(57)【要約】  本発明は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）による感染症及びＰＲＲＳウイルスによる感染症に対する動物の予防的治療に使用するためのワクチンであって、ブタサーコウイルス２型の非複製的免疫原及び弱毒生ＰＲＲＳウイルスを組み合わせて含み、アルブミンをさらに含むワクチンに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタサーコウイルス２型の非複製的免疫原及び弱毒生ＰＲＲＳウイルスを組み合わせて含むワクチンであって、アルブミンをさらに含むことを特徴とするワクチン。
【請求項２】
卵アルブミンを含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記アルブミン濃度が０．１〜１０％（ｗ／ｗ）であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項４】
ＰＣＶ２の前記非複製的免疫原が、ＰＣＶ２の組換え発現ＯＲＦ２タンパク質であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項５】
ＰＣＶ２の前記非複製的免疫原が、ＰＣＶ２のバキュロウイルス発現ＯＲＦ２タンパク質であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項６】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエの非複製的免疫原をさらに含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項７】
ブタサーコウイルス２型の非複製的免疫原及び弱毒生ＰＲＲＳウイルスを組み合わせて含む、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）による感染症及びＰＲＲＳウイルスによる感染症に対する動物の予防的治療における使用のためのワクチンであって、該ワクチンが、アルブミンを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項８】
前記動物の真皮への投与のためのものであることを特徴とする、請求項７に記載の使用のためのワクチン。
【請求項９】
単一用量によって投与されることを特徴とする、請求項７又は８に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１０】
無針ワクチン接種装置で投与されることを特徴とする、請求項７から９のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１１】
ＰＣＶ２の免疫原及び前記弱毒生ＰＲＲＳウイルスが、投与前２４時間以内に、前記ワクチンに組み合わされることを特徴とする、請求項７から１０のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１２】
ＰＣＶ２の免疫原及び前記弱毒生ＰＲＲＳウイルスが、投与前６時間以内に、前記ワクチンに組み合わされることを特徴とする、請求項７から１１のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１３】
前記免疫原を組み合わせる前に、前記アルブミンがＰＲＲＳウイルスの前記免疫原と組み合わせて存在することを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１４】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製的免疫原と弱毒生ＰＲＲＳウイルスとアルブミンとを組み合わせて含むワクチンを動物に投与することによって、ＰＣＶ２による感染症及びＰＲＲＳウイルスによる感染症に対して動物を予防的に治療する方法。
【請求項１５】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）による感染症及びＰＲＲＳウイルスによる感染症に対して動物を予防的に治療するための前記動物に投与用の、ＰＣＶ２の非複製的免疫原と弱毒生ＰＲＲＳウイルスとアルブミンとを組み合わせて含むワクチンを製造するための、ＰＣＶ２の非複製的免疫原及び弱毒生ＰＲＲＳウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ブタの健康の分野に関する。ブタは多くの病原性微生物にかかりやすい。感染の制御は、一般的に、安定した飼料管理、抗ウイルス薬及び抗生物質などの医薬品による治療、又はワクチンを用いた予防的治療によって行われる。特に、本発明は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）及びＰＲＲＳ（ブタ生殖器呼吸器症候群）ウイルスに対するワクチン、並びにワクチンを用いて動物をこのような感染症から保護する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＶ２及びＰＲＲＳウイルスは、養豚業において重大な経済的損失をもたらす２つのウイルスである。ＰＣＶ−２は、子ブタで観察される離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）と関連している。この病気は１９９１年にカナダで初めて生じた。臨床徴候及び病理学が１９９６年に公開され、進行性の衰弱、呼吸困難、頻呼吸、時には黄疸（ｉｃｔｅｒｕｓ）及び黄疸（ｊａｕｎｄｉｃｅ）が含まれる。
【０００３】
Ｎａｙａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，Ｊｕｎｅ  １９９７は、ＰＭＷＳの臨床症状を有するブタでブタサーコウイルスを検出し、ＰＫ−１５細胞の自然の存在として認識される公知のＰＣＶ以外のＰＣＶがＰＭＷＳと関連し得ると結論づけた。後の刊行物（Ｈａｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（６），５２６２−５２６７，１９９８；Ｍｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７９，２１７１−２１７９，１９９８）がこれらの知見を裏付け、新たな病原性ＰＣＶをＰＣＶ−２と呼び（Ｍｅｅｈａｎら、上記）、元のＰＫ−１５細胞培養物単離物（Ｔｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９５，６４−６６，１９８２）をＰＣＶ−１と呼ぶべきであることが提案された。ＰＣＶ−２は、環状一本鎖ＤＮＡゲノムを含む小型（１７〜２２ｎｍ）正二十面体非エンベロープウイルスである。ＰＣＶ−２ゲノムの長さは約１７６８ｂｐである。世界中の異なる領域に由来するＰＣＶ−２単離株は互いに密接に関連しており、９５〜９９％のヌクレオチド配列同一性を示す（Ｆｅｎａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，３８（７），２４９４−２５０３，２０００）。ＰＣＶのＯＲＦ−２はウイルスのカプシドタンパク質をコードする。ＰＣＶ２のＯＲＦ２は約２３３アミノ酸のタンパク質をコードする。全てのＰＣＶ−２単離株のＯＲＦ２は、９１〜１００％のヌクレオチド配列同一性及び９０〜１００％の推定アミノ酸配列同一性を共有する。
【０００４】
ＰＲＲＳウイルスは、１９８７年に北米及び中央ヨーロッパで初めて報告された。ＰＲＲＳウイルスは、小型のエンベロープＲＮＡウイルスである。これは、約１５キロベースのサイズを有する一本鎖、プラス鎖ＲＮＡゲノムを含む。ゲノムは９個のオープンリーディングフレームを含む。ウイルスは、ニドウイルス（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目、アルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）科、アルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）属のメンバーである。ＰＲＲＳＶの２つのプロトタイプ株は、北米株、ＶＲ−２３３２、及び欧州株、レリスタッドウイルス（Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｖｉｒｕｓ）（ＬＶ）である。欧州及び北米のＰＲＲＳＶ株は、同様の臨床症状を引き起こす。２０００年代前半に、北米遺伝子型の高病原性株が中国で出現した。この株、ＨＰ−ＰＲＲＳＶは他の全ての株より毒性が強く、世界的にアジア諸国で大きな損失を引き起こしている。ＰＲＲＳウイルスについては、不顕性感染が一般的であり、その臨床徴候は群れで散発的にしか起こらない。臨床徴候には、流産及び死産又はミイラ変性胎児の出産などの雌ブタの生殖障害、並びに耳及び外陰部のチアノーゼが含まれる。新生児ブタでは、この病気は呼吸困難を引き起こし、グレーサー病などの呼吸器感染症に対する感受性が高まる。
【０００５】
上で同定された病原体に対するワクチンは、一般的に公知である。ＰＣＶ２による感染症に対して動物、特にブタを予防的に治療するための慣用的なワクチンは、（非複製的）免疫原としての全不活性化ＰＣＶ−２ウイルスに基づき得る。また、当技術分野では、ＯＲＦ２にコードされたカプシドタンパク質（例えば、組換え発現される場合）が、十分なワクチンに使用するためのブタサーコウイルス２型のサブユニット免疫原として適していることが示されている。ＤＮＡ及び非構造タンパク質がカプシドの内側に存在しないという事実が本質的に異なるが、このサブユニットは循環系においてウイルス自体と同じ様式を示すので、これが理解され得る。当技術分野では、ＰＣＶ２に対するいくつかのワクチンが商業的に入手可能である。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダから入手可能）は、３週齢以上のブタに使用するための、ブタをブタサーコウイルス２型から保護するためのワクチンである。２回接種（２回投与）ワクチンとして投与する場合、免疫持続期間（ＤＯＩ）は２２週間であり、ブタの肥育期間をほぼ完全にカバーする。Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＣｉｃｒｏＦｌｅｘ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから入手可能）は、２週齢以上のブタに使用するための、ブタをブタサーコウイルス２型から保護するためのワクチンである。これは１回接種（１回投与）ワクチンとしてのみ登録されている。Ｃｉｒｃｏｖａｃ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ、Ｌｙｏｎ、フランスから入手可能）は、３週齢以上のブタに使用するための、ブタをブタサーコウイルス２型から保護するためのワクチンである。Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＣＶ（Ｚｏｅｉｔｉｓ、Ｃａｐｅｌｌｅ  ａ／ｄ  ＩＪｓｓｅｌ、オランダから入手可能）は、３週齢以上のブタに使用するための、ブタをブタサーコウイルス２型から保護するためのワクチンである。他のＰＣＶ２ワクチンは、例えば国際公開第２００７／０２８８２３号、国際公開第２００７／０９４８９３号及び国際公開第２００８／０７６９１５号に記載されている。
【０００６】
ＰＲＲＳウイルスに関しては、不活化ウイルスワクチンが記載され商業的に入手可能であるが、弱毒生形態の欧州型（Ｉ型）又は北米型（ＩＩ型）のいずれかを含む修飾生ワクチン（ＭＬＶ）ワクチンが、その制御のための主要な免疫学的ツールである。いくつかのワクチンが当技術分野で商業的に入手可能である。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダから入手可能）は、弱毒生ＰＲＲＳウイルスＩ型を含むワクチンであり、ＰＲＲＳウイルスによる感染によって引き起こされる感染症（ウイルス血症）を軽減するために登録されている。Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ（登録商標）ＭＬＶ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから入手可能）は、ＰＲＲＳウイルスによって引き起こされる病気の軽減を助けるワクチンであり、このワクチンは異なる種類の株に対する交差防御を提供する。Ｆｏｓｔｅｒａ（登録商標）ＰＲＲＳ（Ｚｏｅｉｔｉｓ、Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、米国から入手可能）もＭＬＶワクチンであり、ＰＲＲＳウイルスによって引き起こされる呼吸器と生殖の両方の形態の病気に対する防御のために登録されている。他のＰＲＲＳワクチンは、例えば国際公開第２００６／０７４９８６号、米国特許第８７２８４８７号明細書及び国際公開第２０１４／０４８９５５号に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００７／０２８８２３号
【特許文献２】国際公開第２００７／０９４８９３号
【特許文献３】国際公開第２００８／０７６９１５号
【特許文献４】国際公開第２００６／０７４９８６号
【特許文献５】米国特許第８７２８４８７号明細書
【特許文献６】国際公開第２０１４／０４８９５５号。
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎａｙａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，Ｊｕｎｅ  １９９７
【非特許文献２】Ｈａｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（６），５２６２−５２６７，１９９８
【非特許文献３】Ｍｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７９，２１７１−２１７９，１９９８
【非特許文献４】Ｔｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９５，６４−６６，１９８２
【非特許文献５】Ｆｅｎａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，３８（７），２４９４−２５０３，２０００。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ブタの健康管理のための、簡便で安全で効果的な手段が絶えず必要とされている。本発明の目的は、この必要性、特に新規なＰＣＶ２／ＰＲＲＳウイルス混合ワクチンの必要性を満たすワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的を達成するために、ブタサーコウイルス２型の非複製的免疫原と弱毒生ＰＲＲＳウイルスとを組み合わせて含む新規なワクチンであって、免疫原に加えて、アルブミン（すなわち、任意の水溶性、熱変性、非グリコシル化球状タンパク質、とりわけ、血清及び卵白中に見られる）を含むワクチンが考案された。
【００１１】
両ウイルスについて、ワクチンが知られておりそして商業的に入手可能であり、これらの免疫原の組み合わせさえ当技術分野で示されているが、特に若い動物で使用するのに効果的であり同時に安全であるワクチンをもたらす改善が絶えず必要とされている。ＰＣＶサブユニットワクチンは、生ＰＲＲＳウイルスに干渉してその生存率を抑制し得るという出願人の認識があった。このことは、混合ワクチンにおいて、ＰＲＲＳウイルス成分の有効性低下をもたらし得る。アルブミンを混合ワクチンに添加することによって、ＰＲＲＳウイルス生存率の抑制が減少するようである。
【００１２】
一般に公知であるように、企図された又は示唆された抗原の全ての組み合わせが安全で最適に有効な混合ワクチンをもたらすことができるわけではない。実際、単一（一価）ワクチンが安全且つ効果的である場合でさえ、混合ワクチンの安全性及び有効性に関しては、高レベルの不確実性が存在する。
【００１３】
欧州医薬品審査庁（ＥＭＥＡ）の獣医用医薬品委員会が、その刊行物「混合獣医製品の要件に関するガイダンス（Ｎｏｔｅ  ｆｏｒ  ｇｕｉｄａｎｃｅ：ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」（ＥＭＥＡ，２０００，ＣＶＭＰ／ＩＷＰ／５２／９７−ＦＩＮＡＬ）で、以下のように言及している（２／６頁）：「混合ワクチンの開発は容易ではない。各組み合わせは、品質、安全性及び有効性の点で個別に開発及び試験されるべきである」。委員会はさらに、優れた混合ワクチンの探索には、典型的には、例えば、保存剤、賦形剤及び安定剤、不活性化剤及びアジュバントを含む混合ワクチン中の個々の成分間の適合性が含まれることを示している。３頁、一番上の段落には、「混合ワクチンでは、２種以上の成分の存在がしばしば相互作用を引き起こし、（１又は複数の）特定の成分を単独で投与した場合と比較して、個々の成分に対する減少又は増加した応答をもたらし得る。このような相互作用はしばしば免疫学的な性質であるが、免疫系に対するあまり直接的でない効果を有する他の因子によっても引き起こされ得る」及び「アジュバントを使用して混合ワクチンに対する免疫応答を増大させる場合、特別な問題が生じ得る」とも述べられている。
【００１４】
アメリカ保健福祉省、食品医薬品局、生物学的製剤評価研究センターは、１９９７年４月に、「予防可能な疾患のための混合ワクチンを評価するための業界ガイダンス：製造、試験及び臨床研究（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ）」を公開し、このガイダンスの中で、（３頁、「成分の適合性」）「一価ワクチンを組み合わせると、望ましいものより安全性又は有効性が低い新たな組み合わせがもたらされ得ることが経験から明らかになった。時には、不活化ワクチンの成分が、活性成分の１種又は複数に対して有害に作用することがある。」と述べられており、特に、不活化ワクチンが生ワクチンの有効性に悪影響を及ぼし得、例えば生百日咳ワクチンと不活化ポリオウイルスワクチンを組み合わせると、百日咳の効力が低下したワクチンが得られるということが起こったことを示している。個々のワクチンと比較して、ワクチン中の任意の追加の成分が最終製品の安全性及び効力を複雑にすることが示されている。
【００１５】
世界保健機関（ＷＨＯ）は、「ワクチン安全性の基礎」と呼ばれるｅラーニングコースを公開し、履修単位２では混合ワクチンを意図している。この履修単位は、「認可された混合ワクチンは、製品が安全で、有効で、許容可能な品質であることを保証するために、国家当局によって承認される前に広範な試験を受けている」で始まっている。「そのため、全ての組み合わせで、製造業者は各抗原成分の効力、免疫を誘導するために組み合わせた場合のワクチン成分の有効性、毒性への復帰の可能性のリスク、及び他のワクチン成分との反応を評価しなければならない」とも述べられている。
【００１６】
概して、混合ワクチンの開発は容易ではなく、安全性及び有効性を決定するための実験を必要とすることが一般に知られている。
【００１７】
本発明はまた、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）による感染症及びＰＲＲＳウイルスによる感染症に対する動物の予防的治療における使用のためのワクチンであって、ブタサーコウイルス２型の非複製的免疫原及び弱毒生ＰＲＲＳウイルスを組み合わせて含み、アルブミンを含むワクチンに関する。
【００１８】
さらに、本発明は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製的免疫原と弱毒生ＰＲＲＳウイルスとアルブミンとを組み合わせて含むワクチンを動物に投与することによって、ＰＣＶ２による感染症及びＰＲＲＳウイルスによる感染症に対して動物を予防的に治療する方法に関する。本発明はまた、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）による感染症及びＰＲＲＳウイルスによる感染症に対して動物を予防的に治療するために動物に投与するための、ＰＣＶ２の非複製的免疫原と弱毒生ＰＲＲＳウイルスとアルブミンとを組み合わせて含むワクチンを製造するためのＰＣＶ２の非複製的免疫原及び弱毒生ＰＲＲＳウイルスの使用に関する。
【００１９】
ワクチンにおいて、免疫原（抗原とも呼ばれる）は、典型的には、薬学的に許容される担体、すなわち生体適合性媒体、すなわち、投与後に対象動物において有意な有害反応を誘導せず、ワクチンの投与後に宿主動物の免疫系に免疫原を提示することができる媒体、例えば水を含む液体及び／又は任意の他の生体適合性溶媒、或いは凍結乾燥ワクチン（糖及び／又はタンパク質に基づく）を得るために一般的に使用されるような固体担体、と組み合わされ、場合により、野生型微生物による感染症に対して動物を治療するため、すなわちこのような感染症又はそこから生じる障害を予防、改善又は治癒するのを補助するための、動物に投与すると免疫応答を誘導する免疫刺激剤（アジュバント）を含んでもよい。場合により、安定剤、粘度調整剤又は他の成分などの他の物質を、ワクチンの意図される用途又は要求される特性に応じて添加してもよい。
【００２０】
定義
ワクチンは、対象動物に投与することが安全であり、その動物において病原性微生物に対する防御免疫を誘導する、すなわち、以下に定義される成功した予防的治療を誘導することができる医薬組成物である。
【００２１】
病原体の非複製的免疫原は、（弱毒形態の野生型における）全体として生きた複製病原体以外の病原体に相当する任意の物質又は化合物であり、この病原体に対して免疫学的応答が誘発され、対応する病原性病原体又はその病原性因子の１つもしくは複数が、それらの免疫応答の結果として宿主の免疫系によって認識され、最終的には少なくとも部分的に中和されるものである。非複製的免疫原の典型的な例は、死滅した全病原体及びこれらの病原体のサブユニット、例えばカプシドタンパク質、及び、表面発現タンパク質、例えば組換え発現タンパク質である。
【００２２】
病原体による感染症に対する予防的治療は、治療後の病原性病原体による曝露から生じる病原体による感染症又はその感染症から生じる障害を予防又は改善するのを補助し、特にこのような曝露後の宿主中のその量を減少させるのを補助し、場合により病原体による感染からの治療後に生じる１つ又は複数の臨床症状を予防又は改善するのを補助する。
【００２３】
弱毒生病原体は、減少した病原性を有する病原体の、生存可能な、複製可能な（生存可能な）形態である。弱毒化の過程は、感染性病原体をとり典型的には細胞系を通した病原体の複数回継代によって又は病原体を遺伝子組換えすることによって、それが無害又は弱毒性になるように変える。
【００２４】
予防的治療における使用のためのワクチンの単一用量投与は、防御免疫に到達するために、ワクチンの第２の投与でワクチン接種を追加する必要がないことを意味する。２回接種レジメンでは、第１の（プライム）ワクチン接種が、典型的には第１の投与から６週間以内、一般的には第１の投与から３週間以内又は２週間以内にさらに追加され、第２の（ブースト）投与後にのみ、防御免疫、すなわち上に定義される成功した予防的治療を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＰＣＶ２血清学的応答の結果を示す図である。
【図２】ＰＲＲＳ血清学的応答の結果を示す図である。
【図３】ウイルス血症データを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明それ自体によるワクチンの第１の実施形態では、ワクチンは卵アルブミンを含む。卵アルブミン（すなわち、卵白に由来するアルブミン）は、ＰＲＲＳウイルス生存率の低下を抑制するのに適しているようであり、例えば、ウシアルブミンとは対照的に、伴う安全性の問題が少ない（特に、ウシ海綿状脳症に関連するプリオンタンパク質が存在しない）。
【００２７】
第２の実施形態では、アルブミン濃度が１〜１０％（ｗ／ｗ）である。実験的に、０．３％、１％及び３％の量のアルブミンが実用的に実現可能であることが分かった。注目すべき効果及びアルブミンの溶解度に基づいて、最適濃度は０．１〜１０％（全ワクチン重量に対するアルブミンの重量）であると考えられる。特に、０．１、０．２、０．３、０．４、……１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０％ｗ／ｗ（及び任意の介在量）の任意の量が、この実施形態で使用される。
【００２８】
別の実施形態では、ＰＣＶ２の非複製的免疫原は、ＰＣＶ２の組換え発現ＯＲＦ２タンパク質である。この組換えタンパク質は、本発明に適用するのに適していることが判明している。特に、ＯＲＦ２タンパク質は、国際公開第２００７／０２８８２３号、国際公開第２００７／０９４８９３号又は国際公開第２００８／０７６９１５号に記載されるようなバキュロウイルス発現系で発現され得る。
【００２９】
さらに別の実施形態では、ワクチンは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）の非複製的免疫原をさらに含む。この実施形態では、ワクチンは、ただ１種のワクチンを使用することによって３つの主要なブタ病原体に対する防御を提供することができる。Ｍ．ｈｙｏに対する多くの商業的ワクチンが存在し、これらは商業的養豚業務の大部分において日常的に使用されている。一般に、これらのワクチンは、典型的には非経口注射によって投与され、サブユニットタンパク質及び／又はバクテリン（すなわち、全細胞、（部分）溶解、均質化、フレンチプレス、この組み合わせとして死細胞を含むか又は組成物が死細菌培養物から得られる限り別の形態の死細胞を含む組成物）などの非複製的免疫原を含む。いくつかの例は、ＲｅｓｐｉＳｕｒｅ（登録商標）（Ｚｏｅｔｉｓ）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）Ｍ．ｈｙｏ及びＭｙｃｏＦＬＥＸ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｈｙｏｒｅｓｐ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ）、Ｓｔｅｌｌａｍｕｎｅ（登録商標）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｅｌａｎｃｏ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｆｏｓｔｅｒａ（登録商標）ＰＣＶ  ＭＨ（Ｚｏｅｔｉｓ）及びＭ＋Ｐａｃ（登録商標）（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）である。
【００３０】
本発明によるワクチンの特定の使用の第１の実施形態では、ワクチンは、動物の真皮への投与用である。新しい混合ワクチンそれ自体を考案することは既に容易ではないが、特定の投与部位用の混合ワクチンを考案することは一層容易ではない。例えば、世界保健機関（ＷＨＯ）は、「ワクチン安全性の基礎」と呼ばれるｅラーニングコースを公開し、このコースの５３頁では、「投与経路は、ワクチン（又は薬物）を身体と接触させる経路である。これは予防接種が成功するための重要な因子である。物質は、侵入部位から、その作用が起こることが望まれる身体の部分まで輸送されなければならない。しかしながら、この目的のために身体の輸送機構を使用することは単純なことではない。」と報告されている。
【００３１】
この点で、カリフォルニア州保健局の予防接種部は、正しい予防接種のためのガイドラインを公開している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ｐｕｂｓ／ｐｉｎｋｂｏｏｋ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ／ｄ／ｖａｃｃ＿ａｄｍｉｎ．ｐｄｆ）。投与部位に関しては、７頁の最初の全段落に、「各ワクチンの推奨経路及び部位は、臨床試験、実際の経験及び理論的考察に基づく。この情報は、各ワクチンの製造業者の製品情報に含まれている。ワクチンの投与に使用される５つの経路が存在する。推奨経路からの逸脱は、ワクチン有効性を低下させる、又は局所的有害反応を増加させる可能性がある。」と言及されている。１４頁には、唯一の米国で認可された皮内ワクチンが記載されている：「Ｆｌｕｚｏｎｅ  Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌは、皮内経路によって投与される唯一の米国で認可されたワクチンである。これは１８歳〜６４歳の人への使用のみが承認されている。このＦｌｕｚｏｎｅ製剤は、不活化インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）の筋肉内製剤と同じではない。他のＴＩＶ製剤は、皮内経路によって投与すべきではない。」。
皮内投与に関しては、ＩＤＡＬ（登録商標）ワクチン接種装置（オランダのＢｏｘｍｅｅｒのＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手可能）などの無針ワクチン接種装置を用いて皮内投与がしばしば行われるが、「皮内」投与自体を「無針」投与と同一視すべきではない。世界保健機関は、２００９年８月２７日の「ワクチンの皮内送達；低及び中所得国で使用するための開発に関する文献及び可能性の概説」と題された論文で、実際に明らかに、「無針」ワクチン接種が、必ずしも「皮内」ワクチン接種を意味するわけではないことを示している（表１、概説の３頁参照）。無針装置が「皮内ワクチン接種用に構成されている」場合にのみ、ワクチンは実際に（少なくとも部分的に）真皮内に送達され得る。そうでなければ、ワクチンは、その全体が皮下又は筋肉内に送達され得る。
【００３２】
本発明によるワクチンの特定の使用の第２の実施形態では、ワクチンは、単一用量によって投与される。単一用量投与が有効なワクチンをもたらすことが分かった。これは、両病原性ウイルスに対して動物を保護するための非常に簡便で経済的な方法を提供する。
【００３３】
本発明によるワクチンの特定の使用の次の実施形態では、ワクチンは、動物の皮膚を通して真皮に到達するためにワクチンの噴射を使用して、無針ワクチン接種装置で投与される。この実施形態では、真皮へのワクチン接種は、典型的には０．０５〜０．２ｍｌの範囲の非常に低容量のワクチンを使用して、ワクチンの液体噴射（高加圧流体流）を使用する無針ワクチン接種装置によって提供される。これによって、ワクチンの安全性及び投与方法がさらに増加する。
【００３４】
本発明によるワクチンの特定の使用のさらに別の実施形態では、ＰＣＶ２の免疫原及び弱毒生ＰＲＲＳウイルスは、投与前２４時間以内、好ましくは６時間以内にワクチンに組み合わせられる。ワクチンの安定性は、少なくともいずれの薬理学的に許容される担体組成物についても達成するのが依然として容易ではないので、投与直前に抗原を組み合わせることによって、賦形剤を選択する自由度が増す。
【００３５】
本発明によるワクチンの特定の使用のさらに別の実施形態では、免疫原を組み合わせる前に、アルブミンはＰＲＲＳウイルスの免疫原と組み合わせて存在する。
【００３６】
本発明を、以下の実施例を用いてさらに説明する。
【００３７】
［実施例］
実験１
第１の実験では、弱毒生ＰＲＲＳウイルスワクチンの生存率に対するＰＣＶ２  ＯＲＦ２サブユニットワクチンの添加の効果を、最終ワクチン中のウシ血清アルブミンの存在下又は非存在下で確立した。このために、ＰＲＲＳウイルス力価を、ワクチンを組み合わせた１時間後にＭＡ−１０４細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）で希釈して測定した（ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）。対照として、ＰＣＶ２ワクチンを添加することなく、同じＰＲＲＳウイルスワクチンの生存率を測定した。ＰＲＲＳウイルスの（目指した）開始力価が４（ｌｏｇ１０）であったワクチンについて、結果を以下の表１に示す。混合ワクチンにおいて、０．３％（３ｇ／Ｌワクチン）血清アルブミンを添加した。表２は、ＰＲＲＳウイルスの（目指した）開始力価が５（ｌｏｇ１０）であったワクチンについての同じ結果を示す。この後者の混合ワクチンにおいても、０．３％（３ｇ／Ｌワクチン）血清アルブミンを添加した。結果は、アルブミンが混合ワクチン中のＰＲＲＳウイルス生存率に有意な効果を有することを示している。
【表１】
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【表２】
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【００３８】
実験２
第２の実験では、異なるタンパク質について、ＰＣＶ２／ＰＲＲＳウイルス混合ワクチン中のＰＲＲＳウイルスの生存率に対するそれらの効果を試験した。この実験では、１％（ｗ／ｗ）の（未確認の）ＰＲＲＳウイルス安定剤の最終濃度を有する組み合わせＰＣＶ２／ＰＲＲＳウイルス試料を、実験１に記載されるようにＰＲＲＳ生存率（開始力価５ｌｏｇ１０）について試験した。このために、安定剤をＰＲＲＳウイルスワクチンと混合し、その後、ＰＣＶ２ワクチンを添加した。以下のタンパク質性ウイルス安定剤（ウシ血清アルブミンの次に）を試験した：
−植物性ペプトン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  １８３３２−５００Ｇ−Ｆ）
−植物性ペプトン１番（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ６１８５４−５００Ｇ−Ｆ）
−植物性ペプトン２番（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  １９９４２−５００Ｇ−Ｆ）
−ダイズペプトン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ７０１７８−１００Ｇ）
−脱脂乳（Ｃａｍｐｉｎａ、オランダ）
−卵アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ５２５３−２５０Ｇ）
−ＮＺ−アミン（カゼイン加水分解物；実験室製品）。
【００３９】
結果を表３で以下に示す。
【表３】
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【００４０】
アルブミン（ウシ又は鶏卵源のいずれか）のみで、ＰＲＲＳウイルス力価の低下を（ほぼ完全に）防止することができるようであった。
【００４１】
実験３
目的
この試験の目的は、ＰＣＶ２／Ｍｈｙｏ／ＰＲＲＳ混合ワクチンの有効性及び安全性を評価すること、特に、ＰＲＲＳ有効性に対するアルブミンの添加の効果を示すことであった。抗ＯＲＦ２血清学を評価することによって、ＰＣＶ２による感染に対する防御有効性を評価した。マイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染に対する有効性を、血清学的応答を商業的に入手可能なＭｈｙｏワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍｈｙｏ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダ）のそれと比較することによって評価した。ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する有効性を、ワクチン接種４週間後の病原性ＰＲＲＳ株での曝露時の血清学及びＰＲＲウイルス血症を評価することによって評価した。
【００４２】
実験設計
この試験では１０匹の雌ブタの子孫が利用可能であった。合計４０匹の動物をそれぞれ１０匹の子ブタからなる４つの群に割り当てた。全ての動物を、約４週齢の時に、動物施設に移した。１〜４群に、首の右側にＩＤＡＬ（登録商標）ワクチン接種装置を用いて皮内ワクチン接種した。１群及び２群それぞれに、さらにＭｈｙｏバクテリン（商業的に入手可能な製品Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏと同じ抗原）を含み、３％卵アルブミン（１群）を含む又はアルブミンを含まない（２群）ＯＲＦ２タンパク質ベースのＰＣＶ２ワクチンを受けさせた。これらの混合ワクチンでは、生ＰＲＲＳウイルスワクチン（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳ）を再構成した。ワクチンは、アジュバントとして、フランスのＳＥＰＰＩＣから入手可能なＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ２５１を使用した。各ワクチンは、９μｇ／用量のＯＲＦ２タンパク質、及び商業的に入手可能なワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  ＯＮＣＥ中のＭ  Ｈｙｏ抗原の濃度の１〜２倍のＭｈｙｏ抗原を含んでいた。ＰＲＲＳワクチンは凍結乾燥ワクチンであり、投与直前に、適切なＰＣＶ２ワクチン又は希釈剤を用いて２００μｌの１用量当たり１０４．５ＴＣＩＤ５０のウイルスを含むように再構成した。３群はＰＲＲＳワクチンのみを受け、４群は未ワクチン接種のままであり、（曝露）対照として役立った。全ての子ブタを臨床徴候について毎日観察した。これらの動物に、約８週齢（２８日目）の時に、病原性ＰＲＲＳウイルス（Ｉ型）を曝露感染させた。曝露材料は、２ｍｌ中（計算用量）５．３ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０のウイルスを含んでいた。材料を、鼻孔１つ当たり１ｍｌ、鼻腔内投与した。観察期間の終了時（曝露２１日後に相当するワクチン接種４９日後）に、全てのブタを屠殺した。０日目、１４日目、２８日目（曝露直前）、３１日目、３５日目、３８日目、４２日目及び４９日目に、血液試料（頚静脈を介して）を全ての動物から個別に採取し、ＰＲＲＳＶ、ＰＣＶ２及びＭｈｙｏに対する抗体についてＰＲＲＳウイルスの存在を試験した。
【００４３】
結果
いずれの動物もワクチン接種による臨床徴候を示さず、直腸温度は対照から１．５℃以内のままであった。したがって、ワクチンは安全とみなされる。
【００４４】
Ｍｈｙｏに関しては、混合ワクチンの血清学的応答は、商業的に入手可能なワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ  Ｍ  Ｈｙｏ（図に数値的結果は示されていない）で得られるものに匹敵するようである。したがって、ワクチンは、Ｍｈｙｏによる感染から保護すると推定され得る。
【００４５】
ＰＣＶ２血清学的応答の結果を図１に示す。２つの混合ワクチンは陽性抗ＯＲＦ２抗体応答を誘導するようであり、これは、ワクチンが野生型ＰＣＶ２による感染に対する防御を誘導することを意味する。
【００４６】
ＰＲＲＳ血清学的応答の結果を図２に示す。商業的に入手可能なＰＲＲＳワクチンと同様に、２つの混合ワクチンは、曝露前に陽性抗ＰＲＲＳ抗体応答を誘導するようである。これは、ワクチンがＰＲＲＳウイルス感染に対する防御を提供することの指標である。アルブミンを含むワクチンにおいて血清学が改善されたことも認められ得る。図３に、ウイルス血症データを示す。これらの結果は図２の結果と一致する。ウイルス血症レベルが、各時点で対照動物（４群）のレベルよりも低いので、３種全てのワクチンがＰＲＲＳウイルス感染に対する防御を提供すると思われる。さらに、アルブミンを含む混合ワクチンは、アルブミンを含まない混合ワクチンよりも曝露に対する優れた保護を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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