(57)【要約】  本発明は、異なる成長及び／又は増殖の条件を有する、少なくとも２つの別個の科の細菌の共培養物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、該組成物は、微生物フローラに高い類似性を有する複数の細菌属を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細菌属及び複数の粒子を含む合成組成物であって、前記複数の細菌属が、（ｉ）異なる成長及び／又は増殖の条件を有する少なくとも２つの別個の科の細菌の共培養物であり、かつ（ｉｉ）微生物叢集団と少なくとも３０％の類似性を有する、合成組成物。
【請求項２】
前記複数の細菌属の少なくとも一部が、前記微生物叢集団に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記微生物叢集団が所定の目的微生物叢集団である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
好気性細菌の少なくとも細菌サブセット及び嫌気性細菌の少なくとも１種の細菌サブセットを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
バイオフィルムの形態の細菌の少なくとも１種の細菌サブセット及び浮遊性細菌の少なくとも１種の細菌サブセットを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記微生物叢集団が、腸微生物叢、唾液微生物叢、皮膚微生物叢、口腔微生物叢、気管支微生物叢、膣微生物叢、土壌微生物叢、又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記複数の細菌属が、糞便試料、唾液試料、皮膚試料、口腔試料、気管支試料、膣試料、土壌試料、又はそれらの混合物からなる群から選択される１以上の試料に由来する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記微生物叢集団が少なくとも１種の起源に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記複数の細菌属が、１以上の健康な哺乳類、動物ドナー、細菌株、保存された微生物叢試料、細菌コロニー、浮遊性試料及びバイオフィルムに由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
さらに複数種類の粒子を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
各粒子が、少なくとも２つの別個の科の細菌の共培養物を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１又は１１のいずれか一項に記載の組成物及び医薬として許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬として許容される担体又は賦形剤が、安定剤、防腐剤、キレート剤、粘度改質剤、緩衝剤、及びｐＨ調整剤のうちの１以上から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
直腸、静脈内、非経口、粘膜、経鼻又は経口投与用に製剤化される、請求項１２及び１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
腸内菌共生バランス失調の治療に使用するためのものである、請求項１２及び１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法であって、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１７】
前記疾患又は障害が腸内菌共生バランス失調である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
異なる成長及び／又は増殖の条件を有する少なくとも２つの別個の科の細菌の共培養物を含む組成物を取得するための方法であって、
ａ．少なくとも１種の起源からの微生物叢を含む複数の細菌属を提供する工程；
ｂ．前記複数の細菌属を懸濁し、細菌属溶液を得る工程；
ｃ．前記複数の細菌属溶液を濾過し、それによって前記複数の細菌属溶液を含む濾液を取得する工程；
ｄ．複数の粒子を有する濾液をインキュベートし、前記複数の細菌属を前記複数の粒子に付着させる工程；
ｅ．前記複数の粒子に付着した複数の細菌属を複数の細菌溶液サブセットに分ける工程；
ｆ．成長培地中で、前記個々のサブセットの増殖に適する増殖条件下で各細菌溶液サブセットを培養する工程；
ｇ．前記成長培地を除去し、前記個々のサブセットを再び合わせる工程；
それによって、異なる成長及び／又は増殖の条件を有する少なくとも２つの別個の科の細菌の共培養物を含む組成物を取得する工程、を含む方法。
【請求項１９】
前記増殖条件が、好気性、嫌気性、及び微好気性の条件からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記増殖条件が、流動条件、振盪条件、及び静的条件から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記増殖条件が、湿潤条件及び低湿度条件から選択される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、そのいくつかの実施形態において、腸内菌共生バランス失調の治療のためなどの複数の細菌属を含む組成物及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
消化管は、豊富で多様な微生物群集を保有している。これは、細菌の多様な株を含む多くの異なる種若しくは生物の群集のための環境又はニッチを提供する複雑なシステムである。通常の微生物フローラはまた、典型的には、皮膚、爪、目、口腔及び上気道及び尿生殖路に生息している。
【０００３】
健常な微生物叢は、宿主に広範囲の病原体に対する耐性を含む複数の利点、必須栄養素の生合成及び吸収、並びに健康な腸上皮及び適切に制御された全身性免疫を維持する免疫刺激を提供する細菌のコロニー形成を必要とする。「腸内菌共生バランス失調」又は破壊された共生の状況において、微生物叢の機能は、失われるか、又は乱され、病原体に対する感受性の増加、代謝プロファイルの変更、又は局所若しくは全身性の炎症又は自己免疫をもたらし得る炎症誘発性シグナルの誘導をもたらし得る。そのため、微生物フローラ、特に、腸内細菌叢は、様々な腸の病原性感染症を含むが、これらに限定されない多くの疾患及び障害の病因に重要な役割を果たしている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
腸内菌共生バランス失調、肥満、感染症、大腸炎、炎症性腸疾患（クローン病など）、自己免疫疾患としての慢性障害を含む様々な疾患を治療又は予防するための、及び癌免疫療法のための組成物並びに方法に対する継続的な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、微生物叢の元の集団と高い類似性を有する複数の細菌属の組成物に関する。
【発明の効果】
【０００６】
一態様によれば、本発明は、異なる成長及び／又は増殖の条件を有する少なくとも２つの別個の科の細菌の共培養物を含む合成組成物を提供する。
【０００７】
別の態様によれば、本発明は、複数の細菌属及び複数の粒子を含む合成組成物であって、複数の細菌属が、（ｉ）異なる成長及び／又は増殖の条件を有する少なくとも２つの別個の科の細菌の共培養物であり、かつ（ｉｉ）微生物叢集団と少なくとも３０％の類似性を有する合成組成物を提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、複数の細菌属の少なくとも一部は、微生物叢集団に由来する。いくつかの実施形態によれば、該微生物叢集団は、所定の目的微生物叢集団である。
【０００９】
いくつかの実施形態によれば、該組成物は、少なくとも１種又はサブセットの好気性細菌及び少なくとも１種又はサブセットの嫌気性細菌を含む。いくつかの実施形態によれば、該組成物は、バイオフィルムの形態の細菌の少なくとも１種の細菌サブセット及び浮遊性細菌の少なくとも１種の細菌サブセットを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態によれば、該組成物は、所定の目的微生物叢集団と少なくとも３０％の類似性を有する複数の細菌属を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、該組成物は、元の微生物叢集団と少なくとも３０％の類似性を有する複数の細菌属を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、該微生物叢集団は、腸微生物叢、唾液微生物叢、皮膚微生物叢、口腔微生物叢、気管支微生物叢、膣微生物叢、土壌微生物叢、又はそれらの混合物からなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、複数の細菌属は、糞便試料、唾液試料、皮膚試料、口腔試料、気管支試料、膣試料、土壌試料、又はそれらの混合物からなる群から選択される１以上の試料に由来する。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、該微生物叢集団は、少なくとも１種の起源に由来する。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、複数の細菌属は、１以上の健康な哺乳類、動物ドナー、細菌株、保存された微生物叢試料、細菌コロニー、浮遊性試料及びバイオフィルムに由来する。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、該組成物はさらに、複数の粒子を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態によれば、各粒子は、少なくとも２つの別個の科の細菌の共培養物を含む。
【００１８】
別の態様によれば、本明細書に記載の組成物及び医薬として許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、医薬として許容される担体又は賦形剤は、安定剤、防腐剤、キレート剤、粘度改質剤、緩衝剤、及びｐＨ調整剤のうちの１以上から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、該医薬組成物は、直腸、静脈内、非経口、粘膜、経鼻又は経口投与用に製剤化される。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、該医薬は、腸内菌共生バランス失調の治療に使用するためのものである。
【００２２】
別の態様によれば、それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法であって、本明細書に記載の組成物を該対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態によれば、前記疾患又は障害は腸内菌共生バランス失調である。
【００２３】
別の態様によれば、異なる成長及び／又は増殖の条件を有する少なくとも２つの別個の科の細菌の共培養物を含む組成物を取得するための方法であって、
ａ．少なくとも１種の起源からの微生物叢を含む複数の細菌属を提供する工程；
ｂ．前記複数の細菌属を懸濁し、細菌属溶液を得る工程；
ｃ．複数の細菌属溶液を濾過し、それによって複数の細菌属溶液を含む濾液を取得する工程；
ｄ．複数の粒子を有する濾液をインキュベートし、複数の細菌属を複数の粒子に付着させる工程；
ｅ．（ｄ）の複数の細菌属を複数の細菌溶液サブセットに分ける工程；
ｆ．成長培地中で、個々のサブセットの増殖に適する増殖条件下で各細菌溶液サブセットを培養する工程；
ｇ．成長培地を除去し、個々のサブセットを再び合わせる工程；
それによって、異なる成長及び／又は増殖の条件を有する少なくとも２つの別個の科の細菌の共培養物を含む組成物を取得する工程、を含む方法が提供される。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、増殖条件は、好気性、嫌気性、及び微好気性の条件からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、該増殖条件は、流動条件、振盪条件、及び静的条件から選択される。いくつかの実施形態によれば、該増殖条件は、湿潤条件及び低湿度条件から選択される。
【００２５】
特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び／又は科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を、本発明の実施形態の実施又は試験において使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を以下に記載する。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、必ずしも限定することを意図するものではない。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照しながら、ほんの一例として、本明細書に記載されている。これから特に詳細に図面を参照するが、示される詳細は、例であり、本発明の実施形態の例示的説明のためのものであることを強調する。この点において、図面と共に説明を利用すると、本発明の実施形態が実施され得る方法が当業者には明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】非限定的な例として、微生物叢組成物を取得するための工程を示すフローチャートである。
【図２】以下の条件で培養した細菌の相対的分布を示す：ボトル１．好気性液体糞便；ボトル２．好気性ＴＳＢ；ボトル３．好気性ＲＣＭ；ボトル４．好気性糞便濾液；ボトル５．嫌気液体糞便；ボトル６．嫌気性ＴＳＢ；ボトル７．嫌気性ＲＣＭ；ボトル８．嫌気性糞便濾液。結果は、各条件（ボトル）の微生物叢群集の１６ｓ  ｒＲＮＡの分析に基づく重み付けＵｎｉＦｒａｃ距離の主座標分析（ＰＣｏＡ）に基づいている。主座標で説明される変化の割合は、軸上に示されている。
【図３】元の土壌微生物叢と比較した異なる試料の類似性の割合を示す棒グラフである。
【図４】異なる条件で成長させた土壌微生物叢及びヒト口腔微生物叢の除歪対応分析（ｄｅｔｒｅｎｄｅｄ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＤＣＡ））序列化分析による細菌属を示すプロットである。
【図５】異なる条件で成長させた土壌微生物叢及びヒト口腔微生物叢からの細菌集団の多次元スケーリング（ＭＤＳ）序列化分析の結果を示すプロットである。
【図６】小規模でのラクトバチルス菌株及びビフィドバクテリウム菌株及びそれらの混合物の細菌成長を示す棒グラフである。
【図７】中規模でのラクトバチルス菌株及びビフィドバクテリウム菌株及びそれらの混合物の細菌成長を示す棒グラフである。
【図８】図８Ａ−図８Ｂ。異なる種類の接種物：バイオフィルムから剥離した細菌（図８Ａ）又はマトリックス接種物（図８Ｂ）に応じた細菌成長を示す棒グラフである。
【図９】細菌細胞計数による、中規模の条件での細菌の耐酸性を示す棒グラフである。
【図１０】細菌細胞計数による、様々な濃度のカルベニシリン中の抗生物質に対する細菌株の耐性を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、複数の細菌属を含む組成物及びその使用方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、微生物フローラに高い類似性を有する複数の細菌属を含む。
【００２９】
さらなる実施形態において、本発明は、細菌属の共培養物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、細菌属の共培養物は、微生物フローラに高い類似性を有する。
【００３０】
本明細書で使用する用語「微生物叢」又は「微生物フローラ」は、環境ニッチ内に見られるか、構成するか、又は存在することが知られている細菌、酵母などの真菌を含むが、これらに限定されない微生物の集合を指す。いくつかの実施形態において、該微生物フローラは、健常対象の環境ニッチに見られるか、又は存在することが知られている微生物の集合である。環境ニッチの非限定的な例としては、腸、皮膚、唾液、口腔及び上気道及び尿生殖路が挙げられる。環境ニッチのさらなる非限定的な例としては、土壌、地下水、及びオープン水域が挙げられる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、該微生物フローラは共通の起源を有する（すなわち、類似の環境ニッチに由来する）。いくつかの実施形態において、該微生物フローラは、共通の目標を有する。本明細書に記載されるように、本発明の方法は、様々な細菌を取得し、目的の環境ニッチに高い同一性又は類似性を有する合成組成物を形成することができる。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、微生物叢の目的環境ニッチに少なくとも３０％の類似性を有する複数の細菌属を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、該組成物の細菌属は、共通の起源（例えば、所定の環境ニッチ）の微生物フローラ又は指定細菌の共培養物に似せるための、細菌の共培養物の合成アセンブリである。
【００３３】
一実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも２つの別個の細菌の共培養物を含む。別の実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０種の別個の細菌の共培養物を含む。一実施形態において、別個の細菌は、異なる科の細菌である。一実施形態において、別個の細菌は異なる属の細菌である。用語「別個の」は、異なる成長及び／又は増殖の条件を有する細菌を指す。一実施形態において、異なる成長及び／又は増殖の条件は、第１の条件が第１の細菌の実質的に最適な成長増殖及び培養を可能にし、第２の条件が第２の細菌の実質的に最適な成長増殖及び培養を可能にする少なくとも２つの最適条件である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明の細菌の共培養物は、少なくとも１種又はサブセットの好気性細菌を含む。いくつかの実施形態において、本発明の細菌の共培養物は、少なくとも１種又はサブセットの嫌気性細菌を含む。いくつかの実施形態において、本発明の細菌の共培養物は、少なくとも１種又はサブセットの好気性細菌及び少なくとも１種又はサブセットの嫌気性細菌を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本発明の細菌の共培養物は、バイオフィルムの形態の少なくとも１種又はサブセットの細菌を含む。いくつかの実施形態において、本発明の細菌の共培養物は、少なくとも１種又はサブセットの浮遊性細菌を含む。いくつかの実施形態において、本発明の細菌の共培養物は、バイオフィルムの形態の少なくとも１種又はサブセットの細菌及び少なくとも１種又はサブセットの浮遊性細菌を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、共培養物の少なくとも一部は共生関係にある。
【００３７】
本明細書下記で実証されるように、本明細書に記載のプロセス下で形成された組成物は、腸内細菌属に高い類似性（例えば、一般的に知られている腸内細菌属と９０％超の類似性）を示した。さらに、本明細書に記載の組成物は、土壌細菌フローラに高い類似性（土壌試料と３０％超の類似性）を示した。さらに、本明細書に記載の組成物は、口腔細菌フローラに高い類似性（口腔試料と３０％超の類似性）を示した。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、合成組成物である。本明細書で使用する用語「合成」は、少なくとも２つの異なる成長培地及び増殖条件下で、インビトロで成長させた細菌組成物を指す。
【００３９】
いくつかの実施形態において、該微生物叢は腸微生物叢である。いくつかの実施形態において、該微生物叢は口腔微生物叢である。いくつかの実施形態において、該微生物叢は唾液から得られる。いくつかの実施形態において、該微生物叢は気管支微生物叢である。いくつかの実施形態において、該微生物叢は皮膚微生物叢である。いくつかの実施形態において、該微生物叢は膣微生物叢である。いくつかの実施形態において、該微生物叢は土壌微生物叢である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、対象（ヒトなど）に由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、糞便試料、唾液試料、口腔試料、気管支試料、皮膚試料、及び膣試料から選択される１以上の試料に由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、糞便試料に由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、唾液試料に由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、口腔試料に由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、気管支試料に由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、皮膚試料に由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、膣試料に由来する。
【００４１】
細菌属は、単一試料又は複数の試料に由来し得る。細菌属の少なくとも一部は、動物以外の試料に由来し得る。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、土壌に由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、植物物質に由来する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、土壌微生物叢の組成物は農業用である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物及び農業上許容される担体が提供される。いくつかの実施形態において、土壌微生物叢の組成物は、所望の植物形質を増強するのに有用である。いくつかの実施形態において、土壌微生物叢の組成物は、植物成長の増強又は改善に有用である。いくつかの実施形態において、土壌微生物叢の組成物は、殺虫剤分解に有用である。いくつかの実施形態において、土壌微生物叢の組成物は、土壌の肥沃度を向上させる。いくつかの実施形態において、土壌微生物叢の組成物は、窒素循環における微生物の重要な役割により、窒素固定、脱窒及び硝化を媒介するために使用される。一実施形態において、複数の細菌属は、汚染されていない土壌又は水の試料から得られる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、該組成物は、それらの間の任意の値を含めて、環境ニッチと少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の類似性を含有する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、それらの間の任意の値を含めて、微生物叢の元の集団と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の類似性を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、該組成物は、それらの間の任意の値を含めて、目的の微生物叢集団と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の類似性を含有する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、該組成物は、腸微生物叢の集団と少なくとも７０％の類似性を含有する。表８は、腸微生物叢の非限定的な例を示している。
【００４７】
いくつかの実施形態において、該組成物は、土壌微生物叢の集団と少なくとも２５％の類似性を含有する。いくつかの実施形態において、該組成物は、土壌微生物叢の集団と少なくとも３０％の類似性を含有する。表９は、腸微生物叢の非限定的な例を示している。
【００４８】
いくつかの実施形態において、該組成物は、唾液の微生物叢の集団と少なくとも２５％の類似性を含有する。いくつかの実施形態において、該組成物は、唾液の微生物叢の集団と少なくとも３０％の類似性を含有する。表１１は、腸微生物叢の非限定的な例を示している。
【００４９】
いくつかの実施形態において、該微生物叢集団は、少なくとも１種の起源に由来する。いくつかの実施形態において、該微生物叢集団は、複数の起源に由来する。いくつかの実施形態において、該微生物叢集団は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの起源に由来する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、該組成物は、それらの間の任意の値を含めて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０、１００の科の細菌を含む。いくつかの実施形態において、該微生物叢集団は、それらの間の任意の値を含めて、少なくとも２、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０、１００の細菌属を含む。いくつかの実施形態において、該組成物は、細菌属の少なくとも１種の集団を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、複数の所定の細菌株を含む。本明細書で使用する用語「所定」は、特定の必要性に応じて選択された細菌株を含むカスタムメイドの組成物を指す。本明細書に例示されるように、所定の細菌株を含む組成物は、様々な成長培地及び増殖条件を用いて微生物叢を培養することによって指定され得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、該組成物は、表８、９又は１１に記載されている微生物叢集団と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％の類似性を含有する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、複数の腸内細菌属の組成物は、表８に記載のものと少なくとも７０％の類似性を有する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、複数の土壌細菌科の組成物は、表９に記載のものと少なくとも３０％の類似性を有する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、複数の口腔細菌科の組成物は、表１１に記載のものと少なくとも３０％の類似性を有する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、該組成物は、アクチノバクテリア門、古細菌門、バクテロイデス門、デイノコッカス・テルムス門、フィルミクテス門、フソバクテリウム門、レンティスファエラ門、プロテオバクテリア門、シネルギステス門、テネリクテス門、及びウェルコミクロビウム門から選択される１以上の細菌の細菌共培養物を含む。
【００５７】
一実施形態において、複数の細菌属は、健康な哺乳類から得られる。一実施形態において、複数の細菌属は、動物ドナーから得られる。一実施形態において、該ドナーは、それらの健康状態及び栄養習慣についてスクリーニングされ得る。一実施形態において、複数の細菌属は細菌株に由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、保存された細菌株に由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、凍結細菌株に由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、凍結バイオフィルムに由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、凍結乾燥された細菌株に由来する。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、プロバイオティクス株である。
【００５８】
本明細書で使用する用語「プロバイオティクス」は、他の微生物、特に有益な特性を有するもの（腸内フローラのものなど）の成長を刺激することもできる有益な又は必要な細菌株を指す。一実施形態において、複数の細菌属は、保存された微生物叢試料に由来する。一実施形態において、複数の細菌属は、細菌コロニーに由来する。
【００５９】
一実施形態において、複数の細菌属の少なくとも一部は、バイオフィルムに由来する。一実施形態において、複数の細菌属の少なくとも一部は、浮遊性試料由来である。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物はさらに、複数の粒子を含む。いくつかの実施形態によれば、該粒子は、バイオフィルム形成のために適合されるか、構成されるか又はそれに適する。いくつかの実施形態によれば、複数の粒子は、種子（例えば、パッションフルーツ、ニゲラ及びザクロ種子）、粉砕種子、穀物、ベントナイト粘土粒子を含む粒子、砂粒子、白色粘土粒子、セルロース繊維を含む粒子、セルロース粒子（例えば、微結晶性セルロース（ＭＣＣ））、リン酸二カルシウム粒子（ＤＣＰ）、アガロースビーズ及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１以上の種の粒子を含む。一実施形態において、１以上の粒子は多孔質である。
【００６１】
いくつかの実施形態において、複数の粒子は合成足場である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、該種子は、ザクロ種子、及びパッションフルーツの種子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、種子は破砕される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が５ミクロン〜１ｃｍの範囲にある。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が５ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が１０ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が１５ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が２０ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が３０ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が４０ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が５０ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が６０ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が７０ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が８０ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が９０ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が１００ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が２００ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が３００ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が４００ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が５００ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が６００ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が７００ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が８００ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が９００ミクロンである。いくつかの実施形態において、該粒子は、直径が１ｃｍである。
【００６４】
図１を参照して、非限定的な例として、本発明の組成物を得るための方法を説明する。まず、複数の細菌属（例えば、少なくとも１種の目的又は元の集団からの微生物叢）を含む試料を提供する（工程２００）。その後、複数の細菌属を懸濁し、細菌属溶液を得る（工程２２０）。細菌試料を、依然として細菌の自然環境を維持し、少なくとも１種の細菌の成長に適するＰＢＳなどの任意の溶液で希釈することができる。希釈は、１ｇ試料：１ｍＬ溶液−１ｇ試料−１０Ｌ溶液、１ｇ試料：１０ｍＬ溶液−１ｇ試料−５Ｌ溶液、又は１ｇ試料：１０ｍＬ溶液−１ｇ試料−１Ｌ溶液などの少なくとも１種の細菌属の成長に適する任意の範囲であり得る。
【００６５】
微生物叢を含む複数の細菌属を含有する濾液を得るために、複数の細菌属溶液を濾過することができる（工程２４０）。濾液は、複数の細菌属の少なくとも一部が複数の粒子に付着するのを可能にする条件下で、複数の粒子と共にインキュベートすることができる（工程２６０）。
【００６６】
その後、複数の粒子に付着した複数の細菌属を、（バイオフィルムの成長を誘導するために）複数の粒子のサブセットに分ける（工程２８０）。あるいは、少なくとも１種のサブセットは、（浮遊性細菌の成長を誘導するために）粒子を欠く（工程２２０又は２４０の）細菌溶液から採取される。その後、培養工程が続き、それぞれの個々のサブセットは、第一の期間、個々のサブセットに特有の成長培地及び増殖条件で培養する（工程３００）；その後、最初の培地を除去し、第２の培養工程を続けてよく、個々のサブセットを、第２の期間、成長培地及び増殖条件で培養する（工程３２０）；その後、第２の成長培地を除去し、個々のサブセットを組み合わせて、本発明の組成物を形成する（工程３４０）。
【００６７】
いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、好気性条件を含む（酸素の存在）。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、嫌気性条件を含む（遊離酸素又は結合酸素の不在）。
【００６８】
いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は微好気性条件を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、エアリフト発酵槽を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、バイオフィルムの成長条件を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は静的条件を含む（細菌に作用するいかなる剪断力も存在しないように、振盪せず、培地の流れなし）。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、浮遊性成長条件を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、流動条件を含む（付着細菌が剪断力に供されるように、表面に付着した細菌に関連して培地が流れる）。
【００７０】
いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４又は少なくとも１５ｍｌ／時の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、最大３０、最大２５、最大２０、最大１９、最大１８、最大１７、最大１６、最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１又は最大１０ｍｌ／時の流速を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約５〜約１０ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約６〜約１０ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約７〜約１０ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約８〜約１０ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約６〜約１２ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約７〜約１２ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約８〜約１２ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約９〜約１２ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１０〜約１２ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１０〜約１４ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１１〜約１４ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１２〜約１４ｍｌ／時間の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１２〜約１５ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１５〜約２０ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１５〜約１８ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１７〜約２０ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約２０〜約２３ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約２２〜約２５ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約２５〜約３０ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１０〜約２０ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約５〜約１５ｍｌ／時の範囲の流速を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１５〜約３０ｍｌ／時の範囲の流速を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、振盪条件を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、傾斜シェーカーによる振盪を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約８０、９０、１００、１２０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｒｐｍ、又はそれらの間の任意の値での振盪を含む。一実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１００ｒｐｍでの振盪を含む。一実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１５０ｒｐｍでの振盪を含む。一実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約１８０ｒｐｍでの振盪を含む。一実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約２３０ｒｐｍでの振盪を含む。一実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約２４０ｒｐｍでの振盪を含む。一実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約２５０ｒｐｍでの振盪を含む。一実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約２６０ｒｐｍでの振盪を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約３０分間の振盪を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、１、２、３、４、５、６、１０、１２、１５時間、又はそれらの間の任意の値の時間の振盪を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、一晩の振盪を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、１、２、３、４、５、６、７、１０日間の振盪を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、１日間の振盪を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、４日間の振盪を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、７日間の振盪を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、増殖条件のインキュベーション時間は、１、２、３、４、５、６、１０、１２、１５時間、又はそれらの間の任意の値である。いくつかの実施形態において、増殖条件のインキュベーション時間は一晩である。いくつかの実施形態において、増殖条件のインキュベーション時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０日である。いくつかの実施形態において、増殖条件のインキュベーション時間は、最大２、３、４、５、６、７、１０日である。いくつかの実施形態において、増殖条件のインキュベーション時間は、少なくとも１日である。いくつかの実施形態において、増殖条件のインキュベーション時間は、少なくとも４日間である。いくつかの実施形態において、増殖条件のインキュベーション時間は、少なくとも７日間である。
【００７５】
いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、元の組織で知られるｐＨ勾配を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約６．６〜約７．５又はそれらの間の任意の値の範囲のｐＨを含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約５．６〜約７．９又はそれらの間の任意の値の範囲のｐＨを含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約４．５〜約８又はそれらの間の任意の値の範囲のｐＨを含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約４．０〜約７．０又はそれらの間の任意の値の範囲のｐＨを含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約３．０〜約４．５又はそれらの間の任意の値の範囲のｐＨを含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約７．０〜約７．５又はそれらの間の任意の値の範囲のｐＨを含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約７．０〜約７．４又はそれらの間の任意の値の範囲のｐＨを含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、５．５超のｐＨを含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約３．０〜約１０．０又はそれらの間の任意の値の範囲のｐＨを含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、約５．５〜約７．５又はそれらの間の任意の値の範囲のｐＨを含む。
【００７６】
一実施形態において、複数の細菌属は、胃腸管におけるｐＨ依存性の目的放出用に構成されている。一実施形態において、該組成物は、腸内で見出されるｐＨで少なくとも１種の細菌株を放出するように構成されている。
【００７７】
いくつかの実施形態において、該組成物は、投与後少なくとも５日間、毎日、１グラム当たり少なくとも約２×１０２〜約２×１０１０細菌の範囲で腸内にコロニー形成することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、哺乳類の微生物叢のための少なくとも１つの増殖条件は、約３０℃〜約４０℃又はそれらの間の任意の値の範囲の温度である。いくつかの実施形態において、土壌微生物叢のための少なくとも１つの増殖条件は、約１５℃〜約２５℃又はそれらの間の任意の値の範囲の温度である。いくつかの実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約１５℃〜約２０℃又はそれらの間の任意の値の範囲の温度を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約２０℃〜約３０℃又はそれらの間の任意の値の範囲の温度を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約３０℃〜約３７℃又はそれらの間の任意の値の範囲の温度を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約４０℃〜約５５℃又はそれらの間の任意の値の範囲の温度を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約５０℃〜約６０℃又はそれらの間の任意の値の範囲の温度を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約５℃〜約３７℃又はそれらの間の任意の値の範囲の温度を含む。いくつかの実施形態において、土壌微生物叢のための増殖条件は、約３０℃〜約７５℃又はそれらの間の任意の値の範囲の温度である。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約３０℃の温度を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約３７℃の温度を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、湿潤条件を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、低湿度条件を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、紫外線（ＵＶ）照射を含む。いくつかの実施形態において、単一サブセットのための少なくとも１つの増殖条件は、２〜３％ｗ／ｖのような高ＮａＣｌ濃度の存在を含む。
【００８０】
一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、嫌気性条件を含む。用語「嫌気性条件」は、５ｐｐｍ（百万分の一部）未満の酸素、好ましくは０．５ｐｐｍ未満の酸素、より好ましくは０．１ｐｐｍ未満の酸素を含有する雰囲気を指す。任意の適切な方法は、所望の嫌気性条件又は雰囲気を提供するために使用することができる。
【００８１】
一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、静的及び嫌気性条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、静的及び好気性条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、流動及び嫌気性条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、流動及び好気性条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、６．６〜７．５の範囲のｐＨ並びに静的及び嫌気性条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、６．６〜７．５の範囲のｐＨ並びに流動及び嫌気性条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、６．６〜７．５の範囲のｐＨ並びに振盪及び嫌気性条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、６．６〜７．５の範囲のｐＨ並びに振盪及び好気性条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、振盪及び浮遊性成長条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、振盪及びバイオフィルム成長条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約３０℃での振盪及びバイオフィルム成長条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約３７℃での振盪及びバイオフィルム成長条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約３０℃での振盪及び浮遊性成長条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約３７℃での振盪及び浮遊性成長条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約１５〜２５℃での振盪及び浮遊性成長条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約１５〜２５℃での振盪及びバイオフィルム成長条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約３０℃での好気性及びバイオフィルム成長条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約３７℃での好気性及びバイオフィルム成長条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約３０℃での好気性及び浮遊性増殖条件を含む。一実施形態において、単一サブセットの増殖条件は、約３７℃での好気性及び浮遊性増殖条件を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、元の微生物叢は、不必要な固体の少なくとも一部を取り除くために、生理食塩水（工程２２０）に懸濁し、培養前に濾過することができる（工程２４０）。いくつかの実施形態において、元の微生物叢を含む試料は、病原体を除去するために滅菌することができる（工程２４０）。
【００８３】
いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、抗生物質、バクテリオファージ、競合細菌と共に培養するか、又はより多くの属がバイオフィルムとして成長するか若しくは他の特性の機能を強化できる特定の集団の成長を低下させる任意の他の方法を用いて培養することができる（図１の工程３００又は２６０）。いくつかの実施形態において、複数の細菌属は、ペニシリン、又は具体的には、カルボキシペニシリン（例えば、カルベニシリン）などの、ラクトバチルス・プランタラムに対する特異的抗生物質と培養することができる（図１の工程３００又は２６０）。当業者は、特定の細菌に対して使用される抗生物質の特定の種類及び用量を決定することができる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、それぞれの個々のサブセットへの成長培地及び増殖条件の変更は、繰り返し工程であり得る（図１の工程３４０：工程３２０及び３００）。いくつかの実施形態において、粒子の複数のサブセットを培養後に合わせる（図１の工程３６０）。いくつかの実施形態において、粒子の複数のサブセットは、特定の処方のために培養後に合わされない。
【００８５】
いくつかの実施形態において、該組成物はさらに、新たな培養のためのスターターなどの増殖工程（粒子の再接種）に供することができる（工程３８０）。いくつかの実施形態において、該組成物は凍結により保存される（工程３８０）。いくつかの実施形態において、該組成物は、凍結緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、該組成物は、凍結乾燥によって保存される（工程３８０）。いくつかの実施形態において、該組成物は、凍結乾燥のための乾燥緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、凍結乾燥のための乾燥緩衝液は、より長い貯蔵寿命及び輸送のために、例えば、１０％のショ糖、タンパク質、スキムミルク、マルトース、マンノースなど（非限定的）を含む。いくつかの実施形態において、該組成物は、患者への送達の前に、凍結又は粉末への凍結乾燥のいずれかの再構成、又は同等物のために合成液体と合わされる微生物叢を含む。
【００８６】
成長培地は、任意の公知の又は市販の成長培地であり得るか、又はそうでなければ、特定の細菌株の成長及び増殖を提供するために合成することができる。成長培地の非限定的な例としては、トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）、ロバートソンの調理肉、強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ）ブロス、栄養ブロス、溶原性ブロス（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ  ｂｒｏｔｈ（ＬＢ））、１／４  ＬＢ、ハートインフュージョンブロス、ウィルキンス−チャルグレンブロス、ブルセラブロス、小麦ふすま、ブレインハートインフュージョン寒天（ＢＨＩ１）、Ｍ９最少培地又は０．２Ｘ  ＢＨＩ、腸微生物叢培地（ＧＭＭ）、コロンビア血液寒天（ＣＢＡ）、チョコレート寒天（ＣＨＯＣ）、トリプシン大豆寒天（ＴＳＹ）、培養の難しい嫌気性菌用寒天（Ｆａｓｔｉｄｉｏｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｅ  ａｇａｒ（ＦＡＡ））、調理肉寒天（ＢＥＥＦ）、ビフィドバクテリウム選択培地（ＢＳＭ）、フェニルエチルアルコール寒天（ＰＥＡ）、放線菌分離寒天（ＡＩＡ）、コリスチンナラジキシン酸寒天（ＣＮＡ）、マッケイ寒天（ＭＫ）、マンニトールスラット寒天培地（ＭＳＡ）、ド・マンロゴサシャープ寒天（ｄｅ  ｍａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ  ａｇａｒ（ＭＲＳ））、バクテロイデス胆汁エスクリン寒天（ＢＢＥ）、デオキシコール酸寒天（ＤＯＣ）、マッコンキー寒天（ＭＡＣ）、及びカナマイシンバンコマイシン溶血血液寒天（ＫＶＬＢ）が挙げられる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、成長培地は、トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）、ロバートソンの調理肉、強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ）ブロス、栄養ブロス、溶原性ブロス（ＬＢ）、１／４  ＬＢ、ハートインフュージョンブロス、ウィルキンス−チャルグレンブロス、ブルセラブロス、ブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ）、小麦ふすま、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、特定の成長培地は、特定の細菌属又は集団を濃縮するために、例えば、限定されないが、ラクトバチルスの濃縮のためのド・マンロゴサシャープ（ＭＲＳ）寒天を使用することができる。いくつかの実施形態において、成長培地には、乾燥させた生存不能バイオフィルムを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、成長培地はまた、表面への細菌の付着を促進するか、又はバイオフィルムの生成を促進する材料を含むことができる。いくつかの実施形態において、成長培地はまた、抗生物質のような細菌増殖を低下させる材料、バクテリオファージ、競合細菌、又はより多くの属が成長できるように特定の集団を低下させる任意の他の方法を含むことができる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、該組成物は、患者において１又は２以上の病原細菌種の成長を防止する。一実施形態において、該組成物は、患者において１又は２以上の病原細菌種を死滅させる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本発明は、複数の細菌属から単離された細菌属の少なくとも１種の集団を含む組成物及び方法を提供する。当業者は、１６ｓリボソームＲＮＡの配列決定、又は特定のＤＮＡプローブの検出によって、本発明の組成物の細菌構成要素を決定することができる。
【００９１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種の起源からの微生物叢は、まず、ウイルス、及び寄生虫などの生物学的ハザードのために処理される。
【００９２】
本発明の実施形態の別の態様によれば、その実施形態の医薬組成物及び医薬として許容される担体が提供される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、該組成物は、それを必要とする対象における本明細書全体に記載の任意の疾患、病状、又は障害に関連する病状を治療するために投与することができる。いくつかの実施形態において、該組成物は、それ自体又は医薬組成物の一部として提供することができる。いくつかの実施形態において、本発明は、該組成物を投与することによって疾患又は障害を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、該組成物は、限定されないが、炎症性腸疾患、慢性疲労症候群、小腸細菌異常増殖症候群、肥満、癌、細菌性膣炎、大腸炎、糖尿病、うつ病、及び便秘などの治療のために使用される。
【００９４】
本明細書で使用する「医薬組成物」は、生理学的に好適な担体及び賦形剤などの他の化学成分での本明細書に記載の組成物の調製物を指す。そのような担体は、該医薬組成物が患者による経口摂取用に、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、及び懸濁液などとして製剤化されるのを可能にする。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。本明細書において、用語「賦形剤」及び「医薬として許容される薬剤」は、互換的に使用され、限定されないが、安定剤、防腐剤、キレート剤、粘度改質剤、緩衝剤、及びｐＨ調整剤から選択される組成物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される少なくとも１種の不活性物質を指す。投与の適切な経路には、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸内、又は筋肉内、皮下、及び髄内注射を含む非経口送達、並びに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、心臓内、鼻腔内又は眼内注射が含まれ得る。一実施形態において、該組成物は、直腸投与用に製剤化される。一実施形態において、該組成物は、経口投与用に製剤化される。一実施形態において、該組成物は、局所投与用に製剤化される。一実施形態において、該組成物は、全身投与用に製剤化される。本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
【００９５】
概要
本明細書で使用される用語「約」は、±１０％を指す。
【００９６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」及びそれらの同根語は、「含むが、これに限定されない」を意味する。用語「からなる」は、「含み、かつこれに限定される」を意味する。用語「から本質的になる」は、組成物、方法又は構造がさらなる成分、工程及び／又は部分を含み得ることを意味するが、追加の成分、工程及び／又は部分は、特許請求の組成物、方法又は構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変えない場合に限る。
【００９７】
本明細書で使用する単語「例示的」は、「例、事例又は例示として役立つ」ことを意味する。「例示的」として記載される任意の実施形態は、必ずしも、他の実施形態よりも好ましい又は有利であると解釈されるべきではなく、かつ／又は他の実施形態からの特徴の組み込みを除外することではない。
【００９８】
本明細書で使用する単語「必要に応じて」は、「いくつかの実施形態で提供され、他の実施形態では提供されない」ことを意味する。本発明の任意の特定の実施形態は、そのような特徴が競合しない限り、複数の「任意の」特徴を含むことができる。
【００９９】
本明細書で使用する単数形「１つ（ａ」」、「１つ（ａｎ）」及び「その」は、特に文脈が明確に指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含む複数の化合物を含むことができる。
【０１００】
本出願を通して、本発明の様々な実施形態が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は、便宜及び簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲における柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解すべきである。したがって、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲並びにその範囲内の個々の数値を有すると考慮されるべきである。例えば、１〜６などの範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示される部分範囲並びにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、及び６を有すると考慮されるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。
【０１０１】
数値範囲が本明細書に示されているときはいつでも、示された範囲内の任意の引用された数字（分数又は整数）を含むことを意味する。第１の提示数と第２の提示数の「間の範囲（ｒａｎｇｉｎｇ）／範囲（ｒａｎｇｅ）」及び第１の提示数から第２の提示数までの「範囲（ｒａｎｇｉｎｇ）／範囲（ｒａｎｇｅ）」という語句は、本明細書で互換的に使用され、第１の提示数及び第２の提示数並びにその間の全ての小数及び整数を含むことを意味する。
【０１０２】
本明細書で使用する用語「方法」は、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の技術分野の専門家に知られる方法、手段、技術及び手順、又はそれらから容易に開発された方法、手段、技術及び手順を含むが、これらに限定されない所定の課題を達成するための方法、手段、技術及び手順を指す。
【０１０３】
本明細書で使用する用語「治療」は、状態の進行を抑止するか、実質的に抑制するか、遅らせるか若しくは逆転させる、状態の臨床的若しくは審美的症状を実質的に改善するか、又は状態の臨床的若しくは審美的症状の出現を実質的に防止することを含む。
【０１０４】
「Ａ、Ｂ、及びＣなどの少なくとも１つ」に類似の慣例が使用される場合において、一般的に、そのような構成は当業者がその慣例を理解する意味で示される（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ一緒に、ＡとＣ一緒に、ＢとＣ一緒に、及び／又はＡ、Ｂ、とＣ一緒になどを有するシステムを含むが、これらに限定されない）。明細書、特許請求の範囲、又は図面内に関わらず、２以上の代替用語を提示する実質的に任意の離接語及び／又は語句は、用語の１つ、用語のいずれか、又は両方の用語を含む可能性を企図することが理解されるべきであることが当業者にさらに理解される。例えば、語句「Ａ又はＢ」は、「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解される。
【０１０５】
明確にするために、別々の実施形態の文脈に記載されている本発明の特定の特徴はまた、単一実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔のために、単一実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴はまた、別々に又は任意の適切なサブコンビネーションで、又は本発明の任意の他の記載の実施形態において好適なものとして提供され得る。様々な実施形態の文脈で記載される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしに動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
【０１０６】
本明細書上記の及び以下の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例で実験的に裏付けられる。
【０１０７】
実施例
上記と共に、非限定的に本発明を説明する以下の実施例についてこれから言及する。
【０１０８】
実施例１
糞便由来の細菌の粒子上での培養
新鮮な糞便１００ｇを、ブレンダー中で６００ｍｌの生理食塩水と混合した。混合物を、ストレーナーを通して１回濾過し、次いで、ガーゼパッドを通してさらに２回濾過した。少量の濾液を−２０℃に維持した。等量のザクロ種子、パッションフルーツの種子及びリン酸二カルシウム（ＤＣＰ）ニゲラを含有する粒子混合物を調製した。
【０１０９】
混合物１０ｇを８本のボトルに入れ、それぞれは６０ｍｌの濾過した新鮮な糞便を含有していた。４本のボトル（ボトル１〜４）を、３７℃で、好気性条件でインキュベートし、残りの４本のボトル（ボトル５〜８）を７日間、３７℃で、嫌気性条件でインキュベートした。
【０１１０】
ボトル処理：
ボトル１及び５：
インキュベーションの７日後に、糞便液を取り出し、マトリックスを穏やかに２回洗浄した（２５ｍｌの滅菌ＰＢＳＸ１で１回及び２回目は１０ｍｌ）。ボトルを３０秒間、３回ボルテックスし、１６ｓリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列決定のために液体から試料を取得した。
【０１１１】
ボトル２及び６：
インキュベーションの７日後、６０ｍｌのトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）を添加し、ボトルをさらに７日インキュベートした。成長培地を取り出し、マトリックスを穏やかに２回洗浄した（２５ｍｌの滅菌ＰＢＳＸ１で１回及び２回目は１０ｍｌ）。ボトルを３０秒間、３回ボルテックスし、１６ｓリボソームＲＮＡ配列決定のために液体から試料を取得した。
【０１１２】
ボトル３及び７：
インキュベーションの７日後、６０ｍｌの強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ）ブロスを添加し、ボトルをさらに７日インキュベートした。成長培地を取り出し、マトリックスを穏やかに２回洗浄した（２５ｍｌの滅菌ＰＢＳＸ１で１回及び２回目は１０ｍｌ）。ボトルを３０秒間、３回ボルテックスし、１６ｓリボソームＲＮＡ配列決定のために液体から試料を取得した。
【０１１３】
ボトル４及び８：
インキュベーションの７日後、６０ｍｌの滅菌糞便（０．２μｍのフィルターを通して濾過した糞便濾液）ブロスを添加し、ボトルをさらに７日インキュベートした。成長培地を取り出し、マトリックスを穏やかに２回洗浄した（２５ｍｌの滅菌ＰＢＳＸ１で１回及び２回目は１０ｍｌ）。ボトルを３０秒間、３回ボルテックスし、１６ｓリボソームＲＮＡ配列決定のために液体から試料を取得した。
【０１１４】
配列決定のための調製：
各ボトルから２ｍｌ試料（第２の洗浄及びボルテックス後）を１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を除去し、１００μｌの滅菌ＰＢＳＸ１を試料に添加し、ＤＮＡを各試料から精製した。
【０１１５】
流れの中での細菌成長：
上記のプロトコルによる粒子を有する糞便細菌の静的成長後、嫌気性条件又は好気性条件下で７日間、１０〜１２ｍｌ／時の流速で、粒子をボトル１及び５から（上記の）成長培地の組み合わせを有するガラスカラムに移した。試料を採取し、ＰＢＳＸ１で洗浄し、配列決定した。
【０１１６】
出発物質（糞便試料）中及び本発明のいくつかの実施形態に従って培養した組成物中に存在するが、糞便試料中に存在する様々な系統レベルでの微生物の定量化を含む結果を、表１〜７に示す。
【０１１７】
表１：ストリンジェントな（４５コピーの最小値）カットオフで各成長条件に見出される微生物
【表１】
2019516750.tif 000003
2019516750.tif 000004
「＋」記号は、特定のボトル中の属の存在を表す。糞便中に存在していた３１の属のうち、２つの属だけが、いずれのボトルにも表れなかった。これは、様々なボトルの組み合わせ後に、元の糞便試料と９３％の類似性を示す。
【０１１８】
表２：緩めた（全ての結果）カットオフでの各成長条件に見出される微生物
【表２】
2019516750.tif 000005
2019516750.tif 000006
2019516750.tif 000007
「＋」記号は、特定のボトル中の属の存在を表す。元の糞便中に見られた６８の属のうち、４つの属だけが、いずれのボトルにも表れなかった。これは、元の糞便試料と９４％の類似性を示す。
【０１１９】
表３：それぞれ異なる条件で成長させた異なるボトル中の門の分布。数字は、ボトルの細菌集団内の特定の門の割合（％）を表す。
【表３】
2019516750.tif 000008
【０１２０】
表４：それぞれ異なる条件で成長させた異なるボトル中の綱の分布。数字は、ボトルの細菌集団内の特定の門の割合（％）を表す。
【表４】
2019516750.tif 000009
【０１２１】
表５：それぞれ異なる条件で成長させた異なるボトル中の目の分布。数字は、ボトルの細菌集団内の特定の門の割合（％）を表す。
【表５】
2019516750.tif 000010
【０１２２】
表６：それぞれ異なる条件で成長させた異なるボトル中の科の分布。数字は、ボトルの細菌集団内の特定の門の割合（％）を表す。
【表６】
2019516750.tif 000011
2019516750.tif 000012
【０１２３】
表７：それぞれ異なる条件で成長させた異なるボトル中の属の分布。数字は、ボトルの細菌集団内の特定の門の割合（％）を表す。
【表７】
2019516750.tif 000013
2019516750.tif 000014
【０１２４】
表８：典型的には、ヒト糞便試料中に見出される微生物の属及び門の代表的な例
【表８】
2019516750.tif 000015
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【０１２５】
実施例２
元の微生物叢として土壌を使用する粒子上でのバイオフィルム成長
新鮮な土壌試料を得て、混合した。その少量を配列決定（元の試料）に送った。残りをＰＢＳＸ１に混合し、２５ｍｌを試料チューブに移し、その中にはザクロ、パッションフルーツ、ＤＣＰ及びＭＣＣ粒子を含む２ｇの滅菌マトリックスが含まれていた。チューブを、一晩、１００ｒｐｍで振盪しながら、ＰＢＳＸ１中のバイオフィルムとして成長させた。インキュベーションの１日後に、試料の一部の配列を決定した（土壌バイオフィルム１−Ｂ１）。残りを、ブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ）、ＬＢ、１／４  ＬＢ及びブルセラブロスを含む４つの異なる合成成長培地（各チューブに１種）とインキュベートした。チューブを、１００ｒｐｍでの２時間の振盪を含めて、４日間、バイオフィルムとして成長させ、残りの時間では、チューブは静止状態にあった。成長培地を毎日交換した。チューブの全てからのバイオフィルムを再び合わせ、配列を決定した（土壌バイオフィルム５−Ｂ５）。
【０１２６】
対照として、土壌細菌を、マトリックスなしの浮遊性成長条件下で、チューブ中で成長させた。土壌細菌を有するチューブをＰＢＳＸ１に入れ、一晩、２３０ｒｐｍで振盪した。インキュベーションの１日後、少量の液体の配列を決定した（土壌浮遊性１−Ｐ１）。残りを遠心分離し、細菌ペレットをＢＨＩ、ＬＢ、１／４  ＬＢ及びブルセラブロスを含む４つの異なる合成成長培地に分けた。チューブを、２３０ｒｐｍで一定の振盪をさせながら、さらに４日間浮遊性条件で成長させた。成長培地を毎日交換した。チューブの全てからのバイオフィルムを再び合わせ、配列を決定した（土壌浮遊性５−Ｐ５）。
【０１２７】
結果
配列解析の結果を表９及び図３に示す。元の土壌微生物叢には、１５４種の科の細菌が含まれていた。Ｂ１バイオフィルム試料中で４３種の科の細菌が特定され、元の微生物叢と２８％の類似性があった。対応する浮遊性試料（Ｐ１）は、２５種の科の細菌を含有しており、元の微生物叢と１６％の類似性があった。
【０１２８】
土壌細菌は、一般的に３つの状態：活性、休眠及び非生存に分けられる。当技術によると、土壌中の活性のある細菌は、理想的な条件下で、約０．１〜約５０％変化する。したがって、試料が５０％活性細胞を有すると仮定すると、調整された類似率は、約５６％までの範囲である。
【０１２９】
【表９】
2019516750.tif 000019
2019516750.tif 000020
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【０１３０】
序列化分析を、細菌の科の類似性を比較するために行った。除歪対応分析（ＤＣＡ）は、データの豊富な生態系のデータセットで使用するために特化した多変量序列化モデルである。ＤＣＡ分析は、図４に示す浮遊性試料と比較して、より高い存在量で、かつマトリックス成長試料中の元の土壌微生物叢とより高い類似性を示した。異なる類似性又は距離の指標に基づいて、元の土壌微生物叢と他の試料との間の類似比較を行った。ブレイ・カーティス及びシンプソンの指数において、インデックス値が１に近い場合は、２つの試料はより近接している。ユークリッド距離において、小さな指数値はより近い近接を示す。この分析の結果を表１０に示す。
【０１３１】
表１０．土壌データ解析から得られる類似性／距離の指標
【表１０】
2019516750.tif 000024
【０１３２】
これらの結果は、分析試料の距離行列に基づく、非メトリック多次元スケーリング（ＭＤＳ）などの他の序列化分析モデルによって支持される。ＭＤＳ分析は、データの性質に応じて異なる類似性指数を用いて行うことができる。ＭＤＳ分析は、試料中に存在する種の数を考慮するシンプソン類似指数（ＯＴＵ）、及びそれぞれの種の相対存在量に基づく。この分析はまた、図５に示すように、浮遊性試料と比較してより高い存在量で、かつマトリックス成長させた試料中の元の微生物叢とより高い類似性を明らかにする。
【０１３３】
マトリックス成長試料と浮遊性成長試料を合わせることにより、供給源とのより高い類似率を含む組成物を生成することが可能である。この実験で、マトリックス成長試料中に存在する細菌の科と浮遊性成長試料中に存在する細菌の科を合わせると、供給源と４０％類似性のある組成物が得られた。
【０１３４】
土壌試料（土壌Ｐ１、Ｐ５及びＢ５）の一部において、１種の属は、実質的に他の属よりも豊富である。例えば、Ｂ５試料中のクレブシエラ属の相対的存在量は３８％であった。共培養物中の異なる株が供給源に対して互いに競合しているため、特定の属又は科の割合を減少させると、より豊かな多様性を可能にすることができる。抗生物質、バクテリオファージ、競合細菌を使用するか、又はより多くの属が試料中で成長するのを可能にするために特定集団を低減する任意の他の方法を使用することは、任意選択である。
【０１３５】
実施例３
元の微生物叢としてヒト口腔微生物叢を使用する粒子上でのバイオフィルム成長
ヒトの口から５つのスワブを採取し、１つを直ちに配列決定に送り（元の試料）、他の４つを、ザクロ、パッションフルーツ、ＤＣＰ及びＭＣＣ粒子の２ｇの滅菌マトリックス並びにＢＨＩ、ＬＢ、１／４  ＬＢ及びブルセラブロスを含む４つの異なる成長培地（各チューブに１種）を含有する異なるチューブにそれぞれ入れた。これらのチューブを、１００ｒｐｍでの振盪条件で一晩置いた。翌日、培地を新しいものにし、チューブをさらに４日間、バイオフィルムとして増殖させた。次いで、全ての試料からのバイオフィルムを有するマトリックスを合わせ、配列を決定した。
【０１３６】
口腔スワブ試料の配列解析により、４９種の細菌の科を特定した。これらのうち、表１１に詳述するように、成長バイオフィルム試料において元の微生物叢と３５％の類似性に達する１７種の科の細菌が特定された。
【０１３７】
表１１．元の微生物叢と比較したバイオフィルム成長培養物中で特定された細菌の科
【表１１】
2019516750.tif 000025
2019516750.tif 000026
【０１３８】
実施例４
元の微生物叢として凍結試料を用いた粒子上でのバイオフィルム成長
スケールアッププロセスの可能性を調べるために、細菌群集を土壌微生物叢及び口腔微生物叢（実施例２及び３）から、並びに個々の菌株又は２種の既知の株の混合物から得た。
【０１３９】
１週間、−２０℃で保存した土壌微生物叢及び口腔微生物叢の試料中の細菌の生存率を調べた。これを、解凍し、二重に、ＬＢ、ＭＲＳ、ＲＣＭ、ブルセラの異なる寒天培地へ３μＬの希釈物をプレーティングすることによって行った。プレートを、好気性と嫌気性条件下で、室温でインキュベートした。ストックからＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びＢ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）を、それぞれＭＲＳ及びＲＣＭ寒天プレートにプレーティングし、嫌気性フード内で、３７℃でインキュベートした。次の日に、細菌成長をプレート上で調べた。プレートを、室温で嫌気性及び好気性条件で、週末の間インキュベートした。Ｌ．プランタラム及びＢ．ロンガムのいくつかの小さなコロニーを、それぞれＭＲＳ及びＲＣＭブロスに添加した。Ｌ．プランタラムを、好気性条件で、３７℃で一晩インキュベートし、１８０ｒｐｍで振盪した。Ｂ．ロンガムを嫌気性フード内で、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、各株（Ｌ．プランタラム及びＢ．ロンガム）の光学密度（ＯＤ）を測定し、表１２に従って、新しい滅菌チューブにおいて最終ＯＤが０．１になるように各株の希釈を行った。
【０１４０】
表１２．細菌及び小規模マトリックスに対する増殖条件
【表１２】
2019516750.tif 000027
2019516750.tif 000028
【０１４１】
試料を、２時間、３０℃で、１００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。２時間後、チューブをそれぞれの増殖条件（表１２による）に移した。
【０１４２】
土壌及び口腔の微生物叢の培養体積のスケールアップのために、各試料の１本のチューブを、２分間、５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、チューブ当たり１０ｍｌのＰＢＳＸ１を添加した。チューブを、インキュベーター内で１分間、１００ｒｐｍで穏やかに混合した。各試料は８０μｍの真空フィルターを通して移した。３つの試料からのマトリックスを合わせ、ＤＮＡ配列決定分析に送った。
【０１４３】
培養体積のスケールアップのための別の手法を、新たなマトリックスに解凍したマトリックス粒子を移すことによって試験した。各Ｌ．プランタラム及びＢ．ロンガム試料の１本のチューブを、２分間、５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、チューブ当たり１０ｍｌのＰＢＳＸ１を添加した。チューブを、インキュベーター内で１分間、１００ｒｐｍで穏やかに混合した。各試料を８０μｍの真空フィルターを通して移した。最後に、１ｇのマトリックス粒子を、新しいマトリックスボトルに移した。さらに、培養体積のスケールアップのための別のアプローチを、Ｌ．プランタラム及びＢ．ロンガム試料のバイオフィルム剥離細菌を移すことによって試験した。各試料の１本のチューブを、２分間、５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、試料を１０ｍｌのＰＢＳＸ１で一回洗浄し、濾過した。１ｍｌのＲＣＭブロスを添加し、試料を３０秒間、高速で３回ボルテックスした。上清を新しいマトリックスに移した。
【０１４４】
Ｌ．プランタラム及びＢ．ロンガム試料のみの定量及び耐酸性のために、各試料の培地を除去し、チューブ当たり１０ｍｌのＰＢＳＸ１を添加し、１分間、１００ｒｐｍでインキュベーターにより穏やかに混合した。試料を、８０μｍの真空フィルターに移し、濾過後に十分に混合した。ｐＨ２での耐酸性を、各試料にｐＨ２の溶液５ｍｌを添加することにより試験した。細胞を室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を５ｍｌのＰＢＳＸ１で１回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳＸ１を添加した後、高速で３０秒間３回、ボルテックスした。ｐＨ７での耐酸性を、各試料にｐＨ７の溶液５ｍｌを添加することにより試験した。細胞を室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を５ｍｌのＰＢＳＸ１で１回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳＸ１を添加した後、高速で３０秒間、３回ボルテックスした。長いインキュベーションについては、（対照チューブを含む）残りのチューブを、表１２で指定した条件に従ってインキュベートした。
【０１４５】
土壌及び口腔の微生物叢の細菌成長が、好気性及び嫌気性増殖条件で行った各希釈での異なる培地中で観察された。土壌マトリックス及び土壌浮遊源で観察された細菌成長は、口腔試料で観察されたものよりも高かった（土壌試料中の平均４００コロニー超／プレート対口腔試料中の１１０個のコロニー）。一般に、移行に関して、結果は、小規模マトリックスから中規模マトリックスに良好な移行を示した。小規模でのインキュベーションの２４時間後に得られた細菌の量を図６にまとめる。インキュベート後、小規模マトリックスからの接種物を中規模マトリックスに移し、図７に示すように平均の細菌成長が改善された。興味深いことに、ラクトバチルス及びビフィドバクテリウムを一緒に接種した時に、細菌の著しい成長が中規模で観察された。加えて、細菌移行を２種類の接種物：バイオフィルム又はバイオフィルムマトリックスから剥離した細菌に応じて評価した。結果は、図８に示されているように、マトリックス接種物はビフィドバクテリウムの成長に有利であり得ることを示している。
【０１４６】
図９に中規模の条件での耐酸性及び細菌生存率を示した。ここに示されているように、細菌細胞計数はｐＨ７又はｐＨ２で非常に類似している。これらの結果は、以前の結果と一致しており、バイオフィルムとして細菌のより高いｐＨ耐性を示唆している。中規模プロセスを細菌剥離接種物から始めたときに、有意差は耐酸性試験では観察されなかった。
【０１４７】
実施例５
Ｌ．プランタラム株を新鮮なプレートから採取し、２５ｍｌのＭＲＳブロス中で４８時間、３７℃で成長させた。１５ｍｌを小麦ふすまチューブに移し、７ｍｌをザクロ種子チューブに移し、３日間インキュベートした。表１３は１ｇ当たりの細菌細胞計数を示す。
【０１４８】
【表１３】
2019516750.tif 000029
【０１４９】
実施例６
抗生物質耐性
Ｌ．プランタラム株を、２５％ＭＲＳブロス及び８０ｇのＤＣＰ粒子２００ｍｌ中で、３７℃で成長させた。ボトルのキャップは、ボトルの底まで届く２本のシリコーンチューブを有していた。ボトルからのチューブの１本を、シリコーンチューブ用の２つの外出を有するキャップと２リットルのＰＶＣボトルと接続させた。ＰＶＣボトルを１５００ｍｌの２５％ＭＲＳで充填した。ボトルを２時間、静止条件下でインキュベートした。次いで、それを６日間、１５ｒｐｍ、傾斜シェーカー上で、流動条件でインキュベートした。抗生物質耐性を試験するために異なる濃度のカルベニシリン：０、１、２、４、８、１６、３２、６４、１２８及び２５６μｇ／ｍｌを添加し、静的条件下で、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１５０】
結果
図１０は、４μｇ／ｍｌのカルベニシリンからのＬ．プランタラム株の成長阻害を示す。
【０１５１】
本発明は、その特定の実施形態に関連して説明してきたが、多くの代替、変更及び変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内に入る全てのそのような代替物、改変及び変形を包含することが意図される。
【０１５２】
各個々の刊行物、特許又は特許出願が、具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれることが示されるのと同程度に、本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。加えて、本出願におけるいずれかの参考文献の引用又は識別は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。節の見出しが使用される程度まで、それらは必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。
【図１】
2019516750.tif 000030
【図２】
2019516750.tif 000031
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019516750.tif 000035
【図７】
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【図８】
2019516750.tif 000037
【図９】
2019516750.tif 000038
【図１０】
2019516750.tif 000039
【国際調査報告】
2019516750.tif 000040
2019516750.tif 000041
2019516750.tif 000042
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