(57)【要約】培養脂肪細胞のセクレトームを含有する凍結乾燥組成物、持続放出薬物送達マトリックスを追加で含有する医薬組成物、ならびにそのような組成物を作製および使用する方法が、本明細書において提供される。この医薬組成物は、ａ）培養脂肪細胞のセクレトームを含む、細胞不含の濃縮条件培地であって、前記脂肪細胞が、少なくとも１つの脂肪幹細胞（ＡＳＣ）を含み、前記培養脂肪細胞のうちの少なくとも９０％が、周皮細胞マーカーを発現する、条件培地と、ｂ）有効量の凍結乾燥剤とを含む凍結乾燥組成物を含み得る。
2019509033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結乾燥組成物であって、
ａ）培養脂肪細胞のセクレトームを含む、細胞不含の濃縮条件培地であって、前記脂肪細胞が、少なくとも１つの脂肪幹細胞（ＡＳＣ）を含み、前記培養脂肪細胞のうちの少なくとも９０％が、周皮細胞マーカーを発現する、条件培地と、
ｂ）有効量の凍結乾燥剤と
を含む、凍結乾燥組成物。
【請求項２】
前記周皮細胞マーカーが、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５からなる群から選択され、前記培養脂肪細胞が、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ３１に関して陰性である、請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項３】
前記培養脂肪細胞のうちの少なくとも９５％が、前記周皮細胞マーカーを発現する、請求項２に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項４】
前記凍結乾燥剤が、スクロースである、請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項５】
有効量の、濾過のための緩衝液をさらに含む、請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項６】
前記濾過のための緩衝液が、トリス−ＥＤＴＡまたはヒスチジンを含む、請求項５に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項７】
前記有効量のトリス−ＥＤＴＡが、約２５ｎＭトリスおよび約１ｍＭ  ＥＤＴＡである、請求項６に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項８】
前記脂肪細胞が、脂肪吸引後に得られる、請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項９】
前記脂肪細胞が、女性から得られる、請求項８に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項１０】
少なくとも３ヶ月間の期間、約２０〜３５℃の温度で、貯蔵安定性である、請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項１１】
非免疫原性である、請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項１２】
前記セクレトームが、治療有効量の、１つまたは複数の再生因子または抗炎症因子を含む、請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項１３】
前記１つまたは複数の再生因子または抗炎症因子が、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、酵素、マイクロＲＮＡ、リン脂質、多糖類、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の再生因子または抗炎症因子が、細胞外小胞体から分離している、請求項１３に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の再生因子または抗炎症因子が、前記ＡＳＣによって分泌される細胞外小胞体の内部または表面に結合している、請求項１３に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのＡＳＣが、前記１つまたは複数の再生因子または抗炎症因子の発現を増加させる条件下において培養されている、請求項１２に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのＡＳＣが、外因的に添加された量のＩＦＮγおよびＴＮＦαの存在下において培養されている、請求項１６に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項１８】
成長制御アルファタンパク質（ＣＸＣＬ１）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２（ＣＣＬ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン８（ＣＣＬ８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン５（ＣＣＬ５）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）のうちの１つまたは複数の発現が、増加する、請求項１７に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項１９】
前記セクレトームが、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１／２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、およびｈｓａ−ｍｉＲ−２６からなる群から選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡを含む、請求項１７に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項２０】
０．０５〜１．５ｍｇ／ｍｌの全タンパク質を含む、請求項１２に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項２１】
１×１０８〜９×１０１１個の細胞外小胞体を含む、請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項２２】
有効量の請求項１に記載の凍結乾燥組成物と、持続放出薬物送達マトリックスとを含む、医薬組成物。
【請求項２３】
前記持続放出薬物送達マトリックスが、生分解性、生体適合性、または生分解性かつ生体適合性である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記脂肪細胞の前記セクレトームから、治療有効量の１つまたは複数の再生因子および抗炎症因子を、最大６ヶ月間の期間、放出する、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記１つまたは複数の再生因子または抗炎症因子が、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、酵素、マイクロＲＮＡ、リン脂質、多糖類、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記再生因子または抗炎症因子が、組織再生、神経血管修復、または組織再生および神経血管修復の両方を刺激する、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記１つまたは複数の再生因子または抗炎症因子が、細胞外小胞体から分離している、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記１つまたは複数の再生因子または抗炎症因子が、前記ＡＳＣによって分泌される細胞外小胞体の内部または表面に結合している、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのＡＳＣが、前記１つまたは複数の再生因子または抗炎症因子の発現を増加させる条件下において培養されている、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのＡＳＣが、外因的に添加された量のＩＦＮγおよびＴＮＦαの存在下において培養されている、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
成長制御アルファタンパク質（ＣＸＣＬ１）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２（ＣＣＬ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン８（ＣＣＬ８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン５（ＣＣＬ５）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）のうちの１つまたは複数の発現が、増加する、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１．５ｍｇ／ｍｌの全タンパク質を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記持続放出薬物送達マトリックスが、ゲル、ペースト様組成物、半固体組成物、および微粒子状組成物からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記持続放出薬物送達マトリックスが、巨視的処理によって機械的に形成される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記持続放出薬物送達マトリックスが、前記凍結乾燥組成物に対していずれの化学的変化も生物学的変化も引き起こさない、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記持続放出薬物送達マトリックスが、疎水性マトリックスを含む、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記疎水性マトリックスが、ステアリン酸マグネシウム、パルミチン酸マグネシウム、脂肪酸塩、パルミチン酸セチル、脂肪酸塩、植物油、脂肪酸エステル、トコフェロール、およびこれらの組合せからなる群から選択される、１つまたは複数の疎水性賦形剤を含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記疎水性マトリックスが、ステアリン酸マグネシウムおよびトコフェロールを含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記疎水性マトリックスが、少なくとも疎水性固体構成成分および疎水性液体構成成分を含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記疎水性固体構成成分が、ワックス、フルーツワックス、カルナウバワックス、ビーズワックス、ワックス様アルコール、植物性ワックス、大豆ワックス、合成ワックス、トリグリセリド、脂質、長鎖脂肪酸およびそれらの塩、パルミチン酸マグネシウム、長鎖脂肪酸のエステル、長鎖アルコール、ワックス様アルコール、オキシエチル化植物油、およびオキシエチル化脂肪アルコールからなる群から選択され、
前記液体疎水性構成成分が、植物油、ヒマシ油、ホホバ油、大豆油、シリコーン油、パラフィン油、および鉱油、クレモフォール、オキシエチル化植物油、オキシエチル化脂肪アルコール、トコフェロール、脂質、ならびにリン脂質からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記長鎖脂肪酸が、ステアリン酸マグネシウムである、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記長鎖アルコールが、パルミチン酸セチルまたはセチルアルコールである、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記凍結乾燥組成物の前記有効量が、約０．０１〜約５０％（重量／重量）である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記凍結乾燥組成物の前記有効量が、約０．２％（重量／重量）である、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記凍結乾燥組成物が、粒子状の形態で、前記疎水性マトリックス中に分散されている、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記凍結乾燥組成物が、溶解した状態で、前記疎水性マトリックス中に分散されている、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
請求項２２に記載の医薬組成物を含み、ヒトまたは哺乳動物の眼に注射するのに好適なサイズおよび形状を有する、剤形。
【請求項４８】
患者における眼科障害を処置する方法であって、有効量の請求項２２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４９】
患者における眼科障害を処置する方法であって、有効量の請求項１に記載の凍結乾燥組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５０】
前記眼科障害が、血管機能、神経機能、または血管および神経機能に影響を及ぼす炎症性もしくは変性眼科疾患である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記眼科障害が、血管機能、神経機能、または血管および神経機能に影響を及ぼす炎症性もしくは変性眼科疾患である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
血管機能、神経機能、または血管および神経機能に影響を及ぼす前記炎症性眼科疾患または変性眼科疾患が、滲出型および萎縮型ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、点状脈絡膜内層症、網膜分枝静脈閉塞症、虹彩炎、ブドウ膜炎、眼内炎、視神経症、緑内障、シュタルガルト病、網膜剥離、網膜色素変性、若年性網膜隔離症、老年性網膜隔離症、角膜幹細胞疲弊症、角膜表面疾患、角膜への損傷を含む外傷性眼損傷、外傷性脳損傷、外傷性眼損傷、および視覚または網膜に影響を及ぼす外傷性脳損傷からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
血管機能、神経機能、または血管および神経機能に影響を及ぼす前記炎症性眼科疾患または変性眼科疾患が、滲出型および萎縮型ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、点状脈絡膜内層症、網膜分枝静脈閉塞症、虹彩炎、ブドウ膜炎、眼内炎、視神経症、緑内障、シュタルガルト病、網膜剥離、網膜色素変性、若年性網膜隔離症、老年性網膜隔離症、角膜幹細胞疲弊症、角膜表面疾患、角膜への損傷を含む外傷性眼損傷、外傷性脳損傷、外傷性眼損傷、および視覚または網膜に影響を及ぼす外傷性脳損傷からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記医薬組成物または前記凍結乾燥組成物が、少なくとも２〜６ヶ月ごとに投与される、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記医薬組成物または前記凍結乾燥組成物が、前記患者の眼に局所的に投与されるか、または注射によって投与される、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記医薬組成物または前記凍結乾燥組成物が、眼内注射によって投与される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記医薬組成物または凍結乾燥組成物が、眼の硝子体腔に注射されるか、結膜下に注射されるか、網膜内に注射されるか、テノン嚢下に注射されるか、または眼球後に注射される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記医薬組成物から放出される再生因子が、血管透過性を減少させるか、異常な血管成長を減少させるか、神経血管組織への損傷を低減させるか、神経膠症を低減させるか、網膜機能を改善もしくは保護するか、神経機能を改善もしくは保護するか、視覚を改善もしくは保護するか、またはこれらの任意の組合せを行う、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記医薬組成物が、０．５〜１ｍｌの前記凍結乾燥組成物と、前記持続放出薬物送達マトリックスとを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項６０】
前記医薬組成物が、硝子体内注射の前に懸濁液中に微粒子化される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記凍結乾燥組成物の前記有効量が、約０．０１〜約５０％（重量／重量）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項６２】
前記凍結乾燥組成物の前記有効量が、約０．２％（重量／重量）である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項１に記載の凍結乾燥組成物を作製する方法であって、
ａ）脂肪細胞の集団を得るために脂肪組織を酵素消化することであって、前記脂肪細胞の集団が、少なくとも１つの脂肪幹細胞（ＡＳＣ）を含むこと、
ｂ）脂肪細胞を、２〜４×１０５個の細胞／ｃｍ２の播種密度で、第１の培養培地において培養すること、
ｃ）前記細胞を、前記第１の培養培地において、少なくとも１回継代させること、
ｄ）１つまたは複数の周皮細胞マーカーの少なくとも９０％の発現を有する細胞を選択すること、
ｅ）前記選択した細胞を、第２の培養培地において培養することであって、前記第２の培養培地が、血清不含であり、少なくとも１つの炎症性サイトカインを含む、培養すること、
ｆ）前記選択した細胞を、炎症性サイトカインを含有しない基礎培養培地中に移すこと、
ｇ）前記脂肪細胞の前記セクレトームを含む、細胞不含の条件培地を生産するために、前記基礎培養培地から細胞を除去すること、および
ｈ）前記条件培地を凍結乾燥させること
を含む、方法。
【請求項６４】
前記脂肪組織が、コラゲナーゼで消化される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記１つまたは複数の周皮細胞マーカーが、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４０ｂ、および神経／神経膠抗原２（ＮＧ２）からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記少なくとも１つの脂肪幹細胞が、ＣＤ４５−である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞のうちの少なくとも９５％が、前記１つまたは複数の周皮細胞マーカーを発現する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記炎症性サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記第２の血清不含培養培地が、約１０〜約３０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、約１〜約２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、またはこれらの組合せを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記第２の血清不含培養培地が、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記第２の血清不含培養培地が、１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞を、少なくとも１つの炎症性サイトカインを含有する前記第２の血清不含培養培地において培養することが、前記細胞によるＴＩＭＰ１発現を増加させる、請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞を、少なくとも１つの炎症性サイトカインを含有する前記第２の血清不含培養培地において培養することが、前記細胞によるＴＳＧ−６発現を増加させる、請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
ＴＳＧ−６の発現が、少なくとも２倍増加する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞を、１つまたは複数の炎症性サイトカインの存在下において培養することが、前記凍結乾燥組成物のＴ細胞活性を減少させる、請求項６３に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞を、少なくとも１つの炎症性サイトカインを含有する前記第２の血清不含培養培地において培養することが、前記細胞による１つまたは複数の再生因子または抗炎症因子の発現を増加させる、請求項６３に記載の方法。
【請求項７７】
前記１つまたは複数の再生因子または抗炎症因子が、成長制御アルファタンパク質（ＣＸＣＬ１）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２（ＣＣＬ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン８（ＣＣＬ８）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン５（ＣＣＬ５）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞が、２４時間後に、前記第２の血清不含培養培地から除去される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１の培養培地中の前記細胞が、２、３、４、または５回継代される、請求項６３に記載の方法。
【請求項８０】
前記条件培地が、有効量のＥＤＴＡを添加することによって安定化される、請求項６３に記載の方法。
【請求項８１】
前記条件培地が、凍結乾燥の前に濃縮される、請求項６３に記載の方法。
【請求項８２】
前記条件培地が、約５ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣ）で、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して濾過される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ＴＦＦ濾過の後に、前記条件培地が、トリスＥＤＴＡ緩衝液またはヒスチジン緩衝液中に透析濾過される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
透析濾過の後に、有効量のスクロースが、凍結乾燥安定剤として添加される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
請求項１０〜４６のいずれかに記載の医薬組成物を作製する方法であって、ゲル、ペースト様、半固体薬物組成物、または微粒子状組成物を形成するために、有効量の前記凍結乾燥組成物を、前記持続放出薬物送達マトリックスと混合することを含む、方法。
【請求項８６】
前記凍結乾燥組成物が、前記持続放出薬物送達マトリックス中に再構成される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記医薬組成物が、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、例えば、ヒアルロン酸、ペクチン、アラビアガム、および他のガム、アルブミン、キトサン、コラーゲン、コラーゲン−ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、フィブリン、フィブリノーゲン、ゼラチン、グロブリン、ポリアミノ酸、アミノ酸を含むポリウレタン、プロラミン、タンパク質ベースのポリマー、コポリマー、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤をさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記ゲル、ペースト様、または半固体の医薬組成物を形成することが、前記持続放出薬物送達マトリックスと前記凍結乾燥組成物との混合物を、アルゴリズム様式で、プレスし、フォールディングするサイクルを繰り返すことを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記医薬組成物を、好適な剤形に形成すること
をさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
前記剤形が、眼内注射に好適である、請求項８９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年２月１２日に出願された米国仮出願番号第６２／２９４，４８９号および２０１６年１０月２８日に出願された米国仮出願番号第６２／４１４，２８５号に基づく優先権を主張しており、これら仮出願の各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
発明の分野
本発明は、概して、条件培地に由来する幹細胞分泌物を含む組成物、ならびにそれを作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
再生医療は、正常な機能を回復させるか、またはそれを確立するための、ヒトの細胞、組織、または器官の置き換えまたは再生に関する医学の分野である。例えば、幹細胞療法は、様々な疾患および障害を処置、予防、または治癒するために利用することができる。
【０００３】
幹細胞は、制限なく分裂する能力を有し、ある特定の条件下において、様々な異なる細胞型に分化することができる、細胞である。全能性幹細胞は、胚を作る細胞および組織のすべてを生成する潜在能力を有する幹細胞である。多能性幹細胞は、中胚葉、内胚葉、および外胚葉の細胞を生じる幹細胞である。複能性幹細胞は、２つまたはそれよりも多くの細胞型に分化する能力を有する幹細胞であり、一方で単能性幹細胞は、１つの細胞型のみに分化する幹細胞である。
【０００４】
しかしながら、生存幹細胞の療法を、臨床関連規模で生産し、保管することは困難である。（Trainorら、Nature  Biotechnology、３２巻（１号）（２０１４年）を参照されたい）。さらに、そのような療法の治療効力および再生能力は、変動することが多く、細胞は、移植の前または最中に死滅する可能性がある。（Newell、Seminars  in  Immunopathology、３３巻（２号）：９１頁（２０１１年）を参照されたい）。埋め込まれた幹細胞はまた、宿主の免疫系による攻撃を受けやすく、効力を評価することおよび／または「投薬」を制御することは、困難であることが多い。したがって、現在の細胞に基づく再生医学療法に関連する費用、保管、および製造品質管理の制限を克服することができる、さらなる再生療法が、当該技術分野において必要とされている。
【０００５】
さらに、当該技術分野において、眼の裏側を標的とすることができ、外傷に対して二次的に生じる炎症、急性炎症、年齢、および／または酸化ストレスに起因して変性している網膜の到達しにくい感覚組織に長期間治療ペイロードを送達することができる、眼科療法に対する多大な必要性もまた、満たされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Newell、Seminars  in  Immunopathology、３３巻（２号）：９１頁（２０１１年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
急性または慢性の代謝性疾患に対して二次的に生じる炎症からの網膜の神経保護が、眼の裏側の疾患を有する患者にとって、満たされていない医療の必要性の主な領域であり、現在のところ、抗ＶＥＧＦ治療薬を利用した現時点の標準的な医療では達成されていない。網膜小膠細胞を含む免疫細胞の活性化が、糖尿病性網膜症および萎縮型ＡＭＤを含む網膜変性疾患の一般的な特色であり、これが、視覚機能の消失に至る神経膠症、出血、地図状萎縮、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の破壊、および血管漏出に至る、慢性神経炎症および神経変性のプロセスの開始および拡大に関与している可能性がある。（Madeiraら、Mediators  of  Inflammation、２０１５巻、６７３０９０頁（２０１５年）を参照されたい）。
【０００８】
脂肪間質細胞（ＡＳＣまたはＡＤＳＣ）は、パラクリンシグナル伝達を通じて、アポトーシスを停止させ、可溶性および膜結合型のケモカイン、サイトカイン、増殖因子、血管新生因子、およびｍｉＲＮＡの分泌を通じて小膠細胞の活性化およびＴ細胞増殖を低減させることによって、神経膠瘢痕および内皮タイトジャンクションの変性から保護する。（Caiら、Stem  Cells、２５巻（１２号）、３２３４〜３２４３頁（２００７年）を参照されたい）。
【０００９】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）による免疫調節の主な機序のうちの１つは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の制御であるが、最近になって、ＭＳＣは、マクロファージを、古典的な炎症促進性のＭ１表現型から、抗炎症性のＭ２表現型に偏向させることが示されている。（Kimら、Exp  Hematol、３７巻（１２号）、１４４５〜１４５３頁（２００９年）を参照されたい）。
【００１０】
パラクリンシグナル伝達のために細胞によって放出されるＡＳＣ分泌物を採取し、処理することにより、費用効果的で貯蔵安定性の細胞不含の再生療法を開発する可能性がもたらされるが、これは、直接的なＡＳＣの移植に代わる有望な処置を提示する。
【００１１】
貯蔵安定性で再構成が容易であり、眼科使用のために硝子体内に注射される、処理された脂肪間質細胞分泌物の凍結乾燥物の組成物が、本明細書において提供される。これらの組成物は、動物研究において試験されており、網膜に送達されるＡＳＣの再生神経血管保護作用を要約する。
【００１２】
細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの網膜環境における炎症を反映した炎症性条件下において事前に活性化することによって、分泌物のＡＳＣパラクリン活性および効力の強化を可能にする、拡張可能なｃＧＭＰに準拠した製造プロセスもまた、本明細書において提供される。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを含む、サイトカインの組合せが、重要な再生タンパク質の発現に対して相乗効果を有することが実証された。分泌物を収集する前の細胞のＭＳＣ事前刺激により、その療法の再生および神経保護能力が増加し、二次的なサイトカインでの事前処置の組合せを製造プロセスに統合することの重要性を示す。
【００１３】
濃縮された細胞不含の培養脂肪細胞のセクレトーム（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）であって、脂肪細胞が、少なくとも１つの脂肪幹細胞（ＡＳＣ）を含み、培養脂肪細胞のうちの少なくとも９０％（すなわち、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）が、間葉マーカーだけでなく、少なくとも１つの周皮細胞マーカーも発現する、セクレトームと、有効量の凍結乾燥剤とを含有する凍結乾燥組成物が、本明細書において提供される。非限定的な例として、周皮細胞マーカーは、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４６、および神経／神経膠抗原２（ＮＧ２）からなる群から選択され得る。これらの細胞はまた、例えば、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５を含む古典的なＭＳＣマーカーに関して陽性であり得、そして／またはＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ３１などの古典的な白血球および内皮マーカーに関して陰性であり得る。（図１を参照されたい）。ＡＳＣのうちの少なくとも９０％による、周皮細胞マーカーのうちの１つまたは複数の発現は、濃縮された細胞不含の脂肪細胞のセクレトームを含有する組成物の治療有効性に影響を及ぼし得る。非限定的な例として、周皮細胞マーカーの発現は、本明細書に記載される組成物のいずれかの効力を増加させ得る。
【００１４】
好適な凍結乾燥剤の例としては、例えば、トリス−ＥＤＴＡおよびスクロースが挙げられる。一実施形態では、本組成物は、さらに、有効量の、濾過のための緩衝液を含む。例えば、トリス−ＥＤＴＡ（例えば、約２５ｍＭトリスおよび約１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を、濾過のために使用される緩衝液として選択することができ（これは、凍結乾燥サイクルに影響する）、スクロースを、凍結サイクル中に製品を保護するためのタンパク質安定剤としての機能を果たす凍結乾燥剤として選択することができる。当該技術分野において一般的に使用される任意の他の凍結乾燥剤もまた、利用することができる。適切な凍結乾燥剤ならびに有効量の他の凍結乾燥剤の決定は、当該技術分野における日常的な技能の範囲内である。
【００１５】
脂肪細胞は、当該技術分野において一般的に使用される任意の方法によって得ることができる。例えば、脂肪細胞は、男性対象または女性対象から、脂肪吸引手順に従って得ることができる。
【００１６】
本明細書に記載される凍結乾燥組成物のいずれも、約２０〜３５℃の温度（すなわち、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５℃）で、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間の期間、貯蔵安定性である。（例えば、図４Ｃを参照されたい）。一部の実施形態では、本組成物は、少なくとも３ヶ月の期間（すなわち、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月、またはそれよりも長く）、貯蔵安定性である。
【００１７】
好ましくは、これらの凍結乾燥組成物は、非免疫原性である。（例えば、図１３Ａ、１３Ｂ、および１４を参照されたい）。
【００１８】
有効量の、本明細書に記載される凍結乾燥組成物のいずれかと、持続放出薬物送達マトリックスとを含有する医薬組成物もまた、提供される。例えば、持続放出薬物送達マトリックスは、生分解性および／または生体適合性である。様々な実施形態では、持続放出薬物送達マトリックスは、ゲル、ペースト様組成物、半固体組成物、および微粒子状組成物からなる群から選択される。
【００１９】
これらのゲル、ペースト様組成物、および半固体組成物は、巨視的処理を通じて機械的に形成され得る。持続放出薬物送達マトリックスの製造の例は、米国第ＵＳ２０１４０３５６４３５号、同第ＵＳ２０１３０１３６７７５号、米国出願第６２／０６０，６４２号、およびＰＣＴ／ＵＳ１５／５４２４９号に提供されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２０】
好ましくは、持続放出薬物送達マトリックスは、凍結乾燥組成物に対して、いずれの化学的変化も生物学的変化も引き起こさない。例えば、持続放出薬物送達マトリックスは、疎水性または親水性の性質であり得る。
【００２１】
様々な実施形態では、持続放出薬物送達マトリックスは、疎水性マトリックスである。疎水性マトリックスは、ステアリン酸マグネシウム、パルミチン酸マグネシウム、脂肪酸塩、パルミチン酸セチル、脂肪酸塩、植物油、脂肪酸エステル、トコフェロール、およびこれらの組合せからなる群から選択される、１つまたは複数の疎水性賦形剤を含み得る。一実施例において、疎水性マトリックスは、ステアリン酸マグネシウムおよびトコフェロールを含有する。
【００２２】
一部の実施形態では、疎水性マトリックスは、少なくとも疎水性固体構成成分および疎水性液体構成成分を含有する。好適な疎水性固体構成成分の例としては、ワックス、フルーツワックス、カルナウバワックス、ビーズワックス、ワックス様アルコール、植物性ワックス、大豆ワックス、合成ワックス、トリグリセリド、脂質、長鎖脂肪酸（すなわち、ステアリン酸マグネシウム）およびそれらの塩、パルミチン酸マグネシウム、長鎖脂肪酸のエステル、長鎖アルコール（すなわち、パルミチン酸セチルまたはセチルアルコール）、ワックス様アルコール、オキシエチル化（oxethylated）植物油、およびオキシエチル化脂肪アルコールが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、好適な液体疎水性構成成分の例としては、植物油、ヒマシ油、ホホバ油、大豆油、シリコーン油、パラフィン油、および鉱油、クレモフォール、オキシエチル化植物油、オキシエチル化脂肪アルコール、トコフェロール、脂質、ならびにリン脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
凍結乾燥組成物の有効量は、約０．０１〜約５０％（重量／重量）（すなわち、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０％（重量／重量））であり得る。一部の実施形態では、医薬組成物中の凍結乾燥組成物の量は、さらに低くなる（すなわち、２０、１５、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５％（重量／重量））。
【００２４】
当業者であれば、本医薬組成物のいずれにおいても、活性成分（すなわち、セクレトーム）の量が、０．０１％〜１０％（すなわち、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０％）であり得ることを認識し得る。
【００２５】
本凍結乾燥組成物は、粒子状の形態または溶解した状態で、疎水性マトリックス中に分散されていてもよい。
【００２６】
本医薬組成物は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、ヒアルロン酸、ペクチン、アラビアガムおよび他のガム、アルブミン、キトサン、コラーゲン、コラーゲン−ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、フィブリン、フィブリノーゲン、ゼラチン、グロブリン、ポリアミノ酸、アミノ酸を含むポリウレタン、プロラミン、タンパク質ベースのポリマー、ならびにそれらのコポリマーおよび誘導体、またはそれらの混合物からなる群から選択される、少なくとも１つの賦形剤をさらに含有し得る。
【００２７】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、１つまたは複数の固化防止剤を含有し得る。例えば、固化防止剤は、ステアリン酸マグネシウム、パルミチン酸マグネシウム、および他の類似の化合物からなる群から選択される化合物である。
【００２８】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、少なくとも１つのポリマーを含有し得る。ポリマーは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ゼラチン、コラーゲン、アルギネート、デンプン、セルロース、キトサン、カルボキシメチルセルロース、セルロース誘導体、ペクチン、アラビアガム、カラゲナン、ヒアルロン酸、アルブミン、フィブリン、フィブリノーゲン、合成高分子電解質、ポリエチレンイミン、アカシアガム、キサンタンガム、寒天、ポリビニルアルコール、ホウ砂、ポリアクリル酸、硫酸プロタミン、およびカゼインからなる群から選択され得る。
【００２９】
本明細書に記載される組成物のいずれも、脂肪細胞のセクレトームから、治療有効量の再生因子および抗炎症因子を、最大６ヶ月間の期間（すなわち、１、２、３、４、５、または６ヶ月間）、放出する。再生因子または抗炎症性因子の非限定的な例としては、細胞外小胞体（例えばエキソソーム）の内部もしくはその表面に結合しているか、または細胞外小胞体から分離しているかのいずれかである、タンパク質（例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、酵素）、核酸（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））、脂質（例えば、リン脂質）、多糖類、および／またはこれらの組合せが挙げられる。当業者であれば、これらの再生因子または抗炎症因子が、組織再生、血管（例えば、神経血管）修復、または組織再生および血管（例えば、神経血管）修復の両方を刺激するように作用し得ることを認識し得る。
【００３０】
本明細書に記載される組成物のいずれかを生成するために、少なくとも１つのＡＳＣは、１つまたは複数の再生因子または抗炎症因子の発現を増加させる条件下において培養されていてもよい。
【００３１】
本明細書に記載される組成物のいずれかに含まれる全タンパク質は、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１．５ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、または１．５ｍｇ／ｍｌ）であり得る。非限定的な例として、本明細書に開示される方法のうちのいずれかに従って培養されたＡＳＣのセクレトームは、以下のタンパク質：腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６としても公知である）（遺伝子：ＴＮＦＡＩＰ６、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ９８０６６）、メタロプロテイナーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０１０３３）、メタロプロテイナーゼ阻害剤２（ＴＩＭＰ２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ１６０３５）、ＳＰＡＲＣ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０９４８６）、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ１７９３６）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ２２６９２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（ＩＧＦＢＰ６、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ２４５９２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質５（ＩＧＦＢＰ５、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ２４５９３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｑ１６２７０）、血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦＣ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ４９７６７）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２（ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０５１２０）、セルピンＢ６（ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ３５２３７）、抗トロンビンＩＩＩ（ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０１００８）、ＰＡＩ１としても公知であるプラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０５１２１）、膠細胞由来ネキシン（ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０７０９３）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦとしても公知である（ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ３６９５５）、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤（ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０５１５５）、セルピンＨ１（ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ５０４５４）、ＣＤ８１抗原（ＣＤ８１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ６００３３）、ＣＤ６３抗原（ＣＤ６３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０８９６２）、組織因子経路阻害剤２（ＴＦＰＩ２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ４８３０７）、７２ｋＤａのＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＭＰ２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０８２５３）、間質コラゲナーゼ（ＭＭＰ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０３９５６）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１４（ＭＭＰ１４、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ５０２８１）、およびガレクチン−１（ＬＧＡＬＳ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０９３８２）のうちの１つまたは複数を含み得る。
【００３２】
図７Ｅは、処理されたＡＳＣ−ＣＭおよびＣＣ−１０１（ヒスチジン緩衝液およびトリス／ＥＤＴＡの両方における）において保存された１００個の豊富なタンパク質を示す。
【００３３】
本明細書に記載される培養方法のうちの任意のもの（例えば、外因的に添加した量のＩＦＮγおよびＴＮＦαの存在下において培養すること）により、以下のサイトカインおよびケモカインのうちの１つまたは複数の発現に２倍またはそれよりも大きい（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、またはそれよりも大きい）変化がもたらされ得る：成長制御アルファタンパク質（ＣＸＣＬ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０９３４１）、インターロイキン−６（ＩＬ６、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０５２３１）、インターロイキン−８（ＩＬ−８、ＣＸＣＬ８、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ１０１４５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２（ＣＣＬ２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ１３５００）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン８（ＣＣＬ８、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ８００７５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン５（ＣＣＬ５、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ１３５０１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｐ０２７７８）、または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号：Ｏ００３００）。（図７Ａおよび７Ｂを参照されたい）。
【００３４】
ＧＲＯ／ＣＸＣＬＩは、内皮細胞に対するＡＳＣの刺激効果を媒介することが示されている。（Zhangら、Nature  Communications、７巻、１１６７４頁（２０１６年）を参照されたい）。
【００３５】
ＭＳＣ条件培地は、ＭＳＣ由来のＣＣＬ２を介してＳＴＡＴ３のリン酸化を抑制することによって、ＥＡＥ由来のＣＤ４  Ｔ細胞活性化を阻害し、さらなる分析により、この効果が、ＭＳＣにより作動されるマトリックスメタロプロテイナーゼによるＣＣＬ２のアンタゴニスト性誘導体へのタンパク質分解処理に依存することが実証されている。（Rafeiら、J.  Immunol.、１８２巻、５９９４〜６００２頁（２００９年）を参照されたい）。
【００３６】
本明細書に開示される方法のうちのいずれかに従って培養されたＡＳＣは、１つまたは複数の細胞外小胞体（ＥＶ）を発現し得る。例えば、細胞外小胞体は、エキソソーム、微小胞体、膜粒子、膜小胞体、エキソソーム様小胞体、エクトソーム様小胞体、エクトソーム、または外小胞体（exovesicle）であり得る。細胞外小胞体は、パラクリン機序を通じてドナー細胞とレシピエント細胞との間のビヒクルとして作用することにより、細胞間伝達において役割を果たす可能性が高い。
【００３７】
エキソソームは、通常、その表面に、通常、テトラスパニン、インテグリン、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ抗原、ＣＤ抗原、ならびに細胞接着分子を発現する。エキソソームは、様々なクラスリン、ＧＴＰａｓｅ、細胞骨格タンパク質、シャペロン、および代謝酵素を含有する（細胞質プロファイルを除外するために、リソソームまたはミトコンドリアＥＲタンパク質は含めない）。これらはまた、ｍＲＮＡスプライシング因子および翻訳因子を含有する。本明細書に記載される凍結乾燥前（ＡＳＣ−ＣＭ）および凍結乾燥後（ＣＣ−１０１）の組成物は、推定上のエキソソーム構成要素のオンラインデータベースであるＥｘｏＣａｒｔａに集約されている多数の例示的なタンパク質を含有する（図７Ｃ）。さらに、ＡＳＣ−ＣＭ／ＣＣ−１０１プロテオームの機能的エンリッチメント分析により、遺伝子オントロジークラス「細胞外エキソソーム」（ＧＯ：００７００６２）におけるタンパク質の統計学的に有意な過剰な出現が示されている（図７Ｄ）。
【００３８】
本明細書に記載される組成物のいずれも、調整可能な抵抗パルスセンシングによって決定すると、３０ｎｍ〜１０００ｎｍ（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、もしくは１０００ｎｍ）、または３０〜５００ｎｍ、または３０〜３００ｎｍの、１×１０８〜９×１０１１個（すなわち、１×１０８個、２×１０８個、３×１０８個、４×１０８個、５×１０８個、６×１０８個、７×１０８個、８×１０８個、９×１０８個、１×１０９個、２×１０９個、３×１０９個、４×１０９個、５×１０９個、６×１０９個、７×１０９個、８×１０９個、９×１０９個、１×１０１０個、２×１０１０個、３×１０１０個、４×１０１０個、５×１０１０個、６×１０１０個、７×１０１０個、８×１０１０個、９×１０１０個、１×１０１１個、２×１０１１個、３×１０１１個、４×１０１１個、５×１０１１個、６×１０１１個、７×１０１１個、８×１０１１個、９×１０１１個、１×１０１１個、２×１０１１個、３×１０１１個、４×１０１１個、５×１０１１個、６×１０１１個、７×１０１１個、８×１０１１個、９×１０１１個）の細胞外小胞体を含有し得る。本明細書に記載される細胞外小胞体は、１つまたは複数の古典的なエキソソームマーカーを含有し得る。非限定的な例として、古典的なエキソソームマーカーは、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ８２、および／またはＣＤ３７から任意選択で選択される１つまたは複数のテトラスパニンであり得る。代替として（または追加として）、エキソソームマーカーは、１４−３−３であり得る。
【００３９】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物、動物、および一部のウイルスにおいて見出される、保存された短い（およそ２２ヌクレオチドの）一本鎖ＲＮＡ分子のファミリーである。ｍｉＲＮＡは、転写後の遺伝子発現レベルを制御するように機能する。ｍｉＲＮＡは、細胞内および細胞外環境（生物学的流体および細胞培養培地など）の両方において、見出され得る。マイクロＲＮＡは、エキソソームなどの細胞外小胞体の推定上のカーゴである。マイクロＲＮＡは、例えば、発生、分化、恒常性、代謝、成長、増殖、およびアポトーシスを含む、様々なプロセスにおいて役割を果たし得る。（Landskroner-Eigerら、Cold  Spring  Harb  Perspect  Med、３巻、ａ０６６４３（２０１３年）を参照されたい）。
【００４０】
非限定的な例として、本明細書に開示される方法のうちのいずれかに従って培養されたＡＳＣのセクレトームは、代替または追加として、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１／２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−２６から選択される１つまたは複数の前駆ｍｉＲＮＡまたは成熟ｍｉＲＮＡを含む。
【００４１】
ｍｉＲ−２２１／２２２は、血管新生促進ｃ−ＫＩＴを標的とすることが示されている。このｍｉＲＮＡの過剰発現により、幹細胞因子（ＳＣＦ）に応答した内皮管の形成、遊走、および創傷治癒が低減される。（Landskroner-Eigerら、表１を参照されたい）。
【００４２】
ｍｉＲ−１９９は、広範な細胞機序および発生機序に関与している。これらとしては、がんの発生および進行、心筋細胞の保護、ならびに／または骨格筋の形成が挙げられる。ｍｉＲ−１９９はまた、血管新生プロセスも制御し得る。（Daiら、Int  J  Clin  Pathol.、８巻（５号）、４７３５〜４７４４頁（２０１５年）、Heら、PloS  One、８巻（２号）、ｅ５６６４７（２０１３年）を参照されたい）。
【００４３】
ｍｉＲ−２２は、腫瘍抑制因子として機能し得る。ｍｉＲ−２２の公知の標的としては、ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）およびＭｙｃ結合タンパク質（ＭＹＣＢＰ）が挙げられる。ｍｉＲ−２２は、ＡＫＴ３を標的とすることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生を阻害し得る。（Zhengら、Cell  Physiol  Biochem、３４巻（５号）、１５４７〜１５５５頁（２０１４年）を参照されたい）。
【００４４】
ｍｉＲ−１６は、細胞分化に関与し得る。ｍｉＲ−１６は、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを標的とし、血管新生を抑制することができる。（Leeら、PloS  One、８巻（１２号）、ｅ８４２５６（２０１３年）を参照されたい）。
【００４５】
ｍｉＲ−２６の発現は、低酸素症に応答して誘導され、平滑筋細胞（ＳＭＣ）分化および神経発生の際に上方制御される。ｍｉＲ−２６の発現はまた、ある特定の悪性腫瘍（例えば、肝細胞癌腫、鼻咽頭癌腫、肺がん、および乳がん）において下方制御され、一部のがん（例えば、高度グリオーマ、胆管癌、下垂体腫瘍、および膀胱がん）において過剰発現される。ｍｉＲ−２６はまた、様々な標的を通じて血管新生を制御する。（Chaiら、PloS  One、８巻（１０号）、ｅ７７９５７（２０１３年）、Icliら、Circ  Res、１１３巻（１１号）、１２３１〜１２４１頁（２０１３年）を参照されたい）。
【００４６】
本明細書に記載される医薬組成物のうちのいずれかを含有し、ヒトまたは哺乳動物の眼に注射するのに好適なサイズおよび形状を有する、剤形もまた、提供される。例えば、医薬組成物は、２９ゲージの針を通じて、懸濁液として、眼に注射され得る。
【００４７】
一実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、投与の前に、微粒子化され得る。一般に、「微粒子化される」という用語は、固体材料の粒子の平均直径を低減させるプロセスを行ったものとして定義される。所望される結果を達成するために、任意の好適な微粒子化技法を、使用することができる。別の実施形態では、本明細書に記載される凍結乾燥組成物を含む持続放出薬物送達組成物は、微粒子状の形態にある。任意の他の好適な剤形および／または投与形態もまた、使用され得る。
【００４８】
有効量の、本明細書に記載される凍結乾燥組成物および／または医薬組成物のうちのいずれかを、患者に投与することによって、患者における眼科障害を処置する方法もまた、提供される。患者における眼科障害の処置において使用するための、本明細書に記載される凍結乾燥組成物および／または医薬組成物が、さらに提供される。凍結乾燥組成物および／または医薬組成物は、有効量で、患者に投与するためのものである。例えば、眼科障害は、網膜の血管および／または神経機能に影響を及ぼす炎症性疾患および／または変性疾患、例えば、滲出型および萎縮型ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、点状脈絡膜内層症、網膜分枝静脈閉塞症、虹彩炎、ブドウ膜炎、眼内炎、視神経症、緑内障、シュタルガルト病、網膜剥離、網膜色素変性、若年網膜隔離症、老年性網膜隔離症、角膜幹細胞疲弊症（limbal  stem  cell  deficiency）、角膜表面疾患、外傷性角膜損傷、外傷性脳損傷、外傷性眼損傷、視覚および／または網膜に影響を及ぼす外傷性脳損傷の処置である。
【００４９】
一実施形態では、有効量の、本明細書に記載される医薬組成物のいずれかは、滲出型および萎縮型ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、点状脈絡膜内層症、網膜分枝静脈閉塞症、虹彩炎、ブドウ膜炎、眼内炎、視神経症、緑内障、シュタルガルト病、網膜剥離、網膜色素変性、若年網膜隔離症、老年性網膜隔離症、角膜幹細胞疲弊症、角膜表面疾患、角膜への損傷を含む外傷性眼損傷、外傷性脳損傷、視覚および／または網膜に影響を及ぼす外傷性脳損傷から選択される、血管および／または神経機能に影響を及ぼす炎症性眼科疾患および／または変性眼科疾患を処置するために、患者に投与される。
【００５０】
異なる実施形態では、有効量の、本明細書に記載される凍結乾燥組成物のうちのいずれかは、滲出型および萎縮型ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、点状脈絡膜内層症、網膜分枝静脈閉塞症、虹彩炎、ブドウ膜炎、視神経炎、緑内障、シュタルガルト病、網膜剥離、網膜色素変性、若年網膜隔離症、老年性網膜隔離症、角膜幹細胞疲弊症、角膜表面疾患、角膜への損傷を含む外傷性眼損傷、外傷性脳損傷、視覚および／または網膜に影響を及ぼす外傷性脳損傷から選択される、血管および／または神経機能に影響を及ぼす炎症性眼科疾患および／または変性眼科疾患を処置するために、患者に投与される。
【００５１】
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、本医薬組成物および／または凍結乾燥組成物は、少なくとも２〜６ヶ月ごと（すなわち、少なくとも２、３、４、５、または６ヶ月ごと）に投与される。
【００５２】
本医薬組成物および／または凍結乾燥組成物は、患者の眼に局所的に投与され得るか、または注射によって（例えば、眼内注射によって）投与され得る。例えば、本医薬組成物または凍結乾燥組成物は、例えば、２９ゲージの針を通じて、眼の硝子体腔に注射される、結膜下に注射される、テノン嚢下に注射される（例えば、Weissら、Neural  Regen  Res、１０巻（６号）、９８２〜９８８頁（２０１５年）を参照されたい）、眼球後に注射される、および／または網膜内に注射される。
【００５３】
当業者であれば、本医薬組成物または凍結乾燥組成物から放出される抗炎症因子および再生因子は、患者において生物学的機能を発揮し得ることを認識し得る。非限定的な例として、これらの再生因子は、周皮細胞、内皮細胞、神経節細胞、および星状細胞の保護および／もしくはそれらの再成長の刺激、ならびに／または神経膠活性化の減少を行うことができる。代替として（または追加として）、再生因子は、血管透過性を減少させるか、異常な血管成長を減少させるか、網膜厚を改善するか、神経血管組織への損傷を低減させるか、神経膠症を低減させるか、網膜機能を改善もしくは保護するか、神経機能を改善もしくは保護するか、視覚を改善もしくは保護するか、またはこれらの任意の組合せを行うことができる。
【００５４】
一実施形態では、本医薬品は、０．５〜１ｍｌの凍結乾燥組成物（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１ｍｌ）および持続放出薬物送達マトリックスを含有する。例えば、本医薬組成物は、硝子体内注射のために、懸濁液中に微粒子化される。
【００５５】
本明細書に記載される凍結乾燥組成物の作製を、ａ）脂肪組織を酵素消化して、脂肪細胞の集団を得ることであって、脂肪細胞の集団が、少なくとも１つの脂肪幹細胞（ＡＳＣ）を含むこと、ｂ）脂肪細胞を、２〜４×１０５個の細胞／ｃｍ２の播種密度で、第１の培養培地において培養すること、ｃ）細胞を、少なくとも１回（例えば、２、３、４、または６回）、第１の培養培地において継代すること、ｄ）１つまたは複数の周皮細胞マーカーの少なくとも９０％（すなわち、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）の発現を有する細胞を選択すること、ｅ）選択した細胞を、第２の培養培地において培養することであって、第２の培養培地が、血清不含であり、少なくとも１つの炎症性サイトカインを含む、培養すること、ｆ）選択した細胞を、炎症性サイトカインを含有しない基礎培養培地中に移すこと、ｇ）細胞を、基礎培養培地から除去して、脂肪細胞のセクレトームを含む細胞不含の条件培地を生産すること、およびｈ）条件培地を凍結乾燥させること、によって行う、方法もまた、提供される。
【００５６】
例えば、脂肪組織は、コラゲナーゼによって消化され得る。
【００５７】
当業者であれば、１つまたは複数の周皮細胞マーカーが、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４６、および／または神経／神経膠抗原２（ＮＧ２）から選択され得ることを認識し得る。同様に、当業者であれば、古典的ＭＳＣマーカーには、ＣＤ７３、ＣＤ９０、および／またはＣＤ１０５が含まれ得ることを認識し得る。
【００５８】
一実施形態では、第２の血清不含培養培地は、約１０〜約３０ｎｇ／ｍｌ（すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｎｇ／ｍｌ）のＴＮＦα、約１〜約２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｇ／ｍｌ）、またはこれらの組合せを含有する。
【００５９】
本明細書に記載される培養手法のいずれも（すなわち、ＴＮＦαおよび／またはＩＦＮγの存在下において血清不含培地中で培養すること）、脂肪幹細胞のセクレトーム中に存在するある特定の増殖因子、サイトカイン、および／または他のタンパク質の量を相乗的に増加させることができる。
【００６０】
メタロプロテイナーゼの組織阻害剤であるメタロプロテイナーゼ阻害剤１（「ＴＩＭＰ１」）は、生物の複数の組織に発現されることが公知の糖タンパク質であり、広範な細胞型において細胞増殖を促進することも示されている。これは、抗アポトーシス機能も呈し得る。
【００６１】
腫瘍壊死因子誘導遺伝子タンパク質（「ＴＳＧ−６」）は、眼科疾患動物モデルにおいて関係付けられている、強力な抗炎症性タンパク質である。例えば、ＴＳＧ−６は、小膠細胞の炎症応答を阻害することが示されている。
【００６２】
細胞を、少なくとも１つの炎症性サイトカインを含有する第２の血清不含培養培地において培養することにより、細胞によるＴＩＭＰ１の発現が増加する。例えば、ＴＩＭＰ１の発現は、少なくとも２、３、４、５、６、７倍、またはそれよりも多く増加し得る。（以下の実施例１を参照されたい）。
【００６３】
細胞を、少なくとも１つの炎症性サイトカインを含有する第２の血清不含培養培地において培養することによって、細胞によるＴＳＧ−６の発現もまた増加する。例えば、ＴＳＧ−６の発現は、少なくとも２、３、４、５、６、７倍、またはそれよりも多く増加する。
【００６４】
これらの方法において、細胞を、１つまたは複数の炎症性サイトカインの存在下において培養することにより、追加として、凍結乾燥組成物のＴ細胞活性（増加）が減少する。例えば、凍結乾燥組成物のＴ細胞活性は、少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、またはそれ未満に減少する。
【００６５】
一部の実施形態では、細胞は、２４時間後に、第２の血清不含培養培地から除去される。
【００６６】
第１の培養培地中の細胞は、２、３、４、または５回継代される。
【００６７】
細胞不含条件培地の効果的な接線流濾過は、有効量のＥＤＴＡを条件培地に添加することによって達成され得る。一部の実施形態では、条件培地は、凍結乾燥の前に濃縮される。例えば、これは、条件培地を、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して、約５ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣ）で濾過することによって、達成することができる。
【００６８】
特定の接線流濾過プロトコールの使用（例えば、以下の実施例１を参照されたい）、濾過の前のＡＳＣ条件培地への有効量のＥＤＴＡ（例えば、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の添加、ならびに特定のフィルターカットオフ（例えば、５ｋＤａ）を組み合わせることにより、エキソソームなどの細胞外小胞体の内部もしくはその表面に結合しているか、または細胞外小胞体とから分離しているかにかかわらず、ＡＳＣ分泌タンパク質、核酸、脂質、および／または多糖類のほぼすべてを保存し濃縮するために、条件培地を処理することが可能となる。加えて、この組合せにより、細胞培養培地に見出される小分子およびペプチドも除去される。合わせると、この組合せにより、可溶性タンパク質画分およびエキソソーム画分の治療的構成成分を保持する組成物がもたらされる。同様に、結果として得られるセクレトーム組成物は、注射された細胞の大半が注射後に排除される、幹細胞療法よりも優れている。（図１３を参照されたい）。
【００６９】
さらなる実施形態では、ＴＦＦ濾過後に、条件培地は、凍結乾燥の前に、トリスＥＤＴＡ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、グリセリン緩衝液、リン酸緩衝液、トリスＨＣｌ緩衝液、クエン酸緩衝液、またはこれらの組合せに透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）される。別の実施例では、条件培地は、所定の分子量カットオフ（ＭＷＣまたはＷＭＣＯ）で、遠心分離フィルターを通して濃縮され得る。当業者であれば、当該技術分野において公知の任意の他の好適な方法を、凍結乾燥の前に条件培地を濃縮するために使用することができることを認識し得る。
【００７０】
有効量の凍結乾燥組成物を、持続放出薬物送達マトリックスと混合して、ゲル、ペースト様、半固体、または微粒子状の形態の薬物組成物を形成することによって、本明細書に記載される医薬組成物を作製する方法もまた、提供される。例えば、凍結乾燥組成物は、持続放出薬物送達マトリックス中に再構成されていてもよい。代替として、凍結乾燥組成物は、持続放出薬物送達マトリックスと混合する前に、再構成されていてもよい。
【００７１】
当業者であれば、ゲル、ペースト様、半固体、または微粒子状の形態の医薬組成物またはそれらの任意の組合せを形成することが、持続放出薬物送達マトリックスと凍結乾燥組成物との混合物を、アルゴリズム様式で、プレスし、フォールディングするサイクルを繰り返すことによって、達成され得ることを認識し得る。プレスは、１０６Ｎ．ｍ−２を上回らない圧力を適用することによって達成され得る。追加として、持続放出薬物送達マトリックス中の疎水性マトリックスは、混合の間中、非溶融状態に保持され得る。
【００７２】
これらの方法は、追加として、医薬組成物を好適な剤形（例えば、眼内注射に好適な剤形）に形成するステップを伴い得る。
【００７３】
本明細書に記載される態様および実施形態のいずれも、以下の特定の非限定的な本発明の実施例／実施形態を含め、本明細書において発明の概要、図面、および／または発明を実施するための形態に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。
【００７４】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本出願が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において、単数形は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形も含む。
【００７５】
本明細書に記載されるものに類似またはそれと同等の方法および材料を、本出願の実施および試験において使用することができるが、好適な方法および材料が、以下に記載されている。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照により組み込まれる。
【００７６】
本明細書において引用される参考文献は、特許請求される本出願に対する先行技術であることを認めるものではない。矛盾が生じた場合には、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
【００７７】
本出願の他の特色および利点は、実施例と併せて、以下の詳細な説明から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、１人のヒトドナーに由来するＡＳＣのフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【００７９】
【図２Ａ】図２Ａは、実施例１において詳述されるプロセス開発実行の接線流濾過および透析濾過後の効果的なセクレトーム回収および精製を実証する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／濾過の結果を示す。
【００８０】
【図２Ｂ−１】図２Ｂは、ＣＣ−１０１が、エキソソームおよび非エキソソームの両方の関連タンパク質を含有することを示す。パネルＡは、１００ｋＤａの分子量カットオフでの濾過前および濾過後のＣＣ−１０１に、類似の豊富さのサイトカインが存在することを示す、抗体アレイのスポットの強度の定量化を示す。パネルＢは、保持液（retentate）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析を示す。エキソソームに組み込まれたタンパク質である１４−３−３、およびエキソソームの脂質膜に組み込まれたテトラスパニンであるＣＤ６３が、保持液に富化されている。
【図２Ｂ−２】図２Ｂは、ＣＣ−１０１が、エキソソームおよび非エキソソームの両方の関連タンパク質を含有することを示す。パネルＡは、１００ｋＤａの分子量カットオフでの濾過前および濾過後のＣＣ−１０１に、類似の豊富さのサイトカインが存在することを示す、抗体アレイのスポットの強度の定量化を示す。パネルＢは、保持液（retentate）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析を示す。エキソソームに組み込まれたタンパク質である１４−３−３、およびエキソソームの脂質膜に組み込まれたテトラスパニンであるＣＤ６３が、保持液に富化されている。
【００８１】
【図３Ａ】図３Ａは、ヒスチジン（ＨＩＳ）緩衝液およびトリス／ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液の両方における凍結乾燥物の物理的検査の結果を示す。
【００８２】
【図３Ｂ】図３Ｂは、凍結乾燥前および凍結乾燥後に存在し、保存されている、タンパク質の例を示す。
【００８３】
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、凍結乾燥前および凍結乾燥後のＴＥ試料およびＨＩＳ試料の、４℃で７日間の生成物安定性データを示す。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、凍結乾燥前および凍結乾燥後のＴＥ試料およびＨＩＳ試料の、４℃で７日間の生成物安定性データを示す。
【００８４】
【図４Ｃ】図４Ｃは、凍結乾燥後のＴＥ試料の生成物安定性を示す。凍結乾燥ＣＣ１０１を、室温、４℃、または−８０℃で、２１日間保管した。インキュベーション後に、試料を、１ｍＬのＨ２Ｏ中に溶解した。全タンパク質およびマイクロＲＮＡの濃度を、それぞれ、Ｑｕｂｉｔタンパク質アッセイおよびＱｕｂｉｔマイクロＲＮＡキットを使用して、３連で測定した。
【００８５】
【図５】図５は、ＤＮＡ除去／Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ分析の結果を示す。
【００８６】
【図６Ａ】図６Ａは、ＣＣ−１０１が、刺激末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内の刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して免疫抑制効果を有することを示す。
【００８７】
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＣＣ−１０１が、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激末梢血単核細胞に対する免疫抑制効果を有することを示す。
【００８８】
【図７Ａ−１】図７Ａは、ＩＦＮγ／ＴＮＦαによるＡＳＣの予備刺激により、ＡＳＣ−ＣＭ中のサイトカインおよびケモカインの豊富さが増加することを示す。７Ａ（パネルＡ）は、未処置またはＩＦＮγおよびＴＮＦαで処置した細胞に由来するＡＳＣ−ＣＭからの多数のサイトカイン／ケモカインの発現レベルを比較する、代表的な膜に基づく抗体アレイを示す。培養培地を、非特異的なバックグラウンドシグナルの対照として使用した。７Ａ（パネルＢ）は、抗体アレイによって分析した未処置細胞またはＩＦＮγ／ＴＮＦα処置細胞由来のＡＳＣ−ＣＭの３つの試料からの選択されたサイトカイン発現の定量化を示す。ＩＦＮγ／ＴＮＦα刺激に応答した倍数変化をより良好に例示するために、このデータは、バックグラウンドが差し引かれており、未処置細胞からのベースラインのサイトカイン発現に対して正規化したものであることに留意されたい。
【図７Ａ−２】図７Ａは、ＩＦＮγ／ＴＮＦαによるＡＳＣの予備刺激により、ＡＳＣ−ＣＭ中のサイトカインおよびケモカインの豊富さが増加することを示す。７Ａ（パネルＡ）は、未処置またはＩＦＮγおよびＴＮＦαで処置した細胞に由来するＡＳＣ−ＣＭからの多数のサイトカイン／ケモカインの発現レベルを比較する、代表的な膜に基づく抗体アレイを示す。培養培地を、非特異的なバックグラウンドシグナルの対照として使用した。７Ａ（パネルＢ）は、抗体アレイによって分析した未処置細胞またはＩＦＮγ／ＴＮＦα処置細胞由来のＡＳＣ−ＣＭの３つの試料からの選択されたサイトカイン発現の定量化を示す。ＩＦＮγ／ＴＮＦα刺激に応答した倍数変化をより良好に例示するために、このデータは、バックグラウンドが差し引かれており、未処置細胞からのベースラインのサイトカイン発現に対して正規化したものであることに留意されたい。
【００８９】
【図７Ｂ】図７Ｂは、細胞を、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを含有する第２の血清不含培養培地において培養することが、ＡＳＣ−ＣＭ中の一部のタンパク質の発現に対して相加効果および相乗効果を有することを示す。ＡＳＣを、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ、または未処置で刺激した。サイトカインを洗い流した２４時間後に、ＡＳＣ−ＣＭを収集し、タンパク質組成を、標識なしのショットガンプロテオミクスによって分析した。
【００９０】
【図７Ｃ】図７Ｃおよび７Ｄは、ショットガンプロテオミクスおよびバイオインフォマティクス分析により、ＡＳＣ−ＣＭ（ＣＣ−１０１）中のエキソソームタンパク質の豊富さが明らかとなることを示す。
【図７Ｄ】図７Ｃおよび７Ｄは、ショットガンプロテオミクスおよびバイオインフォマティクス分析により、ＡＳＣ−ＣＭ（ＣＣ−１０１）中のエキソソームタンパク質の豊富さが明らかとなることを示す。
【００９１】
【図７Ｅ】図７Ｅは、ＬＣ−ＭＳショットガンプロテオミクスによって識別された、ヒスチジン緩衝液およびトリス緩衝液の両方に処方されたＡＳＣ−ＣＭ（凍結乾燥前）、ならびにそれらの凍結乾燥形態（ＣＣ−１０１）において識別された、１００個の多量のタンパク質を示す。ＮＳＡＦ×１０５の値を、ヒートマップとして表す。
【００９２】
【図７Ｆ】図７Ｆは、ＡＳＣによって放出されるパラクリン因子が、凍結乾燥手順によって影響を受けないことを実証する、ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００９３】
【図８】図８は、細胞を、外因的に添加したＴＮＦα、またはＩＦＮγおよびＴＮＦαを有する第２の血清不含培養培地において培養することにより、最終生成物中のＴＳＧ−６発現量が増加することを示す。
【００９４】
【図９Ａ】図９Ａは、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液でのＣＣ−１０１における細胞外小胞体の濃度およびサイズの分布を示す。
【００９５】
【図９Ｂ】図９Ｂは、ヒスチジン緩衝液でのＣＣ−１０１における細胞外小胞体の濃度およびサイズの分布を示す。
【００９６】
【図１０−１】図１０は、持続放出薬物送達マトリックスからの凍結乾燥組成物の放出を示す。
【図１０−２】図１０は、持続放出薬物送達マトリックスからの凍結乾燥組成物の放出を示す。
【００９７】
【図１１】図１１は、ＰＢＳ中に再懸濁した凍結乾燥組成物が、脳への５０ｐｓｉの爆風による外傷性脳損傷後のマウスにおいて、視力を改善することを示す。
【００９８】
【図１２】図１２は、ＰＢＳ中に再懸濁した凍結乾燥組成物が、脳への５０ｐｓｉの爆風による外傷性脳損傷後のマウスにおいて、視覚コントラスト感度を改善することを示す。
【００９９】
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＰＢＳ中に再懸濁した凍結乾燥組成物（ＣＣ−１０１）が、脳への５０ｐｓｉの爆風による外傷性脳損傷後のマウスにおいて、硝子体内注射したときに、網膜色素上皮の過増殖および血管漏出から保護することを実証する、一連の写真である。同様の結果が、ＣＣ−１０１群の８匹の動物で得られた。
【０１００】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＰＢＳ中に再懸濁した凍結乾燥組成物（ＣＣ−１０１）により、ＯＮＨと鋸状縁との中間の領域において、網膜ＧＦＡＰレベルが低減されることを示す。左側に示されている顕微鏡写真によるＧＦＡＰ染色の定量化は、ＧＦＡＰ蛍光の有意な低減を示す。同様の結果が、ＣＣ−１０１群の４匹の動物で得られた。
【０１０１】
【図１４】図１４は、凍結乾燥組成物が、０日目（６４μｇ／ｍｌ全タンパク質）および２９日目（１２８μｇ／ｍｌ全タンパク質）における硝子体内投薬後に、非免疫原性であり、非ヒト霊長類において十分に寛容されることを示す。
【０１０２】
【図１５】図１５は、ＣＣ−１０１が、傍細胞漏出アッセイにおいて、血管透過性から保護することを示す。
【０１０３】
【図１６−１】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−２】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−３】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−４】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−５】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−６】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−７】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−８】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−９】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１０】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１１】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１２】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１３】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１４】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１５】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１６】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１７】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１８】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１９】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−２０】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−２１】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−２２】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−２３】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−２４】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−２５】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−２６】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−２７】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−２８】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−２９】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−３０】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−３１】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−３２】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−３３】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−３４】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−３５】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−３６】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−３７】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−３８】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−３９】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−４０】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−４１】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−４２】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−４３】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−４４】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−４５】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−４６】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−４７】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−４８】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−４９】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−５０】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−５１】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−５２】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−５３】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−５４】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−５５】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−５６】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−５７】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−５８】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−５９】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−６０】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−６１】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−６２】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−６３】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−６４】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−６５】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−６６】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−６７】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−６８】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−６９】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−７０】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−７１】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−７２】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−７３】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−７４】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−７５】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−７６】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−７７】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−７８】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−７９】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−８０】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−８１】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−８２】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−８３】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−８４】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−８５】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−８６】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−８７】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−８８】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−８９】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−９０】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−９１】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−９２】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−９３】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−９４】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−９５】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−９６】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−９７】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−９８】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−９９】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１００】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１０１】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１０２】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１０３】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１０４】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１０５】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１０６】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【図１６−１０７】図１６は、ショットガンプロテオミクスによって決定された、凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１に共通するタンパク質を示す。
【０１０４】
【図１７−１】図１７は、濾過前のＡＳＣ−ＣＭから沈殿させたエキソソームのＲＮＡ次世代シーケンシングにより識別された、上位のｍｉＲＮＡの一覧である。
【図１７−２】図１７は、濾過前のＡＳＣ−ＣＭから沈殿させたエキソソームのＲＮＡ次世代シーケンシングにより識別された、上位のｍｉＲＮＡの一覧である。
【図１７−３】図１７は、濾過前のＡＳＣ−ＣＭから沈殿させたエキソソームのＲＮＡ次世代シーケンシングにより識別された、上位のｍｉＲＮＡの一覧である。
【図１７−４】図１７は、濾過前のＡＳＣ−ＣＭから沈殿させたエキソソームのＲＮＡ次世代シーケンシングにより識別された、上位のｍｉＲＮＡの一覧である。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において使用されるとき、「処置」、「処置する」、または「処置すること」などの用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、および霊長類など）のあらゆる処置を包含し、疾患または状態に罹患しやすいが、まだそれを有するとは診断されていない対象において、疾患または状態が発症するのを予防することを含む。この用語はまた、疾患または状態を阻害すること（その発症を停止させること）、緩和もしくは寛解すること（その後退を引き起こすこと）、または治癒すること（発症もしくは進行を恒久的に止めること）を含む。
【０１０６】
本明細書において使用されるとき、「１つの（a）」または「１つの（an）」という用語は、１つもしくは複数、または少なくとも１つを意味する。
【０１０７】
本明細書において使用されるとき、「約」という用語は、記載された値の±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％を指す。
【０１０８】
本明細書において使用されるとき、組成物の「治療有効」投薬量もしくは量または「有効」投薬量もしくは量は、所与の医学的状態に対して肯定的な作用を有するのに十分な量である。即座でないとすれば、治療有効投薬量もしくは量または有効投薬量もしくは量は、長期間にわたり、患者の健康状態および満足感に対して認識可能または測定可能な作用をもたらし得る。
【０１０９】
本明細書において使用されるとき、「脂肪組織」という語句は、脂肪細胞（fat  cell）（脂肪細胞（adipocyte））を含む結合組織を指す。
【０１１０】
本明細書において使用されるとき、「医薬組成物」は、持続放出薬物送達マトリックスと組み合わせた、有効量の本明細書に記載される凍結乾燥組成物を指す。本医薬組成物は、任意選択で、対象への化合物の投与を容易にし得る、薬学的に好適な担体および賦形剤などの他の構成成分を含有し得る。
【０１１１】
「薬学的に許容される担体」という用語は、対象に対して有意な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性および特性をなくすことがない、担体または希釈剤を指す。
【０１１２】
「賦形剤」という用語は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される、不活性物質を指す。
【０１１３】
本明細書において使用されるとき、「混合する」、「混合すること」などの用語は、構成成分の機械的プロセスまたは機械的処置を意味する。例えば、混合することは、提供される疎水性マトリックスの強い圧縮および混合をもたらす、プレスおよびフォールディングのステップまたは相当する処理ステップを繰り返すサイクルを行う意味であり得る。
幹細胞
【０１１４】
成体幹細胞は、骨髄、脂肪、および歯髄組織を含む、様々な成体組織から採取することができる。すべての成体幹細胞は、自己再生が可能であり、複能性であると考えられるが、成体幹細胞の治療的機能は、それらの起源に応じて変動する。結果として、成体幹細胞のそれぞれの種類は、固有の特徴を有し、それによって、ある特定の疾患に好適となっている。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄および脂肪組織を含む、様々な成体組織から単離された（それらに由来する）、複能性の非造血系（非血液）幹細胞である。本明細書において使用されるとき、「単離された」とは、細胞が、それらの元の環境から取り出されていることを指す。ＭＳＣは、中胚葉系統の細胞、例えば、脂肪細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞に分化し得る。
【０１１５】
幹細胞は、複数の生物学的プロセスを制御するか、またはそれらの制御にとって重要である、因子、例えば、増殖因子を生産する。増殖因子は、細胞の成長および／もしくは増殖、ならびに／または細胞の分化を刺激することができる作用物質、例えば、天然に存在する物質である。典型的に、増殖因子は、タンパク質またはステロイドホルモンである。「増殖因子」および「因子」などの用語は、本明細書において互換可能に使用される一方で、「生物学的因子」という用語は、増殖因子に限定されない。
【０１１６】
成体脂肪組織から採取され、骨髄幹細胞と比較して高頻度に存在する、脂肪幹細胞（本明細書において「ＡＳＣ」および「ＡＤＳＣ」と互換可能に称される）は、血管疾患の処置および軟組織修復に最も適しており、骨髄幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）は、炎症および筋損傷の処置に最も適しており、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）は、神経保護に最も適している。
【０１１７】
当業者であれば、ＡＳＣは、多数の臨床上の利点を有し、広範な臨床使用の可能性を提供するため、ＡＳＣが、炎症および／または変性眼科疾患を処置するための良好な候補であることを認識し得る。ＡＳＣは、議論を招くことのない組織源から得られ、多数の異なる変性疾患に適用可能であり、抗炎症性で免疫特権を有し、骨、軟骨、脂肪、筋肉、心臓、血管、および神経組織型に分化することができ、患者における先天的な再生経路を活性化する。（Stremら、Keio  J  Med、５４巻（３号）、１３２〜４１頁（２００５年）、Traktuevら、Circ.  Res.、１０２巻、７７〜８５頁（２００８年）、およびRajashekhar、Front  Endocrinol  (Lausanne)、５巻、５９頁（２０１４年）を参照されたい）。
【０１１８】
本明細書に記載される組成物および方法において使用するために、セクレトーム採取のために血清不含（ＳＦ）培地に切り替える前に、Ｐ５において、高レベルのＣＤ１４０ｂ、ＮＧ２、および／またはＣＤ１４６周皮細胞タンパク質表面マーカーを発現する拡大されたＡＳＣを有するドナーが、識別され得る。１つの非限定的な実施形態では、ドナーの包含基準には、次のものが含まれる：非喫煙者、女性、年齢が３０歳未満、家族の母親側および父親側が長寿である家系、ならびに／または判明している疾病も慢性疾患の有意な家族歴もないこと。
【０１１９】
ＡＳＣは、周皮細胞と類似の幹細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４６、ＮＧ２、および／または３Ｇ５ガングリオシド抗原）も提示するが、これは、脂肪内の血管構造との関係性に起因する可能性がある。ＡＳＣはまた、新しい血管の再生および形成において重要な役割を果たす。ＡＳＣは、複能性間葉前駆細胞であり、複数のヒト器官（脂肪組織を含む）において微小血管を包囲する周皮細胞と重複する表現型を有するため、これらの細胞は、微小血管支持の提供に直接的な役割を有する。
【０１２０】
ＡＳＣを含む、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ７３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ１０５＋／ＣＤ４４＋（またはこれらの任意の好適なサブセット）の表面マーカープロファイルによって特徴付けられる。（Bourinら、Cytotherapy、１５巻（６号）、６４１〜６４８頁（２０１３年）を参照されたい）。さらに、適切な幹細胞は、単離の時点では、ＣＤ３４＋陽性を提示するが、培養中にこのマーカーは消失される。したがって、本出願に従って使用され得る１つの幹細胞型の完全なマーカープロファイルとしては、ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ７３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ１０５＋が挙げられる。マウス幹細胞を利用する別の実施形態では、幹細胞は、どれが上述のヒト細胞に対するホモログと考えられるかを定義するために、ＣＤ３４ではなくＳｃａ−１マーカーによって特徴付けられ、残りのマーカーは、同じままである。
ＡＳＣ培養条件培地（ＡＳＣ−ＣＭ）
【０１２１】
ＡＳＣによって分泌される生物学的因子（本明細書において、「セクレトーム」、「ＡＳＣ−ＣＭ」とも称される）を含む条件培地（ＣＭ）が、本明細書において提供される。ＡＳＣによって分泌される生物学的因子を含む、接線流濾過によって濾過されている、処理された条件培地（本明細書において、「ＴＦＦ後のＡＳＣ−ＣＭ」または「凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭ」とも称される）、ならびにＡＳＣによって分泌される生物学的因子を含む、接線流濾過によって濾過されている、処理された条件培地を凍結乾燥したもの（本明細書において、「ＣＣ−１０１」、「ＣＣ１０１」とも称される）もまた、提供される。
【０１２２】
条件培地は、幹細胞を、本明細書に記載されるように、培地において培養し、結果として得られた、幹細胞およびそれらにより分泌された幹細胞生成物（セクレトーム）を含有する培地を、条件培地中に分離することによって得られるが、この条件培地は、生物学的因子および分離前に存在していたものよりも少ない幹細胞を含有する。条件培地は、本明細書に記載される方法において使用され得、幹細胞を実質的に含まない（わずかな割合の幹細胞は含有し得る）か、または幹細胞を含まない。条件培地中に存在し得る生物学的因子としては、タンパク質（例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、酵素）、核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）、脂質（例えば、リン脂質）、多糖類、および／またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。これらの生物学的因子の任意の組合せは、細胞外小胞体（例えば、エキソソーム）の内部もしくはその表面に結合しているか、または細胞外小胞体から分離しているかのいずれかであり得る。
【０１２３】
条件培地（およびしたがって幹細胞により分泌された因子）は、処置を受けようとする個体（それを必要とする個体）または別の（ドナー）個体、例えば、若齢および／または健康なドナーから得られた幹細胞から得ることができる。例えば、処置を受けようとする個体から得られたＡＳＣ（自家幹細胞）またはドナーから得られたＡＳＣ（同種異系幹細胞）を使用して、本明細書に記載される条件培地を生産することができる。
【０１２４】
脂肪組織に由来する接着細胞は、当業者に公知の様々な方法によって、単離することができる。例えば、そのような方法は、米国特許第６，１５３，４３２号に記載されており、これは、参照により組み込まれる。脂肪組織は、大網／内臓、乳房、生殖腺、または他の脂肪組織の部位に由来し得る。脂肪組織の１つの好ましい源は、大網脂肪である。ヒトにおいて、脂肪は、典型的に、脂肪吸引によって単離される。例えば、およそ１５０〜３００ｍｌの腹部脂肪組織を、脂肪吸引によって抽出することができる。
【０１２５】
以下の実施例１に概説されるように、脂肪組織消化は、当該技術分野において公知の標準的な組織消化プロトコールに対して軽微な改変を行ったものを使用して、達成される。好ましくは、これらの改変形は、全体的なＰ０におけるＡＳＣの収率を増加させることに役立つものである。
【０１２６】
細胞培養は、標準的な細胞培養プロセスを使用して行われる。適切な細胞培養プロセスの決定は、当該技術分野における日常的な技術レベルの範囲内である。
【０１２７】
Ｐ５において、細胞は、血清不含（ＳＦ）培地に切り替えられる。複数の炎症性因子を、ＳＦ培地の段階で添加して、細胞を２４時間刺激した後、細胞を取り出してすすぎ、その後で、細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）も他の炎症性因子も全くなしに、培養する。ＩＦＮγおよびＴＮＦαを組み合わせて添加することにより、ＴＩＭＰ１の発現が７倍に増加したが、これは、本発明者らの変性血管標的に対するより高い治療的効力と相関性があると考えられる。
【０１２８】
他のサイトカインおよび／または細胞シグナル伝達媒介因子もまた、ＳＦ培養培地に（単独または任意の組合せで）添加され得る。例えば、添加され得るサイトカインおよび／または細胞シグナル伝達媒介因子としては、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、インターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、形質転換増殖因子−ｂ（ＴＧＦ−ｂ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、一酸化窒素（ＮＯドナー分子を介して）、および／または過酸化水素を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１２９】
一実施形態では、ＡＳＣ−ＣＭを１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に急速に移すことがある。ＥＤＴＡの添加は、完全性の維持ならびにＡＳＣ−ＣＭ中に存在する数千個ものタンパク質およびｍｉＲＮＡの濾過の間の分離のために重要である。
【０１３０】
細胞を、少なくとも１つの炎症性サイトカインを含有する第２の血清不含培養培地において培養することによっても、細胞によるＴＳＧ−６の発現が増加する。例えば、ＴＳＧ−６の発現は、少なくとも２、３、４、５、６、７倍、またはそれよりも多く増加する。（図８を参照されたい）。
【０１３１】
次に、ＡＳＣ−ＣＭは、ＴＦＦによって濃縮および透析濾過される。この段階で生じる処理の主な態様としては、ＴＦＦならびにＴＦＦおよび透析濾過の組合せに、５ｋＤのフィルターカットオフを使用することが含まれる。
【０１３２】
また、溶液をさらに濃縮し、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ濾過によってＤＮＡを除去するために、追加の精製ステップをとってもよい。
【０１３３】
次いで、ＡＳＣ−ＣＭを、凍結乾燥させて、本明細書に記載される凍結乾燥組成物を形成する。凍結乾燥サイクルは、固形物を形成するために、非常に緩徐かつ保存的でなければならない。透析濾過および分泌された因子の保存の両方、ならびに希釈セクレトーム溶液の凍結乾燥にとって有効な緩衝液を使用することが、重要である。
【０１３４】
本発明による培養に有用な基礎培地の非限定的な例としては、１９９培地、ＣＭＲＬ  １４１５、ＣＭＲＬ  １９６９、ＣＭＲＬ  １０６６、ＮＣＴＣ  １３５、ＭＢ  ７５２６１、ＭＡＢ  ８７１３、ＤＭ  １４５、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’  Ｇ、Ｎｅｕｍａｎ  ＆  Ｔｙｔｅｌｌ、Ｈｉｇｕｃｈｉ、ＭＣＤＢ  ３０１、ＭＣＤＢ  ２０２、ＭＣＤＢ  ５０１、ＭＣＤＢ  ４０１、ＭＣＤＢ  ４１１、ＭＤＢＣ  １５３を含む多数の他の基礎培地の中でも、イーグル最小必須培地、ＡＤＣ−１、ＬＰＭ（ウシ血清アルブミン不含）、Ｆ１０（ＨＡＭ）、Ｆ１２（ＨＡＭ）、ＤＣＣＭ１、ＤＣＣＭ２、ＲＰＭＩ  １６４０、ＢＧＪ培地（フィットン−ジャクソン改変有りおよび無し）、イーグル基礎培地（アール塩ベースが添加されたＢＭＥ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−血清不含）、Ｙａｍａｎｅ、ＩＭＥＭ−２０、グラスゴー改変イーグル培地（ＧＭＥＭ）、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地、Ｍ１９９培地（Ｍ１９９Ｅ−アール塩ベースを含む）、Ｍ１９９培地（Ｍ１９９Ｈ−ハンクス塩ベースを含む）、最小必須培地アルファ（ＭＥＭ−アルファ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ−Ｅ、アール塩ベースを含む）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ−Ｈ、ハンクス塩ベースを含む）、およびイーグル最小必須培地（ＭＥＭ−ＮＡＡ、非必須アミノ酸を含む）が挙げられる。本発明において使用するのに好ましい培地は、ＭＥＭ−アルファである。これらおよび他の有用な培地は、とりわけ、ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡおよびＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｔ  ＨａＥｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌから入手可能である。これらの培地の多くは、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃによって刊行されたWilliam  B.  JakobyおよびIra  H.Pastanによる編集のMethods  in  Enzymology、Volume  LVIII、「Cell  Culture」、６２〜７２頁に要約されている。
【０１３５】
培地には、ウシまたは他の種の胎児血清などの血清、ならびに任意選択または代替として、増殖因子、サイトカイン、およびホルモンが、ピコグラム／ｍｌからミリグラム／ｍｌのレベルの濃度で、補充されていてもよい。例えば、培地には、細胞を刺激するために、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮγおよび／またはＴＮＦα）が補充されていてもよい。
【０１３６】
さらに、追加の構成成分が培養培地に添加され得ることが、認識される。そのような構成成分は、抗生物質、抗有糸分裂薬、アルブミン、アミノ酸、および細胞の培養のための当該技術分野において公知の他の構成成分であり得る。追加として、必要な場合には、分化プロセスを強化するための構成成分が、添加され得る。
生体模倣再生医薬プラットフォーム
【０１３７】
ほとんどの細胞型は、様々な再生因子（例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子など）を分泌し、これらは、集合的にセクレトームとして公知であり、細胞と細胞との通信のメッセンジャーとして機能する。
【０１３８】
幹細胞が再生を実行する主な手段は、移植を通じてではなく、細胞と細胞とのシグナル伝達を通じて生じると考えられている。結果として、任意の幹細胞の機能および再生シグナル伝達機序を模倣することができ、従来の薬物の実用性および経済的状況を有する、細胞不含の抗炎症性再生医薬プラットフォームが、本明細書において開示される。この生体模倣技術は、生幹細胞と同じ様式で、組織再生および血管修復を刺激するために、幹細胞に由来する再生因子および抗炎症性因子を放出するように設計される。
【０１３９】
分泌された再生因子は、培養により拡大された幹細胞から抽出され、精製される。具体的には、組織（例えば、脂肪組織）を処理し、上清を、細胞集団が集密状態になり、主として幹細胞となるまで成長培地で培養する。
【０１４０】
一部の実施形態では、幹細胞によって分泌された因子は、患者に直接投与され得る。しかしながら、セクレトーム由来の因子は、凍結乾燥の前に、有効量の凍結乾燥剤と組み合わされる。結果として得られる凍結乾燥組成物は、患者に投与する前に、再構成されていてもよい。
【０１４１】
他の実施形態では、凍結乾燥組成物は、本明細書に記載される医薬組成物を形成するために、持続放出薬物送達マトリックスとして機能する、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）賦形剤（Ｔｈｅｒａｋｉｎｅ、Ｂｅｒｌｉｎ）、例えば、米国第ＵＳ２０１４０３５６４３５号に開示されるものと組み合わされ、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、好適な賦形剤（例えば、疎水性賦形剤）を選択し、活性な薬学的成分と合わせ、フォールディング、混練、プレス、および／または切断を通じて均質化する。当業者であれば、利用される厳密な賦形剤および形成技法が、製品の仕様、例えば、セクレトームの放出、持続期間、形状、および／またはサイズを微調整するために、調節され得ることを理解し得る。適切な賦形剤の決定は、当該技術分野における日常的な技術レベルの範囲内である。
【０１４２】
結果として得られる生成物は、標的組織のニッチへの注射後に、幹細胞由来の因子を放出する、生体模倣再生療法である。
【０１４３】
この生体模倣再生療法を使用して、幹細胞因子の持続的な線形放出が、最大６ヶ月間（例えば、最大１、２、３、４、５、もしくは６ヶ月間）またはそれよりも長く達成され得る。さらに、再生幹細胞因子のみの効率的な送達により、他の細胞ベースの再生治療薬と関連する製造および投薬の費用が低減される。同様に、この生体模倣再生療法を使用して、別個の定量可能なｉｎ  ｖｉｖｏ投薬が可能となり、生産が容易に拡張可能であり、標準的な冷蔵だけを必要とする在庫生成物を、容易に製造、保管、および投与することができる。
【０１４４】
この生体模倣プラットフォームは、化学的結合ではなく物理的結合の破壊を利用して、タンパク質および／または細胞外小胞体の効力に良くない影響を及ぼすことなく、最大６ヶ月間の期間、複雑な再生タンパク質詰め合わせのこの持続放出を達成する、生分解性持続放出薬物送達マトリックスを利用する。具体的には、これらのマトリックスは、ナノ規模の物理化学的な相互作用および生物物理学的な相互作用に基づくものであり、巨視的処理を通じて機械的に形成される。化学的な架橋、活性な治療成分に対する化学的変化もしくは生物学的変化、ならびに極端なｐＨ条件および／もしくは熱条件が存在しないため、これらの薬物送達マトリックスの使用は、その中に含有されるタンパク質を変性させることがない。したがって、これらの持続放出薬物送達マトリックスの使用により、選択的な部位特異的送達、薬物毒性の低減、安全性および有効性の改善、数週間から数ヶ月間の範囲に及ぶ持続期間での薬物の線形放出、罹患した器官への直接的な投与、ボーラス放出に続いて最大６ヶ月間もしくはそれよりも長い線形放出、低濃度の活性な治療成分もしくは細胞の使用、ならびに／または製造および送達全体の生物活性の保存が可能となる。さらに、それらは、ＰＬＧＡ送達系の使用に伴って観察される酸バーストをもたらさない。
【０１４５】
したがって、この持続放出薬物送達マトリックスは、脂肪幹細胞のセクレトームにおいて見出されるものなど、再生因子の複雑な混合物を格納することができる。したがって、本明細書に記載される生体模倣性再生医薬プラットフォームは、およそ２〜８週間ごとに送達しなければならない標準的な生物学的処置と比較して、およそ３〜６ヶ月ごとに投与することができ、それによって、患者の不都合、健康管理の費用、および／またはリスクへの曝露が低減される。
持続放出薬物送達マトリックス
【０１４６】
有効量の凍結乾燥組成物と、持続放出薬物送達マトリックスとを含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。そのような医薬組成物は、少なくとも凍結乾燥組成物および疎水性マトリックスを提供すること、ならびに疎水性マトリックスおよび凍結乾燥組成物を混合して、ゲル、ペースト様、半固体、または微粒子状の形態の医薬組成物またはそれらの組合せを形成することによって、製造することができる。この製造方法の利点は、改善された放出特徴を有する持続放出製剤を提供することである。重要なことに、結果として得られる医薬組成物は、他の送達機序を使用した場合には減少または終結され得る、特定の生物学的活性によって特徴付けられる成分の持続放出を可能にする。
【０１４７】
非限定的な例として、疎水性マトリックス自体は、天然のワックス、脂質、および油、トコフェロールおよびそれらの誘導体、ならびに合成物質または化学修飾された天然のロウ、脂質、および／または油から構成され得る。
【０１４８】
一部の実施形態では、疎水性マトリックスは、少なくとも疎水性固体構成成分および疎水性液体構成成分を混合することによって形成され、それによって、広範な粘粘稠度、すなわち、それらの量的関係に応じて、ペースト様または半固体組成物の粘度などのレオロジー特性を有する疎水性マトリックスの形成が可能となる。好適な液体および固体の疎水性構成成分を選択することにより、所望される特性を有するゲル、ペースト様組成物、または半固体組成物の形成が可能となる。
【０１４９】
様々な実施形態では、上述の実施形態の固体の疎水性相と液体の疎水性相との比率は、０またはそれよりも大きく１００またはそれ未満、具体的には、０．５またはそれよりも大きく５０またはそれ未満、より具体的には、１またはそれよりも大きく２０またはそれ未満、さらにより具体的には、１またはそれよりも大きく１０またはそれ未満である。
【０１５０】
本医薬組成物は、任意選択で、緩衝液、充填剤、結合剤、浸透圧剤、滑沢剤として作用し得るか、または類似の機能を満たし得る少なくとも１つの賦形剤もまた、含有し得る。例えば、賦形剤は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、例えば、ヒアルロン酸、ペクチン、アラビアガム、および他のガム、アルブミン、キトサン、コラーゲン、コラーゲン−ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、フィブリン、フィブリノーゲン、ゼラチン、グロブリン、ポリアミノ酸、アミノ酸を含むポリウレタン、プロラミン、タンパク質ベースのポリマー、コポリマー、およびそれらの誘導体、ならびに／またはそれらの混合物もしくは組合せから選択され得る。そのような賦形剤の存在は、持続放出薬物送達マトリックスの放出特徴をさらに改変し得る。
【０１５１】
疎水性材料は、任意選択で、当業者に公知である広範な作用物質のいずれかで標識してもよい。例えば、色素、フルオロフォア、化学発光剤、アイソトープ、金属原子もしくはクラスター、放射性核種、酵素、抗体、またはビオチンおよびアビジンなどの緊密な結合パートナーはすべて、検出目的、局在化目的、撮像目的、または任意の他の分析もしくは医療目的で、疎水性材料を標識するために使用することができる。疎水性材料、特に、マトリックスの液体構成成分はまた、任意選択で、その機能の改変、その安定性の改変、および／または放出の速度のさらなる改変のために、広範な分子とコンジュゲートすることができる。本医薬組成物は、ある種、例えば、小分子、ホルモン、ペプチド、タンパク質、リン脂質、多糖類、ムチン、または生体適合性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、または多数の相当する材料のうちの任意のものの、共有結合または非共有結合により結合した層でコーティングしてもよい。この様式で使用することができる広範な材料、およびこれらのプロセスを達成するための方法は、当業者に周知である。
【０１５２】
本医薬組成物は、プレスおよびフォールディング、例えば、アルゴリズム様式での疎水性マトリックス自体のプレスおよびフォールディングのサイクルを繰り返すこと、ならびに／または凍結乾燥組成物と混合することによって、形成され得る。フォールディングした塊は、次いで、再度プレスされる。これらのプロセスを繰り返すことによって、マトリックス全体の薬学的に活性な化合物（ＡＰＩ）（すなわち、ＡＳＣのセクレトーム）のより良好な分布が達成され得る。例えば、混練は、アルゴリズムによるプレス−フォールディングのサイクルの一例である。プレスは、１０６Ｎ．ｍ−２を上回らない圧力を適用することによって達成され得る。
【０１５３】
構成成分を均質な塊に制御混合することにより、調製物が、徐放組成物の生産に適しているペースト様または生地様の粘稠度に変換される。例えば、すべての固体疎水性成分を、第１のステップにおいて混合した後、液体の疎水性マトリックス構成成分を添加して、機械的処置の間にペースト様または半固体の粘稠度が生成される。凍結乾燥組成物は、例えば、乾燥粉末または液体もしくは水溶液として、ペースト様の塊に添加され、機械的処置を継続して、ペースト様の塊の均質性が得られる。
【０１５４】
固体および液体の構成成分の機械的処置によって形成されるマトリックスは、典型的に、疎水性マトリックスであるが、少量の親水性賦形剤／成分および／または水溶液も含み得る。
【０１５５】
一部の実施形態では、疎水性固体構成成分を液体状態に移行させるために加熱は使用されず、固体の疎水性マトリックスは、機械的処置の間、非溶融状態に維持される。
【０１５６】
他の実施形態では、自己組織化プロセスが生じるのを予防するため、プレスおよびフォールディングのサイクルの間、疎水性マトリックスを非溶融状態に維持するために、能動的な冷却が使用される。
【０１５７】
例えば、プレスおよびフォールディングのサイクル中の混合物の温度は、冷却によって、ある特定の温度値（例えば、３７℃未満、４５℃未満、５０℃未満、または６０℃未満）よりも低く維持され得、それによって、生物学的に活性な分子（例えば、セクレトーム中のタンパク質）を変性から保護する。
【０１５８】
疎水性マトリックスと混合する前に、凍結乾燥組成物を、当該技術分野において公知の任意の好適な再構成方法を使用して再構成されていてもよい。代替として、凍結乾燥組成物は、疎水性構成成分と混合する前に、再構成される必要はない。
【０１５９】
好適な固体疎水性構成成分の例としては、ワックス、フルーツワックス、カルナウバワックス、ビーズワックス、ワックス様アルコール、植物性ワックス、大豆ワックス、合成ワックス、トリグリセリド、脂質、長鎖脂肪酸およびそれらの塩、例えば、ステアリン酸マグネシウム、パルミチン酸マグネシウム、長鎖脂肪酸のエステル、長鎖アルコール、例えば、パルミチン酸セチル、ワックス様アルコール、長鎖アルコール、例えば、セチルアルコール、オキシエチル化植物油、オキシエチル化脂肪アルコール、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
好適な液体疎水性構成成分の例としては、植物油、ヒマシ油、ホホバ油、大豆油、シリコーン油、パラフィン油、および鉱油、クレモフォール、オキシエチル化植物油、オキシエチル化脂肪アルコール、トコフェロール、脂質、リン脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
形成した後、本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを、コロイド形成技法および他の技術的手順を用いて、さらに処理して、好適な形態、例えば、所望される形状、サイズ、およびサイズ分布の物体または微粒子などにしてもよい。コロイド形成技法は、例えば、ミリング、冷間押出、乳化（emulgating）、分散、超音波処理を含む。
【０１６２】
本明細書に記載される方法によって形成される医薬組成物は、数週間から数ヶ月間といった長期間、薬物放出特性を維持する。したがって、凍結乾燥組成物は、（混合の前に再構成されるかどうかに関係なく）、その特定の生物学的活性が維持され得るように、ペースト様または半固体の混合物の状態で保護されたままである。
【０１６３】
所望される場合、追加の障壁層が、医薬組成物の周囲に形成されてもよい。例えば、眼での使用のためのエチレン／酢酸ビニルコポリマーまたは他の材料から作製された微細孔膜を、ペースト様または半固体の混合物の周囲に形成してもよい。さらなる選択肢としては、例えば、皮下注射および筋肉内注射のための生分解性ポリマー、生体内分解性多糖類、ヒドロゲルなどの使用が挙げられる。
【０１６４】
一部の実施形態では、医薬組成物中の凍結乾燥組成物の有効量は、約０．０１〜約２５％（重量／重量）（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２．、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５％（重量／重量）であり得る。他の実施形態では、医薬組成物中の凍結乾燥組成物の量は、はるかに高くなる（すなわち、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０％（重量／重量）、またはそれよりも高く）。
【０１６５】
当業者であれば、医薬組成物中の活性成分（すなわち、ＡＳＣセクレトーム）の割合が、約０．１〜約１０％となることを認識し得る。
【０１６６】
疎水性マトリックスおよび／または凍結乾燥組成物などの様々な出発構成成分は、当業者によく知られている様々な方法、プロセス、および装置を使用して、さらに操作および処理され得る。例えば、疎水性マトリックス構成成分は、ＡＰＩを添加する前に、多数の公知の方法および装置のうちの任意のもの、例えば、乳鉢および乳棒による粉末化、またはＰａｔｔｅｒｓｏｎ−Ｋｅｌｌｅｙツインシェルブレンダーでのブレンドを使用して、十分に混合され得る。さらに、様々な形状、サイズ、形態、および表面組成の医薬組成物を、形成することができる。異なるアスペクト比を有する微粒子または円錐体を、ペースト様または半固体または均質半固体材料の機械的ミリング、成形、および押出、または類似のプロセスを用いて、調製することができる。結果として得られる粒子を、さらに処置して、それらを、特定の用途、例えば、薬物送達系など用に調製することができる。混合物、ペースト、または塊はまた、冷間押出、冷却低圧ホモジナイゼーション、成形、および／または広範な最終生成物をもたらすことができる他のそのような十分に確立された手順を用いて、微粒子または物体に変換することができる。別の例として、本医薬組成物は、押出プロセスによって、均一な細孔幾何形状および直径を有する所定の細孔またはチャネルを含む篩ディスク（すなわち、ダイ）を通して絞り出すこともできる。
治療的使用
【０１６７】
本明細書に記載される凍結乾燥組成物および医薬組成物のいずれも、有効な処置上の解決法が存在しない広範な変性疾患および炎症性疾患に適用可能である。例えば、それらは、網膜疾患にその根源で対処することができるため、眼疾患標的、例えば、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、緑内障、網膜色素変性、未熟児網膜症、虹彩炎、ブドウ膜炎、シュタルガルト病、および外傷性脳損傷、視覚および／または網膜に影響を及ぼす外傷性脳損傷を含むがこれらに限定されない、網膜疾患標的に非常に適している。
【０１６８】
正常な網膜血管において、周皮細胞は、内皮細胞を裏打ちすることによって、網膜において血管を安定させるのに役立っている。しかしながら、網膜症では、年齢または高血糖に起因する炎症および酸化ストレスにより、周皮細胞の死滅および血管裏打ちの変性がもたらされ得、それによって、増殖因子の血管漏出および網膜における望ましくない血管の増殖が引き起こされる。（Cheungら、Lancet、３７６巻（９７３５号）、１２４〜３６頁（２０１０年）、Rehman、J.  Mol.  Med  (Berl)、８９巻：９４３〜４５頁（２０１１年）、Weiら、Stem  Cells、２７巻、４７８〜８８頁（２００９年）、およびAntonetti、Nat  Med、１５巻、１２４８〜４９頁（２００９年）を参照されたい）。
【０１６９】
Rajashekharら、PLoS  One、９巻（１号）、ｅ８４６７１（２０１４年）（参照により本明細書に組み込まれる）において実証されているように、脂肪幹細胞に由来する再生因子の送達により、網膜再生および血管修復がもたらされる。２つの動物モデルにおいて、脂肪幹細胞（ＡＳＣ）および／またはそれによって分泌される因子（細胞を含まない）の静脈内注射により、網膜機能が改善され、栄養因子の放出による神経保護が提供され、周皮細胞への直接的な分化によって血管漏出が軽減され、ＩＣＡＭ−１を含むがこれに限定されない重要な炎症性遺伝子の下方制御によって炎症が低減された。（Gene  ID:  3383を参照されたい）。誘導された分泌因子の注射により、生幹細胞の注射と比較したときに、匹敵する結果がもたらされた。
【０１７０】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の硝子体内注射もまた、レーザーによって誘導された開放隅角緑内障動物モデルにおいて、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）および網膜神経節細胞の神経保護を提供することが示されている。（Ezquerら、Stem  Cell  Res  Ther、７巻：４２頁（２０１６年）を参照されたい）。実際に、ＭＳＣが、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、および毛様体神経栄養因子（ＣＮＦ）を含むがこれらに限定されない、広範な神経栄養因子を分泌し得ることは、十分に確立されている。（Johnsonら、IOVS、５１巻、２０５１〜５９頁（２０１０年）を参照されたい）。さらに、レーザーによって誘導された開放隅角緑内障動物モデルにおける眼の前房への骨髄由来のＭＳＣの注射により、線維柱帯網が誘導され、眼圧が低減される。（Yuら、Biophysical  and  Biochemical  Research  Communication、３４４巻（４号）、１０７１〜７９頁（２００６年）およびKelleyら、Exp  Eye  Res.、８８巻（４号）、７４７〜５１頁（２００９年）を参照されたい）。
【０１７１】
ＡＳＣの重要な再生属性としては、例えば、消失した周皮細胞を置き換えることによる漏出網膜血管の修復、いくつかの神経栄養因子および抗アポトーシス因子の分泌、網膜上皮細胞および網膜神経節細胞の保護および修復、炎症の低減、それによる成長の促進、ならびに／または線維柱帯網再生の誘導および眼圧の低減が挙げられる。
【０１７２】
本明細書に記載される組成物のいずれも、一般的な技法を通じて、眼の硝子体腔に容易に注射することができる。例えば、送達される再生因子は、周皮細胞および星状細胞を保護および／またはその再成長を刺激し、それによって再生を促進するために、生体模倣医薬組成物から放出される。
【０１７３】
本明細書に記載される組成物の有意な臨床上および製造上の効率性としては、次のものが挙げられるがこれらに限定されない。
−  保管および取扱いが容易である真実の在庫生成物：凍結乾燥した後、活性細胞由来の治療薬を、室温で保管することができ、市場にある既存の生物学的薬物に匹敵する貯蔵寿命を有する。さらに、凍結保存は必要なく、最終的な医薬品は、数週間から数ヶ月間、冷蔵し、保管することが可能である。
−  投薬の制御、持続放出：凍結乾燥組成物と持続放出薬物送達マトリックスとを組み合わせて医薬組成物を生産することにより、再生因子がどこでいつ放出されるかに関して優れた制御がもたらされ、再生医療領域において前例のない程度で投薬の定量化および標準化が可能となる。
−  免疫原性の低減：幹細胞は、ドナーに由来せざるを得ないため、レシピエントの組織との長期適合性に関しては重大な問題が残っている。（Eliopolousら、Blood、１０６巻、４０５７〜４０６５頁（２００５年）、Hareら、JAMA、３０８巻、２３６９〜７９頁（２０１２年）、Huangら、Circulation、１２２巻、２４１９〜２９頁（２０１０年）、およびRichardsonら、Stem  Cell  Rev、９巻、２８１〜３０２頁（２０１２年）を参照されたい）。しかしながら、本明細書に記載される細胞不含の組成物は、免疫系の応答に関係なく、幹細胞と類似の因子を放出する。
−  眼組織の非侵襲的な標的化：血液網膜関門が、従来の薬物送達の課題となるため、侵襲的手順が、依然として慣例となっている。したがって、過度のリスクへの曝露を必要とすることなく、薬物をその標的に送達することができる眼薬物送達系を開発する必要性が継続して存在している。（Guadanaら、The  AAPS  Journal、１２巻（３号）（２０１０年）を参照されたい）。
−  バイオアベイラビリティの増加：市販の眼科製剤のうちの９０％超が、点眼薬の形態であるが、これは、網膜には到達することができない。（Roots  Analysis,  Sustained  Release  Ocular  Drug  Delivery  Systems、２０１４〜２０２４頁（２０１３年）を参照されたい）。そのため、眼の裏側に到達する処置の治療用量を増加させ、安全で便宜的な投薬方式を有することが、網膜疾患の処置および管理の重要な因子である。
−  緩徐で一定した制御速度での治療薬の放出：点眼薬または注射手段による小分子または生物製剤の従来の個別の送達は、薬物レベルが上下し、したがって、条件管理に一貫性がないことを意味する。対照的に、本明細書に記載される医薬組成物は、放出時間を延長し、最大６ヶ月間の期間、治療用タンパク質および治療因子の安定な線形放出を可能にする。
−  患者コンプライアンスの改善：ほとんどの眼科処置（点眼薬および懸濁液など）は、毎日の局所投与を必要とする。したがって、患者が、処置を逃すことが一般的にあり、これが、最終的には、疾患管理問題を引き起こし得る。対照的に、患者は、約３ヶ月ごとに１回、医師による本明細書に記載される医薬組成物の注射を必要とするだけとなる可能性が高い。したがって、患者は、毎日の点眼または２ヶ月に１回の注射のリスクまたは問題を伴わずに、継続した利益を受けることになる。
【０１７４】
本凍結乾燥組成物または医薬組成物は、全身様式で投与され得る。代替として、本医薬組成物を、局部的に、例えば、患者の組織域に局所的にまたはそこへの直接的な注射によって、投与してもよい。
【０１７５】
注射に関しては、医薬組成物の活性成分は、微粒子化および／または製剤化して、水溶液、好ましくは、生理学的に適合性の緩衝液、例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理食塩緩衝液にしてもよい。局所投与に関しては、透過させようとする障壁に適切な透過性物質が、製剤中に使用される。そのような透過性物質は、一般に、当該技術分野において公知である。
【０１７６】
本明細書に記載される組成物のいずれも、ヒトまたは動物の体に、例えば、ヒトもしくは動物の体への混合物の埋込みもしくは注射、ヒトもしくは動物の体への混合物の眼内注射、ヒトもしくは動物の体への混合物の皮下注射、ヒトもしくは動物の体への混合物の筋肉内注射、ヒトもしくは動物の体への混合物の腹腔内注射、ヒトもしくは動物の体への混合物の静脈内注射、ヒトもしくは動物の体への混合物の経口投与、そのヒトもしくは動物の体への混合物の筋肉内注射、ヒトもしくは動物の体への混合物の髄腔内注射、ヒトもしくは動物の体への混合物の舌下投与、ヒトもしくは動物の体への混合物の頬内投与、ヒトもしくは動物の体への混合物の直腸投与、ヒトもしくは動物の体への混合物の膣内投与、ヒトもしくは動物の体への混合物の眼内投与、ヒトもしくは動物の体への混合物の耳内投与、ヒトもしくは動物の体への混合物の皮膚投与、ヒトもしくは動物の体への混合物の経鼻投与（すなわち、スプレー噴霧による）、ヒトもしくは動物の体への混合物の皮膚投与、ヒトもしくは動物の体への混合物の局所投与、ヒトもしくは動物の体への混合物の全身投与、ヒトもしくは動物の体への混合物の経皮投与、および／またはヒトもしくは動物の体への混合物の吸入もしくは鼻内（すなわち、ネブライゼーションによる）投与によって、投与することができる。
【０１７７】
本明細書に記載される組成物のいずれに関しても、有効量または有効用量は、まず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよび細胞培養アッセイから、推定され得る。好ましくは、用量は、所望される濃度または力価を達成するように、動物モデルにおいて製剤化される。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１７８】
本明細書に記載される活性成分の毒性および治療有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手順によって、決定することができる。
【０１７９】
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究により得られたデータを、ヒトにおいて使用するための投薬量範囲を形成するために使用することができる。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて変動し得る。厳密な製剤、投与経路、および投薬量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択され得る（例えば、「The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics」のFinglら、１９７５年、第１章、１頁を参照されたい）。
【０１８０】
処置しようとする状態の重症度および応答性に応じて、投薬は、単回投与であっても複数回投与であってもよく、処置過程は、数日間から数週間、または疾患状態の軽減が達成されるまで、継続される。
【０１８１】
投与しようとする組成物の量は、当然ながら、処置されている個体、罹患の重症度、投与の様式、担当医の判断などに依存し得る。投薬量および投与のタイミングは、個々の変化する状態の注意深い継続的なモニタリングに応じることになる。適切な量の決定は、当該技術分野における日常的な技術レベルの範囲内である。
【０１８２】
本明細書に記載される組成物のいずれも、所望される場合、パックまたはディスペンサーデバイス、例えば、ＦＤＡ承認済みのキットで提示されてもよく、それには、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形が含有され得る。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイル、例えば、ブリスターパックを含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与の説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用、または販売を規制している政府当局によって規定された形式で、容器に付随する注意書きが格納されてもよく、この注意書きは、組成物の形態またはヒトもしくは獣医学上の投与の、当局による承認を反映するものである。そのような注意書きは、例えば、処方薬についてはＵ．Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって承認されたラベル付け、または承認された製品の添付文書であり得る。
血管修復
【０１８３】
糖尿病性網膜症は、持続性の代謝調節異常として発症し、網膜微小血管系に進行的な損傷を与える。これが、ひいては血管透過性を増加させる。進行期には、血管内皮細胞の異常な増殖を引き起こし得、それが、網膜の桿体および錐体を損傷し、それによって視覚喪失が引き起こされる。
【０１８４】
これまでの研究により、糖尿病ラットにおける血管透過性の増加が、脂肪幹細胞またはセクレトームの硝子体内への注射によって減少したことが示されている。
神経保護
【０１８５】
神経膠症は、網膜への損傷に応答した、ミューラー膠細胞の非特異的な反応性変化である。網膜の発達の際、ミューラー膠細胞は、神経網膜前駆細胞から生じ、外境界膜から網膜のほぼ全幅に及び、そこで、ミューラープロセスにより、光受容体と内境界膜との接続が形成され、そこで、ミューラーおよび網膜星状細胞のプロセスにより、網膜と硝子体との間の境界が形成される。（Newmanら、Trends  Neurosci.、１９巻、３０７〜３１２頁（１９９６年）を参照されたい）。ミューラー膠細胞および網膜星状細胞のいずれも、網膜ニューロンの支持および保護に非常に重要な役割を果たすことが示されており、特に、血液網膜関門の形成に極めて重要である。（Kuchler-Boppら、Neuroreport.、１０巻、１３４７〜１３５３頁（１９９９年）を参照されたい）。反応性神経膠症は、緑内障、網膜虚血、および糖尿病を含む疾患における、星状細胞、小膠細胞、および乏突起膠細胞を含む、複数の異なる種類の膠細胞の増殖または肥大を伴う。（Bringmannら、Prog  Retin  Eye  Res.、２５巻、３９７〜４２４頁（２００６年）を参照されたい）。その最も極端な形態では、神経膠症と関連する増殖は、神経膠瘢痕の形成を引き起こす。（Silver  Jら、Nat  Rev  Neurosci.、５巻、１４６〜１５６頁（２００４年）を参照されたい）。
【０１８６】
神経膠症は、網膜に対する損傷後に、脂肪由来の間葉系幹細胞またはその再生因子を投与した場合に、神経膠症と関連する遺伝子発現マーカーであるＧＦＡＰおよびＣａｓｐ−３を発現する細胞の低減によって明らかなように、著しく減少した。これまでの研究により、虚血再灌流ラットモデルにおける神経膠症の増加が、脂肪幹細胞および脂肪幹細胞セクレトームの硝子体内への注射によって減少したことが示されている。脂肪幹細胞セクレトームが神経膠症を低減させるさらなる根拠は、小膠細胞活性化の抑制に基づく。活性化小膠細胞は、炎症促進性サイトカインおよび反応性酸素種の生産と関連するＭ１状態、または創傷治癒および残屑のクリアランスと関連する抗炎症性Ｍ２状態という２つの状態で存在する。ＡＳＣセクレトームで処置した活性化小膠細胞は、小膠細胞の活性化の減少を実証した。
網膜機能の改善
【０１８７】
網膜電図（ＥＲＧ）は、短時間の閃光によって眼の網膜から生じ、光受容体（桿体および錐体）、網膜内細胞（両極細胞およびアマクリン細胞）、ならびに神経節細胞を含む網膜細胞の電気応答を測定する。したがって、ＥＲＧは、網膜機能の評価、および糖尿病性網膜症を含むいくつかの網膜障害の診断に役立つ、試験である。
【０１８８】
これまでの研究では、虚血再灌流ラットモデルにおける網膜電図の乏しい応答が、脂肪幹細胞および脂肪幹細胞セクレトームの硝子体内への注射によって軽減されることが示されたと示されている。
抗炎症性
【０１８９】
ＡＳＣは、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞を含む、多くの炎症性免疫細胞の増殖および機能を防ぐ因子を分泌することによって、損傷部位における炎症を有意に低減することが示されている。
【０１９０】
糖尿病性網膜症の研究において関係付けられている複数の炎症促進性サイトカインおよびバイオマーカーパネル遺伝子（例えば、ｃｃｌ２、ＩＣＡＭ−１、Ｅｄｎ２、ＴＩＭＰ１、Ｃｒｙｂｂ２、Ｇａｔ３、Ｌａｍａ５、およびＧｂｐ２）が、糖尿病ラットモデルにおいて、ＡＳＣの単回硝子体内注射によって有意に下方制御された。これまでの研究により、糖尿病ラットにおける糖尿病性網膜症関連遺伝子の転写産物の増加が、脂肪幹細胞の硝子体内への注射によって減少したことが実証されている。
キット、医薬、および製品
【０１９１】
本明細書に記載される組成物のいずれも、医薬、例えば、疾患、状態、または障害を患う患者を処置するためまたはその生存を延長するための医薬の製造において使用することができる。
【０１９２】
本明細書に記載される組成物のいずれかを、任意選択で使用のための説明書とともに含有する、疾患、状態、または障害を有する患者を処置するためまたはその生存を延長するためのキットもまた、提供される。
【０１９３】
本明細書に記載される組成物のいずれかを含有する容器、および疾患、状態、または障害を有する患者を処置するためまたはその生存を延長するための使用の説明書を含む、製品および剤形もまた提供される。
【０１９４】
本明細書に記載される組成物のいずれも、投与のための説明書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０１９５】
本発明を記載してきたが、以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されるものではない。
【実施例】
【０１９６】
（実施例１）
ｃＧＭＰガイドライン下における脂肪組織由来の間葉系間質細胞条件培地製品の開発。
製造プロトコール
ドナーの選択および組織の採取
【０１９７】
脂肪吸引によって抽出したおよそ１５０〜３００ｍｌの腹部組織は、好適なドナー（例えば、非喫煙者、女性、３０歳未満、両親ともに長寿の家族歴、および／または判明している疾病も慢性疾患の有意な家族歴もない）から選択され得る。
消化
【０１９８】
脂肪組織消化は、当該技術分野において公知の標準的な組織消化プロトコールに対して軽微な改変を行ったものを使用して、達成される。好ましくは、これらの改変形は、全体的なＰ０におけるＡＳＣの収率を増加させることに役立つものである。
【０１９９】
およそ３００ｍｌの吸引脂肪を、滅菌ボトルに移し、脂肪組織を、血液分画の上に置いた。血液を、１０ｍｌの吸引ピペットを使用して、脂肪組織の下から除去し、吸引脂肪は、ボトルを１０秒間激しく振盪することによって、３００ｍｌのＤＰＢＳですすぐ。
【０２００】
脂肪組織を、ＤＰＢＳの上に浮遊させた後、１０ｍｌの吸引器を用いて、ＤＰＢＳを除去する。これらのステップを、さらに３回繰り返す。最後のすすぎのＤＰＢＳが透明でなければ、さらなるすすぎが必要となり得る。
【０２０１】
次に、２×リベラーゼＭＮＰ−Ｓ（０．１４ＷＵ／ｍｌ）を調製する。吸引脂肪を、５０ｍｌのチューブに分割し、等体積の２×リベラーゼを添加し、５〜１０秒間激しく振盪させて、適正な混合を確保する。
【０２０２】
次いで、吸引脂肪を、３７℃で９０分間、旋回ミキサーにおいて２４ｒｐｍ／分の軌道回転でインキュベートする。酵素活性を停止させるために、ＦＢＳを、１０％の最終濃度まで添加し、十分に混合する。
【０２０３】
次に、溶液を、３００ｇで１０分間遠心分離し、浮遊している脂肪細胞、脂質、および消化培地を、吸引する。
【０２０４】
ペレットは、脂肪組織の間質血管画分（ＳＶＦ）であり、これを、ＲＢＣ溶解のためにＡＣＫ溶解緩衝液中に再懸濁し、室温で５〜１０分間インキュベートする。
【０２０５】
３００ｇで１０分間遠心分離した後、上清を吸引する。次いで、ペレットを、１０ｍｌの完全培地（α−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ）中に再懸濁し、細胞再懸濁液を、１００ｕｍの細胞ストレーナーに通して、未消化組織凝集物を除去する。ストレーナーを、５ｍｌの完全培地ですすぐ。
【０２０６】
次いで、細胞懸濁液を、４０ｕｍの細胞ストレーナーに通し、フィルターを、５ｍｌの完全培地ですすぐ。
【０２０７】
最後に、細胞懸濁液を、３００ｇで１０分間遠心分離し、細胞ペレットを、完全培地中に再懸濁し、細胞を計数する。
細胞培養：Ｐ０〜Ｐ２
【０２０８】
細胞を、適切なサイズのＴフラスコにおいて、２〜４×１０５個の細胞／ｃｍ２の密度で播種して、Ｐ０培養物を形成する。細胞培養物を、翌日にチェックし、半数フィードを、１日目または２日目に行う。培養物には、３〜４日ごとにフィードを行う。
【０２０９】
コロニーの密度が高くなり始めたら、培養物をＴｒｙＰＬＥで採取し、細胞を計数し、Ｐ１を、適切なサイズのＴフラスコにおいて、５×１０３個の細胞／ｃｍ２で播種する。細胞を、３〜４日ごとに再度フィードし、細胞が、８０〜９０％の集密度になったら採取する。
【０２１０】
細胞を、凍結保存して、１〜２×１０６個の細胞／ｍｌ／バイアルでＰ２のＲＣＢを作製する。
細胞培養：Ｐ２解凍〜Ｐ５
【０２１１】
細胞培養は、標準的な細胞培養プロセスを使用して行い、適切な細胞培養プロセスの決定は、当該技術分野における日常的な技能の範囲内である。
【０２１２】
Ｐ２のＡＳＣを、解凍し、４×Ｔ２２５フラスコにおいて培養する。８０〜９０％の集密度になったら、Ｐ２細胞を採取し、Ｐ３で６×単一トレイに継代培養する。８０〜９０％の集密度になったら、Ｐ３細胞を採取し、Ｐ４で２×１０トレイ細胞ファクトリーに継代培養する。８０〜９０％の集密度になったら、Ｐ３細胞を採取し、Ｐ４で２×１０トレイ細胞ファクトリーに継代培養する。８０〜９０％の集密度になったら、Ｐ４細胞を採取し、Ｐ５で１０×１０トレイ細胞ファクトリー（１０ＣＦ）に継代培養する。
Ｐ５、血清不含培地への切替え
【０２１３】
Ｐ５において、細胞を、血清不含（ＳＦ）培地に切り替える。複数の炎症因子を、ＳＦ培地の段階で添加して、細胞を２４時間刺激する。次いで、細胞を取り出し、すすいだ後、ＦＢＳも他の炎症因子、例えば、ＩＦＮγおよび／もしくはＴＮＦαも全くなしに、培養する。一実施形態では、ＡＳＣ−ＣＭを１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に急速に移すことがある。
【０２１４】
８０％のＡＳＣ集密度で、１０個のＣＦを、ＤＰＢＳ−−（Ｃａ２＋Ｍｇ２＋なし）で２回すすいだ。２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγを補充した血清不含培地（ＳＦＭ）を、１０個のＣＦに添加した。２４時間後に、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγを補充したＳＦＭを廃棄し、細胞を、ＤＰＢＳで２回すすいだ。
【０２１５】
次に、ＳＦＭ（補充なし）を、１０個のＣＦＳそれぞれに添加し、２４時間後に、ＡＳＣ−ＣＭを採取し、５００ｍｌの遠心分離ボトルに収集し、それを、２０００ｇで１０分間遠心分離した（大きな残屑を除去するため）。
【０２１６】
次いで、ＡＳＣ−ＣＭを、１０ＬのＳｔｅｄｉｍのバッグに移し、メタロプロテアーゼを防止するために、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した。
ＴＦＦによるＡＳＣ−ＣＭの濃縮および透析濾過
【０２１７】
次に、ＡＳＣ−ＣＭを、ＴＦＦによって濃縮および透析濾過する。ＴＦＦは、約５ｋＤのフィルターカットオフを使用して行う。以下に実証されるように、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液の使用は、完全性の維持ならびにＡＳＣ−ＣＭ中に存在する数千個ものタンパク質およびｍｉＲＮＡの分離のために、極めて重要である。
【０２１８】
また、溶液をさらに濃縮するために、追加の精製ステップを行ってもよい。さらに、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ濾過を使用して、ＤＮＡを、２５ｍＭトリス＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に除去してもよい。
【０２１９】
５ｋＤのＴａｎｇｅｎＸ  ０．１ｍ２のカセット（ＸＰ００５Ａ０１Ｌ）を２つ、接線流濾過（ＴＦＦ）に使用した。３ポートおよび２ポートのサイドアームを備える３Ｌのガラススピナーを、リザーバに利用した。各サイドアームのポートのうちの１つは、終端を浸漬管につなげた。２ポートのサイドアームの浸漬管を、再循環ラインとして利用し、もう一方のポートは、終端をＨＥＰＡにつなげた。３ポートのサイドアームの浸漬管を、試料採取および濃縮された生成物の取り出しに利用した。３ポートのサイドアームの他の２ポートは、保持液ライン、およびプールされたＡＳＣ−ＣＭのバッグからのフィードラインに使用した。
【０２２０】
システムは、使用の２日前に組み立て、０．５Ｎ  ＮａＯＨで３０分よりも長く消毒した後、０．０１Ｍ  ＮａＯＨ中で保管した。ＴＦＦシステムを、１ＬのｓＷＦＩで中性ｐＨまですすいだ（すべてのＮａＯＨを除去するため）。
【０２２１】
次に、ＴＦＦシステムを、フィードポートを通じて、１ＬのＳＦ培地を使用して調整した。８．５ＬのＡＳＣ−ＣＭバッグを、ＴＦＦシステムのフィードポートに接合し、１Ｌの濃縮物を、初回濃縮プロセスの間、リザーバに維持した。
【０２２２】
再循環ポンプをスタートし、透過ラインを開放したそのときに１２００ｍＬ／分で保持した。透過流速を、ＡＳＣ−ＣＭバッグが空になり、リザーバの濃縮物が１Ｌになるまで、およそ４０ｍＬ／分に維持した。この時点で、ポンプを止め、システム体積のおよそ半分（約５００ｍＬ）を、付属の１Ｌのエルレンマイヤーフラスコに引き抜いた。次いで、エルレンマイヤーに封をして、冷蔵庫に入れた。
ＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０への透析濾過
【０２２３】
３Ｌのトリス−ＥＤＴＡ（２５ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８、ＴＥ）のバッグを、フィードポートに接合した。ＴＥ透析濾過を、開始し、リザーバ内の濃縮物のレベルを、５００ｍｌに維持した。バック内に残るＴＥがおよそ１００ｍＬとなった時点で、ＴＥバッグを取り外し、ＡＳＣ−ＣＭを、さらに、約３２５ｍＬまで濃縮させ、システムから取り出した。次いで、残りのＴＥを、システムに添加し、２００ｍＬ／分で、約５分間循環させてすすいだ後、エルレンマイヤーフラスコにプールした（最終体積＝４６６ｍＬ）。
ヒスチジン緩衝液、ｐＨ８．０中への透析濾過
【０２２４】
代替的な実施形態では、５００ｍｌの濃縮ＡＳＣ−ＣＭ（ＴＥ透析濾過の前に取り出され、４℃で保管していたもの）を含有する１Ｌのエルレンマイヤー、および２５ｍＭヒスチジン、ｐＨ８．０（Ｈｉｓ）の３Ｌのバッグを、次いで、リザーバに取り付けた。Ｈｉｓへの透析濾過を開始し、リザーバ内の濃縮物のレベルを、５００ｍｌに維持した。
【０２２５】
透過流速を、プロセスの期間の間、３５ｍＬ／分に維持した。ＡＳＣ−ＣＭを、約３５０ｍｌまでさらに濃縮し、エルレンマイヤーフラスコに取り出した。ＴＦＦシステムを、ＴＥ緩衝液のときと同様に、約１００ｍＬのＨｉｓ緩衝液ですすぎ、エルレンマイヤーフラスコにプールした（４６３ｍＬの最終体積）。
凍結乾燥
【０２２６】
次に、ＡＳＣ−ＣＭを、凍結乾燥させて、凍結乾燥組成物を形成する。凍結乾燥サイクルは、固形物（ｃａｋｅ）を形成するために、非常に緩徐かつ保存的でなければならない。
バイアルの準備およびローディング
【０２２７】
バルク溶液を、２℃〜８℃で解凍した。バルク溶液を解凍した後、容器を一緒にプールした。スクロース、ＮＦを、２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、各処方物に添加した。
【０２２８】
Ｓｃｈｏｔｔ  Ｓｃｃ／２０ｍｍ（パーツ番号６８０００３１８）チュービングバイアルを、標的充填量２ｍｌまで充填し、Ｓｃｈｏｔｔ  １０ｃｃ／２０ｍｍ（パーツ番号６８０００３２０）チュービングバイアルを、標的充填量４ｍｌまで充填した。量は、１．００ｇ／ｍｌの密度であると想定して、重量によって検証した。Ｗｅｓｔ  ２０ｍｍ  Ｖ１０−Ｆ５９７Ｗ（パーツ番号１９７０００３３）のストッパーを、部分的に、バイアルに挿入した。
【０２２９】
熱電対を、８個のバイアルの底の中央に設置した。製品を含有した２つの底抜きトレイを、Ｈｕｌｌ  Ｍｏｄｅｌ  ８ＦＳ１２パイロットサイズの凍結乾燥装置のシェルフに置き、トレイの底を取り外した。生成物をローディングした後、チャンバーを１２ｐｓｉａに脱気した。
凍結乾燥
【０２３０】
シェルフを、ローディングのために冷却した後、シェルフを、標的設定点５℃（±３℃）で制御して、バイアル内の生成物の温度を均衡させた。次いで、シェルフを、１時間に３０℃の平均制御速度で、−５０℃（±３℃）の標的設定点まで傾斜させ、−５０℃で制御して、凍結ステップを完了させた。コンデンサを、−４０℃未満に冷却し、チャンバーを、４０ミクロン（±１０ミクロン）の標的圧力まで脱気した。
【０２３１】
チャンバーの圧力を、０．２μｍのフィルターを通した窒素、ＮＦをチャンバー内に流すことによって、４０ミクロンの標的設定点で制御した。
【０２３２】
シェルフを、１時間に１５℃の平均制御速度で、−３８℃（±３℃）の標的設定点まで温め、その設定点で制御して、一次乾燥を完了させた。次に、シェルフを、１時間に１５℃の平均制御速度で、２０℃（±３℃）の標的設定点まで温め、二次乾燥の間、その設定点で制御して、残留含水量を低減させた。
【０２３３】
チャンバーに、０．２μｍのフィルターを通した窒素、ＮＦを充填し戻して周囲圧力にし、バイアルに栓をして、チャンバーから出した。
結果：
細胞培養：
【０２３４】
ＡＳＣは、古典的な間葉マーカーを発現する。Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのフローサイトメトリー分析によると、ＡＤＳＣは、ＣＤ７３、９０、１０５のＭＳＣマーカーを発現し、ＣＤ４５に関して陰性である。１人のヒトドナーからのデータを、図１に示す。ＡＤＳＣが、ＣＤ１４０ｂ周皮細胞マーカーを発現し、ｐ２からｐ５において、内皮マーカーＣＤ３１に関して陰性であることもまた、下の２つの図に示されている。
濾過：
【０２３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／濾過で観察されたＴＦＦおよび透析濾過後の効果的なセクレトームの回収および精製を、図２Ａに示す。
凍結乾燥：
【０２３６】
ヒスチジン処方物は、ｐＨが７．４で、溶液中に大きな粒子が浮遊しており（確実に、未溶解のスクロースだけではない）、わずかに濁って見えた。トリス／ＥＤＴＡ処方物は、ｐＨが８で、無色透明に見える。
【０２３７】
凍結乾燥顕微鏡検査（ＦＤＭ）の結果に基づくと、トリス／ＥＤＴＡ処方物は、一次乾燥の間、−４６℃未満に維持する必要があるが、この温度は非常に低い。したがって、トリス／ＥＤＴＡ処方物は、非常に保存的なサイクルを必要とする。
【０２３８】
ヒスチジン処方物は、少し良好に機能し、一次乾燥の間、−３０℃未満に維持する必要がある。
【０２３９】
以下の物理的検査の結果を、図３Ａに示す。
再構成およびｐＨ：
【表１】
2019509033.tif 000003
ＨＴ−ＤＳＣ（高温示差走査熱量測定）：
【表２】
2019509033.tif 000004
材料が非常に硬く粘着性であったため、サブロット３ではＨＴ−ＤＳＣを行うことができなかった。
ＴＧＡ（熱重量水分分析）：
【表３】
2019509033.tif 000005
材料が非常に硬く粘着性であったため、サブロット３ではＴＧＡを行うことができなかった。
【０２４０】
生成物の安定性は、凍結乾燥後に維持された。タンパク質濃度またはバンドプロファイルに関して、凍結乾燥前および凍結乾燥後のＴＥ試料およびＨＩＳ試料の間に、有意差は観察されなかった。（図４Ａおよび４Ｂを参照されたい）。
タンパク質およびｍｉＲＮＡの含量：
【０２４１】
Ｑｕｂｉｔタンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）の結果を、以下の表に要約する。（４℃で１週間を上回る試料）。
【表４】
2019509033.tif 000006
タンパク質およびマイクロRNAの濃度は、3回の測定の平均である。データは、Qubit全タンパク質キットおよびマイクロRNAアッセイキットを使用して得た。
【０２４２】
凍結乾燥ＣＣ−１０１の安定性はまた、異なる保管温度下において研究したが、全タンパク質および全ｍｉＲＮＡは、有意に影響されなかった。凍結乾燥ＣＣ−１０１を、室温、４℃、または−８０℃で、２１日間保管した。インキュベーション後に、試料を、１ｍＬのＨ２Ｏ中に溶解した。全タンパク質およびマイクロＲＮＡの濃度を、それぞれ、Ｑｕｂｉｔタンパク質アッセイおよびＱｕｂｉｔマイクロＲＮＡキットを使用して、３連で測定した。結果を、図４Ｃに示す。
ＤＮＡ除去／Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ：
【０２４３】
ＰｉｃｏｇｒｅｅｎによるＤＮＡ推定は、ＡＳＣ−ＣＭが、２ｍｇのＤＮＡを有し、一方で、リザーバが有したのは１．３５ｍｇであったことを示した。１Ｍ  ＮａＣｌを使用したＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ後のＤＮＡ溶出により、０．１１μｇ／ｍｌのＤＮＡの溶出がもたらされた。１Ｍ  ＮａＣｌよりも低い濃度では、ＤＮＡは溶出されなかった。ＴＦＦに進める前に、ＡＳＣ−ＣＭをＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑカラムに流すことおよび／または好適な量の５００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄することが望ましい。結果を、図５に示す。
ＣＦＳＥ免疫能力アッセイ：
【０２４４】
このアッセイは、各ＡＳＣ細胞（ｐ５もしくは誘導後に採取したｐ５のＡＳＣ）またはＡＳＣ−ＣＭ試料（インタクト、ＴＦＦ後、もしくは凍結乾燥後のいずれか）が、Ｔヘルパー（ＣＤ４＋）リンパ球の増殖を抑制することができる程度を評価するように、設計されている。試料（またはＡＳＣ細胞）を、健常な個体の末梢血から精製した凍結保存白血球を使用して、試験した。
【０２４５】
ＩＰＡは、蛍光標識した抗ヒトＣＤ４抗体とともに、トラッキング色素カルボキシフルオレセイン二酢酸、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を使用したフローサイトメトリーにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の抑制を測定する。
【０２４６】
簡単に述べると、初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＦＳＥで染色し、製造業者のプロトコールに従って培養した。標識した細胞を、上述のＡＳＣまたはＡＳＣ処置試料（ＣＭ、もしくはＴＦＦ後、もしくは凍結乾燥後）のいずれかを含有するウェルに、１ウェル当たり４×１０５個の白血球（１×１０６個の細胞／ｍＬの密度）で蒔いた。これにより、１：１、１：０．５、１：０．２、１：０．１、および１：０．０５の比の滴定ＰＢＭＣ：ＡＳＣ細胞または等体積の試料（ＣＭ、もしくはＴＦＦ後、もしくは凍結乾燥後）が得られる。
【０２４７】
さらなるウェルに、刺激したＰＢＭＣを単独で、およびすべて対照としての機能を果たす、刺激なしの１：０．０５の比のＰＢＭＣ：ＡＳＣ細胞または等体積の試料（ＣＭ、もしくはＴＦＦ後、もしくは凍結乾燥後）を蒔いた。骨髄（ＢＭ）ＭＳＣ細胞を、ＰＢＭＣに対して同じ比で蒔いた（結果として生じるＢＭ−ＭＳＣによる抑制は、このアッセイの参照免疫抑制としての機能を果たす）。
【０２４８】
ＰＢＭＣ単独の対照は、最大Ｔ細胞増殖の陽性対照としての機能を果たし、それに対して、ＡＳＣ（または等体積のＣＭ、またはＴＦＦ後、または凍結乾燥後）に媒介される抑制の程度を測定した。未刺激の１：０．０５比のウェルを使用して、陰性対照ゲートを生成し、それに対して増殖を測定する。同時に、Ｔ細胞刺激モノクローナル抗体、抗ヒトＣＤ３、および抗ヒトＣＤ２８を、各ウェルに添加した。
【０２４９】
細胞を、３７℃で４日間培養し、収集し、抗ヒトＣＤ４蛍光抗体、抗ヒトＣＤ１４蛍光抗体、および生／死染料で染色した。染色した後、細胞を収集し、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋［ＣＤ１４−７ＡＡＤ−］細胞のＣＦＳＥ強度によって、増殖に関して分析した。
【０２５０】
免疫能力アッセイの結果（正規化したＩＣ５０で表す）を、以下の表に要約する。
【表５】
2019509033.tif 000007
【０２５１】
等量のＴ細胞を、漸増用量のＡＤＳＣ−ＣＭとともに蒔いた場合の、用量依存様式でのＴ細胞増殖の有意な減少に注目されたい。データを、図６Ａに示す。
ＢＲＤＵ免疫能力アッセイ：
【０２５２】
Ｔ細胞抑制を、増殖している細胞の新しく合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン）の組込みに基づく、時間分解蛍光免疫アッセイを使用して、評価した。細胞を、ＢｒｄＵを含有する標識培地で培養した場合、このピリミジン類似体が、チミジンの代わりに、新しく合成されたＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＢｒｄＵを、ユーロピウム標識モノクローナル抗体を使用して検出する。
アッセイプレートへの細胞の添加（０日目）：
【０２５３】
ＰＢＭＣ（Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ、密度勾配遠心分離によってヘパリン処理したヒト全血から単離）を、以下のように、９６ウェルの丸底プレートに蒔いた：細胞を、１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で培養培地中に再懸濁し、１００μＬ（１００，０００個の細胞／ウェル）のこの溶液を、プレートの各ウェルに添加する。各ウェルの全体積を、培養培地で２００μＬにする。内側の６０ウェルのみを、各アッセイに使用する。培養プレートを、加湿インキュベーターにおいて、３７℃で７２〜９６時間インキュベートする。アッセイのために、レスポンダー細胞が刺激されるウェルは、それぞれ５μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体である。
【０２５４】
各実験条件を、４連または５連でセットアップし、細胞増殖を測定する。各アッセイにおいて、抗ＣＤ３抗体のみで刺激したＰＢＭＣ細胞の１０個の複製ウェル（最大／陽性刺激対照）、ならびに抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の両方の不在下において培養したＰＢＭＣ細胞の５個の複製物（刺激なし／陰性刺激）を含む、追加の対照もまた、セットアップする。
薬物化合物の添加（０日目）：
【０２５５】
ＴＦＦ後のＡＳＣ−ＣＭ  Ｈｉｓで誘導した試料（ヒスチジン緩衝液中）（ＣＣ−１０１）を、５０μＬの体積で、４つの規定の濃度において、各アッセイ条件について５個のウェルの複製物で各ウェルに添加し、対照として２５ｍＭヒスチジン緩衝液を添加した。培養物（アッセイプレート）を、５％ＣＯ２で３７℃において、インキュベーターで４日間インキュベートする。
Ｅｕ標識ＢｒＤｕの添加（３日目）：
【０２５６】
７２時間の終わりに、細胞に、Ｅｕ＋＋（ユーロピウム）標識したＢｒＤｕをパルスし、これを各ウェル（２０μＬ／ウェル）に添加し、プレートを、加湿インキュベーターにおいて３７℃でさらに１６〜１８時間インキュベートする。
アッセイプレートの採取（４日目）：
【０２５７】
翌日、標識した細胞を、採取し、Ｄｅｌｆｉａ細胞増殖プロトコールに従って処理し、Ｔ細胞増殖を、時間分解蛍光（非放射性）方法を使用して測定する。ＰＢＭＣ細胞の刺激および増殖は、測定ユーロピウム計数を反映する（図６Ｂ）。
【０２５８】
測定したデータを、各実験条件の平均値（例えば、４連のウェルからの）の決定後に、２つの異なる方式で計算する。
【０２５９】
１つのシナリオにおいて、データは、実験ウェルの平均を対照ウェル（未刺激）の平均で除したものとして定義される、標準刺激指数（ＳＩ）として表される。別の方法において、データは、正味の計数またはｃｐｍ（実験ｃｐｍ−バックグラウンド／未刺激ｃｐｍ）として表される。
ＡＳＣ−ＣＭは、エキソソームおよび非エキソソーム関連タンパク質を含有する：
【０２６０】
ＡＳＣ−ＣＭをエキソソームありの画分とエキソソームなしの画分に分離するための実験の結果を、図２Ｂに示す。再構成ＣＣ−１０１の体積のおよそ９５％を、分子量カットオフが１００ｋＤａの回転濃縮装置を使用して濾過した。ここでは、１００ｋＤａよりも小さい生物学的生成物（例えば、タンパク質またはタンパク質複合体）は、フィルターを通るが（濾液）、１００ｋＤａよりも大きい生物学的生成物（例えば、タンパク質、タンパク質複合体、またはエキソソーム）は、保持液中に濃縮される。濾液中のサイトカインは、多数のサイトカイン／ケモカインの発現レベルを比較する膜に基づく抗体アレイにおいて、検出することができることに留意されたい。抗体アレイのスポットの強度の定量化は、濾過前および濾過後のＣＣ−１０１に、類似の豊富さのサイトカインが存在することを示す。培養培地を、非特異的なバックグラウンドシグナルの対照として使用した。アッセイは、製造業者（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）の使用説明書に従って、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像システムを用いて行った。結果は、検出されたサイトカインが、感知できるほどには、フィルター膜全体で通過が制限されると予想されるエキソソームと、またはより大きな分子量の複合体に関連しないことを示す。未濾過の再構成ＣＣ−１０１および濃縮保持液のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットによる分析は、エキソソーム破壊条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離した場合に、エキソソームに組み込まれたタンパク質である１４−３−３、およびエキソソームの脂質膜に組み込まれたテトラスパニンであるＣＤ６３が、個々の分子量が１００ｋＤａ未満であるにもかかわらず、保持液中に富化されることを示す。タンパク質の免疫ブロット分析のために、試料を、４×ＳＤＳ−ＳＢと合わせた。試料を沸騰させ、標準的な方法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、標準的な電気泳動法を使用して、イモビロン−ＦＬ  ＰＶＤＦ膜（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に移した。膜を、ＬＩ−ＣＯＲブロッキング緩衝液でブロッキングし、目的のタンパク質に対する一次抗体でプローブした後、適切な種の反応性および蛍光スペクトルの蛍光二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）でプローブし、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線スキャナ（ＬＩ−ＣＯＲ）で製造業者の説明書に従って撮像した。
ＡＤＳＣによって放出されるパラクリン因子は、凍結乾燥手順によって影響を受けない：
【０２６１】
ＡＤＳＣの細胞上清中のＶＥＧＦおよびＴＩＭＰ１の両方を、ＥＬＩＳＡアッセイによって、測定した。ＶＥＧＦ濃度は、非常に低く（ｐｇ／ｍｌ）、血管新生を作動させる治療的レベル以下である。予測した通り、凍結乾燥手順の前および凍結乾燥手順の後で、検出されたＶＥＧＦおよびＴＩＭＰ１の量は、同様であった。ＥＬＩＳＡの結果を、図７Ｆに示す。
【０２６２】
凍結乾燥前および凍結乾燥後におけるタンパク質の相対的な安定性もまた、免疫ブロット分析によって検査した。ＣＣ−１０１（凍結乾燥後）を、それが由来する処理ＡＳＣ−ＣＭ（凍結乾燥前）と同じ体積に再懸濁した（図３Ｂ）。Ｑｕｂｉｔタンパク質アッセイキットおよびＱｕｂｉｔ  ３．０フルオロメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、同様の全タンパク質濃度が、確認された。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびガレクチン１（ＧＡＬ１）、ＴＳＧ−６、１４−３−３タンパク質、およびＴＩＭＰ１に対する抗体を用いて免疫ブロット分析に供し、凍結乾燥前および凍結乾燥後で同様のこれらのタンパク質の豊富さが示された。免疫ブロットは、上述のように行った。
ＡＤＳＣによって放出されるパラクリン因子は、サイトカイン刺激によって増加する：
【０２６３】
図７Ａおよび図７Ｂは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、またはこれら２つの組合せにより、ＡＳＣ−ＣＭ中のいくつかのタンパク質の発現が増加することを示す。上で示されているように、膜に基づく抗体アレイを使用して、多数のサイトカイン／ケモカインの豊富さを一度に測定することができる。７Ａ（パネルＡ）は、未処置の細胞またはＩＦＮγおよびＴＮＦαで処置した細胞に由来するＡＳＣ−ＣＭにおけるサイトカイン／ケモカインの発現レベルを比較する、抗体アレイの代表的な画像を示す。培養培地を、非特異的なバックグラウンドシグナルの対照として使用した。アッセイは、製造業者の使用説明書に従って、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像システムを用いて行った。選択したサイトカイン発現プロファイルの定量化により、ＩＦＮγ／ＴＮＦα処置により、ＣＸＣＬ１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ８、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、およびＴＮＦＲＳＦ１１Ｂの発現が、少なくとも２倍刺激されることを示す。
【０２６４】
ＩＦＮγおよびＴＮＦαによって刺激した細胞からのパラクリン因子の増加もまた、標識なしの定量的ショットガンプロテオミクス分析を使用して、観察された。ＡＳＣ−ＣＭ由来のタンパク質を、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させ、氷冷アセトンで２回洗浄し、乾燥させ、さらなる処理まで、−２０℃で保管した。タンパク質試料を、１００ｍＭトリス、ｐＨ８．５中８Ｍ尿素中に再懸濁し、還元し、アルキル化し、ｌｙｓ−Ｃおよび／またはトリプシンプロテアーゼの逐次添加によって消化させた。消化させたペプチド溶液を、強カチオン交換および逆相クロマトグラフィーを使用して、オンラインで分画し、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析装置に直接溶出させた。ＭＳ／ＭＳスペクトルを収集し、続いて、ＰｒｏＬｕＣＩＤおよびＤＴＡＳｅｌｅｃｔアルゴリズムを使用して、分析した。ヒトデータベースに対して、データベース検索を行った。タンパク質およびペプチドの識別を、さらに、デコイデータベース戦略によって推定される、５％未満の偽陽性率でフィルタリングした。正規化したスペクトルの豊富さ係数（ＮＳＡＦ）を、タンパク質を識別するスペクトルカウントの数（ＳｐＣ）を、タンパク質の長さ（Ｌ）で除し、実験におけるすべてのタンパク質のＳｐＣ／Ｌの合計で除したものとして計算する。これは、標識なしのプロテオミクスにおいて、実験全体で相対的なタンパク質豊富さを比較するための一般的な測定基準である。図７Ｂは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、または組合せが、いくつかのパラクリン因子の発現を増加させることを示す。さらに、ＩＦＮγおよびＴＮＦαは、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＶＥＧＦＣ、およびＴＳＧ−６を含むいくつかの因子の発現に対して相乗効果を有する。
【０２６５】
ＴＳＧ−６に対するＴＮＦαおよびＩＦＮγの組合せ処置の相乗効果を、ＡＳＣ−ＣＭの免疫ブロットおよびドットブロット分析によって、独立して確認した。図８は、様々な長さのサイトカイン処置を図示し、ＴＮＦαとＩＦＮγとの組合せならびに刺激の長さが、細胞（細胞ライセート）およびＡＳＣ−ＣＭ内のＴＳＧ−６の発現を増加させることを示す。免疫ブロット分析の方法は、上述の通りである。ドットブロット分析については、試料を、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ精密濾過装置を使用して、減圧吸引下において、イモビロン−ＦＬ  ＰＶＤＦに直接結合させた。膜を、ＬＩ−ＣＯＲブロッキング緩衝液でブロッキングし、目的のタンパク質に対する一次抗体でプローブした後、適切な種の反応性および蛍光スペクトルの蛍光二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）でプローブし、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線スキャナ（ＬＩ−ＣＯＲ）で製造業者の説明書に従って撮像した。発現を定量化するために、バックグラウンドを差し引いたバンドまたはドットの統合蛍光強度を、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアを使用して決定した。
ＡＳＣ−ＣＭ／ＣＣ−１０１の組成物を特徴付けるためのプロテオミクス分析：
【０２６６】
凍結乾燥前のＡＳＣ−ＣＭおよび再構成した凍結乾燥後のＣＣ−１０１を、ショットガンプロテオミクスによって分析した。すべての試料に共通したタンパク質を、図１６に提供する。上述のように、タンパク質を、ＴＣＡで沈殿させ、ＬＣ−ＭＳ分析に供して、タンパク質を識別した。図７Ｅは、ＮＳＡＦ値によって決定した場合に豊富さが高かった１００個のタンパク質を示す。これらには、可溶性シグナル伝達タンパク質、上述のサイトカインの一部、ならびに再生タンパク質および抗炎症性タンパク質、例えば、ＴＳＧ−６（ＴＮＦＡＩＰ６）が含まれる。バイオインフォマティクス分析およびデータベース検索により、エキソソームと関連することが公知のタンパク質の過剰発現が明らかとなる。例えば、図７Ｃは、推定上のエキソソーム構成要素のオンラインデータベースであるＥｘｏＣａｒｔａにおけるタンパク質と比較した、ＡＳＣ−ＣＭまたはＣＣ−１０１において識別されたタンパク質の比例ベン図を示す。ＥｘｏＣａｒｔａにおいて最も高頻度に識別された１００個のエキソソーム関連タンパク質のうちの半数超が、ＡＳＣ−ＣＭ／ＣＣ−１０１プロテオームにおいても見出されることに注目されたい。図７Ｄは、ＤＡＶＩＤ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ６．８を使用した機能的エンリッチメント分析（ＦＥＡ）の結果を示す。ＦＥＡは、多くの遺伝子またはタンパク質セットにおいて過剰に出現する遺伝子またはタンパク質のクラスを識別する計算方法である。遺伝子オントロジークラス「細胞外エキソソーム」を有するタンパク質の豊富さおよび有意な過剰出現に注目されたい。
ＡＳＣ−ＣＭ由来のエキソソームからのｍｉＲＮＡの識別：
【０２６７】
エキソソームは、ＥｘｏＱｕｉｃｋ沈殿法（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、ＡＳＣ−ＣＭから沈殿させた。エキソソームＲＮＡを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙによって定量化した。次世代シーケンシングライブラリーを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ機器で、試料１つ当たり最低１０００万の読取り深度で、１×７５ｂｐのシングルエンド読取りにより、シーケンシングした。未加工データを、Ｍａｖｅｒｉｘ  Ｂｉｏｍｉｃｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して分析した。濾過前のＡＳＣ−ＣＭから沈殿させたエキソソームのＲＮＡ次世代シーケンシングにより識別された上位のｍｉＲＮＡの例を、図１７に提供する。
調整可能な抵抗パルスセンシングによるナノ粒子分析：
【０２６８】
ＮＰ１５０ナノ細孔を使用し、調整可能な抵抗パルスセンシング（ｔＲＰＳ）技術に基づくｑＮａｎｏシステムを使用して、ＥＶの濃度およびサイズ分布を得た。元の試料を、ＰＢＳ−０．０３％  Ｔｗｅｅｎ２０中に、１：１０の比で希釈した。濃度を、ポリスチレン粒子（ＣＰＣ２００）キャリブレーションに基づいて計算した。
【０２６９】
図９Ａに示される結果は、生成物の凍結乾燥および保管が、細胞外小胞体（ＥＶ）に対して、有害な影響を有さないことを実証する。トリス−ＥＤＴＡ緩衝液中の凍結乾燥前および凍結乾燥後の生成物の結果を比較すると、凍結乾燥が、ＥＶの濃度およびサイズ分布のいずれに対しても影響をほとんど有さないか、または全く有さないことが明らかに示される。ヒスチジン緩衝液中の生成物は、ＥＶ粒子のサイズ分布を保持するが、濃度の減少を示す。（図９Ｂを参照されたい）
要約：
【０２７０】
この研究により、ＧＭＰグレードのリベラーゼを使用した吸引脂肪処理プロトコール（濃度、インキュベーション時間）、および条件培地採取のための特定の細胞表面マーカーによって定義される、所望されるＡＳＣ細胞集団を生産するための細胞培養プロトコールを確立した。ＩＦＮγおよびＴＮＦαによるＡＳＣの予備刺激が、ＡＳＣおよびＡＳＣ−ＣＭ生成物の効力を増加させるために重要である。ＡＳＣ−ＣＭ採取のために、血清不含培地における２４時間またはそれよりも長い（例えば、４８時間、７２時間、またはそれよりも長い）インキュベーション時間が、使用される。ＤＮＡ、ウイルス、および／またはタンパク質の混入物質を除去するために、深層濾過およびＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑを、ＴＦＦの前に行う必要がある。ＴＦＦによるＡＳＣ−ＣＭの濃縮は、２５ｍＭトリス  １ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（ＴＥ）および２５ｍＭヒスチジン、ｐＨ８．０（Ｈｉｓ）という２つの異なる緩衝液への９回のＣＭの濃縮および透析濾過を使用して、行った。濃縮された生成物は、ＴＦＦの後に、Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＰＶＤＦフィルターを使用して濾過されるため、ＴＦＦプロセスは、無菌で行う必要はない。ＤＮＡの混入を回避するために、ＡＳＣ−ＣＭを、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑフィルターに通し、タンパク質を、５００ｍＭ  ＮａＣｌを使用して溶出した。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑカートリッジを使用したＤＮＡ除去により、ＴＦＦプロセス時間および全タンパク質回収の両方を改善することができる。ＴＥおよびＨｉｓ中の凍結乾燥ＡＳＣ−ＣＭは、ＰＡＧＥによって明らかなように、良好なタンパク質回収で、滅菌水中に再構成された。ＴＥ試料は、さらにより保存的な凍結乾燥サイクルを必要とするが、タンパク質回収は良好であった。さらに、ＴＥ処方物は、Ｈｉｓ試料よりも良好に機能した。ＥＬＩＳＡの後に、ＡＳＣ−ＣＭは、検出可能なレベルのＴＩＭＰ１およびＶＥＧＦを含有していることが見出された。すべての試料は、少なくとも１０日間、４℃で安定であった。
（実施例２）
凍結乾燥組成物および持続放出薬物送達マトリックスを含有する医薬組成物の調製および試験。
【０２７１】
１ｍｌ当たり約４００マイクログラムのタンパク質濃度の、実施例１に概説される方法に従って調製した凍結乾燥組成物の２ｍｌの溶液を調製し、持続放出薬物送達マトリックスへ組み込むための出発溶液として使用した。
【０２７２】
巨視的マトリックスを処方し、放出プロファイルを、６つの異なるマトリックスから測定した。マトリックスの概要を、以下の表に示す：
【表６】
2019509033.tif 000008
【０２７３】
図１０は、バーストおよび９０日間放出測定点の予備放出データを示す（パーセントペイロード）。観察されたバーストおよび安定した放出測定は、予測と一致する。
（実施例３）
凍結乾燥組成物のｉｎ  ｖｉｖｏ寛容性試験。
【０２７４】
この研究は、硝子体内（ＩＶＴ）注射後の非ヒト霊長類におけるＣＣ−１０１の眼寛容性を評価し、有効性試験のための用量を確立するように設計した。これは、漸増投薬を繰り返した後に、細隙灯検査、網膜撮像、眼圧検査、および臨床病理によって達成した。
【０２７５】
試験化合物の取扱い
【０２７６】
バイアルを、２日間の輸送移動時間にわたり、−２０℃未満に維持した輸送容器でドライアイス上で送付した。次いで、バイアルを、使用直前に室温で解凍するまで、−２０℃で維持した。投与のときに、１ｍＬの０．９％滅菌生理食塩水を、１５ＣＣＴ１−１５０７０９  ＣＣ−１０１ヒスチジンの５ｍＬバイアルに添加することによって、低用量（６４μｇ／ｍｌ）を処方した。高用量（１２８μｇ／ｍｌ）は、０．５ｍＬの０．９％滅菌食塩水を、１５ＣＣＴ１−１５０７０９  ＣＣ−１０１ヒスチジンの５ｍＬバイアルに添加することによって処方した。
【０２７７】
対象の採用
【０２７８】
これまでに薬物処置を受けていない３匹の成体のオスを、研究参加に選択した。
【０２７９】
物品の送達
【０２８０】
細隙灯検査、眼底部撮像、および眼圧検査によって、全般的な健康状態が良好であることおよび正常な所見を確認した後、研究に採用した３匹のサルを、以下の表に示されるように、任意に割り当てて、ＣＣ−１０１またはビヒクルを硝子体内に受容させた。１％シクロペントレート（cyclopentalate）および１０％フェニレフリン塩酸塩（phenylepharine  hydrochloride）の点眼薬により瞳孔散大を達成した後、ケタミン／キシラジン鎮静薬（１００ｍｇ／ｍｌケタミンおよび２０ｍｇ／ｍｌキシラジン、０．２ｍｌ／ｋｇ）下において、硝子体内投薬を行った後、局所０．５％プロパラカインを投薬した。開瞼装置を設置し、眼を、５％Ｂｅｔａｄｉｎｅで消毒し、滅菌食塩水ですすいだ後、注射を行った。注射後には、注射関連の併発症がないことを目視で確認し、３重抗生物質軟膏（ネオマイシン、ポリミキシン、バシトラシン）の局所投与を行った。次いで、注射後評価を、以下に示される検査スケジュールに従って行った。
【表７】
2019509033.tif 000009
【表８】
2019509033.tif 000010
【０２８１】
眼科検査
【０２８２】
眼圧検査
【０２８３】
ベースラインおよび上記の示される硝子体内注射後の日程で、眼内圧を測定した。測定は、散瞳剤の投与前に、Ｔｏｎｏ−Ｖｅｔ（登録商標）眼圧計を使用して行った。
細隙灯検査
【０２８４】
ベースラインおよび示される硝子体内注射後の日程で、細隙灯検査によって眼を検査した。前房内細胞、房水フレア、および他の眼科所見について、改変したＭｃＤｏｎａｌｄ−Ｓｈａｄｄｕｃｋスコア付けシステムを使用してグレードを付けた。
【０２８５】
間接的検眼鏡検査
【０２８６】
９０ジオプトリのレンズを用いた後眼部細隙灯検査によって、網膜および硝子体の炎症の評価を行った。硝子体細胞を、１〜２ｍｍの細隙灯ビーム当たり、０＝５個未満の細胞、１＝軽度（約５〜１０個）の細胞、２＝中等度（約１１〜２０個の細胞）、３＝顕著（約２１〜５０個の細胞）、および４＝重度（５０個を上回る細胞）で、０から５のスケールでスコア付けした。硝子体の濁りを、Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔスケールを使用して、０＝透明な硝子体、１＝網膜細部の曇りを伴わない混濁、２＝後方細部の軽度のぼやけを生じる一部の混濁、３＝まだ視覚はあるが、視神経頭および網膜血管の有意なぼやけがある、４＝視神経頭が曇る激しい混濁の０から４のスケールでグレード付けした。網膜の滲出斑および出血、血管の拡張、蛇行、鞘形成、ならびに視神経乳頭浮腫の存在または不在もまた、検眼鏡検査中に評価した。
【０２８７】
眼底部撮像
【０２８８】
ベースラインおよびスケジュールした撮像日において、Ｃａｎｏｎ  ６Ｄデジタル撮像ハードウェアおよびＮｅｗ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｆｕｎｄｕｓ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを搭載したＴｏｐｃｏｎ  ＴＲＣ−５０ＥＸ網膜カメラを使用して、前眼部および眼底部のカラー画像を取得した。眼底部の写真を考察して、有害作用および関連する変化のあらゆる兆候を評価した。定量的スコア付けは適用しなかった。
【０２８９】
血液収集
【０２９０】
血液（９ｍＬ）を、ベースライン、ならびに注射４日後、２１日後、３３日後、および５０日後に収集した。３ｍｌの全血を、Ｋ２ＥＤＴＡを用いて凝固しないようにし、氷上において、差分ありの全血球計数（ＣＢＣ）のためにＲｏｓｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓに輸送した。別の３ｍｌの血液を、クエン酸遠心分離チューブに移し、３回反転させ、４℃で１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離し、結果として得られた血漿（１．５ｍｌ）を、ラベルを付けた凍結チューブに移し、瞬間凍結させた後、凝固プロファイルのために窒素気相シッパーでＡｎｔｅｃｈ  ＧＬＰに輸送した。血清を、室温で１時間、凝固活性化因子なしで、遠心分離チューブにおいて血液をインキュベートして、４℃で１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離することによって、凝固させることによって、調製した。血清アリコートを、事前にラベルを付けた凍結チューブに移し、瞬間凍結させた後、臨床化学プロファイルのために、窒素気相シッパーでＡｎｔｅｃｈ  ＧＬＰ  Ｓｕｐｅｒに輸送した。
【０２９１】
房水収集
【０２９２】
硝子体内注射に関して示されるように眼の準備を行った後、ベースラインおよび示される硝子体内注射後の日程で、両眼の前房穿刺後に、３１ゲージの０．３ｍＬのシリンジを使用して、房水（約０．０５ｍＬ）の試料を採取した。房水アリコートを、事前にラベルを付けた凍結チューブに移し、瞬間凍結させ、−８０℃で保管した後、窒素気相シッパーでドライアイス上においてスポンサーに輸送した。
臨床観察
【０２９３】
全般的な健康状態を、ケージサイド観察によって、１日２回確認する。動物を、眼科検査のために鎮静させた時点で、体重を計測した。
評価の基準
【０２９４】
一次エンドポイント
・細隙灯検査
・眼底部撮像
・房水試料
・血漿試料
・ＣＢＣ試料
・血清試料
【０２９５】
二次エンドポイント
・臨床観察
結果
臨床検査
【０２９６】
サルを、ベースラインおよびそれぞれの眼科観察間隔で、体重、ならびに外皮、胸部、および腹部の完全性を含む、一般的な健康状態に関して、身体検査によって評価した。すべての身体検査の所見は、正常な限度の範囲内であった。眼科検査により、ビヒクルの硝子体内への注射を受容した両方の眼が、この手順に十分に寛容性であり、注射関連の併発症は最小限であったことが明らかとなった。低用量のＣＣ−１０１に関しても同じことが当てはまり、軽度の一過性虹彩充血（Ｋ６００、７日目）および角膜沈着（Ｋ６００、１４日目）のみがあった。高濃度のＣＣ−１０１の投与は、しかしながら、より持続的な眼炎症をもたらし、ここでも、軽度の角膜沈着（Ｋ６００およびＫ７８７、３１日目および３３日目）および前房内細胞（Ｋ７８７、３１日目、Ｋ６００およびＫ７８７、３３日目）として現れ、軽度の虹彩充血（Ｋ６００、３１〜４３日目、Ｋ７８７、３６日目および４３日目）、水晶体被膜細胞（Ｋ７８７、３１日目および３３日目）、および硝子体細胞（Ｋ７８７、３３〜４３日目）を伴った。高用量のＣＣ−１０１後の炎症のすべての兆候は、投薬後２１日目までに解決された。
撮像
【０２９７】
ビヒクル処置眼（Ｋ６０１、両眼）の前眼部および眼底部の画像は、２９日目に、Ｋ６０１の右眼における散瞳剤への応答の低減を除き、すべての検査間隔で正常な限度内にとどまったが、眼底部画像の品質の低下が生じた。散瞳剤に対する瞳の応答の低減およびその結果としての眼底部画像品質の低下は、ＣＣ−１０１処置眼においてさらに明らかであり、１４、２１および２９日目にＫ６００の左眼に生じ、同じ時点でＫ６００の右眼においては低い程度で生じ、７、２９、３６、および４３日目においてＫ７８７の両眼に生じたが、それ以外では前極および後極は、正常な限度内にとどまっていた。
臨床病理
【０２９８】
臨床病理パラメーターは、研究の間、安定したままであった。
安全性
【０２９９】
この研究において生成されたデータは、主として、眼内注射後のＣＣ−１０１ヒスチジンの寛容性を評価するように設計した。寛容性を、細隙灯検査、眼圧検査、および眼底部撮像によって評価したが、これにより、より高いＣＣ−１０１濃度における軽微な炎症が明らかとなった。毎日のケージサイド検査によって、硝子体内注射の有害な全身作用は、観察されなかった。動物は、研究の終了時に、良好な健康状態で通常の収容状態に戻った。
結論：
【０３００】
薬物に誘導される眼の炎症は、眼内硝子体内薬物処置で観察され、十分に認識される。この研究は、アフリカミドリザルにおける有効性試験の用量を確立するために、ＣＣ−１０１ヒスチジンの眼内寛容性を評価するように設計した。投薬バイアルの凍結乾燥物含量を１ｍＬの０．９％食塩水中に懸濁した、最初に評価したＣＣ−１０１の用量は、硝子体内注射後に十分に寛容され、細隙灯検査によって最小限の一過的な炎症変化が検出されたが、投薬３週間後までに解決した。
【０３０１】
この所見は、２倍高い用量を探究するための根拠を提供し、この２倍高い用量では、細隙灯検査によるより持続的で一貫した軽度の炎症兆候が生じたが、これもまた、投薬３週間後までに完全に解決した。より高いＣＣ−１０１用量を、低用量と同じ眼／動物において評価したことを考えると観察された炎症応答が、高用量そのものではなく、ＣＣ−１０１への繰り返しの曝露に対する免疫応答を反映した可能性は、排除できない。
【０３０２】
ヒト細胞由来の薬物生成物として、ＣＣ−１０１が、そのような獲得免疫応答に寄与し得る抗原性ペプチド画分を含有すると想定される。後続の研究設計において投薬の慢性度を制御するまで、無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）を、はっきりと定義することはできないが、しかしながら、これらのデータは、確かに、１回の単回用量のＣＣ−１０１が、十分に寛容性であり、アフリカミドリザル試験システムにおける薬力学的評価に適切な用量を表すと予想されることを示す。
（実施例４）
ｉｎ  ｖｉｖｏでの外傷性脳損傷および視覚欠損研究。
【０３０３】
外傷性脳損傷は、失明をもたらす進行性の視覚問題を高頻度で引き起こす。爆風損傷後の小膠細胞の分極に起因する炎症は、視覚欠損の発症において極めて重要な役割を果たし得る。この研究において、ＣＣ−１０１または脂肪組織由来の間葉系幹細胞（脂肪由来の幹細胞ＡＤＳＣ）が、爆風損傷による網膜組織損傷を制限し、直接的な細胞と細胞との接触または細胞に依存しないパラクリンシグナル伝達を通じて、視覚機能を改善することができるかどうかを評価した。
方法：
爆風損傷モデル
【０３０４】
過圧爆風を、修正したペイントボール銃（Ｉｎｖｅｒｔ  Ｍｉｎｉ、Ｅｍｐｉｒｅ  Ｐａｉｎｔｂａｌｌ）、加圧空気タンク、およびｘ−ｙ表からなる小型の水平方向に載置した空気砲システムによって、送達する。
【０３０５】
１２週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、頭部の頭蓋中央領域の左側の直径７．５ｍｍの領域に限定した５０ｐｓｉの空気パルスに供した。
ＣＣ−１０１処置
【０３０６】
爆風損傷の１時間以内に、マウロカルシン−ｃｙ５ペプチドで標識した１０００個のヒトＡＤＳＣまたは１μＬのＣＣ−１０１（６４μｇ／ｍｌ）（Ｎ＝８匹のマウス／群）を、両眼に硝子体内送達した。爆風のみまたは爆風なしの対照マウスには、生理食塩水を受容させた。
ｉｎ  ｖｉｖｏでのライブ視覚機能実験
【０３０７】
爆風／注射の３週間後および６週間後に、視覚機能実験を、ＯｐｔｏＭｏｔｒｙ（Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）を使用して、標準的な手順によって、視力およびコントラスト感度に関して、視動性トラッキング（ＯＫＴ）によって評価した。
【０３０８】
血管透過性を測定するために、フルオレセイン血管造影検査を行った。マウスに、ケタミン／デクスドミトールカクテルで麻酔を行い、眼を、トロピカミドで拡張させた。約７５μｌのフルオレセインナトリウム（２．５ｍｇ／ｍｌ）を、腹腔内注射し、注射の３０〜６０秒以内に、網膜（左眼のみ）を撮像した。続いて、右眼を撮像した（平均で、腹腔内注射の２〜３分後）。Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶ  Ｒｅｔｉｎａｌ顕微鏡（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）を使用し、適切なフィルターを使用して、明視野、Ｃｙ５蛍光（可能な場合）、および緑色蛍光を捕捉した。スナップショットを、ビデオから取得した。
ＧＦＡＰ免疫組織化学検査
【０３０９】
研究の最後に、動物を、安楽死させた。眼は、ＡＤＳＣまたはＡＤＳＣ−ＣＭ（ＣＣ−１０１）の注射の６週間後に眼球摘出を行い、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドに固定し、４℃で一晩、３０％スクロースにおいて凍害から保護した。その後、眼を、最適切断温度（ＯＣＴ）コンパウンドに埋込み、凍結切断によって１０μｍの切片にした。ＧＦＡＰ免疫組織化学的分析を、研究群に関して盲検状態の調査者によって行った。簡単に述べると、視神経頭（ＯＮＨ）付近の網膜切片を、１倍ＰＢＳで洗浄して、ＯＣＴコンパウンドを除去し、抗原賦活のためにクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０中で沸騰させ、室温で３０分間、ヤギブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、１０％ヤギ血清／５％ＢＳＡ／０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中でブロッキングした。神経膠症を評価するために、切片を、加湿チャンバーにおいて、ＧＦＡＰ一次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１：２５０）とともに、４℃で一晩インキュベートした。翌日、切片を、１倍ＰＢＳで３回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８およびＤＡＰＩ（いずれもＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にコンジュゲートした１：５００のヤギ抗マウスＩｇＧとともにインキュベートして、室温で１．５時間、核を染色した後、１倍ＰＢＳで洗浄した。最後に、スライドを、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ封入剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で封入し、室温で一晩、暗所で乾燥させた。各スライドに関して、１つの切片を、一次抗体なしの陰性対照として保持した。デジタル画像を、Ｚｅｉｓｓ  ７１０レーザー走査共焦点顕微鏡を使用して、およそ２０〜１００μｍ間隔で、３つの網膜切片のＯＮＨと鋸状縁との中間の領域から捕捉し、各抗原のピクセル強度の定量化を、ＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェアを使用して計算した。
結果：
【０３１０】
図１１に示されるように、ＣＣ−１０１の硝子体内注射により、３週間で爆風マウスにおける視力が改善され、保護効果は６週間で持続した。同様に、ＣＣ−１０１の硝子体内注射により、コントラスト感度も改善された。（図１２を参照されたい）。ＡＤＳＣの硝子体内注射は、ＣＣ−１０１と同様の効果を十分に実証した。
【０３１１】
ＡＤＳＣおよび／またはＣＣ−１０１の硝子体内投与により、明視野およびフルオレセイン血管造影で観察されるように、血管漏出が改善された。（図１３Ａを参照されたい）。局所爆風性軽度ＴＢＩモデルは、フルオレセイン漏出（微小血管の損傷）を伴う、網膜における病変部の拡張（可能性として、ＲＰＥの過剰増殖）を示したが、これは、ＣＣ−１０１を受容した動物においてはほぼ完全に不在であった。興味深いことに、ｃｙ−５で標識したＡＤＳＣは、病変部と特異的に関連していることが見出された。ＣＣ−１０１処置動物の免疫組織学的分析では、ＯＮＨと鋸状縁との中間の領域において、有意に低いＧＦＡＰも示された（図１３Ｂを参照されたい）。
結論：
【０３１２】
これらの所見は、ＣＣ−１０１ならびにＡＤＳＣが、活性化炎症促進性小膠細胞および網膜内皮細胞に対する抗炎症特性を通じて、爆風損傷の視覚欠損を改善することを示唆する。さらなる研究が保証されているが、ＴＢＩからの視覚回復は、細胞に依存しないパラクリンシグナル伝達を通じて機能すると考えられる。ＡＤＳＣおよびＣＣ−１０１の観察された治療効果が類似していることを考えると、損傷時に即時送達するための貯蔵安定性の再生治療薬は、網膜に対する爆風損傷の外傷作用に対して、実用的で費用効果的な解決策を提供し得る。
【０３１３】
爆風損傷は、再現的に、病変部および血管漏出を示す。爆風損傷を受けたＣＣ−１０１動物は、有意な正常外見を示し、漏出を示さない。
（実施例５）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管透過性アッセイ。
【０３１４】
５０×１０３個のＨＲＭＶＥＣ細胞を、コーティングした（付着因子で、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上部チャンバー（０．４μｍポリカーボネートトランスウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．）において、２５０μｌのＣＳＣ完全培地（１０％血清、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ）で培養し、５００μｌのＣＳＣ完全培地（１０％血清）を、３７℃、５％ＣＯ２で底部チャンバーに充填した。
【０３１５】
４８時間後に、上部チャンバーを、ＣＣ−１０１（１０％血清を維持するために新しい培地で１：１の比で希釈した）ありおよびなしで、スタウロスポリン（ＳＴ、１μｍ）に曝露した。底部ウェルを、１０％血清を有する５００μｌの培地と置き換えた。
【０３１６】
２時間の処置後に、上部チャンバーから培地を除去し、Ｃａ／Ｍｇ不含のＤＰＢＳ中の１００μｌの４ｋＤａ−ＦＩＴＣデキストラン（５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。１時間後に、底部ウェルから１００μｌの培地を収集し、蛍光を、プレートリーダー（４８５ｎｍ励起および５２０放出）を使用して測定した。測定した蛍光の量により、上部チャンバーのトランスウェルに存在するＨＲＭＶＥＣ細胞を通じたＦＩＴＣデキストラン漏出量を得る。
【０３１７】
図１５に示されるように、ＳＴとともにインキュベートしたインサートにおけるヒト網膜内皮細胞は、蛍光における有意な２倍増加を示した。一方で、ＣＣ−１０１とともにインキュベートした細胞は、蛍光における有意な低減を示した。示されているデータは、３連で行った１回の実験からのものである（＊＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。
均等物
【０３１８】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が、添付の上記説明において説明されている。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が、記載されている。
【０３１９】
前述の説明は、例示の目的のためだけに提示されたものであり、本発明を開示された厳密な形式に制限することを意図するものではなく、本明細書に添付されている特許請求の範囲によって制限する。
【図１】
2019509033.tif 000011
【図２Ａ】
2019509033.tif 000012
【図２Ｂ−１】
2019509033.tif 000013
【図２Ｂ−２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
2019509033.tif 000020
【図６Ａ】
2019509033.tif 000021
【図６Ｂ】
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【図７Ａ−１】
2019509033.tif 000023
【図７Ａ−２】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１６−７】
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【図１６−８】
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【図１６−９】
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【図１６−１０】
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【図１６−１１】
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【図１６−１２】
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【図１６−１３】
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【図１６−１４】
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【図１６−１５】
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【図１６−１６】
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【図１６−１７】
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【図１６−１８】
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【図１６−１９】
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【図１６−２０】
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【図１６−２１】
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【図１６−２２】
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【図１６−２３】
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【図１６−２４】
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【図１６−２５】
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【図１６−２６】
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【図１６−２７】
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【図１６−２８】
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【図１６−２９】
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【図１６−３０】
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【図１６−３１】
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【図１６−３２】
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【図１６−３３】
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【図１６−３４】
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【図１６−３５】
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【図１６−３６】
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【図１６−３７】
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【図１６−３８】
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【図１６−３９】
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【図１６−４０】
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【図１６−４１】
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【図１６−４３】
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【図１６−４４】
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【図１６−５０】
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【図１６−６０】
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【図１６−７０】
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【図１６−８０】
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【図１６−８３】
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【図１６−８５】
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【図１６−８７】
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【図１６−９０】
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【図１６−９１】
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【図１６−９２】
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【図１６−９３】
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【図１６−９４】
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【図１６−９５】
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【図１６−９６】
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【図１６−９７】
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【図１６−９８】
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【図１６−９９】
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【図１６−１００】
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【図１６−１０１】
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【図１６−１０２】
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【図１６−１０３】
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【図１６−１０４】
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【図１６−１０５】
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【図１６−１０６】
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【図１６−１０７】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【国際調査報告】
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