(57)【要約】  インビトロでＢ細胞を拡張及び分化するために用いることができるフィーダー細胞系、Ｂ細胞をフィーダー細胞系とともに培養することを含むインビトロでＢ細胞を拡張する方法、及び単一Ｂ細胞をフィーダー細胞系とともに、Ｂ細胞を抗体を分泌するＢ細胞クローンへと拡張及び分化することを誘発するために十分な条件の下で、十分な時間、培養することを含む、インビトロでモノクロナール抗体を産生する方法【選択図】図１Ａ及び図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでＢ細胞を拡張する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのＢ細胞を単離するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの少なくとも１つのＢ細胞を、ＣＤ１５４ポリペプチド（又はＣＤ４０アゴニスト）及びＢＬｙＳポリペプチド（又はＢ細胞生存因子）を発現するよう改変された間質細胞系を含むフィーダー細胞系とともに、ＩＬ−２１と組合せて、かつ外因的なＩＬ−４を添加することなしに培養するステップであって、該Ｂ細胞をフィーダー細胞系と、ヒトＢ細胞を数において拡張させるのに十分な条件の下、かつ十分な時間、培養するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｂ細胞がヒトＢ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＬ−２１が外因的に培養物に添加される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記フィーダー細胞がＩＬ−２１ポリペプチドを発現するように改変される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｂ細胞が、数において少なくとも平均１０4倍に拡張される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）における少なくとも１つのＢ細胞のフィーダー細胞系との培養が、２週間未満行われる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１つのＢ細胞が単離される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのＢ細胞がステップ（ａ）の単離の前に抗原にさらされる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）における少なくとも１つのＢ細胞のフィーダー細胞系との培養が、抗原の存在下で行われる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）の培養が、抗原の添加を行うことなく行われる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのＢ細胞が、抗原に結合することによって単離される、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）の後に、少なくとも１０％の拡張されたＢ細胞がＩｇＧを発現する、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）の後に、少なくとも２．５％の拡張されたＢ細胞がＩｇＡを発現する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記フィーダー細胞が請求項２８から３５のいずれか１項に記載のフィーダー細胞である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
モノクロナール抗体を産生する方法であって、
（ａ）Ｂ細胞を単離するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からのＢ細胞を単一のＢ細胞に分離するステップと、
（ｃ）複数のＢ細胞クローンを生成するため、単一のＢ細胞を、ＣＤ１５４ポリペプチド（又はＣＤ４０アゴニスト）及びＢＬｙＳポリペプチド（又はＢ細胞生存因子）を発現するよう改変される間質細胞系を含むフィーダー細胞系とともに、ＩＬ−２１と組合せて、かつ外因的なＩＬ−４を添加することなしに培養するステップであって、該Ｂ細胞をフィーダー細胞系と、ヒトＢ細胞を数において拡張させ、モノクロナール抗体を産生するＢ細胞クローンに分化するのに十分な条件の下かつ十分な時間、培養するステップを含む、方法。
【請求項１６】
さらに（ｄ）複数のＢ細胞クローンにより産生された少なくとも１つのモノクロナール抗体の抗原特異性を評価するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
さらに（ｅ）複数のＢ細胞クローンにより産生された少なくとも１つのモノクロナール抗体を精製するステップを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｂ細胞がステップ（ａ）の単離の前に抗原にさらされる、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｂ細胞がヒトＢ細胞である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｂ細胞がマウスＢ細胞又はマウスＢ細胞の部分集合である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
抗原がステップ（ｃ）に含まれていない、請求項１５から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｃ）の後に、少なくとも１０％の拡張されたＢ細胞がＩｇＧを発現する、請求項１５から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｃ）の後に、少なくとも２．５％の拡張されたＢ細胞がＩｇＡを発現する、請求項１５から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記フィーダー細胞が請求項２８から３５のいずれか１項に記載のフィーダー細胞である、請求項１５から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳類Ｂ細胞をインビトロで拡張及び分化するためのキットであって、フィーダー細胞、生体試料からＢ細胞を単離するための少なくとも１つの抗体、及びＢ細胞を末梢血試料から収集するための試薬を含み、該フィーダー細胞が請求項２８から３５のいずれか１項に記載のフィーダー細胞であり、該抗体がＣＤ１９抗体であってよい、キット。
【請求項２６】
改変されたフィーダー細胞と単離されたＢ細胞を培養するために必要な、１つ以上の試薬、場合によりＩＬ−２１、を更に含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
Ｂ細胞から産生されるモノクロナール抗体を特徴づけるためであって、１つ以上の試薬、場合によりＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＥに特異的な抗体、を更に含む、請求項２５又は２６に記載のキット。
【請求項２８】
フィーダー細胞系が、ＣＤ１５４ポリペプチド、ＢＬｙＳポリペプチド、及び場合によっては、ＩＬ−２１ポリペプチドを発現するよう改変される間質細胞系を含む、細胞系。
【請求項２９】
前記改変される間質細胞系が間葉系間質細胞系を含む、請求項２８に記載のフィーダー細胞系。
【請求項３０】
前記改変される間質細胞系が線維芽細胞系を含む、請求項２８に記載のフィーダー細胞系。
【請求項３１】
フィーダー細胞系が、培養物中で２週間未満の間に、ヒトＢ細胞を数において少なくとも平均１０4倍に拡張することができる、請求項２８から３０のいずれか１項に記載のフィーダー細胞系。
【請求項３２】
間質細胞系がＭＳ−５細胞系を含む、請求項２８から３１のいずれか１項に記載のフィーダー細胞系。
【請求項３３】
前記ＣＤ１５４ポリペプチドが、配列番号６８又はその機能的断片若しくは変種を含む、請求項２８から３１のいずれか１項に記載のフィーダー細胞系。
【請求項３４】
前記ＢＬｙＳポリペプチドが配列番号６９又はその機能的断片若しくは変種を含む、請求項２８から３３のいずれか１項に記載のフィーダー細胞系。
【請求項３５】
前記ＩＬ−２１ポリペプチドが配列番号７０又はその機能的断片若しくは変種を含む、請求項２８から３３のいずれか１項に記載のフィーダー細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１６年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２９５，７２８号の優先権の利益を請求するものであり、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（配列表）
配列表が本出願に伴い、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列表は本出願とともにテキストファイルとして提出された。
（技術分野）
本発明は、ヒトＢ細胞を含む、Ｂ細胞を産生及びサポートする方法に関連し、抗原特異的抗体、より具体的には、モノクロナール抗体を産生するために用いることができる。より具体的には本発明は、ハイブリドーマ技術又はＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞を用いることなくモノクロナール抗体を産生するためＢ細胞を培養することに関連する。
【０００２】
（背景技術）
モノクロナール抗体は、例えば、抗体ベースの生物学的又は薬学的発展を通じて、特に医学において有用性を見出されてきた。モノクロナール抗体を産生する現在の方法は、マウスハイブリドーマ法（すなわち、抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させること）を含む。その他の方法としては、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系及びファージディスプレイが挙げられる。ヒトモノクロナール抗体を産生するために用いられるそれぞれの異なる方法は、それを使いにくくしている技術的な限界に苦しんでいる。例えば、ハイブリドーマ技術については、モノクロナール抗体の非ヒト部分に対する免疫反応を促進する頻度を下げるため、抗体を「ヒト化」する必要がある。加えて、特異の抗原又はエピトープに対する免疫反応は、種に特異的であり得る。その他の方法には、ヒトの治療及び診断に用いるためのモノクロナール抗体の開発に用いるためそれらを広く適用することに制約を与える欠点がある。
【０００３】
（発明の概要）
本発明は、培養中のＢ細胞を拡張及び分化するための高度に効率的な方法の発見にも基づいており、Ｂ細胞の単一細胞クローニングを可能とする。ある態様において、本発見は、培養中のＢ細胞を拡張及び分化するための高度に効率的な方法に関連し、ヒトＢ細胞の単一細胞クローニング及び抗体の産生を可能とする。
本発明は、培養中のＢ細胞を拡張及び分化するための高度に効率的な方法の発見に基づいており、それは、Ｂ細胞の単一細胞クローニング（単一Ｂ細胞を播種し、そのＢ細胞をＢ細胞のクローンに拡張すること）を一定量及びモノクロナール抗体を一定量生成するのに十分な時間であって、産生されたモノクロナール抗体の特徴づけを円滑化する時間内で可能とする。本方法のある態様において、ヒトＢ細胞は、単一細胞クローンとして拡張及び分化され、ヒトモノクロナール抗体を産生する。これらの方法の別の態様においては、本方法は培養を拡張するために抗原を必要としない及び／又は添加しない。また別の態様においては、Ｂ細胞の抗原特異性は知られていない。また別の態様において、Ｂ細胞はインビトロで抗原に曝されない。
【０００４】
本発明の別の態様において、モノクロナール抗体、特にＩｇＧタイプのもの、を産生するためのインビトロの方法が提供される。
本発明の別の態様において、フィーダー細胞系が提供され、それは改変された間葉系間質細胞又は改変された胸腺上皮細胞を含み、それらは効率的に培養中の多くの数のＢ細胞を促進及びサポートすることができ、それによって、改変マウス３Ｔ３細胞とともにＢ細胞を培養する過去の試みにおいて観察されたよりも高いレベルでのモノクロナール抗体産生を可能とする。この態様に関連して、フィーダー細胞系は、間葉系間質細胞又は胸腺上皮細胞を含み、それらは、ＣＤ１５４（また、ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ４０リガンドとしても知られている）及びＢＬｙＳ（Ｂリンパ球刺激因子、またＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子）としても知られている）を含む組合せ、又はＣＤ１５４、ＢＬｙＳ、及びＩＬ−２１を含む組合せを発現するよう改変される。本発明のフィーダー細胞は、ヒトＢ細胞及びマウスＢ細胞を含む哺乳類のＢ細胞の著しい繁殖及び分化をサポートし、Ｂ細胞が改変されたフィーダー細胞の存在下でインビトロで培養される場合、外因性の抗原又は外因性のＩＬ−４を加える必要がない（すなわち、無しでよい）。
【０００５】
ある態様において、特異の抗原、典型的には公知の抗原に結合するモノクロナール抗体を産生する方法が提供される。該方法は、抗原に未経験又は抗原に（例えば、インビトロ又はインビボ曝露のいずれかによって）曝されたことのある、いずれかのＢ細胞を単離するステップ；単離されたＢ細胞を単一細胞に分離するステップ；単離されたＢ細胞（単一Ｂ細胞）を、改変されたフィーダー細胞（すなわち、ＣＤ１５４又は別のＣＤ４０アゴニスト及びＢＬｙＳ又は比較可能なＢ細胞活性因子を発現しているフィーダー細胞）の存在下で、本発明にしたがってインビトロで少なくとも数において平均１０4倍の拡張を達成するための条件の下、十分な時間（例えば、単一細胞から１０，０００細胞への拡張、マルチウェルプレート、例えば９６ウェルプレートの平均テイクオーバーウェル）を２週間未満、培養中で、培養するステップ；を含む。モノクロナール抗体は拡張された培養Ｂ細胞クローンから産生する。更なるステップとして、モノクロナール抗体の特徴づけ、例えば、１つ以上の（ａ）モノクロナール抗体の抗原特異性を当該技術分野で公知の方法を用いて決定すること、及び（ｂ）モノクロナール抗体を単離することであって、（ｉ）当該技術分野で公知の方法を用いて培養培地からのモノクロナール抗体を精製すること、及び／又は、（ｉｉ）Ｂ細胞クローンから、全ＲＮＡを単離し、抗体の可変部重鎖（ＶＨ）をコードしているｃＤＮＡ及び抗体の可変部軽鎖（ＶＬ）をコードしているｃＤＮＡを生成し、それらは、公知の方法を用いて、モノクロナール抗体の遺伝子組み換え産生のため、真核細胞発現ベクターにクローンすることができることを含むステップを含んでもよい。代替的には、抗原特異的モノクロナール抗体を産生する選ばれたＢ細胞クローンは、ハイブリドーマ技術、ＥＢＶ−形質転換、ＰＡ３１７  ＬＸＳＮ  １６Ｅ６Ｅ７細胞系によって産生される両種指向性レトロウィルスＬＸＳＮ１６Ｅ６Ｅ７（米国培養細胞系統委保存機関、ＣＲＬ−２２０３（登録商標））又はその他の公知の方法によって不死化することができる。
【０００６】
本発明の別の態様では、培養中の哺乳類Ｂ細胞を拡張及び分化するキットを提供する。該キットはまた、該キットを用いて拡張されたＢ細胞からモノクロナール抗体を産生するために用いてもよい。該キットは、本発明の改変されたフィーダー細胞、生体試料からＢ細胞を単離するための試薬、及び改変されたフィーダー細胞及び試薬を保持するためのパッケージングを含む。該キットは更に、改変されたフィーダー細胞及びＢ細胞を培養するために必要な１つ以上の試薬、及びキットを用いて改変されたフィーダー細胞と共に共培養されたＢ細胞から産生されたモノクロナール抗体の特徴づけを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１はＢ細胞の拡張を示す一連のグラフである。図１Ａは、ヒトＢ細胞の拡張を示すグラフであり、培養日数に対する拡張倍によって測定しており、ヒトＢＬｙＳ及びＣＤ１５４（添加されたＩＬ−２１とともに）を発現する間質細胞（“ＭＳ５DUO”）、ＢＬｙＳ、ＣＤ１５４及びＩＬ−２１を発現する間質細胞（“ＭＳ５TRIO”）を含むいずれかの本発明の改変されたフィーダー細胞とともに培養した結果を、ＢＬｙＳ及びＣＤ１５４（添加されたＩＬ−２１とともに）を発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞（“ＮＩＨ−３Ｔ３−ｍ１５４／ｈＢＬｙＳ）を含むフィーダー細胞と比較したものである。これらの結果は、３回以上の実験で得られたもののうち代表的なものである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、外因性ヒトサイトカインのヒトＢ細胞拡張に対する効果を示すグラフである。値は、ＭＳ５Duo 細胞単分子膜上で６日及び１０日培養された複製（duplicate）からの平均Ｂ細胞数を表しており、示されたサイトカインの組合せ（ａ−ｈ）が、所与の期間中存在した。全てのサイトカインは、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）を除いて、２０ｎｇ／ｍＬ存在した。適切なサイトカインを含む追加的な培地が、第４日及び第８日に培養に添加された。値は、２つの独立した実験からの６サンプルの平均（＋標準誤差）を表す。（ａ）と他の培養の間、又は培養（ｅ）と（ｇ）の間で有意に平均値が異なるものは印を付している；#ｐ＜０．０５。
【図２Ａ】図２は一連のＦＡＣＳヒストグラムであり、示されたセル表面マーカーのレベルを表している。図２Ａは、末梢血から単離された後で本発明の方法による拡張の前のＣＤ１９+ヒトＢ細胞のセル表面表現型（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＣＤ３８及びＣＤ１３８）を示すグラフである。象限儀中の、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＣＤ３８又はＣＤ１３８を発現する生存ＣＤ２０+又はＣＤ１９+Ｂ細胞の平均頻度を、類似の結果が得られた２つの独立した実験から示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＭＳ５Trio細胞の単分子膜上で６から７日間培養した後の結果としてエクスビボで拡張中のヒトＢ細胞のセル表面表現型（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＣＤ３８及びＣＤ１３８）を示すグラフである。これらの結果は、３以上の実験から得られた結果の代表的なものである。象限儀中の、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＣＤ３８又はＣＤ１３８を発現する生存ＣＤ２０+又はＣＤ１９+Ｂ細胞の平均頻度を、類似の結果が得られた２つの独立した実験から示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＭＳ５Trio細胞単分子膜上で１４日間培養した結果としてエクスビボで拡張中のヒトＢ細胞のセル表面表現型（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＣＤ３８及びＣＤ１３８）を示すグラフである。象限儀中の、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＣＤ３８又はＣＤ１３８を発現する生存ＣＤ２０+又はＣＤ１９+Ｂ細胞の平均頻度を、類似の結果が得られた２つの独立した実験から示す。
【図３Ａ】図３は、アイソタイプによる抗体産生を示す一連のグラフである。図３Ａは、ＭＳ５Trio細胞単分子膜上で６、１０、及び１４日間培養した結果としてエクスビボで拡張中のヒトＢ細胞の組織培養上清液中のＩｇＭの産生を示すグラフである。棒は、２つの独立した実験からＥＬＩＳＡによって決定された４サンプル中の平均（＋標準誤差）抗体濃度を表す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＭＳ５Trio細胞単分子膜上で６、１０、及び１４日間培養した結果としてエクスビボで拡張中のヒトＢ細胞の組織培養上清液中のＩｇＧ産生を示すグラフである。棒は、２つの独立した実験からＥＬＩＳＡによって決定された４サンプル中の平均（＋標準誤差）抗体濃度を表す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＭＳ５Trio細胞単分子膜上で６、１０、及び１４日間培養した結果としてエクスビボで拡張中のヒトＢ細胞の組織培養上清液中のＩｇＡ産生を示すグラフである。棒は、２つの独立した実験からＥＬＩＳＡによって決定された４サンプル中の平均（＋標準誤差）抗体濃度を表す。
【図４Ａ】図４は、拡張した細胞及び抗体の様々なアイソタイプの産生を示した一連のグラフである。図４Ａは、単一ヒトＢ細胞クローン（各点は個々のクローンを表す）及びそれらの拡張を数でＭＳ５Trio細胞単分子膜とともに培養した１２日目に対して表すグラフである。これらの結果は２つの独立した実験からの代表的な結果である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＥＬＩＳＡで測定され、培養１０日及び１２日における図４Ａ中に示されたヒトＢ細胞クローンの組織培養上清液中のＩｇＭ及びＩｇＧ濃度を描いたグラフである。これらの結果は２つの独立した実験からの代表的な結果である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＥＬＩＳＡで測定され、培養１２日における図４Ａ中に示されたヒトＢ細胞クローンの組織培養上清液中のＩｇＭとＩｇＧの濃度間の相関関係又は、単一Ｂ細胞クローン拡張とＩｇＭ又はＩｇＧ（ｎ＝６９）の間の相関関係を描いたグラフである。これらの結果は２つの独立した実験からの代表的な結果である。
【図５Ａ】図５は、特異の抗体の産生を示す一連のグラフである。図５Ａは、ＥＬＩＳＡによる抗デスモグレイン１（ＤＳＧ１）ＩｇＧ抗体の測定（「吸収」）を、９６ウェルプレートのウェル数（「プレートウェル数」）に対して示す代表的なグラフである。該プレートは、落葉性天疱瘡患者又は健康な対照から単離されたＢ細胞であり、ＭＳ５Trio細胞とともに共培養されたものを含む。水平な実線は、該プレートの全９６ウェルの平均吸光値を示す。水平な点線は、該プレートの全９６ウェルの平均＋２標準偏差の値を示す。１つのウェルは、その吸光値が点線を超えた場合に陽性と考えられる。
【図５Ｂ】図５Ｂは、抗原特異的Ｂ細胞（ＤＳＧ１又はデスモグレイン３（ＤＳＧ３）に対する特異性を有する）の頻度を示す棒グラフであり、尋常性天疱瘡に罹患している２個体から（ＰＶ１及びＰＶ２）又は落葉性天疱瘡に罹患している２個体から（ＰＦ１及びＰＦ２）の循環系Ｂ細胞（circulating B cells）から計算され、測定可能な抗ＤＳＧ血清自己抗体を持たない健康な個体からの循環系Ｂ細胞（「健康な対照」、ＨＣ）と比較したものである。示された数値は、各個体について、ＤＳＧ１−又はＤＳＧ３−特異的なＩｇＧ抗体に陽性なウェルの平均頻度を表す。１１の個別の９６ウェルＥＬＩＳＡプレートが、各個体の各アッセイについて評価された。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、培養中のＢ細胞を拡張及び分化するための効率的な方法の発見に基づいており、単細胞クローンから一定量のＢ細胞へ、最初のクローン及び免疫グロブリン遺伝子の発現に頼ることなく更に特徴づけることを可能とするだけの十分な量のモノクロナール抗体を産生する。更なる特徴づけは、当該技術分野で公知の、１つ以上のハイスループットスクリーニングアッセイを用いた、１つ以上の抗原特異性、機能、結合及び／又は中和の特徴づけを含んでもよい。本発明は、例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞系（マウス繊維芽細胞系）のような、以前マウスＢ細胞を拡張及び分化するため用いられたフィーダー細胞系の、培養中でヒトＢ細胞を拡張する際の、特にモノクロナール抗体の産生に有用な量及び分化の状態における、欠点を克服している。
【０００９】
定義−下記用語はバイオテクノロジー分野の当業者には十分よく理解されているものと思われるが、下記の定義は、本発明の説明を円滑化するため記載する。
「Ｂ細胞」という用語は、本明細書において用いられる場合、ヒトＢ細胞及びマウスＢ細胞などの哺乳類のＢリンパ球を意味するが、これらに限定されるものではない。任意のＢ細胞を本発明の方法により拡張することができ、本発明の方法は、例えば、（ａ）Ｂ細胞の発達中にＤＮＡの再配置によって生成する様々な抗体レパートリーを含むナイーブＢ細胞、及び（ｂ）特異の抗原に対して曝されている、又は曝された記憶のあるＢ細胞のような抗体産生を含む。Ｂ細胞は、Ｂ細胞個体群、サブ個体群、又はその部分集合を含み、ナイーブＢ細胞、メモリーＢ細胞、活性化Ｂ細胞、Ｂ１細胞、胚中心Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、制御性Ｂ細胞及び濾胞Ｂ細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではないが、。
「モノクロナール抗体」という用語は、本明細書で用いられる場合、抗原のエピトープへの単一結合特異性及び親和性を示す抗体を意味する。「組換えモノクロナール抗体」は、モノクロナール抗体であって、組換え手法、例えば免疫グロブリン遺伝子配列を含有する組換え発現ベクター（例えば、ＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡ）を用い、ホスト細胞に形質移入することによって産生されるものを指す。そのような組換え発現ベクターは、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を含んでもよく（例えば、ヒトＶＨ及びヒトＶＬ  ｃＤＮＡ）、それらは次いでホスト細胞に形質移入される。組換えモノクロナール抗体はまた、マウスＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡを含み、「ヒト化」抗体を産生するために操作され、それは、ヒトにおける治療、診断、又はセラノスティックスへの適用に用いることができる。
「抗原」という用語は、本明細書で用いられる場合、抗体の産生を刺激し、物質に特異的な抗体に結合することができる物質を意味する（すなわち、抗体は、結合特異性を有する抗原に対して特異的に結合することができる）。抗原は、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、核酸及び小分子（無機又は有機）の１つ以上を含む物質を含んでよい。抗原は、ヒトの体にとって異質な物質、ウィルス抗原、バクテリア抗原、寄生虫抗原、腫瘍抗原、毒素抗原、真菌性抗原、自己抗原、変容自己抗原（病気状態の結果として変容又は改変された自己抗原）、改変された抗原（病気状態の結果、健康な又は非病気状態の抗原に比較して、ミスフォールド、又は酸化、又は変容グリコシル化を伴う、又は過剰発現、又は変異したもの）を含んでもよい。
【００１０】
「改変されたフィーダー細胞」及び「フィーダー細胞」という用語は、本明細書で用いられる場合、間葉系間質細胞又は胸腺上皮細胞が改変されて、例えばＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ４０リガンドとしても知られている）のようなＣＤ４０アゴニスト、及び例えばＢｌｙＳ（Ｂリンパ球刺激因子、ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子）としても知られている）のようなＢ細胞生存プロモーターを含む組合せ、又は、ＣＤ１５４、ＢＬｙＳ及びＩＬ−２１を含む組合せを発現するものを意味する。そのような改変されたフィーダー細胞の特定の例としては、改変された間葉系間質細胞系（例えば、ＭＳ−５細胞、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）、ブラウンシュヴァイク、ドイツ連邦共和国、よりカタログ番号ＡＣＣ４４１で入手可能）及び改変された胸腺上皮細胞系（例えばＴＥＣ細胞）がある。例示としては、ＭＳ−５は、マウス間葉系間質細胞系であり、商業的に入手可能である。間葉系間質細胞系は、線維芽細胞系、例えばＮＩＨ／３Ｔ３細胞系（マウス線維芽細胞系ＮＩＨ−３Ｔ３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８として示されている）とは明確に区別され、間葉系間質細胞系は、線維芽細胞系とは異なる因子を分泌し、異なる機能（脈管形成、血管形成を含む）をサポートすることができることを注記する。例えば、ＭＳ−５細胞は、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞よりも著しく高いレベルのＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、ＣＸＣＬ−１６、アンジオポエチン−１、ＭＣＰ−１（単球化学吸引性タンパク質-１、ＣＣＬ２としてもまた知られている）、ＮＯＶ（過剰発現腎芽腫、ＣＣＮ３としてもまた知られている）及びＨＧＦ（肝細胞増殖因子）を分泌する（Zhou et al., 2012, Br. J. Haematology, 157:297-311)。ＴＥＣ又は 胸腺上皮細胞系（例えば、ＴＥＣ−８４、ＴＥＣ−Ｄ１１）はヒトリンパ球新生をサポートする（Beaudette-Ziatanovo, Exp. Hematol., 39(5): 570-579）。胸腺上皮細胞系は、生物学的変化を経験して間葉系細胞表現型をとるよう（上皮間葉転換）、例えば培養中で成長因子を変形させる処置により、誘発することができる。間葉系間質細胞又は胸腺上皮細胞は、ＣＤ１５４ポリペプチドのようなＣＤ４０アゴニスト、及び例えばＢＬｙＳのようなＢ細胞生存プロモーターを含む組み合わせ、又はこれら２つのポリペプチドとＩＬ−２１を含む組合せを、発現するように、本発明の改変されたフィーダー細胞を形成する中で操作される。もしフィーダー細胞が、ＩＬ−２１を発現するように操作できなかった場合は、ＩＬ−２１は外因的に培養培地に培養期間中に添加されなければならない。培養期間は、適切には３週間未満、適切には２週間未満である。培養期間は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれより多い日数であってもよい。 
【００１１】
ＢＬｙＳは、表面で発現してもよく、又は、細胞表面から裂けた後、溶解性であってよい。代替的に、ＢＬｙＳは他の因子によって置き換えられ、該因子は、培養中のＢ細胞生存を促進し、ＢＬｙＳ断片、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ２２リガンド、ＣＤ２２モノクロナール抗体、又はその断片が含まれる。ＢＬｙＳは、配列番号：０１又は同じアミノ酸をコードしている類似のヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされた２８５アミノ酸の糖タンパク質（配列番号：６９）である。ＢＬｙＳは、本発明の改変されたフィーダー細胞によって組換えで産生され、ＢＬｙＳレセプターに結合し、シグナルをし、ヒトＢ細胞の拡張を促進することができる限りにおいて、その長さが異なってよい。その観点から、ＢＬｙＳは、膜結合タイプ又は溶解性の形態で産生することができる。例えば、アミノ酸１３６−２８５を含む溶解性の形態は、機能的に活性であることが認められている。
ＣＤ１５４ポリペプチドは任意のＣＤ４０アゴニストで置き換えられてよく、ＣＤ４０抗体及びその断片、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ１５４ポリペプチド及びそのポリペプチド断片、小分子、合成薬、ペプチド（環状ペプチドを含む）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、アプタマー、合成又は天然無機分子、模倣剤、及び合成又は天然有機分子であって、ＣＤ４０を活性化することができるものが挙げられるがこれらに限定されるものではないが、。ある実施形態では、ＣＤ４０アゴニストはＣＤ４０抗体である。ＣＤ４０抗体は任意の形式であることが可能である。ＣＤ４０に対する抗体は当該技術分野で公知である（例えば、Buhtoiarov et al., 2005, J. Immunol. 174:6013-22; Francisco et al., 2000, Cancer Res. 60:3225-31; Schwulst et al., 2006, 177:557-65を参照。これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＤ４０アゴニストは、ＣＤ１５４ポリペプチドであってよく、フィーダー細胞の表面で発現しても、溶解性の形態で発現してもよい。ヒトＣＤ１５４ポリペプチドが実施例において用いられ、２６１アミノ膜結合タンパク質（配列番号：６８）または１４９アミノ酸溶解性タンパク質として認められ、配列番号：０２又は配列番号：０３を含むヌクレオチド配列、又は類似のヌクレオチド配列であって、同じアミノ酸をコードしているものを含むヌクレオチド配列によってコードされることができる。この観点から、ＣＤ１５４は、様々な長さの膜結合タイプ又は溶解性形式として産生することができる。ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の相互作用のために重要なアミノ酸は、アミノ酸１２８から２５８を含むことが示されている。
【００１２】
ヒトＩＬ−２１（成熟ポリペプチド）は１３１アミノ酸（配列番号：７０）を含み、配列番号：０４を含むヌクレオチド配列、または類似のヌクレオチド配列であって同じアミノ酸をコードしているものによってコードされることができる。この点について、ＩＬ−２１は、ＩＬ−２１レセプターを通じた結合及びシグナリングの誘発が維持される限り、様々な長さで産生することができ、ＩＬ−２１の結合及び機能的相互作用に重要なアミノ酸として、アミノ酸３３、１４５、及び１４８が挙げられるがこれらに限定されるものではないことが示されている。フィーダー細胞は、ＩＬ−２１を発現するように操作することができ、又はＩＬ−２１は外因的に培養に添加することができる。ＩＬ−２１は、２ｎｇ／ｍＬと１０００ｎｇ／ｍＬの間の量、適切には５ｎｇ／ｍＬ及び５００ｎｇ／ｍＬの間の量、適切には１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬの間の量を添加することができる。
【００１３】
「抗原にさらされた」という用語は本明細書において用いられる場合、抗原がＢ細胞に十分な濃度で、抗原（例えば、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）に、又はＢ細胞がトリガー抗原（「特異の抗原」）に特異的な抗体を産生できるようにＢ細胞の分化を誘発するために結合する）によってＢ細胞が活性化されるために十分な時間、接触することを意味する。Ｂ細胞がインビボで抗原に曝される方法は数多くあり、以下に限られるものではないが、感染、注射、予防接種、免疫化、及び循環（例えば、腫瘍抗原、変容した自己抗原、自己抗原）が挙げられる。別の実施形態においては、Ｂ細胞はインビトロで特異の抗原に曝され、活性化されてもよい。例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２９９６５５は、特異の（例えば公知の）抗原によるヒトＢ細胞のインビトロ免疫化のための方法を開示しており、該方法はヒト末梢血単核球の全個体群を抗原性組成物の存在下で培養することを含み、該抗原性組成物は、Ｔａｔタンパク質と結合する少なくとも１つの公知の抗原と抗原提示細胞のレセプターへのリガンド（後者は、Ｃ型レクチンレセプターに結合する糖類、免疫グロブリン又はそのフラグメント（例えば、Ｆｃ部分を含有するもの）であってＦｃレセプターに結合するもの）を含み、該方法は十分な時間及び十分な条件でＢ細胞がヒト末梢血単核球に存在し、抗原組成物によって免疫化される。
【００１４】
抗原にインビボでさらされたＢ細胞は、末梢血又はその他の体液（例えば、滑液、又は浸出液）を含む生体試料、又は組織（例えば、個体の身体からの任意の組織であって、以下に限られるものではないが、骨髄、心臓組織、神経組織、腫瘍組織、患部組織、結合組織、脾臓組織、リンパ節組織、結合組織、胸腺組織及びその他のリンパ節組織が挙げられる）から、公知の方法を用いて単離してもよい。そのような方法としては、抗体で覆われた磁気ビーズを用いる分画と蛍光活性した細胞選別が挙げられる。免疫磁気選別において、陽性及び／又は陰性の選別をＢ細胞を単離するために行ってもよい。Ｂ細胞を単離するための試薬としては、Ｂ細胞単離のための１つ以上の抗体調製物を含む。Ｂ細胞上の細胞表面マーカーに特異的な（結合することができる）抗体としては、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ又はこれらの組合せ（特にＢ細胞を単離するためのサブ個体群又は部分集合）、又は、例えばＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ２３、ＣＤ３８、ＣＤ４８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３８又はＣＤ１４８のような追加的な細胞表面分子を含む組合せに特異的な抗体が挙げられる。Ｂ細胞を免疫磁気分離又は選別によって単離するための試薬を形成するにあたり、抗体または抗体の組合せを、磁気ビーズに結合してよい。抗体は、当該技術分野で公知の蛍光ラベルに結合してよく、蛍光活性細胞選別によりＢ細胞を単離するための試薬を形成する。単一Ｂ細胞培養物を播種するためのＢ細胞の単離は、当該技術分野で公知の方法を用いて行うことが可能であり、該方法としては、限界希釈又は希釈クローニング及び蛍光活性細胞選別が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００１５】
本明細書で提供されるＢ細胞をインビトロ又はエクスビボで拡張する方法は、少なくとも１つのＢ細胞を対象から単離することを含む。該方法で用いられるＢ細胞は、対象の様々な領域から採取してよく、血液、脾臓、腹腔、リンパ節、骨髄、自己免疫疾患の箇所、炎症箇所又は対象中で移植拒絶が進行している組織が挙げられるがこれらに限定されるものではない。該細胞は、対象から当業者にとって用い得る任意の方法によって採取されてよい。採取された細胞個体群は、Ｂ細胞を含むべきであるが、混合細胞個体群であってもよい。対象は、Ｂリンパ球を有する任意の動物であってよいが、適切には哺乳類、適切には、馬、牛、豚、ネコ、イヌ又はニワトリのような家畜、又は適切にはヒトである。代替的には、該細胞は幹細胞由来であってよく、Ｂ細胞幹細胞、骨髄幹細胞、胚性幹細胞及び誘発された多能性幹細胞であって、インビトロでＢ細胞又はＢ細胞前駆体に発達するよう、本明細書に記載された方法において用いる前に適切に分化されたものが挙げられるがこれらに限定されるものではない。例えば、Carpenter et al., 2011, Blood 117: 4008-4011を参照。該Ｂ細胞はナイーブであっても、抗原にさらされた細胞であってもよい。
【００１６】
Ｂ細胞は上述の単離及び選択方法又は当業者に公知のその他の方法を用いて単離されてよく、陽性及び陰性選択工程の両方を含んでよい。Ｂ細胞は１００％Ｂ細胞未満であってよい。単離は、一群の細胞がインキュベーション培地、フィーダー細胞又はその他の非Ｂ細胞から分離されることを示すために、用いられる。単離とは、結果として単離された細胞が一定のレベルの純度又は均一性を有することを意味しない。該細胞は、当業者に用いることができる任意の方法により採取され、単離され、又は選択されてよい。例えば、Ｂ細胞は、適切なインキュベーションの後に付着細胞から非付着細胞を選択することによって採取されてもよい。細胞はまた、細胞表面マーカーの発現のためＦＡＣＳソーティング又は抗体で覆われた磁気ビーズに結合する能力の違いによって選択されてもよい。混合個体群中の細胞選択の方法は、当業者には公知である。
【００１７】
単離されたＢ細胞は、続いてフィーダー細胞系とともに培養され、該細胞系は、ＣＤ４０アゴニスト、Ｂ細胞生存プロモーター及び場合によってはＩＬ−２１を発現するように改変された間質細胞系を含む。ＩＬ−２１は外因的に培養培地に添加してよい。培養工程は、追加的な外因的のＩＬ−４を添加することなく行われる。「追加的な外因的のＩＬ−４抜きで」という用語は、培養物が、２００ｐｇ／ｍｌ未満のＩＬ−４、１００ｐｇ／ｍｌ未満のＩＬ−４、５０ｐｇ／ｍｌ未満のＩＬ−４、又は適切には５ｐｇ／ｍｌ未満が外因的に培養物に添加されることを含むことを示す。これは、米国特許第８，８１５，５４３号又は米国特許公開第２０１４／００６５１１８号のいずれかによって報告されたマウスＢ細胞拡張方法と明確に異なっており、両方とも本明細書に参照により組み込まれる。本明細書で用いられる場合、Ｂ細胞の拡張は、細胞増殖の刺激のみならず、アポトーシス又はその他の細胞死の阻害を含む。本明細書で用いられる場合、「培養（culturing）」及び「インキュベーション（incubation）」は、細胞が細胞培養培地中に３７℃及びＣＯ2５％で一定期間、示された添加剤（フィーダー細胞、サイトカイン、アゴニスト、その他の刺激分子又は培地であって、緩衝液、塩、糖、血清又は様々なその他の成分を含んでよい）とともに維持されることを意味するために用いられる。適切には、本明細書で用いられる場合のインキュベーション又は培養期間は、少なくとも４８時間であるが、８日又はそれより多い日数までの任意の時間であってもよい。当業者は、培養またはインキュベーション時間が、適切な拡張を許容し、個々の部分集合の異なる細胞密度又は頻度を調整し、及び調査者が細胞の使用にあたり適切に時間を見計らうことを許容するため、変わり得ることを理解するであろう。このように、正確な培養期間は、当業者により経験的に決められてよい。培養期間はまた、フィーダー細胞がＩＬ−２１を発現するように改変されている場合、如何なる外因的なサイトカインも添加することなく行ってよく、又はＩＬ−２１が培養物に添加される唯一の外因的なサイトカインであってよい。
【００１８】
該方法は、２倍から５×１０6倍を超えるＢ細胞の拡張を許容し得る。Ｂ細胞は２週間未満に培養中で少なくとも平均１０3、１０4又は１０5倍に拡張する。細胞は培養期間ののち、如何なる非Ｂ細胞も除く、又は陽性的にＢ細胞又は特異のＢ細胞の部分集合を選ぶために選択されてよい。培養工程は、抗原を含んでよく、又は、抗原を添加することなく完了してもよい。抗原を添加することなくとは、上記定義のとおりＩＬ−４を添加することなくと同様である。拡張されたＢ細胞は、培養期間中にクラススイッチを経てよい。ある実施形態では、単離されたＢ細胞はＩｇＭに陽性であり、本明細書に記載の方法によって拡張後、少なくとも、１０％、１５％、２０％、２５％の拡張されたＢ細胞がＩｇＧを発現する。ある実施形態では、少なくとも、１％、２％、３％、４％、５％、７％、１０％またはそれより多くの拡張されたＢ細胞がＩｇＡを発現する。培養工程の前に細胞が単一Ｂ細胞に分離された場合は、得られた拡張されたＢ細胞は、モノクロナール抗体を産生及び単離するために用いてよい。モノクロナール抗原特異性は当業者に用いることができる方法を用いて決定することが可能であり、モノクロナール抗体はＢ細胞から精製することができる。
【００１９】
本件開示は、本明細書に記載の特定の詳細な構造、構成の配置、又は方法の工程に限定されるものではない。本明細書に開示される構成及び方法は、続いての開示に照らして当業者に明らかである、様々なやり方で作り、実施し、用い、実行し及び／又は形成することが可能である。本明細書で用いられる語法及び用語は、記述の目的のためだけであり、特許請求の範囲を限定するものとみなされるべきではない。例えば、第一に、第二に、及び第三に、のような通常の指示語は、本明細書及び特許請求の範囲において様々な構造、又は方法の工程を指すために用いられ、何ら特定の構造又は工程、又はそのような構造又は工程のいかなる特定の順番又は配置を示すものと解釈することを意図するものではない。本明細書に記載の全ての方法は、別途本明細書において示される又は明らかに文脈と矛盾しない限り、任意の適切な順番で実施することが可能である。本明細書における任意の及び全ての実施例、又は例示的な言葉（例えば、「例えば．．．のような」）の使用は、単に開示を円滑にすることを意図したものであり、特許請求されていない限り何ら本開示の範囲を限定することを含意するものではない。本明細書のいかなる言葉、及び図面に示される如何なる構造も、特許請求されていない任意の要素が、開示された内容の実施のために不可欠であることを示していると解釈されるべきではない。本明細書で用いる場合、「含む（including）」、「含む（comprising）」又は、「有する（having）」及びその変化形は、その後に列記された要素及びそれと等価なものに加えて、追加的な要素も包含することを意味する。特定の要素を「含む（including）」、「含む（comprising）」又は、「有する（having）」として再掲された実施形態はまた、それら特定の要素「から成る」及び「実質的に...から成る」とも解釈される。
【００２０】
本明細書における数値範囲の列挙は、本明細書において別途示されない限り、単に該範囲内の各分離した値を個々に参照する簡略な方法として用いることを意図するものであり、各分離した値は、あたかもそれが本明細書に個別に列挙されたかのように本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％から５０％と述べられている場合、それは、例えば、２％から４０％、１０％から３０％、又は１％から３％等のような値が本明細書中に明確に挙げられていることを意図している。これらは、何が具体的に意図されているかの例示に過ぎず、全ての可能な数値の組み合わせの間の値、列挙された最小値及び最大値を含め、明確に本件開示において述べられているものと考えられる。特に挙げられた量又は量の範囲を記載するための「約」という言葉の使用は、挙げられた量に非常に近い値、例えば、製作公差、測定における機器及び人による誤差等により説明することができる、あるいは自然と説明される値、がその量に含まれることを示すことを意味する。全ての百分率で示される量は、別途示されない限り、質量によるものである。
【００２１】
本明細書中で引用される非特許又は特許文献を含む如何なる参照も先行技術を構成するとは認められない。特に、別途述べられない限り、本明細書におけるいかなる文献の参照も、それら文献のいかなるものも米国又はその他の国における当該技術分野における通常の一般的な知識の一部を形成するものとは認められないことが理解されるであろう。参照文献において著者が主張するものとして述べられる如何なる議論も、本明細書において引用される如何なる文献について、出願人はその正確性及び関連性について異議を唱える権利を留保する。本明細書において引用される全ての参考文献は、明示的に別途示されない限り、参照によりその全体が本明細書に完全組み込まれる。引用した参考文献に認められるいかなる定義及び／又は記述との間で不一致が生じた場合は、本件開示が管理する。
別途特定又は分脈上示されない限り、「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」という用語は、「１つ以上」を意味する。例えば、「タンパク質（ a protein）」、又は「ＲＮＡ（an RNA）」は「１つ以上のタンパク質」又は「１つ以上のＲＮＡ」をそれぞれ意味すると理解されるべきである。
以下の実施例は、例示とすることのみを意図するものであり、本発明または付属する特許請求の範囲のスコープを制限することを意図するものではない。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）
本実施例において、本発明によるヒトＢ細胞のインビトロ拡張のための方法が提供される。ヘパリン処置された血液を健康な大人のヒトドナーから収集した。血液単核細胞は、Ｓｅｐｍａｔｅ５０チューブ中のフィコール−メトリゾ酸ナトリウムの層上で３００ｘｇで１０分間遠心分離により単離された。末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を緩衝液（ＰＢＳ）で２倍に希釈し、続いて遠心分離し（３００×ｇ、１０分）、ＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ｗ／ｖ）、２．５ｍＭ  ＰＢＳ中ＥＴＤＡ）の中で〜３×１０7細胞／ｍｌに再懸濁した。ＣＤ１９+Ｂ細胞が、製造者の指示に従いＣＤ１９磁気ビーズを用いた陽性選択によって単離された。簡潔に述べると、単離された単核細胞は、ＣＤ１９モノクロナール抗体で覆われたマイクロビーズ（６０μＬマイクロビーズ／ｍＬのＰＢＭＣ）と共に４℃で１５分間培養され、１０倍に希釈され、遠心分離により再ペレット化され、１ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液中で再懸濁された。細胞はあらかじめ湿らせたＬＳカラム（速やかで優しく細胞を分離することを可能とするコーティングで覆われた強磁性の球体で構成されるマトリックスを含むカラム）に磁場の下で搭載された。続いてカラムは、追加的な６ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液と共に洗浄された。ＣＤ１９+細胞は、カラムを磁場から外し、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含む３ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地をカラムに添加し、別のコニカルチューブに溶出液を収集することにより溶出された。生存細胞の濃度を、顕微鏡下で死細胞のトリパン青染色とともに血球計算盤を用いて決定した。Ｂ細胞純度は、免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により、９８％以上のＣＤ１９+細胞頻度とともに決定された。追加的な選択の繰り返しを、純度を高めるために用いることができる。
【００２３】
ヒトＢ細胞をインビトロで拡張することは、最初、マウスＢ細胞拡張を誘発した培養条件を用いて試みられた。精製されたヒトＢ細胞は、ＢＬｙＳ及びＣＤ１５４（ＮＩＨ−３Ｔ３−ｍ１５４／ｈＢＬｙＳ）を発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を含む間質細胞単分子膜上で、ヒトＩＬ−２１を添加して、マウスＢ細胞培養を模した培養条件下（米国特許出願番号ＵＳ２０１４００６５１１８号）で培養された。精製されたヒトＢ細胞をインビトロで拡張することは、続いて、３Ｔ３−ＣＤ１５４EAT又は３Ｔ３−ＣＤ１５４BEAT細胞を用いて、マウスＢ細胞培養を模した培養条件下で、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０及びＡＰＲＩＬを含む外因的な組換えサイトカイン混合物の存在の下で、試みられた。簡潔に述べると、ＮＩＨ−３Ｔ３−ｍ１５４／ｈＢＬｙＳ細胞は、ＮＩＨ−３Ｔ３−ＣＤ１５４EAT  細胞を生成するためにマウスＣＤ１５４及びマウスＢｌｙＳをコードしたｃＤＮＡ、又はＮＩＨ−３Ｔ３−ＣＤ１５４BEAT細胞を生成するためにマウスＣＤ１５４、マウスＢｌｙＳ、及びマウスＩＬ−２１をコードしたｃＤＮＡとともにスーパー形質移入された。これらｃＤＮＡを発現する間質細胞系が単離され、サブクローンされ、マウス及びヒトＢ細胞の拡張をサポートするそれらの能力についてアッセイされた。間質細胞は、２４−ウェルプレートに、１ｍＬの培養培地中３ｘ１０5細胞／ウェルの密度で、培養物に精製されたヒトＢ細胞（３×１０3／ウェル）を添加する少なくとも１２時間前に播種された。ヒトＢ細胞が培養物に添加された時、各ウェルからの培地は、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む新鮮な培養培地と交換された。培養４日後、各ウェルに、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む追加的な培地（０．７ｍＬ）が添加された。培養６日目、Ｂ細胞と間質細胞が、０．４ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ処理の後、収集された。細胞懸濁液は遠心分離によりペレット化され、２ｍＬの培養培地中で再懸濁された。Ｂ細胞数が顕微鏡検査（血球計数器）により定量され、Ｂ細胞の頻度が、フローサイトメトリー分析を伴う免疫蛍光染色によって決定された。しかしながら、これらの条件下で著しいマウスＢ細胞拡張が観察された一方で、ヒトＢ細胞の著しい生存又は拡張はこれらの試みにおいて観察されなかった（例えば、拡張は１３０倍未満であった）。したがって、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞がヒトＢＬｙＳ及びヒトＣＤ１５４のｃＤＮＡとともに形質移入され、ＣＤ１５４+ＢＬｙＳ+細胞と共に単離され、拡張され、引き続きサブクローニングされた。  これらの条件下で、９〜１２日間の培養期間中の最大ヒトＢ細胞拡張は、ＮＩＨ−３Ｔ３−ｍＣＤ１５４／ｈＢＬｙＳ細胞単分子膜を用いて観察されたもの（米国特許出願ＵＳ２０１４００６５１１８）を超えて著しく増加しなかった。何故なら、１２日間でのヒトＢ細胞拡張はたったの１３０±１７倍（平均±標準誤差；図１Ａ）であったからである。ヒトＢ細胞拡張は、外因的に、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０及びＡＰＲＩＬを含むヒト組換えサイトカイン混合物を添加することにより著しくは改善されなかった。したがって、一連の追加的なヒト及びマウス間質細胞がそのヒトＢ細胞拡張をサポートする能力について評価された。
【００２４】
多様なヒト間質細胞及びマウス間質細胞は、以下のベクター及びクローン選択方法を用いて、ヒトＢＬｙＳ及びヒトＣＤ１５４とともに形質移入された。ヒトＢＬｙＳをコードしているｃＤＮＡが、ＢＬｙＳ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ  ＤＮＡ構造を生成するために用いられ、ＣＤ１５４発現のための免疫蛍光染色から独立した（ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質）選択マーカーを提供した。ヒトＣＤ１５４  ｃＤＮＡ及びヒトＢＬｙＳ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ  ＤＮＡは独立して、ＬＴＲをプロモーターとして有するレトロウィルスベースの発現ベクター（ｐＭＳＣＶｐｕｒｏベクター）にクローンされ、商業的に入手可能なレトロウィルスパッケージング細胞系を用いたレトロウィルスの形質導入によって間質細胞系に形質移入された。形質移入の後、安定なピューロマイシン（５μｇ／ｍＬ）−抵抗細胞が続いて培養中に選択された。ＣＤ１５４を発現し、ＢＬｙＳを分泌する細胞は、間質細胞の細胞表面を、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）−接合ＣＤ１５４モノクロナール抗体、  ＡＰＣ+ＧＦＰ+（ＣＤ１５４+ＢＬｙＳ+）細胞で蛍光活性細胞選別を用いて単離されたものとともに染色することによって可視化された。単離されたＣＤ１５４+ＢＬｙＳ+細胞は培養中で拡張され、サブクローンされ、ヒトＢ細胞をインビトロでサポートし、拡張する能力について試験された。間質細胞でヒトＢ細胞をサポートし、拡張する能力を試験されたものとしては、マウスＭＳ−５細胞、骨髄間質細胞系；ＡＦＴ０２４細胞、マウス胎児肝臓間質細胞系；ＯＰ９細胞、マウス骨髄間質細胞系；ヒトＡ５４９細胞、肺胞基底上皮腺癌細胞系；ヒトＥＡ−Ｈｙ９２６細胞、ヒト血管内皮細胞系；ＨＳ−５細胞、ヒト線維芽細胞様間質細胞系；ＴＥＣ−８４細胞、ヒト胸腺間質細胞系；ヒト包皮線維芽細胞であって、ＰＡ３１７  ＬＸＳＮ  １６Ｅ６Ｅ７細胞系（米国培養細胞系統保存機関、ＣＲＬ−２２０３（登録商標））によって生成された両種指向性レトロウィルスＬＸＳＮ１６Ｅ６Ｅ７を用いて不死化されたもの；及び同様に変形されたヒト臍帯静脈内皮細胞が挙げられる。結果は、ほとんどの間質細胞系でヒトＢＬｙＳ及びＣＤ１５４を発現するものは、Ｂ細胞生存又は拡張をサポートすることができないか、形質移入されたマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞よりもヒトＢ細胞の拡張をサポートする効率が低かったかのいずれかであった。驚くべきことに、また予期せずして、ＭＳ−５細胞及びＴＥＣ−８４細胞は、培養中でヒトＢ細胞をサポート及び拡張する能力があり、それに続くＭＳ−５細胞クローンも、細胞分裂を妨げるため細胞をマイトマイシンＣと共に処置することによって間質細胞の繁殖を阻む著しい必要性なしにヒトＢ細胞の拡張をサポートするために最適な成長特徴を有することが証明された。
【００２５】
ヒトＣＤ１５４及びＢＬｙＳを発現するよう改変されたＭＳ−５細胞及びＴＥＣ−８４細胞は、さらにＩＬ−２１を発現するよう同様に改変された。ヒトＩＬ−２１ｃＤＮＡが青色蛍光タンパク質（ｍＢＦＰ２）を開裂可能な２Ａペプチド配列を経由して発現できるようにするＩＬ−２１−２Ａ−ペプチド−ｍＢＦＰ２  ＤＮＡ構造を生成するため用いられた。ＩＬ−２１−２Ａ−ペプチド−ｍＢＦＰ２  ＤＮＡはｐＭＳＣＶピューロベクターのピューロマイシン遺伝子に代わって挿入された。安定なピューロマイシン（５μｇ／ｍＬ）−耐性細胞が続いて培養中に選択された。改変されたフィーダー細胞であってＡＰＣ+ＧＦＰ+ＢＦＰ+（ＣＤ１５４+ＢＬｙＳ+ＩＬ−２１+）であったものが蛍光活性細胞選別を用いて単離され、各間質細胞系の単一細胞クローンが続いて単離され、ヒトＢ細胞繁殖をサポートする能力について試験された。
【００２６】
本発明による改変されたフィーダー細胞はヒトＢＬｙＳ及びマウスＣＤ１５４ｃＤＮＡ（ＮＩＨ−３Ｔ３−ｍＣＤ１５４／ｈＢＬｙＳ）とともに形質移入されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞と、血液から単離されたヒトＢ細胞の拡張をサポートし、誘発するフィーダー細胞としての能力を比較された。この比較において、生存ヒトＣＤ１９+Ｂ細胞は、新鮮なフィーダー細胞の単分子膜の培養物それぞれに添加された。ヒトＢ細胞はＮＩＨ−３Ｔ３−ｍＣＤ１５４／ｈＢＬｙＳ細胞単分子膜上で外因的なヒトＩＬ−４（２ｎｇ／ｍｌ）とともに７日間培養された。ＩＬ−４（２ｎｇ／ｍｌ）を含む追加的な培地が培養物に第２日及び第４日に添加された。Ｂ細胞は第７日に単離され、新鮮なＮＩＨ−３Ｔ３−ｍＣＤ１５４／ｈＢＬｙＳ細胞単分子膜上に外因的なヒトＩＬ−２１（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに５日間移された。ヒトＣＤ１５４及びＢＬｙＳ（ＭＳ５Duo細胞）を形質移入されたＭＳ−５細胞を用いた培養物中、Ｂ細胞はＭＳ５Duo細胞上で追加的なＩＬ−４及びＩＬ−２１を添加して６日間培養され、続いて外因的なＩＬ−２１とともに１４日まで培養された。ヒトＣＤ１５４、ＢＬｙＳ及びＩＬ−２１（ＭＳ５Trio細胞）を形質移入されたＭＳ−５細胞を用いた培養物中、Ｂ細胞はＭＳ５Trio細胞上で、ＩＬ−４を添加して６日間培養され、続いて外因的なサイトカイン抜きで１４日目まで培養された。第１２日又は１４日に、Ｂ細胞及び間質細胞はそれぞれウェルから収集され分析された。図１は、ヒトＣＤ１５４及びＢＬｙＳ（ＭＳ５Duo）を発現したＭＳ−５クローン、またはヒトＣＤ１５４、ＢＬｙＳ及びＩＬ−２１（ＭＳ５Trio）をＮＩＨ−３Ｔ３−ｍＣＤ１５４／ｈＢＬｙＳ細胞と共に発現したＭＳ−５クローンを含む改変されたフィーダー細胞の比較を、インビトロのヒトＣＤ１９+Ｂ細胞の拡張との関連において示す（拡張倍は、培養の開始時に培養物中に存在したＢ細胞数に対する比である）。改変されたフィーダー細胞がＭＳ５Duo細胞又はＭＳ５Trio細胞である場合、ヒトＢ細胞は、第１０日に１２，０１８±５，５２３−及び２１，６１１±３，５７６−倍に、第１２日までに６１，５４７±１６，１３４−及び８０，７６１±２８，９７９−倍にそれぞれ拡張した（図１Ａ）。ＮＩＨ−３Ｔ３−ｍＣＤ１５４／ｈＢＬｙＳフィーダー細胞との場合、ヒトＢ細胞は、第７日までに３．４−倍に、第１２日までに〜１３０−倍に拡張した。また、ＭＳ５Duo細胞又はＭＳ５Trio細胞のいずれかと一緒のＢ細胞の培養物は、ＩＬ−４が存在しなくても、同様又はより良い結果を増幅及び分化において発揮することができることは注目すべきである（図１Ｂ及び２Ｂ−Ｃ）。したがって、本発明の改変されたフィーダー細胞は、ヒトＢ細胞の拡張を、ＮＩＨ−３Ｔ３−ｍＣＤ１５４／ｈＢＬｙＳ細胞をフィーダー細胞とする場合に比べて著しく促進することができる。本発明の改変されたフィーダー細胞は、この能力を試験された大多数のマウス及びヒト細胞系に比べて、著しくより最適的なヒトＢ細胞の拡張のための間質細胞単分子膜を提供する。
【００２７】
（実施例２）
本実施例で例示されるのは、本発明の改変されたフィーダー細胞の、インビトロで拡張されたヒトＢ細胞の分化を誘発する能力である。インビトロ、ＭＳ５Duo又はＭＳ５Trio培養システム中で拡張されたヒトＢ細胞を、分化の表示であるマーカーについて分析した。ヒトＢ細胞表現型は、ＰｅｒＣＰ−、ＦＩＴＣ−、ＰＥ／Ｃｙ７、ＦＩＴＣ、及びＰＥ／Ｃｙ７−接合ＣＤ１９（ＨＩＢ１９）、ＩｇＭ（ＭＨＭ−８８）、ＩｇＧ（ＨＰ６０１７）、ＣＤ３８（ＨＩＴ２）、及びＣＤ１３８（ＭＩ１５）モノクロナール抗体を用いて評価された。生存細胞はフローサイトメトリーによって分析された。ＭＳ５Duo又はＭＳ５Trio培養システム中で拡張されたヒトＢ細胞は、ＣＤ１９+及びＣＤ２０+のままであり、それらがＢ細胞起源であることが確認された（図２）。概ね８０％の新たに単離されたヒト血液Ｂ細胞は、改変されたフィーダー細胞とともに培養される前に、ＩｇＭを発現し、〜４％がＩｇＧをともに発現した（図２Ａ）。改変されたフィーダー細胞単分子膜とともに培養して第７日に、Ｂ細胞の半分がＩｇＭを発現し、〜１６％がＩｇＧを発現した（図２Ｂ）。培養の終わりまでに、ＭＳ５Trio培養システム中で拡張されたほとんどのＢ細胞は、細胞表面ＩｇＭを発現したが、ＩｇＭ-ＩｇＧ-ＩｇＡ+ＣＤ１９+Ｂ細胞の頻度は拡張した（図２Ｂ−Ｃ）。１０％未満の新たに分離されたＢ細胞がＣＤ３８又はＣＤ１３８を、改変されたフィーダー細胞と共に培養される前に発現し（図２Ａ）、これは活性化Ｂ細胞上に発現した活性化マーカーであり、プラズマ細胞上に高い密度で発現した。培養第６−７日までには、１６％のＢ細胞がＭＳ５Trio培養システム中で拡張し、ＣＤ３８活性化マーカーを発現した（図２Ｂ）。培養第１４日までに、５６％までのこれらＢ細胞がＣＤ３８を発現し、２３％のＢ細胞がＣＤ３８とＣＤ１３８の両方を発現した（図２Ｃ）。全く同じではないにしても類似の結果が、ＭＳ５Duo培養システム中で拡張されたＢ細胞について得られた。本発明の改変されたフィーダー細胞とともに培養されたヒトＢ細胞のいくつかは、それらの抗体分泌プラズマブラストへの活性化及び分化と整合的な表現型を獲得した。
【００２８】
（実施例３）
本実施例で例示されるのは、本発明の改変されたフィーダー細胞の、インビトロで拡張されたヒトＢ細胞の抗体産生を誘発する能力である。インビトロ、ＭＳ５Duo又はＭＳ５Trio培養システム中で拡張されたヒトＢ細胞を、抗体産生について分析した。ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡ抗体レベルは、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定された。プレートは、細胞培養上清液（バルクＢ細胞培養由来であれば１：１０に希釈されたもの、又は単一Ｂ細胞培養由来であれば希釈されていないもの）がプレートに添加される前に、１％のＢＳＡを含むトリス−緩衝生理食塩水でブロックした。抗ＩｇＧ1抗体と接合したアルカリ性ホスファターゼが、結合した抗体を検出するために用いられ、１Ｍジエタノールアミン／０．５Ｍ  ＭｇＣｌ2が４−ニトロフェニルホスファート二ナトリウム塩六水和物とともに検出試薬として用いられた。４０５ｎｍでの吸収を読み取った。対照プレートは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１％ＢＳＡを用いてコートし、上述のとおり、培養上清液及び検出試薬を添加する前にブロックした。抗体濃度は、商業的に入手できるヒトＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡ標準を用いて各ＥＬＩＳＡから得られた検量線に基づいて定量した。
【００２９】
本明細書の実施例２に記載されたインビトロ拡張中のヒトＢ細胞の表現型の変化と整合するように、第６日までインビトロ、ＭＳ５Trio培養システム中で拡張されたヒトＢ細胞の組織培養上清液中で、分泌されたＩｇＭは検出されなかった（図３Ａ）。しかしながら、ＩｇＭ濃度は第１０日までには７．８μｇ／ｍＬに、第１４日には９２μｇ／ｍＬに増加した。同様に、ＩｇＧレベルは、第１４日までには、２．４μｇ／ｍＬまで著しく増加した（図３Ｂ）。ＩｇＡレベルはまた、第１０日及び１４日に増加したが、０．３μｇ／ｍＬ未満に留まった（図３Ｃ）。全く同じではないにしても類似の結果が、ＭＳ５Duo培養システム中で拡張されたＢ細胞について得られた。インビトロ、ＭＳ５Duo又はＭＳ５Trio培養システム中で拡張されたヒトＢ細胞とは対照的に、ＮＩＨ−３Ｔ３−ｍＣＤ１５４／ｈＢＬｙＳ、ＮＩＨ−３Ｔ３−ＣＤ１５４EAT、又は３Ｔ３−ＣＤ１５４BEAT間質細胞単分子膜上で同様の条件下で培養されたヒトＢ細胞は、計測可能な抗体を組織培養上清液に分泌しなかった。したがって、本発明の改変されたフィーダー細胞上で拡張した結果として、いくつかのヒトＢ細胞は、エクスビボ拡張中に分化し、主にＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を分泌する。
【００３０】
本発明のある態様において、特異の抗原、典型的には公知の抗原に結合するヒトモノクロナール抗体を製造する方法が提供される。該方法は、ヒトＢ細胞を単離するステップ、単離されたＢ細胞を単一細胞に分離するステップ、単離されたＢ細胞（単一細胞）を本発明の改変されたフィーダー細胞の存在下で、少なくとも数において１０4倍の拡張を２週間未満で培養中で達成するための条件の下、十分な時間培養するステップ（例えば、単一細胞から１０，０００細胞への拡張。マルチウェルプレートのマルチプルウェル上の平均拡張数）であって、培養物中の拡張されたＢ細胞クローンから産生されたものがモノクロナール抗体であるものを含む。この態様は、抗原選択の誘導又は更なる抗原感作を誘発する試みにおいて、単離されたＢ細胞と本発明の改変されたフィーダー細胞の共培養物に、抗原を直接添加することを排除する（すなわち、単離されたＢ細胞が改変されたフィーダー細胞の存在下で培養される時に、本発明の方法によればモノクロナール抗体を産生するために不必要であるため、外因的な抗原が存在しない）。
【００３１】
この態様を例示するため、単一ヒトＢ細胞がＭＳ５Trio間質細胞単分子膜上で、９６ウェルプレート中、外因的にサイトカインを添加することなく培養された。これらの限界希釈アッセイにおいて、ヒトＢ細胞コロニーが６０から７０％のウェルで観察され、これはクローン効率が６０％から７０％であることを反映している。これらのＢ細胞コロニーを含むウェル中で、単一Ｂ細胞は１２日後に平均４６，６８９±４，１０５−倍に拡張した（図４Ａ）。培養第１０日及び第１２日における組織培養上清液のＩｇＭ濃度は、それぞれ５．５±１．２μｇ／ｍＬ及び９．３±１．４μｇ／ｍＬであった（図４Ｂ）。培養第１０日及び第１２日におけるＩｇＧ濃度は、それぞれ３．５±０．５μｇ／ｍＬ及び１０．５±０．８μｇ／ｍＬであった。個々のＢ細胞クローン中でのＩｇＭ及びＩｇＧ分泌の間に何ら相関はなく、ＩｇＭ分泌とＢ細胞拡張との間にも相関はなかったが、ＩｇＧ分泌とＢ細胞拡張との間には著しい正の相関が認められた（図４Ｃ）。したがって、個々のウェル中のいくつかのＢ細胞は、アイソタイプスイッチを経験し、いくつかのＢ細胞はまた、抗体分泌細胞に分化した。各Ｂ細胞クローンについて産生された著しい抗体濃度は、それによってそれらのＢＣＲ特異性の決定を可能とする。
【００３２】
（実施例４）
本発明の方法の更なる工程は、各Ｂ細胞クローンから産生したモノクロナール抗体の特徴づけ、例えば、当該技術分野で公知の方法を用いて、モノクロナール抗体の抗原に対する特異性を決定することを含んでもよい。本発明の方法に従って産生したモノクロナール抗体の特異性を決定するため、当該技術分野で公知のいくつかの方法のうち任意の１つを用いてよい。例えば、抗原アレイが今では入手可能であり、これは少量の希釈されていないＢ細胞クローンからの細胞培養上清液とともに１００までの異なる抗原のスクリーニングを可能とし、モノクロナール抗体が特異性を有する抗原を確認する効率を、抗体産生数と並行的に著しく増加させる。簡潔に述べると、精製されたビオチン化した抗原は、ストレプトアビジンで覆われた９６ウェルマイクロタイタープレートに、０．２又は０．４ｍｍのベタ印刷ピンを用いて直接接触印刷によって滴下される。印刷されたプレートは、洗浄せずに置かれ、プレートは使用準備ができるまで４℃で保管される。スクリーニングのため、Ｂ細胞クローン上清液が直接ウェルに添加され、もし望むのであれば、場合によってはブロッキング工程を行う（例えばＢＳＡ）。印刷されたアレイ中で抗原に特異的なビオチン化されたヒト抗体が、陽性対照及び位置決めマーカーとして用いられる。Ｂ細胞クローン上清液は抗原アレイに添加され、一晩４℃で培養された。緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％ツイン）で洗浄した後、アレイは２時間、抗ヒト抗体（ヒト抗体を検出するために）又は抗マウス抗体（マウス抗体を検出するために）とともに培養され、蛍光検出のため蛍光体、又は比色検出のため酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）及び非色基質でラベルされた。抗原アレイは、最適化及び定量検出のためイメージキャプチャ及び画像化ソフトウェアを使用してハイスループット顕微鏡で分析することが可能である。
【００３３】
同様にハイスループット抗原マイクロアレイが記載され、それによれば、２５，０００を超える抗原−抗体反応テストを１週間未満で実施することができる。あるシステムにおいて、タンパク質抗原のアレイが、アルデヒドでコートされたガラススライドに共有結合される。アルデヒドガラススライドへの抗原の結合は、安定化するのに２４時間必要とし、少なくとも６カ月間は安定性が証明された。抗原マイクロアレイチップは、ガラススライドの上に、固体ピン成膜技術及び商業的に入手可能なロボティックシステムを用いて印刷された。このシステムを用いると、２０μｌ程度の少ない培養上清液をアレイ表面上で抗原と共に培養することができる。モノクロナール抗体の免疫グロブリンクラスの決定が、抗原特異性の決定と同時に望まれる場合、アレイに結合したヒト抗体の存在は、二つの異なる及び区別できる検出分子に接合した抗ヒトＩｇＧ及び抗ヒトＩｇＭ抗体の混合物により行うことが可能である（例えば、アレイ読み取り機によるレーザースキャンは、３から４つの異なるレーザーを異なる検出のために組み込むことができる）。
【００３４】
本発明の方法の更なる工程は、モノクロナール抗体の特徴づけを含んでもよく、例えば、モノクロナール抗体の単離であって（ｉ）公知技術を用いて培養培地からのモノクロナール抗体を精製すること、及び／又は（ｉｉ）公知技術を用いてモノクロナール抗体の組換え産生のため真核生物発現ベクターにクローンすることができる、可変部重（ＶＨ）抗体鎖をコードするｃＤＮＡ及び可変部軽（ＶＬ）抗体鎖をコードするｃＤＮＡを生成するために全ＲＮＡをＢ細胞クローンから単離することを含む。その観点から、本発明の方法を用いて拡張し、分化されたヒトＢ細胞クローンは採取され、Ｂ細胞クローンの細胞から全ＲＮＡの抽出が続いてもよい。全ＲＮＡを単離するため当該技術分野において公知の数多くの方法のうち任意の１つを用いてよく、例えば、商業的に入手可能なミニプレップキットを用いる方法がある。ヒトＶＨ及びＶＬ鎖遺伝子は、当該技術分野で公知のプライマー（例えば、配列番号：５−１２を参照）及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて各ｃＤＮＡ分子を作るため選択的に増幅されてよい。ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）重（Ｈ）及び軽（Ｌ）鎖の転写物は、外側ＰＣＲプライマーを用いて増幅することができる。免疫グロブリン−特異ｃＤＮＡは、続いて外側ＰＣＲ増幅における鋳型として用いられる。簡潔に述べると、各モノクロナールＢ細胞拡張からの１−２μｌのｃＤＮＡが、外側ＶＨＰＣＲプライマー及び適切な定常領域プライマー（例えば、配列番号：４２−６７参照）と共にアイソタイプ特異的ＢＣＲ転写物を増幅するために鋳型として用いられる。必要であれば、外部増幅からのＰＣＲ生成物を第二ラウンドの内部増幅の鋳型として用いることができる（例えば、配列番号：１３−４１参照）。いずれの場合でも、プラスミド特異的配列を、フォワード又はリバースプライマーに、再発現分析のため選んだベクターに簡単にクローンできる抗体転写物を生成するため、添加することができる。生産的なＩｇ再構成は、生殖系Ｉｇ配列に対して、公に入手可能なソフトウェアを用いて比較することができ、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子ファミリーの用途を決定するため商業的に入手可能なソフトウェアを用いて分析した。生殖細胞系列Ｖ、Ｄ及びＪ配列を用いて、変異頻度を決定することができた。ＶH−Ｄ−ＪH、ＶK−ＪK及びＶλ−Ｊλ転写配列及び系統樹を、平均パーセント同一性に基づいて、商業的に入手可能なソフトウェアを用いて構築することができた。一度特徴づけられたら、ＶＨ及びＶＬ配列は、必要に応じて適切なアイソタイプのヒト又はマウスモノクロナール抗体の組換え体を、その後の真核生物細胞中で発現及びモノクロナール抗体タンパク質の産生とともに、産生するために用いることができた。例えば、ＶＨ鎖ｃＤＮＡ及びＶＬｃＤＮＡは、発現のために用いられるホスト細胞のため選択された発現ベクターにクローンすることができ、発現ベクターはホスト細胞中に共形質移入される。任意の数のホスト細胞を、組換えヒト又はマウスモノクロナール抗体を産生するために用いてよく、哺乳類細胞（例えば、２９３Ｔ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞等）、バキュロウィルス、昆虫細胞、バクテリア細胞、及び植物細胞が挙げられるが、これらに限られるわけでは��い。形質移入されたホスト細胞は、続いてクローンされ、抗体を産生するため十分な条件の下、十分な時間、成長させられる。産生プロセスは、大量の抗体を作るため、当該技術分野で公知の方法及び標準的な産業システムを用いてスケールアップすることができる。モノクロナール抗体は続いて、当該技術分野で公知の、例えば、タンパク質Ａ及び／又はタンパク質Ｇクロマトグラフィー（ＩｇＧのため）を用いて、又は、所望のＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＤに特異的な抗免疫グロブリン抗体を用いるような、標準的な免疫精製技術を用いて精製してもよい。
【００３５】
（実施例５）
本実施例では、特異の抗原、典型的には公知の抗原、に結合するヒトモノクロナール抗体を産生するための方法が例示され、そこでは、抗原への曝露がインビボで起こり、インビボでのこの抗原への曝露の結果、ヒト個体がこの抗原に対する結合特異性を有する抗体を産生することができるＢ細胞を有する。ある例示されたこの方法の適用においては、個体は病態、不調、又は病気の過程を有していてよく、その結果、その個体のＢ細胞が病態、不調、又は病気の過程と関連又はこれらによって引き起こされる１つ以上の抗原に対し曝露されていてもよい。そのような曝露によって産生される抗体は、状態、不調、又は病気の過程の発達又は進行のいずれかに貢献してもよく（「病理的抗体」）、又はその逆に、状態又は病気の発達を阻害又は妨害する試みにおいて産生されていてもよい（「治療的抗体」）。該方法は、Ｂ細胞をそのようなヒト個体から単離し、単離されたＢ細胞を単一細胞に分離し、インビトロで単離されたＢ細胞（単一細胞）を、本発明の改変されたフィーダー細胞の存在下で、培養中で２週間未満の間に少なくとも数において１０4倍の拡張を達成するための条件及び十分な時間、培養する工程を含み、培養中の拡張されたＢ細胞クローンから産生されたものはモノクロナール抗体である。この共培養から産生した各モノクロナール抗体は、次に抗原特異性を評価してよい。
【００３６】
本方法の例示として、尋常性天疱瘡（ＰＶ）又は落葉性天疱瘡（ＰＦ）を有する個体から単離されたＢ細胞からモノクロナール抗体が産生された。いずれかのこれら病気を有する個体は、臨床症状、組織学、及び直接免疫蛍光検査による発見から診断された。この研究は、治験審査委員会の許可のとともに行われ、書面による告知に基づく同意を得ていた。この調査に関与した個体は、天疱瘡患者であって、天疱瘡以外の如何なる体内又は炎症性傷害の治療も受けていなかった。本明細書に記載の方法を用いて、単離されたＢ細胞及び改変されたフィーダー細胞をインビトロで共培養した。簡潔に述べると、天疱瘡を有する患者からの循環系血液Ｂ細胞が単離された。ＭＳ５Trio細胞を９６ウェルプレートで少なくとも１２時間、単離及び精製された天疱瘡患者からの血液Ｂ細胞を添加する前に培養した。限界希釈のため、０．２ｍｌの新鮮な組織培養培地でＢ細胞（１０細胞／ｍＬ）を含むものが各ウェルに、如何なる外因的なサイトカインも添加することなく添加された。培養培地の半分は第６日及び第９日に新鮮な培地と交換した。各ウェルから第１２日に培養上清液を収集し、上清液について、天疱瘡と関連する自己抗体の存在を評価した。その観点から、天疱瘡の両方の形態（ＰＶ及びＰＦ）が自己抗体によって、重層上皮又は粘膜及び皮膚の細胞表面抗原を引き起こした。典型的には、これらの病理的抗体は細胞表面デスモソーム上のカルシウム依存付着分子、とりわけＰＦではデスモグレイン１（ＤＳＧ１）、ＰＶではデスモグレイン３（ＤＳＧ３）及び／又はデスモグレイン１に結合する。したがって、上清液はヒト抗ＤＳＧ１及びヒト抗ＤＳＧ３抗体の存在を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって試験した。図５Ａに示すように、シングル９６ウェルプレートの試験において、平均して３から４ウェルがＥＬＩＳＡで決定されたところヒト抗ＤＳＧ１抗体を産生したＢ細胞クローンを含んだ。１１の９６ウェルプレートが各患者サンプルに用いられ、理論的には１０，５６０個のＢ細胞が播種された。全ての１１プレートからの陽性ウェルの数、及び単一Ｂ細胞培養システムのクローニング効率に基づき、抗原特異的血液Ｂ細胞の割合が計算された。図５Ｂに示すように、約０．３％から０．５％の循環系Ｂ細胞が、天疱瘡患者中でＤＳＧ１又はＤＳＧ３に対する抗原特異性を有する（図５Ｂ、ＰＶ及びＰＦ）。ＥＬＩＳＡにおいてＤＳＧ１及びＤＳＧ３と反応性であるＢ細胞クローンはまた、天疱瘡を有さず、測定可能な抗ＤＳＧ血清抗体を有さない健康な個体（「健康な対照」ＨＣ）から単離された（図５Ｂ）。したがって、単一Ｂ細胞を拡張するため及びＢ細胞を測定可能な、特異の抗原、典型的には公知の抗原に結合し、抗原への曝露がインビボで起こるヒトモノクロナール抗体を産生するよう誘発するためのインビトロの方法が証明された。代替的に、ナイーブＢ細胞であって、前記抗原に結合する能力を有するものを確認し、それらのモノクロナール抗体産生物を単離することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ−Ｃ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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