(57)【要約】間葉系幹細胞の拡大および増殖、ならびにさまざまな治療的応用に有用な、骨髄間質細胞由来細胞外マトリクスタンパク質抽出物が開示される。2019510823.tif 000006
2019510823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体上で増大しかつ不溶性および可溶性のタンパク質を含む骨髄間質細胞由来細胞外マトリクス（ECM）を含む、ECMタンパク質抽出物であって、ECMが、その上で該ECMが増大した基体に付着しておらず、かつECM中に本来存在する可溶性タンパク質の全部または一部が除去されている、前記抽出物。
【請求項２】
請求項1記載の細胞外マトリクス（ECM）タンパク質抽出物を含む、組成物。
【請求項３】
担体をさらに含む、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
担体がゲル、水性液体、またはセラミック粉末である、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
以下を含む方法によって作製された細胞外マトリクス（ECM）タンパク質抽出物：
（a）生存可能な骨髄間質細胞を得る工程；
（b）基体上で骨髄間質細胞を培養して、基体上に3D ECMを生成させる工程；
（c）ECMから骨髄間質細胞を脱細胞する工程；
（d）基体からECMを物理的に分離させる工程；
（e）ECMを水性成分と攪拌しながら接触させて、ECMの可溶性タンパク質を溶解および解離させる工程；ならびに
（f）ECMの残存する不溶性部分（タンパク質抽出物）から水性成分を取り除く工程。
【請求項６】
基体が細胞培養容器、プラスチック製カバースリップ、またはマイクロキャリアである、請求項1または5記載のECMタンパク質抽出物。
【請求項７】
基体がフィブロネクチンでプレコートされている、請求項1、5、または6のいずれか一項記載のECMタンパク質抽出物。
【請求項８】
以下を含む、細胞外マトリクス（ECM）タンパク質抽出物を作製する方法：
（a）生存可能な骨髄間質細胞を得る工程；
（b）基体上で骨髄間質細胞を培養して、基体上に3D ECMを生成させる工程；
（c）ECMから骨髄間質細胞を脱細胞する工程；
（d）基体からECMを物理的に分離させる工程；
（e）ECMを水性成分と攪拌しながら接触させて、ECMの可溶性タンパク質を溶解および解離させる工程；ならびに
（f）ECMの残存する不溶性部分（タンパク質抽出物）から水性成分を取り除く工程。
【請求項９】
基体が細胞培養容器、プラスチック製カバースリップ、またはマイクロキャリアである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
基体がフィブロネクチンでプレコートされている、請求項8または9記載の方法。
【請求項１１】
間葉系幹細胞（MSC）を請求項2記載の組成物と一緒に培養する工程を含む、MSCを拡大させるための方法。
【請求項１２】
請求項1記載のECMタンパク質抽出物を含む骨形成組成物。
【請求項１３】
担体をさらに含む、請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
担体がゲル、水性液体、またはセラミック粉末である、請求項13記載の組成物。
【請求項１５】
セラミック粉末が、ヒドロキシアパタイトまたはヒドロキシアパタイト/リン酸三カルシウムである、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
請求項12から15のいずれか一項記載の組成物を対象に投与する工程を含む、対象において骨を生じさせる方法。
【請求項１７】
α1-抗プロテイナーゼ、α2-HS-糖タンパク質、α2-HS-糖タンパク質前駆体、α2-マクログロブリン、αアクチニン1、アネキシンA2、バイグリカン、カベオリン1、コラーゲンα1(I）、コラーゲンα1(II）、コラーゲンα1(III）、コラーゲンα1(VI）、コラーゲンα1(XII）、コラーゲンα1(XIV）、コラーゲンα2(I）、コラーゲンα2(V）、コラーゲンα2(VI）、コラーゲンα3(VI）、I型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、デコリン、伸長因子1α、EMILIN-1、エンドプラスミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フィビュリン1、フィビュリン2、ガレクチン1-ホモサピエンス（ヒト）、インターフェロン誘導性GTP結合、ラミン-A/C、ラミニン、LIMドメインおよびアクチン結合タンパク質1、ペントラキシン関連、ペリオスチン、ペリオスチン前駆体（PN）、パールカン、プラスミノーゲン、プレクチン、プロフィリン1、ゴム伸長因子タンパク質、セリンプロテアーゼ、セルピンH1、血清アルブミン、シンデカン1、テネイシン前駆体（TN）（ヒト）、トロンボスポンジン1、トランスフォーミング増殖因子β誘導性タンパク質、トランスゲリン、ビメンチンのうちの1つまたは複数を含む、請求項1または5記載のECMタンパク質抽出物。
【請求項１８】
ECM中に本来存在する除去された可溶性タンパク質の全部または一部が、α1-抗プロテイナーゼ、α2-HS-糖タンパク質、α2-HS-糖タンパク質前駆体、α2-マクログロブリン、αアクチニン1、アネキシンA2、バイグリカン、カベオリン1、コラーゲンα1(I）、コラーゲンα1(II）、コラーゲンα1(III）、コラーゲンα1(VI）、コラーゲンα1(XII）、コラーゲンα1(XIV）、コラーゲンα2(I）、コラーゲンα2(V）、コラーゲンα2(VI）、コラーゲンα3(VI）、I型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、デコリン、伸長因子1α、EMILIN-1、エンドプラスミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フィビュリン1、フィビュリン2、ガレクチン1-ホモサピエンス（ヒト）、インターフェロン誘導性GTP結合、ラミン-A/C、ラミニン、LIMドメインおよびアクチン結合タンパク質1、ペントラキシン関連、ペリオスチン、ペリオスチン前駆体（PN）、パールカン、プラスミノーゲン、プレクチン、プロフィリン1、ゴム伸長因子タンパク質、セリンプロテアーゼ、セルピンH1、血清アルブミン、シンデカン1、テネイシン前駆体（TN）（ヒト）、トロンボスポンジン1、トランスフォーミング増殖因子β誘導性タンパク質、トランスゲリン、ビメンチンのうちの1つまたは複数を含む、請求項1または5記載のECMタンパク質抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本願は、参照によってその内容が本明細書に組み入れられる、2016年3月30日に出願された米国特許仮出願第62/315,460号の恩典を主張する。
【０００２】
A. 発明の分野
本発明は概して、細胞由来細胞外マトリクスおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
B. 関連技術の説明
間葉系幹細胞（MSC）は、微少環境を免疫調節する、血管新生を刺激する、および複数の細胞型を生じるその能力のために、組織修復および再生の促進を含むさまざまな治療的応用で有用であることが示されている。しかしながら、MSC療法に付随する障害の1つは、臨床治療に適切な数のMSCを得ることである。それらの全てが参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、US 8,084,023（特許文献1）、US 8,388,947（特許文献2）、およびUS 8,961,955（特許文献3）に開示されているように、骨髄間質細胞によって産生された細胞外マトリクス（ECM）は増殖を促進し、MSCをその未分化状態で維持することが認められている。これらの特定のECMは、培養ディッシュなどの基体上で増大し、それに付着する。ECMが付着する他の基体には、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるPCT出願第PCT/US2015/058335号（特許文献4）に開示されているように、マイクロキャリアが含まれる。しかしながら、特に、この立体配置の既定の性質、すなわち、ECMは、基体（その上で該ECMが増大する）に物理的に付着するために、このようなECMは現在、他の用途；ECMを補助剤として細胞成長培地内に直接添加すること；ECMを他の生物学的物質または医用デバイスと混合すること（すなわち、骨損傷の部位へ直接的送達される骨置換材料）；ECM産生細胞の付着をもたらしえないECMにより表面をコーティングすること；およびゲル、液体、または粉末、例えばセラミック粉末などの担体内にECMを取り込むことなどに関してその使用が制限されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】US 8,084,023
【特許文献２】US 8,388,947
【特許文献３】US 8,961,955
【特許文献４】PCT/US2015/058335号
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、基体（その上で骨髄間質細胞由来ECMが増大した）に物理的に付着している、すなわち、基体と直接接触している骨髄間質細胞由来ECMの使用に関連する分野における前述の制限および不足点に対する解決策を提供する。この解決策は、基体（その上で骨髄間質細胞由来のECMが増大した）からの該ECMの物理的分離およびその可溶性タンパク質の全部または一部の除去に基づいており、その結果、骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物がもたらされる。本発明の目的のために、前述の骨髄間質細胞ECM（不溶性）タンパク質抽出物は、以下の用語のいずれかと呼ばれるか、またはいずれかによって特定される「骨髄（bone marrow）間質細胞由来細胞外マトリクスタンパク質抽出物」、「骨髄（bone marrow）間質細胞由来ECMタンパク質抽出物」、「骨髄（marrow）間質細胞由来細胞外マトリクスタンパク質抽出物」、「骨髄（marrow）間質細胞由来ECMタンパク質抽出物」、「細胞外マトリクスタンパク質抽出物」、「ECM（不溶性）タンパク質抽出物」、または「ECMタンパク質抽出物」。
【０００６】
本発明の骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、基体（その上で骨髄間質細胞が増大した）にもはや付着していない骨髄間質細胞によって産生された無細胞三次元（3D）マトリクスであり、ここで、ECM中に本来存在する可溶性タンパク質の全部または一部が取り除かれている。驚くべきことに、本発明の骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物が、その可溶性タンパク質が依然として存在する骨髄間質細胞由来ECMタンパク質によるMSC刺激よりも大きなMSC刺激を示したことが発見された。また、本発明の骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、基体（その上で骨髄間質細胞由来ECMが増大した）に依然として付着している骨髄間質細胞由来ECMによるMSC刺激よりも大きなMSC刺激を示した。理論に拘束されるものではないが、骨髄間質細胞由来ECMの可溶性タンパク質は、細胞成長に対して阻害作用を有する可能性がある。
【０００７】
本発明のECMタンパク質抽出物の使用は、基体（その上でECMが増大した）に依然として付着しているECMの使用と比較して多くの利点を有する。非限定的な例には、ECMタンパク質抽出物を補助剤として細胞成長培地内に直接添加すること；ECMタンパク質抽出物を他の生物学的物質または医用デバイスと混合すること（すなわち、骨損傷の部位へ直接的送達される骨置換材料）；表面上でECMを増大させるのではなくECMタンパク質抽出物でさまざまな表面を浸漬被覆すること；および/またはECM産生細胞の付着をもたらしえないECMタンパク質抽出物により表面をコーティングすることが挙げられる。加えて、ECMタンパク質抽出物は、ECMタンパク質抽出物の送達のために、ゲル、液体、粉末、例えばセラミック粉末などの担体内に取り込むことができる。
【０００８】
骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物の重要な治療上の使用は、骨の形成、再生、および結合などの骨組織工学におけるその使用である。本発明の骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、セラミック粉末と組み合わせた場合に、セラミック粉末単独など他の骨再生材料より優れた骨再生をインビボで促進した。
【０００９】
本発明の骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物はまた、培養においてMSCを増殖および拡大させ、培養中MSCを未分化状態で維持するためにも用いることができる。
【００１０】
本発明の1つの局面では、基体上で増大しかつ不溶性および可溶性のタンパク質を含む骨髄間質細胞由来細胞外マトリクス（ECM）を含む、ECMタンパク質抽出物が開示され、ここで、ECMは、基体（その上で該ECMが増大した）に付着しておらず、かつ、ECM中に本来存在している可溶性タンパク質の全部または一部が取り除かれている。
【００１１】
本発明の別の局面では、基体上で増大しかつ不溶性および可溶性のタンパク質を含む骨髄間質細胞由来細胞外マトリクス（ECM）から本質的になる、ECMタンパク質抽出物が開示され、ここで、ECMは、基体（その上で該ECMが増大した）に付着しておらず、かつ、ECM中に本来存在している可溶性タンパク質の全部または一部が取り除かれている。
【００１２】
本発明の別の局面では、基体上で増大しかつ不溶性および可溶性のタンパク質を含む骨髄間質細胞由来細胞外マトリクス（ECM）からなる、ECMタンパク質抽出物が開示され、ここで、ECMは、基体（その上で該ECMが増大した）に付着しておらず、かつ、ECM中に本来存在している可溶性タンパク質の全部または一部が取り除かれている。
【００１３】
本発明の別の局面では、基体上で増大しかつ不溶性および可溶性のタンパク質を含む骨髄間質細胞由来細胞外マトリクス（ECM）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、ECMタンパク質抽出物を含む組成物が開示され、ここで、ECMは、基体（その上で該ECMが増大した）に付着しておらず、かつ、ECM中に本来存在している可溶性タンパク質の全部または一部が取り除かれている。いくつかの態様では、組成物は担体をさらに含む。他の態様では、担体はゲル、水性液体、またはセラミック粉末である。
【００１４】
本発明の別の局面では、以下を含む方法によって作製された骨髄間質細胞由来細胞外マトリクス（ECM）タンパク質抽出物が開示される：
(a)生存可能な骨髄間質細胞を得る工程、
(b)基体上で骨髄間質細胞を培養して、基体上に3D ECMを生成させる工程、
(c)ECMから骨髄間質細胞を脱細胞する工程、
(d)基体からECMを物理的に分離させる工程、
(e) ECMを水性成分と攪拌しながら接触させて、ECMの可溶性タンパク質を溶解および解離させる工程、ならびに
(f)ECMの残存する不溶性部分（タンパク質抽出物）から水性成分を取り除く工程。
【００１５】
本発明の別の局面では、以下を含む、骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物を作製する方法が開示される：
(a)生存可能な骨髄間質細胞を得る工程、
(b)基体上で骨髄間質細胞を培養して、基体上に3D ECMを生成させる工程、
(c)ECMから骨髄間質細胞を脱細胞する工程、
(d)基体からECMを物理的に分離させる工程、
(e) ECMを水性成分と攪拌しながら接触させて、ECMの可溶性タンパク質を溶解および解離させる工程、ならびに
(f)ECMの残存する不溶性部分（タンパク質抽出物）から水性成分を取り除く工程。
【００１６】
上記工程（d）および（e）は、同時に実施することができる。工程（d）における基体からのECMの物理的分離には、ECMの酵素消化は含まれない。一方で、工程（d）における基体からのECMの物理的分離には、スパチュラまたはスクレーパーなどによる基体からのECMの機械的分離；および/またはミキサー、ホモジナイザーもしくは超音波処理器などによる攪拌による基体からのECMの分離が含まれる。工程（e）における攪拌には、超音波処理を用いて実施できる混合もしくは均質化、またはスパチュラもしくはホモジナイザーなどによる物理的混合、または当技術分野において公知の他の混合/均質化技術が含まれうる。
【００１７】
本明細書および特許請求の範囲全体にわたって述べられているように、本発明のECMタンパク質抽出物は、骨髄間質細胞由来ECMを含み、該ECMは、基体（その上で該ECMが増大した）に付着していない。「ECMは、基体（その上で該ECMが増大した）に付着していない」という記載は、例えば、上記工程（b）で用いられる基体に言及している。本発明のある特定の非限定的な態様において、本発明の生成されたECMタンパク質抽出物は、続いて別の基体（例えば、その上で抽出物が増大した基体とは異なる基体）に付着するようにさらに処理されうる。さらなる基体は、その上で抽出物が増大した基体と同じ種類であってもよい。
【００１８】
骨髄間質細胞由来ECM中に本来存在する可溶性タンパク質の全部または一部は、本発明のECMタンパク質抽出物をもたらすECMから除去される。骨髄間質細胞由来ECMを、基体（その上で該骨髄間質細胞由来ECMが増大した）から物理的に分離して、水性成分と攪拌しながら接触させると、ECMは小片に砕かれ、タンパク質の一部はほぐれて、ECMから解離または溶解し、水性成分中にとどまる。攪拌はECMを小片に解体し、さらに、基体に付着させたままECMの表面を単純に洗浄するよりも、ECMと水性成分とのより大きな表面接触を可能にする。この水性成分/可溶性タンパク質混合物は、ECMの不溶性部分から取り除かれる。不溶性部分はECMタンパク質抽出物である。したがって、用語「可溶性タンパク質」は、本発明の文脈で用いられる場合、水溶性タンパク質ならびに水性成分中に懸濁および/または溶解される軽タンパク質およびタンパク質断片を意味する。除去された水性成分/可溶性タンパク質混合物は研究、臨床、および治療適用を有する可能性があることが企図される。
【００１９】
本発明の別の局面では、基体上で増大しかつ不溶性および可溶性タンパク質を含む骨髄間質細胞由来細胞外マトリクス（ECM）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるECMタンパク質抽出物を含む組成物と共にMSCを培養する工程を含む、間葉系幹細胞（MSC）を拡大させるための方法が開示され、ここで、ECMは、基体（その上で該ECMが増大した）に付着しておらず、かつ、ECM中に本来存在する可溶性タンパク質の全部または一部は取り除かれている。
【００２０】
本発明の別の局面では、基体上で増大しかつ不溶性および可溶性タンパク質を含む骨髄間質細胞誘導細胞外マトリクス（ECM）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるECMタンパク質抽出物を含む、骨形成組成物が開示され、ここで、ECMは、基体（その上で該ECMが増大した）に付着しておらず、かつ、ECM中に本来存在する可溶性タンパク質の全部または一部は取り除かれている。いくつかの態様では、組成物は担体をさらに含む。他の態様では、担体はゲル、水性液体、またはセラミック粉末である。さらに他の態様では、セラミック粉末は、ヒドロキシアパタイトまたはヒドロキシアパタイト/リン酸三カルシウムである。
【００２１】
本発明の別の局面では、基体上で増大しかつ不溶性および可溶性タンパク質を含む骨髄間質細胞誘導細胞外マトリクス（ECM）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるECMタンパク質抽出物を含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象において骨を生じさせる方法が開示され、ここで、ECMは、基体（その上で該ECMが増大した）に付着しておらず、かつ、ECM中に本来存在する可溶性タンパク質の全部または一部は取り除かれている。いくつかの態様では、組成物は担体をさらに含む。他の態様では、担体はゲル、水性液体、またはセラミック粉末である。さらに他の態様では、セラミック粉末は、ヒドロキシアパタイトまたはヒドロキシアパタイト/リン酸三カルシウムである。
【００２２】
いくつかの態様では、ECMタンパク質抽出物を作製するために用いられる骨髄間質細胞は、マウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、または霊長類である。他の態様では、骨髄間質細胞はヒトである。他の態様では、骨髄間質細胞はウマである。他の態様では、骨髄間質細胞はマウスである。さらに他の態様では、骨髄間質細胞は単離された骨髄間葉系幹細胞である。
【００２３】
いくつかの態様では、骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、正常酸素圧条件下で作製される。
【００２４】
本発明の以下の態様1〜18もまた開示される。
態様1は、基体上で増大しかつ不溶性および可溶性のタンパク質を含む骨髄間質細胞由来細胞外マトリクス（ECM）を含む、ECMタンパク質抽出物であり、ここで、ECMが、その上で該ECMが増大した基体に付着しておらず、かつ、ECM中に本来存在する可溶性タンパク質の全部または一部が除去されている。
態様2は、態様1の細胞外マトリクス（ECM）タンパク質抽出物を含む組成物である。
態様3は、担体をさらに含む、態様2の組成物である。
態様4は、担体がゲル、水性液体、またはセラミック粉末である、態様3の組成物である。
態様5は、以下を含む方法によって作製された細胞外マトリクス（ECM）タンパク質抽出物である：（a）生存可能な骨髄間質細胞を得る工程；（b）基体上で骨髄間質細胞を培養して、基体上に3D ECMを生成させる工程；（c）ECMから骨髄間質細胞を脱細胞する工程；（d）基体からECMを物理的に分離させる工程；（e）ECMを水性成分と攪拌しながら接触させて、ECMの可溶性タンパク質を溶解および解離させる工程；ならびに（f）ECMの残存する不溶性部分（タンパク質抽出物）から水性成分を取り除く工程。
態様6は、基体が細胞培養容器、プラスチック製カバースリップ、またはマイクロキャリアである、態様1または5のECMタンパク質抽出物である。
態様7は、基体がフィブロネクチンでプレコートされている、態様1、5、または6のいずれか1つのECMタンパク質抽出物である。
態様8は、以下を含む、細胞外マトリクス（ECM）タンパク質抽出物を作製する方法である：（a）生存可能な骨髄間質細胞を得る工程；（b）基体上で骨髄間質細胞を培養して、基体上に3D ECMを生成させる工程；（c）ECMから骨髄間質細胞を脱細胞する工程；（d）基体からECMを物理的に分離させる工程；（e）ECMを水性成分と攪拌しながら接触させて、ECMの可溶性タンパク質を溶解および解離させる工程；ならびに（f）ECMの残存する不溶性部分（タンパク質抽出物）から水性成分を取り除く工程。
態様9は、基体が細胞培養容器、プラスチック製カバースリップ、またはマイクロキャリアである、態様8の方法である。
態様10は、基体がフィブロネクチンでプレコートされている、態様8または9の方法である。
態様11は、間葉系幹細胞（MSC）を態様2の組成物と一緒に培養する工程を含む、MSCを拡大させるための方法である。
態様12は、態様1のECMタンパク質抽出物を含む骨形成組成物である。
態様13は、担体をさらに含む、態様12の組成物である。
態様14は、担体がゲル、水性液体、またはセラミック粉末である、態様13の組成物である。
態様15は、セラミック粉末がヒドロキシアパタイトまたはヒドロキシアパタイト/リン酸三カルシウムである、態様14の組成物である。
態様16は、態様12から15のいずれかの組成物を対象に投与する工程を含む、対象において骨を生じさせる方法である。
態様17は、α1-抗プロテイナーゼ、α2-HS-糖タンパク質、α2-HS-糖タンパク質前駆体、α2-マクログロブリン、αアクチニン1、アネキシンA2、バイグリカン、カベオリン1、コラーゲンα1(I）、コラーゲンα1(II）、コラーゲンα1(III）、コラーゲンα1(VI）、コラーゲンα1(XII）、コラーゲンα1(XIV）、コラーゲンα2(I）、コラーゲンα2(V）、コラーゲンα2(VI）、コラーゲンα3(VI）、I型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、デコリン、伸長因子1α、EMILIN-1、エンドプラスミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フィビュリン1、フィビュリン2、ガレクチン1-ホモサピエンス（ヒト）、インターフェロン誘導性GTP結合、ラミン-A/C、ラミニン、LIMドメインおよびアクチン結合タンパク質1、ペントラキシン関連、ペリオスチン、ペリオスチン前駆体（PN）、パールカン、プラスミノーゲン、プレクチン、プロフィリン1、ゴム伸長因子タンパク質、セリンプロテアーゼ、セルピンH1、血清アルブミン、シンデカン1、テネイシン前駆体（TN）（ヒト）、トロンボスポンジン1、トランスフォーミング増殖因子β誘導性タンパク質、トランスゲリン、ビメンチンのうちの1つまたは複数を含む、態様1または5のECMタンパク質抽出物である。
態様18は、ECM中に本来存在する除去された可溶性タンパク質の全部または一部が、α1-抗プロテイナーゼ、α2-HS-糖タンパク質、α2-HS-糖タンパク質前駆体、α2-マクログロブリン、αアクチニン1、アネキシンA2、バイグリカン、カベオリン1、コラーゲンα1(I）、コラーゲンα1(II）、コラーゲンα1(III）、コラーゲンα1(VI）、コラーゲンα1(XII）、コラーゲンα1(XIV）、コラーゲンα2(I）、コラーゲンα2(V）、コラーゲンα2(VI）、コラーゲンα3(VI）、I型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、デコリン、伸長因子1α、EMILIN-1、エンドプラスミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フィビュリン1、フィビュリン2、ガレクチン1-ホモサピエンス（ヒト）、インターフェロン誘導性GTP結合、ラミン-A/C、ラミニン、LIMドメインおよびアクチン結合タンパク質1、ペントラキシン関連、ペリオスチン、ペリオスチン前駆体（PN）、パールカン、プラスミノーゲン、プレクチン、プロフィリン1、ゴム伸長因子タンパク質、セリンプロテアーゼ、セルピンH1、血清アルブミン、シンデカン1、テネイシン前駆体（TN）（ヒト）、トロンボスポンジン1、トランスフォーミング増殖因子β誘導性タンパク質、トランスゲリン、ビメンチンのうちの1つまたは複数を含む、請求項1または5記載のECMタンパク質抽出物である。
【００２５】
「哺乳動物」または「哺乳類」という用語には、これらに限定されないが、ネズミ科の哺乳動物（例えば、ラット、マウス）、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ科の哺乳動物（例えば、ウマ、ロバ）、および霊長類（例えば、サル、類人猿、ヒト）が含まれる。本発明の文脈における特定の局面では、哺乳動物は、ネズミ科の哺乳動物、ウマ科の哺乳動物、またはヒトでありうる。
【００２６】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって理解されるようにそれに近いとして定義され、1つに非限定的な態様では、該用語は、10％の範囲内にある、好ましくは5％の範囲内にある、より好ましくは1％の範囲内にある、および最も好ましくは0.5％の範囲内にあると定義される。
【００２７】
「含む（comprising）」（および「含む（comprise）」および「含む（comprises）」など、含む（comprising）の任意の形態）、「有する」（および「有する（have）」および「有する（has）」など、有する（having）の任意の形態）、「含む（including）」（および「含む（includes）」および「含む（include）」など、含む（including）の任意の形態）または「含有する」（および「含有する（contains）」および「含有する（contain）」など、含有する（containing）の任意の形態）という語は、包括的なまたは非限定的なものであり、追加の記載されていない要素または方法の工程を排除しない。
【００２８】
「1つの（a）」または「1つの（an）」という語の使用は、「含む（comprising）」、「有する」、「含む（including）」、または「含有する」（またはこれらの語の任意の変化形）という用語と併用される場合、「1つの（one）」を意味しうるが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」および「1つ以上」の意味とも一致する。
【００２９】
それらの使用のための組成物および方法は、本明細書全体にわたって開示される成分または工程のいずれかを「含む」、それら「から本質的になる」、またはそれら「からなる」ことができる。
【００３０】
本明細書で議論される任意の態様は、本発明の任意の方法または組成物に関して実行できことが企図される、逆の場合も同様である。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために用いることができる。
【００３１】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。一方で、本発明の精神および範囲の範囲内でのさまざまな変更および修正が、この詳細な説明にから当業者に明らかとなるであろうことから、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の態様を示すものの、例示のみを目的として提供されることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ECMタンパク質抽出物、基体上のECM（陽性対照）、可溶性タンパク質を伴うECM、上清、および陰性対照（2-D培養ディッシュ）によるMSC刺激後の総細胞数。
【図２】ECMタンパク質抽出物、基体上のECM（陽性対照）、可溶性タンパク質を伴うECM、上清、および陰性対照（2-D培養ディッシュ）によるMSC刺激後のSSEA4陽性細胞の絶対数。
【図３】さまざまな濃度のECMタンパク質抽出物、陽性対照、および陰性対照によるMSC刺激後の総細胞数。
【図４】さまざまな濃度のECMタンパク質抽出物、陽性対照、および陰性対照によるMSC刺激後のSSEA4陽性細胞の絶対数。
【図５】さまざまな濃度のECMタンパク質抽出物、陽性対照、および陰性対照によるMSC刺激後の総細胞数（ECMのロットが一致している）。
【図６】さまざまな濃度のECMタンパク質抽出物、陽性対照、および陰性対照によるMSC刺激後のSSEA4陽性細胞の絶対数（ECMのロットが一致している）。
【図７】A群（対照）の2週でのX線画像。
【図８】A群（対照）の4週でのX線画像。
【図９】B群（HA/TCP）の2週でのX線画像。
【図１０】B群（HA/TCP）の4週でのX線画像。
【図１１】C群（HA/TCP＋ECMタンパク質抽出物）の2週でのX線画像。
【図１２】C群（HA/TCP＋ECMタンパク質抽出物）の4週でのX線画像。
【図１３】4週後の試験の最初の6匹の動物についてのA群（対照）、B群（HA/TCP）およびC群（HA/TCP＋ECMタンパク質抽出物）のマイクロCT画像。
【図１４】4週後の試験の最初の6匹の動物についてのA群（対照）、B群（HA/TCP）およびC群（HA/TCP＋ECMタンパク質抽出物）のマイクロCT複合画像。
【図１５】4週後の試験の最初の6匹の動物についてのROIにおける骨量。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
A. 骨髄間質細胞由来細胞外マトリクス（ECM）タンパク質抽出物
本発明の骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、骨髄間質細胞によって産生された三次元（3D）ECMであり、ここで、ECMは、基体（その上で該ECMが増大した）に付着しておらず、かつ、ECM中に本来存在する可溶性タンパク質の全部または一部が取り除かれている。よって、骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、元の骨髄間質細胞由来ECMとは異なる構造を有する。
【００３４】
ECMタンパク質抽出物を生成させるために用いられる細胞は、哺乳類骨髄から得られた間質細胞である。骨髄間質細胞は、さまざまな供給源、例えば、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、または他の髄腔から得ることができる。骨髄間質細胞は、関連技術分野における当業者に明らかな一般的な方法によって入手および培養することができる。骨髄間質細胞は、MSCおよび他の細胞、例えば、線維芽細胞、脂肪細胞、マクロファージ、骨芽細胞、破骨細胞、内皮幹細胞、および内皮細胞などを含有する。骨髄中に存在するMSCは骨髄中に存在する他の細胞から単離することができ、単離されたMSCは、骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物を形成するための骨髄間質細胞として用いることができる。骨髄間質細胞はさまざまな哺乳類種に由来しうる。非限定的な例は、ヒト、霊長類、マウス、ウマ、ウサギ、ネコ、イヌ、またはブタである。
【００３５】
骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物はさまざまなタンパク質で構成される。ECMタンパク質抽出物の構成成分は、当技術分野において公知の方法によって特定することができ、免疫組織化学染色および質量分析を含みうる。骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物には、これらに限定されないが、表1に挙げる以下の構成成分が含まれうる。
【００３６】
【表１】
2019510823.tif 000003
2019510823.tif 000004
2019510823.tif 000005
【００３７】
骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、表1の任意の構成成分の任意の組み合わせを含むことができる。
【００３８】
骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、以下の工程によって生成することができる：
（a）生存可能な骨髄間質細胞を得る工程、
（b）基体上で骨髄間質細胞を培養して、基体上に3D ECMを生成させる工程、
（c）ECMから骨髄間質細胞を脱細胞する工程、
（d）基体からECMを物理的に分離させる工程、
（e）ECMを水性成分と攪拌しながら接触させて、ECMの可溶性タンパク質を溶解および解離させる工程、ならびに
（f）ECMの残存する不溶性部分（タンパク質抽出物）から水性成分を取り除く工程。
【００３９】
工程（a）に関して、骨髄間質細胞は、さまざまな供給源、例えば、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、または他の髄腔から得ることができる。骨髄間質細胞は、関連技術分野における当業者に明らかな一般的な方法によって入手および培養できる。骨髄間質細胞は、MSCおよび他の細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、マクロファージ、骨芽細胞、破骨細胞、内皮幹細胞、および内皮細胞などを含有する。骨髄中に存在するMSCは、骨髄中に存在する他の細胞から単離することができ、単離されたMSCは、骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物を形成するための骨髄間質細胞として用いることができる。骨髄間質細胞はさまざまな哺乳類種に由来しうる。非限定的な例は、ヒト、霊長類、マウス、ウマ、ウサギ、ネコ、イヌ、またはブタである。
【００４０】
工程（b）は、それらの全てが参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、US 8,084,023、US 8,388,947、およびUS 8,961,955に開示された培養方法および技術；ならびに当技術分野において公知の他の培養方法および技術を用いて実施することができる。工程（b）のECMの生成、続いて工程（c）におけるECMの脱細胞のための方法に例は以下の通りである：新鮮に単離したマウス大腿骨の骨髄細胞を組織培養プラスチックの上に3×105細胞/cm2で播種し、グルタミン（2 mM）、ペニシリン（100 U/ml）、ストレプトマイシン（100 μg/ml)（Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.）、および15％前選択したウシ胎仔血清（FBS, Atlanta Biologicals, Lawrenceville, Ga.）を追加したα-MEM（Thermo-Fisher Scientific, Grand Island, N.Y.）中で7日間培養する。次いで、細胞を、フィブロネクチンでコートしたTHERMANOX（登録商標）プラスチック製カバースリップの上に1×104細胞/cm2で播種し、上記の補充α-MEM培地中で7日間培養する。次いで、アスコルビン酸（50 μg/ml)（Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.）をさらに8日間、細胞培養に加える。PBSによる広範な洗浄の後、PBS中に20 mM NH4OHを含有する0.5％ Triton X-100との37℃にて5分間のインキュベーションによって、細胞をECMから取り除く。次いで、ECMを100 μg/mlでのDNase（Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.）によって37℃にて1時間処理する。プレートをPBSで3回洗浄し、次いで、50 μg/mlゲンタマイシンおよび0.25 μg/mlファンギゾンを含有する2.0 mlのPBSをプレートに加える。骨髄間質細胞の培養は、正常酸素圧条件下、すわなち、20〜21％大気中酸素下で行うことができ、37℃、5％ CO2、および90％湿度での条件をさらに含みうる。工程（b）における基体は、細胞由来ECMの生成のための細胞培養において用いられる任意の基体になることができる。基体の非限定的な例には、細胞培養容器、例えば、組織培養ディッシュおよびフラスコ、バットおよび反応器；プラスチック製カバースリップ、例えば、THERMANOXカバースリップ；ポリ(ラクチド-Co-グリコリド)基体；合成ヒドロゲル、例えば、ポリアクリルアミド、PEG；コラーゲン性足場；およびマイクロキャリア、例えば、CYTODEX 1が含まれる。基体は、骨髄間質細胞の培養前にフィブロネクチンなどのタンパク質でプレコートされうる。
【００４１】
工程（d）および（e）は同時に実施できる。工程（d）における基体からのECMの物理的分離には、ECMを分離するためのECMの酵素消化は含まれない。一方で、工程（d）における基体からのECMの物理的分離には、スパチュラまたはスクレーパーなどによる基体からのECMの機械的分離；および/またはミキサー、ホモジナイザーまたは超音波処理器などによる攪拌による基体からのECMの分離が含まれる。工程（e）における攪拌は、超音波処理またはスパチュラもしくはホモジナイザーなどによる物理的混合を用いて実施することができる混合もしくは均質化、または当技術分野において公知の他の混合/均質化技術を含みうる。
【００４２】
工程（f）は、遠心分離もしくはろ過、または当技術分野において公知の他の分離方法を用いて実施することができる。
【００４３】
該プロセスは、工程（b）、（c）、（d）、（e）、または（f）の後に放射線照射をさらに含みうる。
【００４４】
骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は滅菌されうる。それは、放射線照射；化学的滅菌、例えば、エチレンオキシド；熱、例えば、オートクレーブ；または他の滅菌手段によって滅菌することができる。骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は凍結乾燥されうる。
【００４５】
骨髄間質細胞のECMを脱細胞することには、生存可能な骨髄間質細胞を取り除くこと、または骨髄細胞を生存不可能にすることが含まれうる。骨髄間質細胞は、当技術分野において公知の方法を用いることによってECMから脱細胞することができ、これらに限定されないが、骨髄間質細胞を溶解し、次いで洗浄によって溶解した骨髄間質細胞を取り除くことを含みうる。さまざまな物質が、ECMから骨髄間質細胞を取り除くために用いることができ、PBS緩衝液中のTRITON X-100および水酸化アンモニウムを含む。ECMが骨髄間質細胞を脱細胞した後、結果として生じるECMは骨髄間質細胞を本質的に含まない。
【００４６】
水性成分は、水、緩衝液などの水溶液、または水性培養培地でありうる。水性成分は酵素を含まなくてもよい。
【００４７】
骨髄間質細胞由来ECM中に本来存在する可溶性タンパク質の全部または一部は、本発明のECMタンパク質抽出物をもたらすECMから取り除かれる。骨髄間質細胞由来ECMを、基体（その上で該ECMが増大した）から物理的に分離して、水性成分と攪拌しながら接触させると、ECMは小片に砕かれ、タンパク質の一部はほぐれて、ECMから解離または溶解し、水性成分中にとどまる。攪拌はECMを小片に解体し、さらに、基体に付着させたままECMの表面を単純に洗浄するよりも、ECMと水性成分とのより大きな表面接触を可能にする。この水性成分/可溶性タンパク質混合物は、ECMの不溶性部分から取り除かれる。不溶性部分はECMタンパク質抽出物である。したがって、用語「可溶性タンパク質」は、本発明の文脈で用いられる場合、水溶性タンパク質ならびに水性成分中に懸濁および/または溶解される軽タンパク質およびタンパク質断片を意味する。除去された水性成分/可溶性タンパク質混合物は研究、臨床、および治療適用を有する可能性があることが企図される。水性成分/可溶性タンパク質混合物中に存在する可溶性タンパク質には、表1の任意の構成成分の任意の組み合わせが含まれうる。
【００４８】
骨髄間質細胞ECMから取り除かれる可溶性タンパク質の量は、ECM中に本来存在する可溶性タンパク質の全部（100％)；または一部、すなわち、95から100％、または90から100％、または85から100％、または80から100％、または75から100％、または70から100％、または65から100％、または60から100％、または55から100％、または50から100％、または45から100％、または40から100％、または35から100％、または30から100％、または25から100％、または20から100％、または15から100％、または10から100％、または5から100％、または1から100％、または85から90％、または80から90％、または75から90％、または70から90 ％、または65から90 ％、または60から90 ％、または55から90％、または50から90％、または45から90％、または40から90％、または35から90％、または30から90％、または25から90％、または20から90％、または15から90％、または10から90％、または5から90％、または1から90％、または75から80％、または70から80％、または65から80 ％、または60から80 ％、または55から80％、または50から80％、または45から80％、または40から80％、または35から80％、または30から80％、または25から80％、または20から80％、または15から80％、または10から80％、または5から80％、または1から80％、または65から70 ％、または60から70 ％、または55から70％、または50から70％、または45から70％、または40から70％、または35から70％、または30から70％、または25から70％、または20から70％、または15から70％、または10から70％、または5から70％、または1から70％、または55から60％、または50から60％、または45から60％、または40から60％、または35から60％、または30から60％、または25から60％、または20から60％、または15から60％、または10から60％、または5から60％、または1から60％, 45から50％、または40から50％、または35から50％、または30から50％、または25から50％、または20から50％、または15から50％、または10から50％、または5から50％、または1から50％、または35から40％、または30から40％、または25から40％、または20から40％、または15から40％、または10から40％、または5から40％、または1から40％、または25から30％、または20から30％、または15から30％、または10から30％、または5から30％、または1から30％、または20から25％、または15から25％、または10から25％、または5から25％、または1から25％、または15から20％、または10から20％、または5から20％、または1から20％、または10から15％、または5から15％、または1から15％、または5から10％、または1から10％、または1から5％でありうる。
【００４９】
さまざまな市販の細胞培養培地、例えば、α-MEM培養培地（Thermo Fisher Scientific, Grand Island, NY）が骨髄間質細胞を培養するために用いることができ、また、ECMの水溶性成分を溶解するための水性成分にもなることができる。市販の培養培地は、さまざまな補充物質、例えば、炭酸水素ナトリウム、L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンBおよび/または血清を培地に添加することによって改変されうる。血清はウシ胎仔血清でありうる。培地は血清を含まなくてもよい。加えて、L-アスコルビン酸などの物質が、ECMの細胞産生を誘導するために培地または改変培地に加えられうる。
【００５０】
B. 哺乳類MSCを拡大および増殖させる方法
未分化状態の哺乳類MSCを拡大および増殖させるための方法には、哺乳類MSCを得る工程、およびそれを本発明の骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物と一緒に培養する工程が含まれる。
【００５１】
哺乳類MSCの培養は正常酸素圧条件下で行うことができる。
【００５２】
哺乳類MSCは、これらに限定されないが、骨髄を含むさまざまな供給源から得ることができる。骨髄は、さまざまな供給源、例えば、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、または他の髄腔などから得られうる。哺乳類MSCは、これらに限定されないが、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯組織、臍帯血、骨膜、海綿骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、胎児膵臓、肺、肝臓、羊水、ならびに胎児および青年の皮膚および血液を含む他の供給源から得ることができる。MSC単離するおよびその培養を確立するための方法は、関連技術分野における当業者に一般に知られている。臍帯血からMSCを単離するための新規な方法は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許公開第2012/0142102号に開示される。
【００５３】
いくつかの態様では、哺乳類MSCはヒトMSCである。
【００５４】
C. 組織工学
本発明の骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、骨および軟骨の再生ならびに骨結合などのさまざまな組織工学利用において有用である。インビボ試験は、骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、ヒドロキシアパタイト/リン酸三カルシウム（HA/TCP）と組み合わせると、HA/TCP単独と比較して優れた骨量再生を示したことを示している。
【００５５】
骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、骨組織工学利用のために担体および骨再生材料と組み合わせる、または単独で用いることができる。担体および骨再生材料の非限定的な例には、HAまたはHA/TCPなどのセラミック粉末；ゲル；および水性液体が含まれる。いくつかの態様では、骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、HAまたはHA/TCPと組み合わされる。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例は、本発明のある特定の非限定的な局面を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施においてよく機能することが出願人によって発見された技術であることを当業者は理解するはずである。一方で、当業者は、本開示に照らし、開示される特定の態様において多くの変更を行えること、および該変更によって本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果が依然として得られることを理解するはずである。
【００５７】
実施例1
骨髄間質細胞由来ECMからの骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物の生成
骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物を、以下の手法を用いて脱細胞した骨髄間質細胞ECMから作製した：
（a）骨髄間質細胞由来ECMを予め産生させかつ生存可能な間質細胞を取り除いている3枚の150 mm培養ディッシュのそれぞれに、1 mlの無血清培地（MEMα培地078-5077）を加えた。
（b）第1の培養ディッシュのECMをパテ様スパチュラで機械的に擦過して、ディッシュの表面からECMを離し、内容物をスパチュラで混合した。
（c）次いで、第1のディッシュのECM/培地混合物を第2の培養ディッシュ内にデカントした。
（d）第2のディッシュのECMをスパチュラで擦過し、第2のディッシュの内容物をスパチュラで混合した。
（e）次いで、第2のディッシュの混合物を第3の培養ディッシュ内にデカントした。
（f）第3の培養ディッシュのECMをスパチュラで擦過し、第3のディッシュの内容物をスパチュラで混合した。
（g）次いで、第3のディッシュの混合物を15 mlコニカルチューブ内に移した。
（h）3枚の150 mm培養ディッシュのそれぞれを0.5 mlの無血清培地で洗浄し、洗浄液を、ECM/培地混合物を含有する15 mlコニカルチューブに加えた。
（i）15 mlコニカルチューブを、90％増幅でのパルス01、01を用いて、各回の間に1分間の中断を置いて各2分間で4回超音波処理した。
（j）15 mlコニカルチューブからの混合物の試料を1.5 ml Eppendorfチューブ内にピペットで移し、15,000×gで5分間遠心分離した。
（k）可溶性タンパク質を含有する上清を除去し、ECMタンパク質抽出物である不溶性ペレットを残した。
【００５８】
実施例2
骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物によるインビトロMSC刺激
骨髄MSCを、以下の培養培地のイテレーション(iteration)で組織培養ディッシュ中に6000細胞/cm2で播種した：
（a）培養培地中に懸濁された18 μg/mlの骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物（実施例1kのペレット）
（b）培養培地中に懸濁された可溶性タンパク質が除去されていない18 μg/mlの骨髄間質細胞由来ECM（実施例1iの完全抽出物）
（c）培養培地に加えられた3 μg/mlの上清（実施例1kから）
（d）培養培地単独による陰性対照（2Dと表記）
（e）培養培地と一緒に培養ディッシュ基体上で増大しかつそれに付着した骨髄間質細胞由来ECM上に播種する陽性対照（HPMEと表記）。
【００５９】
ディッシュを37℃にて96時間インキュベートし、その後、細胞を剥離し計数した。フローサイトメトリーを用いて、細胞をSSEA4発現（MSCマーカー）について分析した。提示されるデータは、図1の総細胞数および図2のSSEA4陽性細胞絶対数である。
【００６０】
図2に認められるように、MSCの最大の刺激は骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物によって生じた（「ペレット」と表記されるイテレーション（a））。
【００６１】
実施例3
ECMタンパク質抽出物 対 対照試験1によるインビトロMSC刺激
骨髄MSCを、以下の培養培地のイテレーションで組織培養ディッシュ中に6000細胞/cm2で播種した：
（a）培養培地中に懸濁された10 μg/mlの骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物
（b）培養培地中に懸濁された20 μg/mlの骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物
（c）培養培地中に懸濁された40 μg/mlの骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物
（d）培養培地単独による陰性対照（2Dと表記）
（e）培養培地を含む培養ディッシュ基体上で増大しかつそれに付着した骨髄間質細胞由来ECM上に播種する陽性対照（1012-4 HPMEと表記）。
注記：ECMタンパク質抽出物を生成させるために用いた骨髄間質細胞と、試験1で基体に付着したECMとは、同じドナーに由来するが；ECMタンパク質抽出物は、基体に付着したECMの同ロットから作製されなかった。
【００６２】
ディッシュを37℃にて96時間インキュベートし、その後、細胞を剥離し計数した。フローサイトメトリーを用いて、細胞をSSEA4発現（MSCマーカー）について分析した。提示されるデータは、図3の総細胞数および図4のSSEA4陽性細胞絶対数である。
【００６３】
図4に認められるように、骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、陽性対照および陰性対照より大きなMSCの刺激を示した。
【００６４】
実施例4
ECMタンパク質抽出物 対 対照試験2によるインビトロMSC刺激
骨髄MSCを、以下の培養培地のイテレーションで組織培養ディッシュ中に6000細胞/cm2で播種した：
（a）培養培地中に懸濁された10 μg/mlの骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物
（b）培養培地中に懸濁された20 μg/mlの骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物
（c）培養培地単独による陰性対照（2Dと表記）
（d）培養培地と一緒に培養ディッシュ基体上で増大しかつそれに付着した骨髄間質細胞由来ECM上に播種する陽性対照（1013.2 HPMEと表記）。
注記：ECMタンパク質抽出物を生成させるために用いた骨髄間質細胞と、試験2で基体に付着したECMとは、同じドナーに由来し；ECMタンパク質抽出物は、基体に付着したECMの同ロットから作製された。
【００６５】
ディッシュを37℃にて96時間インキュベートし、その後、細胞を剥離し計数した。フローサイトメトリーを用いて、細胞をSSEA4発現（MSCマーカー）について分析した。提示されるデータは、図5の総細胞数および図6のSSEA4陽性細胞絶対数である。
【００６６】
図6に認められるように、骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、陽性対照および陰性対照より大きなMSCの刺激を示した。
【００６７】
実施例5
インビボ整形外科的試験
骨髄間質細胞ECMタンパク質抽出物をラット大腿骨部分的欠損（SBD）モデルにおいてインビボで評価した。試験には3種類の療法が含まれた：A群 - 対照、移植なし；B群 -ヒドロキシアパタイト/リン酸三カルシウム（Medtronic MASTERGRAFT（登録商標） Mini Granules)（HA/TCP）＋自家骨髄；およびC群 - HA/TCP＋自家骨髄＋骨髄間質細胞ECMタンパク質抽出物。骨格的に成熟したSprague-Dawleyラットの大腿骨の中心骨幹に作製した6 mm SBDに各治療を移植した（＞300 gm）。欠損部位を縫合して閉じる前に、予め孔を開けたポリダクチル（polydactyl）プレートおよびキルシュナー鋼線を用いる内固定によって、欠損部位を安定化した。欠損部位をコラーゲン膜（Oestogenics）で包んだ。定期的に各試験ラットの欠損部位のX線画像を撮影した。
【００６８】
安楽死後、大腿骨を摘出し、Skyscan 1176マイクロCTスキャナーでのマイクロコンピュータ断層撮影法（マイクロCT）によって9 μm等方性分解能で大腿骨中心骨幹をスキャンした。骨体積密度および海綿骨体積率を、作製した6 mm SBDを包含する関心対象の体積で測定した。大腿骨を、欠損空間内のミネラル化の程度についても組織学的に評価した。
【００６９】
A群（対照）の2週でのX線画像を図7に示す。A群の4週でのX線画像を図8に示す。B群（HA/TCP）の2週でのX線画像を図9に示す。B群の4週でのX線画像を図10に示す。C群（HA/TCP＋ECMタンパク質抽出物）の2週でのX線画像を図11に示す。C群の4週でのX線画像を図12に示す。
【００７０】
4週後の試験の最初の6匹の動物についてのA群（対照）、B群（HA/TCP）およびのC群（HA/TCP＋ECMタンパク質抽出物）のマイクロCT画像を図13に示す。4週後の試験の最初の6匹の動物についてのA群（対照）、B群（HA/TCP）およびのC群（HA/TCP＋ECMタンパク質抽出物）のマイクロCT複合画像を図14に示す。4週後の試験の最初の6匹の動物についてのROIの骨量を図15に示す。図15に認められるように、C群 - HA/TCP＋骨髄間質細胞由来ECMタンパク質抽出物は、B群 - HA/TCP単独より優れた骨再生を示した。
【図１】
2019510823.tif 000007
【図２】
2019510823.tif 000008
【図３】
2019510823.tif 000009
【図４】
2019510823.tif 000010
【図５】
2019510823.tif 000011
【図６】
2019510823.tif 000012
【図７】
2019510823.tif 000013
【図８】
2019510823.tif 000014
【図９】
2019510823.tif 000015
【図１０】
2019510823.tif 000016
【図１１】
2019510823.tif 000017
【図１２】
2019510823.tif 000018
【図１３】
2019510823.tif 000019
【図１４】
2019510823.tif 000020
【図１５】
2019510823.tif 000021
【国際調査報告】
2019510823.tif 000022
2019510823.tif 000023
2019510823.tif 000024
2019510823.tif 000025