(57)【要約】  本明細書に開示されていることは、抗体融合タンパク質に関する。特に、細胞内及び核内薬物送達のための抗体融合タンパク質に関する。上記融合タンパク質は、生物学的障壁を介したエフェクターペプチドの送達のために様々な標的に特異的に結合するペプチド透過系として使用することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
（ａ）細胞外表面マーカーを標的とすることが可能な抗体又はその抗原結合フラグメント（Ａｂ）と、
（ｂ）前記（ａ）のＡｂに融合又は前記（ａ）のＡｂの内部に融合した１つ以上の細胞膜透過性エフェクターペプチド（ＣＰＥＰ）と、
を含み、
ＣＰＥＰは、
前記ＣＰＥＰが前記（ａ）のＡｂの末端に融合する場合に、ポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）、１つ若しくは２つの切断可能リンカー（ＣＬ）、ポリカチオンドメイン（ＰＣＤ）及びエフェクターペプチド（ＥＰ）をＮ末端からＣ末端に向かって（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）、（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）若しくは（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置で含み、
前記ＣＰＥＰがその２つの末端で前記Ａｂの内部に融合する場合に、ポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）、２つの切断可能リンカー（ＣＬ）、ポリカチオンドメイン（ＰＣＤ）及びエフェクターペプチド（ＥＰ）をＮ末端からＣ末端に向かって（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）若しくは（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置で含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＣＰＥＰが前記Ａｂの重鎖の末端又は内部に融合する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが以下の細胞外マーカーのいずれかを標的とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【表１】
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【請求項４】
前記抗体がアブシキシマブ、アブリルマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフリベルセプト、アレムツズマブ、アマツキシマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベバシズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、デュリゴツマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エルゲムツマブ、エルツマキソマブ、エタネルセプト、エタラシズマブ、エトロリズマブ、フィギツムマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルムレツズマブ、マパツムマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パトリツマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、セリバンツマブ、タネズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、ボロシキシマブ及びザルツムマブからなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記抗体が配列番号２４のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
抗体の抗原結合フラグメントがＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖フラグメント、ダイアボディ又は線状抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＣＰＥＰが前記（ａ）のＡｂの末端に融合する場合に、前記融合タンパク質がＮ末端からＣ末端に向かって（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）−Ａｂ、（ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）−Ａｂ、（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）−Ａｂ、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）−Ａｂ、Ａｂ−（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）、Ａｂ−（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ）、Ａｂ−（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）又はＡｂ−（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ＣＰＥＰがその２つの末端で前記Ａｂの内部に融合する場合に、前記融合タンパク質がＮ末端からＣ末端に向かってＡｂＮ−（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）−ＡｂＣ、ＡｂＮ−（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）−ＡｂＣ、ＡｂＮ−（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）−ＡｂＣ、ＡｂＮ−（ＰＡＤ−ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）−ＡｂＣ、ＡｂＮ−（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）−ＡｂＣ又はＡｂＮ−（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ−ＰＡＤ）−ＡｂＣの配置を有し、ＡｂＮは前記ＡｂのＮ末端フラグメントであり、ＡｂＣは前記ＡｂのＣ末端フラグメントである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ＰＣＤが５個〜２０個の連続塩基性アミノ酸を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ＰＣＤが７個〜１２個の連続塩基性アミノ酸を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＰＣＤがポリリシン、ポリアルギニン及びポリヒスチジン、又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＰＣＤの組成が８個〜１０個の連続したリシン及びアルギニンから構成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＥＰがペプチドフラグメント、タンパク質の酵素ドメイン若しくは機能性タンパク質、又はそれらの組合せである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ＥＰがＡＫＴ、アミロイド−β、ＡＰＡＦ１、ＡＲＦ、Ｂｃｌ−２、ＢＣＬ９、β−カテニン、ＢＨ３ヘリックス、ＣＤＫＮ２Ｂ、シクロスポリンＡ、ディシブルド、Ｅ−カドヘリン、ＥＲＫ、ＥＺＨ２、ＧＮＡＳ、ＧＲＢ７、ＨＩＦ−１、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＩＫＢＫＧ、ＩＴＰＲ３、ＫＬＡ、ＬＡＰ、ＬＦＡ−１、ＭＡＰＫ８ＩＰ１、ＭＤＭ２、ＭＥＫ、ＮＢＳ１、Ｐ５３、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＲＡＦ、Ｓｌｕｇ、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ、Ｓｔａｔ３、サバイビン若しくはＸＩＡＰ、又はそれらの組合せから選択されるペプチドフラグメントである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記ＥＰが配列番号２、３若しくは４、又はそれらの組合せのアミノ酸配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記ＣＰＥＰのＰＡＤが、４個〜２０個の酸性アミノ酸を含む配列を有するポリアニオン性ペプチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ＰＡＤが５個〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記酸性アミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、ホスホセリン及びホスホトレオニンである、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記ＰＡＤが６個〜８個の連続したアスパラギン酸及びグルタミン酸である、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記ＣＰＥＰのＣＬが約６個〜約３０個のアミノ酸を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記ＣＰＥＰのＣＬが約４個〜約１０個のアミノ酸残基を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記ＣＬが細胞環境で切断可能である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記ＣＬが細胞外環境で切断可能である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ＣＬが癌性細胞周辺の酸性条件で切断可能である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ＣＬが以下のいずれか又はそれらの組合せによって切断可能である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【表２】
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【請求項２６】
前記ＣＬの配列がＫＰＬＧＬＡＲ（配列番号５）、ＰＬＧＬＡＧ（配列番号６）若しくはＫＰＬＧＬＡＧ（配列番号７）、又はそれらの組合せを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記ＣＬが請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の１つ以上の配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号９、１３、１５、１７、１９、２１及び２３から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖配列と、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
３Ｄ４ＫＬＡ：配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列、
３Ｄ４Ｓ９：配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列、
３Ｄ４ｒＳ９：配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列、
３Ｄ４ｒＳ９−ΔＤ６：配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列、
３Ｄ４ｒＳ９−Ａ：配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列、
３Ｄ４ｒＳ９−Ｄ：配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列、又は、
３Ｄ４Ｆｃ−ｒＳ９：（配列番号２３）のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬理学的に好適な担体とを含む、細胞へのエフェクターペプチドの送達に使用される組成物。
【請求項３１】
エフェクターペプチドをタンパク質ペイロードとして細胞又は細胞核へと送達する薬剤の製造における請求項１〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項３０に記載の組成物の使用。
【請求項３２】
前記融合タンパク質又は組成物を非経口又は腔内経路で投与する、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記融合タンパク質が、該融合タンパク質によって送達される前記エフェクターペプチドに応じて癌、線維症、炎症疾患、代謝障害、免疫系障害、感染性疾患、老化防止又は酵素補充療法のために投与される、請求項３２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体融合タンパク質に関する。特に、本発明は、細胞内及び核内薬物送達のための抗体融合タンパク質に関する。本発明の抗体融合タンパク質は、二重機能標的（dual functional targets）を有し、細胞外表面マーカーを結合して、細胞内標的調節を達成する。
【背景技術】
【０００２】
標的療法選択の中でも、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は最も有望なものとして台頭してきている。ＡＤＣは、強力な細胞傷害性薬を抗原発現細胞に選択的に送達するように設計されたモノクローナル抗体である。選択抗体（the selection of the antibody）、リンカー、細胞傷害性薬ペイロード、及び薬物を抗体に付着させるために使用される付着部位を含むＡＤＣの幾つかの構成要素が、ＡＤＣの活性に重要である。ＡＤＣの作製に使用される細胞傷害性薬（すなわち、ペイロード）は通例、システイン又はリシン残基を介して抗体にコンジュゲートする。これにより、抗体１つ当たりの薬物の数が不均一なＡＤＣが生じる。一般に薬物抗体比（ＤＡＲ）と称される抗体１つ当たりの薬物の数は、ＩｇＧ１抗体については薬物が０個〜８個と変動する可能性がある。０個の薬物を有する抗体は効果がなく、抗原発現細胞への結合についてＡＤＣと競合する。抗体１つ当たり８個の薬物を有する抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性が低下し、これが標的とは関係のない毒性の一因となり得る。一様な化学量論組成を有する精製ＡＤＣであっても、依然として複数の部位にコンジュゲートする薬物を保有し、独自の要素の複雑な混合物である。初期の不均一なＡＤＣには、臨床開発を妨げる安定性、薬物動態及び効力の問題があった。改変システイン残基、非天然アミノ酸、並びにグリコトランスフェラーゼ及びトランスグルタミナーゼによる酵素的コンジュゲーションの使用を含む化学部位選択的抗体コンジュゲーションの最近の進歩は、より均一なＡＤＣの生成をもたらしているが、抗体の遺伝的修飾の要求、コンジュゲーションへの酵素の使用、及びコンジュゲーション部位の数／位置を含む幾つかの違いが方法の間に見られる。
【０００３】
特許文献１は標的結合部分（ＴＢＭ）、マスキング部分（ＭＭ）及び切断可能部分（ＣＭ）を含有する活性化可能な結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を提供し、ＣＭを切断することが可能な切断剤の存在下でのＣＭの切断後よりも切断されていない場合にＴＢＭの少なくとも１つが標的にアクセスし難いように活性化可能な立体配座をＡＢＰが示すことを提唱している。特許文献２は、標的細胞又は組織においてその病態を治療するために選択的に活性化されることが可能なヒンジ抗体を開示している。ヒンジ抗体は機能的抗体と、２つの阻害ドメインと、４つの切断可能リンカーとを含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００９／０２５８４６号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１６／０１８５８７５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これら２つの特許文献のペイロードは、満足のいく効果を達成することができないため、より高いペイロードを有する薬物送達系を開発する必要がある。
本発明では、細胞内及び核内治療のためのペプチドペイロードを対象の標的に標的化すると同時に送達する、抗体と１つ以上の細胞膜透過性エフェクターペプチド（ＣＰＥＰ）とを含む抗体融合タンパク質を使用する。本発明の抗体融合タンパク質は、化学修飾戦略を用いる場合よりも均一な生産を単純化するだけでなく、ペイロードとしての化学薬品又はコンジュゲートのための修飾化学リンカーを含有しない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、（ａ）細胞外表面マーカーを標的とすることが可能な抗体又はその抗原結合フラグメント（Ａｂ）と、（ｂ）（ａ）のＡｂに融合又は（ａ）のＡｂの内部に融合した１つ以上の細胞膜透過性エフェクターペプチド（ＣＰＥＰ）とを含み、１つのＣＰＥＰは、ＣＰＥＰが（ａ）のＡｂの末端に融合する場合に、任意のポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）、１つ若しくは２つの切断可能リンカー（ＣＬ）、ポリカチオンドメイン（ＰＣＤ）及びエフェクターペプチド（ＥＰ）をＮ末端からＣ末端に向かって（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）若しくは（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置で含み、ＣＰＥＰがその２つの末端でＡｂの内部に融合する場合に、任意のポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）、２つの切断可能リンカー（ＣＬ）、ポリカチオンドメイン（ＰＣＤ）及びエフェクターペプチド（ＥＰ）をＮ末端からＣ末端に向かって（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）若しくは（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置で含む、融合タンパク質を提供する。
【０００７】
一実施の形態では、１つのＣＰＥＰが、ＣＰＥＰが抗体又はその抗原結合フラグメントの末端に融合する場合に任意のポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）、１つ又は２つの切断可能リンカー（ＣＬ）、ポリカチオンドメイン（ＰＣＤ）、及び細胞内標的に結合するエフェクターペプチド（ＥＰ）をＮ末端からＣ末端に向かって（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）又は（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置で含む。
【０００８】
別の実施の形態では、１つのＣＰＥＰが、ＣＰＥＰがその２つの末端で抗体又はその抗原結合フラグメントの内部に融合する場合に任意のポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）、２つの切断可能リンカー（ＣＬ）、ポリカチオンドメイン（ＰＣＤ）、及び細胞内標的に結合するエフェクターペプチド（ＥＰ）をＮ末端からＣ末端に向かって（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）又は（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置で含む。すなわち、ＣＰＥＰは、抗体又はその抗原結合フラグメント（Ａｂ）に上述の配置のいずれか１つで組み込まれる。一実施の形態では、ＣＰＥＰはＡｂの重鎖の内部に融合する。
【０００９】
更なる実施の形態では、ＣＰＥＰは、Ａｂの重鎖の末端又は内部に融合する。
【００１０】
例示的な実施の形態では、好ましい抗体が本明細書の段落［００４６］および［００４７］に記載される。一実施の形態では、抗体は配列番号２４のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを含む。一部の実施の形態では、抗体の抗原結合フラグメントはＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖フラグメント、ダイアボディ（diabody）又は線状抗体である。
【００１１】
一部の実施の形態では、１つ以上のＣＰＥＰがＡｂのＮ末端若しくはＣ末端に融合するか、又はＡｂの内部に融合する。
【００１２】
ＰＣＤは、５個〜２０個又はその任意の中間範囲の連続塩基性アミノ酸を含む配列を有する。一実施の形態では、ポリカチオンペプチドはポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリヒスチジン及びカチオン性多糖、又はそれらの混合物からなる群から選択される。別の実施の形態では、ポリカチオンペプチドはリシン、アルギニン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリヒスチジン及びカチオン性多糖からなる群から選択される少なくとも２つのポリカチオンを含む組成物である。好ましい実施の形態では、ポリカチオンペプチド組成物は、リシン及びアルギニンから構成される。更なる実施の形態では、ポリカチオンペプチドは、ホモポリマー若しくはコポリマー、又はそれらの混合物である。
【００１３】
ＥＰは、細胞内標的に結合するタンパク質ペイロードである。ＥＰの実施の形態は、本明細書の段落［００５４］および［００５５］に記載される。例示的な本発明の融合タンパク質に使用される好ましいＥＰ及びその配列は、本明細書の段落［００５６］および［００５７］に列挙する。
【００１４】
本発明のＣＰＥＰの切断可能リンカー（ＣＬ）は、複数のアミノ酸残基を含む切断可能リンカーである。ＣＬは、例えば約４個〜約１００個のアミノ酸又は約６個〜約３０個のアミノ酸を含み得る。ＣＬはアミノ酸残基を含んでいてもよく、約４個〜約３０個又は約４個〜約１０個のアミノ酸残基のペプチド結合であってもよい。ＣＬは、癌性細胞及び組織周辺に見ることができる酸性条件、若しくは低酸素若しくは虚血細胞及び組織周辺に見ることができる還元環境等の細胞環境に見られる条件；病変、アポトーシス若しくは壊死細胞及び組織等の治療すべき病態を有する細胞の表面上に見られる、若しくは細胞周辺で放出されるプロテアーゼ若しくは他の酵素；又は他の条件若しくは因子によって切断可能である。ＣＬの切断のための例示的な酵素としては、本明細書の段落［００６５］および［００６６］に記載されるものが挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施の形態では、ＣＬは、本明細書の段落［００６７］および［００６８］に記載されるものから選択される。
【００１５】
ＣＰＥＰは、任意のポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）を任意に含んでいてもよい。一実施の形態では、ＣＰＥＰがポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）を有する場合、ＣＰＥＰは活性化可能な細胞膜透過エフェクターペプチド（ＡＣＰＥＰ）である。ＰＡＤは、４個〜２０個の酸性アミノ酸（好ましくは５個〜９個の酸性アミノ酸）を含む配列を有するポリアニオン性ペプチドである。ＰＡＤは、ＡＣＰＥＰが細胞膜を越えるのを妨げる自己組織化ポリアニオン−ポリカチオン相互作用の形成に効果的である。一部の実施の形態では、ＰＡＤは、４個〜２０個又はその任意の中間範囲の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有する。
【００１６】
一部の実施の形態では、ＣＰＥＰが（ａ）のＡｂの末端に融合する場合に、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）−Ａｂ、（ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）−Ａｂ、（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）−Ａｂ、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）−Ａｂ、Ａｂ−（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）、Ａｂ−（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ）、Ａｂ−（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）又はＡｂ−（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置を有する。
【００１７】
一部の他の実施の形態では、ＣＰＥＰがその２つの末端でＡｂの内部に融合する場合、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かってＡｂＮ−（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）−ＡｂＣ、ＡｂＮ−（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）−ＡｂＣ、ＡｂＮ−（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）−ＡｂＣ、ＡｂＮ−（ＰＡＤ−ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）−ＡｂＣ、ＡｂＮ−（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）−ＡｂＣ又はＡｂＮ−（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ−ＰＡＤ）−ＡｂＣの配置を有する。ここで、ＡｂＮはＡｂのＮ末端フラグメントであり、ＡｂＣはＡｂのＣ末端フラグメントである。
【００１８】
本発明の融合タンパク質は二重機能標的を有し、細胞外表面マーカーを結合し、細胞内標的調節を達成する。本発明の融合タンパク質のエフェクターペプチドは、特定の条件の存在下又は特定の環境でＣＬが切断されることによって標的細胞に入ることができる。好ましい実施の形態では、ＣＬは、生理学的条件下で切断可能である。かかるＣＬの切断は、融合タンパク質送達が所望される細胞に関係する特定の病理学的シグナル又は特定の環境によって増強されるか、又は達成することができる。ＣＬは、かかる条件が得られる特定の位置への細胞取込みの標的化を達成することができるように、特異的酵素によって切断することができる。ＣＬの切断後に、融合タンパク質のＰＣＤ−ＥＰ又はＥＰ−ＰＣＤ部分がＡｂから遊離する。
【００１９】
一部の実施の形態では、本発明の融合タンパク質は配列番号９、１３、１５、１７、１９、２１又は２３から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖配列と、配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを含む。
【００２０】
本発明は、細胞へのエフェクターペプチドの送達に使用される組成物も提供する。一実施の形態では、組成物は、本発明の融合タンパク質と薬理学的に好適な担体とを含む。
【００２１】
本発明は、エフェクターペプチドを細胞又は細胞核へと送達する方法であって、本発明の融合タンパク質又は本発明の融合タンパク質を含む組成物を被験体に投与することを含む、方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＡＳＣバイオ医薬品のＭｏＡ（作用機構）の概要図である。工程１は、抗体が細胞表面マーカーを認識した様子を示す。工程２は、ＣＰＥＰの内部の切断可能リンカーが微小環境プロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ及びＡＤＡＭ等）によって切断された後、ＣＰＥＰの細胞膜透過性機能のスイッチを入れた様子を示す。工程３は、疾患治療機能を有する細胞傷害性ペプチド（ＡＳＣバイオ医薬品から切り取られたペプチド）がＣＰＰ／ＰＣＤによって細胞質及び／又は核へと運ばれる様子を示す。
【図２Ａ−２Ｃ】ＡＳＣバイオ医薬品のＭｏＡ研究を示す図である。図２Ａは、フローサイトメトリーによりＡＳＣバイオ医薬品が標的細胞を認識することが実証されたことを示す。図２ＢおよびＣは、フローサイトメトリー及び免疫蛍光を用いることで、結果から３Ｄ４Ｓ９のポリカチオンドメインが切断され、ヒト乳腺癌ＭＣＦ７細胞に内在化することを示す。
【図３Ａ−３Ｂ】３Ｄ４ＫＬＡがヒト乳腺癌ＭＣＦ７及びヒト非小細胞肺癌Ｈ１２９９細胞において悪性化（transformation）活性を低減することを示す図である。３Ｄ４ＫＬＡで処理したヒト乳腺癌ＭＣＦ７（図３Ａ）及びヒト非小細胞肺癌Ｈ１２９９細胞（図３Ｂ）における軟寒天コロニー形成活性の減少を示す。
【図４Ａ−４Ｆ】３Ｄ４Ｓ９が種々の細胞株において悪性化活性を低減することを示す図である。３Ｄ４Ｓ９で処理したヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図４Ａ）、ヒト乳腺癌ＳＫＢＲ３（図４Ｂ）、ヒト乳腺癌ＭＣＦ７（図４Ｃ）、ヒト肺癌Ａ５４９（図４Ｄ）、ヒト非小細胞肺癌Ｈ１２９９（図４Ｅ）及びヒト膵癌ＰＡＮＣ−１細胞（図４Ｆ）における軟寒天コロニー形成活性の減少を示す。
【図５】３Ｄ４ｒＳ９がヒト肺癌Ａ５４９細胞において悪性化活性を低減することを示す図である。３Ｄ４ｒＳ９で処理したヒト肺癌Ａ５４９細胞における軟寒天コロニー形成活性の減少を示す。
【図６Ａ−６Ｂ】３Ｄ４ｒＳ９−Ａがヒト乳腺癌ＳＫＢＲ３及びヒト肺癌Ａ５４９細胞において悪性化活性を低減することを示す図である。３Ｄ４ｒＳ９−Ａで処理したヒト乳腺癌ＳＫＢＲ３（図６Ａ）及びヒト肺癌Ａ５４９細胞（図６Ｂ）における軟寒天コロニー形成活性の減少を示す。
【図７】３Ｄ４ｒＳ９−Ｄがヒト肺癌Ａ５４９細胞において悪性化活性を低減することを示す図である。３Ｄ４ｒＳ９−Ｄで処理したヒト肺癌Ａ５４９細胞における軟寒天コロニー形成活性の減少を示す。
【図８】３Ｄ４ｒＳ９−ΔＤ６がヒト乳腺癌ＳＫＢＲ３細胞において悪性化活性を低減することを示す図である。３Ｄ４ｒＳ９−ΔＤ６で処理したヒト乳腺癌ＳＫＢＲ３細胞における軟寒天コロニー形成活性の減少を示す。
【図９】３Ｄ４Ｆｃ−ｒＳ９がヒト肺癌Ａ５４９細胞において悪性化活性を低減することを示す図である。３Ｄ４Ｆｃ−ｒＳ９で処理したヒト肺癌Ａ５４９細胞における軟寒天コロニー形成活性の減少を示す。
【図１０Ａ−１０Ｃ】３Ｄ４Ｓ９がＮＯＤ／  ＳＣＩＤマウスにおいてヒト膵癌ＰＡＮＣ−１細胞を用いた異種移植片腫瘍成長を低減することを示す図である。３Ｄ４ｓｃｒ又は３Ｄ４Ｓ９を３週間にわたって週２回、３０ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．で与えた。マウスを屠殺した後、腫瘍を摘出し、それらの質量を測定した。３Ｄ４ｓｃｒ対照群の２３１（±１５０）ｍｍ３と比較して、３Ｄ４Ｓ９で処理したヒトＰＡＮＣ−１腫瘍異種移植片を担持するマウスは、３週間後に８４（±４０）ｍｍ３の腫瘍体積を有していた。３Ｄ４Ｓ９処理により異種移植片腫瘍体積が６０％低減した（図１０Ａ）。３Ｄ４ｓｃｒ対照群の０．６６（±０．３）ｇと比較して、３Ｄ４Ｓ９で処理したヒトＰＡＮＣ−１腫瘍異種移植片を担持するマウスは、３週間後に０．１３（±０．０２）ｇの腫瘍重量を有していた。３Ｄ４Ｓ９処理により異種移植片腫瘍重量が８０％低減した（図１０Ｂ）。屠殺前にマウスの体重を量った。３Ｄ４ｓｃｒ又は３Ｄ４Ｓ９で処理したヒトＰＡＮＣ−１腫瘍異種移植片を担持するマウスは、ほぼ同じ体重を有していた（図１０Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下の説明では、特許請求される主題の理解を容易にするために多数の用語を用い、以下の定義を提示する。本明細書で明示的に定義されていない用語は、その一般的かつ通常の意味に従って用いられる。
【００２４】
本明細書に記載される抗体、結合フラグメント及びポリヌクレオチドは、多くの実施形態において、それぞれのポリペプチド又はポリヌクレオチド配列によって記載される。他に指示がない限り、ポリペプチド配列はＮからＣの方向、ポリヌクレオチド配列は５’から３’の方向で提示される。ポリペプチド配列については、遺伝子にコードされるアミノ酸の従来の三文字又は一文字の略称を用いることができる。
【００２５】
本発明に用いられるペプチドの略称は、以下の通りである：
Ａｂ：抗体又はその抗原結合フラグメント、
ＣＰＥＰ：細胞膜透過性エフェクターペプチド、
ＰＡＤ：ポリアニオン性ドメイン、
ＣＬ：切断可能リンカー、
ＰＣＤ：ポリカチオンドメイン、
ＥＰ：エフェクターペプチド、
ＡｂＮ：抗体又はその抗原結合フラグメント（Ａｂ）のＮ末端フラグメント、及び、
ＡｂＣ：抗体又はその抗原結合フラグメント（Ａｂ）のＣ末端フラグメント。
【００２６】
他に指定がない限り、数量を特定しない用語（the term "a" or "an"）は、「１つ以上」を意味する。
【００２７】
「又は」という用語は、文脈上明らかに他の指示がない限り、「及び／又は」という用語を意味するように本明細書で使用され、「及び／又は」という用語と区別なく使用される。
【００２８】
本願全体を通して、「約」という用語は、値が固有の誤差の変動を含むことを示すために使用される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ペイロード」という用語はＥＰを指す。ＥＰは、細胞内標的に結合するペプチド又はタンパク質ペイロードである。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、区別なく使用される。これらは任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか、又はその類似体を指す。ポリヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよく、一本鎖である場合、コード鎖であっても又は非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の修飾ヌクレオチドを含み得る。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、一般式ＮＨ２ＣＨＲＣＯＯＨの有機化合物を表し、ここで、Ｒは任意の有機基とすることができる。具体的には、アミノ酸という用語は、Ａｉｂ＝α−アミノイソ酪酸；ｔＢｕＡｌａ＝ｔｅｒｔ−ブチルアラニン；Ｔｈｒ−ＯＢｚｌ＝トレオニンベンジルエステル；５Ａｖａ＝５−アミノ吉草酸；Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸；Ａｌａ＝Ａ＝アラニン；Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン；Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン；Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン；Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸；Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン；Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン；Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン；Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン；Ｌｙｓ＝Ｋ＝リシン；Ｍｅｔ＝Ｍ＝メチオニン；Ｍａｍｂ＝（３−アミノメチル）安息香酸；Ｍａｍｐ＝（３−アミノメチル）フェニル酢酸；Ｎｌｅ＝ノルロイシン；Ｎｖａ＝ノルバリン；Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン；Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン；Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン；Ｔｈｒ＝Ｔ＝トレオニン；Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン；Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン；及びＶａｌ＝Ｖ＝バリン等の天然及び非天然（人工）のアミノ酸を指す場合がある。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「透過性ペプチド」という用語は、生物学的障壁を介した物質の移行を容易にする任意のペプチドを指す。生物学的障壁の例としては、密着結合及び原形質膜が挙げられるが、これらに限定されない。細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ又はＰＣＤ）は、細胞膜を透過し、種々の積み荷分子（cargoes）を細胞内に移行させることが可能である。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で区別なく使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する自然発生アミノ酸の人工化学模擬体であるアミノ酸ポリマー、並びに自然発生アミノ酸ポリマー及び非自然発生アミノ酸ポリマーに適用される。他に指示がない限り、特定のポリペプチド配列は、保存的に修飾されたその変異体も暗黙的に包含する。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は無傷抗体、モノクローナル又はポリクローナル抗体を指す。「抗体」という用語は、二重特異性抗体等の多重特異性抗体も包含する。ヒト抗体は、通常は各々が可変領域及び定常領域を含む２つの軽鎖及び２つの重鎖でできている。軽鎖可変領域は、フレームワーク領域が隣接するＣＤＲＬ１又はＬ１、ＣＤＲＬ２又はＬ２及びＣＤＲＬ３又はＬ３として本明細書で識別される３つのＣＤＲを含む。重鎖可変領域は、フレームワーク領域が隣接するＣＤＲＨ１又はＨ１、ＣＤＲＨ２又はＨ２及びＣＤＲＨ３又はＨ３として本明細書で識別される３つのＣＤＲを含む。本発明のヒト化抗体のＣＤＲは、Kabat及びChotiaの定義を用いて識別することができる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「活性化可能な」又は「スイッチ可能な」という用語は、活性化可能な細胞膜透過エフェクターペプチド（ＡＣＰＥＰ）が、自然又は非切断状態（すなわち、第１の立体配座）にある場合に標的に対して第１のレベルの非結合を示し、切断状態（すなわち、第２の立体配座）で標的に対して第２のレベルの結合を示すことを指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「投与する（"administer", "administering" or "to administer"）」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与及びｅｘ  ｖｉｖｏ組織への直接投与を含む薬剤の投与又は供給を指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、妥当なベネフィット／リスク比に相応する、毒性、刺激及び／又はアレルギー反応等の必要以上の有害な副作用なしにヒト及び／又は動物への投与に好適な化合物及び組成物を指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「被験体」及び「患者」という用語は本明細書で区別なく使用され、温血動物、特に哺乳動物を指すと理解される。本用語の範囲及び意味内の動物の非限定的な例としては、モルモット、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、動物園の動物、非ヒト霊長類及びヒトが挙げられる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、本発明概念の方法で使用した場合に妥当なベネフィット／リスク比に相応する、過度の有害な副作用（毒性、刺激及びアレルギー反応等）なしに検出可能な治療効果を示すのに十分な融合タンパク質又はペプチドの量を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、疾患の治療のために哺乳動物又は他の被験体に投与した場合に検出可能な治療効果を示すのに十分であり、かかる疾患の治療を達成するのに十分な融合タンパク質又はペプチドの量を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」等の用語は哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるが、疾患を有するとは診断されていない被験体において疾患が生じるのを防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること；及び（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退行を生じさせることを含む。
【００４２】
本発明は、生物学的障壁を介したエフェクターペプチドの送達のために様々な標的に特異的に結合するペプチド透過系としての融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は非効率性、活性物質の生物学的特性の変化、標的細胞の死滅、生物学的障壁の不可逆的な損傷及び／又はヒト被験体への使用に対する高いリスク等の当該技術分野で見られる欠点を直す。本発明の融合タンパク質は、エフェクターペプチド等の変質していない生物活性物質の効率的な非侵襲的送達を示す。
【００４３】
一態様では、本発明は、
（ａ）細胞外表面マーカーを標的とすることが可能な抗体又はその抗原結合フラグメント（Ａｂ）と、（ｂ）（ａ）のＡｂに融合又は（ａ）のＡｂの内部に融合した１つ以上の細胞膜透過性エフェクターペプチド（ＣＰＥＰ）と、を含み、１つのＣＰＥＰは、ＣＰＥＰが（ａ）のＡｂの末端に融合する場合に、任意のポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）、１つ若しくは２つの切断可能リンカー（ＣＬ）、ポリカチオンドメイン（ＰＣＤ）及びエフェクターペプチド（ＥＰ）をＮ末端からＣ末端に向かって（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）若しくは（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置で含み、ＣＰＥＰがその２つの末端でＡｂの内部に融合する場合に、任意のポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）、２つの切断可能リンカー（ＣＬ）、ポリカチオンドメイン（ＰＣＤ）及びエフェクターペプチド（ＥＰ）をＮ末端からＣ末端に向かって（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）若しくは（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置で含む、融合タンパク質を提供する。
【００４４】
１つ以上のＣＰＥＰは、抗体若しくはその抗原結合フラグメントに融合するか、又は抗体若しくはその抗原結合フラグメントの内部に融合する。本発明において使用される抗体又はその抗原結合フラグメントは、対象の標的を発現する任意の細胞又は細胞集団上の対象の標的に特異的に結合する。例示的な標的としては、アミノ酸配列（例えばポリペプチド、ペプチド及びタンパク質）、多糖、オリゴ糖、炭水化物及び脂質が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な非限定的な標的の種類としては、受容体及び抗原が挙げられる。標的には、抗原に結合する受容体、受容体又はリガンドが含まれ、これらにはホルモン、成長因子、分化抗原群（cluster of differentiation）（ＣＤ分子又はＣＤマーカーと総称される）、ホルモン及び成長因子類似体、並びにホルモン、ホルモン類似体、成長因子、成長因子類似体のフラグメント、並びに成長因子及び類似体のフラグメントが含まれる。抗原標的としては、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原及び寄生生物抗原が挙げられる。抗原標的には腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）も含まれる。一実施形態では、標的は細胞外標的である。例示的な好ましい細胞外標的としては、以下の表に列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
【表１】
2019527238.tif 000003
【００４６】
標的に結合する例示的な抗体としては、以下の表に列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
【表２】
2019527238.tif 000004
【００４８】
更なる実施形態では、抗体はアテゾリズマブ、アベルマブ、ペムブロリズマブ、デュリゴツマブ（duligotumab）、ペルツズマブ又はザルツムマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、トラスツズマブである。一実施形態では、抗体は配列番号２４のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを含む。
【００４９】
抗体の抗原結合フラグメントは、完全抗体の構成要素のサブセットを含み、抗体の抗原結合特性を保持するタンパク質を指す。抗体の抗原結合フラグメントは通例、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは任意のサイズ又はアミノ酸組成であってもよく、概して１つ以上のフレームワーク配列に隣接する又はそれとインフレームの少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと会合したＶＨドメインを有する抗原結合フラグメントでは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、互いに任意の好適な配置で位置することができる。例えば、可変領域が二量体であり、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＬ二量体を含有していてもよい。代替的には、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体ＶＨドメイン又はＶＬドメインを含有していてもよい。一部の実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントはＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖フラグメント、ダイアボディ又は線状抗体である。
【００５０】
一実施形態では、１つのＣＰＥＰが、ＣＰＥＰが抗体又はその抗原結合フラグメントの末端に融合する場合に任意のポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）、１つ又は２つの切断可能リンカー（ＣＬ）、ポリカチオンドメイン（ＰＣＤ）及びエフェクターペプチド（ＥＰ）をＮ末端からＣ末端に向かって（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）又は（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置で含む。
【００５１】
別の実施形態では、１つのＣＰＥＰが、ＣＰＥＰがその２つの末端で抗体又はその抗原結合フラグメントの内部に融合する場合に任意のポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）、２つの切断可能リンカー（ＣＬ）、ポリカチオンドメイン（ＰＣＤ）及びエフェクターペプチド（ＥＰ）をＮ末端からＣ末端に向かって（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）、（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）又は（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置で含む。すなわち、ＣＰＥＰは、上述の配置のいずれか１つで抗体又はその抗原結合フラグメント（Ａｂ）に組み込まれる。
【００５２】
本発明のＣＰＥＰの切断可能リンカー（ＣＬ）は、複数のアミノ酸残基を含む切断可能リンカーである。ＣＰＥＰは、１つ又は２つのＣＬを含み得る。２つのＣＬは同じであっても、又は異なっていてもよい。ＣＰＥＰがＰＡＤを有しない場合、ＣＬは、抗体又はその抗原結合フラグメントをＰＣＤ−ＥＰ又はＥＰ−ＰＣＤと接続する必要がある。ＣＰＥＰがＰＡＤを有する場合、ＣＬは、酸性部分ＰＡＤを塩基性部分ＰＣＤと接続する働きをする。ＣＬは、例えば約４個〜約１００個のアミノ酸又は約６個〜約３０個のアミノ酸を含み得る。ＣＬはアミノ酸残基を含んでいてもよく、約４個〜約３０個又は約４個〜約１０個のアミノ酸残基のペプチド結合であってもよい。
【００５３】
ＰＣＤは、少なくとも１つの哺乳動物細胞の膜を介したＣＰＥＰの輸送に効果的な５個〜２０個の塩基性アミノ酸（好ましくは、７個〜１２個の塩基性アミノ酸）を含む配列を有するポリカチオンペプチドである。ポリカチオンペプチドは、核局在化能を有することも見出されている。ＰＣＤは、５個〜２０個又はその任意の中間範囲の連続塩基性アミノ酸を含む配列を有する。一実施形態では、ＰＣＤは７個〜１２個の連続塩基性アミノ酸を含む。一実施形態では、塩基性アミノ酸はｐＨ６．０で正に帯電している。一実施形態では、ポリカチオンペプチドはポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリヒスチジン及びカチオン性多糖、又はそれらの混合物からなる群から選択される。別の実施形態では、ポリカチオンペプチドはリシン、アルギニン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリヒスチジン及びカチオン性多糖からなる群から選択される少なくとも２つのポリカチオンを含む組成物である。好ましい実施形態では、ポリカチオンペプチド組成物は、リシン及びアルギニンから構成される。更なる実施形態では、ポリカチオンペプチドはホモポリマー若しくはコポリマー、又はそれらの混合物である。ポリカチオンペプチドホモポリマーは、同じカチオンモノマーの単一反復単位を含む。ポリカチオンペプチドコポリマーは、異なるカチオンモノマー又は異なるカチオン性ポリマーを含む。一実施形態では、ポリカチオンペプチドコポリマーはカチオンモノマーの混合物、ポリカチオンホモポリマーの混合物又はポリカチオンコポリマーの混合物を含み得る。一部の実施形態では、ＰＣＤは非標準アミノ酸、例えばヒドロキシリシン、デスモシン、イソデスモシン、又は他の非標準アミノ酸を含む。
【００５４】
ＥＰは、細胞内標的に結合するタンパク質ペイロードである。一実施形態では、ＥＰはペプチドフラグメント、タンパク質の酵素ドメイン又は機能性タンパク質である。例示的なＥＰとしては、以下に列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
【表３】
2019527238.tif 000005
【００５６】
例示的な本発明の融合タンパク質に使用される好ましいＥＰ及びそれらの配列を以下に列挙する。
【００５７】
【表４】
2019527238.tif 000006
【００５８】
ＣＰＥＰは、任意のポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）を任意に含んでいてもよい。一実施形態では、ＣＰＥＰがポリアニオン性ドメイン（ＰＡＤ）を有する場合、ＣＰＥＰは活性化可能な細胞膜透過エフェクターペプチド（ＡＣＰＥＰ）である。ＡＣＰＥＰは、標的タンパク質に対して活性化可能な結合（スイッチ可能な結合）を示す。細胞膜透過性ペプチドの全身性細胞取込みは、それらをポリアニオン性ペプチドドメインにプロテアーゼ切断可能リンカーを介して融合し、ポリカチオンドメインを分子内ヘアピンの形成により中和することによって阻止される。特異性については、リンカーは或る特定の酵素によって切断されるように設計される。投与後に、本発明のＡＣＰＥＰを含む融合タンパク質は腫瘍に移動し、そこでＡＣＰＥＰがプロテイナーゼによって切断され、標的組織中に蓄積する。
【００５９】
ＰＡＤは、４個〜２０個の酸性アミノ酸（好ましくは、５個〜９個の酸性アミノ酸）を含む配列を有するポリアニオン性ペプチドである。ＰＡＤは、ＡＣＰＥＰが細胞膜を越えるのを妨げる自己組織化ポリアニオン−ポリカチオン相互作用の形成に効果的である。一部の実施形態では、ＰＡＤは、４個〜２０個又はその任意の中間範囲の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有する。一実施形態では、ＰＡＤは、５個〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む。一実施形態では、酸性アミノ酸は、ｐＨ６．０で負に帯電している。一実施形態では、酸性アミノ酸は、６．０未満のｐＫａを有する側鎖を有する。酸性（acid）アミノ酸の非限定的な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホスホセリン及びホスホトレオニンが挙げられる。特定の実施形態では、ＰＡＤは５個〜９個の連続グルタミン酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物を含む。一部の実施形態では、ＰＡＤは１つ以上のＤ−アミノ酸を含む。特定の実施形態では、ＰＡＤはＤ−アミノ酸からなる。一部の実施形態では、ＰＡＤは６個の連続したアスパラギン酸である。一部の実施形態では、ＰＡＤは非標準アミノ酸、例えばヒドロキシリシン、デスモシン、イソデスモシン、又は他の非標準アミノ酸を含む。Ａ部分は修飾アミノ酸を含んでいてもよい。
【００６０】
一部の実施形態では、ＣＰＥＰが（ａ）のＡｂの末端に融合する場合に、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）−Ａｂ、（ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）−Ａｂ、（ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）−Ａｂ、（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）−Ａｂ、Ａｂ−（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）、Ａｂ−（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ）、Ａｂ−（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ）又はＡｂ−（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）の配置を有する。
【００６１】
一部の他の実施形態では、ＣＰＥＰがその２つの末端でＡｂの内部に融合する場合、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かってＡｂＮ−（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）−ＡｂＣ、ＡｂＮ−（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）−ＡｂＣ、ＡｂＮ−（ＰＡＤ−ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ）−ＡｂＣ、ＡｂＮ−（ＰＡＤ−ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ）−ＡｂＣ、ＡｂＮ−（ＣＬ−ＥＰ−ＰＣＤ−ＣＬ−ＰＡＤ）−ＡｂＣ又はＡｂＮ−（ＣＬ−ＰＣＤ−ＥＰ−ＣＬ−ＰＡＤ）−ＡｂＣの配置を有し、ここで、ＡｂＮはＡｂのＮ末端フラグメントであり、ＡｂＣはＡｂのＣ末端フラグメントである。ＣＰＥＰがその２つの末端でＡｂの内部に融合する場合、ＣＰＥＰは、本発明の融合タンパク質がＮ末端からＣ末端に向かって抗体Ｎ末端フラグメント、ＣＰＥＰ及び抗体Ｃ末端フラグメントを含むようにＡｂ内の対象位置に組み込まれる。抗体Ｎ末端フラグメント及び抗体Ｃ末端フラグメントのサイズは、ＣＰＥＰが組み込まれる位置に応じて異なる。
【００６２】
更なる実施形態では、ＣＰＥＰは、Ａｂの重鎖の末端又は内部に融合する。
【００６３】
本発明の融合タンパク質は二重機能標的を有し、細胞外表面マーカーを結合し、細胞内標的調節を達成する。本発明の融合タンパク質のエフェクターペプチドは、特定の条件の存在下又は特定の環境でＣＬが切断されることによって標的細胞に入ることができる。好ましい実施形態では、ＣＬは、生理学的条件下で切断可能である。かかるＣＬの切断は、融合タンパク質送達が所望される細胞に関係する特定の病理学的シグナル又は特定の環境によって増強されるか、又は達成することができる。ＣＬは、かかる条件が得られる特定の位置への細胞取込みの標的化を達成することができるように、特異的酵素によって切断することができる。ＣＬの切断後に、融合タンパク質のＰＣＤ−ＥＰ又はＥＰ−ＰＣＤ部分がＡｂから遊離する。
【００６４】
一部の実施形態では、ＣＬは、癌性細胞及び組織周辺に見ることができる酸性条件、若しくは低酸素若しくは虚血細胞及び組織周辺に見ることができる還元環境等の細胞環境に見られる条件；病変、アポトーシス若しくは壊死細胞及び組織等の治療すべき病態を有する細胞の表面上に見られる、若しくは細胞周辺で放出されるプロテアーゼ若しくは他の酵素；又は他の条件若しくは因子によって切断可能である。
【００６５】
ＣＬの切断のための例示的な酵素としては、以下に列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
【表５】
2019527238.tif 000007
【００６７】
例示的な本発明の融合タンパク質に使用される好ましいＣＬ及びその配列を以下に列挙する。
【００６８】
【表６】
2019527238.tif 000008
【００６９】
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質は下記表に示される。各融合タンパク質のヌクレオチド及びアミノ酸配列も下記表に列挙する。したがって、一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号９、１３、１５、１７、１９、２１及び２３から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖配列と、配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖配列とを含む。
したがって、本発明の融合タンパク質は、
３Ｄ４ＫＬＡ：配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列、
３Ｄ４Ｓ９：配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列、
３Ｄ４ｒＳ９：配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列、
３Ｄ４ｒＳ９−ΔＤ６：配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列、
３Ｄ４ｒＳ９−Ａ：配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列、
３Ｄ４ｒＳ９−Ｄ：配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列、又は、
３Ｄ４Ｆｃ−ｒＳ９：（配列番号２３）のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖配列を含む。
【００７０】
【表７】
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【００７１】
融合タンパク質の調製は、タンパク質の化学合成、融合タンパク質の各構成要素をコードするポリヌクレオチドを含む（保有する）発現（組み換え）ベクターを用いた（適当な宿主細胞中での）タンパク質発現等のようなタンパク質を調製する任意の一般的方法によって行うことができる。
【００７２】
本発明の融合タンパク質は、従来の公に知られている遺伝子工学的技法に従って製造することができる。このため、例えば、ＡｂをコードするＤＮＡ及びＣＰＥＰをコードするＤＮＡの各々を必要に応じて増幅し、これらのＤＮＡを互いに結合させ、得られるＤＮＡを細胞発現ベクターに挿入し、宿主細胞をベクターでトランスフェクトして、融合タンパク質を発現させることによって、本発明の融合タンパク質を製造することができる。ＤＮＡの増幅は、例えばＰＣＲ法によって行うことができる。増幅ＤＮＡの結合は、例えば重複伸長ＰＣＲ法によって行うことができる。人工合成遺伝子が直接作製されるように発現される融合タンパク質のアミノ酸配列を設計することも可能である。発現ベクターが発現効率を高めるためのプロモーター、及び発現された融合タンパク質の培養上清からの容易な回収のために抗体重鎖シグナル配列又は抗体κ鎖シグナル配列等の分泌シグナル配列を含むのが好ましい。発現宿主細胞については、哺乳動物細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞（大腸菌（Escherichia coli）等）等を使用することができる。中でも動物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が特に好ましい。
【００７３】
このように規定される融合タンパク質をペプチド及びタンパク質の化学合成の既知の方法によって合成することができることが当業者には明らかである。融合タンパク質は、化学ペプチド合成の方法、特に好適な樹脂を担体として使用した固相でのペプチド合成の技法を用いた化学ペプチド合成の方法によって合成することができる。代替的には、融合タンパク質は、連続タンパク質としてのペプチドの化学合成の方法によって合成することができる。代替的には、タンパク質の個々のフラグメント（ドメイン）を別個に合成した後、或るペプチドフラグメントのアミノ末端を第２のペプチドのカルボキシル末端へと縮合することによってペプチド結合を介した１つの連続ペプチドに組み合わせることができる。かかる技法は従来のものであり、よく知られている。
【００７４】
本発明は、細胞へのエフェクターペプチドの送達に使用される組成物も提供する。一実施形態では、組成物は本発明の融合タンパク質と、薬理学的に好適な担体とを含む。通例、かかる組成物は溶液又は懸濁液のいずれかとして調製されるが、錠剤、丸薬、粉末等のような固体形態も企図される。本発明の融合タンパク質は、薬学的に許容可能であり、融合タンパク質に適合する賦形剤と混合してもよい。好適な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、又はそれらの混合物である。加えて、組成物は湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤等のような少量の補助物質を含有していてもよい。加えて、組成物は様々なアジュバント（抗原又は免疫原に対する液性及び／又は細胞性免疫応答を誘導又は増大することができる化合物）を含有していてもよい。組成物の経口形態を投与することが所望される場合、様々な増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤等を添加してもよい。本発明の組成物は、投与に好適な形態の組成物を提供するために、このような任意の付加的な成分を含有することができる。
【００７５】
本発明の組成物（調製物、配合物等）は、非経口（例えば動脈内、静脈内、筋肉内、皮下を含む）、局所（皮膚、経皮、皮下等を含む）、経口、経鼻、粘膜（舌下を含む）及び腔内経路（膣内、頸管内、子宮内、陰茎内（intrapenis）及び鼻腔内等）を含むが、これらに限定されない、当業者によく知られる多くの好適な手段のいずれかによって投与することができる。一部の実施形態では、投与様式は注射、皮内又は経口でのものである。
【００７６】
本発明は、エフェクターペプチドを細胞及び／又は細胞核へと送達する方法であって、本発明の融合タンパク質又は本発明の融合タンパク質を含む組成物を被験体に投与することを含む、方法も提供する。したがって、本発明は、エフェクターペプチドを細胞及び／又は細胞核へと送達する薬剤の製造における本発明の融合タンパク質の使用を提供する。本発明の融合タンパク質が、該融合タンパク質によって送達されるエフェクターペプチドに応じて癌、線維症、炎症疾患、代謝障害、免疫系障害、感染性疾患、老化防止及び酵素補充療法のために投与され得る。融合タンパク質は、細胞内及び核内薬物送達を達成することができる。上述の例は、本発明の特定の実施形態を更に説明する働きをするが、いかなる形でも本発明を限定すると解釈されるものではない。
【実施例】
【００７７】
実施例１  本発明のバイオ医薬品送達技術の作用機構
細胞表面への抗体標的化（工程１）と、その後のＣＰＥＰの腫瘍微小環境での活性化（工程２）と、ＣＰＰ（細胞膜透過性ペプチド）／ＰＣＤによる細胞傷害性ペプチドペイロードであるＥＰの細胞への送達（工程３）とを利用する、この癌治療のための革新的なバイオ医薬品送達技術である、ＡＳＣ（抗体によりスイッチが入る細胞傷害：Antibody Switched-on Cytotoxicity）生物製剤プラットホームの作用機構（ＭＯＡ）の概要図を図１に示す。
【００７８】
実施例２  ＡＳＣバイオ医薬品の発現及び精製
各ＡＳＣバイオ医薬品の遺伝子を、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＤＮＡ合成又はＰＣＲベースの合成によって合成し、修飾哺乳動物発現ベクターにクローニングした。ＡＳＣバイオ医薬品（３Ｄ４ｓｃｒ、３Ｄ４ＫＬＡ、３Ｄ４Ｓ９、３Ｄ４ｒＳ９、３Ｄ４ｒＳ９−ΔＤ６、３Ｄ４ｒＳ９−Ａ、３Ｄ４Ｓ９−Ｄ及び３Ｄ４Ｆｃ−ｒＳ９）を、抗ＤＳＧ２抗体（３Ｄ４）をベースとして作製した。また、細胞傷害性を有しないＥＰを有する３Ｄ４ｓｃｒを、陽性対照として抗ＤＳＧ２抗体（３Ｄ４）をベースとして作製した。３Ｄ４及び３Ｄ４ｓｃｒのヌクレオチド及びアミノ酸配列を下記表１に列挙する。各ＡＳＣバイオ医薬品のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、先の配列表に記載されている（段落［００７０］を参照）。ＡＳＣバイオ医薬品を、Ｅｘｐｉ２９３（商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Thermo Fisher Scientific）を用いた一過性遺伝子発現により、製造業者の使用説明書に従って発現させた。ＡＳＣバイオ医薬品を、プロテインＡアフィニティー精製（GE Healthcare）によりＥｘｐｉ２９３（商標）の上清から精製した。プロテインＡ樹脂を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）及び１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で洗浄した後、ＡＳＣバイオ医薬品を０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）で溶出させ、続いて溶出液１ｍＬ当たり０．１ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の添加によりサンプルｐＨの迅速な調整を行った。次いで、タンパク質溶液を、ＰＤ−１０（Ｎａｐ−１０）  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ（GE Healthcare）を用いてＰＢＳで緩衝液交換し、最後にＶｉｖａｓｐｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（GE Healthcare）を用いて濃縮した。得られるＡＳＣバイオ医薬品には、３Ｄ４ｓｃｒ、３Ｄ４ＫＬＡ、３Ｄ４Ｓ９、３Ｄ４ｒＳ９、３Ｄ４ｒＳ９−ΔＤ６、３Ｄ４ｒＳ９−Ａ、３Ｄ４Ｓ９−Ｄ及び３Ｄ４Ｆｃ−ｒＳ９が含まれる。
【００７９】
【表８】
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【００８０】
実施例３  フローサイトメトリーによるＡＳＣバイオ医薬品の分析
細胞（１×１０６個／ｍｌ）を採取し、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２％  ＦＢＳを含むＰＢＳに再懸濁し、１μｇ／ｍｌ  ＩｇＧ、３Ｄ４ｓｃｒ、３Ｄ４ＫＬＡ又は３Ｄ４Ｓ９と共に４℃で３０分間インキュベートした。４℃で３０分間、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、二次ＦＩＴＣコンジュゲート抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を添加した。サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリーを用いて分析した。１サンプル当たり１００００の細胞事象を分析した。図２Ａにフローサイトメトリーによる表面結合ＡＳＣバイオ医薬品を示すが、結果からＡＳＣバイオ医薬品が標的細胞を認識することが示される。
【００８１】
ヒト乳腺癌ＭＣＦ７細胞を採取し、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２％  ＦＢＳを含むＰＢＳに再懸濁し、３Ｄ４Ｓ９（１μｇ／ｍｌ）と共に各時点（１分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、９０分及び１２０分）について４℃又は３７℃でインキュベートした。全細胞を１％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、一次ウサギ抗リンカー−Ｘ抗体で染色した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して、リンカー−Ｘ及びＡＳＣバイオ医薬品をそれぞれ検出した。フローサイトメトリーを用いてサンプルを分析した。１サンプル当たり１００００の細胞事象を分析した。図２Ｂでは、切断されたＡＳＣバイオ医薬品がフローサイトメトリーにより評価される。
【００８２】
ヒト乳腺癌ＭＣＦ７細胞をガラスカバースリップ上に４８時間播種し、３Ｄ４Ｓ９を用いて３７℃で１時間及び４８時間処理した。カバースリップ上の細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間透過処理した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１０％ＦＢＳで１時間ブロッキングし、続いてウサギ抗リンカー−Ｘ抗体とのインキュベーションを行った。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して、リンカー−Ｘ及びＡＳＣバイオ医薬品の位置をそれぞれ可視化した。最後に、固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、それらの核を対比染色し、マウントし、蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡を用いることによって観察した。図２Ｃにこの蛍光ＩＣＣ染色を示す。図２Ｂ及び図２Ｃの結果から、３Ｄ４Ｓ９のポリカチオンドメインが切断され、ヒト乳腺癌ＭＣＦ７細胞に内在化することが示される。
【００８３】
実施例４  軟寒天コロニー形成アッセイ
細胞（２×１０３個）を３Ｄ４ｓｃｒ、３Ｄ４ＫＬＡ、３Ｄ４Ｓ９、３Ｄ４ｒＳ９、３Ｄ４ｒＳ９−ΔＤ６、３Ｄ４ｒＳ９−Ａ、３Ｄ４Ｓ９−Ｄ又は３Ｄ４Ｆｃ−ｒＳ９で１０分間処理した後、成長培地中で０．３５％アガロースと混合し、１２ウェルプレートの成長培地中の０．５％アガロースの固化層の上部にプレーティングした。１週間〜２週間後にコロニーをクリスタルバイオレット（０．０１％溶液）で着色し、ＰＢＳで洗浄し、顕微鏡を用いてコロニーを計数した。３Ｄ４ｓｃｒ、３Ｄ４ＫＬＡ、３Ｄ４Ｓ９、３Ｄ４ｒＳ９、３Ｄ４ｒＳ９−ΔＤ６、３Ｄ４ｒＳ９−Ａ、３Ｄ４Ｓ９−Ｄ又は３Ｄ４Ｆｃ−ｒＳ９の軟寒天コロニー形成アッセイの結果を図３〜図９に示す。結果から、３Ｄ４ＫＬＡで処理したヒト乳腺癌ＭＣＦ７細胞（図３Ａ）及びヒト非小細胞肺癌Ｈ１２９９（図３Ｂ）における軟寒天コロニー形成活性の低下；３Ｄ４Ｓ９で処理したヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図４Ａ）、ヒト乳腺癌ＳＫＢＲ３（図４Ｂ）、ヒト乳腺癌ＭＣＦ７（図４Ｃ）、ヒト肺癌Ａ５４９（図４Ｄ）、ヒト非小細胞肺癌Ｈ１２９９（図４Ｅ）及びヒト膵臓腺癌ＰＡＮＣ−１細胞（図４Ｆ）における軟寒天コロニー形成活性の低下；３Ｄ４ｒＳ９で処理したヒト肺癌Ａ５４９細胞における軟寒天コロニー形成活性の低下（図５）；３Ｄ４ｒＳ９−Ａで処理したヒト乳腺癌ＳＫＢＲ３（図６Ａ）及びヒト肺癌Ａ５４９細胞（図６Ｂ）における軟寒天コロニー形成活性の低下；３Ｄ４ｒＳ９−Ｄで処理したヒト肺癌Ａ５４９細胞における軟寒天コロニー形成活性の低下（図７）；３Ｄ４ｒＳ９−ΔＤ６で処理したヒト乳腺癌ＳＫＢＲ３細胞における軟寒天コロニー形成活性の低下（図８）；３Ｄ４Ｆｃ−ｒＳ９で処理したヒト肺癌Ａ５４９細胞における軟寒天コロニー形成活性の低下（図９）が示される。
【００８４】
３Ｄ４ｓｃｒ、３Ｄ４Ｓ９、３Ｄ４ＫＬＡ、３Ｄ４ｒＳ９、３Ｄ４ｒＳ９−ΔＤ６、３Ｄ４ｒＳ９−Ａ、３Ｄ４ｒＳ９−Ｄ及び３Ｄ４Ｆｃ−ｒＳ９を様々な癌細胞株中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害アッセイにおいて使用した。結果を下記表２に示す。
【００８５】
【表９】
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【００８６】
実施例５  腫瘍異種移植片
６週齢雄性非肥満糖尿病−重症複合免疫不全マウスに、マトリゲル（１：１）と混合した０．１ｍｌのＰＢＳ中の２×１０６個のヒト膵癌ＰＡＮＣ１細胞株の細胞の皮下注射を行った。腫瘍体積が２０ｍｍ３前後に達した時点で、マウスを各処理群に無作為に割り当てた。ＰＢＳで希釈した３Ｄ４ｓｃｒ及び３Ｄ４Ｓ９（３０ｍｇ／ｋｇ）を、３週間にわたって週２回腹腔内注射した。３Ｄ４ｓｃｒ及び３Ｄ４Ｓ９療法の全身毒性を評価するために、体重を治療期間の終了時に記録した。ノギスを用いて腫瘍サイズを測定し、式（長さ×幅２）／２に従って腫瘍体積を算出した。
【００８７】
図１０Ａ〜図１０Ｃに、３Ｄ４Ｓ９がヒト膵癌ＰＡＮＣ１細胞を用いたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける異種移植片腫瘍成長を低減することが示される。３Ｄ４ｓｃｒ対照群の２３１（±１５０）ｍｍ３と比較して、３Ｄ４Ｓ９で処理したヒトＰＡＮＣ１腫瘍異種移植片を担持するマウスは、３週間後に８４（±４０）ｍｍ３の腫瘍体積を有していた。３Ｄ４Ｓ９処理により異種移植片腫瘍体積が６０％低減した（図１０Ａ）。３Ｄ４ｓｃｒ対照群の０．６６（±０．３）ｇと比較して、３Ｄ４Ｓ９で処理したヒトＰＡＮＣ１腫瘍異種移植片を担持するマウスは、３週間後に０．１３（±０．０２）ｇの腫瘍重量を有していた。３Ｄ４Ｓ９処理により異種移植片腫瘍重量が８０％低減した（図１０Ｂ）。屠殺前にマウスの体重を量った。３Ｄ４ｓｃｒ又は３Ｄ４Ｓ９で処理したヒトＰＡＮＣ１腫瘍異種移植片を担持するマウスは、ほぼ同じ体重を有していた（図１０Ｃ）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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