(57)【要約】  ポリペプチドＦＫＢＰ−Ｌおよびそのペプチドフラグメントを使用する眼疾患、より具体的に角膜の障害の処置が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜血管新生の処置または予防に使用するためのＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメント。
【請求項２】
角膜移植手術後の角膜血管新生の予防または処置のための、請求項１に記載の使用のためのＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメント
【請求項３】
眼の炎症性障害の処置または予防に使用するためのＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメント。
【請求項４】
該眼の炎症性障害がぶどう膜炎である、請求項３に記載の使用のためのＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメント
【請求項５】
該眼の炎症性障害がドライアイ症候群である、請求項３に記載の使用のためのＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメント
【請求項６】
該眼の炎症性障害が眼瞼角結膜炎である、請求項３に記載の使用のためのＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメント
【請求項７】
該ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたは生物学的に活性なペプチドそのフラグメントが目に局所的に投与される、請求項１〜６の何れかに記載の使用のためのＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメント。
【請求項８】
該ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたは生物学的に活性なペプチドそのフラグメントが結膜下注射、基質内注射または眼内注射により投与される、請求項１〜６の何れかに記載の使用のためのＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメント。
【請求項９】
該生物学的に活性なペプチドフラグメントは、アミノ酸配列ＩＲＱＱＰＲＤＰＰＴＥＴＬＥＬＥＶＳＰＤＰＡＳ(配列番号３)またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１〜８の何れかに記載の使用のためのＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメント。
【請求項１０】
該ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドが配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１〜８の何れかに記載の使用のためのＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメント。
【請求項１１】
該生物学的に活性なペプチドフラグメントが配列番号４〜２３の何れかに示すアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１〜８の何れかに記載の使用のためのＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメント。
【請求項１２】
処置を必要とする対象に治療有効量のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメントを投与することを含む、哺乳動物対象における角膜血管新生を処置または予防する方法。
【請求項１３】
処置すべき対象が角膜移植手術を受けている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
処置を必要とする対象に治療有効量のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメントを投与することを含む、哺乳動物対象における眼の炎症性障害を処置または予防する方法。
【請求項１５】
眼の炎症性障害がぶどう膜炎である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
眼の炎症性障害がドライアイ症候群である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
眼の炎症性障害が眼瞼角結膜炎である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
該ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたは生物学的に活性なペプチドそのフラグメントが眼に局所的に投与される、請求項１２〜１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
該ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたは生物学的に活性なペプチドそのフラグメントが結膜下注射、基質内注射または眼内注射により投与される、請求項１２〜１７の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
該生物学的に活性なペプチドフラグメントがアミノ酸配列ＩＲＱＱＰＲＤＰＰＴＥＴＬＥＬＥＶＳＰＤＰＡＳ(配列番号３)またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１２〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
該ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドが配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１２〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
該生物学的に活性なペプチドフラグメントが配列番号４〜２３の何れかに示すアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１２〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
処置される対象がヒトである、請求項１２〜２２の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリペプチドＦＫＢＰ−Ｌおよびそのペプチドフラグメントを使用する眼疾患の処置、より具体的に角膜の障害の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
健康な角膜は、視覚に必須である。ＷＨＯによると、世界的に、角膜性失明は、白内障、緑内障および加齢黄斑変性症に続く、４番目の失明原因である。世界中で、年間で７００万を超える人々が、角膜瘢痕および眼の血管異常増殖(血管新生)により失明している。角膜損傷が生ずる臨床的状況において、瘢痕形成を最小化し、従って失明を最小にすることが不可避である。血管新生誘発角膜混濁損傷の現在の処置は、角膜移植であるが、しかしながら、血管新生の存在それ自体、この高リスク群における移植後の予後悪化に寄与する。角膜移植が、無血管性受容床に成されたら(低リスク角膜移植)、２年移植片生存率は、局所ステロイドカバー下、９０％に近づく(Kuechle et al., 2002)。血管付き、受容床において(高リスク角膜移植)、２年間の移植片生存は、５０％未満まで有意に減少する(Cursiefen et al., 2002)。縫合は、常に顕著な新生血管応答を誘発し、これはまた角膜拒絶反応のリスクの増加と関係する。それ故に、角膜移植片が適所に固定される手段それ自体さえ、移植片拒絶反応のリスクを増加させる。本明細書に提供されるような新規選択肢が、コルチコステロイドなどのこのタイプの眼疾患の処置に現在利用可能な処置の効果が限定的であり、副作用のリスクがあるため、是が非でも必要である。
【０００３】
ドライアイ症候群は、人口の３０％までに影響する極めて一般的な問題であり(Clegg et al., 2006)、重篤な場合、顕著な炎症と関係する眼表面への損傷を起こし得る。ドライアイ症候群における炎症は、炎症性細胞の浸潤および免疫マーカーの発現上方制御と関係する。この状態は、主にコルチコステロイドおよび／またはＴ細胞阻害剤シクロスポリンで管理されている(Pflugfelder, 2003)。長期コルチコステロイドの既知の付随合併症は、別の有効な処置の探索を高い優先度とする。刺痛および不快感によるシクロスポリンに対する耐容性の欠如および相当数の患者における有効性の欠如は、他の有効な処置に対する探求が極めて重要であることを意味する。
【０００４】
小児眼酒さは、別名眼瞼角結膜炎とも称され、慢性後部および前部眼瞼炎により特徴付けられる、珍しい状態である。一部症例では、付随する眼炎症が顕著であり、角膜浸潤、潰瘍化および角膜血管新生に至る(Doan et al., 2007)。根底にある病理は、原発のマイボーム腺炎、続く細菌過増殖およびＴ細胞介在炎症によると考えられる。処置の大黒柱は、経口または局所抗生物質、局所ステロイドおよび／またはステロイド低減剤としてのシクロスポリンの組み合わせである。この状況でしばしば生じ得る角膜血管新生は、急速かつ攻撃的に生じ、進行を押さえるまたは止めるために、高用量局所ステロイドを必要とする。この状態は、有効であり、小児の眼への局所ステロイドの長期使用の現在の必要性を低減する、より良い管理戦略を必要とする。
【０００５】
角膜内の血管退行を誘発するための大部分の処置戦略は、抗ＶＥＧＦ処置を利用しており、このタイプの処置は該状態の初期ならばしばしば充分成功するが、血管が十分に確立されたならば、抗ＶＥＧＦ処置に非応答性となる。あらゆる現在の抗ＶＥＧＦ手法での困難性は、特に該状態がしばしば一進一退し、さらなる炎症を生じ、さらなる血管新生を促進するため、しばしば長期に亘る反復注射を必要とすることである。現在、角膜内で十分に確立された血管を除去するのに利用可能な医学的処置はない。これらの状況での唯一の処置は、レーザー処置または焼灼の使用であり、この何れも、満足とはほど遠く、しばしば、外科的反復介入を必要とする(Gupta & Illingworth, 2011)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
角膜血管新生を低減または予防できるおよび／または炎症性眼疾患を低減または予防できる、新規治療の提供に対する臨床的必要性がある。このような治療は、単独処置としてまたは他の治療剤と組み合わせて使用するために重要であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の要約
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドおよびそのペプチドフラグメントは、癌、特に固形腫瘍の処置において臨床的可能性を有する抗血管形成剤として、先に報告されている。
【０００８】
ＦＫＢＰ−Ｌのペプチドフラグメントは、現在、眼疾患の動物モデル、例えばラット角膜縫合モデルおよびマウス実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎(ＥＡＵ)モデルで試験されている。驚くべきことに、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドフラグメントの角膜への局所投与が、血管形成の顕著な減少をもたらすことが観察された。さらに、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドはまた、眼に注射したときおよび非経腸(腹腔内)投与したときの何れでも、眼の抗炎症剤として作用する。これらの実験的知見は、血管新生および／または炎症により特徴付けられる／関連する多くの眼疾患の処置における、ＦＫＢＰ−Ｌおよびその生物学的に活性なペプチドフラグメントの臨床的有用性を支持する。
【０００９】
それ故に、本発明の第一の態様により、角膜血管新生の処置または予防に使用するための、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメントが提供される。
【００１０】
ある実施態様において、角膜移植手術後の角膜血管新生の予防または処置に使用するための、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメントが提供される。
【００１１】
さらなる実施態様において、眼の炎症性障害の処置または予防に使用するための、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメントが提供される。
【００１２】
ある実施態様において、眼の炎症性障害はぶどう膜炎、ドライアイ症候群または眼瞼角結膜炎である。
【００１３】
本発明は、さらに、処置を必要とする対象に治療有効量のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメントを投与することを含む、哺乳動物対象における角膜血管新生を処置または予防する方法を提供する。
【００１４】
ある実施態様は、角膜移植手術を受けている対象における角膜血管新生を処置または予防する方法に関する。
【００１５】
本発明は、なおさらに、処置を必要とする対象に治療有効量のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメントを投与することを含む、哺乳動物対象における眼の炎症性障害を処置または予防する方法を提供する。
【００１６】
ある実施態様において、眼の炎症性障害はぶどう膜炎、ドライアイ症候群または眼瞼角結膜炎である。
【００１７】
ある実施態様において、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメントは、目に局所的に投与される。
【００１８】
ある実施態様において、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその生物学的に活性なペプチドフラグメントは、結膜下注射、基質内注射または眼内注射により投与される。
【００１９】
本発明の上記態様の各々の好ましい実施態様において、該処置／予防に使用されるＦＫＢＰ−Ｌの生物学的に活性なペプチドフラグメントは、アミノ酸配列ＩＲＱＱＰＲＤＰＰＴＥＴＬＥＬＥＶＳＰＤＰＡＳ(配列番号３)またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
【００２０】
さらなる実施態様において、該処置／予防に使用されるＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
【００２１】
さらなる実施態様において、該処置／予防に使用されるＦＫＢＰ−Ｌの生物学的に活性なペプチドフラグメントは、配列番号４〜２３の何れかに示すアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
【００２２】
好ましい実施態様において、処置される対象はヒトである。
【００２３】
本発明の特徴を以下にさらに詳述する。本発明は、その適用を特許請求の範囲、明細書および図面に詳細に記載したものに限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施態様および種々の方法での実施または実行が可能である。
【００２４】
図面の簡単な説明
本発明は、次の図面を参照してさらに理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ラットにおける縫合誘発血管新生。黒矢印は縫合の位置を示し、白矢印は血管新生を示す。
【００２６】
【図２】結膜下注射  −  (Ａ)トリアムシノロン処置ラット(左パネル)、ＰＢＳ対照ラット(中央パネル)およびＡＬＭ２０１処置ラット(右パネル)における、縫合により誘発された血管新生。(Ｂ)対照と比較したトリアムシノロンまたはＡＬＭ２０１の結膜下注射の効果。
【００２７】
【図３】局所処置  −  (Ａ)ＰＢＳ対照ラット(左パネル)およびＡＬＭ２０１処置ラット(右パネル)における縫合により誘発された血管新生。(Ｂ)局所対照と比較した局所ＡＬＭ２０１の効果。
【００２８】
【図４】デキサメサゾン(左パネル)、ＡＬＭ２０１(右パネル)またはＰＢＳ対照(中央パネル)の結膜下注射で処置したHooded Listerラットにおける縫合誘発血管新生。
【００２９】
【図５】処置経過中の実験マウスの体重。体重を、１０日処置期間中、１日１回測定した。矢印は、ＡＬＭ２０１＋デキサメサゾン処置群(Ｅ)における２匹のマウスの３〜５日目の体重減少を示す。
【００３０】
【図６】ＥＡＵマウスにおける網膜炎症および臨床スコア。(Ａ)炎症マウス網膜からの眼底像の例。(Ｂ−Ｆ)マウスを、ＩＲＢＰペプチド１−２０で免疫化した。免疫化後１４日目からマウスをＰＢＳ(Ｂ)またはＡＬＭ２０１  ０.３mg／kg(Ｃ)またはＡＭＬ２０１  ３mg／kg(Ｄ)、デキサメサゾン０.５mg／kg(Ｅ)またはＡＬＭ２０１  ０.３mg／kg＋デキサメサゾン０.５mg／kg(Ｆ)で１日１回処置した。眼底像(Ｂ−Ｅ)免疫化後２４日目に撮り、臨床スコア(Ｇ)を、標準的評点方式を使用して得た(Xu et al. 2008a)。
【００３１】
【図７】ＡＬＭ２０１処置したＥＡＵモデルにおいて経時的変化を示す、種々の群のマウスにおけるＥＡＵの臨床スコア。眼底像を、ＴＥＦＩ系を使用して免疫化後１４日目および免疫化後２４日目に実験マウスから撮った。臨床的疾患を、先に記載した標準的評点方式を使用して段階分けした(Xu et al. 2008a)。＊＊、Ｐ＜０.０１、対応のあるスチューデントのｔ検定。
【００３２】
【図８】種々の群のマウスにおけるＥＡＵの組織学および組織学的スコア。１０日治療後、マウスを屠殺し、眼を標準的Ｈ＆Ｅ染色のために採取した。各眼の種々の層からの少なくとも３切片を組織学的スコア分析のために使用した。(Ａ)ＰＢＳ処置ＥＡＵマウスからの画像。(Ｂ)ＡＬＭ２０１  ０.３mg／kg処置ＥＡＵマウスからの画像。(Ｃ−Ｄ)ＡＬＭ２０１  ３mg／kg処置マウスからの画像。(Ｅ)デキサメサゾン処置マウスからの画像。(Ｆ、Ｇ)デキサメサゾン＋ＡＬＭ２０１  ３mg／kg処置マウスからの画像。(Ｈ)マウスの各処置群についての組織学的スコアを集め、散布図としてプロットした。Ｌ、水晶体；Ｖｉ、硝子体腔；ＧＬ、神経節層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＮＬ、外顆粒層；Ｃｈ、脈絡膜；ＰＯＳ、視細胞外節。＊、Ｐ＜０.０５；＊＊、Ｐ＜０.０１；＊＊＊、ＰＢＳ処置群と比較してＰ＜０.００１、マン・ホイットニーのＵ検定。
【００３３】
【図９】(Ａ)ｍ／ｚ  ２５７６.３０３±０.００５DaでのペプチドのＦＴＩＣＲマススペクトル。標準(ＳＴＤ)１００nM斑形成オフ組織、ａ２)ＳＴＤ  １００nMオン組織、ａ３)ペプチドの理論的モノアイソトピック分布。ａ４)１００μMおよびａ５)１００nMペプチドで局所的に処置した角膜組織。観察されたペプチドモノアイソトピック質量は理論的分布と一致した(質量精度は、３５０Ｋ質量分解能で＜５ppmであった)；(Ｂ)ｍ／ｚ  ２５７６.３０３±０.００５DaでのＡＬＭ２０１のＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳＩヒートマップ分布；(Ｃ)内在性代謝物のｍ／ｚ  １０２８.１３５±０.０２５Da(大部分角膜に分布)、１４４４.５８４±０.０２５Da(大部分水晶体に分布)、７８２.５７９９±０.０２５Da(大部分房水およびガラス体液に分布)、７８０.５４５１±０.０２５Da(筋肉(青色)に分布)、８３５.５８９１±０.０２５Daおよびペプチド(眼全体に分布)２５７６.３０３±０.０２５Daでのヒートマップ。シグナル強度を示すスケール上に記載する。スケールバーは１０００μmである。データをＲＭＳで正規化した。空間分解能は４０〜５０μmである。
【００３４】
【図１０】Ｈ＆Ｅ染色ラット眼切片および２５７６.３±０.１DaでのＭＡＬＤＩ−ＭＳＩ画像の重ね合わせ。正常眼を、１００μMのＡＬＭ２０１で３日、連日処置し、次いで、最後の処置１５分後眼球除去した。画像は、ペプチドの大部分がガラス体液およびおそらく水晶体と共存することを示す。ペプチドはまた角膜、強膜、脈絡膜および網膜に共存する(空間分解能は約２０μmである)。
【００３５】
【図１１】縫合および処置後６日目、処置サンプル(ＡＬＭ２０１、１μMまたは１００μM)と比較して対照サンプル(ＰＢＳまたはデキサメサゾン)で細胞浸潤増加を示す、ヘマトキシリンおよびエオシン(Ｈ＆Ｅ)染色による組織学的分析。(Ａ)実験群の各々のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片。白矢印は縫合部位を示し、黒矢印は血管を示す(スケールバー＝５００μm)。下部パネルは、各処置群からの切片におけるＣＤ６８＋細胞の分布を示す。各実験群の(Ｂ)総浸潤細胞数および(Ｃ)ＣＤ６８＋浸潤細胞数を定量し、ペプチド処置群と比較して多い浸潤細胞数が対照群に存在する。
【００３６】
【図１２】実施例４に記載するＡＬＭ２０１濃度タイトレーション実験の模式図。
【００３７】
【図１３】(Ａ)ＰＢＳ(媒体対照)、デキサメサゾン(陽性対照)および数種の異なる濃度のＡＬＭ２０１(０.０１μM、０.１μM、１μM、１０μMおよび１００μM)で処置６日後のラット眼の臨床的写真；(Ｂ−Ｄ)各濃度のＡＬＭ２０１と対照ＰＢＳおよびデキサメサゾンを併せた縫合部位までの血管の距離(Ｂ)、血管密度(Ｃ)および炎症(Ｄ)を示す臨床スコアリンググラフ。
【００３８】
【図１４】縫合糸挿入後、次いでＡＬＭ２０１ペプチドで処置後の角膜上皮および支持実質組織の組織における変化を示すＨ＆Ｅ画像。この染色を使用して、浸潤細胞を計数し、縫合部位を発見した。黒矢印＝縫合部位。
【００３９】
【図１５】隣接スライドを、示す処置群におけるＣＤ４４発現の差異を示すための免疫組織化学染色に使用した。
【００４０】
【図１６】隣接スライドを、示す処置群におけるＦＫＢＰＬ発現の差異を示すための免疫組織化学染色に使用した。
【００４１】
【図１７】示す処置群における抗ＮＦκＢ  ｐ６５抗体およびＤＡＰＩを使用する免疫組織化学染色。
【００４２】
【図１８】示す処置群における抗ｐ−ＩκＢα  ｐ６５抗体およびＤＡＰＩを使用する免疫組織化学染色。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な記載
定義
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、当分野の当業者が共通して理解するのと同じ意味を有する。実施者は、特に本分野の定義および用語について、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)を指示される。アミノ酸残基の略語は、２０の一般的Ｌ−アミノ酸の１つを指称するために使用される標準的３文字および／または１文字コードである。
【００４４】
“ここに包含する”とされるあらゆる文献は、その全体を包含すると理解される。
【００４５】
本明細書で使用する限り、単数表現は、明示しない限りおよび明解に１つをいうと限定されない限り、複数の対象を含む。用語“または”は、文脈から他の解釈が明らかに必要でない限り用語“および／または”を含む。
【００４６】
また、用語“部分”および“フラグメント”は相互交換可能に使用され、ポリペプチド、核酸または他の分子構築物の一部をいう。
【００４７】
ここで使用する用語“生物学的に活性なＦＫＢＰ−Ｌペプチド”(例えば、フラグメントおよび／または修飾ポリペプチド)は、完全長ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドと同一または類似する量およびタイプの活性を示すペプチドまたはポリペプチドをいうために使用する。ここでＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、フラグメントまたは誘導体の“生物学的活性”は、抗血管形成活性、血管形成および／または血管成長の阻害および抗炎症性活性の何れか１つを含む。ＦＫＢＰ−Ｌフラグメントまたは誘導体の生物学的活性を、例えばラット角膜縫合モデルまたはＥＡＵモデルなどの付随する実施例に記載するインビトロまたはインビボアッセイの何れかを使用して、完全長ＦＫＢＰ−Ｌと比較して試験し得る。
【００４８】
ここで使用する“対象”は動物であり得る。例えば、対象は哺乳動物であり得る。また、対象はヒトであり得る。別の実施態様において、対象は雄性でも雌性でもよい。ある実施態様において、対象は患者であってよく、ここで、患者は障害または疾患の医学的治療下にあるおよび／または医学的治療を積極的に求めている個体である。
【００４９】
“ポリペプチド”および“タンパク質”は、部分的または完全長タンパク質を含み得るタンパク質分子をいうために、相互交換可能にここで使用される。用語“ペプチド”は、文脈から他のことが示されない限り、完全長未満のタンパク質または極めて短いタンパク質をいう。
【００５０】
当分野で知られるとおり、“タンパク質”、“ペプチド”、“ポリペプチド”および“オリゴペプチド”は、アミノ酸(一般にＬ−アミノ酸)の鎖であり、それらのアルファ炭素が、あるアミノ酸のアルファ炭素のカルボキシル基と他のアミノ酸のアルファ炭素のアミノ基の縮合反応により形成されたペプチド結合により連結している。一般に、タンパク質を構成するアミノ酸は、タンパク質のアミノ末端残基から始まり、カルボキシ末端残基に向かって増える順番で番号付けされる。
【００５１】
用語“同一性”または“％同一”は、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列間の配列同一性をいう。％同一性は、２配列をアラインすることにより決定でき、比較配列と共有する位置での同一残基(すなわち、アミノ酸またはヌクレオチド)の数をいう。配列アラインメントおよび比較を、当分野で標準的なアルゴリズム(例えばSmith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:2444)またはＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡとして公的に利用可能なそれらのアルゴリズムのコンピューターバージョン(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)を使用して実施し得る。また、National Institutes of Health, Bethesda MDにより入手可能なＥＮＴＲＥＺを配列比較のために使用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、各プログラム(例えば、ＢＬＡＳＴＮ；National Center for Biotechnology Informationのインターネットサイトから入手可能)のデフォルトパラメータを使用し得る。ある実施態様において、２配列の％同一性を、各アミノ酸ギャップが、２配列間に単一アミノ酸ミスマッチがあるかのように荷重されるように、ギャップ荷重１を用いて、ＧＣＧを使用して決定され得る。またはＧＣＧ(Accelrys, San Diego, CA)配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)を使用し得る。
【００５２】
ここで使用する用語“保存残基”は、同じ構造および／または機能を有する複数のタンパク質の間で同じである、アミノ酸をいう。保存残基の領域は、タンパク質構造または機能に重要であり得る。それ故に、三次元タンパク質において同定される連続保存残基はタンパク質構造または機能に重要であり得る。３−Ｄ構造の保存残基または保存領域を発見するために、異なる種からの同一または類似タンパク質または同じ種の個体の配列の比較を行い得る。
【００５３】
ここで使用する用語“類似”または“相同体”は、アミノ酸またはヌクレオチド配列をいうとき、野生型アミノ酸配列とある程度の相同性または同一性を有するポリペプチドを意味する。相同性比較は目視でまたはより一般には、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて、実施し得る。これらの市販コンピュータープログラムは、２以上の配列間の％相同性を計算できる(例えばWilbur, W. J. and Lipman, D. J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730)。例えば、相同配列を、別の実施態様において、互いに少なくとも７０％同一、７５％同一、８０％同一、８５％同一、９０％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一または９８％同一であるアミノ酸配列を含むように取ることができる。
【００５４】
ここで使用する用語“それと少なくとも９０％同一”は、示す配列と９０〜９９.９９％同一性(その間の全範囲を含む)の範囲の配列を含む。それ故に、用語それと少なくとも９０％同一は、示す配列と９１％、９１.５％、９２％、９２.５％、９３％、９３.５％、９４％、９４.５％、９５％、９５.５％、９６％、９６.５％、９７％、９７.５％、９８％、９８.５％、９９％、９９.５％同一である配列を含む。同様に用語“少なくとも７０％同一”は、７０〜９９.９９％同一(その間の全範囲を含む)の範囲の配列を含む。％同一性の決定は、ここに記載するアルゴリズムを使用して、決定する。
【００５５】
ここで使用する用語“連結”は、２つの異なる基(例えば、核酸配列、ポリペプチド、ポリペプチドドメイン)の共有結合を特定し、連結される２つの基の間に介在原子または原子を有し得る。ここで使用する、“直接的に連結”は、連結される２つの基の間に何ら介入原子がない、２つの異なる基(例えば、核酸配列、ポリペプチド、ポリペプチドドメイン)の間の共有結合を定義する。
【００５６】
用語“ペプチド模倣体”は、分子間の相互作用においてペプチドの代替として働く構造体をいう(Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem., 24:243-252)。ペプチド模倣体は、アミノ酸および／またはペプチド結合を含んでも含まなくてもよいが、ペプチドまたはアゴニストまたはアンタゴニストの構造的および機能的特性を保持する合成構造体をいう。ペプチド模倣体はまたペプトイド、オリゴペプトイド(Simon et al., 1972, Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 89:9367)；および本発明のペプチドに対応するアミノ酸の全ての可能な配列を表す計画された長さのペプチドを含むペプチドライブラリーも含む。
【００５７】
ここで使用する、“有効量”は、対象において所望の効果を生じるのに有効である薬剤の量を意味する。用語“治療有効量”は、動物またはヒトにおいて必要としている治療応答を誘発する薬物または薬剤の量を意味する。有効量を含む実際の用量は、投与経路、対象の体格および健康状態、処置される障害などに依存し得る。
【００５８】
用語“医薬組成物”は、ここでは、哺乳動物宿主に慣用の非毒性担体、希釈剤、アジュバント、媒体などを含む単位投与量製剤で、例えば局所に、全身にまたは眼内に、投与し得る組成物をいう。
【００５９】
ここで使用する用語“薬学的に許容される担体”は、例えば、目的の障害または疾患の処置のために投与される治療組成物として、ヒトまたは動物対象における使用に適する、化合物および組成物をいう。
【００６０】
“安定な”製剤は、その中のポリペプチドまたはタンパク質が保存により本質的にその物理的および化学的安定性および生物学的活性を維持するものをいう。タンパク質安定性を測定するための種々の分析技術が同分野で利用可能であり、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)およびJones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)にレビューされている。安定性は、選択した温度で選択した期間測定し得る。迅速なスクリーニングのために、目的の製剤を４０℃で１週間〜１か月維持し、その間に安定性が測定され得る。凍結乾燥および保存後の凝集の程度をペプチドおよび／またはタンパク質安定性の指標として使用し得る。例えば、“安定な”製剤は、約１０％未満、好ましくは約５％未満のポリペプチドまたはタンパク質が製剤に凝集物として存在するものである。凍結乾燥および凍結乾燥製剤の保存後の凝集物形成増加が決定され得る。例えば、“安定な”凍結乾燥製剤は、凍結乾燥製剤を４０℃で少なくとも１週間インキュベートしたとき、凍結乾燥製剤における凝集物増加が約５％未満または約３％未満であるものである。融合タンパク質製剤の安定性を、ここに記載する結合アッセイなどの生物学的活性アッセイを使用して測定し得る。
【００６１】
眼疾患処置用ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド
本発明は、ＦＫＢＰ−Ｌおよび特にＦＫＢＰ−Ｌのペプチドフラグメントが、眼に投与されたとき、角膜血管の形成を減少させ、かつ抗炎症性活性を示し得るとの観察に基づく。これらの知見は、一定範囲の眼障害および特に角膜血管新生に関連するまたは介在する眼障害および炎症に関連するまたは介在する眼障害の処置におけるＦＫＢＰ−Ｌおよびそのペプチドフラグメントの有用性を支持する。
【００６２】
用語“ＦＫＢＰ−Ｌ”は、ＦＫ５０６結合タンパク質様タンパク質をいう(McKeen  et al. Endocrinology, 2008, Vol 149(11), 5724-34; Gene ID:63943)。ＦＫＢＰ−Ｌおよびそのペプチドフラグメントは、強力な抗血管形成活性を有することが先に示されている(ＷＯ２００７／１４１５３３)。ＦＫＢＰ−Ｌペプチドフラグメントの抗血管形成活性は、完全長タンパク質のＮ末端領域における３４位と５７位のアミノ酸の間に位置するアミノ酸配列に依存すると考えられる。この抗血管形成活性は、癌、特に固形腫瘍の処置における本ペプチドの臨床的有用性を示唆した。本発明は、角膜血管新生および眼の炎症性障害などの眼疾患の処置におけるＦＫＢＰ−Ｌおよびそのペプチドフラグメントの特定の臨床的有用性を示すことにより、ＷＯ２００７／１４１５３３による知見を凌ぐものである。
【００６３】
本発明の実施態様は、眼疾患の処置における治療剤としての、完全長ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドおよび生物学的活性を示すそのペプチドフラグメント、ならびに完全長タンパク質または生物学的に活性なペプチドフラグメントの修飾形態および誘導体の使用を包含する。
【００６４】
“ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド”という表現は、本明細書においてその最も広い意味で使用される。それは、配列番号１に示す天然に存在する完全長タンパク質を、生物学的活性を保持する該ポリペプチドの多型による相同体、他のバリアント、変異体および部分と共に意味する。例えば、ある実施態様において、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、配列番号１(GENBank Accession No. NP_071393; NM_022110; [gi:34304364])または野生型配列の１８１位にスレオニンおよび１８６位にグリシンを有する配列番号２を含む。他のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの構築物(例えば、フラグメントおよび他の修飾体)およびＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物の例はＷＯ２００７／１４１５３３に記載され、その内容を、明示的にこの目的のために、全体として引用により本明細書に包含させる。
【００６５】
配列番号２において、ＦＫＢＰ−Ｌ挿入体(元々Cambridge BioscienceによりＰＵＣ１８にクローン化され、現在ｐｃＤＮＡ３.１にクローン化されている)は、ＰＵＢＭＥＤデータベースに寄託された配列(配列番号１)と比較して、２つの挿入された点変異を有する。５４０bp(開始コドンから)にＴＣＴからＡＣＴの点変異があり、これは、それ故に、セリン(Ｓ)をスレオニン(Ｔ)に変える(アミノ酸：１８１)。また５５５bp(開始コドンから)にＡＧＧからＧＧＧの点変異があり、これは、それ故に、アルギニン(Ｒ)をグリシン(Ｇ)(アミノ酸：１８６)に変える。両ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド(配列番号１および配列番号２)は生物学的活性を示す。
【００６６】
本発明により使用するためのＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはペプチドは、天然および／または化学合成または人工ＦＫＢＰ−Ｌペプチド、ペプチド模倣体、修飾ペプチド(例えば、ホスホペプチド、環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸および非天然アミノ酸含有ペプチド、ステープル化ペプチド、放射標識含有ペプチド)または抗体、炭水化物、単糖、オリゴ糖、多糖、糖脂質、ヘテロ環式化合物、ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその一部に連結されたペプチドおよび／または小有機または無機分子(例えば、ＰＥＧまたは他の安定化基で修飾されたペプチド)を含み得る。それ故に、本発明のＦＫＢＰ−Ｌ(ポリ)ペプチドはまた化学的に修飾されたペプチドまたは異性体およびラセミ体も含む。
【００６７】
本発明の実施態様は、ここに記載する眼疾患の処置用医薬として使用するための、単離されたＦＫＢＰ−ＬポリペプチドまたはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントまたはこのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはフラグメントの生物学的に活性な誘導体を含む。
【００６８】
好ましいが、非限定的な、本発明の実施態様は、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドまたはここに記載するＦＫＢＰ−Ｌペプチドをコードするヌクレオチドの使用を含み、ここで、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列(IRQQPRDPPTETLELEVSPDPAS)または配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６９】
本発明により使用する方法および医薬組成物は完全長ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたは該ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを使用し得る。それ故に、ある本発明の実施態様は、天然に存在するＦＫＢＰ−ＬのＮ末端アミノ酸配列の生物学的に活性な部分を含むまたはそれからなるＦＫＢＰ−Ｌ誘導体を含む。この配列は、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの活性Ｎ末端部分を含む、それから本質的になるまたはそれからなることが可能である。別の実施態様において、本ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜５７(すなわち、配列番号８)または配列番号２のアミノ酸３４〜５７(すなわち、配列番号４)または配列番号２のアミノ酸３５〜５７(すなわち配列番号３)を含む、それから本質的になるまたはそれからなるものであり得る。または本ペプチドは、配列番号４の少なくとも１８連続アミノ酸を含む配列(例えば、配列番号１０、１２または１９)を含む、それから本質的になるまたはそれからなるものであり得る。別の実施態様において、本発明の方法および組成物において使用するポリペプチドは、配列番号１〜２３の何れかに示すアミノ酸配列の１つを含む、それから本質的になるまたはそれからなるものであり得る。ある実施態様において、本発明はＦＫＢＰ−Ｌの生物学的に活性なフラグメントを含み、ここで、該ポリペプチドは配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列の２００を超えない連続アミノ酸を含むが、ただし、該ポリペプチドは配列番号３として示すアミノ酸配列を含む。
【００７０】
ここに記載するペプチドは修飾されていてよい(例えば、ＰＥＧおよび／またはＨｉｓタグまたは他の修飾を含むため)。または本発明は、特に配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９６％または９７％または９８％または９９％同一である配列を含む、配列番号１〜２３の何れかに示すアミノ酸配列と少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９６％または９７％または９８％または９９％同一である配列を有する単離ポリペプチドを含み得る。この点に関し、ペプチドに、残基の極性、荷電、溶解度、疎水性または親水性の類似性に基づき、該ペプチドの特定の生物学的活性(すなわち機能)が保持される限り、意図的アミノ酸置換をなし得る。
【００７１】
ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、生物学的活性を保持し、上記本発明の種々の態様により使用可能である限り、種々の長さであり得る。
【００７２】
ＦＫＢＰ−Ｌのフラグメント
本発明の実施態様はＦＫＢＰ−Ｌタンパク質のＮ末端のある領域が生物学的活性を示し得ることを認識し、それ故に、本発明は、生物学的に活性なＦＫＢＰ−Ｌのフラグメント、特に２３量体ペプチド(配列番号３)と実質的に同等な生物学的活性を示すあらゆるフラグメントを包含する。ある実施態様において、ＦＫＢＰ−Ｌ  ２３量体ペプチド(配列番号３；ここではＡＬＭ２０１とも称する)の生物学的活性は、ラット角膜縫合モデルにおける血管形成低減として示される(図２〜４)。さらなる実施態様において、ＦＫＢＰ−Ｌ  ２３量体ペプチド(配列番号３；ここではＡＬＭ２０１とも称する)の生物学的活性は、ＥＡＵマウスにおける網膜炎症低減として示される(図６)。
【００７３】
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの“フラグメント”は、ＦＫＢＰ−Ｌの少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも１０アミノ酸または少なくとも１５アミノ酸または少なくとも２０アミノ酸または少なくとも２３アミノ酸の連続配列を含む単離ペプチドをいう。“フラグメント”は、ＦＫＢＰ−Ｌの好ましくは５０を超えないまたは４５を超えないまたは４０を超えないまたは３５を超えないまたは３０を超えないまたは２５を超えないまたは２３を超えない連続アミノ酸を含む。本発明により使用するための好ましいフラグメントは、配列番号４〜２３の何れかに示すアミノ酸配列またはその微細な配列バリアントである(例えば１以上の保存的アミノ酸置換を含むバリアント)。
【００７４】
誘導体
本発明において使用するためのＦＫＢＰ−Ｌ誘導体は、ＦＫＢＰ−Ｌのアミノ酸配列、例えば配列番号１、配列番号２または配列番号２９の変更により修飾されているポリペプチドまたはそのフラグメントまたはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドまたは官能基(例えば、ＰＥＧ)の付加により修飾されているようなペプチドを含む。このようなペプチドの産生は、該ポリペプチドをコードする核酸の操作またはタンパク質自体の改変により実施し得る。
【００７５】
ＦＫＢＰ−Ｌ誘導体は、天然ＦＫＢＰ−Ｌアミノ酸配列のアナログを含み、１以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失および／または置換を含んでよいが、同時に同等な生物学的効果を発揮することができるポリペプチドを提供する。本発明のＦＫＢＰ−Ｌ誘導体にまた含まれるのは、配列番号１〜２３に由来するポリペプチドである。
【００７６】
それ故に、本発明の方法および組成物において使用するＦＫＢＰ−Ｌ誘導体はまた天然に存在するＦＫＢＰ−Ｌのフラグメント、部分または変異体を含む。ある実施態様において、このような誘導体は、５以下のアミノ酸、より好ましくは４以下、さらに好ましくは３以下、最も好ましくは１または２アミノ酸のみの挿入、付加、欠失および／または置換を含む。
【００７７】
ＦＫＢＰ−Ｌ誘導体はまた配列番号１〜２３のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドを含む多量体ペプチドおよびこのような配列を含むプロドラッグも含む。例えば、ある実施態様において、ＦＫＢＰ−ＬまたはＦＫＢＰ−Ｌのフラグメントは、単量体間のジスルフィド結合の形成により多量体を形成し得る。
【００７８】
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの誘導体は、カップリングパートナー、例えば、エフェクター分子、標識、薬物、毒素および／または担体または運搬分子に連結したポリペプチドを含み得る。本発明のポリペプチドをペプチジルおよび非ペプチジル両方のカップリングパートナーにカップリングする技法は、当分野で周知である。
【００７９】
ＦＫＢＰ−Ｌ誘導体はまた融合ペプチドも含む。例えば、誘導体は、例えば、該ペプチドを罹患組織、例えば、角膜または網膜に標的化させる抗体に連結させた本発明のポリペプチドペプチドを含み得る。
【００８０】
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはそのアナログは、免疫グロブリン(ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ)の定常ドメインまたはその部分(ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはそれらの任意の組み合わせ)と融合してよく、キメラポリペプチドをもたらす。これらの融合ポリペプチドまたはタンパク質は精製を促進でき、インビボ半減期の延長を示し得る。このような融合タンパク質は、単量体ポリペプチドまたはそのフラグメント単独より他の分子との結合および中和により効率的であり得る。例えば、Fountoulakis et al., J. Biochem., 270:3958-3964 (1995)参照。
【００８１】
本発明の融合タンパク質はまたアルブミン、例えば組み換えヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントまたはバリアントと融合したＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドも含む(例えば、米国特許５８７６９６９、欧州特許０４１３６２２および米国特許５７６６８８３参照)。
【００８２】
ここに記載するこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用も本発明に包含される。細胞毒性剤に融合したポリヌクレオチドの使用も本発明に包含される。この例において、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは受容体と結合でき、細胞毒性薬物は内部移行する。
【００８３】
例えば、別の実施態様において、誘導体は、半減期を延長するためのペプチドの部位特異的ペグ化(など)；またはタンパク質分解に対して安定化するための非天然アミノ酸取り込みおよび主鎖修飾；または環状誘導体(タンパク質分解抵抗性を与えるため)；またはエキソペプチダーゼおよび／またはプロテイナーゼ活性を阻止または低減するためのＮおよびＣ末端遮断；または細胞表面ＣＤ４４との‘結合活性’を増加するためのリンカー鎖を経る連続鎖またはデンドリマータイプの手法での複数コピーのペプチドの併合を含み得る。例えば、２４量体の三量体共有結合的連結誘導体をＦＫＢＰ−Ｌの誘導体として使用し得る。またはＦＫＢＰ−Ｌ  ２４量体を、非共有結合三量体を形成するためにホモ三量体化するドメインに結合し得る。またはストレプトアビジンと四量体複合体を形成するペプチドのビオチン誘導体をＦＫＢＰ−Ｌの誘導体として使用し得る。またはＦＫＢＰ−ＬまたはＦＫＢＰ−Ｌのフラグメントは、単量体間のジスルフィド結合の形成により多量体を形成し得る。さらに、ＦＫＢＰ−Ｌは、おそらく、タンパク質配列内の予測テトラトリコペプチド反復ドメインと、非共有結合による、オリゴマーを形成し得る。
【００８４】
逆ペプチドアナログ
本発明において使用するためのアナログは、天然ＦＫＢＰ−Ｌタンパク質、その部分またはその合成誘導体の逆またはレトロアナログをさらに含む。例えば、ＥＰ０４９７３６６、米国５,５１９,１１５およびMerrifield et al., 1995, PNAS, 92:3449-53(これらの開示は、引用により本明細書に包含させる)参照。ＥＰ０４９７３６６に記載のとおり、逆ペプチドは、天然に存在するまたは合成ペプチドのアミノ酸配列の逆転により産生される。このような逆ペプチドは、内部プロテアーゼ感受性部位周囲の立体構造およびＮおよびＣ末端の特徴以外、親ペプチドと同じ一般的三次元構造(例えば、アルファ螺旋)を保持し得る。逆ペプチドは、非逆“正常型”ペプチドの生物学的活性の保持だけでなく、生物学的活性増加を含む増強された性質を有し得るとされている(Iwahori et al., 1997, Biol. Pharm. Bull. 20: 267-70参照)。本発明において使用するための誘導体は、それ故に、天然および合成ＦＫＢＰ−Ｌタンパク質の逆ペプチドを含み得る。
【００８５】
本発明において使用するためのペプチド(何れかの逆ペプチドおよびフラグメントを含む)は、完全にまたは一部化学的合成または核酸からの発現により産生され得る。本発明において使用するためのペプチドは、当分野で知られる、十分に確立された、標準液相または、好ましくは、固相ペプチド合成方法により容易に製造できる(例えば、J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), in M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)参照)。
【００８６】
多量体ペプチド
上記のとおり、該ペプチドは多量体の形であり得る。それ故に２、３またはそれ以上の個々のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド単量体単位の多量体または２以上のＦＫＢＰ−Ｌのフラグメントは、本発明の範囲内である。
【００８７】
ある実施態様において、単量体単位および切断可能部位(すなわち、酵素切断可能部位)を含む多量体ペプチドを製造し、次いで、この多量体を切断して所望の単量体を産生することにより、多量体を使用して単量体を生産し得る。
【００８８】
ある実施態様において、多量体の使用は、受容体に対する結合親和性を増加させ得る。
【００８９】
多量体はホモマーまたはヘテロマーであり得る。ここで使用する用語ホモマーは、特定のアミノ酸配列(例えば、配列番号１、配列番号２または配列番号３)またはバリアント、スプライスバリアント、融合タンパク質またはここに記載する他のＦＫＢＰ−Ｌ  アナログまたは誘導体に対応するポリペプチドのみを含む多量体をいう。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するＦＫＢＰ−Ｌペプチドを含み得る。例えば、多量体は、同一アミノ酸配列を有するＦＫＢＰ−Ｌペプチドのみ含んでよくまたは異なるアミノ酸配列を含み得る。多量体はホモ二量体(例えば、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドのみを含み、これらは、次いで同一または異なるアミノ酸配列を含み得る)、ホモ三量体またはホモ四量体であり得る。
【００９０】
ここで使用する用語ヘテロマーは、ここに記載するＦＫＢＰ−Ｌ(ポリ)ペプチドに加えて、１以上の異種ポリペプチド(すなわち、非ＦＫＢＰ−Ｌペプチドまたはポリペプチド)を含む多量体をいう。
【００９１】
多量体は、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合の結果であり得るし、また、例えば、リポソーム形成により間接的に連結され得る。それ故に、ある実施態様において、多量体は、ここに記載するＦＫＢＰ−Ｌペプチドが溶液中で互いに接触したとき形成される。他の実施態様において、ヘテロ多量体は、ＦＫＢＰ−Ｌおよび非ＦＫＢＰ−Ｌ(ポリ)ペプチドが、ここに記載する(ポリ)ペプチドに対する抗体(ここに記載する融合タンパク質における異種(ポリ)ペプチド配列に対する抗体を含む)と溶液中で接触したとき形成される。他の実施態様において、ここに記載する多量体は、ここに記載するＦＫＢＰ−Ｌペプチド(および所望により非ＦＫＢＰ−Ｌペプチド)との、またはそれらの間の、共有結合により形成され得る。
【００９２】
このような共有結合は、ＦＫＢＰ−Ｌ配列(例えば、配列番号１〜２３に示すもの)に含まれる１以上のアミノ酸残基が関与する。ある実施態様において、共有結合は、化学的または組み換え操作の結果である。あるいは、このような共有結合は、ＦＫＢＰ−Ｌ融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に含まれる１以上のアミノ酸残基が関与し得る。一例において、共有結合は、ここに記載する融合タンパク質に含まれる異種配列間である(例えば、米国特許５４７８９２５参照)。他の具体例において、ここに記載する融合タンパク質の共有結合は、共有結合的に結合した多量体、例えば、オステオプロテゲリンを形成できる、他のタンパク質からの異種ポリペプチド配列を使用する(例えば、国際公開ＷＯ９８／４９３０５参照)。他の実施態様において、ここに記載する２以上のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより結合される。例は、米国特許５０７３６２７に記載のペプチドリンカーを含む。ペプチドリンカーにより離された複数ＦＫＢＰ−Ｌペプチドを含むタンパク質を、慣用の組み換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生できる。
【００９３】
多量体はまたＦＫＢＰ−Ｌ(ポリ)ペプチドをロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーポリペプチド配列と融合することにより製造し得る。特に知られるロイシンジッパーは、二量体化または三量体化する天然に存在するペプチドおよびその誘導体である。ここに記載する可溶性多量体タンパク質の製造に適するロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載される。溶液中で二量体化または三量体化するポリペプチド配列と融合させたここに記載するポリペプチドを含む組み換え融合タンパク質を、当分野で知られる技法を使用して、適当な宿主細胞で発現させ、得られた可溶性多量体融合タンパク質を培養上清から回収できる。
【００９４】
多量体はまた当分野で知られる化学的技法を使用しても産生し得る。例えば、ここに記載する多量体に含まれるべきポリペプチドを、当分野で知られるリンカー分子およびリンカー分子長最適化技法を使用して、化学的に架橋させ得る(例えば、米国特許５４７８９２５参照)。さらに、多量体を当分野で知られる技法を使用して製造して、多量体に含まれることが望まれるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間の１以上の分子間架橋を形成させ得る(例えば、米国特許５４７８９２５参照)。さらに、ここに記載するポリペプチドを、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加により日常的な修飾をして良く、当分野で知られる技法をこれらの修飾ポリペプチドを１以上含む多量体の形成に適用し得る(例えば、米国特許５４７８９２５参照)。さらに、当分野で知られる技法を使用して、多量体に含まれることが望まれる２以上のＣ−１２−Ｃペプチドを含むリポソームを製造し得る(例えば、米国特許５４７８９２５参照)。
【００９５】
あるいは、天然に存在するアミノ酸のみを含む多量体を、当分野で知られる遺伝子操作技法を使用して形成し得る。あるいは、翻訳後または他の修飾を含むものを、組み換え技法および化学的修飾の組み合わせにより製造し得る。ある実施態様において、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、ここに記載するまたはそうでなければ当分野で知られる融合タンパク質テクノロジーを使用して組み換えにより産生される(例えば、米国特許５４７８９２５参照(これは、その全体を引用により本明細書に包含させる))。例えば、ここに記載するホモ二量体をコードするポリヌクレオチドを、ここに記載するＦＫＢＰ−Ｌペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列とライゲートさせ、次いで、さらに元のＣ末端からＮ末端の逆配向でポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド(リーダー配列を各)とライゲートさせることにより産生し得る(例えば、米国特許５４７８９２５参照)。ここに記載するまたはそうでなければ当分野で知られる組み換え技法を、膜貫通ドメイン(または疎水性またはシグナルペプチド)を含み、膜再構成技法によりリポソームに取り込まれ得る、組み換えＦＫＢＰ−Ｌ(ポリ)ペプチドの産生に適用できる(例えば、米国特許５４７８９２５参照)。
【００９６】
プロドラッグ
ここに記載するポリペプチドは、少なくともある実施態様において、眼障害、例えば角膜血管新生または眼の炎症性疾患の処置または予防のためにヒトまたは他の哺乳動物に投与することが企図される。下記のとおり、ペプチドは、一般に眼に局所的に、結膜下注射、基質内注射または任意の他の眼内注射経路を使用してまたは全身投与、例えば経口投与または腹腔内投与などの非経腸経路により投与される。
【００９７】
ペプチドまたはポリペプチドは、ペプチド薬物の生理化学的性質を修飾するため、例えば、酸性および酵素分解に対する抵抗性増加および粘膜を通過するこのような薬物の浸透の増強のため、重合部分などの種々の部分とコンジュゲートされ得る。例えば、Abuchowski and Davisは、水可溶性、非免疫原性、インビボ安定化産物を提供するための酵素誘導体化の種々の方法を記載する("Soluble polymers-Enzyme adducts," Enzymes as Drugs, Eds. Holcenberg and Roberts, J. Wiley and Sons, New York, N.Y. (1981))。
【００９８】
それ故に、ある実施態様において、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、デキストラン、ポリビニルピロリドン、糖ペプチド、ポリエチレングリコールおよびポリアミノ酸などのポリマーとコンジュゲートさせ得る。得られたコンジュゲートポリペプチドは、生物学的活性および非経腸適用のための水への溶解度を保持する。ある実施態様において、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドを、５００〜２０,０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールまたはポリプロプロピレングリコールと結合させて、生理学的に活性な非免疫原性水可溶性ポリペプチド組成物を提供し得る(例えば、米国特許４,１７９,３３７およびGarman, A.J., and Kalindjian, S.B., FEBS Lett., 1987, 223, 361-365参照)。ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールは、ポリペプチドを活性喪失から保護でき、組成物を哺乳動物循環系に実質的に免疫原性応答なく注射し得る。他の実施態様において、ＦＫＢＰ−Ｌを、親油性および親水性部分を含むオリゴマーと結合させる(例えば、米国特許５６８１８１１、５４３８０４０および５３５９０３０参照)。
【００９９】
プロドラッグを、例えば、まず、マレイン無水物反応材を多分散ＭＰＥＧ５０００から調製し、次いで、この反応材をここに記載するポリペプチドとコンジュゲートすることにより製造し得る。アミノ酸とマレイン無水物の反応は周知である。アミン含有薬物再形成のためのマレイル−アミド結合の加水分解は、近隣の遊離カルボキシル基および二重結合により形成される攻撃配置によって促進される。ペプチドは、生理学的条件下遊離され得る(プロドラッグの加水分解による)。
【０１００】
ポリペプチドはまた分解可能結合、例えば、Roberts, M.J., et al., Adv. Drug Delivery Rev., 2002, 54, 459-476に示される(ペグ化インターフェロンに関して)分解可能結合により、多分散ＰＥＧなどのポリマーにも結合され得る。
【０１０１】
ポリペプチドはまた１,６または１,４ベンジル脱離(ＢＥ)反応(例えば、Lee, S., et al., Bioconjugate Chem., (2001), 12, 163-169; Greenwald, R.B., et al., 米国特許６,１８０,０９５、２００１; Greenwald, R.B., et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667参照)；トリメチルロックラクトン化(ＴＭＬ)(Greenwald, R.B., et al., J. Med. Chem., 2000, 43, 475-487)；ＰＥＧカルボン酸のヒドロキシ末端カルボン酸リンカーへのカップリング(Roberts, M.J., J. Pharm. Sci., 1998, 87(11), 1440-1445)および、カルバメートとＰＥＧアミドまたはエーテルのメタ関係が関与するプロドラッグ構造(Bently, et al.の米国特許６４１３５０７)を含む、アリールカルバメートによりアミン含有薬物に連結されたＭＰＥＧフェニルエーテルおよびＭＰＥＧベンズアミドのファミリーを含むＰＥＧプロドラッグ(Roberts, M.J., et al., Adv. Drug Delivery Rev., 2002, 54, 459-476)；および加水分解機構と逆の反応機構が関与するプロドラッグ(Zalipsky, S., et al., Bioconjugate Chem., 1999, 10(5), 703-707)を使用してＰＥＧなどのポリマーと連結させ得る。
【０１０２】
本発明のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、遊離アミノ、アミド、ヒドロキシおよび／またはカルボン酸基を有し、これらの官能基を使用して、該ペプチドをプロドラッグに変換し得る。プロドラッグは、１アミノ酸残基またはペプチド結合により結合した２以上の(例えば、２、３または４)アミノ酸残基のポリペプチド鎖が、種々のポリマー、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコールの遊離アミノ、ヒドロキシまたはカルボン酸基を介して結合している化合物を含む。本発明のポリペプチドを含むプロドラッグまたは本発明のペプチド(アナログおよびフラグメントを含む)が放出されるまたは放出可能であるプロドラッグは、本発明のアナログと考えられる。
【０１０３】
プロドラッグはまた、ＰＥＧ、カーボネート、カルバメート、アミドおよびアルキルエステルが、上記ペプチドにＣ末端カルボン酸を介して共有結合している化合物も含む。それ故に、本発明の実施態様は、部位特異的ＰＥＧ付加を含む。
【０１０４】
角膜血管新生の処置／予防
本発明の実施例は、角膜表面へのＦＫＢＰ−Ｌペプチド(特に配列番号３のペプチド)の局所投与が血管形成を劇的に減少させ得ることを決定的に示した。さらに、ＦＫＢＰ−Ｌペプチド(特に配列番号３のペプチド)はまた抗炎症剤としても作用し、ラット角膜縫合モデルにおいて既存の薬物処置より優れた有効性を示した。この結果は、角膜血管新生の処置／予防におけるＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドおよびそのペプチドフラグメントの有用性を明らかに支持する。
【０１０５】
角膜血管新生と関連するおよび／またはそれが介在する種々の眼障害は、ここに記載するＦＫＢＰ−Ｌペプチド化合物、組成物および方法を使用して処置され得る。角膜新生血管疾患は、角膜組織への新生血管の侵襲により特徴付けられ、失明の主原因である。角膜血管新生と関連する他の疾患は、伝染性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏性、アトピー性角膜炎、上方輪部角膜炎、翼状片、乾性角膜炎、類天疱瘡、放射状角膜切開術および角膜移植片拒絶反応を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
血管新生誘発角膜混濁損傷の現在の処置は角膜移植である。しかしながら、血管新生の存在それ自体、この高リスク群における移植後の予後悪化に寄与する。角膜移植が、無血管性受容床に成されたら(低リスク角膜移植)、２年移植片生着率は、局所ステロイド使用下、９０％に近づく(Kuechle et al., 2002)。血管形成受容床では、２年間の移植片生着は、５０％未満まで有意に低下する(Cursiefen et al., 2002)。縫合は、常に顕著な血管新生応答を誘発し、これはまた角膜拒絶反応のリスクの増加と関係する。それ故に、角膜移植片を適所に固定する手段それ自体さえも、移植片拒絶反応のリスクを増加させる。本発明が提供するような新選択肢が、コルチコステロイドなどのこのタイプの眼疾患の処置に現在利用可能な処置の効果が限定的であり、副作用のリスクを伴うため、絶対的に必要である。それ故に、本発明の特に重要な態様は、角膜移植手術を受けている患者の角膜血管新生の予防および／または処置に関する。ＦＫＢＰ−Ｌペプチドでの処置を、移植片拒絶反応のリスクを低減するために、角膜移植手術前および／または術後に投与し得ることが企図される。
【０１０７】
角膜血管新生はまたヘルペスウイルスの角膜実質感染後にしばしば起こり、通常、該ウイルスの三叉神経節内の潜伏位置からの再活性化による二次的(最初の一次感染後)感染である(Liu et al., 2006)。多くの因子が血管新生過程の誘発に関与しており、これはまた疾患病因の発展の経過の間に変わることもあり得るが(Suryawanshi et al., 2011)、直近の研究はＶＥＧＦ−Ａに焦点を絞っている。この増殖因子は、直接的に感染細胞により、そしてまた、Ｉｌ−６を含む多様な傍分泌因子によりそれを産生するために誘発されたバイスタンダー細胞および浸潤性炎症性細胞の両方によって産生される(Kanangat et al., 1996)。このＨＳＶ−１感染により、炎症および血管形成が互いに引き金を引き、周皮細胞を欠くため、内皮細胞が炎症性細胞およびサイトカインを角膜実質に放出する漏出性血管が新しく形成され、これは、より多くの血管の内増殖の誘発に影響し、問題を複雑化する(Ａｚａｒ、２００６)。
【０１０８】
角膜内の血管退行を誘発する大部分の処置は、抗ＶＥＧＦ処置を利用している。このタイプの処置は、該状態の初期においてはしばしば成功するが、血管が十分に確立されたならば、抗ＶＥＧＦ処置に非応答性となる。あらゆる現在の抗ＶＥＧＦ手法での困難性は、特に該状態がしばしば盛衰し、さらなる炎症を生じ、さらなる血管新生を促進するため、しばしば長期に亘る高頻度の注射を必要とすることである。現在、角膜内で十分に確立された血管を除去するのに利用可能な医学的処置はない。これらの状況での唯一の処置は、レーザー処置または焼灼の使用を要し、この何れも、満足とはほど遠く、しばしば、頻回の外科的介入を必要とする(Gupta & Illingworth, 2011)。
【０１０９】
角膜血管新生の処置／予防におけるＦＫＢＰ−Ｌペプチド(例えば配列番号３のペプチド)の特定の(驚くべき)利点は、血管形成の低減が抗炎症効果とも組み合わさっていることである。このような効果が該ペプチドの局所投与によって見られるのも極めて有利であるが、該ペプチドを結膜下注射または眼内注射の他の方式などの他の経路で投与し得ることも予期される。
【０１１０】
角膜血管新生処置／予防と同様に、ＦＫＢＰ−Ｌペプチド(例えば配列番号３のペプチド)の局所投与は、該ペプチドの眼の全区画への浸透のため、眼のどこかの血管新生と関連する適応症の処置／予防に有効である。ＦＫＢＰ−Ｌペプチド(例えば配列番号３のペプチド)の投与(例えば局所投与)により処置／予防し得る眼血管新生と関連する疾患は、例えば、未熟児網膜症(ＲＯＰ)、糖尿病性網膜症、新生血管加齢黄斑変性症、鎌状赤血球網膜症および／または網膜静脈閉塞を含む。
【０１１１】
眼の炎症の処置／予防
本発明の実施例はまた、ＦＫＢＰ−Ｌペプチド(特に配列番号３のペプチド)の投与が、用量依存的態様で実験的自己免疫性ぶどう膜炎(ＥＡＵ)のマウスモデルにおける網膜炎症を抑制したことも決定的に示した。さらに、上記のとおり、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドの局所投与はまたラット角膜縫合モデルにおいて抗炎症効果も生じる。例えば、ＦＫＢＰ−Ｌペプチド(配列番号３)の局所投与は、このようなモデルにおける総細胞および炎症性細胞浸潤(例えば、ＣＤ６８＋またはＣＤ４４＋細胞を使用して測定)の両方を減少させる。併せて、これらの結果は、眼の炎症性疾患、特に網膜の炎症および／または角膜の炎症と関連する／介在する疾患の処置／予防におけるＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドおよびそのペプチドフラグメントの有用性を明らかに支持する。さらに、ＦＫＢＰ−Ｌペプチド(配列番号３)の局所投与は、眼の全層への該ペプチドの浸透をもたらす。ＦＫＢＰＬペプチドは、それ故に眼の他の部分の炎症、例えば脈絡膜、強膜および／または眼筋肉の炎症と関連する／介在する眼の炎症性疾患の処置の可能性を有する。
【０１１２】
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドおよびそのペプチドフラグメント、特に配列番号３のペプチドの投与により処置／予防し得る炎症性眼疾患の例は、ぶどう膜炎、ドライアイ症候群、眼瞼角結膜炎および種々の形態の角膜炎を含む(しかしこれらに限定されない)。
【０１１３】
製剤／投与経路
ここで使用する、“処置”または“治療”は、ヒトまたは非ヒト動物に利益をもたらし得るあらゆるレジメを含む。処置は、現在の状態に関するものであり、または予防(防御的処置)であり得る。処置は、治癒、軽減または予防効果を含み得る。
【０１１４】
角膜血管新生は、そのような処置を必要とする患者への、有効量のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはペプチドそのフラグメントの投与により軽減され得る。
【０１１５】
投与されるＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの用量は、処置される障害の厳密な性質により変わり得る。別の実施態様において、インビボで達成すべき投与量は、１０−１２Ｍまたは１０−１１Ｍまたは１０−１０Ｍまたは１０−９Ｍまたは１０−８Ｍまたは１０−７Ｍまたは１０−６Ｍまたは１０−５Ｍを超えるインビトロレベルと等価であり得る。それ故に、インビボで達成すべき投与量は、１０−１２Ｍ〜１０−５Ｍまたは１０−１１Ｍ〜１０−６Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−９Ｍ〜１０−７Ｍまたはその間のインビトロレベルと等価であり得る。別の実施態様において、投与量は、約１〜１００００ng／mlまたは約１０〜５０００ng／mlまたは約１００〜１０００ng／mlのインビトロレベルと等価であり得る。またはある実施態様において、投与量は、約０.００００１〜５００mg／kg／日または約０.０００１〜３００mg／kg／日または約０.００３〜１００mg／kg／日または約０.０３〜３０mg／kg／日または約０.１mg／kg／日〜１０mg／kg／日または約０.３mg／kg／日〜３mg／kg／日を含み得る。さらに別の実施態様において、使用するヒトインビボ投与量は、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍのラットインビボ投与量と等価であり得る。さらに別の実施態様において、使用するヒトインビボ投与量は、１０−１０〜１０−５または１０−９〜１０−６Ｍであり得る。ある実施態様において、ヒトインビボ投与量は１０−９Ｍ〜１０−８Ｍであり得る。
【０１１６】
投与経路はまた処置される障害の正確な性質により変わり得る。適当な投与経路は、眼への局所適用、例えば角膜表面または眼の他の外部表面への局所投与、眼内注射、結膜下注射、硝子体内注射、腹腔内投与、経口投与を含み得るが、これらに限定されない。
【０１１７】
ヒト対象への投与のために、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントは、選択した送達経路による投与に適する医薬組成物／投与量形態に製剤化され得る。
【０１１８】
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントを単独処置としてまたは組み合わせ処置の成分として使用することが考えられる。
【０１１９】
本発明の実施態様は、眼の炎症性疾患(例えばぶどう膜炎、ドライアイ症候群または眼瞼角結膜炎)の処置のための、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントおよび特に配列番号３のペプチドとデキサメサゾン(またはその任意の誘導体またはアナログ)の組み合わせを含む、組み合わせ処置に関する。
【実施例】
【０１２０】
実施例１  −  眼表面の血管新生に対するＡＬＭ２０１の効果
ＡＬＭ２０１(配列番号３)の眼表面に対する作用を評価するために、血管成長を停止させる能力を試験した。血管成長を、広く受け入れられているモデル(Shi et al., 2011)を介して刺激し、それにより、縫合糸をラット眼の角膜中央部に位置させた(図１)。我々は、ラットの眼が解剖学上ヒトの眼に類似することを示している(Moore JE, McMullen CB, Mahon G and Adamis AP. The corneal epithelial stem cell. DNA Cell Biol. 2002;21(5-6):443-51；引用によりここに包含する)。
【０１２１】
実験群
実験群は：
ペプチドの結膜下注射(５ラット)、対照群(５ラット)および陽性対照群(５ラット)
ペプチドの基質内注射(５ラット)、対照群(５ラット)および陽性対照群(５ラット)
ペプチドの局所適用(５ラット)、対照群(５ラット)および陽性対照群(５ラット)
【０１２２】
方法
各動物の一方の目の角膜中央部で縫合を行い、一方対照眼は無処置とした。注射群について、ペプチドを、０日目、３日目および６日目にラットの眼に注射した。局所適用群について、ペプチドおよび陽性対照を毎日点眼した。縫合の翌日から毎日、ラットを血管成長についてモニターし、Hawk Eye Portable Digital Slit Lamp(Dioptrix, France)および倒立顕微鏡(Nikon's E600FN; Surrey, UK)を使用して写真撮影した。無処置およびペプチド処置動物間で差異が見られた時点で(例えば６日目)、内皮特異的フルオレセインコンジュゲートレクチン(Lycopersicon esculentum; Vector Laboratories, Burlingame, CA)８μg／ｇを尾静脈に注射した。３０分後、眼を摘出し、１０％中性緩衝化ホルマリンに２４時間固定した。角膜を分離し、スライドガラスにフラットマウントした。灌流血管における蛍光をLeica SP5多光子顕微鏡(Milton Keynes, UK)を使用して捕捉した。tagged information file format(.tiff)ファイル内の血管形成を、Image Jでの可視化により試験した(Rasband, 1997-2014)。
６日目全ラットを、処置に対して盲検下で眼科医がグレーディングした。グレーディングのスケールは次のとおりであった。
縫合糸からの血管距離：０＝距離無し；１＝短い距離；２＝中程度の距離；３＝距離の３／４；４＝縫合糸に到達；
血管密度段階分け：０＝密度無し；１＝軽度；２＝中程度；３＝高
炎症段階分け：０＝無し；１＝最小；２＝中程度；３＝重度；
【０１２３】
結果
結膜下注射
統計解析のために、トリアムシノロンおよび１００nM  ＡＬＭ２０１処置両方をＰＢＳ対照処置と比較した。縫合により誘発された血管新生を図３における対照画像で黒矢印により示す。これらの血管は縫合糸に向かって直線的に成長し、トリアムシノロンおよびＡＬＭ２０１処置で見られる正常脈管構造と異なる(図２(ａ))。ｐ＜０.０１の有意差が、ＰＢＳ対照と比較したとき、１００nM  ＡＬＭ２０１の縫合糸からの血管距離で見られた(図２(ｂ))。
【０１２４】
局所処置
対照画像における黒矢印は、血管新生を示し、一方ＡＬＭ２０１画像はラット眼内の正常脈管構造を示す(図３(ａ))。縫合糸からの血管距離、血管密度および炎症は、ＰＢＳ対照処置と比較して、ＡＬＭ２０１処置で全て有意に異なった(図３(ｂ))。
【０１２５】
Hooded Listerラットを使用する結膜下注射
動物の非着色眼の脈管構造の画像は、見ることが困難であり得る。局所ＡＬＭ２０１での実験をHooded Listerラットで繰り返し、抗血管作用のより明確な画像を提供した。
図４において、縫合により誘発された血管新生を対照画像における黒矢印(中央パネル)およびデキサメサゾン処置ラット(左パネル)で示す。これらの血管は、縫合糸に向かって直線的に成長する。デキサメサゾン処置ラットにおいて、血管新生は対照画像で見られるほど顕著ではない。１００nM  ＡＬＭ２０１処置画像内で血管新生はない(右パネル)。
【０１２６】
結論
ＡＬＭ２０１(配列番号３)は、縫合モデルの角膜損傷で結膜下注射または局所適用後、新血管成長を予防する。本ペプチドはまた注射したとき抗炎症性活性も有した。炎症は、局所適用後評価しなかった。これらの初期実験は、角膜損傷後の血管新生減少におけるＡＬＭ２０１の明らかに良好な効果を示し、ＡＬＭ２０１が多くの眼状態処置に有効であることを示す。
【０１２７】
実施例２  −  自己免疫性ぶどう膜炎に対するＡＬＭ２０１の効果
自己免疫性ぶどう膜炎に対するＡＬＭ２０１の効果を、実験的自己免疫性ぶどう膜炎(ＥＡＵ)のマウスモデルで試験した。
【０１２８】
方法
動物
６０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス(３８雌性、２２雄性、９〜１２週齢)を、Queen's University BelfastのBiological Resource Unit (BRU)から購入した。全マウスを通常の実験室で飼育し、１２時間毎の明暗サイクルに曝した。本試験における動物の使用に関する全ての手順は、Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Researchに従い、United Kingdom Animal (Scientific Procedure) 1986の規則に準じた。
【０１２９】
ＥＡＵの誘発
マウスをヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質(ＩＲＢＰ)ペプチド１−２０(ＧＰＴＨＬＦＱＰＳＬＶＬＤＭＡＫＶＬＬＤ、GL Biochem, Shanghai, China)で、先に報告されたプロトコール(Chen M., Copland D.A., Zhao J., Liu J., Forrester J.V., Dick A.D., Xu H., 2012. Persistent inflammation subverts thrombospondin-1-induced regulation of retinal angiogenesis and is driven by CCR2 ligation. Am. J. Pathol. 180, 235-245; Xu H., Manivannan A., Crane I., Dawson R., Liversidge J., 2008. Critical but divergent roles for CD62L and CD44 in directing blood monocyte trafficking in vivo during inflammation. Blood 112, 1166-1174、各々引用によりここに包含する)により、免疫化した。すなわち、２.５mg／mlマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒａ(DIFCO Laboratories)を添加した完全フロインドアジュバント(DIFCO Laboratories, Detroit, USA)に１：１で乳化した５００mg(１００μl)のＩＲＢＰペプチド１−２０を、各マウスに皮下注射した。さらに１mg百日咳菌毒素(Tocris Bioscience, Bristol, UK)を、ペプチド注射直後に腹腔内投与した。
【０１３０】
局所内視鏡眼底造影(ＴＥＦＩ)
マウス瞳孔を１％硫酸アトロピンおよび２.５％塩酸フェニレフリンで散瞳させた(Chauvin, Essex, UK)。動物をイソフルランで麻酔した。先に報告されている(Paques M., Guyomard J.L., Simonutti M., Roux M.J., Picaud S., Legargasson J.F., Sahel J.A., 2007. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 2769-2774., Xu H., Koch P., Chen M., Lau A., Reid D.M., Forrester J.V., 2008. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Exp. Eye Res. 87, 319-326、各々引用によりここに包含する)ＴＥＦＩ系を使用して、免疫化後(ｐ.ｉ.)１２日目、１４日目および２４日目に眼底像を得た。画像をNikon D90カメラを使用して取得し、ＴＦＰＩ形式で保存した。網膜炎症の臨床スコアを、先に我々が報告した基準を使用して評価した(Xu et al. 2008a)。
【０１３１】
群割り付け
網膜炎の臨床スコアに基づき、異なる群間で平均臨床スコアが同等となることを確実とするように、５群に割り当てた。１０匹のマウスを各群に割り当てた。表１は、個々の群における免疫化後１４日目(処置を開始した日)の平均臨床的ＥＡＵスコアを示す。
【表１】
2019523234.tif 000002
＊One-wayＡＮＯＶＡ、続くテューキーの多重比較検定。ＮＳ、他群間との有意差なし
【０１３２】
処置
全動物を、免疫化後１４〜２４日目の１０日間処置した。以下は処置詳細である。
群１：１００ml  ＰＢＳ、ｉ.ｐ.注射、１日１回。
群２：ＡＬＭ２０１  ０.３mg／kgを１００ml、ｉ.ｐ.注射、１日１回。
群３：ＡＬＭ２０１  ３mg／kgを１００ml、ｉ.ｐ.注射、１日１回。
群４：デキサメサゾン０.５mg／kgを１００ml、ｐ.ｏ.(強制経口投与)、１日１回。
群５：ＡＬＭ２０１  ０.３mg／kgを１００ml、ｉ.ｐ.注射＋デキサメサゾン０.５mg／kgを１００ml、ｐ.ｏ.(強制経口投与)、１日１回。
【０１３３】
サンプル採取および病理組織試験
免疫化後２４日目、眼底像を、ＴＥＦＩ形式を使用して全実験マウスから取得した。次いで、マウスをＣＯ２吸入により屠殺し、眼を注意深く摘出した。全ての眼を、２日、室温で２.５％(ｗ／ｖ)グルタルアルデヒド(Agar Scientific Ltd, Cambridge, UK)で固定した。標準Ｈ＆Ｅ染色のために眼をパラフィンに包埋した。網膜炎症の組織スコアを先に報告された(Dick A.D., Cheng Y.F., Liversidge J., Forrester J.V., 1994. Immunomodulation of experimental autoimmune uveoretinitis: a model of tolerance induction with retinal antigens. Eye 8 ( Pt 1), 52-59、引用によりここに包含する)標準スコアリング・システムを使用してグレーディングした。各眼の少なくとも３つの異なる層からの網膜切片を組織病理分析に使用した。３層からの平均スコアを眼の最終病理スコアとして使用した。
【０１３４】
統計解析
データ(臨床スコアおよび組織スコア)を平均±ＳＤとして表した。One-wayＡＮＯＶＡ、続くテューキーの多重比較検定を全処置群間の差異の検出に使用した。さらに、マン・ホイットニーのＵ検定(両側)を使用して、ＡＬＭ２０１またはデキサメサゾン処置群とＰＢＳ対照群の間の差異を検出した。対応のあるスチューデントのｔ検定を、処置前後の臨床スコアの比較に使用した。
【０１３５】
結果
体重
各マウスの体重(ＢＷ)を、処置の経過中、連日モニターした。結果は、ＰＢＳ対照、ＡＬＭ２０１  ０.３mg／kg、ＡＬＭ  ３mg／kgおよびデキサメサゾン０.５mg／kg群からの全マウスが、１０日処置期間中安定なＢＷを有したことを示した(図５Ａ〜５Ｄ)。ＡＬＭ２０１＋デキサメサゾン処置群からの２匹のマウスは、３日目、４日目および５日目にＢＷが減少したが、６日目にＢＷは再び増加し、実験の最後には安定していた(図５Ｅ)。
【０１３６】
ＥＡＵにおける効果
臨床上の炎症：
正常非免疫化マウスにおいて、視神経乳頭(ＯＤ)および網膜血管は眼底検査で明確に可視化できる(図６Ａ)。ＯＤ周囲の浸潤、血管周囲の複数の大きな浸潤(図６Ｂにおける矢印)、複数小浸潤(星印、図６Ｂ)および網膜血管周囲の浸潤を含む重度炎症が、免疫化後２４日目にＰＢＳ処置ＥＡＵマウスで観察された(図６Ｂ)。網膜炎症はまた０.３mg／kg  ＡＬＭ２０１処置を受けたマウスでも観察されたが、浸潤の数はＰＢＳ処置ＥＡＵマウスより少なかった(図６Ｃ)。血管周囲の小さな類白色シート(脈管炎)が３mg／kg  ＡＬＭ２０１(図６Ｄ)、デキサメサゾン(０.５mg／kg)(図６Ｅ)およびＡＬＭ２０１  ０.３mg／kg＋デキサメサゾン(０.５mg／kg)処置を受けたＥＡＵマウスで観察された。網膜血管周囲の大きな浸潤はこれらの群からのマウスでほとんど観察されなかった(図６Ｄ〜６Ｆ)。臨床スコア分析は、ＡＬＭ２０１はＥＡＵにおける炎症を用量依存的に抑制することを示した(図６Ｇ)。デキサメサゾン(０.５mg／kg)は網膜炎症を強く抑制した(図６Ｇ)。３mg／kg  ＡＬＭ２０１および０.５mg／kg  デキサメサゾンで処置したマウスの臨床スコアについて統計的有意差はなかったが、後者は臨床スコアが低いことが明らかであった。０.５mg／kg  デキサメサゾンとＡＬＭ２０１  ０.３mg／kgの組み合わせは、デキサメサゾン単独と比較して、臨床スコアをさらに減少させなかった(図６Ｇ)。
【０１３７】
同じマウスの処置前(免疫化後１４日目)および処置後(免疫化後２４日目)の臨床スコアを比較したとき、ＰＢＳ処置群における全マウスのスコアは増加しており(臨床スコアの平均１.８２の増加、図７Ａおよび表２)、免疫化後１４〜２４日目の炎症のさらなる進展を示唆する。
【０１３８】
０.３mg／kg  ＡＬＭ２０１処置マウスにおいて、１匹のマウスは臨床スコアが低下し、１匹は変わらず、他の８匹のマウスは、免疫化後１４日目から２４日目の臨床スコアのわずかな増加を経験した(平均増加スコア０.６８、図７Ｂ)。しかしながら、全体的臨床スコアはこの群のマウスで免疫化後１４〜２４日目で有意に変化しなかった(図７Ｂ、表２)。ＡＬＭ２０１  ３mg／kg処置は、３匹のマウスでＥＡＵ臨床スコアを減少させ(臨床スコアの平均減少：０.３３)、３匹のマウスで臨床スコアのさらなる増加を阻止し(図７Ｃ、表２)、この処置がＥＡＵにおける網膜炎の進行を低減または予防できることを示す。４匹のマウスは臨床スコアが増加しており、平均増加は０.８２点であった(表２、図７Ｃ)。デキサメサゾン処置は、処置後３匹のマウスでＥＡＵスコアを減少させ(平均減少０.６９)、４匹のマウスでＥＡＵスコアを維持し(図７Ｄ、表２)、３匹のマウスはＥＡＵスコアが増加した(平均増加０.８０)。ＡＬＭ２０１とデキサメサゾンの組み合わせ処置は、６匹のマウスでＥＡＵスコアを減少させ(平均減少０.６９)、２匹のマウスでＥＡＵスコアを維持した(図７Ｅ、表２)。２匹のマウスのみが網膜炎症の進行を経験した。結果は、デキサメサゾンとＡＬＭ２０１の組み合わせが、このＥＡＵモデルでデキサメサゾンまたはＡＬＭ２０１単独より強い免疫抑制効果を有することを示唆する。
【０１３９】
【表２】
2019523234.tif 000003
【０１４０】
病理組織試験：
ＰＢＳ処置：顕著な細胞浸潤がＰＢＳ処置対照ＥＡＵマウスの硝子体腔および神経網膜で観察された(図８Ａ)。網膜襞がしばしば観察された(白矢印、図４Ａ)。視細胞外節(ＰＯＳ)はなかった(図８Ａ)。正常網膜構造は高度に破壊された(図８Ａ)。
【０１４１】
ＡＬＭ２０１(０.３mg／kg)処置：０.３mg／kg  ＡＬＭ２０１処置マウスでわずかな浸潤性細胞が観察された(図８Ｂ)。肉芽腫様損傷(緑矢印、図８Ｂ)が時に検出されたが、網膜構造は、ＰＢＳ処置マウス(図８Ａ)と比較して良好に保存された(図４Ｂ)。
【０１４２】
ＡＬＭ２０１(３mg／kg)処置：処置前に重度炎症があった眼において、わずかな浸潤性細胞と網膜瘢痕が観察された(矢じり、図８Ｃ)。処置前に軽度炎症があった眼において、わずかな浸潤性細胞しか観察されず、ＰＯＳを含む網膜構造は大部分保存された(図８Ｄ)。
【０１４３】
デキサメサゾン(０.５mg／kg、図８Ｅ)およびデキサメサゾン(０.５mg／kg)＋ＡＬＭ２０１  ０.３mg／kg(図８Ｆ、８Ｇ)処置：ＡＬＭ２０１  ３mg／kg処置マウスに類似して、治療前に重度炎症を有した眼において、瘢痕損傷が観察された(矢じり、図８Ｅ、８Ｆ)。わずかな浸潤性細胞がデキサメサゾン処置マウスで観察された(図８Ｅ)。ＰＯＳを含む網膜層が保存された(瘢痕を有する領域から離れた)。治療前に軽度炎症を有した眼において、浸潤性細胞はほとんど検出されず、顕著な構造的損傷は観察されなかった(図８Ｇ)。免疫細胞浸潤および網膜構造的損傷の数／面積を考慮に入れる網膜炎症が標準組織学的スコアリング・システムを使用してグレーディングされたとき、ＡＬＭ２０１は網膜炎症を用量依存的に抑制した(図８Ｈ)。
【０１４４】
結論
このパイロット試験での主な知見は次のものを含む。
−  ＡＬＭ２０１  ０.３mg／kg処置は、網膜炎症を臨床的および組織的にわずかに減少させた。
−  ＡＬＭ２０１  ３mg／kg処置は、網膜炎症を臨床的および組織的に有意に減少させた。
−  デキサメサゾン０.５mg／kg単独またはデキサメサゾン＋ＡＬＭ２０１処置は網膜炎症を有意に減少させた。
−  低用量のＡＬＭ２０１(０.３mg／kg)処置は、２０％のマウスで進行阻止または炎症低減ができ、８０％のマウスでＥＡＵ進行のレベルを減少させた。
−  高用量のＡＬＭ２０１(３mg／kg)処置は、３０％のマウスで炎症進行を阻止でき、３０％マウスで既存の炎症を低減できた。
−  デキサメサゾン(０.５mg／kg)処置は３０％のマウスで既存の網膜炎症を低減でき、４０％のマウスでＥＡＵ進行を阻止できた。
−  デキサメサゾン(０.５mg／kg)およびＡＬＭ２０１(０.３mg／kg)処置の組み合わせ治療は、６０％のマウスで既存の網膜炎症を低減でき、２０％のマウスでＥＡＵ進行を阻止した。
−
上記の結果は、ＡＬＭ２０１がＥＡＵのマウスモデルで網膜炎を用量依存的に抑制することを示唆した。デキサメサゾンとＡＬＭ２０１の組み合わせは、デキサメサゾンまたはＡＬＭ２０１単独より強い免疫抑制効果を有するように見えた。ＡＬＭ２０１の可能性のある機構は、(１)循環から炎症網膜への白血球の輸送阻止／減少；(２)免疫細胞機能および活性化の調節である。
【０１４５】
実施例３  −  局所投与後の眼におけるＡＬＭ２０１の分布および炎症に対する効果
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化(ＭＡＬＤＩ)マススペクトロメトリー造影(ＭＳＩ)を使用して、眼におけるＡＬＭ２０１の分布をマッピングした。
【０１４６】
方法
０日目、縫合をラットの角膜で行い、角膜血管新生および炎症を誘発させた。眼を、１６μlのＡＬＭ２０１(１００nMおよび１００μM)またはＰＢＳ(媒体対照)で３日または６日処置した。
眼を、３日目または６日目処置１時間後に眼球を摘出し、ゼラチン内に凍結させた。横断面(１０μm)を、ＭＳＩのために眼の中心で取り、隣接切片をヘマトキシリンおよびエオシン(Ｈ＆Ｅ)で染色した。
全ＭＡＬＤＩ−ＭＳ造影実験をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ(Ultraflextreme, Bruker DaltonicsまたはＭＡＬＤＩ−ＦＴ−ＩＣＲ(Solarix XR 12T, Bruker Daltonics)マススペクトロメーターで陽イオンモードで、Smartbeam II 2 kHzレーザーを使用して行った。レーザースポットサイズは、低および高空間分解能分析のための焦点の中等度および鋭いレベル(約４０μmおよび１０μmレーザースポット直径)を生じるように選択した。ＭＳ造影データをFlexImaging(Bruker Daltonics), version 4.1を使用して可視化した。ＣＨＣＡ(０.２％ＴＦＡ含有５０％ＡＣＮに溶解した５mg／ml)をＭＡＬＤＩマトリックスとして使用し、自動噴霧器(TM-Sprayer, HTX Technologies)を使用して適用した。
【０１４７】
結果
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ造影結果を図９に示す。
図９Ａは、ｍ／ｚ  ２５７６.３０３±０.００５DaでのＡＬＭ２０１ペプチドのＦＴＩＣＲマススペクトルを示す。結果は、１００μM(最後から2番目のトレース)および１００nMペプチド(下部トレース)で局所的に処置した角膜組織からである。観察されたペプチドモノアイソトピック質量は、理論的分布と一致した(質量精度は３５０Ｋ質量分解能で＜５ppmであった)。
図９Ｂは、ｍ／ｚ  ２５７６.３０３±０.００５DaでのＡＬＭ２０１のＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳＩヒートマップ分布を示し、図９Ｃは、内在性代謝物のｍ／ｚ  １０２８.１３５±０.０２５Da(大部分角膜に分布)、１４４４.５８４±０.０２５Da(大部分水晶体に分布)、７８２.５７９９±０.０２５Da(大部分房水およびガラス体液に分布)、７８０.５４５１±０.０２５Da(筋肉(青色)に分布)、８３５.５８９１±０.０２５Daおよびペプチド(眼全体に分布)２５７６.３０３±０.０２５Daでのヒートマップを示す。これらのデータは、ＡＬＭ２０１は局所処置後眼の全層に浸透したことを示す。
図１０は、Ｈ＆Ｅ染色ラット眼切片および２５７６.３±０.１DaでのＭＡＬＤＩ−ＭＳＩ画像の重ね合わせを示す。正常眼を、１００μMのＡＬＭ２０１で３日、連日処置し、次いで、最後の処置１５分後眼球を摘出した。ヒートマップにより示されるとおり、画像はペプチドの大部分がガラス体液およびおそらく水晶体と共存することを示す。ペプチドはまた角膜、強膜、脈絡膜および網膜にも共存する。
図１１は、組織分析の結果を示す。ＡＬＭ２０１処置ラットからの眼は、対照と比較して血管新生が減少した(図１１Ａ、白矢印は縫合糸を示し、黒矢印は血管を示す)。
さらに、ＡＬＭ２０１処置動物は、ＰＢＳ処置対照およびまたデキサメサゾン処置動物の両方と比較して、総細胞浸潤(図１１Ｂ)およびＣＤ６８＋細胞浸潤(図１１Ｃ)の減少を示した。ＣＤ６８＋はマクロファージおよび単球のマーカーであり、ＣＤ６８＋細胞浸潤減少は、これらのサンプルにおける炎症の減少を示す。
【０１４８】
結論
これらのデータは、角膜に局所的に投与されたＡＬＭ２０１が眼の全層に急速に浸透し、かつ分布することを示す。それ故に、ＡＬＭ２０１は、前部眼疾患および後部眼疾患の有効な処置を提供し得る。Ｈ＆ＥおよびＣＤ６８＋染色は、局所投与ＡＬＭ２０１が血管新生、総細胞浸潤および炎症性細胞浸潤を阻止することを示す。
【０１４９】
実施例４  −  損傷角膜における血管新生および炎症の予防におけるＡＬＭ２０１の使用
ＡＬＭ２０１濃度決定
方法
各ラットを麻酔し、２つの１０−０縫合糸を左眼の側頭角膜内の基質内に、角膜縁から１.５mm離して設置した。縫合糸を実験全体をとおしてそのまま維持した。右眼を、対照として縫合を設置せず、左眼と同じ処置をした。処置は、縫合糸設置約２４時間後に開始し、６日間１日１回実施した。ラットを、図１２に示す処置スキームに従い、処置した。
最後の処置約２４時間後、眼を造影し、臨床スコア化した。縫合糸有りの眼を血管密度、縫合糸までの血管距離および炎症に基づき、スコア化した。血管密度は、０＝密度無し、１＝軽度、２＝中程度、３＝高の３つからスコア化した。縫合糸までの血管距離は０＝到達せず、１＝短い距離、２＝中程度の距離、３＝距離の３／４、４＝縫合糸に到達の４つからスコア化し、炎症は０＝無し、１＝最小、２＝中程度、３＝重度の３つからスコア化した。臨床スコアリング後、眼球を摘出し、組織処理し、蝋包埋し、縫合糸領域を見つける注意をしながら５μm切片に細断した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン(Ｈ＆Ｅ)で染色して、各眼の縫合糸位置を確認し、次いで隣接スライドをＣＤ４４＋細胞およびＦＫＢＰＬ発現ならびにＮＦκＢおよびｐ−ＩκＢαの同定のための免疫組織化学のために使用した。
【０１５０】
結果
縫合後７日目、画像を各ラットから撮り(図１３Ａ)、角膜損傷を臨床スコア化した。臨床スコアリングの結果は、縫合糸までの血管の距離がＰＢＳ媒体対照と比較したとき、１μM  ＡＬＭ２０１およびデキサメサゾン処置群で有意に異なったことを示す(図１３Ｂ)。
血管密度の臨床スコアリングはまたＰＢＳ対照群と比較したとき、ＡＬＭ２０１  １μM、１０μM、１００μM処置群およびデキサメサゾンにおける血管密度の有意な減少も示した(図１３Ｃ)。
炎症スコアリングは、ＰＢＳ処置群と比較して、デキサメサゾン、ＡＬＭ２０１  １０μMおよび１００μMで有意差があることを示す。炎症および血管密度スコアリングの両方で、１００μM  ＡＬＭ２０１およびデキサメサゾンのスコアにも有意差がある。
これらの結果により、１μMおよび１０μMが、血管形成および炎症の阻止にＡＬＭ２０１の最も有効な濃度であった。
【０１５１】
免疫組織化学およびＨ＆Ｅ
切片(５μm)をヘマトキシリンおよびエオシン(Ｈ＆Ｅ)で染色して、各眼で縫合糸位置を確認した。次いで隣接スライドをＣＤ４４＋細胞およびＦＫＢＰＬ発現の確認のための免疫組織試験のために使用した。
Ｈ＆Ｅ染色(図１４)は、細胞浸潤、角膜腫脹および血管が、ＡＬＭ２０１濃度が０.０１μMから１０μMに上がるに連れて減少することを示した。しかしながら、１００μM  ＡＬＭ２０１で、より大きな角膜腫脹が観察された。
ＣＤ４４のための免疫組織化学染色(図１５)は、ＣＤ４４が縫合がない角膜で角膜上皮、実質角膜実質細胞および角膜内皮に内因に発現されることを示した。ＰＢＳ処置、縫合有りの角膜において、ＣＤ４４発現が増加し、これは、実質におけるＣＤ４４＋炎症性細胞による可能性が最も高い。１μM  ＡＬＭ２０１処置縫合有りの角膜は、縫合糸有りのＰＢＳ対照と比較して、ＣＤ４４発現の減少を示した。それ故に、１μM  ＡＬＭ２０１は、ＣＤ４４＋炎症性細胞が角膜に入ることを阻止するように見える。
ＡＬＭ２０１は、天然に存在するＦＫＢＰＬタンパク質の誘導体である。ＦＫＢＰＬの免疫組織化学(図１６)は、ＦＫＢＰＬが正常角膜の角膜上皮および内皮で内因性に発現されることを示す。縫合糸有りＰＢＳ処置角膜において、ＦＫＢＰＬはまた実質で発現される。興味深いことに、縫合糸有り１μM  ＡＬＭ２０１処置角膜において、角膜上皮および実質におけるＦＫＢＰＬ発現は、ＰＢＳ処置縫合糸有り角膜および正常角膜と比較して増加する(図１６)。
【０１５２】
ＮＦκＢ経路
ＮＦκＢおよびリン酸化−ＩκＢα抗体も、ＡＬＭ２０１がＮＦκＢ経路に影響するか否かを見るためにこの実験に使用した。Ｂ細胞の核因子カッパ−軽鎖−エンハンサーまたはＮＦκＢは、炎症、Ｂ細胞増殖、アポトーシス、免疫制御および細胞増殖を含む数過程に関与する転写因子である。ＮＦκＢファミリーに５つの異なるＮＦκＢヘテロ二量体があり、そのヘテロ二量体が活性化されるかによって、上記過程の転写を活性化または抑制できる。ＮＦκＢ経路は極めて複雑な経路であり、ＴＮＦα、増殖因子およびＩＬ−１ｂなどの多数の種々のリガンドにより活性化され、ＣＤ４４を含む多数の種々の遺伝子に作用する。抗ＮＦκＢおよびリン酸化−ＩκＢα(ｐ−ＩκＢα)を、作用機序のさらなる洞察を得るために、ＡＬＭ２０１がこの経路に作用するかどうかを見るために使用した。
非刺激細胞において、ＩκＢαは細胞質におけるＮＦκＢに結合し、ＮＦκＢ核局在化を阻害する。ＮＦκＢ経路が活性化されたら、ＩκＢαはリン酸化され、ＮＦκＢを放出させ、その核局在化シグナルのマスキングをはずさせる。次いで、ＮＦκＢが遊離して核内に入り、そこでそれは転写因子として機能する。遊離ＮＦκＢ発現の免疫組織化学分析(図１７)は、縫合がない角膜において、ＮＦκＢは角膜上皮、内皮および実質角膜実質細胞に内因性に発現されることを示す。ＰＢＳまたは１μM  ＡＬＭ２０１での処置は、縫合糸がない角膜のＮＦκＢ発現のこのパターンに影響しない。しかしながら、ＰＢＳで処置した縫合有りの角膜において、ＮＦκＢ発現は縫合がない対照と比較して増加する。対照的に、１μM  ＡＬＭ２０１処置した縫合有りの角膜は、ＰＢＳ対照縫合有り角膜と比較して、実質におけるＮＦκＢ発現の減少を示す。
遊離ＮＦκＢ発現の観察を確認するために、角膜におけるｐ−ＩκＢα発現をまた免疫組織化学的に決定した。ＰＢＳおよび１μM  ＡＬＭ２０１処置両方の縫合無し角膜でｐ−ＩκＢα発現はなかった。ＰＢＳ処置縫合有りの角膜においてｐ−ＩκＢα発現が増加し、これは１μM  ＡＬＭ２０１処置で減少した(図１８)。
これらの結果から、ＡＬＭ２０１は、ＮＦκＢ経路に直接的に作用し得るかまたはＡＬＭ２０１処置角膜と比較したＰＢＳ処置および縫合有り角膜における炎症性細胞の存在の増加により、発現に差異があり得る。
【０１５３】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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