが約５０〜約１００、約１００〜約２００、約２００〜約３００、約３００〜約４００、約４００〜約５００、約５００〜約６００、約６００〜約７００、約７００〜約８００、約８００〜約９００、または約９００〜約１，０００ヌクレオチドとし得る。あるいは、外因性修復テンプレートは、長さが約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約４．５ｋｂ、または約４．５ｋｂ〜約５ｋｂとし得る。あるいは、外因性修復テンプレートは、例えば、長さが５ｋｂ以下、４．５ｋｂ、４ｋｂ、３．５ｋｂ、３ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ、９００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、または５０ヌクレオチドとし得る。１細胞期胚以外の細胞型では、外因性修復テンプレート（例えば、標的化ベクター）は、より長いものとし得る。例えば、１細胞期胚以外の細胞型では、外因性修復テンプレートは、本明細書の他の箇所に記載されているような大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）とし得る。
【０１６２】
一例では、外因性修復テンプレートは、長さが約８０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドのｓｓＯＤＮである。別の例では、外因性修復テンプレートは、長さが約８０ヌクレオチド〜約３ｋｂのｓｓＯＤＮである。このようなｓｓＯＤＮは、例えば、それぞれ長さが約４０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドのホモロジーアームを有し得る。このようなｓｓＯＤＮは、例えば、長さがそれぞれ約３０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドのホモロジーアームも有し得る。ホモロジーアームは、対称的（例えば、それぞれ、長さが各４０ヌクレオチドもしくは各６０ヌクレオチド）であり得るか、または、それらは、非対称的（例えば、長さが３６ヌクレオチドの１つのホモロジーアーム及び長さが９１ヌクレオチドの１つのホモロジーアーム）であり得る。
【０１６３】
外因性修復テンプレートは、さらなる望ましい特徴（例えば、改変または制御された安定性；蛍光標識を用いる追跡または検出；タンパク質またはタンパク質複合体に対する結合部位など）を提供する改変または配列を含み得る。外因性修復テンプレートは、１つ以上の蛍光標識、精製タグ、エピトープタグ、またはそれらの組み合わせを含み得る。例えば、外因性修復テンプレートは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの蛍光標識などの１つ以上の蛍光標識（例えば、蛍光タンパク質または他の蛍光団もしくは染料）を含み得る。例示的な蛍光標識としては、蛍光団（例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ））、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）ならびにＣｙ７などの蛍光体が挙げられる。オリゴヌクレオチドを標識するための広範囲の蛍光染料（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）が市販されている。このような蛍光標識（例えば、内部蛍光標識）は、例えば、外因性修復テンプレートの末端と適合する突出末端を有する切断されたＦｂｎ１遺伝子に直接インテグレートされている外因性修復テンプレートを検出するために使用することができる。標識またはタグは、５’末端、３’末端、または外因性修復テンプレートの内部に存在し得る。例えば、外因性修復テンプレートは、５’末端で、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＩＲ７００蛍光団（５’ＩＲＤＹＥ（登録商標）７００）と共にコンジュゲートすることができる。
【０１６４】
外因性修復テンプレートは、Ｆｂｎ１遺伝子にインテグレートされるべきＤＮＡのセグメントを含む核酸インサートも含み得る。核酸インサートのＦｂｎ１遺伝子へのインテグレーションは、Ｆｂｎ１遺伝子における目的の核酸配列の付加、Ｆｂｎ１遺伝子における目的の核酸配列の欠失、またはＦｂｎ１遺伝子における目的の核酸配列の置換（すなわち、欠失及び挿入）をもたらし得る。一部の外因性修復テンプレートは、Ｆｂｎ１遺伝子におけるあらゆる対応する欠失なしに、Ｆｂｎ１遺伝子における核酸インサートの挿入のために設計される。他の外因性修復テンプレートは、あらゆる対応する核酸インサートの挿入なしに、Ｆｂｎ１遺伝子において目的の核酸配列を欠失させるように設計される。さらに他の外因性修復テンプレートは、Ｆｂｎ１遺伝子において目的の核酸配列を欠失させ、それを核酸インサートと置換するように設計される。
【０１６５】
欠失及び／または置換されるＦｂｎ１遺伝子における核酸インサートまたは対応する核酸は、種々の長さとし得る。欠失及び／または置換されるＦｂｎ１遺伝子における例示的な核酸インサートまたは対応する核酸は、長さが約１ヌクレオチド〜約５ｋｂ、または長さが約１ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチドである。例えば、欠失及び／または置換されているＦｂｎ１遺伝子における核酸インサートまたは対応する核酸は、長さが約１〜約１０、約１０〜約２０、約２０〜約３０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５０〜約６０、約６０〜約７０、約７０〜約８０、約８０〜約９０、約９０〜約１００、約１００〜約１１０、約１１０〜約１２０、約１２０〜約１３０、約１３０〜約１４０、約１４０〜約１５０、約１５０〜約１６０、約１６０〜約１７０、約１７０〜約１８０、約１８０〜約１９０、または約１９０〜約２００ヌクレオチドとし得る。同様に、欠失及び／または置換されているＦｂｎ１遺伝子における核酸インサートまたは対応する核酸は、長さが約１〜約１００、約１００〜約２００、約２００〜約３００、約３００〜約４００、約４００〜約５００、約５００〜約６００、約６００〜約７００、約７００〜約８００、約８００〜約９００、または約９００〜約１，０００ヌクレオチドとし得る。同様に、欠失及び／または置換されるＦｂｎ１遺伝子における核酸インサートまたは対応する核酸は、長さが約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約４．５ｋｂ、または約４．５ｋｂ〜約５ｋｂとし得る。Ｆｂｎ１遺伝子から欠失される核酸はまた、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜約９００ｋｂ、約９００ｋｂ〜約１Ｍｂまたはそれ以上とし得る。あるいは、Ｆｂｎ１遺伝子から欠失される核酸は、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂ、約３Ｍｂ〜約４Ｍｂ、約４Ｍｂ〜約５Ｍｂ、約５Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、または約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂとし得る。
【０１６６】
核酸インサートは、ゲノムＤＮＡまたは他の任意の種類のＤＮＡを含み得る。例えば、核酸インサートは、原核生物、真核生物、酵母、鳥（例えば、ニワトリ）、非ヒト哺乳動物、齧歯類、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）、家畜哺乳動物、農業哺乳動物、カメ、または目的の他の任意の生物に由来し得る。
【０１６７】
核酸インサートは、Ｆｂｎ１遺伝子の全部または一部（例えば、フィブリリン−１タンパク質の特定のモチーフまたは領域をコードする遺伝子の一部）に対して相同またはオーソログである配列を含み得る。相同配列は、異なる種または同じ種に由来し得る。例えば、核酸インサートは、Ｆｂｎ１遺伝子における置換のために標的とされる配列と比較して、１つ以上の点変異（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）を含む配列を含み得る。一部の場合では、核酸インサートは、ヒトＦｂｎ１配列である。核酸インサートの挿入が、Ｆｂｎ１非ヒト核酸配列の全部または一部の、対応するオーソログヒト核酸配列との置換をもたらす場合、これは、非ヒト動物におけるＦｂｎ１遺伝子座の全部または一部のヒト化をもたらし得る（すなわち、核酸インサートは、その内因性ゲノム遺伝子座で対応する非ヒトＤＮＡ配列の代わりに挿入される）。挿入されるヒト配列は、ヒトＦｂｎ１遺伝子に１つ以上の変異をさらに含み得る。
【０１６８】
欠失及び／または置換されるＦｂｎ１遺伝子における核酸インサートまたは対応する核酸は、エクソンなどのコード領域；イントロン、非翻訳領域、もしくは制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、もしくは転写リプレッサー結合要素）などの非コード領域；またはそれらの任意の組み合わせとし得る。
【０１６９】
核酸インサートは、条件付き対立遺伝子も含み得る。条件付き対立遺伝子は、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されているように、多機能対立遺伝子とし得る。例えば、条件付き対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス方向の作動配列；（ｂ）センスまたはアンチセンス方向の薬物選択カセット（ＤＳＣ）；（ｃ）アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）；ならびに（ｄ）逆方向の反転モジュール（エクソン分割イントロン及び可逆遺伝子トラップ様モジュールを利用するＣＯＩＮ）による条件、を含み得る。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照のこと。条件付き対立遺伝子は、（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠損しており、且つ、（ｉｉ）センス方向にＮＳＩ及びアンチセンス方向にＣＯＩＮを含有する、条件付き対立遺伝子を形成するために、第１のリコンビナーゼへの曝露時に組み換える組み換え可能な単位をさらに含み得る。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照のこと。
【０１７０】
核酸インサートは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドも含み得る。あるいは、核酸インサートは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを欠損し得る。選択マーカーは、選択カセットに含まれ得る。任意に、選択カセットは、自己欠失カセットとし得る。例えば、これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＵＳ８，６９７，８５１及びＵＳ２０１３／０３１２１２９を参照のこと。一例として、自己欠失カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子（イントロンにより分離されているＣｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンを含む）及びヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。Ｐｒｍ１プロモーターを用いることにより、自己欠失カセットは、Ｆ０動物の雄生殖細胞において特異的に欠失させることができる。例示的な選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、もしくは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的とされる細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【０１７１】
核酸インサートは、レポーター遺伝子も含み得る。例示的なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びアルカリホスファターゼをコードするものが挙げられる。このようなレポーター遺伝子は、標的とされている細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【０１７２】
核酸インサートは、１つ以上の発現カセットまたは欠失カセットも含み得る。所与のカセットは、発現に影響を与える種々の制御構成要素と共に、目的のヌクレオチド配列、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、及びレポーター遺伝子のうちの１つ以上を含み得る。含まれ得る選択マーカー及びレポーター遺伝子の例は、本明細書の他の箇所で詳細に考察されている。
【０１７３】
核酸インサートは、部位特異的組み換え標的配列に隣接した核酸を含み得る。あるいは、核酸インサートは、１つ以上の部位特異的組み換え標的配列を含み得る。核酸インサート全体がこのような部位特異的組み換え標的配列に隣接させることができるが、核酸インサート内の目的の任意の領域または個々のポリヌクレオチドは、このような部位に隣接させることもできる。核酸インサートまたは核酸インサートにおける任意の目的のポリヌクレオチドに隣接し得る部位特異的組み換え標的配列は、例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、またはそれらの組み合わせを含み得る。一例では、部位特異的組み換え部位は、核酸インサート内に含有される選択マーカー及び／またはレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドに隣接する。核酸インサートのＦｂｎ１遺伝子へのインテグレーション後に、部位特異的組み換え部位間の配列を除去することができる。任意に、２つの外因性修復テンプレートは、それぞれ、部位特異的組み換え部位を含む核酸インサートと共に使用することができる。外因性修復テンプレートは、目的の核酸に隣接する５’及び３’領域を標的化することができる。２つの核酸インサートの標的ゲノム遺伝子座へのインテグレーション後に、２つの挿入された部位特異的組み換え部位の間の目的の核酸を除去することができる。
【０１７４】
核酸インサートは、制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、制限酵素）のための１つ以上の制限部位も含み得、これは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型エンドヌクレアーゼを含む。Ｉ型及びＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特異的な認識配列を認識するが、通常は、切断部位（認識配列）から数百塩基対離れて存在し得るヌクレアーゼ結合部位からの可変位置で切断する。ＩＩ型系では、制限活性は、任意のメチラーゼ活性に依存せず、切断は通常、結合部位内の、またはその近傍の特定の部位で生じる。ほとんどのＩＩ型酵素は、パリンドローム配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は、非パリンドローム認識配列を認識し、認識配列の外側で切断し、ＩＩｂ型酵素は、認識配列の外側の両方の部位で配列を２回切断し、ＩＩｓ型酵素は、非対称認識配列を認識し、片側で且つ認識配列から約１〜２０ヌクレオチドの定義された距離で切断する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的とする。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：１８０５−１８１２；及びＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ｉｎ  Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ  ＩＩ，ｐｐ．７６１−７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）にさらに記載及び分類される。
【０１７５】
（１）非相同末端結合媒介挿入のための修復テンプレート
一部の外因性修復テンプレートは、（例えば、Ｆｂｎ１遺伝子の）標的ゲノム遺伝子座でのＣａｓタンパク質媒介切断により生成される１つ以上のオーバーハングと相補的な５’末端及び／または３’末端に短い一本鎖領域を有する。これらのオーバーハングは、５’及び３’ホモロジーアームと呼ぶこともできる。例えば、一部の外因性修復テンプレートは、標的ゲノム遺伝子座の５’及び／または３’標的配列でのＣａｓタンパク質媒介切断により生成される１つ以上のオーバーハングと相補的な５’末端及び／または３’末端に短い一本鎖領域を有する。このような一部の外因性修復テンプレートは、５’末端のみに、または３’末端のみに、相補的領域を有する。例えば、このような一部の外因性修復テンプレートは、標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列に生成されるオーバーハングに相補的な５’末端のみで、または標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列に生成されるオーバーハングに相補的な３’末端のみで、相補的領域を有する。他のこのような外因性修復テンプレートは、５’末端及び３’末端の両方に相補的領域を有する。例えば、このような他の外因性修復テンプレートは、例えば、標的ゲノム遺伝子座でのＣａｓ媒介切断により生成される第１及び第２のオーバーハングにそれぞれ相補的な５’末端及び３’末端の両方に、相補的領域を有する。例えば、外因性修復テンプレートが二本鎖である場合、一本鎖相補的領域は、修復テンプレートの上鎖の５’末端及び修復テンプレートの下鎖の５’末端から伸びて、各端に５’オーバーハングを生成し得る。あるいは、一本鎖相補的領域は、修復テンプレートの上鎖の３’末端から及びテンプレートの下鎖の３’末端から伸びて、３’オーバーハングを生成し得る。
【０１７６】
相補的領域は、外因性修復テンプレート及びＦｂｎ１遺伝子の間のライゲーションを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例示的な相補的領域は、長さが約１〜約５ヌクレオチド、約１〜約２５ヌクレオチド、または約５〜約１５０ヌクレオチドである。例えば、相補的領域は、長さが少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドとし得る。あるいは、相補的領域は、長さが約５〜約１０、約１０〜約２０、約２０〜約３０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５０〜約６０、約６０〜約７０、約７０〜約８０、約８０〜約９０、約９０〜約１００、約１００〜約１１０、約１１０〜約１２０、約１２０〜約１３０、約１３０〜約１４０、約１４０〜約１５０ヌクレオチドまたはそれ以上とし得る。
【０１７７】
このような相補的領域は、２対のニッカーゼにより生成されたオーバーハングに相補的であり得る。付着末端を有する２つの二本鎖破断は、第１の二本鎖破断を生成するＤＮＡの対向鎖を切断する第１及び第２のニッカーゼ、ならびに、第２の二本鎖破断を生成するＤＮＡの対向鎖を切断する第３及び第４のニッカーゼを使用することにより生成することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、第１、第２、第３、及び第４のガイドＲＮＡに対応する第１、第２、第３、及び第４のガイドＲＮＡ認識配列にニックを作るために使用することができる。第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列は、ＤＮＡの第１及び第２の鎖上の第１及び第２のニッカーゼで生成されたニックが、二本鎖破断を生成する（すなわち、第１の切断部位は、第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列内にニックを含む）ように、第１の切断部位を生成するために配置することができる。同様に、第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列は、ＤＮＡの第１及び第２の鎖上の第３及び第４のニッカーゼにより生成されたニックが、二本鎖破断を生成する（すなわち、第２の切断部位は、第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列内にニックを含む）ように、第２の切断部位を生成するために配置することができる。好ましくは、第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列及び／または第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列内のニックは、オーバーハングを生成するオフセットニックとし得る。オフセットウィンドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐまたはそれ以上とし得る。Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５４：１３８０−１３８９；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：８３３−８３８；及びＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１：３９９−４０４（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。このような場合には、第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列内のニックにより、且つ、第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列内のニックにより、生成されたオーバーハングに相補的な一本鎖の相補的領域を有する二本鎖外因性修復テンプレートを設計することができる。次に、このような外因性修復テンプレートは、非相同末端結合媒介ライゲーションにより挿入することができる。
【０１７８】
（２）相同性指向修復による挿入のための修復テンプレート
一部の外因性修復テンプレートは、ホモロジーアームを含む。外因性修復テンプレートが、核酸インサートも含む場合、ホモロジーアームは、核酸インサートに隣接することができる。言及を容易にするために、ホモロジーアームは、本明細書では５’及び３’（すなわち、上流及び下流）ホモロジーアームと呼ばれる。この用語は、外因性修復テンプレート内の核酸インサートに対するホモロジーアームの相対位置に関する。５’及び３’ホモロジーアームは、本明細書で、それぞれ「５’標的配列」及び「３’標的配列」と呼ばれるＦｂｎ１遺伝子内の領域に対応する。
【０１７９】
ホモロジーアーム及び標的配列は、２つの領域が相同組み換え反応の基質として作用するのに十分なレベルの配列同一性を互いに共有する時、互いに「対応する」または「対応している」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるか、または配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列及び外因性修復テンプレートに見られる対応するホモロジーアームの間の配列同一性は、相同組み換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であり得る。例えば、外因性修復テンプレート（またはそのフラグメント）のホモロジーアーム及び標的配列（またはそのフラグメント）により共有される配列同一性の程度は、配列が相同組み換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性であり得る。さらに、ホモロジーアーム及び対応する標的配列の間の対応する相同性領域は、相同組み換えを促進するのに十分である任意の長さであり得る。例示的なホモロジーアームは、長さが約２５〜約２．５ｋｂヌクレオチドであるか、長さが約２５〜約１．５ｋｂヌクレオチドであるか、または長さが約２５〜約５００ヌクレオチドである。例えば、所与のホモロジーアーム（またはホモロジーアームのそれぞれ）及び／または対応する標的配列は、Ｆｂｎ１遺伝子内の対応する標的配列を用いるホモロジーアームが相同組み換えを受けるのに十分な相同性を有するように、長さが約２５〜約３０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５０〜約６０、約６０〜約７０、約７０〜約８０、約８０〜約９０、約９０〜約１００、約１００〜約１５０、約１５０〜約２００、約２００〜約２５０、約２５０〜約３００、約３００〜約３５０、約３５０〜約４００、約４００〜約４５０、または約４５０〜約５００ヌクレオチドの対応する相同性領域を含み得る。あるいは、所与のホモロジーアーム（もしくは各ホモロジーアーム）及び／または対応する標的配列は、長さが約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、または約２ｋｂ〜約２．５ｋｂである相同性の対応する領域を含み得る。例えば、ホモロジーアームはそれぞれ、長さが約７５０ヌクレオチドとし得る。ホモロジーアームは、対称的（それぞれ、長さがほぼ同じサイズ）であり得るか、または非対称的（一方が他方よりも長い）であり得る。
【０１８０】
ホモロジーアームは、細胞に固有の遺伝子座（例えば、標的遺伝子座）に対応し得る。あるいは、例えば、それらは、例えば、導入遺伝子、発現カセット、またはＤＮＡの異種もしくは外因性領域を含む、細胞のゲノムにインテグレートされたＤＮＡの異種もしくは外因性セグメントの領域に対応し得る。あるいは、標的化ベクターのホモロジーアームは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体の領域、または適切な宿主細胞に含有される任意の他の操作された領域に対応し得る。さらに別の、標的化ベクターのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、もしくはＰ１ファージライブラリーの領域に対応するか、またはそれに由来し得るか、あるいは合成ＤＮＡに由来し得る。
【０１８１】
ヌクレアーゼ物質が外因性修復テンプレートと組み合わせて使用される場合、５’及び３’標的配列は、好ましくは、ヌクレアーゼ切断部位での一本鎖破断（ニック）または二本鎖破断時に、標的配列及び標的配列の間の相同組み換え事象の発生を促進するように、ヌクレアーゼ切断部位に十分近接して位置する。「ヌクレアーゼ切断部位」という用語は、ニックまたは二本鎖破断がヌクレアーゼ物質により生じるＤＮＡ配列（例えば、ガイドＲＮＡと複合化されたＣａｓ９タンパク質）を含む。ヌクレアーゼ切断部位における一本鎖破断または二本鎖破断時に、距離が５’及び３’標的配列とホモロジーアームの間の相同組み換え事象の発生を促進するようなものである場合、外因性修復テンプレートの５’及び３’ホモロジーアームに対応するＦｂｎ１遺伝子内の標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位に「十分に近接して位置する」。従って、外因性修復テンプレートの５’及び／または３’ホモロジーアームに対応する標的配列は、例えば、所与のヌクレアーゼ切断部位から少なくとも１ヌクレオチド以内または所与のヌクレアーゼ切断部位から少なくとも１０ヌクレオチド〜約１，０００のヌクレオチド以内に存在し得る。一例として、ヌクレアーゼ切断部位は、標的配列のうちの少なくとも一方または両方に直接隣接し得る。
【０１８２】
外因性修復テンプレートのホモロジーアーム及びヌクレアーゼ切断部位に対応する標的配列の空間的関係は変動し得る。例えば、標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位の５’側に位置し得るか、標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位の３’側に位置し得るか、または標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位に隣接し得る。
【０１８３】
１細胞期胚以外の細胞では、外因性修復テンプレートは、細胞において相同組み換えを実施することが意図される他のアプローチにより、通常使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、且つこれに由来するホモロジーアームを含む標的化ベクターを含む「大きな標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」とし得る。ＬＴＶＥＣは、細胞において相同組み換えを実施することを意図した他のアプローチにより、通常使用されるものよりも大きい核酸配列を有する核酸インサートを含む標的化ベクターも含む。例えば、ＬＴＶＥＣは、サイズの制限のために従来のプラスミドベースの標的化ベクターにより収容することができない大きな遺伝子座の改変を可能にする。例えば、標的遺伝子座は、従来の方法を使用して標的化可能でないか、または、ヌクレアーゼ物質（例えば、Ｃａｓタンパク質）により誘導されるニックもしくは二本鎖破断がない状態で、不正確でのみ、もしくは著しく低い効率でのみ、標的化することができる細胞の遺伝子座とし得る（すなわち、５’及び３’ホモロジーアームが、これに相当し得る）。
【０１８４】
ＬＴＶＥＣの例としては、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）に由来するベクターが挙げられる。ＬＴＶＥＣの非限定例及びそれらを作製するための方法は、例えば、米国特許第６，５８６，２５１号；同第６，５９６，５４１号；及び同第７，１０５，３４８号、ならびにＷＯ２００２／０３６７８９に記載され、これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる。ＬＴＶＥＣは、線形形態または円形形態をとり得る。
【０１８５】
ＬＴＶＥＣは、任意の長さであり得、通常は、長さが少なくとも１０ｋｂである。例えば、ＬＴＶＥＣは、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、または約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂとし得る。あるいは、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、または少なくとも５００ｋｂ以上とし得る。ＬＴＶＥＣのサイズは、大きすぎるので、従来のアッセイ、例えば、サザンブロッティング及び長距離（例えば、１ｋｂ〜５ｋｂ）ＰＣＲによる標的化事象のスクリーニングを可能にすることができない。
【０１８６】
ＬＴＶＥＣにおける５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームの合計は通常、少なくとも１０ｋｂである。一例として、５’ホモロジーアームは、約５ｋｂ〜約１００ｋｂに及び得、及び／または３’ホモロジーアームは、約５ｋｂ〜約１００ｋｂに及び得る。各ホモロジーアームは、例えば、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、または約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂとし得る。５’及び３’ホモロジーアームの合計は、例えば、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、または約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂとし得る。あるいは、各ホモロジーアームは、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂとし得る。同様に、５’及び３’ホモロジーアームの合計は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂとし得る。
【０１８７】
ＬＴＶＥＣは、細胞において相同組み換えを実施することを意図した他のアプローチにより、通常使用されるものよりも大きい核酸配列を有する核酸インサートを含み得る。例えば、ＬＴＶＥＣは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、またはそれ以上に及ぶ核酸インサートを含み得る。
【０１８８】
Ｅ．細胞のゲノムと接触すること及び核酸を細胞に導入すること
細胞のゲノムを接触させることは、１つ以上のヌクレアーゼ物質またはヌクレアーゼ物質をコードする核酸（例えば、１つ以上のＣａｓタンパク質または１つ以上のＣａｓタンパク質をコードする核酸、及び１つ以上のガイドＲＮＡまたは１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ）、及び／または１つ以上の外因性修復テンプレートを細胞に導入することを含み得る。但し、細胞が１細胞期胚である場合、例えば、外因性修復テンプレートは、長さが５ｋｂ未満であり得る。細胞のゲノムを接触させること（すなわち、細胞を接触させること）は、上記構成要素のうちの１つのみ、構成要素のうちの１つ以上、または構成要素のうちの全てを、細胞に導入することを含み得る。「導入すること」は、配列が細胞の内部に接近するように、核酸またはタンパク質を細胞に提示すことを含む。導入することは、任意の手段により達成することができ、構成成分のうちの１つ以上（例えば、構成成分のうちの２つ、または構成成分の全て）は、細胞に、同時または任意の組み合わせで逐次的に導入することができる。例えば、外因性修復テンプレートは、ヌクレアーゼ物質の導入前に導入することができるか、またはヌクレアーゼ物質の導入後に導入することができる（例えば、外因性修復テンプレートは、ヌクレアーゼ物質の導入の約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８、または７２時間前または後に、投与することができる）。例えば、ＵＳ２０１５／０２４０２６３及びＵＳ２０１５／０１１０７６２（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０１８９】
ヌクレアーゼ物質は、タンパク質の形態で、またはＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））もしくはＤＮＡなどのヌクレアーゼ物質をコードする核酸の形態で、細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入される場合、ＤＮＡは、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。このようなＤＮＡは、１つ以上の発現構築物に存在し得る。
【０１９０】
例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質のようなタンパク質の形態で、またはＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはＤＮＡ）などのＣａｓタンパク質をコードする核酸の形態で、細胞に導入することができる。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で、細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入される場合、Ｃａｓタンパク質及び／またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。このようなＤＮＡは、１つ以上の発現構築物に存在し得る。例えば、このような発現構築物は、単一の核酸分子の構成要素とし得る。あるいは、それらは、２つ以上の核酸分子の間の任意の組み合わせで分離することができる（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードするＤＮＡ、１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、別々の核酸分子の構成要素とし得る）。
【０１９１】
一部の方法では、ヌクレアーゼ物質をコードするＤＮＡ（例えば、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ）及び／または外因性修復テンプレートをコードするＤＮＡを、ＤＮＡミニサークルを介して細胞に導入することができる。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＷＯ２０１４／１８２７００を参照のこと。ＤＮＡミニサークルは、複製起点も抗生物質選択マーカーも持たない非ウイルス遺伝子導入に使用することができるスーパーコイルＤＮＡ分子である。従って、ＤＮＡミニサークルは通常、プラスミドベクターよりもサイズが小さい。これらのＤＮＡは、細菌のＤＮＡを欠いているため、それにより、細菌のＤＮＡで見つかった非メチル化ＣｐＧモチーフを欠損している。
【０１９２】
本明細書で提供される方法は、核酸またはタンパク質を細胞に導入するための特定の方法によっては決まらず、核酸またはタンパク質が少なくとも１つの細胞の内部へのアクセスを獲得することのみによって決まる。核酸及びタンパク質を種々の細胞型に導入するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、安定なトランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、及びウイルス媒介法が挙げられる。
【０１９３】
トランスフェクションプロトコール、及び核酸またはタンパク質を細胞に導入するためのプロトコールは、変わってもよい。非限定的なトランスフェクション法としては、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２（２）：４５６−６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４（４）：１５９０−４，及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６−９７）；デンドリマー；またはＤＥＡＥデキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学ベースのトランスフェクション法が挙げられる。非化学的方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、及び光学的トランスフェクションが挙げられる。粒子ベースのトランスフェクションは、遺伝子銃、または磁気アシストトランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，２７７−２８）を含む。ウイルス法は、トランスフェクションに使用することもできる。
【０１９４】
核酸またはタンパク質の細胞への導入は、エレクトロポレーションにより、細胞質内注射により、ウイルス感染により、アデノウイルスにより、アデノ随伴ウイルスにより、レンチウイルスにより、レトロウイルスにより、トランスフェクションにより、脂質媒介トランスフェクションにより、またはヌクレオフェクションにより、媒介することもできる。ヌクレオフェクションは、核酸基質を、細胞質に送達することが可能になるだけでなく、核膜を通過して核にも送達することが可能になる、改善されたエレクトロポレーション技術である。加えて、本明細書に開示の方法におけるヌクレオフェクションの使用は通常、標準のエレクトロポレーションよりもはるかに少ない（例えば、標準のエレクトロポレーションによる７００万と比較してわずか約２００万）細胞を必要とする。一例では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して実施する。
【０１９５】
核酸またはタンパク質の細胞（例えば、１細胞期胚）への導入は、マイクロインジェクションにより達成することもできる。１細胞期胚では、マイクロインジェクションは、母系及び／または父系の前核へのもの、あるいは細胞質へのものとし得る。マイクロインジェクションが１つの前核のみへのものである場合、父系の前核は、大きいサイズのために好ましい。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは、（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達する）細胞質へのものであるが、タンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡをコードするＤＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは、核／前核へのものである。あるいは、マイクロインジェクションは、核／前核及び細胞質の両方への注射により実施することができ；針は最初に、核／前核に導入することができ、第１の量を注入することができ、針を１細胞期胚から除去しながら、第２の量を細胞質に注射することができる。ヌクレアーゼ物質タンパク質が細胞質に注入される場合、タンパク質は、好ましくは、核／前核への送達を確実にする核局在化シグナルを含む。マイクロインジェクションを実施するための方法は、周知である。例えば、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｇｙ  Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ  Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ  Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７：１５０２２−１５０２６；及びＭｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：９３５４−９３５９を参照のこと。
【０１９６】
核酸またはタンパク質を細胞に導入するための他の方法は、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エキソソーム媒介送達、脂質−ナノ粒子媒介送達、細胞透過性ペプチド媒介送達、または埋め込み型装置媒介送達を含み得る。
【０１９７】
核酸またはタンパク質の細胞への導入は、ある期間にわたって１回または複数回実施することができる。例えば、導入は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回実施することができる。
【０１９８】
一部の場合では、方法及び組成物に用いられる細胞は、ゲノムに安定的に組み込まれたＤＮＡ構築物を有する。このような場合、接触させることは、ゲノムにすでに安定的に組み込まれた構築物を細胞に提供することを含み得る。例えば、本明細書に開示の方法に用いられる細胞は、ゲノムに安定的に組み込まれた既存のＣａｓコード遺伝子を有してもよい（すなわち、Ｃａｓ−ｒｅａｄｙ細胞）。「安定的に組み込まれた」または「安定的に導入された」または「安定的にインテグレートされた」は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムにインテグレートされ、且つそれらの後代により継承されることが可能であるように、ポリヌクレオチドの細胞への導入を含む。任意のプロトコールは、ＤＮＡ構築物または標的ゲノムインテグレーション系の種々の構成要素の安定した組み込みに使用されてもよい。
【０１９９】
Ｆ．標的遺伝子改変の種類
種々の種類の標的遺伝子改変は、本明細書に記載の方法を使用して導入することができる。このような標的改変としては、例えば、１つ以上のヌクレオチドの付加、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、点変異、目的のポリヌクレオチドもしくはその一部のノックアウト、目的のポリヌクレオチドもしくはその一部のノックイン、内因性核酸配列の異種核酸配列、外因性核酸配列、相同核酸配列、もしくはオルソログの核酸配列との置換、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、制御配列スワップ、遺伝子スワップ、またはそれらの組み合わせを含み得る。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０またはそれ以上のヌクレオチドは、標的ゲノム改変を形成するように変化させる（例えば、欠失させるか、挿入するか、または置換する）ことができる。欠失、挿入、または置換は、本明細書の他の箇所に開示されているように、任意のサイズであり得る。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５３：９１０−９１８；Ｍａｎｄａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４５７６８：１−９；及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０−５３２（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０２００】
このような標的遺伝子改変は、標的ゲノム遺伝子座の破壊をもたらし得、病原性変異または病原性対立遺伝子を導入し得、標的ゲノム遺伝子座のヒト化（すなわち、非ヒト核酸配列の相同体またはオーソログヒト核酸配列との置換）をもたらし得、条件付き対立遺伝子を生成し得る等である。破壊は、制御要素（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）の変更、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、切断変異、ヌル変異、または少数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失（例えば、フレームシフト変異を引き起こす）を含み得、且つそれは、対立遺伝子の不活化（すなわち、機能の喪失）または喪失をもたらし得る。
【０２０１】
標的遺伝子改変は、例えば、二対立遺伝子改変または単一対立遺伝子改変とし得る。好ましくは、標的遺伝子改変は、単一対立遺伝子改変である。二対立遺伝子改変は、同じ改変が、対応する相同染色体（例えば、二倍体細胞）上の同じ遺伝子座に対してなされるか、または異なる改変が、対応する相同染色体上の同じ遺伝子座に対してなされる事象を含む。一部の方法では、標的遺伝子改変は、単一対立遺伝子改変である。単一対立遺伝子改変は、改変が唯一の対立遺伝子になされる事象（すなわち、２つの相同染色体のうちの１つのみにおけるＦｂｎ１遺伝子に対する改変）を含む。相同染色体は、同じ遺伝子座に同じ遺伝子を有するが、場合により異なる対立遺伝子を有する染色体（例えば、減数分裂中に対合する染色体）を含む。対立遺伝子という用語は、遺伝子配列の１つ以上の代替形態のいずれかを含む。二倍体細胞または生物では、所与の配列の２つの対立遺伝子は通常、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占める。
【０２０２】
単一対立遺伝子変異は、標的化Ｆｂｎ１改変についてヘテロ接合型である細胞をもたらし得る。ヘテロ接合性は、Ｆｂｎ１遺伝子の１つの対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対応する対立遺伝子）のみが標的改変を有する状況を含む。
【０２０３】
二対立遺伝子改変は、標的改変についてホモ接合性をもたらし得る。ホモ接合性は、Ｆｂｎ１遺伝子の両方の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対応する対立遺伝子）は、標的改変を有する状況を含む。例えば、二対立遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質が第１のガイドＲＮＡ認識配列内の（すなわち、第１のガイドＲＮＡ認識配列内の第１の切断部位で）一対の第１及び第２の相同染色体を切断する時に、生成して、それにより、第１及び第２の相同染色体において末端配列を生成することができる。次に、第１及び第２の相同染色体のそれぞれの末端配列は、外因性修復テンプレートにより媒介される修復プロセスを経て、標的遺伝子改変を含む二対立遺伝子改変を有するゲノムを形成し得る。例えば、外因性修復テンプレートが核酸インサートを含む場合、核酸インサートは、一対の第１及び第２の相同染色体のＦｂｎ１遺伝子に挿入して、それにより、ホモ接合改変ゲノムがもたらされ得る。
【０２０４】
あるいは、二対立遺伝子改変は、標的改変についての複合ヘテロ接合性（例えば、半接合性）をもたらし得る。複合ヘテロ接合性は、標的遺伝子座の両方の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対立遺伝子）が改変されているが、それらは、異なる方法（例えば、一方の対立遺伝子の標的改変及び他方の対立遺伝子の不活化または破壊）で改変されている状況を含む。例えば、標的改変を伴わない対立遺伝子では、Ｃａｓタンパク質により生成された二本鎖破断は、核酸配列の挿入または欠失を含む変異型対立遺伝子を生成して、それにより、そのゲノム遺伝子座の破壊を引き起こす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介ＤＮＡ修復により修復されていてもよい。例えば、二対立遺伝子改変は、細胞が標的改変を有する一方の対立遺伝子、及び発現させることが不可能なもう一方の対立遺伝子を有する場合、複合ヘテロ接合性をもたらし得る。複合ヘテロ接合性は、半接合性を含む。半接合性は、標的遺伝子座の一方の対立遺伝子（すなわち、２つの相同染色体のうちの１つの対立遺伝子）のみが存在する状況を含む。例えば、二対立遺伝子改変は、標的改変が、一方の対立遺伝子において、他方の対立遺伝子の対応する喪失または欠失を伴って生じる場合、標的改変についての半接合性をもたらし得る。
【０２０５】
Ｇ．標的遺伝子改変を有する細胞の同定
本明細書で開示されている方法は、改変Ｆｂｎ１遺伝子を有する細胞を同定することをさらに含み得る。種々の方法は、欠失または挿入などの標的遺伝子改変を有する細胞を同定するために使用することができる。このような方法は、Ｆｂｎ１遺伝子において標的遺伝子改変を有する１つの細胞を同定することを含み得る。スクリーニングは、改変ゲノム遺伝子座を有するこのような細胞を同定するために行うことができる。
【０２０６】
スクリーニングステップは、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）（例えば、対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）及び／または対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイ）を評価するための定量的アッセイを含み得る。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲを介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的ゲノム遺伝子座を認識する第１のプライマーセット及び非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅配列を認識する蛍光プローブを含み得る。
【０２０７】
スクリーニングステップは、保持アッセイも含み得、これは、核酸インサートを標的ゲノム遺伝子座に正確に標的化挿入することを、核酸インサートを標的ゲノム遺伝子座の外側のゲノム位置にランダムトランスジェニック挿入することと区別するのに使用されるアッセイである。長距離ＰＣＲまたはサザンブロッティングなどの標的改変についてスクリーニングするための従来のアッセイは、挿入された標的ベクターを標的遺伝子座に結合させる。しかし、大きなホモロジーアームサイズのために、ＬＴＶＥＣは、このような従来のアッセイによるスクリーニングを許容しない。ＬＴＶＥＣ標的化をスクリーニングするために、対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）及び対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイを含む対立遺伝子改変（ＭＯＡ）アッセイを使用することができる（例えば、ＵＳ２０１４／０１７８８７９及びＦｒｅｎｄｅｗｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５−３０７（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイは、従来のスクリーニング論理を逆転させ、変異が向けられた天然遺伝子座のコピー数を定量する。正しく標的化された細胞クローンでは、ＬＯＡアッセイは、（ＸまたはＹ染色体上にない遺伝子について）２つの天然の対立遺伝子のうちの一方を検出し、他方の対立遺伝子は、標的改変により破壊されている。同じ原理は、挿入された標的化ベクターのコピー数を定量するための対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイと逆に適用することができる。例えば、ＧＯＡ及びＬＯＡアッセイの併用は、正確に標的とされたヘテロ接合型クローンが、喪失した１コピーの天然の標的遺伝子を有しており、且つ１コピーの薬剤耐性遺伝子または他の挿入マーカーを獲得しているものであると明らかにするであろう。
【０２０８】
一例として、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、対立遺伝子の定量化の方法として使用することができるが、０、１、及び２コピーの標的遺伝子間の差異、または、０、１、及び２コピーの核酸インサート間の差異を確実に区別し得る任意の方法は、ＭＯＡアッセイを進展させるのに使用することができる。例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）は、特に、参照遺伝子と比較することにより、ゲノムＤＮＡ試料中のＤＮＡテンプレートのコピー数を定量するために使用することができる（例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＵＳ６，５９６，５４１を参照のこと）。参照遺伝子は、標的遺伝子（複数可）または遺伝子座（遺伝子座）と同じゲノムＤＮＡにおいて定量される。従って、２つのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）増幅（それぞれが対応するプローブを有する）が実施される。一方のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブは、参照遺伝子の「Ｃｔ」（閾値サイクル）を決定するが、他方のプローブは、成功した標的化により置換される標的遺伝子（複数可）または遺伝子座（遺伝子座）の領域のＣｔを決定する（すなわち、ＬＯＡアッセイ）。Ｃｔは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブのそれぞれに対する出発物質であるＤＮＡの量を反映する量であり、すなわち、より不十分な配列は、閾値サイクルに達する、より多くのＰＣＲサイクルを必要とする。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のテンプレート配列のコピー数を半分に減少させることは、約１Ｃｔ単位の増加をもたらすであろう。標的遺伝子（複数可）または遺伝子座（複数可）の１つの対立遺伝子が相同組み換えにより置換されている細胞におけるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応は、非標的細胞由来のＤＮＡと比較した時に、参照遺伝子の場合のＣｔの増加なしに、標的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応の場合の１Ｃｔの増加をもたらすであろう。ＧＯＡアッセイの場合、別のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブは、良好な標的化により、標的遺伝子（複数可）または遺伝子座（複数可）を置換している核酸インサートのＣｔを決定するために使用することができる。
【０２０９】
対になったｇＲＮＡは、標的ゲノム遺伝子座で大きなＣａｓ媒介欠失を生成し得、それは、（すなわち、１細胞期胚以外の細胞における）ＬＴＶＥＣによる適切な標的化を検証する標準ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイを増強するのに有用であり得る。例えば、ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイ単独では、特に、ＧＯＡアッセイが、ＬＴＶＥＣインサート内の選択カセットに対するプローブを用いる場合、正確に標的とされた細胞クローンを、標的ゲノム遺伝子座の大きなＣａｓ誘導欠失が、ゲノムの他の箇所のＬＴＶＥＣのランダムインテグレーションと一致するクローンと区別しないことがある。標的細胞における選択圧が、選択カセットに基づくので、ゲノム内の他の箇所のＬＴＶＥＣのランダムトランスジェニックインテグレーションは一般に、選択カセット及びＬＴＶＥＣの隣接領域を含むが、ＬＴＶＥＣからより遠位の領域を除外するであろう。例えば、ＬＴＶＥＣの一部がゲノムにランダムにインテグレートされ、且つＬＴＶＥＣが３’ホモロジーアーム、３’ホモロジーアームに隣接する選択カセットを有する長さが約５ｋｂ以上の核酸インサートを含む場合、一般に、５’ホモロジーアームではなく３’ホモロジーアームは、選択カセットと共にトランスジェニック的にインテグレートされるであろう。あるいは、選択カセットが５’ホモロジーアームに隣接する場合、一般に、３’ホモロジーアームではなく５’ホモロジーアームは、選択カセットと共に、トランスジェニック的にインテグレートされるであろう。一例として、ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイがＬＴＶＥＣの標的インテグレーションを評価するために使用され、且つＧＯＡアッセイが選択カセットに対してプローブを利用する場合、ＬＴＶＥＣのランダムトランスジェニックインテグレーションと組み合わせた標的ゲノム遺伝子座でのヘテロ接合型欠失は、標的ゲノム遺伝子座でのＬＴＶＥＣのヘテロ接合型標的インテグレーションと同じ情報を与えるであろう。ＬＴＶＥＣによる適切な標的化を検証するために、保持アッセイは、単独で、またはＬＯＡ及び／またはＧＯＡアッセイと組み合わせて使用することができる。
【０２１０】
保持アッセイは、（ＬＴＶＥＣの５’ホモロジーアームに対応する）５’標的配列及び／または（ＬＴＶＥＣの３’ホモロジーアームに対応する）３’標的配列のＤＮＡテンプレートのコピー数を決定する。特に、選択カセットに隣接するホモロジーアームに対応する標的配列のＤＮＡテンプレートのコピー数を決定することが有用である。二倍体細胞では、２より大きいコピー数は一般に、標的ゲノム遺伝子座ではなく標的ゲノム遺伝子座の外側でランダムにＬＴＶＥＣのトランスジェニックインテグレーションを示し、これは、望ましくない。正確に標的とされたクローンは、コピー数２を保持するであろう。さらに、このような保持アッセイにおける２未満のコピー数は一般に、欠失のために標的とされる領域を超えて拡大する大きなＣａｓ媒介欠失を示し、これもまた望ましくない。例えば、ＵＳ２０１６／０１４５６４６及びＷＯ２０１６／０８１９２３（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０２１１】
好適な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブ（複数可）への定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（登録商標）プローブ技術（例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＵＳ２００５／０１４４６５５を参照のこと）が挙げられる。長距離ＰＣＲ、サザンブロッティング、またはＳａｎｇｅｒシーケンシングなどの標的改変についてスクリーニングするための従来のアッセイも使用することができる。このようなアッセイは通常、挿入された標的化ベクター及び標的化ゲノム遺伝子座の間の結合についての証拠を得るために使用される。例えば、長距離ＰＣＲアッセイの場合、一方のプライマーは、挿入されたＤＮＡ内の配列を認識し得、他方のプライマーは、標的化ベクターのホモロジーアームの末端を超える標的ゲノム遺伝子座配列を認識する。
【０２１２】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、特に、改変されている１細胞期胚において、スクリーニングに使用することもできる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」または「超並列シーケンシング」または「ハイスループットシーケンシング」と呼ぶことができる。このようなＮＧＳは、標的遺伝子改変の正確な性質を規定し、且つモザイク現象を検出するＭＯＡアッセイ及び保持アッセイに加えて、スクリーニングツールとして使用することもできる。モザイク現象は、単一の受精卵（すなわち、接合体）から発生している１つの個体における異なる遺伝子型を有する細胞の２つ以上の集団の存在を指す。本明細書に開示の方法では、選択マーカーを使用して標的クローンについてスクリーニングする必要はない。例えば、本明細書に記載のＭＯＡ及びＮＧＳアッセイは、選択カセットを使用せずに信頼することができる。
【０２１３】
Ｈ．遺伝子改変非ヒト動物の作製方法
遺伝子改変された非ヒト動物は、本明細書に開示の種々の方法を用いて生成することができる。本明細書に記載の方法を含む、遺伝子改変生物を産生するための任意の簡便な方法またはプロトコールは、このような遺伝子改変非ヒト動物を産生するのに適する。胚性幹（ＥＳ）細胞などの多能性細胞を遺伝子改変することから始まるこのような方法は一般に、（１）本明細書に記載の方法を使用する１細胞期胚ではない多能性細胞のゲノムを改変すること；（２）遺伝子改変多能性細胞を同定または選択すること；（３）遺伝子改変多能性細胞を宿主胚に導入すること；ならびに（４）代理母に遺伝子改変多能性細胞を含む宿主胚を移植及び懐胎すること、を含む。次に、代理母は、標的遺伝子改変を含み、且つ生殖系列を介して標的遺伝子改変を送達することが可能なＦ０世代の非ヒト動物を産生し得る。遺伝子改変されたゲノム遺伝子座を有する動物は、本明細書に記載されるように、対立遺伝子改変（ＭＯＡ）アッセイを介して同定することができる。ドナー細胞は、胚盤胞期または前桑実胚期（すなわち、４細胞期または８細胞期）などの、任意の段階で宿主胚に導入することができる。生殖系列を介して遺伝子改変を伝達することが可能な後代が生成される。多能性細胞は、本明細書の他の箇所で考察されるように、例えば、ＥＳ細胞（例えば、齧歯動物ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、またはラットＥＳ細胞）とし得る。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる米国特許第７，２９４，７５４号を参照のこと。
【０２１４】
あるいは、１細胞期胚を遺伝子改変することから始まるこのような方法は一般に、（１）本明細書に記載の方法を使用する１細胞期胚のゲノムを改変すること；（２）遺伝子改変された胚を同定または選択すること；ならびに、（３）遺伝子改変された胚を代理母に移植及び懐胎すること、を含む。次に、代理母は、標的遺伝子改変を含み、且つ生殖系列を介して標的遺伝子改変を送達することが可能なＦ０世代の非ヒト動物を産生し得る。遺伝子改変されたゲノム遺伝子座を有する動物は、本明細書に記載されるように、対立遺伝子改変（ＭＯＡ）アッセイを介して同定することができる。
【０２１５】
核移植技術は、非ヒト哺乳動物を生成するために使用することができる。要約すると、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核するか、または除核卵母細胞を提供するステップ；（２）除核卵母細胞と組み合わせるべきドナー細胞または核を単離または提供するステップ；（３）細胞または核を除核卵母細胞に挿入して、再構成細胞を形成するステップ；（４）再構成細胞を非ヒト動物の子宮に移植して、胚を形成するステップ；及び、（５）胚を成長させるステップ、を含み得る。このような方法では、卵母細胞は一般に、死亡した動物から回収されるが、それらは、生きた動物の卵管及び／または卵巣からも単離されてもよい。卵母細胞は、除核の前に当業者らに既知の様々な培地中で成熟させることができる。卵母細胞の除核は、当業者らに周知の多数の方法で実施することができる。再構成細胞を形成するための、ドナー細胞または核の、除核卵母細胞への挿入は、融合前に、ドナー細胞を透明帯の下にマイクロインジェクションすることによるものとし得る。融合は、接触／融合面を超えるＤＣ電気パルスの印加（電気融合）により、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露により、またはＳｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓなどの不活化ウイルスを介して、誘導されてもよい。再構成細胞は、核ドナー及びレシピエント卵母細胞の融合前、中、及び／または後に、電気的及び／または非電気的手段により活性化することができる。活性化法は、電気パルス、化学的に誘導された衝撃、精子による浸透、卵母細胞における二価カチオンのレベルを増加させること、及び卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化（キナーゼ阻害剤によるものとして）を低減させることを含む。活性化再構成細胞または胚は、当業者らに周知の培地中で培養し、次に、動物の子宮に移植することができる。例えば、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＵＳ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、及び米国特許第７，６１２，２５０号（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０２１６】
本明細書で提供される種々の方法は、遺伝子改変された非ヒトＦ０動物の生成を可能にし、遺伝子改変Ｆ０動物の細胞は、標的遺伝子改変を含む。Ｆ０動物を生成するために使用された方法に応じて、標的遺伝子改変を有するＦ０動物内の細胞の数が変動することが認められる。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を介して、ドナーＥＳ細胞を、対応する生物由来の前桑実胚期胚（例えば、８細胞期マウス胚）に導入することは、より高い割合のＦ０動物の細胞集団が、標的遺伝子改変を有する細胞を含むことを可能にする。例えば、非ヒトＦ０動物の細胞寄与の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、標的遺伝子改変を有する細胞集団を含み得る。さらに、Ｆ０動物の少なくとも１つ以上の生殖細胞は、標的遺伝子改変を有し得る。
【０２１７】
Ｉ．非ヒト動物及び細胞の種類
本明細書で提供される方法は、非ヒト動物、ならびに非ヒト動物由来の細胞及び胚を用いる。このような非ヒト動物は、好ましくは、齧歯動物（例えば、ラット、マウス、及びハムスター）などの哺乳動物である。他の非ヒト哺乳動物としては、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄牛、シカ、バイソン、家畜（例えば、雌牛、早期去勢牛などのウシ種；ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種；ならびにブタ及びイノシシなどブタ種）が挙げられる。「非ヒト」という用語は、ヒトを除外する。
【０２１８】
本明細書で提供される方法に用いられる非ヒト動物細胞は、例えば、全能性細胞または多能性細胞（例えば、齧歯動物ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、またはラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）とし得る。全能性細胞は、任意の細胞型を生じさせ得る未分化細胞を含み、多能性細胞は、複数の分化細胞型に成長する能力を有する未分化細胞を含む。このような多能性及び／または全能性細胞は、例えば、ＥＳ細胞または誘導性多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ様細胞とし得る。ＥＳ細胞は、胚への導入時に、発生中の胚の任意の組織に寄与することが可能な胚由来の全能性または多能性細胞を含む。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から誘導することができ、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、及び中胚葉）のいずれかの細胞に分化することが可能である。
【０２１９】
本明細書で提供される方法で用いられる非ヒト動物細胞は、１細胞期胚（すなわち、受精卵母細胞または接合体）も含み得る。このような１細胞期胚は、任意の遺伝的背景（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、またはそれらの組み合わせ）に由来し得、新鮮または凍結であり得るか、天然の育種またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精から誘導することができる。
【０２２０】
本明細書で提供される方法に用いられるマウス及びマウス細胞は、例えば、１２９株、Ｃ５７ＢＬ／６株、ＢＡＬＢ／ｃ株、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ株、１２９及びＣ５７ＢＬ／６株の混合物、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６株の混合物、１２９及びＢＡＬＢ／ｃ株の混合物、ならびにＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、及び１２９株の混合物を含む任意の株に由来し得る。例えば、本明細書で提供される方法に用いられるマウスまたはマウス細胞は、ＢＡＬＢ／ｃ株に少なくとも部分的に由来し得る（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ株に少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％に由来する、または、ＢＡＬＢ／ｃ株に約２５％、約５０％、約７５％、もしくは約１００％に由来する）。一例では、マウスまたはマウス細胞は、５０％のＢＡＬＢ／ｃ、２５％のＣ５７ＢＬ／６、及び２５％の１２９を含む株を有し得る。あるいは、マウスまたはマウス細胞は、ＢＡＬＢ／ｃを排除する株または株の組み合わせを含み得る。
【０２２１】
１２９株及びＣ５７ＢＬ株の例は、本明細書の他の箇所に開示されている。本明細書に提供される方法に用いられるマウス及びマウス細胞は、上述の１２９株及び上述のＣ５７ＢＬ／６株（例えば、５０％の１２９及び５０％のＣ５７ＢＬ／６）の混合物にも由来し得る。同様に、本明細書に提供される方法に用いられるマウス及びマウス細胞は、上述の１２９株の混合物または上述のＢＬ／６株の混合物（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）株）に由来し得る。マウスＥＳ細胞の具体例は、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞（Ｆ１Ｈ４としても知られる）は、雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスに交配することにより産生されたハイブリッド型胚から誘導された。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＡｕｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９，１０２４−１０２８を参照のこと。
【０２２２】
本明細書で提供される方法に用いられるラットまたはラット細胞は、例えば、ＡＣＩラット株、ダークアグーチ（ＤＡ）ラット株、Ｗｉｓｔａｒラット株、ＬＥＡラット株、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット株、またはＦｉｓｈｅｒＦ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒＦ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット株を含む任意のラット株に由来し得る。ラットまたはラット細胞は、上記の２つ以上の株の混合物に由来する株から得ることもできる。例えば、ラットまたはラット細胞は、ＤＡ株またはＡＣＩ株に由来し得る。ＡＣＩラット株は、白い腹部及び足ならびにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有する黒アグーチを有することを特徴とする。このような株は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。ＡＣＩラット由来のラットＥＳ細胞株の例は、ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞である。ダークアグーチ（ＤＡ）ラット株は、アグーチコート及びＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴とする。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。ＤＡラット由来のラットＥＳ細胞株の例は、ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株及びＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株である。一部の場合では、ラットまたはラット細胞は、同系交配のラット株に由来する。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１を参照のこと。
【０２２３】
宿主胚に移植されている細胞は、「ドナー細胞」と呼ぶことができる。ドナー細胞は、宿主胚と同じ株に由来し得るか、または異なる株に由来し得る。同様に、代理母は、ドナー細胞及び／または宿主胚と同じ株に由来にし得るか、または代理母は、ドナー細胞及び／または宿主胚と異なる株に由来し得る。
【０２２４】
様々な宿主胚は、本明細書に開示の方法及び組成物に用いることができる。例えば、ドナー細胞（例えば、ドナーＥＳ細胞）は、対応する生物由来の前桑実胚期胚（例えば、８細胞期胚）に導入することができる。例えば、ＵＳ７，５７６，２５９；ＵＳ７，６５９，４４２；ＵＳ７，２９４，７５４；及びＵＳ２００８／００７８０００（これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。他の方法では、ドナー細胞は、２細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、３２細胞期、または６４細胞期の宿主胚に移植されてもよい。宿主胚はまた、胚盤胞ともし得、または前胚盤胞胚、前桑実胚期胚、桑実胚期胚（例えば、集合桑実胚期胚）、コンパクションされていない桑実胚期胚、または圧縮桑実胚期胚とし得る。マウス胚を用いる時、宿主胚期は、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＴｈｅｉｌｅｒ（１９８９）“Ｔｈｅ  Ｈｏｕｓｅ  Ｍｏｕｓｅ：Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載のタイラー期（Ｔｈｅｉｌｅｒ  ｓｔａｇｅｓ）に関するタイラー期１（ＴＳ１）、ＴＳ２、ＴＳ３、ＴＳ４、ＴＳ５、及びＴＳ６とし得る。例えば、タイラー期は、ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＳ３、及びＴＳ４から選択することができる。一部の方法では、宿主胚は、透明帯を含み、ドナー細胞は、透明帯の穴を通って宿主胚に導入されるＥＳ細胞である。他の方法では、宿主胚は、透明帯のない胚である。
【０２２５】
ＩＩＩ．化合物のスクリーニング法
本明細書に記載のＦｂｎ１変異を有する非ヒト動物は、先天性リポジストロフィーを伴う新生児早老症候群（ＮＰＳＣＬ）を抑制するか、もしくは低減させること、またはＮＰＳＣＬ様症状（例えば、先天性リポジストロフィー様症状）を改善することに潜在的に有用な活性について化合物をスクリーニングすること、あるいは、ＮＰＳＣＬを促進するか、または悪化させるのに潜在的に有害な活性について化合物をスクリーニングすること、に使用することができる。ＮＰＳＣＬを抑制もしくは低減する活性、またはＮＰＳＣＬ様症状を改善する活性を有する化合物は、ＮＰＳＣＬに対する治療薬または予防薬として潜在的に有用である。ＮＰＳＣＬを促進または悪化させる活性を有する化合物は、有毒であると同定されており、治療薬として、またはそれらがヒトと接触し得る他の状況において（例えば、食品、農業、建設、または給水において）避けるべきである。
【０２２６】
スクリーニングすることができる化合物の例としては、抗体、抗原結合タンパク質、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体）、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシン、及びオリゴカルバマートが挙げられる。化合物の大きな組み合わせのライブラリーは、ＷＯ１９９５／０１２６０８、ＷＯ１９９３／００６１２１、ＷＯ１９９４／００８０５１、ＷＯ１９９５／０３５５０３、及びＷＯ１９９５／０３０６４２に記載のコードされた合成ライブラリー（ＥＳＬ）法により構成することができ、これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる。ペプチドライブラリーは、ファージディスプレイ法により生成することもできる。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＵＳ５，４３２，０１８を参照のこと。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを異なる遺伝子に標的化するためのガイドＲＮＡのライブラリーの使用は、例えば、ＷＯ２０１４／２０４７２７、ＷＯ２０１４／０９３７０１、ＷＯ２０１５／０６５９６４、及びＷＯ２０１６／０１１０８０に開示され、これらのそれぞれは、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれる。
【０２２７】
動物ベースのアッセイは一般に、化合物をＦｂｎ１変異体非ヒト動物に投与すること、及び応答の変化についてヒトのＮＰＳＣＬの症状に酷似した症状を評価することを含む。変更は、化合物を有する非ヒト動物を接触させた前後の症状のレベルから、または、化合物なしの同じＦｂｎ１変異を有する対照動物（例えば、野生型コホート兄弟）を用いて実施される対照実験を実施することにより評価することができる。
【０２２８】
監視することができる好適なＮＰＳＣＬ様の徴候または症状は、本明細書の他の箇所に開示されているような、体重、除脂肪量、体脂肪量、（例えば、体重で正規化された）白色脂肪量、体脂肪率、体重で正規化された摂食量、及び後弯を含む。例えば、（例えば、体重で正規化された）白色脂肪組織量を監視することができる。これらの症状は、耐糖能、血清中コレステロールレベル、血清中トリグリセリドレベル、及び血清中非エステル化脂肪酸レベルのうちの１つ以上と共に監視することができる。同様に、これらの症状は、以下の：耐糖能、血清中コレステロールレベル、血清中トリグリセリドレベル、血清中非エステル化脂肪酸レベル、肝臓重量、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）重量、内臓白色脂肪組織（ＷＡＴ）重量、体重で正規化されたＷＡＴ重量、体重で正規化された代謝率、エネルギー消費、及び高脂肪食餌を摂取中のインスリン感受性、のうちの１つ以上と共に監視することができる。例えば、このようなＮＰＳＣＬ様症状の悪化は、化合物と接触させる前の症状のレベルと比較した、または対照非ヒト動物における症状のレベルと比較した、体重の減少、除脂肪量の減少、体脂肪量の減少、（例えば、体重で正規化された）白色脂肪組織の減少、体脂肪率の減少、体重で正規化された摂食量の増加、及び後弯の増加、のうちの１つ以上をもたらし得る。このような減少または増加は、肝臓重量の減少、（例えば、体重で正規化された）褐色脂肪組織（ＢＡＴ）重量の保存、内臓白色脂肪組織（ＷＡＴ）重量の減少、体重で正規化されたＷＡＴ重量の減少、体重で正規化された代謝率の上昇、エネルギー消費の増加、耐糖能の改善、及び高脂肪食餌を摂取中のインスリン感受性の改善のうちの１つ以上と共に生じ得る。このような減少または増加は、以下の残りの正常な：耐糖能、血清中コレステロールレベル、血清中トリグリセリドレベル、及び血清中非エステル化脂肪酸レベル、のうちの１つ以上を伴って生じ得る。あるいは、このようなＮＰＳＣＬ様症状の改善は、化合物と接触させる前の症状のレベルと比較した、または対照非ヒト動物における症状のレベルと比較した、体重の増加、除脂肪量の増加、体脂肪量の増加、体脂肪率の増加、体重で正規化された摂食量の減少、及び後弯の減少、のうちの１つ以上をもたらし得る。このような減少または増加は、肝臓重量の増加、（例えば、体重で正規化された）褐色脂肪組織（ＢＡＴ）重量の保存または変更、内臓白色脂肪組織（ＷＡＴ）重量の増加、体重で正規化されたＷＡＴ重量の増加、体重で正規化された代謝率の減少、エネルギー消費の減少、耐糖能の減少、及び高脂肪食餌を摂取中のインスリン感受性の減少のうちの１つ以上と共に生じ得る。このような症状は、本明細書に提供される実施例に記載されるようにアッセイすることができる。減少または増加は、統計的に有意であり得る。例えば、減少または増加は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％であり得る。
【０２２９】
上記または下記に引用された全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各個々の条項が参照により組み込まれることが特異的に且つ個別に示されるような同じ程度に、あらゆる目的のために全体が参照により組み込まれる。配列の異なるバージョンが異なる時間でアクセッション番号に関連する場合、本出願の有効出願日におけるアクセッション番号に関連するバージョンを意味する。有効出願日は、実際の出願日または該当する場合のアクセッション番号を参照する優先出願の出願日の早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの出版物、ウェブサイトなどが、異なる時に出版されている場合、別途指示のない限り、その出願の有効出願日に最も直近で発行されたバージョンを意味する。特に別途指示のない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様は、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さ及び理解のための実例及び実施例により、少し詳しく記載されているが、特定の変更及び修正が添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることは明らかであろう。
【０２３０】
配列の簡単な説明
添付の配列表に列挙されたヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基についての標準的な文字の略語、及びアミノ酸についての３文字のコードを使用して示される。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端で開始すること及び前方へ（すなわち、各行で左から右に）３’末端に進むことの標準的な規則に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示されている鎖への任意の言及により含まれると理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から開始すること及び前方へ（すなわち、各行で左から右に）カルボキシ末端に進むことの標準的な規則に従う。
【０２３１】
【表１−１】
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【表１−２】
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【実施例】
【０２３２】
実施例１．切断型Ｃ末端を有するＭＡＩＤ８５０１のＦｂｎ１変異型マウスの生成。
変異型Ｆｂｎ１マウス対立遺伝子を生成して、ヒト変異型ＦＢＮ１対立遺伝子を再現した。参照配列としてＮＭ＿００７９９３．２を使用すると、変異は、ｃ．８２１３＿８２１４ｄｅｌｉｎｓＡＣＴである。ｃ．８２１２及び８２１３の間にＡを挿入し、ｃ．８２１４でＧ＞Ｔ置換を行うことにより生成されたこの変異は、Ｆｂｎ１の最後から２番目のエクソンに早期終止コドンをもたらす。変異型対立遺伝子は、ＭＡＩＤ８５０１として示されている。図１を参照のこと。変異は、最後から２番目のエクソンの最後の５０ヌクレオチド以内に存在し、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）を脱出して、変異型切断型プロフィブリリンタンパク質の発現をもたらすと予測される。
【０２３３】
変異型対立遺伝子を生成するために、ドナーテンプレートと共に前核注入または細胞質ｍＲＮＡピエゾ注入を介して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を、Ｃ５７ＢＬ／６の１細胞期胚に導入した。ＤＮＡ標的化配列であるガイドＲＮＡの配列は、配列番号３７に記載されており、ドナーの配列は、配列番号３８に記載されている。ＮＧＳを使用して、正確に標的とされたクローンについてスクリーニングした。標的化結果を表２に記載する。
【０２３４】
【表２】
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【０２３５】
胚の偽妊娠雌マウスへのマイクロインジェクション後に、Ｆ０ファウンダーマウスを生成した。図２に示されるように、ＭＡＩＤ８５０１  Ｆｂｎ１変異についてホモ接合型である雄または雌マウスは、４０日間後に生存しなかったが、雄及び雌ヘテロ接合型マウスは、はるかに長く生存した。
【０２３６】
実施例２．切断型Ｃ末端を有するＭＡＩＤ８５２０  Ｆｂｎ１変異型マウスの生成。
別の実験では、ヒトｃ．８１５５＿８１５６ｄｅｌ  Ｆｂｎ１対立遺伝子に対応する変異型Ｆｂｎ１対立遺伝子を生成するように、ガイドＲＮＡ配列及びドナー配列を設計して、これは、ｐ．Ｌｙｓ２７１９の１７コドン下流の後続の早期終止コドンでフレームシフトを引き起こす、コードエクソン６４（最後から２番目のエクソン）における２塩基対の欠失を有する。予測された変異型対立遺伝子は、ＭＡＩＤ８５０２として示される。図３を参照のこと。
【０２３７】
変異型対立遺伝子を生成するために、ドナーテンプレートと共に前核注入または細胞質ｍＲＮＡピエゾ注入を介して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を、Ｃ５７ＢＬ／６の１細胞期胚に導入した。生成された１つのクローンは、予想されたＭＡＩＤ８５０２対立遺伝子の代わりに、図３に示される予想されたＭＡＩＤ８５２０変異型対立遺伝子を有していた。ＭＡＩＤ８５２０変異型対立遺伝子はまた、図３に示すように、コードされたＦｂｎ１タンパク質の早期終結をもたらす。
【０２３８】
Ｆ０ファウンダーマウスを、胚の偽妊娠雌マウスへのマイクロインジェクション後に生成し、続いて、Ｆ１世代マウスを生成した。野生型マウスと比較して、Ｆｂｎ１変異についてヘテロ接合型のマウスは、体重で正規化した場合に、はるかに多く食べた。例えば、体重で正規化された週毎の摂食量（グラム対グラム）（ヘテロ接合型の雄は、体重で正規化された時に、それらの野生型対応物よりも約１．７倍多い食餌を食べた）を示す図４を参照のこと。摂食量の増加にもかかわらず、Ｆｂｎ１変異についてヘテロ接合型の雄及び雌マウスの体重は一貫して、経時的に、対応する野生型マウスよりも低かった。例えば、左側に２つの３ヶ月齢の雄Ｆ１ヘテロ接合型マウスを、右側に２つの３ヶ月齢の野生型雄Ｆ１マウスを示す図５を参照のこと。５週齢から１３週齢までのＦ１子孫の体重を示す図６も参照のこと。例えば、ヘテロ接合型変異型雄の体重は、５週で約７グラム及び１３週で１２グラムであり、対応する野生型雄の体重は、５週で約１８グラム及び１３週で２５グラムであった。これらの傾向は、雌マウスにも観察された。
【０２３９】
野生型雌と比較したヘテロ接合型雌のさらなる分析は、野生型雌と比較した時に、ヘテロ接合型変異型雌において後弯（すなわち、背中の前方への丸みの悪化）を示した。図７Ａ〜７Ｅを参照のこと。同様に、ヘテロ接合型雌は、それらの野生型対応物と比較して非常に少ない脂肪を有した。図８Ａ〜８Ｃに示されるように、ヘテロ接合型変異型雌マウスは、齧歯動物の脂肪及び除脂肪量を測定するために使用されるＥＣＨＯＭＲＩ（商標）により測定される場合の体重、除脂肪量、及び体脂肪量が統計的に有意に低いレベルを有した。マウスに２１週間の６０％の高脂肪食餌を給餌したとしても、これらの差異は保持される。体脂肪が存在しないにもかかわらず、ヘテロ接合型変異型雌及び対応する野生型雌は、固形食餌を摂取中の類似した耐糖能（経口耐糖能、一晩絶食後に２ｍｇ／ｋｇ与えられた）、ならびに血清中コレステロール、トリグリセリド、及び非エステル化脂肪酸（ＡＤＶＩＡで測定）の上昇を示した。例えば、それぞれ、図９Ａ〜９Ｆ及び図１０Ａ〜１０Ｆを参照のこと。
【０２４０】
ヘテロ接合型変異型雌のさらなる分析は、内臓白色脂肪のほぼ完全な喪失にもかかわらず、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）貯蔵の保存を示した。図１１Ａ〜１１Ｈを参照のこと。ＢＡＴの保存により、発明者らが、６０％の高脂肪食餌を１２週間給餌した後のヘテロ接合型変異型雌のエネルギー消費を検査できるようになった。図１２Ａ〜１２Ｈを参照のこと。Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｏｘｙｍａｘ  ＣＬＡＭＳシステムを使用する代謝ケージ分析は、マウスが、それらのＶＯ２、ＶＣＯ２、及びエネルギー消費（エネルギー）により示されるように、体重に対して正規化された代謝率の上昇を有することを示した。２０週間の高脂肪食餌の摂取後も、これらのマウスは、耐糖能の改善を示した。図１３Ａ〜１３Ｄを参照のこと。
【０２４１】
フィブリリン−１のＣ末端欠失についてヘテロ接合型のマウスは、白脂肪貯蔵の大幅な低減を伴い痩せているが、野生型マウスと比較して、褐色脂肪の保存、エネルギー消費の増加、類似の耐糖能、高脂肪食餌を摂取中のインスリン感受性の改善、及び血清中脂質の無上昇を有する。これは、多くのリポジストロフィー症候群と異なり、これらの特定のマウスが、内臓脂肪組織がないにもかかわらず、血糖恒常性及び循環脂質に関して正常な代謝プロファイルを有するという点で、ヒトＮＰＳＣＬ患者で観察されたＦＢＮ１表現型を要約する。ＦＢＮ１変異型マウスの他の多くのモデルは、非常に正常なヘテロ接合体を有するが、ホモ接合体は、出生後の早期の死亡または胚の死亡を示している。例えば、あらゆる目的のために本明細書に全体が参照により組み込まれるＰｅｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（７）：３８１９−３８２３を参照のこと。本発明者らのモデルは、優性のヘテロ接合型表現型を示し、これは、ヒト患者の特徴の多くを要約して、本発明者らが治療の選択肢を研究することを可能にする。特に、本発明者らのモデルは、白色脂肪組織の喪失を示すが、褐色脂肪組織は、白色脂肪組織の喪失にもかかわらず、インスリン感受性の改善と組み合わせて保存されている。ヒトＮＰＳＣＬ患者は、本発明者らのモデルが示す白色脂肪組織の喪失にもかかわらず、正常な血糖恒常性を有する。褐色脂肪組織の保存は、インスリン感受性の維持／改善の基礎をなす機序である可能性がある。というのは、これが、マウスに、貯蔵することができない過剰な脂肪を燃焼させ得るからである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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