(57)【要約】  離散カーボンナノチューブを含む幹細胞、骨および神経足場が開示される。離散カーボンナノチューブは、チューブ層の内部および外部における標的化された、または選択的な酸化レベルおよび／または含量を有し得る。記載された足場は、身体に注入後、幹細胞を先導し、標的とし、保護するために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を移植するための足場であって、離散カーボンナノチューブを含み、細胞毒性を示さない前記足場。
【請求項２】
前記離散カーボンナノチューブが、乾燥した離散カーボンナノチューブの少なくとも約１重量パーセントの量の官能基を含む、請求項１に記載の足場。
【請求項３】
複数の前記離散カーボンナノチューブがオープンエンドである、請求項１に記載の足場。
【請求項４】
複数の前記離散カーボンナノチューブが触媒残留物を実質的に除去する、請求項１に記載の足場。
【請求項５】
ポリマーをさらに含む請求項１に記載の足場。
【請求項６】
前記離散カーボンナノチューブが、前記離散カーボンナノチューブの表面への生物学的部分の親和性を増大させる官能基を含む、請求項１に記載の足場。
【請求項７】
（ａ）少なくとも１種の幹細胞、および（ｂ）細胞毒性のない幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含む幹細胞療法のための組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１種の幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、またはその組合せを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１種の幹細胞がニューロン幹細胞を含み、前記組成物が神経性疾患を治療するためのものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記神経性疾患が、神経変性障害からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記離散カーボンナノチューブが懸濁液の形態である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
配置された場所から移動しないように、体組織中に堆積させることができる請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
安定であり、組織を形成して、損傷したまたは欠けている体組織または部分を修復することができる三次元の形状を形成するように堆積させることができる請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物の位置決めを決定するのを支援するために、電磁場により検出することができる請求項７に記載の組成物。
【請求項１５】
組織成長を助けるために制御可能に持続放出することができる、抗生物質、鎮痛剤、成長刺激薬、またはそれらの組合せを含む請求項７に記載の組成物。
【請求項１６】
幹細胞を用いた細胞療法の方法であって、幹細胞療法のための組成物を動物に投与するステップを含み、前記組成物は、（ａ）少なくとも１種の幹細胞、および（ｂ）細胞毒性のない幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含む、前記方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１種の幹細胞がニューロン幹細胞であり、前記組成物が神経性疾患を治療するためのものである、請求項１６に記載の細胞療法の方法。
【請求項１８】
前記離散カーボンナノチューブが懸濁液の形態である、請求項１６に記載の細胞療法の方法。
【請求項１９】
医薬品をさらに含む請求項７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記離散カーボンナノチューブが内部表面および外部表面を含み、前記内部表面が内部表面酸化種含量を有し、前記外部表面が外部表面酸化種含量を有する、請求項１に記載の足場。
【請求項２１】
前記内部表面酸化種含量が、前記外部表面酸化種含量より少ない、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記内部表面酸化種含量および前記外部表面酸化種含量が、カーボンナノチューブ重量に基づき、合計で約１から約９重量パーセントである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記離散カーボンナノチューブが、複数のオープンエンドチューブを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記離散カーボンナノチューブが、多層のカーボンナノチューブである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記内部表面酸化種含量および前記外部表面酸化種含量の総酸化種含量が、カーボンナノチューブの約１％から１５重量％を占める、請求項２０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月７日出願の米国特許出願第（ＵＳＳＮ）６２／３１９，５９９号からの優先権を主張し、その全体の開示を、参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、幹細胞（stem cell）を移植するための離散カーボンナノチューブ足場（discrete carbon nanotube scaffold）および幹細胞療法（stem cell therapy）のための組成物に関する。本発明はまた、骨、組織（tissue）および神経の成長および修復のための離散カーボンナノチューブ足場に関する。
【背景技術】
【０００３】
多分化能幹細胞は、虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、心筋梗塞、および肝疾患のための治療薬として重要となっている。移植された幹細胞は、次の要件を満たす場合のみ疾患の治療において有効となる：第１の要件は、移植された幹細胞が、目的とする細胞タイプに分化することである。第２の要件は、分化した幹細胞と周囲の組織および細胞との間でネットワークを形成することである。再生組織または骨構造には、高次構造を形成するために、細胞の定方向の成長が関与する。
【０００４】
しかしながら、実用的な範囲では、傷害された領域における移植された幹細胞は、ネットワーク（例えば、神経回路網）を形成せずに、洗い流される可能性が非常に高い。さらに悪いことに、これらは、望ましくない領域に移動し、腫瘍などの望ましくない細胞タイプに分化するおそれがある。
【０００５】
したがって、幹細胞についてin vivoで毒性がない足場（scaffold, scaffolding）を開発するための広範な調査が行われている。しかしながら、毒性がない足場の開発は、困難な課題と考えられており、身体に足場を注入すると、有害作用を引き起こすことが頻繁に報告されている。重大な問題は、カーボンナノチューブを製造するために用いられるコバルトなどの残留触媒から生じる有毒な金属元素または塩を有するカーボンナノチューブ、均一な構造の足場を製造するために用いることができないカーボンナノチューブの塊もしくは束、ならびに幹細胞およびこれらの分化の産物との親和性の容易性を可能にしない疎水性の表面により生じ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、in vivoで毒性がない、簡便でより有効な臨床適用性を有する新規な足場を開発する必要が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願にわたって、いくつかの特許および刊行物を参照し、引用を提供する。本発明および本発明に関連する現況技術をより十分に記載するために、これらの特許および刊行物の開示を本出願に組み込む。いくつかの研究の総説は、「Carbon Nanotubes for Stem Cell Control」．D.A.Stout and T.J.Webster.Materials Today、2012年7月-8月、15巻、Number 7-8、pp.312-318、Elsevierにおいて提供される。
【０００８】
本発明者らは、複数の離散カーボンナノチューブ（discrete carbon nanotubes）が、細胞毒性（cytotoxicity）がなく幹細胞のための足場を特異的に位置づけ、創出し、それによって、分化した幹細胞と部位（site）に存在する組織との間でネットワーク化することを可能にし、したがって、有意な細胞療法効果を可能にする、新規な能力を提供することを発見した。細胞毒性は、健康な細胞に重大なまたは望ましくない害を引き起こす特性として、本明細書において定義される。細胞毒性がないことは、足場または組成物の直接の結果として、有益な細胞の有意な部分が、有害に作用せず、死滅せず、またはその両方ということを示す。
【０００９】
本発明の一実施形態は、足場における離散カーボンナノチューブが、乾燥した離散カーボンナノチューブの少なくとも約１重量パーセントの官能基の量をさらに含むものである。複数の離散カーボンナノチューブは、オープンエンドであり得、触媒残留物を実質的に除去することができる。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、離散カーボンナノチューブを含む足場であり、離散カーボンナノチューブは、４マイクロメートル未満、好ましくは、３マイクロメートル未満、より好ましくは、２マイクロメートル未満の長さを有する。離散カーボンナノチューブの長さ分布は、モダリティを有し得、好ましくは、一峰性、最も好ましくは、二峰性である。
【００１１】
本発明のさらに別の実施形態では、足場は、ポリマーをさらに含む。ポリマーは、細胞毒性を示さずまたは免疫応答を刺激しないポリマーの群から選択することができる。ポリマーは、生分解性および／または水溶性であるポリマーの群から選択することもできる。ポリマーはさらに、足場の約１から約９９重量パーセントの範囲、好ましくは、約９０重量パーセント未満、より好ましくは、約５０重量パーセント未満、最も好ましくは、約１０重量パーセント未満を占める。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態は、離散カーボンナノチューブ表面への生物学的部分の親和性を増大させる官能基をさらに含む足場としての離散カーボンナノチューブである。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態は、幹細胞療法のための組成物であり、これは、（ａ）幹細胞；および（ｂ）細胞毒性がなく、幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含む。幹細胞は、胚性幹細胞でも成体幹細胞でもよい。幹細胞はまた、ニューロン幹細胞であり得、組成物は、神経性疾患を治療するためのものである。神経性疾患は、神経変性障害からなる群から選択することができる。神経変性障害は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択することができる。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、幹細胞療法のための組成物であり、離散カーボンナノチューブは、懸濁液の形態である。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態は、幹細胞を用いた細胞療法の方法であり、これは、（ａ）幹細胞；および（ｂ）細胞毒性がなく、幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含む幹細胞療法のための組成物を、動物に投与するステップを含む。幹細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞であり得る。幹細胞はまた、ニューロン幹細胞であり得、組成物は、神経性疾患を治療するためのものである。神経性疾患は、神経変性障害からなる群から選択することができる。神経変性障害は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、神経性運動疾患（neural motor disease）および筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）からなる群から選択することができる。離散カーボンナノチューブは、懸濁液の形態であり得る。
【００１６】
本発明の追加の実施形態は、細胞療法用の医薬品を製造するための、（ａ）幹細胞；および（ｂ）細胞毒性がなく、幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含む組成物の使用である。幹細胞は、胚性幹細胞（embryonic stem cell）または成体幹細胞（adult stem cell）であり得る。幹細胞はまた、ニューロン幹細胞であり得、組成物は、神経性疾患を治療するためのものである。神経性疾患は、神経変性障害（neurodegenerative disorder）および虚血再灌流障害（ischemia-reperfusion injury）からなる群から選択することができる。神経変性障害は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択することができる。虚血再灌流障害は、虚血性脳卒中であり得る。離散カーボンナノチューブは、懸濁液の形態であり得る。
【００１７】
本発明の別の目的は、細胞療法用の医薬品を製造するための、（ａ）幹細胞；および（ｂ）細胞毒性がなく、幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含む組成物を提供することであり、幹細胞療法用の足場および幹細胞は、医薬品をさらに含む。
【００１８】
本発明の別の目的は、（ａ）幹細胞；および（ｂ）細胞毒性がなく、幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含む組成物を提供することであり、足場は、フォーム（発泡体（foam））、繊維またはフィルムの形態である。足場は、多層をさらに含むことができる。
【００１９】
本発明の追加の目的は、足場内に離散カーボンナノチューブを提供することであり、離散カーボンナノチューブは、配向した離散カーボンナノチューブの少なくとも一部を有する。
【００２０】
本発明の別の目的は、幹細胞を離散カーボンナノチューブを含む足場に入れることにより、損傷から幹細胞を保護する方法を提供することである。
【００２１】
本発明の一実施形態は、幹細胞を離散カーボンナノチューブを含む足場に入れることにより、注入または堆積中、損傷から幹細胞を保護する方法である。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、幹細胞分化のためのインデューサーをさらに含む、（ａ）幹細胞；および（ｂ）細胞毒性がなく、幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含む組成物である。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態は、異なる官能基を有する離散ナノチューブの混合物を混合することにより、幹細胞の足場を形成する方法であり、混合後、ナノチューブは、官能基の互いのタイプと会合する。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態は、離散カーボンナノチューブを含む幹細胞足場であり、界面活性剤をさらに含む。界面活性剤は、陰イオン性、陽イオン性または非イオン性であり得る。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、組織、または骨のための接着剤として用いることができる、離散カーボンナノチューブを含む幹細胞足場である。
【００２６】
本発明のさらに別の実施形態では、足場は、ポリマーをさらに含み、ポリマーは、タンパク質、ペプチド、長鎖炭水化物、プロテオグリカン、または脂質を含む生物学的ポリマーの群から選択される。ポリマーは、部分的に消化または修飾することができる。ポリマーの構成成分は、細胞外マトリックスの構成または病変もしくは細胞損傷の部位に足場を固定する抗体と実質的に類似し得る。
【００２７】
本発明の追加の実施形態では、足場は、ポリマーをさらに含み、ポリマーは、走化性、創傷治癒、細胞外マトリックス産生タンパク質を含む生物学的ポリマーの群から選択される。細胞外産生タンパク質は、フィブロネクチン、インテグリン、またはフィブリンをさらに含むことができる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
次の説明では、本明細書に開示される本実施形態が完全に理解されるように、例えば、指定された量、サイズなど、いくつかの詳細を記載する。しかしながら、かかる特定の詳細なしで、本開示が、実行され得ることは、当業者に明らかであろう。多くの場合では、かかる詳細が、本開示の完全な理解を得るために必要でなく、関連する技術分野の当業者の範囲内であるため、かかる考慮などに関係する詳細は、省略されている。
【００２９】
本明細書に用いられる用語のほとんどが、当業者に認識可能であるが、しかしながら、明示的に定義されない場合、用語は、当業者によって現在許容される意味を採用するものと解釈するべきであることが理解されるべきである。用語の構成が、意味がないまたは本質的に意味がない場合には、定義は、Webster's Dictionary、第3版、2009年から選ぶべきである。定義および／または解釈は、本明細書において詳細に示されない限りまたは組み込みが妥当性を維持するために必要である場合、関連するまたは関連しない他の特許出願、特許、または刊行物から組み込まれるべきでない。
【００３０】
本発明において用いられる幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブ（discrete carbon nanotube：ＤＣＮＴ）は、単層、二層、または多層グラフェンシェルからなり得る。
【００３１】
用語「離散カーボンナノチューブ（ＤＣＮＴ）」とは、触媒を用いて反応器中で製造された状態から束になっていない（unbundled）またはほどかれている（untangled）カーボンナノチューブであって、カーボンナノチューブの長さに沿って実質的に互いに分離することができるようにカーボンナノチューブの長さをさらに切断することを要しないカーボンナノチューブを意味する。離散カーボンナノチューブは、チューブの表面および媒体およびチューブの濃度の熱力学的相互作用の選択により、所与の媒体に個別に分散させることができる。例えば、本発明の離散カーボンナノチューブは、分子量約５０，０００ダルトン（Daltons）のポリビニルアルコール０．５重量％を用いて、水中の１重量％の濃度で容易に分散させることができる。
【００３２】
カーボンナノチューブの束またはからみ合った塊から、離散（discrete）または剥離された（exfoliated）カーボンナノチューブ（単層（single-walled）、二層（double-walled）および多層（multiwall）の構造であり得る）を製造する過程の間、ナノチューブは、少なくとも１つのオープンエンドを有するセグメントに切断され、製造業者から受け取った状態のカーボンナノチューブの内側にある残りの触媒粒子は除去される。これらのチューブの切断は、剥離に役立つ。チューブを切断することによって、Molecular Rebarとしてここに定義されるカーボンナノチューブセグメントに、チューブの長さが短縮される。カーボンナノチューブ供給材料の適切な選択は、触媒粒子タイプに関連し、カーボンナノチューブの分布は、得られる個々のチューブの長さおよび全体的なチューブの長さ分布に対するさらなる制御を可能にする。好ましい選択は、内部触媒部位（internal catalyst sites）が均等に間隔が開く場所および触媒が最も効率的である場所である。さらなる好ましい選択は、カーボンナノチューブの１つまたは複数の層（wall）に沿って存在するＳｔｏｎｅｓ−Ｗａｌｅｓ欠陥がある場所である。個別の離散カーボンナノチューブは、流体粘性および性能のバランスについてのアスペクト比が約１０から約５００まで、好ましくは、２５〜２００、最も好ましくは、５０〜１２０であり得る。足場についてのチューブの選択は、電子顕微鏡検査および離散または剥離されたチューブ分布の決定を用いて評価することができる。
【００３３】
酸化された離散カーボンナノチューブ（discrete carbon nanotubes）（別の呼び名では剥離されたカーボンナノチューブ（exfoliated carbon nanotubes））は、濃硫酸および硝酸の組合せを用いるなど、酸化を含むような方法により、出来上がった状態のままの束になった（bundled）またはからみ合った（entangled）カーボンナノチューブから得られる。束になったまたはからみ合ったカーボンナノチューブは、例えば、化学蒸着法、レーザーアブレーション、および高圧一酸化炭素合成などの任意の公知の手段から製造することができる。カーボンナノチューブが、非毒性である触媒、例えば鉄を用いて製造されることが好ましい。束になったカーボンナノチューブは、例えば、すす、粉末、繊維、およびバッキーペーパーを含めた、様々な形態で存在することができる。さらに、束になったカーボンナノチューブは、任意の長さ、直径、またはキラリティーであり得る。カーボンナノチューブは、これらのキラリティーおよび層（wall）の数に基づき、金属、セミメタリック、半導体、または非金属であり得る。酸化された離散カーボンナノチューブは、例えば、単層カーボンナノチューブ、二層カーボンナノチューブ、または多層カーボンナノチューブおよびそれらの組合せを含むことができる。当業者は、カーボンナノチューブのある特定のタイプを利用して例証した本発明の特定の態様の多くが、カーボンナノチューブの他のタイプを利用した開示の精神および範囲の内で同等に実行することができることを認識するであろう。
【００３４】
本発明のカーボンナノチューブの好ましい選択は、Ｓｔｏｎｅ−Ｗａｌｅｓ欠陥と呼ばれる構造の部分の取り込みであり、これは、カーボンナノチューブの層（wall）を構成する縮合ベンゼン環の六角形の格子内で適合する七角形−五角形対へのグラフェンの６員環の再配列である。これらのＳｔｏｎｅ−Ｗａｌｅｓ欠陥は、グラフェンまたはカーボンナノチューブの層の酸化など、より容易な反応のための、より高い結合−ひずみエネルギーの部位を創出するのに有用である。これらの欠陥および縮合環構造の他のタイプは、カーボンナノチューブの長さに沿った屈曲または弯曲を容易にすることもでき、このことは、離散カーボンナノチューブのより高い濃度で、離散カーボンナノチューブの流体との混合物の流動性を維持するために有利である。
【００３５】
Ｓｔｏｎｅ−Ｗａｌｅｓ欠陥は、カーボンナノチューブの層の湾曲の程度が高くなるエンドキャップでより普及していると考えられる。酸化中、カーボンナノチューブの末端は、開き、また、カーボンナノチューブの層（wall）に沿うよりも酸化の程度もやはり高くなり得る。チューブの末端でのより高い程度の酸化、したがって、より高い極性または水素結合は、チューブが水などの極性媒体中で存在する場合、末端対末端比に対する平均の輪郭長の減少を助けるのに有用である。
【００３６】
好ましい実施形態によれば、離散カーボンナノチューブは官能化されている。ＤＣＮＴに連結される官能基には、それだけには限らないが、ヒドロキシル、チオール、アミド、アミンおよびカルボキシル基が含まれる。官能化されたＤＣＮＴによって、媒体中のＤＣＮＴ分子間の凝集の減少ならびに幹細胞および他の生物学的部分のより高い親和性が可能になる。官能化によって、無機金属、無機塩、有機分子、例えば、それだけには限らないが、ポリエチレングリコールなど、および生物学的種、例えば、それだけには限らないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質および酵素などとの相互作用が可能になる。本開示の官能化されたカーボンナノチューブは、一般に、上記に記載したカーボンナノチューブタイプのいずれかの化学修飾を指す。かかる修飾には、ナノチューブの末端、側壁、または両方が関与し得る。化学修飾は、それだけには限らないが、共有結合、イオン結合、化学吸着、インターカレーション、界面活性剤相互作用、ポリマー包装、切断、溶媒和、およびそれらの組合せを含むことができる。
【００３７】
界面活性剤は、チューブと選ばれる媒体との間の熱力学的相互作用を修飾するためにも有用に用いることができる。末端対末端比に対する離散カーボンナノチューブの輪郭長の比に影響を与える代替の手段には、チューブの表面に付着させるまたはそれらと接触させることができる、塩化ナトリウムなどの無機もしくはイオン性塩およびポリエチレンオキシドまたはポリビニルアルコールなどの有機含有官能基の使用が含まれる。
【００３８】
離散カーボンナノチューブは、限定されるものではないが、円形ダイもしくはスリットダイを通した押出しにより、配向することができる。配向は、流体中のポリマーの存在により容易となる。この一例は、ポリビニルアルコール配向離散カーボンナノチューブ繊維が、電界紡糸または回転型遠心機の壁中の開口部によって得ることができるように、ポリビニルアルコールおよび水の存在下で、本発明の離散カーボンナノチューブを使用している。
【００３９】
本明細書に記載した本発明において用いられる離散カーボンナノチューブは、１００％の離散カーボンナノチューブを含む必要はない。すなわち、一部のチューブ束は、からみ合った、非離散チューブとして依然として存在し得る。しかしながら、本足場の発明において用いられるカーボンナノチューブは、離散カーボンナノチューブの少なくとも７０％（全ナノチューブ組成物に基づいた重量）、より好ましくは８０％を超える、最も好ましくは９５％を超える、特に９９％またはそれ以上の離散カーボンナノチューブを含む。
【００４０】
離散カーボンナノチューブを含む幹細胞足場は、ポリマーをさらに含むことができる。ポリマーは、約１から約９９重量パーセントの範囲、好ましくは、約９０重量パーセント未満、より好ましくは、約５０重量パーセント未満、最も好ましくは、約１０重量パーセント未満の、離散カーボンナノチューブに対する濃度で変わり得る。
【００４１】
ポリマーは、生体適合性または生分解性である様々な天然、合成、および生合成ポリマーから選択される。Ｃ−Ｃ主鎖に基づくポリマーは、分解に抵抗する傾向があり、一方、ヘテロ原子−含有ポリマー主鎖は、生分解性を与える。したがって、生分解性は、その中でもとりわけ、ポリマーへの、無水物、エステル、またはアミド結合などの化学結合の慎重な付加により操作することができる。分解についての通常の機序は、加水分解または不安定なヘテロ原子結合の酵素的開裂により、その結果、ポリマー主鎖が切断されるものである。肉眼的生物は、ポリマーを食べるおそれがあり、時折それを消化するおそれがあり、また、機械的、化学的、または酵素的老化を開始する。加水分解性の化学結合を有する生分解性ポリマーは、生物医学、医薬品、農業、および包装の適用分野について広範に研究される。医療デバイスおよび制御薬物放出適用において用いられるために、生分解性ポリマーは、生体適合性であり、他の基準を満たして、バイオマテリアル処理可能であり、滅菌可能であり、生物学的条件に応答して、制御された安定性または分解が可能なものとして認定されなくてはならない。ポリマーそのものよりも、分解生成物の化学的性質が、しばしば、生体適合性に大きく影響する。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）に基づいたポリ（エステル）、およびそれらのコポリマーは、バイオマテリアルとして広範に使用されている。これらの材料の分解によって、対応するヒドロキシ酸を生成し、これらが、in vivoで安全に使用される。他の生分解性および環境分解性ポリマーには、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、例えば、ポリヒドロキシ酪酸−ポリヒドロキシ吉草酸クラスなど、追加のポリ（エステル）、および天然ポリマー、特に、修飾ポリ（サッカライド）、例えば、デンプン、セルロース、およびキトサンが含まれる。
【００４２】
離散カーボンナノチューブを含む足場の硬性は、ポリマーの選択、ポリマー対離散カーボンナノチューブ比および足場の密度に基づいて選択することができる。足場の硬性は、幹細胞が分化する細胞のタイプを決定することができる。
【００４３】
本発明に適用される幹細胞は、固有の特性、例えば、非分化、無限増殖および特定の細胞への分化の潜在性などを有する任意の幹細胞を含めて、制限されない。本発明において用いられる好ましい幹細胞は、２つのグループに分類される：多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞および胚性生殖細胞；ならびに多分化能幹細胞である。胚性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し、胚性生殖細胞は、５〜１０週齢の生殖堤中に存在する始原生殖細胞に由来する。多分化能幹細胞は、胚組織、胎児組織または成体（体性）幹細胞を含めた、成体組織において見出される。多能性幹細胞は、in vitroで無制限に増殖し、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）に分化する。予期せず、多分化能幹細胞は、これらの前駆組織に分化する能力を有し、これらの自己再生の効力は、制限される。多分化能幹細胞の発生源には、組織の任意のタイプ、特に、骨髄、血液、肝臓、皮膚、腸、脾臓、脳、足場筋および歯髄が含まれる。
【００４４】
好ましくは、本発明において用いられる幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、胚性生殖細胞および胚性癌細胞（embryonic carcinoma cell）であり、より好ましくは、胚性幹細胞および成体幹細胞である。
【００４５】
好ましくは、本発明の細胞療法用組成物は、幹細胞分化のためのインデューサーをさらに含む。インデューサーの好ましい例は、レチノイン酸、アスコルビン酸、メラトニンおよび様々な成長因子［例えば、ＧＤＮＦ（グリア細胞系由来神経栄養因子）、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）］を含む。幹細胞分化のためのインデューサーは、離散カーボンナノチューブの外部表面または内部表面と会合することができる。最も好ましくは、幹細胞分化のためのインデューサーは、制御された持続放出方式（controlled time-release manner）で離散カーボンナノチューブの表面から放出される。制御された持続放出の例としては、オープンエンドの離散カーボンナノチューブ内に幹細胞分化のためのインデューサー（inducer）を置き、インデューサー分子の拡散によって放出を可能にすることである。別の方法としては、ポリ乳酸−グリコール酸などの生体適合性または生分解性の材料内で離散カーボンナノチューブおよびインデューサー分子を封入することである。インデューサー分子は、生体適合性材料によって拡散することも、材料が生分解されるものとして放出することもできる。幅広い物質を制御可能に持続放出する多くの他の方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に組み込まれる。
【００４６】
本明細書に記載した幹細胞の足場は、繊維、フィルム、血小板、または球状粒子、もしくはそれらの組合せをさらに含むことができる。
【００４７】
離散カーボンナノチューブを含む幹細胞の足場は、幹細胞分化を方向づけるための伝導性の他の添加物、例えば、グラファイト、グラフェン、およびシリケート構造のような他の無機のタイプなど、ポリマー添加物（ほんの数例を挙げると、ポリプロピレン、ポリエチレン）、および天然物、例えば、絹またはＤＮＡ鎖をさらに含むことができる。
【００４８】
幹細胞の足場は、離散カーボンナノチューブ約０．１％〜１００％（体積）を有することができ、離散カーボンナノチューブが、好ましくは、約５％を超え、より好ましくは、約１０％を超え、最も好ましくは、約５０％を超え、特に、約９５％を超える。
【００４９】
幹細胞の足場は、離散カーボンナノチューブを含むことができ、離散カーボンナノチューブの長さは、一峰性分布、または多峰性分布（例えば、二峰性分布など）であり得る。多峰性分布は、長さの範囲（例えば、ある長さの範囲５０％および別の長さの範囲約５０％）を均等に分布することができる。分布はまた、非対称であり得、−離散ナノチューブの相対的に低いパーセントが、ある特定の長さを有することができ、より多い量が、別の長さを含むことができることを意味する。
【００５０】
幹細胞の足場は、離散カーボンナノチューブを含むことができ、離散カーボンナノチューブの直径は、一峰性分布、または多峰性分布（例えば、二峰性分布など）であり得る。多峰性分布は、直径の範囲（例えば、ある直径の範囲５０％から別の直径の範囲約５０％など）を均等に分布することができる。分布はまた非対称であり得る、すなわち、離散ナノチューブの相対的に低いパーセントが、ある特定の直径を有することができ、より多い量が、別の直径を含むことができることを意味する。
【００５１】
幹細胞の足場は、離散カーボンナノチューブを含むことができ、離散カーボンナノチューブは、官能基の組合せを含むことができる。一例としては、幹細胞の足場構造として離散カーボンナノチューブのネットワークを形成する目的で、カルボン酸基２重量％を有する離散カーボンナノチューブの一部が、アミン基２重量％を有する離散カーボンナノチューブの一部と混合される。別の例としては、幹細胞の足場構造として離散カーボンナノチューブのネットワークを形成する目的で、陰イオン性界面活性剤と接触させる離散カーボンナノチューブの一部が、陽イオン性界面活性剤と接触させる離散カーボンナノチューブの一部と混合される。カーボンナノチューブは、陰イオン性、陽イオン性または非イオン性界面活性剤と接触させることができる。陰イオン性界面活性剤の一例は、ドデシル硫酸ナトリウムである。陽イオン性界面活性剤の一例は、セチルトリメチルブロミドである。非イオン性界面活性剤の一例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、ブロックポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドである。
【００５２】
ＤＣＮＴを含む幹細胞を移植するための足場は、分化した幹細胞と周囲の細胞との間でネットワーク化する優れた足場特性を示す。ＤＣＮＴ幹細胞足場は、細胞密度および細胞間接着を改善するための細胞接着性の改善、および非細胞毒性を示す。ＤＣＮＴのかかる特徴は、移植された幹細胞と周囲の組織との間のネットワーク化の形成に寄与し、移植された幹細胞によって、これらの機能および効果を発揮することが可能になる。さらに、かかる特徴は、移植された幹細胞が洗い流されることを防ぐ。
【００５３】
特に、ＤＣＮＴを含む幹細胞を移植するための混合物は、流体の形態で、例えば、注射器を用いて容易に移植することができる。幹細胞は、離散カーボンナノチューブの分散に囲まれて、流体輸送中、例えば、インクジェットプリンターを用いて、幹細胞を保護することができる。
【００５４】
さらに、本発明の足場は、シリコーンと異なり、細胞の電気的／生理的作用を促進する。これに加えて、本発明において用いられるＤＣＮＴは、炎症性応答を低下させるという意味でいくつかの利点を有する（Shvedova AAら、Am.1.Physiol Lung Cell Mol Physiol、2005年、11月;289巻(5号):L698-708. Epub 2005年6月10日）。
【００５５】
ＤＣＮＴが、幹細胞と十分に混合され、目的とする部位に注入されるため、これによって、外科手技に伴う有害作用を減少させることができる。注入されたＤＣＮＴは、細胞間ネットワークの形成に適した構造を経時的に形成することができる。ＤＣＮＴの電気的導電率は、電気誘導によって目的とする部位にそれを送達することを可能にし、それによって、破壊された組織を有する部位で幹細胞の足場として働くことが可能になる。
【００５６】
本組成物によって治療される疾患または障害は、幹細胞療法によって治療することができるすべての疾患または障害を含む。好ましくは、本発明の細胞療法用組成物は、神経性疾患、心虚血傷害または心筋症、脊柱の傷害および変性鼻炎の治療に適用される。
【００５７】
好ましい実施形態によれば、本発明に含まれる幹細胞は、ニューロン幹細胞であり、本組成物は、神経性疾患を治療するためのものである。
【００５８】
細胞療法用組成物が、神経性疾患を治療するために用いられる場合、これらの疾患には、神経細胞の損傷によって引き起こされる任意の神経性疾患が含まれる。好ましくは、神経性疾患は、神経変性障害からなる群から選択される。より好ましくは、神経変性障害は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ニューロン運動疾患および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択され、最も好ましくは、パーキンソン病である。
【００５９】
ＤＣＮＴを含む幹細胞を移植するための足場が、注射器を用いて幹細胞で炭素ナノ粒子として容易に移植されるため、本発明の細胞療法用組成物は、懸濁液の形態で離散カーボンナノチューブを含むことが好ましい。
【００６０】
細胞療法用組成物中のＤＣＮＴの適当な量は、０．００２〜６０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、０．０１〜０．３ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００６１】
本発明の細胞療法用組成物では、薬学的に許容される担体は、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、セルロース）、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、食塩液、アルコール、アラビアゴム、シロップ、植物油（例えば、トウモロコシ油、綿実油、ラッカセイ油、オリーブ油、ヤシ油）、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油を含めた、配合物に慣習的なものであり得、それだけには限らないが、本発明の医薬組成物は、湿潤剤、滑沢剤、安定剤、またはこれらの物質の混合物をさらに含むことができる。適当な薬学的に許容される担体および配合物の詳細は、Reminglon's Pharmaceutical Sciences（第l9版、1995年）において見出すことができ、これを参照により本明細書に組み込む。
【００６２】
本発明の医薬組成物の正確な用量は、特定の配合物、適用のモード、患者の年齢、体重および性別、食事、投与時間、投与経路、患者の状態、排泄率、反応感受性などによって変わる。
【００６３】
当業者に公知の従来の技法に従って、本発明の細胞療法用組成物は、薬学的に許容される担体および／またはビヒクルと共に配合することができ、最終的に、単位剤形または複合単位剤形を含めた、いくつかの形態を提供する。剤形は、油性もしくは水性媒体中の溶液、懸濁液または乳剤ならびにさらに分散液または安定剤を含むことができる。
【００６４】
本発明の細胞療法用組成物は、移植された幹細胞と周囲の組織との間のネットワーク化の形成を促進し、移植された幹細胞によって、これらの機能および効果を十分に発揮させることが可能である。
【００６５】
足場の適用において離散カーボンナノチューブが関わる本発明の他の態様には、ＭＲまたはＤＣＮＴおよび少なくとも１種の活性薬物成分を含む制御された薬物送達系が含まれ、好ましくは、活性薬物成分は、体内のある特定の部位を標的とするＭＲまたはＤＣＮＴに付着させる物質（例えば、タンパク質）をさらに含む、かかる足場を含めた、ＭＲまたはＤＣＮＴの体積の実質的に範囲内にある。制御された薬物送達方法は、放射線、例えば、電磁放射線、熱放射または紫外線（例えば、磁気共鳴断層撮影、ＭＲＩ）などによって活性化することができる。
【００６６】
足場の適用の別の態様は、好ましくは、電磁放射線（例えば、ＭＲＩ）により活性化された、ＭＲまたはＤＣＮＴおよび生体適合性接着剤（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、リン酸カルシウム、またはポリウレタン）を含む骨接着組成物である。
【００６７】
ＭＲまたはＤＣＮＴを含む構造的な骨系および組成物、ＭＲまたはＤＣＮＴを含む神経修復ならびにＭＲもしくはＤＣＮＴの生体適合性のある被膜もまた、本発明の視野の範囲内である。これらの系および組成物は、放射線、例えば、電磁放射線、Ｘ線、赤外線または紫外線などによって活性化することができる。
【００６８】
足場の他に、本発明には、ＭＲまたはＤＣＮＴを含む幹細胞の成長および／または送達基質も含まれる。
【００６９】
離散カーボンナノチューブ足場はまた、フォーム（foam）または細胞構造を含むこともできる。
【００７０】
離散カーボンナノチューブ足場はまた、フィルムまたは繊維を含むこともできる。
【００７１】
離散カーボンナノチューブを含むフィルム、繊維またはフォーム（foam）構造はまた、組成物において異なる層を含むこともできる。例えば、テープにおいて、これらの層は、異なる量の離散カーボンナノチューブ、異なるタイプの離散カーボンナノチューブ、または異なる添加物もしくは添加物の濃度からなり得る。
【００７２】
幹細胞を分化するための有用な方法は、第１に、離散カーボンナノチューブを含む選ばれた足場、例えば、テープなどの中または上に幹細胞を置くステップと、幹細胞を培養して、分化した細胞成長の所望のタイプを創出するステップと、次いで、分化細胞を、生存実体に移植するステップとを含むことができる。
【００７３】
様々な実施形態では、複数のカーボンナノチューブは、アスペクト比が約１０から約５００、好ましくは、約４０から約２００であり、全（総）酸化レベルが、約１重量パーセントから約１５重量パーセント、好ましくは、約１重量パーセントから約１０重量パーセント、より好ましくは、約１重量パーセントから５重量パーセント、より好ましくは、約１重量パーセントから３重量パーセントである、単層、二層または多層のカーボンナノチューブ繊維を含むものが開示されている。酸化レベルは、酸化ナノチューブの総重量質量で割ったカーボンナノチューブに共有結合した、酸化された種の重量による量として定義される。カーボンナノチューブにおける酸化された種のパーセント重量の決定のための熱重量法では、乾燥した酸化カーボンナノチューブ約７〜１５ｍｇを利用し、乾燥窒素雰囲気中で５℃／分で、１００℃から７００℃まで加熱するものである。２００から６００℃までの百分率重量の喪失は、酸化された種のパーセント重量の喪失と考えられる。酸化された種はまた、フーリエ変換赤外分光法、ＦＴＩＲを用いて、特に、波長範囲１７３０〜１６８０ｃｍ−１で定量化することもできる。
【００７４】
カーボンナノチューブは、種を含有するカルボン酸またはカルボニル誘導体を含む酸化種を有することができ、塊としてからみ合ってない、本質的に離散した個別のナノチューブである。通常、酸化および剪断の過程を完了した後の離散カーボンナノチューブの量は、はるかに多数（すなわち、複数）であり、７０、８０、９０、またはさらに９９パーセントの離散カーボンナノチューブであり得るが、残りのチューブが、何らかの形でまだ部分的にからみ合っている。ナノチューブの個別化した離散チューブへの完全な転換（すなわち、１００パーセント）が、最も好ましい。カルボニル誘導体種は、フェノール、ケトン、４級アミン、アミド、エステル、アシルハロゲン、カルボキシル基、ヒドロキシル基、一価金属塩などを含むことができ、チューブの内表面と外表面との間で変わり得る。例えば、酸の１タイプを用いて、チューブ外部表面を酸化し、その後、水で洗浄し、剪断を誘導し、それによって、チューブを分解し、分離することができる。所望であれば、内側のチューブ層の酸化が本質的にない（好ましくは＜０．５％、より好ましくは０）、形成された離散チューブは、異なる酸化剤で、または、さらに異なる濃度におけるチューブの外層表面のために用いられるものと同じ酸化剤でさらに酸化することができ、その結果、内側および表面の酸化の異なる量、および／または異なるタイプ、になり得る。
【００７５】
ある実施形態では、内部表面酸化種含量（interior surface oxidized species content）は、２０％を超える、２５％を超える、３０％を超える、３５％を超える、４０％を超える、４５％を超える、５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９９％を超える、または１００％を超えるまで、外部表面酸化種含量（exterior surface oxidized species content）と異なり得る。他の実施形態では、内部表面酸化種含量は、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９５％未満、１００％未満まで、外部表面酸化種含量と異なり得る。
【００７６】
さらなる実施形態では、外部表面酸化種含量は、２０％を超える、２５％を超える、３０％を超える、３５％を超える、４０％を超える、４５％を超える、５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９９％を超える、または１００％を超えるまで、内部表面酸化種含量と異なり得る。他の実施形態では、外部表面酸化種含量は、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９５％未満、１００％未満まで、内部表面酸化種含量と異なり得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、平均の長さが９００ｎｍ、外径１０〜１５ｎｍおよび内径３〜６ｎｍである離散カーボンナノチューブは、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）が、チューブ１ｇ当たり約０．１ｍＭｏｌからチューブ１ｇ当たり約０．４ｍＭｏｌであり得る。ＯＨ基の濃度は、１ｇ当たり約０．１ｍＭｏｌから１ｇ当たり約０．４ｍＭｏｌであり得、ラクトンの濃度は、１ｇ当たり約０．０５ｍＭｏｌから１ｇ当たり約０．３ｍＭｏｌであり得る。総表面積は、１ｇ当たり２００ｍ２から１ｇ当たり２８０ｍ２であり得る。離散チューブの乾燥させた加圧マットのバルク導電率は、約１から６オームであり得る。離散チューブの密度は、１．８から１．９ｇ／ｃｍ２であり得る。
【００７８】
離散カーボンナノチューブ（ＤＣＮＴ）またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｂａｒ（ＭＲ）を製造する一般的な方法
製造の場合、繊維状の束または顆粒の形態のカーボンナノチューブは、異なる供給源から得て、離散カーボンナノチューブを製造することができる。しかしながら、本明細書において用いられる例の場合、ＣＮａｎｏ、Ｆｌｏｔｕｂｅ  ９０００グレードから得られた、からみ合ったカーボンナノチューブを用いる。Ｆｌｏｔｕｂｅ  ９０００カーボンナノチューブは、不純物が５重量％未満であり、その約４重量％またはそれ以下が、残留触媒である。カーボンナノチューブを構成する層の数は、約１０である。チューブの直径分布は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により約１３ｎｍである（本明細書中の後述の表では、約１２．５ｎｍの他のチューブ直径を列挙している）。カーボンナノチューブ製造業者は、製造技法に応じて、不純物の百分率がより高く、直径チューブ分布がより広くより大きくなり得る。カーボンナノチューブ直径および直径分布は、カーボンナノチューブを製造するために用いられる方法および触媒条件によって決定され、特徴付けることができる。他のカーボンナノチューブ製造業者には、Ａｒｋｅｍａ社およびＳｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が含まれる。
【００７９】
ＭＲを製造する方法から得られた離散カーボンナノチューブの長さおよび長さ分布は、からみ合ったまたは束になったカーボンナノチューブについての最初の触媒効率およびプロセス条件に一部で関連する。ＭＲプロセスでは、触媒部位、または高濃度のＳｔｏｎｅｓ−Ｗａｌｅｓ欠陥で、優先的に、からみ合ったまたは束になったカーボンナノチューブを切断する。より大型の直径のカーボンナノチューブは、一般に切断するのがより難しく、ＭＲプロセスから得られた非常に長い離散カーボンナノチューブは、直径がより大型になる傾向がある。好ましくは、離散カーボンナノチューブの末端の実質的にすべては、ＭＲ転換プロセス後に開く。
【００８０】
離散ＣＮＴを製造する方法
制御された高エネルギー分散型ミキサーと併せた、硝酸溶液（水中で、約６０重量％を超える濃度、好ましくは、６５％を超える硝酸濃度）を用いて、カーボンナノチューブを剥離する。代替の酸化方法、例えば、混合された酸系（例えば、硝酸および硫酸）を用いることができるが、単一の酸系は、その後のろ過および酸化速度の制御を改善し、このことが今度はプロセスの操作性を改善する。カーボンナノチューブのより高い濃度によって使用が可能になるその低い粘性（室温で１センチポアズ）のため、硝酸の使用がやはり好ましい。
【００８１】
離散カーボンナノチューブを製造するためのある例示的な方法は、次の通りである。６５％超の硝酸中に１．２重量％の（ＣＮａｎｏ、Ｆｌｏｔｕｂｅ  ９０００グレードから得られた）カーボンナノチューブ（ＣＮＴ’ｓ）の１６リットル混合物を、直径３４ｍｍのソニトロード（ｓｏｎｉｔｒｏｄｅ）を用いた１０００ワットＨｅｉｌｓｈｅｒ cellによって、１．５ｌ／分でポンピングする。背圧は、３０ｐｓｉであり、振幅を８５％で設定し、記録されるワットは、５００〜６００である。１６リットルすべてを、細胞全体にポンピングした後、ＣＮＴスラリを戻して流出させ、例えば、光学顕微鏡法および／またはＵＶ吸収により試験された通り、ＣＮＴ’ｓが、所望の規格に剥離されるまで、本プロセスを繰り返す。酸化の程度は、いくつかの試験、例えば、Ｏ１ｓ分光測定、エネルギー分散Ｘ線および熱重量分析によって測定することができる。
【００８２】
次いで、酸および離散カーボンナノチューブ混合物をろ過し、３を超えるｐＨまで洗浄する。カルボン基およびヒドロキシル基の定量を、水酸化ナトリウム溶液を用いて滴定により決定することができる。
【００８３】
酸化の程度および混合の強度が変わることにより製造した離散カーボンナノチューブの長さの測定の一例を、表１に示す。
【００８４】
【表１】
2019510586.tif 000002
【００８５】
条件１は、平均の長さが短い、狭い分布の例である。条件２は、平均の長さが短い、広い分布の例である。条件３は、平均の長さが大きく広い分布の例である。
【００８６】
添加物を含めることができ、本配合物の他の構成成分とさらに反応させることも、完全に不活性にすることもできる。繊維状の添加物は、周囲と反応させるために界面活性があってもよい。チューブの長さを決定するために、チューブのサンプルを、イソプロピルアルコール中で希釈し、３０分間超音波処理する。次いで、これを、シリカウェーハーに堆積させ、ＳＥＭにより１５ｋＶおよび２０，０００×倍率で撮像する。異なる位置で３つの像を撮影する。（ＳＥＭによって含まれる）ＪＥＯＬソフトウェアを利用して、各像上に最小２本の線を引き、この線を交差するチューブの長さを測定する。
【００８７】
歪度は、確率分布の非対称の測度である。正の値は、分布ヒストグラムの右側の尾部が左側よりも長く、逆の場合もあることを意味する。正の歪度が好ましく、これは、チューブの長さがより長いことを意味することを示す。ゼロの値は、平均値の両側における相対的に均等な分布を意味する。尖度は、分布曲線の形状の測度であり、一般に、正規分布に関連する。歪度も尖度も単位はない。
【００８８】
次の表は、離散カーボンナノチューブ直径の代表的な値を示す。
【００８９】
【表２】
2019510586.tif 000003
【００９０】
カーボンナノチューブは、種（species）を含有するカルボン酸またはカルボニル誘導体を含む酸化種を有することができ、塊としてからみ合ってない、本質的に個別化した離散したナノチューブである。通常、酸化および剪断の過程を完了した後の離散カーボンナノチューブの量は、はるかに多数（すなわち、複数）であり、７０、８０、９０、またはさらに９９パーセントの離散カーボンナノチューブであり得るが、残りのチューブは、何らかの形でまだ部分的にからみ合っている。ナノチューブの個別化した離散チューブへの完全な転換（すなわち、１００パーセント）が、最も好ましい。カルボニル誘導体種は、フェノール、ケトン、４級アミン、アミド、エステル、アシルハロゲン、カルボキシル基、ヒドロキシル基、一価金属塩などを含むことができ、チューブの内表面と外表面の間で変わり得る。例えば、酸の１タイプを用いて、チューブ外部表面を酸化し、その後、水で洗浄し、剪断を誘導し、それによって、チューブを分解し、分離することができる。所望であれば、内側のチューブ層の酸化が本質的にない（好ましくは＜０．５％、より好ましくは０）、形成された離散チューブは、異なる酸化剤で、さらに、異なる濃度におけるチューブの外層表面のために用いられるものと同じ酸化剤でさらに酸化することができ、その結果、内側および表面の酸化の異なる量、および／または異なるタイプ、になり得る。
【００９１】
ある実施形態では、内部表面酸化種含量は、２０％を超える、２５％を超える、３０％を超える、３５％を超える、４０％を超える、４５％を超える、５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９９％を超える、または１００％を超えるまで、外部表面酸化種含量と異なり得る。他の実施形態では、内部表面酸化種含量は、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９５％未満、１００％未満まで、外部表面酸化種含量と異なり得る。
【００９２】
さらなる実施形態では、外部表面酸化種含量は、２０％を超える、２５％を超える、３０％を超える、３５％を超える、４０％を超える、４５％を超える、５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９９％を超える、または１００％を超えるまで、内部表面酸化種含量と異なり得る。他の実施形態では、外部表面酸化種含量は、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９５％未満、１００％未満まで内部表面酸化種含量と異なり得る。
【００９３】
いくつかの実施形態では、平均の長さが９００ｎｍ、外径１０〜１５ｎｍおよび内径３〜６ｎｍである離散カーボンナノチューブは、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）が、チューブ１ｇ当たり約０．１ｍＭｏｌからチューブ１ｇ当たり約０．４ｍＭｏｌであり得る。ＯＨ基の濃度は、１ｇ当たり約０．１ｍＭｏｌから１ｇ当たり約０．４ｍＭｏｌであり得、ラクトンの濃度は、１ｇ当たり約０．０５ｍＭｏｌから１ｇ当たり約０．３ｍＭｏｌであり得る。総表面積は、１ｇ当たり２００ｍ２から１ｇ当たり２８０ｍ２であり得る。離散チューブの乾燥させた加圧マットのバルク導電率は、約１から６オームであり得る。離散チューブの密度は、１．８から１．９ｇ／ｃｍ２であり得る。
【００９４】
標的化された酸化を有する離散カーボンナノチューブを生成する一般的な方法
カーボンナノチューブ０．５重量％から５重量％、好ましくは、３重量％の混合物を、ＣＮａｎｏ  Ｆｌｏｔｕｂｅ  ９０００グレードカーボンナノチューブおよび６５％硝酸で調製する。撹拌しながら、酸およびカーボンナノチューブ混合物を、２から４時間７０から９０℃まで加熱する。次いで、形成された、酸化されたカーボンナノチューブを、酸混合物から単離する。遠心、ろ過、機械的な発現、デカントおよび他の固体−液体分離技法を含むがそれだけに限らない、いくつかの方法を用いて、酸化されたカーボンナノチューブを単離することができる。次いで、酸化されたカーボンナノチューブを、ｐＨ３から４まで、水性媒体、例えば、水、好ましくは、脱イオン水を用いて洗浄することにより、残留酸を除去する。次いで、カーボンナノチューブを、濃度０．５重量％から４重量％、好ましくは、１．５重量％で水に懸濁する。溶液に、エネルギー密度１０６から１０８ジュール／ｍ３を生成することが可能である工程装置による剪断（乱流）および／またはキャビテーションによって生成される極めて破壊的な力にかける。本明細書に合う装置は、それだけには限らないが、ウルトラソニケーター、キャビテーター、メカニカルホモジナイザー、圧力式ホモジナイザーおよびマイクロフルイダイザーを含む（表４）。かかる１種のホモジナイザーは、米国特許第７５６，９５３号明細書で示され、その開示を参照により本明細書に組み込む。剪断プロセシング後、酸化されたカーボンナノチューブは、離散および個別化したカーボンナノチューブである。通常、からみ合った、受け入れた状態のままおよび出来上がった状態のままのカーボンナノチューブの所与の開始量に基づき、複数の酸化された離散カーボンナノチューブは、少数のチューブで、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７５％、最も好ましくは、少なくとも約９５％および１００％まで本過程によって生じ、通常、かなり少数のチューブは、からみ合ったままである、または完全に個別化されない。
【００９５】
離散カーボンナノチューブを生成するための別の例示的な方法は、次の通りである。カーボンナノチューブ０．５重量％から５重量％、好ましくは、３重量％の混合物を、ＣＮａｎｏ  Ｆｌｏｔｕｂｅ  ９０００グレードカーボンナノチューブならびに硫酸３重量部（硫酸９７％および水３％）および硝酸１重量部（硝酸６５〜７０パーセント）からなる酸混合物で調製する。混合物を、３〜４時間撹拌しながら、室温で保持する。次いで、形成された、酸化されたカーボンナノチューブを、酸混合物から単離する。遠心、ろ過、機械的な発現、デカントおよび他の固体−液体分離技法を含むがそれだけに限らない、いくつかの方法を用いて、酸化されたカーボンナノチューブを単離することができる。次いで、酸化されたカーボンナノチューブを、ｐＨ３から４まで、水性媒体、例えば、水、好ましくは、脱イオン水を用いて洗浄することにより、酸を除去する。次いで、酸化されたカーボンナノチューブを、濃度０．５重量％から４重量％、好ましくは、１．５重量％で水に懸濁する。溶液に、エネルギー密度１０６から１０８ジュール／ｍ３を生成することが可能である工程装置による剪断（乱流）および／またはキャビテーションによって生成される極めて破壊的な力にさらされる。本明細書に合う装置は、それだけには限らないが、ウルトラソニケーター、キャビテーター、メカニカルホモジナイザー、圧力式ホモジナイザーおよびマイクロフルイダイザーを含む（表４）。
【００９６】
最小酸酸化（ＭＡＯ）
本出願は、最小酸酸化（minimal acid oxidation）を用いたカーボンナノチューブの製造の新規な方法を開示する。Ｂｏｓｎｙａｋらの様々な特許（例えば、米国特許第８４７５９６１号明細書、米国特許第８９９３１６１号明細書および米国特許第９０６５１３２号明細書、そのそれぞれの開示を、参照により本明細書に組み込む）および特許出願において以前に記載されている通り、カーボンナノチューブ酸酸化は、酸中の２〜４重量％ＣＮＴの濃度で、カーボンナノチューブの酸懸濁液によって行われる。酸化後、酸は、固体／流体分離、例えば、ろ過などのいくつかの手段により除去される。酸の量は、６０％から７０％までの範囲で除去され、約３０％から４０％が廃棄物になる。遠心は、１０％まで廃棄物を減少することができる；しかしながら、遠心は、高価および手のかかる方法である。
【００９７】
ＭＡＯ方法では、反応過程におけるカーボンナノチューブの濃度は、増加する。高ＣＮＴ濃度の硝酸（濃度６５％）混合物、例えば、硝酸中のＣＮＴ４３重量％などを用いると、流動性粉末の予期しないコンシステンシーを有する。酸化過程が完了した場合、酸は、除去されないが、水で希釈され、次いで、洗浄過程中、ろ過される。これによって、酸の回収のために酸ろ過のステップが除かれる。洗浄過程における廃棄された酸の量は、反応中ナノチューブを少なくし、より多くの酸を利用する過程よりも有意に少ない。
【００９８】
最小酸酸化（ＭＡＯ）は、過剰な酸を除去するために湿潤粉末過程を用いる。ＭＡＯ方法では、硝酸（濃度６５％）をＣＮＴと混合して、酸に対してＣＮＴを４３．２重量％の濃度にする、。次いで、これを、９０℃まで加熱させる。金属の酸化および除去の量は、反応の時間および温度により制御される。表４は、例示的な例である。硝酸廃棄物は、ＭＡＯ方法を利用している場合、７０％酸除去効率を有するＣＮＴの重量の９．６倍または９０％酸除去効率を有するＣＮＴの重量の３．２倍と比較して、ＣＮＴの重量の１．３倍に過ぎないことに留意する。これは、ＣＮＴの質量当たりの廃棄酸の量を減少させ、廃棄処理を減少させ、酸ステップのろ過を除去することにより、生成のコストを有意に下げる。
【００９９】
【表３】
2019510586.tif 000004
【０１００】
廃棄物を削減する他に、ＭＡＯ方法は、チューブからの同じ量の金属不純物を除去し、チューブの長さ、チューブの長さ分布およびほどき品質は、より高い酸方法と同じである。３つのスケールアップされた実験室における生成を実施し、ＭＡＯによって、高酸方法（より高い量の酸によるＭＡＯｖ．１．９％Ｏｘで２．５９、２．９９、４．０１％Ｏｘ）と比較して、カーボンナノチューブの酸化の百分率が高くなる。したがって、非効率的な実験室の混合と相対的に同等に、ＭＡＯによって、再現可能な酸化をもたらし、温度および時間の制御により、酸化の量および除去された残留金属の量は、制御される。ＭＡＯにより生成されたカーボンナノチューブは、同じ種類の官能基を有し、酸化の増加によって、種は変化しないが、各種の官能基の量ｍｍ／ｇは増加する。ＭＡＯは、酸ろ過を除き、廃棄される酸の量を低減し、酸化パーセントのより大きな制御を与え、酸化の増加を達成し、少ない時間で残留物を低減することによる利点を提供する。ＭＡＯにおける酸化の増加によって、さらなる下流の化学修飾も可能になる。
【０１０１】
様々な実施形態では、複数のカーボンナノチューブは、アスペクト比が約１０から約５００、好ましくは、約４０から約２００であり、全（総）酸化レベルが、約１重量パーセントから約１５重量パーセント、好ましくは、約１重量パーセントから約１０重量パーセント、より好ましくは、約１重量パーセントから５重量パーセント、より好ましくは、約１重量パーセントから３重量パーセントである、単層、二層、または多層のカーボンナノチューブ繊維を含むものが開示されている。酸化レベルは、酸化ナノチューブの総重量質量で割ったカーボンナノチューブに共有結合した、酸化された種の重量による量として定義される。カーボンナノチューブにおける酸化された種のパーセント重量の決定のための熱重量法では、乾燥した酸化カーボンナノチューブ約７〜１５ｍｇを利用し、乾燥窒素雰囲気中で５℃／分で、１００℃から７００℃まで加熱するものである。２００から６００℃までの百分率重量の喪失は、酸化された種のパーセント重量の喪失と考えられる。酸化された種はまた、フーリエ変換赤外分光法、ＦＴＩＲを用いて、特に、波長範囲１７３０〜１６８０ｃｍ−１で定量化することもできる。
【０１０２】
カーボンナノチューブは、種を含有するカルボン酸またはカルボニル誘導体を含む酸化種を有することができ、塊としてからみ合ってない、本質的に個別化した離散したナノチューブである。通常、酸化および剪断の過程を完了した後の離散カーボンナノチューブの量は、はるかに多数（すなわち、複数）であり、７０、８０、９０、または、さらに９９パーセントの離散カーボンナノチューブであり得るが、残りのチューブが、何らかの形でまだ部分的にからみ合っている。ナノチューブの個別化した離散チューブへの完全な転換（すなわち、１００パーセント）が、最も好ましい。カルボニル誘導体種は、フェノール、ケトン、４級アミン、アミド、エステル、アシルハロゲン、カルボキシル基、ヒドロキシル基、一価金属塩などを含むことができ、チューブの内表面と外表面の間で変わり得る。例えば、酸の１タイプを用いて、チューブ外部表面を酸化し、その後、水で洗浄し、剪断を誘導し、それによって、チューブを分解し、分離することができる。所望であれば、内側のチューブ層の酸化が本質的にない（好ましくは＜０．５％、より好ましくは０）、形成された離散チューブは、異なる酸化剤で、または、さらに異なる濃度におけるチューブの外層表面のために用いられるものと同じ酸化剤でさらに酸化し、その結果、内側および表面の酸化の異なる量−および／または異なるタイプ−をもたらし得る。
【０１０３】
ある実施形態では、内部表面酸化種含量は、２０％を超える、２５％を超える、３０％を超える、３５％を超える、４０％を超える、４５％を超える、５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９９％を超える、または１００％を超えるまで、外部表面酸化種含量と異なり得る。他の実施形態では、内部表面酸化種含量は、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９５％未満、１００％未満まで、外部表面酸化種含量と異なり得る。
【０１０４】
さらなる実施形態では、外部表面酸化種含量は、２０％を超える、２５％を超える、３０％を超える、３５％を超える、４０％を超える、４５％を超える、５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９９％を超える、または１００％を超えるまで、内部表面酸化種含量と異なり得る。他の実施形態では、外部表面酸化種含量は、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９５％未満、１００％未満まで、内部表面酸化種含量と異なり得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、平均の長さ９００ｎｍ、外径１０〜１５ｎｍおよび内径３〜６ｎｍである離散カーボンナノチューブは、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）が、チューブ１ｇ当たり約０．１ｍＭｏｌからチューブ１ｇ当たり約０．４ｍＭｏｌであり得る。ＯＨ基の濃度は、１ｇ当たり約０．１ｍＭｏｌから１ｇ当たり約０．４ｍＭｏｌであり得、ラクトンの濃度は、１ｇ当たり約０．０５ｍＭｏｌから１ｇ当たり約０．３ｍＭｏｌであり得る。総表面積は、１ｇ当たり２００ｍ２から１ｇ当たり２８０ｍ２であり得る。離散チューブの乾燥させた加圧マットのバルク導電率は、約１から６オームであり得る。離散チューブの密度は、１．８から１．９ｇ／ｃｍ２であり得る。
【０１０６】
剪断および／またはキャビテーションプロセシング後、酸化されたカーボンナノチューブによって、離散カーボンナノチューブが酸化される。通常、所与の開始量のからみ合った、受け入れた状態のままおよび出来上がった状態のままのカーボンナノチューブに基づき、複数の酸化された離散カーボンナノチューブは、少数のチューブで、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７５％、最も好ましくは、少なくとも約９５％および１００％まで本過程によって生じ、通常、かなり少数のチューブは、からみ合ったままである、または完全に個別化されない。
【実施例】
【０１０７】
[実施例１]
ＭＷＣＮＴとしてからみ合った状態での酸化−３時間（ｏＭＷＣＮＴ−３）
６４％超の硝酸１００ミリリットルを８５℃まで加熱する。酸に、受け入れた状態のままの多層のカーボンナノチューブ（Ｃ９０００、ＣＮａｎｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３グラムを加える。受け入れた状態のままのチューブは、羊毛のからみ合ったボールの形態である。酸およびカーボンナノチューブの混合物は、混合しながら溶液を８５℃で３時間維持し、「ｏＭＷＣＮＴ−３」と称する。反応期間の終了時、ｏＭＷＣＮＴ−３をろ過して、酸を除去し、逆浸透（ＲＯ）水でｐＨ３〜４まで洗浄する。酸処理後、カーボンナノチューブは、依然としてからみ合ったボールである。チューブを６０℃で恒量まで乾燥する。
【０１０８】
[実施例２]
ＭＷＣＮＴとしてからみ合った状態での酸化−６時間（ｏＭＷＣＮＴ−６）
６４％超の硝酸１００ミリリットルを８５℃まで加熱する。酸に、受け入れた状態のままの多層のカーボンナノチューブ（Ｃ９０００、ＣＮａｎｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３グラムを加える。受け入れた状態のままのチューブは、羊毛のからみ合ったボールの形態である。酸およびカーボンナノチューブの混合物は、混合しながら溶液を８５℃で６時間維持し、「ｏＭＷＣＮＴ−６」と称する。反応期間の終了時、ｏＭＷＣＮＴ−６をろ過して、酸を除去し、逆浸透（ＲＯ）水でｐＨ３〜４まで洗浄する。酸処理後、カーボンナノチューブは、依然としてからみ合ったボールである。チューブを６０℃で恒量まで乾燥する。
【０１０９】
[実施例３]
離散カーボンナノチューブ−最外層を酸化する（ｏｕｔ−ｄＭＷＣＮＴ）
容器中、６４％硝酸９２２キログラムを８３℃まで加熱する。酸に、受け入れた状態のままの多層のカーボンナノチューブ（Ｃ９０００、ＣＮａｎｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）２０キログラムを加える。混合物を混合し、８３℃で３時間維持する。３時間後、酸を、ろ過により除去し、カーボンナノチューブをＲＯ水でｐＨ３〜４まで洗浄する。酸処理後、カーボンナノチューブは、オープンエンドがほとんどない、依然としてからみ合ったボールである。チューブの外側が酸化して様々な酸化種を形成するが、ナノチューブの内側は、酸への曝露がほとんどないためほとんど酸化されない。次いで、酸化されたカーボンナノチューブを、濃度１．５重量％でＲＯ水に懸濁する。ＲＯ水および酸化したからみ合ったナノチューブ溶液に、エネルギー密度１０６から１０８ジュール／ｍ３を生成することが可能である工程装置による剪断（乱流）および／またはキャビテーションにより生成された極めて破壊的な力をかける。得られたサンプルは、「ｏｕｔ−ｄＭＷＣＮＴ」と称し、これは、酸化された外層および離散の「ｄ」を表す。この剪断に合う装置には、それだけに限らないが、ウルトラソニケーター、キャビテーター、メカニカルホモジナイザー、圧力式ホモジナイザー、およびマイクロフルイダイザーが含まれる（表４）。剪断および／またはキャビテーションプロセシングは、普通なら６員炭素環であるＣＮＴ構造中の特に欠陥での分解によりチューブの末端の分解および開口をもたらす機械的な手段によって、酸化されたカーボンナノチューブをほどき離散化すると考えられる。欠陥は、６員炭素環でないチューブ中の場所で起こる。これが水中で行われるとき、離散カーボンナノチューブの内部表面で酸化は起こらない。
【０１１０】
[実施例４]
離散カーボンナノチューブ−外層および内層の酸化（ｏｕｔ／ｉｎ−ｄＭＷＣＮＴ）
離散カーボンナノチューブの内部を酸化するために、ｏｕｔ−ｄＭＷＣＮＴ３グラムを、８５℃まで加熱した６４％硝酸に加える。溶液を混合し、温度で３時間維持する。この時間中、硝酸は、カーボンナノチューブの内部表面を酸化する。３時間の終了時に、チューブをろ過して、酸を除去し、次いで、ＲＯ水でｐＨ３〜４まで洗浄する。このサンプルは、「ｏｕｔ／ｉｎ−ｄＭＷＣＮＴ」と称し、外層および内層の酸化および離散の「ｄ」を表す。
【０１１１】
カーボンナノチューブのサンプルの酸化を、熱重量分析法を用いて決定する。本実施例では、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ５０  Ｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＧＡ）を用いる。乾燥したカーボンナノチューブのサンプルを、振動ボールミルを用いて粉砕する。ＴＧＡの質量既知の白金製皿中で、粉砕したカーボンナノチューブ７〜１５ｍｇを加える。測定プロトコールは、次の通りである。窒素環境下で、温度を、１分当たり１０℃の速度で室温から１００℃まで上昇させ、この温度で４５分間保持することにより、残留水の除去を可能にする。次に、温度を、１分間当たり５℃の速度で７００℃まで上昇させる。本過程中、重量パーセントの変化を、温度および時間の関数として記録する。すべての値を、１００℃等温式中の残留水除去に伴う任意の変化について正規化する。カーボンナノチューブの酸素の重量パーセント（％Ｏｘ）を、２００℃でのパーセント重量の変化から、６００℃でのパーセント重量の変化を減じることにより決定する。
【０１１２】
比較表（以下の表５）により、外側のみ（バッチ１、バッチ２、およびバッチ３）、または外側および内側の両方（バッチ４）のいずれかが酸化されているカーボンナノチューブの異なるバッチの酸化のレベルを示す。バッチ１（上記実施例１で製造されたｏＭＷＣＮＴ−３）は、バッチが、依然としてからみ合った形態である場合の、外側のみ酸化されたからみ合ったカーボンナノチューブのバッチである（表５、１列目）。バッチ２（上記実施例２で製造されたｏＭＷＣＮＴ−６）はまた、バッチが、依然としてからみ合った形態である場合の、外側のみ酸化されたからみ合ったカーボンナノチューブのバッチである（表５、２列目）。バッチ１（２．０４％Ｏｘ）およびバッチ２（２．０６％Ｏｘ）の平均の酸化パーセントは、本質的に同じである。バッチ１（酸に３時間曝露）とバッチ２（酸に６時間曝露）との間の差が、カーボンナノチューブがバッチ２において２倍の長さの時間、酸に曝露されたということであるため、これによって、酸にさらに曝露しても、カーボンナノチューブの表面における酸化の量が増加しないことが示される。
【０１１３】
バッチ３（上記実施例３で製造されたＯｕｔ−ｄＭＷＣＮＴ）は、バッチが、依然としてからみ合った形態である場合の、外側のみ酸化されたからみ合ったカーボンナノチューブのバッチである（表５、３列目）。次いで、バッチ３は、さらにいかなる酸化もせずに、カーボンナノチューブの離散したバッチになっている。バッチ３は、からみ合ったカーボンナノチューブを離散ナノチューブにすることが酸化に及ぼす効果を調べるための、対照サンプルとして働く。バッチ３は、バッチ１およびバッチ２と本質的に同じ平均酸化レベル（１．９９％Ｏｘ）を示す。したがって、バッチ３は、カーボンナノチューブをほどき水中でこれらを離散させると、内部を酸化させずにチューブの末端を開くということを示す。
【０１１４】
最後に、バッチ４（明細書中の本実施例４で製造されたＯｕｔ／Ｉｎ−ｄＭＷＣＮＴ）は、バッチが、依然としてからみ合った形態である場合の、外側で酸化され、次いで、バッチがカーボンナノチューブの離散したバッチになった後、再度酸化された、からみ合ったカーボンナノチューブのバッチである（表５、４列目）。この離散カーボンナノチューブはオープンエンドであるため、バッチ４において酸は、チューブの内部に入り、内側表面を酸化させる。バッチ４では、バッチ１、バッチ２およびバッチ３と比較して、平均の酸化のレベルの有意な上昇を示す（２．３９％Ｏｘ）。バッチ４における平均酸化レベルの有意な上昇は、これらの内側表面におけるカーボンナノチューブの追加の酸化を表す。したがって、バッチ４についての平均酸化レベル（２．３９％Ｏｘ）は、バッチ３の平均の酸化レベル（１．９９％Ｏｘ）より、約２０％高い。以下の表５では、酸化の平均値は、チューブの４つのバッチについて反復して示される。酸化パーセントは、バッチ１、バッチ２およびバッチ３についての標準偏差の範囲内である。
【０１１５】
【表４】
2019510586.tif 000005
【０１１６】
【表５】
2019510586.tif 000006
【０１１７】
幹細胞の足場を製造する方法
離散カーボンナノチューブ、生体適合性ポリマーおよび幹細胞の懸濁液。組成物３の長さ分布および酸化種２重量％を有する離散カーボンナノチューブ（１グラム）を、室温の水（９８グラム）およびポリビニルアルコール１グラム（Ａｌｄｒｉｃｈ社、８８％が加水分解、分子量３１〜７０ＫＤａ）と混合する。混合物のｐＨを、水酸化ナトリウムを用いて約ｐＨ７に調整する。混合物を、ソニケーター浴中で３０分間超音波処理する。水（１リットル当たりおよそ１×１０９細胞）中の幹細胞の混合物１００グラムを、離散カーボンナノチューブ混合物に加えて、安定した混合物を形成する。混合物をガラス表面に堆積させて、分化した幹細胞の増殖物を培養することができる。混合物はまた、皮下注射用注射器によって動物の中に配置することもできる。混合物が、実質的に同じ位置に留まる場合、皮下注射用注射器または別の設置方法によって配置した後混合物を定着させて、配置された場所から移動しないことを考慮する。いくつかの実施形態では約１０％未満の混合物が配置された場所から著しく移動し、その他では約５％未満、その他では約３％未満、さらにその他の実施形態では約１％未満の混合物が配置された場所から著しく移動する。混合物の組成物、設置の位置、および設置の周囲の状況に応じて、著しい移動は、１０センチメートルを超える、または５センチメートルを超える、または３センチメートルを超える、または１センチメートルを超える、または５ミリメートルを超える、または１ミリメートルを超える移動を示し得る。
【０１１８】
医薬品を含める方法
オープンエンドの一部を有する離散カーボンナノチューブを、ｐＨ６になるまで洗浄し、真空中で４時間８０℃で乾燥する。乾燥した離散カーボンナノチューブ（１ｇ）を、レチノイン酸０．０５ｇ（ビタミンＡ酸としても公知）を含有する無水エタノール（１００ｇ）に加える。混合物を、５０℃で３０分間超音波処理し、次いで、室温まで冷却する。レチノイン酸が吸着した離散カーボンナノチューブをろ過し、乾燥する。レチノイン酸を有する離散カーボンナノチューブ１グラムを、ｐＨ約７の水９８グラムおよびポリビニルアルコール１グラム（Ａｌｄｒｉｃｈ社、８８％が加水分解、分子量３１〜７０ＫＤａ）と室温で混合し、水浴で３０分間超音波処理して、レチノイン酸を含有する離散カーボンナノチューブの安定した分散液を得る。水中の幹細胞の混合物１００グラム（１リットル当たりおよそ１×１０９細胞）を、レチノイン酸を含有する離散カーボンナノチューブ混合物に加える。混合物をガラス表面上に堆積させて、分化した幹細胞の増殖物を培養することができる。混合物はまた、皮下注射用注射器によって動物の中に配置することもできる。
【０１１９】
実施形態
本明細書に開示される詳細な実施形態は以下が含まれる。
１．幹細胞を移植するための足場であって、離散カーボンナノチューブを含み、細胞毒性を示さない、足場。
２．離散カーボンナノチューブが、乾燥した離散カーボンナノチューブの少なくとも約１重量パーセントの量の官能基を含む、実施形態１の足場。
３．複数の離散カーボンナノチューブが、オープンエンドである、実施形態１の足場。
４．複数の離散カーボンナノチューブが、触媒残留物を実質的に除去する、実施形態１の足場。
５．複数の離散カーボンナノチューブが、４マイクロメートル未満、好ましくは、３マイクロメートル未満、より好ましくは、２マイクロメートル未満の長さを有する、実施形態１の足場。
６．複数の離散カーボンナノチューブが、長さ分布のモダリティを有し、好ましくは、二峰性である、実施形態５の足場。
７．ポリマーをさらに含む、実施形態１の足場。
８．ポリマーが、細胞毒性を示さないポリマーの群から選択される、実施形態７の足場。
９．ポリマーが、生分解性であるポリマーの群から選択される、実施形態７の足場。
１０．ポリマーが、水溶性であるポリマーの群から選択される、実施形態７の足場。
１１．離散カーボンナノチューブが、離散カーボンナノチューブの表面への生物学的部分の親和性を増大させる官能基を含む、実施形態１の足場。
１２．（ａ）幹細胞；および（ｂ）細胞毒性がなく、幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含む、幹細胞療法のための組成物。
１３．幹細胞が、胚性幹細胞または成体幹細胞である、実施形態１２に記載の組成物。
１４．幹細胞がニューロン幹細胞であり、組成物が神経性疾患を治療するためのものである、実施形態１２に記載の組成物。
１５．神経性疾患が、神経変性障害からなる群から選択される、実施形態１４に記載の組成物。
１６．神経変性障害が、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、実施形態１５に記載の組成物。
１７．離散カーボンナノチューブが、懸濁液の形態である、実施形態１２に記載の組成物。
１８．配置された場所から移動しないように、体組織中に堆積させることができる、実施形態１２に記載の組成物。
１９．安定であり得、組織を形成して、損傷したまたは欠けている体組織および部分を修復することができる三次元の形状を形成するように堆積させることができる、実施形態１２に記載の組成物。
２０．離散カーボンナノチューブが、体組織の一部として体組織に取り込むことができる、実施形態１２に記載の組成物。
２１．組成物の位置決めを決定するために、電磁場により検出することができる、実施形態１２に記載の組成物。
２２．組織成長を助けるためにゆっくりと放出することができる抗生物質または鎮痛剤または成長刺激薬を含有することができる、実施形態１２に記載の組成物。
２３．（ａ）幹細胞；および（ｂ）細胞毒性がなく、幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含む、幹細胞療法のための組成物を動物に投与するステップを含む、幹細胞を用いた細胞療法の方法。
２４．幹細胞が、胚性幹細胞または成体幹細胞である、実施形態１８に記載の細胞療法の方法。
２５．幹細胞がニューロン幹細胞であり、組成物が神経性疾患を治療するためのものである、実施形態１８に記載の細胞療法の方法。
２６．神経性疾患が、神経変性障害からなる群から選択される、実施形態２０に記載の細胞療法の方法。
２７．神経変性障害が、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、実施形態１８に記載の細胞療法の方法。
２８．虚血再灌流障害が、虚血性脳卒中である、実施形態１８に記載の細胞療法の方法。
２９．離散カーボンナノチューブが、懸濁液の形態である、実施形態１８に記載の細胞療法の方法。
３０．細胞療法用の医薬品を製造するための、（ａ）幹細胞；および（ｂ）細胞毒性がなく、幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含む、組成物の使用。
３１．幹細胞が、胚性幹細胞または成体幹細胞である、実施形態２５に記載の使用。
３２．幹細胞がニューロン幹細胞であり、組成物が神経性疾患を治療するためのものである、実施形態２５に記載の使用。
３３．神経性疾患が、神経変性障害からなる群から選択される、実施形態２７に記載の使用。
３４．神経変性障害が、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、神経性運動疾患および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、実施形態２８に記載の使用。
３５．離散カーボンナノチューブが、懸濁液の形態である、実施形態２５に記載の使用。
３６．幹細胞療法用の足場および幹細胞が、医薬品をさらに含む、実施形態１２の組成物。
３７．足場が、フォーム（foam）、繊維またはフィルムの形態である、実施形態１２の組成物。
３８．足場が、多層を含む、実施形態１２の組成物。
３９．離散カーボンナノチューブの少なくとも一部が配向している、実施形態１の足場。
４０．ポリマーが、足場の約１から約９９重量パーセントの範囲、好ましくは、約９０パーセント未満、より好ましくは、約５０パーセント未満および最も好ましくは、約１０パーセント未満を占める、実施形態７の足場。
４１．幹細胞を、離散カーボンナノチューブを含む足場に入れることにより、損傷から幹細胞を保護する方法。
４２．注入または堆積中、幹細胞を、離散カーボンナノチューブを含む足場に入れることにより、損傷から幹細胞を保護する方法。
４３．幹細胞分化のためのインデューサーをさらに含む、実施形態１２の組成物。
４４．異なる官能基を有する離散ナノチューブの混合物を混合することにより、足場を形成する方法であって、混合後、ナノチューブが、官能基の互いのタイプと会合する、方法。
４５．界面活性剤をさらに含む、実施形態１の足場。
４６．組織、または骨のための接着剤として用いられる、実施形態１の足場。
４７．ポリマーが、タンパク質、ペプチド、長鎖炭水化物、プロテオグリカン、および脂質からなる生物学的ポリマーの群から選択される、実施形態７の足場。
４８．ポリマーが、部分的に消化または修飾される、実施形態４３の足場。
４９．細胞外マトリックスの構成に実質的に類似した構成成分を有する、実施形態４３の足場。
５０．ポリマーが、病変または細胞損傷の部位に足場を固定する抗体である、実施形態４３の足場。
５１．バイオポリマーが、走化性、創傷治癒、フィブロネクチン、インテグリン、またはフィブリンを含む、細胞外マトリックスを産生するタンパク質からなる群から選択される、実施形態４３の足場。
５２．ポリマーが、患者から回収されて、免疫学的な攻撃から足場を保護する、実施形態４３の足場。
５３．ポリマーが、アルブミン、α−フェトグロブリン、およびα−アルブミンからなるタンパク質の群から選択される、実施形態４８の足場。
５４．用いられる幹細胞が、患者から組織サンプルを用いて成長する（個別化医療）、実施形態１２の組成物。
５５．幹細胞が、移植前に分化する、実施形態１２の組成物。
５６．離散カーボンナノチューブが、内部表面および外部表面を含み、各表面が、内部表面酸化種含量および外部表面酸化種含量を含む、実施形態１の足場。
５７．内部表面酸化種含量が、外部表面酸化種含量より少ない、実施形態５７の組成物。
５８．内部表面酸化種含量が、外部表面酸化種含量を超える、実施形態５７の組成物。
５９．内部表面酸化種含量が、外部表面酸化種含量を少なくとも９９％を超える、実施形態５７の組成物。
６０．外部表面酸化種含量が、内部表面酸化種含量を少なくとも９９％を超える、実施形態５７の組成物。
６１．内部表面酸化種含量および外部表面酸化種含量が、カーボンナノチューブ重量に基づき、合計で約５７から約９重量パーセントであり、離散カーボンナノチューブが、複数のオープンエンドチューブを含む、実施形態５７の組成物。
６２．離散カーボンナノチューブが、多層のカーボンナノチューブである、実施形態５７の組成物。
６３．酸化種が、カルボン酸、フェノール、アルデヒド、ケトン、ヒドロキシル、カルボン、エーテル結合、およびそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態５７の組成物。
６４．内部表面酸化種含量および外部表面酸化種含量の総酸化種含有量が、カーボンナノチューブの約１％から１５重量％を占める、実施形態５７の組成物。
【０１２０】
上記の説明は、本出願を実行するための方法を当業者に教示する目的のためであり、すべてのこれらの明らかなその修正および変形を詳述することを目的とせず、この説明を読んだ後、当業者には明らかとなろう。しかしながら、かかるすべての明らかな修正および変形は、本出願の範囲内に含まれることを目的とし、これらは、次の特許請求の範囲によって定義される。これらの特許請求の範囲は、文脈が反することを特に示さない限り、特許請求された構成物およびそこで意図された目的を満たすために有効である任意の順序におけるステップを包含することを目的としている。
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月6日(2018.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を移植するための足場であって、
前記足場は、離散カーボンナノチューブを含み、細胞毒性を示さず、
前記離散カーボンナノチューブは、内部表面および外部表面を含み、前記内部表面が内部表面酸化種含量を有し、前記内部表面が内部表面酸化種含量を有し、
前記内部表面酸化種含量は、前記外部表面酸化種含量より少ない、前記足場。
【請求項２】
前記離散カーボンナノチューブが、乾燥した離散カーボンナノチューブの少なくとも約１重量パーセントの量の官能基を含む、請求項１に記載の足場。
【請求項３】
複数の前記離散カーボンナノチューブがオープンエンドである、請求項１に記載の足場。
【請求項４】
複数の前記離散カーボンナノチューブが触媒残留物を実質的に除去する、請求項１に記載の足場。
【請求項５】
ポリマーをさらに含む請求項１に記載の足場。
【請求項６】
前記離散カーボンナノチューブが、前記離散カーボンナノチューブの表面への生物学的部分の親和性を増大させる官能基を含む、請求項１に記載の足場。
【請求項７】
（ａ）少なくとも１種の幹細胞、および（ｂ）細胞毒性のない幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含む幹細胞療法のための組成物であって、
前記離散カーボンナノチューブは、内部表面および外部表面を含み、前記内部表面が内部表面酸化種含量を有し、前記内部表面が内部表面酸化種含量を有し、
前記内部表面酸化種含量は、前記外部表面酸化種含量より少ない、前記組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１種の幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、またはその組合せを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１種の幹細胞がニューロン幹細胞を含み、前記組成物が神経性疾患を治療するためのものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記神経性疾患が、神経変性障害からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記離散カーボンナノチューブが懸濁液の形態である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
配置された場所から移動しないように、体組織中に堆積させることができる請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
安定であり、組織を形成して、損傷したまたは欠けている体組織または部分を修復することができる三次元の形状を形成するように堆積させることができる請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物の位置決めを決定するのを支援するために、電磁場により検出することができる請求項７に記載の組成物。
【請求項１５】
組織成長を助けるために制御可能に持続放出することができる、抗生物質、鎮痛剤、成長刺激薬、またはそれらの組合せを含む請求項７に記載の組成物。
【請求項１６】
幹細胞を用いた細胞療法の方法であって、幹細胞療法のための組成物を動物に投与するステップを含み、前記組成物は、（ａ）少なくとも１種の幹細胞、および（ｂ）細胞毒性のない幹細胞の足場として働く離散カーボンナノチューブを含み、
前記離散カーボンナノチューブは、内部表面および外部表面を含み、前記内部表面が内部表面酸化種含量を有し、前記内部表面が内部表面酸化種含量を有し、
前記内部表面酸化種含量は、前記外部表面酸化種含量より少ない、前記方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１種の幹細胞がニューロン幹細胞であり、前記組成物が神経性疾患を治療するためのものである、請求項１６に記載の細胞療法の方法。
【請求項１８】
前記離散カーボンナノチューブが懸濁液の形態である、請求項１６に記載の細胞療法の方法。
【請求項１９】
医薬品をさらに含む請求項７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記内面酸化種含量および前記外面酸化種含量が、カーボンナノチューブ重量に基づき、合計で約１から約９重量パーセントである、請求項７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記離散カーボンナノチューブが、複数のオープンエンドチューブを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項２２】
前記離散カーボンナノチューブが、多層のカーボンナノチューブである、請求項７に記載の組成物。
【請求項２３】
前記内面酸化種含量および前記外面酸化種含量の総酸化種含量が、カーボンナノチューブの約１％から１５重量％を占める、請求項７に記載の組成物。
【国際調査報告】
2019510586.tif 000007