(57)【要約】  本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及び同じウイルスのヌクレオシドカプシド（又はコア、ＨＢｃＡｇ）の抗原を含む医薬組成物を明らかにする。この組成物のＨＢｃＡｇは、この抗原中のリボ核酸（ＲＮＡ）の全量の４５％を超える割合でメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含む。それを形成する抗原の構成の変化のために、本発明の組成物は、慢性Ｂ型肝炎の予防又は治療に有用である。本発明はまた、ＨＢＶ感染に対する免疫予防又は免疫療法のための薬剤の製造におけるこの医薬組成物の使用、及びこれらの抗原の混合物と同時投与される追加の抗原に対する免疫応答を増加させるためのその使用を包含する。
2019510064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下により特徴付けられる医薬組成物：
Ｂ型肝炎ウイルスのコア抗原（ＨＢｃＡｇ）であって、該抗原のリボ核酸（ＲＮＡ）の総量の４５％を超える割合でメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含むもの、及び
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）。
【請求項２】
ＨＢｓＡｇがこの抗原のリン脂質の総量の５％を超える割合でホスファチジルセリンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
非経口経路及び粘膜経路による投与のための製剤により特徴付けられる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ワクチンアジュバントをさらに含むことにより特徴付けられる、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
Ｂ型肝炎ウイルスのコア抗原（ＨＢｃＡｇ）であって、該抗原のリボ核酸（ＲＮＡ）の総量の４５％を超える割合でメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含むもの、及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による感染に対する免疫予防又は免疫治療において用いられる薬物の製造のための使用。
【請求項６】
ＨＢｓＡｇがこの抗原の全リン脂質の５％を超える割合でホスファチジルセリンを含む、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
薬物が、非経口経路又は粘膜経路による投与のために製剤化されている、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
薬物が慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）の患者、又は感染性ウイルスの１つがＨＢＶである重感染を有する患者の治療において用いられる、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
ＣＨＢ患者の治療が、ＨＢＶ感染に由来する肝細胞癌の予防において用いられる、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
免疫療法が細胞刺激を介して能動的形態又は受動的形態で行われる、請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
以下により特徴付けられるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の感染に対する免疫防御又は免疫療法のための方法：
Ｂ型肝炎ウイルスのコア抗原（ＨＢｃＡｇ）であって、該抗原のリボ核酸（ＲＮＡ）の総量の４５％を超える割合でメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含む医薬組成物の有効量、及び
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の有効量、
を必要とする個体に、投与がなされること。
【請求項１２】
ＨＢｓＡｇが、この抗原のリン脂質の総量の５％を超える割合でホスファチジルセリンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
医薬組成物が、非経口経路及び粘膜経路によって投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
免疫療法を受ける個体が、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）を有する患者である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＨＢ患者の免疫療法が、ＨＢＶ感染に由来する肝細胞癌の予防のために使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｂ型肝炎ウイルスのコア抗原（ＨＢｃＡｇ）及びＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の総量の４５％を超える割合で、これらの抗原の混合物と同時投与される追加の抗原に対する免疫応答を増加させるために、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含むＢ型肝炎ウイルスのコア（ＨＢｃＡｇ）からの抗原の使用。
【請求項１７】
ＨＢｓＡｇが、この抗原の総量の５％を超える割合でホスファチジルセリンを含む、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬分野、特にワクチン学の枝、特に有効性の高いワクチン組成物の開発に関する。これらの組成物は、予期せず免疫原性を増加させたその化学組成に修飾を有するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の抗原を含む。化学組成が修飾されたＨＢＶ抗原は、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及びコア抗原（ＨＢｃＡｇ）であった。
【０００２】
世界保健機関（ＷＨＯ）は、感染の血清学的マーカーの存在に基づいて、世界人口のほぼ半分がＨＢＶによって感染していると考えている。成人の約５〜１０％、ＨＢＶに感染した新生児の９０％までが、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）を発症すると推定されている。現在、３億５０００万人の人々が、持続感染又は慢性感染を有する。長期間のウイルスの持続的な複製は、肝硬変、肝細胞癌、又は腹水症、食道出血及び脾腫などの他の合併症の結果として、感染した集団の２５％の試をもたらす肝臓炎症のプロセスを導く。近年、新生児及び子供の普遍的な予防接種、新しいＨＢＶ感染の発生率のその後の減少はにもかかわらず、ＣＨＢは、依然として世界規模で重大な健康問題である［Ｈｉｌｌｅｍａｎ, Ｍ.Ｒ. Ｖａｃｃｉｎｅ （２００１年）, １９, １８３７−４８］。
【０００３】
αインターフェロン（ＩＦＮ−α）、そのペグ化変異体（ＰｅｇＩＦＮ）並びにテノフォビル、エンテカビル、ラミブジン、アデフォビル−ジピボキシル及びテルビブジンなどのヌクレオシド類似体による治療は、ＣＨＢ治療の最先端である。一般的には、これらの薬物は、治療後のＨＢＶの持続的な排除に関して劣った有効性を有し、それらの使用は、重要な有害事象（ＡＥ）に関連しており、これは、広く認識されている［Ｎａｓｈ Ｋ. Ａｄｖ Ｔｈｅｒ （２００９年）, ２６：１５５−１６９； Ｙａｎｇ Ｎ, Ｈｅｐａｔｏｌ Ｉｎｔ. ２０１５年９月１２日 ［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］ ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２６３６３９２２］。
【０００４】
ＣＨＢ治療における免疫療法戦略としての、ワクチン製剤の使用は、興味深いアプローチである。ウイルス持続性は、抗ＨＢＶ細胞性免疫の発達における欠陥に関連している。１９８０年代の開始以来、ワクチン戦略は、ＣＨＢ患者のＴ細胞の弱い応答を増加させ、増強することに集中した。これらの免疫療法戦略は、最初に、ＨＢＶに対すると特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋応答、並びにウイルス複製を制御するための前炎症性サイトカインを導入する目的で、市販の抗ＨＢＶワクチンを使用した。従って、ほとんど全ての市販予防ワクチンは、単独で、又は従来の抗ウイルス療法と一緒に試験された。治療ワクチン接種の以前の研究において、ワクチンは、他の抗ウイルス治療の有無に関わらず投与された。さらに、市販のワクチンを用いた免疫療法は、大量の接種スケジュールを提案し、代替の非経口経路も検討された。主な研究を以下に要約する。
【０００５】
Ｇｅｎｈｅｖａｃ Ｂ（登録商標）（Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ、フランス、−ＣＨＯ哺乳細胞で産生）を使用するＣＨＢ患者におけるパイロットワクチン接種試験は、慢性キャリアの約５０％でＨＢＶ複製の減少を示した［Ｐｏｌ Ｓら、Ｃ Ｒ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＩＩＩ （１９９３年）, ３１６：６８８−９１］。別のプラセボ制御マルチセンター試験はまた、Ｇｅｎｈｅｖａｃ Ｂ（登録商標）ワクチン、及びＲｅｃｏｍｂｉｖａｘ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ Ｄｏｈｍｅ−Ｃｈｉｂｒｅｔ, フランス）酵母産生ワクチンを評価した。Ｇｅｎｈｅｖａｃ（登録商標）及びＲｅｃｏｍｂｉｖａｘ（登録商標）をそれぞれ接種した群の６ヶ月目に、有意差が認められた（３％、２０％及び２２％）。しかしながら、その差は、１２ヶ月目に消失した［Ｐｏｌ Ｓ, Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ （２００１年）； ３４：９１７-２１］。明確な利益は認められず、Ｇｅｎｈｅｖａｃ Ｂ（登録商標）に見られるｐｒｅ−Ｓ２抗原は、さらなる効果をもたないようであったと結論付けられた。治療用Ｇｅｎｈｅｖａｃ（登録商標）ワクチンは、評価された他の研究［Ｙａｌｃｉｎ Ｋ,らＩｎｆｅｃｔｉｏｎ （２００３年）, ３１： ２２１−２２５； Ｄｉｋｉｃｉ Ｂら Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ （２００３年）, １８(２)： ２１８−２２］は、その治療に関連するわずかな利益しか示さなかった。
【０００６】
Ｈｅｐａｇｅｎｅ（登録商標）（Ｍｅｄｅｖａ Ｌｔｄ., ＵＫ）ＣＨＯ産生ワクチンは、ＨＢｓＡｇの３つの変異体（Ｌ、Ｓ及びＭ）を含み、健康なボランティア及び非応答者におけるそれらの結果は、高レベルの免疫原性を示した［Ｐａｇｅ Ｍ,ら Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００１年）, ４４：８８−９７； Ｙａｐ Ｉ, ら.  Ａｎｎ Ａｃａｄ Ｍｅｄ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ （１９９６年）, ２５： １２０−１２２； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ ＪＮ,ら ＢＭＪ （１９９７年）, ３１４： ３２９； Ｊｏｎｅｓ ＣＤ, ら. Vａｃｃｉｎｅ （１９９９年）, １７（２０-２１）： ２５２８-３７］。これを考慮して、その治療可能性を評価するための研究が行われた。ワクチン２０μｇの８回投与量を、４回の接種の２サイクルで、それらの間に５ヶ月間隔で投与した［Ｃａｒｍａｎ ＷＦ,ら Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ （２００１年）； ３４：９１７-９２１］。スケジュールの最後に、スケジュールを完了した２２人の患者のうち８人が、ＨＢＶの持続的クリアランスを有し、７人の患者がＨＢｅＡｇを除去した。この制御されていない限定試験の後に、より多数の患者による制御試験が行われた。ＨＢｅＡｇ陽性の１０３人の慢性患者とのこの第２回臨床試験において、ワクチンの４用量又はプラセボの４用量を１及び８ヶ月の間隔で投与し、その後全ての被験者に１ヶ月間隔で８回追加用量を与えた。治療終了時には、有意な臨床的利益は得られなかった［Ｍｅｄｅｖａ ＰＬＣ. http://www.investegate.co.uk/article.aspx?id=200001171532169093D（２０１５年１０月２０日の相談）］。
【０００７】
抗ウイルス免疫応答の発達を促進するために、治療は、治療ワクチンと従来の抗ウイルス療法とを組み合わせた。この戦略は、ウイルス複製の阻害の結果として、末梢血中の特定のＴ−ＨＢＶ細胞の頻度を増加させるラミブジンの効果に関連する知見を考慮する［Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｉ ＡらＥｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ （２００９年）, ３(５)： ５６１−９］。
【０００８】
併用抗ウイルスワクチン戦略は、ＨＢＶのＴ細胞応答のより大きな反応性を支持すべきであるが、免疫系の活性化の結果として肝臓損傷をさけるべきであるので、より安全であると考えられることもできる。しかしながら、ＣＨＢ患者のワクチンによる特異的免疫応答の活性化が、劇症肝炎を引き起こすことが示された証拠はない。
【０００９】
２００２年に発表された研究は、ＣＨＢ患者において、ラミブジンとのＥｎｇｅｒｉｘ Ｂ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）ワクチンの皮膚内投与（ＩＤ）を評価した。月１回、ラミブジンの毎日投与と組み合わせたＥｎｇｅｒｉｘ Ｂ（登録商標）の６回投与を使用した。別のグループは、インターロイキン２（ＩＬ−２）の皮下（ＳＣ）毎日投与と一緒に同じ治療を受けた。治療終了後、第１群の９人の患者のうち７人と第２群の５人の患者のうち２人は、ウイルス量を検出可能なレベルまで減少させた。４人の応答者がウイルスを除去し、トランスアミナーゼを正常化した。別の臨床試験において、ミョウバン中にＨＢｓＡｇを含有するワクチンを使用して、１年間ラミブジンの毎日投与して、ＩＤ経路による治療ワクチン接種の組み合わせを評価した［Ｈｏｒｉｉｋｅ Ｎ, ら  Ｊ  Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ （２００５年）, ３２： １５６-１６１］。これらの研究は、併用療法が効果的であり、ＣＨＢ患者にはほとんど合併症がないことを示した。しかしながら、療法の場合において、ＩＤ経路が使用され、これはワクチンの免疫原性に有利であることができた。
【００１０】
強力なアジュバントに処方された同じ表面抗原は、ラミブジンとの併用療法では効果的でなく、したがって、免疫経路の効果を無視すべきではなく、将来の予防接種の重要な要素であることを示唆している。
【００１１】
ウイルス負荷抑制条件のためのワクチン候補の長い臨床評価期間を終了させる研究は、Ｖａｎｄｅｐａｐｅｌｉｅｒｅらの報告である［Ｖａｎｄｅｐａｐｅｌｉｅｒｅ Ｐ, らＶａｃｃｉｎｅ （２００７年） Ｄｅｃ １２； ２５（５１）：８５８５−９７］。これは、１００μｇのＨＢｓＡｇ中に油性アジュバントとともに、及び脂質モノホスホリルＡ及びサポニンＱＳ２１などの強力な免疫調節物質と共に筋肉内（ＩＭ）経路を介して注入されたＨＢｓＡｇに基づくワクチン候補の臨床評価に関する研究であった。減少したバイアル負荷条件下で１０回の投与は、抗ウイルス剤単独で処置した対照群と比較した場合、ウイルス学的応答に関して利点を示さなかった。
【００１２】
宿主の免疫応答の特徴及び従来のワクチンの治療的使用に関する知識の量は、ＨＢＶの抗原に対するＴ細胞の強力で持続的な反応性の誘導に向けた戦略は、実現可能であり、ＣＨＢ患者の満足のいく治療に対する希望を表すことを示唆する。
【００１３】
ヌクレオカプシド抗原に対する免疫刺激の欠如はおそらく、ＨＢｓＡｇに基づく治療用ワクチンの失敗の主な免疫学的マーカーである。実際には、治療的ワクチン接種の目的は、急性Ｂ型肝炎の間に支配的であり、自己制御されるのと同じ自然免疫機構、又はセロコンバージョンを経るＣＨＢにおいてトリガーとすることである。免疫療法がこれらの免疫応答を刺激しない場合、おそらくセロコンバージョンを誘導しないだろう。
【００１４】
抗原選択及びワクチン接種戦略に関して、製剤の改善は、これらの困難を克服する方法であることができる。エンベロープのタンパク質の特性は、治療用ワクチンでその包含を正当化する。実際には、エンベロープのタンパク質は、細胞Ｂ及びＴの多数のエピトープを含み［Ｐｅｎｎａ Ａ,ら Ｊ Ｖｉｒｏｌ （１９９２年）, ６６（２）：１１９３-６； Ｎａｙｅｒｓｉｎａ Ｒ,ら. Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ （１９９３年）, １５０：４６５９-７１］、抗体抗エンベロープは、遊離ウイルス粒子を循環から除去し、感受性細胞の再感染を防止することにより、ウイルス抑制において重要な役割を果たすと推定される。一方、高レベルのＨＢｓＡｇは、ＣＨＢ患者の血清中を循環し；この事実は、Ｔ細胞の枯渇及び抗ＨＢｓ抗体の産生の抑制により、免疫寛容の主な役割を果たすことができる［Ｎａｇａｒａｊｕ Ｋ,ら  Ｊ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ （１９９７年）, ４：２２１-３０］。
【００１５】
この意味で、ＨＢｃＡｇは、ＣＨＢの治療用ワクチンに含まれるべき主要な抗原候補であることが示唆されている。急性自己解離性肝炎中に、Ｔ細胞のエピトープ応答は強く支持され、自発性又は治療誘発性のＣＨＢにおけるセロコンバージョンの間に優勢である［Ｆｅｒｒａｒｉ Ｃ, ら. Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ （１９９１年）, ８８：２１４-２２； Ｍａｒｉｎｏｓ Ｇ,ら Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ （１９９５年）, ２２：１０４０-９； Ｔｓａｉ ＳＬ, ら Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ （１９９２年）, ８９：８７-９６］。
【００１６】
現在までに、抗Ｂ型肝炎の市販ワクチンは、現在の治療と競合するのに十分な臨床結果を示しておらず、医療現場での導入を単に支持するものでもありません。しかしながら、これらのワクチンは、抗Ｂ型肝炎免疫療法の環境だけでなく、他の疾患治療分野においても、収縮性か否か、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及び癌の感染など他の慢性疾患の環境においても、治療分野で大きな期待を寄せている。したがって、この戦略は、新しいワクチン概念の臨床評価と全ての関連要因の最適化が必要である。この意味で、ＨＢｓＡｇに加えてＨＢｃＡｇを含む治療用ワクチン候補は、これらの免疫療法戦略の開発の結果である。
【００１７】
遺伝子工学とバイオテクノロジーセンター（ＣＩＧＢ）は、宿主酵母であるピキア・パトリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で得られた組換えタンパク質としてＨＢｓＡｇを産生する。この抗原は、１９９０年代の初めから予防ワクチンＨｅｂｅｒｂｉｏｖａｃ ＨＢ（登録商標）に含まれている［Ｍｕｚｉｏ Ｖ, ら. Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇiａ Ａｐｌｉｃａｄａ （２００１年） １８； １０３−１０４； ｕｌ−Ｈａｑ Ｎ,ら. Ｖａｃｃｉｎｅ （２００３年） ２１：３１７９−８５］。
【００１８】
さらに、ＣＩＧＢは、Ｂ型肝炎に対する免疫応答が延長された製剤を開発し、この製剤は、主成分としてＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇを含み；抗原は、全身及び粘膜応答を生成する粘膜経路を介して投与される［欧州特許第１１３６０７７号］。この同じセンターの別の特許文献において、粒子を形成する凝集した抗原性構造の生成が記載されている。この文書は、凝集、脱脂又は酸化、並びに３０〜５００ｎｍの粒子の選択、及びこれらの凝集体の処方は、好都合には、アジュバントが添加されて、得られた抗原製剤の免疫原性を支持することを明らかにしている［欧州特許第ＥＰ１３４６７２７号］。両方の特許文書に記載された戦略を組み合わせることで、ＣＩＧＢは、ＮＡＳＶＡＣと呼ばれる治療用ワクチン候補を開発し［Ｌｏｂａｉｎａ Ｙ, ら. Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ （２０１５年）, ６３：３２０-３２７］、これは、免疫化経路の組み合わせによって投与される。ワクチン製剤の臨床結果は、非常に魅力的であり；しかしながら、より強力な免疫原を使用することにより、製品の有効性を高めるべきである。
【００１９】
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇなどの主要なＨＢＶ抗原を含むワクチン戦略は、特定の抗ウイルス効果を有する製剤を製造している。しかしながら、その持続性の抗ウイルス応答を有する患者の数、並びに抗ＨＢｓＡｇに対するＨＢｓＡｇのセロコンバージョンに達する患者の数を増加させるためにその改善が必要である。
【００２０】
本発明は、１）ＨＢｃＡｇ抗原のリボ核酸（ＲＮＡ）の総量の４５％を超える割合でメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含むＨＢｃＡｇ抗原及び２）ＨＢＶのＨＢｓＡｇ抗原によって特徴付けられる医薬組成物を提供することによって上記問題を解決することを助ける。本発明の実現において、医薬組成物は、この抗原を形成する総脂質の５％を超える割合でホスファチジルセリンを含むＨＢｓＡｇを含む。
【００２１】
この特定の様式で化学的構成が修飾されたＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原の包含は、免疫療法のためのこの組成物の免疫学的及び抗ウイルス的性質を支持する。しかしながら、上記修飾は、本発明のＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原のタンパク質組成に影響を及ぼさない。それらの一次、二次及び三次構造は、それらの未修飾変異体と比較して同一であるからである。それにもかかわらず、これらの修飾は、これらの抗原の予想外の特性をもたらし、より強力な免疫原をもたらす。また、これらの修飾された抗原の組み合わせは、ＣＨＢ治療のためにより高い治療的抗ウイルス効果を有する製剤をもたらす。
【００２２】
本発明において、ＨＢｃＡｇは、４５％を超えるレベルのｍＲＮＡを用いて得られた。特定の場合において、この修飾された抗原は、その発酵プロセスのパラメーターの変化の組み合わせのために得られた。この場合において、科学的に規定された培地の使用及び比増殖の低い速度は、その中に存在するＲＮＡの残りと比較して、ｍＲＮＡの割合が増加したＨＢｃＡｇの変異体に帰着した。
【００２３】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で得られたＨＢｃＡｇの高い免疫原性は、（１８３アミノ酸の）完全な粒子状抗原の免疫原性における核酸の組成の関与と同様に記載されているが、本発明までは、各ＲＮＡ変異体は、ＨＢｃＡｇの最終免疫原性に対する特異的な寄与に関して未知であった。４５％を超えるｍＲＮＡレベルを有するＨＢｃＡｇが未修飾ＨＢｃＡｇと比較してより免疫原性であり、より強いＴｈ１応答を達成させることが見出されたことは驚くべきことであった。
【００２４】
検出されたｍＲＮＡの割合の変化は、タンパク質含有量に関連して、粒子中に存在する全ＲＮＡの含量に影響しなかった。予想外に、全ＲＮＡ内の４５％を超えるｍＲＮＡを含むＨＢｃＡｇは、そのｍＲＮＡ含量の修飾なしに得られたＨＢｃＡｇと比較してより高い免疫原性を有することが見出された。免疫原性のこの増加は、Ｔｈ１サイトカインの有意な増加、及びＣＨＢトランスジェニックマウス及び患者の免疫化後の循環ＨＢｓＡｇの排除能力の向上を含んでいた。
【００２５】
一方、本発明において、本発明者らは、このリポタンパク質抗原中に存在するリン脂質の５％を超えるレベルでホスファチジルセリンを含有するＨＢｓＡｇを評価した。特に、リン脂質の総量の５％を超えるホスファチジルセリンの割合の増加は、発酵培地中のカルシウム及びマグネシウム濃度の増加、低い比増殖速度及び低いｐＨなどのパラメーターの変動に関連して立証された。しかしながら、本発明は、これらの条件下で得られたＨＢｓＡｇに限定されなかった。５％を超えるホスファチジルセリンの割合の増加は、このリン脂質のより低い含有量を有するＨＢｓＡｇと比較して、得られた抗原の免疫原性の増加と相関していた。Ｔｈ１サイトカインの有意な増加が見出され、並びにＨＢｓＡｇトランスジェニックマウス及び５％を超えるホスファチジルセリンを含むＨＢｓＡｇを有するＣＨＢ患者の免疫化後の循環ＨＢｓＡｇ除去能力が、リン脂質の全％に対してより多く認められた。
【００２６】
本発明において、特に修飾されたＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原は、未修飾抗原が使用された製剤と比較して、免疫及び抗ウイルス応答のより高い強度に基づいて選択されている。さらに、両方の抗原を含む製剤は、別々に投与された抗原と比較すると、より多数の個体においてＨＢｓＡｇの抗ＨＢｓＡｇへのセロコンバージョンを生成することができ、本発明の組成物の一部を形成する抗原において検出された修飾の重要性及び機能性、並びに各抗原と比較して、組み合わされた製剤の優位性を立証した。
【００２７】
本発明は、免疫応答抗ＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢｃＡｇを増強させることを可能にする新規な製剤の必要性に関する当該技術水準の一般的な問題に対する新しい解決法を示し、ＨＢＶによる慢性感染症の制御のためのより効果的な治療を達成する。本発明の問題は、記載された抗原の新しい特性の同定の結果であるため、知識のある人による現状から明らかであり、又は由来すると考えられない。これらの修飾された抗原は、それらのタンパク質組成を損なわれないまま維持するが、それらに関連する分子の化学組成に関して異なる。
【００２８】
本発明の効果のために、修飾されたＨＢｃＡｇは、その抗原の全ＲＮＡの４５％を超える割合でｍＲＮＡを含むＨＢｃＡｇからの調製物である。同時に、修飾されたＨＢｓＡｇは、この抗原のリン脂質の総量の５％を超える割合でホスファチジルセリンを含むＨＢｓＡｇの調製物である。
【００２９】
本発明の実現において、この抗原及びＨＢＶのＨＢｓＡｇ抗原の全ＲＮＡの４５％を超える割合のｍＲＮＡを有するＨＢｃＡｇ抗原を有する組成物は、それらが非経口及び粘膜経路による投与のために製剤化されるため、特徴的である。粘膜経路、特に鼻腔経路により本発明の組成物を投与するために、その経路を通じた医薬製剤の投与のために開発され又は市販されている装置を使用し得る。
【００３０】
特定の実現において、この組成物は、ワクチンアジュバントを有することによってさらに特徴付けられる。本発明の組成中に存在するワクチンアジュバント内には、例えば、アルミニウム塩、ヒト使用のために開発された油中水のエマルジョン、免疫系の刺激剤などの本技術分野に精通した者によって周知であることを見出した。
【００３１】
さらに、本発明は、この抗原及びＨＢｓＡｇ抗原の全ＲＮＡの４５％を超える割合でｍＲＮＡを含むＨＢｃＡｇ抗原及びＨＢＶ感染に対する免疫予防又は免疫療法のための薬物を製造するためのＨＢｓＡｇ抗原の使用を提供する。本発明の実現において、この薬物の一部を形成するＨＢｓＡｇは、この抗原の全リン脂質の５％を超える割合でホスファチジルセリンを有する。特定の実現において、この薬物は、非経口経路及び粘膜経路による投与のために処方される。好ましい実現において、この抗原の全ＲＮＡの４５％を超える割合のｍＲＮＡ及びＨＢｓＡｇ抗原を有するＨＢｃＡｇを有する薬物は、ＣＨＢ患者又は共感染症の患者の治療に使用され、感染するウイルスの１つは、ＨＢＶである。さらに、この薬物でＣＨＢ患者を治療する場合、使用は、ＨＢＶ感染に由来する肝細胞癌の予防につながる。
【００３２】
この抗原及びＨＢｓＡｇ抗原の全ＲＮＡの４５％を超える割合のｍＲＮＡを有するＨＢｃＡｇを有する薬物が、免疫療法によりＣＨＢ患者の治療で使用される場合、これは、能動的に行うことができるか（この薬物での患者の免疫化による）又は受動的な形態で細胞刺激によって投与されることができる。その成分のために、本発明の医薬製剤は、自己又は異種細胞の刺激で使用されることができる。したがって、本発明は、樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファーアジを含む自己又は異種細胞のインビボ又はインビトロでの最大刺激に基づいて、この製剤を用いた細胞刺激方法及びＣＨＢ患者の後の受動免疫をもたらす。
【００３３】
さらに、本発明は、この抗原及びＨＢＶのＨＢｓＡｇの総ＲＮＡの４５％を超える割合でｍＲＮＡを有するＨＢｃＡｇ抗原を含む医薬組成物の有効量を必要とする個体に投与することを特徴とする、ＨＢＶ感染に対する免疫予防法又は免疫療法を明らかにする。本発明の実現において、ＨＢｓＡｇは、この抗原のリン脂質の総量の５％を超える割合でホスファチジルセリンを含む。本発明の材料化において、この医薬組成物は、非経口経路及び粘膜経路によって投与される。好ましい実現において、免疫療法を受ける個体は、ＣＨＢ患者である。この場合において、ＣＨＢ患者の免疫療法のための本発明の適用は、ＨＢＶ感染に由来する肝細胞癌の予防をもたらす。
【００３４】
本発明の目的はまた、この抗原及びＨＢｓＡｇ抗原の総ＲＮＡの４５％を超える割合でｍＲＮＡを有するＨＢｃＡｇ抗原を使用してこれらの抗原の混合物を併用投与するさらなる抗原に対して免疫応答を増加させることである。本発明の実現において、抗原混合物の一部を形成するＨＢｓＡｇは、この抗原のリン脂質の総量の５％を超える割合でホスファチジルセリンを有する。
【００３５】
上記で言及した抗原の混合物は、（治療のシナリオにおいて）ＣＨＢに対する免疫応答の増強に、又はワクチンが多価である予防的ワクチン接種のための戦略下で使用されることができる。これは、特定の形態で修飾されたＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原の免疫原性の増加に加えて、それらが異種抗原の強力な免疫原性効果を誘導することができることを実証することが可能であったためである。実験評価の結果は、多価製剤中に見出されるこれらの抗原が、予防的又は治療的使用に有用であることができることを実証する。
【００３６】
本発明の製剤に関して、アジュバント、安定化剤又は他の添加剤の使用を避けることができるが、これは、製剤の免疫原性又は得られた最終製剤の免疫原性を低下させない添加剤、賦形剤、希釈剤の導入、又は投与された製剤の抗ウイルス効果を制限しない。
【００３７】
本発明の医薬組成物及び本発明の免疫防御又は免疫療法では、持続的抗ウイルス応答が達成され、ＨＢｓＡｇの抗ＨＢｓＡｇへのセロコンバージョンに達する患者の数が、この技術分野で公知の組成物及び方法と比較して、増加する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】２回投与後のＩｇＧ抗ＨＢｃＡｇ抗体の応答。
【図２】抗体ＩｇＧ抗ＣＲ３。
【図３】ＣＲ３（ＨＩＶ−１）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖応答。
【実施例】
【００３９】
実現のモードの詳細な説明／実現の例
例１  異なる比率のＲＮＡ変異体を有するＨＢｃＡｇタンパク質の取得
ＨＢｃＡｇは、この抗原をコードする遺伝子を有するプラスミドで遺伝的に形質転換された大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）株から得られた［Ａｇｕｉｌａｒ ＪＣ,ら Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ （２００４年） ８２：５３９-４６］。
【００４０】
異なる期間中に行われた発酵プロセスからＨＢｃＡｇの粒子を特徴付けると、より長い発酵期間で製造されたＨＢｃＡｇの調製物中に組み込まれたｍＲＮＡの割合が増加することがあることが見出された。２０時間の発酵後、抗原中のｍＲＮＡのレベルは、表１に示すように、１４時間までのプロセスで得られたＨＢｃＡｇと比較して、２０％以上に増加した。全ＲＮＡのレベル、又はＲＮＡ含量／タンパク質含量の比に有意差は見られなかったので、粒子中のＲＮＡ総量に有意な変化は検出されなかった。しかしながら、他の変異体、具体的には、ｍＲＮＡの増加に伴ってその存在の減少を示したリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）と比較した場合、ｍＲＮＡレベルの有意な増加があった。ＨＢｃＡｇに関連するマイナー成分又は特定の汚染物質には、質量分析やその他の化学的及び物理的試験による試験を実施する際に、他の関連する変化はみられなかった。
【表１】
2019510064.tif 000003
【００４１】
結果は、５つの測定値の平均値を表す。「変異体」と題される欄には、発酵の持続時間を括弧内に示す。ｔＲＮＡ：トランスファーＲＮＡ、ｒＲＮＡ：リボソームＲＮＡ及びｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ。（＊）：有意差（ｐ＜０．０５）。
【００４２】
異なる割合のｍＲＮＡを組み込んだＨＢｃＡｇの変異体の免疫原性のＢａｌｂ／ｃマウスにおける評価
粒子内に組み込まれたｍＲＮＡの異なるパーセンテージ（表１）のＨＢｃＡｇの異なる変異体を得た後、これらの調整物の免疫学的評価をＢａｌｂ／ｃマウスで行った。この研究のために、本発明者らは、０日目と１５日目に２回の免疫化をＳＣ経路を通して、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１μｇのＨＢｃＡｇの用量を用いて、８〜１２週齢の雌マウスを使用し、１００μＬの最終容積を投与した。スケジュールの詳細な説明を表２に示す。
【表２】
2019510064.tif 000004
【００４３】
２回目の投与後の１０日目に、免疫により生じた特異的抗原応答の評価のための血液抽出を行った。抗体抗ＨＢｃＡｇ応答の測定は、ＥＬＩＳＡ技術を使用して行った。
【００４４】
図１に見られるように、各試験群で得られたＩｇＧ抗体価の抗ＨＢｃＡｇを示すと、生成されたＩｇＧ抗ＨＢｃＡｇ応答は、４５％を超える組み込まれたｍＲＮＡを有するＨＢｃＡｇを受けた群について有意により高かった（表２の３〜６群）。群３、４、５及び６の中で、有意差は検出されなかったが、組み込まれたｍＲＮＡの割合の増加に関連するＩｇＧ応答の増加に対してわずかな傾向がある。その結果は、組み込まれた全ＲＮＡに関して４５％を超えるレベルでＨＢｃＡｇ粒子内に組み込まれたｍＲＮＡの割合の増加が、このタンパク質に対するより大きな体液性免疫原性を付与することを示す。ＩｇＧサブクラスのパターン予備分析は、細胞型免疫応答のレベルで同様の性能を示唆する。
【００４５】
例２  異なる割合のホスファチジルセリンを有するＨＢｓＡｇのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の取得
組換えＨＢｓＡｇは、この抗原をコードする遺伝子を使用して、遺伝的に形質転換されたＰ. ｐａｓｔｏｒｉｓの株から得られた［欧州特許第ＥＰ４８０５２５号］。この酵母種で発現されるＨＢｓＡｇは、その構造脂質内にホスファチジルセリンを含むことが知られている［Ｌｏｂａｉｎａ Ｙ,ら Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇiａ Ａｐｌｉｃａｄａ （２００８年）, ２５：３２５-３３１］。しかしながら、本発明までは、この抗原の免疫原性におけるこの脂質の存在の影響は、研究されていなかった。
【００４６】
ホスファチジルセリンの割合がＨＢｓＡｇの免疫原性にどのように影響するかを研究するために、本発明者らは、異なる発酵条件下でこのＶＬＰの調製物を得た。組換え酵母発酵槽中での培養中に、本発明者らは、培地中のＭｇ（２＋）の濃度を１．０〜２．０％に増加させ、ＨＢｓＡｇのＶＬＰに関連するこのリン脂質の増加をもたらした。これは、異なる増殖条件下で得られたＨＢｓＡｇの特徴付けの間に薄層クロマトグラフィー使用することによって検出した。
【００４７】
ホスファチジルセリンは、既知の脂質性のＨＢｓＡｇのＶＬＰに結合している。表３に示す結果は、５つの異なる繰り返しの平均値を表す。精製は、異なる実験条件下で生成されたＨＢｓＡｇの全ての調製物について同様であった。表に見られるように、１．２％未満のＭｇ（２＋）濃度を含む培地で発酵を行った場合、得られた試料中にホスファチジルセリンが検出されなかった。２．０％のＭｇ（２＋）を含む培地で得られた調製物中に見られるホスファチジルセリンのレベルは、１．４％のＭｇ（２＋）を含む培地（変異体Ｃ）で得られた調製物に見られるものよりも有意に高かった。
【表３】
2019510064.tif 000005
【００４８】
ＮＤ：検出なし、Ｍｇ（２＋）（％）：培地の生理食塩水添加物中で見られるＭｇイオンの濃度（百分率）。ＦＳ（％）：生成されたＨＢｓＡｇの抽出後に決定された全リン脂質中のホスファチジルセリンの百分率。（＊）：有意差（ｐ＜０．０５）、（＊＊）高い有意差（ｐ＜０．０１）。
【００４９】
表３に示すＨＢｓＡｇの調製物は、元の変異体に匹敵する、それらの一次、二次及び三次構造を研究するためになされた特性に従って、それらのタンパク質組成物において同一であった。脂質濃度／たんぱく質濃度比は、研究でいずれの変異体についても変化しなかったことを指摘することが重要である。総リン脂質対全タンパク質含量の割合で同じ知見が得られた。質量分析法を用いたそれらの組成物の分析の結果として、ＨＢｓＡｇ又は他の微量な化合物の不純物の分析中の他の重要な変化は起こらなかった。
【００５０】
例３  ホスファチジルセリンの異なる割合を示すＨＢｓＡｇ調製物の免疫学的評価
ホスファチジルセリンの存在が、ＨＢｓＡｇに対する免疫応答に影響を及ぼすかどうかを評価する目的で、血清中にＨＢｓＡｇを発現するトランスジェニックマウスで免疫原性試験を行った［Ｃａｓｔｒｏ ＦＯ, ら Ｉｎｔｅｒｆｅｒoｎ ｙ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ （１９８９年） ６：２５１-２５７； Ｐｅｒｅｚ Ａ,ら. Ａｃｔａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９３年） １３： ３７３−３８３］。６匹のマウスからなる７つの群をそれぞれ使用した。これらは、鼻腔内経路（ＩＮ）で免疫された８〜１２週齢の雌マウスであった。研究の最初の６つのグループは、フロイントアジュバントと共に表３に記載されたＨＢｓＡｇの異なる変異体の５μｇをそれぞれ受けた。第７群は、対照群として使用され、ＰＢＳ  １Ｘを受けた。全ての処置群は、１４日間ごとに投与された免疫原を１０回投与した。最初の免疫化前及び各投与の１０日後に、３回目の投与として血液抽出を行った。表４において、トランスジェニックマウスの血液中のＨＢｓＡｇのレベル、並びに１０回投与後に単離された、脾細胞培養の上清に誘導されたサイトカイン（ＩＦＮγ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−γ）及びＩＬ−２のレベルを示す。評価は、ＥＬＩＳＡ技術を用いて行った。
【００５１】
５μｇのＨＢｓＡｇの投与後、１０回の連続した免疫化のＩＮ経路により、このＨＢｓＡｇ中のホスファチジルセリンのレベルが５％以上である場合、ＨＢｓＡｇのトランスジェニックマウスの血液中のＨＢｓＡｇの濃度は、有意に低下した（例２、表３における変異体Ｄ、Ｅ及びＦ）。同様に、５％以上のホスファチジルセリンのＨＢｓＡｇの変異体は、低レベルの変異体（変異体Ｃ）又はホスファチジルセリンが検出されない変異体と比較して、有意に優れたレベルのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２を誘導し、用量依存的な効果を示唆する。これは、表４で見出される。
【００５２】
ホスファチジルセリンを含まないＨＢｓＡｇと比較した場合、Ｔｈ１サイトカインの有意な増加があり、５％を超えるホスファチジルセリンのレベルを含むＨＢｓＡｇの変異体を有するトランスフェニックＨＢｓＡｇマウスの免疫化後に、循環ＨＢｓＡｇの高い除去能力が見出された（表４、変異体Ｄ〜Ｆ）。変異体Ｄ〜Ｆについて見出されたサイトカインレベルは、条件Ａ〜Ｃのものよりも有意に高かった。Ｄ〜Ｆ変異体は、免疫化されたトランスジェニック動物におけるインビトロでの脾細胞の刺激後のサイトカインの最も強力な分泌を誘導した。
【表４】
2019510064.tif 000006
【００５３】
Ａ〜Ｆ：ＨＢｓＡｇの変異体は、表３に示されるように、組成物中に増殖するレベルのホスファチジルセリンを伴って産生された。(*)：有意差（ｐ＜０．０５）、＊＊高い有意差（ｐ＜０．０１）。
【００５４】
見出されたように、ホスファチジルセリンのより高い含有量を有するＨＢｓＡｇの変異体を用いてＨＢｓＡｇにトランスジェニックしたマウスの免疫化によって、Ｔｈ１サイトカインの優位な増加及び循環ＨＢｓＡｇのより大きい除去能力があり、それにより、この抗原によって形成されたＶＬＰに会合した脂質中のこの脂質成分の割合の増加に伴う抗原の免疫原性の増加を立証した。
【００５５】
ＨＢｓＡｇの粒子でのホスファチジルセリンの挿入は、従来、技術水準で報告されている。しかしながら、この成分の割合がこれらの粒子の免疫原性に影響する方法は、研究されていなかった。２００８年には、Ｌｏｂａｉｎａらは、Ｐ. ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて産生されたより高いＨＢｓＡｇにおけるホスファチジルセリンの役割を推測しており［Ｌｏｂａｉｎａ Ｙら. Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇiａ Ａｐｌｉｃａｄａ （２００８年）, ２５：３２５-３３１］、この同じ報告において、同じ宿主で産生されたＨＢｓＡｇに基づく２つのワクチンは、免疫原性の点で異なるが、ホスファチジルセリンのレベルは、それを産生する酵母種により、おそらく同じであった。
【００５６】
例４  カプセル化されたｍＲＮＡのより高い割合を有するＨＢｃＡｇの変異体のＣＨＢ患者の免疫原性の増加の実証
例１において、カプセル化されたＲＮＡの全量内でｍＲＮＡの割合の増加に伴って、ＨＢｃＡｇの免疫原性の増加があったことがマウスで証明された。これらの結果を考慮して、ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇの両方を含む製剤の免疫学的挙動及び抗ウイルスインビボ応答を、それらのｍＲＮＡ及びホスファチジルセリンの修飾によって、それぞれ特徴付けた。
【００５７】
このために、慢性Ｂ型肝炎患者において、第ＩＩ相無作為二重盲検臨床試験を実施した。選択された患者は、１００００コピー／ｍＬを超える高ウイルス負荷を有し、ＨＢｅＡｇは、研究の開始時に陽性であった。患者はそれぞれ１５人の患者の６つの群に分けられ、表５に記載される治療が施された。合計１０回の投与量を与えられ、５用量の２サイクルに分けられ、その間に１ヶ月間隔を置いた。最初の５用量は、ＩＮ経路のみで行い、他の５用量は、ＩＮ／ＳＣで同時に投与した。両方の投与サイクルにおいて、用量は、１４日間隔で与えられた。
【表５】
2019510064.tif 000007
【００５８】
ｍＨＢｃＡｇ：この抗原の全ＲＮＡの５０％の割合でｍＲＮＡを含むＨＢｃＡｇ；ｍＨＢｓＡｇ：ＶＬＰの脂質成分内に７％のホスファチジルセリンを含むＨＢｓＡｇ。
【００５９】
驚くべきことに、両方の修飾された抗原（すなわち５％を超えるホスファチジルセリンのレベルを有するＨＢｓＡｇを含んだ製剤、及び４５％を超えるｍＲＮＡを有するＨＢｃＡｇ）を含む製剤で処置した患者群において、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇへのセロコンバージョンの有意により高いレベルが、これらの特性を持たない製剤で処置した患者群と比較した場合、見出された（表６参照）。これは、患者において生成された抗ウイルス応答の質の増加におけるこれらの修飾の関連性を示す。
【００６０】
ヒトにおいて、抗原は、１用量当たり５０μｇの抗原、最大１用量当たり１０００μｇまでの抗原で、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇへのセロコンバージョン、ウイルス学的対照及び治療終了後１年以上経過した１ｍＬ当たりのＨＢＶのＤＮＡの１００００コピー下での持続したウイルス学的応答により評価された。
【表６】
2019510064.tif 000008
【００６１】
同様の結果が、ＨＢｓＡｇにトランスジェニックされたマウスのモデルでも見出され、ここで、表５に記載されたものと同様である治療群を評価することが行われ、循環ＨＢｓＡｇのより大きな減少、並びにより高い抗ＨＢｓＡｇ抗体価が、より早い出現を有して、上記の修飾を有する抗原に含まれる製剤を投与する群について、得られた。
【００６２】
興味深いことに、修飾されたＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇの変異体を含む製剤は、未修飾抗原を含む製剤、又はこれらの修飾された抗原の１つのみを含む製剤で得られた応答と比較して、ＨＢＶトランスジェニックマウス及び患者においてより強力なＴｈ１免疫原性を発達させた。
【００６３】
例５  多価製剤におけるｍＲＮＡ及びホスファチジルセリン含有量のそれぞれにおいて修飾を有するＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇ抗原のアジュバント効果
この研究において、アジュバントの能力、すなわち、それぞれ、それらのｍＲＮＡ及びホスファチジルセリン含量の修飾を有する組換えＨＢｃＡｇ及びＨＢｃＡｇタンパク質の混合中で、経口経路及び粘膜経路を介して、未修飾ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇの混合物を用いて同時に投与される抗原に対する免疫応答の増加を比較した。この目的のために、組換えキメラタンパク質ＣＲ３が選択された；これは、ＨＩＶ−１の多重エピトープ抗原である［Ｉｇｌｅｓｉａｓ Ｅ ら Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓ （２００１年） １：１０９-１２２］。６〜８週齢の８匹の雌Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスの８グループに、１）ＳＣ免疫化によるＰＢＳ（プラセボ）（これまでプラセボ）と称している）（ＳＣ）；２）ＩＮ免疫化による酢酸塩緩衝液（ＮａＡｃ）、ｐＨ＝５．２（プラセボ（ＩＮ））；３）ＳＣ経路によるＨＢｃＡｇ（Ｃ）及びＨＢｓＡｇ（Ｓ）の混合物（Ｃ＋Ｓ（ＳＣ））；４）この抗原及びＳＣ経路による脂質成分（ｍＳ）中に７％のホスファチジルセリンを含むＨＢｓＡｇ（ｍＳ）の全ＲＮＡの５０％の割合でｍＲＮＡを含むＨＢｃＡｇの混合物（ｍＣ＋ｍＳ（ＳＣ））；５）ＩＮ経路によるＣ＋Ｓ（Ｃ＋Ｓ（ＩＮ））；６）ＩＮ経路によるｍＣ＋ｍＳ（ｍＣ＋ｍＳ（ＩＮ））；７）ＳＣ経路によるＨＢｃＡｇ（Ｃ）及びＨＢｓＡｇ（Ｓ）を有するＣＲ３の混合物（ＣＲ３＋Ｃ＋Ｓ（ＳＣ））；８）ＣＲ３＋ｍＣ＋ｍＳ（ＳＣ）：９）ＣＲ３＋Ｃ＋Ｓ（ＩＮ）及び１０）ＣＲ３＋ｍＣ＋ｍＳを接種した。使用された用量は、各経路によって各抗原の５μｇであった；免疫化スケジュールの０、７及び２１日目に免疫原を投与した。ＳＣ免疫化のため、タンパク質をＰＢＳ中に溶解し、１．４ｍｇ／ｍＬの水酸化アルミニウム（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ Ａ/Ｓ, Ｖｅｄｂａｅｋ, Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着させた。ＩＮ経路について、タンパク質をＮａＡｃ、ｐＨ５．２に溶解した。動物を、仰臥位に位置する３０μＬのケタミン（１０ｍｇ／ｍＬ）の腹腔内（ＩＰ）投与によって麻酔し、免疫原をピペットチップで５０μＬ（２５μＬ／鼻孔）にゆっくりと分注した。免疫化の１０日後、全ての動物の血清を集め、研究の最後に５匹の動物を犠牲にして（無作為に）、細胞性免疫応答の研究のために脾臓を得た。
【００６４】
血清中のＩｇＧの応答を、プレートをＣＲ３タンパク質でコーティングした間接ＥＬＩＳＡによって評価した。ＣＲ３で刺激された培養上清中ＩＦＮ−γの分泌の定量のための方法論は、以前より知られている［Ｇａｒｃｉａ Ｄｉａｚ ＤらＩｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ （２０１３年） １４９：７７-８４］。
【００６５】
ガウス分布は、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ-Ｓｍｉｒｎｏｖ検定及びＢａｒｔｌｅｔｔ検定との分散の等価性を用いてデータの統計的分析を評価した。正規分布を有するサンプル（又はガウス分布が推定されるサンプル）及び等分散がパラメトリック検定と比較された；それ以外の場合は、代替ノンパラメトリック検定を使用した。値の正期分布を達成するために、ＩｇＧの全ての力価を、ｌｏｇ１０に変換した。セロコンバージョンに達しなかった動物の血清は、統計的処理のために１：１０の任意の力価が割り当てられた。ｐ＜０・０５の値は、統計的に有意であると考えられた。
【００６６】
図２で見出されたＩｇＧ抗ＣＲ３抗体測定（ＨＩＶ−１）の結果は、それぞれＣＲ３＋ｍＣ＋ｍＳ（第８及び１０群）対ＣＲ３＋Ｃ＋Ｓ（第７及び９群）の混合物で免疫化された動物の群におけるＳＣ及びＩＮ経路による投与後、より高い応答（ｐ＜０．０５）を示した。以前の結果と一致して、ＩＦＮ−γのより大きな分泌も、表７で見出されるような同じ群のマウスから培養上清中に見出された。最後の免疫付与後（３１日目）の１０日に、この分析のために、１群当たり５匹のマウスから脾細胞を培養した。個々の動物の脾細胞懸濁液をプラセボ群のために調製した。それらを２．５μｇ／ｍＬのＣＲ３タンパク質でエキソビボで５日間刺激した。上清中で、ＣＲ３特異的ＩＦＮ−γをサンドイッチ型ＥＬＩＳＡで定量した。検出限界は、０．８０ｎｇ／ｍＬであった。
【表７−１】
2019510064.tif 000009
【表７−２】
2019510064.tif 000010
【００６７】
最後に、ＳＣ経路によって免疫化した群において、エキソビボ刺激後に、ＣＲ３（ＨＩＶ−１）に特異的であるＣＤ８＋細胞の頻度を比較した。図３で見出されるように、ＣＲ３＋ｍＣ＋ｍＳ（ＳＣ）対ＣＲ３＋Ｃ＋Ｓ（ＳＣ）の刺激群においてＣＤ８＋細胞のより高い頻度が得られた。
【００６８】
これらの結果は、全体として、４５％を超えるｍＲＮＡを有するＨＢｃＡｇ（ｍＣ）及び５％を超えるホスファチジルセリンのレベルを有するＨＢｓＡｇ（ｍＳ）の混合物は、非経口及び粘膜経路により、より高いＴｈ１アジュバント効果を有することを示す。特に、ＨＩＶに対するワクチンの接種の場合、この結果は、抗ウイルスＴｈ１応答が、ＡＩＤＳへの感染及び進行に対する防御に関連しているため、非常に重要である。
【００６９】
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原（この例ではＣ及びＳと略する）に対する体液性免疫応答を測定するこの実験の目的ではなかったが、本発明者らは、未修飾ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇの混合物（Ｃ＋Ｓ、データは占めさす）と比較した場合、修飾ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原（ｍＣ＋ｍＳ）の混合物で免疫化されたマウスの群において、より高く統計的に有意であったＩｇＧ抗ＨＢｃＡｇ及び抗ＨＢｓＡｇの応答を観察した。これは、上記の結果を確認した。
【００７０】
例６  ＨＢｓＡｇを発現するトランスジェニックＢａｌｂ／ｃマウスに、それぞれｍＲＮＡ含量及びホスファチジルセリンの修飾を有するＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇの製剤で免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスからの細胞の養子免疫伝達による受動免疫
本発明において、本発明者らは、ホスファチジルセリン及びｍＲＮＡのそれぞれの含量において修飾を含む、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇの抗原を含む製剤を用いた個体の能動免疫化により、ドナーにおける免疫応答抗ＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢｃＡｇを増強することを望み、また、移入されるべき細胞は、移入前にインビトロで活性化されるので、これらの抗体に対する応答は、細胞が受容体に接種された場合に最大となる。したがって、人には存在しない応答のタイプが、人工的に得られ、ＨＢＶに感染したか否かにかかわらず、類似のハロタイプを有する人へのドナーのマージンを増やすことが可能になる。
【００７１】
現在の例において、本発明者らは、細胞の養子免疫伝達により、それぞれホスファチジルセリン及びｍＲＮＡの含有量を有するＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原からなる製剤によるワクチン接種によって生成された免疫応答の効果を評価し、これは、ＨＢＶの持続性感染のモデルであるＨＢｓＡｇを発現するトランスジェニックマウスとの関連で、ＩＮ／非経口経路により適用される。この研究の目的の１つは、トランスジェニックマウスの血清中のＨＢｓＡｇ（抗遺伝子）の濃度に対する転移免疫応答の効果の評価であった。さらに、本発明者らは、インビボ及びインビトロでＨＢｓＡｇのみで刺激された細胞の移動によって発生した効果と比較して、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原の製剤の投与についてＩＮ／非経口投与経路の組み合わせによって誘導される応答の効果を比較した。さらに、この抗原のためのトランスジェニックマウスの文脈で移入され抗体応答抗ＨＢｓＡｇの動力学を研究した。本発明者らは、Ｂａｌｂ／ｃマウス及びＨＢｓＡｇ（＋）トランスジェニックであるマウス（ＣＩＧＢで得られたＢａｌｂ／ｃの遺伝的背景を有する）を使用した。
【００７２】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける免疫抗ＨＢｓＡｇの生成
８〜１２週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウスで免疫スケジュールを実施した。ＩＮ及び非経口経路により、修飾抗原ＨＢｓＡｇ（ホスファチジルセリンの含量の５％以上）及びＨＢｃＡｇ（ｍＲＮＡの含量の４５％以上）を含むワクチン調製物で免疫した。非経口経路内では、本発明者らは、ＩＭ、ＳＣ及びＩＤ経路を試験した。用量（１００μＬの容量）を、０日目及び１４日目に投与し、ブースターショットを移入前の１００日目で投与した。血液抽出は、２日目、１０日目及び２５日目に眼窩後叢で行った。表８は、各群によって受けた治療を含む、免疫スケジュールの設計を示す。
【表８】
2019510064.tif 000011
【００７３】
ｍＨＢｃＡｇ：この抗原の全ＲＮＡの５０％の割合でｍＲＮＡを含むＨＢｃＡｇ；ｍＨＢｓＡｇ：ＶＬＰの脂質成分中に７％のホスファチジルセリンを含むＨＢｓＡｇ。
【００７４】
これらの処置によって生成された免疫体液性応答の評価は、各接種後、ＩｇＧ応答及びＩｇＧ抗ＨＢｓＡｇのサブクラスをＥＬＩＳＡ技術を使用して測定することによって行った。細胞性免疫応答を評価するために、最初の投与の１０日後に、本発明者らは、脾臓由来のＣＤ８＋リンパ球によるＨＢｓＡｇに対する特異的ＩＦＮ−γの分泌を測定するＥＬＩＳＰＯＴ型試験を行った。これらの評価の結果は、第５群が最大の細胞応答及び調査された群の残りのものと異なる体液性応答を生成することを示す。これに基づいて、本発明者らは、養子免疫伝達のための脾細胞ドナーとしてこの群から２匹の動物を選択した。免疫原の選択は、１：１（ＨＢｓＡｇ：ＨＢｃＡｇ）の割合で実施した。
【００７５】
免疫脾細胞の取得
ブースターショットを受けてから１５日後、第５群の２匹のマウス及び第７群（プラセボ）の３匹のマウスを屠殺し、それらの脾臓を抽出した。第５群の脾臓及び第７群の脾臓をそれぞれ、グループ分けした。脾臓は、脾細胞が得られるまで処理された。それらは、受容体マウスへの移転のために１００μＬのＰＢＳ１Ｘの３０×１０６細胞のアリコートに分離した。
【００７６】
免疫の養子免疫伝達
受容体として使用されたＨＢｓＡｇを発現するトランスジェニックマウスは、１６〜２０週齢及び両性のものであった。それらは、表９に示すように異なる治療群に割り当てられた。脾細胞の移動の前に、血清中のＨＢｓＡｇのレベルをチェックするために、部分的な血液抽出を行った。その後、本発明者らは、１００μＬのＰＢＳ  １Ｘの容積中に３０×１０６の脾細胞を（ＩＰ経路により）接種した。免疫の養子免疫伝達の効果を評価するための血液抽出物を、眼窩後叢を介して毎週５週間行った。移入後８週目に、動物から採血し、犠牲にした。
【表９】
2019510064.tif 000012
【００７７】
ＨＢｓＡｇにトランスジェニックなマウスの血清中のＨＢｓＡｇの定量
血清中のＨＢｓＡｇのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。プレートを、Ｈｅｐ４（ＣＩＧＢによって製造された）と呼ばれるモノクローナル抗体抗ＨＢｓＡｇでコーティングした。ＨＢｓＡｇに対する以前の免疫性を有する細胞を受けた全てのマウスは、移入後、週の評価から、血清中のＨＢｓＡｇの顕著な減少を示し、時間０と第２及び第３週の間に有意差があった（ｐ＜０．０５）。第４週（３５日目）現在、本発明者らは、血清中のＨＢｓＡｇの濃度が上昇し始めたことを観察し、したがって転移免疫による抗遺伝子血症（ａｎｔｉ−ｇｅｎｅｍｉａ）の抑制が減少していることを示唆している。この時点で、そして第８週（６３日目）まで、試験時間ゼロについて報告されたものと抗遺伝子血症の差はない。
【００７８】
ＨＢｓＡｇに対する特異的免疫を有する脾細胞移入を受けたマウスの場合、本発明者らは、血清中のＨＢｓＡｇの顕著な減少を検出したが、これは７日目と２８日目の間に顕著であった。しかしながら、プラセボ脾細胞移入又はＰＢＳを投与されたマウスについて、血清中のＨＢｓＡｇの濃度の変化があったものの、時間ゼロと共に有意差には到達せず、５μｇ／ｍｌ未満の値は、検出されなかった。
【００７９】
これらの結果は、このタンパク質のこれらのトランスジェニック動物の血清中を循環するＨＢｓＡｇのレベルを効率的に低下させることが、細胞によって媒介される免疫の養子免疫伝達によって可能であることを示している。この場合に移入された免疫応答によって、抗遺伝子血症について確立された対照は、単一細胞移入後約３週間続いた。
【００８０】
血清中のＩｇＧ抗ＨＢｓＡｇ応答
ＨｂｓＡｇに対する特異的ＩｇＧ抗体応答が、この抗原に対する先の免疫を有する脾細胞の移入を受けた全てのマウスについて検出された。これは、得られた抗遺伝子血症結果と一致する。抗ＨＢｓＡｇ応答を有する動物の場合、検出された力価は高く（力価＞１０４）、３週間目で減少し始め、これは、約第４週目（第３５日目）でこれらの動物で見出された抗遺伝子血症の増加に関連する。プラセボ細胞の移入又はＰＢＳを受けた群は、特異的な抗体を示さない。
【図１】
2019510064.tif 000013
【図２】
2019510064.tif 000014
【図３】
2019510064.tif 000015
【国際調査報告】
2019510064.tif 000016
2019510064.tif 000017
2019510064.tif 000018
2019510064.tif 000019
2019510064.tif 000020
2019510064.tif 000021
2019510064.tif 000022
2019510064.tif 000023
2019510064.tif 000024
2019510064.tif 000025