(57)【要約】  本発明は、レイノー現象および免疫異常を患う患者における全身性強皮症の予防治療に使用するためにＰ２Ｙ１２受容体を阻害する物質に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レイノー現象および免疫異常を有する患者における、全身性強皮症の予防治療に使用するための、Ｐ２Ｙ１２受容体を阻害する物質。
【請求項２】
前記物質が、チエノピリジン、チカグレロル、エリノグレル、およびカングレロル、それらの活性代謝物、それらの薬学的塩、ならびにそれらの混合物から選択される、請求項１に記載の使用のための物質。
【請求項３】
前記物質が、チエノピリジン、その活性代謝物、およびそれらの薬学的塩から選択される、請求項１または２に記載の使用のための物質。
【請求項４】
前記チエノピリジンが、クロピドグレル、プラスグレル、およびチクロピジンから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための物質。
【請求項５】
前記免疫異常が抗核抗体を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための物質。
【請求項６】
前記抗核抗体が、抗Ｓｃｌ７０抗体、抗セントロメア抗体、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ抗体、抗Ｔｈ／Ｔｏ抗体、および抗ＰＭ−Ｓｃｌ抗体から選択される１つ以上の抗体である、請求項５に記載の使用のための物質。
【請求項７】
前記患者がさらに、強皮症パターンを有する毛細血管顕微鏡所見も示す、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための物質。
【請求項８】
前記薬学的塩が、硫酸水素塩、ベシル酸塩、重硫酸塩、塩酸塩、樹脂酸塩、ナパジシル酸、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カリウム、および硝酸塩からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための物質。
【請求項９】
前記物質がクロピドグレル硫酸水素塩である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための物質。
【請求項１０】
１日当たり５ｍｇ〜２５０ｍｇの前記物質の用量で投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための物質。
【請求項１１】
前記予防治療が、前記患者における全身性強皮症の発症を遅延させるか、または予防することからなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための物質。
【請求項１２】
前記予防治療が、前記治療の開始後２年以内に、皮膚強皮症、指潰瘍、ステージ３またはステージ４の呼吸困難、異常な毛細血管顕微鏡所見、従来の治療法では１ヶ月間続く胸焼け、関節痛および／または関節腫脹、毛細血管拡張症、皮下石灰沈着、色素異常症、ならびに筋肉痛からなる群から選択される少なくとも１つの症状の解消をもたらす、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための物質。
【請求項１３】
血小板活性化を阻害するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための物質。
【請求項１４】
血小板活性化に起因する炎症誘発性因子の発現および分泌を阻害するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のための物質。
【請求項１５】
内皮細胞による胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）の発現および／または産生を阻害するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性強皮症の予防治療に使用するための物質に関する。
【０００２】
したがって、本発明は医学分野および医薬品分野において有用性を有する。
【０００３】
以下の解説において、括弧（［  ］）内の参照は、本文の最後にある参照リストを指す。
【背景技術】
【０００４】
全身性強皮症（ＳＳｃ）は、皮膚および内部臓器に影響を及ぼす微小血管機能障害、免疫活性化、ならびに間質性線維症および血管周囲線維化によって特徴付けられる、限局性皮膚強皮症（ｌＳＳｃ）および汎発性皮膚強皮症（ｄＳＳｃ）という２つのサブセットへ古典的に分類される、複雑な全身性自己免疫疾患である（Gabrielli et al. N Engl J Med 2009; 360:1989-2003 （［１］））。この疾患の進行が遅ければ機能障害が増加する。重篤な合併症、特に、肺線維症が発生することがある。有病率は１０件／１００，０００と推定される。通常、疾患は４０〜５０歳ごろに発症し、その原因が明確に特定されることはない。
【０００５】
現在、この疾患を発病した場合に利用可能な特定の治療法は存在しない（Tyndall et al.: “Causes and risk factors for death in systemic sclerosis a study from the EULAR Scleroderma Trials and Research (EUSTAR) database”, Ann Rheum Dis 2010; 69: 1809-1815（［２］））。
【０００６】
全身性強皮症（ＳＳｃ）において、血管損傷と線維症との関連は依然としてほとんど知られていない。より具体的には、微小血管機能障害、免疫活性化、ならびに間質性線維症および血管周囲線維化のプロセスが相互に関連する仕組みは現在知られておらず、３つの病理学的特徴間における相互作用のより良く理解することが、病因のより良い理解に寄与することとなり、治療法の選択肢の改善が期待できる。
【０００７】
内皮細胞（ＥＣ）の活性化が疾患経過において非常に早期に表れるという事実は、慢性的な線維芽細胞の活性化が、少なくとも部分的に、内皮障害をもたらし得るということを示唆している（（［１］）；Pattanaik et al.: “Pathogenesis of Systemic Sclerosis”, Front Immunol 2015; 6:272（［３］））。
【０００８】
２５年以上に渡り、ＳＳｃであると診断された患者における多くの観察が血小板活性化を強調している。毛細血管内皮細胞活性化は、ＳＳｃにおける血管リモデリングの内膜肥厚特性に先行することが実証されてきている（Prescott et al.: “Sequential dermal microvascular and perivascular changes in the development of scleroderma”, J Pathol 1992; 166:255-263（［４］））。脈管構造の進行性消失は、ＳＳｃ患者において観察される、細胞外基質の蓄積および血小板の慢性的活性化に関与していると考えられる（Kahaleh MB, Osborn I, Leroy EC. Elevated levels of circulating platelet aggregates and beta-thromboglobulin in scleroderma. Ann Intern Med 1982;96:610-613（［５］）; Postlethwaite AE, Chiang TM. Platelet contributions to the pathogenesis of
systemic sclerosis. Curr Opin Rheumatol 2007;19:574-579 （［６］）; Solanilla A, Villeneuve J, Auguste P, et al. The transport of high amounts of vascular endothelial growth factor by blood platelets underlines their potential contribution
in systemic sclerosis angiogenesis. Rheumatology (Oxford) 2009;48:1036-1044 （［７］）; Chiang TM, Takayama H, Postlethwaite AE. Increase in platelet non-integrin type I collagen receptor in patients with systemic sclerosis. Thromb Res 2006;117:299-306（［８］））。反対に、血小板由来因子は、ＳＳｃにおける内皮細胞（ＥＣ）活性化および恒常性維持を調節する（Maugeri N, Franchini S, Campana L, et al. Circulating platelets as a source of the damage-associated molecular pattern HMGB1 in patients with systemic sclerosis. Autoimmunity 2012;45:584-587 （［９］）;
van Bon L, Affandi AJ, Broen J, et al. Proteome-wide analysis and CXCL4 as a biomarker in systemic sclerosis. N Engl J Med 2014; 370:433-443（［１０］））。近年、線維芽細胞活性化および細胞外基質成分の析出における血小板由来セロトニンの役割が、ＳＳｃにおいて説明されてきている（Dees C, Akhmetshina A, Zerr P, et al. Platelet-derived serotonin links vascular disease and tissue 線維症. J Exp Med 2011;
208:961-972（［１１］））。しかしながら、血小板／内皮細胞相互作用が線維芽細胞活性化に直接関与し、その後線維症に関与する因子の分泌を誘導し得るかどうかは、ＳＳｃにおいて依然として不明である。
【０００９】
上記のことから、いくつかの血小板可溶性メディエーターがＳＳｃ患者の血漿中で増加することが分かる。これらのメディエーターの中には、ベータ−トロンボグロブリン、血小板因子４（ＰＦ−４）、血小板由来増殖因子、可溶性ＣＤ４０Ｌまたは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Postlethwaite  et al. （［６］）; Kahaleh  et al.: （［５］）;
Allanore et al.: “lncreased plasma soluble CD40 ligand concentrations in systemic  sclerosis and association with pulmonary arterial  hypertension and digital
ulcers”, Ann Rheum Dis 2005; 64: 481-483 （［１２］）; Solanilla al.（［７］））。ＳＳｃ患者の血小板はまた、Ｐ−セレクチンといった活性化細胞膜マーカーを過剰発現する（Solanilla et  al.（［７］））。
【００１０】
ＳＳｃ患者における血小板活性化はまた、内皮細胞の壊死を誘導することができるＨＭＧＢ１（グループボックス１への高移動度）の、細胞質からアラーミン（alarmine）の膜への転位によっても付随して生じる（Maugeri et al.（［９］））。ＨＭＧＢ１の血中循環濃度はＳＳｃ患者において増加し、Rodnanスコアに対して正の相関を示し、肺機能に対して負の相関を示す（Yoshizaki et al.:  “Clinical significance of serum HMGB-1 and sRAGE levels in systemic  sclerosis: association with disease  severity”, J 
Clin  lmmunol  2009;29:  1 80-189（［１３］））。
【００１１】
近年の研究では、特にＳＳｃの病態生理学において血小板によって産生されるＣｘＣＬ４（ＰＦ−４）の主要な役割が強調されている。２０１４には、T. Radstakeのグループが、ＣｘＣＬ４の血中循環濃度の上昇がＳＳｃのバイオマーカーであることを示した（van Bon et al.（［１０］））。実際に、ＣｘＣＬ４は疾患の早期に上昇し、ＥＴ−１産生の増加に関与する。血管生成、成熟、および安定化、特にＶＥＧＦの阻害を通じて破壊する。
【００１２】
３７名のＳＳｃ患者の気管支肺胞液におけるベータ−トロンボグロブリンおよびＣｘＣＬ４比率の分析は、肺線維症における血小板の積極的役割を示す最近の間質性肺疾患に罹患するＳＳｃ患者のみにおいて、患者の３０％近くにおける濃度の上昇を示した（Kowal-Bielecka et al.: “Beta thromboglobulin and platelet factor 4 in bronchoalveolar
lavage fluid of patients with systemic sclerosis”, Ann Rheum Dis 2005;64:484-486（［１４］））。
【００１３】
そして、活性化した血小板によるメディエーターの過剰放出でのセロトニンの血中循環濃度の上昇が、ＳＳｃ患者において説明されている（Klimiuk et al.: “Platelet serot
onin in systemic sclerosis”,  Ann Rheum Dis 1989;48:586-589（［１５］）); its pro-fibrotic effect in scleroderma has been demonstrated only much more recently (Dees et al.:（［１１］））。活性化血小板によるセロトニン放出は、ＴＧＦ−βシグナル依存様式で、ＳＳｃ患者における線維芽細胞による細胞外基質の過剰産生を引き起こす。同一の論文において、クロピドグレルによる血小板活性化のインビボでの遮断およびセロトニン放出のインビボでの遮断は、強皮症の２匹のマウスモデルにおける線維症を減少させ、報告されているＳＳｃに罹患する患者においてのみ、血小板活性化の制御の治療効果の概念の証拠を提供する（Dees et al.:（［１１］））。
【００１４】
ＳＳｃ疾患の生理病理学に関するこれら全てのデータにも関わらず、この疾患の有効な治療法は存在せず、免疫抑制薬であるシクロホスファミドとして、この疾患の治療に現在使用されていると報告されている分子は、非常に緩やかな効果と患者に対する実質的な副作用のリスクを示す。
【００１５】
近年、Ntelis et al.（“Clopidogrel treatment may associate with worsening of endothelial function and development of new digital ulcers in patients with systemic sclerosis: results from an open label, proof of concept study”; BMC Musculoskeletal Disorders (2016) 17:213（［４６］））は、ＳＳｃに罹患する患者のクロピドグレル治療は、内皮機能のマーカーを悪化させ、ＳＳｃに罹患する患者における新規の指潰瘍の発生と関連し得ることを観測した。
【００１６】
ＳＳｃを発生するリスクを有する患者の文献データベースは、ＳＳｃに罹患する患者のものと比べ圧倒的に少ない。
【００１７】
ＳＳｃの発生における重要なステップは、前臨床段階、または病気に罹る前のステージである。特に、免疫異常および血管形成異常は臨床疾患の発達前の数年間で観察可能であることが示されている。これらの異常にのうち、次の２つは特に関連性があり、ＳＳｃの上流で検出するのが容易である。
・レイノー現象（ＲＰ）：これは寒冷などのいくつかの刺激に対する血液の微小循環の過剰反応である。単独では、この現象は一切の臨床的帰結を伴わない身体的特徴であり得るが、いくつかのＲＰはＳＳｃの最初の症状発現である。古典的な止血をはるかに超えて影響を及ぼす可能性があり、ＳＳｃにて観測される脈管障害、免疫異常、および組織リモデリングに影響を及ぼし得る、ＲＰ過剰血小板活性化に存在する可能性がある（Pauling et al.: “The  contribution of platelets to the pathogenesis of Raynaud's phenomenon and systemic sclerosis”, Platelets 2013; 24: 503-515（［１６］））。単にレイノー現象を有する対象は、血小板活性化マーカーが増加した（Silveri et al.:  “Relative rates of endothelial cell damage and platelet activation in primary Raynaud's phenomenon (RP) and RP secondary to  systemic sclerosis”, Scand J Rheumatol  2001; 30: 290-296（［１７］））。前強皮症であると同定された患者において、内皮活性化のいくつかのマーカー（エンドセリン−１（ＥＴ−１）および可溶性細胞接着分子（ＩＣＡＭ−１））、ならびに血小板活性化のいくつかのマーカー（ベータ−トロンボグロブリンおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ））が増加した（（［１７］）；Vettori et al.: “Early systemic sclerosis: serum profiling of factors involved in endothelial, T-cell, and fibroblast interplay is marked by elevated interleukin-33 levels”, J Clin lmmunol 2014; 34: 663-668（［１８］））；
・免疫異常：前臨床段階の間に、自己免疫強化および自己抗体を検出し、測定することができるが、その一方で、臨床徴候が対象に警告をすることは一切できない。
【００１８】
「前ＳＳｃ状態」とも呼ばれる前臨床段階は、２０１３年のＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ（米国リウマチ学会／ヨーロッパリウマチ連盟）の基準に基づくＳＳｃの分類以外の基準にはよ
らずに、ＲＰの存在、免疫異常、および／または異常な毛細血管顕微鏡所見の存在によって３つの群に区別される。群Ｉは、ＲＰ、特に、抗Ｓｃｌ７０、抗セントロメア、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（抗ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ）、抗Ｔｈ／Ｔｏ、および／または抗ＰＭ−Ｓｃｌ（多発性筋炎−強皮症）抗体の存在を伴う特定の免疫異常、ならびに異常な毛細血管顕微鏡所見の組合せとして定義される。これらの対象において、真性のＳＳｃに向かうリスクは３年以内に８０％へ到達する。群ＩＩは、ＲＰ、および異常な毛細血管顕微鏡所見を伴わない特定の免疫異常を有する対象を含む。この群において、ＳＳｃに向かうリスクは、３年以内で３５％〜６６％の範囲である。最後に、ＲＰ、非特異的な免疫異常（すなわち、前述の自己抗体以外の抗核抗体）、および異常な毛細血管顕微鏡所見に関連する群ＩＩＩは、３年以内にＳＳｃを発生させる２５％のリスクを有する（Koenig et al.: “Autoantibodies and Microvascular Damage Are Independent Predictive Factors for the Progression of Raynaud’s Phenomenon to Systemic Sclerosis>>, ARTHRITIS & RHEUMATISM, Vol. 58, No. 12, December 2008, pp 3902-3912［４２］）；Valentini et al.: “Early Systemic Sclerosis: Analysis of the Disease Course in Patients
With Marker Autoantibody and/or Capillaroscopic Positivity”, Arthritis Care & Research, Vol. 66, No. 10, October 2014, pp 1520-1527（［４３］））。
【００１９】
この前臨床段階は、以下の３つの条件において、強皮症への進行を防ぐための治療の機会の窓となり得る：
・比較的単純かつ安価であり、患者にとって有利なリスクベネフィット比を有すること、
・早期に動作する可能性のある明確な生理病理学的なメカニズムが同定されること、
・大多数の症例において有意な臨床徴候を示さないため、標的集団を同定することができること。
【００２０】
ＳＳｃは通常、中期的には命に関わる状態であり、疾患を発症した場合には特定の治療法が存在しないため、患者にとっての個人的な利益は重要となり得る。
【００２１】
したがって、ＳＳｃの、代替的で、より効果的、かつ低毒性な治療方法、特にＳＳｃ予防治療の必要性が存在する。本発明はこれらの必要性およびその他の必要性を満たす。
【発明の概要】
【００２２】
一連の全身性強皮症に関する広範な研究の後、本出願人は、血小板活性化が内皮活性化によるＳＳｃ患者における線維症に寄与し得ることを実験し、観測した最初の者である。これらの所見は、ＳＳｃの病態生理学の２つの重要な要素（脈管障害および線維症）の間に関係性をもたらす。本出願人は、インビトロでの血小板活性化が、ＩＬ−１βおよび血小板セロトニンの放出によるメカニズムにおけるヒト皮膚微小血管内皮細胞によって、前線維性メディエーターである胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）の産生を誘導すること、ならびにこの血小板活性化の遮断が内皮細胞によるＴＳＬＰの発現を妨げることを示した最初の者である。
【００２３】
本出願人は、驚くべきことに、ＴＳＬＰは、コラーゲンＡ１およびＡ２の分泌、ならびにメタプロテアーゼ（ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−２）の産生減少を誘発させて、マトリクス皮膚線維芽細胞によりそれらを前線維性プロファイルへ導くことができるということもまた実証した。
【００２４】
本出願人は、驚くべきことに、主に内皮細胞に起因するＳＳｃ患者の真皮におけるＴＳＬＰの過剰発現を強調したため、これらのインビトロでの観察はインビボで確認された。ＴＳＬＰはまた、ケラチノサイトによっても発現されたが、ＳＳｃ集合全体でかなり均質であった。本出願人は、驚くべきことに、ＳＳｃ患者における真皮ＴＳＬＰの発現がRodn
anスコアと相関することを、特に実証した。ＴＳＬＰの真皮発現はまた、罹病期間（非レイノー現象（ＲＰ）症状の出現以来）と逆相関した。そして、真皮ＴＳＬＰ濃度は、超音波検査（ＰＡＰＳ＞３５ｍｍＨｇ）によって診断された肺動脈高血圧（ＰＡＨ）を罹患する患者においてより高かった。
【００２５】
したがって、本出願人の結果は、血小板誘導体の影響下における内皮細胞によるＴＳＬＰ産生、および患者ＳＳｃにおいて観察された線維症におけるその潜在的役割を初めて示す。これらの結果は、したがって、血小板活性化の遮断がＳＳｃ患者における線維化プロセスを妨げることができるという根拠となる。
【００２６】
したがって、本出願人は驚くべきことに、血小板活性化と、ＴＳＬＰおよび線維症の内皮細胞産生との関連性を示している。
【００２７】
したがって、本発明は、全身性強皮症を発症するリスクのある患者の予防治療を提供することを目的とする。本出願人が得た病態生理学的データにおいて、提案されている治療法は、これらの患者におけるＳＳｃの発生を妨げるための、Ｐ２Ｙ１２受容体の阻害剤の使用である。
【００２８】
この戦略は、現在非常に重要なＳＳｃ疾患の社会経済的負担を大幅に軽減し得る。その上、この新規の徴候は、予防的治療効果を提供することによって、プライマリケアの一部として、リスクのあるこれらの対象の早期発見を促すことができる。一般開業医は、予防的治療効果を提供するための予防処置があれば、そのような患者を同定するためにさらなる注意を払うであろう。
【００２９】
したがって、本発明は、概して、レイノー現象および免疫異常に罹患する患者における全身性強皮症の予防治療に使用するための、Ｐ２Ｙ１２受容体の阻害剤、または２つ以上のＰ２Ｙ１２受容体阻害剤の混合物に関する。
【００３０】
Ｐ２Ｙ１２、Ｐ２Ｙプリン受容体１２、ＡＤＰグルコース受容体、ＡＤＰＧ−Ｒ、Ｐ２Ｔ（ＡＣ）、Ｐ２Ｙ（ＡＣ）、Ｐ２Ｙ（ｃｙｃ）、Ｐ２Ｙ１２血小板ＡＤＰ受容体、Ｐ２Ｙ（ＡＤＰ）、ＳＰ１９９９、Ｐ２ＲＹ１２とも呼ばれるＰ２Ｙ１２受容体は、Ｐ２ＲＹ１２（ＨＯＲＫ３とも呼ばれる）遺伝子によってコード化される。これは、Ｇたんぱく質共役型（ＧＰＣＲ）プリン受容体の群のＧｉクラスに属し、アデノシン二リン酸塩（ＡＤＰ）に対する化学受容体である。Ｐ２Ｙファミリーは、種々のアデノシンおよびウリジンヌクレオチドについて、いくつかの場合において重複する、異なる薬理学的選択性を伴う数個の受容体サブタイプを有する。Ｐ２Ｙ１２は、限定されることはないが、主に血小板表面上において見出され、血小板凝集を介する血液凝固における重要な制御因子である。
【００３１】
「Ｐ２Ｙ１２受容体の阻害剤」とは、本明細書において、Ｐ２Ｙ１２受容体の生物学的な正常効果を、可逆的もしくは不可逆的に、選択的もしくは非選択的に、制限または回避するような、Ｐ２Ｙ１２受容体のあらゆる拮抗物質を指す。より具体的には、可逆的または非可逆的にＰ２Ｙ１２受容体を結合することによって、Ｐ２Ｙ１２受容体の生物学的な正常効果を、可逆的もしくは非可逆的に制限または回避する、Ｐ２Ｙ１２受容体のあらゆる拮抗物質を指してもよい。「制限」または「制限する」では、Ｐ２Ｙ１２受容体の正常生物学的効果、すなわち、阻害剤に阻害されていないＰ２Ｙ１２受容体の生物学的効果と比較して、少なくとも５０％、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％のＰ２Ｙ１２受容体の生物学的効果の減少が理解される。
【００３２】
Ｐ２Ｙ１２受容体の阻害剤は、チエノピリジン、チカグレロル、エリノグレル、ならびにカングレロル、それらの活性代謝物、それらの薬学的塩、およびそれらの混合物からな
る物質の群から選択することができる。
【００３３】
有利には、この物質は、チエノピリジン、チエノピリジンの活性代謝物、およびそれらの薬学的塩から選択することができる。例えば、チエノピリジンは、クロピドグレル、プラスグレル、およびチクロピジンからなる群から選択することができる。
【００３４】
チエノピリジンは、選択的かつ不可逆的なＰ２Ｙ１２阻害剤のクラスであり、一般的には、その抗血小板活性のために使用される。このクラスの薬剤としては、Plavix（商標）として市販されているクロピドグレル、Effient（商標）として市販されているプラスグレル、およびTiclid（商標）として市販されているチクロピジンがある。全てのチエノピリジンは薬理活性代謝物および不活性代謝物へと急速に代謝されるプロドラッグである。チエノピリジンは以下に示す化学式（式Ｉ）を有する：
【００３５】
【化１】
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【００３６】
チエノピリジンの薬学的塩は、硫酸水素塩、ベシル酸塩、重硫酸塩、塩酸塩、樹脂酸塩、ナパジシル酸、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硝酸塩から選択してもよい。
【００３７】
クロピドグレル（国際一般名称）は、冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患において血液凝固を阻害するため、そして心筋梗塞、特に心臓発作を予防するために、一般的に使用されるチエノピリジンクラス剤である。クロピドグレルはＰ２Ｙ１２受容体を不可逆的に阻害することで作用する。これは、肝臓の活性代謝物に対するその活性化のためにシトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９（ＣＹＰ２Ｃ１９）を必要とする、プロドラッグである。クロピドグレルの活性代謝物は、Ｐ２ＲＹ１２受容体上における遊離システインを結合し、ＡＤＰ結合および受容体活性化を不可逆的に遮断する、チロール基を含有する。クロピドグレルは、以下に示す化学式（式ＩＩ）を有する：
【００３８】
【化２】
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【００３９】
クロピドグレルはチクロピジン類似体であるため、構造的にチクロピジンと関連し、抗血小板薬のこのクラスの第１メンバーである。クロピドグレルは、チクロピジンと比較して、ヒトにおいてより良好なリスクベネフィット比を有するバックアップ化合物を得るために開発された。プラスグレルは、同一の目的で開発された第３世代のチエノピリジンである（Jean-Pierre Maffrand: “The story of clopidogrel and its predecessor, ticlopidine: Could these major antiplatelet and antithrombotic drugs be discovered and developed today?”, C. R. Chimie 15 (2012) 737-743（［４４］））。
【００４０】
クロピドグレルは塩基として投与してもよい。あるいは、硫酸水素塩、ベシル酸塩、重硫酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、樹脂酸塩、およびナパジシル酸、好ましくは硫酸水素塩からなる群から選択してもよい、クロピドグレルの薬学的塩として投与することができる。
【００４１】
プラスグレル（国際一般名称）は、Ｐ２Ｙ１２受容体を不可逆的に結合することによって血小板の凝集を減少させるために一般的に使用される、チエノピリジンクラス抗血小板薬である。プラスグレルは、腸内で急速に加水分解されてチオラクトンとなり、その後主にＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｂ６によって活性代謝物へと変換され、そしてＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｃ１９によってはより少ない程度で変換される、プロドラッグである。活性代謝物は、Ｓメチル化、またはシステインとの抱合によって２つの不活性な化合物へと代謝される。プラスグレルは、等量の（Ｒ）−プラスグレルおよび（Ｓ）−プラスグレルを含むラセミ化合物として利用可能であり、以下に示す化学式（式ＩＩＩ）を有する：
【００４２】
【化３】
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【００４３】
プラスグレルは、あるいは、活性精製したエナンチオマーとしても使用することができる。
【００４４】
プラスグレルの薬学的塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩からなる群から選択してもよい。
【００４５】
チクロピジン（国際一般名称）は、アデノシン二リン酸塩（ＡＤＰ）受容体阻害剤である、チエノピリジンクラス抗血小板薬である。これは、血小板凝集をもたらすＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体活性化に関するＡＤＰ受容体を遮断して肝臓中の活性チオール代謝物へと代謝される、プロドラッグである。チクロピジンは、以下に示す化学式（式ＩＶ）を有する：
【００４６】
【化４】
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【００４７】
チクロピジンの薬学的塩は塩酸塩であってもよい。
【００４８】
チカグレロルは、Ｐ２Ｙ１２受容体を可逆的に阻害するシクロ−ペンチルトリアゾロ−ピリミジンである。これは、シクロペンタン環が糖リボースに類似し、窒素に富む芳香族環系が核酸塩基プリンに似ており、アデノシンとの全体的な類似性を分子に与える、ヌクレオシド類似体である。チエノピリジンプラスグレル、クロピドグレル、およびチクロピジンとは異なり、チカグレロルはＡＤＰと異なる結合部位を有し、これをアロステリックな拮抗物質にし、そして遮断が可逆的である。チカグレロルは、Ｏ−脱エチル基によって形成された１つの活性代謝物であるＡＲ−Ｃ１２４９１０ＸＸを有するが、チカグレロルおよびその活性代謝物はほぼ等効力である。チカグレロルは、以下に示す化学式（式Ｖ）を有する：
【００４９】
【化５】
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【００５０】
チカグレロルは、多数の異なる実質的な結晶形態（多形Ｉ、多形ＩＩ、多形ＩＩＩ、お
よび多形ＩＶ）で存在し得る。
【００５１】
カングレロルはＰ２Ｙ１２可逆的阻害剤抗血小板薬であり、代謝的変換を必要としない活性薬物である。カングレロルは、以下に示す化学式（式ＶＩ）を有する：
【００５２】
【化６】
2019502739.tif 000008
【００５３】
エリノグレルは、Ｐ２Ｙ１２阻害剤として作用する抗血小板薬である。チカグレロルと同様に、エリノグレルは可逆的阻害剤である。これは薬理学的に活性である。エリノグレルは、以下に示す化学式（式ＶＩＩ）を有する：
【００５４】
【化７】
2019502739.tif 000009
【００５５】
エリノグレルはそのカリウム塩の形態で、例えば経口的に使用してもよい。
【００５６】
より具体的には、本発明は、レイノー現象および免疫異常に罹患する患者における全身性強皮症の予防治療に使用するための、チエノピリジン、その活性代謝物、その薬学的塩、およびそれらの混合物から選択される物質に関する。
【００５７】
さらにより具体的には、物質は、クロピドグレルおよびプラスグレルから選択してもよい。
【００５８】
好ましくは、使用した物質は、クロピドグレル、その薬学的塩、その活性代謝物、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００５９】
クロピドグレルは、アスピリンと同様に、抗血小板薬である。しかしながら、アスピリンとは対照的に、クロピドグレルは、血小板溶解性メディエーターの開口分泌の減少、お
よびＣＤ４０Ｌとしての免疫応答の共刺激分子の膜発現の減少をさらに誘導する。本出願人は、クロピドグレルが、アスピリンとは異なり、健康な内皮細胞からのインビトロの前線維性ＴＳＬＰ分子発現を遮断することができるということを示している。あらゆる生物学メカニズムの理論に関連するものではないが、本出願人は、内皮細胞によるＴＳＬＰの産生を介した血小板活性化と線維症との関連に関するこれらの結果およびこれらの実験結果を考慮して、クロピドグレルのこれらの免疫学的側面、すなわちクロピドグレルのこの免疫調節効果は、クロピドグレルの止血効果に加えて、少なくとも部分的に、内皮細胞による血小板活性化の遮断およびＴＳＬＰの発現の阻害を介して、レイノー現象および免疫異常に罹患する患者の全身性強皮症の予防治療におけるその効果を経験してもよい、と仮定する。
【００６０】
以前に述べた通り、クロピドグレルは現在、指潰瘍の様なあらゆる副作用を伴わない、種々の血管病理学、すなわち、脳卒中および心筋梗塞において、広く使用されている。本発明のＳＳｃの予防治療の文脈において、同一のタイプの集合、すなわち、確定された線維症を有しないが、血管障害を有するタイプの集合が標的とされる。
【００６１】
さらに、Ntelis et al.（［４６］）によって観察されたものとは対照的に、線維症確定前のマウスのクロピドグレルによる予防治療は、指潰瘍の発達と関連しない。
【００６２】
「予防治療」とは、本明細書において、疾患治療とは対照的に、疾患の予防のために取られる予防対策を指す。より具体的には、予防治療は、将来的に全身性強皮症を発生するリスクのある患者に対して、リスクのある患者における全身性強皮症の発症を、遅延させる、制限する、または妨げる目的のために、投与される治療である。
【００６３】
「リスクのある患者」とは、本明細書において、最終的に強皮症パターンを伴う毛細血管顕微鏡所見を有する、レイノー現象および免疫異常を、現在有している、または過去に有していた、あらゆる患者を指す。いずれの場合においても、これらの患者は確定された線維症を有しない。
【００６４】
本発明によれば、「予防する」とは、本発明の予防治療が、治療の開始後２年以内に、皮膚強皮症、指潰瘍、ステージ３またはステージ４の呼吸困難、異常な毛細血管顕微鏡所見、従来の治療法では１ヶ月間続く胸焼け、関節痛、および／または関節腫脹、毛細血管拡張症、皮下石灰沈着、色素異常症、ならびに筋肉痛からなる群から選択される少なくとも１つの症状の解消をもたらすことを意味する。
【００６５】
本発明によれば、「遅延させる」とは、レイノー現象および／または免疫異常および／または強皮症パターンを伴う毛細血管顕微鏡所見の発生と、ＳＳｃの発生との間の期間が、本発明の予防治療によって処置されない患者における期間よりも、本発明の予防治療によって処置された患者における期間の方が平均して長いということをもたらすことを意味する。治療した患者における期間は、無処置の患者における平均期間と比較して、１年以上、例えば２年、もしくは３年、またはさらに長くなり得る。
【００６６】
本発明によれば、「制限する」とは、症状の重篤度および／または症状の範囲が、本発明の予防治療によって平均して減少することを意味する。
【００６７】
「レイノー現象」とは、本明細書において、次の症状のうち少なくとも１つを引き起こす、寒冷または精神的ストレスに応じて減少した血流を指す：指、つま先、および時にはその他の領域の変色、長手方向への隆起を伴い脆化する爪、ならびに皮膚、皮下組織、および筋肉の萎縮。機構的な理論とは関係なく、これらの症状は、末梢血管の極度な血管収縮を引き起こし、組織低酸素をもたらす、交感神経系の活性化過剰によって引き起こされ
得る。診断は、当業者に現在利用可能な診断基準のあらゆる組合せによって、例えば、患者による症状の説明によって実現され、そして医師により慎重に作成された病歴によって確認される。
【００６８】
「免疫異常」とは、本明細書において、その他の臨床徴候が検出され得ない中で、異常な自己免疫、特に、検出およびまたは測定され得る陽性レベルの自己抗体の存在を指す。免疫異常は、特異的な免疫異常または非特異的な免疫異常であり得る。
【００６９】
「特異的な免疫異常」とは、本明細書において、ＳＳｃ患者、およびＳＳｃに対して高いリスクを有するいくつかの対象（前述のＩ群およびＩＩ群）の両方で検出可能な抗核抗体を指す。これらは、抗セントロメア（Ａおよび／もしくはＢ）、抗ＤＮＡトポイソメラーゼＩ（抗Ｓｃｌ７０とも呼ばれる）、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、抗Ｔｈ／Ｔｏ、ならびに／または抗Ｐｍ−Ｓｃｌを含み得る。
【００７０】
「非特異的な免疫異常」とは、本明細書において、ＳＳｃに対して低いリスクを有する対象（前述のＩＩＩ群）の両方において検出可能な抗核抗体を指す。これらはＳＳｃに特異的でない自己抗体を含んでいてもよいため、特異的な自己抗体とは異なる。自己抗体は、この場合、抗核抗体（ＡＮＡ）であってもよい。自己抗体の存在、および特にＡＮＡの存在は、現在利用可能なあらゆる方法、ＡＮＡ検出のためのゴールドスタンダードであるＨｅｐ−２細胞における間接免疫蛍光法によって測定することができる。ＡＮＡ検出の国際的指針は、有意な陽性ＡＮＡレベルが、成人に関して１／１６０以上、６５歳以上に関して１／３２０以上、および子供に関して１／４０以上であると述べている（Agmon-Levin N. et L.: “International recommendations for the assessment of autoantibodies
to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies.”, Ann Rheum Dis. 2014 Jan;73(1):17-23（［４５］））。
【００７１】
「強皮症パターンを伴う毛細血管顕微鏡所見」とは、本明細書において、微小循環の形態的評価によって明らかとなった、健康な対象と比較して、爪郭における、より大きな毛細血管（メガキャピラリー（megacapillaries））および／または無血管野および／または微小出血の存在を指す。有利には、毛細血管顕微鏡所見はビデオ毛細血管顕微鏡所見であってもよい。
【００７２】
有利には、上で規定した物質は血小板活性化を阻害し得る。「阻害」とは、本明細書において、正常レベル、またはほぼ正常レベルの血小板活性化、すなわち、健康な対象において発生する血小板活性化のレベルに対する血小板活性化の減少を指す。血小板活性化の減少は、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−１β、セロトニン、ベータ−トロンボグロブリン、ＣｘＣＬ４（ＰＦ−４）から選択された血小板活性化マーカーのうち少なくとも１つの減少であってもよい。減少は、少なくとも２０％の減少、例えば３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、またはそれ以上の減少であってもよい。
【００７３】
有利には、上で定義した物質は、血小板活性化に由来する少なくとも１つの炎症誘発性因子の発現および分泌を阻害し得る。「阻害」とは、本明細書において、正常レベル、またはほぼ正常レベルの血小板活性化、すなわち、健康な対象において発生する血小板活性化に由来する炎症誘発性因子の発現および分泌のレベルに対する、血小板活性化に起因する炎症誘発性因子の発現および分泌の減少を指す。炎症誘発性因子は、エンドセリン−１、フォンウィルブランド因子、Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−１β、セロトニン、ベータ−トロンボグロブリン、およびＣｘＣＬ４（ＰＦ−４）から選択してもよい。減少は、少なくとも２０％の減少、例えば３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９
０％、またはそれ以上の減少であってもよい。
【００７４】
有利には、上で定義した物質は、内皮細胞による胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）の発現および／または産生を阻害し得る。より具体的には、内皮細胞によるＴＳＬＰの発現および／または分泌は、活性化血小板によるＩＬ−１βおよび血小板セロトニンの放出に応じた仕組みで発生し得る。ＴＳＬＰは、種々の炎症性疾患に結びつけられているインターロイキン−７（ＩＬ−７）サイトカインファミリーメンバーである（Hillen MR,
Radstake TR, Hack CE, et al. Thymic stromal lymphopoietin as a novel mediator amplifying immunopathology in rheumatic disease (Rheumatology (Oxford) 2015（［１９］）；Lo Kuan E, Ziegler SF. Thymic stromal lymphopoietin and cancer. J Immunol 2014; 193:4283-4288（［２０］））。ＴＳＬＰは、ナイーブなＴ細胞のＴｈ２表現型への分化、およびＩＬ１３を含む種々の前線維性因子の分泌を促進する（Ito T, Wang YH, Duramad O, et al. TSLP-activated dendritic cells induce an inflammatory T helper type 2 cell response through OX40 ligand. J Exp Med 2005; 202:1213-1223（［２１］）；Pedroza-Gonzalez A, Xu K, Wu TC, et al. Thymic stromal lymphopoietin fosters human breast tumor growth by promoting type 2 inflammation. J Exp Med 2011;
208:479-490［２２］））。実際に、本出願人は、ＩＬ−１βおよび血小板セロトニンの放出に応じた仕組みで、ヒト皮膚微小血管内皮細胞によってＴＳＬＰの産生を誘導するインビトロでの血小板活性化を実証している。
【００７５】
物質は、本発明の予防治療のため薬学的に許容可能かつ有効な用量で、上に規定したようなリスクのある患者に投与することができる。
【００７６】
物質は、必要に応じて、例えば２年以上、または５年以上、または１０年以上、または２０年以上、または３０年以上、または生涯に渡り投与することができる。例えば、クロピドグレルは生涯に渡り投与することができる。
【００７７】
例えば、物質は、１日当たり５ｍｇ〜２５０ｍｇ、例えば、１０ｍｇ〜２００ｍｇ、または５０ｍｇ〜１５０ｍｇからなる用量で、リスクのある患者に投与することができる。
【００７８】
例えば、クロピドグレルは、１日当たり約７５ｍｇの用量で、１日当たり単一用量の形態にて投与することができる。本実施形態において、用量は、１日当たり５０ｍｇ〜１日当たり１００ｍｇ、または１日当たり７０ｍｇ〜１日当たり９０ｍｇからなっていてもよい。
【００７９】
別の例において、プラスグレルは、約５ｍｇの用量で１日１回または２回、または約１０ｍｇの用量で１日１回投与することができる。本実施形態において、用量は、１日当たり２ｍｇ〜１日当たり２０ｍｇ、または１日当たり７ｍｇ〜１日当たり１５ｍｇからなっていてもよい。
【００８０】
別の例において、チクロピジンは、約２５０ｍｇの用量で１日１回投与してもよい。本実施形態において、用量は、１日当たり１５０ｍｇ〜１日当たり３００ｍｇ、または１日当たり１８０ｍｇ〜１日当たり２８０ｍｇからなっていてもよい。
【００８１】
別の例において、チカグレロルは、約９０ｍｇの用量で１日１回投与することができる。本実施形態において、用量は、１日当たり５０ｍｇ〜１日当たり１２０ｍｇ、または１日当たり７０ｍｇ〜１日当たり１００ｍｇの用量からなっていてもよい。
【００８２】
一実施形態において、投与は、経口投与であってもよい。本実施形態において、投与は、口腔内投与または舌下投与であってもよい。投与は、例えば、液剤、経口発泡性剤形（
oral effervescent dosage form）、経口用パウダー、ピル、多粒子システム（multiparticule system）、口内分散性剤形、溶液、シロップ、懸濁液、乳剤、および経口用滴剤（oral drops）からなる群から選択された形態であってもよい。薬物が経口発泡性剤形の形態である場合、錠剤、顆粒剤、散剤からなる群から選択することができる。薬物が経口用パウダーまたは多粒子システムの形態である場合、ビーズ、顆粒剤、小型錠剤（mini tablets）、およびマイクロ顆粒剤（micro granules）からなる群から選択することができる。薬物が口内分散剤形の形態である場合、口内分散性錠剤（orodispersible tablets）、冷凍乾燥ウェーハ（lyophilized wafers）、薄膜、咀嚼錠、錠剤、およびカプセル剤、医療用チューインガムからなる群から選択される形態であってもよい。本発明によれば、薬物が口腔内経路および舌下経路用である場合、口腔内錠剤または舌下錠剤、粘膜付着性製剤、口腔粘膜用滴剤（oro-mucosal drops）、および噴霧剤からなる群から選択することができる。
【００８３】
別の実施形態において、投与は、非経口投与である。非経口投与は、静脈内投与、筋肉内投与、および皮下投与からなる群から選択することができる。これらの場合において、物質は注射剤の形態であってもよい。
【００８４】
別の実施形態において、投与は、経皮投与または経粘膜投与であってもよい。薬物が局所経皮投与用である場合、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、パッチ剤、およびフォーム剤からなる群から選択することができる。薬物は経鼻投与のための薬物であってもよく、例えば、点鼻剤、鼻腔用スプレー剤、鼻腔用散剤からなる群から選択することができる。
【００８５】
当業者であれば、本明細書にて使用される用語「形態」とは、実用のための薬物の製剤処方を指すということが明確に理解されよう。例えば、薬物は、タブレット剤（例えば、Plavix（登録商標）７５ｍｇ、またはEffient（登録商標）５ｍｇもしくは１０ｍｇ、またはTiclid（登録商標）２５０ｍｇ、またはBrilique（登録商標）９０ｍｇなど）、注射剤型（例えば、Avlocardyl（登録商標）５ｍｇ／ｍｌなど）、シロップ剤（例えば、Efferalgan（登録商標）３％など）、経口懸濁液、ペレット剤（例えば、Dafalgan（登録商標）１ｇなど）、散剤（例えば、Doliprane（登録商標）１００ｍｇなど）、顆粒剤（例えば、Zoltum（登録商標）１０ｍｇなど）、噴霧剤、経皮パッチ（例えば、Cordipatch（登録商標）５ｍｇ／２４時間など）、または局所形（クリーム剤、ローション剤、洗眼剤）（例えば、それぞれDermoval creme（登録商標）、Betneval（登録商標）ローション、およびChibroxine（登録商標）点眼薬など）からなる群から選択される形態であってもよい。
【００８６】
これらの例において、物質、例えばクロピドグレルは、関連する場合、該薬物の活性成分に添加されてもよく、または置換されてもよい。
【００８７】
薬剤的に許容可能な担体は、対象に応じて、ヒトまたは動物への物質の投与に使用される、あらゆる既知の好適な薬剤的担体であってもよい。例えば、この担体は、Plavix（登録商標）、またはEffient（登録商標）もしくはTiclid（登録商標）、またはBrilique（登録商標）中に存在する１つ以上の担体であってもよい。
【００８８】
本発明は、限定するためのものとして解釈すべきではない付属の図面に関して、以下の実施例によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、強皮症患者、特に指潰瘍に罹患する患者の血清中におけるＴＳＬＰの過剰発現の実証を表す。（Ａ）２０人の健常ドナー（ＨＤ）、２０３人の強皮症（ＳＳｃ）患者の血清におけるＴＳＬＰ測定。クラスカル・ワリスの多重比較ノンパラメトリック検定を用いて、ＴＳＬＰ血清レベルを比較した。（Ｂ）指潰瘍の存在によるＳＳｃ患者におけるＴＳＬＰ血清レベル。対応のないｔ検定を使用した。（Ｃ）指潰瘍の存在または非存在に応じた血清中において、ＴＳＬＰ陽性である患者の割合。フィッシャーの正確検定が用いられた。（Ｄ）指潰瘍、ＰＡＨ強皮症、および／または腎クリーゼのいずれかを含む血管プロファイルに応じたＳＳｃ患者におけるＴＳＬＰ血清レベル。対応のないｔ検定を使用した。散布図（scatter dot plot）において、各ドットは別々の固体を表す。Ｐ＜０．０５は有意であると見なした。
【図２】図２は、ＴＳＬＰが、健常ドナーと比較してＳＳｃ患者の皮膚において過剰発現され、線維症と相関することの実証を表す。（Ａ）免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して、ヒトの皮膚におけるＴＳＬＰのエクスビボでの発現を同定した。５人の健常ドナー（ＨＤ）、９人の限局性皮膚ＳＳｃ（ｌＳＳｃ）、および１０人の汎発性皮膚ＳＳｃ（ｄＳＳｃ）のうち１人におけるＴＳＬＰのＩＨＣの代表的な染色を示す（元の倍率の４０倍）。矢印は陽性のＴＳＬＰ染色を示す。下部パネルにおいて、倍率１００倍のＴＳＬＰの代表的な染色のＩＨＣは、陽性細胞の血管周囲分布を示す。矢印は陽性ＴＳＬＰ染色を示す。（Ｂ）５人の異なるＨＤおよび１８人のＳＳｃ皮膚由来の２つの別々のスライドについて分析された切片において、全細胞中の真皮におけるＴＳＬＰ陽性細胞の数として表される、ＴＳＬＰ陽性真皮細胞の定量。ｐ＜０．０００１、対応のないｔ検定を使用。（Ｃ）真皮ＴＳＬＰ発現細胞の割合とRodnan（ｍＲＳＳ）の皮膚線維化スコアとの相関（＊ｐ＝０．０００１、およびｒ＝０．６１４６、Spearman試験を使用）。（Ｄ）真皮ＴＳＬＰ発現細胞と年単位での罹病期間との相関（＊ｐ＝０．００３４、およびｒ＝０．４７５１、Spearman試験を使用）。細胞数はＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析した。
【図３】図３は、内皮細胞がＳＳｃ内およびインビトロで、ＴＳＬＰをエクスビボで産生することができることの実証を表す。（Ａ、Ｂ）線維芽細胞（Ａ）および周皮細胞（Ｂ）に対するＴＳＬＰ（緑色）およびαＳＭＡ（赤色）の共染色、（Ｃ）内皮細胞に対するＴＳＬＰ（緑色）およびＣＤ３１（赤色）の共染色を示す、健常ドナー（下部パネル）およびＳＳｃ患者（上部パネル）の皮膚におけるＴＳＬＰの間接免疫蛍光分析。皮膚片を落射蛍光顕微鏡（オリンパスＡＸ７０）で分析した。核はＤＡＰＩ染色した（青色）。元の倍率は示されている通り、４００倍または６００倍である。黄色は共染色された細胞を示す。
【図４】図４は、ＩＬ１β−誘導ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）がＴＳＬＰを産生することを表す。通常のＨＤＭＥＣは正常皮膚から精製され（形成外科）、（Ａ）ＳＳｃおよびＴＬＲ４アゴニストＬＰＳに潜在的に関与するサイトカイン、または（Ｂ）完全ＭＶ−２培地（Ｍ）中のＩＬ１β（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）の量を増加させて、２４時間刺激される。上清を収集し、ＴＳＬＰ含量をeBioscience製の専用ＥＬＩＳＡによって測定した。平均値および標準偏差は、独立した３回の実験（Ａ）および独立した６回の実験（Ｂ）から得た。（Ｃ）ＩＬ１β（５０ｎｇ／ｍＬ）活性化ＨＤＭＥＣよりＴＳＬＰ  ｍＲＮＡを定量化、３のうち１つの代表的な実験である、ＲＴｑＰＣＲを使用。＊Ｐ＜０．０５、および＊＊＊Ｐ＝０．０００４、クラスカル・ワリス検定を使用。
【図５】図５は、血小板が、ＩＬ１β依存的様式でヒト皮膚微小血管系内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）によって、ＴＳＬＰ産生を誘導することの実証を表す。（Ａ）７００００個のＨＤＭＥＣを、精製非活性化血小板（白色バー）またはアデノシン二リン酸塩活性化血小板（黒色バー）の量の増加（１個のＨＤＭＥＣに対して１０〜２００個の血小板）に伴い、ＭＶ−２完全培地中の２４ウェル培養プレートにおいて２４時間培養した。クラスカル・ワリスの多重比較ノンパラメトリック検定を使用して、ＴＳＬＰレベルを比較した（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）ＨＤＭＥＣは、抗ＩＬ１β阻止抗体を有するまたは有しない、ＡＤＰ活性化血小板で刺激した。条件「血小板−」とは、血小板を用いない比較である。クラスカル・ワリスの多重比較ノンパラメトリック検定を使用して、ＴＳＬＰレベルを比較した（＊＊ｐ＝０．００７）。（Ｃ）ＨＤＭＥＣを、セロトニンの用量の増加（０〜９０ｎｇ／ｍｌ）によって刺激した。ウィルコクソン検定を使用した（＊ｐ＝０．０１３）。（Ｄ）５ＨＴ受容体（５ＨＴＲ２ａおよび５ＨＴＲ２ｂ）遮断抗体を有するまたは有さずに抗ＩＬ１βを遮断するか、または遮断せずに、ＡＤＰ活性化血小板（ＨＤＭＥＣ：血小板比率＝１：２００）でＨＤＭＥＣを刺激した。クラスカル・ワリスの多重比較ノンパラメトリック検定を使用して、ＴＳＬＰレベルを比較した（＊＊ｐ＝０．００７）。上清を収集し、ＴＳＬＰ含量を、専用ＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果は、独立した３回の実験により平均値およびＳＥＭであった。
【図６】図６は、ＴＳＬＰが、健常ドナーおよびＳＳｃ患者由来の真皮線維芽細胞において前線維化プロファイルを誘導することの実証を表す。ヒト真皮線維芽細胞を健康な皮膚から単離し、ＤＭＥＭ、ＩＬ１β、組換えＴＳＬＰまたはＴＧＦβ１と共に４８時間インキュベートした。（Ａ）３人の異なる健常ドナーに由来するＲＴ−ｑＰＣＲを用いた活性化線維芽細胞からのＣｏｌ１Ａ１  ｍＲＮＡの定量化を、ＤＭＥＭを基準値として用いてΔΔＣＴで表した。（Ｂ）ＲＴｑＰＣＲを用いた活性化線維芽細胞からのＭＭＰ−１  ｍＲＮＡの定量化、３人の異なる健常ドナーの結果。（Ｃ）ＲＴ−ｑＰＣＲを用いた活性化正常線維芽細胞に由来するＭＭＰ−１（コラゲナーゼ）ｍＲＮＡ上のＣＯＬ１Ａ１の割合、３人の異なる健常ドナー（左パネル）および３人のＳＳｃ患者（右パネル）の結果。ＳＳｃ患者のうち、２人の患者がｄｃＳＳｃであり、線維芽細胞はＴＳＬＰ＋線維性皮膚（患者番号１番および２番）に由来し、その他はｌｃＳＳであり、線維芽細胞はＴＳＬＰ−低線維性皮膚（患者番号３番）に由来する。（Ｄ）ＲＴ−ｑＰＣＲを用いた活性化正常線維芽細胞に由来するＭＣＰ−１の定量化、３人の異なるドナーの結果。クラスカル・ワリス検定を使用して、ｍＲＮＡ発現レベルの平均値を比較した。＊Ｐ＜０．０５。
【図７】図７は、左から右の順に、健常ドナー（ＨＤ、ｎ＝６）に由来する血小板、クロピドグレル（ｎ＝３）で処置された患者に由来する血小板、またはチカグレロル（ｎ＝４）で処置された患者に由来する血小板によって刺激された後の、内皮細胞によるＴＳＬＰ分泌（ｐｇ／ｍｌ：Ａ、または％：Ｂ）を表す。ヒト真皮内皮細胞は健康な皮膚から生成され（形成外科による）、健常ドナーの末梢血液、またはＰ２Ｙ１２阻害剤クロピドグレルもしくはチカグレロルで処置された患者の末梢血液から得た血小板（内皮細胞／血小板比率＝１／４００）と共に、２４時間培養した。上清を収集し、分析の前に凍結させた。ＴＳＬＰ濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。
【図８】図８は、第１の健康な非強皮症患者に由来する血小板、用量０、１０、および１０００ｐｇ／ｍｌのアセチルサリチル酸（アスピリン、ｐｇ／ｍｌ）で以前治療されていた第２の非強皮症患者に由来する血小板の存在下における健康内皮細胞による、インビトロでのＴＳＬＰ産生（ｐｇ／ｍｌ）を表す。
【図９】図９は、実施例５に記載の治療法に従う、対照群（丸）、疾患群（四角形）、および疾患予防群（三角形）における、１、７、１４、２２、２９、および３６日目のマウスの皮膚の皮膚厚（ｍｍ）を測定することによる、皮下脂肪（cutaneous fold）の測定を表す：マウスは、ＰＢＳまたはブレオマイシン（３０μｇ／マウス）のいずれかを皮下注射する１５日前に、水またはクロピドグレル（２５ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで経口的に前処理をした。水＋ＰＢＳ＝対照（Ａ群、ｎ＝４）、水＋ブレオマイシン＝疾患（Ｂ群、ｎ＝４）、クロピドグレル＋ブレオマイシン＝疾患予防（Ｃ群、ｎ＝４）。皮下脂肪を、１、７、１４、２２、２９、および３６日目の注射の周辺で、ｍｍ単位のキャリパスを用いて測定した。クラスカル・ワリスの多重比較ノンパラメトリック検定を使用して、各日程での皮膚厚を比較した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１０】図１０は、表皮垂線を引くことによって６ヶ所のランダムに決定された部位において測定した、真皮厚さ（μｍ）を表す。マウスは、ＰＢＳまたはブレオマイシン（３０μｇ／マウス）のいずれかを皮下注射する１５日前に、水またはクロピドグレル（２５ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで経口的に前処理をした。水＋ＰＢＳ＝対照（Ａ群、ｎ＝４）、水＋ブレオマイシン＝疾患（Ｂ群、ｎ＝４）、クロピドグレル＋ブレオマイシン＝疾患予防（Ｃ群、ｎ＝４）。各群からのマウスの平均値およびＳＥＭを示し、クラスカル・ワリスの多重比較ノンパラメトリック検定を使用して比較する。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１１】図１１は、正式な固定化後にパラフィン中へ包埋し、その後ヘマトキシリン・エオシンで染色し、スキャンした（Nanozoomer、浜松ホトニクス株式会社）切片を表す。各群の１つの代表的な皮膚の写真：Ａ群＝水＋ＰＢＳ＝対照、Ｂ群＝水＋ブレオマイシン＝疾患、およびＣ群＝クロピドグレル＋ブレオマイシン＝疾患予防。
【実施例】
【００９０】
実施例１：患者および方法
研究集団。フランスのボルドー大学病院（the University hospital of Bordeaux）に出席した２０３人のＳＳｃ患者が、２０１２年３月〜２０１５年１月までの間、本研究に展望的に含まれていた。全ての患者が、米国リウマチ学会（ＡＣＲ）およびヨーロッパ対リウマチ連盟（ＥＵＬＡＲ）によって２０１３年に提唱された分類基準を満たしていた（van den Hoogen F, Khanna D, Fransen J, et al. 2013 classification criteria for systemic sclerosis: an American College of Rheumatology/European League against Rheumatism collaborative initiative. Arthritis Rheum 2013; 65:2737-2747（［２３］））。患者は、２０１２年に設立され、倫理委員会（ＣＰＰ、２０１２−Ａ０００８１−４２、アキテーヌ）によって承認された、ＶＩＳＳ（全身性強皮症における脈管障害および炎症、Vasculopathy and Inflammation in Systemic Sclerosis）生物医学研究プロジェクトの文脈に含まれた。全ての参加者から、参加の前に書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００９１】
細胞培養。線維芽細胞は、他に記載したような３人の健常ドナー由来の病変皮膚生検組織から得た（Truchetet ME, Brembilla NC, Montanari E, et al. Interleukin-17A+ cell counts are increased in systemic sclerosis skin and their number is inversely correlated with the extent of skin involvement. Arthritis Rheum 2013;65:1347-1356（［２４］））。
【００９２】
免疫組織化学および細胞定量化。免疫組織化学は記載の通りに実施した（Truchetet et
al.（［２４］））。エピトープダマスキング（Epitope damasking）を、ｐＨ９の、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中において、９８℃で４０分間、浴槽中で加熱した。免疫組織化学的な画像を、Bordeaux Imaging Centre（ＢＩＣ）のNanozoomer装置を用いて組織切片全体をスキャンすることによって得た。各皮膚生検について少なくとも２つの切片を、個体毎に分析した。各切片は、ImageJソフトウェア（詳細は、http://rsbweb.nih.gov/ij/を参照のこと）を用いて表皮および真皮に手動で細区画した。付加物は分析から除外した。真皮中のＴＳＬＰ＋細胞を、ImageJソフトウェアを用いて半自動的に定量化した。陽性細胞（褐色）を大きさで濾過し、各フィールドにおける細胞（青色）の総数に対して規準化した。代表的な画像を、２人のオペレーター（ＭＥＴおよびＢＤ）によって手動でレビューした。
【００９３】
免疫蛍光法。ＰＢＳ−４％のＢＳＡ中にて、パラフィン除去、エピトープ回収、および遮断を終えた後、組織切片を、抗ＴＳＬＰ（ヒツジ、ＡＦ１３９８、R&D）、抗ＣＤ３１（ウサギ、ＳＡＢ４５０２１６７、Sigma-Aldrich）、および抗−アルファ−ＳＭＡ（クローン１Ａ４、DAKO）、抗体でインキュベートした。結合を、Invitrogen（オスロ、ノルウェー）製のＡｌｅｘａ−４８８−共役ロバ抗−ヤギ、およびａｌｅｘａ−５６８共役ロバ抗−マウスまたは抗−ウサギで明らかにした。核はＤＡＰＩで染色した。レーザー走査型共焦点画像を、LSM510meta顕微鏡（Zeiss）を用いて得た。
【００９４】
定量的リアルタイムＰＣＲ。全ＲＮＡを、NucleoSpin RNA II抽出システム（Macherey-Nagel、ドイツ、デューレン）でトリプシン処理した線維芽細胞から単離し、説明書に従って、ランダムヘキサマーおよびSuperscriptIII逆転写酵素（Invitrogen、カリフォルニ
ア州カールスバッド）を用いて０．２５μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。遺伝子発現を、SDS 7900 HT機器（Applied Biosystems）で行ったＳＹＢＲグリーンを用いて定量化した。補足資料に記載の各遺伝子に対して特異的なプライマー対（Datta A, Alexander R, Sulikowski MG, et al. Evidence for a functional thymic stromal lymphopoietin signaling axis in fibrotic lung disease. J Immunol 2013;191:4867-4879（［２５］）；Brembilla NC, Montanari E, Truchetet ME, et al. Th17 cells favor inflammatory responses while inhibiting type I collagen deposition by dermal fibroblasts:
differential effects in healthy and systemic sclerosis fibroblasts. Arthritis Res Ther 2013;15:R151（［２６］）；Yoda A, Yoda Y, Chiaretti S, et al. Functional
screening identifies CRLF2 in precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 2010;107:252-257（［２７］）；Le QT, Gomez G, Zhao W, et al. Processing of human protryptase in mast cells involves cathepsins L, B, and C. J Immunol 2011;187:1912-1918（［２８］））。各反応は３回実施した。より安定したハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）およびＥＥＦ１Ａ１（真核細胞翻訳伸長因子１アルファ１））を、規準化のために選択した。オリゴヌクレオチドをSigma-Aldrichから購入した。差は、相対的な定量化のために、閾値サイクル（Ｃｔ）および比較Ｃｔ法で算出した。
【００９５】
サイトカイン定量。細胞培養上清または血清中のＴＳＬＰレベルを、説明書に従ってeBiosciences製のＥＬＩＳＡキットで定量化した。
【００９６】
内皮細胞活性化。ヒト皮膚微小血管内皮細胞を、平底の９６ウェルプレート（２００μｌのウェル毎に細胞２００００個）中の完全ＭＶ２増殖培地で培養し、一晩静置した後、異なる試薬（ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＰＳ、５ＨＴ、もしくはトリプターゼ）、または２４時間３７℃で活性化したもしくはしていない血小板ＡＤＰを加えた。抗ＩＬ１ｂ（カナキヌマブ）または抗セロトニン受容体（５ＨＴ２ａおよび５ＨＴ２ｂ）の遮断は、指示された場合、１０μｇ／ｍＬの最終濃度で加える。血小板濃縮血漿は、加速および破裂をさせずに１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後に、ＥＤＴＡ管上への静脈穿刺を用いて全血から調製した。その後、上清を収集し、１μＭのＰＧＥ１を加えた。遠心分離（破裂させずに２０００ｒｐｍで１０分間）後、上清を廃棄し、タイロード緩衝剤を加えて、８．１０８個血小板／ｍｌ溶液を得た。
【００９７】
統計分析。統計分析を、GraphPad Prism（カリフォルニア州ラホヤ）を用いて実施した。コルモゴロフ・スミルノフ正規性検定を満たした集団について、対応のないまたは対応のある試料に対するスチューデントの両側ｔ検定、および１元配置反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）とその後のボンフェローニ補正を使用して、実験デザインに応じた異なる集合を比較した。正規性検定が満たされなかった場合、マンホイットニー検定、ウィルコクソン検定、およびクラスカル・ワリス検定が使用された。相関関係を、スピアマン検定を用いて分析した。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると考えた。
【００９８】
実施例２：結果
循環ＴＳＬＰはＳＳｃ患者由来の血清中で増加し、指潰瘍と関連する
２０１３年４月〜２０１５年１月、２０３人の連続するＳＳｃ患者が本研究に含まれた。コホート（ｎ＝１３３、６５．５％）のおよそ２／３に相当する疾患の限られた形態。人口統計学的観察および主要な臨床的特徴を、以下の表１に記載する。
【００９９】
【表１−１】
2019502739.tif 000010
【表１−２】
2019502739.tif 000011
【０１００】
ＴＳＬＰの血清レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。ＴＳＬＰレベルが健常ドナーと比較して、ＳＳｃ患者由来の血清において有意に増加したことを観測した（それぞれ、１
２．９５±２．６ｐｇ／ｍＬ対０ｐｇ／ｍｌの平均値±ＳＥＭ、図１Ａを参照、＊Ｐ＜０．０００１、クラスカル・ワリス検定の後にDunnポストホック検定）。ｌＳＳｃと比較して、ｄＳＳｃにおけるより高いレベルのＴＳＬＰの傾向を観測したものの、有意なレベルへは達しなかった（それぞれ、１９．０２±５．８ｐｇ／ｍＬ対１２．４±３．２ｐｇ／ｍＬの平均値±ＳＥＭ）。ｄＳＳｃを有する患者は、ｌＳＳｃよりも高レベルのＴＳＬＰが存在する傾向にあるだけでなく、ＴＳＬＰについてもより頻繁に陽性となる傾向もまた有する（２９％対２１％、図１Ｃを参照）。ＴＳＬＰがＳＳｃにおけるバイオマーカーとなり得るかどうかを判定するために、循環ＴＳＬＰといくつかの臨床的指標との相関を探した。ＴＳＬＰ血清レベルと線維化の指標（修正Rodnan皮膚スコア（ｍＲＳＳ）、一酸化炭素肺拡散能（ＤＬＣＯ）、または全肺気量（ＴＬＰ）など）との間に相関は認められなかった。同様に、罹病期間または超音波検査で診断されたＰＡＨの間にも関連はなかった。対照的に、ＴＳＬＰと血管損傷との間に有意な関連を観測し、ＴＳＬＰレベルは指潰瘍のいかなる病歴も有しない患者と比較して、指潰瘍を有する患者において有意により高かった（それぞれ、２２．０３±３．１ｐｇ／ｍＬ対６．８５±４．６ｐｇ／ｍＬの平均値±ＳＥＭ、図１Ｂを参照、ｐ＝０．００８９、対応のないｔ検定）。その上、ＴＳＬＰ血清レベルは、指潰瘍、ならびに／または右心カテーテル法（ＲＨＣ）における強皮症腎クリーゼ（ＳＲＣ）および／もしくは肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の存在によって証明される、少なくとも１つの脈管障害の症状を有する患者において増加した（それぞれ、１９．４８±４．２ｐｇ／ｍＬ対５．５３±２．６ｐｇ／ｍＬの平均値±ＳＥＭ、図１Ｄを参照、ｐ＝０．０２２）。全体として、これらの結果は、血清ＴＳＬＰがＳＳｃ患者において増加していること、および血管損傷が関連していることを示唆している。
【０１０１】
ＴＳＬＰは、健常ドナーと比較してＳＳｃ患者の皮膚において過剰発現し、線維症と相関する。
ＴＳＬＰの細胞供給源を分析するために、ＳＳｃ患者および対照に由来する皮膚におけるＴＳＬＰ発現のＩＨＣ分析を行った。二次抗体による直接染色は、染色の特異性を確認する、あらゆる有意な蛍光（図２Ａ、左パネルを参照）をもたらさなかった。染色の特異性を確認するために、ＴＳＬＰ組換えたんぱく質の１０倍過剰を伴う抗ＴＳＬＰ  Ａｂｓのプレインキュベーションを実施し、基底膜のわずかな境界を除いた染色の実質的に完全な抑止をもたらした（図２Ａ、右パネル参照）。ＴＳＬＰ発現が健康な個体の皮膚でほとんど検出されなかった一方で、前述の通り、有意なＴＳＬＰ発現がｄＳＳｃおよびｌＳＳｃの両方で観測された（Usategui A, Criado G, Izquierdo E, et al. A profibrotic role for thymic stromal lymphopoietin in systemic sclerosis. Ann Rheum Dis 2013（［２９］））。興味深いことに、ＴＳＬＰ発現は、前述の報告と一致して、表皮および真皮において、特にｄＳＳｃの血管周辺領域において検出された（Christmann RB, Mathes A, Affandi AJ, et al. TSLP upregulation in human SSc skin and induction of overlapping profibrotic genes and intracelullar signaling with IL-13 and TGFss. Arthritis Rheum 2013（［３０］））。これらの観測は、ｌＳＳｃ患者においてもまた当てはまる。表皮上のＴＳＬＰの染色は、ＳＳｃ集団全体に渡り非常に均質であった；したがって、真皮おいてＴＳＬＰを発現する細胞に注目した。全細胞数およびＴＳＬＰ陽性細胞の数を、生検の真皮切片表面において測定した。１ｍｍ２あたり総細胞数は、群の間では統計的に異ならなかったが（ＳＳｃスライド中細胞１１９０±１３８．３個対ＨＤスライド中細胞１０４６±９８．２個、対応のないｔ検定ｐ＝０．４９０９、図２Ｂを参照）、真皮ＴＳＬＰ陽性細胞の集合は、健常ドナーの皮膚と比較してＳＳｃにおいて有意に増加した（それぞれ細胞２０．３５±２．２８個対細胞３．６６９±０．８８個、対応のないｔ検定ｐ＜０．０００１、図２Ｃを参照）。ｌｃＳＳｃと比較して、ｄｃＳＳｃにおけるＴＳＬＰ陽性細胞のより高い割合への傾向が観察された（２９．９２±３．２％対２０．２８±５．１％、データは示さず）。真皮ＴＳＬＰ発現は、ｍＲＳＳによって評価される皮膚線維症と相関した（ｒ＝０．６１４６、ｐ＝０．０００１、スピアマン検定を使用）。ＴＳＬＰの真皮発現はまた、罹病期間（非レイノー現象（ＲＰ）症状以降）と逆相関した
（ｒ＝−０．４７５１、ｐ＝０．００３４、スピアマン検定を使用、図２Ｄを参照）。そして、真皮ＴＳＬＰは、超音波検査ＰＡＨ（ＰＡＰＳ＞３５ｍｍＨｇ）を有する患者においてより高かった（３３．１２±２．８％の陽性細胞対２３．５８±２．４％の陽性細胞、対応のないｔ検定ｐ＝０．０２３８）。
【０１０２】
本発明者は、ＳＳｃ皮膚におけるＴＳＬＰ発現が、血管周囲領域において増加し、疾患の初期形態に関連し、皮膚線維症の程度と相関すると結論付ける。
【０１０３】
ヒト真皮毛細血管内皮細胞はエクスビボでのＳＳｃ皮膚において過剰発現し、ＩＬ１β依存性機構においてＴＳＬＰをインビトロで産生する。
ＴＳＬＰに対して陽性に染色されたかを更に分析するため、まず免疫蛍光検査法を使用した。アルファ−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）陽性筋線維芽細胞（図３Ａを参照）、およびＴＳＬＰに対して陽性に染色されたＣＤ３１陽性内皮細胞（図３Ｃの矢印を参照）の両方を観察した。注目すべきことに、血管周囲アルファ−ＳＭＡ陽性周皮細胞はＴＳＬＰに対して陰性だった（図３Ｂを参照）。
【０１０４】
皮膚内皮細胞が強力なＴＳＬＰの産生者である可能性を確認するために、前線維性サイトカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−１３）、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ１β、ＴＮＦα、およびＩＦＮγ）、ならびにＴＬＲアゴニストの存在または非存在下において、インビトロで真皮毛細血管内皮細胞を培養した。本発明者は、ＩＬ１βのみが、たんぱく質（真皮毛細血管内皮細胞単独で６５１．７±９５．４ｐｇ／ｍＬ対７．４±３．５ｐｇ／ｍＬ、対応のあるｔ検定ｐ＝０．０００２、図４Ｂおよび図４Ｃを参照）、およびトランスクリプトームのレベルにおいて、ＴＳＬＰの発現を増加させることができることを発見した。試験した全てのその他の刺激は、わずかではあるが再現性のあるＴＳＬＰ産生（図４Ａを参照）を誘導するＬＰＳ以外の効果を示さなかった。
【０１０５】
まとめると、これらの結果は、血小板は、ＩＬ１β依存性様式での真皮毛細血管内皮細胞によるＴＳＬＰ産生の強力な誘導因子であるということを実証している。
【０１０６】
活性化血小板は、ＩＬ−１βおよびセロトニン依存性機構を介した内皮細胞によるＴＳＬＰの分泌を促進する。
ＳＳｃ患者において活性化され、ＩＬ−１βを分泌する能力を特徴とする細胞のうち、血小板は有意な関心を示した（Dees et al.（［１１］）；Loppnow H, Bil R, Hirt S, et al. Platelet-derived interleukin-1 induces cytokine production, but not proliferation of human vascular smooth muscle cells. Blood 1998; 91:134-141（［３１］））。健常ボランティア由来の血小板は、真皮毛細血管内皮細胞によるＴＳＬＰ産生を誘導した（２００の比率で１６４．７±４１．４ｐｇ／ｍＬ対真皮毛細血管内皮細胞単独で８．５±３．９ｐｇ／ｍＬ、対応のあるｔ検定ｐ＝０．００９１）。真皮毛細血管内皮細胞によるＴＳＬＰ産生は、刺激されていない血小板と比較して、ＡＤＰ−活性化血小板の存在下においてさらに増加した（それぞれ３１８．２±１０５ｐｇ／ｍＬ対１６４．７±４１．４ｐｇ／ｍＬ、対応のあるｔ検定ｐ＝０．０３、図５Ａ参照）。注目すべきは、活性化血小板は有意な量のＴＳＬＰを分泌することができなかったため、ＴＳＬＰ産生は真皮毛細血管内皮細胞に依存していた。真皮毛細血管内皮細胞による血小板誘導ＴＳＬＰ産生の原因となる機構を解明するために、まずモノクローナル抗体カナキヌマブを用いてＩＬ−１βを遮断した。カナキヌマブの添加によって血小板誘導ＴＳＬＰ産生は有意に減少したが（２０．９±３．７ｐｇ／ｍＬ対６４．８±３．９ｐｇ／ｍｌ、対応のあるｔ検定ｐ＜０．０００１、図５Ｂ参照）、完全ではなく、その他の血小板由来因子もまた関連しているであろうことが示唆されている。なぜならば、血小板由来セロトニンはＳＳｃの病因に直接関与しているからであり（Dees et al.（［１１］））、本発明者は、異なる濃度の組換えセロトニンを加え、セロトニンが真皮毛細血管内皮細胞によってＴＳＬＰ産生
を誘導することができたことを観測した（それぞれ、９０ｎｇ／ｍｌで５８．９±１１．４ｐｇ／ｍＬ対真皮毛細血管内皮細胞単独で０．７５±０．５ｐｇ／ｍＬ、対応のあるｔ検定ｐ＝０．０１３、図５Ｃ参照）。ＴＳＬＰ産生におけるＩＬ１βとセロトニンとのいかなる相乗効果も観測されなかった。血小板／内皮細胞共培養に対するセロトニン受容体（５ＨＴ２ａおよび５ＨＴ２ｂ）阻止抗体の添加は、ＴＳＬＰ産生を有意に減少させた（血小板／内皮細胞で６４９±１３．８ｐｇ／ｍＬ対カナキヌマブで３３５．１±２８．５ｐｇ／ｍＬ対カナキヌマブ＋セロトニン受容体阻害剤で２４２．２±９．１ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．００７２、ＡＮＯＶＡ、図５Ｄ参照）。全体として、これらの結果は、真皮毛細血管内皮細胞による血小板誘導ＴＳＬＰ産生が、より少ない程度には、主にＩＬ−１βおよびセロトニンによるものであることを示唆している。
【０１０７】
ＴＳＬＰは、細胞外基質産生およびコラゲナーゼ阻害を介して、ヒトにおける線維症を誘導する。
ＴＳＬＰはマウスモデルに線維化プロセスに関与しているが、ヒトにおけるその役割は依然として不明である（Usategui et al.（［２９］）；Christmann et al.（［３０］））。したがって、組換えＴＳＬＰ（ｒＴＳＬＰ）が健常ドナーに由来する真皮線維芽細胞の活性化および細胞外基質（ＥＣＭ）産生に直接影響し得るかどうかを評価した。
【０１０８】
特異的なＴＳＬＰ受容体ＣＲＬＦ２  ｍＲＮＡは全ての正常な線維芽細胞にて検出された（データ示さず）。真皮健常ドナー線維芽細胞を、ＩＬ−１β、ＴＳＬＰ、またはＴＧＦβを対照条件として刺激した。予想通り、ＴＧＦβは、健常ドナー真皮線維芽細胞における、コラーゲン１Ａ１（５．３５±０．９倍増加対培地条件、ｐ＝０．０４８６、対応のあるｔ検定、図６Ａ参照）およびコラーゲン１Ａ２（データ示さず）のｍＲＮＡ過剰発現を誘導した。興味深いことに、ｒＴＳＬＰは、線維芽細胞による、コラーゲン１Ａ１（１．５±０．０６倍増加対培地条件、ｐ＝０．０１８８、対応のあるｔ検定、図６Ａを参照）およびコラーゲン１Ａ２（データ示さず）のｍＲＮＡ発現の、再現性のある有意な増加を誘導した。同時に、ｒＴＳＬＰは、ＴＧＦβ１と同程度のコラゲナーゼＭＭＰ−１の発現を有意に減少させた（それぞれ、０．５９±０．０６倍増加および０．５６±０．１４対培地条件、ｐ＝０．０２４１、対応のあるｔ検定、図６Ｂ参照）。対照的に、コラーゲン／コラゲナーゼ比は、サイトカインの直接前線維性効果を示すｒＴＳＬＰの存在下において有意に増加した（２．６±０．３倍増加対培地条件、ｐ＝０．０３０９、対応のあるｔ検定、図６Ｃ参照）。興味深いことに、ｒｅｃＴＳＬＰの存在下において、２人のｄｃＳＳｃ患者のＴＳＬＰ＋線維性皮膚から精製された線維芽細胞は、ｌｃＳＳｃ患者または正常な線維芽細胞のＴＳＬＰ−皮膚から精製された線維芽細胞と比較して、より低いコラーゲン／コラゲナーゼ比を有する。また、ＳＳｃ微小環境に潜在的に存在するサイトカインであるＩＬ−１βの効果も試験した。ＴＳＬＰとは対照的に、ＩＬ−１βによる結果はさらに均一ではなく、統計学的有意性に達しなかった。ＩＬ−１βは、ＴＳＬＰおよびＴＧＦβ１とは対象的に、コラーゲン発現のわずかな増加を誘導し（１．７±０．４倍増加、ｐ＝０．１９３、図６Ａ参照）、ＩＬ−１βはＭＭＰ−１発現を増加させた（５．７±１．７倍増加、ｐ＝１．１、図６Ｂを参照）。その結果として、コラーゲン／コラゲナーゼ比は、有意ではないが、減少する傾向がある（０．４７±０．３倍増加対培地条件、ｐ＝０．２、対応のあるｔ検定、図６Ｃ参照）。注目すべきことに、ｒＴＳＬＰおよびＴＧＦ−βは、ＭＣＰ−１  ｍＲＮＡ発現の強力な下方制御を誘導したが（ぞれぞれ、０．４８±０．０２および０．３１±０．０９倍増加対培地条件、ｐ＝０．００１２、図６Ｄ参照）、ＩＬ−１βは、ヒト真皮線維芽細におけるＭＣＰ−１の発現を高度に増加させた（それぞれ、５２．７±１１．２倍増加対培地条件、ｐ＝０．０４７１、図６Ｄ参照）。
【０１０９】
全体として、本発明者の知見は、ＴＳＬＰがヒト真皮線維芽細胞において前線維性応答を促進することを実証している。
【０１１０】
考察
ＳＳｃに関与する線維化メカニズムのより良好な性質決定は、近年突破口が作られたにも関わらずアンメットメディカルニーズ（unmet medical need）の存在するバイオマーカーおよび有効な疾患修飾療法を開発するための重要な要素である（van Bon L, Affandi AJ, Broen J, et al. Proteome-wide analysis and CXCL4 as a biomarker in systemic sclerosis. N Engl J Med 2014;370:433-443 (van Bon et al.（［１０］）； Dees et al.（［１１］）; Rice LM, Padilla CM, McLaughlin SR, et al. Fresolimumab treatment
decreases biomarkers and improves clinical symptoms in systemic sclerosis patients. J Clin Invest 2015;125:2795-2807（［３２］）; Bhattacharyya S, Tamaki Z, Wang W, et al. FibronectinEDA promotes chronic cutaneous fibrosis through Toll-like receptor signaling. Sci Transl Med 2014; 6:232ra250（［３３］）; Wynn TA, Ramalingam TR. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.
Nat Med 2012;18:1028-1040（［３４］））。本研究において、ＳＳｃにおける活性化血小板、微小血管内皮細胞、およびＥＣＭ産生に関係する新規の病原性ループの証拠を提供する。
【０１１１】
本発明者の知見は、ＳＳｃにおけるＴＳＬＰ産生の数々の貢献者に新たな光を当て、対象におけるこれまでの出版物にまで及ぶ（Usategui et al（［２９］）; Christmann et al.（［３０］））。Usategui et al.は、ＴＳＬＰ情報制御が主にケラチノサイトに起因し、マスト細胞および線維芽細胞といった真皮細胞にはほとんど認められなかったものの、Lafyatis群（Christmann et al.（［３０］））は、ＳＳｃ患者と対照との間のケラチノサイト染色においてはいかなる差異も認められなかったことを実証した（Usategui et al. （［２９］）; Christmann et al.（［３０］））。代わりに、ＳＳｃ患者において血管周囲浸潤ＣＤ１６３＋マクロファージに起因する特異的で顕著な血管周囲染色を観測した。これらの矛盾の正確な性質は明らかでないが、研究された集団（Lafyatis研究におけるｄｃＳＳｃ対本発明者におけるｄｃＳＳｃおよびｌｃＳＳｃ）と関連してもよく、特に、Ｔ細胞およびマクロファージを含む血管周囲浸潤としての疾患のステージは、疾患の初期形態において古典的に観察される（Manetti M. Deciphering the alternatively activated (M2) phenotype of macrophages in scleroderma. Exp Dermatol 2015; 24:576-578（［３５］））。
【０１１２】
当初は、アレルギーに関して、ＴＳＬＰの調節解除された発現が、アトピー性皮膚炎および乾癬、特発性肺線維症、関節リウマチ、ならびにがんおよび炎症を含む、数の増大する障害において、現在観測されている（Datta et al.（［２５］）; Soumelis V, Reche PA, Kanzler H, et al. Human epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by producing TSLP. Nat Immunol 2002;3:673-680（［３６］）; Volpe E, Servant N, Zollinger R, et al. A critical function for transforming growth factor-beta, interleukin 23 and proinflammatory cytokines in driving and modulating human T(H)-17 responses. Nat Immunol 2008;9:650-657（［３７］）; Zhou B, Comeau MR, De Smedt T, et al. Thymic stromal lymphopoietin as a key initiator of allergic airway inflammation in mice. Nat Immunol 2005;6:1047-1053（［３８］））。これらの設定において注目すべきことに、ＴＳＬＰ発現内皮細胞は、古典的に観測されていない。さらに、指潰瘍およびＰＡＨとのＴＳＬＰ関連の観測は、ＳＳｃ関連脈管障害とＴＳＬＰ産生との直接的な関連を強く示唆している。結果として、ＴＳＬＰの内皮細胞の調節解除された発現は、ＳＳｃに対してより特異的に見え、特に、疾患の初期形態において新規のバイオマーカーを構成し得る。
【０１１３】
血小板は、脈管構造の完全性の標識となるだけでなく、生得的かつ適応性のある免疫細胞応答の調節においての役割も果たす（Boilard E, Blanco P, Nigrovic PA. Platelets:
active players in the pathogenesis of arthritis and SLE. Nat Rev Rheumatol 2012
;8:534-542（［３９］）; Elzey BD, Tian J, Jensen RJ, et al. Platelet-mediated modulation of adaptive immunity. A communication link between innate and adaptive immune compartments. Immunity 2003;19:9-19（［４０］）; Duffau P, Seneschal J, Nicco C, et al. Platelet CD154 potentiates interferon-alpha secretion by plasmacytoid dendritic cells in systemic lupus erythematosus. Sci Transl Med 2010;2:47ra63（［４１］））。血小板活性化はＳＳｃにおいて解説されているが（Kahaleh et al.（［５］）Postlethwaite et al.（［６］）; Solanilla et al.（［７］）; Chiang et al.（［８］））、線維症への寄与は最近になって実証されてきている（(Dees et al.（［１１］）; Kowal-Bielecka et al.（［１４］））。血小板由来ベータ−トロンボグロブリンおよびＣｘＣＬ４レベルは、肺間質性線維症に罹患するＳＳｃ患者からの気管支肺胞洗浄で増加するが、（Kowal-Bielecka et al.（［１４］））、血小板由来セロトニンは、ＳＳｃのヒトとマウスモデルとの両方における線維芽細胞活性化およびＥＣＭ産生を直接促進する（Dees et al.（［１１］））。ここで、血小板由来IL-1β、およびそれ程ではないにせよセロトニンが、用量依存的な方法での微小血管内皮細胞によるＴＳＬＰ産生を誘導することを示す。順番に、ｒＴＳＬＰは、マウスにおけるＴＳＬＰ連続的な皮下注射（Christmann et al. （［３０］））の後にChristmann et al.によって観測された前線維性遺伝子特性と一致する、正常線維芽細胞における前線維性プロファイルを再現可能に促進する。
【０１１４】
結論として、本発明者は、ＳＳｃ患者における血小板、内皮細胞、および線維芽細胞を含む新規の病原性ループを定義し、線維症を予防するためのＳＳｃにおける血小板活性化の遮断の影響について疑問を呈した。
【０１１５】
実施例３：ＳＳｃの予防治療と関連する臨床研究
予期される第ＩＩ／ＩＩＩ相の臨床治験がボルドー大学病院センター（the University
Hospital Center of Bordeaux）で実施される。この治験は、多中心性で、ランダム化され、プラセボを対象とした、平行する二重盲検アッセイである。レイノー現象および免疫異常を有する９９人の対象を、以下の通りにランダム化する：
・第１部門（対象６６名）：クロピドグレル７５ｍｇ、１日１回、２４ヶ月
・第２部門（対象３３名）：プラセボ、７５ｍｇ、１日１回、２４ヶ月
【０１１６】
第Ｉ群、第ＩＩ群、および第ＩＩＩ群に属する患者が含まれる。
・第Ｉ群は、ＲＰ、特異的免疫異常（すなわち、抗Ｓｃｌ７０、抗セントロメア、抗−ＲＮＡポリＩＩＩ、抗Ｔｈ／Ｔｏ、および／または抗Ｐｍ−Ｓｃｌ）、ならびに異常な毛細血管顕微鏡所見の組合せとして定義される。
・第ＩＩ群は、ＲＰ、特異的免疫異常を有し、異常な毛細血管顕微鏡所見を有しない対象を含む。
・第ＩＩＩ群は、ＲＰ、非特異的免疫異常（前述の自己抗体以外の抗核抗体）、および異常な毛細血管顕微鏡所見に関連する。
【０１１７】
本研究の主な目的は、強皮症を発生する高いリスクのある患者を、全身性強皮症臨床マーカー（ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ  ２０１３分類基準による）の発生を予防する、上述の通りに行われた２年間のクロピドグレル治療の、その後２年以内の有効性を評価することである。
【０１１８】
アッセイの開始時に存在する、レイノー現象および免疫異常とは異なる全身性強皮症臨床マーカーは、皮膚強皮症、指潰瘍、ステージ３またはステージ４の呼吸困難、従来の治療法では１ヶ月間続く胸焼け、毛細血管拡張症、皮下石灰沈着、筋炎であってもよい。
【０１１９】
第１部門と第２部門の比較を行う。
【０１２０】
さらに、血小板活性化レベル、内皮活性化レベル、および循環ＴＳＬＰを評価する。 
【０１２１】
患者は、治療の最初の１ヶ月間を除き、四半期に１回追跡される。
【０１２２】
試験は、以下の表２に従って、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２１ヶ月、および２４ヶ月で実施される。
【０１２３】
【表２−１】
2019502739.tif 000012
【表２−２】
2019502739.tif 000013
【０１２４】
実施例４：クロピドグレルで治療した健康な非強皮症患者由来、およびチカグレロルで治療した健康な非強皮症患者由来の血小板の治療
簡単に述べると、アテローム血栓症イベントを予防するために、健常な正常対象、またはクロピドグレル（７５ｍｇ／日）で治療した非強皮症患者、もしくはチカグレロル（９０ｍｇ／日）で治療した非強皮症患者から精製した血小板を、ヒト正常微小血管内皮細胞と共に、２００：１の割合で２４時間インキュベートした。細胞培養上清を回収し、ＴＳＬＰ含量を専用の市販ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。図７に示すように、クロピドグレルおよびチカグレロルにより治療された患者由来の血小板は、内皮細胞によるＴＳＬＰ産生を誘導できなかった。この結果は、クロピドグレルまたはチカグレロルによって治療されていない健康な患者由来の血小板では観察されない。
【０１２５】
したがって、エクスビボでのＰ２Ｙ１２阻害剤処理は、血小板誘導内皮細胞ＴＳＬＰ産生を減少させ、潜在的な抗線維化効果をもたらす。
【０１２６】
内皮ＴＳＬＰ産生は、アセチルサリチル酸（アスピリン活性代謝産物）で処置した健康な患者の血小板によって阻害されない（図８参照）。 
【０１２７】
これらの結果は、健康な内皮細胞からインビトロでの前線維性ＴＳＬＰ分子発現の遮断がすべての抗凝集剤で観察されないことを示す。これは、クロピドグレルおよびチカグレロルの阻害効果が、Ｐ２Ｙ１２受容体に対するその特異的効果およびその抗凝集効果に加えて、それらの免疫調節効果に起因し得るという結論を導く。実際に、この効果はアスピリンでは観察されない。
【０１２８】
実施例５：マウスモデルにおけるクロピドグレルのインビボでの予防効果
強皮症マウスモデル（ブレオマイシン注射マウス）における線維症の確定に対するクロピドグレルの予防効能を評価するために、以下の実験が実現されている。
【０１２９】
ブレオマイシン誘導真皮線維症。皮膚線維症は、６週間に渡るブレオマイシンの局所皮下注射によって、病原体を含まない、６週齢のメスＤＢＡ／２マウス（Charles River）において誘導された。
【０１３０】
マウスは、真皮線維症を誘導するために、１日おきに背中の所定の領域に３０μｇ／マウスの濃度で、ＰＢＳに溶解した１００μｌのブレオマイシンを毎日皮下注射した。
【０１３１】
ブレオマイシン誘導真皮線維症のマウスモデルを使用して、クロピドグレルの線維症からの潜在的な保護を評価した。マウスは、ＰＢＳまたはブレオマイシンのいずれかの皮下注射（３０μｇ／マウス）の１５日前に、水またはクロピドグレル（２５ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで経口的に前処理した。
【０１３２】
群：
水＋ＰＢＳ＝対照（群Ａ、ｎ＝４）、
水＋ブレオマイシン＝疾患（群Ｂ、ｎ＝４）、
クロピドグレル＋ブレオマイシン＝疾患予防（群Ｃ、ｎ＝４）。皮下脂肪を、１、７、１４、２２、２９、および３６日目の注射の周辺で、ｍｍ単位のキャリパスを用いて測定した。クラスカル・ワリスの多重比較ノンパラメトリック検定を使用して、各日程での皮膚厚を比較した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０１３３】
結果を以下の表３に示す。
【０１３４】
【表３】
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【０１３５】
皮膚、脾臓、肺および腎臓を、線維症遺伝子発現（Ｃｏｌ１Ａ１、ＭＭＰ１、ＭＣＰ−１など）の分析のために収集する。
【０１３６】
より具体的には、皮膚生検を採取し、半分に切断し、正式な固定化後にパラフィン中へ
包埋した。切片をヘマトキシリン・エオシンで染色し、スキャンした（Nanozoomer、浜松ホトニクス株式会社）。各群の１つの代表的な皮膚の写真を示す。
【０１３７】
結果を図９、図１０および図１１に示す。これらの図は、クロピドグレルが真皮の厚さを減少させることを明確に示している。
【０１３８】
結論として、インビボでのクロピドグレル前処理は、マウスにおけるブレオマイシンの皮膚線維化効果を有意に減少させる。 
【０１３９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019502739.tif 000020
【図７】
2019502739.tif 000021
【図８】
2019502739.tif 000022
【図９】
2019502739.tif 000023
【図１０】
2019502739.tif 000024
【図１１】
2019502739.tif 000025
【国際調査報告】
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2019502739.tif 000027
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