(57)【要約】  本発明は、がんの治療における使用のための、（ｉ）化合物ＡＢＸ１９６と、（ｉｉ）少なくとも１つの化学療法剤および／または少なくとも１つの免疫療法剤とを含む抗腫瘍医薬組み合わせに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんの治療における使用のための、
（ｉ）式（Ｉ）
【化１】
2019531343.tif 000055
の化合物ＡＢＸ１９６と、
（ｉｉ）少なくとも１つの化学療法剤および／または少なくとも１つの免疫療法剤と
を含む抗腫瘍医薬組み合わせであって、前記少なくとも１つの免疫療法剤は、抗原でない、抗腫瘍医薬組み合わせ。
【請求項２】
式（Ｉ）
【化２】
2019531343.tif 000056
の前記化合物ＡＢＸ１９６は、腫瘍抗原をさらに含むワクチン組成物（ｉｉｉ）中に含まれる、請求項１に記載のその使用のための抗腫瘍医薬組み合わせ。
【請求項３】
式（Ｉ）
【化３】
2019531343.tif 000057
の前記化合物ＡＢＸ１９６（ｉ）または前記ワクチン組成物（ｉｉｉ）と、前記少なくとも１つの化学療法剤および／または前記少なくとも１つの免疫療法剤（ｉｉ）とは、別々に投与される、請求項１または２に記載のその使用のための抗腫瘍医薬組み合わせ。
【請求項４】
式（Ｉ）
【化４】
2019531343.tif 000058
の前記化合物ＡＢＸ１９６（ｉ）または前記ワクチン組成物（ｉｉｉ）と、前記少なくとも１つの化学療法剤および／または前記少なくとも１つの免疫療法剤（ｉｉ）とは、ほぼ同時に投与される、請求項１または２に記載のその使用のための抗腫瘍医薬組み合わせ。
【請求項５】
式（Ｉ）
【化５】
2019531343.tif 000059
の前記化合物ＡＢＸ１９６（ｉ）または前記ワクチン組成物（ｉｉｉ）と、前記少なくとも１つの化学療法剤および／または前記少なくとも１つの免疫療法剤（ｉｉ）との投与は、前記組み合わせの最大有効性を得るためにある期間にわたって間隔が置かれる、請求項１または２に記載のその使用のための抗腫瘍医薬組み合わせ。
【請求項６】
がんの治療における少なくとも１つの化学療法剤および／または少なくとも１つの免疫療法剤との組み合わせにおいて使用するための、式（Ｉ）
【化６】
2019531343.tif 000060
の化合物ＡＢＸ１９６と腫瘍抗原とを含むワクチン組成物であって、前記少なくとも１つの免疫療法剤は、抗原でない、ワクチン組成物。
【請求項７】
がんの治療における少なくとも１つの化学療法剤および／または少なくとも１つの免疫療法剤との組み合わせにおいて使用するための、式（Ｉ）
【化７】
2019531343.tif 000061
の化合物ＡＢＸ１９６であって、前記少なくとも１つの免疫療法剤は、抗原でない、化合物ＡＢＸ１９６。
【請求項８】
前記組み合わせは、抗腫瘍抗原をさらに含む、請求項７に記載のその使用のための式（Ｉ）
【化８】
2019531343.tif 000062
の化合物ＡＢＸ１９６。
【請求項９】
がんの治療における使用のための、
（ｉ）１以上の用量単位の式（Ｉ）
【化９】
2019531343.tif 000063
の化合物ＡＢＸ１９６と、
（ｉｉ）１以上の用量単位の少なくとも１つの化学療法剤および／または１以上の用量単位の免疫療法剤と
を含む組み合わせ製剤であって、前記少なくとも１つの免疫療法剤は、抗原でない、組み合わせ製剤。
【請求項１０】
式（Ｉ）
【化１０】
2019531343.tif 000064
の前記化合物ＡＢＸ１９６は、腫瘍抗原をさらに含むワクチン組成物中に含まれる、請求項９に記載のその使用のための組み合わせ製剤。
【請求項１１】
前記化学療法剤は、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびオキサリプラチンからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のその使用のための抗腫瘍医薬組み合わせ、請求項６に記載のその使用のためのワクチン組成物、請求項７もしくは８に記載のその使用のための化合物ＡＢＸ１９６または請求項９もしくは１０に記載のその使用のための組み合わせ製剤。
【請求項１２】
前記化学療法剤は、ドキソルビシンまたはソラフェニブである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のその使用のための抗腫瘍医薬組み合わせ、請求項６に記載のその使用のためのワクチン組成物、請求項７もしくは８に記載のその使用のための化合物ＡＢＸ１９６または請求項９もしくは１０に記載のその使用のための組み合わせ製剤。
【請求項１３】
前記免疫療法剤は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＴＡＣＥ、カテプシンＳ、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＰＤ−１、グリピカン３、クローディン３、クローディン４、ＢＭＣＡおよびＣＴＬＡ４からなる群から選択される腫瘍抗原に特異的な抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のその使用のための抗腫瘍医薬組み合わせ、請求項６に記載のその使用のためのワクチン組成物、請求項７もしくは８に記載のその使用のための化合物ＡＢＸ１９６または請求項９もしくは１０に記載のその使用のための組み合わせ製剤。
【請求項１４】
前記免疫療法剤は、モノクローナル抗ＰＤ１抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のその使用のための抗腫瘍医薬組み合わせ、請求項６に記載のその使用のためのワクチン組成物、請求項７もしくは８に記載のその使用のための化合物ＡＢＸ１９６または請求項９もしくは１０に記載のその使用のための組み合わせ製剤。
【請求項１５】
前記がんは、メラノーマ、肝細胞がん、結腸直腸がんおよび膀胱がんからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のその使用のための抗腫瘍医薬組み合わせ、請求項６に記載のその使用のためのワクチン組成物、請求項７もしくは８に記載のその使用のための化合物ＡＢＸ１９６または請求項９もしくは１０に記載のその使用のための組み合わせ製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんを治療するための新しい治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、長年の研究および治療の進歩にもかかわらず、死亡率の主因である。
【０００３】
化学療法および免疫療法を含む極めて多数の治療が存在する。しかし、たとえこれらの治療が場合により有効であり得るとしても、それらは、一般に、非常に長期にわたりかつ再発が頻発する。加えて、それらは、患者の生活の質に悪影響を及ぼす極めて多数の副作用に関与する。
【０００４】
新しい治療法は、近年発見されている腫瘍学の局面、例えばがんに対する防御における免疫系の意義に対して役立つ。しかし、これらの治療は、常に非常に有効なわけではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、現行の治療法、特に化学療法および／または免疫療法の有効性を、好ましくはこれらの治療法の副作用を低減しつつ改善するという重要な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、他の公知の抗がん治療、特に化学療法および／または免疫療法と組み合わせた特定のＮＫＴ作動薬、すなわち式（Ｉ）
【化１】
2019531343.tif 000002
のα−ガラクトシルセラミド誘導体ＡＢＸ１９６の使用が、特に侵襲性がんに対するこれらの公知の治療の有効性を有意に改善することを可能にするという本発明者らによる想定外の発見に起因する。
【０００７】
特に、本発明者らは、他の公知の抗がん治療、特に化学療法および／または免疫療法と組み合わせた、式（Ｉ）
【化２】
2019531343.tif 000003
の化合物ＡＢＸ１９６および腫瘍抗原を含むワクチン組成物の使用が、特に侵襲性がんに対するこれらの公知の治療の有効性を有意に改善することを可能にすることを発見した。
【０００８】
本発明者らは、ドキソルビシンまたは抗ＰＤ−１モノクローナル抗体と組み合わせた、ＡＢＸ１９６および腫瘍抗原Ｔｒｐ２を含むワクチン組成物の使用が、メラノーママウスモデルにおけるこれらの化合物の抗腫瘍効果を改善することを確かに実証した。
【０００９】
本発明者らは、ドキソルビシン、ソラフェニブまたは抗ＰＤ−１モノクローナル抗体と組み合わせたＡＢＸ１９６の使用が、メラノーマ、結腸直腸がん、膀胱がんおよび肝細胞がんマウスモデルにおけるこれらの化合物の抗腫瘍効果を改善し、マウスモデルの生存をさらに改善することも実証した。
【００１０】
したがって、本発明は、がんの治療における使用のための、
（ｉ）式（Ｉ）
【化３】
2019531343.tif 000004
の化合物ＡＢＸ１９６と、
（ｉｉ）少なくとも１つの化学療法剤および／または少なくとも１つの免疫療法剤と
を含む抗腫瘍医薬組み合わせ（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に関する。一実施形態では、前記抗腫瘍医薬組み合わせは、腫瘍抗原をさらに含む。特定の一実施形態では、式（Ｉ）
【化４】
2019531343.tif 000005
の化合物ＡＢＸ１９６は、腫瘍抗原をさらに含むワクチン組成物（ｉｉｉ）中に含まれる。
【００１１】
本発明の別の目的は、がんの治療における少なくとも１つの化学療法剤および／または少なくとも１つの免疫療法剤との組み合わせにおいて使用するための、式（Ｉ）
【化５】
2019531343.tif 000006
の化合物ＡＢＸ１９６（ｉ）と腫瘍抗原とを含むワクチン組成物に関する。
【００１２】
本発明は、がんの治療における少なくとも１つの化学療法剤および／または少なくとも１つの免疫療法剤との組み合わせにおいて使用するための、式（Ｉ）
【化６】
2019531343.tif 000007
の化合物ＡＢＸ１９６に関する。一実施形態では、前記組み合わせは、腫瘍抗原もさらに含む。
【００１３】
本発明の別の目的は、がんの治療における使用のための、
（ｉ）１以上の用量単位の式（Ｉ）
【化７】
2019531343.tif 000008
の化合物ＡＢＸ１９６（Ｉ）と、
（ｉｉ）１以上の用量単位の少なくとも１つの化学療法剤および／または１以上の用量単位の免疫療法剤と
を含む組み合わせ製剤に関する。
【００１４】
一実施形態では、前記組み合わせ製剤において、式（Ｉ）
【化８】
2019531343.tif 000009
の化合物ＡＢＸ１９６（Ｉ）は、腫瘍抗原をさらに含むワクチン中に含まれる。
【００１５】
一実施形態では、上で定義されるような化合物ＡＢＸ１９６が本発明の上記目的に従うワクチン組成物中に含まれるとき、それは、前記ワクチン組成物中のアジュバントとして用いられる。
【００１６】
特に、ＡＢＸ１９６と、少なくとも１つの化学療法剤および／または少なくとも１つの免疫療法剤との組み合わせにおいて得られる治療／対照パーセント（Ｔ／Ｃ（％））指数は、少なくとも１つの化学療法剤単独および／または少なくとも１つの免疫療法剤単独において得られるＴ／Ｃ（％）指数よりも低い。一実施形態では、本発明の組み合わせのＴ／Ｃ（％）は、４２％以下である。
【００１７】
治療／対照パーセント（Ｔ／Ｃ（％））指数は、治療された腫瘍体積中央値を対照腫瘍体積中央値で除し、それに１００を掛けることにより計算され得る。例えば、治療された腫瘍体積中央値は、ＡＢＸ１９６と、本発明に記載の少なくとも１つの化学療法剤および／または少なくとも１つの免疫療法剤との組み合わせの投与に従って得られ、対照腫瘍体積中央値は、前記組み合わせの媒体の投与に従って得られ、前記腫瘍体積は、同時に評価される。
【００１８】
抗腫瘍医薬組み合わせ
本発明に従って用いられる式（Ｉ）
【化９】
2019531343.tif 000010
の化合物ＡＢＸ１９６は、ＮＫＴ（ナチュラルキラーＴ）細胞を刺激することが公知であるα−ガラクトシル誘導体である。本発明によると、化合物ＡＢＸ１９６は、その薬学的に許容できる塩も指す。用語「薬学的に許容できる塩」は、ＡＢＸ１９６の生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的ではないかまたは他に望ましくない塩を指す。薬学的に許容できる塩のレビューとして、Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ  ａｌ．（（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｄ，ｖｏｌ．６６，１）を参照されたい。
【００１９】
本明細書で用いられるとき、用語「組み合わせ」、「治療的組み合わせ」または「医薬組み合わせ」は、１用量単位形態での固定的組み合わせまたは組み合わせ投与の複数部分のキットのいずれかを定義する。特定の一実施形態では、化合物ＡＢＸ１９６または下で定義されるようなワクチン組成物と、下で定義されるような少なくとも１つの化学療法剤および／または少なくとも１つの免疫療法剤とは、同時に独立してまたは組み合わせパートナーが相乗効果を示すことを可能にする時間間隔以内に別々に投与され得る。
【００２０】
特に、化合物ＡＢＸ１９６またはワクチン組成物が化学療法剤と組み合わせて使用されるとき、それらは、同時に独立してまたは時間間隔以内に別々に投与され得る。同様に、化合物ＡＢＸ１９６またはワクチン組成物が免疫療法剤と組み合わせて使用されるとき、それらは、同時に独立してまたは時間間隔以内に別々に投与され得る。
【００２１】
加えて、化合物ＡＢＸ１９６またはワクチン組成物が２つ以上の化学療法剤と組み合わせて使用されるとき、組み合わせの成分の各々は、同時に独立してまたは時間間隔以内に別々に投与され得、または組み合わせの成分の一部が同時に独立して投与され得る一方、組み合わせの他の成分が間隔以内に別々に投与され得る。
【００２２】
同様に、化合物ＡＢＸ１９６またはワクチン組成物が２つ以上の免疫療法剤と組み合わせて使用されるとき、組み合わせの成分の各々は、同時に独立してまたは時間間隔以内に別々に投与され得、または組み合わせの成分の一部が同時に独立して投与され得る一方、組み合わせの他の成分が間隔以内に別々に投与され得る。
【００２３】
同様に、化合物ＡＢＸ１９６またはワクチン組成物が化学療法剤および免疫療法剤と組み合わせて使用されるとき、組み合わせの成分の各々は、同時に独立してまたは時間間隔以内に別々に投与され得、または組み合わせの成分の一部が同時に独立して投与され得る一方、組み合わせの他の成分が間隔以内に別々に投与され得る。
【００２４】
この組み合わせの構成成分は、組み合わせの最大有効性を得るために同時に、ほぼ同時に、別々に、またはある期間にわたって間隔を置いて投与され得、各投与において、迅速な投与から連続灌流にかけてのその持続時間以内に変動することがあり得る。
【００２５】
したがって、本発明の組み合わせの化合物は、２つ、３つまたはそれを超える別々の医薬組成物中に配合され得る。
【００２６】
化合物ＡＢＸ１９６または上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるようなワクチン組成物の少なくとも１回の投与と、上の「化学療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの化学療法剤の少なくとも１回の投与との間のタイミングは、好ましくは、約４日である。
【００２７】
好ましくは、上の「化学療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの化学療法剤は、化合物ＡＢＸ１９６または上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるようなワクチン組成物の投与から４日後に投与される。好ましくは、上の「化学療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの化学療法剤は、化合物ＡＢＸ１９６または上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるようなワクチン組成物の投与から４日前に投与される。
【００２８】
化合物ＡＢＸ１９６または上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるようなワクチン組成物の少なくとも１回の投与と、上の「免疫療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの免疫療法剤の少なくとも１回の投与との間のタイミングは、好ましくは、約７日である。
【００２９】
好ましくは、上の「免疫療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの免疫療法剤は、化合物ＡＢＸ１９６または上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるようなワクチン組成物の投与から７日後に投与される。好ましくは、上の「免疫療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの免疫療法剤は、化合物ＡＢＸ１９６または上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるようなワクチン組成物の投与から７日前に投与される。
【００３０】
本発明との関連で用いられる組成物は、好ましくは、静脈内に投与可能な組成物である。しかし、これらの組成物は、局在化領域治療の症例では経口的、皮下または腹腔内に投与され得る。一実施形態では、これらの組成物は、腫瘍内に投与される。
【００３１】
用語「組み合わせ製剤」は、特に、組み合わせパートナー（ｉ）および（ｉｉ）が、上に定義される通り、独立してまたは異なる量の組み合わせパートナーと、すなわち同時にもしくは異なる時点での異なる固定的組み合わせの使用により投与され得るという意味で（これは、化学療法剤および免疫療法剤の両方または幾つかの化学療法剤および／もしくは幾つかの免疫療法剤が用いられるとき、パートナー（ｉｉ）の異なる成分にも適用される）、「複数部分のキット」を指すように本明細書で定義される。次に、複数部分のキットの複数部分は、例えば、同時にまたは経時的に変動して、すなわち複数部分のキットの任意の部分に対して異なる時点で、かつ等しいまたは異なる時間間隔で投与され得る。
【００３２】
本発明の組み合わせ製剤の組み合わせパートナーは、好ましくは、用量単位形態で配合される。用語「用量単位」は、ヒト対象および他の哺乳類における単位用量として好適な物理的に分かれた単位を指し、各単位は、任意選択的に好適な医薬賦形剤に関連して、所望される治療効果をもたらすように算出された所定量の活性材料を有する。
【００３３】
組み合わせ製剤中において投与される、組み合わせパートナー（ｉｉ）（すなわち組み合わせパートナー（ｉｉ）の異なる成分に適用可能である場合）に対する組み合わせパートナー（ｉ）の総量の比は、例えば、治療される患者亜集団の需要または単一患者の需要に対処するために変動し得る。
【００３４】
ワクチン組成物
本発明との関連で用いられるワクチン組成物は、式（Ｉ）
【化１０】
2019531343.tif 000011
の化合物ＡＢＸ１９６と腫瘍抗原とを含む。
【００３５】
「腫瘍抗原」は、本明細書では、腫瘍組織に対して排他的に発現される抗原、腫瘍組織に関連した抗原、または腫瘍組織内で過剰発現される抗原を意味する。例示的な腫瘍抗原として、限定されないが、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、ＡＰＲＩＬ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（ＢＡＧＥ）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ブラキュリ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ−８（ＣＡＳＰ−８、ＦＬＩＣＥとしても公知）、カテプシンＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（ＣＲ２）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（ＣＲＴ）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ＣＤ４６／膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（ｃｏｘ−２）、結腸直腸がん遺伝子での欠失（ＤＣＣ）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（ＦＧＦ８ａ）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（ＦＧＦ８ｂ）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（ＧＡＧＥファミリー）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（ＧＤ２）／ガングリオシド３（ＧＤ３）／ガングリオシド−モノシアル酸−２（ＧＭ２）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ：Ｍａｎ（α１−６）］β１、６−Ν−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１−１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質１（ｇｐ７５／ＴＲＰ−１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ヒト乳がんウイルス（ＨＭＴＶ）、７０ｋＤ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インスリン様増殖因子受容体１（ＩＧＦＲ−１）、インターロイキン１３受容体（ＩＬ−１３Ｒ）、誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原をコードするファミリー（少なくともＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、およびＭＡＧＥ−４を含むＭＡＧＥファミリー）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原−１（ＭＡＲＴ−１）、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポイエチン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＴＮＦ−α転換酵素（ＴＡＣＥ）、チモシン−β−１５、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、グリピカン３、クローディン３、クローディン４、ＢＭＣＡおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
【００３６】
好ましくは、前記腫瘍抗原は、ＴＲＰ−２である。
【００３７】
一実施形態では、前記腫瘍抗原の配列は、配列番号１、配列番号３および配列番号４からなる群から選択され、好ましくは配列番号３である。
【００３８】
好ましくは、腫瘍抗原は、治療される特定のがんに応じて選択される。当然ながら、当業者は、いずれの腫瘍抗原が特定のがんに特異的に関連するかを理解している。例えば、当業者にとって、ＴＲＰ−２腫瘍抗原がメラノーマがん細胞によって発現されることは周知である。
【００３９】
したがって、特に好ましい実施形態では、腫瘍抗原は、ＴＲＰ−２であり、治療されるがんは、メラノーマである。
【００４０】
本発明との関連で用いられるワクチン組成物は、追加的なアジュバントを含み得る。ＡＢＸ１９６以外の追加的なアジュバントは、当業者にとって周知であり、アルミニウム塩、水中油乳剤、例えばフロイント不完全アジュバントまたはＭＦ５９（登録商標）、ＰＲＲリガンド、ＴＬＲ３およびＲＬＲリガンド、例えばポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ４リガンド、例えばＬＰＳまたはモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、ＴＬＲ５リガンド、例えばフラジェリン、ＴＬＲ７／８リガンド、例えばイミダゾキノリン、ＴＬＲ９リガンド、例えばＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよびＮＯＤ２リガンド、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）を含む。
【００４１】
しかし、化合物ＡＢＸ１９６は、本発明との関連で用いられるワクチン組成物中にアジュバントとして存在し得ることから、好ましい実施形態では、このワクチン組成物は、アジュバントとして化合物ＡＢＸ１９６のみを含む。好ましい実施形態では、アジュバントとして用いられる化合物ＡＢＸ１９６は、本発明に従う前記ワクチン組成物である。
【００４２】
化学療法剤
本明細書で用いられるとき、用語「化学療法剤」は、抗がん化学療法に用いられる任意の細胞増殖阻害化合物または細胞傷害性化合物を指す。かかる化合物が抗原でないことは理解される。かかる化学療法剤は、当業者にとって周知であり、
−  アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、例えばシクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシルおよびメルファラン；エチレンアミンおよびメチルメラミン、例えばチオテパ；メチルヒドラジン誘導体、例えばプロカルバジン；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン；ニトロソウレア、例えばカルムスチンまたはロムスチン；トリアゼン、例えばダカルバジンおよびテモゾロミド；白金配位複合体、例えばシスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチン；
−  代謝拮抗薬、例えば葉酸類似体、例えばメトトレキサート；ピリミジン類似体、例えばフルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビンおよびカペシタビン；プリン類似体、例えばメルカプトプリン、ペントスタチン、クラドリビンおよびフルダラビン；
−  ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンクリスチン；
−  タキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル；
−  エピポドフィロトキシン、例えばエトポシドおよびテニポシド；
−  カンプトテシン、例えばトポテカンおよびイリノテカン；
−  抗がん抗生物質、例えばダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、プリカマイシンおよびエピルビシン；
−  アントラセンジオン、例えばミトキサントロン、マイトマイシンおよびブレオマイシン；
−  ドラスタチンなどの有糸分裂阻害剤；
−  Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；
−  ヒドロキシ尿素などの置換尿素；
−  トレチノインなどの分化誘導剤；
−  プロテインキナーゼ阻害剤、例えばイマチニブまたはブリオスタチン；
−  プロテアソーム阻害剤、例えばゲフィチニブおよびボルテゾミブ；
−  ホルモンおよび拮抗剤、例えば副腎皮質抑制薬、例えばアミノグルテチミド；副腎皮質ステロイド、例えばプレドニゾン；プロゲスチン、例えば酢酸メゲストロールおよびメドロキシプロゲステロン；エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール；抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ジンドキシフェン、トリオキシフェン、ＩＣＩ１８２、７８０、ＥＭ−８００およびトレミフェン；アロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトロゾールおよびエキセメスタン；アンドロゲン、例えばプロピオン酸テストステロン；抗アンドロゲン、例えばフルタミド；およびゴナドトロピン放出剤、例えばリュープロリド
を含む。
【００４３】
当然ながら、化学療法剤の任意の好適な組み合わせは、がんのタイプに応じて用いられ得る。
【００４４】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの化学療法剤は、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびオキサリプラチンからなる群から選択される。一実施形態では、少なくとも１つの化学療法剤は、ドキソルビシンまたはキナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブである。好ましくは、少なくとも１つの化学療法剤は、ドキソルビシンまたはソラフェニブ、より好ましくはドキソルビシンである。
【００４５】
本発明との関連で用いられる少なくとも１つの化学療法剤は、医薬組成物中に配合され得、この医薬組成物は、下に定義される通り、薬学的に許容できる賦形剤をさらに含み得る。
【００４６】
異なる化学療法剤の組み合わせが用いられる場合、これらの化学療法剤は、単一の医薬組成物中または別々の医薬組成物中に配合され得る。
【００４７】
本発明との関連で用いられる少なくとも１つの化学療法剤は、当業者にとって周知の任意の好適な経路を介して投与され得る。当業者によって理解されるように、化学療法剤を含む医薬組成物は、意図される投与経路に適合するように好適に配合され得る。好適な投与経路の例として、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経口（例えば、頬側、吸入、経鼻および肺噴霧）、皮内、経皮（局所）、経粘膜、眼内および直腸投与が挙げられる。
【００４８】
好ましくは、本発明との関連で用いられる少なくとも１つの化学療法剤は、静脈内に投与される。
【００４９】
本発明との関連で用いられる化学療法剤の投与計画は、用いられる特定の薬剤に依存する。かかる投与計画は、当業者にとって周知である。当業者は、典型的には、投与される化学療法剤の特定の濃度と特定の投与スキームとを組み合わせる。
【００５０】
例えば、ドキソルビシンは、好ましくは、４０〜７５ｍｇ／ｍ２／サイクルの用量での３〜５分の静脈内注入により投与され、各サイクルは、３〜４週の間隔で前サイクルと分けられ、それらサイクルは、好ましくは、５５０ｍｇ／ｍ２の最大総用量に達するまで反復される。
【００５１】
しかし、化合物ＡＢＸ１９６または上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるワクチン組成物の化学療法剤と組み合わされた使用は、前記化学療法剤の抗がん効果を有意かつ相乗的に高めることから、用いられる化学療法剤の用量および／または投与持続時間を標準的な投与計画と比べて減少させることが可能である。
【００５２】
したがって、好ましい実施形態では、少なくとも１つの化学療法剤は、特に単独に使用されるかまたは別の化学療法剤および／もしくは免疫療法剤と組み合わせて使用される、この化学療法剤用に推奨される標準的な投与計画よりも低い投与計画で投与される。
【００５３】
免疫療法剤
本明細書で用いられるとき、用語「免疫療法剤」は、がん細胞に対して新規の免疫応答を開始させるか、または既存の免疫応答を追加免疫することにより抗新生物効果を媒介する抗がん剤、例えば腫瘍抗原を標的にする抗体またはリンパ球を指す。免疫療法剤は、悪性細胞に対する宿主免疫系を（再）活性化するその能力に基づき、「活性型」または「受動型」として分類され得る。
【００５４】
一実施形態では、前記免疫療法剤は、抗原でない。
【００５５】
好ましくは、免疫療法剤は、上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるように腫瘍抗原に特異的な抗体である。
【００５６】
「抗体」は、天然または通常の抗体であり得、２つの重鎖がジスルフィド結合により互いに連結され、かつ各重鎖がジスルフィド結合により軽鎖に連結される。本明細書で用いられるとき、用語「抗体」は、通常の抗体およびその断片、ならびに単一ドメイン抗体およびその断片、特に単一ドメイン抗体の可変重鎖およびキメラ、ヒト化、二重特異性または多重特異性抗体を意味する。
【００５７】
本明細書で用いられるとき、抗体は、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部であるような抗体である「単一ドメイン抗体」も含む。単一ドメイン抗体の例として、重鎖抗体、天然で軽鎖が欠けている抗体、通常の４鎖抗体由来の単一ドメイン抗体、改変された単一ドメイン抗体が挙げられる。単一ドメイン抗体は、限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、リャマ、ヤギ、ウサギおよびウシを含む任意の種に由来し得る。単一ドメイン抗体は、軽鎖が欠けている重鎖抗体として公知の天然に存在する単一ドメイン抗体、例えばラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）種、例えばラクダ、ヒトコブラクダ、リャマ、アルパカおよびグアナコにより産生されるものであり得る。
【００５８】
軽鎖が欠けているこれらの単一ドメイン抗体の可変重鎖は、「ＶＨＨ」または「ナノボディ」として当該技術分野で公知である。通常のＶＨドメインと同様に、ＶＨＨは、４つのＦＲと３つのＣＤＲとを含む。ナノボディは、ＩｇＧ分子よりも約１０倍小さいという利点を有し、結果として、適切に折り畳まれた機能的ナノボディは、インビトロ発現により、高収量を達成しながら産生され得る。さらに、ナノボディは、非常に安定であり、プロテアーゼの作用に対して抵抗性がある。
【００５９】
用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、本明細書で用いられるとき、特異抗原に特異的な単一のアミノ酸組成の抗体分子を指す。
【００６０】
モノクローナル抗体は、Ｂ細胞またはハイブリドーマの単一クローンにより作製され得ることに加え、組換えであり得、すなわちタンパク質工学により作製され得る。
【００６１】
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体からの１つ以上の領域および１つ以上の他の抗体からの１つ以上の領域を含む改変された抗体を指す。特に、キメラ抗体は、別の抗体、特にヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインと関連した、非ヒト動物由来の抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。非ヒト動物として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの任意の動物を用いることができる。キメラ抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して特異性を有する多重特異抗体も意味し得る。一実施形態では、キメラ抗体は、マウス由来の可変ドメインおよびヒト由来の定常ドメインを有する。
【００６２】
用語「ヒト化抗体」は、元から全体的または部分的に非ヒト由来であり、ヒトにおける免疫応答を回避または最小化するため、特に重鎖および軽鎖のフレームワーク領域内で特定のアミノ酸を置換するように修飾されている抗体を指す。ヒト化抗体の定常ドメインは、ほとんどの場合、ヒトＣＨおよびＣＬドメインである。一実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト由来の定常ドメインを有する。
【００６３】
（通常の）抗体の「断片」は、インタクト抗体の一部、特にインタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例として、抗体断片から形成されるＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ、二重特異性および多重特異性抗体が挙げられる。通常の抗体の断片は、単一ドメイン抗体、例えば重鎖抗体またはＶＨＨでもあり得る。
【００６４】
用語「Ｆａｂ」は、約５０，０００Ｄａの分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を意味し、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分と全Ｌ鎖とが、ＩｇＧをプロテアーゼのパパインで処理することによって得られる断片中において、ジスルフィド結合を通じて互いに結合される。
【００６５】
用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、約１００，０００Ｄａの分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を指し、ＩｇＧをプロテアーゼのペプシンで処理することによって得られる断片中において、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されるＦａｂよりもやや大きい。
【００６６】
用語「Ｆａｂ’」は、約５０，０００Ｄａの分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を指し、Ｆ（ａｂ’）２断片のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる。
【００６７】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、通常、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合から発現される、共有結合的に連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。ヒトｓｃＦｖ断片は、特に遺伝子組換え技術を用いることにより適切な立体構造で保持されるＣＤＲを含む。二価および多価抗体断片、例えば二価ｓｃ（Ｆｖ）２は、一価ｓｃＦｖの会合により自発的に形成し得るか、またはペプチドリンカーによる一価ｓｃＦｖのカップリングにより産生され得るかのいずれかである。
【００６８】
「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。
【００６９】
「（ｄｓＦｖ）２」は、ペプチドリンカーによってカップリングされた２つのｄｓＦｖを意味する。
【００７０】
用語「二重特異性抗体」または「ＢｓＡｂ」は、単一分子内部で２つの抗体の抗原結合部位を複合させる抗体を意味する。したがって、ＢｓＡｂは、２つの異なる抗原に同時に結合することができる。
【００７１】
用語「多重特異性抗体」は、単一分子内部で２つ以上の抗体の抗原結合部位を複合させる抗体を意味する。
【００７２】
用語「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上で２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位の創出が強いられる。
【００７３】
特定の一実施形態では、本発明との関連で用いられる免疫療法剤は、モノクローナル抗体またはその断片、特にＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディおよびＶＨＨからなる群から選択される断片である。
【００７４】
最も好ましくは、本発明との関連で用いられる免疫療法剤は、モノクローナル抗体である。
【００７５】
好ましくは、本発明との関連で用いられる免疫療法剤は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＴＡＣＥ、カテプシンＳ、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＰＤ−１、グリピカン３、クローディン３、クローディン４、ＢＭＣＡおよびＣＴＬＡ４からなる群から選択される腫瘍抗原に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体である。特に好ましい実施形態では、本発明との関連で用いられる免疫療法剤は、ＰＤ−１に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体である。一実施形態では、本発明との関連で用いられる免疫療法剤は、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ３８、抗４−１ＢＢ、抗ＯＸ４０、抗ＬＡＧ３および抗ＴＩＭ−３からなる群から選択される抗体である。
【００７６】
特に好ましい実施形態では、免疫療法剤は、モノクローナル抗ＰＤ１抗体である。
【００７７】
上の腫瘍抗原に特異的なモノクローナル抗体の例は、当業者にとって周知であり、リツキシマブ、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、アレムツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ（ＭＢＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６またはＯＮＯ−４５３８抗ＰＤ−１抗体としても公知）、ペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５抗ＰＤ−１抗体としても公知）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１抗ＰＤ−１抗体としても公知）、ＢＭＳ−９３６５５９抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＭＰＤＬ３２８０Ａ抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＭＥＤＩ４７３６抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ抗ＰＤ−Ｌ１抗体、Ｄ１（Ａ１２）抗ＴＡＣＥ抗体、Ａ９抗ＴＡＣＥ抗体、Ｆｓｎ０５０３ｈ抗カテプシンＳ抗体、ＡＴＮ−６５８抗ｕＰＡＲ抗体またはＪ６Ｍ０抗ＢＭＣＡ抗体を含む。
【００７８】
好ましくは、本発明との関連で用いられる免疫療法剤は、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびピディリズマブからなる群から選択される。
【００７９】
本発明との関連で用いられる免疫療法剤は、上で定義されるようなモノクローナル抗体と、上の「化学療法剤」セクションに定義されるような化学療法剤とを含むコンジュゲートでもあり得る。
【００８０】
別の実施形態では、本発明との関連で用いられる免疫療法剤は、養子移植Ｔ細胞である。
【００８１】
本発明との関連で、用語「養子細胞移植」は、一般に、（１）循環性または腫瘍浸潤性リンパ球の収集、（２）生体外でのそれらの選択／修飾／拡大／活性化、および（３）ほとんどの場合にリンパ球を枯渇させるプレコンディショニング後に免疫刺激剤と組み合わせたそれらの患者への（再）投与を含む、細胞に基づく抗がん免疫療法の変形形態を指す。
【００８２】
本発明との関連で用いられる少なくとも１つの免疫療法剤は、医薬組成物中で配合され得、この医薬組成物は、下に定義される通り、薬学的に許容できる賦形剤をさらに含み得る。
【００８３】
異なる免疫療法剤の組み合わせが用いられる場合、これらの免疫療法剤は、単一の医薬組成物中または別々の医薬組成物中で配合され得る。
【００８４】
本発明との関連で用いられる少なくとも１つの免疫療法剤は、当業者にとって周知の任意の好適な経路により投与され得る。当業者によって理解されるように、免疫療法剤を含む医薬組成物は、意図される投与経路に適合するように好適に配合され得る。好適な投与経路の例として、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経口（例えば、頬側、吸入、経鼻および肺噴霧）、皮内、経皮（局所）、経粘膜、眼内および直腸投与が挙げられる。
【００８５】
一実施形態では、本発明との関連で用いられる少なくとも１つの免疫療法剤は、静脈内または腫瘍内に投与される。好ましくは、本発明との関連で用いられる少なくとも１つの免疫療法剤は、静脈内に投与される。
【００８６】
本発明との関連で用いられる免疫療法剤の投与計画は、用いられる特定の薬剤に依存する。かかる投与計画は、当業者にとって周知である。当業者は、典型的には、投与される化学療法剤の特定の濃度と特定の投与スキームとを組み合わせる。
【００８７】
例えば、ニボルマブは、好ましくは、２週ごとに３ｍｇ／ｋｇ体重の用量で６０分の静脈内注入により投与される。
【００８８】
本発明との関連で用いられる免疫療法剤は、好ましくは、複数回投与を含むサイクルにわたって投与され、各投与は、好ましくは、３〜４日の時間間隔で分けられる。
【００８９】
しかし、化合物ＡＢＸ１９６または上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるワクチン組成物の免疫療法剤と組み合わされた使用は、前記免疫療法剤の抗がん効果を有意にかつ相乗的に高めることから、用いられる免疫療法剤の用量および／または投与持続時間を標準的な投与計画と比べて減少させることが可能である。
【００９０】
したがって、好ましい実施形態では、少なくとも１つの免疫療法剤は、特に単独に使用されるかまたは別の化学療法剤および／もしくは免疫療法剤と組み合わせて使用される、この免疫療法剤用に推奨される標準的な投与計画よりも低い投与計画で投与される。
【００９１】
本発明との関連で用いられる医薬組み合わせおよび／またはワクチン組成物は、薬学的に許容できる賦形剤をさらに含み得る。
【００９２】
「薬学的に」または「薬学的に許容できる」は、必要に応じて、哺乳動物、特にヒトに投与されるとき、有害反応、アレルギー反応または他の有害反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容できる担体または賦形剤は、非毒性固体、半流動または液体フィラー、希釈剤、封入材または任意のタイプの補助製剤を指す。
【００９３】
本発明との関連で用いられる医薬組み合わせおよび／またはワクチン組成物は、当業者にとって周知の任意の好適な経路により投与され得る。当業者によって理解されるように、医薬組み合わせおよび／またはワクチン組成物は、意図される投与経路に適合するように好適に配合され得る。好適な投与経路の例として、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経口（例えば、頬側、吸入、経鼻および肺噴霧）、皮内、経皮（局所）、経粘膜、眼内および直腸投与が挙げられる。
【００９４】
好ましくは、本発明との関連で用いられる医薬組み合わせおよび／またはワクチン組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内または腫瘍内に、より好ましくは静脈内に投与される。一実施形態では、本発明との関連で用いられる医薬組み合わせおよび／またはワクチン組成物は、静脈内または腫瘍内に投与される。
【００９５】
本発明との関連で用いられる医薬組み合わせおよび／またはワクチン組成物は、それを必要とする患者に１回または数回（例えば、予備刺激用量およびその後の１回または数回の追加免疫用量を含む）投与され得る。好ましくは、本発明との関連で用いられるワクチン組成物は、１回のみ投与される（すなわち任意の追加免疫用量の投与を全く必要としない）。
【００９６】
本発明との関連で用いられる医薬組み合わせおよび／またはワクチン組成物は、化合物ＡＢＸ１９６の少なくとも０．２μｇ／患者の用量で送達され得る。一実施形態では、本発明との関連で用いられる医薬組み合わせおよび／またはワクチン組成物は、化合物ＡＢＸ１９６の少なくとも３ｎｇ／ｋｇ、例えば３ｎｇ／ｋｇ〜５ｎｇ／ｋｇの用量で送達され得る。有効用量は、投与経路とともに他の薬剤との併用の可能性に応じて変動することにもなる。
【００９７】
がんの治療
本発明は、上の「抗腫瘍医薬組み合わせ」セクションに定義される通り、治療有効量の、
（ｉ）式（Ｉ）
【化１１】
2019531343.tif 000012
の化合物ＡＢＸ１９６と、
（ｉｉ）上の「化学療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの化学療法剤および／または上の「免疫療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの免疫療法剤と
を含む抗腫瘍医薬組み合わせの、それを必要とする患者における投与を含む、がんを治療する方法に関する。一実施形態では、前記ＡＢＸ１９６化合物は、上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるような腫瘍抗原をさらに含むワクチン組成物中に含まれる。
【００９８】
本発明は、がんの治療を意図された抗腫瘍医薬組み合わせを作製するための、
（ｉ）式（Ｉ）
【化１２】
2019531343.tif 000013
の化合物ＡＢＸ１９６と、
（ｉｉ）上の「化学療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの化学療法剤および／または上の「免疫療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの免疫療法剤と
の使用にも関する。一実施形態では、前記ＡＢＸ１９６化合物は、上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるような腫瘍抗原をさらに含むワクチン組成物中に含まれる。
【００９９】
本発明は、治療有効量の式（Ｉ）
【化１３】
2019531343.tif 000014
の化合物ＡＢＸ１９６の、治療有効量の上の「化学療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの化学療法剤および／または治療有効量の上の「免疫療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの免疫療法剤と組み合わせた、それを必要とする患者における投与、特に同時投与を含む、がんを治療するための方法にも関する。一実施形態では、前記ＡＢＸ１９６化合物は、上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるような腫瘍抗原をさらに含むワクチン組成物中に含まれる。
【０１００】
本発明は、がんの治療を意図されたワクチン組成物を作製するための、上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるような、式（Ｉ）
【化１４】
2019531343.tif 000015
の化合物ＡＢＸ１９６および腫瘍抗原の、上の「化学療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの化学療法剤および／または上の「免疫療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの免疫療法剤との組み合わせにも関する。
【０１０１】
本発明は、治療有効量の式（Ｉ）
【化１５】
2019531343.tif 000016
の化合物ＡＢＸ１９６の、（ａ）治療有効量の上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるような腫瘍抗原、ならびに（ｂ）治療有効量の上の「化学療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの化学療法剤および／または治療有効量の上の「免疫療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの免疫療法剤と組み合わせた、それを必要とする患者における投与、特に同時投与を含む、がんを治療するための方法にも関する。
【０１０２】
本発明は、がんの治療を意図された薬剤を作製するための、式（Ｉ）
【化１６】
2019531343.tif 000017
の化合物ＡＢＸ１９６の、（ａ）上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるような腫瘍抗原、ならびに（ｂ）上の「化学療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの化学療法剤および／または上の「免疫療法剤」セクションに定義されるような少なくとも１つの免疫療法剤との組み合わせにも関する。
【０１０３】
本発明のあらゆる上記の態様において、化合物ＡＢＸ１９６は、ワクチン組成物中に含まれるとき、アジュバントとして用いられ得る。
【０１０４】
用語「同時投与」または「組み合わせ投与」は、本明細書で用いられるとき、選択された治療薬の単一患者への投与を包含するように定義され、この薬剤が必ずしも同じ投与経路によりまたは同時に投与されない治療計画を含むように意図される。
【０１０５】
本発明によると、用語「対象」または「それを必要とする対象」は、がんに罹患したかまたは罹患している可能性が高いヒトまたは非ヒト哺乳動物が対象であるように意図される。
【０１０６】
本発明との関連で、用語「治療する」または「治療」は、かかる用語が適用される障害もしくは状態またはかかる障害もしくは状態の１つ以上の症状を回復させるか、軽減するか、その進行を阻害するか、または予防することを意味する。
【０１０７】
本発明の化合物の「治療有効量」は、任意の医学的治療に適用可能である適切なリスク／ベネフィット比でがんを治療するため（例えば、増殖を制限するためまたは腫瘍転移を緩徐化もしくは遮断するため）のこの化合物の十分な量を意味する。しかし、本発明の化合物の総一日使用量は、主治医により、健全な医学的判断の範囲内で決定されることが理解されるであろう。任意の特定の対象における特定の治療有効量レベルは、種々の要素、例えば治療されている障害および障害の重症度、用いられる特定化合物の活性、用いられる特定の組み合わせ、対象の年齢、体重、一般健康、性別および食事、用いられる特定化合物の投与期間、投与経路および排出速度、治療の持続期間、用いられる特定化合物と組み合わせて使用されるかまたは同時使用される薬剤、ならびに医術において周知であるような要素に依存する。例えば、所望される治療効果を達成するのに要求されるより低いレベルでこの化合物の投与を開始し、所望される効果が達成されるまで用量を漸増させることは、十分に当業者の範囲内にある。
【０１０８】
本発明に従う抗腫瘍医薬組み合わせは、がんを治療するために特に有用である。
【０１０９】
本発明の抗腫瘍医薬組み合わせは、知覚できるがん性腫瘍のその発生の任意のフェーズ、例えばがんの進化のその進行フェーズにおける治療を行うために用いることができる。特に、本発明の抗腫瘍医薬組み合わせは、侵襲性の高いがんを治療するために用いることができる。
【０１１０】
より詳細には、用語「がんの治療」は、本明細書で用いられるとき、以下の特徴：がんに関連する症状の軽減、がん性腫瘍の程度の減少（例えば、腫瘍増殖の減少）、がん性腫瘍の状態の安定化（例えば、腫瘍増殖の阻害）、がんのさらなる伝播（例えば転移）の予防、がんの発生または再発の予防、がんの進行の遅延化または遅延（例えば、腫瘍増殖の減少）またはがんの状態における改善（例えば、腫瘍サイズの減少）の少なくとも１つを含む。
【０１１１】
本明細書で用いられるとき、用語「がん」または「がん性腫瘍」は、細胞の集団が、程度の差はあっても、通常、増殖および分化を支配する制御機構に対して非応答性になっているような障害を指す。がんは、様々なタイプの悪性新生物および腫瘍、例えば原発性腫瘍、ならびに腫瘍転移を指す。本発明の組み合わせにより治療可能ながんの非限定例として、リンパ増殖性障害、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、骨がん、肝がん、胃がん、大腸がん、膵がん、甲状腺のがん、頭頚部がん、中枢神経系のがん、末梢神経系のがん、皮膚がん、腎がん、肝細胞がん、肝腫瘍、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道がん、甲状腺がん、神経節芽腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋皮肉腫、浸潤性乳管がん、乳頭腺がん、メラノーマ、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、腎細胞がん、グラヴィッツ腫瘍、副腎様腺がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺がん、例えば小細胞がん、非小細胞がんおよび大細胞肺がん、膀胱がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、結腸がん、直腸がん、造血性悪性腫瘍、例えば白血病およびリンパ腫のすべてのタイプ、例えば急性骨髄性白血病、急性骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、肥満細胞白血病、多発性骨髄腫、骨髄性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫および肝細胞がんが挙げられる。
【０１１２】
好ましくは、本発明との関連で治療されるがんは、メラノーマ、腎がん、肝細胞がん、膵がんおよび肺がんからなる群から選択される。
【０１１３】
一実施形態では、本発明との関連で治療されるがんは、メラノーマ、肝細胞がん、膀胱がんおよび結腸直腸がんからなる群から選択される。
【０１１４】
最も好ましくは、本発明との関連で治療されるがんは、メラノーマである。
【０１１５】
組み合わせ療法は、個別治療に関連した鑑別毒性を考慮すると、治療的利点を提供し得る。例えば、１つの化学療法剤を用いる治療または１つの免疫療法剤を用いる治療は、ＡＢＸ１９６または本発明のワクチン組成物の場合に認められない特定の毒性をもたらし得る。そのように、この鑑別毒性は、各治療で毒性が不在または最小である用量で投与されることを可能にし得ることから、まとめると、組み合わせ療法は、治療量を提供しつつも、併用剤の各成分の毒性を回避する。さらに、組み合わせ療法の結果として達成される治療効果が高まることから、薬剤の各々の用量がさらに低減され、したがってそれに関連する毒性がさらにより大幅に低下し得る。
【０１１６】
特に好ましい実施形態では、本発明に従うがんの治療方法は、化合物ＡＢＸ１９６または上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるような本発明のワクチン組成物の好ましくは静脈内への１回の投与と、続いて４日後の上の「化学療法剤」セクションに定義されるような化学療法剤、特にドキソルビシンの好ましくは静脈内注入による１回の投与とを含む。
【０１１７】
別の実施形態では、本発明に従うがんの治療方法は、化合物ＡＢＸ１９６または上の「ワクチン組成物」セクションに定義されるような本発明のワクチン組成物の好ましくは静脈内への１回の投与と、続いて７日後の上の「免疫療法剤」セクションに定義されるような免疫療法剤、特にニボルマブの好ましくは静脈内注入による１回目投与と、好ましくは続いて４日後の前記免疫療法剤の好ましくは静脈内注入による２回目投与と、好ましくはさらに続いて３日後の前記免疫療法剤の好ましくは静脈内注入による３回目投与と、さらに好ましくは続いて４日後の前記免疫療法剤の好ましくは静脈内注入による４回目投与とを含む。
【０１１８】
本発明は、下の図面および実施例によってさらに例示される。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】実施例１における、Ｄ３にＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７およびＤ２１に抗ＰＤ−１抗体またはＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６と抗ＰＤ−１抗体との組み合わせで治療された、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植されたＢ１６−Ｆ１０腫瘍の体積の平均および中央値である。
【図２】実施例１における、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を有し、かつＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６、抗ＰＤ−１抗体またはＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６と抗ＰＤ−１抗体との組み合わせで治療された、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの生存である。＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１；ｎ．ｓ．：非有意。
【図３】実施例１における、Ｄ３にＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６、Ｄ７にドキソルビシンまたはＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６とドキソルビシンとの組み合わせで治療された、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植されたＢ１６−Ｆ１０腫瘍の体積の平均および中央値である。
【図４】実施例１における、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を有し、かつＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６、ドキソルビシンまたはＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６とドキソルビシンとの組み合わせで治療された、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの生存である。＊＊：ｐ＜０．０１＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊＊：ｐ＜０．０００１；ｎ．ｓ．：非有意。
【図５】媒体、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、静脈内投与されるＡＢＸ１９６、または静脈内投与される抗ＰＤ−１モノクローナル抗体とＡＢＸ１９６との組み合わせに曝露された、実施例５のＢ１６Ｆ１０保有マウスの平均腫瘍体積（ｍｍ３）である。平均＋／−平均値の標準誤差。
【図６】媒体、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、腫瘍内投与されるＡＢＸ１９６、または腫瘍内投与される抗ＰＤ−１モノクローナル抗体とＡＢＸ１９６との組み合わせに曝露された、実施例５のＢ１６Ｆ１０保有マウスの平均腫瘍体積（ｍｍ３）である。平均＋／−平均値の標準誤差。
【図７】媒体、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、静脈内投与されるＡＢＸ１９６、または静脈内投与される抗ＰＤ−１モノクローナル抗体とＡＢＸ１９６との組み合わせに曝露された、実施例５のＢ１６Ｆ１０保有マウスの生存である。平均＋／−平均値の標準誤差。
【図８】媒体、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、腫瘍内投与されるＡＢＸ１９６、または腫瘍内投与される抗ＰＤ−１モノクローナル抗体とＡＢＸ１９６との組み合わせに曝露された、実施例５のＢ１６Ｆ１０保有マウスの生存である。平均＋／−平均値の標準誤差。
【図９】媒体、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、静脈内投与されるＡＢＸ１９６、または静脈内投与される抗ＰＤ−１モノクローナル抗体とＡＢＸ１９６との組み合わせに曝露された、実施例６のＣＴ−２６保有マウスの平均腫瘍体積（ｍｍ３）である。平均＋／−平均値の標準誤差。
【図１０】媒体、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、静脈内投与されるＡＢＸ１９６、または抗ＰＤ−１モノクローナル抗体とＡＢＸ１９６との組み合わせに曝露された、実施例６のＭＢＴ−２保有マウスの平均腫瘍体積（ｍｍ３）である。平均＋／−平均値の標準誤差。
【図１１】媒体（２）、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（４）、静脈内投与されるＡＢＸ１９６（３）、または抗ＰＤ−１モノクローナル抗体とＡＢＸ１９６との組み合わせ（１）に曝露された、実施例６のＭＢＴ−２保有マウスの生存である。
【図１２】２０日目での実施例７の各マウス群からの肝臓の腫瘍浸潤の％である。Ｇ１：媒体；Ｇ２：ソラフェニブ；Ｇ３：ソラフェニブ＋ＡＢＸ１９６；Ｇ４：ドキソルビシン；Ｇ５ドキソルビシン＋ＡＢＸ１９６；Ｇ６：抗ＰＤ−１；Ｇ７  抗ＰＤ−１＋ＡＢＸ１９６。
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
【表１】
2019531343.tif 000018
【実施例】
【０１２１】
実施例１
本実施例は、化合物ＡＢＸ１９６および腫瘍抗原を含むワクチン組成物がドキソルビシンなどの化学療法剤または抗ＰＤ−１抗体などの免疫療法剤の抗がん効果を高めることを示す。
【０１２２】
１．材料および方法
１．１．化合物
用いたワクチン組成物は、ペプチドＣｌ  ＩＩ−ＴＲＰ２１８０−１８８およびＡＢＸ１９６アジュバントを含む。
【０１２３】
配列ＫＦＧＷＴＧＰＤＣＮＲＫＫＰＡ  ＧＧ  ＮＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬＨＹＹ（配列番号１）のペプチドＣｌ  ＩＩ−ＴＲＰ２１８０−１８８は、メラニン細胞内で過剰発現される腫瘍関連抗原のチロシナーゼ関連タンパク質２からの免疫優性ペプチド（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３））と融合されたクラスＩＩエピトープ（ＫＦＧＷＴＧＰＤＣＮＲＫＫＰＡ（配列番号２））からなる。
【０１２４】
アジュバントＡＢＸ１９６は、ＮＫＴ細胞を活性化する特性を有する。
【０１２５】
用いた化学療法剤は、ドキソルビシンであった（ＤＯＸＯ  ＣＥＬＬ，Ｃｅｌｌ  Ｐｈａｒｍ）。
【０１２６】
用いた免疫療法剤は、抗ＰＤ−１抗体であった（参照：ＢＥ０１４６，ＢｉｏＸｃｅｌｌ；クローン：ＲＭＰ１−１４、反応性：マウス；アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ；貯蔵条件：＋４℃）。
【０１２７】
１．２．化合物媒体
ドキソルビシンをＮａＣｌ０．９％で希釈した。
【０１２８】
製造業者の推奨に従い、抗ＰＤ−１抗体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または他の好適な溶媒で調製した。
【０１２９】
Ｃｌ  ＩＩ−ＴＲＰ２ペプチド（５ｍｇ／チューブ）を５０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに再懸濁した。
【０１３０】
アジュバントＡＢＸ１９６を２５０μｇ／ｍＬの溶液として準備した。
【０１３１】
Ｃｌ  ＩＩ−ＴＲＰ２ペプチドおよびＡＢＸ１９６を含有するワクチンの最終製剤をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で調製した。
【０１３２】
３日目に群１で用いた媒体溶液（セクション２．１．２．を参照されたい）は、ＣＬ  ＩＩ−ＴＲＰ２／ＡＢＸ１９６ワクチンに関して同じ最終濃度においてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈したＤＭＳＯを含有した。
【０１３３】
１．３．治療用量
ペプチドＣｌ  ＩＩ−ＴＲＰ２は、１μｇのアジュバントＡＢＸ１９６とともに５０μｇ／マウスの用量で投与した。
【０１３４】
抗ＰＤ−１抗体は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。
【０１３５】
ドキソルビシンは、１２ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。
【０１３６】
１．４．投与経路
ワクチン組成物は、静脈内経路によりマウスの尾側静脈に注射した（ＩＶ、ボーラス）。
【０１３７】
抗ＰＤ−１抗体は、マウスの腹膜腔に注射した（腹腔内、ＩＰ）。
【０１３８】
ドキソルビシンは、マウスの尾側静脈に静脈内注射した（ＩＶ、ボーラス）。
【０１３９】
すべての群において、ワクチン組成物は、マウスの直近体重に応じて、１０ｍＬ／ｋｇ／投与の用量ボリュームで投与した（すなわち体重が２０ｇのマウス１匹に対してワクチン組成物２００μＬを投与した）。
【０１４０】
１．５．がん細胞株および培養条件
１．５．１．がん細胞株
用いた細胞株は、下の表１に詳細に示す。
【０１４１】
【表２】
2019531343.tif 000019
【０１４２】
Ｂ１６−Ｆ１０細胞株は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて自然発生するメラノーマに起因する肺転移から樹立した。
【０１４３】
１．５．２．細胞培養条件
細胞を、それら各々の培地において、加湿雰囲気中（５％ＣＯ２、９５％空気）、３７℃、単層で増殖させた（下表を参照されたい）。培地は、１０％ウシ胎仔血清（参照：３３０２，Ｌｏｎｚａ）を添加した、２ｍＭのＬ−グルタミン（参照：ＢＥ１２−７０２Ｆ，Ｌｏｎｚａ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有するＤＭＥＭであった。腫瘍細胞は、プラスチックフラスコに接着する。実験使用のため、腫瘍細胞を、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス培地（参照：ＢＥ１０−５４３Ｆ，Ｌｏｎｚａ）中、トリプシン−バーゼン液（参照：ＢＥ１７−１６１Ｅ，Ｌｏｎｚａ）で５分間処理することにより培養フラスコから剥離し、完全培地の添加により中和した。細胞を血球計数器で計数し、それらの生存度を０．２５％トリパンブルー排除アッセイにより評価した。
【０１４４】
１．６．動物の使用
１．６．１．動物
６〜７週齢の健常な雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウス９５匹をＪＡＮＶＩＥＲ  ＬＡＢＳ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓａｉｎｔ−Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。動物は、ＦＥＬＡＳＡガイドラインに従い、ＳＰＦ健康状態で維持した。
【０１４５】
動物収容および実験手順は、Ｆｒｅｎｃｈ  ａｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｓおよびＮＲＣ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに準じて実現した。
【０１４６】
１．６．２．収容条件
動物は、次の制御された環境条件下において収容室内で維持した。
−  温度：２２±２℃、
−  湿度５５±１０％、
−  光周期（１２時間明／１２時間暗）、
−  ＨＥＰＡ濾過空気、
−  再循環なしで空気交換１５回／時間
【０１４７】
動物収容では、下記の通り、ベッディング材料、食料および水、環境および社会エンリッチメントを有する滅菌された十分なスペースを提供した（グループ収容）。
−  上面フィルター、ポリカーボネート製Ｅｕｒｏｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｙｐｅ  ＩＩＩまたはＩＶケージ、
−  トウモロコシ穂軸のベッディング（参照：ＬＡＢ  ＣＯＢ１２，ＳＥＲＬＡＢ，Ｆｒａｎｃｅ）、
−  ２５ｋＧｙの照射食餌（Ｓｓｎｉｆｆ（登録商標）Ｓｏｅｓｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、
−  免疫担当齧歯類用の完全食物−Ｒ／Ｍ−Ｈ  Ｅｘｔｒｕｄａｔｅ、
−  水０．２μｍで滅菌濾過、
−  環境エンリッチメント（ＳＩＺＺＬＥ−ｄｒｉ  ｋｒａｆｔ−Ｄ２０００４  ＳＥＲＬＡＢ，Ｆｒａｎｃｅ）
【０１４８】
２．治療
２．１．皮下Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ保有マウスにおけるＰＤ−１標的化抗体またはドキソルビシンと組み合わせた新規ワクチンの抗腫瘍活性試験
２．１．１．動物におけるＢ１６−Ｆ１０腫瘍の誘発
ＰＢＳ緩衝液２００μＬ中、１×１０６個のＢ１６−Ｆ１０細胞のＣ５７ＢＬ／６雌動物９５匹の右側腹部への皮下注射により、腫瘍を誘導した。右側腹部への腫瘍細胞注射の日をＤ０とみなした。
【０１４９】
２．１．２．治療スケジュール
次にＤ３に９５匹中９０匹を、それらの体重に従い、各群が動物１５匹からなる６群（群１〜６）に無作為化した。
【０１５０】
統計学的試験（分散の分析、ＡＮＯＶＡ）を実施し、Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて群間の均一性について試験した。
・群１からの動物は、３日目にワクチン組成物用に用いる媒体の１回のＩＶ注射と、１０、１４、１７および２１日目に抗ＰＤ−１抗体用に用いる媒体の４回のＩＰ投与とを受けた。
・群２からの動物は、３日目に１μｇのＡＢＸ１９６とともに５０μｇのＣｌ  ＩＩ−ＴＲＰ２の１回のＩＶ注射を受けた。
・群３からの動物は、１０、１４、１７および２１日目に抗ＰＤ−１抗体の４回のＩＰ投与を受けた。
・群４からの動物は、３日目に１μｇのＡＢＸ１９６とともに５０μｇのＣＬ  ＩＩ−ＴＲＰ２の１回のＩＶ注射と、１０、１４、１７および２１日目に抗ＰＤ−１抗体の４回のＩＰ投与とを受けた。
・群５からの動物は、７日目に１２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの１回のＩＶ注射を受けた。
・群６からの動物は、３日目に１μｇのＡＢＸ１９６とともに５０μｇのＣＬ  ＩＩ−ＴＲＰ２の１回のＩＶ注射と、７日目に１２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの１回のＩＶ注射とを受けた。
【０１５１】
治療スケジュールを下の表２にまとめる。
【０１５２】
【表３】
2019531343.tif 000020
【０１５３】
２．２セクションに記載のように動物の監視を実施した。
【０１５４】
２．２．動物の監視
２．２．１．臨床的監視
生存度および挙動を毎日記録した。体重は、腫瘍細胞の注射まで週２回、次に週３回測定した。腫瘍の長さおよび幅をノギスで週３回測定し、腫瘍の体積を式：
【数１】
2019531343.tif 000021
により評価した。
【０１５５】
２．２．２．人道的エンドポイント
−  疼痛、苦痛または窮迫の徴候：痛み姿勢、痛みフェイスマスク（ｐａｉｎ  ｆａｃｅ  ｍａｓｋ）、挙動、
−  正常体重の１０％を超える（個別腫瘍を考慮）が、１，５００ｍｍ３を超えない（右側腹部の腫瘍体積／ＭＦＰと左側腹部の腫瘍体積／ＭＦＰとの和を考慮）腫瘍、
−  異所運動または栄養に干渉する腫瘍、
−  潰瘍化腫瘍または組織侵食、
−  ２連続日での２０％の体重減少状態、
−  身体状態不良、るいそう、悪液質、脱水、
−  外部刺激に対する自発的応答不在の遷延、
−  迅速な努力性呼吸、貧血、有意な出血、
−  神経性徴候：旋回、痙攣、麻痺、
−  持続的な体温低下、
−  腹部膨満。
【０１５６】
２．２．３．剖検
実験を終了したすべての動物、可能であれば、すべての安楽死・瀕死動物または死亡が認められた動物に対して剖検（肉眼検査）を実施した。
【０１５７】
２．３．動物手順
２．３．１．麻酔
腫瘍接種および静脈内注射においてイソフルランガス麻酔を用いた。
【０１５８】
２．３．２．安楽死
動物の安楽死は、過剰用量（イソフルラン）によるガス麻酔、その後の頸部脱臼または全採血により実施した。
【０１５９】
３．データ処理
３．１．健康パラメータ
Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて以下の健康評価基準を決定した。
−  動物の各体重および平均体重を準備した。
−  平均体重変化（ＭＢＷＣ）：パーセントでの治療動物の平均体重変化（Ｂ日目の体重からＡ日目の体重を引いてＡ日目の体重で除したもの）を算出した。ＭＢＷＣを算出した区間を体重曲線および体重測定日の関数として選択した。
【０１６０】
３．２．有効性パラメータ
対照動物と比べた治療動物の腫瘍体積に対するワクチン組成物の効果の観点で治療有効性を評価した。Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、抗腫瘍有効性の以下の評価基準を決定した。
−  個別の腫瘍体積の平均および中央値を準備した。
−  腫瘍を有しないマウスの数を準備した。
マウスの生存をさらに監視し、有効性パラメータとして用いた。生存曲線を描いた。
【０１６１】
治療／対照パーセント（Ｔ／Ｃ（％）指数）は、１４日目に治療腫瘍体積中央値を対照腫瘍体積中央値で除し、１００を掛けることにより算出する。４２％以下のＴ／Ｃ％は、がん治療部の薬剤評価部門（ＮＣＩ）により、有意な抗腫瘍活性とみなされる。
【数２】
2019531343.tif 000022
腫瘍増殖阻害は、同様に抗腫瘍有効性を反映したものであり、式：
【数３】
2019531343.tif 000023
に従って算出する。５０％を超える％ＴＧＩは、活性型とみなされる。
【０１６２】
３．３．統計分析
規定の時点での平均腫瘍体積は、すべての治療において、クラスカル・ウォリス検定を用いるＧｒａｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェア（バージョン６．０７）で分析した。すべての治療間の有意差（Ｐ＜０．０５）に続き、ダンの多重比較検定を用いてペアワイズ比較を行った。ＧｒａｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェア（バージョン６．０７）でのログランク（マンテル・コックス）検定を用いて、生存を分析した。すべての治療間の有意差（Ｐ＜０．０５）に続き、ログランク（マンテル・コックス）検定を用いてペアワイズ比較を行った。
【０１６３】
４．結果
４．１．皮下Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ保有マウスにおけるＰＤ−１標的化抗体またはドキソルビシンと組み合わせた本発明のワクチン組成物（ＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６）の抗腫瘍活性試験
４．１．１．毒性パラメータ
平均体重曲線を決定し、マウス個別体重に対する治療の効果を試験した。
【０１６４】
全身状態における悪化は認められず、臨床状態は、治療動物において、治療群を問わず試験中に良好なままであった。
【０１６５】
ＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６で免疫したマウスの３群において、免疫後２日目に重要な体重減少、すなわち約１０％を測定した。体重減少は、すべてのマウスにおいて一過性であり、５日目にそれらは迅速に体重が回復した。
【０１６６】
治療期間中に体重が安定化した、ＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６とドキソルビシンとの組み合わせで治療したマウスを除いて、他のすべての治療群において体重進化が同様であった。
【０１６７】
したがって、ワクチンＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６の単独または組み合わせ投与後の一過性の体重減少を除いて、すべての治療は、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで十分に耐容性があった。
【０１６８】
４．１．２．抗腫瘍活性分析
個別の腫瘍体積の平均および中央値曲線を図１および３に示す。
【０１６９】
マウス生存曲線を図２および４に示す。
【０１７０】
日数における生存時間中央値の概要を下の表３に示す。
【０１７１】
【表４】
2019531343.tif 000024
【０１７２】
Ｄ１７での腫瘍体積の統計分析を下の表４に示す。
【０１７３】
【表５】
2019531343.tif 000025
【０１７４】
Ｄ１９での腫瘍体積の統計分析を下の表５に示す。
【０１７５】
【表６】
2019531343.tif 000026
【０１７６】
３つの亜群内のＤ１７およびＤ１９での腫瘍体積の統計分析を下の表６に示す。
【０１７７】
【表７】
2019531343.tif 000027
【０１７８】
マウス生存の統計分析を下の表７に示す。
【０１７９】
【表８】
2019531343.tif 000028
【０１８０】
【表９】
2019531343.tif 000029
【０１８１】
抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６の抗腫瘍活性分析
Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍保有マウスをＤ３にＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６ワクチン、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７およびＤ２１に抗ＰＤ−１抗体または両方の組み合わせで治療した。腫瘍増殖の動力学を図１に示す。
【０１８２】
予想通り、媒体治療群と比べて抗ＰＤ−１抗体治療に関連した抗腫瘍活性は認められなかった。それらの観察結果は、Ｔ／ＣおよびＴＧＩ値により支持され、それは、抗ＰＤ−１が任意の活性を示す（表８；Ｔ／Ｃ＞４２％およびＴＧＩ＜５０％）ことを示す。それに対し、マウスのＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６での治療の結果、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍の増殖が媒体治療群の場合と比べて緩徐化した。Ｔ／ＣおよびＴＧＩ値は、ＴＲＰ２／ＡＢＸ１９６活性の抗腫瘍活性を示す（表８；Ｔ／Ｃ＜４２％およびＴＧＩ＞５０％）。ＴＲＰ２／ＡＢＸ１９６の抗腫瘍活性は、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせてさらに改善され、後者の群では最大１４日の腫瘍増殖の完全な安定化が認められたが、それは、Ｔ／ＣおよびＴＧＩ値（表８）の各々が１５％未満および９０％超であることからも示される。それらの値は、ＮＣＩガイドラインによると、１５％未満のＴ／Ｃが治療の効力が高いことを示すことから、非常に有効な治療であることを示す。
【０１８３】
Ｄ１７での腫瘍増殖の厳密で徹底的な統計分析（表５）は、すべての群間の腫瘍体積の有意差、ならびにＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６ワクチンおよび抗ＰＤ−１のみで治療したマウスの群における腫瘍体積の媒体治療群と比べて高度に有意な減少を示した。
【０１８４】
統計分析の検出力を増強することを目的として、かつ組み合わせ群対ワクチン治療群における差異が証明されたことから、続いて３つの群、すなわちＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６、ＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６＋抗ＰＤ−１抗体およびＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６＋ドキソルビシンの場合に統計分析を実施した（表６）。この分析によると、ＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６と、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６との間でＤ１７に腫瘍体積の有意な減少が示された一方、この差異は、１９日目に有意性に達しなかった。
【０１８５】
マウス生存について図２に図示する。ＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６で治療したマウスおよび抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６で治療したマウスの生存は、媒体治療群の場合と比べて有意に改善された一方（表７）、その増加は、組み合わせ治療では、ＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６ワクチン単独と比べて有意性に接近した（Ｐ＝０．０７１０）。
【０１８６】
ドキソルビシンと組み合わせたＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６の抗腫瘍活性分析
Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍保有マウスをＤ３にＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６ワクチン、Ｄ７にドキソルビシンまたは両方の組み合わせで治療した。腫瘍増殖の動力学を図３に示す。
【０１８７】
ドキソルビシン単独で治療したマウスは、媒体治療群と比べて、腫瘍増殖の弱くて非有意な（表４および５）減少を示した。たとえＴＧＩが５０％よりやや高くても、Ｔ／Ｃ値は、４２％より高いままであり、これは、ドキソルビシンの抗腫瘍効力の欠如を示す。ドキソルビシンと組み合わせたＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６の組み合わせで治療したマウスは、最大１４日の腫瘍増殖の完全な安定化を示し、実験の完全な統計分析時、Ｄ１７およびＤ１９での腫瘍体積における減少は、媒体治療群に対して有意性に達した（表４および５）。ＴＲＰ２／ＡＢＸ１９６およびドキソルビシンの相乗効果についても、Ｔ／ＣおよびＴＧＩ値の各々が＜４２％および＞５０％であることにより示される（表８）。
【０１８８】
３群でのその後の統計分析（表６）によると、Ｄ１７およびＤ１９において、ＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６と、ドキソルビシンと組み合わせたＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６との間に腫瘍体積の有意な減少が見出された。
【０１８９】
マウス生存について図４に図示する。ドキソルビシンと組み合わせたＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６で治療したマウスの生存は、媒体治療群の場合と比べて有意に改善された一方（表７）、生存の増加は、各治療様式単独と比べて有意性に達しなかった。
【０１９０】
すべての実験群における生存中央値の合成を表３に示す。
【０１９１】
５．結論
本実施例の目的は、ＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６ワクチンと抗ＰＤ−１抗体または化学療法剤ドキソルビシン（免疫原性細胞死を誘導することで知られる）のいずれかとを組み合わせることであった。
【０１９２】
試験化合物は、単独または組み合わせのいずれかであり、動物で十分に耐容性があり、薬物に関連した重篤な毒性も死亡も記録されなかった。
【０１９３】
ＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６ワクチンを受けたすべての群において、１０％に近い一過性の体重減少が認められたが、すべてのマウスは、迅速に、すなわち単回ワクチン注射から２〜５日後にそれらの正常体重に回復した。
【０１９４】
ＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６ワクチンで治療したマウスの生存は、媒体治療群と比べて有意に改善された。両方の組み合わせ群において、抗腫瘍活性は、ワクチン単独と比べてさらに改善され、２１日の生存中央値は、抗ＰＤ−１抗体またはドキソルビシンと組み合わせると、各々が２８および２６日に増加した。ＴＲＰ２−ＡＢＸ１９６ワクチンと抗ＰＤ−１抗体との組み合わせの場合でのワクチン単独に対する生存の増加は、ほぼ有意であった（Ｐ＝０．０７１）。たとえＴＲＰ２／ＡＢＸ１９６およびドキソルビシン治療が抗腫瘍効果を示しても、それらの治療は、本発明の組み合わせ（ＡＢＸ１９６＋抗ＰＤ−１または＋ドキソルビシン）により改善されるが、それは、マウスが組み合わせを用いて治療されるときにＴ／Ｃ比が１６％より低いことから示される（表８を参照されたい）。ＮＣＩガイドラインによると、１５％未満では、治療は、非常に有効とみなされる。同様に、ＴＧＩ（腫瘍増殖阻害）は、組み合わせ治療の存在下で最大７８％であり、組み合わせ治療が非常に有効であることが示される。
【０１９５】
これらの結果は、Ｂ１６−Ｆ１０モデルの強力な攻撃性およびそのそれほど顕著でない免疫原性との関連で注目に値する。特に、実験は、多回注射される腫瘍細胞（すなわち百万回／動物）を用いて実施していることから、それは、腫瘍の完全退縮が認められなかった理由を潜在的に説明し得る。
【０１９６】
実施例２
本実施例は、アジュバントとして他のα−ガラクトシルセラミド誘導体を含む他のワクチン組成物と比べた、アジュバントとしてＡＢＸ１９６を含む本発明のワクチン組成物を用いて得られる具体的効果を説明する。
【０１９７】
材料および方法
実験は、マウスに５×１０５個のＢ１６−Ｆ１０細胞を投与した以外、実施例１に記載のように実施した。
【０１９８】
用いた他のα−ガラクトシルセラミド誘導体は、以下の式：
【化１７】
2019531343.tif 000030
のα−ＧａｌＣｅｒであった。
【０１９９】
第１の実験の治療スケジュールは、次の通りであった。
【０２００】
【表１０】
2019531343.tif 000031
【０２０１】
第２の実験の治療スケジュールは、次の通りであった。
【０２０２】
【表１１】
2019531343.tif 000032
【０２０３】
第３の実験の治療スケジュールは、次の通りであった。
【０２０４】
【表１２】
2019531343.tif 000033
【０２０５】
第４の実験の治療スケジュールは、次の通りであった。
【０２０６】
【表１３】
2019531343.tif 000034
【０２０７】
１群あたりマウス５匹を屠殺し、Ｄ１２およびＤ１６に剖検した。腫瘍を収集し、以下の集団のフローサイトメトリー分析を実施した。
・Ｔ細胞傷害性集団：ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＴＮＦα／パーフォリン／グランザイム
・Ｔｒｅｇ集団：ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８−／ＦｏｘＰ３＋
【０２０８】
実施例３
１．試験目的
異所性Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマモデルにおけるＡＢＸ１９６および実施例２に定義のようなα−Ｇａｌ−Ｃｅｒの抗腫瘍活性を評価する。異所性Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマモデルにおけるドキソルビシン治療と組み合わせたＡＢＸ１９６およびα−Ｇａｌ−Ｃｅｒの抗腫瘍活性を評価する。
【０２０９】
２．材料および方法
実験は、以下を除いて実施例１と同様である。
【０２１０】
試験および参照物質媒体
ドキソルビシンをＮａＣｌ０．９％で希釈した。ＡＢＸ１９６を２５０μｇ／ｍＬの溶液として提供した。α−Ｇａｌ−Ｃｅｒを１ｍｇ／ｍＬの溶液として提供した。ＡＢＸ１９６またはαＧａｌＣｅｒの希釈をＰＢＳ緩衝液で実施した。７日目に群１で用いる媒体溶液は、ＡＢＸ１９６試験アイテムと同じ最終濃度においてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈したＤＭＳＯを含有した。
【０２１１】
治療用量
ＡＢＸ１９６およびα−Ｇａｌ−Ｃｅｒ化合物を１０または１００ｎｇ／マウスの用量で投与した。ドキソルビシンを１２ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。
【０２１２】
投与経路
試験物質は、静脈内経路によりマウスの尾側静脈に注射した（ＩＶ、ボーラス）。ドキソルビシンは、マウスの尾側静脈に静脈内注射した（ＩＶ、ボーラス）。
【０２１３】
すべての群において、試験物質（ＡＢＸ１９６およびα−Ｇａｌ−Ｃｅｒ）は、マウスの直近体重に従い、５ｍＬ／ｋｇ／投与の用量ボリュームで投与した（すなわち体重が２０ｇのマウス１匹に対して１００μＬの試験物質を投与した）。ドキソルビシンを１０ｍＬ／ｋｇ／投与の用量ボリュームで投与した。
【０２１４】
３．実験設計および治療
３．１．１．動物におけるＢ１６−Ｆ１０腫瘍の誘導
ＰＢＳ緩衝液２００μＬ中、５×１０５個のＢ１６−Ｆ１０細胞の１９５匹のＣ５７ＢＬ／６雌動物の右側腹部への皮下注射により、腫瘍を誘導した。右側腹部への腫瘍細胞注射の日をＤ０とみなした。
【０２１５】
３．１．２．治療スケジュール
次に、Ｄ７において、１９５匹中１５０匹の動物を、それらの腫瘍体積に従い、各群が動物１５匹からなる１０群（群１〜１０）に無作為化した。Ｄ７の体積が小さすぎる場合、特にマウスが測定可能な腫瘍を示さない場合、それらの体重に従い、無作為化を実施した。
【０２１６】
群間の均一性について試験するため、Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて統計学的試験（分散分析）を実施した。
【０２１７】
治療スケジュールを下表にまとめる。
【０２１８】
【表１４】
2019531343.tif 000035
【０２１９】
・群１からの動物は、７および１０日目に試験物質媒体の１回のＩＶ注射を受けた。
・群２からの動物は、１０日目に１０ｎｇのＡＢＸ１９６の１回のＩＶ注射を受けた。
・群３からの動物は、１０日目に１０ｎｇのα−Ｇａｌ−Ｃｅｒの１回のＩＶ注射を受けた。
・群４からの動物は、１０日目に１００ｎｇのＡＢＸ１９６の１回のＩＶ注射を受けた。
・群５からの動物は、１０日目に１００ｎｇのα−Ｇａｌ−Ｃｅｒの１回のＩＶ注射を受けた。
・群６からの動物は、７日目に１２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの１回のＩＶ注射を受けた。
・群７からの動物は、７日目に１２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの１回のＩＶ注射と、１０日目に１０ｎｇのＡＢＸ１９６の１回のＩＶ注射とを受けた。
・群８からの動物は、７日目に１２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの１回のＩＶ注射と、１０日目に１００ｎｇのＡＢＸ１９６の１回のＩＶ注射とを受けた。
・群９からの動物は、７日目に１２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの１回のＩＶ注射と、１０日目に１０ｎｇのα−Ｇａｌ−Ｃｅｒの１回のＩＶ注射とを受けた。
・群１０からの動物は、７日目に１２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの１回のＩＶ注射と、１０日目に１００ｎｇのα−Ｇａｌ−Ｃｅｒの１回のＩＶ注射とを受けた。
【０２２０】
実施例４
１．試験目的
パート１：異所性Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマモデルにおけるワクチンＣＬ  ＩＩ−ＴＲＰ２／ＡＢＸ１９６またはＣＬ  ＩＩ−ＴＲＰ２／α−Ｇａｌ−Ｃｅｒと抗ＰＤ−１抗体との組み合わせの抗腫瘍活性を評価する。
パート２：ＣＬ  ＩＩ−ＴＲＰ２／ＡＢＸ１９６ワクチンの単独または抗ＰＤ−１抗体治療との組み合わせで治療したマウスからのＢ１６−Ｆ１０腫瘍における免疫浸潤物の特徴付け。
【０２２１】
２．材料および方法
実験のパート１は、以下を除き、実施例１と同様である。
【０２２２】
試験および参照物質媒体
製造業者の推奨に従い、抗ＰＤ−１抗体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または他の好適な媒体中で調製した。Ｃｌ  ＩＩ−ＴＲＰ２ペプチド（５ｍｇ／チューブ）を５０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに再懸濁した。アジュバントＡＢＸ１９６を２５０μｇ／ｍＬの溶液として準備した。アジュバントα−Ｇａｌ−Ｃｅｒを１ｍｇ／ｍＬの溶液として準備した。Ｃｌ  ＩＩ−ＴＲＰ２ペプチドおよびＡＢＸ１９６を含有するワクチンの最終製剤をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で調製した。３日目に群１で用いた媒体溶液は、ＣＬ  ＩＩ−ＴＲＰ２／ＡＢＸ１９６ワクチンについて同じ最終濃度においてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈したＤＭＳＯを含有した。
【０２２３】
治療用量
ペプチドＣｌ  ＩＩ−ＴＲＰ２を１００ｎｇのアジュバントＡＢＸ１９６またはα−Ｇａｌ−Ｃｅｒとともに５０μｇ／マウスの用量で投与した。抗ＰＤ−１抗体を１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。
【０２２４】
投与経路
試験物質は、静脈内経路によりマウスの尾側静脈に注射した（ＩＶ、ボーラス）。抗ＰＤ−１抗体は、マウスの腹膜腔に注射した（腹腔内、ＩＰ）。
【０２２５】
すべての群において、試験物質は、マウスの直近体重に従い、５ｍＬ／ｋｇ／投与の用量ボリュームで投与した（すなわち体重が２０ｇのマウス１匹に対して１００μＬの試験物質を投与した）。抗ＰＤ−１抗体を１０ｍＬ／ｋｇ／投与の用量ボリュームで投与した。
【０２２６】
３．実験設計および治療
パートＩ：皮下Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ保有マウスにおけるＰＤ−１標的化抗体と組み合わせたワクチンの抗腫瘍活性試験
ｉ．動物におけるＢ１６−Ｆ１０腫瘍の誘導
ＰＢＳ緩衝液２００μＬ中、５×１０５個のＢ１６−Ｆ１０細胞の１５６匹のＣ５７ＢＬ／６雌動物の右側腹部への皮下注射により、腫瘍を誘導した。右側腹部への腫瘍細胞注射の日をＤ０とみなした。
【０２２７】
ｉｉ．治療スケジュール
次に、Ｄ３において、１５６匹中１２０匹の動物を、それらの体積に従い、動物１５匹からなる６群（群１〜６のＡＣＴ２）および動物１０匹からなる３群（群１〜３のＡＣＴ３）の９群に無作為化した。
【０２２８】
群間の均一性について試験するため、Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて統計学的試験（分散分析）を実施した。
・群１からの動物は、３日目に試験物質媒体の１回のＩＶ注射と、１０、１４、１７および２１日目に試験参照媒体（抗体）の４回のＩＰ投与とを受けた。
・群２からの動物は、３日目に１００ｎｇのＡＢＸ１９６とともに５０μｇのＣｌ  ＩＩ−ＴＲＰ２の１回のＩＶ注射を受けた。
・群３からの動物は、１０、１４、１７および２１日目に抗ＰＤ−１抗体の４回のＩＰ投与を受けた。
・群４からの動物は、３日目に１００ｎｇのＡＢＸ１９６とともに５０μｇのＣＬ  ＩＩ−ＴＲＰ２の１回のＩＶ注射と、１０、１４、１７および２１日目に抗ＰＤ−１抗体の４回のＩＰ投与とを受けた。
・群５からの動物は、３日目に１００ｎｇのα−Ｇａｌ−Ｃｅｒとともに５０μｇのＣｌ  ＩＩ−ＴＲＰ２の１回のＩＶ注射を受けた。
・群６からの動物は、３日目に１００ｎｇのα−Ｇａｌ−Ｃｅｒとともに５０μｇのＣＬ  ＩＩ−ＴＲＰ２の１回のＩＶ注射と、１０、１４、１７および２１日目に抗ＰＤ−１抗体の４回のＩＰ投与とを受けた。
【０２２９】
治療スケジュールを下表にまとめる。
【０２３０】
【表１５】
2019531343.tif 000036
【０２３１】
パートＩＩ：ＰＤ−１標的化抗体と組み合わせたワクチンで治療したマウスからのＢ１６−Ｆ１０メラノーマ腫瘍における免疫Ｔ細胞浸潤物の特徴付け
・群１からの動物は、３日目に試験物質媒体の１回のＩＶ注射と、１０、１４、１７および２１日目に試験参照媒体（抗体）の４回のＩＰ投与とを受けた。
・群２からの動物は、３日目に１００ｎｇのＡＢＸ１９６とともに５０μｇのＣｌ  ＩＩ−ＴＲＰ２の１回のＩＶ注射を受けた。
・群３からの動物は、３日目に１００ｎｇのＡＢＸ１９６とともに５０μｇのＣＬ  ＩＩ−ＴＲＰ２の１回のＩＶ注射と、１０、１４、１７および２１日目に抗ＰＤ−１抗体の４回のＩＰ投与とを受けた。
【０２３２】
治療スケジュールを下表にまとめる。
【０２３３】
【表１６】
2019531343.tif 000037
【０２３４】
Ｄ１３およびＤ１７において、腫瘍における免疫Ｔ細胞浸潤物を評価した。終了時、各群のマウス５匹から腫瘍を収集した。群２および３において、各収集日、すなわちＤ１３およびＤ１７において、応答および非応答マウス間でのバランス良い割合を収集した。
【０２３５】
各腫瘍をマウスからの除去後に秤量し、ＲＰＭＩ培地を有するチューブに移した。腫瘍を数ｍｍサイズの小片に小刀で機械的に破壊し、最後に７０μｍの篩上で１ｍＬのシリンジプランジャーを用いて粉砕した（参照：３５２３５０，ＦＡＬＣＯＮ）。次に、細胞をトリパンブルー染色後に計数し、百万個の細胞を遠心分離し、染色緩衝液（ＰＢＳ（参照：１７−５１６Ｆ，Ｌｏｎｚａ）、０．２％ＢＳＡ（参照：Ａ７０３０，Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ−Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）、０．０２％ＮａＮ３（参照：Ｓ２００２，Ｓｉｇｍａ））に再懸濁した。
【０２３６】
選択されたマーカーに特異的な抗体を、各抗体における供給業者によって記載される条件に従い、腫瘍細胞懸濁液に添加した。マーカーＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８を細胞表面上で検出した。細胞透過処理後、マーカーＦｏｘＰ３、ＴＮＦα、パーフォリン、グランザイムを細胞内で検出した。各場合に陰性対照としてアイソタイプ対照抗体を用いた。２つの以下の集団を測定するために用いる抗体パネルを下表に列挙する。
・Ｔｒｅｇ細胞集団：ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８−／ＦｏｘＰ３＋
・Ｔ細胞傷害性集団：ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＴＮＦａ／パーフォリン／グランザイム
【０２３７】
【表１７】
2019531343.tif 000038
【０２３８】
細胞および抗体の混合物を暗所、室温で２０〜３０分間インキュベートし、洗浄し、染色緩衝液２００μＬに再懸濁した。すべての試料をフローサイトメトリー分析まで氷上で貯蔵し、光から保護した。波長４０５、４８８および６３３ｎｍでの３つの励起レーザーを備えたＣｙＦｌｏｗ（登録商標）ｓｐａｃｅフローサイトメーター（ＬＳＲ  ＩＩ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色細胞を分析した。各試料について１０，０００のｍＣＤ４５＋事象のいずれかが記録されるまで、または２分間の最大持続時間にわたり、フローサイトメトリーデータを取得した。
【０２３９】
実施例５：抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて静脈内または腫瘍内に投与したＡＢＸ１９６の試験
１．試験目的
試験は、同系インビボメラノーマＢ１６Ｆ１０腫瘍保有マウスモデルで実施した。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を免疫担当Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下接種した。
【０２４０】
０日目、メラノーマＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を、細胞を８〜１０週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に細胞を注射することにより皮下接種し、次に動物を対照（媒体としてＰＢＳ処理）群および治療群に無作為に割り当てた。
【０２４１】
抗ＰＤ−１抗体治療では、６、９、１２、１５および２１日目、マウスに抗ＰＤ−１抗体を腹腔内（ＩＰ）注射した。さらに、ＡＢＸ１９６を１用量で静脈内または腫瘍内に投与し、腫瘍サイズの平均が１００ｍｍ３に達する１０日目に１回投与した。
【０２４２】
抗腫瘍有効性評価のための動物の薬理学的群を以下のように組織化した。
１群あたりマウス１４〜１５匹
インビボ有効性評価において全部でマウス９０匹の場合、
−  対照媒体治療群（抗ＰＤ−１治療スケジュールに基づくＰＢＳ）
−  抗ＰＤ−１治療群（１用量での腹腔内投与）
−  ＡＢＸ１９６治療群（１０日目に１用量での静脈内（ｉｖ）投与）
−  組み合わせ治療群（抗ＰＤ−１抗体の１用量での腹腔内（ｉｐ）投与と組み合わせた１０日目にＡＢＸ１９６の１用量での静脈内（ｉｖ）投与）
−  ＡＢＸ１９６治療群（１０日目に１用量での腫瘍内（ｉｔ）投与）
−  組み合わせ治療群（抗ＰＤ−１抗体の１用量での腹腔内（ｉｐ）投与と組み合わせた１０日目にＡＢＸ１９６の１用量での腫瘍内（ｉｔ）投与）
【０２４３】
２．実験手順
２．１  動物
マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、Ｃ５７ＢＬ／６株、雌
提供者：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−ＢＰ０１０９−Ｆ６９５９２  Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ  Ｃｅｄｅｘ。
【０２４４】
動物は、８〜１０週で用いた。６週齢マウスを約１４日間順化させた（８週齢時にＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞の移植）。動物９０匹を本試験に用いた。
【０２４５】
換気および空気処理は、頻繁なターンオーバー（収容される動物の密度に応じて８〜２０体積／時間）および２２〜２５℃の制御温度を通じて実施した。湿度は、４０〜７０％に維持した。人工照明は、１日１２時間維持した。食料（固形飼料）および飲料（水道水）に対する量およびアクセスを毎日点検した。マウスは、動物１０匹／ケージ（８２０ｃｍ２のケージ）で集合ケージに収容した。ケージは、動物管理人により週１回更新した。
【０２４６】
２．２  動物監視
動物の腫瘍体積および体重は、週３回、測定し、記録した。２０００ｍｍ３を超える腫瘍体積または動物の初期体重と比べて１５％を超える体重減少をエンドポイントとみなした。
【０２４７】
同様に、マウスが（ｉ）疲弊した場合または（ｉｉ）その外皮がもはやきれいでなくなった（毛が逆立ち、艶がない）場合、（ｉｉｉ）可動性が低下した場合、これもエンドポイントとみなした。これらの条件の少なくとも１つが満たされたとき、マウスを頸部脱臼により屠殺した。
【０２４８】
このモデルに関する疼痛、苦痛および不安を最小化するため、動物は、２日毎に監視された。観察は、体重減少（１５％）および姿勢の変化などの信頼できる判断基準を含んだ。不安を最小化するため、環境エンリッチメントを行った（プラスチックチューブ）。
【０２４９】
疼痛処置：
手術ステップ（腫瘍細胞の皮下注射）では、麻酔は、腹腔内注射により、ケタミン（０．３３ｍｇ／ｍｌ）およびキシラジン（３３．６μｇ／ｍｌ）を用いて行った。
【０２５０】
２．３  メラノーマがん細胞の移植手順
−  がん細胞株：
メラノーマＢ１６Ｆ１０細胞を、提供者の仕様に従い、１０％の最終濃度のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０でインビトロ培養した。マウスへの移植前、トリパンブルー排除を用いて細胞生存度を評価し、細胞懸濁物を生菌数に従って調製した。
−  マウスにおけるメラノーマＢ１６Ｆ１０腫瘍の誘導：
Ｂ１６Ｆ１０細胞をＣ５７ＢＬ／６免疫担当マウス（８週齢雌）の右側腹部に皮下移植した。移植手順は以下の通りであった（すべてのステップを無菌層流条件下で実施した）：マウス（約２０ｇの体重）を９０μＬの麻酔剤（すなわち１．５ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１５０μｇ／Ｋｇのキシラジン）の腹腔内注射で麻酔した。移植される細胞を滅菌ＰＢＳに再懸濁し、移植に必要な量を２５Ｇ針で１ｍｌのシリンジに充填した（１０００，０００細胞／１００μＬ）。
【０２５１】
２．４  薬理学的治療
−  抗ＰＤ−１抗体治療
腹腔内注射による１００μｇでの抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ａ−ＰＤ−１）治療スケジュールを適用した。治療は、６、９、１２、１５および１８日目に４回反復した。腹腔内注射用に２７Ｇゲージ針を用いた。
材料：
−  抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（ａ−ＰＤ−１）−（クローンＲＭＰ１−１４）
−  腹腔内投与用の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体製剤
−  リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液に溶解した抗ＰＤ−１  ｍＡｂ
ダルベッコＰＢＳを用いて、抗ＰＤ−１抗体を１，０ｍｇ／ｍＬの濃度（１００ｕＬの体積）で溶解した。次に、保存液をアリコートし（１日治療用分量）、−２０℃で貯蔵した。
−  ＡＢＸ１９６治療
１０日目にＡＢＸ１９６を、
−  １００ｎｇ／マウスの用量での静脈内（ｉ．ｖ）注射により；または
−  １０ｎｇ／マウスの用量での腫瘍内（ｉ．ｔ）注射により
投与した。
材料：
ｉ．ｖ投与用のＡＢＸ１９６
ＡＢＸ１９６は、ＰＢＳ中、２５０μｇ／ｍＬの溶液として準備した。１μｇ／ｍＬのＡＢＸ１９６溶液を調製し、４℃で貯蔵した。１０日目、１μｇ／ｍＬのＡＢＸ１９６溶液１００μＬを３および４群からのマウスの尾静脈に注射した。
ｉ．ｔ投与用のＡＢＸ１９６
ＡＢＸ１９６は、ＰＢＳ中、２５０μｇ／ｍＬの溶液として準備した。０，４μｇ／ｍＬのＡＢＸ１９６溶液を調製し、４℃で貯蔵した。１０日目、５および６群からの動物を麻酔し、０，４μｇ／ｍＬのＡＢＸ１９６溶液２５μＬを腫瘍に注射した。
【０２５２】
【表１８】
2019531343.tif 000039
【０２５３】
３．結果
すべての実験動物群は、以下のパラメータについて、Ｂ１６Ｆ１０細胞接種後６日目から４週間にわたり週に３回監視した。
−  腫瘍サイズ：身体検査により週に３回測定、
−  体重：週に３回監視、および
−  生存：週に３回、カプラン・マイヤープロットで表現
【０２５４】
抗腫瘍活性指数の計算は、Ｔ／Ｃ（％）指数およびＴＧＩ（％）について実施例１と同様であった。
【０２５５】
１．抗腫瘍応答評価
ａ）腫瘍体積
結果は、腫瘍負荷後、異なる治療に曝露されたＢ１６Ｆ１０保有マウスの平均腫瘍体積（ｍｍ３）を示す図５および６に示す。
【０２５６】
特に、結果によると、抗ＰＤ−１抗体と本発明に従うＡＢＸ１９６との組み合わせは、ＡＢＸ１９６単独または抗ＰＤ−１抗体単独よりも腫瘍体積の低減に有効であることが示される（静脈内または腫瘍内のいずれかに投与）。
【０２５７】
結果を下表にも示す。
【０２５８】
【表１９】
2019531343.tif 000040
【０２５９】
ｂ）生存
結果は、腫瘍負荷後、異なる治療に曝露されたＢ１６Ｆ１０保有マウスの生存を示す図７および８に示す。
【０２６０】
特に、結果によると、抗ＰＤ−１抗体と本発明に従うＡＢＸ１９６との組み合わせは、ＡＢＸ１９６単独または抗ＰＤ−１抗体単独よりも高い生存の百分率をもたらすことが示される（静脈内または腫瘍内のいずれかに投与）。
【０２６１】
ｃ）抗腫瘍活性指数
【０２６２】
【表２０】
2019531343.tif 000041
【０２６３】
結論：
本試験は、メラノーマの同系マウスモデルにおけるＰＤ−１の遮断と組み合わせたＡＢＸ１９６の利益を評価することを目的とする。
【０２６４】
たとえ１８日目に追加用量を投与していても、抗ＰＤ−１抗体の効果は認められなかった。腫瘍体積（図５および６）と生存レベル（図７および８）との両方で効果の欠如が認められた。
【０２６５】
また、ＡＢＸ１９６の一過性効果がその投与（静脈内または腫瘍内のいずれか）後の早い時点で認められたが、それは、有意な効果に至らなかった。
【０２６６】
しかし、ＡＢＸ１９６と抗ＰＤ１  Ａｂとの間に相乗効果が認められることは興味深かった。当然ながら、ＡＢＸ１９６は、抗ＰＤ−１効果（全く有効でなかった）を増強することができた。この相乗効果は、ＡＢＸ１９６のｉｖおよびｉｔ投与の両方で観察可能であった。特に、それは、腫瘍体積レベルで（図５および６）、抗ＰＤ−１と抗ＰＤ−１＋ＡＢＸ１９６（ｉｖまたはｉｔ）との間の有意差（それぞれｐ＝０，０１２および０，０２４５）で観察可能であった。生存データは、媒体に対するＡＢＸ１９６と抗ＰＤ−１抗体との組み合わせの利益を明示した。
【０２６７】
実施例６：結腸および膀胱がんにおける単独でまたは抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて全身投与されるＡＢＸ１９６の抗腫瘍活性の判定
１．材料および方法
１．１．試験および参照物質
１．１．１．試験物質
ＡＢＸ１９６。
【０２６８】
１．１．２．参照物質
抗ＰＤ−１抗体（参照：ＢＥ０１４６，ＢｉｏＸｃｅｌｌ；クローン：ＲＭＰ１−１４、反応性：マウス；アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ；貯蔵条件：＋４℃）。
【０２６９】
１．１．３．試験および参照物質媒体
製造業者の推奨に従い、抗ＰＤ−１抗体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または他の好適な媒体中で調製した。ＡＢＸ１９６を２５０μｇ／ｍＬの溶液として準備した。
【０２７０】
１．２．治療用量
ＡＢＸ１９６を１００ｎｇ／マウスの用量で投与した。抗ＰＤ−１抗体を１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。
【０２７１】
１．３．投与経路
試験物質は、静脈内経路によりマウスの尾側静脈に注射した（ＩＶ、ボーラス）。抗ＰＤ−１抗体は、マウスの腹膜腔に注射した（腹腔内、ＩＰ）。すべての群において、ＡＢＸ１９６は、１００μＬの一定用量ボリューム（すなわち体重が２０ｇのマウス１匹に対して約５ｍＬ／ｋｇ／投与）で投与した。抗ＰＤ−１抗体は、１０ｍＬ／ｋｇ／投与の用量ボリュームで投与した。
【０２７２】
１．４．がん細胞株および培養条件
１．４．１．がん細胞株
用いた細胞株を下表に詳細に示す。
【０２７３】
【表２１】
2019531343.tif 000042
【０２７４】
・ＣＴ−２６細胞株は、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレタン−（ＮＮＭＵ）誘導性のＢＡＬＢ／Ｃマウスの未分化結腸がん細胞株である。
・マウスＭＢＴ−２細胞株は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおける発がん物質誘導性膀胱腫瘍に由来した。ＭＢＴ−２細胞株は、Ｄｒ  Ｃｏｚｚｉ，Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）から入手した。
【０２７５】
１．４．２．細胞培養条件
腫瘍細胞は、加湿雰囲気下（５％ＣＯ２、９５％空気）において３７℃で単層として増殖させた。培地は、１０％ウシ胎仔血清（参照：３３０２，Ｌｏｎｚａ）を添加した、２ｍＭのＬ−グルタミン（参照：ＢＥ１２−７０２Ｆ，Ｌｏｎｚａ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有するＲＰＭＩ１６４０であった。腫瘍細胞は、プラスチックフラスコに接着した。実験使用のため、腫瘍細胞を、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス培地（参照：ＢＥ１０−５４３Ｆ，Ｌｏｎｚａ）中、トリプシン−バーゼン液（参照：ＢＥ０２−００７Ｅ，Ｌｏｎｚａ）で５分間処理することにより培養フラスコから剥離し、完全培地の添加により中和した。
【０２７６】
細胞を計数し、それらの生存度を０．２５％トリパンブルー排除アッセイにより評価した。
【０２７７】
１．５．動物
６〜７週齢の健常雌ＢＡＬＢ／ｃマウス６３匹を、マウスのこの株（すなわちＣＴ−２６）に同系の各モデルについてＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から入手し、６〜７週齢の健常雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ）マウス６８匹をＭＢＴ−２モデルについてＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から入手した。
【０２７８】
動物は、ＦＥＬＡＳＡガイドラインに従い、ＳＰＦ健康状態で維持した。動物収容および実験手順は、Ｆｒｅｎｃｈ  ａｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｓおよびＮＲＣ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに準じて実現した。動物の収容条件は、実施例１などと同じであった。
【０２７９】
２．実験設計および治療
２．１．動物におけるＣＴ−２６およびＭＢＴ−２腫瘍の誘導
ＲＰＭＩ１６４０の２００μＬ中、１×１０６個のＣＴ−２６細胞の６３匹の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの右側腹部への皮下注射により、腫瘍を誘導した。ＭＢＴ−２腫瘍は、ＲＰＭＩ１６４０の２００μＬ中、１×１０６個の細胞の６８匹の雌動物の右側腹部への皮下注射により誘導した。
【０２８０】
２．２．治療スケジュール
腫瘍が８０〜１２０ｍｍ３の平均体積に達した時、治療を開始した。Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、ＣＴ−２６モデルにおける６３匹またはＭＢＴ−２モデルにおける６８匹からの４８匹の動物を、それら個別の腫瘍体積に従い、各群が動物１２匹からなる４群に無作為化した。統計学的試験（分散の分析、ＡＮＯＶＡ）を実施し、群間の均一性について試験した。治療スケジュールは以下の通りであった。
−  群１からの動物は、ＡＢＸ１９６媒体のＩＶ注射および抗ＰＤ−１抗体媒体のＩＰ注射を受けた。
−  群２からの動物は、１００ｎｇのＡＢＸ１９６のＩＶ注射を受けた。
−  群３からの動物は、抗ＰＤ−１抗体の週２回投与を受けた。
−  群４からの動物は、１００ｎｇのＡＢＸ１９６のＩＶ注射および抗ＰＤ−１抗体の週２回投与を受けた。
【０２８１】
治療スケジュールを下表にまとめる。
【０２８２】
【表２２】
2019531343.tif 000043
【０２８３】
２．３．動物の監視
２．３．１．臨床的監視
動物の体重測定値、腫瘍体積、臨床および死亡率記録ならびに治療を含むすべての試験データをスケジュール化し、Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）データベース（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｄｉｊｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）に記録した。
【０２８４】
生存度および挙動を毎日記録した。体重を週２回測定した。腫瘍の長さおよび幅をノギスで週２回測定し、腫瘍の体積を式：
【数４】
2019531343.tif 000044
により評価した。
【０２８５】
抗腫瘍活性指数の計算は、Ｔ／Ｃ（％）指数およびＴＧＩ（％）について実施例１と同様であった。
【０２８６】
２．４．統計学的試験
すべての統計学的解析は、Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて実施した。ＡＮＯＶＡを用いて、平均体重、ＭＢＷＣ、無作為化時の平均腫瘍体積、平均腫瘍体積Ｖ、Ｖに達するための平均時間および平均腫瘍倍加時間の統計分析を実施した。有意なＡＮＯＶＡ結果の場合、ボンフェローニ／ダン補正を用いてペアワイズ検定を実施した。ログランク（カプラン・マイヤー）検定を用いて生存曲線を比較した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【０２８７】
２．５．人道的エンドポイント
人道的エンドポイントは、実施例１と同様であった。
【０２８８】
２．６．剖検
試験において終了したすべての動物、可能であれば、すべての安楽死・瀕死動物または死亡が認められた動物に対して剖検（肉眼検査）を実施した。
【０２８９】
２．７．麻酔
すべての手順：腫瘍接種および静脈内注射において、イソフルランガス麻酔を用いた。
【０２９０】
２．８．鎮痛
すべての痛みを伴う処置に対して、非薬理学的ケアを準備した。加えて、主治獣医師の推奨により、試験（局所治療）に干渉しない薬理学的ケアを準備することができた。
【０２９１】
２．９．安楽死
ガス麻酔の過剰用量（イソフルラン）、その後の頸部脱臼または全採血により、動物の安楽死を実施した。
【０２９２】
３．結果
３．１．皮下ＣＴ−２６結腸直腸がんを有するマウスにおける試験治療の抗腫瘍活性
結果は、腫瘍負荷後、異なる治療に曝露されたＣＴ−２６保有マウスの平均腫瘍体積（ｍｍ３）を示す図９に示す。特に、結果によると、抗ＰＤ−１抗体と本発明に従うＡＢＸ１９６との組み合わせは、ＡＢＸ１９６単独または抗ＰＤ−１抗体単独よりも腫瘍体積の低減に有効であることが示される。
【０２９３】
抗腫瘍活性指数を下表に示す。
【０２９４】
【表２３】
2019531343.tif 000045
【０２９５】
３．２．皮下ＭＢＴ−２膀胱がんを有するマウスにおける試験治療の抗腫瘍活性
結果は、腫瘍負荷後、異なる治療に曝露されたＭＢＴ−２保有マウスの平均腫瘍体積（ｍｍ３）を示す図１０に示す。特に、結果によると、抗ＰＤ−１抗体と本発明に従うＡＢＸ１９６との組み合わせは、ＡＢＸ１９６単独または抗ＰＤ−１抗体単独よりも腫瘍体積の低減に有効であることが示される。
【０２９６】
抗腫瘍活性指数を下表に示す。
【０２９７】
【表２４】
2019531343.tif 000046
【０２９８】
３．３．生存
結果は、腫瘍負荷後、異なる治療に曝露されたＭＢＴ−２保有マウスの生存を示す図１１、および下表に示す。
【０２９９】
【表２５】
2019531343.tif 000047
【０３００】
ＡＢＸ１９６と抗ＰＤ−１抗体との組み合わせは、ＡＢＸ１９６または抗ＰＤ−１抗体単独による治療と比べてマウスの生存を有意に改善する。
【０３０１】
【表２６】
2019531343.tif 000048
【０３０２】
４．結論
試験治療は、単独または組み合わせのいずれかであり、動物で十分に耐容性があり、薬物に関連した重篤な毒性も死亡も記録されなかった。
【０３０３】
結腸直腸がんに対するＡＢＸ１９６＋抗ＰＤ−１の抗腫瘍活性
ＡＢＸ１９６＋抗ＰＤ−１で治療したマウスの腫瘍増殖遅延は、媒体治療群と比べて有意に改善される（図９を参照されたい）。Ｔ／ＣおよびＴＧＩ比は、ＡＢＸ１９６と抗ＰＤ−１抗体との間の相乗効果を明示する。ＡＢＸ１９６＋抗ＰＤ−１治療を有する群のみがＴ／Ｃ＜４２％を示す。
【０３０４】
膀胱がんに対する抗腫瘍効果
ＡＢＸ１９６＋抗ＰＤ−１抗体の組み合わせは、腫瘍増殖を有意に低減する（図１０を参照されたい）。Ｔ／ＣおよびＴＧＩ比は、ＡＢＸ１９６と抗ＰＤ−１抗体との間の相乗作用を明示する。ＡＢＸ１９６＋抗ＰＤ−１で治療したマウスの生存は、媒体治療群と比べて有意に改善される（図１１を参照されたい）。組み合わせ群では、抗腫瘍活性は、ＡＢＸ１９６単独または抗ＰＤ−１単独と比べてさらに改善され、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせるとき、２７または２８日の生存中央値は、３４日まで増加する。
【０３０５】
実施例７：同所性Ｈｅｐａ１−６肝細胞がんモデルにおけるドキソルビシンもしくはソラフェニブまたは抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡＢＸ１９６の抗腫瘍活性の評価
１．材料および方法
１．１  試験および参照物質
１．１．１  試験物質
ＡＢＸ１９６。
【０３０６】
１．１．２  参照物質
ドキソルビシン：ＤＯＸＯ  ＣＥＬＬ，Ｃｅｌｌ  Ｐｈａｒｍ
ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標），Ｂａｙｅｒ  Ｐｈａｒｍａ，２００ｍｇ／丸薬）。
抗ＰＤ−１抗体（参照：ＢＥ０１４６，ＢｉｏＸｃｅｌｌ；クローン：ＲＭＰ１−１４、反応性：マウス；アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ；貯蔵条件：＋４℃）。
【０３０７】
１．２．試験および参照物質媒体
ドキソルビシンをＮａＣｌ０．９％で希釈した。
【０３０８】
製造業者の推奨に従い、抗ＰＤ−１抗体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または他の好適な媒体中で調製した。
【０３０９】
マウスへの投与の各日においてソラフェニブ丸薬を粉砕し、最初にＤＭＳＯ（参照：４１６４０，Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）に、次にツイーン２０（参照：Ｐ９４１６，Ｓｉｇｍａ）に溶解し、その後、１０ｍｇ／ｍＬの適切な濃度に達するようにＮａＣｌ（０．９％）を添加した（ＤＭＳＯ／ツイーン２０／ＮａＣｌ（０．９％）の最終比：５／５／９０ｖ／ｖ）。
【０３１０】
ＡＢＸ１９６を２５０μｇ／ｍＬの溶液として準備した。ＡＢＸ１９６の希釈をＰＢＳ緩衝液で実施した。
【０３１１】
５日目に群１で用いた媒体溶液は、ＡＢＸ１９６試験アイテムと同じ最終濃度においてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈したＤＭＳＯを含有した。
【０３１２】
１．３．治療用量
ＡＢＸ１９６を１００ｎｇ／マウスの用量で投与した。ドキソルビシンを１２ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。抗ＰＤ−１抗体を１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。ソラフェニブを１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。
【０３１３】
１．４．投与経路
ＡＢＸ１９６は、静脈内経路によりマウスの尾側静脈に注射した（ＩＶ、ボーラス）。ドキソルビシンは、マウスの尾側静脈に静脈内投与した（ＩＶ、ボーラス）。抗ＰＤ−１抗体は、マウスの腹膜腔に注射した（腹腔内、ＩＰ）。ソラフェニブは、カニューレを介した経口経管栄養により投与した（経口、ＰＯ）。
【０３１４】
すべての群において、ＡＢＸ１９６は、１００μＬの一定用量ボリューム（体重が２０ｇのマウスに対して約５ｍＬ／ｋｇ／投与）で投与した。ドキソルビシン、抗ＰＤ−１抗体およびソラフェニブは、マウスの直近体重に応じて１０ｍＬ／ｋｇ／投与の用量ボリュームで投与した。
【０３１５】
１．５．がん細胞株および培養条件
１．５．１．がん細胞株
用いた細胞株を下表に詳細に示す。
【０３１６】
【表２７】
2019531343.tif 000049
【０３１７】
１．５．２．細胞培養条件
腫瘍細胞は、加湿雰囲気下（５％ＣＯ２、９５％空気）において３７℃で単層として増殖させた。培地は、１０％ウシ胎仔血清（参照：３３０２，Ｌｏｎｚａ）を添加した、４ｍＭのＬグルタミン（参照：ＢＥ１２−６０４Ｆ，Ｌｏｎｚａ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、４．５ｇ／ｌのグルコースおよび１ｍＭのＮａＰｙｒを含有するＤＭＥＭであった。この細胞は、プラスチックフラスコに接着した。
【０３１８】
実験使用のため、腫瘍細胞を、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス培地（参照：ＢＥ１０−５４３Ｆ，Ｌｏｎｚａ）中、トリプシン−バーゼン液（参照：ＢＥ１７−１６１Ｅ，Ｌｏｎｚａ）で５分間処理することにより培養フラスコから剥離し、完全培地の添加により中和した。細胞を血球計数器で計数し、それらの生存度を０．２５％トリパンブルー排除アッセイにより評価した。
【０３１９】
１．５．３．動物
５〜６週齢の健常雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃ５７ＢＬｌ６Ｊ）マウス１００匹をＪＡＮＶＩＥＲ  ＬＡＢＳ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓａｉｎｔ−Ｉｓｌｅ）から入手した。
【０３２０】
動物は、ＦＥＬＡＳＡガイドラインに従い、ＳＰＦ健康状態で維持した。動物収容および実験手順は、Ｆｒｅｎｃｈ  ａｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｓおよびＮＲＣ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに準じて実現した。収容条件は、実施例１などと同じであった。
【０３２１】
１．６．磁気共鳴画像法
すべての画像化実験は、能動的遮蔽勾配システムを備えた４．７Ｔの水平磁気（ＰｈａｒｍａＳｃａｎ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で実施した。すべてのＭＲ画像は、ＰａｒａＶｉｓｉｏｎ（ＰＶ５．１，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ）下で取得した。
【０３２２】
１．６．１．コイルおよびクレイドル
マウスは、Ｐｈａｒｍａｓｃａｎ内部のボリュームコイル（３８ｍｍの内直）内をスライドする専用のマウス身体用クレイドル内に腹臥位にした。
【０３２３】
１．６．２．麻酔および生理学的監視
すべてを取得する間、マウスは、鼻部分を介し、空気の混合物中のイソフルラン（Ｍｉｎｅｒｖｅ，Ｂｏｎｄｏｕｆｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて継続的に麻酔した。マウスの呼吸速度は、その腹部にテープ固定した圧力センサを用いて継続的に監視した。生理学的シグナルは、ＭＲＩワークステーションに併置され、光ファイバケーブルによりセンサに接続されたラップトップを介して監視した（ＳＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）。
【０３２４】
１．６．３．ＭＲイメージングシーケンス
較正および位置決め
磁気における動物の位置決め後、スカウト画像を較正目的に取得した。矢状、冠状および軸スライスを取得した。この取得の開始時、自動調節を実施し、シム、ＲＦ力およびＭＲシグナルの増幅を最適化した。
【０３２５】
【表２８】
2019531343.tif 000050
【０３２６】
１．６．４．Ｔ２加重（Ｔ２ｗ）解剖学的イメージング  −  軸方向
Ｔ２ｗ  ＲＡＲＥシーケンスを用いて解剖学的画像を取得した。この工程間に用いたシーケンスは、以下の特徴を有する。
【０３２７】
【表２９】
2019531343.tif 000051
【０３２８】
１．６．５．画像プロセシング
すべてのＭＲ画像は、ＩｍａｇｅＪ下で分析するため、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）に基づくワークステーションに移した。腫瘍浸潤は、全肝臓における腫瘍の百分率の目視評価により半定量的に評価した。
【０３２９】
２．実験設計および治療
２．１．脾臓内注射による動物におけるＨｅｐａ１−６腫瘍の誘導
ＲＰＭＩ１６４０培地５０μＬ中の１００万（１×１０６）個の腫瘍細胞を、脾臓内注射を通じて１００Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植した。すなわち、左肋骨下側腹部を少し切開した。脾臓を露出させた。脾臓を滅菌ガーゼパッド上に曝露し、視覚制御下で細胞懸濁液ともに２７ゲージ針を用いて注射した。細胞接種後、脾臓を切除した。腫瘍細胞注射日をＤ０とみなした。
【０３３０】
２．２．治療スケジュール
治療はＤ５に開始した。Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、１００匹中９９匹の動物を、それら個別の体重に従い、動物１３匹での３群および動物１２匹での５群に無作為化した。統計学的試験（分散の分析、ＡＮＯＶＡ）を実施し、群間の均一性について試験した。治療スケジュールは以下の通りであった。
−  群１からの動物は、５日目にＡＢＸ１９６媒体の１回のＩＶ注射を受けた。
−  群２からの動物は、５日目から２１連続日、１００ｍｇ／ｋｇ／投与のソラフェニブの１日１回のＰＯ投与を受けた。
−  群３からの動物は、５日目に１００ｎｇのＡＢＸ１９６の１回のＩＶ注射と、および５日目から２１連続日、１００ｍｇ／ｋｇ／投与のソラフェニブの１日１回のＰＯ投与とを受けた。
−  群４からの動物は、５日目に１２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの１回のＩＶ注射を受けた。
−  群５からの動物は、５日目に１００ｎｇのＡＢＸ１９６の１回のＩＶ注射と、１２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの１回のＩＶ注射とを受けた。
−  群６からの動物は、７、１０、１４および１７日目（週２回×２）に抗ＰＤ−１抗体の４回のＩＰ投与を受けた。
−  群７からの動物は、５日目に１００ｎｇのＡＢＸ１９６の１回のＩＶ注射と、７、１０、１４および１７日目（週２回×２）に抗ＰＤ−１抗体の４回のＩＰ投与とを受けた。
【０３３１】
治療スケジュールを下表にまとめる。
【０３３２】
【表３０】
2019531343.tif 000052
【０３３３】
２．３．採血
Ｄ７およびＤ２２において、約１２０μＬの血液を、頸静脈穿刺により、血餅アクチベーターを有する血液捕集管に収集した。室温、１，３００ｇで１０分間のサンプリングから３０分後、チューブを遠心分離し、血清を得た。血清試料をプロピレンチューブ内、−８０℃で貯蔵した。Ｄ２２において、すべての収集した血清試料を、ＥＬＩＳＡ分析により、循環するＡＦＰレベルの判定のために分析した（Ｄｏｓａｇｅ  Ｍｏｕｓｅ  ａ−フェトプロテイン／ＡＦＰ，参照：ＭＡＦＰ００，ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０３３４】
２．４．ＭＲＩ画像化の時点
Ｄ１９およびＤ２０において群１〜８からのマウス５匹／群を画像化した（動物４０匹／日）。次に、半定量分析を実施した。
【０３３５】
２．５．マウスの終了
最終のマウス終了の時点で（Ｄ６０頃）、肝臓を秤量した。転移の数を肉眼で評価し、限局化、外観（形状、色、一貫性）およびそれら各々の大きさを記録した。肝臓の肉眼写真を撮った。
【０３３６】
倫理的理由のためまたは最終の終了時のいずれかから屠殺したすべての動物からの肝臓／腫瘍を４ｍｍ厚切片に切断し、４％中性緩衝ホルマリンで２４時間〜４８時間固定し、次にパラフィンで包埋した（Ｈｉｓｔｏｓｅｃ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０３３７】
２．６．動物の監視
２．６．１．臨床的監視
動物の体重測定値、腫瘍体積、臨床および死亡率記録ならびに治療を含むすべての試験データをスケジュール化し、Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）データベース（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｄｉｊｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）に記録した。
【０３３８】
生存度および挙動を毎日記録した。体重を週３回測定した。
【０３３９】
２．６．２．人道的エンドポイント
２５ｍｍを上回る腹部直径、
疼痛、苦痛または窮迫の徴候：痛み姿勢、痛みフェイスマスク、挙動、
異所運動または栄養に干渉する腫瘍、
３連続日での２０％の体重減少状態、
身体状態不良、るいそう、悪液質、脱水、
外部刺激に対する自発的応答不在の遷延、
迅速な努力性呼吸、貧血、有意な出血、
神経性徴候：旋回、痙攣、麻痺、
持続的な体温低下、
腹部膨満。
【０３４０】
２．６．３．剖検
試験におけるすべての終了した動物、可能であれば、すべての安楽死・瀕死動物または死亡が認められた動物に対して剖検（肉眼検査）を実施した。
【０３４１】
２．６．４．手術
手術方法は、ＩＡＣＵＣによって認可された手術法に記載された。
【０３４２】
２．６．５．麻酔
すべての処置：手術および採血においてイソフルランガス麻酔を用いた。
【０３４３】
２．６．６．鎮痛
マルチモーダルなカプロフェン／ブプレノルフィンまたはキシロカイン／ブプレノルフィン鎮痛プロトコルは、外科手技の厳密さに適応した。すべての痛みを伴う処置に対して、非薬理学的ケアを施した。加えて、主治獣医師の推奨により、試験（局所治療）に干渉しない薬理学的ケアを施すことができた。
【０３４４】
２．６．７．安楽死
動物の安楽死は、過剰用量（イソフルラン）によるガス麻酔、その後の頸部脱臼または全採血により実施した。
【０３４５】
３．データの提示
４．１．健康パラメータ
Ｖｉｖｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて以下の健康評価基準を決定した。
−  動物の個別および／または平均（または中央値）体重、
−  平均体重変化（ＭＢＷＣ）：パーセントでの治療動物の平均体重変化（Ｂ日目の体重からＡ日目の体重を引いてＡ日目の体重で除したもの）を算出した。ＭＢＷＣを算出した区間を体重曲線および体重測定日の関数として選択した。
【０３４６】
３．２．有効性パラメータ
対照動物と比べた治療動物の腫瘍体積に対する試験物質の効果の観点で治療有効性を評価した。抗腫瘍有効性の以下の評価基準を決定した。
−  Ｄ１９〜２０、ＭＲＩ画像化を用いた肝臓内部の腫瘍浸潤の個別および／または平均（または中央値）測定、
−  Ｄ２２、血漿中の循環するａ−フェトプロテインの測定、
−  終了時の肝臓重量測定、
−  生存曲線、
−  生存時間中央値。
【０３４７】
結果
腫瘍浸潤
結果は、２０日目の各治療群からの肝臓の腫瘍浸潤の百分率を示す図１２に示す。
【０３４８】
【表３１】
2019531343.tif 000053
【０３４９】
【表３２】
2019531343.tif 000054
【０３５０】
結論
この実験は、化学療法剤または免疫療法剤およびＡＢＸ１９６を含む組み合わせが単独に摂取される組み合わせの各成分よりも強力であることを示す。
【０３５１】
図１２に示すように、ＡＢＸ１９６を含む組み合わせ治療は、腫瘍浸潤の低下を呈する。腫瘍浸潤の低下は、より良好な生存につながる。
【図１】
2019531343.tif 000065
【図２】
2019531343.tif 000066
【図３】
2019531343.tif 000067
【図４】
2019531343.tif 000068
【図５】
2019531343.tif 000069
【図６】
2019531343.tif 000070
【図７】
2019531343.tif 000071
【図８】
2019531343.tif 000072
【図９】
2019531343.tif 000073
【図１０】
2019531343.tif 000074
【図１１】
2019531343.tif 000075
【図１２】
2019531343.tif 000076
【配列表】
2019531343000001.app
【国際調査報告】
2019531343.tif 000077
2019531343.tif 000078
2019531343.tif 000079