(57)【要約】  トリテルペノイド誘導体、及び、式（Ｉ）の前記トリテルペノイド誘導体を含む組成物が記載され、Ｒ＝−Ｃ（Ｏ）ＮＨＯＨである。前記トリテルペノイド及び組成物は、ＰＨＤ２を結合し、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αタンパク質を安定させ、異種細胞型においてＨＩＦ経路を活性化し、ヒト内皮血管細胞に血管新生を誘発させ、インビトロ及びインビボで神経保護的活性を示し、抗糖尿病活性を示し、インビボで脂質のレベルを低下させ、及びインビボでエリスロポエチンの血漿レベルを増大させる能力を示す。記載されるトリテルペノイド誘導体は選択的な様式でも作用し、且つ、天然のトリテルペノイド前駆体の既知の活性である、Ｎｒｆ２活性化、ＮＦ−κＢ阻害、ＳＴＡＴ３阻害、及びＴＧＲ５活性化を誘発しない。前記トリテルペノイド誘導体は、脳卒中、脳性麻痺、外傷、及び神経変性疾患などのＨＩＦ活性化に反応する疾病及び疾患；及び、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺障害、糖尿病性及び慢性の創傷、臓器移植、急性腎臓損傷、動脈の疾患の処置に役立つ。【化１】2019519464.tif 000077【選択図】なし
2019519464.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体、或いはその立体異性体、薬学的に許容可能な塩、又はその薬学的に許容可能な溶媒和物であって、
【化１】
2019519464.tif 000060
式中、独立して、
Ａ−Ｂは、一重の炭素炭素結合又は二重の炭素炭素結合から選択され；
Ｂは、メチレン（−ＣＨ２−）、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、又はヒドロキシル化されたオレフィン炭素［−Ｃ（ＯＨ）＝］から選択され；
Ｂ−Ｃは、一重の炭素炭素結合又は二重の炭素炭素結合から選択され；或いは、１以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり、ここで前記ヘテロ原子の少なくとも１つは窒素であり；及び、ここで、前記複素環は１つの窒素と１つの酸素とを含む五員環であり；
Ｃは、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、アシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、カルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］、オキシム［−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−］、又はヒドラゾン［−Ｃ（＝Ｎ−ＮＨ２）−］から選択され、ここでＲ’はメチルであり；
Ｄ−Ｅは、一重又は二重の炭素炭素結合であり；
Ｆは、Ｆ１ａ、Ｆ２ａ、又はＦ３ａから選択され；
【化２】
2019519464.tif 000061
Ｇは、メチレン（−ＣＨ２−）又はカルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］から選択され；及び
Ｒはヒドロキサメート基（−ＣＯＮＨＯＨ）であり；
及び、ここで、
Ｃがアシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］であるとき、式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体は
【化３】
2019519464.tif 000062
であり；
Ｂがメチレン（−ＣＨ２−）であるとき、Ｃはヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］であり、Ｄ−Ｅは二重炭素炭素結合であり、Ｇはメチレン（−ＣＨ２−）であり、Ｒはヒドロキサメート（−ＣＯＮＨＯＨ）であり、ＦはＦ３ａであり；
Ｂがメチレン（−ＣＨ２−）であるとき、Ｃはヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］であり、Ｄ−Ｅは一重の炭素炭素結合であり、Ｇはメチレン（−ＣＨ２−）であり、Ｒはヒドロキサメート（−ＣＯＮＨＯＨ）であり、ＦはＦ１ａ又はＦ２ａから選択され；
Ｂがメチレン（−ＣＨ２−）であるとき、Ｃはオキシム［−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−］であり、Ｄ−Ｅは二重炭素炭素結合であり、Ｇはメチレン（−ＣＨ２−）であり、Ｒはヒドロキサメート（−ＣＯＮＨＯＨ）であり、ＦはＦ１ａ又はＦ３ａから選択される
ことを特徴とする式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体。
【請求項２】
前記トリテルペン誘導体は以下から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体。
【化４−１】
2019519464.tif 000063
【化４−２】
2019519464.tif 000064
【請求項３】
（ＸＶＩＩＩ）又は（ＸＩＸ）から選択される、請求項１又は２に記載の化合物の合成における中間化合物。
【化５】
2019519464.tif 000065
【請求項４】
薬物として使用するための、請求項１又は２に記載の式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体。
【請求項５】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患の処置に使用するための、請求項１又は２に記載の式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体。
【請求項６】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患は、脳卒中、脳性麻痺、外傷、及び神経変性疾患から選択される、ことを特徴とする請求項５記載の式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体。
【請求項７】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺障害、糖尿病性及び慢性の創傷、臓器移植、急性腎臓損傷、又は動脈の疾患から選択される、ことを特徴とする請求項５記載の式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体。
【請求項８】
第１の有効成分として請求項１又は２に記載の式（Ｉａ）の少なくとも１つのトリテルペン誘導体と、少なくとも１つの賦形剤又は担体とを含み、随意に少なくとも１つの第２の有効成分を更に含む、医薬組成物。
【請求項９】
薬物として使用するための請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患の処置に使用するための、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患は、脳卒中、脳性麻痺、外傷、及び神経変性疾患から選択される、ことを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺障害、糖尿病性及び慢性の創傷、臓器移植、急性腎臓損傷、又は動脈の疾患から選択される、ことを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患の処置に使用するための、式（Ｉ）のトリテルペン誘導体、或いはその立体異性体、薬学的に許容可能な塩、又は薬学的に許容可能な溶媒和物であって、
【化６】
2019519464.tif 000066
式中、独立して、
Ａ−Ｂは、一重の炭素炭素結合又は二重の炭素炭素結合から選択され；
Ｂは、メチレン（−ＣＨ２−）、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、又はヒドロキシル化されたオレフィン炭素［−Ｃ（ＯＨ）＝］から選択され；
Ｂ−Ｃは、一重の炭素炭素結合又は二重の炭素炭素結合から選択され；或いは、１以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり、ここで前記ヘテロ原子の少なくとも１つは窒素であり；及び、ここで、前記複素環は１つの窒素と１つの酸素とを含む五員環であり；
Ｃは、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、アシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、カルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］、オキシム［−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−］、又はヒドラゾン［−Ｃ（＝Ｎ−ＮＨ２）−］から選択され、ここでＲ’はメチルであり；
Ｄ−Ｅは、一重又は二重の炭素炭素結合であり；
Ｆは、Ｆ１、Ｆ２、又はＦ３から選択され；
【化７】
2019519464.tif 000067
Ｇは、メチレン（−ＣＨ２−）又はカルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］から選択され；及び
Ｒはヒドロキサメート基（−ＣＯＮＨＯＨ）である
ことを特徴とする式（Ｉ）のトリテルペン誘導体。
【請求項１４】
前記トリテルペン誘導体は、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、又は（ＸＶ）から選択される、ことを特徴とする使用のための請求項１３に記載の式（Ｉ）のトリテルペン誘導体。
【化８−１】
2019519464.tif 000068
【化８−２】
2019519464.tif 000069
【化８−３】
2019519464.tif 000070
【化８−４】
2019519464.tif 000071
【請求項１５】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する前記疾病又は疾患は、脳卒中、脳性麻痺１４、外傷、及び神経変性疾患から選択される、ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の式（Ｉ）のトリテルペン誘導体。
【請求項１６】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する前記疾病又は疾患は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺障害、糖尿病性及び慢性の創傷、臓器移植、急性腎臓損傷、又は動脈の疾患から選択される、ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の式（Ｉ）のトリテルペン誘導体。
【請求項１７】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患の処置に使用するための、少なくとも１つのトリテルペン誘導体、或いはその立体異性体、薬学的に許容可能な塩、又は薬学的に許容可能な溶媒和物と、少なくとも１つの賦形剤又は担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのトリテルペン誘導体は以下から選択される、ことを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。
【化９−１】
2019519464.tif 000072
【化９−２】
2019519464.tif 000073
【化９−３】
2019519464.tif 000074
【化９−４】
2019519464.tif 000075
【請求項１９】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する前記疾病又は疾患は、脳卒中、脳性麻痺、外傷、及び神経変性疾患から選択される、ことを特徴とする請求項１７又は１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する前記疾病又は疾患は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺障害、糖尿病性及び慢性の創傷、臓器移植、急性腎臓損傷、又は動脈の疾患から選択される、ことを特徴とする請求項１７又は１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患は独立して、糖尿病、高脂血症、及び高トリグリセリド血症から選択される、ことを特徴とする請求項５記載の式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体。
【請求項２２】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患は独立して、糖尿病、高脂血症、及び高トリグリセリド血症から選択される、ことを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患は独立して、糖尿病、高脂血症、及び高トリグリセリド血症から選択される、ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の式（Ｉ）のトリテルペン誘導体。
【請求項２４】
ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患は独立して、糖尿病、高脂血症、及び高トリグリセリド血症から選択される、ことを特徴とする請求項１７又は１８に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記トリテルペン誘導体は式（Ｉｂ）のトリテルペン誘導体である、ことを特徴とする請求項１３に記載の式（Ｉ）のトリテルペン誘導体。
【化１０】
2019519464.tif 000076
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なトリテルペノイド誘導体と上記化合物の合成に関する。さらに、本発明は、薬物として、および、治療におけるその使用に関し、とりわけ、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αのタンパク質の安定化剤、ＨＩＦ−１経路のアクチベーターとして、およびＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２の安定化に対する疾患と疾病を処置する際のその使用に関する。本発明は、上記化合物を含む医薬組成物と、上記化合物で疾患を処置する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞はその好気性代謝とエネルギー生産を実行するために適切な酸素ホメオスタシスを維持する必要がある。低酸素症誘導可能な因子（ＨＩＦ）−１の発見以来、ＨＩＦ転写因子による酸素感知の根底にあるシグナル伝達メカニズムは、生物学的な文脈で広範に研究されてきた（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｄｏｘ  Ｒｅｐ．１９９６  Ａｐｒ．；２（２）：８９−９６）。酸素に不安定なαと構成的に発現されたβのサブユニットからなるＨＩＦは、赤血球形成、血管新生、エネルギー代謝、虚血、および炎症を含む多様な細胞のプロセスに関与する多くの遺伝子の転写を引き起こす（Ｓｅｍｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４  Ｓｅｐｔ  ２３；２６９（３８）：２３７３５７−６３  ａｎｄ  Ｅｌｔｚｓｃｈｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１４  Ｎｏｖ；１３（１１）：８５２−６９）。ＨＩＦは、ほぼ例外なく２つの形態：ＨＩＦ−１とＨＩＦ−２で細胞中に存在する。これらは、構成的に生成された非常に豊富なＨＩＦ−βサブユニットと、ＨＩＦ−１とＨＩＦ−２の場合には４８％の配列相同性を共有するそれぞれＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２αのパートナーのいずれかとからなるヘテロ二量体転写因子である（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＭＨ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１３  Ｄｅｃ  １２；５６（２３）：９３６９−４０２５）。ＨＩＦ−１はしばしば低酸素症に対する代謝反応と血管反応に関連付けられるが、ＨＩＦ−２は血管系に関連付けられるが、ある程度は赤血球形成にも関連付けられる（Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ  ＰＪ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００７  Ａｐｒ；ｌ  １７（４）：８６２−５）。
【０００３】
酸素がＨＩＦ−１を制御するメカニズムは、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）の同定によって明らかにされてきた（Ｂｒｕｉｃｋ  ａｎｄ  ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１  Ｎｏｖ  ９；２９４（５５４５）：１３３７−４０）。酸素正常状態では、ＰＨＤは、ＨＩＦ−１αの酸素依存分解（ＯＤＤ）ドメインのプロリン残留物をヒドロキシル化し、それによって、フォンヒッペル・リンダウタンパク質（ｐＶＨＬ）−ｅｌｏｎｇｉｎＢ−ｅｌｏｎｇｉｎＣへの結合を可能にし、およそ５分の半減期の活性なユビキチン化と分解をもたらす。他方では、低酸素下での酸素欠乏はＰＨＤによるＨＩＦ−１αのヒドロキシル化を損ない、結果として、ＨＩＦ−１αの減少、ターンオーバー、およびその後の標的遺伝子転写の誘発をもたらす（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＭＨ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１３  Ｄｅｃ  １２；５６（２３）：９３６９−４０２５）。ＰＨＤは、その触媒活性のために酸素、鉄、および２−オキシグルタラート（２−ＯＧ）を必要とするジオキシゲナーゼ酵素のファミリーに属する。生理的な酸素濃度よりも約２〜１０倍高い酸素への低親和性により、酵素を酸素センサーとして作用させる。３つのＰＨＤアイソフォーム（ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、およびＰＨＤ３）が同定されており、こうした基質は極めて多様かつアイソフォーム特異的であることが知られている（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＭＨ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ２０１３  Ｄｅｃ  １２；５６（２３）：９３６９−４０２５、および、Ｅｌｔｚｓｃｈｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１４  Ｎｏｖ；１３（１１）：８５２−６９）
【０００４】
ＰＨＤ２はＨＩＦ経路の調節に決定的であると考えられている。具体的には、血管新生の増強と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）−Ａとエリスロポエチン（ＥＰＯ）のレベルの増加が、ＰＨＤ２のコンディショナルノックアウトで観察された（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００７  Ａｕｇ．  １４；  １１６（７）：７７４−８１）。こうした観察は、ＨＩＦがＥＰＯ放出を増強し、付随的に赤血球形成を増加させたという以前の報告に加えて、ＰＨＤの調節によるＨＩＦの活性化は貧血と虚血に関連する疾患の患者にとって有益なことがあるということを示唆している。これに応じて、ＰＨＤ活性を阻害することによりＨＩＦ経路を活性化する薬理学的な手法は、ＨＩＦ活性化から治療が利益を得ることがある全身性および局所的な疾患を処置するために追求されてきた（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＭＨ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１３  Ｄｅｃ  １２；５６（２３）：９３６９−４０２５  ａｎｄ；  Ｅｌｔｚｓｃｈｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１４  Ｎｏｖ；  １３（１１）：８５２−６９）。
【０００５】
低酸素症と炎症は多くのレベルで密接に関連しており、多くのヒトの疾患において機能的な役割を有している。実際に、広範な臨床症状は、低酸素症または虚血により引き起こされた炎症、あるいは炎症に関連する低酸素症を特徴とする。増え続ける証拠は、炎症性病変がおそらく代謝の増加と酸素供給の減少の結果である組織低酸素症の発生を特徴とすることを示している。例えば、これは、潰瘍性大腸炎とクローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に苦しむ患者で観察された腸の炎症の間の症例である（Ｋａｒｈａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００４  Ｏｃｔ；１１４（８）：１０９８−１０６）。こうした炎症性の低酸素症は代謝性の需要と供給の比率の劇的な変化によって引き起こされる。新たな証拠は、ＰＨＤの同時の阻害とその後の組織低酸素症中のＨＩＦの安定化が、低酸素症により引き起こされる炎症を平衡させ、かつ、正常な細胞の機能を回復させるための内因性の適応反応として機能することがあることを示している。
【０００６】
脳低酸素と神経変性プロセスなどの脳損傷による神経損傷は、炎症性変化を含む複雑なプロセスである。ＨＩＦ−１αの安定化とトランス活性化を媒介とする生存または細胞死に関連する共通のメカニズムの活性化がこれらの疾病で観察されてきた。ＰＨＤは、ＨＩＦ−１αの酸素依存性分解のためのゲートキーパーであり、細胞の代謝の統合センサーとしても機能する（Ａｒａｇｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２００９  Ｊａｎ  ７；９（１）：１１−２２）。低酸素プレコンディショニング（ＨＰ）がその後のより深刻な酸素欠乏症を防ぐという現象はおよそ２０年前に発見された。その後、ＨＰの効果は、急性低酸素状態のインビトロおよびインビボのモデルにおいて集中的に研究されてきた。正確なメカニズムは完全には開示されていないが、根本的な分子のメカニズムが仮定されてきた。例えば、ＨＰは、重篤な酸素欠乏下における細胞生存の能力を増加させるＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αの安定化を含む多種多様な内因性の保護的なメディエータを活性化する（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ＣＮＳ，  Ａｎｏｘｉａ，  Ｄｒ．  Ｐａｍｅｌａ  Ｐａｄｉｌｌａ  （Ｅｄ．），  ＩｎＴｅｃｈ，  ＤＯＩ：  １０．５７７２／２７６２１）。低酸素症が主として生じる脳疾患は、卒中、脳性麻痺、外傷などを含む。これまでのところ、こうした疾患から脳を保護する効果的な医薬品は存在しない。ＨＰのメカニズムの開示は上記疾患の予防のための創薬に貢献するであろう。低酸素症に対する多くの細胞の適応反応は、ＨＩＦ−１αを媒介とし、ＨＰによるこの因子の活性化は、深刻な酸素欠乏症あるいは虚血に耐える能力を増強する。一方で、ＨＩＦ−１の標的遺伝子は、赤血球形成の調節におけるＥＰＯ、血管新生における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、グルコース取り込みにおけるグルコース伝達物質（ＧＬＵＴ）、および嫌気的解糖の解糖酵素などのエネルギー恒常性に関与している（Ｓｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｏ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２０１３  Ｓｅｐ；  ６２：２３−３６）。さらに、オリゴデンドロサイトにおけるＨＩＦ−１αの活性化は、オリゴデンドロサイト中で興奮毒性に対する防御を与えるＥＰＯを引き起こすことが報告されている（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２０１０  Ｊｕｌ  １４；３０（２８）：９６２１−３０）。この意味において、多発性硬化症、卒中、および外傷性脳損傷などのいくつかの疾患におけるＥＰＯの利点も実証されている（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  ２０１４  Ｓｅｐ；  １２１（３）：６５３−６４；  Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｏｋｅ  ２００９  Ｄｅｃ；４０（１２）：  ｅ６４７−５６；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２００４  Ｄｅｃ；５６（６）：７６７−７７）。加えて、デスフェリオキサミン（ＤＦＸ）などの低酸素擬態薬（つまり、低酸素症が生じると生成される生体応答と同じ生体応答をもたらす薬剤）は、３−ニトロピオン（ｎｉｔｒｏｐｏｉｏｎｉｃ）酸によって引き起こされた神経細胞の発作を保護する（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ２００５  Ｍａｙ；９６（３）：５１３−２５）。したがって、低酸素擬態性の小分子によるＰＨＤ阻害は、卒中、脳性麻痺、外傷、および多発性硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、ならびにパーキンソン病などの神経変性疾患といった、低酸素症が存在する疾病の臨床管理のための興味深い戦略あるいは神経保護治療の開発を表す。
【０００７】
（一般に非特異的なＰＤＨ２阻害剤を使用する）薬理学的試験の実質的な数は、動物モデルで行われており、少数の臨床研究が行なわれてきた。実際に、いくつかの会社が貧血に関するＰＨＤ阻害剤の発見と開発に携わっており、ＩＢＤ、心筋虚血再灌流障害、急性肺障害、臓器移植、急性腎臓損傷、および動脈の疾患などの他の兆候は、新規な治療的アプローチとして多くの研究者によってＰＨＤ阻害剤が盛んに探究されている領域である（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＭＨ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１３  Ｄｅｃ  １２；５６（２３）：９３６９−４０２５  ａｎｄ；  Ｅｌｔｚｓｃｈｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１４  Ｎｏｖ；  １３（１１）：８５２−６９）。
【０００８】
ＨＩＦ発現の制御因子としてのＨＩＦ選択性のＰＨＤの元々の記載は、ＰＨＤベースの分子ツールと治療の開発のための鋳型を提供した。２−ＯＧアナログによるＰＨＤの薬理学的な不活性化は、ＨＩＦ−１αを安定させるのに十分であるが、この作用は、個々のＰＨＤアイソフォームに対して非特異的であり、インビトロ研究では、ＨＩＦ１αのＯＤＤ配列がＰＨＤ２によって最も効率的にヒドロキシル化されることが示されている（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＭＨ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１３  Ｄｅｃ  １２；５６（２３）：９３６９−４０２５）。こうした観察は、酵素修飾就職小分子阻害剤の識別に対する大きな関心を集めた。実際に、以下を含む複数のＰＨＤ阻害剤クラスが記載されている：ＤＦＸ、ヒドララジン、ＡＫＢ−４９２４、ＦＧ−２２２９、ＴＭ−６００８、およびｌ−ミモシンなどの鉄キレート化剤；ＭＬＮ４９２４などのＣＵＬ２脱ＮＥＤＤ化剤（ｄｅｎｅｄｄｙｌａｔｏｒｓ）；キシメチルオキサリルグリシン（ｘｉｍｅｔｈｙｌｏｘａｌｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）とＮ−オキサリル−ｄ−フェニルアラニンなどの２−ＯＧ模倣薬；ピラゾロピリジン、８−ヒドロキシキノリン、化合物Ａ、ＦＧ−４４９７、およびＴＭ−６０８９などのＰＨＤ活性部位遮断薬；ならびに、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、およびＣｕ２＋などのＦｅ２＋置換基。これらの化合物の作用機序は、必須Ｆｅ２＋イオンを抱える触媒領域への補助基質２−ＯＧの結合が、酵素ＰＨＤ２活性に必要不可欠であるという観察に基づいている。したがって、Ｎ−オキサリルグリシンあるいはその前駆体ＤＭＯＧなどの２−ＯＧを構造上模倣する化合物は、補助基質の侵入を阻むことにより、ＰＨＤ２を阻害する（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＭＨ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１３  Ｄｅｃ  １２；５６（２３）：９３６９−４０２５  ａｎｄ；  Ｅｌｔｚｓｃｈｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１４  Ｎｏｖ；  １３（１１）：８５２−６９）。
【０００９】
ＤＦＸは、急性の鉄中毒の治療および輸血依存性貧血による慢性の鉄過剰の治療のための臨床的に使用される金属キレート化剤として作用するヒドロキサム酸誘導体である。しかしながら、ＤＦＸは慢性疾患の処置については指摘されておらず、主として腎臓は薬と鉄キレートを排泄するため、ＤＦＸは重篤な腎疾患では禁忌である。さらに、ＤＦＸは細胞中で比較的高い濃度でＨＩＦ−１αの安定化と活性化を引き起こすだけである。
【００１０】
トリテルペノイドは食用と薬用の植物に広く分布しており、人間の食べ物の欠くことのできない部分である。それらの中で、５員環トリテルペノイドは線形の炭化水素スクワレンに由来し、高度に多機能であるため、殺虫剤、医薬品、アジュバント、抗菌剤、抗癌剤、界面活性剤、保存剤など、農業、食物、化粧品、および医薬品の部門で広範囲の商業的用途がある（Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  Ｒｅｐ．  ２０１１  Ｍａｒ；  ２８（３）：５４３−９３；  Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｎｓ  （Ｂａｓｅｌ）  ２０１０  Ｏｃｔ；２（１０）：２４２８−６６）。トリテルペノイドの酸性の官能基とヒドロキシル（ＯＨ）基は、化合物の両側に位置するため、固定相と相互に作用することができない。３つの主なトリテルペン・ファミリー：オレアン（ｏｌｅａｎｅ）、ウルサン、およびルパンのトリテルペンがある。オレアンファミリーで見られる主なトリテルペノイドは、オレアノール酸、マスリン酸、エリトロジオール、およびβ−アミリンであり、ウルサンファミリーでは、ウルソール酸とウバオールがあり、および、ルパンファミリーでは、ルペオール、ベツリン、およびベツリン酸がある（Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｎｓ  （Ｂａｓｅｌ）  ２０１０  Ｏｃｔ；２（１０）：２４２８−６６）。
【００１１】
オレアノール酸、ウルソール酸、ベツリン酸、およびマスリン酸などの食物性トリテルペノイドは、生物活性と製薬用途について広範に研究されており、改善された生物活性を備えた新規な誘導体を生成するための鋳型としても広く使用されてきた。トリテルペノイドは、転写因子ＮＦ−κＢ（核因子カッパＢ）とＳＴＡＴ３（シグナル伝達性転写因子３）の活性化を阻害し、Ｎｒｆ２（ＮＦＥ２Ｌ２あるいは核因子（赤血球由来２）−様２）経路を調節し、および胆汁受容体ＴＧＲ５と結合してこれを活性化することが示されてきた（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ２００７  Ｎｏｖ  ３；３６２（４）：７９３−８）。しかしながら、ＰＤＨ２阻害とＨＩＦ−１αの安定化に対するトリテルペノイドの潜在的な活性は記載されていない。驚くべきことに、本明細書に開示された化合物ＩＩ乃至ＸＩＶの前駆体であるウルソール酸、ベツリン酸、およびオレアノール酸は、ＰＨＤ２に結合するが、ＨＩＦ−１α経路を活性化しない。この発見は、ＰＨＤ２と結合し、その活性なポケットでＦｅ２＋をキレート化することができるヒドロキサメート誘導体の生成をもたらし、結果として、このような化合物はＨＩＦ経路を活性化し、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αタンパク質を安定させる。化合物ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、およびＸＩＶ、ならびにＸＶは新規な化学成分であるが、化合物ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩＩ、およびＸＩＩＩはインビトロで抗癌活性を有することが報告されており、これはＨＩＦ−１α活性化には関係しない（Ｗｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１５  Ｄｅｃ  １；１０６：１９４−２１０；  Ｗｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  ２０１６  Ｆｅｂ  １；２６（３）：９０７−９；  ＣＮ１０２１８０９３９  Ｂ）。実際、ＨＩＦ−１αの活性化とは正反対なように、いくつかのトリテルペノイドによるＨＩＦ−１αの阻害は、抗癌治療用の潜在的な戦略として提唱されてきた（Ｄａｓｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  ２０１５  Ｊｕｌ；  １８（３）：  ２８３−９９；  Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  ２００７  Ａｐｒ；  ３０（４）：  ４１２−８；  Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．  ２００６  Ｄｅｃ；  ６９（１２）：  １７１５−２０）。
【発明の概要】
【００１２】
従来から逸脱して、本発明の問題は、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αの安定化を誘発し、ＨＩＦ経路を活性化させる新規な５員環トリテルペノイド誘導体（トリテルペノイド誘導体）を提供することである。本発明は、式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体、その立体異性体、薬学的に許容可能な塩、あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物に関し、
【００１３】
【化１】
2019519464.tif 000003
ここで、独立して、
Ａ−Ｂは、一重の炭素炭素結合あるいは二重の炭素炭素結合から選択され、
Ｂはメチレン（−ＣＨ２−）、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、あるいはヒドロキシル化されたオレフィン炭素［−Ｃ（ＯＨ）＝］から選択され、
Ｂ−Ｃは、一重の炭素炭素結合あるいは二重の炭素炭素結合から選択され、あるいは、１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり、前記ヘテロ原子の少なくとも１つが窒素であり、および、前記複素環は１つの窒素と１つの酸素を含む５員環であり、
Ｃはヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、アシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、カルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］、オキシム［−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−］、あるいはヒドラゾン［−Ｃ（＝Ｎ−ＮＨ２）−］から選択され、ここで、Ｒ’はメチルであり、
Ｄ−Ｅは一重または二重の炭素炭素結合であり、
ＦはＦ１ａ、Ｆ２ａ、あるいはＦ３ａから選択され、
【００１４】
【化２】
2019519464.tif 000004
Ｇはメチレン（−ＣＨ２−）あるいはカルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］から選択され、および、
Ｒはヒドロキサメート基（−ＣＯＮＨＯＨ）であり、
ここで、Ｃがアシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］である場合、式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体は
【００１５】
【化３】
2019519464.tif 000005
であり、
Ｂがメチレン（−ＣＨ２−）である場合、Ｃはヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］であり、Ｄ−Ｅは二重炭素炭素結合であり、Ｇはメチレン（−ＣＨ２−）であり、Ｒはヒドロキサメート（−ＣＯＮＨＯＨ）であり、ＦはＦ３ａであり、
Ｂがメチレン（−ＣＨ２−）である場合、Ｃはヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］であり、Ｄ−Ｅは一重の炭素炭素結合であり、Ｇはメチレン（−ＣＨ２−）であり、Ｒはヒドロキサメート（−ＣＯＮＨＯＨ）であり、ＦはＦ１ａまたはＦ２ａから選択され、
Ｂがメチレン（−ＣＨ２−）である場合、Ｃはオキシム［−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−］であり、Ｄ−Ｅは二重炭素炭素結合であり、Ｇはメチレン（−ＣＨ２−）であり、Ｒはヒドロキサメート（−ＣＯＮＨＯＨ）であり、ＦはＦ１ａまたはＦ３ａから選択される。
【００１６】
さらに、本発明は、本明細書に記載されるように、第１の有効成分として式（Ｉａ）の少なくとも１つのトリテルペン誘導体、および、少なくとも１つの賦形剤あるいは担体、および、随意に少なくとも第２の有効成分を含む医薬組成物を指す。
【００１７】
本発明の別の態様は、薬物として使用するための上に本明細書に記載されるような式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体とその医薬組成物を指す。
【００１８】
本発明はさらに、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病または疾患の処置で使用するための、式（Ｉ）のトリテルペン誘導体、あるいはその立体異性体、薬学的に許容可能な塩、または薬学的に許容可能な溶媒和物を指し、
【００１９】
【化４】
2019519464.tif 000006
ここで、独立して、
Ａ−Ｂは、一重の炭素炭素結合あるいは二重の炭素炭素結合から選択され、
Ｂはメチレン（−ＣＨ２−）（オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、あるいはヒドロキシル化されたオレフィン炭素［−Ｃ（ＯＨ）＝］から選択され、
Ｂ−Ｃは、一重の炭素炭素結合あるいは二重の炭素炭素結合から選択され、あるいは、１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり、前記ヘテロ原子の少なくとも１つが窒素であり、および、上記複素環は１つの窒素と１つの酸素を含む５員環であり、
Ｃはヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、アシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］、オレフィンメチン］（＝ＣＨ−）、カルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］、オキシム［−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−］、あるいはヒドラゾン［−Ｃ（＝Ｎ−ＮＨ２）−］から選択され、ここで、Ｒ’はメチルであり、
Ｄ−Ｅは一重または二重の炭素炭素結合であり、
ＦはＦ１、Ｆ２、あるいはＦ３から選択され、
【００２０】
【化５】
2019519464.tif 000007
Ｇはメチレン（−ＣＨ２−）あるいはカルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］から選択され、および、
Ｒはヒドロキサメート基（−ＣＯＮＨＯＨ）である。
【００２１】
本発明はさらに、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病あるいは疾患の治療で使用するための、上に本明細書に記載されたようなトリテルペン誘導体を含む医薬組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は２８位でヒドロキサメート官能基を含むトリテルペノイド誘導体と、上記トリテルペノイド誘導体を含む組成物に関し、これは、ＰＨＤ２と結合し、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αのタンパク質を安定させ、様々な細胞タイプでＨＩＦ経路を活性化し、ヒト内皮血管細胞の血管新生を引き起こし、インビトロとインビボで神経保護的活性、インビボで抗糖尿病性活性を呈し、および、インビボでエリスロポエチンの血漿レベルを増加させる能力を示す。
【００２３】
上記トリテルペノイド誘導体は選択的なやり方でも作用し、天然のトリテルペノイド前駆体の既知の活性であるＮｒｆ２活性化、ＮＦ−κＢ阻害、ＳＴＡＴ３阻害、およびＴＧＲ５活性化を引き起こさない。上記トリテルペノイド誘導体はＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病および／または疾患の処置に役立つ。したがって、本発明は、その治療がＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αの活性化の利益を得るか、あるいは該活性化に反応する疾患に関し、したがって、本発明は、ＨＩＦ−１α阻害の利益を得るか、その阻害に反応する疾患あるいは疾病を指さない。具体的には、本発明は、式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体を指し、
【００２４】
【化６】
2019519464.tif 000008
ここで、独立して、
Ａ−Ｂは、一重の炭素炭素結合あるいは二重の炭素炭素結合から選択され、
Ｂはメチレン（−ＣＨ２−）（オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、あるいはヒドロキシル化されたオレフィン炭素［−Ｃ（ＯＨ）＝］から選択され、
Ｂ−Ｃは、一重の炭素炭素結合あるいは二重の炭素炭素結合から選択され、あるいは、１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり、前記ヘテロ原子の少なくとも１つが窒素であり、
Ｃはヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、アシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］、オレフィンメチン］（＝ＣＨ−）、カルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］、オキシム［−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−］、あるいはヒドラゾン［−Ｃ（＝Ｎ−ＮＨ２）−］から選択され、ここで、Ｒ’はメチルであり、
Ｄ−Ｅは一重または二重の炭素炭素結合であり、
ＦはＦ１ａ、Ｆ２ａ、およびＦ３ａから選択され、
【００２５】
【化７】
2019519464.tif 000009
Ｇはメチレン（−ＣＨ２−）あるいはカルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］から選択され、および、
Ｒはヒドロキサメート基（−ＣＯＮＨＯＨ）であり、
ここで、
Ｂがメチレン（−ＣＨ２−）である場合、Ｃはヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］であり、Ｄ−Ｅは二重炭素炭素結合であり、Ｒはヒドロキサメート（−ＣＯＮＨＯＨ）であり、ＦはＦ３ａであり、
Ｂがメチレン（−ＣＨ２−）である場合、Ｃはヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］であり、Ｄ−Ｅは一重の炭素炭素結合であり、Ｒはヒドロキサメート（−ＣＯＮＨＯＨ）であり、ＦはＦ１ａまたはＦ２ａから選択され、
Ｂがメチレン（−ＣＨ２−）である場合、Ｃはオキシム［−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−］であり、Ｄ−Ｅは二重炭素炭素結合であり、Ｒはヒドロキサメート（−ＣＯＮＨＯＨ）であり、ＦはＦ２ａまたはＦ３ａから選択される。
【００２６】
式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体の１つの実施形態において、上に本明細書で開示されるように、Ｂ−Ｃが１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり得て、ここで、上記ヘテロ原子の少なくとも１つは窒素であり、上記複素環は５員環である。
【００２７】
式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体の１つの実施形態において、上に本明細書で開示されるように、Ｂ−Ｃは１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり得て、ここで、上記ヘテロ原子の少なくとも１つは窒素であり、上記複素環は２つのチッ素原子を含む５員環である
【００２８】
式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体の１つの実施形態において、上に本明細書で開示されるように、Ｂ−Ｃは１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり得て、ここで、上記ヘテロ原子の少なくとも１つは窒素であり、上記複素環は１つのチッ素と１つの酸素を含む５員環である。
【００２９】
式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体は、上に本明細書で開示されるように、そのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩、あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物を含む。
【００３０】
本記載について、用語「アナログ（ａｎａｌｏｇｕｅ／ｓ）」とは、本明細書で開示される化合物に構造上由来するか、あるいは、相同する任意の実体を指す。
【００３１】
本記載の文脈において、本明細書で開示された化合物の用語「誘導体」とは、本明細書の上のＲの定義に従って、２８位で常に置換される任意のトリテルペノイドアナログとして解釈されなければならず、これは本明細書に記載される薬理学的性質をトリテルペノイド化合物に与えるが、本明細書に記載された置換とは異なる、トリテルペノイド分子の他の位置の他の置換においても重要な役割を与える。
【００３２】
用語「互変異性型」は、化学プロセス（互変異性化）によって容易に相互交換する有機化合物の構造異性体である。
【００３３】
用語「異性体」は、ＩＵＰＡＣ（国際純正応用化学連合）によって、同じ原子組成（分子式）を有するが、異なる式または異なる立体化学式を有するいくつかの種（あるいは分子実体）の１つとして正式に定義されるが、用語「立体異性体」とは、同一の化学構造を有するが、空間中の原子または基の配置に関して異なる化合物として、ＩＵＰＡＣによって正式に定義される。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「多形体」は、結晶を形成する分子、原子、及び／又はイオンの同じ化学組成を持つが異なる立体配置を持つ結晶形態を指す。
【００３５】
用語「薬学的に許容可能な塩」は、患者への投与後に本明細書に記載されるような化合物を（直接又は間接的に）提供することができる、任意の薬学的に許容可能な塩を指す。そのような塩は好ましくは、生理学的に許容可能な有機酸又は無機酸を含む酸付加塩である。酸付加塩の例として、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸付加塩、及び、例えば酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、及びｐ−トルエンスルホン酸塩などの有機酸付加塩が挙げられる。アルカリ付加塩の例として、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、及びアンモニウム塩などの無機塩類、並びに、例えばエチレンジアミン、エタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジアルキレンエタノールアミン、トリエタノールアミン、及び塩基性アミノ酸塩などの有機アルカリ塩が挙げられる。しかし、非薬学的に許容可能な塩も、薬学的に許容可能な塩の調製に役立つ場合があるため、本発明の範囲内にあることが認識される。造塩の手順は当該技術分野では従来のものである。
【００３６】
本発明に係る用語「溶媒和物」は、本発明に係る活性化合物の任意の形態を意味するものとして理解されるべきであり、そこでは前記化合物は、特に水和物及びアルコラートを含む、別の分子（通常は極性溶媒）への非共有結合により結合される。
【００３７】
好ましい実施形態において、開示されたトリテルペン誘導体は、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）の化合物、或いは、それらのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩又は薬学的に許容可能な溶媒和物を指す。
【００３８】
【化８−１】
2019519464.tif 000010
【００３９】
【化８−２】
2019519464.tif 000011
【００４０】
【化８−３】
2019519464.tif 000012
【００４１】
式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体の好ましい実施形態において、Ｃがアシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］であるとき、式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体は以下である。
【００４２】
【化９】
2019519464.tif 000013
【００４３】
本記載の例と図に示されるように、式（Ｉａ）に含まれる修飾は、ＰＨＤ２を結合し、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αタンパク質を安定させ、異種細胞型においてＨＩＦ経路を活性化し、ヒト内皮血管細胞に血管新生を誘発させ、インビトロ及びインビボで神経保護的活性を示し、インビボで抗糖尿病活性を示し、及びインビボでエリスロポエチンの血漿レベルを増大させる能力を、本明細書に開示される化合物に与える。前記式（Ｉａ）の化合物、或いはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩又は薬学的に許容可能な溶媒和物は、選択的な方式で作用し、且つ、天然のトリテルペノイド前駆体の既知の活性であるＮｒｆ２活性化、ＮＦ−κＢ阻害、ＳＴＡＴ３阻害、及びＴＧＲ５活性化を誘発しない。
【００４４】
本明細書に開示される例は、組成物、具体的には医薬組成物を指すものであり、該医薬組成物は、本明細書上に記載されるような式（Ｉａ）の少なくとも１つの化合物、或いはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩又は薬学的に許容可能な溶媒和物、及び、少なくとも１つの賦形剤又は担体を含む。
【００４５】
前記賦形剤又は担体は、本発明の目的のために、助溶剤、界面活性剤、油、保水剤、皮膚軟化剤、防腐剤、安定剤、及び酸化防止を含むがこれらに限定されない不活性成分を指す。ＴＲＩＳ又は任意のリン酸緩衝液などの、薬理学的に許容可能な緩衝液を使用してもよい。
【００４６】
本明細書に開示される別の実施形態は、組成物、具体的には医薬組成物を指すものであり、該医薬組成物は、本明細書上に記載されるような式（Ｉａ）の少なくとも１つの化合物、或いはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩又は薬学的に許容可能な溶媒和物、及び、付加的又は相乗的な生物活性を持つ少なくとも１つの第２の活性化合物を含む。
【００４７】
本記載の目的のために、用語「活性化合物又は有効成分」は同義語として得られるべきであり、ヒト又は動物への投与時に治療効果を及ぼす化学実体を意味する。
【００４８】
本明細書に開示される更なる実施形態は、薬剤として使用するための、本発明の式（Ｉａ）の化合物、或いはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩又は薬学的に許容可能な溶媒和物を指す。
【００４９】
本明細書に開示される更なる実施形態は、薬剤として使用するための、本発明の式（Ｉａ）の化合物、或いはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩又は薬学的に許容可能な溶媒和物を含む、本明細書中で上述される医薬組成物を指す。
【００５０】
前記式（Ｉａ）の化合物、或いはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩又は薬学的に許容可能な溶媒和物は、ＰＨＤ２を結合し、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αタンパク質を安定させ、異種細胞型においてＨＩＦ経路を活性化し、ヒト内皮血管細胞に血管新生を誘発させ、インビトロ及びインビボで神経保護的活性を示し、インビボで抗糖尿病活性を示し、及びインビボでエリスロポエチンの血漿レベルを増大させる能力を示す。前記式（Ｉａ）の化合物、或いはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩又は薬学的に許容可能な溶媒和物は、選択的な方式で作用し、且つ、天然のトリテルペノイド前駆体の既知の活性であるＮｒｆ２活性化、ＮＦ−κＢ阻害、ＳＴＡＴ３阻害、及びＴＧＲ５活性化を誘発しない。
【００５１】
前記式（Ｉａ）のトリテルペノイド誘導体及びその医薬組成物は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病と疾患の処置に役立つ。
【００５２】
それ故、式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患に役立ち、従って前記疾病又は疾患の処置は、ＨＩＦ経路の活性化から利益を得るか、又はそれに反応する。
【００５３】
本開示に従い、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病と疾患には、固形腫瘍は含まれない。これは、固形腫瘍が転移拡散を促す血管新生を進行させるためであり、それ故ＨＩＦ−１阻害剤は、異常な血管の成長及び機能を遮断するための抗癌剤として開発されている（Ｐｏｔｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ．  ２０１１  Ｓｅｐ  １６；１４６（６）：８７３−８７）。
【００５４】
特に、１つの実施形態は、卒中、脳性麻痺、外傷、及び神経変性疾患を含むがこれらに限定されない、ＨＩＦ経路の活性化に反応する様々な疾病又は疾患の処置に使用するための、本明細書で上述される式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体、及びその医薬組成物を開示する。神経変性疾患の例として、多発性硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、又はパーキンソン病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本記載の目的のために、卒中は脳血管性の原因の神経学的欠損を指す。卒中は、虚血性と出血性の２つの大範疇に分類することができる。虚血性卒中は脳への血液供給の停止により引き起こされ、一方で出血性卒中は血管又は異常な血管構造物の破裂に起因する。
【００５６】
本記載の目的のために、脳性麻痺は、幼児期に現われ、発達異常、又は、運動、バランス、及び姿勢を制御する脳の一部への損傷により引き起こされる、恒久的な運動障害の群を指す。
【００５７】
本記載の目的のために、外傷は、即時の治療を必要とする突然発症と重症度の身体損傷を指す。外傷は、種々様々な鈍的、貫通、及び熱傷の機構の結果である。前記外傷には、自動車衝突事故、スポーツ損傷、転倒、自然災害、及び多くの他の身体損傷が挙げられる。
【００５８】
別の実施形態は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する様々な疾病又は疾患の処置に使用するための、本明細書で上述される式（Ｉａ）のトリテルペン誘導体、及びその医薬組成物を開示し、ここで、前記疾病又は疾患には、限定されないが、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺損傷、糖尿病性及び慢性の創傷、臓器移植、急性腎臓障害、又は動脈の疾患が挙げられる。より好ましくは、前記疾病又は疾患は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺損傷、臓器移植、急性腎臓障害、又は動脈の疾患から選択される。
【００５９】
本記載の目的のために、ＩＢＤは、結腸と小腸の炎症性疾病の群を指す。
クローン病と潰瘍性大腸炎は、他の中で主要な型の炎症性腸疾患である。
【００６０】
本記載の目的のために、心筋虚血−再灌流傷害は、血液供給が心筋虚血又は酸素の欠如（無酸素症、低酸素症）の期間後に組織に戻る時に引き起こされる組織損傷を指す。
【００６１】
本記載の目的のために、急性肺損傷は、急性の重度の低酸素症を特徴とする疾病を指し、その診断は、臨床的に病気の患者における非心原性肺水腫および呼吸不全の存在に基づく。
【００６２】
本記載の目的のために、感染症は、細菌、ウイルス、寄生生物、又は真菌類などの病原性微生物により引き起こされた疾患を指し、この疾患は、人から人へと直接又は間接的に広がり得る。
【００６３】
本記載の目的のために、糖尿病性及び慢性の創傷は、糖尿病性疾病により引き起こされ得る創傷を指し、これは、大半の創傷が治癒する順序正しい設定の段階、及び予測可能な時間量では治癒しない。一般に、３か月以内に治癒しない創傷は頻繁に慢性であると考慮される。
【００６４】
本記載の目的のために、急性腎臓障害は、７日以内に進行する、多数の原因による腎臓機能の急な損失を指す。前記腎臓機能の急な損失は、腎臓組織に損傷を引き起こし、これは通常、腎血流の減少（腎虚血）により引き起こされる。
【００６５】
本記載の目的のために、動脈の疾患は、血管に関与する疾患の分類を含む。
【００６６】
特に、１つの実施形態は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺損傷、糖尿病性及び慢性創傷、臓器移植、急性腎臓障害、又は動脈の疾患から選択される、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患の処置に使用するための、本明細書に記載されるような式（Ｉａ）の化合物、及びその医薬組成物を開示する。好ましい実施形態において、ＨＩＦ経路の活性化に反応する前記疾病又は疾患は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺損傷、臓器移植、急性腎臓障害、又は動脈の疾患から選択される。
【００６７】
本発明の１つの実施形態はまた、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患の処置に使用するための、本明細書に記載されるような式（Ｉａ）の化合物、及びその医薬組成物を開示し、前記ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患は、代謝症状である。好ましい実施例において、前記代謝症状は糖尿病である。別の好ましい実施形態において、前記代謝症状は脂質代謝障害である。また別の好ましい実施形態において、前記代謝症状は高脂血症である。別の好ましい実施形態において、前記代謝症状は高トリグリセリド血症である。ＰＨＤ２阻害剤は、グルコースと脂質代謝を改善し、且つ肥満症とメタボリック症候群に対する保護を行うことが記載されている（Ｒａｈｔｕ−Ｋｏｒｐｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ２０１４  Ｏｃｔ；６３（１０）：３３２４−３３）。
【００６８】
用語「代謝症状」は、通常の代謝プロセスが変更された場合の病状を指す。
【００６９】
用語「糖尿病」は、本発明の目的のために、高い血糖レベルが長期間にわたり存在する代謝障害の群を指す。糖尿病は、膵臓のインスリン産生の低下、又は、産生されるインスリンに対する身体の不適当な反応によるものである。
【００７０】
「高脂血症」は、血液中の脂質又はリポタンパク質の何れか、或いはそれら全ての異常なレベルの上昇を被験体が提示する疾病を指す。
【００７１】
「高トリグリセリド血症」は、被験体が高い血中レベルのトリグリセリドを提示する疾病を指す。トリグリセリドのレベルの上昇は、高コレステロール血圧（高いコレステロールレベル）の欠如下でさえもアテローム性動脈硬化に関連し、これは心疾患の素因となる。非常に高いトリグルセリドレベルはまた、急性膵炎のリスクを増大させる。
【００７２】
本明細書に開示される別の実施形態は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患の処置に使用するための、式（Ｉ）のトリテルペン誘導体、或いはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩又は薬学的に許容可能な溶媒和物を指し、
【００７３】
【化１０】
2019519464.tif 000014
式中、独立して、
Ａ−Ｂは、一重の炭素炭素結合又は二重の炭素炭素結合から選択され；
Ｂは、メチレン（−ＣＨ２−）、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、又はヒドロキシル化されたオレフィン炭素［−Ｃ（ＯＨ）＝］から選択され；
Ｂ−Ｃは、一重の炭素炭素結合又は二重の炭素炭素結合から選択され；或いは、１以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり、ここで前記ヘテロ原子の少なくとも１つは窒素であり；
Ｃは、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、アシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、カルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］、オキシム［−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−］、又はヒドラゾン［−Ｃ（＝Ｎ−ＮＨ２）−］から選択され、ここでＲ’はメチルであり；
Ｄ−Ｅは、一重又は二重の炭素炭素結合であり；
Ｆは、Ｆ１、Ｆ２、又はＦ３から選択され；
【００７４】
【化１１】
2019519464.tif 000015
Ｇは、メチレン（−ＣＨ２−）又はカルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］から選択され；及び
Ｒはヒドロキサメート基（−ＣＯＮＨＯＨ）である。
【００７５】
それ故、式（Ｉ）のトリテルペン誘導体は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病又は疾患に役立ち、従って前記疾病又は疾患の処置は、ＨＩＦ経路の活性化から利益を得るか、又はそれに反応する。
【００７６】
本明細書で上述されるような、式（Ｉ）のトリテルペン誘導体はまた、本発明の目的のために上記で定義されるように、そのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩又は薬学的に許容可能な溶媒和物を含む。特に、本発明の式（Ｉ）のトリテルペン誘導体は、本明細書で上記に開示されるように、その全ての立体異性体、及び任意の薬学的に許容可能な塩又は薬学的に許容可能な溶媒和物を含む。
【００７７】
本明細書で上記に開示されるような式（Ｉ）のトリテルペン誘導体の１つの実施形態において、Ｂ−Ｃは、１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり得、ここで前記ヘテロ原子の少なくとも１つは窒素であり、前記複素環は五員環である。
【００７８】
本明細書で上記に開示されるような式（Ｉ）のトリテルペン誘導体の１つの実施形態において、Ｂ−Ｃは、１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり得、ここで前記ヘテロ原子の少なくとも１つは窒素であり、前記複素環は２つの窒素原子を含む五員環である。
【００７９】
本明細書で上記に開示されるような式（Ｉ）のトリテルペン誘導体の１つの実施形態において、Ｂ−Ｃは、１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり得、ここで前記ヘテロ原子の少なくとも１つは窒素であり、前記複素環は、１つの窒素と１つの酸素を含む五員環である。
【００８０】
式（Ｉ）のトリテルペン誘導体の別の実施形態において、Ｃがアシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］であるとき、式（Ｉ）のトリテルペン誘導体は以下である。
【００８１】
【化１２】
2019519464.tif 000016
【００８２】
式（Ｉ）のトリテルペン誘導体の１つの実施形態は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病または疾患の処置における使用のための、
その立体異性体である式（Ｉａ）を指し：
【００８３】
【化１３】
2019519464.tif 000017
式中、独立して、
Ａ−Ｂは、一重の炭素炭素結合又は二重の炭素炭素結合から選択され；
Ｂは、メチレン（−ＣＨ２−）、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、又はヒドロキシル化されたオレフィン炭素［−Ｃ（ＯＨ）＝］から選択され；
Ｂ−Ｃは、一重の炭素炭素結合又は二重の炭素炭素結合から選択され；或いは、１以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり、ここで前記ヘテロ原子の少なくとも１つは窒素であり；
Ｃは、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、アシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、カルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］、オキシム［−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−］、又はヒドラゾン［−Ｃ（＝Ｎ−ＮＨ２）−］から選択され、ここでＲ’はメチルであり；
Ｄ−Ｅは、一重又は二重の炭素炭素結合であり；
Ｆは
【００８４】
【化１４】
2019519464.tif 000018
から選択され；
式中、Ｆ１はＦ１ａであり、Ｆ２はＦ２ａであり、Ｆ３はＦ３ａであり、
【００８５】
【化１５】
2019519464.tif 000019
Ｇはメチレン（ＣＨ２−）またはカルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］から選択され；かつ、
Ｒはヒドロキサメート基（ＣＯＮＨＯＨ）である。
【００８６】
式（Ｉ）のトリテルペン誘導体の別の実施形態は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病または疾患の処置における使用のための、その立体異性体の式（Ｉｂ）：
【００８７】
【化１６】
2019519464.tif 000020
を指し、
式中、独立して、
Ａ−Ｂは、一重の炭素炭素結合または二重の炭素炭素結合から選択され；
Ｂはメチレン（−ＣＨ２−）、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、またはヒドロキシル化オレフィン炭素［−Ｃ（ＯＨ）＝］から選択され；
Ｂ−Ｃは、一重の炭素炭素結合または二重の炭素炭素結合から選択され；または、１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり、ここで、前記ヘテロ原子の少なくとも１つは窒素であり；
Ｃは、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、アシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、カルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］、オキシム［−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−］、または、ヒドラゾン［−Ｃ（＝Ｎ−ＮＨ２）−］から選択され、ここでＲ’はメチルであり；
Ｄ−Ｅは、一重または二重の炭素炭素結合であり；
Ｆは、Ｆ１、Ｆ２またはＦ３から選択され；
【００８８】
【化１７】
2019519464.tif 000021
式中、ＦはＦ３であり、Ｆ３はＦ３ｂである：
【００８９】
【化１８】
2019519464.tif 000022
【００９０】
本発明に記載の式（Ｉ）の化合物、または、そのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物は、
本明細書で以下に開示する実施例２に示すように、ＰＨＤ２に結合し、
本明細書で以下に開示する実施例４に示すように、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αタンパク質を安定化し、
本明細書で以下に開示する実施例３に示すように、様々な細胞型でＨＩＦ経路を活性化し、
本明細書で以下に開示する実施例５に示すように、ヒト内皮血管細胞において血管新生を誘発し、
本明細書で以下に開示する実施例７に示すように、インビトロおよびインビボでの神経保護的活性を示し、
本明細書で以下に開示される実施例６に示すように、インビボでエリスロポエチンの血漿レベルを上昇させ；
本明細書で以下に開示する実施例９に示すように、抗糖尿病活性を示し、インビボで脂質レベルを低下させる、能力を示す。
【００９１】
上記トリテルペノイド誘導体はまた、選択的に作用し、Ｎｒｆ２活性化、ＮＦ−κＢ阻害、ＳＴＡＴ３阻害、およびＴＧＲ５活性化を誘発せず、これらは、（本明細書の実施例３に示されるように）天然のトリテルペノイド前駆体の既知の活性である。
【００９２】
本発明の実施例３は、上述のように、式（Ｉ）の化合物が様々な細胞型においてＨＩＦ経路をどのように活性化するかを示す。実施例３はまた、２つの比較化合物ＸＸおよびＣＤＤＯ−ＭＥを試験した。グリチルレチン酸に由来する比較化合物ＸＸは、２０位にヒドロキサメート基を含み、したがって本発明の化合物のように２８位に含まれることはない。
【００９３】
【化１９】
2019519464.tif 000023
【００９４】
実施例３の結果は、本発明の化合物によって特徴付けられる２８位からのヒドロキサメートの位置の変化が、ＨＩＦ経路の活性化がもたらされないことを示す。
【００９５】
一方、比較組成物ＣＤＤＯ−Ｍｅ（２−シアノ−３，１２−ジオキソ−オレアナ−１，９（１１）−ジエン−２８−オイック酸メチルエステル、ＣＡＳ  ｎｕｍ．  ２１８６００−５３−４）はオレアノール酸誘導体であるが、これは本発明に開示された式Ｉの化合物によって上記位置に特徴付けられるものとは実質的に異なる置換基である、シアノ基（式ＩのＢ位の置換基）を２位に含むものである。
【００９６】
【化２０】
2019519464.tif 000024
【００９７】
実施例３の結果は、ＣＤＤＯ−ＭｅがＨＩＦ経路の活性化を提供せず、したがって、式Ｉの化合物の構造特性を提示しない比較化合物ＸＸおよびＣＤＤＯ−Ｍｅのいずれも、ＨＩＦ経路の活性化を提供しないことを示す。
【００９８】
したがって、本発明で開示される式Ｉで定義されるトリテルペノイド誘導体は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病または疾患、すなわち、その処置がＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αの活性化から恩恵を得る疾病または疾患の処置に有用である。
【００９９】
特に、一実施形態は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病または疾患の処置における使用のための、本明細書で上述される式（Ｉ）のトリテルペン誘導体を開示し、この疾病または疾患は、脳卒中、脳性麻痺、外傷、および神経変性疾患を含むが、これらに限定されない。神経変性疾患の例には多発性硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病またはパーキンソン病を含むが、これらに限定されない。
【０１００】
別の実施形態は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病または疾患の処置に使用するための、本明細書で上述される式（Ｉ）のトリテルペン誘導体を開示し、この疾病または疾患は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺損傷、糖尿病性および慢性の創傷、臓器移植、急性腎障害または動脈疾患を含むが、これらに限定されない。より好ましくは、上記疾病または疾患は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺損傷、臓器移植、急性腎障害または動脈疾患から選択される。
【０１０１】
本発明の一実施形態はまた、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病または疾患の処置に使用するための、本明細書で上述される式（Ｉ）の化合物を開示し、ここで、ＨＩＦ経路の活性化に反応する上記疾病または疾患は代謝症状である。好ましい実施形態では、上記代謝症状は糖尿病である。別の好ましい実施形態では、上記代謝症状は脂質代謝障害である。さらに別の好ましい実施形態では、上記代謝症状は高脂血症である。別の好ましい実施形態では、上記代謝症状は高トリグリセリド血症である。
【０１０２】
本明細書に開示される別の実施形態は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病または疾患の処置における使用のための、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）または（ＸＶ）から選択される、式（Ｉ）の化合物、または、そのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を指す。
【０１０３】
【化２１】
2019519464.tif 000025
【０１０４】
【化２２】
2019519464.tif 000026
【０１０５】
【化２３】
2019519464.tif 000027
【０１０６】
【化２４】
2019519464.tif 000028
【０１０７】
【化２５】
2019519464.tif 000029
【０１０８】
【化２６】
2019519464.tif 000030
【０１０９】
【化２７】
2019519464.tif 000031
【０１１０】
【化２８】
2019519464.tif 000032
【０１１１】
【化２９】
2019519464.tif 000033
【０１１２】
【化３０】
2019519464.tif 000034
【０１１３】
【化３１】
2019519464.tif 000035
【０１１４】
【化３２】
2019519464.tif 000036
【０１１５】
【化３３】
2019519464.tif 000037
【０１１６】
【化３４】
2019519464.tif 000038
好ましい実施形態は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病または疾患の処置における使用のための（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）または（ＸＶ）から選択される、式（Ｉ）の化合物、または、そのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を指す。
【０１１７】
上記の化合物ＩＩからＸＶ、または、そのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物は、ＰＨＤ２に結合し、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αタンパク質を安定化し、様々な細胞型でＨＩＦ経路を活性化し、ヒト内皮血管細胞において血管新生を誘発し、インビトロおよびインビボでの神経保護的活性を示し、抗糖尿病活性を示し、インビボで脂質レベルを低下させ、インビボでエリスロポエチンの血漿レベルを上昇させる能力を示す。式（Ｉ）の上記化合物、または、そのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物は、選択的に作用し、Ｎｒｆ２活性化、ＮＦ−κＢ阻害、ＳＴＡＴ３阻害、およびＴＧＲ５活性化を誘発せず、これらは、天然のトリテルペノイド前駆体の既知の活性である。
【０１１８】
実施例１で示されるように、天然のトリテルペン酸（ベツリン酸、オレアノール酸、ウルソール酸またはマスリン酸）の既知の誘導体または天然のトリテルペン酸自体から出発して、一般式（Ｉ）の化合物で終了し、一般的な合成経路を用いて、２８位の酸基をヒドロキサメート誘導体に変換し、ここで、式（Ｉ）の最終化合物の官能基化に応じて、他の余分な合成工程を式（Ｉ）の特定の化合物のそれぞれについて実施した。
【０１１９】
本発明の化合物ＩＩＩ〜ＶＩは、天然のオレアノール酸の既知の誘導体から出発して合成することができる。本発明の化合物ＶＩＩＩ〜ＸＩは、天然のベツリン酸またはその既知の誘導体から出発して合成することができる。本発明の化合物ＸＩＶおよびＸＶは、天然のマスリン酸の既知の誘導体から出発して合成することができる。
【０１２０】
実施例１はまた、化合物ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩおよびＸＩＸを記載し、これらはそれぞれ、化合物ＸＶおよびＸＩＶの合成の中間にある新規な化合物である。
【０１２１】
本明細書に開示される別の実施形態は、ＨＩＦ経路の活性化に反応する疾病または疾患の処置における使用のための、少なくとも一つの式（Ｉ）のトリテルペン誘導体、または、そのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を含む医薬組成物を指し、
【０１２２】
【化３５】
2019519464.tif 000039
式中、独立して、
Ａ−Ｂは、一重の炭素炭素結合または二重の炭素炭素結合から選択され；
Ｂはメチレン（−ＣＨ２−）、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、ヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、またはヒドロキシル化オレフィン炭素［−Ｃ（ＯＨ）＝］から選択され；
Ｂ−Ｃは、一重の炭素炭素結合または二重の炭素炭素結合から選択され；または、１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であり、ここで、前記ヘテロ原子の少なくとも１つは窒素であり；
Ｃはヒドロキシメチン［−ＣＨ（ＯＨ）−］、アシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］、オレフィンメチン（＝ＣＨ−）、カルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］、オキシム［−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−］、または、ヒドラゾン［−Ｃ（＝Ｎ−ＮＨ２）−］から選択され、ここでＲ’はメチルであり；
Ｄ−Ｅは一重または二重の炭素炭素結合であり；
ＦはＦ１、Ｆ２またはＦ３から選択され；
【０１２３】
【化３６】
2019519464.tif 000040
Ｇはメチレン（ＣＨ２−）またはカルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］から選択され；
Ｒはヒドロキサメート基（ＣＯＮＨＯＨ）である。
【０１２４】
本明細書で上述するように、式（Ｉ）のトリテルペン誘導体を含む医薬組成物の一実施形態では、Ｂ−Ｃは１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であってもよく、ここで、上記ヘテロ原子の少なくとも１つが窒素であり、かつ、上記複素環は５員環である。
【０１２５】
本明細書で上述するように、式（Ｉ）のトリテルペン誘導体を含む医薬組成物の一実施形態では、Ｂ−Ｃは１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であってもよく、ここで、上記ヘテロ原子の少なくとも１つが窒素であり、かつ、上記複素環は２つの窒素原子を含む５員環である。
【０１２６】
本明細書で上述するように、式（Ｉ）のトリテルペン誘導体を含む医薬組成物の一実施形態では、Ｂ−Ｃは１つ以上のヘテロ原子を含む複素環の一部であってもよく、ここで、上記ヘテロ原子の少なくとも１つが窒素であり、かつ、上記複素環は１つの窒素と１つの酸素を含む５員環である。
【０１２７】
式（Ｉ）のトリテルペン誘導体の一実施形態では、Ｃがアシルオキシメチン［−ＣＨ（ＯＣＯＲ’）−］である時、式（Ｉ）のトリテルペン誘導体は、
【０１２８】
【化３７】
2019519464.tif 000041
であり；式（Ｉ）の化合物、または、そのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を含む上記医薬組成物は、ＰＨＤ２に結合し、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αタンパク質を安定化し、様々な細胞型でＨＩＦ経路を活性化し、ヒト内皮血管細胞において血管新生を誘発し、インビトロおよびインビボでの神経保護的活性を示し、抗糖尿病活性を示し、インビボで脂質レベルを低下させ、インビボでエリスロポエチンの血漿レベルを上昇させる能力を示す。式（Ｉ）の化合物、または、そのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を含む上記の組成物は、選択的に作用し、Ｎｒｆ２活性化、ＮＦ−κＢ阻害、ＳＴＡＴ３阻害、およびＴＧＲ５活性化を誘発せず、これらは、天然のトリテルペノイド前駆体の既知の活性である。
【０１２９】
本明細書に開示される別の実施形態は、限定されないが、脳卒中、脳性麻痺、外傷および神経変性疾患を含む、ＨＩＦ経路の活性化に反応性のある疾病または疾患の処置における使用のための；あるいは限定されないが、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺損傷、糖尿病性および慢性の創傷、臓器移植、急性腎障害または動脈疾患を含む、ＨＩＦ経路の活性化に反応性のある疾病または疾患の処置における使用のための、本明細書で上に記載されるような、少なくとも１つの式（Ｉ）のトリテルペン誘導体あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を含む医薬組成物に言及している。より好ましくは、前記疾病または疾患は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、臓器移植、急性腎障害または動脈疾患から選択される。
【０１３０】
本明細書に開示される別の実施形態は、ＨＩＦ経路の活性化に反応性のある疾病または疾患の処置における使用のための、本明細書で上に記載されるような、少なくとも１つの式（Ｉ）のトリテルペン誘導体あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を含む医薬組成物に言及しており、ここでＨＩＦ経路の活性化に反応性のある前記疾病または疾患は、代謝症状である。好ましい実施形態では、前記代謝症状は糖尿病である。別の好ましい実施形態では、前記代謝症状は脂質代謝障害である。さらに別の好ましい実施形態は、前記代謝症状は高脂血症である。別の好ましい実施形態では、前記代謝症状は高トリグリセリド血症である。
【０１３１】
前記組成物は、ヒトまたは動物に投与されたときに治療効果を働かせる別の有効成分をさらに含む。
【０１３２】
典型的な組成物は、例として、担体または希釈剤であり得る、薬学的に許容可能な賦形剤に関係して本明細書で上に記載される、式（Ｉ）の化合物、あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を含む。そのような組成物は、カプセル、小袋、紙または他の容器の形態であり得る。組成物を作る際に、医薬組成物の調製のための従来の技術が使用されてもよい。例えば、本明細書で上に開示される式（Ｉ）の化合物は、担体と混合されるか、担体によって希釈されるか、またはアンプル、カプセル、小袋、紙、または他の容器の形態であり得る担体内に封入されてもよい。担体は、希釈剤として働くときに、活性化合物のためのビヒクル、賦形剤または培地として作用する固体、半固体または液体の材料であり得る。本明細書で上に記載されるような式（Ｉ）の化合物は、粒状固体容器上で例えば小袋に吸着され得る。適切な担体の幾つかの例は、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシル化ヒマシ油、ピーナッツ油、オリーブ油、ラクトース、白土、スクロース、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸、あるいはセルロース、ケイ酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンの低級アルキルエーテルである。同様に、担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの当該技術分野で既知の徐放材を、単独で又はワックスと混合して含んでもよい。前記組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、甘味剤または香味剤を含んでもよい。本発明の組成物は、当該技術分野で周知の手順を利用することによって、患者への投与後に本明細書に開示される式（Ｉ）の化合物の急速、持続、または遅延の放出を提供するように製剤」されてもよい。
【０１３３】
医薬組成物は、望まれれば、本明細書で上に開示される化合物と有害に反応しない、助剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液及び／又は発色剤などで滅菌され、それらと混合され得る。
【０１３４】
本明細書に開示される１つの好ましい実施形態は、本明細書で上に開示される、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を、適切な又は望ましい作用部位に有効に輸送する経路であり得る、投与経路、例えば、経口、経鼻、局所、肺、経皮、または非経口の、例えば、直腸、皮下、静脈内、尿道内、筋肉内、鼻腔内の点眼用の溶液または軟膏に言及している。
【０１３５】
経鼻投与に関して、組成物は、液体担体、特にエアロゾル適用のための水性担体中に溶解または懸濁された、本明細書で上に開示される、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を含有し得る。担体は、可溶化剤、例えば、プロピレングリコール、界面活性剤、レシチン（ホスファチジルコリン）などの吸収促進剤、シクロデキストリン、またはパラベンなどの防腐剤などの、添加剤を含有し得る。
【０１３６】
局所用組成物を調製するために、本明細書で上に開示される、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物は、当該技術分野で知られているような皮膚用ビヒクルに入れられる。投与される本明細書で上に開示される、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物の量、および局所製剤中の化合物の濃度は、ビヒクル、選択される送達システムまたはデバイス、患者の臨床症状、製剤中の化合物の副作用および安定性に左右される。したがって、医師は、本明細書で上に開示される、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物の適切な濃度を含有している適切な調製物を利用し、係る患者または類似した患者の臨床経験に依存して、投与される製剤の量を選択する。
【０１３７】
眼への適用に関して、本明細書で上に開示される、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物は、眼における使用に適した溶液、懸濁液、および軟膏へと製剤される。その濃度は、通常、局所用調製物のために本明細書で上に議論される通りである。
経口投与に関して、固体または流体の単位剤形のいずれかが調製され得る。錠剤などの固形組成物を調製するために、本明細書で上に開示される、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ジ−リン酸カルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、硫酸カルシウム、デンプン、ラクトース、アカシア、メチルセルロース、および薬学的な希釈剤または担体と機能的に類似した物質などの、従来の成分とともに製剤へと混合される。
【０１３８】
カプセルは、本明細書で上に開示される、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を、不活性な薬学的希釈剤と混合し、その混合物を適切なサイズの硬ゼラチンカプセルへと充填することによって調製される。軟ゼラチンカプセルは、許容可能な植物油、軽流動ワセリンまたは他の不活性油を用いる式（Ｉ）の化合物のスラリーのマシンカプセル化によって調製される。シロップ剤、エリキシル剤および懸濁液などの、経口投与用の流体単位剤形が調製され得る。水溶性形態は、糖、芳香族香味剤および防腐剤と一緒に水性ビヒクル中に溶解されて、シロップが形成される。芳香族香味剤と一緒に、糖およびサッカリンなどの適切な甘味料とともに水アルコールの（例えば、エタノール）ビヒクルを使用することによって、エリキシルが調製される。懸濁液は、アカシア、トラガカント、メチルセルロースなどの懸濁化剤の助けとともに水性ビヒクルで調製され得る。
【０１３９】
非経口使用に適切な組成物は、適切な注射剤または懸濁液の使用などの当該技術の実施者に明白である。滅菌されている組成物は、皮内、筋肉内、血管内および皮下を含む様々な局所または非経口の経路に適している。
【０１４０】
本明細書で上に開示される、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物に加えて、該組成物は、組成物および望ましい送達の様式に依存して、動物またはヒトへの投与のための医薬組成物を形成するために一般に使用されるビヒクルを含む、薬学的に許容可能な無毒の担体または希釈剤を含み得る。希釈剤は、組み合わせの生物活性に過度に影響を与えないように選択される。
【０１４１】
注射可能な製剤に特に有用であるそのような希釈剤の例は、水、様々な生理食塩水、有機塩または無機塩の溶液、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体；アジュバント；または無毒の、非治療的な、非免疫原性の安定剤などの、添加剤を含んでもよい。
【０１４２】
さらに、賦形剤が、開示される組成物中に含まれ得る。その例は、限定されないが、共溶媒、界面活性剤、油、保水剤、皮膚軟化剤、防腐剤、安定剤および抗酸化剤を含む。トリスまたはリン酸塩緩衝液などの、あらゆる薬理学的に許容可能な緩衝液も使用されてもよい。希釈剤、添加剤、および賦形剤の有効な量は、溶解度、生物活性などの点から薬学的に許容可能な製剤を得るのに有効である、それらの量である。
【０１４３】
本明細書で上に開示される、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を含む、医薬組成物は、ミクロスフェアへと取り込まれ得る。本明細書で上に開示される、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物は、アルブミンのミクロスフェアへと充填され得、そこから、経鼻投与のための乾燥粉でのそのようなミクロスフェアを回収することが可能である。ミクロスフェアの調製に適した他の物質は、寒天、アルギン酸塩、キトサン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アルブミン、アガロース、デキストラン、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、およびカゼインを含む。ミクロスフェアは、噴霧乾燥プロセスまたは乳化プロセスなどの、当業者に既知の様々なプロセスによって産生され得る。
【０１４４】
例えば、アルブミンのミクロスフェアは、撹拌しながらリン酸塩緩衝液中のウサギ血清アルブミンをオリーブ油に加えて、油中水型エマルジョンを産生することによって調製され得る。その後、グルタルアルデヒド溶液はエマルジョンに加えられ、エマルジョンは撹拌されて、アルブミンを架橋する。その後、ミクロスフェアは遠心分離によって分離され得、油を除去し、ミクロスフェアは、例えば、石油エーテルおよび続いてエタノールで洗浄される。最終的に、ミクロスフェアは篩過され、濾過によって収集および乾燥され得る。
【０１４５】
デンプンのミクロスフェアは、例えば、ジャガイモデンプンの暖かい水性デンプン溶液を、撹拌しながら水中のポリエチレングリコールの加熱溶液に加えて、エマルジョンを形成することによって調製され得る。二相系が（内相としてデンプン溶液とともに）形成されると、混合物は、その後、撹拌を継続しながら室温に冷却され、そこで内相はゲル粒子に変換される。その後、これらの粒子は、室温で濾過され、エタノールなどの溶媒中でスラリー状にされ（ｓｌｕｒｒｅｄ）、その後、粒子は、再び濾過され、静置されて空気乾燥される。ミクロスフェアは、熱処理などの周知の橋架手順によって、または化学的架橋剤の使用によって硬化され得る。適切な薬剤は、グリオキサール、マロンジアルデヒド、コハクアルデヒド、アジプアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびフタルアルデヒドを含むジアルデヒド、ブタジオンなどのジケトン、エピクロロヒドリン、ポリリン酸塩、およびホウ酸塩を含む。ジアルデヒドは、アミノ基との相互作用によってアルブミンなどのタンパク質と架橋するために使用され、ジケトンはアミノ基とシッフ塩基を形成する。エピクロロヒドリンは、エポキシド誘導体に対するアミノまたはヒドロキシルなどの求核試薬で化合物を活性化する。
【０１４６】
本発明の別の好ましい実施形態は、本明細書で上に記載されるような、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物、および前記化合物を含む組成物の投薬スキームである。用語「単位剤形」は、被験体、例えば、哺乳動物の被験体、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、およびげっ歯類のための単一の投薬量として適切な物理的に離散性の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的な希釈剤、担体またはビヒクルとともに望ましい薬学的効果をもたらすために計算された活性物質の予め決められた量を含有している。本発明の単位剤形のための仕様は、（ａ）本明細書で上に開示される、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物の固有の特性、および達成される特定の効果、並びに（ｂ）ヒトおよび動物における使用さのために前記式（Ｉ）の化合物を調合する当該技術に固有の限定によって決定され、それらに依存する。単位剤形の例は、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末パケット、ウェーハ、坐剤、果粒剤、カシェ剤、茶さじ１杯、テーブルスプーン１杯、スポイト１杯、アンプル、バイアル、放出量が測定されたエアロゾル、前述のいずれかの分離された倍数（ｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｓ）、および本明細書に記載されるような他の形態である。本明細書に開示される組成物は、キットに含まれ、キットは、組成物の１つ以上の単位剤形および本明細書に記載される疾患の１つ以上を処置する使用のための説明書を含むことができる。
【０１４７】
多くのバイオポリマー（生物ベースの系）、リポソーム、コロイド、樹脂を利用する系、および他のポリマー送達系または区画されたリザーバーのいずれかを含む、遅延放出または持続放出の送達系は、本明細書に記載される組成物とともに利用されて、治療化合物の継続的または長期的なソースを提供することができる。そのような遅延放出系は、局所、眼内、経口、および非経口経路を経由する送達のための製剤に適用可能である。
【０１４８】
本明細書で上に記載されたような、有効な量の式（Ｉ）の化合物またはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物は、組成物中に含まれる。本発明に従って使用される化合物の投薬量は、化合物および処置されている状態、例えば、疾病、レシピエント患者の年齢、体重、および臨床症状に応じて様々である。他の因子は次のものを含む：投与経路、患者、患者の病歴、疾患プロセスの重要度、および特定の化合物の効力。投与量は、患者に対して許容しがたい毒性をもたらすことなく、処置される疾患の症状または徴候を改善するのに十分であるべきである。一般に、有効な量の化合物は、症状の自覚的な軽減または臨床医または他の資格のある観察者によって留意されるような客観的に特定可能な改善のいずれかを提供する量である。
【０１４９】
本明細書に開示される１つの実施形態は、ＨＩＦ経路の活性化に反応性のある疾病または疾患の処置における、式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物の使用の方法に言及している。
【０１５０】
前記式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物は、ＰＨＤ２を結合する能力を示し、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αのタンパク質を安定させ、異なる細胞型においてＨＩＦ経路を活性化し、ヒト内皮血管細胞の血管新生を誘発し、インビトロおよびインビボで神経保護的活性、抗糖尿病活性を示し、インビボで脂質のレベルを低下させ、およびインビボでエリトロポイエチンの血漿レベルを増大させる。前記式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物は、選択的な方法で作用し、Ｎｒｆ２活性化、ＮＦ−κΒ阻害、ＳＴＡＴ３阻害、およびＴＧＲ５活性化を誘発せず、これらは、それらの天然のトリテルペノイド前駆体のための既知の活性である。
【０１５１】
本明細書に開示される別の実施形態は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、糖尿病性および慢性の創傷、臓器移植、急性腎障害または動脈疾患などの、ＨＩＦ経路の活性化に反応性のある疾患を処置するための式（Ｉ）の化合物の使用の方法に言及している。好ましい実施形態では、前記疾患は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、臓器移植、急性腎障害または動脈疾患から選択される。
【０１５２】
本明細書に開示される別の実施形態は、脳卒中、脳性麻痺、外傷または神経変性疾患から選択される、ＨＩＦ経路の活性化に反応性のある疾病または疾患の処置における式（Ｉ）の化合物の使用の方法に言及している。
【０１５３】
本明細書に開示される１つの実施形態は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、糖尿病性および慢性の創傷、臓器移植、急性腎障害または動脈疾患から選択される、ＨＩＦ経路の活性化に反応性のある疾病または疾患の処置の方法に言及し、前記方法は、本明細書で上に記載されたような、有効な量の式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を、前記処置を必要としている個体に投与する工程を含む。好ましい実施形態では、前記疾患は、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、臓器移植、急性腎障害または動脈疾患から選択される。
【０１５４】
本明細書に開示される別の実施形態は、ＨＩＦ経路の活性化に反応性のある疾病または疾患の処置の方法に言及し、前記方法は、本明細書で上に記載されるような、有効な量の式（Ｉ）の化合物あるいはそのアナログ、誘導体、互変異性型、異性体、立体異性体、多形体、薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を、前記処置を必要としている個体に投与する工程を含む。
【０１５５】
本明細書に開示される１つの実施形態では、ＨＩＦ経路の活性化に反応性のある疾病または疾患は、限定されないが、脳卒中、脳性麻痺、外傷および神経変性疾患を含む。神経変性疾患の例としては、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病または多発性硬化症が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、ＰＨＤ２（ＰＤＢ  ４ＢＱＷ）に結合したベツリン酸（図１のＡ）および化合物ＶＩＩ（図ＩのＢ）上位スコアの立体配座を示す。
【図２】図２は、ＨａＣａＴ−ＥＰＯ  Ｌｕｃケラチノサイト細胞におけるＨＩＦ−１αトランス活性化アッセイを示す。図２はまた、ＨａＣａＴ−ＥＰＯ−Ｌｕｃ細胞におけるＤＦＸおよび化合物ＩＩ−ＸＶの低酸素模倣効果を示す。試験済みの化合物の濃度（μΜ）はＸ軸で示され、ＨＩＦ−１α活性化のパーセンテージはＹ軸で示される。この図は、ＤＦＸ（１５０μΜ）によって媒介された誘発を未処置の細胞と比較した１００％の活性化として考慮した、ＥＰＯ−ｌｕｃ活性に対するＤＦＸ対化合物（図２のＡ）ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、（図２Ｂ）ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶおよびＸＶの効果を示す。
【図３】図３は、オリゴデンドロサイトにおけるＨＩＦ−１α安定化を示す。図３はまた、ウエスタンブロットによってＨＩＦ−１αおよびβ−アクチンの発現を判定するための、１５０μＤＦΧまたは１０μΜのオレアノール酸（ＯＡ）、化合物ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ（図３のＡ）、ベツリン酸（ＢＡ）、化合物ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ（図３のＢ）、ウルソール酸（ＵＡ）、マスリン酸（ＭＡ）、化合物ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶおよびＸＶ（図３のＣ）での３時間のヒトのオリゴデンドロサイトＭ０１３．３細胞の刺激を示す。
【図４】図４は、２９３Ｔ細胞におけるＨＩＦ−１α安定化を示す。図４はまた、３時間の間の濃度が増加している化合物ＶＩＩまたはＤＦＸ（１５０μΜ）でのヒト胚腎臓２９３細胞の刺激を示す。タンパク質ＨＩＦ−Ια、ＰＨＤ１、ＰＨＤ２およびβ−アクチンの定常状態のレベルを、ウエスタンブロットによって判定した。
【図５】図５は、ｈＩＰＣにおけるＨＩＦ−２α安定化を示す。図５はまた、３時間の間の濃度が増加している化合物ＶＩＩまたはＤＦＸ（１５０μΜ）でのヒト島由来の前駆細胞（ｈＩＰＣ）の刺激およびウエスタンブロットによって判定されたＨＩＦ−２ａ、ＰＨＤ３およびβ−アクチンの発現を示す。
【図６】図６は、化合物ＶＩＩが血管新生を誘発することを示す。図６はまた、７日間、一次線維芽細胞で共培養され、化合物ＶＩＩ（１μΜ）、ｒｈＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＶＥＧＦＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）で別々に刺激された、緑色蛍光のヒト内皮血管細胞（ＨＵＶＥＣ）における血管新生のモデルとしての内皮細胞管形成の測定値を示す。値は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表わす。
【図７】図７は、インビボでのエリトロポイエチン（ＥＰＯ）に対する化合物ＶＩＩの影響を示す。図７はまた、化合物ＶＩＩ（３０ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／ｋｇ）またはベツリン酸（ＢＡ）（６０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与されたＣ５７ＢＬ／６の雄マウスにおける、マウスＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキットを使用して測定された、血漿中のＥＰＯを示す。対照群は処置を受けなかった。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表わされる。
【図８】図８は、化合物ＶＩＩが、Ｑ７およびＱ１１の線条体細胞において３−ＮＰ毒性を抑止することを示す。Ｑ７およびＱ１１１の線条体細胞を、６時間濃度が増加している化合物ＶＩＩで前処置し、その後、さらに２４時間３−ＮＰ（１０ｍＭ）にさらし、その後、ＹＯＹＯ−１染色を使用して、細胞死を調査した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＨＤソフトウェアを使用して細胞死を判定し、Ｑ１１１細胞における３−ＮＰ単独での処置を１００％の細胞死として考えた。
【図９】図９は、３ＮＰ中毒後の行動スコアを示す。３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）で中毒にしたマウスを、中毒にされていないマウスの対照に対する化合物ＶＩＩ（３０ｍｇ／ｋｇ）および（ＢＡ）（ベツリン酸３０ｍｇ／ｋｇ）での処置後にそれらの神経学的状態を判定するための行動試験にさらした。後肢抱擁（Ｈｉｎｄ  ｌｉｍｂ  ｃｌａｓｐｉｎｇ）、自発運動活性、後肢筋緊張異常および体幹ジストニアを、重症度に基づいて０〜２で評価し、０のスコアは典型的に正常機能を示し、２のスコアは深刻に影響を受けたことを示す。値は、１群当たり６匹の動物に対する平均±ＳＥＭとして表わされる。
【図１０】図１０は、ニューロンの欠損に対する化合物ＶＩＩの効果を示す。図１０はまた、対照（中毒にされていないマウス）、３ＮＰ、３ＮＰ＋ＢＡおよび３ＮＰ＋化合物ＶＩＩを含む、線条体において変性を判定するための３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）で中毒にしたマウスを示す。図１０はまた、マウスの線条体におけるニッスル陽性細胞の定量化を示す。ニューロンの合計の平均数（１００×倍率）が示される。値は、１群当たり６匹の動物に対する平均±ＳＥＭとして表わされる。データを、一元配置分散分析に続いてスチューデント・ニューマン・クールズ検定に使用した。対照群を３ＮＰおよび対照群と比較したときに＊＊＊Ｐ＜０．００１。３ＮＰ群を３ＮＰの＋の化合物ＶＩＩ群と比較したときに＃Ｐ＜０．０５。
【図１１】図１１は、３ＮＰによって誘発された小膠細胞症（Ｉｂａ１＋）およびアストログリオーシス（ＧＦＡＰ＋）に対する化合物ＶＩＩの効果を示す。図１１はまた、対照（中毒にされていないマウス）、３ＮＰ、３ＮＰ＋ＢＡおよび３ＮＰ＋化合物ＶＩＩを含む、ミクログリア活性化およびアストログリオーシスを判定するための３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）で中毒にしたマウスを示す。Ｉｂａ−１およびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現を、マウスの異なる群を介する脳切片の免疫染色によって判定し、異なるマーカーの定量化を、Ｉｍａｇｅ  Ｊのソフトウェアで実行した。ミクログリア（Ｉｂａ１＋）およびアストロサイト（ＧＦＡＰ＋）の合計の平均数が示される。
【図１２Ａ】図１２Ａは、化合物ＶＩＩが線条体における炎症マーカーｍＲＮＡ上の発現を低減させることを示す。ＩＬ−６の炎症マーカーの遺伝子発現を、３ＮＰ＋ビヒクルマウスと比較した３ＮＰ＋化合物ＶＩＩ（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスにおいてダウンレギュレートした。ベツリン酸（ＢＡ）での処置（３０ｍｇ／ｋｇ）は、炎症マーカーの発現も阻害した。発現レベルを、２−ΔΔＣｔ法を使用して計算した。値は、１群当たり６匹の動物に対する平均±ＳＥＭとして表わされる。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、化合物ＶＩＩが線条体における炎症マーカーｍＲＮＡ上の発現を低減させることを示す。  ＩＬ−１βの炎症マーカーの遺伝子発現を、３ＮＰ＋ビヒクルマウスと比較した３ＮＰ＋化合物ＶＩＩ（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスにおいてダウンレギュレートした。  ベツリン酸（ＢＡ）での処置（３０ｍｇ／ｋｇ）は、炎症マーカーの発現も阻害した。  発現レベルを、２−ΔΔＣｔ法を使用して計算した。  値は、１群当たり６匹の動物に対する平均±ＳＥＭとして表わされる。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、化合物ＶＩＩが線条体における炎症マーカーｍＲＮＡ上の発現を低減させることを示す。  ｉＮＯＳを含む炎症マーカーの遺伝子発現を、３ＮＰ＋ビヒクルマウスと比較した３ＮＰ＋化合物ＶＩＩ（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスにおいてダウンレギュレートした。  ベツリン酸（ＢＡ）での処置（３０ｍｇ／ｋｇ）は、炎症マーカーの発現も阻害した。  発現レベルを、２−ΔΔＣｔ法を使用して計算した。  値は、１群当たり６匹の動物に対する平均±ＳＥＭとして表わされる。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、化合物ＶＩＩが線条体における炎症マーカーｍＲＮＡ上の発現を低減させることを示す。  ＣＯＸ−２の炎症マーカーの遺伝子発現を、３ＮＰ＋ビヒクルマウスと比較した３ＮＰ＋化合物ＶＩＩ（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスにおいてダウンレギュレートした。  ベツリン酸（ＢＡ）での処置（３０ｍｇ／ｋｇ）は、炎症マーカーの発現も阻害した。  発現レベルを、２−ΔΔＣｔ法を使用して計算した。  値は、１群当たり６匹の動物に対する平均±ＳＥＭとして表わされる。
【図１３Ａ】図１３Ａは、高脂肪食（ＨＦＤ動物）を与えたマウスにおける体重、体脂肪量および脂肪症に対する化合物ＶＩＩの効果を示す。マウスに１３週間ＨＦＤを与え、マウスを２１日間化合物ＶＩＩ（３０ｍｇ／ｋｇ）で毎日処置し、体重に対する効果を３−４日ごとにモニタリングした。体脂肪量および脂肪症のパーセンテージを、週１５で計算した。身体組成を、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）によって評価した。値は、１群当たり１０匹の動物に対する平均±ＳＥＭとして表わされる。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、高脂肪食（ＨＦＤ動物）を与えたマウスにおける体重、体脂肪量および脂肪症に対する化合物ＶＩＩの効果を示す。  ％除脂肪量を、脂肪が原因の比率のない身体の全重量の比率として計算した。  体脂肪量および脂肪症のパーセンテージを、週１５で計算した。  身体組成を、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）によって評価した。値は、１群当たり１０匹の動物に対する平均±ＳＥＭとして表わされる。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、高脂肪食（ＨＦＤ動物）を与えたマウスにおける体重、体脂肪量および脂肪症に対する化合物ＶＩＩの効果を示す。  ％体脂肪量を、全体重に対する脂肪の比率として計算している。  体脂肪量および脂肪症のパーセンテージを、週１５で計算した。  身体組成を、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）によって評価した。値は、１群当たり１０匹の動物に対する平均±ＳＥＭとして表わされる。
【図１４】図１４は、化合物ＶＩＩがＨＦＤ動物における耐糖能（ＧＴＴ）を改善することを示す。図１４はまた、３週間のビヒクル（対照、ＣＤ）または化合物ＶＩＩの投与（３０ｍｇ／ｋｇ）後のＨＦＤを与えたマウスのＧＴＴを示す。各動物に対応する０、１５、３０、４５、６０、９０および１２０分の時間点の間の台形領域（ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ  ａｒｅａ）の合計を集約し、曲線下面積（ＡＵＣ）を得た。相対的な面積値は、ビヒクルコホートの平均ＡＵＣに対するパーセンテージとして表わされ、これは１００％として定義される。値は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（ｎ＝６）として表わされる。
【図１５】図１５は、化合物ＶＩＩがＨＦＤ動物における高トリグリセリド血症を防ぐことを示す。図１５はまた、３週間のビヒクル（対照、ＣＤ）または化合物ＶＩＩの投与（３０ｍｇ／ｋｇ）後の対照およびＨＦＤを与えたるマウスにおける血漿トリグリセリドのレベルを示す。値は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（ｎ＝６）として表わされる。
【実施例】
【０１５７】
以下に記載される本発明の実施例は、その保護の範囲を制限せずに、その好ましい実施形態を例示することを目的とする。
実施例１．式（Ｉ）および比較化合物ＸＸのトリテルペノイド誘導体の合成。
式（Ｉ）のＮ−ヒドロキシ−トリテルペン−２８−アミド誘導体の一般的な合成（ヒドロキサメート形成）：
乾燥したジクロロメタン（ＤＣＭ）中のトリテルペン酸前駆体（１当量／ｍｏｌ）の氷冷溶液に、塩化オキサリル（６当量／ｍｏｌ）を液滴で加え、混合物を１．５時間４０℃で加熱した。溶媒を真空内で除去し、残留物を乾燥したピリジンまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤｉＰＥＡ）中に溶解し、塩化ヒドロキシルアンモニウム（６当量／ｍｏｌ）を加えた。反応物を、３時間４０℃で加熱し、２ＮのＨ２ＳＯ４溶液でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して、真空下で蒸発させた。粗製化合物をシリカゲル上に精製した。
【０１５８】
既知の化合物を、可能であるときにそれらのＣＡＳ番号を用いて（ｗｉｔｈ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ）特定する。
【０１５９】
（３β）３−ヒドロキシ−Ｎ−ヒドロキシ−オレアン−１２−エン−２８−アミド（化合物ＩＩ）
ＣＡＳ番号：１８５４９２２−２２−７
オフホワイト固形物（６０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：ｄ：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：ｄ  ＝  ５．４１  ｂｒｔ，  １Ｈ，  Ｈ−  １２），  ３．１９  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １０．０，  ４．８９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．４４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １０．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．０５−１．８６  （ｍ，  ３Ｈ），  １．１６  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．９８  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．９２  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．９０  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．８８  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．８１  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．７８  （ｓ，  ３Ｈ）（単に容易に（ｏｎｌｙ  ｒｅａｄｉｌｙ）、ピークが報告される）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：ｄ  ＝  １７６．７，  １４４．９，  １２３．９，  ７８．９，  ５５．２，  ４７．６，  ４６．４，  ４５．５，  ４２．０，  ４０．８，  ３９．５，  ３８．８，  ３８．６，  ３７．０，  ３４．０，  ３２．９，  ３２．３，  ３２．０，  ３０．７，  ２８．１  ，  ２７．３，  ２７．２，  ２５．８４，  ２３．７，  ２３．６，  ２３．５，  １８．３，  １６．７，  １５．６，  １５．４。
【０１６０】
３−ヒドロキシイミノ−Ｎ−ヒドロキシ−オレアン−１２−エン−２８−アミド（化合物ＩＩＩ）
【０１６１】
化合物ＩＩＩは、本明細書に上述の、一般的な合成スキーム（ヒドロキサメート形成）により得られ、既知の前駆体ＣＡＳ登録番号１７９９０−４２−０から始まる：
【０１６２】
【化３８】
2019519464.tif 000042
【０１６３】
化合物ＩＩＩのＣ位にあるオキシム形成は、ヒドロキサメート形成と同様に、同じ一般的な合成経路中に実行された。
オフホワイト固形物（７０％）。ｌＨ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ＝５．４３（ｂｒｔ，１Ｈ），３．０７（ｂｄｔ，Ｊ＝１４．９，１Ｈ），２．４６（ｍ，１Ｈ），１．９８（ｍ，３Ｈ），１．１３（ｓ，１０Ｈ），１．０７（ｓ，６Ｈ），１．０５（ｓ，３Ｈ），０．８６（ｓ，６Ｈ），０．８２（ｓ，３Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）ｄ＝１７６．７，１６７．５，１４４．９，１２３．８，５５．７，４７．１，４６．２，４５．５，４２．０，４０．８，４０．３，３９．４，３８．４，３７．０，３３．９，３２．９，３１．９，３０．７，２９．７，２９．２，２７．２，２５．７，２５．５，２３．７，２３．５，２３．４，１９．０，１７．３，１６．７，１４．９。
【０１６４】
（３β）３−アセチルオキシ−ｌｌ−オキソ−オレアン−１２−エン−Ｎ−ヒドロキシ−２８−アミド（化合物Ｖ）
【０１６５】
化合物Ｖは、本明細書に上述の一般的な合成スキーム（ヒドロキサメート形成）により、既知の前駆体ＣＡＳ登録番号１４６０５−１７−５から得られた：
【０１６６】
【化３９】
2019519464.tif 000043
【０１６７】
淡黄色固形物（７５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ＝５．６５（ｓ，１Ｈ），４．４７（ｄｄ，Ｊ＝４．８Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３１（ｍ，１Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，２Ｈ），２．３２（ｓ，１Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ），１．１２（ｓ，３Ｈ），０．９１（ｓ，３Ｈ），０．８８（ｓ，６Ｈ），０．８２（ｓ，９Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）ｄ＝２００．５，１７４．４，１７１．２，１６８．４，１２７．８，８０．７，６１．９，５５．０，４５．３，４４．８，４３．６，４３．０，４０．７，３８．７，３８．０，３７．１，３３．８，３２．８，３２．６，３２．１，３０．７，２８．１，２７．３，２３．６，２３．５，２３．４，２３．１，２１．３，１９．０，１７．３，１６．７，１６．３。
【０１６８】
（３β）３−ヒドロキシ−ｌｌ−オキソ−オレアン−１２−エン−Ｎ−ヒドロキシ−２８−アミド（化合物ＩＶ）
【０１６９】
化合物ＩＶを得るために、化合物Ｖの脱アセチルは以下のように実行された：
【０１７０】
【化４０】
2019519464.tif 000044
【０１７１】
ＴＨＦ／ＭｅＯＨ１：１中の化合物Ｖ（３β）３−アセチルオキシ−ｌｌ−オキソ−オレアン−１２−エン−Ｎ−ヒドロキシ−２８−アミド（１ｅｑ／ｍｏｌ）の溶液に、ＮａＯＨ  ４Ｎ（５０ｅｑ／ｍｏｌ）を添加した。その混合物を、４０℃において一晩加熱し、Ｈ２ＳＯ４  Ｓｏｌ．２Ｎでクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４にかざして乾燥させ、真空下で蒸発させた。粗製化合物はシリカゲル上で精製された。
淡黄色固形物（６５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ＝５．６７（ｓ，１Ｈ），３．２０（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），２．７４（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，２Ｈ），２．３２（ｓ，１Ｈ），２．１０−２．０２（ｍ，１Ｈ），１．１８（ｓ，３Ｈ），０．９６（ｓ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ），０．９０（ｓ，９Ｈ），０．７７（ｓ，３Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）ｄ＝２００．２，１７５．８，１６７．９，１２８．０，７８．８，６２．１，５５．０，４５．２，４４．７，４３．６，４０．９，３９．２，３７．３，３３．７，３２．８，３２．７，３２．１，３０．７，２９．７，２８．１，２７．４，２７．３，２３．７，２３．４，２３．３，１９．０，１７．５，１６．２，１５．６，１４．２。
【０１７２】
オレアナ−２，１２−ジエン−Ｎ−ヒドロキシ−２８−アミド（化合物ＶＩ）
【０１７３】
化合物ＶＩは、本明細書に上述の一般的な合成スキーム（ヒドロキサメート形成）に従って得られ、既知の前駆体ＣＡＳ登録番号２７２１０８−０４−０から始まる：
【０１７４】
【化４１】
2019519464.tif 000045
【０１７５】
黄色の油（４８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ＝５．４３−５．３２（ｍ，３Ｈ），２．４４（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ），１．１４（ｓ，３Ｈ），０，９７（ｓ，６Ｈ），０，８７（ｓ，１２Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）ｄ＝１７６．４，１４４．５，１３８．０，１２４．１，１２１．３，５１．９，４６．４，４６．１，４５．５，４２．１，４１．０，４０．７，３９．５，３６．１，３４．５，３４．０，３３．０，３１．９，３１．８，３１．６，３０．７，２７．２，２５．９，２５．７，２３．８，２３．５，２２．９，１９．６，１６．３，１５．６。
【０１７６】
（３β）３−ヒドロキシ−Ｎ−ヒドロキシ−ルパ−２０（２９）−エン−２８−アミド（化合物ＶＩＩ）
【０１７７】
ＣＡＳ登録番号：１８２２３７５−０７−４
オフホワイト固形物（５５％）。１ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ：４．７３（ｓ，１Ｈ），４．６０（ｓ，１Ｈ），３．２０−３．１５（ｍ，１Ｈ），３．０５（ｄｄｄ，Ｊ＝ｌ１．４，６，４．４９Ｈｚ，１Ｈ），１．６７（ｓ，３Ｈ），０．９５（ｓ，６Ｈ），０．９２（ｓ，３Ｈ），０．８０（ｓ，３Ｈ），０．７４（ｓ，３Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ：１７５．２，１５０．９，１０８．５，７８．４，５５．７，５４．３，５０．８，５０．７，４６．７，４２．３，４０．７，３８．７，３８．２，３７．８，３７．１，３６．９，３４．３，３２．６，３０．７，２９．３，２７．８，２６．９，２５．５，２０．８，１９．２，１８．２，１６．０，１５．９，１５．２，１４．５。
【０１７８】
ルパ−２−エノ［２，３−ｄ］イソオキサゾール−Ｎ−ヒドロキシ−２８−アミド（化合物ＶＩＩＩ）
【０１７９】
化合物ＶＩＩＩは、本明細書に上述の一般的な合成スキーム（ヒドロキサメート形成）に従って得られ、既知の前駆体ＣＡＳ登録番号６２０９５８−４３−２から始まる：
【０１８０】
【化４２】
2019519464.tif 000046
【０１８１】
白色固形物。１ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：ｄ＝１０．３６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３２（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），８．２６（ｓ，１Ｈ），４．６７（ｓ，１Ｈ），４．５５（ｓ，１Ｈ），３．００（ｔ，Ｊ＝９．３  Ｈｚ，１Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝１２．０  Ｈｚ，１Ｈ），１．６４（ｓ，３Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ），１．２２（ｓ，３Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ），０．７４（ｓ，３Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）ｄ＝１７２．６，１５１．３，１５１．０，１０９．９，１０９．４，５４．０，５３．３，５０．６，４９．０，４８．９，４６．７，４２．４，３８．９，３７．３，３５．６，３４．８，３３．４，３２．６，３０．９，２９．０，２５．７，２１．７，１９．５，１８．７，１６．４，１６．２，１４．８。
【０１８２】
ｌ’Ｈ−ルパ−２０（２９）−エノ［３，２−ｃ］ピラゾール−Ｎ−ヒドロキシ−２８−アミド（化合物ＩＸ）
【０１８３】
化合物ＩＸは、本明細書に上述の一般的な合成スキーム（ヒドロキサメート形成）により得られ、既知の前駆体ＣＡＳ登録番号１３３４３８６−３１−０から始まる：
【０１８４】
【化４３】
2019519464.tif 000047
【０１８５】
淡黄色固形物。ｌＨ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＣＯ）：ｄ＝７．１７（ｓ，１Ｈ），４．７２（ｓ，１Ｈ），４．５８（ｓ，１Ｈ），３．２０−３．１３（ｍ，１Ｈ），２．６９−２．６１（ｍ，１Ｈ），１．６９（ｓ，３Ｈ），１．２８（ｓ，３Ｈ），１．１８（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ），０．９８（ｓ，３Ｈ），０．８０（ｓ，３Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＣＯ）ｄ＝１７２．４，１５１．０，１４９．１，１３２．８，１１１．９，１０９．０，５９．７，５０．０，５３．７，５０．５，４９．２，４６．８，４２．２，４０．７，３８．６，３７．９，３７．７，３６．６，３３．５，３３．４，３２．３，３０．８，３０．６，２５．７，２３．３，２１．４，１９．１，１８．７，１５．６，１４．２，１３．７。
【０１８６】
ルパ−２，２０（２９）−ジエン−Ｎ−ヒドロキシ−２８−アミド（化合物Ｘ）
【０１８７】
化合物Ｘは、本明細書に上述の一般的な合成スキーム（ヒドロキサメート形成）により得られ、既知の前駆体ＣＡＳ登録番号１７３１０６−１９−９から始まる：
【０１８８】
【化４４】
2019519464.tif 000048
【０１８９】
淡黄色固形物（５４％）１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ＝５．３８−５．２８（ｍ，２Ｈ），４．６９（ｓ，１Ｈ），４．５６（ｓ，１Ｈ），３．０１（ｔ，Ｊ＝１０．７  Ｈｚ，１Ｈ），２．３７（ｔ，Ｊ＝１２．１  Ｈｚ，１Ｈ），１．６３（ｓ，３Ｈ），１．２１（ｓ，３Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ），０．８９（ｓ，３Ｈ），０．８２（ｓ，３Ｈ），０．８１（ｓ，３Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）ｄ＝１７５．０，１５０．５，１３７．９，１２１．６，１０９．６５，５４．３，５２．１，５０．４，４９．２，４２．３，４０．８，３８．４，３７．９，３６．４，３４．６，３３．５，３２．８，３１．７，３０．９，３０．８，２９．７，２９．３，２５．６，２２．６，１９．５，１６．４，１５．８，１４．６，１４．５，１４．３。
【０１９０】
３−ヒドロキシイミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ルパ−２０（２９）−エン−２８−アミド−工程（ｂ）−（化合物ＸＩ）
【０１９１】
本明細書に上述の一般的な合成スキーム（ヒドロキサメート形成）に先立ち、ベツリン酸のＣ−３位にある水酸基の、カルボニル基への転化が以下のように実行された：
【０１９２】
【化４５】
2019519464.tif 000049
【０１９３】
アセトン／ＥｔＯＡｃ５：５（１０ｍＬ）中のベツリン酸溶液（１ｇｒ、２．１９ｍｍｏｌ）に、出発物質の消失まで、ジョーンズ試薬を添加した（ＴＬＣによる制御）。応答物をブラインで洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を、Ｎａ２Ｓ０４にかざして乾燥させ、真空下で蒸発させ、および粗製物はシリカゲル（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ９：１）、３−オキソ−ルパ−２０（２９）−エン−２８−酸（化合物ＸＶＩ；ＣＡＳ登録番号：４４８１−６２−３）（８９％）上でオフホワイト固形物として精製された。
その後、化合物ＸＩを得るために、本明細書に上述の一般的な合成スキームに従って、ヒドロキサメート形成を実行するために化合物ＸＶＩが使用された。
オフホワイト固形物（６５％）。ｌＨ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ＝４．７３（ｓ，１Ｈ），４．６１（ｔ，Ｊ＝６．１  Ｈｚ，１Ｈ），３．０４−３．００（ｍ，２Ｈ），２．３２（ｓ，１Ｈ），１．６８（ｓ，３Ｈ），１．２４（ｓ，６Ｈ），１．２２（ｓ，３Ｈ），１．１２（ｓ，３Ｈ），０．９７（ｓ，３Ｈ），０．９６（ｓ，３Ｈ），０．９１（ｓ，３Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１７７．３，１６７．３，１５０．５，１０９．６，５５．６，５５．０，５０．３，５０．２，４６．８，４２．５，４０．８，４０．２，３８．７，３８．２，３７．９，３７．２，３４．０，３３．３，３０．８，２９．４，２７．４，２５．６，２２．９，２１．５，２１．２，１９．４，１９．１，１６．１，１５．８，１４．６。
【０１９４】
（３β）３−ヒドロキシ−Ｎ−ヒドロキシ−ウルス−１２−エン−２８−アミド（化合物ＸＩＩ）
【０１９５】
ＣＡＳ登録番号：９１５４１５−６１−１
オフホワイト固形物（５５％）。ｌＨ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ＝５．３４（ｂｒｔ，１Ｈ，Ｈ−１２），３．１８（ｄｄ，Ｊ＝９．５，３．９Ｈｚ，１Ｈ），２．０９−１．９２（ｍ，３Ｈ），１．０６（ｓ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ），０．９０（ｄ，Ｊ＝３．２  Ｈｚ，３Ｈ），０．８７（ｄ，Ｊ＝７．８  Ｈｚ，３Ｈ），０．８０（ｓ，３Ｈ），０．７８（ｓ，３Ｈ），０．７５（ｓ，３Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ＝１７６．８，１４０．１，１２６．６，１２６．６，７９．０，５５．１，５２．２，４７．５，４２．４，３９．５，３９．５，３９．０，３８．８，３６．９，２８．１，２５．７，２３．３，２１．２，１７．２，１６．７，１５．７，１５．５。
【０１９６】
３  ヒドロキシイミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ウルス−１２−エン−２８−アミド（化合物ＸＩＩＩ）
【０１９７】
特許ＣＮ１０２１８０９３９に開示された化合物。前記化合物は、化合物ＸＩへの類似の合成を行うウルソール酸から調製された。そこでは、第一の工程で、ジョーンズ試薬を用いたＣ−３ヒドロキシルのカルボニルへの転化が行なわれ、続いて、化合物ＸＩＩＩを得るために、本明細書に上述の一般的合成スキームに従ってヒドロキサメート形成が行われた。
淡黄色固形物（７０％）。１ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ＝５．４０（ｂｒｔ，１Ｈ），３．０７（ｂｄｔ，Ｊ＝１５．６，１Ｈ），２．１２（ｍ，１Ｈ），１．２４（ｓ，３Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．０８（ｓ，３Ｈ），１．０６（ｓ，３Ｈ），１．０３（ｓ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ），０．８１（ｓ，３Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）ｄ＝１７７．３，１６７．７，１４０．６，１２６．５，５５．７，５２．１，４７．０，４２．５，４０．２，３９．６，３９．４，３９．０，３８．５，３７．０，３６．７，３２．２，３０．６，２９．７，２７．７，２７．４，２４．８，２３．５，２３．４，２３．３，２１．１，１９．０，１７．３，１７．２，１６．８，１５．１。
【０１９８】
（２α，３β）２，３−ジヒドロキシ−Ｎ−ヒドロキシ−オレアン−１２−エン−２８−アミド（化合物ＸＩＶ）
【０１９９】
化合物のＸＩＶは、本明細書に上述の一般的な合成スキーム（ヒドロキサメート形成）により得られ、既知の前駆体ＣＡＳ登録番号６０８９−９２−５から始まる：
【０２００】
【化４６】
2019519464.tif 000050
【０２０１】
化合物ＸＩＸは、化合物ＸＩＶを得るために脱アセチルされた：
【０２０２】
【化４７】
2019519464.tif 000051
【０２０３】
オフホワイト固形物（４５％）。１Ｎ  ＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ＝５．４４（ｂｒｔ，１Ｈ），３．７２−３．６１（ｍ，１Ｈ），２．９９（ｄ，Ｊ＝９．５  Ｈｚ，１Ｈ），２．４５（ｄ，Ｊ＝１２．２  Ｈｚ，１Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ），０．９８（ｓ，３Ｈ），０．９０（ｓ，３Ｈ），０．８７（ｓ，３Ｈ），０．８２（ｓ，３Ｈ），０．７８（ｓ，３Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ＝１７５．９，１４４．０，１２３．６，８３．７，６８．２，５５．０，４７．３，４６．２，４６．１，４５．６，４１．２，４１．０，３９．０，３８．７，３７．８，３３．６，３２．６，３２．４，３２．３，３１．４，２８．５，２７．４，２７．３，２３．２，２３．１，２２．８，１８．６，１６．３，１６．５，１６．１。
【０２０４】
２−ヒドロキシ−３−オキソ−オレアナ−ｌ，１２−ジエン−Ｎ−ヒドロキシ−２８−アミド（化合物ＸＶ）
【０２０５】
本明細書に上述の一般的な合成スキーム（ヒドロキサメート形成）に先立ち、ＣＡＳ登録番号１３８２９２３−７５−２を有する既知のマスリン酸誘導体の、Ｃ−２位の水酸基のアセチル化が、以下のように実行された：
【０２０６】
【化４８】
2019519464.tif 000052
【０２０７】
乾燥したピリジン（１ｇｒ酸当たり１０ｍＬ）中の既知のマスリン酸誘導体（１ｅｑ／ｍｏｌ）の溶液に、無水酢酸（２ｅｑ／ｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．１ｅｑ／ｍｏｌ）を連続して添加した。その反応を、出発物質の消失まで室温で撹拌し（ＴＬＣによる制御）、メタノールでクエンチし、Ｈ２ＳＯ４  Ｓｏｌ．２Ｎで希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２Ｓ０４にかざして乾燥させ、さらなる精製を行うことなく化合物ＸＶＩＩを供給するために真空下で蒸発させた。
その後、本明細書に上述の一般的な合成スキームに従って、ヒドロキサメート転化を実行するために化合物ＸＶＩＩが以下のように使用された：
【０２０８】
【化４９】
2019519464.tif 000053
【０２０９】
化合物ＸＶＩＩはその後、化合物ＸＶを得るために以下のように脱アセチルされた：
【０２１０】
【化５０】
2019519464.tif 000054
【０２１１】
ＴＨＦ／ＭｅＯＨ１：１中の化合物ＸＶＩＩ（１ｅｑ／ｍｏｌ）の溶液に、ＮａＯＨ４Ｎ（５０ｅｑ／ｍｏｌ）を添加した。その混合液を、４０℃で一晩加熱し、Ｈ２ＳＯ４  Ｓｏｌ．２Ｎでクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４にかざして乾燥させ、真空下で蒸発させた。粗製物をシリカゲル上で精製した。
淡黄色固形物（６９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：ｄ＝６．３１（ｓ，１Ｈ），５．４７（ｂｒｔ，１Ｈ），２．４６（ｄ，Ｊ＝１１．３  Ｈｚ，１Ｈ），１．２０（ｓ，３Ｈ），１．１９（ｓ，３Ｈ），１．１３（ｓ，３Ｈ），１．１０（ｓ，３Ｈ），０．８８（ｓ，３Ｈ），０．８６（ｓ，６Ｈ），（ごく簡単にピークのみを報告する）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）ｄ＝２０１．０，１７６．４，１４５．２，１４３．８，１２７．８，１２３．２，５３．７，４６．１，４５．５，４４．０，４３．１，４２．４，４０．９，４０．１，３８．４，３３．９，３２．９，３２．０，３０．７，２７．１，２７．０，２５．８，２３．６，２３．４，２１．９，２０．８，１９．６，１８．７，１７．１，１４．２。
【０２１２】
比較として、化合物ＸＸが、保護基を必要とすることなく、Ｔ３Ｐ／トリエチルアミンプロトコルを使用することにより、グリシレチン酸（ＧＡ）から合成された（Ｅｃｈ−Ｃｈａｈａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００５，４６：５１１３−５１１５）。
【０２１３】
【化５１】
2019519464.tif 000055
【０２１４】
インシリコアッセイ
【０２１５】
実施例２  ＰＨＤ２結合親和性インシリコの計算
【０２１６】
分子構造は、ＰｕｂＣｈｅｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から得た、あるいはＭａｒｖｉｎＳｋｅｔｃｈ（ＣｈｅｍＡｘｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて設計された。使用された受容体モデルはＰＤＢ参照４ＢＱＷであった。結合特性は、ＡｕｔｏＤｏｃｋ４（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．  ２００９  Ｄｅｃ；３０（１６）２７８５−９１）およびＶｉｎａ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．  ２０１０  Ｊａｎ  ３０；３１（２）：４５５−６１）を、仮想スクリーニングツールと共に使用することによって算出された。受容分子表面の周囲の、ドッキングのための検索スペースは、様々なＰＨＤ２配位子のための複数の結合部位に関するこれまでの発見に従って設定された（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＭＨ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１３  Ｄｅｃ  １２；５６（２３）：９３６９−４０２５）。
【０２１７】
一旦分析が行なわれると、ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｖｉｎａは、両分子間の相互作用による分子間エネルギーの合計である推定の結合親和性値、および、適切に相互作用表面を取り付けるためにこれらの分子によって取り入れられた配座によるねじれの自由エネルギーペナルティを提供する。負の値は、結合が熱力学的に安定していることを示し、一方で正の値は不安定であることを意味する。
【０２１８】
表１は、本発明に記載の化合物に対する、およびさらに陽性対照（ＩＯＸ−２）、陰性対照（グリチルレチン酸）に対する、ＰＨＤ２結合エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を示す。４ＢＱＷ構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋより）を使用するＡｕｔｏＤｏｃｋ−Ｖｉｎａにより得た平均値が示される。３つの独立した実験からの平均値が示される。
【０２１９】
【表１】
2019519464.tif 000056
【０２２０】
表１．トリテルペノイドおよび誘導体の、ＰＤＨ２へのエネルギー結合。ＰＨＤ２結合エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。４ＢＱＷ構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋより）を使用するＡｕｔｏＤｏｃｋ／Ｖｉｎａにより得た平均値。３つの独立した実験から得た平均値が示される。
【０２２１】
検索スペースは、残基Ｈ３１３、Ｄ３１５、Ｈ３７４、Ｒ３８３、Ｙ３０３、Ｙ３１０、Ｙ３２９、Ｉ３２７、Ｉ２５６およびＭ２９９のまわりの３００Å量に制限され、３つの軸に沿った１０Ａｍｓｔｒｏｎｇでこれらのスペースをしのぐグリッドを構築することにより主要な結合部位に推薦された（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＭＨ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１３  Ｄｅｃ  １２；５６（２３）：９３６９−４０２５）（図１）。化合物ＶＩＩのために発見された成果としての結合エネルギーは、−６．５５Ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｋｉ１５．７４ｕＭ（２９８．１５°Ｋ）、分子間エネルギー−７．３８Ｋｃａｌ／ｍｏｌ、および原子位置０．０Åからの平均二乗偏差、であり、したがって−４．７６Ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを有し、天然の前駆体ベツリン酸のために発見された結合特性を向上させた。
【０２２２】
インビトロおよびインビボアッセイ。
【０２２３】
実施例３  ＨＩＦ−Ια活性の選択的誘導
【０２２４】
様々な化合物の生物学的活性を調べるために、ＨＩＦ−１αトランスアクチベーションアッセイが、ＮＩＨ−３Ｔ３−ＥＰＯ−Ｌｕｃ細胞（表２）とＨａＣａＴ−ＥＰＯ−ｌｕｃ細胞（図２）の双方において行われた。ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＰＯ−ｌｕｃおよびＨａＣａＴＥＰＯ−ｌｕｃ細胞は、プラスミドＥｐｏ−Ｌｕｃプラスミドを用いて安定にトランスフェクトされた。ＥＰＯ低酸素応答配列（ＨＲＥ）−ルシフェラーゼ・レポータープラスミドは、ルシフェラーゼ遺伝子に融合したエリトロポイエチン遺伝子のプロモーターからの、ＨＲＥコンセンサス配列の３つの複写物を含む。ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＰＯ−ｌｕｃ細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および１％（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で、５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気下で、３７℃で維持された。ＤＦＸはシグマ・オールドリッチ（アメリカ）から購入された。細胞（９６ウェルプレート中にｌｘｌ０４／ウェル）をアッセイの前日に播種した。翌日、オレアノール酸（ＯＡ）、ベツリン酸（ＢＡ）、ウルソール酸（ＵＡ）、マスリン酸（ＭＡ）、グリチルレチン酸（ＧＡ）、化（Ｉ）、ＩＩからＸＶの化合物、または対照化合物ＸＸおよびＣＤＤＯ−Ｍｅのいずれかの高濃度により細胞は刺激された。６時間の細胞への刺激の後、細胞を２５ｍＭのトリス・リン酸塩ｐＨ７．８、８ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１％のトリトンｘ−１００、および７％のグリセロールに１５分間、室温で、水平の振盪機中で溶解した。ルシフェラーゼ活性は、マイクロプレート照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）の説明書に従って、測定された。ＲＬＵが算出され、およびＥＣ５０とＩＲＡ（内因性の相対活量）の値は以下の方程式を使用して、１５０のμΜデフェロキサミン（ＤＦＸ）に対して判定された：ＩＲＡ係数＝（ＥＣ５０−ＤＦＸ  ｘ  Ｅｍａｘ）／（ＥＣ５０  ｘ  Ｅｍａｘ−ＤＦｘ）。ここで、ＥＣ５０とＥｍａｘはアゴニストのＥＣ５０およびＥｍａｘを表わし、ＥＣ５０−ＤＦＸおよびＥｍａｘ−ＤＦＸは、標準的なアゴニストＤＦＸのＥＣ５０とＥｍａｘの値を表わす（表２）。
本発明に含まれる化合物の合成のためのテンプレートとして使用される天然のトリテルペノイド（ＯＡ；オレアノール酸、ＢＡ；ベツリン酸、ＵＡ；ウルソール酸、およびＭＡ；マスリン酸）はいずれも、ＨＩＦ−１α活性の代理マーカーとしてのＥＰＯプロモーターを活性化することができなかった。対照的に、本発明の全てのトリテルペノイド誘導体は、明らかにＨＩＦ−１α経路を活性化した（表２）。さらに、以下の表２に示されるように、式１のオレアノール酸誘導体である化合物ＩＩからＶＩは、ＨＩＦ経路の活性化をもたらし、一方で対照的に、ＣＤＤＯ−Ｍｅなどのオレアノール酸誘導体は、２位（式１のＢ位に対応する）にシアン化物を含み、ＨＩＦ経路の活性化をもたらさない。
したがって、記載された化合物中に導入された化学的修飾は、ＰＨＤ２の酵素活性を抑制するために重要であり、そして結果として、ＨＩＦ経路を活性化するために、ただしタンパク質に化合物を結合するためにではないが、重要であると結論付けることができる。
表２はさらに、ＧＡおよびそのヒドロキサメート誘導体化合物ＸＸがＨＩＦ−１α経路を活性化しないことを示す。したがって、特に、本発明で定義される脊柱の２８位に導入された化学的修飾は、ＰＨＤ２の酵素活性を抑制するために重要であり、および結果として、ＨＩＦ経路を活性化するために、ただしタンパク質に化合物を結合するためにではないが、重要であると結論付けることができる。
【０２２５】
【表２】
2019519464.tif 000057
【０２２６】
表２．ＮＩＨ−３Ｔ３−ＥＰＯ  Ｌｕｃ繊維芽細胞におけるＨＩＦ−１αトランスアクチベーションアッセイ。ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＰＯ−ｌｕｃ細胞株は、Ｅｐｏ−Ｌｕｃプラスミドにより安定にトランスフェクトした。Ｅｐｏ−Ｌｕｃプラスミドは、ルシフェラーゼ遺伝子に融合したエリスロポエチン遺伝子のプロモーターからの、低酸素応答配列コンセンサス配列の３つの複写物を含む。ＨＩＦ−１α活性化に対する効果および効能が示される。
【０２２７】
次に、ケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ−ＥＰＯ−Ｌｕｃなどの他の細胞型中の化合物の活性を調査した。１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および１％（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭの中で、３７℃の５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で細胞を維持した。細胞（２４ウェルプレート、１×１０５／ウェル）をアッセイの前の日に播種し、次に６時間かけてＤＦＸ（１５０μＭ）または高濃度の化合物ＩＩ−ＸＶのいずれかで刺激した。その後、細胞を、ｐＨ７．８の２５ｍＭのトリリン酸塩、８ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１％のトリトンＸ−１００、および７％のグリセリン中に溶解させた。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）の説明書に従って。ＴｒｉＳｔａｒ  ＬＢ  ９４１  ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  （Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を細胞溶解物中で測定した。上記のアッセイは図２によって例示されており、図２はＨａＣａＴ−ＥＰＯ−Ｌｕｃ細胞におけるＤＦＸおよび化合物ＩＩ−ＸＶの低酸素症模倣効果（ｈｙｐｏｘｉｍｉｍｅｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を示す。データは、ＤＦＸ（１５０μＭ）を未処理細胞上での誘発が１００％とみなした、活性化のパーセンテージとして与えられる。未処理細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性の有意な増加は全てのトリテルペノイド誘導体で見られた。
【０２２８】
本発明に記載される化合物の標的選択性をさらに調査するために、ＮＦ−κＢ阻害、ＳＴＡＴ−３阻害、Ｎｒｆ２活性化、およびＴＧＲ５活性化に対する、天然のトリテルペノイド（ＯＡ；ＢＡ、ＵＡ、およびＭＡ）、本発明で開示される式（Ｉ）の化合物ＩＩ−ＸＶ、および比較用化合物ＣＤＤＯ−Ｍｅの効果を分析した。この調査のために、細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３−ＫＢＦ−Ｌｕｃ、ＨｅＬａ−ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ、ＨａＣａＴ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ、およびＣＨＯ−ＴＧＲ５−ＣＲＥ−ｌｕｃをそれぞれ使用した。（主要組織適合遺伝子複合体プロモーターからの）ＮＦ―κＢ結合部位の３つのコピーを含むプラスミドであるＫＢＦ−Ｌｕｃプラスミドで安定してトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３−ＫＢＦ−Ｌｕｃ細胞株は、ルシフェラーゼ遺伝子を駆動する最小のサルウイルス４０プロモーターに融合した。細胞（１×１０４／ウェル）を９６ウェルプレート内に播種し、１５分間かけて高濃度の化合物ＩＩ−ＸＶで処理し、次に３０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで刺激した。６時間後、上で示したように細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を測定した。ＲＬＵを算出し、その結果をＴＮＦαによって誘発したＮＦ−κＢ活性の阻害のパーセンテージ（１００％活性化）として表示した（表３）。
【０２２９】
【表３】
2019519464.tif 000058
【０２３０】
表ＩＩＩ、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ−３、Ｎｒｆ２、およびＴＧＲ５の経路に対する効果。ＮＦ−κＢ阻害（ＩＣ５０）、ＳＴＡＴ−３阻害（ＩＣ５０）、Ｎｒｆ２活性化（ＥＣ５０）および阻害（ＩＣ５０）、ならびにＴＧＲ５活性化（ＥＣ５０）に対する、化合物ＩＩ−ＸＶ、ＯＡ；ＢＡ、ＵＡ、ＭＡ、および比較用化合物のＣＤＤＯ−Ｍｅの効果。細胞株であるＮＩＨ−３Ｔ３−ＫＢＦ−Ｌｕｃ、ＨｅＬａ−ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ、ＨａＣａＴ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ、およびＣＨＯ−ＴＧＲ５−ＣＲＥ−ｌｕｃをそれぞれ使用した。ＩＣ５０およびＥＣ５０のデータが示される。
【０２３１】
ＨｅＬａ−ＳＴＡＴ３−ｌｕｃ細胞をプラスミド４ｘＭ６７  ｐＴＡＴＡ  ＴＫ−Ｌｕｃで安定してトランスフェクトした。細胞（２０×１０３細胞／ｍｌ）を９６ウェルプレート内に播種し、１５分にわたって高濃度の化合物ＩＩ−ＸＩＶおよび比較用化合物ＣＤＤＯ−Ｍｅで処理し、その後、２５ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−γで刺激した。６時間後、上で示したように細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を測定した。ＲＬＵを算出し、結果をＩＦＮ−γによって誘発されたＳＴＡＴ３活性の阻害のパーセンテージ（１００％活性化）として示した（表３）。ＨａＣａＴ−ＡＲＥ−Ｌｕｃ細胞株は、Ｎｑｏ１抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）−Ｌｕｃレポータープラスミドを含む。因子（Ｎｒｆ１、Ｎｒｆ２、Ｎｒｆ３、およびｐ４５  ＮＦ−Ｅ２）のＣＮＣファミリーの全メンバーによって、ＡＲＥを活性化させた。３７℃のＣＯ２インキュベーターにおいて、２５×１０３細胞／ウェルの濃度で、細胞を９６ウェルプレート内で培養した。Ｎｒｆ２活性化を誘導するために、細胞を６時間にわたって高濃度の化合物ＩＩ−ＸＶおよび比較用化合物ＣＤＤＯ−Ｍｅで処理した。陽性対照として、細胞を０．０２ｍＭの抗酸化剤ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドロキノン（ＴＢＨＱ）で処理した。上に示したように、細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性を測定し、ＥＣ５０を算出した（表３）。ＣＨＯ−ＴＧＲ５−ＣＲＥ−Ｌｕｃ細胞を、ｐＴＧＲ５およびＣＲＥ−Ｌｕｃで安定してトランスフェクトした。ＣＲＥ応答性ルシフェラーゼ構成物は、最小の（ｍ）ＣＭＶプロモーター、およびＣＲＥ転写応答配列（ＴＲＥ）の縦列反復の制御下で、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をコード化し、これによりＴＧＲ５アゴニストによって活性化されたｃＡＭＰシグナル経路をモニタリングするのに役立つ。細胞（１×１０４／ウェル）を、９６ウェルプレート内に播種し、６時間かけて高濃度の化合物ＩＩ−ＸＶおよびＣＤＤＯ−Ｍｅで処理した。陽性対照として、細胞を１０μＭのＬＣＡ（リトコール酸）で処理した。上に示したように、細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性を測定し、ＥＣ５０を算出した（表３）。
【０２３２】
化合物は、ＴＮＦαとＩＦＮγによってそれぞれ誘発したＮＦ−κＢおよびＳＴＡＴ３の経路を阻害しなかった。加えて、化合物はＮｒｆ２経路を活性化せず、化合物ＶＩＩＩ、ＸＩ、およびＸＩＩのみがアゴニストＴＧＲ５活性を示した（表３）。これに対して、ＣＤＤＯ−ＭｅはＮＦ−κＢおよびＳＴＡＴ−３シグナル経路を明確に阻害し、Ｎｒｆ２経路を活性化した。この結果によって、シアン基がいくつかの生物学的活性にとって重要であるが、ＨＩＦ−１α経路を活性化するためには必要ではないことがさらに実証された（表３）。
【０２３３】
実施例４、トリテルペノイド誘導体がＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αを安定化させる。
本発明に記載されている化合物によるＨＩＦ−１α安定化の調節についての洞察を得るために、様々な細胞型におけるＨＩＦ−１α発現に対する効果を調査した。ヒトオリゴデンドロサイトＭＯ１３．３細胞を、１５０μのＤＦＸまたは１０μＭのオレアノール酸（Ｏｌｅｎａｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＯＡ）のいずれか、化合物ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ（図３Ａ）、ベツリン酸（ＢＡ）、化合物ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ（図３Ｂ）、ウルソール酸（ＵＡ）、マスリン酸（ＭＡ）、化合物ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、およびＸＶ（図３Ｃ）で３時間刺激した。その後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１０μｇ／ｍｌもロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅ）、１μｇ／ｍｌのペプスタチンおよびアプロチニン、ならびに１μｌ／ｍｌの飽和したＰＭＳＦで補った、５０μｌのＮＰ−４０緩衝液（ｐＨ７．５、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、および１％のＮＰ−４０）内でインキュベートした。遠心分離した後、上澄み液をＳＤＳサンプル緩衝液と混合させ、９５℃で沸騰させた。タンパク質を８−１０％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）内で電気泳動にかけ、ポリフッ化ビニリデン膜へ転写した（膜当たり２０Ｖで３０分間）。ＴＢＳＴ緩衝液中の無脂肪牛乳またはＢＳＡで遮断した後に、一次抗体を添加した。増強された化学発光系（ＵＳＢ）によって検知された、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された適切な二次抗体を用いて、洗浄した膜をインキュベートした。ＨＩＦ−１αに対する抗体（６１０９５９）はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから、抗体、抗β−アクチン（ＡＣ−７４）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【０２３４】
本発明に記載されるすべての化合物は、酸素正常状態（２１％のＯ２）下でＨＩＦ−１αのタンパク質レベルを上昇させた。誘導の範囲は、ＨＩＦ−１αを安定化させることが知られている鉄キレート剤であるデスフェリオキサミン（ＤＦＸ）の誘導の範囲に匹敵した（図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ）。
【０２３５】
次に、ヒト胚腎臓２９３細胞（２９３Ｔ）を、３時間の間、高濃度の化合物ＶＩＩ、またはＤＦＸ（１５０μＭ）で刺激した。その後、タンパク質を単離し、ウエスタンブロットを図３のように実施した。ＨＩＦ−１α（６１０９５９）に対する抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ＵＳＡ）から、抗体、抗ＰＨＤ１（ａｂ８０３６１）および抗ＰＨＤ２（ａｂ１０９０８８）はＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｇｄｅ，  ＵＫ）から、および抗体、抗β−アクチン（ＡＣ−７４）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【０２３６】
その結果によって、本発明に記載される化合物の代表である化合物ＶＩＩがＰＤＨ１およびＰＤＨ２の発現へ影響することなくＨＩＦ−１αの発現を安定化させたことが明確に示される（図４）。
【０２３７】
ＰＤＨ２とＰＤＨ３がさらにＨＩＦ−２αの発現を調節するので、Ｉｎｎｏｐｒｏｔ  ＳＬ（Ｓｐａｉｎ）（文献ｐ１０４７２）から入手したヒト島由来の前駆細胞（ｈＩＰＣｓ）におけるＨＩＦ−２αの安定化に対する化合物ＶＩＩの効果を調査した。ｈＩＰＣｓを、高濃度の化合物ＶＩＩ、またはＤＦＸ（１５０μＭ）で３時間の間刺激した。その後、タンパク質を単離し、ウエスタンブロットを図３のように実施した。ＨＩＦ−２α（ａｂ８３６５）およびＰＨＤ３（ａｂ３０７８２）に対する抗体はＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｇｄｅ，  ＵＫ）から、および抗体、抗β−アクチン（ＡＣ−７４）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した（図５）。その結果によって、本発明に記載される化合物の代表である化合物ＶＩＩがＰＨＤ３の発現へ影響することなくＨＩＦ−２αの発現を安定化させたことが明確に示される（図５）。
【０２３８】
要するに、結果により、化合物ＶＩＩが活性を阻害するＰＤＨ２に結合し、結果として、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αタンパク質レベルが安定化されることが示される。
【０２３９】
実施例５．化合物ＶＩＩによって血管新生が誘発する。
生理学的モデルにおける化合物ＶＩＩの刺激の機能的結果を試験するために、内皮細胞管形成を血管新生のモデルとして測定した。ヒトマトリックス（正常ヒト皮膚線維芽細胞、ＮＨＤＦ）および細管形成の最も初期段階の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖共培養物として、ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒＴＭ  ＧＦＰ  ＡｎｇｉｏＫｉｔ−９６  （Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，  Ｗｅｌｗｙｎ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｃｉｔｙ，  ＵＫ）を供給した。ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ９６ウェル動的血管新生アッセイを製造業者のプロトコルに従って実施した。簡潔に言えば、レンチウイルスで感染した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−ＨＵＶＥＣを、９６ウェルマイクロプレート中でヒト皮膚線維芽細胞と共に共培養した。プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）中に置き、６時間ごとに７日間にわたって相と蛍光の両方の画像を自動的に取得した。１日目では、化合物ＶＩＩ（１および２、５μＭ）またはＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を内皮管網状体上に添加し、その実験を通じて保持した。７日間のアッセイによる管形成を、Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ血管新生分析用モジュール  （Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｏｄｕｌｅ）を使用して定量化した。このモジュールは管長および枝分かれ部位の形成を含む多数のアッセイメトリクスを提供し、網状体の形成に対する血管新生の効果を評価するために使用される。簡潔に言えば、蛍光画像を分析し、インビトロ網状体に非常によく似ているセグメンテーションマスク（ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｍａｓｋ）を生成した。その後、管を形成する事象を具体的に特定するようにマスクを改善し、動的応答をＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）とＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してプロットした。
【０２４０】
図６では、陽性対照（ｒＦＧＦ；１０ｎｇ／ｍｌおよびＶＥＧＦＡ；１０ｎｇ／ｍｌ）と同様に化合物ＶＩＩ１μＭも、ＨＵＶＥＣ細胞の網状体長さを有意に増大させたことが示される。
【０２４１】
実施例６．化合物ＶＩＩがエリスロポエチン（ＥＰＯ）の血漿レベルを増大させる。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は最初に報告され、かつ最も高感度なＨＩＦ標的遺伝子の１つであり；転写レベルで正に調節される。ここでは、調節されたインビボのＥＰＯレベルに対する化合物ＶＩＩの性能を調査した。１６週齢のＣ５７ＢＬ／６のオスのマウスを、ベツリン酸（６０ｍｇ／ｋｇ）または化合物ＶＩＩ（３０ｍｇ／ｋｇもしくは６０ｍｇ／ｋｇ）を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）を処理した。血液サンプルを処理の４時間後に全身麻酔下で採取し、血漿中のＥＰＯの循環レベルを、製造業者の説明書に従ってマウスＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量化した。ＥＰＯ値は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。
【０２４２】
図７に示されるように、マウスにおける、本発明に記載される化合物の代表としての化合物ＶＩＩのインビボ投与（３０および６０ｍｇ／ｋｇ／日）は、循環ＥＰＯ血漿レベルを激しく増大させた。ベツリン酸（ＢＡ）とは対象的に、化合物ＶＩＩの親は、血漿中のＥＰＯのレベルには影響を与えなかった。
【０２４３】
実施例７．線条体細胞における３−ＮＰで誘発された細胞毒性に対する化合物ＶＩＩの効果、およびマウスにおける３−ＮＰで誘発されるハンチントン病の予防。
＜７．１：線条体細胞における３−ＮＰで誘発された細胞毒性に対する化合物ＶＩＩの効果＞
線条体のＱ７およびＱ１１１細胞におけるＨＩＦ活性化が線条体ニューロン（神経保護を提供する）を保護するのに十分であるかを調査するために、３−ＮＰで誘発される死に対する化合物ＶＩＩの効果を調査した。特に、ＳＴＨｄｈＱ７／Ｑ７（線条体のＱ７）およびＳＴＨｄｈＱ１１１／Ｑ１１１（線条体のＱ１１１）細胞における２４時間の３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）暴露に対する化合物ＶＩＩを用いた６時間の事前処理の効果を調査した。
【０２４４】
ＳＴＨｄｈＱ１１１／Ｑ１１１細胞はハンチンチンタンパク質の突然変異型を発現し、ＳＴＨｄｈＱ７／Ｑ７細胞はこのタンパク質の野生型形態を表示する。ＨｄｈＱ１１１／Ｑ１１１（突然変異体）およびＨｄｈＱ７／Ｑ７（野生型）ノックインマウスの同腹子のＥ１４線条体原基から株化されたクローンの線条体細胞株を、ｔｓＡ５８／Ｕ１９の大きなＴ抗原（Ｔｒｅｔｔｅｌ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２０００；９：２７９９−２８０９）を形質導入する複製欠陥レトロウイルスを使用して、不死化した。線条体のＱ７およびＱ１１１細胞を、２５ｍＭのＤ−グルコース、１ｍＭのＬ−グルタミン、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および４００μｇ／ｍＬのジェネテシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で維持し、３３℃で５％のＣＯ２を用いてインキュベートした。
【０２４５】
３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）はミトコンドリア複合体ＩＩ酵素の有力な不可逆阻害剤であり、ミトコンドリアの機能障害および酸化ストレスを引き起こす。
【０２４６】
ＳＴＨｄｈＱ７／Ｑ７およびＳＴＨｄｈＱ１１１／Ｑ１１１細胞（９６ウェルプレート中、１０４細胞／ウェル）を、ＹＯＹＯ−１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でインキュベートし、その後ＰＨＤを阻害するために、陽性対照として３−ＮＰ（１０ｍＭ）およびまたはＤＦＸ（５０μＭ）で処理した。ＹＯＹＯ−１を細胞培養培地内で希釈し、実験ウェルおよび対照ウェルの両方に０．１μＭの最終濃度になるまで添加した。ＹＯＹＯ−１は、傷つけられた原形質膜を有する細胞だけに入り、核ＤＮＡを蛍光で染色することができる細胞非透過性シアニン二量体核酸染色である。損傷した細胞によるＹＯＹＯ−１の取り込みは、ＹＯＹＯ−１蛍光の増加と相関する。処理された細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＦＬＲ撮像システム中に置き、ＹＯＹＯ−１蛍光を３−ＮＰ処理の２４時間後に測定する。インキュベーション時間後に、ＹＯＹＯ−１蛍光陽性細胞の総数および対象（エンドポイント）を含む合計ＤＮＡを計算するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＦＬＲソフトウェアを使用して、対象カウント分析（ｏｂｊｅｃｔ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。ＹＯＹＯ−１蛍光陽性対象の数を、各処理グループの対象を含むＤＮＡの総数で割ることにより、細胞毒性指数を算出し、細胞死のパーセンテージに変換した。
【０２４７】
ＳＴＨｄｈＱ１１１／Ｑ１１１細胞は、３−ＮＰへの曝露に対してＳＴＨｄｈＱ７／Ｑ７細胞よりも高感度であり、化合物ＶＩＩは３−ＮＰで誘発された細胞毒性に対する神経保護の有意なレベルを明確にもたらした（図８）。より狭い範囲までだが、ＤＦＸは３−ＮＰの細胞毒性活性からの細胞も保護した。
【０２４８】
＜７．２：マウスにおける３−ＮＰで誘発されるハンチントン病の予防＞
３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）によるマウスの中毒症状は、ハンチントン病（ＨＤ）の症状のいくつかの態様を思わせる無数の神経学的な影響、生化学的な影響、および組織学的な影響を結果としてもたらす。３ＮＰに処理されたマウスは、（３−ＮＰによる中毒症状のない）対照動物と比較して、後肢抱擁（ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｃｌａｓｐｉｎｇ）、ジストニア、脊柱後弯、および一般的自発運動活性における高いスコアを示した。
【０２４９】
３−ニトロプロピオン酸（３ＮＰ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）に６回注入（３０ｍｇ／ｋｇ；ＰＢＳ中で調製したものを１２時間ごとに１回注入）することにより、１６週齢のＣ５７ＢＬ／６のオスのマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｉｂｅｒｉｃａ，  Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，  Ｓｐａｉｎ）において、線条体神経変性を誘発させた。３ＮＰで処理された動物、および（ＰＢＳを注入された）非病変対照群を、薬理学的試験のために、ベツリン酸（３０ｍｇ／ｋｇ）および化合物ＶＩＩ（３０ｍｇ／ｋｇ）とともに使用した。処理は、５０ｍｇ／ｋｇの試験化合物、またはビヒクル（生理食塩水緩衝液中に１０％のＤＭＳＯおよび６，２％のＴｗｅｅｎ２０）を用いた、２４時間ごとの５回のｉ．ｐ．注入から成り、１回目の３ＮＰを注入する２４時間前に１回目の注入をし、３ＮＰを注入する３０分前に投与量の残りを注入した。神経学的状態を測定するために、マウスに行動試験を受けさせた。一般的自発運動活性、後肢抱擁、およびジストニア、および体幹ジストニアを評価した。調査中の化合物の急性効果を回避するために、全ての行動試験を薬物注入前に実施した。調査中の化合物の急性効果を回避するために、全ての行動試験を薬物注入前に実施し、かつ全ての動物を３ＮＰの最後の注入の１２時間後に安楽死させた。一旦安楽死させたら、動物を解剖し、脳を速やかに摘出した。線条体を解剖するために右半球を使用し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で直ちに凍結し、炎症マーカーをリアルタイムＰＣＲによって分析した。左半球を、４℃で４８時間にわたって新鮮な４％のパラホルムアルデヒド（０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水）中に固定し、組織学的分析のためにパラフィンワックス内に埋め込んだ。
【０２５０】
図９は、化合物ＶＩＩが３−ＮＰの中毒症状によって誘発した臨床症状を明らかに緩和したことを示す。ベツリン酸（ＢＡ）は、より少ない程度ではあるが、いくらかの神経保護の活性も示した。
【０２５１】
次に、３ＮＰ病変マウスの線条体実質組織も、この実験モデルに影響を与える、炎症および神経変性に関係するいくらかの組織学的および分子マーカーを分析するために使用した。これらの３ＮＰで処理された動物の線条体実質組織はニッスル染色された細胞の重要な低下を示し、この低下が３ＮＰにより引き起こされたニューロン死の重要な程度を示し、このニューロン死がベツリン酸（ＢＡ）ではなく化合物ＶＩＩを用いる処理により明確に予防された（図１０）。
【０２５２】
加えて、化合物ＶＩＩを介した神経保護は、Ｉｂａ１およびＧＦＡＰ免疫組織化学的検査により判定されるような、低下した、３ＮＰによって誘発した小膠細胞症およびアストログリオーシスに関係していた（図１１）。この試験のために、３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）によって中毒となったマウスを、非中毒性マウスの対照を含めて（３ＮＰ、３ＮＰ＋ＢＡ、および３ＮＰ＋化合物ＶＩＩ）、ミクログリアの活性化およびアストログリオーシスを測定するために使用した。Ｉｂａ−１およびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現を、マウスの異なるグループを通して脳の部分を免疫染色することにより判定した。様々なマーカーの定量化をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて実施した。ミクログリア（Ｉｂａ１＋）およびアストロサイト（ＧＦＡＰ＋）の総平均数は、図１１内に示される。
【０２５３】
最後に、炎症性酵素ＣＯＸ−２およびｉＮＯｓの発現を、炎症誘発性のサイトカインＩＬ−１βおよびＩＬ−６の発現の増大と平行して、３ＮＰ病変マウスを有意にアップレギュレートした。ＣＯＸ−２（図１２Ｄ）、ＩＬ−１β（図１２Ｂ）、ＩＬ−６（図１２Ａ）、およびｉＮＯＳ（図１２Ｃ）に対するｍＲＮＡ発現を、３ＮＰ＋ビヒクルマウスと比較して、３ＮＰ＋化合物ＶＩＩ（３０ｍｇ／ｋｇ）で処理されたマウスにおいてダウンレギュレートした。ベツリン酸（ＢＡ）処理（３０ｍｇ／ｋｇ）は、炎症マーカーの発現も阻害した（図１２に示されるように）。２−ΔΔＣｔ法を使用して発現レベルを算出した。値は、グループ当たり６匹の動物に対する平均±ＳＥＭとして表わされる。
【０２５４】
実施例８：本発明（例７）において使用されるリアルタイム定量ＰＣＲ。
ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  ＧｍｂＨ）を使用して、線条体（３ＮＰモデル）から全ＲＮＡを分離した。抽出したＲＮＡの合計量を２６０ｎｍでの分光測定によって定量し、その純度を２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度の値の比率から定量した。ゲノムＤＮＡを取り除き、ＤＮＡ汚染を除去した。ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を使用して、最大１μｇの全ＲＮＡ（グループ当たり少なくとも３匹の動物からのプール（ｐｏｏｌ））から、単鎖の相補的ＤＮＡを合成した。反応混合物を、酵素が増幅するまで−２０℃で凍結状態のまま維持した。ＣＯＸ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、およびｉＮＯＳに対するｍＲＮＡ値を定量するために、ｉＱＴＭ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、リアルタイムＰＣＲを実施した。すべてのサンプルにおけるｍＲＮＡ発現値を標準化するために、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子を使用した。２−ΔΔＣｔ法を使用して発現レベルを算出した。オリゴヌクレオチドプライマーの配列は表ＩＶに与えられる。
【０２５５】
【表４】
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【０２５６】
本結果により、脳卒中、脳性麻痺、外傷、多発性硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流傷害、急性肺傷害、臓器移植、急性腎障害、ならびに動脈疾患などの疾病および疾患の臨床管理のための本発明において記載される化合物の治療用途が実証され、それらの処置はＨＩＦ活性化に応答する。
【０２５７】
実施例９．糖尿病および代謝症状の高脂肪食（ＨＦＤ）モデル対する化合物ＶＩＩの効果。
高脂肪食を餌として与えたマウスは、耐糖能障害（ＩＧＴ）および２型糖尿病のために広く使われているモデルである。８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ−Ｆｒａｎｃｅ）を実験のために使用した。水道水および標準的なげっ歯動物の餌に対するアクセスを自由にした制御条件下［１２時間の明暗周期；温度２０℃（±２℃）、および４０−５０％の相対湿度］で、マウスを維持した。順化の１週間後に、マウスを２つのグループへと分け、１５週間で肥満（食餌性肥満、ＤＩＯ）を誘発させるために、標準的な食事−ＣＤ−（Ｃｏｄｅ  Ｕ８２２０Ｇ１０Ｒ，ＳＡＦＥ  Ｄｉｅｔｓ，Ａｕｇｙ，Ｆｒａｎｃｅ）または高脂肪食−ＨＦＤ−（Ｄ１２４５１；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，  ＮＪ）を無制限に与えた。ＤＩＯのモデルにおける化合物ＶＩＩの潜在的で有益な代謝効果を評価するために、化合物（３０ｍｇ／ｋｇの体重）の薬学的投与を、食事暴露の１２から１５週目まで、２４時間ごとに、腹腔内（ｉ．ｐ．）注入により実施した。対照動物は、対応するビヒクル注入（１：１：１８エタノール：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）：生理食塩水）を受けた。
【０２５８】
ＨＦＤ給餌法の有効性を確かなものとし、代謝表現型の向上の観点から化合物の効能を評価するために、ＥｃｈｏＭＲＩ  ７００  ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ｈｏｕｓｔｏｎ，  ＴＸ，  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ．２．０）を使用するＱＭＲ（定量的磁気共鳴）により、太った集団およびやせた集団の身体組成の分析を実施した。この意味で、実験期間の間に３つの時点においてＭＲＩスキャンを撮った：食事暴露を開始する前、給餌法の１２週後（処理の開始と一致）、および実験手順の終了時（食事暴露の１５週目）。加えて、屠殺の５日前に、一晩食物を摂取しないマウスにおいて糖負荷試験（ＧＴＴ）を実施した。そのために、２ｍｇのグルコース／ｇ体重をマウスの腹腔内に注入し、Ａｃｃｕ−ｃｈｅｋ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）血糖値測定器を活用して、注入する前、および注入して３０、６０、および１２０分後に、血中グルコースを測定した。実験終了時に、マウスを屠殺し、ＥＤＴＡを塗った管を使用して血液サンプルを採取し、血漿を−８０℃で保管した。ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｋｉｔ（ＱＣＡ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を使用して、血漿トリグリセリドを測定した。
【０２５９】
化合物ＶＩＩが体重増加（図１３Ａ）体脂肪量の増加（図１３Ｂ）、および肥満症（図１３Ｃ）を緩和したことがわかった。さらに化合物ＶＩＩはＨＦＤマウスにおいて、耐糖能（図１４）を向上させ、トリグリセリド（図１５）の血漿値を標準化した。これらの結果は、ＰＤＨ阻害剤が、ＨＦＤにより誘発された肥満症および糖尿病のマウスモデルにおけるグルコースおよび脂質の代謝を向上させることを示す先の報告書（Ｒａｈｔｕ−Ｋｏｒｐｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ２０１４  Ｏｃｔ；６３（１０）：３３２４−３３）に一致している。したがって、前記結果は、本発明の化合物が糖尿病、または高トリグリセリド血症などの他の関連する代謝症状の処置に有益であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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