(57)【要約】  脳におけるＰＡＲＩＳのファルネシル化およびＰＧＣ−１αの発現増強を生じさせるのに有効な量で薬剤を被験体に投与する、被験体においてパーキンソン病を予防または治療する方法を記載する。これらの方法は、一部には、ドーパミンニューロンの喪失を防止することによって被験体におけるパーキンソン病の影響を軽減する。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてパーキンソン病を予防または治療する方法であって、ペルオキシソーム増殖活性化受容体γコアクチベーター１α（ＰＧＣ−１α）の発現の１つ以上の誘導物質の有効量を前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記誘導物質が、ファルネソールまたはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、リン酸誘導体または立体異性体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ファルネソールを経口投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ファルネソールを、前記被験体がファルネソールを投与されていない場合と比較して、前記被験体におけるＮＲＦ−１のｍＲＮＡレベルの増加をもたらす量で投与する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ファルネソールを、前記被験体がファルネソールを投与されない場合と比較して、前記被験体の脳におけるファルネシルトランスフェラーゼ活性を増加させる量で投与する、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ファルネソールを、前記被験体がファルネソールを投与されていない場合と比較して、前記被験体の脳におけるパーキン相互作用基質（ＰＡＲＩＳ）のファルネシル化を増加させる量で投与する、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ファルネシル化が、ＰＡＲＩＳの残基６３１のシステイン残基上で起こる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ファルネソールが、ファルネソールを投与されていない被験体と比較した場合、前記被験体におけるＰＡＲＩＳのその標的ＤＮＡへの結合を実質的に排除する、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ファルネソールが、ファルネソールを投与されていない被験体と比較した場合、前記被験体におけるドーパミンニューロンの喪失を防止する、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
被験体においてパーキンソン病を予防または治療する方法であって、ＡＶＳ−３６４８、ＡＢＴ−０５２９、ファルネソールおよびそれらの組み合わせ、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、リン酸誘導体もしくは立体異性体からなる群より選択される実体の有効量を前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項１１】
前記実体を経口投与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記実体を、前記被験体が前記実体を投与されていない場合と比較して、前記被験体におけるＮＲＦ−１のｍＲＮＡレベルの増加をもたらす量で投与する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記実体を、前記被験体が前記実体を投与されていない場合と比較して、前記被験体の脳におけるファルネシルトランスフェラーゼ活性を増加させる量で投与する、請求項１０、１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記実体を、前記被験体が前記実体を投与されていない場合と比較して、前記被験体の脳におけるＰＡＲＩＳのファルネシル化を増加させる量で投与する、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ファルネシル化が、ＰＡＲＩＳの残基６３１のシステイン残基上で起こる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記実体が、前記実体を投与されていない被験体と比較した場合、前記被験体におけるＰＡＲＩＳのその標的ＤＮＡへの結合を実質的に排除する、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記実体が、前記実体を投与されていない被験体と比較した場合、前記被験体におけるドーパミンニューロンの喪失を防止する、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記実体がＡＶＳ−３６４８である、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記実体がＡＢＴ−０５２９である、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
被験体においてパーキンソン病を予防または治療する薬剤を同定する方法であって、第一の被験体に、ある実体を投与されていない第二の被験体の脳におけるＰＧＣ−１αの発現と比較した場合、前記第一の被験体の脳におけるＰＧＣ−１αの発現増強をもたらす前記実体を投与することを含む方法。
【請求項２１】
前記実体を経口投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第二の被験体と比較して、前記第一の被験体におけるＮＲＦ−１のｍＲＮＡレベルの増加が存在する、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第二の被験体と比較して、前記第一の被験体の脳におけるファルネシルトランスフェラーゼ活性の増加が存在する、請求項２０、２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第二の被験体と比較して、前記第一の被験体の脳におけるＰＡＲＩＳのファルネシル化の増加が存在する、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ファルネシル化が、ＰＡＲＩＳの残基６３１のシステイン残基上で起こる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第二の被験体と比較した場合、前記第一の被験体におけるＰＡＲＩＳのその標的ＤＮＡへの結合が減少する、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第二の被験体と比較した場合、前記第一の被験体におけるドーパミンニューロンの喪失がより少ない、請求項２０から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
パーキンソン病を予防および／または治療するための医薬品をスクリーニングするインビトロの方法であって、以下の工程：
ａ．ＰＡＲＩＳタンパク質またはその機能性ＤＮＡ結合部分を発現する細胞を提供する工程；
ｂ．１つ以上の実体を前記細胞に適用する工程；
ｃ．前記実体で処理した１つ以上の細胞が、前記１つ以上の実体で処理していない細胞と比較した場合、ＰＡＲＩＳタンパク質またはその機能性ＤＮＡ結合部分のその標的配列への結合を喪失しているかどうかを決定する工程
を含む、インビトロの方法。
【請求項２９】
前記実体が、化学物質、タンパク質、ペプチド、核酸配列またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権益に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＮＳ３８３７７の下での政府の支援を得てなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
【０００２】
本出願は、２０１６年３月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／３０９，５８３号の優先権を主張するものであり、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は治療不能の進行性神経変性疾患である。臨床的には、黒質（ＳＮ）におけるドーパミン作動性ニューロンの選択的喪失に起因する運動機能障害を特徴とする。ＰＤのいくつかの遺伝的原因が同定されており、疾患過程の根底にある分子機構を理解する機会を提供している。ＰＤの現在の治療戦略は、主として、Ｌ−ＤＯＰＡまたはドーパミン受容体アゴニストなどの薬剤による運動症状の管理および脳深部刺激療法に限定されている。残念なことに、これらの治療法はドーパミン作動性ニューロン（ＤＡ）の進行性の死を防ぐことができない。加えて、ＰＤの発症または進行を遅らせるまたは予防する実証された治療法はない。したがって、ＰＤを治療するための新たな薬理学的アプローチに対する重要な、未だ満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、脳におけるパーキン相互作用基質（ＰＡＲＩＳ）のファルネシル化およびペルオキシソーム増殖活性化受容体γコアクチベーター１α（ＰＧＣ−１α）の発現増強を生じさせるのに有効な量の薬剤を投与することによって、被験体においてパーキンソン病を予防または治療する方法を提供することにより、これらの満たされていない必要性に応える。これらの方法は、一部には、ドーパミンニューロンの喪失を防止することによって被験体におけるパーキンソン病の影響を軽減する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の１つの実施形態は、ＰＧＣ−１αの１つ以上の誘導物質の有効量を被験体に投与することを含む、被験体においてパーキンソン病を予防または治療する方法である。ＰＧＣ−１αの任意の直接または間接的誘導物質を本開示の方法において利用し得るが、特定の実施形態では、誘導物質は、ファルネソールまたはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、リン酸誘導体もしくは立体異性体である。ファルネソールの構造は、
【０００６】
【化１】
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【０００７】
（２Ｅ、６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエン−１−オールである。
【０００８】
本発明の別の実施形態は、ペルオキシソーム増殖活性化受容体γコアクチベーター１α（ＰＧＣ−１α）の発現の１つ以上の誘導物質の有効量を投与することを含む、被験体においてパーキンソン病を予防または治療する方法である。好ましい誘導物質は、ファルネソールまたはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、リン酸誘導体もしくは立体異性体である。誘導物質は、経口的に、注射によって、または局所的に投与し得る。ファルネソールが誘導物質である場合、ファルネソールを、被験体がファルネソールを投与されていない場合と比較して、被験体におけるＮＲＦ−１のｍＲＮＡレベルの増加をもたらす量で投与することが好ましい。また、ファルネソールを、被験体がファルネソールを投与されていない場合と比較して、被験体の脳におけるファルネシルトランスフェラーゼ活性を増加させる量で投与することも好ましい。また、ファルネソールを、被験体がファルネソールを投与されていない場合と比較して、被験体の脳におけるパーキン相互作用基質（ＰＡＲＩＳ）のファルネシル化を増加させる量で投与することも好ましい。また、ファルネシル化がＰＡＲＩＳの残基６３１のシステイン残基上で起こることも好ましい。また、ファルネソールが、ファルネソールを投与されていない被験体と比較した場合、被験体におけるＰＡＲＩＳのその標的ＤＮＡへの結合を実質的に排除することも好ましい。また、ファルネソールが、ファルネソールを投与されていない被験体と比較した場合、被験体におけるドーパミンニューロンの喪失を防止することも好ましい。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、ＡＶＳ−３６４８、ＡＢＴ−０５２９、ファルネソールおよびそれらの組み合わせ、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、リン酸誘導体もしくは立体異性体からなる群より選択される実体の有効量を被験体に投与することを含む、被験体においてパーキンソン病を予防または治療する方法である。ＡＶＳ−３６４８およびＡＢＴ−０５２９の化学構造については図９を参照のこと。実体を、被験体が実体を投与されていない場合と比較して、被験体におけるＮＲＦ−１のｍＲＮＡレベルの増加をもたらす量で投与することが好ましい。実体を、被験体が実体を投与されない場合と比較して、被験体の脳におけるファルネシルトランスフェラーゼ活性を増加させる量で投与することが好ましい。実体を、被験体が実体を投与されていない場合と比較して、被験体の脳におけるＰＡＲＩＳのファルネシル化を増加させる量で投与することが好ましい。ファルネシル化がＰＡＲＩＳの残基６３１のシステイン残基上で起こることが好ましい。実体が、被験体が実体を投与されていない場合と比較して、被験体におけるＰＡＲＩＳのその標的ＤＮＡへの結合を実質的に排除することが好ましい。また、実体が、実体を投与されていない被験体と比較した場合、被験体におけるドーパミンニューロンの喪失を防止することも好ましい。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、被験体においてパーキンソン病を予防または治療する薬剤を同定する方法であって、第一の被験体に、実体を投与されていない第二の被験体の脳におけるＰＧＣ−１αの発現と比較した場合、第一の被験体の脳におけるＰＧＣ−１αの発現増強をもたらす実体を投与することを含む方法である。実体は、経口的に、または本明細書で言及される他の方法によって投与し得る。この方法は、第二の被験体と比較して第一の被験体におけるＮＲＦ−１のｍＲＮＡレベルの増加をもたらす。この方法は、第二の被験体と比較して第一の被験体の脳におけるファルネシルトランスフェラーゼ活性の増加をもたらす。この方法は、第二の被験体と比較して第一の被験体の脳におけるＰＡＲＩＳのファルネシル化の増加をもたらす。ファルネシル化がＰＡＲＩＳの残基６３１のシステイン残基上で起こることが好ましい。ＰＡＲＩＳのその標的ＤＮＡへの結合が、第二の被験体と比較した場合、第一の被験体において減少していることが好ましい。この方法は、第二の被験体と比較した場合、第一の被験体におけるドーパミンニューロンの喪失をより少なくする。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、以下の工程：ＰＡＲＩＳタンパク質またはその機能性ＤＮＡ結合部分を発現する細胞を提供する工程；１つ以上の実体を細胞に適用する工程；実体で処理した１つ以上の細胞が、１つ以上の実体で処理していない細胞と比較した場合、ＰＡＲＩＳタンパク質またはその機能性ＤＮＡ結合部分のその標的配列への結合を喪失しているかどうかを決定する工程、を含む、パーキンソン病を予防および／または治療するための医薬品をスクリーニングするインビトロの方法である。実体は、好ましくは化学物質、タンパク質、ペプチド、核酸配列またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ＰＧＣ−１αの発現を増加させる化合物を同定するためのハイスループットスクリーニングを示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｊは、ＰＡＲＩＳの存在下でＰＧＣ−１αプロモータを活性化する化合物を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｊは、ＰＡＲＩＳの存在下でＰＧＣ−１αプロモータを活性化する９つの化合物を、いずれの化合物がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＰＧＣ−１αレベルを誘導するかを判定するために評価したことを示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｈは、ＰＡＲＩＳのファルネシル化部位を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｉは、ファルネソールによるドーパミン作動性ニューロンの保護を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｋは、ファルネソールの保護作用を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｇは、ＰＡＲＩＳのファルネシル化がインビボでのファルネソールの保護作用のために必要であることを示す。
【図８】図８は、本発明によって決定されたファルネソールの作用方法を示す。
【図９】図９は、ＡＶＳ−３６４８、ＡＢＴ−０５２９の化学構造を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、本発明において使用されるアッセイがハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に対して堅固であったことを示す。
【図１１】図１１は、本発明で使用されるハイスループットスクリーニングプロトコルを示す。
【図１２】図１２は、一次スクリーニングから同定された１７の化合物を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｆは、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲが、ＦＸＲ  ｍＲＮＡが脾臓、気管、食道、精巣および前立腺における軽度の発現と共に肝臓、腎臓、結腸および卵巣において強く認められることを示すことを例示する。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、ファルネソールがクロマチン結合ＰＡＲＩＳ  ＷＴのレベルを消失させたが、ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓのレベルは消失させず、一方、細胞質、膜および可溶性核分画におけるＰＡＲＩＳの分布には変化がないことを示す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｄは、共免疫染色分析が、ファルネソールがドーパミン作動性ニューロンのＰＧＣ−１α免疫反応性の増加をもたらしたことを示すことを例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示の実施形態は、パーキン−ＰＡＲＩＳ−ＰＧＣ１α経路の調節が直接または間接的に関連する神経学的障害を治療および／または予防するための方法および／または組成物に関する。特定の実施形態では、パーキンソン病などの神経学的障害を有する個体を経路の調節因子で治療し、具体的な実施形態では、ＰＤを有する個体にＰＧＣ１αの発現の調節因子、例えばその発現の誘導物質を提供する。
【００１４】
特定の実施形態では、ＰＧＣ１α発現の誘導物質のレベルは、誘導物質がＰＤを含む神経学的障害の少なくとも１つの症状の改善を提供する限り、任意のレベルであり得る。発現のレベルは、少なくともいくつかの場合には、標準品における発現のレベルと比較して少なくとも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、１０００倍またはそれ以上の発現まで増加し得る。個体は、例えばノーザンブロット分析または定量ＰＣＲなどの当技術分野における標準的な方法を用いてＰＧＣ１αの発現レベルを観測し得る。
【００１５】
ＰＤを有することが既知である個体、ＰＤを有する疑いがある個体、またはＰＤを有する危険性がある個体に、ファルネソールを含むＰＧＣ１α発現の誘導物質の有効量を提供し得る。ＰＤの危険性がある個体は、例えば、１つ以上の遺伝的因子を有する個体であり得るか、高齢者であり得るか、および／または家族歴を有し得る。
【００１６】
本開示の特定の実施形態では、個体には、ＰＧＣ−１αの１つ以上の誘導物質に加えてＰＤ治療のための薬剤が与えられる。そのような追加療法には、例えばＬ−ＤＯＰＡまたはドーパミン受容体アゴニストおよび／または脳深部刺激療法が含まれ得る。併用療法がＰＧＣ−１αの１つ以上の誘導物質と共に使用される場合、追加療法は、ＰＧＣ−１αの誘導物質の前に、誘導物質と同時に、および／または誘導物質の後に与えられ得る。
【００１７】
本開示の特定の方法は、本開示の治療方法に先立ってＰＤを診断する方法を提供し、そのような診断は、少なくとも遺伝子マーカーアッセイ、単一光子放射断層撮影、嗅覚系試験、自律神経系試験またはそれらの組み合わせを含む、任意の方法または手段によって行い得る。
【００１８】
パーキン不活性化のモデルおよびヒトＰＤ脳においてそのレベルが蓄積するパーキン基質、ＰＡＲＩＳ（ＺＮＦ７４６）は、以前に同定された。ＰＡＲＩＳは、増殖活性化受容体γコアクチベーター１α（ＰＧＣ−１α）プロモータにおけるインスリン応答配列（ＩＲＳ）の占有を介して、ＰＧＣ−１αおよびその標的遺伝子である核呼吸因子１（ＮＲＦ−１）の発現を転写的に抑制する。ＰＡＲＩＳは、成体動物でのパーキンのコンディショナルノックアウトにおけるドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失に必要であり、ＰＡＲＩＳの過剰発現は選択的ＤＡ神経変性をもたらす。ＤＡ神経変性に付随して起こるのは、ミトコンドリアの量および呼吸のＰＡＲＩＳ依存性減少であり、ＰＧＣ−１αの欠損と一致して、パーキンの喪失がミトコンドリア生合成を損なうことを示唆する。
【００１９】
ＰＧＣ−１αは、ミトコンドリア生合成のために重要な転写プログラムを共調節することおよびミトコンドリアの酸化ストレスから保護することによるミトコンドリア機能の主要調節因子である。新しく出現した証拠は、ＰＧＣ−１αがＰＤにおいて役割を果たすことを示唆する。ＰＤ患者では、ＰＧＣ−１αレベルが減少する。ＰＤにおけるＰＧＣ−１αの下方調節は、ＰＧＣ−１αプロモータのメチル化に起因し得る。ＰＧＣ−１αノックアウトマウスは、ＰＤ神経毒、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の変性作用に対してより感受性であり、ＰＧＣ−１αの過剰発現は、ＭＰＴＰの活性代謝産物であるＮ−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン（ＭＰＰ＋）の毒性から保護する。さらに、ＰＧＣ−１αの過剰発現は、α−シヌクレイン、ＭＰＴＰ、酸化ストレスおよびロテノン誘発変性から保護する。ＰＤの発症年齢および危険性はＰＧＣ−１αの多型に関連し、パーキン関連ＰＤにおいては、ＰＧＣ−１αは機能不全である。ＰＧＣ−１α応答遺伝子は、ＰＤ患者からのドーパミン作動性ニューロンでは下方調節されており、ＰＤの病因において重要な役割を果たすことを示唆する。ＰＡＲＩＳが過剰発現された場合のドーパミンニューロンの喪失はＰＧＣ−１αの過剰発現によって防止され、ＰＧＣ−１αがＰＡＲＩＳをドーパミン作動性ニューロン変性に関連付ける一次標的であることを示唆する。したがって、ＰＧＣ−１αシグナル伝達の欠陥は、ＰＤにおけるドーパミン作動性変性に対する重要な寄与因子として浮上しつつあり、パーキンによるＰＡＲＩＳの調節は、ＰＧＣ−１αをＰＤに結び付ける基礎となる機構であり得る。
【００２０】
パーキン−ＰＡＲＩＳ−ＰＧＣ−１α経路は、ＰＤにおけるドーパミン作動性ニューロンの死に重要な役割を果たすと考えられるので、増加したＰＡＲＩＳの存在下でＰＧＣ−１α機能を維持する化合物を同定するために、偏りのないスクリーニングを開発し、実施した。本発明は、ＣＳＵ−１８０６（ファルネソール）が、ＰＡＲＩＳによるＰＧＣ−１αの転写抑制を阻害する、ＰＡＲＩＳのファルネシル化を介したＰＧＣ−１αの強力な誘導物質であることを示した。さらに、ファルネソールは、ＰＡＲＩＳトランスジェニックマウスおよび成体パーキンコンディショナルノックアウトマウスにおけるドーパミンニューロンの喪失を強力に防止することが実証された。
【００２１】
ＰＧＣ−１αの誘導物質のハイスループットスクリーニング
ＰＧＣ−１αの発現を増加させる化合物を同定するために、１ＫｂのヒトＰＧＣ−１αプロモータ（ＳＨ−ＰＧＣ−１α）の制御下でルシフェラーゼおよび不安定化ＧＦＰ（ｄｓｃＧＦＰ）を発現する安定なレポーター細胞株を作製した（図１Ａ）。代表的な化学物質ライブラリを、２３０，０００の化合物から、それらの構造、薬物動態および薬力学特性に基づいて選択した（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂａｎｋ，Ｄａｅｇｅｏｎ）。この代表的な化学物質ライブラリは、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって品質管理された６０００の薬理学的な活性な化合物を含んだ。さらに、臨床的に認可された薬剤（６０％）、天然産物（２５％）および他の生物活性成分（１５％）からなる２３２０の化合物を含むＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ、ｗｗｗ．ｍｓｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ｃｏｍ／ｓｐｅｃｔｒｕｍ．ｈｔｍｌ）もスクリーニングに使用した。アッセイがハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に対して堅固であるかどうかを判定するために、プレート間変動および日々変動、シグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比、変動係数（ＣＶ）およびＺ’因子を含む標準的なパラメータを測定した。プレート内およびプレート間変動ならびに日間変動は非常にわずかであった（図１０Ａ〜１０Ｃ）。Ｚ’因子は、一般にＨＴＳについてのアッセイの即応性の指標とされている、０．５〜１の範囲内であった。０．５％までのＤＭＳＯは、アッセイの感度および細胞生存率に影響を及ぼさなかった（図１０Ｂおよび１０Ｄ）。すべてのＨＴＳ手順は、ＮＩＨガイドライン（ハイスループットスクリーニングアッセイ指導基準、（ｗｗｗ）ｎｃａｔｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／ｎｃｇｃ／ａｓｓａｙ／ｃｒｉｔｅｒｉａ／ｃｒｉｔｅｒｉａ．ｈｔｍｌ）に従って実施した（図１１：ＨＴＳアッセイプロトコル）。
【００２２】
ＳＨ−ＰＧＣ−１α細胞を、１０μＭの最終濃度の８３２０の化合物の各々で４８時間処理した。ルシフェラーゼ活性を一次読み出しとして評価し、ＤＭＳＯに正規化した（図１Ａ）。初期スクリーニングでは、１２８の化合物がルシフェラーゼ活性を１．５倍増加させる（図１Ｂ）。これらの化合物を三重に再スクリーニングした（図１Ｃ）。すべての化合物がルシフェラーゼ活性を増加させ、これらの化合物のうちで１７の化合物がルシフェラーゼ活性を２．５倍以上に増加させる（図１Ｃ）。これら１７の化合物のいずれもが、１０μＭの作用濃度で細胞毒性を示さない（図１０Ｄおよび図１２）。これら１７の化合物を、ＰＡＲＩＳ過剰発現の設定でＰＧＣ−１αの活性化因子を同定するために評価した（図１Ｄ）。ＰＡＲＩＳまたはモックでトランスフェクトしたＳＨ−ＰＧＣ−１α細胞を個々の化合物の漸増濃度（０、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭ）に暴露した。４８時間後にルシフェラーゼ活性を観測した。ＰＡＲＩＳの同等の発現およびＰＧＣ−１αの抑制が各設定で確認された。１７の化合物のうち９つが、ＰＡＲＩＳの存在下でＰＧＣ−１αの抑制を防止し、ＰＧＣ−１αプロモータを用量依存的に活性化した（図１Ｄ）。これら９つの化合物のいずれかが中枢神経系（ＣＮＳ）適用の可能性を有するどうかを評価するために、ＡＤＭＥ特性（吸収、分布、代謝および排泄）をＳｔａｒＤｒｏｐ（商標）（（ｗｗｗ）ｏｐｔｉｂｒｉｕｍ．ｃｏｍ／ｓｔａｒｄｒｏｐ／）によって評価し、ＡＶＳ−３６４８、ＡＢＴ−０５２９およびＣＳＵ−１８０６（ファルネソール）が血液脳関門（ＢＢＢ）通過性の高い可能性を有し、ｐ糖タンパク質輸送（Ｐ−ｇｐ）との相互作用がないことを明らかにした。
【００２３】
ファルネソール（ＣＳＵ−１８０６）は、ＰＡＲＩＳがＰＧＣ−１αを誘導するのを阻害する
ＰＡＲＩＳの存在下でＰＧＣ−１αプロモータを活性化する９つの化合物を評価して、いずれの化合物がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＰＧＣ−１αレベルを誘導するかを決定した（図２Ａおよび２Ｂ）。ＰＧＣ−１αは、免疫ブロット分析によって測定されたように潜在的なＣＮＳ浸透剤、ＡＶＳ−３６４８、ＡＢＴ−０５２９およびファルネソール（ＣＳＵ−１８０６）によって有意に増加する（図２Ａおよび２Ｂ）。ＡＶＳ−３６４８、ＡＢＴ−０５２９およびファルネソール（ＣＳＵ−１８０６）を使用して、ＰＧＣ−１αの増加がオキシダント代謝、ミトコンドリア生合成および酸化的リン酸化に関与するＰＧＣ−１α標的遺伝子を機能的に調節するかどうかを判定した。銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、マンガンＳＯＤ（ＳＯＤ２）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ１）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、核呼吸因子−１（ＮＲＦ−１）、ミトコンドリア転写因子Ａ（ＴＦＡＭ）、ミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ２およびＵＣＰ３）、ならびに酸化的リン酸化調節因子、ＡＴＰ５ｂ、シトクロムＣ（ＣｙｔＣ）およびシトクロムＣオキシダーゼ（ＣＯＸ  ＩＩおよびＩＶ）を含むＰＧＣ−１α標的遺伝子のｍＲＮＡレベルをリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって測定した（図２Ｃ）。ＰＧＣ−１α、ＳＯＤ１およびＡＴＰ５ＢのｍＲＮＡレベルは、ＡＶＳ−３６４８、ＡＢＴ−０５２９またはファルネソール（ＣＳＵ−１８０６）での処理後に増加する（図２Ｃ）。興味深いことに、ファルネソール（ＣＳＵ−１８０６）だけが、ＰＤモデルにおいて潜在的ＰＡＲＩＳ／ＰＧＣ−１α標的遺伝子として同定されたＮＲＦ−１のｍＲＮＡレベルを堅固に増加させた。
【００２４】
ファルネソールがパーキン喪失の設定においてＰＧＣ−１αを誘導するかどうかを判定するために、レンチウイルスｓｈＲＮＡ−パーキンを使用して、前述のようにＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるパーキン発現を減少させた。パーキンのノックダウンは、ＰＡＲＩＳのレベルの２．７倍の増加およびＰＧＣ−１αの６５％の減少をもたらす（図２Ｄおよび２Ｅ）。ファルネソールは、パーキンおよびＰＡＲＩＳのレベルに影響を及ぼすことなくＰＧＣ−１αのレベルを回復させる（図２Ｄおよび２Ｅ）。パーキンをノックダウンした後、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによってＰＧＣ−１αおよびその標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを評価した。前述のように、ＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１のｍＲＮＡはパーキンノックダウンＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において減少し、この減少はファルネソールによって救済される（図２Ｆ）。さらに、パーキンノックダウンの設定におけるＳＯＤ２、ＴＦＡＭ、ＡＴＰ５Ｂ、ＣＹＴＣおよびＣＯＸ  ＩＩのｍＲＮＡレベルは、ファルネソールの存在下で有意に増加する（図２Ｆ）。合わせて考慮すると、これらの結果は、ファルネソールがパーキンの不在下でＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１のレベルを回復させることを示す。
【００２５】
ファルネソールは、植物および動物の両方における天然有機化合物である。ファルネソールのリン酸誘導体は、哺乳動物細胞におけるコレステロールのビルディングブロックである。外因性ファルネソールがＣＮＳに浸透するかどうかを調べるために、マウスにファルネソール食（ＡＩＮ−７６Ａ食餌中に０．５％ｗ／ｗのトランスファルネソール、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔ，ＮＪ）を７日間給餌し、質量分析法によって脳および血漿中でファルネソールの濃度を測定した（図２Ｇ）。ファルネソールの血漿レベルは、対照食（ＡＩＮ−７６Ａ）給餌マウスと比較してファルネソール給餌マウスでは検出不能レベルから血漿中１１３ｎｇ／ｍｌに増加する。脳内のファルネソールレベルは、対照食給餌マウスと比較してファルネソール給餌マウスでは１５５ｎｇ／ｇファルネソールまで３７％有意に増加する（図２Ｇ）。ファルネソール給餌マウスの種々の脳領域からＰＧＣ−１αのレベルを測定した。ＰＧＣ−１αレベルは、正常マウス飼料給餌マウスと比較して、嗅球（ＯＢ）では２．７倍、海馬（ＨＩＰ）では１．６倍、および黒質（ＳＮ）では１．７倍増加する（図２Ｈおよび２Ｉ）。小脳（ＣＢＭ）、脳幹（ＢＳ）、線条体（ＳＴＲ）または前頭皮質（ＣＴＸ）ではＰＧＣ−１αレベルの有意の変化は認められない（図２Ｈおよび２Ｉ）。これらのデータは、ファルネソールによるＰＧＣ−１αの変化が脳領域特異的であり得ることを示唆する。さらに、ファルネソール給餌マウスのＳＴＲ、ＨＩＰおよびＳＮにおけるＰＧＣ−１αおよび様々なＰＧＣ−１αの標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定した。ファルネソールはＳＴＲ中のＰＧＣ−１αレベルに影響を及ぼさなかったので、これを陰性対照として使用した。ＰＧＣ−１αのｍＲＮＡレベルは、正常飼料給餌マウスと比較して、ファルネソール給餌マウスのＨＩＰおよびＳＮでは有意に上方調節されるが、ＳＴＲにおいては上方調節されず、ＨＩＰおよびＳＮにおけるＰＧＣ−１αのタンパク質レベルの増加が主として転写工程に起因することを示す（図２Ｊ）。興味深いことに、ＮＲＦ−１、ＣＯＸ  ＩＩおよびＣＯＸ  ＩＶのｍＲＮＡレベルは、正常飼料給餌マウスと比較して、ファルネソール給餌マウスのＨＩＰおよびＳＮの両方において上方調節される（図２Ｊ）。しかし、ＳＯＤ２、ＴＦＡＭ、ＵＣＰ２およびＣＹＴＣのｍＲＮＡレベルは、ファルネソール給餌マウスのＳＮにおいて排他的に増加するが、ＨＩＰおよびＳＴＲでは増加しない。これらの所見は、ファルネソールが、脳領域特異的にＰＧＣ−１αの標的遺伝子の異なるサブセットと共にＰＧＣ−１αのレベルを調節することを示唆する。
【００２６】
ファルネソールは、主として肝臓、腎臓および腸で見出されるファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を活性化することが公知である。ＦＸＲが脳内で発現されるかどうかを調べるために、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、脾臓、結腸、気管、甲状腺、胸腺、膀胱、食道、脂肪、精巣、前立腺、子宮頸部および卵巣を含む様々なヒト組織においてＦＸＲのｍＲＮＡをリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した（Ｍａｓｔｅｒ  ｐａｎｅｌ  ＩＩ（商標）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。以前に報告されたように、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲは、ＦＸＲ  ｍＲＮＡが、脾臓、気管、食道、精巣および前立腺における軽度の発現と共に、肝臓、腎臓、結腸および卵巣において強く認められることを示す（図１３）。以前に報告されたように、ＦＸＲ  ｍＲＮＡは、脳、心臓、胎盤、肺、骨格筋、甲状腺、胸腺、膀胱、脂肪および子宮頸部では検出されない。これらの組織に低レベルのＦＸＲ  ｍＲＮＡが存在するかどうかを調べるために、ＲＴ−ＰＣＲを飽和状態で４５サイクル行い、さらにもう１つの組織、すなわち膀胱においてのみＦＸＲが観察された。ＦＸＲ  ｍＲＮＡ発現を、ＨｅｐＧ２細胞（肝臓起源）、ＨＥＫ２９３細胞（腎臓起源）およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（神経起源）において評価した。ＦＸＲの堅固なｍＲＮＡ発現がＨｅｐＧ２細胞で認められるが、ＨＥＫ２９３およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞では認められない。しかし、半定量ＲＴ−ＰＣＲの４５サイクルで、ＳＨ−ＳＹ５ＹにおいてＦＸＲのｍＲＮＡ発現が検出された。ファルネソールで処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＦＸＲとＰＧＣ−１α誘導との間に関連があるかどうかを調べるために、ＦＸＲに対するｓｉＲＮＡを用いてＦＸＲをノックダウンした。ＦＸＲノックダウンの設定において、ファルネソール処理はＰＧＣ−１αレベルに影響を及ぼさない。これらの所見は、ファルネソールのＰＧＣ−１α誘導がＦＸＲに依存しないことを示唆する。
【００２７】
ファルネソールによるＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１レベルの増加がＰＡＲＩＳ依存性であることを確認するために、ＰＡＲＩＳのｓｈＲＮＡノックダウン後にファルネソールをＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に投与した。前述のように、ＰＡＲＩＳのノックダウンは、ＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１レベルの２倍を超える増加をもたらす。ファルネソールは、それ以上はレベルを高めることができず、ファルネソールのＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１レベル増加にはＰＡＲＩＳが必要であることを示唆する。ファルネソールはまた、インビトロでＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγの両方を活性化することができるので、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγならびにそれらの標的遺伝子のいくつかのレベルを評価した。ファルネソールは、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγタンパク質およびｍＲＮＡまたはそれらの標的遺伝子の一部であるアシル補酵素Ａオキシダーゼ１（ＡＣＯＸ１）、カルニチンＯ−パルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ−１Ａ）、中鎖特異的アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＭＣＡＤ）および長鎖特異的アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＬＣＡＤ）のレベルに影響を及ぼすことができない。興味深いことに、ＰＡＲＩＳの不在下でｍＲＮＡ  ＰＰＡＲγレベルは減少し、ＡＣＯＸ１およびＣＰＴ−１Ａは上方調節され、これらの遺伝子がＰＡＲＩＳ標的であり得ることを示唆する。ファルネソール給餌マウスにおいて、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγのレベルには変化がなく、ＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１レベルは増加する。さらに、ファルネソール処理は、ＰＰＡＲγおよびＡＣＯＸ１のｍＲＮＡレベルを減少させ、ファルネソール給餌マウスのＳＮにおけるＭＣＡＤレベルを増加させる。ファルネソールはまた、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＰＰＡＲ応答エレメントを活性化することができない。合わせて考慮すると、これらの所見は、脳におけるファルネソールの作用はＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγから独立しており、ＰＡＲＩＳを必要とすることを示唆する。
【００２８】
ＰＡＲＩＳのファルネシル化はＰＧＣ−１αを転写的に調節する
ファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＴａｓｅ）は、ＣａａＸモチーフによるカルボキシル末端のシステイン残基の修飾を介したタンパク質のファルネシル化のために、ファルネソールおよびその中間体を利用する。ファルネシル化は、タンパク質のプレニル化と称される、イソプレノイドによるタンパク質の翻訳後脂質化の一形態である。バイオインフォマティクス解析は、ＣＧＬＳ（アミノ酸６３１〜６３４）においてＰＡＲＩＳのＣ末端の推定上のＣａａＸモチーフを明らかにする（図３Ａ）。ＦＴａｓｅは、ＣａａＸコンセンサスに関連してシステインを認識し、ここで、Ｃはシステイン、Ａは脂肪族アミノ酸、およびＸは標的タンパク質のＣ末端アミノ酸である。ＦＴａｓｅは、Ｘ位置でメチオニンまたはセリンを優先的に選択し、１５炭素ファルネシル基を転移する。ＣＧＬＳ配列は、ＰＡＲＩＳの予測アイソフォーム間および種間（ヒト、マウス、ラット、ウシおよびゴリラ）で高度に保存されている。ＰＡＲＩＳがファルネシル化されているかどうかを判定するために、［３Ｈ］−ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、Ｆｌａｇタグ付きＰＡＲＩＳプラスｓｉＲＮＡ−対照またはＦＴａｓｅαに対するｓｉＲＮＡのいずれかを用いてトランスフェクトした。オートラジオグラフィは、免疫沈降したＦｌａｇタグ付きＰＡＲＩＳはファルネシル化されるが、ＦＴａｓｅαのノックダウンを有するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞はＰＡＲＩＳのファルネシル化を排除したことを示す（図３Ｂ）。α−ファルネシル抗体による免疫ブロット分析は、［３Ｈ］−ＦＰＰで処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＰＡＲＩＳのファルネシル化を確認し、ＦＴａｓｅαのノックダウンはＰＡＲＩＳのファルネシル化を減少させる（図３Ｂ）。
【００２９】
次に、ＰＡＲＩＳがプレニル化されていることを確認するためのバイオテクノロジーアプローチを適用した（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。Ｆｌａｇタグ付きＰＡＲＩＳでトランスフェクトしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の全細胞溶解物を、ビオチン官能基化ゲラニルピロリン酸類似体（Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＰＰ）およびビオチン−ＧＰＰを脂質供与体として利用するように操作された組換えＦＴａｓｅ  Ｗ１０２Ｔ／Ｙ１５４Ｔ変異体と共にインキュベートした（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。Ｆｌａｇタグ付きＰＡＲＩＳの免疫沈降後、ビオチン−ＧＰＰ結合ＰＡＲＩＳがα−ストレプトアビジン抗体によって検出され、ＰＡＲＩＳがＦＴａｓｅプレニル化の基質であることを示す（図３Ｃ）。さらに、ｓｉＲＮＡ−対照またはｓｉＲＮＡ−ＦＴａｓｅαのいずれかでトランスフェクションしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞からのＦｌａｇタグ付きＰＡＲＩＳの免疫沈降物を、インビトロファルネシル化アッセイ（ＩＶＦ）のためのＦＰＰのＣｙ３蛍光類似体、ＮＢＤ−ＧＰＰと混合した。ＮＢＤ−ＧＰＰ蛍光シグナルが、免疫沈降したＦｌａｇタグ付きＰＡＲＩＳにおいて観察され、内因性ＦＴａｓｅがＦｌａｇタグ付きＰＡＲＩＳと共免疫沈降し、免疫沈降したＦＴａｓｅがＮＢＤ−ＧＰＰをＰＡＲＩＳに成功裏に転移したことを実証する（図３Ｄ）。ＦＴａｓｅがＰＡＲＩＳを直接ファルネシル化するかどうかを判定するために、組換えＧＳＴ−ＰＡＲＩＳを、ＦＴａｓｅ阻害剤、ＦＴＩ−２７７の存在下と不在下で、ＦＴａｓｅおよびＦＰＰと共にインキュベートした。ＧＳＴ−ＰＡＲＩＳはＦＴａｓｅによるファルネシル化を受けるが、これは、ＦＴａｓｅ阻害剤、ＦＴＩ−２７７の添加によって廃止される（図３Ｅ）。
【００３０】
ファルネソールがＰＡＲＩＳのファルネシル化の増強をもたらすかどうかを確かめるために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＦｌａｇタグ付きＰＡＲＩＳでトランスフェクトし、４８時間のファルネソール処理、続いて免疫沈降に供した（図３Ｆ）。ファルネソールは、ＰＡＲＩＳのファルネシル化を用量依存的に増加させる（図３Ｆおよび３Ｇ）。ＰＡＲＩＳファルネシル化の増加に伴って、ＰＧＣ−１αが増加する（図３Ｆおよび３Ｇ）。ゲラニオールまたはゲラニルゲラニオールはファルネソールと類似の構造を有するので、ファルネソールの特異性を確認するために利用した。ゲラニオールまたはゲラニルゲラニオールはＰＧＣ−１αレベルに影響を及ぼさない（図３Ｈ）。ファルネソールがインビボでＰＡＲＩＳのファルネシル化を増加させるかどうかを判定するために、ＰＡＲＩＳをファルネソール給餌マウスのＳＮから免疫沈降させた。免疫ブロット分析は、内因性ＰＡＲＩＳがファルネシル化され、ファルネソールが、ＰＧＣ−１αの上方調節と共にファルネシル化ＰＡＲＩＳのレベルを増強することを示す（図３Ｉおよび３Ｊ）。
【００３１】
ＰＡＲＩＳのＣＧＬＳ（アミノ酸６３１〜６３４）がファルネシル化部位を含むことを確認するために、ＩＶＦによるファルネシル化ＰＡＲＩＳを質量分析（ｍｉｃｒｏＴＯＦ−ＱおよびＨＣＴウルトライオントラップ）に供した（図４Ａ）。ペプチド（６１８ＧＰＬＡＳＴＤＬＶＴＤＷＴＣＧＬＳＶＬＧＰＴＤＧＧＤＭ６４４）は、高度酸性アミノ酸と疎水性脂質部分を含むので、ＭＳ／ＭＳのイオンフラグメンテーションが妨げられ、そのため、ファルネシル部分の付加と一致する分子量の増加により、ファルネシル基が６１８ＧＰＬＡＳＴＤＬＶＴＤＷＴＣＧＬＳＶＬＧＰＴＤＧＧＤＭ６４４ペプチド上に存在することが確認できただけであった。このペプチドは残基６３１にシステイン残基を１つしか有していないので、これがＰＡＲＩＳのファルネシル化部位である可能性が極めて高い（図４Ａ）。残基６３１がファルネシル化の部位であることを確認するために、ＰＡＲＩＳの保存されたＣ６３１Ｓ変異を生成した。
【００３２】
ＦＬＡＧ−ＰＡＲＩＳ  ＷＴまたはＦＬＡＧ−ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓ変異体を免疫沈降させ、ファルネソールの存在下でファルネシル化のレベルを測定した。ＰＡＲＩＳ  ＷＴはファルネシル化され、そのファルネシル化はファルネソール処理で増加するが、ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓ変異体のファルネシル化は存在しない（図４Ｂ）。ファルネソールによるＰＡＲＩＳ  ＷＴのファルネシル化に伴って、ＰＧＣ−１αの上方調節が起こる（図４Ｂ）。ファルネソールは、ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓ変異体の設定においてＰＧＣ−１αレベルの回復に影響を及ぼさない（図４Ｂ）。ＰＡＲＩＳのファルネシル化がＦＴａｓｅを必要とすることを確認するために、ＰＡＲＩＳ過剰発現の設定においてｓｉＲＮＡ−ＦＴａｓｅαノックダウンまたはＦＴａｓｅのＦＴＩ−２７７阻害を実施した（図４Ｃ）。ＦＴａｓｅαノックダウンまたはＦＴＩ−２７７阻害は、ファルネソールによるＰＡＲＩＳのファルネシル化を強く防止する（図４Ｃ）。ＰＡＲＩＳのファルネシル化が、ＰＧＣ−１αプロモータのＩＲＳモチーフに対するＰＡＲＩＳのＤＮＡ結合活性に影響を及ぼすかどうかを確かめるために、ＧＦＰタグ付きＰＡＲＩＳ  ＷＴまたはＧＦＰタグ付きＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１ＳでトランスフェクトしたＳＨ−ＳＹ５Ｙからのクロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）を実施した。ファルネソールは、ＰＡＲＩＳ  ＷＴのクロマチン占有率を低下させるが、ＰＧＣ−１αプロモータ上のＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓのクロマチン占有率は低下させない（図４Ｄおよび４Ｅ）。ＰＡＲＩＳのファルネシル化がその細胞内分布を変化させる可能性を調べるために、細胞下分画を用いて、サイトゾル、膜、可溶性核およびクロマチン結合核画分中のＰＡＲＩＳのレベルを免疫ブロット分析によって観測した（図４Ｆ）。ＣｈＩＰアッセイと一致して、ファルネソールは、クロマチン結合ＰＡＲＩＳ  ＷＴのレベルを排除したが、ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓは排除せず、一方細胞質、膜および可溶性核画分におけるＰＡＲＩＳの分布には変化がない（図４Ｆおよび図１４）。ファルネソール処理によるＰＡＲＩＳ  ＷＴのファルネシル化に伴って、ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓ変異体では観察されないＰＧＣ−１αプロモータ活性の増加が起こる（図４Ｇ）。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は、インビトロファルネシル化ＧＳＴタグ付きＰＡＲＩＳ  ＷＴはＰＧＣ−１αプロモータ内のインスリン応答配列（ＩＲＳ）に結合することができないが、ナイーブＧＳＴタグ付きＰＡＲＩＳ  ＷＴおよびＣ６３１ＳはＤＮＡ−タンパク質複合体を形成することを示す。合わせて考慮すると、これらのデータは、ＰＡＲＩＳがファルネシル化され、ＰＡＲＩＳのファルネシル化がそのＤＮＡ結合親和性を排除し、それによってＰＧＣ−１αの抑制を防止することを示した。
【００３３】
ファルネソールは、ＰＤモデルにおけるドーパミン作動性ニューロンの喪失を防ぐ
ファルネソールが、インビボでドーパミン作動性ニューロンをＰＡＲＩＳ発現の増加およびＰＧＣ−１αレベルの減少から保護することができるかどうかを判定するために、Ｔｅｔ誘導性ＰＡＲＩＳコンディショナルトランスジェニックマウス（Ｔｇ−ＰＡＲＩＳ）を作製した。テトラサイクリン応答調節因子の制御下にあるＣ末端ＦＬＡＧタグ付きヒトＰＡＲＩＳ（ＴｅｔＰ−ＰＡＲＩＳ−Ｆｌａｇ）を使用して、テトラサイクリン応答性トランスジェニックマウスを作製した（図Ｓ５Ａ）。テトラサイクリンプロモータのＰＣＲスクリーニングによって、ＴｅｔＰ−ＰＡＲＩＳを発現する２９のファウンダーを同定した（図Ｓ５Ｂ）。最も高いコピー数の雄性ファウンダーマウスのうちの３匹をＣａｍＫＩＩα−ｔＴＡトランスジェニックマウスと交配させて、マウス前脳全体で導入遺伝子発現を達成した（Ｍａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ＣａｍＫＩＩα−ｔＴＡおよびＰＡＲＩＳの両方を発現するマウスは生まれず、発生の間のＰＡＲＩＳ過剰発現が胚性致死であることを示唆した。そこで、母マウスを、ＰＡＲＩＳ発現を抑制するためにドキシサイクリンで維持し、仔マウスは誕生後３週間ドキシサイクリン食で維持した。これらの条件下で、ＣａｍＫＩＩα−ｔＴＡおよびＰＡＲＩＳの両方を発現するマウスをＰＣＲによって同定した（図Ｓ５Ｃ）。５週齢で、ＣａｍＫＩＩα−ｔＴＡまたはＴｅｔＰ−ＰＡＲＩＳのいずれかだけを発現する同腹仔対照（対照−ＣＴＬ）と比較して、ＰＡＲＩＳの過剰発現がＴｇ−ＰＡＲＩＳの嗅球（ＯＢ）、皮質（ＣＴＸ）、線条体（ＳＴＲ）および腹側中脳（ＶＭ）において検出される（図５Ａ）。Ｔｇ−ＰＡＲＩＳ系統Ｎｏ．１５８では、ＰＡＲＩＳは、ＯＢ、ＣＴＸおよびＳＴＲにおいて１５〜２０倍過剰発現される（図５Ａおよび５Ｂ）。ＶＭにおいては、ＰＡＲＩＳは、パーキンコンディショナルノックアウトマウスおよび散発性ＰＤ患者由来のヒト死後脳におけるＰＡＲＩＳの増強された発現に類似して、３倍発現される（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）（図５Ｂ）。ＰＡＲＩＳの過剰発現は、ドキシサイクリン投与がＰＡＲＩＳの上方調節を完全にブロックするので、テトラサイクリン応答性である（図Ｓ５Ｄ）。２つのさらなる独立したＴｇ−ＰＡＲＩＳ系統（系統Ｎｏ．１２１および系統Ｎｏ．１５８）は、ＣＴＸおよびＶＭにおいてＰＡＲＩＳを同等のレベルで発現する（図Ｓ５Ｅ）。３系統すべてが、クラスピング、発作および不動状態の発生に続いて、誘導の３週間後（６週齢）に死亡する。ＰＡＲＩＳがドーパミンニューロンで発現されることを確認するために、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）およびＦＬＡＧ抗体を用いて共免疫染色を実施した（図５Ｃ）。ＦＬＡＧ免疫染色によって示されたように、ＰＡＲＩＳは、ＳＮ全体にわたってＴＨ陽性ニューロンと共局在する。さらに、ドーパミンニューロンにおけるＣａｍＫＩＩプロモータの発現は、ＣａｍＫＩＩα−ｔＴＡマウスをｔｅｔＰ−ＬａｃＺレポーターマウスと交配することによって確認された（図Ｓ５Ｇ）。ＣａｍＫＩＩプロモータは、海馬（ＨＩＰ）および前脳において高レベルで駆動するが、ＶＭおよびＳＮではＬａｃＺレポーターの発現を駆動する（図５Ａ〜５Ｃおよ���図Ｓ５Ｇ）。ドーパミンニューロン数は、マウスが瀕死であった６週齢で、ＴＨおよびＮｉｓｓｌ陽性ニューロンの不偏ステレオロジー計数によって評価した。Ｔｇ−ＰＡＲＩＳ系統Ｎｏ．１５８では、ドーパミンニューロンの３０％を超える減少および線条体ＴＨ免疫反応性の４５％の減少が存在する（図５Ｄ〜５Ｆ）。Ｔｇ−ＰＡＲＩＳ系統Ｎｏ．１２１では、ドーパミンニューロンの約２５％の減少が存在する。Ｔｇ−ＰＡＲＩＳのＣＴＸではニューロンの喪失はなく、ＰＡＲＩＳの過剰発現によって誘導されるＳＮドーパミンニューロンの喪失がドーパミンニューロンに選択的であることを示す。Ｔｇ−ＰＡＲＩＳ系統Ｎｏ．１５８におけるドーパミンニューロンの喪失に伴って、ＨＰＬＣによって測定されるように線条体におけるドーパミンおよびその代謝産物の減少が起こる（図５Ｇおよび５Ｈ）。ドーパミン代謝回転率の測定は、Ｔｇ−ＰＡＲＩＳのＳＴＲにおけるドーパミン異化が、ＣＴＬマウスの場合と比較して有意に増加することを示した。ノルエピネフリンおよびエピネフリンのレベルは変化しなかった。５〜６週齢で、ドーパミン機能の感受性の高い測定であるポール試験で、下降行動の時間の有意の遅延が存在する（図５Ｉ）。
【００３４】
この新しいマウスモデルを利用して、ファルネソール処理の潜在的な保護作用を評価した。Ｔｇ−ＰＡＲＩＳマウスに、ドキシサイクリン停止の３日前にファルネソール食を与えた。Ｔｇ−ＰＡＲＩＳマウスの第二のコホートは、ドキシサイクリン停止前に正常マウス飼料食で維持した。非トランスジェニック対照（ＣａｍＫＩＩα−ｔＴＡまたはＴｅｔＰ−ＰＡＲＩＳ）マウスの２つの群を同じ食餌レジメンに供した。ファルネソールがドーパミンニューロンの喪失から保護するかどうかを判定するために、ＴＨおよびＮｉｓｓｌステレオロジーを実施した。ファルネソール処理は、Ｔｇ−ＰＡＲＩＳのＳＮにおけるドーパミンニューロンの喪失を完全に防止する（図６Ａおよび６Ｂ）。さらに、ポール試験によって評価されるように完全な行動救済が存在する（図６Ｃ）。さらに、ファルネソールは、ＰＡＲＩＳの過剰発現に起因する早期致死を遅延させる（図Ｓ６Ａ）。正常マウス飼料のＴｇ−ＰＡＲＩＳマウスは、ファルネソール処理によってブロックされるＰＧＣ−１αレベルの約５０％の減少およびＮＲＦ−１レベルの４０％の減少を示す（図６Ｄおよび６Ｅ）。対照マウスのファルネソール処理は、ＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１レベルを増加させる（図６Ｄおよび６Ｅ）。ファルネソール処理は、ＦＬＡＧによる免疫沈降およびファルネシルに対する抗体によるプロービングによって検出される、ＰＡＲＩＳのファルネシル化の増強を導く（図６Ｄおよび６Ｅ）。さらに、ファルネソールを給餌したマウスのＳＮにおいて、正常飼料を与えたマウスと比較してＰＧＣ−１αおよび様々なＰＧＣ−１αの標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定した。ＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１のｍＲＮＡレベルは、ファルネソール給餌マウスにおいて有意に上方調節される（図６Ｆ）。Ｔｇ−ＰＡＲＩＳ  ＳＮのドーパミン作動性ニューロンにおけるＰＧＣ−１αのレベル減少がファルネソールによって回復されるかどうかを確かめるために、共免疫染色分析を適用し、ファルネソールがドーパミン作動性ニューロンのＰＧＣ−１α免疫反応性の増加をもたらすことを示した（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。
【００３５】
次に、ＰＡＲＩＳ依存性であるドーパミンニューロンの進行性喪失を有する成体パーキンコンディショナルノックアウト（ｃＰＫ−ＫＯ）マウスにおいて、ファルネソール処理の潜在的保護作用を評価した。ｃＰＫ−ＫＯは、Ｐａｒｋｉｎｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスのＳＮにＡＡＶ−ＧＦＰＣｒｅを定位的に注入することによって作製した。ｃＰＫ−ＫＯマウスには、分析まで、ウイルス注射の７日前にファルネソール食または正常マウス飼料食のいずれかを与えた。野生型Ｐａｒｋｉｎｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ同腹仔（ＷＴｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）を対照として使用し、ＡＡＶ−ＧＦＰＣｒｅを注射して、分析まで、ウイルス注射の７日前にファルネソール食または正常マウス飼料食を与えた。ファルネソール処理は、ｃＰＫ−ＫＯマウスのＳＮで観察されるドーパミンニューロンの喪失を完全におよび有意に防止する（図６Ｇおよび６Ｈ）。この設定で、ファーネシル化ＰＡＲＩＳのレベルを、飼料食またはファルネソール食のいずれかを与えたｃＰＫ−ＫＯマウスのＳＮにおいて観測した。散発性ＰＤのＳＮで観察されるものと同等の、ｃＰＫ−ＫＯマウスにおけるＰＡＲＩＳレベルの２倍を超える増加が存在する（図６Ｉおよび６Ｊ）。正常マウス飼料のｃＰＫ−ＫＯマウスは、Ｔｇ−ＰＡＲＩＳマウスで観察されるものと同様のＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１レベルの減少を示す（図６Ｉおよび６Ｊ）。ファルネソール処理は、対照マウスのＳＮにおけるＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１レベルを増加させ、ＰＡＲＩＳのファルネシル化の増強をもたらし、ｃＰＫ−ＫＯマウスのＳＮにおけるＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１レベルの減少を防止する（図６Ｉおよび６Ｊ）。ＰＧＣ−１αおよび様々なＰＧＣ−１αの標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを、正常飼料給餌マウスと比較してファルネソール給餌マウスのＳＮにおいて測定し、ＰＧＣ−１α、ＮＲＦ−１、ＳＯＤ２、ＴＦＡＭ、ＵＣＰ２、ＣｙｔＣ、ＣＯＸ  ＩＩおよびＣＯＸ  １の上方調節を認め、ファルネソールがＰＧＣ−１αおよびその標的遺伝子の多くを増加させることを実証した（図６Ｋ）。
【００３６】
ＰＡＲＩＳのファルネシル化がインビボでのファルネソールの保護作用に必要であるかどうかを判定するために、ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  ＷＴ、ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１ＳまたはＡＡＶ−ＧＦＰをＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＳＮに定位的に注入した。ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  ＷＴ、ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１ＳまたはＡＡＶ−ＧＦＰの定位注入の前に、マウスに正常マウス飼料またはファルネソール食を１週間与えた（図７Ａ）。形質導入されたＡＡＶベクターの同等の発現が確認された。ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  ＷＴおよびＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓの両方が、パーキンコンディショナルノックアウトマウスおよび散発性ＰＤの黒質において観察されたものと同等の、ＰＡＲＩＳ発現の３〜４倍の増加をもたらす（図７Ｂおよび７Ｃ）。ファルネソールは、ＰＡＲＩＳ  ＷＴまたはＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓのレベルには影響を及ぼさなかった（図７Ｂおよび７Ｃ）。ファルネソール給餌マウスにおけるＡＡＶ注入の２週間後に、ファルネシルに対する抗体で免疫沈降ＰＡＲＩＳをプローブすることによってＰＡＲＩＳのファルネシル化を評価した。ファルネシル化ＰＡＲＩＳは、ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓ注入マウスと比較して、ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  ＷＴ注入マウスにおいて堅固に観察される（図７Ｂおよび７Ｃ）。ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓ注入マウスにおけるファルネシル化ＰＡＲＩＳの最小レベルは、内因性ＰＡＲＩＳから生じた。ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  ＷＴをファルネソール給餌マウスのＣＴＸおよびＳＮに注入して、領域特異的ＰＡＲＩＳファルネシル化が存在するかどうかを評価した。興味深いことに、ＳＮにおけるＰＡＲＩＳのファルネシル化は、ＳＮにおけるＦＴａｓｅの堅固なレベルと極めて一致するが、ＣＴＸにおけるファルネシル化は、ＣＴＸにおけるＦＴａｓｅの低レベルと一致して低い（図７Ｄ）。ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  ＷＴおよびＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓの両方が、ＴＨおよびＮｉｓｓｌステレオロジーによって評価されるようにドーパミンニューロンの喪失を導く（図７Ｅおよび７Ｆ）。ファルネソール処理は、ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  ＷＴマウスにおけるドーパミンニューロンの喪失を、Ｔｇ−ＰＡＲＩＳマウスおよび成体ｃＰＫ−ＫＯにおけるその保護と同様に完全に防止するが、ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓマウスにおけるドーパミンニューロン生存には影響を及ぼさない（図７Ｅおよび７Ｆ）。ファルネソールによるドーパミン作動性ニューロン救済に伴って、ＡＡＶ−ＰＡＲＩＳ  ＷＴにおけるアンフェタミン誘発性回転行動の回復が起こる（図７Ｇ）。
【００３７】
本発明の主要な所見は、１５炭素セスキテルペノイド分子であるファレンソール（３，７，１１−トリメチル−２，６，１０−ドデカトリエン−１−オール）が、ＰＡＲＩＳのファルネシル化および阻害を介したＰＧＣ−１αの強力な誘導物質であるということである。ＰＧＣ−１α誘導物質のスクリーニングとそれに続くＰＡＲＩＳ発現の設定におけるＰＧＣ−１α誘導物質の二次スクリーニングは、ＰＡＲＩＳによるＰＧＣ−１αの抑制を防止するいくつかの化合物の同定をもたらした。ファルネソールはＡＤＭＥ特性を有しており、ＰＧＣ−１αのレベルを改変し得る有望な、経口的にバイオアベイラブルで脳透過性の化合物であり得ることを示唆するので、ファルネソールをさらなる特徴付けのために選択した。マウス飼料中でのファルネソールの経口投与は、ＢＢＢに有効に通過し、ＰＧＣ−１αレベルを増強する。ファルネソールがＰＧＣ−１αレベルを増強する機構の探索は、ＰＡＲＩＳがシステイン６３１上でファルネシル化されるという発見につながった。ＰＡＲＩＳのファルネシル化は、クロマチンに結合して遺伝子転写を阻害するその能力を妨げる。ファルネソールによるＰＡＲＩＳの阻害は、ＰＤモデルにおけるＰＡＲＩＳの過剰発現によって誘導されるドーパミンニューロンの喪失からの保護をもたらす。
【００３８】
ファルネシル化およびゲラニルゲラニル化（タンパク質プレニル化）は、多くのタンパク質のＣ末端の保存されたシステイン残基へのファルネシルまたはゲラニルゲラニルイソプレノイドのいずれかの共有結合付加を含む脂質修飾である。数多くのタンパク質がプレニル化されることが公知であり、プレニル化は、膜へのタンパク質標的化、タンパク質−タンパク質相互作用に関与し、結果としてタンパク質の細胞活性を変化させる。
【００３９】
ＰＡＲＩＳはＦＴａｓｅと相互作用し、このことがＰＡＲＩＳのファルネシル化を説明する。本発明者らの知る限り、タンパク質プレニル化による転写の調節はこれまで記載されていない。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＭＡＤＳボックス転写因子ＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）のファルネシル化が記載されているが、ＡＰ１の機能および特異性におけるその役割を決定する必要がある。ＰＡＲＩＳのファルネシル化はクロマチンへのその結合を防止し、ＰＡＲＩＳは遺伝子転写に影響を及ぼすことができず、これは転写制御の独特の機構である。他の転写調節因子がタンパク質プレニル化によってどこで制御されるかを決定することが重要である。
【００４０】
注目すべきことに、パーキンコンディショナルノックアウトマウスおよび散発性ＰＤ由来のヒト死後黒質で観察されるレベルと同等のレベルでのコンディショナルトランスジェニックアプローチを介したＰＡＲＩＳの過剰発現は、ドーパミンニューロンの選択的喪失をもたらすことが見出された。ＰＡＲＩＳトランスジェニックマウスにおけるニューロン変性は、ＰＡＲＩＳレベルがはるかに高いにもかかわらず変性を示さなかった皮質などの他の脳領域と比較した場合、ＳＮのドーパミンニューロンに限定される。これまでに、ＰＡＲＩＳのＡＡＶ媒介性過剰発現は、パーキンまたはＰＧＣ−１α過剰発現によって救済されるＤＡニューロンの喪失につながることが示された。興味深いことに、ＰＡＲＩＳトランスジェニックマウスは早期に死亡した。早期死亡の原因は不明であるが、ＣａｍＫＩＩαプロモータによって指令される領域におけるＰＡＲＩＳの発現に起因する可能性が高い。ファルネソールは、ＤＡニューロンの喪失を完全に防止し、ＰＡＲＩＳトランスジェニックマウスの早期死亡を部分的に救済し、少なくとも部分的に、ＰＧＣ−１αの減少が早期死亡およびドーパミンニューロンの喪失を説明し得ることを示唆する。ファルネソールの保護作用は、ファルネシル化を増強することによってＰＡＲＩＳの転写抑制を防止することを介した、ＰＡＲＩＳの阻害によるものである。この概念と一致するのは、ファルネソールはファルネシル化欠損変異体ＰＡＲＩＳ６３１Ｓに対して保護することができないという観察である。ファルネソールはまた、パーキンの成体コンディショナルノックアウトに起因するドーパミンニューロンの喪失を完全に防止する。ＰＡＲＩＳの欠失は、ＰＧＣ−１αの減少およびＰＧＣ−１α減少の有害な影響を防ぐことによって成体パーキンコンディショナルノックアウトマウスにおけるドーパミンニューロンの喪失を防止するので、成体パーキンコンディショナルノックアウトマウスにおけるファルネソールによるＰＡＲＩＳファルネシル化の増強ならびにＰＧＣ−１αレベルおよびＰＧＣ−１α標的遺伝子の回復は、ファルネソールの保護作用を説明する可能性が高い。
【００４１】
ファルネソールは、ファレンソイドＸ受容体（ＦＸＲ、ＮＲ１Ｈ４としても知られている）の公知のアゴニストである。他の著者や本発明者らが、ＦＸＲは脳内で発現されないことを示しているので、本明細書で報告されるファルネソールの作用はＦＸＲ非依存性である可能性が高い。ファルネソールはまた、インビトロでＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγの両方を活性化することができ、ＰＰＡＲαに対してより強力な作用を有する。マウス脳およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγへのファルネソールの作用は観察されず、脳におけるＰＧＣ１−αへのファルネソールの作用がＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγ非依存性であることを示した。さらに、ファルネソールは、ＰＡＲＩＳのファルネシル化を介してＰＧＣ１−αのレベルを高め、ＰＡＲＩＳの不在下ではＰＧＣ１−αレベルを増加させることができないため、およびＰＰＡＲγがＰＧＣ１−αのレベルを調節することは知られていないので、ＰＧＣ１−αへのファルネソールの作用はＰＡＲＩＳのファルネシル化によるものであり、ＰＰＡＲに対するその作用からは独立している可能性が最も高い。
【００４２】
本明細書で使用したのと同様の濃度でのラットにおける食餌性ファルネソールが炭水化物および脂質代謝に関連して検討されており、食餌性ファルネソールは、ＦＸＲおよびＰＰＡＲαに対するその作用を介して血清トリグリセリド、コレステロールのレベルを低下させる。げっ歯動物における食餌性ファルネソールはまた、タンパク質のゲラニルゲラニル化を増強することを介して、ＦＸＲおよびＰＰＡＲに対するその作用とは無関係に心臓保護作用を示す。ファルネソールは、通常、ハーブ、液果および果物において認められ、このことは、脂質代謝の障害および心臓血管健康へのその有益な作用を部分的に説明し得る。ファルネソールは、インビボでリン酸化されてＦＰＰを形成することができ、それによりタンパク質のファルネシル化およびゲラニルゲラニル化を増強することができる。したがって、タンパク質プレニル化のファルネソール増強は、脳および心臓の両方における有益な作用の主要な機構であると考えられる。
【００４３】
ファルネソールはまた、タバコの一般的な添加物である。おそらく、ファルネソールは、タバコの喫煙がＰＤの発症に対して防御的であるという疫学データを説明するタバコの煙の成分であり得る。ヒトにおいて安全に耐容され得るファルネソールの量ならびにその薬物動態特性およびファルネソールがヒトにおけるＰＤの変性作用から保護するかどうかを決定することが重要である。
【実施例】
【００４４】
方法／実施例
レポーター細胞株の作製および化学物質スクリーニング。
安定なレポーターＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ＳＨ−ＰＧＣ−１α−Ｌｕｃ）のために、１ＫｂのヒトＰＧＣ−１αプロモータをレンチウイルスｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に挿入した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に濃縮ウイルスを形質導入し、補足情報に記載されているようにピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を用いて選択した。ＳＨ−ＰＧＣ−１α−Ｌｕｃ細胞をＤＭＥＭ１００μｌ中１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルの白色平底プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、ＳｔｅａｄｙＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて化合物を処理し、４８時間のインキュベーション後にルシフェラーゼ活性を測定した。各プレートは、３つの内部対照、すなわちダイゼイン（陽性対照として、１０μＭ）および２つの陰性対照（処置なしおよびＤＭＳＯ）を有していた。補足情報に記載されているように、各ウェルの生ルシフェラーゼデータを正規化した。
【００４５】
プラスミド構築物。
記載されているように（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）ｐＣＭＶ−ＰＡＲＩＳ野生型（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ａ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を作製し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてｐＣＭＶ−ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓ変異体を作製した。詳細は補足情報に記載されている。
【００４６】
インビトロファルネシル化アッセイ。
インビトロファルネシル化アッセイ（ＩＶＦ）を記載されているように実施した（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。簡単に述べると、代謝包括的ファルネシル化のために、５μＣｉの［３Ｈ］−ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）（ＮＥＴ１０４２００１ＭＣ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中に処理し、ファルネシル抗体による免疫ブロット分析によって免疫沈降物を観測した。人工ＩＶＦについては、細胞溶解物をビオチン−ゲラニルピロリン酸（Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＰＰ、ＲａｂＧＧＴａｓｅの特異的基質、ＬＩ−０１５、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および組換えＦＴａｓｅ  Ｗ１０２Ｔ／Ｙ１５４Ｔ変異体（ＰＲ−９５２、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に６時間インキュベートした。蛍光ベースのＩＶＦについては、免疫沈降したＦｌａｇタグ付きＰＡＲＩＳをＮＢＤ−ＧＰＰ（ＬＩ−０１４、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に２０分間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを蛍光イメージャー（ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ（商標）Ｑシステム）で走査した。詳細は補足情報に記載されている。
【００４７】
ＣＡＳＴ、ＥＭＳＡ、ＣｈＩＰ、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ
補足情報に記載されているように、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＰＡＲＩＳ、ＧＳＴ−ＰＡＲＩＳ−Ｃ６３１Ｓを電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）に使用した。クロマチン免疫沈降を、補足情報に記載されているように製造者の指示に従って実施した。
【００４８】
ＰＡＲＩＳコンディショナルトランスジェニックマウスおよびパーキンコンディショナルノックアウトマウス
ｔｅｔ−ｏｆｆ  ＰＡＲＩＳコンディショナルトランスジェニックマウスを作製するために、線状化トランスジェニック構築物（ＮｏｔＩ消化物、８ｋｂｐ）を胚に微量注入し、胚をＢ６Ｄ２Ｆ１偽妊娠雌性マウス（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｒｅ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に移入した。３つの高コピーファウンダー（系統Ｎｏ．１２１、１５８、１７９）をＣ５７／ＢＬ６マウスと２〜３世代交配させてトランスジェニック系統を樹立した。コンディショナルトランスジェニックマウスにおけるＰＡＲＩＳ誘導を、マウスにドキシサイクリン含有食餌（ドキシサイクリンＤｉｅｔ−Ｓｔｅｒｉｌｅ、２００ｍｇ／ｋｇドキシサイクリン、Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ）を与えることによって抑制した。
【００４９】
パーキンノックアウトのＣｒｅ−ｆｌｏｘコンディショナルモデルを作製するために、ＧＦＰ融合Ｃｒｅリコンビナーゼ（ＡＡＶ−ＧＦＰＣｒｅ）を発現するアデノ随伴ベクターを、エクソン７ｆｌｏｘｅｄパーキンマウス（ｐａｒｋｉｎＦｌｏｘ／Ｆｌｏｘ）のＳＮに定位的に導入した。
【００５０】
統計
一般に、定量的データは平均±ＳＥＭとして提示される。統計的有意性は、対応のない両側スチューデントｔ検定またはスチューデント−ニューマン−クールズ事後分析を伴うＡＮＯＶＡ検定のいずれかによって評価した。差は、ｐ＜０．０５の場合に有意であるとみなした。
【００５１】
医薬製剤
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解または分散した、ファルネソールなどの、ペルオキシソーム増殖活性化受容体γコアクチベーター１α（ＰＧＣ−１α）の発現の１つ以上の誘導物質の有効量を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、適宜に、例えばヒトなどの動物に適切に投与された場合に、有害な、アレルギー性のまたは他の好ましくない反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。ＰＧＣ−１αまたは追加の活性成分の発現の少なくとも１つの誘導物質を含む医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５に例示されているように、本開示に照らして当業者に公知である。さらに、動物（例えばヒト）投与については、製剤は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求される無菌性、発熱原性、一般的安全性および純度基準を満たすべきであることが理解される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知のように、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存料、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、香味料、色素、同様の物質およびそれらの組み合わせを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９−１３２９参照）。いずれかの従来の担体が活性成分と不適合性である場合を除き、医薬組成物におけるその使用が企図される。
【００５３】
ＰＧＣ−１αの発現の誘導物質は、固体、液体またはエアロゾルの形態で投与されるかどうか、および注入のような投与経路のために滅菌される必要があるかどうかに依存して、様々な種類の担体を含み得る。本発明の組成物は、当業者に公知のように、静脈内、皮内、経皮、髄腔内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所、筋肉内、皮下、粘膜、経口、局所、吸入（例えばエアロゾル吸入）、注射、注入、持続注入、標的細胞を直接浸す局所灌流で、カテーテルによって、洗浄によって、クリーム中で、脂質組成物（例えばリポソーム）中で、または他の方法もしくは前記方法の任意の組み合わせによって投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０参照）。
【００５４】
ＰＧＣ−１αの発現の誘導物質（ファルネソールを含む）は、ハーブ、液果および／または果実などの、誘導物質を含む１つ以上の食べ物を食事で摂取することによってそれを必要とする個体に提供され得る。
【００５５】
ＰＧＣ−１αの発現の誘導物質は、遊離塩基、中性または塩の形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、または、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸のような有機酸で形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインのような有機塩基から誘導され得る。製剤されると、溶液は、投与製剤と適合する方法で、および治療的に有効な量で投与される。製剤は、注射用溶液もしくは肺への送達のためのエアロゾルなどの非経口投与用に製剤された、または薬物放出カプセル等のような経消化器投与用に製剤された様々な剤形で容易に投与される。
【００５６】
さらに、本開示に従って、投与に適した本発明の組成物は、不活性希釈剤を含むまたは含まない薬学的に許容される担体中で提供される。担体は、同化可能であるべきであり、液体、半固体、すなわちペースト、または固体担体を含む。任意の従来の媒体、薬剤、希釈剤または担体がレシピエントに対してまたはその中に含まれる組成物の治療有効性に対して有害である場合を除き、本発明の方法を実施する際に用いるための投与可能な組成物におけるその使用は適切である。担体または希釈剤の例には、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤等、またはそれらの組み合わせが含まれる。組成物はまた、１つ以上の成分の酸化を遅らせるための様々な抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物の作用の防止は、パラベン（例えばメチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない様々な抗菌剤および抗真菌剤などの防腐剤によってもたらされ得る。
【００５７】
本発明に従って、組成物は、任意の好都合で実用的な方法で、すなわち溶液、懸濁液、乳化、混合、封入、吸収等によって担体と組み合わされる。そのような手順は当業者には日常的である。
【００５８】
本発明の特定の実施形態では、組成物は、半固体または固体の担体と十分に組み合わされるまたは混合される。混合は、粉砕などの任意の好都合な方法で行うことができる。組成物を治療活性の損失、すなわち胃での変性から保護するために、混合工程で安定剤を添加することもできる。組成物における使用のための安定剤の例には、緩衝剤、グリシンおよびリシンなどのアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトール等のような炭水化物が含まれる。
【００５９】
さらなる実施形態では、本発明は、ＰＧＣ−１αの発現の誘導物質、１つ以上の脂質および水性溶媒を含む薬学的脂質ビヒクル組成物の使用に関し得る。本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、特徴として水に不溶性であり、有機溶媒で抽出可能な広範囲の物質のいずれかを含むと定義される。この広範なクラスの化合物は当業者に周知であり、「脂質」という用語が本明細書で使用される場合、特定の構造に限定されない。例としては、長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含む化合物が挙げられる。脂質は、天然に存在するものまたは合成されたもの（すなわち人によって設計もしくは生成されたもの）であり得る。しかし、脂質は通常、生物学的物質である。生物学的脂質は当技術分野で周知であり、例えば中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテルおよびエステル結合脂肪酸を有する脂質ならびに重合性脂質、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。当然のことながら、脂質として当業者に理解される、本明細書に具体的に記載されるもの以外の化合物も、本発明の組成物および方法に包含される。
【００６０】
当業者は、脂質ビヒクル中に組成物を分散させるために用いることができる一連の技術に精通している。例えば、ＰＧＣ−１αの発現の誘導物質は、脂質を含む溶液に分散させ得る、脂質で溶解し得る、脂質で乳化し得る、脂質と混合し得る、脂質と組み合わせ得る、脂質と共有結合させ得る、脂質中に懸濁液として含まれ得る、ミセルもしくはリポソームに含まれ得るかまたはミセルもしくはリポソームと複合体化させ得る、または当業者に公知の任意の手段によって脂質または脂質構造と会合させ得る。分散液は、リポソームの形成をもたらしてもよくまたはもたらさなくてもよい。
【００６１】
被験体に投与される本発明の組成物の実際の投薬量は、体重、状態の重症度、治療される疾患の種類、過去のまたは現在併用される治療的介入、患者の特発性疾患および投与経路などの物理的および生理学的因子によって決定することができる。投薬量および投与経路に依存して、好ましい投薬量および／または有効量の投与回数は、被験体の応答に応じて変化し得る。投与を担う医療従事者は、いずれの場合にも、組成物中の活性成分の濃度および個々の被験体のための適切な用量を決定する。
【００６２】
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、例えば、単位重量の約２％〜約７５％または約２５％〜約６０％、およびその中で導かれる任意の範囲を構成し得る。当然ながら、各々の治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投薬量が化合物の任意の所与の単位用量で得られる方法で調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命ならびに他の薬理学的考慮事項などの因子が、そのような医薬製剤を調製する分野の当業者によって企図され、したがって、様々な投薬量および治療レジメンが望ましいと考えられる。
【００６３】
他の非限定的な例では、用量はまた、各投与当たり、約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重またはそれ以上まで、およびその中で導かれる任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙される数値から導かれる範囲の非限定的な例では、上記の数値に基づき、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重等を投与することができる。
【００６４】
Ａ．経消化器組成物および製剤
本開示の１つの実施形態では、ＰＧＣ−１αの発現の誘導物質は、消化器経路を介して投与されるように製剤される。消化器経路には、組成物が消化管と直接接触するすべての可能な投与経路が含まれる。具体的には、本明細書で開示される医薬組成物は、経口的、口腔、直腸または舌下経路で投与され得る。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に製剤されてもよく、またはハードもしくはソフトシェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、または錠剤に圧縮されてもよく、または食事の食品と共に直接取り込まれてもよい。
【００６５】
特定の実施形態では、活性化合物は、賦形剤と共に取り込まれ、経口摂取可能な錠剤、口腔テーブル、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤等の形態で使用され得る（各々その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；米国特許第５，６４１，５１５号；同第５，５８０，５７９号および同第５，７９２，４５１号）。錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤等はまた、以下を含んでもよい：例えばトラガカントガム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンまたはそれらの組み合わせなどの結合剤；例えばリン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムまたはそれらの組み合わせなどの賦形剤；例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸またはそれらの組み合わせなどの崩壊剤；例えばステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；例えばスクロース、ラクトース、サッカリンまたはそれらの組み合わせなどの甘味料；例えばペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー香料、オレンジ香料等のような香味料。単位剤形がカプセルである場合、これは、上記種の類の物質に加えて、液体担体を含み得る。様々な他の物質が、コーティングとして、またはさもなければ単位剤形の物理的形態を改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセルは、シェラック、糖またはその両方でコーティングされ得る。剤形がカプセルである場合、これは、上記の種類の物質に加えて、液体担体などの担体を含み得る。ゼラチンカプセル、錠剤または丸剤は、腸溶性コーティングされてもよい。腸溶性コーティングは、ｐＨが酸性である胃または上部腸における組成物の変性を防止する。例えば米国特許第５，６２９，００１号参照。小腸に達すると、その中の塩基性ｐＨはコーティングを溶解し、組成物が放出されて、特殊な細胞、例えば上皮腸細胞およびパイエル板Ｍ細胞によって吸収されることを可能にする。エリキシルのシロップは、活性化合物甘味料としてのスクロース、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、ならびにチェリー香料またはオレンジ香料などの香味料を含み得る。言うまでもなく、任意の単位剤形を調製するのに使用されるいかなる物質も、薬学的に純粋であり、使用される量で実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、徐放性調製物および製剤に組み込まれてもよい。
【００６６】
経口投与のために、本開示の組成物は、代替的に、うがい薬、歯磨き剤、口腔錠、経口スプレーまたは舌下投与製剤の形態で１つ以上の賦形剤と共に組み込まれ得る。例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル溶液）などの適切な溶媒中に必要量の活性成分を組み込んだうがい薬を調製し得る。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含有するもののような経口溶液中に組み込み得るか、または歯磨き剤に分散させ得るか、または治療上有効な量で、水、結合剤、研磨剤、香味料、発泡剤および湿潤剤を含み得る組成物に添加し得る。あるいは、組成物は、舌下に配置され得るかまたはさもなければ口の中で溶解され得る錠剤または溶液の形態に形成され得る。
【００６７】
経消化器投与の他の様式に適するさらなる製剤には坐剤が含まれる。坐剤は、直腸への挿入のための、通常は薬用の、様々な重量および形状の固体剤形である。挿入後、坐剤は、体腔液中で軟化、融解または溶解する。一般に、坐剤の場合、従来の担体は、例えばポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはそれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、坐剤は、例えば約０．５％〜約１０％、好ましくは約１％〜約２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成され得る。
【００６８】
Ｂ．非経口組成物および製剤
さらなる実施形態では、ＰＧＣ−１αの発現の誘導物質は、非経口経路を介して投与され得る。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、消化管を迂回する経路を含む。具体的には、本明細書で開示される医薬組成物は、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下または腹腔内経路で投与され得るが、これらに限定されない。米国特許第６，７５３７，５１４号、同第６，６１３，３０８号、同第５，４６６，４６８号、同第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号；および同第５，３９９，３６３号（各々その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）。
【００６９】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製されてもよい。通常の保存および使用条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含む。注射可能な使用に適する医薬形態には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる（その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる、米国特許第５，４６６，４６８号）。すべての場合に、剤形は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（すなわちグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、ならびに／または植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらされ得る。
【００７０】
水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液を必要に応じて適切に緩衝し、液体希釈剤を、最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にするべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適する。これに関連して、使用できる滅菌水性媒質は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、１回分の投薬量を等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、皮下注入液に添加し得るかまたは提案される注入部位に注入し得る（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ  １０３５−１０３８  ａｎｄ  １５７０−１５８０参照）。投薬量のある程度の変動は、治療される被験体の状態に依存して必然的に起こる。いずれにしても、投与を担う者が個々の被験体のための適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与のために、製剤は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求される無菌性、発熱原性、一般的安全性および純度基準を満たすべきである。
【００７１】
滅菌注射溶液は、上記に列挙した様々な他の成分と共に、必要量の活性化合物を適切な溶媒中に組み込み、続いて、必要に応じて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分プラス任意のさらなる所望成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥技術である。粉末組成物は、安定剤を伴ってまたは伴わずに、例えば水または生理食塩水のなどの液体担体と組み合わせられる。
【００７２】
Ｃ．その他の医薬組成物および製剤
本発明の他の好ましい実施形態では、ＰＧＣ−１αの発現の誘導物質である活性化合物は、様々なその他の経路を介した投与、例えば局所（すなわち経皮）投与、粘膜投与（鼻腔内、膣等）および／または吸入用に製剤され得る。
【００７３】
局所投与のための医薬組成物は、軟膏、ペースト、クリームまたは粉末などの医薬適用のために製剤された活性化合物を含み得る。軟膏は、局所適用のためのすべての油性、吸着性、エマルジョンおよび水溶性ベースの組成物を含み、一方、クリームおよびローションはエマルジョンベースだけを含む組成物である。局所投与される薬剤は、皮膚を通しての活性成分の吸着を促進するための浸透増強剤を含み得る。適切な浸透増強剤には、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドンおよびルアロカプラムが含まれる。局所適用のための組成物の可能な基剤には、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリームおよびワセリンならびに任意の他の適切な吸収性、エマルジョンまたは水溶性軟膏基剤が含まれる。局所製剤はまた、活性成分を保存し、均質な混合物を提供するために、必要に応じて乳化剤、ゲル化剤および抗菌性防腐剤も含み得る。本発明の経皮投与は、「パッチ」の使用も含み得る。例えば、パッチは、１つ以上の活性物質を所定の速度でおよび一定の期間にわたって連続的に供給し得る。
【００７４】
特定の実施形態では、医薬組成物は、点眼薬、鼻腔内スプレー、吸入および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。鼻エアロゾルスプレーを介して肺に組成物を直接送達する方法は、例えば米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号（各々その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）およびリゾホスファチジルグリセロール化合物（その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる、米国特許第５，７２５，８７１号）を使用する薬物送達も、製薬技術分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されている。
【００７５】
「エアロゾル」という用語は、液化または加圧ガス噴射剤中に分散された液体粒子の微細に分割された固体のコロイド系を指す。吸入のための本発明の典型的なエアロゾルは、液体噴射剤中の活性成分の懸濁液または液体噴射剤と適切な溶媒との混合物からなる。適切な噴射剤には、炭化水素および炭化水素エーテルが含まれる。適切な容器は、噴射剤の圧力必要条件に応じて変化する。エアロゾルの投与は、被験体の年齢、体重ならびに症状の重症度および応答に応じて変化する。
【００７６】
本開示のキット
本明細書に記載される組成物のいずれもがキットに含まれ得る。非限定的な例では、ＰＧＣ−１αの発現の誘導物質（例えばファルネソール）がキットに含まれ得る。
【００７７】
キットは、適切に等分されたＰＧＣ−１αの発現の誘導物質および、いくつかの場合には、１つ以上のさらなる薬剤を含み得る。キットの１つまたは複数の構成要素は、水性媒質中または凍結乾燥形態のいずれかで包装され得る。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、シリンジまたは他の容器手段を含み、その中に構成要素が配置され得、好ましくは適切に等分され得る。キット中に２つ以上の構成要素が存在する場合、キットは一般に、その中に追加の構成要素が別々に配置され得る第二、第三または他の追加容器も含む。しかし、構成要素の様々な組み合わせを１つのバイアルに含めてもよい。本発明のキットはまた、典型的には、ＰＧＣ−１αの発現の誘導物質および任意の他の試薬容器を、市販のために厳密に閉じ込めて含有するための手段を含む。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。
【００７８】
キットの構成要素が１つおよび／または複数の液体溶液として提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。ＰＧＣ−１α組成物の発現の誘導物質の１つまたは複数の組成物は、注射可能な組成物に製剤され得る。その場合、容器手段自体がシリンジ、ピペットおよび／または他の同様の装置であってもよく、それらから製剤が身体の感染領域に適用され得る、動物に注入され得る、ならびに／またはさらにキットの他の構成要素に適用され得るおよび／もしくはキットの他の構成要素と混合され得る。しかし、キットの構成要素は乾燥粉末として提供されてもよい。試薬および／または構成要素が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。溶媒が別の容器手段でも提供され得ることが想定される。
【００７９】
本明細書で引用される出版物、特許出願および特許を含むすべての参考文献は、各々の参考文献が個別におよび具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
本発明を説明する文脈において（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）「１つの」および「その」という用語ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。「含む」、「有する」、「包含する」および「含有する」という用語は、特に明記されない限り、制限のない用語（すなわち「含むが、これに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書で特に指示されない限り、単に、範囲内に含まれる各々別個の値を個別に参照する簡略方法として機能することを意図しており、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、特に特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、何らかの特許請求されていない要素を本発明の実施に不可欠なものとして示すと解釈されるべきではない。
【００８１】
本発明を実施するために本発明者らが知る最良の様式を含む、本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載している。これらの好ましい実施形態の変形が、前記の説明を読むことによって当業者に明らかになる可能性がある。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切に使用することを期待しており、また本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての変更および等価物を含む。さらに、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、それらのすべての可能な変形における上記の要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
2019510088.tif 000034
【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月8日(2019.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３−１】
2019510088.tif 000045
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４−１】
2019510088.tif 000046
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ＰＧＣ−１αの発現を増加させる化合物を同定するためのハイスループットスクリーニングを示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｊは、ＰＡＲＩＳの存在下でＰＧＣ−１αプロモータを活性化する化合物を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｊは、ＰＡＲＩＳの存在下でＰＧＣ−１αプロモータを活性化する９つの化合物を、いずれの化合物がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＰＧＣ−１αレベルを誘導するかを判定するために評価したことを示す。図３ＡはＰＡＲＩＳのＣ−末端配列を示す（配列番号１）。
【図４】図４Ａ〜４Ｈは、ＰＡＲＩＳのファルネシル化部位を示す。図４ＡはＰＡＲＩＳのペプチド配列中のアミノ酸６１８〜６４４を示す（配列番号２）。
【図５】図５Ａ〜５Ｉは、ファルネソールによるドーパミン作動性ニューロンの保護を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｋは、ファルネソールの保護作用を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｇは、ＰＡＲＩＳのファルネシル化がインビボでのファルネソールの保護作用のために必要であることを示す。
【図８】図８は、本発明によって決定されたファルネソールの作用方法を示す。
【図９】図９は、ＡＶＳ−３６４８、ＡＢＴ−０５２９の化学構造を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、本発明において使用されるアッセイがハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に対して堅固であったことを示す。
【図１１】図１１は、本発明で使用されるハイスループットスクリーニングプロトコルを示す。
【図１２】図１２は、一次スクリーニングから同定された１７の化合物を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｆは、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲが、ＦＸＲ  ｍＲＮＡが脾臓、気管、食道、精巣および前立腺における軽度の発現と共に肝臓、腎臓、結腸および卵巣において強く認められることを示すことを例示する。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、ファルネソールがクロマチン結合ＰＡＲＩＳ  ＷＴのレベルを消失させたが、ＰＡＲＩＳ  Ｃ６３１Ｓのレベルは消失させず、一方、細胞質、膜および可溶性核分画におけるＰＡＲＩＳの分布には変化がないことを示す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｄは、共免疫染色分析が、ファルネソールがドーパミン作動性ニューロンのＰＧＣ−１α免疫反応性の増加をもたらしたことを示すことを例示する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
ＰＡＲＩＳのＣＧＬＳ（アミノ酸６３１〜６３４）がファルネシル化部位を含むことを確認するために、ＩＶＦによるファルネシル化ＰＡＲＩＳを質量分析（ｍｉｃｒｏＴＯＦ−ＱおよびＨＣＴウルトライオントラップ）に供した（図４Ａ）。ペプチド（６１８ＧＰＬＡＳＴＤＬＶＴＤＷＴＣＧＬＳＶＬＧＰＴＤＧＧＤＭ６４４（配列番号２））は、高度酸性アミノ酸と疎水性脂質部分を含むので、ＭＳ／ＭＳのイオンフラグメンテーションが妨げられ、そのため、ファルネシル部分の付加と一致する分子量の増加により、ファルネシル基が６１８ＧＰＬＡＳＴＤＬＶＴＤＷＴＣＧＬＳＶＬＧＰＴＤＧＧＤＭ６４４（配列番号２）ペプチド上に存在することが確認できただけであった。このペプチドは残基６３１にシステイン残基を１つしか有していないので、これがＰＡＲＩＳのファルネシル化部位である可能性が極めて高い（図４Ａ）。残基６３１がファルネシル化の部位であることを確認するために、ＰＡＲＩＳの保存されたＣ６３１Ｓ変異を生成した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019510088000001.app
【国際調査報告】
2019510088.tif 000047
2019510088.tif 000048
2019510088.tif 000049