(57)【要約】  本発明は、ATPやKIM-1といった他のバイオマーカーと組み合わせてもよい、毒性バイオマーカーとして細胞外EGFのレベルを測定するインビトロ細胞ベースのアッセイを使用して、薬剤、特に、siRNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドといった核酸分子、のインビボ腎毒性を予測するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における薬剤のインビボ腎毒性を予測するためのインビトロの方法であって、
前記方法は、以下の工程：
a. 上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞を、少なくとも4ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む適切な細胞培養培地内で培養すること；
b. 細胞培養物に薬剤を投与すること；
c. 細胞を一定期間インキュベートすること；および
d. その後上清におけるEGFレベルを測定すること；を含み、
ここで、前記上清におけるEGFの増加は、腎毒性に関連する、又は腎毒性に関連すると予測される薬剤の指標である、前記方法。
【請求項２】
前記上清におけるEGFレベルは、ビヒクル対照又は非毒性基準薬剤で処理した細胞から得られる基準値と比較され、ここで、前記非毒性薬剤は、インビボで非毒性であることが確認されている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記非毒性基準薬剤は、CGTcagtatgcgAATc（配列番号1）からなるオリゴヌクレオチド化合物であり、ここで、小文字はDNA単位を表し、大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表し、全てのLNA Cは5’メチルCであり、かつ全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記上清におけるEGFのレベルが前記ビヒクル対照又は非毒性基準値に対し200％を超えることは、薬剤の腎毒性を予測させる、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記上清におけるEGFレベルは、腎毒性薬剤で処理した細胞から得られる第2基準値と更に比較され、ここで、前記腎毒性基準薬剤は、インビボで腎毒性を引き起こすことが確認されている、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記毒性基準薬剤は、GCtgtgtgagcttGG（配列番号4）からなるオリゴヌクレオチド化合物であり、ここで、小文字はDNA単位を表し、大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表し、全てのLNA Cは5’メチルCであり、かつ全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
毒性グレードが下記式：
【化１】
2019527038.tif 000031
に従って決定される、
式中、AWは、前記非毒性基準薬剤と前記腎毒性基準薬剤との差として決定されるアッセイウィンドウである、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項８】
毒性グレードが6を超える、例えば、20を超える、例えば、50を超えることは、薬剤の腎毒性を予測させる、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
工程d）が、細胞内アデノシン三リン酸（ATP）レベルを測定することを更に含み、
ここで、細胞内ATPレベルの減少は、腎毒性に関連する、又は腎毒性に関連すると予測される薬剤の指標である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
塩水又は非毒性基準値に対する細胞内ATPのレベルが80％未満であることは、薬剤の腎毒性を予測させる、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
工程d）が、細胞外腎障害分子1（KIM-1）タンパク質又は細胞内mRNAレベルを測定することを更に含み、
ここで、KIM-1レベルの増加は、腎毒性に関連する、又は腎毒性に関連すると予測される薬剤の指標である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
塩水又は非毒性基準値に対するレベルが200％を超えることは、薬剤の腎毒性を予測させる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記EGFRを発現する細胞は、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、神経外胚葉細胞及び肝細胞からなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培養物は、近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞、及び集合管上皮細胞、特に、初代ヒトPTEC又はラットPTEC細胞からなる群より選択される初代腎上皮細胞培養物である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記EGFRを発現する細胞は、PTEC-TERT-1、ciPTEC、HK-2、NKi-2又はヒトA549細胞系といった、不死化細胞系から培養される、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤とのインキュベーションの期間は、2〜6日間、例えば、約3日間である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤は、核酸ベースの分子、化学療法剤、アミノグリコシド；抗細菌剤、抗ウイルス剤；抗真菌剤、抗炎症剤および免疫抑制薬からなる群より選択される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤は、RNAi剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアプタマーより選択される核酸分子である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸分子は、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-DNA、アラビノ核酸（ANA）、2’-フルオロ-ANA及びLNAヌクレオシドからなる群より独立して選択される1つ又は複数の糖部2’位修飾ヌクレオシドを含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸分子は、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項18又は19に記載の方法。
【請求項２１】
前記KIM-1の増加は、前記EGFのレベルが増加しなくとも、請求項18〜20のいずれか1項に記載の核酸分子についての腎毒性を予測させる、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項２２】
薬剤のライブラリから、哺乳動物にインビボで投与するための1つ又は複数の薬剤を選択する方法であって、
以下の工程：
a. 薬剤のライブラリを得ること；
b. 薬剤のライブラリの各メンバーを、上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞培養物に投与すること、ここで培地は、少なくとも4ng／mlの上皮成長因子（EGF）、例えば、8〜15ng／ml、例えば、10ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む；
c. 細胞をインビトロで一定期間、例えば、請求項16に記載のいずれかのように、培養すること；
d. 各薬剤について細胞内EGFおよび場合により他のバイオマーカーの量を、例えば、請求項1〜12のいずれか1項に記載のように、測定すること；並びに、
e. 請求項7に従って決定したとき毒性グレードが6未満である1つ又は複数の薬剤を選択すること；を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記選択された薬剤の治療指数は、毒性基準物質又は親薬剤と比較して低い、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸分子のライブラリは、親核酸分子の核酸分子変異体（子核酸分子）のライブラリであり、ここで、前記親核酸分子は、例えば、腎毒性といった毒性であり、かつ、工程d）は、親核酸分子よりも毒性が低い1つ又は複数の核酸分子変異体を同定し、ここで、前記核酸分子変異体は、親核酸分子の核酸塩基配列を保持する、請求項22又は23に記載の方法。
【請求項２５】
請求項22〜24のいずれか1項に記載の方法により得られる薬剤。
【請求項２６】
医薬に使用するための請求項25に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毒性バイオマーカーとして上皮成長因子（EGF）のレベルを測定するインビトロ細胞ベースの、アデノシン三リン酸（ATP）や腎障害分子1（KIM-1）といった他のバイオマーカーと組み合わせる可能性があるアッセイを使用して、薬剤、特に、siRNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドといった核酸分子、のインビボ腎毒性を予測するための方法に関する。本発明は、更に、前記アッセイを使用して、薬剤のライブラリから、インビボで投与するための1つ又は複数の薬剤、特に、RNAi剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドといった核酸分子、を選択する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
新しくかつ最適化された薬物候補の同定における問題の1つは、用量が制限される毒性が起こることである。インビボで評価すると、典型的に、薬剤化合物のサブセットは、薬物誘発性腎障害又は腎毒性といった毒性の表現型を誘発する。
【０００３】
ここ数年、様々なバイオマーカーを用いて薬剤の腎毒性を予測するためのいくつかのモデルが開発されてきた。
【０００４】
Sohn et al 2013 Toxicology letters Vol 217 pp235およびHuang et al 2015 Pharmacological Research & Perspectives Vol 3 pp e00148 の両者は、腎障害分子1（KIM-1）を含む様々なバイオマーカーを用いて小分子の腎毒性を予測するためのインビトロ細胞ベースのアッセイを開示する。
【０００５】
Ju et al 2015 Science translational medicine Vol 7, pp316ra193は、糸球体濾過率と相関する尿中のEGF転写物および分泌を測定することによる、慢性腎疾患のインビボのバイオマーカーとしての上皮成長因子（EGF）を記載する。インビトロの細胞外EGF取り込みの測定についての記載はない。
【０００６】
Wilmer et al 2016 Trends in Biotechnology Vol 34 pp 156は、インビボおよびインビトロ両方の薬物による腎毒性のスクリーニングのための更なるバイオマーカーについてレビューする（表2参照）。
【０００７】
インビトロ腎毒性アッセイは、アンフォテリシンB（抗真菌剤）、コリスチン（ポリペプチド抗生物質）、シクロスポリン（免疫抑制剤）、シスプラチン（化学療法剤）、ドキソルビシン（化学療法剤）、ゲンタマイシン（抗細菌剤）といったある種の小分子またはポリペプチド薬剤で既知の腎毒性を予測することができることが示されている。
【０００８】
しかし、これは、異なるクラスの薬物、すなわち、iRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアプタマーといった核酸ベースの薬物の場合には当てはまらない。個々の核酸化合物の腎毒性については従前から公表されているが、予測はできないようだ（例えば、Henry et al 1997 Toxicology Vol 120 pp 145; Monteith et al 1999 Toxicologic pathology Vol 27, pp. 307; Herrington et al 2011 American journal of kidney diseases: the official journal of the National Kidney Foundation Vol 57, pp300; Voit et al. 2014 The Lancet. Neurology Vol 13, pp987; van Poelgeest et al 2015 British journal of clinical pharmacology Vol 80, pp1350参照）。
【０００９】
我々の知る限り、薬剤の腎毒性の予測のためのバイオマーカーとしてEGFを用いたインビトロ細胞ベースのアッセイは報告されていない。特に、核酸ベースの分子の腎毒性のインビトロ予測はこれまでに報告されていない。
【００１０】
本発明の目的
本発明は、薬物化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドのような核酸分子に関するインビボ腎毒性の予測のためのインビトロ細胞ベースのアッセイにおいて信頼できるバイオマーカーとしてのEGFを確立する。
【００１１】
信頼性の高い腎毒性のインビトロの予測は、薬物の臨床開発の成功率を高め、創薬スクリーニングの初期に動物を使用せず、費用効果が高く、効率的かつ倫理的であり、薬剤のライブラリの毒性スクリーニングに必要な動物の数をかなり減少させる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、薬剤、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドといったオリゴヌクレオチドのインビボ腎毒性を予測可能であると発見されたインビボ毒性アッセイを提供する。
【００１３】
本発明の1つの態様では、本発明者らは、薬剤を上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞に投与するときの腎毒性のバイオマーカーとして上皮成長因子（EGF）を同定した。EGFバイオマーカーは、アデノシン三リン酸（ATP）、および／または腎障害分子-1（KIM-1）などの他のバイオマーカーと組み合わせることができる。
【００１４】
本発明は、急性腎臓傷害または薬剤性腎臓傷害といった有害な腎毒性がなくインビボ投与に適切であるか、または適切であると予測される薬剤化合物を選択するために使用してもよい、薬剤のインビボ毒性（又はインビボ毒性の可能性）を予測するためのインビトロの方法（アッセイ）を提供する。
【００１５】
本発明は、哺乳動物における薬剤、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドといった核酸ベースの分子、のインビボ腎毒性を予測するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
a. 上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞を、少なくとも4ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む適切な細胞培養培地内で培養すること；
b. 細胞培養物に薬剤を投与すること；
c. 細胞を一定期間インキュベートすること；及び
d. その後上清におけるEGFレベルを測定すること；を含み、
ここで、前記上清におけるEGFレベルの増加は、腎毒性に関連する、又は腎毒性に関連すると予測される薬剤の指標である、方法を提供する。
【００１６】
本発明は、インビボで投与するための1つ又は複数の適切な薬剤を薬剤のライブラリから選択する方法であって、
以下の工程：
a. 薬剤のライブラリを得ること；
b. 薬剤のライブラリの各メンバーを、上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞培養物に投与すること、ここで培地は、少なくとも4ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む；
c. 細胞をインビトロで一定期間培養すること；
d. 各薬剤について、細胞外EGFの量を測定すること；及び
e. 毒性グレードが6未満である1つ又は複数の薬剤を選択すること；
を含む、方法を提供する。
【００１７】
場合により、上記方法は、選択した薬剤を哺乳動物ンインビボで投与することを更に含んでもよい。
【００１８】
適切には、本発明の方法において、薬剤の投与による少なくとも1つのバイオマーカーのレベルの減少または増加を決定するために、少なくとも1つのバイオマーカーのレベル又は量は、（インビボで非毒性であることが確認されている）非毒性基準薬剤を投与した際に得られるレベルと比較されてもよい。更に、少なくとも1つのバイオマーカーを、（インビボで毒性であることが確認されている）毒性基準薬剤を投与した際に得られるレベルと比較して、少なくとも1つのバイオマーカーのアッセイウィンドウを決定してもよい。
【００１９】
いくつかの実施形態では、EGFRを発現する細胞は、上皮細胞、間葉細胞、神経外胚葉細胞及び肝細胞由来の細胞培養物より選択される。特に、ヒトPTEC又はヒトPTEC-TERT-1細胞培養物といった腎上皮細胞培養物由来の細胞培養物は、本発明の方法に有用である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、予測された腎毒性は、細胞培養培地におけるバイオマーカーとしてのEGFレベルの増加に関連する。更なる実施形態では、KIM-1レベルの増加は、腎毒性に関連する、又は腎毒性に関連すると予測される薬剤の指標である。腎毒性を予測するための更なるバイオマーカーは、細胞内ATPレベルの減少と関連してもよい。本発明は、薬剤、特にLNAオリゴヌクレオチドといったオリゴヌクレオチド等の核酸ベースの分子、の（例えば、可能性のある）腎毒性を決定するためのインビトロアッセイの使用を提供する。
【００２１】
本発明は、本発明の腎毒性を予測するための方法又は薬剤のライブラリからスクリーニングする方法により得られる薬剤を提供する。
【００２２】
本発明の腎毒性を予測するための方法又は薬剤のライブラリからスクリーニングする方法により得られる薬剤、並びに医薬的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントを含む医薬組成物。
【００２３】
医薬における使用のための、本発明の腎毒性を予測するための方法又は薬剤のライブラリからスクリーニングする方法により得られる核酸分子、あるいは、かかる分子を含む医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、100μMのオリオゴヌクレオチドで7日間処理したPTEC-TERT1細胞の形態学的変化を示す。
【００２５】
【図２】図２は、様々なバイオマーカーがインビボで観察された毒性とどのように相関するかを模式的に示す。白は非毒性を示す（無害）；薄い灰色は軽度の毒性を示す；中程度の濃さの灰色は中程度の毒性を示す；濃い灰色は高い毒性を示す。
【００２６】
定義
薬剤（Drug Substance）
本願の文脈における用語「薬剤」は、一般に、疾患又は状態の治療、緩和または予防のための有効成分として理解されるべきである。また、薬剤は、有効成分を含む組成物、例えば医薬組成物として理解することもできる。一般に、いかなる薬剤も、本発明のインビトロ腎毒性予測方法の対象となり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、核酸ベースの分子、抗癌剤；アミノグリコシド；抗細菌剤、抗ウイルス剤；抗真菌剤、抗炎症剤および免疫抑制剤からなる群より選択される。既知の腎毒性を有する抗細菌剤の例は、コリスチンといったポリミキシンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、RNAi剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアプタマーより選択される核酸分子である。いくつかの実施形態では、薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
薬剤のライブラリは、共通の認識可能な化学構造を有する薬剤の集合体として理解されるべきである。一般的に、薬剤のライブラリは、改善が望まれる親または先祖薬剤ベースであり、例えば、本発明の文脈では、親薬剤が腎毒性インビボを誘発することが判明している。
【００２８】
不死化細胞系（Immortalized cell line）
本発明の文脈における用語「不死化細胞系」は、正常な細胞老化を免れ連続的な細胞の増殖又は分裂が可能になるよう改変された、多細胞生物における単一の細胞に由来する細胞の集団として理解されるべきである。不死化細胞は、インビトロで長期間増殖させることができる。不死化に必要な突然変異は自然に発生するか、またはウイルスベクター、遺伝子の欠失、遺伝子の誘導またはテロメラーゼなどのタンパク質の誘導であるか、または癌細胞といった不死細胞との融合により意図的に誘導される。
【００２９】
初代細胞培養物（Primary cell culture）
本発明の文脈における用語「初代細胞培養物」は、動物の特定の組織から単離された細胞の集団として理解されるべきである。初代細胞培養物は、事前の遺伝子操作又はクローン選択なしに培養されるが、例えばFACSまたは選択的増殖条件を用いて精製してもよい。初代細胞培養物は新鮮なものでも凍結保存された組織から確立されたものでもよい。
【００３０】
標的核酸（Target nucleic acid）
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物のタンパク質をコードする核酸であり得て、例えば、遺伝子、RNA、mRNA、およびpre-mRNA、成熟mRNAまたはcDNA配列であってもよい。また、標的核酸は、マイクロRNA、長い非コードRNA、小さな核小体RNAまたは転写RNAであってもよい。
【００３１】
核酸分子（Nucleic acid molecule）
本明細書で使用される用語「核酸分子」または「治療用核酸分子」は、2つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般的に理解されるように定義される。本発明の方法における核酸分子は、一般的に、50ヌクレオチド長未満の治療用オリゴヌクレオチドである。また、核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよく又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよく、あるいは、RNAi剤、アプタマー、またはリボザイムといった別のオリゴマー性の核酸分子であってもよい。核酸分子は、一般に、固相化学合成とそれに続く精製によって実験室で作られる。核酸分子の配列の場合、共有結合されたヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分またはそれらの修飾体の配列または順序のことをいう。本発明の核酸分子は人工物であり、化学的に合成され、典型的には精製されるかまたは単離される。本発明の核酸分子は、1または複数の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、8〜40ヌクレオチドの長さ、例えば9〜35、例えば10〜30、例えば11〜22、例えば12〜20、例えば13〜18または14から16の連続したヌクレオチド長を含む又はそれからなる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、核酸分子又はその連続ヌクレオチド配列は、22以下のヌクレオチド、例えば20以下のヌクレオチド、例えば18以下のヌクレオチド、例えば14、15、16または17ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。本明細書で示される任意の範囲は、示された範囲の端点を含むことが理解されるべきである。したがって、10〜30ヌクレオチドを含むと言う場合、10ヌクレオチドと30ヌクレオチドの両方が含まれる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30連続ヌクレオチド長を含む又はそれからなる。
【００３５】
核酸分子は、典型的に、哺乳動物における1つ又は複数の標的核酸の発現を調節するためのものである。いくつかの実施形態では、siRNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドといった核酸分子は、典型的には、例えばmRNAまたはマイクロRNA等の哺乳動物においてRNAの発現を阻害するためのものである。したがって、核酸分子は、哺乳動物において1つまたは複数の標的核酸の発現を調節するのに有効であってもよい。
【００３６】
本発明の1実施形態では、核酸分子は、RNAi剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアプタマーより選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ホスホロチオエート核酸分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、非ヌクレオシド部分（コンジュゲート部分）にコンジュゲートしてもよい。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用されるまたは同定される核酸分子は、少なくとも1つの立体選択的（stereodefined）ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００４０】
核酸分子のライブラリは、変異体核酸分子の集合体として理解されるべきである。核酸分子のライブラリの目的は様々である。いくつかの実施形態では、核酸分子のライブラリは、異なる核酸塩基配列を持つオリゴヌクレオチドで構成される。例えば、標的核酸にわたり設計された核酸分子のライブラリ（例えばRNA配列）、例えば標的核酸上の領域を同定する目的でmRNA遺伝子ウォークによって生成されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又はRNAi剤のライブラリであってもよい（ここで、核酸分子は効率的に標的核酸を調節する）。いくつかの実施形態では、核酸分子のライブラリは、核酸分子のライブラリ内で最も強力な配列を同定する目的で、標的分子上の特定の領域を標的とする重複核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで構成される。いくつかの実施形態では、核酸分子のライブラリは、親または祖先の核酸分子の核酸分子設計変異体（子核酸分子）のライブラリであり、ここで、核酸分子設計変異体は、親核酸分子のコアの核酸塩基配列を保持する。いくつかの実施形態では、核酸分子変異体（子核酸分子）のライブラリは、1つ又は複数の設計パラメーターが親核酸分子とは異なる。このようなライブラリの目的は、親核酸分子を改良することであり、例えば、本願の文脈における親核酸分子は、インビボ腎毒性を誘発することが見出されている。
【００４１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（Antisense oligonucleotides）
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本発明において、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節可能な核酸分子として定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、1つ又は複数のDNAまたはDNA様ヌクレオシドの伸長（stretch）を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってsiRNAではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼHをリクルートすることができ、例えば、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-DNA、アラビノ核酸（ANA）、2’-フルオロ-ANA及びLNAヌクレオシド、又はそれらの混合物（混合ウイングギャップマー）といった、1つ又は複数の糖部2’位修飾ヌクレオシドを両端に含む、本明細書で定義されるようなギャップマーオリゴヌクレオチドであってもよく、あるいはギャップブレーカーオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはミックスマーである。ミックスマオリゴヌクレオチドは、典型的には、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-DNA、アラビノ核酸（ANA）、2’-フルオロ-ANAおよびLNAヌクレオシドといった1-4又は1-3DNAヌクレオシドの短い領域を有する高親和性の糖部2’位修飾ヌクレオシドの交互領域を含む。典型的に、ミックスマーは、例えば、［LNA］1-5［DNA］1-3［LNA］1-4［DNA］1-3［LNA］1-4［DNA］1-3といったDNAの短い伸長（stretch）を有する交互領域を含む。
【００４４】
様々なミックスマーの設計が、例えば、マイクロRNA（antimiRs）を標的とする場合、mRNAsに対するマイクロRNA結合部位（ブロックマー）又はスプライススイッチングオリゴマー（ASO）として、非常に有効である。例えば、WO2007／112754（LNA-AntimiRsTM）、WO2008／131807（LNAスプライススイッチングオリゴ：LNA splice switching oligos）参照。
【００４５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが7〜10ヌクレオチドのTINY LNAオリゴヌクレオチドであってもよい。このようなTINY LNAは、参照として本明細書に援用されるWO2009／043353に開示されている。それらは、典型的には、マイクロRNAおよびマイクロRNAファミリーを阻害するために使用され、完全にLNAで修飾されていてもよい（すなわち、各ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである）。また、ギャップマーとミックスマーオリゴヌクレオチドと同様に、ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、そして本明細書で言及するオリゴヌクレオチドと同様に、完全ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００４６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的に、長さが7〜10ヌクレオチドである、例えば、7〜10ヌクレオチド（例えば、TINY LNA）又は10〜14ヌクレオチド（例えば、ショートマー又はショートギャップマー）又は12〜20又は10〜22又は10〜24ヌクレオチドの長さである。
【００４７】
iRNA
本明細書中で使用される用語「RNAi」、「RNAi剤」、「iRNA剤」、「RNA干渉剤」または「siRNA」は、互換的に使用され、RNAヌクレオシドを含み、RNA誘導性サイレンシング複合体（RlSC）経路を介するRNA転写物などの標的核酸の標的の切断を媒介するオリゴヌクレオチド分子を指す。iRNAはRNA干渉（RNAi）として知られているプロセスを介してmRNAの配列特異的な分解を誘導する。iRNAは、細胞、例えば、哺乳動物の対象といった対象の細胞における標的核酸の発現を調節、例えば阻害する。
【００４８】
本発明の方法に供されるRNAi剤は、切断へ向かうRISC経路を介して、例えば標的RNA配列といった標的核酸配列と相互作用する二本鎖RNA（dsRNA）または一本鎖RNA分子のいずれであってもよい。二本鎖RNAi剤は、一般的に、長さが20〜50ヌクレオチド、例えば、長さが25〜35ヌクレオチドであり、そしてdsRNAを19〜23塩基対の短い干渉RNAへ分解すると考えられるダイサーとして知られるエンドヌクレアーゼと相互作用し、特徴的な2塩基の3’オーバーハングを有し、これらは次にRNA誘発サイレンシング複合体（RISC）に組み込まれる。二本鎖RNAi剤は、一緒に二重鎖を形成するセンスおよびアンチセンス鎖からなるsiRNA分子であってもよい。あるいは、本質的にヘアピンの領域で二本鎖になる二次ヘアピン構造を形成するオリゴヌクレオチドであってもよく、そのような分子はshRNAとも呼ばれる。ダイサー基質の効果的な伸長形態は、参照として本明細書に援用される米国特許第8,349,809号および米国特許第8,513,207号に記載されている。適切な標的mRNAに結合すると、RISC内の1つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する。一本鎖RNAi剤は、RISCエンドヌクレアーゼArgonaute2に結合し、その後、標的mRNAを切断する。一本鎖iRNAは一般的に15〜30個のヌクレオチドの長さであり、化学的に修飾されており、例えば、修飾されたヌクレオシド間結合および修飾される可能性のあるヌクレオシドを含む。一本鎖siRNAの設計および検査は、参照として本明細書に援用される米国特許第8,101,348号およびLima et al., (2012) Cell l 50: 883-894に記載される。dsRNAは、一本鎖RNAi剤と同じように化学的に修飾してもよい。
【００４９】
アプタマー（Aptamer）
本明細書中で使用される用語「アプタマー」は、リガンド-タンパク質相互作用またはリガンド-DNAへリックスの相互作用といった、リガンド-標的の相互作用を介して標的を調節することができる三次元構造を形成するオリゴヌクレオチドまたはペプチドを指す。オリゴヌクレオチドアプタマーは、DNA、RNAまたは修飾されたヌクレオシドまたはこれらの混合物で形成できる。アプタマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNAi剤のように、標的ハイブリダイゼーションを介さずに三次元構造により効果がある。
【００５０】
修飾ヌクレオシド間結合（Modified Internucleoside Linkages）
修飾ヌクレオシド間結合は、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエートおよびボラノホスフェートからなる群より選択されてもよい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート又はボラノホスフェートのように、本発明の方法で検査されるオリゴヌクレオチドのリボヌクレアーゼHリクルートと互換性がある。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合のように硫黄（S）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用又は同定されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００５２】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ抵抗性、有益な薬物動態および製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列において、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも80又は、例えば少なくとも90％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるといった、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列において、少なくとも50％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、1つ又は複数の中性ヌクレオシド間結合、特にホスホトリエステル、メチルホスホネート、MMI、アミド-3、ホルムアセタール又はチオホルムアセタールより選択されるヌクレオシド間結合を含む。
【００５４】
更なるヌクレオシド間結合がWO2009／124238（参照として本明細書に援用される）に開示されている。1実施形態では、ヌクレオシド間結合は、WO2007／031091（参照として本明細書に援用される）に開示のリンカーより選択される。特に、ヌクレオシド間結合は、-O-P（O）2-O-、-O-P（O，S）-O-、-O-P（S）2-O-、-S-P（O）2-O-、-S-P（O，S）-O-、-S-P（S）2-O-、-O-P（O）2-S-、-O-P（O，S）-S-、-S-P（O）2-S-、-O-PO（RH）-O-、0-PO（OCH3）-0-、-O-PO（NRH）-O-、-O-PO（OCH2CH2S-R）-O-、-O-PO（BH3）-O-、-O-PO（NHRH）-O-、-O-P（O）2-NRH-、-NRH-P（O）2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-より選択されてもよく、及び／又は、ヌクレオシド間リンカーは、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRHCO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-からなる群より選択されてもよい（式中、RHは、水素及びC1-4-アルキルより選択される）。
【００５５】
ホスホロチオエート結合といったヌクレアーゼに耐性の結合は、ギャップマーに対する領域Gといった標的核酸又はヘッドマー（headmers）やテイルマー（tailmers）の非修飾ヌクレオシド領域と二重鎖を形成する場合、ヌクレアーゼをリクルート可能なオリゴヌクレオチド領域に特に有用である。しかし、ホスホロチオエート結合は、非ヌクレアーゼリクルート領域、及び／又はギャップマーに対する領域FやF’といった親和性増強領域、又はヘッドマーとテイルマーの修飾ヌクレオシド領域にも有用である。
【００５６】
しかし、設計領域の各々は、特に、LNAなどの修飾ヌクレオシドがヌクレアーゼ分解に対し結合を保護する領域において、ホスホジエステル結合などのホスホロチオエート以外のヌクレオシド間結合を含んでもよい。特に、（典型的には非ヌクレアーゼリクルート領域において）修飾されたヌクレオシド単位の間に又は隣接するように、一つまたは二つの結合といったホスホジエステル結合を包含すると、オリゴヌクレオチドの生物学的利用能および／または生体分布を改変できる（参照として本明細書に援用されるWO2008／113832を参照）。
【００５７】
1実施形態において、オリゴヌクレオチドにおけるすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート及び／又はボラノホスフェート結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドにおけるすべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
【００５８】
立体選択的ヌクレオチド間結合（Stereodefined internucleotide linkages）
本発明の文脈において、用語「立体選択的」は、オリゴヌクレオチド中に存在する少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合が立体化学的に規定された、つまり、Rp又はSpのいずれかである、アンチセンス、RNIおよびアプタマー分子を含むオリゴヌクレオチドといった核酸分子を指す。いくつかの実施形態では、立体選択的オリゴヌクレオチドにおけるホスホロチオエートヌクレオシド間結合のすべてが立体選択的、つまり、各ホスホロチオエートヌクレオシド間結合がRpおよびSpホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる群より独立して選択されてもよい。
【００５９】
典型的には、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートがRpとSpホスホロチオエート結合のランダムな混合物（ラセミ混合物とも呼ばれる）として合成される。本発明では、ギャップ領域オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのホスホロチオエート結合が立体選択的、つまり、オリゴヌクレオチドサンプルに存在する少なくとも75％、例えば少なくとも80％、又は少なくとも85％、又は少なくとも90％又は少なくとも95％、又は少なくとも97％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％、又は（本質的に）全てのオリゴヌクレオチド分子がRp又はSpのいずれかであるギャップマーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドは、立体選択的（stereodefined）、立体選択的（stereoselective）又は立体特異的（stereospecified）であるということができる。それらは、立体特異的である少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む。立体選択的（stereodefined）および立体特異的（stereospecified）／立体選択的（stereoselective）という用語は、本明細書において交換可能に用いてもよい。これらの用語、立体選択的、立体選択的および立体特異的は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（Rp又はSp）を指すのに用いてもよく、あるいは、このようなホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを指すのに用いてもよい。立体選択的オリゴヌクレオチドは、いずれか1つの位置で少量の別の立体異性体を含んでもよいと認識され、例えば、Wan et alは、NAR，November 2014に記載のように、ギャップマーについて98％の立体選択性を報告する。
【００６０】
発現の調節（Modulation of expression）
本明細書で使用する用語「発現の調節」は、オリゴヌクレオチドの投与前の核酸標的の量と比較したときの核酸標的の量を改変できるオリゴヌクレオチドの能力を指す全体的な用語として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照することによって決定してもよい。一般的に、対照は非標的オリゴヌクレオチド（mock）で処理した個体または標的細胞であることが理解される。しかし、標準的な治療により処置した個体であってもよい。
【００６１】
調節の一つのタイプは、例えばmRNAの分解または転写の遮断によって、核酸標的の発現を、阻害、ダウンレギュレート、低減、抑制、除去、停止、遮断、防止、軽減、低減、回避または停止するオリゴヌクレオチドの能力である。調節の別のタイプは、例えば、スプライス部位の修復、又はスプライシングの防止、又はマイクロRNA抑制などの阻害機構の除去又は遮断によって、核酸標的の発現を、回復、増加又は増強するオリゴヌクレオチドの能力である。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の方法は、本発明のオリゴヌクレオチドの標的がEGFR発現細胞に存在するとき、オリゴヌクレオチドで処理した後にEGFR発現細胞の集団における標的調節（例えば、siRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのための阻害）のレベルを決定する工程を更に含んでもよい（例えば、少なくとも一つのバイオマーカーの測定工程に平行してまたはその一部として行ってもよい）。この点で、本発明の方法は、インビボで使用するための非毒性で効力のある化合物の選択を可能にする、オリゴヌクレオチドと比較毒性の比較効力または有効性を決定するために使用することができる。化合物の効力／有効性の決定は、EGFR発現細胞、特に標的を発現する細胞における別個のインビトロ実験で行ってもよいことが理解されるであろう。
【００６３】
修飾オリゴヌクレオチド（Modified Oligonucleotides）
非修飾DNA及びRNA分子は、インビボで急速に分解されるため、治療的にほとんど有用でない。したがって、典型的には、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチド（単数または複数）は修飾される。1つの広く使用される修飾は、核酸分解からオリゴヌクレオチドを安定化し、そして望ましい薬理学的特性を提供することが知られているホスホロチオエートヌクレオシド間結合の使用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００６４】
別の望ましい修飾は、オリゴヌクレオチドに標的核酸へのより高い親和性を付与するものであり、二環式「LNA」ヌクレオシドならびに多数の2’位置換ヌクレオシドを含むいわゆる高親和性修飾ヌクレオシドである。
【００６５】
高親和性修飾ヌクレオシド（High affinity modified nucleosides）
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、1つ又は複数の高親和性修飾ヌクレオシドを含む。高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれたとき、例えば、融解温度（Tm）によって測定される、相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させる修飾ヌクレオシドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシド1つにつき好ましくは＋0.5〜＋12℃、より好ましくは＋1.5〜＋10℃そして最も好ましくは＋3〜＋8℃の融解温度の上昇をもたらす結果となる。多数の高親和性修飾ヌクレオシドは、当該技術分野で知られており、例えば、糖部2’位修飾ヌクレオシド、例えば多くの2’位置換ヌクレオシド並びに架橋型核酸（LNA）を含む（例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213参照）。
【００６６】
糖の修飾（Sugar modifications）
天然のDNA及びRNAヌクレオシドに見られるリボース糖部分と比較したとき、オリゴヌクレオチド（単数または複数）は、修飾された糖部分、つまり、糖部分の修飾、を有する1つ又は複数のヌクレオシドを含んでもよい。
【００６７】
主にオリゴヌクレオチドの特定の特性、例えば親和性および／またはヌクレアーゼ耐性等、を改善する目的で、リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが作成されてきた。そのような修飾は、例えば、ヘキソース環（HNA）で置換することにより、リボース環構造が修飾されるものを含む。
【００６８】
糖修飾は、リボース環上の置換基を水素又は天然DNA及びRNAのヌクレオシドに見出される2’-OH基以外の基に変更することを介して行われた修飾も含む。置換基は、例えば、リボース環の2’、3’、4’または5’位に導入してもよい。修飾された糖部分を有するヌクレオシドは、2’位修飾ヌクレオシド、例えば2’位置換ヌクレオシドも含む。多数の2’位置換ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれたときに、例えば、ヌクレオシド耐性および親和性の増大といった有益な特性を有することが見られる。一実施形態では、そのような分子の核酸分子又はライブラリは、1つ又は複数の糖部2’位修飾ヌクレオシドを含む。
【００６９】
2’置換に加えて、典型的にリボース環上のC2とC4の炭素間にビラジカル架橋を有する二環式環の導入（架橋型核酸又はLNAとしても知られる）または典型的にC2とC3の炭素間に結合を欠く非結合リボース環（例えば、UNA）といったリボース環の2位における修飾を含む他の修飾が存在する。他の糖修飾ヌクレオシドとしては、例えば、ビシクロヘキソース核酸（WO2011／017521）、または三環式核酸（WO2013／154798）が挙げられる。また、修飾ヌクレオシドは、糖部分が、例えば、ペプチド核酸（PNA）又はモルホリノ核酸の場合、非糖部分で置換されたヌクレオシドも含む。
【００７０】
糖部2’位修飾ヌクレオシド
糖部2’位修飾ヌクレオシドは、2’位にH又は-OH以外の置換基を有する（2’位置換ヌクレオシド）又は2’位で架橋したビラジカルを含むヌクレオシド、および2’位置換ヌクレオシド、およびLNA（2’-4’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。例えば、2’位で修飾された糖は、オリゴヌクレオチドに対する結合親和性の増大及び／又はヌクレアーゼ耐性の増大を提供できる。2’位置換修飾ヌクレオシドの例は、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA（MOE）、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、および2’-F-ANAヌクレオシドである。更なる例は、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, and Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照。以下に、2’位置換修飾ヌクレオシドのいくつかを示す。
【化１】
2019527038.tif 000002
【００７１】
架橋型核酸ヌクレオシド(Locked Nucleic Acid Nucleosides)（LNA）
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、LNAオリゴヌクレオチドである、つまり、少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む。
【００７２】
LNAモノマー（二環式核酸、BNAとも称される）は、リボース環の2位と4位の間にビラジカルがあるヌクレオシドである。2’-4’ビラジカルは、架橋とも称される。LNAモノマーは、オリゴヌクレオチドに組み込まれたとき、相補的DNAまたはRNA配列へのオリゴヌクレオチドの結合親和性を増強することが知られており、これは、典型的には、オリゴヌクレオチド／標的二重鎖を融解するのに必要な温度（Tm）の上昇として測定または計算される。
【００７３】
LNAオリゴマーは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００７４】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物で使用するLNAは、一般式Iの構造を有してもよい。
【化２】
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式中、すべてのキラル中心に関し、非対称基はR又はS配向のいずれで観察されてもよい；
Xは、-O-、-S-、-N（RN＊）-、-C（R6R6＊）-より選択され、例えば、いくつかの実施形態では-O-である；
Bは、水素、場合により置換されたC1-4-アルコキシ、場合により置換されたC1-4-アルキル、場合により置換されたC1-4-アシルオキシ、核酸塩基（天然の核酸塩基および核酸塩基アナログを含む）、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、及びリガンドより選択され；好ましくは、Bは核酸塩基又は核酸塩基アナログである；
Pは、隣接するモノマーに対するヌクレオチド間結合、又は5’-末端基を指し、このようなヌクレオチド間結合又は5’-末端基は、場合により置換基R5又は同等に適用可能な置換基R5＊を含む；
P＊は、隣接するモノマーに対するヌクレオチド間結合、又は3’-末端基を指す；
R4＊及びR2＊は、一緒になって、-C（RaRb）-、-C（Ra）＝C（Rb）-、-C（Ra）＝N-、-O-、-Si（Ra）2-、-S-、-SO2-、-N（Ra）-、および＞C＝Zより選択される1-4個の基／原子からなる二価のリンカー基を指し、式中、Zは、-O-、-S-、および-N（Ra）-より選択され、Ra及びRbは、それぞれ独立して水素、場合により置換されたC1-12-アルキル、場合により置換されたC2-12-アルケニル、場合により置換されたC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、場合により置換されたC1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ（C1-6-アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ（C1-6-アルキル）-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ（C1-6-アルキル）アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドより選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、場合により置換されてもよく、2つのジェミナル置換基RaおよびRbは、一緒になって、場合により置換されたメチレン（＝CH2）を指してもよく、式中、すべてのキラル中心に関し、非対称基はR又はS配向のいずれで観察されてもよい；そして、
置換基R1＊、R2、R3、R5、R5＊、R6及びR6＊のそれぞれは、存在する場合、水素、場合により置換されたC1-12-アルキル、場合により置換されたC2-12-アルケニル、場合により置換されたC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル，アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ（C1-6-アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ（C1-6-アルキル）-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ（C1-6-アルキル）アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、及びリガンドより独立してより選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは場合により置換されてもよく、2つのジェミナル置換基RaおよびRbは、一緒になって、オキソ、チオ、イミノ、又は場合により置換されたメチレンを指してもよく、RNは水素及びC1-4-アルキルより選択され、2つの隣接する（ジェミナルではない）置換基は、二重結合となる追加的な結合を指してもよく、ビラジカルに関与しないRN＊が存在する場合、水素およびC1-4-アルキル塩基性塩およびそれらの酸付加塩より選択される。すべてのキラル中心に関し、非対称基はR又はS配向のいずれで観察されてもよい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、R4＊及びR2＊は、一緒になってC（RaRb）-C（RaRb）-、C（RaRb）-O-、C（RaRb）-NRa-、C（RaRb）-S-、及びC（RaRb）-C（RaRb）-O-（式中、各Ra及びRbは場合により独立して選択されてよい）からなる群より選択される基を含むビラジカルを指す。いくつかの実施形態では、Ra及びRbは、場合により、水素及びC1-6アルキル、例えばメチル、例えば水素からなる群より独立して選択されてもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態では、R4＊及びR2＊は、一緒になって-R又はS配置におけるビラジカル-O-CH（CH2OCH3）-（2’O-メトキシエチル二環式核酸：Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を指す。
【００７７】
いくつかの実施形態では、R4＊及びR2＊は、一緒になって-R又はS配置におけるビラジカル-O-CH（CH2CH3）-（2’O-エチル二環式核酸：Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を指す。
【００７８】
いくつかの実施形態では、R4＊及びR2＊は、一緒になって-R-又はS配置におけるビラジカル-O-CH（CH3）-を指す。いくつかの実施形態では、R4＊及びR2＊は、一緒になってビラジカル-O-CH2-O-CH2- -（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を指す。
【００７９】
いくつかの実施形態では、R4＊及びR2＊一緒になってビラジカル-O-NR-CH3- -（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を指す。
【００８０】
いくつかの実施形態では、LNA単位は、以下の基：
【化３】
2019527038.tif 000004
より選択される構造を有する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3、R5、R5＊は、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル又は置換されたC2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換されたC1-6アルコキシル、アシル、置換されたアシル、C1-6アミノアルキル又は置換されたC1-6アミノアルキルからなる群より独立して選択される。すべてのキラル中心に関し、非対称基はR又はS配向のいずれで観察されてもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3、R5、R5＊は水素である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3は、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル又は置換されたC2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換されたC1-6アルコキシル、アシル、置換されたアシル、C1-6アミノアルキル又は置換されたC1-6アミノアルキルからなる群より独立して選択される。すべてのキラル中心に関し、非対称基はR又はS配向のいずれで観察されてもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3は水素である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、R5およびR5＊はそれぞれH、-CH3、-CH2-CH3、-CH2-O-CH3、及び-CH＝CH2からなる群より独立して選択される。適切には、いくつかの実施形態において、R5又はR5＊の一方は水素であり、他方は（それぞれR5又はR5＊）は、C1-5アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換されたC1-6アルキル、置換されたC2-6アルケニル、置換されたC2-6アルキニル又は置換されたアシル（-C（＝O）-）からなる群より選択され；式中、各置換された基は、以下より独立してより選択される置換基で一置換又は多置換される；ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換されたC2-6アルキニル、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、COOJ1、CN、O-C（＝O）NJ1J2、N（H）C（＝NH）NJ、J2又はN（H）C（＝X）N（H）J2、式中XはO又はSであり；各J1およびJ2は独立してH、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換されたC2-6アルキニル、C1-6アミノアルキル、置換されたC1-6アミノアルキル又は保護基である。いくつかの実施形態では、各R5又はR5＊は置換されたC1-6アルキルである。いくつかの実施形態では、各R5又はR5＊は置換されたメチレンであり、ここで、好ましい置換基は、F、NJ1J2、N3、CN、OJ1、SJ1、O-C（＝O）NJ1J2、N（H）C（＝NH）NJ、J2又はN（H）C（O）N（H）J2より独立して選択される1つ又は複数の基を含む。いくつかの実施形態では、各J1およびJ2は、独立してH又はC1-6アルキルである。いくつかの実施形態では、R5又はR5＊のいずれかは、メチル、エチル又はメトキシメチルである。いくつかの実施形態では、R5又はR5＊のいずれかは、メチルである。更なる実施形態では、R5又はR5＊のいずれかは、エチレニルである。いくつかの実施形態では、R5又はR5＊のいずれかは、置換されたアシルである。いくつかの実施形態では、R5又はR5＊のいずれかは、C（＝O）NJ1J2である。すべてのキラル中心に関し、非対称基はR又はS配向のいずれで観察されてもよい。このような5’修飾二環式ヌクレオチドは、全体が参照として本明細書に援用されるWO2007／134181に開示されている。
【００８６】
いくつかの実施形態では、Bは、核酸塩基アナログおよび天然の核酸塩基、例えばプリン又はピリミジン、又は置換されたプリン又は置換されたピリミジン、例えば本明細書にて称される核酸塩基、例えば以下からなる群より選択される核酸塩基アデニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシル、及び／又は修飾又は置換された核酸塩基、例えば5-チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、5-プロピニル-ウラシル、2’チオ-チミン、5-メチルシトシン、5-チアゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシン、及び2，6-ジアミノプリン、を含めた核酸塩基である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、R4＊およびR2＊一緒になって、-C（RaRb）-O-、-C（RaRb）-C（RcRd）-O-、-C（RaRb）-C（RcRd）-C（ReRf）-O-、-C（RaRb）-O-C（RcRd）-、-C（RaRb）-O-C（RcRd）-O-、-C（RaRb）-C（RcRd）-、-C（RaRb）-C（RcRd）-C（ReRf）-、-C（Ra）＝C（Rb）-C（RcRd）-、-C（RaRb）-N（Rc）-、-C（RaRb）-C（RcRd）-N（Re）-、-C（RaRb）-N（Rc）-O-、および-C（RaRb）-S-、-C（RaRb）-C（RcRd）-S-より選択されるビラジカルを指し、式中、Ra、Rb、Rc、Rd、Re、およびRfはそれぞれ、独立して水素、場合により置換されたC1-12-アルキル、場合により置換されたC2-12-アルケニル、場合により置換されたC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ（C1-6-アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ（C1-6-アルキル）-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ（C1-6-アルキル）アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドより選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、場合により置換されてもよく、2つのジェミナル置換基RaおよびRbは、一緒になって、場合により置換されたメチレン（＝CH2）を指してもよく、すべてのキラル中心に関し、非対称基はR又はS配向のいずれで観察されてもよい。
【００８８】
更なる実施形態では、R4＊およびR2＊は、一緒になって-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-N（CH3）-、-CH2-CH2-O-、-CH2-CH（CH3）-、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH（CH3）-、-CH＝CH-CH2-、-CH2-O-CH2-O-、-CH2-NH-O-、-CH2-N（CH3）-O-、-CH2-O-CH2-、-CH（CH3）-O-、および-CH（CH2-O-CH3）-O-、及び／又は、-CH2-CH2-、および-CH＝CH-より選択されるビラジカル（二価の基）を指す。すべてのキラル中心に関し、非対称基はR又はS配向のいずれで観察されてもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態では、R4＊およびR2＊は、一緒になってビラジカルC（RaRb）-N（Rc）-O-を指し、式中、RaおよびRbは、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル又は置換されたC2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換されたC1-6アルコキシル、アシル、置換されたアシル、C1-6アミノアルキル又は置換されたC1-6アミノアルキル、例えば水素、からなる群より独立して選択され；Rcは、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル又は置換されたC2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換されたC1-6アルコキシル、アシル、置換されたアシル、C1-6アミノアルキル又は置換されたC1-6アミノアルキル、例えば水素からなる群より選択される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、R4＊およびR2＊は一緒になってビラジカルC（RaRb）-O-C（RcRd）-O-を指し、式中、Ra、Rb、Rc、およびRdは、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル又は置換されたC2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換されたC1-6アルコキシル、アシル、置換されたアシル、C1-6アミノアルキル又は置換されたC1-6アミノアルキル、例えば水素からなる群より独立して選択される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、R4＊およびR2＊は、ビラジカル-CH（Z）-O-を形成し、式中、Zは、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換されたC1-6アルキル、置換されたC2-6アルケニル、置換されたC2-6アルキニル、アシル、置換されたアシル、置換されたアミド、チオール又は置換されたチオからなる群より選択され；そして前記置換された基のそれぞれは、独立してハロゲン、オキソ、ヒドロキシl、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC（＝X）J1、OC（＝X）NJ1J2、NJ3C（＝X）NJ1J2およびCNより選択される場合により保護された置換基により独立して一置換又は多置換され、ここで各J1、J2およびJ3は、独立してH又はC1-6アルキルであり、かつXはO、S又はNJ1である。いくつかの実施形態では、Zは、C1-6アルキル又は置換されたC1-6アルキルである。いくつかの実施形態では、Zは、メチルである。いくつかの実施形態では、Zは置換されたC1-6アルキルである。いくつかの実施形態では、前記置換基は、C1-6アルコキシである。いくつかの実施形態では、ZはCH3OCH2-である。すべてのキラル中心に関し、非対称基はR又はS配向のいずれで観察されてもよい。このような二環式ヌクレオチドは、全体が参照として本明細書に援用されるUS7,399,845に開示されている。いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3、R5、R5＊は水素である。いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3＊は水素であり、R5、R5の一方又は両方は、水素以外の上述の基およびWO2007／134181に記載されるような基であってもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態では、R4＊およびR2＊一緒になって、架橋において置換されたアミノ基を含むビラジカル、例えば-CH2-N（Rc）-（式中、RcはC1-12アルキルオキシである）からなる又は含むビラジカルを指す。いくつかの実施形態では、R4＊およびR2＊一緒になって、ビラジカル-Cq3q4-NOR-（式中q3およびq4は、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル又は置換されたC2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換されたC1-6アルコキシル、アシル、置換されたアシル、C1-6アミノアルキル又は置換されたC1-6アミノアルキルからなる群より独立して選択される）を指し；置換された基のそれぞれは、独立してハロゲン、OJ1、SJ1、NJ1J2、COOJ1、CN、O-C（＝O）NJ1J2、N（H）C（＝NH）NJ1J2又はN（H）C（＝X＝N（H）J2より選択される置換基により独立して一置換又は多置換され、式中、XはO又はSであり；かつ各J1、およびJ2は、独立してH、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アミノアルキル又は保護基である。すべてのキラル中心に関し、非対称基はR又はS配向のいずれで観察されてもよい。このような二環式ヌクレオチドは、全体が参照として本明細書に援用されるWO2008／150729に開示されている。いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3、R5、R5＊は、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル又は置換されたC2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換されたC1-6アルコキシル、アシル、置換されたアシル、C1-6アミノアルキル又は置換されたC1-6アミノアルキルからなる群より独立して選択される。いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3、R5、R5＊は、水素である。いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3は水素であり、R5、R5の一方又は両方は、水素以外の上述の基およびWO2007／134181に記載されるような基であってもよい。いくつかの実施形態では、R4＊およびR2＊は一緒になってビラジカル（２価の基）C（RaRb）-O-を指し、式中、RaおよびRbはそれぞれ独立してハロゲン、C1-C12アルキル、置換されたC1-C12アルキル、C2-C12アルケニル、置換されたC2-C12アルケニル、C2-C12アルキニル、置換されたC2-C12アルキニル、C1-C12アルコキシ、置換されたC1-C12アルコキシ、OJ1SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C（＝O）OJ1、C（＝O）NJ1J2、C（＝O）J1、O-C（＝O）NJ1J2、N（H）C（＝NH）NJ1J2、N（H）C（＝O）NJ1J2又はN（H）C（＝S）NJ1J2であるか；あるいは、RaおよびRbは一緒になって＝C（q3）（q4）であり；式中、q3およびq4はそれぞれ独立してH、ハロゲン、C1-C12アルキル又は置換されたC1-C12アルキルであり；それぞれ置換された基は、独立してハロゲン、C1-C6アルキル、置換されたC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、置換されたC2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換されたC2-C6アルキニル、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、CN、C（＝O）OJ1、C（＝O）NJ1J2、C（＝O）J1、O-C（＝O）NJ1J2、N（H）C（＝O）NJ1J2又はN（H）C（＝S）NJ1J2．より選択される置換基により独立して一置換又は多置換され、式中、各J1、およびJ2は、独立してH、C1-C6アルキル、置換されたC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、置換されたC2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換されたC2-C6アルキニル、C1-C6アミノアルキル、置換されたC1-C6アミノアルキル又は保護基である。このような化合物は、全体が参照として本明��書に援用されるWO2009006478Aに開示されている。
【００９３】
いくつかの実施形態では、R4＊およびR2＊は、ビラジカル-Q-を形成し、式中、Qは、C（q1）（q2）C（q3）（q4）、C（q1）＝C（q3）、C［＝C（q1）（q2）］-C（q3）（q4）又はC（q1）（q2）-C［＝C（q3）（q4）］であり；式中、q1、q2、q3、q4のそれぞれは、独立してH、ハロゲン、C1-12アルキル、置換されたC1-12アルキル、C2-12アルケニル、置換されたC1-12アルコキシ、OJ1、SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C（＝O）OJ1、C（＝O）-NJ1J2、C（＝O）J1、-C（＝O）NJ1J2、N（H）C（＝NH）NJ1J2、N（H）C（＝O）NJ1J2又はN（H）C（＝S）NJ1J2であり；各J1およびJ2は、独立して、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アミノアルキル又は保護基であり；そして場合により、QがC（q1）（q2）（q3）（q4）でありq3又はq4の一方がCH3であるときに、q3又はq4の他方又はq1およびq2の一方のうち少なくとも1つはHではない。いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3、R5、R5＊は水素である。すべてのキラル中心に関し、非対称基はR又はS配向のいずれで観察されてもよい。このような二環式ヌクレオチドは、全体が参照として本明細書に援用されるWO2008／154401に開示されている。いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3、R5、R5＊は、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル又は置換されたC2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換されたC1-6アルコキシル、アシル、置換されたアシル、C1-6アミノアルキル又は置換されたC1-6アミノアルキルからなる群より独立して選択される。いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3、R5、R5＊は水素である。いくつかの実施形態では、R1＊、R2、R3は水素であり、R5、R5＊の一方又は両方は、水素以外の上述の基およびWO2007／134181又はWO2009／067647に記載されるような基（α-L-二環式核酸アナログ）であってもよい。
【００９４】
更なる二環式ヌクレオシドアナログおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるそれらの使用は、WO2011115818、WO2011／085102、WO2011／017521、WO09100320、WO10036698、WO09124295およびWO09006478に開示されている。そのようなヌクレオシドアナログは、いくつかの態様では、本発明の化合物において有用である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド化合物において使用されるLNAは、好ましくは一般式IIの構造を有する：
【化４】
2019527038.tif 000005
式中、Yは、-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N（Re）及び／又は-CH2-からなる群より選択され；式中、ZおよびZ＊は、ヌクレオチド間結合、RH、末端基又は保護基から独立して選択され；Bは、天然又は非天然ヌクレオチド塩基部分（核酸塩基）であり、かつRHは、水素およびC1-4-アルキルより選択され；Ra、Rb、Rc、RdおよびReは、場合により独立して水素、場合により置換されたC1-12-アルキル、場合により置換されたC2-12-アルケニル、場合により置換されたC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ（C1-6-アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ（C1-6-アルキル）-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ（C1-6-アルキル）アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドからなる群より選択され、式中、アリールおよびヘテロアリールは、場合により置換されてもよく、2つのジェミナル置換基RaおよびRbは一緒になって場合により置換されたメチレン（＝CH2）を指してもよく；かつRHは水素およびC1-4-アルキルより選択される。いくつかの実施形態では、Ra、Rb、Rc、RdおよびReは、場合により水素およびC1-6アルキル、例えばメチルからなる群より独立して選択される。すべてのキラル中心に関し、非対称基はR又はS配向のいずれで観察されてもよく、例えば、2つの例示的なとして以下のように図示できる立体化学異性体が挙げられる：
【化５】
2019527038.tif 000006
【００９６】
特定の例示的なLNA単位を以下に示す。
【化６】
2019527038.tif 000007
【００９７】
用語「チオ-LNA」は、上記一般式におけるYがS又は-CH2-S-より選択される架橋型ヌクレオチドを含む。チオ-LNAはβ-D配置とα-L-配置のいずれでもよい。
【００９８】
用語「アミノ-LNA」は、上記一般式におけるYが-N（H）-、N（R）-、CH2-N（H）-、および-CH2-N（R）-（式中、Rは、水素およびC1-4-アルキルより選択される）より選択される架橋型ヌクレオチドを含む。アミノ-LNAはβ-D配置とα-L-配置のいずれでもよい。
【００９９】
用語「オキシ-LNA」は、上記一般式におけるYが-O-を示す架橋型ヌクレオチドを含む。オキシ-LNAはβ-D配置とα-L-配置のいずれでもよい。
【０１００】
用語「ENA」は、上記一般式におけるYが-CH2-O-（式中、-CH2-O-の酸素原子は、塩基Bに関し第2’位に結合する）である架橋型ヌクレオチドを含む。Reは、水素又はメチルである。
【０１０１】
いくつかの例示的な実施形態では、LNAは、β-D-オキシ-LNA、α-L-オキシ-LNA、β-D-アミノ-LNAおよびβ-D-チオ-LNA、特にβ-D-オキシ-LNAより選択される。
【０１０２】
LNAヌクレオシドのいくつかの例をスキーム1に示す。
【化７】
2019527038.tif 000008
【０１０３】
実施例に示すように、本発明のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドにおけるLNAヌクレオシドは、β-D-オキシ-LNAヌクレオシドである。
【０１０４】
ギャップマー（Gapmer）
本明細書で使用される用語「ギャップマー」は、1つ又は複数の親和性を増強する修飾がされたヌクレオシドを含む領域によりフランキングされた5’および3’（フランク又はウイング）である、RNaseHをリクルートするオリゴヌクレオチド（ギャップ）の領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。本明細書には、様々なギャップメーカーの設計が記載されている。ヘッドマー（headmer）及びテイルマー（tailmer）は、フランクの一方を欠き、つまり、オリゴヌクレオチドの片方の端部のみが親和性を増強する修飾がされたヌクレオシドを含む、RNaseHをリクルート可能なオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーでは、3’フランクを欠き（つまり、5’フランクが、親和性を増強する修飾がされたヌクレオシドを含む）、テイルマーでは、5’フランクを欠く（つまり、3’フランクが、親和性を増強する修飾がされたヌクレオシドを含む）。
【０１０５】
ギャップマーの設計（Gapmer Designs）
ギャップマーオリゴヌクレオチドは、細胞内の標的RNA、例えばmRNA又はウイルスRNA、をアンチセンス機構により阻害するために広く使用されている（そのため、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドとも称される）。ギャップマー構造では、オリゴヌクレオチドは、‘5-＞3’の方向で、5’-フランク、ギャップ、3’-フランク、つまり、F-G-F’の少なくとも3つの異なる構造領域を含む。G領域又はギャップ領域は、リボヌクレアーゼHをリクルート可能又はリクルートする少なくとも5つの連続したヌクレオチドの領域、例えば、DNAヌクレオチド、例えば、6-14DNAヌクレオチドその他のRNaseHをリクルート可能なヌクレオシドの領域、例えば、α-L-オキシ-LNA、2’-フルオロ-ANAおよびUNAを含む。ギャップ領域は、1つ又は複数の親和性を増強する修飾、例えば2’位修飾ヌクレオチドがされたヌクレオシドを含む領域によりフランキングされた5’および3’である（FおよびF’は、フランキング領域又はウイング領域とも称される）。いくつかの実施形態では、フランキング領域は、1〜8ヌクレオチドの長さであってもよい。
【０１０６】
更なる実施形態では、領域F（5’フランク又は5’ウイング）は、領域Gの‘5末端に結合し、そして領域F’（3’フランク又は3’ウイング）は、領域Gの‘3末端に結合する。領域FおよびF’は、独立して、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7個の修飾ヌクレオシドを含むか、包含する、またはそれからなる。一実施形態では、領域F及び／又はF’は、独立して、1〜7個の修飾ヌクレオシド、例えば2〜6個の修飾ヌクレオシド、例えば2〜5個の修飾ヌクレオシド、例えば2〜4個の修飾ヌクレオシド、例えば1〜3個の修飾ヌクレオシド、例えば1、2、3又は4個の修飾ヌクレオシド、を含むか、包含する、またはそれからなる。F領域は、その領域の5’末端及び3’末端に少なくとも1個の修飾ヌクレオシドを有することによって定義される。F’領域は、その領域の5’末端及び3’末端に少なくとも1個の修飾ヌクレオシドを有することによって定義される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、領域F及び／又はF’における修飾ヌクレオシドは、3’endo構造を有する。
【０１０８】
一実施形態では、領域F及び／又はF’における1つ又は複数の修飾ヌクレオシドは、2’位修飾ヌクレオシドである。一実施形態では、領域F及び／又はF’における全ての修飾ヌクレオシドは、2’位修飾ヌクレオシドである。
【０１０９】
別の一実施形態では、領域F及び／又はF’は、2’位修飾ヌクレオシドに加えてDNA及び／又はRNAを含む。DNA及び／又はRNAを含むフランクは、F及び／又はF’領域の5’末端及び3’末端に2’位修飾ヌクレオシドを有するという特徴がある。一実施形態では、領域F及び／又はF’は、DNAヌクレオシド、例えば1〜3個の連続したDNAヌクレオシド、例えば1〜3又は1〜2個の連続したDNAヌクレオシド、を含む。フランクにおけるDNAヌクレオシドは、好ましくはRNaseHをリクルート不能である。いくつかの実施形態では、F及び／又はF’領域における2’位修飾ヌクレオシドとDNA及び／又はRNAヌクレオシドは、1〜3個の2’位修飾ヌクレオシドと、1〜3個のDNA及び／又はRNAヌクレオシドが交互になっている。このようなフランクは、交互フランク（alternating flanks）と称されることもある。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドにおける領域F及び／又はF’の長さは、独立して4〜10ヌクレオシド、例えば4〜8、例えば4〜6ヌクレオシド、例えば4、5、6又は7修飾ヌクレオシド、であってもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドにおいてF領域のみが交互である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドにおいてF’領域のみが交互である。
【０１１０】
交互ヌクレオシドを有する領域F及び／又はF’の特定の例は、
2’1-3-N’1-4-2’1-3
2’1-2-N’1-2-2’1-2-N’1-2-2’1-2
（式中、2’は修飾ヌクレオシドを指し、N’はRNA又はDNAである）である。いくつかの実施形態では、交互フランクにおける全ての修飾ヌクレオシドはLNAであり、N’はDNAである。更なる実施形態では、領域F及び／又はF’における1つ又は複数の2’位修飾ヌクレオシドは、独立して2’-O-アルキル-RNA単位、2’-O-メチル-RNA、2’-アミノ-DNA単位、2’-フルオロ-DNA単位、2’-アルコキシ-RNA、MOE単位、LNA単位、アラビノ核酸（ANA）単位、及び2’-フルオロ-ANA単位より選択される）である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、F及び／又はF’領域は、LNAおよび2’位置換修飾ヌクレオシドの両方を含む。それらは、混合ウイング又は混合フランクオリゴヌクレオチドと称されることが多い。
【０１１２】
本発明の一実施形態では、領域F及び／又はF’における全ての修飾ヌクレオシドはLNAヌクレオシドである。更なる実施形態では、領域F及び／又はF’における全てのヌクレオシドはLNAヌクレオシドである。更なる実施形態では、領域F及び／又はF’におけるLNAヌクレオシドは、オキシ-LNA、チオ-LNA、アミノ-LNA、cET、及び／又はENA（β-D又はα-L配置のいすれでも）又はそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される。好ましい実施形態では、領域F及び／又はF’は、連続配列の5’末端に少なくとも1β-D-オキシLNA単位を含む。
【０１１３】
更なる実施形態では、領域G（ギャップ領域）は、好ましくは、上述のヌクレアーゼ、特にリボヌクレアーゼHをリクルート可能な、少なくとも4個、例えば少なくとも5個、例えば少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個又は少なくとも16個の連続したヌクレオシド．を含むか、包含する、またはそれからなる。更なる実施形態では、領域Gは、上述のヌクレアーゼをリクルート可能な、5〜12個、又は6〜10個又は7〜9個、例えば8個の連続したヌクレオチド単位を含むか、包含する、またはそれからなる。
【０１１４】
ヌクレアーゼをリクルート可能な領域Gにおけるヌクレオシド単位は、一実施形態では、DNA、α-L-LNA、C4’アルキル化DNA（いずれも参照として本明細書に援用されるPCT／EP2009／050349およびVesteretal.,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008) 2296-2300に記載されるような）、ANAおよび2’F-ANAのようなアラビノース由来ヌクレオシド（Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661）、UNA（非架橋型核酸）（参照として本明細書に援用されるFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039に記載のように）からなる群より選択される。UNAは、典型的には、リボースのC2およびC3間の結合が除去され、非架橋型の「糖」残基を形成する非架橋型核酸である。
【０１１５】
より更なる実施形態では、領域Gにおける少なくとも1つのヌクレオシド単位は、DNAヌクレオシド単位、例えば1〜12個のDNA単位、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11個のDNA単位、好ましくは2〜12個のDNA単位、例えば4〜12個のDNA単位、より好ましくは5〜11個、又は2〜10個、4〜10個又は6〜10個のDNA単位、例えば7〜10個のDNA単位、最も好ましくは8、9又は10個のDNA単位である。いくつかの実施形態では、領域Gは、100％DNA単位からなる。
【０１１６】
更なる実施形態では、領域Gは、DNAおよびRNaseH切断部位に介在可能なその他のヌクレオシドの混合物から成ってもよい。領域Gは、少なくとも50％DNA、より好ましくは60％、70％又は80％DNA、さらにより好ましくは90％又は95％DNAからなってもよい。
【０１１７】
より更なる実施形態では、領域Gにおける少なくとも1つのヌクレオシド単位は、α-L-LNAヌクレオシド単位、例えば少なくとも1つのα-L-LNA、例えば2、3、4、5、6、7、8又は9個のα-L-LNAである。更なる実施形態では、領域Gは、α-L-オキシ-LNAである少なくとも1つのα-L-LNAを含む。更なる実施形態では、領域Gは、DNAとα-L-LNAヌクレオシド単位の組み合わせを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、領域Gにおける連続した配列のサイズはより長くてもよい、例えば12、13、14、15、16、17、18、19又は20ヌクレオシド単位であってもよい。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、領域Gにおけるヌクレオシドは、2’’endo構造を有する。
【０１２０】
本明細書にて報告するギャップマー設計において、ギャップ領域（Y’）は、1つ又は複数の立体選択的ホスホロチオエート結合を含んでもよく、該ギャップ領域の残りのヌクレオシド間結合は、例えば、非立体選択的ヌクレオシド間結合であってもよく、又は立体選択的ホスホロチオエート結合であってもよい。
【０１２１】
LNAギャップマー
用語LNAギャップマーは、少なくとも1つの親和性を増強する修飾がされたヌクレオシドがLNAヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ギャップマーオリゴヌクレオチドのいずれのフランクも少なくとも1つのLNA単位を含み、いくつかの実施形態では、フランクの全てのヌクレオシドがLNAヌクレオシドである。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、3’フランクは、少なくとも1つのLNAヌクレオシド、好ましくは少なくとも2個のLNAヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、5’フランクは少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、5’と3’フランキング領域のいずれもLNAヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態ではフランキング領域における全てのヌクレオシドがLNAヌクレオシドである。典型的には、LNAギャップマーのフランクのLNA搭載率は、2’置換されたヌクレオシドよりも低く、LNAギャップマー設計の例として［LNA］1-4-［DNA］5-15-［LNA］1-4が挙げられる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ギャップマーは、参照として本明細書に援用されるWO2008／113832に記載のようないわゆるショートマーである。
【０１２４】
更なるギャップマー設計は、WO2004／046160、WO2007／146511及び参照として本明細書に援用される文献に記載される。
【０１２５】
混合ウイングギャップマー（Mixed Wing Gapmer）
用語「混合ウイングギャップマー又は混合フランクギャップマー」は、少なくとも1つのフランク領域が、少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび少なくとも1つの非LNA修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも1つのDNAヌクレオシド又は少なくとも1つの2’位置換修飾ヌクレオシド、例えば、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA（MOE）、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA 及び2’-F-ANAヌクレオシド（複数可）、を含むLNAギャップマーを指す。いくつかの実施形態では、混合ウイングギャップマーは、唯一のLNAヌクレオシド（例えば、5’又は3’）を含む1つのフランクを有し、他のフランク（それぞれ3’又は5’）は、2’位置換修飾ヌクレオシド（複数可）そして場合によりLNAヌクレオシドを含む。
【０１２６】
ギャップブレーカー（Gapbreaker）
用語「ギャップブレーカーオリゴヌクレオチド」は、ギャップ領域がリボヌクレアーゼHリクルートしないヌクレオシド（ギャップブレーカーヌクレオシド、E）によって分断されたとしても、RNAseHリクルート能を維持可能なギャップマーに関連して使用され、例えば、ギャップ領域は、5個未満の連続したDNAヌクレオシドを有する。リボヌクレアーゼHリクルートしないヌクレオシドは、例えば、3’endo構造におけるヌクレオシド、例えばヌクレオシドリボース糖鎖のC2’およびC4’との間の架橋がβ構造にあるLNA、例えばβ-D-オキシLNA又はScETヌクレオシド、である。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのリボヌクレアーゼHをリクルートする能力は、典型的には、配列又は化合物特異的である（いくつかの例では、より特異的な標的RNAの切断をもたらすリボヌクレアーゼHをリクルートする「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドについて開示するRukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487参照）。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ギャップがリボヌクレアーゼHリクルートしないヌクレオシドによって分断され、例えば、ギャップが少なくとも3又は4個の個未満の連続したDNAヌクレオシド（ギャップブレーカーヌクレオシド、E）を有する5’-フランク（F）、ギャップ（G）および3’-フランク（F’）を含む。ギャップブレーカー設計は、例えば、本明細書に記載のような（例えば、領域Fが上述のギャップマーX’領域に対応し、領域F’が上述のギャップマーZ’領域に対応する）ギャップマー設計に基づくが、ただし、ギャップ領域（領域Y’）がギャップブレーカーヌクレオシドを含むという点で異なる。いくつかの実施形態では、ギャップブレーカーヌクレオシド（E）は、例えば、3’ endo構造におけるヌクレオシド、例えばヌクレオシドリボース糖鎖のC2’およびC4’との間の架橋がβ構造であり、ギャップ領域に位置されており、ギャップブレーカーLNAヌクレオシドが少なくとも3（5’）および3（3’）又は少なくとも3（5’）および4（3’）又は少なくとも4（5’）および3（3’）DNAヌクレオシドにより5’および3’フランキングされ、オリゴヌクレオチドがリボヌクレアーゼHをリクルートするようになっているLNAヌクレオシドである。
【０１２８】
ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
F-G-E-G-F’；特にF1-7-G3-4-E1-G3-4-F’1-7
D’-F-G-F’、特にD’1-3-F1-7-G3-4-E1-G3-4-F’1-7
F-G-F’-D’’、特にF1-7-G3-4-E1-G3-4-F’1-7-D’’1-3
D’-F-G-F’-D’’、特にD’1-3-F1-7-G3-4-E1-G3-4-F’1-7-D’’1-3
（式中、GはDNAヌクレオシドを示し、領域D’およびD’’は場合により存在し、追加的な5’および／または3’ヌクレオシド、例えばDNAヌクレオシドであってもよい）。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ギャップブレーカーヌクレオシド（E）は、LNA、β-D-オキシLNA又はScET又はその他のLNAヌクレオシド、例えば本明細書に記載のβ-D-ヌクレオシドである。
【０１３０】
立体選択的ギャップマー（Stereodefined Gapmers）
いくつかの実施形態では、親ギャップマーオリゴヌクレオチドに由来する子オリゴヌクレオチドは、立体選択的なギャップ領域の少なくとも1つのヌクレオシド間結合を有し、ここで、場合によりギャップ領域は、RpおよびSpヌクレオシド間結合の両方を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、子オリゴヌクレオチド（複数可）（そして場合により親）において、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、立体選択的なギャップ領域の少なくとも1つのヌクレオシド間結合を有し、ここで、場合により中央領域は、RpおよびSpヌクレオシド間結合の両方を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、子オリゴヌクレオチド（複数可）（そして場合により親）において、領域Gにおけるヌクレオシド間結合は、全て立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、子オリゴヌクレオチド（複数可）（そして場合により親）において、領域FおよびF’におけるヌクレオシド間結合は、立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、子オリゴヌクレオチド（複数可）（そして場合により親）において、領域FおよびGの間および領域GおよびF’の間におけるヌクレオシド間結合は、立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、子オリゴヌクレオチド（複数可）（そして場合により親）において、領域sF-G-F’の連続したヌクレオシドにおけるヌクレオシド間結合は、全て立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１３３】
オリゴヌクレオチドのギャップ領域に少なくとも1つの立体選択的ホスホロチオエート結合を導入することを、オリゴヌクレオチドの生物学的なプロファイルを調節、例えば毒性プロファイルを調節するのに用いられてもよい。いくつかの実施形態では、子オリゴヌクレオチド（複数可）（そして場合により親）のギャップ領域において、2、3、4又は5個のホスホロチオエート結合が立体選択的である。いくつかの実施形態では、ギャップ領域における残りのヌクレオシド間結合は非立体選択的である、つまり、それらは、オリゴヌクレオチド種の集団におけるRpおよびSpのラセミ混合物として存在する。いくつかの実施形態では、子オリゴヌクレオチド（複数可）（そして場合により親）において、オリゴヌクレオチドにおける残りのヌクレオシド間結合は非立体選択的である。いくつかの実施形態では、子オリゴヌクレオチド（複数可）（そして場合により親）において、ギャップ領域における全てのヌクレオシド間結合が立体選択的である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、オリゴマーのギャップ領域における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14個の結合は、立体選択的ホスホロチオエート結合である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、オリゴマー（例えば、ギャップマー）の結合の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％は、立体選択的ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、オリゴマーにおける全てのホスホロチオエート結合が立体選択的ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、オリゴマーにおける全てのヌクレオシド間結合が立体選択的ホスホロチオエート結合である。
【０１３６】
RNase H活性及びリクルート（RNase H Activity and Recruitment）
アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNaseH活性は、相補的RNA分子と二重鎖にあるときに、RNaseHをリクルートする能力を指す。WO01／23613は、リボヌクレアーゼHをリクルートする能力を決定するのに使用できる、リボヌクレアーゼH活性を決定するためのインビトロの方法を提供する。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列を与えられたときに、WO01／23613（参照として本明細書に援用される）の例91-95に見られる方法を用いて、pmol／l／minの測定で、検査対象の修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するがオリゴヌクレオチドにおいて全てのモノマー間の結合がホスホロチオエート結合であるDNAモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを使用した場合に決定される初期速度の少なくとも5％、例えば少なくとも10％又は20％超の初期速度を有する場合、RNaseHをリクルート可能であるとされる。
【０１３７】
効能及び治療指数（Efficacy and Therapeutic index）
本発明の方法により同定される薬剤は、有効な薬剤であると判断するために、本発明の方法の一部として毒性を検査してもよい。特に核酸ベースの薬剤では、毒性の低下は、部分的には薬剤の効力の低下によるものであることが観察されている。本発明の一態様では、毒性グレードの減少は効能の有意な減少をもたらさない。いくつかの実施形態では、本発明の方法により選択された薬剤の治療指数（TI）は、毒性基準物質と比較して改善される。本発明の目的のために、TIは、50％の対象において腎臓に有害な作用を引き起こす薬剤の用量（TD50）を50％の対象に所望の効能（標的ノックダウンまたは薬理学的効果）をもたらす用量（EC50）で除算した値を指す。いくつかの実施形態では、TIは、毒性基準薬剤、例えば本明細書における化合物4-1又は毒性親オリゴヌクレオチド又は毒性親薬剤と比較して、少なくとも10％、例えば少なくとも15、25、50、75、100、150、200、250又は300％上昇する。実験目的のために、標的がマウスに存在すると仮定すると、7日間のマウス試験でマウスのTD50およびEC50を決定することができる。例えば、核酸分子の場合、マウスにおける配列保存が好ましくない場合、他のモデル種、例えば、ラット、サル、イヌ、ブタまたはサル（例えば、カニクイザル）を使用してもよい。いくつかの実施形態では、TIの上昇は、TD50の上昇とEC50の低下が少ない又は全くないことによる。TIの上昇は、両方のパラメーターの改善の結果であることもある。本発明の方法に関連して、TIの上昇は、薬剤の効能を改善すること（つまり、EC50の低下）によってのみもたらされるものではない。
【０１３８】
したがって、本発明の方法は、（例えば、子）薬剤のライブラリを、標的を調節、例えば阻害するという効果についてスクリーニングする追加の工程を含んでもよい。あるいは、本発明の方法は、毒性が低減した選択された薬剤（例えば、立体選択的オリゴヌクレオチド変異体）を、薬剤としての効能、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての効能、を判断するための検査する追加の工程を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドでは、効能は、リボヌクレアーゼH、をリクルートするオリゴヌクレオチドの能力によって決定してもよく、あるいは、いくつかの実施形態では、インビトロ、またはいくつかの実施形態ではインビボにて、細胞における標的の発現を調節する能力であってもよい。
【０１３９】
コンジュゲート部分（Conjugate Moieties）
いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、炭水化物、非ヌクレオシド糖、炭水化物複合体を含むまたは炭水化物、非ヌクレオシド糖、炭水化物複合体である。いくつかの実施形態では、炭水化物は、ガラクトース、ラクトース、n-アセチルガラクトサミン、マンノース、およびマンノース-6-ホスフェートからなる群より選択される。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、タンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、酵素、および抗体フラグメントの群を含む又はそれらより選択される。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、親油性部分、例えば脂質、リン脂質、脂肪酸、ステロールからなる群より選択される部分である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、小分子薬、毒素、レポーター分子、および受容体リガンドからなる群より選択される。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコールである。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、およびN-イソブタノイルガラクトサミン-アミンを含んでもよい、アシアロ糖タンパク質受容体標的部分である又はそれを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、ガラクトースクラスター、例えばN-アセチルガラクトサミン三量体を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、GalNAc（N-アセチルガラクトサミン）、例えば、一価、二価、三価、又は四価GalNAcを含む。三価GalNAcコンジュゲートを、化合物を肝臓に標的化するために使用してもよい（例えば、US5、994517及びHangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701、WO2009/126933、WO2012/089352、WO2012/083046、WO2014/118267、WO2014/179620、およびWO2014/179445参照）、図2の具体的な実施例も参照。これらの参考文献で使用されるGalNAcや特定のコンジュゲートも参照として本明細書に援用される。
【０１４４】
発明の詳細な説明
インビボ毒性の予測
本明細書中に記載される方法は、哺乳動物における薬物のインビボ毒性を予測するために使用してもよい。任意の化合物の毒性は、典型的にはその用量に依存するため、本発明の方法は、陰性対照及び／又はは毒性プロファイルが知られている薬剤と比較して、あるいは、薬剤の母集団（またはライブラリ）、例えば核酸分子のライブラリと比較して、化合物の相対的な毒性プロファイルを評価するために使用してもよい。この点において、インビボ毒性の予測は、薬剤が哺乳動物にインビボで投与された場合の毒性表現型、例えば腎毒性が起こる相対的なリスクの評価であってもよい。
【０１４５】
薬剤の安全性を評価する際に検討されるパラメータの1つは、腎臓に対する物質、例えば、腎臓近位尿細管内の蓄積、尿細管変性／再生の変化（尿細管毒性）、KIM-1のような尿中で検出可能な急性腎臓傷害のバイオマーカー、の影響である。腎臓関連の毒性は一般に腎毒性として知られている。
【０１４６】
本発明の方法は、哺乳動物における薬剤のインビボ腎毒性（例えば、腎毒性）を予測するため、又はインビボ毒性プロファイル（例えば、腎毒性）の可能性を決定するために使用してもよい。本発明の一実施形態では、インビボ腎毒性は、急性腎臓傷害及び／又は尿細管の変性であってもよい。本発明の方法は、標的を調節するのに有効な用量または治療的に有効な用量で使用する場合に、インビボで毒性ではない（例えば、腎毒性ではない）薬剤を同定するために使用されてもよい。したがって、本発明の方法は、有効な用量でインビボで使用する場合に、毒性（例えば、腎毒性）の用量制限を示さない薬剤の選択を可能にする。インビボ又は治療用の薬剤を選択する際に広範囲な安全性を有することが有利であることが理解され、そして本発明の方法は、例えば、有効用量、あるいは、より高い用量、例えば、最大2倍の有効用量、又は最大3倍の有効用量、又は最大5倍の有効用量、又は最大10倍の有効用量で、腎毒性といった、インビボ毒性を誘発しない薬剤を選択または同定するのに使用してもよい。本発明の方法は、従って、有効用量よりも最大許容用量が高い（例えば、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍）を有するインビボでの使用のための薬剤を同定するために使用してもよい。この点で、本発明の方法は、安全な治療に適した治療指数（TL）又は本明細書で定義するような改善された治療指数を有する薬剤を選択するために使用してもよい。
【０１４７】
本発明は、EGFを、薬剤のインビボ腎毒性を予測するためのインビトロ細胞ベースのアッセイにおいて信頼できるバイオマーカーとして確立する。
【０１４８】
本発明の一態様は、哺乳動物における薬剤のインビボ腎毒性を予測するためのインビトロの方法であって、前記方法は、以下の工程：
a) 上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞を、少なくとも4ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む適切な細胞培養培地内で培養すること；
b) 細胞培養物に薬剤を投与すること；
c) 細胞を一定期間インキュベートすること；および
d) その後上清におけるEGFレベルを測定すること；を含み、
ここで、前記上清におけるEGFレベルの増加は、腎毒性に関連する、又は腎毒性に関連すると予測される薬剤の指標である。
【０１４９】
細胞外EGFレベルの増加は、非処理細胞、ビヒクルで処理した細胞（ビヒクル対照、つまり、薬剤を溶解する溶媒、例えば、生理食塩水、DMSO又は他の適切な溶媒で処理した細胞）、インビボで非毒性であることが確認されている非毒性基準薬剤（インビボ検証済み非毒性薬剤）で処理した細胞、から得られる基準値に関連させて評価できる。そのような非毒性薬剤は、本発明のアッセイ対象である薬剤が核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合、例えば、配列番号1を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物1-1であり得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、EGFバイオマーカーの変化は、基準値に対するパーセンテージとして決定される。実施例に示されるように、本発明者らは、上清中のEGFのレベル（細胞外EGF）の増加が、基準値に対し175％超、例えば少なくとも200％、例えば少なくとも250％、例えば少なくとも300％、例えば少なくとも350％、例えば少なくとも400％の場合、薬剤化合物が腎毒性であることを予測することを発見した。薬剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである実施形態では、そのオリゴヌクレオチドは、10マイクロモル超、例えば20〜150マイクロモル、例えば30〜120マイクロモル、例えば50〜100マイクロモルの濃度で細胞に投与される。
【０１５１】
更なる実施形態では、前記上清におけるEGFレベルは、腎毒性薬剤で処理した細胞から得られる第2基準値と更に比較される、ここで、前記腎毒性基準薬剤は、インビボで腎毒性を引き起こすことが確認されている（インビボ検証済み腎毒性基準薬剤）。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、毒性（例えば、腎毒性）プロファイルが知られている1つ又は複数の薬剤、例えば腎毒性を引き起こすことが知られている陽性対照薬剤及び／又腎毒性を引き起こさないことが知られている陰性対照薬剤を投与し、薬剤投与からの上清中のEGFのレベルと陽性及び／又は陰性対照から得られるレベルと比較することを含んでもよい。陰性対照（ビヒクル対照又はインビボ検証済み非毒性薬剤）および陽性対照（インビボ検証済み腎毒性薬剤）から得られたデータを生成することは、アッセイにおけるバッチ間の変動を正規化するために使用できるアッセイウィンドウの決定を可能にする。アッセイウィンドウ（AW）は、非毒性基準薬剤又はビヒクル対照と腎毒性基準薬剤との間の差である。異なる薬物を比較するために例えば、薬物のライブラリから、各薬剤の毒性グレードを決定すると有利である。これは、以下の式に従って行われる。
【化８】
2019527038.tif 000009
【０１５２】
毒性グレードは、腎毒性のレベルを区分するため、または薬剤の腎毒性のレベルを予測するために使用できる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、毒性のグレードは、次のように予測インビボ腎毒性を区分するのに使用できる。
【化９】
2019527038.tif 000010
【０１５４】
特に、薬剤は、6超、例えば20超、例えば50超である場合、腎毒性であると予測される。
【０１５５】
一実施形態では、毒性グレードは、「材料および方法」の項に記載のオリゴヌクレオチド処理、つまりオリゴヌクレオチドが、10マイクロモル超、例えば20〜150マイクロモル、例えば30〜120マイクロモル、例えば50〜100マイクロモルの濃度で細胞に投与される、といった条件を用いて評価される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、インビボ検証済み腎毒性基準薬剤は、配列番号4を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物4-1である。
【０１５７】
追加的に又は代替的に、対照データは、本発明の方法を順次または並行のいずれかで用いて薬剤のライブラリ、特に核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAi剤又はアプタマーのライブラリと比較し、薬剤のライブラリーの各メンバーの投与後EGFバイオマーカーのレベルを比較することによって決定してもよい。このような方法は、比較的毒性（例えば、腎毒性など）が低い薬剤の選択を可能にする。いくつかの実施形態では、対照データが、薬剤を投与されていない細胞培養物サンプル又はビヒクル対照（0日目対照）から得られた対照データであっても、それを含んでもよい。そのようなサンプルは、投与工程の直前に得られてもよい。
【０１５８】
補完的バイオマーカー（Complementary Biomarkers）
実施例に示されるように、本発明者らは、細胞内アデノシン三リン酸（ATP）レベルおよび細胞外腎臓損傷分子-1（KIM-1）タンパク質レベルまたは細胞内KIM-1mRNAレベルが、EGFバイオマーカーに対する補完的バイオマーカーとして機能し、さらに、本発明の方法の予測可能性を強化することを発見した。
【０１５９】
本発明の1実施形態では、哺乳動物における薬剤のインビボ腎毒性を予測するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
a) 上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞を、少なくとも4ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む適切な細胞培養培地内で培養すること；
b) 細胞培養物に薬剤を投与すること；
c) 細胞を一定期間インキュベートすること；および
d) その後上清におけるEGFレベルおよび細胞内ATPレベルを測定すること；を含み、
ここで、前記上清におけるEGFレベルの増加および細胞内ATPレベルの減少は、腎毒性に関連する、又は腎毒性に関連すると予測される薬剤の指標である、方法を提供する。
【０１６０】
基準値（陰性対照）に対する細胞内ATPのレベルの減少が少なくとも80％、例えば、基準値に対し少なくとも約70％、例えば少なくとも約60％、例えば少なくとも50％、例えば少なくとも40％であることは、インビボで腎毒性を引き起こす傾向が高いことの指標である。EGFバイオマーカーに関連してすでに説明したように、ATPバイオマーカーは、対照のセットと比較される。特に、非処置細胞、ビヒクル対照ビヒクル（ビヒクル対照、つまり、薬剤を溶解する溶媒、例えば、塩水、DMSO又は他の適切な溶媒）で処理した細胞、又はインビボで非毒性であることが確認されている非毒性薬剤（インビボ検証済み非毒性薬剤）で処理した細胞から得られる陰性対照基準値と比較される。そのような非毒性薬剤は、特に、本発明のアッセイ対象である薬剤が核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合、例えば、配列番号1を有する化合物1-1であり得る。細胞内ATPバイオマーカーは、インビボで腎毒性を引き起こすことが確認されている腎毒性薬剤（インビボ検証済み腎毒性基準薬剤）で処理した細胞から得られる第2基準値と更に比較されてもよい。
【０１６１】
いくつかの例では、EGFバイオマーカー単独では、インビボ腎毒性を有することが知られている化合物の腎毒性を予測するのに十分ではなかった。これらの例では、インビトロバイオマーカーとしてのKIM-1はEGFバイオマーカーを非常によく補完することを示した。図2に示すように、本発明のアッセイにおけるEGFとKIM-1バイオマーカーの組み合わせは、インビボ腎毒性を有することが知られている化合物を100％予測する結果となった。
【０１６２】
本発明の1実施形態では、哺乳動物における薬剤のインビボ腎毒性を予測するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
a) 上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞を、少なくとも4ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む適切な細胞培養培地内で培養すること；
b) 細胞培養物に薬剤を投与すること；
c) 細胞を一定期間インキュベートすること；および
d) その後上清におけるEGFレベルおよびKIM-1タンパク質レベルを測定すること；を含み、
ここで、前記上清におけるEGFレベル又はKIM-1レベルの増加は、腎毒性に関連する、又は腎毒性に関連すると予測される薬剤の指標である、方法を提供する。
【０１６３】
代替としてまたは細胞外KIM-1タンパク質レベルの補完として、KIM-1 mRNAレベルの細胞内レベルを測定してもよい。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、細胞外KIM-1バイオマーカーの変化は、対照基準値（陰性対照）のパーセンテージとして決定される。実施例に示されるように、本発明者らは、上清中のKIM-1のレベル（細胞外KIM-1）の増加が、基準値に対し175％超、例えば少なくとも200％、例えば少なくとも250％、例えば少なくとも300％、例えば少なくとも350％、例えば少なくとも400％の場合、薬剤化合物が腎毒性であることを予測させることを発見した。特に、薬剤が核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合、同じ化合物によりEGFレベルの増加および／またはATPレベルの減少が観察されなくても、KIM-1レベルの上昇は腎毒性を予測させるものである。理論に縛られることないが、我々は、KIM-1バイオマーカーのインビトロでの増加が起こるメカニズムは、細胞外EGFレベルの増加または細胞内ATPレベルの減少が起こるメカニズムとは異なるのではないかと考える。
【０１６５】
バイオマーカーの増加／減少の実際のレベルは、細胞培養物の性質、細胞培養物の密度、使用される薬剤の濃度、および薬剤のインキュベーション時間を含む多くの要因に依存することが認識されるべきである。関連するパラメータを以下のセクションで説明する。
【０１６６】
細胞培養物（Cell cultures）
本発明の実施例では、いくつかの細胞培養物を検査した。初代細胞培養物ならびに不死化細胞培養物のいずれも、機能的上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する限り、本発明の方法において機能するようである。EGFRは内因性（それらの細胞によって発現されることを意味する）である。
【０１６７】
本発明の方法は、例えば、マウス、ラットといった齧歯類種、又はウサギ又はブタ（例えば、ミニブタ）又はイヌ、又はサル（例えば、カニクイザル）といった霊長類等のモデル種における薬剤のインビボ毒性の可能性を決定するために使用されてもよく、あるいは、ヒトにおける薬剤のインビボ毒性の可能性を決定するために使用されてもよい。本発明者らは、齧歯類試験においてもヒト臨床試験と同様に、初代EGFR発現上皮細胞または初代肝細胞または不死化EGFR発現上皮細胞の使用が、インビボで見られる毒性プロファイルを予測させることを発見した。特に機能的EGFRを発現する腎臓または肺組織由来の上皮細胞は本発明の方法において適切である。一実施形態では、上皮細胞は眼球由来ではなく、特に網膜色素上皮由来ではなく、特に細胞培養物はARPE19細胞培養物ではない。
【０１６８】
本発明の一実施形態では、機能的EGFRを発現する細胞は、通常の条件下で（薬剤又はビヒクル物質に曝すことなく）培養する場合、増殖培地に存在するEGFを消費する。EGF消費率は、細胞を、薬剤又はビヒクル物質に曝すことなく通常の条件下で増殖させる場合、72時間で培地から好ましくは少なくとも50％のEGFを消費する。より高いEGF消費率を有する、例えば、60時間で培地の少なくとも50％のEGFを消費する、あるいは、48時間で培地の少なくとも50％のEGFを消費する細胞培養物もある。細胞培養物中のEGF消費を測定するためには、培地がEGFを含むことが重要である。細胞培養物のEGF消費は、実施例8の原理に従って評価することができる。
【０１６９】
未処理の細胞培養物のEGF消費を評価するため、並びにEGFレベルのの増加を測定するために培地中で必要とされるEGFのレベルは、以下のように薬剤処理が細胞型によって異なる。いくつかの実施形態では、細胞培養物培地は、培養物培地に対し3〜20ngEGF／mlの間、例えば5〜15ng／mlの間、例えば6〜10ng／mlの間、例えば少なくとも3ng／ml、例えば少なくとも4ng／ml、例えば少なくとも5ng／ml、例えば少なくとも6ng／ml、例えば少なくとも7ng／ml、例えば少なくとも8ng／ml、例えば少なくとも9ng／mlのEGFを含む。好ましい実施形態では、細胞培養物培地は、培養物培地に対し8〜15ng／mlの間のEGFを含む。より好ましい実施形態では、細胞培養物培地は、培養物培地に対し少なくとも10ngEGF／ml含む。
【０１７０】
一実施形態では、機能的EGFRを発現する細胞は、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、神経外胚葉細胞および肝細胞からなる群より選択される。特に、上皮細胞または肝細胞由来の細胞培養物が、本発明の方法において使用される。
【０１７１】
一実施形態では、上皮細胞は、哺乳動物の初代細胞培養物、例えば、齧歯類初代上皮細胞、例えばマウス又はラット初代上皮細胞；ブタ（例えば、ミニブタ）上皮細胞、イヌ上皮細胞、およい非ヒト霊長類初代上皮細胞、例えばサル（例えば、カニクイザル）又はヒト初代上皮細胞、からなる群より選択される細胞培養物の形態であり得る。好ましい実施形態では、初代細胞培養物は、ラット又はヒト上皮細胞又は肝細胞より得られる。様々な種から入手可能であることに加えて、細胞培養物はまた、様々な器官、例えば胃腸管、肺、生殖器および尿道、腎臓、外分泌腺および内分泌腺由来の上皮細胞からも得られてもよい。一実施形態では、上皮細胞培養物は、腎臓上皮細胞培養物又は肺上皮細胞培養物である。本発明は腎毒性を予測するものなので、近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞および集合管上皮細胞からなる群より選択される腎臓上皮細胞が特に関係する。初代細胞培養物の特定の例は、ヒトPTEC又はラットPTEC細胞より作成されるものである。上皮細胞培養物に加えて、本発明の実施例はまた、EGFRを発現する他の細胞型、例えば初代肝細胞を使用できることも示す。
【０１７２】
別の一実施形態では、EGFRを発現する細胞は、不死化細胞系から培養される。不死化細胞系から得られる特定の例は、ヒトPTEC-TERT-1、ciPTEC、HK-2、NKi-2又はヒトA549細胞系である。EGFRは発現しないがEGFを消費しない不死化細胞系の例は、CACO2細胞である。本発明の一実施形態では、EGFRを発現する細胞系は、CACO2細胞系又はARPE19細胞系ではない。
【０１７３】
薬剤の投与（Administering the drug substance）
本発明の方法において評価される薬剤は、当該技術分野において公知の一般的な方法、例えば、受動拡散、エレクトロポレーション、超音波処理、細胞圧搾、静水圧、ナノ粒子（例、リポソーム）、マグネトフェクションおよび細胞透過性ペプチドによって細胞培養物に投与することができる。核酸分子は一般にトランスフェクションを用いて投与されるか、またはジムノシスとして知られる方法（裸の送達（naked delivery）としても知られる、Stein et al., NAR 2010 38(1) e3又はSoifer et al., Methods Mol Biol 2012, 815: 333-46参照）を介して投与されるが、他の投与方法を適用してもよい。実施例において、EGFバイオマーカーを用いたインビトロ腎毒性の予測は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞培養物への投与がトランスフェクションまたはジムノシスによるかどうかとは無関係であることがわかる。投与の様式は、細胞培養物の性質に適合させる必要がある。PTEC型細胞系で実証されているように、ジムノシスによりオリゴヌクレオチドを取り込む傾向がある細胞型もあるし、A549細胞系で見られるようにトランスフェクションにより適していいる細胞系もある。したがって、特定の細胞培養物について最良の投与様式を調査するように、投与の様式は最適化の対象となる。
【０１７４】
本発明の一実施形態では、特に核酸分子が一本鎖オリゴヌクレオチド例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド又は一本鎖RNAi剤である場合、核酸分子ははジムノシスにより投与される。5年前の発見以来、ジムノシスによる送達はオリゴヌクレオチドの研究に使用される標準的なツールとなっており、当該分野で使用される確立された用語である。典型的には、オリゴヌクレオチドクレオチドのジムノシスによる送達は、約1μM〜約1000μMの間、例えば約5μM〜約100μMの間、例えば約10μM〜約50μMの間、例えば約20μM〜40μMの間、例えば約25〜35μMの濃度のオリゴヌクレオチドクレオチドを利用する。適切には、例えばPBS中の細胞培養物に、1〜100μM、例えば5〜50μM、例えば10又は30μMの最終濃度を達成するようなオリゴヌクレオチドを投与してもよい。ジムノシスによる送達の利点の1つは、細胞内にオリゴヌクレオチドを入れるために追加の化学物質が必要でないという点でインビボで起こる送達に似ているということである。
【０１７５】
本発明の別の一実施形態では、核酸分子はトランスフェクションによって投与され、このアプローチは一本鎖と二本鎖オリゴヌクレオチドの両方に適している。トランスフェクションは、当技術分野で公知の標準的な方法、例えばリポフェクション、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウムなどを用いて実施することができる。典型的には、トランスフェクションは、0.5ng〜50ngの間、例えば1ng〜25ngの間、例えば2ng〜15ngの間、例えば約3ng〜10ngの間の濃度のオリゴヌクレオチドクレオチドを利用する。適切には、例えばPBS中の細胞培養物に上述の濃度に対応する最終濃度を達成するようなオリゴヌクレオチドを投与してもよい。
【０１７６】
インキュベーション時間（Incubation time）
薬剤の投与と関連するバイオマーカーの測定の間の時間が、インキュベーション時間または培養時間である。インビトロ毒性アッセイが可能な限り効果的であるためには、読み出しに再現性があり、毒性の問題がある可能性を有する化合物を一貫して予測する必要がある。もう1つの関連するパラメーターは、アッセイを実行するのにかかる時間であり、より早い程より高いスループットを達成することができ、これは本発明の方法が薬剤の大きなライブラリーをスクリーニングするために使用される場合に非常に関連深い。インキュベーション時間は細胞培養物や投与方法によって最適化の対象となる。本発明の一実施形態では、薬剤とのインキュベーション時間は、1〜9日間の間、例えば2〜8日間の間、3〜7日間の間、又は4〜6日間の間、特に2〜6日間の間、又は3〜6日間の間、例えば2、3、4、5、6、7、8又は9日間である。本発明者らは、細胞外バイオマーカー、EGFおよびKim-1では、2〜6日のインキュベーション時間により十分な再現性が達成でき、特に投与後3日目〜6日目のバイオマーカー測定は良い結果を示すことを発見した。本発明の一実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、細胞培養物に50〜100μMの濃度でジムノシスにより投与され、3〜6日間インキュベートされ、EGF及び／又はKIM-1がそれらの時間に測定される。
【０１７７】
細胞内バイオマーカーであるATPが測定される場合、薬剤とののインキュベーション時間は5〜10日間の間、例えば6〜9日間の間、例えば、6、7、8または9日間である。
【０１７８】
投与がトランスフェクションを用いて実施される実施形態では、核酸分子とのインキュベーション時間は、1〜4日間の間、例えば2〜3日間の間、例えば1、2、3又は4日間である。本発明の一実施形態では、核酸分子は、細胞培養物に1〜20ngの濃度でトランスフェクションにより投与され、1〜3日間インキュベートされ、EGF及び／又はKIM-1がそれらの時間に測定される。
【０１７９】
哺乳動物細胞の細胞培養は、典型的には37℃又は約37℃で行われ、そして5％又は約5％CO2雰囲気中に保たれるような外因性CO2をさらに含んでもよい。培養物中の細胞は通常2〜4日ごとに定期的に新鮮な培地を必要とする。インキュベーション時間が3〜4日を超える場合、培地は3〜4日ごとに交換できる。新鮮な培地は、インキュベーション時間中に継続して薬剤が存在することを確実にするために、0日目における所与の濃度に対応する濃度の薬剤を含む。
【０１８０】
本発明の利点の1つは、インキュベーション期間の開始から比較的直後に、予測因子である毒性バイオマーカーを早期に読み出すこと、および使用するバイオマーカーが信頼できるシグナルを提供することである。
【０１８１】
低減した毒性プロファイルを予測することにより子薬剤を同定するためのバリアントのスクリーニングライブラリ（Screening Library of Variants to identify child drug substances with a predicted reduced toxicity profile in vivo）：
本発明は、薬剤のライブラリから、哺乳動物にインビボで投与するために適切な1つ又は複数の薬剤を選択する方法であって、以下の工程：
a) 薬剤のライブラリを得ること；
b) 薬剤のライブラリの各メンバーを、上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞培養物に投与すること、ここで培地は、少なくとも4ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む；
c) 細胞をインビトロで一定期間培養すること；
d) 少なくとも1つの腎毒性バイオマーカーの量を測定すること；並びに、
e) 毒性グレードが6未満である1つ又は複数の薬剤を選択すること；を含む、方法を提供する。
【０１８２】
本発明の一実施形態では、前記工程e）で選択された薬剤の治療指数は、毒性基準物質又は親薬剤と比較して低い。
【０１８３】
選択された薬剤は、その化合物が腎毒性を引き起こさないことを確認するために場合により哺乳動物にインビボで投与してもよい。特にラットは腎毒性のある核酸分子に対して非常に敏感であり、したがって本発明の方法を用いて得られる予測を確認するための適切な種である。また、本明細書に記載のその他の天然哺乳動物種を関連させてもよい。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、薬剤のライブラリは、RNAi剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアプタマーからなる核酸分子のライブラリである。
【０１８５】
一実施形態では、核酸分子のライブラリは、異なる核酸塩基配列を有し、例えば、それらは、標的配列を横切って設計された核酸分子（例、mRNA）のライブラリ、例えば、mRNA遺伝子ウォークにより生成されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又はRNAi剤であってもよい。
【０１８６】
一実施形態では、核酸分子のライブラリのメンバーは、配列の連続箇所で同一の核酸塩基配列を持ち、ここで当該連続箇所は核酸分子よりも短く、ライブラリ内の分子の少なくとも1つのサブセットを含む。そのような「ホットスポット」ライブラリは、例えば、標的配列にわたって、例えば、ライブラリーのメンバーが少なくとも4〜14核酸塩基、例えば5〜12核酸塩基、例えば6〜10核酸塩基オーバーラップする50〜100核酸塩基の長さ（例として、標的RNA上のホットスポット）にわたって設計されている核酸分子のライブラリであってもよい。ライブラリは、例えば、同定されたホットスポットを標的とする最も高いTIを有するオリゴヌクレオチドを同定するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるRNAi剤のライブラリであってもよい。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、薬剤のライブラリは、親核酸分子の核酸分子変異体（子核酸分子）のライブラリであり、ここで、親核酸分子は、例えば、腎毒性といった毒性であり、かつ、工程d）は、親核酸分子よりも毒性が低い1つ又は複数の核酸分子変異体を同定し、ここで、オリゴヌクレオチド変異体は、親核酸分子のコア核酸塩基配列、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドを保持する。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、子核酸分子は、親核酸分子と同じ長さであり、同じ核酸塩基配列を保持してもよい。しかしながら、いくつかの実施形態では、子核酸分子は、5’および／または3’末端のヌクレオチドの除去によって切断されてもよく、またはいくつかの実施形態では、5’および／または3’末端で追加のヌクレオチドを有してもよいと考えられる。1つまたは複数の末端高親和性ヌクレオシドの除去、例えばLNAヌクレオチドは、1つまたは複数のLNAヌクレオチドがギャップ領域に挿入されるとRNA標的に対する親和性が増大するので、RNA標的に対する核酸分子の親和性を保持すること可能にする。いくつかの実施形態では、親核酸分子と比較して毒性が低い子核酸分子を同時に選択できるように、ライブラリーが異種ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する立体選択的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの複合ライブラリとするために、子核酸分子のライブラリは、異なるフランク領域、切断されているもの、追加のヌクレオシドを有しているもの、1または2ヌクレオシド分配列がシフトした配列（RNA標的に対して測定されたとき）を有するもの、フランクに追加の高親和性ヌクレオシドを含むものを有する変異体を含んでもよいことが想定される。
【０１８９】
親核酸分子と子核酸分子は共通のコア核酸塩基配列を有する。共通のコア核酸塩基配列（又は連続した核酸塩基配列）は、典型的には少なくとも10核酸塩基長、例えば少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、又は少なくとも16核酸塩基長であり、いくつかの実施形態では親核酸分子と同一の核酸塩基配列であってもよい。いくつかの実施形態では、親核酸分子および子核酸分子（少なくとも一部）は、核酸分子の長さにわたって同一の核酸塩基配列を有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、子核酸分子の一部が追加の5’または3’ヌクレオチド、例えば1、2又は3個の追加的な5’または3’ヌクレオチドを含んでもよいことが想定される。追加的に又は代替的にいくつかの実施形態では、子核酸分子の一部が、親に対して切断され、例えば、5’または3’末端に1、2又は3個の切断を含んでもよい。いくつかの実施形態では、子核酸分子（の一部）の追加的な核酸塩基または核酸塩基配列の切断は、1個の核酸塩基追加又は切断であってもよい。いくつかの実施形態では、子オリゴヌクレオチド、又はその一部は、標的配列にアラインしたとき、親核酸分子に対し、1個の核酸塩基または2又は3個の核酸塩基がシフトしてもよい（効果としては、一方の端では切断され、もう一方の端では追加される）。追加のヌクレオチドは、標的核酸配列との相補性を保持する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、核酸分子変異体（子核酸分子）のライブラリは、親核酸分子と1つ又は複数の設計パラメーターが異なる。設計パラメーターは、
i）1つ又は複数の立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の存在；ii）ギャップサイズの変化；iii）ギャップブレーカーの導入；iv）ウイングサイズの変化；v）糖部2’位修飾ヌクレオシドの導入；およびvi）例えばLNAヌクレオシドおよび2’位置換ヌクレオシド、特にLNAおよびMOEといった少なくとも2つの異なる2’位修飾ヌクレオシドをウイングに導入する、ウイングにおける糖部2’位修飾ヌクレオシド組成の変化：からなる群より選択され得る。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、核酸分子変異体は、オリゴヌクレオチド変異体である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド変異体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーオリゴヌクレオチドである。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド変異体は、RNAi剤である。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド変異体は、親オリゴヌクレオチドと、1つ又は複数の立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の存在が異なる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド変異体は、LNAオリゴヌクレオチドである。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、子アンチセンスオリゴヌクレオチドのライブラリは、場合により異なる混合ウイングギャップマー設計、ギャップブレーカー設計、ギャップ長およびフランク長を含む、異なるギャップマー設計を有する子オリゴヌクレオチドの集団である、またはかかる集団を含む。
【０１９７】
本発明の方法は、インビボ毒性（例えば腎毒性）が低減された立体選択的な核酸分子、特に立体選択的アンチセンスオリゴヌクレオチドを同定するために使用してもよい。
【０１９８】
従って、本発明は、立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を用いて、アンチセンスオリゴヌクレオチド（親オリゴヌクレオチド）の毒性を低減する特定の方法を提供し、ここで、該方法は、以下の工程：
a) 親オリゴヌクレオチドのコア核酸塩基配列を保持する立体選択的オリゴヌクレオチド変異体（子オリゴヌクレオチド）のライブラリを作成すること；
b) 工程a）において作成されたライブラリを上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞培養物内で（培地は少なくとも4ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む）（本明細書に記載の本発明の方法に従い）スクリーニングすること；並びに、
c) 細胞培養物において、ライブラリに存在する、親オリゴヌクレオチドよりも毒性が低い1つ又は複数の立体選択的変異体を同定すること；
を含む。
【０１９９】
場合により、例えば、この方法によって同定された1つまたは複数の立体選択的変異体が、次のラウンドのスクリーニング方法において親オリゴヌクレオチドとして使用されるように、本方法を繰り返す（反復スクリーニング）。
【０２００】
本発明の方法において、工程b）において作成されたライブラリの各メンバーは、親とは異なる少なくとも1つの立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【０２０１】
本発明の方法は、本発明の方法の1つを用いて毒性が低減された1つまたは複数の選択された核酸分子変異体を製造する追加の後続工程を更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、後続する製造は1g超、例えば10g超の規模である。いくつかの実施形態では、インビボ又はインビトロスクリーニング工程用のオリゴヌクレオチドの合成は、1g未満、例えば0.5g未満、例えば0.1g未満の規模で行われる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本方法は、薬剤のライブラリ、または工程c）またはe）で同定されたライブラリ内の選択された1つ又は複数の薬剤のいずれかのインビトロまたはインビボ効力を決定する工程を更に含む。
【０２０３】
本発明は、オリゴヌクレオチド、例えばLNAオリゴヌクレオチドのインビボ腎毒性（例えば、その可能性）を予測するための方法を提供し、該方法は、以下の工程：
オリゴヌクレオチドを上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞培養物に投与すること、ここで、培地は、少なくとも4ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む；細胞をオリゴヌクレオチドの存在下で、例えば、2-9日間の間、例えば2-6日間、例えば3日間の期間インキュベートすること；および
その後毒性の少なくとも1つのバイオマーカー、例えば本明細書に記載のもの、培地に放出されたEGF及び／又ははKIM-1の量を測定するにより、測定すること；並びに、場合により細胞内ATPレベルを決定すること；を含む。適切には、細胞内ATPレベルの減少は、腎毒性のあるオリゴヌクレオチドの指標であり、培養培地におけるEGF又はKIM-1の増加は、腎毒性のあるオリゴヌクレオチドの指標である。
【０２０４】
本発明は、薬剤、例えば、核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばLNAオリゴヌクレオチドの腎毒性（例えば、その可能性）を決定するためのインビトロアッセイの使用、の使用を提供する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、インビボ毒性（例えば、腎毒性）を予測する（または決定する）ための方法は、インビトロ又はインビボ毒性が低減している、親オリゴヌクレオチドの立体選択的な変異体を同定するために使用してもよいことが認識されるであろう。
【０２０６】
補完的毒性アッセイ（Complementary toxicity assays）
本願に記載される薬剤の予測するインビボ腎毒性を予測するための方法に加えて、本方法はさらに、薬剤、特に治療的オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発に関連する他の毒性を予測するための方法と組み合わせてもよい。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本出願において開示されているまたは請求される腎毒性を予測するための方法は、薬剤、特にオリゴヌクレオチドの免疫毒性を予測するための方法であってもよい。
【０２０８】
薬剤、特にオリゴヌクレオチドの免疫毒性を予測するための1つの方法は、薬剤で処理された血液サンプルにおける少なくとも1つの補完バイオマーカーおよび／または少なくとも1つ（例えば少なくとも2つ）のサイトカインバイオマーカーを測定することを含む。特定の実施形態において、免疫毒性は、薬剤特にオリゴヌクレオチドで処理された血液サンプルにおける少なくとも1つの補完バイオマーカーおよび少くとも2つのサイトカインバイオマーカーを測定することによって予測される。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、免疫毒性を予測するための方法を更に含む又は提供し、該方法は、以下の工程：a）薬剤、特にオリゴヌクレオチドを、ヒト血液（体から単離された血液）に投与すること；b）サンプルを30分〜8時間の間インキュベートすること；c）反応を停止すること；並びに、d）以下のバイオマーカー：i）補完バイオマーカーC3aC5a、及び／又はii）サイトカインバイオマーカーインターロイキン6（IL6）、インターロイキン8（IL8）、腫瘍壊死因子アルファ（TNFa）、および単球走化性タンパク質-1（MCP1）の少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、又はすべてを測定すること；を含み、ここで、バイオマーカーのうちの上記2つが対照におけるもと比較して約2倍を超える平均の増加は、薬剤、例えば、オリゴヌクレオチドのインビボ免疫毒性の指標である。工程a）の血液サンプルは、典型的には少なくとも1人の健康なヒト対象、例えば少なくとも2人または少なくとも3人の健康なヒト対象から得られる。一般に、血液サンプルは混合されていない。いくつかの実施形態では、補完バイオマーカーC3aおよびC5aの少なくとも1つは、インターロイキン6（IL6）、インターロイキン8（IL8）、腫瘍壊死因子アルファ（TNFa）、および単球走化性タンパク質-1（MCP1）からなる群より選択される少なくとも2つのサイトカインバイオマーカーと組み合わせて測定される。いくつかの実施形態では、少なくともサイトカインバイオマーカー、インターロイキン8（IL8）および単球走化性タンパク質-1（MCP1）が測定される。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、少なくとも3人のドナーから得た血液サンプルを使用する。通常、血液は健康なドナーから得られる（つまり、体から単離される）。いくつかの実施形態では、3つの異なる血液サンプルから得た測定値を平均して、免疫毒性を得る。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本出願において開示され又は請求される方法は、薬剤、特にオリゴヌクレオチドの肝毒性を予測するための方法と組み合わせてもよい。オリゴヌクレオチドインビボ肝毒性を予測するための方法は、参照として本明細書に援用されるWO2017／067970に記載されている。簡潔には、オリゴヌクレオチドインビボ肝毒性を予測するための方法の1つは、以下の工程：a）オリゴヌクレオチドを、細胞培養培地において、初代哺乳動物の肝細胞の集団（又は、人工多能性幹細胞由来の肝細胞の集団）にインビトロで投与すること；b）一定期間、例えば1〜14日間の間、特に2〜7日間の間、細胞をインビトロで培養すること；そして、c）その後、培養培地中に放出された乳酸脱水素酵素（LDH）のレベルを測定すること、および／または細胞内ATPレベルを測定すること；を含み、ここで、細胞培養培地中の乳酸脱水素の増加、例えば、対照と比較して20％の増加、または、細胞内ATPレベルの減少、例えば対照と比較して20％の減少は、オリゴヌクレオチドが哺乳動物においてインビボ肝毒性であることの指標又は予測させるものである。肝毒性の予測を補足できるさらなるバイオマーカーは、培養培地中に放出されるマイクロRNA-122であり（ここで細胞培養物培地中のマイクロRNA-122の増加は、肝毒性を予測させる）、また、細胞内グルタチオン（GSH）レベルである（ここで、GSHレベルの減少はの肝毒性を予測させる）。
【０２１２】
本発明のいくつかの実施形態では、インビボ腎毒性を予測するための方法は、例えば上記の方法といったインビボ免疫毒性を予測するための方法やインビボ肝毒性を予測するための方法と組み合わせる。
【０２１３】
医薬組成物
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得られる薬剤またはその塩を提供する。さらなる態様において、本発明の方法によって得られる薬剤またはその塩は、上記の薬剤のいずれか、並びに医薬的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントトを含む医薬組成物に製剤化することができる。医薬品に許容される希釈剤としては、リン酸緩衝塩水（PBS）および医薬的に許容される塩が含まれるが、ナトリウム塩やカリウム塩に限定されない。いくつかの実施形態では、医薬的に許容される希釈剤は無菌リン酸緩衝塩水である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、医薬的に許容される希釈剤中に50〜300μMの濃度で使用される。
【０２１４】
本発明に使用するのに適した製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985に見られる。薬剤送達の簡単なレビューには、例えば、Langer（Science 249:1527-1533, 1990）を参照のこと。WO2007／031091（参照として本明細書に援用される）は、医薬的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントのさらに適切で好ましい例を提供する。また、適切な投与量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組み合わせ、プロドラッグ製剤は、WO2007／031091に提供されている。
【０２１５】
本発明の方法により得られる薬剤は、医薬組成物又は製剤の調製のために、医薬的に許容される活性または不活性物質と混合してもよい。医薬組成物を製剤化するための組成および方法は、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含むがこれらに限定されない、いくつかの基準に依存する。
【０２１６】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されてもよく、または滅菌濾過されてもよい。得られた水溶液はそのまま使用するように包装してもよく、凍結乾燥して、投与前に滅菌水性担体と混合される凍結乾燥製剤に使用するようにしてもよい。製剤のpHは、典型的には、3〜11の間、より好ましくは5〜9の間、又は6〜8の間、最も好ましくは7〜8の間、例えば7〜7.5の間、である。得られた固体形態の組成物は、各単回投与単位が一定量の上記薬剤（複数可）を含有する複数の単回投与単位に包装することができ、例えば、錠剤またはカプセル剤の密封包装に包装してもよい。また、固体形態の組成物は、柔軟な量、例えば局所適用可能なクリームまたは軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブに入れて容器に包装することもできる。
【０２１７】
本発明は、疾患を治療または予防するための方法であって、本発明の方法によって得られる治療的または予防的有効量の薬剤またはその塩あるいは本発明の医薬組成物を、その疾患に罹患している又は罹患しやすい対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０２１８】
また、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載される本発明の方法により得られる薬剤またはその塩あるいは医薬組成物に関する。
【０２１９】
本発明の方法により得られる薬剤またはその塩あるいは本発明の医薬組成物は、典型的には有効量で投与される。
【０２２０】
また、本発明は、本明細書に記載の疾患を治療するための医薬を製造するため、あるいは、本明細書に記載の疾患を治療するための、本発明の方法によって得られる薬剤またはその塩の使用も提供する。
【０２２１】
本発明の実施形態
本発明の下記の実施形態は、本明細書に記載の他の実施形態と組み合わせて使用してもよい。
【０２２２】
哺乳動物における薬剤のインビボ腎毒性を予測するためのインビトロの方法であって、
前記方法は、以下の工程：
a. 上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞を、少なくとも4ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む適切な細胞培養培地内で培養すること；
b. 細胞培養物に薬剤を投与すること；
c. 細胞を一定期間インキュベートすること；および
d. その後上清におけるEGFレベルを測定すること；を含み、
ここで、前記上清におけるEGFレベルの増加は、腎毒性に関連する、又は腎毒性に関連すると予測される薬剤の指標である、前記方法。
【０２２３】
2．前記上清におけるEGFレベルは、ビヒクル対照又は非毒性基準薬剤で処理した細胞から得られる基準値と比較され、ここで、前記非毒性薬剤は、インビボで非毒性であることが確認されている、実施形態1に記載の方法。
【０２２４】
3．前記非毒性基準薬剤は、CGTcagtatgcgAATc（配列番号1）からなるオリゴヌクレオチド化合物であり、ここで、小文字はDNA単位を表し、大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表し、全てのLNA Cは5’メチルCであり、かつ全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、実施形態2に記載の方法。
【０２２５】
4．前記上清におけるEGFのレベルが前記ビヒクル対照又は非毒性基準値に対し200％を超えることは、薬剤の腎毒性を予測させる、実施形態3に記載の方法。
【０２２６】
5．前記上清におけるEGFレベルは、腎毒性薬剤で処理した細胞から得られる第2基準値と更に比較され、ここで、前記腎毒性基準薬剤は、インビボで腎毒性を引き起こすことが確認されている、実施形態2〜4のいずれか1項に記載の方法。
【０２２７】
6．アッセイウィンドウ（AW）が、非毒性基準薬剤又はビヒクル対照と前記腎毒性基準薬剤との差として決定される、実施形態5に記載の方法。
【０２２８】
7．前記毒性基準薬剤は、GCtgtgtgagcttGG（配列番号4）からなるオリゴヌクレオチド化合物であり、ここで、小文字はDNA単位を表し、大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表し、全てのLNACは5’メチルCであり、かつ全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、実施形態5に記載の方法。
【０２２９】
8．毒性グレードが下記式：
【化１０】
2019527038.tif 000011
に従って決定される、実施形態5〜7のいずれか1項に記載の方法。
【０２３０】
9．毒性グレードが6を超える、例えば、20を超える、例えば、50を超えることは、薬剤の腎毒性を予測させる、実施形態2〜8のいずれか1項に記載の方法。
【０２３１】
10．工程d）が、細胞内アデノシン三リン酸（ATP）レベルを測定することを更に含み、
ここで、細胞内ATPレベルの減少は、腎毒性に関連する、又は腎毒性に関連すると予測される薬剤の指標である、実施形態1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【０２３２】
11．塩水又は非毒性基準値に対する細胞内ATPのレベルが80％未満であることは、薬剤の腎毒性を予測させる、実施形態10に記載の方法。
【０２３３】
12．工程d）が、細胞外腎障害分子1（KIM-1）タンパク質又は細胞内mRNAレベルを測定することを更に含み、
ここで、KIM-1レベルの増加は、腎毒性に関連する、又は腎毒性に関連すると予測される薬剤の指標である、実施形態1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【０２３４】
13．塩水又は非毒性基準値に対するレベルが200％を超えることは、薬剤の腎毒性を予測させる、実施形態12に記載の方法。
【０２３５】
14．前記EGFRを発現する細胞は、72時間かけて前記培地から少なくとも50％のEGFを消費する、実施形態1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【０２３６】
15．前記EGFRを発現する細胞は、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、神経外胚葉細胞及び肝細胞からなる群より選択される、実施形態1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【０２３７】
16．前記EGFRを発現する細胞は、上皮細胞培養物又は肝細胞培養物である、実施形態1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【０２３８】
17．前記細胞は、マウス又はラット初代細胞といった齧歯類初代細胞；ブタ（例えば、ミニブタ）細胞；並びにサル（例えば、カニクイザル）又はヒト初代細胞といった霊長類初代細胞からなる群より選択される初代細胞培養物の形態である、実施形態16に記載の方法。
【０２３９】
18．前記初代細胞培養物は、ラット又はヒトの上皮細胞又は肝細胞より得られる、実施形態17に記載の方法。
【０２４０】
19．前記上皮細胞培養物は、腎臓上皮細胞培養物又は肺上皮細胞培養物である、実施形態16〜18のいずれか1項に記載の方法。
【０２４１】
20．前記腎臓上皮細胞は、近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞及び集合管上皮細胞からなる群より選択される、実施形態19に記載の方法。
【０２４２】
21．前記細胞培養物は、ヒトPTEC又はラットPTEC細胞より作成される、実施形態19又は20に記載の方法。
【０２４３】
22．前記EGFRを発現する細胞は、不死化細胞系から培養される、実施形態1〜16、19、及び20のいずれか1項に記載の方法。
【０２４４】
23．前記細胞系は、CACO2又はARPE19ではない、実施形態22に記載の方法。
【０２４５】
24．細胞培養物は、ヒトPTEC-TERT-1、ciPTEC、HK-2、NKi-2又はヒトA549細胞系からなる群より得られる、実施形態22に記載の方法。
【０２４６】
25．前記細胞培養培地は、5〜15ng／ml、例えば、8〜15ng／ml例えば、約10ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む、実施形態1〜24のいずれか1項に記載の方法。
【０２４７】
26．前記薬剤とのインキュベーションの期間は、2〜6日間、例えば、約3日間である、実施形態1〜24のいずれか1項に記載の方法。
【０２４８】
27．前記薬剤は、核酸ベースの分子、化学療法剤、アミノグリコシド；抗細菌剤、抗ウイルス剤；抗真菌剤、抗炎症剤および免疫抑制薬からなる群より選択される、実施形態1〜26のいずれか1項に記載の方法。
【０２４９】
28．前記薬剤は、RNAi剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアプタマーより選択される核酸分子である、実施形態1〜27のいずれか1項に記載の方法。
【０２５０】
29．前記薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態1〜28のいずれか1項に記載の方法。
【０２５１】
30．前記オリゴヌクレオチドは、トランスフェクション剤の存在無く、つまり、ジムノシス（gymnosis）と称されるプロセスにより細胞培養物に投与される、実施形態29に記載の方法。
【０２５２】
31．前記オリゴヌクレオチドは、トランスフェクション剤の存在下で細胞培養物に投与される、実施形態28に記載の方法。
【０２５３】
32．前記核酸分子は、1つ又は複数の糖部2’位修飾ヌクレオシドを含む、実施形態28〜31のいずれか1項に記載の方法。
【０２５４】
33．前記1つ又は複数の糖部2’位修飾ヌクレオシドは、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-DNA、アラビノ核酸（ANA）、2’-フルオロ-ANA及びLNAヌクレオシドからなる群より独立して選択される、実施形態32に記載の方法。
【０２５５】
34．前記1つ又は複数の糖部2’位修飾ヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである、実施形態32又は33に記載の方法。
【０２５６】
35．前記LNAヌクレオシドは、β-D-オキシ-LNA、α-L-オキシ-LNA、β-D-アミノ-LNA、α-L-アミノ-LNA、β-D-チオ-LNA、α-L-チオ-LNA、（S）cET、（R）cET、β-D-ENA又はα-L-ENAより選択される、実施形態33又は34に記載の方法。
【０２５７】
36．前記核酸分子は、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態28〜35のいずれか1項に記載の方法。
【０２５８】
37．前記連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態36に記載の方法。
【０２５９】
38．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNaseHをリクルート可能である、実施形態28〜37のいずれか1項に記載の方法。
【０２６０】
39．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである、実施形態38に記載の方法。
【０２６１】
40．前記オリゴヌクレオチドは、式5’-F-G-F’-3’のギャップマーであり、式中、領域FおよびF’は独立して1〜7個の修飾ヌクレオシドを含み、Gはヌクレアーゼをリクルート可能な6〜16ヌクレオシドの領域である、実施形態38又は39に記載の方法。
【０２６２】
41．前記KIM-1の増加は、前記EGFのレベルが増加しなくとも、実施形態28〜40のいずれか1項に記載の核酸分子についての腎毒性を予測させる、実施形態12又は13に記載の方法。
【０２６３】
42．前記インビボ腎毒性は急性腎臓傷害及び／又は尿細管変性である、実施形態1〜40のいずれか1項に記載の方法。
【０２６４】
43．薬剤のライブラリから、哺乳動物にインビボで投与するための1つ又は複数の薬剤を選択する方法であって、以下の工程：
a. 薬剤のライブラリを得ること；
b. 薬剤のライブラリの各メンバーを、上皮成長因子受容体（EGFR）を発現する細胞培養物に投与すること、ここで培地は、例えば、実施形態14〜25のいずれか1項に記載のように、少なくとも4ng／mlの上皮成長因子（EGF）を含む；
c. 細胞をインビトロで一定期間、例えば、実施形態26に記載ののように、培養すること；
d. 各薬剤について細胞内EGFの量を、例えば、実施形態1〜13のいずれか1項に記載のように、特定すること；並びに、
e. 実施形態8に従って決定したとき毒性グレードが6未満である1つ又は複数の薬剤を選択すること；を含む、方法。
【０２６５】
44．前記選択された薬剤の治療指数は、毒性基準物質又は親薬剤と比較して低い、実施形態43に記載の方法。
【０２６６】
45．前記核酸分子のライブラリは、実施形態28〜40のいずれか1項に記載の核酸分子のライブラリである、実施形態43又は44に記載の方法。
【０２６７】
46．前記核酸分子のライブラリは、親核酸分子の核酸分子変異体（子核酸分子）のライブラリであり、ここで、前記親核酸分子は、例えば、腎毒性といった毒性であり、かつ、工程d）は、親核酸分子よりも毒性が低い1つ又は複数の核酸分子変異体を同定し、ここで、前記核酸分子変異体は、親核酸分子の核酸塩基配列を保持する、実施形態44に記載の方法。
【０２６８】
47．前記親核酸分子は、実施形態28〜40のいずれか1項に記載の核酸分子、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態44〜46のいずれか1項に記載の方法。
【０２６９】
48．前記核酸分子変異体のライブラリは、親核酸分子とは設計が異なる子核酸分子の集団を含む、実施形態44〜47のいずれか1項に記載の方法。
【０２７０】
49．前記核酸分子変異体のライブラリは、前記親核酸分子と、
i. 1つ又は複数の立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の存在；
ii. ギャップサイズの変化；
iii. ギャップブレーカーの導入；
iv. ウイングサイズの変化；
v. ウイングにおける糖部2’位修飾ヌクレオシドの変化；並びに
vi. ウイングにおいて少なくとも2つの異なる2’位修飾ヌクレオシドを有する混合ウイングギャップマー、例えばLNAヌクレオシドおよび2’位置換ヌクレオシド、特にMOE
からなる群より選択される1つ又は複数の設計パラメーターが異なる、実施形態44〜48のいずれか1項に記載の方法。
【０２７１】
50．前記哺乳動物にインビボで投与するための1つ又は複数の薬剤の選択は、更に、インビボ免疫毒性及び／又はインビボ肝毒性を予測するのに適切なインビトロ免疫毒性アッセイ及び／又はインビトロ肝毒性アッセイの結果に基づく、実施形態44〜49のいずれか1項に記載の方法。
【０２７２】
51．実施形態43〜50のいずれか1項に記載の方法により得られる薬剤。
【０２７３】
52．実施形態51に記載の薬剤および医薬的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントを含む医薬組成物。
【０２７４】
53．医薬における使用のための実施形態51の薬剤又は実施形態52の医薬組成物。
【実施例】
【０２７５】
方法と材料
化合物
表1：本実施例で使用されるオリゴヌクレオチドのリスト
【表１】
2019527038.tif 000012
【０２７６】
上記化合物に関し、小文字はDNA単位を表し、大文字は、β-D-オキシ-LNA単位を表す。全てのLNA C単位は5’メチルCであり、かつ全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、Rp立体選択的ホスホロチオエート結合は下付き文字rで示す。Sp立体選択的ホスホロチオエート結合は下付き文字sで示す。太字、イタリック体の文字はMOE単位を表す。化合物20-1では、すべてのC単位（DNAおよびMOE）が5’メチルCである。配列番号は、化合物の核酸塩基配列を示す。
【０２７７】
インビボ腎毒性の測定
研究目的に繁殖されたWistar Han Crl：WI（Han）雄ラットは、生後7〜8週目でCharles River Laboratoriesから入手し、体重に基づいて4（表1、実験A）または8（表1、実験B）の群に分け、投与前に少なくとも5日間順化させた。標準的な環境条件（22±2℃、相対湿度50±20％、明／暗サイクル12h／12h、ペレット餌および水は自由）下で飼育した動物は、AAALAC認定施設にてリッチな環境を与えられ、定期的に注意深くモニターした。すべての手順は、それぞれの地域の規制及び施設内動物管理使用委員会による動物飼育認定に従った。試験化合物は、等張滅菌食塩水にて調合し、滅菌濾過（0.22μm）し、および肩甲骨内領域に1日目と8日目に40mgの／kg（2.5mL／kg）で投与した。対照群の動物は、ビヒクル対照として塩水を与えた。15日目に動物に水道水（10ml／kg）を経口投与し、代謝ケージで6時間尿を氷上に収集した。尿蛋白レベル（Aution Max AX-4280）と尿中腎障害バイオマーカーを測定した（Multiplex MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 2）。15日目に、ラットを、ペントバルビタールの腹腔内注射および放血により犠牲にした。腎皮質サンプルを収集し、10％中性緩衝ホルマリンに浸漬して固定し、パラフィンに包埋し、5μmに切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色した。H＆E切片は、その後、Aperio ScanScope AT（Leica Biosystems）スキャナを使用して20倍の倍率でスキャンし、その後スキャンからImageScopeソフトウェアにより画像を取り込んだ。1つまたは複数の以下のパラメータ：腎臓の重量、血清クレアチニン、尿タンパク、尿中KIM-1タンパク質、KIM-1のmRNA、腎臓の変性／再生、および相対尿細管毒性グレード、を評価した。
【０２７８】
細胞培養物（Cell cultures）
ヒト初代近位尿細管上皮細胞（PTEC）細胞培養物
初代PTEC（Science Cell Research Labotories catalog ＃4100）を、PTEC培地［フェノールレッドを含まないDMEM／F12（ThermoFisher Scientific 11039021）、1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（ThermoFisher Scientific 15140122）、10mMのHEPES（ThermoFisher Scientific 15630056）、5 μg／mlインスリンおよび5 μg／mlトランスフェリンおよび8.65ng／ml亜セレン酸ナトリウム（全て100倍濃縮ストック溶液ThermoFisher Scientific 41400045から得た）、100 nMヒドロコルチゾン（Sigma H6909）、3.5 μg／mlアスコルビン酸（Sigma A4403）、25ng／mlプロスタグランジンE1（Sigma P5516）、3.25 pg／mlトリヨード-L-チロニン（Sigma T6397）、10ng／mlヒト組換え上皮成長因子（EGF、R＆D Systems 236-EG-200）、および100μg／mlジェネティシン（G418硫酸塩、ThermoFisher Scientific 10131027）を含有する］にて、製造元の説明書に従って培養した。
【０２７９】
オリゴヌクレオチドを用いた処理の前に、初代PTEC細胞をPTEC培地にそれぞれ40000〜20000細胞／wellの密度でI型コラーゲンでコーティングした96ウェルプレート（Corning、356407）に播種し、コンフルエントになるまで増殖させた。
【０２８０】
ヒトPTEC-TERT1細胞培養物
PTEC-TERT1（Evercyte GmbH, Austria）を、PTEC培地［フェノールレッドを含まないDMEM／F12（ThermoFisher Scientific 11039021）、1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（ThermoFisher Scientific 15140122）、10mMのHEPES（ThermoFisher Scientific 15630056）、5 μg／mlインスリンおよび5 μg／mlトランスフェリンおよび8.65ng／ml亜セレン酸ナトリウム（全て100倍濃縮ストック溶液ThermoFisher Scientific 41400045から得た）、100 nMヒドロコルチゾン（Sigma H6909）、3.5 μg／mlアスコルビン酸（Sigma A4403）、25ng／mlプロスタグランジンE1（Sigma P5516）、3.25 pg／mlトリヨード-L-チロニン（Sigma T6397）、10ng／mlヒト組換え上皮成長因子（EGF，R＆D Systems 236-EG-200）、および100μg／mlジェネティシン（G418硫酸塩，ThermoFisher Scientific 10131027）を含有する］にて、製造元の説明書に従って培養した。
【０２８１】
オリゴヌクレオチドを用いた処理の前に、PTEC-TERT1をPTEC培地にそれぞれ40 000〜20 000細胞／wellの密度でI型コラーゲンでコーティングした96ウェルプレート（Corning、356407）に播種し、コンフルエントになるまで増殖させた。
【０２８２】
Rat初代近位尿細管上皮細胞（PTEC）細胞培養物
近位尿細管上皮細胞は、Bruce et al, Methods Mol Biol 1001, 53-64 （2013）に記載されたものを単純化した手順によって調製した。腎臓を1匹の麻酔したオスのWistarラット（年齢：10〜18週）から取り出し、冷たい1倍濃縮ハンクス平衡塩溶液（HBSS, ThermoFisher Scientific 14065049）で洗浄した。臓器の膜を剥がし、髄質のない腎臓皮質の外側のストリップを1〜2 mm 3の小片に切断した。組織片を2mg／mlコラゲナーゼA（Roche10103586001）および10μg／ml DNAse I（Roche10104159001）を含有する25mlのHBSS中で37℃で60分間連続的に穏やかに振とうすることで消化した。解離した組織を最初に200μm細胞ストレーナー（pluriSelect 43-50200）に通して、続いて100μm細胞ストレーナー（pluriSelect 43-50100）に通して連続的に濾過した。単一細胞および細管フラグメントを含む濾液を洗浄し、MgCl 2およびCaCl 2を含まないHBSS溶液（HBSS-／-，ThermoFisher Scientific 14175053）中で3回（100g）遠心分離した。沈殿物を25mlのHBSS-／-に再懸濁し、25mlの30％OptiPrep溶液［5容量の60％OptiPrep密度勾配培地（Sigma D1556）、4容量のH2O滅菌液、および1容量の10倍濃縮リン酸緩衝塩水（MgCl 2およびCaCl 2を含まない）（PBS-／-ThermoFisher Scientific 14200-067）の混合物］と混合し、15％OptiPrep内に細胞と細管フラグメントの懸濁液を得た。懸濁液を遠心分離した（800g、室温で20分間）。管の上部3分の1の細胞帯を採取した。管の底の堆積物中の細胞は捨てた。採取した細胞を洗浄し、ラット以下のPTEC培地［1容量のDMEM（ThermoFisher Scientific 11966025）、1容量のHam’s F-12栄養ミックス（ThermoFisher Scientific 21765029）、2％ウシ胎児血清（FBS，ThermoFisher Scientific 16000044）、1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（ThermoFisher Scientific 15140122）、10 mM HEPES（ThermoFisher Scientific 15630056）、5 μg／mlインスリンおよび5 μg／mlトランスフェリンおよび8.65ng／ml亜セレン酸ナトリウム（すべて100倍濃縮原液からのもの、ThermoFisher Scientific 41400045）、100 nMヒドロコルチゾン（Sigma H6909）、3.5 μg／mlアスコルビン酸（Sigma A4403）、25ng／mlプロスタグランジンE1（Sigma P5516）、3.25 pg／mlトリヨード-L-チロニン（Sigma T6397）、および10ng／mlラット組み換え上皮成長因子（EGF，R＆D Systems 3214-EG-100／CF）］中で3回（400g、室温で5分間）遠心分離した。最後の遠心分離工程の後、細胞調製物を50mlのラットPTEC培地に再懸濁し、3つのコラーゲンI被覆150cm 2細胞培養物フラスコ（Corning 354486）に分配し、続いて最初の2日は培地交換して4日間インキュベートした。
【０２８３】
オリゴヌクレオチドを用いた処理の前に、拡大ラットPTEC細胞を、トリプシン-EDTA溶液（ThermoFisher Scientific 25200056）を用いた剥離により培養フラスコから採取し、ラットPTEC培地にて洗浄し、ラットPTEC培地にそれぞれ36 000細胞／wellの密度でI型コラーゲンでコーティングした96ウェルプレート（Corning、356407）に播種し、コンフルエントになるまで増殖させた。
【０２８４】
初代ヒト肝細胞
凍結保存したヒト肝細胞を、10％ウシ胎児血清、ペニシリン（100U／ml）、ストレプトマイシン（0.1mg／ml）を補充したフェノールレッド（Sigma W-1878）を含まないWilliam培地M（WME）中に約1×106細胞／mlの密度で懸濁し、コラーゲンコート96ウェルプレート（Becton Dickinson AG、Allschwil、Switzerland）に0.4×105細胞／wellの密度で播種した。オリゴヌクレオチドで処理を開始する前に、細胞を、細胞培養物プレートへ付着させるために、3〜4時間、予備培養した。
【０２８５】
オリゴヌクレオチド処理前に、播種培地を90μlの無血清WMEと交換した。
【０２８６】
A549細胞（腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞）
A549細胞（ATCC CCL-185）を製造元の説明書に従ってA549培地［F-12K栄養ミックス（Gibco，21127-022）、1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco：15140-122）、10％FBS（Gibco 16000-044）］中で培養した。
【０２８７】
オリゴヌクレオチドを用いた処理の前に、A549細胞をA549標準培地に3000細胞／wellの密度で96ウェルプレートに播種し、60％コンフルエントになるまで増殖させた。
【０２８８】
リポフェクションのために、リポフェクタミン（Invitrogen，11668-019）を用い製造元の説明書に従って細胞に1または10ngのオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。24時間後、培地を10ng／mlのEGFおよび2％のFCSを含有するA549標準培地に交換した。72時間後、細胞を回収し、ATPを測定し、上清をEGF分析のために-20℃で保存した。
【０２８９】
ジムノシスを用いたオリゴヌクレオチド処理
オリゴヌクレオチドをPBSに溶解し、所定の濃度、例えば10、30または100μMで細胞培養物に添加した。各ウェルの総容積は100μlであった。PBSはビヒクル対照として使用した。
【０２９０】
オリゴヌクレオチド処理後に細胞内ATPを分析する際、0日目に同じ濃度のオリゴヌクレオチドを添加することを含め、3日毎に培地を交換した。
【０２９１】
オリゴヌクレオチド処理後にEGFおよびKIM-1のような細胞外マーカーを分析する際、培地を回収し、さらなる分析まで-20℃で保存した。最初のオリゴヌクレオチド処理から3日を超えて増殖した細胞は、3日ごとに培地を回収し新鮮なオリゴヌクレオチドを含め交換した。回収した培地は-20℃で保存した。
【０２９２】
ATPアッセイ
細胞内ATPレベルの決定のために、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viabilityアッセイ（G7571、Promega Corporation、Madison WI、USA）を製造元の説明書に従って使用した。各サンプルは三重にテストされた。特に記載のない限り、細胞内ATPレベルは、オリゴヌクレオチド処理後9日目に測定した。
【０２９３】
EGFアッセイ
ヒトEGFの分析には、細胞上清を氷上で解凍し、サンプル希釈緩衝液（BioRadカタログ番号M60-009RDPD）中で1：2および1：10に希釈し、そしてヒトEGFビーズ（Bio-Plex ProTMヒト癌バイオマーカーパネル2 EGF Set＃171BC603M）を使用してLuminexベースのELISAにより分析をし、またはその後にBio-Plex（登録商標）200システム（BioRad）を用いた分析を製造元の説明書に従って行った。データは、三重で行いウェルの平均濃度および標準偏差として報告する。EGFレベルの200超％の増加を腎毒性を予測させるものとした。
【０２９４】
KIM-1アッセイ
ヒトKIM-1の分析には、細胞上清を氷上で解凍し、サンプル希釈緩衝液（BioRadカタログ番号M60-009RDPD）中で1：2および1：10に希釈し、そしてヒトKIM-1ビーズ（Bio-Plex ProTMヒト腎臓傷害パネル4、Millipore HKI4MAG-99K-KIM1）を使用してLuminexベースのELISAにより分析をし、その後にBio-Plex（登録商標）200システム（BioRad）を用いた分析を製造元の説明書に従って行った。データは、三重で行いウェルの平均濃度および標準偏差として報告する。KIM-1レベルの200超％の増加を腎毒性を予測させるものとした。
【０２９５】
実施例1：オリゴヌクレオチド処理による細胞培養物の形態変化
本実施例は、オリゴヌクレオチド処理後の細胞培養物の形態に対する効果を評価する。
【０２９６】
PTEC-TERT1細胞は、「材料および方法」の項に記載の通りに培養した。腎尿細管の循環する裸のオリゴヌクレオチドへの生理的暴露（つまり、本明細書ではジムノシスまたはジムノシス送達とも称される送達技術の助けを借りずに）、PTEC-TERT1細胞のコンフルエントな単層を100μMのオリゴヌクレオチドの水溶液に曝露した。新鮮培地中の100μMの新鮮オリゴヌクレオチドを含む培地を3日ごとに交換した。
【０２９７】
7日間処理した後、処理した細胞培養物における形態学的変化を明視野顕微鏡下で調べた。図1は、オリゴヌクレオチド化合物1-1（インビボ毒性無）で処理したPTEC-TERT1細胞が、塩水処理細胞と比較して形態学的変化を全く示さなかったことを示す。オリゴヌクレオチド化合物3-1（中度のインビボ毒性）で処理した細胞は不規則なドームおよび液胞を形成したのに対し、オリゴヌクレオチド化合物4-1（高度のインビボ毒素）で処理したPTEC-TERT1細胞は平らで安定した外観をとった。毒性化合物は両方とも形態学的変化を示すが、毒性の低い化合物3-1は毒性の高い化合物4-1よりも有意な形態学的変化を生じた。
【０２９８】
結論として有毒なオリゴヌクレオチドは形態に影響を与えるが、その毒性の程度は形態学的変化を用いて予測できない。
【０２９９】
実施例2：PTECおよびPTEC-TERT1細胞における細胞外EGFに対するオリゴヌクレオチドの効果
本実施例は、オリゴヌクレオチドの曝露後の細胞培養物培地における可溶性バイオマーカーEGFに対する効果を評価する。
【０３００】
初代PTEC細胞および不死化PTEC-TERT-1細胞系は、「材料および方法」の項に記載の通りに培養した。コンフルエントな細胞を「材料および方法」の項に記載のように、3、10、30または100μMの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。
【０３０１】
培地中のEGF濃度は、「材料と方法」の項のEGFアッセイに従って測定した。
【０３０２】
結果を以下の表2に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３０３】
表2．オリゴヌクレオチド処理から3又は6日後のEGF濃度
【表２】
2019527038.tif 000013
【０３０４】
この結果から、初代PTEC細胞では3日目ですでに見られるように、有毒なオリゴヌクレオチド（化合物3-1および4-1）は、塩水および無毒な化合物1-1と比較して、100μMのオリゴヌクレオチド濃度で培地中の可溶性EGFの有意な増加を示す。6日目では、初代PTEC細胞では10μMの濃度まで毒性化合物を検出することが可能であるが、PTEC-TERT1細胞では100μMが必要である。さらに、両細胞系において6日目にこれらの化合物についてインビボで観察された毒性の程度を区別することが可能である。PTEC-TERT1細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）の触媒サブユニットの安定な発現により不死化されたヒト近位尿細管細胞からなる。PTEC-TERT1は、テロメア短縮によりインビトロの寿命が有限な初代PTEC細胞よりもさらに複製上の利点を備え、初代PTEC細胞の形態学的および機能的特性を維持する細胞モデルとして開発された。
【０３０５】
実施例3：PTEC-TERT1細胞における細胞外EGFに対するオリゴヌクレオチドの効果
本実施例は、不死化PTEC-TERT1細胞におけるバイオマーカーとしてのEGFが、無害な1つのオリゴヌクレオチドとインビボ毒性グレードが異なる4つのリボヌクレオチドを用いて観察される毒性のグレードを区別するために使用できるか否かを評価する。
【０３０６】
不死化PTEC-TERT-1細胞系は、「材料および方法」の項に記載の通りに培養した。コンフルエントな細胞を「材料および方法」の項に記載のように、3、10、30または100μMの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。
【０３０７】
EGF濃度は、「材料および方法」の項のEGFアッセイに従って処理後、3日目、7日および10日目に測定した。
【０３０８】
結果を以下の表3に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３０９】
表3：オリゴヌクレオチド処理から3、7および10日後のEGF濃度
【表３】
2019527038.tif 000014
【０３１０】
この結果から、3日目では、33または100μMで投与した場合、高度な毒性化合物（化合物4-1）は他の化合物と比較して、培地中の可溶性EGFの有意な増加を示すことがわかる。7日目には、中度および高度の毒性化合物を33μMの濃度で検出することが可能であり、化合物間の毒性の程度は100μMのオリゴヌクレオチドで区別することができる。10日目では、中度の毒性のオリゴヌクレオチド（化合物3-1）と低度の毒性のオリゴヌクレオチド（化合物2-1）を区別するのがより困難である。しかしながら、どちらも無害なオリゴヌクレオチド（化合物1-1）とは区別され、100μMで投与された場合、より毒性の高い化合物4-1および5-1は依然として10日目で十分に区別される。
【０３１１】
実施例4：PTEC-TERT1細胞における細胞外EGFに対するオリゴヌクレオチドの効果
本実施例は、実施例3の知見が他の標的に向けられたより大きなオリゴヌクレオチドのセットに対しても再現できるか否かを評価する。同じ研究で、他の2つのバイオマーカーのKIM-1と細胞内ATPを同様に測定した。
【０３１２】
不死化PTEC-TERT-1細胞系は、「材料および方法」の項に記載の通りに培養した。コンフルエントな細胞を「材料および方法」の項に記載のように、10、30または100μMの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。
【０３１３】
EGFおよびKIM-1測定は6日目に行った。ATP測定では、細胞をオリゴヌクレオチド処理後9日目に収集した。EGF、KIM-1およびATP濃度は、「材料および方法」の項のアッセイに従って測定した。
【０３１４】
結果を以下の表4に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３１５】
表4：オリゴヌクレオチド処理から6日目の培養培地におけるEGFおよびKIM-1レベル、並びに9日目の細胞内ATPレベル
【表４】
2019527038.tif 000015
【０３１６】
表4から、EGFバイオマーカーは、100μMのオリゴヌクレオチド用量で12種の毒性化合物のうち10種を予測することができることが分かる。
【０３１７】
KIM-1は12種の毒性化合物のうち2種しか予測しないが、しかしこれらはEGFバイオマーカーで予測できなかった化合物であるため、KIM-1はバイオマーカーとしてのEGFによる予測を補完ことができることを示す。
【０３１８】
バイオマーカーとしてのATPは、12種の毒性化合物のうち5種を予測することができる。したがって、ATPバイオマーカーはEGFバイオマーカーを補完するために使用することができるが、EGFバイオマーカー程、毒性を予測させるものではない。
【０３１９】
結果も図2にまとめる。
【０３２０】
実施例5：初代肝細胞における細胞外EGFに対するオリゴヌクレオチドの効果
以下の実施例では、機能的EGFRを発現する腎臓以外の細胞が、オリゴヌクレオチドの腎毒性を予測するのに使用できるか否かを調べた。
【０３２１】
ヒト初代肝細胞は、「材料および方法」の項に記載の通りだが、培地に10ng／mlのEGFを添加して培養した。コンフルエントな細胞を「材料および方法」の項に記載のように、10または100μMの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。
【０３２２】
培地は3日目に得て、EGFレベルは「材料と方法」の項に記載のアッセイに従って測定した。
【０３２３】
結果を以下の表5に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３２４】
表5：オリゴヌクレオチド処理から3日目の初代肝細胞由来の培養培地におけるEGFレベル
【表５】
2019527038.tif 000016
【０３２５】
上記結果から、100μMのオリゴヌクレオチドでは全ての腎毒性のある化合物が初代肝細胞を用いて同定することができ、そして重度の毒性を有する化合物（4-1）は中程度の毒性を有する化合物と区別できることが分かる。
【０３２６】
実施例6：トランスフェクトされた細胞における細胞外EGFに対するオリゴヌクレオチドの効果
本実施例では、ジムノシスよりもオリゴヌクレオチドを用いるトランスフェクションに適した細胞系が腎毒性を予測するための方法に適用できるか否かを検査した。
【０３２７】
A549は、「材料および方法」の項に記載の通りに培養した。50〜60％コンフルエントで、25μlのOptiMEM（GIBCO 31985062）に0.5μlのLipofectamin（Invitrogen、11668〜019）を含む溶液、および同容量のOptiMEMに1ngまたは10ngのオリゴヌクレオチドを含む溶液を用いて、オリゴヌクレオチドを細胞にトランスフェクトした。細胞を37℃で一晩インキュベートした。培地はA459標準培地＋10ng／ml EGFを用いて交換した。トランスフェクションの48時間後、培地をEGF測定のために回収し、細胞をATP測定のために収集した。
【０３２８】
結果を以下の表6に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３２９】
表6：オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションから48時間後のA549細胞から得たEGFおよびATPレベル
【表６】
2019527038.tif 000017
【０３３０】
これらのデータは、EGFが、トランスフェクトされた上皮細胞における腎毒性のバイオマーカーとしても使用できることを示す。毒性の高いオリゴヌクレオチド（4-1および8-1）は1ngですでに検出可能であるが、中毒性のオリゴヌクレオチド（3-1）では10ngが必要である。
【０３３１】
また、このデータは、ATPが、10ngの用量のオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた上皮細胞における腎毒性のバイオマーカーとして使用できることも示す。
【０３３２】
無毒性のオリゴヌクレオチド（2-1）は、10ngのオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた場合バイオマーカーとしてEGFとATPの両方で毒性の兆候を示す。可能性として、1〜10ngの間の濃度、例えば5ngがより適切であるようだ。
【０３３３】
実施例7：親オリゴヌクレオチドの設計変異体で処理された細胞における細胞外EGFに対する影響
本実施例では、親化合物と同じヌクレオチド配列を有するが、異なる設計、この場合、所与の位置で固定された立体化学を有する、オリゴヌクレオチド変異体の小さいライブラリをスクリーニングして、親化合物より毒性の低いオリゴヌクレオチド変異体を選択した。親オリゴヌクレオチドは検査の際、中度の毒性（化合物10-1）または高度の毒性（化合物8-1）を発することが知られていた。
【０３３４】
不死化PTEC-TERT-1細胞系は、「材料および方法」の項に記載の通りに培養した。コンフルエントな細胞を「材料および方法」の項に記載のように、10又は30μMの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。
【０３３５】
EGFレベルは、「材料および方法」の項のアッセイに従って処理後、6日目に測定した。
【０３３６】
結果を以下の表7に3回の同じ処理の平均として示す。毒性グレードは、以下の式に従って計算した。
【化１１】
2019527038.tif 000018
【０３３７】
式中、AWは、塩水基準と腎毒性基準化合物4-1との間の差（つまり、AW＝塩水-毒性基準）として決定されるアッセイウィンドウである。
【０３３８】
表7：6日後のPTEC-TERT1細胞におけるキラル修飾されたオリゴヌクレオチドのライブラリのEGFレベル
【表７】
2019527038.tif 000019
【０３３９】
これらのデータから、本アッセイを用いると、オリゴヌクレオチド変異体のライブラリをスクリーニングし、親分子と比較した場合に毒性グレードが有意に低減する化合物と同定することが可能であることが分かる。特に化合物10-2および10-4はさらなるインビボ試験のための適切な候補である。
【０３４０】
実施例8：PTEC-TERT-1細胞におけるEGF消費
本実施例では、PTEC-TERT1細胞においてEGFがどのように消費されるのかを調べ、また、オリゴヌクレオチド毒性の予測における培地中のEGFの効果を調べた。
【０３４１】
非処理PTEC-TERT1細胞の培地からのEGF消費を、細胞に10ngのEGF／mlの培地を添加した後72時間までを表8に示す。これは、明らかに非処理PTEC-TERT1細胞が時間の経過とともに培地内のEGFを消費することを示す。
【０３４２】
表8：PTEC-TERT1細胞におけるEGF消費
【表８】
2019527038.tif 000020
【０３４３】
実施例9：培地中のEGFの関連性
「材料および方法」の節に記載されているようにPTEC-TERT1細胞を培養し、コンフルエントな細胞を、培地中にEGFの存在する場合（10ng／ml）または存在しない場合のいずれかで25又は100μMオリゴヌクレオチドで6時間処理することによって、オリゴヌクレオチドの毒性を評価する際のEGFの培地への添加の関連性を評価した。結果を以下の表9に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３４４】
表9：オリゴヌクレオチド毒性を評価する際の培地におけるEGFの影響
【表９】
2019527038.tif 000021
【０３４５】
上記表から、培地中にEGFが存在しない場合、毒性のあるオリゴヌクレオチドで処理する際の培地中のEGFレベルに対する効果を見ることは不可能であることが分かる。一方、10ng／mlのEGFが培地中に存在する場合、毒性のあるオリゴヌクレオチドで処理された細胞中のEGFレベルは明らかに培地中で増加し、これは細胞のEGF消費がオリゴヌクレオチド処理により減損されていることを示す。
【０３４６】
消費（細胞内へのEGFの取り込み）の減損であり、細胞によるEGF発現の減少ではないことを確認するために、細胞内のmRNA EGFレベルを測定したところ、細胞がEGFを発現しないことが明らかに示された。
【０３４７】
実施例10：培地中のEGF濃度の調査
実施例9に見られるように、培地中のある程度のEGFの存在は、アッセイにおける腎毒性の読み取りのために必要である。本実施例は、細胞内のATPレベル、ならびにオリゴヌクレオチドによる標的ノックダウンに対する培地中のEGF濃度の影響を評価する。
【０３４８】
細胞内ATPレベルは、培地中に0、1、3、10、30および100ng／mlのEGFを添加した100μMのオリゴヌクレオチドに9日間曝露した後のコンフルエントなPTEC-TERT1において測定した。結果を表10に示し、そして3つの同一の処理の平均を表す。結果を以下の表10に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３４９】
表10：異なるEGFレベルを添加した培地における塩水の％としての細胞内ATP
【表１０】
2019527038.tif 000022
【０３５０】
標的ノックダウン（PCSK9 mRNAレベル）を評価するために、100μlの1x RNA lysis mixture（QuantiGene（登録商標） Sample Processing Kit, QS0101）を直接ウェルに加え製造元の説明書に従って、細胞から全mRNAを抽出した。分析までRNA溶解混合物を-80℃に保った。遺伝子発現分析のために、20μlの溶解物をmRNA捕捉磁気ビーズセット（PanomicsQuantiGene（登録商標）Plex Setカタログ番号12697）と混合し、一晩インキュベートし、製造元の説明書に従って（Panomics QuantiGene（登録商標） Plex Assay kit, QP1015）分岐DNA増幅用に処理し、分析した。PPIBプローブを正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。3つの生物学的複製物の平均蛍光強度（FI）および標準偏差を計算し、ビヒクル対照で正規化した。結果を以下の表11に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３５１】
表11：異なるEGFレベルを添加した培地における塩水の％としてのPCSK9 mRNA
【表１１】
2019527038.tif 000023
【０３５２】
これらの結果は、オリゴヌクレオチドをPTEC-TERT1細胞に適用した場合、細胞内ATPレベルに対する効果は培地中のEGF濃度に依存するのに対し、標的ノックダウンは培地中のEGFレベルに影響されないことを示している。培地中のEGFが10ng／mlの場合、オリゴヌクレオチド化合物の毒性をうまく区別することができるが、3ng／ml未満では有意な区別は観察されない。培地中のEGFの必要性は、バイオマーカーとしてEGFを用いた実施例6における知見と一致している。
【０３５３】
実施例11：EGFRをブロックした場合のアッセイに対する影響
本実施例は、本発明の腎毒性アッセイに使用される細胞系でEGFRをブロックすることがアッセイに影響を及ぼすかどうかを同定することを目的としている。
【０３５４】
本アッセイでは、EGFRキナーゼ活性の小分子阻害剤であるエルロチニブを5μMで使用した。細胞内ATPレベルを、エルロチニブ有りおよび無しで、培地中の10ng／mlのEGFとともに100μMのオリゴヌクレオチドで9日間曝露した後のコンフルエントなPTEC-TERT1中で測定した。結果を以下の表12に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３５５】
表12：エルロチニブ存在下におけるオリゴヌクレオチドの細胞内ATPへの影響
【表１２】
2019527038.tif 000024
【０３５６】
これらのデータは、エルロチニブを用いてEGFRを不活性化した細胞では、無害および有毒オリゴヌクレオチドのATPプロファイルの区別がつかないことを示している。これは、細胞ベースのアッセイにおいて、オリゴヌクレオチドの腎毒性プロファイルを評価する際、EGFR発現が細胞内で機能的である必要があることを強く示唆している。
【０３５７】
実施例12：PTEC-TERT1細胞における細胞内ATPに対するオリゴヌクレオチドの影響
上記の実施例4、6、10および11において、ATPは、腎毒性を評価する際の、EGFの代替としてまたは補完的なバイオマーカーとして有用であることが示された。表1の化合物1-1、3-1および4-1のPTEC-TERT1細胞における細胞内ATPレベルに影響を与えるのに必要な条件を調べた。
【０３５８】
PTEC-TERT1細胞は、「材料および方法」の節に記載のように培養した。PTEC-TERT1細胞のコンフルエントな単層を、「材料および方法」の節に記載されているように、3、10、30または100μMの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。処理は3日間または9日間行った。
【０３５９】
結果を以下の表13と14に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３６０】
表13：以下の処理単回によるATPの割合％
【表１３】
2019527038.tif 000025
【０３６１】
表14：以下の処理を3回繰り返したATPの割合％。ここで各処理は表に示された濃度である。
【表１４】
2019527038.tif 000026
【０３６２】
上記表から、PTEC-TERT1細胞における細胞内ATPの減少は、毒性が重度の化合物4-1の単回処理で6日目と、特に9日目に観察できることが分かる。一方、中程度の毒性の化合物3-1については、細胞内ATPに対する影響は、100μM用量は単回処理により、30μMの用量では反復処理により、9日目に観察される。
【０３６３】
実施例13：初代ヒトPTEC細胞における細胞内ATPに対するオリゴヌクレオチドの影響
ヒト初代PTEC細胞およびPTEC-TERT1細胞における細胞内ATPレベルに対するインビトロの効果に基づいて、化合物4-1（高度の毒性）と化合物3-1（中程度の毒性）との間で毒性の程度を区別する能力を調べた。
【０３６４】
細胞を「材料および方法」の節に記載されるように培養した。コンフルエントの細胞を、「材料および方法」の節に記載されるように、下記表に示されるような濃度で、オリゴヌクレオチドで処理した。処理は9日間行った。
【０３６５】
結果を以下の表15に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３６６】
表15：用量反応におけるATPの割合％。
【表１５】
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【０３６７】
このことから、いずれの細胞系でも、オリゴククレオチド3-1（中程度の毒性）とオリゴヌクレオチド4-1（高度な毒性）との間の毒性を区別することができるが、非毒性オリゴヌクレオチド1-1は細胞内ATPの減少をもたらさないことがわかる。
【０３６８】
実施例14：PTEC-TERT1細胞のけるEGFレベルに対するシクロスポリンA（cyclosporine A）とスタウロスポリン（Staurosporine）の影響
本実施例では、上記実施例のオリゴヌクレオチドで示したインビトロ腎毒性アッセイが、腎毒性を有することが知られている他の薬剤化合物にも適用可能かどうかを調べた。
【０３６９】
初代PTECまたはPTEC-TERT1細胞を、「材料と方法」の項に記載されているように培養した。初代PTECまたはPTEC-TERT1細胞のコンフルエントな単層を、DMSOで希釈したシクロスポリンA（Sigma-Aldrich C3662）またはスタウロスポリン（Sigma-Aldrich S4400）にさらし、100μMの最終容量において1、3、10、30又は100μMの最終濃度で細胞培養物に加えた。処理3日後に培地中のEGFのレベルを測定した。DMSOはビヒクル対照として使用した。
【０３７０】
結果を以下の表16に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３７１】
表16：シクロスポリンAまたはスタウロスポリンで3日間処理した細胞培養物中のEGFレベル（対照の割合％として示す）
【表１６】
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【０３７２】
これらのデータから、2つの非常に異なる小分子薬、シクロスポリンA（免疫抑制薬）およびスタウロスポリン（抗生物質薬）のインビボ腎毒性が、本発明のアッセイを用いてインビトロで再現できることがわかる。このデータはまた、このアッセイがこれらの薬物の1μMで、そしておそらくそれよりも低い腎毒性を検出できることも示す。
【０３７３】
実施例15：初代PTECおよびPTEC-TERT1細胞におけるATP、EGFおよびKim-1に対するオリゴヌクレオチドの影響
化合物20-1は、ISIS388626としても知られており、ナトリウム-グルコース共輸送体2（SGLT2）を標的とする、2’-O-メトキシエチル-RNA（MOE）修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。この化合物は、13週間の研究で毎週50mg、100mgまたは200mgで投与された場合、可逆的インビボ腎毒性をヒトに引き起こすことが示されている（Meer et al 2016 J Pharmacol Exp Ther Vol 359 pp 280-289）。
【０３７４】
本実施例では、化合物20-1を初代PTEC細胞またはPTEC-TERT1細胞に投与した際に、細胞外EGFおよびKIM-1ならびに細胞内ATPを測定することにより、この腎毒性を予測できるか否かを調べた。
【０３７５】
初代PTEC細胞および不死化PTEC-TERT-1細胞系を、「材料および方法」の項に記載の条件に従って培養した。コンフルエントな細胞を、「材料および方法」の節に記載されるように、30、100、300、400または500μMの濃度で、オリゴヌクレオチドで処理した。
【０３７６】
EGF、KIM-1、およびATPバイオマーカーは、「材料と方法」の項に記載されているアッセイを用いて測定した。
【０３７７】
結果を以下の表17および表18に3回の同じ処理の平均として示す。
【０３７８】
表17：初代PTEC細胞におけるオリゴヌクレオチド処理後6日目のEGFおよびKIM-1濃度、並びに処理9日後のATP濃度
【表１７】
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【０３７９】
表18：PTEC-TERT1細胞におけるオリゴヌクレオチド処理後6日目のEGFおよびKIM-1濃度、並びに処理9日後のATP濃度
【表１８】
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【０３８０】
これらのデータから、初代PTEC細胞とPTEC-TERT1細胞のいずれでも、EGFをバイオマーカーとしてしようすると、MOEアンチセンスオリゴヌクレオチドクレオチド（化合物20-1）のインビボ腎毒性を予測できることがわかる。ATPの減少は初代PTEC細胞でのみ観察されたが、予測因子であるKIM-1の上昇はPTEC-TERT1細胞でのみ観察された。まとめると、アッセイは、EGF、ATPおよびKIM-1に基づいて腎毒性を予測し、この予測は使用される細胞系に依存することの裏付けとなる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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