(57)【要約】式（I）の新しい化合物を提供し、式中：XはCHまたはN、好ましくはCHであり；nは1-5、好ましくは1-2であり；mは0-5、好ましくは1-2であり；およびmが2-5であるとき、二つのR2ラジカルはベンゼン環の二つの隣接する炭素と一緒になってそのベンゼン環と縮合した5-または6-員の複素環を形成することができる。化合物（I）は、ヘム制御インヒビター（HRI）アクチベーターであり、および例えば、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪変性、非アルコール性脂肪性肝炎、高血圧、脂質異常症、アテローム性動脈硬化、および心臓疾患などのような心臓代謝性疾患の防止または処置に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）
【化１】
2019523248.tif 000010
の化合物ならびにその薬学的に許容可能な塩および溶媒和物であり、式中：
XはCHまたはNであり；
R1は、H、SF5、ハロゲン、CF3、NO2、CN、およびOCF3からなる群より無関係に選ばれるラジカルであり；nは1から5までの整数であり；ハロゲンはF、Cl、BrまたはIであり；
R2は、SF5、ハロゲン、CF3、NO2、CN、OCF3、ヒドロキシル、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ジ-(C1-C4)アルキルアミノエトキシ、2-(ピペリジン-1-イル)エトキシ、2-(ピロリジン-1-イル)エトキシ、2-(アゼパン-1-イル)エトキシ、2-モルホリノエトキシ、および2-(ピペラジン-1-イル)エトキシからなる群より無関係に選ばれるラジカルであり；mは0から5までの整数であり；あるいはまた、XがCHであり、およびmが2から5までの整数であるとき、二つのR2ラジカルはそれらが結合しているベンゼン環の二つの隣接する炭素と一緒になってO、N、およびSからなる群より無関係に選ばれる1から3までのヘテロ原子を有する5-または6-員の複素環を形成し、複素環はベンゼン環と縮合し、およびベンゼン環はSF5、ハロゲン、CF3、NO2、CN、およびOCF3からなる群より無関係に選ばれる一以上のラジカルで随意に置換され；
ただし、式（I）の化合物は以下の式：
【化２】
2019523248.tif 000011
のいずれも有さない。
【請求項２】
式中、XはCHである、請求項1に従う化合物。
【請求項３】
式中、nは1または2であり、およびmは1または2である、請求項1-2のいずれか一項に従う化合物。
【請求項４】
式中：mは2から5までの整数であり、および二つのR2ラジカルはそれらが結合しているベンゼン環の二つの隣接する炭素と一緒になってO、N、およびSからなる群より無関係に選ばれる1から3までのヘテロ原子を有する5-または6-員の複素環を形成し、複素環はベンゼン環と融合し、およびベンゼン環はSF5、ハロゲン、CF3、NO2、CN、およびOCF3からなる群より無関係に選ばれる一以上のラジカルで随意に置換される、請求項1-2のいずれか一項に従う化合物。
【請求項５】
式中、二つのR2ラジカルは下記式：
【化３】
2019523248.tif 000012
の一を有する複素環を形成する、請求項4に従う化合物。
【請求項６】
式中、R2は、SF5、ハロゲン、CF3、NO2、CN、OCF3、ヒドロキシル、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ジ-(C1-C4)アルキルアミノエトキシ、2-(ピペリジン-1-イル)エトキシ、2-(ピロリジン-1-イル)エトキシ、2-(アゼパン-1-イル)エトキシ、2-モルホリノエトキシ、および2-(ピペラジン-1-イル)エトキシからなる群より無関係に選ばれる、請求項1-3のいずれか一項に従う化合物。
【請求項７】
R1ラジカルを有するフェニル環の3位に付着したSF5ラジカルを有する、請求項1-6のいずれか一項に従う化合物。
【請求項８】
式中、ハロゲンはFまたはClである、請求項1-7のいずれか一項に従う化合物。
【請求項９】
下記式：
【化４】
2019523248.tif 000013
の一を有する、請求項5に従う化合物。
【請求項１０】
下記式：
【化５】
2019523248.tif 000014
の一を有する、請求項6に従う化合物。
【請求項１１】
活性薬剤原料として使用するための、請求項1-10のいずれか一項に規定する化合物。
【請求項１２】
メタボリックシンドローム、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪変性、非アルコール性脂肪性肝炎、高血圧、脂質異常症、アテローム性動脈硬化、および心臓疾患からなる群より選ばれる心臓代謝性疾患の防止または処置に使用するための、請求項1-10のいずれか一項に規定する化合物。
【請求項１３】
心臓代謝性疾患はメタボリックシンドロームである、請求項12に従う使用のための化合物。
【請求項１４】
治療上有効な量の請求項1-10のいずれか一項に規定する化合物を、適切な量の薬学的に許容可能な賦形剤または担体と一緒に含む、薬剤組成物。
【請求項１５】
メタボリックシンドローム、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪変性、非アルコール性脂肪性肝炎、高血圧、脂質異常症、アテローム性動脈硬化、および心臓疾患からなる群より選ばれる心臓代謝性疾患の防止または処置に使用するための、請求項14に規定する薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は製薬化学、特に新しい化合物および既知の疾患の防止または処置におけるそれらの使用に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
背景技術
メタボリックシンドロームは、一緒に起こる容態の組合せであり、心血管疾患および糖尿病の人においてリスクが高まる。メタボリックシンドロームで遭遇する可能性がある容態は、血圧の上昇、高血糖、腰の周りの過剰な体脂肪、低HDLコレステロールレベル、および高トリグリセリドレベルである。メタボリックシンドロームと診断されるには、少なくとも三つの代謝危険因子が必要である。世界の成人人口の20-25％前後がメタボリックシンドロームを患っていると推定されている。今日まで、糖尿病、脂質異常症（dyslipidaemia）、肥満、および高血圧の治療のための医薬品はあるが、有効性が低く、耐容性が限られ、またはその双方のために、メタボリックシンドロームの処置につついて併用は満足できないようである。メタボリックシンドロームを有する成人集団が心血管疾患、例えば、心臓発作または卒中などのようなものを有する危険性が高いことに加え、危険因子の上記の組合せを有する人々は、2型糖尿病を発症する危険性が五倍高い。主に健康的なライフスタイルをもつことで、メタボリックシンドロームを防止または遅延させることは可能である。それにもかかわらず、メタボリックシンドロームをうまく制御するには、いくつかのライフスタイルを変え、および保健専門家（health professionals）と共同作業する長期的な努力が必要である。しかしながら、時折、食事療法および身体活動の組合せは、求められる効果を達成するのに不十分である。
【０００３】
臨床的、実験的および疫学的研究から入手可能なデータは、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）がメタボリックシンドロームの肝症状である可能性があることを示す（Marchesini（マーケイシニ）G.ら、「Nonalcoholic fatty liver disease: a feature of the metabolic syndrome（非アルコール性脂肪肝疾患：メタボリックシンドロームの特長）」、Diabetes（ダイアビーティズ）、2001年、第50巻、第1844-1850頁を参照）。ここ数年にわたる研究は、NAFLDがインスリン抵抗性および糖尿病に関連していること、NAFLDが2型真性糖尿病（T2DM）の発症を予測すること、およびその逆もまた同様であること、および各容態が他のもののための進行性因子としてはたらくことを示した（Musso（ムッソ）G.ら、「Metaanalysis: natural history of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and diagnostic accuracy of non-invasive tests for liver disease severity（メタアナリシス：非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）の自然発達および肝疾患の重症度に対する非侵襲性試験の診断精度）」、Ann. Med.（アナールズ・オブ・メディシン）、2011年、第43巻、第617-649頁を参照）。他方、NAFLDは、単純脂肪症（simple steatosis）から非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）まで、線維症および硬変（cirrhosis）までの一連の病理学を組み込む（Musso G.ら、同上参照）。著しい脂肪症は5％を超える肝細胞における脂肪（トリグリセリド）蓄積として規定される。インスリン抵抗性はNAFLDおよびメタボリックシンドロームの双方における重要な病原因子である。
【０００４】
HRIアクチベーターがeIF2αリン酸化を誘導し、eIF2・GTP・tRNAiMet三元複合体の存在量が減少し、および従ってガン細胞増殖が抑制されることが知られる（Denoyelle（デノイエール）S.ら、「In vitro inhibition of translation initiation by N,N'-diarylureas potential anti-cancer agents（N,N'-ジアリール尿素の潜在的抗ガン剤による翻訳開始のインビトロ抑制）」、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、2012年、第22巻、第402-409頁を参照）。特に、いくつかのN,N'-ジアリール尿素はHRIを活性化する薬剤として識別され、および、そういうものとして、これらの薬剤は一定のガン細胞の増殖を抑制し、従って潜在的な抗ガン剤である（Chen（チン）T.ら、「Chemical genetics identify eIF2α kinase heme-regulated inhibitor as an anticancer target（化学遺伝学は、抗ガン標的としてeIF2αキナーゼヘム制御インヒビターを識別する）」、Nature Chemical Biology、2011年、第7巻、第610-616頁、およびSupporting Information（支持情報）を参照）。
【０００５】
目下、メタボリックシンドロームのための独自の長期有効な薬剤処置は存在しない。したがって、メタボリックシンドロームおよびその関連障害、例えば、肥満およびT2DMなどのようなものに関連する容態、ならびに脂肪蓄積、例えば、NAFLDおよびNASHなどのようなものと関連する他の心臓代謝性疾患の処置において改善された活性を示す化合物を開発することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概略
本発明の一態様は、式（I）
【化１】
2019523248.tif 000002
の化合物およびその薬学的に許容可能な塩および溶媒和物の提供であり、式中：
XはCHまたはNであり；
R1は、H、SF5、ハロゲン、CF3、NO2、CN、およびOCF3からなる群より無関係に選ばれるラジカルであり；nは1から5までの整数であり；ハロゲンはF、Cl、BrまたはIであり；
R2は、SF5、ハロゲン、CF3、NO2、CN、OCF3、ヒドロキシル、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ジ-(C1-C4)アルキルアミノエトキシ、2-(ピペリジン-1-イル)エトキシ、2-(ピロリジン-1-イル)エトキシ、2-(アゼパン-1-イル)エトキシ、2-モルホリノエトキシ、および2-(ピペラジン-1-イル)エトキシからなる群より無関係に選ばれるラジカルであり；mは0から5までの整数であり；あるいはまた、XがCHであり、およびmが2から5までの整数であるとき、二つのR2ラジカルはそれらが結合しているベンゼン環の隣接する二つの炭素と一緒になってO、N、およびSからなる群より無関係に選ばれる1から3までのヘテロ原子を有する5-または6-員の複素環を形成し、複素環はベンゼン環と縮合しており、およびベンゼン環はSF5、ハロゲン、CF3、NO2、CN、およびOCF3からなる群より無関係に選ばれる一以上（一またはそれよりも多くとも言う）のラジカルで随意に置換され；
ただし、式（I）の化合物は以下の式； 
【化２】
2019523248.tif 000003
のいずれも有さない。
【０００７】
式（I）からディスクレームされた三つのN,N'-ジアリール尿素は化学的に開示され：最初のものは合成中間体としてのものであり（Karagiannidis（カラジャンニディス）L.E.ら、「Highly effective yet simple transmembrane anion transporter based upon ortho-phenylenediamine bis-ureas（オルト-フェニレンジアミンビスウレアをベースとする非常に有効で単純な膜貫通型アニオントランスポーター）」、Chem. Commun.（ケミカル・コミュニケーションズ）、2014年、第50巻、第12050-12053頁、Electronic Supplementary Information（電子的補足情報）参照）、および他の二つは、土壌での、および水中の藻類コントロール、細菌コントロール、腸内寄生虫の排除、植物におけるクロロフィル形成の抑制および選択的雑草コントロールにおける活性を有するものとしてものである（米国特許第US 3073861号明細書参照）。
【０００８】
特定の実施態様において、式（I）の化合物はX=CHを有する。別の特定の実施形態において、式（I）の化合物において、nは1または2であり、およびmは1または2である。特定の実施形態は、式（I）においてSF5ラジカルが、R1ラジカルを有するフェニル環の３位に付着するものであり；またハロゲンがFまたはClであるものでもある。
【０００９】
化合物（I）の特定の実施態様において、mは2から5までの整数であり、および二つのR2ラジカルは、それらが結合しているベンゼン環の二つの隣接する炭素と一緒になってO、N、およびSからなる群より無関係に選ばれる1から3までのヘテロ原子を有する5-または6-員の複素環を形成し、その複素環はベンゼン環と縮合しており、およびベンゼン環はSF5、ハロゲン、CF3、NO2、CN、およびOCF3からなる群より無関係に選ばれる一以上の基で随意に置換される。より一層詳細な実施形態は、二つのR2ラジカルが以下の式：
【化３】
2019523248.tif 000004
のうちの一つを有する複素環を形成するものである。
【００１０】
さらにより一層詳細には、化合物（I）が以下の化合物からなる群より選ばれ、それらの調製が付随する例に開示されるそれらの実施形態である：1-(ベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-イル)-3-(4-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-25）；1-(ベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-イル)-3-(3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-26）；1-(ベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-イル)-3-(2-クロロ-5-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-27）；1-(ベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-イル)-3-(2-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-28）；および1-(ベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-イル)-3-(4-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-29）。
【００１１】
別の特定の実施態様において、化合物（I）は、R2が、SF5、ハロゲン、CF3、NO2、CN、OCF3、ヒドロキシル、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、ジ-(C1-C4)アルキルアミノエトキシ、2-(ピペリジン-1-イル)エトキシ、2-(ピロリジン-1-イル)エトキシ、2-(アゼパン-1-イル)エトキシ、2-モルホリノエトキシ、および2-(ピペラジン-1-イル)エトキシからなる群より無関係に選ばれるラジカルであるものである。より一層詳細なものは、化合物（I）が以下の化合物からなる群より選ばれ、それらの調製が付随する例に開示されるそれらの実施形態である：1,3-ビス(2-クロロ-5-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-32）；1-(4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-(2-クロロ-5-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-33）；1,3-ビス(3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-36）；1-(3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)-3-(4-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-37）；および1,3-ビス(4-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-38）。
【００１２】
本発明者らは、本発明の化合物がHRI（heme-regulated inhibitor）アクチベーターであり、および従ってそれらが活性薬剤原料として、特に、「心臓代謝性疾患（cardiometabolic disease）」と呼ばれることがあるそれらの代謝性疾患、例えば、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪変性、非アルコール性脂肪性肝炎、高血圧、脂質異常症、アテローム性動脈硬化、および心臓疾患、特にメタボリックシンドロームなどのようなものの防止または処置において有用であることを見出した。したがって、本発明の別の態様は、それらの疾患の予防または治療に使用するための本発明の化合物に関する。この態様はまた、それらの疾患のいくつかに悩まされるヒトまたは動物のペイシェントの予防または処置の方法として表現することもでき、それには治療上有効な量の本発明の化合物の施与が含まれる。それはまた、それらの疾患の防止または処置用の薬の調製のための化合物の使用として表現することもできる。
【００１３】
本発明の別の態様は、治療上有効な量の本発明の化合物を、適切な量の薬学的に許容可能な賦形剤または担体と一緒に含む、薬剤組成物に関する。これらの組成物は上記の心臓代謝性疾患の防止または処置に使用することができる。
【００１４】
式（I）の化合物は、式（III）のイソシアネートを式（II）のアミン誘導体と反応させることによって得ることができ、そこではラジカルは上記で規定される値を有する。随意に、反応は塩基の存在下で行われる。
【化４】
2019523248.tif 000005
【００１５】
好ましい実施態様において、式（II）の化合物は、適切な塩基、好ましくは、n-ブチルリチウムを用い、テトラヒドロフランのような無水溶媒において、好ましくは、低温で、まず脱プロトン化され、および次いで、式（III）の化合物を添加する。あるいはまた、反応は塩基の不存在下、好ましくは、室温で行われる。次に、式（III）のイソシアナートは商業上入手可能であるか、または式（IV）の適切なアミンと、有機溶媒、例えば、トルエンなどのようなものにおいて、塩基、そのようなトリエチルアミンの存在下でトリホスゲンとの反応によって得ることができる。
【化５】
2019523248.tif 000006
【００１６】
スキーム1およびスキーム2は、本発明の化合物の全般的な調製プロセスを例示する。調製プロセスを行うためのアニリンおよびイソシアナート誘導体の商業上の入手可能性をそれぞれ表1および表2に例示する。
【化６】
2019523248.tif 000007
【００１７】
【表１】
2019523248.tif 000008
【００１８】
【表２】
2019523248.tif 000009
【００１９】
式（I）の化合物の薬学的に許容可能な塩の調製は、本技術において知られる方法によって行うことができる。例として、それらは、親化合物で、それが塩基性または酸性部分を含むものから、慣習的な化学的方法によって調製することができる。大抵、そのような塩は、例えば、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、それぞれ、化学量論的量の適切な薬学的に許容可能な塩基または酸と、水においてもしくは有機溶媒においてまたはそれらの混合物において反応させることによって調製される。式（I）の化合物およびそれらの塩は、いくつかの物理的性質において異なり得るが、それらは本発明の目的にとって等価である。
【００２０】
本発明の化合物は、フリー溶媒和化合物としても、または溶媒和物（例えば水和物）としてもいずれでも結晶形でありえ、およびこれらのすべての形態は本発明の範囲内にあることが意図される。概して溶媒和の方法は本技術で知られる。大抵は、薬学的に許容可能な溶媒、例えば、水またはエタノールなどのようなものとの溶媒和形態は、本発明の目的のための非溶媒和形態と等価である。
【００２１】
例に示されるように、HRIアクチベーター（HRI活性化因子、HRI活性化物質、HRI活性化剤などとも言う）は、いくつかの代謝パラメータ、例えば、血しょうグルコースおよびトリグリセリドレベルならびに肝脂肪変性（脂肪肝とも言う）などのようなものを改善するのに有用である。したがって、それらは心臓代謝性疾患、例えば、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病（真性糖尿病とも言う）、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪変性（脂肪症とも言う）、非アルコール性脂肪性肝炎、高血圧（高血圧症とも言う）、脂質異常症、アテローム性動脈硬化、および心臓疾患（心疾患、心臓病、心臓障害などとも言う）などのようなものの治療上または予防上の処置に使用することができる。
【００２２】
本明細および請求の範囲を通して、「comprise（含む）」という単語およびその単語の変形は、他の技術的特長、添加剤、構成要素、またはステップを排除することを意図しない。さらに、「comprise」という単語は、「consisting of（からなる）」の場合を包含する。以下の例は例示的であり、および本発明を制限することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ビヒクル（DMSO、CT細胞）または10μMの各々の化合物I-25、I-26、I-27、I-28、およびI-29と共に24時間インキュベートしたヒトHuh-7肝細胞における合計およびホスホ-HRIのイムノブロット分析および定量化を示す。データは平均±SD（n=4）として提供する。コントロール（CT）細胞に対して*p<0.05。BTdCPU処理細胞に対して#p<0.05。BTdCPU=1-(ベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-イル)-3-(3,4-ジクロロフェニル)尿素である（Chen T.ら、上記において化合物（2））。
【図２】ビヒクル（DMSO、CT細胞）または10μMの各々の化合物I-30、I-2、およびI-33と共に24時間インキュベートしたヒトHuh-7肝細胞における合計およびホスホ-HRIのイムノブロット分析および定量化を示す。データは平均±SD（n=4）として提供する。コントロール（CT）細胞に対して***p<0.001および*p<0.05。BTdCPU処理細胞に対して#p<0.05。化合物I-2（1-(4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-(4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)尿素)は本発明の一部分ではないが、それを比較目的のためにいくつかの図に導入した。
【図３】ビヒクル（DMSO、CT細胞）または10μMの各々の化合物I-25、I-26、I-27、I-28およびI-29と共に24時間インキュベートしたヒトHuh-7肝細胞における合計およびホスホ-eIF2αのイムノブロット分析および定量化を示す。データは平均±SD（n=4）として提供する。コントロール（CT）細胞に対して**p<0.01および*p<0.05。BTdCPU処理細胞に対して##p<0.01および#p<0.05。
【図４】ビヒクル（DMSO、CT細胞）または10μMの各々の化合物I-30およびI-33と共に24時間インキュベートしたヒトHuh-7肝細胞における合計およびホスホ-eIF2αのイムノブロット分析および定量化を示す。データは平均±SD（n=4）として提供する。コントロール（CT）細胞に対して*p<0.05。
【図５】Oil Red（オイルレッド）Oで染色したHuh-7細胞の巨視的画像（上側の画像）および顕微鏡画像を示す。Huh-7細胞は、BSA（コントロール、CT）、BSAとコンジュゲートした0.75mmol（ミリモル）/Lパルミタート（Pal）、または0.75mmol/L BSA-パルミタートに加えた10μmol/L BTdCPU（Pal+BTdCPU）と共に予め24時間インキュベートした。
【図６】合計およびリン酸化Akt（A）、ならびに合計Akt.（B）のイムノブロット分析を示す。示されるとき（+）、細胞を最後の10分間100nmol/Lのインスリン（I）と共にインキュベートした。データは平均±SDとして提供する（1群あたりn=4）。インスリンに曝されていないコントロール細胞に対して***p<0.001および*p<0.05。インスリン刺激コントロール細胞に対して###p<0.001および##p<0.01。パルミチン酸と共にインキュベートしたインスリン刺激細胞に対して†††p<0.001。Ins：インスリン。
【図７】標準食（standard chow）（CT）、3週間のHFD（HFD）、または3週間のHFDに加え最後の週の間BTdCPU（HFD+BTdCPU）を与えたマウスの糖負荷試験（glucose tolerance test、ブドウ糖負荷試験などとも言う）および曲線下面積（AUC）の結果を示す。データは平均値±SDとして提供する（1群あたりn=6）。標準餌料（standard diet）（CT）を与えたマウスに対して*p<0.05。HFDを与えたマウスに対して#p<0.05。G：グルコース。
【図８】（Ａ）標準食（CT）、3週間のHFD（HFD）、または3週間のHFDに加え最後の週の間BTdCPU（HFD+BTdCPU）を与えたマウスの肝臓のOil Red Oおよびエオシン-ヘマトキシリン（H&E）染色。（Ｂ）肝臓トリグリセリドレベル。データは平均値±SDとして提供する（1群あたりn=6）。標準餌料（CT）を与えたマウスに対して*p<0.05。HFDを与えられたマウスに対して#p<0.05。G：グルコース。TG：トリグリセリド。
【図９】肝細胞でのFGF21発現に及ぼす異なるHRIアクチベーターの効果を示す。ヒトHuh-7肝細胞を化合物の不存在（コントロール、CT）下において、または存在下（10μM）において24時間インキュベートした。FGF21の量的な実時間RT-PCRによる評価。データは平均±SD（1群あたりn=4）として提供する。CTに対して***p<0.001および**p<0.01。BTCtFPUに対して###p<0.001、##p<0.01および#p<0.05。BTdCPUに対して††p<0.01および†p<0.05。BTCtFPU=1-(ベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-イル)-3-(4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)尿素（Chen T.ら、上記において化合物（3））。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
調製例1．1-(ベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-イル)-3-(4-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-25）。ステップ1．トルエン中の4-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（259mg、1.18mmol）の溶液（5mL）をトリホスゲン（175mg、0.59mmol）で処理した。直ちにトリエチルアミン（0.16mL、1.18mmol）を加え、および反応混合物を70℃で2時間撹拌した。その後、ペンタン（1mL）を加え、および白色沈殿物を形成した。混合物をろ過し、およびペンタンを、トルエン溶液において4-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニルイソシアナートを与えるために室温にて真空中で蒸発させ、それをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ステップ2．前のステップからのイソシアナートの溶液に、THF中のベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-アミン（178mg、1.18mmol）の溶液（6mL）を加えた。懸濁物を室温で夜通し撹拌した。有機物の真空中での蒸発はオレンジ色の固体を与えた。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル混合物）は、化合物I-25を白色の固体として与えた（203mg、43%の全体収率）。分析用サンプルは冷却したジクロロメタン（126mg）で洗浄することによって取得した。m.p.：274-275℃。IR（ATR）ν：612、641、659、716、801、832、1059、1101、1134、1191、1245、1271、1297、1325、1351、1413、1467、1510、1528、1595、1721、3100、3136、3297、3338cm-1。正確な質量：[C13H9F5N4OS2-H]-について計算値：395.0065。実測値：395.0064。
【００２５】
調製例2．1-(ベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-イル)-3-(3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-26）。ステップ1．トルエンにおいて3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（259mg、1.18mmol）の溶液（5.8mL）を、トリホスゲン（175mg、0.59mmol）で処理した。直ちにトリエチルアミン（0.16mL、1.18mmol）を加え、および反応混合物を70℃で2時間撹拌した。その後、ペンタン（1mL）を加え、および白色沈殿物を形成した。混合物をろ過し、およびペンタンを、トルエン溶液において3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニルイソシアナートを与えるために室温にて真空中で蒸発させ、それをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ステップ2．前のステップからのイソシアナートの溶液に、THFにおけるベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-アミン（178mg、1.18mmol）の溶液（6mL）を加えた。懸濁物を室温にて夜通し撹拌した。有機物の真空中での蒸発は、オレンジ色の固体を与えた（440mg）。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル混合物）は、化合物I-26を淡白色固体として与えた（243mg、52%の全体収率）。分析用サンプルはペンタンで洗浄することにより取得した（199mg）。m.p.：229-230℃。IR（ATR）ν：614、680、718、780、801、819、830、878、912、922、1057、1009、1113、1134、1196、1219、1294、1312、1349、1412、1434、1466、1529、1540、1568、1602、1718、2852、2919、3090、3126、3271、3302、3338cm-1。元素分析：C13H9F5N4OS2・0.05C4H8O2・0.5C5H12について計算値：C 43.17%、H 3.55%、N 12.83%、S 14.68%。実測値：C 43.51%、H 3.17%、N 12.96%、S 14.61%。
【００２６】
調製例3．1-(ベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-イル)-3-(2-クロロ-5-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-27）。ステップ1．トルエン中の2-クロロ-5-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（300mg、1.18mmol）の溶液（5mL）をトリホスゲン（175mg、0.59mmol）で処理した。直ちにトリエチルアミン（0.16mL、1.18mmol）を加え、および反応混合物を70℃で2時間撹拌した。その後、ペンタン（1mL）を加え、および白色沈殿物を形成した。混合物をろ過し、およびペンタンを、トルエン溶液において2-クロロ-5-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニルイソシアナートを与えるために室温にて真空にし、それをさらに精製することなく次のステップで使用した。ステップ2．前のステップからのイソシアナートの溶液に、THF中のベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-アミン（178mg、1.18mmol）の溶液（6mL）を加えた。懸濁物を室温で夜通し撹拌した。有機物の真空中での蒸発はオレンジ色の固体を与えた（378mg）。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル混合物）は化合物I-27をベージュ色固体として与えた（106mg、21%の全体収率）。分析サンプルは冷却したジクロロメタンで洗浄することによって取得した（80mg）。m.p.：227℃。IR（ATR）ν：615、664、729、805、816、837、884、922、964、1033、1052、1134、1222、1287、1349、1413、1467、1536、1563、1666、1721、3333cm-1。正確な質量：[C13H8ClF5N4OS2-H]-について計算値：428.9675；実測値428.9676。
【００２７】
調製例4．1-(ベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-イル)-3-(2-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-28）。ステップ1．トルエン中の2-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（300mg、1.18mmol）の溶液（5mL）を、トリホスゲン（175mg、0.59mmol）で処理した。直ちにトリエチルアミン（0.16mL、1.18mmol）を加え、および反応混合物を70℃で2時間撹拌した。その後、ペンタン（1mL）を加え、および白色沈殿物を形成した。混合物をろ過し、およびペンタンを、トルエン溶液中の2-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニルイソシアナートを与えるために室温にて真空中で蒸発させ、それをさらに精製することなく次のステップに用いた。ステップ2．前のステップからのイソシアナートの溶液に、THF中のベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-アミン（178mg、1.18mmol）の溶液（6mL）を加えた。懸濁物を室温にて夜通し撹拌した。有機物の真空中での蒸発はオレンジ色の固体（478mg）を与えた。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル混合物）は化合物I-28を淡白色固体として与えた（149mg、30%の全体収率）。m.p.：225℃。IR（ATR）ν：628、649、673、705、729、760、783、814、847、915、1054、1126、1155、1217、1245、1279、1318、1346、1411、1462、1527、1571、1664、1718、2852、2919、2956、3317cm-1。元素分析：C13H8ClF5N4OS2・0.05 C4H8O2・0.5 C6H14について計算値：C 40.68%、H 3.25%、N 11.71%、S 13.41%；実測値：C 40.88%、H 3.00%、N 11.51%、S 13.17%。
【００２８】
調製例5．1-(ベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-イル)-3-(4-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-29）。ステップ1．トルエン中の4-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（300mg、1.18mmol）の溶液（5mL）をトリホスゲン（175mg、0.59mmol）で処理した。直ちにトリエチルアミン（0.16mL、1.18mmol）を加え、および反応混合物を70℃にて2時間撹拌した。その後、ペンタン（1mL）を加え、および白色沈殿物を形成した。混合物をろ過し、およびペンタンを、トルエン溶液中の4-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニルイソシアナートを与えるために室温にて真空中で蒸発させ、それをさらに精製することなく次のステップにおいて用いた。ステップ2．前のステップからのイソシアナートの溶液に、THF中のベンゾ[d][1,2,3]チアジアゾール-6-アミン（178mg、1.18mmol）の溶液（6mL）を加えた。懸濁物を室温で夜通し撹拌した。有機物の真空中での蒸発はオレンジ色固体（325mg）を与えた。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル混合物）は化合物I-29を薄茶色固体として与えた（237mg、47%の全体収率）。分析用サンプルはペンタンで洗浄することにより取得した（180mg）。m.p.：213-214℃。IR（ATR）ν：647、669、726、801、819、845、894、923、960、1033、1126、1152、1207、1245、1276、1315、1349、1387、1413、1465、1527、1571、1594、1723、2919、3091、3126、3178、3271、3297、3338cm-1。元素分析：C13H8ClF5N4OS2・0.5 C6H14・0.25 C4H8O2について計算値：C 41.17%、H 3.46%、N 11.30%、S 12.93%；実測値：C 41.30%、H 3.22%、N 11.43%、S 12.72%。
【００２９】
調製例6．1,3-ビス(2-クロロ-5-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素、（化合物I-32）。ステップ1．トルエン中の2-クロロ-5-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（350mg、1.38mmol）の溶液（4mL）をトリホスゲン（204mg、0.69mmol）で処理した。直ちにトリエチルアミン（0.19mL、1.38mmol）を加え、および反応混合物を70℃で2時間撹拌した。その後、ペンタン（1mL）を加え、および白色沈殿物を形成した。混合物をろ過し、およびペンタンを、トルエン中で2-クロロ-5-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニルイソシアナートを得るために室温にて真空中で蒸発させ、それをさらに精製することなく次のステップにおいて用いた。ステップ2．2-クロロ-5-(ペンタフルオロスルファニル)アニリン（384mg、1.51mmol）をアルゴン下でanh.（無水）THF（12mL）に溶解し、およびアセトン浴においてドライアイス上で-78℃に冷却した。次いで、ヘキサン中の2.5Mのn-ブチルリチウム（0.73mL、1.78mmol）を20分間滴下した。その後、反応混合物をアセトン浴中のドライアイスから取り出し、および氷浴により0℃に調節した。その間に、前のステップからのトルエン溶液中のイソシアナート（387mg、1.38mmol）をアルゴン下で撹拌し、および反応混合物に連続的に添加した。混合物を室温で夜通し撹拌した。メタノール（4.5mL）を、任意の未反応n-ブチルリチウムをクエンチするために添加し、および溶媒の蒸発は薄茶色固体（670mg）を提供した。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル混合物）は化合物I-32をベージュ色固体として与えた（283mg、39%の全体収率）。m.p.：227-228℃。IR（ATR）ν：663、703、736、752、798、805、820、887、920、961、1037、1075、1108、1157、1233、1256、1281、1294、1414、1460、1533、1587、1661、1696、1717、1890、1908、2843、2920、2956、3294、3304、3329cm-1。正確な質量：[C13H8Cl2F10N2OS2-H]-について計算値：530.9223；実測値：530.9222。
【００３０】
調製例7．1-(4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-(2-クロロ-5-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-33）。ステップ1．トルエン中の2-クロロ-5-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（350mg、1.38mmol）の溶液（4mL）をアルゴン下でトリホスゲン（204mg、0.69mmol）により処理した。直ちにトリエチルアミン（0.19mL、1.38mmol）を加え、および反応混合物を70℃で2時間撹拌した。その後、ペンタン（1mL）を加え、および白色沈殿物を形成した。混合物をろ過し、およびペンタンを、トルエン溶液において2-クロロ-5-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニルイソシアナート溶液を与えるために室温にて真空中で蒸発させ、それをさらに精製することなく次のステップにおいて用いた。ステップ2．4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)アニリン（296mg、1.51mmol）をアルゴン下で無水THF（12mL）に溶解し、およびアセトン浴中のドライアイス上で-78℃に冷却した。次いで、ヘキサン中の2.5Mのn-ブチルリチウム（0.73mL、1.78mmol）を20分間滴下して加えた。その後、反応混合物をアセトン浴中のドライアイスから取り出し、および氷浴で0℃に調節した。その間に、前のステップからのトルエン溶液中のイソシアナート（387mg、1.38mmol）をアルゴン下で撹拌し、および反応混合物に連続的に加えた。混合物を室温で夜通し撹拌した。メタノール（5mL）を、任意の未反応n-ブチルリチウムをクエンチするために添加し、および溶媒の蒸発が褐色油状物（767mg）を提供した。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル混合物）は化合物I-33を薄茶色固体として与えた（138mg、22%の全体収率）。m.p.：156-157℃。IR（ATR）ν：632、666、684、701、727、742、760、801、812、840、855、863、906、950、963、1034、1065、1111、1126、1175、1216、1229、1260、1283、1301、1329、1372、1408、1459、1485、1513、1546、1582、1592、1608、1654、1695、1715、1769、1905、1925、2025、2179、2323、2369、2851、2917、2953、3276、3328、3671、3733、3795、3815cm-1。正確な質量：[C14H8Cl2F8N2OS-H]-について計算値：475.9534；実測値：475.9538。
【００３１】
調製例8．1,3-ビス(3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-36）。ステップ1．トルエン中の3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（350mg、1.60mmol）の溶液（6.8mL）をトリホスゲン（237mg、0.80mmol）で処理した。直ちにトリエチルアミン（0.22mL、1.60mmol）を加え、および反応混合物を70℃で2時間撹拌した。その後、ペンタン（1mL）を加え、および白色沈殿物を形成した。混合物をろ過し、およびペンタンを、トルエン溶液中の3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニルイソシアナートを与えるために室温にて真空中で蒸発させ、それをさらに精製することなく次のステップで使用した。ステップ2．3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（351mg、1.60mmol）をアルゴン下で無水THF（3mL）において溶解し、およびアセトン浴中のドライアイス上で-78℃に冷却した。次に、ヘキサン中2.5Mのn-ブチルリチウム（0.86mL、2.08mmol）を20分間滴下した。その後、反応混合物をアセトン浴中のドライアイスから取り出し、および氷浴で0℃に調節した。その間に、前のステップからのイソシアナート（392mg、1.60mmol）をアルゴン下で撹拌し、および反応混合物に連続的に添加した。混合物を室温で夜通し撹拌した。メタノール（4.5mL）を、任意の未反応n-ブチルリチウムをクエンチするために添加し、および溶媒の蒸発がベージュ色固体（710mg）を提供した。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル混合物）はI-36を淡白色固体として与えた（362mg、49%の全体収率）。分析用サンプルを熱酢酸エチルから結晶化することによって白色固体（183mg）として取得した。m.p.：267-268℃。IR（ATR）ν：1117、1242、1314、1418、1485、1599、1663、3102、3202、3310cm-1。正確な質量：[C13H10F10N2OS2-H]-について計算値：463.0002；実測値：463.0022。
【００３２】
調製例9．1-(3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)-3-(4-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-37）。ステップ1．トルエン中の3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（350mg、1.60mmol）の溶液（5mL）をトリホスゲン（237mg、0.80mmol）で処理した。直ちにトリエチルアミン（0.22mL、1.60mmol)を加え、および反応混合物を70℃で2時間撹拌した。その後、ペンタン（1mL）を加え、および白色沈殿物を形成した。混合物をろ過し、およびトルエン溶液中の3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニルイソシアナートを与えるために、ペンタンを室温にて真空中で蒸発させ、それをさらに精製することなく次のステップで使用した。ステップ2．4-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（246mg、1.12mmol）を、アルゴン下で無水THF（5mL）に溶解し、およびアセトン浴中のドライアイス上で-78℃に冷却した。次いで、ヘキサン中の2.5Mのn-ブチルリチウム（0.6mL、1.46mmol）を20分の間滴下して加えた。その後、反応混合物をアセトン浴中のドライアイスから取り出し、および氷浴で0℃に調節した。その間に、前のステップからのイソシアナート（275mg、1.12mmol）をアルゴン下で撹拌し、および反応混合物に連続的に添加した。混合物を室温で夜通し撹拌した。メタノール（4.5mL）を、任意の未反応n-ブチルリチウムをクエンチするために添加し、および溶媒の蒸発は褐色ゴム（742mg）を提供した。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル混合物）は化合物I-37を淡白色固体として与えた（102mg、20%の全体収率）。m.p.：216-217℃。IR（ATR）ν：1103、1196、1229、1304、1410、1487、1549、1597、1665、3088、3134、3204、3321cm-1。正確な質量：[C13H10F10N2OS2-H]-について計算値：463.0002。実測値：463.0017。
【００３３】
調製例10．1,3-ビス(4-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニル)尿素（化合物I-38）。ステップ1．トルエン中の4-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（350mg、1.37mmol）の溶液（5mL）をトリホスゲン（204mg、0.69mmol）で処理した。直ちにトリエチルアミン（0.20mL、1.37mmol）を加え、および反応混合物を70℃で2時間撹拌した。その後、ペンタン（1mL）を加え、および白色沈殿物を形成した。混合物をろ過し、およびトルエン溶液中の4-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)フェニルイソシアナートを得るために、ペンタンを室温にて真空中で蒸発させ、それをさらに精製することなく次のステップに用いた。ステップ2．4-クロロ-3-(ペンタフルオロ-λ6-スルファニル)アニリン（278mg、1.09mmol）を、アルゴン下で無水THF（6mL）に溶解し、およびアセトン浴中のドライアイス上で-78℃に冷却した。次いで、ヘキサン中の2.5Mのn-ブチルリチウム（0.60mL、1.42mmol）を20分の間滴下して加えた。その後、反応混合物をアセトン浴中のドライアイスから取り出し、および氷浴で0℃に調節した。その間に、前のステップからのイソシアナート（307mg、1.09mmol）をアルゴン下で撹拌し、および反応混合物に連続的に添加した。混合物を室温で夜通し撹拌した。任意の未反応n-ブチルリチウムをクエンチするために、メタノール（4.5mL）を添加し、および溶媒の蒸発がオレンジ色ガム（675mg）を提供した。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル混合物）は化合物I-38を白色固体として与えた（136mg、23%の全体収率）。m.p.：237-238℃。IR（ATR）ν：1042、1130、1227、1290、1396、1477、1545、1587、1645、1699、3030、3138、3306cm-1。正確な質量：[C13H8Cl2F10N2OS2-H]-として計算値：530.9223。実測値：530.9236。
HRIアクチベーターの識別および活性の例
【００３４】
以下の略語を用いる：Akt：プロテインキナーゼB；ORO：Oil Red O；BSA：ウシ血清アルブミン；DMSO：ジメチルスルホキシド；GTT：糖負荷試験；AUC：曲線下面積；HFD：高脂肪食；CT：コントロール。
【００３５】
HRIアクチベーターはヒトHuh-7肝細胞においてHRIリン酸化を増加させる。HRIは自己リン酸化によって活性化され、およびこのことはその活性化を評価するために使用した。実際、HRIの過剰リン酸化はそのeIF2αキナーゼ活性の増加を伴う(Lu（ルー）Lら、「Translation initiation control by heme-regulated eukaryotic initiation factor 2α kinase in erythroid cells under cytoplasmic stresses（細胞質ストレス下の赤血球細胞におけるヘム制御真核生物翻訳開始因子2αキナーゼによる翻訳開始コントロール）」、Mol. Cell. Biol.（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー）、2001年、第21巻、第7971-7980頁参照）。したがって、HRIタンパク質は、自然な非リン酸化76-kDa種および/または自己活性化/自己リン酸化92-kDaとして構成的に存在するが、各HRI種の相対的存在量は調べた細胞によって異なる傾向がある（Acharya（アチャリヤ）P.ら、「Hepatic heme-regulated inhibitor (HRI) eukaryotic initiation factor 2α kinase: A protagonist of heme-mediated translational control of CYP2B enzymes and a modulator of basal endoplasmic reticulum stress tone（肝臓ヘム制御インヒビター（HRI）真核生物翻訳開始因子2αキナーゼ：CYP2B酵素のヘム媒介翻訳コントロールの主役および基礎小胞体ストレストーンのモジュレーター）」、Mol.Pharmacol（モレキュラー・ファーマコロジー）、2010年、第77巻、第575-592頁参照）。新しい合成化合物がHRIを活性化することができたかどうかを評価するために、本発明者らは新しい化合物に曝露されたHuh-7細胞が比率のリン酸化/合計HRIでの増加を示し、この酵素の活性化がこれらの化合物によって指し示されるかどうかをウェスタンブロットにより調べた。したがって、Huh-7細胞をビヒクル（DMSO、CT細胞）または10μMの各アッセイ化合物と共に24時間インキュベートした。これらの化合物の効果を、よく知られるHRIアクチベーターBTdCPUと比較した。化合物I-25、I-26、I-27、I-28、およびI-29は、比率のリン酸化/合計HRIを増加させ（図1）、特に、化合物I-28およびI-29は、このキナーゼの活性化を指し示した。化合物I-30（図2）もまた、BTdCPUについて観察されたものと同様にリン酸化HRIのレベルを増加させた一方、I-33によって引き起こされる増加もまた主にこの化合物によって引き起こされる合計HRIでの減少のため、統計的に有意であった。
【００３６】
HRIアクチベーターはヒトHuh-7肝細胞においてeIF2αリン酸化を増加させる。HRIはタンパク質合成制御を実行するために真核生物翻訳開始因子2α（eIF-2α）をそのSer 51残基にてリン酸化するキナーゼであり、およびそれによってHRIアクチベーターは以前に記載されたようにeIF2αのリン酸化を引き起こす（Chen Tら、同上）。新しい合成化合物がHRI eIF2αキナーゼを活性化することができたかどうかを確認するために、本発明者らは、よく知られるHRI eIF2αキナーゼアクチベーターBTdCPUと比較してこれらの化合物によって引き起こされるeIF2αリン酸化を調べた。ヒトHuh-7肝細胞をビヒクル（DMSO、CT細胞）または10μMの各アッセイ化合物と共に24時間インキュベートした。eIF2αリン酸化はウエスタンブロットにより決定した。化合物I-26、I-27、I-28、およびI-29は、eIF2αリン酸化の顕著な、BTdCPUで観察されたものよりも高い増加を引き起こしたが、化合物I-25によって誘発されたリン酸化は、BTdCPUについて観察されたものと類似していた（図3）。化合物I-30およびI-33は、eIF2αリン酸化をBTdCPU曝露によって達成されたものと同様の値にまで増強した（図4）。
【００３７】
肝細胞におけるトリグリセリド蓄積。肝細胞におけるトリグリセリド蓄積およびインスリンシグナル伝達に対するHRIアクチベーターの効果を調べるために、N,N'-ジアリール尿素BTdCPUを使用した。HRIは、タンパク質合成制御を実行するために、eIF2αをそのSer 51残基にてリン酸化するキナーゼであり、およびそれによってHRIアクチベーターは、以前に記載されたようにeIF2αのリン酸化を引き起こす（Chen T.ら、同上）。まず、飽和脂肪酸パルミテートに曝露されたヒトHuh-7肝細胞に対するBTdCPUの効果を探索した。Huh-7細胞を、24時間、BSA（コントロール、CT）、BSAとコンジュゲートした0.75mmol/Lパルミタートまたは0.75mmol/Lパルミタートに加えた10μmol/L BTdCPU（Pal+BTdCPU）と共にインキュベートした。次に、それらを、Huh-7細胞内の中性脂質（主にトリグリセリドおよびコレステロールエステル）の選択的検出を可能にするOil Red Oで染色した。パルミタートに曝露されたHuh-7細胞は、Oil Red O（ORO）染色によって実証されるように、トリグリセリドの高い蓄積を示したが、この蓄積はBTdCPU化合物の存在下で妨げられた（図5参照）。したがって、このアッセイは、HRI活性化がヒトHuh-7肝細胞におけるパルミタート誘発トリグリセリド蓄積を妨げることを実証する。
【００３８】
肝細胞におけるインスリンシグナル伝達。本発明者らは、インスリン刺激性Aktリン酸化を測定することによってインスリンシグナル伝達経路を調べた。Huh-7細胞を、BSA（コントロール、CT）、BSAとコンジュゲートした0.75mmol/Lパルミタート（Pal）、または0.75mmol/Lパルミタートに加えた10μmol/L BTdCPU（Pal+BTdCPU）と共に24時間インキュベートした。合計およびリン酸化Aktの免疫ブロット分析を行った。図6は、細胞をインスリンで10分間刺激したとき（陽性コントロール、CT+）、このホルモンがインスリンに曝露されていないコントロール細胞（陰性コントロールCT-）と比較してリン酸化Aktのレベルをどのように増加させたかを示す。しかしながら、飽和脂肪酸パルミタートに曝露された細胞では、インスリンはAktのリン酸化を増加させず、これはインスリンシグナル伝達経路が減弱されたことを示す。興味深いことに、BTdCPU化合物は、パルミタートによって引き起こされるインスリン刺激性Aktリン酸化において減少を部分的に回復させ（図6参照）、この薬物処置がパルミタート誘発性インスリン抵抗性を防止することが示される。したがって、このアッセイは、HRI活性化がヒトHuh-7肝細胞においてパルミタート誘発性インスリン抵抗性を防止することを実証する。
【００３９】
耐糖能（Glucose tolerance、糖耐性とも言う）。T2DMは、末梢性（筋肉、脂肪、および肝臓）インスリン抵抗性ならびに膵島β細胞機能不全によって与えられる耐糖能障害によって特徴付けられる（Andrikopoulos（アンドリコプロス）S.ら、「Evaluating the glucose tolerance test in mice（マウスにおける耐糖能試験の評価）」、Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.（アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー。エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム）、2008年、第295巻、pp.E1323-32を参照）。糖負荷試験（glucose tolerance test、GTT）は、グルコース負荷の処分を評価することによって耐糖能異常を有する個体を識別するための臨床診療および研究において使用される。GTTが、耐糖能異常（impaired glucose tolerance、耐糖能障害とも言う）を識別する唯一の手段であり、それが前糖尿病状態と考えられることを認めることが重要である（Andrikopoulos S.ら、上記同書を参照）。GTTsからの結果の標準的な提示は、グルコース施与後の経時的な血糖レベルの説明である。大抵は、絶対的なグルコースレベルの時間経過が示される。糖尿病またはインスリン抵抗性モデル（例えば、HFD給餌マウスなどのようなもの）を使用するとき、ベースライングルコースを超えるAUCの計算とともに絶対的なグルコースレベルの時間経過をさらに提示する必要がある。このアッセイにおいて、高脂肪餌料（HFD）を与えたマウスにおいて耐糖能に及ぼすBTdCPU化合物の効果を調べた。アッセイのために、マウスに標準食（CT）、3週間のHFD（HFD）、または3週間のHFDに加え最後の週の間のBTdCPU（HFD+BTdCPU）を与えた。標準食を給餌したマウスおよびHFDを給餌した半数のマウスは、最後の週について1日1回DMSO（ビヒクル）の腹腔内施与を受けた。HFDを与えられた残りのマウスは最後の週についてBTdCPU（70 mg kg-1 day-1）の1日1回の腹腔内施与を受けた。予想通り、HFDはAUCを有意に増加させ、耐糖能障害（glucose intolerance、耐糖能異常とも言う）の存在が示された（図7参照）。注目すべきことに、HFDを給餌したマウスへのBTdCPU投与はベースライングルコースを超えるAUCでの増加を防ぎ、およびこれらのマウスは標準餌料（CT）を給餌したマウスで観察されたものと類似のAUCを示した。したがって、HRI活性化はHFD誘発耐糖能障害を防ぐと結論付けられる。
【００４０】
脂肪変性。本発明者らは、HRIアクチベーター（BTdCPU）による処置が、HFDによって誘発される脂肪変性の発症を防止するかどうかを調べた。肝生検の組織学的分析は、脂肪変性の程度を評価するためのゴールドスタンダード（究極の判断基準とも言う）のままである。肝臓切片のORO染色およびエオシン-ヘマトキシリン（H&E）染色を実行した。標準食を給餌したマウスおよびHFDを給餌した半数のマウスに最後の週の間で1日1回DMSO（ビヒクル）の腹腔内投与を受けた。HFDを給餌した残りのマウスは最後の週の間で1日1回BTdCPU（70mg kg-1 day-1）の腹腔内投与を受けた。標準餌料を給餌したマウスと比較して、HFDを給餌したマウスの肝臓は、ORO切片の評価において赤色に染色された脂肪滴の存在を示した（図8A、上段）。同様に、H&E切片の分析は、大滴性の（macrovesicular）脂肪変性の存在を示した（図8A、下段）。マウスにHFDを給餌し、およびHRIアクチベーターで処置したとき、OROおよびH&E染色によって実証されるように、脂肪肝（hepatic steatosis）が逆転した。最終的に、肝臓脂質を抽出し、および肝臓トリグリセリドレベルを商業上入手可能なキット（TR0100、Sigma（シグマ社））を用いることによって評価した。HFDを給餌されたマウスの肝臓は、肝臓トリグリセリドのレベルにおいて著しい増加を示し、およびこの増加は、マウスがBTdCPUで処置されたとき完全に効果をなくされた（図8B）。全体として、これらの知見はHRI活性化がHFD誘発脂肪変性を防止することを示す。
【００４１】
肝細胞におけるFGF21発現。本発明者らがヒトHuh-7肝細胞においてFGF21発現に対するHRIアクチベーターの効果を調べたとき、その者らは化合物BTdCPU、I-36、I-37およびI-38が化合物BTCtFPUより著しく高い増加を示すことを観察した。加えて、化合物I-36、I-37およびI-38は、化合物BTdCPUよりもFGF21発現において著しく高い増加を誘導した（図9A参照）。さらに、化合物I-26による処置は、FGF21においてBTCtFPUよりも高い発現をもたらしたが、その一方で化合物I-26およびI-29は、化合物BTdCPUに関して観察されるものよりもFGF21発現においてより一層高い増加を示した（図9B参照）。
【００４２】
本出願に引用される参考文献
特許文献
-米国特許第US 3073861号明細書
-米国特許第US 7932416号明細書
-米国特許第US 8937088号明細書
非特許文献
-Acharya P.ら、「Hepatic heme-regulated inhibitor eukaryotic initiation factor 2α kinase: A protagonist of heme-mediated translational control of CYP2B enzymes and a modulator of basal endoplasmic reticulum stress tone」、Mol. Pharmacol、2010年、第77巻、第575-592頁。
-Andrikopoulos S.ら、「Evaluating the glucose tolerance test in mice」、Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.、2008年、第295巻、pp. E1323-32。
-Chen T.ら、「Chemical genetics identify eIF2α kinase heme-regulated inhibitor as an anticancer target」、Nature Chem. Biol.、2011年、第7巻、第610-616頁、およびSupp. Information。
-Denoyelle S.ら、「In vitro inhibition of translation initiation by N,N'-diarylureas potential anti-cancer agents」、Bioorg. Med. Chem. Lett.、2012年、第22巻、第402-409頁。
-Karagiannidis L.E.ら、「Highly effective yet simple transmembrane anion transporter based upon ortho-phenylenediamine bis-ureas」、Chem. Commun.、2014年、第50巻、第12050-12053頁、Electronic Supplementary Information。
-Lu L.ら、「Translation initiation control by heme-regulated eukaryotic initiation factor 2α kinase in erythroid cells under cytoplasmic stresses」、Mol. Cell. Biol.、2001年、第21巻、第7971-7980頁。
-Marchesini G.ら、「Nonalcoholic fatty liver disease: a feature of the metabolic syndrome」、Diabetes、2001年、第50巻、第1844-1850頁。
-Musso G.ら、「Metaanalysis: natural history of non-alcoholic fatty liver disease and diagnostic accuracy of non-invasive tests for liver disease severity」、Ann. Med.、2011年第43巻、第617-649頁。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【国際調査報告】
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