(57)【要約】本開示は、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患の治療に使用される間葉系幹細胞及びその集団に関する。本開示は、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患を治療する方法であって、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞集団を投与するステップを含み、該細胞集団がＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む方法を提供する。【選択図】図２７Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の神経変性疾患を治療する方法であって、
神経変性疾患の治療を必要とする対象に対して、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞集団を治療有効量で投与するステップを含み、
前記細胞集団がＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含み、それによって、前記対象の前記神経変性疾患を治療する方法。
【請求項２】
前記神経変性疾患が、
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）；パーキンソン病；多系統萎縮症（ＭＳＡ）；ハンチントン病；アルツハイマー病；レット症候群；リソソーム蓄積症；「白質疾患」またはグリア／脱髄疾患（サンフィリポ症を含む）；ゴーシェ病；テイ・サックス病（ベータ・ヘキソサミニダーゼ欠損症）；多発性硬化症（ＭＳ）；視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、ＮＭＯスペクトラム疾患、虚血、事故、または環境障害に起因する脳損傷または外傷；脳卒中；脳性麻痺（ＣＰ）；自閉症及び自閉症スペクトラム障害；脊髄損傷；運動失調；またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞が、
（ａ）骨髄間葉系幹細胞、脂肪細胞間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、末梢血間葉系幹細胞、歯周靭帯間葉系幹細胞、子宮内膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、または臍帯血間葉系幹細胞、
（ｂ）前記対象の自己由来細胞、
（ｃ）前記対象の同種異系細胞、
またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が、
（ａ）非遺伝子組み換えヒト細胞、
（ｂ）少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を発現及び分泌するようにエクスビボで誘導された間葉系幹細胞、
またはそれらの組み合わせを含む、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞における前記少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌が、同一の前記対象から取得した非分化間葉系幹細胞における前記ＮＴＦの基礎分泌よりも多い、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記投与の前及び前記投与の後に前記対象から取得した生体試料を分析するステップをさらに含む、請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記生体試料が、血液、血清、尿、または脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記投与後に、前記生体試料が、対照生体試料と比較して、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）の濃度の増加を含む、請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記神経栄養因子（ＮＴＦ）が、
血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、ニューブラスチン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記投与後に、前記生体試料中が、対照生体試料と比較して、炎症性因子、アポトーシス促進因子、及び、炎症性因子に影響を与える因子のうちの少なくとも１つの濃度の減少を含む、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記炎症性因子、アポトーシス促進因子、または、炎症性因子に影響を与える因子が、
キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１ｂ、グルタミン酸、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において、少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現が、対照ＭＳＣ細胞と比較して調節される、請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記調節された遺伝子発現が、遺伝子発現の減少を含み、
前記バイオマーカーが、ＴＯＰ２Ａ、ＦＧＦ２、ＭＥＳＴ、ＳＬＣ１Ａ１、及びＴＵＢＢ３のうちのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記調節された遺伝子発現が、遺伝子発現の増加を含み、
前記バイオマーカーが、ＢＭＰ２、ＬＩＦ、ＷＮＴ５Ａ、ＡＲＥＧ、ＨＧＦ、ＢＤＮＦ、ＰＣＳＫ１、ＲＡＢ２７Ｂ、ＳＮＡＰ２５、ＳＬＣ１Ａ３、及びＳＬＣ１６Ａ６のうちのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与後に、前記生体試料が、対照生体試料と比較して、少なくとも１つの神経栄養因子の濃度の増加、並びに、炎症性因子、アポトーシス促進因子、及び、炎症性因子に影響を与える因子のうちの少なくとも１つの濃度の減少を含む、請求項１ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記投与が、
（ａ）前記対象の脳脊髄液または中枢神経系への投与、
（ｂ）筋肉内（ＩＭ）注射または髄腔内（ＩＴ）注射、
またはそれらの組み合わせを含む、請求項１ないし１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記筋肉内（ＩＭ）注射の１回の注射あたりの用量は、約２×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞であり、
前記髄腔内（ＩＴ）注射の１回の注射あたりの用量は、約１００〜１２５×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与が、複数回の筋肉内（ＩＭ）注射を含み、
前記複数回の筋肉内（ＩＭ）注射の総用量は、約４８×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与が、治療上有効な数の時点を含む、請求項１ないし１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連するバイオマーカー、前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進行を識別するバイオマーカー、またはそれらの組み合わせを検出するステップをさらに含む、請求項２ないし１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオマーカーが、キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７６−ａ、ｍｉＲ−１３２、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
組成物であって、
少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞集団を、神経変性疾患の治療を必要とする対象にとっての治療有効量で含有し、
前記細胞集団がＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む組成物。
【請求項２３】
前記神経変性疾患が、
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）；パーキンソン病；多系統萎縮症（ＭＳＡ）；ハンチントン病；アルツハイマー病；レット症候群；リソソーム蓄積症；「白質疾患」またはグリア／脱髄疾患（サンフィリポ症を含む）；ゴーシェ病；テイ・サックス病（ベータ・ヘキソサミニダーゼ欠損症）；多発性硬化症（ＭＳ）；視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、ＮＭＯスペクトラム疾患、虚血、事故、または環境障害に起因する脳損傷または外傷；脳卒中；脳性麻痺（ＣＰ）；自閉症及び自閉症スペクトラム障害；脊髄損傷；運動失調；またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記間葉系幹細胞が、
（ａ）骨髄間葉系幹細胞、脂肪細胞間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、末梢血間葉系幹細胞、歯周靭帯間葉系幹細胞、子宮内膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、または臍帯血間葉系幹細胞、
（ｂ）前記対象の自己由来細胞、
（ｃ）前記対象の同種異系細胞、
またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が、
（ａ）非遺伝子組み換えヒト細胞、
（ｂ）少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を発現及び分泌するようにエクスビボで誘導された間葉系幹細胞、
またはそれらの組み合わせを含む、請求項２２ないし２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞における前記少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌が、非分化間葉系幹細胞における前記ＮＴＦの基礎分泌よりも多い、請求項２２ないし２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
前記神経栄養因子（ＮＴＦ）が、
血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、ニューブラスチン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項２２ないし２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
対象のキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）を検出する方法であって、
前記対象から生体試料を取得する取得ステップと、
前記生体試料中のキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度を検出する検出ステップとを含み、
前記キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度が、５００〜３００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である方法。
【請求項２９】
前記生体試料が、前記対象から取得した脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、尿試料、血液試料、または血清試料を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出ステップが、前記生体試料中の単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を検出するステップをさらに含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有し、
前記検出ステップによって、前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進行を判定する、請求項２８ないし３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
対象の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を診断する方法であって、
前記対象から生体試料を取得する取得ステップと、
前記生体試料中のキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度を検出する検出ステップとを含み、
前記キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度が５００〜３００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である場合には、前記対象が前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有すると判定する方法。
【請求項３３】
前記生体試料が、前記対象から取得した脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、尿試料、血液試料、または血清試料を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記検出ステップが、前記対象の単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を検出するステップをさらに含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記診断が、前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進行を判定する、請求項３２ないし３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
対象の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する方法であって、
前記対象から生体試料を取得する取得ステップと、
前記生体試料中のキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度を検出し、前記キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度が、５００〜３００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である場合には、前記対象が前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有すると判定する、該検出ステップと、
検出された前記キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度に基づき、前記対象の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する治療ステップとを含む方法。
【請求項３７】
前記生体試料が、前記対象から取得した脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、尿試料、血液試料、または血清試料を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記治療ステップの後に、前記対象の前記生体試料中の血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６）、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ３７６−ａ、ｍｉＲ−１４６ａ−５、またはそれらの任意の組み合わせの濃度が、対照生体試料と比較して増加する、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記治療ステップの後に、前記対象の前記生体試料中のキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１ｂ、グルタミン酸、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、またはそれらの任意の組み合わせの濃度が、対照生体試料と比較して減少する、請求項３６ないし３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記対象の前記生体試料中のｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７６ａ、ｍｉＲ−１３２、またはそれらの任意の組み合わせの基礎濃度が、レスポンダー患者から取得した体試料と比較して低い場合には、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞治療に対するノンレスポンダーを示す、請求項３６ないし３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
対象の神経栄養因子、炎症性因子、アポトーシス促進因子、または、炎症性因子に影響を与える因子を調節する方法であって、
前記対象に対して、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞集団を治療有効量で投与するステップを含み、
前記細胞集団がＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含み、それによって、前記対象の神経栄養因子、炎症性因子、アポトーシス促進因子、または、炎症性因子に影響を与える因子を調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患の治療に使用される細胞及びその集団に関する。特に、本開示は、神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導された間葉系幹細胞の投与によってＡＬＳを治療することに関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は致命的な神経疾患であり、運動ニューロン（ＭＮ）が変性または死滅することにより、衰弱、麻痺、そして最終的には、人工呼吸器の補助を必要とする呼吸不全が引き起こされる。ＡＬＳの進行を止めたり回復させたりする治療法は、現在存在していない。したがって、ＡＬＳ患者にとって安全で効果的な治療法に対する未だ満たされていない医療ニーズ（アンメットメディカルニーズ）が、依然として存在する。
【０００３】
ＡＬＳ症例の大多数は散発的であるが、ＡＬＳ症例の約１０％を占める様々な形態の家族性ＡＬＳが確認されている。スーパーオキシド・ジスムターゼ遺伝子でのようないくつかのＡＬＳ特異的突然変異の確認により、ＡＬＳにおける神経変性の病因に関するいくつかの機構的仮説が導かれた。それにもかかわらず、運動ニューロン変性の最終共通経路に至る様々な機序が存在し得る。推定上の病態生理学的機序に基づき、抗グルタミン酸薬、タンパク質の誤った折り畳み及び蓄積を標的とする薬物、抗酸化物質療法、免疫調節剤、並びに幹細胞移植を含む様々な治療法が、ＡＬＳにおいて研究されている。ニューロンの成長及び生存を促進する神経栄養因子（ＮＴＦ）が、従来の、重要な前臨床研究及び臨床研究の分野であった。
【０００４】
キトトリオシダーゼ（ＣＨＩＴ−１）は、主に、キチンの単糖への加水分解を触媒する酵素のクラスを表すキチナーゼファミリー１に属する。ＣＨＩＴ−１の天然基質であるキチン、無脊椎動物及び人体寄生虫に見られる不溶性Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーである。
【０００５】
健康人集団では、ＣＨＩＴ−１活性は非常に低く、そして循環多形核細胞に由来する。逆に、急性／慢性炎症性疾患の発症中は、ＣＨＩＴ−１の酵素活性は、単球のマクロファージへの効果的な成熟を通じて大幅に増加する。
【０００６】
ＣＨＩＴ−１は、ゴーシェ病の分泌バイオマーカーの１つとして含まれている。これらの患者におけるＣＨＩＴ−１の上昇は、マクロファージの活性化の特定の状態を反映する。また、ＣＨＩＴ−１は、免疫機能不全を伴う様々な疾患に広く関与している。近年、ＣＨＩＴ−１は、それが血清中に過剰に分泌されること、及び慢性的に炎症を起こしている組織において過剰発現することに起因して、ますます精査されている。
【０００７】
キチンは、ヒトの脳には存在しない。しかしながら、基質であるキチンが存在しなくても、ＣＨＩＴ−１は、ミクログリアまたは浸潤性マクロファージにより合成される。ＣＨＩＴ−１は神経炎症の一因となるようであり、多発性硬化症及びアルツハイマー病において増加することが分かっている。
【０００８】
したがって、ＡＬＳを治療するための改良された組成物及び方法が求められている。さらに、本明細書に記載されるように、ＣＨＩＴ−１は、ＡＬＳの進行を追跡するためのバイオマーカーを提供する。このバイオマーカーは、治療方法と組み合わせて、ＡＬＳに罹患している対象（患者）に利益をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本開示によれば、対象の神経変性疾患を治療する方法であって、神経変性疾患の治療を必要とする対象に対して、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞集団を治療有効量で投与するステップを含み、前記細胞集団がＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含み、それによって、前記対象の前記神経変性疾患を治療する方法が提供される。
【００１０】
関連する態様では、前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）；パーキンソン病；多系統萎縮症（ＭＳＡ）；ハンチントン病；アルツハイマー病；レット症候群；リソソーム蓄積症；「白質疾患」またはグリア／脱髄疾患（サンフィリポ症を含む）；ゴーシェ病；テイ・サックス病（ベータ・ヘキソサミニダーゼ欠損症）；多発性硬化症（ＭＳ）；視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、ＮＭＯスペクトラム疾患、虚血、事故、または環境障害に起因する脳損傷または外傷；脳卒中；脳性麻痺（ＣＰ）；自閉症及び自閉症スペクトラム障害；脊髄損傷；運動失調；またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の関連する態様では、前記間葉系幹細胞は、（ａ）骨髄間葉系幹細胞、脂肪細胞間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、末梢血間葉系幹細胞、歯周靭帯間葉系幹細胞、子宮内膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、または臍帯血間葉系幹細胞、（ｂ）前記対象の自己由来細胞、（ｃ）前記対象の同種異系細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の関連する態様では、前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、（ａ）非遺伝子組み換えヒト細胞、（ｂ）少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を発現及び分泌するようにエクスビボで誘導された間葉系幹細胞、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１１】
関連する態様では、前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞における前記少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌が、同一の前記対象から取得した非分化間葉系幹細胞における前記ＮＴＦの基礎分泌よりも多い。
【００１２】
関連する態様では、本方法は、前記投与の前及び前記投与の後に前記対象から取得した生体試料を分析するステップをさらに含む。別の関連する態様では、前記生体試料は、血液、血清、尿、または脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。別の関連する態様では、前記投与後に、前記生体試料が、対照生体試料と比較して、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）の濃度の増加を含む。別の関連する態様では、前記神経栄養因子（ＮＴＦ）は、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、ニューブラスチン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００１３】
関連する態様では、前記投与後に、前記生体試料中が、対照生体試料と比較して、炎症性因子、アポトーシス促進因子、及び、炎症性因子に影響を与える因子のうちの少なくとも１つの濃度の減少を含む。別の関連する態様では、前記炎症性因子、アポトーシス促進因子、または、炎症性因子に影響を与える因子は、キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１ｂ、グルタミン酸、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。別の関連する態様では、前記投与後、前記投与後に、前記生体試料が、対照生体試料と比較して、少なくとも１つの神経栄養因子の濃度の増加、並びに、炎症性因子、アポトーシス促進因子、及び、炎症性因子に影響を与える因子のうちの少なくとも１つの濃度の減少を含む。
【００１４】
関連する態様では、前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において、少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現が、対照ＭＳＣ細胞と比較して調節される。別の関連する態様では、前記調節された遺伝子発現は、遺伝子発現の減少を含み、前記バイオマーカーが、ＴＯＰ２Ａ、ＦＧＦ２、ＭＥＳＴ、ＳＬＣ１Ａ１、及びＴＵＢＢ３のうちのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の関連する態様では、前記調節された遺伝子発現は、遺伝子発現の増加を含み、前記バイオマーカーが、ＢＭＰ２、ＬＩＦ、ＷＮＴ５Ａ、ＡＲＥＧ、ＨＧＦ、ＢＤＮＦ、ＰＣＳＫ１、ＲＡＢ２７Ｂ、ＳＮＡＰ２５、ＳＬＣ１Ａ３、及びＳＬＣ１６Ａ６のうちのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００１５】
関連する態様では、前記投与は、（ａ）前記対象の脳脊髄液または中枢神経系への投与、（ｂ）筋肉内（ＩＭ）注射または髄腔内（ＩＴ）注射、またはそれらの組み合わせを含む。別の関連する態様では、前記筋肉内（ＩＭ）注射の１回の注射あたりの用量は、約２×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞であり、前記髄腔内（ＩＴ）注射の１回の注射あたりの用量は、約１００〜１２５×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量である。別の関連する態様では、前記投与は、複数回の筋肉内（ＩＭ）注射を含み、前記複数回の筋肉内（ＩＭ）注射の総用量は、約４８×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞である。別の関連する態様では、前記投与は、治療上有効な数の時点を含む。
【００１６】
関連する態様では、本方法は、前前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連するバイオマーカー、前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進行を識別するバイオマーカー、またはそれらの組み合わせを検出するステップをさらに含む。別の関連する態様では、前記バイオマーカーは、キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７６−ａ、ｍｉＲ−１３２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００１７】
一態様では、本開示によれば、組成物であって、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞集団を、神経変性疾患の治療を必要とする対象にとっての治療有効量で含有し、前記細胞集団がＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む組成物が提供される。関連する態様では、前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）；パーキンソン病；多系統萎縮症（ＭＳＡ）；ハンチントン病；アルツハイマー病；レット症候群；リソソーム蓄積症；「白質疾患」またはグリア／脱髄疾患（サンフィリポ症を含む）；ゴーシェ病；テイ・サックス病（ベータ・ヘキソサミニダーゼ欠損症）；多発性硬化症（ＭＳ）；視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、ＮＭＯスペクトラム疾患、虚血、事故、または環境障害に起因する脳損傷または外傷；脳卒中；脳性麻痺（ＣＰ）；自閉症及び自閉症スペクトラム障害；脊髄損傷；運動失調；またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００１８】
別の関連する態様では、前記間葉系幹細胞は、（ａ）骨髄間葉系幹細胞、脂肪細胞間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、末梢血間葉系幹細胞、歯周靭帯間葉系幹細胞、子宮内膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、または臍帯血間葉系幹細胞、（ｂ）前記対象の自己由来細胞、（ｃ）前記対象の同種異系細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の関連する態様では、前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、（ａ）非遺伝子組み換えヒト細胞、（ｂ）少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を発現及び分泌するようにエクスビボで誘導された間葉系幹細胞、またはそれらの組み合わせを含む。別の関連する態様では、前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞における前記少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌は、非分化間葉系幹細胞における前記ＮＴＦの基礎分泌よりも多い。別の関連する態様では、前記神経栄養因子（ＮＴＦ）は、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、ニューブラスチン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００１９】
一態様では、本開示によれば、対象のキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）を検出する方法であって、前記対象から生体試料を取得する取得ステップと、前記生体試料中のキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度を検出する検出ステップとを含み、前記キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度が、５００〜３００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である方法が提供される。
【００２０】
関連する態様では、前記生体試料は、前記対象から取得した脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、尿試料、血液試料、または血清試料を含む。別の関連する態様では、前記検出ステップは、前記生体試料中の単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を検出するステップをさらに含む。別の関連する態様では、前記対象は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有し、前記検出ステップによって、前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進行を判定する。
【００２１】
一態様では、本開示によれば、対象の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を診断する方法であって、前記対象から生体試料を取得する取得ステップと、前記生体試料中のキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度を検出する検出ステップとを含み、前記キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度が５００〜３００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である場合には、前記対象が前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有すると判定する方法が提供される。
【００２２】
関連する態様では、前記生体試料は、前記対象から取得した脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、尿試料、血液試料、または血清試料を含む。別の関連する態様では、前記検出ステップは、前記対象の単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を検出するステップをさらに含む。別の関連する態様では、前記診断は、前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進行を判定する。
【００２３】
一態様では、本開示によれば、対象の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する方法であって、前記対象から生体試料を取得する取得ステップと、前記生体試料中のキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度を検出し、前記キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度が、５００〜３００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である場合には、前記対象が前記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有すると判定する、該検出ステップと、検出された前記キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度に基づき、前記対象の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する治療ステップとを含む方法が提供される。
【００２４】
関連する態様では、前記生体試料は、前記対象から取得した脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、尿試料、血液試料、または血清試料を含む。別の関連する態様では、前記治療ステップの後に、前記対象の前記生体試料中の血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６）、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ３７６−ａ、ｍｉＲ−１４６ａ−５、またはそれらの任意の組み合わせの濃度が、対照生体試料と比較して増加する。
【００２５】
別の関連する態様では、前記治療ステップの後に、前記対象の前記生体試料中のキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１ｂ、グルタミン酸、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、またはそれらの任意の組み合わせの濃度が、対照生体試料と比較して減少する。別の関連する態様では、前記対象の前記生体試料中のｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７６ａ、ｍｉＲ−１３２、またはそれらの任意の組み合わせの基礎濃度が、レスポンダー患者（responder patient）から取得した体試料と比較して低い場合には、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞治療に対するノンレスポンダー（non-responder）を示す。
【００２６】
一態様では、本開示によれば、対象の神経栄養因子、炎症性因子、アポトーシス促進因子、または、炎症性因子に影響を与える因子を調節する方法であって、前記対象に対して、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞集団を治療有効量で投与するステップを含み、前記細胞集団がＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含み、それによって、前記対象の神経栄養因子、炎症性因子、アポトーシス促進因子、または、炎症性因子に影響を与える因子を調節する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本開示の特定の実施形態をさらに実証するために含められる。本明細書に記載された細胞及びその使用方法は、これらの図面の１または複数を、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによってより良く理解されるであろう。
【００２８】
【図１Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）におけるトポイソメラーゼ（ＤＮＡ）ＩＩアルファ（Ｔｏｐ２Ａ）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図１Ｂ】Ｔｏｐ２Ａ遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図２Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）における骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】ＢＭＰ２遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図３Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）における白血病抑制因子（ＬＩＦ）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図３Ｂ】ＬＩＦ遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図４Ａ】正常（健康）なドナーからのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）における線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図４Ｂ】ＦＧＦ２遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものである）。
【図５Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）におけるＷｎｔファミリーメンバー５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図５Ｂ】ＷＮＴ５Ａ遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図６Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）におけるアンフィレグリン（ＡＲＥＧ）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図６Ｂ】ＡＲＥＧ遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図７Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）における肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図７Ｂ】ＨＧＦ遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図８Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）における脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図８Ｂ】ＢＤＮＦ遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図９Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）における中胚葉特異的転写産物（ＭＥＳＴ）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図９Ｂ】ＭＥＳＴ遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図１０Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）におけるプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン１型（ＰＣＳＫ１）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図１０Ｂ】ＰＣＳＫ１遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図１１Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）におけるＲＡＢ２７Ｂ、ＲＡＳ癌遺伝子ファミリーメンバー（ＲＡＢ２７ｂ）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図１１Ｂ】ＲＡＢ２７ｂ遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図１２Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）におけるシナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図１２Ｂ】ＳＮＡＰ２５遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図１３Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）における溶質キャリアファミリー１メンバー１（ＳＬＣ１Ａ１（ＥＡＡＣ１））遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図１３Ｂ】ＳＬＣ１Ａ１（ＥＡＡＣ１）遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図１４Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）における溶質キャリアファミリー１メンバー３（ＳＬＣ１Ａ３（ＧＬＡＳＴ））遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図１４Ｂ】ＳＬＣ１Ａ３（ＧＬＡＳＴ）遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図１５Ａ】正常（健康）なドナーからのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）におけるチューブリンベータ３クラスＩＩＩ（ＴＵＢＢ３（ＴＵＪ１））遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図１５Ｂ】ＴＵＢＢ３（ＴＵＪ１）遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものである）。
【図１６Ａ】正常（健康）なドナー及びＡＬＳ患者からのＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）における溶質キャリアファミリー１６メンバー６（ＳＬＣ１６Ａ６）遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図１６Ｂ】ＳＬＣ１６Ａ６遺伝子発現についてのサンプル倍率変化（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）を示す（Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４は健康なドナーからのものであり；０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭはＡＬＳ患者からのものである）。
【図１７Ａ】第ＩＩａ相臨床試験（ClinicalTrials.gov ID：ＮＣＴ０１７７７６４６）に参加したＡＬＳ患者から取得した細胞からの、培養上清中で測定した、ＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）からの骨形成タンパク質２ポリペプチド（ＢＭＰ−２）分泌の比較結果を示す。
【図１７Ｂ】実施例３で説明した第ＩＩ相臨床試験（ClinicalTrials.gov ID：ＮＣＴ０２０１７９１２）に参加したＡＬＳ患者から取得した細胞からの、培養上清中で測定した、ＭＳＣ−ＮＴＦからの骨形成タンパク質２ポリペプチド（ＢＭＰ−２）の分泌結果を示す。
【図１８Ａ】第ＩＩａ相臨床試験（ClinicalTrials.gov ID：ＮＣＴ０１７７７６４６）に参加したＡＬＳ患者から取得した細胞からの、培養上清中で測定した、ＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）からのコロニー刺激因子３ポリペプチド（Ｇ−ＣＳＦ）分泌の比較結果を示す。
【図１８Ｂ】実施例３で説明した米国臨床試験に参加したＡＬＳ患者から取得した細胞からの、培養上清中で測定した、ＭＳＣ−ＮＴＦからのコロニー刺激因子３ポリペプチド（Ｇ−ＣＳＦ）の分泌結果を示す。
【図１９Ａ】第ＩＩａ相臨床試験（ClinicalTrials.gov ID：ＮＣＴ０１７７７６４６）に参加したＡＬＳ患者から取得した細胞からの、培養上清中で測定した、ＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）からの白血病抑制因子ポリペプチド（ＬＩＦ）分泌の比較結果を示す。
【図１９Ｂ】実施例３で説明した第ＩＩ相臨床試験（ClinicalTrials.gov ID：ＮＣＴ０２０１７９１２）に参加したＡＬＳ患者から取得した細胞からの、培養上清中で測定した、ＭＳＣ−ＮＴＦからの白血病抑制因子ポリペプチド（ＬＩＦ）の分泌結果を示す。
【図２０】第ＩＩａ相臨床試験（ClinicalTrials.gov ID：ＮＣＴ０１７７７６４６）に参加したＡＬＳ患者から取得した細胞からの、培養上清中で測定した、ＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）刺激遺伝子６（ＴＳＧ−６）の分泌結果を示す。
【図２１】第ＩＩａ相臨床試験（ClinicalTrials.gov ID：ＮＣＴ０１７７７６４６）に参加したＡＬＳ患者から取得した細胞からの、培養上清中で測定した、ＭＳＣ（黒色）及びＭＳＣ−ＮＴＦ（灰色）からのグルタミン酸の分泌結果を示す
【図２２Ａ】本明細書に開示された実施形態による、研究概要（臨床試験デザイン）を示す。来院１（ＶＩ）は、スクリーニング来院。来院２（Ｖ２）は、Ｖ１の４〜６週後に行われた、移植前の来院。来院３（Ｖ３）は、Ｖ１の８〜１０週後に行われた、２回目の移植前の来院。来院４（Ｖ４）は、Ｖ１の９〜１１週後に行われた、骨髄穿刺のための来院。来院５（Ｖ５）は、０日目（骨髄穿刺から２４〜３８日目）に行われた、細胞移植（治療処置）のための来院。来院６（Ｖ６）〜来院１０（Ｖ１０）は、移植から２４〜２６週間にわたって定期的に行われた。
【図２２Ｂ】治療処置群及びプラセボ群におけるプラセボ及び細胞移植を説明する研究群フローチャートを示す。
【図２２Ｃ】試験への参加者登録、処置介入の割り当て、及び追跡調査を説明するためのフローチャートを示す。
【図２３Ａ】移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）の神経栄養因子のＣＳＦ分析測定値を示す。ＣＳＦ中での血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の力価の有意な増加が、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞処置患者では見られた（図２３Ａ）が、プラセボ処置患者では変化は見られなかった（図２３Ｂ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２３Ｂ】移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）の神経栄養因子のＣＳＦ分析測定値を示す。ＣＳＦ中での血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の力価の有意な増加が、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞処置患者では見られた（図２３Ａ）が、プラセボ処置患者では変化は見られなかった（図２３Ｂ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２３Ｃ】移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）の神経栄養因子のＣＳＦ分析測定値を示す。ＣＳＦ中での肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の力価の有意な増加が、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞処置患者では見られた（図２３Ｃ）が、プラセボ処置患者では変化は見られなかった（図２３Ｄ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２３Ｄ】移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）の神経栄養因子のＣＳＦ分析測定値を示す。ＣＳＦ中での肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の力価の有意な増加が、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞処置患者では見られた（図２３Ｃ）が、プラセボ処置患者では変化は見られなかった（図２３Ｄ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２３Ｅ】移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）の神経栄養因子のＣＳＦ分析測定値を示す。ＣＳＦ中での肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の力価の有意な増加が、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞処置患者では見られた（図２３Ｃ）が、プラセボ処置患者では変化は見られなかった（図２３Ｄ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２３Ｆ】移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）の神経栄養因子のＣＳＦ分析測定値を示す。ＣＳＦ中での白血病抑制因子（ＬＩＦ）の力価の有意な増加が、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞処置患者では見られた（図２３Ｅ）が、プラセボ処置患者では変化は見られなかった（図２３Ｆ）。図２３Ａ〜図２３Ｆにおいて、治療処置に対するレスポンダーは、移植８週後に、移植前のＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配と比較して５０％の改善を示した患者と定義された。
【図２３Ｇ】ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞処置患者に応答した患者のＣＳＦ中の神経栄養因子及び炎症因子の力価の変化を示す表である。
【図２４Ａ】移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）の炎症性バイオマーカーのＣＳＦ分析測定値を示す。ＣＳＦ中のＭＣＰ−１レベルの有意な減少が、ＭＳＣ−ＮＴＦ処置患者では見られたが（ＭＳＣ−ＮＴＦ処置：図２４Ａ）、プラセボ群では有意な変化は見られなかった（プラセボ処置：図２４Ｂ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２４Ｂ】移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）の炎症性バイオマーカーのＣＳＦ分析測定値を示す。ＣＳＦ中のＭＣＰ−１レベルの有意な減少が、ＭＳＣ−ＮＴＦ処置患者では見られたが（ＭＳＣ−ＮＴＦ処置：図２４Ａ）、プラセボ群では有意な変化は見られなかった（プラセボ処置：図２４Ｂ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２４Ｃ】移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）の炎症性バイオマーカーのＣＳＦ分析測定値を示す。ＣＳＦ中のＳＤＦ−１レベルの有意な減少が、ＭＳＣ−ＮＴＦ処置患者では見られたが（ＭＳＣ−ＮＴＦ処置：図２４Ｃ）、プラセボ群では有意な変化は見られなかった（プラセボ処置：図２４Ｄ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２４Ｄ】移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）の炎症性バイオマーカーのＣＳＦ分析測定値を示す。ＣＳＦ中のＳＤＦ−１レベルの有意な減少が、ＭＳＣ−ＮＴＦ処置患者では見られたが（ＭＳＣ−ＮＴＦ処置：図２４Ｃ）、プラセボ群では有意な変化は見られなかった（プラセボ処置：図２４Ｄ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２４Ｅ】移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）の炎症性バイオマーカーのＣＳＦ分析測定値を示す。ＣＳＦ中のＣＨＩＴ−１レベルの有意な減少が、ＭＳＣ−ＮＴＦ処置患者では見られたが（ＭＳＣ−ＮＴＦ処置：図２４Ｅ）、プラセボ群では有意な変化は見られなかった（プラセボ処置：図２４Ｆ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２４Ｆ】移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）の炎症性バイオマーカーのＣＳＦ分析測定値を示す。ＣＳＦ中のＣＨＩＴ−１レベルの有意な減少が、ＭＳＣ−ＮＴＦ処置患者では見られたが（ＭＳＣ−ＮＴＦ処置：図２４Ｅ）、プラセボ群では有意な変化は見られなかった（プラセボ処置：図２４Ｆ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２４Ｇ】炎症性マーカＣＲＰの調節について分析した（ＭＳＣ−ＮＴＦ処置：図２４Ｇ、プラセボ処置：図２４Ｈ）。
【図２４Ｈ】炎症性マーカＣＲＰの調節について分析した（ＭＳＣ−ＮＴＦ処置：図２４Ｇ、プラセボ処置：図２４Ｈ）。
【図２４Ｉ】炎症性マーカＭＩＰ−１βの調節について分析した（ＭＳＣ−ＮＴＦ処置：図２４Ｉ、プラセボ処置：図２４Ｊ）。
【図２４Ｊ】炎症性マーカＭＩＰ−１βの調節について分析した（ＭＳＣ−ＮＴＦ処置：図２４Ｉ、プラセボ処置：図２４Ｊ）。
【図２５Ａ】ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞処置患者後のＣＳＦ中のＶＥＧＦの増加とＭＣＰ−１の減少との間の相関。移植２週後の来院６において、ＭＳＣ−ＮＴＦ処置患者ではＣＳＦ中のＶＥＧＦの増加とＭＣＰ−１の減少との間の有意な相関が見られたが（図２５Ａ）、プラセボ群では有意な変化は見られなかった（図２５Ｂ）。治療処置前（Ｖ５）には、ＶＥＧＦレベルとＭＣＰ−１レベルとの間に相関は見られなかった。
【図２５Ｂ】ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞処置患者後のＣＳＦ中のＶＥＧＦの増加とＭＣＰ−１の減少との間の相関。移植２週後の来院６において、ＭＳＣ−ＮＴＦ処置患者ではＣＳＦ中のＶＥＧＦの増加とＭＣＰ−１の減少との間の有意な相関が見られたが（図２５Ａ）、プラセボ群では有意な変化は見られなかった（図２５Ｂ）。治療処置前（Ｖ５）には、ＶＥＧＦレベルとＭＣＰ−１レベルとの間に相関は見られなかった。
【図２６Ａ】ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配の平均変化の経時的結果を示す。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞群（黒色）及びプラセボ群（灰色）についての治療処置１２週前の勾配（−１２ｗｋｓ）の最小二乗平均、並びに、総母集団（図２６Ａ）及び緩徐進行者を除外した場合（緩徐進行者は、スクリーニング及びベースライン間での治療処置前ＡＬＳＦＲＳ−Ｒの変化が−２以上の参加者と定義される）（図２６Ｂ）の治療処置後の各時点での平均変化。治療処置群とプラセボ群との間の差は、移植２週後及び移植４週後の時点で統計的に有意であった（それぞれ、ｐ＝０．０２１、０．０３３、ｐ＜０．０５については＊で示す）。
【図２６Ｂ】ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配の平均変化の経時的結果を示す。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞群（黒色）及びプラセボ群（灰色）についての治療処置１２週前の勾配（−１２ｗｋｓ）の最小二乗平均、並びに、総母集団（図２６Ａ）及び緩徐進行者を除外した場合（緩徐進行者は、スクリーニング及びベースライン間での治療処置前ＡＬＳＦＲＳ−Ｒの変化が−２以上の参加者と定義される）（図２６Ｂ）の治療処置後の各時点での平均変化。治療処置群とプラセボ群との間の差は、移植２週後及び移植４週後の時点で統計的に有意であった（それぞれ、ｐ＝０．０２１、０．０３３、ｐ＜０．０５については＊で示す）。
【図２６Ｃ】緩徐進行者（Ｖ１［スクリーニング］からＶ５［ベースライン］への変化が−２ポイント以上の参加者）を除外した、週ごとのＡＬＳＦＲＳ−ＲスコアにおけるベースラインからのＬＳ平均変化を示す。略語：ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ＝ＡＬＳ機能評価尺度改訂版。ｗｋｓ＝週。治療処置群とプラセボ群との間の差は、移植２週後、移植４週後、及び移植１６週後の時点で統計的に有意であった（それぞれ、ｐ＝０．０２４８、０．１０３１、０．１４９３、ｐ＜０．０５については＊で示し、両側検定のｐ＜０．２については＋で示す）。
【図２６Ｄ】緩徐進行者（Ｖ１［スクリーニング］からＶ５［ベースライン］への変化が−２ポイント以上の参加者）を除外した、週ごとのＡＬＳＦＲＳ−Ｒスコアの変化を示す。略語：ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ＝ＡＬＳ機能評価尺度改訂版。グラフ上の線プロットは、ベースラインから各時点への変化を意味する。各時点のバーは、平均値の標準誤差（ＳＥ）を表す。治療処置群とプラセボ群との間の差は、移植２週後、移植４週後、及び移植１６週後の時点で統計的に有意であった（それぞれ、ｐ＝０．０２４８、０．１０３１、０．１４９３、ｐ＜０．０５については＊で示し、両側検定のｐ＜０．２については＋で示す）。
【図２７Ａ】レスポンダー分析：治療処置後の追跡調査期間にわたって、ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配が１．５ポイント以上改善した。各時点での、治療処置群（ＭＳＣ−ＮＴＦ）及びプラセボ群の総母集団における、ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配が治療処置前期間の１２週間での治療処置前勾配と比較して１．５ポイント以上改善した参加者の割合。
【図２７Ｂ】緩徐進行者（スクリーニングとベースラインとの間で治療処置前ＡＬＳＦＲＳ−Ｒの変化が−２以上の参加者と定義される）を除外した場合。
【図２７Ｃ】１００％以上改善したレスポンダー定義に対するＳＶＣ（静的肺活量）スコアの変化を示す。
【図２８Ａ】レスポンダー分析：治療処置後の追跡調査期間にわたって、ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配が１００％改善した。各時点での、治療処置群（ＭＳＣ−ＮＴＦ）及びプラセボ群の総母集団における、ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配が治療処置前期間の１２週間での治療処置前勾配と比較して１００％以上改善した参加者の割合（図２８Ａ）。
【図２８Ｂ】緩徐進行者（スクリーニングとベースラインとの間で治療処置前ＡＬＳＦＲＳ−Ｒの変化が−２以上の参加者と定義される）を除外した場合。緩徐進行者を除くと、治療処置群とプラセボ群との間の差は、移植２週後及び移植４週後の時点で統計的に有意であった（それぞれ、ｐ＝０．００５、０．０３１、ｐ＜０．０５については＊で示す）。
【図２９Ａ】治療処置２週後（来院６、図２９Ｂ）でのＣＳＦ中のＭＣＰ−１と、治療処置１２週後での緩徐疾患進行との間には有意な相関が見られたが、プラセボ群では有意な変化は見られなかった（図２９Ａ）。
【図２９Ｂ】治療処置２週後（来院６、図２９Ｂ）でのＣＳＦ中のＭＣＰ−１と、治療処置１２週後での緩徐疾患進行との間には有意な相関が見られたが、プラセボ群では有意な変化は見られなかった（図２９Ａ）。
【図３０Ａ】レスポンダー患者（ｎ＝６）、ノンレスポンダー患者（ｎ＝９）及びプラセボ患者（ｎ＝６）からプールしたＣＳＦを、移植前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）にサンプリングし、特定のｍｉＲＮＡを測定した。図３０Ａでは、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐについて測定した。
【図３０Ｂ】ｍｉＲ−３７６ａ−３ｐについて測定した。
【図３０Ｃ】ｍｉＲ−１９ｂについて測定した。
【図３０Ｄ】ｍｉＲ−１３２について測定した。
【図３０Ｅ】ｍｉＲ−１４６ａについて測定した。
【図３０Ｆ】ｍｉＲ−９−５ｐについて測定した。
【図３０Ｇ】ｍｉＲ−１２６−３ｐについて測定した。
【図３１】ＭＳＣ−ＮＴＦ処置患者のＣＳＦ中のグルタミン酸レベルの、対照と比較した有意な増加を示す棒グラフである。
【図３２】ＭＳＣ−ＮＴＦ処置後のＣＳＦ中のグルタミン酸レベルの変化対ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配の変化を示す表である。
【図３３】来院５（治療処置前）でのＡＬＳＦＲＳ−ＲスコアとＣＳＦ中のＣＨＩＴ−１レベルとの間の逆相関を示す。ＡＬＳＦＲＳ−ＲスコアとＣＳＦ中のＣＨＩＴレベルとの間の相関は、統計的に有意であった（ｐ＜０．００１）。
【図３４】ＡＬＳ疾患進行とＣＳＦ中のＣＨＩＴ−１レベルとの間の逆相関を示す。ＡＬＳ疾患進行は、治療３ヶ月前のＡＬＳＦＲＳ−Ｒスコアの勾配によって決定される。緩徐疾患進行（正またはわずかに負の勾配）は、低レベルのＣＨＩＴ−１と相関する（ｐ＜０．０５）。
【図３５】ＳＶＦによって決定されるＡＬＳ疾患進行と、ＣＳＦ中のＣＨＩＴ−１レベルとの間の逆相関を示す。ＡＬＳ疾患進行は、治療処置３ヶ月間前のＳＶＣの勾配（予測％）によって決定される。緩徐疾患進行（正またはわずかに負の勾配）は、低レベルのＣＨＩＴ−１と相関する（ｐ＜０．００５）。
【図３６】ＡＤ−ＭＳＣ及びＡＤ−ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞におけるＣＤ４４及びＣＤ７３の発現を示す。左側パネル：ＣＤ４４；黒色のヒストグラムはＡＤ−ＭＳＣを表し、緑色のヒストグラムはＡＤ−ＭＳＣ−ＮＴＦを表す。右側パネル：ＣＤ７３；黒色のヒストグラムはＡＤ−ＭＳＣを表し、赤色のヒストグラムはＡＤ−ＭＳＣ−ＮＴＦを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患の治療に使用される間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びその集団を提供する。具体的には、本開示は、神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌することができる分化間葉系幹細胞を投与することによって、例えばＡＬＳなどの神経変性疾患を治療する方法を提供する。
【００３０】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びその組成物
【００３１】
「間葉系幹細胞」、「間葉系間質細胞」、「多能性間質細胞」、または「ＭＳＣ」という用語は、幹細胞を生成するために分裂するか、間葉系幹細胞を生成するために不可逆的に分化するか、または、神経系統などの他の非中胚葉系譜の細胞に分化形質転換することができる、最終分化していない成体細胞について互換的に使用される。一実施形態では、ＭＳＣは、自己由来細胞を含む。別の実施形態では、ＭＳＣは、同種異系細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、非間葉系系統細胞に分化転換される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、間葉系細胞に分化する。
【００３２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、ほぼ全ての組織に見られ、様々な組織から単離され得る。骨髄（ＢＭ）がＭＳＣの最も広く認識されている供給源であるが、最近の研究により、脂肪組織（ＡＴ）、胎盤、歯髄、滑膜、末梢血、歯周靭帯、子宮内膜、臍帯（ＵＣ）、及び臍帯血（ＵＣＢ）を含むＭＳＣ様細胞の別の供給源が識別された。実際、ＭＳＣが全身の血管組織中に実質的に存在する可能性があるという証拠が示唆されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＭＳＣは、それらが存在する任意の組織から単離された。いくつかの実施形態では、ＭＳＣが単離され得る組織には、これに限定しないが、骨髄、脂肪組織、胎盤、歯髄、滑膜、末梢血、歯周靭帯、子宮内膜、臍帯、及び臍帯血が含まれる。
【００３３】
間葉系幹細胞を末梢血から単離する方法は、Ｋａｓｓｉｓらによる「Bone Marrow Transplant. 2006 May; 37(10):967-76」に記載されている。間葉系幹細胞を胎盤組織から単離する方法は、Ｚｈａｎｇらによる「Chinese Medical Journal, 2004, 117 (6):882-887」に記載されている。脂肪組織、胎盤、及び臍帯血間葉系幹細胞を単離及び培養する方法は、Ｋｅｒｎｖらによる「Stem Cells, 2006; 24:1294-1301」に記載されている。いくつかの実施形態では、当分野において既知の任意の方法が、間葉系幹細胞を組織から単離するために使用され得る。
【００３４】
本明細書に記載されたＭＳＣは、任意の幹細胞に由来し得ることは理解できるであろう。一実施形態では、ＭＳＣ細胞は、骨髄ＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、脂肪細胞ＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、歯髄間葉系幹細胞を含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、腱から取得された間葉系幹細胞を含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、胎盤から取得された間葉系幹細胞を含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、臍帯から取得された間葉系幹細胞を含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、脂肪組織から取得された間葉系幹細胞を含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、滑膜から取得された間葉系幹細胞を含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、末梢血から取得された間葉系幹細胞を含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、歯周靱帯から取得された間葉系幹細胞を含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、子宮内膜から取得された間葉系幹細胞を含む。他の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、臍帯血から取得された間葉系幹細胞を含む。別の実施形態では、ＭＳＣは、胚性幹（ＥＳ）細胞に由来しない。別の実施形態では、ＭＳＣは、成体幹細胞を含む。
【００３５】
一実施形態によれば、間葉系幹細胞は、ヒト由来である。一実施形態では、間葉系幹細胞は、対象に対して自己由来である。別の実施形態では、間葉系幹細胞は、対象に対して非自己由来である。別の実施形態では、間葉系幹細胞は、対象に対して同種異系である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、遺伝的に改変されない。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、ヒト細胞である。一実施形態では、骨髄は、吸引によって個体の腸骨稜から単離することができる。低密度ＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣ）は、例えば、ＦＩＣＯＬ−ＰＡＱＵＥ密度勾配遠心分離によって分離することができる。間葉系幹細胞を得るために、間葉系幹細胞（例えばＢＭＭＮＣ）を含む細胞集団が、例えば血小板溶解物の存在下で細胞を維持及び／または増殖させることができる増殖培地中で培養され得る。一実施形態によれば、細胞集団は、ポリスチレンプラスチック表面（例えば組織培養フラスコ中）上に載置され、間葉系幹細胞は非接着細胞を除去することによって単離される。あるいは、間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞マーカーを使用して、ＦＡＣＳによって単離され得る。
【００３７】
単離後、細胞は一般的に、例えば血小板溶解物の存在下でエクスビボ単離された細胞を維持及び／または増殖させることができる増殖培地中で培養することにより増殖させられる。増殖培地には、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２が含まれ得る。
【００３８】
一実施形態では、間葉系幹細胞がヒト由来の場合、血小板溶解物もヒト細胞から取得される。一実施形態によれば、培地は、ゼノ混入物（xeno contaminant）を含まない、すなわち動物由来成分を含まない。間葉系幹細胞の単離及び増殖プロトコルの実施形態は、実施例１に提示されている。
【００３９】
単離された（及び任意選択で増殖させられた）細胞集団が間葉系幹細胞を含むことの検証は、表現型及び機能的基準の同定によって達成され得る。表現型の基準は、特定の表面抗原の発現：ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５（９５％以上陽性）と、ＣＤ−３（Ｔ細胞表面マーカー）、ＣＤ１４（単球表面マーカー）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ３４（造血幹細胞）、ＣＤ４５（造血細胞）、及びＨＬＡ−ＤＲ（ヒトクラスＩＩ組織適合性抗原）の非存在（＜２％）とを含み得る。これらの細胞の表面発現は、当分野において既知の方法を使用して、例えばフローサイトメトリーによって分析することができる。
【００４０】
間葉系幹細胞の存在を確認するために使用され得る抗体の例としては、これに限定しないが、例えば、ＣＤ７３  ＰＥコンジュゲート抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ９０  ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１０５  ＰＥコンジュゲート抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＣＤ１４  ＦＩＴＣコンジュゲート抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１９  ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３４  ＦＩＴＣコンジュゲート抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ４５  ＰＥコンジュゲート抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＨＬＡ−ＤＲ  ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が挙げられる。
【００４１】
間葉系幹細胞の存在を確認するための別の方法は、細胞が、例えば脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞などの多系統に分化できることを示すことである。これは、例えば、ヒト間葉系幹細胞機能同定キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施することができる。
【００４２】
本明細書中に記載されるように、血小板溶解物含有培地中で間葉系幹細胞を増殖させた後に、間葉系幹細胞を分化培地中で分化させることにより、神経変性疾患を治療するのに有用な細胞を生成することができる。
【００４３】
分化培地及びその成分は当分野では公知である。分化培地の成分は必要とされる細胞表現型に従って選択されることは、理解されるであろう。
【００４４】
いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）細胞は少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導され、上記の細胞集団はＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「神経栄養因子（ＮＴＦ）」なる用語は、ニューロンの増殖（成長）、分化、機能維持、及び／または生存効果を含む脳神経系に作用する細胞因子を指す。神経栄養因子の例としては、これに限定しないが、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５、ニュールツリン（ＮＴＮ）、ニューロトロフィン−４、パーセフィン、アルテミン（ＡＲＴ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、増殖分化因子（ＧＤＦ−１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、及びニューブラスチン（Neublastin）が挙げられる。
【００４６】
一実施形態では、ＮＴＦは、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５、ニュールツリン（ＮＴＮ）、ニューロトロフィン−４、パーセフィン、アルテミン（ＡＲＴ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、増殖分化因子（ＧＤＦ−１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、ニューブラスチン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００４７】
別の実施形態では、ＮＴＦは、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、ニューロトロフィン−４／５である。別の実施形態では、ＮＴＦは、ニュールツリン（ＮＴＮ）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、ニューロトロフィン−４である。別の実施形態では、ＮＴＦは、パーセフィンである。別の実施形態では、ＮＴＦは、アルテミン（ＡＲＴ）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、増殖分化因子（ＧＤＦ−１５）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）である。別の実施形態では、ＮＴＦは、ニューブラスチンである。
【００４８】
別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも１つのＮＦＴを分泌し、分泌されるＮＦＴは、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５、ニュールツリン（ＮＴＮ）、ニューロトロフィン−４、パーセフィン、アルテミン（ＡＲＴ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、増殖分化因子（ＧＤＦ−１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、ニューブラスチン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００４９】
別の実施形態では、ＮＴＦは、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、ニューロトロフィン−４／５を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、ニュールツリン（ＮＴＮ）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、ニューロトロフィン−４を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、パーセフィンを分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、アルテミン（ＡＲＴ）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、増殖分化因子（ＧＤＦ−１５）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を分泌する。別の実施形態では、ＮＴＦは、ニューブラスチンを分泌する。
【００５０】
別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも２つのＮＦＴを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも３つのＮＦＴを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも４つのＮＦＴを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも５つのＮＦＴを分泌する。
【００５１】
ヒト間葉系幹細胞を分泌する神経栄養因子は当分野で公知であり、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０２４１８３号、同第２０１５／１２１８５９号、「Gothelf et al., 2014, Clin Transl Med., vol. 3, page 21」、「Petrou et al. 2014; Muscle & Nerve. 49(3):455-457」、「Petrou et al., 2016 JAMA Neurol. Jan 11:1-8」に詳しく記載されている（これらの内容の全体は、参照により本明細書中に援用される）。
【００５２】
一実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのＮＴＦを分泌する。
【００５３】
別の実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）からなる群より選択される少なくとも１つのＮＴＦを分泌する。別の実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）からなる群より選択されるＮＴＦを分泌する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の集団のうちの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上が、少なくとも１つのＮＴＦを発現する。いくつかの実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の集団のうちの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上が、少なくとも１つのＮＴＦを分泌する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子を発現する。いくつかの実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子を発現及び分泌する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたｍｉＲＮＡ分子は、生体試料中に存在する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞における少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子の発現は、対照ＭＳＣにおいて観察されるものよりも大きい。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦが投与された対象から取得された生体試料、例えばＣＳＦ生体試料中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子の濃度は、同等の対照生体試料中で観察されるものよりも高い。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、例えばエキソソームによって、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から分泌され得る。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞からの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子の発現及び／または分泌は、対照ＭＳＣで観察されるものよりも大きい。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、対照ＭＳＣと比較して、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現が減少するかまたは発現をしない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、対照ＭＳＣと比較して、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの分泌が減少するかまたは分泌をしない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、対照ＭＳＣと比較して、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現または分泌が減少するか、あるいは発現または分泌をしない。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、他の細胞において少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子の発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、他の細胞において少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子を誘導することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、他の細胞において少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子の発現を誘導することができる。細胞が近くの細胞の変化を誘導するシグナルを生成して近くの細胞の挙動を変化させる細胞間コミュニケーションは、いくつかの実施形態では、パラクリン応答と呼ばれる。
【００５９】
「ｍｉＲＮＡ」、「ｍｉＲ」、及び「マイクロＲＮＡ」という用語は、全て同じ意味及び性質を有し、短い非コードＲＮＡを包含し、互換的に使用され得ることは、当業者には理解できるであろう。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、約２１〜２５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、約２１〜２４個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子の翻訳を抑制するか、または標的ｍＲＮＡを切断してそれらの分解を誘導することによって、細胞遺伝子発現の調節において重要な役割を果たし得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、パラクリンシグナル伝達メディエータとして機能し得る。
【００６０】
ｍｉＲＮＡの例としては、これに限定しないが、例えば、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−３７６−３ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、及びｍｉＲ−５７７が挙げられる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−３７６ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、及びｍｉＲ−１４６ａからなるからなる群より選択された少なくとも１つのｍｉＲＮＡを発現する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞における発現は、ＭＳＣと比較して増加する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦで治療された対象から取得された生体試料（これに限定しないが、例えばＣＳＦ試料）中のｍｉＲＮＡの濃度は、未処理（プラセボ）対象または治療前の対象から取得した対照生体試料と比較して増加する。濃度が増加したｍｉＲＮＡの例としては、これに限定しないが、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３４ａを発現する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１３２を発現する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３７６ａ−３ｐを発現する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１９ｂを発現する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１４６ａを発現する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−３７６ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、及びｍｉＲ−１４６ａからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを発現する。いくつかの実施形態では、分泌は、ＭＳＣと比較して増加する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された対象から取得された生体試料中での、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−３７６ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、及びｍｉＲ−１４６ａからなる群より選択されるｍｉＲＮＡの濃度は、対照生体試料と比較して増加する。濃度が増加したｍｉＲＮＡの例としては、これに限定しないが、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−３７６−３ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ、及びｍｉＲ−１４６ａが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３４ａを分泌する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１３２を分泌する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３７６ａを分泌する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１９ｂを分泌する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１４６ａを分泌する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された対象から取得された生体試料中でのｍｉＲ−３４ａの濃度は、対照試料と比較して増加する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された対象から取得された生体試料中でのｍｉＲ−１３２の濃度は、対照試料と比較して増加する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された対象から取得された生体試料中でのｍｉＲ−３７６ａの濃度は、対照試料と比較して増加する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された対象から取得された生体試料中でのｍｉＲ−１９ｂの濃度は、対照試料と比較して増加する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された対象から取得された生体試料中でのｍｉＲ−１４６ａの濃度は、対照試料と比較して増加する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを発現しないか、または発現が低い。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１２６を発現しないか、または発現が低い。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−９を発現しないか、または発現が低い。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１２６を発現しないか、または発現が低い。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１５５を発現しないか、または発現が低い。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−５７７を発現しないか、または発現が低い。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＡＬＳ患者の運動ニューロンにおいて全体的に下方制御されている。
【００６５】
一実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも１つの間葉系幹細胞マーカーを発現する間葉系幹細胞からエクスビボで分化される。
【００６６】
一実施形態では、本明細書に記載された間葉系幹細胞は、本明細書に記載された分化細胞及び細胞集団を生成するために遺伝子操作されていない（すなわち、発現構築体で形質転換されていない）。
【００６７】
別の実施形態では、少なくとも１つの間葉系幹細胞表現型を含み、かつ少なくとも１つのＮＴＦ（例えば、ＶＥＧＦ、ＧＤＮＦ、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＴＧＳ−６、ＢＭＰ２、ＦＧＦ２、ニューロブラスチン（neuroblastin）、ＨＧＦ、またはそれらの任意の組み合わせ）を分泌するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む単離されたヒト細胞は、非分化間葉系幹細胞におけるＮＴＦの基礎分泌よりも大きいＮＴＦの基礎分泌を含む。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、そのインビボ位置（例えば、これに限定しないが、骨髄、神経組織、脂肪組織、歯髄、胎盤、滑膜、末梢血、歯周組織、靭帯、子宮内膜、及び臍帯血を含む）から取り出された細胞を指す。一実施形態では、単離された細胞は、そのインビボ位置に存在する他の物質（例えば他の細胞型）を実質的に含まない。
【００６９】
本明細書に記載された細胞に含まれる間葉系幹細胞表現型は、通常は構造的である。例えば、本明細書に記載された細胞は、間葉系幹細胞の形態と同様の形態（紡錘状の形態）を示し得る。その代わりにまたはそれに加えて、本明細書に記載された細胞は、間葉系幹細胞には典型的であるが天然星状細胞には非定型のマーカー（例えば表面マーカー）を発現し得る。間葉系幹細胞表面マーカーの例としては、これに限定しないが、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、及びＦＭＣ７が挙げられる。他の間葉系幹細胞マーカーとしては、これに限定しないが、チロシンヒドロキシラーゼ、ネスチン、及びＨ−ＮＦが挙げられる。
【００７０】
本明細書中で使用されるとき、「基礎分泌」という用語は、刺激剤の添加を伴わない分泌をいう。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、本明細書に記載された方法を用いて未分化ＭＳＣから産生され得る。したがって、一般的に、未分化間葉系幹細胞はＭＳＣ−ＮＴＦ細胞と同一の培地中に存在するが、分化剤は添加されない。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、いくつかの実施形態では、「発現する」という用語は、本明細書で記載されたような神経栄養因子の合成及び／または分泌を包含し得る。いくつかの実施形態では、「発現する」という用語は、本明細書に記載されたｍｉＲＮＡの合成及び／または分泌を包含し得る。
【００７２】
ＶＥＧＦ
【００７３】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、内皮細胞増殖及び血管新生を誘導する。神経再生に関する研究により、ＶＥＧＦの神経栄養性の性質が観察された。ＡＬＳの動物モデルにおいて、ＶＥＧＦ治療は、疾患発症の遅延、運動機能の改善、ＭＮ及び神経筋接合部の保護、並びに生存期間の延長をもたらす。
【００７４】
ＨＧＦ
【００７５】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、肝臓に作用する増殖因子を含み、該増殖因子は、エンドトキシン誘発性肝不全の後に肝臓において抗アポトーシス活性を発揮する。ＨＧＦは、軸索切断後の培養中及びインビボでのＭＮに対する保護効果を有することに加えて、ＭＮ変性を減少させ、ＡＬＳのげっ歯類モデルにおける生存率を増加させることが分かっている。
【００７６】
とりわけ、ＡＬＳ患者におけるＨＧＦ濃度は調節不全であるように思われるので、ＨＧＦは、ＡＬＳの治療のための良好な候補だと思われる。
【００７７】
ＬＩＦ
【００７８】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、サイトカインのインターロイキン−６ファミリーのメンバーであり、異なる細胞型に対して異なる効果を発揮する多機能性サイトカインである。ＬＩＦは、インビトロでのＭＮの生存を支援すること、及び神経損傷後のＭＮ損失を減少させることが分かっている。加えて、ＬＩＦが神経筋接続性の制御に関与することが実証されている。ＬＩＦはまた、乏突起膠細胞前駆体の増殖を促進し、軸索再ミエリン化を増強することによって、乏突起膠細胞（オリゴデンドロサイト）の機能を支援する。
【００７９】
ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ
【００８０】
ｍｉＲ−３４ａ−５ｐは、ｐ５３によって活性化される腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐは、神経突起成長及び脊椎形態を調節する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐは、発症前のハンチントン病（ＨＤ）遺伝子キャリアの血漿において上方制御される。
【００８１】
ｍｉＲ−１３２
【００８２】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１３２は、ＶＥＧＦに応答して血管新生を能動的に制御する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１３２は、炎症の負の調節因子である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１３２は、ニューロンが豊富であり、インビトロ及びインビボでニューロン成長を促進する。いくつかの実施形態では、細胞質ＴＤＰ−４３は、ｍｉＲ−１３２−３ｐの生合成を妨げる。
【００８３】
ｍｉＲ−３７６ａ
【００８４】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−３７６ａは、ニューロンが豊富であり、ニューロンの分化を促進する。
【００８５】
ｍｉＲ−１９ｂ
【００８６】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１９ｂは、抗アポトーシス活性及び増殖促進活性を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１９ｂは、ＳＯＤ１マウスの運動皮質及び脳幹運動核において下方制御される。
【００８７】
ｍｉＲ−１４６ａ
【００８８】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４６ａは、炎症反応の抑制を媒介する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４６ａは、ＭＣＰ−１の濃度を減少させる。
【００８９】
ｍｉＲ−１２６
【００９０】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２６は、主に内皮ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２６は、運動ニューロンにおいて発現される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２６は、炎症反応を増強させる。
【００９１】
ｍｉＲ−９
【００９２】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−９は、発生期及び成体脳において最も高度に発現されているマイクロＲＮＡの１つである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−９は、神経発生の重要な調節因子である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−９は、ニューロフィラメントライト（ＮＦＬ）発現を抑制すること、及びミクログリア活性化に関与することが分かっている。
【００９３】
炎症性因子、プロアポトーシス因子、または、炎症性因子に影響を与える因子
【００９４】
累積証拠は、異常な免疫応答及び炎症が、ＡＬＳの発症及び疾患進行の過程に関与していることを示している。これらの見解は、ミクログリア活性化、反応性アストロサイトの数の増加、マクロファージ及びＴリンパ球の浸潤を含む。ＡＬＳにおける免疫応答の本質は完全には理解されていないが、現在の見解では、ＡＬＣ疾患の初期段階において神経保護効果を付与し、ＡＬＳ進行中に神経毒性効果に変化すると考えられている。
【００９５】
ＣＲＰ
【００９６】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、その血清中での増加の程度が高いこと及び炎症状態との相関に起因して、炎症マーカーとして広く使用されている肝臓産生タンパク質である。加えて、ＣＳＦ中のＣＲＰ濃度は、ＣＮＳ中の炎症（例えば、細菌性髄膜炎）を同定するために使用できることが報告されている。さらに、ＣＲＰ濃度は、多くのＡＬＳ患者のＣＳＦ中で上昇することが分かっている。
【００９７】
ＭＣＰ−１
【００９８】
単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１／ＣＣＬ２）は、炎症に応答した単球／マクロファージ浸潤及び遊走の調節に関与する主要なケモカインの１つである。ＭＣＰ１発現がＡＬＳ患者の脊髄の死後試料において上方制御されることが、過去に報告されている。また、ＡＬＳ患者のＣＳＦ中でのＭＣＰ１濃度の上昇が、いくつかの研究で観察されている。
【００９９】
ＳＤＦ−１
【０１００】
間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１／ＣＸＣＬ１２）は、その受容体ＣＸＣＲ４への結合を介して異なる細胞型の動員に関与するケモカインである。ＳＤＦ１及びＣＸＣＲ４の両方が、ＣＮＳにおいて発現し、神経伝達及びニューロン−グリア相互作用を調節することが知られている。通常、ＳＤＦ１は、アストロサイトからのグルタミン酸放出を調節します。しかしながら、ＳＤＦ１発現の上方制御は、グルタミン酸放出の増加をもたらし、それにより、神経毒性及びアポトーシスをもたらし得る。ＳＤＦ１濃度の減少は、グルタミン酸の減少、並びに神経毒性及びアポトーシスの減少をもたらすであろう。近年、ＣＸＣＲ４アンタゴニストの投与によって、ＡＬＳマウスモデルの寿命が延び、運動機能が改善し、脊髄における炎症誘発性サイトカインが減少することが分かった。
【０１０１】
興味深いことに、ＧＬＡＳＴは、細胞外空間からグルタミン酸を除去するトランスポータである。実施例２に提示された結果はＧＬＡＳＴ分泌の増加を示し、これは、ＭＳＣ細胞培養上清と比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞培養上清中のグルタミン酸が減少したことを説明する。一実施形態では、ＳＤＦ−１の分泌はＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において減少し、ＧＬＡＳＴの分泌はＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において増加する。
【０１０２】
ＣＨＩＴ
【０１０３】
キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）は、慢性的に活性化された組織マクロファージ及びミクログリアにおいて発現される分泌酵素である。過去の研究では、ＣＨＩＴはＡＬＳ患者の血液試料及びＣＳＦの両方において上方制御されていたので、ＣＨＩＴはＡＬＳ進行の潜在的なバイオマーカーとして示唆されていた。さらに、血中ＣＨＩＴ濃度は、ゆっくり進行する患者よりも急速に進行するＡＬＳ患者において有意に高かった。
【０１０４】
カスパーゼ３
【０１０５】
カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）は、アポトーシスの実行における重要なメディエータの１つである。ＡＬＳマウスモデルにおいて、カスパーゼ３は、運動ニューロンの死に関与することが分かっている。さらに、カスパーゼ３の上方制御を阻害するカスパーゼ阻害剤を投与することにより、ＡＬＳマウスモデルにおける疾患の発症も遅延及び死亡率の低下をもたらすことができる。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書に記載されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、神経成長因子（ＮＧＦ）を分泌しない。
【０１０７】
「生物学的とマーカー」の混成語である「バイオマーカー」という用語が、医学的徴候の広いサブカテゴリ、すなわち患者の外部から観察される医学的状態の客観的な指標（これは、正確かつ再現可能に測定することができる）を包含することは、当業者には理解できるであろう。１９９８年に、国立衛生研究所バイオマーカー定義ワーキンググループは、バイオマーカーを、「通常の生物学的プロセス、発症プロセス、または治療的介入に対する薬理学的反応の指標として客観的に測定及び評価される特性」と定義した。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、対象の神経変性疾患の指標として使用され得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、神経変性疾患の進行を追跡するのに使用され得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、神経変性疾患を診断するのに使用され得る。いくつかの実施形態では、複数のバイオマーカーが、対象の神経変性疾患の指標として使用される。いくつかの実施形態では、複数のバイオマーカーが、神経変性疾患の進行を追跡するのに使用される。いくつかの実施形態では、複数のバイオマーカーが、神経変性疾患を診断するのに使用される。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、対象におけるＡＬＳの指標として使用され得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＡＬＳの進行を追跡するのに使用され得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＡＬＳを診断するのに使用され得る。いくつかの実施形態では、複数のバイオマーカーが、対象におけるＡＬＳの指標として使用される。いくつかの実施形態では、複数のバイオマーカーが、ＡＬＳの進行を追跡するのに使用される。いくつかの実施形態では、複数のバイオマーカーが、ＡＬＳを診断するのに使用される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＡＬＳの指標であるバイオマーカーは、向神経性因子、炎症性因子、アポトーシス促進因子、炎症性因子に影響を与える因子、ｍｉＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡＬＳの進行を追跡するのに使用されるバイオマーカーは、向神経性因子、炎症性因子、アポトーシス促進因子、炎症性因子に影響を与える因子、ｍｉＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡＬＳを診断するのに使用されるバイオマーカーは、向神経性因子、炎症性因子、アポトーシス促進因子、炎症性因子に影響を与える因子、ｍｉＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１ｂ、グルタミン酸、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−３７６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５７７、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ＡＬＳ治療効力の指標として使用されるバイオマーカーは、治療された対象から取得された生体試料において、その発現が対照生体試料と比較して変化している遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＬＳ治療効果の指標として使用されるバイオマーカーは、ＴＯＰ２Ａ、ＲＡＢ２７ｂ、ＷＮＴ５Ａ、ＳＮＡＰ２５、ＡＲＥＧ、ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ６、ＭＥＳＴ、ＳＬＣ１Ａ３、ＰＣＳＫ１、ＴＵＢＢ３、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、治療された対象から取得された生体試料において、対照生体試料と比較して、少なくとも１つのバイオマーカーの分泌は増加し、少なくとも１つの他のバイオマーカーの分泌は減少する。
【０１１４】
本明細書に記載の方法に従って得られた細胞集団が一般的に不均質であることは、理解できるであろう。
【０１１５】
したがって、本明細書に記載された別の実施形態によれば、ヒト細胞を含む単離された細胞集団であって、（ｉ）ヒト細胞の少なくともＮ％が、本明細書に記載されたような神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、ＦＧＦ２、もしくはＧ−ＣＳＦ、またはそれらの任意の組み合わせ）を分泌し、その神経栄養因子の基礎分泌が、未分化間葉系幹細胞における同じ神経栄養因子の基礎分泌よりも多く、（ｉｉ）ヒト細胞の少なくともＭ％が、少なくとも１つの間葉系幹細胞表現型を含み、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヒト細胞が、神経栄養因子及び少なくとも１つの間葉系幹細胞表現型を分泌し、かつ、Ｍ及びＮが各々、１から９９の間で選択される細胞集団が提供される。
【０１１６】
Ｍは、１％から９９％までの任意のパーセンテージ、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり得る。
【０１１７】
Ｎは、１％から９９％までの任意のパーセンテージ、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり得る。
【０１１８】
神経栄養因子を分泌する細胞のパーセンテージは、意図されたニーズに応じて増加または減少され得る。
【０１１９】
分化され、任意選択で単離された後、本明細書に記載されたようにして、細胞は、神経栄養因子を分泌する能力について（培養中に）試験される。神経栄養因子の分泌を分析する方法（本明細書に記載された方法を含む）が当分野で既知であることは、当業者には理解できるであろう。
【０１２０】
一実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイが、分泌されたＮＴＦの検出に使用され得る。分泌されたＮＴＦの分析のために、本明細書中に記載された分化手順の終わりにＭＳＣまたはＮＴＦ分泌細胞の培養物から上清を収集し、細胞を採取しカウントする。例えば、細胞の培養上清中のＮＴＦの量は、製造業者のプロトコルに従ってＥＬＩＳＡアッセイを使用することにより定量することができる。上記のＮＴＦには、例えば、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＧＤＦ−１５、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）などが含まれる。
【０１２１】
一実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の使用方法は、対象の生体試料中の神経栄養因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＧＧＦ−ＣＳＦ、ＢＭＰ２、ＦＧＦ２）の濃度を、対照生体試料と比較して増加させる。別の実施形態では、生体試料は、脳脊髄液である。別の実施形態では、生体試料は、血液または血清である。別の実施形態では、生体試料は、尿である。
【０１２２】
一実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の使用方法は、対象の生体試料中の炎症性因子、アポトーシス促進性因子、または、炎症性因子に影響を与える因子（例えば、これに限定しないが、ＣＨＩＴ−１、ＣＲＰ、ＭＣＰ１、ＳＤＦ−１、ＭＩＰ−１ｂ、グルタミン酸、ＣＡＳＰ３）の濃度を、対照生体試料と比較して減少させる。別の実施形態では、生体試料は脳脊髄液である。別の実施形態では、生体試料は血液または血清である。別の実施形態では、生体試料は尿である。
【０１２３】
別の実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の使用方法は、対照生体試料と比較して、対象のＣＳＦ中の神経栄養因子の濃度を増加させ、それと同時に、対象のＣＳＦ中の炎症性因子、プロアポトーシス因子、または、炎症性因子に影響を与える因子の濃度を減少させる。別の実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の使用方法は、対照生体試料と比較して、対象の血液または血清中の神経栄養因子の濃度を増加させ、それと同時に、対象の血液または血清中の炎症性因子、プロアポトーシス因子、または、炎症性因子に影響を与える因子の濃度を減少させる。別の実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦの使用方法は、対照生体試料と比較して、対象の尿中の神経栄養因子の濃度を増加させ、それと同時に、対象の尿中の炎症性因子、プロアポトーシス因子、または、炎症性因子に影響を与える因子の濃度を減少させる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本開示の使用方法は、バイオマーカーの発現後に、血液循環中のバイオマーカーの発現が、ＣＳＦ中のバイオマーカーの存在と比較される。上記のバイオマーカーには、これに限定しないが、例えば、ＮＴＦ、ｍｉＲＮＡ、炎症性因子、プロアポトーシス因子、炎症性因子に影響を与える因子、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の使用方法は、バイオマーカーの発現後に、血液循環中のバイオマーカーの存在が、ＣＳＦ中のバイオマーカーの存在と比較される。上記のバイオマーカーには、これに限定しないが、例えば、ＮＴＦ、ｍｉＲＮＡ、炎症性因子、プロアポトーシス因子、炎症性因子に影響を与える因子、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０１２５】
一実施形態では、本開示の方法によって産生されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、投与に適した組成物に組み込まれ得る。そのような組成物は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団と、薬学的に許容される担体とを含み得る。本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などを含むことを意図する。好適な担体は、参照により本明細書中に援用される、この分野の標準的な参考書である「Remington's Pharmaceutical Sciences」の最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の例には、これに限定しないが、水、食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、基礎培地（ＤＭＥＭ）、バイオプリザベーション（biopreservation）培地、及び５％ヒト血清アルブミンが含まれる。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が企図される。また、補助的な活性化合物を組成物に組み入れることができる。
【０１２６】
本開示の組成物は、意図される投与経路に適合するように調製される。投与経路の例には、筋肉内及び髄腔内が含まれる。
【０１２７】
一実施形態では、注射用途に適した組成物は、滅菌水溶液を含む。全ての場合において、組成物は、滅菌されており、かつ注射が容易な程度に流動性を有していなければならない。また、組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定性を有し、かつ細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されている必要がある。
【０１２８】
一実施形態では、組成物は、投与のための使用説明書と共に、容器、バイアル、パック、またはディスペンサー（例えばシリンジ）内に含まれる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、対象の神経変性疾患を治療するのに有効な量（治療有効量）の細胞集団を含み、該細胞集団は、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象の神経変性疾患の治療有効量の細胞集団を含み、該細胞集団は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを発現及び／または分泌するように誘導されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象の神経変性疾患の治療有効量の細胞集団を含み、該細胞集団は、少なくとも１種のｍｉＲＮＡを発現及び分泌するように誘導されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象の神経変性疾患の治療有効量の細胞集団を含み、該細胞集団は、パラクリンシグナル伝達を誘導するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象の神経変性疾患の治療有効量の細胞集団を含み、該細胞集団は、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）、または少なくとも１つのｍｉＲＮＡを発現及び分泌するように誘導されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む。
【０１３２】
「治療有効量」が、所望の治療結果を達成するのに必要な有効量、投与量、及び期間を包含し得ることは、当業者には理解できるであろう。治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、及び体重、並びに、個体において所望の反応を誘発する細胞の能力などの要因によって異なり得る。また、治療有効量は、治療上有益な効果が、細胞の毒性または有害作用を上回るような量である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、神経変性疾患を効果的に治療することができる。本開示の組成物により効果的に治療することができる神経変性疾患には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）；パーキンソン病；多系統萎縮症（ＭＳＡ）；ハンチントン病；アルツハイマー病；レット症候群；リソソーム蓄積症；「白質疾患」またはグリア／脱髄疾患（サンフィリポ症を含む）；ゴーシェ病；テイ・サックス病（ベータ・ヘキソサミニダーゼ欠損症）；多発性硬化症（ＭＳ）；視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、ＮＭＯスペクトラム疾患、虚血、事故、または環境障害に起因する脳損傷または外傷；脳卒中；脳性麻痺（ＣＰ）；自閉症及び自閉症スペクトラム障害；脊髄損傷；運動失調；またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０１３４】
別の実施形態では、本開示の組成物は、本明細書に記載及び例示されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、骨髄間葉系幹細胞の集団を含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、脂肪間葉系幹細胞の集団を含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、歯髄間葉系幹細胞の集団を含む。
【０１３５】
別の実施形態では、本開示の組成物は、間葉系幹細胞からエクスビボで分化し、少なくとも１つの間葉系幹細胞マーカーを発現するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む。別の実施形態では、本開示の組成物は、本明細書に詳細に記載されたように、少なくとも１つの神経栄養因子を分泌するＭＳＣ−ＮＴＦを含む。さらに別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は少なくとも１つのＮＴＦを分泌する。分泌されるＮＴＦには、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０１３６】
使用方法
【０１３７】
一実施形態では、表現型に応じて、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞及びその集団は、神経変性疾患または障害の治療に使用され得る。一実施形態では、本開示の方法は、神経変性疾患の治療を必要とする対象を治療することを含む。本方法は、対象に対して、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団を治療有効量で投与するステップを含み、それによって、対象の神経変性疾患を治療する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、対象の神経変性疾患の治療に用いられる別の治療または療法と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、別の治療または療法は、リルゾールの投与を含む。いくつかの実施形態では、別の治療または療法は、エダラボン（Radicava）の投与を含む。
【０１３９】
一実施形態では、用語「治療すること（treating）」及びその文法上の等価物、例えば治療（treatment）は、本明細書では、全く同じ意味及び性質を有する用語「移植（transplanting）」と互換的に使用され得ることは、当業者には理解できるであろう。いくつかの実施形態では、移植は、治療を必要としている対象に、本開示の組成物を注射することによって行われる。いくつかの実施形態では、移植は、治療を必要としている対象に、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団を注射することによって行われる。
【０１４０】
別の実施形態では、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、多系統萎縮症（ＭＳＡ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、ハンチントン病を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、レット症候群を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、リソソーム蓄積症を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、「白質疾患」またはグリア／脱髄疾患（サンフィリポ症を含む）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、ゴーシェ病を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、テイ・サックス病（ベータ・ヘキソサミニダーゼ欠損症）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、ＮＭＯスペクトラム疾患を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、虚血、事故、または環境障害に起因する脳損傷または外傷を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、脳卒中を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、脳性麻痺（ＣＰ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、自閉症及び自閉症スペクトラム障害を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、脊髄損傷を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、運動失調を含む。
【０１４１】
一実施形態では、本開示の方法は、分化の直後のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団またはその組成物を使用する。別の実施形態では、本開示の方法は、特定の表現型についてリッチ化されているＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団またはその組成物を使用する。特定の神経栄養因子または神経栄養因子のセットは、ＡＬＳの治療に特に有益であることが分かっている。
【０１４２】
別の実施形態では、神経変性疾患または障害を治療する方法に使用されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団またはその組成物は、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む。他の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはその集団、あるいはその組成物は、治療される神経変性疾患または障害の治療に有益なＮＴＦを分泌する。例えば、一実施形態では、本開示のＡＬＳを治療する方法は、血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、またはそれらの任意の組み合わせを分泌するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはその組成物の使用を含む。
【０１４３】
別の実施形態では、本開示の方法は、投与の前及び投与の後に、対象から取得された生体試料を分析するステップをさらに含む。別の実施形態では、生体試料は、血液、血清、尿、または脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはその集団あるいはその組成物の投与後、生体試料中の少なくとも１つの神経栄養因子は、プラセボが投与された対照対象から取得された対照生体試料と比較して濃度が増加する。一実施形態では、対照対象は、未治療の対象である。いくつかの実施形態では、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはその集団あるいはその組成物の投与後、生体試料中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、プラセボが投与された対照対象から取得された対照生体試料と比較して濃度が増加する。別の実施形態では、対照対象は、プラセボ処置された対象である。いくつかの実施形態では、対照生体試料は、プラセボが投与された対照対象から取得された試料を含む。いくつかの実施形態では、対照生体試料は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の投与前に対象から取得された試料を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、対照試料は、少なくとも１つのＮＴＦの分泌の濃度が増加するように誘導されていない同じ対象から取得されたＭＳＣ細胞を含む。ＭＳＣ及びＭＳＣ−ＮＴＦは両方とも同一の少なくとも１つのＮＴＦを分泌し得るが、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が由来するＭＳＣと比較して、少なくとも１つのＮＴＦの分泌が増加するように誘導されていることは、当業者には理解できるであろう。いくつかの実施形態では、対照試料は、ＭＳＣ−ＮＴＦで治療される対象から取得された未分化ＭＳＣを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、対照生体試料は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が由来する（分化するように誘導された、すなわち分化の前後に）同一のドナー／対象から取得されたＭＳＣ細胞を含む。いくつかの実施形態では、対照生体試料は、治療前に、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療される対象から取得された試料を含む。いくつかの実施形態では、対照試料は、未治療の対象（プラセボ）から取得された試料を含む。
【０１４７】
一実施形態では、上記投与後、生体試料は、対照生体試料と比較して、少なくとも１つの、炎症性因子、アポトーシス促進因子、または、炎症性因子に影響を与える因子の濃度の減少を含む。別の実施形態では、炎症性因子、アポトーシス促進因子、または、炎症性因子に影響を与える因子は、キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１）、グルタミン酸、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。別の実施形態では、上記投与後、生体試料は、対照生体試料と比較して、少なくとも１つの炎症性因子、アポトーシス促進因子、または、炎症性因子に影響を与える因子の濃度の減少を含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、上記投与後、生体試料は、対照対象から取得した対照生体試料と比較して、ノンレスポンダー（non-responders）において少なくとも１つのｍｉＲＮＡの濃度の増加を含む。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６−３ｐである。別の実施形態では、上記投与後、生体試料は、対照対象から取得した対照生体試料と比較して、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの濃度の増加、及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡの濃度の減少を含む。
【０１４９】
ヒト間葉系幹細胞を分泌する神経栄養因子は、当業者に既知の任意の方法によって投与され得る。ヒト間葉系幹細胞を分泌する神経栄養因子の移植は、例えば、「Gothelf et al., 2014, Clin Transl Med., vol. 3, page 21」、「Petrou et al., 2016 JAMA Neurol. Jan 11:1-8」、「Petrou et al. 2014; Muscle & Nerve. 49(3):455-457」、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０２４１８３号、同第２０１５／１２１８５９号に開示されている（これらの内容の全体は、参照により本明細書中に援用される）。
【０１５０】
別の実施形態では、本開示は、対象の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療有効量の細胞集団を含む組成物の使用方法であって、上記細胞集団が、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌可能に改変された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む使用方法を提供する。
【０１５１】
本開示の組成物は、当業者に既知の任意の適切な方法によって投与され得る。そのような方法の例としては、これに限定しないが、髄腔内投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、及び経口経路投与が含まれる。投与はまた、本開示の組成物の全身投与または局所投与を含み得る。
【０１５２】
投与はまた、対象に対しての、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはその集団の外科的投与、移植、挿入、または注射を包含し得る。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、髄腔内に、皮下に、筋肉内に、中枢神経系（ＣＮＳ）に、または、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞がそれの意図する機能を実施することを可能にする別の身体部位に投与することができる。投与に好適な部位は、医療専門家によって容易に決定され得る。
【０１５３】
一実施形態では、細胞集団は、対象のＣＳＦに髄腔内投与される。別の実施形態では、細胞集団は、対象の筋肉に投与される。さらに別の実施形態では、投与は、対象の脳脊髄液に投与することを含む。さらなる別の実施形態では、投与は、対象の中枢神経系に投与することを含む。別の実施形態では、投与は、対象の脳脊髄液、中枢神経系、またはそれらの組み合わせへの投与を含む。
【０１５４】
「中枢神経系」という用語が、脳及び脊髄を包含し得ることは、当業者には理解できるであろう。いくつかの実施形態では、投与は、脳に投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、脊髄に投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、脳及び脊髄に投与することを含む。
【０１５５】
一実施形態では、投与は、筋肉内（ＩＭ）注射、髄腔内（ＩＴ）注射、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１５６】
一実施形態では、ＩＭ注射は、１回の注射あたり、約１×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量で行われる。別の実施形態では、ＩＭ注射は、１回の注射あたり、約２×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量で行われる。別の実施形態では、ＩＭ注射は、１回の注射あたり、約３×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量で行われる。別の実施形態では、ＩＭ注射は、１回の注射あたり、約１×１０６個ないし約２×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量で行われる。別の実施形態では、ＩＭ注射は、１回の注射あたり、約２×１０６個ないし約３×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量で行われる。別の実施形態では、ＩＭ注射は、１回の注射あたり、約１×１０６個ないし約３×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量で行われる。
【０１５７】
別の実施形態では、ＩＭ投与は、同じ時点での複数回の注射を含む。同じ時点での複数回の注射が、所与の時点での連続的に行われる注射を包含し得ることは、当業者には理解できるであろう。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２０回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２１回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２２回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２３回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２４回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２５回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２６回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２７回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２８回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２９回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約３０回の注射を含む。
【０１５８】
別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約２４×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約３０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約３６×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約４０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約４２×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約４４×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約４６×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約４８×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約５０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約５６×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約６０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。
【０１５９】
別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約２４×１０６個ないし約６０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約２４×１０６個ないし約３０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約３０×１０６個ないし約３６×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約３６×１０６個ないし約４２×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約４２×１０６個ないし約４８×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約４４×１０６個ないし約５０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約４６×１０６個ないし約５２×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約４８×１０６個ないし約５４×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、複数回のＩＭ注射の用量は、約５４×１０６個ないし約６０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。
【０１６０】
一実施形態では、ＩＴ注射は、約８０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１００×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１０５×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１１０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１１５×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１２０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１２５×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１３０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１３５×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１４０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１５０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約２００×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。
【０１６１】
一実施形態では、投与は、治療上有効な数の時点での投与を含む。いくつかの実施形態では、投与（注射）は、１ヶ月毎に行われる。いくつかの実施形態では、投与（注射）は、２ヶ月毎に行われる。いくつかの実施形態では、投与（注射）は、３ヶ月毎に行われる。いくつかの実施形態では、投与（注射）は、必要に応じて行われる。いくつかの実施形態では、各投与において、複数回の注射が行われる。いくつかの実施形態では、各投与において、２回ないし３０回の注射が行われる。いくつかの実施形態では、各投与において、２回ないし２０回の注射が行われる。いくつかの実施形態では、各投与において、２０回ないし３０回の注射が行われる。いくつかの実施形態では、各投与において、１０回ないし２０回の注射が行われる。いくつかの実施形態では、各投与において、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、または３０回の注射が行われる。
【０１６２】
一実施形態では、ＩＴ注射は、約８０×１０６個ないし約１４０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１００×１０６個ないし約１２５×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１２５×１０６個ないし約１４０×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１５０×１０６個ないし約２００×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量を含む。
【０１６３】
別の実施形態では、ＩＴ注射は、約１２５×１０６個の分化した間葉系幹細胞の用量の２ヶ月毎の投与を含み、各投与において３回の注射が行われる。
【０１６４】
一実施形態では、投与は、単一の時点を含む。治療が、本開示のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のフォローアップ投与（follow-up administration）を包含し得ることは、当業者には理解できるであろう。別の実施形態では、投与は、少なくとも２つの時点を含む。別の実施形態では、投与は、２つの時点を含む。第２の時点またはさらなる時点の投与のタイミングは、本明細書中に記載されたように、対象から取得された生体試料のＮＴＦ及び／または炎症性因子についての分析を包含し得る。いくつかの実施形態では、投与は、治療効果に必要な数の時点を含む。いくつかの実施形態では、治療効果は、本明細書に詳細に記載されたように、少なくとも１つのＮＴＦ、及び／または、少なくとも１つの炎症性因子、またはアポトーシス促進因子、または炎症性因子に影響を与える因子の分泌についての分析に基づいて決定され得る。
【０１６５】
別の実施形態では、フォローアップ投与は、例えばＡＬＳなどの神経変性疾患の治療を強化する。別の実施形態では、反復投与は、初期投与の約８〜１２週間後の２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、初期投与の約７週間後の２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、初期投与の約８週間後の２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、初期投与の約９週間後の２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、初期投与の約１０週間後の２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、初期投与の約１１週間後の２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、初期投与の約１２週間後の２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、初期投与の約１３週間後の２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、初期投与の約１４週間後の２回目の投与を含む。別の実施形態では、投与は、少なくとも３つの時点での反復投与を含む。別の実施形態では、投与は、少なくとも４つの時点での反復投与を含む。別の実施形態では、投与は、少なくとも５つの時点での反復投与を含む。別の実施形態では、投与は、５回を超える時点での反復投与を含む。別の実施形態では、投与は、１０回を超える時点での反復投与を含む。別の実施形態では、投与は、疾患または障害の期間でのフォローアップ時点（follow-up time points）での反復投与を含む。
【０１６６】
本開示の使用方法によって治療される神経変性疾患または状態は、上記に記載した疾患等である。一実施形態では、本開示の使用方法によって治療される神経変性疾患または状態としては、これに限定しないが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）並びにその関連疾患及び症状を挙げられる。
【０１６７】
本明細書で使用されるとき、「治療する（treat）」及び「治療（treatment）」という用語は、疾患または状態に関連する望ましくない生理学的変化を予防するかまたは遅らせる（軽減する）ことを目的とした、予防的措置を含む治療的処置を包含し得る。有益なまたは望ましい臨床結果には、これに限定しないが、検出の可否に関わらず、症状の緩和、疾患または状態の程度の低減、疾患または状態の安定化（すなわち、疾患または状態が悪化しないようにすること）、疾患または状態の進行を遅らせること、疾患または状態の改善または緩和、及び疾患または状態の（部分的または全体的な）寛解が含まれる。「治療」はまた、治療を受けない場合の予測生存期間と比較して、生存期間が長くなることを意味し得る。治療を必要とする人々には、その疾患または状態にすでに罹患している人々、その疾患または状態に罹患しやすい人々、またはその疾患または状態を予防すべき人々が含まれる。
【０１６８】
別の実施形態では、本開示は、対象の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を診断する方法であって、対象から生体試料を取得する取得ステップと、生体試料中のキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度を検出する検出ステップとを含む方法を提供する。例えば、１、６００〜１０７、６００ｐｇ／ｍｌの範囲のＣＨＩＴ−１の濃度は、対象が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有することを示す。任意の生体試料を使用することができる。別の実施形態では、ＣＨＩＴ−１の濃度は、５００〜５００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である。別の実施形態では、ＣＨＩＴ−１の濃度は、５００〜４００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である。別の実施形態では、ＣＨＩＴ−１の濃度は、５００〜３００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である。別の実施形態では、ＣＨＩＴ−１の濃度は、５００〜２００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である。別の実施形態では、ＣＨＩＴ−１の濃度は、１０００〜３００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である。別の実施形態では、ＣＨＩＴ−１の濃度は、１０００〜２００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である。別の実施形態では、ＣＨＩＴ−１の濃度は、１５００〜２００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である。別の実施形態では、ＣＨＩＴ−１の濃度は、１５００〜１５０、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、生体試料は、対象から取得された脳脊髄液（ＣＳＦ）試料である。いくつかの実施形態では、生体試料は、対象から取得された血液試料または血漿試料である。いくつかの実施形態では、生体試料は、対象から取得された尿試料である。ＣＨＩＴ−１の検出結果に基づいて、対象のＡＬＳが治療され得る。
【０１７０】
「対象（subject）」という用語は、ヒトを含むがこれに限定されない。本開示の治療方法は、霊長類（サル、ヒトなど）、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ウサギ、げっ歯類（ラット、マウスなど）を含む任意の適切な哺乳動物の治療に使用され得る。特定の実施形態では、治療される哺乳動物はヒトである。
【０１７１】
本明細書に引用された全ての特許文献及び科学刊行物は、その内容の全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１７２】
以下の実施例は、本開示の実施形態をより完全に説明するために提示されている。しかしながら、以下の実施例は、本開示の幅広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１７３】
実施例
【０１７４】
実施例１
ヒトＢＭ−ＭＳＣの単離及び分化
【０１７５】
分化ヒトＢＭ−ＭＳＣの調製
【０１７６】
目的：神経栄養因子を分泌するヒト骨髄間葉系幹細胞を生産すること。
【０１７７】
方法：
【０１７８】
ヒト骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）を単離する方法は当分野で公知であり、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１２１８５９号、及び同第ＷＯ２０１４／０２４１８３号に完全に開示されている（これらの内容の全体は、参照により本明細書に援用される）。
【０１７９】
診断処置の過程で骨髄穿刺を受けている成人ドナーの後腸骨稜から、骨髄サンプル（３０−６０ｍｌ）をヘパリン含有チューブに収集した。骨髄穿刺物をＨＢＳＳで１：１に希釈し、単核細胞をＦｉｃｏｌｌ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ）含有チューブ上での密度勾配遠心分離（１０００×Ｇ、２０分間）により分離した。単核細胞画分を収集し、ＤＭＥＭ中で洗浄した。細胞を、１０％血小板溶解物（ＰＭ）を含有する増殖培地中に再懸濁し、トリパンブルー排除色素によってカウントし、２２５ｃｍ２の組織培養フラスコ中に１５０、０００−３００、０００細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。フラスコを、５％ＣＯ２加湿インキュベータ中で、３７℃でインキュベートした。
【０１８０】
ＰＭ増殖培地は、Ｌ−グルタミン溶液２００ｍＭ（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）、ピルビン酸ナトリウム溶液１００ｍＭ（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ＩＵ／ｍｌヘパリン（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、及び１０％血小板溶解物が添加された低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）から成る。１６−２４時間後、ＰＭ培地を吸引してフラスコから非接着細胞を除去し、接着細胞を１０ｍｌのＤＭＥＭで軽く洗浄し、３０ｍｌの新鮮なＰＭをフラスコに添加した。ｈＭＳＣ細胞をＰＭ培地中で１２−１５日間増殖させた。ＰＭ培地は、週に２回交換した。１２−１５日後、またはフラスコがコンフルエンスに達したとき、細胞を、全ての増殖培地を除去することによって採取し、３７℃のＴｒｙｐＬＥ（ＴＭ）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で５分間インキュベートした。その後、その細胞をＤＭＥＭ中で洗浄し、カウントし、ＰＭ培地中に再懸濁し、そして、ＣｅｌｌＳｔａｃｋ中に１０００−３０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。
【０１８１】
サブコンフルエントな細胞層をＴｒｙｐＬＥ（ＴＭ）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離することによって、ＭＳＣ培養物を週に２回継代した。細胞は、２−４継代後に移植した。したがって、細胞は、分化を誘導する前に、ＰＭ中で最低２週間継代された。
【０１８２】
１ｍＭジブチリル環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、２０ｎｇ／ｍｌヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）、５ｎｇ／ｍｌヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、及び５０ｎｇ／ｍｌヒトヘレグリンβ１が添加された低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）中でＭＳＣを３日間インキュベートすることによって、神経栄養因子（ＮＴＦ）分泌を誘導した。培養物は、採取されるまで、分化培地中で３日間維持した。
【０１８３】
ｈＢＭ  ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（すなわち、ＮＴＦを分泌するように誘導されたｈＭＳＣ）は、２−８℃で約５−７２時間安定していた。
【０１８４】
血小板溶解物の調製
【０１８５】
血小板溶解物は、当分野で既知の任意の方法を用いて調製され得る。例えば、一実施形態では、血小板溶解物は、下記のような凍結融解プロトコルを使用して調製され得る。
【０１８６】
多血小板血漿（ＰＲＰ）は、感染性因子（すなわち、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ、ＨＢｓＡｇ）を含有しないことが判明している、血液バンクから提供されたものであり得る。ＰＲＰ含有バッグを−８０℃で貯蔵し、次いで、３７℃の水浴中で解凍した。解凍後、複数のドナーの多血小板血漿をプールし、混合し、そして、１４０００×Ｇで１０分間遠心分離して血小板粒子及び膜を除去した。その後、血小板溶解物上清を収集し、使用するまで−８０℃で凍結した。血小板溶解物を、内毒素、ヘモグロビン、ｐＨ、総タンパク質、アルブミン、浸透圧、無菌性、及びマイコプラズマについて試験した。
【０１８７】
実施例２
分化ヒトＢＭ−ＭＳＣ（ｈＢＭ  ＭＳＣ−ＮＴＦ）の特徴付け
【０１８８】
目的：骨髄ＭＳＣと実施例１で調製した分化骨髄ＭＳＣとの差異を特徴付けること。
【０１８９】
方法：
【０１９０】
細胞
【０１９１】
細胞は、健康なドナーまたは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者から取得した。
【０１９２】
遺伝子発現−ｍＲＮＡ  ｑＰＣＲ測定
【０１９３】
定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＮＡ  ｑＰＣＲ）を用いて、骨髄（ＢＭ）ＭＳＣ及びＢＭ由来ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞におけるいくつかの遺伝子の発現を比較した。簡潔に説明すると、標的遺伝子を、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）、及びリボソームタンパク質Ｌ１７（ＲＰＬ１７）の幾何平均に正規化した。Ｂ２Ｍ、ＥＦ１ａ及びＲＰＬ１７は、ＭＳＣ細胞及びＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において同等に発現することが分かっているため、公表されている正規化遺伝子のパネルから選択された。ＲＮＡ  ｑＰＣＲにおいて、クロスポイント（Ｃｐ）は、増幅からの蛍光がバックグラウンド蛍光を超えるサイクルである。より低いＣＰ値は、分析される遺伝子のより高い発現と相関する。ｑＰＣＲ  Ｃｐ＞３５を有するサンプルは、検出されなかったと見なし、計算のために３５のＣＰ値を与えた。Ｐ値は、両側ｔ検定を用いて計算した。健康なドナーは、Ｄ１２、Ｄ２６、Ｄ２２、Ｄ２３、及びＤ２４であった。ＡＬＳ患者は、０７−ＲＩ、０８−ＲＳ、１１−ＡＧ、及び１２−ＮＭであった。
【０１９４】
分泌物の測定
【０１９５】
ＭＳＣ及びＭＳＣ−ＮＴＦからの標的化合物及びポリペプチドの分泌を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、例えば、既知の市販されているＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）（ＥＬＩＳＡキットの一例）またはＲａｙ  Ｂｉｏ市販アッセイキット（多重検定システムの一例）を使用して測定した。
【０１９６】
結果
【０１９７】
健康なドナー及びＡＬＳ患者の両方からのＭＳＣ及びＭＳＣ−ＮＴＦにおけるｍＲＮＡ発現を測定することによって、遺伝子発現を分析した。分析した遺伝子としては、細胞周期遺伝子（ＴＯＰ２Ａなど）、分泌遺伝子（ＢＭＰ２、ＬＩＦ、ＦＧＦ２、ＷＮＴ５Ａ、ＡＲＥＧ、ＨＧＦ、ＢＤＮＦ）、間葉系遺伝子（ＭＥＳＴ）、分泌関連遺伝子（ＰＣＳＫ１、ＲＡＢ２７Ｂ、ＳＮＡＰ２５）、グルタミン酸トランスポーター遺伝子［ＳＬＣ１Ａ１（ＥＡＡＣ１）、ＳＬＣ１Ａ３（ＧＬＡＳＴ）］、ニューロン遺伝子ＴＵＢＢ３（ＴＵＪ１）、及びＳＬＣ１６Ａ６が挙げられる。
【０１９８】
結果は、正常ドナーのＭＳＣ−ＮＴＦ対ＭＳＣにおいて、Ｔｏｐ２Ａ発現の有意な減少（＜０．０００１）を示し、これは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が細胞周期停止の状態にあることを示唆する（図１Ａ）。図１Ｂは、サンプルあたりの倍率変化を示し、Ｔｏｐ２Ａの発現は７１倍減少した（ＭＳＣ−ＮＴＦ／ＭＳＣ）（Ｐ値＝２．９×１０−７、ｎ＝９）。
【０１９９】
正常ドナー及びＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ対ＭＳＣにおいて、ＢＭＰ２（５３．７倍）及びＬＩＦ（６．８倍）の発現の有意な増加が観察され、これにより、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて神経栄養因子遺伝子ＬＩＦの発現が増加したことが実証された（図２Ａ及び図２Ｂ、図３Ａ及び図３Ｂ）。一部のドナーのＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（患者由来の細胞は試験しなかった）において、ＦＧＦ２発現の減少が観察された（図４Ａ及び図４Ｂ）。これらの結果に対するＰ値は、ＢＭＰ２では９．７３×１０−９（ｎ＝９）、ＬＩＦでは６．９×１０−４（ｎ＝９）、ＦＧＦ２では０．０１５（ｎ＝５）であった。ＢＭＰ２遺伝子の発現増加は、第ＩＩａ相臨床試験において、ドナー及びＡＬＳ患者から取得したＭＳＣ細胞と比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で観察されたＢＭＰ−２分泌の増加と良好に相関した（図１７Ａ及び図１７Ｂ）。同様に、ＬＩＦ発現は、第ＩＩａ相及び第ＩＩ相の臨床試験において、大多数の正常ドナー及びＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で観察された神経栄養因子の分泌の増加（ＭＳＣと比較して１４倍）と相関した（図１９Ａ及び図１９Ｂ）。
【０２００】
正常ドナー（ＡＲＥＧ）及び患者（ＷＲＥＴ５Ａ）のＭＳＣ−ＮＴＦ対ＭＳＣにおいて、ＷＮＴ５Ａ発現（２．４倍の変化）及びＡＲＥＧ発現（アンフィレグリン、上皮成長因子ファミリーメンバー、２０．１倍の変化）の有意な増加が観察された（それぞれ、図５Ａ及び図５Ｂ、図６Ａ及び図６Ｂ）。これらの結果についてのＰ値は、ＷＮＴ５Ａでは０．００１（ｎ＝９）、ＡＲＥＧでは０．０２３（ｎ＝５）であった。
【０２０１】
同様に、正常ドナー及びＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ対ＭＳＣにおいて、ＨＧＦ発現（〜２．３倍の変化）及びＢＤＮＦ発現（〜１．５倍の変化）の有意な増加が観察された（それぞれ、図７Ａ及び図７Ｂ、図８Ａ及び図８Ｂ）。これらの結果についてのＰ値は、ＨＧＦでは０．０４２（ｎ＝９）、ＢＤＮＦでは０．０４０（ｎ＝９）であった。
【０２０２】
間葉系遺伝子ＭＥＳＴの分析は、正常ドナー及び患者のＭＳＣ対ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて、ＭＥＳＴ（中胚葉特異的転写産物）発現の有意な減少（０．１４倍の変化；Ｐ値は、２．１×１０−４（ｎ＝９））を示した（図９Ａ及び図９Ｂ）。
【０２０３】
分泌関連遺伝子の発現は、患者及び健康なドナーのＭＳＣ−ＮＴＦ対ＭＳＣにおいて、ＰＣＳＫ１（プロタンパク質転換酵素１）及びＲＡＢ２６Ｂの増加を示した（それぞれ、図１０Ａ及び図１０Ｂ（Ｐ値＝９．８×１０−７、ｎ＝９）、図１１Ａ及び図１１Ｂ（Ｐ値＝０．００１、ｎ＝９））。ＳＮＡＰ２５発現の増加は、ドナーのＭＳＣ−ＮＴＦ対ＭＳＣでは観察され、患者では測定されなかった（図１２Ａ及び図１２Ｂ；Ｐ値＝６．７７×１０−４、ｎ＝５）。ＰＣＳＫ１及びＳＮＡＰ２５は、いずれのＭＳＣサンプルにおいても検出されなかった（Ｃｐ＞３５）。そのため、これらの遺伝子には、倍率変化計算のために、Ｃｐ＝３５の任意値を与えた。
【０２０４】
グルタミン酸トランスポーター遺伝子ＳＬＣ１Ａ１及びＳＬＣ１Ａ３の発現は、ＳＬＣ１Ａ３（ＧＬＡＳＴ−アストロサイトグルタミン酸トランスポーター）の発現の増加（７．９倍の変化）（図１４Ａ及び図１４Ｂ；Ｐ値＝０．００７、ｎ＝９）、及びＳＬＣ１Ａ１の発現の減少（ＥＡＡＣ１発現；ニューロングルタミン酸トランスポーター）（１．６６倍の変化）（図１３Ａ及び図１３Ｂ；Ｐ＝０．０３２、ｎ＝５）を示した。これらの結果は、同一のドナーからのＭＳＣと比較して、ＡＬＳ患者からのＭＳＣ−ＮＴＦにおけるＧＬＡＳＴ発現の増加を示すデータと良好に相関した（図１４）。さらに、大部分の患者において、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、それらが由来するＭＳＣ細胞と比較して、より少ないグルタミン酸を分泌した（図２１）。ＧＬＡＳＴは細胞外空間からグルタミン酸を除去するトランスポーターであるので、ＧＬＡＳＴの発現の増加は、ＭＳＣ細胞培養上清と比較したＭＳＣ−ＮＴＦ細胞培養上清中のグルタミン酸の減少を説明することができる。
【０２０５】
ニューロン遺伝子ＴＵＢＢ３の分析は、正常ドナーのＭＳＣ−ＮＴＦ細胞においてＴＵＢＢ３発現が３．４倍下方調節されたことを示した（図１５Ａ及び図１５Ｂ；Ｐ値＝０．０２７、ｎ＝５）。加えて、ＳＣＬ１６Ａ６の分析は、ＭＳＣ−ＮＴＦ対ＭＳＣにおいて、発現が２９．６倍上方調節されたことを示した（図１６Ａ及び図１６Ｂ；Ｐ値＝０．０３１、ｎ＝５）。興味深いことに、ＳＬＣ１６Ａ６発現は、文献に記載されている多くのＭＳＣ操作において増加することが分かったが、それはいずれのＭＳＣサンプルにおいても発現しなかった（Ｃｐ＞３５）。
【０２０６】
ＴＳＧ−６分泌の分析は、大部分のＡＬＳ患者において、ＴＳＧ−６は、ＭＳＣ−ＮＴＦの培養上清に分泌されるが、ＭＳＣ細胞の培養上清には分泌されないことを示した（図２０）。
【０２０７】
Ｇ−ＣＳＦ
【０２０８】
長年にわたり、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は非常に特異的な造血成長因子だと考えられてきた。最近の研究では、脳内のＧ−ＣＳＦ／Ｇ−ＣＳＦ−受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）系の存在と、それの神経保護、神経組織修復、及び機能回復の向上における役割が分かってきている。ＡＬＳのマウスモデルにおいて、Ｇ−ＣＳＦは、運動能力及び運動ニューロン生存性を有意に改善し、脱神経萎縮を減少させた。臨床前の知見に基づいて、ＡＬＳ患者におけるいくつかの小規模な研究が結果を期待して開始された。
【０２０９】
分化前の同一の被験者のＭＳＣと比較した、ＡＬＳ患者及び正常ドナーのＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の培養上清中のＧ−ＣＳＦの分泌を、Ｇ−ＣＳＦのためのＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して評価した。この結果は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞におけるｐｇ／１０６細胞のＧ−ＣＳＦ分泌の特定生産性を示す。
【０２１０】
ＭＳＣ中のＧ−ＣＳＦの検出可能な分泌は存在しなかったが、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞によって有意な量のＧ−ＣＳＦが分泌された（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞におけるＧ−ＣＳＦ分泌の増加（ＭＳＣと比較した）を示す、この神経栄養因子の発現及び分泌の増加の測定値が、２つの臨床試験において、大部分（しかし、全てではない）の正常ドナー及びＡＬＳ患者で観察された（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。同様に、ＡＬＳ患者から取得したＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてＬＩＦ（図１９Ａ及び図１９Ｂ）及びＴＳＧ−６（図２０）の分泌が増加した。
【０２１１】
要約
【０２１２】
分泌関連遺伝子（ＰＣＳＫ１及びＲＡＢ２６Ｂ）の増加は、分化プロセスが、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＢＭＰ２などの複数の分泌神経栄養因子の検出に反映される分泌機序を誘導することを示唆する。ＭＥＳＴの減少は、分化プロセス後のナイーブＭＳＣ表現型からの変化を示唆する。細胞周期関連遺伝子ＴＯＰ２Ａの減少は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の細胞周期停止及び増殖減少、並びにＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の分化と相関する。
【０２１３】
実施例３
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療されたＡＬＳ患者のＣＳＦ中の神経栄養因子及び炎症性因子の調節
【０２１４】
目的：この研究の主な目的は、実施例１及び実施例２で説明した増殖させた自己ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の移植の安全性を評価することであった。
【０２１５】
材料及び方法
【０２１６】
ＢＭ−ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ（登録商標））
【０２１７】
神経栄養因子（ＮＴＦ）の分泌が増加したＭＳＣは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患に罹患している患者に対して複数のＮＴＦを送達するとともに、免疫調節効果などのＭＳＣの潜在的な治療上の利点を活用するための新規の方法を提供する。様々な神経栄養因子（ＮＴＦ）を増加したレベルで分泌するようにＭＳＣを誘導することができる培養方法が開発されている。上記に詳述したように、ＢＭ−ＭＳＣから分泌され得るＮＴＦとしては、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＢＭＰ−２、ＴＳＧ−６及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が挙げられる（実施例２の結果も参照されたい）。ＮＴＦ分泌ＭＳＣ（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはＮｕｒＯｗｎ（登録商標））は、骨髄由来ＭＳＣから生じた自家療法である（実施例１参照）。一実施形態では、「ＭＳＣ−ＮＴＦ」及び「ＮｕｒＯｗｎ」という用語は、相互互換的に使用され、互いに同一の意味及び性質を有する。
【０２１８】
簡潔に説明すると、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の生産は、患者の骨髄吸引物の単核画分からのＭＳＣの単離、エクスビボ増殖、及びＮＴＦ分泌を誘導する独自の培養条件下での誘導から開始される。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、動物には、筋肉内（ＩＭ）、髄腔内（ＩＴ）、及び脳室内（ＩＣＶ）投与を介して投与され、ＡＬＳ患者には、ＩＭ及びＩＴの一方または組み合わせを介して投与される。
【０２１９】
二重盲検プラセボ対照臨床試験
【０２２０】
「筋萎縮性側索硬化症の患者における神経栄養因子を分泌する自己間葉系幹細胞の移植の第ＩＩ相無作為化二重盲検プラセボ対照多施設試験」と題するＡＬＳ患者における第ＩＩ相多施設二重盲検プラセボ対照試験が、米国の３大医療センターで最近終了した（ClinicalTrials.gov ID：ＮＣＴ０２０１７９１２）。試験の完了時にデータ安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＢ）は安全データを検討し、治療は極めて良好に耐容され、治療に関連する重大な有害事象は存在しないと結論付けた。安全性プロフィールは、本明細書に記載された本発明の方法が、ＡＬＳを治療できることを示す。
【０２２１】
研究の評価項目
【０２２２】
本研究の主要評価項目は、ＡＬＳ患者における、髄腔内（ＩＴ）投与と、右上腕二頭筋及び三頭筋への２４回の筋肉内（ＩＭ）注射とを組み合わせて単一の機会で投与した、増殖させた自己ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の移植の安全性及び耐容性の評価を目的としている。
【０２２３】
副次的評価項目は有効性であり、ＡＬＳ機能評価尺度改訂版（ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ：ＡＬＳ疾患進行の有効な結果尺度）及び静的肺活量（ＳＶＣ）肺機能検査によって決定される、治療処置群とプラセボ群との間での移植前期間から移植後期間までの疾患進行の変化を比較した。副次的評価項目は、移植前の１２〜１６週間のベースライン期間と比較して、２４週間の移植後期間にわたって治療処置群及びプラセボ群において評価した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）をプラセボとして使用した。
【０２２４】
探索的な評価項目
【０２２５】
ＨＨＤ、及び電気インピーダンスミオグラフィー（ＥＩＭ：この任意選択の帰結評価指標が利用可能な患者について）の減少の勾配をプラセボと比較するとともに、１２〜１６週間の移植前モニタリング期間と移植後の２４週間の追跡調査期間とを比較すること。
【０２２６】
第ＩＩＩ相有効性試験にプラセボ群を含めることの必要性を見越して、患者及び介護者を治療に対して盲検化することに成功することの実現可能性を決定すること。
【０２２７】
神経栄養因子及び可能性のあるＡＬＳバイオマーカーの存在について、ベースライン期間及び治療処置２週後のＡＬＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）を検査すること。
【０２２８】
研究の概要
【０２２９】
適格基準を満たした参加者を、その後の来院で評価して適格性を確認した。その後、参加者を無作為化し、骨髄穿刺を行った。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞移植は、骨髄穿刺の３〜４週後に行った。移植のために、全ての参加者は、４８時間のモニタリングのために病院に入院した。その後の外来治験来院は、移植の２週後、その後は４週間ごとに、６ヶ月間にわたって行われた（図２２Ａ）。
【０２３０】
方法
【０２３１】
研究プロトコルは、ＦＤＡ及び各参加施設の施設内審査委員会（ＩＲＢ）によって承認された。全ての参加者が、インフォームドコンセントに署名した。この研究は、ＧＣＰ（Good Clinical Practice）に従って実施された（ClinicalTrials.gov ID：ＮＣＴ０２０１７９１２）。
【０２３２】
参加者の選択基準
【０２３３】
スクリーニング時に、適格な参加者は、身長、年齢、性別、及び１年以上２年以下の症状発現期間についての予測される正常値のＡＬＳＦＲＳ−Ｒ＞３０、肺活量（ＶＣ）＞６５％において、エル・エスコリアル基準によるＡＬＳの「可能性あり（possible）」、「可能性大であり検査所見で裏付けられる（probable- laboratory-supported）」、「可能性大（probable）」、「確実（definite）」の診断を受けた。参加者は、リルゾールを投与されていなかったか、または３０日以上安定的な投与量であり、ＩＴ細胞移植手技のために横になる能力を有しており、ＡＬＳに起因する少なくともある程度の四肢の筋力低下を有しており、かつ米国の居住者であった。以下の理由に該当する者は、参加者から除外した。人工呼吸器の使用者；栄養チューブの使用者；幹細胞による治療を受けたことがある者；妊娠中の者；スクリーニングの４週間以内に治験薬の投与または免疫抑制療法を受けた者；自己免疫疾患または感染症（Ｈｅｐ  Ｂ、Ｈｅｐ  Ｃ、ＨＩＶを含む）の罹患者；過去５年以内に癌を発症した者；精神医学的または医学的に不安定な状態にあるか、あるいは安全性の臨床値が臨床的に著しく異常である者。
【０２３４】
参加者の評価
【０２３５】
５９人の参加者がこの試験のためにスクリーニングされた。８人がスクリーン不適格であった。また、３か月の導入期間中に、３人の参加者が、無作為化の前に試験を中止した。４８人の参加者が無作為化され、そのうちの４３人の追跡調査を完了した（図２２Ｃ）。
【０２３６】
治療処置群は、同様のベースライン特性を示した。治療された参加者の大部分は、男性（３５名、７２．９％）及び白人（４８名、１００％）であった。参加者の平均年齢は、５１．１歳であった（範囲：２６〜７１歳（下記の表１Ａ及び表１Ｂ））。
【０２３７】
表１Ａ：被験者の性質、人口統計学的属性及び医療歴
【０２３８】
【表１Ａ】
2019527218.tif 000003
【０２３９】
表１Ｂ：治療処置群別の人口統計学的属性及びベースライン特性の要約＊
【０２４０】
【表１Ｂ】
2019527218.tif 000004
【０２４１】
＊略語：ＡＬＳ＝筋萎縮性側索硬化症；ＳＤ＝標準偏差。データは、ｎ及びパーセンテージまたは平均（±ＳＤ）として提示される。略語：ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ＝ＡＬＳ機能評価尺度改訂版。パーセンテージは、分析する母集団に対する、所与の処置群の参加者数（Ｎ）に基づいている。
【０２４２】
インフォームドコンセントを提供した後、各患者は、約１２〜１６週のベースライン期間中は毎月来院し、ＡＬＳ機能評価尺度（ＡＬＳＦＲＳ）及び改訂ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ（ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ）スコア及び静的肺活量（ＳＶＣ）を測定した。この期間中に、実施例１で上記したように、患者の骨髄を採取し、間葉系間質細胞を単離し、増殖させた。
【０２４３】
簡潔に説明すると、最初のスクリーニング来院の約９〜１１週後に患者の骨髄を吸引した。ＭＳＣ単離及び細胞増殖プロセスを約３〜５週間継続し、その後にＭＳＣ−ＮＴＦ細胞移植を行った。
【０２４４】
スクリーニングの１２〜１６週間後、患者は、自己ＭＳＣ−ＮＴＦまたはそれに相当するプラセボの移植を受けた。自己ＭＳＣ−ＮＴＦまたはプラセボを、全て１回の治験来院で、髄腔内（ＩＴ）、並びに、右上腕二頭筋及び三頭筋への２４回のＩＭ注射として筋肉内（ＩＭ）に投与した（図２２Ｂ）。いずれの場合でも、プラセボは、ＭＳＣ細胞が懸濁されている賦形剤と一致する賦形剤であった。
【０２４５】
自己ＭＳＣ−ＮＴＦの投与量は次の通りであった：２４回のＩＭ投与の各々は、２００μｌ中に２×１０６のＭＳＣ−ＮＴＦ（細胞濃度は１０×１０６細胞／ｍｌ）を含有しており、ＩＴ投与では、１００〜１２５×１０６のＭＳＣ−ＮＴＦを含有する４ｍｌが使用された。したがって、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の投与量は、ＩＴ投与では１００〜１２５×１０６個の細胞、ＩＭ投与では４８×１０６個の細胞であった。
【０２４６】
治療処置後、患者は、最大６ヶ月の来院（移植日から２４〜２６週；２、４、８、１２、１６、及び２４週で評価した）で追跡され、そのときに、ＡＬＳ機能評価尺度（ＡＬＳＦＲＳ）及び改訂ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ（ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ）及び静的肺活量（ＳＶＣ）を、バイタルサイン、併用薬及び有害事象（ＡＥ）の臨床検査及び記録と共に取得した（図１Ａのスキーム参照）。
【０２４７】
分泌された神経栄養因子バイオマーカーの存在及び該バイオマーカーと治療処置との関係を確認することを目的として、研究の過程で、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを、投与日（治験来院５）及び治療処置２週後（治験来院６）に全ての患者から収集した。
【０２４８】
ランダム化及び盲検化
【０２４９】
これは、無作為化二重盲検プラセボ対照試験であった。参加者をサイトごとに階層化し、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはそれに対応するプラセボに対して３：１の比率で無作為に割り当てた。盲検を維持するために、全ての参加者から骨髄を吸引し、さらに、プラセボに無作為化された参加者には、移植処置時に賦形剤を投与した。
【０２５０】
骨髄穿刺
【０２５１】
無作為化群にかかわらず、全ての参加者は、資格のある医師により標準的な手技を使用して行われた骨髄穿刺を受けた。各参加者から合計５０〜７０ｍＬの骨髄を吸引した。
【０２５２】
細胞製造及び移植
【０２５３】
実施例１に詳細に記載したように、骨髄からＭＳＣを単離し、培養物ベースのアプローチを用いて培養物中で増殖及び分化させてＮＴＦを分泌させた。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の生産は、ＧＭＰ（Good Manufacturing Practices）に準拠したクリーンルーム内で、完全な環境制御下で行った。
【０２５４】
自己ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、該細胞が安全性、有効性及び同一性試験を含む適用可能なリリース基準を満たした場合に、移植のためにリリースされた。
【０２５５】
リリース試験後の移植日に、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を、ＩＴ移植用の１個の５ｍＬシリンジとＩＭ移植用の２４個の１ｍＬシリンジとからなる、すぐに使える参加者用にカスタマイズされた治療処置パッケージで提供した。プラセボ（賦形剤）は、細胞含有シリンジと同数のシリンジタイプ及びサイズで提供した。
【０２５６】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞用シリンジとプラセボ用シリンジは外観が若干異なるため、注射は非盲検注射チームによって行われ、パッケージは盲検処置チームの存在下では開封されなかった。参加者は、移植材料及び手順に対する彼らの見解を不明瞭にするように、目隠しされた。移植後の評価者は、処置の割り当てについては知らされていなかった。
【０２５７】
帰結評価指標
【０２５８】
有害事象は、試験期間を通じて評価された。安全性の臨床試験結果は、各来院時に収集し、中央研究所で分析し、現場調査員、医療モニタ、及び薬物安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＢ）により監視した。臨床的な帰結評価指標は、全ての来院時に、バロー神経研究所のノースイーストＡＬＳコンソーシアムのアウトカム及びモニタリングセンターにより認定された各サイトの訓練された評価者によって収集された。帰結評価指標には、静的肺活量（ＳＶＣ）、ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ、ハンドヘルドダイナモメトリ（ＨＨＤ）が含まれる。ＡＬＳＦＲＳ−Ｒは、治療処置の１２週後及び２０週後の来院時に、電話を介して実施した。プロトコルの修正後、９人目の参加者から始めて、移植の直前及び２週後に腰椎穿刺によって脳脊髄液を採取した。盲検を評価するために、全ての参加者及び処置した医師に、移植来院の最後及び治験の最後の追跡調査来院時に、細胞投与だと思ったかそれともプラセボ投与だと思ったかを質問した。
【０２５９】
ＣＳＦの収集及び分析
【０２６０】
細胞投与（移植）前の治験来院５（図２２Ａ；全体を通じてＶ５）、及びその約２週間後の治験来院６（図２２Ａ；全体を通じてＶ６）のときに、標準的な腰椎穿刺によって、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の髄腔内投与、または細胞を含まないプラセボ投与を受けているＡＬＳ患者から脳脊髄液（ＣＳＦ）を採取した。
【０２６１】
細胞投与前及び移植２週後に腰椎穿刺によって収集した脳脊髄液（ＣＳＦ）は、直ちに１７５０ｇで１０分間遠心分離し、分注し、−８０℃で保存した。移植前及び移植後のサンプルが入手可能な治療処置患者の２６対のサンプル及びプラセボ患者の９対のサンプルを分析した。
【０２６２】
ＣＳＦの多重分析
【０２６３】
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘイムノアッセイ（米国カリフォルニア州サンタクララのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製のカスタマイズされたＰｒｏｃａｒｔａイムノアッセイ）を製造業者の説明書に従って使用して、バイオマーカーを分析した。検体特異的イムノアッセイビーズセットの平均蛍光強度は、フローベースのＬｕｍｉｎｅｘ３Ｄサスペンションアレイシステム（米国テキサス州オースティン、Ｌｕｍｉｎｅｘ）によって検出した。
【０２６４】
ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ
【０２６５】
市販のキットを製造業者の説明書に従って使用して、キトトリオシダーゼ（ＣＨＩＴ−１）のレベルを測定した。
【０２６６】
加えて、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、及びＬＩＦを検出するための市販のすぐに使えるＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。
【０２６７】
多重分析
【０２６８】
カスタムメイドの多重分析キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ｅＢｉｏｓｉｅｎｃｅ）を使用して、炎症性、神経栄養性及び他の因子をＣＳＦ中で検出した。
【０２６９】
ＣＳＦマイクロＲＮＡの定量化
【０２７０】
患者のＣＳＦの利用可能性が限られているので、治療処置前（Ｖ５）及び治療処置２週後（Ｖ６）のｍｉＲＮＡ発現を評価するために、レスポンダー、ノンレスポンダー及びプラセボ患者の等量のＣＳＦサンプルをプールした。プールの制限を最小限にするために、レスポンダー群は、治療処置に応答して、移植の少なくとも１２週後に１．５ポイント／月以上のＡＬＳＦＲＳ−Ｒの改善が見られた群と定義し、ノンレスポンダー群は、移植４週後に改善が見られなかった患者と定義した。
【０２７１】
各群内の患者からの等量のＣＳＦを一緒にプールして、合計１８０μｌをプールした。各プールに、担体として２μｇのＲＮＡグレードグリコーゲン（米国マサチューセッツ州ウォルサム、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、次いで、分子生物学用水（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｗａｔｅｒ）（Ｓｉｇｍａ）を最終体積が２００μｌになるまで添加した。プールに０．０３モルのＵｎｉＳｐ６（デンマーク、Ｅｘｉｑｏｎ）を添加し、次いで、ｍｉＲＣＵＲＹ  ＲＮＡ単離キット−バイオフルイド（デンマーク、Ｅｘｉｑｏｎ）を製造業者の説明書に従って使用してＲＮＡを単離した。
【０２７２】
ユニバーサルｃＤＮＡ合成キットＩＩ（デンマーク、Ｅｘｉｑｏｎ）を製造業者の説明書に従って使用して逆転写を行った。マイクロＲＮＡ  ｑＰＣＲ測定は、ＥｘｉＬＥＮＴ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス及びＬＮＡプライマー（両方とも、デンマーク、Ｅｘｉｑｏｎ）を使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ｉｉ（米国カリフォルニア州プレザントン、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって行った。各マイクロＲＮＡの発現は、ＵｎｉＳｐ６スパイクインの発現に対して相対的に計算した。
【０２７３】
ＣＳＦ中のグルタミン酸の定量化
【０２７４】
当分野において既知の２つの許容可能なアッセイを用いて、グルタミン酸のＨＰＬＣ及び比色アッセイを測定した。両方の方法とも、同様の相対結果を示した。比色アッセイはより良好な反復を示したので、この方法で分析を続けた。
【０２７５】
リルゾールが投与されていない患者と比較した、リルゾールが投与された患者におけるＡＬＳＦＲＳ−Ｒスコアの変化
【０２７６】
移植日にリルゾールが投与された患者と、リルゾールが投与されていない患者とを別々に分析し、移植後のＡＬＳＦＲＳ−Ｒスコアの変化に対するリルゾールの影響を評価した。ＡＬＳＦＲＳ−Ｒの合計スコアに対して、リルゾールの顕著な影響は観察されなかった。
【０２７７】
リルゾールが投与された患者では、２週後（１．０以上、及び１．５以上の閾値）、１６週後及び２４週後（２．５以上の閾値）を除く全ての時点で、レスポンダーの割合は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞群の方がプラセボ群よりも多かった。プラセボ群よりもＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を支持する１２週後での０．５ポイント以上のスコアで観察された変化は、統計的に有意であった（３８．９％対０；片側、ｐ＝０．０９）（データは示さず）。
【０２７８】
リルゾールが投与されていない患者では、８週後（０．５以上、及び１．５以上の閾値）、１２週後（１．５以上）、１６週後及び２４週後（０．５以上、及び１．５以上の閾値）を除く全ての時点で、プラセボと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞群において改善が見られた。また、２週後での０．５ポイント以上、及び１．０ポイント以上（片側、ｐ＜０．０９）、並びに、４週後での１．５ポイント以上（片側、ｐ＝０．０９）は、統計的に有意であった（図２７Ａ及び図２７Ｂ、データは示さず）。
【０２７９】
リルゾールが投与された患者、及びリルゾールが投与されていない患者の両方のサブグループにおいて、リルゾールが投与された患者のサブグループにおける８週後（７５％及び１００％の閾値）を除く全ての時点で、レスポンダーの割合は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞群の方がプラセボ群よりも多かった。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を支持する、リルゾールが投与されていない患者において２週後に観察された変化は、統計的に有意であった（片側、ｐ＝０．０６）。
【０２８０】
統計分析
【０２８１】
主な試験結果は、治療下発現ＡＥ（有害事象）及びＳＡＥ（重篤有害事象）の発生率、臨床検査の異常値、バイタルサイン、ＥＣＧ（心電図）及び身体検査に関する安全性評価であった。ＡＥは、ＭｅｄＤＲＡを用いてコード化した。
【０２８２】
統計分析計画（ＳＡＰ）における事前に指定された有効性分析には、モデルフィット最小二乗平均を用いた処置群間の治療処置前及び治療処置後のＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配の比較、並びに、ＭＳＣ−ＮＴＦ群とプラセボ群とを比較したレスポンダー分析が含まれる。レスポンダー分析は事前に指定されており、治療処置前と比較した、治療処置後の勾配の２０〜３０％の改善と定義されている。
【０２８３】
レスポンダー分析をさらに拡張するために、様々なレスポンダー閾値及び定義を使用した。カットオフを定義するための２つの方法を調べた。（１）ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配の正確な変化を１ヶ月あたりのポイントで定義する。（２）ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ治療処置後勾配の治療処置前勾配と比較したパーセント変化を用いる。各方法について、各回の追跡調査来院時に、移植後の勾配を移植前の勾配と比較し、レスポンダーについての閾値の範囲（０．５以上から２．５以上のポイント／月；及び２５％以上から１００％以上の変化）を定義した。
【０２８４】
３つの、事前に指定されたサブグループ分析には、ＡＬＳＦＲＳ−Ｒの全体の治療処置前スコアの変化（−２ポイント未満の「速い進行者」または−２ポイント以上の「遅い進行者」）；ＡＬＳＦＲＳ−Ｒの運動の治療処置前スコアの変化（−１ポイント未満対−１ポイント以上）；及びベースラインＳＶＣ（７０％未満）が含まれる。二次的目的及び探索的目的には、ＳＶＣ、ＨＨＤ及びＣＳＦ薬力学的マーカーの分析が含まれる。Ｐ値が０．０５未満（両側）であればＬＳ平均が統計的に有意である判断し、Ｐ値が０．０５未満（両側フィッシャーの正確確率検定）であればレスポンダー分析が統計的に有意であると判断した。
【０２８５】
ＣＳＦデータは、スチューデントのｔ検定または適用可能なＡＮＯＶＡ分析によって、有意性について統計的に評価された。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると見なされた。
【０２８６】
結果
【０２８７】
ＣＳＦ採集
【０２８８】
プロトコルの修正案の提出後、ＣＳＦの収集を開始した。移植前及び移植後の一対のサンプルのみを分析した。合計で、２６対の治療処置サンプルと、９対のプラセボサンプルとが分析に利用可能であった。
【０２８９】
ＡＬＳ患者のＣＳＦ中の神経栄養因子
【０２９０】
治療処置前及び治療処置２週後における、患者のＣＳＦサンプル中のＮＴＦを測定した。ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、及びＬＩＦのレベルは、治療処置患者のＣＳＦでは有意に増加したが、プラセボ患者のＣＳＦでは有意には増加しないことが分かった（範囲ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．００１、表２）。このことは、治療処置２週後の細胞の存在及びその活性を示し、これは、神経保護因子の継続的な分泌から明らかである。
【０２９１】
表２：治療処置後のＭＳＣ‐ＮＴＦ細胞からＡＬＳ患者のＣＳＦ中への神経栄養因子の分泌
【０２９２】
【表２】
2019527218.tif 000005
【０２９３】
ＶＥＧＦ、ＨＧＦ及びＬＩＦの有意な増加が移植後に観察された（図２３Ａ〜２３Ｆ）。ＶＥＧＦの平均基礎レベルは、治療処置患者では３７．１±１５．８ｐｇ／ｍｌ（平均±ＳＥＭ）であり、プラセボ患者では３０．６±１４．４ｐｇ／ｍｌであった。移植後、平均ＶＥＧＦ増加は、治療処置患者では６２９．８２±２４３．３５２（ｐ＝０．０１６）、プラセボ患者では−０．７８±０．９９５（ｐ＝０．４５）であった（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。ＣＳＦは、高い基礎レベルのＨＧＦを有することが分かった（治療処置患者では３９１．１±１１５．９ｐｇ／ｍｌ；プラセボ患者では４４８．４±１４６．３ｐｇ／ｍｌ）。移植後、ＨＧＦレベルは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された参加者では有意に増加したが（１０７．１８±３４．４４４；ｐ＝０．００４６）、プラセボ群の参加者ではほとんど変化しなかった（１８．８２±２２．２５；ｐ＝０．４２）（図２４Ｃ及び図２４Ｄ）。ＬＩＦは、移植前のＣＳＦでは検出されなかったが、治療された参加者では移植後に有意に増加した（１２．３３＋３．２２７；ｐ＝０．０００８）。一方、プラセボ群では、移植前でも移植後でもＬＩＦは検出されなかった（図２３Ｅ及び図２３Ｆ）。
【０２９４】
ＡＬＳ患者のＣＳＦ中の炎症性因子とアポトーシス促進性バイオマーカー
【０２９５】
膨大な証拠は、ＡＬＳの発症と進行における炎症過程の関与を示している。ＣＳＦ中の炎症性因子の存在を、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞による治療処置の前後に分析した。炎症性因子のレベルの統計的に有意な減少は、治療処置患者のＣＳＦでは見られたが、プラセボ患者では見られなかった（表３）。このことは、治療処置２週後での、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の存在及びその継続的な免疫調節及び抗炎症効果を示している。治療処置２週後での、プラセボ患者では見られない治療処置患者のＣＳＦ中の高レベルの神経栄養因子の存在は、観察された有効性シグナルの原因となる治療処置患者のＣＳＦ中のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の持続を明確に示す。
【０２９６】
表３：ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞による治療処置後のＡＬＳ患者のＣＳＦ中の炎症性因子及びカスパーゼ３の調節
【０２９７】
【表３】
2019527218.tif 000006
【０２９８】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された参加者において観察された、試験した炎症性マーカー（ＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１、及びＣＨＩＴ−１）のいくつかの有意な減少を示す移植後の結果を、図２４Ａ、図２４Ｃ、図２４Ｅに示す。なお、プラセボ群では、変化は観察されなかった（図２４Ｂ、図２４Ｄ、図２４Ｆ）。ＭＣＰ−１の基礎レベルは、治療された参加者では４２．２±９．４ｐｇ／ｍｌ、プラセボ群では４０．５±９．５ｐｇ／ｍｌであった。移植後、平均ＭＣＰ−１レベルは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された参加者では有意に減少したが（−１７．２９±１．８３ｐｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０００１）、プラセボ群では有意な変化は観察されなかった（−０．８９±２．２９ｐｇ／ｍｌ；ｐ＝０．７）（図２４Ａ及び図２４Ｂ）。ＭＳＣ−ＮＴＦで治療された参加者とプラセボ群との間の移植後の差は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１）。ＳＤＦ−１αの平均基礎レベルは、ＭＳＣ−ＮＴＦで治療された参加者では１９５．６±３１．１ｐｇ／ｍｌ、プラセボ群では２００．８±１４．９９ｐｇ／ｍｌであった。移植後、ＳＤＦ−１αは、ＭＳＣ−ＮＴＦで治療された参加者では有意に減少したが（−４６．５７±１２．９３ｐｇ／ｍｌ；ｐ＝０．００１４）、プラセボ群では変化しなかった（０．２７±５．０４９ｐｇ／ｍｌ；ｐ＝０．９６）（図２４Ｃ及び図２４Ｄ）。治療処置群とプラセボ群との間の移植後の差は、統計的に有意であった（ｐ＝０．０４）。治療処置群とプラセボ群との両方で、ＭＩＰ−１β及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルにおける移植後の有意な変化は見られなかった（データは示さず）。
【０２９９】
アポトーシスの重要なメディエータの１つであるカスパーゼ３のレベル。興味深いことに、カスパーゼ−３は、ＭＳＣ−ＮＴＦで治療された参加者では移植後に有意に減少したが（−２．０９＋０．４２９；ｐ＜０．０００１）、プラセボ群では有意に減少しなかった（−０．９１＋０．９２２；ｐ＝０．３５）。
【０３００】
ＣＲＰとＭＩＰ−１βについて最小の差が観察された（それぞれ、図２４Ｇ及び図２４Ｈ、図２４Ｉ及び図２４Ｊ）。
【０３０１】
ＣＳＦ神経栄養因子と炎症性バイオマーカー因子との間の相関
【０３０２】
ＣＳＦ中の神経栄養因子の増加と炎症性因子の減少との間の統計的に有意な相関は、治療処置患者では確認されたが、プラセボ患者では確認されなかった（表４）。このことは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から分泌されたＮＴＦが、ＣＳＦ中の炎症性因子のレベルの減少に対して直接的に作用することを示す。
【０３０３】
表４：ＮＴＦの増加と炎症マーカーの減少との間の相関＊
【０３０４】
【表４】
2019527218.tif 000007
【０３０５】
＊Ｐ値はＡＮＯＶＡによって計算された。強調表示されたセル内のＰ値は統計的に有意である。＊ＮＡは該当なし
【０３０６】
移植２週後における、ＶＥＧＦとＭＣＰ−１との間（相関−０．５６、ｐ＝０．００３、図２５Ａ及び図２５Ｂ）、ＶＥＧＦとＳＤＦ−１ａとの間（相関−０．７７、ｐ＜０．０００１）、ＨＧＦとＳＤＦ−１ａとの間（相関−０．４１、ｐ＝０．００４）、ＬＩＦとＳＤＦ−１との間（相関−０．５３、ｐ＝０．００５）、及び、ＬＩＦとＭＣＰ−１との間（相関−０．４２２、ｐ＝０．０３４）での統計的に有意な逆相関（表３）が、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された参加者では観察されたが、プラセボ群では観察されなかった。
【０３０７】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞による治療処置後のＣＳＦにおける、ＶＥＧＦの増加とＭＣＰ−１の減少との間に検出された統計的に有意な逆相関（ｐ＜０．０１）により、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の生物学的機能（作用機序）が複数の栄養因子の分泌によって媒介されることが、インビボで初めて証明された（図２５Ａ及び図２５Ｂ）。
【０３０８】
レスポンダー分析（有効性分析）
【０３０９】
全ての参加者、及び緩徐進行者を除く事前に指定されたサブグループにおける平均勾配変化
【０３１０】
治療処置前のＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配は、２つの群で同様であった：−０．７ｐｔｓ．／ｍｏ.（ＭＳＣ−ＮＴＦ群）及び−０．６ｐｔｓ.／ｍｏ.（プラセボ群）。移植後のＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配の変化は、２週後では、＋１．７ｐｔｓ．／ｍｏ．（ＭＳＣ−ＮＴＦ）及び−０．４ｐｔｓ／ｍｏ（プラセボ）であり（ｐ＝０．１１０）、４週後では、＋０．６ｐｔｓ．／ｍｏ．（ＭＳＣ−ＮＴＦ）及び−０．０３ｐｔｓ．／ｍｏ．（プラセボ）であった（ｐ＝０．３６８）。８週後では、治療処置前の勾配と比較した勾配変化は、各群で同様であった（図２６Ａ）。
【０３１１】
ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ合計スコアの変化
【０３１２】
緩徐進行者を除いた母集団についてのＡＬＳＦＲＳ−Ｒ合計スコアの変化の結果を表７に示す。ベースラインからのＬＳ平均の変化は、２週後（ＬＳ平均：０．９０対−１．２０）、４週後（ＬＳ平均：０．５０対−１．００）及び１６週後（ＬＳ平均：−３．４０対−７．８０）の追跡調査時点で、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞群がプラセボと比較して改善したことを示した。２週後、４週後、及び１６週後の追跡調査時点で、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞群を支持するＬＳ平均差に基づく統計的に有意な改善が観察された（それぞれ、ｐ＝０．０２、０．１０、０．１５）。緩徐進行者を除いた被験者についてのＡＬＳＦＲＳ−Ｒ合計スコアのＬＳ平均変化のグラフ表示を図２６Ｃ、図２６Ｄ、及び図２７Ｅに示す。
【０３１３】
緩徐進行者を除く（すなわち、スクリーニングからベースラインまでの３ヶ月間にＡＬＳＦＲＳ−Ｒスコアの減少が２ポイント未満であった者を除く）事前に指定されたサブグループでは、ＭＳＣ群の参加者は１５人であり（４２％）、プラセボ群の参加者は６人（５０％）であった。このサブグループの分析では、治療処置前のＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配は同程度であった：ＭＳＣ−ＮＴＦ群では−１．５、プラセボ群では−１．２（ｐ＝０．２３２）。ＭＳＣ−ＮＴＦ群とプラセボ群との間の移植後ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配から移植前勾配を差し引いたＬＳ平均の比較結果は、２週後及び４週後で、ＭＳＣ−ＮＴＦ群において有意な改善を示し（それぞれ、＋３．３対−１．３；ｐ＝０．０２１、＋２．０対−０．１；ｐ＝０．０３３）、また、残りの全ての時点でＭＳＣ−ＮＴＦ群における改善の継続的な傾向を示した（図２６Ｂ）。
【０３１４】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞からＣＳＦ中に分泌された神経栄養因子と治療処置患者の臨床反応との間の相関の分析において、ＡＬＳＦＲＳ−Ｒスコア（ＡＬＳ疾患進行の有効な結果尺度）によって評価すると、移植８週後での移植前ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配と比較した５０％の改善によって決定されるように、治療処置に応答した患者のＣＳＦ中でＶＥＧＦが有意に増加していることが分かった（図２３Ａ〜図２３Ｂ、図２３Ｇ）。ＣＳＦ中の他の神経栄養因子のレベルの増加、炎症性因子レベルの減少、及び臨床反応の間の相関は、応答患者集団の対非応答患者集団に対する明らか変化への明白な傾向を示唆する（図２４Ｇ）。プラセボ患者のＣＳＦ中では、神経栄養因子または炎症性因子のレベルの変化は検出されなかった（図２４Ｇ）。
【０３１５】
ＡＬＳＦＲＳ−Ｒレスポンダー解析、治療意図母集団
【０３１６】
事前に指定されたレスポンダー分析は、治療処置前の勾配と比較した治療処置後のＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配における改善率と絶対ポイント改善／月との両方を調べた。前者では、２５％、５０％、７５％及び１００％の改善を達成した患者を調べた。神経学者は、勾配の２５％の改善は、少なくとも多少は臨床的に意味があると見なし、勾配の５０％の改善は、臨床的に非常に意味があると見なしている（Castrillo-Viguera et al, Amyotrophic Lateral Sclerosis 2010; 11:178-180）。
【０３１７】
「レスポンダー」の全ての定義にわたって、そして１つの研究時点を除いて、レスポンダーの割合は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ）の治療処置患者の方がプラセボ患者よりも高かった。一例として、治療処置の１２週後では、プラセボ患者においてはわずか１７％であったの対して、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ）群の被験者の４０％は、治療処置前と比較して、治療処置後のＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配が少なくとも５０％改善した。
【０３１８】
静的肺活量（ＳＶＣ）勾配−レスポンダー分析の変化
【０３１９】
勾配が少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、５０％、７５％、及び１００％変化（改善）した患者の頻度及び割合を、フィッシャーの正確確率検定を用いて処置群間で比較した。２５％、５０％、７５％、及び１００％の閾値での結果のみを要約した。
【０３２０】
２週間から２４週間の追跡調査期間にわたって、ＳＶＣにおける移植前の勾配と比較した移植後の改善率に基づいて、レスポンダーであった患者の割合を測定した。１００％以上の改善という高い閾値では、４週間から２４週間の追跡調査時点で、レスポンダーの割合は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された患者の方がプラセボ患者よりも高かった。少なくとも２５％、５０％、７５％、１００％の改善が見られたレスポンダーでは、２週後及び２４週後を除く全ての時点（５０％の閾値）で、レスポンダーの割合は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された患者の方がプラセボ患者よりも高かった。そして、その差は、１６週後の追跡調査時点では、５０％閾値に対して統計的に有意であった（片側、ｐ＝０．０９）。他の時点で観察された変化は、統計的に有意ではなかった。ＳＶＣスコアが１００％以上改善した患者の割合のグラフ表示を図２７Ｃに示す。
【０３２１】
移植後のＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配において、移植前と比較して、１．５ポイント以上／月の正の変化を示したレスポンダー
【０３２２】
治療処置前勾配と比較したＡＬＳＦＲＳ−Ｒ治療処置後勾配における絶対ポイント改善／月に基づいて治療処置に対する応答を経時的な評価した場合、この場合もやはり、ＭＳＣ−ＮＴＦ（ＮｕｒＯｗｎ）治療効果の強力な証拠が存在した。
【０３２３】
ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ移植後勾配において、移植前と比較して１．５ポイント以上／月の正の変化によって定義されるレスポンダーは、全ての時点で、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞群の方がプラセボ群よりも高い割合で観察された。この差は、４週後において有意であった（ＭＳＣ−ＮＴＦ４７％、プラセボ９％、ｐ＝０．０３３、図２７Ａ）。
【０３２４】
緩徐進行者を除いた亜集団では、レスポンダー（１．５ポイント以上／月の改善として定義される）は、全ての時点で、ＭＳＣ−ＮＴＦ群の方がプラセボ群よりも高い割合で観察されたが観察された；２週後（７３％対２０％）、４週後（８０％対０％）、８週後（５３％対２０％）、１２週後（５３％対０％）、１６週後（４７％対０％）、２４週後（２７％対０％）。この差は、４週後（ｐ＝０．００４）及び１２週後（ｐ＝０．０４６、図２７Ｂ）において有意であった。
【０３２５】
移植後のＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配が移植前と比較して１００％以上改善したレスポンダー
【０３２６】
８週後を除く全ての追跡調査来院時では、疾患の進行が停止した者、またはＡＬＳＦＲＳ−Ｒが実際に安定化または改善した者と定義されるレスポンダーの割合は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞治療処置群の方がより高いことが観察された（移植後のＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配が、移植前と比較して１００％以上改善）（図２８Ａ）。
【０３２７】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ）が疾患の進行を遅らせると考えられると仮定し、疾患がゆっくり進行している被験者を除外するために事前に指定されたサブグループを定義した（治療処置前段階で、ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配が−０．７以上と定義される）。これらの被験者は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ）から、検出可能な利益を得る可能性は低いであろう。この研究における被験者の約半分を含む、より急速に進行しているサブグループは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ）治療からの著しい利益を示した。緩徐進行者を除いた亜集団では、全ての追跡調査来院において、レスポンダーの割合は、ＭＳＣ−ＮＴＦ群の方がプラセボ群よりも高いことが観察された；２週後（９３％対２０％）、４週後（８０％対２０％）、８週後（５３％対２０％）、１２週後（４７％対１７％）、１６週後（４０％対０％）、２４週後（２７％対０％）。この差は、２週後（ｐ＝０．００５）及び４週後（ｐ＝０．０３１）において、統計的に有意であった（図２８Ｂ）。
【０３２８】
図２８Ａは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ）で治療された患者に見られる利点を示す。レスポンダーは、治療処置後勾配が治療処置前勾配と比較して１００％改善したという非常に高い閾値を用いて定義した。これは、被験者が、疾患を安定化させるか、またはレスポンダーとして定義されるために改善される必要があることを意味する。図２８Ａは、プラセボと比較した場合の、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ）で治療された患者の短期的利益及び長期的利益の両方を実証する。
【０３２９】
ＭＣＰ−１と治療処置後のＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配との間の相関
【０３３０】
移植２週後のＭＣＰ−１レベルの減少と、移植後の疾患進行が移植前勾配と比較して遅くなることとの間に、統計的に有意な相関が観察された。治療処置の４週後、１２週後、１６週後及び２４週後に、有意な相関（ｐ＜０．０５）が見られた（図２９Ａ及び図２９Ｂ、１２週後での相関）。このことは、より高いレベルのＭＣＰ−１レベルが、ＡＬＳ疾患の進行に寄与し得ることを示唆する。
【０３３１】
バイオマーカー
【０３３２】
ＮＴＦ及び炎症性因子の変化を示すデータの要約において、ＭＳＣ−ＮＴＦで治療された患者のＣＳＦ中のＮＴＦレベルが有意に増加したことが分かった。プラセボ患者のＣＳＦ中のＮＴＦレベルの有意な変化は観察されなかった。
【０３３３】
ＣＮＳ及び体循環における炎症は、ＡＬＳの病因における重要な因子であると考えられている。試験した炎症性マーカー（ＭＣＰ−１及びＳＤＦ−１）のいくつかにおいて移植後の有意な減少が、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された患者で観察されたが、プラセボ群では変化は観察されなかった。このことは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から分泌されたＮＴＦが、これらの炎症性因子のレベルを調節することを示唆する。
【０３３４】
さらに、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞治療処置群では、ＮＴＦの増加と炎症性因子の減少との間に統計的に有意な相関が見られたが、プラセボ群では、これらのバイオマーカーの間に相関は見られなかった。このことは、炎症マーカーにおける治療の直接的な影響を示唆している。
【０３３５】
加えて、ＡＬＳＦＲＳ−Ｒスコアと、神経炎症に影響を及ぼすことが分かっているミクログリアまたは浸潤マクロファージによって合成される酵素であるＣＨＩＴのＣＳＦレベルとの間に統計的に有意な逆相関が確認された。このことは、ＣＨＩＴが、ＡＬＳの診断とその経過観察との両方のための推定バイオマーカーとして開発できることが示唆している。実際、ＣＳＦ中のＣＨＩＴ−１の正常レベルは８０〜１、２５０ｐｇ／ｍｌ（平均９８２＋２４５、Ｖａｒｇｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ.２０１３）の範囲であると報告されているが、ＡＬＳ患者ではベースラインレベルは正常レベルよりも約２０倍高く、１、６００〜１０７、６００ｐｇ／ｍＬの範囲であることがわかった。来院５（移植前）及び来院６（移植後）間における、ＮＴＦ及び潜在的なＡＬＳ炎症性バイオマーカー（ＣＨＩＴ、ＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＳＤＦ−１）及びカスパーゼ−３（アポトーシス促進因子）のレベルの平均変化を測定した（データは示さず）。
【０３３６】
ＣＳＦ中のｍｉＲＮＡ発現の調節
【０３３７】
特定のｍｉＲＮＡが、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において異なるレベルの発現を有することが判明した。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞におけるｍｉＲ−３４ａ及びｍｉＲ−１３２の発現は、ＭＳＣと比較して増加する（本明細書に完全に援用されるＷＯ２０１４／０２４１８３号を参照）。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において、ｍｉＲ−３７６ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、及びｍｉＲ−１４６ａが発現する（本明細書に完全に援用されるＷＯ２０１４／０２４１８３号を参照）。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において、ｍｉＲ−１２６及びｍｉＲ−９は、発現しないか、または発現量は非常に低い（本明細書に完全に援用されるＷＯ２０１４／０２４１８３号を参照）。
【０３３８】
患者のＣＳＦの量が限られているため、レスポンダー、ノンレスポンダー及びプラセボ患者の均質なグループのサンプルをプールして、治療処置前（Ｖ５）及び治療処置２週後（Ｖ６）のｍｉＲＮＡレベルを評価した。具体的には、個々のＣＳＦサンプルを次のようにプールした。レスポンダーＶ５（ｎ＝６）、レスポンダーＶ６（ｎ＝６）、ノンレスポンダーＶ５（ｎ＝９）、ノンレスポンダーＶ６（ｎ＝９）、プラセボＶ５（ｎ＝９）、プラセボＶ６（ｎ＝９）。
【０３３９】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において高度に発現するｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ３７６ａ−３ｐ、及びｍｉＲ−１４６ａ−５ｐの発現を測定した（データは示さず）。正規化のためにサンプルに添加した非ヒト外因性ｍｉＲＮＡに対して発現の測定を行った。ＣＳＦからＲＮＡを抽出する前に、一定量の非ヒトｍｉＲＮＡを分析対象の等量（同量）の各ＣＳＦサンプルに添加し、分析対象の標的ｍｉＲＮＡの発現を正規化するのに用いた。これらのｍｉＲＮＡは、治療処置後に、ＭＳＣ−ＮＴＦで治療された患者では増加するが、プラセボ患者では増加しないことが分かった（図３０Ａ、図３０Ｂ、図３０Ｃ、図３０Ｄ、及び図３０Ｅ）。興味深いことに、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ３７６ａ−３ｐ及びｍｉＲ−１３２の基礎レベルは、レスポンダー患者と比較して、ノンレスポンダーにおいて著しく低かった（図３０Ａ、図３０Ｂ、及び図３０Ｄ）。
【０３４０】
加えて、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１５５及びｍｉＲ−５７７を含む、ＡＬＳに影響を及ぼすことが知られているｍｉＲＮＡの発現を測定した。ＡＬＳ患者のＣＳＦ中には、ｍｉＲ−１５５及びｍｉＲ−５７７は検出されなかった。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞では発現しないｍｉＲ−９−５ｐは、治療処置後では、いずれの群においても有意に変化しなかった（図３０Ｆ）。加えて、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において発現量が低いかまたは発現しないｍｉＲ−１２６は、ノンレスポンダーにおいて発現の増加を示した（図３０Ｇ）。
【０３４１】
結果は、レスポンダー及びノンレスポンダーの患者におけるいくつかのｍｉＲＮＡの様々な発現を示す。
【０３４２】
上記のｍｉＲＮＡデータに基づく結論は、下記の（１）及び（２）を含む。（１）治療処置患者においてのみ観察された、ＭＳＣ−ＮＴＦから分泌されることが知られているｍｉＲＮＡの発現レベルの増加は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の生物学的機能のさらなる証拠である。（２）ｍｉＲＮＡの調節された発現は、抗炎症効果及び神経支持効果を示唆する。
【０３４３】
ＣＳＦ中のグルタミン酸濃度
【０３４４】
プラセボサンプル及びＭＳＣ−ＮＴＦサンプルにおけるＣＳＦのグルタミン酸濃度を、細胞投与の２週前（Ｖ５）及び２週後（Ｖ６）に分析した。図３１は、ＨＰＬＣ及び比色アッセイを用いて検出された、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で治療された患者のＣＳＦ中のグルタミン酸の有意なレベル上昇を示す。プラセボＣＳＦサンプルでは、変化は観察されなかった。
【０３４５】
さらに、図３２に示す表は、治療処置後にグルタミン酸の最も有意な倍率変化を示した７人の治療処置患者をハイライトしている（５２４、６０５、６０８、６１３、７０２、７１１、７１５）。これらの患者は全て、少なくとも２週後の時点でレスポンダーであり、患者６０５、６１３及び７１１は全ての時点でレスポンダーであり、患者７１５及び６０８は１６週後まではレスポンダーであった。グルタミン酸が移植細胞から放出されたのか、それとも患者自身から放出されたのかは不明であるが、グルタミン酸のレベル上昇は無害であったように思われる。
【０３４６】
全ての患者についてのグルタミン酸の結果の欠如は、一部の患者において比較的少量のＣＳＦが残っていたことに起因する。
【０３４７】
静的肺活量（ＳＶＣ）
【０３４８】
治療処置前の勾配と比較した治療処置後の勾配の変化の分析、及び様々な閾値を用いたレスポンダー分析では、２つの処置群間に有意な差は示されなかった。緩徐進行者を除外しても、分析には影響を及ぼさなかった。
【０３４９】
ハンドヘルドダイナモメトリ（Hand Held Dynamometry：ＨＨＤ）
【０３５０】
ＨＨＤによって測定した、ＩＭ移植腕と非注射腕との筋力の比較は、２４週間にわたってＨＨＤスコア勾配の有意な患健側差を示さなかった。
【０３５１】
安全性と耐容性
【０３５２】
この試験は、その安全性と耐容性の主要評価項目を満たした。４３人の参加者（９０％）が、来院対面で追跡調査期間を完了した（３３人：ＭＳＣ−ＮＴＦ、１０人：プラセボ）。５人の参加者が来院対面での追跡調査を中止した。その５人のうち、２人が電話による遠隔追跡調査を完了した（図２２Ｃ）。試験中の死亡、治療関連ＳＡＥ、及び試験の脱落につながったＡＥはなかった。ＭＳＣ−ＮＴＦ治療処置群の２人の参加者は、治療処置の約４ヶ月後に、栄養チューブの留置後の呼吸不全のために気管切開手術を受けた。
【０３５３】
ＭＳＣ−ＮＴＦまたはプラセボの送達に関連する有害事象は一過性であり、頭痛（７５％ＭＳＣ−ＮＴＦ；５０％プラセボ）、発熱（３３％ＭＳＣ−ＮＴＦ；０％プラセボ）、腰痛（７２％ＭＳＣ−ＮＴＦ；８％プラセボ）、及び注射部位のあざ（３０．６％ＭＳＣ−ＮＴＦ；２５％プラセボ）を含む（表５）。
【０３５４】
表５：処置群ごとの有害事象（ＡＥ）及び重篤有害事象（ＳＡＥ）の総合的な要約−安全集団＊
【０３５５】
【表５】
2019527218.tif 000008
【０３５６】
略語：ＳＡＥ＝重篤有害事象；ＴＥＡＥ＝治療下発現有害事象。パーセンテージは、分析対象の母集団における所与の処置群の参加者数（Ｎ）に基づいている。有害事象の開始日／開始時間が細胞移植の開始日／開始時間以降である場合、または細胞移植の開始後に重症度が悪化した場合、有害事象はＴＥＡＥと見なされる。［１］治療関連ＴＥＡＥは、治験薬に対して、可能性大、可能性あり、または確実な関係を有すると考えられるＴＥＡＥである。
【０３５７】
ＡＥ及びＳＡＥは、器官別大分類によって表６に要約した。研究の過程で、１１人の参加者（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞群における９／３６（２５％）、及びプラセボ群における２／１２（１７％））が、１６のＳＡＥを発症した（表７）。試験エントリー後、かつ治験前に、２つのＳＡＥが発生した。治療下発現重篤有害事象（ＴＥ−ＳＡＥ）は全て、ＡＬＳ疾患の進行に関連しており、治療関連重篤有害事象（ＴＲ−ＳＡＥ）は試験中には観察されなかった（治験薬に対して、可能性大、可能性あり、または確実な関係を有すると考えられるＴＥ−ＳＡＥ）。試験中の安全性臨床検査（血液学的検査、化学的検査、尿検査）では、臨床的に有意な異常は確認されなかった。
【０３５８】
表６：試験群と種類ごとの、治療下発現有害事象を有する参加者の割合（いずれの群でも＞１５％）
【０３５９】
【表６】
2019527218.tif 000009
【０３６０】
表７：試験群と種類ごとの、治療下発現重篤有害事象を有する参加者の人数と割合
【０３６１】
【表７】
2019527218.tif 000010
【０３６２】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ）は、安全で良好な耐容性を有し、有害事象の大部分は軽度または中程度であり、かつ一過性であることが分かった（上記の表６及び表７を参照）。
【０３６３】
この試験では死亡は報告されず、有害事象のために参加を中止した患者もいなかった。アクティブ治療処置群とプラセボ群との両方における全ての患者が、少なくとも１つの治療下発現有害事象を経験した。両方の群において、有害事象の強度の傾向は、軽度から中程度であった。盲検研究者によって決定された治療関連の有害事象は、プラセボ処置患者よりもアクティブ治療処置患者の方が若干より頻繁に発生し、９７．２％対７５．０％であった。頻度における最大の差異は、注射部位の痛みと背中の痛みの局所的な反応、及び発熱、頭痛、及び関節痛の全身性の反応であった。有害事象のパターンは、移植に対する一過性反応と一致している。これらの有害事象は、本質的に軽微で自己限定的なものであった。治療処置後の重篤有害事象（ＳＡＥ）は、プラセボ患者（１／１２、８．３％）よりもアクティブ治療処置患者（８／３６、２２．２％）において、より頻繁に発生する傾向があった。大部分のＳＡＥは、基本的なＡＬＳの進行、最も一般的には嚥下障害に関連していた。治験に関連したＳＡＥはなかった。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のリスク対効果比は依然として正であった。
【０３６４】
盲検の妥当性
【０３６５】
処置の直後に質問したところ、治療処置群の参加者の８５％及びプラセボ群の８２％がＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の投与を受けたと思っており、試験の終了時には、各処置群のそれぞれ５１％及び５０％が、ＭＳＣ−ＮＴＦの投与を受けたと思っていた。移植直後には、研究者らは、アクティブ治療処置群の８９％及びプラセボ群の５０％がＭＳＣ−ＮＴＦの投与を受けたと思った。研究者の意見は、試験終了時でも同様であった（それぞれ８２％及び６０％）。
【０３６６】
結論
【０３６７】
ＡＬＳ患者に髄腔内移植された自己ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、インビボでＣＳＦ中にＮＴＦを活発に分泌し、治療処置患者のＣＳＦ中の炎症性因子のレベルの有意な減少をもたらす。プラセボ患者のＣＳＦでは、ＮＴＦレベルの変化も炎症性因子レベルの変化も検出されなかった。
【０３６８】
ＮＴＦの分泌はまた、細胞からのＮＴＦの分泌の増加、移植２週後の炎症性因子の減少、及びＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配の移植後の改善の間の相関によって決定されるように、疾患進行の変化とも相関した。炎症性因子は、実際にはＡＬＳの病理に関与していると考えられる。
【０３６９】
さらに、主な目的は達成され、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が、安全性及び良好な耐容性を有することが実証された。
【０３７０】
この実施例で得られたデータが示すように、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ（登録商標））の単回投与は、ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ評価尺度及びＣＳＦバイオマーカーの両方に関して臨床的に意義のある有益な反応を生成させた。
【０３７１】
「レスポンダー」の全ての定義にわたって、２４週後の時点を除いて、治療意図（ＩＴＴ）集団において、レスポンダーの割合は、ＭＣＳ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ（登録商標））治療処置患者の方がプラセボ患者よりも高かった。
【０３７２】
緩徐進行患者を除いた事前に指定されたサブグループ分析において、ＭＣＳ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ（登録商標））治療処置患者はプラセボ処置患者と比較して顕著な良好な成績を示した。
【０３７３】
２週後に観察されたＣＳＦ中の増殖因子レベルの増加及び炎症マーカーの減少は、生物学的効果のさらなる証拠である。
【０３７４】
実施例４
ＡＬＳ用のバイオマーカーとしてのキトトリオシダーゼ
【０３７５】
キトトリオシダーゼ（ＣＨＩＴ１）とＡＬＳＦＲＳ−Ｒとの間の相関
【０３７６】
上記の実施例３は、ＡＬＳ患者におけるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（ＮｕｒＯｗｎ（登録商標））の第ＩＩ相試験を説明している。上述したように、患者は、筋肉内注射及び髄腔内注射の組み合わせ（ｎ＝３６）によるＮｕｒＯｗｎ（登録商標）細胞の投与、またはプラセボ（ｎ＝１２）の投与を受けるように無作為化された。患者は、移植前の約３ヶ月間及び移植後の６ヶ月間、毎月追跡調査された。ＣＳＦは、移植の直前（Ｖ５）及び移植２週後（Ｖ６）にＡＬＳ患者から収集した。
【０３７７】
方法及び結果
【０３７８】
幅広い検出範囲を有するＥＬＩＳＡ市販キットを使用して、実施例３からの被験者のＣＳＦ中のＣＨＩＴ−１を検出した。ＣＨＩＴ−１のベースライン（治療処置前、Ｖ５）レベルと、ＡＬＳ−ＦＲＳ−Ｒ（ＡＬＳ疾患進行の有効な結果尺度）との間に統計的に有意な逆相関が観察された（図３３）。
【０３７９】
さらに、治療処置前の３ヶ月間（すなわち、治療処置前の勾配）におけるＡＬＳＦＲＳ−Ｒ勾配の変化（図３４）及び静的肺活量（ＳＶＣ、肺機能の尺度、図３５）の向上から明らかなように、治療処置前のＣＨＩＴ−１レベルとＡＬＳの進行速度との間に有意な逆相関が観察された。
【０３８０】
結論
【０３８１】
現在、ＡＬＳ疾患の進行の診断及び追跡調査に使用できるバイオマーカーは存在しない。結果は、ＣＳＦ中のキトトリオシダーゼ（ＣＨＩＴ−１）レベルが、ＡＬＳ疾患の診断及び進行についてのバイオマーカーとして使用できることを示す。
【０３８２】
実際、ＣＳＦ中のＣＨＩＴ−１の正常レベルは、８０〜１、２５０ｐｇ／ｍｌの範囲で、平均が９８２±２４５（ｎ＝１１）であると報告されているのに対し、ＡＬＳ患者での検出レベルは正常レベルよりも２０倍高く、約１、６００〜１０７、６００ｐｇ／ｍｌの範囲で、平均が３０、１７１±２５、８９７（ｎ＝３４）であった。
【０３８３】
実施例５
脂肪由来ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞
【０３８４】
目的：他の組織から単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞になるように誘導できるか否かを評価すること。
【０３８５】
方法及び結果：
【０３８６】
ＭＳＣを、血小板増殖培地（ＰＭ）中で増殖させた健康なドナーの脂肪組織（ＡＴＣＣ）から単離し、次いで、ＢＭ由来ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞からＮＴＦの分泌を誘導するのに使用した方法（例えば、実施例１参照）を用いて、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの神経栄養因子（ＮＴ）を分泌するように誘導した。
【０３８７】
脂肪由来ＭＳＣ（ＡＤ−ＭＳＣ）から分化するように誘導された脂肪由来ＭＳＣ−ＮＴＦ（ＡＤ−ＭＳＣ−ＮＴＦ）細胞からのＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ、及びＨＧＦの分泌を測定した。測定結果は、健康なドナーのＢＭ−ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から以前に得られた値の範囲内であった（表８）。ＡＤ−ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＮＴＦの分泌量は、分化前の同一の被験体のＭＳＣと比較して３〜４３倍であった。
【０３８８】
脂肪由来ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞をフローサイトメトリーによって特徴付けた。これにより、全ての骨髄（ＢＭ）由来ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の特徴的な陽性マーカーは発現したが、陰性マーカー（ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ）は発現しないことが分かった。ＣＤ９０、ＣＤ７３、及びＣＤ４４は、＞９６％の脂肪由来ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において発現した。ＣＤ１０５は、少なくとも９１．８％の脂肪由来ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で発現した（表９）。全ての陰性マーカーの発現は、１．８３％未満であった（表９）。また、ＣＤ４９ａの発現も、ＢＭ由来ＭＳＣ及びＭＳＣ−ＮＴＦ細胞について示されたものと同様であった（表９）。
【０３８９】
表８：ドナーＢＭ−ＭＳＣと比較した、解凍ＡＤ−ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の特定生産性
【０３９０】
【表８】
2019527218.tif 000011
【０３９１】
表９：ＡＤ−ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の表現型
【０３９２】
【表９】
2019527218.tif 000012
【０３９３】
ＡＤ−ＭＳＣ及びＡＤ−ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＣＤ４４及びＣＤ７３  ＭＦＩの調節
【０３９４】
ＣＤ４４及びＣＤ７３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の調節は、ＢＭ由来ＭＳＣ及びＭＳＣ−ＮＴＦ細胞で観察されたものと同様であった（図３６）。表１０は、様々なピークのＭＦＩを示す。
【０３９５】
表１０
【０３９６】
【表１０】
2019527218.tif 000013
【０３９７】
ＣＤ４４平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、分化前のＡＤ−ＭＳＣの１３６から、ＡＤ−ＭＳＣ−ＮＴＦの３４．７（０．２６の比率、図１）に下方制御された。ＣＤ７３は、分化前のＡＤ−ＭＳＣの８８．５から、ＡＤ−ＭＳＣ−ＮＴＦの１５５に上方制御された（１．７５の比率、図３６）。これらの比率は、同日に同一の実験条件下で分析された骨髄由来ＭＳＣ及びＭＳＣ−ＮＴＦ細胞について得られたものと一致する（それぞれ、比率は０．５９、１．８）。
【０３９８】
結論：脂肪組織由来のＭＳＣは、骨髄由来のものと同一の特徴を有するＭＳＣ−ＮＴＦ分泌細胞に分化するように誘導することができる。
【０３９９】
実施例６
ＮＴＦ細胞由来の歯髄幹細胞
【０４００】
目的：歯髄から単離した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）がＭＳＣ−ＮＴＦ細胞になるように誘導できるか否かを評価すること。
【０４０１】
方法及び結果：
【０４０２】
歯髄由来幹細胞（ＤＰＳＣ）は、商業ベンダー（Ｌｏｎｚａ）から購入し、抗生物質の非存在下でＰＭ中で増殖するように適合させ（実施例１参照）、ＤＰＳＣ−ＮＴＦ分泌細胞に誘導した。ＤＰＳＣ集団は、抗生物質の非存在下でＰＭ中で増殖させることができ、細胞数は平均０．９１倍に倍増した。
【０４０３】
次いで、ＢＭ由来ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞からのＮＴＦの分泌を誘導するのに使用した方法によって、ＤＰＳＣを誘導してＮＴＦを分泌させた（実施例１及び実施例１中の開示を参照）。
【０４０４】
表面マーカーの発現は、ＢＭ由来ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞におけるものと同様であり、全てのＭＳＣ陽性マーカーは、ＰＭ中で増殖させた細胞の＞９５％で発現した（表１１）。
【０４０５】
表１１：ＤＰＳＣ対ＤＰＳＣ−ＮＴＦ表現型
【０４０６】
【表１１】
2019527218.tif 000014
【０４０７】
表面マーカーＣＤ４９ａは、ＢＭ由来ＭＳＣ及びＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（表１２）と同様に、ＭＳＣの６７％と比べて、＞９０％のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞でも発現した。
【０４０８】
表１２：ＣＤ４４及びＣＤ７３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）
【０４０９】
【表１２】
2019527218.tif 000015
【０４１０】
分化の終わりに、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ及びＨＧＦの分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、ＤＰＳＣ−ＮＴＦ細胞は、全てのＮＴＦの分泌量が、ＤＰＳＣよりも少なくとも２．２７倍高いことを示す（表１３）。また、結果は、ＤＰＳＣのＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ及びＨＧＦの誘導の倍率が、健康なドナーの新鮮なＢＭ−ＭＳＣから以前に得られた値の範囲内であることを示した（表１３）。
【０４１１】
表１３：ＤＰＳＣ及び新鮮ドナーＢＭ−ＭＳＣの特定生産性
【０４１２】
【表１３】
2019527218.tif 000016
【０４１３】
本開示の特定の特徴を本明細書に例示し説明したが、当業者には、様々な修正、置換、変更、及び等価物が想到されよう。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのような修正及び変更の全てを本開示の真の趣旨に含まれるものとして包含することが意図していることを理解されたい。
【図１Ａ】
2019527218.tif 000017
【図１Ｂ】
2019527218.tif 000018
【図２Ａ】
2019527218.tif 000019
【図２Ｂ】
2019527218.tif 000020
【図３Ａ】
2019527218.tif 000021
【図３Ｂ】
2019527218.tif 000022
【図４Ａ】
2019527218.tif 000023
【図４Ｂ】
2019527218.tif 000024
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２３Ｇ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２４Ｈ】
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【図２４Ｉ】
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【図２４Ｊ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３０Ｆ】
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【図３０Ｇ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月25日(2019.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における神経変性疾患を治療するための組成物の使用であって、
少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）を含む細胞集団を含有する、組成物の使用。
【請求項２】
前記神経変性疾患が、
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）；パーキンソン病；多系統萎縮症（ＭＳＡ）；ハンチントン病；アルツハイマー病；レット症候群；リソソーム蓄積症；「白質疾患」またはグリア／脱髄疾患；サンフィリポ症；ゴーシェ病；テイ・サックス病（ベータ・ヘキソサミニダーゼ欠損症）；多発性硬化症（ＭＳ）；視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、ＮＭＯスペクトラム疾患、虚血、事故、または環境障害に起因する脳損傷または外傷；脳卒中；脳性麻痺（ＣＰ）；自閉症及び自閉症スペクトラム障害；脊髄損傷；運動失調；またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項３】
少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）を含有する組成物。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞が、
（ａ）骨髄間葉系幹細胞、脂肪細胞間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、末梢血間葉系幹細胞、歯周靭帯間葉系幹細胞、子宮内膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、または臍帯血間葉系幹細胞、
（ｂ）前記対象の自己由来細胞、
（ｃ）前記対象の同種異系細胞、
またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１または２に記載の組成物の使用、あるいは請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が、
（ａ）非遺伝子組み換えヒト細胞、
（ｂ）少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を発現及び分泌するようにエクスビボで誘導された間葉系幹細胞、
またはそれらの組み合わせを含むか、または
（ｃ）前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞における前記少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌が、同一の前記対象から取得した非分化間葉系幹細胞における前記ＮＴＦの基礎分泌よりも多いか、または
（ｄ）前記ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において、少なくとも１つのバイオマーカーの遺伝子発現が、対照ＭＳＣ細胞と比較して調節される、請求項１、２、または４のいずれかに記載の組成物の使用、あるいは請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が前記対象に投与され、前記投与の前及び前記投与の後に前記対象から取得した生体試料を分析する、請求項１、２、４、または５のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項７】
前記生体試料が、血液、血清、尿、または脳脊髄液（ＣＳＦ）を含み、
前記投与後に、
（ａ）前記生体試料中の少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）の濃度が対照生体試料と比較して増加する、
（ｂ）前記生体試料中の炎症性因子、アポトーシス促進因子、及び炎症性因子に影響を与える因子のうちの少なくとも１つの濃度が対照生体試料と比較して減少する、または
（ｃ）前記生体試料中の少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）の濃度が対照生体試料と比較して増加し、前記生体試料中の炎症性因子、アポトーシス促進因子、及び炎症性因子に影響を与える因子のうちの少なくとも１つの濃度が対照生体試料と比較して減少する、請求項６に記載の組成物の使用。
【請求項８】
前記神経栄養因子（ＮＴＦ）が、
血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質の別名でも知られている）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、ニューブラスチン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１、２、４、５、６、または７のいずれかに記載の組成物の使用、あるいは請求項３ないし５のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記炎症性因子、アポトーシス促進因子、または、炎症性因子に影響を与える因子が、
キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１ｂ、グルタミン酸、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
（ａ）前記調節された遺伝子発現が、遺伝子発現の減少を含み、前記バイオマーカーが、ＴＯＰ２Ａ、ＦＧＦ２、ＭＥＳＴ、ＳＬＣ１Ａ１、及びＴＵＢＢ３のうちのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、または
（ｂ）前記調節された遺伝子発現が、遺伝子発現の増加を含み、前記バイオマーカーが、ＢＭＰ２、ＬＩＦ、ＷＮＴ５Ａ、ＡＲＥＧ、ＨＧＦ、ＢＤＮＦ、ＰＣＳＫ１、ＲＡＢ２７Ｂ、ＳＮＡＰ２５、ＳＬＣ１Ａ３、及びＳＬＣ１６Ａ６のうちのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
前記組成物が、
（ａ）前記対象の脳脊髄液または中枢神経系への投与、
（ｂ）１回の注射あたり約２×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量での筋肉内（ＩＭ）注射、
（ｃ）１回の注射あたり約１００〜１２５×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の用量での髄腔内（ＩＴ）注射、
（ｄ）約４８×１０６個のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の総用量での複数回の筋肉内（ＩＭ）注射、
（ｅ）筋肉内（ＩＭ）注射及び髄腔内（ＩＴ）注射の組み合わせ、
またはそれらの任意の組み合わせのために製剤化されている、請求項１、２、４、５、６、７、８、または９のいずれかに記載の組成物の使用、あるいは請求項３、４、５、または８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含み、
前記分析が、ＡＬＳの診断、ＡＬＳの進行の追跡、またはそれらの組み合わせのためにＡＬＳバイオマーカーを検出することを含む、請求項６ないし１１のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１３】
前記バイオマーカーが、キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７６−ａ、ｍｉＲ−１３２、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１２に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
前記バイオマーカーがキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）であり、
検出された前記キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度が５００〜３００、０００ｐｇ／ｍｌの範囲である場合には、前記対象がＡＬＳを有すると判定し、
検出された前記キチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）の濃度が、１、６００〜１０７、６０００ｐｇ／ｍｌの範囲である場合には、前記対象が継続的な治療を必要すると判定する、請求項１３に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
前記組成物の投与後に、
（ａ）前記対象の前記生体試料中の血管内皮膚増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６）、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ３７６−ａ、ｍｉＲ−１４６ａ−５、またはそれらの任意の組み合わせの濃度が、対照生体試料と比較して増加するか、または
（ｂ）前記対象の前記生体試料中のキチナーゼ１（ＣＨＩＴ−１）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１ｂ、グルタミン酸、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、またはそれらの任意の組み合わせの濃度が、対照生体試料と比較して増加し、
前記対象の前記生体試料中のｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７６ａ、ｍｉＲ−１３２、またはそれらの任意の組み合わせの基礎濃度が、レスポンダー患者から取得した体試料と比較して低い場合には、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞治療に対するノンレスポンダーを示す、請求項１２ないし１４のいずれかに記載の組成物の使用。
【国際調査報告】
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2019527218.tif 000105
2019527218.tif 000106
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