(57)【要約】【課題】機能的なジストロフィンの不在下において、機械的ストレスは、筋細胞膜の破裂につながり、カルシウムの筋線維内部への制御不能な流入をもたらすことによって、カルシウム活性化プロテアーゼ及び繊維壊死を引き起こす。【解決手段】  本開示は、細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子の修飾方法を提供する。本開示は、細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子を修飾する組成物及びキットをさらに提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子の修飾方法であって、
ａ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、又は前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び
ｂ）前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに対応する第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、又は前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸（前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、前記変異ジストロフィン遺伝子のイントロン４４内で標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、前記変異ジストロフィン遺伝子のイントロン５５内で標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含む）、
を前記細胞に導入することを含み、
前記導入することは、エクソン４５〜５５を含む前記変異ジストロフィン遺伝子の３３０キロベースを超える領域の欠失をもたらす、
前記方法。
【請求項２】
前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質であり、前記対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡが、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、又はＣ２ｃ２タンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１５５〜１１５９のいずれかに記載の１７ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１５０〜１１５４及び配列番号１２２３〜１２６９のいずれかに記載の２０ヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１７５〜１１７９のいずれかに記載の１７ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３、６、又は７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１７０〜１１７４及び配列番号１３１８〜１３６５のいずれかに記載の２０ヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、１７ヌクレオチド配列ＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５８）を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、１７ヌクレオチド配列ＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７７）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、２０ヌクレオチド配列ＧＵＵＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５３）を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、２０ヌクレオチド配列ＵＧＵＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７２）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
イントロン４４内の前記標的配列とイントロン５５内の前記標的配列が、互いに５００ｋｂ以上離れている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
イントロン４４内の前記標的配列とイントロン５５内の前記標的配列が、互いに７００ｋｂ以上離れている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、インビトロである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、エクスビボである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、インビボである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、筋細胞又は周皮細胞である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記筋細胞が、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、幹細胞である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記幹細胞が、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、前記導入後に、前記細胞を個体に移植するステップを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞は、前記個体に対して自己由来である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子を修飾するキットであって、
（ｉ）第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、又は前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、前記ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４に対応する第１の標的配列と１７以上の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有するガイド配列を含む）、及び
（ｉｉ）第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、前記ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５に対応する第２の標的配列と１７以上の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有するガイド配列を含む）、
を含み、
前記第１及び第２の標的配列は、互いに３３０ｋｂ以上離れている
前記キット。
【請求項２４】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１５５〜１１５９のいずれかに記載の１７ヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１５０〜１１５４及び配列番号１２２３〜１２６９のいずれかに記載の２０ヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１７５〜１１７９のいずれかに記載の１７ヌクレオチド配列を含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１７０〜１１７４及び配列番号１３１８〜１３６５のいずれかに記載の２０ヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、１７ヌクレオチド配列ＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５８）を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、１７ヌクレオチド配列ＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７７）を含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２９】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、２０ヌクレオチド配列ＧＵＵＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５３）を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、２０ヌクレオチド配列ＵＧＵＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７２）を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、前記ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４に対応する標的配列と２０の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有し、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、前記ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５に対応する標的配列と２０の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有する、請求項２３に記載のキット。
【請求項３１】
イントロン４４に対応する前記標的配列とイントロン５５に対応する前記標的配列が、
互いに５００ｋｂ以上離れている、請求項２３又は３０に記載のキット。
【請求項３２】
イントロン４４内の前記標的配列とイントロン５５内の前記標的配列が、互いに７００ｋｂ以上離れている、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、又は前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む、請求項２３〜３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３４】
前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡが、Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡである、請求項２３〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡが、単一分子ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡである、請求項２３〜３５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３７】
個体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法であって、
ａ）前記個体から得られた細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子を修飾することであって、前記方法は、
ｉ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、又は前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び
ｉｉ）前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに対応する第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、又は前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸（前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、前記変異ジストロフィン遺伝子のイントロン４４内で標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、前記変異ジストロフィン遺伝子のイントロン５５内で標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含む）、を前記細胞にインビトロで導入することを含み、
前記導入することは、エクソン４５〜５５を含む前記変異ジストロフィン遺伝子の３３０キロベースを超える領域の欠失をもたらし、
それによって、修飾細胞を作製する、前記修飾すること、及び
ｂ）前記修飾細胞を前記個体における治療部位に又はその近くに導入すること
を含む、前記方法。
【請求項３８】
前記細胞が、筋細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、周皮細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記筋細胞が、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が、幹細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記幹細胞が、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記個体が、ヒトである、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質であり、前記対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡが、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、又はＣ２ｃ２タンパク質である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１５５〜１１５９のいずれかに記載の１７ヌクレオチド配列を含む、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１５０〜１１５４及び配列番号１２２３〜１２６９のいずれかに記載の２０ヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１７５〜１１７９のいずれかに記載の１７ヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１７０〜１１７４及び配列番号１３１８〜１３６５のいずれかに記載の２０ヌクレオチド配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、１７ヌクレオチド配列ＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５８）を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、１７ヌクレオチド配列ＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７７）を含む、請求項３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、２０ヌクレオチド配列ＧＵＵＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５３）を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、２０ヌクレオチド配列ＵＧＵＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７２）を含む、請求項３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
イントロン４４内の前記標的配列とイントロン５５内の前記標的配列が、互いに５００ｋｂ以上離れている、請求項３７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
イントロン４４内の前記標的配列とイントロン５５内の前記標的配列が、互いに７００ｋｂ以上離れている、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１６年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／２９４，０９０号の利益を主張し、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号Ｐ３０  ＡＲ０５７２３０及びＲ０１ＡＲ０６４３２７、ならびに米国国立科学財団による助成金番号ＤＧＥ−１１４４０８７の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組込み
配列表を、テキストファイル「ＵＣＬＡ−１４７ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として本明細書と共に提供し、これは、２０１７年２月６日に作製され、サイズは、７，９２２ＫＢである。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
ジストロフィンは、筋線維において重要な構造上の役割を果たし、細胞外マトリックスと細胞骨格を結び付ける。Ｎ末端領域はアクチンと結合する一方、Ｃ末端は、ジストロフィン糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の一部であり、筋細胞膜に延びている。機能的なジストロフィンの不在下において、機械的ストレスは、筋細胞膜の破裂につながり、カルシウムの筋線維内部への制御不能な流入をもたらすことによって、カルシウム活性化プロテアーゼ及び繊維壊死を引き起こす。
【０００５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、ジストロフィンの発現の欠陥によってもたらされる。ジストロフィンをコードする遺伝子は、ＤＮＡの２００万超のヌクレオチドにわたって広がる７９のエクソンを含有する。エクソンのリーディングフレームを変化させるか、もしくは終止コドンを導入するか、又は全アウトオブフレームエクソン（複数可）の除去、又は１つ以上のエクソンの重複によって特徴付けられる、任意のエクソンの変異は、機能的ジストロフィンの生成を撹乱する可能性を有し、ＤＭＤをもたらす。ＤＭＤ遺伝子のフレームシフトは、短縮型の非機能的ジストロフィンタンパク質の生成をもたらし、進行性の筋消耗及び筋力低下をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子の修飾方法を提供する。本開示は、細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子を修飾する組成物及びキットをさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子の修飾方法を提供し、本方法は、ａ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、又はクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及びｂ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに対応する第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、又は第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を細胞に導入することを含み、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、変異ジストロフィン遺伝子のイントロン４４内で標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、変異ジストロフィン遺伝子のイントロン５５内で標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含んで、当該導入することは、エクソン４５〜５５を含む変異ジストロフィン遺伝子の３３０キロベースを超える領域の欠失をもたらす。ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質であり、対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、又はＣ２ｃ２タンパク質である。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１５５〜１１５９のいずれかに記載される１７ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１５０〜１１５４のいずれかに記載される２０ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１７５〜１１７９のいずれかに記載される１７ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１７０〜１１７４のいずれかに記載される２０ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、１７ヌクレオチド配列ＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５８）を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、１７ヌクレオチド配列ＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７７）を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、２０ヌクレオチド配列ＧＵＵＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５３）を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲ���Ａ）のガイド配列は、２０ヌクレオチド配列ＵＧＵＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７２）を含む。ある場合には、イントロン４４内の標的配列とイントロン５５内の標的配列は、互いに５００ｋｂ以上離れている。ある場合には、イントロン４４内の標的配列とイントロン５５内の標的配列は、互いに７００ｋｂ以上離れている。ある場合には、細胞は、インビトロである。ある場合には、細胞は、エクスビボである。ある場合には、細胞は、インビボである。ある場合には、細胞は、筋細胞である。ある場合には、筋細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来である。ある場合には、細胞は、幹細胞である。ある場合には、幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。ある場合には、細胞は、周皮細胞である。ある場合には、細胞は、２型の周皮細胞である。ある場合には、細胞は、筋幹細胞である。ある場合には、細胞は、筋原前駆細胞である。ある場合には、方法は、導入ステップ後、細胞を個体（例えば、ＤＭＤを有する個体）に移植するステップを含む。ある場合には、細胞は、個体に対して自己由来である。幹細胞がｉＰＳ細胞である場合、ある場合には、方法は、導入ステップ後、ｉＰＳ細胞を誘発して、筋細胞に分化させるステップを含む。幹細胞がｉＰＳ細胞である場合、ある場合には、方法は、導入ステップ後、ｉＰＳ細胞を誘発して、筋細胞に分化させるステップ、及び分化筋細胞を個体（例えば、ＤＭＤを有する個体）に移植するステップを含む。
【０００８】
本開示は、細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子を修飾するキットを提供し、キットは、（ｉ）ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４に対応する標的配列と１７以上の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有するガイド配列を含む第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）、及び（ｉｉ）ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５に対応する標的配列と１７以上の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有するガイド配列を含む第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）を含み、イントロン４４内の標的配列とイントロン５５内の標的配列は、互いに３３０ｋｂを超えて離れている。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１５５〜１１５９のいずれかに記載される１７ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１５０〜１１５４のいずれかに記載される２０ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１７５〜１１７９のいずれかに記載される１７ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１７０〜１１７４のいずれかに記載される２０ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、１７ヌクレオチド配列ＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５８）を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、１７ヌクレオチド配列ＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７７）を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、２０ヌクレオチド配列ＧＵＵＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５３）を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、２０ヌクレオチド配列ＵＧＵＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７２）を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４に対応する標的配列と２０の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有し、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５に対応する標的配列と２０の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有する。ある場合には、イントロン４４に対応する標的配列とイントロン５５に対応する標的配列は、互いに５００ｋｂ以上離れている。ある場合には、イントロン４４内の標的配列とイントロン５５内の標的配列は、互いに７００ｋｂ以上離れている。ある場合には、キットは、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、又はクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む。ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質である。ある場合には、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。ある場合には、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、単一分子ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡである。
【０００９】
本開示は、個体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法を提供し、本方法は、ａ）個体から得られた細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子を修飾すること、ｉ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、又はクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及びｉｉ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに対応する第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、又は第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を細胞にインビトロで導入することであって、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、変異ジストロフィン遺伝子のイントロン４４内で標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、変異ジストロフィン遺伝子のイントロン５５内で標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含み、当該導入することは、エクソン４５〜５５を含む変異ジストロフィン遺伝子の３３０キロベースを超える領域の欠失をもたらすことで、それにより修飾細胞を作製すること、及びｂ）修飾細胞を個体における治療部位に又はその近くに導入すること、又は修飾細胞を個体全体に導入することを含む。ある場合には、治療部位は、筋肉内又はその周辺である。ある場合には、修飾細胞を全身に導入することは、修飾細胞の静脈内投与を含む。ある場合には、細胞は、筋細胞である。ある場合には、細胞は、周皮細胞である。ある場合には、筋細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来である。ある場合には、細胞は、幹細胞である。ある場合には、幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。ある場合には、個体は、ヒトである。ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質であり、対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、又はＣ２ｃ２タンパク質である。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列は、配列番号１１５５〜１１５９のいずれかに記載される１７ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列は、配列番号１１５０〜１１５４のいずれかに記載される２０ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列は、配列番号１１７５〜１１７９のいずれかに記載される１７ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列は、配列番号１１７０〜１１７４のいずれかに記載される２０ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列は、１７ヌクレオチド配列ＧＡＡＡＵＵＡＡ���ＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５８）を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列は、１７ヌクレオチド配列ＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７７）を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列は、２０ヌクレオチド配列ＧＵＵＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５３）を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列は、２０ヌクレオチド配列ＵＧＵＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７２）を含む。ある場合には、イントロン４４内の標的配列とイントロン５５内の標的配列は、互いに５００ｋｂ以上離れている。ある場合には、イントロン４４内の標的配列とイントロン５５内の標的配列は、互いに７００ｋｂ以上離れている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ株の生成を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、エクソン４５〜５５欠失を有するＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ株の生成を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、２９３ＦＴ細胞におけるｇＲＮＡ活性及びエクソン４５〜５５欠失を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、ＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣにおけるサーベイヤーアッセイによる切断を示すｇＲＮＡを示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、ＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣにおける対合ｇＲＮＡのヌクレオフェクションの効果を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、フレーム再構成されたＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ株の特徴付けを示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、フレーム再構成されたＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞及び骨格筋細胞におけるジストロフィン発現を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｆは、フレーム再構成されたＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞及び骨格筋細胞のインビトロ及びインビボ機能を示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、ＣＲＩＳＰＲプラットフォームのｈＤＭＤマウスへのインビボエレクトロポレーションを示す。
【図１０】試験したガイドＲＮＡ（例えば、図２３に提供される表２を参照されたい）、及び期待欠失サイズ（「総欠失距離」）の概略図を示す。
【図１１】２９３Ｔ細胞において種々のガイドＲＮＡ対を有するゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。
【図１２】２９３Ｔ細胞において種々のガイドＲＮＡ対のゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。
【図１３】ｉＰＳＣ細胞において種々のガイドＲＮＡ対のゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。
【図１４】ｉＰＳＣ細胞において種々のガイドＲＮＡ対のゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。
【図１５】ｉＰＳＣ細胞において種々のガイドＲＮＡ対のゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。
【図１６】ｉＰＳＣ細胞において種々のガイドＲＮＡ対のゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。
【図１７】ガイドＲＮＡ対のゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。
【図１８】ガイドＲＮＡ対のゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。
【図１９】ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における変異ジストロフィン遺伝子のイントロン４４内の標的配列のガイドＲＮＡ又はイントロン５５内の標的配列のガイドＲＮＡを用いた切断活性を示す。
【図２０】サーベイヤーアッセイによる切断を示す、変異ジストロフィン遺伝子のイントロン４４を標的にするガイドＲＮＡを示す。
【図２１】種々のガイドＲＮＡ対のゲノム欠失を示すゲルを示す。
【図２２】サーベイヤーアッセイによる切断を示す、変異ジストロフィン遺伝子のイントロン５５を標的にするガイドＲＮＡを示す。
【図２３】ヒト細胞における変異ジストロフィン遺伝子のゲノム欠失を達成するように使用することができる、ガイドＲＮＡのガイド配列、及び標的配列の非相補鎖の例を提供する表２を提供する。
【図２４】ヒト細胞における変異ジストロフィン遺伝子のゲノム欠失を達成するように使用することができる、ガイドＲＮＡのガイド配列、及び標的配列の非相補鎖の例を提供する表９を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本明細書で互換的に使用する、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。従って、本用語は、非限定的に、一本鎖、二本鎖、又は多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基又は他の天然の、化学的に又は生物学的に修飾された、人工の、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有するポリマーを含む。
【００１２】
「ハイブリダイズできる」又は「相補的な」又は「実質的に相補的な」という用語は、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が、非共有結合、すなわち、ワトソン・クリック型塩基対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を形成すること、配列特異、非平行、温度及び溶液のイオン強度が適切なインビトロ及び／又はインビボ条件下での方法（すなわち、相補的核酸に特異的に結合する核酸）における別の核酸への「アニール」又は「ハイブリダイゼーション」を可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。標準的ワトソン・クリック型塩基対には、チミジン（Ｔ）と対を成すアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）と対を成すアデニン（Ａ）、及びシトシン（Ｃ）と対を成すグアニン（Ｇ）［ＤＮＡ、ＲＮＡ］を含む。さらに、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間でのハイブリダイゼーション、及びＤＮＡ分子とＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーション（例えば、ＤＮＡ標的核酸がガイドＲＮＡと塩基対を形成する場合など）に対しては、グアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）とも塩基対を形成することができる。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対は、ｍＲＮＡにおけるコドンと塩基対を成すｔＲＮＡアンチコドンの脈絡において、その遺伝子コードの縮退（すなわち、冗長性）に対して部分的に対応している。従って、本開示の文脈において、（例えば、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二本鎖）の、ガイドＲＮＡと塩基対を形成する標的核酸の、など）グアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）及びアデニン（Ａ）の両方と相補的であると考えられる。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対が、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重分子）の所与のヌクレオチドの位置で形成できる場合、その位置は、非相補的であるとみなされず、代わりに相補的であるとみなされる。
【００１３】
ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、それらの中の、特に１１章及び表１１．１、及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００１）に例示されている。温度及びイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
【００１４】
ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的配列を含むことが必要であるが、塩基間の不一致も可能である。２つの核酸間でのハイブリダイゼーションに適切な条件は、その核酸の長さ、相補性の度合い、当該技術分野で公知の変動要因に依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補性度合いが大きいほど、それら配列を有する核酸ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）の値は大きい。相補性の長さが短い（例えば、３５以下の、３０以下の、２５以下の、２２以下の、２０以下の、１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）核酸間のハイブリダイゼーションに対しては、ミスマッチの位置が重要になり得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，１１．７−１１．８を参照されたい）。通常、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、８ヌクレオチド以上（例えば、１０ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、２２ヌクレオチド以上、２５ヌクレオチド以上、又は３０ヌクレオチド以上）である。温度、洗浄液の塩濃度、及び他の条件は、相補領域の長さ及び相補性の度合いなどの要因により必要に応じて調整されてよい。
【００１５】
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能である又はハイブリダイズ可能であるために、標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要はないことが理解される。さらに、ポリヌクレオチドは、介在又は隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象（例えば、バルジ、ループ構造、又はヘアピン構造など）に関与しないように、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズし得る。ポリヌクレオチドは、それがハイブリダイズする標的核酸配列内の標的領域に対して６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列相補性を含むことができる。例えば、アンチセンス化合物の２０ヌクレオ塩基のうちの１８が、標的領域と相補的であり、従って、特異的にハイブリダイズするであろうアンチセンス化合物は、９０％の相補性を示すであろう。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドでクラスター化又は散在され得、相互又は相補的ヌクレオ塩基に隣接する必要はない。核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間の相補性パーセンテージは、任意の好都合な方法を用いて判定することができる。方法の例としては、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局在配置探査ツール）及びパワーＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０、Ｚｈａｎｇ及びＭａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）のアルゴリズムを利用し、デフォルト設定を使用したＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）などが挙げられる。
【００１６】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用し、及び任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を示し、コードされた及び非コードのアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導されたアミノ酸、及び修飾されたペプチドのバックボーンを有するポリペプチドを含むことができる。
【００１７】
本明細書で使用する「結合している」（例えば、ポリペプチドのＲＮＡ結合ドメイン、標的核酸への結合などを指して）は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸の間、Ｃａｓ９タンパク質／ガイドＲＮＡ複合体と標的核酸の間など）の非共有性相互作用を指す。非共有性相互作用の状態にある間、それらの高分子は、「会合している」又は「相互作用している」又は「結合している」といわれる（例えば、分子Ｘが、分子Ｙと相互作用しているといわれる場合、非共有的な方法で、分子Ｘは、分子Ｙに結合する）。結合相互作用の全ての成分が、配列特異性である必要は無いが（例えば、ＤＮＡバックボーンのリン酸残基と接触する）、結合相互作用のある部分は、配列特異性であり得る。結合相互作用は、一般的に、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、又は１０−１５Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）により特徴付けられる。「親和性」は、結合の強さを指し、増加した結合親和性は、低いＫＤと相関する。
【００１８】
「結合ドメイン」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質ドメインを意味する。結合ドメインは、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合ドメイン）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合ドメイン）及び／又はタンパク質分子（タンパク質結合ドメイン）に結合することができる。タンパク質結合ドメインを有するタンパク質の場合、ある場合には、それ自身（ホモダイマー、ホモトリマーなど）に結合することができ及び／又は異なるタンパク質又は複数タンパク質の１つ以上の領域に結合することができる。
【００１９】
「保存アミノ酸置換」という用語は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群、セリン及びスレオニンからなる脂肪族水酸基側鎖を有するアミノ酸の群、アスパラギン及びグルタミンからなるアミド含有側鎖を有するアミノ酸の群、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる芳香族側鎖を有するアミノ酸の群、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる塩基性側鎖を有するアミノ酸の群、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる酸性側鎖を有するアミノ酸の群、及びシステイン及びメチオニンからなる硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群である。例示的な保存アミノ酸置換基には、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン−グリシン、及びアスパラギン−グルタミンがある。
【００２０】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、別のポリヌクレオチド又はポリペプチドに対してある特定のパーセントの「配列同一性」を有し、それは、並べた際に、その２つの配列を比較すると、そのパーセンテージの塩基又はアミノ酸が同じであること、及び同じ相対位置にあることを意味する。配列同一性は、いくつかの異なる方法により判断することができる。配列同一性を判断するために、配列を種々の従来の方法及びコンピュータープログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｔ−ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴなど）で整列することができ、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｌｉ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｔｃｏｆｆｅｅ／、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／、ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／を含むサイトで、ワールドワイドウェブを通じて利用できる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｉ．２１５：４０３−１０を参照されたい。
【００２１】
特定のＲＮＡを「コード」するＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしてよく（従って、ＤＮＡ及びｍＲＮＡは両方ともタンパク質をコードする）、又はＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、「非コード」ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡなど）をコードしてもよい。
【００２２】
「タンパク質コード配列」又は特定のタンパク質又はポリペプチドをコードする配列とは、適切な調整配列の制御下に置かれた場合、インビトロ又はインビボでｍＲＮＡに転写され（ＤＮＡの場合）及びポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）、核酸配列である。そのコード配列の境界は、５’末端（Ｎ末端）での開始コドン及び３’末端（Ｃ末端）での転写停止のノンセンスコドンにより決定される。コード配列には、非限定的に、原核生物又は真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成核酸を含むことができる。転写終了配列は、通常はそのコード配列の３’に位置しているであろう。
【００２３】
本明細書で互換的に使用する「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」という用語は、非コード配列（例えば、ガイドＲＮＡ）、又はコード配列（例えば、Ｃａｓ９タンパク質などのクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）の転写をもたらす及び／もしくは調節する、及び／又はコードされたポリペプチドの翻訳を調節する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写及び翻訳の制御配列を指す。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３’方向）コード又は非コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本開示の目的のために、プロモーター配列は、そのその３’末端で転写開始部位と境をなし、最低限の塩基又は背景より高く検出可能なレベルで転写開始するのに必要な最低限のエレメントを含むように、上流（５’方向）に伸長する。プロモーター配列内に、転写開始部位、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは多くの場合、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含む。誘導性プロモーターを含む種々のプロモーターが、本発明の種々のベクターを誘導するために使用されてよい。
【００２５】
核酸、ポリペプチド、細胞、又は生命体に適用される、本明細書で使用する「自然発生」又は「非修飾」又は「野生型」という用語は、自然界に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、又は生命体を指す。例えば、自然の供給源から単離でき及び研究室でヒトにより意図的に修飾されていない生命体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、野生型（及び自然発生）である。
【００２６】
核酸又はポリペプチドに適用される、本明細書で使用する「キメラ」という用語は、異なる供給源由来の構造により定義される２つの要素を指す。例えば、「キメラ」が、キメラポリペプチド（例えば、キメラＣａｓ９タンパク質）の文脈で使用される場合、そのキメラポリペプチドは、異なるポリペプチド由来のアミノ酸配列を含む。キメラポリペプチドは、修飾された又は自然発生のポリペプチド配列（例えば、修飾された又は非修飾のＣａｓ９タンパク質由来の第１のアミノ酸配列、及び第２のアミノ酸配列、例えば、Ｃａｓ９の別の種由来の配列、Ｃａｓ９タンパク質以外のタンパク質由来の配列など）のいずれかを含み得る。同様に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの文脈における「キメラ」は、異なるコード領域由来のヌクレオチド配列（例えば、修飾された又は非修飾のＣａｓ９タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＣａｓ９タンパク質以外のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列）を含む。
【００２７】
「キメラポリペプチド」という用語は、通常、ヒトの介入を通じてアミノ配列の２つの別々のセグメントの組み合わせ（すなわち、「融合」）により作られる、ポリペプチドを指す。キメラアミノ酸配列を含むポリペプチドは、キメラポリペプチドである。
【００２８】
本明細書で使用する「異種」は、天然の核酸又はタンパク質の各々には見出されないヌクレオチド又はポリペプチド配列を意味する。例えば、キメラＣａｓ９タンパク質において、自然発生の細菌Ｃａｓ９ポリペプチド（又はそれらの変異体）のＲＮＡ結合ドメインは、異種ポリペプチド配列（すなわち、Ｃａｓ９以外のタンパク質由来のポリペプチド配列又は別の生命体由来のポリペプチド配列）に融合されてよい。異種ポリペプチドは、活性（例えば、酵素活性）を示してもよく、キメラＣａｓ９タンパク質によっても示される（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）。異種核酸配列は、キメラポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチド配列を生成するために、自然発生の核酸配列（又はそれらの変異体）に（例えば、遺伝子工学によって）連結されてよい。別の例として、融合変異体Ｃａｓ９ポリペプチドにおいて、変異体Ｃａｓ９ポリペプチドは、異種ポリペプチド（すなわち、Ｃａｓ９以外のポリペプチド）に融合されてよく、その異種ポリペプチドは、融合変異体Ｃａｓ９ポリペプチドによっても示される活性を示す。異種核酸配列を、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を生成するために、変異体Ｃａｓ９ポリペプチドに（例えば、遺伝子工学によって）連結されてよい。
【００２９】
本明細書で使用する「組換え」は、特定の核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）が、自然系に見出される内因性核酸と区別できる、構造的コード又は非コード配列を有するコンストラクトをもたらすクローニング、制限、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び／又は、ライゲーションステップの種々の組み合わせの産物であることを意味する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、細胞又は無細胞の転写及び翻訳系に含まれる、組換え転写ユニットから発現され得る合成核酸を与えるように、断片又は一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができる。該当する配列を含むゲノムＤＮＡも、組換え遺伝子又は転写ユニットの形成に使用できる。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームからの５’又は３’に存在し、そのような配列は、コード領域の操作又は発現と干渉せず、実際、種々のメカニズムにより所望の産物の生成を調整するように作用する。あるいは、翻訳されないＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列も、組換えであるとみなされ得る。従って、例えば、「組換え」核酸という用語は、自然には発生しないもの、例えば、人間が介在した２つの別の配列セグメントの人工的な組み合わせより作られたものを指す。この人工的組み合わせは、化学的な合成手段、又は核酸の単離セグメントの人工的な操作のいずれかにより、例えば、遺伝子組換え技術により、多くの場合行われる。通常、そのような方法は、コドンを同じアミノ酸、保存アミノ酸、又は非保存アミノ酸をコードするコドンと入れ替えて行われる。あるいは、所望の機能の組み合わせを生成するように、所望の機能の核酸セグメントを共につなげて実施される。この人工的組み合わせは、化学的な合成手段、又は核酸の単離セグメントの人工的な操作のいずれかにより、例えば、遺伝子組換え技術により、多くの場合行われる。組換えポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、コードされるポリペプチドの配列は、自然に発生するものであり得（「野生型」）、又は自然発生配列の変異体（例えば、突然変異体）であり得る。そのような場合の一例は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ（組換え）であり、そのＤＮＡ配列は、タンパク質が自然で見られない（例えば、真核細胞における、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの発現）細胞（例えば、真核細胞）におけるタンパク質の発現に最適化されたコドンである。従って、コドン最適化ＤＮＡは、組換えかつ自然には発生しないものであり得る一方、ＤＮＡによりコードされるタンパク質は、野生型アミノ酸配列を有してもよい。
【００３０】
従って、「組換え」ポリペプチドという用語は、その配列が自然には発生しないポリペプチドを指す必要はない。代わりに、「組換え」ポリペプチドは、組換えの自然には発生しないＤＮＡ配列によりコードされるが、ポリペプチドのアミノ酸配列は、自然に発生するもの（「野生型」）又は自然には発生しない（例えば、変異体、突然変異体など）ことができる。従って、「組換え」ポリペプチドは、ヒト介入の結果であるが、自然発生のアミノ酸配列を有してもよい。
【００３１】
「ベクター」又は「発現ベクター」は、別のＤＮＡセグメント、すなわち「挿入物」を付加し、付加したしたセグメントの複製を細胞においてもたらすようにすることができる、プラスミド、ファージ、ウイルス、又はコスミドなどの、レプリコンである。
【００３２】
「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。「作動可能に連結された」は、記述される成分が、意図した方法で機能することを許容する関係にある場所において、並置であることを指す。例えば、プロモーターが、コード配列の転写又は発現に影響を与えるならば、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている（又はコード配列は、プロモーターに作動可能に連結されていると言うこともできる）。
【００３３】
「組換え発現ベクター」、又は「ＤＮＡコンストラクト」という用語は、ベクター及び１つの挿入物を含むＤＮＡ分子を指すために本明細書では互換的に使用する。組換え発現ベクターは、挿入物の発現及び／又は伝播の目的で、又は他の組換えヌクレオチド配列の構築のために通常は作製される。挿入物（複数可）は、プロモーター配列に作動可能に連結されても、されなくてもよく、及びＤＮＡ調節配列に作動可能に連結されても、されなくてもよい。
【００３４】
細胞は、外因性のＤＮＡ、例えば、組換え発現ベクターにより、そのようなＤＮＡが、細胞内へ導入された場合に、「遺伝子的に修飾され」又は「形質転換され」又は「遺伝子導入され」ている。外因性ＤＮＡの存在は、恒久的な又は一時的な遺伝子変化をもたらす。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムと一体化されて（共有結合的に連結されて）いても又はいなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、哺乳類細胞において、形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソーム因子上に保持されてよい。真核細胞については、安定な形質転換細胞は、その中で、形質転換ＤＮＡが、染色体と一体化し、そのため染色体の複製を通して娘細胞により継承されるものである。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団を含む、細胞株又はクローンを確立する真核細胞の能力により示される。「クローン」は、単一細胞又は有糸分裂により共通の祖先から誘導された細胞の集団である。「細胞株」は、多世代にわたりインビトロで安定的に増殖することができる初期細胞のクローンである。
【００３５】
遺伝子修飾（「形質転換」とも呼ばれる）の適切な方法には、ウイルス又はバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポソーム介在トランスフェクション、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈殿、ダイレクト・マイクロインジェクション、ナノ粒子介在核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ  ｅｔ．，ａｌ  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１２  Ｓｅｐ  １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９−４０９Ｘ（１２）００２８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照されたい）などを含む。
【００３６】
遺伝子修飾方法の選択は、一般的に、形質転換する細胞の型及びその形質転換が行われる環境（例えば、インビトロ、エクスビボ、インビボ）に依存する。これら方法の一般的な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５に見出すことができる。
【００３７】
本明細書で使用する「標的核酸」は、ゲノム編集エンドヌクレアーゼにより標的とされる部位（「標的部位」又は「標的配列」）を含むポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ）である。ゲノム編集エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである場合、標的配列は、主題のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列がハイブリダイズする配列である。例えば、標的核酸内の標的部位（又は標的配列）である５’−ＧＡＧＣＡＵＡＵＣ−３’は、配列の５’−ＧＡＵＡＵＧＣＵＣ−３’により標的とされる（又は結合される、又はハイブリダイゼーションされる、又は相補的である）。適切なハイブリダイゼーション条件には、通常、細胞に存在する生理学的な条件を含む。二本鎖標的核酸の場合、ガイドＲＮＡと相補的な及びハイブリダイズする標的核酸鎖は、「相補鎖」又は「標的鎖」と呼ばれる一方、「相補鎖」に相補的な標的核酸の鎖（及びそれゆえに、ガイドＲＮＡには相補的でない）は、「非標的鎖」又は「非相補鎖」と呼ばれる。
【００３８】
「切断」は、標的核酸分子（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）の共有バックボーンの切断を意味する。切断は、非限定的に、リン酸ジエステル結合の酵素による又は化学的な加水分解を含む、種々の方法により開始できる。一本鎖切断及び二本鎖切断の両方が可能であり、及び二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果から起こり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）及び対応するガイドＲＮＡを含む複合体を、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の標的切断、例えば、二本鎖ＤＮＡ破壊（ＤＳＢ）の誘導に使用する。
【００３９】
「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」は、核酸切断に対する触媒活性（例えば、リボヌクレアーゼ活性（リボ核酸切断）、デオキシリボヌクレアーゼ活性（デオキシリボ核酸切断）など）を保有する酵素の意味で、本明細書においては互換的に使用する。「ゲノム編集エンドヌクレアーゼ」は、（例えば、細胞のゲノムＤＮＡ内の標的位置で切断することで）細胞のゲノムの編集に使用することができるエンドヌクレアーゼである。ゲノム編集エンドヌクレアーゼの例としては、（ａ）ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、（ｂ）Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質など、及び（ｃ）ＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質などのクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
ヌクレアーゼの「切断ドメイン」又は「活性ドメイン」又は「ヌクレアーゼドメイン」は、核酸切断に対する触媒活性を保有するヌクレアーゼ内のポリペプチド配列又はドメインを意味する。切断ドメインは、単鎖ポリペプチド鎖に含まれ得て、又は切断活性は、２つ（又はそれ以上）のポリペプチドの会合によってもたらすことができる。単一ヌクレアーゼドメインは、所与のポリペプチド内の、単離された１つ以上のアミノ酸のストレッチからなってよい。
【００４１】
本明細書で使用する「宿主細胞」又は「標的細胞」は、インビボ又はインビトロの真核細胞、原核細胞（例えば、細菌又は古細菌細胞）、又は単細胞実体として培養された、多細胞の有機体由来の細胞（例えば、細胞株）を指し、その真核又は原核細胞は、主題のゲノムターゲティング組成物に対する受容体として使用でき、又は使用されており、（例えば、細胞が核酸により形質転換されている場合、又は細胞ゲノムがゲノムターゲティング組成物により修飾されている場合）起源細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、自然に、偶発的に、又は意図的な突然変異のために、その起源親と、形態において又は遺伝子的又は全ＤＮＡ補体において、完全に同一である必要はないことが理解される。「組換え宿主細胞」（また「遺伝子的に修飾された宿主細胞」とも呼ばれる）は、例えば、核酸、例えば、発現ベクターを含むことができる主題のゲノムターゲティング組成物が導入されている宿主細胞である。例えば、主題の細菌宿主細胞は、外因性核酸（例えば、プラスミド又は組換え発現ベクター）が適切な細菌宿主細胞に導入されたために、遺伝子的に修飾された細菌宿主細胞であり得、主題の真核宿主細胞は、外因性核酸が適切な真核宿主細胞に導入されたために、遺伝子的に修飾された真核宿主細胞（例えば、哺乳類生殖細胞）であり得る。
【００４２】
「幹細胞」という用語は、本明細書では、自己再生し及び分化した細胞型を生成する両能力を有する細胞（例えば、植物幹細胞、脊椎動物幹細胞）を指すために使用する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８：２８７−２９８を参照されたい）。細胞の個体発生の文脈においては、形容詞「分化した」、又は「分化している」は、相対的な用語である。「分化した細胞」は、それと比較される細胞に比べて、発達経路がさらに進化した細胞である。従って、多能性幹細胞（後述）は、血統制限前駆細胞（例えば、胚葉幹細胞）に分化でき、それは次いで、さらに制限された細胞（例えば、ニューロン前駆細胞）に分化でき、それは最終段階の細胞（すなわち、神経細胞、心筋細胞などの終末分化細胞）に分化でき、それは特定の組織型における特徴的な役割を果たし、及びさらに増殖する能力を保持していても、していなくてもよい。幹細胞は、特定マーカーの存在（例えば、タンパク質、ＲＮＡなど）及び特定マーカーの不在の両方により特徴づけられてよい。幹細胞はまた、インビトロ内及びインビボの両方の機能アッセイ、特に、複数の分化した子孫を増加させる幹細胞の能力に関連したアッセイにより特定され得る。
【００４３】
目的の幹細胞には、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む。「多能性幹細胞」又は「ＰＳＣ」という用語は、本明細書では、生命体の全ての細胞型を産生することができる幹細胞を意味するために使用する。従って、ＰＳＣは、生命体の全ての胚層の細胞（例えば、脊椎動物の内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の増加をもたらすことができる。多能性細胞は、奇形種の形成及び生きている生命体の外胚葉、中胚葉、又は内胚葉への寄与が可能である。植物の多能性幹細胞は、その植物の全ての細胞型（例えば、根、幹、葉などの細胞）を生じさせることができる。
【００４４】
動物のＰＳＣは、多数の異なる方法で誘導できる。例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、胚の内部細胞塊から派生し（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８  Ｎｏｖ  ６；２８２（５３９１）：１１４５−７）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞から派生する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ．ａｌ，Ｃｅｌｌ．２００７  Ｎｏｖ  ３０；１３１（５）：８６１−７２、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ．ａｌ，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（１２）：３０８１−９、Ｙｕ  ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７  Ｄｅｃ  ２１；３１８（５８５８）：１９１７−２０．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｎｏｖ  ２０）。ＰＳＣという用語は、その由来に関係なく多能性幹細胞を指すので、ＰＳＣという用語は、ＥＳＣ及びｉＰＳＣという用語、ならびに、ＰＳＣの別の例である、胚性生殖幹細胞（ＥＧＳＣ）という用語も包含する。ＰＳＣは、確立された細胞株の形態でよく、１次胚組織から直接取得してよく、又は体細胞から誘導してよい。ＰＳＣは、本明細書に記述する方法の標的細胞であり得る。
【００４５】
「胚性幹細胞」（ＥＳＣ）は、胚から、通常は胚盤胞の内部細胞塊から単離されたＰＳＣを意味する。ＥＳＣ株は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）のヒト胚性幹細胞レジストリにリストされており、例えば、ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３、ｈＥＳＢＧＮ−０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．）、ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、Ｍｉｚ−ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、及び  Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））である。目的の幹細胞にはまた、アカゲザル（Ｒｈ）幹細胞及びマーモセット幹細胞などの、他の霊長類由来の胚性幹細胞を含む。幹細胞は、任意の哺乳類、例えば、ヒト、馬、牛、豚、犬、猫、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などから取得してよい（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：７８４４、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８）。培養において、ＥＳＣは、大きな核−細胞質比を持つフラットコロニーとして成長し、境界及び突出した核小体として定義される。さらに、ＥＳＣは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びアルカリホスファターゼを発現するが、ＳＳＥＡ−１は発現しない。ＥＳＣを生成し及び特徴づける方法の例は、例えば、米国特許第７，０２９，９１３号、米国特許第５，８４３，７８０号、及び米国特許第６，２００，８０６号に見出され、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。未分化形態でのｈＥＳＣを増殖する方法は、ＷＯ９９／２０７４１、ＷＯ０１／５１６１６、及びＷＯ０３／０２０９２０に記述されている。
【００４６】
「胚性生殖幹細胞」（ＥＧＳＣ）又は「胚性生殖細胞」又は「ＥＧ細胞」は、生殖細胞及び／又は生殖細胞前駆細胞、例えば、始原生殖細胞、すなわち、精子及び卵になる細胞から派生したＰＳＣを意味する。胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）は、上述の胚性幹細胞に似た性質を持つと考えられる。ＥＧを生成し及び特徴づける方法の例示は、例えば、米国特許第７，１５３，６８４号、Ｍａｔｓｕｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７０：８４１、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１１３、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１３７２６、及びＫｏｓｈｉｍｉｚｕ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２２：１２３５に見出され、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４７】
「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」は、ＰＳＣではない細胞から（すなわち、ＰＳＣに対して相対的に分化した細胞から）派生したＰＳＣを意味する。ｉＰＳＣは、終末分化細胞を含む、複数の異なる細胞型から誘導できる。ｉＰＳＣは、ＥＳ様形態を有し、大きな核−細胞質比を持つフラットコロニーとして成長し、境界及び突出した核小体として定義される。さらに、ｉＰＳＣは、非限定的に、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ  １、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａｌ、ＴＥＲＴ、及びｚｆｐ４２を含む、当業者には公知の１つ以上の主要な多能性マーカーを発現する。ｉＰＳＣを生成し及び特徴づける方法の例は、例えば、アメリカ公開特許番号ＵＳ２００９００４７２６３、ＵＳ２００９００６８７４２、ＵＳ２００９０１９１１５９、ＵＳ２００９０２２７０３２、ＵＳ２００９０２４６８７５、及びＵＳ２００９０３０４６４６に見出され、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一般的に、ｉＰＳＣを生成するためには、体細胞は、多能性幹細胞になる体細胞を再プログラム化するために、当該技術分野では公知の再プログラム化因子（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８など）と共に与えられる。
【００４８】
「体細胞」とは、実験操作の不在下で、通常は、生命体の全ての細胞型の増加をもたらさない生命体の任意の細胞を意味する。言い換えれば、体細胞は、身体の３つの全ての胚葉体、すなわち、外胚葉、中胚葉、内胚葉の細胞を、自然には生成しない十分に分化した細胞である。例えば、体細胞は、神経細胞及び神経前駆細胞の両方を含み、後者は、中枢神経系の全ての又はいくつかの細胞型を自然に増加させることができ得るが、胚葉及び内胚葉系統の細胞の増加をもたらすことができない。
【００４９】
「有糸分裂細胞」は、有糸分裂を起こしている細胞を意味する。有糸分裂は、真核細胞が、その核の中の染色体を、２つの別々の核の中の、２つの同じセットに分割することによるプロセスである。一般的には、細胞質分裂が即座に続き、核、細胞質、細胞小器官及び細胞膜を、これらの細胞成分のほぼ等しい振り分を含むように２つの細胞中に分割する。
【００５０】
「有糸分裂後細胞」とは、有糸分裂が終了した、すなわち、「静止した」、すわなち、もはや分裂していない細胞を意味する。この静止状態は、一時的で、すなわち、可逆的であってよく、又は恒久的であり得る。
【００５１】
「減数分裂細胞」とは、減数分裂を起こしている細胞を意味する。減数分裂は、細胞が、配偶子又は胞子を産生する目的で、その核物質を分割することによるプロセスである。有糸分裂とは異なり、減数分裂においては、染色体が、染色体間の遺伝物質をシャッフルで組換えるステップを取る。さらに、有糸分裂から生み出される２つの（遺伝的には同じ）二倍体細胞と比較して、減数分裂の結果、４つの（遺伝的には一意の）半数体細胞になる。
【００５２】
「治療」、「治療する」などの用語は、本明細書では、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するために使用する。その効果は、疾患又はそれらの症状を完全に又は部分的に防ぐ観点からの予防のためであってよく、及び／又は疾患及び／又はその疾患に起因する悪影響を部分的に又は完全に治す観点からの治療のためであってよい。本明細書で使用する「治療」は、哺乳類における疾患又は症状の任意の治療を対象とし、（ａ）その疾患又は症状をもたらす傾向があるが、未だそれを引き起こしたとして診断されていない対象者に起こる疾患又は症状を予防すること、（ｂ）その疾患又は症状を阻害すること、すなわち、その発症を抑止すること、又は（ｃ）その疾患を緩和すること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすことを含む。治療薬は、疾患又は傷害の発症前、その間又はその後に投与されてよい。治療が、患者の望ましくない臨床的症状を安定化させ又は軽減する場合の、進行中の疾患の治療が、特に興味深い治療である。そのような治療は、影響を受ける組織の機能が完全に失われる前に行われるのが望ましい。対象の治療は、その疾患の症候性段階の間に、及びある場合には、その疾患の症候性段階の後で投与されるのが望ましい。
【００５３】
「個人」「対象者」、「宿主」及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用し、及び診断を受ける、治療を受ける、又は治療が望まれる任意の哺乳類の対象、例えば、ヒトを指す。
【００５４】
ある場合には、成分（例えば、核酸成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ）、タンパク質成分（例えば、ゲノム編集エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質）など）は、標識部分を含む。本明細書で使用する「標識」、「検出可能な標識」、又は「標識部分」という用語は、シグナル検出を提供する任意の部分を指し、アッセイの特定の性質に応じて大きく変化し得る。目的の標識部分は、直接的に検出可能な標識（直接標識）（例えば、蛍光標識）、及び間接的に検出可能な標識（間接標識）（例えば、結合対メンバー）の両方を含む。蛍光標識は、任意の蛍光標識（例えば、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）標識など）、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、チェリー、トマト、タンジェリン、及びそれらの任意の蛍光誘導体）など）であってもよい。方法で使用される適切な検出可能な（直接的又は間接的に）標識部分には、分光学、光化学、生化学、免疫化学、電気、光学、化学、又は他の手段により検出可能ないずれかの部分を含む。例えば、適切な間接標識には、ストレプトアビジン（それ自身を直接又は間接的に標識することができる）によって結合することができるビオチン（結合対メンバー）が含まれる。標識は、放射性標識（直接標識）（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、酵素（間接標識）（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、蛍光タンパク質（直接標識）（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びそれらの任意の便利な誘導体）、金属標識（直接標識）、比色標識、結合対メンバーなども含み得る。「結合対のパートナー」又は「結合対メンバー」は、第１及び第２の部分の１つを意味し、第１及び第２の部分は、互いに対して特異的な結合親和性を有する。適当な結合対としては、抗原／抗体（例えば、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル−Ｘ−抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ルシファーイエロー／抗ルシファーイエロー、及びローダミン抗ローダミン）、ビオチン／アビジン（又はビオチン／ストレプトアビジン）、カルモジュリン結合性タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリンが挙げられるが、これらに限定されない。任意の結合対メンバーは、間接的に検出可能な標識部分として使用するのに適し得る。
【００５５】
任意の所与の成分もしくは成分の組み合わせは、非標識であってもよく、又は標識部分で検出可能に標識されてもよい。ある場合には、２つ以上の成分が標識されている場合、それらは、互いに区別可能な標識部分で標識することができる。
【００５６】
分子及び細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９９）、ＰｒｏｔｅｉｎＭｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ  ＆  Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＭｅｔｈｏｄｓＭａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）、及びＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）などの、標準的な教科書に見出され得、それらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、従って、言うまでもなく、変動し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することを単に目的とし、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定され得るため、限定を意図しないことも理解されたい。
【００５８】
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、並びにその指定範囲の任意の他の指定値又は介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、独立して、より小さい範囲に含まれてよく、指定範囲内の任意の具体的に除外された値に従って、これらも本発明に包含される。指定範囲がそれらの上限値及び下限値のうちの１つ又は両方を含む場合、それらの含まれる上限値及び下限値のいずれか又は両方を除外する範囲も本発明に包含される。
【００５９】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と同様もしくは同等の任意の方法及び材料も、本発明の実践又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料が、これから説明される。本明細書で言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれて、その刊行物が引用されるものと関連する方法及び／又は材料を開示及び説明する。
【００６０】
本明細書で及び添付の特許請求の範囲で用いるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことに留意されたい。従って、例えば、「リボ核タンパク質複合体」への言及は、複数のかかる複合体を含み、「変異ジストロフィン遺伝子」への言及は、１つ以上の変異ジストロフィン遺伝子及び当業者に公知のその等価物を含む等である。請求項は、いかなる任意の要素をも排除するように作成され得ることにさらに留意されたい。従って、この記述は、請求項要素の列挙に関連する、「単に」、「のみ」等のような排他的用語の使用、又は「否定的」限定の使用に対する、先行詞の役割を果たすことが意図される。
【００６１】
明確にするために、別個の実施形態の文脈において説明される本発明のある特定の特長は、単一の実施形態にて組み合わせで提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特長は、別個に又は任意の好適な副組み合わせで提供されてよい。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、それぞれ及び全ての組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びそれらの要素の全ての副組み合わせも本発明によって具体的に包含され、それぞれ及び全てのそのような副組み合わせが個別にかつ明確に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
【００６２】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の出版日とは異なる可能性があり、別々に確認する必要があり得る。
【００６３】
詳細な説明
本開示は、細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子の修飾方法を提供する。本開示は、細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子を修飾するための組成物及びキットをさらに提供する。
【００６４】
組成物、キット、及び方法
細胞（例えば、ヒト細胞）のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子を修飾することを含む方法を提供する。ある場合には、方法は、（ａ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）、又はクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び（ｂ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに対応する第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、又は第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を細胞に導入することを含む。第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、変異ジストロフィン遺伝子のイントロン４４内で標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、変異ジストロフィン遺伝子のイントロン５５内で標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含む。導入するステップは、エクソン４５〜５５を含む変異ジストロフィン遺伝子の３３０キロベースを超える領域の欠失をもたらす（例えば、ある場合には、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による）。
【００６５】
従って、ある場合には、主題の方法は、変異ジストロフィン遺伝子のイントロン４４及び５５における細胞のゲノムの切断、及びエクソン４５〜５５を含む変異ジストロフィン遺伝子の３３０キロベースを超える領域の欠失をもたらす。従って、主題の方法は、変異ジストロフィン遺伝子の３３０キロベースを超える領域の欠失をもたらし、欠失領域は、エクソン４５〜５５を含む（例えば、残りの配列が、エクソン４５〜５５が欠けているジストロフィンｍＲＮＡをコードし、例えば、イントロン４４の残りの配列及びイントロン５５の残りの配列が、単一イントロンになり、エクソン４４が、それによってエクソン５６に直接スプライシングされるように）。従って、ある場合には、欠失領域は、イントロン配列を含み、及び残りの配列も、イントロン配列を含む。
【００６６】
ある場合には、主題の方法は、３３０キロベース（ｋｂ）を超えるゲノム欠失をもたらす。ある場合には、主題の方法は、４００キロベース（ｋｂ）以上（例えば、４５０ｋｂ以上、５００ｋｂ以上、５５０ｋｂ以上、６００ｋｂ以上、６５０ｋｂ以上、７００ｋｂ以上など）のゲノム欠失をもたらす。例えば、ある場合には、イントロン４４内の標的配列とイントロン５５内の標的配列は、互いに３３０キロベース（ｋｂ）を超えて離れている。ある場合には、イントロン４４内の標的配列とイントロン５５内の標的配列は、互いに４００ｋｂ以上（例えば、４５０ｋｂ以上、５００ｋｂ以上、５５０ｋｂ以上、６００ｋｂ以上、６５０ｋｂ以上、７００ｋｂ以上など）離れている。ある場合には、イントロン４４内の標的配列とイントロン５５内の標的配列は、互いに７００ｋｂ以上離れている。
【００６７】
従って、ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４に対応する標的配列（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内の標的配列、マウスジストロフィン遺伝子内の標的配列など）と２０の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有し、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５に対応する標的配列（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内の標的配列、マウスジストロフィン遺伝子内の標的配列など）と２０の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有する。いくつかのそのような場合には、イントロン４４に対応する標的配列とイントロン５５に対応する標的配列は、互いに３３０キロベース（ｋｂ）を超えて離れている。ある場合には、イントロン４４に対応する標的配列とイントロン５５に対応する標的配列は、互いに４００キロベース（ｋｂ）以上（例えば、４５０ｋｂ以上、５００ｋｂ以上、５５０ｋｂ以上、６００ｋｂ以上、６５０ｋｂ以上、７００ｋｂ以上など）離れている。ある場合には、イントロン４４内の標的配列とイントロン５５内の標的配列は、互いに７００ｋｂ以上離れている。
【００６８】
ヒト細胞におけるそのようなゲノム欠失を達成するために使用することができるガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡのガイド配列）及び標的配列の例を（図２３に提供される）表２及び（図２４に提供される）表９に提供する。
【００６９】
主題の組成物、キット、及び方法では、成分（例えば、（ａ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など、及び／又は（ｂ）第１及び第２の対応するガイドＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡなど）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質として細胞に送達する（細胞に導入する）ことができる。例えば、主題の組成物、キット、及び／又は方法が、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）、及び対応するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡなど）を含む場合、エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは、ＲＮＰ複合体（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及び対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡの予め組み立てられた複合体）として送達する（細胞に導入する）ことができる。従って、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、タンパク質として細胞に導入することができる。クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、エンドヌクレアーゼをコードする核酸（ＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ）として細胞に導入することもできる。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、ＲＮＡとして、又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとして細胞に導入することができる。
【００７０】
ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも称される）に融合される融合タンパク質である。ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、細胞内局在化を与えるアミノ酸配列（融合パートナー）に融合され、すなわち、融合パートナーは、細胞内局在化配列（例えば、核に標的化するための１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、２つ以上のＮＬＳ、３つ以上のＮＬＳなど）である。いくつかの実施形態では、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、追跡及び／又は精製を容易にするためのタグ（すなわち、融合パートナーは、検出可能な標識である）を与えるアミノ酸配列（融合パートナー）に融合される（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど、ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグなど）。いくつかの実施形態では、融合パートナーは、安定性の増加又は低減を与え得る（すなわち、融合パートナーは、安定性制御ペプチド、例えば、ある場合には、制御可能なデグロン（例えば、温度感受性又は薬剤により制御可能なデグロン配列）であり得る）。
【００７１】
ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、細胞による取り込みを促進するために（すなわち、融合パートナーは、細胞による取り込みを促進する）、ポリペプチド浸透性ドメインにコンジュゲートされる（例えば、融合される）。いくつかの浸透性ドメインが当該技術分野において公知であり、用いられてもよく、これには、ペプチド、ペプチド模倣薬、及び非ペプチド担体が含まれる。例えば、浸透性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１０８０）を含む、ペネトラチンと称される、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐａｅｄｉａ）の第三αヘリックスに由来し得る。別の例として、浸透性ペプチドは、例えば、自然発生のｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７を含み得る、ＨＩＶ−１  ｔａｔ基本領域アミノ酸配列を含むことができる。他の浸透性ドメインには、ポリ−アルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１  ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４〜５６の領域、ノナ−アルギニン、オクタ−アルギニンなどが含まれる。（例えば、Ｆｕｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．２００３  Ａｐｒ；４（２）：８７−９  ａｎｄ  ４４６、及びＷｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２０００  Ｎｏｖ．２１；９７（２４）：１３００３−８、米国特許出願公開第２００３０２２０３３４号、同第２００３００８３２５６号、同第２００３００３２５９３号、及び同第２００３００２２８３１号（これらは、移行ペプチド及び移行ペプトイドの教示のために参照によって本明細書に明確に組み込まれる）を参照されたい）。ノナ−アルギニン（Ｒ９）配列は、特徴付けされたより効率的なＰＴＤの１つである（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｕｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。融合が起こる部位は、ポリペプチドの生物活性、分泌、又は結合の特徴を最適化するために、選択されてもよい。最適な部位は、通例の実験法により判断することができる。
【００７２】
ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、「タンパク質形質導入ドメイン」又はＰＴＤ（ＣＰＰ：細胞浸透性ペプチドとしても知られている）を含み、これは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、又はベシクル膜の横断を促進するポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、又は有機もしくは無機化合物を指す。低分子極性分子から巨大な高分子及び／又はナノ粒子まで及び得る別の分子に結合したＰＴＤは、その分子が膜を横切ること、例えば、細胞外間隙から細胞内空間、又は細胞基質から細胞小器官内への移行を促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、アミノ末端ポリペプチド（例えば、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質）のアミノ末端に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチド（例えば、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質）のカルボキシル末端に共有結合的に連結される。ある場合には、ＰＴＤは、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）の内部に挿入される（すなわち、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼのＮ又はＣ末端ではない）。ある場合には、主題のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、１つ以上のＰＴＤ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のＰＴＤ）を含む（にコンジュゲートされる、に融合される）。ある場合には、ＰＴＤは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（例えば、ある場合には、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のＮＬＳ）を含む。
【００７３】
ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、１つ以上のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、Ｃａｓ９タンパク質又はＶ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質などのクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドなど）に共有結合的に連結される。ＰＴＤの例としては、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号１０７６を含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応）、細胞への侵入を方向付けるのに充分な多くのアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０〜５０個のアルギニン）を含むポリアルギニン配列、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）、ドロソフィラ・アンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（７）：１７３２−１７３７）、切断型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１２４８−１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３００３−１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号１０７７）、トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１０７８）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号１０７９）、及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１０８０）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤとしては、限定はされないが、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１０８１）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１０８２）、３個のアルギニン残基〜５０個のアルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられ、例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列としては、限定はされないが、以下：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１０８３）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１０８４）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１０８５）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０８６）、及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０８７）のいずれかが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能ＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ  Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５−６）：３７１−３８１）。ＡＣＰＰは、切断可能なリンカーを介して適合するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９又は「Ｅ９」）に連結されたポリカチオンＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９又は「Ｒ９」）を含み、これは、実効電荷をほぼゼロに減少させることで、細胞への接着及び取り込みを阻害する。リンカーを切断すると、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその固有の接着性が局所的に��露され、それによってＡＣＰＰの膜横断が「活性化」される。
【００７４】
クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、上記の任意の組み合わせにおける複数の（１つ以上、２つ以上、３つ以上など）融合パートナーを有し得る。例示的な例として、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、タグ付けを与える融合パートナー（例えば、ＧＦＰ）を有し得、及び細胞内局在化配列（例えば、１つ以上のＮＬＳ）も有し得る。ある場合には、そのような融合タンパク質は、追跡及び／又は精製を容易にするためのタグ（例えば、ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグなど）も有し得る。別の例示的な例として、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、１つ以上のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのＮＬＳ）を有し得る。ある場合には、融合パートナー（又は複数の融合パートナー、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのＮＬＳ）（例えば、ＮＬＳ、タグ、活性を与える融合パートナーなど）は、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）Ｃ末端に又はその近くに位置する。ある場合には、融合パートナー（又は複数の融合パートナー、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのＮＬＳ）（例えば、ＮＬＳ、タグ、活性を与える融合パートナーなど）は、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）のＮ末端に位置する。ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、Ｎ末端及びＣ末端の両方に融合パートナー（又は複数の融合パートナー、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのＮＬＳ）（例えば、ＮＬＳ、タグ、活性を与える融合パートナーなど）を有する。
【００７５】
クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ
細菌及び古細菌におけるＲＮＡ媒介適応免疫系は、一緒に機能してウイルス及びプラスミドの侵入からの防御をもたらすクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ゲノム遺伝子座、及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質に依存する。いくつかの実施形態では、主題の方法、組成物、及び／又はキットは、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。クラス２  ＣＲＩＳＰＲ系では、エフェクター複合体（例えば、標的ＤＮＡの切断）の機能は、単一エンドヌクレアーゼによって実施される（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｏｃｔ  ２２；１６３（３）：７５９−７１；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５  Ｎｏｖ；１３（１１）：７２２−３６；及びＳｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｎｏｖ  ５；６０（３）：３８５−９７を参照されたい）。従って、「クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質」という用語は、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ系由来のエンドヌクレアーゼ（標的核酸を切断するタンパク質）を包含するように本明細書で使用される。従って、本明細書で使用する「クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」という用語は、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）、Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２Ｃ３）、及びＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃ２ｃ２）を包含する。現在まで、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を包含するが、この用語は、対応するガイドＲＮＡに結合して、ＲＮＰ複合体を形成する（例えば、標的ＤＮＡを切断する）のに適した任意のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を包含することも意図する。
【００７６】
ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）
自然のＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、Ｃａｓ９は、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を一緒に生成するか又は一本鎖ＤＮＡ切断（ＳＳＢ）を個別に生成することができるＣａｓ９における２つのヌクレアーゼ活性部位を伴うメカニズムによって、ｃｒＲＮＡを有する二重ガイドＲＮＡ及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を使用して、標的認識及び切断するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼとして機能する。ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼＣａｓ９、及び遺伝子操作された二重（ｄｇＲＮＡ）又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、所望のＤＮＡ配列に標的化することができるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。二重ＲＮＡ複合体又はキメラ単一ガイドＲＮＡによるガイドで、Ｃａｓ９は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同性指向的組換え（ＨＤＲ）のいずれかによって回復される二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的核酸内で部位特異的ＤＳＢ又はＳＳＢを生成する。
【００７７】
ある場合には、主題の方法、組成物、及び／又はキットは、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの一種である。ある場合には、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡと複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、標的核酸（本明細書の他の箇所に記載される）の配列（標的部位）に相補的であるヌクレオチド配列（ガイド配列）を有することで、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ複合体に対する標的特異性をもたらす。複合体のＣａｓ９タンパク質は、部位特異的活性をもたらす。言い換えれば、Ｃａｓ９タンパク質は、それ自体がＣａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントと会合することによって、標的核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）内で標的部位にガイドされる（例えば、標的部位で安定化される）。
【００７８】
ある場合には、ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、自然発生のタンパク質（例えば、細菌及び／又は古細菌細胞で自然発生する）である。他の場合では、ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、自然発生のポリペプチドではない（例えば、ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、変異体ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、キメラタンパク質などであり、例えば、ある場合には、ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、１つ以上のＮＬＳを含む）。
【００７９】
適切なＣａｓ９タンパク質の例としては、配列番号５〜８１６に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。自然発生のＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡと結合するため、標的核酸（標的部位）内の特異的配列に指向され、標的核酸を切断する（例えば、ｄｓＤＮＡを切断して、二重鎖切断を生成する）。キメラＣａｓ９タンパク質は、異種タンパク質（融合パートナーと称される）に融合されるＣａｓ９ポリペプチドを含む融合タンパク質であり、異種タンパク質は、活性（例えば、Ｃａｓ９タンパク質によって提供されないもの）をもたらす。融合パートナーは、活性、例えば、酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡメチル化に対する活性、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ切断に対する活性、ヒストンアセチル化に対する活性、ヒストンメチル化に対する活性、ＲＮＡ修飾に対する活性、ＲＮＡ結合に対する活性、ＲＮＡスプライシングに対する活性など）をもたらすことができる。ある場合には、Ｃａｓ９タンパク質の部分（例えば、ＲｕｖＣドメイン、及び／又はＨＮＨドメイン）は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の対応する部分に対してヌクレアーゼ活性の低下を示す（例えば、ある場合には、Ｃａｓ９タンパク質は、ニッカーゼである）。ある場合には、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質に対して（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９に対して）酵素的に不活性であるか又は酵素活性が低下している。
【００８０】
所与のタンパク質がＣａｓ９ガイドＲＮＡと相互作用するかどうかを判定するアッセイは、タンパク質と核酸の間の結合を試験する任意の便利な結合アッセイであってもよい。適当な結合アッセイ（例えば、ゲルシフトアッセイ）は、当業者に公知である（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡとタンパク質を標的核酸に添加することを含むアッセイ）。
【００８１】
タンパク質が活性を有するかどうかを判定する（例えば、タンパク質が、標的核酸を切断するヌクレアーゼ活性、及び／又はいくつかの異種活性を有するかどうかを判定する）アッセイは、任意の便利なアッセイ（例えば、核酸切断を試験する任意の便利な核酸切断アッセイ）であってもよい。適当なアッセイ（例えば、切断アッセイ）は、当業者に公知であり、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡとタンパク質を標的核酸に添加することを含むことができる。
【００８２】
ある場合には、キメラＣａｓ９タンパク質は、標的核酸を修飾する酵素活性を有する異種ポリペプチドを含む（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ回復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性、又はグリコシラーゼ活性）。
【００８３】
ある場合には、キメラＣａｓ９タンパク質は、標的核酸と関連するポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性を有する異種ポリペプチドを含む（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、又は脱ミリストイル化活性）。
【００８４】
ある場合には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、細胞内で局在化をもたらす異種ポリペプチドを含む。例えば、ある場合には、主題のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上など）の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上など）のＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）内の任意の便利な位置、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、内部などであってもよい。ある場合には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、Ｎ末端で１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上など）のＮＬＳ、及びＣ末端で１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上など）のＮＬＳを含む。
【００８５】
種々様々な種に由来する多くのＣａｓ９オルソログが同定されており、ある場合には、タンパク質は、同一のアミノ酸をわずかしか共有していない。同定されたＣａｓ９オルソログは、中心のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン及び分割されたＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメイン（例えば、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩ）を有する類似のドメイン構造を有する（例えば、表１を参照されたい）。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、３つの異なる領域（ＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｃＣ−ＩＩＩと呼ばれることもある）を有し得、それらは、Ｃａｓ９タンパク質の一次アミノ酸配列に対して連続していないが、タンパク質が一度産生されて折り畳まれると、一緒に折り畳まれて、ＲｕｖＣドメインを形成する。従って、Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも４つの重要なモチーフを、保存された構造と共有すると言うことができる。モチーフ１、２、及び４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、一方、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。表１に記載されるモチーフは、当該技術分野で受け入れられているＲｕｖＣ様及び／又はＨＮＨドメイン全体を表していない場合があるが、表１は、所与のタンパク質がＣａｓ９タンパク質であるかどうかの判断を助けるために使用することができるモチーフを提示する。
【００８６】
表１．表１は、種々の種に由来するＣａｓ９配列に存在する４つのモチーフを列挙する。表１に列挙されるアミノ酸は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のＣａｓ９（配列番号５）である。
【表１】
2019509031.tif 000002
【００８７】
ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１〜４の各々は、配列番号１〜４にそれぞれ記載されるモチーフ１〜４（例えば、表１を参照されたい）、又は配列番号５〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００８８】
言い換えれば、ある場合には、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１〜４の各々は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のモチーフ１〜４（例えば、配列番号１〜４に記載の配列、例えば、表１を参照されたい）、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００８９】
ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１〜４の各々は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のモチーフ１〜４（モチーフは、表１であり、列番号１〜４にそれぞれ記載される）、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して６０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１〜４の各々は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のモチーフ１〜４（モチーフは、表１であり、列番号１〜４にそれぞれ記載される）、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１〜４の各々は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のモチーフ１〜４（モチーフは、表１であり、列番号１〜４にそれぞれ記載される）、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して７５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１〜４の各々は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のモチーフ１〜４（モチーフは、表１であり、列番号１〜４にそれぞれ記載される）、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１〜４の各々は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のモチーフ１〜４（モチーフは、表１であり、列番号１〜４にそれぞれ記載される）、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１〜４の各々は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のモチーフ１〜４（モチーフは、表１であり、列番号１〜４にそれぞれ記載される）、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１〜４の各々は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のモチーフ１〜４（モチーフは、表１であり、列番号１〜４にそれぞれ記載される）、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１〜４の各々は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のモチーフ１〜４（モチーフは、表１であり、列番号１〜４にそれぞれ記載される）、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１〜４の各々は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のモチーフ１〜４（モチーフは、表１であり、列番号１〜４にそれぞれ記載される）、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有する。上で定義される任意のＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチドとして、キメラＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９融合タンパク質）の一部として使用することができ、それらのいずれも、本開示のＲＮＰにおいて使用することができる。
【００９０】
ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６又は７３１〜１００３、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９１】
ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６又は７３１〜１００３、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して６０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６又は７３１〜１００３、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６又は７３１〜１００３、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して７５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６又は７３１〜１００３、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６又は７３１〜１００３、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６又は７３１〜１００３、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６又は７３１〜１００３、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６又は７３１〜１００３、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のアミノ酸７〜１６６又は７３１〜１００３、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。上で定義される任意のＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチドとして、キメラＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９融合タンパク質）の一部として使用することができ、それらのいずれも、本開示のＲＮＰにおいて使用することができる。
【００９２】
ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９３】
ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して６０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して７５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して９９以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。上で定義される任意のＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチドとして、キメラＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９融合タンパク質）の一部として使用することができ、それらのいずれも、本開示のＲＮＰにおいて使用することができる。
【００９４】
ある場合には、Ｃａｓ９タンパク質は、４つのモチーフ（表１に列挙される）を含み、少なくとも１つ（又は各々）は、表１に列挙される４つのモチーフの各々（配列番号１〜４）、又は配列番号６〜８１６に記載されるアミノ酸配列のいずれかに対応する部分に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９５】
ある場合には、Ｃａｓ９タンパク質は、高性能Ｃａｓ９タンパク質である（例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１６  Ｊａｎ  ２８；５２９（７５８７）：４９０−５を参照されたい）。
【００９６】
ある場合には、適切なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１：８４に記載されるＣａｓ９タンパク質である。例えば、適切なＣａｓ９タンパク質は、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３、及びＲ１０６０の１つ以上の置換を有するストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９を含む（アミノ酸ナンバリングは、配列番号５に記載されたナンバリングに基づいている）。例えば、適切なＣａｓ９タンパク質は、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、及びＲ１０６０Ａ置換を有するストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９を含む（アミノ酸ナンバリングは、配列番号５に記載されたナンバリングに基づいている）。別の例として、適切なＣａｓ９タンパク質は、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、及びＲ１０６０Ａ置換を有するストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９を含む（アミノ酸ナンバリングは、配列番号５に記載されたナンバリングに基づいている）。別の例として、適切なＣａｓ９タンパク質は、Ｋ８５５Ａ置換を有するストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９を含む（アミノ酸ナンバリングは、配列番号５に記載されたナンバリングに基づいている）。
【００９７】
Ｖ型及びＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ
ある場合には、主題の方法、組成物、及び／又はキットは、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３）を含む。Ｖ型及びＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの一種である。Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの例としては、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、及びＣ２ｃ３が挙げられるが、これらに限定されない。ＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの一例は、Ｃ２ｃ２である。ある場合には、主題の方法、組成物、及び／又はキットは、Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３）を含む。ある場合には、Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１タンパク質である。ある場合には、主題の方法、組成物、及び／又はキットは、ＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃ２ｃ２）を含む。
【００９８】
ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼと同様、Ｖ型及びＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、対応するガイドＲＮＡと複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、標的核酸（本明細書の他の箇所に記載される）の配列（標的部位）に相補的であるヌクレオチド配列（ガイド配列）を有することで、エンドヌクレアーゼガイドＲＮＡ  ＲＮＰ複合体に対する標的特異性をもたらす。複合体のエンドヌクレアーゼは、部位特異的活性をもたらす。言い換えれば、エンドヌクレアーゼは、それ自体がガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントと会合することによって、標的核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）内で標的部位にガイドされる（例えば、標的部位で安定化される）。
【００９９】
Ｖ型及びＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ３ガイドＲＮＡ）に関する例及び手引きは、当該技術分野で見出すことができ、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｏｃｔ  ２２；１６３（３）：７５９−７１；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５  Ｎｏｖ；１３（１１）：７２２−３６；及びＳｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｎｏｖ  ５；６０（３）：３８５−９７を参照されたい。
【０１００】
ある場合には、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３）は、酵素的に活性であり、例えば、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合する際に、標的核酸を切断する。ある場合には、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３）は、対応する野生型のＶ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３）に対して酵素活性の低下を示し、ＤＮＡ結合活性を保持する（例えば、ある場合には、エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼである）。
【０１０１】
ある場合には、Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１タンパク質である。ある場合には、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号１０８８〜１０９２のいずれかに記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号１０８８〜１０９２のいずれかに記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列の１００アミノ酸〜２００アミノ酸（ａａ）、２００ａａ〜４００ａａ、４００ａａ〜６００ａａ、６００ａａ〜８００ａａ、８００ａａ〜１０００ａａ、１０００ａａ〜１１００ａａ、１１００ａａ〜１２００ａａ、又は１２００ａａ〜１３００ａａの連続したストレッチに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
ある場合には、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号１０８８〜１０９２のいずれかに記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号１０８８〜１０９２のいずれかに記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号１０８８〜１０９２のいずれかに記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号１０８８〜１０９２のいずれかに記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
ある場合には、Ｃｐｆ１タンパク質は、野生型Ｃｐｆ１タンパク質に対して（例えば、配列番号１０８８〜１０９２のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むＣｐｆ１タンパク質に対して）酵素活性の減少を示し、ＤＮＡ結合活性を保持する。ある場合には、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号１０８８〜１０９２のいずれかに記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１０８８に記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列のアミノ酸９１７に対応するアミノ酸残基でアミノ酸置換（例えば、Ｄ→Ａ置換）を含む。ある場合には、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号１０８８〜１０９２のいずれかに記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１０８８に記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列のアミノ酸１００６に対応するアミノ酸残基でアミノ酸置換（例えば、Ｅ→Ａ置換）を含む。ある場合には、Ｃｐｆ１タンパク質は、配列番号１０８８〜１０９２のいずれかに記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１０８８に記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列のアミノ酸１２５５に対応するアミノ酸残基でアミノ酸置換（例えば、Ｄ→Ａ置換）を含む。
【０１０４】
ある場合には、適切なＣｐｆ１タンパク質は、配列番号１０８８〜１０９２のいずれかに記載されるＣｐｆ１アミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
ある場合には、Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃ２ｃ１タンパク質である（例としては、配列番号１１１２〜１１１９に記載されるものが挙げられる）。ある場合には、Ｃ２ｃ１タンパク質は、配列番号１１１２〜１１１９のいずれかに記載されるＣ２ｃ１アミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃ２ｃ１タンパク質は、配列番号１１１２〜１１１９のいずれかに記載されるＣ２ｃ１アミノ酸配列の１００アミノ酸〜２００アミノ酸（ａａ）、２００ａａ〜４００ａａ、４００ａａ〜６００ａａ、６００ａａ〜８００ａａ、８００ａａ〜１０００ａａ、１０００ａａ〜１１００ａａ、１１００ａａ〜１２００ａａ、又は１２００ａａ〜１３００ａａの連続したストレッチに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
ある場合には、Ｃ２ｃ１タンパク質は、配列番号１１１２〜１１１９のいずれかに記載されるＣ２ｃ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃ２ｃ１タンパク質は、配列番号１１１２〜１１１９のいずれかに記載されるＣ２ｃ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃ２ｃ１タンパク質は、配列番号１１１２〜１１１９のいずれかに記載されるＣ２ｃ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃ２ｃ１タンパク質は、配列番号１１１２〜１１１９のいずれかに記載されるＣ２ｃ１アミノ酸配列のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０７】
ある場合には、Ｃ２ｃ１タンパク質は、野生型Ｃ２ｃ１タンパク質に対して（例えば、配列番号１１１２〜１１１９のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むＣ２ｃ１タンパク質に対して）酵素活性の減少を示し、ＤＮＡ結合活性を保持する。ある場合には、適切なＣ２ｃ１タンパク質は、配列番号１１１２〜１１１９のいずれかに記載されるＣ２ｃ１アミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
ある場合には、Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃ２ｃ３タンパク質である（例としては、配列番号１１２０〜１１２３に記載されるものが挙げられる）。ある場合には、Ｃ２ｃ３タンパク質は、配列番号１１２０〜１１２３のいずれかに記載されるＣ２ｃ３アミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃ２ｃ３タンパク質は、配列番号１１２０〜１１２３のいずれかに記載されるＣ２ｃ３アミノ酸配列の１００アミノ酸〜２００アミノ酸（ａａ）、２００ａａ〜４００ａａ、４００ａａ〜６００ａａ、６００ａａ〜８００ａａ、８００ａａ〜１０００ａａ、１０００ａａ〜１１００ａａ、１１００ａａ〜１２００ａａ、又は１２００ａａ〜１３００ａａの連続したストレッチに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
ある場合には、Ｃ２ｃ３タンパク質は、配列番号１１２０〜１１２３のいずれかに記載されるＣ２ｃ３アミノ酸配列のＲｕｖＣＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃ２ｃ３タンパク質は、配列番号１１２０〜１１２３のいずれかに記載されるＣ２ｃ３アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃ２ｃ３タンパク質は、配列番号１１２０〜１１２３のいずれかに記載されるＣ２ｃ３アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃ２ｃ３タンパク質は、配列番号１１２０〜１１２３のいずれかに記載されるＣ２ｃ３アミノ酸配列のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
ある場合には、Ｃ２ｃ３タンパク質は、野生型Ｃ２ｃ３タンパク質に対して（例えば、配列番号１１２０〜１１２３のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むＣ２ｃ３タンパク質に対して）酵素活性の減少を示し、ＤＮＡ結合活性を保持する。ある場合には、適切なＣ２ｃ３タンパク質は、配列番号１１２０〜１１２３のいずれかに記載されるＣ２ｃ３アミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１１】
ある場合には、ＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃ２ｃ２タンパク質である（例としては、配列番号１１２４〜１１３５に記載されるものが挙げられる）。ある場合には、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１１２４〜１１３５のいずれかに記載されるＣ２ｃ２アミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１１２４〜１１３５のいずれかに記載されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の１００アミノ酸〜２００アミノ酸（ａａ）、２００ａａ〜４００ａａ、４００ａａ〜６００ａａ、６００ａａ〜８００ａａ、８００ａａ〜１０００ａａ、１０００ａａ〜１１００ａａ、１１００ａａ〜１２００ａａ、又は１２００ａａ〜１３００ａａの連続したストレッチに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
ある場合には、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１１２４〜１１３５のいずれかに記載されるＣ２ｃ２アミノ酸配列のＲｕｖＣＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１１２４〜１１３５のいずれかに記載されるＣ２ｃ２アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１１２４〜１１３５のいずれかに記載されるＣ２ｃ２アミノ酸配列のＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１１２４〜１１３５のいずれかに記載されるＣ２ｃ２アミノ酸配列のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１３】
ある場合には、Ｃ２ｃ２タンパク質は、野生型Ｃ２ｃ２タンパク質に対して（例えば、配列番号１１２４〜１１３５のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むＣ２ｃ２タンパク質に対して）酵素活性の減少を示し、ＤＮＡ結合活性を保持する。ある場合には、適切なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号１１２４〜１１３５のいずれかに記載されるＣ２ｃ２アミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１４】
ＰＡＭ配列
野生型クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、通常、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列と標的核酸との間の相補性によって定義される標的部位で標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ））を切断するヌクレアーゼ活性を有する。ある場合には、標的核酸の部位特異的切断は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ及び標的核酸間の塩基対形成相補性、並びに（ｉｉ）標的核酸におけるショートモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される）の両方によって決定される位置で起こる。例えば、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが野生型Ｃａｓ９タンパク質である場合、Ｃａｓ９タンパク質によって認識される（例えば、結合される）ＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡの非相補鎖（Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない鎖）上に存在し、標的部位に隣接している。
【０１１５】
ある場合には、（例えば、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９タンパク質である、いくつかの場合には）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＸＧＧ−３’であり、ここで、Ｘは、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、Ｘは、標的ＤＮＡの非相補鎖の標的配列のすぐ３’側である。従って、ＰＡＭ配列とハイブリダイズする相補鎖の配列は、５’−ＣＣＹ−３’であり、ここで、Ｙは、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、Ｙは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列のすぐ５’側である。いくつかのそのような実施形態では、Ｘ及びＹは、相補的であり得、Ｘ−Ｙ塩基対は、任意の塩基対でもあり得る（例えば、Ｘ＝Ｃ及びＹ＝Ｇ、Ｘ＝Ｇ及びＹ＝Ｃ、Ｘ＝Ａ及びＹ＝Ｔ、ならびにＸ＝Ｔ及びＹ＝Ａ）。
【０１１６】
ある場合には、異なるクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、種々の種に由来するＣａｓ９タンパク質、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼなど）は、異なるエンドヌクレアーゼの種々の特徴（例えば、酵素的特徴）を十分に利用するために、主題の方法において使用するのに有利であり得る（例えば、異なるＰＡＭ配列優先度のため、酵素活性の増加又は減少のため、細胞毒性レベルの増加又は減少のため、ＮＨＥＪ、相同組換え回復、一本鎖切断、二本鎖切断などの間のバランスを変化させるため）。
【０１１７】
種々の種に由来するクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、標的ＤＮＡにおいて異なるＰＡＭ配列を必要とし得、異なる種類のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型タンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型タンパク質、ＶＩ型タンパク質など）は、標的ＤＮＡの標的配列に対するＰＡＭ配列の位置に対して異なる要求（例えば、５’、３’、相補鎖、非相補鎖、標的配列からの距離など）を有し得る。従って、特定の最適なクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼにおいて、ＰＡＭ配列の要求は、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９タンパク質に対して上に記載した５’−ＸＧＧ−３’配列とは異なり得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では（例えば、Ｃａｓ９タンパク質がＳ．ピオゲネス由来である場合、又は密接に関連したＣａｓ９を使用する場合、例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｍａｙ；１０（５）：７２６−３７；及びＪｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６−２１を参照されたい。それらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＰＡＭ配列は、５’−ＮＧＧ−３’であり得、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では（例えば、Ｃａｓ９タンパク質が髄膜炎菌のＣａｓ９タンパク質由来である場合、又は密接に関連したＣａｓ９を使用する場合）、ＰＡＭ配列は、５’−ＮＮＮＮＧＡＮＮ−３’、５’−ＮＮＮＮＧＴＴＮ−３’、５’−ＮＮＮＮＧＮＮＴ−３’、５’−ＮＮＮＮＧＴＮＮ−３’、５’−ＮＮＮＮＧＮＴＮ−３’、又は５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３’であり得、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では（例えば、Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカス‐サーモフィルス＃１由来である場合、又は密接に関連したＣａｓ９を使用する場合）、ＰＡＭ配列は、５’−ＮＮＡＧＡＡ−３’、５’−ＮＮＡＧＧＡ−３’、５’−ＮＮＧＧＡＡ−３’、５’−ＮＮＡＮＡＡ−３’、又は５’−ＮＮＧＧＧＡ−３’であり得、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では（例えば、Ｃａｓ９タンパク質がトレポネーマデンティコラ（ＴＤ）由来である場合、又は密接に関連したＣａｓ９を使用する場合）、ＰＡＭ配列は、５’−ＮＡＡＡＡＮ−３’、５’−ＮＡＡＡＡＣ−３’、５’−ＮＡＡＡＮＣ−３’、５’−ＮＡＮＡＡＣ−３’、又は５’−ＮＮＡＡＡＣ−３’であり得、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドである。
【０１１９】
任意の所与のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼのＰＡＭ要求は、標準方法、常法、従来の方法を用いて決定することができ、これには、実験的方法、及び／又は目的の種由来の天然に存在する配列のインシリコ解析を含むことができる。例えば、当業者によって知られているであろうように、他のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、異なる種のＣａｓ９タンパク質、ＩＶ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼなど）のさらなるＰＡＭ配列を、生物情報解析（例えば、ゲノムシーケンシングデータの解析）を用いて容易に決定することができる。例えば、さらなる情報については、Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００９  Ｍａｒ、１５５（Ｐｔ  ３）：７３３−４０、及びＥｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｎｏｖ、１０（１１）：１１１６−２１を参照されたい。
【０１２０】
さらに、当該技術分野で周知のように、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）のＰＡＭ相互作用ドメインは、第１の種由来のエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）から誘導することができ、ＰＡＭ配列は、そのドメインに対応することができる。従って、ある場合には、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、第１の種のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）から誘導される（例えば、由来である）ＰＡＭ相互作用ドメインを有し、及びクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）の他の部分は、第２の種から誘導され得る（例えば、由来であり得る）。
【０１２１】
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの）ガイドＲＮＡ
クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質など）に結合し、複合体を標的核酸内の特定の位置に標的化する核酸分子は、「ガイドＲＮＡ」又は「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸」又は「ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ」と本明細書で呼ばれる。
【０１２２】
ガイドＲＮＡは、標的核酸の配列に相補的であるヌクレオチド配列であるガイド配列（ターゲティング配列とも本明細書で呼ばれる）を含むターゲティングセグメントを含むことによって、複合体（ＲＮＰ複合体）に標的特異性をもたらす。
【０１２３】
ガイドＲＮＡは、それが対応するタンパク質によって参照することができる。例えば、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である場合、対応するガイドＲＮＡは、「Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ」と呼ぶことができる。同様に、別の例として、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣｐｆ１タンパク質である場合、対応するガイドＲＮＡは、「Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ」と呼ぶことができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、２つの別々の核酸分子、すなわち「アクチベーター」及び「ターゲッター」を含み、「二重ガイドＲＮＡ」、「二重分子型ガイドＲＮＡ」、「二分子型ガイドＲＮＡ」、又は「ｄｇＲＮＡ」と本明細書で呼ばれる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、一分子（例えば、いくつかのクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質では、対応するガイドＲＮＡは、単一分子であり、ある場合には、アクチベーター及びターゲッターは、例えば、介在ヌクレオチドを介して、互いに共有結合的に連結されている）であり、及びガイドＲＮＡは、「単一ガイドＲＮＡ」、「単一分子型ガイドＲＮＡ」、「一分子型ガイドＲＮＡ」、又は単に「ｓｇＲＮＡ」と称される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、主題のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、表２（図２３に提供される）に示す標的配列を標的にする（例えば、以下の例の表３も参照されたい）。いくつかの実施形態では、主題のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、表９（図２４に提供される）に示す標的配列を標的にする。
【０１２６】
表２（図２３）。（ｉ）標的ＤＮＡの標的配列（非相補鎖）、及び（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、非相補鎖においてＮＧＧのＰＡＭ要求を有するＳ．ピオゲネス由来のＣａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質）のガイド配列の例、ここで、第１の標的配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内であり、第２の標的配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内である。ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内の標的配列に標的化されるガイド配列は、「４４」シリーズガイド配列と称され、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内の標的配列に標的化されるガイド配列は、「５５」シリーズガイド配列と称される。
【０１２７】
例えば、ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１４０〜１１４４から選択される配列を含む（その配列は、２０ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内である）。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１４５〜１１４９から選択される配列を含む（その配列は、１７ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内である）。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５０〜１１５４から選択される配列を含むガイド配列を含む（その配列は、２０ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内の標的配列にハイブリダイズする）。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５５〜１１５９から選択される配列を含むガイド配列を含む（その配列は、１７ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内の標的配列にハイブリダイズする）。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１３６〜１１３９及び配列番号１１８０〜１２２２から選択される配列を含む（その配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内である）。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１２２３〜１２６９から選択される配列を含むガイド配列を含む（その配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内の標的配列にハイブリダイズする）。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１６０〜１１６４から選択される配列を含む（その配列は、２０ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内である）。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１６５〜１１６９から選択される配列を含む（その配列は、１７ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内である）。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７０〜１１７４から選択される配列を含むガイド配列を含む（その配列は、２０ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内の標的配列にハイブリダイズする）。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７５〜１１７９から選択される配列を含むガイド配列を含む（その配列は、１７ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内の標的配列にハイブリダイズする）。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１２７０〜１３１７から選択される配列を含む（その配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内である）。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１３１８〜１３６５から選択される配列を含むガイド配列を含む（その配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内の標的配列にハイブリダイズする）。
【０１２９】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１４０〜１１４４から選択される配列を含み（その配列は、２０ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内である）、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１６０〜１１６４から選択される配列を含む（その配列は、２０ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内である）。
【０１３０】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１３６〜１１３９及び配列番号１１８０〜１２２２から選択される配列を含み（その配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内である）、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１２７０〜１３１７から選択される配列を含む（その配列は、２０ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内である）。
【０１３１】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１４５〜１１４９から選択される配列を含み（その配列は、１７ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内である）、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１６５〜１１６９から選択される配列を含む（その配列は、１７ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内である）。
【０１３２】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５０〜１１５４から選択される配列を含むガイド配列を含み（その配列は、２０ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内の標的配列にハイブリダイズする）、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７０〜１１７４から選択される配列を含むガイド配列を含む（その配列は、２０ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内の標的配列にハイブリダイズする）。
【０１３３】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５０〜１１５４から選択される配列を含むガイド配列を含み（その配列は、２０ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内の標的配列にハイブリダイズする）、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７０〜１１７４から選択される配列を含むガイド配列を含む（その配列は、２０ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内の標的配列にハイブリダイズする）。
【０１３４】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１２２３〜１２６９から選択される配列を含むガイド配列を含み（その配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内の標的配列にハイブリダイズする）、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１３１８〜１３６５から選択される配列を含むガイド配列を含む（その配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内の標的配列にハイブリダイズする）。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１３５】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１２２３に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１３２０に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含む。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１３６】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１２２４に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１３２０に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含む。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１３７】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１２２５に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１３２０に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含む。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１３８】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５３に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７２に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含む。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１３９】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５３に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７１に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含む。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１４０】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５２に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７２に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含む。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１４１】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５２に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７１に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含む。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１４２】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５０に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７２に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含む。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１４３】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５０に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７１に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含む。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１４４】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５０に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７４に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含む。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１４５】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５２に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７４に記載されるヌクレオチド配列を含むガイド配列を含む。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１４６】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５５〜１１５９から選択される配列を含むガイド配列を含み（その配列は、１７ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内の標的配列にハイブリダイズする）、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７５〜１１７９から選択される配列を含むガイド配列を含む（その配列は、１７ヌクレオチド長であり、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内の標的配列にハイブリダイズする）。
【０１４７】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１４３（イントロン４４内）に記載の配列を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１６２（イントロン５５内）に記載の配列を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１４８（イントロン４４内）に記載の配列を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）により標的とされる標的配列の非相補鎖は、配列番号１１６７（イントロン５５内）に記載の配列を含む。
【０１４８】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５３に記載の配列を含む（イントロン４４を標的にする）ガイド配列を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７２に記載の配列を含む（イントロン５５を標的にする）ガイド配列を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１５８に記載の配列を含む（イントロン４４を標的にする）ガイド配列を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）は、配列番号１１７７に記載の配列を含む（イントロン５５を標的にする）ガイド配列を含む。
【０１４９】
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ
Ｃａｓ９タンパク質に結合し、複合体を標的核酸内の特定の位置で標的とする核酸分子は、「Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ」と本明細書で呼ばれる。
【０１５０】
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、２つのセグメント、すなわち第１のセグメント（「ターゲティングセグメント」と本明細書で呼ばれる）、及び第２のセグメント（「タンパク質結合セグメント」と本明細書で呼ばれる）を含むと言われることができる。「セグメント」は、分子のセグメント／セクション／領域（例えば、核酸分子における連続した一連のヌクレオチド）を意味する。セグメントは、セグメントが２つ以上の分子の領域を含み得るような、複合体の領域／セクションを意味する場合もある。
【０１５１】
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの第１のセグメント（ターゲティングセグメント）は、標的核酸（例えば、標的ゲノムＤＮＡ）内の特異的配列（標的部位）に相補的である（従って、それとハイブリダイズする）ヌクレオチド配列（ガイド配列）を含む。タンパク質結合セグメント（又は「タンパク質結合配列」）は、Ｃａｓ９ポリペプチドと相互作用する（に結合する）。主題のＣａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ二本鎖）を形成する、２本の相補的な一連のヌクレオチドを含む。標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）の部位特異的結合、及び／又は切断は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのガイド配列）と標的核酸の間の塩基対相補性によって決定される位置（例えば、標的遺伝子座の標的配列、例えば、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４及び５５）で起こり得る。
【０１５２】
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質は、複合体を形成する（例えば、非共有結合性相互作用を介して結合する）。Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、ガイド配列（標的核酸の配列に相補的であるヌクレオチド配列）を含むターゲティングセグメントを含むことによって、標的特異性を複合体にもたらす。複合体のＣａｓ９タンパク質は、部位特異的活性（例えば、切断活性）をもたらす。言い換えれば、Ｃａｓ９タンパク質は、それ自体がＣａｓ９ガイドＲＮＡと会合することによって、標的核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）にガイドされる。
【０１５３】
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの「ターゲティング配列」とも称される「ガイド配列」は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を考慮に入れることができることを除いて、任意の所望の標的核酸の任意の所望の配列にＣａｓ９タンパク質を標的化することができるように修飾することができる。従って、例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、真核細胞中の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）における配列と相補性を有する（例えば、それにハイブリダイズすることができる）配列（ガイド配列）を有するターゲティングセグメントを有し得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、２つの別々の核酸分子、すなわち「アクチベーター」及び「ターゲッター」を含み、「二重Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ」、「二重分子型Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ」、又は「二分子型Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ」、「二重ガイドＲＮＡ」、又は「ｄｇＲＮＡ」と本明細書で呼ばれる。いくつかの実施形態では、アクチベーター及びターゲッターは、（例えば、介在ヌクレオチドを介して）互いに共有結合的に連結されており、及びガイドＲＮＡは、「単一ガイドＲＮＡ」、「Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡ」、「単一分子型Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ」又は「一分子型Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ」、又は又は単に「ｓｇＲＮＡ」と称される。
【０１５５】
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」／「ターゲッター」／「ｃｒＲＮＡ」／「ｃｒＲＮＡリピート」）分子と、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作動性ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」／「アクチベーター」／「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡ様分子（ターゲッター）は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのターゲティングセグメント（一本鎖）と、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の片方を形成する一連のヌクレオチド（「二重鎖形成セグメント」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（アクチベーター／ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ガイド核酸のタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖のもう片方を形成する一連のヌクレオチド（二重鎖形成セグメント）を含む。言い換えれば、ｃｒＲＮＡ様分子の一連のヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子の一連のヌクレオチドと相補的であり、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子の一連のヌクレオチドとハイブリダイズして、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。従って、各ターゲッター分子は、（ターゲッターとハイブリダイズする領域を有する）対応するアクチベーター分子を有するということができる。ターゲッター分子は、ターゲティングセグメントをさらに提供する。従って、ターゲッター及びアクチベーター分子は、（対応する対として）ハイブリダイズして、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡを形成する。所与のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が見られる種に特有のものである。主題の二重Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、任意の対応するアクチベーターとターゲッター対を含むことができる。
【０１５６】
「アクチベーター」又は「アクチベーターＲＮＡ」という用語は、Ｃａｓ９二重ガイドＲＮＡ（従って、「アクチベーター」及び「ターゲッター」が、例えば、介在ヌクレオチドによって一緒に連結した場合、Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡ）のｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（ｔｒａｃｒＲＮＡ：「トランス作動性ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）を意味するものとして本明細書で使用する。従って、例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）は、アクチベーター配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含む。ｔｒａｃｒ分子（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ分子（ｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズして、Ｃａｓ９二重ガイドＲＮＡを形成する天然に存在する分子である。「アクチベーター」という用語は、天然に存在するｔｒａｃｒＲＮＡを包含するが、修飾（例えば、切断、配列変異、塩基修飾、骨格修飾、結合修飾など）を有するｔｒａｃｒＲＮＡも包含するように本明細書で使用され、ここで、アクチベーターは、ｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも１つ機能を保持する（例えば、Ｃａｓ９タンパク質が結合するｄｓＲＮＡ二本鎖に寄与する）。ある場合には、アクチベーターは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用し得る１つ以上のステムループを与える。アクチベーターは、ｔｒａｃｒ配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を有すると称することができ、ある場合には、ｔｒａｃｒＲＮＡであるが、「アクチベーター」という用語は、天然に存在するｔｒａｃｒＲＮＡに限定されない。
【０１５７】
「ターゲッター」又は「ターゲッターＲＮＡ」という用語は、Ｃａｓ９二重ガイドＲＮＡ（従って、「アクチベーター」及び「ターゲッター」が、例えば、介在ヌクレオチドによって一緒に連結した場合、Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡ）のｃｒＲＮＡ様分子（ｃｒＲＮＡ：「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）を称するものとして本明細書で使用する。従って、例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）は、（標的核酸とハイブリダイズする（に相補的である）ヌクレオチドを含む）ターゲティングセグメント、及び二本鎖形成セグメント（例えば、ｃｒＲＮＡリピートとも称することができるｃｒＲＮＡの二本鎖形成セグメント）を含む。ターゲッターのターゲティングセグメント（標的核酸の標的配列とハイブリダイズするセグメント）の配列は、所望の標的核酸とハイブリダイズするようにユーザーによって改変されるため、ターゲッターの配列は、自然には発生しない配列であることが多い。しかしながら、アクチベーターの二本鎖形成セグメントとハイブリダイズするターゲッターの二本鎖形成セグメント（以下により詳細に説明される）は、天然に存在する配列を含むことができる（例えば、天然に存在するｃｒＲＮＡの二本鎖形成セグメントの配列を含むことができ、これは、ｃｒＲＮＡリピートとも称することができる）。従って、「ターゲッター」という用語は、ターゲッターの一部（例えば、二本鎖形成セグメント）がｃｒＲＮＡ由来の自然発生の配列を含むことが多いという事実にもかかわらず、自然発生のｃｒＲＮＡと区別するように本明細書で使用される。しかしながら、「ターゲッター」という用語は、自然発生のｃｒＲＮＡを包含する。
【０１５８】
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、３つの部分、すなわち（ｉ）ターゲティング配列（標的核酸の配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列）、（ｉｉ）アクチベーター配列（上述のように）（ある場合には、ｔｒａｃｒ配列と称される）、及び（ｉｉｉ）アクチベーター配列の少なくとも一部にハイブリダイズして、二本鎖二重鎖を形成する配列を含むと言うこともできる。ターゲッターは、（ｉ）及び（ｉｉｉ）を有する一方、アクチベーターは、（ｉｉ）を有する。
【０１５９】
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（例えば、二重ガイドＲＮＡ又は単一ガイドＲＮＡ）は、任意の対応するアクチベーター及びターゲッター対からなり得る。ある場合には、二本鎖形成セグメントは、アクチベーターとターゲッターの間で交換することができる。言い換えれば、ある場合には、ターゲッターは、ｔｒａｃｒＲＮＡの二本鎖形成セグメント由来のヌクレオチドの配列（その配列は、通常、アクチベーターの一部である）を含む一方、アクチベーターは、ｃｒＲＮＡの二本鎖形成セグメント由来のヌクレオチドの配列（その配列は、通常、ターゲッターの一部である）を含む。
【０１６０】
上述のように、ターゲッターは、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのターゲティングセグメント（一本鎖）と、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の片方を形成する一連のヌクレオチド（「二重鎖形成セグメント」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（アクチベーター）は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖のもう片方を形成する一連のヌクレオチド（二重鎖形成セグメント）を含む。言い換えれば、ターゲッターの一連のヌクレオチドは、アクチベーターの一連のヌクレオチドと相補的であり、アクチベーターの一連のヌクレオチドとハイブリダイズして、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。従って、各ターゲッターは、（ターゲッターとハイブリダイズする領域を有する）対応するアクチベーターを有するということができる。ターゲッター分子は、ターゲティングセグメントをさらに提供する。従って、ターゲッター及びアクチベーター分子は、（対応する対として）ハイブリダイズして、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡを形成する。所与の天然に存在するｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の特定の配列は、ＲＮＡ分子が見られる種に特有のものである。適切なアクチベーター及びターゲッターの例は、当該技術分野において周知である。
【０１６１】
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（例えば、二重ガイドＲＮＡ又は単一ガイドＲＮＡ）は、任意の対応するアクチベーター及びターゲッター対からなり得る。Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）に含まれ得るヌクレオチド配列の非限定例としては、配列番号８２７〜１０７５に記載される配列又はその補体が挙げられる。例えば、ある場合には、（ｔｒａｃｒＲＮＡ由来である）配列番号８２７〜９５７由来の配列又はその補体は、（ｃｒＲＮＡ由来である）配列番号９６４〜１０７５由来の配列又はその補体と対合し、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖を形成することができる。ある場合には、本明細書での使用に適したガイドＲＮＡの二本鎖形成部分は、配列：ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３６６）、又はｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａＧＡＡＡｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３６７）を含む。
【０１６２】
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのターゲティングセグメント
主題のガイドＲＮＡは、ガイド配列（すなわち、ターゲティング配列）（標的核酸における配列（標的部位）に相補的であるヌクレオチド配列）を含む。言い換えれば、主題のガイド核酸のターゲティングセグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介した配列特異的な方法で標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ））と相互作用することができる。従って、ターゲティングセグメントのヌクレオチド配列は、（標的に応じて）変化し得、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡと標的核酸が相互作用する標的核酸内の位置を決定することができる。Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのターゲティングセグメントは、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡなどの真核生物標的核酸）内で任意の所望の配列（標的部位）にハイブリダイズするように改変（例えば、遺伝子工学によって）／設計することができる。
【０１６３】
ターゲティングセグメントは、７以上のヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、又は４０以上のヌクレオチド）の長さを有し得る。ある場合には、ターゲティングセグメントは、７〜１００ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、７〜８０ｎｔ、７〜６０ｎｔ、７〜４０ｎｔ、７〜３０ｎｔ、７〜２５ｎｔ、７〜２２ｎｔ、７〜２０ｎｔ、７〜１８ｎｔ、８〜８０ｎｔ、８〜６０ｎｔ、８〜４０ｎｔ、８〜３０ｎｔ、８〜２５ｎｔ、８〜２２ｎｔ、８〜２０ｎｔ、８〜１８ｎｔ、１０〜１００ｎｔ、１０〜８０ｎｔ、１０〜６０ｎｔ、１０〜４０ｎｔ、１０〜３０ｎｔ、１０〜２５ｎｔ、１０〜２２ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、１０〜１８ｎｔ、１２〜１００ｎｔ、１２〜８０ｎｔ、１２〜６０ｎｔ、１２〜４０ｎｔ、１２〜３０ｎｔ、１２〜２５ｎｔ、１２〜２２ｎｔ、１２〜２０ｎｔ、１２〜１８ｎｔ、１４〜１００ｎｔ、１４〜８０ｎｔ、１４〜６０ｎｔ、１４〜４０ｎｔ、１４〜３０ｎｔ、１４〜２５ｎｔ、１４〜２２ｎｔ、１４〜２０ｎｔ、１４〜１８ｎｔ、１６〜１００ｎｔ、１６〜８０ｎｔ、１６〜６０ｎｔ、１６〜４０ｎｔ、１６〜３０ｎｔ、１６〜２５ｎｔ、１６〜２２ｎｔ、１６〜２０ｎｔ、１６〜１８ｎｔ、１８〜１００ｎｔ、１８〜８０ｎｔ、１８〜６０ｎｔ、１８〜４０ｎｔ、１８〜３０ｎｔ、１８〜２５ｎｔ、１８〜２２ｎｔ、又は１８〜２０ｎｔ）の長さを有し得る。
【０１６４】
標的核酸のヌクレオチド配列（標的部位）に相補的であるターゲティングセグメントのヌクレオチド配列（ターゲティング配列、ガイド配列）は、１０ｎｔ以上の長さを有し得る。例えば、標的核酸の標的部位に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、１２ｎｔ以上、１５ｎｔ以上、１７ｎｔ以上、１８ｎｔ以上、１９ｎｔ以上、又は２０ｎｔ以上の長さを有し得る。ある場合には、標的核酸のヌクレオチド配列（標的部位）に相補的であるターゲティングセグメントのヌクレオチド配列（ターゲティング配列）は、１２ｎｔ以上の長さを有する。ある場合には、標的核酸のヌクレオチド配列（標的部位）に相補的であるターゲティングセグメントのヌクレオチド配列（ターゲティング配列）は、１７ｎｔ以上の長さを有する。ある場合には、標的核酸のヌクレオチド配列（標的部位）に相補的であるターゲティングセグメントのヌクレオチド配列（ターゲティング配列）は、１８ｎｔ以上の長さを有する。
【０１６５】
例えば、標的核酸の標的配列に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列（ガイド配列）は、１０〜１００ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１０〜９０ｎｔ、１０〜７５ｎｔ、１０〜６０ｎｔ、１０〜５０ｎｔ、１０〜３５ｎｔ、１０〜３０ｎｔ、１０〜２５ｎｔ、１０〜２２ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、１２〜１００ｎｔ、１２〜９０ｎｔ、１２〜７５ｎｔ、１２〜６０ｎｔ、１２〜５０ｎｔ、１２〜３５ｎｔ、１２〜３０ｎｔ、１２〜２５ｎｔ、１２〜２２ｎｔ、１２〜２０ｎｔ、１５〜１００ｎｔ、１５〜９０ｎｔ、１５〜７５ｎｔ、１５〜６０ｎｔ、１５〜５０ｎｔ、１５〜３５ｎｔ、１５〜３０ｎｔ、１５〜２５ｎｔ、１５〜２２ｎｔ、１５〜２０ｎｔ、１７〜１００ｎｔ、１７〜９０ｎｔ、１７〜７５ｎｔ、１７〜６０ｎｔ、１７〜５０ｎｔ、１７〜３５ｎｔ、１７〜３０ｎｔ、１７〜２５ｎｔ、１７〜２２ｎｔ、１７〜２０ｎｔ、１８〜１００ｎｔ、１８〜９０ｎｔ、１８〜７５ｎｔ、１８〜６０ｎｔ、１８〜５０ｎｔ、１８〜３５ｎｔ、１８〜３０ｎｔ、１８〜２５ｎｔ、１８〜２２ｎｔ、又は１８〜２０ｎｔ）の長さを有し得る。ある場合には、標的核酸の標的配列に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する。ある場合には、標的核酸の標的配列に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、１５ｎｔ〜２５ｎｔの長さを有する。ある場合には、標的核酸の標的配列に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、１７ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する。ある場合には、標的核酸の標的配列に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、１７ｎｔ〜２５ｎｔの長さを有する。ある場合には、標的核酸の標的配列に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、１７ｎｔ〜２２ｎｔの長さを有する。ある場合には、標的核酸の標的配列に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、１８ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する。ある場合には、標的核酸の標的配列に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、１８ｎｔ〜２５ｎｔの長さを有する。ある場合には、標的核酸の標的配列に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、１８ｎｔ〜２２ｎｔの長さを有する。ある場合には、標的核酸の標的部位に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、２０ヌクレオチドの長さである。ある場合には、標的核酸の標的部位に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、１９ヌクレオチドの長さである。ある場合には、標的核酸の標的部位に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、１８ヌクレオチドの長さである。ある場合には、標的核酸の標的部位に相補的であるターゲティングセグメントのターゲティング配列は、１７ヌクレオチドの長さである。
【０１６６】
ターゲティングセグメントのターゲティング配列（ガイド配列）と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）であり得る。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の７の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％である。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、約２０の連続したヌクレオチドにわたって６０％以上である。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の１４の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたって０％以上と低い。そのような場合、ターゲティング配列は、１４ヌクレオチドの長さであると考えられ得る。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の７の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたって０％以上と低い。
【０１６７】
ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、（Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのターゲティング配列の３’末端のヌクレオチドに相補的であり得る）標的核酸の標的部位の７の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％である。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、（Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのターゲティング配列の３’末端のヌクレオチドに相補的であり得る）標的核酸の標的部位の８の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％である。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、（Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのターゲティング配列の３’末端のヌクレオチドに相補的であり得る）標的核酸の標的部位の９の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％である。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、（Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのターゲティング配列の３’末端のヌクレオチドに相補的であり得る）標的核酸の標的部位の１０の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％である。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、（Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのターゲティング配列の３’末端のヌクレオチドに相補的であり得る）標的核酸の標的部位の１７の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％である。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、（Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのターゲティング配列の３’末端のヌクレオチドに相補的であり得る）標的核酸の標的部位の１８の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％である。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、２０の連続したヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、１７の連続したヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）である。
【０１６８】
ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の７の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたって０％以上と低い。そのような場合、ターゲティング配列は、７ヌクレオチドの長さであると考えられ得る。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の８の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたって０％以上と低い。そのような場合、ターゲティング配列は、８ヌクレオチドの長さであると考えられ得る。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の９の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたって０％以上と低い。そのような場合、ターゲティング配列は、９ヌクレオチドの長さであると考えられ得る。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の１０の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたって０％以上と低い。そのような場合、ターゲティング配列は、１０ヌクレオチドの長さであると考えられ得る。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の１１の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたって０％以上と低い。そのような場合、ターゲティング配列は、１１ヌクレオチドの長さであると考えられ得る。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の１２の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたって０％以上と低い。そのような場合、ターゲティング配列は、１２ヌクレオチドの長さであると考えられ得る。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の１３の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたって０％以上と低い。そのような場合、ターゲティング配列は、１３ヌクレオチドの長さであると考えられ得る。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の１４の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたって０％以上と低い。そのような場合、ターゲティング配列は、１４ヌクレオチドの長さであると考えられ得る。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の１７の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたって０％以上と低い。そのような場合、ターゲティング配列は、１７ヌクレオチドの長さであると考えられ得る。ある場合には、ターゲティングセグメントのターゲティング配列と標的核酸の標的部位との間のパーセント相補性は、標的核酸の標的部位の１８の連続した５’末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたって０％以上と低い。そのような場合、ターゲティング配列は、１８ヌクレオチドの長さであると考えられ得る。
【０１６９】
種々のＣａｓ９タンパク質及びＣａｓ９ガイドＲＮＡの例（並びに、標的核酸に存在するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に関連する要求に関する情報）は、当該技術分野で見出すことができる、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ。２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６−２１、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｍａｙ；１０（５）：７２６−３７、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３  Ｓｅｐ  ２４；１１０（３９）：１５６４４−９、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１、Ｐａｔｔａｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｓｅｐ；３１（９）：８３９−４３、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｆｅｂ  ２８；１５２（５）：１１７３−８３、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｍａｙ  ９；１５３（４）：９１０−８、Ａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｏｃｔ  ３１、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  １；４１（２０）：ｅ１９、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３−７１、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１９５（３）：１１７７−８０、ＤｉＣａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ａｐｒ；４１（７）：４３３６−４３、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｏｃｔ；１０（１０）：１０２８−３４、Ｅｂｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０、Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  １；４１（２０）：ｅ１８７、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ；２３（１１）：１３２２−５、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  １；４１（２０）：ｅ１８８、Ｌａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  Ｎｏｖ；８（１１）：２１８０−９６、Ｍａｌｉ  ｅｔ．ａｔ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７−６３、Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３  Ｄｅｃ；５１（１２）：８３５−４３、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｓｅｐ  １２；１５４（６）：１３８０−９、Ｕｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３  Ｄｅｃ  ９；３（１２）：２２３３−８、Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３  Ｓｅｐ  ２４；１１０（３９）：１５５１４−５、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ．２０１３  Ｏｃｔ  ９、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｓｅｐ  １２；１５４（６）：１３７０−９、Ｂｒｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ２３；５６（２）：３３３−９、及び米国特許及び特許出願：８，９０６，６１６、８，８９５，３０８、８，８８９，４１８、８，８８９，３５６、８，８７１，４４５、８，８６５，４０６、８，７９５，９６５、８，７７１，９４５、８，６９７，３５９、２０１４００６８７９７、２０１４０１７０７５３、２０１４０１７９００６、２０１４０１７９７７０、２０１４０１８６８４３、２０１４０１８６９１９、２０１４０１８６９５８、２０１４０１８９８９６、２０１４０２２７７８７、２０１４０２３４９７２、２０１４０２４２６６４、２０１４０２４２６９９、２０１４０２４２７００、２０１４０２４２７０２、２０１４０２４８７０２、２０１４０２５６０４６、２０１４０２７３０３７、２０１４０２７３２２６、２０１４０２７３２３０、２０１４０２７３２３１、２０１４０２７３２３２、２０１４０２７３２３３、２０１４０２７３２３４、２０１４０２７３２３５、２０１４０２８７９３８、２０１４０２９５５５６、２０１４０２９５５５７、２０１４０２９８５４７、２０１４０３０４８５３、２０１４０３０９４８７、２０１４０３１０８２８、２０１４０３１０８３０、２０１４０３１５９８５、２０１４０３３５０６３、２０１４０３３５６２０、２０１４０３４２４５６、２０１４０３４２４５７、２０１４０３４２４５８、２０１４０３４９４００、２０１４０３４９４０５、２０１４０３５６８６７、２０１４０３５６９５６、２０１４０３５６９５８、２０１４０３５６９５９、２０１４０３５７５２３、２０１４０３５７５３０、２０１４０３６４３３３、及び２０１４０３７７８６８を参照されたい。それらの全ては、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
Ｖ型及びＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに対応するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ）
Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３）に結合し、複合体を標的核酸内の特定の位置で標的とするガイドＲＮＡは、一般に、「Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ」と本明細書で称される。より具体的な用語の一例は、「Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ」である。
【０１７１】
Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ）は、３０ヌクレオチド（ｎｔ）〜２００ｎｔ、例えば、３０ｎｔ〜１８０ｎｔ、３０ｎｔ〜１６０ｎｔ、３０ｎｔ〜１５０ｎｔ、３０ｎｔ〜１２５ｎｔ、３０ｎｔ〜１００ｎｔ、３０ｎｔ〜９０ｎｔ、３０ｎｔ〜８０ｎｔ、３０ｎｔ〜７０ｎｔ、３０ｎｔ〜６０ｎｔ、３０ｎｔ〜５０ｎｔ、５０ｎｔ〜２００ｎｔ、５０ｎｔ〜１８０ｎｔ、５０ｎｔ〜１６０ｎｔ、５０ｎｔ〜１５０ｎｔ、５０ｎｔ〜１２５ｎｔ、５０ｎｔ〜１００ｎｔ、５０ｎｔ〜９０ｎｔ、５０ｎｔ〜８０ｎｔ、５０ｎｔ〜７０ｎｔ、５０ｎｔ〜６０ｎｔ、７０ｎｔ〜２００ｎｔ、７０ｎｔ〜１８０ｎｔ、７０ｎｔ〜１６０ｎｔ、７０ｎｔ〜１５０ｎｔ、７０ｎｔ〜１２５ｎｔ、７０ｎｔ〜１００ｎｔ、７０ｎｔ〜９０ｎｔ、又は７０ｎｔ〜８０ｎｔ）の全長を有し得る。ある場合には、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ）は、少なくとも３０ｎｔ（例えば、少なくとも４０ｎｔ、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも６０ｎｔ、少なくとも７０ｎｔ、少なくとも８０ｎｔ、少なくとも９０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、又は少なくとも１２０ｎｔ）の全長を有する。
【０１７２】
ある場合には、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡは、３５ｎｔ、３６ｎｔ、３７ｎｔ、３８ｎｔ、３９ｎｔ、４０ｎｔ、４１ｎｔ、４２ｎｔ、４３ｎｔ、４４ｎｔ、４５ｎｔ、４６ｎｔ、４７ｎｔ、４８ｎｔ、４９ｎｔ、又は５０ｎｔの全長を有する。
【０１７３】
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡと同様、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ）は、標的核酸結合セグメント及び二本鎖形成領域（例えば、ある場合には、２つの二本鎖形成セグメント、すなわち、互いにハイブリダイズして、二本鎖を形成するヌクレオチドの２つのストレッチから形成される）を含むことができる。
【０１７４】
Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ）の標的核酸結合セグメントは、１５ｎｔ〜３０ｎｔ、例えば、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、又は３０ｎｔの長さを有し得る。ある場合には、標的核酸結合セグメントは、２３ｎｔの長さを有する。ある場合には、標的核酸結合セグメントは、２４ｎｔの長さを有する。ある場合には、標的核酸結合セグメントは、２５ｎｔの長さを有する。
【０１７５】
Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、１５ｎｔ〜３０ｎｔ（例えば、１５〜２５ｎｔ、１５〜２４ｎｔ、１５〜２３ｎｔ、１５〜２２ｎｔ、１５〜２１ｎｔ、１５〜２０ｎｔ、１５〜１９ｎｔ、１５〜１８ｎｔ、１７〜３０ｎｔ、１７〜２５ｎｔ、１７〜２４ｎｔ、１７〜２３ｎｔ、１７〜２２ｎｔ、１７〜２１ｎｔ、１７〜２０ｎｔ、１７〜１９ｎｔ、１７〜１８ｎｔ、１８〜３０ｎｔ、１８〜２５ｎｔ、１８〜２４ｎｔ、１８〜２３ｎｔ、１８〜２２ｎｔ、１８〜２１ｎｔ、１８〜２０ｎｔ、１８〜１９ｎｔ、１９〜３０ｎｔ、１９〜２５ｎｔ、１９〜２４ｎｔ、１９〜２３ｎｔ、１９〜２２ｎｔ、１９〜２１ｎｔ、１９〜２０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、２０〜２５ｎｔ、２０〜２４ｎｔ、２０〜２３ｎｔ、２０〜２２ｎｔ、２０〜２１ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、又は３０ｎｔ）の長さを有し得る。ある場合には、ガイド配列は、１７ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１８ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、１９ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２０ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２１ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２２ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２３ｎｔの長さを有する。ある場合には、ガイド配列は、２４ｎｔの長さを有する。
【０１７６】
Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、標的核酸配列の対応する長さと１００％の相補性を有し得る。ガイド配列は、標的核酸配列の対応する長さと１００％未満の相補性を有し得る。例えば、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、標的核酸配列に相補的ではない１、２、３、４、又は５ヌクレオチドを有し得る。例えば、ある場合には、ガイド配列が、２５ヌクレオチドの長さを有し、標的核酸配列が、２５ヌクレオチドの長さを有する場合、ある場合には、標的核酸結合セグメントは、標的核酸配列に１００％の相補性を有する。別の例として、ある場合には、ガイド配列が、２５ヌクレオチドの長さを有し、標的核酸配列が、２５ヌクレオチドの長さを有する場合、ある場合には、標的核酸結合セグメントは、標的核酸配列と１の非相補的ヌクレオチド及び２４の相補的ヌクレオチドを有する。別の例として、ある場合には、ガイド配列が、２５ヌクレオチドの長さを有し、標的核酸配列が、２５ヌクレオチドの長さを有する場合、ある場合には、標的核酸結合セグメントは、標的核酸配列と２の非相補的ヌクレオチド及び２３の相補的ヌクレオチドを有する。
【０１７７】
（例えば、ターゲッターＲＮＡ又はアクチベーターＲＮＡの）Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ）の二本鎖形成セグメントは、ある場合には、１５ｎｔ〜２５ｎｔ（例えば、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、又は２５ｎｔ）の長さを有し得る。
【０１７８】
ある場合には、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ）のＲＮＡ二本鎖は、５塩基対（ｂｐ）〜４０ｂｐ（例えば、５〜３５ｂｐ、５〜３０ｂｐ、５〜２５ｂｐ、５〜２０ｂｐ、５〜１５ｂｐ、５〜１２ｂｐ、５〜１０ｂｐ、５〜８ｂｐ、６〜４０ｂｐ、６〜３５ｂｐ、６〜３０ｂｐ、６〜２５ｂｐ、６〜２０ｂｐ、６〜１５ｂｐ、６〜１２ｂｐ、６〜１０ｂｐ、６〜８ｂｐ、７〜４０ｂｐ、７〜３５ｂｐ、７〜３０ｂｐ、７〜２５ｂｐ、７〜２０ｂｐ、７〜１５ｂｐ、７〜１２ｂｐ、７〜１０ｂｐ、８〜４０ｂｐ、８〜３５ｂｐ、８〜３０ｂｐ、８〜２５ｂｐ、８〜２０ｂｐ、８〜１５ｂｐ、８〜１２ｂｐ、８〜１０ｂｐ、９〜４０ｂｐ、９〜３５ｂｐ、９〜３０ｂｐ、９〜２５ｂｐ、９〜２０ｂｐ、９〜１５ｂｐ、９〜１２ｂｐ、９〜１０ｂｐ、１０〜４０ｂｐ、１０〜３５ｂｐ、１０〜３０ｂｐ、１０〜２５ｂｐ、１０〜２０ｂｐ、１０〜１５ｂｐ、又は１０〜１２ｂｐ）の長さを有し得る。
【０１７９】
一例として、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、（５’から３’で）：ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号１０９３）、ＡＡＵＵＵＣＵＧＣＵＧＵＵＧＣＡＧＡＵ（配列番号１０９４）、ＡＡＵＵＵＣＣＡＣＵＧＵＵＧＵＧＧＡＵ（配列番号１０９５）、ＡＡＵＵＣＣＵＡＣＵＧＵＵＧＵＡＧＧＵ（配列番号１０９６）、ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＡＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号１０９７）、ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＣＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号１０９８）、ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号１０９９）、及びＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号１１００）から選択されるヌクレオチド配列を含むことができる。ガイド配列は、（５’から３’で）二本鎖形成セグメントに従い得る。
【０１８０】
Ｃ２ｃ１ガイドＲＮＡ（二重ガイド又は単一ガイド）のアクチベーターＲＮＡ（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）の非限定例は、ヌクレオチド配列ＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＡＡＧ（配列番号１１０１）を含むＲＮＡである。ある場合には、Ｃ２ｃ１ガイドＲＮＡ（二重ガイド又は単一ガイド）は、ヌクレオチド配列を含むＲＮＡである。ある場合には、Ｃ２ｃ１ガイドＲＮＡ（二重ガイド又は単一ガイド）は、ヌクレオチド配列ＧＵＣＵＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＡＡＧ（配列番号１１０２）を含むＲＮＡである。ある場合には、Ｃ２ｃ１ガイドＲＮＡ（二重ガイド又は単一ガイド）は、ヌクレオチド配列ＵＣＵＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＡＡＧ（配列番号１１０３）を含むＲＮＡである。Ｃ２ｃ１ガイドＲＮＡ（二重ガイド又は単一ガイド）のアクチベーターＲＮＡ（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）の非限定例は、ヌクレオチド配列ＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＡＡＧ（配列番号１１０４）を含むＲＮＡである。ある場合には、アクチベーターＲＮＡ（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）のＣ２ｃ１ガイドＲＮＡ（二重ガイド又は単一ガイド）の二本鎖形成セグメントは、ヌクレオチド配列ＡＧＣＵＵＣＵＣＡ（配列番号１１０５）又はヌクレオチド配列ＧＣＵＵＣＵＣＡ（配列番号１１０６）（天然に存在するｔｒａｃｒＲＮＡ由来の二本鎖形成セグメント）を含む。
【０１８１】
Ｃ２ｃ１ガイドＲＮＡ（二重ガイド又は単一ガイド）のターゲッターＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ）の非限定例は、ヌクレオチド配列ＣＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号１１０７）を有するＲＮＡであり、Ｎは、ガイド配列を表し、標的配列に応じて変化するが、２０個のＮは、許容可能な異なる長さの範囲を示す。ある場合には、ターゲッターＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ）のＣ２ｃ１ガイドＲＮＡ（二重ガイド又は単一ガイド）の二本鎖形成セグメントは、ヌクレオチド配列ＣＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣ（配列番号１１０８）を含み、又はヌクレオチド配列ＣＵＧＡＧＡＡＧＵ（配列番号１１０９）を含み、又はヌクレオチド配列ＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣ（配列番号１１１０）を含み、又はヌクレオチド配列ＵＧＡＧＡＡＧＵ（配列番号１１１１）を含む。
【０１８２】
Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（並びに、標的核酸に存在するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に関連する要求に関する情報）に関する例及び手引きは、当該技術分野で見出すことができ、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｏｃｔ  ２２；１６３（３）：７５９−７１、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５  Ｎｏｖ；１３（１１）：７２２−３６、及びＳｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｎｏｖ  ５；６０（３）：３８５−９７を参照されたい。
【０１８３】
標的細胞
標的核酸（例えば、標的ゲノムＤＮＡ）は、真核細胞内に、例えば、真核細胞の内部にインビトロ、真核細胞の内部にインビボ、真核細胞の内部にエクスビボで位置することができる。従って、ある場合には、主題の方法の標的細胞（例えば、ヒト細胞）（クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、及び一対の対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡを導入することができる細胞）は、インビトロである。ある場合には、主題の方法の標的細胞（例えば、ヒト細胞）（クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、及び一対の対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡを導入することができる細胞）は、エクスビボである。ある場合には、主題の方法の標的細胞（例えば、ヒト細胞）（クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、及び一対の対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡを導入することができる細胞）は、インビボである。
【０１８４】
主題のキット、組成物、及び方法は、研究及び治療用途に使用することができる。従って、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４乃至イントロン５５の領域に対応する領域を有する任意の真核細胞を使用することができる。
【０１８５】
ある場合には、標的細胞（クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、及び一対の対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡを導入することができる細胞）は、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）の細胞、哺乳動物の細胞（例えば、マウス又はラットなどのげっ歯類の細胞、非ヒト霊長類の細胞、ヒトの細胞など）などである。ある場合には、標的細胞（クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、及び一対の対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡを導入することができる細胞）は、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）である。
【０１８６】
いかなる種類の細胞も対象になり得る（例えば、幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞など）、体細胞、筋細胞、インビトロ又はインビボにおける、あらゆる段階の胚の胚細胞、例えば、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞などの段階のゼブラフィッシュ胚など）。細胞は、樹立細胞株から得てもよいし、あるいは初代細胞であってもよく、ここで、「初代細胞」、「初代細胞株」、及び「初代培養物」は、本明細書で互換的に使用されて、対象から得られ、培養物の、限定された回数の継代（すなわち、分裂）だけインビトロにおいて増殖した、細胞及び細胞培養物を指す。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、又は１５回継代されている場合があるが、危機期を起こすには十分な回数継代されていない、培養物である。
【０１８７】
細胞は、初代細胞（例えば、エクスビボ細胞）である場合、あらゆる好都合な方法によって個体から採取することができる。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離などによって採取することが好都合であり得、一方、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織由来の細胞は、生検によって好都合に採取することができる。
【０１８８】
ある場合には、細胞は、周皮細胞である。周皮細胞は、骨格筋の血管内に位置する多能性幹細胞である。周皮細胞は、全身に送達することができ、血管障壁を通過することができる。血管系を通過すると、周皮細胞は融合し、筋管を形成することができる。周皮細胞は、動脈に注入することができ、動脈壁を通過して筋肉に到達し、そこで、機能的な筋肉に分化することができる。
【０１８９】
従って、ある場合には、標的細胞（クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、及び一対の対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡを導入することができる細胞）は、周皮細胞である（例えば、Ｄｅｌｌａｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００７  Ｍａｒ；９（３）：２５５−６７を参照されたい）。ある場合には、細胞は、（例えば、筋管を形成することができ、ネスチンの陽性発現（ＰＤＧＦＲβ＋ＣＤ１４６＋ＮＧ２＋）によって特徴付けることができる）２型の周皮細胞である。ある場合には、細胞は、筋幹細胞である。ある場合には、細胞は、筋原前駆細胞である。
【０１９０】
発明者らの知見（例えば、以下の実施例を参照）は、ＤＭＤの幹細胞治療に使用することができる。例えば、周皮細胞由来細胞を抽出し、培養で増殖させることができ、その後、これらの細胞を血流に注入することができ、そこで、骨格筋の損傷領域に入り込むことができる。
【０１９１】
ある場合には、主題の方法は、（クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、及び対応する第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡを標的細胞に導入した後）、細胞を個体（例えば、ＤＭＤを有する個体）に移植するステップを含む。ある場合には、細胞は、個体に対して自己由来である（例えば、細胞は、ＤＭＤを有する個体から採取され、主題の成分を細胞に導入して、本明細書の他の箇所に記載されるゲノム欠失を生成し、「矯正された」細胞及び／又は「矯正された」細胞由来の細胞、例えば、子孫細胞を個体に導入する）。
【０１９２】
核酸
上述のように、主題の成分（例えば、（ａ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など、及び／又は（ｂ）第１及び第２の対応するガイドＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡなど）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質として細胞に送達する（細胞に導入する）ことができる。従って、ある場合には、主題の方法又は組成物又はキットは、（ｉ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）、（ｉｉ）第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるイントロン４４にハイブリダイズする）、及び（ｉｉｉ）第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるイントロン５５にハイブリダイズする）のうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を含む。ある場合には、１つの核酸（例えば、発現ベクター）が、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードする。ある場合には、同じ核酸（例えば、発現ベクター）が、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼもコードする。
【０１９３】
核酸を標的細胞に移すのに有用な多くのベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ミニサークル、ファージ、ウイルスなどが利用可能である。核酸（複数可）を含むベクターは、例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ウイルス、例えば、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどとしてエピソームに保持されていてもよいし、あるいは、相同組換え又はランダムインテグレーション、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶなどのレトロウイルス由来ベクターによって、標的細胞ゲノム内に組み込まれてもよい。
【０１９４】
ベクターは、主題の細胞に直接的に与えてもよい。言い換えれば、細胞は、ベクターが細胞に取り込まれるように、（ｉ）第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、（ｉｉ）第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼのうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸（例えば、ベクター）と接触させることができる。
【０１９５】
細胞をプラスミドである核酸ベクターと接触させるための方法、例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、及びリポフェクションは、当該技術分野において周知である。ウイルスベクター送達において、細胞は、核酸を含むウイルス粒子と接触させる。レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、本発明の方法に特に適している。一般的に用いられるレトロウイルスベクターは、「欠陥」を有する、すなわち、増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株内での増殖を必要とする。目的の核酸を含むウイルス粒子を生成するために、核酸を含むレトロウイルス核酸は、パッケージング細胞株によってウイルスカプシド内にパッケージングされる。異なるパッケージング細胞株は、カプシド内に取り込まれる異なるエンベロープタンパク質（同種志向性、両種指向性、又は異種指向性）を与え、このエンベロープタンパク質が、細胞に対するウイルス粒子の特異性を決定する（マウス及びラットに対する同種志向性、ヒト、イヌ、及びマウスを含むほとんどの哺乳類細胞種に対する両種指向性、並びにマウス細胞以外のほとんどの哺乳類細胞種に対する異種指向性）。適切なパッケージング細胞株を用いることで、細胞がパッケージングされたウイルス粒子の標的となることを確実にすることができる。再プログラム因子をコードする核酸を含むレトロウイルスベクターをパッケージング細胞株に導入する方法、及びパッケージング系によって生成されたウイルス粒子を収集する方法は、当該技術分野において周知である。核酸は、直接的微量注入によって導入することもできる（例えば、ＲＮＡのゼブラフィッシュ胚への注入）。
【０１９６】
第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、及び／又はクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸を標的細胞に与えるために用いられるベクターは、目的の核酸の発現（すなわち、転写活性化）を駆動するのに適したプロモーターを含むことができる。言い換えれば、目的の核酸（第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列など）は、プロモーター（例えば、標的細胞において作動可能なプロモーター）に作動可能に連結することができる。これには、遍在的作用性プロモーター（例えば、ＣＭＶ−β−アクチンプロモーター、ＥＦ−１αプロモーターなど）、又は誘導性プロモーター（例えば、特定の細胞集団において活性がある、又はテトラサイクリンなどの薬剤の存在に応答するプロモーター）が含まれ得る。転写活性化により、転写は少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、より一般的には少なくとも約１０００倍、標的細胞において基底レベルを超えて増加することが意図される。発現ベクターは、導入された核酸を取り込んだ細胞を特定するために、標的細胞内の選択マーカーをコードする核酸配列を含んでいてもよい。
【０１９７】
上述のように、プロモーターは、恒常的活性型プロモーター（すなわち、恒常的に活性／「ＯＮ」状態であるプロモーター）であってもよく、誘導性プロモーター（すなわち、活性／「ＯＮ」又は不活性／「ＯＦＦ」状態が、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、又はタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）であってもよく、空間限定的プロモーター（すなわち、転写調節要素、エンハンサーなど）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であってもよく、及び時間限定的プロモーター（すなわち、プロモーターが、胚発生の特定の段階の間、又は生物学的プロセスの特定の段階、例えば、マウスにおける毛包周期の間に、「ＯＮ」状態又は「ＯＦＦ」状態にある）であってもよい。
【０１９８】
組織特異的プロモーターは、当該技術分野において周知である。組織特異的プロモーターの非限定例は、筋細胞特異的プロモーターである。適切な筋肉特異的プロモーターには、例えば、デスミンプロモーター、α−ミオシン重鎖プロモーター、ミオシン軽鎖−２プロモーター、心筋トロポニンＣプロモーター、筋クレアチンキナーゼプロモーター、α−アクチニンプロモーター、心筋トロポニンＩプロモーターなどが含まれる。例えば、Ｐａｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｇｅｎｅｔ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｔｈｅｒ．６：１３を参照されたい。
【０１９９】
適切なプロモーターは、ウイルス由来であってもよく、従って、ウイルス性プロモーターと称されてもよく、あるいは、適切なプロモーターは、原核生物又は真核生物を含むあらゆる生物に由来していてもよい。適切なプロモーターを用いることで、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、ｐｏｌＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，４９７−５００（２００２））、高感度Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  Ｓｅｐ  １；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２００】
誘導性プロモーターの例としては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。従って、誘導性プロモーターは、ドキシサイクリン、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、エストロゲン受容体、エストロゲン受容体融合物などを含むがこれらに限定はされない分子によって調節され得る。
【０２０１】
上述のように、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、及び／又はＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをＲＮＡとして細胞に導入してもよい。細胞にＲＮＡを導入する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、直接注入、トランスフェクション、又はＤＮＡの導入に用いられる任意の他の方法が含まれ得る。
【０２０２】
クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）をポリペプチドとして細胞に導入してもよい（例えば、ある場合には、ガイドＲＮＡと複合化することで、ＲＮＰを形成する）。そのようなポリペプチドを、必要に応じて、産物の溶解性を増加させるポリペプチドドメインに融合してもよい。ドメインは、ＴＥＶプロテアーゼによって切断される、規定のプロテアーゼ切断部位（例えば、ＴＥＶ配列）を介してポリペプチドに連結されていてもよい。リンカーは、１つ以上の、より可撓性の性配列、例えば、１〜１０個のグリシン残基も含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の切断は、産物の溶解性を維持する緩衝液中、例えば、０．５〜２Ｍ尿素の存在下、溶解性を増加させるポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの存在下などで行われる。目的のドメインには、エンドソーム溶解性ドメイン、例えば、インフルエンザＨＡドメイン、及び生成を助ける他のポリペプチド、例えば、ＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメインなどが含まれる。ポリペプチドは、安定性を向上させるために製剤化されてもよい。例えば、ペプチドは、ＰＥＧ化されていてもよく、ポリエチレンオキシ基によって血流中の寿命が延長される。
【０２０３】
さらに、又は、あるいは、Ｃａｓ９タンパク質などのクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、細胞による取り込みを促進するために、ポリペプチド浸透性ドメインに融合されていてもよい。多くの浸透性ドメインが当該技術分野において公知であり、本発明の非組込みポリペプチドに用いられてもよく、これには、ペプチド、ペプチド模倣薬、及び非ペプチド担体が含まれる。例えば、浸透性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１０８０）を含む、ペネトラチンと称される、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐａｅｄｉａ）の第三αヘリックスに由来し得る。別の例として、浸透性ペプチドは、例えば、自然発生のｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７を含み得る、ＨＩＶ−１  ｔａｔ基本領域アミノ酸配列を含む。他の浸透性ドメインには、ポリ−アルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１  ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４〜５６の領域、ノナ−アルギニン、オクタ−アルギニンなどが含まれる。（例えば、Ｆｕｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．２００３  Ａｐｒ；４（２）：８７−９  ａｎｄ  ４４６、及びＷｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２０００  Ｎｏｖ．２１；９７（２４）：１３００３−８、米国特許出願公開第２００３０２２０３３４号、同第２００３００８３２５６号、同第２００３００３２５９３号、及び同第２００３００２２８３１号（これらは、移行ペプチド及び移行ペプトイドの教示のために参照によって本明細書に明確に組み込まれる）を参照されたい）。ノナ−アルギニン（Ｒ９）配列は、特徴付けされているより効率的なＰＴＤの１つである（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００、Ｕｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。融合が起こる部位は、ポリペプチドの生物活性、分泌、又は結合の特徴を最適化するために、選択されてもよい。最適な部位は、通例の実験法により決定される。
【０２０４】
クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、インビトロで、又は真核細胞によって、又は原核細胞によって生成され得、アンフォールディング、例えば、熱変性、ＤＴＴ還元などによってさらに処理されてもよく、当該技術分野において公知の方法を用いてリフォールディングされてもよい。
【０２０５】
一次配列を変化させない目的の修飾には、ポリペプチドの化学誘導体化、例えば、アシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化などが含まれる。グリコシル化の修飾、例えば、ポリペプチドの合成中及びプロセシング中又はさらなるプロセシングステップ中に、例えば、ポリペプチドを哺乳類グリコシル化酵素又は脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響を与える酵素に暴露することにより、ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより成されるものも含まれる。リン酸化したアミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホトレオニンを有する配列も含まれる。
【０２０６】
クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、組換え合成の常法に従って、単離及び精製することができる。発現宿主の可溶化液を作製して、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、又は他の精製技術を用いて、その可溶化液を精製してもよい。ほとんどの場合、用いられる組成物は、産物の調製法及びその精製に関連した混入物との関連で、少なくとも２０重量％の所望の産物、より一般的には少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％の所望の産物を含み、治療目的には、例えば、少なくとも約９９．５重量％の所望の産物を含むことができる。パーセンテージは、総タンパク質量に基づくことができる。
【０２０７】
本明細書に記載される方法及び組成物（及びキット）の成分は、あらゆる好都合な方法を用いて細胞に導入することができる。例えば、ゲノムターゲティング組成物は、種々の形態で、例えば、（ｉ）ＲＮＰ（例えば、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、及び対応する第１及び第２のガイドＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡを含む）として、（ｉｉ）タンパク質（例えば、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）として、（ｉｉｉ）ＲＮＡ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡなど）として、（ｉｖ）ＤＮＡ（例えば、ゲノム編集エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡなど）として、及び（ｖ）それらの任意の組み合わせで細胞に導入することができる。
【０２０８】
上記の成分を導入する方法の例としては、ウイルス感染又はバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、原形質融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性トランスフェクション、リポソーム介在性トランスフェクション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、ナノ粒子介在性核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ  ｅｔ．，ａｌ  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１２  Ｓｅｐ  １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９−４０９Ｘ（１２）００２８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
成分は、あらゆる好都合な方法（例えば、局所又は全身、注入、局所又は全身注入、経口、非経口、皮下、静脈内、頭蓋内、脊髄内、眼内、又は髄液内など）を用いて、インビボで細胞に導入する（例えば、個体に投与する）ことができる。ある場合には、導入は、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーションなどを含むことができる。ある場合には、導入は、ヌクレオフェクション又はエレクトロポレーションを含まない。
【０２１０】
キット
ある場合には、主題のキット、及び／又は主題の組成物は、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、ジストロフィン遺伝子のイントロン４４内の第１の標的配列にハイブリダイズする、例えば、上記でより詳細に記載されるように）、及び（ｂ）第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、ジストロフィン遺伝子のイントロン５５内の第２の標的配列にハイブリダイズする、例えば、上記でより詳細に記載されるように）を含み、及び第１及び第２の標的配列は、互いに３３０ｋｂを超えて離れている。
【０２１１】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１５５〜１１５９のいずれかに記載される１７ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１５０〜１１５４のいずれかに記載される２０ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１７５〜１１７９のいずれかに記載される１７ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１２２３〜１２６９のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列配列番号１１７０〜１１７４のいずれかに記載される２０ヌクレオチドを含む。ある場合には、第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１３１８〜１３６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を含む。
【０２１２】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１５５〜１１５９のいずれかに記載される１７ヌクレオチド配列を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１７５〜１１７９のいずれかに記載される１７ヌクレオチド配列を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１５０〜１１５４のいずれかに記載される２０ヌクレオチド配列を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、配列番号１１７０〜１１７４のいずれかに記載される２０ヌクレオチド配列を含む。
【０２１３】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、１７ヌクレオチド配列ＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５８）を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、１７ヌクレオチド配列ＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７７）を含む。ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、２０ヌクレオチド配列ＧＵＵＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５３）を含み、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、２０ヌクレオチド配列ＵＧＵＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７２）を含む。
【０２１４】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４に対応する標的配列（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４内の標的配列、マウスジストロフィン遺伝子内の標的配列など）と２０の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有し、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５に対応する標的配列（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５内の標的配列、マウスジストロフィン遺伝子内の標的配列など）と２０の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有する。いくつかのそのような場合には、イントロン４４に対応する標的配列とイントロン５５に対応する標的配列は、互いに３３０キロベース（ｋｂ）を超えて離れている。ある場合には、イントロン４４に対応する標的配列とイントロン５５に対応する標的配列は、互いに４００キロベース（ｋｂ）以上（例えば、４５０ｋｂ以上、５００ｋｂ以上、５５０ｋｂ以上、６００ｋｂ以上、６５０ｋｂ以上、７００ｋｂ以上など）離れている。ある場合には、イントロン４４内の標的配列とイントロン５５内の標的配列は、互いに７００ｋｂ以上離れている。
【０２１５】
ある場合には、第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４に対応する標的配列と１７の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有し、及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）のガイド配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５に対応する標的配列と１７の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有する。いくつかのそのような場合には、イントロン４４に対応する標的配列とイントロン５５に対応する標的配列は、互いに３３０キロベース（ｋｂ）を超えて離れている。ある場合には、イントロン４４に対応する標的配列とイントロン５５に対応する標的配列は、互いに４００キロベース（ｋｂ）以上（例えば、４５０ｋｂ以上、５００ｋｂ以上、５５０ｋｂ以上、６００ｋｂ以上、６５０ｋｂ以上、７００ｋｂ以上など）離れている。ある場合には、イントロン４４内の標的配列とイントロン５５内の標的配列は、互いに７００ｋｂ以上離れている。
【０２１６】
ある場合には、主題のキットは、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）、又はエンドヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含み得る。
【０２１７】
主題のキットの構成要素（ａ）及び（ｂ）は、同じ又は別々の容器中であってもよい。
【０２１８】
組成物及び／又はキットは、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照発現ベクター又はＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡ又はＲＮＡからクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをインビトロ生成するための試薬、ＤＮＡからＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをインビトロ生成するための試薬などから選択される１つ以上の追加の試薬をさらに含み得る。
【０２１９】
上記構成要素に加えて、主題のキットは、キットの構成要素を用いて、主題の方法を実施するための説明書をさらに含み得る。主題の方法を実施するための説明書は、一般的には、適切な記録媒体上に記録される。例えば、説明書は、紙又はプラスチックなどの基体上に印刷されていてもよい。従って、説明書は、添付文書としてキット内に、キット又はその構成要素の容器の標識中（すなわち、パッケージ又はサブパッケージに付随して）など、存在していてもよい。他の実施形態では、説明書は、適切なコンピューター可読の記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなど上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態においては、実際の説明書がキット内に存在しないが、例えば、インターネットを介して、遠隔の供給源から説明書を得るための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができる、及び／又は説明書をダウンロードすることができる、ウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様、説明書を得るためのこの手段は、適切な基体上に記録される。
【実施例】
【０２２０】
以下の実施例は、当業者に本発明の作成及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために記載され、発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定する意図はなく、下記の実験が実行される全て又は唯一の実験であると示すようにも意図されていない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確実にするよう尽力したが、実験の誤差及び偏差は多少考慮されるべきである。別で指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏の温度であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。標準的な省略が使用され得、例えば、ｂｐ：塩基対（複数可）、ｋｂ：キロベース（複数可）、ｐｌ：ピコリットル（複数可）、ｓ又はｓｅｃ：秒（複数可）、ｍｉｎ：分（複数可）、ｈ又はｈｒ：時間（複数可）、ａａ：アミノ酸（複数可）、ｋｂ：キロベース（複数可）、ｂｐ：塩基対（複数可）、ｎｔ：ヌクレオチド（複数可）、ｉ．ｍ．：筋肉内（に）、ｉ．ｐ．、腹腔内（に）、ｓ．ｃ．：皮下（に）、などである。
【０２２１】
材料及び方法
ｇＲＮＡのクローニング
５つのガイドＲＮＡは、Ｚｈａｎｇ  ｌａｂ  ＣＲＩＳＰＲ設計ツール（「ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ」、その後、「．ｅｄｕ」）を用いて、ＤＭＤイントロン４４及び５５を標的とするように設計され、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１３．８：２２８１−２３０８）を改変して、Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇから得たｓｐＣａｓ９プラスミドｐＸ３３０又はｐＸ４５９（それぞれ、Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃４２２３０、＃４８１３９）にクローニングした。簡単に言えば、ｇＲＮＡ配列及びＢｂｓＩ制限酵素部位を含有する、互いに相補的なオリゴを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得て、アニールした。アニールしたオリゴ及びプラスミドをＢｂｓＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で同時に消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でライゲーションした。
表３：クローニングに使用したｇＲＮＡ配列及びオリゴ類
【表２】
2019509031.tif 000003
太文字及び下線付きの文字は、ＮＧＧ  ＰＡＭ配列である。
【０２２２】
マウス
全ての動物実験は、Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＯｖｅｒｓｉｇｈｔにおけるＵＣＬＡ動物研究委員会によって承認されたプロトコル下で実施された。生着実験に使用したマウスは、ｍｄｘ  ｓｃｉｄ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をＮＯＤ  ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスと交配させることで生成した。簡潔に言えば、雌のＢ１０ＳｃＳｎ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＤｍｄｍｄｘ／Ｊを雄のＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪと交配させた。その後、その交配からのＦ１雌を雄のｍｄｘ−ｓｃｉｄと交配させた。Ｆ３雄をジストロフィン及びγ変異についてスクリーニングした後、突然変異体をｍｄｘ−ｓｃｉｄ雌と再び戻し交配させた。Ｆ４雌をＦ３変異体の雄と交配させて、ホモ接合ＮＳＧ−ｍｄｘマウスを生成した。ジェノタイピングは、ＴｒａｎｓｎｅｔＹＸを通じて行った。
【０２２３】
細胞培養
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３ＦＴ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＤＭＥＭ（高グルコース）からなる成長培地で標準条件下にて増殖させた。
【０２２４】
ヒト骨格筋芽細胞（ＨＳＭＭ、Ｌｏｎｚａ）を、ＳｋＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）で製造者の指示に従って維持した。最終分化のために、それらが少なくとも８０％のコンフルエントになるまで、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養した後、Ｎ２分化培地（１％のＮ２サプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１％のインスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２）に７日間切り替えた。
【０２２５】
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、前述のように、ＳＴＥＭＣＣＡカセットで皮膚線維芽細胞から再プログラムした（Ｋａｒｕｍｂａｙａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１２．１：３６−４３）。それらをｈＥＳＣ最適化マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で増殖させ、ｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を毎日供給し、０．５ｍＭのＥＤＴＡで５〜７日ごとに継代した。核型及びＦＩＳＨ解析を、Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって行った。
【０２２６】
テラトーマ注入
注入用のｈｉＰＳＣを調製するため、１〜２のコンフルエントウェルを、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ型又は０．５ｍＭのＥＤＴＡを用いて収集した。５ｍｌピペットを用いてコロニーを解離し、１０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを４０μｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で再懸濁し、６〜８週齢のＳＣＩＤ  ＢＥＩＧＥマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の精巣に前に記載されたように注入した（Ａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２０１１．２９：１９５２−１９６２）。４〜８週間後、テラトーマを単離し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で２４時間固定した後、７０％のエタノールで固定した。固定したテラトーマを埋め込み、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄａｖｉｄ  Ｇｅｆｆｅｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｔ  ＵＣＬＡｎｉによって処理した。テラトーマが大きい場合、４〜６個の四半部を分離し、上述のようにＰＦＡで固定した。腫瘍をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、オリンパスＢＸ５１顕微鏡で画像化した。
【０２２７】
ｇＲＮＡのトランスフェクション及びヌクレオフェクション
３×１０５個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を１２ウェルごとに播種し、翌日、製造者の指示に従って、３μｌのＴｒａｎｓＩＴ２９３（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）を用いて、１μｇのＤＮＡで重複してトランスフェクトした。
【０２２８】
ｈｉＰＳＣのＡｍａｘａ  ４Ｄ（Ｌｏｎｚａ）ヌクレオフェクションを、製造者の指示に従って行った。簡単に言えば、ｈｉＰＳＣを、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で１時間前処理し、ＴｒｙｐｌＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でトリプシン処理して、単一細胞懸濁液にした。８×１０５個のｈｉＰＳＣを、溶液Ｐ３、２μｇ又は３．５μｇの総ＤＮＡ、及びプログラムＣＡ〜１３７（Ｌｏｎｚａ）を用いて、１００μｌキュベットごとにヌクレオフェクトした。ｐＭＡＸ  ＧＦＰ（Ｌｏｎｚａ）は、トランスフェクション対照として使用した。ヌクレオフェクション後、ＲＯＣＫｉでｍＴｅＳＲ１に細胞を直ちに載置した。選択では、ｍＴｅＳＲ１中の０．３５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを、ヌクレオフェクションの２４時間後に細胞に添加した。
【０２２９】
クローンｈｉＰＳＣ株の生成
クローン株の生成のために、ｇＲＮＡのヌクレオフェクションの次の日、４４Ｃ４及び５５Ｃ３（ｐＸ４５９中）細胞を、ｍＴｅＳＲ１中の０．３５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで１日間選択した。細胞をｍＴｅＳＲ１中で７〜９日間拡張した後、単一細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａソーター（ＢＤ）を用いてＲＯＣＫｉで、個別の９６ウェルに選別した、又はｍＴｅＳＲ１＋ＲＯＣＫｉ中の１０ｃｍ皿ごとに３×１０５個〜５×１０５個の細胞の低密度で載置した。２週間後、個別のコロニーを対応する４８ウェルに解体し、コロニーのサブセットを手で切断し、以下の欠失ジェノタイピングＰＣＲを用いてスクリーニングした。
【０２３０】
欠失ジェノタイピングＰＣＲ
エクソン４５〜５５欠失が生じたかどうかを判定するため、個別のＰＣＲ反応、又は両方のプライマーセットを含むマルチプレックスＰＣＲのいずれかをＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行った。１つのプライマー対は、欠失領域（ｄｅｌ）に隣接し、一対は、欠失領域（ｕｎｄｅｌ）内であった。ＰＣＲ産物を１．２％のアガロースゲル上でランさせ、臭化エチジウム染色で視覚化した。
表４：ＰＣＲのプライマー配列（ジェノタイピング）
【表３】
2019509031.tif 000004
【０２３１】
エクソン４５〜５５欠失後の再結合配列の解析を、製造者の指示、及びＬａｒａｇｅｎ  Ｉｎｃによるインサートのシーケンシングに従って、欠失ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯバックボーン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にブラントクローニングすることによって行った。
【０２３２】
ｈｉＰＳＣ由来の骨格筋の分化
ｈｉＰＳＣを、Ａｂｕｊａｒｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．，２０１４．３：１４９−１６０）を改変して、ＭｙｏＤの過剰発現によって骨格筋細胞に分化させた。細胞をＴｒｙｐｌＥでトリプシン処理し、３．５×１０５個の細胞／６ウェルで、ＳＭＣ４（基礎培地：２０％のノックアウト血清代替（ＫＯＳＲ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％のＮＥＡＡ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００μＭのβ−メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＭＣ４：５μＭのＲＯＣＫｉを毎日加えた基礎培地、０．４μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２μＭのＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２）中のマトリゲル上に単一細胞として載置した。おおよそ６０〜８０％のコンフルエントに到達すると、ウェル当たり４μｇ／ｍＬの硫酸プロタミンとともに０．０６μｇ／ｍＬのタモキシフェン誘導性ＭｙｏＤ−ＥＲＴレンチウイルス（Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００８．１７：２５０７−２５１７から出典）で感染させて、１２５０ｒｐｍで９０分間３２℃にてスピン接種した。回復の１日後、ＳＭＣ４中の２μｇ／ｍｌのピューロマイシンで２日間選択した。その後、細胞を分割し、おおよそ１×１０５個の細胞／ｃｍ２で、ｂＦＧＦを有さず、１０μＭのＲＯＣＫｉを有する基礎培地中でマトリゲル上に載置し、１５％のＦＢＳ及び５μＭのタモキシフェンを有するＤＭＥＭ中で４日間誘導させた。誘導後、細胞を５％のウマ血清及び１μＭのタモキシフェンを有する低グルコースＤＭＥＭ中で５〜７日間分化させた。培地は毎日変えた。
【０２３３】
ＭｙｏＤ過剰発現の代替プロトコルを生着に使用した。細胞は、ＲＯＣＫｉを有するｍＴｅＳＲ１中でマトリゲル上に２．５×１０４個の細胞／ｃｍ２で単一細胞として載置した。翌日から開始して、１％のＩＴＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中の３μＭのＣＨＩＲ９９０２１で２日間処理した。細胞は、１０％のＦＢＳ及び１％のＮＥＡＡを有するＤＭＥＭ中でおおよそ６×１０４個の細胞／ｃｍ２に分割され、上記のようにＭｙｏＤ−ＥＲＴレンチウイルスで感染させた。回復の１日後、細胞を１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで４日間選択した後、１５％のＦＢＳ、１０％のウマ血清（ＨＳ）、１％のニワトリ胚抽出液、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、４．５ｍＭのモノチオグリセロール、５μＭのタモキシフェンを有する５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するＩＭＤＭ中で２日間誘導させて、下に記載するように生着に使用した。
【０２３４】
Ｓｈｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４．３：５１６−５２９）を改変して、ｈｉＰＳＣの指向分化プロトコルも使用して、ＳＭＰＣを得た。細胞は、３．７５×１０５個の細胞／６ウェルで、１０μＭのＲＯＣＫｉを有するｍＴｅＳＲ１中で単一細胞として載置した。翌日、１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１をＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ６培地（Ｅ６、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に２日間添加し、Ｅ６で１２日目まで細胞を分化させた。２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するＳｔｅｍＰｒｏ（Ｇｉｂｃｏ）を１２〜２０日目の間に添加した。その後、最終分化させるために、細胞をＮ２培地に切り替えた３５日目までＥ６を添加した。５０日目に、細胞を蛍光活性化細胞選別し、神経堤細胞をＨＮＫ１−（１：３００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で除去し、ＳＭＰＣをＢＶ６５０−ＮＣＡＭ＋（１：２５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で増強した。ＳＭＰＣを、Ｎ２培地に変えてコンフルエントになるまで拡張培地（２０％のＦＢＳ、５％のＨＳ、１％のニワトリ胚抽出液、０．５％のペニシリン／ストレプトマイシン）中で７日間培養し、最終分化を誘導させた。
【０２３５】
ｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞の分化
コンフルエントｈｉＰＳＣを酵素的に解離して、凝集体を形成し、心筋細胞系統に分化させた（例えば、Ａｒｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３；Ｍｉｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２を参照されたい）。培地を、１５日目まで２日ごと、及び３０日目まで５日ごとに変えた。３０日目に、心筋細胞を解析用に採取するか、又は低浸透圧ストレスアッセイを施した。
【０２３６】
サーベイヤーアッセイ
異なるｇＲＮＡの活性を試験するため、製造者の指示に従って、Ｑｕｉｃｋ  ｇＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、又はＱｕｉｃｋ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １．０（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を用いたトランスフェクション／ヌクレオフェクションの後、第３日又は４日にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。サーベイヤーアッセイで使用するＰＣＲは、標的領域に隣接するプライマーと共にＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙで行った
【０２３７】
サーベイヤーアッセイ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、製造者の指示に従って行った。簡単に言えば、最大２０μｌの１×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ緩衝液中のおおよそ３００ｎｇのＰＣＲ産物を変性させて、９５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと段階的に４℃に冷却することによって再アニールした。その後、２μｌのＭｇＣｌ２、１μｌのサーベイヤーエンハンサー、及び１．２μｌのサーベイヤー酵素を添加し、４２℃で１時間インキュベートした。サーベイヤーキットで提供されるＧ／Ｃプラスミドを、ゲルごとに陽性対照として使用した。産物は、６％又は４〜２０％のＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でランし、臭化エチジウム染色で視覚化した。切断のパーセントは、ＩｍａｇｅＪ（Ｒａｓｂａｎｄ，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  Ｈｅａｌ．，１９９７）を用いて決定した。
表５：ＰＣＲのプライマー配列（サーベイヤーアッセイ）
【表４】
2019509031.tif 000005
【０２３８】
低浸透圧ストレスＣＫ放出アッセイ
２連で載置した最終分化した骨格筋細胞及び心筋細胞に、６６〜２４０オスモルの範囲の低浸透圧溶液中のインキュベーションによってストレスをかけた。６６〜２４０オスモルの範囲の低浸透圧塩溶液を、様々な量のスクロース（約２５〜１７５ｍＭ）を、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＣｌ、１．２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのグルコースからなる塩基性塩溶液に添加することによって作製した。オスモル濃度は、Ｗｅｓｃｏｒ  Ｖａｐｒｏ  ５５２０浸透圧計で測定した。
【０２３９】
分化したＭｙｏＤ  ＯＥ骨格筋管及び心筋細胞を、試験した条件ごとに、３８４又は９６ウェルプレートに２連で載置した。１００μｌ（又は３８４ウェルプレートに対して３０μｌ）の低浸透圧溶液を各ウェルに添加し、細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。その後、溶液（上清）を除去し、ＣＫ解析まで−８０℃で保存した。細胞をトリプシン処理し、凍結／解凍を３回繰り返すことによって１００μｌのｄＩ水中に溶解した。溶解物をＣＫ解析まで−８０℃で保存した。ＣＫは、製造者の指示に従って、クレアチンキナーゼ−ＳＬキット（Ｓｅｋｉｓｕｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、２μｌ又は８μｌの非希釈試料で３連で測定した。あらゆる負の読み取りは、０に強制し、異常値は、解析から無視した。上清へのＣＫ放出のパーセントを決定し、標準誤差は、計算全体を通じて伝播させた。
【０２４０】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ、及びＰＣＲ
ＲＮＡを、製造者の指示に従って、ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、分化心筋細胞から抽出した。ｃＤＮＡ合成は、ＲＴ−ｑＰＣＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のｉＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを用いて、５０〜２５０ｎｇのＲＮＡで行った。２つのＰＣＲ反応を全ての試料で行い、１つは、欠失の内部にプライマーで、１つは、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑを用いた４０サイクルの欠失に隣接するプライマーで行った。ＰＣＲ産物は、製造者の指示に従って、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてクローンし、ＵＣＬＡ  ＧｅｎｏＳｅｑ  Ｃｏｒｅで配列決定した。
表６：ＰＣＲのプライマー配列（ＲＮＡ抽出）
【表５】
2019509031.tif 000006
【０２４１】
ｍｉＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ、及びｄｄＰＣＲ
ｍｉＲＮＡを、製造者の指示に従って、マイクロＲＮＡ精製キット（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐ）を用いて、ＭｙｏＤ  ＯＥによって得られた融合した筋管から単離した。ｃＤＮＡ合成は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１（アッセイＩＤ  ００２２７９）、及び特異的ＲＴプライマーでＵ６  ｓｎＲＮＡ（アッセイＩＤ  ００１９７３）に対するＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって５μｌのｍｉＲＮＡ上で行った。ＰＣＲ反応物は、試料ごとに重複して、プローブ（ＵＴＰを有さない）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、及び１．１μｌの２０×ＴａｑＭａｎアッセイプローブに対するｄｄＰＣＲスーパーミックスにおいて、１．４６μｌのｃＤＮＡ（Ｕ６に対して１：３０に希釈、又はｍｉＲ３１に対して非希釈のいずれか）と共に２２μｌのプレミックスで調製した。２０μｌのＰＣＲ反応プレミックスは、製造者のプロトコルに従って使用して、液滴を生成した。簡潔に言えば、ＰＣＲプレミックスを７０μｌの油と共に液滴発生器カートリッジに添加し、液滴をＱＸ２００液滴発生器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で生成した。４０μｌの反応混合物をＰＣＲプレートに移し、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間を４０サイクル、６０℃で６０秒間、その後、９８℃で１０分間をＴ１００サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でランした。無テンプレート対照を、ＰＣＲ反応ごとに含めた。ＦＡＭ蛍光を、ＱＸ２００液滴リーダー及びＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて評価した。ｍｉＲ３１の陽性液滴のパーセントを、Ｕ６の陽性液滴のパーセントに正規化した。標準偏差誤差は、計算全体を通じて伝播させた。全ての株をＣＤＭＤ  １００２野生型に正規化した。
【０２４２】
免疫不全マウスへの生着
ＮＯＤ  ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒγ（ＮＳＧ）免疫不全マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をｍｄｘ  ｓｃｉｄマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に交配させて、ＮＳＧ−ｍｄｘマウスを生成した。上を参照されたい。生着の２４時間前に、５〜７週齢のＮＳＧ−ｍｄｘマウスの右の前脛骨筋（ＴＡ）を５０μｌの１０μＭ心臓毒素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で前処理した。ＭｙｏＤ  ＯＥ細胞の場合、１００μＬの５ｍｇ／ｍｌタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）も５日間ＩＰ注入し、生着の１日前にタモキシフェンで前処理した（Ｍｕｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，２０１４．１：１４０２５）。誘導後にＭｙｏＤ  ＯＥから得られた１×１０６個の細胞をペレット化し、５μＬのＨＢＳＳ中に再懸濁し、ＴＡに筋肉内注射した。組織を３０日後に採取し、後述のように解析した。生着は、ラミンＡ／Ｃ及びスペクトリンの両方が陽性であったヒト細胞が特定された場合に成功したと見なされた。生着の成功は、以下に見られた：ＣＤＭＤ１００２  Ｎ＝４／４生着に成功、ＣＤＭＤ１００３  Ｎ＝１／１生着に成功、及びＣＤＭＤ１００３−４９  Ｎ＝１／２生着に成功。
【０２４３】
免疫染色
ｈｉＰＳＣを４％のＰＦＡで２０分間固定し、０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘで１０分間透過処理し、１０％のヤギ血清で１時間遮断した。ＳＯＸ２（１：２００、細胞シグナル伝達）及びＮＡＮＯＧ（１：８００、細胞シグナル伝達）に対する一次抗体を１％のヤギ血清及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘに一晩４℃で添加した後、二次抗体を翌日２時間添加した。
【０２４４】
ＭｙｏＤ過剰発現から得られた分化骨格筋管を８０％のアセトンで７分間−２０℃にて固定し、１０％のヤギ血清で１時間遮断し、上記のようにジストロフィン（１：３００、Ａｂｃａｍ）及びミオシン重鎖（１．９μｇ／ｍｌ、ＭＦ２０、ＤＨＳＢ）で染色した。５０日間の指向分化プロトコルから得られた分化した心筋細胞及び骨格筋管を４％ＰＦＡで２０分間固定し、０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘで１０分間透過し、１０％のヤギ血清で１時間遮断し、ジストロフィン（１：５、ＭＡＮＤＹＳ１０６、ＭＤＡ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、（Ｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９３．５２：１０５７−１０６６））、又はβ−ストログリカン（１：１００、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及びミオシン重鎖（１．９μｇ／ｍｌ、ＭＦ２０、ＤＨＳＢ）で染色した。画像は、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で得た。
【０２４５】
採取したＴＡ筋肉をイソペンタンで急速冷凍した。１０μｍの凍結切片を、筋肉全体を通じて一定間隔で得て、−２０℃で保存した。染色の場合、０．２５％のゼラチン、０．１％のＴｗｅｅｎ、３％のウシ血清アルブミンで１時間遮断した。Ｍ．Ｏ．Ｍ．ブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、製造者の指示に従って適用した。ヒトラミンＡ／Ｃ（１：１２５、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ヒトスペクトリン（１：７５、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトジストロフィン（１：５、ＭＡＮＤＹＳ１０６）、ラミニン（１：２００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ジストロフィン（１：７５、Ａｂｃａｍ）、及びβ−ストログリカン（１：５０、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなる一次抗体を４℃で一晩適用した。翌日、二次抗体を１時間インキュベートし、スライドをＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤに取り付けて、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１顕微鏡で画像化した。
【０２４６】
ウェスタンブロット解析
最終分化した骨格筋細胞及び心筋細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、液体窒素で急速冷凍した。細胞ペレットを溶解するまで液体窒素で保存した。ウェスタンブロッティングでは、試料は、わずかに改変して、Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２０１０．４２：６１４−６２７）に記載されたように調製した。簡単に言えば、細胞を１０ｃｍ培養皿ごとに５００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％のグリセロール、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、及びＨＡＬＴプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（ｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で可溶化した後、穏やかに回転しながら４℃で３０分間インキュベーションした。その後、溶解物を１００μｌの６×ＲＳＢと混合し、注射針を数回通過させて、粘度を低下させた。その後、試料を３分間沸騰させ、氷上で冷却し、注射針を再び通過させて、１３，０００ｇで５分間遠心分離した。清澄化した溶解液を新しいチューブに移し、小分けし、使用するまで−８０℃で保存した。ジストロフィン及びＭｙＨＣ含有量を評価するため、細胞溶解物に、６％のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を定電流（１０ｍＡ／ゲル）で３時間施した後、ニトロセルロース膜に定電圧で（１００Ｖ）２．５時間氷上でブロッティングした。０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を転写緩衝液に添加し、高分子タンパク質をブロッティングしやすくした。イムノブロットアッセイを、マウス抗ＭｙＨＣ（１：１，０００、ＭＦ２０、ＤＨＳＢ）及びマウス抗ジストロフィン（１：５００、Ｍａｎｄｙｓ８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）抗体で実施した。使用した二次抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからの抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲート（１：１０，０００）であった。ＣｈｅｍｉＧｌｏｗ  Ｗｅｓｔ化学発光検出キット（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を用いてブロットを現像した。シグナルは、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  ＦＣ２デジタルイメージングシステム（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）によって登録した。
【０２４７】
β−ジストログリカンについて、７．５％のＰＡＧＥゲルを１００Ｖで１．５時間ランした。移入は、２０％のＭｅｔＯＨと共にＴｒｉｓ／グリシンで、１００Ｖで１時間１５分間行った。イムノブロッティングは、上記のように、マウス抗β−ジストログリカン（１：２００、ＭＡＮＤＡＧ２（７Ｄ１１）、ＤＨＳＢ）及びＭｙＨＣ抗体で行った。
【０２４８】
オフターゲット解析
使用したｇＲＮＡごとの上位１０個の固有のオフターゲット部位（４４Ｃ４及び５５Ｃ３）は、以下の基準を用いて、ＣＯＳＭＩＤ（Ｃｒａｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２０１４．３：ｅ２１４）で決定した：ＮＲＧ  ＰＡＭ、インデル無しで３つのミスマッチ、及び１つの塩基欠失又は挿入を有する２つのミスマッチ。潜在的なオフターゲット位置に対応するアクセスアレイプライマーはＦｌｕｉｄｉｇｍが設計し、製造し、検証した。親及び欠失クローン株から抽出したｇＤＮＡをアクセスアレイ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）でランし、ＵＣＬＡ  ＧｅｎｏＳｅｑ  ＣｏｒｅにおけるＭｉＳｅｑで配列決定した。読み取りをＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃでトリミングし、ＢＷＡを用いてゲノムに整列した。ベースクオリティスコアの再較正及びインデル再整列は、ＧＡＴＫを用いて行い、ＳＮＰコーリングは、２０ｂｐのｇＲＮＡ相同領域上で２つの別々のプログラムであるＧＡＴＫ及びＬｏＦｒｅｑを用いて行った。真の誘発突然変異は、所与の変異体による読み込みの割合がベースコーリングの誤差率よりも実質的に高い場合に可能であると見なした。
表７：ＣＯＳＭＩＤによって判断された上位の可能性のあるオフターゲット部位
【表６】
2019509031.tif 000007
【０２４９】
統計解析
統計解析は、２群のデータに対して両側ｔ検定を用いて行った。まず、Ｆ検定を用いて、分散が等しいか又は等しくないかを判定し、次いで対応するｔ検定を用いた。有意性は、０．０５未満のｐ値によって判定した。
【０２５０】
実施例１：大多数のＤＭＤ患者を標的にする単一ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９欠失戦略は、ｈｉＰＳＣ由来の筋細胞におけるジストロフィン機能を回復する
ＤＭＤの突然変異は、リーディングフレームを破壊し、ジストロフィン翻訳を妨げ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を引き起こす。６０％のＤＭＤ患者突然変異に適用可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームについて記載する。プラットフォームは、ＤＭＤ由来のｈｉＰＳＣに適用され、最大７２５ｋｂの欠失及び非相同末端結合の成功が、ＤＭＤ遺伝子を再構成した。ｈｉＰＳＣの使用により、疾患関連の細胞型におけるジストロフィンを評価することができた。フレーム再構成されたｈｉＰＳＣクローン株由来の心筋細胞及び骨格筋筋管は、ジストロフィンタンパク質を回復した。内部欠失ジストロフィンは、ジストロフィン糖タンパク質複合体のインビトロ及びインビボでの膜完全性及び回復の改善によって実証されたように機能的であった。さらに、ｍｉＲ３１は、フレーム再構成する際に減少し、これは、ベッカー型筋ジストロフィーにおける観察と類似であった。
【０２５１】
ＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ株は、多能性であり、遺伝的に安定である
野生型及びＤＭＤ患者の線維芽細胞由来の、生体異物を含まないいくつかのｈｉＰＳＣ株を、医薬品適正製造基準プロトコルを用いて開発した。各ＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ株は、エクソン４５〜５５のホットスポット領域内に固有のフレームシフトＤＭＤ突然変異を含む。全てのｈｉＰＳＣ株（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＣＤＭＤ）１００３、１００６、及び１００８）は、多能性マーカー（ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２）を発現し、核型が正常である（図１Ａ及び図１Ｂ）。ＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣは、３つ全ての胚葉（図１Ｃ）を表すテラトーマをインビボで形成し、かつ、各々が固有の突然変異（図１Ｄ）を含むように、多能性を維持する。
【０２５２】
図１：ＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣは、多能性かつ遺伝的に安定である。図１Ａ。ＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣは、ＤＭＤ線維芽細胞から生成された。明視野像は、ｈｉＰＳＣへの再プログラムの前後の線維芽細胞を示す。免疫細胞化学染色により、細胞が多能性マーカーＮＡＮＯＧ（緑色）及びＳＯＸ２（赤色）を発現することが明らかになる。スケールバー：１００μｍ。図１Ｂ。全ての株の核型分析を示す。図１Ｃ。ＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣをマウスに注入して、インビボでのテラトーマ形成を試験した。３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の代表的なヘマトキシリン及びエオシン染色を示す。図１Ｄ。各ＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ株の患者突然変異を示す。さらに、ＮＨＥＪの成功に必要なエクソン数及び近似距離が、患者の原因となる突然変異サイズの比較ゲノムハイブリダイゼーションデータに基づいて示される。
【０２５３】
ＤＭＤ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在欠失及び最大７２５ｋｂのＮＨＥＪ
ＤＭＤのエクソン４５〜５５を欠失するために、ｇＲＮＡを、イントロン４４及び５５を標的にするように設計した。ｇＲＮＡ部位は、隣接するエクソン（４４及び５６）のそれぞれに隣接する約５００ｂｐのイントロンのみを保持するように選択した。この設計の理論的根拠は、できる限り多くの患者突然変異に適用可能なｇＲＮＡを開発し、小さな機能的キメライントロンの生成を保証するためであった。ＮＨＥＪ中に、イントロン４４の３’末端とイントロン５５の５’末端は結合して、約１ｋｂのキメライントロン（図２Ａ）を生成する。このようにして生成されたイントロンは、機能的であり、正しくスプライスされて、エクソン４４がエクソン５６と結合したインフレーム転写産物を作成することが予想される。
【０２５４】
図２：エクソン４５〜５５欠失を有する、安定した多能性のＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ株の生成。図２Ａ。イントロン４４及び５５（稲妻）に特異的なｇＲＮＡを用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在欠失を標的としたＤＭＤの領域のイラスト（正確な縮尺ではない）を示す。ＮＨＥＪの成功により、エクソン４５〜５５が欠失し、この領域内の突然変異に対するリーディングフレームが回復される。異なる欠失サイズが、患者の原因となる突然変異（黒色の矢頭）に応じて必要である。図２Ｂ。それぞれ親株ＣＤＭＤ１００６及び１００３由来の１１７及び１０９単一細胞クローンのＰＣＲジェノタイピングを、ｇＲＮＡ  ４４Ｃ４及び５５Ｃ３でヌクレオフェクトした細胞で実施した。ＣＤＭＤ  １００６（ＣＤＭＤ１００６−１）由来の１つのクローン、及びＣＤＭＤ１００３（ＣＤＭＤ１００３−４９、１００３−５７、１００３−８１）由来の３つのクローンは、安定した欠失として同定された。６つのｈｉＰＳＣクローン株に対する欠失ＰＣＲジェノタイピング結果を示す。一対のプライマー（Ａで赤色の矢印）は、欠失の内部に位置し、非欠失クローンＣＤＭＤ１００３−１３及び１００３−５１において１２０１ｂｐバンドのみを生成した。別のプライマーセット（Ａで紫色の矢印）は、欠失領域に隣接し、再構成されたクローンＣＤＭＤ１００６−１、１００３−４９、１００３−５７、１００３−８１と同様に、欠失及びＮＨＥＪが正常に発生した場合にのみ、７８８ｂｐバンドを生成した。図２Ｃ。各クローン株は、正常な形態（明視野）を維持し、免疫細胞化学によってＮＡＮＯＧ（緑色）及びＳＯＸ２（赤色）を発現した。スケールバー：１００μｍ。右に示すものは、イントロン４４（Ｉ４４）と５５（Ｉ５５）の間の再結合部位でのｇＤＮＡの配列である。配列決定により、ＣＤＭＤ１００６−１における１６ｂｐ欠失、ＣＤＭＤ１００３−４９における２ｂｐ挿入、ＣＤＭＤ１００３−５７及びＣＤＭＤ１００３−８１における１ｂｐの挿入が明らかになった。
【０２５５】
ｈｉＰＳＣは遺伝的に操作するのが難しいので、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３ＦＴ細胞を使用して、各イントロン領域で５つのｇＲＮＡをスクリーニングした。全てのｇＲＮＡは、最大で３４％のサーベイヤーアッセイでの個別の切断活性を示した（図３Ａ及び図３Ｂ）。多重ＰＣＲを用いて、対でトランスフェクトしたｇＲＮＡは、エクソン４５〜５５を包含する７０８ｋｂ領域全体を効率的に欠失することを示した（図３Ｃ及び図３Ｄ）。
【０２５６】
図３：２９３ＦＴ細胞におけるｇＲＮＡ活性及びエクソン４５〜５５欠失。図３Ａ〜３Ｂ。イントロン４４及び５５にそれぞれ標的化される５つのｇＲＮＡは、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるサーベイヤーアッセイの活性を示す。赤色の矢印は、切断産物の期待バンドを示す（表８）。Ａにおいて、青色の矢頭で強調されるバンドは、非特異的ＰＣＲ産物の可能性があり、解析から無視したことに留意されたい。切断の推定パーセントを下の各レーンに示す。陽性対照（ｐｏｓ）は、サーベイヤーキットで提供される。１００ｂｐのラダーを使用した。図３Ｃ。ＣＲＩＳＰＲ対に標的化されるＤＮＡの領域を強調し、ＰＣＲに使用したプライマーを示す略図。ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ部位を稲妻で示す。イントロン４４及び５５に標的化されるｇＲＮＡ対を共トランスフェクションする場合、エクソン４５〜５５欠失（約７０８ｋｂ）が、ＮＨＥＪ後に得られる。この欠失は、多重ＰＣＲを用いて測定され、ここで、赤色で示すプライマー対は、非欠失産物を増幅する一方、欠失領域に隣接する紫色のプライマー対は、再結合が成功した場合にのみ産物をもたらす。図３Ｄ。図３Ｃに示すプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲの例であり、エクソン４５〜５５の効果的な欠失は、２９３ＦＴ細胞で試験した全てのｇＲＮＡ対で達成された。１００ｂｐのラダーを使用した。
表8：サーベイヤーアッセイからの切断産物の期待サイズ
【表７】
2019509031.tif 000008
【０２５７】
異なる患者突然変異にわたるエクソン４５〜５５欠失の実現可能性を評価するために、ｇＲＮＡを３つのＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ株に適用した。株（ＣＤＭＤ１００３、１００６、１００８）は、ＤＭＤの欠失及びＮＨＥＪの成功のために、それぞれ、約５３０ｋｂ、６７０ｋｂ、又は７２５ｋｂを必要とした。使用したｇＲＮＡは、３つ全ての株で活性であることを示し、エクソン４５〜５５を効果的に欠失した（図４及び図５）。ＣＲＩＳＰＲプラスミドでヌクレオフェクトした細胞の一過性のピューロマイシン選択は、ＣＤＭＤ１００３及び１００６  ｈｉＰＳＣにおける欠失の効率を改善させた（図５Ｄ）。
【０２５８】
図４：ｇＲＮＡは、ＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣにおけるサーベイヤーアッセイによる切断を示す。図４Ａ。ＧＦＰでヌクレオフェクトしたＣＤＭＤ１００６  ｈｉＰＳＣは、未処理対照として機能し、約４０％のトランスフェクション効率を示す。図４Ｂ〜図４Ｄ。ｇＲＮＡは、ＣＤＭＤ１００３、１００６、及び１００８株のそれぞれにおけるサーベイヤーアッセイの活性を示す。＊３×量の５５Ｃ３  ＤＮＡをヌクレオフェクション中に添加した。赤色の矢印は、切断産物の期待バンドを示す（表８）。青色の矢頭で強調される図４Ｂのバンドは、非特異的ＰＣＲ産物の可能性があり、解析から無視したことに留意されたい。切断の推定パーセントを下の各レーンに示す。１００ｂｐのラダーを使用した。
【０２５９】
図５：対合ｇＲＮＡのヌクレオフェクションは、ＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣにおいてエクソン４５〜５５欠失をもたらす。図５Ａ。欠失領域に隣接するプライマーを用いるＰＣＲは、ｈｉＰＳＣ  ＣＤＭＤ１００６における種々のＣＲＩＳＰＲ対のヌクレオフェクション後の欠失及び再結合が成功したバンドを示す。１００ｂｐのラダーを使用した。図５Ｂ。シーケンシング後に特定された異なる再結合産物の種類の例。図５Ｃ。４４Ｃ４＋５５Ｃ３＊のシームレスな再結合の配列決定を示す。図５Ｄ。多重ＰＣＲは、４４Ｃ４及び５５Ｃ３  ｇＲＮＡでヌクレオフェクトした全ての株におけるエクソン４５〜５５欠失産物を示す。１日間の０．３５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択後のＣＤＭＤ１００６及び１００３における欠失効率の有意な増加を示す。＊３×量の５５Ｃ３  ＤＮＡをヌクレオフェクション中に添加した。１００ｂｐのラダーを使用した。
【０２６０】
クローンのフレーム再構成されたＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ株は、候補部位でオフターゲット活性を含まない
安定欠失ＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ株を、ｇＲＮＡ対４４Ｃ４及び５５Ｃ３でヌクレオフェクション後のクローン選択によってＣＤＭＤ１００３及び１００６から生成され（図２Ｂ及び図２Ｃ）、多能性である（図２Ｃ及び図６Ｂ）。全てのフレーム再構成された株は、１つのクローン（ＣＤＭＤ１００３−８１）を除いて核型が正常であり、その１つのクローンは、ＦＩＳＨ解析後に確認された１ｑ３２増幅を含むことが判明し（図６Ａ）、それは、元の親株及びｐｏｓｔ−ｈｏｃ解析後の全ての娘クローンでも観察された。１ｑ３２増幅は、培養中の拡大増殖後のｈＰＳＣで一般的であるため（Ｄｅｋｅｌ−Ｎａｆｔａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２．２０：１２４８−１２５５）、ＣＲＩＳＰＲ介在のオフターゲット活性の結果ではなかった。ｇＲＮＡのオフターゲット活性を判断するため、上位１０個の相同部位／ガイドをＣＯＳＭＩＤによって決定し（Ｃｒａｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２０１４．３：ｅ２１４）、全てのクローン及び親株で配列決定した。オフターゲット突然変異は、いかなる部位でも観察されなかった。染色体１１におけるヘテロ接合ＳＮＰ以外の、全ての変異体が、読み取りの１％未満で検出され、これは、シーケンシング法における誤差と一致している。
【０２６１】
図６：再構成された株のさらなる特徴付け。図６Ａ。全てのフレーム再構成された株は、ＦＩＳＨ解析を介して１ｑ３２増幅を含むことが判明したＣＤＭＤ１００３−８１を除いて核型が正常であると判断された。遡及的解析の際に、１ｑ３２増幅は、親株（２２％でＣＤＭＤ１００３株）で存在していたと判定され、全ての娘株（８２．５％でＣＤＭＤ１００３−５７及び１００３−４９）で見られ、ＣＲＩＳＰＲ活性の結果ではなかった。図６Ｂ。フレーム再構成された株ＣＤＭＤ１００６−１、１００３−４９、１００３−５７、及び１００３−８１は、３つの胚葉からなるテラトーマをインビボで形成した。図６Ｃ。フレーム再構成された株由来のｍＲＮＡの解析。ｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞からのジストロフィンｃＤＮＡの欠失領域内のプライマー（赤色の矢印）又は欠失領域に隣接するプライマー（紫色の矢印）を用いたＰＣＲは、ＣＤＭＤ１００２と１００６の両方における非欠失バンド、及びＣＤＭＤ１００６−１と１００３−４９の両方における欠失バンドを示す。１００ｂｐのラダーを使用した。図６Ｄ。配列決定により、フレーム再構成されたＣＤＭＤ１００６−１及び１００３−４９におけるエクソン４４及び５６の再結合が確認される。図６Ｅ。２４０オスモルを下回る低浸透圧条件に暴露されたｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞のＣＫ放出アッセイからのデータのグラフ。図４Ａと同様の同じＣＤＭＤ１００２対照データを示す。データは、平均±標準誤差として示す。図６Ｆ。ＣＫ放出アッセイデータは、アウトオブフレーム細胞に正規化され、示された全ての実験（アウトオブフレーム及び再構成に対してｎ＝６（再構成された１３５オスモルに対してｎ＝５）、野生型に対してｎ＝４）からプールした。データは、平均±標準誤差として示す。
【０２６２】
ジストロフィン（ＤＹＳΔ４５−５５）発現は、フレーム再構成されたＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞及び骨格筋管において回復される
ＤＭＤのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在欠失により、エクソン４５〜５５を欠いている内部欠失ジストロフィンタンパク質（ＤＹＳΔ４５−５５と以下で称される）が得られるはずである。ｈｉＰＳＣはジストロフィンを発現しないため、フレーム再構成されたＤＭＤ  ｈｉＰＳＣクローン株を、ＭｙｏＤの指向分化又は過剰発現を用いて、２つの疾患関連細胞型、心筋細胞と骨格筋筋管に分化させて、ＤＹＳΔ４５−５５の救済を評価した。フレーム再構成された心筋細胞クローンからのｃＤＮＡにおけるエクソン４４／５６境界のＰＣＲ及び配列決定により、ジストロフィン転写産物の正しいスプライシングが示された（図６Ｃ及び図６Ｄ）。さらに、フレーム再構成された心臓細胞株及び骨格筋細胞株の両方は、免疫細胞化学及びウェスタンブロットによって評価されたようにジストロフィン発現を回復させた（図７Ａ〜図７Ｃ）。野生型ＣＤＭＤ１００２又はヒト骨格筋筋管（ＨＳＭＭ）と比較して、バンドは、予想された通り、約６６ｋＤａで切り捨てられた。
【０２６３】
図７：フレーム再構成されたＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣ由来の骨格筋及び心筋細胞は、ジストロフィン発現を回復する。図７Ａ。指向分化によるｈｉＰＳＣ由来の野生型（ＣＤＭＤ１００２）、フレーム外（ＣＤＭＤ１００３、１００６）、又はフレーム再構成（ＣＤＭＤ１００３−４９、１００６−１）の心筋細胞のヒトミオシン重鎖（ＭｙＨＣ、赤色）及びジストロフィン（緑色）の免疫細胞化学染色。挿入図は、ホワイトボックスによって画定される領域の拡大図を示す。スケールバー：５０μｍ。図７Ｂ。ｈｉＰＳＣ由来の野生型（ＣＤＭＤ１００２）、フレーム外（ＣＤＭＤ１００６）、又はフレーム再構成（ＣＤＭＤ１００６−１、１００３−４９）の骨格筋筋管のＭｙＨＣ（赤色）及びジストロフィン（緑色）の免疫細胞化学染色。筋管は、ＭｙｏＤ過剰発現（ＯＥ）後に融合させた、又は適応指向分化５０日プロトコル後の選別されたＮＣＡＭ＋細胞由来であった。挿入図は、白い枠によって画定される領域の拡大図を示す。スケールバー：１００μｍ。図７Ｃ。抗ジストロフィンでプローブした細胞抽出物のウェスタンブロットを。抽出物は、ＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣから誘導された、フレーム外及びフレーム再構成された心筋細胞（左）、及び骨格筋筋管（右）からであった。野生型（ｗｔ）のｈｉＰＳＣ（ＣＤＭＤ１００２）又はヒト骨格筋筋管（ＨＳＭＭ）は、ジストロフィンの対照として使用した。エクソン４５〜５５欠失（１７７９ｂｐ、約６６ｋＤａ）によって引き起こされる分子量のシフトは、野生型ジストロフィン（矢印）に対してフレーム再構成ジストロフィンで明らかである。２２０ｋＤａあたりの非特異的バンドが、いくつかの試料で見られた。試料は、ローティング対照として抗ＭｙＨＣでもプローブした（下パネル）。
【０２６４】
ＤＹＳΔ４５−５５タンパク質は、インビトロで、心筋細胞及び骨格筋管へ膜機能性を回復させる
ジストロフィンを欠いている心筋細胞又は骨格筋管は、ヒト患者で見られるように（Ｐｅａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９６４．２７：１８１−１８５）、インビトロでの膜脆弱性を示し、ＣＫのレベル上昇を放出することによって浸透圧ストレスに応答する（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２０１４．１２：４６７−４８０、Ｍｅｎｋｅ  ａｎｄ  Ｊｏｃｋｕｓｃｈ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１９９５．１０８：７２７−７３３）。ＤＹＳΔ４５−５５がジストロフィー細胞膜への安定性を回復できたかどうかを判定するため、フレーム再構成及びフレーム外ｈｉＰＳＣ由来の分化した心筋細胞及び骨格筋筋管を低浸透圧条件に供した。低浸透圧溶液（６６〜２４０オスモル）中でインキュベーションにより細胞にストレスを与え、上清へのＣＫ放出を測定して、ジストロフィン回復後の機能的改善を示した。フレーム再構成されたＣＤＭＤ１００３−４９の心筋細胞及び骨格筋細胞の両方は、野生型（ＣＤＭＤ１００２）と同様に、フレーム外のＣＤＭＤ１００３細胞においてと比較して、ＣＫ放出の低下を示し、ＤＹＳΔ４５−５５が膜脆弱性を低下できることを示した（図８Ａ）。同じ傾向は、ＣＤＭＤ１００６／１００６−１心筋細胞でも観察された（図６Ｅ）。全ての実験を正規化し、プールした後、大幅に少ないＣＫが、フレーム外と比較して、再構成及び野生型の細胞において、９３、１３５、及び２４０オスモルで放出されることが観察された（図６Ｆ）。
【０２６５】
図８：フレーム再構成されたｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞及び骨格筋細胞は、インビトロ及びインビボでの回復された機能を示す。図８Ａ。低浸透圧条件に暴露された細胞からのＣＫ放出アッセイの代表的なグラフ。ｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞及び骨格筋筋管を２４０オスモルを下回る様々なオスモル濃度に供し、上清へのＣＫ放出を、膜脆弱性の指標として測定した。データは、平均±標準誤差として示す。図８Ｂ。ｍｉＲ３１の発現の倍数変化を、ＭｙｏＤ  ＯＥにより、フレーム外又はフレーム再構成されたｈｉＰＳＣに由来する筋管におけるｄｄＰＣＲによって測定され、野生型（ＣＤＭＤ１００２）に正規化した。データは、平均±標準誤差として示す。図８Ｃ。細胞抽出物のウェスタンブロットは、抗β−ジストログリカンでプローブした。抽出物は、ＭｙｏＤ  ＯＥによって得られたフレーム外及びフレーム再構成された骨格筋筋管からであった。ＨＳＭＭを、陽性対照として使用した。試料は、ローティング対照として抗ＭｙＨＣでもプローブした（下パネル）。図８Ｄ。野生型（ＣＤＭＤ１００２）、フレーム外（ＣＤＭＤ１００６）、又はフレーム再構成（ＣＤＭＤ１００６−１）骨格筋筋管におけるＭｙＨＣ（赤色）、及びβ−ジストログリカン（緑色）、ＤＧＣ成分の免疫細胞化学染色。挿入図は、白い枠によって画定される領域の拡大図を示す。スケールバー：５０μｍ。図８Ｅ。ＮＳＧ−ｍｄｘマウスのＴＡに移植した野生型（ＣＤＭＤ１００２）、フレーム外（ＣＤＭＤ１００３）、及びフレーム再構成（ＣＤＭＤ１００３−４９）ＭｙｏＤ  ＯＥ細胞におけるヒトジストロフィン回復の評価。移植したヒト細胞は、ヒトスペクトリン及びラミンＡ／Ｃ（赤色で示す）の同時免疫染色によって特定された。ヒトジストロフィンの陽性染色は、緑色で示し、全ての繊維は、ラミニン（灰色）を用いて示す。全ての切片をＤＡＰＩ（青色）で染色し、核を特定した。スケールバー：１００μｍ。図８Ｆ。ＮＳＧ−ｍｄｘマウスのＴＡに移植した野生型（ＣＤＭＤ１００２）、フレーム外（ＣＤＭＤ１００３）、及びフレーム再構成（ＣＤＭＤ１００３−４９）ＭｙｏＤ  ＯＥ細胞からのヒト繊維におけるβ−ジストログリカン回復の評価。移植したヒト細胞は、ヒトスペクトリン及びラミンＡ／Ｃ（赤色で示す）の同時免疫染色によって特定された。ジストロフィンの陽性染色は、灰色で示し、β−ジストログリカンは、緑色で示す。全ての切片をＤＡＰＩ（青色）で染色し、核を特定した。細胞の順序は、図８Ｅに記載のものと同じである。スケールバー：２０μｍ。
【０２６６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９フレーム再構成は、インビトロでの骨格筋管におけるｍｉＲ３１レベルと相関している
ｍｉＲ３１のレベル上昇は、野生型又はＢＭＤと比較して、ＤＭＤ患者生検で観察されている（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，２０１１。１２：１３６−１４１）。ｍｉＲ３１のレベルは、フレーム外及びフレーム再構成されたＣＤＭＤ  ｈｉＰＳＣの骨格筋管への分化後に、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて測定した。ＤＭＤのフレーム再構成は、ヒトジストロフィン異常症で観察されるように、アウトオブフレームＤＭＤと比較して、（野生型細胞と同様に）ｍｉＲ３１のレベルを低下させた（図８Ｂ）。従って、ＤＭＤ遺伝子のフレーム再構成は、ＢＭＤと同様にｍｉＲ３１レベルを正常にし、ジストロフィー表現型のＢＭＤ表現型への機能的救済を示した。
【０２６７】
ＤＹＳΔ４５−５５タンパク質は、ＤＧＣをインビトロ及びインビボで回復する
第３のＤＹＳΔ４５−５５機能性アッセイとして、ＤＧＣをインビトロ及びインビボで回復するその能力について評価した。ＤＧＣメンバーであるβ−ジストログリカンは、免疫染色及びウェスタンブロットによる骨格筋へのインビトロ指向分化後に、フレーム再構成されたｈｉＰＳＣの膜で回復、検出されたが、フレーム外ｈｉＰＳＣでは回復、検出されなかった（図８Ｃ及び図８Ｄ）。さらに、野生型（ＣＤＭＤ１００２）、フレーム外（ＣＤＭＤ１００３）、又はフレーム再構成（ＣＤＭＤ１００３−４９）ｈｉＰＳＣ株由来の骨格筋細胞をＮＳＧ−ｍｄｘマウスの前脛骨筋に注入した。正しく局在化されたジストロフィン及びβ−ジストログリカンは、フレーム再構成株又は野生型株（図８Ｅ及び図８Ｆ）からの移植ヒト細胞（ヒトのラミンＡ／Ｃ及びスペクトリンによって分画）でのみ観察された。これらの試験は、低浸透圧ストレスアッセイと共に、ＤＹＳΔ４５−５５がＤＧＣを機能的に組み立て直し、インビトロ及びインビボでの膜安定性を回復する能力を実証する。
【０２６８】
実施例２：ＣＲＩＳＰＲプラットフォームのインビボエレクトロポレーションは、ｈＤＭＤマウスにおけるエクソン４５〜５５欠失をもたらす
ｈＤＭＤマウスをＣＲＩＳＰＲプラットフォームで電気穿孔し、エクソン４５〜５５の欠失が得られた。
【０２６９】
図９：図９Ａ。１つのＦＤＢ筋肉にＧＦＰプラスミドで電気穿孔したｈＤＭＤマウスは、通常光（上）又はＵＶ（下）光での発現を示した。図９Ｂ。ｇＲＮＡ  ４４Ｃ４及び５５Ｃ３を含有するＣＲＩＳＰＲプラスミドで電気穿孔したｈＤＭＤマウスのＦＤＢ筋肉から採取されたゲノムＤＮＡの多重ＰＣＲは、１頭のマウス（＊）において欠失ＰＣＲ産物を示した。図９Ｃ。再結合領域の配列決定により、効果的なエクソン４５〜５５欠失が確認され、イントロン４４（Ｉ４４）及び５５（Ｉ５５）境界での１ｂｐ挿入が明らかになった。
【０２７０】
インビボエレクトロポレーションは、以下のように実施した。８週齢のｈＤＭＤマウス（‘ｔ  Ｈｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：５８９９）に、対照として２３μｇのｐｍａｘ  ＧＦＰプラスミド、又は２８μｇのｐｘ３３０プラスミドＤＮＡで電気穿孔し、後者の半分は、ガイド配列４４Ｃ４を含有し、半分は、ガイド配列５５Ｃ３を含有した。まず、５μｌのヒアルロニダーゼを短指屈筋（ＦＤＢ）筋肉に注入した。ヒアルロニダーゼ処理の１時間後、プラスミドＤＮＡをＦＤＢ筋肉に注入して、２０ミリ秒間１００Ｖで２０回電気穿孔した。注入及びエレクトロポレーションの１０日後、ＦＤＢ筋肉を採取し、プロテイナーゼＫで消化し、Ｑｕｉｃｋ  ｇＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を用いて消化筋肉からゲノムＤＮＡを単離した。
【０２７１】
実施例３：種々のガイドＲＮＡ対が、ゲノム欠失の成功のために使用された
図１０は、試験したガイドＲＮＡ（例えば、表２、図２３を参照されたい）、及び期待欠失サイズ（「総欠失距離」）の概略図を示す。図１１は、２９３Ｔ細胞において種々のガイドＲＮＡ対でのゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。図１２は、２９３Ｔ細胞において種々のガイドＲＮＡ対でのゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。図１３は、ｉＰＳＣ細胞において種々のガイドＲＮＡ対でのゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。図１４は、ｉＰＳＣ細胞において種々のガイドＲＮＡ対をでのゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。図１５は、ｉＰＳＣ細胞において種々のガイドＲＮＡ対でのゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。図１６は、ｉＰＳＣ細胞において種々のガイドＲＮＡ対でのゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。図１７は、ガイドＲＮＡ対でのゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。図１８は、ガイドＲＮＡ対でのゲノム欠失の成功を示すゲルを示す。
【０２７２】
ガイドＲＮＡのさらなるガイド配列（及び標的配列）を図２４（表９）に提供する。図１９は、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における単一ガイド切断活性の活性を提供する。図２０は、「４４」シリーズのガイドＲＮＡに対するサーベーヤーデータを提供する。図２１は、「５５」シリーズのガイドＲＮＡとの組み合わせた、「４４」シリーズのガイドＲＮＡに対するゲノム欠失データを提供する。図２２Ａは、「５５」シリーズのガイドＲＮＡに対するサーベーヤーデータを提供する。図２２Ｂは、「５５」ガイドＲＮＡと「４４」ガイドＲＮＡの組み合わせ、具体的には：１）４４Ｃ４＋５５Ｃ３、及び２）４４Ｃ４＋５５Ｃ８ｄに対するゲノム欠失データを提供する。
【０２７３】
本発明をその特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされてよく、等価物が置換されてよいことは、当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスの１つ又は複数のステップを、本発明の目的、精神及び範囲に適合させるために、多くの修正を行ってよい。そのような修正は全て、本明細書に添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図１−１】
2019509031.tif 000009
【図１−２】
2019509031.tif 000010
【図２−１】
2019509031.tif 000011
【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
2019509031.tif 000043
【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２４−５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月11日(2018.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子の修飾方法であって、
ａ）クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、又は前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び
ｂ）前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに対応する第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、又は前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸（前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、前記変異ジストロフィン遺伝子のイントロン４４内で標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、前記変異ジストロフィン遺伝子のイントロン５５内で標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含む）、
を前記細胞に導入することを含み、
前記導入することは、エクソン４５〜５５を含む前記変異ジストロフィン遺伝子の３３０キロベースを超える領域の欠失をもたらす、
前記方法。
【請求項２】
（ａ）前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼであるか、又は
（ｂ）前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質であり、前記対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡが、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｖ型又はＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼであるか、又は
（ｂ）前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、又はＣ２ｃ２タンパク質である、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１５５〜１１５９のいずれかに記載の１７ヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号１１５０〜１１５４及び配列番号１２２３〜１２６９のいずれかに記載の２０ヌクレオチド配列を含み、及び／又は
（ｂ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１７５〜１１７９のいずれかに記載の１７ヌクレオチド配列を含か、又は配列番号１１７０〜１１７４及び配列番号１３１８〜１３６５のいずれかに記載の２０ヌクレオチド配列を含む、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、１７ヌクレオチド配列ＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５８）を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、１７ヌクレオチド配列ＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７７）を含か、又は
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、２０ヌクレオチド配列ＧＵＵＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５３）を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、２０ヌクレオチド配列ＵＧＵＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７２）を含む、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
イントロン４４内の前記標的配列とイントロン５５内の前記標的配列が、互いに５００ｋｂ以上離れているか、又は
イントロン４４内の前記標的配列とイントロン５５内の前記標的配列が、互いに７００ｋｂ以上離れている、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、インビトロ、エクスビボ、又はインビボである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、筋細胞、周皮細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来の筋細胞、幹細胞、又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、前記導入後に、前記細胞を個体に移植するステップを含み、
前記細胞は、好ましくは前記個体に対して自己由来である、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞のゲノムにおける変異ジストロフィン遺伝子を修飾するキットであって、
（ｉ）第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、又は前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４に対応する第１の標的配列と１７以上の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有するガイド配列を含む）、及び
（ｉｉ）第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５に対応する第２の標的配列と１７以上の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有するガイド配列を含む）、
を含み、
前記第１及び第２の標的配列は、互いに３３０ｋｂ以上離れている
前記キット。
【請求項１１】
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１５５〜１１５９のいずれかに記載の１７ヌクレオチド配列を含むか、又は、配列番号１１５０〜１１５４及び配列番号１２２３〜１２６９のいずれかに記載の２０ヌクレオチド配列を含み、及び／又は
（ｂ）前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、配列番号１１７５〜１１７９のいずれかに記載の１７ヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号１１７０〜１１７４及び配列番号１３１８〜１３６５のいずれかに記載の２０ヌクレオチド配列を含む、
請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
（ａ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、１７ヌクレオチド配列ＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５８）を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、１７ヌクレオチド配列ＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７７）を含むか、又は、
（ｂ）前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、２０ヌクレオチド配列ＧＵＵＧＡＡＡＵＵＡＡＡＣＵＡＣＡＣＡＣ（配列番号１１５３）を含み、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、２０ヌクレオチド配列ＵＧＵＡＵＧＡＵＧＣＵＡＵＡＡＵＡＣＣＡ（配列番号１１７２）を含む、  請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、前記ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン４４に対応する標的配列と２０の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有し、及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡのガイド配列が、前記ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５５に対応する標的配列と２０の連続したヌクレオチドにわたって１００％の相補性を有する、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
イントロン４４に対応する前記標的配列とイントロン５５に対応する前記標的配列が、互いに５００ｋｂ以上、又は互いに７００ｋｂ以上離れている、
請求項１０又は１３に記載のキット。
【請求項１５】
クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、又は前記クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はＣａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡが、Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡであるか、又は、
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡが、単一分子ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡである、
請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
個体、好ましくはヒトにおけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法に使用するための変異ジストロフィン遺伝子を有するよう修飾された細胞であって、
前記治療方法が、
ａ）請求項１から９のいずれかの方法を実施すること、及び
ｂ）前記修飾された細胞を前記個体における治療部位に又はその近くに導入すること
を含む、
細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号Ｐ３０  ＡＲ０５７２３０及びＡＲ０６４３２７、ならびに米国国立科学財団による助成金番号１１４４０８７の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【国際調査報告】
2019509031.tif 000048
2019509031.tif 000049
2019509031.tif 000050
2019509031.tif 000051
2019509031.tif 000052