(57)【要約】  連続式ウイルスクリアランスのバリデーション方法であって、バリデーションされるプローブを用意するステップと、有効な状態でプローブをスパイクするステップと、ウイルスクリアランスを行うステップと、スパイクされたプローブをサンプリングするステップと、ステップｄ）のスパイクされたプローブのサンプルを分析するステップと、を含む方法をここに開示する。
2019537435.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続式ウイルスクリアランスのバリデーション方法であって、前記方法は、
ａ）バリデーションされるプローブを用意するステップと、
ｂ）有効な状態でプローブをスパイクするステップと、
ｃ）ウイルスクリアランスを行うステップと、
ｄ）スパイクされたプローブをサンプリングするステップと、
ｅ）ステップｄ）のスパイクされたプローブのサンプルを分析するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記プローブは、ストリームおよび／または製品流である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スパイクされたプローブをサンプリングするステップｄ）は、所定の時間の間にサンプリングすることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
有効な状態で前記サンプルをスパイクするステップｂ）は、前記サンプルを、ホモジナイズ後にスパイクすることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｃ）において、前記ウイルスクリアランスは、ウイルス不活化である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｃ）において、前記ウイルスクリアランスは、ＣＦＩ内で行われるウイルス不活化である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記スパイクされたプローブをサンプリングするステップは、前後逆サンプリングを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記スパイクされたプローブをサンプリングするステップは、サンプリング容器に入るときに直ちに中和された各プローブ滴を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記スパイクされたプローブのサンプルを分析するステップｄ）は、ウイルス粒子が存在するかどうかを判別することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記スパイクされたプローブのサンプルを分析するステップｄ）は、ウイルス粒子の定量化を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
治療用タンパク質の連続式製造方法における請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
治療用タンパク質製造の連続式プロセシングは、益々重要になっており、真に連続式システムを実現するための最初の解決策が登場している。治療用タンパク質製造の連続式方法の根幹は、ウイルス不活化である。Ｋｌｕｔｚらは、連続式低ｐＨウイルス不活化用ツールとして、コイルドフローインバータ（ＣＦＩ）を導入した（Klutz, S. et al. 2015, Journal of Biotechnology 213, pp. 120-130）。これは、バッチ式概念を連続式方法になるように狭く規定された滞留時間分布を提供している（Klutz, S. et al. (2015) Chemical Engineering Research and Design 95, pp. 22-33）。加えて、使い捨て技術の使用を可能にする治療用タンパク質製造の連続式方法は特に興味深い。
【０００２】
しかしながら、ＧＭＰ（国際調和会議  統一三極ガイドライン）、ＦＤＡ（ＣＢＥＲ、２／２８／１９９７ガイドライン）およびＥＭＥＡ（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６８／９５、１９９６ガイドラインまたはＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＢＷＰ／３９８４９８、２００９ガイドライン）などのガイドラインおよび規格に従った治療用タンパク質製造の連続式プロセシングを使用するため、いかなるウイルス汚染も確実に除去することを保証する必要があるだけでなく、これを実証しなければならない。
【０００３】
したがって、治験薬（ＩＮＤ）提出のために規制当局により、ウイルスクリアランス検査を必要とし、とりわけ、抗体（モノクロナール）、組換えタンパク質および糖タンパク質、ならびに組織および血液由来製品のための方法開発において特に重要である。
【０００４】
すなわち、効果的ウイルスクリアランスは、患者の安全性を保証するために全てのバイオ医薬製品方法にとって必須である。例えば、モノクロナール抗体（ｍＡｂ）の製造のため、２つの直交型専用ウイルスクリアランスステップが必要である。各ステップは、≧４の対数減少値（ＬＲＶ）でなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の目的は、ウイルス汚染が確実にクリアされている、すなわち、除去または不活化されていることを示すための新規で簡便かつ安価な解決策を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、連続式ウイルスクリアランス（continuous viral clearance）のバリデーション（validation）であって、
ａ）バリデーションされるプローブを用意するステップと、
ｂ）有効な状態でプローブをスパイクするステップと、
ｃ）ウイルスクリアランスを行うステップと、
ｄ）スパイクされたプローブをサンプリングするステップと、
ｅ）ステップｄ）のスパイクされたプローブのサンプルを分析するステップと、
を含む方法により目的を達成する。
【０００７】
この方法は、連続式ウイルスクリアランスの簡便かつ安価なバリデーションを可能とする利点を有する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書で使用されるとき、用語「バリデーション」は、特定の方法（process）、方法（method）、またはシステムが所定の判定基準を満足する結果を一貫して製造する証拠または高度な保証を確立する方法を表す。
【０００９】
医薬産業において、例えば、それ自体を製造するようになされた方法が期待される結果を一貫して製造することを保証することは非常に重要である。
【００１０】
本明細書で使用されるとき、用語「連続式」は、プローブが処理されるとき、バリデーションを連続的に行う事実を表す。対照的に、「バッチ式」方法では、プローブ、例えば、製品の完全な変化を所与の時点においてバリデーションする。すなわち、本明細書で使用されるとき、連続式方法は、少なくとも２つの工程段階を連続して行い、それにより第二工程段階は、第一工程段階が完了する前にプローブ処理を始める方法を表す。
【００１１】
本明細書で使用されるとき、用語「クリアランス」は、ウイルス粒子の除去またはウイルス粒子の不活化を表す。
【００１２】
したがって、ウイルスクリアランスを行うステップは、プローブ内に存在するより少ないウイルス粒子をもたらし、および／または該ウイルス粒子は、もはや細胞、特に宿主細胞に感染することができない、すなわち、該ウイルス粒子は不活化されている。
【００１３】
本明細書で使用されるとき、用語「プローブ」は、ウイルスを含む可能性がある物質を表す。
【００１４】
本明細書で使用されるとき、用語「スパイクすること」は、実質的にウイルス負荷量を意図的に増加させることを表す。
【００１５】
本明細書で使用されるとき、用語「ウイルス」は、用語「ウイルス粒子」と互換的に使用し、細菌より小さく、宿主細胞に感染した後にのみ繁殖することができる病原体を表す。
【００１６】
ウイルスクリアランス試験の多くの場合、所与のサンプル中のウイルス濃度は極めて低い。他の抽出方法では、低レベルの不純物は無視することができるが、ウイルスは感染性不純物であるのでたとえ１個のウイルス粒子でも全体の過程連鎖を損なうのに充分であり得る。特定の測定を行い、どんな種類のウイルスでもどんな種類のプローブからでも抽出する適切な除去方法または不活化方法を決めなければならないことは、この理由による。
【００１７】
スパイキング試験は、特にこの目的のために開発された。スパイキング試験は、ウイルス除去、すなわち、クリアランスまたは不活化の可能な方法を決めるために行われた試験である。これらは、プローブのウイルス数（または活動水準）が最初の１０４倍または１０５倍で増加することがウイルス除去／不活化比を１桁変化させるだけであるという原理による。この知識から、ウイルス数（または活性化水準）を元のプローブの１０４倍または１０５倍増加または「スパイクする」最先端で公知のスパイキング試験が開発された。それから、この新しい活動数または活動レベルを含むプローブを、通常、最適なクリアランス方法に付す。最新技術では、ウイルスの活動数または活動レベルを、最適なクリアランス方法の初めと終わりに測定して、減少率の算出に使用する。ウイルス除去または不活化ステップに関する従来試験のこの減少率（ＲＦ）を、次式を用いて算出する：
ＲＦｓｔｅｐ＝ｌｏｇ１０［（Ｖ１×Ｔ１）／（Ｖ２×Ｔ２）］
式中：
・Ｖ１＝クリアランスステップ前のスパイクした供給原料の体積
・Ｔ１＝クリアランスステップ前のスパイクした供給原料のウイルス濃度
・Ｖ２＝クリアランスステップ後の材料の体積
・Ｔ２＝クリアランスステップ後の材料のウイルス濃度
【００１８】
本明細書で使用されるとき、用語「有効な状態」は、スパイクを再現性よく行う必要があり、ウイルス粒子負荷の所望レベルが常に保証されなければならないという事実を表す。
【００１９】
すなわち、ウイルス粒子負荷が一貫してウイルスクリアランス前の単位操作と関係なく所望レベルに達するようにスパイキング点を選択することを保証されなければならない。
【００２０】
したがって、ウイルスクリアランス方法は、連続式方法の特定の特徴、例えば、様々なｐＨレベル、滞留時間、温度、添加剤濃度、溶液の均一性および導電性などを考慮する必要がある。
【００２１】
バリデーション方法の１つの実施形態では、プローブはストリームおよび／または製品流である。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、用語「ストリーム」は、液体および／または気体の連続フローを表す。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、用語「製品流」は、製品を含んでなるストリームを表す。
【００２４】
本明細書に記載されているバリデーション方法の１つの実施形態では、プローブは製品流である。この製品流は、例えば、製品が所望の特性に達するまで、１つの単位操作から別の単位操作に流れる。
【００２５】
本明細書に記載されているバリデーション方法の代替の実施形態では、プローブはストリームである。このストリームは、例えば、製造過程に入るストリームであってよい。
【００２６】
同じ製造過程は、プローブが製品流である本明細書に記載されているバリデーション方法およびプローブがストリームである本明細書に記載されているバリデーション方法の両方を含んでなることができる。
【００２７】
特定のストリームおよび／または製品流に必要とされる減少率は、多くの異なる因子に依存し、そのいくつかは、以下のものが挙げられる：
・  予想されるウイルス初期濃度、および／または
・  精製されている製品、および／または
・  ウイルス感染量（インビボ使用）、および／または
・  完全除去に代わって不活化が実行可能かどうか、もしそうなら不活化状態
【００２８】
スパイキング材料を添加するため、ポンプまたはシリンジを使用することができる。
【００２９】
本明細書に記載されているバリデーション方法の好ましい実施形態では、有効な状態でプローブをスパイクするステップを、コネクタ、例えば、Ｙ接合部および／またはＴ接合部を用いて行う。
【００３０】
本明細書に記載されているバリデーション方法の好ましい実施形態では、混合装置を使用してストリームおよび／または製品流およびスパイキング材料を混合しない。
【００３１】
代替の実施形態では、静的ミキサーおよび／または混合容器または混合なしの容器を使用してストリームおよび／または製品流およびスパイキング材料を混合する。
【００３２】
本明細書に記載されているバリデーション方法の１つの実施形態では、スパイクされたプローブのサンプリングのステップｄ）は、所定時間のサンプリングを含む。
【００３３】
この実施形態は、連続式製造過程では製品流を、例えば、ｐＨ値、電導度または製品濃度に関する異なる単位操作における周期的変動条件に付することができることを考慮すると好都合である。
【００３４】
この実施形態の利点は、下記実施例を参照すれば特に明らかになる。この実施例では、製品流は連続式クロマトグラフィーの溶出液であり、ウイルス不活化のためにコイルドフローインバータ（ＣＦＩ）を使用する。この実施形態では、所定時間、すなわち、固定サンプリング時間は連続式クロマトグラフィーから得られるｐＨ変動の影響を除外する効果を有する。この好ましい実施形態では、サンプリング時間を１つのスイッチ時間に設定することがさらに好ましい。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、用語「スイッチ時間」は、連続式クロマトグラフィーが溶出のために次のカラムに切り換える前に特定のカラムを溶出する時間を表す。
サンプリング時間を１つのスイッチ時間に設定することにより、連続式クロマトグラフィーから得られる期待されるｐＨレベルの完全収集を集める。すなわち、所定時間、例えば、スイッチ時間にわたってサンプリングすることにより、周期的変動条件を考慮する。さもなければ−例えば、連続式クロマトグラフィー後にｐＨ測定する場合−連続式クロマトグラフィーから出る製品流が低ｐＨレベルである時間における瞬間と比較して、連続式クロマトグラフィーから出る製品流が高ｐＨレベルである時間における瞬間にサンプルを採取するかどうかに応じて、結果は偽装されてもよく、再現性がなくてもよい。
【００３６】
したがって、同条件で同じ結果を確実に与える方法、すなわち、連続式ウイルス不活化のバリデーション手順に適した方法を提供するため、スパイクされたプローブをサンプリングするステップは、ウイルス不活化に先行する単位操作が周期的変動条件を有する場合はいつでも、所定時間、例えば、スイッチ時間にサンプリングすることを含むことが好ましい。
【００３７】
本明細書に記載されているバリデーション方法の１つの実施形態では、プローブは、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、核酸からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含んでなる。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」は、比較的短い長さ（例えば、５０アミノ酸未満）のアミノ酸の重合体を表す。該重合体は、直鎖でも分岐鎖でもよく、修飾アミノ酸を含んでなり得、非アミノ酸により割り込まれていてもよい。該用語は、例えば、ジスルフィド結合生成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または、これに限定されないが、蛍光マーカー、粒子、ビオチン、ビーズ、タンパク質、放射性標識、化学発光タグ、生物発光標識、および同様のものなどの標識成分との結合など、他の操作により修飾されたアミノ酸重合体も包含する。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、用語「タンパク質」は、アミノ酸のポリペプチドを表す。該用語は、完全長野生型またはそのフラグメントであり得るタンパク質を包含する。該タンパク質は、対応する天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸重合体および非天然アミノ酸重合体のヒト、非ヒト、および人工または化学的擬態であってよい。
【００４０】
好ましくは、タンパク質は治療用タンパク質である。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、用語「治療用タンパク質」は、生体に投与して前記生体の組織、器官または系の生物応答または医療応答を誘発することができるタンパク質を表す。
【００４２】
さらにより好ましくは、タンパク質は抗体である。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの免疫活性部分、すなわち、抗原結合部位を含む分子などの結合分子を表す。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、用語「小分子薬物」は、生物過程の調節を助け得る低分子量（＜９００ダルトン）化合物を表す。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖の形態のいずれかにおけるその重合体を表す。特に限定されない限り、該用語は、参照核酸として類似の結合特性を有する、および天然ヌクレオチドと同様に代謝された天然ヌクレオチドの類似体を含む核酸を包含する。特に断りがない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列ならびに明示的に指定された配列も黙示的に包含する。
【００４６】
下記に記載されている実施例では、コイルドフローインバータ（ＣＦＩ）を、ウイルス不活化のために使用した。  これは規定された最短の滞留時間をもたらすように構成された。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、用語「最短滞留時間」は、所与の機器、例えばＣＦＩにおいて単独ウイルス／ウイルス粒子が少なくとも残存する時間を表す。
【００４８】
本明細書に記載されているバリデーション方法の１つの実施形態では、有効な状態でサンプルをスパイクするステップは、サンプルを、ホモジナイズ後にスパイクすることを含む。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、用語「ホモジナイズすること（homogenization）」は、ウイルスクリアランスのために重要であるプローブの１つ以上の特性がプローブ内で一貫していることを保証する単位操作を表す。
【００５０】
例えば、プローブが製品流であり、ウイルスクリアランス前の単位操作は連続式クロマトグラフィーであり、ウイルスクリアランスに重要であるプローブの特性はｐＨ値である場合、ホモジナイズすることは、ホモジナイズから出たときの製品流全体は同じｐＨレベルである。
【００５１】
好ましい実施形態では、ホモジナイゼーションループにおいてホモジナイズを行う。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、用語「ホモジナイゼーションループ」は、管から構成された連続式撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）を表す。すなわち、ホモジナイゼーションループは、撹拌機器を備えた１つの大きな槽からなるのではなく、むしろ、ストリームをポンプ輸送する管の円形配置からなる。内容積フローは入口および出口フローより高いので、入ってくるストリームの良好な混合が達成される。
【００５３】
ｐＨ３〜ｐＨ７で変動する連続式クロマトグラフィーのｐＨレベルを調節するために連続式撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）としてホモジナイゼーションループを使用する場合、どの具体的なクロマトグラフィーカラムから所与のサンプルが由来しているのかを識別することは不可能である。したがって、サンプリングされた体積は、連続式クロマトグラフィーシステムの１つまたは２つでさえ不特定カラムの溶出液を保持することができる。異なるクロマトグラフィーカラムの影響を排除するために、ＣＦＩ内のいくつかのサンプル点を２回サンプリングする。
【００５４】
下記に考察される実施例では、スパイク点をホモジナイゼーションループ後に設定した。
【００５５】
ＣＦＩは実際の低ｐＨウイルス不活化装置であるので、これはその例であった。したがって、実際の単位操作（ＵＯ）、すなわち、ＣＦＩ中の低ｐＨウイルス不活化前のホモジナイゼーションループ中の低ｐＨレベルにおいてプローブは特定の滞留時間を有するので、ホモジナイゼーションループ前のスパイキングは最大ＬＲＶの減少の可能性の原因となっただろう。
【００５６】
本明細書に記載されているバリデーション方法の実施形態では、ステップｃ）のウイルスクリアランスはウイルス不活化である。
【００５７】
このウイルス不活化は、好ましくは、ｐＨレベル≦４で行う。これらの条件におけるウイルス不活化は、所与の適切な滞留時間が大きなエンベロープを持ったウイルスを確実に不活性化する効果を有する。
【００５８】
本明細書に記載されているバリデーション方法の実施形態では、ステップｃ）のウイルスクリアランス
ウイルスクリアランスは、コイルドフローインバータ（ＣＦＩ）中で行うウイルス不活化である。
【００５９】
このウイルス不活化を、例えば、ＣＦＩ中、ｐＨ≦４において行う。ウイルス不活化に必要な滞留時間が信頼でき、再現性よく保証されるので、ＣＦＩの使用は有利である。
【００６０】
好ましくは、ウイルス不活化を、ｐＨ≦４において行う。
【００６１】
しかしながら、リン酸トリ（ｎ−ブチル）およびツイーンまたはトリトンＸ−１００もしくはヨウ素もしくはβ−プロピオラクトンなどの他の不活化化学薬品などの溶媒および／または界面活性剤を用いて、ウイルス不活化を行ってもよい。加えて、ＣＦＩを用いたウイルス不活化を、照射および／または、例えば、カプリル酸の使用など沈殿により行ってもよい。
【００６２】
さらに、低ｐＨ処理ならびに溶媒および／または界面活性剤および／または照射および／または沈殿の使用によるウイルス不活化の組合せを使用してよい。
【００６３】
本明細書に記載されているバリデーション方法のさらなる実施形態では、ステップｃ）のウイルスクリアランスを、ＣＦＩに加えてまたはＣＦＩの代わりに、プラグドフローリアクター、ストレート管および／またはストレートヘリックスで行う。
【００６４】
本明細書に記載されているバリデーション方法のさらに別の実施形態では、スパイクされたプローブのサンプリングステップは、前後逆サンプリング（back to front sampling）を含む。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、用語「前後逆サンプリング」は、サンプリングを方法の終わりに開始し、それから、前記方法の開始点に向かって進む方法を表す。
【００６６】
例えば、ＣＦＩにおけるウイルス不活化の場合、前後逆サンプリングは、ＣＦＩの出口において、またはその近くで第一サンプルを採取し、それから、ＣＦＩの入口に向かって、すなわち、ＣＦＩ中の現在のフローに逆らってサンプリングを進めることを意味する。
【００６７】
連続式方法としてウイルス不活化の場合に、前後逆サンプリングは、ストリームまたは製品流を連続式方法の開始点においてサンプルを採取するために停止する必要がない利点を有する。下記に記載されている実施例の場合、≦４の低ｐＨ値においてウイルス不活化が継続するが製品流はＣＦＩを通り抜けて進行しないので、このような連続式製品流の休止は分析を歪めるだろう。したがって、ウイルス不活化レベルは、もはや製品流がＣＦＩ中で進行した距離と相関しないだろう。加えて、ＣＦＩの必要な部分は流され、サンプリング毎に最初に定常状態に達する必要があり、広く増長した実験期間をもたらす。
【００６８】
さらに、ＣＦＩ内のサンプリングは、内部フローパターンの撹乱をもたらす。したがって、サンプリング方法は、こういう理由からも、妥当な結果を保証するために注意深く選択されなければならなかった。したがって、下記に記載されている実施例では、サンプリングをＸＭ１８において開始し、ＸＭ１２で終了した（図３参照）。
【００６９】
本明細書に記載されているバリデーション方法のさらに別の実施形態では、スパイクされたプローブのサンプリングステップは、サンプリング容器に入るときに各プローブ滴を直ちに中和することを含む。
【００７０】
サンプリング容器に入るときに、各プローブ滴を直ちに中和することの特徴は、ｐＨ約７にｐＨ値が直ちに変化する緩衝液、例えば、２Ｍトリス緩衝液で容器を満たすことにより達成することができる。したがって、高度に時間依存性である低ｐＨ値を使用したウイルス不活化の場合、サンプリング時に反応を確実に停止し、それによりサンプル内の低ｐＨレベルにおける不均一な滞留時間を防止する。
【００７１】
好ましくは、三方コックによりサンプルを採取する。さらに、方法を中断しないでサンプルを採取することを可能とするサンプルを取り出すいずれもの方法を使用してよく、例えば、Ｔ接合部を使用してもよく、ＣＦＩの管を連続的に短くしてもよい。
【００７２】
本明細書に記載されているバリデーション方法のさらに別の実施形態では、スパイクされたプローブのサンプルを分析するステップｄ）は、ウイルス粒子が存在するかどうかを判別することを含む。
【００７３】
ウイルス粒子数を増加させる方法ならびに、例えば、次世代シーケンスおよび／またはシーケンシング法と組み合わせた他のＰＣＲベース方法などの当技術分野で公知の標準的方法を用いたそれらの判別により、この判別を行うことができる。
【００７４】
本明細書に記載されているバリデーション方法のさらなる実施形態では、ステップｄ）−スパイクされたプローブのサンプルを分析する−は、ウイルス粒子の定量化を含む。
【００７５】
概して、ウイルス定量化は、特定の体積中のウイルス数を計数して、 プラークアッセイ、フォーカス形成アッセイ、エンドポイント滴定−エンドポイント希釈アッセイとも呼ぶ−タンパク質ベースウイルス定量化アッセイ、等価電子顕微鏡法、調整可能抵抗パルスセンシング、定量ＰＣＲおよび／または大容量プレーティングなどの方法によりウイルス濃度を決定することを含む。
【００７６】
好ましくは、ウイルス粒子の前記定量化を、エンドポイント滴定および／または大容量プレーティングにより行う。
【００７７】
エンドポイント滴定−エンドポイント希釈アッセイとも呼ぶ−は、感染された宿主の５０％を死滅させるのに必要なウイルス数または接種組織培養細胞の５０％の細胞変性効果を得るウイルス数を定量化する。したがって、これは、感染性ウイルス力価の測定として組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）と関連する。組織培養との関連で使用される場合、宿主細胞を播種し、ウイルスの段階希釈を添加する。インキュベーション後、細胞死（すなわち、感染細胞）のパーセンテージを手動で観察し、各ウイルス希釈について記録し、結果を使用してＴＣＩＤ５０結果を数学的に算出する。ＴＣＩＤ５０を算出するために共通に使用される２つ方法は、スピアマン−カルバーおよびリード−ミュンヒの方法である。
【００７８】
大容量プレーティング（ＬＶＰ）は、ＴＣＩＤ５０アッセイと同じ検出法を表す。エンドポイント滴定と対照的に、もっと大量の液体をＬＶＰのために使用して、もっと低い検出限界をもたらす。
【００７９】
さらにより好ましくは、前記ウイルス粒子の定量化を、エンドポイント滴定および大容量プレーティングの組合せにより達成する。
【００８０】
好ましくは、排除されたウイルスは、大きなエンベロープを持ったウイルスである。さらに、ウイルスフィルターにより、小さなエンベロープを持たないウイルスを排除することが可能である。
【００８１】
好ましくは、本明細書に記載されているバリデーション方法を行うため、単回使用装置を使用する。
【００８２】
好ましくは、本明細書に記載されているバリデーション方法を行うため、使い捨て装置を使用する。
【００８３】
好ましい実施形態では、装置は単回使用かつ使い捨てである。
【００８４】
異なる態様では、本発明は、治療用タンパク質製造の連続式方法において本明細書に記載されているバリデーション方法の使用に関する。
【００８５】
したがって、本明細書に記載されているバリデーション方法全体は、規定された滞留時間を保証するためにバッチ式方法でウイルスクリアランスを行うべきであるという最新技術の先入観を、初めて克服する。
【００８６】
さらに、本明細書に記載されているバリデーション方法は：
・規定されたバッチ式滞留時間を連続式方法に移行すること、
・連続式方法において有効なスパイキング手順を保証すること、
・有効なスパイキング点の選択により方法自体を妨害することなく方法条件においてバリデーションを行うこと、
・全ての変動および測定の困難さ、例えば、ポンプの変動、ｐＨ、ウイルス濃度、濃度変動、ストリーム条件測定などを考慮しながら、代表的サンプルをサンプリングすること、
・より遅いサンプリング点を妨害することなく、有効なサンプリング手順を開発すること、
が可能であることを初めて示す
【実施例】
【００８７】
以下に、連続式ウイルスクリアランスのバリデーションを行う例示的方法を記載する。
【００８８】
全ての実験について、Ｔａｒｐｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＢｉｏＳＭＢクロマトグラフィー装置のプロトタイプを使用した。全ての実験の分析としては、それぞれ、ｐＨ電極および使い捨てルアー電導度センサーを用いたｐＨおよび電導度測定を含んだ。
【００８９】
さらに、コイルドフローインバータ（ＣＦＩ）を、ウイルス不活化のために使用した。これを、１２０分の最短滞留時間をもたらすように構成した。したがって、平均滞留時間は１２０分より長く、下記の通りＲＴＤ（滞留時間分布）特性により決定された。最終ＣＦＩセットアップの画は、図３で見ることができる。
【００９０】
プラントセットアップ全体は、図１で見ることができる。このセッティングにおいて、低ｐＨウイルス不活化ステップを、クロマトグラフィー装置後に配置する。Ｔａｒｐｏｎ  ＢｉｏＳＭＢクロマトグラフィー装置の溶出プロファイルは、溶出緩衝液（ｐＨ３．１）および洗浄緩衝液（ｐＨ７．０）の間の周期的に変動するｐＨレベルを示す。低ｐＨウイルス不活化のためのｐＨ全体が４未満にあるとき、ｐＨプロファイルの平均化のためにホモジナイゼーションループを実現する。すなわち、ホモジナイゼーションループ（ＨＬ）を、ｐＨレベルを一定に４未満にする連続式撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）として理解することができる。ＨＬ後、実際の低ｐＨウイルス不活化は、コイルドフローインバータ（ＣＦＩ）内で起こる。
【００９１】
２つの単位操作ＨＬおよびＣＦＩを特性決定するために、滞留時間分布試験を行った。ミリＱ水および１Ｍ  ＮａＣｌ溶液の間の電導度変化を測定した。詳細には、流速を４．８ｍＬ／分に設定した。ステップ機能を、三方コックを用いて行った。３つの異なるセットアップを調査した：ＨＬ（Ａ）、ＣＦＩ（Ｂ）およびＨＬとＣＦＩの組合せ（Ｃ）。両方の可能性のある方向において、ステップ機能を行った。したがって、１Ｍ  ＮａＣｌ溶液で完全に満たした後、ＵＯ、すなわち、４．８ｍＬ／分の一定の流れにおいてミリＱ水を含むＣＦＩまたはＨＬを満たすことにより他の方向において実験を反復した。濃度測定を１に正規化し、最大値の０．５％〜９９．５％の値に限定した。台形法則を使用した数値積分により平均滞留時間を決定した。それから、該平均滞留時間を用いて、滞留時間を１に正規化した。式１に従って、相対幅Ｒｗを算出した。この結果、Θ０．００５およびΘ０．９９５は、無次元時点が０．５％であり、最大無次元濃度の９９．５％に達することを示す。したがって、相対幅は、ＲＴＤが如何に狭いかを示す。
【００９２】
ＲＷ＝θ０．００５／θ０．９９５  （１）
【００９３】
低ｐＨウイルス不活化のため２つの異なる平均ｐＨレベルを調査するために、２つの異なる連続式クロマトグラフィー方法を試験した。両方の方法の実験手順は同じであった。詳細には、ＣＦＩを開始し、クロマトグラフィーから独立してＣＩＰ洗浄した（定置洗浄した）。最初のウイルス実験前に、ＣＦＩを、緩衝液で完全に洗い流し、０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液でＣＩＰ洗浄した。後で、別の緩衝液での洗い流しを行い、システム全体の内部に閉じ込められた気泡を取り除いた。同時に、連続式クロマトグラフィーを開始し、これには、第一カラムが全サイクルを１回通過する前に２．５時間の初回運転を必要とした。洗い流しおよびＣＩＰ手順後の初期段階中、ＨＬおよびＣＦＩを連続式クロマトグラフィーと連結した。連続式クロマトグラフィーの最初の２．５時間後、定常状態に達するために３時間スパイクしたクロマトグラフィー溶出液でＣＦＩを完全に満たさなければならなかった。対応するＲＴＤ実験から、３時間の必要な時間を決定した。最初のウイルス実験後、ＣＦＩを、少なくとも１時間、５Ｍ  ＮａＯＨでＣＩＰ洗浄した。
【００９４】
連続式方法のための新規スパイキング手順を開発しなければならなかった。５％の標準的スパイキングレベルを達成するため、２３０μＬ／分のスパイキング材料を、４．６ｍＬ／分のクロマトグラフィー溶出液流に添加しなければならなかった。Ｇｉｌｓｏｎ  Ｍｉｎｉｐｕｌｓ３ポンプを使用し、スパイク流を、コネクタ経由でクロマトグラフィー溶出液流に添加した。内部混合装置を使用しなかった。スパイク点をホモジナイゼーションループ後に設定した。
【００９５】
ＣＦＩ内の異なる時点からサンプルを取り出すために、三方コックを特定のフレーム間に導入した。サンプリング点、ならびに最終ＣＦＩを図３で見ることができる。異なるサンプリング点によって代表される時点を、完全ＣＦＩ内の平均滞留時間を測定することにより決定した。低ｐＨウイルス不活化は高度に時間依存性であるので、サンプリング手順の間、反応を停止しなければならなかった。したがって、各サンプリング容器を、サンプリング前に２Ｍトリス緩衝液４．１３ｍＬで満たした。この方法のおかげで、サンプリング容器に入る直後に、サンプルの各滴のｐＨを中和した。これにより、サンプル内の低ｐＨレベルにおける不均一な滞留時間を防止した。
【００９６】
変動するｐＨの影響を排除するために、サンプリング時間を、連続式クロマトグラフィーの１つのスイッチ時間（１７．３分）に設定した。これにより、連続式クロマトグラフィーから期待されるｐＨレベルの完全な収集をもたらす。
【００９７】
ｐＨ３〜ｐＨ７で変動する連続式クロマトグラフィーのｐＨレベルを調節するために連続式撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）としてホモジナイゼーションループを使用する場合、どの具体的なクロマトグラフィーカラムからＣＦＩにおける所与のサンプル採取が由来しているのかを識別することは不可能である。したがって、サンプリングされた体積は、連続式クロマトグラフィーシステムの１つまたは２つでさえ不特定カラムの溶出液を保持することができる。異なるクロマトグラフィーカラムの影響を排除するために、ＣＦＩ内のいくつかのサンプル点を２回サンプリングする。第一サンプルを１つのスイッチ時間（１７．３分）内で採取した。その後、サンプリングを別のスイッチ時間について続ける前に、スイッチ時間の半分（８．６５分）で休止した。サンプリングの休止内で、三方コックの位置を変更しなかった。サンプル点を通過する連続する流れを排容器に供給した。この手順で、サンプリング系内に捕捉された滞留液はなかった。滞留液は、延長された滞留時間低ｐＨレベルに晒され、したがって結果を偽装するだろう。
【００９８】
使用されたホモジナイゼーションループ（ＨＬ）およびコイルドフローインバータ（ＣＦＩ）を特性決定するために行われた水およびＮａＣｌ溶液実験の結果を用いて、サンプリング点までの対応する滞留時間を決定した。ＲＴＤ測定の結果を図４で見ることができる。
【００９９】
上記のように、ＣＦＩを、１２０分の最短滞留時間をもたらすように構成した。
【０１００】
実施された実験前に、細胞毒性アッセイおよび干渉アッセイを行った。サンプルの必要な最終希釈を１：５４と決定した。この希釈倍率で、細胞成長およびウイルス複製に対する影響は観察することができなかった。
【０１０１】
両方の連続式クロマトグラフィーモードのｐＨおよび電導度測定は、周期的に変動する挙動を示す。さらに、ＨＬの湿し効果、ならびにＣＦＩの一部分を見ることができる。
【０１０２】
図１は、前ウイルス試験のための方法スキームの模式的概要を示す。
図２は、ＲＴＤ測定のための実験セットアップを示す。
Ｃｏｎｄ＝電導度センサー、ＨＬのＲＴＤ測定用セットアップＡ、ＣＦＩのＲＴＤ測定用セットアップＢ、両方のＵＯ一緒のＲＴＤ測定用セットアップＣ。
図３は、サンプリング点、ならびに最終ＣＦＩの模式的概要を示す。
図４は、滞留時間分布特性の結果を示す。
図４の左上図は、ＣＦＩに関するＲＴＤ特性決定結果を示す。平均滞留時間を、０．８１９の相対幅Ｒｗで１４５分において決定した。結果的に、ＣＦＩ内で実現された１０アーム外の全てのアームは、１４．５分の滞留時間を提供する。ＣＦＩ内のＲＴＤは非常に狭く、全ての単一液体要素、すなわち、ウイルス粒子の最短化された滞留時間をもたらす。
図４の左下図は、ＨＬに関する結果を示す。これは、典型的なＣＳＴＲ  ＲＴＤ挙動を示す。平均滞留時間は８．１２分であり、Ｒｗは０．０２７である。図４の右上図は、ＨＬとＣＦＩの組合せに関する測定を示す。左上図に示されたＣＦＩ結果と比較して、平均滞留時間は１５４分に増長し、相対幅は０．７３９に減少している。図４の右下図は、実験結果の全体的比較、ならびに層状ストレート管および層状ストレートヘリックスに関する算出されたグラフを示す。ＨＬおよびＣＦＩの組合せは、ＣＦＩ単独の使用より、明白に広い滞留時間分布をもたらす。それにもかかわらず、両方の配列は、代替物、層状ストレート管および層状ストレートヘリックスより有意に良好なＲＴＤを示す。
図５は、前ウイルス試験連続式方法の結果を示す。
２つの実験のウイルス力価およびＬＲＶ結果を図５で見ることができる。図の上側部分は、連続式クロマトグラフィーのモードＡで単一サンプリングの結果を示す。第一の２つのカラムは、負荷および保持サンプルに関するウイルス力価結果を表す。保持サンプルに関してウイルス力価の減少を見ることができないので、方法条件（例えば、温度および緩衝液組成物）、ならびにそれ自体の試験品目（ｍＡＢ）はウイルス安定性に対して影響を及ぼさない。したがって、ウイルス不活化は、低ｐＨ条件にもっぱら起因する。図の中央の列は、滴定サンプルからウイルス力価および対応するＬＲＶ値を示す。全サンプルのウイルス力価は検出限界まで減少し、「＞」ＬＲＶ値となる。サンプル１Ｍ１７および１Ｍ１８は大容量プレーティングにより付加的に分析されるので、サンプル１Ｍ１７および１Ｍ１８において４．１２（１Ｍ１６）から４．０１へのＬＲＶの減少は異なる希釈倍率に起因する。したがって、分析体積は、３３．３３μＬ（１Ｍ１６）から４４．４４μＬ（１Ｍ１７および１Ｍ１８）に変化する。図の右手側に、サンプル１Ｍ１７および１Ｍ１８から得たＬＶＰ結果を見ることができる。２１３３．３３μＬの分析体積でさえ、感染ウェルを見出すことはできず、＞５．８２のＬＲＶ値を得る。
図５の中央図および下図は、ＰｒｏｔＡクロマトグラフィーのモードＢを用いた２つのサンプリングの結果を示す。サンプリング手順を、１７．３１分に対して３Ｍ１８で開始した。８．６６分の休止後、サンプル４Ｍ１８を引き出した。同様に、さらなるサンプリングを対で行った。
図６は、ＣＦＩの場合にＣＦＩ中の特定の位置と等しいＣＦＩ中の滞留時間に対するウイルス力価の対数減少値（ＬＲＶ）の模式図を示す。すなわち、所与のウイルス力価の対数減少は、ＣＦＩの反応速度論のせいでＣＦＩ内の同位置において常に達成される。したがって、所与の時点１におけるＬＲＶは、ＣＦＩ内の特定のサンプリング点、例えば、この場合、フレーム１後のサンプリング点において前記ＬＲＶと常に対応するだろう。同様に、この実施例では、時点６におけるＬＲＶは、フレーム６語のサンプリング点におけるＬＲＶと常に対応するだろう。したがって、スパイクされたプローブのサンプリングは、バッチ式条件下の場合であるとき、時点特異的よりむしろ位置特異的である。
参考文献 
【０１０３】
Klutz, S.; Magnus, J.; Lobedann, M.; Schwan, P.; Maiser, B.; Niklas, J.; Temming, M.; Schembecker, G. (2015): Developing the biofacility of the future based on continuous processing and single-use technology. In Journal of Biotechnology 213, pp. 120-130
Klutz, S.; Kurt, S. K.; Lobedann, M.; Kockmann, N. (2015): Narrow residence time distribution in tubular reactor concept for Reynolds number range 10-100.In Chemical Engineering Research and Design 95, pp. 22-33
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、前ウイルス試験のための方法スキームの模式的概要を示す。
【図２】図２は、ＲＴＤ測定のための実験セットアップを示す。
【図３】図３は、サンプリング点、ならびに最終ＣＦＩの模式的概要を示す。
【図４】図４は、滞留時間分布特性の結果を示す。
【図５】図５の中央図および下図は、ＰｒｏｔＡクロマトグラフィーのモードＢを用いた２つのサンプリングの結果を示す。
【図６】図６は、ＣＦＩの場合にＣＦＩ中の特定の位置と等しいＣＦＩ中の滞留時間に対するウイルス力価の対数減少値（ＬＲＶ）の模式図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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