(57)【要約】  本発明は、適正な条件下で開裂性または変換性の抗体−薬物コンジュゲートの疎水性を低減させる非線状自壊性リンカーを含む、リンカー−薬物化合物（ＬＤ）および抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）のリンカー−薬物化合物
【化１】
2019537622.tif 000058
またはその医薬的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物であって、ここで
Ｖ１は化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによって開裂または変換することができる、条件付きで開裂性または条件付きで変換性の部分であり；
Ｚはフェノール性ヒドロキシル基を含む細胞障害性薬物であり、そのフェノール性ヒドロキシル基を通してＺはリンカーに結合しており、好ましくは、ＺはデュオカルマイシンまたはＣＢＩ二量体誘導体であり、より好ましくは、Ｚはデュオカルマイシン誘導体であり；
ｎは０、１、２、または３であり；
ｍは０または１である、化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、Ｚは
【化２】
2019537622.tif 000059
ここでＲ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＦ３、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ハロゲン、Ｒａ、ＳＲａ、Ｓ（Ｏ）Ｒａ、Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、Ｓ（Ｏ）ＯＲａ、Ｓ（Ｏ）２ＯＲａ、ＯＳ（Ｏ）Ｒａ、ＯＳ（Ｏ）２Ｒａ、ＯＳ（Ｏ）ＯＲａ、ＯＳ（Ｏ）２ＯＲａ、ＯＲａ、ＮＨＲａ、Ｎ（Ｒａ）Ｒｂ、＋Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）Ｒｃ、Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＲｂ）、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＲｂ）、ＳｉＲａＲｂＲｃ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）Ｒｂ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、ＯＣ（Ｏ）ＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）Ｒｂ、Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）Ｒｃ、および水溶性基から選択され、ここで
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは独立にＨ、および任意に置換されていてもよい、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａａＣＨ２ＣＨ２Ｘ１Ｒａ１、Ｃ１〜１５アルキル、Ｃ１〜１５ヘテロアルキル、Ｃ３〜１５シクロアルキル、Ｃ１〜１５ヘテロシクロアルキル、Ｃ５〜１５アリール、またはＣ１〜１５ヘテロアリールから選択され、ここでａａは１〜１０００から選択され、Ｘ１はＯ、Ｓ、およびＮＲｂ１から選択され、Ｒｂ１およびＲａ１は独立にＨおよびＣ１〜３アルキルから選択され、Ｒａ、Ｒｂ、および／またはＲｃにおける任意の置換基の１つ以上は任意に水溶性基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃの２つ以上は、任意に１つ以上の結合によって連結されて、任意に置換されていてもよい１つ以上の炭素環および／またはヘテロ環を形成する、化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物であって、Ｚは
【化３−１】
2019537622.tif 000060
【化３−２】
2019537622.tif 000061
である、化合物。
【請求項４】
請求項２または３に記載の化合物であって、Ｒ１はＨ、メチルおよびメトキシから選択される、化合物。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の化合物であって、Ｚは
【化４】
2019537622.tif 000062
である、化合物。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の化合物であって、Ｖ１は、任意にキャップされた、バリルアラニン、バリルリジン、バリルシトルリン、フェニルアラニルリジン、およびアラニルフェニルアラニルリジンから選択され、好ましくは、Ｖ１は、任意にキャップされた、バリルシトルリンおよびバリルアラニンから選択される、化合物。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の化合物であって、下記から選択される、化合物。
【化５−１】
2019537622.tif 000063
【化５−２】
2019537622.tif 000064
【請求項８】
抗体−薬物コンジュゲートであって、請求項１〜７の何れか１項に記載の化合物が、抗体またはその抗原結合断片に、前記抗体または抗原結合断片のシステイン残基を通してコンジュゲートされている、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、前記化合物は、抗体またはその抗原結合断片に、
重鎖４０、４１、および８９（Ｋａｂａｔナンバリングによる）；
重鎖１５２、１５３、１５５、１７１、２４７、２９７、３３９、３７５、および３７６（Ｅｕナンバリングによる）；ならびに
軽鎖４０、４１、１６５、および１６８（Ｋａｂａｔナンバリングによる）
から選択される前記抗体または抗原結合断片の１つ以上の位置で、改変システインを通して部位特異的にコンジュゲートされている、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
請求項９に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、前記化合物は、抗体またはその抗原結合断片に、
重鎖４０、４１、および８９（Ｋａｂａｔナンバリングによる）；ならびに
軽鎖４０および４１（Ｋａｂａｔナンバリングによる）
から選択される前記抗体または抗原結合断片の１つ以上の位置で、改変システインを通して部位特異的にコンジュゲートされている、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１１】
式（ＩＩＩ）の、請求項８〜１０の何れか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、
【化６】
2019537622.tif 000065
ここで
抗体は抗体またはその抗原結合断片であり；
ｎは０、１、２、または３であり；
ｙは１〜６の平均ＤＡＲを表し；
Ｒは下記から選択される、抗体−薬物コンジュゲート。
【化７】
2019537622.tif 000066
【請求項１２】
請求項８〜１１の何れか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートであって、前記抗体または抗原結合断片が、アネキシンＡ１、ＣＡ２４２、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１１５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ３０３、ＣＤ３３３、ＣＥＡＣＡＭ、ＣＬＬ−１、ｃ−ＭＥＴ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ３、ＥＴＢＲ、ＦＡＰ、ＦｃＲＬ５、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１、ＧＣＣ、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＭＷ−ＭＡＡ、インテグリン、ルイスＡ様炭水化物、ルイスＹ、ＬＩＶ１、メソテリン、ＭＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン−４、ＰＳＭＡ、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＴＥＡＰ−１、５Ｔ４抗原、Ｔａｇ７２、組織因子、ＴＦ−Ａｇ、ＴＲＯＰ２、およびＶＬＡからなる群より選択される抗原標的と結合する、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１〜７の何れか１項に記載の化合物または請求項８〜１２の何れか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートと、１種以上の医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
医薬品として使用するための、請求項１〜７の何れか１項に記載の化合物、請求項８〜１２の何れか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、または請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ヒトの固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療に使用するための、請求項１〜７の何れか１項に記載の化合物、請求項８〜１２の何れか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、または請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
１種以上の他の治療薬との併用療法に使用するための、請求項１〜７の何れか１項に記載の化合物、請求項８〜１２の何れか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、または請求項１３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、開裂性または変換性の非線状自壊性リンカーを含む、リンカー−薬物化合物（ＬＤ）および抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、抗体の特異性と細胞障害性分子の効力とが組み合わされた、新たに出現しつつある種類の標的治療薬である。
【０００３】
抗体および標的の選択に加えて、薬物およびリンカーがＡＤＣ開発の焦点となっている。その結果として、抗体は、開裂性または非開裂性リンカーの何れかを介して種々の細胞障害性薬物にコンジュゲートされている。
【０００４】
ヒト患者の治療に既に承認されているＡＤＣの例は、急性骨髄性白血病の治療用に米国食品医薬品局（食品医薬品局）によって２０００年に承認された、開裂性の酸加水分解性リンカーを介してカリチアマイシンにコンジュゲートされたヒト化抗ＣＤ３３抗体を含む、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ）；ホジキンリンパ腫および未分化大細胞リンパ腫の治療用に食品医薬品局によって２０１１年に承認された、酵素開裂性リンカーを介してモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）にコンジュゲートされた、ＣＤ３０へのキメラ抗体を含むＡＤＣである、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標）（ブレンツキシマブ  ベドチン、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；ならびに、トラスツズマブおよびタキサンでの前治療を受けたＨＥＲ２−陽性転移性乳癌を有する患者の治療用に食品医薬品局によって２０１３年２月に承認された、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体が非開裂性チオエーテルリンカーを介してメルタンシン（メイタンシン誘導体、ＤＭ１としても公知である）にコンジュゲートされたＡＤＣである、Ｋａｄｃｙｌａ（商標）（Ｔ−ＤＭ１、ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシンまたはトラスツズマブエムタンシン、Ｒｏｃｈｅ）である。
【０００５】
化学的開裂性リンカーを有するＡＤＣと比較して、酵素開裂性リンカーの方が薬物放出のより良い制御を実現することができる。しかし、幾つかの酵素開裂性リンカーに関連する疎水性の増大は、特に疎水性の強い薬物で、ＡＤＣの凝集を招くおそれがある。加えて、動物モデルではＡＤＣの疎水性が高くなると循環からのクリアランスが速くなる。このようにクリアランスが速くなることから、かかるＡＤＣには薬物動態（ＰＫ）上の不都合があることが示唆される。
【０００６】
ＷＯ２０１４／１２４３１６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）およびＷＯ２０１５／１７７３６０（Ｓｙｎｔｈｏｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に開示されるように、ＡＤＣの疎水性は、抗体の重鎖および軽鎖の両方のＦａｂおよび／またはＦｃ部分内の特定の位置で、改変システイン残基に（疎水性）リンカー−薬物をコンジュゲートさせることによって減少させることができる。これらのシステイン残基にコンジュゲートさせると、リンカー−薬物は抗体周囲の親水性水性環境から遮蔽され、ＡＤＣの疎水性が低くなる。
【０００７】
あるいは、リンカー−薬物および得られるＡＤＣの疎水性は、適正なリンカーを選択することによって減少させることができる。たとえば、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓは、ＷＯ２０１５／１２３６７９において、親水性アミノ酸のみを含むリンカーを使用して、コンジュゲートの親水性を、コンジュゲートされていない抗体と同様のものに維持した。代替的手法では、水溶性基、たとえばポリエチレングリコールポリマーがリンカー中に含まれ、たとえば、ＷＯ２０１４／１００７６２（Ｂｉｏａｌｌｉａｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｂｇｅｎｏｍｉｃｓ）のように薬物と抗体の結合部位との間に、またはＷＯ２０１５／０５７６９９（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のように並列位置に含まれた。疎水性を最低限に抑えるための第３の手法は、薬物−ポリマーを抗体に付加することであった。この手法では、ＷＯ２０１２／１７１０２０（Ｍｅｒｓａｎａ）のように各ポリマーが多数の薬物を含有する。しかし、大きな可溶化基を付加すると、かかるコンジュゲートの製造の複雑性が増大する。
【０００８】
リンカー−薬物および／またはＡＤＣの疎水性を低減させる上記の手法にもかかわらず、ＡＤＣの凝集を（さらに）低減させ、関連する薬物動態の不都合を克服することを目的として、ＡＤＣの前記疎水性を低減させる新たな戦略に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、非線状自壊性リンカーを含む、リンカー−薬物化合物（ＬＤ）および抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関し、該リンカーは、適正な条件下で開裂性または変換性であり、抗体−薬物コンジュゲートの疎水性を低減させる。
【００１０】
第１の側面では、本発明は、式（Ｉ）のリンカー−薬物化合物
【化１】
2019537622.tif 000002
またはその医薬的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物に関し、ここで
Ｖ１は化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによって開裂または変換することができる、条件付きで開裂性または条件付きで変換性の部分であり；
Ｚはフェノール性ヒドロキシル基を含む細胞障害性薬物であり、そのフェノール性ヒドロキシル基を通してＺはリンカーに結合しており、好ましくは、ＺはデュオカルマイシンまたはＣＢＩ二量体誘導体であり、より好ましくは、Ｚはデュオカルマイシン誘導体であり；
ｎは０、１、２、または３であり；
ｍは０または１である。
【００１１】
第２の側面では、本発明は、式（Ｉ）のリンカー−薬物化合物を含む抗体−薬物コンジュゲートに関する。
【００１２】
本発明の他の側面は、リンカー−薬物化合物または抗体−薬物コンジュゲートの医薬組成物、およびそれらの医薬品としての、特にヒトの固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】リンカー−薬物化合物の構造式。
【図１−２】リンカー−薬物化合物の構造式。
【図２】線状ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（リンカー−薬物化合物１）を含む比較ＡＤＣに対する本発明の非線状リンカー−薬物を含むＡＤＣの相対的疎水性。
【図３Ａ】本発明の非線状リンカー−薬物を含む野生型および改変システイン抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣの、線状ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（リンカー−薬物化合物１）を含む比較抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣに対する相対的疎水性。
【図３Ｂ】本発明の非線状リンカー−薬物または線状ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（リンカー−薬物化合物１）を含む改変システイン抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣの、前記リンカー−薬物を含む比較非改変抗ＰＳＭＡ  ｗｔ  ＡＤＣ（ＰＳＭＡ）に対する相対的疎水性。
【図３Ｃ】本発明の非線状リンカー−薬物または線状ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（リンカー−薬物化合物１）を含む野生型および改変システイン抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣの、線状ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（リンカー−薬物化合物１）を含む比較非改変抗ＰＳＭＡ  ｗｔ  ＡＤＣ（ＰＳＭＡ）に対する相対性疎水性の差分。
【図４】本発明の非線状リンカー−薬物を含む、改変システイン抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣのＨＩＣクロマトグラム。
【図５Ａ】マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＮＣａＰ−Ｃ４．２細胞株異種移植片に対する有効性：リンカー−薬物化合物４、７、または８を含む、改変システイン抗ＰＳＭＡ（ＶＨ  Ｓ４１Ｃ）ＡＤＣの、ビヒクル対照、および線状ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（リンカー−薬物化合物１）を含む比較の改変システイン抗ＰＳＭＡ（ＶＨ  Ｓ４１Ｃ）ＡＤＣに対する有効性。２ｍｇ／ｋｇの１回注射後。
【図５Ｂ】マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＮＣａＰ−Ｃ４．２細胞株異種移植片に対する有効性：リンカー−薬物化合物４、７、または８を含む、改変システイン抗ＰＳＭＡ（ＶＨ  Ｓ４１Ｃ）ＡＤＣの、ビヒクル対照、および線状ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（リンカー−薬物化合物１）を含む比較の改変システイン抗ＰＳＭＡ（ＶＨ  Ｓ４１Ｃ）ＡＤＣに対する有効性。５ｍｇ／ｋｇの１回注射後。
【実施形態】
【００１４】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、小分子治療薬の有効性を抗体の標的指向能と組み合わせた新種の抗癌治療薬として新たに出現しつつある。これらの２つの構成成分を新たな単一の分子的実体に組み合わせることによって、細胞障害性の高い小分子薬物を標的癌組織に送達し、それによって有効性を強化しながら小分子の潜在的な全身性毒性副作用を低減させることができる。
【００１５】
抗体は、ＤＮＡと結合する（たとえばアントラサイクリン）、ＤＮＡをアルキル化もしくは架橋する（たとえば、それぞれ、デュオカルマイシン、またはＣＢＩもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体）、ＤＮＡ鎖の切断を引き起こす（たとえばカリチアマイシン）、または微小管を阻害する（たとえばメイタンシノイド、アウリスタチン、およびツブリシン）小分子を含めた種々の細胞障害性薬物にコンジュゲートされている。
【００１６】
薬物は、抗体のアミノ酸残基の側鎖、たとえばシステインまたはリジン残基の側鎖と薬物とを接続する特定の化合物を通して抗体に結合させることができる。この連結化合物、すなわちリンカーは、薬物の放出を所定の場所、たとえば癌細胞のリソソーム内でタイミングを合わせて行うことができるように開裂性であり、それによって薬物の全身的な毒性作用を低減させるであろう。
【００１７】
本発明は、非線状自壊性リンカーを含む、式（Ｉ）のリンカー−薬物化合物、すなわちリンカー−薬物
【化２】
2019537622.tif 000003
または医薬的に許容されるその塩、水和物、もしくは溶媒和物に関する。
【００１８】
Ｖ１は条件付きで開裂性または条件付きで変換性の部分である。  
Ｚはフェノール性ヒドロキシル基を含む細胞障害性薬物であり、そのフェノール性ヒドロキシル基を通してＺはリンカーに結合している。  
ｍおよびｎは独立に０または正の整数である。
【００１９】
マレイミド部分はリンカー−薬物を抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートさせるために使用される。
【００２０】
自壊性リンカーは、離間した２つの化学部分を共有結合によって共に連結して通常安定な３部構成の分子にする能力のある、二官能性の化学または生化学部分として定義されるであろう。それは、離間した化学部分のうちの１つを、たとえば酵素的開裂を利用して３部構成の分子から放出することができ、かかる酵素的開裂に続いて、分子の残部から自然に開裂して、離間した化学部分のうちの他方を放出することができる。リンカーは、（酵素的）開裂のための部位が第１の化学部分と第２の化学部分の結合部位との間にないとき、線状リンカーとは対照的に、非線状とみなされる。
【００２１】
本発明は部分的に、リンカーと細胞障害性薬物とのいくつかの組み合わせを使用して、コンジュゲートされていない（ネイキッド）抗体または抗原結合断片のものと同様の疎水性を有するＡＤＣを調製することができるという発見に基づく。コンジュゲートされていない抗体のものと同様の疎水性を得るようにコンジュゲートを設計することによって、ネイキッド抗体のいくつかの望ましい特性、たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏでのクリアランスの低減および／または標的細胞（複数可）への曝露の増大を含めた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの都合のよい薬物動態プロファイルを維持するであろう。有利なことに、かかるコンジュゲートは、追加的な可溶化基、たとえばポリエチレングリコールまたは他の水溶性ポリマーを含むことを必要とせずにネイキッド抗体のものと同様の疎水性を有するように設計することができる。
【００２２】
式（Ｉ）の化合物における非線状自壊性リンカーは、ＡＤＣの疎水性を減少させるように設計されている。本発明者らは、リンカー中で細胞障害性薬物と抗体の結合部位との間の原子の数を減少させることによって、ＡＤＣの疎水性も比例して減少することを見出した。
【００２３】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明のリンカー中の配置を通して、疎水性薬物と抗体との距離が短くなり、薬物が抗体によって抗体周囲の親水性水性環境から遮蔽されて、ＡＤＣをより疎水性でなくすると本発明者らは考える。
【００２４】
リンカーによって、細胞毒性または細胞分裂停止性作用を誘導するのに十分な、標的細胞または標的細胞内での細胞障害性薬物の効率的な放出が可能となる。典型的には、リンカーは、コンジュゲートが標的細胞によって内部に取り込まれたときに薬物を効率的に放出するように設計される。
【００２５】
Ｖ１は条件付きで開裂性または条件付きで変換性の部分であり、化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによって開裂または変換することができる。言い換えれば、それは、いくつかの条件に移されるかまたは置かれたときに、化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによって変換されるおよび／または開裂されるように設計されている。この条件は、たとえば、本発明の化合物を、Ｖ１の加水分解をもたらす水性環境に移すこと、または本発明の化合物を、Ｖ１を認識して開裂する酵素を含有する環境に移すこと、または本発明の化合物を、Ｖ１の還元および／または除去をもたらす還元条件下に置くこと、または本発明の化合物を、Ｖ１の酸化および／または分離をもたらす酸化条件下に置くこと、または本発明の化合物を、変換および／または開裂をもたらす放射線たとえばＵＶ光に接触させること、または本発明の化合物を、変換および／または開裂をもたらす熱に接触させること、または本発明の化合物を、変換たとえば逆環化付加および／または開裂をもたらす減圧下に置くこと、または本発明の化合物を、変換および／または開裂をもたらす昇圧もしくは高圧下に置くことであろう。この条件は、本発明の化合物を哺乳動物、たとえばヒトに投与した後に満たされるであろう。
【００２６】
好ましくは、Ｖ１は条件付きで開裂性の部分である。より好ましくは、Ｖ１は酵素開裂性の部分である。
【００２７】
開裂によって薬物を放出するのに適した認識部位は、リンカーからの薬物の効率的な分離を可能にする部位である。好ましくは、認識部位はペプチド開裂部位である。ペプチド開裂部位の例として、細胞内プロテアーゼ、たとえばリソソーム内に存在するものによって認識されるものが挙げられる。
【００２８】
一態様では、Ｖ１はペプチドである。  
好ましい態様では、Ｖ１はジ−、トリ−、またはテトラ−ペプチド、すなわち、２個、３個または４個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、標的細胞、たとえば腫瘍細胞の近傍または内部に存在するタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）、たとえば、プラスミン、カテプシン、カテプシンＢ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、またはマトリックスメタロプロテイナ−ゼファミリーのメンバーによって認識可能および開裂性である。Ｖ１に適したペプチドは下記のものを含むが、限定されない。アラニルフェニルアラニルリジン、バリルロイシルリジン、アラニルロイシルリジン、バリルフェニルアラニルリジン、バリルトリプトファニルリジン、アラニルトリプトファニルリジン、アラニルフェニルアラニルシトルリン、バリルロイシルシトルリン、アラニルロイシルシトルリン、バリルフェニルアラニルシトルリン、バリルトリプトファニルシトルリン、アラニルトリプトファニルシトルリン、フェニルアラニルリジン、バリルリジン、バリルアラニン、グリシルフェニルアラニルリジン、アラニルリジン、バリルシトルリン、フェニルアラニルシトルリン、イソロイシルシトルリン、トリプトファニルリジン、トリプトファニルシトルリン、フェニルアラニルアルギニン、フェニルアラニルアラニン、アラニルロイシルアラニルロイシン、アラニルアルギニルアルギニン、ロイシルリジン、およびロイシルシトルリン。好ましくは、Ｖ１はバリルアラニン、バリルリジン、バリルシトルリン、フェニルアラニルリジン、およびアラニルフェニルアラニルリジンから選択される。より好ましくは、Ｖ１はバリルシトルリンおよびバリルアラニンから選択される。
【００２９】
Ｖ１はそのＣ末端側を通して非線状リンカーに結合し、Ｎ末端側は露出されたままである。任意に、Ｖ１のＮ末端側はアミンブロック基によってキャップされる。アミンブロック基の好適な例は下記のものを含む。Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、（アルコキシ）カルボニル（たとえば、Ｂｏｃとして公知のｔ−ブトキシカルボニル）、（アリールアルコキシ）カルボニル（たとえば、ベンジルオキシカルボニル、またはＣｂｚとして公知のカルボベンジルオキシ）、およびＦｍｏｃとして公知の９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）。
【００３０】
一態様では、Ｖ１のＮ末端側は水溶性基、たとえば直鎖状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）オリゴマーによってキャップされる。好ましくは、直鎖状ＰＥＧオリゴマーは、１〜２０個のエチレングリコール部分、より好ましくは３〜１０個、さらにより好ましくは５〜７個を含有する。
【００３１】
Ｚはフェノール性ヒドロキシル基を含む細胞障害性薬物であり、そのフェノール性ヒドロキシル基を通してＺはリンカーに結合している。好ましくは、ＺはデュオカルマイシンまたはＣＢＩ二量体誘導体である。より好ましくは、Ｚはデュオカルマイシン誘導体である。
【００３２】
デュオカルマイシンは、ストレプトマイセス種の培養ブロスから最初に単離された構造的に関連する毒素の部類であり、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、およびＣＣ−１０６５を含む抗腫瘍性抗生物質ファミリーのメンバーである。
【００３３】
デュオカルマイシンはＤＮＡの副溝に結合し、引き続きＤＮＡの不可逆的なアルキル化を引き起こす。これは核酸の構造を破壊し、これは腫瘍を最終的に細胞死させる。
【００３４】
ＷＯ２０１０／０６２１７１はＤＮＡ−アルキル化剤ＣＣ−１０６５の一連の新規な類似体を開示している。これらのデュオカルマイシン誘導体は本発明による使用に適している。多くのこれらの薬物の化学合成がＷＯ２０１０／０６２１７１の例１−２２に記載されている。
【００３５】
ＣＢＩ二量体（１，２，９，９ａ−テトラヒドロシクロプロパ［ｃ］ベンゾ［ｅ］インドール−４−オン二量体）もＣＣ−１０６５に由来する毒性の高い抗生物質の群の一部であるが、デュオカルマイシンがＤＮＡのアルキル化を引き起こすのに対し、構造的に関連するＣＢＩ二量体は鎖間ＤＮＡ架橋を引き起こし、それによって細胞死をもたらす。
【００３６】
本発明の一態様では、Ｚは
【化３】
2019537622.tif 000004
ここでＲ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＦ３、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ハロゲン、Ｒａ、ＳＲａ、Ｓ（Ｏ）Ｒａ、Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、Ｓ（Ｏ）ＯＲａ、Ｓ（Ｏ）２ＯＲａ、ＯＳ（Ｏ）Ｒａ、ＯＳ（Ｏ）２Ｒａ、ＯＳ（Ｏ）ＯＲａ、ＯＳ（Ｏ）２ＯＲａ、ＯＲａ、ＮＨＲａ、Ｎ（Ｒａ）Ｒｂ、＋Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）Ｒｃ、Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＲｂ）、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＲｂ）、ＳｉＲａＲｂＲｃ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）Ｒｂ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、ＯＣ（Ｏ）ＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）Ｒｂ、Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）Ｒｃ、および水溶性基から選択され、ここで
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは独立に、Ｈ、および任意に置換されていてもよい、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａａＣＨ２ＣＨ２Ｘ１Ｒａ１、Ｃ１〜１５アルキル、Ｃ１〜１５ヘテロアルキル、Ｃ３〜１５シクロアルキル、Ｃ１〜１５ヘテロシクロアルキル、Ｃ５〜１５アリール、またはＣ１〜１５ヘテロアリールから選択され、ここでａａは１〜１０００から選択され、Ｘ１はＯ、Ｓ、およびＮＲｂ１から選択され、Ｒｂ１およびＲａ１は独立にＨおよびＣ１〜３アルキルから選択され、Ｒａ、Ｒｂ、および／またはＲｃにおける任意の置換基の１つ以上は任意に水溶性基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃの２つ以上は、任意に１つ以上の結合によって連結されて、任意に置換されていてもよい、１つ以上の炭素環および／またはヘテロ環を形成する。
【００３７】
「水溶性基」という用語は、水性環境中で十分に溶媒和され、それが結合している化合物に向上した水溶性を付与する官能基を指す。水溶性基の例は下記のものを含むが、それらに限定されない。多価アルコール、直鎖または環式サッカライド、第一級、第二級、第三級、または第四級アミンまたはポリアミン、サルフェート基、スルホネート基、スルフィネート基、カルボキシレート基、ホスフェート基、ホスホネート基、ホスフィネート基、アスコルベート基、グリコール、たとえばポリエチレングリコール、およびポリエーテル。好ましい水溶性基は第一級、第二級、第三級、および第四級アミン、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェート、スルホネート、スルフェート、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙｙＣＨ２ＣＨ２Ｘ２Ｒｙｙ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙｙＣＨ２ＣＨ２Ｘ２−、−Ｘ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙｙＣＨ２ＣＨ２−、グリコール、オリゴエチレングリコール、およびポリエチレングリコールであり、ここでｙｙは１〜１０００から選択され、Ｘ２はＯ、Ｓ、およびＮＲｚｚから選択され、ＲｚｚおよびＲｙｙは独立にＨおよびＣ１〜３アルキルから選択される。
【００３８】
「置換されている」という用語は、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」などに対する形容詞として使用されるとき、前記「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、または同様の基が１つ以上の置換基（水素に対する置換によって導入される）を含有することを示す。代表的な置換基は下記のものを含むが、これらに限定されない。ＯＨ、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＲｄ、＝Ｎ−ＯＲｄ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＮＯ、Ｎ３、ＣＦ３、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ハロゲン、Ｒｄ、ＳＲｄ、Ｓ（Ｏ）Ｒｄ、Ｓ（Ｏ）ＯＲｄ、Ｓ（Ｏ）２Ｒｄ、Ｓ（Ｏ）２ＯＲｄ、ＯＳ（Ｏ）Ｒｄ、ＯＳ（Ｏ）ＯＲｄ、ＯＳ（Ｏ）２Ｒｄ、ＯＳ（Ｏ）２ＯＲｄ、Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒｄ）Ｒｅ、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（Ｒｄ）Ｒｅ、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｄ）Ｒｅ、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｄ）Ｒｅ、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲｄ）（ＯＲｅ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲｄ）（ＯＲｅ）、ＯＲｄ、ＮＨＲｄ、Ｎ（Ｒｄ）Ｒｅ、＋Ｎ（Ｒｄ）（Ｒｅ）Ｒｆ、Ｓｉ（Ｒｄ）（Ｒｅ）（Ｒｆ）、Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｄ）Ｒｅ、ＯＣ（Ｏ）Ｒｄ、ＯＣ（Ｏ）ＯＲｄ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｄ）Ｒｅ、Ｎ（Ｒｄ）Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、Ｎ（Ｒｄ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｅ、Ｎ（Ｒｄ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｅ）Ｒｆ、水溶性基、およびこれらの置換基のチオ誘導体、ならびにこれらの置換基の何れかのプロトン化、荷電、および脱プロトン化形態、ここでＲｄ、Ｒｅ、およびＲｆは独立にＨ、および任意に置換されている、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙｙＣＨ２ＣＨ２Ｘ２Ｒｙｙ、Ｃ１〜１５アルキル、Ｃ１〜１５ヘテロアルキル、Ｃ３〜１５シクロアルキル、Ｃ１〜１５ヘテロシクロアルキル、Ｃ５〜１５アリール、もしくはＣ１〜１５ヘテロアリール、またはそれらの組み合わせから選択され、ここでｙｙは１〜１０００から選択され、Ｘ２は独立にＯ、Ｓ、およびＮＲｚｚから選択され、ＲｚｚおよびＲｙｙは独立にＨおよびＣ１〜３アルキルから選択され、Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆの２つ以上は任意に１つ以上の結合によって連結されて１つ以上の任意に置換されていてもよい炭素環および／またはヘテロ環を形成する。２つ以上の置換基が存在するとき、各置換基は独立に選択される。２つ以上の置換基は、該置換基のそれぞれの１つ以上の水素原子の、１つ以上の接続結合による置きかえによって互いに接続されてもよく、結合は単結合、二重結合、もしくは三重結合でもよいし、または共鳴構造が可能であるならば、前記結合の結合次数は２つ以上のこれらの共鳴構造において異なっていてもよい。こうして、２つの置換基は１つ以上の環の形成下によって連結されるであろう。
【００３９】
置換基が「１つ以上の結合によって連結されて１つ以上の任意に置換された炭素環および／またはヘテロ環を形成」してもよい場合、これは該置換基のそれぞれの１つ以上の水素原子が１つ以上の接続結合による置きかえによって該置換基が互いに接続されていてもよいことを意味する。
【００４０】
「アリール」という用語は、ここで使用される場合、５〜２４個の環炭素原子を含む炭素環式芳香族置換基を指し、これは荷電または非荷電であってもよく、１つの環からなっていても共に縮合した２つ以上の環からなっていてもよい。アリール基の例は以下のものを含むが、これらに限定されない。フェニル、ナフチル、およびアントラセニル。
【００４１】
「ヘテロアリール」という用語は、ここで使用される場合、１〜２４個の環炭素原子および少なくとも１つの環ヘテロ原子、たとえば酸素、窒素、硫黄、ケイ素またはリンを含む複素環式芳香族置換基を指し、ここで窒素および硫黄は任意に酸化されていてもよく、窒素は任意に四級化されていてもよく、該複素環式芳香族置換基は１つの環からなっていても共に縮合した２つ以上の環からなっていてもよい。ヘテロ原子は、互いに直接接続されてもよい。ヘテロアリール基の例は以下のものを含むが、これらに限定されない。ピリジニル、ピリミジル、フラニル、ピロリル、トリアゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、チエニル、インドリル、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、プリニル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、キノキサリニル、イソキノリル、およびキノリル。一態様では、ヘテロアリール基は１〜４個のヘテロ原子を含む。「Ｃ１ヘテロアリール基」はヘテロ芳香族基の環系に炭素が１つしか存在しないことを表す（よって任意の置換基中の炭素原子はカウントされない）ことを留意すべきである。かかるヘテロ芳香族基の例はテトラゾリル基である。
【００４２】
「アリール」および「ヘテロアリール」基は１つ以上の非芳香族環がアリールまたはヘテロアリール環または環系に縮合された環系も包含する。
【００４３】
「アルキル」という用語は、ここで使用される場合、直鎖または分枝の、飽和または不飽和ヒドロカルビル置換基を指す。アルキル基の例は下記のものを含むが、これらに限定されない。メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、２−メチルブチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、および１−ブチニル。
【００４４】
「ヘテロアルキル」という用語は、ここで使用される場合、直鎖または分枝の、飽和または不飽和ヒドロカルビル置換基であって、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子によって、たとえば酸素、窒素、硫黄、ケイ素、またはリンによって置きかえられたものを指し、ここで窒素および硫黄は任意に酸化されていてもよく、窒素は任意に四級化されていてもよい。ヘテロ原子は互いに直接接続していてもよい。例は下記のものを含むが、これらに限定されない。メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ、メチルオキシメチル、エチルオキシメチル、メチルオキシエチル、エチルオキシエチル、メチルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、メチルアミノエチル、ジメチルアミノエチル、メチルチオメチル、エチルチオメチル、エチルチオエチル、およびメチルチオエチル。
【００４５】
「シクロアルキル」という用語は、ここで使用される場合、飽和または不飽和の非芳香族環式ヒドロカルビル置換基を指し、これは１つの環からなっていても共に縮合した２つ以上の環からなっていてもよい。例は下記のものを含むが、これらに限定されない。シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエニル、デカリニル、および１，４−シクロヘキサジエニル。
【００４６】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、ここで使用される場合、飽和または不飽和の非芳香族環式ヒドロカルビル置換基であって、１つの環からなっていても共に縮合した２つ以上の環からなっていてもよく、環の一方における少なくとも１つの炭素がヘテロ原子によって、たとえば酸素、窒素、硫黄、ケイ素、またはリンによって置きかえられているものを指し、ここで窒素および硫黄は任意に酸化されていてもよく、窒素は任意に四級化されていてもよい。ヘテロ原子は、互いに直接接続していてもよい。例は下記のものを含むが、これらに限定されない。テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、ピペリジニル、１，４−ジオキサニル、デカヒドロキノリニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、およびモルホリニル。「Ｃ１ヘテロシクロアルキル基」はヘテロシクロアルカンの環系に炭素が１つしか存在しないことを表す（よって任意の置換基中の炭素原子はカウントされない）ことを留意すべきである。かかる基の例はジオキシラニル基である。
【００４７】
「アシル」という用語は、ここで使用される場合、カルボニル官能基を通して親構造に結合している、直鎖、分枝、または環式構成またはそれらの組み合わせを有する基を指す。かかる基は飽和であっても不飽和であっても、脂肪族であっても芳香族であっても、炭素環式であっても複素環式であってもよい。Ｃ１〜Ｃ８アシル基の例は下記のものを含む。アセチル−、ベンゾイル−、ニコチノイル−、プロピオニル−、イソブチリル−、オキサリル−など。
【００４８】
「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「アシル」などが含有してもよい炭素原子の数は前記用語に先立つ記号によって示され、すなわちＣ１〜１０アルキルは前記アルキルが１〜１０個の炭素を含有してもよいことを意味する（このアルキルに結合した任意の置換基中の炭素原子はカウントされない）。
【００４９】
「炭素環」という用語は、ここでは飽和または不飽和のシクロアルカンまたはアレーン部分を指し、ここで「シクロアルカン」および「アレーン」という用語はそれぞれ、先に定義した通りの「シクロアルキル」および「アリール」置換基の親部分として定義される。
【００５０】
「ヘテロ環」という用語は、ここでは飽和または不飽和のヘテロシクロアルカンまたはヘテロアレーン部分を指し、ここで「ヘテロシクロアルカン」および「ヘテロアレーン」という用語はそれぞれ、先に定義した通りの「ヘテロシクロアルキル」および「ヘテロアリール」置換基の親部分として定義される。
【００５１】
たとえば「アルキル」に対する「アルキレン」における「−イル」に対する「−イレン」という接尾語は、前記のたとえば「アルキル」では１つの単結合を介して１つの部分に接続する一価の基であるのに対して、前記のたとえば「アルキレン」は少なくとも１つ以上の二重結合または２つ以上の単結合を介して１つ以上の他の部分に接続する二価（または多価）の部分であることを示す。したがって、「アルキレン」という用語は直鎖または分枝の、飽和または不飽和ヒドロカルビレン部分を指し；「ヘテロアルキレン」という用語は、ここで使用される場合、少なくとも１つの炭素がヘテロ原子によって置きかえられている直鎖または分枝の、飽和または不飽和ヒドロカルビレン部分を指し；「アリーレン」という用語は、ここで使用される場合、炭素環式芳香族部分を指し、これは１つの環からなっていても共に縮合した２つ以上の環からなっていてもよく；「ヘテロアリーレン」という用語は、ここで使用される場合、炭素環式芳香族部分であって、１つの環からなっていても共に縮合した２つ以上の環からなっていてもよく、環の一方における少なくとも１つの炭素がヘテロ原子によって置きかえられているものを指し；「シクロアルキレン」という用語は、ここで使用される場合、飽和または不飽和の非芳香族環式ヒドロカルビレン部分を指し、これは１つの環からなっていても共に縮合した２つ以上の環からなっていてもよく；「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、ここで使用される場合、飽和または不飽和の非芳香族環式ヒドロカルビレン部分であって、１つの環からなっていても共に縮合した２つ以上の環からなっていてもよく、環の一方における少なくとも１つの炭素がヘテロ原子によって置きかえられているものを指す。代表的な二価の部分は、先に一価の基に関して示したものであって、１つの水素原子を取り除いたものを含む。
【００５２】
「ポリアルキレン」、「ポリヘテロアルキレン」、「ポリアリーレン」、「ポリヘテロアリーレン」、「ポリシクロアルキレン」、「ポリヘテロシクロアルキレン」などにおける接頭語「ポリ」は、かかる「−イレン」部分、たとえばアルキレン部分の２つ以上が共に連結されて隣接する部分に２つ以上の結合部位を含有する分枝または非分枝の多価部分を形成していることを示す。同様に、たとえばオリゴエチレングリコールにおける「オリゴ」という接頭語は、２つ以上のエチレングリコール部分が共に連結されて分枝または非分枝の多価部分を形成していることを示す。接頭語「オリゴ」と「ポリ」の相違は、接頭語「オリゴ」は比較的少数の繰返し単位を表すのに最も頻繁に使用される一方で、接頭語「ポリ」は比較的多数の繰返し単位を通常指すことである。
【００５３】
ｍおよびｎはそれぞれ独立に０または正の整数である。好ましくは、ｎは０、１、２、または３であり、ｍは０、または１である。より好ましくは、ｎは０、１、２、または３であり、ｍは０である。
【００５４】
一態様では、本発明は、式（Ｉ）のリンカー−薬物化合物、または医薬的に許容されるその塩、水和物、もしくは溶媒和物に関し、ここで、
Ｖ１は化学的、光化学的、物理的、生物学的、または酵素的プロセスによって開裂または変換することができる、条件付きで開裂性または条件付きで変換性の部分であり；
Ｚはフェノール性ヒドロキシル基を含む細胞障害性薬物であり、そのフェノール性ヒドロキシル基を通してＺはリンカーに結合しており、好ましくは、ＺはデュオカルマイシンまたはＣＢＩ二量体誘導体であり、より好ましくは、Ｚはデュオカルマイシン誘導体であり；
ｎは、０、１、２、または３であり；
ｍは、０または１である。
【００５５】
一態様では、Ｚは
【化４】
2019537622.tif 000005
ここでＲ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＦ３、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ハロゲン、Ｒａ、ＳＲａ、Ｓ（Ｏ）Ｒａ、Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、Ｓ（Ｏ）ＯＲａ、Ｓ（Ｏ）２ＯＲａ、ＯＳ（Ｏ）Ｒａ、ＯＳ（Ｏ）２Ｒａ、ＯＳ（Ｏ）ＯＲａ、ＯＳ（Ｏ）２ＯＲａ、ＯＲａ、ＮＨＲａ、Ｎ（Ｒａ）Ｒｂ、＋Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）Ｒｃ、Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＲｂ）、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＲｂ）、ＳｉＲａＲｂＲｃ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）Ｒｂ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、ＯＣ（Ｏ）ＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）Ｒｂ、Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）Ｒｃ、および水溶性基から選択され、ここで
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは独立にＨ、および任意に置換されていてもよい、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａａＣＨ２ＣＨ２Ｘ１Ｒａ１、Ｃ１〜１５アルキル、Ｃ１〜１５ヘテロアルキル、Ｃ３〜１５シクロアルキル、Ｃ１〜１５ヘテロシクロアルキル、Ｃ５〜１５アリール、またはＣ１〜１５ヘテロアリールから選択され、ここでａａは１〜１０００から選択され、Ｘ１はＯ、Ｓ、およびＮＲｂ１から選択され、Ｒｂ１およびＲａ１は独立にＨおよびＣ１〜３アルキルから選択され、Ｒａ、Ｒｂ、および／またはＲｃにおける任意の置換基の１つ以上は任意に水溶性基であり、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃの２つ以上は、任意に１つ以上の結合によって連結されて、任意に置換されていてもよい１つ以上の炭素環および／またはヘテロ環を形成する。
【００５６】
一態様では、Ｚは
【化５】
2019537622.tif 000006
好ましい態様では、Ｚは
【化６−１】
2019537622.tif 000007
【化６−２】
2019537622.tif 000008
【化６−３】
2019537622.tif 000009
【００５７】
一態様では、Ｒ１はＨ、メチル、およびメトキシから選択される。好ましくは、Ｒ１はメチルである。
【００５８】
より好ましい態様では、Ｚは
【化７】
2019537622.tif 000010
【００５９】
特に好ましい態様では、Ｚは、
【化８】
2019537622.tif 000011
【００６０】
別の態様では、Ｚは、
【化９】
2019537622.tif 000012
【００６１】
好ましい態様では、Ｚは
【化１０】
2019537622.tif 000013
【００６２】
一態様では、Ｒ１はＨ、メチル、およびメトキシから選択される。好ましくは、Ｒ１はメチルである。
【００６３】
より好ましい態様では、Ｚは
【化１１】
2019537622.tif 000014
【００６４】
一態様では、式（Ｉ）の化合物は、下記で表される。
【化１２】
2019537622.tif 000015
ここで、Ｖ１、Ｚ、およびｎは前の態様において定義した通りである。
【００６５】
好ましい態様では、式（Ｉａ）の化合物は
【化１３】
2019537622.tif 000016
ここで、Ｒ４およびＲ５は独立にＨまたはアミンブロック基である。
【００６６】
より好ましい態様では、式（Ｉａ）の化合物は
【化１４】
2019537622.tif 000017
【００６７】
別の好ましい態様では、式（Ｉａ）の化合物は
【化１５】
2019537622.tif 000018
【００６８】
さらに好ましい態様では、式（Ｉａ）の化合物は
【化１６】
2019537622.tif 000019
【００６９】
一態様では、式（Ｉ）の化合物は
【化１７】
2019537622.tif 000020
ここで、Ｖ１、Ｚ、およびｎは前の態様において定義した通りである。
【００７０】
好ましい態様では、式（Ｉｂ）の化合物は
【化１８】
2019537622.tif 000021
【００７１】
加えて、本発明は、本発明によるリンカー−薬物化合物（式Ｉ）が、抗体またはその抗原結合断片に、該抗体またはその抗原結合断片に存在するシステインを通してコンジュゲートされている、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。
【００７２】
ＡＤＣの平均薬物抗体比（ＤＡＲ）、すなわち、抗体にコンジュゲートされた薬物の平均の数は、典型的には１〜６の範囲である。当技術分野で周知のように、ＤＡＲおよび薬物ロード分布は、たとえば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）または逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用することによって決定することができる。ＨＩＣは、平均ＤＡＲを決定するのに特に適している。好ましくは、平均ＤＡＲは１〜４、より好ましくは１〜３、最も好ましくは１．５〜２の範囲である。
【００７３】
本発明によるリンカー−薬物は、かかるリンカー−薬物を含むＡＤＣの疎水性が、線状リンカー−薬物を含むＡＤＣの疎水性の場合よりも、ネイキッド抗体またはその抗原結合断片の疎水性により匹敵するように設計される。疎水性の制御を使用して、ＡＤＣの薬物動態パラメータを管理することができる。
【００７４】
ＡＤＣの疎水性は、コンジュゲートの疎水性をコンジュゲートされていない抗体またはその抗原結合断片の疎水性と比較することによって決定することができ、相対的疎水性と呼ばれる。いくつかの態様では、コンジュゲートの保持時間は、例における表１Ａおよび１Ｂに記載した方法によって決定したときに、コンジュゲートされていない抗体またはその抗原結合断片の保持時間よりも３分以内長い。いくつかの他の態様では、コンジュゲートの保持時間は、例における表１Ａおよび１Ｂに記載した方法によって決定したときに、コンジュゲートされていない抗体またはその抗原結合断片の保持時間よりも２分以内長い。いくつかの他の態様では、コンジュゲートの保持時間は、表１Ａおよび１Ｂに記載した方法によって決定したときに、コンジュゲートされていない抗体またはその抗原結合断片の保持時間よりも１．５分以内長い。いくつかの他の態様では、コンジュゲートの保持時間は、表１Ａおよび１Ｂに記載した方法によって決定したときに、コンジュゲートされていない抗体またはその抗原結合断片の保持時間よりも１分以内長い。
【００７５】
相対的疎水性に対する本発明のリンカーの効果は、薬物の性質がより疎水性である態様ではより顕著となる。
【００７６】
本発明に関連して、任意の抗体−特に治療活性を有することが公知の任意の抗体もしくはＡＤＣの技術分野で公知の任意の抗体、または任意のその抗原結合断片、たとえば、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦａｂ’断片、一本鎖（ｓｃ）抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン（ｓｄ）抗体、二重特異性の抗体、またはミニボディーを、ここに特許請求するリンカー−薬物の（野生型または部位特異的）コンジュゲーションに使用することができる。抗体は任意のアイソタイプたとえばＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ抗体であってもよい。好ましくは、抗体はＩｇＧ抗体であり、より好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。
【００７７】
抗体は、単一特異性（すなわち１つの抗原に対して特異的；かかる抗原は種の間で共通であるか、または種の間で関連する抗原を有するであろう）抗体であっても、二重特異性（すなわち２つの異なる抗原に対して特異的）抗体であってもよい。本発明の一態様では、抗体は単一特異性の抗体またはその抗原結合断片である。
【００７８】
これらの抗体は、組換えによって、合成によって、または当技術分野で公知の他の好適な方法によって生成されるであろう。
【００７９】
好ましくは、抗体は腫瘍細胞の細胞膜内または細胞膜上（たとえば細胞表面上）に発現する抗原標的に結合する。より好ましくは、ＡＤＣは抗体が（抗原）標的に結合した後に細胞によって内部に取り込まれ、その後細胞障害性薬物が細胞内に放出される。
【００８０】
一態様では、本発明に従って使用すべき抗体は、以下のものからなる群より選択される標的の１つに対する単一特異性の抗体（またはその抗原結合断片）である。アネキシンＡ１、ＣＡ２４２（癌抗原２４２）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０（腫瘍壊死因子８）、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８（サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ）、ＣＤ４４、ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質）、ＣＤ５６（神経細胞接着分子）、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１１５（コロニー刺激因子１受容体）、ＣＤ１２３（インターロイキン−３受容体）、ＣＤ１３８（シンデカン１）、ＣＤ２０３ｃ（ＥＮＰＰ３）、ＣＤ３０３、ＣＤ３３３、ＣＥＡＣＡＭ、ＣＬＬ−１（Ｃ型レクチン様分子−１）、ｃ−ＭＥＴ（肝細胞増殖因子受容体）、Ｃｒｉｐｔｏ、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ３、ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、ＦＡＰ、ＦｃＲＬ５（Ｆｃ受容体様タンパク質５、ＣＤ３０７）、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１（葉酸受容体アルファ）、ＧＣＣ（グアニリルシクラーゼＣ）、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＭＷ−ＭＡＡ（高分子量メラノーマ関連抗原）、インテグリン、ルイスＡ様炭水化物、ルイスＹ（ＣＤ１７４）、ＬＩＶ１、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＮ（ＣＡ９）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン−４、ＰＳＭＡ、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＴＥＡＰ−１、５Ｔ４抗原、Ｔａｇ７２、組織因子（ＴＦ、トロンボプラスチン、ＣＤ１４２）、ＴＦ−Ａｇ、ＴＲＯＰ２（腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２）、およびＶＬＡ。
【００８１】
別の態様では、本発明に従って使用すべき抗体は、上に列挙した群から選択される２つの標的の組み合わせに対する二重特異性の抗体（またはその抗原結合断片）である。
【００８２】
適切な抗体の例は以下のものを含む。ブリナツモマブ（ＣＤ１９）、エピラツズマブ（ＣＤ２２）、イラツムマブおよびブレンツキシマブ（ＣＤ３０）、バダスツキシマブ（ＣＤ３３）、テツルマブ（ＣＤ３７）、イサツキシマブ（ＣＤ３８）、ビバツズマブ（ＣＤ４４）、ロルボツズマブ（ＣＤ５６）、ボルセツズマブ（ＣＤ７０）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ポラツズマブ（ＣＤ７９）、ロバルピツズマブ（ＤＬＬ３）、フツキシマブ（ＥＧＦＲ）、オポルツズマブ（ＥＰＣＡＭ）、ファルレツズマブ（ＦＯＬＲ１）、グレンバツムマブ（ＧＰＮＭＢ）、トラスツズマブおよびペルツズマブ（ＨＥＲ２）、エタラシズマブ（インテグリン）、アネツマブ（メソテリン）、パンコマブ（ＭＵＣ１）、エンフォルツマブ（ネクチン−４）、ならびにＨ８、Ａ１、およびＡ３（５Ｔ４抗原）。
【００８３】
本発明に従って使用すべき抗体は、好ましくはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、キメラ、ヒト化、またはヒトｍＡｂであり得る。より好ましくは、本発明に従ってヒト化またはヒトｍＡｂが使用され、さらにより好ましくはヒト化またはヒトＩｇＧ抗体が使用され、最も好ましくはヒト化またはヒトＩｇＧ１  ｍＡｂが使用される。好ましくは、前記抗体はκ（カッパ）軽鎖を有し、すなわちヒト化またはヒトＩｇＧ１−κ抗体である。
【００８４】
ヒト化抗体において、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の可変領域内の抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）は、非ヒト種、通常はマウス、ラットまたはウサギからの抗体に由来する。これらの非ヒトＣＤＲはＨＣおよびＬＣの可変領域（フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）のヒトフレームワーク内に配置されるであろう。結合親和性を向上させながら低い免疫原性を保持するために、ヒトフレームワーク領域内で選択したアミノ酸を、対応する当初の非ヒト種のアミノ酸と交換してもよい。こうしてヒト化された可変領域をヒト定常領域と組み合わせる。あるいは、非ヒトフレームワークを含む非ヒト可変領域をヒト軽鎖定常領域およびヒト重鎖定常領域と組み合わせる。この場合、当初の非ヒト種のフレームワーク領域の選択されたアミノ酸を、免疫原性を低減させながら抗体の結合親和性を保持するために、それらの対応するヒトアミノ酸と交換する。より好ましくない態様では、ＣＤＲ内に位置するアミノ酸も、抗体の親和性を低減させることなく免疫原性を低減させるために交換されるであろう。これらのヒト化抗体のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（抗体の可変領域および軽鎖定常領域）およびＫａｂａｔ  Ｅｕシステム（抗体の重鎖定常領域）に従ってナンバリングできる。
【００８５】
抗体およびその抗原結合断片は、種々の細胞障害性薬物に開裂性リンカーまたは非開裂性リンカーの何れかを介してコンジュゲートされている。当業者に公知のリンカー−薬物の例は下記のものを含む。ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（すなわち、ＳＹＤ９８０）、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（ｍｃ−ｖｃ−ＭＭＡＥおよびｖｃ−ＭＭＡＥとも略される）、ｍｃ−ＭＭＡＦ、およびｍｃ−ｖｃ−ＭＭＡＦ。これらの略語は、当業者に周知である（ＷＯ２０１５／１７７３６０も参照されたい）。リンカー−薬物、ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡは、ＷＯ２０１１／１３３０３９に化合物１８ｂとして２１０頁、ｌｌ．２１〜２７に開示されている。
【００８６】
ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ  ＡＤＣの一般的な分子構造を下に図示する。
【化１９】
2019537622.tif 000022
【００８７】
本発明に従って使用されるリンカーは、たとえば非開裂性のマレイミドカプロイル（ｍｃ）と対照的に開裂性リンカーであり、たとえば開裂性のジペプチドたとえばバリンシトルリン（ｖｃ）またはバリンアラニン（ｖａ）を含んでいるであろう。
【００８８】
先行技術のリンカーの多くが線状リンカーであり、すなわち薬物と抗体またはその抗原結合断片の結合部位との間に開裂部位を有する。これらのリンカーは、本発明者らによって「エンドリンカー」と定義される。リンカー−薬物の疎水性を向上させるための当技術分野で公知の試みおよびそれによって得られたＡＤＣは、薬物と抗体もしくは抗原結合断片との間または並列位置（リンカーの側基として）の何れかで、水溶性基たとえばポリエチレングリコールポリマーをリンカーに結合させることを含む。しかし、可溶化基を付加すると、必然的にリンカー分子の複雑性が増大し、可溶化基が大きい場合はさらにコンジュゲートを生成する複雑性が増大する。
【００８９】
驚くべきことに、本発明者らは、非線状リンカー、すなわち薬物と抗体または抗原結合断片との間に開裂部位を有していないリンカー（本発明者らによって「エキソリンカー」と定義される）を使用することによって、（バルキーな）水溶性基内に構築することを必要とせずにＡＤＣの疎水性を向上させることができることを見出した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明に従って使用されるリンカー内の配置は、疎水性の薬物と抗体または抗原結合断片との間により短い距離をもたらすであろう。その結果、薬物は抗体または抗原結合断片の周囲の親水性水性環境から遮断され、よってＡＤＣをより疎水性でなくする。
【００９０】
この疎水性低下作用は、下の表Ａに示すように抗体の（または抗原結合断片の）硫黄原子と薬物の酸素原子との間の原子の数が減少すると増大する。
【００９１】
たとえば、ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ  ＡＤＣ中には、抗体のＳ原子と薬物のＯ原子との間に２９個の原子が存在する。
【００９２】
【表１】
2019537622.tif 000023
【００９３】
一態様では、本発明は、本発明によるリンカー−薬物が、改変システインを通して抗体に部位特異的にコンジュゲートされている、ＡＤＣに関する。
【００９４】
本発明によれば、「改変システイン」という用語は、抗体のＨＣまたはＬＣ内の非システインアミノ酸をシステインで置きかえること、既存のアミノ酸の間にシステインを追加すること、または天然の鎖間ジスルフィド結合のシステインを非システインアミノ酸、たとえばセリンで置換することによって遊離の「改変」システインを他方の鎖中に作り出すことを意味する。当業者に公知であるように、システイン改変抗体は、組換えクローニング法によって宿主細胞内で発現させてもよいし、従来の分子クローニング技法を使用して調製することもできるし、または抗体のシステイン変異（複数可）を有するＨＣもしくはＬＣドメイン（複数可）を公知の（ペプチドまたはＤＮＡ）合成機器および手順を使用してそれ自体で合成することができる。典型的には、ＷＯ２０１５／１７７３６０に開示されるものと同様の手順が使用される。
【００９５】
改変システインを含む抗体は、部位特異的ＡＤＣを調製する機会を与え、リンカー−薬物との良好な反応性を示すコンジュゲーション位置を与えることができ、同時に抗体間に追加的なジスルフィド結合を形成する（凝集をもたらす）または抗体構造を妨げる危険性が低減する。抗体の適切な位置にシステイン残基を導入するとコンジュゲーション部位を制御することが可能となり、得られた部位特異的コンジュゲートは、従来の方法、すなわち野生型の鎖間ジスルフィドシステインを介するコンジュゲーションによって得られたコンジュゲートより均質である。かかる従来の方法はＡＤＣの不均一な混合物をもたらし、たとえばコンジュゲートされていない抗体を除去するための精製を必要とするであろう。従来のようにコンジュゲートされたＡＤＣ混合物の個々の成分は、ｉｎ  ｖｉｖｏ性能が不十分なことがある。Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３０巻、第２号、２０１２、１８４〜１８９頁におけるＢ．−Ｑ．Ｓｈｅｎらに従って、改変システインを介してＡＤＣのリンカー−薬物を部位特異的にコンジュゲートすれば、有効性、安全性、および安定性に関するＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ性能は向上し得る。
【００９６】
下の表Ｂに示すように、リンカー−薬物が外側を向く位置でリンカー−薬物が部位特異的にコンジュゲートされているＡＤＣでも、本発明のリンカー−薬物の疎水性低下作用が明らかに見られる。
【００９７】
【表２】
2019537622.tif 000024
【００９８】
本発明者らは、リンカー−薬物がＦａｂまたはＦｃキャビティ内の位置で部位特異的にコンジュゲートされたときに疎水性の減少がさらにより顕著であることを観察した。この作用は、表ＣにおいてＬＣ４０位および４１位、ならびにＨＣ４１位の場合に示される。相対的疎水性の値は、野生型にコンジュゲートされたＰＳＭＡ−ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ  ＡＤＣの疎水性を参照値として使用して（部位特異的にコンジュゲートされたＡＤＣについての値を示している最初の列）、またはそれぞれの部位特異的にコンジュゲートされたＡＤＣの疎水性を使用して（部位特異的にコンジュゲートされたＡＤＣについての値を示している２番目の列）算出した。参照値は１．０に指標化する。
【００９９】
【表３】
2019537622.tif 000025
【０１００】
一態様では、本発明は、リンカー−薬物が抗体に、重鎖４０、４１、８９（Ｋａｂａｔナンバリング）、１５２、１５３、１５５、１７１、２４７、２９７、３３９、３７５、および３７６（Ｅｕナンバリング）、ならびに軽鎖４０、４１、１６５、および１６８（Ｋａｂａｔナンバリング）から選択される前記抗体の１つ以上の位置で、改変システインを通して部位特異的にコンジュゲートされている、ＡＤＣに関する。
【０１０１】
本発明に関連して、抗体のＨＣ可変およびＬＣ可変および定常領域中の、改変システインアミノ酸位置を示すためにＫａｂａｔナンバリングが使用され、ＨＣ定常領域中の位置を示すためにＥｕナンバリングが使用される。
【０１０２】
「Ｋａｂａｔナンバリング」という表現は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、公衆衛生局、国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１）において、抗体の重鎖可変もしくは軽鎖可変ドメインまたは定常ドメインの編集に使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮またはそれらへの挿入に対応する、より少ないまたは追加のアミノ酸を含有するであろう。残基のＫａｂａｔナンバリングは、所与の抗体について、抗体の配列と「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列との相同性の領域での配列比較によって決定されるであろう。
【０１０３】
「Ｅｕナンバリング」という表現は、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、公衆衛生局、国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２、６６２、６８０、６８９頁（１９９１）のＥｕインデックスを指す。「ＫａｂａｔのＥｕインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  Ｅｕ抗体の残基のナンバリングを指す（Ｅｄｅｌｍａｎ、Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６３、７８〜８５（１９６９））。
【０１０４】
重鎖４０、４１、および８９位は抗体の可変領域に位置し、１５２、１５３、１５５、１７１、２４７、２９７、３３９、３７５、および３７６位は定常領域に位置する。軽鎖４０および４１位は抗体の可変領域に位置し、１６５および１６８位は定常領域に位置する。
【０１０５】
重鎖４０、４１、８９、１５２、１５３、１５５、および１７１位、ならびに軽鎖４０、４１、１６５、および１６８位は抗体のＦａｂ部分に位置し、重鎖２４７、２９７、３３９、３７５、および３７６位はＦｃ部分に位置する。
【０１０６】
驚くべきことに、本発明者らは、部位特異的にコンジュゲートされた本発明のＡＤＣは、抗体の天然の（すなわち内在性）鎖間ジスルフィド結合システインを通して線状リンカー−薬物がコンジュゲートされている従来のＡＤＣと比較して、向上した物理化学的、薬理学的、および／または薬物速度論的特性を示すことを見出した。
【０１０７】
ヒト化以外の抗体の可変ドメインの修飾は一般に、抗原結合特性の部分的または完全な喪失につながるおそれがあるために回避される。しかし、抗体の重鎖および軽鎖のフレームワーク領域中の特定のアミノ酸残基は、システインと交換されたときに、コンジュゲーションに適しているだけでなく、リンカー−薬物のコンジュゲーション後に抗原結合の（有意な）低減をもたらさない。その上、Ｆａｂ部分中のこれらの位置へのコンジュゲーションは、完全にインタクトな抗体の代わりに抗原結合断片の使用も可能にする。腫瘍微小環境内の腫瘍関連プロテアーゼはヒンジ領域の下のＦｃ定常ドメインを部分的に開裂することがあるので、Ｆａｂ部分でのコンジュゲーションはＦｃ部分でのコンジュゲーションより好ましい。Ｆｃ定常ドメインのこのように開裂は、Ｆｃでコンジュゲートされているリンカー−薬物の喪失をもたらすであろう。何故なら、これらは癌細胞によって内部に取り込まれず、ひいてはｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＤＣの活性の減少をもたらしうるからである。（Ｆａｎら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２；１４：Ｒ１１６、およびＢｒｅｚｓｋｙら、ＰＮＡＳ  ２００９；１０６：１７８６４〜１７８６９）。
【０１０８】
したがって、好ましい態様では、本発明は、リンカー−薬物が抗体に、重鎖４０、４１、および８９位ならびに軽鎖４０および４１位から選択される前記抗体の１つ以上の位置で改変システインを通して部位特異的にコンジュゲートされている、ＡＤＣに関する。
【０１０９】
より好ましい態様では、本発明は、リンカー−薬物が抗体に、重鎖４１位ならびに軽鎖４０および４１位から選択される前記抗体の１つ以上の位置で改変システインを通して部位特異的にコンジュゲートされている、ＡＤＣに関する。
【０１１０】
特に好ましい態様では、本発明は、リンカー−薬物が抗体に、重鎖４１位で改変システインを通して部位特異的にコンジュゲートされている、ＡＤＣに関する。
【０１１１】
代表的な一例として、本発明に従って使用すべき抗体は、ＷＯ２０１５／１７７３６０にＳＹＤ１０３０として開示されている、改変システインを重鎖４１位に有する抗ＰＳＭＡ抗体（すなわち、ＰＳＭＡ−ＨＣ４１）である（重鎖が配列番号２のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号５のアミノ酸配列を含む）。
【０１１２】
別の代表的な例として、本発明に従って使用すべき抗体は、ＷＯ２０１５／１７７３６０にＨ８−ＨＣ４１として開示される、改変システインを重鎖４１位に有する抗５Ｔ４抗原抗体である（重鎖が配列番号８のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号１１のアミノ酸を含む）。
【０１１３】
本発明に従ったＡＤＣは、当業者に周知の方法および手順によって得ることができる。
【０１１４】
デュオカルマイシンリンカー−薬物の非部位特異的（野生型）コンジュゲーション、すなわち、内在性鎖間ジスルフィド結合システインへのコンジュゲーションに好適な方法は、ＷＯ２０１１／１３３０３９の例１５に開示されている。
【０１１５】
ＣＢＩ二量体リンカー−薬物の非部位特異的（野生型）コンジュゲーションに好適な方法はＷＯ２０１５／１１０９３５に開示されている。
【０１１６】
本発明に従ったＡＤＣは、ネイキッド抗体と同様の結合親和性、優れたｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性、および良好なｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を有する。特に、該ＡＤＣは一般に、先行技術から公知の線状リンカー−薬物ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡにコンジュゲートされているＡＤＣよりも、より疎水性でなく、カテプシンＢの開裂を受けにくく、したがって腫瘍塊（腫瘍微小環境）内の他の細胞内または細胞外の酵素／プロテアーゼの開裂も受けにくいが、それでも同様のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示すことが見出された。
【０１１７】
予想外なことに、本発明に従ったＡＤＣは、線状リンカー−薬物ｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡにコンジュゲートされたＡＤＣと比較して向上したｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を腫瘍異種移植動物モデルにおいて示す。
【０１１８】
特定の態様では、本発明は式（ＩＩ）のＡＤＣに関する。
【化２０】
2019537622.tif 000026
ここで、「抗体」は、ここに開示した少なくとも１つの改変システインを有するかまたは有していない、抗体またはその抗原結合断片であり；
ｎは０、１、２、または３であり；
ｙは１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜３、最も好ましくは１．５〜２の平均ＤＡＲを表し；
Ｖ１およびＺは、先の態様で定義した通りである。
【０１１９】
好ましい態様では、本発明は式（ＩＩＩ）のＡＤＣに関する。
【化２１】
2019537622.tif 000027
ここで、「抗体」は、ここに開示した少なくとも１つの改変システインを有するかまたは有していない、抗体またはその抗原結合断片であり；
ｎは０、１、２、または３であり；
ｙは１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜３、最も好ましくは１．５〜２の平均ＤＡＲを表し；
Ｒは下記から選択される。
【化２２】
2019537622.tif 000028
【０１２０】
特に好ましい態様では、本発明は、重鎖４０および４１位ならびに軽鎖４０および４１位から選択される１つ以上の位置に改変システインを有する抗体を含む、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のＡＤＣに関する。好ましくは、前記改変システインは、重鎖４１位または軽鎖４０もしくは４１位にあり、より好ましくは重鎖４１位にある。
【０１２１】
本発明はさらに、先に記載した通りのリンカー−薬物またはＡＤＣと１種以上の医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。治療用タンパク質たとえばモノクローナル抗体および（モノクローナル）抗体−薬物コンジュゲートの典型的な医薬製剤は、静脈内注入前に（水）溶解（すなわち再構成）を要する凍結乾燥ケーキ（凍結乾燥粉末）、または使用前に解凍を要する凍結（水）溶液の形態を取る。
【０１２２】
典型的には、本発明による医薬組成物は凍結乾燥ケーキの形態で提供される。医薬組成物中に（フリーズドライ前に）含めるのに好適な医薬的に許容される賦形剤は下記のものを含む。緩衝液（たとえばクエン酸塩、ヒスチジン、またはコハク酸塩を含有する水中塩）、リオプロテクタント（たとえばスクロース、トレハロース）、等張化剤（たとえば塩化ナトリウム）、界面活性剤（たとえばポリソルベート）、および増量剤（たとえばマンニトール、グリシン）が挙げられる。フリーズドライしたタンパク質製剤用の賦形剤は、フリーズドライプロセスの間ならびに保管中のタンパク質変性を防止するその能力に関して選択される。一例として、滅菌、凍結乾燥粉末の単回使用製剤であるＫａｄｃｙｌａ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）は、静菌注射用水または滅菌注射用水（ＢＷＦＩまたはＳＷＦＩ）で再構成したときに、２０ｍｇ／ｍＬのａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート２０、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、および６％ｗ／ｖのスクロースを含有し、ｐＨは５．０である。
【０１２３】
本発明はさらに、医薬品として使用するための、先に記載した通りのリンカー−薬物、ＡＤＣ、または医薬組成物に関する。
【０１２４】
一態様では、本発明は、ヒトの固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療に使用するための、先に記載した通りのリンカー−薬物、ＡＤＣ、または医薬組成物に関する。
【０１２５】
第１の好ましい態様では、本発明は、乳癌、脳癌（たとえば神経膠芽細胞腫）、頭頸部癌、甲状腺癌、副腎癌、骨癌、眼癌、食道癌、胃癌、小腸癌、結腸直腸癌、尿路上皮癌（たとえば、膀胱癌または腎癌）、卵巣癌、子宮癌、膣癌および子宮頚癌、肺癌（とりわけ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ））、中皮腫（とりわけ悪性胸膜中皮腫）、肝臓癌、膵癌、皮膚癌、精巣癌、ならびに前立腺癌からなる群より選択されるヒトの固形腫瘍の治療に使用するための、先に記載した通りのリンカー−薬物、ＡＤＣ、または医薬組成物に関する。
【０１２６】
第２の好ましい態様では、本発明は、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、尿路上皮癌（たとえば膀胱癌）、卵巣癌、子宮癌、肺癌（とりわけ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ））、中皮腫（とりわけ悪性胸膜中皮腫）、肝臓癌、膵癌、ならびに前立腺癌からなる群より選択されるヒトの固形腫瘍の治療に使用するための、先に記載した通りのリンカー−薬物、ＡＤＣ、または医薬組成物に関する。
【０１２７】
第３の好ましい態様では、本発明は、ヒトの血液悪性腫瘍、詳細には白血病、より詳細には急性リンパ芽球性白血病および骨髄性白血病（それぞれＡＬＬおよびＡＭＬ）からなる群より選択される白血病の治療に使用するための、先に記載した通りのリンカー−薬物化合物、ＡＤＣ、または医薬組成物に関する。
【０１２８】
本発明はさらに、先に記載した通りのヒトの固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療のための、逐次または同時に投与される、先に記載した通りのリンカー−薬物化合物、ＡＤＣ、または医薬組成物と１つ以上の他の治療薬、たとえば、さらなる癌関連標的に対する治療抗体、化学療法薬、および／またはＡＤＣとの組み合わせの使用に関する。
【０１２９】
本発明の一態様では、該治療抗体は、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アマツキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、ゲムツズマブ、ラベツズマブ、マパツムマブ、ミンレツモマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、シブロツズマブ、トラスツズマブ、またはボロシキシマブであり、該化学療法薬は、ｉ）アルキル化剤、特に、ナイトロジェンマスタード、たとえば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、およびメルファラン；ニトロソ尿素、たとえば、ストレプトゾシン、カルムスチン、およびロムスチン；スルホン酸アルキル、たとえばブスルファン；トリアジン、たとえば、ダカルバジン、およびテモゾロミド；エチレンイミン、たとえば、チオテパ、およびアルトレタミン；またはプラチナ薬、たとえば、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチン；ｉｉ）代謝拮抗物質、特に、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、またはペメトレキセド；ｉｉｉ）抗腫瘍抗生物質、特に、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシン−Ｃ、またはミトキサントロン；ｉｖ）トポイソメラーゼ阻害剤、特に、トポイソメラーゼＩ阻害剤、たとえば、トポテカン、およびイリノテカン；またはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、たとえば、エトポシド、テニポシド、およびミトキサントロン；ｖ）分裂阻害剤、特に、タキサン、たとえば、パクリタキセル、カバジタキセル、およびドセタキセル；エポシロン、たとえばイクサベピロン；ビンカアルカロイド、たとえば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン；またはエストラムスチン；ｖｉ）シグナル伝達カスケード阻害剤、特に、ｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的）阻害剤、たとえば、テムシロリムス、およびエベロリムス；またはチロシンキナーゼ阻害剤、たとえば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、パゾパニブ、セリチニブ、クリゾチニブ、ラパチニブ、およびアファチニブ；ｖｉｉ）副腎皮質ステロイド、特に、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、またはデキサメタゾン；ｖｉｉｉ）ホルモン治療薬、特に、アンドロゲン受容体調節剤、たとえば、ビカルタミド、エンザルタミド、およびアビラテロン酢酸エステル；抗エストロゲン、たとえば、タモキシフェン；またはアロマターゼ阻害剤もしくはステロイド修飾剤、たとえば、アナストロゾール、レトロゾール、フルベストラント、およびエキセメスタン；ｉｘ）ＰＡＲＰ阻害剤、特に、オラパリブ；あるいはｘ）別の化学療法薬、特に、Ｌ−アスパラギナーゼ、またはボルテゾミブである。当業者であれば、先に記載した通りのヒトの固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療に使用するための適切な併用療法を選択することに困難を伴うことはないであろう。
【０１３０】
本発明によるＡＤＣの治療的有効量は、約０．０１〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内、特に約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内、より特に約０．３〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。この後者の範囲は２０〜８００ｍｇの範囲内の固定用量のリンカー−薬物またはＡＤＣにおおよそ体相当する。本発明の化合物は１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１か月に１回、または６週間に１回投与してもよい。適切な治療レジメンは疾患の重症度、患者の年齢、投与されている化合物、および治療する医師によって考慮されるような他の要因に依存する。
【実施例】
【０１３１】
材料および方法
システインを改変した抗体をＷＯ２０１５／１７７３６０に記載される材料および手順を使用して得た。試薬および緩衝液を商業サプライヤから調達した。
【０１３２】
ＨＩＣ  −分析ＨＩＣについては、５〜１０μＬの試料（１ｍｇ／ｍｌ）をＴＳＫｇｅｌ  Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム（内径４．６ｍｍ×長さ３．５ｃｍ、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４９４７）上に注入した。溶出方法は、１００％緩衝液Ａ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．９５）から１００％緩衝液Ｂ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９５、２０％イソプロパノール）への線形グラジエント、０．４ｍＬ／分、２０分間とした。カラム温度は２５℃に維持した。ＰＤＡ検出器およびＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアを備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システムを使用した。吸光度を２１４ｎｍで測定して、様々なＡＤＣの平均ＤＡＲを定量化し、相対的疎水性を決定した。
【０１３３】
ＳＥＣ  −分析ＳＥＣについては、５μＬの試料（１ｍｇ／ｍｌ）を、ＴＳＫｇｅｌ  ＳＷＸＬガードカラム（７μｍ、内径６．０ｍｍ×長さ４．０ｃｍ、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号０８５４３）を備えたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（５μｍ、内径７．８ｍｍ×長さ３０ｃｍ、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号０８５４１）上に注入した。溶出方法は、１００％の５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５での溶出、０．６ｍＬ／分、３０分間とした。カラム温度は２５℃に維持した。ＰＤＡ検出器およびＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアを備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣシステムを使用した。吸光度を２１４ｎｍで測定して、ＨＭＷ種の量を定量化した。
【０１３４】
ＳＨＰＣ  −試料を、７０μｌのＡＤＣ溶液を３０μｌのＤＭＡと混合することによって調製した。ＰＤＡ検出器およびＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアを備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣシステム内に装着したシールド型疎水性相カラム（ＳＵＰＥＬＣＯＳＩＬ  ＬＣ−ＨＩＳＥＰ  ５μｍ、内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ、Ｓｕｐｅｌｃｏ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、カタログ番号５８９３５）上に５０μｌの試料を注入した。溶出方法は、９０％緩衝液Ａ（１００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．０）および１０％緩衝液Ｂ（アセトニトリル）から３２％緩衝液Ａおよび６８％緩衝液Ｂへの線形グラジエント、１．０ｍＬ／分、１０分間とした。カラム温度を４５℃に維持した。吸光度を３２５ｎｍで測定して、遊離のリンカー−薬物の量を定量化した。
【０１３５】
エキソリンカー−薬物の合成
使用した溶媒は試薬等級またはＨＰＬＣ等級であった。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ４００（１Ｈについては４００ＭＨｚ；１３Ｃについては１００ＭＨｚ）で記録した。化学シフトは、内部標準としてのテトラメチルシランに対するｐｐｍで示す。
【０１３６】
粗リンカー−薬物を、このリンカー−薬物をＤＭＡに溶解し、その溶液をＷａｔｅｒｓ  ＳｕｎＦｉｒｅ（商標）Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤ（商標）カラム（粒子径５μｍ、５０×１５０ｍｍ）に入れ、続いて２０％緩衝液Ａから７０％緩衝液Ａへの線形グラジエントを使用して１１７ｍｌ／分の流量での溶出によって精製した。緩衝液Ａはアセトニトリルである。緩衝液Ｂは水中０．１％ＴＦＡ（ｍ／ｍ）である。純度を、０．４ｍｌ／分の流量でＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（Ｃ）ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（粒子径１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）を使用してＵＰＬＣによって評価した。
【０１３７】
一般に、リンカー−薬物の合成は化合物１１および環化モジュールから開始する。その合成は、Ｅｌｇｅｒｓｍａら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２０１５；１２：１８１３〜１８３５およびＷＯ２０１１／１３３０３９に記載されている。
【０１３８】
【化２３】
2019537622.tif 000029
【０１３９】
化合物の合成
【化２４】
2019537622.tif 000030
【０１４０】
保護されたマレイミドである化合物７５を、Ｅｌｄｕｑｕｅら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１３；２４：８３２〜８３９に記載される通りに合成した。ＮＭＲスペクトルはこの参考文献におけるスペクトルと同一であった。
【０１４１】
Ｂｏｃ−Ｍｏｍで保護された薬物−ＣＳ（１１）（１．０ｇ、１．１６ｍｍｏｌ、１当量）および保護されたマレイミド７５（０．３４ｇ、１．７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解させ、続いて減圧濃縮し、減圧乾燥させた。固体残留物を乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）に窒素雰囲気下で再溶解させ、トリフェニルホスフィン（０．４６ｇ、１．７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、得られた混合物を氷浴上で冷却した。次に、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）（０．３５ｇ、１．７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を混合物に滴加し、徐々に室温（ＲＴ）に戻し、室温で３０分間撹拌を続けた。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９５：５、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、減圧乾燥させて、化合物１２（１．０６ｍｍｏｌ、９１％）を白色の泡状物として得た。
【０１４２】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.30-1.44 (9H, m, CH3, Boc), 1.53 (3H, s, CCH3), 1.56 (3H, s, CCH3), 2.78-2.94 (8H, m, ArCH3, NCH3, 2 x CHexo), 3.35-3.74 (13H, m, CHCl, 4 x NCH2, 2 x OCH2), 3.41 (3H, s, OCH3) 3.79-3.84 (1H, m, CHCl), 4.45 (1H, t, H1), 4.62-4.67 (1H, m, H2), 5.16-5.21 (1H, m, H2), 5.30 (2H, s, OCH2O), 6.35 (2H, d, HC=CH), 7.17 (2H, d, H3''), 7.31-7.37 (1H, m, H7), 7.39-7.40 (1H, m, H8), 7.57-7.59 (1H, m, H8'), 7.71-7.82 (2H, m, H6, H7'), 7.99 (2H, d, H2''), 8.35 (1H, br s, H4), 8.68 (1H, s, H3'), 9.46 (1H, s, H5'), 10.30 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 15.6, 15.7 (CCH3), 22.4 (Ar-CH3), 28.0, 28.1 (CH3, Boc), 34.1, 34.6 (NCH3), 37.5, 37.6 ((C=O)2NCH2CH2), 44.2 (C1), 45.1, 45.5, 45.9, 46.3, 47.0 (NCH2), 47.4 (CH2Cl), 52.1 (CHexo), 54.5 (C2), 55.8 (OCH3), 66.6, 68.0, 68.3 (OCH2), 78.6, 78.6 (CBoc), 86.9 (Cexo), 93.7 (OCH2O), 110.6, 110.6 (C4), 115.6 (C3''), 117.3 (C5'), 117.5 (C7'), 119.0 (C3'), 120.7 (C6), 122.3 (C9b), 123.1 (C8'), 124.6 (C7), 125.8 (C5a), 127.3 (C6'), 127.4 (C1''), 129.6 (C2''), 129.7 (C9a), 130.5 (C8), 132.9, 132.9 (C9), 140.5 (C8a'), 140.6 (C=Cexo), 141.4 (C2'), 141.9 (C3a), 148.0, 148.1 (Ar-OC(O)N), 153.7 (C=OBoc), 154.7, 155.0 (C5), 159.6 (C4''), 161.9 (NC=O), 165.1 (Ar-NHC(O)-Ar), 174.7, 174.7 (C=Oexo)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1034.41 [M+H]+, 実測値: 1034.84 [M+H]+。
【０１４３】
【化２５】
2019537622.tif 000031
【０１４４】
化合物１３（２．０１ｇ、９．６５ｍｍｏｌ、１当量）のＴＨＦ（２５ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、その後クロロギ酸４−ニトロフェニル（２．１４ｇ、１０．６２ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＥｔ３Ｎ（２．６９ｍｌ、１９．３０ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、得られた混合物を室温に戻しながら２時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ、１：０から１：１、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、中間体１４（２．５ｇ、６．７０ｍｍｏｌ、６９％）を黄色の油状物として得た。ＤＭＦ（２０ｍｌ）中の化合物１４（１．３４ｇ、３．５８ｍｍｏｌ、１．０５当量）およびＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢＡ  １５（ＵＳ２０１４／０３６３４５４（Ｉｇｅｎｉｃａ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に記載される通りに合成したもの、１．０ｇ、３．４１ｍｍｏｌ、１当量）を氷浴中で０℃に冷却し、この溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１．４９ｍｌ、８．５２ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加し、混合物を室温まで徐々に戻しながら１８時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９：１、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物１６（１．４ｇ、２．６５ｍｍｏｌ、７８％）を白色の固体として得た。
【０１４５】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.89 (3H, d, CH3,Val), 0.91 (3H, d, CH3,Val), 1.34 (3H, d, CH3,Ala), 1.98-2.03 (1H, m, , β-HVal), 3.25 (3H, s, OCH3), 3.41-3.62 (14H, m, O-CH2), 3.92 (1H, t, α-HVal), 4.08-4.12 (2H, m, CH2OC(O)NH), 4.44-4.49 (3H, m, Ar-CH2, α-HAla), 5.10-5.14 (1H, m, -OH), 7.12-7.30 (3H, m, H3, NHVal), 7.57 (2H, d, H2), 8.14 (1H, d, NHAla), 9.91 (1H, s, NHPABA)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 18.1 (CH3,Val), 18.2 (CH3,Ala), 19.2 (CH3,Val), 30.4 (β-CHVal), 49.0 (α-CHAla), 58.1 (OCH3), 60.1 (α-CHVal), 62.7 (Ar-CH2), 63.6 (CH2OC(O)NH), 68.9 (OCH2), 69.7 (OCH2), 69.9 (OCH2), 69.9 (OCH2), 71.4 (OCH2), 119.0 (C2), 127.0 (C3), 137.5 (C4), 137.6 (C1), 156.4 (OC(O)NH) 171.0 (C=OAla), 171.1 (C=OVal)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 528.62 [M+H]+, 実測値: 510.47 (-H2O) [M+H]+。
【０１４６】
化合物１６（１．３ｇ、２．４６ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（２０ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（１．５０ｇ、４．９３ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＰＥＡ（０．６５ｍｌ、３．７０ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。混合物を室温まで徐々に戻しながら３時間撹拌した。粗混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９：１、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物１７（１．７ｇ、２．４５ｍｍｏｌ、定量的収率）を白色の固体として得た。
【０１４７】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ =0.87 (3H, d, CH3,Val), 0.92 (3H, d, CH3,Val), 1.35 (3H, d, CH3,Ala), 1.99-2.04 (1H, m, , β-HVal), 3.26 (3H, s, OCH3), 3.36-3.62 (14H, m, O-CH2), 3.92 (1H, t, α-CHVal), 4.08-4.12 (2H, m, CH2OC(O)NH), 4.47 (1H, m, α-CHAla), 5.27 (2H, s, Ar-CH2), 7.16-7.30 (1H, m, NHVal), 7.44 (2H, d, H3), 7.59 (2H, d, H6), 7.68 (2H, d, H2), 8.19 (1H, d, NHAla), 8.33 (2H, d, H7), 10.09 (1H, s, NHPABA)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 18.0 (CH3,Val), 18.1 (CH3,Ala), 19.2 (CH3,Val), 30.4 (β-CHVal), 49.1 (α-CHAla), 58.0 (OCH3), 60.0 (α-CHVal), 63.5 (CH2OC(O)NH), 68.8 (OCH2), 69.6 (OCH2), 69.8 (OCH2), 69.8 (OCH2), 70.3 (Ar-CH2), 71.3 (OCH2), 119.1 (C2), 122.6 (C6), 125.4 (C7), 129.3 (C4), 129.5 (C3), 139.5 (C1), 145.2 (C5), 152.0 (OC(O)O), 155.3 (C8), 156.3 (OC(O)NH) 171.1 (C=OVal), 171.3 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 693.73 [M+H]+, 実測値: 693.63 [M+H]+。
【０１４８】
【化２６】
2019537622.tif 000032
【０１４９】
Ｈ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢＡ  １５（ＵＳ２０１４／０３６３４５４（Ｉｇｅｎｉｃａ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に記載される通りに合成したもの）、１．４ｇ、４．７７ｍｍｏｌ、１当量）のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）（１００ｍｌ）溶液に、引き続きＮ−メチルモルホリン（１．０５ｍｌ、９．５４ｍｍｏｌ、２当量）、ホルムアルデヒド（３．５５ｍｌ、４７．７ｍｍｏｌ、１０当量）、およびＮａＣＮＢＨ３（０．９ｇ、１４．３２ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、続いて酢酸（０．５５ｍｌ、９．５４ｍｍｏｌ、２当量）を滴加した。得られた混合物を３０分間撹拌した。次いで、粗混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物１８（１．５５ｇ、定量的収率）を白色のろう状固体として得た。
【０１５０】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.84 (3H, d, CH3,Val), 0.97 (3H, s, CH3,Val), 1.35 (3H, d, CH3,Ala), 1.98-2.11 (1H, m, β-HVal), 2.39 (6H, br s, N(CH3)2), 3.20-3.60 (α-CHVal), 4.45 (2H, ArCH2), 4.46-4.55 (1H, m, α-CHAla), 5.12 (1H, s, OH), 7.26 (2H, d, H3), 7.56 (2H, d, H2), 8.29 (1H, br s, NHAla), 10.01 (1H, s, NHPABA)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 322.21 [M+H]+, 実測値: 322.16 [M+H]+。
【０１５１】
化合物１８（１．５３ｇ、４．７７ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（２０ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（２．９０ｇ、９．５４ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＰＥＡ（１．２５ｍｌ、７．１６ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。得られた混合物を室温まで徐々に戻しながら３時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から８：２、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物１９（２．２ｇ、４．５２ｍｍｏｌ、９５％）を黄色のろう状固体として得た。
【０１５２】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.81 (3H, d, CH3,Val), 0.91 (3H, d, CH3,Val), 1.34 (3H, d, CH3,Ala), 1.93-2.01 (1H, m, β-HVal), 2.29 (6H, br s, N(CH3)2), 3.20-3.60 (α-CHVal), 4.50 (1H, m, α-CHAla), 5.24 (2H, s, ArCH2), 7.42 (2H, d, H3), 7.56 (2H, d, H2'), 7.64 (2H, d, H2), 8.24 (1H, br s, NHAla), 8.30 (2H, d, H3'), 10.14 (1H, s, NHPABA)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 18.8 (CH3,Ala), 20.0 (CH3,Val), 27.1 (β-CHVal), 41.8 (N(CH3)2), 49.3 (α-CHAla), 70.7 (Ar-CH2), 73.1 (α-CHVal), 119.5 (C2), 122.9, 123.0 (C2'), 125.8 (C3'), 129.7 (C4), 130.0 (C3), 139.9 (C1), 145.6 (C1'), 152.4 (OC(O)O) , 155.8 (C4'), 162.8 (C=OVal), 171.8 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 487.22 [M+H]+, 実測値: 487.60 [M+H]+。
【０１５３】
【化２７】
2019537622.tif 000033
【０１５４】
Ｈ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＰＡＢＡ  ２０（ＷＯ２０１３／６７５９７、８０〜８２頁（Ａｓｃｅｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に記載される通りに合成したもの、１．２６ｇ、２．８０ｍｍｏｌ、１当量）のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）（５０ｍｌ）溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（０．６２ｍｌ、５．５９ｍｍｏｌ、２当量）、ホルムアルデヒド（２．０８ｍｌ、２８．０ｍｍｏｌ、１０当量）、およびＮａＣＮＢＨ３（０．５３ｇ、８．３９ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、続いて酢酸（０．３２ｍｌ、５．５９ｍｍｏｌ、２当量）を滴加した。混合物を３０分間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３  ｖ／ｖ）によって精製して、化合物２１（１．１３ｇ、２．３６ｍｍｏｌ、８４％）を白色のろう状固体として得た。
【０１５５】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.80 (3H, d, CH3,Val), 0.91 (3H, d, CH3,Val), 1.22-1.53 (13H, m, CH3,Boc 2 x CH2,Lys), 1.62-1.73 (2H, m, CH2,Lys), 1.84-1.96 (1H, m, β-CHVal), 2.26 (6H, br s, 2 x NCH3), 2.52 (1H, s, α-CHVal), 3.41 (2H, t, CH2,Lys), 4.45 (3H, s, Ar-CH2, α-CHLys), 6.77 (1H, br s, ε-NHLys), 7.25 (2H, d, H3), 7.54 (2H, d, H2), 8.09 (1H, br s, NHLys), 10.00 (1H, s, NHPABA), 11.99 (1H, br s, OH)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 20.0 (CH3,Val), 23.4 (CH2,Lys), 27.2 (β-CHVal), 28.7 (CH3, Boc), 29.6 (CH2,Lys), 32.0 (CH2,Lys), 39.8 (CH2,Lys), 41.8 (NCH3), 53.5 (α-CHLys), 63.0 (Ar-CH2), 73.4 (α-CHVal), 77.8 (CBoc), 119.3 (C2), 127.4 (C3), 137.8 (C4), 138.1 (C1), 156.0 (C=OBoc), 171.2 (C=OVal, C=OLys)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 479.32 [M+H]+, 実測値: 479.67 [M+H]+。
【０１５６】
化合物２１（１．０６ｇ、２．２２ｍｍｏｌ、１当量）のＤＣＭ（２０ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＴＦＡ（１５ｍｌ）を添加し、３０分間撹拌し、次いでＤＣＭで希釈し、減圧濃縮し、ＤＣＭと共蒸発させた（２回）。得られたＴＦＡ塩をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解させ、マレイミド−カルバメート２２（０．３４ｇ、２．２２ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、続いてＥｔ３Ｎ（１．２４ｍｌ、８．８６ｍｍｏｌ、４当量）を添加した。反応混合物を５０℃で４８時間撹拌し、その後追加の０．５当量のＥｔ３Ｎを添加し、さらに２４時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３  ｖ／ｖ）によって精製して、化合物２３を得て、それを次のステップにすぐに使用した。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 459.26 [M+H]+, 実測値: 459.53 [M+H]+。
【０１５７】
化合物２３（１．０ｇ、２．１８ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（１．３３ｇ、４．３６ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＰＥＡ（０．５７ｍｌ、３．２７ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、得られた混合物を氷浴中０℃で３時間撹拌した。次いで、混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から８：２  ｖ／ｖ）によって精製して、化合物２４（０．５５ｇ、０．８８ｍｍｏｌ、４０％）をオフホワイトの固体として得た。
【０１５８】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.77 (3H, d, CH3,Val), 0.88 (3H, d, CH3,Val), 1.20-1.42 (2H, m, CH2,Lys), 1.44-1.76 (4H, m, 2 x CH2,Lys), 1.84-1.96 (1H, m, β-CHVal), 2.18 (6H, br s, 2 x NCH3), 2.60 (1H, d, α-CHVal), 3.41 (2H, t, CH2,Lys), 4.39 (1H, m, α-CHLys), 5.25 (2H, s, Ar-CH2), 7.00 (2H, s, HC=CH), 7.42 (2H, d, H3), 7.57 (2H, d, H6), 7.62 (2H, d, H2), 8.04 (1H, d, NHLys), 8.32 (2H, d, H7), 10.12 (1H, s, NHPABA)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 19.4, 19.5 (CH3,Val), 23.0 (CH2,Lys), 26.7 (β-CHVal), 27.6 (CH2,Lys), 31.1 (CH2,Lys), 37.0 (CH2,Lys), 41.3 (NCH3), 52.8 (α-CHLys), 70.2 (Ar-CH2), 72.9 (α-CHVal), 119.0 (C2), 122.6 (C6), 125.4 (C7), 129.2 (C4), 129.5 (C3), 134.4 (HC=CH) 139.4 (C1), 145.2 (C5), 151.9 (OC(O)O) , 155.3 (C8), 170.1 (C=OVal), 171.0 (C=Omaleimide), 171.1 (C=OLys)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 624.27 [M+H]+, 実測値: 624.61 [M+H]+。
【０１５９】
【化２８】
2019537622.tif 000034
【０１６０】
エタン−１，２−ジアミン２６（２．１５ｍｌ、３２．１ｍｍｏｌ、４当量）、ヨウ化カリウム（１．３３ｇ、８．０３ｍｍｏｌ、１当量）、および炭酸カリウム（２．２２ｇ、１６．０６ｍｍｏｌ、２当量）のＭｅＣＮ（２５ｍｌ）中の混合物に、２−（２−クロロエトキシ）エタノール２５（０．８５ｍｌ、８．０３ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を滴加した。得られた混合物を６０℃で２日間撹拌した。次に、粗混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃに溶解させ、１０分間撹拌した。懸濁液をろ過し、ろ液を減圧濃縮して、化合物２７、２−（２−（２−アミノエチルアミノ）エトキシ）エタノール（７５０ｍｇ、５．０６ｍｍｏｌ、６３％）を無色の油状物として得た。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 149.13 [M+H]+, 実測値: 149.23 [M+H]+。
【０１６１】
冷却した（０℃）、２，２，２−トリフルオロアセテート（６０２μｌ、５．０６ｍｍｏｌ、１当量）のＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液に、２−（２−（２−アミノエチルアミノ）エトキシ）エタノール２７（７５０ｍｇ、５．０６ｍｍｏｌ、１当量）のＴＨＦ（５ｍｌ）溶液を滴加し、混合物を４５分間撹拌した。次いでＴＨＦ（５ｍｌ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１．３３ｇ、６．０７ｍｍｏｌ、１．２当量）を滴加し、続いてＥｔ３Ｎ（８４６μｌ、６．０７ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加し、１時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ、１：０から１：１、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物２８（９８０ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ、５６％）を黄色の油状物として得た。
【０１６２】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.38 (9H, s, CH3,Boc), 3.25-3.36 (6H, m, CH2NBoc, CH2N), 3.39-3.43 (2H, m, CH2O), 3.46-3.52 (4H, m, CH2OH, CH2O ), 4.62 (1H, t, OH)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 28.2, 28.4 (CH3,Boc), 38.2, 38.4 (CH2NH), 46.2, 46.5, 46.8, 47.2 (CH2NBoc), 60.6 (CH2OH), 68.8, 69.2 (NCH2CH2O), 72.6 (CH2O), 79.3 (CBoc), 112.1, 114.9, 117.8, 120.7 (CF3), 155.0, 155.3 (C=OBoc), 156.3, 156.7, 157.0, 157.4 (C=O)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 367.15 [M+Na]+, 実測値: 245.18 [M-Boc]+, 367.29 [M+Na]+。
【０１６３】
化合物２８（９００ｍｇ、２．６１ｍｍｏｌ、１当量）のＭｅＯＨ（１０ｍｌ）溶液にＮａＯＨ（１５７ｍｇ、３．９２ｍｍｏｌ、１．５当量、水（５ｍｌ）に溶解させたもの）を添加し、混合物を室温で４時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、ＤＣＭおよび水（ＮａＣｌで飽和させたもの）を添加した。ＤＣＭ層をＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮して、化合物２９（６６０ｍｇ、１００％）を黄色の油状物として得た。
【０１６４】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.39 (9H, s, CH3,Boc), 2.64 (2H, t, CH2NH2), 3.10 (3H, br s, NH2, OH) 3.12-3.19 (2H, m, CH2NBoc), 3.27-3.33 (2H, m, CH2NBoc), 3.39-3.44 (2H, m, CH2O), 3.45-3.51 (4H, m, CH2OH, CH2O)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 28.5 (CH3,Boc), 40.9 (CH2NH2), 47.3, 47.4 (CH2NBoc), 50.6, 51.1 (CH2NBoc), 60.7 (CH2OH), 68.9, 69.3 (NCH2CH2O), 72.6 (CH2O), 78.9 (CBoc), 155.2 (C=OBoc)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 249.18 [M+H]+, 実測値: 249.30 [M+H]+。
【０１６５】
化合物２９（６５０ｍｇ、２．６２ｍｍｏｌ、１当量）およびＮａＨＣＯ３（４４０ｍｇ、５．２４ｍｍｏｌ、２当量）の水（６ｍｌ）溶液に、ＴＨＦ（６ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＳｕ（１．１８ｇ、２．８８ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。次いでＴＨＦを蒸発させ、水を添加し、ＥｔＯＡｃで抽出した（２回）。合わせた有機層をブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９：１、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物３０（１．２ｇ、２．２２ｍｍｏｌ、８５％）を白色の固体として得た。
【０１６６】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.21 (3H, d, CH3,Ala), 1.39 (9H, s, CH3,Boc), 3.11-3.52 (12H, m, CH2NH, CH2NBoc, CH2O, CH2OH), 3.94-4.06 (1H, m, α-CHAla), 4.18-4.30 (3H, m, CHFmoc, CH2,Fmoc), 4.60 (1H, t, OH), 7.31-7.36 (2H, m, CHAr), 7.39-7.50 (3H, m, CHAr, NHAla), 7.71-7.76 (2H, m, CHAr), 7.86-7.95 (3H, m, CHAr, NH)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 18.7 (CH3,Ala), 28.5 (CH3,Boc), 37.7, 38.0 (CH2NH), 47.1 (CHFmoc), 47.3, 47.5 (CH2NBoc), 50.6 (α-CHAla), 60.7 (CH2OH), 66.1 (CH2,Fmoc), 68.8, 69.2 (NCH2CH2O), 72.6 (CH2O), 79.1 (CBoc), 120.6 (CHAr), 125.8 (CHAr),127.5 (CHAr), 128.1 (CHAr), 141.2 (CAr), 144.3, 144.4 (CAr), 155.1, 155.2 (C=OBoc), 156.1 (C=OFmoc), 173.0 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 564.27 [M+Na]+, 実測値: 442.47 [M-Boc]+, 564.55 [M+Na]+。
【０１６７】
化合物３０（１．２ｇ、２．１６ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液にピペリジン（４．４ｍｌ、４４．３ｍｍｏｌ、２０当量）を添加し、９０分間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、水（１２ｍｌ）に再溶解させ、エーテルで２回抽出した。次いでＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ（０．９４ｇ、２．１６ｍｍｏｌ、１当量）のＴＨＦ（１６ｍｌ）溶液を水層に添加し、続いて炭酸水素ナトリウム（０．２ｇ、２．３８ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、得られた混合物を室温で４時間撹拌した。次に、ＴＨＦを蒸発させ、水を添加し、ＥｔＯＡｃで２回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９：１、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物３１（１．４ｇ、２．１９ｍｍｏｌ、定量的収率）を白色の泡状物として得た。
【０１６８】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.83-0.89 (6H, m, CH3,Val), 1.21 (3H, d, CH3,Ala), 1.39 (9H, s, CH3,Boc), 1.95-2.03 (1H, m, β-HVal), 3.10-3.51 (14H, m, CH2NH2, CH2NBoc, CH2O, CH2OH), 4.18-4.30 (4H, m, α-CHAla, CHFmoc, CH2,Fmoc), 4.60 (1H, t, OH), 7.30-7.36 (2H, m, CHAr), 7.39-7.47 (3H, m, CHAr, NHVal), 7.72-7.77 (2H, m, CHAr), 7.87-7.99 (4H, m, CHAr, NHAla, NH)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 18.6 (CH3,Val), 18.9 (CH3,Ala), 19.7 (CH3,Val), 28.5 (CH3,Boc), 30.8 (β-CHVal), 37.5, 38.0 (CH2NH), 47.2 (CHFmoc), 47.0, 47.3 (CH2NBoc), 48.6 (α-CHAla), 60.5 (α-CHVal), 60.7 (CH2OH), 66.2 (CH2,Fmoc), 68.9, 69.2 (NCH2CH2O), 72.6 (CH2O), 79.1 (CBoc), 120.5 (CHAr), 125.8 (CHAr),127.5 (CHAr), 128.1 (CHAr), 141.2, 141.2 (CAr), 144.2, 144.4 (CAr), 155.1 (C=OBoc), 156.6 (C=OFmoc), 171.1 (C=OVal), 172.5 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 641.35 [M+H]+, 実測値: 641.59 [M+H]+。
【０１６９】
化合物３１（１．４ｇ、２．１９ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液にピペリジン（４．３ｍｌ、４３．７ｍｍｏｌ、２０当量）を添加し、２時間撹拌した。粗混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、固体残留物をＥｔ２Ｏで洗浄し、ろ過し、減圧乾燥させて、化合物３２（０．６８ｇ、１．６３ｍｍｏｌ、７４％）を灰色の固体として得た。
【０１７０】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.76 (3H, d, CH3,Val), 0.88 (3H, d, CH3,Val), 1.18 (3H, d, CH3,Ala), 1.39 (9H, s, CH3,Boc), 1.90-1.97 (1H, m, β-HVal), 2.99 (1H, d, α-CHVal), 3.10-3.52 (12H, m, CH2NH, CH2NBoc, CH2O, CH2OH), 4.22-4.30 (1H, m, α-CHAla), 4.62 (1H, br s, OH), 7.98-8.05 (2H, m, NHAla, NH)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 17.2 (CH3,Val), 19.3 (CH3,Ala), 19.9 (CH3,Val), 28.5 (CH3,Boc), 31.7 (β-CHVal), 37.6, 38.0 (CH2NH), 47.0, 47.2, 47.4 (CH2NBoc), 48.1 (α-CHAla), 60.1 (α-CHVal), 60.7 (CH2OH), 68.9, 69.2 (NCH2CH2O), 72.6 (CH2O), 79.1 (CBoc), 155.1, 155.2 (C=OBoc), 172.7 (C=OAla), 174.3 (C=OVal)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 419.29 [M+H]+, 実測値: 419.58 [M+H]+。
【０１７１】
化合物３２（６８０ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ、１当量）のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（５０ｍｌ、１：１、ｖ／ｖ）溶液に、引き続きＮ−メチルモルホリン（３５７μｌ、３．２５ｍｍｏｌ、２当量）、ホルムアルデヒド（１．２１ｍｌ、１６．２５ｍｍｏｌ、１０当量）、およびＮａＣＮＢＨ３（３０６ｍｇ、４．８７ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、続いて酢酸（１８６μｌ、３．２５ｍｍｏｌ、２当量）を滴加した。得られた混合物を１５分間撹拌した。粗混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から８：２、ｖ／ｖ）によって精製した。生成物をトルエンと再び共蒸発させて、化合物３３（６８０ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、９４％）を無色の油状物として得た。
【０１７２】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.77 (3H, d, CH3,Val), 0.88 (3H, d, CH3,Val), 1.20 (3H, d, CH3,Ala), 1.38 (9H, s, CH3,Boc), 1.89-1.98 (1H, m, β-HVal), 2.24 (6H, s, N(CH3)2), 2.63-2.72 (1H, d, α-CHVal), 3.08-3.62 (12H, m, CH2NH, CH2NBoc, CH2O, CH2OH), 4.28-4.34 (1H, m, α-CHAla), 7.87-8.01 (2H, m, NHAla, NH)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 19.4 (CH3,Val), 19.4 (CH3,Ala), 20.0 (CH3,Val), 27.0 (β-CHVal), 28.5 (CH3,Boc), 37.5, 37.9 (CH2NH), 41.8 (NCH3), 46.9, 47.3, 47.5 (CH2NBoc), 48.2 (α-CHAla), 60.7 (CH2OH), 68.9, 69.2 (NCH2CH2O), 72.6 (CH2O), 73.4 (α-CHVal), 79.1 (CBoc), 155.1 (C=OBoc), 169.2 (C=OVal), 172.6 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 447.32 [M+H]+, 実測値: 447.85 [M+H]+。
【０１７３】
化合物３３（６８０ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、１当量）の乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）溶液を窒素雰囲気下に置き、マレイミド（１９２ｍｇ、１．９８ｍｍｏｌ、１．３当量）およびトリフェニルホスフィン（５１９ｍｇ、１．９８ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加した。混合物を氷浴中で０℃に冷却し、ＤＥＡＤ（トルエン中２．２Ｍ）（９００μｌ、１．９８ｍｍｏｌ、１．３当量）を滴加し、室温で３０分間撹拌した。粗混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９：１、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物３４（２８０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、３５％）を無色のろう状固体として得た。
【０１７４】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.76 (3H, dd, CH3,Val), 0.87 (3H, dd, CH3,Val), 1.13-1.30 (3H, m, CH3,Ala), 1.38 (9H, s, CH3,Boc), 1.86-2.01 (1H, m, β-HVal), 2.18 (6H, br s, N(CH3)2), 2.57 (1H, d, α-CHVal), 3.05-3.71 (12H, m, NCH2, OCH2), 4.27-4.35 (1H, m, α-CHAla), 7.02 (2H, s, HC=CH), 7.87 (2H, br s, NHAla, C(=O)NHCH2)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 19.4 (CH3,Ala), 19.7 (CH3,Val), 20.0 (CH3,Val), 27.1 (β-CHVal), 28.5 (CH3,Boc), 37.3, 37.4 ((C=O)2NCH2CH2), 37.8 (NHCH2), 41.8 (N(CH3)2), 46.9, 47.1, 46.5 (NCH2), 48.0 (α-CHAla), 67.3, 68.6, 68.9 (OCH2), 73.5 (α-CHVal), 79.1 (CBoc), 135.0 (HC=CH), 155.7 (C=OBoc), 169.7 (C=OVal), 171.3 (C=Omaleimide), 172.7 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 526.32 [M+H]+, 実測値: 526.65 [M+H]+。
【０１７５】
【化２９】
2019537622.tif 000035
【０１７６】
フタルイミド−テトラエチレングリコール−トシレート３７の合成は、幾つかの文献の手順に記載されている。たとえば、Ｋｉｍら  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００７、９（２２）：４４１９〜４４２２。
【０１７７】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（ベンジルアミノ）エチル（メチル）カルバメート３８（６６４ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ、１当量）、フタルイミド−テトラエチレングリコール−トシレート３７（１．２ｇ、２．５１ｍｍｏｌ、１当量）、Ｋ２ＣＯ３（６９５ｍｇ、５．０３ｍｍｏｌ、２当量）、およびＫＩ（４１７ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ、１当量）のアセトニトリル（２０ｍｌ）中の混合物を３日間還流した。混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から８：２、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物３９（１．４ｇ、２．４６ｍｍｏｌ、９８％）を無色の油状物として得た。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 570.32 [M+H]+, 実測値: 570.50 [M+H]+。
【０１７８】
パラジウム炭素（２６２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、０．１当量）をＭｅＯＨ（１０ｍｌ）に懸濁させ、続いて化合物３９（１．４ｇ、２．４６ｍｍｏｌ、１当量、ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中）および酢酸（４２２μｌ、７．３７ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。得られた混合物を水素下で３時間撹拌した。混合物をセライトでろ過し、減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、減圧乾燥させて、化合物４０（８５０ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ、７２％）を得た。
【０１７９】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.38 (CH3,Boc), 2.59-2.65 (4H, m, CH2NHCH2), 2.77 (3H, br s, NCH3), 3.19 (2H, t, NCH2), 3.35-3.68 (10H, M, OCH2), 3.62 (2H, t, (C=O)2NCH2CH2), 3.75 (2H, t, (C=O)2NCH2), 7.82-7.89 (4H, m, HAr)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 28.5 (CH3,Boc), 34.7 (NCH3), 37.6 ((C=O)2NCH2CH2), 47.5 (NHCH2), 48.8 (NCH2), 67.4 ((C=O)2NCH2CH2O), 70.0, 70.0, 70.1, 70.2, 70.4 (OCH2), 78.7 (CBoc), 123.5 (CHAr), 132.0 (CAr), 134.9 (CHAr), 155.3 (C=OBoc), 168.2 (C=OPhthalimide)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 480.27 [M+H]+, 実測値: 480.44 [M+H]+。
【０１８０】
【化３０】
2019537622.tif 000036
【０１８１】
化合物１５（３．５８ｇ、１０．２ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（２０ｍｌ）溶液に化合物４８（３．１６ｇ、１０．２ｍｍｏｌ、１当量）およびＤＩＰＥＡ（２．０ｍｌ、１１．５ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、得られた混合物を２時間撹拌した。次いで、炭酸ビス−（４−ニトロフェニル）（４．６８ｇ、１５．４ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、１８時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０、９：１、ｖ／ｖ）によって精製し、ジオキサン／水に溶解させ、フリーズドライさせて、化合物５０（５．１６ｇ、７．７ｍｍｏｌ、７５％）をオフホワイトの固体として得た。
【０１８２】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.82-0.90 (6H, m, CH3,Val), 1.32 (3H, d, CH3,Ala), 1.92-2.03 (1H, m, β-HVal), 3.50-3.60 (6H, m, NCH2, OCH2), 3.85-3.91 (1H, m, α-CHVal), 3.96-4.07 (2H, m, CH2OC(O)NH), 4.38-4.47 (1H, m, α-CHAla), 5.25 (1H, s, Ar-CH2), 7.02 (2H, s, HC=CH), 7.17 (1H, d, NHVal), 7.42 (2H, d, H3), 7.57 (2H, d, H2'), 7.64 (2H, d, H2), 8.16 (1H, d, NHAla), 8.31 (2H, d, H3'), 10.06 (1H, s, NHPABA)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 18.5 (CH3,Val, CH3,Ala), 19.6 (CH3,Val), 30.8 (β-CHVal), 37.1 ((C=O)2NCH2CH2), 49.5 (α-CHAla), 60.4 (α-CHVal), 63.8 (CH2OC(O)NH), 67.4, 68.8 (OCH2), 70.7 (ArCH2O), 119.5 (C2), 123.1 (C2'), 125.9 (C3'), 129.8 (4), 129.9 (C3), 135.0 (HC=CH), 139.9 (C1), 145.6 (C1'), 152.4 (OC(O)O), 155.8 (C4'), 156.6 (OC(O)NH), 171.3 (C=Omaleimide), 171.5 (C=OVal), 171.7 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 670.24 [M+H]+, 実測値: 670.30 [M+H]+。
【０１８３】
【化３１】
2019537622.tif 000037
【０１８４】
化合物３８（２．０５ｇ、７．７５ｍｍｏｌ、１当量）、２−ブロモエタノール（５４、５５１μｌ、７．７５ｍｍｏｌ、１当量）、Ｋ２ＣＯ３（２．１４ｇ、１５．５ｍｍｏｌ、２当量）、およびＫＩ（１．２９ｇ、７．７５ｍｍｏｌ、１当量）の混合物をアセトニトリル（２０ｍｌ）に溶解させ、７２時間加熱還流した。混合物を室温に冷却し、減圧濃縮した。粗生成物をＤＣＭに溶解させ、水（２×）およびブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ、１：０から０：１  ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、化合物５５（１ｇ、３．２４ｍｍｏｌ、４２％）を橙色の油状物として得た。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 309.22 [M+H]+, 実測値: 309.38 [M+H]+。
【０１８５】
Ｐｄ／Ｃ（３４５ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、０．１当量）のＭｅＯＨ（５０ｍｌ）懸濁液に、化合物５５（１ｇ、３．２４ｍｍｏｌ、１当量、ＭｅＯＨ５０ｍｌ中）の溶液を添加し、続いて酢酸（５５７μｌ、９．７３ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。得られた混合物を水素雰囲気下で４時間撹拌した。次いで、混合物をセライトでろ過し、減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、勾配）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、ＯＥＧＣＳ（５６）（７２０ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ、定量的収率）を油状物として得た。
【０１８６】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.39 (9H, s, CH3,Boc), 2.63 (2H, t, NCH2CH2OH), 2.68 (2H, t, NCH2CH2N), 2.78 (3H, br s, NCH3), 3.24 (2H, t, NCH2), 3.46 (2H, t, CH2OH), 4.25 (2H, br s, NH, OH)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 28.5 (CH3,Boc), 34.7 (NCH3), 46.8, 47.2, 47.8, 48.3 (NHCH2), 51.5 (NCH2), 60.3 (CH2OH), 78.8 (CBoc), 155.3 (C=OBoc)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 219.17 [M+H]+, 実測値: 219.28 [M+H]+。
【０１８７】
【化３２】
2019537622.tif 000038
【０１８８】
化合物Ａは、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓから市販されている（ＣＡＳ番号８３６−４３−１、供給コード１８１９６）。
【０１８９】
化合物Ａ（２．７３ｇ、１２．７ｍｍｏｌ、１当量）のＤＣＭ（２０ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＤＩＰＥＡ（６．６８ｍｌ、３８．２ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、続いてＭＯＭ−Ｃｌ（１．４５ｍｌ、１９．１ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴加した。混合物を室温で２４時間撹拌した。次に、水およびＤＣＭを添加し、層を分離した。ＤＣＭ層を１Ｍ  ＨＣｌ溶液、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、水、およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。ＤＣＭ層をろ過し、ろ液を減圧濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃ７／ＥｔＯＡｃ、１：０から９：１、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、化合物Ｂ（２．６ｇ、１０．１ｍｍｏｌ、７９％）を無色の油状物として得た。
【０１９０】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 3.40 (3H, s, OCH3), 4.52 (2H, s, ArCH2), 4.68 (2H, s, OCH2O), 5.06 (ArCH2, benzyl), 6.96 (2H, d, H2), 7.26-7.44 (7H, m, H3, Hbenzyl)。
【０１９１】
Ｐｄ／Ｃ（０．２１ｇ、２．０１ｍｍｏｌ、０．２当量）のＭｅＯＨ（６ｍｌ）懸濁液にＴＨＦ（１２ｍｌ）中の化合物Ｂ（２．６ｇ、１０．０７ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。混合物を水素で３回パージし、水素雰囲気下で４時間撹拌した。懸濁液をセライトでろ過し、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃ７／ＥｔＯＡｃ、１：０から３：１、ｖ／ｖ）によって精製した。生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、化合物５７（１．６８ｇ、９．９９ｍｍｏｌ、９９％）を無色の油状物として得た。
【０１９２】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 3.42 (3H, s, OCH3), 4.52 (2H, s, ArCH2), 4.70 (2H, s, OCH2O), 6.55 (1H, br s, OH), 6.75 (2H, d, H2), 7.20 (2H, d, H3)。
【０１９３】
【化３３】
2019537622.tif 000039
【０１９４】
化合物５７（１．６８ｇ、１０ｍｍｏｌ、１当量）のＴＨＦ（２５ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、クロロギ酸４−ニトロフェニル（２．１２ｇ、１０．５ｍｍｏｌ、１．０５当量）およびＥｔ３Ｎ（４．１８ｍｌ、３０ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、混合物を氷浴中０℃で３０分間撹拌した。次に、ＨＯＢｔ（１．５３ｇ、１０ｍｍｏｌ、１当量）および環化スペーサー４Ａ（ＷＯ２０１１／１３３０３９、例１（Ｓｙｎｔａｒｇａ）に記載される通りに合成したもの、ＴＨＦ（１０ｍｌ）中、２．６２ｇ、１０ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、５０℃で９０分間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ、１：０から１：１、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、化合物５８（３．１ｇ、６．８ｍｍｏｌ、６８％）を黄色の油状物として得た。
【０１９５】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.34-1.43 (9H, m, CH3,Boc), 2.80-2.87 (3H, m, NCH3), 3.31 (3H, s, OCH3), 3.29-3.66 (12H, m, CH2N, CH2O), 4.52 (2H, s, ArCH2), 4.66 (2H, s, OCH2O), 7.06-7.11 (2H, m, H2), 7.33-7.38 (2H, m, H3)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 28.4 (CH3,Boc), 34.4, 34.7, 34.9 (NCH3), 45.7,46.5, 46.6, 47.1, 47.3, 47.4 (NCH2), 55.2 (OCH3), 60.7, 60.7 (CH2OH), 68.4 (ArCH2), 68.7, 69.2 (NCH2CH2O), 72.7, 72.8 (OCH2), 79.0, 79.0 (CBoc), 95.7 (OCH2O), 122.0, 122.2 (C2), 128.9, 129.0 (C3), 135.4 (C4), 151.0 (C1), 154.3 (C=O), 155.2 (C=OBoc)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 457.25 [M+H]+, 実測値: 357.16 (-Boc), 457.58 [M+H]+。
【０１９６】
化合物５８（１ｇ、２．１９ｍｍｏｌ、１当量）のＴＨＦ（２０ｍｌ）溶液を氷浴中で冷却し、クロロギ酸アリル（０．２６ｍｌ、２．４１ｍｍｏｌ、１．１当量）およびピリジン（０．３５ｍｌ、４．３８ｍｍｏｌ、２当量）を滴加した。混合物を氷浴中０℃で５時間撹拌した。粗混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ、１：０から１：１、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、化合物５９（１．１ｇ、２．０ｍｍｏｌ、９２％）を無色の油状物として得た。
【０１９７】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.33-1.41 (9H, m, CH3,Boc), 2.78-2.86 (3H, m, NCH3), 3.30 (3H, s, OCH3), 3.29-3.70 (10H, m, CH2N, CH2O), 4.22-4.26 (2H, m, (C=O)OCH2CH2O), 4.51 (2H, s, ArCH2), 4.57-4.62 (2H, m, CH2,Aloc), 4.65 (2H, s, OCH2O), 5.22-5.35 (2H, m, C=CH2,Aloc), 5.86-5.99 (1H, m, CHAloc), 7.05-7.11 (2H, m, H2), 7.32-7.36 (2H, m, H3)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 28.5 (CH3,Boc), 34.5, 35.0 (NCH3), 45.7,46.5, 47.2 (NCH2), 55.2 (OCH3), 67.2 (C=O)OCH2CH2O), 68.3 (CH2,Aloc), 68.4 (ArCH2), 68.6, 69.2 (OCH2), 79.0, 79.0 (CBoc), 95.7 (OCH2O), 118.8 (C=CH2,Aloc), 122.0, 122.2 (C2), 129.0 (C3), 132.6 (CHAloc), 135.5 (C4), 151.0 (C1), 154.3 (C=O), 154.9 (C=OAloc), 155.2 (C=OBoc)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 563.26 [M+Na]+, 実測値: 441.50 [M-Boc]+, 563.57 [M+Na]+。
【０１９８】
化合物５９（２５０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１当量）をクロロホルム（６ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、ＴＦＡ（６ｍｌ）を添加し、８時間撹拌した。混合物をクロロホルムで希釈し、減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、減圧乾燥させた。得られたＴＦＡ塩を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）中に再溶解させ、氷浴中で０℃に冷却した。化合物１９（２２５ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１当量）の乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）溶液を添加し、続いてＥｔ３Ｎ（０．１４ｍｌ、１．３９ｍｍｏｌ、３当量）を滴加した。得られた混合物を３時間撹拌し、続いてＭｅＯＨ（２ｍｌ）を添加し、１５分間さらに撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から８：２、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、化合物６０（１９０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、５５％）を淡黄色の油状物として得た。
【０１９９】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.82-0.86 (3H, m, CH3,Val), 0.94-0.98 (3H, m, CH3,Val), 1.33-1.37 (3H, m, CH3,Ala), 2.06 (1H, br s, β-HVal), 2.30 (6H, br s, N(CH3)2), 2.85-2.90 (3H, m, NCH3), 3.30-3.72 (10H, m, CH2N, CH2O), 4.21-4.26 (2H, m, (C=O)OCH2CH2O), 4.46-4.61 (5H, m, α-CHAla, ArCH2, CH2,Aloc), 4.95-5.03 (2H, m, CH2,PABA) 5.20-5.35 (2H, m, OH, C=CH2,Aloc), 5.86-5.96 (1H, m, CHAloc), 6.96-7.04 (2H, m, H2'), 7.23-7.32 (4H, m, H3, H3'), 7.52-7.61 (2H, m, H2), 8.55 (1H, br s, NHAla), 9.74 (1H, br s, OH), 10.16 (NHPABA)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 18.6 (CH3,Val), 18.6 (CH3,Ala), 19.8 (CH3,Val), 27.1 (β-CHVal), 34.5, 34.7, 35.1, 35.2 (NCH3), 41.7 (NCH3,Val), 45.7, 46.4, 46.7, 47.1, 47.3 (NCH2), 49.5 (α-CHAla), 62.9 (ArCH2OH), 66.5, 66.7 (ArCH2,PABA), 67.2 (C=O)OCH2CH2O), 68.3, 68.3 (CH2,Aloc), 68.5, 68.6, 69.1 (OCH2), 72.7 (α-CHVal), 118.7 (C=CH2,Aloc), 119.5 (C2) 121.8 (C2'), 127.6, 127.7 (C3), 128.9 (C3'), 132.0, 132.1 (C4, C4'), 132.6 (CHAloc), 139.2 (C1), 139.8 (C4'), 150.3 (C1'), 154.3 (Ar-OC(O)N), 154.9 (C=OAloc), 156.0, 156.1 (Ar-CH2OC(O)N), 171.4 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 744.38 [M+H]+, 実測値: 744.72 [M+H]+。
【０２００】
化合物６０（１９０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、１当量）の乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（１５５ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＰＥＡ（６７μｌ、０．３８ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、４時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９：１、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、化合物６１（２０２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、８７％）を得た。
【０２０１】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.80 (3H, d, CH3,Val), 0.90 (3H, d, CH3,Val), 1.32 (3H, d, CH3,Ala), 1.94 (1H, br s, β-HVal), 2.25 (6H, br s, N(CH3)2), 2.85-2.91 (3H, m, NCH3), 3.30-3.71 (10H, m, CH2N, CH2O), 4.23 (2H, br s, (C=O)OCH2CH2O), 4.45-4.54 (1H, m, α-CHAla), 4.59 (2H, br s, CH2,Aloc), 4.95-5.03 (2H, m, CH2,PABA), 5.31 (2H, s ArCH2), 5.20-5.34 (2H, m, C=CH2,Aloc), 5.86-5.96 (1H, m, CHAloc), 7.07-7.15 (2H, m, H2'), 7.23-7.33 (2H, m, H3), 7.45-7.49 (2H, m, H3'), 7.52-7.60 (4H, m, H2, H2''), 8.14 (1H, br s, NHAla), 8.29-8.35 (2H, m, H3''), 10.09 (NHPABA)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 18.5 (CH3,Ala), 20.0 (CH3,Val), 27.1 (β-CHVal), 34.5, 34.8, 35.1, 35.3 (NCH3), 41.8 (NCH3,Val), 45.7, 45.9, 46.4, 46.7, 47.1, 4743 (NCH2), 49.2 (α-CHAla), 66.5, 66.7 (ArCH2,PABA), 67.2 (C=O)OCH2CH2O), 68.3 (CH2,Aloc), 68.5, 68.6, 69.0 (OCH2), 70.4 (ArCH2), 73.3 (α-CHVal), 118.8 (C=CH2,Aloc), 119.5 (C2) 122.3, 122.4 (C2'), 123.0 (C2''), 125.9 (C3''), 128.9, 128.9 (C3), 130.1 (C3'), 131.9, 132.0 (C4, C4'), 132.6 (CHAloc), 139.2 (C1), 145.7 (C1''), 151.9 (C1'), 152.4 (OC(O)O) 154.3 (Ar-OC(O)N), 154.9 (C=OAloc), 155.8 (C4''), 156.0, 156.1 (Ar-CH2OC(O)N), 171.7 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 909.39 [M+H]+, 実測値: 909.77 [M+H]+。
【０２０２】
【化３４】
2019537622.tif 000040
【０２０３】
（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）プロピオン酸（５ｇ、１６．１ｍｍｏｌ）および（４−アミノフェニル）メタノール（２．７７ｇ、２２．５ｍｍｏｌ、１．４当量）のＤＣＭ（９０ｍｌ）およびＭｅＯＨ（３０ｍｌ）溶液を０℃に冷却し、エチル２−エトキシキノリン−１（２Ｈ）−カルボキシレート（７．９４ｇ、３２．１ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、１８時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、エーテル（１００ｍｌ）中で撹拌し、ろ過して、（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソプロパン−２−イルカルバメート（６ｇ、１４．４１ｍｍｏｌ、９０％）をオフホワイトの固体として得た。
【０２０４】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.32 (3H, d, CH3,Ala), 4.17-4.29 (4H, m, α-CHAla, CHFmoc, CH2 Fmoc), 4.44 (2H, s, ArCH2), 7.24-7.90 (13H, m, CHArFmoc, H2, H3, NHAla), 9.95 (1H, s, NHPABA)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 18.1 (CH3,Ala), 46.6 (CH2,Fmoc), 50.7 (α-CHAla), 62.6 (CH2), 65.6 (CH2 Fmoc), 118.9 (C2), 120.1 (CHFmoc), 125.3 (CHFmoc), 126.9 (CHFmoc), 127.1 (C3), 127.6 (CHFmoc), 137.4, 137.6 (C1, C4), 140.7 (CFmoc), 143.8 (CFmoc), 143.9 (CFmoc), 155.8 (C=OFmoc), 171.4 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 417.18 [M+H]+, 実測値: 417.48 [M+H]+。
【０２０５】
（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−１−オキソプロパン−２−イルカルバメート（６ｇ、１４．４１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解させ、ピペリジン（９．８１ｇ、１１５ｍｍｏｌ）を添加し、１時間撹拌した。混合物を濃縮し、トルエンと共蒸発させた。粗生成物（固体）をエーテル（１５０ｍｌ）中で１時間撹拌し、ろ過した。この手順を１回繰り返し、得られた固体生成物を高真空で乾燥させて、脱保護された化合物６６（２．４ｇ、１２．３６ｍｍｏｌ、８６％）を白色の固体として得て、次のステップで直接使用した。
【０２０６】
化合物６５（２２４ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ、１当量）および脱保護された化合物６６（３００ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（５ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＥＤＡＣ（４７４ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ、１．６当量）、ＨＯＢｔ（２８４ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ、１．２当量）、およびＤＩＰＥＡ（１．３５ｍｌ、７．７２ｍｍｏｌ、５当量）を添加した。得られた混合物を室温まで戻しながら１８時間撹拌した。粗混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９：１、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物６７を定量的収率で得た。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 336.19 [M+H]+, 実測値: 336.36 [M+H]+。
【０２０７】
化合物６７（１５０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ（２．５ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（２７２ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＰＥＡ（１１７μｌ、０．６７ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、得られた溶液を室温に戻しながら３時間撹拌した。次いで、混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９５：５、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物６８（２００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、８９％）をオフホワイトの固体として得た。
【０２０８】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.85 (3H, d, CH3,Val), 0.89 (3H, d, CH3,Val), 1.32 (3H, d, CH3,Ala), 1.89 (3H, s, CH3,Acetyl), 1.90-1.99 (1H, m, β-HVal), 4.15-4.21 (1H, m, α-CHVal), 4.37-4.43 (1H, m, α-CHAla), 5.25 (2H, s, ArCH2), 7.42 (2H, d, H3), 7.57 (2H, d, H2'), 7.65 (2H, d, H2), 7.90 (1H, d, NHVal), 8.23 (1H, d, NHAla), 8.31 (2H, d, H3'), 9.99 (1H, s, NHPABA)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 18.3 (CH3,Ala), 18.7 (CH3,Val), 19.6 (CH3,Val), 23.1 (CH3, Acetyl), 30.9 (β-CHVal), 49.5 (α-CHAla), 58.2 (α-CHVal), 70.7 (Ar-CH2), 119.5 (C2), 123.1 (C2'), 125.9 (C3'), 129.7 (C4), 129.9 (C3), 139.9 (C1), 145.7 (C1'), 152.4 (OC(O)O) , 155.8 (C4'), 170.0 (C=OAcetyl), 171.5(C=OVal), 171.7 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 501.20 [M+H]+, 実測値: 501.40 [M+H]+。
【０２０９】
【化３５】
2019537622.tif 000041
【０２１０】
Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＰＡＢＡ、化合物７０の合成は、Ｎａｉｒら  Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５；５１：２４０３〜２４０６に記載されている。
【０２１１】
化合物７１を、ＤＭＦ（２０ｍｌ）中でＥＤＡＣ（１．６当量）、ＨＯＢｔ（１．２当量）、およびＤＩＰＥＡ（５当量）を使用する、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＰＡＢＡ７０（１当量）とＭｅ２ＶａｌＯＨ（１．２当量）との１８時間のカップリングの副生物として得た。この副反応は、Ｍｅ２ＶａｌＯＨ中にＡｃＯＨが存在することによって引き起こされた。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９：１、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、化合物７１（５４０ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ、４０％）を、エーテルからの結晶化後に白色の固体として得た。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 394.24 [M+H]+, 実測値: 394.23 [M+H]+。
【０２１２】
化合物７１（５４０ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ、１当量）のクロロホルム（１２ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＴＦＡ（８ｍｌ）で希釈し、混合物を４５分間撹拌した。次いで、反応混合物をＤＣＭで希釈し、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から１：１、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、中間体のアミン（３００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、７５％）を淡黄色の油状物として得た。この油状物をＴＨＦ（２０ｍｌ）中に懸濁させ、氷浴中で０℃に冷却し、化合物２２（１５９ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、１当量）およびＥｔ３Ｎ（５７０μｌ、４．０９ｍｍｏｌ、４当量）を添加し、２０分間撹拌した。反応混合物を５０℃に４８時間温めた。混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９：１、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、化合物７２（９０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、２４％）を無色のろう状固体として得た。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 374.17 [M+H]+, 実測値: 374.38 [M+H]+。
【０２１３】
化合物７２（９０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（２．５ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（１４７ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＰＥＡ（６３μｌ、０．３６ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、得られた溶液を室温に徐々に戻しながら３時間撹拌した。次いで、混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９：１  ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、化合物７３（５６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、４３％）を無色の固体として得た。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 539.18 [M+H]+, 実測値: 539.40 [M+H]+。
【０２１４】
リンカー−薬物化合物の合成
【化３６】
2019537622.tif 000042
【０２１５】
化合物１１（５３０ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＴＨＦ（１５ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、クロロギ酸４−ニトロフェニル（２０６ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＥｔ３Ｎ（６４７μｌ、１．４９ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、４５分間撹拌した。次いで、乾燥ＴＨＦ（３ｍｌ）中の化合物５６（２６３ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ、１．３当量）、およびＨＯＢｔ（１５６ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、得られた混合物を４５℃に２時間温めた。その後、粗混合物を室温に冷却し、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９３：７、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、生成物４６（５８０ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ、７７％）を白色の泡状物として得た。
【０２１６】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.32-1.45 (9H, m, CH3, Boc), 2.78-2.95 (6H, m, ArCH3, NCH3), 3.30-3.79 (9H, m, CHCl, NCH2, OCH2), 3.41 (3H, s, OCH3), 3.81-3.86 (1H, m, CHCl), 4.47 (1H, t, H1), 4.64-4.70 (1H, m, H2), 4.89, 5.04 (1H, 2 x br s, OH) 5.17-5.21 (1H, m, H2), 5.31 (2H, s, OCH2O), 7.18 (2H, d, H3''), 7.31-7.37 (1H, m, H7), 7.37-7.44 (1H, m, H8), 7.56-7.60 (1H, m, H8'), 7.71-7.86 (2H, m, H6, H7'), 8.00 (2H, d, H2''), 8.37 (1H, br s, H4), 8.70 (1H, s, H3'), 9.47 (1H, s, H5'), 10.32 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 22.9 (Ar-CH3), 28.5, 28.6 (CH3, Boc), 34.5 (NCH3), 44.7 (C1), 45.8, 46.2, 46.4 (NCH2), 48.0 (CH2Cl), 55.1 (C2), 56.3 (OCH3), 59.1, 59.7 (CH2OH), 79.1, 79.2 (CBoc), 93.7 (OCH2O), 111.0, 111.1 (C4), 116.2 (C3''), 117.8 (C5'), 118.0 (C7'), 119.6 (C3'), 121.3 (C6), 122.8 (C9b), 123.6 (C8'), 125.1 (C7), 126.3 (C5a), 127.8 (C6'), 127.9 (C1''), 130.1 (C2''), 130.3 (C9a), 131.0 (C8), 133.4 (C9), 141.0 (C2'), 141.9 (C8a'), 142.4 (C3a), 148.6, 148.6 (Ar-OC(O)N), 154.3, 154.4 (C5), 155.2 (C=OBoc), 160.1 (C4''), 162.4 (NC=O), 165.6 (Ar-NHC(O)-Ar)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 815.32 [M+H]+, 実測値: 815.60 [M+H]+。
【０２１７】
化合物４６（２００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１当量）、マレイミド（３１ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１．３当量）、およびトリフェニルホスフィン（８４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１．３当量）の乾燥ＴＨＦ（４ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＤＥＡＤ（トルエン中２．２Ｍ、１４５μｌ、０．３２ｍｍｏｌ、１．３当量）を滴加し、混合物を室温で４５分間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９５：５、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させて、化合物４７（１５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、６８％）を白色の泡状物として得た。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 894.32 [M+H]+, 実測値: 894.62 [M+H]+。
【０２１８】
化合物４７（１５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１当量）のクロロホルム（４ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＴＦＡ（２ｍｌ）で希釈し、３時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、減圧乾燥させた。中間体を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、続いて活性化リンカー１９（９８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＥｔ３Ｎ（４７μｌ、０．３４ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。反応混合物を２時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、粗化合物３を得て、これを分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ−１８、ＭｅＣＮ／ＭｉｌｌｉＱ  ０．１％ｍ／ｍ  ＴＦＡ）によってさらに精製した。アセトニトリルを蒸発させ、水性残留物をフリーズドライさせ、得られた固体をジオキサン／水（６ｍｌ、２：１）に溶解させ、フリーズドライさせて、リンカー−薬物化合物３のＴＦＡ塩（６９ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、３８％）を白色の固体として得た。
【０２１９】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.89 (3H, d, CH3,Val), 1.07 (3H, d, CH3,Val), 1.37 (3H, d, CH3,Ala), 2.24-2.34 (1H, m, β-HVal), 2.78 (6H, br s, N(CH3)2), 2.84 (3H, br s, ArCH3), 2.84-2.98 (3H, d, C(O)NCH3), 3.35-3.88 (11H, m,CH2Cl, α-CHVal, NCH2), 4.44-4.51 (1H, m, H1), 4.55 (1H, t, α-CHAla), 4.61-4.69 (1H, m, H2), 4.97-5.10 (3H, m, H2, Ar-CH2), 6.92 (2H, d, H3''), 6.98 (1H, s, HC=CH), 7.08 (1H, s, HC=CH), 7.19-7.80 (9H, m, H6, H7, H8, H7', H8', H2''', H3'''), 7.91 (2H, d, H2''), 8.21-8.32 (1H, m, H4), 8.78-8.83 (1H, m, H3'), 8.99 (1H, d, NHAla), 9.54-9.68 (2H, m, H5', OH), 10.11-10.20 (1H, m, NHPABA), 10.30 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): 17.1 (CH3,Val), 18.5 (CH3,Ala), 19.6 (CH3,Val), 22.8 (Ar-CH3), 27.0 (β-CHVal), 34.7 (NCH3), 35.5 ((C=O)2NCH2CH2), 41.5 (NCH3,Val), 42.1 (NCH3,Val), 44.8 (C1), 45.6 (NCH2), 47.9 (CH2Cl), 49.8 (α-CHAla), 54.9 (C2), 66.4 (Ar-CH2OC(O)N), 72.0 (α-CHVal), 111.0 (C4), 115.6 (C3''), 117.0 (C7'), 117.8 (C5'), 119.3 (C3'), 119.5 (C2'''), 121.1 (C6), 123.1 (C9b), 125.0 (C1''), 125.3 (C7, C8'), 126.3 (5a), 128.7 (C6'), 128.9 (C3'''), 130.2 (C9a), 130.3 (C2''), 131.1 (C8), 132.3 (C4'''), 133.4 (C9), 135.1, 135.2 (HC=CH), 138.9 (C1'''), 141.1 (C2', C8a'), 142.1 (C3a), 148.4 (Ar-OC(O)N), 154.2 (C5), 154.7 (Ar-CH2OC(O)N), 161.4 (NC=O), 161.4 (C4''), 165.4 (C=OVal), 165.9 (Ar-NHC(O)-Ar), 170.7 (C=OAla), 171.4, 171.5 (C=Omaleimide)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1097.43 [M+H]+, 実測値: 1097.76 [M+H]+。
【０２２０】
【化３７】
2019537622.tif 000043
【０２２１】
化合物１２（９９０ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ、１当量）のＤＣＭ（５ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＴＦＡ（５ｍｌ）で希釈した。混合物を２．５時間撹拌し、次いでＤＣＭで希釈し、減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させた。活性化化合物１９（５１２ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、１．１当量）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、引き続きＥｔ３Ｎ（５３３μｌ、４．０６ｍｍｏｌ、４当量）を添加し、続いてＴＦＡ塩（乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解させたもの）を滴加した。得られた混合物を氷浴中０℃から室温まで徐々に戻しながら３時間撹拌した。次に、混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、勾配）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させた。次いで、得られた固体をトルエン（１２０ｍｌ）中に懸濁させ、５時間で９０℃に徐々に温めた。混合物を減圧濃縮し、粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ−１８、ＭｅＣＮ／ＭｉｌｌｉＱ  ０．１％ｍ／ｍ  ＴＦＡ）によって精製した。アセトニトリルを蒸発させ、水分残留物をフリーズドライさせた。得られた生成物をジオキサン／水（１８ｍｌ、２：１）に溶解させ、２回目にフリーズドライさせて、リンカー−薬物化合物４のＴＦＡ塩（４７５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、４４％）を白色の固体として得た。
【０２２２】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.88 (3H, d, CH3,Val), 1.06 (3H, d, CH3,Val), 1.36 (3H, d, CH3,Ala), 2.25-2.30 (1H, m, β-HVal), 2.77 (6H, br s, N(CH3)2), 2.85 (3H, br s, ArCH3), 2.85-2.92 (3H, d, C(O)NCH3), 3.33-3.71 (14H, m, CHCl, α-CHVal, NCH2, OCH2), 3.83 (1H, d, CHCl), 4.47-4.51 (1H, m, H1), 4.51-4.57 (1H, m, α-CHAla), 4.63-4.69 (1H, m, H2), 4.96-5.07 (3H, m, H2, Ar-CH2), 6.89-6.97 (3H, m, HC=CH, H3''), 7.03 (1H, d, CH=CH), 7.17-7.59 (6H, m, H7, H8, H2''', H3'''), 7.62-7.80 (3H, m, H6, H7', H8'), 7.91 (2H, d, H2''), 8.28-8.39 (1H, m, H4), 8.79-8.81 (1H, m, H3'), 8.99 (1H, d, NHAla), 9.55-9.62 (2H, m, H5', OH), 10.11-10.18 (1H, m, NHPABA), 10.30 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 17.1 (CH3,Val), 18.5 (CH3,Ala), 19.6 (CH3,Val), 22.9 (Ar-CH3), 27.0 (β-CHVal), 34.4, 34.8, 35.2 (NCH3), 37.1, 37.4 ((C=O)2NCH2CH2), 41.5 (NCH3,Val), 42.1 (NCH3,Val), 44.8 (C1), 47.4, 47.6 (NCH2), 47.9 (CH2Cl), 49.8 (α-CHAla), 54.9 (C2), 66.4, 66.5 (Ar-CH2OC(O)N), 67.6, 68.4, 68.6 (OCH2), 71.9 (α-CHVal), 111.0 (C4), 115.6 (C3''), 117.0 (C7'), 117.8 (C5'), 119.5 (C3', C2'''), 121.2 (C6), 123.0 (C9b), 124.9 (C1''), 125.3 (C7, C8'), 126.3 (C5a), 128.8 (C6'), 128.9, 129.0 (C3'''), 130.2 (C9a), 130.3 (C2''), 131.1 (C8), 132.4 (C4'''), 133.5 (C9), 134.9, 135.0 (HC=CH), 138.9 (C1'''), 139.0 (C2'), 140.9 (C8a'), 142.1 (C3a), 148.5 (Ar-OC(O)N), 154.1, 154.3 (C5), 156.2 (Ar-CH2OC(O)N), 161.3 (NC=O), 161.4 (C4''), 165.4 (C=OVal), 165.9 (Ar-NHC(O)-Ar), 170.8 (C=OAla), 171.4 (C=Omaleimide)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1141.45 [M+H]+, 実測値: 1141.90 [M+H]+。
【０２２３】
【化３８】
2019537622.tif 000044
【０２２４】
化合物４４（７２０ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ、１当量）、マレイミド（１０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、１．３当量）、およびトリフェニルホスフィン（２７２ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、１．３当量）の乾燥ＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＤＥＡＤ（トルエン中２．２Ｍ、４７１μｌ、１．０４ｍｍｏｌ、１．３当量）を滴加し、室温で４５分間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９５：５、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させて、化合物４５（５９０ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ、７５％）を白色の泡状物として得た。
【０２２５】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.29-1.45 (9H, m, CH3, Boc), 2.78-2.95 (6H, m, ArCH3, NCH3), 3.42 (3H, s, OCH3), 3.35-3.74 (17H, m, CHCl, NCH2, OCH2), 3.80-3.86 (1H, m, CHCl), 4.47 (1H, t, H1), 4.63-4.70 (1H, m, H2), 5.16-5.21 (1H, m, H2), 5.31 (2H, s, OCH2O), 6.97-7.02 (2H, m, HC=CH), 7.18 (2H, d, H3''), 7.31-7.44 (2H, m, H7, H8), 7.57-7.61 (1H, m, H8'), 7.68-7.84 (2H, m, H6, H7'), 7.99 (2H, d, H2''), 8.35 (1H, br s, H4), 8.70 (1H, s, H3'), 9.47 (1H, s, H5'), 10.32 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 22.9 (Ar-CH3), 28.5, 28.6 (CH3, Boc), 34.6 (NCH3), 37.2, 37.3 ((C=O)2NCH2CH2), 44.7 (C1), 45.5, 46.0, 47.5 (NCH2), 47.9 (CH2Cl), 55.1 (C2), 56.3 (OCH3), 67.5, 68.6, 69.1, 69.9, 70.2, 70.3 (OCH2), 79.1, 79.1 (CBoc), 94.2 (OCH2O), 111.0, 111.1 (C4), 116.2 (C3''), 117.8 (C5'), 118.0 (C7'), 119.6 (C3'), 121.2 (C6), 122.8 (C9b), 123.6 (C8'), 125.1 (C7), 126.3 (C5a), 127.8 (C6'), 127.9 (C1''), 130.1 (C2''), 130.3 (C9a), 131.0 (C8), 133.5 (C9), 134.9, 134.9 (HC=CH), 141.0 (C2'), 141.9 (C8a'), 142.4 (C3a), 148.5, 148.6 (Ar-OC(O)N), 154.3 (C5), 155.2 (C=OBoc), 160.1 (C4''), 162.3 (NC=O), 165.6 (Ar-NHC(O)-Ar), 171.3, 171.3 (C=Omaleimide)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 982.37 [M+H]+, 実測値: 982.80 [M+H]+。
【０２２６】
化合物４５（２００ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１当量）のクロロホルム（２ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＴＦＡ（２ｍｌ）で希釈し、３時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、減圧乾燥させた。この中間体を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、活性化リンカー１９（１１９ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＥｔ３Ｎ（８５μｌ、０．６１ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、混合物を２時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製して、粗化合物５を得て、これを分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ−１８、ＭｅＣＮ／ＭｉｌｌｉＱ  ０．１％ｍ／ｍ  ＴＦＡ）によって精製した。ＭｅＣＮを蒸発させ、水性残留物をフリーズドライさせ、得られた固体をジオキサン／水（６ｍｌ、２：１）に溶解させ、フリーズドライさせて、リンカー−薬物化合物５のＴＦＡ塩（１８ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、７％）を白色の固体として得た。
【０２２７】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.88 (3H, d, CH3,Val), 1.06 (3H, d, CH3,Val), 1.37 (3H, d, CH3,Ala), 2.23-2.33 (1H, m, β-HVal), 2.77 (6H, br s, N(CH3)2), 2.85 (3H, br s, ArCH3), 2.85-2.98 (3H, d, C(O)NCH3), 3.36-3.99 (19H, m, CH2Cl, α-CHVal, NCH2, OCH2), 4.46-4.51 (1H, m, H1), 4.55 (1H, t, α-CHAla), 4.63-4.69 (1H, m, H2), 4.97-5.18 (3H, m, H2, Ar-CH2), 6.91 (2H, d, H3''), 6.95-7.01 (2H, m, HC=CH), 7.18-7.59 (6H, m, H7, H8, H2''', H3'''), 7.62-7.80 (3H, m, H6, H7', H8'), 7.91 (2H, d, H2''), 8.28-8.39 (1H, m, H4), 8.72 (1H, s, H3'), 8.99 (1H, d, NHAla), 9.50(1H, br s, H5'), 9.64 (1H, br s, OH), 10.11-10.30 (2H, m, NHPABA, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 17.2 (CH3,Val), 18.5 (CH3,Ala), 19.7 (CH3,Val), 22.9 (Ar-CH3), 27.0 (β-CHVal), 34.9, 35.3 (NCH3), 37.3 ((C=O)2NCH2CH2), 41.6 (NCH3,Val), 42.0 (NCH3,Val), 44.8 (C1), 47.4, 47.6 (NCH2), 47.9 (CH2Cl), 49.8 (α-CHAla), 55.0 (C2), 66.5 (Ar-CH2OC(O)N), 67.5, 69.0, 69.8, 70.1, 70.3 (OCH2), 71.9 (α-CHVal), 111.0 (C4), 115.5 (C3''), 117.7 (C7'), 117.7 (C5'), 119.5 (C3', C2'''), 121.3 (C6), 122.9 (C9b), 124.1 (C8'), 125.1 (C7), 126.3 (C5a, C1''), 128.3 (C6'), 128.8 (C3'''), 130.3 (C9a), 130.3 (C2''), 131.1 (C8), 132.6 (C4'''), 133.5 (C9), 134.9, 135.0 (HC=CH), 138.9 (C1'''), 141.6 (C2', C8a'), 142.3 (C3a), 148.5 (Ar-OC(O)N), 154.5 (C5), 156.3 (Ar-CH2OC(O)N), 158.1, 158.4, 158.8, 159.1 (TFA), 161.4 (NC=O), 161.4 (C4''), 165.4 (C=OVal), 165.9 (Ar-NHC(O)-Ar), 170.7 (C=OAla), 171.3 (C=Omaleimide)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1185.48 [M+H]+, 実測値: 1186.79 [M+H]+。
【０２２８】
【化３９】
2019537622.tif 000045
【０２２９】
化合物３５（１７０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、１当量）の乾燥ＴＨＦ（５ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、クロロギ酸４−ニトロフェニル（６６ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＥｔ３Ｎ（２０７μｌ、１．４９ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、３０分間撹拌した。次に、化合物４０（１８６ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１．３当量）の乾燥ＴＨＦ（３ｍｌ）溶液、およびＨＯＢｔ（５０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、得られた混合物を４５℃に２時間温めた。混合物を室温に冷却し、減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９５：５、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物４１（３２５ｍｇ、定量的収率）を得た。
【０２３０】
H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.30-1.44 (9H, m, CH3, Boc), 2.78-2.95 (6H, m, ArCH3, NCH3), 3.35-3.77 (21H, m, CHCl, 4 x NCH2, 6 x OCH2), 3.41 (3H, s, OCH3) 3.79-3.85 (1H, m, CHCl), 4.42-4.48 (1H, m, H1), 4.62-4.69 (1H, m, H2), 5.16-5.21 (1H, m, H2), 5.30 (2H, s, OCH2O), 7.18 (2H, d, H3''), 7.29-7.41 (2H, m, H7, H8), 7.56-7.80 (1H, m, H8'), 7.67-7.86 (6H, m, H6, H7', HPhthalimide), 7.99 (2H, d, H2''), 8.36 (1H, br s, H4), 8.68 (1H, s, H3'), 9.46 (1H, s, H5'), 10.30 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 22.9 (Ar-CH3), 28.4, 28.6 (CH3, Boc), 34.5 (NCH3), 37.5, 37.6 ((C=O)2NCH2CH2), 44.7 (C1), 45.5, 46.0, 46.4, 47.5 (NCH2), 47.9 (CH2Cl), 55.1 (C2), 56.3 (OCH3), 67.4, 68.5, 69.1, 70.0, 70.0, 70.2, 70.3, 70.3 (OCH2), 79.1,79.1 (CBoc), 94.2 (OCH2O), 111.0, 111.1 (C4), 116.1 (C3''), 117.8 (C5'), 118.0 (C7'), 121.2 (C3'), 121.3 (C6), 122.8 (C9b), 123.4 (CHPhthalimide) 123.5 (C8'), 125.1 (C7), 126.3 (C5a), 127.8 (C6'), 127.9 (C1''), 130.1 (C2''), 130.2 (C9a), 131.0 (C8), 132.0 (CPhthalimide), 133.4, 133.4 (C9), 134.8 (CHPhthalimide) 141.0 (C2'), 141.9 (C8a'), 142.4 (C3a), 148.5, 148.6 (Ar-OC(O)N), 154.3 (C5), 155.2, 155.5 (C=OBoc), 160.1 (C4''), 162.3 (NC=O), 165.6 (Ar-NHC(O)-Ar), 168.2, 168.2 (C=OPhthalimide)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1076.42 [M+H]+, 実測値: 1076.77 [M+H]+。
【０２３１】
化合物４１（３２３ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液にヒドラジン（４４μｌ、０．９ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、新たなヒドラジン（３０μｌ、０．６ｍｍｏｌ、２当量）を４５分毎に定期的に添加しながら混合物を３５℃に５．５時間温めた。粗混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物４２（２８４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、５６％）を黄色／橙色のろう状固体として得た。
【０２３２】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.29-1.45 (9H, m, CH3, Boc), 2.74-2.96 (8H, m, ArCH3, NCH3, CH2NH2), 3.34 (2H, br s, NH2), 3.41 (3H, s, OCH3), 3.40-3.79 (19H, m, CHCl, NCH2, OCH2), 3.81-3.86 (1H, m, CHCl), 4.48 (1H, t, H1), 4.64-4.71 (1H, m, H2), 5.15-5.20 (1H, m, H2), 5.31 (2H, s, OCH2O), 7.18 (2H, d, H3''), 7.34-7.46 (2H, m, H7, H8), 7.63-8.08 (5H, m, H6, H7', H8', H2''), 8.35 (1H, br s, H4), 8.70 (1H, s, H3'), 9.49 (1H, s, H5'), 10.43 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 22.9 (Ar-CH3), 28.5, 28.6 (CH3, Boc), 34.6 (NCH3), 39.1 (CH2NH2), 44.7 (C1), 45.5, 45.9, 47.4 (NCH2), 48.0 (CH2Cl), 55.1 (C2), 56.3 (OCH3), 67.3, 68.4, 69.0, 70.2, 70.2, 70.4 (OCH2), 79.1, 79.2 (CBoc), 94.2 (OCH2O), 111.0, 111.1 (C4), 116.1 (C3''), 117.8 (C5'), 118.0 (C7'), 119.5 (C3'), 121.2, 121.3 (C6), 122.9 (C9b), 123.7 (C8'), 125.1 (C7), 126.3 (C5a), 127.7 (C6'), 128.0 (C1''), 130.1 (C2''), 130.3 (C9a), 131.0 (C8), 133.5 (C9), 141.0 (C2'), 141.9 (C8a'), 142.4 (C3a), 148.5, 148.6 (Ar-OC(O)N), 154.3 (C5), 155.2 (C=OBoc), 160.1 (C4''), 162.4 (NC=O), 165.6 (Ar-NHC(O)-Ar)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 946.41 [M+H]+, 実測値: 946.71 [M+H]+。
【０２３３】
化合物４２（１６０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１当量）をＴＨＦ（５ｍｌ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１ｍｌ）の混合物に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、マレイミド−カルバメート２２（２６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。混合物を３０分間撹拌した。次いで、Ｎａ２ＣＯ３（Ｈ２Ｏ中１Ｍ）（１６９μｌ、０．１７ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、さらに４５分間撹拌した。次いで、Ｈ２Ｏを混合物に添加し、ＥｔＯＡｃで２回抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水した。溶液をろ過し、減圧濃縮し、続いて粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９５：５  ｖ／ｖ）によって精製して、化合物４３（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、５８％）を白色のろう状固体として得た。
【０２３４】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.31-1.45 (9H, m, CH3, Boc), 2.76-2.95 (6H, m, ArCH3, NCH3), 3.41 (3H, s, OCH3), 3.40-3.79 (21H, m, CHCl, NCH2, OCH2), 3.79-3.85 (1H, m, CHCl), 4.46 (1H, t, H1), 4.63-4.70 (1H, m, H2), 5.16-5.21 (1H, m, H2), 5.30 (2H, s, OCH2O), 6.99 (2H, d, HC=CH), 7.11-7.27 (4H, d, H3''), 7.32-7.43 (2H, m, H7, H8), 7.56-7.60 (1H, m, H8'), 7.68-7.84 (2H, m, H6, H7'), 7.99 (2H, d, H2''), 8.35 (1H, br s, H4), 8.69 (1H, s, H3'), 9.47 (1H, s, H5'), 10.31 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 22.9 (Ar-CH3), 28.5, 28.6 (CH3, Boc), 34.5 (NCH3), 37.2, 37.3 ((C=O)2NCH2CH2), 44.7 (C1), 45.5, 46.0, 46.4, 47.5 (NCH2), 47.9 (CH2Cl), 55.1 (C2), 56.3 (OCH3), 67.4, 67.4, 68.5, 69.1, 69.9, 69.9, 70.2, 70.2, 70.3,70.4 (OCH2), 79.1, 79.1 (CBoc), 94.2 (OCH2O), 111.0, 111.1 (C4), 116.2 (C3''), 117.8 (C5'), 118.0 (C7'), 119.5 (C3'), 121.2, 121.3 (C6), 122.8 (C9b), 123.6 (C8'), 125.1 (C7), 126.3 (C5a), 127.8 (C6'), 127.9 (C1''), 130.1 (C2''), 130.3 (C9a), 131.0 (C8), 133.5 (C9), 135.0 (HC=CH), 141.0 (C2'), 141.9 (C8a'), 142.4 (C3a), 148.5, 148.6 (Ar-OC(O)N), 154.3 (C5), 155.2, 155.5 (C=OBoc), 160.1 (C4''), 162.4 (NC=O), 165.6 (Ar-NHC(O)-Ar), 171.3 (C=Omaleimide)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1026.40 [M+H]+, 実測値: 1026.59 [M+H]+。
【０２３５】
化合物４３（１００ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ、１当量）のクロロホルム（４ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＴＦＡ（２ｍｌ）で希釈し、３時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、減圧乾燥させた。次いで、この中間体を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、活性化リンカー１９（５７ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＥｔ３Ｎ（２７μｌ、０．１９５ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、混合物を２時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１；０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物６を得て、これを分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ−１８、ＭｅＣＮ／ＭｉｌｌｉＱ  ０．１％ｍ／ｍ  ＴＦＡ）によってさらに精製した。アセトニトリルを蒸発させ、水性残留物をフリーズドライさせ、得られた固体をジオキサン／水（６ｍｌ、２：１）に溶解させ、フリーズドライさせて、リンカー−薬物化合物６のＴＦＡ塩（１９ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、１５％）を白色の固体として得た。
【０２３６】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.88 (3H, d, CH3,Val), 1.06 (3H, d, CH3,Val), 1.37 (3H, d, CH3,Ala), 2.18-2.32 (1H, m, β-HVal), 2.77 (6H, br s, N(CH3)2), 2.85 (3H, br s, ArCH3), 2.85-2.98 (3H, d, C(O)NCH3), 3.39-4.11 (23H, m, CH2Cl, α-CHVal, NCH2, OCH2), 4.46-4.51 (1H, m, H1), 4.51-4.58 (1H, m, α-CHAla), 4.63-4.69 (1H, m, H2), 4.97-5.15 (3H, m, H2, Ar-CH2), 6.91 (2H, d, H3''), 6.99 (2H, s, HC=CH), 7.18-7.59 (6H, m, H7, H8, H2''', H3'''), 7.63-7.82 (3H, m, H6, H7', H8'), 7.91 (2H, d, H2''), 8.28-8.39 (1H, m, H4), 8.76 (1H, s, H3'), 8.97 (1H, d, NHAla), 9.53(2H, br s, H5', OH), 10.11-10.30 (2H, m, NHPABA, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 17.1 (CH3,Val), 18.6 (CH3,Ala), 19.7 (CH3,Val), 22.9 (Ar-CH3), 27.0 (β-CHVal), 34.6, 35.2 (NCH3), 37.2 ((C=O)2NCH2CH2), 41.5 (NCH3,Val), 42.2 (NCH3,Val), 44.8 (C1), 47.4, 47.6 (NCH2), 47.9 (CH2Cl), 49.8 (α-CHAla), 55.0 (C2), 66.5 (Ar-CH2OC(O)N), 67.4, 68.5, 69.9, 70.2, 70.3 (OCH2), 72.0 (α-CHVal), 111.1 (C4), 115.5 (C3''), 117.4 (C7'), 117.7 (C5'), 119.5 (C3', C2'''), 121.2 (C6), 122.9 (C9b), 124.4 (C8'), 125.0 (C1''), 125.2 (C7), 126.3 (C5a), 128.5 (C6'), 128.8 (C3'''), 130.3 (C9a), 130.3 (C2''), 131.0 (C8), 132.5 (C4'''), 133.5 (C9), 135.0 (HC=CH), 138.8 (C1'''), 141.4 (C2'), 141.4 (C8a'), 142.2 (C3a), 148.5 (Ar-OC(O)N), 154.2, 154.5 (C5), 156.2 (Ar-CH2OC(O)N), 158.1, 158.4, 158.8, 159.1 (TFA), 161.4 (NC=O), 161.4 (C4''), 165.4 (C=OVal), 165.9 (Ar-NHC(O)-Ar), 170.7 (C=OAla), 171.3 (C=Omaleimide)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1229.51 [M+H]+, 実測値: 1229.82 [M+H]+。
【０２３７】
【化４０】
2019537622.tif 000046
【０２３８】
保護された薬物−ＣＳ１２（１．０５ｇ、１．０２ｍｍｏｌ、１当量）のＤＣＭ（５ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、その後ＴＦＡ（５ｍｌ）を添加し、得られた混合物を２．５時間撹拌し、次いでＤＣＭで希釈し、減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させた。次に、活性化リンカー１７（０．７０ｇ、１．０２ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、Ｅｔ３Ｎ（０．５７ｍｌ、４．０６ｍｍｏｌ、４当量）を添加し、続いて乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）中のＴＦＡ塩を滴加した。得られた混合物を室温まで戻しながら３時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させた。次いで、この固体をトルエン（１２０ｍｌ）に懸濁させ、３時間にわたって９０℃に徐々に温めた。次に、混合物を減圧濃縮し、分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ−１８、ＭｅＣＮ／ＭｉｌｌｉＱ  ０．１％ｍ／ｍ  ＴＦＡ）によって精製した。収集した画分のアセトニトリルを蒸発させ、水分残留物をフリーズドライさせた。得られた固体をジオキサン／水（１８ｍｌ、２：１）に溶解させ、２回目にフリーズドライさせて、化合物７のＴＦＡ塩（０．５０ｇ、０．３７ｍｍｏｌ、３７％）を白色の固体として得た。
【０２３９】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.82 (3H, d, CH3,Val), 0.87 (3H, d, CH3,Val), 1.28 (3H, d, CH3,Ala), 1.93-1.98 (1H, m, β-HVal), 2.85 (3H, br s, Ar-CH3), 2.84-2.93 (3H, m, NCH3), 3.22 (3H, s, OCH3), 3.34-3.72 (27H, m, CHCl, NCH2, OCH2), 3.82-3.89 (2H, m, CHCl, α-CHVal), 4.03-4.06 (2H, m, CH2OC(O)NH), 4.40 (1H, t, α-CHAla), 4.48-4.50 (1H, m, H1), 4.65-4.69 (1H, m, H2), 4.95-5.05 (3H, m, H2, Ar-CH2), 6.89-6.97 (3H, m, CH=CH, H3''), 7.03 (1H, d, HC=CH), 7.17-7.58 (7H, m, H7, H8, H2''', H3''', NHVal), 7.67-7.83 (3H, m, H6, H7', H8'), 7.91 (2H, d, H2''), 8.13-8.15 (1H, m, NHAla), 8.28-8.39 (1H, m, H4), 8.84-8.88 (1H, m, H3'), 9.59, (1H, s, H5'), 9.96-10.00 (1H, m, NHPABA), 10.15-10.40 (1H, br s, OH), 10.33 (1H, s, , Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 18.5 (CH3,Val), 18.6 (CH3,Ala), 19.6 (CH3,Val), 22.8 (Ar-CH3), 30.8 (β-CHVal), 34.4, 35.2 (NCH3), 37.1, 37.4 ((C=O)2NCH2CH2), 44.8 (C1), 47.4, 47.6 (NCH2), 47.9 (CH2Cl), 49.4 (α-CHAla), 54.9 (C2), 58.5 (OCH3), 60.4 (α-CHVal), 63.9 (CH2OC(O)NH), 66.5 (Ar-CH2OC(O)N), 66.6 (Ar-CH2OC(O)N), 68.4, 68.5, 68.7 (OCH2, maleimide PEG), 69.3, 70.0, 70.2, 70.3, 71.7 (OCH2), 111.0 (C4), 115.6 (C3''), 116.4 (C7'), 117.9 (C5'), 119.4 (C3', C2'''), 121.2 (C6), 123.1 (C9b), 124.9 (C1''), 125.4 (C7), 126.4 (C8'), 126.5 (C5a) 128.8, 129.0 (C3'''), 129.1 (C6'), 130.2 (C9a), 130.4 (C2''), 131.1 (C8), 132.2 (C4'''), 133.5, 133.6 (C9), 134.9, 135.0 (HC=CH), 139.0 (C1'''), 139.1 (C2'), 140.4 (C8a'), 141.9 (C3a), 148.5 (Ar-OC(O)N), 154.1, 154.3 (C5), 155.8, 155.9 (Ar-CH2OC(O)N) 156.7 (OC(O)NH), 158.4, 158.8 (TFA), 161.5 (C4''), 165.9 (Ar-NHC(O)-Ar), 171.4 (C=OVal), 171.5 (C=Omaleimide), 171.5 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1347.53 [M+H]+, 実測値: 1347.84 [M+H]+。
【０２４０】
【化４１】
2019537622.tif 000047
【０２４１】
化合物１１（６３０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ、１当量）のジオキサン（６ｍｌ）溶液に、４Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサン（１５ｍｌ）を添加し、混合物を２時間撹拌した。次いで、混合物を濃縮し、減圧乾燥させた。次に、活性化化合物２４（５０３ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ、１．１当量）を乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、Ｅｔ３Ｎ（３０７μｌ、２．２０ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。次いで、ＨＣｌ塩（５ｍｌのＤＭＦに溶解させたもの）を滴加し、混合物を３時間撹拌し、室温に徐々に戻した。次に、混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製して、粗化合物８を得て、これを分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ−１８、ＭｅＣＮ／ＭｉｌｌｉＱ  ０．１％ｍ／ｍ  ＴＦＡ）によってさらに精製した。収集した画分のアセトニトリルを蒸発させ、水分残留物をフリーズドライさせた。得られた固体をジオキサン／水（１２ｍｌ、２：１）に溶解させ、２回目にフリーズドライさせて、リンカー−薬物化合物８のＴＦＡ塩（２１７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、２５％）を白色の固体として得た。
【０２４２】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.88 (3H, d, CH3,Val), 1.04 (3H, d, CH3,Val), 1.20-1.38 (2H, m, CH, Lys), 1.46-1.59 (2H, m, CH2,Lys), 1.61-1.81 (2H, m, CH2 Lys) , 2.26-2.32 (1H, m, β-HVal), 2.78 (6H, br s, N(CH3)2), 2.85 (3H, br s, ArCH3), 2.85-2.98 (3H, d, C(O)NCH3), 3.36-3.86 (17H, m,2 x CHCl, α-CHVal, CH2,Lys, 2 x NCH2, OCH2), 4.48-4.53 (2H, m, H1, α-CHLys), 4.63-4.69 (1H, m, H2), 4.97-5.08 (3H, m, H2, Ar-CH2), 6.92 (2H, d, H3''), 6.99 (2H, s, HC=CH), 7.19-7.58 (6H, m, , H7, H8, H2''', H3'''), 7.70-7.81 (3H, m, H6, H7', H8'), 7.92 (2H, d, H2''), 8.30-8.42 (1H, m, H4), 8.79-8.81 (1H, m, H3'), 8.94 (1H, d, NHLys), 9.56 (1H, s, H5'), 9.62 (1H, br s, OH), 10.14-10.22 (1H, m, NHPABA), 10.30 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 17.2 (CH3,Val), 19.7 (CH3,Val), 22.9 (Ar-CH3), 23.2 (CH2 Lys), 27.0 (β-CHVal), 28.1 (CH2 Lys), 31.8 (CH2 Lys), 34.4, 34.8, 35.2 (NCH3), 37.4 (CH2,Lys), 41.6, 41.9 (NCH3,Val), 44.8 (C1), 47.5, 47.7 (NCH2), 47.9 (CH2Cl), 53.7 (α-CHLys), 54.9 (C2), 60.7, 60.7 (CH2OH) 66.5 (ArCH2), 68.5, 69.1 (NCH2CH2O), 72.0 (α-CHVal), 72.7, 72.9 (OCH2), 111.0 (C4), 115.6 (C3''), 117.0 (C7'), 117.8 (C5'), 119.6 (C3', C2'''), 121.3 (C6), 123.0 (C9b), 125.0 (C1''), 125.0 (C7), 125.3 (C8'), 126.3, 126.4 (C5a), 128.8 (C6'), 128.8 (C3'''), 130.2 (C9a), 130.3 (C2''), 131.1 (C8), 132.5 (C4'''), 133.5 (C9), 134.9 HC=CH), 138.7 (C2', C1'''), 141.1 (C8a'), 142.1 (C3a), 148.5 (Ar-OC(O)N), 154.2, 154.4 (C5), 156.2 (Ar-CH2OC(O)N), 161.3 (NC=O), 161.5 (C4''), 165.8 (C=OVal), 165.9 (Ar-NHC(O)-Ar), 170.1 (C=OLys), 171.4 (C=Omaleimide)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1199.50 [M+H]+, 実測値: 1199.93 [M+H]+。
【０２４３】
【化４２】
2019537622.tif 000048
【０２４４】
化合物５１（２００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、１当量）の乾燥ＴＨＦ（５ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、クロロギ酸４−ニトロフェニル（７８ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＥｔ３Ｎ（２４５μｌ、１．７６ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、３０分間撹拌した。次いで、環化スペーサー４Ａ（ＷＯ２０１１／１３３０３９、例１（Ｓｙｎｔａｒｇａ）に記載される通りに合成したもの、１３８ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、１．５当量）の乾燥ＴＨＦ（３ｍｌ）溶液、およびＨＯＢｔ（６０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、得られた混合物を５０℃に２時間温めた。混合物を室温に冷却し、減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９３：７、ｖ／ｖ）によって精製して、化合物５２（２５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、８０％）を白色の固体として得た。
【０２４５】
1H NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 1.33-1.45 (9H, m, CH3,Boc), 2.86 (3H, s, Ar-CH3), 2.79-2.96 (3H, m, NCH3), 3.41(3H, s, OCH3), 3.39-3.80 (13H, m, CHCl, CH2OH, OCH2, NCH2), 3.84-3.91 (1H, m, CHCl), 4.50-4.55 (1H, m, H1), 4.62-4.73 (2H, m, H2, OH), 5.01-5.06 (1H, m, H2), 5.31 (2H, s, OCH2O), 7.18 (2H, d, H3''), 7.37-7.46 (2H, m, H7, H8), 7.68-7.89 (1H, m, H6), 7.97-8.06 (6H, m, H2', H3', H2''), 8.31-8.42 (1H, m, H4), 9.43 (1H, s, Htriazole), 10.41 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 22.8 (Ar-CH3), 28.5, 28.6 (CH3,Boc), 34.6 (NCH3), 44.6 (C1), 45.5, 46.0, 47.6 (NCH2), 48.1 (CH2Cl), 54.8 (C2), 56.3 (OCH3), 60.7, 60.7 (CH2OH), 68.5, 69.0, 72.7, 72.9 (OCH2), 79.1 (CBoc), 94.2 (OCH2O), 110.8, 110.9 (C4), 116.1 (C3''), 121.2 (C6), 121.4, 121.5 (C2', C3'), 123.2 (C9b), 125.4 (C7), 125.5 (C1''), 126.5 (C5a), 127.6 (CHtriazole), 130.1 (C2''), 130.3 (C9a), 131.2 (C8), 131.9 (C4'), 133.5 (C9), 140.7 (C1'), 141.8 (C3a), 145.0 (CTriazole), 148.6 (Ar-OC(O)N), 154.3 (C5), 155.2 (C=OBoc), 159.3 (NC(O)C), 160.0 (C4''), 165.6 (Ar-NHC(O)-Ar)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 886.35 [M+H]+, 実測値: 886.68 [M+H]+。
【０２４６】
化合物５２（１２５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１当量）のジオキサン（２ｍｌ）溶液を４Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサン（８ｍｌ）で希釈し、室温で１０分間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、ＤＣＭと共蒸発させ、減圧乾燥させた。得られたＨＣｌ塩を乾燥ＤＭＦ（２．５ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、続いて活性化化合物５０（１４２ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＥｔ３Ｎ（３９μｌ、０．２８ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。混合物を室温に戻しながら１．５時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、化合物９を得て、これを分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ−１８、ＭｅＣＮ／ＭｉｌｌｉＱ  ０．１％ｍ／ｍ  ＴＦＡ、勾配）によってさらに精製した。アセトニトリルを蒸発させ、水性残留物をフリーズドライさせ、得られた固体をジオキサン／水に溶解させ、フリーズドライさせて、リンカー−薬物化合物９のＴＦＡ塩（５７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、３２％）を白色の固体として得た。
【０２４７】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.82 (3H, d, CH3,Val), 0.86 (3H, d, CH3,Val), 1.29 (3H, d, CH3,Ala), 1.89-2.02 (1H, m, β-HVal), 2.85 (3H, br s, ArCH3), 2.83-2.99 (3H, m, NCH3), 3.20-3.80 (20H, m, CHCl, CH2OH, OCH2, NCH2), 3.82-3.90 (2H, m, CHCl, α-CHVal), 3.98-4.03 (2H, m, CH2OC(O)NH), 4.40 (1H, t, α-CHAla), 4.49-4.55 (1H, m, H1), 4.67-4.73 (1H, m, H2), 4.95-5.07 (3H, m, H2, Ar-CH2), 6.90 (2H, d, H3''), 7.00 (2H, s, HC=CH), 7.15-7.58 (7H, m, H7, H8, H2''', H3''', NHVal), 7.69-7.83 (1H, m, H6), 7.90 (2H, d, H2''), 7.97-8.05 (4H, m, H2', H3'), 8.13 (1H, d, NHAla), 8.30-8.42 (1H, m, H4), 9.37-9.42 (1H, m, Htriazole), 9.88-10.02 (1H, m, NHPABA), 10.19 (1H, br s, Ar-OH), 10.30 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 18.5 (CH3,Val, CH3,Ala), 19.6 (CH3,Val), 22.8 (Ar-CH3), 30.8 (β-CHVal), 35.2 (NCH3), 37.1 ((C=O)2NCH2CH2), 44.6 (C1), 47.7 (NCH2), 48.1 (CHCl), 49.4 (α-CHAla), 54.8 (C2), 60.4 (α-CHVal), 60.7, 60.7 (CH2OH), 63.8 (CH2OC(O)NH), 66.6 (Ar-CH2OC(O)N), 68.4, 68.8, 68.9, 72.7, 72.9 (OCH2), 110.8 (C4), 115.5 (C3''), 119.4 (C2'''), 121.3 (C6), 121.5 (C2', C3'), 123.2 (C9b), 125.4 (C7), 125.5 (C1''), 126.4 (C5a), 127.7 (CHtriazole), 128.8, 129.0 (C3'''), 130.2 (C9a), 130.3 (C2''), 131.1 (C8), 131.7 (C4'), 132.2 (C4'''), 133.5 (C9), 135.0 (HC=CH), 139.0 (C1'''), 140.8 (C1'), 141.8 (C3a), 145.0 (CTriazole), 148.6 (Ar-OC(O)N), 154.2 (C5), 154.4 (Ar-CH2OC(O)N), 156.6 (OC(O)NH), 159.3 (NC(O)C), 161.3 (C4''), 165.8 (Ar-NHC(O)-Ar), 171.3 (C=OVal), 171.4 (C=Omaleimide), 171.5 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1272.48 [M+H]+, 実測値: 1272.57 [M+H]+。
【０２４８】
【化４３】
2019537622.tif 000049
【０２４９】
化合物５２（２００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）、マレイミド（２９ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、１．３当量）、およびトリフェニルホスフィン（７７ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、１．３当量）を乾燥ＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、ＤＥＡＤ（トルエン中２．２Ｍ、１３３μｌ、０．２９ｍｍｏｌ、１．３当量）を滴加した。混合物を室温で１００分間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から９７：３、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、化合物５３（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、４６％）を橙色の泡状物として得た。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 965.36 [M+H]+, 実測値: 965.70 [M+H]+。
【０２５０】
化合物５３（８０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１当量）のクロロホルム（２ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＴＦＡ（２ｍｌ）で希釈し、３時間撹拌した。次いで混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、減圧乾燥させた。得られたＴＦＡ塩を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、活性化化合物１９（４８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＥｔ３Ｎ（５８μｌ、０．４１ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、混合物を２時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、粗化合物１０を得て、これを分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ−１８、ＭｅＣＮ／ＭｉｌｌｉＱ  ０．１％ｍ／ｍ  ＴＦＡ）によってさらに精製した。ＭｅＣＮを蒸発させ、水性残留物をフリーズドライさせ、得られた固体をジオキサン／水（６ｍｌ、２：１）に溶解させ、フリーズドライさせて、リンカー−薬物化合物１０のＴＦＡ塩（３３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、３４％）を白色の固体として得た。
【０２５１】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.94 (3H, d, CH3,Val), 1.11 (3H, d, CH3,Val), 1.42 (3H, d, CH3,Ala), 2.28-2.36 (1H, m, β-HVal), 2.82 (6H, br s, N(CH3)2), 2.91 (3H, br s, ArCH3), 2.90-3.02 (3H, d, C(O)NCH3), 3.38-3.80 (14H, m, CHCl, α-CHVal, NCH2, OCH2), 3.89-3.94 (1H, m, CHCl), 4.55-4.63 (2H, m, H1, α-CHAla), 4.71-4.79 (1H, m, H2), 5.03-5.12 (3H, m, H2, Ar-CH2), 6.96 (2H, d, H3''), 7.01 (1H, d, CH=CH), 7.08 (1H, d, CH=CH), 7.23-7.64 (6H, m, H7, H8, H2''', H3'''), 7.72-7.83 (1H, m, H6), 7.96 (2H, d, H2''), 8.03-8.11 (4H, m, H2', H3'), 8.36-8.45 (1H, m, H4), 9.02 (1H, d, NHAla), 9.42-9.48 (1H, m, Htriazole), 9.61 (1H, br s, CN(CH3)2H+ CF3COO-), 10.16-10.28 (2H, m, NHPABA, OH), 10.36 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 17.1 (CH3,Val), 18.6 (CH3,Ala), 19.7 (CH3,Val), 22.8 (Ar-CH3), 27.0 (β-CHVal), 34.5, 34.8 (NCH3), 37.2, 37.4 ((C=O)2NCH2CH2), 41.5 (NCH3,Val), 42.2 (NCH3,Val), 44.6 (C1), 45.9, 46.4, 47.4 (NCH2), 48.0 (CH2Cl), 49.8 (α-CHAla), 54.8 (C2), 66.5 (Ar-CH2OC(O)N), 67.5, 68.4, 68.7 (OCH2), 72.0 (α-CHVal), 110.9 (C4), 115.5 (C3''), 119.5 (C2'''), 121.3 (C6), 121.3, 121.5 (C2', C3'), 123.1 (C9b), 125.4 (C7), 125.5 (C1''), 126.4 (C5a), 127.7 (CHtriazole), 128.8, 129.0 (C3'''), 130.2 (C9a), 130.3 (C2''), 131.1 (C8), 131.7 (C4'), 132.4 (C4'''), 133.6 (C9), 134.9, 135.0 (HC=CH), 138.8 (C1'''), 140.9 (C1'), 141.8 (C3a), 145.0 (Ctriazole), 148.5 (Ar-OC(O)N), 154.1, 154.3 (C5), 155.7, 156.1 (Ar-CH2OC(O)N), 159.3 (NC(O)C), 161.3 (C4''), 165.4 (C=OVal), 165.9 (Ar-NHC(O)-Ar), 170.7 (C=OAla), 171.4 (C=Omaleimide)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1168.47 [M+H]+, 実測値: 1168.79 [M+H]+。
【０２５２】
【化４４】
2019537622.tif 000050
【０２５３】
化合物３４（１４０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１当量）のクロロホルム（４ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＴＦＡ（２ｍｌ）を添加し、続いて混合物を１時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、減圧乾燥させた。別に、化合物３５（１５２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＴＨＦ（３ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、クロロギ酸４−ニトロフェニル（５９ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＥｔ３Ｎ（１８６μｌ、１．３３ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、１５分間撹拌した。次いでＨＯＢｔ（４１ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１当量）および（脱保護された化合物３４の）ＴＦＡ塩／ＴＨＦ（３ｍｌ）をこの溶液に添加し、これを５０℃に１時間温めた。粗混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮した。残った固体をクロロホルム（３ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、ＴＦＡ（３ｍｌ）を添加し、２時間撹拌した。次いで減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、勾配）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して粗生成物３６を得て、これを分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ−１８、ＭｅＣＮ／ＭｉｌｌｉＱ  ０．１％ｍ／ｍ  ＴＦＡ）によって精製した。アセトニトリルを蒸発させ、水性残留物をフリーズドライさせ、得られた固体をジオキサン／水（６ｍｌ、２：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、フリーズドライさせて、リンカー−薬物化合物３６のＴＦＡ塩（６５ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、２５％）を白色の固体として得た。
【０２５４】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.87 (3H, dd, CH3,Val), 1.02 (3H, dd, CH3,Val), 1.26-1.33 (3H, m, CH3,Ala), 2.22-2.30 (1H, m, β-HVal), 2.76 (6H, br s, N(CH3)2), 2.85 (3H, br s, ArCH3), 3.26-3.77 (14H, CHCl, α-CHVal, NCH2, OCH2), 3.84 (1H, d, CHCl), 4.36-4.46 (1H, m, α-CHAla), 4.49 (1H, t, H1), 4.68 (1H, t, H2), 5.09 (1H, d, H2), 6.91 (2H, d, H3''), 6.95 (1H, s, HC=CH), 7.05 (1H, s, HC=CH), 7.32-7.39 (1H, m, H7), 7.40-7.46 (1H, m, H8), 7.66-7.72 (1H, m, H8'), 7.75-7.83 (2H, m, H6, H7'), 7.91 (2H, d, H2''), 8.25-8.44 (2H, m, H4, (C=O)NH-CH2), 8.78 (1H, s, H3'), 8.86 (1H, d, NHAla), 9.54 (1H, s, H5'), 9.57 (1H, br s, OH), 10.28 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 17.1, 17.1 (CH3,Val), 18.8, 18.9 (CH3,Ala), 19.6, 19.6 (CH3,Val), 22.9 (Ar-CH3), 26.9, 26.9 (β-CHVal), 37.1, 37.3 ((C=O)2NCH2CH2), 38.1 (CH2NH), 41.5 (NCH3,Val), 42.1 (NCH3,Val), 44.7 (C1), 47.4, 47.7 (NCH2), 48.0 (CH2Cl), 48.2 (NCH2), 49.0 (α-CHAla), 55.0 (C2), 68.3, 68.5, 68.7, 68.9 (OCH2, maleimide PEG), 72.0 (α-CHVal), 111.0, 111.1 (C4), 115.6 (C3''), 117.3 (C7'), 117.7 (C5'), 119.3 (C3'), 121.3, 121.4 (C6), 122.9, 123.0 (C9b), 124.7 (C8'), 125.0 (C1''), 125.2 (C7), 126.4, 126.4 (C5a) 128.6 (C6'), 130.2 (C9a), 130.3 (C2''), 131.1 (C8), 133.5, 133.5 (C9), 134.9, 135.0 (HC=CH), 139.3 (C2'), 141.3 (C8a'), 142.2 (C3a), 148.5, 148.6 (Ar-OC(O)N), 154.1, 154.3 (C5), 161.4 (NC=O), 161.6 (C4''), 165.2 (C=OVal), 165.9 (Ar-NHC(O)-Ar), 171.4 (C=Omaleimide), 172.0, 172.1 (C=OAla)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 978.39 [M+H]+, 実測値: 978.70 [M+H]+。
【０２５５】
【化４５】
2019537622.tif 000051
【０２５６】
化合物６２（６０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、１当量）のＤＣＭ（２ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＴＦＡ（２ｍｌ）で希釈し、混合物を２時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、減圧乾燥させた。次に、化合物６１（６４ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、１．１当量）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、Ｅｔ３Ｎ（３６ｍｌ、０．２６ｍｍｏｌ、４当量）を添加し、続いてＴＦＡ塩（１ｍｌのＤＭＦに溶解させたもの）を滴加した。得られた混合物を２時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して中間体６３を得た。  
(MS (ESI) m/z; 計算値: 1563.62 [M+H]+, 実測値: 1563.31 [M+H]+)。
【０２５７】
中間体６３（３０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、１当量）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解させ、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１１ｍｇ、９．６μｍｏｌ、０．５当量）、続いて２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン（２８ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１０当量）を添加し、混合物を室温で３時間、窒素雰囲気下で撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して粗生成物６４を得て、これを分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ−１８、ＭｅＣＮ／ＭｉｌｌｉＱ  ０．１％ｍ／ｍ  ＴＦＡ）によってさらに精製した。ＭｅＣＮを蒸発させ、水性残留物をフリーズドライさせ、得られた固体をジオキサン／水（６ｍｌ、２：１）に溶解させ、フリーズドライさせて、リンカー−薬物化合物６４のＴＦＡ塩（６ｍｇ、３．９μｍｏｌ、２０％）を白色の固体として得た。
【０２５８】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 0.87 (3H, m, CH3,Val), 1.05 (3H, m, CH3,Val), 1.34-1.39 (3H, m, CH3,Ala), 2.24-2.33 (1H, br s, β-HVal), 2.76 (6H, br s, N(CH3)2,Val), 2.84 (3H, s, ArCH3), 2.82-2.97 (6H, m, NCH3), 3.30-3.96 (26H, m, CH2Cl, CH2N, CH2O), 4.43-4.49 (1H, m, H1), 4.50-4.59 (1H, m, α-CHAla), 4.60-4.69 (1H, m, H2), 4.92-5.12 (5H, m, H2, ArCH2,PABA, ArCH2), 6.86-7.04 (6H, m, HC=CH, H3'', H2'''), 7.22-7.43 (6H, m, H7, H8, H3''', H3''''), 7.49-7.76 (5H, m, H6, H7', H8', H2''''), 7.90 (2H, d, H2''), 8.30-8.38 (1H, m, H4), 8.71 (1H, br s, H3'), 8.96 (1H, d, NHAla), 9.46-9.57 (2H, m, H5', OH), 1.13-10.26 (3H, m, NHPABA, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 17.1 (CH3,Val), 18.6 (CH3,Ala), 19.6 (CH3,Val), 22.9 (Ar-CH3), 27.0 (β-CHVal), 35.2 (NCH3), 37.2, 37.4 ((C=O)2NCH2CH2), 41.5, 42.2 (NCH3,Val), 44.7 (C1), 46.0, 46.7, 47.4 (NCH2), 47.9 (CH2Cl), 49.8 (α-CHAla), 55.0 (C2), 60.7 (CH2OH), 66.3 (Ar-CH2OC(O)N), 67.6, 68.4, 68.6, 69.1 (OCH2), 72.0 (α-CHVal), 72.7 (OCH2), 111.1 (C4), 115.5 (C3''), 117.7 (C5', C7'), 119.6 (C3', C2''''), 121.2 (C6), 122.1 (C2'''), 122.9 (C9b), 124.0 (C8'), 125.1 (C1''), 125.2 (C7), 126.3 (C5a), 128.3 (C6'), 128.9, 129.1 (C3''', C3''''), 130.3 (C2''), 131.0 (C8), 131.7 (C9a), 132.4 (C4''', C4''''), 133.5 (C9), 134.9, 135.0 (HC=CH), 138.9 (C1''''), 140.4 (C2'), 141.7 (8a'), 142.3 (C3a), 148.5 (Ar-OC(O)N), 151.1 (C1'''), 154.1, 154.3 (C5), 155.9, 156.1 (Ar-CH2OC(O)N), 161.4 (C4''), 162.1 (NC=O), 165.4 (C=OVal), 165.9 (Ar-NHC(O)-Ar), 170.7 (C=OAla), 171.4 (C=Omaleimide)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1479.60 [M+H]+, 実測値: 1480.86 [M+H]+。
【０２５９】
【化４６】
2019537622.tif 000052
【０２６０】
化合物６２（１１０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１当量）のクロロホルム（３ｍｌ）溶液を氷浴中で０℃に冷却し、ＴＦＡ（３ｍｌ）で希釈し、３時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、トルエンと共蒸発させ、減圧乾燥させた。次いで、得られたＴＦＡ塩を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、活性化リンカー６８（６５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＥｔ３Ｎ（３３μｌ、０．２３ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、混合物を３時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して粗化合物６９を得て、これを分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ−１８、ＭｅＣＮ／ＭｉｌｌｉＱ  ０．１％ｍ／ｍ  ＴＦＡ）によって精製した。アセトニトリルを蒸発させ、水性残留物をフリーズドライさせ、得られた固体をジオキサン／水（６ｍｌ、２：１）に溶解させ、フリーズドライさせると、リンカー−薬物化合物６９のＴＦＡ塩（２８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、２１％）を白色の固体として得た。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1155.43 [M+H]+, 実測値: 1155.65 [M+H]+。
【０２６１】
【化４７】
2019537622.tif 000053
【０２６２】
化合物１１（７５ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、１当量）のジオキサン（２ｍｌ）溶液を４Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサン（６ｍｌ）で希釈し、２時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、減圧乾燥させた。得られたＨＣｌ塩をＤＭＡ（２ｍｌ）に溶解させ、氷浴中で０℃に冷却し、化合物７３（５６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＥｔ３Ｎ（２４μｌ、０．１７ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、混合物を１．５時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１：０から７：３、ｖ／ｖ）によって精製し、生成物を含有する画分を合わせ、減圧濃縮して、粗化合物７４を得て、これを分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ−１８、ＭｅＣＮ／ＭｉｌｌｉＱ  ０．１％ｍ／ｍ  ＴＦＡ）によって精製した。アセトニトリルを蒸発させ、水性残留物をフリーズドライさせた。得られた固体をジオキサン／水（６ｍｌ、２：１）に溶解させ、フリーズドライさせて、リンカー−薬物化合物７４（２６ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、２７％）を白色の固体として得た。
【０２６３】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 1.15-1.28 (2H, m, CH, Lys), 1.37-1.69 (4H, m, 2 x CH2,Lys), 1.86 (3H, s, CH3,Acetyl), 2.85 (3H, br s, ArCH3), 2.85-3.00 (3H, d, NCH3), 3.37 (2H, t, (C=O)2NCH2,Lys), 3.36-4.05 (17H, m, CHCl, NCH2, OCH2), 4.29-4.36 (1H, m, α-CHLys), 4.46-4.52 (1H, m, H1), 4.64-4.70 (1H, m, H2), 4.96-5.07 (3H, m, H2, Ar-CH2), 6.92 (2H, d, H3''), 6.98 (2H, s, HC=CH), 7.15-7.59 (6H, m, , H7, H8, H2''', H3'''), 7.69-7.82 (3H, m, H6, H7', H8'), 7.92 (2H, d, H2''), 8.10 (1H, d, NHLys), 8.30-8.42 (1H, m, H4), 8.84 (1H, br s, H3'), 9.57 (1H, s, H5'), 9.96-10.04 (1H, m, NHPABA), 10.24 (1H, br s, OH), 10.30 (1H, s, Ar-NHC(O)-Ar)。  
13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 22.9 (Ar-CH3), 23.2 (CH2 Lys), 28.2 (CH2 Lys), 30.9 (CH3,Acetyl), 32.0 (CH2 Lys), 34.4, 35.0, 35.3 (NCH3), 37.4 ((C=O)2NCH2,Lys), 44.8 (C1), 46.7, 47.5, 47.7 (NCH2), 47.9 (CH2Cl), 53.7 (α-CHLys), 54.9 (C2), 60.7, 60.7 (CH2OH), 66.5 (ArCH2), 68.5, 69.1 (OCH2), 72.7, 72.9 (OCH2), 111.0 (C4), 115.6 (C3''), 116.8 (C7'), 117.9 (C5'), 119.6 (C3', C2'''), 121.3 (C6), 123.1 (C9b), 125.0 (C1''), 125.4 (C7, C8'), 126.3 (C6'), 126.5 (C5a), 128.7 (C3'''), 130.2 (C9a), 130.3 (C2''), 131.1 (C8), 132.2 (C4'''), 133.5, 133.6 (C9), 134.9 (HC=CH), 138.9 (C1'''), 140.9 (C2', C8a'), 142.0 (C3a), 148.5 (Ar-OC(O)N), 154.2, 154.4 (C5), 156.3 (Ar-CH2OC(O)N), 161.4 (NC=O), 161.5 (C4''), 165.9 (Ar-NHC(O)-Ar), 169.9 (C=OAcetyl), 171.3 (C=OLys), 171.4 (C=Omaleimide)。  
MS (ESI) m/z; 計算値: 1114.41 [M+H]+, 実測値: 1114.66 [M+H]+。
【０２６４】
部位特異的および野生型コンジュゲーションのプロトコル
部分的に還元された内在性ジスルフィドを介するコンジュゲーションの一般的なコンジュゲーションプロトコル（野生型（ｗｔ）コンジュゲーション）
抗体の溶液（５〜１０ｍｇ／ｍｌ、４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース中、ｐＨ６）をＥＤＴＡ（２５ｍＭ／水、４％ｖ／ｖ）で希釈した。ＴＲＩＳ（１Ｍ／水、ｐＨ８）を使用してｐＨを約７．４に調整し、その後ＴＣＥＰ（１０ｍＭ／水、抗体および所望のＤＡＲに応じて１〜３当量）を添加し、得られた混合物を室温で１〜３時間インキュベートした。ＤＭＡ、続いてリンカー−薬物の溶液（１０ｍＭ／ＤＭＡ）を添加した。ＤＭＡの最終濃度は５〜１０％であった。得られた混合物を室温で光の非存在下で１〜１６時間インキュベートした。過剰なリンカー−薬物を除去するために活性炭を添加し、混合物を室温で１時間インキュベートした。０．２μｍのＰＥＳフィルタを使用して活性炭を除去し、得られたＡＤＣを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（３０ｋＤａカットオフ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中に調合した。最後に、０．２２μｍのＰＥＳフィルタを使用してＡＤＣ溶液を滅菌ろ過した。
【０２６５】
一般的な部位特異的コンジュゲーションプロトコル
プロトコルＡまたはプロトコルＢの何れかに記載する通りの手順に従って部位特異的コンジュゲートを合成した。
【０２６６】
１）プロトコルＡ
システイン改変抗体の溶液（５〜１０ｍｇ／ｍｌ、４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース中、ｐＨ６）をＥＤＴＡ（２５ｍＭ／水、４％ｖ／ｖ）で希釈した。ＴＲＩＳ（１Ｍ／水、ｐＨ８）を使用してｐＨを約７．４に調整し、その後ＴＣＥＰ（１０ｍＭ／水、２０当量）を添加し、得られた混合物を室温（ＲＴ）で１〜３時間インキュベートした。ＰＤ−１０脱塩カラム、または４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６を使用した遠心濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎフィルタ、３０ｋＤａカットオフ、ＰＥＳ）の何れかによって過剰なＴＣＥＰを除去した。
【０２６７】
ＴＲＩＳ（１Ｍ／水、ｐＨ８）を使用して、得られた抗体溶液のｐＨを約７．４に上げ、その後デヒドロアスコルビン酸（１０ｍＭ／水、２０当量）を添加し、得られた混合物を室温で１〜２時間インキュベートした。室温または３７℃で、ＤＭＡ、続いてリンカー−薬物の溶液（１０ｍＭ／ＤＭＡ）を添加した。ＤＭＡの最終濃度は５〜１０％であった。得られた混合物を室温または３７℃で光の非存在下で１〜１６時間インキュベートした。過剰なリンカー−薬物を除去するために活性炭を添加し、混合物を室温で１時間インキュベートした。０．２μｍのＰＥＳフィルタを使用して活性炭を除去し、得られたＡＤＣを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（３０ｋＤａカットオフ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中に調合した。最後に、０．２２μｍのＰＥＳフィルタを使用してＡＤＣ溶液を滅菌ろ過した。
【０２６８】
２）プロトコルＢ
システイン改変抗体の溶液（５００μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍＭヒスチジン、５０ｍＭスクロース、０．０１％ポリソルベート−２０中、ｐＨ６）を１００ｍＭヒスチジン、ｐＨ５（１３００μｌ）で希釈した。２−（ジフェニルホスフィノ）ベンゼンスルホン酸（ＤＰＰＢＳ）（４２６μｌ、１０ｍＭ／水、３２当量）を添加し、得られた混合物を室温で１６〜２４時間インキュベートした。４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６を使用した遠心濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎフィルタ、３０ｋＤａカットオフ、ＰＥＳ）によって過剰なＤＰＰＢＳを除去した。
【０２６９】
ＴＲＩＳ（１Ｍ／水、ｐＨ８）を使用して、得られた抗体溶液のｐＨを約７．４に上げた。室温または３７℃で、ＤＭＡ、続いてリンカー−薬物の溶液（１０ｍＭ／ＤＭＡ）を添加した。ＤＭＡの最終濃度は５〜１０％であった。得られた混合物を室温または３７℃で光の非存在下で１〜１６時間インキュベートした。過剰なリンカー−薬物を除去するために活性炭を添加し、混合物を室温で１時間インキュベートした。０．２μｍのＰＥＳフィルタを使用して活性炭を除去し、得られたＡＤＣを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（３０ｋＤａカットオフ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭヒスチジン、５０ｍＭトレハロース、ｐＨ６中に調合した。最後に、０．２２μｍのＰＥＳフィルタを使用してＡＤＣ溶液を滅菌ろ過した。
【０２７０】
上の一般的なコンジュゲーション手順を使用して、本発明のリンカー−薬物およびｖｃ−ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ（ＳＹＤ９８０、リンカー−薬物化合物１）リンカー−薬物をベースとする、システイン改変ＡＤＣおよび野生型ＡＤＣを合成し、分析疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、およびシールド型疎水性相クロマトグラフィー（ＳＨＰＣ）を使用して特性評価した。
【０２７１】
分析ＨＩＣから明白になった通りに、様々なＡＤＣのＤＡＲ２種についての保持時間（ＲＴ）には差があった（表１Ａおよび１Ｂ）。最も興味深いことに、非線状エキソリンカーを通して薬物を抗体にコンジュゲートさせると、公知の線状リンカーを介してコンジュゲートされた薬物と比較して保持時間の（劇的な）減少が生じた。この減少は、薬物が抗体のより近くに位置していた、すなわちリンカー中の薬物と抗体との間の原子の数がより小さい非線状エキソリンカーを含むＡＤＣにおいて、より顕著であった（原子の数は、リンカー−薬物化合物３の７個からリンカー−薬物化合物６の１６個まで増加する）。
【０２７２】
ＷＯ２０１５／１７７３６０に示される通りに、抗体のＦａｂキャビティまたはＦｃキャビティの内側の特定の部位でリンカー−薬物をコンジュゲートさせると、部分的に還元された内在性ジスルフィドを介してコンジュゲートされたＡＤＣと比較して、保持時間が減少する。本発明のリンカー−薬物をこれらの特定の部位でコンジュゲートさせると、保持時間がさらに低減した。すなわち、コンジュゲートされている抗体とコンジュゲートされていない抗体との間の疎水性の差がさらに小さくなった。
【０２７３】
この効果をさらに定量化するために、相対的疎水性という用語を導入する。これは、以下のように定義される：
（ＲＴＤＡＲ２−ＲＴＤＡＲ０）／（ＲＴＤＡＲ２、参照−ＡＤＣ−ＲＴＤＡＲ０、参照−ＡＤＣ）
要するに、相対的疎水性は、リンカーが線状リンカーであるリンカー−薬物を含むＡＤＣの疎水性と非線状エキソリンカーを有するリンカー−薬物を含むＡＤＣの疎水性との間の容易な比較を可能にする、ＨＩＣデータに基づいた尺度である。データを表１Ａおよび１Ｂにまとめる。
【０２７４】
【表４】
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【０２７５】
図２は、表１Ａのデータをグラフで示す。ＡＤＣの（相対的）疎水性は、リンカーの長さと共に増大する。すなわち、抗体のＳ原子と薬物のＯ原子との間の原子の数が少なくなると、（相対的）疎水性が低くなる。リンカー−薬物化合物３を有するＡＤＣは、最も低い相対的疎水性を示す。リンカー−薬物化合物７を有するＡＤＣは、リンカー−薬物化合物１を有する比較ＡＤＣより低い相対的疎水性を有するが、リンカー−薬物化合物７の開裂部位に結合した極性ＰＥＧ基は、同様のリンカーを有するがＰＥＧ基がないリンカー−薬物化合物４を含むＡＤＣと比較すると、ＡＤＣの相対的疎水性をさらに減少させることはない。
【０２７６】
【表５】
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【０２７７】
図３Ａ〜Ｃおよび図４は、表１Ｂのデータをグラフで示す。  
図３Ａでは、水平軸のリンカー−薬物は、リンカー−薬物の疎水性が高いものから順に配置されている。比較ＡＤＣは、線状リンカー−薬物化合物１にコンジュゲートされた同じ野生型またはシステイン改変抗体を有するＡＤＣである。本発明のリンカー−薬物を有するＡＤＣの（相対的）疎水性は、比較ＡＤＣに対して減少している。この疎水性の減少は、リンカー−薬物がＦａｂキャビティ内に位置するシステインでコンジュゲートされているＡＤＣにおいて、より顕著である。
【０２７８】
図３Ｂでは、本発明のリンカー−薬物および参照リンカー−薬物１を含む、ｗｔコンジュゲートＰＳＭＡ  ＡＤＣの疎水性を参照値としている。このグラフは、１つの抗体における様々なリンカー−薬物間の差をより明らかに視覚化している。とりわけ、Ｆａｂキャビティ内に位置するシステインでコンジュゲートされているリンカー−薬物を含むＡＤＣに関して、線状参照リンカー−薬物化合物１を有するＡＤＣと比較して、本発明のリンカー−薬物を有するＡＤＣには、相対的疎水性に比較的大きな差がある。
【０２７９】
図３Ｃは、参照ＡＤＣであるＰＳＭＡ−ＬＤ１に対する、様々なコンジュゲートの相対的疎水性の差を示す。本発明の同じリンカー−薬物をＦａｂキャビティ内に位置するシステインで含む様々な抗体間の差は小さいが、線状参照リンカー−薬物化合物１を含む同じ抗体に対して有意な減少が観察される。よって、Ｆａｂキャビティの潜在的遮断効果は、非線状リンカーおよび本発明のリンカー−薬物との組み合わせにおいて最適に使用される。
【０２８０】
図４は、参照のネイキッド抗体ＰＳＭＡ−ＨＣ４１に対する様々なコンジュゲートの相対的疎水性の差を示すＨＩＣクロマトグラムである。本発明のリンカー−薬物を有するＡＤＣの（相対的）疎水性は、ネイキッド抗体に対して増大している。しかし、この増大は、抗体と薬物との間の距離が小さくなると、すなわち抗体のＳ原子と薬物のＯ原子との間の原子の数が小さくなると、小さくなる。
【０２８１】
細胞結合
３種の抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣ、ＰＳＭＡ−ＬＤ１、ＰＳＭＡ−ＨＣ４１−ＬＤ１、および比較ＰＳＭＡ−ＨＣ１２０−ＬＤ１は、ＰＳＭＡを発現するＬＮＣａＰ−Ｃ４．２細胞に対して野生型抗体と同様の等しい結合親和性を有し（０．１〜０．２μｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ５０）、３種すべてのＡＤＣがＰＳＭＡ−陰性ＤＵ−１４５細胞と結合できなかった（ＥＣ５０＞１０μｇ／ｍｌ）。
【０２８２】
２種の抗５Ｔ４  ＡＤＣ、Ｈ８−ＬＤ１およびＨ８−ＨＣ４０−ＬＤ１は、５Ｔ４を発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対してＨ８抗体と同様の等しい結合親和性を有し（０．１〜１．２μｇ／ｍｌの範囲内のＥＣ５０）、両方のＡＤＣが５Ｔ４−陰性ＳＫ−ＭＥＬ−３０細胞と結合できなかった（ＥＣ５０＞１０μｇ／ｍｌ）。
【０２８３】
よって、ＡＤＣの結合は、結合したデュオカルマイシン誘導体リンカー−薬物によって影響されなかった。
【０２８４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性
ＰＳＭＡを発現するＬＮＣａＰ−Ｃ４．２細胞に対する本発明の非線状リンカー−薬物を含む抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣの効力（０．２〜２．１ｎＭの範囲内のＩＣ５０、薬物当量に基づく、下の表２Ａを参照されたい）は、野生型でも部位特異的にコンジュゲートされたものでも、線状参照リンカー−薬物化合物１を含むそれぞれの比較抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣの効力と同様であった。
【０２８５】
すべてのＡＤＣはＰＳＭＡ−陰性ＤＵ−１４５細胞に対して不活性であり（ＩＣ５０＞７０ｎＭ）、ＰＳＭＡを通した腫瘍細胞の選択的殺傷を示した。
【０２８６】
４種の野生型および部位特異的な非結合対照ＡＤＣは、本発明の非線状リンカー−薬物を含むそれぞれの抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣより少なくとも１５倍効力が低かった。
【０２８７】
【表６】
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【０２８８】
本発明のリンカー−薬物を含む野生型抗ＨＥＲ２  ＡＤＣの効力は、ＨＥＲ２を発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞に対してＡＤＣトラスツズマブ−ＬＤ１と同様であった（０．１〜０．３ｎＭのＩＣ５０、表２Ｂ）。抗ＨＥＲ２  ＡＤＣはＨＥＲ２−陰性ＳＷ６２０細胞に対して不活性であった（ＩＣ５０＞１００ｎＭ）。
【０２８９】
３種の非結合対照ＡＤＣは抗ＨＥＲ２  ＡＤＣより少なくとも２００倍効力が低かった。
【０２９０】
【表７】
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【０２９１】
総合的に、これらのデータは、本発明のリンカー−薬物化合物を含むＡＤＣが優れた腫瘍細胞殺傷効力を有することを示している。その上、前記リンカー−薬物をＦａｂ部分の可変領域内に部位特異的に連結しても、開裂後に同じデュオカルマイシン薬物単位を放出する線状の比較リンカー−薬物化合物１の部位特異的連結と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性に何も影響を及ぼさない。
【０２９２】
腫瘍異種移植動物モデル
４種の抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性をＬＮＣａＰ−Ｃ４．２前立腺癌異種移植モデルで評価した。ＬＮＣａＰ−Ｃ４．２細胞株は、親であるアンドロゲン依存性ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ異種移植細胞株の去勢誘導後退および再燃後にマウスにおいて連続的に増殖させた異種移植から誘導されたヒト前立腺癌上皮細胞株である。
【０２９３】
マトリゲル（５０：５０、ｖ：ｖ）を含有する２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０中のＬＮＣａＰ−Ｃ４．２細胞１×１０７個をＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスの右脇腹に注射することによって、腫瘍を皮下誘導した。ＬＮＣａＰ−Ｃ４．２腫瘍細胞の移植は、γ線源（１．４４Ｇｙ、６０Ｃｏ、ＢｉｏＭｅｐ、Ｂｒｅｔｅｎｉｅｒｅｓ、フランス）での全身照射の２４〜７２時間後に行った。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３の平均体積に達したときに処置を開始した。マウスをそれらの個々の腫瘍体積に従って無作為に群に分け、２ｍｇ／ｋｇ（図５Ａ）または５ｍｇ／ｋｇ（図５Ｂ）の抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣまたはビヒクルを尾静脈内に１回皮下注射した。腫瘍体積の変化をモニタリングした。４種すべてのＡＤＣの平均ＤＡＲはおよそ１．６〜１．８である。
【０２９４】
すべての群で悪液質が観察され、４つの群の間で体重に及ぼす影響に有意差は観察されなかった。
【０２９５】
図５Ａおよび５Ｂは、ＰＳＭＡ−Ｈ４１Ｃ−ＬＤ４、−ＬＤ７、および−ＬＤ８  ＡＤＣがＰＳＭＡ−Ｈ４１Ｃ−ＬＤ１  ＡＤＣより良好なｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を有することが明らかに実証している。
【０２９６】
総合すると、これらのデータは、本発明の非線状リンカー−薬物にカップリングされた抗体（結果的にＡＤＣの疎水性が低減する）がそれらの抗腫瘍活性に関して有利なｉｎ  ｖｉｖｏ特性を有することを示している。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際調査報告】
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