(57)【要約】  本発明は、コアと、その表面に結合されたシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体を含む結合体、及びその用途に関するものである。本発明にて提供される結合体は、インフルエンザウィルスの表面に存在するヘマグルチニンと結合して、インフルエンザウィルスの感染過程を抑制することにより、インフルエンザウィルス感染症を予防または治療することができるのみならず、抗ウィルス製剤に対して耐性を示すインフルエンザウィルスに対しても、その感染症を予防または治療することができるので、インフルエンザウィルス感染症の予防または治療用製剤の開発に広く活用されることができる。
2019529527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コア（core）と、その表面に結合されたシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体を含み、前記シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体は、互いに同一の間隔で配列されたことを特徴とする、結合体。
【請求項２】
前記コアは、ポリアミドアミン、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリジン、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンフマレート、ポリジオキサノン、ポリヌクレオチド、これらの共重合体、及びこれらの組み合わせで構成された群から選択される物質で構成された、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記コアは、デンドリマーである、請求項１に記載の結合体。
【請求項４】
前記コアは、3.0ないし6.0nmの直径を有する、請求項１に記載の結合体。
【請求項５】
前記コアは、3.5ないし5.5nmの直径を有する、請求項１に記載の結合体。
【請求項６】
前記コアは、4.0ないし6.0nmの直径を有する、請求項１に記載の結合体。
【請求項７】
前記コアは、4.5ないし5.4nmの直径を有する、請求項１に記載の結合体。
【請求項８】
前記シアル酸誘導体は、シアリルオリゴ糖（sialyloligosaccharide）である、請求項１に記載の結合体。
【請求項９】
前記シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体は、3'-シアリルラクトース（3'-Sialyllactose）、6'-シアリルラクトース（6'-Sialyllactose）、シアリルラクト-N-テトラオース(sialyllacto-N-tetraose）、ジシアリルラクト-N-テトラオース（disialyllacto-N-tetraose）、及びこれらの組み合わせで構成された群から選択される化合物である、請求項１に記載の結合体。
【請求項１０】
前記シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体は、コアの反応器と結合するか、又はリンカーを介してコアと結合する、請求項１に記載の結合体。
【請求項１１】
前記シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体は、1.0ないし4.0nmの間隔で配列されている、請求項１に記載の結合体。
【請求項１２】
前記シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体は、1.6ないし3.5nmの間隔で配列されている、請求項１に記載の結合体。
【請求項１３】
前記シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体は、2.0ないし3.1nmの間隔で配列されている、請求項１に記載の結合体。
【請求項１４】
第1項ないし第13項のいずれか1つに記載の結合体を含む、インフルエンザウィルス感染症の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１５】
第1項ないし第13項のいずれか1つに記載の結合体を含む、インフルエンザウィルス感染症の予防または改善用食品組成物。
【請求項１６】
第1項ないし第13項のいずれか1つに記載の結合体を、インフルエンザウィルスの感染が疑われるか、又はインフルエンザウィルスに感染した個体に投与する段階を含める、インフルエンザウィルス感染症を予防または治療する方法。
【請求項１７】
前記インフルエンザウィルスは、インフルエンザAウィルス、又はインフルエンザBウィルスである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記結合体は、インフルエンザウィルスのヘマグルチニン（hemagglutinin、HA）と結合して、前記ウィルスの感染を抑制する、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
第1項ないし第13項のいずれか1つに記載の結合体を、インフルエンザウィルスに処理する段階を含める、インフルエンザウィルスの感染を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コアとその表面に結合されたシアル酸、シアリルラクトース又はこれらの誘導体を含む結合体とその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウィルス（Influenza  virus）は、オルトミクソ系統（FamilyOrthomyxoviridae）に属するRNAウィルスであり、血清型は、A型、B型、C型などの3つの型に区分される。そのうち、B型とC型は人においてのみ感染が確認されており、A型は、人、馬、豚、その他の哺乳類および様々な種類の家禽と野鳥での感染が確認されている。A型インフルエンザウィルスの血清型は、ウィルス表面の二つの蛋白質である血球凝集素（Hemagglutinin;HA）と、ノイラミニダーゼ（Neuraminidase：NA）の種類によって区分されるが、これまでに144種類（HA蛋白質の16種とNA蛋白質の9種）が知られている。HAは、ウィルスが体細胞に付着する役割を果たし、NAは、ウィルスが細胞の内に浸透することができるようにする。このようなインフルエンザウィルスは、毎年冬になると、新しい抗原性を持つインフルエンザウィルスが流行し、人を含めた家畜、鳥類を経てウィルスが流行し、これらのウィルスのモニタリングは非常に重要である。したがって、これによる特異性と敏感性の高いプライマーとプローブの開発が求められている。
【０００３】
最近の関心が集中されている新型インフルエンザA（H1N1）ウィルスは、「新型フルー」または「新型インフルエンザウィルス」とも呼ばれており、これは人、豚、鳥インフルエンザウィルスの遺伝物質が混合されている新しいタイプのウィルスであって、2009年4月に初めて発見された。ウィルスの感染経路については、未だに明確に明らかにされていないが、既存の季節性インフルエンザウィルスと同様に飛沫感染、すなわち感染した人の咳や、くしゃみなどを通じて、主に人から人へ、感染者と近い接触者の間（約2m以内）で伝播されることと知られている。また、食品の場合、70℃以上加熱調理すると食品に存在するウィルスが死滅することが知られている。
【０００４】
前記新型インフルエンザウィルスの潜伏期は、およそ1〜7日の間と推定され、症状としては、確定患者にて発熱、悪寒、頭痛、咳、咽喉の痛み、鼻水、呼吸困難などの上気道の症状、筋肉痛、関節痛、疲労感、嘔吐、または下痢などが現れると知られている。通常、症状が現れた日の前の日から症状が現れた日以降7日までに伝染力があると報告されており、子供の場合には、10日以上長くなることもある。前記新型インフルエンザウィルスの感染による被害を減らすために、新型インフルエンザウィルスの感染を早期に診断することができる方法を開発しようとする研究が活発に進められてきた。たとえば、韓国公開特許第2011-0064174号には、他種のインフルエンザウィルスを除く新型インフルエンザウィルスA/H1N1のみに対して特異的なモノクローナル抗体と、これを生産する融合細胞、前記モノクローナル抗体を含む診断キット、およびこれを用いた新型インフルエンザウィルスA/H1N1を診断する方法が開示されており、韓国公開特許第2011-0096940号には、新型インフルエンザウィルスのヘマグルチニン（HA）抗原に対する抗体を用いた迅速免疫クロマトグラフィー法を利用して、新型A型インフルエンザウィルス（Influenza  A、H1N1）を診断することができる診断キットが開示されており、韓国公開特許第2011-0127034号には、インフルエンザA型ウィルスを検出するための、インフルエンザA型ウィルスの共通のPCRプライマー及び、豚由来のインフルエンザ（新型インフルエンザ、A/Korea/01/2009（H1N1））ウィルス検出特異PCRプライマーを用いて新型インフルエンザ（A/Korea/01/2009（H1N1））ウィルスを迅速かつ正確に検出する方法が開示されている。
【０００５】
しかし、このようにウィルスの感染を診断するにしても、感染したインフルエンザウィルスを治療することができる製剤としては、オセルタミビル（Oseltamivir、商品名タミフル）、ザナミビル（Zanamivir、商品名リレンザ）などで過ぎず、これらの製剤を使用してもそれに対する耐性を有するウィルスが発見されることにより、前記ウィルスを治療する方法の開発は、依然として微々たる実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、インフルエンザウィルスの感染症を効果的に治療する方法を開発しようと鋭意研究努力した結果、コア（core）とその表面に結合されたシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体を含み、前記シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体は、互いに同一の間隔で配列されたことを特徴とする結合体を使用する場合、インフルエンザウィルスの感染症を治療することができるだけでなく、従来の抗ウィルス製剤に対して耐性を示すウィルスによる感染までも治療することができることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一の目的は、コアと、その表面に結合されたシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体を含み、前記シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体は、互いに同一の間隔で配列されたことを特徴とする結合体を提供するものである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記結合体を含むインフルエンザウィルス感染症の予防または治療用薬学組成物を提供するものである。
【０００９】
本発明の更なる目的は、前記結合体を含むインフルエンザウィルス感染症の予防又は改善用食品組成物を提供するものである。
【００１０】
本発明の更なる目的は、前記結合体をインフルエンザウィルスの感染が疑われるか、またはインフルエンザウィルスに感染された個体に投与する段階を含むインフルエンザウィルス感染症を予防または治療する方法を提供するものである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、前記結合体を、分離されたインフルエンザウィルスに処理する段階を含むインフルエンザウィルスの感染を抑制する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明で提供される結合体は、インフルエンザウィルスの表面に存在するヘマグルチニンと結合し、インフルエンザウィルスの感染過程を抑制することにより、インフルエンザウィルス感染症を予防または治療することができるのみならず、抗ウィルス製剤に対して耐性を示すインフルエンザウィルスに対してもその感染症を予防又は治療することができるので、インフルエンザウィルス感染症の予防又は治療用製剤の開発に広く活用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１ａ】図1aは、NaCNBH3を使用した、還元糖、6SL及びPAMAMデンドリマー（G2ないしG5）の1次アミノ基の還元性アミノ化を示す反応式である。
【図１ｂ】図1bは、6SL-PAMAM結合体の特性をMALDI-TOFMSの方法で分析した結果を示すグラフである。
【図１ｃ】図1cは、6SL-PAMAM結合体の特性を1H-NMRの方法で分析した結果を示すグラフである。
【図１ｄ】図1dは、本発明にて合成した様々な6SL-PAMAM結合体の構造を示す概略図である。
【図１ｅ】図1eは、S3-G4結合体の構造を分析した結果を示すが、左側はS3-G4結合体の具体的な構造を示す概略図であり、右側はそれを構成する各成分の1H-NMRスペクトルであり、上段は6SLを示し、中段はPAMAMデンドリマー（G4）を示し、下段はそれらの結合体（S3-G4）を示す。
【図２ａ】図2aは、本発明で合成した様々な6SL-PAMAM結合体のインフルエンザウィルス感染抑制効果を分析した結果を示すグラフである。
【図２ｂ】図2bは、リガンドの間隔に応じた6SL-PAMAM結合体のインフルエンザウィルスの感染抑制の効果を分析した結果を示すグラフである。
【図３ａ】図3aは、6SL-PAMAM結合体とHAの間の反応性を分析した結果であり、左側は6SL-PAMAM結合体とHAの相互作用を示すSPRセンサーグラムであり、右側はHAに対する6SL-PAMAM結合体の結合親和力（in  response  units、RU）を示すグラフである。
【図３ｂ】図3bは、HA三量体の構造を示す概略図であり、赤色の部分は6SLの結合部位を示し、黒い点線は、前記6SLの結合部位との間の間隔を示す。
【図３ｃ】図3cは、6SL-PAMAM結合体（S3-G4、又はS6-G4）と、HA三量体の結合部位との間の相互作用を示す概略図である。
【図４】図4は、6SL-PAMAM結合体（S3-G4）と、H1N1ウィルスとの間の結合特性を分析した結果を示すTEM写真であり、左側の上段は6SL-PAMAM結合体（S3-G4）を示し、右側の上段はH1N1ウィルスを示し、左側の下段はPAMAMデンドリマー（G4）とH1N1ウィルスとの反応の結果を示し、右側の下段は6SL-PAMAM結合体（S3-G4）H1N1ウィルスの反応の結果を示す。
【図５】図5は、単一染色されたウィルス（R18標識されたHIN1）と、二重染色されたウィルス（DiOC18及びR18標識されたH1N1）に対するS3-G4の効果を時間の経過に沿って測定した結果を示す蛍光顕微鏡の写真である。
【図６】図6は、H3N2ウィルス（A/Shandong/3/93）及び他の種類のH1N1（A/NWS/33、A/PuertoRico/8/43及びA/California/07/2009）に対するS3-G4の感染抑制の活性を示す蛍光顕微鏡の写真である。
【図７ａ】図7aは、マウスを感染したH1N1ウィルスの力価に及ぼすS3-G4結合体の効果を示すグラフである。
【図７ｂ】図7bは、H1N1ウィルスに感染されたマウスの肺組織の組織病理学的状態に及ぼすS3-G4結合体の効果を示す顕微鏡の写真である。
【図７ｃ】図7cは、H1N1ウィルスに感染されたマウスの肺組織おけるサイトカインの発現レベルに及ぼすS3-G4結合体の効果を示すグラフである。
【図７ｄ】図7dは、H1N1ウィルスに感染されたマウスの生存率に及ぼすS3-G4結合体の効果を示すグラフである。
【図７ｅ】図7eは、H1N1ウィルスに感染されたマウスの体重の変化に及ぼすS3-G4結合体の効果を示すグラフである。
【図８ａ】図8aは、抗ウィルス剤耐性H1N1ウィルスの感染に及ぼすS3-G4結合体の効果を示す蛍光顕微鏡の写真である。
【図８ｂ】図8bは、抗ウィルス剤耐性H1N1ウィルスに対するS3-G4結合体の感染抑制の活性を分析した結果を示すグラフである。
【図８ｃ】図8cは、抗ウィルス剤耐性H1N1ウィルスに対するS3-G4結合体の増殖抑制の活性を分析した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
前述した目的を達成するための一の実施様態として、本発明は、コア（core）、とその表面に結合されたシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体を含み、前記シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体は、互いに同一の間隔で配列されたことを特徴とする、結合体を提供する。
【００１５】
本発明の用語、「コア（core）」とは、シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体と結合し、前記シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体が互いに同一の間隔で配列されるようにする支持体としての役割を果たす物質を意味する。
【００１６】
本発明において、前記コアを構成する物質は、シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体と結合することができる反応器を含む限り、特に限定されないが、一例として、ポリアミドアミン（polyamidoamine、PAMAM）、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリジン、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンフマレート、ポリジオキサノン、ポリヌクレオチド、これらの共重合体を単独または組み合わせて使用することができる。
【００１７】
本発明において、前記コアは、その表面に複数のシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体が結合し、互いに同一の間隔で配列されるため、所定レベル以上の直径を有することが望ましい。前記コアの直径は、その表面に複数のシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体が結合し、互いに同一の間隔で配列され得る限り、特に限定されないが、一例として、3.0ないし6.0nmであっても良く、他の例としては、3.5ないし5.5nmであっても良く、また、別の例としては、4.0ないし6.0nmであっても良く、また、別の例としては、4.5ないし5.4nmであっても良い。
【００１８】
本発明にて提供される前記コアの形態は、特に限定されないが、一例として、前記コア構成物質の高分子体で構成される球状の形態になることができ、他の例としては、前記コア構成物質の線形の高分子体が多数の折りたたみ（folding）を通じて、重畳された形態になることもでき、別の例として、前記コア構成物質を基盤化合物として用いて形成されたデンドリマーの形態になることもできる。
【００１９】
本発明の一実施例では、前記コア構成物質に含まれている反応器が規則的に配列され、それに結合されたシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体が同一の間隔で配列することのできる、デンドリマーの形態のコアを製作した。
【００２０】
本発明の用語「デンドリマー（dendrimer）」とは、基盤の化合物がデンドロン（dendron）の形の分子鎖で重畳され球形の構造をなす巨大分子を意味するが、正確な分子量と構造を有するナノサイズの粒子の形成が容易で、最外殻に反応器を多数保有しているため、化学的または物理的に独特な特性を示し、表面の密集している末端器に様々な誘導体と反応器を導入することが可能である。特に、デンドリマーは、線形高分子の形態と比べて調整しやすく、構造の予測が容易であるため、様々な分野に適用することが可能である。
【００２１】
デンドリマーを形成する基盤化合物の重畳レベルに応じて、デンドリマーの世代を特定することができる。例えば、一つの基盤化合物が相互に結合されていない状態で重合された場合、第1世代デンドリマー（G1）と表現することができ、前記第1世代デンドリマーに含まれている基盤化合物の末端に1つの基盤化合物が追加的に結合された場合、第2世代デンドリマー（G2）と表現することができ、前記第2世代デンドリマーに含まれている基盤化合物の末端に1つの基盤化合物が追加的に結合された場合、第3世代デンドリマー（G3）と表現することができ、前記第3世代デンドリマーに含まれている基盤化合物の末端に1つの基盤化合物が追加的に結合された場合、第4世代デンドリマー（G4）と表現することができ、前記第4世代デンドリマーに含まれている基盤化合物の末端に1つの基盤化合物が追加的に結合された場合、第5世代デンドリマー（G5）と表現することができる。すなわち、基盤化合物が1つ追加的に結合されることにより世帯数が第1世代ずつ増加する。
【００２２】
本発明において、前記デンドリマーは、前述したコアを構成する物質を基盤化合物として用いられるが、前記基盤化合物は、表面に複数のシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体が結合して、互いに同一の間隔で配列することができるコアを形成することができる限り、特に限定されないが、一例として、ポリミドアミン、ポリリジン、ポリヌクレオチドなどであっても良いし、他の例としては、ポリミドアミンであっても良い。
【００２３】
本発明の用語「シアル酸（sialicacid）」とは、シアリン酸またはノイラミン酸とも呼ばれ、ピルビン酸と、マンノサミンとのアルドール縮合体であるノイラミン酸がn-アセチル化、n-グリコシル化、又はo-アセチル化された化学構造を有するアミノ糖の一種を意味する。
【００２４】
本発明において、前記シアル酸は、ウィルスのヘマグルチニン（HA）と結合して、その機能を抑制するリガンドとして用いられ、前記リガンドとしては、シアル酸のみならず、その誘導体を使用することもできる。
【００２５】
本発明の用語「誘導体（derivative）」とは、目的化合物の一部を化学的に変化させて得られる類似な化合物を意味するが、概して目的化合物の中の水素原子または特定の原子団が、他の原子又は原子団と置換された化合物もなり得る。
【００２６】
本発明において、前記誘導体は、シアル酸又はシアリルラクトースの誘導体として解釈され得るが、前記シアル酸又はシアリルラクトースの誘導体は、ウィルスのHAと結合し、その機能を抑制することができる限り、特に限定されないが、一例として、シアル酸に糖類が結合されたシアリルオリゴ糖であっても良いし、他の例としては、3'-シアリルラクトース（3'-Sialyllactose）、6'-シアリルラクトース（6'-Sialyllactose）、シアリルラクト-N-テトラオース(sialyllacto-N-tetraose）、ジシアリルラクト-N-テトラオース（disialyllacto-N-tetraose）などであっても良い。
【００２７】
本発明にて提供される結合体に含まれているシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体との間の間隔は、特に限定されないが、1.0nm以上であっても良く、1.2nm以上であっても良く、1.6nm以上であっても良く、1.9nm以上であっても良く、2.0nm以上であっても良く、2.1nm以上であっても良く、2.4nm以上であっても良く、3.1nm以上であっても良く、1.0ないし4.0nmであっても良いし、1.2ないし4.0nmであっても良いし、1.6ないし4.0nmであっても良いし、1.9ないし4.0nmであっても良いし、2.0ないし4.0nmであっても良いし、2.1ないし4.0nmであっても良いし、2.4ないし4.0nmであっても良いし、3.1ないし4.0nmであっても良い。
【００２８】
一つの例示として、ポリアミドアミンデンドリマーをコアとして含み、6'-シアリルラクトース（6SL）を前記コアに結合されるシアル酸誘導体として含む結合体の場合、前記6SLの間隔は、特に限定されないが、一例として、1.0ないし4.0nmであっても良く、他の例としては、1.6ないし3.5nmであっても良く、また、他の例としては、2.0ないし3.1nmであっても良く、また、他の例としては、2.4ないし3.1nmであっても良い。
【００２９】
本発明の用語「結合体（conjugate）」とは、1つのコアに多数のシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体が結合された形態の物質を意味する。具体的には、前記結合体は、シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体が同一の間隔でコアに結合された形態であることができる。また、本発明の結合体は、シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体がコアの反応器を介して結合されるか、またはリンカーを介して多数のシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体がコアに結合された形態であることができる。この際、前記コアの反応器は、シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体がコアに結合することができる限り、特に制限されず、当業界に公知された反応器を使用することができる。
【００３０】
前述したように、前記コアは、シアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体が結合し得る限り、彼の構成物質または形態の側面で制限されていないので、前記結合体は、コアとシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体の様々な組み合わせにより、様々な形で形成されることができる。
【００３１】
一つの例示として、ポリアミドアミン（PAMAM）デンドリマーをコアとして含み、6'-シアリルラクトース（6SL）を前記コアに結合されるシアル酸誘導体として含む結合体としては、2ないし5世代のPAMAMデンドリマーの末端アミン基に10〜128個の6SLが結合された形態（6SL-PAMAM）の結合体であることができる。
【００３２】
前記6SL-PAMAM結合体は、用いられたPAMAMデンドリマーの世代に応じて、それに結合された6SLの数が変化することができるが、一例として、第3世代のPAMAMデンドリマーを含む6SL-PAMAM結合体は、前記デンドリマーの末端アミン基に10〜32個の6SLが結合することができ、他の例としては、第4世代のPAMAMデンドリマーを含む6SL-PAMAM結合体は、前記デンドリマーの末端アミン基に20〜64個の6SLが結合されることができ、また別の例としては、5世代のPAMAMデンドリマーを含む6SL-PAMAM結合体は、前記デンドリマーの末端アミン基に20〜128個の6SLが結合することができる。
【００３３】
より詳しくは、用いられたデンドリマーの世代別に述べると、以下の通りである：
まず、第4世代のPAMAMデンドリマーを含む6SL-PAMAM結合体の場合、一例として、前記デンドリマーの末端アミン基に20〜64個の6SLが結合することができ、他の例として、20〜40個の6SLが結合することができ、また別の例として、20〜31個の6SLが結合することができ、また別の例として、20〜26個の6SLが結合することができ、また別の例として、20個の6SLが結合することができる。
【００３４】
次に、第5世代のPAMAMデンドリマーを含む6SL-PAMAM結合体の場合、一例として、前記デンドリマーの末端アミン基に20〜128個の6SLが結合することができ、他の例として、30ないし80個の6SLが結合することができ、別の例として、30ないし77個の6SLが結合することができ、また別の例として、30ないし56個の6SLが結合することができ、また他の例として、30ないし48個の6SLが結合することができ、また別の例として、30ないし40個の6SLが結合することができ、また別の例として、37個の6SLが結合することができる。
【００３５】
本発明の一実施例によれば、エチレンジアミンコア（G2ないしG5）を有するPAMAMデンドリマーのアミノ基で6SLの還元糖のアルデヒド基を還元性アミノ化することにより、様々な形の6SL-PAMAM結合体を製造し（図1aおよび1d）。これを含まれた6SLの数を決定した（表4）。
【００３６】
続いて、前記6SL-PAMAM結合体のインフルエンザウィルス感染抑制能を試験管の条件で分析した結果、一定のサイズのデンドリマーが必要であり（図2a）、6SLリガンドとの間の間隔とH1N1ウィルスの感染抑制効率が関連されていることを確認した（表5、図2b）。また、ノイラミニダーゼ（neuraminidase、NA）の抑制剤を前記6SL-PAMAM結合体と併用し処理する場合には、H1N1ウィルス感染抑制効果が増加することを確認した（表6）。
【００３７】
次に、HAに対する6SL-PAMAM結合体の結合親和力を分析した結果、6SLリガンドとの間の間隔が2.4nm以上である6SL-PAMAM結合体（S3-G4、S4-G4、及びS7-G5）は、全てHA蛋白質と高い結合親和度を示すことを確認した（図3a）。
【００３８】
他の実施様態として、本発明は、前記結合体を含むインフルエンザウィルス感染症の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００３９】
本発明の用語「インフルエンザウィルス（influenza  virus）」とは、ウィルス性呼吸器疾患の主な原因病原体を意味するが、NP（nuleocapsid）と、M（matrix）蛋白質の抗原性の違いにより大きくA、B、及びC型に区分される。このうちA型は、また、ヘマグルチニン（hemagglutinin）蛋白質の抗原の特性によってH1型からH16型まで、ノイラミニダーゼ（Neuraminidase）蛋白質の抗原の特性によってN1型からN9型の亜型に分類される。
【００４０】
本発明において、前記インフルエンザウィルスは、特にこれに限定されないが、一例として、インフルエンザAウィルス、又はインフルエンザBウィルスであっても良く、他の例として、新型インフルエンザA（H1N1）ウィルスであっても良い。
【００４１】
本発明の用語「新型インフルエンザA（H1N1）ウィルス」とは、本発明の明細書で「新型インフルエンザウィルス」、「H1N1」または「H1N1ウィルス」とも表記し、A型インフルエンザウィルスが変異を起こして生成され、ウィルスの表面の二種類の蛋白質である血球凝集素（Hemagglutinin;HA）とノイラミニダーゼ（Neuraminidase：NA）の種類によって決定される血清型はH1N1であり、人に感染して新しい呼吸器疾患を誘発させるウィルスを意味する。
【００４２】
本発明の用語「インフルエンザウィルス感染症」とは、個体にインフルエンザウィルスが感染して現わられる病理学的疾患を意味する。たとえば、A型インフルエンザウィルスの変異株の感染によって引き起こされる疾患である「新型フルー」は、発熱、悪寒、頭痛、咳、咽喉の痛み、鼻水、呼吸困難などの上気道の症状、筋肉痛、関節痛、疲労感、嘔吐、または下痢などの症状をおこすと知られている。
【００４３】
本発明の用語、「予防」とは、本発明にて提供される前記結合体又はこれを含む薬学組成物の投与により、インフルエンザウィルス感染症の症状を抑制させたり、または遅延させたりする全ての行為を意味する。
【００４４】
本発明の用語、「治療」とは、本発明にて提供される前記結合体又はこれを含む薬学組成物の投与により、インフルエンザウィルス感染症の症状を好転させたり、又は有利に変更させたりする全ての行為を意味する。
【００４５】
本発明にて提供される薬学組成物に含まれている結合体の含量は、インフルエンザウィルス感染症を予防または治療する効果を示すことができる限り、特に限定されないが、一例として、総組成物の重量比0.0001〜50重量％になることができ、他の例としては、0.01重量％〜10重量％になることができる。
【００４６】
本発明の薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常的に使用される薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができ、前記担体は、非自然的担体（non-naturally  occurring  carrier）を含むことができる。
【００４７】
本発明の用語、「薬学的に許容可能な」とは、前記組成物にさらされる細胞や人間に毒性がない特性を示すことを意味する。
【００４８】
具体的には、前記の薬学組成物は、は、それぞれの通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤、および滅菌注射溶液の形で製剤化して使用することができる。本発明では、前記薬学組成物に含まれることができる担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、通常的に使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。
【００４９】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（calcium  carbonate）、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムスティレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（propyleneglycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤は、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【００５０】
本発明の一実施例によると、本発明にて提供される6SL-PAMAM結合体がウィルスの感染にどのような影響を与えるか、電子顕微鏡を使用して分析した結果、前記6SL-PAMAM結合体がウィルスの表面に存在するヘマグルチニン（hemagglutinin、HA）と結合して、ウィルスの表面に小包を形成し、これにより、ウィルスの付着、細胞内進入とエンドソームの融合/放出の過程を抑制すると分析された（図4）。また、免疫蛍光分析を通じて、前記6SL-PAMAM結合体がウィルスの細胞内進入に関与することが分かった（図5）。さらに、前記6SL-PAMAM結合体は、ウィルスの感染によって増加するNAの発現レベルを低下させる効果を果たすことを確認した（図6）。
【００５１】
そこで、生体内でのウィルスの感染の6SL-PAMAM結合体の効果を分析した結果、感染した宿主の肺組織内のウィルス力価を減少させ（図7a）、ウィルス感染による組織病理学的症状を減少させ（図7b）、ウィルス感染によるサイトカイン（IL-6およびCCL2）のレベルを減少させ（図7c）、感染した宿主の生存率を増加させ（図7d）、ウィルス感染によって減少した体重を回復させる効果を達すること（図7e）を確認した。
【００５２】
最後に、抗ウィルス製剤に対して耐性を示すウィルスの感染に対する6SL-PAMAM結合体の効果を分析した結果、現存する抗ウィルス剤に対して耐性を示すインフルエンザウィルスの感染に対しても本発明の6SL-PAMAM結合体が抑制活性を示すことが分かった（図8aないし8c）。
【００５３】
別の実施様態として、本発明は、前記結合体または前記結合体を含む薬学組成物をインフルエンザウィルス感染症の発症が疑われるか又はインフルエンザウィルス感染症が発症した個体に投与する段階を含む、インフルエンザウィルス感染症を予防または治療する方法を提供する。
【００５４】
本発明の用語「個体」とは、インフルエンザウィルス感染症が発症しているか、又は発症することができる有機体を意味するが、一例として、呼吸器官を含む高等脊椎動物であっても良く、他の例として、哺乳動物であっても良く、別の例としては、霊長類であっても良く、また別の例としては、人を含むラット、マウス、家畜などであっても良い。
【００５５】
本発明の用語「投与」とは、適切な方法で患者に所定の物質を導入する行為を意味し、有効成分を人体または獣医用に製剤化させた後、様々な経路で投与することができる。本発明の結合体を含む薬学組成物の投与経路は特に限定されないが、一例として、非経口経路、例えば、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内または皮下などの経路で投与することができ、他の例としては、経口、鼻腔、直腸、経皮またはエアゾールによる吸入経路で投与することができ、また別の例としては、ボーラスで投与するか、または徐々に注入することもできる。
【００５６】
本発明の結合体又はこれを含む薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与することができる。
【００５７】
本発明の用語、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵/リスク比で疾患を治療するのに十分であり、副作用を起こさない程度の量を意味し、有効容量の水準は、患者の性別、年齢、体重、健康状態、疾病の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路、および排出比率、治療期間、配合または同時に使用される薬物を含む要素およびその他医学分野でよく知られている要素に応じて、当業者によって容易に決定することができる。
【００５８】
一例として、本発明の結合体は、一例として、1回投与の際1×107ないし1×1011個、他の例として、1×108ないし5×1010個、また別の例として、5×108ないし2×1010個投与することができるが、これらに限定されない。
【００５９】
他の例として、本発明の薬学組成物を基準とする場合には、固形分を基準に1日0.0001ないし100mg/体重kg、より具体的に0.001ないし100mg/体重kgで投与することができる。投与は、前記の推奨投与量を一日に一回投与することができ、数回に分けて投与することもできる。
【００６０】
本発明のインフルエンザウィルス感染症の予防または治療方法において、前記薬学組成物を投与する投与経路及び投与方法は、特に制限されず、目的とする当該部位に前記結合体を含む薬学組成物が到達することができる限り、任意の投与経路及び投与方法に従うことができる。具体的には、前記の薬学組成物は、経口または非経口の多様な経路を通じて投与されることができ、その投与経路の非限定的な例としては、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻側内または吸入などを通じて投与することを挙げることができる。
【００６１】
また別の実施様態として、本発明は、前記結合体を含むインフルエンザウィルス感染症の予防または改善用食品組成物を提供する。
【００６２】
本発明の用語「改善」とは、本発明の結合体を含む組成物の投与によって治療される状態に関するパラメータ、例えば症状の程度を少なくとも減少させる全ての行為を意味する。
【００６３】
本発明の用語「食品」とは、肉、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、健康機能食品及び健康食品などがあり、通常の意味での食品の全て含む。
【００６４】
本発明の食品組成物は、日常的に摂取することが可能であるため、高い水準でインフルエンザウィルス感染症を改善させる効果が期待でき、健康増進を目的として非常に有用に使用することができる。
【００６５】
前記健康機能（性）食品（functionalfood）とは、特定保健用食品（foodforspecialhealthuse、FoSHU）と同じ用語であり、栄養補給のほか、生体調節機能が効率的に現れるように加工された医学、医療効果が高い食品を意味する。ここで「機能（性）」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調整したり、生理学的作用などのように保健の用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の食品は、当業界で通常的に使用される方法により製造が可能であり、前記製造の際には、当業界で通常的に添加する原料及び成分を添加して製造することができる。また、前記食品の製形もまた、食品として認められている製形であれば制限なく製造することができる。本発明の食品用組成物は、様々な形の製形で製造することができ、一般医薬品とは異なり、食品を原料とため、薬品の長期服用の際に発生し得る副作用などがない利点があり、携帯性に優れているため、本発明の食品は、インフルエンザウィルス感染症の改善効果を促進させるための補助剤として摂取が可能である。
【００６６】
前記健康食品（healthfood）は、一般的な食品と比べて積極的な健康維持や増進効果を有する食品を意味し、健康補助食品（healthsupplementfood）は、健康補助の目的の食品を意味する。場合によっては、健康機能食品、健康食品、健康補助食品の用語は、互用される。
【００６７】
具体的に、前記の健康機能食品は、本発明の化合物を飲料、茶類、香辛料、ガム、菓子類などの食品素材に添加したもの、又はカプセル化、粉末化、懸濁液などで製造した食品であり、これを摂取した場合、健康上の特定の効果をもたらすことを意味するが、一般医薬品とは異なり、食品を原料とするため、薬品の長期服用の際に発生し得る副作用がない利点がある。
【００６８】
前記食品組成物は、生理学的に許容可能な担体をさらに含むことができるが、担体の種類は特に制限されず、当該技術分野で通常的に使用される担体であれば、いずれも使用することができる。
【００６９】
また、前記食品組成物は、食品組成物に通常的に使用され、香り、味、視覚などを向上させることができる追加的成分を含むことができる。例えば、ビタミンA、C、D、E、B1、B2、B6、B12、ナイアシン（niacin）、ビオチン（biotin）、葉酸（folate）、パントテン酸（panthotenic  acid）などを含むことができる。また、亜鉛（Zn）、鉄（Fe）、カルシウム（Ca）、クロム（Cr）、マグネシウム（Mg）、マンガン（Mn）、銅（Cu）、クロム（Cr）などのミネラル;及びリジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。
【００７０】
また、前記食品組成物は、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（漂白粉と高度漂白粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、ブチルヒドロキシトルエン（BHT）等）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜窒酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（MSGグルタミン酸ナトリウム等）、甘味料（ズルチン、チクロ、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、D-酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、皮膜剤、ガム基礎剤、泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（food  additives）を含むことができる。前記添加物は、食品の種類に応じて選別され、適切な量で使用することができる。
【００７１】
本発明の食品組成物の一例として、健康飲料組成物として使用することができ、この場合、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。前述した天然炭水化物はブドウ糖、果糖のような単糖類;マルトース、スクロースのような二糖類;デキストリン、シクロデキストリンのような多糖類;キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールであることができる。甘味料は、タウマーティン、ステビア抽出物のような天然甘味料;サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の健康飲料組成物100mL当たり、一般的に約0.01〜0.04g、具体的には約0.02〜0.03gであることができる。
【００７２】
前記のほか、健康飲料組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸塩、アルギン酸、アルギン酸塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調整剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコールまたは炭酸化剤などを含有することができる。その他の天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、または野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。これらの成分は、独立して、または混合して使用することができる。これらの添加剤の比率は、それほど重要ではないが、本発明の健康飲料組成物100重量部当たり0.01ないし0.1重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【００７３】
また別の実施様態として、本発明は、前記結合体または前記結合体をインフルエンザウィルスに処理する段階を含む、インフルエンザウィルスの感染を抑制する方法を提供する。
【００７４】
前述したように、本発明の結合体は、これに含まれているシアル酸、シアリルラクトース、又はこれらの誘導体がインフルエンザウィルスの表面に存在するヘマグルチニンと結合して小包を形成し、これにより、前記ウィルスの付着、細胞内進入とエンドソームの融合/放出過程を抑制し、ウィルスの細胞内進入に関与して、ウィルスの感染によって増加するNAの発現水準を低下させる効果を達することができる。
【００７５】
したがって、本発明の結合体は、試験管の条件（in  vitro）、生体内の条件（in  vivo）または生体外の条件（ex  vivo）にてインフルエンザウィルスの感染を抑制するために使用することができる。
【００７６】
特に、目的とする細胞に対するインフルエンザウィルスの感染性の研究を行うために、試験管の条件（in  vitro）又は生体外の条件（ex  vivo）にてインフルエンザウィルスの感染を抑制しようとする場合には、前記結合体を適切な濃度で緩衝液に希釈した後、ウィルス溶液またはウィルスに感染した細胞へ処理して、前記細胞に対するインフルエンザウィルスの感染を抑制することができる。
【実施例】
【００７７】
以下、本発明を実施例を通じてより詳しく説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７８】
実施例1：6SL-PAMAM結合体の合成
エチレンジアミンコア（G2ないしG5）を有するPAMAMデンドリマーのアミノ基で6SLの還元糖のアルデヒド基を還元性アミノ化することにより、6SL-PAMAM結合体を製造した（図1a）。
【００７９】
概して、50mMNaCNBH3を含む0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）に、それぞれのPAMAMデンドリマー（20mg）と、お互いに異なる量の6SL溶液とを混合した（表1）。
【００８０】
【表１】
2019529527.tif 000003
反応液を徐々に攪拌しながら、暗所及び室温で5日間連続的に反応させた。
【００８１】
反応が終了した後、適切なサイズ（MWCO3Kまたは10K）のAmiconcentrifugalfilters（Millipore）を使用して濾過することにより、反応していない製剤を除去し、脱イオン水に溶媒を交換した。
【００８２】
濾過の後、溶液を凍結乾燥させ、得られた白色粉末の試料を使用時までに乾燥し保存した。
【００８３】
実施例2：6SL-PAMAM結合体の特性分析
前記実施例1で合成された6SL-PAMAM結合体の特性をMALDI-TOFMS（BrukerDaltonics）と1H-NMRを使用して分析した。
【００８４】
実施例2-1：MALDI-TOFMS分析
337nm窒素レーザーを使用してMALDI-TOFMS分析を行った。このとき、マトリックスとして2,5-ジヒドロキシ安息香酸（10mg/ｍL）を含む50％アセトニトリルを使用したが、分析物-マトリックス溶液を1：2（分析物：マトリックス、v/v）の割合で製造した。前記製造された分析物-マトリックス溶液（1μL）を試料用プレートに加え、真空蒸発し乾燥させた。また、線形カチオンモードを使用して、スペクトルごとに少なくとも100回の撮影を行った。前記撮影されたデータの分析は、Bruker  Daltonics  Microflex  Analysis  Softwareを使用して実行し（図1b）、前記データの分析を通じてPAMAMに結合された6SLの平均値を算出した（表2）。
【００８５】
【表２】
2019529527.tif 000004
実施例２−２：1H-NMR分析
G2-G5デンドリマー、6SL及びこれらの結合体のNMRスペクトルを、Bruker  Ascend  TM500分光器を使用して重水素オキサイドで測定し（図1c）、前記データの分析を通じてPAMAMに結合された6SLの平均値を算出した（表3及び図1c）。
【００８６】
図1cにて分かるように、PAMAMデンドリマーの1H-NMRスペクトルは、PAMAMデンドリマーの内のアミド結合に隣接する-CH2-に該当する2.45ないし2.50ppmで信号を示し、このような全体的な信号は、G2の場合56H、G3の場合120H、G4の場合248H及びG5の場合504Hを示す内部標準として使用され、6SLアセチル基の-CH3に該当する2.07ppmでの特有の全体的な信号は、各デンドリマー上の6SLリガンドの数を決定するために使用された。
【００８７】
【表３】
2019529527.tif 000005
前記得られた結果から、合成された6SL-PAMAM結合体のおおよその構造を予測することができた（表4及び図1d）。
【００８８】
【表４】
2019529527.tif 000006
前記の結果から得られたS3-G4結合体の1H-NMR分析の結果、及びこれから推論された結合体の構造を図1eに示した。
【００８９】
実施例3：試験管の条件で6SL-PAMAM結合体のインフルエンザウィルス感染の抑制の分析
インフルエンザ感染を抑制する6SL-PAMAM結合体の能力評価方法を用いて、試験管の条件での感染抑制の分析を行った。
【００９０】
まず、PBSを用いて試験しようとする結合体の半-ログ連続希釈液（half-logserial  dilution）を製造した。前記製造された希釈液50μLを同じ体積の1×103TCID50のH1N1菌株（A/California/04/2009  or  oseltamivir-resistantH1N1、A/Gyeongnam/1820/2009）と混合した。前記混合液を37℃で1時間培養し、続いて1.5×105細胞数/ｍLのMDCK細胞を100μLずつ加えた後、5％CO2及び37℃の条件で18時間の間、追加的に培養した。培養が終了した後、前記培養されたMDCK細胞に固定液（アセトン：PBS=4：1、v/v）を加え、10ないし15分間固定した。続いて、抗-NAマウス抗体（Millipore）および抗-マウスヤギ抗体-HRP結合体（JacksonImmunoresearch）を使用したELISA分析を行い、前記各MDCK細胞に含まれているインフルエンザ核蛋白質（NP）を検出した（図2a）。このとき、陰性対照群（未感染細胞、感染率0％）、及び陽性対照群（抑制剤なしで感染した細胞、感染率100％）に対する吸光度を使用して前記各MDCK細胞の感染率を算出し、前記算出された感染率の統計分析は、GraphPad  Prism6.0（GraphPad  Software、SanDiego、CA）を使用して行った。
【００９１】
図2aに示すように、サイズが比較的に小さいS1-G2及びS2-G3の場合（G2及びG3デンドリマーは4nm未満の直径）、感染抑制は、観察されず、S6-G4を除いた、G4及びG5デンドリマー（4.5nmを超える直径）を含む全ての6SL結合体は、H1N1感染を抑制することを確認した。
【００９２】
前記の結果は、試験管の条件で、H1N1感染を抑制するためには、一定の大きさのデンドリマー支持体が必要であることを示唆する。
【００９３】
また、前記図2aは、PAMAM結合体に結合された6SLの数が増加するほど、H1N1ウィルスの感染抑制の効率が減少する結果を示したが、それは、多価リガンドの結合親和力が、リガンド原子価（例えば、リガンドの数）に応じて増加するというこれまでの研究結果と合致しなかった。
【００９４】
炭疽毒素の場合、これに対する抑制剤の開発に用いられる要因として、原子価だけでなく、リガンドとの間の間隔が用いられることを勘案して、6SL-PAMAM結合体に含まれている6SLリガンドとの間の間隔が、前記H1N1ウィルスの感染抑制の効率と関連付けできるのか確認しようとした。
【００９５】
これにより、6SL-PAMAM結合体に含まれているPAMAMデンドリマーの直径を用いて前記デンドリマーの表面積（4πr2）を算出し、前記表面積を6SLリガンドの数で割り、6SLリガンドとの間の間隔を算出した後、前記算出された6SLリガンドとの間の間隔と、H1N1ウィルスの感染抑制の効率との関連性を分析した（表5、図2b）。
【００９６】
【表５】
2019529527.tif 000007
前記表5及び図2bから分かるように、6SLリガンドとの間の間隔とH1N1ウィルスの感染抑制の効率が関連されていることを確認した。
【００９７】
具体的に、G2及びG3を含む6SL-PAMAM結合体（S1-G2及びS2-G3）の場合には、6SLリガンドとの間の間隔が狭く、H1N1ウィルスの感染抑制の効果を示していなかった。これに反して、G4を含む6SL-PAMAM結合体（S3-G4、S4、-G4、S5、-G4及びS6-G4）の場合には、6SLリガンドとの間の間隔が減少するほど、H1N1ウィルスの感染抑制の効果が低下した。また、G5を含む6SL-PAMAM結合体（S7-G5、S8-G5、S9-G5とS10-G5）の場合にも、6SLリガンドとの間の間隔が減少するほど、H1N1ウィルスの感染抑制の効果が低下した。
【００９８】
しかし、同一な6SLリガンドとの間の間隔を有しても、6SL-PAMAM結合体に含まれているエチレンジアミンコア（G4又はG5）に応じて、H1N1ウィルスの感染抑制の効果が違い見せることが分かった。
【００９９】
一方、H1N1ウィルスのノイラミニダーゼ（neuraminidase、NA）は、6SLリガンドを加水分解することができ、6SL-PAMAM結合体のH1N1ウィルス感染抑制効果を制限することができる。
【０１００】
そこで、前記NAの抑制剤であるオセルタミビルカルボキシレート（oseltamivir  carboxylate、OC）の処理の有無が、6SL-PAMAM結合体のH1N1ウィルス感染抑制の効果に影響を与えるかを確認しようとした。
【０１０１】
概して、1μMのOCを処理した条件、または処理していない条件で6SL-PAMAM結合体とH1N1菌株を混合する段階を含むことを除いて、前述したところと同様の実験を行い、6SL-PAMAM結合体のH1N1ウィルス感染抑制の効果を分析した（表6）。
【０１０２】
【表６】
2019529527.tif 000008
実施例4：HAの6SL-PAMAM結合体の結合親和力の分析
標準アミンカップリングプロトコル（GE  healthcare、Uppsala、Sweden）に従ってH1N1ウィルスの表面抗原であるHA蛋白質をCM5チップに固定し、それから6-SLPAMAM結合体と、HA蛋白質との間の分子の反応/速度データを得るSPR（Surface  plasmon  resonance）分析を通じ、HAと6SL-PAMAM結合体の結合親和力を分析した。
【０１０３】
概して、CM5チップ表面のカルボキシメチル基は、N-エチル-N-（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとN-ヒドロキシスクシンイミドとの同一モル量の混合物（最終濃度0.05M）35ｍLを加え（流速、5ｍL/分）活性化させた。その後、HAを100mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）緩衝液に50μｇ/ｍLになるように加え、前記活性化されたCM5チップ表面に加えた。続いて、35μLの1Mエタノールアミンを処理して前記CM5チップ表面の未反応部位を不活性化させた。
【０１０４】
一方、N-エチル-N-（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとN-ヒドロキシスクシンイミド（最終濃度0.05M）との同一モル量の混合物（最終濃度0.05M）35ｍLを加えた後（流速、5ｍL/分）、35μLの1Mエタノールアミンを処理して対照群を作製した。
【０１０５】
次に、6-SL  PAMAM結合体をHBS-EP緩衝液（0.01MHEPES、0.15MNaCl、3mM  EDTA、0.005％surfactant  P20、pH7.4）で希釈した。互いに違う水準の6-SLPAMAM結合体の希釈液を50μL/分の流速で前記HAが結合されたCM5チップに加えた。その後、前記CM5チップにHBS-EP緩衝液を加えて、解離を促進させた。3分経過した後、前記CM5チップに2MNaCl、50μLを加え、前記CM5チップの表面を再生した。反応の結果は、BIAcore  3000  control及びBIA  evaluation  software（version4.0.1）を使用したBIAcore3000（GE  healthcare、Uppsala、Sweden）を用いて分析し、25℃で時間（センサーグラム）の関数として表示した（図3a）。
【０１０６】
図3aに示すように、使用された6SL-PAMAM結合体のうち、一部の6SL-PAMAM結合体（S3-G4、S4、-G4、S7-G5及びS8-G5）のみHA蛋白質と高い結合親和度を示すことを確認した。
【０１０７】
特に、6SLリガンドとの間の間隔が2.4nm以上である6SL-PAMAM結合体（S3-G4、S4、-G4及びS7-G5）は、全てHA蛋白質と高い結合親和度を示すことを確認した。
【０１０８】
それに反して、6SLリガンドとの間の間隔が1.9nmより短い6SL-PAMAM結合体（S2-G3、S6-G4、S9-G5及びS10-G5）は、HA蛋白質と著しく低い結合親和度を示し、これらのほとんど（S6-G4、S9-G5及びS10-G5）は、前記6SLリガンドとの間の間隔が2.4nm以上である6SL-PAMAM結合体（S3-G4、S4-G4及びS7-G5）のより多くの6SLリガンドを含んでいるにもかかわらず、HA蛋白質と著しく低い結合親和度を示すことを確認した。
【０１０９】
一方、HA三量体の結晶を分析した結果、H1N1の三量体型HAの内部に存在する6SL結合部位との間の距離が約4nmであることが確認された（図3b）。
【０１１０】
したがって、前記の結果を総合すると、前記6SL-PAMAM結合体に含まれている6SLリガンドとの間の間隔が2.4ないし4.0nmである場合には、HA蛋白質に効果的に結合することが分かった。
【０１１１】
また、前記6SL-PAMAM結合体は、G4及びG5のエチレンジアミンコアを含む形態が好ましく、前記エチレンジアミンコアの種類に応じて、適切な水準の6SLリガンドを含むことが望ましいということが分かった。
【０１１２】
具体的に、G4を含む6SL-PAMAM結合体は、約20ないし30個の6SLリガンドを含むことが好ましく、G5を含む6SL-PAMAM結合体は、約30ないし40個の6SLリガンドを含むことが望ましいということが分かった。
【０１１３】
前記6SL-PAMAM結合体のうちS3-G4及びS6-G4を使用して、前記の分析内容を図式化した（図3c）。
【０１１４】
図3cに示すように、約3.1nmの6SLリガンド間隔を有するS3-G4は、H1N1ウィルスの表面抗原であるHA蛋白質に存在するリガンド結合部位の間の間隔と、前記S3-G4に含まれている6SLリガンド間隔とが類似しているので、前記S3-G4は、H1N1ウィルスの表面抗原であるHA蛋白質に強く結合すると分析された。これに反して、約1.6nmの6SLリガンド間隔を有するS6-G4は、H1N1ウィルスの表面抗原であるHA蛋白質に存在するリガンド結合部位の間の間隔と、前記S6-G4に含まれている6SLリガンド間隔とが異なるため、前記S6-G4は、H1N1ウィルスの表面抗原であるHA蛋白質に弱く結合するしかないと分析された。
【０１１５】
実施例5：電子顕微鏡分析
公知の方法でインフルエンザウィルス（A/California/07/2009）を精製した。
【０１１６】
概して、インフルエンザウィルス（A/California/07/2009）に感染した鶏の卵の卵胞液を収集し、遠心分離（3000rpm、10分）して上澄み液を収得した。前記収得した上澄み液を高速遠心分離（19,000ｘg、2時間）し、沈殿物を収得した。前記収得した沈殿物をTNE緩衝液（50mMTris-HCl（pH7.4）、100mMNaCl、および1mMEDTA）1ｍLに懸濁させ、3段階の不連続スクロース勾配（50、40、および30％スクロースを含むTNE緩衝液2ｍL）条件下で遠心分離し（36,000xg、2時間）、ウィルス分画を収得した。前記収得したウィルス画分をPBSに懸濁させ、再度遠心分離し（100,000xg、1時間、4℃）、沈殿物を収得した後、これをPBS2ｍLに懸濁させた。前記懸濁されたウィルス溶液20μLと、S3-G4溶液（100nmol/ｍL）20μLとを混合し、これを加速電圧120kVにて動作するTecnaiG2spiritTEM（FEIcompany、Hillsboro、OR）に適用してTEM（Transmissionelectronmicroscopy）分析を行った（図4）。この際。対照群としては、前記ウィルス溶液5μLを空気中で3分間グロー放電させた炭素コーティンググリッドに加えた後、2％酢酸ウラニルを使用して染色したものを使用した。
【０１１７】
図4に示すように、約7nmの球形（左側上段パネル）のS3-G4粒子と、前記S3-G4の結合によりH1N1の表面に形成された小胞の形成（右側下段パネル）を確認したが、前記小包の形成は6SLリガンドが含まれていないG4PAMAMデンドリマーを処理した場合には、確認されなかった（左側下段パネル）。前記小包の形成は、S3-G4の表面凝集によるものと予想されつつ、これにより、ウィルスの付着、細胞内進入とエンドソームの融合/放出過程が抑制されるものと分析された。
【０１１８】
実施例6：ウィルス感染過程の分析
まず、インフルエンザウィルス（A/PR/8/34）を精製し、1ｍLPBSに懸濁させて、ウィルス溶液を収得した。前記ウィルス溶液に100μMのR18溶液（6μL）を加え、1時間室温で反応させて、R18として単独標識し；または前記ウィルス溶液にDiOC18（33μM）とR18（67μM）とを含むエタノール溶液（6μL）を加えた後、室温で1時間徐々に震盪させながら反応させてDiOC18及びR18として二重標識した。反応が終了した溶液を0.22μmメンブレンフィルター（Millipore）を使用して濾過した。
【０１１９】
次に、MDCK細胞を37℃及び5％CO2の条件で24時間培養した。前記培養された細胞に、前記濾過されたウィルス溶液を加え、4℃で20分間反応させ、反応が終了した後、液状成分を除去し、前記細胞を冷PBSで3回洗浄した。前記細胞を、37℃及び5％CO2の条件で488及び594nmの波長の共焦点顕微鏡で（LSM700、CarlZeiss）撮影した（図5）。
【０１２０】
図5に図示された、R18として単独標識されたウィルスを用いた分析の結果から分かるように、MDCK細胞の表面にR18標識されたウィルスが付着するのをS3-G4が抑制することを確認した。
【０１２１】
また、図5に図示されたDiOC18とR18とで一緒に標識されたウィルスを用いた分析の結果から分かるように、R18およびDiOC18として標識された対照群のウィルスを処理した場合には、緑と黄色のウィルス粒子が確認されたが、S3-G4を前処理したウィルスを処理した場合には、緑と黄色のウィルス粒子が確認されていないことを確認した。
【０１２２】
したがって、S3-G4がウィルスの細胞内進入に関与することが分かった。
【０１２３】
実施例7：免疫蛍光分析
MDCK細胞を48ウエルプレートに接種し、S3-G4（10または100nmol/ｍL）を処理した条件、または処理していない条件で、様々なH1N1ウィルス（A/NWS/33、A/PuertoRico/8/43  and  A/California/07/2009）又はH3N2ウィルス（A/Shandong/9/93）を37℃で24時間感染させた。前記感染した細胞に4％パラホルムアルデヒドを処理し、室温で10分間固定させた後、前記固定された細胞を冷PBSで洗浄し、0.25％TritonX-100を含むPBSを加え、10分間反応させた後、再びPBSで5分間ずつ3回洗浄した。前記洗浄された細胞にインフルエンザウィルスANP-特異的モノクローナル抗体を1時間処理した後、Alexa488-ヤギ抗-マウス二次抗体を加え、1時間反応させ、逆相蛍光顕微鏡で撮影した（図6）。この際、前記細胞の核は、NucBLuefixed  cell  stain（Life  technologies）を使用して対照染色し、前記細胞のアクチンは、ActinRed  555  Ready  Probes  Reagent（Life  technologies）を使用して染色した。
【０１２４】
図6に示すように、H1N1に感染したMDCK細胞（対照群）では、緑色に表示されたNP蛋白質の発現レベルが急激に増加したが、S3-G4結合体を処理した場合には、NP蛋白質の発現レベルが低レベルを示すことを確認した
実施例8：生体内の条件での6SL-PAMAM結合体のインフルエンザウィルス感染抑制の分析
実施例8-1：インフルエンザウィルスに感染したマウスの作製
6週齢の18-20gの雌性無菌BALB/cマウスを用いて、6SL-PAMAM結合体のインフルエンザウィルス感染抑制能を分析した。
【０１２５】
前記マウスにAvertin（375mg/kg）を腹腔注射して麻酔させ、S3-G4を鼻腔投与し、10分後に104EID50（50％  egg  infective  dose）のH1N1ウィルス（A/NWS/33）を鼻腔投与して感染させた。このとき、S3-G4及びウィルスの投与水準に応じて、4つの試験群に分類した：陽性対照群（ウィルス単独投与）、陰性対照群（S3-G4単独投与）、比較群（PBS単独投与）、及び実験群（ウィルス及び50μmol/kgS3-G4投与）。前記各試験群のマウスを14日間飼育した後、以降の実験を行った。
【０１２６】
実施例8-2：肺組織のウィルス力価分析
前記14日間飼育した各マウスから肺を摘出した後、その破砕物を得て、遠心分離（1400xg、4℃、20分）をして上澄み液を収得し、前記上澄み液にPBSを加えて10倍の体積に希釈した。前記希釈された上澄み液をMDCK細胞に処理して、上澄み液に含まれているウィルスの力価をTCID50（tissue  culture  infective  dose）で算出した（図7a）。
【０１２７】
図7aに示すように、S3-G4を投与したマウスの肺から検出されたウィルスの力価は、S3-G4を投与していない対照群のものよりも10倍低い水準を示すことを確認した。
【０１２８】
実施例8-3：肺組織の組織病理学的分析
前記14日間飼育した各マウスから肺を摘出した後、それを10％ホルマリンで固定し、その組織薄片を収得した後、ヘマトキシリンとエオシンで染色し、その組織病理学的検査を行った（図7b）。
【０１２９】
図7bに示すように、陽性対照群（H1N1）の場合、肺のそばにある気管支領域での炎症細胞である単球とリンパ球の浸潤が確認され、肺胞壁の肥厚と、重症度の出血が確認されつつ、病変は全葉全体に広がっていることを確認した。これに反して、実験群（H1N1+S3-G4）の場合、炎症性病変が減少し、肺のそばにある気管支領域と肺胞の領域で単球とリンパ球の浸潤が減少したことを確認した。
【０１３０】
実施例8-4：肺組織のサイトカインレベルの分析
前記14日間飼育した各マウスから肺を摘出し、その破砕物に含まれているサイトカイン（IL-6、IL-10、TNF-α、CXCL1、CXCL2またはCCL2）のレベルを測定し、比較した（図7c）。
【０１３１】
図7cに示すように、TNF-α、IL-10、CXCL1及びCXCL2のレベルは、陽性対照群（H1N1）と実験群（H1N1+S3-G4）とで特な差を示していなかったが、IL-6及びCCL2の水準は陽性対照群（H1N1）と比べて、実験群（H1N1+S3-G4）にて有意に減少したことを確認した。
【０１３２】
実施例8-5：マウスの生存率分析
前記14日間飼育した各マウスの生存率の変化を分析した（図7d）。
【０１３３】
図7dに示すように、陰性対照群（S3-G4（50μmol/kg））及び比較群（PBS）は、飼育期間が経過しても生存率が変化されなかったが、陽性対照群（H1N1）の場合、6日目から生存率が減少し始めて10日目が経過した時点で、全て死滅したことを確認した。これに反して、実験群（H1N1+S3-G4）の場合、8日目に生存率が約75％に減少したが、以降は前記生存率が変化しなかったことを確認した。
【０１３４】
実施例8-6：マウスの体重変化の分析
前記14日間飼育した各マウスの生存率の変化を分析した（図7e）。
【０１３５】
図7eに示すように、陰性対照群（S3-G4（50μmol/kg））及び比較群（PBS）は、飼育期間が経過するにつれ、体重が徐々に増加する傾向を示したが、陽性対照群（H1N1）の場合、全て死滅する直前の9日目まで飼育期間が経過するにつれて、体重が減少したことを確認した。これに反して、実験群（H1N1+S3-G4）の場合、9日目まで飼育期間が経過するにつれて、体重が減少したが、以降は飼育期間が経過するにつれて、体重が回復したことを確認した。
【０１３６】
実施例9：抗ウィルス剤耐性ウィルスの6SL-PAMAM結合体の効果
実施例9-1：抗ウィルス剤耐性ウィルスに対する免疫蛍光分析
一般的に使用されるNA抑制性抗ウィルス剤の使用により、オセルタミビル（oseltamivir）耐性変異が増加したことが報告されたところ、本発明にて提供される6SL-PAMAM結合体の一種であるS3-G4がオセルタミビル耐性H1N1ウィルスの感染を抑制することができるかどうか確認しようとした。
【０１３７】
概して、オセルタミビルとペラミビル（peramivir）の治療を受けたが、入院中に死亡した1歳の女性の患者から分離されたオセルタミビル耐性  H1N1  ウィルス（A/Gyeongnam/1820/2009）に対するS3-G4の感染抑制能を免疫蛍光分析方法を用いて評価した（図8a）。
【０１３８】
図8aに示すように、10nmol/ｍLのS3-G4は、オセルタミビル耐性H1N1ウィルスの感染を90％抑制することを確認した。
【０１３９】
実施例9-2：抗ウィルス剤耐性ウィルスのMN（Microneutralization）分析
ウィルスとしてオセルタミビル耐性H1N1ウィルス（A/Gyeongnam/1820/2009）を使用し、6SL-PAMAM結合体としてS3-G4を使用することを除いては、前記実施例3の方法を行い、オセルタミビル耐性H1N1ウィルス（A/Gyeongnam/1820/2009）に対するS3-G4の感染抑制活性を分析した（図8b）。
【０１４０】
図8bに示すように、H1N1ウィルス（A/California/04/2009）のS3-G4の抑制活性（IC50=3.4μM）と類似な水準であり、オセルタミビル耐性H1N1ウィルス（A/Gyeongnam/1820/2009）に対してもS3-G4が抑制活性（IC50=5.8μM）を示すことを確認した。
【０１４１】
実施例9-3：抗ウィルス剤耐性ウィルスに対するプラーク減少の分析
S3-G4を処理しているか、または処理していないH1N1ウィルス（A/Gyeongnam/1820/2009）をMDCK細胞に加え、1時間の間、感染させ、PBSで洗浄して結合されていないウィルスを除去した後、様々な濃度のオセルタミビルを処理した。次いで、前記細胞をアガロース固体培地で培養し、培養された固体培地に1％のアガロースを含む重層培地を重畳した後、37℃で48時間培養した。培養が終了した後、下部の固体培地を1％crystalvioletで染色し、プラークを計数した（図8c）。
【０１４２】
図8cに示すように、オセルタミビルを単独で投与した場合と比べて、オセルタミビルとS3-G4を併用して投与した場合、オセルタミビル耐性H1N1ウィルスに感染したMDCK細胞でプラーク形成が有意に減少したことを確認した。
【０１４３】
前記の結果を総合すると、抗ウィルス剤に対して耐性を示すウィルスに対しても、本発明の6SL-PAMAM結合体が抑制活性を示すことが分かった。
【０１４４】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明が、その技術的思想や必須的特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されることができることを理解できるだろう。これに関して、以上で記述した実施例らは、すべての側面から例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は、前記の詳細な説明よりも、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価の概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
2019529527.tif 000010
【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
2019529527.tif 000019
【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
2019529527.tif 000022
【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
2019529527.tif 000025
【図７ｅ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【国際調査報告】
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2019529527.tif 000031
2019529527.tif 000032
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