(57)【要約】  本発明は、医薬品の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＧＦＲＡＬ受容体を作動することによる糖尿病または肥満症の治療方法、そのような治療で使用するための化合物、及びそのような化合物を含有する薬学的組成物に関する。本発明はまた、ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗し、阻害し、中和し、またはブロックすることによる悪液質の治療方法、そのような治療で使用するための化合物、及びそのような化合物を含有する薬学的組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における血中グルコースを低下させる方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を作動する有効量の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項２】
哺乳動物における血中グルコースを増加させる方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗し、阻害し、中和し、またはブロックする有効量の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項３】
哺乳動物における体重を減少させる方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を作動する有効量の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項４】
哺乳動物における体重を増加させる方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗し、阻害し、中和し、またはブロックする有効量の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項５】
前記化合物が、ＧＤＦ１５の結合を阻害することによって、前記ＧＦＲＡＬ受容体をブロックする、請求項２または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、抗体またはその断片を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＦＲＡＬ受容体が、配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＧＤＦ１５が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物がマウスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＦＲＡＬ受容体が、配列番号９のアミノ酸配列を有し、前記ＧＤＦ１５が、配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と共に投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、ＧＬＰ−１、インスリン、インスリン類似体、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、及びグルカゴンのうちの１つ以上と共に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＦＲＡＬ受容体を作動する化合物と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項１４】
ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗し、阻害し、中和し、またはブロックする化合物と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項１５】
ＧＬＰ−１、インスリン、インスリン類似体、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、及びグルカゴンのうちの１つ以上を更に含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記化合物と、ＧＬＰ−１、インスリン、インスリン類似体、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、及びグルカゴンのうちの１つ以上とが融合されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ＧＦＲＡＬ受容体を作動する単離された化合物。
【請求項１８】
ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗し、阻害し、中和し、またはブロックする単離された化合物。
【請求項１９】
前記化合物が、抗体またはその断片である、請求項１６または１７に記載の化合物。
【請求項２０】
前記抗体またはその断片が、ＧＦＲＡＬ上のＧＤＦ１５と同じエピトープまたはアミノ酸領域に結合する、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
前記化合物が、ＧＦＲＡＬ上のＧＤＦ１５と同じエピトープまたはアミノ酸領域に結合するペプチドまたはタンパク質である、請求項１７または１８に記載の化合物。
【請求項２２】
哺乳動物における糖尿病の治療方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を作動する有効量の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項２３】
哺乳動物における肥満症の治療方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を作動する有効量の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
哺乳動物における悪液質の治療方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗し、阻害し、中和し、またはブロックする有効量の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項２５】
（ａ）不溶性ヒトＧＦＲＡＬ受容体のＧＤＦ１５結合可溶性断片であって、前記不溶性ヒトＧＦＲＡＬ受容体が、ヒトＧＤＦ１５に特異的に結合する、ＧＤＦ１５結合可溶性断片と、（ｂ）ヒト免疫グロブリンＩｇＧ重鎖の定常領域の、前記定常領域の第１のドメイン以外のドメインの全てと、を含むタンパク質であって、ヒトＧＤＦ１５に特異的に結合する、タンパク質。
【請求項２６】
前記不溶性ヒトＧＦＲＡＬ受容体が、配列番号４を含む、請求項２５に記載のタンパク質。
【請求項２７】
前記タンパク質が、前記不溶性ヒトＧＦＲＡＬ受容体の細胞外領域と、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖の定常領域の、前記定常領域の第１のドメイン以外の全てのドメインとから本質的になる、請求項２５に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＧＦＲＡＬ受容体を作動する（ａｇｏｎｉｚｅ）ことによる糖尿病または肥満症の治療方法、そのような治療で使用するための化合物、及びそのような化合物を含有する薬学的組成物に関する。本発明はまた、ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗し（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）、阻害し、中和し（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ）、またはブロックすることによる悪液質の治療方法、そのような治療で使用するための化合物、及びそのような化合物を含有する薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＤＦ１５は、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属する。ＧＤＦ１５の多くの報告された生物学的機能の中で、エネルギー恒常性の制御は、肥満症及び代謝疾患の治療におけるその潜在性のために重要であり得る。ＧＤＦ１５と体重との間のつながりは、当初、進行性前立腺癌の個体における高い血清ＧＤＦ１５レベルと体重減少との間の相関の観察に基づくものであった。更に、動物モデルにおけるＧＤＦ１５の過剰発現は、痩せた表現型、食欲不振、及び代謝パラメータの改善をもたらす。ＧＤＦ１５が、視床下部及び脳幹に作用することによって、飼料摂取及び体重を調節することが報告されている。しかしながら、ＧＤＦ１５の作用機序は、分子レベルでは解明されておらず、ＧＤＦ１５の受容体はこれまでのところ特定されていない。
【発明の概要】
【０００３】
出願者は、ＧＤＦ１５が、既知のリガンドを有さない単一膜貫通ドメインを有する膜タンパク質である、ＧＦＲα受容体ファミリーの遠縁のメンバーであるＧＦＲＡＬ（ＧＤＮＦ受容体アルファ様タンパク質）に対して高親和性で結合することを見い出した。ＧＦＲＡＬは、受容体のグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバーである。ＧＤＮＦファミリーリガンドは、システイン−ノットタンパク質ファミリーに属し、ホモ二量体として機能する。標準的なＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーとは異なり、全てのＧＤＮＦファミリーリガンドは、ＲＥＴ受容体とＧＤＮＦファミリー受容体−αとの間の複合体を通してシグナル伝達する。ＧＦＲα受容体は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを有する形質膜タンパク質である。４つの異なるＧＦＲα受容体が特性化されており（ＧＦＲα１−４）、それらのリガンド特異性が決定されている。ＧＤＮＦはＧＦＲα１に結合し、ＮＲＴＮはＧＦＲα２に結合し、ＡＲＴＮはＧＦＲα３に結合し、かつＰＳＰＮはＧＦＲα４に結合する。興味深いことに、ＧＦＲα受容体の２つの遠縁のホモログであるＧＦＲＡＬ及びＧａｓ１（増殖停止時特異的遺伝子１）が、配列相同性に基づいて特定されている。それらのリガンドは、これまでまだ知られていない。
【０００４】
ＧＦＲＡＬは、ＧＦＲαファミリーの遠縁ホモログであり、これは、ＧＦＲα−１、−２、または−４に対してよりもＧＦＲα−３に対してより緊密に関連している（３０％の同一性）。ＧＦＲαファミリーのＧＦＲＡＬと他のメンバーとの間の１つの区別は、ＧＦＲＡＬがＣ末端のＧＰＩアンカーモチーフを欠くことである。その代わりに、ＧＦＲＡＬは、単一の膜貫通ドメインを有する膜タンパク質であると予測される。
【０００５】
出願者は、動物モデルにおける体重、飼料摂取及びグルコースパラメータに及ぼすＧＤＦ１５の効果が、ＧＦＲＡＬ受容体を必要とすることを本明細書で開示する。血中グルコース及び体重を低減するための組換えＧＤＦ１５の有効性は、ホモ接合性ＧＦＲＡＬ欠損マウスでは不在である。これらのデータは、ＧＦＲＡＬをＧＤＦ１５受容体として支持するための明確な証拠を提供している。この発見は、ＧＦＲＡＬ受容体と相互作用して、糖尿病、肥満症、及び悪液質のうちの１つ以上を治療するための新しい化合物を開発するための基礎である。
【０００６】
本明細書に記載の本発明は、ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ活性を、ＧＦＲＡＬ受容体を作動し、拮抗し、阻害し、中和し、またはブロックすることを含む化合物で調節する方法を提供する。この化合物は、ＧＤＦ１５よりも大きな親和性でＧＦＲＡＬ受容体に結合し、ＧＤＦ１５がＧＦＲＡＬ受容体に結合することをブロックする抗体を含んでもよい。本発明はまた、ＧＦＲＡＬ受容体を作動する化合物または薬学的組成物を投与することを含む、哺乳動物における血中グルコースを低下させ、かつ体重を減少させる方法も含む。本発明は、ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗し、阻害し、中和し、またはブロックする化合物または薬学的組成物を投与することを含む、哺乳動物における血中グルコースを増加させかつ体重を増加させる方法を更に含む。
【０００７】
本発明は、哺乳動物における血中グルコースを低下させる方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を作動する有効量の化合物を投与することを含む、方法を含む。本発明は、哺乳動物における血中グルコースを増加させる方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗する有効量の化合物を投与することを含む、方法を含む。また、本発明は、哺乳動物における体重を減少させる方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を作動する有効量の化合物を投与することを含む、方法を含む。本発明は、哺乳動物における体重を増加させる方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗し、阻害し、中和し、またはブロックする有効量の化合物を投与することを含む、方法を更に含む。
【０００８】
本発明は、本化合物が、ＧＤＦ１５の結合を阻害することによってＧＦＲＡＬ受容体をブロックし、本化合物が抗体またはその断片を含むところの、前述の方法を含む。本発明は、哺乳動物がヒトであり、ＧＦＲＡＬ受容体が、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＧＤＦ１５が、配列番号２のアミノ酸配列を有するところの、前述の方法を更に含む。本発明は、哺乳動物がマウスであり、ＧＦＲＡＬ受容体が、配列番号９のアミノ酸配列を有し、ＧＤＦ１５が、配列番号７のアミノ酸配列を有するところの、前述の方法を更に含む。
【０００９】
本発明は、本化合物が１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と共に投与され、本化合物が、ＧＬＰ−１、インスリン、インスリン類似体、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、及びグルカゴンのうちの１つ以上と共に投与されるところの、前述の方法を含む。
【００１０】
本発明は、ＧＦＲＡＬ受容体を作動する化合物と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を含む。本発明は、ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗し、阻害し、中和し、またはブロックする化合物と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を含む。本発明はまた、ＧＬＰ−１、インスリン、インスリン類似体、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、及びグルカゴンのうちの１つ以上を更に含む前述の組成物を含む。本発明は、本化合物と、ＧＬＰ−１、インスリン、インスリン類似体、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、及びグルカゴンのうちの１つ以上とが融合されている前述の組成物を更に含む。
【００１１】
本発明は、ＧＦＲＡＬ受容体を作動する単離された化合物を含む。本発明は、ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗し、阻害し、中和し、またはブロックする単離された化合物を更に含む。本発明はまた、前記化合物がペプチド、タンパク質、抗体またはその断片であるところの、前述の化合物も含む。本発明は、前記抗体またはその断片が、ＧＦＲＡＬ上のＧＤＦ１５と同じエピトープまたはアミノ酸領域に結合するところの、前述の化合物を更に含む。
【００１２】
本発明は、哺乳動物における糖尿病の治療方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を作動する有効量の化合物を投与することを含む、方法を含む。本発明は、哺乳動物における肥満症の治療方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を作動する有効量の化合物を投与することを含む、方法を含む。本発明はまた、哺乳動物における悪液質の治療方法であって、それを必要とする哺乳動物に、ＧＦＲＡＬ受容体を拮抗し、阻害し、中和し、またはブロックする有効量の化合物を投与することを含む、方法も含む。
【００１３】
本発明は、（ａ）不溶性ヒトＧＦＲＡＬ受容体のＧＤＦ１５結合可溶性断片であって、不溶性ヒトＧＦＲＡＬ受容体が、ヒトＧＤＦ１５に特異的に結合する、ＧＤＦ１５結合可溶性断片と、（ｂ）ヒト免疫グロブリンＩｇＧ重鎖の定常領域の該定常領域の第１のドメイン以外のドメインの全てと、を含むタンパク質を含み、該タンパク質は、ヒトＧＤＦ１５に特異的に結合する。本発明は、不溶性ヒトＧＦＲＡＬ受容体が、配列番号４を含むところの前述のタンパク質を更に含む。本発明はまた、タンパク質が、不溶性ヒトＧＦＲＡＬ受容体の細胞外領域と、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖の定常領域の、定常領域の第１のドメイン以外の全てのドメインとから本質的になるところの、前述のタンパク質も含む。
【００１４】
本発明の場合には、「抗体」とは、インタクトな抗体（完全または完全長Ｆｃ領域を含む）、実質的にインタクトな抗体、抗原結合領域、例えば、動物、ヒト化もしくはヒト抗体のＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片もしくはＦ（ａｂ’）２断片を含む抗体の一部もしくは断片を指す。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団に由来する抗体を指し、すなわち、一般には少量で存在する変異体などのモノクローナル抗体の産生中に生じ得る可能な変異体を除いて、この集団を構成する個々の抗体が同一であり、及び／または同じエピトープ（複数可）に結合することを指す。そのようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この標的結合ポリペプチド配列は、単一の標的結合ポリペプチド配列の複数のポリペプチド配列からの選択を含むプロセスによって得られたものである。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの特有のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列は、例えば、標的に対する親和性を改善するために、標的結合配列をヒト化するために、細胞培養中のその産物を改善するために、インビボでその免疫原性を低減させるために、多特異性抗体を作り出すためになど、更に変更することができること、そして、変更された標的結合配列を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であることを理解すべきである。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、これらが典型的に他の免疫グロブリンによって汚染されない点でも有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質の抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されないものとする。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、及びファージディスプレイ技術のうちの１つ以上が含まれる、当該技術分野において既知の様々な技法によって作製され得る。
【００１５】
本明細書のモノクローナル抗体は、具体的には、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、キメラ抗体では、重鎖及び／または軽鎖の一部は、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同であり、一方、鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来するか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の、ならびにそれらが所望の生物活性を呈する限りにおいて、そのような抗体の断片中の対応する配列と同一であるか、または相同である。キメラ抗体を作製する方法は、当該技術分野において既知である。
【００１６】
糖尿病及び／または肥満症の治療のための薬剤が、糖尿病及び／または肥満症の治療のために他の薬剤と組み合わされてもよいことは、当該技術分野において周知である。本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、ＧＬＰ−１、インスリン、インスリン類似体、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、及びグルカゴンが挙げられるが、これらに限定されない、糖尿病または肥満症のための他の有効な治療処置（複数可）と同時にまたは逐次的に共投与されてもよい。本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、単独で、または他の有効な治療処理（複数可）と組み合わせて、同時にまたは逐次的に投与され、その後、肥満症手術、例えば、胃バイパス手術または調節可能な胃バンド処置などの承認された医療処置が続くことができる。
【００１７】
ＧＤＦ１５と一群のＧＦＲα受容体関連タンパク質との相互作用は、共免疫沈降アッセイを通して試験される。３つの受容体、ＧＦＲα４、ＧＦＲＡＬ（配列番号４）及びＧａｓ１は、ＦＬＡＧ（商標）タグが付けられ、ＨＥＫ２９３細胞中で一時的に過剰発現される。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの登録商標であるＦＬＡＧ（商標）は、配列モチーフ  Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓを有する、タンパク質に付加され得るタグである。細胞溶解物を採取し、抗ＦＬＡＧ（商標）抗体による免疫沈降の前に、ＧＤＦ１５−タンデムＦｃ融合組換えタンパク質とインキュベートする。３つ全てのタンパク質が発現及び免疫沈殿されるが、ＧＤＦ１５（配列番号２）−タンデムＦｃは、ＧＦＲＡＬの存在下でのみ免疫共沈降しており（図１）、ＧＦＲＡＬとＧＤＦ１５との間の直接相互作用を実証している。
【００１８】
ＧＦＲＡＬとＧＤＦ１５との間の相互作用のためのより多くの証拠を提供するために、そして相互作用の特異性のより良好な理解を得るために、ＧＦＲＡＬ（配列番号４）の細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）の組換えタンパク質を発現させて、精製して、固相アッセイを展開し、相対結合親和性のより定量的な測定値を生成する。このアッセイでは、組換え未変性ＧＤＮＦタンパク質を、本アッセイにおいて陽性対照として利用しており、これは、ＧＦＲα１との最も強い相互作用を伴って、ＧＦＲα受容体に結合する（図２Ａ）。ＧＤＮＦとＧＦＲＡＬとの間のまたはＧａｓ１との間の相互作用は認められない。逆に、未変性ＧＤＦ１５（配列番号２）は、ＧＦＲＡＬのＥＣＤに強力に結合するが、その他の受容体のいずれも認識しない（図２Ｂ）。これらの結果は、ＧＦＲＡＬとＧＤＦ１５との間の相互作用が、選択的かつ特異的であることを実証している。
【００１９】
ＳＰＲ分光法を使用して、ＧＦＲＡＬ（配列番号４）とＧＤＦ１５（配列番号２）との間の親和性を評価する。ＧＦＲＡＬの精製された組換えＥＣＤを、アミンカップリングを介して、ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＣＭ５チップ上に固定化する。様々な濃度の組換えＧＤＦ１５タンパク質を移動相内に供給する（図３）。６つのデータセットが二価分析モデルに適合され、タンパク質の親和性（ＫＤ）を算出する。未変性組換えＧＤＦ１５とＧＦＲＡＬのＥＣＤとの間の親和性は、およそ０．７ｎＭである。
【００２０】
動物モデルを使用して、ＧＤＦ１５の生物学的機能がＧＦＲＡＬを必要とすることを確認する。ＧＦＲＡＬの全本体欠失を有するマウスを、この試験用に、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から取得する。ホモ接合ＧＦＲＡＬノックアウトマウスは生存可能であり、肉眼的異常を有さない。雄のホモ接合ノックアウトマウスは、野生型の性が一致する同腹子よりも体重が軽いが、雌のＫＯと野生型同腹子との間には体重の有意差は認められていない。
【００２１】
ＧＤＦ１５によるマウスの処置は、グルコースパラメータの改善を伴って、飼料摂取及び体重増加を抑制する。ＧＦＲＡＬがこれらの効果に必要とされるかどうかを決定するために、我々は、野生型及びホモ接合ノックアウトマウスの両方に、組換えタンデムＦｃ  ＧＤＦ１５（配列番号２）タンパク質を、２日毎に、０．１ｍｇ／ｋｇの用量で、１３日間注入する。野生型（「ＷＴ」）動物は、持続的な体重減少及び大幅に減退した飼料摂取を示した（図４）。我々はまた、グルコース恒常性におけるＧＤＦ１５の役割も検討する。ＧＤＦ１５は、ＷＴマウスにおいて、ベースライングルコースレベルの大幅な減少をもたらした（図４）。経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）中には、試験の終了時に、ＧＤＦ１５で処置したＷＴ動物は、ビヒクル処置群と比較して、減少したグルコース可動域を有した（図４）。
【００２２】
しかしながら、ＧＤＦ１５の体重、飼料摂取及びグルコースパラメータに及ぼす効果は、ＧＦＲＡＬノックアウトコホートには存在しない（図４）。ＧＤＦ１５の処置が、ＧＦＲＡＬノックアウトマウスに及ぼす効果を有さないことは、ＧＦＲＡＬがＧＤＦ１５の生物活性を媒介する内因性のＧＤＦ１５受容体であるという我々の仮説を裏付けた。このアプローチはまた、飼料摂取、体重増加及びグルコースに及ぼす効果を、ＧＦＲＡＬ受容体を有するＷＴ動物をＧＤＦ１５で処置した同じ種類の動物と比較して測定することによって、潜在的に治療効果のあるＧＦＲＡＬアゴニスト抗体またはタンパク質を特定するために使用されてもよい。
【００２３】
ＧＦＲＡＬ抗体を生成する。マウスＧＦＲＡＬに対する６つのマウスモノクローナル抗体を、配列番号１１の組換えタンパク質抗原に曝露されたマウスから形成されたマウスハイブリドーマを用いて生成する。結果として生じる６つの抗体を選択して、それらのＧＤＦ１５の結合を妨害する能力を試験する。２つの抗体、８Ａ２及び８Ｇ２は、ＧＤＦ１５とＧＦＲＡＬとの間の結合を用量依存的に阻害する（図５）。これら２つの抗体は、ヒト及びマウスのＧＦＲＡＬ受容体の両方に結合する。他の４つの抗体、７Ｆ１０、５Ｅ１、６Ｆ１０及び２Ｈ８は、マウスＧＦＲＡＬ受容体のみに結合する。
【００２４】
ヒト及びマウスＧＤＦ１５のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び６として以下に提示されている。これらの配列のプロドメインは、活性ＧＤＦ１５分子を生成するために、完全長タンパク質から切断されなければならない。活性ＧＤＦ１５分子のアミノ酸配列は、ヒトＧＤＦ１５については配列番号２として、マウスＧＤＦ１５については配列番号７として以下に提供されている。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】共免疫沈降アッセイは、ＧＦＲＡＬがＧＤＦ１５と相互作用することを示す。ＨＥＫ２９３細胞から調製した細胞溶解物を、ＦＬＡＧ（商標）タグ付けＧＦＲα４、ＧＦＲＡＬ、またはＧＡＳ１で一時的にトランスフェクトして、組換えタンデムＦｃ−ＧＤＦ１５タンパク質とインキュベートする。免疫沈降を抗ＦＬＡＧ（商標）抗体を用いて実施し、続いて、抗ＦＬＡＧ（商標）及び抗Ｆｃ抗体で免疫ブロッティングする。
【図２】固相結合アッセイは、（Ａ）組換えＧＤＮＦタンパク質が、ＧＦＲα１に最も強力に結合することと、（Ｂ）組換えＧＤＦ１５が、ＧＦＲＡＬのＥＣＤと特異的に相互作用することとを示す。
【図３】表面プラズモン共鳴（「ＳＰＲ」）センサグラムは、ＧＤＦ１５（配列番号２）とＧＦＲＡＬのＥＣＤ（配列番号４）との間の結合を示す。ＧＦＲＡＬの組換えＥＣＤと、（Ａ）未変性ＧＤＦ１５及び（Ｂ）タンデムＦｃ−ＧＤＦ１５との間の結合は、２５℃で試験する。バイオセンサーチップの応答を、時間の関数としてプロットする。
【図４】ＧＤＦ１５（配列番号７）のＧＦＲＡＬ受容体（配列番号９）を有するマウス及びそれを有さないマウスにおける効果を示す。効果は、１０週齢の野生型またはＧｆｒａｌ−／−（ＫＯ）マウス（野生型ではｎ＝９；ＫＯではｎ＝８）をＧＤＦ１５で通常の給餌方法での処置中の（Ａ）体重、（Ｂ）飼料摂取、及び（Ｃ）給餌時血中グルコース値で示し、（Ｄ）ＧＤＦ１５による処置から１３日後に雄マウスで行った経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）であり、（Ｅ〜Ｈ）は、同じそれぞれの試験を雌マウスで行った結果である。
【図５】抗体を、これらがＧＤＦ１５とＧＦＲＡＬとの間の相互作用をブロックするかどうかを決定するために試験する。ＧＤＦ１５（配列番号２）とＧＦＲＡＬ（配列番号９）との間の相互作用を、生成される異なるＧＦＲＡＬの存在下で、固相結合アッセイによって評価する。８Ａ２及び８Ｇ２は、用量依存的様式で結合を阻害することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
方法：
組換え未変性ＧＤＦ１５、ＧＤＮＦ、ＧＦＲα１、ＧＦＲα２、ＧＦＲα３、Ｇａｓ１タンパク質、抗ＧＤＦ１５及び抗ＧＤＮＦは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入する。タンデムＦｃ  ＧＤＦ１５は、Ｃ末端に、第１のＦｃ領域ならびに第２のＦｃ領域及び未変性のＧＤＦ１５（配列番号２）を含む。第１及び第２のＦｃ領域は、フレキシブルリンカーを通して連結され、隣接したポリペプチドを形成して、二量体化してＦｃダイマーを形成する。組換えタンデムＦｃ及びＧＦＲＡＬのＥＣＤは、Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎによって発現かつ精製される。ＧＦＲＡＬノックアウトマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃから取得され、ＧＦＲＡＬ遺伝子からのエクソン２及び３が、相同組換えを通して、ＬａｃＺ／Ｎｅｏカセットで置き換えられる。
【００２７】
免疫沈降及び免疫ブロット分析。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ修飾イーグル培地中に維持する。細胞を、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、発現ベクターでトランスフェクトする。細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えたＰＢＳ及び１％ＮＰ４０中に採取する。免疫沈降は、１μｇ／ｍｌのタンデムＦｃ  ＧＤＦ１５組換えタンパク質の存在下で、抗ＦＬＡＧ（商標）抗体結合ビーズを用いて行う。免疫ブロット法は、抗ＦＬＡＧ（商標）及び抗ヒトＦｃ抗体を用いて行う。
【００２８】
固相結合アッセイ。Ｎｕｎｃ９６−ウェルプレートを、０．２μｇ／ｍｌの組換えＧＦＲα受容体５０μｌで４℃にて一晩コーティングする。０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで洗浄後、１μｇ／ｍｌの組換えＧＤＮＦまたはＧＤＦ１５（配列番号２）タンパク質５０μｌを、室温で各ウェルに添加する。２時間後、抗ＧＤＮＦまたは抗ＧＤＦ１５抗体を添加し、プレートを更に１時間、室温でインキュベートする。プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合二次抗体を検出用に使用する。
【００２９】
ＳＰＲ分光法。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００機器を使用して、ＧＤＦ１５（配列番号２）のＧＦＲＡＬ（配列番号４）受容体への結合反応速度を測定する。測定値は２５℃で実施する。試料は、ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４中に溶解させる。ＧＦＲＡＬタンパク質を、アミンカップリングケミストリーを用いて、２４３反応単位（ＲＵ）のレベルでＣＭ５センサーチップのフローセル上に固定化する。複数サイクルを使用して結合を評価する。各サイクルは、以下の、１）約４５μｌのＧＤＦ１５を３０μｌ／分の流速で注入し、続いて５分間解離させるステップと、２）約１５μｌの１０ｍＭグリシン塩酸塩、ｐＨ１．５を用いて再生するステップと、からなる。各サイクルの会合及び解離速度を、ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して評価する。
【００３０】
動物及び治療。野生型及びＧＦＲＡＬホモ接合性ノックアウト同腹子を試験に使用する。組換えタンデムＦｃ  ＧＤＦ１５タンパク質またはビヒクル（ＰＢＳ）を０．１ｍｇ／ｋｇで２日毎に１回腹腔内（「ｉ．ｐ」）に注射する。指示された時間後、体重及び飼料摂取を測定する。尾静脈血液を収集し、血中グルコースをグルコース計で測定する。
【００３１】
経口グルコース負荷試験。マウスを、６時間絶食させた後にグルコース（２ｇ／ｋｇ）を経口投与し、グルコース値は、投与直前、グルコース負荷後１５、３０、６０及び１２０分に測定されるであろう。
配列
【００３２】
ヒトＧＤＦ１５  ＡＡ配列（配列番号１）
ＭＰＧＱＥＬＲＴＶＮＧＳＱＭＬＬＶＬＬＶＬＳＷＬＰＨＧＧＡＬＳＬＡＥＡＳＲＡＳＦＰＧＰＳＥＬＨＳＥＤＳＲＦＲＥＬＲＫＲＹＥＤＬＬＴＲＬＲＡＮＱＳＷＥＤＳＮＴＤＬＶＰＡＰＡＶＲＩＬＴＰＥＶＲＬＧＳＧＧＨＬＨＬＲＩＳＲＡＡＬＰＥＧＬＰＥＡＳＲＬＨＲＡＬＦＲＬＳＰＴＡＳＲＳＷＤＶＴＲＰＬＲＲＱＬＳＬＡＲＰＱＡＰＡＬＨＬＲＬＳＰＰＰＳＱＳＤＱＬＬＡＥＳＳＳＡＲＰＱＬＥＬＨＬＲＰＱＡＡＲＧＲＲＲＡＲＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ
【００３３】
ヒト活性ＧＤＦ１５  ＡＡ配列（配列番号２）
ＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ
【００３４】
ヒトＧＤＦ１５  ＤＮＡ配列（配列番号３）
ＡＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＡＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＣＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＴＧＧＧＧＧＣＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＧＣＡＡＧＴＴＴＣＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＴＧＣＡＣＴＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＣＧＡＧＡＧＴＴＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＴＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＧＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＴＡＣＴＣＡＣＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＧＣＴＣＴＧＴＴＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＴＣＡＡＧＧＴＣＧＴＧＧＧＡＣＧＴＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＣＧＴＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＣＡＡＧＡＣＣＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＧＡＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＧＣＡＧＴＣＧＧＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＧＴＣＣＧＣＡＣＧＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＧＣＡＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＧＧＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＣＧＣＡＡＣＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＣＴＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＴＧＣＴＧＣＣＧＴＣＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣＣＧＣＧＣＧＴＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＡＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＴＣＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＴＧＡＣＣＡＴＧＴＧＣＡＴＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡＡＣＡＴＧＣＡＣＧＣＧＣＡＧＡＴＣＡＡＧＡＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＣＡＴＴＣＡＡＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＧＴＴＡＧＣＣＡＡＡＧＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＡＴＡＴＧＡ
【００３５】
ヒトＧＦＲＡＬ受容体ＡＡ配列（配列番号４）
ＭＩＶＦＩＦＬＡＭＧＬＳＬＥＮＥＹＴＳＱＴＮＮＣＴＹＬＲＥＱＣＬＲＤＡＮＧＣＫＨＡＷＲＶＭＥＤＡＣＮＤＳＤＰＧＤＰＣＫＭＲＮＳＳＹＣＮＬＳＩＱＹＬＶＥＳＮＦＱＦＫＥＣＬＣＴＤＤＦＹＣＴＶＮＫＬＬＧＫＫＣＩＮＫＳＤＮＶＫＥＤＫＦＫＷＮＬＴＴＲＳＨＨＧＦＫＧＭＷＳＣＬＥＶＡＥＡＣＶＧＤＶＶＣＮＡＱＬＡＳＹＬＫＡＣＳＡＮＧＮＰＣＤＬＫＱＣＱＡＡＩＲＦＦＹＱＮＩＰＦＮＩＡＱＭＬＡＦＣＤＣＡＱＳＤＩＰＣＱＱＳＫＥＡＬＨＳＫＴＣＡＶＮＭＶＰＰＰＴＣＬＳＶＩＲＳＣＱＮＤＥＬＣＲＲＨＹＲＴＦＱＳＫＣＷＱＲＶＴＲＫＣＨＥＤＥＮＣＩＳＴＬＳＫＱＤＬＴＣＳＧＳＤＤＣＫＡＡＹＩＤＩＬＧＴＶＬＱＶＱＣＴＣＲＴＩＴＱＳＥＥＳＬＣＫＩＦＱＨＭＬＨＲＫＳＣＦＮＹＰＴＬＳＮＶＫＧＭＡＬＹＴＲＫＨＡＮＫＩＴＬＴＧＦＨＳＰＦＮＧＥＶＩＹＡＡＭＣＭＴＶＴＣＧＩＬＬＬＶＭＶＫＬＲＴＳＲＩＳＳＫＡＲＤＰＳＳＩＱＩＰＧＥＬ
【００３６】
ヒトＧＦＲＡＬ受容体ＤＮＡ配列（配列番号５）
ＡＴＧＡＴＡＧＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＡＴＧＧＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡＴＡＣＡＣＴＴＣＣＣＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＴＴＧＣＡＣＡＴＡＴＴＴＡＡＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＴＡＣＧＴＧＡＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＴＡＡＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＧＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＣＴＧＴＡＡＣＣＴＧＡＧＴＡＴＣＣＡＧＴＡＣＴＴＡＧＴＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＴＴＧＣＡＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＴＡＴＴＧＴＡＣＴＧＴＧＡＡＣＡＡＡＣＴＧＣＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＡＴＡＡＡＴＣＡＧＡＴＡＡＣＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＴＡＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＣＴＡＡＣＴＡＣＡＣＧＴＴＣＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＧＡＴＧＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＧＴＡＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＴＡＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＡＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＴＴＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＣＣＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧＣＡＡＧＡＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡＣＣＣＣＣＴＡＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＴＧＴＡＡＴＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＡＴＴＴＣＡＧＴＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＧＴＧＴＧＡＣＴＡＧＡＡＡＧＴＧＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＴＴＡＧＣＡＣＣＴＴＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＣＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＧＡＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＡＴＡＧＡＴＡＴＣＣＴＴＧＧＧＡＣＧＧＴＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＴＧＴＡＣＣＴＧＴＡＧＧＡＣＣＡＴＴＡＣＡＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＣＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＧＴＴＴＣＡＡＴＴＡＴＣＣＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＡＡＴＧＴＣＡＡＡＧＧＣＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＴＡＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＣＡＣＴＴＴＡＡＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＴＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＧＴＡＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＴＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＧＡＡＴＣＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＡＴＣＡＡＧＴＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＴＣＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＣＣＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＣＴＧＡ
【００３７】
マウスＧＤＦ１５  ＡＡ配列（配列番号６）
ＭＡＰＰＡＬＱＡＱＰＰＧＧＳＱＬＲＦＬＬＦＬＬＬＬＬＬＬＬＳＷＰＳＱＧＤＡＬＡＭＰＥＱＲＰＳＧＰＥＳＱＬＮＡＤＥＬＲＧＲＦＱＤＬＬＳＲＬＨＡＮＱＳＲＥＤＳＮＳＥＰＳＰＤＰＡＶＲＩＬＳＰＥＶＲＬＧＳＨＧＱＬＬＬＲＶＮＲＡＳＬＳＱＧＬＰＥＡＹＲＶＨＲＡＬＬＬＬＴＰＴＡＲＰＷＤＩＴＲＰＬＫＲＡＬＳＬＲＧＰＲＡＰＡＬＲＬＲＬＴＰＰＰＤＬＡＭＬＰＳＧＧＴＱＬＥＬＲＬＲＶＡＡＧＲＧＲＲＳＡＨＡＨＰＲＤＳＣＰＬＧＰＧＲＣＣＨＬＥＴＶＱＡＴＬＥＤＬＧＷＳＤＷＶＬＳＰＲＱＬＱＬＳＭＣＶＧＥＣＰＨＬＹＲＳＡＮＴＨＡＱＩＫＡＲＬＨＧＬＱＰＤＫＶＰＡＰＣＣＶＰＳＳＹＴＰＶＶＬＭＨＲＴＤＳＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＶＡＲＧＣＨＣＡ
【００３８】
マウス活性ＧＤＦ１５  ＡＡ配列（配列番号７）
ＡＨＰＲＤＳＣＰＬＧＰＧＲＣＣＨＬＥＴＶＱＡＴＬＥＤＬＧＷＳＤＷＶＬＳＰＲＱＬＱＬＳＭＣＶＧＥＣＰＨＬＹＲＳＡＮＴＨＡＱＩＫＡＲＬＨＧＬＱＰＤＫＶＰＡＰＣＣＶＰＳＳＹＴＰＶＶＬＭＨＲＴＤＳＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＶＡＲＧＣＨＣＡ
【００３９】
マウスＧＤＦ１５  ＤＮＡ配列（配列番号８）
ＡＴＧＧＣＣＣＣＧＣＣＣＧＣＧＣＴＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＡＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＡＡＴＧＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＴＣＡＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＧＣＴＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＧＡＧＡＧＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＧＧＡＴＡＣＴＣＡＧＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴＣＣＧＣＧＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＣＴＧＡＧＴＣＡＧＧＧＴＣＴＣＣＣＣＧＡＡＧＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＣＡＣＣＧＡＧＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＧＣＣＧＡＣＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＣＧＴＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＡＣＣＣＣＧＴＧＣＴＣＣＣＧＣＡＴＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＧＣＴＴＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＧＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＡＧＡＧＡＣＴＣＧＴＧＣＣＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣＡＧＧＣＡＡＣＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＧＡＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＴＣＣＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＧＴＡＴＣＧＣＴＣＣＧＣＧＡＡＣＡＣＧＣＡＴＧＣＧＣＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＡＣＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＡＧＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＴＡＴＧＣＡＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＣＴＴＡＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＧＣＴＴＧＡ
【００４０】
マウスＧＦＲＡＬ受容体ＡＡ配列（配列番号９）
ＭＬＶＦＩＦＬＡＶＴＬＳＳＥＮＥＳＳＳＱＴＮＤＣＡＨＬＩＱＫＣＬＩＤＡＮＧＣＥＱＳＷＲＳＭＥＤＴＣＬＴＰＧＤＳＣＫＩＮＮＳＬＨＣＮＬＳＩＱＡＬＶＥＫＮＦＱＦＫＥＣＬＣＭＤＤＬＨＣＴＶＮＫＬＦＧＫＫＣＴＮＫＴＤＮＭＥＫＤＮＫＤＫＷＮＬＴＴＴＰＦＹＨＧＦＫＱＭＱＳＣＬＥＶＴＥＡＣＶＧＤＶＶＣＮＡＱＬＡＬＹＬＫＡＣＳＡＮＧＮＬＣＤＶＫＨＣＱＡＡＩＲＦＦＹＱＮＭＰＦＮＴＡＱＭＬＡＦＣＤＣＡＱＳＤＩＰＣＱＱＳＫＥＴＬＨＳＫＰＣＡＬＮＩＶＰＰＰＴＣＬＳＶＩＨＴＣＲＮＤＥＬＣＲＴＨＹＲＴＦＱＴＥＣＷＰＨＩＴＧＫＣＨＥＤＥＴＣＩＳＭＬＧＫＱＤＬＴＣＳＧＳＥＳＣＲＡＡＦＬＧＴＦＧＴＶＬＱＶＰＣＡＣＲＧＶＴＱＡＥＥＨＶＣＭＩＦＱＨＭＬＨＳＫＳＣＦＮＹＰＴＰＮＶＫＤＩＳＳＹＥＫＫＮＳＫＥＩＴＬＴＧＦＮＳＦＦＮＧＥＬＬＹＶＶＶＣＭＡＶＴＣＧＩＬＦＬＶＭＬＫＬＲＩＱＳＥＫＲＤＰＳＳＩＥＩＡＧＧＶＩＩＱ
【００４１】
マウスＧＦＲＡＬ受容体ＤＮＡ配列（配列番号１０）
ＡＴＧＣＴＡＧＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＡＣＧＴＴＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＴＴＧＴＧＣＡＣＡＴＴＴＡＡＴＡＣＡＧＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＡＧＴＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＴＧＧＡＡＧＡＣＡＣＣＴＧＣＣＴＴＡＣＴＣＣＡＧＧＴＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＡＡＴＡＡＴＴＣＡＣＴＡＣＡＴＴＧＴＡＡＣＣＴＧＡＧＴＡＴＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＴＴＧＴＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＴＡＣＡＧＴＡＡＡＣＡＡＡＣＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＴＧＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＡＣＡＧＡＴＡＡＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＡＡＴＧＧＡＡＴＣＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡＴＣＡＴＧＧＡＴＴＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＡＧＴＣＴＴＧＴＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＴＧＴＡＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＡＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣＴＴＴＡＣＣＴＴＡＡＡＧＣＡＴＧＣＴＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＡＡＴＣＴＧＴＧＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＡＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＡＴＧＣＣＴＴＴＴＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＴＴＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＡＴＡＴＡＣＣＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧＣＡＡＧＣＣＡＴＧＴＧＣＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＧＴＴＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＴＧＴＡＡＴＴＣＡＣＡＣＴＴＧＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＧＡＣＡＣＡＣＴＡＣＣＧＡＡＣＡＴＴＣＣＡＧＡＣＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＴＡＡＣＴＧＧＧＡＡＧＴＧＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＡＣＣＴＧＣＡＴＴＡＧＣＡＴＧＴＴＡＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＡＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＣＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＧＧＧＧＣＧＴＴＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＣＧＴＧＴＧＣＡＴＧＡＴＴＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＣＡＴＡＧＣＡＡＡＴＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＴＴＡＣＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＴＧＴＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＴＣＣＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＴＴＣＡＡＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＣＣＴＧＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＣＡＡＧＴＴＡＡＧＧＡＴＡＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＴＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＧＡＡＡＴＡＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＴＣＡＴＴＣＡＧＴＧＡ
【００４２】
ＧＦＲＡＬに対するマウス抗体を生成するための組換えタンパク質抗原（配列番号１１）
ＤＨＨＨＨＨＨＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＫＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＶＰＶＬＤＳＤＧＳＦＲＬＡＳＹＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＲＡＱＴＮＤＣＡＨＬＩＱＫＣＬＩＤＡＮＧＣＥＱＳＷＲＳＭＥＤＴＣＬＴＰＧＤＳＣＫＩＮＮＳＬＨＣＮＬＳＩＱＡＬＶＥＫＮＦＱＦＫＥＣＬＣＭＤＤＬＨＣＴＶＮＫＬＦＧＫＫＣＴＮＫＴＤＮＭＥＫＤＮＫＤＫＷＮＬＴＴＴＰＦＹＨＧＦＫＱＭＱＳＣＬＥＶＴＥＡＣＶＧＤＶＶＣＮＡＱＬＡＬＹＬＫＡＣＳＡＮＧＮＬＣＤＶＫＨＣＱＡＡＩＲＦＦＹＱＮＭＰＦＮＴＡＱＭＬＡＦＣＤＣＡＱＳＤＩＰＣＱＱＳＫＥＴＬＨＳＫＰＣＡＬＮＩＶＰＰＰＴＣＬＳＶＩＨＴＣＲＮＤＥＬＣＲＴＨＹＲＴＦＱＴＥＣＷＰＨＩＴＧＫＣＨＥＤＥＴＣＩＳＭＬＧＫＱＤＬＴＣＳＧＳＥＳＣＲＡＡＦＬＧＴＦＧＴＶＬＱＶＰＣＡＣＲＧＶＴＱＡＥＥＨＶＣＭＩＦＱＨＭＬＨＳＫＳＣＦＮＹＰＴＰＮＶＫＤＩＳＳＹＥＫＫＮＳＫＥ
【図１】
2019510739.tif 000002
【図２Ａ】
2019510739.tif 000003
【図２Ｂ】
2019510739.tif 000004
【図３】
2019510739.tif 000005
【図４Ａ】
2019510739.tif 000006
【図４Ｂ】
2019510739.tif 000007
【図４Ｃ】
2019510739.tif 000008
【図４Ｄ】
2019510739.tif 000009
【図４Ｅ】
2019510739.tif 000010
【図４Ｆ】
2019510739.tif 000011
【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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