(57)【要約】  本発明は、逆平行のヘリックス−ターン−ヘリックス配置で立体構造的に拘束されている新規のポリペプチドライブラリに関する。本発明はさらに、生物学的使用、薬学的使用および他の使用のために、そのようなライブラリを生成する方法およびスクリーニングする方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドのライブラリにおいて、前記ライブラリの各メンバーは式ヘリックス−１−Ｌｉ−ヘリックス−２のヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造を含み、
この式中、
ヘリックス−１およびヘリックス−２は第１および第２のα−ヘリックスペプチドを含み、前記α−ヘリックスペプチドの各々は、アミノ酸配列
Ｘ１−Ｘ２−Ｈｙ−Ｖａｒ１−Ｘ３−Ｈｙ−Ｖａｒ１−Ｖａｒ２−Ｘ４−Ｈｙ−Ｖａｒ１−Ｘ５−Ｈｙ−Ｖａｒ１−Ｖａｒ３（配列番号１）
を含み、
この式中、
Ｘ１はＤ、Ｔ、Ｎ、ＳまたはＰであり、
Ｘ２はＥ、Ｐ、Ｑ、ＷまたはＤであり、
Ｘ３はＭ、Ａ、Ｉ、ＱまたはＲであり、
Ｘ４はＡ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、ＫまたはＥであり、
Ｘ５はＭ、Ｌ、Ａ、Ｗ、ＦまたはＫであり、
Ｈｙは、０．６２超の疎水性を示す側鎖を有する任意のアミノ酸残基であり、
Ｖａｒ１、Ｖａｒ２およびＶａｒ３は、Ｇ、ＰおよびＣを除いて天然に存在するアミノ酸の混合物であり、
Ｌｉはリンカーであり、
前記第１および前記第２のα−ヘリックスペプチドは逆平行のコイルドコイル構造を形成する
ことを特徴とするライブラリ。
【請求項２】
請求項１に記載のライブラリにおいて、前記リンカーＬｉは１〜３０個のアミノ酸残基を含む（配列番号２）ことを特徴とするライブラリ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のライブラリにおいて、
Ｘ１はＤであり、
Ｘ２はＥであり、
Ｘ３は、ヘリックス−１中ではＱであり、ヘリックス−２中ではＡであり、
Ｘ４は、ヘリックス−１中ではＥであり、ヘリックス−２中ではＫであり、
Ｘ５は、ヘリックス−１中ではＫであり、ヘリックス−２中ではＭである
ことを特徴とするライブラリ（配列番号３）。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載のライブラリにおいて、ＨｙはＬ、ＶまたはＩである（配列番号４）ことを特徴とするライブラリ。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載のライブラリにおいて、
Ｖａｒ２はＲ、ＱおよびＥの混合物であり、
Ｖａｒ３はＲ、ＱおよびＨの混合物である
ことを特徴とするライブラリ（配列番号５）。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載のライブラリにおいて、前記ライブラリのポリペプチドはバクテリオファージ上で提示されることを特徴とするライブラリ。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のライブラリにおいて、前記ライブラリは少なくとも１×１０６種のポリペプチドメンバーを含むことを特徴とするライブラリ。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか１項に記載のライブラリにおいて、前記ライブラリの各メンバーは少なくとも１つの追加部分に連結されていることを特徴とするライブラリ。
【請求項９】
請求項８に記載のライブラリにおいて、前記追加部分は、抗体もしくはこの抗体断片、毒素、サイトカイン、レポーター酵素、金属イオンに結合し得る部分、検出および／もしくは精製に適したタグ、ホモ会合ドメインもしくはヘテロ会合ドメイン、タンパク質の溶解性を増加させる部分、または酵素開裂部位を含む部分であることを特徴とするライブラリ。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載のライブラリメンバーをコードすることを特徴とする核酸分子のコレクション。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子のコレクションを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸分子のコレクションまたは請求項１１に記載のベクターを含むことを特徴とする組換え宿主細胞。
【請求項１３】
抗原に特異的なポリペプチドを単離する方法において、
ａ．請求項１乃至９の何れか１項に記載のライブラリと抗原とを接触させるステップと、
ｂ．前記ライブラリの前記抗原に結合していないメンバーを除去するステップと、
ｃ．前記ライブラリの前記抗原に結合したメンバーを回収するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法を使用して同定されたことを特徴とするポリペプチド。
【請求項１５】
抗体または抗体断片に連結されたヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造において、前記ヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造は逆平行のコイルドコイル構造を形成する第１および第２のα−ヘリックスペプチドを含むことを特徴とするヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、逆平行のヘリックス−ターン−ヘリックス配置で立体構造的に拘束されている新規のポリペプチドライブラリに関する。本発明はさらに、生物学的使用、薬学的使用および他の使用のために、そのようなライブラリを生成する方法およびスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療に関連する分子を同定するための強力な資源としてペプチドライブラリが現れている。加えて、ペプチドライブラリは、多くの他の目的および基礎研究に関連した資源でもある。
【０００３】
治療上、ペプチドは、小分子および大きい生物製剤（例えば抗体）を超えるいくつかの利点を有する。小分子と比較してペプチドは抗原との大きな相互作用界面を概して有し、この相互作用界面は水素結合およびファンデルワールス力を含む。この相互作用界面により、高親和性結合、抗原に対する高特異性および典型的には高効力がもたらされる。抗体と比較してペプチドは非常に小さく、従って典型的には組織に容易に浸透する。抗体治療は特定の腫瘍に利用不能である。
【０００４】
拘束されたペプチドを利用するライブラリ等の多数のファージディスプレイペプチドライブラリが存在する。拘束性ペプチドは、直鎖ペプチドに関連するいくつかの欠点（例えば、より高い立体構造的柔軟性に起因する弱い結合親和性、および人体でのタンパク質分解に対する感受性の増加）を克服する。
【０００５】
（ポリ）ペプチドの天然に存在する拘束モチーフはα−ヘリックス束である。α−ヘリックスは最大クラスのタンパク質二次構造を構成し、タンパク質−タンパク質相互作用の仲介で重要な役割を果たす。しかしながら、長さが１０〜３０個のアミノ酸である短い合成ペプチドは通常、水中において熱力学的に安定なヘリックスではなくランダム構造のみを取る（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１０  Ｊｕｎ  ２９；１０７（２６））。
【０００６】
α−ヘリックス束は、２つ、４つまたはさらに多くの束等の様々な形態で現れ得る。そのような束タンパク質中の個々のα−ヘリックスペプチドは平行または逆平行の配置で配向され得、そのためヘリックス軸が互いにわずかにずれて並ぶコイルドコイル構造が形成される。
【０００７】
そのような束中に存在するα−ヘリックス構造は通常、親水性の外部と、疎水性の内部と、ヘリックス間の塩架橋相互作用を形成する極性アミノ酸残基の境界とからなるプロファイルを有するヘプタド反復を含む。
【０００８】
ケラチン、ミオシン、エピデルミン、フィブリノゲンおよびトロポミオシンのような多くの天然に存在するタンパク質は、２つの二量体化α−ヘリックスペプチドにより形成されたコイルドコイル構造を有する。さらに、コイルドコイル構造はＤＮＡ結合タンパク質で頻繁に見出されており、このモチーフはロイシンジッパーと称される。
【０００９】
コイルドコイルドメインはまた、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ（Ｏ’Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４５：６４６−６４８（１９８９））、Ｃ／ＥＢＰ（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４０：１７５９−１７６４（１９８８））でも見出されており、例えばＧＣＮ４結合タンパク質（Ｏ’Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４２：５３８−５４２（１９８９））で見出されている。天然に存在するα−ヘリックスコイルドコイル構造は平行配向で見出されることが多く、この平行方向は安定した立体構造であると考えられる。
【００１０】
そのような構造を特定の認識分子の設計に適応させるアプローチが説明されている。国際公開第９４／２９３３２号パンフレットでは逆平行のコイルドコイルを含むポリペプチドが説明されており、上記骨格は、ＤＮＡ結合タンパク質およびサイトカイン等の天然に存在するタンパク質由来のヘリックス認識配列を組み込むように改変された。
【００１１】
米国特許第５，８２４，４８３号明細書では、新規に設計され且つ化学合成されたα−ヘリックスペプチドのコンビナトリアルライブラリの構築が説明されている。このα−ヘリックスペプチドはヘリックス内ラクタム架橋により安定化されており、任意選択で追加の第２のα−ヘリックスペプチドにより安定化されており、そのため平行または逆平行の配向の二量体コイルコイル構造が得られた。しかしながら、唯一の使用可能なペプチドライブラリは、２つのヘリックス内ラクタム架橋により安定化され且つ５箇所のアミノ酸位置で多様化された単一の２４個のアミノ酸の長さのα−ヘリックスポリペプチド鎖を包含した。
【００１２】
Ｆｕｊｉｉら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４２，３３２３−３３２５（２００１））は、ヘリックス−ターン−ヘリックスベースのライブラリのより具体的なアプローチを説明する。この科学刊行物では、アミノ酸末端ペプチドおよびカルボキシル末端ペプチドがグリシンベースのリンカーを介して連結されている新規に化学合成された逆平行配向のヘリックス−ターン−ヘリックスペプチドライブラリが開示されている。２つのヘリックス−ターン−ヘリックス形成ペプチドの各々は１４個のアミノ酸で構成され、２つのそれぞれのヘリックス上のロイシン残基との疎水性相互作用により安定化された。本開示のライブラリとは対照的に、カルボキシル末端ヘリックスペプチドのみが、５つの天然に存在するアミノ酸残基の混合物により３箇所の溶媒露出位置で多様化された。
【００１３】
ペプチドライブラリを利用する補足的な方法は、繊維状バクテリオファージ上でのそのようなライブラリの提示である。この方法は、合成により調製され得るライブラリと比べてはるかに大きい１０１０種の固有のペプチドメンバーほどのライブラリの調製を可能にする。
【００１４】
２００８年にはＦｕｊｉｉおよび共同研究者により、ファージにより提示される逆平行配向のヘリックス−ターン−ヘリックスペプチドライブラリが説明された（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７，６７４５−６７５１（２００８））。上述したライブラリとは対照的に、カルボキシル末端ヘリックスペプチドは、５つの溶媒曝露領域でランダム化されて３．２×１０６種の理論的ライブラリサイズを生じた。このライブラリは、検出可能なタグと共にグリシン／セリンリンカーにより、繊維状ファージの主要なコートタンパク質ＶＩＩＩ上で提示された。２０１１年（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，２６−６，２０１１，ｐ．５９３−６０３）、２００９年（Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ，１２９（１１），１３０３−１３０９，２００９）および２０１３年（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．５（３），１７１−１９４，２０１３）にはＦｕｊｉｉらにより、「マイクロ抗体」を生成するためのヘリックス−ターン−ヘリックスペプチドライブラリの特定の利用がさらに説明されている。
【００１５】
Ｆｕｊｉｉおよび共同研究者により説明された２種のライブラリの共通する構造上の特徴は、２つのα−ヘリックスペプチドの溶媒曝露位置でのアラニンの優勢な使用である。アラニンの伸長（ポリアラニン）はα−ヘリックス構造の形成を促進することが知られているが、水溶液中では低い溶解度を示す場合もあり、そのため凝集する傾向がある。
【００１６】
さらに重要なことに、Ｆｕｊｉｉおよび共同研究者により説明されたライブラリは、溶媒露出アラニン位置を多様化させることによりカルボキシル末端α−ヘリックスペプチド内でのみ多様化されている。このシナリオでは、多様化されていないアミノ末端ペプチドは、そのα−ヘリックス構造を保持し且つこの分子のヘリックス−ターン−ヘリックス構造を安定化させると考えられる。しかしながら、Ｆｕｊｉｉにより提供されたカルボキシル末端α−ヘリックスペプチドのランダム化により、正確に折り畳まれたヘリックス−ターン−ヘリックス構造を富化させるために特定の精製プロセスを必要とする望ましくない複数のランダム様立体構造を有するライブラリメンバーが依然として生じた（Ｆｕｊｉｉら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４２，３３２３−３３２５（２００１））。
【００１７】
２つのα−ヘリックスペプチドのうちの一方のみを多様化することの主な欠点は、このアプローチが、達成可能なライブラリサイズを著しく限定し、且つライブラリのポリペプチドと、このポリペプチドが結合した目的の標的分子との間の相互作用界面相（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）を著しく狭めて特異性および親和性が低下するという事実にある。
【００１８】
上述のアプローチの限界に基づいて、相当なサイズの改善されたヘリックス−ターン−ヘリックスポリペプチドライブラリを開発するという満たされていない必要性が依然として存在する。
【００１９】
本開示のライブラリは、Ｆｕｊｉｉにより開示されたライブラリと様々な形で異なる。本開示のライブラリの設計は、統計的な、構造的なおよび合理的な因子を考慮した複合アプローチに基づく。このアプローチは、第１の例では、天然に存在するα−ヘリックス構造中の所与の位置で見出された最も豊富なアミノ酸残基の分析および使用を含んだ。そのようなアミノ酸は、低い免疫原性、温度および化学変性に対する耐性、ｐＨ変化に対する比較的非感受性、血清安定性、ならびにプロテアーゼによるタンパク質分解に対する耐性等の好都合な生物物理学的特性を有すると考えられる。
【００２０】
第２に、本開示のヘリックス−ターン−ヘリックスライブラリ内の可変位置はアミノ末端およびカルボキシル末端の両方のα−ヘリックスペプチドに存在し、且つ同一の比較的平行な配向で提示される。この２つの特徴により、ヘリックス−ターン−ヘリックス分子の全長にわたり幅広く且つ平坦な相互作用界面の形成が可能になる。広がった相互作用界面は、特異性および親和性（両方とも治療分子の開発における重大な側面である）が改善される、目的の標的抗原との最適なタンパク質−タンパク質相互作用に不可欠である。
【００２１】
さらに、両方のα−ヘリックスペプチド中での多数の可変位置の導入により引き起こされるヘリックス−ターン−ヘリックス骨格の潜在的な不安定化を防止するために、ヘリックスの形成を促進するための且つヘリックス−ターン−ヘリックス構造を安定化させるためのさらなる構造上の考察を考慮して、各不変位置で最も適切なアミノ酸残基を選択した。このアミノ酸残基を選択して、ヘリックス間およびヘリックス内の静電的相互作用ならびにヘリックス間の水素結合により分子構造を安定化させた。
【００２２】
まとめると、本開示のライブラリは、結果として得られるポリペプチドのより効率的な開発ならびに患者におけるそれぞれの治療の安全性および有効性の増加につながるα−ヘリックス構造の安定化に支障を来すことなく、多様化位置の数を最大化することにより、Ｆｕｊｉｉおよび共同研究者により開示されたヘリックス−ターン−ヘリックスライブラリの限界を克服する。
【発明の概要】
【００２３】
本開示は、著しく大きいライブラリサイズを特徴とするヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）ポリペプチドライブラリを開示する。このライブラリから、高い親和性、特異性および機能性で目的の標的分子に結合するポリペプチドを単離し得る。
【００２４】
好ましくは、上記ポリペプチドライブラリはファージディスプレイライブラリである。
【００２５】
本開示のライブラリの配列多様性は、このＨＴＨ骨格の両方のα−ヘリックスドメインに存在する。従って、このライブラリによりコードされるポリペプチドは、例えば、２つ以上の空間的に別個ではあるが関連する結合部位で受容体に結合し得る。両方のα−ヘリックスドメインに存在する可変位置は、特定のポリペプチドとその標的抗原との間の相互作用界面相の拡大にさらに寄与し得、そのため特異性および親和性が改善される。
【００２６】
本開示の別の態様では、多様化アミノ酸残基位置は、本明細書で説明されているＨＴＨ骨格の溶媒露出領域に位置する。
【００２７】
本開示のライブラリは最大１２箇所のアミノ酸位置で多様化され得、各々は最大１７種の天然に存在するアミノ酸残基の混合物を有する。従って、１×１０１１種超のライブラリサイズが達成され得る。
【００２８】
このライブラリから単離されたポリペプチドは伝統的な免疫グロブリン結合剤および非免疫グロブリン結合剤と比較していくつかの優れた特性を有することも発見した。そのような特性として、例えば、このポリペプチドのコンパクトで小さいサイズ（約６ｋＤａ）、低い免疫原性、熱変性および化学変性に対する極度の安定性、ｐＨの変化およびタンパク質分解に対する比較的不感応性が挙げられる。
【００２９】
本開示のライブラリを使用して、治療上での使用のために分子を同定し得る、またはエピトープマッピング等の手段により、そのような分子の特徴を明らかにし得る。
【００３０】
一態様では、本開示は、ポリペプチドのライブラリにおいて、このライブラリの各メンバーは式ヘリックス−１−Ｌｉ−ヘリックス−２のヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造を含み、
この式中、
ヘリックス−１およびヘリックス−２は第１および第２のα−ヘリックスペプチドを含み、上記α−ヘリックスペプチドの各々は、アミノ酸配列
Ｘ１−Ｘ２−Ｈｙ−Ｖａｒ１−Ｘ３−Ｈｙ−Ｖａｒ１−Ｖａｒ２−Ｘ４−Ｈｙ−Ｖａｒ１−Ｘ５−Ｈｙ−Ｖａｒ１−Ｖａｒ３（配列番号１）
を含み、
この式中、
Ｘ１はＤ、Ｔ、Ｎ、ＳまたはＰであり、
Ｘ２はＥ、Ｐ、Ｑ、ＷまたはＤであり、
Ｘ３はＭ、Ａ、Ｉ、ＱまたはＲであり、
Ｘ４はＡ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、ＫまたはＥであり、
Ｘ５はＭ、Ｌ、Ａ、Ｗ、ＦまたはＫであり、
Ｈｙは、０．６２超の疎水性を示す側鎖を有する任意のアミノ酸残基であり、
Ｖａｒ１、Ｖａｒ２およびＶａｒ３は、Ｇ、ＰおよびＣを除いて天然に存在するアミノ酸の混合物であり、
Ｌｉはリンカーであり、
上記第１および上記第２のα−ヘリックスペプチドは逆平行のコイルドコイル構造を形成する
ことを特徴とするライブラリを提供する。
【００３１】
本開示のさらなる態様では、リンカーＬｉは１〜３０個のアミノ酸残基を含む（配列番号２）。
【００３２】
本開示の別の実施形態（配列番号３）では、
Ｘ１はＤであり、
Ｘ２はＥであり、
Ｘ３は、ヘリックス−１中ではＱであり、ヘリックス−２中ではＡであり、
Ｘ４は、ヘリックス−１中ではＥであり、ヘリックス−２中ではＫであり、
Ｘ５は、ヘリックス−１中ではＫであり、ヘリックス−２中ではＭである。
【００３３】
ある実施形態では、本開示は、ライブラリにおいて、ＨｙはＬ、ＶまたはＩであることを特徴とするライブラリ（配列番号４）を提供する。
【００３４】
ある実施形態では、本開示は、ライブラリにおいて、
Ｖａｒ２はＥ、ＲおよびＱの混合物であり、
Ｖａｒ３はＲ、ＱおよびＨの混合物である
ことを特徴とするライブラリ（配列番号５）を提供する。
【００３５】
本開示のさらなる実施形態では、このライブラリのポリペプチドはバクテリオファージ上で提示される。
【００３６】
本開示のさらなる実施形態では、このライブラリは少なくとも１×１０６種のポリペプチドメンバーを含む。
【００３７】
本開示のさらなる実施形態では、このライブラリの各メンバーは少なくとも１つの追加部分に連結されている。
【００３８】
本開示のある実施形態では、上記追加部分は、抗体もしくはこの抗体断片、毒素、サイトカイン、レポーター酵素、金属イオンに結合し得る部分、検出および／もしくは精製に適したタグ、ホモ会合ドメインもしくはヘテロ会合ドメイン、タンパク質の溶解性を増加させる部分、または酵素開裂部位を含む部分である。
【００３９】
さらなる実施形態では、本開示は、本開示のライブラリメンバーをコードする核酸分子のコレクションを提供する。
【００４０】
さらなる実施形態では、本開示は、本開示のライブラリメンバーをコードする核酸分子のコレクションを含むベクターを提供する。特定の実施形態では、上記ベクターはディスプレイベクターまたは発現ベクターである。
【００４１】
さらなる実施形態では、本開示は、本開示のライブラリメンバーをコードする核酸分子のコレクションまたはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００４２】
さらなる実施形態では、本開示は、抗原に特異的なポリペプチドを単離する方法において、
ａ．本開示に係るライブラリと抗原とを接触させるステップと、
ｂ．このライブラリの、この抗原に結合していないメンバーを除去するステップと、
ｃ．このライブラリの、この抗原に結合したメンバーを回収するステップと
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００４３】
さらなる実施形態では、本開示は、本開示の方法により同定されたことを特徴とするポリペプチドを提供する。
【００４４】
ある実施形態では、本開示は、抗体または抗体断片に連結されたヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造において、上記ヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造は逆平行のコイルドコイル構造を形成する第１および第２のα−ヘリックスペプチドを含むことを特徴とするヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造を提供する。
【００４５】
定義
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「で構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていないメンバー、構成要素または方法のステップを除外しない。
【００４６】
「ライブラリ」は複数種のメンバーを含む実体を意味する。本開示の文脈では、この用語は、ポリペプチドのライブラリにおいて、少なくとも２つの異なるポリペプチドを含むライブラリを指す。
【００４７】
用語「ペプチド」は、２０個以下のアミノ酸を有する短い分子を意味する。
【００４８】
用語「ポリペプチド」は、２０個超のアミノ酸を有する分子を意味する。
【００４９】
「融合タンパク質」は、互いに共有結合的に連結された２種の部分を有するポリペプチドにおいて、これらの部分の各々は異なる特性を有するペプチドまたはポリペプチドである、ポリペプチドである。この特性は、インビトロまたはインビボでの活性等の生物学的特性であり得る。この特性は、標的分子への結合、反応の触媒作用等の単純な化学的特性または物理的特性でもあり得る。これら２種の部分は、単一のペプチド結合により直接連結され得る、または１つもしくは複数のアミノ酸残基を含むペプチドスペーサーを介して連結され得る。一般に、これら２種の部分およびスペーサーは互いにリーディングフレーム中に存在する。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「ヘリックス−ターン−ヘリックス骨格」または「ＨＴＨ骨格」は、２つのα−ヘリックスが平行または逆平行の向きで配向され且つ２つのα−ヘリックスがアミノ酸の短いストレッチを介して連結されているポリペプチドの二次構造を指す。
【００５１】
用語「ヘプタド」、「ヘプタド単位」、「ヘプタド反復単位」および「ヘプタドモチーフ」は本明細書では互換的に使用され、ＨＴＨ骨格内で２回以上反復されている７ｍｅｒのペプチド断片を指す。α−ヘリックスの三次構造は、一次配列中の７個のアミノ酸残基がα−ヘリックスの約２回の折り返し（ｔｕｒｎ）に対応するようなものである。従って、α−ヘリックス立体構造を生じさせる一次アミノ酸配列を、それぞれ７個の残基の単位に分解し得る。ヘプタド単位の個々の位置を小文字で示し、即ち、１個のヘプタド単位を例えば配列「ａｂｃｄｅｆｇ」、「ｂｃｄｅｆｇａ」、「ｃｄｅｆｇａｂ」、「ｄｅｆｇａｂｃ」、「ｅｆｇａｂｃｄ」、「ｆｇａｂｃｄｅ」または「ｇａｂｃｄｅｆ」で表す。本開示のＨＴＨ骨格中で構築されたヘプタド単位の「ａ」および「ｄ」の位置は疎水性の性質である。これらの位置は概して、ロイシン、イソロイシンまたはバリンの何れかであり、ＨＴＨの平行または逆平行の二次構造は、２つの別々のα−ヘリックスペプチドに存在する異なるヘプタド単位間のこれらの位置を介した疎水性相互作用により形成される。
【００５２】
用語「コイルドコイル」および「コイルドコイル構造」は本明細書では互換的に使用され、共通の一般知識ならびに本明細書で引用された説明およびさらなる参考文献に基づいて当業者に明らかであるだろう。一般に、コイルドコイル構造は本来、タンパク質中のα−ヘリックスを安定化させるために使用される。コイルドコイルとは、２〜７個のα−ヘリックスが一緒に巻き付けられた、ポリペプチド中のまたはタンパク質中の構造モチーフのことである。α−ヘリックスペプチドのコイルドコイル形成は、α−ヘリックスの片側での疎水性側鎖の配置によるこの疎水性側鎖の埋没により促進され、そのため、この疎水性側鎖には極性水分子が接触しない。典型的なコイルドコイルモチーフ（４−３疎水性反復）は、「ａ」および「ｄ」が疎水性であるような「ａ」から「ｇ」までのアミノ酸のヘプタド反復である。この点に関して、例えば以下のコイルド構造に関する総括書を特に参照する：Ｃｏｈｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９９０，７：１−１５；Ｋｏｈｎ  ａｎｄ  Ｈｏｄｇｅｓ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８，１６：３７９−３８９；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  １９９８，３：Ｒ２９−Ｒ４０；Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８２：１４６２−１４６７；Ｍａｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｒｎｄｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２００４，５：１７０−１７６；Ｌｕｐａｓ  ａｎｄ  Ｇｒｕｂｅｒ  Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７０：３７−７８；Ｗｏｏｌｆｓｏｎ  Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７０：７９−１１２；Ｐａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２００８，１６３：２５８−２６９；ＭｃＦａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００９，６２５：１０１−１０７。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「逆平行」は、１つのα−ヘリックスペプチドのアミノ末端が別のα−ヘリックスペプチドのカルボキシル末端と並ぶように且つ逆の場合も同じようにＨＴＨ骨格の２つのα−ヘリックスペプチドが配置されているＨＴＨ骨格を指す。そのため、逆平行の向きで整列された２つの相互作用するα−ヘリックスのヘプタド「ａ−ｇ」位置の相対的な向きは逆方向である。例えば、第１のヘリックスのヘプタド位置が、アミノ末端からカルボキシル末端までの読み取りとして「ａｂｃｄｅｆｇ」と定義される場合、逆平行の向きの第２のα−ヘリックスのヘプタド位置は、アミノ末端からカルボキシル末端までの読み取りとして「ｇｆｅｄｃｂａ」と定義されるだろう。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「平行」は、１つのヘリックスのアミノ末端が別のα−ヘリックスのアミノ末端と並ぶように且つ逆の場合も同じように同一の向きを有するように２つのα−ヘリックスペプチドが整列されているＨＴＨ骨格を指す。そのため、平行の向きで整列された２つの相互作用するα−ヘリックスペプチドのヘプタド「ａ−ｇ」位置の相対的な向きは同一方向である。例えば、第１のヘリックスのヘプタド位置が、アミノ末端からカルボキシル末端まで「ａｂｃｄｅｆｇ」と定義される場合、平行の向きの第２のヘリックスのヘプタド位置も、アミノ末端からカルボキシル末端までの読み取りとして「ａｂｃｄｅｆｇ」と定義されるだろう。
【００５５】
用語「リンカー」、「ターン」、「リンカー配列」または「ターン配列」は本明細書では互換的に使用され、ＨＴＨポリペプチドの隣接アミノ酸配列の一部であるアミノ酸配列断片を指し、このポリペプチドの２つのα−ヘリックスペプチド配列を共有結合的に連結する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「一本鎖」は、本開示のＨＴＨ骨格において、適切な様式で折り畳まれたＨＴＨポリペプチド鎖の隣接アミノ酸配列の様々な領域から安定したコイルドコイル構造が形成される、ＨＴＨ骨格を指す。
【００５７】
用語「溶媒配向」または「溶媒曝露」は、ある実体の、この実体が存在する環境（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）中のまたは環境（ｍｉｌｉｅｕ）中の溶媒に直接曝露されるまたは直接接触する領域を指す。本開示の文脈では、この領域は、ＨＴＨ骨格の、このＨＴＨ骨格が存在する環境（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）中のまたは環境（ｍｉｌｉｅｕ）中の溶媒に直接曝露されるまたは直接接触するα−ヘリックスまたはα−ヘリックス部分である。より具体的には、結合部位において、ＨＴＨ骨格の溶媒配向部分に位置する１つまたは複数のアミノ酸がこの結合部位に寄与する結合部位の文脈では、この結合部位はＨＴＨ骨格の溶媒配向部分により形成されると考えられる。
【００５８】
ポリペプチドの「α−ヘリックス部分」は、本開示のポリペプチドの、α−ヘリックス二次構造を有する部分を指す。
【００５９】
ＨＴＨ骨格の「疎水性コア」は、ＨＴＨ骨格の、このＨＴＨ骨格が存在する溶媒に直接曝露されていない部分を指す。
【００６０】
本明細書で使用される場合、本開示のポリペプチドが抗原と１種または複数種の参照抗原とを識別し得る場合には、本開示のポリペプチドはそのような抗原に「特異的に結合し（ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｔｏ）」、「特異的に結合し（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ）」、「対して特異的であり」、またはそのような抗原を「特異的に認識し」、なぜならば、結合特異性は絶対的ではなく相対的な性質だからである。参照抗原は、参照点として使用される１種または複数種の密接に関連した抗原であり得る。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイで特異的結合を決定し得る。代替方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験およびペプチドスキャンを含むがこれらに限定されない。点数化を、標準的な発色（例えば、セイヨウワサビペルオキシドによる抗体の検出、および過酸化水素によるテトラメチルベンジジンの検出）により実行し得る。特定のウェル中での反応を、例えば４５０ｎｍでの光学密度で点数化する。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は０．１ＯＤであり得、典型的な陽性反応は１ＯＤであり得る。このことは、陽性／陰性の差が１０倍を超え得ることを意味する。典型的には、結合特異性の決定を、単一の参照抗原を使用するのではなく約３〜５種の無関係の抗原（例えば、ミルクパウダー、ＢＳＡ、トランスフェリンまたは同類のもの）のセットを使用して実施する。加えて、「特異的な結合」は、標的抗原の異なる部分（例えば、上記標的抗原の異なるドメインもしくは領域、または標的抗原の１つもしくは複数の重要なアミノ酸残基またはアミノ酸残基のストレッチ）を識別する能力に関連する場合がある。
【００６１】
ポリペプチドの「親和性」は、このポリペプチドと、このポリペプチドが結合する目的の標的タンパク質との解離に関する平衡定数で表される。ＫＤ値が低いほど、上記ポリペプチドと、このポリペプチドが結合する目的の標的タンパク質との間の結合強度が強くなる。あるいは、この親和性を、１／ＫＤに対応する親和定数（ＫＡ）の観点でも表し得る。ポリペプチドの結合親和性を、目的の特定の標的タンパク質に応じて当業者に既知の方法で決定し得る。当分野では、ＫＤを、複合体の解離速度定数（ｋｏｆｆ（秒−１またはｓ−１で表される）として示される）の、この複合体の会合の速度定数（ｋｏｎ（モル濃度−１秒−１またはＭ−１ｓ−１で表される）として示される）に対する比として表し得ることが一般に知られている。約１ミリモル濃度を超えるＫＤ値は、非結合または非特異的結合を示すと考えられる。
【００６２】
用語「多様化アミノ酸残基位置」または「バリアントアミノ酸残基位置」は、少なくとも２つの異なるアミノ酸残基が存在し得るアミノ酸残基を指す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「阻害する」、「低減する」および／または「防止する」は、目的の標的に特異的に結合して、目的の標的タンパク質と、その天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害する、低減するおよび／もしくは防止するならびに／または目的の標的タンパク質の生物学的活性を阻害する、低減するおよび／もしくは防止する本開示に係るポリペプチドを指す。本開示のポリペプチドの阻害活性または拮抗活性は可逆的であってもよし不可逆的であってもよいが、薬学的および薬理学的な適用の場合には概して可逆的に生じる。本開示のポリペプチドの阻害活性または拮抗活性を、適切なインビトロでの、細胞のまたはインビボでのアッセイを使用して測定し得る。
【００６４】
用語「合成」は、合成により人体外で作られたまたは合成された分子（例えばＤＮＡ）を説明する。用語「合成」はまた、タンパク質（例えば、合成ＤＮＡ分子から翻訳された抗体または断片）も説明する。
【００６５】
「直鎖」は、本開示で使用される場合、いかなる二次または三次の環状構造も含まないアミノ酸のストレッチまたは（ポリ）ペプチドを指す。
【００６６】
用語「単離された」は、例えば本開示のポリペプチドであり得る化合物、または他のポリペプチドを実質的に含まない抗原結合部分であり得る化合物、または異なる抗原特異性を有する抗原結合部分であり得る化合物を指す。さらに、単離されたポリペプチドまたは抗原結合部分は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００６７】
「拘束された」は、本開示で使用される場合、三次元構造が時間と共に１つの空間的配置で実質的に維持されるペプチドを指す。本開示内のポリペプチドは、拘束された立体構造を有する。ペプチドが拘束されているかどうかを決定する方法は当分野で既知である。
【００６８】
「メンバー」は、本開示で使用される場合、ライブラリの一部を形成する１種の分子を指す。本開示の文脈では、この用語は、ポリペプチドライブラリの一部である１種のポリペプチドを指す。
【００６９】
「混合物」は、本開示で使用される場合、複数の分子を含み且つ少なくとも２つの分子が異なるという解釈を指す。この用語は特に、所与の位置でのアミノ酸組成を説明するために、または所与の位置に関してそれぞれのコドンをコードするコドンを説明するために使用される。例えば、各々の選択されたコドンは多様化位置にて特定の確率で存在する。例えば、Ｖａｒ１が天然に存在するアミノ酸の「均等な混合物」を表す場合、２０種の天然に存在するアミノ酸の各々は、この位置にて同一の確率（即ち５％）で存在する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、アミノ酸残基は、そのフルネームでまたは標準的な３文字もしくは１文字のアミノ酸コードに従って示される。「天然に存在するアミノ酸」は以下のアミノ酸を意味する。
2019509040.tif 000002
【００７１】
「疎水性アミノ酸残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２）の標準化コンセンサス疎水性スケール（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｓｃａｌｅ）に従ってゼロよりも大きい疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸として、Ｐ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、ＡおよびＹが挙げられる。
2019509040.tif 000003
【００７２】
用語「ベクター」は、ポリヌクレオチド分子において、このポリヌクレオチド分子が連結されている別のポリヌクレオチドの輸送が可能なポリヌクレオチド分子を指す。好ましいベクターは、連結された核酸の自律複製および／または自律発現が可能なものである。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、このプラスミドは、追加のＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、このウイルスベクターでは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、このベクターが導入された宿主細胞中での自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物ベクター）。他のベクターが、宿主への導入時にこの宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより宿主のゲノムと一緒に複製される。ベクターは、原核細胞または真核細胞に適合し得る。原核生物ベクターは概して、細菌宿主細胞（例えば、この原核生物ベクターで形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））中でペプチドの発現（転写および翻訳）を指示することが可能な原核生物プロモーターを含み得る原核生物レプリコンを含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こることを可能にするＤＮＡ配列により形成された発現制御エレメントである。細菌宿主に適合するプロモーター配列は概して、ＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を含むプラスミドベクター中に設けられる。そのようなベクタープラスミドの例として、市販のｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３が挙げられる。
【００７３】
「発現ベクター」は、このベクターに作動可能に連結された核酸の発現を指示することが可能なベクターであり、且つウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）等の他の形態の発現ベクターを含むことが意図されており、この他の形態の発現ベクターは同等の機能を果たす。
【００７４】
「ディスプレイベクター」は、このディスプレイベクターで形質転換された宿主細胞（例えば細菌宿主細胞）中において染色体外で組換えＤＮＡ分子の複製および維持を指示する能力を有するＤＮＡ配列を含む。そのようなＤＮＡ配列は当分野で公知である。ディスプレイベクターは例えば、ｆｄ、Ｍ１３またはｆｌ繊維状バクテリオファージのクラスに由来するファージベクターまたはファージミドベクターであり得る。そのようなベクターは、タンパク質（例えば結合タンパク質またはこの断片）の繊維状バクテリオファージの表面上での提示を容易にし得る。ファージ上での、リボソーム上での、ＤＮＡ上での、細菌細胞上でのまたは真核細胞（例えば酵母細胞もしくは哺乳動物細胞）上での提示に適したディスプレイベクターも当分野で既知であり、例えばウイルスベクターまたはキメラタンパク質をコードするベクターである。
【００７５】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されていることを理解すべきである。変異または環境の影響に起因して後続の世代で特定の改変が起こり得ることから、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではあり得ないが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲に依然として含まれる。典型的な宿主細胞は、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられるがこれに限定されない細菌）または真核生物（酵母、哺乳動物等が挙げられる）である。細菌細胞は好ましい原核宿主細胞であり、典型的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））の株（例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄから入手可能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５）である。好ましい真核宿主細胞として、酵母細胞および哺乳動物細胞（例えばマウスおよび齧歯類）が挙げられ、好ましくは脊椎動物細胞（例えば、マウス、ラット、サルまたはヒトの細胞株に由来するもの、例えばＨＫＢ１１細胞、ＰＥＲＣ．６細胞またはＣＨＯ細胞）が挙げられる。
【００７６】
用語「エピトープ」は抗原決定基を指し、即ち、抗原の、抗体またはペプチド等の結合分子により認識される部分を指す。
【００７７】
用語「結合領域」、「結合部位」および「相互作用部位」は、本明細書で使用される場合、標的分子への結合に関与する本開示のポリペプチドに存在するアミノ酸残基の特定の部位、部分、ドメインまたはストレッチを指す。そのような結合領域は、標的分子に接触する上記ポリペプチド由来の特定のアミノ酸残基からなる。
【００７８】
「ファージディスプレイ」は、バリアントポリペプチドがファージ（例えば繊維状ファージ粒子）の表面上でコートタンパク質に融合タンパク質として提示され、同時に各バリアントをコードする遺伝子物質が内側に存在する技術である。これにより、各バリアントタンパク質配列とこの配列をコードするＤＮＡとの間に物理的連結が作られ、パニングと呼ばれるインビトロでの選択プロセスにより所与の標的分子（抗体、酵素、細胞表面受容体等）への結合親和性に基づいて迅速な分配が可能になる。この技術の最も単純な形態では、標的で被覆されたプレート（またはビーズ）上で、ファージにより提示されたペプチドのライブラリをインキュベートし、未結合のファージを洗い流し、特異的に結合したファージを溶出させることにより、パニングを実行する。次いで、溶出したファージを増幅させ、さらなる結合／増幅サイクルにより結合配列を優先してプールを富化させる。数回後、個々のクローンの特徴をＤＮＡ配列決定およびＥＬＩＳＡにより明らかにする。
【００７９】
ファージディスプレイの有用性は、ペプチドの高親和性提示で標的分子に結合する配列に関して、ランダム化されたタンパク質バリアントの大きなライブラリを迅速に且つ効率的に選別し得るという事実、およびファージ上のタンパク質ライブラリを使用して、特定の結合特性を持つものに関して数百万のポリペプチドがスクリーニングされているという事実にある。多価ファージディスプレイ法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩの何れかへの融合を解して小さいランダムペプチドおよび小さいタンパク質を提示するために使用されている（Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ（（１９９２）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  Ｂ  ３５５−３６２）およびこの文献で引用された参考文献）。一価ファージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドのライブラリは遺伝子ＩＩＩまたはその一部に連結され、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下にて低レベルで発現され、その結果、ファージ粒子は１コピーの融合タンパク質を提示する、または融合タンパク質を提示しない。
【００８０】
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含み且つ複製が可能なバクテリオファージの二本鎖複製形態を意味する。このファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。このファージは好ましくは繊維状バクテリオファージであり、例えば、Ｍ１３、ｆｄファージもしくはその誘導体、ラムドイドファージ、例えばラムダ、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージウイルス、または上述の何れかの誘導体である。
【００８１】
用語「コートタンパク質」は、ウイルス粒子の表面上に少なくとも一部が存在するタンパク質を意味する。機能的な観点からは、コートタンパク質は、宿主細胞中でのウイルス組み立てプロセスの最中にウイルス粒子と会合し、別の宿主細胞に感染するまで、組み立てられたウイルスと会合したままである任意のタンパク質である。このコートタンパク質は、ｐＶＩＩＩ等のメジャーなコートタンパク質であってもよいし、ｐＩＩＩ等のマイナーなコートタンパク質であってもよい。
【００８２】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原と相互作用するジスルフィド結合により相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および重鎖定常領域で構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）および軽鎖定常領域で構成されている。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬで構成されている。ＶＨ領域およびＶＬ領域を、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化され得、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が点在している。ＶＨおよびＶＬそれぞれは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃｌｑ）等の宿主組織または宿主因子への免疫グロブリン結合を媒介し得る。用語「抗体」は、例えばモノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ抗体およびキメラ抗体を含む。抗体は、任意のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。軽鎖および重鎖の両方は、構造的相同および機能的相同の領域に分類される。
【００８３】
語句「抗体断片」は、本明細書で使用される場合、抗体の、（例えば、結合により、立体障害により、空間分布を安定化させることにより）抗原と特異的に相互作用する能力を保持する１つまたは複数の部分を指す。結合断片の例として以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、これらＶＬおよびＶＨをＶＬ領域およびＶＨ領域が対形成して一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）として既知である）を形成する単一タンパク質鎖として作製することが可能な合成リンカーにより、これらＶＬおよびＶＨを組換え法を使用して連結し得る（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。そのような一本鎖抗体はまた、用語「抗体分子」に包含されることも意図されている。この抗体断片は当業者に既知の従来の技術を使用して得られ、この断片は、インタクトな抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。また、抗体断片を単一ドメイン抗体、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ミニボディ、イントラボディ、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖにも組み込み得る（例えばＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６を参照されたい）。抗体断片を、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）等のポリペプチドをベースとする骨格に移植し得る（米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたく、この明細書は、フィブロネクチンポリペプチドモノボディを説明する）。抗体断片を、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合部位を形成する一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む分子に組み込み得る（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７−１０６２；および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、本開示のヘリックス−ターン−ヘリックスＨＴＨ−ｌｉｂ１ライブラリの漫画を示す。図１は、出現順にそれぞれ配列番号１、７および１を開示する。
【図２Ａ】図２Ａは、本開示のヘリックス−ターン−ヘリックス参照配列（ＨＴＨｄｅｓ２）の２つのα−ヘリックスペプチドのヘリックス輪横断面を示す。本開示のＨＴＨ−ｌｉｂ１ライブラリ内の多様化アミノ酸位置Ｖａｒ１、Ｖａｒ２およびＶａｒ３を外側の円内に示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本開示のヘリックス−ターン−ヘリックスＨＴＨ−ｌｉｂ１ライブラリの三次元の漫画を示し、可変アミノ酸残基Ｖａｒ１、Ｖａｒ２およびＶａｒ３の位置を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、鎖内および鎖間の静電相互作用ならびに別々のアミノ酸残基間の鎖間水素結合と共にＨＴＨｄｅｓ２参照配列を示す。
【図３】図３は、本明細書で開示されているポリペプチドライブラリＨＴＨ−ｌｉｂ１（出現順にそれぞれ配列番号８〜９）の設計を示す。
【図４】図４は、図３のポリペプチドライブラリの品質評価を示す。図４Ａは、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を使用した、個々にサンプリングされたクローンのＨＴＨ−ｌｉｂ１ライブラリの多様化位置でのアミノ酸分布を示す。図４Ｂは、図４Ａの配列決定の結果に関連して予想されるアミノ酸分布を各多様化アミノ酸位置に関して示す。
【図５】図５は、選択されていないＨＴＨ−ｌｉｂ１ライブラリ由来のポリペプチドの例（出現順にそれぞれ配列番号８、９および１０〜４１）を示す。この例は、ライブラリの設計が成功裏に行なわれたことを示す。
【図６】図６は、ディスプレイベクターおよび発現ベクター、ならびにディスプレイベクターから発現ベクターへのポリペプチドコーディング挿入物のサブクローニングのためのＰＣＲベースのアプローチの略図を示す。図６は、配列番号４２として「Ｈｉｓ６」を開示する。
【図７】図７は、Ｔａｒｇｅｔ−Ｘ上の図３のＨＴＨ−ｌｉｂ１ライブラリの２回目のパニングのアウトプットに由来する個々のクローンのＥＬＩＳＡスクリーニング後に同定したポリペプチドに由来する例示的な配列決定結果を示す。この結果は、多数の標的特異的ポリペプチドが同定され得ることを裏付ける（出現順にそれぞれ配列番号４３〜６７）。
【図８】図８は、２０℃にてｐＨ７．２で１０ｍＭリン酸緩衝液でのならびに２０℃および９０℃の温度で処理した０．１ｍｇ／ｍｌのポリペプチド濃度でのＴａｒｇｅｔ−Ｘ特異的ポリペプチドの２つの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。
【図９】図９は、抗体または抗体断片に連結された、本明細書に開示されているＨＴＨ骨格の漫画を示す。図９Ａは、抗体の重鎖のカルボキシル末端に連結された２つのＨＴＨ骨格を示す。図９Ｂは、抗体の軽鎖のカルボキシル末端に連結された２つのＨＴＨ骨格を示す。図９Ｃは、抗体Ｆａｂ断片の重鎖のカルボキシル末端に連結されたＨＴＨ骨格を示す。図９Ｄおよび図９Ｅは、抗体のＦｃ断片のカルボキシル末端またはアミノ末端に連結されたＨＴＨ骨格を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
本開示は、逆平行のヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）配置で立体構造的に拘束されている新規のポリペプチドライブラリを提供する。本開示はさらに、生物学的使用、薬学的使用および他の使用のためにポリペプチドを同定すべく、そのようなライブラリを生成する方法およびスクリーニングする方法に関する。
【００８６】
本開示のポリペプチドライブラリを使用して、目的の標的分子に特異的に結合する１種または複数種のポリペプチドをスクリーニングし得る、および／または選択し得る。
【００８７】
このライブラリから単離されたポリペプチドは特定の好ましい特性を有し且つ当分野で既知の他の結合剤よりも優れていることを発見している。そのような特性として、高親和性での標的結合、コンパクトで小さいサイズ（約６ｋＤａ）、低い免疫原性、熱変性および化学変性に対する極度の安定性、ｐＨの変化およびタンパク質分解に対する不感応性が挙げられる。
【００８８】
ライブラリの設計
様々な配列の組み合わせの構造的に拘束された提示に適した骨格構造を設計するために、天然のα−ヘリックスで生じる統計的なおよび構造的なアミノ酸の性質を組み合わせる新規でユニークなアプローチを使用した。
【００８９】
天然のα−ヘリックス中に見出される最も豊富なアミノ酸残基は、より効率的な開発につながり且つ患者おいて結果として得られるポリペプチドの安全性および有効性を増加させる好ましい生物物理学的特性を有し得る。そのような好ましい生物物理学的特性として、高い相対的提示速度、高い発現収率、低い免疫原性、温度および化学変性に対する耐性、ｐＨ変化に対する比較的不感応性、血清安定性、ならびにプロテアーゼによるタンパク質分解に対する耐性が挙げられる。
【００９０】
α−ヘリックス中における天然に存在するアミノ酸の豊富さに関するデータを、公的に利用可能な文献から得ることができ、例えばＡｕｒｏｒａら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８），７：２１−３８）およびＰａｃｅら（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９８），Ｖｏｌ．７５，４２２−４２７）から得ることができる。このデータを編集して、水溶液中におけるα−ヘリックスコイルドコイル構造の特定の位置でのアミノ酸の優先度のカタログを作成することができる。このアプローチにより設計テンプレートを作成し得、例えば、２つの連続したヘプタド配列からなる、１５個のアミノ酸残基からなるα−ヘリックス参照配列のための設計テンプレートを作成し得る。
【００９１】
上記１５箇所のアミノ酸残基位置の各々に関して、５〜６個の最も頻繁に存在するアミノ酸残基は、２つの独立したα−ヘリックスペプチド配列（それぞれヘリックス−１およびヘリックス−２と命名される）を設計するための基礎と考えられる。
【００９２】
本開示に係るポリペプチドライブラリの生成に最適な参照配列を選択するために、ヘリックス形成を促進し且つα−ヘリックスコイルドコイル構造を安定化するための追加の構造的考察を考慮して、各位置で最も適切なアミノ残基を選択する。
【００９３】
従って、２つのα−ヘリックスペプチドおよびリンカーセグメントを含む参照ポリペプチド配列（ＨＴＨｄｅｓ２）を設計した。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル測定による試験によって、ＨＴＨｄｅｓ２参照配列が溶液中で高度のα−ヘリックス含有量および低含有量のランダムコイルド構造が生じることを確認した。さらなる研究により、ＨＴＨｄｅｓ２配列が熱変性および化学変性に対して極めて耐性であることを明らかにした。
【００９４】
本開示のポリペプチドライブラリは、逆平行配置で配向された２つのα−ヘリックスペプチドを含むヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）骨格構造をベースとし、その結果、上記α−ヘリックスペプチドは安定したコイルドコイル構造を形成し得る。本開示のＨＴＨ骨格を構成する２つのα−ヘリックスペプチドは、本明細書においてヘリックス−１およびヘリックス−２と称される。
【００９５】
従って、ヘリックス−１およびヘリックス−２は、ヘリックス−１のアミノ末端がヘリックス−２のカルボキシル末端と並ぶように２つのヘリックスが配置されている逆平行配置でヘリックス−ターン−ヘリックス骨格へと会合する。
【００９６】
本開示の特定の実施形態では、２つのα−ヘリックスペプチドであるヘリックス−１およびヘリックス−２は同様のサイズであり、それぞれ長さが約１０〜約５０個の残基の範囲である。別の実施形態では、ヘリックス−１およびヘリックス−２は同等の長さである。別の実施形態では、ヘリックス−１およびヘリックス−２は長さが１５個のアミノ酸残基である。
【００９７】
ヘリックス−１およびヘリックス−２の会合は、保存されたアミノ酸残基の繰り返しのヘプタドモチーフの存在に起因して生じる。
【００９８】
本開示の好ましい実施形態では、ヘリックス−１およびヘリックス−２は単一ポリペプチドにより形成され、これら２つのα−ヘリックスペプチドは、互いに単一のペプチド結合により直接連結されているか、またはヘリックス−１およびヘリックス−２のコイルドコイル構造への会合に実質的に干渉しないリンカーセグメントにより連結されている。
【００９９】
本開示のある実施形態では、２つのα−ヘリックスペプチドは、第１のα−ヘリックスペプチド（ヘリックス−１）のカルボキシル末端が第２のα−ヘリックスペプチド（ヘリックス−２）のアミノ末端に連結されるようにフレキシブルリンカー（Ｌｉ）により共有結合的に連結されている。
【０１００】
そのため、本開示の特定の実施形態によれば、本開示のライブラリのＨＴＨ骨格構造は一般式ヘリックス−１−Ｌｉ−ヘリックス−２を含む。
【０１０１】
α−ヘリックスペプチドを形成する骨格構造の各々は、配列が「不変」位置（即ち、本ライブラリの各メンバーにおいて同一のアミノ酸残基を含む位置）と「可変」位置（即ち、本ライブラリの様々なメンバーにおいて様々なアミノ酸残基を含む位置）とを含むペプチドで構成されている。この可変位置は本ライブラリを多様化するのに重要であり、即ち、様々なメンバーからなるライブラリを生成するのに重要である。
【０１０２】
本開示のある実施形態では、導入された配列の多様性または本ライブラリ内の可変位置は、本開示のＨＴＨ骨格を形成する両方のα−ヘリックスペプチドに存在する。
【０１０３】
本開示のある実施形態では、ヘリックス−１およびヘリックス−２は、それらの不変位置で同一のアミノ酸残基を有し得る。
【０１０４】
本開示の別の実施形態では、ヘリックス−１およびヘリックス−２は、それらの不変位置で異なるアミノ酸残基を有する。
【０１０５】
本開示の特定の実施形態では、ヘリックス−１およびヘリックス−２の不変位置は、天然に存在するタンパク質配列に対応していない。本開示の別の実施形態では、ヘリックス−１およびヘリックス−２の不変位置は非天然起源である。本開示の別の実施形態では、ヘリックス−１およびヘリックス−２の不変位置は人工配列である。
【０１０６】
本開示のある態様では、ヘリックス−１およびヘリックス−２の不変位置に存在するアミノ酸残基は、それぞれＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＨｙと称される（図１を参照されたい）。
【０１０７】
不変アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は溶媒に曝露され、なぜならば、これらのアミノ酸残基がＨＴＨ骨格の外向き側に位置し、ＨＴＨ骨格構造が溶液中である場合には溶媒と接触するからである。
【０１０８】
本開示のある実施形態では、不変アミノ酸残基Ｘ１は、Ｄ、Ｔ、Ｎ、ＳおよびＰの群から選択される。本開示の別の実施形態では、不変アミノ酸残基Ｘ１は、ヘリックス−１ではＤであり、ヘリックス−２ではＤである。
【０１０９】
本開示のある実施形態では、不変アミノ酸残基Ｘ２は、Ｅ、Ｐ、Ｑ、ＷおよびＤの群から選択される。本開示の別の実施形態では、不変アミノ酸残基Ｘ２は、ヘリックス−１ではＥであり、ヘリックス−２ではＥである。
【０１１０】
本開示のある実施形態では、不変アミノ酸残基Ｘ３は、Ｍ、Ａ、Ｉ、ＱおよびＲの群から選択される。本開示の別の実施形態では、不変アミノ酸残基Ｘ３は、ヘリックス−１ではＱであり、ヘリックス−２ではＡである。
【０１１１】
本開示のある実施形態では、不変アミノ酸残基Ｘ４は、Ａ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、ＫおよびＥの群から選択される。本開示の別の実施形態では、不変アミノ酸残基Ｘ４は、ヘリックス−１ではＥであり、ヘリックス−２ではＫである。
【０１１２】
本開示のある実施形態では、不変アミノ酸残基Ｘ５は、Ｍ、Ｌ、Ａ、Ｗ、ＦおよびＫの群から選択される。本開示の別の実施形態では、不変アミノ酸残基Ｘ５は、ヘリックス−１ではＫであり、ヘリックス−２ではＭである。
【０１１３】
本開示のポリペプチドライブラリにおいて変化し且つ多様性に寄与するアミノ酸残基は、Ｖａｒ１、Ｖａｒ２およびＶａｒ３と称される。このことは、α−ヘリックスペプチド  ヘリックス−１およびヘリックス−２のヘプタド位置ｂ、ｅおよびｆに対応する。
【０１１４】
ヘリックス−１およびヘリックス−２は、２つのα−ヘリックスペプチド  ヘリックス−１およびヘリックス−２の不変位置で残基の同一性により決定される様式で互いに可逆的に結合する。
【０１１５】
本開示のヘリックス−１およびヘリックス−２はそれぞれ２つの「ヘプタド」で構成され、そのため「ヘプタド反復」と称され得る。ヘプタド反復は規則的に反復するヘプタド位置を生じさせ、α−ヘリックスに沿って規則的に反復するアミノ酸残基に対応する（図１および図３）。
【０１１６】
本開示の逆平行配置で並べられる２つの相互作用するα−ヘリックスの「ａ〜ｇ」位置の相対的な向きを図１および図３に示す。
【０１１７】
本開示の一態様では、ＨＴＨ骨格は主に非共有結合で安定化されている。好ましい実施形態では、上記非共有結合は、ヘリックス−１とヘリックス−２との間の接触領域での疎水性残基間の疎水性相互作用により形成される。
【０１１８】
従って、個々のα−ヘリックスペプチド  ヘリックス−１およびヘリックス−２は、それらそれぞれの疎水性面（規則的に反復するアミノ酸残基Ｈｙにより形成される）に沿って互いに接触する。このことはヘプタド位置「ａ」および「ｄ」に対応する。
【０１１９】
ヘリックス−１およびヘリックス−２の接触領域は、本開示のヘリックス−ターン−ヘリックス骨格の疎水性コアを含む。一態様では、上記疎水性アミノ酸残基は不変アミノ酸残基である。
【０１２０】
ヘプタド位置「ａ」位置および「ｄ」位置での疎水性残基Ｈｙの適切な選択はコイルドコイル構造の形成に重要である。
【０１２１】
本開示のある実施形態では、上記疎水性アミノ酸は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２）の標準化コンセンサス疎水性スケールに従って０．６２超の疎水性を有する。
【０１２２】
本開示のある実施形態では、Ｈｙは、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｗ、Ｍ等の群から選択される疎水性アミノ酸である。本開示の別の実施形態では、Ｈｙは、Ｉ、ＬおよびＶの群から選択される。本開示のさらに別の実施形態では、疎水性アミノ酸ＨｙはＬである。
【０１２３】
さらなる実施形態では、本開示のＨＴＨ骨格は、各α−ヘリックスペプチドのアミノ末端で負に帯電したアミノ酸残基の導入によりさらに安定化され得る。このアミノ酸残基は、上記ペプチドのα−ヘリックスの双極子モーメントを安定化し得る。そのように負に帯電したアミノ酸残基はＤまたはＥであり得る。別の実施形態では、そのように負に帯電したアミノ酸残基はＤである。
【０１２４】
さらなる実施形態では、本開示のＨＴＨ骨格は、ヘリックス間のまたはヘリックス内の静電的相互作用によりさらに安定化され得る。そのような静電的相互作用はイオン相互作用であり得る。
【０１２５】
さらなる実施形態では、本開示のＨＴＨ骨格は、不変アミノ酸残基
ヘリックス−１のＸ２とヘリックス−２のＸ４との間、
ヘリックス−１のＸ４とヘリックス−２のＸ４との間、および／または
ヘリックス−１のＸ５とヘリックス２のＸ２との間
のヘリックス内イオン相互作用により安定化されている。
【０１２６】
好ましくは、ヘリックス−１のＸ２およびＸ４は負に帯電したアミノ酸残基であり、Ｘ５は正に帯電したアミノ酸残基である。負に帯電したアミノ酸残基はＤまたはＥであり得、正に帯電したアミノ酸残基はＫ、ＨまたはＲであり得る。
【０１２７】
好ましくは、ヘリックス−２のＸ２は負に帯電したアミノ酸残基であり、ヘリックス−２のＸ４は正に帯電したアミノ酸残基である。
【０１２８】
さらなる実施形態では、本開示のＨＴＨ骨格は、ヘリックス−１の不変アミノ酸残基Ｘ４とＸ５との間のヘリックス間イオン相互作用により安定化されている。好ましくは、Ｘ４は負に帯電したアミノ酸残基であり、Ｘ５は正に帯電したアミノ酸残基である。別の実施形態では、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＫである。
【０１２９】
さらなる実施形態では、本開示のＨＴＨ骨格は、ヘリックス間水素結合により安定化されている。
【０１３０】
一実施形態では、上記ヘリックス間水素結合は、ヘリックス−１の不変アミノ酸残基Ｘ２とＸ３との間および／またはＸ３とＸ４との間である。別の実施形態では、Ｘ２はＥであり、Ｘ３はＱであり、Ｘ４はＥである。
【０１３１】
リンカー
本開示の２つのα−ヘリックスペプチド（ヘリックス−１およびヘリックス−２）は、ヘリックス−１のカルボキシル末端をヘリックス−２のアミノ末端に接続するペプチドリンカー（Ｌｉ）により連結され、それにより、本開示のポリペプチドのための一本鎖アミノ酸配列が生じる。
【０１３２】
ある実施形態では、ヘリックス−１、Ｌｉおよびヘリックス−２は、ヘリックス−１のカルボキシル末端がＬｉのアミノ末端に連結され且つＬｉのカルボキシル末端がヘリックス−２のアミノ末端に連結されるように共有結合的に連結されている。別の実施形態では、アミノ末端からカルボキシル末端への配置は以下の通りである：ヘリックス−１、Ｌｉおよびヘリックス−２。本開示に係る典型的なヘリックス１−リンカー−ヘリックス２構造を図１および図３に示す。
【０１３３】
好ましくは、このリンカーは非ヘリカル領域を含む。この非ヘリカル領域の最初および最後の残基はあらゆるアミノ酸であり得る。好ましくは、一方または両方の残基は、ヘリックスを破壊するまたはヘリックスを不安定化する残基（例えばグリシンまたはプロリン）である。
【０１３４】
そのようなペプチドリンカーとして、例えば、当業者に既知であるグリシンリンカー、セリンリンカー、混合グリシン／セリンリンカー、グリシンリッチリンカーおよびセリンリッチリンカーが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３５】
本開示のある実施形態では、このリンカーは存在しない。
【０１３６】
本開示のある実施形態では、このリンカーは長さが１〜５０個のアミノ酸残基である。別の実施形態では、このリンカーは長さが１〜３０個のアミン酸残基である。さらに別の実施形態では、このリンカーは長さが１〜１０個のアミノ酸残基である。一実施形態では、このリンカーは長さが５個のアミノ酸である。一実施形態では、このリンカーはアミノ酸配列ＱＧＶＤＳ（配列番号６）を含む。一実施形態では、このリンカーはアミノ酸配列ＱＧＶＤＳ（配列番号６）を有する。
【０１３７】
本ライブラリの多様性
一般に、コイルドコイルモチーフは、α−ヘリックスが実質的に不安定化されない限りアミノ酸置換に対して耐性がある。
【０１３８】
本開示のポリペプチドライブラリは、アミノ酸残基の混合物が配置される規定の多様化位置を特徴とする。このライブラリ内の多様化位置は、本開示のＨＴＨ骨格構造を形成するα−ヘリックスペプチドの両方（ヘリックス−１およびヘリックス−２）に存在する。
【０１３９】
ある実施形態では、ヘリックス−１中の６箇所の位置とヘリックス−２中の６箇所の位置とが多様化されている。
【０１４０】
従って、本開示のＨＴＨ骨格の可変位置でのアミノ酸多様性により、配列が異なるポリペプチドメンバーが生じる。
【０１４１】
可変位置でのアミノ酸残基はＶａｒ１、Ｖａｒ２およびＶａｒ３と称される。このことは、本ＨＴＨ骨格の２つのα−ヘリカルペプチド内のヘプタド位置「ｂ」、「ｅ」、「ｆ」に対応する。
【０１４２】
多様化アミノ酸残基位置は、ＨＴＨ骨格の溶媒曝露領域の一面に位置し、それにより本ライブラリのポリペプチドメンバーに優勢な結合部位が形成される。
【０１４３】
図２Ａおよび図２Ｂで見られるように、Ｖａｒ１は、本開示のＨＴＨ骨格の同一側上で整列する溶媒曝露アミノ酸残基を表し、そのため、本開示のライブラリを生成するために多様化に使用した。実施例１も参照されたい。
【０１４４】
本ライブラリのサイズをさらに増加させるために、および本ライブラリのポリペプチドと、このポリペプチドの結合した目的の標的分子との間の接触界面相を増加させるために、ヘリックス−１およびヘリックス−２にさらなる可変位置を導入した。上記で示したように、本開示のさらなる可変位置でのアミノ酸残基はそれぞれＶａｒ２およびＶａｒ３と称される。
【０１４５】
本開示のライブラリで用いられる多様化は、天然に存在するアミノ酸残基および合成アミノ酸残基の両方を包含し得る。
【０１４６】
しかしながら、特定の実施形態では、多様化アミノ酸残基Ｖａｒ１、Ｖａｒ２およびＶａｒ３は、本明細書で定義されたように、天然に存在するアミノ酸の混合物に独占される。
【０１４７】
本開示の好ましい実施形態では、上記混合物は、天然に存在するアミノ酸の均等な混合物である。
【０１４８】
さらなる実施形態では、多様化アミノ酸残基Ｖａｒ１は、Ｇ、Ｐ、Ｃを除いて天然に存在するアミノ酸の混合物を含む。Ｇ、Ｐ、Ｃはα−ヘリックス構造を破壊することが知られており、そのため避けた。２つ以上の多様化アミノ酸残基位置の間の潜在的なジスルフィド結合の形成を避けるために、Ｃをさらに除外した。さらに、Ｃ残基は、他の天然に存在するアミノ酸残基と比較して天然に存在するα−ヘリックスにおいて有意に低い頻度で現れることが示された（Ａｕｒｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８），７：２１−３８）およびＰａｃｅら（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９８），Ｖｏｌ．７５，４２２−４２７））。
【０１４９】
本開示のある実施形態では、多様化アミノ酸残基位置Ｖａｒ２およびＶａｒ３は、天然に存在するアミノ酸残基Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、ＱおよびＨを含む。好ましい実施形態では、上記混合物は上記アミノ酸残基の均等な混合物である。
【０１５０】
一実施形態では、Ｖａｒ２は、天然に存在するアミノ酸残基Ｒ、Ｅ、Ｑの混合物を含み、Ｖａｒ３は、天然に存在するアミノ酸残基Ｒ、Ｑ、Ｈの混合物を含む。好ましい実施形態では、上記混合物は均等な混合物である。
【０１５１】
本開示のライブラリメンバーは、上記ポリペプチドが、１２箇所の多様化アミノ酸残基位置の規定のセットにおいて互いに異なることを特徴とする。
【０１５２】
従って、本ライブラリメンバーは、１２箇所の多様化アミノ酸残基位置の規定のセット内の少なくとも１箇所のアミノ酸残基位置で互いに異なり得る。あるいは、本ライブラリメンバーは、これらのアミノ酸残基位置のうちの１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、１０箇所、１１箇所または全１２箇所で互いに異なり得る。
【０１５３】
従って、本ライブラリメンバーは、１２箇所の多様化アミノ酸残基位置の規定のセット中に存在する配列相違により互いに区別され得る。
【０１５４】
特定の実施形態では、本開示のポリペプチドライブラリはバクテリオファージ上で提示される。ファージディスプレイは、有用な分子の迅速な選択を可能にする重要な利点を有することが知られている。この方法は、合成により調製され得るライブラリと比べて数桁大きい、１０１０種の固有のペプチドメンバーの大きさのライブラリの調製を可能にする。そのような頑強なプラットフォームの使用により、大きくて多様なライブラリの提示が可能になる。
【０１５５】
特定の実施形態では、本開示に係るポリペプチドのライブラリは、少なくとも１０２個、少なくとも１０３個、少なくとも１０４個、少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、少なくとも１０９個またはさらに多い異なるライブラリメンバーを含む。一実施形態では、本開示のポリペプチドのライブラリまたはコレクションは、少なくとも１０６個の異なるライブラリメンバーを含む。
【０１５６】
特定の実施形態では、本開示は、本開示のポリペプチドのライブラリをコードする核酸のコレクションを提供する。
【０１５７】
特定の実施形態では、本開示は、本開示のポリペプチドのライブラリをコードする核酸のコレクションを含むベクターを提供する。
【０１５８】
特定の実施形態では、このベクターはディスプレイベクターである。他の実施形態では、このベクターは発現ベクターである。
【０１５９】
特定の実施形態では、本開示は、本開示のポリペプチドのライブラリをコードする核酸分子のコレクションまたはベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
【０１６０】
特定の実施形態では、本開示は、ある抗原に特異的なポリペプチドを単離する方法において、
ａ）本開示のライブラリと、ある抗原とを接触させるステップと、
ｂ）このライブラリの、この抗原に結合していないメンバーを除去するステップと、
ｃ）このライブラリの、この抗原に結合したメンバーを回収するステップと
を含む方法を提供する。
【０１６１】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されているポリペプチドのライブラリを使用して同定されたポリペプチドを提供する。
【０１６２】
ある実施形態では、本開示は、抗体または抗体断片にヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造を付与し、上記ヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造は、逆平行のコイルドコイル構造を形成する第１および第２のα−ヘリックスペプチドを含む。
【０１６３】
一態様では、本開示は、ポリペプチドのライブラリにおいて、このライブラリの各メンバーは式ヘリックス−１−Ｌｉ−ヘリックス−２のヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造を含み、
この式中、
ヘリックス−１およびヘリックス−２は第１および第２のα−ヘリックスペプチドを含み、上記α−ヘリックスペプチドの各々はアミノ酸配列
Ｘ１−Ｘ２−Ｈｙ−Ｖａｒ１−Ｘ３−Ｈｙ−Ｖａｒ１−Ｖａｒ２−Ｘ４−Ｈｙ−Ｖａｒ１−Ｘ５−Ｈｙ−Ｖａｒ１−Ｖａｒ３（配列番号１）
を含み、
この式中、
Ｘ１はＤ、Ｔ、Ｎ、ＳまたはＰであり、
Ｘ２はＥ、Ｐ、Ｑ、ＷまたはＤであり、
Ｘ３はＭ、Ａ、Ｉ、ＱまたはＲであり、
Ｘ４はＡ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、ＫまたはＥであり、
Ｘ５はＭ、Ｌ、Ａ、Ｗ、ＦまたはＫであり、
Ｈｙは、０．６２超の疎水性を示す側鎖を有する任意のアミノ酸残基であり、
Ｖａｒ１、Ｖａｒ２およびＶａｒ３は、Ｇ、Ｐ、Ｃを除いて天然に存在するアミノ酸の混合物であり、
Ｌｉはリンカーであり、
上記第１および第２のα−ヘリックスペプチドは逆平行のコイルドコイル構造を形成する、
ライブラリを提供する。
【０１６４】
本開示の一実施形態では、ヘリックス−ターン−ヘリックス骨格のアミノ末端および／またはカルボキシル末端で追加のアミノ酸残基が付加されている。
【０１６５】
アミノ酸残基を置き換えて、欠失させて、または付加させて、例えば、好ましい宿主種中でのライブラリメンバーの発現を助けることもできる、分子のクローニングを容易にすることもできる、ペプチドの安定性を高めることもできる；ヘリックスのパッキングを増加させることもできる。本開示の一実施形態では、本ヘリックス−ターン−ヘリックス骨格のアミノ末端およびカルボキシル末端でＧが導入されている。
【０１６６】
多様化された遺伝子ライブラリを生成する方法
多様化された遺伝子および遺伝子ライブラリの生成のための多数の方法が知られている。この方法としてＳｌｏｎｏｍｉｃｓ技術が挙げられる（米国特許出願公開第１２／４１４，１７４号明細書およびＶａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｕｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００８），４５，３４０−３４３））。
【０１６７】
このＳｌｏｎｏｍｉｃｓ技術は、自己相補的領域を含む規定の数の標準化ビルディングブロックを使用する。２つの異なるクラスのビルディングブロック（「スプリンカー（ｓｐｌｉｎｋｅｒ）」および「アンカー」と呼ばれる）を使用して、任意の所望のバイアスでオーダーメイドヌクレオチドライブラリが連続的に構築される。
【０１６８】
多様化トリヌクレオチド含有オリゴヌクレオチド（ＴＲＩＭ）技術（国際公開第９３／２１２０３号パンフレット）およびオリゴヌクレオチド介在型変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒら（（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１０  ６４８７−６５０４））は、多様化された遺伝子ライブラリを調製するためのさらなる方法である。
【０１６９】
カセット変異誘発は、多様化された遺伝子ライブラリを調製するためのさらなる方法である。この方法は、Ｗｅｌｌｓら（（１９８５）Ｇｅｎｅ  ３４：３１５）が説明したものをベースとする。
【０１７０】
多様化された遺伝子ライブラリを、標準的な固相ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６３，８５（１４），ｐｐ  ２１４９−２１５４）と、その後の精製物の混合とによりも調製し得る。
【０１７１】
特定の実施形態では、本開示のポリペプチドライブラリの合成は、少なくとも１００種のメンバーの核酸またはベクターのライブラリを製造するステップにおいて、各メンバーは本開示に係るポリペプチドをコードし、コードされた異なるライブラリメンバーは、１２箇所の多様化アミノ酸残基位置の規定のセットのうちの少なくとも１箇所で互いに異なる、製造するステップを含む。
【０１７２】
宿主細胞中での発現の際に、本開示のポリペプチドライブラリが得られる。このステップを、当業者に既知であるように様々な方法で達成し得る。一般に、そのようなステップは概して、本ポリペプチドライブラリをコードする核酸もしくはベクターのライブラリまたは感染性粒子で適切な宿主細胞を形質転換することまたは適切な宿主細胞に遺伝子導入することを含む。さらに、そのようなステップは概して、上記宿主細胞の増殖（増加、成長）に適した条件下で上記宿主細胞を培養すること、およびコードされたポリペプチドの産生（発現、合成）に適した条件下で培養するステップを含む。増殖または発現に適した条件下で宿主細胞を培養することは概して、細胞の成長または発現の誘導に適した成分を含む培地の存在下で達成される。特定の実施形態では、本開示のポリペプチドライブラリの製造方法は、産生されたポリペプチドを宿主細胞または培地から単離するステップをさらに含む。発現されたポリペプチドライブラリは、異なる配列のポリペプチドに加えて同一のポリペプチドの複数のコピーも含み得る。
【０１７３】
ファージディスプレイ法
融合ポリペプチドをコードする遺伝子融合体に作動可能に連結された転写調節エレメントを含むバリアント複製可能ベクターのファミリを構築すること、適切な宿主細胞を形質転換すること、形質転換細胞を培養して、ファージ粒子の表面上で融合ポリペプチドを提示するファージ粒子を形成すること、組換えファージ粒子と標的分子とを接触させ、その結果、この粒子の少なくとも一部が標的に結合する、接触させること、結合している粒子を、結合していない粒子から分離することを含む、タンパク質、ペプチドおよびこれらの変異バリアントのファージディスプレイ法は当業者に既知であり、本明細書で開示されているライブラリと共に使用され得る。
【０１７４】
特定の実施形態では、本開示のポリペプチドはファージコートタンパク質の少なくとも一部に連結され、本明細書で開示されているポリペプチドを含む融合タンパク質が形成される。この融合タンパク質は、既知のファージディスプレイの技術を使用して、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を発現させることにより作製され得る。この融合タンパク質はファージまたはファージミドの粒子の一部を形成し得、この粒子の表面上でペプチドの１つまたは複数のコピーが提示される。
【０１７５】
特定の実施形態では、本開示は、上記の融合遺伝子を含むベクターおよびこのベクターのライブラリを提供する。このベクターのライブラリは、融合遺伝子のライブラリを含むＤＮＡライブラリ、ウイルス（ファージまたはファージミド）粒子のライブラリの形態であってもよいし、発現ベクターまたはウイルス粒子のライブラリを含む宿主細胞のライブラリの形態であってもよい。
【０１７６】
特定の実施形態では、本開示は、複数のベクターを含むライブラリを調製するステップにおいて、各ベクターは、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体に作動可能に連結された転写調節エレメントを含み、遺伝子融合体は、本明細書で開示されているペプチドをコードする第１の遺伝子と、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の遺伝子とを含み、このライブラリはポリペプチド融合タンパク質をコードする複数の遺伝子を含む、調製するステップを含む方法を提供する。
【０１７７】
ファージのコートタンパク質をコードする遺伝子と、本開示の融合タンパク質の所望のポリペプチド部分（ファージコートタンパク質の少なくとも一部に連結された本開示のポリペプチド）をコードする遺伝子とを、当分野で既知の方法により得ることができる（一般にＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい）。遺伝子をコードするＤＮＡを化学的に合成し得る（Ｍｅｒｒｆｉｅｌｄ（１９６３）７  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８５：２１４９）。
【０１７８】
ファージコートタンパク質は好ましくは、Ｍ１３等の繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩコートタンパク質または遺伝子ＶＩＩＩコートタンパク質である。ペプチドの提示に、ｆｄ−ＣＡＴｌ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３４８  ５５２−５５４）およびｐＨＥＮ  ｌ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９  ４１３３−４１３７）等の任意の適切な遺伝子ＩＩＩベクターを使用し得る。
【０１７９】
本開示に従った使用に適切なファージベクター、ファージミドベクターおよびヘルパーファージは当業者に既知である。
【０１８０】
本開示の方法では、エレクトロポレーションにより形質転換され得る任意の適切な細胞を宿主細胞として使用し得る。形質転換され得る適切な宿主細胞として、グラム陰性細菌細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））が挙げられる。適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株として、ＴＧ１Ｆ−または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−ｌ  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられ得る。
【０１８１】
特定の実施形態では、エレクトロポレーション用の宿主細胞は、ファージＦ’エピソームを含むコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。この株中でのファージ複製を可能にするあらゆるＦ’エピソームを使用し得る。
【０１８２】
形質転換細胞の選択後、この細胞を培養液中で増殖させ、次いでベクターＤＮＡを単離し得る。ファージベクターＤＮＡまたはファージミドベクターＤＮＡを、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらで説明されているように、当分野で既知の方法を使用して単離して分析し得る。
【０１８３】
パニング法
本開示に従って様々なパニング法を使用し得る。直接パニングプロトコルでは、標的は固体担体上に固定化される。固体担体の例は、マイクロタイタープレートもしくはマイクロタイターチューブ（例えば、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート、Ｍａｘｉｓｏｒｐチューブ、Ｎｕｎｃ）または磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。標的は、プラスチックもしくはビーズ（例えば、表面が活性化されたビーズ、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ）上に直接コーティングされ得る、またはこの標的がビオチン化される場合にはストレプトアビジンを介してコーティングされ得る。他のタグを使用してＨｉｓ−タグ等の標的を捕捉し得る、あるいは、標的に対する抗体も使用して担体上の標的を捕捉し得る。
【０１８４】
また、溶液パニングプロトコルも使用し得る。ここで、標的は、ファージライブラリとのインキュベーション後に固体担体上で捕捉される。標的−ファージ相互作用は溶液中で実施される。結合していないファージを洗い流し得るために、標的を固体担体上で固定化する必要がある。
【０１８５】
特定の実施形態では、Ｆｃタグ付きの標的を使用し、それにより、標的に結合する本開示のポリペプチドを提示するファージが、プロテインＧまたはプロテインＡでコーティングされた担体（例えば磁気ビーズ）で捕捉される。
【０１８６】
本開示のポリペプチド
本開示のポリペプチドを様々な手段により合成し得、例えば、組換えＤＮＡ技術によりまたは化学合成により合成し得る。ペプチドの合成方法は当分野で既知である。
【０１８７】
あるいは、本ポリペプチドのコーディング配列は組換えＤＮＡ分子であり得、このＤＮＡを遺伝子発現に必要な必須発現制御領域（例えば調節領域）に作動可能に連結させることにより、発現ベクターまたはファージに導入される。
【０１８８】
このベクターを、当分野で公知の方法（例えば“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９  ａｎｄ  １９９２を参照されたい）により、原核細胞（例えば細菌）または真核細胞（例えば酵母もしくは哺乳動物）等の適切な宿主細胞に導入し得る。多数のクローニングベクターが当業者に既知であり、適切なクローニングベクターの選択は好みの問題である。
【０１８９】
遺伝子は、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現の場合）および任意選択でオペレーター（本明細書ではまとめて「制御」エレメントと称される）の制御下に置かれ得、その結果、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、この発現構築物を含むベクターにより形質転換された宿主細胞中でＲＮＡへと転写される。コーディング配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでもよいし含まなくてもよい。
【０１９０】
選択された発現系および宿主に応じて、本開示のタンパク質は、目的のタンパク質が発現される条件下で、上記で説明されている発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させことにより産生される。
【０１９１】
次いで、このタンパク質を宿主細胞から単離して精製する。発現系がこのタンパク質を増殖培地中に分泌する場合、このタンパク質をこの培地から直接精製し得る。このタンパク質が分泌されない場合、このタンパク質を細胞培養物から単離する、または細胞膜画分から回収する。適切な増殖条件および回収方法の選択は当分野の技術内である。
【０１９２】
次いで、本開示のポリペプチドは当業者に既知の複数の技術により精製され得る。
【０１９３】
本開示のライブラリおよびポリペプチドは天然に存在するタンパク質ではないことに留意すべきである。典型的には、本開示のポリペプチドは、組換え、合成または半合成のアミノ酸配列、ポリペプチドまたはタンパク質である。
【０１９４】
本明細書でさらに説明されているように、本開示のポリペプチド中のアミノ酸残基の総数は、２つのα−ヘリックスペプチドと、ヘリックス−ターン−ヘリックス骨格に連結され得る追加部分とを相互に連結するフレキシブルリンカーの長さに主に応じて、２５〜５００００個の範囲、２５〜１００００個の範囲、２５〜５０００個の範囲、２５〜１０００個の範囲、２５〜５００個の範囲、２５〜２５０個の範囲、２５〜１００個の範囲、２５〜５０個の範囲または２５〜３５個の範囲であり得る。
【０１９５】
本開示のポリペプチドを、このポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端の連結を可能にするために、アミノ末端およびカルボキシル末端で追加のアミノ酸残基を付加して合成し得る。そのように形成された環化ポリペプチドは、α−ヘリックス構造の安定性をさらに増加させ得、且つプロテアーゼによるタンパク質分解に対する耐性をさらに改善し得る。
【０１９６】
例えばジスルフィド架橋または還元非感受性のチオエーテル連結を導入して、本開示のポリペプチドを環化し得る。アミノ末端で導入されたシステイン残基とカルボキシル末端で導入されたシステイン残基との間に酸化条件下でジスルフィド結合を形成し得る。本開示に係るチオエーテル結合は、例えばアミノ末端に存在するＮ−クロロアセチルグリシンとカルボキシル末端に存在するＣ残基との間に形成され得る。
【０１９７】
本開示のある実施形態では、本開示に係るポリペプチドは環状ポリペプチドである。
【０１９８】
本開示のある実施形態では、この環状ポリペプチドは共有結合により形成されている。
【０１９９】
本開示の特定の実施形態では、この共有結合はジスルフィド結合である。
【０２００】
本開示の特定の実施形態では、このジスルフィド結合は２つのＣ残基により形成されている。
【０２０１】
本開示の特定の実施形態では、このジスルフィド結合は、本開示のポリペプチドのアミノ末端に存在するＣ残基とカルボキシル末端に存在するＣ残基との間に形成されている。
【０２０２】
本開示の特定の実施形態では、この共有結合はチオエーテル結合である。
【０２０３】
本開示の特定の実施形態では、この共有結合は、Ｎ−クロロアセチルグリシンとＣ残基との間に形成されたチオエーテル結合である。
【０２０４】
特定の実施形態では、この共有結合は、本開示のポリペプチドのアミノ末端に存在するＮ−クロロアセチルグリシンとカルボキシル末端に存在するＣ残基との間に形成されたチオエーテル結合である。
【０２０５】
特定の実施形態では、この共有結合は、本開示のポリペプチドのアミノ末端に存在するＮ−クロロアセチルグリシンとカルボキシル末端に存在するＣ末端との間に形成されたチオエーテル結合である。
【０２０６】
ポリペプチド融合タンパク質
本開示のライブラリにより提供されるポリペプチドは、１つまたは複数の他の部分に連結されていてもよいし連結されていなくてもよい。
【０２０７】
そのような融合タンパク質を、遺伝学的アプローチまたは化学的アプローチ等の任意の適切な方法で調製し得る。
【０２０８】
上記連結された部分は、分泌配列もしくはリーダー配列、検出、発現、分離もしくは精製を助ける配列、または例えば組換え産生の最中にタンパク質安定性の増加をもたらす配列を含み得る。
【０２０９】
可能性のある部分の例として、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ断片、分泌シグナルペプチド、抗体またはこの抗体断片、毒素、レポーター酵素、金属イオンに結合し得る部分、ポリヒスチジンタグのように検出および／もしくは精製に適したタグ、ホモ会合ドメインもしくはヘテロ会合ドメイン、タンパク質の溶解性を増加させる部分、または酵素開裂部位を含む部分が挙げられる。従って、本開示のポリペプチドは、他の標的または目的の標的タンパク質に結合するための１つまたは複数の部分を任意選択で含み得る。
【０２１０】
そのようなさらなる部分は、本開示のポリペプチドにさらなる機能性を付与してもよいし付与しなくてもよく、且つ本開示のポリペプチドの特性を変更してもよいし変更しなくてもよいことは明らかなはずである。
【０２１１】
本開示のポリペプチドは、単一のペプチド結合により直接的にまたは１つもしくは複数のアミノ酸残基を含む１つもしくは複数のスペーサーを介して、１つまたは複数の他の部分に連結され得る。
【０２１２】
本開示のポリペプチドと１つまたは複数の部分との連結での使用に適したスペーサーは、ペプチドおよび／またはタンパク質を連結するために当分野で使用される任意のスペーサー領域であり得る。
【０２１３】
いくつかの適切なスペーサーとして、例えば、ポリペプチドスペーサー、例えばグリシンスペーサー、セリンスペーサー、混合グリシン／セリンスペーサー、グリシンリッチスペーサーおよびセリンリッチスペーサー、主に極性ポリペプチド断片で構成されたスペーサー、またはランダムコイル立体構造を形成するアミノ酸配列を含むスペーサーが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１４】
スペーサーは、長さが１〜５００個のアミノ酸残基である任意の適切なアミノ酸配列であり得、例えば長さが１〜１００個、１〜５０個、１〜１０個または１〜５個のアミノ酸残基である任意の適切なアミノ酸配列であり得る。
【０２１５】
ある実施形態では、本開示のポリペプチドはポリヒスチジンタグに連結されている。他の実施形態では、本開示のポリペプチドはＦＬＡＧタグに連結されている。さらに別の実施形態では、このポリペプチドはＦＬＡＧとポリヒスチジンタグとに連結されている。特定の実施形態では、上記ポリヒスチジンタグおよび／またはＦＬＡＧタグは、本開示のポリペプチドのカルボキシル末端および／またはアミノ末端に連結されている。
【０２１６】
別の実施形態では、本開示のポリペプチドはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に連結されている。マルトース結合タンパク質は、細菌宿主中での発現の最中に溶解性を増加させ得る。特定の実施形態では、このマルトース結合タンパク質ドメインは、このポリペプチドのアミノ末端に連結されている。
【０２１７】
特定の実施形態では、発現に使用される細菌宿主は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【０２１８】
別の実施形態では、マルトース結合ドメインのカルボキシル末端と本開示のポリペプチドのアミノ末端との間に酵素開裂側が存在している。特定の実施形態では、上記酵素開裂側はＦＸａ開裂側である。
【０２１９】
さらなる実施形態では、本ポリペプチドは抗体またはこの抗体断片に連結されている。特定の実施形態では、上記抗体断片はＦａｂ断片を含む。
【０２２０】
この抗体またはこの抗体断片は、本開示のポリペプチドと同一の結合特異性または異なる結合特異性を有し得る。
【０２２１】
本開示のポリペプチドは、このポリペプチドのアミノ末端および／もしくはカルボキシル末端への直接連結により、またはこのポリペプチドのアミノ末端および／もしくはカルボキシル末端で１つもしくは複数のアミノ酸残基を含むスペーサー領域により、この抗体またはこの抗体断片に連結され得る。
【０２２２】
特定の実施形態では、本開示のポリペプチドは抗体の重鎖のカルボキシル末端に連結されている。図９Ａを参照されたい。
【０２２３】
他の実施形態では、本開示のポリペプチドは抗体の軽鎖のカルボキシル末端に連結されている。図９Ｂを参照されたい。
【０２２４】
他の実施形態では、本開示のポリペプチドは重鎖抗体Ｆａｂ断片のカルボキシル末端に連結されている。図９Ｃを参照されたい。
【０２２５】
他の実施形態では、本開示のポリペプチドは抗体Ｆｃ断片（ＣＨ２−ＣＨ３）のカルボキシル末端に連結されている。図９Ｄを参照されたい。
【０２２６】
他の実施形態では、本開示のポリペプチドは抗体Ｆｃ断片（ＣＨ２−ＣＨ３）のアミノ末端に連結されている。図９Ｅを参照されたい。
【０２２７】
ある実施形態では、本開示は、抗体または抗体断片に連結されたヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造において、逆平行のコイルドコイル構造を形成する第１および第２のα−ヘリックスペプチドを含むヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造を提供する。
【０２２８】
ある実施形態では、本開示は、抗体の重鎖のカルボキシル末端に連結されたヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造において、逆平行のコイルドコイル構造を形成する第１および第２のα−ヘリックスペプチドを含むヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造を提供する。
【０２２９】
ある実施形態では、本開示は、抗体の軽鎖のカルボキシル末端に連結されたヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造において、逆平行のコイルドコイル構造を形成する第１および第２のα−ヘリックスペプチドを含むヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造を提供する。
【０２３０】
ある実施形態では、本開示は、抗体Ｆａｂ断片の重鎖のカルボキシル末端に連結されたヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造において、逆平行のコイルドコイル構造を形成する第１および第２のα−ヘリックスペプチドを含むヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造を提供する。
【０２３１】
ある実施形態では、本開示は、抗体Ｆｃ断片のアミノ末端に連結されたヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造において、逆平行のコイルドコイル構造を形成する第１および第２のα−ヘリックスペプチドを含むヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造を提供する。
【０２３２】
ある実施形態では、本開示は、抗体Ｆｃ断片のカルボキシル末端に連結されたヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造において、逆平行のコイルドコイル構造を形成する第１および第２のα−ヘリックスペプチドを含むヘリックス−ターン−ヘリックス骨格構造を提供する。
【０２３３】
機能性
本開示のポリペプチドは、このポリペプチドが対象とする目的の標的分子が関与する生物学的経路により媒介される疾患または障害の予防および処置に使用され得る。
【０２３４】
本開示のポリペプチドを使用して、１つまたは複数の目的の標的分子と、これらの対応する受容体または天然の結合パートナーとの間の相互作用を防止し得、または阻害し得、それにより、これらの目的の標的分子により媒介されるシグナル伝達経路が防止される、阻害される、もしくは低減する、および／またはこれらの目的の標的分子が関与する生物学的経路および生物学的機構が調節される。
【０２３５】
機能活性をアッセイする方法は結合アッセイを利用し得、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）および当分野で公知である他の方法（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ，ＭＮ）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）を参照されたい）を利用し得る。あるいは、アッセイは、インビボまたはインビトロの何れかにおいて、生物学的標的への結合の結果としての生物学的応答の誘発でのペプチド模倣物の能力を試験し得る。そのようなアッセイとして、Ｂ細胞増殖アッセイおよびＴ細胞増殖アッセイ、ならびに増殖の阻害アッセイが挙げられる（Ｐａｕｌら（１９９１）を参照されたい）。他の適切なアッセイが当業者に既知であるだろう。
【０２３６】
医薬組成物
特定の実施形態では、本開示は、本開示の方法により得られる１種または複数種のポリペプチドと任意選択の少なくとも１種の薬学的に活性な担体と（本明細書では共に医薬成分と称される）を含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、少なくとも１種の他の薬学的に活性な化合物をさらに含み得る。
【０２３７】
本開示の医薬組成物を、目的の標的分子と関連する疾患および障害の診断、予防および／または処置で使用し得る。
【０２３８】
特に、本開示は、温血動物（具体的には哺乳動物、より具体的にはヒト）での予防的使用、治療的使用および／または診断的使用に適している本開示に係るポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【０２３９】
一般に、本開示のポリペプチドは、本開示に係る少なくとも１種のポリペプチドと、少なくとも１種の薬学的に許容される担体、賦形剤もしくは添加剤および／またはアジュバントと、任意選択の１種または複数種のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物とを含む医薬品または医薬組成物として製剤化され得る。そのような製剤は、経口、非経口、局所投与または吸入による投与に適し得る。
【０２４０】
特に、本開示のポリペプチドを、目的の標的分子が関与する疾患および障害の予防および／または処置のためであるまたはこれらのために使用され得る他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて使用し得、この結果として、相乗効果が得られてもよいし得られなくてもよい。そのような化合物ならびにこの化合物を投与するための経路、方法および製剤または組成物の例は臨床医に明らかであるだろう。
【０２４１】
ある実施形態では、本開示は、１種または複数種のポリペプチドが特異的に結合する目的の標的分子の望ましくない存在に関連する障害または状態の予防および／または処置での使用のための、本開示の１種または複数種のポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【０２４２】
ある実施形態では、本開示は、医薬品としての使用のための、本開示の１種または複数種のポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【０２４３】
ある実施形態では、本開示は、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、新生血管疾患、感染性疾患、血栓症、心筋梗塞および／または糖尿病の予防および／または処置での使用のための、本開示の１種または複数種のポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【０２４４】
さらなる実施形態では、本開示は、本開示の１種または複数種のポリペプチドを含む医薬組成物を使用して、必要とする対象の自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、新生血管疾患、感染性疾患、血栓症、心筋梗塞および／または糖尿病の処置の方法を提供する。
【実施例】
【０２４５】
実施例１：本ライブラリの設計
本ライブラリの設計は、統計的な、構造的なおよび合理的な因子を考慮した複合アプローチをベースとする。
【０２４６】
これには、天然のα−ヘリックス構造で見られる最も豊富なアミノ酸残基の分析が含まれる。そのようなアミノ酸は、より効率的な開発をもたらすことになり且つ患者中で結果として得られるポリペプチドの安全性および有効性を増加させることになる好ましい生物物理学的特性を有し得る。α−ヘリックス中で天然に存在するアミノ酸の豊富さを、Ａｕｒｏｒａら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８），７：２１−３８）およびＰａｃｅら（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９８），Ｖｏｌ．７５，４２２−４２７）等の文献から得た。これらのデータを使用して、α−ヘリックスのアミノ末端およびカルボキシル末端での残基の優先度のカタログを作成し、ならびにα−ヘリックスの中心領域でより多く見られる残基の優先度のカタログを作成した。水溶液中でのα−ヘリックスコイルドコイル構造の形成に関連する位置に存在するアミノ酸に特に焦点を合わせた。
【０２４７】
その後、データをテンプレートに移して、潜在的なα−ヘリックス参照配列を設計した。そのような参照配列は長さが１５個のアミノ酸残基であり、且つ２つの連続したヘプタド配列を含む。上記１５箇所のアミノ酸残基位置の各々に関して、５〜６個の最も頻繁に存在するアミノ酸残基を、水溶液中にて安定した逆平行配向のコイルドコイル構造に由来し得る２つの独立したα−ヘリックスペプチド配列を設計するためのベースと考えた。
【０２４８】
本開示に係るポリペプチドライブラリの生成に最適な参照配列を選択するために、ヘリックス形成を促進し且つα−ヘリックスコイルドコイル構造を安定化させるための追加の構造的考察を考慮して、各位置で最も適切なアミノ酸残基を選択した。
【０２４９】
従って、図３に示す２つのα−ヘリックスペプチドおよびリンカーセグメントを含む参照ポリペプチド配列（ＨＴＨｄｅｓ２）を設計し、合成および円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル測定によるα−ヘリックス含有量の試験のために選択した。得られたデータは、ＨＴＨｄｅｓ２参照配列により、溶液中で高度のα−ヘリックス構造および低含有量のランダムコイル構造が得られることを裏付けた。さらなる研究により、ＨＴＨｄｅｓ２配列が熱変性および化学変性に対して極めて耐性であることが明らかになった。実施例１２も参照されたい。
【０２５０】
加えて、ＨＴＨｄｅｓ２参照配列のコンピューター内でのＴ細胞エピトープ配列決定（Ｌｏｎｚａ，Ｔｈｅ  Ｅｐｉｂａｓｅ（商標）Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏツール）により、生成された構築物に対する免疫原性リスクは低いまたはないことが明らかとなった。
【０２５１】
その後、ＨＴＨｄｅｓ２参照配列を本開示に係るポリペプチドライブラリの構築に使用した。
【０２５２】
最初のステップでは、本発明者らは、ＨＴＨｄｅｓ２参照配列上のどの特定のアミノ酸位置を、２つのＨＴＨ形成ペプチドのα−ヘリックス二次構造を不安定化することなく且つコイルドコイル構造の形成に支障を来すことなく多様化のために使用すべきかを決定しなければならなかった。
【０２５３】
Ｆｕｊｉｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７，６７４５−６７５１（２００８））により説明されているように、ＨＴＨ構造の安定化を、２つのアルファヘリックスペプチドのうちの１つのみを多様化させることにより達成し得る。このシナリオでは、第２の多様化されていないペプチドは、そのα−ヘリックス構造を保持してヘリックス−ターン−ヘリックス構造を安定化させる。しかしながら、一方のペプチドのみの多様化により、達成可能なライブラリサイズは著しく制限され、且つライブラリのポリペプチドと、このポリペリペプチドが結合した目的の標的分子との間の相互作用界面相が狭められる。
【０２５４】
そのため、本発明者らは両方のα−ヘリックスペプチドを多様化することを決定した。両方のα−ヘリックスペプチドに存在する可変位置は、特定のポリペプチドとその標的抗原との間の相互作用界面相の拡大に寄与し、その結果、特異性および親和性が改善される。
【０２５５】
本明細書で説明されているように且つ図１および図３で示されているように、多様化のために主に選択されたアミノ酸位置は、ヘリックス−１およびヘリックス−２のヘプタド位置「ｂ」および「ｅ」であった。各ヘリックスは２つのヘプタドを含むことから、１つのヘリックス当たり４箇所のアミノ酸位置が多様化される。本明細書においてＶａｒ１と称されるこれらのアミノ酸位置は同一の相対的に平行な配向で提示され、目的の標的抗原と相互作用するための重要な溶媒曝露残基である（図２Ａおよび図２Ｂ）。この主な役割のために、それぞれの位置を、α−ヘリックス構造を破壊することが知られているＧ、ＰおよびＣのみを除いて１７種の天然に存在するアミノ酸で完全に多様化した。
【０２５６】
２つのα−ヘリックスペプチドの会合により合計で８つの多様化アミノ酸残基が生じ、これらの全ては、２つの整列されたペプチド内の多様化位置のわずかな空間的ずれにてＨＴＨ骨格構造から同一の相対的に平行な配向で提示される。その結果、ＨＴＨ骨格構造の全長にわたり幅広くて平坦な相互作用界面が形成され、目的の標的抗原との最適なタンパク質−タンパク質相互作用が可能になる。
【０２５７】
ライブラリサイズおよび相互作用界面をさらに増加させるために、ＨＴＨｄｅｓ２参照配列内のさらなるアミノ酸残基を多様化に考慮した。ヘプタド位置ｆに存在するアミノ酸残基も、完全に平行ではないが相互作用界面に向かって配向されている。局所幾何学に基づいて、ヘプタド位置ｆでの残基の配向はわずかに角張っているように見える（図１および図２Ａおよび図２Ｂ）が、それにもかかわらずこの残基は標的抗原と相互作用し得る。そのため、上記ヘプタドｆ位置のうちの４箇所をさらなる多様化のために選択し、Ｖａｒ２およびＶａｒ３と命名した。
【０２５８】
相互作用界面に向かう残基の角張った配向に基づいて、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、ＱおよびＨのような帯電側鎖または極性側鎖を有するアミノ酸を、Ｖａｒ２およびＶａｒ３の多様化に最適な残基と考えた。このシナリオでは、各残基の末端に位置する極性のまたは帯電した官能基は周囲の溶媒と相互作用し得、非極性の炭素主鎖は標的抗原と作用し得る。Ａｕｒｏｒａら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８），７：２１−３８）およびＰａｃｅら（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９８），Ｖｏｌ．７５，４２２−４２７）により説明されているように、Ｖａｒ２およびＶａｒ３の多様化のために使用される３種のアミノ酸残基の最終選択を、対応する位置でのα−ヘリックスにおけるそれらの天然の存在により行なった。従って、Ｖａｒ２およびＶａｒ３に、わずかに異なるアミノ酸残基混合物を使用した。従って、理論上のライブラリサイズは合計５．６×１０１１種のライブラリメンバーに達した。
【０２５９】
まとめると、本開示のライブラリを、本開示のＨＴＨ骨格構造を形成するα−ヘリックス構造の安定化に支障を来すことなく多様化位置の数を最大化するよう構築した。
【０２６０】
実施例２：ＨＴＨ−ｌｉｂ１ライブラリの生成
ポリペプチドライブラリ配列を含むＤＮＡ断片を以下のように合成した：シグナル配列、エピトープタグおよびスペーサー領域を含む隣接定常領域を遺伝子合成により合成した。１２箇所の多様化アミノ酸位置を有するポリペプチド配列をコードするポリペプチドライブラリをＳｌｏｎｏｍｉｃｓ技術で合成した。結果として得られた、ポリペプチドライブラリおよび隣接定常領域を含む２７９ｂｐの合成直鎖ＤＮＡ断片を、（わずかに変更して国際公開第２０１５１６６０３６号パンフレットで説明されているように）ｐＰＥＰｄｉｓＣ３ｆｌ＿ＨＴＨ−ｌｉｂ１ディスプレイベクターにクローニングした。
【０２６１】
実施例３：提示速度の決定
産生されたファージ上でのポリペプチドの提示をウェスタンブロットで評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後、ＦＬＡＧエピトープに対する抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してタンパク質を検出し、なぜならば、このエピトープタグはＰＩＩＩ（ｆｌ）ポリペプチドライブラリによりコードされ、従って提示されたペプチドの一部だからである。全ｐＩＩＩの検出のために、抗ｐＩＩＩ抗体（ＭｉＢｉＴｅｃ）を使用した。ヘルパーファージは１個のファージ当たり約２〜３個のライブラリペプチドを提示し、ハイパーファージ（ｈｙｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）上では５個のｐＩＩＩコピー全てがライブラリペプチドを担持する。
【０２６２】
さらに、産生されたファージ上でのポリペプチドの提示を、ファージを捕捉するための抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および特異的検出のための２種の抗体を用いて、ＥＬＩＳＡにより定性的に評価した。モノクローナル抗Ｍ１３はＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に共役し、ＦＬＡＧエピトープに対するモノクローナル抗体はＡＰ（Ｓｉｇｍａ）に共役した。
【０２６３】
この結果はライブラリペプチドの高い提示速度を裏付けた。
【０２６４】
実施例４：品質管理
別の重要な態様は、ポリペプチドＨＴＨ−ｌｉｂ１ライブラリの品質および機能性の評価である。アミノ酸の分布、頻度および重複性に関するファージライブラリの定性的評価を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を使用して実行した。
【０２６５】
Ｓａｎｇｅｒ配列決定を使用して、図３に示すライブラリ設計から１７５個のクローンを分析した。配列決定の結果を図４Ａに示す。図４Ａは、それぞれヘリックス−１およびヘリックス−２での多様化位置で示されたアミノ酸の位置および分布を示す。
【０２６６】
サンプリングした１７５個の個々のクローンのうち、Ｖａｒ１に関して、Ｇ、ＰおよびＣを除いて天然に存在するアミノ酸のバランスの取れた分布を同定した。同様に、Ｖａｒ２に関してアミノ酸Ｒ、ＱおよびＥのバランスの取れた分布ならびにＶａｒ３に関してアミノ酸Ｒ、ＱおよびＨのバランスの取れた分布を確認し得た。
【０２６７】
図４Ｂは、配列決定の結果と比較して、予想されるアミノ酸分布を示す（パーセンテージで示す）。この結果は、合成されたライブラリの組成がライブラリの設計と実質的に同一であることを実証する。
【０２６８】
実施例５：パニングおよびスクリーニング
可能性のある治療用ペプチドの同定への本明細書で開示されているポリペプチドライブラリＨＴＨ−ｌｉｂ１の適合性を、利用可能なモデル抗原を使用して分析した。
【０２６９】
ＨＴＨ−ｌｉｂ１ライブラリを、モデルＴａｒｇｅｔ−Ｘに対する試験選択に使用した。Ｔａｒｇｅｔ−ＸをｈＩｇＦｃ融合タンパク質として使用した。抗原のヒトＦｃタグにより抗原−ファージ複合体を捕捉し得るプロテインＧ共役磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、溶液中で選択を実施した。
【０２７０】
このポリペプチドライブラリを、選択ストリンジェンシーの観点から微調整し且つファージミドベクター系へ適応させつつ、ファージディスプレイをベースとするペプチド選択（Ｚｗｉｃｋ，Ｍ．Ｂ．，Ｍｅｎｅｎｄｅｚ，Ａ．，Ｂｏｎｎｙｃａｓｔｌｅ，Ｌ．Ｌ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．（２００１）．Ｉｎ  Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ，Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｋ．Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｇ．Ｊ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ｐｐ．１８．１−１８．４４）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に関する公表された標準プロトコルに従って取り扱った。
【０２７１】
従来の配列決定により特定の配列をモニタリングしつつ、その後の３回の濃縮ラウンドにわたり試験選択を実施した。簡潔に言うと、全てのパニングを、標準的な洗浄条件下にて様々な抗原濃度（ラウンド１では１００ｎＭ、ラウンド２では５０ｎＭ、およびラウンド３では２５ｎＭ）で完了した。標的タンパク質を、予め吸着したファージと共にインキュベートした。コーティングされた磁性Ｄｙｎａｂｅａｄの洗浄を磁性粒子分離器で実行し、インキュベーションを低結合チューブ中でのオーバーヘッド回転により行なった。その後、特異的に結合したファージを、グリシン／ＨＣｌを使用して溶出させた。
【０２７２】
各選択のファージ溶出物に、ＯＤ６００ｎｍが０．６〜０．８である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１Ｆ’を添加し、振盪させることなくインキュベーター中でインキュベートした。感染後、各選択に関して２つの大きなＬＢ／クロラムフェニコール／グルコース寒天プレート上に細菌を均等に播種し、３７℃で一晩インキュベートし、グリセロールファージストックを調製した。
【０２７３】
以下のパニングラウンドのために、各プールの細菌懸濁液を収集し、この細菌懸濁液を使用して、上記で説明したように追加のパニングラウンドのためにファージを増殖させた。
【０２７４】
各ラウンドのパニングの後、ファージ力価を決定した。予想範囲は、インプットの場合は１．０Ｅ＋１０〜１．０Ｅ＋１２個のファージ／ｍｌであり、アウトプットの場合は１．０Ｅ＋０７〜１．０Ｅ＋０９個のファージ／ｍｌである。表３は各ラウンドのパニング後のアウトプットを示し、全ての値は予想範囲内である。
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【０２７５】
パニングラウンドの完了後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのポリペプチドの細胞質発現を促進するために、ファージアウトプットプールをＰＣＲにより発現ベクターにサブクローニングした。単一クローンの発現により、Ｎ末端でマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に連結され且つプロテアーゼ開裂部位を含むポリペプチドが産生された。
【０２７６】
標的特異性を調べるために、抗ヒトＦｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）およびパニングアウトプットから得られたポリペプチドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物を予めコーティングしたマイクロタイタープレートの表面上のＦｃタグ付きのカニクイザルおよびヒトのＴａｒｇｅｔ−Ｘタンパク質ならびに無関係のＦｃタグ付きのタンパク質を捕捉することにより、ＥＬＩＳＡスクリーニングを実行した。結合したポリペプチドを、抗ＦＬＡＧ検出（抗ＦＬＡＧ−ＡＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、コードされたＦＬＡＧタグにより検出した。ＭＢＰ−ポリペプチド融合発現を分析するために、抗Ｈｉｓ捕捉（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ＭＢＰ検出（Ａｂｃａｍ）を適用した。
【０２７７】
合計で、２８０個のポリペプチドがＥＬＩＳＡにおいてカニクイザルＴａｒｇｅｔ−Ｘ／Ｆｃ融合タンパク質を認識することを確認した。さらに、ほとんど全てのカニクイザル陽性クローン（９８％）はヒトＴａｒｇｅｔ−Ｘタンパク質に対して交差反応性を明らかにしたが、無関係のＦｃ融合タンパク質には結合しなかった。
【０２７８】
その後のパニングラウンドからのパニングアウトプットの配列分析およびＥＬＩＳＡは、特異的結合剤（即ち、標的タンパク質には結合するが無関係のタンパク質には結合しない結合剤）の富化を明らかにした。
【０２７９】
実施例６：Ｔａｒｇｅｔ−Ｘ特異的ポリペプチドの配列決定の結果
Ｓａｎｇｅｒ配列決定を実施して、ヒトおよびカニクイザルのＴａｒｇｅｔ−Ｘ／Ｆｃ融合タンパク質に特異的な結合剤を分析した（実施例５を参照されたい）。この配列決定の結果から、図９に示すように、多数の標的特異的ポリペプチドが明らかになった。このことは、本開示のライブラリを使用して、目的の標的タンパク質に特異的である多種多様なポリペプチドを同定し得ることを実証する。
【０２８０】
次のステップとして、スクリーニングキャンペーンから選択されたポリペプチドを、関連するインビトロアッセイでのＥＬＩＳＡおよび細胞結合、親和性および機能的活性等の特性に関してより詳細に特徴を明らかにするために、より大きなスケールで産生させた。
【０２８１】
実施例７：ＥＬＩＳＡ結合に関する精製済Ｔａｒｇｅｔ−Ｘ特異的ポリペプチドのキャラクタリゼーション
ヒトおよびカニクイザルのＴａｒｇｅｔ−Ｘへの結合をＥＬＩＳＡで試験した。
【０２８２】
方法：
各Ｆｃ融合タンパク質１．５μｇ／ｍｌを、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上の抗ヒトＦｃ捕捉（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）特異的抗体により捕捉し、結合したＭＢＰ−ポリペプチド融合体を、抗ＦＬＡＧ検出抗体を使用して検出した。
【０２８３】
結果：
全１８種のポリペプチドは、組換えカニクイザルおよびヒトのＴａｒｇｅｔ−Ｘ／Ｆｃタンパク質の両方への有意で特異的な結合を示した。ＥＣ５０値は、１桁から３桁のナノモル濃度範囲に及ぶ。
2019509040.tif 000005
【０２８４】
これらの結果は、本開示のライブラリから単離されたポリペプチドの非常に特異的な性質を裏付ける。
【０２８５】
実施例８：細胞結合（ＦＡＣＳ）に関するＴａｒｇｅｔ−Ｘ特異的ポリペプチドのキャラクタリゼーション
ＣＨＯ細胞上で発現されたカニクイザルＴａｒｇｅｔ−Ｘへの細胞結合をＦＡＣＳで分析した。
【０２８６】
方法：
カニクイザルＴａｒｇｅｔ−Ｘを安定的に遺伝子導入されたＣＨＯ細胞を、ＰＢＳ／３％ＦＣＳ／０．０２％ＮａＮ３（ＦＡＣＳ緩衝液）で２×１０６個の細胞／ｍｌに調整した。Ｖ底９６ウェルマイクロタイター中でＦＡＣＳ染色を実施し、１つのウェル当たり１×１０５個の細胞を精製済ポリペプチドと混合し、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、１時間にわたり氷上でインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液１５０μｌ／ウェルで４回洗浄し、ウサギ抗ＭＢＰ（Ａｂｃａｍ）５０μｌに取り、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００００に希釈した。氷上での１時間のインキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄し、フィコエリトリン共抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）５０μｌに取り、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈した。氷上での３０分のインキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で４回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液１００μｌに再懸濁し、カニクイザルＴａｒｇｅｔ−Ｘ特異的抗体の細胞表面結合を、ＦＡＣＳアレイ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中において細胞のＦＬ２蛍光強度で測定した。
【０２８７】
結果：
１９種の精製済ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞上で発現されたカニクイザルＴａｒｇｅｔ−Ｘへの特異的細胞結合を示し、ＥＣ５０は１〜３桁のナノモル濃度範囲であった。
2019509040.tif 000006
【０２８８】
この場合もやはり、この結果は、本開示のライブラリから単離されたポリペプチドの非常に特異的な性質を裏付ける。ポリペプチドはまた、全細胞上で標的タンパク質に結合することもできる。
【０２８９】
実施例９：表面プラズモン共鳴を使用したＴａｒｇｅｔ−Ｘ特異的ポリペプチドの親和性の決定
カニクイザルＴａｒｇｅｔ−Ｘ／ＦｃとＴａｒｇｅｔ−Ｘ特異的ポリペプチドとの間の相互作用の動力学的キャラクタリゼーションを、ポリペプチドを溶液中で分析物として適用したリガンド捕捉形式（ｌｉｇａｎｄ−ｃａｐｔｕｒｅ  ｆｏｒｍａｔ）で実行した。
【０２９０】
方法：
Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を共有結合的に修飾して、ヒトＦｃに特異的な高密度捕捉表面を生成した。標準的なＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学を使用して、全てのフローセルに約３５００ＲＵのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）リガンド（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１０ｍＭの酢酸緩衝液ｐＨ４．５中に５０μｇ／ｍＬ）で固定した。１０ｍＭのＨＢＳ−ＥＰ＋ｐＨ７．４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をランニング緩衝液およびサンプル希釈剤として使用した。動力学的キャラクタリゼーションの最中に、Ｔａｒｇｅｔ−Ｘ／Ｆｃを抗ヒト−Ｆｃ特異的フローセル上に捕捉し（２０ｎＭ；７５秒注入；捕捉レベル約２５０ＲＵ）、続いて１８０秒にわたり分析物を注入し（会合させ）、解離させた（可変時間：最大６００秒；流速４０μＬ／分）。分析物濃度が１．３７〜１０００ｎＭである一連の２倍連続希釈物を分析した。各サイクルの終了時に、捕捉されたリガンドおよび結合した分析物を、３０秒にわたる２回の注入により１０ｍＭのグリシン／ＨＣｌ  ｐＨ１．５で取り出した。ブランク注入（分析物濃度＝０ｎＭ）を含め、二重参照のために差し引いた。結果として得られたセンサーグラムを、１：１の動態状態モデルおよび定常状態モデルを使用してＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で評価した。
【０２９１】
結果：
Ｔａｒｇｅｔ−Ｘ特異的ポリペプチドの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅシステムにおいて捕捉されたカニクイザルＴａｒｇｅｔ−Ｘ／Ｆｃで測定した。このポリペプチドの親和性は、動態モデルでは３６ｎＭであり、定常状態モデルでは４５ｎＭであった（表６）。
【０２９２】
このことは、本開示のポリペプチドが高度に特異的であるだけでなく、このポリペプチドの標的に対して高い親和性で結合することも実証する。
【０２９３】
実施例１０：カニクイザルＴａｒｇｅｔ−Ｘ／受容体結合阻害アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
方法：
１０μｇ／ｍｌのＴａｒｇｅｔ−Ｘ関連組換え受容体タンパク質でＭＳＤプレートをコーティングし、粉ミルクでブロックした。様々な濃度のＴａｒｇｅｔ−Ｘ特異的ＭＢＰフリーポリペプチドを０．５μｇ／ｍｌのカニクイザルＴａｒｇｅｔ−Ｘ／Ｆｃと混合し、ＲＴで３０分にわたりインキュベートした。ブロックされたＭＳＤプレートを洗浄した後、このプレートにポリペプチド−Ｔａｒｇｅｔ−Ｘ／Ｆｃ混合物をアプライし、ＲＴで１時間にわたりインキュベートした。洗浄した後、ＥＣＬが共役した抗ヒトＦｃ特異的抗体（１：２０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、受容体が結合したＴａｒｇｅｔ−Ｘを検出した。ポリペプチドによる特異的な受容体／標的相互作用の阻害により、受容体に結合したＴａｒｇｅｔ−Ｘ／Ｆｃ結合のシグナルが減少する。
【０２９４】
結果：
精製済カニクイザルＴａｒｇｅｔ−Ｘ特異的ＭＢＰフリーポリペプチドを、受容体／カニクイザルＴａｔｇｅｔ−Ｘ相互作用に対する潜在的な阻害のインビトロ活性について分析した。このポリペプチドは、ＥＬＩＳＡにおいて有意な受容体／カニクイザルＴａｒｇｅｔ−Ｘ相互作用の阻害を示し、ＩＣ５０値は１４．７ｎＭであった。
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【０２９５】
実施例１１：Ｔａｒｇｅｔ−Ｘ特異的ポリペプチドのヘリックス−ターン−ヘリックス設計の構造分析
Ｃｈｉｒａｓｃａｎ  Ｐｌｕｓ  ＣＤ−Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ）を使用して、ペプチド濃度が０．１ｍｇ／ｍｌである１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中での円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを測定することにより、Ｔａｒｇｅｔ−Ｘ特異的ポリペプチドのα−ヘリックス含有量を分析した。
【０２９６】
図８に示すように、このポリペプチドは２０８ｎｍおよび２２２ｎｍで二重に最小値を示しており、このことは、このポリペプチドが水溶液中でα−ヘリックス構造の高い含有量を有することを示す。
【０２９７】
加えて、このポリペプチドを、２０〜９０℃の範囲の温度上昇にて水溶液中でインキュベートすることにより、熱安定性を決定した。ＣＤスペクトルの分析により、このポリペプチドは９０℃での処理後であっても構造のアンフォールディングをほとんど示さないことが明らかとなった（図８）。
【０２９８】
実施例１２：ヘリックス−ターン−ヘリックス設計の安定性
２０℃にて２モル濃度および４モル濃度のグアニジン塩酸塩（ＧｄｍＨＣＬ）中でＨＴＨｄｅｓ２参照配列を含むポリペプチドをインキュベートすることにより、化学変性に対する安定性を決定した。４ＭのＧｄｍＨＣＬによる処理であっても、ポリペプチドの完全なアンフォールディングは起きなかった。さらなる実験では、ポリペプチドを、２２℃〜９０℃の範囲の温度上昇にて２ＭのＧｄｍＨＣＬで処理した。再度、９０℃での２ＭのＧｄｍＨＣＬによる処理後であっても、ポリペプチドの完全なアンフォールディングを観測し得なかった。
【０２９９】
ヘリックス−２中で６個のアミノ酸残基を交換したＨＴＨｄｅｓ２参照配列ポリペプチドの配列バリアントに関して、低ｐＨ変性に対する安定性を調べた。ｐＨ７．２へのその後の中和を行なうまたは行なわない６０分にわたるｐＨ２でのポリペプチドの処理により、このポリペプチドのα−ヘリックス含有量は変化しなかった。
【０３００】
実施した全ての研究は、本開示のライブラリから単離され得るポリペプチドの優れた安定性特性を明確に実証している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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