(57)【要約】【課題】、現在、臨床試験において、抗ＬＡＧ−３治療はわずかしかなく、治療として認可されたものはなく、それゆえ、ＬＡＧ−３を標的とする追加の分子を開発する必要性が依然としてある。【解決手段】  本開示は、プログラム死リガンド１（PD-L1）及びリンパ球活性化遺伝子３（LAG-3）と結合する抗体分子に関する。抗体分子は、好ましくは、ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位、及び抗体分子のＣＨ３ドメインの２個以上の構造ループに位置し得るＬＡＧ−３抗原結合部位を含む。本開示の抗体分子は、例えば、がん治療に適用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム死リガンド１（PD-L1）及びリンパ球活性化遺伝子３（LAG-3）と結合する抗体分子であって、
（i）ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位；及び
（ii）当該抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位
を含み、前記ＬＡＧ−３結合部位が、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）及びＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）を含み、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤが、前記ＣＨ３ドメインの第１の構造ループに位置し、アミノ酸配列ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥが、前記ＣＨ３ドメインの第２の構造ループに位置する、抗体分子。
【請求項２】
前記ＬＡＧ−３抗原結合部位が、前記ＣＨ３ドメインのＡＢループ中に、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、ＥＦループ中に、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３】
（i）配列番号１に示されるアミノ酸配列が、前記ＣＨ３ドメインの残基１１から１８に位置し、及び／又は
（ii）配列番号３に示されるアミノ酸配列が、前記ＣＨ３ドメインの残基９２から１０１に位置し、
アミノ酸残基の番号付けが、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（IMGT）の番号付けスキームによる、請求項１又は２に記載の抗体分子。
【請求項４】
前記ＬＡＧ−３抗原結合部位が、以下の配列：
（i）ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号２、８、及び１８）；
（ii）ＳＮＧＱＰＥＤＮＹ（配列番号１３）；
（iii）ＳＮＧＹＰＥＩＥＦ（配列番号２３）；
（iv）ＳＮＧＩＰＥＷＮＹ（配列番号２８）；
（v）ＳＮＧＹＡＥＹＮＹ（配列番号３３）；
（vi）ＳＮＧＹＫＥＥＮＹ（配列番号３８）；
（vii）ＳＮＧＶＰＥＬＮＶ（配列番号４３）；又は
（viii）ＳＮＧＹＱＥＤＮＹ（配列番号４８）
の１つをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項５】
前記ＬＡＧ−３抗原結合部位が、前記ＣＨ３ドメインのＣＤループ中に、配列番号２、８、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、又は４８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体分子。
【請求項６】
前記ＬＡＧ−３抗原結合部位が、前記ＣＨ３ドメインのＣＤループ中に、配列番号２、２８、又は３８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体分子。
【請求項７】
前記ＬＡＧ−３抗原結合部位が、前記ＣＨ３ドメインのＣＤループ中に、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体分子。
【請求項８】
配列番号２、８、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、又は４８に示されるアミノ酸配列が、当該抗体分子の前記ＣＨ３ドメインの残基４３から７８に位置し、残基が、ＩＭＧＴの番号付けスキームに従って番号付けされる、請求項４から７のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項９】
免疫グロブリンＧ分子である、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１０】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４分子である、請求項９に記載の抗体分子。
【請求項１１】
ＩｇＧ１分子である、請求項１０に記載の抗体分子。
【請求項１２】
配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０に示されるＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１３】
配列番号５、３０、又は４０に示される前記ＣＨ３ドメインを含む、請求項１２に記載の抗体分子。
【請求項１４】
配列番号５に示される前記ＣＨ３ドメインを含む、請求項１３に記載の抗体分子。
【請求項１５】
ＣＨ２ドメインを含み、前記ＣＨ２ドメインが、配列番号５３又は配列番号５４に示される配列を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１６】
配列番号６、７、１１、１２、１６、１７、２１、２２、２６、２７、３１、３２、３６、３７、４１、４２、４６、４７、５１、又は５２に示される配列を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１７】
配列番号６、７、３１、３２、４１、又は４２に示される配列を含む、請求項１６に記載の抗体分子。
【請求項１８】
配列番号６又は７に示される配列を含む、請求項１７に記載の抗体分子。
【請求項１９】
配列番号８６から９１に示される前記相補性決定領域（CDR）を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２０】
配列番号９２及び９３に示されるＶＨ及び／又はＶＬドメインを含む、請求項１９に記載の抗体分子。
【請求項２１】
配列番号９４から１１３のいずれか１つに示される重鎖配列を含む、請求項１９又は２０に記載の抗体分子。
【請求項２２】
配列番号９４、９５、１０４、１０５、１０８、又は１０９に示される重鎖配列を含む、請求項２１に記載の抗体分子。
【請求項２３】
配列番号９４又は９５に示される重鎖配列を含む、請求項２２に記載の抗体分子。
【請求項２４】
配列番号１１６に示される軽鎖配列を含む、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２５】
ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３と同時に結合する能力がある、請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２６】
ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３が２つの異なる細胞上に存在する、請求項２５に記載の抗体分子。
【請求項２７】
当該抗体分子が、免疫系調節物質、細胞傷害性分子、放射性同位元素、又は検出可能な標識にコンジュゲートしている、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２８】
免疫系調節物質又は細胞傷害性分子がサイトカインである、請求項２７に記載の抗体分子。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする核酸。
【請求項３０】
請求項２９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３１】
請求項２９に記載の核酸又は請求項３０に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体分子を産生する方法であって、請求項３１に記載の組換え宿主細胞を、抗体分子の産生のための条件下で培養する工程を含む、方法。
【請求項３３】
前記抗体分子を単離及び／又は精製する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項３５】
患者においてがんを処置する方法における使用のための、請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項３６】
患者においてがんを処置する方法であって、請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体分子の治療的有効量を患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の使用又は請求項３６に記載の方法のための抗体分子であって、がんが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、前立腺がん、結腸直腸がん、線維肉腫、腎細胞癌、メラノーマ、膵がん、乳がん、多形神経膠芽腫、肺がん、頭頚部がん、胃がん、膀胱がん、子宮頚がん、子宮がん、外陰がん、精巣がん、陰茎がん、白血病、多発性骨髄腫、扁平上皮がん、精巣がん、食道がん、カポジ肉腫、及び中枢神経系（CNS）リンパ腫、肝細胞癌、メルケル細胞癌、上咽頭がん、及び中皮腫からなる群から選択される、特異的結合要素又は抗体分子。
【請求項３８】
方法が、抗腫瘍ワクチンを患者に投与する工程をさらに含む、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の使用又は方法のための抗体分子。
【請求項３９】
方法が、化学療法剤を患者に投与する工程をさらに含む、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の使用又は方法のための抗体分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本ケースは、２０１６年６月２０日に出願された米国特許出願第６２／３５２４８２号に関係し、その出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、プログラム死リガンド１（PD-L1）及びリンパ球活性化遺伝子３（LAG-3）と結合する抗体分子に関する。抗体分子は、好ましくは、ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位、及び抗体分子のＣＨ３ドメインの２個以上の構造ループに位置し得るＬＡＧ−３抗原結合部位を含む。本発明の抗体分子は、例えば、がん治療に適用される。
【背景技術】
【０００３】
リンパ球活性化遺伝子−３（LAG-3; CD223）は、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであり、ＣＤ４に、遺伝子的及び構造的に関係している（もっとも、たった２０％配列同一性を有するだけである）。ＣＤ４のように、ＬＡＧ−３は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するが、ＣＤ４より高い親和性で結合する（ＫＤ＝６０ｎＭ）。ＬＡＧ−３は、活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｐＤＣ、Ｂ細胞、γδＴ細胞上に発現し、免疫抑制に、特に一定の割合の制御性Ｔ細胞（Treg）における持続性の強い発現を通して、関与する（Liangら、2008）。
【０００４】
ＬＡＧ−３遺伝子は、ヒト１２番染色体上に、ＣＤ４遺伝子に隣接して位置し、８個のエクソンに及ぶ。５個の選択的転写産物があり、そのうちの２個がタンパク質産物：完全長膜貫通タンパク質及び選択的にスプライシングされた可溶性単量体型を生じる。完全長転写産物は、７０ｋＤａの分子量をもつ、５２５アミノ酸のタンパク質をコードし、機能活性を有し、一方、可溶性型は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を結合しないと思われ、その機能はわかっていない。ヒト完全長ＬＡＧ−３タンパク質は、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＬＡＧ−３との９３％配列同一性及びＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（イエハツカネズミ）ＬＡＧ−３との７０％配列同一性を有する。
【０００５】
ＬＡＧ−３は、４個の細胞外Ｉｇ様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）、及びＬＡＧ−３シグナル伝達に関与する細胞質部分を有する膜貫通タンパク質である。細胞質ドメインは、ＬＡＧ−３関連タンパク質（LAP）に関連するＥＰ（グルタミン酸／プロリン）モチーフ、及びＴ細胞機能のＬＡＧ−３調節に必要とされると考えられるＫＩＥＥＬＥモチーフを有する。ＥＰモチーフの役割に関するレポートは、それが、ＬＡＧ−３のＴ細胞表面膜への輸送に関与し得（Baeら、2014）、又はＴ細胞活性化中のＳＴＡＴ５の下流シグナル伝達を調節することに直接、関与し得（Durhamら、2014）、又はもしかすると、両方であり得ると示唆している。
【０００６】
Ｔ細胞上のＬＡＧ−３の免疫抑制機構は、ＬＡＧ−３の活性化Ｔ細胞への架橋により作動され、その結果として、Ｔ細胞活性化中のカルシウム流及びＩＬ−２放出の減少を生じると考えられている（Huardら、1997）。抗原提示細胞（APC）上において、ＬＡＧ−３陽性制御性Ｔ細胞によるＭＨＣ  ＩＩ分子との結合は、ＩＬ−１２分泌の減少、及び活性化の「二次シグナル」であるＣＤ８６の下方制御を引き起こし（Liangら、2008）、その結果、不適切な活性化及び／又はＡＰＣによる抗原提示の低下からＴ細胞アネルギーを生じる。ＬＡＧ−３ノックアウトマウスモデルは、穏やかなリンパ球過剰増殖だけで、生存可能であり（Workmanら、2003）、ＬＡＧ−３が中程度の免疫「ブレーキ」として働くことを示している。
【０００７】
ＬＡＧ−３とＭＨＣクラスＩＩとの間のこの抑制性相互作用はまた、ＴｒｅｇとＣＤ４陽性Ｔ細胞との間に起こることが提案されている（Segaら、2014）。Ｔｒｅｇは、抑制性サイトカイン（IL-10及びTGFβなど）の放出、炎症性代謝の操作（CD73異化アデノシンなど）、ＡＰＣ成熟の制御、又は制御性Ｔ細胞とエフェクターＴ細胞との間の直接的相互作用のいずれかにより、免疫応答を抑制する。ＭＨＣクラスＩＩ陽性ＴｒｅｇがＭＨＣクラスＩＩ陰性Ｔｒｅｇより抑制性であり（Baecher-Allenら、2006）、エフェクターＴ細胞上に発現したＬＡＧ−３との直接的相互作用を通して免疫応答を活発に抑制するという証拠がヒトにおいてある。ＬＡＧ−３陰性Ｔｒｅｇは、通常のＴ細胞増殖を抑制することができるが、ＬＡＧ−３陰性ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ免疫抑制に抵抗性である。この過程は、トロゴサイトーシスとして公知の過程を通してヒトＴ細胞間で起こり（Segaら、2014）、それにより、ＴｒｅｇがＡＰＣ成熟を阻止するだけでなく、ＭＨＣクラスＩＩを獲得して、プライミングされたＬＡＧ−３陽性ＣＤ４  Ｔ細胞を抑制すると言われた。
【０００８】
ＬＡＧ−３発現はまた、繰り返された抗原刺激のマーカーである。がんにおいて、Ｔ細胞は、一般的に、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、及びＬＡＧ−３などの免疫抑制因子の発現を含む、「疲弊した」表現型の形をとり（Wherryら、2011）、その場合、その細胞は、抗原に応答して、適切に増殖し、かつケモカインを分泌する一般的能力をもたない。これらの免疫抑制因子の阻害は、免疫閾値を低下させ、Ｔ細胞による適切な抗がん応答を（再び）可能にする。前臨床モデルにおいて、これは、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、及びＰＤ−１に対するアンタゴニスト抗体を用いて裏付けられており、その場合、腫瘍量の減少が見られた。アンタゴニスト抗体によるＬＡＧ−３阻害は、腫瘍微小環境において免疫応答を再活性化すると考えられ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞上のＬＡＧ−３の発現が、疲弊した表現型と関連しており、Ｔｒｅｇ上のＬＡＧ−３の発現が、強力な免疫抑制能力と関連している。ＬＡＧ−３をブロックする抗体は、Ｔエフェクター細胞の増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性を増加させ、Ｔｒｅｇ抑制因子活性を減少させて、腫瘍成長の減少をもたらす。
【０００９】
ヒト腫瘍において、ＬＡＧ−３の発現の増加は、ヒト腎細胞癌、並びにメラノーマ及びリンパ腫などの他の腫瘍からの腫瘍浸潤リンパ球（TIL）上に見出された（Demeureら、2001; Wolchockら、2013）。重要なことには、ＬＡＧ−３はまた、慢性ウイルス感染症（Workmanら、2005）及びがん（Workmanら、2003）を有する患者におけるＴ細胞機能不全と密接に相関している。ＬＡＧ−３はまた、様々なヒトがんにおいて腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇについての表面マーカーとして同定されている（Camisachiら、2010; Gandhiら、2006）。
【００１０】
がん（固形及び血液系悪性腫瘍）において、免疫抑制をなくし、可能であれば抗原提示を増強するためのヒトＬＡＧ−３に対するモノクローナル抗体が、臨床開発中である。
【００１１】
ＬＡＧ−５２５及びＩＭＰ−７０１（Novartis AG）は、ＬＡＧ−３に対するヒト抗体であり、腎がん（腎細胞がん）；非小細胞肺がん（NSCLC）；上咽頭がん；結腸直腸がん；メラノーマ；胃がん、及び食道胃接合部腺癌において、それぞれ、第ＩＩ相及び第Ｉ相臨床研究に進んでいる。
【００１２】
抗ＬＡＧ−３抗体ＢＭＳ−９８６０１６（Bristol-Myers Squibb Company）は、現在、卵巣がん；ＮＳＣＬＣ；結腸直腸がん；子宮頚がん；メラノーマ；胃がん；膀胱がん；頭頚部がん；扁平上皮癌；腎細胞癌について第Ｉ相臨床試験中であり、単剤療法としてか、又は併用療法の一部としてかのいずれかで、ＮＳＣＬＣ；再発性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；難治性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；メラノーマ；非ホジキンリンパ腫；ホジキンリンパ腫；びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫；間慢性リンパ腫；マントル細胞リンパ腫；難治性多発性骨髄腫；及び間慢性多発性骨髄腫において第ＩＩ相研究中である。
【００１３】
ＬＡＧ−３に対するさらなる抗体もまた、前臨床開発中である。
【００１４】
プログラム細胞死１（PD-1）並びにそのリガンドＰＤ−Ｌ１（CD274、B7-H1）及びＰＤ−Ｌ２（B7-DC）は、Ｔ細胞活性化と寛容と免疫病理との間でのバランスを制御する阻害性シグナルを送達する。ＰＤ−Ｌ１は、全ての免疫細胞及びいくつかの腫瘍細胞上に一過性に発現する。
【００１５】
ＰＤ−Ｌ１は、細胞外領域内の２個のＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン、及び短い細胞質ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質である。細胞質ドメインは、公知のシグナル伝達モチーフをもたず、リガンドのその受容体との相互作用に際し、ＰＤ−Ｌ１によるシグナル伝達がないことを示唆している。その分子量は、４０ｋＤａ（２９０アミノ酸）であり、それは、マウス１９番染色体及びヒト９番染色体それぞれにおけるＣＤ２７４遺伝子によりコードされる。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ７タンパク質ファミリーのメンバーであり、Ｂ７．１及びＢ７．２とおよそ２０％のアミノ酸配列同一性を共有する。ヒトＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−Ｌ１のマウス及びカニクイザルのオルソログそれぞれと、７０％及び９３％のアミノ酸同一性を共有する。
【００１６】
ＰＤ−Ｌ１は、その受容体ＰＤ−１と７７０ｎＭの親和性（KD）で結合する。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄系細胞上に発現し、細胞性免疫応答の活性化又は阻害を調節する。ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１との結合は、阻害性シグナルを送達し、Ｔ細胞のサイトカイン産生及び増殖を低下させる。結果として、細胞によるＰＤ−Ｌ１発現は、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）殺害からの保護を媒介することができ、ウイルス感染中、慢性免疫応答を鈍らせる制御機構である。慢性かつ炎症促進性疾患としてのがんは、ＰＤ−Ｌ１発現の上方制御を通して、この免疫防御経路を破壊し、宿主免疫応答を逃れる。能動免疫応答の関連において、ＩＦＮγもまた、ＰＤ−Ｌ１の発現を上方制御する。
【００１７】
ＰＤ−Ｌ１はまた、別のタンパク質、Ｂ７．１（CD80としても知られている）との相互作用を通して免疫抑制を媒介し、Ｔ細胞へＣＤ２８を通して活性化の二次シグナルの１つを送達するＢ７．１の能力をブロックする。腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１発現及びそのＢ７．１との会合に関して、この特異的な相互作用の腫瘍免疫抵抗性における関連性はまだ明らかではない。
【００１８】
ＰＤ−Ｌ１発現は、幅広い種類の固形腫瘍に示されている。異なる部位由来の１９個の腫瘍に及ぶ、一つの研究において調べられた６５４個の試料のうち、８９個（１４％）がＰＤ−Ｌ１陽性（≧５％頻度）であった。最も高いＰＤ−Ｌ１陽性頻度は、頭頚部（１７／５４；３１％）、子宮頚部（１０／３４；２９％）、原発不明癌（CUP; 8/29; 28％）、多形神経膠芽腫（GBM; 5/20; 25%）、膀胱（８／３７；２１％）、食道（１６／８０；２０％）、トリプルネガティブ（TN）乳房（６／３３；１８％）、及び肝細胞癌（６／４１；１５％）に見られた（Grossoら、2013）。ＰＤ−Ｌ１の腫瘍関連発現は、免疫抵抗性を与えることが示されており、Ｔ細胞媒介性アポトーシスから腫瘍細胞を保護する可能性がある。
【００１９】
ＰＤ−Ｌ１を標的にする治療は、マウスのインビボ研究にいて優れた結果を示している。メラノーマのＢ１６マウスモデルにおいて、ＧＶＡＸか又はＦＶＡＸのいずれかのワクチン接種ストラテジーと組み合わせた抗ＰＤ−Ｌ１での処置は、その研究の終わりにおいて、生存（対照について３０日間対ＰＤ−Ｌ１処置について５２日間）と、腫瘍を含まない（５％）動物のパーセンテージの両方に有意な効果を生じた（Curranら、2010）。抗ＰＤ−Ｌ１治療はまた、Ｐ８１５マウス肥満細胞腫モデルにおける免疫抑制の機構を研究するために用いられている。マウスへ注射されたＰ８１５細胞は、正常には、強い免疫応答を引き起こし、彼らの拒絶を生じる。ＰＤ−Ｌ１がＰ８１５細胞上に発現している場合、これらの細胞は、免疫攻撃を逃避し、それは、次に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与を通して無効にすることができる（Iwaiら、2002）。免疫原性ヒトがんにおいてＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を標的にすること（Herbstら、2014）は、抗がん免疫応答の刺激を通して生存の優位を生じることが明白である（Wolchockら、2013; Larkinら、2015）。
【００２０】
アテゾリズマブ（MPDL3280A、RG7466、TECENTRIQ）は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒト化ＩｇＧ１抗体である。それは、固形がんの処置のための、単剤として、並びにまた、他の生物学的療法及び／又は小分子治療と組み合わせての臨床試験中であり、その固形がんには、結腸直腸がん、乳がん、非小細胞肺癌、膀胱がん、及び腎細胞癌が挙げられる。アテゾリズマブでの処置は、ＮＳＣＬＣにおける２３％、メラノーマにおける３６％、膀胱がんにおける３３％、ＲＣＣにおける１４％、及び頭頚部がんにおける１３％の奏効率（ORR）を生じた（Herbstら、2014； Powlesら、2014）。
【００２１】
アベルマブ（MSB0010718C）は、ＰＤ−Ｌ１と結合する完全ヒトＩｇＧ１抗体であり、膀胱がん、胃がん、頭頚部がん、中皮腫、非小細胞肺癌、卵巣がん、腎がん、及びメルケル細胞癌を含むいくつかのがんにおいて臨床試験中である。
【００２２】
デュルバルマブ（MEDI4736）は、ＰＤ−Ｌ１と結合するヒトＩｇＧ１抗体であり、非小細胞肺がん、頭頚部の扁平上皮癌、膀胱がん、膵がんにおいて、単独で又はトレメリムマブと組み合わせて、臨床試験で試験されようとしており、並びに他の生物学的分子及び小分子と組み合わせて、胃がん、メラノーマ、及び切除不能な肝細胞癌などの追加の固形がんについて治験中である。
【００２３】
ＢＭＳ−９３６５５９を含むさらなる抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、臨床試験において試験されており、他のものは、前臨床試験中である。
【００２４】
しかしながら、現在、臨床試験において、抗ＬＡＧ−３治療はわずかしかなく、治療として認可されたものはなく、それゆえ、ＬＡＧ−３を標的とする追加の分子を開発する必要性が依然としてある。開発中のいくつかの抗ＰＤ−Ｌ１治療用物質があるが、現在のデータは、抗ＰＤ−Ｌ１単剤療法での全面処置が、がん患者の５０％未満において応答を生じることを示している。したがって、ＬＡＧ−３及び／又はＰＤ−Ｌ１を標的にすることができ、かつがん治療に適用される追加の分子についての必要性が依然として当技術分野に残っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
抗ＰＤ−１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、主に、免疫寛容を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を活性化することに関与する。活性化後Ｔ細胞上に発現し、疲弊したＴ細胞上に恒常的に発現するＬＡＧ−３は、これらの細胞を抑制状態でさらに維持する。他の確立された免疫抑制性分子（すなわち、PD-1、PD-L1）と組み合わせて使用される場合、ＬＡＧ−３の遮断はまた、マウス腫瘍モデルにおいて相乗的な向上した免疫応答を与えることが示されている（Wooら、2012）。本発明者らは、これらの経路の両方を同時に標的にする治療が、Ｔ細胞疲弊を促進及び維持する機構に直接、対処するだろうと仮定した。加えて、本発明者らは、ＬＡＧ−３を標的にすることが、ＬＡＧ−３発現する制御性Ｔ細胞のＡＰＣへの作用を通しての抗原提示を抑制し得ると予想し、発表された研究は、ＣＤ８６の下方制御を実証している（Grossoら、2013）。この相互作用をブロックすることは、抗原提示を維持することが予想され、一方、ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達をブロックすることが、寛容を破壊することが予想され、結果として、両方の経路が同時に阻害された時、有意な抗腫瘍応答を生じる。
【００２６】
抗ＬＡＧ−３抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せに関する発表されたデータは、前臨床の同系マウス腫瘍モデル及びウイルス負荷モデルからのいくつかの結果があるが、限られている。骨髄腫のマウスモデルにおいて、抗ＰＤ−Ｌ１ブロッキング抗体と抗ＬＡＧ−３ブロッキング抗体の組合せが、低線量全身照射後に投与され、生存率を８０％より高く向上させた（Jingら、2015）。全身性又は器官特異的自己免疫の証拠は観察されなかった。ＬＡＧ−３及びＰＤ−１ノックアウトマウスは、複数の移植可能な腫瘍からの生存及びそのクリアランスの著しい増加を示した（Wooら、2012）。
【００２７】
本発明者らは、ＬＡＧ−３とＰＤ−Ｌ１の両方と結合する二重特異性抗体が、これらの抗原に対するモノクローナル抗体の組合せを越えるいくつかの利点を与えると仮定し、その利点には、以下が挙げられる：
１．  指向型治療
活性化Ｔ細胞は、リンパ節においてＬＡＧ−３を発現する。抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の一部は、リンパ節において、プライミングされたＬＡＧ−３陽性Ｔ細胞を標的にし、その後、そのＴ細胞は、腫瘍の部位へ移動して、二重特異性抗体を輸送する。いったん腫瘍微小環境内に入れば、二重特異性抗体を所有するＴ細胞が、抗ＰＤ−Ｌ１部分を介して腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１をすぐに会合し、ブロックすることができる。結果的に、腫瘍部位に移動した全てのＴ細胞が、ＬＡＧ−３シグナル伝達とＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１シグナル伝達の両方に抵抗性である。
２．  橋渡し
プライミングされたＣＤ８陽性Ｔ細胞は、腫瘍微小環境内で腫瘍抗原と遭遇し、そこで、それらは、抑制性シグナルの非存在下で腫瘍細胞を殺害することにより応答する。二重特異性抗体は、Ｔ細胞と腫瘍細胞のこの接触を維持又は延長することにより個々のモノクローナル治療の組合せより優れていると予想される。Ｔ細胞の活性化におけるシグナル強度は必須であり、がんにおける提示された抗原の場合には鍵となり得（Engelsら、2013）、ＡＰＣ又はがん細胞上の標的と結合した二重特異性抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１抗体の存在は、Ｔ細胞が成功裏に抗原を認識し、かつ活性化し得る時間を増加させることが予想される。
３．  局在化
炎症及び進行中の免疫応答のエリアにおいて、ＰＤ−Ｌ１発現は、局在性ＩＦＮ−γ放出のために有意に増加する。標的がん細胞に関してであろうと、腫瘍関連マクロファージ（TAM）に関してであろうと、又はＴ細胞集団の繰り返される刺激に関してであろうと、同じことが言える。ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３をアンタゴナイズする二重特異性抗体は、局在化し、腫瘍における最も高いＰＤ−Ｌ１発現のエリアに集中し、同時に、抗ＬＡＧ−３部分が、Ｔ細胞に結合し、かつＴ細胞のＬＡＧ−３媒介性抑制を防ぐことを可能にすることが予想される。
【００２８】
広範なスクリーニング及び親和性成熟プログラム後、本発明者らは、分子のＣＨ３ドメイン内に、ＬＡＧ−３に特異的な結合部位を含む、１０個の特異的結合要素を同定することができた。これらの分子は、ヒトＬＡＧ−３とカニクイザルＬＡＧ−３の両方に対して高い親和性を有することが示された。ヒトＬＡＧ−３に対する高親和性は、ヒト患者における、例えば、ＬＡＧ−３を発現する腫瘍浸潤リンパ球（TIL）を含有するがんの処置において有利であることが予想され、一方、ヒトＬＡＧ−３に対する親和性に匹敵する、カニクイザルＬＡＧ−３に対する高親和性は、カニクイザル疾患モデルにおける特異的結合要素の性質の評価に有用であることが予想される。このことについての理由は、その得られた結果が、ヒト及びカニクイザルＬＡＧ−３に対するその親和性により高い変動性を有する分子がカニクイザルモデルで試験される場合より、ヒト患者における特異的結合要素の効果を予測する可能性がより高いということである。
【００２９】
特異的結合要素はまた、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて高い活性を有することが示され、そのことにより、ＬＡＧ−３の阻害の増強を通してヒト患者において向上した効力を予測するものであると予想される。
【００３０】
本発明者らはさらに、ＣＨ３ドメインにＬＡＧ−３に特異的な結合部位を含むこれらの特異的結合要素を、ＰＤ−Ｌ１に対するＣＤＲに基づいた抗原結合部位を含む抗体Ｆａｂドメインと組み合わせて、ＬＡＧ−３とＰＤ−Ｌ１の両方に対する結合部位を含む二重特異性抗体分子を作製し、その二重特異性抗体分子は、上記で詳述された利点を有すると予想される。マウスＬＡＧ−３及びマウスＰＤ−Ｌ１と結合するこれらの抗体分子の代替マウスバージョンもまた、本発明者らにより調製され、がんの同系マウスモデルにおいて腫瘍成長を有意に阻害する能力があることが示された。特に、これらの代替マウス分子の使用は、試験されたマウスモデルにおいて、ＬＡＧ−３とＰＤ−Ｌ１の両方に対する結合部位を含む抗体分子がマウスに投与された時、腫瘍成長抑制への相乗的効果があることを実証した。腫瘍環境におけるマウス及びヒトのＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１の類似した作用機構に基づいて、腫瘍量を減少させる効力を示すマウス研究は、ヒトがん患者における臨床治療的利益へと変換されることが予想される。したがって、これらの結果に基づいて、本発明の抗体分子が、例えばＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１それぞれに結合する２つの別々の分子の投与より、ヒト患者におけるがんの処置に、特に腫瘍成長を抑制することに、より優れた効果を示すだろうと予想される。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
したがって、第１の態様において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１とＬＡＧ−３の両方と結合する抗体分子を提供する。具体的には、これらの抗体は、
（i）ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位；及び
（ii）抗体分子のＣＨ３ドメインの２個以上の構造ループに位置し、又はそれらへと操作されたＬＡＧ−３抗原結合部位
を含む。ＬＡＧ−３結合部位は、好ましくは、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）及びＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）を含む。
【００３２】
抗体分子は、好ましくは、ＣＨ３ドメインのＡＢループに、配列番号１に示されるアミノ酸配列、及びＥＦループに、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
したがって、第１の態様において、本発明は、プログラム死リガンド１（PD-L1）及びリンパ球活性化遺伝子３（LAG-3）と結合する抗体分子を提供する。抗体分子は、好ましくは、（i）ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位；及び（ii）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含む。
【００３４】
ＬＡＧ−３結合部位は、好ましくは、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）及びＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）を含む。アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤは、好ましくは、ＣＨ３ドメインの第１の構造ループに位置し、アミノ酸配列ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥは、好ましくは、ＣＨ３ドメインの第２の構造ループに位置する。
【００３５】
例えば、ＬＡＧ−３抗原結合部位は、抗体分子のＣＨ３ドメインの構造ループ領域に位置し得、構造ループ領域は、好ましくは、２個以上の構造ループを含み、ＬＡＧ−３結合部位は、好ましくは、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）及びＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）を含む。
【００３６】
さらなる例として、ＬＡＧ−３抗原結合部位は、抗体分子のＣＨ３ドメインの２個以上の構造ループへと操作され得、ＬＡＧ−３結合部位は、好ましくは、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）及びＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）を含む。
【００３７】
上記で言及されているように、ＬＡＧ−３結合部位の配列は、好ましくは、抗体分子のＣＨ３ドメインの２個以上の構造ループに位置する。好ましい実施形態において、ＬＡＧ−３抗原結合部位は、ＣＨ３ドメインのＡＢループ中に、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、ＥＦループ中に、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、好ましくは、ＣＨ３ドメインの残基１１から１８に位置し、及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインの残基９２から１０１に位置し、アミノ酸残基の番号付けは、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（IMGT）の番号付けスキームによる。
【００３９】
抗体分子のＬＡＧ−３抗原結合部位は、以下の配列：
（i）ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号２、８、及び１８）；
（ii）ＳＮＧＱＰＥＤＮＹ（配列番号１３）；
（iii）ＳＮＧＹＰＥＩＥＦ（配列番号２３）；
（iv）ＳＮＧＩＰＥＷＮＹ（配列番号２８）；
（v）ＳＮＧＹＡＥＹＮＹ（配列番号３３）；
（vi）ＳＮＧＹＫＥＥＮＹ（配列番号３８）；
（vii）ＳＮＧＶＰＥＬＮＶ（配列番号４３）；又は
（viii）ＳＮＧＹＱＥＤＮＹ（配列番号４８）
の１つを、好ましくは抗体分子のＣＨ３ドメインのＣＤループ中にさらに含み得る。
【００４０】
好ましくは、抗体分子のＬＡＧ−３抗原結合部位は、以下の配列：ＣＨ３ドメインのＣＤループにおける配列番号２、２８、又は３８に示されるアミノ酸配列の１つを、好ましくは抗体分子のＣＨ３ドメインのＣＤループ中にさらに含む。より好ましくは、抗体分子のＬＡＧ−３抗原結合部位は、ＣＨ３ドメインのＣＤループ中に、配列番号２に示されるアミノ酸配列をさらに含む。
【００４１】
配列番号２、８、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、又は４８に示されるアミノ酸配列は、好ましくは、抗体分子のＣＨ３ドメインの残基４３から７８に位置し、その残基は、ＩＭＧＴの番号付けスキームに従って番号付けされる。
【００４２】
ＬＡＧ−３抗原結合部位の配列以外の、抗体分子のＣＨ３ドメインの配列は、特に限定されるということはない。好ましくは、ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインなどのヒト免疫グロブリンＧドメイン、最も好ましくは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインである。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインの配列は当技術分野において公知である。
【００４３】
好ましい実施形態において、抗体分子は、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０に示されるＣＨ３ドメイン、より好ましくは、配列番号５、３０、又は４０に示されるＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、配列番号５に示されるＣＨ３ドメインを含む。あるいは、抗体分子は、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０、好ましくは配列番号５、３０、又は４０、より好ましくは配列番号５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＨ３ドメインを含み得る。
【００４４】
抗体分子は、ＣＨ２ドメインをさらに含み得る。ＣＨ２ドメインは、好ましくは、ヒトＩｇＧ分子における場合のように、ＣＨ３ドメインのＮ末端に位置する。抗体分子のＣＨ２ドメインは、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインである。ヒトＩｇＧドメインの配列は、当技術分野において公知である。好ましい実施形態において、抗体分子は、配列番号５３若しくは配列番号５４に示される配列を有するＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン、又は配列番号５３若しくは配列番号５４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＨ２ドメインを含む。
【００４５】
好ましい実施形態において、抗体分子は、配列番号６、７、１１、１２、１６、１７、２１、２２、２６、２７、３１、３２、３６、３７、４１、４２、４６、４７、５１、若しくは５２に示される配列、又は配列番号６、７、１１、１２、１６、１７、２１、２２、２６、２７、３１、３２、３６、３７、４１、４２、４６、４７、５１、若しくは５２に示される配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有する配列を含む。より好ましくは、抗体分子は、配列番号６、７、３１、３２、４１、若しくは４２に示される配列、又は配列番号６、７、３１、３２、４１、若しくは４２に示される配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有する配列を含む。さらにより好ましくは、抗体分子は、配列番号６若しくは７に示される配列、又は配列番号６若しくは７に示される配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有する配列を含む。
【００４６】
好ましい実施形態において、抗体分子は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４分子などのヒト免疫グロブリンＧ分子、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１分子である。ヒト免疫グロブリンＧ分子の配列は、当技術分野において知られており、ＣＨ３ドメイン、又は本明細書に開示されているようなＣＨ３ドメイン配列をそのような分子に導入することは、当業者にいかなる困難も提示することはないだろう。
【００４７】
抗体分子は、好ましくは、配列番号９２及び９３に示されるＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインのＣＤＲを含む。所定のＶＨ又はＶＬドメインにおけるＣＤＲ配列を決定するための方法は、当技術分野において知られており、それには、Ｋａｂａｔ及びＩＭＧＴ番号付けシステムが挙げられる。より好ましくは、抗体分子は、好ましくは、配列番号８６から９１に示される相補性決定領域の１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、又は全部の６個を含む。好ましくは、抗体分子は、配列番号９２及び９３それぞれに示されるＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含む。
【００４８】
好ましい実施形態において、抗体分子は、配列番号９４から１１３のいずれか１つに示される重鎖配列、又は重鎖配列のＶＨドメインが変化しないままであるという条件で、配列番号９４から１１３のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む。より好ましくは、抗体分子は、配列番号９４、９５、１０４、１０５、１０８、及び１０９のいずれか１つに示される重鎖配列、又は重鎖配列のＶＨドメインが変化しないままであるという条件で、配列番号９４、９５、１０４、１０５、１０８、及び１０９のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む。さらにより好ましくは、抗体分子は、配列番号９４若しくは９５に示される重鎖配列、又は重鎖配列のＶＨドメインが変化しないままであるという条件で、配列番号９４若しくは９５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【００４９】
さらなる好ましい実施形態において、抗体分子は、加えて、又は代替として、配列番号１１６に示される軽鎖配列、又は軽鎖配列のＶＬドメインが変化しないままであるという条件で、配列番号１１６と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含み得る。
【００５０】
抗体分子は、好ましくは、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３と同時に結合する能力がある。ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３は、例えば、２つの異なる細胞上に存在し得る。理論に縛られるつもりはないが、これは、細胞間の架橋、並びにＰＤ−Ｌ１及び／又はＬＡＧ−３を内部移行させて、それらを刺激に利用できないようにすることを生じると考えられる。
【００５１】
本発明者らは、本発明による、（i）ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位；及び（ii）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含む抗体分子、ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９が、驚くべきことに、ＬＡＧ−３発現細胞とＰＤ−Ｌ１発現細胞の混合物が試料に存在している場合でさえも、ＰＤ−Ｌ１発現細胞の補体依存性細胞傷害（CDC）を媒介したが、ＬＡＧ−３発現細胞のそれを媒介しなかったことを示した。この性質は、ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９の場合と同様に、抗体分子のＣＤＲに基づいた抗原結合が、腫瘍細胞を標的にし、かつ抗体分子の定常ドメインに位置する結合部位が、免疫細胞を標的にする場合、有用であると予想され、これは、免疫細胞が、抗体分子との結合により媒介されるＣＤＣから保護されると同時に、腫瘍細胞がＣＤＣを受けるからである。
【００５２】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、腫瘍抗原及び免疫細胞抗原と結合する抗体分子であって、抗体分子が、
（i）腫瘍抗原に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位；及び
（ii）抗体分子の定常ドメイン、好ましくは、ＣＨ３又はＣＨ２ドメイン、より好ましくはＣＨ３ドメインに位置する免疫細胞抗原に対する抗原結合部位
を含み、前記免疫細胞抗原を含む免疫細胞が抗体分子により結合されている場合、抗体分子が、前記免疫細胞の補体依存性細胞傷害を媒介せず、又は有意な補体依存性細胞傷害を媒介することはない、抗体分子に関する。
【００５３】
好ましくは、抗体分子はさらに、前記腫瘍抗原を含む腫瘍細胞が抗体分子により結合されている場合、前記腫瘍細胞の補体依存性細胞傷害を媒介する。
【００５４】
抗体分子のＣＤＣを測定するための方法は当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。
【００５５】
本発明者らはさらに、本発明による、（i）ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位；及び（ii）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含む抗体分子、ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９が、驚くべきことに、ＰＤ−Ｌ１発現細胞の抗体依存性細胞傷害（ADCC）と比較して、ＬＡＧ−３発現細胞の低いＡＤＣＣを媒介したことを示している。この場合もやはり、この性質は、ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９の場合と同様に、抗体分子のＣＤＲに基づいた抗原結合が腫瘍細胞を標的にし、かつ抗体分子の定常ドメインに位置する結合部位が、免疫細胞を標的にする場合、有用であると予想され、これは、免疫細胞が、抗体により結合された腫瘍細胞より低いＡＤＣＣに曝されるからである。
【００５６】
本明細書に説明されているように、抗体分子のＡＤＣＣ活性を低下させ、又は抑止するための変異は、当技術分野において公知である。１つのそのような変異は、本明細書に記載されたＬＡＬＡ変異である。ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９が、ＬＡＧ−３発現細胞に対する低いＡＤＣＣ活性を有することが、予想外にも見出された。ＡＤＣＣ活性を完全に抑止することが必要ではない場合、これは優位を表し得る。
【００５７】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、腫瘍抗原及び免疫細胞抗原と結合する抗体分子であって、抗体分子が、
（i）腫瘍抗原に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位；及び
（ii）抗体分子の定常ドメイン、好ましくは、ＣＨ３又はＣＨ２ドメイン、より好ましくはＣＨ３ドメインに位置する免疫細胞抗原に対する抗原結合部位
を含み、抗体分子が、前記腫瘍抗原を含む腫瘍細胞が抗体分子により結合されている場合の前記腫瘍細胞に応答してのＡＤＣＣより、前記免疫細胞抗原を含む免疫細胞が抗体分子により結合されている場合の前記免疫細胞に応答して、より低いＡＤＣＣを引き起こす、抗体分子に関する。好ましくは、抗体分子は、前記免疫細胞抗原を含む免疫細胞が抗体分子により結合されている場合の、前記免疫細胞のＡＤＣＣを媒介せず、又は有意なＡＤＣＣを媒介することはない。抗体分子はさらに、前記免疫細胞抗原を含む免疫細胞が抗体分子により結合されている場合、前記免疫細胞の補体依存性細胞傷害を媒介し得ず、若しくは有意な補体依存性細胞傷害を媒介し得ることはなく、及び／又は前記腫瘍抗原を含む腫瘍細胞が抗体分子により結合されている場合、前記腫瘍細胞の補体依存性細胞傷害を媒介し得る。
【００５８】
抗体分子のＡＤＣＣを測定するための方法は当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。
【００５９】
様々な腫瘍抗原及び免疫細胞抗原が当技術分野において公知である。腫瘍抗原及び免疫細胞抗原は、好ましくは、細胞表面抗原である。免疫細胞抗原は、好ましくは、腫瘍浸潤リンパ球上に存在する抗原である。
【００６０】
免疫細胞抗原に対する抗原結合部位は、好ましくは、抗体分子の定常ドメインの１つ又は複数の構造ループ、例えば、定常ドメインのＡＢ、ＣＤ、及び／又はＥＦループに、１個又は複数の改変を含む。例えば、結合部位は、本明細書に記載されているようなＬＡＧ−３結合部位であり得る。
【００６１】
本発明の抗体分子は、免疫系調節物質、細胞傷害性分子、放射性同位元素、又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。免疫系調節物質は、サイトカインであり得る。
【００６２】
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードする核酸、加えて、そのような核酸を含むベクターを提供する。
【００６３】
本発明の核酸又はベクターを含む組換え宿主細胞もまた提供される。そのような組換え宿主細胞は、抗体分子を産生するために用いられ得る。したがって、本発明の抗体分子を産生する方法であって、抗体分子の産生のための条件下で組換え宿主細胞を培養する工程を含む、方法もまた提供される。方法は、抗体分子を単離及び／又は精製する工程をさらに含み得る。
【００６４】
本発明の抗体分子は、治療的適用、特にがん処置などのヒトにおける治療的適用に適用されることが予想される。したがって、本発明による特異的結合要素又は抗体分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物もまた提供される。
【００６５】
本発明はまた、患者においてがんを処置する方法における使用のための、本発明の抗体分子を提供する。患者においてがんを処置する方法であって、本発明による抗体分子の治療的有効量を患者に投与する工程を含む、方法もまた提供される。患者におけるがんの処置のための薬物の製造における使用のための、本発明による抗体分子の使用がさらに提供される。処置は、抗腫瘍ワクチン及び／又は化学療法剤を患者に投与する工程をさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】２回目の親和性成熟後に同定された以下の９個のＦｃａｂ：ＦＳ１８−７−３２；ＦＳ１８−７−３３；ＦＳ１８−７−３６；ＦＳ１８−７−５８；ＦＳ１８−７−６２；ＦＳ１８−７−６５；ＦＳ１８−７−７８；ＦＳ１８−７−８８；及びＦＳ１８−７−９５の、親Ｆｃａｂ、ＦＳ１８−７−９に対する配列アラインメントを示す図である。
【図１Ｂ】これらのＦｃａｂのそれぞれの、親Ｆｃａｂ、ＦＳ１８−７−９の配列とのパーセンテージ配列同一性を示す図である。
【図２Ａ】Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す図である。具体的には、図２Ａは、ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９及び対照抗体で処理された細胞株のパネルにおける、Ｔ細胞活性化を示すＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１に関するアッセイは、活性化を生じるために、両方の標的の阻害（FS18-7-9/84G09LALA、FS18-7-9/4420LALA+84G09、25F7+84G09LALA、又は25F7+S1LALA）を必要とした。
【図２Ｂ】Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す図である。具体的には、図２Ｂは、ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９及び対照抗体で処理された細胞株のパネルにおける、Ｔ細胞活性化を示すＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。ＬＡＧ−３のみに関するアッセイは、活性化のためにＬＡＧ−３の阻害（FS18-7-9/84G09LALA、FS18-7-9/4420LALA+84G09、25F7+84G09LALA、25F7+S1LALA、25F7、FS18-7-9/4420 LALA）を必要とした。
【図２Ｃ】Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す図である。具体的には、図２Ｃは、ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９及び対照抗体で処理された細胞株のパネルにおける、Ｔ細胞活性化を示すＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。ＰＤ−Ｌ１のみに関するアッセイは、活性化のためにＰＤ−Ｌ１の阻害（FS18-7-9/84G09LALA、FS18-7-9/4420LALA+84G09、25F7+84G09LALA、25F7+S1LALA、84G09LALA）を必要とした。
【図２Ｄ】Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す図である。具体的には、図２Ｄは、ＦＳ１８−７−６２／８４Ｇ０９又はＦＳ１８−７−７８／８４Ｇ０９、及び対照抗体で処理された細胞株のパネルにおける、Ｔ細胞活性化を示すＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１に関するアッセイは、活性化のために、両方の標的の阻害（FS18-7-62/84G09LALA、FS18-7-78/84G09LALA、FS18-7-62/4420LALA+84G09、FS18-7-78/4420LALA+84G09、25F7+84G09LALA、又は25F7+S1LALA）を必要とした。
【図２Ｅ】Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す図である。具体的には、図２Ｅは、ＦＳ１８−７−６２／８４Ｇ０９又はＦＳ１８−７−７８／８４Ｇ０９、及び対照抗体で処理された細胞株のパネルにおける、Ｔ細胞活性化を示すＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。ＬＡＧ−３のみに関するアッセイは、活性化のためにＬＡＧ−３の阻害（FS18-7-62/84G09LALA、FS18-7-62/4420LALA、FS18-7-78/84G09LALA、FS18-7-78/4420LALA、FS18-7-62/4420LALA+84G09、FS18-7-78/4420LALA+84G09、25F7+84G09LALA、又は25F7+S1LALA）を必要とした。
【図２Ｆ】Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す図である。具体的には、図２Ｆは、ＦＳ１８−７−６２／８４Ｇ０９又はＦＳ１８−７−７８／８４Ｇ０９、及び対照抗体で処理された細胞株のパネルにおける、Ｔ細胞活性化を示すＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。ＰＤ−Ｌ１のみに関するアッセイは、活性化のためにＰＤ−Ｌ１の阻害（FS18-7-62/84G09LALA、FS18-7-78/84G09LALA、FS18-7-62/4420LALA+84G09、FS18-7-78/4420LALA+84G09、25F7+84G09LALA、又は25F7+S1LALA）を必要とした。
【図３】ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９は、ｃＬＡＧ−３＋ｃＰＤ−Ｌ１の両方、及びｃＬＡＧ−３又はｃＰＤ−Ｌ１の単独の存在下で、ＩＬ−２放出により示されているように、Ｔ細胞活性化を誘導することができ、機能的にカニクイザル交差反応性を示したことを示す図である。
【図４】ＳＥＢアッセイからの代表的なプロットを示す図である。ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２及びＬＡＧ−３／４４２０  ｍＡｂ２＋８４Ｇ０９ＬＡＬＡの組合せは、８４Ｇ０９ＬＡＬＡ  ｍＡｂ単独より高い活性化を示したが、ＬＡＧ−３／４４２０  ｍＡｂ２又は４４２０  ｍＡｂは、有意な活性化を示さなかった。
【図５】非定着ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおける２０日目の最終腫瘍重量を示す図である。ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２（FS18-29/S1）で処置されたマウスは、ベンチマークｍＡｂ、Ｃ９Ｂ７ＷとＳ１の組合せで処置されたマウスより有意により少ない重量をもつ最終腫瘍を有した。
【図６】非定着ＭＣ３８同系腫瘍モデルの成長曲線を示す図である。ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２（FS18-29/S1）で処置されたマウスは、ベンチマークｍＡｂ、Ｃ９Ｂ７ＷとＳ１の組合せで処置されたマウス、又はＳ１単独で処置されたマウスより小さい腫瘍を有した。ＬＡＧ−３／４４２０  ｍＡｂ２及びベンチマーク抗ＬＡＧ−３  ｍＡｂは、腫瘍成長にほとんど影響を及ぼさなかった。
【図７】定着ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおける２４日目の最終腫瘍重量を示す図である。ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２（FS18-29/S1）は、ベンチマーク抗体、Ｃ９Ｂ７ＷとＳ１の組合せとちょうど同じくらい、腫瘍成長を抑制するのに効果的であった。ＦＳ１８−２９／４４２０単独は、腫瘍成長に顕著な影響を及ぼすことなく、Ｓ１及びＣ９Ｂ７Ｗのどちらも、生じる腫瘍成長に穏やかな効果を生じた。
【図８】定着ＭＣ３８同系腫瘍モデルの腫瘍成長曲線を示す図である。ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２（FS18-29/S1）で処置されたマウスは、ベンチマークｍＡｂ、Ｃ９Ｂ７ＷとＳ１の組合せで処置されたマウスと類似した腫瘍容積を有した。Ｓ１又はＣ９Ｂ７Ｗ単独で処置されたマウスは、中間の腫瘍容積を示したが、ＬＡＧ−３／４４２０  ｍＡｂ２処置は、腫瘍成長に影響を及ぼさなかった。
【図９】非定着ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける２０日目の最終腫瘍重量を示す図である。ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２（FS18-29/S1及びFS18-35/S1）は、ベンチマーク抗体、Ｃ９Ｂ７ＷとＳ１の組合せより高い程度で腫瘍成長を抑制した。
【図１０】非定着ＣＴ２６同系腫瘍モデルの腫瘍成長曲線を示す図である。腫瘍成長を抑制することにおけるＦＳ１８−３５／Ｓ１対ＩｇＧ対照の統計的有意差が実証された。そのような統計的有意差は、ＩｇＧ対照群に対するベンチマーク抗体の組合せに関しては観察されなかった。
【図１１】ｍＡｂ２におけるＬＡＬＡ変異の腫瘍成長阻害への効果を比較するために用いられた非定着ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおける２２日目の最終腫瘍重量を示す図である。ＬＡＬＡ変異を含むｍＡｂ２で処置されたマウスとＬＡＬＡ変異を含まないｍＡｂ２で処置されたマウスの間に最終腫瘍重量に統計的有意差はなかった。
【図１２】ＬＡＬＡ変異を含むｍＡｂ２及びＬＡＬＡ変異を含まないｍＡｂ２の腫瘍成長阻害への効果を比較するために用いられた非定着ＭＣ３８同系腫瘍モデルの腫瘍成長曲線を示す図である。ＬＡＬＡ変異を含むｍＡｂ２で処置されたマウスとＬＡＬＡ変異を含まないｍＡｂ２で処置されたマウスの間に腫瘍成長曲線の統計的有意差はなかったが、ＬＡＬＡ変異を含有する分子による腫瘍成長阻害の増加への傾向があった。
【図１３】ｍＡｂ２処理のＴ細胞ＬＡＧ−３発現への効果を示す図である。ｍＡｂ２  ＦＳ１８−２９／Ｓ１、ＦＳ１８−２９／４４２０、Ｓ１、ＦＳ１８−２９／４４２０とＳ１、又は対照抗体４４２０で処理されたＣＤ８（A）、ＣＤ４（B）、及びＦｏｘＰ３（C）腫瘍浸潤リンパ球（TIL）上のＬＡＧ−３発現が、最後のｍＡｂ２／抗体投与後３日目及び７日目それぞれに対応する、腫瘍接種後１９日目及び２３日目において示されている。ＬＡＧ−３発現は、１９日目及び２３日目においてｍＡｂ２  ＦＳ１８−２９／Ｓ１での処理後に減少した。ＦＳ１８−２９／４４２０とＳ１の組合せを与えられた動物はＬＡＧ−３発現の減少も示したが、その効果は２３日目まで遅れ、一方、個々に投与されたＦＳ１８−２９／４４２０又はＳ１は、ＬＡＧ−３発現の減少をほとんど又は全く生じなかった。
【図１４】乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出ＣＤＣアッセイを用いる様々な抗体／ｍＡｂ２処理後のＰＤ−Ｌ１発現Ｒａｊｉ細胞及びＬＡＧ−３発現Ｒａｊｉ細胞の溶解のパーセンテージを示す図である。Ａ及びＢは、ＰＤ−Ｌ１発現Ｒａｊｉ細胞及びＬＡＧ−３発現Ｒａｊｉ細胞それぞれのＣＤＣ媒介性溶解を示す。細胞を、抗ＬＡＧ−３抗体  ２５Ｆ７、抗ＰＤ−Ｌ１抗体  ８４Ｇ０９、ＬＡＬＡ変異を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体８４Ｇ０９、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ、ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９、ＬＡＬＡ変異を含むｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９、又はＬＡＬＡ変異を含むリツキシマブとインキュベートした。ＬＤＨの放出を、ベビーウサギ補体での処理から４時間後、測定し、全溶解と比較したパーセンテージとして表した。抗体／ｍＡｂ２処理の濃度は、Ｘ軸に示されている。曲線に渡って比較することができるように全ての曲線の傾きについて共有値を設定した。
【図１５】フローサイトメトリに基づいたＣＤＣアッセイを用いた、様々な処理後の死んだＰＤ−Ｌ１発現Ｒａｊｉ細胞及び死んだＬＡＧ−３発現Ｒａｊｉ細胞のパーセンテージを示す図である。異なって蛍光標識されたＰＤ−Ｌ１発現細胞及びＬＡＧ−３発現細胞の混合物を、対照抗体４４２０、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（RIT）、抗ＬＡＧ−３抗体２５Ｆ７と抗ＰＤ−Ｌ１抗体８４Ｇ０９の組合せ、又はｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９とインキュベートした。その後、細胞を、ベビーウサギ補体で処理し、死細胞のみを染色する色素を用いて染色した。２つの細胞集団における死細胞のパーセンテージを、全細胞に占めるパーセンテージとして評価した。各処理後に評価された細胞型（示差的蛍光標識により同定されるＰＤ−Ｌ１発現性又はＬＡＧ−３発現性）は、図１５において、関連処理の名前の後に示されており、例えば、対照抗体４４２０での処理後のＰＤ−Ｌ１発現Ｒａｊｉ細胞の生存率の評価を指す、４４２０  ＰＤＬ１を参照されたい。抗体／ｍＡｂ２処理の濃度はＸ軸に示されている。
【図１６】乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出ＡＤＣＣアッセイを用いた、様々な処理後のＰＤ−Ｌ１発現Ｒａｊｉ細胞及びＬＡＧ−３発現Ｒａｊｉ細胞のパーセンテージ溶解（細胞傷害性）を示す図である。細胞を、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体８４Ｇ０９、ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９、ＬＡＬＡ変異を含むリツキシマブ、ＬＡＬＡ変異を含むｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９、抗ＬＡＧ−３抗体２５Ｆ７、ＬＡＬＡ変異を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体８４Ｇ０９、対照抗体４４２０、又はＬＡＬＡ変異を含む対照抗体４４２０で処理した。その後、処理された細胞を、初代ＮＫ細胞と同時インキュベートし、特異的ＬＤＨ放出を、標的細部の全溶解と比較したパーセンテージとして測定した。抗体／ｍＡｂ２処理の濃度は、Ｘ軸に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明は、ＰＤ−Ｌ１とＬＡＧ−３の両方と結合する抗体分子に関する。具体的には、本発明の抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位、及び抗体分子の定常ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含む。用語「ＰＤ−Ｌ１」及び「ＬＡＧ−３」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＬＡＧ−３、マウスＰＤ−Ｌ１及びマウスＬＡＧ−３、並びに／又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１及びカニクイザルＬＡＧ−３を指し得る。好ましくは、用語「ＰＤ−Ｌ１」及び「ＬＡＧ−３」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＬＡＧ−３を指す。
【００６８】
用語「抗体分子」は、天然であろうと、部分的又は全体的に合成されようと、免疫グロブリンを記載する。抗体分子は、ヒト又はヒト化型であり得る。抗体分子は、好ましくは、モノクローナル抗体分子である。抗体の例は、免疫グロブリンＧなどの免疫グロブリンアイソタイプ、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４などのそれらのアイソタイプのサブクラス、加えてそれらの断片である。
【００６９】
したがって、本明細書に用いられる場合、用語「抗体分子」は、抗体断片を含み、ただし、前記断片は、ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位、及び抗体分子の定常ドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメイン、好ましくはＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含むという条件である。したがって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書に用いられる場合、用語「抗体分子」は、「抗体分子又はその断片」と等価である。
【００７０】
モノクローナル抗体及び他の抗体を利用し、かつ組換えＤＮＡテクノロジーの技術を用いて、最初の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を作製することが可能である。そのような技術は、ＣＤＲ若しくは可変領域、及び／又はＬＡＧ−３抗原結合部位を提供する定常ドメイン配列を異なる免疫グロブリンへ導入することを含み得る。一つの免疫グロブリンのＣＤＲの別の免疫グロブリンへの導入は、例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８Ａ、又はＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されている。同様の技術が、関連の定常ドメイン配列に使用することができた。あるいは、抗体分子を産生するハイブリドーマ又は他の細胞は、遺伝子変異又は他の変化を受けやすくあり得、それは、産生する抗体の結合特異性を変化させる場合もあるし、変化させない場合もある。
【００７１】
抗体は、いくつかの方法で改変することができるため、用語「抗体分子」は、天然であろうと、全体的又は部分的合成であろうと、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体断片、抗体の誘導体、機能的等価物、及び相同体を網羅すると解釈されるべきである。したがって、別のポリペプチドと融合した、免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子、又は等価物が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４及びＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。
【００７２】
ＣＤＲ配列とＣＨ３ドメインの両方を含む抗体断片の例はミニボディであり、それは、ＣＨ３ドメインに連結したｓｃＦｖを含む（Huら（1996）、Cancer Res.、56（13）:3055-61）。
【００７３】
本発明の抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３と結合する。この関連における結合は、特異的結合を指し得る。用語「特異的」は、抗体分子が、それの特異的結合パートナー、ここではＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３、以外の分子とのいかなる有意な結合も示さないだろうという状況を指し得る。用語「特異的」はまた、抗体分子が、いくつかの抗原により所有される特定のエピトープ、例えば、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３上のエピトープに対して特異的である場合にも適用でき、その場合、抗体分子は、エピトープを所有する様々な抗原と結合することが可能になると予想される。
【００７４】
ＬＡＧ−３は、その最も密接に関連するタンパク質である、ＣＤ４と、４０％配列同一性を共有する。本発明者らは、配列番号１から３に示されるアミノ酸配列を含むＦＳ１８−７−９  ＦｃａｂをＣＤ４との結合について試験した。ＦＳ１８−７−９  Ｆｃａｂは、ＣＤ４との結合を示さず、この分子がＬＡＧ−３を特異的に結合することを実証した。したがって、好ましい実施形態において、本発明の抗体分子のＬＡＧ−３結合部位は、ＣＤ４と結合せず、又はＣＤ４とのいかなる有意な結合も示さない。
【００７５】
本発明の抗体分子は、好ましくは、ＬＡＧ−３抗原結合部位を含む。ＬＡＧ−３抗原結合部位は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、又はＣＨ４ドメインなどの抗体分子の定常ドメインに位置する。好ましくは、ＬＡＧ−３抗原結合部位は、抗体分子のＣＨ３ドメインに位置する。ＬＡＧ−３結合部位は、好ましくは、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）及びＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）を含む。これらの配列は、実施例に記載されているような広範なスクリーニング及び特徴付けのプログラム後に本発明者らにより同定されたリード抗ＬＡＧ−３  Ｆｃａｂクローンの全部に存在した。
【００７６】
配列番号１及び２に示されるアミノ酸配列は、好ましくは、抗体分子の定常ドメインの構造ループに位置する。新しい抗原結合部位を生じさせるための抗体定常ドメインの構造ループ領域への配列の導入は、例えば、ＷＯ２００６／０７２６２０及びＷＯ２００９／１３２８７６に記載されている。
【００７７】
抗体定常ドメインの構造ループは、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループを含む。ＣＨ３ドメインにおいて、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループは、ＣＨ３ドメインの残基１１から１８、４３から７８、及び９２から１０１に位置し、そのアミノ酸残基の番号付けはＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（IMGT）の番号付けスキームによる。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、好ましくは、定常ドメインのＡＢループに位置する。配列番号３に示されるアミノ酸配列は、好ましくは、定常ドメインのＥＦループに位置する。より好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインの残基１１から１８に位置し、及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインの残基９２から１０１に位置し、そのアミノ酸残基の番号付けはＩＭＧＴの番号付けスキームによる。
【００７８】
加えて、抗体分子は、好ましくは、抗体分子の定常ドメインの構造ループに、配列番号２、８、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、又は４８、より好ましくは、配列番号２、２８、又は３８、さらにより好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。構造ループは、好ましくは、ＣＤループであり、定常ドメインは、好ましくは、ＣＨ３ドメインである。配列番号２、８、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、又は４８に示されるアミノ酸配列は、好ましくは、ＣＨ３ドメインの残基４３から７８に位置し、そのアミノ酸残基の番号付けはＩＭＧＴの番号付けスキームによる。
【００７９】
本発明の抗体分子は、（図１Ａに示されているように）ＣＨ３ドメインの位置３６にグルタミン酸残基（E）及び／又は位置８５．２にチロシン残基（Y）をさらに含み得、そのアミノ酸残基の番号付けはＩＭＧＴの番号付けスキームによる。特に、配列番号８に示されるＣＤ構造ループ領域を含む抗体分子は、好ましくは、ＣＨ３ドメインの位置３６にグルタミン酸残基（E）をさらに含む。同様に、配列番号１８に示されるＣＤ構造ループ領域を含む抗体分子は、好ましくは、ＣＨ３ドメインの位置８５．２にチロシン残基（Y）をさらに含む。
【００８０】
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０に示される配列を含み、有し、又はそれからなるＣＨ３ドメイン、好ましくは、配列番号５、３０、又は４０に示される配列を有するＣＨ３ドメイン、より好ましくは、配列番号５に示される配列を有するＣＨ３ドメインを含む。
【００８１】
本発明の抗体分子は、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０に示される配列を含み、有し、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含み得、ＣＨ３ドメイン配列は、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０に示される配列のＣ末端側すぐにリジン残基（K）をさらに含む。したがって、例えば、本発明の抗体分子は、配列番号５に示される配列を含み、有し、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含み得、配列番号５に示される配列のＣ末端にリジン残基を有する。その場合、そのようなＣＨ３ドメインの配列は以下の通りである：
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１３５）
【００８２】
加えて、本発明の抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４分子のＣＨ２ドメインなどの免疫グロブリンＧ分子のＣＨ２ドメインを含み得る。好ましくは、本発明の抗体分子は、ＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインは、配列番号５３に示される配列を有し得る。
【００８３】
抗体分子のＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩなどの１つ若しくは複数のＦｃγ受容体及び／又は補体とのＣＨ２ドメインの結合を低下させ、又は抑止するための変異を含み得る。ヒトＩｇＧドメインのＣＨ２ドメインは、通常、Ｆｃγ受容体及び補体と結合し、本発明者らは、Ｆｃγ受容体との結合の低下が、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）を低下させ、補体との結合の低下が、抗体分子の補体依存性細胞傷害（CDC）活性を低下させるだろうと推論する。１つ又は複数のＦｃγ受容体及び補体へのＣＨ２ドメインの結合を低下させ、又は抑止するための変異は、公知であり、Ｂｒｕｈｎｓら（２００９）及びＸｕら（２０００）に記載された「ＬＡＬＡ変異」を含む。したがって、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み得、ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの位置４及び５にアラニン残基を含み、その番号付けは、ＩＭＧＴの番号付けスキームによる。例えば、抗体分子は、配列番号５４に示される配列を含み、有し、又はそれからなるＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む。
【００８４】
本発明による抗体分子は、ＣＤＲに基づいたＰＤ−Ｌ１に対する抗原結合部位を含む。用語「ＣＤＲに基づいた抗原結合部位」は、６個のＣＤＲで構成される抗体分子可変領域の抗原結合部位を指す。ＰＤ−Ｌ１に対する抗体分子の調製、及びそのような抗体分子のＣＤＲ配列の決定は、十分、当業者の能力の範囲内であり、多くの適切な技術が当技術分野において公知である。
【００８５】
好ましくは、本発明の抗体分子は、抗体８４Ｇ０９のＨＣＤＲ３を含む。ＨＣＤＲ３は、抗体分子の特異性を決定することにおいて役割を果たすことが公知である（Segalら、 （1974）、PNAS, 71:4298-4302; Amitら、（1986）、Science、233:747-753; Chothiaら、（1987）、J. Mol. Biol.、196:901-917; Chothiaら、（1989）、Nature、342:877-883; Catonら、（1990）、J. Immunol.、144:1965-1968; Sharonら、（1990a）、PNAS、87:4814-4817; Sharonら、（1990b）、J. Immunol.、144:4863-4869; Kabatら、（1991b）、J. Immunol., 147:1709-1719）。
【００８６】
抗体分子は、抗体８４Ｇ０９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３をさらに含み得る。配列番号９２及び９３それぞれに示される、抗体８４Ｇ０９のＶＨドメイン配列及びＶＬドメイン配列由来のＣＤＲの配列を決定することに当業者は何の困難もないだろう。ＣＤＲ配列は、例えば、Ｋａｂａｔ（Kabat, E.A.ら、（1991））又はＩＭＧＴ番号付けスキームにより決定され得る。
【００８７】
ＩＭＧＴ番号付けスキームによる抗体８４Ｇ０９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列は、それぞれ、配列番号８６、８７、８８、８９、９０、及び９１に示されている。
【００８８】
Ｋａｂａｔによる抗体８４Ｇ０９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列は、それぞれ、配列番号１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、及び１４１に示されている。
【００８９】
抗体はまた、抗体８４Ｇ０９のＶＨ及び／又はＶＬドメインを含み得る。抗体８４Ｇ０９のＶＨドメイン配列及びＶＬドメイン配列は、それぞれ、配列番号９２及び９３に示されている。
【００９０】
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、（i）抗体８４Ｇ０９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む、ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位、並びに（ii）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含み、ＬＡＧ−３結合部位が、配列番号１及び３に示されるアミノ酸配列、並びに配列番号２、８、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９１】
より好ましくは、本発明の抗体分子は、（i）抗体８４Ｇ０９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む、ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位、並びに（ii）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含み、ＬＡＧ−３結合部位が、配列番号１及び３に示されるアミノ酸配列、並びに配列番号２、２８、及び３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９２】
さらにより好ましくは、本発明の抗体分子は、（i）抗体８４Ｇ０９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む、ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位、並びに（ii）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含み、ＬＡＧ−３結合部位が、配列番号１、２、及び３に示されるアミノ酸配列を含む。
【００９３】
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号９２及び９３それぞれに示される配列を含み、有し、又はそれからなるＶＨドメイン及びＶＬドメイン、並びに、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０に示される配列を含み、有し、又はそれからなるＣＨ３ドメイン、好ましくは、配列番号５、３０、又は４０に示される配列を含み、有し、又はそれからなるＣＨ３ドメイン、より好ましくは、配列番号５に示される配列を含み、有し、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含む。
【００９４】
さらなる好ましい実施形態において、抗体分子は、配列番号９４から１１３に示される配列を含み、有し、又はそれからなる重鎖、及び配列番号１１６に示される配列を含み、有し、又はそれからなる軽鎖を含む。より好ましくは、抗体分子は、配列番号９４、９５、１０４、１０５、１０８、及び１０９に示される配列を含み、有し、又はそれからなる重鎖、並びに配列番号１１６に示される配列を含み、有し、又はそれからなる軽鎖を含む。最も好ましくは、抗体分子は、配列番号９４又は９５に示される配列を含み、有し、又はそれからなる重鎖、及び配列番号１１６に示される配列を含み、有し、又はそれからなる軽鎖を含む。
【００９５】
本発明の抗体分子はまた、軽鎖配列及び重鎖配列のＶＬドメイン及びＶＨドメインがそれぞれ変化しないままであるという条件で、本明細書に開示された構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、軽鎖、又は重鎖の配列のバリアントを含み得る。適切なバリアントは、配列変化又は変異の方法、及びスクリーニングを用いて得ることができる。好ましい実施形態において、１つ又は複数のバリアント配列を含む抗体分子は、ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１に対する結合特異性及び／又は結合親和性などの、親の抗体分子の機能的特性の１つ又は複数を保持する。例えば、１つ又は複数のバリアント配列を含む抗体分子は、好ましくは、（親の）抗体分子と同じ親和性、又はそれより高い親和性で、ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１と結合する。親の抗体分子は、バリアント抗体分子へ組み込まれているアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を含まない抗体分子である。
【００９６】
例えば、本発明の抗体分子は、軽鎖配列及び重鎖配列のＶＬドメイン及びＶＨドメインがそれぞれ変化しないままであるという条件で、本明細書に開示された構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、軽鎖、又は重鎖の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％配列同一性を有する構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、軽鎖、又は重鎖の配列を含み得る。
【００９７】
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号４、５、又は１３５に示されるＣＨ３ドメイン配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％配列同一性を有するＣＨ３ドメイン配列を含む。
【００９８】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号６又は７に示されるＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％配列同一性を有する、ＣＨ３及びＣＨ２ドメイン配列を含む。
【００９９】
配列同一性は、一般的に、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin GCGパッケージ、Accelerys Inc、San Diego USA）を参照して定義される。ＧＡＰは、２つの完全な配列をアラインメントするために、マッチの数を最大限にし、かつギャップの数を最小限にするＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いる。一般的に、ギャップ生成ペナルティー＝１２及びギャップ伸長ペナルティー＝４を有するデフォルトパラメータが用いられる。ＧＡＰの使用は好ましくあり得るが、他のアルゴリズムが用いられてもよく、例えば、一般的にデフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴ（Altschulら、（1990）J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を用いる）、ＦＡＳＴＡ（Pearson及びLipman （1988）PNAS USA 85: 2444-2448の方法を用いる）、又はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Smith及びWaterman（1981）J. Mol Biol. 147: 195-197）、又はＡｌｔｓｃｈｕｌら（1990）上記のＴＢＬＡＳＴＮプログラムである。特に、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Nucl. Acids Res.（1997）25 3389-3402）が用いられ得る。
【０１００】
本発明の抗体分子は、軽鎖配列及び重鎖配列のＶＬドメイン及びＶＨドメインがそれぞれ変化しないままであるという条件で、本明細書に開示された構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、軽鎖、又は重鎖の配列と比較して、１個又は複数のアミノ酸配列変化（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、及び／又は挿入）、好ましくは、２０個若しくはそれ未満の変化、１５個若しくはそれ未満の変化、１０個若しくはそれ未満の変化、５個若しくはそれ未満の変化、４個若しくはそれ未満の変化、３個若しくはそれ未満の変化、２個若しくはそれ未満の変化、又は１個の変化を有する構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、軽鎖、又は重鎖の配列も含み得る。特に、ＶＨ及びＶＬドメイン配列以外の、抗体分子の１つ又は複数のフレームワーク領域に変化が生じ得る。
【０１０１】
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号４、５、又は１３５に示されるＣＨ３ドメイン配列と比較して、１個又は複数のアミノ酸配列変化（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、及び／又は挿入）、好ましくは、２０個若しくはそれ未満の変化、１５個若しくはそれ未満の変化、１０個若しくはそれ未満の変化、５個若しくはそれ未満の変化、４個若しくはそれ未満の変化、３個若しくはそれ未満の変化、２個若しくはそれ未満の変化、又は１個の変化を有するＣＨ３ドメイン配列を含み得る。
【０１０２】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号６又は７に示されるＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列と比較して、１個又は複数のアミノ酸配列変化（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、及び／又は挿入）、好ましくは、２０個若しくはそれ未満の変化、１５個若しくはそれ未満の変化、１０個若しくはそれ未満の変化、５個若しくはそれ未満の変化、４個若しくはそれ未満の変化、３個若しくはそれ未満の変化、２個若しくはそれ未満の変化、又は１個の変化を有するＣＨ３及びＣＨ２ドメイン配列を含む。
【０１０３】
ＬＡＧ−３及び／若しくはＰＤ−Ｌ１との結合において本発明の抗体分子と競合し、又はＬＡＧ−３及び／若しくはＰＤ−Ｌ１上の、本発明の抗体分子と同じエピトープと結合する抗体分子であって、ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位と、抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位の両方を含む、抗体分子も企図される。２つの抗体による抗原における競合を決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、２つの抗体による抗原との結合の競合は、ＢＩＡｃｏｒｅを用いて決定することができる。抗体により結合されたエピトープをマッピングするための方法は、同様に、当技術分野において公知である。
【０１０４】
本発明の抗体分子は、好ましくは、１×１０−９Ｍの親和性（KD）又はそれより高い親和性で、ＬＡＧ−３と結合する。例えば、本発明の抗体分子は、８×１０−１０Ｍの親和性（KD）又はそれより高い親和性で、ＬＡＧ−３と結合し得る。
【０１０５】
Ｆｃａｂの結合部位は、極めて近接して位置する２つの結合部位を有する相対的にコンパクトな抗体断片を形成するため、Ｆｃａｂはモノクローナル抗体より小さい結合界面を有する。対照的に、典型的なｍＡｂのＦａｂアームは、可動性ヒンジ領域により隔てられている。Ｆｃａｂの２つの抗原結合部位はまた、典型的なｍＡｂのそれらと比較した場合、お互いに空間的に近接している。このより小さい結合界面及び２つの結合部位の可動性の低減に基づけば、抗ＬＡＧ−３  Ｆｃａｂが、モノクローナル抗体ベンチマークと類似した親和性及び作用強度でＬＡＧ−３と結合し、かつそれを阻害することができることは驚くべきことであった。
【０１０６】
本発明の抗体分子は、好ましくは、１×１０−９Ｍの親和性（KD）、又はそれより高い親和性で、ＰＤ−Ｌ１と結合する。
【０１０７】
ＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１などの同族抗原との抗体分子の結合親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴法（SPR）により決定することができる。細胞表面上に発現したＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１などの同族抗原との抗体分子の結合親和性は、フローサイトメトリにより決定することができる。
【０１０８】
本発明の抗体分子は、好ましくは、細胞の表面上に発現したＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１と結合する能力がある。その細胞は、好ましくは、がん細胞である。
【０１０９】
本発明の抗体分子は、好ましくは、ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１と同時に結合する能力がある。好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１と同時に結合する能力があり、ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１が、単一細胞の表面上、又は２つの異なる細胞の表面上に発現している。
【０１１０】
本発明の抗体分子は、ヒトＬＡＧ−３、マウスＬＡＧ−３、及び／又はカニクイザルＬＡＧ−３と結合し得る。好ましくは、本発明の抗体分子は、ヒトＬＡＧ−３と結合する。最も好ましくは、本発明の抗体分子は、ヒトＬＡＧ−３及びヒトＰＤ−Ｌ１と結合する。
【０１１１】
本発明の抗体分子は、（i）ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位、及び（ii）抗体分子の定常ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含む。したがって、抗体分子の、ＣＨ３ドメインなどの定常ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含まない抗体分子は、本発明の一部を形成することはない。同様に、ＰＤ−Ｌ１に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位を含まない分子は、本発明の一部を形成することはない。
【０１１２】
本発明の抗体分子は、治療剤又は検出可能な標識とコンジュゲートされ得る。この場合、抗体分子は、コンジュゲートと呼ばれ得る。例えば、抗体分子は、免疫系調節物質、細胞傷害性分子、放射性同位元素、又は検出可能な標識とコンジュゲートされ得る。免疫系調節物質又は細胞傷害性分子はサイトカインであり得る。検出可能なマーカーは、放射性同位元素、例えば、非治療的放射性同位元素であり得る。
【０１１３】
抗体分子は、ペプチド結合又はリンカーを用いて、治療剤又は検出可能な標識とコンジュゲートされ得、すなわち、融合ポリペプチド内に、前記治療剤又は検出可能な標識、及び抗体分子又はそのポリペプチド鎖コンポーネントを含む。コンジュゲーションのための他の手段には、化学的コンジュゲーション、特に、二機能性試薬を用いる（例えば、DOUBLE-REAGENTS（商標）架橋試薬選択ガイド（Cross-linking Reagents Selection Guide）、Pierceを使用する）架橋が挙げられる。
【０１１４】
したがって、抗体分子及び治療剤又は検出可能な標識は、お互いに直接的に、例えば、任意の適切な化学結合を通して、又はリンカー、例えば、ペプチドリンカーを通して、接続され得る。
【０１１５】
ペプチドリンカーは、短くあり得る（アミノ酸の２から２０個、好ましくは２から１５個の残基ひと続き）。ペプチドリンカー配列の適切な例は当技術分野において公知である。１つ又は複数の異なるリンカーが用いられ得る。リンカーは、約５アミノ酸長であり得る。
【０１１６】
化学結合は、例えば、共有結合又はイオン結合であり得る。共有結合の例には、ペプチド結合（アミド結合）及びジスルフィド結合が挙げられる。例えば、抗体分子と治療剤又は診断剤は、共有結合的に連結され得る。例えば、ペプチド結合（アミド結合）による。したがって、抗体分子及び治療剤又は診断剤は、単一鎖ポリペプチドとして産生（分泌）され得る。
【０１１７】
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。当業者は、当技術分野で周知の方法を用いて、そのような核酸を調製することに困難もないだろう。単離された核酸は、本発明の抗体分子を、例えば、細菌、酵母、昆虫、又は哺乳類の宿主細胞における発現により発現するのに用いられ得る。好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ、又はＮＳ０細胞などの哺乳類細胞である。核酸は、一般的に、発現のための組換えベクターの形をとって提供される。
【０１１８】
単離された核酸は、例えば、ＦＳ１８−７−９（ＣＨＯコドン最適化ヌクレオチド配列）、ＦＳ１８−７−９（ＨＥＫ２９３発現型ヌクレオチド配列）、ＦＳ１８−７−３２、ＦＳ１８−７−３３、ＦＳ１８−７−３６、ＦＳ１８−７−５８、ＦＳ１８−７−６２、ＦＳ１８−７−６５、ＦＳ１８−７−７８、ＦＳ１８−７−８８、及びＦＳ１８−７−９５のＣＨ３ドメイン、それぞれをコードする配列番号１４２、４、９、１４、１９、２４、２９、３４、３９、４４、又は４９に示される配列を含み得る。
【０１１９】
そのような核酸及びベクターを含むインビトロ宿主細胞は、本発明の抗体分子を発現するためのそれらの使用であるように、本発明の一部であり、その後、その抗体分子は、細胞培養から精製され、任意選択により薬学的組成物へ製剤化され得る。したがって、本発明は、本発明の組換え宿主細胞を抗体分子の産生のための条件下で培養する工程を含む、本発明の抗体分子を産生する方法をさらに提供する。上記で言及されているような適切な宿主細胞を培養するための方法は、当技術分野において周知である。方法は、抗体分子を単離及び／又は精製する工程をさらに含み得る。方法はまた、抗体分子を、任意選択により薬学的に許容される賦形剤又は下記のような他の物質と共に、薬学的組成物へ製剤化する工程を含み得る。
【０１２０】
ＰＤ−Ｌ１は、多くのがん細胞上に発現していることが公知であるが、がん細胞上のＬＡＧ−３の発現はより限られている。どちらも、免疫系の細胞上に発現している。特に、ＬＡＧ−３は、腫瘍環境内の疲弊したＴ細胞上に発現していることが公知である。加えて、本発明者らは、ＬＡＧ−３とＰＤ−Ｌ１の両方と結合する抗体分子の使用が、がんの同系マウスモデルにおいて腫瘍成長を抑制することに効果的であること、並びにそのような抗体分子が、ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１それぞれに結合する２つの結合分子の投与より効果的であることを示している。
【０１２１】
したがって、本発明の抗体分子は、患者においてがんを処置する方法に用いられ得る。患者は、好ましくは、ヒト患者である。
【０１２２】
本発明の抗体分子を用いて処置されるがんの細胞は、例えばそれらの細胞表面上に、ＬＡＧ−３を発現し得る。一実施形態において、処置されるがんの細胞は、例えばそれらの細胞表面上に、ＬＡＧ−３を発現することが決定されている場合がある。例えば、Ｂ細胞リンパ腫は、それらの細胞表面上にＬＡＧ−３を発現することが示されている。細胞表面上での抗原の発現を決定するための方法は、当技術分野において公知であり、それには、例えば、フローサイトメトリが挙げられる。
【０１２３】
下記の実施例４は、本発明の抗体分子が、マウスにおいて、ＬＡＧ−３発現ＴＩＬなどの、高レベルのＬＡＧ−３発現免疫細胞を有する腫瘍を処置するために用いることができることを示している。したがって、加えて、又は代替として、本発明の抗体分子を用いて処置されるがんの腫瘍は、ＬＡＧ−３発現免疫細胞を含み得る。ＬＡＧ−３発現ＴＩＬなどのＬＡＧ−３発現免疫細胞は、多くのがんにおける腫瘍細胞の間に存在する。一実施形態において、本発明の抗体分子を用いて処置されるがんの腫瘍は、ＬＡＧ−３発現免疫細胞を含有することが決定されている。腫瘍において、又は腫瘍の周辺において、ＬＡＧ−３発現免疫細胞の存在を決定するための方法は、当技術分野において公知である。
【０１２４】
下記の実施例４は、本発明の抗体分子が、ＰＤ−Ｌ１を細胞表面上に発現する腫瘍を処置するために用いられ得ることも示す。したがって、加えて、又は代替として、本発明の抗体分子を用いて処置されるがんの細胞は、例えばそれらの細胞表面上に、ＰＤ−Ｌ１を発現し得る。加えて、又は代替として、処置されるがんの腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１を発現する、ＴＩＬなどの免疫細胞を含み得る。処置されるがんの細胞は、例えばそれらの細胞表面上に、ＰＤ−Ｌ１を発現することが決定されている場合がある。加えて、又は代替として、処置されるがんの腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１を発現する、ＴＩＬなどの免疫細胞を含有することが決定されている場合がある。
【０１２５】
ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１の細胞表面発現は、抗体分子が、免疫細胞及び／又はがん細胞の表面上に発現したＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１と結合するのを可能にすることが予想される。これは、指向型治療、がん細胞と免疫細胞の橋渡し、及び局在化を生じると考えられる。
【０１２６】
本発明の抗体分子を用いて処置されるがんは、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、緩徐進行性非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫）、卵巣がん、前立腺がん、結腸直腸がん、線維肉腫、腎細胞癌、メラノーマ、膵がん、乳がん、多形神経膠芽腫、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、頭頚部がん（例えば、頭頚部扁平上皮癌）、胃がん（stomach cancer）（胃がん（gastric cancer））、膀胱がん、子宮頚がん、子宮がん、外陰がん、精巣がん、陰茎がん、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、又は慢性リンパ芽球性白血病）、多発性骨髄腫、扁平上皮がん、精巣がん、食道がん（例えば、食道胃接合部の腺癌）、カポジ肉腫、及び中枢神経系（CNS）リンパ腫、肝細胞癌、上咽頭がん、メルケル細胞癌、及び中皮腫からなる群から選択され得る。これらのがんの腫瘍は、それらの細胞表面上にＰＤ−Ｌ１を発現し、並びに／又はＰＤ−Ｌ１及び／若しくはＬＡＧ−３を発現するＴＩＬなどの免疫細胞を含有することが知られ、又は予想される。
【０１２７】
抗ＬＡＧ−３抗体を用いる、腎細胞癌、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、上咽頭がん、結腸直腸がん、メラノーマ、胃がん（stomach cancer）（胃がん（gastric cancer））、食道がん（例えば、食道胃接合部の腺癌）、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、頭頚部がん（例えば、頭頚部扁平上皮癌）、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、緩徐進行性非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫）、及び多発性骨髄腫の処置は、臨床試験において調べられており、有望な結果が示されている。したがって、本発明の抗体分子を用いて処置されるがんは、腎細胞癌、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、上咽頭がん、結腸直腸がん、メラノーマ、胃がん（stomach cancer）（胃がん（gastric cancer））、食道がん（例えば、食道胃接合部の腺癌）、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、頭頚部がん（例えば、頭頚部扁平上皮癌）、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、緩徐進行性非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫）、又は多発性骨髄腫であり得る。
【０１２８】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いる、メラノーマ、結腸直腸がん、乳がん、膀胱がん、腎細胞癌、膀胱がん、胃がん、頭頚部がん（例えば、頭頚部扁平上皮癌）、中皮腫、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、卵巣がん、メルケル細胞癌、膵がん、メラノーマ、及び肝細胞癌の処置もまた、臨床試験で調べられて、有望な結果が示されている。したがって、本発明の抗体分子を用いて処置されるがんは、メラノーマ、結腸直腸がん、乳がん、膀胱がん、腎細胞癌、膀胱がん、胃がん、頭頚部がん（例えば、頭頚部扁平上皮癌）、中皮腫、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、卵巣がん、メルケル細胞癌、膵がん、メラノーマ、又は肝細胞癌であり得る。
【０１２９】
本発明の抗体分子を用いる処置についての好ましいがんは、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、膀胱がん、頭頚部がん（頭頚部の扁平上皮癌）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、胃がん（gastric cancer）、膵がん、及び肝細胞癌である。これらのがんの腫瘍は、ＬＡＧ−３発現免疫細胞を含むこと、及びそれらの細胞表面上にＰＤ−Ｌ１を発現するか、又はＰＤ−Ｌ１を発現する免疫細胞を含むかのいずれかであることがわかっている。
【０１３０】
適用が、乳がんなどの特定の型のがんを指す場合、これは、関連組織、この場合、乳房組織の悪性形質転換を指す。異なる組織、例えば卵巣組織の悪性形質転換が起源であるがんは、乳房などの身体の別の場所において転移性病変を生じ得るが、それにより、本明細書で言及されているような乳がんではなく、卵巣がんである。
【０１３１】
がんは原発性又は続発性がんであり得る。したがって、本発明の抗体分子は、患者においてがんを処置する方法に用いられ得、そのがんは原発性腫瘍及び／又は腫瘍転移である。
【０１３２】
本発明の抗体分子は、患者、好ましくはヒト患者の処置の方法に用いられるように設計される。抗体分子は、通常、薬学的組成物の形で投与され、その薬学的組成物は、抗体分子に加えて、薬学的に許容される賦形剤などの少なくとも１つのコンポーネントを含み得る。例えば、本発明の薬学的組成物は、活性成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤、又は当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような材料は、無毒であるべきであり、かつ活性成分の効力に干渉すべきではない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、その投与経路は、注射、例えば、静脈内又は皮下注射により得る。抗体分子は、静脈内に、又は皮下に投与され得る。
【０１３３】
液体薬学的組成物は、一般的に、水、石油、動物油又は植物油、ミネラルオイル又は合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロース若しくは他の糖類溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれ得る。
【０１３４】
静脈内注射、又は苦痛の部位における注射について、抗体分子、又は抗体分子を含む薬学的組成物は、好ましくは、発熱物質を含まず、かつ適切なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形をとる。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性媒体を用いて適切な溶液を調製する能力が十分、ある。必要に応じて、保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤が使用され得る。薬学的製剤の調製のための多くの方法は当業者に公知である。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照。
【０１３５】
本発明による抗体分子を含む組成物は、処置される状態に依存して、単独で、又は他の処置と組み合わせて、同時に若しくは逐次的に、又は別の治療剤との混合調製物として、投与され得る。例えば、本発明の抗体分子は、処置される疾患、例えば、上記で言及されているようながんについての既存の治療剤と組み合わせて、投与され得る。例えば、本発明の抗体分子は、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種（がんワクチン接種とも呼ばれる）、放射線治療、免疫療法、腫瘍退縮ウイルス、キメラ抗原受容体（CAR）Ｔ細胞治療、又はホルモン治療などの第２の抗がん治療と組み合わせて、患者に投与され得る。
【０１３６】
本発明の抗体分子が、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種、又は放射線治療などの抗がん治療におけるアジュバントとして働き得ることが予想される。理論に縛られるつもりはないが、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種、又は放射線治療の一部としての抗体分子の患者への投与は、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種、又は放射線治療の単独で達成されるものより大きい、がん関連抗原ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１に対する免疫応答を引き起こすだろうことが考えられる。例えば、抗ＬＡＧ−３治療は、マウスにおいて、ウイルスに基づいた病態を処置することに良い効力を示している（Blackburn SDら、2009）。
【０１３７】
したがって、患者においてがんを処置する方法は、化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射線核種、免疫療法剤、腫瘍退縮ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン治療のための作用物質と組み合わせて、本発明による抗体分子の治療的有効量を患者に投与する工程を含み得る。化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射線核種、免疫療法剤、腫瘍退縮ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン治療のための作用物質は、好ましくは、問題になっているがんについての化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射線核種、免疫療法剤、腫瘍退縮ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン治療のための作用物質、すなわち、問題になっているがんの処置において有効であると示されている化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射線核種、免疫療法剤、腫瘍退縮ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン治療のための作用物質である。問題になっているがんについて有効であると示されている適切な化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射線核種、免疫療法剤、腫瘍退縮ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン治療のための作用物質の選択は、十分、当業者の能力の範囲内である。
【０１３８】
例えば、方法が、化学療法剤と組み合わせて、本発明による抗体分子の治療的有効量を患者に投与する工程を含む場合、化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ＿ＲＡＦ酵素阻害剤、アルキル化剤、白金類似体、ヌクレオシド類似体、サリドマイド誘導体、抗悪性腫瘍性化学療法剤その他からなる群から。タキサンには、ドセタキセル、パクリタキセル及びｎａｂ−パクリタキセルが挙げられる；細胞傷害性抗生物質には、アクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、及びバルルビシンが挙げられる；チロシンキナーゼ阻害剤には、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コビメチニブ（cobemitinib）、及びトラメチニブが挙げられる；ＰＡＲＰ阻害剤には、ニラパリブ（piraparib）が挙げられる；Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤には、ベムラフェニブ及びダブラフェニブが挙げられる；アルキル化剤には、ダカルバジン、シクロホスファミド、テモゾロミドが挙げられる；白金類似体には、カルボプラチン、シスプラチン、及びオキサリプラチンが挙げられる；ヌクレオシド類似体には、ゲムシタビン及びアザシチジンが挙げられる；抗悪性腫瘍剤には、フルダラビンが挙げられる。本発明における使用に適した他の化学療法剤には、メトトレキセート、デファクチニブ、エンチノスタット、ペメトレキセド、カペシタビン、エリブリン、イリノテカン、フルオロウラシル、及びビンブラスチンが挙げられる。
【０１３９】
がんの処置のためのワクチン接種ストラテジーは、診療所で実行されており、かつ科学文献（例えば、Rosenberg, S. 2000 Development of Cancer Vaccines）内で詳細に論じられている。これは、主に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）有り又は無しのどちらの場合にしても、ワクチン接種の方法として、自己又は同種異系のがん細胞を用いることにより、免疫系を促して、その自己又は同種異系のがん細胞により発現する様々な細胞マーカーに対して応答させるためのストラテジーを含む。ＧＭ−ＣＳＦは、抗原提示において強い応答を誘発し、前記ストラテジーと共に使用される場合、特によく働く。
【０１４０】
投与は、「治療的有効量」であり得、これは、患者に利益を示すのに十分である。そのような利益は、少なくとも１つの症状の寛解で少なくともあり得る。したがって、特定化された疾患の「処置」は、少なくとも１つの症状の寛解を指す。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、処置されることになっているものの性質及び重症度、処置されることになっている特定の患者、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達の部位、抗体分子の型、投与方法、投与のスケジューリング、並びに医師に知られた他の因子に依存する。処置の処方、例えば、投与量の決定などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度及び／又は処置されることになっている疾患の進行に依存し得る。抗体分子の適切な用量は、当技術分野において周知である（Ledermannら（1991）Int. J. Cancer 47: 659-664; 及びBagshaweら（1991）Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922）。本明細書中、又は投与されることになっている抗体分子に適切である場合にはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（2003）に示された特定の投与量が用いられ得る。抗体分子の治療的有効量又は適切な用量は、そのインビトロ活性と動物モデルにおけるインビボ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の試験動物における有効な投与量のヒトへの外挿のための方法は公知である。正確な用量は、処置される領域のサイズ及び位置や、抗体分子の正確な性質などの数々の要因に依存する。処置は、毎日、週２回、毎週、又は毎月の間隔で、医師の裁量で繰り返される場合がある。処置は、手術の前及び／又は後に与えられる場合があり、外科的処置の解剖学的部位に直接、投与又は適用され得る。
【０１４１】
本発明のさらなる態様及び実施形態は、以下の実験的例証を含む本開示を考慮すれば、当業者に明らかであろう。
【０１４２】
本明細書で言及された全ての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１４３】
本明細書に用いられる場合、「及び／又は」は、その他のものの有無に関わらず、その２つの特定された特徴又はコンポーネントのそれぞれの特定の開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、ちょうどあたかもそれぞれが本明細書に個々に示されているかのように、（i）Ａ、（ii）Ｂ、及び（iii）ＡとＢのそれぞれの特定の開示として解釈されるべきである。
【０１４４】
文脈が他に指示しない限り、上記で示された特徴の記載及び定義は、本発明のいかなる特定の態様又は実施形態にも限定されず、記載されている全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
【０１４５】
以下、本発明のある特定の態様及び実施形態を、例として、上記の図を参照して例証する。
【実施例】
【０１４６】
実施例１
Ｆｃａｂ分子の選択及び特徴付け
１．１  抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂのナイーブ選択及び親和性成熟
１．１．１  ナイーブ選択
ＡＢ（残基１４から１８）及びＥＦ（残基９２から１０１）ループ内にランダム化を有するヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン（IMGTの番号付け１．４から１３０）を示すナイーブファージライブラリーを、組換えＦｃタグ付きヒトＬＡＧ−３（LAG-3 Fc）抗原（R&D systems、2319-L3-050）での選択に用いた。ライブラリーを、プロテインＡ（Life Technologies、10002D）又はプロテインＧ（Life Technologies、10004D）ビーズ上に捕獲された抗原を用いて３ラウンドで選択した。そのアウトプットをＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、陽性結合剤をサブクローニングし、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔピキア発現キット（Life Technologies、K1740-01）を用いてピキア・パストリス（Pichia pastoris）において、可溶性Ｆｃａｂ（短縮型ヒンジを含有する）として発現させた。その後、Ｆｃａｂを、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００（GE Healthcare）において組換えヒトＬＡＧ−３  Ｆｃとの結合についてスクリーニングした。簡単に述べれば、ＬＡＧ−３  Ｆｃ（R&D systems、2319-L3-050）を、７２００ＲＵの密度で、アミンカップリング（GE Healthcare、BR-1000-50）を用いて、ＣＭ５チップ（GE Healthcare、BR-100012）にカップリングさせた。Ｆｃａｂを、ＨＢＳ−Ｐ（GE Healthcare、BR100368）バッファー中に希釈し、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、及び１０００ｎＭで３分間、注入し、その後、５分間、バッファー中で解離させた。参照を引いたデータ（LAG-3 Fcフローセル２−ブランクフローセル）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．２ソフトウェアを用いて分析して、結合を同定した。その後、Ｆｃａｂを、ＨＥＫ細胞に発現したヒトＬＡＧ−３（pcDNA5FRTベクター［Life Technologies、V6010-20］にクローニングされたLAG-3）との結合について試験した（方法論についてセクション1.4.5を参照）。簡単に述べれば、１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）、及び１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中で成長した、ヒトＬＡＧ−３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、細胞解離バッファー（Life Technologies、13151-014）を用いて組織培養フラスコから剥離し、細胞２×１０５個／ウェルでＶ底９６ウェルプレート中に播種した。Ｆｃａｂを、１００μｌ体積中、５μＭの細胞と、４℃で１時間、インキュベートした。そのプレートを洗浄し、二次抗体（抗ヒトFc-488、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）をＰＢＳ中１：１０００希釈し、１００μｌを細胞へ加え、４℃で３０分間、インキュベートした。そのプレートを洗浄し、細胞を、１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Biotium、40043）を含有するＰＢＳ  １００μｌ中に再懸濁した。そのプレートを、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター（BD Biosciences）において読み取り、データを、ＦｌｏｗＪｏＸを用いて分析した。その後、Ｆｃａｂを、リポフェクタミン（Life Technologies、11668-019）を用いるＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ２９３細胞（Life Technologies、R780-07）への形質転換により、哺乳類細胞内に発現させた。ＬＡＧ−３結合性Ｆｃａｂを、Ａ３７５細胞（ATCC、CRL-1619）上のヒトＭＨＣクラスＩＩの組換えＬＡＧ−３  Ｆｃとの結合の阻害について（実施例1.6における方法論を用いて）試験した。３��ウンドのファージ選択から５４個の固有のＦｃａｂ配列が同定され、これらのＦｃａｂのうちの１２個が、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によりＬＡＧ−３  Ｆｃと結合し、及び／又はＬＡＧ−３発現ＨＥＫ細胞と結合することが決定された。選択されたＦｃａｂのうちの３個はまた、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩとの相互作用を阻害することができ、親和性成熟のために選択された。その３つのＦｃａｂは、ＦＳ１８−３、ＦＳ１８−７、及びＦＳ１８−２１と名付けられた。
【０１４７】
１．１．２  親和性成熟
１回目の親和性成熟
６個のファージディスプレイ親和性成熟ライブラリーを、上記のナイーブ選択プロセスを用いて同定された３個のＦｃａｂのそれぞれのＡＢループにおける５個の残基（残基１４から１８）、及びＥＦループにおける５個の残基（残基９２から９４及び９７から９８）か又は８個の残基（残基９２から９４及び９７から１０１）のいずれかの残基をランダム化することにより構築した。
【０１４８】
親和性成熟ライブラリーを、（上記のように）組換えヒトＬＡＧ−３  Ｆｃ（R&D systems、2319-L3-050）及びヒトＬＡＧ−３を発現するＨＥＫ細胞を用いて選択した。そのアウトプットをファージＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、陽性結合剤をサブクローニングし、ＨＥＫ  Ｅｘｐｉ２９３細胞において、可溶性Ｆｃａｂ（短縮型ヒンジを含有する）として発現させた（pTT5ベクター[National Research Council of Canada]にクローニングされたFcabは、ExpiFectamine 293トランスフェクションキット[Life Technologies、A14524]を用いて、Expi293F細胞[Life technologies、A14527]へトランスフェクションされた）。その後、ＨＥＫ発現可溶性Ｆｃａｂを、細胞に発現したヒトＬＡＧ−３との結合、細胞に発現したカニクイザルＬＡＧ−３との結合（実施例1.4.3のような方法論）、及びＭＨＣクラスＩＩの組換えＬＡＧ−３  Ｆｃとの結合をブロックする能力（実施例1.6においてのような方法論）についてスクリーニングした。ブロックするＦｃａｂを、それらが、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＩＬ−２分泌のＬＡＧ−３誘導性阻害を逆転させることができるかどうかを決定するためにさらに試験した（実施例2.1においてのような方法論）。これらのスクリーニング方法を用いて、６個の親和性成熟ライブラリーから６１個の固有の抗ＬＡＧ−３  Ｆｃａｂが同定された。ＦＳ１８−７系列由来の親和性成熟したＦｃａｂは、カニクイザルＬＡＧ−３と最高レベルの交差反応性を生じることが示された。カニクイザルＬＡＧ−３  Ｆｃとの最強の結合及びＴ細胞活性化アッセイにおける最高の活性を有する、この系列由来の３個のＦｃａｂ（FS18-7-7、FS18-7-9、及びFS18-7-11と名付けられた）を、さらなる親和性成熟のために選択した。これらの３個のＦｃａｂはまた、ＬＡＧ−３  Ｆｃの、細胞に発現したＭＨＣクラスＩＩとの相互作用をブロックすることが示された。
【０１４９】
２回目の親和性成熟
１回目の親和性成熟からの３個のＦｃａｂ（FS18-7-7、FS18-7-9、及びFS18-7-11）のプールを用いて、さらなる親和性成熟ライブラリーを作製した。ＣＤループを、ＥＬＬＡ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製のランダム化プライマーを用いて、激しくランダム化した。ＣＤループにおけるアミノ酸位置の一部（残基４５．１から７８）を、システインを除くアミノ酸の等モルの配分を用いてランダム化した。変異性ＰＣＲもまた、ＣＨ３ドメイン配列全体に渡って実行して、結合を増強する可能性がある追加の変異を導入した。
【０１５０】
親和性成熟ライブラリーを、ファージにおいて作製し、ビオチン化組換えＬＡＧ−３  ａｖｉ−Ｆｃ（BPS Bioscience、71147）及びＨＥＫ  ｈＬＡＧ−３細胞に対して選択を実施し、ファージＥＬＩＳＡにより、組換えＬＡＧ−３  Ｆｃ（R&D systems、2319-L3-050）との結合についてスクリーニングした。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞において８６個の固有のＦｃａｂ（短縮型ヒンジを含有する）が発現した。選択されたＦｃａｂをまた、上記のように、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて活性についてスクリーニングした。Ｔ細胞活性化アッセイにおける最高活性を有する２回目の親和性成熟中に同定された９個のＦｃａｂ（FS18-7-32、FS18-7-33、FS18-7-36、FS18-7-58、FS18-7-62、FS18-7-65、FS18-7-78、FS18-7-88、及びFS18-7-95）、加えて親のＦｃａｂクローン、ＦＳ１８−７−９をその後、下記のようにさらに特徴付けた。これらの９個のＦｃａｂの、親のＦｃａｂクローン、ＦＳ１８−７−９に対する配列アラインメントは、図１Ａに示されている。図１Ｂは、９個のＦｃａｂクローンのそれぞれの、親のＦｃａｂクローン、ＦＳ１８−７−９とのパーセンテージ配列同一性を詳述する。その他の２個の親のＦｃａｂクローン、ＦＳ１８−７−７及びＦＳ１８−７−１１の親和性成熟から生じたＦｃａｂは、ＦＳ１８−７−９の親和性成熟から生じたものほど有望な候補ではなく、それゆえに、さらに探究されなかった。
【０１５１】
１．２  マウスＬＡＧ−３に特異的な代替Ｆｃａｂの選択
上記のナイーブ選択プロトコールを用いて選択されたＦｃａｂ  ＦＳ１８−７を用いて、マウスＬＡＧ−３に対して選択するためのファージライブラリーを作製した。２ラウンドの親和性成熟を実施し、高親和性、マウスＬＡＧ−３との特異的結合を示したＦｃａｂクローン、ＦＳ１８−７−１０８−２９及びＦＳ１８−７−１０８−３５が、親和性成熟後に選択された。Ｔ細胞活性化アッセイにおけるマウスＬＡＧ−３を阻害するＦＳ１８−７−１０８−２９及びＦＳ１８−７−１０８−３５の能力が確認された。Ｏｃｔｅｔ（Forteo Bio）を用いるエピトープマッピングにより、抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂが、抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ（上記のように２回目の親和性成熟後に選択された）と、ヒトＬＡＧ−３との結合において競合することが示された。抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂと抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂとの間に４から８個の残基の違いがある。したがって、抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂが、マウスにおいて、抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂの結合及び機能についての適切な代替となることが予想される。
【０１５２】
１．３  ニセｍＡｂ２の構築及び発現
上記の１．１及び１．２で同定されたリード抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ及び抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂを含む「ニセ」ｍＡｂ２を、ｍＡｂ２型式におけるこれらのＦｃａｂの特徴付けを可能にするために調製した。これらのニセｍＡｂ２を、抗ＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ、及び抗ＦＩＴＣ抗体４４２０の可変領域（詳細として、配列番号８３、配列番号８４、及び配列番号８５参照）から調製した（Bedzyk, W. D.ら、1989及びBedzyk, W. D.ら、1989）。重鎖のＣＨ２ドメインにおいてＬＡＬＡ変異を含むニセｍＡｂ２（配列番号６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、及び８１）とそれを含まないニセｍＡｂ２（配列番号６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、及び８２）の両方が調製され（詳細として、下記のセクション1.5参照）、抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  ４４２０の軽鎖（配列番号８５）をさらに含んだ。ニセｍＡｂ２を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞において一過性発現により産生させ、ｍＡｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプロテインＡカラムを用いて精製した。
【０１５３】
１．４  ＬＡＧ−３に対するＦｃａｂの結合親和性
１．４．１  表面プラズモン共鳴法（SPR）により決定される場合のヒトＬＡＧ−３に対するＦｃａｂの結合親和性
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（GE Healthcare）を用いて、ヒトＬＡＧ−３に対するニセｍＡｂ２型式における抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂの親和性を測定した。アミンカップリングキット（GE Healthcare、BR-1000-50）を用いて、ＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare、BR1005-30）のフローセル４にヒトＬＡＧ−３−Ｆｃ（R&D Systems、2319-L3-050）を固定化し、フローセル３に参照としてのバッファーを固定化した。ＬＡＧ−３−Ｆｃを、酢酸ナトリウム、ｐＨ５（ForteoBio、18-1069）中５μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌ／分の流速で１２秒間、注入し、続いて、エタノールアミンの注入による表面の非活性化を４２０秒間、行った。固定化レベルは１５８ＲＵであった。ニセｍＡｂ２（又は対照抗ヒトLAG-3 mAb、25F7）を、ＨＢＳ−Ｐバッファー（GE Healthcare、BR-1003-68）中に、４μｇ／ｍｌから２倍希釈系列で希釈した。対照ｍＡｂ／ニセｍＡｂ２を注入し、３０μｌ／分で２４０秒間の会合時間、及び３０μｌ／分で３００秒間の解離時間であった。表面を、２５ｍＭ  ＮａＯＨを１００μｌ／分で３０秒間、用いて、再生した。データは、速度定数を計算するために、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．２ソフトウェアを用いて、二重参照を引き算され、分析された。ニセｍＡｂ２型式におけるＦｃａｂは、０．８から１．１ｎＭの範囲の、ヒトＬＡＧ−３に対する親和性を有し（表１）、その親和性は、ベンチマーク抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２５Ｆ７の親和性と類似している。これは、驚くべきことであり、なぜなら、Ｆｃａｂの結合部位は、極めて接近して位置する２つの結合部位を有する相対的にコンパクトな抗体断片を形成するため、Ｆｃａｂは、モノクローナル抗体より小さい結合界面を有するからである。対照的に、典型的なｍＡｂのＦａｂアームは、可動性ヒンジ領域により隔てられている。このより小さい結合界面及びその関連した、Ｆｃ領域における２つの結合部位の可動性の低減に基づけば、抗ＬＡＧ−３  Ｆｃａｂが、ベンチマーク抗体２５Ｆ７と類似した親和性及び作用強度でＬＡＧ−３と結合し、かつそれを阻害することができることは予想外であった。
【０１５４】
【表１】
2019526273.tif 000002
【０１５５】
１．４．２  ＳＰＲにより決定された場合の、マウスＬＡＧ−３に対するマウスＬＡＧ−３に特異的な代替Ｆｃａｂの結合親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００（GE Healthcare）を用いて、マウスＬＡＧ−３に対するマウスＬＡＧ−３に特異的な代替Ｆｃａｂの親和性を測定した。アミンカップリング（アミンカップリングキット、GE Healthcare、BR-1000-50）を用いて、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ５．０（ForteBio、18-1069）中に希釈されたｍＬＡＧ−３  Ｆｃ（R&D Systems、3328-L3-050）をＣＭ５チップ（GE Healthcare、BR-1000-12）に直接、コーティングした。フローセル１を、９５０ＲＵで、マウスＦｃ（SinoBiological、51094-MNAH）でコーティングし、フローセル２を、ｍＬＡＧ−３  Ｆｃでコーティングした。Ｆｃａｂを、ＨＢＳ−Ｐバッファー（GE Healthcare、BR-1003-68）中に希釈し、様々な濃度（１００ｎＭから４倍希釈）で、２０μｌ／分で３分間、注入し、その後、バッファー中で１２分間、解離させた。チップを、１０ｍＭ  グリシン  ｐＨ２．５の３０μｌ／分、３０秒間の注入により再生した。データは、速度定数を計算するために、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．２ソフトウェアを用いて、二重参照を引き算され、分析された。試験された代替Ｆｃａｂは、表２に示されているように、１桁のナノモル濃度親和性でマウスＬＡＧ−３と結合した。
【０１５６】
【表２】
2019526273.tif 000003
【０１５７】
１．４．３  フローサイトメトリにより決定される場合の、細胞上に発現したヒトＬＡＧ−３に対するＦｃａｂの結合親和性
ＬＡＧ−３を過剰発現する細胞株の作製
レンチウイルス形質導入方法論を用い、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングシステム（Clontech、カタログ番号631249）を使用して、ヒト、カニクイザル、又はマウスのＬＡＧ−３を過剰発現するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）を作製した。マウスＬＡＧ−３  ｃＤＮＡ（配列番号９６）、ヒトＬＡＧ−３  ｃＤＮＡ（配列番号９５）、又はカニクイザルＬＡＧ−３  ｃＤＮＡ（配列番号９７）を含有するＬｅｎｔｉ−Ｘ発現ベクター（pLVX）（Clontech、カタログ番号631253）を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングミックスを用いて、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞株（Clontech、カタログ番号632180）へ同時トランスフェクションして、ウイルスを作製した。ＤＯ１１．１０細胞株に、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングシステムで、作製されたレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。
【０１５８】
ニセｍＡｂ２型式における抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂの、ヒトＬＡＧ−３を発現する細胞（ヒトLAG-3をトランスフェクションされたDO11.10細胞株）に対する親和性を、フローサイトメトリを用いて測定した。ｍＡｂ２希釈溶液及び対照ｍＡｂ希釈溶液（２×最終濃度）を、１×ＤＰＢＳ（Gibco、14190-094）中に３連で調製した。ＤＯ１１．１０：ＬＡＧ−３細胞懸濁液を、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ（Sigma、A7906）中に調製し、Ｖ底９６ウェルプレート（Costar、3897）中、５０μｌ／ウェル、細胞４×１０−６個／ｍｌで播種した。ｍＡｂ２希釈溶液又は対照ｍＡｂ（抗ヒトLAG-3 mAb、25F7）希釈溶液５０μｌを、細胞を含有するウェルに加え（最終体積１００μｌ）、４℃で１時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、その後、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ中１：１０００希釈された１００μｌ／ウェルの二次抗体（抗ヒトFc-488抗体、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）を加え、暗闇中４℃で３０分間、インキュベートした。プレートを洗浄し、ＤＡＰＩ（Biotium、４００４３）を含有するＰＢＳ  １００μｌ中、１ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。プレートを、Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を除去し、ＦＩＴＣチャネル（488nm/530/30）における蛍光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答（log (agonist) vs response）を用いてフィッティングした。全ての試験された、ニセｍＡｂ２型式におけるＦｃａｂ、及びベンチマーク抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ、２５Ｆ７は、表３に示されているように、１．２から２．１ｎＭの範囲の類似した親和性（EC50）でヒトＬＡＧ−３を結合した。
【０１５９】
【表３】
2019526273.tif 000004
【０１６０】
１．４．４  フローサイトメトリにより決定された場合の、細胞上に発現したカニクイザルＬＡＧ−３に対するＦｃａｂの結合親和性
ニセｍＡｂ２型式における抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂの、カニクイザルＬＡＧ−３を発現する細胞（カニクイザルLAG-3をトランスフェクションされたDO11.10細胞株）に対する親和性を、フローサイトメトリを用いて測定した。ｍＡｂ２希釈溶液及び対照ｍＡｂ希釈溶液（２×最終濃度）を、１×ＤＰＢＳ（Gibco、14190-094）中に３連で調製した。ＤＯ１１．１０：ＬＡＧ−３細胞懸濁液を、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ（Sigma、A7906）中に調製し、Ｖ底９６ウェルプレート（Costar、3897）中、５０μｌ／ウェル、細胞４×１０−６個／ｍｌで播種した。ｍＡｂ２希釈溶液又は対照ｍＡｂ（抗ヒトLAG-3 mAb、25F7）希釈溶液５０μｌを、細胞を含有するウェルに加え（最終体積１００μｌ）、４℃で１時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、その後、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ中１：１０００希釈された１００μｌ／ウェルの二次抗体（抗ヒトFc-488抗体、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）を加え、暗闇中４℃で３０分間、インキュベートした。プレートを洗浄し、ＤＡＰＩ（Biotium、40043）を含有するＰＢＳ  １００μｌ中、１ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。プレートを、Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を除去し、ＦＩＴＣチャネル（488nm/530/30）における蛍光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答を用いてフィッティングした。試験された、ニセｍＡｂ２型式におけるＦｃａｂは、０．５から０．６ｎＭ親和性でカニクイザルＬＡＧ−３と結合し、カニクイザルにおける毒性学研究は、ヒトに見られた効果を予測すると予想されることを示している（表４参照）。ベンチマーク抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ、２５Ｆ７は、カニクイザルＬＡＧ−３を１５分の１の親和性（EC50）で結合する（表４）。
【０１６１】
【表４】
2019526273.tif 000005
【０１６２】
１．４．５  フローサイトメトリにより決定された場合の、細胞上に発現したマウスＬＡＧ−３に対する、代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ及び抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂの結合親和性
ｍＬＡＧ−３を過剰発現するＨＥＫ細胞の作製
マウスＬＡＧ−３配列（配列番号９６）を、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴベクター（Life Technologies、V6010-20）に、ＫｐｎＩ（NEB、R0142）及びＮｏｔＩ（NEB、R0146）制限消化を用いてサブクローニングした。その後、ベクターを、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３  ＨＥＫ細胞株（Life Technologies、R780-07）へ、リポフェクタミン２０００（Life Technologies、11668-019）を用いて形質転換した。形質転換されたＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ２９３細胞を、１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中、３から４週間、安定的に形質転換された細胞のコロニーが明らかになるまで成長させた。これらのコロニーを、１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）の存在下で増幅し、ＰＥコンジュゲート化抗マウスＬＡＧ−３（クローンC9B7W、BD Biosciences、552380）を用いて、マウスＬＡＧ−３発現について試験した。
【０１６３】
代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ（短縮型ヒンジを含有する；配列番号５８）の、細胞に発現したマウスＬＡＧ−３に対する親和性を、フローサイトメトリを用いて決定した。１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）、及び１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中で成長した、ｍＬＡＧ−３を発現するＨＥＫ細胞を、組織培養フラスコから細胞解離バッファー（Life Technologies、13151-014）を用いて、剥離し、細胞２×１０５個／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Costar、3897）に播種した。プレートを、１５００ｒｐｍ、４℃で３分間、遠心分離して、細胞をペレット化した。Ｆｃａｂ（又は対照mAb）の希釈系列を、１００μｌ体積中で細胞と４℃で１時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、二次抗体（Fcabについて、抗ヒトFc-488、Jackson ImmunoResearch、109-546-098、又はC9B7Wについて、抗ラットIgG（H+L）、Alexa Fluor 488コンジュゲート、ThermoFisher、A-11006）をＰＢＳ中１：１０００希釈し、１００μｌを、４℃で３０分間、細胞に加えた（プレートは暗闇中に保った）。その後、プレートを洗浄し、細胞を、１μｇ／ｍｌＤＡＰＩ（Biotium、40043）を含有するＰＢＳ  １００μｌ中に再懸濁した。プレートを、Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を除去し、ＦＩＴＣチャネル（488nm/530/30）における蛍光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答を用いてフィッティングした。試験されたＦｃａｂは、マウスＬＡＧ−３と類似した親和性で結合した（表５参照）。ベンチマークＬＡＧ−３  ｍＡｂ、Ｃ９Ｂ７Ｗ（2B Scientific、BE0174-50MG）は、マウスＬＡＧ−３を、Ｆｃａｂの１７分の１の親和性（EC50）で結合する（表５）。
【０１６４】
【表５】
2019526273.tif 000006
【０１６５】
ニセｍＡｂ２型式における抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９の、細胞に発現したマウスＬＡＧ−３に対する親和性を、フローサイトメトリを用いて決定した。１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）、及び１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中で成長した、ｍＬＡＧ−３を発現するＨＥＫ細胞を、組織培養フラスコから細胞解離バッファー（Life Technologies、13151-014）を用いて、剥離した。細胞を、１５００ｒｐｍ、４℃、３分間で遠心分離して、細胞をペレット化することにより収集し、その後、１×ＤＰＢＳ中に再懸濁し、その後、Ｖ底９６ウェルプレート（Costar、3897）に３０μｌにおいて細胞１．２×１０５個／ウェルで播種した。ｍＡｂ２（又は対照mAb）の希釈系列の１：１体積を加え、細胞と４℃で１時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、二次抗体（抗ヒトFc-488、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）をＰＢＳ中１：１０００希釈し、６０μｌを、４℃で３０分間、細胞に加えた（プレートは暗闇中に保った）。その後、プレートを洗浄し、細胞を、１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Biotium、40043）を含有するＰＢＳ  ６０μｌ中に再懸濁した。プレートを、Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を除去し、ＦＩＴＣチャネル（488nm/530/30）における蛍光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答を用いてフィッティングした。ニセｍＡｂ２型式における抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９は、代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９−１０８についての２．６ｎＭのＥＣ５０と比較して、１９ｎＭのＥＣ５０でマウスＬＡＧ−３と結合した（表６）。ヒトｍＡｂ、２５Ｆ７は、マウスＬＡＧ−３との少しの検出可能な結合も示さず、ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ、ＦＳ１８−７−９が、２５Ｆ７のエピトープとは異なる、ＬＡＧ−３上の結合エピトープを有することを示している。
【０１６６】
【表６】
2019526273.tif 000007
【０１６７】
１．５  Ｆｃ受容体に対するＦｃａｂの結合親和性
ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインにおけるＬＡＬＡ変異の導入は、Ｆｃγ受容体結合を低下させることが公知である（Bruhns, P.ら（2009）及びXu, D.ら（2000））。ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、ＬＡＬＡ変異が、Ｆｃγ受容体に対するＦｃａｂ（ニセmAb2型式における）の結合親和性を低下させていることを確認した。ヒトＦｃγＲ結合アッセイを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（GE Healthcare）において、ニセｍＡｂ２型式におけるＦｃａｂを用いて実施した。ヒトＦｃγＲ（R&D Systems、1257-FC、1330-CD、1875-CD、4325-FC）を、アミンカップリング（アミンカップリングキット、GE Healthcare、BR-1000-50）を用いて、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５チップ（GE Healthcare、BR-1005-30）上に、ＦｃγＲＩについて３７０ＲＵ、ＦｃγＲＩＩＩについて２６４ＲＵ（高親和性ヒトＦｃγＲ）、並びにＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂについて５００ＲＵ（低親和性ヒトＦｃγＲ）の表面密度で固定化した。各固定化されたチップについて、１つのフローセルを、バックグラウンドの引き算のためにブランクのままにしておいた。ＦｃγＲを、酢酸ナトリウム  ｐＨ５（ForteBio、18-1069）中５μｇ／ｍｌの濃度を用いて固定化し、１０μｌ／分の流速、１５秒サイクルで、必要とされる固定化レベルに達するまで、注入した。
【０１６８】
高親和性ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩについて、２００μｇ／ｍｌのｍＡｂ又はニセｍＡｂ２を、チップに渡って、３０μｌ／分の流速で３分間、流し、続いて、５分間の解離を行った。ランニングバッファーは、ＨＢＳ−Ｐ（0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、0.005% v/v Surfactant P20、GE Healthcare、BR-1003-68）であった。低親和性ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂについて、ニセｍＡｂ２の濃度を、５００μｇ／ｍｌまで増加した。
【０１６９】
陽性対照は、野生型ＩｇＧ１アイソタイプｍＡｂであり、それを、対照ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ｍＡｂ並びに無関係の標的に対するモノクローナルＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプｍＡｂと比較した。フローセルを、１０ｍＭ  水酸化ナトリウム（VWR、28244.262）を１００μｌ／分の流速で３０秒間、注入することにより再生した。データ分析を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア  バージョン３．２  ＲＣ１を用いて、ブランクフローセル（固定化ＦｃγＲを含まない）に対して二重参照し、試験ｍＡｂ２からバッファーサイクルを引き算することにより実施した。結果は表７に示されている。
【０１７０】
【表７】
2019526273.tif 000008
【０１７１】
試験された全てのニセｍＡｂ２（全て、上記に示されているようなLALA変異を含む）は、ＬＡＬＡ変異を含まない対照抗体（ニセmAb IgG1）と比較して、試験されたＦｃγ受容体との結合の有意な低下を示し、ＬＡＬＡ変異が、これらのニセｍＡｂ２によるＦｃγ受容体結合を低下させており、したがって、そのｍＡｂ２のＡＤＣＣ活性を低下させることが予想されることを示している。
【０１７２】
１．６  ＭＨＣクラスＩＩのＬＡＧ−３との結合のブロッキング
Ｆｃａｂ（短縮型ヒンジを有する;配列番号５８）の、組換えヒト又はマウスＬＡＧ−３  ＦｃとヒトＭＨＣクラスＩＩとの間の相互作用をブロックする能力を、ヒトＭＨＣクラスＩＩを発現するメラノーマ細胞株である、Ａ３７５細胞とのＬＡＧ−３  Ｆｃの結合を測定することにより研究した。１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-106）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中で成長したＡ３７５（ATCC、CRL-1619）細胞を、細胞培養フラスコから細胞解離バッファー（Life Technologies、13151-014）を用いて、剥離し、細胞２×１０５個／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Costar、3897）に播種した。プレートを、１５００ｒｐｍ、４℃で３分間、遠心分離して、細胞をペレット化した。関連濃度のＦｃａｂ又は対照ｍＡｂを、１μｇ／ｍｌ  ＬＡＧ−３  Ｆｃ（ヒトLAG-3-Fc  R&D Systems、2319-L3-050、又はマウスLAG-3 Fc  R&D Systems、3328-L3-050）と、１０％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ  １００μｌ中、４℃で１時間、インキュベートした。ＬＡＧ−３／Ｆｃａｂ混合物をＡ３７５細胞に加え、４℃で１時間、インキュベートした。細胞を洗浄した。二次抗体（Alexa Fluor 488コンジュゲート化ヤギ抗ヒトFc F(ab’)2、Jackson Immunoresearch、109-546-098、又はヤギ抗マウスIgG (H+L) 488コンジュゲート、Life Technologies、A-1101）をＰＢＳ中に１：１０００希釈し、１００μｌを細胞に、４℃で３０分間、加えた（プレートを暗闇中に保った）。細胞をＰＢＳ中で１回、洗浄し、ＰＢＳ  １００μｌ＋１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Biotium、40043）中に再懸濁した。プレートをＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター（BD Biosciences）で読み取り、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、解析した。
【０１７３】
両方の抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂは、ヒトＭＨＣクラスＩＩのマウスＬＡＧ−３との相互作用を阻害することができたが、対照抗マウスＬＡＧ−３  ｍＡｂ（C9B7W、2B Scientific、BE0174-50MG）は阻害することができなかった（表８参照）。
【０１７４】
【表８】
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【０１７５】
試験された抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂもまた、ヒトＭＨＣクラスＩＩのヒトＬＡＧ−３との相互作用を、対照抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ（25F7）と類似した作用強度で阻害することができた。
【０１７６】
【表９】
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【０１７７】
実施例２：ｍＡｂ及びｍＡｂ２分子の調製及び特徴付け
２．１  ｍＡｂ  ８４Ｇ０９の調製
２．１．１  ＤＮＡ構築物の作製
８４Ｇ０９の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ挿入断片を、哺乳類発現のためにコドン最適化し、ＤＮＡ２．０（Menlo Park、CA、USA）により合成した。ｐＪ−Ａｍｐ−ｈｉｇｈ宿主ベクターに供給された挿入断片を、発現ベクターｐＦＳ−ｈＨＣ２．１−Ｇ１ｍ１７（ｚ）  ＬＡＬＡ（ＬＡＬＡ変異を含有するＩｇＧ重鎖）又はｐＦＳ−ｈＨＣ２．１−Ｇ１ｍ１７（ｚ）（ＬＡＬＡ変異を含まないＩｇＧ重鎖）及びｐＦＳｈＫ１．０（ＩｇＧ  κ軽鎖）へＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ制限消化によりサブクローニングした。
【０１７８】
クローニングの忠実度を、コロニーＰＣＲ、及びその後、第三者（GATC Biotech）によるヌクレオチドシーケンシング分析により検証した。
【０１７９】
２．１．２  細胞維持
ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（NRCC）を、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Invitrogen、35050-038）、０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（Invitrogen A13835-01）及び２５μｇ／ｍｌのジェネティシン（Invitrogen、10131-027）を追加した、予熱されたＦ１７培地（Invitrogen、A13835-01）中で継代培養した。細胞を、３７℃、１４０ｒｐｍ、５％  ＣＯ２でインキュベートし、３日間、その後、４日間のレジメンにおいて細胞０．３×１０６個／ｍｌで継代培養した。
【０１８０】
２．１．３  一過性トランスフェクション
ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を、１ｍｇ／ｍｌでのＰＥＩｐｒｏ（Polyplus、PPLU115）を用いて一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を、培地中、細胞０．８×１０６個／ｍｌで播種した。細胞培養物の２００ｍｌごとに、ＤＮＡ混合物を、温められたＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ（Invitrogen、11058-021）１０ｍｌ、重鎖をコードする、内毒素を含まないＤＮＡ１００μｇ、及び軽鎖をコードする、内毒素を含まないＤＮＡ１００μｇを混合することにより調製した。ＰＥＩ混合物を、温められたＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ  １０ｍｌ及びＰＥＩｐｒｏ  ２００μｌを混合し、ボルテックスすることにより調製した。ＤＮＡ混合物を、ボルテックスされたＰＥＩ混合物に素早く加え、ボルテックスパルスを１秒間、３回、行うことにより混合し、室温で３分間、インキュベートし、一滴ずつ、細胞に加えた。トランスフェクションから４８時間後、０．５％トリプトンＮ１（TekniScience Inc.、19553）を含むＦ１７＋サプリメント２０ｍｌを各フラスコに加えた。
【０１８１】
トランスフェクションから６日後、細胞を、４５００ｒｐｍで４０分間の遠心分離により収集した。その後、上清を、０．２２μｍポリエーテルスルホンフィルターユニット（Millipore、 SCGPU01RE、SCGPU02RE、SCGPU05RE、SCGPU11RE）で濾過し、精製まで＋４℃で保存した。
【０１８２】
２．１．４  プロテインＡクロマトグラフィ
透明化された上清を、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ又はＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓにおいて、あらかじめ充填された５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（GE Healthcare、11-0034-95）を用いて精製した。簡単に述べれば、カラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化し、結合していない材料を、同じバッファーを用いて５ｍｌ／分で洗浄した。その産物を、１０ｍＭ  ギ酸ナトリウム、ｐＨ３．０を用いて５ｍｌ／分で溶出した。溶出した試料をすぐに、製造会社の推奨に従って、ＰＢＳ  ｐＨ７．４であらかじめ平衡化されたＰＤ−１０カラム（GE Healthcare、17-0851-01）を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．４へバッファー交換した。
【０１８３】
２．１．５  分光光度法による産物濃度測定
各精製された産物の２８０ｎｍにおける吸光度を、ＤｒｏｐＰｌａｔｅ  ９６  Ｄ＋（PerkinElmer、CLS135136）と共にＬａｂＣｈｉｐ  ＤＳ（PerkinElmer、133089）を用いて測定した。産物濃度を、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  ｖ１１．５．４ソフトウェア（Thermofisher Scientific、A13784）を用いて計算された消衰係数（1mg/mlのA280）を用いて、計算した。
【０１８４】
２．１．６  産物濃度
必要に応じて、精製された画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心フィルターユニット３０Ｋ（Millipore、UFC803024）を用いて濃縮した。３０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離によるＰＢＳ  ｐＨ７．４でのＵｌｔｒａｃｅｌ再生セルロース膜の平衡化後、試料を、４ｍｌユニットへ負荷し、所望のタンパク質濃度に達するまで３０００ｒｐｍで遠心分離した。
【０１８５】
２．１．６  フィルター滅菌
最終試料を、あらかじめ湿らせたＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ  ＰＶＤＦシリンジフィルター（Millipore、SLGV013SL）を用いて濾過した。
【０１８６】
２．２  ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の調製
ｍＡｂ２分子  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９（配列番号９４及び９５）、ＦＳ１８−７−３２／８４Ｇ０９（配列番号９６及び９７）、ＦＳ１８−７−３３／８４Ｇ０９（配列番号９８及び９９）、ＦＳ１８−７−３６／８４Ｇ０９  （配列番号１００及び１０１）、ＦＳ１８−７−５８／８４Ｇ０９（配列番号１０２及び１０３）、ＦＳ１８−７−６２／８４Ｇ０９（配列番号１０４及び１０５）、ＦＳ１８−７−６５／８４Ｇ０９（配列番号１０６及び１０７）、ＦＳ１８−７−７８／８４Ｇ０９（配列番号１０８及び１０９）、ＦＳ１８−７−８８／８４Ｇ０９（配列番号１１０及び１１１）、並びにＦＳ１８−７−９５／８４Ｇ０９（配列番号１１２及び１１３）の重鎖は、ヒトＩｇＧ１の非改変ＣＨ３ドメインの配列に存在するＸｈｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位の範囲内において、モノクローナル抗体８４Ｇ０９（ＬＡＬＡ変異を含む、及び含まない）のＣＨ３ドメインを、ヒトＬＡＧ−３特異的Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９、ＦＳ１８−７−３２、ＦＳ１８−７−３３、ＦＳ１８−７−３６、ＦＳ１８−７−５８、ＦＳ１８−７−６２、ＦＳ１８−７−６５、ＦＳ１８−７−７８、ＦＳ１８−７−８８、及びＦＳ１８−７−９５のＣＨ３ドメインに置き換えることにより調製された。上記のセクション２．１においてｍＡｂ  ８４Ｇ０９について記載されているように、ｍＡｂ２の重鎖を、８４Ｇ０９の軽鎖（配列番号１１６）と同時トランスフェクションした。その後、上記のセクション２．１においてｍＡｂ  ８４Ｇ０９について記載されているように、ｍＡｂ２を発現させ、精製した。
【０１８７】
２．３  ヒトＬＡＧ−３／ニセｍＡｂ２の調製
抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ（ＬＡＬＡ変異を含む、及び含まない）を、上記のセクション２．１においてｍＡｂ  ８４Ｇ０９について記載されているように、ｍＡｂ  ４４２０の重鎖（配列番号８３及び８４；ＬＡＬＡ変異を含む、及び含まない）及び軽鎖（配列番号８５）を用いて調製した。
【０１８８】
ｍＡｂ２分子  ＦＳ１８−７−９／４４２０（配列番号６３及び６４）、ＦＳ１８−７−３２／４４２０（配列番号６５及び６６）、ＦＳ１８−７−３３／４４２０（配列番号６７及び６８）、ＦＳ１８−７−３６／４４２０（配列番号６９及び７０）、ＦＳ１８−７−５８／４４２０（配列番号７１及び７２）、ＦＳ１８−７−６２／４４２０（配列番号７３及び７４）、ＦＳ１８−７−６５／４４２０（配列番号７５及び７６）、ＦＳ１８−７−７８／４４２０（配列番号７７及び７８）、ＦＳ１８−７−８８／４４２０（配列番号７９及び８０）及びＦＳ１８−７−９５／４４２０（配列番号８１及び８２）の重鎖は、ヒトＩｇＧ１の非改変ＣＨ３ドメインの配列に存在するＸｈｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位の範囲内において、モノクローナル抗体４４２０（ＬＡＬＡ変異を含む、及び含まない）のＣＨ３ドメインを、ヒトＬＡＧ−３特異的Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９、ＦＳ１８−７−３２、ＦＳ１８−７−３３、ＦＳ１８−７−３６、ＦＳ１８−７−５８、ＦＳ１８−７−６２、ＦＳ１８−７−６５、ＦＳ１８−７−７８、ＦＳ１８−７−８８、及びＦＳ１８−７−９５のＣＨ３ドメインに置き換えることにより調製された。上記のセクション２．１においてｍＡｂ  ８４Ｇ０９について記載されているように、ｍＡｂ２の重鎖を、ｍＡｂ  ４４２０の軽鎖と同時トランスフェクションした。その後、上記のセクション２．１においてｍＡｂ  ８４Ｇ０９について記載されているように、そのタンパク質を発現させ、精製した。
【０１８９】
２．４  マウスＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の調製
マウス抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（ＬＡＬＡ変異を含む、及び含まない）を、上記のセクション２．１においてｍＡｂ  ８４Ｇ０９について記載されているように、ｍＡｂ  Ｓ１の重鎖（配列番号１２２及び１２３）及び軽鎖（配列番号１１９）を用いて調製した。
【０１９０】
ｍＡｂ２分子  ＦＳ１８−７−１０８−２９／Ｓ１（配列番号１１７及び１１８）及びＦＳ１８−７−１０８−３５／Ｓ１（配列番号１２０及び１２１）の重鎖は、ヒトＩｇＧ１の非改変ＣＨ３ドメインの配列に存在するＸｈｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位の範囲内において、モノクローナル抗体Ｓ１（ＬＡＬＡ変異を含む、及び含まない）のＣＨ３ドメインを、マウスＬＡＧ−３特異的Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−１０８−２９及びＦＳ１８−７−１０８−３５のＣＨ３ドメインと置き換えることにより調製された。上記のセクション２．１においてｍＡｂ  ８４Ｇ０９について記載されているように、ｍＡｂ２の重鎖を、Ｓ１の軽鎖と同時トランスフェクションした。その後、上記のセクション２．１においてｍＡｂ  ８４Ｇ０９について記載されているように、そのタンパク質を発現させ、精製した。
【０１９１】
２．５  ヒトＬＡＧ−３及びヒトＰＤ−Ｌ１に対するｍＡｂ２の結合親和性及び動態
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００装置についての製造会社の使用説明書に従うことにより、プロテインＬ（Thermo、21189）を、２０００ＲＵの表面密度まで、アミンカップリング（GE Healthcare、BR-1000-50）により、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５チップ（GE Healthcare、BR-1005-30）のフローセル１及び２上へ固定化した。ＬＡＧ−３結合について、ｍＡｂ２試料（全て、ＬＡＬＡ変異を含有する）を、フローセル２上のみに捕獲し、０．５ｎＭから開始した２倍希釈系列での４つの濃度でのヒトＬＡＧ−３  Ｆｃ（R&D Systems、2319-L3）を、３０μｌ／分の流速でフローセル１と２の両方に渡って流した。会合時間は３分であり、解離時間は６分であった。ランニングバッファーは、ＨＢＳ−Ｐ（GE Healthcare、BR-1003-68）であった。両方のフローセルを、１０ｍＭ  水酸化ナトリウム（NaOH）を１００μｌ／分の流速で２０秒間、注入することにより再生した。データは、ブランクフローセルに対して二重参照することにより分析した。
【０１９２】
ＰＤ−Ｌ１結合について、４０ｎＭから開始したＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ（R&D Systems、156-B7）の２倍希釈系列における４つの濃度を、同じプロテインＬチップ上に捕獲されたｍＡｂ２に渡って流した。全ての他の条件は、ＬＡＧ−３結合についてと同じであった（上記参照）。
【０１９３】
結合動態を、１：１ラングミュアモデルを用いてフィッティングして、結合の会合速度（ka）及び解離速度（kd）を導いた。平衡結合定数（KD）を、各試料について解離速度を会合速度で割ることにより計算した。データ分析を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア  バージョン３．２で実施した。結果は表１０及び１１に示されている。
【０１９４】
【表１０】
2019526273.tif 000011
【０１９５】
【表１１】
2019526273.tif 000012
【０１９６】
ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＬＡＧ−３に対する結合親和性は、試験された全てのｍＡｂ２について類似していた。ヒトＰＤ−Ｌ１に対するｍＡｂ２結合親和性は、８４Ｇ０９に匹敵し、ＬＡＧ−３結合部位のＣＨ３ドメインへの導入がＰＤ−Ｌ１結合に影響しなかったことを示した。
【０１９７】
２．６  ヒトＬＡＧ−３及びヒトＰＤ−Ｌ１とのｍＡｂ２の同時結合
ｍＡｂ２（FS18-7-09/84G09、FS18-7-32/84G09、FS18-7-33/84G09、FS18-7-36/84G09、FS18-7-62/84G09、FS18-7-65/84G09、及びFS18-7-78/84G09、全て、LALA変異を含む）のＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１と同時に結合する能力を、ＳＰＲにより試験した。製造会社の使用説明書に従うことにより、ヒトＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ（R&D Systems、156-B7）を、１５０ＲＵの表面密度までＳｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５チップ（GE Healthcare、BR-1005-30）のフローセル２上へ固定化した。フローセル１を、バックグラウンドの引き算のために、いかなるタンパク質も固定化することなく、活性化し、かつ非活性化した。各試料について、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ２を、フローセル１及び２に渡って、１０μｌ／分の流速で３分間、流した。続いて、４０ｎＭのＬＡＧ−３  Ｆｃ（R&D Systems、2319-L3）を、フローセル１と２の両方に渡って、１０μｌ／分の流速で３分間、流した。各結合工程について、解離は３分間、追跡された。センサーチップを、各サイクル後に、１００μｌ／分の流速で２５ｍＭ  ＮａＯＨの１５秒間の注入で再生した。
【０１９８】
試験された全てのｍＡｂ２は、ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１と同時に結合する能力があった。親の抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ、８４Ｇ０９は、ＰＤ−Ｌ１と結合するだけである。
【０１９９】
２．７  マウスＬＡＧ−３及びマウスＰＤ−Ｌ１との代替ｍＡｂ２の同時結合
２つの代替マウスｍＡｂ２（FS18-7-108-29/S1及びFS18-7-108-35/S1、どちらもLALA変異を含有する）の、マウスＬＡＧ−３及びマウスＰＤ−Ｌ１と同時に結合する能力を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（GE Healthcare）においてＳＰＲにより試験した。製造会社の使用説明書に従って、マウスＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ（R&D Systems、1019-B7-100）を、８３０ＲＵの表面密度までＣＭ５チップのフローセル４上へ固定化した。フローセル３を、バックグラウンドの引き算のために、８２０ＲＵのヒトＦｃ（R&D system、110-HG）で固定化した。各試料について、５０ｎＭのｍＡｂ２を、フローセル１及び２に渡って、２０μｌ／分の流速で１５０秒間、流した。続いて、５０ｎＭのマウスＬＡＧ−３  Ｆｃ（R&D Systems、3328-L3-050）を、フローセル３と４の両方に渡って、２０μｌ／分の流速で１５０秒間、流した。各結合工程について、解離は３分間、追跡された。センサーチップを、各サイクル後に、５０ｍＭ  ＮａＯＨ１０μｌの２回で再生した。試験されたどちらのｍＡｂ２も、マウスＬＡＧ−３及びマウスＰＤ−Ｌ１と同時に結合する能力があり、したがって、ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２についての適切な代替である。
【０２００】
２．８  ＬＡＬＡ変異を含むｍＡｂ２によるヒトＦｃγ受容体との結合
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置についての製造会社の使用説明書に従って、ヒトＦｃγ受容体を、ＣＭ５チップ上に、Ｆｃγ  ＲＩ（R&D Systems、1257-FC）及びＦｃγ  ＲＩＩＩａ（R&D Systems、4325-FC）についておよそ２００ＲＵ、並びにＦｃγ  ＲＩＩａ（R&D Systems、1330-CD）及びＦｃγ  ＲＩＩｂ／ｃ（R&D Systems、1875-CD）についておよそ５００ＲＵの表面密度まで固定化した。Ｆｃγ  ＲＩ及びＦｃγ  ＲＩＩＩａについて、１００μｇ／ｍｌのｍＡｂ又はｍＡｂ２を、チップに渡って、１０μｌ／分の流速で３分間、流し、解離を、５分間、追跡した。ランニングバッファーはＰＢＳ（Lonza、BE17-516F）＋０．０５％（v/v）  Ｐ２０表面活性剤（GE Healthcare、BR-1000-54）であった。陽性対照は、野生型ＩｇＧ１  ４４２０−ｍＡｂであった。無関係の標的（20H4及びMOR7490）に対するモノクローナルＩｇＧ２及びＩｇＧ４  ｍＡｂ、並びにマウスＩｇＧ１（Sigma、P5305）が、参照点として含まれた。結合複合体の速い解離速度のために、再生は必要とされなかった。Ｆｃγ  ＲＩＩａ及びＦｃγ  ＲＩＩｂ／ｃ試験について、ｍＡｂ２の濃度を、これらの２つの受容体とのより弱い結合を補償するために５００μｇ／ｍｌに増加させた。結果は表１２に示されている。
【０２０１】
【表１２】
2019526273.tif 000013
【０２０２】
予想された通り、ｍＡｂ又はｍＡｂ２へ導入されたＬＡＬＡバリアントは、これらの分子のヒトＦｃγ受容体に結合する能力を低下させた。
【０２０３】
２．９  ヒトＬＡＧ−３を発現する細胞及びカニクイザルＬＡＧ−３を発現する細胞とのｍＡｂ２の結合
ヒトＬＡＧ−３配列（配列番号１２６）又はカニクイザルＬＡＧ−３配列（配列番号１２８）を、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴベクター（Life Technologies、V6010-20）へ、ＫｐｎＩ（NEB、R0142）及びＮｏｔＩ（NEB、R0146）制限消化を用いてサブクローニングした。その後、ベクターを、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３  ＨＥＫ細胞株（Life Technologies、R780-07）へ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Life Technologies、11668-019）を用いて形質転換した。形質転換されたＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞を、１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラスチシジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中、安定的に形質転換された細胞のコロニーが明らかになるまで３から４週間、成長させた。これらのコロニーを、１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）の存在下で増幅し、ＬＡＧ−３発現について試験し、フローサイトメトリにより確認した。
【０２０４】
細胞に発現したヒト又はカニクイザルＬＡＧ−３に対するｍＡｂ２（全て、LALA変異を含有する）の親和性を、フローサイトメトリを用いて決定した。１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラスチシジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）、及び１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中で成長した、ヒト又はカニクイザルＬＡＧ−３を発現するＨＥＫ細胞を、組織培養フラスコから細胞解離バッファー（Life Technologies、13151-014）を用いて、剥離し、細胞２×１０５個／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Costar、3897）に播種した。プレートを、１５００ｒｐｍ、４℃で３分間、遠心分離して、細胞をペレット化した。ｍＡｂ２（又は対照mAb）の希釈系列を、１００μｌ体積中で細胞と４℃で１時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、二次抗体（抗ヒトFc-488、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）をＰＢＳ中１：１０００希釈し、１００μｌを、４℃で３０分間、細胞に加えた（プレートは暗闇中に保った）。プレートを洗浄し、その後、細胞を、１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Biotium、40043）を含有するＰＢＳ  １００μｌ中に再懸濁した。プレートを、Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を除去し、ＦＩＴＣチャネル（488nm/530/30）における蛍光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおけるｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）  ｖｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅを用いてフィッティングした。プレートを、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター（BD Biosciences）において読み取り、データを、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。結果は表１３に示されている。
【０２０５】
【表１３】
2019526273.tif 000014
【０２０６】
結果は、ＨＥＫ細胞上に発現したヒト及びカニクイザルＬＡＧ−３とのｍＡｂ２結合を確証している。計算されたＥＣ５０値に関して、試験されたｍＡｂ２は、対照抗ＬＡＧ−３抗体２５Ｆ７と比較した場合、ヒトＬＡＧ−３とのより良い、又は匹敵する結合、及びカニクイザルＬＡＧ−３との少なくとも２倍より良い結合を示している。ＨＥＫ細胞株の表面上に発現した他のタンパク質との交差反応性は観察されなかった。
【０２０７】
２．１０  ヒトＰＤ−Ｌ１を発現する細胞及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１を発現する細胞とのｍＡｂ２の結合
ヒトＰＤ−Ｌ１配列（配列番号１２９）又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１配列（配列番号１３１）を、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴベクター（Life Technologies、V6010-20）へ、ＫｐｎＩ（NEB、R0142）及びＮｏｔＩ（NEB、R0146）制限消化を用いてサブクローニングした。その後、ベクターを、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３  ＨＥＫ細胞株（Life Technologies、R780-07）へ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Life Technologies、11668-019）を用いて形質転換した。形質転換されたＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞を、１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラスチシジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中、安定的に形質転換された細胞のコロニーが明らかになるまで３から４週間、成長させた。これらのコロニーを、１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）の存在下で増幅し、ＬＡＧ−３発現を、フローサイトメトリにより確認した。
【０２０８】
細胞に発現したヒト若しくはカニクイザルＰＤ−Ｌ１との、又は親（形質転換されていない細胞）とのｍＡｂ２（全て、LALA変異を含有する）結合の親和性を、フローサイトメトリを用いて決定した。１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラスチシジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）、及び１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中で成長した、ヒト又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１を発現するＨＥＫ細胞を、組織培養フラスコから細胞解離バッファー（Life Technologies、13151-014）を用いて、剥離し、２細胞×１０５個／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Costar、3897）に播種した。プレートを、１５００ｒｐｍ、４℃で３分間、遠心分離して、細胞をペレット化した。ｍＡｂ２（又は対照mAb）の希釈系列を、１００μｌ体積中で細胞と４℃で１時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、二次抗体（抗ヒトFc-488、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）をＰＢＳ中１：１０００希釈し、１００μｌを、４℃で３０分間、細胞に加えた（プレートは暗闇中に保った）。プレートを洗浄し、その後、細胞を、１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Biotium、40043）を含有するＰＢＳ  １００μｌ中に再懸濁した。プレートを、Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を除去し、ＦＩＴＣチャネル（488nm/530/30）における蛍光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおけるｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）  ｖｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅを用いてフィッティングした。プレートを、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター（BD Biosciences）において読み取り、データを、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。結果は表１４に示されている。
【０２０９】
【表１４】
2019526273.tif 000015
【０２１０】
試験されたＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の全部が、ヒトＰＤ−Ｌ１及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１と、８４Ｇ０９  ｍＡｂのＥＣ５０に近いＥＣ５０で結合し、ＰＤ−Ｌ１結合親和性が、ｍＡｂ２のＣＨ３ドメインへのＬＡＧ−３結合部位の導入により影響されないことを実証した。
【０２１１】
２．１１  マウスＬＡＧ−３又はマウスＰＤ−Ｌ１を発現する細胞との代替マウスｍＡｂ２の結合
マウスＬＡＧ−３配列（配列番号１２７）又はマウスＰＤ−Ｌ１配列（配列番号１３０）を、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴベクター（Life Technologies、V6010-20）へ、ＫｐｎＩ（NEB、R0142）及びＮｏｔＩ（NEB、R0146）制限消化を用いてサブクローニングした。その後、ベクターを、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３  ＨＥＫ細胞株（Life Technologies、R780-07）へ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Life Technologies、11668-019）を用いて形質転換した。形質転換されたＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞を、１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラスチシジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中、安定的に形質転換された細胞のコロニーが明らかになるまで３から４週間、成長させた。これらのコロニーを、１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）の存在下で増幅し、ＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１発現を、フローサイトメトリにより確認した。
【０２１２】
細胞に発現したマウスＬＡＧ−３又はマウスＰＤ−Ｌ１とのｍＡｂ２（全て、LALA変異を含有する）結合の親和性を、フローサイトメトリを用いて決定した。１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラスチシジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）、及び１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中で成長した、マウスＬＡＧ−３又はマウスＰＤ−Ｌ１を発現するＨＥＫ細胞を、組織培養フラスコから細胞解離バッファー（Life Technologies、13151-014）を用いて、剥離し、細胞２×１０５個／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Costar、3897）に播種した。プレートを、１５００ｒｐｍ、４℃で３分間、遠心分離して、細胞をペレット化した。ｍＡｂ２（又は対照mAb）の希釈系列を、６０μｌ体積中で細胞と４℃で１時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、二次抗体（mAb2について、抗ヒトFc-488、Jackson ImmunoResearch、109-546-098、又は抗LAG-3対照、C9B7Wについて、抗ラットIgG（H+L）、Alexa Fluor 488、ThermoFisher、A-11006）をＰＢＳ中１：１０００希釈し、５０μｌを、４℃で３０分間、細胞に加えた（プレートは暗闇中に保った）。プレートを洗浄し、その後、細胞を、ＦＡＣＳ  Ｃｅｌｌ  Ｆｉｘ（BD Bioscience、340181）５０μｌ中に１５分間、再懸濁し、その後、洗浄し、１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Biotium、40043）を含有するＰＢＳ  １００μｌ中に再懸濁した。プレートを、Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を除去し、ＦＩＴＣチャネル（488nm/530/30）における蛍光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおけるｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）  ｖｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅを用いてフィッティングした。プレートを、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター（BD Biosciences）において読み取り、データを、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。結果は表１５に示されている。
【０２１３】
【表１５】
2019526273.tif 000016
【０２１４】
代替ｍＡｂ２は、細胞に発現したマウスＬＡＧ−３及び細胞に発現したマウスＰＤ−Ｌ１と結合することができた。細胞に発現したマウスＬＡＧ−３との代替ｍＡｂ２の結合親和性は、抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２のヒトＬＡＧ−３に対する親和性とおよそ同じであり（２．５から４．２ｎＭと比較して２．３から３．８ｎＭ）、細胞に発現したマウスＰＤ−Ｌ１に対する代替ｍＡｂ２の結合親和性は、抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２のヒトＰＤ−Ｌ１に対する親和性の３倍以内であり（３．１から４．０ｎＭと比較して１１．９から１２．３ｎＭ）、これらのｍＡｂ２が、マウスにおけるインビボ研究での使用のための、抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の適切な代替であることを実証している。
【０２１５】
実施例３：Ｔ細胞活性化アッセイ及びＳＥＢアッセイにおけるｍＡｂ２分子の活性
３．１  Ｔ細胞活性化アッセイ
ＤＯ１１．１０  ＯＶＡ  Ｔリンパ球ハイブリドーマ細胞株及びＬＫ３５．２  Ｂリンパ球ハイブリドーマ細胞株に基づいたＩＬ−２放出アッセイを、ｍＡｂ２の機能的スクリーニングのために用いた。ＩＬ−２放出はＴ細胞活性化のマーカーである。内因性マウスＰＤ−１を発現するＴ細胞に、空ベクター（pLVX）又はヒトＬＡＧ−３構築物をトランスフェクションした。Ｂ細胞に、空ベクター（pLVX）又はヒトＰＤ−Ｌ１構築物をトランスフェクションした。
【０２１６】
これらの４個の細胞株の３つの組合せを、ｍＡｂ２によるＴ細胞活性化を試験するために並べて用いた：
・抗ＰＤ−Ｌ１活性についてのＤＯ１１．１０  ｐＬＶＸ＋ＬＫ３５．２  ｈＰＤ−Ｌ１；
・抗ＬＡＧ−３活性についてのＤＯ１１．１０  ｈＬＡＧ−３  ＋  ＬＫ３５．２  ｐＬＶＸ；
・同時の抗ＬＡＧ−３／抗ＰＤ−Ｌ１活性についてのＤＯ１１．１０  ｈＬＡＧ−３＋ＬＫ３５．２  ｈＰＤ−Ｌ１
【０２１７】
全てのｍＡｂ２（全て、LALA変異を含有する）を、このＴ細胞活性化アッセイにおいて２回、試験した。カニクイザルＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１との交差反応性を、機能性Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、カニクイザル標的（cPD-L1及びcLAG-3）を過剰発現する細胞を用いて試験した。
【０２１８】
ＬＡＧ−３を過剰発現するＴ細胞株の作製
レンチウイルス形質導入方法論を用いて、ヒト、カニクイザル、又はマウスＬＡＧ−３を過剰発現するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングシステム（カタログ番号631249）を用いて作製した。マウスＬＡＧ−３  ｃＤＮＡ（配列番号１２７）、ヒトＬＡＧ−３  ｃＤＮＡ（配列番号１２６）、又はカニクイザルＬＡＧ−３  ｃＤＮＡ（配列番号１２８）を含有するＬｅｎｔｉ−Ｘ発現ベクター（pLVX）（カタログ番号631253）を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングミックスを用いて、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞株（カタログ番号632180）へ同時トランスフェクションして、ウイルスを作製した。ＤＯ１１．１０細胞株に、作製されたレンチウイルスベクターを用いて、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングシステムで形質導入した。
【０２１９】
ＰＤ−Ｌ１を過剰発現する抗原提示細胞の作製
レンチウイルス形質導入方法論を用いて、ヒト、カニクイザル、又はマウスＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＬＫ３５．２  Ｂ細胞リンパ腫（ATCC、HB-98）を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングシステム（カタログ番号631249）を用いて作製した。マウスＰＤ−Ｌ１  ｃＤＮＡ（配列番号１３０）、ヒトＰＤ−Ｌ１  ｃＤＮＡ（配列番号１２９）、又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１  ｃＤＮＡ（配列番号１３１）を含有するＬｅｎｔｉ−Ｘ発現ベクター（pLVX）（カタログ番号631253）を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングミックスを用いて、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞株（カタログ番号632180）へ同時トランスフェクションして、ウイルスを作製した。ＬＫ３５．２細胞株に、作製されたレンチウイルスベクターを用いて、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングシステムで形質導入した。
【０２２０】
培地及びペプチド
細胞培養培地：ＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）  １０％  ＦＢＳ（Gibco、10270-106）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070）、１μｇ／ｍｌ  ピューロマイシン（Gibco、A11138-03）
実験培地：ピューロマイシンを含まない完全ＤＯ１１．１０培養培地
ＯＶＡペプチド（MW = 1773.9Da）：Ｈ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ−ＯＨ（Pepscan）
【０２２１】
細胞：
・ＤＯ１１．１０  ｈＬＡＧ−３：ヒトＬＡＧ−３を過剰発現するためにレンチウイルスベクターを形質導入されたＤＯ１１．１０  Ｔ細胞ハイブリドーマ；
・ＤＯ１１．１０  ｐＬＶＸ：空レンチウイルスベクターを形質導入されたＤＯ１１．１０  Ｔ細胞ハイブリドーマ；
・ＤＯ１１．１０  ｃＬＡＧ−３：カニクイザルＬＡＧ−３を過剰発現するためにレンチウイルスベクターを形質導入されたＤＯ１１．１０  Ｔ細胞ハイブリドーマ
・ＬＫ  ３５．２  ｈＰＤ−Ｌ１：ヒトＰＤ−Ｌ１を過剰発現するために、ｈＰＤ−Ｌ１を含有するレンチウイルスベクターを形質導入されたＢ細胞ハイブリドーマ；
・ＬＫ  ３５．２  ＰＬＶＸ：空レンチウイルスベクター（ｐＬＶＸ）を形質導入されたＢ細胞ハイブリドーマ；
・ＬＫ  ３５．２  ｃＰＤ−Ｌ１：カニクイザルＰＤ−Ｌ１を過剰発現するためにレンチウイルスベクターを形質導入されたＢ細胞ハイブリドーマ．
【０２２２】
細胞０．３×１０６個／ｍｌでのＤＯ１１．１０細胞（DO11.10 pLVX細胞又はDO11.10 hLAG-3細胞）を、３×最終濃度での抗体と１：１比で混合した。抗体及びＤＯ１１．１０細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で１時間、インキュベートした。ＬＫ  ３５．２細胞（pLVX及びPD-L1-pLVXの両方）を、細胞３×１０５個／ｍｌ実験培地において、１．５μＭのＯＶＡペプチドと３０分間、インキュベートした。ＬＫ  ３５．２細胞＋ＯＶＡを、ＤＯ１１．１０細胞／処理混合物に、以下の組合せにおいて１：２比で加えた：
ヒト機能的スクリーニング
ＤＯ１１．１０  ｐＬＶＸ＋ＬＫ３５．２  ｈＰＤ−Ｌ１、
ＤＯ１１．１０  ｈＬＡＧ−３＋ＬＫ３５．２  ｐＬＶＸ、
ＤＯ１１．１０  ｈＬＡＧ−３＋ＬＫ３５．２  ｈＰＤ−Ｌ１
カニクイザル交差反応性スクリーニング
ＤＯ１１．１０  ｐＬＶＸ＋ＬＫ３５．２  ｃＰＤ−Ｌ１、
ＤＯ１１．１０  ｃＬＡＧ−３＋ＬＫ３５．２  ｐＬＶＸ、
ＤＯ１１．１０  ｃＬＡＧ−３＋ＬＫ３５．２  ｃＰＤ−Ｌ１
【０２２３】
細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間、インキュベートした。上清を収集し、マウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、88-7024-88、又はR&D systems、SM2000）を用いて、製造会社の使用説明書に従ってアッセイした。プレートを、Ｇｅｎ５ソフトウェア、ＢｉｏＴｅｋでプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍで読み取った。５７０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍの吸光度値から引き算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータのロジスティク曲線フィットに基づいた（Gen5ソフトウェア、BioTek）。ｍＩＬ−２の濃度を、Ｆｃａｂ又はｍＡｂのｌｏｇ濃度に対してプロットし、その結果生じた曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答方程式を用いてフィッティングした。表１６は、対照（84G09 + 25F7）に対するパーセンテージとして計算された、ｍＡｂ２及び対照ｍＡｂのＥＣ５０値及び最大ＩＬ−２放出を示す。図２ＡからＦは、ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９、ＦＳ１８−７−６２／８４Ｇ０９、又はＦＳ１８−７−７８／８４Ｇ０９、及び対照で処理された細胞株のパネルによるＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。両方の標的が存在する（DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 hPD-L1）Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、ＬＡＧ−３とＰＤ−Ｌ１の両方が阻害された場合だけ、例えば、ｍＡｂ２、又はＬＡＧ−３抗体とＰＤ−Ｌ１抗体の組合せが用いられた場合だけ、ＩＬ−２放出が誘導された。したがって、ｍＡｂ２は、単剤の単独を越える利益を生じる。ＬＡＧ−３（DO11.10 hLAG-3 + LK35.2 pvlx）だけ又はＰＤ−Ｌ１（DO11.10 pvlx + LK35.2 PD-L1）だけに関するアッセイにおいて、ｍＡｂ２は、これらの標的を阻害することにおいて単剤と類似した活性を示し、ｍＡｂ２が、ＬＡＧ−３、ＰＤ−Ｌ１、又はＬＡＧ−３＋ＰＤ−Ｌ１の存在下でＴ細胞活性化をもたらすことができる唯一の単一分子であることを実証した。
【０２２４】
【表１６】
2019526273.tif 000017
【０２２５】
ＤＯ１１．１−／ＬＫ３５．２  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、ｍＡｂ２のうちの１個（LALA変異を含有するFS18-7-9/84G09）を、カニクイザル機能的交差反応性について試験した。図３ＡからＣは、３つの、細胞に基づいたアッセイのパネルにおける結果を示す。ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９は、ｃＬＡＧ−３＋ｃＰＤ−Ｌ１の両方、及びｃＬＡＧ−３又はｃＰＤ−Ｌ１の単独の存在下で、Ｔ細胞活性化を誘導することができ、ｍＡｂ２が、機能的にカニクイザル交差反応性であり、したがって、霊長類に基づいた安全性研究における使用に適していることを示した。
【０２２６】
３．２  ブドウ球菌エンテロトキシンＢアッセイ
３個のｍＡｂ２（全て、LALA変異を含有する）を、ヒトＰＢＭＣに基づいたブドウ球菌エンテロトキシンＢアッセイ（SEBアッセイ）において試験した。ブドウ球菌エンテロトキシンＢは、スーパー抗原であり、抗原提示細胞（APC）上のＭＨＣクラスＩＩ分子及びＴ細胞受容体（TCR）のｖβ鎖と結合し、Ｔ細胞の非特異的活性化及びサイトカイン放出を引き起こす。Ｔ細胞活性化を見るために存在すべき抗原についての必要条件はない。ＳＥＢアッセイは、生理的レベルのチェックポイント阻害剤と共に、刺激されたヒト細胞（PBMC）を用い、ヒト系においてＴ細胞活性化がｍＡｂ２により増強されることを確認するために用いることができる。３個のｍＡｂ２を、４人の異なるドナーに由来する細胞を用いるＳＥＢシステムにおいて試験した。
【０２２７】
増殖したＴ細胞の産生
ＰＭＢＣを、フィコール勾配分離により白血球コーン（leukocyte cone）から単離した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec Ltd、130-096-533）を用いて、製造会社の使用説明書に従って単離した。ヒトＴ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Life technologies、11131D）を、ボルテックスすることにより再懸濁した。ビーズを、無菌１５ｍｌチューブに移し、１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270106）及び１×ペニシリン  ストレプトマイシン（Life Technologies、15140122）を含むＲＰＭＩ（Life Technologies、61870044）１０ｍｌを加えて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを洗浄した。上清を捨てた。３：１のビーズ対細胞の比での、１０％  ＦＢＳ及び１×ペニシリン  ストレプトマイシン溶液、並びに５０ＩＵ／ｍｌ  組換えヒトＩＬ２（Peprotech、200-02-50ug）を含むＲＰＭＩ中細胞１．０×１０６個／ｍｌのＣＤ４＋  Ｔ細胞の必要とされる量を、Ｔ７５フラスコ（Greiner Bio-one、690195）に移し、３７℃＋５％  ＣＯ２でインキュベートした。３日後、細胞を優しく再懸濁し、カウントした。細胞密度を、必要に応じて新鮮な培地（RPMI-10% FBS + ペニシリン  ストレプトマイシン溶液1× + 50IU/mL rhuIL2）を加えることにより、細胞０．８から１×１０６個／ｍｌに維持した。７日目又は８日目において、ＣＤ３／２８ビーズを除去し、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、低減した１０ＩＵ／ｍｌ  ｒｈｕＩＬ２を含む、１０％  ＦＢＳ＋ペニシリン  ストレプトマイシン溶液  １×を含む新鮮な培地ＲＰＭＩの細胞１×１０６個／ｍｌで、一晩、休止させた。細胞を、必要とされるまで凍結保存した。
【０２２８】
ＭｏｉＤＣの作製
手付かずの（Untouched）単球を、ヒトＰＢＭＣからヒトＰａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Miltenyi Biotec Ltd、130-096-537）を用いて、製造会社の使用説明書に従って単離した。単球を、ヒトＭｏ−ＤＣ分化培地（Miltenyi Biotec Ltd、130-094-812）を用いて製造会社の使用説明書に従って、ｉＤＣへ分化させた。
【０２２９】
ＳＥＢアッセイ
増殖したＴ細胞を、実験の１日前に解凍し、ＡＩＭ培地（Gibco、12055-091）で洗浄し、ＡＩＭ培地中細胞１×１０６個／ｍｌで、３７℃、５％  ＣＯ２、一晩、インキュベートした。２μＭ濃度の各抗体／混合物を、ＤＰＢＳ（Gibco、14190-169）中に調製し、培地（３０μｌ＋２７０μｌ）中に１：１０希釈して、２００ｎＭを得た。９６ウェルプレートにおいて、段階希釈を、１：１０（３０μｌ＋２７０μｌ実験培地；２×最終濃度）で行った。ＭｏｉＤＣを解凍し、ＡＩＭ培地で洗浄し、同じドナー由来のＴ細胞と１：１０比で混合した（細胞２×１０５個／ｍｌのＩＤＣ  ５ｍｌを、細胞２×１０６個／ｍｌのＴ細胞  ５ｍｌと組み合わせた）。０．１μｇ／ｍｌのＳＥＢ（Sigma、S4881）２０μｌを、細胞１０ｍｌに加えた。丸底９６ウェルプレートにおいて、細胞／ＳＥＢ混合物  １００μｌを、抗体希釈溶液１００μｌに加え、ウェルあたりＡＩＭ培地２００μｌ中０．１ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢと共に、１０４個のｉＤＣ細胞対１０５個のＴ細胞の比が得られ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００１ｎＭの最終抗体濃度であった。細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で３日間、インキュベートした。上清を収集し、すぐに、ヒトＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems、PDIF50）でアッセイし、又はさらなる分析のために−２０℃で凍結した。アッセイは、ＰＢＡ（DPBS、2% BSA（Sigma、A7906-100G））で１：３０希釈された上清を用いて、キットの製造会社の使用説明書に従って、実施された。ヒトＩＦＮγの濃度を、ｍＡｂ２又はｍＡｂのｌｏｇ濃度に対してプロットし、生じた曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答方程式を用いてフィッティングした。表１７は、４人の異なる細胞ドナー（ドナーAからD）由来の細胞に関する、ＳＥＢアッセイにおけるＥＣ５０値及びＩＦＮγ放出のスパンを示す。図４は、単一のドナーに関する、ＳＥＢアッセイの代表的なプロットを示す。全ての６つのアッセイにおいて、ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２及びＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２＋８４Ｇ０９ＬＡＬＡの組合せは、８４Ｇ０９ＬＡＬＡ  ｍＡｂ単独より高い活性化を示したが、ＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２又は４４２０  ｍＡｂがアッセイされた場合、それらは、有意な活性化を示さなかった。したがって、ＳＥＢアッセイの結果は、より生理学的な系において、ＤＯ１１．１０／ＬＫ３５．２アッセイの結果を確証した。
【０２３０】
【表１７−１】
2019526273.tif 000018
【０２３１】
【表１７−２】
2019526273.tif 000019
【０２３２】
【表１７−３】
2019526273.tif 000020
【０２３３】
実施例４：マウス腫瘍モデルにおけるｍＡｂ２分子のインビボ活性
４．１  ＭＣ３８の非定着腫瘍モデルにおけるｍＡｂ２分子の活性
ＭＣ３８腫瘍が、それらの細胞表面上にＰＤ−Ｌ１を発現すること、並びに腫瘍及び腫瘍周辺における免疫細胞上のＬＡＧ−３発現の増加を生じる高度に免疫原性であることが公知であるため、ＭＣ３８同系腫瘍モデルをこの実験に用いた。
【０２３４】
ＦＳ１８−２９／Ｓ１と呼ばれる、ＬＡＬＡ変異を含有する代替マウスｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−２９／Ｓ１（配列番号１１７及び１１９）を、ＭＣ３８同系マウス腫瘍成長モデルを用いてインビボ活性について試験した。ｍＡｂ２の腫瘍成長を阻害する能力を、ＦＳ１８−２９／４４２０と呼ばれる、ＬＡＬＡ変異を含有するＬＡＧ−３／ニセｍＡｂ２、ＦＳ１８−７−１０８−２９／４４２０（配列番号１３２及び８５）、ベンチマーク抗ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  Ｃ９Ｂ７Ｗ（2B scientific; カタログ番号BE0174-50MG）、ＬＡＬＡ変異を含有するベンチマーク抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  Ｓ１（配列番号１２２及び１１９）、及びｍＡｂ  Ｃ９Ｂ７ＷとＳ１の組合せのそれと比較した。
【０２３５】
それぞれ、週齢８から１０週間かつ体重２０から２５ｇのＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Charles River）を、研究開始の前の１週間、休養させた。全ての動物に、マイクロチップを埋め、固有の識別名を与えた。各コホートは１０匹のマウスを有した。ＭＣ３８結腸癌細胞株（S. Rosenberg、NIH）は、初めに、増殖され、保存され、その後、ＩＭＰＡＣＴ  Ｉプロトコールを用いる病原体についてのＩＤＥＸＸ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈによりプレスクリーニングされ、病原体が含まれないことが示された。ＭＣ３８細胞を、−１５０℃保存から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコにおける１０％  ＦＣＳ（Gibco、10270-106）を含むＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）２０ｍｌに加えた。マウスは、イソフルラン（Abbott Laboratories）を用いて麻酔され、各動物は、左脇腹に細胞２×１０６個の皮下注射を受けた。腫瘍細胞接種から７から８日後、この時点で腫瘍を有しないマウスを、研究から除いた。
【０２３６】
ｍＡｂ２分子及び対照抗体の全部を、注射前の２４時間以内にＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイリングにより分析し、不純物についてチェックした。抗体を、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇの最終濃度に調製し、組合せ研究において第２の抗体と組み合わせた。ｍＡｂ２分子及び対照抗体を、マウスに、腫瘍接種後８日目、１１日目、及び１４日目に腹腔内（IP）注射により投与した。腫瘍の正確な測定値をとり、問題になっている日における任意の薬物投与を実施し、マウスは、治験のリマインダーとして緻密な観察を受けた。腫瘍容積測定値を、ノギスで計って、腫瘍の最長軸及び最短軸を決定した。以下の式を用いて、腫瘍容積を計算した：
Ｌ×（Ｓ２）／２
式中、Ｌ＝最長軸；Ｓ＝最短軸。
【０２３７】
試験は、腫瘍量が制限に近いと見なされた時点の２０日目に停止された。全てのマウスを、安楽死させ、腫瘍を切除し、重量を測定した。
【０２３８】
結果は図５及び６に示されている。ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２（FS18-29/S1）処置されたマウスは、ベンチマークｍＡｂ、Ｃ９Ｂ７ＷとＳ１の組合せで処置されたマウスより有意に少ない重量の最終腫瘍を有した。具体的には、最終腫瘍重量の統計的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ内の両側スチューデントｔ検定を用いて実施し、ＦＳ１８−２９／Ｓ１の投与と、ベンチマーク抗体Ｃ９Ｂ７ＷとＳ１の組合せの投与との間の統計的有意差（p = 0.0125）を実証し、同じ分子により提供されるＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１阻害が、別々の分子により提供されるＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１阻害と比較して、最終腫瘍重量に相乗的効果を生じることを示した。
【０２３９】
代替ｍＡｂ２  ＦＳ１８−２９／Ｓ１はまた、８個の成長するＭＣ３８腫瘍のうちの６個において定着を阻止し、及び残りの２個の成長を遅らせる、腫瘍成長への著しい効果を生じた。ベンチマーク抗ＬＡＧ−３抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組み合わせての投与は、７匹の動物において腫瘍成長を遅らせ、腫瘍を含まない動物はなかった。
【０２４０】
ＦＳ１８−２９／４４２０単独は、腫瘍成長に著しい効果を生じず、最大効力のために、そのｍＡｂ２が抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆａｂを必要とすることを示した。ベンチマーク抗マウスＬＡＧ−３抗体単独は、生じる腫瘍成長にほとんど、又は全く効果を生じず、一方、ベンチマーク抗マウスＰＤ−Ｌ１は、このコホートにおいて７個の腫瘍のうちの１個の定着を阻止し、腫瘍成長を遅らせるといういくらかの全体的効果を生じた。
【０２４１】
同系マウスモデルは、治療的標的を阻害する抗腫瘍効果を試験するための適切なマウス系として受け入れられ、ヒト治療用物質の開発を検証するために広く用いられている。
【０２４２】
４．２  ＭＣ３８の定着腫瘍モデルにおけるｍＡｂ２分子の活性
ＦＳ１８−２９／Ｓ１と呼ばれる、ＬＡＬＡ変異を含有する代替マウスｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−２９／Ｓ１（配列番号１１７及び１１９）を、ＭＣ３８同系マウス腫瘍成長モデルにおいてインビボ活性について試験した。そのｍＡｂ２の腫瘍成長を阻害する能力を、ＦＳ１８−２９／４４２０と呼ばれる、ＬＡＬＡ変異を含有するＬＡＧ−３／ニセｍＡｂ２、ＦＳ１８−７−１０８−２９／４４２０（配列番号１３２及び８５）、ベンチマークＬＡＧ−３  ｍＡｂ  Ｃ９Ｂ７Ｗ、ＬＡＬＡ変異を含有するベンチマークＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  Ｓ１（配列番号１２２及び１１９）、及びＣ９Ｂ７ＷとＳ１の組合せのそれと比較した。
【０２４３】
それぞれ、週齢８から１０週間かつ体重２０から２５ｇのＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Charles River）を、研究開始前の１週間、休養させた。全ての動物に、マイクロチップを埋め、固有の識別名を与えた。各コホートは１０匹のマウスを有した。ＭＣ３８結腸癌細胞株（S. Rosenberg、NIH）は、初めに、増殖され、保存され、その後、ＩＭＰＡＣＴ  Ｉプロトコールを用いて病原体についてＩＤＥＸＸ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈによりプレスクリーニングされ、病原体が含まれないことが示された。ＭＣ３８細胞（およそ３×１０６から５×１０６個）を、−１５０℃保存から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコにおける１０％  ＦＣＳ（Gibco、10270-106）を含むＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）２０ｍｌに加えた。マウスは、イソフルラン（Abbott Laboratories）を用いて麻酔され、各マウスの左脇腹へ１００μｌ中２×１０６個の細胞が皮下注射された。腫瘍細胞接種から７から８日後、マウスを、研究の開始のために適当な健康及び腫瘍成長について日常的にモニターした。マウスの大部分が、直径５から１０ｍｍの腫瘍を示した時、それらを分類し、再び、研究コホートへランダム化した。この時点で適切なサイズの腫瘍をもたなかったいかなるマウスも研究から除いた。
【０２４４】
ｍＡｂ２分子及び対照抗体の全部を、注射前の２４時間以内にＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイリングにより分析し、不純物についてチェックした。抗体を、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇの最終濃度に調製し、組合せ研究のために第２の抗体と組み合わせた。ｍＡｂ２分子及び対照抗体を、マウスに、腫瘍接種後１５日目、１８日目、及び２１日目にＩＰ注射により投与した。動物を、盲検方式で週３回、麻酔下、健康スクリーニングし、その時間中に、腫瘍の正確な寸法を計った。腫瘍容積測定値をノギスで計って、腫瘍の最長軸及び最短軸を決定した。腫瘍容積を計算するために用いられた式は、上記のセクション４．１に示されている通りであった。
【０２４５】
試験は、腫瘍量が制限に近いと見なされた時点の２４日目に停止された。全てのマウスを、安楽死させ、腫瘍を切除し、重量を測定した。結果は図７及び８に示されている。
【０２４６】
マウスでの同系腫瘍モデルおける腫瘍成長の効果的な制御又は抑制は、初期時点での（４０ｍｍ３未満の腫瘍容積で開始する）治療介入を通して最も良く達成される。介入の投与が遅くなればなるほど、腫瘍成長に関してプラス効果を観察することが難しくなり、やはり、おそらく、これは、ヒト臨床設定における状況により類似している。
【０２４７】
ＦＳ１８−２９／Ｓ１は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、初期時点で与えられた場合、免疫能力のあるマウスで、ＭＣ３８結腸癌の腫瘍成長を抑制すること、及びそれの定着を阻止することの両方にプラス効果を生じた。より遅い時点で（５０から１２５ｍｍ３の腫瘍容積で開始する）投与された場合、ＦＳ１８−２９／Ｓ１は、ベンチマーク抗体の組合せとちょうど同じくらい、腫瘍成長を抑制することに効果的であった。ＦＳ１８−２９／４４２０単独は、腫瘍成長に顕著な影響を生じることはなく、Ｓ１及びＣ９Ｂ７Ｗのどちらも、生じた腫瘍成長に穏やかな効果を生じた。
【０２４８】
４．３  ＣＴ２６非定着腫瘍モデルにおけるｍＡｂ２分子の活性
ＣＴ２６腫瘍は、それらの細胞表面上にＰＤ−Ｌ１を発現すること、並びに腫瘍及び周辺における免疫細胞上のＬＡＧ−３発現の増加を生じる高度に免疫原性であることが公知であるため、ＣＴ２６同系腫瘍モデルをこの実験に用いた。
【０２４９】
ＦＳ１８−２９／Ｓ１と呼ばれる、ＬＡＬＡ変異を含有する代替マウスｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−２９／Ｓ１（配列番号１１７及び１１９）、及びＦＳ１８−３５／Ｓ１と呼ばれる、ＬＡＬＡ変異を含有するＦＳ１８−７−１０８−３５／Ｓ１（配列番号１２０及び１１９）を、ＣＴ２６同系マウス腫瘍成長モデルにおいてインビボ活性について試験した。そのｍＡｂ２の腫瘍成長を阻害する能力を、ＦＳ１８−２９／４４２０と呼ばれる、ＬＡＬＡ変異を含有するＬＡＧ−３／ニセｍＡｂ２、ＦＳ１８−７−１０８−２９／４４２０（配列番号１３２及び８５）、及びＦＳ１８−３５／４４２０と呼ばれる、ＬＡＬＡ変異を含有するＦＳ１８−７−１０８−３５／４４２０（配列番号１３３及び８５）、ベンチマークＬＡＧ−３  ｍＡｂ  Ｃ９Ｂ７Ｗ、ＬＡＬＡ変異を含有するベンチマークＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  Ｓ１（配列番号１２２及び１１９）、並びにＣ９Ｂ７ＷとＳ１の組合せのそれと比較した。
【０２５０】
それぞれ、週齢８から１０週間かつ体重２０から２５ｇのＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）を、研究開始前の１週間、休養させた。全ての動物に、マイクロチップを埋め、固有の識別名を与えた。各コホートは１０匹のマウスを有した。ＣＴ２６結腸癌細胞株（ATCC、CRL-2638）は、初めに、増殖され、保存され、その後、ＩＭＰＡＣＴ  Ｉプロトコールを用いて病原体についてＩＤＥＸＸ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈによりプレスクリーニングされ、病原体が含まれないことが示された。ＣＴ２６細胞（およそ３×１０６から５×１０６個）を、−１５０℃保存から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコにおける１０％  ＦＣＳ（Gibco、10270-106）を含むＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）２０ｍｌに加えた。腫瘍細胞接種から７から８日後、マウスを、研究の開始のために適当な健康及び腫瘍成長について日常的にモニターした。マウスの大部分が、直径３から５ｍｍ３の腫瘍を示した時、それらを分類し、再び、研究コホートへランダム化した。この時点で腫瘍をもたなかったいかなるマウスも研究から除いた。
【０２５１】
ｍＡｂ２分子及び対照抗体の全部を、注射前の２４時間以内にＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイリングにより分析し、不純物についてチェックした。抗体を、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇの最終濃度に調製し、組合せ研究のために第２の抗体と組み合わせた。ｍＡｂ２分子及び対照抗体を、マウスに、腫瘍接種後８日目、１１日目、及び１４日目に投与した。動物を、健康スクリーニングし、その時間中に、腫瘍の正確な寸法を計った。腫瘍容積測定値をノギスで計って、腫瘍の最長軸及び最短軸を決定した。腫瘍容積を計算するために用いられた式は、上記のセクション４．１に示されている通りであった。
【０２５２】
試験は、腫瘍量が制限に近いと見なされた時点の２０日目に停止された。全てのマウスを、安楽死させ、腫瘍を切除し、重量を測定した。結果は図９及び１０に示されている。
【０２５３】
最終腫瘍重量の統計的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ内の両側スチューデントｔ検定を用いて実施した。腫瘍成長曲線の統計的解析を、統計的計算のためのＲ  Ｐｒｏｊｅｃｔから利用できる統計的モデリングパッケージ、ｓｔａｔｍｏｄ（Elsoら、2004及びBaldwinら、2007）からの比較成長曲線関数を用いて決定した。
【０２５４】
腫瘍成長を抑制することにおいて、ＦＳ１８−３５／Ｓ１  ｍＡｂ２とＩｇＧ対照（通常の成長）との間に実証された統計的有意差があった。そのような統計的有意差は、ＩｇＧ対照群に対する、又はこの試験における任意の他のコホートに対する、ベンチマーク抗体の組合せ又はＦＳ１８−２９／Ｓ１  ｍＡｂ２のいずれに関しても観察されなかった。
【０２５５】
ＣＴ２６腫瘍モデルは、活動的で速く成長する腫瘍モデルであり、本質的に、マウスの腸転移を発生させる傾向にあり、結果として、非常に限られた治療濃度域を有するものである。
【０２５６】
驚くべきことに、ベンチマークＬＡＧ−３抗体とＰＤ−Ｌ１抗体の組合せは、ＩｇＧ対照コホートと比較して腫瘍成長を有意に抑制することはなかった。しかしながら、ＦＳ１８−３５／Ｓ１処置されたコホートは、ＩｇＧ対照と比較して、成長の有意な抑制を示した。ＦＳ１８−２９／Ｓ１は、ＩｇＧ対照と比較して、同様に腫瘍成長を抑制したが、それは、統計的に有意ではなかった。この試験は、マウス反応性ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２が、ベンチマークモノクローナル抗体の組合せの投与と少なくとも同じ程度で、腫瘍成長を遅らせることにおいてプラス効果を実証したという第２の腫瘍モデルを示している。
【０２５７】
４．４  ＭＣ３８非定着腫瘍モデルにおける腫瘍成長阻害へのＬＡＬＡ変異の効果
２個のｍＡｂ２（FS18-7-108-29/S1 LALA及びFS18-7-108-29/S1）を、Ｆｃ領域にＬＡＬＡ変異を含む、及び含まないこれらのｍＡｂ２の抗腫瘍活性における潜在的な差を調べるために試験した。ＬＡＬＡ変異を含む（配列番号１１７及び１１９）、及びＬＡＬＡ変異を含まない（配列番号１１８及び１１９）、ＦＳ１８−２９／Ｓ１と呼ばれる、代替マウスｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−２９／Ｓ１を、ＭＣ３８同系マウス腫瘍成長モデルを用いてインビボ活性について試験した。そのｍＡｂ２の腫瘍成長を阻害する能力を、ＦＳ１８−２９／４４２０ＬＡＬＡ及びＦＳ１８−２９／４４２０と呼ばれる、ＬＡＬＡ変異を含む（配列番号１３２及び８５）、及びＬＡＬＡ変異を含まない（配列番号１３４及び８５）、ＬＡＧ−３／ニセｍＡｂ２、ＦＳ１８−７−１０８−２９／４４２０、並びにＬＡＬＡ変異を含む、及び含まないＬＡＧ−３／ニセｍＡｂ２と、ＬＡＬＡ変異を含む（配列番号１２２及び１１９）、及びＬＡＬＡ変異を含まない（配列番号１２３及び１１９）、ベンチマークＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  Ｓ１との組合せのそれと比較した。
【０２５８】
それぞれ、週齢８から１０週間かつ体重２０から２５ｇのＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Charles River）を、研究開始前の１週間、休養させた。全ての動物に、マイクロチップを埋め、固有の識別名を与えた。各コホートは１０匹のマウスを有した。ＭＣ３８結腸癌細胞株（S. Rosenberg、NIH）は、初めに、増殖され、保存され、その後、ＩＭＰＡＣＴ  Ｉプロトコールを用いて病原体についてＩＤＥＸＸ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈによりプレスクリーニングされ、病原体が含まれないことが示された。ＭＣ３８細胞（およそ３×１０６から５×１０６個）を、−１５０℃保存から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコにおける１０％  ＦＣＳ（Gibco、10270-106）を含むＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）２０ｍｌに加えた。マウスは、イソフルラン（Abbott Laboratories）を用いて麻酔され、各マウスの左脇腹へ１００μｌ中２×１０６個の細胞が皮下注射された。マウスを、観察の下、回復させ、接種日付を０日目と表した。腫瘍細胞接種から７から８日後、マウスを、研究の開始のために適当な健康及び腫瘍成長について日常的にモニターした。この時点で腫瘍をもたなかったいかなるマウスも研究から除いた。
【０２５９】
ｍＡｂ２分子及び対照抗体の全部を、注射前の２４時間以内にＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイリングにより分析し、不純物についてチェックした。抗体を、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇの最終濃度に調製し、組合せ研究において第２の抗体と組み合わせた。ｍＡｂ２分子及び対照抗体を、マウスに、腫瘍接種後８日目、１１日目、及び１４日目にＩＰ注射により投与した。動物を、盲検方式で週３回、麻酔下、健康スクリーニングし、その時間中に、腫瘍の正確な寸法を計った。腫瘍容積測定値をノギスで計って、腫瘍の最長軸及び最短軸を決定した。腫瘍容積を計算するために用いられた式は、セクション４．１に示されている通りであった。
【０２６０】
全てのマウスを、安楽死させ、腫瘍を切除し、重量を測定した。結果は図１１及び１２に示されている。
【０２６１】
この試験は、ＡＤＣＣ活性を抑止するＬＡＬＡ変異の存在又は非存在が、ＭＣ３８結腸癌モデルにおいて腫瘍成長に統計的に有意な効果を生じないことを確認したが、ＬＡＬＡ変異を含むそれらのｍＡｂ２は、腫瘍成長抑制の増加を生じる傾向があった。それでもやはり、ＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１を発現するＴ細胞に対するＡＤＣＣ活性を阻害する可能性がある変異を含むための論理的根拠は、ＬＡＬＡ変異が、ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の抗腫瘍活性への有害な効果を生じないとして正当化される。ＬＡＬＡ変異の包含が、ＰＤ−Ｌ１抗体についてのみ重大な意味をもつことを示唆するいくつかの証拠があった。
【０２６２】
この試験はまた、ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２が、個々の抗体（LAG-3 LALA + PD-L1 LALA）の投与を越える効力の増加を生じ得るかどうかを調べた。この場合、これらの２つのコホートの間で有意差はなかった。どちらの群も、ＭＣ３８結腸癌モデルにおいて成長を抑制した。
【０２６３】
４．５  結論
全体的に見て、ＬＡＧ−３とＰＤ−Ｌ１の両方に対する結合部位を含むｍＡｂ２分子が、試験されたマウスモデルにおけるマウスに投与された場合、腫瘍成長抑制に相乗的効果があることは、上記結果から明らかである。これらの結果に基づいて、本発明の抗体分子が、ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１をそれぞれ、結合する２つの別々の分子の投与より、ヒト患者におけるがんの処置に、特に腫瘍成長を抑制することに、より優れた効果を示すだろうことが予想される。
【０２６４】
実施例５
Ｔ細胞ＬＡＧ−３発現へのｍＡｂ２処置の効果
ＦＳ１８−２９／Ｓ１と呼ばれる、ＬＡＬＡ変異を含有する、代替マウスｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−２９／Ｓ１（配列番号１１７及び１１９）が腫瘍量の減少をもたらした機構を、オボアルブミンを発現するＭＣ３８同系マウス腫瘍成長モデル（MC38.OVA）において試験した。ＦＳ１８−２９／Ｓ１の効果を、ＦＳ１８−２９／４４２０と呼ばれる、ＬＡＬＡ変異を含有するＬＡＧ−３／ニセｍＡｂ２、ＦＳ１８−７−１０８−２９／４４２０（配列番号１３２及び８５）、ＬＡＬＡ変異を含有するベンチマークＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  Ｓ１（配列番号１２２及び１１９）、及びＦＳ１８−２９／４４２０とＳ１の組合せの効果と比較した。
【０２６５】
移植の当日、培養されたＭＣ３８．ＯＶＡ細胞を、対数期成長（培養密度約７５％）中に採取し、ＰＢＳ中、細胞１×１０７個／ｍＬの濃度で再懸濁した。まず各動物をイソフルランで麻酔し、その後、続いて、１×１０６  ＭＣ３８．ＯＶＡ細胞（懸濁液０．１ｍＬ）を各試験動物の左脇腹へ皮下移植することにより腫瘍を惹起した。腫瘍細胞移植から１１日後、動物を、決定論的ランダム化方法を用いて、３２から６２．５ｍｍ３の個々の腫瘍容積を有する５つの群へランダム化した。動物に、腫瘍接種後１２日目、１４日目、及び１６日目に１０ｍｇ／ｋｇ  抗体又はｍＡｂ２で投与し、腫瘍接種後１９日目及び２３日目に３匹の動物／群から腫瘍を収集した。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）分散装置（Dissociator）を用いて、腫瘍を分散させ、その後、細胞を、７０μｍ細胞ストレーナーを通して篩にかけて、単一細胞懸濁液を得た。９６ウェルプレート上の細胞１×１０６個／ウェルを、ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、１：３０００生存率染色及びＦｃブロック（抗CD16/32抗体）を行った。ＦＡＣＳ分析のために細胞を、ＣＤ４３、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＦｏｘＰ３、及びＬＡＧ−３に対する標識抗体を含むマスターミックスを用いて染色した。ＦｏｘＰ３細胞内染色について、細胞を固定し、ＦｏｘＰ３抗体での染色の前に透過処理した。試料を、コンペンセーションマトリックスを有し、かつ最低限５００，０００個の事象がカウントされるＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターに流した。
【０２６６】
この実験において、ＴＩＬは、抗体／ｍＡｂ２の３回目の用量が投与された後のＬＡＧ−３発現について調べられ、その時、対照処置とｍＡｂ２処置の間で腫瘍の成長の分離が見られるが、その前に腫瘍サイズ間に大きな差があり、それは結果を歪め得る。この時点において、ＴＩＬ上のＬＡＧ−３発現は、ｍＡｂ２  ＦＳ１８−２９／Ｓ１、又はＦＳ１８−２９／４４２０とＳ１の組合せで処置された動物において、著しく減少することが見出された。具体的には、図１３に示されているように、ＣＤ８、ＣＤ４、及びＦｏｘＰ３腫瘍浸潤リンパ球（TIL）上のＬＡＧ−３発現が、最後の抗体／ｍＡｂ２投与から３日後及び７日後それぞれに対応する、腫瘍接種後１９日目及び２３日目に、ＦＳ１８−２９／Ｓ１での処置後に減少した。ＬＡＧ−３発現の減少は、２３日目においてよりはっきりしていたが、１９日目においてもなお明白であった。ＦＳ１８−２９／４４２０とＳ１の組合せを与えられた動物もまた、ＴＩＬ上のＬＡＧ−３発現の減少を示すが、その効果は、２３日目まで遅れ、一方、個々に投与されたＦＳ１８−２９／４４２０又はＳ１での処置は、ＴＩＬ上のＬＡＧ−３発現へほとんど、又は全く効果を生じなかった。
【０２６７】
これらの結果は、ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１の二重阻害が、ＴＩＬによるＬＡＧ−３発現の減少に必要とされることを示しているが、この現象は、ＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１に対する単一作用物質で処置された動物において見られなかったためである。理論に縛られるつもりはないが、二重の抗ＬＡＧ−３と抗ＰＤ−Ｌ１の処置が、ＴＩＬ上のＬＡＧ−３発現の減少をもたらし、それにより、ＬＡＧ−３の阻害効果を低下させ、ＴＩＬが疲弊を克服することを可能にすると考えられる。いったんＴＩＬが活性化すると、それらは、腫瘍により発現したネオ抗原を認識し、それに対して応答を開始することができる。したがって、これは、抗ＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２での処置が、腫瘍量の低減を生じる機構であると考えられる。
【０２６８】
実施例６：ｍＡｂ２の抗体依存性細胞傷害及び補体依存性細胞傷害活性
ＩｇＧ１抗体は、通常、その分子の定常領域内の保存された相互作用部位を介してエフェクター機能を示す。これらには、単球／マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞、好中球、及び他の顆粒球上に発現したＦｃγＲとの結合により媒介される抗体依存性細胞傷害（ADCC）、並びに、Ｃ１ｑ補体成分との結合により惹起される補体カスケードの誘導により媒介される補体依存性細胞傷害（CDC）が挙げられる。ＬＡＧ−３は、主に、活性化Ｔ細胞上に発現し、ＰＤ−Ｌ１は、これらだけでなく、腫瘍細胞上にも高レベルで発現するため、ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９（配列番号９４及び１１６）のＡＤＣＣ及びＣＤＣを誘導する能力を調べた。
【０２６９】
具体的には、ＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１を発現する細胞のＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９処理、続いて、ＮＫ細胞か補体のいずれかとのインキュベーションが、それぞれの標的細胞の溶解を誘導するかどうかが試験された。加えて、ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９は、二重特異性抗体であるため、その特異性の一方への標的会合が、他方の特異性についての標的を発現する細胞に対するエフェクター機能に影響するかどうかもまた試験された。
【０２７０】
ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９のエフェクター機能を理解することは、いくつかの理由のために有用であり、その理由には、ＬＡＬＡ変異などのエフェクター機能を低下させる変異が、腫瘍殺害に関与するＬＡＧ−３発現エフェクターＴ細胞を、ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９媒介性ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣから保護するために、その分子に含まれるべきかどうかを決定することが挙げられる。
【０２７１】
６．１  研究デザイン
ＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１を組換え的に発現するＲａｊｉ細胞を、全てのアッセイに用い、標的タンパク質の組換え発現とは無関係に、加えられた補体及びＮＫ細胞調製物の機能活性を実証するために、リツキシマブのジェネリックバージョンで標的にするための対照としてＣＤ２０のそれらの内因性発現を用いた。標的発現は、これらの実験の前に確認された。
【０２７２】
ＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１を発現する細胞への基本的ＣＤＣ活性を決定するために、この活性を、基質の蛍光色素（Promega製のCytoTox-ONE（商標））への変換により測定されるＬＤＨ放出を用いて、測定した。ＬＡＧ−３発現細胞とＰＤ−Ｌ１発現細胞の両方を含む細胞混合物におけるどの標的細胞が、溶解されることになるかを測定するために、生細胞から排除される蛍光色素を用いて死細胞を検出する、ｍＡｂ２／抗体とのインキュベーション後の、異なって蛍光標識された標的細胞のフローサイトメトリにより、示差的ＣＤＣが測定された。
【０２７３】
ＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１を発現する細胞へのＡＤＣＣ活性を決定するために、この活性を、凍結ＰＢＭＣから単離されたＮＫ細胞を用いて測定し、ＬＤＨ放出を、比色分析（Promega製のCytoTox 96）で測定した。全てのこれらの研究について、様々なアイソタイプ及びＦｃ配置におけるリツキシマブを対照として用いた。ＡＤＣＣを示差的に測定するための信頼できる方法は知られておらず、それゆえに、示差的ＡＤＣＣ活性は測定されなかった。
【０２７４】
全ての実験において、ＰＤ−Ｌ１特異的ｍＡｂ（84G09）及びＬＡＧ−３特異的ｍＡｂ（25F7）を対照として用いた。陰性対照としてか、又はＣＤＣバックグラウンド活性を導くためのいずれかとして用いられるＩｇＧアイソタイプ対照（4420）もまた用いた。それぞれの抗体及びｍＡｂ２（25F7を除く）のＬＡＬＡバージョンもまた、ＣＤＣ及びＡＤＣＣアッセイにおいて、この変異のこれらのエフェクター機能への効果を決定するために、ＩｇＧ１野生型と比較した。
【０２７５】
６．２  材料及び方法
６．２．１  ＣＤＣアッセイ
リツキシマブを含む全ての抗体／ｍＡｂ２を、１０点の１／２段階希釈で希釈した。用いられる最高濃度でのＩｇＧ（4420 LALA）を含有する対照ウェルもまた調製した。ＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１をそれぞれ、組換え的に発現するＲａｊｉ細胞の細胞懸濁液を、ＬＤＨ放出アッセイのために無血清培地中に調製し、調製された抗体／ｍＡｂ２の同体積に加えた。
【０２７６】
フローサイトメトリに基づいたＣＤＣアッセイについて、５×１０７細胞の細胞懸濁液を調製し、無血清培地中０．５μＭ  ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  ｄｅｅｐ  ｒｅｄ（CellTracker（商標）Deep Red、Thermo Fisher、#C34565）か又は５μＭ  ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（CellTracker（商標）Green CMFDA（５−クロロメチルフルオレセインジアセテート、Thermo Fisher、# C7025）に再懸濁した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を無血清培地中で洗浄し、調製された抗体／ｍＡｂ２含有ウェルに、直接、加えるか、又は同体積の他の、異なって染色された細胞株と組み合わせて、その後、上記のような抗体／ｍＡｂ２含有ウェルに加えた。両方のアッセイについて、細胞培養条件下での３０分間のインキュベーション後、無血清培地中１０％のベビーウサギ補体（ベビーウサギ補体、TEBU-bio、#CL3441）の同体積をウェルにつぎ足した。プレートを、細胞培養条件で４時間、インキュベートした。ＬＤＨ放出ＣＤＣアッセイについて、１００％溶解対照を、４４２０  ＬＡＬＡ処理されたウェルの半分にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００を加えることにより作製し、Ｃｙｔｏｔｏｘアッセイを、製造会社の使用説明書（CytotoxOne、Promega、G7891）に従って実施した。読み取りを得た後、１００％溶解対照からのシグナルを、１００％に設定し、試料ウェルからのシグナルを、そのレベルに対するパーセンテージとして計算した。
【０２７７】
フローサイトメトリに基づいたＣＤＣアッセイについて、インキュベーション時間の終わりに、死細胞色素（SYTOX（登録商標）Blue Dead Cell Stain、Thermo Fisher、#S34857）を、ＰＢＳ中５００／１に希釈し、ウェルに同体積をつぎ足した。ＦＳＣ及びＳＳＣに基づいて無傷細胞集団に関してゲーティングするＣｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーターでフローサイトメトリを実施し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ陽性細胞集団とＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ陽性細胞集団の両方のＳｙｔｏｘ陽性細胞（チャネルPB450）のパーセンテージを検出した。
【０２７８】
６．３．２  ＡＤＣＣアッセイ
ＡＤＣＣを、以前に記載されているように測定した（Broussas, Matthieu; Broyer, Lucile; 及びGoetsch, Liliane．（2013）  Evaluation of Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity Using Lactate Dehydrogenase（LDH）  Measurement in Glycosylation Engineering of Biopharmaceuticals: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. New York: Springer Science + Business Media. 988巻、305-317ページ）。簡単に述べれば、標的細胞を、抗体とプレインキュベートし、その後、ヒトＰＢＭＣから単離された初代ＮＫ細胞（NK細胞単離キット、Miltenyi Biotec、130-092-657）を２０対１の比で、４時間、加えた。細胞傷害性アッセイを、製造会社の使用説明書（CytoTox 96非放射性細胞傷害性アッセイ、Promega、G1780）に従って実施した。％溶解を、エフェクター細胞及び標的細胞の自発性溶解を考慮に入れて、１００％標的細胞溶解に基づいて計算した。
【０２７９】
６．３  結果及び結論
６．３．１  ＣＤＣアッセイ
ＰＤ−Ｌ１発現Ｒａｊｉ細胞は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブにより標的にされ、その結果、一般的なＬＤＨ放出によりＣＤＣを測定する場合、６０％未満の最大溶解を生じた。抗ＰＤ−Ｌ１抗体８４Ｇ０９（mAb2 FS18-7-9/84G09のF(ab)2部分を含む）、及びＩｇＧ１型式におけるＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９は、より高い最大溶解及びまた、より高い溶解作用強度を示し、ＩｇＧ１型式におけるリツキシマブにより必要とされる最大半量の用量の約半分の最大半量の用量と推定された。これは、ＬＡＧ−３結合部位の８４Ｇ０９抗体への導入が、そのＰＤ−Ｌ１ターゲティング活性を作用強度又は最大応答に関して変化させなかったことを示しており、どちらも、８４Ｇ０９とＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９が比較された場合、非常に類似していたからである。ＬＡＬＡ変異の導入は、リツキシマブ、８４Ｇ０９、及びＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９についての最大応答の低下を示したが、作用強度は、８４Ｇ０９及びＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９についてのみ低下した。予想通り、抗ＬＡＧ−３抗体２５Ｆ７は、ＰＤ−Ｌ１発現Ｒａｊｉ細胞の細胞生存率に効果を生じず、これらの細胞がヒトＬＡＧ−３を発現していなかったためである。これらの結果は図１４Ａに示されている。
【０２８０】
ＬＡＧ−３発現Ｒａｊｉ細胞は、抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブによりＣＤＣについて標的にされるが、ＬＡＧ−３抗体２５Ｆ７は、さらにより良い作用強度を示し、リツキシマブについて必要される最大半量の用量の約半分の最大半量の用量の推定値であった。ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９を含むその他の抗体のいずれも、ＬＡＧ−３発現Ｒａｊｉ細胞に対して少しのＣＤＣ活性も示さなかった。ＬＡＬＡ変異の導入は、リツキシマブのＣＤＣ活性に非常に限られた効果を生じた（図１４Ｂ）。
【０２８１】
６．３．２  示差的ＣＤＣアッセイ
ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９又は対照抗体で処理された時、どの標的発現細胞が溶解されたかを区別するために、フローサイトメトリを使用する示差的ＣＤＣアッセイを本発明者らは開発した。このアッセイを用いて、上記の基本的ＬＤＨ放出ＣＤＣアッセイからの結果を確認した。生細胞のパーセンテージに効果を生じないＩｇＧアイソタイプ対照抗体（4420）と比較して、リツキシマブは、ＰＤ−Ｌ１発現細胞とＬＡＧ−３発現細胞の両方の、生細胞の低減及び死細胞の増加を媒介した。しかしながら、ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９は、ＬＡＧ−３発現細胞に効果を生じなかったが、ＰＤ−Ｌ１発現細胞を非常に効率的に溶解した。同様に、ＬＡＧ−３特異的抗体２５Ｆ７とＰＤ−Ｌ１抗体８４Ｇ０９の混合物もまた、生細胞における用量依存性減少、及び死細胞における相互交換の増加を示したが、ＬＡＧ−３発現細胞の最大溶解は、かろうじて細胞の５０％を超えるだけであったが、試験された全ての抗体の最大溶解を達成するための最低用量である、およそ１ｎＭの濃度ですでに達成された。これは、ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９のＣＨ３ドメインにおけるＬＡＧ−３結合部位が、ＬＡＧ−３発現標的細胞のＣＤＣ媒介性溶解を誘導しないという前の所見を確証している。加えて、この実験は、ＬＡＧ−３発現細胞の存在が、ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９のＰＤ−Ｌ１発現細胞へのＣＤＣ活性に効果を生じないことを示している。結果は、図１５に示されている。
【０２８２】
６．３．３  ＡＤＣＣアッセイ
ＰＤ−Ｌ１発現Ｒａｊｉ細胞は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ、ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９、及び８４Ｇ０９によりＡＤＣＣについて、非常に類似した効力及び作用強度で標的にされ、細胞のおよそ４０％の最大溶解を生じた。ＬＡＬＡ変異を含有する、リツキシマブ及び８４Ｇ０９は、ＰＤ−Ｌ１発現標的細胞のＡＤＣＣ媒介性溶解を示さず、ＬＡＬＡ変異を含有するＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９は、皆無か又は非常に低いＡＤＣＣ媒介性溶解を示した。ＬＡＬＡ変異を含む、及び含まないＬＡＧ−３特異的抗体２５Ｆ７及びアイソタイプ対照４４２０は、このアッセイにおいて活性を示さなかった。
【０２８３】
これらの結果は、ＬＡＧ−３結合部位の抗体８４Ｇ０９への導入が、そのＰＤ−Ｌ１標的型ＡＤＣＣ活性を、作用強度又は最大応答において変化させなかったことを示しているが、これは、どちらもＰＤ−Ｌ１特異的抗体８４Ｇ０９と非常に類似していたからである。ＬＡＬＡ変異の導入は、ＡＤＣＣ活性の抑止を生じた（図１６Ａ）。
【０２８４】
ＬＡＧ−３発現Ｒａｊｉ細胞は、リツキシマブ及び２５Ｆ７により、ＡＤＣＣ媒介性溶解について標的にされ、約４０％の最大溶解を生じた。ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９もまた、ＬＡＧ−３発現細胞の溶解をＡＤＣＣにより媒介するが、それは、ずっとより低い作用強度及び効力であり、２．５ｎＭ濃度で２０％弱の溶解に達するのみであった。ＬＡＬＡ変異の導入は、リツキシマブ及びＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９の全てのＡＤＣＣ活性を抑止した。ＬＡＬＡ変異を含む、及び含まない８４Ｇ０９及びアイソタイプ対照４４２０は、予想通り、このアッセイにおいてＡＤＣＣ活性を示さず、これらの抗体はＬＡＧ−３に結合しないためである（図１６Ｂ）。
【０２８５】
配列表
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−９  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−９  ＣＤループ  −  ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号２）
ＦＳ１８−７−９  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号４）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９  ＣＨ３ドメインのＣＨＯコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号１４２）
GGCCAGCCCCGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCTGGGATGAGCCCTGGGGCGAGGATGTGTCTCTGACCTGTCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGCCCTACGACAGATGGGTGTGGCCCGACGAGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｃ末端リジンを含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−９  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１３５）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−９  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号６）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−９  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号７）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３２ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−３２  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−３２  ＣＤループ  −  ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号８）
ＦＳ１８−７−３２  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３２  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号９）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAAATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３２  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSEIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−３２  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSEIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−３２  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１２）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSEIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３３ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−３３  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−３３  ＣＤループ  −  ＳＮＧＱＰＥＤＮＹ（配列番号１３）
ＦＳ１８−７−３３  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３３  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号１４）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGGACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３３  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１５）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−３３  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１６）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−３３  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１７）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３６ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−３６  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−３６  ＣＤループ  −  ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号１８）
ＦＳ１８−７−３６  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３６  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号１９）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３６  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２０）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−３６  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのＣＨ２＋ＣＨ３のアミノ酸配列（配列番号２１）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−３６  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２２）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−５８ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−５８  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−５８  ＣＤループ  −  ＳＮＧＹＰＥＩＥＦ（配列番号２３）
ＦＳ１８−７−５８  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−５８  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号２４）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGTATCCAGAAATCGAATTCAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCTTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−５８  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２５）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYPEIEFKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−５８  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２６）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYPEIEFKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−５８  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２７）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYPEIEFKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−６２ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−６２  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−６２  ＣＤループ  −  ＳＮＧＩＰＥＷＮＹ（配列番号２８）
ＦＳ１８−７−６２  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−６２  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号２９）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCCCAGAATGGAACTATAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−６２  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３０）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPEWNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−６２  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPEWNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−６２  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３２）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPEWNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−６５ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−６５  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−６５  ＣＤループ  −  ＳＮＧＹＡＥＹＮＹ（配列番号３３）
ＦＳ１８−７−６５  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−６５  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号３４）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGTATGCAGAATATAACTATAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−６５  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３５）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYAEYNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−６５  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３６）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYAEYNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−６５  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３７）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYAEYNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−７８ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−７８  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−７８  ＣＤループ  −  ＳＮＧＹＫＥＥＮＹ（配列番号３８）
ＦＳ１８−７−７８  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−７８  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号３９）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGTATAAAGAAGAAAACTATAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−７８  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４０）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYKEENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−７８  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４１）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYKEENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−７８  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４２）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYKEENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−８８ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−８８  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−８８  ＣＤループ  −  ＳＮＧＶＰＥＬＮＶ（配列番号４３）
ＦＳ１８−７−８８  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−８８  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号４４）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGTTCCAGAACTGAACGTTAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−８８  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４５）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGVPELNVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−８８  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４６）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGVPELNVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−８８  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４７）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGVPELNVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９５ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−９５  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−９５  ＣＤループ  −  ＳＮＧＹＱＥＤＮＹ（配列番号４８）
ＦＳ１８−７−９５  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９５  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号４９）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGTATCAGGAAGATAACTATAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９５  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５０）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYQEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−９５  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５１）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYQEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−９５  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５２）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYQEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号５３）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
「ＬＡＬＡ変異」（下線）を含むヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号５４）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
ＬＡＬＡ変異を含まない「野生型」Ｆｃａｂ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５５）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含む「野生型」Ｆｃａｂ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５６）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号５７）
EPKSCDKTHTCPPCP
ヒトＩｇＧ１短縮型ヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号５８）
TCPPCP
ＬＡＬＡ変異（下線）を含む抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−１０８−２９のアミノ酸配列（配列番号５９）
ＣＨ３ドメインはイタリック体で示される。ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループは、太字と下線で示される。
【表１８】
2019526273.tif 000021
ＬＡＬＡ変異を含まない抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−１０８−２９のアミノ酸配列（配列番号６０）
ＣＨ３ドメインはイタリック体で示される。ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループは、太字と下線で示される。
【表１９】
2019526273.tif 000022
ＬＡＬＡ変異（下線）を含む抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−１０８−３５のアミノ酸配列（配列番号６１）
ＣＨ３ドメインはイタリック体で示される。ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ領域は、太字と下線で示される。
【表２０】
2019526273.tif 000023
ＬＡＬＡ変異を含まない抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−１０８−３５のアミノ酸配列（配列番号６２）
ＣＨ３ドメインはイタリック体で示される。ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ領域は、太字と下線で示される。
【表２１】
2019526273.tif 000024
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６３）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表２２】
2019526273.tif 000025
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６４）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表２３】
2019526273.tif 000026
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３２／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６５）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表２４】
2019526273.tif 000027
抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３２／ＬＡＬＡ変異なしの重鎖のアミノ酸配列（配列番号６６）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表２５】
2019526273.tif 000028
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３３／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６７）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表２６】
2019526273.tif 000029
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３３／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６８）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表２７】
2019526273.tif 000030
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３６／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６９）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表２８】
2019526273.tif 000031
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３６／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７０）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表２９】
2019526273.tif 000032
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−５８／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７１）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表３０】
2019526273.tif 000033
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−５８／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７２）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表３１】
2019526273.tif 000034
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−６２／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７３）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表３２】
2019526273.tif 000035
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−６２／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７４）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表３３】
2019526273.tif 000036
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−６５／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７５）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表３４】
2019526273.tif 000037
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−６５／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７６）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表３５】
2019526273.tif 000038
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−７８／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７７）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表３６】
2019526273.tif 000039
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−７８／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７８）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表３７】
2019526273.tif 000040
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−８８／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７９）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表３８】
2019526273.tif 000041
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−８８／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８０）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表３９】
2019526273.tif 000042
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９５／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８１）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表４０】
2019526273.tif 000043
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９５／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８２）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表４１】
2019526273.tif 000044
ＬＡＬＡ変異を含む抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  ４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８３）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表４２】
2019526273.tif 000045
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  ４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８４）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  ４４２０軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８５）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗ＰＤ−Ｌ１抗体８４Ｇ０９のＣＤＲのアミノ酸配列（IMGTによる）
HCDR1            GFTFDDYA（配列番号８６）
HCDR2            ISWKSNII（配列番号８７）
HCDR3            ARDITGSGSYGWFDP（配列番号８８）
LCDR1            QSISSY（配列番号８９）
LCDR2            VAS（配列番号９０）
LCDR3            QQSYSNPIT（配列番号９１）
抗ＰＤ−Ｌ１抗体８４Ｇ０９のＣＤＲのアミノ酸配列（Kabatによる）
HCDR1            DYAMH（配列番号１３６）
HCDR2            GISWKSNIIGYADSVKG（配列番号１３７）
HCDR3            DITGSGSYGWFDP（配列番号１３８）
LCDR1            RASQSISSYLN（配列番号１３９）
LCDR2            VASSLQS（配列番号１４０）
LCDR3            QQSYSNPIT（配列番号１４１）
抗ＰＤ−Ｌ１抗体８４Ｇ０９  ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９２）
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSS
抗ＰＤ−Ｌ１抗体８４Ｇ０９  ＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKPLIYVASSLQSGVPSSFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSNPITFGQGTRLEIK
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号９４）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表４３】
2019526273.tif 000046
抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号９５）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。
【表４４】
2019526273.tif 000047
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３２／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号９６）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表４５】
2019526273.tif 000048
抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３２／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号９７）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。
【表４６】
2019526273.tif 000049
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３３／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号９８）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表４７】
2019526273.tif 000050
抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３３／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号９９）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。
【表４８】
2019526273.tif 000051
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３６／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１００）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表４９】
2019526273.tif 000052
抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３６／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０１）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。
【表５０】
2019526273.tif 000053
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−５８／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０２）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表５１】
2019526273.tif 000054
抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−５８／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０３）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。
【表５２】
2019526273.tif 000055
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−６２／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０４）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表５３】
2019526273.tif 000056
抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−６２／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０５）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。
【表５４】
2019526273.tif 000057
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−６５／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０６）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表５５】
2019526273.tif 000058
抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−６５／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０７）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。
【表５６】
2019526273.tif 000059
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−７８／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０８）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表５７】
2019526273.tif 000060
抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−７８／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０９）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。
【表５８】
2019526273.tif 000061
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−８８／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１０）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表５９】
2019526273.tif 000062
抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−８８／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１１）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。
【表６０】
2019526273.tif 000063
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９５／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１２）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表６１】
2019526273.tif 000064
抗ヒトＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９５／８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１３）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表６２】
2019526273.tif 000065
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  ８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１４）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表６３】
2019526273.tif 000066
抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  ８４Ｇ０９  重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１５）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSGISWKSNIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDITGSGSYGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  ８４Ｇ０９  軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１１６）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKPLIYVASSLQSGVPSSFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSNPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ＬＡＬＡ変異重鎖を含む抗マウスＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−２９／Ｓ１のアミノ酸配列（配列番号１１７）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表６４】
2019526273.tif 000067
抗マウスＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−２９／Ｓ１重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１８）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表６５】
2019526273.tif 000068
抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  Ｓ１軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１１９）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLFTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ＬＡＬＡ変異重鎖を含む抗マウスＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−３５／Ｓ１のアミノ酸配列（配列番号１２０）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表６６】
2019526273.tif 000069
抗マウスＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−３５／Ｓ１重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２１）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表６７】
2019526273.tif 000070
ＬＡＬＡ変異重鎖を含む対照ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  Ｓ１アミノ酸配列（配列番号１２２）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
対照ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  Ｓ１重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２３）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
対照抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２５Ｆ７重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２４）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
対照抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２５Ｆ７軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１２５）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ヒトＬＡＧ−３のアミノ酸配列（配列番号１２６）
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL
マウスＬＡＧ−３のアミノ酸配列（配列番号１２７）
MREDLLLGFLLLGLLWEAPVVSSGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGGVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLRSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVHWFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGFNVSITYNLKVLGLEPVAPLTVYAAEGSRVELPCHLPPGVGTPSLLIAKWTPPGGGPELPVAGKSGNFTLHLEAVGLAQAGTYTCSIHLQGQQLNATVTLAVITVTPKSFGLPGSRGKLLCEVTPASGKERFVWRPLNNLSRSCPGPVLEIQEARLLAERWQCQLYEGQRLLGATVYAAESSSGAHSARRISGDLKGGHLVLVLILGALSLFLLVAGAFGFHWWRKQLLLRRFSALEHGIQPFPAQRKIEELERELETEMGQEPEPEPEPQLEPEPRQL
カニクイザルＬＡＧ−３のアミノ酸配列（配列番号１２８）
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPPQPGAEISVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPPVPGHRPAAPYSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRATVHLRDRALSCRLRLRVGQASMTASPPGSLRTSDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRSRGQGRVPVQGSPHHHLAESFLFLPHVGPMDSGLWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPATPLTVYAGAGSRVELPCRLPPAVGTQSFLTAKWAPPGGGPDLLVAGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYICHIRLQGQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPASGQEHFVWSPLNTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLHQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALRAGHLPLFLILGVLFLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPELEPEPELERELGPEPEPGPEPEPEQL
ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号１２９）
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET
マウスＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号１３０）
MRIFAGIIFTACCHLLRAFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYCCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTHWVLLGSILLFLIVVSTVLLFLRKQVRMLDVEKCGVEDTSSKNRNDTQFEET
カニクイザルＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号１３１）
MRIFAVFIFTIYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLDPEENHTAELVIPELPLALPPNERTHLVILGAIFLLLGVALTFIFYLRKGRMMDMKKCGIRVTNSKKQRDTQLEET
ＬＡＬＡ変異を含む抗マウスＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−２９／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１３２）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表６８】
2019526273.tif 000071
ＬＡＬＡ変異を含む抗マウスＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−３５／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１３３）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表６９】
2019526273.tif 000072
抗マウスＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−２９／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１３４）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は太字と下線で示される。
【表７０】
2019526273.tif 000073
【０２８６】
参考文献
本明細書で言及された全ての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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