(57)【要約】本発明は、デスレセプター４及び／又はデスレセプター５に結合するモノクローナル抗体、それを含む医薬組成物、及びそのような医薬組成物を患者に投与することを含む処置の方法に関する。【選択図】図２０Ｂ
2019502653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デスレセプターに結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であって、
図５ＡのＤ１１４の軽鎖Ｖ領域配列由来の３つのＣＤＲを有する軽鎖可変（Ｖ）領域及び図５ＢのＤ１１４の重鎖Ｖ領域配列由来の３つのＣＤＲを有する重鎖Ｖ領域を含む、又は図５ＣのＧ４．２の軽鎖Ｖ領域配列由来の３つのＣＤＲを有する軽鎖Ｖ領域及び図５ＤのＧ４．２の重鎖Ｖ領域配列由来の３つのＣＤＲを有する重鎖Ｖ領域を含む、
ｍＡｂ。
【請求項２】
ヒト化抗体である、請求項１に記載のｍＡｂ。
【請求項３】
前記ｍＡｂが、図５ＡのＨｕＤ１１４−Ｌ１と少なくとも９０％同一の配列を有する軽鎖Ｖ領域及び図５ＢのＨｕＤ１１４−Ｈ１又はＨｕＤ１１４−Ｈ２と少なくとも９０％同一の配列を有する重鎖Ｖ領域を含み、ここで、Ｋａｂａｔナンバリングによる軽鎖位置４８及び７１が、それぞれＶ及びＹによって占められ、Ｋａｂａｔナンバリングによる重鎖位置４８及び７１が、それぞれＬ及びＡによって占められる、又は
前記ｍＡｂが、図５ＣのＨｕＧ４．２−Ｌ１又はＨｕＧ４．２−Ｌ２と少なくとも９０％同一の配列を有する軽鎖Ｖ領域及び図５ＤのＨｕＧ４．２−Ｈ１又はＨｕＧ４．２−Ｈ２と少なくとも９０％同一の配列を有する重鎖Ｖ領域を含み、ここで、Ｋａｂａｔナンバリングによる軽鎖位置４及び６８が、それぞれＬ及びＲによって占められ、Ｋａｂａｔナンバリングによる重鎖位置２７、２８、３０及び９３が、それぞれＬ、Ｐ、Ｎ及びＴによって占められる、
請求項２に記載のｍＡｂ。
【請求項４】
前記ｍＡｂが、図５ＡのＨｕＤ１１４−Ｌ１の配列を有する軽鎖Ｖ領域及び図５ＢのＨｕＤ１１４−Ｈ１又はＨｕＤ１１４−Ｈ２の配列を有する重鎖Ｖ領域を含む、又は前記ｍＡｂが、図５ＣのＨｕＧ４．２−Ｌ１又はＨｕＧ４．２−Ｌ２の配列を有する軽鎖Ｖ領域及び図５ＤのＨｕＧ４．２−Ｈ１又はＨｕＧ４．２−Ｈ２の配列を有する重鎖Ｖ領域を含む、
請求項２に記載のｍＡｂ。
【請求項５】
マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する、請求項１に記載のｍＡｂ。
【請求項６】
二重特異性抗体である、請求項１に記載のｍＡｂ。
【請求項７】
ヒトＦｃガンマレセプターへの結合を増加させる１又は複数の突然変異を有するヒト定常領域を含む、請求項１に記載のｍＡｂ。
【請求項８】
前記ヒト定常領域がガンマ−１定常領域であり、前記１又は複数の突然変異が、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ突然変異のうち１つ又は両方を含む、請求項７に記載のｍＡｂ。
【請求項９】
医薬的に許容されるキャリア中に請求項１に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の医薬組成物を投与することを含む、がんを患っている患者を処置する方法。
【請求項１１】
２対の重鎖及び軽鎖を含む二重特異性抗体であって、各重鎖／軽鎖対が、ＤＲ４に結合するドメイン及びＤＲ５に結合するドメインを含む、二重特異性抗体。
【請求項１２】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ二重特異性抗体である、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
各結合ドメインが、ヒト化又はヒトモノクローナル抗体由来である、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
ヒトＦｃガンマレセプターへの結合を増加させる１又は複数の突然変異を有するヒト定常領域を含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
前記ヒト定常領域がガンマ−１定常領域であり、前記１又は複数の突然変異が、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ突然変異のうち１つ又は両方を含む、請求項１４に記載の二重特異性抗体。
【請求項１６】
医薬的に許容されるキャリア中に請求項１１に記載の二重特異性抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、がんを患っている患者を処置する方法。
【請求項１８】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であって、前記ｍＡｂがデスレセプターに結合し、前記ｍＡｂが２以上の突然変異を有するヒト定常領域を含み、前記突然変異のそれぞれが、ヒトＦｃガンマレセプター、任意選択的にＦｃガンマレセプターＩＩｂへの結合を増加させる、ｍＡｂ。
【請求項１９】
前記ヒト定常領域がガンマ−１定常領域であり、前記２以上の突然変異が、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ突然変異のうち１つ又は両方を含む、請求項１８に記載のｍＡｂ。
【請求項２０】
請求項１８に記載のｍＡｂを含む、医薬組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の医薬組成物を投与することを含む、がんを患っている患者を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、参照によりその全体が全ての目的のために組み込まれる、ＵＳ  ６２／２４８，７８２（２１０５年１０月３０日出願）の利益を主張する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は概して、新規の生物製剤を開発するためのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び組換えＤＮＡ技術の組み合わせに関し、より具体的には、例えば、デスレセプター４及び５に結合し活性化するモノクローナル抗体の産生に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、Ａｐｏ２リガンドとしても知られ、Ａｐｏ２Ｌ又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとも命名される）は、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのメンバーである（ＩＡＭ  ｖａｎ  Ｒｏｏｓｍａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ９１：４４７−４５６，  ２０１４においてレビューされている）。ＴＲＡＩＬは、刺激依存的に免疫系の多くの細胞上で発現し、例えば、ＮＫ細胞媒介細胞傷害における重要なエフェクター分子として、免疫応答を調節する（Ｃ  Ｆａｌｓｃｈｌｅｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２７：１４５−１５４，  ２００９）。ＴＲＡＩＬは、細胞膜レセプターである、デスレセプター４（ＤＲ４、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１とも呼ばれる）及び／又はデスレセプター５（ＤＲ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２又はＡｐｏ２とも呼ばれる）に結合することによって、外因性アポトーシス経路を活性化し、したがって、感受性細胞の殺滅を誘導する。より具体的には、ＴＲＡＩＬの活性型の可溶性形態は、高い親和性で３つのレセプター分子の細胞外ドメインに結合する、自己集合性非共有結合性ホモ三量体である。これは、細胞内デスドメインのオリゴマー化及びホモマー又はヘテロマー複合体の形成を誘導し（ＦＣ  Ｋｉｓｃｈｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：６１１−６２０，  ２０００）、これに、デスドメインを有するＦａｓ関連タンパク質（ＦＡＤＤ）の動員及び死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）の形成が続き、カスパーゼの活性化、及び次いでアポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死につながる（ｖａｎ  Ｒｏｏｓｍａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  前掲書を参照されたい）。
【０００４】
多くのがん細胞はＤＲ４及び／又はＤＲ５を発現し、ＴＲＡＩＬは、がん細胞（Ｊ  Ｌｅｍｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２１：  １３５０−１３６４，  ２０１４においてレビューされている）及び架橋形態の腫瘍内皮細胞（ＮＳ  Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２２：８０−９０，  ２０１２）のアポトーシスを選択的に誘導することができる。ＴＲＡＩＬそれ自体及び様々なＴＲＡＩＬ−レセプターアゴニストは、がん細胞株に対して及び前臨床モデルにおいて、強い抗腫瘍活性を示している（例えば、Ａ  Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０４：１５５−１６２，  １９９９）。これらは、ヒトＴＲＡＩＬの細胞外領域から成る組換えヒトＴＲＡＩＬ（ｒｈＴＲＡＩＬ；デュラネルミン）（Ｒ  Ｐｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：  １２６８７−１２６９０，  １９９６）、及びマウス、キメラ、ヒト化及びヒトｍＡｂを含む、ＤＲ４又はＤＲ５に対する多数のアゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ｖａｎ  Ｒｏｏｓｍａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  前掲書を参照されたい）を含む。そのようなｍＡｂは、ＤＲ４に対する、４Ｈ６．１７．８  ｍＡｂ（本明細書中で４Ｈ６と命名される；米国特許第７，２５２，９９４号）及びマパツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ１；Ｐｕｋａｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９２：１４３０−１４４１，  ２００５）；及びＤＲ５に対する、３Ｈ３．１４．５  ｍＡｂ（本明細書中で３Ｈ３と命名される；米国特許第６，２５２，０５０号）、コナツムマブ（ＡＭＧ６５５；Ｐ  Ｋａｐｌａｎ−Ｌｅｆｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：６１８−６３１，  ２０１０）、ドロジツマブ（Ａｐｏｍａｂ；Ｃ  Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  １５：７５１−７６１，  ２００８）、レクサツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２；Ｇ  Ｇｅｏｒｇａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １３０：５０１−５１０，  ２００５）及びＴＲＡ−８及びそのヒト化形態のティガツズマブ（ＣＳ−１００８、Ａ  Ｙａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９：１０６０−１０６７，  ２００８）；並びにｖａｎ  Ｒｏｏｓｍａｌｅｎ，  前掲書（４５０ページの表１を参照されたい）に列挙される他のｍＡｂ、を含む。
【０００５】
しかしながら、これらの薬剤は全て、インビトロにおいて及び概して動物モデルにおいて、腫瘍細胞を殺滅するのに非常に有効であるが（上記参考文献を参照されたい）、これらの薬剤はいずれも、単独で使用されるか又は他の薬剤と組み合わせて使用されるかに関わらず、臨床試験において強い活性を示しておらず、またいずれもフェーズＩＩＩに進んでいない（ＰＭ  Ｈｏｌｌａｎｄ，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ２５：１８５−１９３，  ２０１４、及びＬｅｍｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  ，  前掲書において、レビューされている）。Ｈｏｌｌａｎｄ中の表１及びＬｅｍｋｅ  ｅｔ  ａｌ．中の表２及び３、及びその中で引用されている参考文献を特に参照されたい）。ｍＡｂについて、１つの理由は、デスレセプターをオリゴマー化してアポトーシス経路の引き金を引くために、ｍＡｂの架橋が必要であることであり得る。そのような必要条件は、免疫細胞上のＦｃガンマレセプター（ＦｃγＲ）へのｍＡｂのＦｃドメインの結合によって、インビボで満たされる可能性があるが、腫瘍に浸潤する免疫細胞が少なすぎる可能性があり、又はそのような結合の親和性が十分に高くない可能性がある。がん細胞はまた、アポトーシスタンパク質のインヒビターを発現し得る（Ｌｅｍｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  前掲書を参照されたい）。効能を向上させるために、安定性、オリゴマー化及び／又は標的化を強化するための他のタンパク質ドメインとの融合を含む、ＴＲＡＩＬの改変された形態が開発されているところである（Ｌｅｍｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  前掲書及びＨｏｌｌａｎｄ，  前掲書）。同様に、ＤＲ４及び／又はＤＲ５に対する複数の抗体結合ドメインを含む構築物が、開発されている（Ｋ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：４８５４−４８６１，  ２００３；  Ｗ  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９１：３６０−３６７，  ２０１３；  ＪＥ  Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２０８７−９５，  ２０１２；  Ｈ  Ｈｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７２  ａｂｓｔｒａｃｔ  ３８５３，  ２０１２；  ＷＯ  ２０１４／０２２５９２；  ＷＯ  ２０１５／０１７８２２）が、臨床試験に入っていないか、又は臨床試験で成功しておらず（ＫＰ  Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ；  Ｆｅｂ  ２７，  ２０１５，  ＰＭＩＤ：  ２５７２１０６４）；それらの非常に不自然な構造は、それらの臨床実用性を限定し得る。別のアプローチにおいて、ＴＲＡＩＬ及び抗ＤＲ５  ｍＡｂ  ＡＭＧ６５５の組み合わせ又は共投与は、インビトロ及びインビボで、いずれかの薬剤単独よりも有効であった（ＪＤ  Ｇｒａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２６：１７７−１８９，  ２０１４）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項に係る発明の概要
本発明は、ＤＲ４及びＤＲ５に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、例えばＤ１１４及びＧ４．２など、及びそれらのヒト化形態を提供する。一つの実施形態において、本発明は、２対の重鎖及び軽鎖を含む二重特異性モノクローナル抗体を提供し、ここで、各重鎖／軽鎖対が、ＤＲ４に結合するドメイン及びＤＲ５に結合するドメインを含む。他の実施態様において、本発明は、ＤＲ４に対する４つの結合ドメイン、又はＤＲ５に対する４つの結合ドメインを有する、マルチマーモノクローナル抗体を提供する。好ましい実施形態において、抗体は、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ抗体（この用語は以下に定められる）の形態を有する。二重特異性ｍＡｂ又はマルチマーｍＡｂのいずれかにおいて、各結合ドメインは好ましくは、Ｄ１１４及びＧ４．２のヒト化形態などの、ヒト化又はヒトｍＡｂ由来である。また、本発明の任意のｍＡｂは、細胞Ｆｃガンマレセプター（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩＩｂへの結合を強化する突然変異、例えば、ガンマ−１定常領域中のＳ２６７Ｅ及び／又はＬ３２８Ｆ突然変異（Ｅｕインデックスを用いるＫａｂａｔナンバリングに従う）、好ましくは２以上のそのような突然変異、を含む定常領域を含むことができる。有利には、ｍＡｂは、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する。別の態様において、これらのｍＡｂのうち任意のものを含む医薬組成物が提供される。第３の態様において、そのような医薬組成物は、がん又は他の疾患を処置するために患者に投与される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａ、Ｂは、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ抗体フォーマットの模式図であり、個々の可変領域及び定常領域（Ａ）、又は各軽鎖領域をそれぞれの重鎖領域と共に折り畳むことによって形成されたドメイン（Ｂ）を示している。ＶＨ１（それぞれＶＬ１）＝第１の抗体の重（それぞれ軽）鎖可変領域であり、第２の抗体のＶＨ２及びＶＬ２についても同様である。ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３（それぞれＣＬ）＝重（それぞれ軽）鎖定常領域であり、Ｈ＝ヒンジ領域である。Ｖ１（それぞれＶ２）＝第１の（それぞれ第２の）抗体の完全可変ドメインである。
【０００８】
【図２Ａ−２Ｂ】（Ａ）は、ＤＲ４への４Ｈ６及びＤ１１４  ｍＡｂの結合を示すグラフである。（Ｂ）は、４Ｈ６及びＤ１１４  ｍＡｂによる、ＤＲ４へのＡｐｏ２Ｌの結合の阻害を示すグラフである。
【図２Ｃ−２Ｄ】（Ｃ）は、ＤＲ５への３Ｈ３及びＧ４．２  ｍＡｂの結合を示すグラフである。（Ｄ）は、３Ｈ３及びＧ４．２  ｍＡｂによる、ＤＲ５へのＡｐｏ２Ｌの結合の阻害を示すグラフである。ｍＩｇＧは、マウスネガティブコントロールｍＡｂである。
【０００９】
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体（抗ｍＩｇＧ−Ｆｃ）の存在下での、４Ｈ６及びＤ１１４  ｍＡｂでの処置後の、Ｈ６０肺腫瘍細胞（Ａ）及びＳＷ４８０結腸腫瘍細胞（Ｂ）の細胞生存性である。
【図３Ｃ−３Ｄ】図３Ｃ及び図３Ｄは、抗ｍＩｇＧ−Ｆｃの存在下での、３Ｈ３及びＧ４．２  ｍＡｂでの処置後の、Ｈ６０肺腫瘍細胞（Ｃ）及びＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍細胞（Ｄ）の細胞生存性である。
【００１０】
【図４Ａ−４Ｄ】図４Ａ−Ｄは、４Ｈ６  ｍＡｂの成熟重（Ａ）及び軽（Ｂ）鎖可変領域のアミノ酸配列、及び３Ｈ３  ｍＡｂの成熟重（Ｃ）及び軽（Ｄ）鎖可変領域のアミノ酸配列であり、１文字コードを使用している（それぞれ、配列番号１−４）。
【００１１】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ及び図５Ｂには、ＨｕＤ１１４−Ｌ１軽鎖（Ａ）及びＨｕＤ１１４−Ｈ１及びＨｕＤ１１４−Ｈ２重鎖（Ｂ）の成熟可変領域のアミノ酸配列が、マウスＤ１１４及びヒトアクセプターＶ領域と整列して示されている。
【図５Ｃ−５Ｄ】図５Ｃ及び図５Ｄには、ＨｕＧ４．２−Ｌ１及びＨｕＧ４．２−Ｌ２軽鎖（Ｃ）及びＨｕＧ４．２−Ｈ１及びＨｕＧ４．２−Ｈ２重鎖（Ｄ）の成熟可変領域のアミノ酸配列が、マウスＧ４．２及びヒトアクセプターＶ領域と整列して示されている。これらの配列は、（Ａ）配列番号５−７、（Ｂ）配列番号８−１１、（Ｃ）配列番号１２−１５、及び（Ｄ）配列番号１６−１９と命名される。ＣＤＲは、Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）配列において、下線が付されている。Ｄ１１４のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３、−Ｈ１、−Ｈ２及び−Ｈ３は、それぞれ配列番号２０−２５と命名され、Ｇ４．２のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３、−Ｈ１、−Ｈ２及び−Ｈ３は、それぞれ配列番号２６−３１と命名され、マウスＤ１１４（それぞれＧ４．２）アミノ酸で置換されたアミノ酸は、ＨｕＤ１１４（それぞれＨｕＧ４．２）配列において、二重下線が付されている。本明細書中の全ての図において、軽鎖及び重鎖の両方について、１文字アミノ酸コード及びＫａｂａｔナンバリングシステムが使用されている。
【００１２】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ、Ｂは、Ｂ−３Ｈ３／４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊二重特異性抗体（配列番号３２及び３３）の完全な重（Ａ）及び軽（Ｂ）鎖のアミノ酸配列（１文字コード）であり、これは、切断され、そのため成熟タンパク質には存在しない、シグナルペプチドを含んでいる。成熟タンパク質は、配列番号３４及び３５と命名される。配列の下にある矢印は、シグナルペプチド（取り消し線で示される）、４Ｈ６  ＶＨ領域（Ａ）又はそれぞれ３Ｈ３  ＶＨ領域（Ｂ）、リンカー配列（下線で示される）、４Ｈ６  ＶＬ領域（Ａ）又はそれぞれ３Ｈ３  ＶＬ領域（Ｂ）、及び重鎖（Ａ）又は軽鎖（Ｂ）定常領域の順に区切っている。変異アミノ酸２６７Ｅ及び３２８Ｆは、二重下線が付されている。
【００１３】
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ、Ｂは、ＷＳＴ−８アッセイによって測定した、ヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）における、示された薬剤による処置後の、ＳＷ４８０結腸腫瘍細胞の細胞生存性である。ｈＩｇＧは、本明細書中の図において、対照ヒトｍＡｂである。
【００１４】
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ、Ｂは、ヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃなし（Ａ）及びヒトＰＢＭＣの存在下（Ｂ）での、示された薬剤による処置後の、Ｈ４６０肺腫瘍細胞の細胞生存性である。
【００１５】
【図９Ａ−９Ｂ】（Ａ）は、０．５μｇ／ｍＬの示された薬剤と４人のヒトドナー由来のＰＢＭＣとのインキュベーション後の、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍細胞の細胞生存性である。（Ｂ）は、１．０μｇ／ｍＬの示された薬剤とＰＢＭＣとのインキュベーション後の、示された細胞の細胞生存性である。エラーバーは、本明細書中の図において、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。
【００１６】
【図１０Ａ−１０Ｂ】（Ａ）は、ＰＢＭＣの存在下における、示された薬剤による処置後の、ＣＯＬＯ  ２０５細胞の細胞生存性である（短いダッシュは４Ｈ６−ｈＦｃ；長いダッシュは４Ｈ６−ｈＦｃ＊）。（Ｂ）は、示された薬剤による、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍異種移植片の増殖の阻害である。
【００１７】
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ及び図１１Ｂは、示された薬剤による、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍異種移植片（Ａ）及びＳＷ４８０結腸腫瘍異種移植片（Ｂ）の増殖の阻害である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、示された薬剤による、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍異種移植片（Ｃ）の増殖の阻害である。
【００１８】
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ、Ｂは、示された薬剤による、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍異種移植片（Ａ）及びＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓腫瘍異種移植片（Ｂ）の増殖の阻害である。
【００１９】
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａ、Ｂは、ＤＲ４への示された抗ＤＲ４  ｍＡｂの結合（Ａ）及びＤＲ５への示された抗ＤＲ５  ｍＡｂの結合（Ｂ）を示すグラフである。本明細書中の全ての図の凡例において、−Ｆｃ及び−Ｆｃ＊＊接頭辞は、それぞれ−ｈＦｃ及び−ｈＦｃ＊＊と同じ意味を有する（例えば、ＨｕＤ１１４−Ｆｃ＃１は、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＃１と同じ意味を有する、など）。この図及び以下の図において、凡例によって示されるように、概して、実線はｍＡｂのｈＦｃ＊＊形態を示し、破線はｈＦｃ又はｈＦｃ＊形態を示し、点線はマウスｍＡｂを示す。
【００２０】
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａ、Ｂは、ヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの存在下における、抗ＤＲ４  ｍＡｂ（Ａ）及び抗ＤＲ５  ｍＡｂ（Ｂ）による処置後の、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍細胞の細胞生存性である。異なる濃度ユニットが（Ａ）及び（Ｂ）において使用されている。
【００２１】
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ及び図１５Ｂは、マウスＴＲＡ−８  ｍＡｂの場合は抗ｍＩｇＧ−Ｆｃの存在下における、又はヒト化又はヒトｍＡｂの場合はヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの存在下における、示されたｍＡｂによる処置後の、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍細胞の細胞生存性（Ａ）及びＳＷ４８０結腸腫瘍細胞の細胞生存性（Ｂ）である。
【図１５Ｃ−１５Ｄ】図１５Ｃ及び図１５Ｄは、マウスＴＲＡ−８  ｍＡｂの場合は抗ｍＩｇＧ−Ｆｃの存在下における、又はヒト化又はヒトｍＡｂの場合はヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの存在下における、示されたｍＡｂによる処置後の、ＣＯＬＯ  ２０５細胞の細胞生存性（Ｃ）及びＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓腫瘍細胞の細胞生存性（Ｄ）である。
【００２２】
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ及び図１６Ｂは、ヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの存在下における、示された薬剤による処置後の、Ｈ６０肺腫瘍細胞（Ａ）及びＳＷ４８０結腸腫瘍細胞（Ｂ）の細胞生存性である。
【００２３】
【図１７Ａ−１７Ｂ】図１７Ａ及び図１７Ｂは、ヒトＰＢＭＣの存在下における、示された薬剤による処置後の、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍細胞（Ａ）及びＨ６０肺腫瘍細胞（Ｂ）の細胞生存性である。
【図１７Ｃ−１７Ｄ】図１７Ｃ及び図１７Ｄは、ヒトＰＢＭＣの存在下における、示された薬剤による処置後の、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍細胞（Ｃ）及びＨ６０肺腫瘍細胞（Ｄ）の細胞生存性である。
【図１７Ｅ−１７Ｆ】図１７Ｅ及び図１７Ｆは、ヒトＰＢＭＣの存在下における、示された薬剤による処置後の、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍細胞（Ｅ）及びＨ６０肺腫瘍細胞（Ｆ）の細胞生存性である。
【００２４】
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ及び図１８Ｂは、示された薬剤による、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍異種移植片（Ａ）、及びＨ６０肺腫瘍異種移植片（Ｂ）の増殖の阻害である。
【図１８Ｃ−１８Ｄ】図１８Ｃ及び図１８Ｄは、示された薬剤による、ＣＯＬＯ  ２０５異種移植片（Ｃ）、及びＲａｍｏｓリンパ腫異種移植片（Ｄ）の増殖の阻害である。
【００２５】
【図１９Ａ−１９Ｂ】図１９Ａ、Ｂは、示された薬剤による、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍異種移植片（Ａ）及びＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓腫瘍異種移植片（Ｂ）の増殖の阻害である。
【００２６】
【図２０Ａ−２０Ｂ】（Ａ）は、ＤＲ４及びＤＲ５への各示された薬剤の同時結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果である。（Ａ）において、４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊及び３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊についての曲線は重なり合い、区別することができない。（Ｂ）は、ヤギ抗ｍＩｇＧ−Ｆｃの非存在下における、示された薬剤による処置後の、ＣＯＬＯ  ２０５細胞の細胞生存性である。
【図２０Ｃ−２０Ｄ】（Ｃ）は、ＤＲ４及びＤＲ５への各示された薬剤の同時結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果である。（Ｄ）は、ヤギ抗ｍＩｇＧ−Ｆｃの非存在下における、示された薬剤による処置後の、ＣＯＬＯ  ２０５細胞の細胞生存性である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
好ましい実施形態の詳細な説明
１．抗体
本明細書中で使用されるように、「抗体」は、抗原に結合することのできる１又は複数のドメインを含むタンパク質を意味し、ここで、そのようなドメインは、天然抗体の可変ドメインに由来するか、又は相同性である。モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）は、様々な抗体の混合物とは対照的な、ただ一つの種類のみの抗体である。文脈によって特に指示のない限り、本明細書に記載される抗体は概してモノクローナルである。抗体の「抗原」は、抗体が特異的に結合する化合物を意味し、典型的にはポリペプチドであるが、小さいペプチド又は小分子ハプテン又は炭水化物又は他の部分であることもできる。抗体の例は、天然の完全長４量体抗体；Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'及び（Ｆａｂ'）２などの抗体断片；一本鎖（ｓｃＦｖ）抗体（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９，  １９８８；  Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３，  １９８８）；単一アーム抗体（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：８４０，  ２００３）；及び二重特異性、キメラ及びヒト化抗体（これらの用語は以下でさらに説明する）を含む。抗体は、鶏、げっ歯類（例えば、マウス、ラット及びハムスター）、ウサギ、ラクダ、霊長類及びヒトを含む、任意の脊椎動物種に由来し得る。定常ドメインを含む抗体は、以下のうちの任意のものであってよい：既知のアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ及びそれらのサブタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４及びマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３、及びそれらのアロタイプ及びイソアロタイプ（アロタイプ及びイソアロタイプにおいて多型位置を占める残基の順列を含む）。抗体はまた、キメラアイソタイプであってもよい。すなわち、その定常（Ｃ）領域のうち１又は複数は、異なるアイソタイプ由来の領域、例えば、ガンマ−１  ＣＨ１領域を、ガンマ−２、ガンマ−３及び／又はガンマ−４遺伝子に由来する、ヒンジであるＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインと共に、含むことができる。補体媒介性細胞傷害又はＡＤＣＣなどのエフェクター機能を低減する又は増加させるために（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，８３４，５９７号；及びＬａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：４００５，  ２００６を参照されたい）、又はヒトにおける半減期を延長するために（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：６２１３，  ２００４を参照されたい）、抗体は、定常領域に置換を含んでもよい。
【００２８】
天然抗体分子は、概して、２つの同一のヘテロダイマーから成るテトラマーであり、このヘテロダイマーのそれぞれは、１つの重鎖と対になった１つの軽鎖を含む。各軽鎖及び重鎖は、可変（軽鎖についてＶＬ、又は重鎖についてＶＨ、又は両方についてＶ）領域と、それに続く定常（ＣＬ又はＣＨ、又はＣ）領域とから成る。ＣＨ領域はそれ自体、ＣＨ１、ヒンジ（Ｈ）、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含む。３次元（３Ｄ）空間において、ＶＬ及びＶＨ領域は、共に折り重なってＶドメインを形成する。Ｖドメインは、抗原に結合するため、結合ドメインとしても知られる。ＣＬ領域は、ＣＨ１領域と共に折り重なり、その結果、軽鎖のＶＬ−ＣＬ及び重鎖のＶＨ−ＣＨ１領域が、Ｆａｂとして知られる抗体の一部を共に形成する。したがって、天然に「Ｙ字型」の抗体が、２つのＦａｂを含み、ここで、１つのＦａｂは各ヘテロダイマーに由来し、Ｙ字のアームを形成する。一方のヘテロダイマーのＣＨ２領域が、他方のヘテロダイマーのＣＨ２領域に対向して位置し、それぞれのＣＨ３領域が相互に折り重なって、免疫系の他のコンポーネントと相互作用する抗体の単一のＦｃドメイン（Ｙ字の基部）を共に形成する。
【００２９】
各軽鎖又は重鎖可変領域内には、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる３つの短いセグメント（平均すると約１０アミノ酸長）が存在する。抗体可変ドメイン中の６つのＣＤＲ（軽鎖由来の３つ及び重鎖由来の３つ）は、３Ｄ空間において共に折り重なり、標的抗原にロックされる実際の抗体結合部位を形成する。ＣＤＲの位置及び長さは、Ｅ  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  米国保健福祉省，  １９８３，  １９８７，  １９９１によって、正確に定められている。ＣＤＲに含まれない可変領域の部分はフレームワークと呼ばれ、これはＣＤＲの環境を形成する。Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１，  １９８７は、構造によって決定される超可変領域又はループの関連概念を定めている。
【００３０】
本明細書中で使用されるように、「遺伝子操作された」ｍＡｂは、組換えＤＮＡ技術の助けを借りて、遺伝子が非天然環境中に構築されている又は置かれている（例えば、マウス中のヒト遺伝子又はバクテリオファージ上のヒト遺伝子）ｍＡｂであり、それ故に、以下に説明されるように、キメラ抗体及びヒト化抗体を含むが、従来のハイブリドーマ技術で作製されたマウス又は他のげっ歯類ｍＡｂを包含しない。キメラ抗体（又はそれぞれキメラ抗体軽鎖又は重鎖）は、マウス（又は他の非ヒト種）抗体（又はそれぞれ抗体軽鎖又は重鎖）の可変領域が、ヒト抗体の定常領域と組み合わされている抗体（又はそれぞれ抗体軽鎖又は重鎖）であり、遺伝子工学によるそれらの構築は周知である。そのような抗体は、約３分の２がヒトでありながら、マウス抗体の結合特異性を保持している。
【００３１】
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体（例えば、鶏、マウス、ラット、ウサギ又はハムスター）に由来するＣＤＲがヒト「アクセプター」抗体配列に移植されている、遺伝子操作された抗体であり、その結果、ヒト化抗体はドナー抗体の結合特異性を保持する（例えば、Ｑｕｅｅｎ，  米国特許第５，５３０，１０１号及び５，５８５，０８９号；Ｗｉｎｔｅｒ，  米国特許第５，２２５，５３９号；Ｃａｒｔｅｒ，  米国特許第６，４０７，２１３号；Ａｄａｉｒ，  米国特許第５，８５９，２０５号６，８８１，５５７号；Ｆｏｏｔｅ，  米国特許第６，８８１，５５７号を参照されたい）。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、生殖系ヒト抗体配列、又はそのような配列の２以上の複合物であることができる。したがって、ヒト化抗体は、ドナー抗体に完全に又は実質的に由来するいくつかの又は全てのＣＤＲ、及びヒト抗体配列に完全に又は実質的に由来する可変領域フレームワーク配列及び定常領域（存在する場合）を有する抗体である。同様に、ヒト化軽鎖（それぞれ重鎖）は、ドナー抗体軽（それぞれ重）鎖に完全に又は実質的に由来する、少なくとも１つの、２つの及び通常は３つ全てのＣＤＲ、及びヒト軽（それぞれ重）アクセプター鎖に実質的に由来する、軽（それぞれ重）鎖可変領域フレームワーク及び軽（それぞれ重）鎖定常領域（存在する場合）を有する。ヒト化抗体は、概して、ヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体中のＣＤＲは、対応するアミノ酸（Ｋａｂａｔにより定められる）の少なくとも８５％、９０％、９５％又は１００％が、それぞれのＣＤＲ間で同一である場合、非ヒト抗体中の対応するＣＤＲに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク又は定常領域は、対応するアミノ酸（Ｋａｂａｔにより定められる）の少なくとも８５、９０、９５又は１００％が同一である場合、それぞれヒト可変領域又はヒト定常領域に実質的に由来する。
【００３２】
ここで、本出願中の他の場所と同様に、配列同一性のパーセンテージは、Ｋａｂａｔナンバリング規則（ＣＨ領域についてのＥｕインデックス）によって最大限に整列された抗体配列で決定される。整列の後、対象抗体領域（例えば、重鎖又は軽鎖の全体の成熟可変領域）が、参照抗体の同じ領域と比較されている場合、対象抗体領域と参照抗体領域との間の配列同一性のパーセンテージは、対象抗体領域及び参照抗体領域の両方において同じアミノ酸によって占められる位置の数を、２つの領域の整列された位置の総数で割ったもの（ギャップはカウントしない）に、１００を乗じてパーセンテージに変換したものである。
【００３３】
ヒト化抗体において高い結合親和性を保持するために、２つの追加の構造的要素のうち少なくとも１つを採用することができる。ヒト化抗体の構築についての詳細な説明を提供する、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３０，１０１号及び５，５８５，０８９号を参照されたい。第１の構造的要素において、アクセプター又はヒト化抗体の重鎖可変領域のフレームワークは、多くの既知のヒト抗体の中からアクセプター抗体重鎖を適切に選択することによって、ドナー抗体の重鎖可変領域のフレームワークと高い配列同一性（６５％〜９５％）を有するように選択される。第２の構造的要素において、ヒト化抗体を構築する際に、ヒトアクセプター抗体のフレームワーク（ＣＤＲの外側）中の選択されたアミノ酸が、特定の規則に従って、ドナー抗体に由来する対応するアミノ酸で置換される。具体的には、フレームワーク中の置換されるべきアミノ酸は、ＣＤＲと相互作用するそれらの能力に基づいて選択される。例えば、置換されたアミノ酸は、３次元空間で測定されるときに、ドナー抗体配列においてＣＤＲに隣接することができ、又はヒト化抗体においてＣＤＲの４−６オングストローム以内にあることができる。
【００３４】
上述の米国特許第５，５３０，１０１号及び第５，５８５，０８９号の方法、例えば、「スーパーヒト化（ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：  １１１９，  ２００２、及び米国特許第６，８８１，５５７号を参照されたい）又はＳｔｕｄｎｉｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ７：８０５，  １９９４の方法と同じ結果を、ヒト化抗体を設計するための他のアプローチを使用して達成することもできる。さらに、遺伝子操作された、免疫原性の低下したｍＡｂを産生するための他のアプローチは、例えば、Ｖａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８１：１０５，  １９９８；Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ９：８９５，  １９９６；及び米国特許第６，０７２，０３５号及び第５，６３９，６４１号に説明されるような、「リシェイピング（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」、「ハイパーキメラ化（ｈｙｐｅｒｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」及びベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）／リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）を含む。ベニア化抗体は、Ｂ又はＴ細胞エピトープに寄与し得る、非ヒトドナー抗体の可変領域フレームワーク中の特定のアミノ酸、例えば暴露残基を置換することによって、よりヒト様に作製される（Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２８：４８９，  １９９１）。他のタイプの遺伝子操作された抗体は、ファージディスプレイ法を使用して（Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ９１／１７２７１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ９２／００１０４７；Ｗｉｎｔｅｒ，  ＷＯ９２／２０７９１；及びＷｉｎｔｅｒ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２３：９２，  １９９８、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）、又はトランスジェニック動物を使用することによって（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ９３／１２２２７；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ＷＯ９１／１０７４１、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）、作製されたヒト抗体を含む。
【００３５】
用語「抗体」又は「ｍＡｂ」はまた、二重特異性抗体を包含する。「二重特異性抗体」は、第１の抗原に結合する第１のドメイン及び第２の抗原に結合する第２の（異なる）ドメインを含む抗体であり、ここで、第１のドメイン及び第２のドメインは、天然抗体の可変ドメインに由来する又は相同性である。第１の抗原及び第２の抗原は同じ抗原であってよく、その場合、第１のドメイン及び第２のドメインは、その抗原上の異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体という用語は、多重特異性抗体を包含する。この多重特異性抗体は、第１のドメイン及び第２のドメインに加えて、他の抗原に結合し且つ天然抗体の可変ドメインに由来する又は相同性の、１又は複数の他のドメインを含む。二重特異性抗体という用語はまた、天然抗体の可変ドメインに由来する又は相同性の第１の結合ドメイン、及び別のタイプのタンパク質、例えば、レセプターの細胞外ドメインに由来する第２の結合ドメインを含む抗体を包含する（「二重特異性抗体−イムノアドヘシン」）。そして、二重特異性抗体という用語は、二重特異性結合ドメインを備える「ツーインワン（ｔｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ）」抗体をさらに包含する（Ｇ  Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０：４７２−４８６，  ２０１１）。
【００３６】
二重特異性抗体は、様々な形態で産生されている（例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  ＭＡｂｓ  ４：１８２−１９７，  ２０１２及びその中で引用されている参考文献を参照されたい）。様々な形態としては、例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、及びｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（Ｃｏｌｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：１２５−１２６，  １９９７；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６７：２１３−２２６，  ２００２；Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１９９−２０６，  １９９４）、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ（Ｚ  Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １３：  ３６１−３６７，  ２０００）、二重可変ドメイン抗体（Ｃ  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：１２９０−１２９７，  ２００７）、及びダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，  １９９３）がある。二重特異性Ｆ（ａｂ'）２抗体断片は、化学的カップリングによって（Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１，  １９８５）、又はロイシンジッパーを使用することによって（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１５４７−１５５３，  １９９２）、産生されている。各重鎖−軽鎖対が異なるＶ領域を有する、より天然の形状の二重特異性抗体は、例えば、別々に産生された２つの重鎖−軽鎖対を化学的に架橋することによって作製することができる（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６０：１６８６−１７０１，  １９８４）。天然の形状の二重特異性抗体はまた、２つのハイブリドーマ細胞株を融合することによって（「クアドローマ」；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：  ５３７−５４０）又は遺伝子導入によって作製される単一の細胞中で、必要とされる重鎖及び軽鎖の両方を発現することによって産生することができる。所望の二重特異性抗体を形成する、細胞中で発現された正しい軽鎖及び重鎖の会合は、「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」技術（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９：６１７−６２１，  １９９６；Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７０：２６−３５，  １９９７；及び米国特許第７，６９５，９３６号）を使用することによって；任意選択的に、１つの軽鎖−重鎖対の抗原結合断片（Ｆａｂ）内での重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインの交換又は「乗り換え」を伴い、結果として「ＣｒｏｓｓＭＡｂ」と呼ばれる二重特異性抗体を作り出すことによって、促進することができる（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：１１１８７−１１１９２，  ２０１１；ＷＯ  ２００９／０８０２５１；ＷＯ  ２００９／０８０２５２；ＷＯ  ２００９／０８０２５３）。
【００３７】
二重特異性抗体の概念に関連するのは、「マルチマー」抗体である。この「マルチマー」抗体は、それぞれが同じ抗原に結合する２より多い結合ドメインを含むｍＡｂである。二重特異性ｍＡｂのためのフォーマットの多く、例えばＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ及び二重可変ドメインは、各結合ドメインと同じ可変ドメインを使用することによってマルチマーｍＡｂを作製するように適合させることができる。したがって、例えば、マルチマーＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ抗体は、同じ結合ドメインの４つのコピーを含むであろう。
【００３８】
抗体は、抗原に結合しない無関係の抗体よりも顕著にその抗原に結合する場合に、抗原に「特異的に」結合すると言われ、したがって典型的には、抗原に対して、少なくとも約１０６であるが、好ましくは１０７、１０８、１０９又は１０１０Ｍ−１の結合親和性（Ｋａ）を有する。概して、抗体が抗原に結合すると言われる場合、特異的結合が意味される。抗体が抗原に結合しないと言われる場合、結合を示す任意のシグナルが、無関係の対照抗体のシグナルと実験誤差内で区別できないことが意味される。ｍＡｂのエピトープは、ｍＡｂが結合するその抗原の領域である。２つの抗体は、それぞれの抗体が、抗原への他方の抗体の結合を競合的に阻害する（ブロックする）場合に、同じ又は重複するエピトープに結合すると判断される。結合を競合的に阻害するとは、競合的結合アッセイにおいて測定したときに、１ｘ又は５ｘ過剰の一方の抗体が、少なくとも５０％であるが好ましくは７５％だけ、他方の抗体の結合を阻害すること、又は１０ｘ、２０ｘ又は１００ｘ過剰の一方の抗体が、少なくとも７５％であるが好ましくは９０％又は９５％又は９９％だけ、他方の抗体の結合を阻害することを意味する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５０：１４９５，  １９９０を参照されたい）。競合的結合アッセイにおいて、（第１のｍＡｂの）結合を阻害するための、第２のｍＡｂの阻害濃度５０（ＩＣ５０）が、第１のｍＡｂそれ自体の結合を阻害するための第１のｍＡｂのＩＣ５０に匹敵する、すなわち、第１のｍＡｂのＩＣ５０の２倍又は３倍以内である場合に、１つのｍＡｂ（第２のｍＡｂ）は、抗原と別のｍＡｂ（第１のｍＡｂ）との結合について、「完全に」競合すると言われる。（第１のｍＡｂの）結合を阻害するための第２のｍＡｂのＩＣ５０が、結合を阻害するための第１のｍＡｂのＩＣ５０よりも実質的に大きい、例えば、３倍又は５倍又は１０倍大きい場合に、第２のｍＡｂは、抗原と第１のｍＡｂとの結合について、「部分的に」競合すると言われる。概して、２つのｍＡｂは、抗原への結合についてそれぞれが他方と完全に競合する場合、抗原上の同じエピトープを有し、少なくとも１つのｍＡｂが他方のｍＡｂと結合について部分的に競合する場合、重複するエピトープを有する。代替的に、２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原における、本質的に全てのアミノ酸突然変異が、他方の抗体の結合を低減又は排除する場合、同じエピトープを有する。その一方で、２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減又は排除するいくつかのアミノ酸突然変異が、他方の抗体の結合を低減又は排除する場合、重複するエピトープを有する。
【００３９】
２．抗ＤＲ４抗体及び抗ＤＲ５抗体
ＤＲ４に結合するモノクローナル抗体（すなわち、抗ＤＲ４  ｍＡｂ）、又はそれぞれ、ＤＲ５に結合する抗体（すなわち、抗ＤＲ５  ｍＡｂ）は、細胞膜レセプターＤＲ４又はそれぞれＤＲ５へのｍＡｂの結合が、少なくともいくつかのタイプの細胞にアポトーシスシグナルを伝達し、結果としてアポトーシスを誘導する場合に、アゴニストであると言われる。そのような抗体は、ブロッキングであってもノンブロッキングであってもよい、すなわち、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの、ＤＲ４又はＤＲ５それぞれへの結合を阻害しても阻害しなくてもよい。本発明のアゴニストｍＡｂは、ＤＲ４及びＤＲ５及び第２の抗原のうちいずれかに結合する、又はＤＲ４及びＤＲ５の両方に結合する、二重特異性抗体であってよく、例えば、０．１、１、１０、１００、１０００、又は１０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度で、例えば、ＷＳＴ−８アッセイを使用して、例えば細胞代謝の阻害によって測定されるように、およそ２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上だけ、細胞生存性を阻害する又はアポトーシスを誘導する。そのような細胞株は、例えば、ＣＯＬＯ  ２０５又はＳＷ４８０結腸腫瘍株、Ｈ４６０肺がん株、又はＢｘＰＣ−３膵臓がん細胞株であってよい。そのような活性は、ｍＡｂ単独の使用によって、又は末梢血単核細胞などのヒト細胞の存在下、又はｍＡｂを架橋する抗体、例えばヤギ抗ＩｇＧ−Ｆｃ（例えば、１０μｇ／ｍＬ）の存在下で、得られ得る。活性は典型的には、ｍＡｂプラス細胞プラス任意の他の薬剤の、３７℃で一晩のインキュベーションの後に測定される。
【００４０】
本発明において使用されるＭＡｂは好ましくは、ＤＲ４又はそれぞれＤＲ５に特異的である、すなわちそれらは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２及びＴＮＦＲスーパーファミリーの他のメンバーなどの、ＤＲ４又はＤＲ５に関連するタンパク質、Ａｐｏ−１（Ｆａｓ）などの他のデスレセプター、及びデコイレセプターＤｃＲ１及びＤｃＲ２に、（特異的に）結合しない、又ははるかに少ない程度（例えば、１０倍未満）でしか結合しない。本発明において使用されるＭＡｂは典型的には、少なくとも１０７Ｍ−１であるが、好ましくは１０８Ｍ−１以上の、及び最も好ましくは１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１又は１０１１Ｍ−１以上の、ＤＲ４又はＤＲ５についての結合親和性（Ｋａ）を有する。そのようなｍＡｂは、ヒトＤＲ４又はＤＲ５に結合するが、有利には、他の種、例えば、マウス又はカニクイザルなどの非ヒト霊長類由来のＤＲ４又はＤＲ５にも、理想的には、ヒトＤＲ４又はＤＲ５への結合親和性と同様（例えば、１０倍以内）の結合親和性で結合する。ヒトＤＲ４及びＤＲ５の配列はそれぞれ、例えば、Ｇ  Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２７６：１１１−１１３，  １９９７  （ＧｅｎＢａｎｋ：  ＡＡＣ５１２２６．１）及びＨ  Ｗａｌｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ  １６：５３８６−５３９７，  １９９７  （ＧｅｎＢａｎｋ：  ＣＡＧ４６６９６．１）によって提供される。
【００４１】
本発明の例示的な抗体は、Ｄ１１４及びＧ４．２、並びにそれらのキメラ及びヒト化形態、例えばＨｕＤ１１４及びＨｕＧ４．２などである。これらの抗体、及び他の、４Ｈ６（ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ−１２４５５によって産生される；米国特許第７，２５２，９９４号を参照されたい）などの抗ＤＲ４  ｍＡｂ、及び３Ｈ３（ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ−１２５３４によって産生される；米国特許第６，２５２，０５０号を参照されたい）などの抗ＤＲ５  ｍＡｂ、又は４Ｈ６又は３Ｈ３の全てのＣＤＲを含む他の抗体は、本発明の二重特異性及びマルチマーｍＡｂにおいて、使用することができ、キメラ、ヒト化又はヒトアゴニストｍＡｂがそのような使用に好ましい。本発明の他の実施形態は好ましくは、ＩｇＧ抗体のためのレセプター（ＦｃγＲ）などのＦｃレセプター、例えば、ＦｃγＲＩＩｂレセプターへの結合を増加させる、定常領域中の突然変異を含む、アゴニスト抗ＤＲ４又は抗ＤＲ５  ｍＡｂ（これは、通常のＩｇＧか、又は二重特異性又はマルチマー抗体のいずれかである）、例えば、以下に説明されるＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊及びＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊ｍＡｂを含む。例示的な突然変異は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（これは、本明細書中で記載される全てのアミノ酸位置を定めるのに使用される）を使用する、単一突然変異であるＧ２３６Ｄ、Ｌ３２８Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、及びＳ２６７Ｅ、及び好ましくは、いずれかの構成的単一突然変異よりも大きな結合親和性をＦｃγＲに対し提供する、Ｇ２３６Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅなどの二重突然変異、及び最も好ましくはＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＳＹ  Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５：３９２６−３９３３，  ２００８）、並びにこれらのアミノ酸位置での他の突然変異、である。これらのうち、Ｓ２６７Ｅ単一突然変異は、抗ＤＲ５  ｍＡｂの効力をインビトロ及びインビボで増加させることが示されている（Ｆ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９：１０９６６−１０９７１，  ２０１２）。最も好ましくは、本発明のｍＡｂは、実施例中のアッセイ又は本分野において別に知られるアッセイのうち任意のものによって評価された場合に、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する。
【００４２】
ＭＡｂは、Ｋａｂａｔにより定められるＣＤＲ（例えば軽鎖中の３つのＣＤＲ及び重鎖中の３つのＣＤＲ）を有し、これらのＣＤＲは、個々に又は集合的に、Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）のＣＤＲと、アミノ酸配列が少なくとも９０％、９５％又は９８％又は完全に同一であり、その機能性特性を維持している。例えば、ヒト化Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）ｍＡｂ、又は少ない数の機能的に重要でないアミノ酸置換（例えば、以下に定められるような保存的置換）、欠失、又は挿入によってＤ１１４（それぞれＧ４．２）とは異なるものもまた、上述の突然変異の有無にかかわらず、本発明の一実施形態である。
【００４３】
本明細書に記載される所望の特性を有する、単一の、原型的な抗ヒト−ＤＲ４（それぞれ抗ヒト−ＤＲ５）ｍＡｂ、例えばＤ１１４（それぞれＧ４．２）が単離されると、当技術分野で公知の方法を使用することによって、ＤＲ４（それぞれＤＲ５）への結合についてＤ１１４（それぞれＧ４．２）と競合する及び／又は同じエピトープを有するｍＡｂを含む、同様の特性を備える他のｍＡｂを発生させることは容易である。例えば、マウスをＤＲ４（それぞれＤＲ５）の細胞外ドメインで免疫化し、ハイブリドーマを産生し、結果として得られるｍＡｂを、ＤＲ４（それぞれＤＲ５）への結合についてＤ１１４（それぞれＧ４．２）と競合する能力についてスクリーニングすることができる。マウスは、Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）が結合するエピトープを含むＤＲ４（それぞれＤＲ５）のより小さい断片で免疫化することもできる。エピトープは、例えば、ＤＲ４（それぞれＤＲ５）にまたがる一連の重複するペプチドへの結合についてスクリーニングすることによって、位置を突き止めることができる。これらの方法で発生させたマウスｍＡｂは、次いでヒト化することができる。代替的に、Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９，  １９９４（これは参照により本明細書に組み込まれる）の方法を使用して、Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）と同じエピトープ及びそれ故に同様の特性を有するｍＡｂの選択を導くことができる。ファージディスプレイを使用して、最初に、Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）の重鎖を（好ましくはヒト）軽鎖のレパートリーと対にして、ＤＲ４−結合（それぞれＤＲ５−結合）ｍＡｂを選択し、次いで新しい軽鎖を、（好ましくはヒト）重鎖のレパートリーと対にして、Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）と同じエピトープを有する（好ましくはヒト）ＤＲ４−結合（それぞれＤＲ５−結合）ｍＡｂを選択する。代替的に、Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）の変異体を、Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡの変異誘発によって得ることができる。
【００４４】
遺伝子操作されたｍＡｂ、例えば、キメラ又はヒト化又は二重特異性ｍＡｂは、様々な当技術分野で公知の方法によって発現させてよい。例えば、それらの軽鎖及び重鎖Ｖ領域をコードする遺伝子は、重複するオリゴヌクレオチドから合成され、入手可能なＣ領域と共に、必要な調節領域、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ部位、などを提供する発現ベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている）に挿入されてよい。ＣＭＶプロモーター−エンハンサーの使用が好ましい。発現ベクターは次いで、リポフェクション又はエレクトロポレーションなどの様々な周知の方法を使用して、ＣＨＯ又はＳｐ２／０及びＮＳ０を含む非産生骨髄腫などの様々なほ乳類細胞株に遺伝子導入し、抗体を発現する細胞を適切な抗生物質選択によって選択することができる。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号を参照されたい。細胞を市販のバイオリアクターで増殖させることによって、より大量の抗体を産生することができる。したがって、本発明は、本明細書に記載されるｍＡｂのうち任意のものを発現する細胞株を提供する。
【００４５】
いったん発現されると、二重特異性ｍＡｂを含む本発明のｍＡｂは、精密ろ過、限外ろ過、プロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー及び／又は有機染料などに基づく他の形態のアフィニティークロマトグラフィーなどの、本技術分野の標準的な手順にしたがって精製され得る。少なくとも約９０又は９５％の同質性の、実質的に純粋な抗体が好ましく、医薬用途には９８％又は９９％又はそれ以上の同質性が最も好ましい。ｍＡｂが従来の手順によって製造される場合、重鎖のＣ末端リジンなどの、軽鎖及び／又は重鎖のアミノ又はカルボキシ末端にある１〜数個のアミノ酸は、一部の又は全部の分子において欠損して又は誘導体化されてよく、そのような組成は依然として、同じｍＡｂであると見なされる、ということも理解される。
【００４６】
３．二重特異性及びマルチマー抗体
一つの実施形態において、本発明は、ＤＲ４に結合する少なくとも１つの結合ドメイン及びＤＲ５に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む、二重特異性モノクローナル抗体を提供する。そのような抗体は、本明細書中で、二重特異性ＤＲ４／ＤＲ５抗体又はｍＡｂと呼ばれる。好ましい実施形態において、各結合ドメインは、ヒト化又はヒトｍＡｂに由来する。好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、ＤＲ４に結合する２以上の結合ドメイン及びＤＲ５に結合する２以上の結合ドメインを含み、しばしば、ＤＲ４への２つの結合ドメインは同じであり、ＤＲ５への２つの結合ドメインは同じである。いずれにしても、二重特異性ｍＡｂは好ましくは、上述のようなアゴニストである、すなわち、がん細胞などの感受性細胞において、ＤＲ４及び／又はＤＲ５を介してアポトーシスシグナルを誘導する。例示的な二重特異性ｍＡｂは、本明細書中に開示される、４Ｈ６抗ＤＲ４  ｍＡｂ又はＤ１１４  ｍＡｂ又はそれらのヒト化形態の結合ドメイン、及び本明細書中に開示される、３Ｈ３抗ＤＲ５  ｍＡｂ又はＧ４．２  ｍＡｂ又はそれらのヒト化形態の結合ドメインを含む。
【００４７】
本発明の二重特異性抗体は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  前掲書に列挙されているフォーマットのうち任意のものなどの、任意のフォーマットにあってよい。１つの好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  前掲書に説明され、図１Ａ、Ｂに示される、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧフォーマットにある。このフォーマットにおいて、一本鎖（ｓｃＦｖ）形態の１つの結合ドメインはＣＬ領域に連結され、結果としてこの軽鎖のＮ末端ドメインとなり、一方、ｓｃＦｖ形態の他の結合ドメインは、ＣＨ１ドメインに連結され、結果としてこの重鎖のＮ末端ドメインとなる。２つの軽鎖及び２つの重鎖は、通常のＩｇＧ抗体でのようにホモダイマーを形成するが、結合ドメインをそれぞれ２つずつ含む。したがって、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧフォーマットの利点は、それが、各モノマー中に同じ重鎖及び軽鎖を備えるホモダイマーであり、そのため正しいヘテロ二量体化を保証するために予防措置を取る必要がないことである。ＶＬ領域及びＶＨ領域を連結する各ｓｃＦｖ内のリンカーは、しばしば、（Ｇ４Ｓ）３ＧＳ又はＡＳＧＳ（Ｇ４Ｓ）３として選択される。各ｓｃＦｖ結合ドメインは、ＶＬ−リンカー−ＶＨの形態又はＶＨ−リンカー−ＶＬの形態（図１Ａに示されるように）であってよく、いずれの結合ドメインも軽鎖の一部であってよい一方で、もう一方の結合ドメインは重鎖の一部であり、そのため、合計で２ｘ２ｘ２＝８のＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ抗体の変異体を、異なる特性を有し得る２つの所与の結合ドメイン（例えば、ＨｕＤ１１４及びＨｕＧ４．２の結合ドメイン）から作製することができる。
【００４８】
本発明の別の実施形態において、二重特異性抗体は、例えば、  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  前掲書において説明される、二重可変ドメインフォーマットにある（ラベル付きの図１Ａを参照されたい）。Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ  ｍＡｂのように、そのような二重特異性ｍＡｂはホモダイマーであり、各モノマーは、結合ドメインをそれぞれ１つずつ含み、Ｖ１−Ｖ２−定常ドメインの配列に連結される。様々なペプチドリンカー、例えば、重鎖中のＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ及び軽鎖中のＲＴＶＡＡＰＳＶＩＦＩＰＰ、又は両方の鎖中のＡＳＧＳ（Ｇ４Ｓ）３、を使用して、第１の可変領域及び第２の可変領域を連結してよい。例えば、そのような二重特異性ｍＡｂにおいて、ＨｕＧ４．２の可変ドメインは第１のドメインである可能性があり、ＨｕＤ１１４の可変ドメインは第２のドメインである可能性があり；リンカーは上記の従来のものである可能性があり、定常領域はヒトＩｇＧ１、カッパアイソタイプである可能性がある。
【００４９】
本発明の他の好ましい実施形態において、軽鎖及び重鎖を含む抗ＤＲ４  ｍＡｂの１つのモノマーは、軽鎖及び重鎖を含む抗ＤＲ５  ｍＡｂの１つのモノマーと対をなして、ＩｇＧ分子の通常の立体配置を有するヘテロダイマーを形成する。４つの鎖全てが細胞において発現される場合、ホモダイマーではなく、所望のヘテロダイマー二重特異性抗体の形成は、ノブ及びホールをそれぞれの重鎖のＣＨ３領域に挿入することによって促進される（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９：６１７−２１，  １９９６；Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７０：２６−３５，  １９９７；及び米国特許第７，６９５，９３６号）一方で、各抗ＤＲ４及び抗ＤＲ５モノマーを形成するための、軽鎖及び重鎖の正しい対形成は、モノマーのうちの１つの中での重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインの「乗り換え（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｏｖｅｒ）」によって促進される（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：１１１８７−９２，  ２０１１；ＷＯ  ２００９／０８０２５１；ＷＯ  ２００９／０８０２５２；ＷＯ  ２００９／０８０２５３）。
【００５０】
別の実施形態において、本発明は、ＤＲ４に対する３以上の結合ドメイン又はＤＲ５に対する３以上の結合ドメイン、例えば、４つの結合ドメイン、を含むマルチマー抗体を提供する。好ましい実施形態において、抗ＤＲ４又は抗ＤＲ５マルチマーｍＡｂは、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ又は二重可変ドメインフォーマットにあり、そのためそれは、ＤＲ４又はＤＲ５それぞれに対する正確に４つの結合ドメインを含む。
【００５１】
本発明の特に好ましい実施形態において、二重特異性ＤＲ４／ＤＲ５又はマルチマー抗ＤＲ４又は抗ＤＲ５抗体は、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ及び二重可変ドメインなどの、具体的に上述したものを含む任意の形態で、Ｆｃレセプター、例えばＦｃγＲＩＩｂレセプターへの結合を増加させる、定常領域中の突然変異を含む。例示的な突然変異は、単一突然変異であるＧ２３６Ｄ、Ｌ３２８Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、及び好ましくは二重突然変異Ｇ２３６Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、及び最も好ましくはＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＳＹ  Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  前掲書に説明される）、並びにこれらのアミノ酸位置での他の突然変異、である。天然ヒト定常領域を備える、ＤＲ５に結合するＶ１ドメイン及びＤＲ４に結合するＶ２ドメイン（図１Ｂを参照されたい）を備える任意のＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ又は二重可変ドメイン二重特異性抗体は、Ｂ−ＤＲ５／ＤＲ４−ｈＦｃと命名され、それがＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ二重突然変異をさらに含む場合、Ｂ−ＤＲ５／ＤＲ４−ｈＦｃ＊＊と命名され；ＤＲ４に結合するＶ１及びＤＲ５に結合するＶ２を備えるＢ−ＤＲ４／ＤＲ５−ｈＦｃ及びＢ−ＤＲ４／ＤＲ５−ｈＦｃ＊＊についても同様である。Ｖ１及びＶ２の両方がＤＲ４（それぞれＤＲ５）に結合する、マルチマーＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ又は二重可変ドメイン抗体は、Ｂ−ＤＲ４／ＤＲ４−ｈＦｃ（それぞれＢ−ＤＲ５／ＤＲ５−ｈＦｃ）と命名され、それがＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異をさらに含む場合、Ｂ−ＤＲ４／ＤＲ４−ｈＦｃ＊＊（それぞれＢ−ＤＲ５／ＤＲ５−ｈＦｃ＊＊）と命名される。
【００５２】
本発明はまた、二重特異性抗体であって、その軽鎖及び重鎖が、少数（例えば、典型的には１、２、３、５又は１０以下）の置換、欠失又は挿入（これは通常Ｃ領域又はＶ領域フレームワークにあるが、ＣＤＲにある可能性もある）によって、本明細書に具体的に記載されるものとは異なる、二重特異性抗体、を含む変異体抗体を提供する。ほとんどの場合、変異体配列で行われる置換は、置換されたアミノ酸に関して保存的である。アミノ酸は、保存的置換、すなわち、グループ内での置換、を決定するために、以下のようにグループ分けすることができる：グループＩ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性の側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及びグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。好ましくは、抗体中の置換は、抗体の結合親和性又は効力に対して、すなわち、ＤＲ４及び／又はＤＲ５を介してアポトーシスシグナルを伝達する抗体の能力に対して、実質的な効果を有しない。好ましくは、変異体配列は、元の配列と、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９８％、同一である。加えて、定常領域の他のアロタイプ又はアイソタイプを使用してもよい。
【００５３】
４．治療方法
好ましい実施形態において、本発明は、本明細書に記載される任意の抗体、例えば、Ｂ−ＤＲ５／ＤＲ４−ｈＦｃ、Ｂ−ＤＲ５／ＤＲ４−ｈＦｃ＊＊、Ｂ−ＤＲ４／ＤＲ５−ｈＦｃ又はＢ−ＤＲ４／ＤＲ５−ｈＦｃ＊＊二重特異性ｍＡｂ、又はＢ−ＤＲ４／ＤＲ４−ｈＦｃ、Ｂ−ＤＲ４／ＤＲ４−ｈＦｃ＊＊、Ｂ−ＤＲ５／ＤＲ５−ｈＦｃ又はＢ−ＤＲ５／ＤＲ５−ｈＦｃ＊＊マルチマーｍＡｂ、並びにＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊及びＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊などのＤ１１４及びＧ４．２のヒト化形態、を含む医薬製剤を提供する。医薬製剤は、生理的に許容されるキャリア中に、任意選択的に添加剤又は安定剤と共に、凍結乾燥された溶液又は水溶液の形態で、ｍＡｂを含有する。許容されるキャリア、添加剤又は安定剤は、採用される用量及び濃度で受容者に無毒であり、典型的には５．０〜８．０の、ほとんどの場合は６．０〜７．０のｐＨの、リン酸塩、クエン酸塩、又は酢酸塩などのバッファー；等張にするための、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩；抗酸化剤、保存料、低分子量ポリペプチド、タンパク質、ポリソルベート８０などの親水性ポリマー、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖、及び当業者に知られる他の標準的成分（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  １９８０）を含む。ｍＡｂは典型的には、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ又は１〜１００ｍｇ／ｍｌであるが、ほとんどの場合は１０〜５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、１０、２０、３０、４０又は５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００５４】
別の好ましい実施形態において、本発明は、典型的にはＤＲ４及び／又はＤＲ５を発現しているがん細胞などの有害細胞を破壊する目的で、医薬製剤中の、本発明の任意の抗体、例えば、Ｂ−ＤＲ５／ＤＲ４−ｈＦｃ、Ｂ−ＤＲ５／ＤＲ４−ｈＦｃ＊＊、Ｂ−ＤＲ４／ＤＲ５−ｈＦｃ又はＢ−ＤＲ４／ＤＲ５−ｈＦｃ＊＊二重特異性ｍＡｂ、又はＢ−ＤＲ４／ＤＲ４−ｈＦｃ、Ｂ−ＤＲ４／ＤＲ４−ｈＦｃ＊＊、Ｂ−ＤＲ５／ＤＲ５−ｈＦｃ又はＢ−ＤＲ５／ＤＲ５−ｈＦｃ＊＊マルチマーｍＡｂ、並びにＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊及びＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊などのＤ１１４及びＧ４．２のヒト化形態を投与することによる、疾患を有する患者を処置する方法を提供する。医薬製剤中に調製されたｍＡｂは、任意の適切な経路によって、静脈内注入又はボーラス注射、筋肉内、又は皮下によって、特に非経口的に、患者に投与することができる。静脈内注入は、わずか１５分間にわたって与えることができるが、より頻繁には、３０分間、又は１、２又は３時間にわたって与えることができる。ｍＡｂはまた、疾患の部位（例えば、腫瘍）中に直接注射することができ、又はリポソームなどの運搬剤中にカプセル化することができる。与えられる用量は、処置されている状態を緩和するのに十分であり（「治療的に有効な用量」）、０．１−５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１、２、３、４又は５ｍｇ／ｋｇである可能性が高いが、１０ｍｇ／ｋｇ又は１５又は２０又は３０ｍｇ／ｋｇの高さ、例えば、０．１−１ｍｇ／ｋｇ、１−１０ｍｇ／ｋｇ又は１−２０ｍｇ／ｋｇの範囲にあってよい。固定された単位用量もまた、例えば、５０、１００、２００、５００又は１０００ｍｇで与えられてよく、又は用量は、患者の表面積に基づいてよく、例えば、１０００ｍｇ／ｍ２であってよい。通常、１〜８回の用量、（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８回）が、がんを処置するために投与されるが、１０、２０又はそれ以上の回数の用量を与えてよい。ｍＡｂは、毎日、１週間に２回、毎週、隔週、毎月又はいくらかの他のインターバルで、例えばｍＡｂの半減期に応じて、１週間、２週間、４週間、６週間、８週間、３−６ヶ月又はそれ以上の期間、投与することができる。慢性投与と同様に、処置過程を反復することも可能である。
【００５５】
本発明のｍＡｂでの治療に特に感受性の疾患は、同じ組織タイプの正常細胞と比較して上昇したレベルのＤＲ４及び／又はＤＲ５を発現しているがん細胞などの細胞に関連する疾患、例えば卵巣がん、乳がん、肺がん（小細胞又は非小細胞）、結腸がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、肝臓がん（肝細胞がん）、腎臓がん（腎細胞がん）、頭頸部腫瘍、メラノーマ、肉腫、及び脳腫瘍（例えば、グリオブラストーマ）を含む。白血病及びリンパ腫などの血液悪性疾患もまた感受性であり得る。任意選択的に、処置されている被験体のがん細胞におけるＤＲ４及び／又はＤＲ５の発現を、処置を開始又は継続する前に評価することができる。発現は、ｍＲＮＡで、又は好ましくはタンパク質レベルで、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）などの生検標本の免疫アッセイによって、評価することができる。ＤＲ４及び／又はＤＲ５の発現は、好ましくは、無関係の対照抗体で免疫アッセイにより評価されたバックグラウンドを少なくとも上回り、より好ましくは、同じ組織タイプの非がん細胞のレベルを上回る。本発明のｍＡｂでの治療に感受性の他の疾患は、リウマチ性関節炎、多発性硬化症及び炎症性腸疾患などの自己免疫性疾患を含む。
【００５６】
好ましい実施形態において、本発明のｍＡｂは、他の治療と組み合わせて（すなわち、共に、すなわち、前、最中、又は後に）投与される。例えば、がんを処置するために、ｍＡｂは、既知の化学療法薬物のうち任意の１又は複数と共に投与してよく、既知の化学療法薬物としては、例えば、アルキル化剤、例えばカルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジン、及びシクロホスファミドなど；代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシル、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキセート及びヒドロキシ尿素など；植物アルカロイド及び抗生物質を含む天然物、例えばブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エトポシド、マイトマイシン、ミトキサントロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びタキソール（パクリタキセル）又はＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）などの関連化合物；トポイソメラーゼ１阻害剤であるイリノテカン；及びチロシンキナーゼの阻害剤、例えばＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（イマチニブ）、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）（スニチニブ）、Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）（ソラフェニブ）、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）、Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）（ラパチニブ）、Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ）及びＸａｌｋｏｒｉ（登録商標）（クリゾチニブ）など；ラパマイシン（登録商標）（シロリムス）及び他のｍＴＯＲ阻害剤；及び血管新生の阻害剤；及びＷＯ  ２００５／０１７１０７  Ａ２（これは、参照により本明細書中に組み込まれる）に列挙される全ての承認された抗がん剤及び実験的抗がん剤、がある。ｍＡｂは、１、２、３又はそれ以上のこれらの他の薬剤と組み合わせて、好ましくは標準的化学療法レジメンにおいて、使用してよい。通常、他の薬剤は、処置されている特定のタイプのがんに有効であると既に考えられている又は知られている薬剤である。
【００５７】
がんを処置するために本発明のｍＡｂと共に投与することができる他の薬剤は、生物製剤を含み、生物製剤としては、モノクローナル抗体、例えばＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）又はＰｅｒｊｅｔａ（登録商標）（ペルツズマブ）；ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）；又はＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）及びＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）などの上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターに対する抗体、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）（イピリムマブ）などの免疫系の活性化剤、例えばＯｐｄｉｖｏ（登録商標）（ニボルマブ）及びＫｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペンブロリズマブ）などの抗ＰＤ−１  ｍＡｂ、並びにＫａｄｃｙｌａ（商標）（アド−トラスツズマブエムタンシン）などの抗体−薬物コンジュゲート、などがある。さらに、ｍＡｂは、任意の形態の外科及び／又は放射線治療と共に使用することができる。
【００５８】
本発明のｍＡｂを含む処置（例えば、標準的化学療法）は、上に列挙されたものなどの特定のタイプのがんを有する患者の無増悪生存期間又は全体の生存期間の中央値を、ｍＡｂを用いない同じ処置（例えば、化学療法）と比較して、少なくとも２０％又は３０％又は４０％であるが好ましくは５０％、６０％〜７０％又は１００％又はそれ以上長く；又は（少なくとも）２、３、４、６又は１２ヶ月だけ、増加させ得る。加えて又は代替的に、ｍＡｂを含む処置（例えば、標準的化学療法）は、患者（特に再発性又は難治性の場合）の完全奏効率、部分奏効率、又は客観的奏効率（完全＋部分）を、ｍＡｂを用いない同じ処置（例えば、化学療法）と比較して、少なくとも３０％又は４０％であるが好ましくは５０％、６０％〜７０％又は１００％だけ、増加させ得る。
【００５９】
典型的には、臨床試験（例えば、フェーズＩＩ、フェーズＩＩ／ＩＩＩ又はフェーズＩＩＩ試験）において、化学療法単独（又はプラスプラセボ）を受ける患者の対照群に対する、化学療法プラス本発明のｍＡｂで処置された患者の無増悪生存期間の中央値及び／又は奏効率の上述の増加は、例えばｐ＝０．０５又は０．０１又は０．００１レベルで、統計的に有意である。奏効率が、例えば、国立がん研究所及び／又は食品医薬品局に受け入れられているような、がんの臨床試験において一般的に使用される客観的判定基準、例えばＲＥＣＩＳＴ判定基準（固形がん効果判定基準）によって決定されることもまた理解される。
【００６０】
５．他の方法
本発明のｍＡｂは、診断方法、予後診断方法、及び実験室的方法においても用途がある。それらは、腫瘍中の又は腫瘍を有する患者の循環中のＤＲ４及び／又はＤＲ５のレベルを測定するために、そしてそれ故に腫瘍の処置を監視及び誘導するために、使用され得る。例えば、高いレベルのＤＲ４及び／又はＤＲ５に関連する腫瘍は、ｍＡｂでの処置に特に感受性であるだろう。具体的な実施形態において、ｍＡｂをＥＬＩＳＡ又はラジオイムノアッセイにおいて使用して、例えば、腫瘍生検標本中の又は血清中の、ＤＲ４及び／又はＤＲ５のレベルを測定することができる。ＤＲ４及びＤＲ５の両方を発現する細胞を検出するために、１つの抗ＤＲ４  ｍＡｂ及び１つの抗ＤＲ５  ｍＡｂの使用が、特に有用である。様々なアッセイのために、ｍＡｂを、蛍光分子、スピン標識分子、酵素又は放射性同位元素で標識してよく、アッセイを実施するために必要な全ての試薬を備えるキットの形態で提供してよい。他の用途において、ｍＡｂを使用して、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによって、ＤＲ４又はＤＲ５を精製する。
【実施例】
【００６１】
６．実施例
＜例１：抗ＤＲ４及び抗ＤＲ５  ｍＡｂの発生＞
【００６２】
ヒトＤＲ４に結合するｍＡｂを発生させてアッセイするために、分子生物学の標準的な方法を使用して、いくつかの融合タンパク質を構築した。ＤＲ４−ｈＦｃを産生するために、ヒトＤＲ４の細胞外ドメイン（アミノ酸１０９〜２３９）をコードするｃＤＮＡを発生させ、ｐＣＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体に挿入し、ヒトＩｇガンマ−１Ｆｃ領域（ヒンジ−ｃＨ２−ｃＨ３）にＣ末端で連結し、２９３Ｆ哺乳動物細胞に遺伝子導入して発現させた。サルＤＲ４ドメインを得るために、カニクイザル肝臓ｃＤＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）からクローニングしたサルＤＲ４細胞外ドメインを使用して、カニクイザルｃＤＲ４−ｈＦｃ融合タンパク質を同様に構築した。プロテインＡカラムを使用することによって、２９３Ｆ培養上清からこれらのＦｃ−融合タンパク質を精製した。ヒトＤＲ４細胞外ドメインをヒトＩｇカッパ定常領域に連結し、続いてＣ末端にＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を連結することによって、ＤＲ４−ＫＦ融合タンパク質を同様に産生した。カニクイザルＤＲ４を使用して類似タンパク質ｃＤＲ４−ＫＦを作製した。抗ＦＬＡＧカラムを使用して、これらのＦＬＡＧタグ化融合タンパク質を精製した。ヒトＤＲ５に結合するｍＡｂを発生させてアッセイするために、完全に類似の一連のタンパク質ＤＲ５−ｈＦｃ及びＤＲ５−ＫＦ、及びｃＤＲ５−ｈＦｃ及びｃＤＲ５−ＫＦを、ヒト及びカニクイザルＤＲ５細胞外ドメイン（アミノ酸５４−１８３）をそれぞれ使用して、ＤＲ４と同じやり方で作製した。ブロッキングアッセイのために、ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬタンパク質（アミノ酸９５−２８１）を使用した（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）。市販のヒトＤＲ４−Ｆｃ及びＤＲ５−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）も使用した。
【００６３】
抗ＤＲ４  ｍＡｂを発生させるために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、各後足蹠において、１週間に２回、１μｇのＤＲ４−ｈＦｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのＴＲＡＩＬＲ１−Ｆｃ）で１１回、次いで上述のように調製され、ＭＰＬ／ＴＤＭアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に再懸濁された、５μｇのＤＲ４−ｈＦｃで５回、免疫化した。最終追加免疫の３日後に、３５％ポリエチレングリコールを使用して、膝窩リンパ節細胞を、マウス骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ．１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５９７）と融合させた。説明されるように（Ｃｈｕｎｔｈａｒａｐａｉ  ａｎｄ  Ｋｉｍ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：７６６，  １９９７）、ＨＡＴ培地において、ハイブリドーマを選択した。融合の１０日後に、ハイブリドーマ培養上清を、以下に説明されるＤＲ４結合ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングした。選択されたハイブリドーマを限界希釈によって２回クローニングした。プロテインＡ／Ｇカラムを使用して、選択されたハイブリドーマの腹水及び培養液中のＭＡｂを精製した。さらなる分析のために選択されたいくつかの抗体のうち、抗体Ｄ１１４が細胞殺滅アッセイにおいて優れたアゴニスト活性を示したため、抗体Ｄ１１４を開発のために選択した。アイソタイピングキットを使用して、Ｄ１１４のアイソタイプがＩｇＧ１、カッパであると決定した。
【００６４】
抗ＤＲ５  ｍＡｂを発生させるために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、各後足蹠において、１週間に２回、５μｇのＤＲ５−ｈＦｃで１２回、次いでＭＰＬ／ＴＤＭアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に再懸濁された、１μｇのＤＲ５−ｈＦｃで１回、免疫化した。抗ＤＲ４  ｍＡｂについて上述したように、最終追加免疫の３日後に、膝窩リンパ節細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、ＨＡＴ培地においてハイブリドーマを選択した。融合の１０日後に、ハイブリドーマ培養上清を、以下に説明されるＤＲ５結合ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングした。次いで、抗ＤＲ４  ｍＡｂについて上述したように、選択されたハイブリドーマを限界希釈によって２回クローニングし、ｍＡｂを精製した。選択されたｍＡｂを、以下に説明されるように、ＣＯＬＯ  ２０５の細胞生存性に対するそれらの効果について、及びサルＤＲ５に対するそれらの結合活性について、さらに試験した。いくつかの選択された抗体のうち、抗体Ｇ４．２が細胞殺滅アッセイにおいて優れたアゴニスト活性を示したため、抗体Ｇ４．２を開発のために選択した。アイソタイピングキットを使用して、Ｇ４．２のアイソタイプがＩｇＧ１、カッパであると決定した。
【００６５】
＜例２：抗体の結合及びブロッキング活性＞
【００６６】
この特許出願において説明される各ＥＬＩＳＡアッセイの各ステップは、最初のプレートコーティングステップを４℃で一晩行った後、２％のＢＳＡで１時間ブロッキングしたことを除いては、適切な試薬と共に１時間室温でインキュベーションすることによって実施した。各ステップの間に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中で、３回プレートを洗浄した。データ点は概して、２連又は３連であり、概して、反復データ点間にはばらつきがほとんどなかった。
【００６７】
ＤＲ４（それぞれＤＲ５）へのｍＡｂの結合を測定するために、捕捉アッセイを概して使用した。プレートを、最初にヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングし、２％のＢＳＡでブロッキングし、ハイブリドーマ上清又は増加する濃度の試験される精製抗体と共にインキュベートし、次いで０．３μｇ／ｍｌのＤＲ４−ＫＦ（それぞれＤＲ５−ＫＦ）と共にインキュベートした。ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトカッパを添加し、次いでＴＭＢ基質を添加することによって、捕捉されたＤＲ４−ＫＦ（それぞれＤＲ５−ＫＦ）を検出した。しかしながら、以下に説明されるように、ＨｕＧ４．２変異体のＤＲ５への結合を測定するために、直接結合アッセイを使用した。プレートを、Ｄｒ５−Ｆｃ（０．５μｇ／ｍＬ）でコーティングし、ブロッキングし、増加する濃度のｍＡｂと共にインキュベートした。そして、結合されたｍＡｂをＨＲＰ−ヤギ抗ヒトカッパで検出した。
【００６８】
ｍＡｂのブロッキング活性を測定するために、プレートを、最初にヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（２μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングし、２％のＢＳＡでブロッキングし、次いでＤＲ４−ｈＦｃ又はそれぞれＤＲ５−ｈＦｃ（０．５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。次いで、様々な濃度の精製ｍＡｂと混合した５０ｎｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ（ＴＲＡＩＬ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）をウェルに添加した。そして、０．２μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＴＲＡＩＬ抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、それに続いてＨＲＰ−ストレプトアビジンを添加し、次いでＴＭＢ基質を添加することによって、結合されたＡｐｏ２Ｌを検出した。
【００６９】
これらのＥＬＩＳＡアッセイを使用して、Ｄ１１４が、４Ｈ６と同じように、ＤＲ４に結合し（図２Ａ）、４Ｈ６と同じように、Ａｐｏ２ＬのＤＲ４への結合をブロッキングする（図２Ｂ）ことが示された。結合アッセイにおいてｃＤＲ４−ｈＦｃタンパク質を使用することによって、Ｄ１１４が、ヒトＤＲ４とほぼ同じように、カニクイザルＤＲ４に結合することも同様に示された。Ｇ４．２が、ＤＲ５に良好に結合し（図２Ｃ）、Ａｐｏ２ＬのＤＲ５への結合を有効にブロッキングする（図２Ｄ）ことも示された。さらに、上述の結合アッセイにおいてｃＤＲ５−ｈＦｃタンパク質を使用することによって、Ｇ４．２もまたカニクイザルＤＲ５に良好に結合する一方で、このアッセイにおいて３Ｈ３がカニクイザルＤＲ５に結合しないことが示された。これは、３Ｈ３に対するＧ４．２の利点を提供し、Ｇ４．２が３Ｈ３とは異なるエピトープを有するはずであることを示している。
【００７０】
＜例３：Ｄ１１４及びＧ４．２による細胞殺滅＞
【００７１】
細胞生存性の減少（本明細書中で細胞殺滅と呼ばれる）を測定するためのアッセイを実施するために、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中のヒト腫瘍細胞株を、９６穴プレートに２ｘ１０４細胞／１００μｌ／ウェルで播種し、（３７℃及び５％ＣＯ２の標準的条件下で）一晩インキュベートした。次いで、培地を除去し、１０μｇ／ｍＬの、マウス抗体についてはヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（抗ｍＩｇＧ−Ｆｃ）、及びヒト、ヒト化又はキメラ抗体についてはヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（抗ｈＩｇＧ−Ｆｃ）を、含む又は含まない、増加する濃度のｍＡｂを含有する、１００μｌの同じ培地に交換した。ある特定のアッセイにおいて、ｍＡｂ及び抗ＩｇＧ−Ｆｃは代わりに、腫瘍細胞が播種されたときに培地中に含まれた。ｍＡｂの各濃度は２連で行った。標準的条件下で一晩のインキュベーションの後、１０μｌ／ウェルのＷＳＴ−８を１時間添加し、ＯＤ４５０での吸光度を測定することにより、細胞生存性を決定した。いくつかの実験において使用されたヤギ抗ｍＩｇＧ−Ｆｃ又は抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの目的は、試験されている抗ＤＲ４又は抗ＤＲ５抗体を架橋（オリゴマー化）して、その結果より強力なアポトーシスシグナルを細胞に伝達することを可能にすることであった。抗ＩｇＧ−Ｆｃ抗体によるそのような架橋は、白血球が白血球の表面上のＦｃγＲを介して腫瘍に浸潤する際に、抗ＤＲ４又は抗ＤＲ５抗体が白血球に結合し、その結果白血球によって連結されるときに起こる架橋を、模倣すると考えられる。
【００７２】
このアッセイを使用して、Ｄ１１４が、４Ｈ６と同様に、抗ｍＩｇＧ−Ｆｃの存在下で、Ｈ４６０肺腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１７７；図３Ａ）及びＳＷ４８０結腸腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２８；図３Ｂ）及び他の試験された細胞株の細胞生存性を阻害することを決定した。同様に、Ｇ４．２は、３Ｈ３とほぼ同様に、Ｈ４６０細胞（図３Ｃ）及びＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２２；図３Ｄ）の細胞生存性を阻害する。
【００７３】
＜例４：抗体の構築及び特徴付け＞
【００７４】
ｍＡｂの重鎖及び軽鎖可変領域のクローニング、様々なｍＡｂの構築及び発現、及び突然変異の導入は全て、例えば、米国特許第７，６３２，９２６号（これは、参照により全ての目的のために本明細書中に組み込まれる）において説明されるような、分子生物学の標準的な方法を使用して実施した。４Ｈ６の（成熟）重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ図４Ａ及び４Ｂに示し、３Ｈ３の（成熟）重鎖及び軽鎖可変領域をそれぞれ図４Ｃ及び４Ｄに示す。Ｄ１１４の（成熟）重鎖及び軽鎖可変領域をそれぞれ図５Ａ及び５Ｂに示し（一番上の行がＤ１１４とラベル付けされている）、Ｇ４．２の（成熟）重鎖及び軽鎖可変領域をそれぞれ図５Ｃ及び５Ｄに示す（一番上の行がＧ４．２とラベル付けされている）。
加えて、本明細書中に開示されるｍＡｂを比較するために、いくつかの他の抗ＤＲ５  ｍＡｂを、それらの公開された配列：ヒトｍＡｂドロジツマブ（Ａｐｏｍａｂ；米国特許第８，０３０，０２３号の図１７及び１８）及びコナツムマブ（ＡＭＧ６５５；ＷＯ２０１２／１０６５５６の図１９）、及びマウスｍＡｂ  ＴＲＡ−８（米国特許第７，２４４，４２９号の図２３及び２４）に基いて、構築した。
【００７５】
本明細書中で使用される規則として、抗体に適用されるｈＦｃ＊＊という接頭辞（ある特定の図においてはＦｃ＊＊とも記載される）は、それがＳ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ突然変異を有するヒトガンマ−１定常領域（その配列は図６Ａの一部として示されている（図６Ａの凡例を参照されたい））を含むことを意味し、一方でｈＦｃという接頭辞は、それがＳ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ突然変異を有しない（したがってＳ及びＬをそれらのアミノ酸位置に有する）ヒトガンマ−１定常領域を含むことを意味する。我々は、それぞれのマウス抗体の可変領域を、ヒトカッパ定常領域及びヒトガンマ−１定常領域と組み合わせることによって、３Ｈ３−ｈＦｃ、４Ｈ６−ｈＦｃ、Ｄ１１４−ｈＦｃ及びＧ４．２−ｈＦｃキメラ抗体を構築し、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ突然変異を含むヒトガンマ−１定常領域と組み合わせることによって、対応する３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊、４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊、Ｄ１１４−ｈＦｃ＊＊及びＧ４．２−ｈＦｃ＊＊キメラ抗体を構築した。いくつかの実験において比較するために、我々はまた、ヒトＡｐｏｍａｂ可変領域を、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ突然変異を含むヒトガンマ−１定常領域と組み合わせることによって、抗体Ａｐｏｍａｂ−ｈＦｃ＊＊を構築した。
【００７６】
Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧフォーマットにおいて二重特異性抗体Ｂ−４Ｈ６／３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊を構築した。このｍＡｂの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列はそれぞれ図６Ａ及び図６Ｂに示され、各成熟鎖は、シグナルペプチドの後の最初のアミノから始まる。したがって、このｍＡｂは、４Ｈ６  ｍＡｂ由来のＶＨ１及びＶＬ１及び３Ｈ３  ｍＡｂ由来のＶＨ２及びＶＬ２を備える、図１Ａに示される構成を有する。
【００７７】
＜例５：抗体による細胞殺滅＞
【００７８】
上述の様々な抗体の、様々な異なる細胞株を殺滅する（すなわち、細胞生存性を低減する）能力を、上述の細胞殺滅アッセイにおいて試験した。抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの非存在下では、３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊も、４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊も、これらの２つのｍＡｂの組み合わせ（混合物）も、ＳＷ４８０結腸腫瘍細胞（図７Ａ）又はＨ４６０肺腫瘍細胞（図８Ａ）のいずれの殺滅も示さなかった。なぜなら、抗体をオリゴマー化する架橋剤がなければ、それらは死シグナルを細胞に伝達することができないためである。しかしながら、３Ｈ３−ｈＦｃ＊及び４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊は、架橋剤抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの存在下でＳＷ４８０細胞を殺滅することができ、殺滅の程度は４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊のほうが大きかった（図７Ｂ）。３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊を４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊に添加しても、殺滅はさらに増加しなかった。
【００７９】
突然変異を有する抗体の形態が、ＦｃγＲＩＩｂ発現細胞の存在下で、腫瘍細胞の殺滅に利点を有するかどうかを決定するために、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の指示に従って使用して、大部分が単球及びリンパ球から成る末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト血液から単離した。ｍＡｂを含む培地もまた概して２ｘ１０５のヒトＰＢＭＣを含んでいたことを除いては、上述のように、細胞生存性アッセイを実施した。ＰＢＭＣの存在下では、４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊は実際に、４Ｈ６−ｈＦｃよりも実質的に有効に、Ｈ４６０腫瘍細胞を殺滅した（図８Ｂ）。
【００８０】
我々は次に、ヒトガンマ−１定常領域中の２つの突然変異が、単一突然変異よりも大きい細胞殺滅活性を提供したかどうかを調査した。したがって我々は、４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊中のＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ二重突然変異ではなく、Ｓ２６７Ｅ突然変異のみを有する、キメラ４Ｈ６−ｈＦｃ＊  ｍＡｂ（単一のアスタリスクを有するｈＦｃ＊で示される）を構築した。固定された濃度の、０．５μｇ／ｍＬ  ｍＡｂ、４ｘ１０４  ＣＯＬＯ  ２０５腫瘍細胞／ウェル、及び（ＰＢＭＣの潜在的なばらつきを考慮するために）４人の異なるヒトドナー由来の４ｘ１０５  ＰＢＭＣ／ウェルで、上述の細胞殺滅アッセイを使用した。ドナーのそれぞれについて、４Ｈ６−ｈＦｃは、（各ドナーについて、生存性１００％と設定された対照ｈＩｇＧ  ｍＡｂと比べて）腫瘍細胞の生存性を中程度に低減し、単一突然変異を有する４Ｈ６−ｈＦｃ＊は、４Ｈ６−ｈＦｃよりもわずかに〜顕著に、生存性を低減したが、４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊は、４Ｈ６−ｈＦｃ＊よりも実質的に良好に、生存性を低減した（図９Ａ）。このことは、ＦｃγＲＩＩｂへの結合を増加させるという、１つの突然変異に対する、２つの突然変異の利点を示している。これが、少なくとも２つの突然変異の他の組み合わせにも当てはまったかどうかを決定するために、我々は、以下の表に従って、突然変異の他の対を４Ｈ６−ｈＦｃに導入した。
【表１】
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【００８１】
１μｇ／ｍＬの固定された抗体濃度で且つヒトＰＢＭＣの存在下で、４つの変異体全てが、ＣＯＬＯ  ２０５細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）及びＨ４６０細胞についてほぼ等しく、細胞生存性を低減した（図９Ｂ）。本アッセイの条件下では、最も大きな効果がＣＯＬＯ  ２０５細胞に対して見られ、Ｈ６０については中程度の効果のみが見られた。したがって、ＦｃγＲＩＩｂへの結合をそれぞれ増加させる２以上の突然変異の様々な組み合わせは、腫瘍細胞殺滅を強化するのに等しく適している。
【００８２】
１つの突然変異に対する２つの突然変異の利点をさらに調査するために、ＰＢＭＣの存在下における、４Ｈ６−ｈＦｃ、４Ｈ６−ｈＦｃ＊、及び４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊のＣＯＬＯ  ２０５細胞を殺滅する能力を、ある範囲の抗体濃度にわたって試験した（図１０Ａ）。この実験において、４Ｈ６−ｈＦｃによる殺滅は見られず、４Ｈ６−ｈＦｃ＊による中程度の殺滅が見られ、４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊による実質的な殺滅が見られた。このことも、１つの突然変異に対する２つの突然変異の利点を示している。
【００８３】
これに関する最終実験として、マウスにおけるＣＯＬＯ  ２０５腫瘍異種移植片の増殖を阻害する４Ｈ６−ｈＦｃ、４Ｈ６−ｈＦｃ＊、及び４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊の能力を、直ぐ下で説明される方法を使用して比較した。２ｍｇ／ｋｇの各ｍＡｂを１週間に２回投与した場合に、２つの突然変異を有する４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊は、それぞれ突然変異を有しない又は１つの突然変異を有する、４Ｈ６−Ｆｃ又は４Ｈ６−Ｆｃ＊のいずれよりも強く、異種移植片を阻害した（図１０Ｂ）。これは、細胞殺滅結果と一致する。
【００８４】
＜例６：腫瘍異種移植片の増殖を阻害する抗体の能力＞
【００８５】
本質的に既に説明されているように（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１，  １９９３）、異種移植片実験を実施した。完全なＤＭＥＭ培地中で典型的に増殖させたヒト腫瘍細胞を、ＨＢＳＳ中に採取した。メス免疫不全マウス（４−６週齢）に、０．１〜０．２ｍｌのＨＢＳＳ中の２−１０ｘ１０６細胞を、いくつかの実験においてはＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）と共に、背側の領域において、皮下注射した。腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達した時に、マウスをランダムにグループ分けし、典型的に、０．５−５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂを、１回のみ又は１週間に１回又は２回、０．１ｍｌの体積で、腹腔内投与した。２次元［長さ（ａ）及び幅（ｂ）］で測定することによって、１週間に２回、腫瘍サイズを決定した。腫瘍体積を、Ｖ＝ａｂ２／２に従って計算し、平均腫瘍体積±ＳＥＭとして表した。各処置群中のマウスの数は、典型的に、５−７マウスであった。統計的分析は、例えば、最終データ点に対してスチューデントのｔ検定を使用して、実施することができる。
【００８６】
我々は最初に、異種移植片実験を実施して、上述の、ＰＢＭＣの存在下における細胞殺滅の強化と一致して、ｈＦｃ＊＊形態の抗ＤＲ４及び抗ＤＲ５  ｍＡｂが、ｈＦｃ＊＊定常領域中の突然変異によってもたらされるＦｃγＲ結合の強化に起因して、インビボで、ｈＦｃ形態よりも有効であったかどうかを決定した。実際、抗ＤＲ４  ｍＡｂであるＤ１１４−ｈＦｃが、２ｍｇ／ｋｇの単回用量として投与した場合に、ＣＯＬＯ  ２０５異種移植片の増殖を中程度に阻害したに過ぎない一方で、Ｄ１１４−ｈＦｃ＊＊は、これらの条件下で、異種移植片をほぼ完全に阻害した（図１１Ａ）。（以下に説明されるように、ヒト化形態、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ及びＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊によるＣＯＬＯ  ２０５異種移植片の阻害について、非常に似た結果が得られた、図１８Ａ。）そして、Ｄ１１４−ｈＦｃが、同様にこのやり方で投与した場合に、ＳＷ４８０結腸腫瘍異種移植片の増殖を顕著に阻害しなかった一方で、Ｄ１１４−ｈＦｃ＊＊は、これらの条件下で、異種移植片増殖を中程度に阻害した（図１１Ｂ）。最終的に、別の抗ＤＲ４  ｍＡｂである４Ｈ６−ｈＦｃは、２ｍｇ／ｋｇで１週間に２回与えた場合に、ＣＯＬＯ  ２０５異種移植片の増殖を中程度に阻害したが、４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊は、これらの条件下で、異種移植片を完全に阻害した（図１１Ｃ）。
【００８７】
抗ＤＲ５  ｍＡｂに関して、３Ｈ３−Ｆｃは、０．５ｍｇ／ｋｇで１回投与した場合に、ＣＯＬＯ  ２０５異種移植片の増殖を顕著に阻害しなかったが、３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊は、この非常に低い用量レベルで与えた場合にも、これらの異種移植片の増殖を完全に阻害した（図１２Ａ）。同様に、３Ｈ３−Ｆｃは、１ｍｇ／ｋｇで１回投与した場合に、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４２０）膵臓腫瘍異種移植片の増殖を中程度に阻害したに過ぎなかったが、３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊は、この非常に低い用量レベルで与えた場合にも、これらの異種移植片の増殖を完全に阻害した（図１２Ｂ）。類似的に、以下に説明されるように、１ｍｇ／ｋｇで１回投与した場合に、ヒト化ｍＡｂ  ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊は、ＣＯＬＯ  ２０５異種移植片及びＭＩＡ  ＰａＣａ−２異種移植片の両方の増殖を、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃよりも良好に阻害した（図１９Ａ、Ｂ）。したがって、抗ＤＲ４及び抗ＤＲ５  ｍＡｂの両方について、突然変異を有するｈＦｃ＊＊形態は、突然変異を有しないｈＦｃ形態よりもインビボではるかに有効であった。
【００８８】
＜例７：ヒト化抗体の構築及び特徴付け＞
【００８９】
ヒト化Ｄ１１４及びヒト化Ｇ４．２  ｍＡｂの設計、構築、発現及び精製は全て、例えば、Ｌ２Ｇ７  ｍＡｂについて米国特許第７，６３２，９２６号（これは、参照により全ての目的のために本明細書中に組み込まれる）に説明されるような、分子生物学の標準的な方法を使用して実施した。より具体的には、ヒト化Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）ｍＡｂを設計するために、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，５３０，１０１号及び第５，５８５，０８９号の方法に概して従った。図５Ａ及び５Ｂ（それぞれ５Ｃ及び５Ｄ）の一番下の行に示される、ヒトＶＫ配列ＡＩＴ３８７４６及びＶＨ配列ＡＡＣ１８２９３（それぞれヒトＶＫ配列ＡＡＱ０２６９８及びＶＨ配列ＡＡＣ５０９９８）を、Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）ＶＬ及びＶＨ配列のためのアクセプター配列として機能するように、それぞれ選択した。なぜなら、それらは、それらに対し特に高いフレームワーク相同性（すなわち、配列同一性）を有するからである。Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）可変ドメインのコンピュータで生成された分子モデルを使用して、それらと潜在的に相互作用するのに十分にＣＤＲに近いアミノ酸をフレームワーク中に位置づけた。ヒト化Ｄ１１４（それぞれＧ４．２）軽鎖及び重鎖可変領域を設計するために、マウスＤ１１４（それぞれＧ４．２）ｍＡｂ由来のＣＤＲを最初に、アクセプターフレームワーク領域に概念的に移植した。ＣＤＲ配座を維持するために必要であり得る、コンピュータモデルがＣＤＲとの顕著な接触を示唆したフレームワーク位置で、マウス抗体由来のアミノ酸をヒトフレームワークアミノ酸で置換した。
【００９０】
Ｄ１１４について、軽鎖の残基４８及び７１で（ＨｕＤ１１４−Ｌ１）、及び重鎖の残基４８及び７１で（ＨｕＤ１１４−Ｈ１）、又はこれらの残基プラス追加の重鎖残基６７及び６９で（ＨｕＤ１１４−Ｈ２）、そのような置換を行った。ヒト化Ｄ１１４の軽鎖及び重鎖Ｖ領域配列は、図５Ａ及び５Ｂにそれぞれ示され、真ん中の行にＨｕＤ１１４とラベルされており、ここで、それらは、それぞれのＤ１１４ドナー及びヒトアクセプターＶ領域に対して整列されている。ＨｕＤ１１４−Ｌ１軽鎖及びＨｕＤ１１４−Ｈ１又はＨｕＤ１１４−Ｈ２重鎖を有するｍＡｂはそれぞれ、ＨｕＤ１１４＃１及びＨｕＤ１１４＃２と命名される。これらのそれぞれを、２つの形態：ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ（ここでヒトガンマ−１定常領域はＳ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ突然変異を有しない（そしてその結果、Ｓ及びＬを位置２６７及び３２８に有する））、及びＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊（ここで定常領域はこれらの突然変異を有しない）、に作製した。上述の結合アッセイを使用して、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＃１及びＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＃２の両方が、上述のキメラ抗体Ｄ１１４−ｈＦｃと同様にＤＲ４に結合する（図１３Ａ）。これは、ヒト化中に親和性が失われなかったことを示す。ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊＃１及びＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊＃２は、等しく良好に、ヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの存在下で、ＣＯＬＯ  ２０５細胞を殺滅する（図１４Ａ）。細胞殺滅活性を向上させる試みにおいて、追加のマウス置換を有する新しいバージョンのＨｕＤ１１４軽鎖及び重鎖：ＨｕＤ１１４−Ｌ２（これは、マウス置換を残基４８及び７１プラス４３及び４４に含む）、及びＨｕＤ１１４−Ｈ３（これは、マウス置換を残基４８、６７、６９及び７１プラス９１に含む）、を産生した。ＨｕＤ１１４−Ｌ１及びＨｕＤ１１４−Ｌ２と、ＨｕＤ１１４−Ｈ１、ＨｕＤ１１４−Ｈ２及びＨｕＤ１１４−Ｈ３との全ての組み合わせから成る、６つの抗体を産生したが、それらは全て同等の結合活性及び細胞殺滅活性を有した。したがって、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＃２及びＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊＃２をさらなる研究に使用した。そしてそれらを、これ以降及び図において、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ及びＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊と表す。
【００９１】
本発明はまた、これらの好ましい抗体の変異体、例えば、図５ＡのＨｕＤ１１４−Ｌ１と少なくとも９０、９５、９８又は９９％同一の配列を有する軽鎖Ｖ領域及び図５ＢのＨｕＤ１１４−Ｈ１又はＨｕＤ１１４−Ｈ２と少なくとも９０、９５、９８又は９９％同一の配列を有する重鎖Ｖ領域を含むヒト化抗体、を含む。そのような抗体中の好ましくは全てのＣＤＲ残基は、ドナーのものである。好ましくは、軽鎖位置４８及び７１は、それぞれＶ及びＹによって占められ、重鎖位置４８及び７１は、それぞれＬ及びＡによって占められる。
【００９２】
同様に、Ｇ４．２について、マウス置換を、軽鎖の残基４及び６８で（ＨｕＧ４．２−Ｌ１）又はこれらの残基プラス残基１で（ＨｕＧ４．２−Ｌ２）、及び重鎖の残基２７、２８、３０及び９３で（ＨｕＧ４．２−Ｈ１）又はこれらの残基プラス残基４７で（ＨｕＧ４．２−Ｈ２）、行なった。ＨｕＧ４．２の軽鎖及び重鎖Ｖ領域配列は、図５Ｃ及び５Ｄにそれぞれ示され、真ん中の行にＨｕＧ４．２とラベルされており、ここで、それらは、それぞれのＧ４．２ドナー及びヒトアクセプターＶ領域に対して整列されている。ヒト化軽鎖のそれぞれをヒト化重鎖のそれぞれと組み合わせることによって、以下の表（ここで、各鎖中の置換の数は丸括弧に入れて与えられる）に示されるように、ＨｕＧ４．２＃１、＃２、＃３及び＃４と命名される４つの異なるヒト化Ｇ４．２１抗体を作製した。ＨｕＤ１１４に関しては、これらのｍＡｂのそれぞれは、２つの形態：ヒトガンマ−１重鎖定常領域中に突然変異のないｈＦｃ、及び突然変異Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆを有するｈＦｃ＊＊、で作製した。
【表２】
2019502653.tif 000004
【００９３】
ＨｕＧ４．２の４つのバージョンは全て、ＤＲ５に良好に結合し、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊＃１及びＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊＃２が、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊＃３及びＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊＃４よりもわずかに良好であった（図１３Ｂ）。実際、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊＃１及び＃２は、キメラ抗体Ｇ４．２−ｈＦｃ＊＊と同等にＤＲ５に結合した。これは、ヒト化中に親和性がほとんど又は全く失われなかったことを示す。ＨｕＧ４．２の４つのバージョンは全てまた、ヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの存在下で、ＣＯＬＯ  ２０５細胞を良好に殺滅し（図１４Ｂ）、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊＃２が、他のものよりもわずかに良好であり、キメラ抗体Ｇ４．２−ｈＦｃ＊＊と本質的に同じであった。したがって、ＨｕＧ４．２−Ｆｃ＃２及びＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊＃２をさらなる研究に使用した。そしてそれらを、これ以降及び図において、ＨｕＧ４．２−Ｆｃ及びＨｕＧ４．２−Ｆｃ＊＊と表す。
【００９４】
本発明はまた、図５ＣのＨｕＧ４．２−Ｌ１又はＨｕＧ４．２−Ｌ２と少なくとも９０、９５、９８又は９９％同一の配列を有する軽鎖Ｖ領域及び図５ＤのＨｕＧ４．２−Ｈ１又はＨｕＧ４．２−Ｈ２と少なくとも９０、９５、９８又は９９％同一の配列を有する重鎖Ｖ領域を含む、ＨｕＧ４．２の変異体を含む。そのような抗体中の好ましくは全てのＣＤＲ残基が、ドナー抗体のものである。好ましくは、軽鎖位置４及び６８は、それぞれＬ及びＲによって占められ、重鎖位置２７、２８、３０及び９３は、それぞれＬ、Ｐ、Ｎ及びＴによって占められる。任意選択的に、重鎖位置４７はＬによって占められる。
【００９５】
細胞を殺滅する様々なヒト化ｍＡｂの能力を、架橋剤としてヤギ抗ＩｇＧ−Ｆｃ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で試験した。ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ及びＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊の両方は、ＣＯＬＯ  ２０５結腸腫瘍細胞（図１５Ａ）及びＳＷ４８０結腸腫瘍細胞（図１５Ｂ）を、臨床試験において試験されている抗ＤＲ４  ｍＡｂであるマパツムマブよりもはるかに良好に、殺滅した。しかしながら、突然変異によってもたらされるＦｃγＲＩＩｂへの結合の増加が、ＦｃγＲＩＩｂ発現細胞の非存在下で効果を有するはずがないために、予想されるように、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃとＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊との間に顕著な差はなかった。同様に、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ及び／又はＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊の能力を、抗ＤＲ５  ｍＡｂであるＡｐｏｍａｂ、ＡＭＧ６５５及びレクサツムマブのＣＯＬＯ  ２０５細胞を殺滅する能力と（図１５Ｃ）、及びＡｐｏｍａｂ及びＴＲＡ−８のＭＩＡ  ＰＡＣＡ−２膵臓腫瘍細胞を殺滅する能力と（図１５Ｄ）、比較した。試験したところ、ここでも、ＦｃγＲＩＩｂ発現細胞の非存在のために、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃとＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊との間に顕著な差はなかった。しかしながら、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ及びＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊は、臨床試験されている他の試験されたｍＡｂよりも実質的に良好に、両方の細胞株を殺滅した。抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの存在下で、Ｈ４６０細胞（図１６Ａ）及びＳＷ４８０細胞（図１６Ｂ）を殺滅する様々なｍＡｂの能力もまた決定した。ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊及びＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊は、抗ＤＲ５  ｍＡｂであるＡｐｏｍａｂ及びＡＭＧ６５５よりも実質的に良好に、Ｈ４６０細胞を殺滅したが、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊は、Ａｐｏｍａｂ及びＡＭＧ６５５よりも実質的に良好に、そしてＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊は、Ａｐｏｍａｂ及びＡＭＧ６５５よりもわずかに良好に、ＳＷ４８０細胞を殺滅した。これは、今述べた結果と一致する（図１５Ａ−Ｄ）。
【００９６】
次に、我々は、ヒトＰＢＭＣの存在下で細胞を殺滅する様々なｍＡｂの能力を比較した。ここで、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ突然変異によってもたらされるＦｃγＲＩＩｂ結合の強化に起因して、ｈＦｃ＊＊形態が、ｈＦｃ形態よりも優れている可能性がある。実際、ＨｕＧ４．２−Ｆｃ＊＊は、ＣＯＬＯ  ２０５細胞（図１７Ａ）又はＨ６０細胞（図１７Ｂ）のいずれかを、ＨｕＧ４．２−Ｆｃよりもはるかに良好に殺滅した。そして同様に、上述のようにこれらの突然変異を我々が導入した、Ａｐｏｍａｂの一形態である、Ａｐｏｍａｂ−ｈＦｃ＊＊は、Ａｐｏｍａｂそれ自体よりも良好に、細胞を殺滅した（図１７Ａ、Ｂ）。しかしながら、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊は依然として、ＣＯＬＯ  ２０５又はＨ６０細胞のいずれも、Ａｐｏｍａｂ−ｈＦｃ＊＊よりも実質的に良好に（そしてＡＭＧ６５５よりも良好に）、殺滅した。これもまた、ＨｕＧ４．２−ｈＲＦｃ＊＊抗ＤＲ５  ｍＡｂの優れた効力を示している。
【００９７】
ＨｕＤ１１４及びＨｕＧ４．２の文脈において、２つの突然変異の効果と１つの突然変異の効果を比較するために、我々は、突然変異を有しないｍＡｂ  ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ（それぞれＨｕＧ４．２−ｈＦｃ）、Ｓ２６７Ｅ突然変異のみを有するｍＡｂ  ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊（それぞれＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊）、及びＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ二重突然変異を有するｍＡｂ  ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊（それぞれＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊）の、ＰＢＭＣの存在下における細胞殺滅能力を試験した。ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊は、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃよりもわずかに良好に、ＣＯＬＯ  ２０５細胞（図１７Ｃ）及びＨ４６０細胞（図１７Ｄ）を殺滅したが、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊ははるかに良好に細胞を殺滅した。同様に、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊は、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃよりもわずかに良好に、ＣＯＬＯ  ２０５細胞（図１７Ｅ）及びＨ４６０細胞（図１７Ｆ）を殺滅したが、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊ははるかに良好に細胞を殺滅した。したがって、定常領域中に２つの突然変異が存在することは、１つの突然変異よりも実質的に有利である。
【００９８】
最終的に、異種移植片の増殖を阻害するヒト化ｍＡｂ  ＨｕＤ１１４及びＨｕＧ４．２の能力を見てみると、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃは、２ｍｇ／ｋｇで１回投与した場合にＣＯＬＯ  ２０５異種移植片の増殖を中程度に阻害したが、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊は、これらの条件下で、異種移植片増殖を完全に阻害した（図１８Ａ）。２ｍｇ／ｋｇで１回与えられたＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊はまた、Ｈ４６０肺腫瘍異種移植片の増殖能力を強く阻害した（図１８Ｂ）。別の実験において、試験された低い用量で、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊はＣＯＬＯ  ２０５異種移植片の増殖を完全に阻害したが、臨床試験において試験されている抗体マパツムマブは効果がなかった（図１８Ｃ）。２ｍｇ／ｋｇで１回投与したときに、ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊はまた、Ｒａｍｏｓ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９６）リンパ腫異種移植片の増殖の阻害において、マパツムマブよりもいくぶん有効であった（図１８Ｄ）。ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ又はＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊の１ｍｇ／ｋｇの単回用量は、ＣＯＬＯ  ２０５異種移植片（図１９Ａ）及びＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓腫瘍異種移植片（図１９Ｂ）の増殖を阻害し、ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊はＨｕＧ４．２−ｈＦｃよりも明らかに有効であった。（ＨｕＤ１１４−ｈＦｃ＊＊もまたこのモデルにおいて有効であった、図１９Ｂ。）異種移植片モデルにおいて、これらのｍＡｂのｈＦｃ＊＊形態の効能が、ｈＦｃ形態よりも大きいことは、上述のＰＢＭＣの存在下における、インビトロでの、腫瘍細胞を殺滅するｈＦｃ＊＊形態の能力がより大きいことと一致する。
【００９９】
＜例８：二重特異性抗体の特徴付け＞
【０１００】
上述の二重特異性Ｂ−４Ｈ６／３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊  ｍＡｂ（図６Ａ、Ｂ）が、ＤＲ４及びＤＲ５に同時に結合することができることを示すために、プレートを最初に、４Ｈ６との結合について競合しない抗ＤＲ４  ｍＡｂ（２μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングし、２％のＢＳＡでブロッキングし、次いでＤＲ４−ｈＦｃ（０．５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。次いで、増加する濃度のＢ−４Ｈ６／３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊  ｍＡｂをウェルに添加し、続いて０．５μｇ／ｍｌのＤＲ５−ＫＦを添加した。結合されたＤＲ５−ＫＦを、ＨＲＰ−抗Ｆｌａｇ  Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）及び基質で検出した。ＤＲ４（ＤＲ４−ｈＦｃの形態）及びＤＲ５（ＤＲ５−ＫＦの形態）の両方に結合することのできるｍＡｂのみが、このＥＬＩＳＡアッセイにおいて陽性の結果を与えるため、結果（図２０Ａ）は、Ｂ−４Ｈ６／３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊がこの能力を有する一方で、もちろんｍＡｂ  ４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊及び３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊はそうではない、ということを示している。
【０１０１】
架橋剤である抗ｍＩｇＧ−Ｆｃなしで、ＣＯＬＯ  ２０５を殺滅する、Ｂ−４Ｈ６／３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊の能力を決定した。４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊は、これらの条件下で、細胞を殺滅することができなかったが、３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊は、いくらかの殺滅を示した（図２０Ｂ）。これは、ＣＯＬＯ  ２０５細胞がデスレセプターアゴニストに対して非常に感受性であり、本明細書中で利用されるＨ６０及びＳＷ４８０などの他の細胞株よりも感受性である、という事実に起因する。しかしながら、Ｂ−４Ｈ６／３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊二重特異性ｍＡｂは、３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊よりも実質的に良好に細胞を殺滅した一方で、４Ｈ６コンポーネントは、そのままでは細胞殺滅能力を有しなかった（図２０Ｂ）。対照的に、別個のｍＡｂである３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊及び４Ｈ６−ｈＦｃ＊＊を単純に混合しても、いずれの細胞殺滅能力も増加しなかった（図７Ａ、Ｂ）。
【０１０２】
別の二重特異性抗体Ｂ−ＨｕＤ１１４／ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊を、Ｂ−４Ｈ６／３Ｈ３−ｈＦｃ＊＊と同じ方法で、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧフォーマットにおいて構築した。これもまた、定常領域中に二重突然変異を含んでいる。この例において上述のＥＬＩＳＡアッセイを使用すると、このＢ−ＨｕＤ１１４／ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊ｍＡｂは、ＤＲ４及びＤＲ５の両方に結合したが、ＨｕＧ４．２−ｈＦＣ＊＊は結合しなかった（図２０Ｃ）。Ｂ−ＨｕＤ１１４／ＨｕＧ４．２−ｈＦｃ＊＊ｍＡｂはまた、抗ｈＩｇＧ−Ｆｃの非存在下で、天然リガンドＴＲＡＩＬよりも一層良好に、ＣＯＬＯ  ２０５細胞を殺滅した（図２０Ｄ）。
【０１０３】
本発明を、現在のところ好ましい実施形態を参照して説明してきたが、本発明から逸脱することなく様々な改変を行うことができることが理解されるべきである。文脈から他に明らかでない限り、本発明の任意のステップ、要素、実施形態、特徴又は態様は、任意の他のものと共に使用することができる。引用された受託番号などを含む全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許及び特許出願が、具体的に且つ個々に示されて、参照によりその全体が全ての目的のために組み込まれたのと同じ程度に、参照によりそれらの全体が全ての目的のために本明細書中に組み込まれる。単語「本明細書中（ｈｅｒｅｉｎ）」は、単語「本明細書中」が出現するセクション内だけではなく、この特許出願中のどこかの場所を指す。１つより多い配列が、様々な時点で１つの受託番号に関連付けられている場合、本出願の有効出願日現在の受託番号に関連付けられた配列が意図され、ここで有効出願日とは、問題の受託番号を開示する、実際の出願日又はより早い優先権出願の出願日を意味する。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図２Ｃ−２Ｄ】
2019502653.tif 000007
【図３Ａ−３Ｂ】
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【図３Ｃ−３Ｄ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図５Ｃ−５Ｄ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
2019502653.tif 000013
【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１５Ａ−１５Ｂ】
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【図１５Ｃ−１５Ｄ】
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【図１６Ａ−１６Ｂ】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図１７Ｃ−１７Ｄ】
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【図１７Ｅ−１７Ｆ】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１８Ｃ−１８Ｄ】
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【図１９Ａ−１９Ｂ】
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【図２０Ａ−２０Ｂ】
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【図２０Ｃ−２０Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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