(57)【要約】  本発明は、Ｈｉｂポリリボシルリビトール−ホスフェート（ＰＲＰ）誘導体及びそれらのコンジュゲートの安定した合成糖類を提供する。該糖類、該コンジュゲート及びそれらの医薬組成物は、加水分解耐性、長期安定性があり、ヘモフィルス属インフルエンザ菌に関連する疾患、及びより具体的にはヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に関連する疾患、好ましくは髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎から選択される疾患の予防及び／又は治療に有用である。
2019527243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）の糖類
【化１】
2019527243.tif 000226
式中
Ａは
【化２】
2019527243.tif 000227
であり；
Ｂは
【化３】
2019527243.tif 000228
であり；
Ｃは
【化４】
2019527243.tif 000229
であり；
Ｄは
【化５】
2019527243.tif 000230
であり；
Ｅは
【化６】
2019527243.tif 000231
であり；
Ｆは
【化７】
2019527243.tif 000232
であり、
Ｔ１及びＴ２は−Ｈ、−Ｌ−ＮＨ２を表し、Ｔ１が−Ｌ−ＮＨ２の場合、Ｔ２は−Ｈであり、Ｔ１が−Ｈの場合、Ｔ２は−Ｌ−ＮＨ２又は−Ｌ−ＣＯＯＨであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６は、互いに独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＦ３を表し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも２つは−ＯＨではなく、
ｎは１、２、３又は４から選択される整数であり、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は互いに独立して０及び１から選択され、
ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４≧１である、
ただし、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＝１の場合、ｎ＝１の場合、及び
Ａが
【化８】
2019527243.tif 000233
である場合、
Ｆは
【化９】
2019527243.tif 000234
であり、また、
ただし、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＝１の場合、ｎ＝１の場合、及び
Ｆが
【化１０】
2019527243.tif 000235
である場合、
Ａは
【化１１】
2019527243.tif 000236
であり、また、
Ｌはリンカーであり、Ｌは、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−から選択され、
式中、−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｂ−は−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−を表し、
−Ｌｄ−は−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＦ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−Ｃ２Ｈ４−、及び−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｅ−は−（ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＦ２）ｐ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−及び−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ２−から選択され、
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２は、互いに独立して、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である、
前記糖類、その糖類のエナンチオマー、ジアステレオマー、エナンチオマーの混合物、ジアステレオマーの混合物、アノマー、水和物、溶媒和物、及びそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記糖類は、式（ＩＩ−１）で表され、
【化１２】
2019527243.tif 000237
式中
Ａは
【化１３】
2019527243.tif 000238
であり；
Ｆは
【化１４】
2019527243.tif 000239
であり、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は請求項１に定義された意味を有し、
ｎは１又は２であり、
Ｘ２−Ｘ６は、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である、
請求項１に記載の糖類。
【請求項３】
前記糖類は、式（ＩＩ−２）で表され、
【化１５】
2019527243.tif 000240
式中
Ａは
【化１６】
2019527243.tif 000241
であり；
Ｆは
【化１７】
2019527243.tif 000242
であり、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は請求項１に定義された意味を有し、
ｎは１又は２であり、
Ｘ１−Ｘ５は、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＣＨ３である、請求項１に記載の糖類。
【請求項４】
前記糖類は、式（ＩＩＩ−１）で表され、
【化１８】
2019527243.tif 000243
式中
Ｌは請求項１に定義の通りの意味を有し、
ｍは１〜９から選択される整数であり、
Ｘａは、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である、請求項１に記載の糖類。
【請求項５】
前記糖類は式（ＩＶ−１）で表され、
【化１９】
2019527243.tif 000244
式中
ｍは１〜９から選択される整数であり、
Ｘａは、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である、請求項１に記載の糖類。
【請求項６】
以下からなる群から選択される、請求項１に記載の糖類：
【化２０】
2019527243.tif 000245
2019527243.tif 000246
2019527243.tif 000247
2019527243.tif 000248
2019527243.tif 000249
【請求項７】
−Ｘ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介して免疫原性担体とコンジュゲートしている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の糖類。
【請求項８】
医薬における医薬活性剤として使用するための、請求項１〜７のいずれかに記載の糖類。
【請求項９】
ヒト及び／又は動物の宿主において防御免疫応答を惹起するのに使用するための、請求項１〜８のいずれかに記載の糖類。
【請求項１０】
ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に関連する疾患の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載の糖類。
【請求項１１】
前記ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に関連する疾患が、髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎（ｅｐｉｇｌｏｔｉｔｉｓ）から選択される、請求項１０に記載の糖類。
【請求項１２】
少なくとも１つの薬学的に許容されるアジュバント、担体、凍結防止剤、凍結保護剤、
賦形剤及び／又は希釈剤と共に、請求項１〜１１のいずれかに記載の糖類を含むワクチン組成物。
【請求項１３】
ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に関連する疾患に対する免疫化における使用のための、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
ジフテリア抗原、破傷風抗原、百日咳抗原、Ｂ型肝炎抗原、不活化ポリオワクチン及び不活化ロタウイルスワクチンのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１２又は１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
ヘモフィルス属インフルエンザ菌Ｂ型によって引き起こされる疾患の診断のための免疫学的アッセイにおけるマーカーとして使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の糖類。
【請求項１６】
式（Ｉ）の糖類を合成するための中間化合物は、
Ａ１＊−２、Ａ１＊−３、Ａ１＊−４、Ａ１＊−５、Ａ１＊−５´、Ａ１＊−５´´、Ａ１＊−６、Ａ１＊−７、Ａ１＊−８、Ｂ１＊−１、Ｂ１＊−２、Ｂ１＊−３、Ｂ１＊−４、Ｂ１＊−５、Ｂ１＊−６、Ｃ１＊−２、Ｃ１＊−３、Ｃ１＊−３´、Ｃ１＊−３´´Ａ２＊−１、Ａ２＊−２、Ａ２＊−３、Ａ２＊−４、Ｂ２＊−１、Ｂ２＊−２、Ｂ２＊−３、Ｂ２＊−４、Ｃ２＊−１、Ｃ２＊−２、Ｃ２＊−３、Ｃ２＊−４、Ａ２＊−１´、Ａ２＊−２´、Ａ２＊−３´、Ａ２＊−４´、Ａ２＊−２´´、Ａ２＊−３´´、Ａ２＊−４´´、Ｂ２＊−１´、Ｂ２＊−１´´、Ｂ２＊−１´´´、Ｂ２＊−２´、Ｂ２＊−３´、Ｂ２＊−３´´、Ｂ２＊−３´´´、Ｂ２＊−４´、Ｃ２＊−１´、Ｃ２＊−２´、Ｃ２＊−３´及びＣ２＊−４´からなる群から選択され、
【化２１】
2019527243.tif 000250
2019527243.tif 000251
2019527243.tif 000252
2019527243.tif 000253
2019527243.tif 000254
式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、及びＰ５は、−Ｏ−に結合したときにＸi及びＸｊと同一ではない保護基を表し、
Ｘｉ及びＸｊは、互いに独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＦ３を表し、
基ＸｉかＸｊが１つだけ存在する場合、Ｘｉ又はＸｊは−ＯＨにはできず、
基ＸｉとＸｊの両方が存在する場合、ＸｉとＸｊは同時に−ＯＨになることはできず、
Ｌは請求項１に定義された意味を有し、
Ｍ＋は、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、又はＨＮＥｔ３＋を表す、
請求項１に記載の糖類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈｉｂポリリボシルリビトール−ホスフェート（ＰＲＰ）誘導体及びそのコンジュゲートの安定した合成糖類を提供する。該糖類、該コンジュゲート及びそれらの医薬組成物は、加水分解耐性、長期安定性があり、ヘモフィルス属インフルエンザ菌に関連する疾患、及びより具体的にはヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に関連する疾患の予防及び／又は治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）は世界的に深刻なヒトの健康問題であり、髄膜炎、肺炎、喉頭蓋炎（ｅｐｉｇｌｏｔｉｔｉｓ）、及び特に５歳未満の小児の気道の他の疾患を含む様々な疾患の原因である。疾患の生存者の３０％が続いて聴覚障害から精神遅滞までの範囲を示す。
【０００３】
ヘモフィルス属インフルエンザ菌の精製莢膜多糖類は、成人において防御免疫を誘導することができる。しかし、小児の免疫応答は非常に乏しく、２歳未満の乳児では事実上存在しない。Ｈｉｂ細菌から単離された莢膜多糖類は、リボシルリビトールホスフェート反復単位を提示する。
【０００４】
【化１】
2019527243.tif 000003
【０００５】
Ｈｉｂの感染を予防するための様々なワクチンが開発されており、それらは、合成ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）又は担体タンパク質にコンジュゲートされた異なる長さの合成ＰＲＰの混合物からなる（ＷＯ９２１０９３６Ａ１、ＥＰ０２７６５１６Ａ２、ＥＰ０３２０９４２Ａ２、ＷＯ０１１６１４６Ａ１）。最近いくつかのワクチンが米国や他の地域で小児用に認可されている。
Ｈｉｂオリゴ糖類の合成は、細菌からのＨｉｂ  ＰＲＰの費用がかかり面倒な単離の有用な代替法であると報告されている（ＩＮ  ２０１３／ＤＥＬ／０２９８９、ＵＳ  ６，７６５，０９１、ＷＯ  ２０１６０４４１６４及びＥＰ  ０３２０９４２）。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９２，１１，２６５には、Ｈｉｂオリゴ糖類の固相合成が記載されている。アセチル化及びメチル化Ｈｉｂ二糖類が、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９７９，７３，５９において質量分析によって調べられた。
【０００６】
上記のように、ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）は、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）によって引き起こされる疾患の予防に成功したことが証明されている様々なワクチンの活性成分である。
【０００７】
Ｈｉｂワクチンの長期安定性は該ワクチンの免疫原性を維持するために必要であり、これはＰＲＰポリマー中のホスホジエステル結合の加水分解開裂に対する潜在的な感受性を考えると、Ｈｉｂ−コンジュゲートワクチンにとっての課題であり得る。通常、ワクチンの莢膜多糖類の代謝によりワクチンの免疫原性が低下する。アジュバントとして使用される酸化アルミニウムはＰＲＰの加水分解を促進し、ＰＲＰの解重合はＨｉｂワクチンの不安定性及びＨｉｂワクチンの免疫原性の低下を早めることが知られている（Ｖａｃｃｉｎｅ  １９，１９９９，ｐ１１６９−１１７８）。
【０００８】
結果として、その市販の認可されたＨｉｂワクチンは２℃〜８℃で保存する必要があり、通常これらの条件下ではわずか２４〜３６ヶ月間しか安定しない。さらに、液体Ｈｉｂワクチン製剤は、液体製剤に存在するアルミニウム塩により引き起こされると考えられる凍結によって、損傷を受ける傾向がある。凍結を防ぐためには氷の使用を避けなければならないため、凍結損傷に対する感度により、冷却しなければならない液体Ｈｉｂワクチンの保存及び輸送が妨げられている。
【０００９】
市販のワクチンに含まれる細菌細胞壁の精製天然多糖類成分が、ｂ受容体の阻害に関与している可能性があることも報告されている。それは気管支収縮の増加をもたらす。さらに、Ｈｉｂワクチンが３歳未満の乳児において発作の症状のリスクを高めることはよく知られている。したがって、投与量がより少なく、副作用が低減した投与をすることによって免疫原性が増強された新しいＨｉｂワクチンが要求されている。
【００１０】
本発明の目的は、液体製剤で代謝安定性、加水分解耐性及び保存安定性を有するはずである、Ｈｉｂポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）誘導体及びそのコンジュゲートの合成糖類を提供することである。該糖類、該コンジュゲート及びその医薬組成物は免疫原性が増強されており、したがってヘモフィルス属インフルエンザ菌に関連する疾患、より具体的にはヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に関連する疾患の予防及び／又は治療に特に有用であるはずである。
【００１１】
本発明の目的は、独立請求項の教示によって解決される。本発明のさらなる有利な特徴、態様、及び詳細は、従属請求項、説明、図面、及び本願の実施例から明らかである。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、一般式（Ｉ）の糖類、その糖類のエナンチオマー、ジアステレオマー、エナンチオマーの混合物、ジアステレオマーの混合物、アノマー、水和物、溶媒和物及びそれらの薬学的に許容される塩を提供することであり、
【００１３】
【化２】
2019527243.tif 000004
【００１４】
式中
Ａは、
【００１５】
【化３】
2019527243.tif 000005
【００１６】
であり、
Ｂは、
【００１７】
【化４】
2019527243.tif 000006
【００１８】
であり、
Ｃは、
【００１９】
【化５】
2019527243.tif 000007
【００２０】
であり、
Ｄは、
【００２１】
【化６】
2019527243.tif 000008
【００２２】
であり、
Ｅは、
【００２３】
【化７】
2019527243.tif 000009
【００２４】
であり、
Ｆは、
【００２５】
【化８】
2019527243.tif 000010
【００２６】
であり、
Ｔ１及びＴ２は−Ｈ、−Ｌ−ＮＨ２又は−Ｌ−ＣＯＯＨを表し、Ｔ１が−Ｌ−ＮＨ２又は−Ｌ−ＣＯＯＨの場合、Ｔ２は−Ｈであり、Ｔ１が−Ｈの場合、Ｔ２は−Ｌ−ＮＨ２又は−Ｌ−ＣＯＯＨであり、又はＴ１及びＴ２の一方が−Ｈを表し、Ｔ１及びＴ２の他方が−Ｌ−ＮＨ２又は−Ｌ−ＣＯＯＨを表し、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６は、互いに独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＦ３を表し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも１つは−ＯＨではなく、好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも５０％が−ＯＨではなく、より好ましくはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも２つは、−ＯＨではなく、最も好ましくはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６のすべてが−ＯＨではなく、
ｎは１、２、３又は４から選択される整数であり、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は互いに独立して０及び１から選択され、
ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４≧１であり、
ただし、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＝１の場合、ｎ＝１の場合、及び
Ａは、
【００２７】
【化９】
2019527243.tif 000011
【００２８】
である場合、
Ｆは、
【００２９】
【化１０】
2019527243.tif 000012
【００３０】
であり、また、
ただし、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＝１の場合、ｎ＝１の場合、及び
Ｆは
【００３１】
【化１１】
2019527243.tif 000013
【００３２】
である場合、
Ａは、
【００３３】
【化１２】
2019527243.tif 000014
【００３４】
であり、また
Ｌは、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｄ−Ｌｃ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−から選択され、
式中、−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ａ−、−（ＣＦ２）ａ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ａ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ａ−ＣＨ２−、−（ＣＲ１０Ｒ１１）ａ−
【００３５】
【化１３】
2019527243.tif 000015
【００３６】
から選択され、
−Ｌｂ−と−Ｌｃ−は、互いに独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、
−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ９−、−ＮＲ１８−、−ＳＯ２−、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−
【００３７】
【化１４】
2019527243.tif 000016
【００３８】
から選択され、
−Ｌｄ−は、−（ＣＨ２）ｄ−、−（ＣＦ２）ｄ−、−（ＣＲ１２Ｒ１３）ｄ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｄ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｄ−ＣＨ２−
【００３９】
【化１５】
2019527243.tif 000017
【００４０】
を表し、
−Ｌｅ−は−（ＣＨ２）ｅ１−、−（ＣＦ２）ｅ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｅ２−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｅ２−、−（ＣＨ２）ｅ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｅ２−、−（ＣＨ２）ｅ１−Ｓ−（ＣＨ２）ｅ２−、−（ＣＲ１４Ｒ１５）ｅ１−、−（ＣＲ１４Ｒ１５）ｅ１−Ｏ−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｅ２−、−（ＣＲ１４Ｒ１５）ｅ１−Ｓ−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｅ２−、
【００４１】
【化１６】
2019527243.tif 000018
【００４２】
から選択され、
Ｒ９とＲ１８は、互いに独立して、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、及び−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３から選択され、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２は、互いに独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ５Ｈ９、−Ｃ６Ｈ１３、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２、−ＳＣＨ３、−ＳＣ２Ｈ５、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、及び−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２から選択され、
ａ、ｄ、ｅ１及びｅ２は互いに独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数である。
【００４３】
式（Ｉ）で特許請求される最小の糖類は二糖類であり、ただし、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＝１の場合、及びｎ＝１の場合、及び
Ａは
【００４４】
【化１７】
2019527243.tif 000019
【００４５】
である場合、
Ｆは、
【００４６】
【化１８】
2019527243.tif 000020
【００４７】
であり、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＝１の場合、及びｎ＝１の場合、及び
Ｆは、
【００４８】
【化１９】
2019527243.tif 000021
【００４９】
である場合；
Ａは、
【００５０】
【化２０】
2019527243.tif 000022
【００５１】
であり、
「一般式（Ｉ）の糖類は少なくとも二糖類である」という条件で置き換えることができる。
【００５２】
或いは、前述の限定は、
ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＝１である場合、ｎ≠１（ｎは１とは異なる）であり、及び
ｎ＝１である場合、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４≠１（ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４は１とは異なる）である
という条件に置き換えられる。
【００５３】
かくして、代わりに好ましいのは一般式（Ｉ）の糖類、その糖類のエナンチオマー、ジアステレオマー、エナンチオマーの混合物、ジアステレオマーの混合物、アノマー、水和物、溶媒和物及びそれらの薬学的に許容される塩であり、
【００５４】
【化２１】
2019527243.tif 000023
【００５５】
式中
Ａは
【００５６】
【化２２】
2019527243.tif 000024
【００５７】
であり、
Ｂは
【００５８】
【化２３】
2019527243.tif 000025
【００５９】
であり、
Ｃは、
【００６０】
【化２４】
2019527243.tif 000026
【００６１】
であり、
Ｄは、
【００６２】
【化２５】
2019527243.tif 000027
【００６３】
であり、
Ｅは、
【００６４】
【化２６】
2019527243.tif 000028
【００６５】
であり、
Ｆは、
【００６６】
【化２７】
2019527243.tif 000029
【００６７】
であり、
Ｔ１及びＴ２は−Ｈ、−Ｌ−ＮＨ２又は−Ｌ−ＣＯＯＨを表し、Ｔ１が−Ｌ−ＮＨ２又は−Ｌ−ＣＯＯＨの場合、Ｔ２は−Ｈであり、Ｔ１が−Ｈの場合、Ｔ２は−Ｌ−ＮＨ２又は−Ｌ−ＣＯＯＨであり、又はＴ１及びＴ２の一方が−Ｈを表し、Ｔ１及びＴ２の他方が−Ｌ−ＮＨ２又は−Ｌ−ＣＯＯＨを表し、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６は、互いに独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＦ３を表し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも１つは−ＯＨではなく、好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも５０％が−ＯＨではなく、より好ましくはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の８０％は、−ＯＨではなく、最も好ましくはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６のすべてが−ＯＨではなく、
ｎは１、２、３又は４から選択される整数であり、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は互いに独立して０及び１から選択され、
ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４≧２であり、
Ｌは、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｄ−Ｌｃ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−から選択され、
式中、−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ａ−、−（ＣＦ２）ａ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ａ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ａ−ＣＨ２−、−（ＣＲ１０Ｒ１１）ａ−
【００６８】
【化２８】
2019527243.tif 000030
【００６９】
から選択され、
−Ｌｂ−と−Ｌｃ−は、互いに独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ９−、−ＮＲ１８−、−ＳＯ２−
【００７０】
【化２９】
2019527243.tif 000031
【００７１】
から選択され、
−Ｌｄ−は、−（ＣＨ２）ｄ−、−（ＣＦ２）ｄ−、−（ＣＲ１２Ｒ１３）ｄ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｄ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｄ−ＣＨ２−
【００７２】
【化３０】
2019527243.tif 000032
【００７３】
を表し、
−Ｌｅ−は−（ＣＨ２）ｅ１−、−（ＣＦ２）ｅ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｅ２−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｅ２−、−（ＣＨ２）ｅ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｅ２−、−（ＣＨ２）ｅ１−Ｓ−（ＣＨ２）ｅ２−、−（ＣＲ１４Ｒ１５）ｅ１−、−（ＣＲ１４Ｒ１５）ｅ１−Ｏ−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｅ２−、−（ＣＲ１４Ｒ１５）ｅ１−Ｓ−（ＣＲ２１Ｒ２２）ｅ２−、
【００７４】
【化３１】
2019527243.tif 000033
【００７５】
から選択され、
Ｒ９とＲ１８は、互いに独立して、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、及び−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３から選択され、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２は、互いに独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ５Ｈ９、−Ｃ６Ｈ１３、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２、−ＳＣＨ３、−ＳＣ２Ｈ５、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、及び−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２から選択されて、
ａ、ｄ、ｅ１及びｅ２は互いに独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数である。
【００７６】
より好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６は、互いに独立して、−Ｈ、−Ｆ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＦ３、さらにより好ましくは−Ｈ、−Ｆ、−ＣＨ３、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２を表す。
【００７７】
式（Ｉ）の糖類は少なくとも二糖類であり、一方で少なくとも三糖類が好ましく、より好ましいのは一般式（Ｉ）の糖類が少なくとも四糖類であることである。
本発明の糖類は塩基性及び／又は酸性基を有し、それらは有機又は無機の酸又は塩基と塩を形成してもよい。そのような酸付加塩形成に適した酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、マロン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、アスコルビン酸、マレイン酸、スルホン酸、ホスホン酸、過塩素酸、硝酸、ギ酸、プロピオン酸、グルコン酸、乳酸、酒石酸、ヒドロキシマレイン酸、ピルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、亜硝酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、エチレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフチルスルホン酸、スルファニル酸、カンファースルホン酸、キナ酸、マンデル酸、ｏ−メチルマンデル酸、水素−ベンゼンスルホン酸酸、ピクリン酸、アジピン酸、ｄ−ｏ−トリル酒石酸、タルトロン酸、（ｏ，ｍ，ｐ）−トルイル酸、ナフチルアミンスルホン酸、及び当業者に周知の他の鉱物又はカルボン酸である。塩は、慣用の方法で遊離の形態の塩基を十分な量の所望の酸と接触させて塩を製造することにより調製する。
【００７８】
適切な無機又は有機塩基の例は、例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、トリアルキルアミン、トリエチルアミン、テトラアルキルアンモニウムヒドロキシド、リシン又はアルギニンなどである。塩は、当技術分野で周知の方法を用いて、例えば、一般式（Ｉ）の糖類の溶液を上記の群から選択される塩基の溶液で処理することによる、従来の方法で調製することができる。
最も好ましくは、一般式（Ｉ）の糖類のリン酸基は、ナトリウム又はトリエチルアンモニウムカチオンを有する塩又は双性イオン形態を構築する。
【００７９】
無機カチオンとの塩が好ましく、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、及びＫ＋などの単一の陽電荷を有する無機カチオンとの塩がより好ましい。最も好ましいのはＮａ＋塩である。
驚くべきことに、一般式（Ｉ）の糖類は塩基性水性媒体ならびにリン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムを含有する懸濁液、例えば一般に使用されるアジュバントＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ中で安定していることが見出された。天然のＨｉｂ  ＰＲＰは塩基性水性媒体中又はアルミニウム塩の存在下で１日以内に加水分解するが、一般式（Ｉ）の糖類及びそれらのコンジュゲートは、高温でも数日間にわたって安定している。安定性が増大することは、ヘモフィルス属インフルエンザ菌に対するワクチンでそれらを使用するのに特に有利である。したがって、一般式（Ｉ）の糖類及びそのコンジュゲートは、ヘモフィルス属インフルエンザ菌に対する保存安定性の液体ワクチンに特に有用であり、それは周囲温度で保存することができ、例えば輸送の間に生じ得る凍結乾燥によって、損傷を受けにくい。
【００８０】
驚くべきことに、免疫原性担体にコンジュゲートした一般式（Ｉ）の糖類は、ヒト及び／又は動物宿主においてヘモフィルス属インフルエンザ菌に対する防御的な免疫応答を付与することができることも見出された。さらに、免疫原性担体にコンジュゲートした一般式（Ｉ）の糖類は、対応する市販のＨｉｂ  ＰＲＰコンジュゲートワクチンと速度論及びＩｇＧ産生に関して匹敵する、実質的なＩｇＭ及びＩｇＧ応答をウサギにおいて誘発することができる。免疫原性担体にコンジュゲートした一般式（Ｉ）の糖類によって誘発された抗体は、天然のＨｉｂ  ＰＲＰと交差反応し、かくしてこれらの抗体がヘモフィルス属インフルエンザ菌に結合し、ヘモフィルス属インフルエンザ菌感染に対する防御を与える能力を示している。
式（ＩＩ−１）の糖類、その糖類のエナンチオマー、ジアステレオマー、エナンチオマーの混合物、ジアステレオマーの混合物、アノマー、水和物、溶媒和物及びそれらの薬学的に許容される塩が好ましい。
【００８１】
【化３２】
2019527243.tif 000034
【００８２】
式中
Ａは
【００８３】
【化３３】
2019527243.tif 000035
【００８４】
であり、
Ｆは
【００８５】
【化３４】
2019527243.tif 000036
【００８６】
であり、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は上で定義した通りの意味を有し、
ｎは１又は２であり、
Ｘ２−Ｘ６は、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である。
式（ＩＩ−２）の糖類、その糖類のエナンチオマー、ジアステレオマー、エナンチオマーの混合物、ジアステレオマーの混合物、アノマー、水和物、溶媒和物及びそれらの薬学的に許容される塩もまた好ましく、
【００８７】
【化３５】
2019527243.tif 000037
【００８８】
式中
Ａは
【００８９】
【化３６】
2019527243.tif 000038
【００９０】
であり、
Ｆは、
【００９１】
【化３７】
2019527243.tif 000039
【００９２】
であり、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は上で定義した通りの意味を有し、
ｎは１又は２であり、
Ｘ１−Ｘ５は、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である。
式（ＩＩ−３）の糖類、その糖類のエナンチオマー、ジアステレオマー、エナンチオマーの混合物、ジアステレオマーの混合物、アノマー、水和物、溶媒和物及びそれらの薬学的に許容される塩もまた好ましい。
【００９３】
【化３８】
2019527243.tif 000040
【００９４】
式中
Ａは
【００９５】
【化３９】
2019527243.tif 000041
【００９６】
であり、
Ｆは、
【００９７】
【化４０】
2019527243.tif 000042
【００９８】
であり、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は上で定義した通りの意味を有し、
ｎは１又は２であり、
Ｘ２−Ｘ６は、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である。。
式（ＩＩ−４）の糖類、その糖類のエナンチオマー、ジアステレオマー、エナンチオマーの混合物、ジアステレオマーの混合物、アノマー、水和物、溶媒和物及びそれらの薬学的に許容される塩もまた好ましい。
【００９９】
【化４１】
2019527243.tif 000043
【０１００】
式中
Ａは、
【０１０１】
【化４２】
2019527243.tif 000044
【０１０２】
であり、
Ｆは、
【０１０３】
【化４３】
2019527243.tif 000045
【０１０４】
であり、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は上で定義した通りの意味を有し、
ｎは１又は２であり、
Ｘ１−Ｘ５は、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である。
式（ＩＩＩ−１）の糖類がさらに好ましい。
【０１０５】
【化４４】
2019527243.tif 000046
【０１０６】
式中
Ｌは上で定義した通りの意味を有し、
ｍは１〜９から選択される整数であり、
Ｘａは、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である。
さらに好ましいのは、式（ＩＩＩ−２）の糖類である。
【０１０７】
【化４５】
2019527243.tif 000047
【０１０８】
式中
Ｌは上で定義した通りの意味を有し、
ｍは１〜９から選択される整数であり、
Ｘｂは、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である。
より好ましいのは式（ＩＶ−１）の糖類である。
【０１０９】
【化４６】
2019527243.tif 000048
【０１１０】
式中
ｍは１〜９から選択される整数であり、
Ｘａは、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である。
さらにより好ましいのは式（ＩＶ−２）の糖類である。
【０１１１】
【化４７】
2019527243.tif 000049
【０１１２】
式中
ｍは１〜９から選択される整数であり、
Ｘｂは−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である。
最も好ましいのは、以下からなる群から選択される糖類である。
【０１１３】
【化４８】
2019527243.tif 000050
【０１１４】
【化４９】
2019527243.tif 000051
【０１１５】
【化５０】
2019527243.tif 000052
【０１１６】
【化５１】
2019527243.tif 000053
【０１１７】
【化５２】
2019527243.tif 000054
【０１１８】
【化５３】
2019527243.tif 000055
【０１１９】
【化５４】
2019527243.tif 000056
【０１２０】
合成的なアプローチ
１．本発明の糖類の段階的合成
適切な保護基Ａ１＊−３〜Ａ１＊−５、Ｂ１＊−１〜Ｂ１＊−６、Ｃ＊１−３で保護されたリボシルリビトール骨格を有する二糖類反復単位、リボース又はリビトール骨格を有する半反復単位Ａ１＊−１、Ａ１＊−２、Ｃ１＊−１、Ｃ１＊−２、及びリンカーＬを含む末端単位、又はＴ１＊〜Ｔ３＊は、本発明の糖類の様々な合成経路に適用することができる。Ａ１＊−１〜Ａ１＊−５、Ｂ１＊−１〜Ｂ１＊−６、Ｃ１＊−１〜Ｃ１＊−３及びＴ１＊〜Ｔ３＊は以下の構造を有する。
【０１２１】
【化５５】
2019527243.tif 000057
【０１２２】
【化５６】
2019527243.tif 000058
【０１２３】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及び／又はＸｊと同一
ではあり得ない保護基を表し、
Ｌは上で定義した通りの意味を有し、
Ｍ＋は、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、Ｈ＋又はＥｔ３ＮＨ＋を表す。
【０１２４】
当業者は、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）の本発明の糖類、ならびにそれらの免疫原性担体とのコンジュゲートの合成に用いられる保護基Ｐ１〜Ｐ５は、酸素原子に結合している場合、Ｘｉ及び／又はＸｊと同一ではあり得ないことを想定できる。
【０１２５】
有用な合成経路のいくつかは、上記の構成要素の組み合わせによって利用可能である。
本発明の実施形態では、以下の構成要素Ａ１＊−３、Ｂ１＊−１及びＴ１＊又はＴ３＊を本発明の糖類の合成に使用することができる（スキーム１）。
【０１２６】
【化５７】
2019527243.tif 000059
【０１２７】
出発構成要素として、Ａ１＊−３を使用することができる。
合成方法Ａは以下の工程を含む：
ｉ）出発構成要素Ａ１＊−３を準備する、
【０１２８】
【化５８】
2019527243.tif 000060
【０１２９】
式中、ＸｉはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉと同一ではない保護基である、
ｉｉ）Ａ１＊−３からＰ３基を除去する、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に、得られた化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素基（hydrogen phosphonate  group）を導入する、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の後に、得られた化合物を構成要素Ｂ１＊−１とカップリングさせる、
【０１３０】
【化５９】
2019527243.tif 000061
【０１３１】
式中、ＸｉはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉと同一ではない保護基である、
ｖ）工程ｉ）の出発構成要素Ａ１＊−３の代わりに工程ｉｖ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｖ）をｔ回任意に繰り返し、ｔは０〜２０の整数である、
ｖｉ）工程ｖ）の後、得られた化合物からＰ２保護基を除去する、
ｖｉｉ）工程ｖｉ）の後に得られた化合物を化合物Ｔ１＊とカップリングさせる、
ｖｉｉｉ）式（Ｉ）の化合物を得るために、Ｐ１及びＰ３保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換する。
【０１３２】
上記合成法Ａにおいて、工程ｖｉｉ）のＴ１＊の代わりに化合物Ｔ３＊を使用することもできる。工程ｖｉｉｉ）において、Ｐ１及びＰ３保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
【０１３３】
上述の合成方法Ａにおいて、出発構成要素Ａ１＊−３の代わりに半反復単位Ａ１＊−１が出発構成要素として使用される場合、工程ｖ）の後、以下の工程ｖｉ´）及びｖｉｉ´）を、工程ｖｉ）〜ｖｉｉｉ）の代わりに行い得る：
ｖｉ´）工程ｖ）の後に得られた化合物をＴ２＊とカップリングさせる
ｖｉｉ´）式（Ｉ）の化合物を得るために、保護基Ｐ１及びＰ３を除去し、アジド基をアミン基に変換する。
【０１３４】
半反復単位Ｃ１＊−１は、上記合成方法Ａにおける工程ｖ）の後に終了構成要素として使用することができ、次いで、工程ｖｉ）〜ｖｉｉｉ）の代わりに以下の工程ｖｉ´´）−ｘｉ´´）を実施することができる：
ｖｉ´´）工程ｖ）の後、得られた化合物からＰ３保護基を除去する
ｖｉｉ´´）工程ｖｉ´）の後、得られた化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素基を導入する
ｖｉｉｉ´´）工程ｖｉｉ´´）の後に得られた化合物をＣ１＊−１とカップリングする
【０１３５】
【化６０】
2019527243.tif 000062
【０１３６】
式中、Ｐ１及びＰ５は保護基である、
ｉｘ´´）工程ｖｉｉｉ´´）の後、得られた化合物からＰ２保護基を除去する
ｘ´´）工程ｉｘ´´）の後に得られた化合物を化合物Ｔ１＊とカップリングさせる
ｘｉ´´）式（Ｉ）の化合物を得るために、Ｐ１及びＰ５保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換する。
【０１３７】
合成方法Ａの工程ｉｉｉ）及びｖｉｉ´´）において、工程ｉｉ）又は工程ｖｉ´´）の後に得られる化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素基の代わりにホスホルアミダイト基を導入することもできる。その後、Ｔ１＊はビス（ジイソプロピルアミノ）ベンジルオキシホスフィンとＨＯ−Ｌ−Ｎ３に置き換えられる。
【０１３８】
本発明の別の実施形態では、以下の構成要素Ａ１＊−４又はＡ１＊−５、及びＢ１＊−１を、本発明の糖類の合成に使用することができる（スキーム２）。
【０１３９】
【化６１】
2019527243.tif 000063
【０１４０】
出発構成要素として、Ａ１＊−４又はＡ１＊−５を使用することができる。
合成方法Ｂは以下の工程を含む：
ｉ）出発構成要素Ａ１＊−４又はＡ１＊−５を準備する
【０１４１】
【化６２】
2019527243.tif 000064
【０１４２】
式中、Ｌはリンカーであり、上記と同義であり、
ＸｉはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉと同一ではない保護基である、
【０１４３】
【化６３】
2019527243.tif 000065
【０１４４】
式中、Ｌはリンカーであり、上記と同義であり、
ＸｉはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉと同一ではない保護基である、
ｉｉ）Ａ１＊−４又はＡ１＊−５からＰ３基を除去する
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に、得られた化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素基を導入する
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の後に得られた化合物を構成要素Ｂ１＊−１とカップリングさせる
【０１４５】
【化６４】
2019527243.tif 000066
【０１４６】
式中、ＸｉはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉと同一ではない保護基である
ｖ）工程ｉ）の出発構成要素Ａ１＊−４又はＡ１＊−５の代わりに工程ｉｖ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｖ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜２０の整数である、
ｖｉ）式（Ｉ）の化合物を得るために、Ｐ１及びＰ３保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換する。
【０１４７】
工程ｖｉ）において、Ｐ１及びＰ３保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
半反復単位Ｃ１＊−１は、上記合成方法Ｂにおける工程ｖ）の後に終了構成要素として使用することができ、次いで、工程ｖｉ）の代わりに以下の工程ｖｉ´´）〜ｉｘ´´）を実施することができる：
ｖｉ´´）工程ｖ）の後、得られた化合物からＰ３保護基を除去する、
ｖｉｉ´´）工程ｖｉ´´）の後、得られた化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素基を導入する、
ｖｉｉｉ´´）工程ｖｉｉ´´）の後に得られた化合物をＣ１＊−１とカップリングする、
【０１４８】
【化６５】
2019527243.tif 000067
【０１４９】
式中、Ｐ１及びＰ５は保護基である、
ｉｘ´´）式（Ｉ）の化合物を得るために、Ｐ１及びＰ５保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換する。
【０１５０】
合成方法Ｂの工程ｉｉｉ）及びｖｉｉ´´）において、工程ｉｉ）又は工程ｖｉ´´）の後に得られる化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素基の代わりにホスホルアミダイト基を導入することもできる。出発構成要素Ａ１＊−５はその後Ａ１＊−５´又はＡ１＊−５´´に置き換えられる。
【０１５１】
【化６６】
2019527243.tif 000068
【０１５２】
スキーム１．合成方法ＡによるＨｉｂ莢膜オリゴ糖類誘導体の合成
【０１５３】
【化６７】
2019527243.tif 000069
【０１５４】
スキーム２．合成方法ＢによるＨｉｂ莢膜オリゴ糖類誘導体の合成
【０１５５】
【化６８】
2019527243.tif 000070
【０１５６】
本発明の実施形態では、以下の構成要素Ａ１＊−３、Ｂ１＊−１及びＴ１＊又はＴ３＊
を本発明の糖類の合成に使用することができる（スキーム１）。
【０１５７】
【化６９】
2019527243.tif 000071
【０１５８】
出発構成要素として、Ａ１＊−３を使用することができる。
合成方法Ｃは以下の工程を含む：
ｉ）出発構成要素Ａ１＊−３を準備する
【０１５９】
【化７０】
2019527243.tif 000072
【０１６０】
式中、ＸｉはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉと同一ではない保護基である、
ｉｉ）Ａ１＊−３からＰ３基を除去する、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に、得られた化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素基を導入する、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の後に、得られた化合物を構成要素Ｂ１＊−１とカップリングさせる、
【０１６１】
【化７１】
2019527243.tif 000073
【０１６２】
式中、ＸｉはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉと同一ではない保護基である、
ｖ）工程ｉ）の出発構成要素Ａ１＊−３の代わりに工程ｉｖ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｖ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜２０の整数である、
ｖｉ）工程ｖ）の後、得られた化合物からＰ３保護基を除去する、
ｖｉｉ）工程ｖｉ）の後に得られた化合物を化合物Ｔ１＊又はＴ３＊とカップリングさせる、
ｖｉｉｉ）式（Ｉ）の化合物を得るために、Ｐ１及びＰ２保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換する。
【０１６３】
工程ｖｉｉｉ）において、Ｐ１及びＰ３保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
【０１６４】
半反復単位Ａ１＊−１は出発構成要素として使用することができる。
【０１６５】
【化７２】
2019527243.tif 000074
【０１６６】
上記合成方法Ｃにおける工程ｉ）のＡ１＊−３の代わりに、次いでＰ４保護基を除去する工程が工程ｖｉｉｉ）に加えられる。
半反復単位Ｃ１＊−１は、上記合成方法Ｃにおける工程ｖ）の後に終了構成要素として使用することができ、次いで、工程ｖｉ）〜ｖｉｉｉ）の代わりに以下の工程ｖｉ´´）−ｘｉ´´）を実施することができる：
ｖｉ´´）工程ｖ）の後、得られた化合物からＰ３保護基を除去する、
ｖｉｉ´´）工程ｖｉ´´）の後、得られた化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素基を導入する、
ｖｉｉｉ´）工程ｖｉｉ´´）の後に得られた化合物をＣ１＊−１とカップリングする、
【０１６７】
【化７３】
2019527243.tif 000075
【０１６８】
式中、Ｐ１及びＰ５は保護基である、
ｉｘ´´）工程ｖｉｉｉ´´）の後、得られた化合物からＰ５保護基を除去する、
ｘ´´）工程ｉｘ´´）の後、得られた化合物を化合物Ｔ１＊又はＴ３＊カップリングさせる、
ｘｉ´´）式（Ｉ）の化合物を得るために、Ｐ１保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換する。
【０１６９】
合成方法Ｃの工程ｉｉｉ）及びｖｉｉ´´）において、工程ｉｉ）又は工程ｖｉ´´）の後に得られる化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素基の代わりにホスホルアミダイト基を導入することもできる。その後、Ｔ１＊は、ビス（ジイソプロピルアミノ）ベンジルオキシホスフィンとＨＯ−Ｌ−Ｎ３に置き換えられる。
スキーム３．合成方法ＣによるＨｉｂ莢膜オリゴ糖類誘導体の合成
【０１７０】
【化７４】
2019527243.tif 000076
【０１７１】
本発明の別の実施形態では、以下の構成要素Ａ１＊−３、Ｂ１＊−１、及びＣ１＊−２又はＣ１＊−３を本発明の糖類の合成に使用することができる。
【０１７２】
【化７５】
2019527243.tif 000077
【０１７３】
出発構成要素として、Ａ１＊−３を使用することができる。
合成方法Ｄは以下の工程を含む：
ｉ）出発構成要素Ａ１＊−３を準備する、
【０１７４】
【化７６】
2019527243.tif 000078
【０１７５】
式中、Ｌはリンカーであり、上記と同義であり、
ＸｉはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉと同一ではない保護基である、
ｉｉ）Ａ１＊−３からＰ３基を除去する、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に、得られた化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素基を導入する、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の後に、得られた化合物を構成要素Ｂ１＊−１とカップリングさせる、
【０１７６】
【化７７】
2019527243.tif 000079
【０１７７】
式中、ＸｉはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉと同一ではない保護基である
ｖ）工程ｉ）の出発構成要素Ａ１＊−３の代わりに工程ｉｖ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｖ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜２０の整数である、
ｖｉ）工程ｖ）の後に得られた化合物からＰ３基を除去する
ｖｉｉ）工程ｖｉ）の後に得られた化合物を構成要素Ｃ１＊−２又はＣ１＊−３とカップリングさせる
【０１７８】
【化７８】
2019527243.tif 000080
【０１７９】
式中、Ｐ１は保護基である、
【０１８０】
【化７９】
2019527243.tif 000081
【０１８１】
式中、Ｘｊは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１は、−Ｏ−に結合したときにＸｊと同一ではない保護基である、
ｖｉｉｉ）式（Ｉ）の化合物を得るために、Ｐ１及びＰ２保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換する。
【０１８２】
工程ｖｉｉｉ）において、Ｐ１及びＰ２保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
【０１８３】
工程ｉｉｉ）では、工程ｉｉ）の後に、得られた化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素基の代わりにホスホルアミダイト基を導入することもできる。開始構成要素Ｃ１＊−３は次いでＣ１＊−３´又はＣ１＊−３´´で置き換えられる。
【０１８４】
【化８０】
2019527243.tif 000082
【０１８５】
本発明の一実施形態において、２つの繰り返し単位からなる以下の構成要素は、［２＋２］合成アプローチによる本発明の糖類の合成に有用である。
【０１８６】
【化８１】
2019527243.tif 000083
【０１８７】
合成方法Ｅ−１は以下の工程を含む（スキーム４）：
ｉ）Ａ２＊−２、Ａ２＊−３、又はＡ２＊−４から選択された出発構成要素を準備する
【０１８８】
【化８２】
2019527243.tif 000084
【０１８９】
式中、Ｌはリンカーであり、上記と同義であり、
Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基を表し、
ｉｉ）構成要素Ｂ２＊−３をＡ２＊−２、Ａ２＊−３、又はＡ２＊−４から選択される出発構成要素とカップリングさせる、
【０１９０】
【化８３】
2019527243.tif 000085
【０１９１】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基であり、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に得られた化合物からＰ３基を除去する、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の後、得られた化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素を導入する、
ｖ）工程ｉ）の出発構成要素の代わりに工程ｉｖ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｖ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜１０の整数である、
ｖｉ）工程ｖ）の後に得られた化合物からＰ１及びＰ３保護基を除去し、式（Ｉ）の化合物を得るためにアジド基をアミン基に変換する。
【０１９２】
工程ｖｉ）において、Ｐ１及びＰ３保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
合成方法Ｅ−１の工程ｖ）の後、さらなる構成要素Ｂ２＊−４を、工程ｖ）の後に得られた化合物と代替でカップリングさせることができる。この場合、合成方法Ｅ−１は、工程ｖｉ）の代わりに以下の工程を含む：
ｖｉ´）工程ｖ）の後に得られた化合物を構成要素Ｂ２＊−４とカップリングさせる、
【０１９３】
【化８４】
2019527243.tif 000086
【０１９４】
式中、Ｘｊは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ５は、−Ｏ−に結合したときにＸｊと同一ではない保護基である、
ｖｉｉ´）工程ｖｉ´）の後に得られた化合物からＰ１及びＰ５保護基を除去し、式（Ｉ）の化合物を得るためにアジド基をアミン基に変換する。
スキーム４．方法Ｅ−１によるＨｉｂ莢膜オリゴ糖類誘導体の合成
【０１９５】
【化８５】
2019527243.tif 000087
【０１９６】
もちろん、Ｂ２＊−３又はＢ２＊−４を出発構成要素として使用することができる。こ
の場合、代替合成方法Ｅ−２は以下の工程を含む：
ｉ）Ｂ２＊−３又はＢ２＊−４から選択される出発構成要素を準備する、
【０１９７】
【化８６】
2019527243.tif 000088
【０１９８】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基であり、
【０１９９】
【化８７】
2019527243.tif 000089
【０２００】
式中、ＸｊはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ５は、−Ｏ−に結合したときにＸｊと同一ではない保護基である、
ｉｉ）構成要素Ｂ２＊−１をＢ２＊−３又はＢ２＊−４から選択される出発構成要素とカップリングさせる、
【０２０１】
【化８８】
2019527243.tif 000090
【０２０２】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ２は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基であり、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に、得られた化合物からＰ２保護基を除去する、
ｉｖ）工程ｉ）の出発構成要素の代わりに工程ｉｉｉ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｉｉ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜１０の整数である、ｖ）工程ｉｖ）の後に得られた化合物を、Ａ２＊−２、Ａ２＊−３、又はＡ２＊−４から選択される構成要素とカップリングさせる、
【０２０３】
【化８９】
2019527243.tif 000091
【０２０４】
式中、Ｌはリンカーであり、上記と同義であり、
Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及び／又はＸｊと同一ではない保護基を表す、
ｖｉ）工程ｖ）の後に得られた化合物からＰ１、Ｐ３及びＰ５保護基を除去し、式（Ｉ）の化合物を得るためにアジド基をアミン基に変換する。
【０２０５】
工程ｖｉ）において、Ｐ１、Ｐ３及びＰ５保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
【０２０６】
代替合成方法Ｅ−３は、ホスホネート化学現象の代わりにホスホルアミダイトが使用されるという点で合成方法Ｅ−１とは異なる。したがって、合成方法Ｅ−３は以下の工程を含む：
ｉ）Ａ２＊−２´´、Ａ２＊−３´´、又はＡ２＊−４´´から選択された出発構成要素を準備する、
【０２０７】
【化９０】
2019527243.tif 000092
【０２０８】
式中、Ｌはリンカーであり、上記と同義であり、
Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基を表し、
ｉｉ）構成要素Ｂ２＊−３´´をＡ２＊−２´´、Ａ２＊−３´´、又はＡ２＊−４´´から選択される出発構成要素とカップリングさせる、
【０２０９】
【化９１】
2019527243.tif 000093
【０２１０】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基であり、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に得られた化合物からＰ３基を除去する、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の後、得られた化合物のリボースのＣ−３位にホスホルアミダイト基を導入する、
ｖ）工程ｉ）の出発構成要素の代わりに工程ｉｖ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｖ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜１０の整数である、
ｖｉ）工程ｖ）の後に得られた化合物からＰ１及びＰ３保護基を除去し、式（Ｉ）の化合物を得るためにアジド基をアミン基に変換する。
【０２１１】
工程ｖｉ）において、Ｐ１及びＰ３保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
合成方法Ｅ−３の工程ｖ）の後、さらなる構成要素Ｂ２＊−４´´を、工程ｖ）の後に得られた化合物と代替でカップリングさせることができる。この場合、合成方法Ｅ−３は、工程ｖｉ）の代わりに以下の工程を含む：
ｖｉ´）工程ｖ）の後に得られた化合物を構成要素Ｂ２＊−４´´とカップリングさせる、
【０２１２】
【化９２】
2019527243.tif 000094
【０２１３】
式中、Ｘｊは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ５は、−Ｏ−に結合したときにＸｊと同一ではない保護基である、
ｖｉｉ´）工程ｖｉ´）の後に得られた化合物からＰ１及びＰ５保護基を除去し、式（Ｉ）の化合物を得るためにアジド基をアミン基に変換する。
合成方法Ｆ−１は以下の工程を含む（スキーム５）：
ｉ）Ａ２＊−１又はＢ２＊−１から選択された出発構成要素を準備する、
【０２１４】
【化９３】
2019527243.tif 000095
【０２１５】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１、Ｐ２及びＰ４は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基を表し
、
ｉｉ）構成要素Ｂ２＊−３をＡ２＊−１又はＢ２＊−１から選択される出発構成要素とカップリングさせる、
【０２１６】
【化９４】
2019527243.tif 000096
【０２１７】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基であり、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に得られた化合物からＰ３基を除去する、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の後、得られた化合物のリボースのＣ−３位にリン酸水素を導入する、
ｖ）工程ｉ）の出発構成要素の代わりに工程ｉｉｉ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｖ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜１０の整数である、
ｖｉ）Ｃ２＊−１、Ｃ２＊−２、Ｃ２＊−３又はＣ２＊−４から選択される構成要素を結合し、
【０２１８】
【化９５】
2019527243.tif 000097
【０２１９】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基である、
ｖｉｉ）工程ｖｉ）の後に得られた化合物からＰ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４保護基を除去し、式（Ｉ）の化合物を得るためにアジド基をアミン基に変換する。
【０２２０】
工程ｖｉｉ）において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
【０２２１】
もちろん、Ｃ２＊−１、Ｃ２＊−２、Ｃ２＊−３、又はＣ２＊−４を出発構成要素とし
て使用できる。この場合、代替合成方法Ｆ−２は以下の工程を含む：
ｉ）Ｃ２＊−１、Ｃ２＊−２、Ｃ２＊−３、又はＣ２＊−４から選択された出発構成要素を準備する、
【０２２２】
【化９６】
2019527243.tif 000098
【０２２３】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基であり、
ｉｉ）構成要素Ｂ２＊−１をＣ２＊−１、Ｃ２＊−２、Ｃ２＊−３、又はＣ２＊−４から選択される出発構成要素とカップリングさせる、
【０２２４】
【化９７】
2019527243.tif 000099
【０２２５】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ２は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基であり、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に、得られた化合物からＰ２保護基を除去する、
ｉｖ）工程ｉ）の出発構成要素の代わりに工程ｉｉｉ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｉｉ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜１０の整数である、ｖ）Ａ２＊−１又はＢ２＊−１から選択される出発構成要素とカップリングさせる、
【０２２６】
【化９８】
2019527243.tif 000100
【０２２７】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１、Ｐ２及びＰ４は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基を表す、
ｖｉ）工程ｖ）の後に得られた化合物からＰ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４保護基を除去し、式（Ｉ）の化合物を得るためにアジド基をアミン基に変換する。
【０２２８】
工程ｖｉ）において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
スキーム５．方法Ｆ−１によるＨｉｂ莢膜オリゴ糖類誘導体の合成
【０２２９】
【化９９】
2019527243.tif 000101
【０２３０】
さらに、２つの繰り返し単位からなる以下の構成要素は、［２＋２］合成アプローチによる本発明の糖類の合成に有用である。
【０２３１】
【化１００】
2019527243.tif 000102
【０２３２】
合成方法Ｇ−１は以下の工程を含む：
ｉ）Ａ２＊−２´、Ａ２＊−３´、又はＡ２＊−４´から選択された出発構成要素を準備する、
【０２３３】
【化１０１】
2019527243.tif 000103
【０２３４】
式中、Ｌはリンカーであり、上記と同義であり、
Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基を表し、
ｉｉ）構成要素Ｂ２＊−３´をＡ２＊−２´、Ａ２＊−３´、又はＡ２＊−４´から選択される出発構成要素とカップリングさせる、
【０２３５】
【化１０２】
2019527243.tif 000104
【０２３６】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基であり、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に、得られた化合物からＰ３基を除去する、
ｉｖ）工程ｉ）の出発構成要素の代わりに工程ｉｉｉ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｉｉ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜１０の整数である、ｖ）工程ｉｖ）の後に得られた化合物からＰ１及びＰ３保護基を除去し、式（Ｉ）の化合物を得るためにアジド基をアミン基に変換する。
【０２３７】
工程ｖ）において、Ｐ１及びＰ３保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換すること
は、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
合成方法Ｇ−１の工程ｉｖ）の後、さらなる構成要素Ｂ２＊−４´を、工程ｖ）の後に得られた化合物と代替でカップリングさせることができる。この場合、合成方法Ｇ−１は、工程ｖｉ）の代わりに以下の工程を含む：
ｖ´）工程ｖｉ）の後に得られた化合物を構成要素Ｂ２＊−４´とカップリングさせる
【０２３８】
【化１０３】
2019527243.tif 000105
【０２３９】
式中、Ｘｊは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ５は、−Ｏ−に結合したときにＸｊと同一ではない保護基である、
ｖｉ´）工程ｖ´）の後に得られた化合物からＰ１及びＰ５保護基を除去し、式（Ｉ）の化合物を得るためにアジド基をアミン基に変換する。
【０２４０】
もちろん、Ｂ２＊−３´又はＢ２＊−４´は出発構成要素として使用できる。この場合、代替合成方法Ｇ−２は以下の工程を含む：
ｉ）Ｂ２＊−３´又はＢ２＊−４´から選択される出発構成要素を準備する、
【０２４１】
【化１０４】
2019527243.tif 000106
【０２４２】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基であり、
【０２４３】
【化１０５】
2019527243.tif 000107
【０２４４】
式中、ＸｊはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ５は、−Ｏ−に結合したときにＸｊと同一ではない保護基である、
ｉｉ）構成要素Ｂ２＊−１´をＢ２＊−３又はＢ２＊−４から選択される出発構成要素とカップリングさせる、
【０２４５】
【化１０６】
2019527243.tif 000108
【０２４６】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ２は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基であり、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に、得られた化合物からＰ２保護基を除去する、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の後に、得られた化合物のリビトールのＣ−５位にリン酸水素を導入する
ｖ）工程ｉ）の出発構成要素の代わりに工程ｉｖ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｖ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜１０の整数である、
ｖｉ）工程ｖ）の後に得られた化合物を、Ａ２＊−２´、Ａ２＊−３´、又はＡ２＊−４´から選択される構成要素とカップリングさせる、
【０２４７】
【化１０７】
2019527243.tif 000109
【０２４８】
式中、Ｌはリンカーであり、上記と同義であり、
Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基を表す、
ｖｉｉ）工程ｖｉ）の後に得られた化合物からＰ１、Ｐ３及びＰ５保護基を除去し、式（Ｉ）の化合物を得るためにアジド基をアミン基に変換する。
【０２４９】
工程ｖｉｉ）において、Ｐ１、Ｐ３及びＰ５保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
【０２５０】
合成方法Ｈ−１は以下の工程を含む:
ｉ）Ａ２＊−１´又はＢ２＊−１´から選択された出発構成要素を準備する、
【０２５１】
【化１０８】
2019527243.tif 000110
【０２５２】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１、Ｐ２及びＰ４は保護基を表す、
ｉｉ）構成要素Ｂ２＊−３´をＡ２＊−１´又はＢ２＊−１´から選択される出発構成要素とカップリングさせる
【０２５３】
【化１０９】
2019527243.tif 000111
【０２５４】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は保護基である、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に得られた化合物からＰ３基を除去する、
ｉｖ）工程ｉ）の出発構成要素の代わりに工程ｉｉｉ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｉｉ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜１０の整数である、ｖ）工程ｉｖ）の後に得られた化合物をＣ２＊−１´、Ｃ２＊−２´、Ｃ２＊−３´、又はＣ２＊−４´から選択される構成要素とカップリングさせる、
【０２５５】
【化１１０】
2019527243.tif 000112
【０２５６】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は保護基である、
ｖｉ）工程ｖ）の後に得られた化合物からＰ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４保護基を除去し、式（Ｉ）の化合物を得るためにアジド基をアミン基に変換する。
【０２５７】
工程ｖｉ）において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
【０２５８】
もちろん、Ｃ２＊−１´、Ｃ２＊−２´、Ｃ２＊−３´、又はＣ２＊−４´は出発構成要素として使用できる。この場合、代替合成方法Ｈ−２は以下の工程を含む：
ｉ）Ｃ２＊−１´、Ｃ２＊−２´、Ｃ２＊−３´、又はＣ２＊−４´から選択された出発構成要素を準備する、
【０２５９】
【化１１１】
2019527243.tif 000113
【０２６０】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基であり、
ｉｉ）構成要素Ｂ２＊−１´をＣ２＊−１´、Ｃ２＊−２´、Ｃ２＊−３´、又はＣ２＊−４´から選択される出発構成要素とカップリングさせる、
【０２６１】
【化１１２】
2019527243.tif 000114
【０２６２】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ２は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基であり、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に、得られた化合物からＰ２保護基を除去する、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の後に、得られた化合物のリビトールのＣ−５位にリン酸水素を導入する、
ｖ）工程ｉ）の出発構成要素の代わりに工程ｉｉｉ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｖｉ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜１０の整数である
ｖｉ）工程ｖ）の後に得られた化合物を、Ａ２＊−１´又はＢ２＊−１´から選択される構成要素とカップリングさせる、
【０２６３】
【化１１３】
2019527243.tif 000115
【０２６４】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１、Ｐ２及びＰ４は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基を表す、
ｖｉｉ）工程ｖｉ）の後に得られた化合物からＰ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４保護基を除去し、式（Ｉ）の化合物を得るためにアジド基をアミン基に変換する。
【０２６５】
工程ｖｉｉ）において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に実施することができるが、同じ反応条件下で同時に行うのが好ましい。
合成方法Ｊ−１は以下の工程を含む：
ｉ）出発構成要素Ｂ２＊−１´´を準備する、
【０２６６】
【化１１４】
2019527243.tif 000116
【０２６７】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基を表す、
ｉｉ）出発要素Ｂ２＊−１´´のリボースのＣ−３位にホスホルアミダイト基を導入する、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に、得られた化合物を構成要素Ｂ２＊−３´´とカップリングさせる、
【０２６８】
【化１１５】
2019527243.tif 000117
【０２６９】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基である、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の後に得られた化合物からＰ３基を除去する、
ｖ）工程ｉｉｉ）の構成要素Ｂ２＊−３´´の代わりに工程ｉｖ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｖ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜１０の整数である、
ｖｉ）工程ｖ）の後に得られた化合物を化合物ＨＯ−Ｌ−Ｎ３とカップリングさせる、
ｖｉｉ）式（Ｉ）の化合物を得るために、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換する。
【０２７０】
工程ｖｉｉ）において、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に、又は同じ反応条件下で同時に行うことができる。
合成方法Ｊ−２は以下の工程を含む：
ｉ）出発構成要素Ｂ２＊−１´´´を準備する、
【０２７１】
【化１１６】
2019527243.tif 000118
【０２７２】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基を表す、
ｉｉ）出発要素Ｂ２＊−１´´´のリボースのＣ−３位にホスホルアミダイト基を導入する、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の後に得られた化合物と構成要素Ｂ２＊−３´´´をカップリングする、
【０２７３】
【化１１７】
2019527243.tif 000119
【０２７４】
式中、Ｘｉ及びＸｊは互いに独立してＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５又はＸ６を表し、Ｐ１及びＰ３は、−Ｏ−に結合したときにＸｉ及びＸｊと同一ではない保護基である、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の後、得られた化合物からＰ３基を除去する、
ｖ）工程ｉｉｉ）の構成要素Ｂ２＊−３´´´の代わりに工程ｉｖ）の後に得られる化合物を使用することにより工程ｉ）〜ｉｖ）をｔ回任意に繰り返し、式中ｔは０〜１０の整数である、
ｖｉ）工程ｖ）の後に得られた化合物と化合物ＨＯ−Ｌ−Ｎ３をカップリングさせる、
ｖｉｉ）式（Ｉ）の化合物を得るために、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換する。
【０２７５】
工程ｖｉｉ）において、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換することは、段階的に、又は同じ反応条件下で同時に行うことができる。
さらに、本発明のＨｉｂ莢膜オリゴ糖類誘導体は、重縮合方法Ｉによって合成することができる。重縮合方法Ｉには、以下の構成要素が適している。
【０２７６】
【化１１８】
2019527243.tif 000120
【０２７７】
式中、Ｘｉ、Ｘｊ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＬは、上記と同じ意味を有する。
２つの官能基、すなわちリン酸水素又はホスホルアミダイト及びヒドロキシ基を有する反復単位が重縮合反応に適している。重縮合反応をクエンチするために、ヒドロキシル基を有するクエンチング構成要素を使用することができる。反復単位として、二糖類Ｂ１＊−５、Ｂ１＊−６及び四糖類Ｂ２＊−２、Ｂ２＊−３´が重縮合に適している。クエンチング構成要素として、Ｔ２＊、Ａ１＊−６、Ａ１＊−７、Ａ１＊−８、Ｂ１＊−１、Ｂ１＊−４、Ｃ１＊−１、Ｃ１＊−２、及びＣ１＊−３が使用し得る。
【０２７８】
Ｂ１＊−５又はＢ２＊−２が反復単位として使用されるとき、Ｔ２＊、Ｃ１＊−１、Ｃ１＊−２及びＣ１＊−３がクエンチング構成要素として使用され得る。Ｂ１＊−６又はＢ２＊−２´が反復単位として使用されるとき、Ｔ２＊、Ａ１＊−６、Ａ１＊−７及びＡ１＊−８がクエンチング構成要素として使用され得る。
【０２７９】
以下の工程を含む重縮合による合成方法Ｉ：
ｉ）重縮合反応に適した少なくとも１つの反復単位をを準備する、
ｉｉ）少なくとも１つの反復単位の重縮合反応を実施する、
ｉｉｉ）クエンチング構成要素によって少なくとも１つの反復単位の重縮合反応をクエンチする、
ｉｖ）式（Ｉ）の化合物又は式（Ｉ）の化合物の混合物を得るために、Ｐ保護基を除去し、アジド基をアミン基に変換する、
式中、Ｂ１＊−５又はＢ２＊−２が反復単位として使用される場合、Ｔ２＊、Ｃ１＊−１、Ｃ１＊−２又はＣ１＊−３がクエンチング構成要素として使用される、
Ｂ１＊−６又はＢ２＊−２´が反復単位として使用されるとき、Ｔ２＊、Ａ１＊−６、Ａ１＊−７又はＡ１＊−８がクエンチング構成要素として使用される。
【０２８０】
或いは、少なくとも１つの反復単位及びクエンチング構成要素を同時に準備してもよく、少なくとも１つの反復単位の重縮合反応及び重縮合反応のクエンチを、ワンポットシステムで自動的に実施する。
【０２８１】
少なくとも１つの反復単位の合計とクエンチング構成要素とのモル比は、オリゴ糖（類）の長さ及び多様性に対して重要な役割を果たす。
反復単位とクエンチング構成要素とのモル比が２０：１から１：１、好ましくは２０：１から３：１、より好ましくは１５：１から４：１、最も好ましくは１０：１から５：１の範囲で少なくとも１つの反復単位とクエンチング構成が準備される。
【０２８２】
したがって、本発明の一実施形態は、式（Ｉ）の糖類を合成するための中間体化合物であり、
Ａ１＊−２、Ａ１＊−３、Ａ１＊−４、Ａ１＊−５、Ａ１＊−５´、Ａ１＊−５´´、Ａ１＊−６、Ａ１＊−７、Ａ１＊−８、Ｂ１＊−１、Ｂ１＊−２、Ｂ１＊−３、Ｂ１＊−４、Ｂ１＊−５、Ｂ１＊−６、Ｃ１＊−２、Ｃ１＊−３、Ｃ１＊−３´、Ｃ１＊−３´´、Ａ２＊−１、Ａ２＊−２、Ａ２＊−３、Ａ２＊−４、Ｂ２＊−１、Ｂ２＊−２、Ｂ２＊−３、Ｂ２＊−４、Ｃ２＊−１、Ｃ２＊−２、Ｃ２＊−３、Ｃ２＊−４、Ａ２＊−１´、Ａ２＊−２´、Ａ２＊−３´、Ａ２＊−４´、Ａ２＊−２´´、Ａ２＊−３´´、Ａ２＊−４´´、Ｂ２＊−１´、Ｂ２＊−１´´、Ｂ２＊−１´´´、Ｂ２＊−２´、Ｂ２＊−３´、Ｂ２＊−３´´、Ｂ２＊−３´´´、Ｂ２＊−４´、Ｃ２＊−１´、Ｃ２＊−２´、Ｃ２＊−３´及びＣ２＊−４´からなる群から選択され、
【０２８３】
【化１１９】
2019527243.tif 000121
【０２８４】
2019527243.tif 000122
【０２８５】
2019527243.tif 000123
【０２８６】
2019527243.tif 000124
【０２８７】
2019527243.tif 000125
【０２８８】
式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、及びＰ５は、−Ｏ−に結合したときにＸi及びＸｊと同一ではない保護基を表し、
Ｘｉ及びＸｊは、互いに独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＦ３を表し、
基ＸｉかＸｊが１つだけ存在する場合、Ｘｉ又はＸｊは−ＯＨにはできず、
基ＸｉとＸｊの両方が存在する場合、ＸｉとＸｊは同時に−ＯＨになることはできず、
Ｌは上で定義された意味を有し、
Ｍ＋は、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、又はＨＮＥｔ３＋を表す：
或いは、本発明の実施形態は、式（Ｉ）の糖類を合成するための中間体化合物であり、
Ａ１＊−４、Ａ１＊−５、Ａ１＊−６、Ａ１＊−７、Ａ１＊−８、Ｂ１＊−１、Ｂ１＊−２、Ｂ１＊−３、Ｂ１＊−４、Ｂ１＊−５、Ｂ１＊−６、Ｃ１＊−２、Ｃ１＊−３、Ａ２＊−１、Ａ２＊−２、Ａ２＊−３、Ａ２＊−４、Ｂ２＊−１、Ｂ２＊−２、Ｂ２＊−３、Ｂ２＊−４、Ｃ２＊−１、Ｃ２＊−２、Ｃ２＊−３、Ｃ２＊−４、Ａ２＊−１´、Ａ２＊−２´、Ａ２＊−３´、Ａ２＊−４´、Ｂ２＊−１´、Ｂ２＊−２´、Ｂ２＊−３´、Ｂ２＊−４´、Ｂ２＊−１´´´、Ｂ２＊−３´´´、Ｃ２＊−１´、Ｃ２＊−２´、Ｃ２＊−３´及びＣ２＊−４´からなる群から選択され：
【０２８９】
【化１２０】
2019527243.tif 000126
【０２９０】
2019527243.tif 000127
【０２９１】
2019527243.tif 000128
【０２９２】
2019527243.tif 000129
【０２９３】
式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、及びＰ５は保護基を表し、
Ｘｉ及びＸｊは、互いに独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＦ３を表し、
基ＸｉかＸｊが１つだけ存在する場合、Ｘｉ又はＸｊは−ＯＨにはできず、
基ＸｉとＸｊの両方が存在する場合、ＸｉとＸｊは同時に−ＯＨになることはできず、
Ｌは上で定義された意味を有し、
Ｍ＋は、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、又はＨＮＥｔ３＋を表す：
本明細書で使用される「保護基」という用語は、有機合成において、好ましくはヒドロキシル基に対して一般的に使用される保護基を示す。
【０２９４】
より具体的には、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６は、好ましくはヒドロキシル基のための適切な保護基、さらに好ましくは適切な一連の脱保護反応によって順次互いに除去され得るヒドロキシル基のための異なる適切な保護基である。したがって、ヒドロキシル基のための保護基Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６は、アセチル、ベンジル、ベンゾイル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−メトキシフェニル、パラ−ブロモベンジル、ｏ−ニトロフェニル、ｐ−ニトロフェニル、アリル、メチル、イソプロピル、レブリニル、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、トリチル、２−ナフチルメチル（Ｎａｐ）、ピバロイル、トリイソプロピルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルメトックスフェニルシリル（ｂｕｔｙｌｍｅｔｈｏｘｐｈｅｎｙｌｓｉｌｙｌ）、トリエチルシリル、トリメチルシリル、２−トリメチルシリルエトキシメチルからなる、又はそれらを含む群から選択することができる。
【０２９５】
より具体的には、本発明の好ましい実施形態において、Ｐ１、Ｐ５及びＰ６はベンジル又はｐ−メトキシベンジルであり得、Ｐ２はアリル、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、２−ナフチルメチル（Ｎａｐ）又はトリチルであり得、Ｐ３はレブリニル（Ｌｅｖ）又は２−ナフチルメチル（Ｎａｐ）であり得、Ｐ４はメチル又はアセチルであり得る。
【０２９６】
特に好ましい実施形態において、Ｐ１はベンジルであり得、Ｐ２は２−ナフチル−メチルであり得、Ｐ３はレブリニルであり得る。
トリクロロ酢酸で処理することによりＰ２保護基としてのＤＭＴｒ基を除去すると、リビトールのＣ−５位に第一級アルコールが得られ、これはパートナー構成要素のリボースのＣ−３位にリン酸水素又はホスホルアミダイトとカップリングする。酢酸ヒドラジンでの処理によるＰ３保護基としてのレブリニル基の開裂は、リボースのＣ−３位で第二級アルコールをもたらし、これもまたパートナー構成要素のリビトールのＣ−５位でリン酸水素又はホスホルアミダイトと反応する。
【０２９７】
Ｐ１保護基としてのベンジル基の脱保護は、Ｐｄ触媒水素化反応によって好ましく行われる。同じ反応条件がアジド基からアミン基への変換にも当てはまる。
Ｐ３又はＰ２保護基を脱保護した後、構成要素のリボースのＣ−３位又は構成要素のリビトールのＣ−５位又は得られる化合物にリン酸水素基を導入するためには、リボースのＣ−３位又はリビトールのＣ−５位のヒドロキシル基をイミダゾールの存在下でトリクロロホスフィン及びトリエチルアミンと反応させるのが好ましい。
【０２９８】
Ｐ３又はＰ２保護基を脱保護した後、構成要素のリボースのＣ−３位又は構成要素のリビトールのＣ−５位又は得られる化合物にホスホルアミダイト基を導入するためには、リボースのＣ−３位又はリビトールのＣ−５位のヒドロキシル基をジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドの存在下でビス（ジイソプロピルアミノ）−ベンジルオキシホスフィンと反応させるのが好ましい。
【０２９９】
塩化ピバロイルは、一対の構成要素をカップリングするためのカップリング試薬又は縮合試薬として使用される。上述したように、カップリング反応において、一方のカップリングのパートナーはヒドロキシル基を有し、他方のカップリングのパートナーはリン酸水素基を有する。
【０３００】
重縮合反応では、構成要素は２つの官能基、すなわちヒドロキシル基とリン酸水素基を有する。
リンカー
したがって、本発明は、−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介した免疫原性担体とのコンジュゲートに適した−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基を含む、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれかの糖類に関する。本発明はまた、−Ｏ−Ｌ−ＣＯＯＨ基のカルボン酸を介した免疫原性担体とのコンジュゲートに適した−Ｏ−Ｌ−ＣＯＯＨ基を含有する、一般式のいずれかの糖類に関する。リンカーＬは、上で定義したような任意の非免疫原性部分であり得る。したがって、リンカーＬは、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれかの糖類の一部、ならびに一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれかの糖類と免疫原性担体との任意のコンジュゲートであるが、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれかの糖類、ならびに一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれかの糖類と免疫原性担体との任意のコンジュゲートの免疫原
性に影響を及ぼさない。
【０３０１】
式ＨＯ−Ｌ−ＮＨ２又はＨＯ−Ｌ−ＣＯＯＨの任意の二官能性リンカーは、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、及び（ＩＩＩ−２）のいずれかの本発明の糖類、ならびに免疫原性担体とのそれらのコンジュゲートに使用できる。一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、及び（ＩＩＩ−２）のいずれかの糖類である本発明の一実施形態では、リンカー−Ｌ−は、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−から選択され、
式中、−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｂ−は−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−を表し、
−Ｌｄ−は−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＦ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−Ｃ２Ｈ４−、及び−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｅ−は−（ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＦ２）ｐ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−及び−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ２−から選択され、
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２は、互いに独立して、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。
【０３０２】
したがって、本発明はまた、一般式（Ｉ）の糖類、その糖類のエナンチオマー、ジアステレオマー、エナンチオマーの混合物、ジアステレオマーの混合物、アノマー、水和物、溶媒和物、及びそれらの薬学的に許容される塩を対象とする。
【０３０３】
【化１２１】
2019527243.tif 000130
【０３０４】
式中
Ａは
【０３０５】
【化１２２】
2019527243.tif 000131
【０３０６】
であり、
Ｂは、
【０３０７】
【化１２３】
2019527243.tif 000132
【０３０８】
であり、
Ｃは、
【０３０９】
【化１２４】
2019527243.tif 000133
【０３１０】
であり、
Ｄは、
【０３１１】
【化１２５】
2019527243.tif 000134
【０３１２】
であり、
Ｅは、
【０３１３】
【化１２６】
2019527243.tif 000135
【０３１４】
であり、
Ｆは、
【０３１５】
【化１２７】
2019527243.tif 000136
【０３１６】
であり、
Ｔ１及びＴ２は−Ｈ、−Ｌ−ＮＨ２を表し、Ｔ１が−Ｌ−ＮＨ２の場合、Ｔ２は−Ｈであり、Ｔ１が−Ｈの場合、Ｔ２は−Ｌ−ＮＨ２又は−Ｌ−ＣＯＯＨであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６は、互いに独立して−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＦ３を表し、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも２つは−ＯＨではなく、
ｎは１、２、３又は４から選択される整数であり、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は互いに独立して０及び１から選択され、
ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４≧１である、
ただし、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＝１の場合、ｎ＝１の場合、及び
Ａは
【０３１７】
【化１２８】
2019527243.tif 000137
【０３１８】
である場合、
Ｆは
【０３１９】
【化１２９】
2019527243.tif 000138
【０３２０】
であり、また、
ただし、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＝１の場合、ｎ＝１の場合、及び
Ｆは
【０３２１】
【化１３０】
2019527243.tif 000139
【０３２２】
である場合、
Ａは
【０３２３】
【化１３１】
2019527243.tif 000140
【０３２４】
であり、
Ｌはリンカーであり、Ｌは、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−から選択され、
式中、−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｂ−は−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−を表し、
−Ｌｄ−は−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＦ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−Ｃ２Ｈ４−、及び−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−から選択し、
−Ｌｅ−は−（ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＦ２）ｐ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−及び−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−（Ｃ
Ｈ２）ｐ２−から選択し、
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２は、互いに独立して、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。
【０３２５】
また、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、及び（ＩＩＩ−２）のいずれかの本発明の糖類が、−Ｌａ−Ｌｅ−であるリンカー−Ｌ−を有することが好ましく、
式中−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｅ−は、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＨ２）ｐ１−、及び−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ２−から選択し、
ｏ、ｐ１、ｐ２は、互いに独立して、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。
一実施形態において、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、及び（ＩＩＩ−２）のいずれかの糖類であって、リンカー−Ｌ−が−Ｌａ−であり、
式中−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ１−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ２−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ２−ＣＨ２−を表し、
ｏ１は、２、３、４、５、及び６から選択される整数であり、
ｏ２は、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。
【０３２６】
複合糖質
本発明の別の態様は、−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介して免疫原性担体とコンジュゲートしている、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれかの糖類に関する。該糖類はまた、免疫原性担体と、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれかの糖類とを反応させることによって得られる複合糖質と定義する。したがって、−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介して免疫原性担体とコンジュゲートした一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれかの該糖類、及び、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれかの糖類を免疫原性担体と反応させることによって得られる該複合糖質は、同じ意味を持つ。
【０３２７】
該複合糖質は、細菌に関連する疾患に対する免疫のためのワクチンとして有効であることが証明された。
糖類は、一般にＴＩ−２（Ｔ細胞非依存性−２）抗原及び弱い免疫原として当業者に知られている。ＴＩ−２抗原は抗原であるが、表面に露出した免疫グロブリン受容体の架橋を介して成熟Ｂ細胞によってのみ認識される。Ｔ細胞の助けがなければ、免疫学的記憶は生じず、ＩｇＭから他のＩｇＧサブクラスへのアイソタイプ転換も、Ｂ細胞親和性の成熟も起こらない。さらに、糖類は、ヒト糖脂質及び糖タンパク質に対する構造的相同性のために、ヒトにおいて免疫原が乏しいことが知られている。糖類は、それらの乏しい免疫原性特性のために、Ｂ細胞による抗体産生、ならびにメモリー細胞の形成の両方をあまりもたらすことができないことを示している。それらは、強力なワクチンの産生に不可欠であるという特徴である。
【０３２８】
したがって、糖類に基づく強力なワクチンを産生するために、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−
１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）の糖類を免疫原性担体にコンジュゲートして複合糖質を産生する。これは糖類と比較して免疫原性が増加したことを示すものである。
【０３２９】
糖類−タンパク質コンジュゲートは、一般式（Ｉ）の少なくとも１つの合成糖類と、少なくとも１つの糖類（Ｉ）が共有結合している免疫原性担体とからなる。
本稿の文脈では、「免疫原性担体」という用語は、糖類とコンジュゲートして糖類それ自体と比較して高い免疫性を示す複合糖質を形成する構造と定義する。したがって、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）の糖類の免疫原性担体に対するコンジュゲートは、該免疫原性担体に対する免疫応答を誘導することのない、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）の糖類に対する免疫応答の刺激として効果がある。
【０３３０】
好ましい免疫原性担体は担体タンパク質である。当業者にとって、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド、変異型ジフテリアトキソイド、修飾型ジフテリアトキソイド、変異修飾型ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、修飾型破傷風トキソイド、変異型破傷風トキソイド、外膜タンパク質（ＯＭＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はコレラトキソイド（ＣＴ）を含む又はそれらからなる群から選択されるタンパク質である。本明細書で使用される「トキソイド」という用語は、他の特性、典型的には免疫原性を維持しながら、その毒性が化学物質（ホルマリン）又は熱処理のいずれかによって不活性化又は抑制された細菌毒素（通常は外毒素）を示す。本明細書中で使用される場合、変異型トキソイドは、野生型アミノ酸配列を修正することによって、より毒性が低く、又は無毒性でさえあるように修正されている組換え細菌毒素である。そのような突然変異は、１つ以上のアミノ酸の置換であり得る。そのような変異型トキソイドは、その表面に、相互接続分子の官能基Ｙと反応して修飾型トキソイドを提供することができる官能基を提示する。
【０３３１】
本発明の実施形態は、−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２−基の窒素原子を介して免疫原性担体に共有結合している糖類（Ｉ）である。−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２−基の−Ｌ−は、共有結合（免疫原性担体に直接又は間接的に結合したＯ−Ｌ−ＮＨ２−基の酸素原子）の形又は−Ｌ−ＮＨ−の形で、免疫原性担体に結合しており、それにおいて窒素原子が担体タンパク質に直接又は間接的に結合している。
【０３３２】
直接結合するとは、免疫原性担体の官能基又は側鎖に、間接結合するとは、免疫原性担体及び／又は−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２−基の窒素と一緒になる追加の官能基を介する結合を意味する。
【０３３３】
担体タンパク質が免疫原性担体として使用される場合、糖類を担体タンパク質にカップリングするためには、糖類の、時にはタンパク質の化学的活性化が必要である。タンパク質へ糖類をコンジュゲーションする方法の選択は、タンパク質のｐＨ及び温度感受性、及びほとんどの有機溶媒でそれらの溶解性が限られていることに起因して、制限されている。この手順は、タンパク質の変性及び糖類の分解を防ぐために温和な条件下で行われなければならない。したがって、コンジュゲーションの反応は緩衝液中で中性又はほぼ中性のｐＨで行われる。今日まで、炭水化物をタンパク質に共有結合させるための数多くのプロトコルが報告されてきた。以下の結合方法は、合成糖類（Ｉ）を担体タンパク質に結合するために使用することができる。
【０３３４】
還元的アミノ化は、タンパク質中のリシン残基のε−アミノ基へ還元末端を介して遊離オリゴ糖類を結合するための最も一般的な複合糖質化法の１つである。本発明では、合成
糖類（Ｉ）のアミノ基は、アルデヒド官能基、例えば、グルタルアルデヒドを用いてさらに官能化することができ、アルデヒドで官能化された合成糖類とリシン残基を有する担体タンパク質との間の複合糖質化は、還元的アミノ化によって形成することができる。
【０３３５】
安定した結合をもたらすためのマレイミドとチオールとの不可逆的反応としてのマレイミド−チオールコンジュゲーションもまた、複合糖質の調製のために頻繁に使用されてきた。例えば、マレイミドは、還元末端にアミンリンカーを有する合成糖類（Ｉ）から調製することができる。次いで、糖類−マレイミド構築物は、担体タンパク質のシステイン中のチオール側鎖と反応でき、安定した複合糖質を生じる。逆に、担体タンパク質をマレイミドで活性化し、合成糖類（Ｉ）をチオール官能基でさらに官能基化することができる。
【０３３６】
スクアリン酸エステルを用いた複合糖質化法を適用することができる。最初に、合成糖類（Ｉ）のスクアリン酸アミドエステルは、アミン基とスクアリン酸エステルとのカップリングによって調製することができる。合成糖類（Ｉ）のスクアリン酸アミドエステルは、担体タンパク質のリシン残基のε−アミノ基とさらにカップリングすることができ、スクアリン酸ジアミドが形成される。
【０３３７】
ジ（Ｎ−スクシンイミジル）アジペート、ジ（Ｎ−スクシンイミジル）グルタレート（ＤＳＧ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）、スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル−３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、２−ピリジルジチオール−テトラオキサテトラデカン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＰＥＧ−４−ＳＰＤＰ）を含む活性化エステルを適用することができる（図１を参照）。好ましくは、ジ（Ｎ−スクシンイミジル）アジペートを、複合糖質の調製に使用することができる。
【０３３８】
カルボジイミドを用いたゼロレングス架橋法では、ほとんどすべてのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を使用することができる。Ｎ−置換カルボジイミドは、担体タンパク質のカルボン酸と反応して、高度に反応性のＯ−アシルイソ尿素誘導体を形成することができる。この活性種は、次に合成糖類（Ｉ）の第一級アミンと反応してアミド結合を形成することができる。
【０３３９】
さらなるコンジュゲートの方法としてクリックケミストリーを使用することができる。クリックケミストリーはアルキンとアジドの［３＋２］環状付加である。好ましくは、歪み促進型アジド−アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）を複合糖質化に適用することができる。シクロオクチンのような歪んだアルキンは、無毒の反応条件のためにバイオコンジュゲーションに有利である。担体タンパク質は、アジド含有アミノ酸で簡単に標識され、アルキンで官能化された合成糖類（Ｉ）とコンジュゲートすることができる。逆に、アジドで官能化された合成糖類（Ｉ）は、アルキンで標識された担体タンパク質とコンジュゲートすることができる。
【０３４０】
天然の化学的連結（ＮＣＬ）は、複合糖質化に使用できる。この方法を複合糖質化に適用するためには、合成糖類（Ｉ）をチオエステル、例えばベンジルチオエステル、エチルチオエステル、又はフェニルチオエステルでさらに官能化するべきである。天然の化学的連結において、担体タンパク質のＮ末端システイン残基のチオレート基は官能化合成糖類（Ｉ）のチオエステルを攻撃する。この可逆的なトランスチオエステル化工程は、化学選択的及び位置選択的であり、チオエステル中間体を形成し、この中間体は分子内Ｓ、Ｎ−アシルシフトによって再配列し、それが連結部位での天然アミド結合の形成をもたらす。結果として、合成糖類（Ｉ）及び担体タンパク質はアミド結合とコンジュゲートしている。
【０３４１】
痕跡のないシュタウディンガーライゲーションもまた、複合糖質化に使用できる。この反応において、ホスフィンはチオエステル求電子剤を担持する。アジドとの反応後、生成物はアミド及び脱離ホスフィンオキシドである。シュタウディンガーライゲーションは、アジドとホスフィンの関連濃度での非毒性が証明されているため、インビトロでも、生細胞でも、生きた動物でも、アジド含有タンパク質を標識するのに理想的であることが証明されてきた。複合糖質化での適用のために、合成糖類（Ｉ）は、チオエステル担持ホスフィンで官能化され、アジド基は、その後のホスフィンプローブ導入のためにいくつかの方法で目的の担体タンパク質に導入される。通常、タンパク質のメチオニンの代わりにアジドホモアラニンを統合することができる。アジドホモアラニンで修飾された担体タンパク質は、シュタウディンガーライゲーションによって合成糖類（Ｉ）と効果的かつ特異的にコンジュゲートすることができる。
【０３４２】
光架橋は分子生物学の分野における重要な化学的方法である。最近、リガンド結合領域の同定にこの方法を応用することに、多大な注目が集まっている。光架橋法は、複合糖質化に応用することができる。光親和性標識には、光化学的に活性化して反応性の高い中間体、通常はニトレン又はカルベンを生成することができる官能基が必要である。官能基としては、ベンゾフェノン、アリールアジド、アリール−、又はアルキルジアジリンが適用される。最近、好ましいことに、アルキル−又はアリールジアジリンが光親和性標識に使用されている（Ｍ．Ｒ．Ｂｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２００９，４（７），１０４４−１０６３；  Ｍ．Ｒ．Ｂｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１１，２２  （９），１８１１−１８２３）。合成糖類（Ｉ）と担体タンパク質とのコンジュゲーションのために、合成糖類（Ｉ）をアルキル−又はアリールジアジリン、例えば３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリンで官能化することができる。ＵＶ照射後、アリールジアジリンで官能化された合成糖類（Ｉ）から反応性カルベンが生成され、このカルベンはＣ−Ｃ共有結合によって担体タンパク質とカップリングしている。
【０３４３】
一般式（Ｉ）の糖類及び／又は好ましくは糖類２ａ、２ｂ、２ｃ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、６ａ、６ｂ、６ｃ、８ａ、８ｂ及び８ｃが、官能基としてリシン残基の第一級アミン官能基を提供する、無毒性の変異型ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７にコンジュゲートしていることが特に好ましい。
【０３４４】
野生型ジフテリア毒素のようなＣＲＭ１９７は、グリシンに対するグルタミン酸の単一アミノ酸置換を有するジスルフィド架橋によって連結された２つのサブユニットからなる、５３５アミノ酸（５８ｋＤ）の単一ポリペプチド鎖である。それは、肺炎球菌による細菌感染症のような疾患のための多くの承認されたコンジュゲートワクチン（例えば、Ｐｒｅｖｎａｒ）の担体タンパク質として利用されている。
【０３４５】
好ましくは、ジ（Ｎ−スクシンイミジル）アジペートは、第一級アミノ基を有する合成糖類（Ｉ）に最初に結合される。続いて活性化糖類（Ｉ）をＣＲＭ１９７などの担体タンパク質と縮合させて複合糖質を得る。また、関連するジスクシンイミジルグルタレートの使用も適用することができる（図２（Ａ））。
【０３４６】
担体タンパク質とコンジュゲートした該糖類は、好ましくは９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の純度を有する。
【０３４７】
本発明の別の態様は、本発明の糖類及びそれらの複合糖質の薬物としての、すなわち医薬に適用可能な医薬活性剤としての使用に関する。
一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）の糖類、ならびに一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）の糖類を免疫原性担体と反応させることによって得られる該複合糖質は、医薬における医薬活性剤に適していることが見出された。該糖類及び該複合糖質は、動物において免疫応答を誘発するのに適しており、したがって、ヒト及び／又は動物宿主において防御的免疫応答を惹起するのに有用である。
【０３４８】
好ましくは、該糖類及び該複合糖質は、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に関連する疾患、好ましくは髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎から選択される疾患の予防及び／又は治療に有用である。
【０３４９】
驚くべきことに、本発明の新規コンジュゲートはヒト及び／又は動物宿主において免疫応答を惹起するのにも適しており、したがってヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に関連する疾患に対する防御にも適していることが見出された。したがって、本明細書に開示される本発明のコンジュゲートは、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に関連する疾患の予防又は治療に有用である。そのような疾患には、髄膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、及びその他の気道の疾患が含まれるがこれらに限定されない。さらに、本発明の新規のコンジュゲートを用いた動物の治療は、免疫グロブリンＩｇＧアイソタイプの形成をもたらし、それは生物におけるメモリーＢ細胞の発達を証明することが見出された。メモリーＢ細胞の存在は、免疫記憶を実証している。したがって、本発明のコンジュゲートは、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に対して、動物において長期防御を誘導することができることが示された。
したがって、本発明によるコンジュゲートは、特にヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に起因又は関連する疾患に対するワクチン接種に使用するための、医薬に適用可能な医薬活性剤としての使用に適している。
【０３５０】
ワクチン組成
本発明の一態様は、医薬組成物、特に一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）、及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの少なくとも１つの糖類、それらの薬学的に許容される塩、それらの複合糖質を、少なくとも１つの薬学的に許容されるアジュバント、担体、凍結防止剤、凍結保護剤、賦形剤及び／又は希釈剤と共に含むワクチン組成物に関する。
【０３５１】
したがって、一般式（Ｉ）の合成糖類のための本発明の合成は、工程Ｂ）をさらに含み得る。
Ｂ）一般式（Ｉ）の糖類の塩を調製すること、又は一般式（Ｉ）の糖類又は一般式（Ｉ）の合成糖類の塩の凍結乾燥物を調製する。
【０３５２】
好ましい実施形態において、式（Ｉ）の糖類のための本発明の合成は、工程Ｂ）をさらに含み得る。
Ｂ）一般式（Ｉ）の糖類の塩を調製すること、又は式（Ｉ）の糖類又は式（Ｉ）の糖類の塩の凍結乾燥物を調製する。
【０３５３】
本発明による医薬組成物は、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの少なくとも１つの糖類、それらの薬学的に許容される塩を含む。特に、本
明細書に開示されている全化学合成に従って得られる糖類２ａ、２ｂ、２ｃ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、６ａ、６ｂ、６ｃ、８ａ、８ｂ及び８ｃがこれらのワクチンにおいて使用される。一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）、及び（ＩＶ−２）の糖類、ならびに本明細書に開示されている全化学合成によって得られる糖類２ａ、２ｂ、２ｃ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、６ａ、６ｂ、６ｃ、８ａ、８ｂ及び８ｃは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の純度を有する。
【０３５４】
本発明の糖類、ならびに一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの少なくとも１つの糖類を含有する医薬組成物、及び特に糖類２ａ、２ｂ、２ｃ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、６ａ、６ｂ、６ｃ、８ａ、８ｂ及び８ｃを含有するワクチンは、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる又は関連する疾患、好ましくは髄膜炎、肺炎及び喉頭蓋炎に対する免疫化におけるワクチンとしての使用に非常に有用である。
【０３５５】
本発明によれば、糖類２ａ、２ｂ、２ｃ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、６ａ、６ｂ、６ｃ、８ａ、８ｂ及び８ｃ、ならびに本明細書に開示される他のいずれかの本発明の糖類は、上記疾患に対する免疫化のためのワクチンとして使用するための該医薬組成物の製造に有用である。
【０３５６】
ワクチンは懸濁液の形態で調製しても、凍結乾燥してもよい。懸濁形態は凍結保存することができる。凍結乾燥形態では、１以上の安定剤を添加することが好ましい。予防接種はどの年齢でも実施できる。ワクチンは、多くの場合、皮下、スプレー、注射、経口、眼内、気管内、又は経鼻で投与される。ヒト又は動物に投与される本発明のワクチンの量及び投与レジメは、特定の抗原、アジュバント（存在する場合）、特定の動物又は患者の年齢、性、体重、種及び状態、ならびに投与経路などの要因を考慮して、製薬及び獣医学の当業者に周知の標準的な技術に従って決定することができる。
【０３５７】
対象においてヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に対する免疫応答を誘導する方法は、本発明の糖類、それらの混合物、それらのコンジュゲート、又はそれらの医薬組成物を投与することを含む。対象においてヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる又は関連する疾患、好ましくは髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎を治療又は予防する方法は、少なくとも１つの本発明の合成糖類又はその混合物、そのコンジュゲート、又はその組成物又はワクチンを投与することを含む。
【０３５８】
本発明において、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に対するワクチン接種に有効な用量を提供する式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの糖類の量は、体重１ｋｇあたり０．０２μｇ〜約１０μｇであり得る。好ましくはＣＲＭ１９７などの担体タンパク質である、免疫原性担体と任意にコンジュゲートされた、式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの糖類は、単回投与として、又は一連で（すなわち、「ブースター」と共に）投与することができる。例えば、小児は、小児の疾患を予防するための他のワクチンについて現在推奨されているように、人生の早い時期に単回投与を受け、その後、１０年後まで追加免疫投与を投与されることができる。
【０３５９】
静脈内及び非経口投与が好ましい。そのような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコ
ースなどのような適切な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合してもよい。免疫原性担体と任意にコンジュゲートされた、本発明による式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの組成物又は糖類もまた凍結乾燥することができる。
【０３６０】
本発明の凍結乾燥させた糖類は、最終的には液体成分で再構成されて、患者への投与に適した材料が得られる。再構成は通常、使用時に行われる。したがって、本発明の糖類及び水中油型エマルジョンアジュバント又はアジュバントの緩衝液は、使用時に最終製剤化する準備ができている、包装された又は分配されたワクチンキットに、別々に保存してもよい。２つの容器を含むキットでは、一方は再構成用の液体を含み、第２の容器は凍結乾燥材料を含む。安定性の理由から、本発明の凍結乾燥成分は、ラクトース、スクロース及び／又はマンニトールのような安定剤、ならびにそれらの混合物を含み得る。スクロース／マンニトール混合物を使用すると、乾燥工程の速度を上げることができる。凍結乾燥成分は、塩化ナトリウムも含み得る。凍結乾燥材料の可溶性成分は再構成後に組成物に保持され、したがって最終的な液体ワクチンはラクトース及び／又はスクロースを含み得る。
【０３６１】
本発明のワクチンの処方は、当技術分野において公知の方法を用いて達成することができる。明らかに、適切な担体及び他の添加剤の選択は、正確な投与経路及び特定の剤形の性質に依存する。
【０３６２】
本発明のワクチン組成物は１つ以上のアジュバントを含み得る。本明細書で定義されるように、「アジュバント」は、免疫原性担体と任意にコンジュゲートされた、本発明による式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの糖類の免疫原性を増強する働きをする物質である。免疫アジュバントは、単独で投与された場合に免疫原性が弱い抗原、例えば抗体価がまったくないか弱い抗体価、又は細胞性免疫応答を誘導する抗原に対する免疫応答を増強することができる。さらにアジュバントは、抗原に対する抗体価を増加させ、及び／又は個体において免疫応答を達成するのに有効な抗原の用量を低下させることができる。したがって、アジュバントは免疫応答を高めるために頻繁に投与され、当業者に周知である。有効性を増強するための適切なアジュバントとしては、限定ではなく例として、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム又はそれらの組み合わせなどのアルミニウム塩）、フロイントアジュバント（完全又は不完全）、ＢＡＹ  Ｒ１００５（Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドヒドロアセテート）、ＤＣ−コール（ジメチルアミノエタン）−カルバモイルコレステロール、ＰＣＰＰ（ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］）、モノホスホリル脂質Ａ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＱＳ−２１（キラヤサポナリアサポニン（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｓａｐｏｎｉｎ）免疫アジュバント）、コレラ毒素、及びホルミルメチオニルペプチドが挙げられる。
【０３６３】
代替のアジュバントとしては、水中油型エマルジョン製剤、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４８３７に記載のＭＦ５９が挙げられ、ＳＡＦ−１（エマルジョンビヒクル［５％スクアラン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ１２１、０．２％ポリソルベート８０、及びリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）］中のＳｙｎｔｅｘアジュバント製剤トレオニル−ＭＤＰ（０．０５〜１％））、及びモノホスホリル脂質（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）、サポニンアジュバント、例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ  ＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、マサチューセッツ州）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分が、使用され得る、又はそれから粒子が発生し得る。様々な水中油型エマルジョンアジュバントが知られており、それらは典型的には少なく
とも１つの油及び少なくとも１つの界面活性剤を含み、油及び界面活性剤は生分解性（代謝性）及び生体適合性である。スクアレン、スクアレンの飽和類似体が、好ましい油である。他の好ましい油はトコフェロールである。油の混合物を使用することができる。界面活性剤は、その「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、以下のものを含むがこれらに限定されない界面活性剤と共に使用することができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、又はトクチルフェノキシポリエトキシエタノール）などの反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が異なり得るオクトキシノール；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；ラウリル、セチル、ステアリル及びオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪族エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られている）。エマルジョンに含めるための好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
さらなるアジュバントは、サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）であり得る。
【０３６４】
組成物は、投与経路及び所望の製剤に応じて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化剤又は粘度増強添加剤、保存剤、香味剤、着色剤などの補助物質を含有することができる。本発明の組成物は、特に複数回投与形式で包装されている場合、抗菌剤を含み得る。チオメルサール及び２−フェノキシエタノールのような抗菌剤は一般にワクチン中に見出されるが、無水銀保存剤を使用するか保存剤をまったく使用しないことが好ましい。
組成物は温度保護剤を含み得る。例としては、グリセリン、プロピレングリコール、及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
本発明のワクチン組成物は、ジフテリア抗原、破傷風抗原、百日咳抗原、Ｂ型肝炎抗原、不活化ポリオワクチン及び不活化ロタウイルスワクチンのうちの少なくとも１つをさらに含み得る。
【０３６５】
本明細書で使用される「ジフテリア抗原」という用語は、好ましくはジフテリアトキソイドである。ジフテリアトキソイドは、ジフテリアに対する活性免疫剤として使用される、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）のホルムアルデヒド不活性化毒素である。ジフテリアトキソイドの調製は十分に文書化されている（例えば、Ｐｌｏｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２）。任意の適切なジフテリアトキソイドが使用できる。ジフテリアトキソイドの濃度は、一般的に５〜１００Ｌｆ（凝集限界）／ｍＬである。好ましい濃度は１０〜５０Ｌｆ／ｍＬの間である。より好ましい濃度は２０〜４０Ｌｆ／ｍＬの間である。最も好ましくは、濃度は約３０Ｌｆ／ｍＬである。
【０３６６】
本明細書で使用される「破傷風抗原」という用語は、好ましくは破傷風トキソイドである。破傷風トキソイドは当業者に周知である（例えば、Ｐｌｏｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３３）。任意の適切な破傷風トキソイドが使用できる。テンタウストキソイド（ｔｅｎｔａｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）の濃度は、一般的に１〜５０Ｌｆ／ｍＬである。好ましい濃度は２〜９Ｌｆ／ｍＬである。より好ましい濃度は５〜８Ｌｆ／ｍＬの間である。最も好ましくは、濃度は約６．５Ｌｆ／ｍＬである。
【０３６７】
本明細書で使用される「百日咳抗原」という用語は、細胞性（例えば全細胞）又は無細胞性であり得る。両タイプの抗原の調製は十分に文書化されている（例えば、Ｐｌｏｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２３）。細胞性百日咳抗原については、百日咳抗原の濃度は一般に５〜５０ＯＵ／ｍＬである。好ましい濃度は１０〜４０ＯＵ／ｍＬの間である。より好ましい濃度は２５〜３５ＯＵ／ｍＬの間である。最も好ましくは、濃度は約３０ＯＵ／ｍＬである。無細胞抗原が使用される場合、百日咳ホロトキシン（ＰＴ）及び繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、より好ましくはペルタクチン（ＰＲＮ又は６９ｋＤａ抗原としても知られる）と組み合わせたもの、及び場合によっては凝集原（線毛としても知られる）２及び３を使用することが好ましい。ＰＴは毒性タンパク質であり、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｓｉｓ）抗原に存在する場合、それは好ましくは解毒されている。解毒は化学的及び／又は遺伝的手段によってもよい。好ましい解毒変異体は９Ｋ／１２９Ｇドウルブ変異体（ｄｏｕｌｂ  ｍｕｔａｎｔ）である。
【０３６８】
本明細書で使用される「Ｂ型肝炎抗原」という用語は、Ｂ型肝炎表面抗原であり得る。Ｂ型肝炎表面抗原の調製は十分に文書化されている（例えば、Ｐｌｏｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５）。
【０３６９】
本明細書で使用される「不活性化ポリオワクチン（ＩＰＶ）」という用語は、好ましくは、ポリオウイルスＩ型〜３型の３種すべての不活性化（死滅）ポリオウイルス株からなる。本発明において、ウイルス不活化は、ウイルスの感染能力の除去を意味する。不活性化の２つの方法（化学的及び物理的）において、最も一般的に使用される化学物質はホルムアルデヒドとベタプロピオラクトンである。ジフテリアトキソイドの調製は十分に文書化されている（例えば、Ｐｌｏｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２７）。
【０３７０】
本明細書で使用される「不活性化ロタウイルスワクチン」という用語は、好ましくは、ウシ（ＵＫ株）／ヒト再集合体ワクチン、ヒト新生児ＲＶ３株又はウシ／ヒト新生児１１６Ｅ株であり得る。本発明において、ウイルス不活化は、ウイルスの感染能力の除去を意味する。不活性化の２つの方法（化学的及び物理的）において、最も一般的に使用される化学物質はホルムアルデヒドとベタプロピオラクトンである。不活性化ロタウイルスワクチンの調製は十分に文書化されている（例えば、Ｐｌｏｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３０）。
【０３７１】
本発明の組成物は、選択されたｐＨに緩衝することができる液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルジョン又は粘性組成物として好都合にも提供される。液体製剤のための薬学的に許容される担体は、水溶液又は非水溶液、懸濁液、エマルジョン又は油であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体は、水、アルコール溶液、エマルジョン、又は懸濁液、例えば食塩水及び緩衝媒体を含む。
再構成後の組成物のｐＨは、好ましくは６〜８、より好ましくは６．５〜７．５（例えば約７）である。本発明の組成物は、緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、酢酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩及びトリエタノールアミン緩衝液の使用により維持し得る。したがって、本発明の組成物は緩衝剤を含むのが好ましい。等張剤は、塩などのイオン性等張剤、又は炭水化物などの非イオン性等張剤であり得る。イオン性等張剤の例としては、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ及びＭｇＣｌ２が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性等張剤の例としては、ソルビトール及びグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７２】
本発明の好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、保存剤を含む、又は含まない、無菌の液体で、発熱物質を含まない、リン酸緩衝生理食塩水として処方される。
薬学的に許容される保存剤を使用して、組成物の保存寿命を延ばすことができる。ベンジルアルコールが適切であり得るが、例えば、パラベン、チメロサール、クロロブタノール、又は塩化ベンザルコニウムを含む様々な保存剤も使用できる。保存剤の適切な濃度は、選択された薬剤に応じてかなりの変動があり得るが、総重量に基づいて０．０２％〜２％である。
【０３７３】
本発明の組成物は、単回投与用バイアル、複数回投与用バイアル、又はプレフィルドシリンジとして製剤化することができる。
【０３７４】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの薬学的に許容されるアジュバント、担体、賦形剤、溶媒及び／又は希釈剤と共に、場合により免疫原性担体とコンジュゲートする一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの少なくとも１つの糖類を含有する医薬製剤及び医薬組成物、又は活性成分としてのワクチンに関する。
【０３７５】
さらに好ましくは、医薬組成物は、凍結乾燥物又は液体緩衝液の形態で処方される。
ワクチン又は医薬組成物はまた、場合により実質的に無毒の薬学的に許容される担体、賦形剤、アジュバント又は希釈剤を用いてその医薬活性塩の形で投与することもできる。本発明のワクチン又は医薬組成物は、従来の固体又は液体の担体又は希釈剤、及び従来の薬学的に製造されたアジュバントで、適切な投与量レベルで公知の方法で調製される。好ましい調製及び製剤は、経口投与に適した投与可能な形態である。これらの投与可能な形態としては、例えば、丸剤、錠剤、フィルム錠、コーティング錠、カプセル剤、散剤及び沈殿物剤が挙げられる。経口投与の形態以外も可能である。本発明のワクチン又は医薬組成物は、吸入、注射（静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下）、上皮又は皮膚粘膜内層（口腔粘膜、直腸及び膣上皮の内層、鼻咽頭粘膜、腸粘膜）を介した吸収、経口、直腸性、経皮、局所的、皮内、胃内、皮内、膣内、脈管内、鼻腔内、頬内、経皮的、舌下、又は製薬業界で利用可能な他の任意の手段を含むがこれらに限定されない任意の適切な手段で投与できる。
【０３７６】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれかの少なくとも１つの糖類を含有する本発明のワクチン又は医薬組成物、好ましくは２ａ、２ｂ、２ｃ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、６ａ、６ｂ、６ｃ、８ａ、８ｂ及び８ｃである糖類又は活性成分としてのその薬学的に許容される塩は、典型的には、意図する投与形態に関して適切に選択された適切な担体材料、すなわち経口錠剤、カプセル（固体充填、半固体充填又は液体充填）、構成用粉末剤、経口ゲル剤、エリキシル剤、分散性顆粒剤、シロップ剤、懸濁剤などと混合して投与され、従来の薬務での慣習と一致する。例えば、錠剤又はカプセル剤の形態での経口投与のためには、活性成分を、ラクトース、デンプン、スクロース、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、タルク、マンニトール、エチルアルコール（液状）などといった任意の経口の無毒の薬学的に許容される不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望又は必要に応じて、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤及び着色剤も混合物に組み入れることができる。散剤及び錠剤は、約５〜約９５パーセントの四糖類から構成されていてもよい。
【０３７７】
適切な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、コーン甘味料、アカシアなどの天然及び合成ゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール及びワックスが挙げられる。これらの剤形に使用するために挙げることができ
る潤滑剤の中には、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどがある。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、グアーガムなどが挙げられる。甘味剤及び香味剤ならびに保存剤もまた、適切な場合には含まれてもよい。上記の用語のいくつか、すなわち崩壊剤、希釈剤、潤滑剤、結合剤などは、以下により詳細に論じる。
【０３７８】
さらに、本発明のワクチン又は医薬組成物は、治療効果を最適化するために任意の１つ以上の成分又は活性成分の速度制御放出をもたらすために、徐放形式で処方してもよい。徐放のための適切な剤形には、活性成分を含浸させて錠剤又はカプセルの形態に成形した様々な崩壊速度をもつ又は制御されて放出するポリマーマトリックスを含有する層状の錠剤が含まれ、当該ポリマーマトリックスには、活性成分が含浸又は封入された多孔質ポリマーマトリックスが含まれる。
【０３７９】
液状の形態の調製物は、液剤、懸濁剤及びエマルジョンを含む。例として、非経口注射用の水、又は水−プロピレングリコールの溶液、或いは経口用液剤、懸濁剤及びエマルジョン用の甘味剤及び乳白剤の添加を挙げることができる。液状形態の調製物はまた、鼻腔内投与用の溶液を含み得る。
【０３８０】
吸入に適したエアロゾル調製物は、溶液及び粉末の形態の固体を含み得、これらは、不活性圧縮ガス、例えば窒素などの薬学的に許容される担体と組み合わせてもよい。
坐剤を調製するために、カカオ脂などの脂肪酸グリセリドの混合物などの低融点ワックスを最初に溶融させ、活性成分を撹拌又は同様の混合をすることによって、その中に均質に分散させる。次いで、溶融した均質の混合物を、都合のよい大きさの型に注ぎ込み、冷却させ、それによって固化させる。
【０３８１】
使用直前に、経口投与又は非経口投与のいずれかのための液状の形態の調製物に変換されることが意図されている固体の形態の調製物も含まれる。そのような液状の形態は、溶液、懸濁液及びエマルジョンを含む。
【０３８２】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれかの少なくとも１つの糖類、好ましくは糖類１ｆ、２ａ、２ｂ、２ｂ´、２ｃ、２ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｆ、８ａ、８ｂ、８ｃ及び８ｆを含有する本発明のワクチン又は医薬組成物はまた、経皮的に送達可能であってよい。経皮組成物は、クリーム、ローション、エアロゾル及び／又はエマルジョンの形態をとることができ、この目的のために当技術分野において慣例的であるように、マトリックス又はリザーバータイプの経皮パッチに含めることができる。
【０３８３】
カプセルという用語は、活性成分を含む組成物を保持又は含有するための、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、又は変性ゼラチンもしくはデンプンで作られた特別な容器又はエンクロージャを示す。ハードシェルカプセルは典型的には比較的高いゲル強度の骨と豚皮のゼラチンの混合物から作られる。カプセル自体は、少量の染料、不透明の薬剤、可塑剤及び保存剤を含み得る。
【０３８４】
錠剤とは、活性成分を適切な希釈剤と共に含有する圧縮又は成形された固形剤形を意味する。錠剤は、湿式造粒、乾式造粒又は当業者に周知の圧縮によって得られた混合物又は顆粒を圧縮することによって調製することができる。
【０３８５】
経口ゲルは、親水性半固体マトリックスに分散又は可溶化された活性成分を示す。
構成用の粉末は、水又はジュースに懸濁することができる活性成分及び適切な希釈剤を含有する粉末混合物を示す。
【０３８６】
適切な希釈剤は、通常、組成物又は剤形の大部分を構成する物質である。適切な希釈剤としては、ラクトース、スクロース、マンニトール及びソルビトール、小麦、トウモロコシ、米、及びジャガイモ由来のデンプンなどの糖類、ならびに微結晶セルロースなどのセルロースが挙げられる。組成物中の希釈剤の量は、全組成物の約５〜約９５重量％、好ましくは約２５〜約７５重量％、より好ましくは約３０〜約６０重量％、最も好ましくは約４０〜約５０重量％の範囲であり得る。
【０３８７】
崩壊剤という用語は、それが分解（崩壊）して、医薬を放出するのを補助するために、組成物に添加される物質を示す。適切な崩壊剤としては、デンプン；カルボキシメチルデンプンナトリウム等の「冷水可溶性」加工デンプン；イナゴマメ、カラヤ、グアー、トラガント、アガー等の天然及び合成ゴム；メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース等のセルロース誘導体；クロスカルメロースナトリウム等の架橋された微結晶性セルロース；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム等のアルギン酸塩；ベントナイト等の粘土、及び発泡性混合物が挙げられる。組成物中の崩壊剤の量は、組成物の約１〜約４０重量％、好ましくは組成物の２〜約３０重量％、さらに好ましくは組成物の約３〜２０重量％、最も好ましくは約５〜約１０重量％の範囲であり得る。
【０３８８】
結合剤は、粉末を一緒に結合又は「接着」し、顆粒を形成することによってそれらを凝集性にし、したがって配合物中の「接着剤」として働く物質を特徴付ける。結合剤は、希釈剤又は増量剤においてすでに利用可能な凝集力を加える。適切な結合剤としては、スクロースなどの糖、小麦、トウモロコシ、米、及びジャガイモ由来のデンプン；アカシア、ゼラチン、トラガントなどの天然ゴム；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、及びアルギン酸カルシウムアンモニウムなどの海藻の誘導体；メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース系材料；ポリビニルピロリドン；ケイ酸マグネシウムアルミニウムなどの無機物が挙げられる。組成物中の結合剤の量は、組成物の約１〜３０重量％、好ましくは組成物の約２〜約２０重量％、さらに好ましくは約３〜約１０重量％、さらにより好ましくは約３〜約６重量％の範囲であり得る。
【０３８９】
潤滑剤は、錠剤、顆粒などが、圧縮された後に、摩擦又は磨耗を減少させることによって鋳型又はダイス型から放出することを可能にするために剤形に添加される物質を示す。適切な潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸カリウムなどのステアリン酸金属塩；ステアリン酸；高融点ワックス；及び塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、及びＤ´Ｌ−ロイシンなどの水溶性潤滑剤が含まれる。潤滑剤は、顆粒の表面上及びそれらと打錠機の部品との間に存在しなければならないので、通常、圧縮前のまさに最後の工程で添加される。組成物中の潤滑剤の量は、組成物の約０．０５〜約１５重量％、好ましくは組成物の０．２〜約５重量％、より好ましくは約０．３〜約３重量％、最も好ましくは組成物の約０．３〜約１．５重量％の範囲であり得る。
【０３９０】
滑沢剤はケーキングを防止し、顆粒の流動特性を改善する物質であり、その結果流動は滑らかで均一になる。適切な滑沢剤は、二酸化ケイ素及びタルクを含む。組成物中の滑沢剤の量は、組成物の約０．０１〜１０重量％、好ましくは全組成物の０．１〜約７重量％、さらに好ましくは約０．２〜５重量％、最も好ましくは約０．５〜約２重量％の範囲であり得る。
【０３９１】
着色剤は、組成物又は剤形に着色をもたらす賦形剤である。そのような賦形剤は、粘土又は酸化アルミニウムなどの適切な吸着剤に吸着された食品用染料及び食品用染料を含むことができる。着色剤の量は、組成物の約０．０１〜１０重量％、好ましくは約０．０５
〜６重量％、より好ましくは組成物の約０．１〜約４重量％、最も好ましくは約０．１〜約１％で変化し得る。
【０３９２】
本発明のワクチンの処方及び投与のための技術は、´´Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ´´  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに見出すことができる。一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの少なくとも１つの糖類を含む適切なワクチン組成物、好ましくは糖類１ｆ、２ａ、２ｂ、２ｂ´、２ｃ、２ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｆ、８ａ、８ｂ、８ｃ及び８ｆ、及び／又はそれらの薬学的に許容される塩は、適切な液体医薬担体又は錠剤、丸剤、フィルム錠剤、コーティング錠、糖衣剤、カプセル剤、散剤及び沈殿物剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤、エマルジョンなどの他のいずれかの製剤における、そのような糖類の溶液であり得る。
【０３９３】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの糖類、好ましくは糖類１ｆ、２ａ、２ｂ、２ｂ´、２ｃ、２ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｆ、８ａ、８ｂ、８ｃ及び８ｆの治療有効用量は、疾患に対する少なくとも部分的な免疫化をもたらす化合物の量を示す。そのような化合物の毒性及び治療効能は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的、薬理学的、及び毒性学的手順によって判定することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療指数である。投与される組成物の実際の量は、治療される対象、対象の体重、苦痛の重症度、投与方法及び処方する医師の判断に左右される。
【０３９４】
言及されたワクチン製剤は、本発明の化合物のモジュール式構成により、室温で驚くべき安定性を示し、該ワクチン製剤は少なくとも２５℃の温度で、再構成の前に、少なくとも３ヶ月の期間、維持され得る。本明細書に記載のワクチン製剤の温度安定性は、今までに記載されているヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に対するワクチンを超える本発明の特定の利点を構成する。
本発明の好ましい実施形態において、該期間は６ヶ月又は少なくとも１２ヶ月を含む。
【０３９５】
抗体
本発明はまた、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）、及び（ＩＶ−２）の少なくとも１つの合成糖類に対する抗体について示す。抗体はモノクローナルハイブリドーマによって産生される。この抗体は、肺炎、髄膜炎、中耳炎、菌血症、慢性気管支炎の急性増悪、副鼻腔炎、関節炎、結膜炎の診断、予防、治療のためのものである。本発明の別の実施形態は、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎の診断、予防、及び治療用の医薬又は装置を製造するための抗体の使用である。
【０３９６】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体調製物及びモノクローナル抗体調製物、ならびに親抗体分子の免疫学的結合特性を示すハイブリッド抗体、Ｆ（ａｂ´）２断片、Ｆ（ａｂ）分子、単一ドメイン抗体及びその機能的断片を含む調製物を包含する。本発明による抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得る。
【０３９７】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの糖類、好ましくは糖類１ｆ、２ａ、２ｂ、２ｂ´、２ｃ、２ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｆ、８ａ、８ｂ、８ｃ及び８ｆ又はそれらの抗体は、医薬組成物
、特にヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる疾患の治療又は予防のためのワクチンの調製に使用することができる。本発明の糖類又はその抗体は、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に起因する疾患の治療又は予防に使用することができる。
【０３９８】
さらに本発明は、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎の診断のための免疫学的アッセイにおける、本発明による一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）、及び（ＩＶ−２）の少なくとも１つの糖類、好ましくは糖類１ｆ、２ａ、２ｂ、２ｂ´、２ｃ、２ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｆ、８ａ、８ｂ、８ｃ及び８ｆ、又は本発明の少なくとも１つの糖類に対する少なくとも１つの抗体の使用に関する。
【０３９９】
そのようなアッセイは、例えば、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる疾患の診断に有用なマイクロアレイ及びＥＬＩＳＡを含む。したがって、本発明の他の態様は、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に起因する疾患の診断のための、式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）、及び（ＩＶ−２）の糖類、好ましくは、糖類１ｆ、２ａ、２ｂ、２ｂ´、２ｃ、２ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｆ、８ａ、８ｂ、８ｃ及び８ｆのいずれか１つの使用に関する。
【０４００】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）、及び（ＩＶ−２）の糖類、好ましくは糖類１ｆ、２ａ、２ｂ、２ｂ´、２ｃ、２ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｆ、８ａ、８ｂ、８ｃ及び８ｆのいずれか１つ、又はそのような糖類の混合物をマイクロアレイ表面又は他の任意の表面に固定化し、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型を検出するインビトロ法に使用することができる。ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型を同定する方法は、本発明の少なくとも１つの糖類の使用を含む。さらに、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）、及び（ＩＶ−２）の合成糖類、好ましくは、糖類１ｆ、２ａ、２ｂ、２ｂ´、２ｃ、２ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｆ、８ａ、８ｂ、８ｃ及び８ｆ、又はそのような糖類の混合物をイムノアッセイの分析基準として使用することができる。
【０４０１】
診断装置
本発明の他の態様は、一般式（Ｉ）の少なくとも１つの糖類、好ましくは、式（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）の糖類、より好ましくは式（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）、及び（ＩＶ−２）の糖類、好ましくは糖類１ｆ、２ａ、２ｂ、２ｂ´、２ｃ、２ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｆ、８ａ、８ｂ、８ｃ及び８ｆを含む固体支持体に関する。
【０４０２】
この固体支持体は診断装置の一部であるのが好ましい。固体支持体及び診断装置は、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎の診断に使用され、一般式（Ｉ）の少なくとも１つの糖類は、好ましくは共有結合によって該固体支持体に固定される。
【０４０３】
本発明の他の態様は、固体支持体がガラススライド、ガラスプレート、マイクロタイタープレート、マイクロスフェア、又はビーズを含む群から選択される診断装置である。
本発明のさらに他の実施形態は、一般式（Ｉ）の少なくとも１つの糖類が連結分子により共有結合している診断装置である。
【０４０４】
さらに、本発明は、式（Ｉ）による糖類が、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる髄膜炎、肺炎及び喉頭蓋炎の免疫学的アッセイに使用できることを示す。
【０４０５】
そのようなアッセイは、例えば、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎の診断に有用なマイクロアレイ及びＥＬＩＳＡを含む。
【０４０６】
したがって、本発明の別の態様は、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎の診断のための式（Ｉ）の糖類の使用に関する。
本発明による糖類（Ｉ）は、共有結合によって固体支持体に固定化されている。固体支持体に結合していないか又は固体支持体に固定化された少なくとも１つの合成糖類（Ｉ）が、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる髄膜炎、肺炎及び喉頭蓋炎の診断に使用される。
【０４０７】
ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎の診断のための糖類（Ｉ）の使用は、一般式（Ｉ）の少なくとも１つの糖類に特異的な抗体の存在の検出に基づく。したがって、一般式（Ｉ）の少なくとも１つの糖類を含む診断装置は、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎の診断に使用される。
【０４０８】
ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎に使用される式（Ｉ）の糖類は、実質的に純粋であり、純度が９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上であることが好ましい。
【０４０９】
ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎の診断に式（Ｉ）の糖類が使用されるアッセイシステムの選択には、様々な可能性がある。本発明による診断目的のために行われるアッセイは、固相酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、特に「間接的」ＥＬＩＳＡ又は放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）のような免疫測定法であり得る。そのようなアッセイにおいて式（Ｉ）の糖類を使用するためには、式（Ｉ）の糖類を固体支持体に固定化することが必要であり得る。
【０４１０】
したがって、本発明の他の実施形態は、少なくとも１つの糖類（Ｉ）がリンカー又はスペーサーを介した共有結合によって固定化されている固体支持体である。本発明のさらに他の実施形態は、−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介して直接又は間接的に固体支持体に共有結合により固定化された糖類である（図２（Ｂ））。
【０４１１】
それ故、式（Ｉ）の糖類は、特に診断用途のために、固体支持体に固定化され得る。本発明の好ましい一実施形態は、共有結合によって固体支持体に固定化された一般式（Ｉ）の糖類である。本発明の特に好ましい一実施形態は、直接又は間接的な共有結合により固体支持体に固定化された一般式（Ｉ）の糖類である。それにより、直接的な共有結合が特に好ましい。
【０４１２】
さらに好ましくは、固体支持体は、スライドガラス、マイクロタイタープレート、試験管、マイクロスフェア、ナノ粒子又はビーズを含むか又はそれらからなる群から選択される。
【０４１３】
固体支持体がスライドガラス又はマイクロタイタープレートであることが特に好ましい。マイクロタイタープレート又はマイクロプレート又はマイクロウェルプレートは、小さな試験管として使用される複数の「ウェル」を有する平板である。典型的には、６、２４、９６、３８４又は１５３６もの試料のウェルを有するマイクロタイタープレートを使用することができる。マイクロプレートは、ＰＣＲに使用されるマイクロタイタープレート用のポリカーボネートのように、多くの様々な材料から製造されている。最も一般的なものは、ほとんどの光学検出マイクロプレートに使用されているポリスチレンである。それは、吸光度又はルミネセンスの検出のために二酸化チタンを添加することによって白色に着色することができ、又は蛍光生物学的アッセイのために炭素を添加することによって黒色に着色することができる。
【０４１４】
本明細書で使用される「直接的な共有結合」は、一般式（Ｉ）の糖類の官能基を、固体支持体が作られる材料の官能基と反応させることによる、一般式（Ｉ）の化合物の固定化を示す。一般式（Ｉ）の糖類の官能基は、−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２において上で定義されたようなアミンであることが好ましい。固体支持体の可能な反応性官能基は、フェニル基、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、カルボニル基、カルボキシル基、ビニル基、フッ化物、塩化物、臭化物及びヨウ化物などのハロゲン化物、マレイミド、スクシンイミドエステルであり得る。
【０４１５】
本明細書で使用される「間接的な共有結合」は、固体支持体への一般式（Ｉ）の糖類の固定化を示し、一般式（Ｉ）の糖類は、固体支持体への固定化を媒介する第２の化合物に共有結合する。この第２の化合物は免疫応答を引き起こさないタンパク質であることが好ましい。偽陽性の結果を避けるために、第２の化合物それ自体が、おそらく患者の血液又は血清中に存在するいかなる抗体によっても結合されないことが重要である。さらに、第２の化合物は、共有結合又は非共有結合によって固体担体に固定化できるべきである。この第２の化合物は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）、ゼラチン又はカゼインを含むかそれらからなる群から選択されることが好ましい。したがって、間接的な共有結合を用いた固定化は、好ましくは第２の化合物としてのタンパク質への一般式（Ｉ）の糖類の共有結合（例えばタンパク質の遊離アミノ基を用いる）、及び固体支持体とタンパク質との間の共有結合又は非共有相互作用による後続のタンパク質の固体支持体への結合を示す。可能な非共有相互作用は、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用である。ポリスチレン及びポリプロピレンのような多くのポリマーは事実上疎水性である。それにもかかわらず、異なる接着条件に対して最適化された特殊な表面を有する固体支持体を供給する製造業者もある。
【０４１６】
しかし、固定化、特に間接的な共有結合を使用した固定化もまた強い接着によって起こり得る。したがって、本発明による効果的な固定化は、化学的な結合によってだけでなく、物理的な吸着に関連する固定化による非結合によって、実現され得る。物理的な吸着の重要な特徴として、付着力がファンデルワールス力によって引き起こされるという現象が作用する。「非結合」という用語は、共有結合以外の結合を示す。
【０４１７】
本発明による固定化形態としての化学吸着は、固体支持体と式（Ｉ）の糖類との間の化学的な結合を使用する。そのような結合は共有結合性であり得るが、イオン性でもあり得る。
【０４１８】
本発明の好ましい態様において、固体支持体への式（Ｉ）の糖類の固定化は、直接的な共有結合、すなわちこれら２つの反応物間の化学反応、好ましくは置換反応によって実現される。本発明のより好ましい態様において、固体支持体は、本発明の化合物との反応時に固体支持体を離れることができる官能基で修飾されている。このような官能基は、固体支持体の構成分子に直接結合しても、固体支持体の構成分子に直接結合しているリンカー
に結合してもよい。したがって、本発明のより好ましい実施形態では、固体支持体は適切な脱離基を有するように修飾されている。適切な脱離基は、塩化物、臭化物及びヨウ化物のようなハロゲン化物、水酸化物、オキシム、マレイミド、スクシンイミド、アルコール及びエステルであり得る。そのような脱離基は、マレイミド；α−ヨードアセチル；α−ブロモアセチル；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）及び２−ピリジルジチオールであっても、組み込まれてもよい。さらにより好ましい実施形態において、固体支持体の脱離基は、好ましくはプロトン交換の際に、アミン、アルコール及びチオールと反応することができる。本発明の最も好ましい実施態様において、固体支持体は、スクシンイミジルヒドロキシド官能基、より好ましくはＮ−スクシンイミジルヒドロキシドで官能化され、これはＮ−ヒドロキシスクシンイミドとしての本発明の化合物との反応時に固体支持体を脱離する。
【０４１９】
適切な脱離基の導入による固体支持体の修飾は、好ましくは未修飾担体と反応性二官能性分子、好ましくは２つの官能基間に分子架橋又はスペーサーアームを有する二官能性分子との反応により行われる。本発明の好ましい実施形態では、固体支持体と積極的に反応する官能基は、スルホスクシンイミドエステル及びスクシンイミドを含む。
【０４２０】
二官能性連結分子の１つのさらなる好ましい態様は、式（Ｉ）の糖類と結合することを意図する官能基を、固体担体まで適切な距離になるようにすることである。そのような適切な距離は、適切な長さの分子架橋又はスペーサーアームによって得られる。そのような分子架橋又はスペーサーアームは、好ましくは３Å（１０−１０ｍ）〜１０ｎｍ、より好ましくは５Å〜５０Å、最も好ましくは６Å〜３０Åの長さを有し得る。
【０４２１】
固体支持体の修飾に適した反応性二官能性分子は、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＯ）、スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＮ）、スクシンイミジル−３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、２−ピリジルジチオール−テトラオキサテトラデカン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＰＥＧ−４−ＳＰＤＰ）を含む。
【０４２２】
共有結合のために導入された反応性官能基を有するポリマーから製造された市販の固体支持体もある。一例は、Ｔｈｅｒｍｏサイエンティフィック社によりＣｏｖａＬｉｎｋ（商標）ＮＨと命名されたマイクロプレートであり、これは第二級アミン基を介した共有結合を可能にする。
【０４２３】
本発明の別の態様は、ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型によって引き起こされる髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎の診断のための、共有結合によって固体支持体に固定化された一般式（Ｉ）の少なくとも１つの合成糖類を含む診断装置の使用である。
【０４２４】
キット
本発明の一実施形態は、共有結合によって固体支持体に固定化された一般式（Ｉ）の少なくとも１つの糖類、又は固体支持体に固定化するための一般式（Ｉ）の糖類を含むキットに関する。一般式（Ｉ）の少なくとも１つの糖類は、該アッセイにおけるマーカーとして使用できる。本発明の別の実施形態は、一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの糖類に対する少なくとも１つの抗体を含むキットに関する。
【０４２５】
分子生物学又は医学的診断におけるキットは、特定の方法又は単独の工程を実施するために必要なすべての成分を含むパッケージである。いかなる標準的な分子生物学や医学研究室に存在する標準的な化学物質も、通常含まれていない。それにもかかわらず、これらの標準的な化学物質のいくつかは、診断又は固定化を適切に実施するために不可欠であり
得る。すべての成分は、科学的、診断的及び工業的用途の大部分での所望の反応を適切に実行できるようにする量で提供されることが理解される。
【０４２６】
常にではないが多くの場合、これらの成分はすでに調製された溶液中で、すぐに使える状態、又はすぐに使えるのに近い状態で提供される。すでに一緒に添加されている異なる成分の組み合わせもあり得る。さらなる利点は、そのようなキットが検証されるために使用されるということである。したがって、操作者は診断方法の実行可能性を再度証明する必要はなく、少なくともいくつかの制御実験を省くことができる。したがって、キットは研究、診断及び産業の実験室で非常に一般的なツールである。
【０４２７】
本発明によるそのようなキットは、少なくとも以下の構成要素を含むものとする：
Ａ）一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）の少なくとも１つの糖類が固定化されている固体支持体、
Ｂ）検出抗体のような少なくとも１つの抗体、
Ｃ）標準溶液、
又は本発明によるキットは少なくとも以下の構成要素を含むものとする：
Ａ´）一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）の糖類に対する少なくとも１つの抗体が固定化されている固体支持体、
Ｂ）検出抗体のような少なくとも１つのさらなる抗体、
Ｃ）標準溶液。
【０４２８】
以下の構成要素もそのようなキットに含まれてもよい：
Ｄ）ブロッキング液
Ｅ）洗浄液
Ｆ）試料緩衝液。
【０４２９】
キットの抗体は、捕捉抗体として使用することができる特異的抗体であり得る。しかし好ましくは、抗体のＦｃ領域に特異的に結合するのは、検出抗体として使用される少なくとも酵素結合二次抗体である。定量的判定のために、試料の光学密度（ＯＤ）又は蛍光を標準曲線と比較する。それは、典型的には、標的分子の既知の濃度の溶液（標準溶液）の連続希釈である。ブロッキング溶液は、抗原によってコーティングされていないウェル内の任意のプラスチック表面をブロックするために添加される、ウシ血清アルブミンやカゼインなどの非反応性タンパク質の溶液であり得る。洗浄液は非結合成分を除去するために使用される。標的分子の濃度が、使用される試験システムによって通常検出され得る範囲内にあるように、試料緩衝液を使用して患者の試料（血液、血清、尿）を希釈することができる。
【０４３０】
固体支持体に一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）の糖類を固定化することに対してキットが許容される場合、キットは少なくとも以下を含むべきである：
Ａ）一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）及び（ＩＶ−２）のいずれか１つの少なくとも１つの糖類、又は一般式（Ｉ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩ−３）、（ＩＩ−４）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＶ−１）、（ＩＶ−２）の少なくとも１つの合成糖類に対する抗体、
Ｂ）マイクロタイタープレート又はマイクロアレイスライドのような固体支持体。
【０４３１】
それによって、固体支持体を修飾することができ、例えば、固体支持体を上記のように
リンカー分子で官能化することができる。
以下の構成要素もそのようなキットに含まれてもよい：
Ｃ）ブロッキング液
Ｄ）洗浄液
Ｅ）反応緩衝液
【図面の簡単な説明】
【０４３２】
【図１】本発明による市販の相互連結分子を示す。
【図２】（Ａ）担体タンパク質とコンジュゲートした糖類。（Ｂ）固体支持体にコンジュゲートした糖類を示す。
【図３】ＣＲＭ１９７及びシステインにコンジュゲートした２´−メトキシリボシルリビトールホスフェート四量体２９の合成スキーム。
【図４】（Ａ）０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液で２０時間処理した後の断片化Ｈｉｂ  ＣＰＳ、及び（Ｂ）参照としての未処理Ｈｉｂ  ＣＰＳの１Ｈ  ＮＭＲスペクトル。比較は、Ｈｉｂ  ＣＰＳが塩基性条件下で２０時間以内に完全に加水分解することを示す。
【図５】０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で２０時間処理した後の断片化Ｈｉｂ  ＣＰＳの（Ａ）ＨＰＬＣクロマトグラム及び（Ｂ）ＥＳＩ質量スペクトル。
【図６】（Ａ）７日間及び（Ｂ）３７℃で２日間、ならびに（Ｄ）７日間及び（Ｅ）室温で２日間、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で処理した後のＨｉｂ  ＣＰＳのＨＰＬＣクロマトグラム。未処理Ｈｉｂ  ＣＰＳのＨＰＬＣクロマトグラムを（Ｃ）に示す。
【図７】（Ａ）Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、（Ｂ）リン酸アルミニウム、（Ｃ）水で７日間３７℃で処理した後の化合物１６のＨＰＬＣクロマトグラム。未処理化合物１６及び８のＨＰＬＣクロマトグラムを（Ｄ）及び（Ｅ）に示す。
【図８】（Ａ）Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、（Ｂ）リン酸アルミニウム、（Ｃ）水で２〜８℃で７日間処理した後の化合物１６のＨＰＬＣクロマトグラム。未処理化合物１６及び８のＨＰＬＣクロマトグラムを（Ｄ）及び（Ｅ）に示す。
【図９】（Ａ）Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、（Ｂ）リン酸アルミニウム、（Ｃ）水で７日間室温で処理した後の化合物１６のＨＰＬＣクロマトグラム。未処理化合物１６及び８のＨＰＬＣクロマトグラムを（Ｄ）及び（Ｅ）に示す。
【図１０】（Ａ）Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、（Ｂ）リン酸アルミニウム、（Ｃ）水で７日間７０℃で処理した後の化合物１６のＨＰＬＣクロマトグラム。未処理化合物１６及び８のＨＰＬＣクロマトグラムを（Ｄ）及び（Ｅ）に示す。
【図１１】（Ａ）Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、（Ｂ）リン酸緩衝液、（Ｃ）水で１４日間室温で処理した後の化合物３０のＨＰＬＣクロマトグラム。未処理化合物３０、１６及び８のＨＰＬＣクロマトグラムを（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）に示す。
【図１２】（Ａ）Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、（Ｂ）リン酸緩衝液、（Ｃ）水で２〜８℃で１４日間処理した後の化合物３０のＨＰＬＣクロマトグラム。未処理化合物３０、１６及び８のＨＰＬＣクロマトグラムを（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）に示す。
【図１３】（Ａ）０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で３日間処理した後の化合物３０、（Ｃ）０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で３日間処理した後の化合物１６のＨＰＬＣクロマトグラム。未処理の化合物３０、１６及び８のＨＰＬＣクロマトグラムを（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｅ）に示す。
【図１４Ａ】ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした（Ａ）化合物３０のＭＡＬＤＩ質量スペクトル。
【図１４Ｂ】ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした（Ｂ）化合物９４のＭＡＬＤＩ質量スペクトル。
【図１５】リン酸緩衝剤の存在下での化合物９４のＨＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラム。
【図１６】コンジュゲート９４の構造を示す。
【図１７Ａ】グリカンアレイ分析：（Ａ）２１日後のＨｉｂ  ＰＲＰ阻害剤の存在下（灰色の棒）又は阻害剤なし（黒い棒）の化合物１９、２４、２９、５３及び６２の抗体（Ｈｉｂヒト参照血清）への結合を示す。エラーバーは四重反復試料の標準偏差を表す。
【図１７Ｂ】グリカンアレイ分析：（Ｂ）２１日後の、Ｈｉｂ  ＰＲＰ阻害剤の存在下（灰色の棒）又は阻害剤なし（黒い棒）の化合物１９、２４、２９、５３及び６２の抗体（ウサギタイピング血清）への結合を示す。エラーバーは四重反復試料の標準偏差を表す。
【図１７Ｃ】グリカンアレイ分析：３５日後の、（Ｃ）化合物９４及び（Ｄ）Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌで化合物９４を免疫することによって生じた抗体に対する参照としての化合物１９、２４、２９、５３、６２及び天然Ｈｉｂ  ＰＲＰの結合。エラーバーは四重反復試料の標準偏差を表す。
【図１７Ｄ】グリカンアレイ分析：３５日後の、（Ｃ）化合物９４及び（Ｄ）Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌで化合物９４を免疫することによって生じた抗体に対する参照としての化合物１９、２４、２９、５３、６２及び天然Ｈｉｂ  ＰＲＰの結合。エラーバーは四重反復試料の標準偏差を表す。
【図１８Ａ】ＥＬＩＳＡ研究：非アジュバントコンジュゲート９４（四角）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌでアジュバントしたコンジュゲート９４（三角）、ＰＢＳ／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（黒丸）、及びＨｉｂｅｒｉＸ（登録商標）（逆三角）で免疫化したウサギ（ｎ＝４）から得たＩｇＧ抗体の、０日後（Ａ−陰性対照）の天然Ｈｉｂ  ＰＲＰ抗原でコートされたプレートへの結合。血清を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５倍に希釈した。希釈した血清（１００μＬ）を１μｇのＨｉｂ−ＰＲＰ多糖類で被覆したマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、１：１００００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体で検出し、ＴＭＢを用いて現像した。吸光度を４５０ｎｍで測定し、データをグラフパッドプリズムソフトウェアを用いてプロットした。
【図１８Ｂ】ＥＬＩＳＡ研究：非アジュバントコンジュゲート９４（四角）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌでアジュバントしたコンジュゲート９４（三角）、ＰＢＳ／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（黒丸）、及びＨｉｂｅｒｉＸ（登録商標）（逆三角）で免疫化したウサギ（ｎ＝４）から得たＩｇＧ抗体の、１４日後（Ｂ）の天然Ｈｉｂ  ＰＲＰ抗原でコートされたプレートへの結合。血清を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５倍に希釈した。希釈した血清（１００μＬ）を１μｇのＨｉｂ−ＰＲＰ多糖類で被覆したマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、１：１００００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体で検出し、ＴＭＢを用いて現像した。吸光度を４５０ｎｍで測定し、データをグラフパッドプリズムソフトウェアを用いてプロットした。
【図１８Ｃ】ＥＬＩＳＡ研究：非アジュバントコンジュゲート９４（四角）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌでアジュバントしたコンジュゲート９４（三角）、ＰＢＳ／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（黒丸）、及びＨｉｂｅｒｉＸ（登録商標）（逆三角）で免疫化したウサギ（ｎ＝４）から得たＩｇＧ抗体の、２１日後（Ｃ）の天然Ｈｉｂ  ＰＲＰ抗原でコートされたプレートへの結合。血清を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５倍に希釈した。希釈した血清（１００μＬ）を１μｇのＨｉｂ−ＰＲＰ多糖類で被覆したマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、１：１００００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体で検出し、ＴＭＢを用いて現像した。吸光度を４５０ｎｍで測定し、データをグラフパッドプリズムソフトウェアを用いてプロットした。
【図１８Ｄ】ＥＬＩＳＡ研究：非アジュバントコンジュゲート９４（四角）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌでアジュバントしたコンジュゲート９４（三角）、ＰＢＳ／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（黒丸）、及びＨｉｂｅｒｉＸ（登録商標）（逆三角）で免疫化したウサギ（ｎ＝４）から得たＩｇＧ抗体の、３５日後（Ｄ）の天然Ｈｉｂ  ＰＲＰ抗原でコートされたプレートへの結合。血清を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５倍に希釈した。希釈した血清（１００μＬ）を１μｇのＨｉｂ−ＰＲＰ多糖類で被覆したマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、１：１００００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体で検出し、ＴＭＢを用いて現像した。吸光度を４５０ｎｍで測定し、データをグラフパッドプリズムソフトウェアを用いてプロットした。
【図１９Ａ】ＥＬＩＳＡ研究：非アジュバントコンジュゲート９４（四角）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌでアジュバントしたコンジュゲート９４（三角）、ＰＢＳ／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（黒丸）、及びＨｉｂｅｒｉＸ（登録商標）（逆三角）で免疫化したウサギ（ｎ＝４）から得たＩｇＧ抗体の、０日後（Ａ−陰性対照）の天然Ｈｉｂ  ＰＲＰ抗原でプレコートされた市販のＡＤｉプレートへの結合。血清を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５倍に希釈した。希釈した血清（１００μＬ）を１μｇのＨｉｂ−ＰＲＰ多糖類で被覆したマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、１：１００００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体で検出し、ＴＭＢを用いて現像した。吸光度を４５０ｎｍで測定し、データをグラフパッドプリズムソフトウェアを用いてプロットした。
【図１９Ｂ】ＥＬＩＳＡ研究：非アジュバントコンジュゲート９４（四角）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌでアジュバントしたコンジュゲート９４（三角）、ＰＢＳ／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（黒丸）、及びＨｉｂｅｒｉＸ（登録商標）（逆三角）で免疫化したウサギ（ｎ＝４）から得たＩｇＧ抗体の、１４日後（Ｂ）の天然Ｈｉｂ  ＰＲＰ抗原でプレコートされた市販のＡＤｉプレートへの結合。血清を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５倍に希釈した。希釈した血清（１００μＬ）を１μｇのＨｉｂ−ＰＲＰ多糖類で被覆したマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、１：１００００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体で検出し、ＴＭＢを用いて現像した。吸光度を４５０ｎｍで測定し、データをグラフパッドプリズムソフトウェアを用いてプロットした。
【図１９Ｃ】ＥＬＩＳＡ研究：非アジュバントコンジュゲート９４（四角）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌでアジュバントしたコンジュゲート９４（三角）、ＰＢＳ／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（黒丸）、及びＨｉｂｅｒｉＸ（登録商標）（逆三角）で免疫化したウサギ（ｎ＝４）から得たＩｇＧ抗体の、２１日後（Ｃ）の天然Ｈｉｂ  ＰＲＰ抗原でプレコートされた市販のＡＤｉプレートへの結合。血清を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５倍に希釈した。希釈した血清（１００μＬ）を１μｇのＨｉｂ−ＰＲＰ多糖類で被覆したマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、１：１００００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体で検出し、ＴＭＢを用いて現像した。吸光度を４５０ｎｍで測定し、データをグラフパッドプリズムソフトウェアを用いてプロットした。
【図１９Ｄ】ＥＬＩＳＡ研究：非アジュバントコンジュゲート９４（四角）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌでアジュバントしたコンジュゲート９４（三角）、ＰＢＳ／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（黒丸）、及びＨｉｂｅｒｉＸ（登録商標）（逆三角）で免疫化したウサギ（ｎ＝４）から得たＩｇＧ抗体の、３５日後（Ｄ）の天然Ｈｉｂ  ＰＲＰ抗原でプレコートされた市販のＡＤｉプレートへの結合。血清を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５倍に希釈した。希釈した血清（１００μＬ）を１μｇのＨｉｂ−ＰＲＰ多糖類で被覆したマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、１：１００００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体で検出し、ＴＭＢを用いて現像した。吸光度を４５０ｎｍで測定し、データをグラフパッドプリズムソフトウェアを用いてプロットした。
【発明を実施するための形態】
【０４３３】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を表し、したがってその実施のための好ましい様式を構成すると考えられ
ることを、当業者は理解するべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されて依然本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を依然として得る特定の実施形態において、多くの変更がなされ得ることを理解すべきである。
【０４３４】
本発明の様々な態様のさらなる修正及び代替の実施形態は、この説明に鑑みて当業者には明らかであろう。したがって、この説明は例示にすぎないと解釈されるべきであり、当業者に本発明を実施する一般的な方法を教示することを目的としている。本明細書に示され記載された本発明の形態は、実施形態の例として解釈されるべきであることを理解されたい。本明細書の説明の恩恵を受けた後に当業者にすべて明らかとなるように、要素及び材料は本明細書で図示及び説明したものに代わることができ、部品及びプロセスは逆にすることができ、本発明の特定の特徴は独立して利用できる。以下の特許請求の範囲に記載の本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の要素に変更を加えることができる。
【実施例】
【０４３５】
化学合成
略語：
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー、ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル、ＤＣＭ：ジクロロメタン、ＲＢＦ：丸底フラスコ、ＡＣＮ：アセトニトリル、ＡｃＯＨ：酢酸、ＴＢＡＦ：フッ化テトラブチルアンモニウム、ＢｎＢｒ：ベンジルブロマイド、ＤＭＡＰ：ジメチルアミノピリジン、ＰＴＦＥ：ポリテトラフルオロエチレン、ＡＩＢＮ：アゾビスイソブチロニトリル、ＴＨＦ：テトラヒドロフラン、ＮＡＰ：２−ナフチルメチル、Ｌｅｖ：レブリニル。
化学合成に関する一般情報
特記しない限り、市販の試薬をさらに精製することなく使用した。溶媒を通常の方法で使用前に乾燥して再蒸留した。特記しない限り、すべての反応は、乾燥器乾燥ガラス器具中で不活性雰囲気下で実施した。分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、０．２５ｍｍの厚さのシリカゲルでプレコートされたＫｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４アルミニウムプレートで行った。ＴＬＣプレートをＵＶ光で、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ溶液（硫酸水溶液の硫酸セリウム及びモリブデン酸アンモニウム）又は硫酸−エタノール溶液で染色することによって可視化した。カラムクロマトグラフィーはＦｌｕｋａ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０（２３０−４００メッシュ）で行った。旋光度（ＯＲ）は、ｇ／１００ｍＬで表される濃度（ｃ）でＳｃｈｍｉｄｔ  ＆  Ｈａｅｎｓｃｈ  ＵｎｉＰｏｌ  Ｌ１０００旋光計を用いて測定した。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、内部標準としてＭｅ４Ｓｉを用いてＶａｒｉａｎ４００−ＭＲ又はＶａｒｉａｎ  ６００分光計で測定した。ＮＭＲの化学シフト（δ）はｐｐｍで記録し、カップリング定数（Ｊ）はＨｚで報告した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ６２１０  ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いて高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を記録した。
一般手順Ａ）ジシリルオキシ脱保護
ＴＢＡＦ（０．２１ｍＬ、０．２１ｍｍｏｌ）及びＡｃＯＨ（７μＬ、０．１１ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１．５ｍＬ）中の出発物質（０．０７３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、アルゴン雰囲気下で、１０ｍＬのＲＢＦ（乾燥器での乾燥）の中で室温で加えた。反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。出発物質を完全に消費した後、反応混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物は、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（２０〜６０％）を用いる自動フラッシュクロマトグラフィーによるものであった。生成物（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、無色の油状物が得られた。
一般手順Ｂ）Ｂｕ２ＳｎＯを用いたベンジル化
Ａｇ２Ｏ（０．１１６ｇ、０．５ｍｍｏｌ）及びＢｎＢｒ（８μＬ、０．０７ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１ｍＬ）中の出発物質（０．０６３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、アルゴン雰
囲気下で、１０ｍＬのＲＢＦ（乾燥器での乾燥）の中で室温で加えた。反応混合物を室温で６時間撹拌し続けた。反応をＴＬＣによってモニターした。出発物質を完全に消費した後、反応混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ）で希釈し、セライトパッドを通して濾過し、濾液を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜５０％）を用いて自動フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、無色の油状物が得られた。
【０４３６】
トルエン（５０ｍＬ）中のジオール出発物質（４．６ｇ、６．４８ｍｍｏｌ）の透明溶液に、撹拌子を備えてアルゴン雰囲気下で室温にて１４００ｒｐｍで撹拌しながら、Ｂｕ２ＳｎＯ（２．４２ｇ、９．７３ｍｍｏｌ）を加えた。次に反応混合物を１３０℃で６時間還流下に保った。６時間後、溶媒を真空下で除去し、反応物をトルエン（５×１０ｍＬの乾燥トルエン）と共沸乾燥させた。溶媒を完全に除去した後、アセタールを真空下で２０分間乾燥した。アセタールをアルゴンの存在下で真空から除去し、ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解した。この溶液にＢｎＢｒ（１．１６ｍＬ、９．７３ｍｍｏｌ）及びＴＢＡＩ（４．７８ｇ、１２．９６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１００℃で２０時間撹拌し続けた。反応をＴＬＣ（ｎ−ヘキサン中の４０％のＥｔＯＡｃ）によりモニターした。２０時間後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）と水（２０ｍＬ）で希釈した。水層を分離し、ＥｔＯＡｃ（２×３０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４（約２ｇ）で乾燥し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（勾配、０〜３０％）を使用するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製した。試験管から得た溶媒の濃縮により、無色の油状物（３．８ｇ、７３％）が得られた。
一般手順Ｃ）Ｌｅｖによる保護
アルゴン雰囲気下、２５ｍＬのＲＢＦ中のＤＣＭ（３ｍＬ）中のヒドロキシル化合物（０．１９５ｍｍｏｌ）の溶液に、レブリン酸（０．３ｍｍｏｌ、３０μＬ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ´−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．３ｍｍｏｌ、５８ｍｇ）及びＤＭＡＰ（０．２ｍｍｏｌ、２４ｍｇ）を加えた。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。出発物質を完全に消費した後、反応混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、ブライン（５ｍＬ）で洗浄した。水層をＤＣＭ（２×５ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４（０．２ｇ）で乾燥し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜５０％）を用いて自動フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、白色油状物が生じた。
一般手順Ｄ）ＮＡＰ脱保護
アルゴン雰囲気下、１０ｍＬのＲＢＦ（乾燥器での乾燥）中のジクロロメタン：Ｈ２Ｏ（１．８：０．２ｍＬ）のＮＡＰ保護化合物（０．０４８ｍｍｏｌ）の溶液に、２．３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（１４ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。反応液をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５ｍＬ）及びブライン（５ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４（０．２ｇ）で乾燥し、濾過し、濾液を真空下で１５分間濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜８０％）を用いて自動フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、白色油状物が生じた。
一般手順Ｅ）リン酸カップリング：ホスホルアミダイト法
アルゴン雰囲気下、２５ｍＬのＲＢＦ（乾燥器での乾燥）中のＤＣＭ（１．２ｍＬ）中の３−ＯＨ化合物（０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液に、ビス（ジイソプロピルアミノ）−ベンジルオキシホスフィン（０．１０８ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルアンモニウムテトラ
ゾリド（０．０８１ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で１．５時間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。反応混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５ｍＬ）でクエンチした。水層をＤＣＭ（２×５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４（０．５ｇ）で乾燥し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜３０％）及び２％トリエチルアミンを用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラム２×１０ｃｍ）で精製した。生成物（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、黄色油状物が得られた。生成物をトルエン（５ｍＬ）を用いてより小さなＲＢＦ（１０ｍＬ）に移し、溶媒を真空下で２０分間蒸発させると、白色油状物が得られた。生成物を高真空下に１０分間放置し、アルゴンでフラッシュし、直ちに次の工程に使用した。アルゴン雰囲気下、１０ｍＬのＲＢＦ（乾燥器での乾燥）中のＤＣＭ（１．２ｍＬ）中のホスホルアミダイト（０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液に、５−ＯＨ化合物（０．０３６ｍｍｏｌ）及びＡＣＮ中のテトラゾール０．４５Ｍ溶液（０．２４ｍＬ、０．１０８ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で２時間撹拌した。次に、デカン中のｔ−ブチルペルオキシド５．０〜６．０Ｍ溶液（０．０１５ｍＬ、０．０７２ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応混合物を１時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５ｍＬ）でクエンチした。水層をＤＣＭ（２×５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４（０．３ｇ）で乾燥し、濾過し、濾液を３５℃の槽温度であるロータリーエバポレーターで１５分間真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、ｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜８０％）を用いて自動フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、無色の油状物が生じた。
一般手順Ｆ）リンカーとのリン酸カップリング：ホスホルアミダイト法（ワンポット手順）
アルゴン雰囲気下、１０ｍＬのＲＢＦ（乾燥器での乾燥）中のＤＣＭ（１．０ｍＬ）中のヒドロキシル化合物（０．０１６ｍｍｏｌ）の溶液に、ビス（ジイソプロピルアミノ）−ベンジルオキシホスフィン（０．０３２ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．０２４ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で１．５時間撹拌した。次に、リンカー（０．０９７ｍｍｏｌ）及びテトラゾール０．４５ＭのＡＣＮ溶液（０．１１ｍＬ、０．０４９ｍｍｏｌ）、及び溶液を室温で２時間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。次に、デカン中のｔ−ブチルペルオキシド５．０〜６．０Ｍ溶液（０．００６ｍＬ、０．０３２ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応混合物を１時間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。反応混合物をＤＣＭ（５ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３ｍＬ）でクエンチした。水層をＤＣＭ（２×３ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（３ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４（０．２ｇ）で乾燥し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、ｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜８０％）を用いて自動フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、無色の油状物が生じた。
以下のリンカーを合成に用いた。
【０４３７】
【化１３２】
2019527243.tif 000141
【０４３８】
2019527243.tif 000142
【０４３９】
一般手順Ｇ）Ｌｅｖ脱保護
ＤＣＭ（２ｍＬ）中のＬｅｖ保護化合物（０．０６０ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸（０．０８ｍＬ）とピリジン（０．１２ｍＬ）に溶解したヒドラジン水和物（０．２６７ｍｍｏｌ、１３μＬ）の溶液を加えた。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。アセトン（０．５ｍＬ）を添加して反応をクエンチし、溶媒を真空下で除去して粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜８０％）を用いて自動フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、白色油状物が生じた。
一般手順Ｈ）水素化
撹拌子を備えた１０ｍＬの丸底フラスコ中の保護された化合物（２０ｍｇ）のＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＡｃＯＨ（１．０：０．５：０．２５：０．１２５、１．８２５ｍＬ）中の溶液に、パラジウム炭素（２０ｍｇ）を加えた。バルーンを使用して、溶液を水素で２分間洗い流し、室温で水素圧下に４０時間撹拌した。反応物をＰＴＦＥフィルタ
ー（０．４５μＭ）で濾過し、フラスコをＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ溶液（１：１、５ｍＬ）を用いて洗浄した。濾液を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をＳｅｐＰａｋ  Ｃ１８  ｅｃ（小）で１００％Ｈ２Ｏ、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ（１：１）及び１００％ＭｅＯＨを溶離液として使用して精製した。凍結乾燥機で主生成物を含有するバイアルからの溶媒を一晩濃縮すると、白色の固形物が得られた。
実施例Ａ．グリコシル化
実施例Ａ−１．化合物４
【０４４０】
【化１３３】
2019527243.tif 000143
【０４４１】
２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−５−Ｏ−（２−ナフタレニルメチル）−１−Ｏ−ｄ−リビトール２（４０ｇ、７１．０８ｍｍｏｌ）を無水トルエンと同時蒸発させ、真空で乾燥させた。アルゴン雰囲気下で攪拌しながら無水ＤＣＭ（３２０ｍＬ）中の２の溶液を０℃に冷却し、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（１９．３ｍＬ、１５６．３８ｍｍｏｌ）を滴下した。５分後、トルエン（４８０ｍＬ）中の１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−β−ｄ−リボフラノース１（１５．０８ｇ、４７．３８ｍｍｏｌ）の溶液を４５分かけて加えた。反応混合物を室温に温め、２時間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。反応混合物をトリエチルアミン（５０ｍＬ）を添加することでクエンチし、ＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２００ｍＬ）で洗浄し、水層をＤＣＭ（２×１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４（約２０ｇ）で乾燥し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物４を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（２０〜３０％）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物を含む試験管からの溶媒を真空で濃縮すると黄色油状物が得られた。次いで生成物（３１．０５ｇ、３７．８２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で２５０ｍＬのＲＢＦ（乾燥器での乾燥）中のメタノール（７０ｍＬ）に再溶解し、メタノール中のナトリウムメトキシド２５重量％溶液（４．０９ｍＬ、１８．９１ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で４時間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。反応混合物をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０Ｈ（５００ｍｇ）の添加により中和し（ｐＨ７）、濾過し、溶媒を真空下で蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（５０〜１００％）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物４を含む試験管からの溶媒を真空で濃縮すると黄色油状物を得た（１１．４６ｇ、２工程にわたって３５％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４２Ｈ４６Ｏ９Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値７１７．３０４０、実測値７１７．３０５７。
実施例Ａ−２．化合物５
【０４４２】
【化１３４】
2019527243.tif 000144
【０４４３】
１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（８．２ｇ、１１．７９ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で１００ｍＬのＲＢＦ（乾燥器での乾燥）中でアセトニトリル（７０ｍＬ）中トリオール４（３．５３ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（３．０５ｍｇ、４４．８ｍｍｏｌ）の溶液に滴下した。反応をＴＬＣによってモニターした。室温で１０分間撹拌した後、反応混合物を水（１０ｍＬ）を加えることによりクエンチし、ＤＣＭ（５０ｍＬ）及び水（２０ｍＬ）で希釈した。水層を分離し、ＤＣＭ（２×３０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４（約２ｇ）で乾燥し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜３０％）を用いて自動フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物５を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、無色の油状物（８．４ｇ、７６％）が得られた。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５４Ｈ７２Ｎ２Ｏ１０Ｓｉ２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値９５９．４５６２、実測値９５９．４５９０。
実施例Ｂ．２´−メトキシポリリボシルリビトールホスフェート
実施例Ｂ−１．化合物６
【０４４４】
【化１３５】
2019527243.tif 000145
【０４４５】
アルゴン雰囲気下、２５ｍＬのＲＢＦ（乾燥器での乾燥）中、室温でＡｇ２Ｏ（６ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）をＭｅＩ（６ｍＬ）中のアルコール５（３．５ｇ、３．７３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。反応混合物を２．５日間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。出発物質を完全に消費した後、反応混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）パッドで濾過し、濾液を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜２０％）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物を含む試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、無色の油状物６（３．０ｇ、８５％）が得られた。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５５Ｈ７４
Ｎ２Ｏ１０Ｓｉ２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値９７３．４７１８、実測値９７３．４７３８。
実施例Ｂ−２．化合物７
【０４４６】
【化１３６】
2019527243.tif 000146
【０４４７】
一般手順Ａ）に従って、シリル化化合物６をジオール生成物７（４．６ｇ、９６％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４３Ｈ４８Ｏ９Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値７３１．３１９６、実測値７３１．３２１７。
実施例Ｂ−３．化合物８
【０４４８】
【化１３７】
2019527243.tif 000147
【０４４９】
一般手順Ｈ）に従って、単量体７を脱保護単量体８（５ｍｇ、６７％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１１Ｈ２２Ｏ９Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値３２１．１１６２、実測値３２１．１１８７。
実施例Ｂ−４．化合物９
【０４５０】
【化１３８】
2019527243.tif 000148
【０４５１】
臭化ベンジル（７７ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）及び水素化ナトリウム（１６ｍｇ、０．６７２ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下０℃で、ＴＨＦ：ＤＭＦ（１．５：０．２、１．７ｍＬ）中のジオール７（８０ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加えた。反応物を室温に温め、一晩撹拌した。反応混合物を氷冷水（１ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４（約０．５ｇ）で乾燥し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜５０％）を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物９を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、無色の油状物（７５ｍｇ、７５％）が得られた。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５７Ｈ６０Ｏ９Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値９１１．４１３５、実測値９１１．４１６２。
実施例Ｂ−５．化合物１０
【０４５２】
【化１３９】
2019527243.tif 000149
【０４５３】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護中間体９を５−ヒドロキシル化合物１０（１８９ｍｇ、８９％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４６Ｈ５２Ｏ９Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値７７１．３５０９、実測値７７１．３５２１。
実施例Ｂ−６．化合物１１
【０４５４】
【化１４０】
2019527243.tif 000150
【０４５５】
一般手順Ｂ）に従って、ジオール７をベンジル化生成物１１（３．８ｇ、７３％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５０Ｈ５４Ｏ９Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値８２１．３６６６、実測値８２１．３６７２。
実施例Ｂ−７．化合物１２
【０４５６】
【化１４１】
2019527243.tif 000151
【０４５７】
一般手順Ｃ）に従って、３−ヒドロキシル中間体１１をＬｅｖ保護化合物１２（１．７５ｇ、９７％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５５Ｈ６０Ｏ１１Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値９１９．４０３３、実測値９１９．４０６２。
実施例Ｂ−８．化合物１３
【０４５８】
【化１４２】
2019527243.tif 000152
【０４５９】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護中間体１２を５−ヒドロキシル化合物１３（１．２
３ｇ、８０％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４４Ｈ５２Ｏ１１Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値７７９．３４０７、実測値７７９．３４３１。
実施例Ｂ−９．化合物１５
【０４６０】
【化１４３】
2019527243.tif 000153
【０４６１】
一般手順Ｅ）に従って、３−ヒドロキシル化合物１１及び５−ヒドロキシル化合物１０を二量体１５（６０ｍｇ、９５％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１０３Ｈ１１１Ｏ２０ＰＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値１７２１．７３０４、実測値１７２１．７３９３。
実施例Ｂ−１０．化合物１６
【０４６２】
【化１４４】
2019527243.tif 000154
【０４６３】
一般手順Ｈ）に従って、二量体１５を脱保護二量体１６（５．６ｍｇ、７７％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１１Ｈ２２Ｏ９Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値６８１．１９８３、実測値６８１．２０００。
実施例Ｂ−１１．化合物１７
【０４６４】
【化１４５】
2019527243.tif 000155
【０４６５】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護二量体１５を５−ヒドロキシル化合物１７（３０ｍｇ、６０％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ９２Ｈ１０３Ｏ２０Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値１５８１．６６７８、実測値１５８１．６７３４。
実施例Ｂ−１２．化合物１８
【０４６６】
【化１４６】
2019527243.tif 000156
【０４６７】
一般手順Ｅ）に従って、二量体１７をリンカー５−アジド−ペンタノールにカップリングさせて二量体１８（６ｍｇ、４２％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１０４Ｈ１１９Ｎ３Ｏ２３Ｐ２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値１８６３．７６４１、実測値１８６３．７７０９。
実施例Ｂ−１３．化合物１９
【０４６８】
【化１４７】
2019527243.tif 000157
【０４６９】
一般手順Ｈ）に従って、二量体１８を脱保護二量体１９（１．２ｍｇ、５５％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２７Ｈ５Ｏ２３Ｐ２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値８４６．２５３８、実測値８４６．２５４０。
実施例Ｂ−１４．化合物２０
【０４７０】
【化１４８】
2019527243.tif 000158
【０４７１】
一般手順Ｅ）に従って、３−ヒドロキシル化合物１１及び５−ヒドロキシル化合物１３を二量体２０（１．５ｇ、７６％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１０１Ｈ１１１Ｏ２２ＰＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値１７２９．７２０２、実測値１７２９．７２４０。
実施例Ｂ−１５．化合物２１
【０４７２】
【化１４９】
2019527243.tif 000159
【０４７３】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護中間体２０を５−ヒドロキシル化合物２１（３８６ｍｇ、６３％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ９０Ｈ１０３Ｏ２２ＰＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値１５８９．６５７６、実測値１５８９．６６１３。
実施例Ｂ−１６．化合物２２
【０４７４】
【化１５０】
2019527243.tif 000160
【０４７５】
一般手順Ｇ）に従って、二量体２０を３−ヒドロキシル二量体２２（４７３ｍｇ、７４％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ９６Ｈ１０５Ｏ２０ＰＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値１６３１．６８３５、実測値１６３１．６８７３。
実施例Ｂ−１７．化合物２３
【０４７６】
【化１５１】
2019527243.tif 000161
【０４７７】
一般手順Ｅ）に従って、３−ヒドロキシル二量体２２をリンカー５−アジド−ペンタノールにカップリングさせて二量体２３（３ｍｇ、３０％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１０８Ｈ１２１Ｎ３Ｏ２３Ｐ２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値１９１２．７７６４、実測値１９１２．７７８１。
実施例Ｂ−１８．化合物２４
【０４７８】
【化１５２】
2019527243.tif 000162
【０４７９】
一般手順Ｈ）に従って、二量体２３を脱保護二量体２４（１．１ｍｇ、７６％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２７Ｈ５Ｏ２３Ｐ２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算
値８４６．２５３８、実測値８４６．２５４０。
実施例Ｂ−１９．化合物２５
【０４８０】
【化１５３】
2019527243.tif 000163
【０４８１】
一般手順Ｅ）に従って、３−ヒドロキシル二量体２２及び５−ヒドロキシル二量体２１を四量体２５（３６７ｍｇ、８６％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１９３Ｈ２１３Ｏ４４Ｐ３Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値３３５０．３５４０、実測値３３５０．３５３１。
実施例Ｂ−２０．化合物２６
【０４８２】
【化１５４】
2019527243.tif 000164
【０４８３】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護四量体２５を５−ヒドロキシル四量体２６（１２５ｍｇ、７５％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１８２Ｈ２０５Ｏ４４Ｐ３Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値３２１０．２９１４、実測値３２１０．２９１１。
実施例Ｂ−２１．化合物２７
【０４８４】
【化１５５】
2019527243.tif 000165
【０４８５】
一般手順Ｅ）に従って、四量体２６をリンカー５−アジド−ペンタノールにカップリングさせて四量体２７（３５ｍｇ、７７％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１９４Ｈ２２１Ｎ３Ｏ４７Ｐ４Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値３４９１．３８４４、実測値３４９２．３７８７。
実施例Ｂ−２２．化合物２８
【０４８６】
【化１５６】
2019527243.tif 000166
【０４８７】
一般手順Ｇ）に従って、四量体２７を３−ヒドロキシル四量体２８（３０ｍｇ、９０％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１８９Ｈ２１５Ｎ３Ｏ４５Ｐ４Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値３３９３．３４７６、実測値３３９３．３５４３。
実施例Ｂ−２３．化合物２９
【０４８８】
【化１５７】
2019527243.tif 000167
【０４８９】
一般手順Ｈ）に従って、四量体２８を脱保護四量体２９（１０ｍｇ、７３％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４９Ｈ９７ＮＯ４５Ｐ４Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値１５６６．４１８１、実測値１５６６．４１７４。
実施例Ｂ−２４．化合物３０
【０４９０】
【化１５８】
2019527243.tif 000168
【０４９１】
四量体３０は、一般手順Ｇ）及び一般手順Ｈ）に従って四量体２６から２段階で調製される。
実施例Ｂ−２５．化合物３１
【０４９２】
【化１５９】
2019527243.tif 000169
【０４９３】
一般手順Ｅ）に従って、３−ヒドロキシル二量体２２及び５−ヒドロキシル四量体２６を六量体３１（８５ｍｇ、８５％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２８５Ｈ３１５Ｏ６６Ｐ５Ｎａ＋［Ｍ／２＋Ｎａ］＋の計算値２４９６．９８８８、実測値２４９６．０２７１。
実施例Ｂ−２６．化合物３２
【０４９４】
【化１６０】
2019527243.tif 000170
【０４９５】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護六量体３１を５−ヒドロキシル六量体３２（５０ｍｇ、６５％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２７４Ｈ３０７Ｏ６６Ｐ５Ｎａ＋［Ｍ／２＋Ｎａ］＋の計算値２４２６．９６７７、実測値２４２６．９９７７。
実施例Ｂ−２７．化合物３３
【０４９６】
【化１６１】
2019527243.tif 000171
【０４９７】
一般手順Ｅ）に従って、３−ヒドロキシル二量体２２及び５−ヒドロキシル六量体３２を八量体３３（５０ｍｇ、７７％）に変換した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．８６−７．６２（ｍ，４Ｈ），７．５１−７．３５（ｍ，３Ｈ），７．３７−７．０６（ｍ，１９５Ｈ），５．１０（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），５．０３（ｄｔ，Ｊ＝７．６，４．２Ｈｚ，７Ｈ），４．９７−４．７７（ｍ，２２Ｈ），４．６９−４．３７（ｍ，６０Ｈ），４．３６−４．１４（ｍ，２３Ｈ），３．９８−３．５５（ｍ，４７Ｈ），３．５３−３．３６（ｍ，１３Ｈ），３．３４−３．２１（ｍ，２４Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．６５−２．５４（ｍ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ）。
実施例Ｂ−２８．化合物３４
【０４９８】
【化１６２】
2019527243.tif 000172
【０４９９】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護八量体３３を５−ヒドロキシル八量体３４（３５ｍｇ、７３％）に変換した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．４３−７．０７（ｍ，１９５Ｈ），５．１０（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），５．０８−４．７８（ｍ，２９Ｈ），４．７０−４．４５（ｍ，５１Ｈ），４．４５−４．１５（ｍ，３８Ｈ），３．９５−３．５４（ｍ，５０Ｈ），３．５４−３．３６（ｍ，１６Ｈ），３．
３６−３．２５（ｍ，２４Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．６５−２．５６（ｍ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ）。
実施例Ｂ−２９．化合物３５−ホスホネート化学現象
【０５００】
【化１６３】
2019527243.tif 000173
【０５０１】
アルゴン雰囲気下、１０ｍＬのＲＢＦ（乾燥器での乾燥）中のＤＣＭ（２ｍＬ）中の３−ヒドロキシル化合物１１（１０ｍｇ）及びイミダゾール（５．９６ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＰＣｌ３（４．３７μＬ、０．０５０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１２．２８μＬ、０．０８７ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、反応混合物を室温に温め、１時間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。反応液をＤＣＭ（５ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５ｍＬ）及びトリエチルアンモニウム緩衝液（５ｍＬ）を加えてクエンチした。水層をＤＣＭ（２×１０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をブライン（５ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４（０．２５ｇ）で乾燥し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物３５（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮して、黄色油状物（１０ｍｇ、８３％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５６Ｈ７１ＮＯ１１ＳＰ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値９６４．４７６５、実測値９６４．４７５９。
実施例Ｂ−３０．化合物３６
【０５０２】
【化１６４】
2019527243.tif 000174
【０５０３】
Ｈ−ホスホネート３５（１０ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）及び化合物１３（７．８５ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）をピリジン（１ｍＬ）に溶解した。次に塩化トリメチルアセチル（３．８３μＬ、０．０３１ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ピリジン−水（９６：４、ｖ／ｖ；６７μＬ）中のヨウ素（２．６ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、反応物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を
ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）で希釈し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（５ｍＬ）で洗浄し、次いで１．０ＭのＴＥＡＢ溶液（５ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１０：１、ｖ／ｖ）で精製して、無色油状物として３６（５．５ｇ、２９％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ９４Ｈ１０４Ｏ２２Ｐ＋［Ｍ］−の計算値１６１５．６７６２、実測値１６１５．７０５６。
実施例Ｃ．２´−デオキシポリリボシルリビトールホスフェート
実施例Ｃ−１．化合物３７
【０５０４】
【化１６５】
2019527243.tif 000175
【０５０５】
アルゴン雰囲気下、２５ｍＬのＲＢＦ（乾燥器での乾燥）中の１，２−ジクロロエタン（５ｍＬ）中のアルコール４（８６０ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）の溶液に、チオカルボニルジイミダゾール（３２７ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を６０℃で６４時間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。溶媒を真空下で蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜３０％）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物３７（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、白色油状物（９５０ｍｇ、９８％）が得られた。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５８Ｈ７４Ｎ２Ｏ１０ＳＳｉ２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値１０６９．４５００、実測値１０６９．４５２５。
実施例Ｃ−２．化合物３８
【０５０６】
【化１６６】
2019527243.tif 000176
【０５０７】
６０℃のアルゴン雰囲気下で、１００ｍＬのＲＢＦ（乾燥器での乾燥）中のＢｕ３ＳＮＨ（０．４９ｍＬ、１．８１４ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（トルエン中０．２Ｍ、０．４６ｍＬ、０．０９１ｍｍｏｌ）のトルエン（２０ｍＬ）中の溶液に、チオカルバメート３７
（９５０ｍｇ、０．９０７ｍｍｏｌ）のトルエン（２０ｍＬ）中の溶液を滴下した。反応混合物を２時間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。反応混合物を希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）でクエンチした。水層を酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４（０．５ｇ）で乾燥し、濾過し、濾液を真空下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、ｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜５０％）を使用する自動フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物３８（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、無色の油状物（５１０ｍｇ、６１％）が得られた。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５８Ｈ７２Ｏ９Ｓｉ２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値９４３．４６１３、実測値９４３．４６４０
実施例Ｃ−２．化合物３９
【０５０８】
【化１６７】
2019527243.tif 000177
【０５０９】
一般手順Ａ）に従って、シリル化化合物３８をジオール生成物３９（３３０ｍｇ、９０％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４２Ｈ４６Ｏ８Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値７０１．３０９０、実測値７０１．３１１７。
実施例Ｃ−３．化合物４０
【０５１０】
【化１６８】
2019527243.tif 000178
【０５１１】
一般手順Ｂ）に従って、ジオール３９をベンジル化生成物４０（２６０ｍｇ、６９％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４９Ｈ５２Ｏ８Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値７９１．３５６０、実測値７９１．３５６５。
実施例Ｃ−４．化合物４１
【０５１２】
【化１６９】
2019527243.tif 000179
【０５１３】
一般手順Ｃ）に従って、３−ヒドロキシル中間体４０をＬｅｖ保護化合物４１（１３５ｍｇ、８２％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５４Ｈ５８Ｏ１０Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値８８９．３９２８、実測値８８９．３９２８。
実施例Ｃ−５．化合物４２
【０５１４】
【化１７０】
2019527243.tif 000180
【０５１５】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護中間体４１を５−ヒドロキシル化合物４２（９５ｍｇ、８５％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４３Ｈ５０Ｏ１０Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値７４９．３３０２、実測値７４９．３３２５。
実施例Ｃ−６．化合物４４
【０５１６】
【化１７１】
2019527243.tif 000181
【０５１７】
一般手順Ｅ）に従って、３−ヒドロキシル化合物４０及び５−ヒドロキシル化合物４２を二量体４４（１６０ｍｇ、７８％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ９９Ｈ１０７Ｏ２０ＰＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値１６６９．６９９１、実測値１６６９．６９８１。
実施例Ｃ−７．化合物４５
【０５１８】
【化１７２】
2019527243.tif 000182
【０５１９】
一般手順Ｄ）に従って、二量体４４を５−ヒドロキシル二量体４５（５３ｍｇ、７３％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ９９Ｈ１０７Ｏ２０ＰＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値１５２９．６３６５、実測値１５２９．６３９７。
実施例Ｃ−８．化合物４６
【０５２０】
【化１７３】
2019527243.tif 000183
【０５２１】
一般手順Ｇ）に従って、二量体４４を３−ヒドロキシル二量体４６（８５ｍｇ、９１％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ９４Ｈ１０１Ｏ１８ＰＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値１５７１．６６２３、実測値１５７１．６６５６。
実施例Ｃ−９．化合物４９
【０５２２】
【化１７４】
2019527243.tif 000184
【０５２３】
一般手順Ｅ）に従って、３−ヒドロキシル二量体４６及び５−ヒドロキシル二量体４５を四量体４９（９６ｍｇ、８３％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１８９Ｈ２０５Ｏ４０Ｐ３Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値３２３０．３１１８、実測値３２３０．３１１１。
実施例Ｃ−１０．化合物５０
【０５２４】
【化１７５】
2019527243.tif 000185
【０５２５】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護四量体４９を５−ヒドロキシル四量体５０（５０ｍｇ、５６％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１７８Ｈ１９７Ｏ４０Ｐ３Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値３０９０．２４９２、実測値３０９０．２４０５。
実施例Ｃ−１１．化合物５１
【０５２６】
【化１７６】
2019527243.tif 000186
【０５２７】
一般手順Ｅ）に従って、四量体５０をリンカー５−アジド−ペンタノールにカップリングさせて四量体５１（４１ｍｇ、７６％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１９０Ｈ２１３Ｎ３Ｏ４３Ｐ４Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値３３７１．３４２１、実測値３３７１．３３２１。
実施例Ｃ−１２．化合物５２
【０５２８】
【化１７７】
2019527243.tif 000187
【０５２９】
一般手順Ｇ）に従って、四量体５１を３−ヒドロキシル四量体５２（３６ｍｇ、９２％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１８５Ｈ２０７Ｎ３Ｏ４１Ｐ４Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値３２７３．３０５３、実測値３２７３．３０７９。
実施例Ｃ−１３．化合物５３
【０５３０】
【化１７８】
2019527243.tif 000188
【０５３１】
一般手順Ｈ）に従って、四量体５２を脱保護四量体５３（６ｍｇ、７０％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４５Ｈ８９ＮＯ４１Ｐ４Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ／２］＋についての計算値７２３．１８７９、実測値７２３．１９９６。
実施例Ｄ．２´−Ｎ、Ｎ、−ジメチルアミノカルボニルポリリボリボシルリビトールリン
酸
実施例Ｄ−１．化合物５４
【０５３２】
【化１７９】
2019527243.tif 000189
【０５３３】
アルゴン雰囲気下、室温でＤＣＭ（１０ｍＬ）中のアルコール４（２．１５３ｇ、２．２９９ｍｍｏｌ）の溶液に１，１´−カルボニルジイミダゾール（１４５ｍｇ、４．５９８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２０分間撹拌し（ＣＤＩが完全に溶解したとき）、出発物質が完全に消費されるまでＴＬＣでモニターした。溶媒を真空で蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜１００％）を用いて自動フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物５４（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、無色の油状物（２．３５ｇ、９９％）が得られた。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５８Ｈ７５Ｎ２Ｏ１１Ｓｉ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値１０３１．４９０９、実測値１０３１．４９３６。
実施例Ｄ−２．化合物５５
【０５３４】
【化１８０】
2019527243.tif 000190
【０５３５】
単量体５４（２．３９６ｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を室温のアルゴン雰囲気下でＡＣＮ（２０ｍＬ）に溶解し、Ｍｅ２ＮＨを加えた（１．８９ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）。反応混合物を室温で６５時間撹拌し、ＴＬＣによりモニターした。溶液をセライトのパッドで濾別し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で洗浄した。溶媒を真空で蒸発させた。得られた固体をＤＣＭ（１００ｍＬ）に可溶化し、有機溶液をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４（約２ｇ）で乾燥した。有機溶媒を真空で蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物を、溶離液としてｎ−ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜１００％）を用いて自動フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物５５（ＴＬＣに基づく）を含有する試験管からの溶媒を真空で濃縮すると、無色の油状物（２ｇ、８５％）が得られた。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ
５７Ｈ７７ＮＯ１１Ｓｉ２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値１０３０．４９３３、実測値１０３０．４９５８。
実施例Ｄ−３．化合物５６
【０５３６】
【化１８１】
2019527243.tif 000191
【０５３７】
一般手順Ａ）に従って、シリル化化合物５５をジオール生成物５６（１．１ｇ、７３％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４５Ｈ５１ＮＯ１０Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値７８８．３４１１、実測値７８８．３４３１。
実施例Ｄ−４．化合物５７
【０５３８】
【化１８２】
2019527243.tif 000192
【０５３９】
一般手順Ｂ）に従って、ジオール５６をベンジル化生成物５７（９１ｍｇ、１６％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５２Ｈ５７ＮＯ１０Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値８７８．３８８０、実測値８７８．３９３０。
実施例Ｄ−５．化合物５８
【０５４０】
【化１８３】
2019527243.tif 000193
【０５４１】
一般手順Ｃ）に従って、３−ヒドロキシル中間体５７をＬｅｖ保護化合物５８（４６ｍｇ、９２％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５７Ｈ６３ＮＯ１２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値９７６．４２４８、実測値９７６．４３１８。
実施例Ｄ−６．化合物５９
【０５４２】
【化１８４】
2019527243.tif 000194
【０５４３】
一般手順Ｄ）に従って、単量体５８を５−ヒドロキシル単量体５９（２３ｍｇ、６０％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４６Ｈ５５ＮＯ１２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋についての計算値８３６．３６２２、実測値８３６．３６８２。
実施例Ｄ−７．化合物６０
【０５４４】
【化１８５】
2019527243.tif 000195
【０５４５】
一般手順Ｅ）に従って、単量体５９をリンカー５−アジド−ペンタノールにカップリングさせて単量体６０（１９ｍｇ、７０％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５８Ｈ７１Ｎ４Ｏ１５ＰＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値１１１７．４５５１、実測値１１１７．４６２８。
実施例Ｄ−８．化合物６１
【０５４６】
【化１８６】
2019527243.tif 000196
【０５４７】
一般手順Ｇ）に従って、単量体６０を３−ヒドロキシル単量体６１（１２ｍｇ、７１％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５３Ｈ６５Ｎ４Ｏ１３ＰＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値１０１９．４１８３、実測値１０１９．４２４６。
実施例Ｄ−９．化合物６２
【０５４８】
【化１８７】
2019527243.tif 000197
【０５４９】
一般手順Ｈ）に従って、単量体６１を脱保護単量体６２（３ｍｇ、６０％）に変換した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１８Ｈ３８Ｎ２Ｏ１３ＰＮａ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値５２１．２１１２、実測値５２１．２１２５。
実施例Ｅ．２´−フルオロポリリボシルリビトールホスフェート
実施例Ｅ−１．化合物６３
【０５５０】
【化１８８】
2019527243.tif 000198
【０５５１】
アセトン中の化合物４に２，２−ジメトキシプロパン（１．２当量）、続いてカンファースルホン酸（０．５当量）を加えた。６時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、それをカラムクロマトグラフィーで精製して純粋な化合物６３を得た。
実施例Ｅ−２．化合物６４
【０５５２】
【化１８９】
2019527243.tif 000199
【０５５３】
化合物６３を０℃でＤＣＭ中のトリフルオロメタンスルホン酸無水物及びピリジンで処理した。２時間後、テトラブチルアンモニウムニトライト及び亜硝酸ナトリウムを加え、混合物を室温でさらに５時間撹拌した。生成物をヘキサン（２００ｍＬ）中に抽出した。抽出物を水酸化ナトリウム水溶液（２Ｎ）、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮して褐色油状物を得た。フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：エーテルで溶出する）により精製して６４を得た。
実施例Ｅ−３．化合物６５
【０５５４】
【化１９０】
2019527243.tif 000200
【０５５５】
ＤＡＳＴ（ジエチルアミノサルファートリフルオリド）（１．２当量）を、ジクロロメタン中６４の撹拌溶液に−７８℃で滴下した。適所で冷却に曝して、混合物を一晩かけて室温まで温めた。２０時間後、溶液を氷と過剰の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液の激しく攪拌した混合物にゆっくり注いだ。発泡が止んだとき、生成物をヘキサン（２００ｍＬ）中に抽出した。抽出物を水酸化ナトリウム水溶液（２Ｎ）、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮して褐色油状物を得た。フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：エーテルで溶出）で精製して６５を得た。
実施例Ｅ−４．化合物６６
【０５５６】
【化１９１】
2019527243.tif 000201
【０５５７】
化合物６５を８０％の酢酸にて取得し、８０℃で２時間撹拌した。反応終了後（ＴＬＣ）、酸性溶液を減圧濃縮して粗生成物を得、これをカラムクロマトグラフィーで精製して化合物６６を得た。
実施例Ｅ−５．化合物６７
【０５５８】
【化１９２】
2019527243.tif 000202
【０５５９】
一般手順Ｂ）に従って、ジオール６６をベンジル化生成物６７に変換した。
実施例Ｅ−６．化合物６８
【０５６０】
【化１９３】
2019527243.tif 000203
【０５６１】
一般手順Ｃ）に従って、３−ヒドロキシル中間体６７をＬｅｖ保護化合物６８に変換した。
実施例Ｅ−７．化合物６９
【０５６２】
【化１９４】
2019527243.tif 000204
【０５６３】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護中間体６８を５−ヒドロキシル化合物６９に変換した。
実施例Ｅ−８．化合物７１
【０５６４】
【化１９５】
2019527243.tif 000205
【０５６５】
一般手順Ｅ）に従って、３−ヒドロキシル化合物６７及び５−ヒドロキシル化合物６９を二量体７１に変換した。
実施例Ｅ−９．化合物７２
【０５６６】
【化１９６】
2019527243.tif 000206
【０５６７】
一般手順Ｈ）に従って、二量体７１を脱保護二量体７２に変換した。
実施例Ｅ−１０．化合物７３
【０５６８】
【化１９７】
2019527243.tif 000207
【０５６９】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護二量体７１を５−ヒドロキシル化合物７３に変換した。
実施例Ｅ−１１．化合物７４
【０５７０】
【化１９８】
2019527243.tif 000208
【０５７１】
一般手順Ｅ）に従って、二量体７３をリンカー５−アジド−ペンタノールにカップリングさせて二量体７４を得た。
実施例Ｅ−１２．化合物７５
【０５７２】
【化１９９】
2019527243.tif 000209
【０５７３】
一般手順Ｈ）に従って、二量体７４を脱保護二量体７５に変換した。
実施例Ｆ．２´−置換ポリリボシルリビトールホスフェート
実施例Ｆ−１．化合物７６
【０５７４】
【化２００】
2019527243.tif 000210
【０５７５】
一般手順Ｅ）に従って、３−ヒドロキシル化合物６７及び５−ヒドロキシル化合物６９を二量体７６に変換した。
実施例Ｆ−２．化合物７７
【０５７６】
【化２０１】
2019527243.tif 000211
【０５７７】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護中間体７６を５−ヒドロキシル化合物７７に変換した。
実施例Ｆ−３．化合物７９
【０５７８】
【化２０２】
2019527243.tif 000212
【０５７９】
一般手順Ｅ）に従って、３−ヒドロキシル二量体２２及び５−ヒドロキシル二量体７７を四量体７９に変換した。
実施例Ｆ−４．化合物８０
【０５８０】
【化２０３】
2019527243.tif 000213
【０５８１】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護四量体７９を５−ヒドロキシル四量体８０に変換した。
実施例Ｆ−５．化合物８１
【０５８２】
【化２０４】
2019527243.tif 000214
【０５８３】
一般手順Ｅ）に従って、四量体８０をリンカー５−アジド−ペンタノールにカップリングさせて四量体８１を得た。
実施例Ｆ−６．化合物８２
【０５８４】
【化２０５】
2019527243.tif 000215
【０５８５】
一般手順Ｇ）に従って、四量体８１を３−ヒドロキシル四量体８２に変換した。
実施例Ｆ−７．化合物８３
【０５８６】
【化２０６】
2019527243.tif 000216
【０５８７】
一般手順Ｈ）に従って、四量体８２を脱保護四量体８３に変換した。
実施例Ｆ−８．化合物８５
【０５８８】
【化２０７】
2019527243.tif 000217
【０５８９】
一般手順Ｅ）に従って、３−ヒドロキシル二量体２２及び５−ヒドロキシル二量体４５を四量体８５に変換した。
実施例Ｆ−９．化合物８６
【０５９０】
【化２０８】
2019527243.tif 000218
【０５９１】
一般手順Ｄ）に従って、ＮＡＰ保護四量体８５を５−ヒドロキシル四量体８６に変換した。
実施例Ｆ−１０．化合物８７
【０５９２】
【化２０９】
2019527243.tif 000219
【０５９３】
一般手順Ｅ）に従って、四量体８６をリンカー５−アジド−ペンタノールにカップリングさせて四量体８７を得た。
実施例Ｆ−１１．化合物８８
【０５９４】
【化２１０】
2019527243.tif 000220
【０５９５】
一般手順Ｇ）に従って、四量体８７を３−ヒドロキシル四量体８８に変換した。
実施例Ｆ−１２．化合物８９
【０５９６】
【化２１１】
2019527243.tif 000221
【０５９７】
一般手順Ｈ）に従って、四量体８８を脱保護四量体８９に変換した。
実施例Ｇ．安定化糖類−ＣＲＭ１９７−システインコンジュゲートの合成
実施例Ｇ−１．化合物９０
【０５９８】
【化２１２】
2019527243.tif 000222
【０５９９】
ＣＲＭ１９７のコンジュゲーションに向けた準備：ストック溶液からのＣＲＭ１９７（３．０ｍｇ、０．０５１７μｍｏｌ）をＡｍｉｃｏｎフィルター（０．５ｍＬ、ＭＷＣＯ
３０ＫＤａ）に移し、１００００ＲＰＭで３分間遠心分離した。３００μＬの１×ＰＢＳをＡｍｉｃｏｎフィルター中の残りのタンパク質に添加し、１００００ＲＰＭで３分間再度遠心分離した。次に４００μＬの１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）をＡｍｉｃｏｎフィルターに加え、１００００ＲＰＭで３分間遠心分離した。次に、タンパク質を含むフィルターを新しいＡｍｉｃｏｎマイクロ遠心分離チューブ（１．５ｍＬ）の内側で逆転させ、１０００ＲＰＭで１分間遠心分離してタンパク質をマイクロ遠心分離チューブ（容量約１００〜１２０μＬ）に集めた。
【０６００】
コンジュゲーション手順：１×ＰＢＳ緩衝液（約１００μＬ）中のＣＲＭ１９７を、撹拌子を備えた反応バイアルにおいて室温で、１．３ｍＬの１×ＰＢＳ緩衝液で希釈した。３−（マレイミド）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（０．６８８ｍｇ、２．５８μｍｏｌ）を２０μＬのＤＭＳＯで溶解したタイプＩガラス−２ｍＬ反応バイアルに移し、それを１×ＰＢＳ緩衝液中のＣＲＭ１９７を含む反応バイアルに加えた。反応物を室温で４時間撹拌した。ＲＭは無色透明の溶液であった。
【０６０１】
洗浄工程：反応混合物をＡｍｉｃｏｎフィルター（０．５ｍＬ、ＭＷＣＯ  ３０ＫＤａ）に移し、１００００ＲＰＭで３分間遠心分離し、全反応混合物を移して遠心分離するまでこのプロセスを繰り返した。その後、４００μＬの１×ＰＢＳ緩衝液を反応バイアルに加え、すすいでそれをＡｍｉｃｏｎフィルターに移した。この洗浄を４００μＬのＰＢＳ緩衝液でさらに４回繰り返した。最後に、ＣＲＭ１９７−マレイミドを含むＡｍｉｃｏｎフィルターを新しいＡｍｉｃｏｎマイクロ遠心分離チューブ（１．５ｍＬ）内で逆転させ、１０００ＲＰＭで１分間遠心分離してマイクロ遠心分離チューブ内に約１３０μＬのＣＲＭ１９７−マレイミドを回収した。そこに９５０μＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を加え、バイアルを２〜８℃で保存した（総容量＝約１．０８ｍＬ）。ＣＲＭ１９７−マレイミドコンジュゲートをＭＡＬＤＩ、ＳＤＳ−ｐａｇｅ、ウエスタンブロット、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びＢＣＡによるタンパク質推定によって分析した。ＣＲＭ１９７−マレイミドコンジュゲートをＭＡＬＤＩによって分析したところ２１〜２４の間に見出された。ＢＣＡ推定もまた、タンパク質の良好な回収率を示した。ＳＤＳ  ｐａｇｅは、ＣＲＭ−マレイミドコンジュゲート９０がＣＲＭ１９７よりも高い分子量であり、安定していることを示した。ウエスタンブロットは、ＣＲＭ抗ヤギ抗体がＣＲＭコンジュゲート９０を認識しているのに対し、Ｈｉｂ抗ウサギ抗体は糖を含まないＣＲＭ−マレイミドコンジュゲート９０を認識しなかったことを示している。さらに使用するまで、試料を２〜８℃で保存した。
実施例Ｇ−２．化合物９４糖類−ＣＲＭ１９７−システインコンジュゲート
化合物９４の合成経路は図３に概説されている。
ＤＴＴ法：化合物２９（５ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）をｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液（５ｍＬ）に溶解し、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））（２０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２．５ｍＬ）溶液を室温で一晩加えた。その後、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）（４ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を４０℃でさ
らに２時間撹拌した。化合物９１をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムクロマトグラフィー（４．５ｍｇ、８８％）で精製した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５１Ｈ９９ＮＯ４６Ｐ４Ｓ［Ｍ＋２Ｎａ＋２Ｋ−４Ｈ］−についての計算値１７３６．２７９３、実測値１７３６．２７９。
【０６０２】
糖類−チオールのコンジュゲーションに向けた準備：ＴＣＥＰ方法：１００μＬのＴＣＥＰ懸濁液を１．５ｍＬバイアル中に取り、３００μＬの１×ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を添加した。遠心分離し、上澄み液を除去した。そしてＰＢＳによる洗浄をもう一度繰り返した。そして最後に、残渣を１００μＬのＰＢＳ溶液に取り、２ｍＬのタイプＩガラスバイアル中のＰＢＳ緩衝液（０．１５ｍＬ）中のＳｕｇａｒ−ジスルフィド９１（１．３８ｍｇ、０．２９２μｍｏｌ）に加えた。室温で１時間、オービタルシェーカーを用いて穏やかに振とうした。ＲＭをバイアルに移し、ガラス製反応バイアルを２００μＬのＰＢＳ溶液ですすぎ、バイアルに移した。遠心分離し、２ｍＬのタイプＩガラスバイアル中のＰＢＳ溶液の上清（約３２５μＬ）を集めた。残渣に２００μＬのＰＢＳ溶液を添加し、よく混合し、遠心分離し、上澄みを集めて再び２ｍＬのタイプＩガラスバイアルに移した。そのため、還元型チオール７８溶液の総量は約５２５μＬであった。分析用に約２５μＬ保存した。
【０６０３】
コンジュゲーション手順：１×ＰＢＳ緩衝液（約８５０μＬ）中のＣＲＭ１９７−マレイミド９０を、室温で撹拌子を備えた反応バイアルに入れた。１×ＰＢＳ緩衝液中のＰＢＳ溶液（〜５００μＬ）中の糖類−チオール９２をＣＲＭ１９７−マレイミド９０溶液に滴下して加えた。バイアルを５０μＬのＰＢＳ溶液ですすぎ、溶液を室温で反応混合物に移した。ＲＭは透明溶液であり、室温で２０時間撹拌した。［反応混合物の約４０μＬのアリコートを分析目的で取り出した］。次に、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、３０μＬ）中のシステイン（０．１４ｍｇ）を、９３を含むＲＭに添加し、室温で１時間撹拌した。
【０６０４】
洗浄工程：９４を含む反応混合物をＡｍｉｃｏｎフィルター（０．５ｍＬ、ＭＷＣＯ  ３０ＫＤａ）に移し、１００００ＲＰＭで３分間遠心分離し、全反応混合物を移して遠心分離するまでこのプロセスを繰り返した。その後、４００μＬの１×ＰＢＳ緩衝液を反応バイアルに加えて洗浄し、溶液をＡｍｉｃｏｎフィルターに移した。この洗浄を４００μＬのＰＢＳ緩衝液でさらに４回繰り返した。最後に、ＣＲＭ１９７−マレイミド−糖類−システイン９４を含むフィルターを新しいＡｍｉｃｏｎマイクロ遠心分離チューブ（１．５ｍＬ）の内側で逆転させ、１０００ＲＰＭで１分間遠心分離して約１５０μＬのＣＲＭ１９７−マレイミド−糖類−システインをマイクロ遠心分離チューブに集めた。Ａｍｉｃｏｎフィルターに２００μＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を添加し、よくすすいで溶液をマイクロ遠心分離チューブに移し、７５０μＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）で溶液を希釈し、バイアルを２〜８℃で保存した。（総容量＝約１１００μＬ）。４０μＬのコンジュゲート９４のアリコートをＡｍｉｃｏｎフィルターを用いてｍｉｌｌｉＱ水で洗浄し、ＭＡＬＤＩ（シナピン酸マトリックス）を用いて分析し、３．４〜４．２の負荷を得た。ＳＤＳ−Ｐａｇｅ、ウエスタンブロット及びＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、コンジュゲート９４をさらにうまく分析した。ＢＣＡ法を用いたタンパク質推定は、コンジュゲート中のタンパク質の良好な回収率を示した。
【０６０５】
実施例Ｈ．安定性テスト
実施例Ｈ−１．塩基性媒体中のＨｉｂ莢膜多糖類の安定性
本発明の糖類の安定性研究は、安定な液体Ｈｉｂ複合糖質ワクチンの開発にとって重要である。対照として、最初にＨｉｂポリリボシルリビトールホスフェート莢膜多糖類（ＣＰＳ）の安定性及び開裂を調べた。したがって、Ｈｉｂ  ＣＰＳは、０．４３ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨ中の１ｍｇのＨｉｂ  ＣＰＳ、２０時間という、Ｖａｃｃｉｎｅ，２０００，１８，１９８２−１９９３に記載されているような、標準的な手順を使用して断片化された。精製後に得られた断片（３０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎフィルターを通して濾過し、
続いて脱塩する）を、１Ｈ  ＮＭＲ、ＨＰＬＣ及びＨＲＭＳによって分析した。
【０６０６】
【化２１３】
2019527243.tif 000223
【０６０７】
図４Ａは断片化されたＨｉｂ  ＣＰＳの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示し、図４Ｂは未処理Ｈｉｂ  ＣＰＳの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。図５Ａは、断片化されたＨｉｂ  ＣＰＳのＨＰＬＣクロマトグラムを示し、図５Ｂは、処理されたＨｉｂ  ＣＰＳのＥＳＩ質量スペクトルを示す。この一連の初期の実験は、Ｈｉｂ  ＣＰＳが塩基性培地中でその最小の２及び３−Ｏリン酸断片に開裂されたことを実証した。
実施例Ｈ−２．水酸化アルミニウム懸濁液中のＨｉｂ莢膜多糖類の安定性
対照Ｈｉｂ  ＣＰＳの安定性データを確立した後、水酸化アルミニウム中のＨｉｂ  ＣＰＳの安定性を調べたが、それは様々な温度｛３７℃（Ａ１）及び室温（Ａ３）｝でワクチン製剤｛０．５ｍｇ  Ｈｉｂ  ＣＰＳ、３ｍＬ  Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（Ｂｒｅｎｔａｇ）及び２２ｍＬｍｉｌｌｉＱ水｝において不安定であることが知られている。３７℃では２日後に最小の断片への開裂が認められ、室温では７日後にこのパターンが認められた（図６）。この実験から、Ｈｉｂ  ＣＰＳは、市販のワクチンに使用される最も一般的なアジュバントである水酸化アルミニウム中で、温度に応じて２〜７日で２及び３−Ｏリン酸断片に分解することが確認された。
実施例Ｈ−３．化合物１６の安定性
合成された２´−メトキシリボシルリビトールホスフェート二量体１６の安定性研究を、様々なアジュバントの存在下で実行した。１６の第１の工程の安定性はＡｌ（ＯＨ）３、ＡｌＰＯ４、水を用いて様々な温度｛３７℃（Ａ１）、２〜８℃（Ａ２）、室温（Ａ３）、７０℃（Ａ４）｝で研究された。
【０６０８】
この研究に使用されたＡｌ（ＯＨ）３及びＡｌＰＯ４の量は、市販のＨｉｂワクチンに存在する量と同様であった。１週間後のＨＰＬＣを用いた異なる温度での試料の分析を図７〜１０に示す。二量体１６の分解は単量体８をもたらすはずであるので、化合物１６及び８を参照として用いた。２４時間ごとに４０μＬの溶液を各バイアルから分注し、５０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。ＨＰＬＣ分析のために上清（２５μＬ）を採取した。７日後でさえも、分解は認められなかった。この研究から、２´−メトキシ−リボシルリビトール二量体１６は３７℃（Ａ１）、２〜８℃（Ａ２）、室温（Ａ３）及び７０℃で安定していることが明らかになった。
【０６０９】
実施例Ｈ−１に適用したように、水性塩基性条件下で二量体１６の安定性をさらに調べた。図１３ＤのＨＰＬＣクロマトグラムから、二量体１６は４日後に完全に開裂されたが、天然のＨｉｂ  ＣＰＳは２０時間以内に既に完全に開裂されていたと結論付けられた。これは、２´−メトキシリボシルリビトールホスフェートオリゴマーが、天然のＨｉｂ  ＣＰＳと比較して極端な塩基性条件下でさえも非常に安定していることを実証している。実施例Ｈ−４．化合物２９の安定性
リンカー２９を有する合成された２´−メトキシリボシルリビトールホスフェート四量体の安定性研究を様々なアジュバントの存在下で行った。第１の工程として、２９の安定性をＡｌ（ＯＨ）３、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）及び水を用いて様々な温度｛２〜８℃（Ａ２）、及び室温（Ａ３）｝で研究した。
【０６１０】
この研究に使用されたＡｌ（ＯＨ）３の量は市販のＨｉｂワクチンに存在する量と同様であった。１週間後のＨＰＬＣを用いた異なる温度での試料の分析を図１１及び１２に示す。四量体２９の分解は二量体１６及び単量体８をもたらすはずであるので、化合物２９、１６及び８を参照として用いた。２４時間ごとに４０μＬの溶液を各バイアルから分注し、５０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。ＨＰＬＣ分析のために上清（２５μＬ）を採取した。７日後でさえも、分解は認められなかった。この研究から、２´−メトキシ−リボシルリビトールホスフェート四量体２９は、Ａｌ（ＯＨ）３の存在下、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中及び水中で２〜８℃（Ａ２）及び室温（Ａ３）で安定していることが明らかであった。
【０６１１】
実施例Ｈ−１に適用したように、水性塩基性条件下で四量体２９の安定性をさらに調べた。図１３ＡのＨＰＬＣクロマトグラムから、四量体２９は４日後に完全に開裂されたが、天然のＨｉｂ  ＣＰＳは２０時間以内に既に完全に開裂されていたと結論付けられた。これは、２´−メトキシリボシルリビトールホスフェートオリゴマーが、天然のＨｉｂ  ＣＰＳと比較して極端な塩基性条件下でさえも非常に安定していることを実証している。実施例Ｈ−５．リン酸緩衝液の存在下におけるコンジュゲート９４の安定性
２つのバイアルに入っている約５μｇの化合物９４をそれぞれ５００μＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４に希釈した。一方のバイアルを２５℃で保存し、もう一方のバイアルを２〜８℃で保存した。１日後及び１５日後に、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）及びＨＰＬＣ−ＳＥＣ（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷ×１、緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）によって試料を分析した。データは、１５日後もなおコンジュゲート９４が存在し、２５℃及び２〜８℃の両方の温度条件で安定していることを示した。
実施例Ｈ−６．水酸化アルミニウムの存在下における化合物９４の安定性
約５μｇの化合物９４とＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（０．１２５ｍｇ／用量）を含む２つのバイアルに、それぞれ５００μＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４を充填した。１つのバイアルを２５℃で、もう１つのバイアルを２〜８℃で保存した。試料を１日後及び１週間後ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）、ＨＰＬＣ−ＳＥＣカラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷ×１、緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）、ＳＤＳ−ｐａｇｅ及びウエスタンブロットにより分析した。データは、約７５％のコンジュゲート９４がＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に吸着され、吸着されたコンジュゲートは両方の温度条件で安定していることを示した。この間に分解生成物は認められなかった。
【０６１２】
【表１】
2019527243.tif 000224
【０６１３】
実施例Ｉ．グリカンアレイ分析
実施例Ｉ−１．ウサギにおける免疫化
免疫実験をウサギで行った（Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９７，ｐ．４９１８−４９２５；  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０５  （５６８３），ｐ．５２２−５２５．）。ウサギは国際的な動物の規制（ＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵ）に従って飼育及び処理され、政府当局（Ｌａｎｄｅｓａｍｔ  ｆｕｒ  Ｌａｎｄｗｉｒｔｓｃｈａｆｔ、Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌｓｉｃｈｅｒｈｅｉｔ及びＦｉｓｃｈｅｒｅｉ  Ｍｅｃｋｌｅｎｂｕｒｇ−Ｖｏｒｐｏｍｍｅｒｎ）の認可を受けている。
【０６１４】
各群につき４匹のウサギを含む４つの群を、５μｇの糖類２９を含有するアジュバント化されていないコンジュゲート９４又はＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌをアジュバント化したコンジュゲート９４（５μｇのＨｉｂ糖類２９を含有）で、プライムブーストレジメンで免疫した。陰性対照群はＰＢＳ／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌのみを投与した。陽性対照群には、承認されたワクチンＡｃｔＨＩＢ（登録商標）（５μｇのＰＲＰ、ヒトの用量の半分に相当する）、破傷風トキソイド（ＴＴ）に対する天然ＰＲＰのコンジュゲートを投与した。免疫前血清及び出血２１日目の抗血清（２回の免疫化後）を採取し、グリカンアレイにて分析した。ＡｃｔＨＩＢ特異的血清は、本発明のＨＩＢ類似体の２回の免疫化とは対照的に３回の投与後に得られた。
実施例Ｉ−２．グリカンアレイ分析
ＰＢＳ中の糖類を、Ｓ３マイクロアレイスポッター（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ）を用いてＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ガラススライド（ＣｏｄｅＬｉｎｋスライド、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）上に印刷した。スライドを湿気飽和チャンバー中で一晩インキュベートし、１００ｍＭのエタノールアミン、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で２時間クエンチし、水で洗浄して乾燥した。
【０６１５】
インキュベーションのために、スライドを３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−ＰＢＳで１時間ブロッキングし、ＰＢＳ及び水で洗浄し、遠心分離により乾燥した。６４ウェルインキュベーショングリッドを取り付けた。血清を３％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅ
ｎ−２０で希釈し、３７℃で１５分間インキュベートし、３２２０ｒｐｍで２分間遠心分離した。血清希釈物をスライドに適用し、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。二次抗体（抗ウサギＩｇＧ  ＦＩＴＣ、抗ウサギＩｇＭ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８及びＩｇＭ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５９４）をスライド上で３０分間室温でインキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。インキュベーショングリッドを外し、スライドをＰＢＳと水で洗浄した。遠心分離により乾燥した後、スライドをＧｅｎｅＰｉｘ４３００Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）マイクロアレイリーダーを用いてスキャンした。
【０６１６】
一次免疫応答を、０日目、２１日目及び３５日目に回収された血清試料のグリカンアレイスクリーニングによって評価した。２´−メトキシリボシルリビトールホスフェート二量体１９、２´−メトキシリボシルリビトールホスフェート二量体２４、２´−メトキシリボシルリビトールホスフェート四量体２９、２´−デオキシリボシルリビトールホスフェート四量体５３及び２´−ジメチル−アミノカルボニルリボシルリビトールホスフェート６２ならびに天然Ｈｉｂ  ＰＲＰをＮＨＳエステル活性化マイクロアレイスライドに印刷した。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌでアジュバント添加されたコンジュゲート９４及びアジュバントなしのコンジュゲート９４で免疫した後、Ｈｉｂ  ＰＲＰ誘導体１９、２４、２９、５３及び６２、ならびにすべての免疫化ウサギにおける天然のＨｉｂ  ＰＲＰ多糖類に対するＩｇＧ及びＩｇＭのサブタイプの抗体を検出した。
【０６１７】
グリカンアレイスクリーニングはまた、ヒト参照血清（図１７Ａ）及びウサギタイピング血清（図１７Ｂ）中に存在する抗Ｈｉｂ抗体がＨｉｂ  ＰＲＰ誘導体１９、２４、２９、５３及び６２に結合することを示した。天然のＨｉｂ  ＰＲＰが存在することで、Ｈｉｂ  ＰＲＰ誘導体１９、２４、２９及び６２の結合が阻害されるが、２´−デオキシリボシルリビトールホスフェート５３の結合は阻害しない。
【０６１８】
血清ＩｇＧ抗体は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌをアジュバント化したコンジュゲート９４での最初の免疫化の２１日後、及びアジュバント化していないコンジュゲート９４での最初の免疫化の３５日後に、検出可能であった。天然のＨｉｂ  ＰＲＰ多糖類と交差反応する抗体は、これらの抗体がヘモフィルス属インフルエンザ菌に結合し、ヘモフィルス属インフルエンザ菌感染に対する防御を付与する可能性を示している。
Ｊ．ＥＬＩＳＡでの研究の例
・ＥＬＩＳＡプレート（高結合、ＥＩＡ／ＲＩＡプレート、９６ウェル、平底、低蒸発蓋付き、会社名：ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３３６１）
・市販のウサギ抗Ｈｉｂ−ＰＲＰ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡアセンブリキット（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｌ．Ｉｎｃ、＃９８０−１３０−ＰＲＧ；ロット：１７０５３１Ｋ５、有効期限：２０１８年６月）
・抗原：ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ由来のホスホリボシルホスフェート（ＰＲＰ）莢膜多糖類（ＮＩＢＳＣ、コード：１２／３０６）
・試験血清：ＢｉｏＧｅｎｅｓ  ＧｍｂＨにより供給された。
・検出抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ４９１４）。
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：自社製（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＧｍｂＨ、カタログ番号：Ｌ１８２−１０）
・ブロッキング液：ＰＢＳ中１％ＦＣＳ（ｖ／ｖ）。
・抗体希釈液：ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）。
・洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）
・現像液：１工程（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ。（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：３４０２８）
・停止液−２Ｍ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）（自社製）
・プレートリーダー：Ａｎｔｈｏｓ  ｈｔ  ２
ソフトウェア：吸光度測定用のＷｉｎＲｅａｄ  ２．３６及びデータプロット及び分析用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７。
実施例Ｊ−１．免疫化スケジュールと血清採取
免疫実験はすべてＢｉｏＧｅｎｅｓ  ＧｍｂＨ  Ｂｅｒｌｉｎで実施した。実験群は、ｉ）Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含むＰＢＳ（陰性対照）、ｉｉ）Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含まない化合物９４、ｉｉｉ）Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含む化合物９４、及びｉｖ）市販のワクチンＨｉｂｅｒｉＸ（登録商標）（陽性対照）を含んだ。手短に言えば、ウサギ（ｎ＝４）を、表１に記載されているように、それぞれの実験群のための構築物を用いてプライムブーストレジメンで免疫した。プライムブーストレジメンに従ってマウスを免疫し、０日目（免疫前）、１４日目、２１日目、及び３５日目に血清を収集した。
【０６１９】
【表２】
2019527243.tif 000225
【０６２０】
血清の収集と取り扱い
異なる実験群から得た血清及びそれぞれの時点から得た血清は−２０℃で保存した。特定の実験群の個々のウサギからの血清（２０μｌ）をプールして、−２０℃で保存した。個々のウサギ血清（２０μｌ）を別々のストックとして等分し、さらなる使用まで−２０℃で保存した。
実施例Ｊ−２．自家抗原被覆プレートを用いた血清の酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）抗原によるプレートのコーティング
抗原、Ｈｉｂ  ＰＲＰ莢膜多糖類（ストック濃度１ｍｇ／ｍＬ）をｐＨ７．４のＰＢＳ中で作用抗原濃度１０μｇ／ｍＬに希釈した。１００μＬを各ウェルに添加し（１μｇ抗原／ウェル）、４℃で一晩インキュベートした。
洗浄：
抗原を一晩吸着させた後、プレートをＰＢＳ−Ｔ（２００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、プレートを反転させて清潔な乾いたティッシュタオルで軽くたたくことにより、各ウェルの過剰な流体を除去した。
ブロッキング：
プレートを３００μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳ＋１％ＦＣＳ）を用いて室温で２時間ブロッキングした。
洗浄：
ブロッキング後、プレートをＰＢＳ−Ｔ（２００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、プレートを反転させて清潔な乾いたティッシュタオルで軽くたたくことにより、各ウェルの過剰な流体を除去した。
【０６２１】
血清とインキュベーションの希釈：
異なる実験群のプールされた（ｎ＝４ウサギ／群）免疫前血清及び試験血清、及び個々のウサギの試験血清（ｎ＝４）を、抗体希釈剤（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）中で、それらの個々の希釈度に希釈した。異なる実験群の１００μＬの希釈血清試料（１００個を対応するウェルに２連で加え、２５０ｒｐｍに設定した振とう機で、室温で１時間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの抗体希釈剤（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）が実験用ブランクを形成した。血清とインキュベートした後プレートをＰＢＳ−Ｔ（２００μＬ／ウェル）で５回洗浄し、プレートを反転させて清潔な乾いたティッシュタオルで軽くたたくことにより、各ウェルの過剰な流体を除去した。
インキュベーション（検出抗体）：
検出抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼを抗体希釈剤（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）中で１：１０，０００に希釈し、１００μＬをウェルに添加し、室温で２５０ｒｐｍで１時間、振とう機でインキュベートした。検出抗体と共にインキュベートした後、プレートをＰＢＳ−Ｔ（２００μＬ／ウェル）で５回洗浄し、プレートを反転させて清潔な乾いたティッシュタオルで軽くたたくことによって、各ウェルの過剰な流体を除去した。
現像：
各ウェルに、１００μＬのすぐに使えるＴＭＢ基質（４℃の室温の形態に標準化されたもの）を加え、１５分間暗所でインキュベートした。酵素反応の青色は、１００μＬ／ウェルの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加することによって停止され、黄色の溶液が得られた。黄色の溶液の吸収を、プレートリーダーを使用して６３０ｎｍの補正波長で４５０ｎｍで測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフをプロットすることによって、吸収値を分析した。
結果：
図１８Ａに見られるように、全希釈にわたる全実験群の免疫前血清は、有意な応答を示さず、示度は０に等しかった。免疫後／試験血清において、１４日目のＨｉｂｅｒｉＸ群（逆三角）は、２１日目及び−３５日目の群に１：２５００の力価まで増加したＰＢＳ対照群（黒丸）よりもかなり高い免疫応答を示した（図１８Ｂ〜Ｄ）。アジュバント化化合物９４で免疫した実験群（三角）では、抗体力価は、１４日目のＰＢＳ群のものより低かった。それは、１：２５０００の力価でＨｉｂｅｒｉＸ群のものまで実質的に増加したが、１倍低かった。非アジュバント化化合物９４（四角）で免疫した実験群は１４日目にＨｉｂｅｒｉＸ群に匹敵する免疫力価を示したが、アジュバント化群が追加免疫応答を示した２１日目の時点で追加免疫応答は認められなかった。しかし、２回目の追加免疫の後、非アジュバント化化合物９４は、アジュバント化群に匹敵するが、Ｈｉｂｅｒｉｘ群のそれよりも低い免疫力価を示した。
実施例Ｊ−３．市販のＡＤｉプレートを用いた血清の酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）
ウサギ抗Ｈｉｂ−ＰＲＰ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（ＡＤｉ）は、ワクチン接種動物の血清中のＨｉｂ−ＰＲＰ特異的ＩｇＧ抗体を検出する。キットは、洗浄緩衝液及び過酸化物コンジュゲート検出抗体を供給され、抗原Ｈｉｂ−ＰＲＰ多糖類でプレコートした９６ウェルマイクロタイタープレートを含んでいる。このキットには、一連のキャリブレータ（０．５、１．０、２．５、及び５．０Ｕ／ｍＬ）と陽性対照／参照血清も含まれている。キャリブレータは、内部アッセイパラメータの制御をし、１：５０以上の血清希釈度
において偽陽性を区別する。０．５Ｕ／ｍＬ値は、最低検出可能力価になり、それ未満では試験値が偽陽性である可能性がある。製造業者からの指示に従って通常のＥＬＩＳＡフォーマットでアッセイを実施した。簡単に説明すると、試験する血清を、キットに含まれる希釈剤中で、１：１００以上の適切な希釈範囲に希釈した。キャリブレーター、陽性対照及び陰性対照と共に１００μＬの希釈血清を所定のウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いでウェルをキット洗浄緩衝液で４回洗浄し、１００μＬの検出抗体を添加し、さらに３０分間インキュベートし、続いて５回洗浄した。１００μＬのＴＭＢ基質を加え、１５分間インキュベートし、続いて１００μＬの停止溶液を用いて反応を停止させることによってウェルを現像し、黄色の溶液を得た。黄色の溶液の吸収は、マイクロプレートリーダーを使用して６３０ｎｍの補正波長で４５０ｎｍで測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフをプロットすることによって、吸収値を分析した。
結果：
Ｈｉｂ−ＰＲＰ多糖類（抗原）は、ＥＬＩＳＡにおいて抗原の検出が低下する可能性があるｐＨの差及び他の物理化学的要因のために、加水分解に対して非常に反応しやすい。図１８Ｂ〜図１８Ｄで認められた免疫力価を裏付けるために、抗原の自家でのコーティングに起因する異常を排除するために、Ｈｉｂ−ＰＲＰ多糖類で予めコーティングした市販の診断プレート（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ−ａｄｉ）で、ウサギの血清をスクリーニングした。実施例Ｊ−２に記載のように、異なる実験群及び時点から得たウサギの免疫血清を５倍希釈し（１：１００、５００、２５００、及び１２５００）、多糖類特異的ＩｇＧ抗体について分析した。図１９Ａに見られるように、全希釈にわたる全実験群の免疫前血清は有意な応答を示さず、示度は閾値未満であった。閾値は、同じプレートで実行された０．５Ｕ／ｍＬキャリブレータについて得られた吸収値を示し、それ未満の値は陰性又は偽陽性として割り当てることができる。
【０６２２】
免疫後／試験血清において、１４日目のＨｉｂｅｒｉＸ群（逆三角形）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含む（三角）及び含まない（四角）化合物９４は、１：１００の最高希釈でさえも閾値より低い免疫力価を示した（図１９Ｂ）。しかし、ＰＢＳ対照群（黒丸）は、１４日目の時点でのみ１：１００の最高希釈で閾値より高いシグナルを示したが、２１日目と３５日目の他のすべての時点で閾値よりも低かった。これは、自家でコーティングした抗原プレートにおいて認められたのと同様の傾向であった（図１８Ｂ〜Ｄ）。２１日目及び３５日目の時点におけるアジュバント化化合物９４（三角）及びＨｉｂｅｒｉＸ群（逆三角）は、それぞれ１：５００及び１：２５００の希釈まで飽和を示した。力価が２１日目の時点での１：２５００から３５日目の時点での１：１２５００まで顕著に増加するので、アジュバント及び追加免疫応答の効果は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ群を有する化合物９４において明らかに見られた。明らかに３５日目に、アジュバント化化合物９４で免疫した群はＨｉｂｅｒｉＸに対して同等の応答を示したが、１倍低かった。しかし、非アジュバント化化合物９４で免疫した群では、２１日目まで検出可能なＩｇＧ力価はなかったが、２回目の追加免疫後に１：２５００まで顕著に増加した。この傾向は、自家の抗原コートプレートを使用して実施されたＥＬＩＳＡにおいて認められたものと同様であった（図１８Ｃ、Ｄ）。
【０６２３】
これらのデータはコンジュゲート９４の免疫原性を実証している。アイソタイプ転換は、Ｔ細胞依存性の抗体応答を示している。血清ＩｇＧ抗体は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌをアジュバント化したコンジュゲート９４で最初に免疫化した２１日後、及びアジュバント化していないコンジュゲート９４での最初の免疫化の３５日後に、検出可能であった。天然のＨｉｂ  ＰＲＰ多糖類と交差反応する抗体は、それらの抗体がヘモフィルス属インフルエンザ菌に結合し、ヘモフィルス属インフルエンザ菌感染に対する防御を付与する可能性を示している。
【図１】
2019527243.tif 000255
【図２】
2019527243.tif 000256
【図３】
2019527243.tif 000257
【図４】
2019527243.tif 000258
【図５】
2019527243.tif 000259
【図６】
2019527243.tif 000260
【図７】
2019527243.tif 000261
【図８】
2019527243.tif 000262
【図９】
2019527243.tif 000263
【図１０】
2019527243.tif 000264
【図１１】
2019527243.tif 000265
【図１２】
2019527243.tif 000266
【図１３】
2019527243.tif 000267
【図１４Ａ】
2019527243.tif 000268
【図１４Ｂ】
2019527243.tif 000269
【図１５】
2019527243.tif 000270
【図１６】
2019527243.tif 000271
【図１７Ａ】
2019527243.tif 000272
【図１７Ｂ】
2019527243.tif 000273
【図１７Ｃ】
2019527243.tif 000274
【図１７Ｄ】
2019527243.tif 000275
【図１８Ａ】
2019527243.tif 000276
【図１８Ｂ】
2019527243.tif 000277
【図１８Ｃ】
2019527243.tif 000278
【図１８Ｄ】
2019527243.tif 000279
【図１９Ａ】
2019527243.tif 000280
【図１９Ｂ】
2019527243.tif 000281
【図１９Ｃ】
2019527243.tif 000282
【図１９Ｄ】
2019527243.tif 000283
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月20日(2017.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）の糖類
【化１】
2019527243.tif 000284
式中
Ａは
【化２】
2019527243.tif 000285
であり；
Ｂは
【化３】
2019527243.tif 000286
であり；
Ｃは
【化４】
2019527243.tif 000287
であり；
Ｄは
【化５】
2019527243.tif 000288
であり；
Ｅは
【化６】
2019527243.tif 000289
であり；
Ｆは
【化７】
2019527243.tif 000290
であり、
Ｔ１及びＴ２は−Ｈ、−Ｌ−ＮＨ２を表し、Ｔ１が−Ｌ−ＮＨ２の場合、Ｔ２は−Ｈであり、Ｔ１が−Ｈの場合、Ｔ２は−Ｌ−ＮＨ２であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６は、互いに独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＦ３を表し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６の少なくとも２つは−ＯＨではなく、
ｎは１、２、３又は４から選択される整数であり、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は互いに独立して０及び１から選択され、
ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４≧１である、
ただし、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＝１の場合、ｎ＝１の場合、及び
Ａが
【化８】
2019527243.tif 000291
である場合、
Ｆは
【化９】
2019527243.tif 000292
であり、また、
ただし、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＝１の場合、ｎ＝１の場合、及び
Ｆが
【化１０】
2019527243.tif 000293
である場合、
Ａは
【化１１】
2019527243.tif 000294
であり、また、
Ｌはリンカーであり、Ｌは、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−から選択され、
式中、−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｂ−は−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−を表し、
−Ｌｄ−は−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＦ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−Ｃ２Ｈ４−、及び−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｅ−は−（ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＦ２）ｐ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−及び−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ２−から選択され、
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２は、互いに独立して、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である、
前記糖類、その糖類のエナンチオマー、ジアステレオマー、エナンチオマーの混合物、ジアステレオマーの混合物、アノマー、水和物、溶媒和物、及びそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記糖類は、式（ＩＩ−１）で表され、
【化１２】
2019527243.tif 000295
式中
Ａは
【化１３】
2019527243.tif 000296
であり；
Ｆは
【化１４】
2019527243.tif 000297
であり、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は請求項１に定義された意味を有し、
ｎは１又は２であり、
Ｘ２−Ｘ６は、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である、
請求項１に記載の糖類。
【請求項３】
前記糖類は、式（ＩＩ−２）で表され、
【化１５】
2019527243.tif 000298
式中
Ａは
【化１６】
2019527243.tif 000299
であり；
Ｆは
【化１７】
2019527243.tif 000300
であり、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は請求項１に定義された意味を有し、
ｎは１又は２であり、
Ｘ１−Ｘ５は、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＣＨ３である、請求項１に記載の糖類。
【請求項４】
前記糖類は、式（ＩＩＩ−１）で表され、
【化１８】
2019527243.tif 000301
式中
Ｌは請求項１に定義の通りの意味を有し、
ｍは１〜９から選択される整数であり、
Ｘａは、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である、請求項１に記載の糖類。
【請求項５】
前記糖類は式（ＩＶ−１）で表され、
【化１９】
2019527243.tif 000302
式中
ｍは１〜９から選択される整数であり、
Ｘａは、−Ｈ、−Ｆ、又は−ＯＣＨ３である、請求項１に記載の糖類。
【請求項６】
以下からなる群から選択される、請求項１に記載の糖類：
【化２０】
2019527243.tif 000303
2019527243.tif 000304
2019527243.tif 000305
2019527243.tif 000306
2019527243.tif 000307
【請求項７】
−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介して免疫原性担体とコンジュゲートしている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の糖類。
【請求項８】
医薬における医薬活性剤として使用するための、請求項１〜７のいずれかに記載の糖類。
【請求項９】
ヒト及び／又は動物の宿主において防御免疫応答を惹起するのに使用するための、請求項１〜８のいずれかに記載の糖類。
【請求項１０】
ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に関連する疾患の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載の糖類。
【請求項１１】
前記ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に関連する疾患が、髄膜炎、肺炎、及び喉頭蓋炎（ｅｐｉｇｌｏｔｉｔｉｓ）から選択される、請求項１０に記載の糖類。
【請求項１２】
少なくとも１つの薬学的に許容されるアジュバント、担体、凍結防止剤、凍結保護剤、賦形剤及び／又は希釈剤と共に、請求項１〜１１のいずれかに記載の糖類を含むワクチン組成物。
【請求項１３】
ヘモフィルス属インフルエンザ菌ｂ型に関連する疾患に対する免疫化における使用のための、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
ジフテリア抗原、破傷風抗原、百日咳抗原、Ｂ型肝炎抗原、不活化ポリオワクチン及び不活化ロタウイルスワクチンのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１２又は１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
ヘモフィルス属インフルエンザ菌Ｂ型によって引き起こされる疾患の診断のための免疫学的アッセイにおけるマーカーとして使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の糖類。
【請求項１６】
式（Ｉ）の糖類を合成するための中間化合物は、
Ａ１＊−２、Ａ１＊−３、Ａ１＊−４、Ａ１＊−５、Ａ１＊−５´、Ａ１＊−５´´、Ａ１＊−６、Ａ１＊−７、Ａ１＊−８、Ｂ１＊−１、Ｂ１＊−２、Ｂ１＊−３、Ｂ１＊−４、Ｂ１＊−５、Ｂ１＊−６、Ｃ１＊−２、Ｃ１＊−３、Ｃ１＊−３´、Ｃ１＊−３´´、Ａ２＊−１、Ａ２＊−２、Ａ２＊−３、Ａ２＊−４、Ｂ２＊−１、Ｂ２＊−２、Ｂ２＊−３、Ｂ２＊−４、Ｃ２＊−１、Ｃ２＊−２、Ｃ２＊−３、Ｃ２＊−４、Ａ２＊−１´、Ａ２＊−２´、Ａ２＊−３´、Ａ２＊−４´、Ａ２＊−２´´、Ａ２＊−３´´、Ａ２＊−４´´、Ｂ２＊−１´、Ｂ２＊−１´´、Ｂ２＊−１´´´、Ｂ２＊−２´、Ｂ２＊−３´、Ｂ２＊−３´´、Ｂ２＊−３´´´、Ｂ２＊−４´、Ｂ２＊−４´´、Ｃ２＊−１´、Ｃ２＊−２´、Ｃ２＊−３´及びＣ２＊−４´からなる群から選択され、
【化２１】
2019527243.tif 000308
2019527243.tif 000309
2019527243.tif 000310
2019527243.tif 000311
2019527243.tif 000312
式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、及びＰ５は、−Ｏ−に結合したときにＸi及びＸｊと同一ではない保護基を表し、
Ｘｉ及びＸｊは、互いに独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｆ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＦ３を表し、
基ＸｉかＸｊが１つだけ存在する場合、Ｘｉ又はＸｊは−ＯＨにはできず、
基ＸｉとＸｊの両方が存在する場合、ＸｉとＸｊは同時に−ＯＨになることはできず、
Ｌは請求項１に定義された意味を有し、
Ｍ＋は、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、又はＨＮＥｔ３＋を表す、
請求項１に記載の糖類。
【国際調査報告】
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