(57)【要約】  本発明の目的は、老化度を簡便かつ正確に決定することができる新規な方法を提供することである。  本発明は、血中代謝物を指標として用いる、老化度を決定するための方法に関する。好ましくは、被験者からの全血、赤血球及び血漿からなる群より選択される少なくとも１つが試料として用いられ、試料中の血中代謝物が指標として用いられる。
2019509489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血中代謝物を指標として用いることを特徴とする、老化度を決定する方法。
【請求項２】
被験者の全血、赤血球及び血漿からなる群より選択された少なくとも１つを試料として用い、その試料中の血中代謝物を指標として用いることを特徴とする、請求項１に記載の老化度を決定する方法。
【請求項３】
採血後ただちに試料を冷有機溶媒で処理する、請求項２に記載の老化度を決定する方法。
【請求項４】
血中代謝物がグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、Ｎ−アセチルアルギニン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、シトルリン、ジメチルグアノシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ロイシン、Ｎ２−アセチルリシン、オフタルミン酸、パントテン酸、Ｎ６−アセチルリシン、ＮＡＤ＋、ＣＤＰ−コリン、グリセロホスホコリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ホスホクレアチン、チロシン、イソロイシン、ＮＡＤＰ＋、ペントースリン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ＣＤＰ−エタノールアミン、クレアチン、ＣＴＰ、フルクトース−６−リン酸、グリセロールリン酸、セリン、トリプトファン、ＵＤＰ−グルコース、アデノシン、アスパラギン酸、ジメチルアルギニン、ジホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン酸、グルタル酸、Ｎ−アセチル（イソ）ロイシン、及びケトバリンからなる群より選択される少なくとも１つの代謝物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の老化度を決定する方法。
【請求項５】
血中代謝物がグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、Ｎ−アセチルアルギニン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、シトルリン、ジメチルグアノシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ロイシン、Ｎ２−アセチルリシン、オフタルミン酸、パントテン酸、Ｎ６−アセチルリシン、ＮＡＤ＋、ＣＤＰ−コリン、グリセロホスホコリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ホスホクレアチン、チロシン、イソロイシン、ＮＡＤＰ＋、ペントースリン酸、及びＳ−アデノシルホモシステインからなる群より選択される少なくとも１つの代謝物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の老化度を決定する方法。
【請求項６】
血中代謝物がグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、Ｎ−アセチルアルギニン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、シトルリン、ジメチルグアノシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、及びロイシンからなる群より選択される少なくとも１つの代謝物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の老化度を決定する方法。
【請求項７】
老化度が請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により決定される、老化度を決定する装置。
【請求項８】
入力手段と、決定手段を含み、被験者の血中代謝物のデータが入力手段に入力され、被験者のデータと母集団のデータを比較することによって老化度が決定される、老化度を決定するための装置。
【請求項９】
老化度が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法又は請求項７もしくは８に記載の装置によって決定される、老化度を決定するためのシステム。
【請求項１０】
血中代謝物を測定する工程を含む、老化度に影響を与える物質を評価する方法であって、血中代謝物としては、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、Ｎ−アセチルアルギニン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、シトルリン、ジメチルグアノシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ロイシン、Ｎ２−アセチルリシン、オフタルミン酸、パントテン酸、Ｎ６−アセチルリシン、ＮＡＤ＋、ＣＤＰ−コリン、グリセロホスホコリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ホスホクレアチン、チロシン、イソロイシン、ＮＡＤＰ＋、ペントースリン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ＣＤＰ−エタノールアミン、クレアチン、ＣＴＰ、フルクトース−６−リン酸、グリセロールリン酸、セリン、トリプトファン、ＵＤＰ−グルコース、アデノシン、アスパラギン酸、ジメチルアルギニン、ジホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン酸、グルタル酸、Ｎ−アセチル（イソ）ロイシン及びケトバリンからなる群より選択される少なくとも１つの代謝物を含む方法。
【請求項１１】
採血管及び検出標準としての血液代謝化合物を含み、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法を用いて老化度を決定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、老化度を決定するための方法、老化度を決定するための装置、老化度を決定するためのシステム、及び老化度に影響を与える物質を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血中代謝物は、それらの存在量及び生物学的意義を決定するため、並びに診断マーカーとしてそれらを使用する可能性のために十分に研究されてきた。医学的診断では、採取及び検査が簡便であるという理由から、血漿又は血清からの非細胞代謝物が一般的に用いられている。成熟ヒト赤血球（ＲＢＣ）は核及び細胞小器官を欠くが（非特許文献１）、ＲＢＣはＡＴＰ産生のための解糖系を利用し、レドックス恒常性を維持し、浸透圧調節を行っている（非特許文献２）。それらの活性代謝は細胞恒常性を支持し、約４ヶ月の寿命を確保する（非特許文献３）。それらの代謝物は、血漿の代謝物とは異なって、健康状態又は環境ストレスを反映し得る。赤血球は総血液量の約半分（約５Ｌ）を占めるので、調査されていない代謝物のプロファイルは調査に値すると思われた。
【０００３】
メタボロミクスは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−質量分析（ＭＳ）などの技術を用いて、細胞及び生体中の代謝物をプロファイリングする化学生物学の部門である。通常、１．５ｋＤａ未満の分子を扱い、プロテオミクスやトランスクリプトミクスなどの他の包括的な分析と組み合わせて代謝調節を研究する重要なツールである。最近、我々は、ヒト血液中に同定された１３３の化合物のうち１０１が分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅにも見出されること事を報告し（非特許文献４）、これは多くの代謝物が進化的に保存されている可能性があることを示している。個体間で化合物の配列を定量的に測定することで、健康状態や病状、並びに栄養、薬物、及びストレスの影響を深く知ることができる。さらに、代謝物の個々の変動に関する包括的な情報は、医学の将来に影響を与える可能性がある（非特許文献５〜１１）。
【０００４】
血液は非細胞性（血漿又は血清）成分と細胞成分で構成されているが、大部分のヒト血液代謝研究は血漿又は血清に焦点を当てており、そのために大規模なバイオバンク（血漿、尿などの検体の厳選された収集）が今や利用されている（非特許文献１２〜１６）。これらの研究は、疾患メカニズムを理解し、糖尿病などの疾患の診断マーカーを同定するのに有用である（非特許文献１７）。いくつかのゲノムワイド研究では、メタボロミクスも使用されている（Ｋａｓｔｅｎｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５（非特許文献１８））。対照的に、赤血球は血液量のほぼ半分を占めているにもかかわらず、赤血球（ＲＢＣ）に関する包括的メタボロミクス報告はほとんど存在しない［例えば、Ｎｉｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ  ２００９（非特許文献１９）］。これは、ひとつには、不安定な細胞代謝物を安定化することが技術的に困難であることに起因する（非特許文献２０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Rapoport SM, Schewe T, & Thiele B-J (1990) Maturational breakdown of mitochondria and other organelles in reticulocytes. in Erythroid Cells, ed Harris JR (Springer US), pp 151-194.
【非特許文献２】van Wijk R & van Solinge WW (2005) The energy-less red blood cell is lost: erythrocyte enzyme abnormalities of glycolysis. Blood 106(13):4034-4042.
【非特許文献３】Bax BE, Bain MD, Talbot PJ, Parker-Williams EJ, & Chalmers RA (1999) Survival of human carrier erythrocytes in vivo. Clin Sci (Lond) 96(2):171-178.
【非特許文献４】Chaleckis R, et al. (2014) Unexpected similarities between the Schizosaccharomyces and human blood metabolomes, and novel human metabolites. Molecular BioSystems 10(10):2538.
【非特許文献５】Fernie AR, Trethewey RN, Krotzky AJ, & Willmitzer L (2004) Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology. Nat Rev Mol Cell Biol 5(9):763-769.
【非特許文献６】Goodacre R, Vaidyanathan S, Dunn WB, Harrigan GG, & Kell DB (2004) Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol 22(5):245-252.
【非特許文献７】Hirai MY, et al. (2004) Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A 101(27):10205-10210.
【非特許文献８】Kell DB (2004) Metabolomics and systems biology: making sense of the soup. Curr Opin Microbiol 7(3):296-307.
【非特許文献９】Nicholson JK & Lindon JC (2008) Systems biology: Metabonomics. Nature 455(7216):1054-1056.
【非特許文献１０】Patti GJ, Yanes O, & Siuzdak G (2012) Innovation: Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nat Rev Mol Cell Biol 13(4):263-269.
【非特許文献１１】Ramautar R, Berger R, van der Greef J, & Hankemeier T (2013) Human metabolomics: strategies to understand biology. Curr Opin Chem Biol 17(5):841-846.
【非特許文献１２】Dunn WB, et al. (2015) Molecular phenotyping of a UK population: defining the human serum metabolome. Metabolomics 11:9-26.
【非特許文献１３】Guertin KA, et al. (2014) Metabolomics in nutritional epidemiology: identifying metabolites associated with diet and quantifying their potential to uncover diet-disease relations in populations. Am J Clin Nutr 100(1):208-217.
【非特許文献１４】Lawton KA, et al. (2008) Analysis of the adult human plasma metabolome. Pharmacogenomics 9(4):383-397.
【非特許文献１５】Psychogios N, et al. (2011) The human serum metabolome. PLoS One 6(2):e16957.
【非特許文献１６】Yu Z, et al. (2012) Human serum metabolic profiles are age dependent. Aging Cell 11(6):960-967.
【非特許文献１７】Suhre K (2014) Metabolic profiling in diabetes. J Endocrinol 221(3):R75-85.
【非特許文献１８】Kastenmuller G, Raffler J, Gieger C, & Suhre K (2015) Genetics of human metabolism: an update. Hum Mol Genet 24(R1):R93-R101.
【非特許文献１９】Nishino T, et al. (2009) In silico modeling and metabolome analysis of long-stored erythrocytes to improve blood storage methods. J Biotechnol 144(3):212-223.
【非特許文献２０】Gil A, et al. (2015) Stability of energy metabolites-An often overlooked issue in metabolomics studies: A review. Electrophoresis 36(18):2156-2169.
【非特許文献２１】Pluskal T, Nakamura T, Villar-Briones A, & Yanagida M (2010) Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol Biosyst 6(1):182-198.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、老化度を簡便かつ正確に決定することができる新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ヒトの血液中に存在する代謝物は、遺伝的に、エピジェネティックに、及びライフスタイルの要因によって影響される個々の生理学的状態を記録する。高分解能液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）を用いて、我々は１５人の若年者（２９±４歳）及び１５人の高齢者（８１±７歳）の血液中の非標的、定量的メタボロミクス分析を行った。全３０人のドナーの１２６の血中代謝物について、変動係数（ＣＶ＝標準偏差／平均）を得た。メタボロミクスの研究が十分されていない５５のＲＢＣ中に多く含まれる代謝物に焦点を当てた。我々は、年齢に関連した顕著な増加又は減少を示す４３の血液化合物を見出した。それらのうち１８個はＲＢＣに多く含まれていて、ＲＢＣメタボロミクスはヒトの老化研究にとって非常に貴重であることを示唆している。年齢差は、高齢者における抗酸化物質の生産の減少又は尿素代謝の効率の悪化によって部分的に説明される。ピアソンの係数は、加齢に関連する化合物のいくつかが相関していることを示し、老化がそれらに同時に影響を及ぼすことを示唆している。我々のＣＶ値は、以前に公表された値とほぼ一致しているが、ここでは５１の血液化合物の新規ＣＶを報告する。中〜高ＣＶ値（０．４〜２．５）を有する化合物はしばしば変動する。ＡＴＰ及びグルタチオンのような低いＣＶ値を有する化合物は、それらの濃度が厳密に制御され、それらの変化が健康を損なうため、様々な疾患に関連し得る。したがって、人間の血液は、個々の代謝の違いについての豊富な情報源である。
【０００８】
本研究では、血中代謝物を指標とした老化度を決定するための新しい方法を提示する。 本発明の方法は、容易であり、かつ正確である。
【０００９】
本発明は以下の通りである。
［１］血中代謝物を指標として用いる、老化度を決定する方法。
［２］被験者の全血又は赤血球を試料とし、該試料中の血中代謝物を指標として用いる、［１］に記載の老化度を決定する方法。
［３］前記試料を、採血後直ちに冷有機溶媒で処理する、［２］に記載の老化度を決定する方法。
［４］前記血中代謝物が、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、Ｎ−アセチルアルギニン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、シトルリン、ジメチルグアノシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ロイシン、Ｎ２−アセチルリシン、オフタルミン酸、パントテン酸、Ｎ６−アセチルリシン、ＮＡＤ＋、ＣＤＰ−コリン、グリセロホスホコリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ホスホクレアチン、チロシン、イソロイシン、ＮＡＤＰ＋、ペントース−リン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ＣＤＰ−エタノールアミン、クレアチン、ＣＴＰ、フルクトース−６−リン酸、グリセロールリン酸、セリン、トリプトファン、ＵＤＰ−グルコース、アデノシン、アスパラギン酸、ジメチルアルギニン、ジホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン酸、グルタル酸、Ｎ−アセチル（イソ）ロイシン及びケトバリンからなる群より選択される少なくとも１つの代謝物を含む［１］〜［３］のいずれか一項に記載の老化度を決定する方法。
［５］前記血中代謝物が、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、Ｎ−アセチルアルギニン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、シトルリン、ジメチルグアノシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ロイシン、Ｎ２−アセチルリシン、オフタルミン酸、パントテン酸、Ｎ６−アセチルリシン、ＮＡＤ＋、ＣＤＰ−コリン、グリセロホスホコリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ホスホクレアチン、チロシン、イソロイシン、ＮＡＤＰ＋、ペントース−リン酸、及びＳ−アデノシルホモシステインからなる群より選択される少なくとも１つの代謝物を含む［１］〜［３］のいずれか一項に記載の老化度を決定する方法。
［６］前記血中代謝物が、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、Ｎ−アセチルアルギニン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、シトルリン、ジメチルグアノシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、及びロイシンからなる群より選択される少なくとも１つの代謝物を含む［１］〜［３］のいずれか一項に記載の老化度を決定する方法。
［７］老化度が［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法によって決定される、老化度を決定する装置。
［８］入力手段と決定手段を含み、被験者の血中代謝物のデータが入力手段に入力され、老化度が、被験者のデータと母集団のデータを比較することによって決定される、老化度を決定する装置。
［９］老化度が［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法、又は［７］もしくは［８］に記載の装置によって決定される、老化度を決定するシステム。
［１０］血中代謝物を決定する工程を含む、老化度に影響を与える物質を評価する方法であって、血中代謝物はグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、Ｎ−アセチルアルギニン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、シトルリン、ジメチルグアノシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ロイシン、Ｎ２−アセチルリシン、オフタルミン酸、パントテン酸、Ｎ６−アセチルリシン、ＮＡＤ＋、ＣＤＰ−コリン、グリセロホスホコリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ホスホクレアチン、チロシン、イソロイシン、ＮＡＤＰ＋、ペントースリン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ＣＤＰ−エタノールアミン、クレアチン、ＣＴＰ、フルクトース−６−リン酸、グリセロールリン酸、セリン、トリプトファン、ＵＤＰ−グルコース、アデノシン、アスパラギン酸、ジメチルアルギニン、ジホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン酸、グルタル酸、Ｎ−アセチル（イソ）ロイシン及びケトバリンからなる群より選択される少なくとも１つの代謝物を含む方法。
［１１］採血管及び検出標準とする血液代謝化合物を含む［１］〜［６］のいずれかに記載の方法を用いて老化度を決定するキット。
【発明の効果】
【００１０】
ヒトの血液は、健康、病気、食生活、生活様式の個体差を反映した代謝物について豊富な情報を提供する。慎重に調製した後に赤血球又は血漿に高濃度で含まれるヒト血中代謝物の変動係数を定量した。我々は４３の老化関連代謝物を同定することができた。高齢者で顕著に減少する代謝物には、抗酸化物質及び高い身体活動に関与するものが含まれる。高齢者で著しく増加する代謝物には、腎機能及び肝機能の低下に関連するものが含まれる。統計学的分析は、高齢者において増加又は減少する特定の老化関連化合物が相関していることを示唆している。血中代謝物の個々の変動性は、ヒトの老化又は関連する疾患のマーカーの候補を同定する可能性がある。これらの知見に基づく本発明は、老化度を簡単かつ正確に決定することができる新規の方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】１２６のヒト血中代謝物のＣＶプロファイルの要約；Ａ．６種類の異なる範囲の変動係数（ＣＶ３０）を有する１２６の血液成分。上パネル、＜０．３，０．３〜０．４；下パネル、０．４〜０．５，０．５〜０．７，０．７〜１．０，１．０〜２．５）。最も低いＣＶ３０（＜０．３）群は２８の化合物を含む。ＲＢＣに多く含まれている化合物は灰色で強調表示されている。そのピーク領域によって示される化合物の量：赤、高ピーク領域を有する化合物（＞１０８ＡＵ）；緑、中程度のピーク領域（１０８〜１０７ＡＵ）；青、低いピーク領域（＜１０７ＡＵ）。文献中にＣＶが以前に報告されていない化合物には、下線が引かれている。青色のボックスの数値は、１つのＣＶ範囲にリストされたすべての化合物を表し、赤いボックスの数値は、ここで報告されたＣＶが新しい化合物を表す。Ｂ．低及び高変動性群における化合物数の概要。
【図２】ヒトの血中代謝物のクラスターは、構造又は機能によって定義され、同様のＣＶを示す；３０人のボランティア全員からの血液データは、ピアソン相関係数＞０．７を有する化合物のいくつかの群を明らかにした。これらのクラスターの中には、エルゴチオネイン（Ａ）、解糖経路代謝物（Ｂ）、及びメチル化化合物（Ｃ）に関連する化合物があった。対の化合物間のピアソン相関係数は、パネルの右上部に示されている。左下部には、実際の化合物レベルが各ペア毎にプロットされている。
【図３】必須代謝物はほとんど不変であるが、修飾代謝物（例えば、メチル化アミノ酸）は広く変化する。；３０人の血液におけるＡＴＰ（Ａ），グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）（Ｂ）、ジホスホグリセリン酸（Ｃ）、グルコース−６−リン酸（Ｄ）、トリメチルヒスチジン（Ｅ）、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン（Ｆ）、４−グアニジノブタン酸（Ｇ）、トリメチルトリプトファン（Ｈ）の分布。黒、オレンジ、及び紺色の点は、それぞれ、すべての、高齢の、及び若年の被験者を表す。代謝物のピーク領域を各群で１０のビンに分けた。エラーバーは平均±ＳＤを表す。
【図４】若年者（２９±４歳）と高齢者（８１±７）間で濃度において異なる血中代謝物の同定；１，５−アンヒドログルシトール（Ａ）、オフタルミン酸（Ｂ）、アセチルカルノシン（Ｃ）、カルノシン（Ｄ）は、若年者においてより高く、一方、シトルリン（Ｅ）、パントテン酸（Ｆ）、ジメチルグアノシン（Ｇ）、Ｎ−アセチルアルギニン（Ｈ）は高齢者でより高い。 代謝物のピーク領域を各群で１０のビンに分けた。エラーバーは平均±ＳＤを表す。年齢層間のｐ値は０．０２２から０．０００３９の範囲にある。
【図５】この図は、多くのヒト血中代謝物が恒常性を表すことを示している。１２６の化合物の大多数について、４人のボランティアにおける濃度の日内変動は無視できる程のごくわずかであった。Ａ．ほとんどの化合物と同様に、ＡＴＰ及びエルゴチオネインのピークレベルはほとんど変化しなかった。しかし、エルゴチオネインの濃度は人によって異なる。さらに、グリコケノデオキシコール酸、テトラデカノイルカルニチン、４−アミノ安息香酸及びカフェインを含む約１０種類の化合物は、例外的に２４時間の変動を示した。Ｂ．３０個の個々の代謝物から決定された、ＲＢＣに富む、２つの例示的化合物（ブチロベタイン及びグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ））の濃度の生データはドットプロットとして示される（各ドットは単一の個体を表す）。変動係数は、ブチロベタインとＧ−３−Ｐについて、それぞれ０．３５及び０．９９であった。最大量と最小量の比はそれぞれ３．７及び２９である。各群で代謝物のピーク領域を１０のビンに分けた。エラーバーは平均値±ＳＤを表す。
【図６】この図は、代謝物決定の実験的変動性は非常に小さいことを示している。１２６個の化合物のＣＶ分布は、（Ａ）ＣＶｗｉ：同じ血液試料調製物の３回の注入について；（Ｂ）ＣＶｓｓ：同じ血液から３つの独立して調製した試料、（Ｃ）全３０の血液試料からの各化合物の変動係数（ＣＶ３０）を示す。ほとんどの化合物は無視できるＣＶｗｉを示したが、ＣＶｓｓは特定の代謝物に対してより可変であり、かなりより高かった。
【図７】この図は、ＣＤＰ−コリン、ＵＤＰ−グルクロン酸、ホスホクレアチニン及び４−アミノ安息香酸の変化を示す。Ａ及びＢ．２つのかなり変動のある代謝物、ＣＤＰ−コリン及びＵＤＰ−グルクロン酸は、２つの年齢群間でおそらく異なる候補化合物である。これらの化合物は生合成に用いられ、若年者ではより高い活性レベルを反映するかもしれない。代謝物のピーク領域を１群当たり１０のビンに分割した。エラーバーは平均±ＳＤを表す。Ｃ．ホスホクレアチンは個人間で中程度の変動を示すが、若年者と高齢者の間には有意差はない。ピーク領域はグループ当たり１０のビンに分割した。エラーバーは平均±ＳＤを表す。Ｄ．４−アミノ安息香酸は個体間で非常に変動的である。ピーク領域はグループ当たり１０のビンに分けた。エラーバーは平均±ＳＤを表す。
【図８】この図は、若年者と高齢者群間で濃度の異なるパターンを示す追加の代謝物を示す；ＮＡＤ＋（Ａ）、ＮＡＤＰ＋（Ｂ）、ロイシン（Ｃ）、イソロイシン（Ｄ）は若年者で高レベルを示した。Ｎ６−アセチルリシンは高齢者においてより高い（Ｅ）。代謝物のピーク領域を各群で１０のビンに分けた。エラーバーは平均±ＳＤを表す。ｐ値の範囲は０．００１７〜０．０４６であった。
【図９】この図は、１４の老化関連ヒト血液化合物すべての相関値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は記載された特定の方法論、装置、及びシステムに限定されないことを理解されたい。なぜなら、これらの方法、装置、及びシステムは当然様々な種類がありうるからである。本明細書で使用する用語は、特定の実施態様のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。
【００１３】
他に定義されない限り、又は文脈が他に明確に指示しない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は等価な任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料がここで記載される。
【００１４】
本明細書中に言及された全ての刊行物は、参照が引用された特定の材料及び方法を開示及び記載する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日に先立って開示のためにのみ提供される。本明細書中のいかなるものも、発明が先行発明によってそのような開示よりも先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるものではない。
【００１５】
［定義］
用語「老化度」は、本明細書では、老化又は老化指数の程度を指すために使用される。これは、被験者の老化の速度が平均より早いか遅いかを示す値である。
【００１６】
「血中代謝物」という用語は、本明細書では、血液成分に含まれる生物学的代謝活性に関与する低分子化合物を指すために使用される。
【００１７】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施態様は、態様及び実施態様「からなる」及び／又は「から本質的になる」ことを含むことが理解される。
【００１８】
本発明の他の目的、利点及び特徴は、添付の図面と併せて以下の明細書から明らかになるであろう。
【００１９】
［老化度を決定する方法］
本発明によれば、老化度は、被験者の特定の血中代謝物を指標として評価される。被験者の全血、赤血球又は血漿中の特定の血中代謝物の量を測定することにより、被験者の老化度（老化度）を決定することができる。
【００２０】
ここで、被験者の老化程度を判定するために用いられる試料は、全血、赤血球及び血漿からなる群より選択される少なくとも１種であってもよい。全血又は赤血球のいずれかを用いることが好ましい。全血、赤血球及び血漿のいずれか２つを用いることがより好ましい。全血、赤血球及び血漿の全てを試料として用いることが最も好ましい。
【００２１】
本発明における血中代謝物はとして、化合物は、高齢者と若年者群の間で血液含量に大きな差があることが好ましい。血中代謝物は、グルタチオンジスルフィド（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ；ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン（Ｋｅｔｏ（ｉｓｏ）ｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｎ−アセチルアルギニン（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）、１，５−アンヒドログルシトール（１，５−Ａｎｈｙｄｒｏｇｌｕｃｉｔｏｌ）、アセチルカルノシン（Ａｃｅｔｙｌ−ｃａｒｎｏｓｉｎｅ）、シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）、ジメチルグアノシン（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、カルノシン（Ｃａｒｎｏｓｉｎｅ）、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ａｃｅｔｙｌ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｎ２−アセチルリシン（Ｎ２−Ａｃｅｔｙｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、オフタルミン酸（Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｃｉｄ）、パントテン酸（Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ）、Ｎ６−アセチルリシン（Ｎ６−Ａｃｅｔｙｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、ＮＡＤ＋、ＣＤＰ−コリン（ＣＤＰ−ｃｈｏｌｉｎｅ）、グリセロホスホコリン（Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、ホスホクレアチン（Ｐｈｏｓｐｈｏｃｒｅａｔｉｎｅ）、チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ＮＡＤＰ＋、ペントース−リン酸（Ｐｅｎｔｏｓｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ＣＤＰ−エタノールアミン（ＣＤＰ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、クレアチン（Ｃｒｅａｔｉｎｅ）、ＣＴＰ、フルクトース−６−リン酸（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、グリセロールリン酸（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、  セリン（Ｓｅｒｉｎｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、ＵＤＰ−グルコース（ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ）、アデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）、ジメチルアルギニン（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）、ジホスホグリセリン酸（Ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ−ｇｌｙｃｅｒａｔｅ）、グルコース−６−リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、グルタル酸（Ｇｌｕｔａｒａｔｅ）、Ｎ−アセチル（イソ）ロイシン（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−（ｉｓｏ）ｌｅｕｃｉｎｅ）及びケトバリン（Ｋｅｔｏｖａｌｉｎｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの代謝物を含む。
【００２２】
グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ロイシン、オフタルミン酸、ＮＡＤ＋、ＣＤＰ−コリン、グリセロホスホコリン、ヒスチジン、ホスホクレアチン、イソロイシン、ＮＡＤＰ＋、ペントースリン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ＣＤＰ−エタノールアミン、ＣＴＰ、フルクトース−６−リン酸、セリン、トリプトファン、ＵＤＰ−グルコース、アデノシン、及びケトバリンは、高齢者においてより低い。したがって、これらの化合物の含有量が標準よりも低い場合、被験者の老化度が高いと判断される。
【００２３】
他方、Ｎ−アセチルアルギニン、シトルリン、ジメチルグアノシン、Ｎ２―アセチルリシン、パントテン酸、Ｎ６−アセチルリシン、フェニルアラニン、チロシン、クレアチン、グリセロールリン酸、アスパラギン酸、ジメチルアルギニン、ジホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン酸、グルタル酸及びＮ−アセチル（イソ）ロイシンは、高齢者でより高い。したがって、これらの化合物の含有量が標準よりも多い場合、被験者の老化度が高いと判断される。
【００２４】
好ましくは、血中代謝物は、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、Ｎ−アセチルアルギニン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、シトルリン、ジメチルグアノシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ロイシン、Ｎ２−アセチルリシン、オフタルミン酸、パントテン酸、Ｎ６−アセチルリシン、ＮＡＤ＋、ＣＤＰ−コリン、グリセロホスホコリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ホスホクレアチン、チロシン、イソロイシン、ＮＡＤＰ＋、ペントースリン酸及び、Ｓ−アデノシルホモシステインからなる群より選択される少なくとも１つの代謝物を含む。
【００２５】
より好ましくは、血中代謝物が、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、Ｎ−アセチルアルギニン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、シトルリン、ジメチルグアノシン、カルノシン、ＵＤＰアセチル−グルコサミン、及びロイシンからなる群より選択される少なくとも１つの代謝物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の老化度を決定するための方法。
【００２６】
老化程度のより正確な決定結果を得るためには、複数の血中代謝物を分析することが好ましい。
【００２７】
本発明の老化度の決定方法は、（i）試料を調製する工程、（ii）分析の工程、及び（iii）老化度を決定する工程を含む。
【００２８】
（ｉ）試料を調製する工程
代謝物試料は、以前に報告されたように調製することができる（非特許文献４）。すべての血液試料は、迅速な試料調製を確実にするために病院の実験室に持ち込まれる。簡単に説明すると、メタボロミクス分析のための静脈血試料を５ｍＬヘパリンチューブ（テルモ）に取る。直ちに、０．１〜１．０ｍＬの血液（４〜６０×１０８ＲＢＣ）を、−２０℃〜−８０℃（好ましくは−４０℃〜−５０℃）で、血液の５〜１０倍量の３０〜７０％メタノール（好ましくは５０％〜６０％）中でクエンチした。血液サンプリング直後のこの迅速なクエンチング工程が、多くの不安定な代謝物の正確な測定を確実にした。全血試料を使用することにより，さもなければ長い細胞分離手順により影響を受ける可能性のある細胞代謝物レベルを観察することができた。フィコール分離又は濾過による白血球除去の間に、血液細胞は非生理的条件に長時間曝される（非特許文献４）。
【００２９】
各ドナーからの残りの血液試料を室温で１５分間１２０ｇで遠心分離して、血漿及びＲＢＣを分離する。遠心分離後、分離された血漿及び赤血球（ＲＢＣ）（７−１００ｘ１０８個）のそれぞれ０．１〜１．０ｍＬを、−２０℃〜−８０℃（好ましくは−４０℃〜−５０℃）で、試料の５〜１０倍量の３０〜７０％メタノール（好ましくは５０〜６０％）中でクエンチする。２つの内部標準（１０ｎｍｏｌのＨＥＰＥＳ及びＰＩＰＥＳ）を各試料に添加する。短時間ボルテックスした後、試料をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１０−ｋＤａカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に移して、タンパク質及び細胞破片を除去する。こうして、各血液試料から、３つの異なるサブサンプル、すなわち全血、ＲＢＣ及び血漿が調製される。白血球含量（ＷＢＣ）は、本発明者らの調製物の細胞容積の１％未満である（非特許文献４）。フィコール勾配を用いたＷＢＣの完全メタボロミクス分析は、ＷＢＣがＲＢＣに関する現在のメタボロミクスの結果に影響を与えてはならないことを確認した。真空エバポレーションによる試料濃縮後、各試料を４０μＬの５０％アセトニトリルに再懸濁し、１μＬをＬＣ−ＭＳシステムへの各注入に使用する。
【００３０】
（ｉｉ）分析工程
この工程では、被験者の試料中の血中代謝物の含有量を分析する。ＬＣ−ＭＳデータは、好ましくは、以前に記載されたように、ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）に結合されたＰａｒａｄｉｇｍ  ＭＳ４  ＨＰＬＣシステム（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて得られる（非特許文献２１）。簡潔に述べると、ＬＣ分離は、ＺＩＣ−ｐＨＩＬＩＣカラム（Ｍｅｒｃｋ  ＳｅＱｕａｎｔ，Ｕｍｅａ，Ｓｗｅｄｅｎ；１５０ｍｍ×２．１ｍｍ，５μｍｍ粒径）で実施する。ＨＩＬＩＣカラムは、以前は他者によってアッセイされていない多くの親水性血中代謝物を分離するために非常に有用である（非特許文献４）。アセトニトリル（Ａ）及び１０ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ９．３（Ｂ）を１００μＬ・ｍＬ−１の流速で、移動相として使用し、３０分間で８０−２０％Ａの勾配で溶離する。目的の代謝物のピーク領域は、ＭＺｍｉｎｅ  ２ソフトウェア（８７）を用いて測定する。詳細なデータ分析手順及びパラメータは以前に記載されている（非特許文献２１）。メタボロームデータセットは、ＭｅｔａｂｏＬｉｇｈｔｓデータベースに保存される（データの有用性を参照）。
【００３１】
（ｉｉｉ）老化度を決定する工程
我々は、標準又はＭＳ／ＭＳ分析によって確認された１２６の血液成分を分析する（非特許文献４）。各代謝物について、一価の［Ｍ＋Ｈ］＋又は［Ｍ−Ｈ］−ピークを選択する（表１）。代謝物はそのピーク領域に応じて３グループ（Ｈ，Ｍ．Ｌ）に分類される。Ｈは、高いピーク領域（＞１０８ＡＵ）を有する化合物、Ｍは中程度のピーク領域（１０８〜１０７ＡＵ）を有する化合物及びＬは低いピーク領域（＜１０７ＡＵ）を有する化合物を示す。
【００３２】
これまでに報告されているように、ＡＭＰ及びＡＴＰなどの同一モル濃度の標準物質は異なる効率でイオン化し、ピーク領域の定量化に影響する（非特許文献２１）。従って、ある場合には、純粋な試料と代謝物試料混合物との間の特定の化合物の異なるイオン化効率のために、ピーク領域を実際のモル量に確実に変換することができなかった。しかしながら、この研究では、個々に異なるピーク領域の相対比がＣＶを得るために関連するので、化合物の実際のモル濃度は必要とされなかった。
【００３３】
実験手順の評価は以下のように行われる。まず、試料内ばらつきに対する試料取扱いの関与を評価する。同じ血液試料調製物を８０分間隔でＬＣ−ＭＳに３回注入する（図６Ａ）。このようにして、１２６の化合物のうち１０７個（８５％）において０．１未満である試料内ＣＶ（ＣＶｗｉとして示される）を得る。ＣＶｗｉが０．１〜０．２であるのは１０化合物のみであり、ＣＶｗｉが０．２以上であるのは９化合物であった（表１）。多くの可変化合物は低ピーク領域（Ｌ）群に属し、ＬＣ−ＭＳの間にいくつかの低濃度化合物が不安定である可能性があることを示唆している。しかし、これらの化合物のための純粋な標準物のＬＣ−ＭＳ測定は、はるかに低いＣＶを示し（データ示さず）、それらの不安定性は、ＬＣ−ＭＳ測定前に他の血液化合物又は溶媒との反応から生じることを意味する。
【００３４】
第二に、試料調製によって生じる試料間の変動も調べた。３つの試料を同じ血液試料（ひとりの人）から独立して調製し、このようにして決定したＣＶをＣＶｓｓと命名する（図６Ｂ）。血液試料中のＨＥＰＥＳとＰＩＰＥＳのＣＶｓｓ値は非常に小さい（ＨＥＰＥＳでは０．０６〜０．０８、ＰＩＰＥＳでは０．０４〜０．０８）。ＣＶｓｓの大多数（１１６／１２６＝９２％）は０．３未満である（表１）。ＣＶｓｓが＞０．３の１０種類の化合物のうち、９つの化合物が低ピーク領域（Ｌ）群に属する。Ｍピーク領域を有するビタミンであるニコチンアミドは、ＣＶｓｓ＝０．４７である。しかしながら、ニコチンアミド標準物の３回の注入では、ＣＶ＝０．０５である。同様の状況は、高いＣＶｓｓ値を有するＵＭＰ及び１−メチルグアノシンなどの９種の他の化合物について観察される。血液中のこれらの１０種類の化合物のＣＶｓｓは、試料調製の影響を受け得るか、又は試料調製中に他の代謝物と反応し得る。第三に、３０人のボランティア全員（ＣＶ３０）から各血液化合物のＣＶを得る（表１、図６Ｃ）。ＣＶ３０を６つの異なる値の範囲に分類した（図１Ａ）。
【００３５】
ｍｚＭＬ形式における生のＬＣ−ＭＳデータは、ＭｅｔａｂｏＬｉｇｈｔｓリポジトリ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｅｔａｂｏｌｉｇｈｔｓ）からアクセスできる。同じ血液試料の３回の注入から得られたデータと、同じ血液から調製された３つの試料のデータは、受託番号ＭＴＢＬＳ２６３として入手可能である。４人のボランティアから２４時間以内に４回採取した血液試料は、受託番号ＭＴＢＬＳ２６４として入手可能である。全３０人の被験者からの全血のメタボロームデータは、受託番号ＭＴＢＬＳ２６５として入手可能である。全３０人の被験者からの血漿及びＲＢＣのデータは、それぞれＭＴＢＬＳ２６６及びＭＴＢＬＳ２６７のもとに見出すことができる。
【００３６】
本発明の老化度の決定方法は、上記代謝物を指標とするものであれば特に限定されない。 以下の方法は、単なる例として例示される。年齢スコア（計算値）は、年齢マーカーの定量値（ピーク領域）及び暦年齢のプロットから作成された標準曲線に基づいて、被験者の老化マーカーのデータから決定することができる。老化度は暦年齢との違いによって決めることができる。例えば、代謝物の年齢スコアを暦年齢で除し、１００を掛けた時、若年傾向は１００ほど低いと判断され、高齢傾向は１００より高いと判断される。
【００３７】
装置
本発明は、老化度を決定するための装置を提供する。この装置は、上記の本発明の方法を使用する。
【００３８】
本発明の老化度を決定する装置は入力手段と決定手段からなり、被験者の血中代謝物のデータが入力手段に入力され、老化度は、被験者の血中代謝物のデータを集団のデータと比較することによって決定される。方法セクションは、本装置によって用いられる本発明の方法の詳細について参照することができる。
【００３９】
システム
本発明は、老化度を決定するためのシステムを提供する。老化度は、上記の本発明の方法又は上記の本発明の装置によって決定される。方法セクション及び装置セクションは、本発明のシステムの詳細について参照することができる。
【００４０】
方法
本発明は、血中代謝物を測定する工程からなり、老化度に影響を与える物質を評価する方法であって、血中代謝物はグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、Ｎ−アセチルアルギニン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、シトルリン、ジメチルグアノシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ロイシン、Ｎ２−アセチルリシン、オフタルミン酸、パントテン酸、Ｎ６−アセチルリシン、ＮＡＤ＋、ＣＤＰ−コリン、グリセロホスホコリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ホスホクレアチン、チロシン、イソロイシン、ＮＡＤＰ＋、ペントースリン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ＣＤＰ−エタノールアミン、クレアチン、ＣＴＰ、フルクトース−６−リン酸、グリセロールリン酸、セリン、トリプトファン、ＵＤＰ−グルコース、アデノシン、アスパラギン酸、ジメチルアルギニン、ジホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン酸、グルタル酸、Ｎ−アセチル（イソ）ロイシン及びケトバリンからなる群より選択される少なくとも１つ代謝物を含む方法を提供する。この評価方法で見つかった物質は、老化防止の食品、飲料、サプリメント、医薬品、化粧品などとして広く使用することができる。方法セクションは、血中代謝物を測定する工程の詳細について参照することができる。
【００４１】
キット
本発明は、採血管及び検出標準として血液代謝化合物を含む、本発明の方法を用いて老化度を決定するためのキットを提供する。本発明のキットは、採血管などの他に任意の構成要素を含んでいてもよい。検出標準として血液代謝化合物は、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、ＵＴＰ、ケト（イソ）ロイシン、Ｎ−アセチルアルギニン、１，５−アンヒドログルシトール、アセチルカルノシン、シトルリン、ジメチルグアノシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ロイシン、Ｎ２−アセチルリシン、オフタルミン酸、パントテン酸、Ｎ６−アセチルリシン、ＮＡＤ＋、ＣＤＰ−コリン、グリセロホスホコリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、ホスホクレアチン、チロシン、イソロイシン、ＮＡＤＰ＋、ペントースリン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ＣＤＰ−エタノールアミン、クレアチン、ＣＴＰ、フルクトース−６−リン酸、グリセロールリン酸、セリン、トリプトファン、ＵＤＰ−グルコース、アデノシン、アスパラギン酸、ジメチルアルギニン、ジホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン酸、グルタル酸、Ｎ−アセチル（イソ）ロイシン及びケトバリンからなる群より選択されうる。
【００４２】
［ＲＢＣのメタボロミクス］
ＬＣ−ＭＳによるヒト血液について標的化されていないメタボロミクス（非特許文献４）が変動係数（ＣＶ）を用いて健常者間の個体差異を評価するのに実施された。試料の急速冷却、遠心分離なしの全血分析及びＨＩＬＩＣカラムの使用を含む我々の技術が、なぜ、多くの代謝物についてこれまでに報告されていないＣＶを同定することに成功したかについて部分的に説明する。我々はＲＢＣメタボロミクスの重要性を強調した。これは単にそのような研究の不足によるのではなく、ＲＢＣがこのような重要な機能を果たすことによる。例えば、グルタチオンのような血液中に豊富な抗酸化物質は、１０００倍を超えてＲＢＣに独占的に富んでいる。さらに、抗酸化物質に関連するオフタルミン酸とカルノシンは、ＲＢＣに豊富であり、その量は年齢に依存するようであることを示す。従って、赤血球は、血液中の抗酸化において中心的な役割を果たすようである。エネルギー生産のための糖リン酸、ヌクレオチド及びヌクレオチド糖誘導体などの多くの細胞性化合物がＲＢＣに富んでいる。血液量の半分がＲＢＣによって占められているので、ＲＢＣメタボロミクスは、ヒト血液の多様な機能を理解するのに、血漿のそれと同じくらい重要である。
【００４３】
［パーソナルマーカーとしての高いＣＶを有する血中代謝物］
我々は、中〜高のＣＶ３０（０．５〜２．３）を示す４８の代謝物を同定した。私たちの知る限りでは、これらの化合物の２２のＣＶはこれまで報告されていない。ほとんどの場合、これらの化合物は日内変動しない。したがって、個体差は（エピ）ジェネティックな差異又は慢性状態を反映している可能性があると我々は考えている。パーソナルマーカーとしてのそれらの可能性を十分探求するために、これらの化合物の生理学的役割のさらなる調査が必要である。低いＣＶを有する化合物は、インビボで生理的ホメオスタシスを支持することができる。事実、異常なグルタチオンレベルは、パーキンソン病、ＨＩＶ、肝臓疾患、及び嚢胞性線維症などの多くの疾患ならびに老化で報告されている。多くの疾患が、ロイシン、バリン及びイソロイシンの分解経路に関連していることが報告されている。したがって、低ＣＶ化合物は、健康マーカーとして良好な候補になり得る。
【００４４】
［高齢者の血液中の特定の老化関連化合物の増加］
ＲＢＣを含むヒト血液のメタボローム比較により、若年者と高齢者の間で、１４の老化関連化合物が明らかになった。そのうち６つはＲＢＣに豊富である。１４の化合物のうち３つ（１，５−アンヒドログルシトール、パントテン酸、シトルリン）のＣＶ３０に関する結果は以前の研究で確認されている。すなわち、１，５−アンヒドログルシトールは、若年者（５７）においてより高いが、パントテン酸及びシトルリンは健常高齢者により豊富である（１４，７９）。我々のアプローチの設計は、研究の集団が大きくない（Ｎ＝３０）にもかかわらず、これらの新規な局面を統計的有意性で同定するのに役立つかもしれない。 その研究から中年の人（４０〜７０歳）を除いたところ、２つのグループ間の年齢差がより明らかになった。また、正確な測定のために、試料は一度にまとめて分析した。残りの新規の老化関連化合物の１１のうちの８つは、高齢者においてより低い。我々の結果は、高齢の被験者の血液は、抗酸化物質（オフタルミン酸、カルノシンなど）及び酸化還元代謝物（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋）に関連するいくつかの化合物、ならびに筋肉の維持及び強化を支援する化合物（ロイシン、イソロイシン）について減少レベルを示すことを示唆する。対照的に、３つの血漿に豊富な化合物（Ｎ−アセチルアルギニン、ジメチルグアノシン及びＮ６−アセチルリシン）は、高齢者において増加する。尿素サイクルの副産物であるＮ−アセチルアルギニン及びシトルリンは、このサイクルの効率の低下のために増加する可能性がある。実際、尿素サイクル酵素の欠乏はこれらの化合物の蓄積を引き起こすことが知られている（７８，８０）。ジメチルグアノシンは、尿毒症患者の血漿中で増加することが知られている（５６）。これらの結果は、肝臓又は腎機能の漸進的で進行性の崩壊が一般的に高齢者の間で典型的であり、これらの血中代謝物が徐々に上昇することを示唆している。
【００４５】
［活発な活動を支える特定の化合物が高齢者では低下］
カルノシンを含むいくつかの老化関連化合物がＲＢＣ分析で同定されることも注目に値する。カルノシン（β−アラニル−Ｌ−ヒスチジン）は、酸化体のスカベンジャーであり得るが、筋肉及び脳に高濃度で存在する（８１）。我々のデータは、カルノシンが、ＲＢＣで豊富で非常に可変性の代謝物であることを示している。これらの知見は、血液中のＲＢＣの生理学的役割を再考することを可能にする。ＲＢＣはまた、カルノシン及び他の代謝物を遠隔組織に輸送するのに役立ち得る。一貫して、分解に抵抗性のアセチルカルノシン（８２）は、血漿で高濃度である。３０人の被験者のＲＢＣ／血漿比は、１０．８（カルノシン）及び０．１３（アセチルカルノシン）である。カルノシンは明らかにＲＢＣに富むが、アセチルカルノシンは明らかに血漿化合物である。我々の研究は、両方の化合物が高齢者で減少することを実証した。ＲＢＣにおけるカルノシンの役割を解明するためのさらなる研究はかなり興味深い。
【００４６】
［抗酸化剤、及び血液中のエネルギー及び細胞の維持に関連する化合物］
若年者の活発な活動に必要な化合物は、高齢者では低下する可能性がある。オフタルミン酸はグルタチオンに関連しており、両方とも同じ生合成酵素によって生成される。従って、オフタルミン酸は抗酸化剤に関連していると考えられている；また、高齢者で減少する。ＵＤＰ−アセチルグルコサミンのレベルは、高齢者よりも若年で２倍高かった。この化合物は、プロテオグリカン及び糖脂質合成中の細胞シグナル伝達及び核細孔の形成のために必要である（８３）。これらの機能は、抗酸化剤及び細胞維持化合物の合成が加齢とともに低下するという仮説に適合する（８３）。一貫して、若年者により豊富に存在するロイシン、イソロイシン、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋は、これら化合物が、身体活動がより高い時に、身体で、特に筋肉においてより活発に消費されることを示唆している（８４，８５）。これらの化合物のレベルが低いほど筋肉及び、おそらく脳の活性を減少するのかどうか、又はそれらが減少した活性を反映するかどうかは不明である。酸化剤のスカベンジャーは、ＲＢＣにおけるエネルギー関連生化学反応を回復させるために必要なのかもしれない（８６）。
【００４７】
［ヒトメタボロミクスの今後の展望］
これらの４３の老化関連化合物のうち３８（１，５−アンヒドログルシトール、カルノシン、クレアチン、ホスホクレアチン及びアセチルカルノシンを除く）が分裂酵母にも存在することは注目に値する。近い将来、分裂酵母及び他の生物におけるこれらの化合物の遺伝学は、それらの生理学的及び細胞学的な重要性を解明するのに有用であり得る。もしそうなら、ＲＢＣ、血漿、及び全血の現在の分析は、ヒトメタボロミクスの開発を支援するだろう。本発明で見出される４３の血中代謝物は、老化関連疾患と相関すると考えられる。これらの代謝物の血中濃度を指標として、疾患の危険性、疾患の状態、疾患感受性などを判定することができる。以下の疾患を前記疾患として例示することができる。生活習慣病（例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧、２型糖尿病、閉経、骨粗鬆症、癌など）神経学的障害（例えば、脳梗塞、アルツハイマー病、痴呆、パーキンソン症候群）眼疾患（例えば、白内障、緑内障、加齢性黄斑変性症、老眼、ドライアイなど）耳鼻咽喉疾患（例えば、聴力障害、慢性甲状腺炎、口腔乾燥症）血液学的障害（例えば、悪性リンパ腫、白血病、貧血）心疾患（例えば、虚血性心疾患、心筋梗塞、心不全、狭心症、急性冠動脈症候群）肺疾患（例えば、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、肺線維症）消化器系疾患（例えば、萎縮性胃炎、肝硬変、脂肪肝、肝機能障害など）腎及び泌尿器疾患（例えば、尿失禁、遅発性性腺機能低下症候群、慢性腎不全、前立腺肥大など）、筋骨格疾患（例えば、関節炎、運動器症候群、サルコペニア、腰痛、関節痛、虚弱など）、栄養失調、早老症、ヴェルナー症候群等が挙げられる。
【実施例】
【００４８】
実施例の要約は以下の通りである。我々は、３つの異なる面を有する研究において、３０人の血中代謝物を報告する。我々は、標準又はＭＳ／ＭＳ分析（非特許文献４）によって確認された１２６の血中代謝物を分析した。各代謝物について、我々は一価の、［Ｍ＋Ｈ］＋又は［Ｍ−Ｈ］−、ピークを選択した（表１）。我々はメタボローム解析のために、ＲＢＣ、血漿及び全血から試料を集めた。ＲＢＣ及びＲＢＣから慎重に分離された白血球（ＷＢＣ）の以前の分析と現在の定量的データとを組み合わせることにより、ＲＢＣに豊富な代謝物についての十分な知識が得られるようになった。ＲＢＣに富む代謝物は、血漿の代謝物とは異なる健康状態又は環境ストレスを反映し得る。
【００４９】
第二に、個々の変動を定量化するために、各血液化合物について変動係数（ＣＶ）と呼ばれる単純なパラメータを採用した。ＣＶは、代謝物の存在量（ＬＣ−ＭＳからのピーク領域）の標準偏差（ＳＤ）を平均で割った比である。安定した比較的不変な代謝物については、ＳＤ及びＣＶは低く又は無視できるが、可変代謝物のＣＶは、個体間の代謝物の変動の評価に有用であることが判明する可能性がある。３０名のボランティアからのＲＢＣ及び血漿代謝物をＬＣ−ＭＳを用いて分析した（非特許文献４，２１）。ＨＥＰＥＳ及びＰＩＰＥＳは、内部標準としてすべての血液試料に添加された。ＨＥＰＥＳ及びＰＩＰＥＳのＣＶよりも有意に大きい任意の化合物のＣＶが、個々の代謝物の変動について分析されるべき候補であった。
【００５０】
第三に、若年者と高齢者のボランティアとの間の血液メタボロームの比較は、年齢解析の対象とは考えられなかったＲＢＣ代謝物に重点を置いて行われた。我々は、統計学的に老化に関連する合計４３の代謝物を同定することができた。それらのうちの４つは以前に報告されていたが、それ以外は過去に報告がなかったと考えている。ヒトの老化に関する我々の発見を議論する。
【００５１】
【表１−１】
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【００５２】
【表１−２】
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【００５３】
【表１−３】
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【００５４】
【表１−４】
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【００５５】
【表１−５】
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【００５６】
［倫理声明］
ヘルシンキ宣言に従って、すべてのドナーから書面による同意が得られた。すべての実験は、関連する日本の法律及び制度ガイドラインに準拠して行われた。すべての議定書は、京都大学病院 医の倫理委員会及び沖縄科学技術大学院大学（ＯＩＳＴ）の人対象研究審査委員会によって承認された。
【００５７】
［ヒト被検者の特徴及び血液メタボロミクス分析］
３０名の健常男性と女性のボランティアがこの研究に参加した（表２）。メタボローム試料は、以前に報告されたように調製した（非特許文献４）。各代謝物のＬＣ−ＭＳ測定及びＣＶの決定の詳細な手順は、上述されている。メタボロミクス分析のための血液試料及び臨床血液パラメータは朝に採取し、被験者に少なくとも１２時間の絶食を確実にするために朝食を摂らないように要請した。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
［メタボロミクス解析のための血液試料の調製］
メタボローム試料は、以前に報告されたように調製した（非特許文献４）。全ての血液試料は、迅速な試料調製を確実にするために病院の実験室に持ち込まれた。簡単に説明すると、メタボロミクス分析のための静脈血試料を５ｍＬヘパリンチューブ（テルモ）に採取した。直ちに、０．２ｍＬの血液（８〜１２×１０８ＲＢＣ）を、−４０℃で５５％メタノール１．８ｍＬ中でクエンチした。血液サンプリングの直後のこの迅速なクエンチング工程は、多くの不安定な代謝物の正確な測定を確実にした。全血試料を使用することにより、さもなければ長時間の細胞分離手順により影響を受けた可能性のある細胞代謝物レベルも観察することができた。フィコール分離又は濾過による白血球除去の間、血液細胞は非生理学的状態に長時間曝される（非特許文献４）。
【００６０】
各ドナーからの残りの血液試料を室温で１５分間１２０ｇで遠心分離して、血漿及びＲＢＣを分離した。遠心分離後、分離された血漿及びＲＢＣ（１４〜２０×１０８ＲＢＣ）のそれぞれ０．２ｍＬを、−４０℃で５５％メタノール１．８ｍＬ中でクエンチした。２つの内部標準（１０ｎｍｏｌのＨＥＰＥＳ及びＰＩＰＥＳ）を各試料に添加した。短時間のボルテックス後、試料をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １０−ｋＤａカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に移して、タンパク質及び細胞破片を除去した。したがって、各血液試料から、３つの異なるサブサンプル、全血、ＲＢＣ及び血漿を調製した。白血球含量（ＷＢＣ）は、本発明者らの調製物の細胞容積の１％未満である（非特許文献４）。フィコール勾配を用いたＷＢＣの完全メタボロミクス分析は、ＷＢＣがＲＢＣに関する現在のメタボロミクスの結果に影響を与えてはならないことを確認した。真空蒸発による試料濃縮後、各試料を５０％アセトニトリルの４０μＬに再懸濁し、１μＬをＬＣ−ＭＳシステムへの各注入に使用した。
【００６１】
［ＬＣ−ＭＳ分析］
ＬＣ−ＭＳデータは、前述したように、ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）に連結されたＰａｒａｄｉｇｍ  ＭＳ４  ＨＰＬＣシステム（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて得た（非特許文献２１）。簡単に述べると、ＺＩＣ−ｐＨＩＬＩＣカラム（Ｍｅｒｃｋ  ＳｅＱｕａｎｔ，Ｕｍｅａ，Ｓｗｅｄｅｎ；１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、５μｍ粒径）上でＬＣ分離を行った。ＨＩＬＩＣカラムは、以前は他人によってアッセイされていなかった多くの親水性血中代謝物を分離するために非常に有用である（非特許文献４）。アセトニトリル（Ａ）及び１０ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ９．３（Ｂ）を１００μＬ・ｍＬ−１の流速で移動相として使用し、３０分間で８０−２０％Ａの勾配で溶離する。目的の代謝物のピーク領域をＭＺｍｉｎｅ  ２ソフトウェアを用いて決定した（８７）。詳細なデータ分析手順及びパラメータは以前に記載されている（非特許文献２１）。メタボロームデータセットは、ＭｅｔａｂｏＬｉｇｈｔｓデータベースに保存されている（データの可用性を参照）。
【００６２】
［ＬＣ−ＭＳで分析した血中代謝物のＣＶ］
我々は、標準又はＭＳ／ＭＳ分析（非特許文献４）によって確認された１２６の血液成分を分析した。各代謝物について、我々は一価の［Ｍ＋Ｈ］＋又は［Ｍ−Ｈ］−、ピークを選択した（表１）。代謝物はそのピーク領域に応じて３つのグループ（Ｈ，Ｍ，Ｌ）に分類された。Ｈは高いピーク領域（＞１０８ＡＵ）を有する化合物を意味し、Ｍは中程度のピーク領域（１０８〜１０７ＡＵ）を有し、Ｌは低いピーク領域（＜１０７ＡＵ）を有する化合物を意味する。
【００６３】
これまでに報告されているように、ＡＭＰやＡＴＰなどの同一モル濃度の標準物質は異なる効率でイオン化し、ピーク領域の定量化に影響する（非特許文献２１）。従って、ある場合には、純粋な試料と代謝物試料混合物との間の特定の化合物の異なるイオン化効率のために、ピーク領域を実際のモル量に確実に変換することができなかった。しかしながら、本研究では、個々に異なるピーク領域の相対比がＣＶを得るために関連するので、化合物の実際のモル濃度は必要とされなかった。
【００６４】
［各代謝物のＣＶの決定］
実験手順の検証は以下のように行った。まず、試料内ばらつきに対する試料取扱いの寄与を評価した。同じ血液試料調製物を８０分間隔でＬＣ−ＭＳに３回注入した（図６Ａ）。
このようにして、１２６の化合物のうち１０７の化合物（８５％）において０．１未満である試料内ＣＶ（ＣＶｗｉと称する）を得た。ＣＶｗｉが０．１〜０．２であるのは１０化合物のみであり、ＣＶｗｉが０．２以上であるのは９化合物であった（表１）。多くの可変化合物は低ピーク領域（Ｌ）群に属し、いくつかの低濃度の化合物はＬＣ−ＭＳ中に不安定である可能性があることを示唆している。しかし、これらの化合物のための純粋な標準物のＬＣ−ＭＳ測定は、はるかに低いＣＶを示し（データ示さず）、それらの不安定性は、ＬＣ−ＭＳ測定前に他の血液化合物又は溶媒との反応から生じることを意味する。
【００６５】
第二に、試料調製によって生じた試料間の変動も調べた。同じ血液試料（１人）から３つの試料を独立して調製し、このようにして決定したＣＶをＣＶｓｓとした（図６Ｂ）。血液試料中のＨＥＰＥＳとＰＩＰＥＳのＣＶｓｓ値は非常に小さかった（ＨＥＰＥＳでは０．０６〜０．０８、ＰＩＰＥＳでは０．０４〜０．０８）。ＣＶｓｓの大多数（１１６／１２６＝９２％）は＜０．３であった（表１）。ＣＶｓｓが＞０．３の１０の化合物のうち、９つの化合物が低ピーク領域（Ｌ）群に属していた。Ｍピーク領域を有するビタミンであるニコチンアミドは、ＣＶｓｓ＝０．４７であった。しかし、ニコチンアミド標準物の３回の注入では、ＣＶ＝０．０５であった。同様の状況がＵＭＰ及び１−メチルグアノシンのような９つの他の化合物についても、高いＣＶｓｓ値と共に観察された。血液中のこれらの１０の化合物のＣＶｓｓは、試料調製の影響を受け得るか、又は試料調製中に他の代謝物と反応し得る。第三に、３０人のボランティア全員（ＣＶ３０）から各血液製剤のＣＶを得た（表１、図６Ｃ）。ＣＶ３０を６つの異なる値の範囲に分類した（図１Ａ）。
【００６６】
［データの可用性］
ｍｚＭＬ形式の生のＬＣ−ＭＳデータは、ＭｅｔａｂｏＬｉｇｈｔｓリポジトリ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｅｔａｂｏｌｉｇｈｔｓ）からアクセスできる。同じ試料の３回の注射から得られたデータと、同じ供与血液から調製された３つの試料のデータは、受託番号ＭＴＢＬＳ２６３として入手可能である。４人のボランティアから２４時間以内に４回採取した血液試料は、受託番号ＭＴＢＬＳ２６４として入手可能である。全３０人の被験者からの全血の代謝物データは、アクセッション番号ＭＴＢＬＳ２６５で入手可能である。全３０人の被験者からの血漿及びＲＢＣデータは、それぞれ、ＭＴＢＬＳ２６６及びＭＴＢＬＳ２６７で見出すことが出来る。
【００６７】
［血中代謝物の日内変動；多くの代謝物レベルは日常的に一定である］
我々は、最初に、４人のボランティアの血中代謝物の日内変動を調べた。一晩の絶食後、朝食をとらずに初日には９：００、１０：００，１３：００の昼食の前に試料を採取した。ボランティアはその日、いつものようにランチとディナーを取った。一晩絶食した後の２日目に、血液を再び９：００に採取した。これらの短期間に大部分の代謝物はほとんど変動しなかった（１２６の代謝物のうち１１７は４人のボランティアで平均２．５倍未満の変動であった、図５Ａ）。各人のエルゴチオネインレベルは異なっていたが、ＡＴＰ及びエルゴチオネインはほとんど変化しなかった。対照的に、４つの可変化合物は２４時間にわたってかなり変動した。グリコケノデオキシコール酸、テトラデカノイルカルニチン、４−アミノ安息香酸、カフェインなどの代謝物は、食品、飲料、サプリメント、及び薬の毎日の摂取量に応じて幅広く変動する（２２−２４）。我々の結果は以前に報告されたものと一致している。これらの日々の変動性化合物は、血漿及びＲＢＣの両方で見出された（非特許文献４）。
【００６８】
［各代謝物の個々のＣＶの決定］
３０名のボランティアが供与した血液試料のメタボローム分析を行った。ＲＢＣにおける化合物濃度に関するデータは、我々の以前の報告と一致する（非特許文献４）。フィコール勾配遠心分離によるＷＢＣからのＲＢＣの分離は、代謝物及びそのレベルがＲＢＣ及びＷＢＣにおいて同様であることを確認した（非特許文献４）。ＷＢＣは健常人の血液量のわずかな部分（＜１％）しか占めていないので、現在の結果はＷＢＣ混入による影響を受けていないはずである。
【００６９】
ＬＣ−ＭＳ分析及びＣＶの取得及び評価の手順は、上で詳述されている。ＣＶを決定するために使用される方法を以下に簡単に説明する。まず、試料内のばらつきに対する試料処理の影響をテストした。これを達成するために、同じ血液試料をＬＣ−ＭＳに３回注入した。試料内ＣＶ（ＣＶｗｉと称する；図６Ａ）は、ほとんどの場合に０．１未満であった。他の例外は、ＬＣ−ＭＳ中に不安定であるように見える。
【００７０】
第二に、試料調製によって生じた試料間の変動を調べた。この目的のために、同じ血液試料から３つの試料を独立して調製し、化合物のＣＶを決定した（ＣＶｓｓ）（図６Ｂ）。
血液試料中のＨＥＰＥＳ及びＰＩＰＥＳ（内部標準）のＣＶｓｓは、それらが不活性で非反応性の化合物であるため、非常に小さかった（０．０４〜０．０８）。血液化合物ＣＶｓｓの大部分は０．３未満であった（表１）。１０の化合物のＣＶｓｓは例外的であり、０．３を超えていた。それらは、試料調製技術によって影響されるか、又は試料調製中に他の血中代謝物と反応し得る。
【００７１】
３０人の実験集団全体のＣＶを各血液化合物（ＣＶ３０）について決定した（図６Ｃ及び表１）。３０人の健常ボランティア（表２）からの血中代謝物のＣＶ３０を、ＲＢＣに豊富な化合物又は全血に存在する化合物のサブカテゴリーで６つの異なる値の範囲に整理した（図１Ａ）。ＡＴＰ、グルタチオン及び糖リン酸のような多くのＲＢＣに富む化合物は血漿中に実際には存在しないが、多くの血漿化合物はＲＢＣにも存在する（非特許文献４）。
【００７２】
ＣＶ３０が０．３０未満である２８個の化合物は、１２６個の血中代謝物のうち最も可変性の低いサブセットを含む（図１Ｂ）。追加の２８の化合物は０．３〜０．４のＣＶ３０値を有し、第二に最小の可変群に属する。カルニチンの前駆体であるブチロベタインは、ＲＢＣに富み、この群に属する（図５Ｂ）。残りの７０の化合物は、０．４〜２．５のＣＶ３０値を示す。我々は、これらの化合物が可変であると考えている。０．４〜０．５のＣＶ３０を有する２２種の化合物は中程度に変化する。グルコース、１，５−アンヒドログルシトール、ＣＤＰ−コリン、及びグルコサミンがこの群に属する。腎試験に使用されるクレアチニンは、第二群に属する（ＣＶ３０＝０．３〜０．４）。ＣＶ３０＞０．５を有する４８の化合物は非常に変化しやすいと考えられている。それらはしばしばメチル化又はアセチル化され、又はヌクレオチド又は脂肪酸のような大きな基で修飾される。
【００７３】
［５１のヒト代謝物についてこれまでに報告されていないＣＶ］
上記に分類された化合物のＣＶ３０値は、多くの場合、文献からの証拠によって十分支持されている。ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳ、及びＮＭＲによって分析された、４６の化合物（主に標準アミノ酸及びその誘導体）のＣＶは以前に報告されている（１２、１５、２５）。これらの４６の化合物のうち、３６は我々の結果（ＣＶ３０）の±０．３以内のＣＶであった。文献では、我々の１２６の化合物のうちの７１に対してもＣＶを見いだした（２２、２６−６９）。これらの報告では、ＣＶの７２％（５１／７１）が我々の結果と同様であった（±０．３）。総合的に、７５／１２６化合物（６０％）の我々のＣＶ３０（表１）は文献と合理的に一致している。残りの５１の化合物についてのＣＶは、我々が知る限り、新規である。以下に記載するように、これらの５１の化合物の多く（図１Ａに下線が引かれ、表３にも列挙されている）はＲＢＣに富んでいる。
【００７４】
それらの分子構造と機能に基づいて１２６の化合物を１４のカテゴリーに分類した（表１）。１７の検出可能な標準アミノ酸及び１０すべてのカルニチンのＣＶは以前に報告されている。１２のヌクレオシド、核酸塩基、及びそれらの誘導体のうち、ジメチルキサンチンのＣＶのみが新規であった。対照的に、すべての４つのヌクレオチド糖誘導体及び大部分（８／９）の糖リン酸誘導体は同様に新規である。それらの新規性は、これらの化合物がＲＢＣに富むという事実を反映している。他のカテゴリーではいくらかのＣＶは新規である：メチル化アミノ酸（８／１３）、ヌクレオチド（７／１１）、ビタミン及び補酵素（２／５）、糖及び誘導体（３／６）、有機酸（６／１０）、アセチル化アミノ酸（５／７）、他のアミノ酸誘導体（４／１６）、コリン誘導体（２／３）、抗酸化剤（１／３）。これらの多くはまたＲＢＣに富んでいる。メチル化されたアミノ酸がＲＢＣに蓄積するのは興味深い。
【００７５】
【表３−１】
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【００７６】
【表３−２】
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【００７７】
［エルゴチオネイン関連、解糖系、及びメチル化化合物は相関関係がある］
いくつかの機能的に関連する血中代謝物のレベルが相関していることは興味深い。トリメチルヒスチジン、エルゴチオネイン及びＳ−メチルエルゴチオネインは構造的に関連しており、前者の２つの化合物が生化学的経路でリンクしているので、これらの間で相関関係が存在するかどうかを最初に調べた。これらの化合物の存在量は、非常に強く、正の相関がある（ｒ２＝０．８１〜０．９２、図２Ａ）。
【００７８】
第二に、ＲＢＣに富むグルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）、フルクトース−６−リン酸（Ｆ−６−Ｐ）、ジホスホグリセリン酸（ＤＧ）及びホスホグリセリン酸（ＰＧ）間で潜在的相関を調べた（図２Ｂ）。Ｇ−６−ＰとＦ−６−Ｐ、ＤＧとＰＧ、Ｆ−６−ＰとＤＧ、並びにＧ−６−ＰとＤＧの間には、非常に強い相関が見られた。これらのＲＢＣ化合物は、解糖経路の成分である。
【００７９】
第三に、メチル化化合物、ジメチルアルギニン（ＤＡ）、ジメチルグアノシン（ＤＧＵ）、１−メチルグアノシン（１ＭＧ）及びメチル−ヒスチジン（ＭＨ）間の相関も評価した。ＤＡの存在量は、ＤＧＵ、１ＭＧ、及びＭＨのそれと強く正の相関がある（図２Ｃ）。さらに、１ＭＧもまたＤＧＵ及びＭＨと正の相関がある。これらの結果は、いくつかのメチル化化合物のレベルが同じ同化経路又は異化経路に関連していることを示唆している。一貫して、これらの化合物はすべて、ＲＢＣ及び血漿の両方において富んでいる。従って、個体間の代謝物の変動は、エルゴチオネイン、解糖及びメチル化のような経路に関して調整される。
【００８０】
［低いＣＶを有する代謝物は、生命の維持に重要な機能を有し得る］
５１の新規ＣＶ化合物のうち、１９は低いＣＶ３０＜０．４を示した。これらの内の１６種は、ＲＢＣで豊富であった（図．１Ａ、表１）。それらには、糖リン酸、糖ヌクレオチド誘導体、糖及び誘導体、並びにＡＴＰ産生に関与する有機酸が含まれる。低いＣＶを有する化合物は、基本的なＲＢＣ機能を支持する可能性が高い。ＡＴＰ（ＣＶ３０＝０．１７）とグルタチオンジスルフィド（ＣＶ３０＝０．１８）のＣＶは低く、高齢者と若年者の間に有意差は見られなかった（図３Ａ−Ｂ）。ＡＴＰ及びグルタチオンは、それぞれエネルギー源及び抗酸化剤として極めて重要であり、そのため、ＲＢＣにおけるそれらの濃度は、年齢に特異的なばらつきがほとんどなく、厳しく調節され得る。同様の状況が、２つの糖リン酸、ジホスホグリセリン酸（ＣＶ＝０．２４）及びグルコース−６−リン酸（ＣＶ３０＝０．２９、図３Ｃ−Ｄ）に見られる。生理的ホメオスタシスに必須であるため、小さなＣＶ（ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、標準アミノ酸、及びヌクレオチド）を有するこれらの重要な代謝化合物のレベルは厳密に調節されているはずである。換言すれば、小さなＣＶ化合物は、測定値が正確であれば、健康チェック指標の良い候補となる可能性がある。
【００８１】
必須の解糖系代謝物であるグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）は例外である。それは高いＣＶ３０を有する（図５Ｂ）。この化合物のレベルは、個人によって大きく異なる。しかし、それは不安定な化合物（ＣＶｓｓ、０．４９）であり、そのため、高いＣＶ３０（０．９９）は慎重に取り扱われなければならない。酵素であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼは、癌細胞のエネルギー代謝において重要であることが知られている（７０）。
【００８２】
［高いＣＶをもつ未報告の化合物は、しばしば修飾され、ライフスタイルの差異や食習慣との関係を示す］
以前報告されていないＣＤＰ−コリンやホスホクレアチンなどの１０の血中代謝物は、中程度の０．４〜０．５ＣＶ３０の変動を示す（図１Ａ、図７Ａ及び７Ｃ）。１３種の化合物は、さらに高い０．５〜０．７ＣＶ３０（トリメチルヒスチジンＣＶ３０＝０．５７；図３Ｅ）を示す。それらのうちの９つは、ＲＢＣに豊富であり、ヌクレオチド糖及びトリメチル化誘導体を含む。それらのＣＶは健常人の血液では以前には報告されていなかった。ＲＢＣに富むＵＤＰ−グルクロン酸（ＣＶ３０＝０．６４、図３Ｂ）はグルクロニドとＵＤＰ−グルコースの中間体である（７１）。Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼの基質であるＵＤＰ−アセチルグルコサミン（ＣＶ３０＝０．６４、図３Ｆ）は、プロテオグリカン及び糖脂質合成の前駆体である（７２，７３）。ＵＤＰ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−グルクロン酸の存在量は、若年者と高齢者の間でいくつかの差異を示す（ｐ値、それぞれ０．００７３及び０．１２；下記参照）。
【００８３】
より高いＣＶ３０（０．７〜２．５）を示す化合物は最も可変な基（例えば、４−グアニジノブタン酸ＣＶ３０２．０５；トリメチル−トリプトファンＣＶ３０１．６７）を含む（図３Ｇ−Ｈ）。これらのうちの９つは以前に報告されていない。４つはメチル化されたアミノ酸であり、そのうち３つはトリメチル化されている。メチル化アミノ酸はＲＢＣに富んでいるが、アセチル化アミノ酸は血漿及びＲＢＣの両方で見出される。この区別の理由は不明である。見出された最も可変性の化合物の多くは、おそらくライフスタイル、特に食生活に関連するマーカー化合物として適切な修飾アミノ酸である
【００８４】
４−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡとも呼ばれる）のデータは興味深い。そのＣＶ３０は非常に高い（２．１８）。５人は高レベルのＰＡＢＡを有していたが、その他の人ではレベルは低く、又はほとんど検出されなかった（図７Ｄ）。ＰＡＢＡは動物ではビタミンＢ９の、並びに植物（７４）及びバクテリア（７５）では葉酸の前駆体であるが、ＰＡＢＡはヒトでは必須ではない。この非常に大きな可変的な存在量は、食物又は他の未知の個体差を反映し得る。
【００８５】
［ＣＶ測定によって明らかにされた老化関連化合物］
分析された１２６の化合物のうち、大多数は若年者と高齢者において同様のＣＶレベルを示した。我々は、２つの年齢群の間で有意に異なる４３の化合物を見出した。例えば、血糖マーカー（７６）として知られている１，５−アンヒドログルシトール（図４Ａ）は、健常若年者と比較して健常高齢者では著しく低いレベルを示す（ｐ＝０．０００３９）。 ３０人のボランティアのどれもが糖尿病患者ではないことを明記する（表２の血液検査でのＨｂＡ１ｃ及びグルコースの値を参照）。１，５−アンヒドログルシトール（単糖）は、通常、腎臓を介して血液中に再吸収されるが、この化合物は、再吸収のためにグルコースと競合し、そのために血液中の高グルコースを含む糖尿病患者においては、１，５−アンヒドログルシトール量は低い。考えられる解釈は、健常高齢者は、１，５−アンヒドログルシトールを吸収して尿に放出し、血中で同時に減少する能力を徐々に失う可能性があるということである。
【００８６】
グルタチオンのトリペプチド類似体であるオフタルミン酸は、若年者と高齢者の間で顕著な差異を示す（高齢者の血液中でははるかに少ない；ｐ値０．００８７；図４Ｂ）。同様に、β−アラニン及びヒスチジンを含むジペプチドに関連した、２つの酸化体スカベンジャー、アセチルカルノシン（ｐ＝０．００１４、図４Ｃ）及びカルノシン（ｐ＝０．００２７、図４Ｄ）のレベルは、高齢者では明らかにあまり多くはない。これは、ＲＢＣに高濃度の２つの酸化還元補酵素、ＮＡＤ＋（ｐ＝０．０４６）及びＮＡＤＰ＋（ｐ＝０．０２２）についても当てはまり（図８Ａ−Ｂ）、高齢者の赤血球において酸化還元代謝が幾分低下している可能性を示唆する。しかし、ロイシンとイソロイシンは、高齢者の骨格筋活動を支えるために明確な役割を果たす可能性があり（７７）、そのために高齢者の血中代謝物におけるそれらの減少（それぞれｐ＝０．００１７と０．００１２、図８Ｃ−Ｄ）は、老化による血中のそれらの減少を示唆する可能性がある。おそらく抗酸化剤と無関係であるＵＤＰ−アセチルグルコサミンのレベルも、また高齢者の血液中で減少している（ｐ＝０．００７３、図３Ｆ）。この化合物は成長及び増殖にとって重要であるので、その低下はまた老化を加速する可能性がある。要するに、高齢者の血液は、抗酸化物質、酸化還元物質、及び激しい身体活動に必要な栄養素が減少している可能性がある。
【００８７】
一方、シトルリン（ｐ＝０．０００８９、図４Ｅ）、パントテン酸（ｐ＝０．０２２、図４Ｆ）、ジメチルグアノシン（ｐ＝０．００８１、図４Ｇ）、Ｎ−アセチルアルギニン（ｐ＝０．０００４、図４Ｈ）及びＮ６−アセチルリシン（ｐ＝０．０１２、図８Ｅ）は、高齢被験者の血液において明らかにより富んでいる。パントテン酸は、ＴＣＡサイクル及びβ酸化に関与する重要な補酵素であるＣｏＡの前駆体である。シトルリンは、尿素サイクルの最初の代謝物である。ジメチルグアノシンは尿中ヌクレオシドであり、尿毒症患者の血漿中に高レベルを示す（５６）。アルギナーゼ（尿素サイクルの最後の酵素）が不足している患者では、Ｎ−アセチルアルギニンの濃度が正常より４倍以上高い（７８）。 したがって、シトルリン及びＮ−アセチルアルギニンの増加は、尿素サイクル障害を示唆する。これらの結果の可能な解釈は、尿中の代謝物が尿中に排出されることが、高齢者において幾分損なわれる可能性があることである。減少した血液１，５−アンヒドログルシトールはまた、弱くなった腎機能に関連している可能性がある。高齢者における豊富なパントテン酸は、ＣｏＡ生合成がわずかに損なわれている可能性があることを示唆する。
【００８８】
ロイシンとイソロイシンの分解代謝物であるケトロイシンとケト（イソ）ロイシンが高齢者で有意に減少していることを示唆するデータを得た。分岐アミノ酸であるロイシン及びイソロイシンは、骨格筋及び脳において代謝されることがよく知られている。特に、ＡＴＰは筋肉の運動中にＡＤＰとＡＭＰを介してＩＭＰに変換される。この過程で有毒なアンモニアが生成される。アンモニアとグルタミン酸はグルタミン合成酵素と結合し、無毒性のグルタミンに変換される。運動中、分岐鎖アミノ酸はアミノトランスフェラーゼの存在下で２−ケトグルタル酸と反応してアンモニアの処理に必要なグルタミン酸を生成する。 ケトロイシン及びケト（イソ）ロイシンは、この酵素反応によって生成される。最後に、それはアセチルＣｏＡ又はスクシニルＣｏＡに変換し、クエン酸サイクルに使用される。 したがって、ケトロイシン及びケト（イソ）ロイシンは、筋肉量及び運動量の減少を反映する高齢者においてより低いことが妥当である。ケトロイシン及びケト（イソ）ロイシンは、老化マーカーとして使用することができる。
【００８９】
上記の血中代謝物に加えて、高齢者と若年者との間に有意差を示す２７の化合物が見出された。高齢者と若年者の間で異なる血中代謝物が以下の表に要約されている。
【００９０】
【表４】
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【００９１】
【表５】
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【００９２】
【表６】
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【００９３】
【表７】
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【００９４】
［老化関連化合物内での相関］
最初に、我々は、比較的に強い相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｒ）を示す老化関連の１４化合物（１，５−アンヒドログルシトール、Ｎ−アセチルアルギニン、シトルリン、アセチルカルノシン、ロイシン、オフタルミン酸、Ｎ６−アセチルリシン、カルノシン、ＵＤＰ−アセチルグルコサミン、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、イソロイシン、パントテン酸及びジメチルグアノシン）の１２対を見つけた（０．６０〜０．８４；表８、図９）。興味深いことに、そのような組み合わせは、高齢者の間で増加又は減少した化合物の群内で起こった。シトルリン含量はＮ−アセチルリシン（０．８４）と強く相関し、Ｎ−アセチルアルギニン（０．６８）とジメチルグアノシン（０．６４）とはあまり相関しない（表８）。Ｎ−アセチルアルギニンとＮ−アセチルリシン（０．６３）の間並びにＮ−アセチルアルギニンとジメチルグアノシン（０．６１）の間にも相関がある。これらの４つの化合物は、高齢者で血中レベルの上昇を示す。次に、高齢者で減少した７つの化合物の間に相関（０．６〜０．８３）を見出した。ロイシンとイソロイシン（０．８３）との間並びにカルノシンとアセチルカルノシン（０．７３）との間の相関は強く、これらの化合物はそれらの密接な機能的関係のために相関があることを示唆している。他の互いに密接に関連する組み合わせには、カルノシンとＮＡＤＰ＋、ロイシンとアセチルカルノシンが含まれる（表８；図９）。これらの結果は、老化関連化合物の２つの別個の群（高齢者における減少又は増加）の量は内的相関するという概念と一致しているが、群間に相関はない。例えば、豊富なロイシンの高齢ボランティアは高い確率で高イソロイシンを有し、一方、豊富なシトルリンを有する高齢者は、また高い確率で高レベルのＮ６−アセチルリシンを有するであろう。しかしながら、個体間でロイシン及びシトルリンの存在量についての相関は存在しない。
【００９５】
【表８】
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【００９６】
我々は４３の老化関連化合物間の相関を調べた。我々は、全血中に比較的強い相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｒ）（０．６０〜０．９１；表９）を示した４３の老化関連化合物の２７対を見出した。加えて、比較的強い相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｒ）（０．６１〜０．８５；表１０）を示した血漿中の４３の老化関連化合物の４５対を見出した。我々はまた、比較的強い相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｒ）（−０．６４〜０．９４；表１１）を示したＲＢＣ中の４３の老化関連化合物の３５対を見出した。
【００９７】
【表９】
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【００９８】
【表１０】
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【００９９】
【表１１】
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【０１００】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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