(57)【要約】  本発明は、配座異性体抗原認識抗体誘導用の神経変性疾患のワクチン組成物および感染性ウイルスワクチン組成物を提供する。本発明のワクチン組成物は、配座異性体抗原認識抗体の生成を誘導する。これらの配座異性体抗原認識抗体は、抗原に対して高い特異度を有するので、疾患の改善、予防または治療に有効に用いることができる。【選択図】図１０
2019519614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）タウ（τ）タンパク質のＲＤ（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）；および（ｂ）ビブリオバルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）由来のＦｌａＢタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む配座異性体抗原認識抗体誘導用の神経変性疾患のワクチン組成物。
【請求項２】
上記ＲＤは、配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
上記ＲＤは、大腸菌発現のためにコドン最適化された（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）配列表の配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
上記ＦｌａＢタンパク質は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
上記組成物は、粘膜投与（ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、皮下、皮内、経皮または筋肉内接種用であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
上記組成物は、タウタンパク質凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）に特異的な抗体の生成を誘導することを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
上記抗体は、タウタンパク質の凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を抑制することを特徴とする請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
上記抗体は、オプソニンの食作用（ｏｐｓｏｎｉｃ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を促進することを特徴とする請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
上記神経変性疾患は、アルツハイマー病、タウ性病症、認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶力低下、重症筋無力症およびプリオン関連疾患からなる群から選択される疾患であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の組成物を対象に投与する段階を含む神経変性疾患の治療方法。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の組成物を対象に投与して生成された抗体の生成程度を測定する段階を含む、神経変性疾患の診断に必要な情報を提供する方法。
【請求項１２】
タウ（τ）タンパク質のＲＤ（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）をコードするコドン−最適化された（ｃｏｄｏｎ−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）配列表の配列番号５のヌクレオチド。
【請求項１３】
（ａ）感染性ウイルスのカプシドタンパク質；および（ｂ）ビブリオバルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）由来ＦｌａＢタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む配座異性体抗原認識抗体誘導用の感染性ウイルスのワクチン組成物。
【請求項１４】
上記感染性ウイルスは、ノロウイルス（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｎｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）または呼吸器多核体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）であることを特徴とする請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
上記感染性ウイルスのカプシドタンパク質は、ノロウイルスのＰドメインであることを特徴とする請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
上記Ｐドメインは、配列表の配列番号１３のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
上記Ｐドメインは、配列表の配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
上記ＦｌａＢタンパク質は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
上記組成物は、粘膜投与（ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、皮下、皮内、経皮または筋肉内接種用であることを特徴とする請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
上記組成物は、血清内の抗原特異的なＩｇＧの生成を増加させることを特徴とする請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
上記組成物は、血清内の抗原特異的なＩｇＡの生成を増加させることを特徴とする請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
上記組成物は、糞便内の抗原特異的なＩｇＧの生成を増加させることを特徴とする請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
請求項１３ないし請求項２２のいずれかに記載の組成物を対象に投与する段階を含む感染性ウイルス性疾患の予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配座異性体抗原認識抗体の生産を誘導するフラジェリンワクチン補助剤ベースのワクチンの製造およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、抗原と特異的に結合して抗原−抗体反応を起こして免疫反応を起こす物質である。免疫系から細菌やウイルスなどの外部抗原だけでなく、癌とその他の自家由来の内部抗原を認識し特異的な結合をして、同時に中和またはオプソニンの食作用をする免疫グロブリンを免疫抗体というが、一般的に抗体と称するものは、特定抗原を特異的に認識し結合する免疫抗体を意味する。
【０００３】
抗体は、抗原提示細胞が、外因性または内因性抗原を貪食し消化して、Ｔリンパ球に伝えることで、その形成が開始される。最初感染を通じて当該抗原を認識する特定画分のＢ細胞クローンが選択および拡張された後、当該細胞は、形質細胞（ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ）に分化されて抗体を形成することになる。免疫反応の特性上、最初感染の時期に比べて再感染時の抗体形成の速度および量が爆発的に高くなり、これは現在の感染性疾患などの予防、または特定種類の癌（癌抗原を高く発現するタイプの癌）の免疫治療用のワクチン接種の理論的な基盤として知られている。
【０００４】
抗原−抗体結合を介して認識された抗原の除去機序は、現在、以下のように知られている。その中で最も広く知られているのは、貪食細胞による食作用を促進するオプソニンの食作用である。また、ナチュラルキラー細胞によるＡＤＣＣ（ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は、ウイルスおよび細胞内の感染病原菌の感染や特定抗原を標識する腫瘍の除去などに非常に重要な役割を果たすことが知られている。最後に、抗原−抗体結合によって誘導される代案的副補体経路（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）は、病原菌の感染などに対して、人体の免疫系が対応する強力な対応法の一つである。
【０００５】
抗体の存在が明らかになった後、感染性疾患だけでなく、腫瘍などの複数の疾患群の治療に抗原−抗体反応を用いようとする努力があった。抗原−抗体反応は、これまで知られている生体内外の複数の生物学的な結合反応の中、非常に高い（〜１０−１２ｍｏｌ／Ｌ）特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有していることが知られており、これを用いて、より安全で、高い治療効果を有する治療法を開発することができると期待されているからである。１９９０年代の後半に至ってモノクローナル抗体を用いた腫瘍の治療技術が開発されながら、２００６年以来、現在まで米国ＦＤＡから市販が許可されたＴｏｐ  １０薬物の８０％以上がモノクローナル抗体ベースの薬物が占めている。特に、癌のような新生物疾患の新しい治療法として抗体治療をはじめ、複数の免疫治療法が脚光を浴びているが、２０１４年免疫チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の市販が許可された後、癌治療の分野で最も脚光を浴びる分野として浮上している。
【０００６】
このような抗体ベースの免疫治療の成功のためには、適切な抗原の選定および最適化された抗体の製造が必須要件である。つまり、特定疾患において、高い選択性および特異度を有する標的抗原を発掘すべきことだけでなく、これを特異的に認識し結合する抗体の生産技術の開発は、抗体ベースの免疫治療の成否を左右する最も重要な段階とすることができる。
【０００７】
現在まで免疫学的に抗体が認識し結合することができる抗原の特性に応じて、大きく二つに分けることができる。一番目は、抗原提示細胞で消化されて提示されたオリゴペプチド（８−１２個のアミノ酸）の配列を認識し結合する「線形エピトープ認識抗体」であり、二番目は、抗原が有している固有の３次元構造を認識し結合する「構造認識抗体または配座異性体認識抗体（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」である。特定抗原に対する抗体の生成が誘導されるとき、殆ど（〜９０％）の抗体は、一番目の抗体の分類である「線形エピトープ認識の抗体」が生成される。しかし、これまで知られているところによると、抗原の配列を認識し結合することができる配列認識抗体より抗原の構造自体を認識する抗体、すなわち配座異性体認識抗体の場合が、抗原に対してより高い特異性を有するだけでなく、特定構造的な特性を示す抗原に対して結合力を有することができるわけで、抗原−抗体反応に伴う免疫学的な機序をより高く誘導することができる長所がある。
【０００８】
現在、様々な感染性疾患に対する予防ワクチンが開発されたにもかかわらず、いまだにＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）とＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）を含む複数の感染性疾患や癌などの新生物疾患、タウ病症によるアルツハイマー病およびパーキンソン病、プリオン関連疾患などの神経変性疾患の予防および治療ワクチンは未だはるかに遠い状態である。
【０００９】
また、既にワクチンが開発されたインフルエンザの場合には、誘発病原菌であるインフルエンザウイルス特有の頻繁な抗原変異によって毎年ワクチンを接種を受けないといけないだけでなく、当該年度の予測流行株と実際流行株が異なる場合、まったく予防効果を示すことができない大きな欠点が存在する。これは未だ現在のワクチン開発技術を用いて誘導する抗体の生産に大きな障害があることを示唆していると言える。
【００１０】
即ち、殆どの現在技術で生産される人工抗原を用いたワクチン接種で誘導される抗体は、「線形のエピトープ認識抗体」であるわけで、当該エピトープの変形がひどい場合や、抗原単独ではなく、抗原のポリマーによって形成された構造抗原に対する配座異性体認識が必ず要る場合には、現在の技術では解決できないわけである。
【００１１】
前述したＨＩＶワクチンの場合、広範囲中和抗体（ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の誘導が成功的なワクチン療法の必須要件であると考えられる。即ち、ＡＩＤＳワクチンの成功も、最終的には、外皮糖タンパク質三重体（ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒｉｍｅｒ）に対する構造認識抗体誘導の可否にかかっているといえる。それだけでなく、ＲＳＶワクチンも表面抗原に対する配座異性体認識が必須であり、一度の接種でインフルエンザＡウイルス特有の抗原小変異（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｒｉｆｔ）を防ぐことができるユニバーサルインフルエンザワクチンも変異が多様で頻繁なヘマグルチニン（ｈｅｍｅａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；  ＨＡ）のヘッド構造ではない、比較的に変異が少ない茎（ｓｔａｌｋ）部位に対する配座異性体認識が必須だといえる。
【００１２】
感染性疾患だけではなく、新生物疾患および神経変性疾患などの内因性疾患に対する成功的な免疫治療のためにも効果的な配座異性体認識抗体の誘導が非常に重要である。
【００１３】
特に、内因性タンパクの病的変化によって誘発されるタウ病症性アルツハイマー病の場合、正常的に存在するタウ単量体は、ニューロン軸索の強健性を維持するに必須であるが、ある刺激などによって過剰リン酸化が誘発された場合、互いに凝集して形成されるＰＨＦ（ｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）の形のタウ凝集体は、タウ病症を誘発し、周囲の他のニューロンの病的損傷を生じることと知られている。これはタウ病症だけでなく、アルファシヌクレインの病的過剰リン酸化および凝集によって発生することと知られているパーキンソン病だけではなく、プリオンによるクロイツフェルト−ヤコブ病など複数の神経変性および神経系疾患で現われる現象である。従って、このような神経変性疾患に対する成功的でありながら、安全な免疫治療を図るためには、病的な形態の内因性タンパク質凝集体のみを選択的に認識し結合するが、正常形態の単量体には結合しない配座異性体認識抗体の誘導が非常に必須的だということができる。
【００１４】
本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文および特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として挿入されて、本発明が属する技術分野の水準および本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者は、配座異性体（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）抗原認識抗体の生産を誘導するフラジェリン−ベースのワクチン組成物を製造しようと努力した。その結果、タウタンパク質の疾患媒介部位、即ち、過剰リン酸化が誘発される部位であるＲＤ（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）と敗血症ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）の鞭毛構成因子であるＦｌａＢタンパク質の組み換えタンパク質を製造して、アルツハイマー病を誘発する内因性タンパク質であるタウ（τ）タンパク質の過剰リン酸化および凝集を抑制して、アルツハイマー病を改善、予防および治療することができるワクチン組成物を製造し、ノロウイルス（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）の膜タンパク質であるＰドメイン（Ｐ  ｄｏｍａｉｎ）と敗血症ビブリオ菌の鞭毛構成因子であるＦｌａＢタンパク質の組み換えタンパク質を製造してノロウイルスワクチン組成物を製造することにより、本発明を完成した。
【００１６】
従って、本発明の目的は、タウ（τ）タンパク質のＲＤとビブリオバルニフィカス由来ＦｌａＢタンパク質で構成された組み換えタンパク質を提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、神経変性疾患（Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）の予防または免疫治療用のワクチン組成物を提供することにある。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は、タウ（τ）タンパク質のＲＤをコードするコドン−最適化されたヌクレオチドを提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、ノロウイルスのＰドメインおよびビブリオバルニフィカス由来ＦｌａＢタンパク質で構成された組み換えタンパク質を提供することにある。
【００２０】
本発明のもう一つの目的は、ノロウイルスの予防用のワクチン組成物を提供することにある。
【００２１】
本発明の他の目的は、配座異性体認識抗体誘導用のワクチン組成物の製造方法を提供することにある。
【００２２】
本発明の他の目的および利点は、下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によってさらに明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）タウ（τ）タンパク質のＲＤ（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）；および（ｂ）敗血症ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）鞭毛構成因子であるＦｌａＢタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む配座異性体抗原認識抗体誘導用の神経変性疾患のワクチン組成物を提供する。
【００２４】
本発明の他の様態によると、本発明は、（ａ）感染性ウイルスのカプシドタンパク質；および（ｂ）ビブリオバルニフィカス由来ＦｌａＢタンパク質で構成された組み換えタンパク質を含む配座異性体抗原認識抗体誘導用の感染性ウイルスワクチン組成物を提供する。
【００２５】
本発明者らは配座異性体（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）抗原認識抗体の生産を誘導するフラジェリン−ベースのワクチン組成物を製造しようと努力した。その結果、タウタンパク質の疾患媒介部位であるＲＤ（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）およびビブリオバルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）由来ＦｌａＢタンパク質の組み換えタンパク質を製造して、アルツハイマー病を誘発する内因性タンパク質であるタウ（τ）タンパク質の過剰リン酸化および凝集を抑制して、アルツハイマー病を改善、予防および治療することができるワクチン組成物を製造し、ノロウイルス（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）の膜タンパク質であるＰドメイン（Ｐ  ｄｏｍａｉｎ）およびビブリオバルニフィカス由来ＦｌａＢタンパク質の組み換えタンパク質を製造してノロウイルスワクチン組成物を製造した。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の特徴および利点を要約すると次の通りである：
（ａ）本発明は、配座異性体抗原認識抗体誘導用の神経変性疾患のワクチン組成物および感染性ウイルスワクチン組成物を提供する。
（ｂ）本発明のワクチン組成物は、配座異性体抗原認識抗体の生成を誘導する。
（ｃ）これらの配座異性体抗原認識抗体は、抗原に対して高い特異度を有するので、疾患の改善、予防または治療に有効に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、タウ（τ）タンパク質のＲＤ（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）のクローニング過程を図式化して示す。
【図２】図２は、上記タウタンパク質のＲＤのクローニングを確認した結果を示す。左側のパネルは、ＲＤの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて確認した結果であり、右側のパネルは、ウエスタンブロットを通じて確認した結果である。ＲＤは１３ｋＤａの大きさを示す。
【図３】図３は、ＦｌａＢ−ＴａｕＲＤ組み換えタンパク質のクローニングを確認した結果を示す。
【図４】図４は、ＦｌａＢ−ＴａｕＲＤ組み換えタンパク質の投与による配座異性体構造認識抗体の生成を確認した結果を示す。フラジェリンとＴａｕタンパク質の一部を発現させたＴａｕ−Ａｇを免疫して得た抗血清がＴａｕ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｎｆｏｒｍｅｒのＰＨＦ（ｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）と反応する「構造認識抗体」の生成を誘導することを示す実験結果である。
【図５】図５は、ＦｌａＢ、ＴａｕＲＤとＦｌａＢ−ＴａｕＲＤのＴＬＲ５（ｔｏｌｌ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５）に対する刺激能を確認した結果を示す。
【図６】図６は、ＦｌａＢ−ＴａｕＲＤ組み換えタンパク質の免疫スケジュールを示す。
【図７ａ】図７ａは、ｔａｕＲＤとＦｌａＢ−ｔａｕＲＤ組み換えタンパク質を含むワクチンの免疫回数および濃度によるＩｇＧ生成能を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、ｔａｕＲＤとＦｌａＢ−ｔａｕＲＤ組み換えタンパク質を含むワクチンの免疫回数および濃度によるＩｇＧ生成能を示す。
【図８】図８は、ＦｌａＢ−ＴａｕＲＤ組み換えタンパク質のＰＨＦ形態の凝集体を形成する画像を示す。
【図９】図９は、ＦｌａＢ−ＴａｕＲＤ組み換えタンパク質の投与による構造認識抗体の生成を確認した結果を示す。ＰＨＦ  ｍｏｌｅｃｕｌｅらがｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅ類似構造を形成した状態で、ｂｅｔａ  ｓｈｅｅｔに選択的に結合するｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  Ｓ（Ｔｈ−Ｓ）と抗血清を同時に作用させて生成された抗体がｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎすることを確認した結果である。
【図１０】図１０は、ＦｌａＢ−ＴａｕＲＤ組み換えタンパク質に対する抗血清によるタウタンパク質の凝集抑制効果を示す。
【図１１】図１１は、ＦｌａＢ−ＴａｕＲＤ組み換えタンパク質に対する抗血清のオプソニンの食作用（ｏｐｓｏｎｉｃ  ｐｈｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）促進効果を示す。
【図１２】図１２は、ノロウイルスのＰドメイン発現精製の結果を示す。
【図１３】図１３は、Ｐｄ−ＦｌａＢ組み換えタンパク質の発現精製およびＰｄ抗血清とＦｌａＢ抗血清に対して特異的に結合することを示している。
【図１４】図１４は、ＦｌａＢおよびＰｄ−ＦｌａＢのＴＬＲ５（ｔｏｌｌ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５）に対する刺激能を確認した結果を示す。
【図１５】図１５は、Ｐｄ−ＦｌａＢ組み換えタンパク質の免疫スケジュールを示す。
【図１６】図１６は、タンパク質工学を通じて構造認識抗体の生成を誘導した結果を示す。タウ抗原とは異なり、ノロウイルスＰドメイン（Ｐｄ）抗原の場合には、フラジェリンと単に混合投与するだけでは構造認識抗体が生成されなかったが（左）、Ｐｄ−フラジェリン融合抗原で免疫した場合にのみ、単量体は認識できず、ドットブロット（ｄｏｔ  ｂｌｏｔ）実験法で抗原構造が維持された細胞融解物を試験した場合にのみ反応する構造認識抗体を生成させた（右）。
【図１７】図１７は、Ｐｄ−ＦｌａＢ組み換えタンパク質の電子顕微鏡観察画像を示す。
【図１８】図１８は、Ｐｄ−ＦｌａＢ組み換えタンパク質の免疫による血清ＩｇＧの力価を示す。
【図１９】図１９は、Ｐｄ−ＦｌａＢ組み換えタンパク質の免疫による血清ＩｇＡの力価を示す。
【図２０】図２０は、Ｐｄ−ＦｌａＢ組み換えタンパク質の免疫による糞便ＩｇＧの力価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、（ａ）タウ（τ）タンパク質のＲＤ；および（ｂ）ビブリオバルニフィカス由来ＦｌａＢ  タンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む神経変性疾患のワクチン組成物は、配座異性体抗原認識抗体の生産を誘導する。
【００２９】
本明細書において、用語、「タウタンパク質」は、中枢神経系、特に神経細胞の軸索突起に主に発現される微小管結合タンパク質（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ＭＡＰ）として微小管を安定化させる役割を果たす。
【００３０】
アルツハイマー病をはじめとする複数の神経変性疾患の病因に対して様々な学説が存在するが、現在、最も脚光を浴びている学説は、内因性タンパク質の異常発生（過剰リン酸化、ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎなど）及びこれらの凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）による神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）の枯死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）および神経膠細胞（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）などの過剰活性（ｏｖｅｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）などによる慢性炎症反応の誘発およびそれに伴う脳組織の破壊である。
【００３１】
タウタンパク質の２６２番目ないし３５６番目のアミノ酸の間に位置する反復ドメイン（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ；以下ＲＤ）がタウタンパク質のリン酸化と関連したドメインに明らかになった。定常状態では、細胞内のリン酸化酵素（ｋｉｎａｓｅ）および脱リン酸化酵素（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）のバランスの取れた調節によりタウタンパクの過剰リン酸化が調節されるが、いくつかの内因性および外因性の刺激によってこの調節メカニズムに問題が生じた場合、タウタンパクの過剰リン酸化誘導される。過剰リン酸化されたタウタンパクは、水に対する溶解度が高かった本来の性質で溶解度が極めて低下することになり、自ら凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を形成することになる。この凝集された過剰リン酸化されたタウタンパク質は、アルツハイマー病患者の剖検脳試料から神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅ；以下ＮＦＴ）で観察される。凝集されたタウタンパク質は、初期には神経細胞の軸索部分に主に分布して軸索の微小管の安定性の阻害などを起こして、細胞の正常な活動を妨害し、神経細胞の枯死を引き起こすことになる。しかし、中等度以上のタウタンパク質の凝集は、周辺神経細胞および膠細胞にまで伝播されて、当該事件が起こった細胞だけでなく、周辺の他の細胞の枯死および小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）の活性による慢性炎症を誘発するなど、脳組織の広範囲な破壊を誘発することになり、これにより、神経変性疾患を示すことになる。
【００３２】
本発明は、タウタンパク質の２６２番目ないし３５６番目のアミノ酸の間に位置しているＲＤを組み換えタンパク質を製造して、これの抗原（または免疫原）としての機能を確認する。
【００３３】
本明細書において、用語「配座異性体抗原認識抗体」は、抗原固有の３次元構造を認識し結合する構造認識抗体を意味する（Ａ  Ｋ  Ａｂｂａｓ  ＆  Ａ  Ｈ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００３，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  ｐ．５９）。
【００３４】
本明細書において、用語「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」は、上述したタウタンパク質から由来されたＲＤタンパク質で、免疫系を刺激して生体に特異的な免疫反応を誘導する物質を意味し、本発明において、用語「免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）」と混用して使用されることができる。
【００３５】
上記組み換えタンパク質は、当業界に公知された様々な方法によって製造することができる。例えば、遺伝子クローニングの方法を通じて製造することができる。
【００３６】
本発明の一具現例によると、上記ＲＤは、配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【００３７】
上記ＲＤは、大腸菌発現のためにコドン最適化された（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）配列表の配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００３８】
上記組み換えタンパク質を大腸菌を用いて製造するために、タウタンパク質のＲＤのヌクレオチド配列を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現に適したコドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）する。上記ヒト由来ＲＤが大腸菌で高発現されることができるように、大腸菌に適したコドンに転換した。コドン最適化プロセスを経ると遺伝子配列は、塩基配列のみ転換されるだけで、アミノ酸配列は転換されない。
【００３９】
本発明で用いられるヌクレオチド配列は、前述された配列の以外に、上記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。上記の実質的な同一性は、本発明のヌクレオチド配列と、任意の他の配列を最大限に対応されるようにアライン（ａｌｉｇｎ）し、当業界で通常的に用いられるアルゴリズムを用いて、アライメントされた配列を分析した場合に、少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。
【００４０】
配列比較のためのアライメント方法は、当業界に公知されている。アライメントに対する様々な方法およびアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２（１９８１）Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ４８：４４３（１９７０）；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３１（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−４４（１９８８）；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３（１９８９）；  Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐｌ．  ＢｉｏＳｃｉ．  ８：１５５−６５（１９９２）ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３１（１９９４）に開示されている。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０（１９９０））は、ＮＢＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などでアクセス可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ，  ｂｌａｓｍ，  ｂｌａｓｔｘ，  ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動されて用いることができる。ＢＬＡＳＴはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性の比較方法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。
【００４１】
上記組み換えタンパク質を構成するＦｌａＢタンパク質はビブリオバルニフィカス由来の免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）である。
【００４２】
本発明の一具現例によると、上記ＦｌａＢタンパク質は配列番号の配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【００４３】
下記実施例で立証されたように、上記組み換えタンパク質は、配列表の配列番号７のアミノ酸配列によってなり、配列表の配列番号６のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００４４】
本発明の組成物には、他の薬物または他の免疫補助剤が含まれて追加的な免疫刺激効果を提供することができる。例えば、アルミニウム塩（Ａｌ（ＯＨ）３，  ＡｌＰＯ４）、スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、ソルビタン（ｓｏｒｂｉｔａｎｅ）、ポリソルベート８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）、ＣｐＧ、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）、界面活性物質、細菌由来物質、サイトカイン、ホルモン、多価陰イオン（ｐｏｌｙａｎｉｏｎ）、ポリアクリル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌ）、担体（ｃａｒｒｉｅｒ）、生ベクター（ｌｉｖｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）、ミネラルオイル（ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ）、ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来コレラ毒素（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ）とＧＬＡ（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）を含むが、これに限定されない。
【００４５】
下記実施例で立証されたように、本発明の（ａ）タウ（τ）タンパク質のＲＤ；および（ｂ）ビブリオバルニフィカス由来ＦｌａＢタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む神経変性疾患のワクチン組成物は、経口または非経口投与用のワクチン組成物である。
【００４６】
本発明の一具現例によると、上記組成物は、粘膜、皮下、皮内、経皮または筋肉内接種用である。
【００４７】
本発明の他の具現例によると、上記組成物は粘膜接種用である。
【００４８】
上記粘膜投与は、経口投与（ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、鼻腔投与（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、舌下投与（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、直腸投与（ｒｅｃｔａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）および膣内投与（ｖａｇｉｎａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を含み、これに限定されない。
【００４９】
上記タウタンパク質の過剰リン酸化は凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成するようにし、上記凝集された過剰リン酸化されたタウタンパク質は、アルツハイマー病患者の剖検脳試料から神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅ）で観察される。上記凝集されたタウタンパク質は、神経細胞の軸索部分に主に分布して軸索の微小管の安定性に阻害などを起こして、細胞の正常な活動を妨害し、神経細胞の枯死を引き起こす。ひどい場合に周辺の他の細胞の枯死および小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）の活性による慢性炎症を誘発するなど、脳組織の広範囲な破壊を誘発することになり、これにより、神経変性疾患の症状が発現することになる。
【００５０】
本発明の一具現例によると、上記ワクチン組成物は、タウタンパク質凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）に特異的な抗体の生成を誘導する。
【００５１】
本発明の他の具現例によると、上記抗体は、タウタンパク質の凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を抑制する。
【００５２】
本発明のワクチン組成物を対象に投与して生成される抗体は、タウタンパク質の凝集を抑制する。
【００５３】
本発明の他の具現例によると、上記抗体は、オプソニンの食作用（ｏｐｓｏｎｉｃ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を促進する。
【００５４】
本明細書において、用語「オプソニンの食作用」は、白血球の食作用を助けるオプソニン（ｏｐｓｏｎｉｎ）による貪食（または食菌）作用を意味する。
【００５５】
本発明のワクチン組成物は、神経変性疾患に対する改善、予防または治療用ワクチンの組成物である。
【００５６】
本発明の一具現例によると、上記神経変性疾患は、アルツハイマー病、タウ性病症、認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶力低下、重症筋無力症およびプリオンによる疾患などで構成された群から選択される疾患である。
【００５７】
本発明の他の具現例によると、上記タウ性病症は嗜銀顆粒性認知症（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、ボクサー認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｐｕｇｉｌｉｓｔｉｃａ）、神経原線維のもつれ（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ）、１７番染色体関連前頭側頭型認知症（Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １７）、ハレルフォルデン‐スパッツ症候群（Ｈａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ  ｄｉｓｅａｓｅ）、筋緊張性ジストロフィー（Ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ニーマン−ピック病Ｃ型（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｙｐｅ  Ｃ）、ピック病（Ｐｉｃｋ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、脳炎後パーキンソニズム（Ｐｏｓｔｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）、進行性皮質下グリオーシス（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌ  ｇｌｉｏｓｉｓ）、進行性核上麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ）、亜急性硬化性全脳炎（Ｓｕｂａｃｕｔｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｐａｎｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）とクロイツフェルト−ヤコブ病などのプリオンによって誘発される疾患を含む。
【００５８】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、オキシ安息香酸メチル、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、上記成分ら以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，  １９９５）に詳細に記載されている。
【００５９】
本発明の薬剤学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食品、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因らによって多様に処方されることができる。一方、本発明の薬剤学的組成物の経口投与量は、好ましくは、１日あたりの０．００１−１００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。
【００６０】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量形態で製造されるか、または多用量容器内に内入れて製造されることができる。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であることもでき、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００６１】
本発明の別の様態によると、本発明は、タウ（τ）タンパク質のＲＤをコードするコドン−最適化された配列表の配列番号５のヌクレオチドを提供する。
【００６２】
本発明のヌクレオチドは、上記組み換えタンパク質を構成するヌクレオチドで、このふたつの間に共通の内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００６３】
本発明の別の様態によると、本発明は、（ａ）感染性ウイルスのカプシドタンパク質；および（ｂ）敗血症ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）鞭毛構成因子であるＦｌａＢタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む感染性ウイルスワクチン組成物を提供する。
【００６４】
本発明の一具現例によると、上記感染性ウイルスは、ノロウイルス（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｎｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）または呼吸器多核体ウイルス（ｒｅｓｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）である。
【００６５】
本発明の他の具現例によると、上記感染性ウイルスのカプシドタンパク質は、ノロウイルスのＰドメインである。
【００６６】
上記ノロウイルスは、腸炎誘発ウイルスで、食中毒発生原因の約５０％がノロウイルスによるものであり、ウイルス性胃腸炎の９６％がノロウイルスによるものだと報告されたことがある（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｏｕｔｂｒｅａｋｓ）。ノロウイルスのカプシド遺伝子の塩基配列は、ウイルス抗原と密接な関係を有している。ノロウイルスのカプシドタンパク質は大きくＳ、Ｐ１、Ｐ２の３タンパク質ドメインで構成されており、Ｓドメインは保存的部位（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）であり、Ｐ１とＰ２のタンパク質配列の変化によって、抗原の多様性（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）が発生することが知られている（Ｈａｒｄｙ，  Ｍ．  Ｅ．，  ２００５）。
【００６７】
上記ＰドメインはノロウイルスＶＬＰ（ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）のＰ１およびＰ２を含む２２２番目から５３９番目までのアミノ酸を含み、これは、配列表の配列番号１３のアミノ酸配列からなり、上記アミノ酸は配列表の配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００６８】
下記実施例で立証されたように、上記組み換えタンパク質は、配列表の配列番号１５のアミノ酸配列によってなり、配列表の配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００６９】
上記ワクチン組成物は、ノロウイルスの構造を特異的に認識する抗体の生成を誘導する。
【００７０】
上記ワクチン組成物は、経口または非経口投与用のワクチン組成物である。
【００７１】
本発明の一具現例によると、上記組成物は、粘膜、皮下、皮内、経皮または筋肉内接種用である。
【００７２】
本発明の他の具現例によると、上記組成物は粘膜接種用である。
【００７３】
上記粘膜投与は、経口投与（ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、鼻腔投与（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、舌下投与（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、直腸投与（ｒｅｃｔａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）および膣内投与（ｖａｇｉｎａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を含み、これに限定されない。
【００７４】
下記実施例で立証されたように、上記ワクチン組成物は、血清中の抗原特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの生成を増加させる。また、糞便内の抗原特異的ＩｇＧの生成を増加させることを確認した。
【００７５】
本発明の感染性ウイルスワクチン組成物は、上記の神経変性疾患のワクチン組成物を構成するＦｌａＢタンパク質、薬剤学的組成物としての用途などが似ているので、このふたつの間に共通の内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００７６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に応じて、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明である。
【実施例】
【００７７】
実施例１：アルツハイマー病の免疫ワクチンの製造
実験材料
各菌株の培養および保管
本発明で使用した大腸菌菌株らは、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｃｏ．）で培養した。使用した菌株らは、培養後、グリセロールが３０％になるように添加した後−８０℃超低温冷凍庫で保管した。本発明に用いられた菌株とプラスミドは、表１にまとめた。
【００７８】
【表１】
2019519614.tif 000003
【００７９】
実験方法および実験結果
１．  タンパク質の発現と精製
ａ．  敗血症ビブリオ菌由来ＦｌａＢ組み換えタンパク質の発現および精製
敗血症ビブリオ菌ＣＭＣＰ６の鞭毛構成因子ＦｌａＢの遺伝子配列（配列表の配列番号１）を用いて、ｆｌａＢ組み換えタンパク質を製造した。フラジェリン遺伝子ｆｌａＢのＮ−末端またはＣ−末端融合用のＤＮＡ断片を得るために配列表の配列番号８および配列番号９に記載されたＦｌａＢ−ＮおよびＦｌａＢ−Ｃプライマー対を使用してＮ−末端融合用の、またはＣ−末端融合用のＦｌａＢ遺伝子が含まれている１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。即ち、それぞれのプライマー対を用いたＰＣＲ反応は、９５℃で５分間の初期変性させた後、９５℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、および２℃で１分間伸長するサイクルを３０回繰り返した後、最後に２℃で１０分間反応させる条件で実施した。
【００８０】
大腸菌株発現のための発現システムは、ＮＥＢ社のＩｎｔｅｉｎ−ＣＮシステムを用い、当該システムのｐＴＹＢ１２プラスミドをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで制限酵素処理した後、増幅されたｆｌａＢ  ＰＣＲ産物をライゲーション処理した（ｐＣＭＭ１１１０１）。ライゲーションしたプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、ｐＴＹＢ１２プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有ＬＢ寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号８および配列番号９のＰＣＲプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した（ＣＭＭ１１１０１）。
【００８１】
ＣＭＭ１１１０１大腸菌株を５ブロモ−インドール３−クロロイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．５ｍＭを加えて発現を誘導した。メーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）の指針に従って、キチン質ビーズコラムと１，４−ジチオトレイトール（１，４−ＤＴＴ）を用いて、インテイン融合タンパク質から配列表の配列番号２のＦｌａＢタンパク質を得た。分離されたタンパク質内に含有されている内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）はＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋＴＭＤｅｔｏｘｉ  ＧｇｌＴＭ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖｉｎｇ  ｇｅｌ（Ｐｉｅｒｅｃｅ社）を用いて除去した。
【００８２】
ｂ．  組み換えタウ反復ドメイン（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）の発現および精製
抗原としてヒトτ（タウ）タンパク質の過剰リン酸化に対する高い関連性を有している反復ドメイン（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ；  ＲＤ）全体を大腸菌を用いて組み換えタンパク質を製造した。組み換えタンパク質の生産のために、その遺伝子（配列表の配列番号）を大腸菌に対してコドン最適化および遺伝子合成を行った（配列表の配列番号５）。クローニングの容易性のために、遺伝子合成時Ｎ−末端およびＣ−末端にそれぞれＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識遺伝子配列を追加した。融合用のＤＮＡ断片を得るために記載されたｔａｕＲＤ−Ｎ（配列表の配列番号１０）およびｔａｕＲＤ−Ｃ（配列表の配列番号１１）プライマー対を使用してＮ−末端融合用またはＣ−末端融合用のｔａｕＲＤ遺伝子が含まれてある１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。つまり、それぞれのプライマー対を用いたＰＣＲ反応は、９５℃で５分間の初期変性させた後、９５℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１分間伸長するサイクルを３０回繰り返した後、最後に７２℃で１０分間反応させる条件で実施した。大腸菌株の発現のための発現システムは、ＮＥＢ社のＩＭＰＡＣＴ−ＣＮシステムを用い、当該システムのｐＴＹＢ１２プラスミドをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで制限酵素処理した後、増幅されたｔａｕＲＤ  ＰＣＲ産物をライゲーション処理した（ｐＣＭＭ１１１０２）。ライゲーション処理したプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、ｐＴＹＢ１２プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有ＬＢ寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号１０及び配列番号１１のＰＣＲプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した（ＣＭＭ１１１０２）。
【００８３】
ＣＭＭ１１１０２大腸菌株を５−ブロモインドール３−クロロイソプロピルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．５ｍＭを加えて発現を誘導した。メーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）の指針に従って、キチン質ビーズコラムと１，４−ジチオトレイトール（１，４−ＤＴＴ）を用いて、インテイン融合タンパク質から配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するＴａｕＲＤタンパク質を得た。分離されたタンパク質内に含有されている内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）はＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋＴＭＤｅｔｏｘｉ  ＧｅｌＴＭ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖｉｎｇ  ｇｅｌ（Ｐｉｅｒｅｃｅ社）を用いて除去した。
【００８４】
精製した組み換え融合タンパク質の発現を確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた組み換え融合タンパク質の分子量を確認した結果、１３ＫＤａサイズの組み換え融合タンパク質が製造されることを確認した（図２）。
【００８５】
精製した組み換え融合タンパク質が、適切なタウタンパク質の断片であるかを確認するために抗−タウ抗体を用いてウエスタンブロットを実施した結果、抗−タウ抗体に特異的なバンドを確認した（図２）。
【００８６】
ｃ．  組み換えＦｌａＢ−ＴａｕＲＤ融合タンパク質製造用の遺伝子クローニング
ｐＣＭＭ１１１０１のｆｌａＢ遺伝子をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ制限酵素を用いて処理し、ｐＣＭＭ１１１０２も同じ制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動を通じて、それぞれのｆｌａＢ遺伝子切片とｐＣＭＭ１１１０２プラスミドを精製した。この二つの遺伝子をライゲーションしてｐＴＹＢ１２：：ｆｌａＢ−ｔａｕＲＤ遺伝子融合プラスミドを製造した（ｐＣＭＭ１１１０３）。ライゲーションしたプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、ｐＴＹＢ１２プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有ＬＢ寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号８及び配列番号１１のＰＣＲプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した（ｐＣＭＭ１１１０４）。
【００８７】
ｐＣＭＭ１１１０３大腸菌株を５ブロモインドール３−クロロイソプロピルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．５ｍＭを加えて発現を誘導した。メーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）の指針に従って、キチン質ビーズコラムと１，４−ジチオトレイトール（１，４−ＤＴＴ）を用いて、インテイン融合タンパク質から配列表の配列番号６のＦｌａＢ−ＴａｕＲＤ融合タンパク質を得た。分離されたタンパク質内に含有されている内毒素はＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋＴＭＤｅｔｏｘｉ  ＧｅｌＴＭ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖｉｎｇ  ｇｅｌ（Ｐｉｅｒｅｃｅ社）を用いて除去した。
【００８８】
精製したＦｌａＢ−ＴａｕＲＤの的確性を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＦｌａＢ特異的マウス抗血清を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、精製したＦｌａＢ−ＴａｕＲＤ融合タンパク質は、５７ＫＤａサイズの諸サイズのバンドを見せ、ウェスタンブロット上でもＦｌａＢ特異的抗血清と結合することを確認した（図３）。
【００８９】
図４は、ＦｌａＢと一部のＴａｕタンパク質を発現させたＴａｕ−Ａｇを免疫して得た抗血清がＴａｕ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｎｆｏｒｍｅｒのＰＨＦと反応する「構造認識抗体」の生成を誘導することを示す実験結果を示す。免疫に使用したＴａｕ−ＡｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法で分離した後、ナイロン膜にトランスファーしポンソーＳ染色した結果、単量体タンパク質を確認した。同じ方法で準備した膜をＦｌａＢとＴａｕ−Ａｇを免疫して得た抗血清で免疫ブロットした場合には、単量体バンドは殆ど認識できず、ポンソーＳ  染色では全く観察されなかった極少量の多量体構造体を強力に認識した。これを反証するために、多量体構造を維持させた状態で、ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥした後、免疫ブロットした結果、標準血清は全く感知できない多量体構造体を免疫血清は強く反応することを確認した。これは、本発明で誘導された抗血清は、アルツハイマー病を誘発するタウ凝集体に対して、はるかに高い結合力を示すものである。
【００９０】
ｄ．  組み換えＦｌａＢ−ＴａｕＲＤタンパク質の特性確認
（１）組み換えＦｌａＢ−ＴａｕＲＤタンパク質のＴＬＲ５刺激能の確認
精製した組み換えタウ−ＲＤペプチド自体がフラジェリンの作用点であるＴＬＲ５に対して刺激能を保持しているかどうかを確認するために、ウェル平板培養基に２９３−Ｔ細胞を１×１０５細胞ずつ分注して一夜培養した後、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＮＦ−κ−Ｌｕｃプラスミド（漢陽大学校医学部微生物学教室のＫｉｍ  Ｊｅｏｎｇｍｏｋ教授から取得）、ＴＬＲ−５遺伝子がクローニングされたｐ３ｘＦｌａｇ−ｈＴＬＲ−５プラスミド（米国Ｗａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＳｔｅｖｅｎ  Ｂ．  Ｍｉｚｅｌから取得）およびβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）発現対照群ラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を同時に細胞内に導入させた。２４時間追加培養した後、新しい培地に交換し、ＩＭＰＡＣＴシステムで分離したＦｌａＢおよびタウ−ＲＤペプチドを一定時間処理した後、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性を発光分析器（Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いて測定してＮＦ−κＢの転写精度を確認し、その結果を図５に示した。図５の結果から抗原として用いた遺伝子組み換えタウ−ＲＤペプチドはＴＬＲ５刺激能を見せなかったが、ＦｌａＢ−ＴａｕＲＤ融合タンパク質は、ＦｌａＢ対比の有意なＴＬＲ５刺激能を示した。
【００９１】
（２）組み換えＦｌａＢ−ＴａｕＲＤ混合ワクチン投与によるタウ抗原特異的抗体形成能の比較
本発明によるフラジェリンタウ−ＲＤペプチド混合ワクチンを６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（オリエントバイオ、韓国）の鼻腔内へ１週間間隔で３回、５回および６回免疫した後、血清を得てタウ−ＲＤペプチド特異的な抗体の形成を比較した（図６）。比較のために、組み換えフラジェリンタウ−ＲＤタンパク質を９６ウェル平板ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした後、免疫で得られた抗血清を２倍連続−希釈して処理して間接ＥＬＩＳＡ法を通じて確認した。
【００９２】
その結果、フラジェリンタウ−ＲＤペプチド混合ワクチンは、タウ−ＲＤペプチド単独免疫群に比べて高い血清内のＩｇＧ形成を示した。それぞれ異なる容量の抗原処理時、３回免疫時には、統計的に有意ではない容量−反応関係を示したが、５回免疫後の場合には、抗原６μｇ処理群と１０μｇ処理群の間で統計的に有意な抗原特異的抗体形成能を確認することができた。１０μｇ処理群と４μｇ処理群の間で抗原特異的抗体形成能の差は確認することができなかった（図７ａ）。
【００９３】
３回、５回および６回の免疫後の抗原特異的抗体形成能を比較した結果では、３回投与群と５回投与群の間で統計的に有意な抗原特異的な抗体形成能の違いを確認することができたが、５回投与群と６回投与群の間では、統計的に有意な差を確認することができなかった（図７ｂ）。
【００９４】
（４）組み換えＦｌａＢ−ＴａｕＲＤタンパク質の凝集体形成
本発明で誘導された抗血清が脳の特異的抗原が自ら凝集体を形成して精製５日後に、図８のようにＰＨＦの形態の凝集体を形成することを、電子顕微鏡を介して確認した。
【００９５】
（５）組み換えＦｌａＢ−ＴａｕＲＤタンパク質の凝集体誘導
タンパク質のβシート（ｓｈｅｅｔ）の構造に特異的に結合するチオフラビンＳ（ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  Ｓ；  Ｇｒｅｅｎ）でタウタンパク質凝集体（精製したタウ−ＲＤペプチドにヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）を処理して凝集を誘導）を染色し、本発明品の免疫で得られた抗血清を抗−マウスＩｇＧラビットＩｇＧをＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６３３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ）で染色した後、共焦点レーザー顕微鏡を用いてタウタンパク質と抗血清の結合可否および程度を比較した。
【００９６】
実験の結果、本発明で誘導された抗血清は、凝集誘導２日目に比べて５日目（より多く凝集された）タウタンパク質に結合する様相を見せた（図９）。
【００９７】
（６）組み換えＦｌａＢ−ＴａｕＲＤタンパク質の凝集阻害効果
本発明で誘導された抗タウ血清のタウ凝集阻害効果を確認するために、本発明で誘導された抗血清を、組み換えタウ−ＲＤペプチドに前処理して除去した後、ヘパリンを用いてタウペプチドの凝集を誘導し凝集体の形成程度を透過電子顕微鏡を介して確認した。
【００９８】
生理食塩水を免疫して獲得した対照血清を前処理した場合には、タウタンパク質の凝集が観察されるが、本発明で誘導された抗血清を前処理した場合には、タウタンパク質の凝集が低下する現象を観察した（図１０）。
【００９９】
（７）組み換えＦｌａＢ−ＴａｕＲＤタンパク質の貪食活性
本発明で誘導された抗血清が脳の特異的抗原提示細胞である小膠細胞細胞株（ＢＶ２細胞株、全南大学校医学部のＭｏｏｎ  Ｃｈａｎｇｊｏｎｇ教授研究室の分譲）のタウ凝集体のオプソニンの食作用（ｏｐｓｏｎｉｃ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）の促進可否を確認する実験を行った。組み換えタウ−ＲＤペプチドをヘパリンを用いて、３日間凝集を誘導した後、ＦＮＲ  ４８８（Ｇｒｅｅｎ、ＢｉｏＡｃｔｓ、韓国）を用いて染色した。１０秒間超音波破砕を通じてタウ凝集体を分けた後、培養したＢＶ２細胞株に、本発明による抗タウ血清と一緒に処理した。対照群としてはＰＢＳ免疫を通じて取得した対照血清を用いた。培養３０分後、培地を除去し、ＢＶ２細胞の核はＤＡＰＩ（Ｂｌｕｅ）で染色し、ＢＶ２細胞の細胞膜は、麦芽凝集素（Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；  ＷＧＡは、Ｒｅｄ）を用いて染色した後、共焦点顕微鏡を用いて破砕タウ凝集体の貪食可否および程度を比較した。
【０１００】
その結果、本発明で誘導された抗血清で処理した破砕タウ凝集体は、ＢＶ２細胞によって貪食されたが、対照血清処理群では、このような現象が発見されなかった。これは、本発明で誘導された抗血清が脳の特異的な抗原提示細胞に高いオプソニンの貪食能を提供することを意味する（図１１）。
【０１０１】
実施例２：ノロウイルス免疫ワクチンの製造
ａ．  ノロウイルスＰドメイン抗原配列及びコドン最適化
ノロウイルスワクチン製造のための抗原用のＤＮＡは、全南大学校のＣｈｏ  Ｋｙｅｏｎｇｏ教授から取得したノロウイルスＰドメインがクローニングされたｐＧＥＸ−４Ｔ−１：：ＶＡｘｘｘを用いた。挿入遺伝子配列は、配列表の配列番号１２と同一である。
【０１０２】
ｂ．  組み換えＰｄ抗原製造用の遺伝子クローニング
抗原用のＰｄ遺伝子のＮ−末端またはＣ−末端融合用のＤＮＡ断片を得るために、配列表の配列番号１６及び配列番号１７に記載されたＰｄ−ＮおよびＰｄ−Ｃプライマー対を使用して配列表の配列番号１２のＰｄを含むプラスミドを鋳型としてＰｄ遺伝子が含まれている１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。即ち、それぞれのプライマー対を用いたＰＣＲ反応は、９５℃で５分間初期変性させた後、９５℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１分間伸長するサイクルを３０回繰り返した後、最後に７２℃で１０分間反応させる条件で実施した。
【０１０３】
大腸菌株発現のための発現システムは、ＮＥＢ社のＩＭＰＡＣＴ−ＣＮシステムを利用し、当該システムのｐＴＹＢ１２プラスミドをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで制限酵素処理した後、増幅されたＰｄ  ＰＣＲ産物をライゲーション処理した（ｐＣＭＭ１１１０５）。ライゲーションしたプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、ｐＴＹＢ１２プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有ＬＢ寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号１６及び配列番号１７のＰＣＲプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した（ｐＣＭＭ１１１０５）。
【０１０４】
ｐＣＭＭ１１１０５大腸菌株を５−ブロモインドール−３−クロロイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．５ｍＭを加えて発現を誘導した。メーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）の指針に従って、キチン質ビーズコラムと１，４−ジチオトレイトール（１，４−ＤＴＴ）を用いて、インテイン融合タンパク質から配列表の配列番号１５のＦｌａＢ−Ｐｄ融合タンパク質を得た。分離されたタンパク質内に含有されている内毒素はＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋＴＭＤｅｔｏｘｉ  ＧｅｌＴＭ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖｉｎｇ  ｇｅｌ（Ｐｉｅｒｅｃｅ社）を用いて除去した。
【０１０５】
精製した組み換えＰｄタンパク質の的確性を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した（図１２）。その結果、精製した組み換えＰｄタンパク質は４４ＫＤａサイズの諸サイズのバンドを示した。
【０１０６】
ｃ．  組み換えＦｌａＢ−Ｐｄ融合タンパク質製造用の遺伝子クローニング
ｐＣＭＭ１１１０１のｆｌａＢ遺伝子をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ制限酵素を用いて処理し、ｐＣＭＭ１１１０５も同じ制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動を通じて、それぞれのｆｌａＢ遺伝子切片とｐＣＭＭ１１１０４プラスミドを精製した。この二つの遺伝子をライゲーションしてｐＴＹＢ１２：：ｆｌａＢ−Ｐｄ遺伝子融合プラスミドを製造した（ｐＣＭＭ１１１０６）。ライゲーションしたプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、ｐＴＹＢ１２プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有ＬＢ寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号８及び配列番号１７のＰＣＲプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した（ｐＣＭＭ１１０６）。
【０１０７】
ｐＣＭＭ１１１０５大腸菌株を５−ブロモインドール−３−クロロイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．５ｍＭを加えて発現を誘導した。メーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）の指針に従って、キチン質ビーズコラムと１，４−ジチオトレイトール（１，４−ＤＴＴ）を用いて、インテイン融合タンパク質から配列表の配列番号１５のＦｌａＢ−Ｐｄ融合タンパク質を得た。分離されたタンパク質内に含有されている内毒素はＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋＴＭＤｅｔｏｘｉ  ＧｅｌＴＭ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖｉｎｇ  ｇｅｌ（Ｐｉｅｒｅｃｅ社）を用いて除去した。
【０１０８】
精製したＦｌａＢ−Ｐｄの的確性を確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＦｌａＢまたはＰｄ特異的マウス抗血清を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、精製したＦｌａＢ−Ｐｄ融合タンパク質は、４４ＫＤａサイズの諸サイズのバンドを見せ、ウェスタンブロット上でもＦｌａＢおよびＰｄ特異的抗血清と結合することを確認した（図１３）。
【０１０９】
ｄ．  組み換えＦｌａＢ−Ｐｄタンパク質の特性確認
（１）組み換えｆｌａＢ−Ｐｄタンパク質のＴＬＲ５刺激能
ＦｌａＢ−Ｐｄ融合タンパク質の生体効果を類推するために、２４ウェル平板培養基に２９３−Ｔ細胞を１Ｘ１０５細胞ずつ分注して一夜培養した後、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＮＦ−κＢ−Ｌｕｃプラスミド（漢陽大学校医学部微生物学教室のＫｉｍ  Ｊｅｏｎｇｍｏｋ教授から取得）とＴＬＲ−５遺伝子がクローニングされたｐ３ｘＦｌａｇ−ｈＴＬＲ−５プラスミド（米国Ｗａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＳｔｅｖｅｎ  Ｂ．  Ｍｉｚｅｌから取得）β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）発現対照群プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を同時に細胞内に導入させた。２４時間追加培養した後、新しい培地に交換し、上記で製造しＩＭＰＡＣＴシステムで分離したＦｌａＢ−Ｐｄ融合タンパク質を一定時間処理した後、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性を発光分析器（Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いて測定してＮＦ−κＢ転写精度を確認し、その結果を図１４に示した。
【０１１０】
（２）組み換えＦｌａＢ−Ｐｄタンパク質の構造認識
製造したＰｄおよびＦｌａＢ−Ｐｄタンパク質のワクチン効能を検証するためにオリエント社から購入した６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いた。
【０１１１】
図１５のスケジュールでＰＢＳ（陰性対照群）、Ｐｄ（１μｇ）、ＦｌａＢ（１．２μｇ）＋Ｐｄ（１．２μｇ）混合投与、ＦｌａＢ−Ｐｄ（２．２μｇ）融合タンパク質をそれぞれマウスの鼻腔を介して３回投与した。そして、最後投与の７日後、マウスの全血を獲得した後、血清を分離した。
【０１１２】
図１６は、ノロウイルスＰｄ抗原の場合に、ＦｌａＢと混合投与するだけでは、構造認識抗体が生成されなかったが、組み換えＦｌａＢ−Ｐｄタンパク質を抗原として免疫した場合にのみ、単量体は認識できず、抗原構造が維持された細胞溶解物を用いたドットブロット（ｄｏｔ  ｂｌｏｔ）で抗原と反応する構造認識抗体を生成させた。これは抗原によって、タンパク質工学を通じて特殊な抗原構造を備える必要があることを意味する。
【０１１３】
（３）電子顕微鏡観察
組み換えノロウイルスＰドメインタンパク質とＦｌａＢ−Ｐドメイン融合タンパク質をそれぞれ精製した後、試料らを酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）で染色した後、炭素グリッド（ｃａｒｂｏｎ  ｇｒｉｄ）に２μｌ落とし乾燥した後、ＪＥＯＬ  ＪＥＭ−２１００Ｆ透過電子顕微鏡を用いて３０ｋＶの加速電圧で観察した。その結果、ノロウイルスＰドメインの組み換えタンパクでＶＬＰ（ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）構造の形成が観察された。ＦｌａＢ−Ｐドメイン融合タンパク質の場合、ＶＬＰの形態が観察されるが、これらをサブウニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）にして、互いに凝集された構造を観察することができた（図１７）。
【０１１４】
（４）ＩｇＧおよびＩｇＡの力価を観察
図１５の免疫スケジュールを用いて、６週齢の雌ＢａｌＢ／ｃマウスに、組み換えＰドメイン抗原単独、ＦｌａＢとＰドメインの混合、ＦｌａＢ−Ｐドメイン融合タンパク質ワクチンをマウス鼻腔を介して投与した。３回の免疫後、マウスの全血（図１８：血清ＩｇＧ、図１９の血清ＩｇＡ）および糞便（図２０糞便内の分泌性ＩｇＡの力価測定）を回収した後、血清を分離した後、組み換えＰドメインタンパク質を抗原とする抗原特異的抗体力価をＥＬＩＳＡを用いて確認した（２次ＩｇＧ抗体；  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、Ｈｕｍａｎ  ａｄｓ−ＨＲＰ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．１０３０−０５、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ  ３５２６０、ＵＳＡ：２次ＩｇＡ抗体；  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＡ−ＨＲＰ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．１０４０−０５，  ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  ＡＬ  ３５２６０，  ＵＳＡ利用）（図１８〜２０）。その結果、Ｐドメイン単独投与群に比べてＦｌａＢ−Ｐドメインの混合投与およびＦｌａＢ−Ｐドメインの融合ワクチン投与群の両方で有意な抗原特異的抗体力価の上昇を確認することができた。
【０１１５】
以上で、本発明の特定部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、これらの具体的な技術は、単に好ましい具現例だけであり、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とその等価物によって定義されるといえる。
【図１】
2019519614.tif 000004
【図２】
2019519614.tif 000005
【図３】
2019519614.tif 000006
【図４】
2019519614.tif 000007
【図５】
2019519614.tif 000008
【図６】
2019519614.tif 000009
【図７ａ】
2019519614.tif 000010
【図７ｂ】
2019519614.tif 000011
【図８】
2019519614.tif 000012
【図９】
2019519614.tif 000013
【図１０】
2019519614.tif 000014
【図１１】
2019519614.tif 000015
【図１２】
2019519614.tif 000016
【図１３】
2019519614.tif 000017
【図１４】
2019519614.tif 000018
【図１５】
2019519614.tif 000019
【図１６】
2019519614.tif 000020
【図１７】
2019519614.tif 000021
【図１８】
2019519614.tif 000022
【図１９】
2019519614.tif 000023
【図２０】
2019519614.tif 000024
【配列表】
2019519614000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月18日(2019.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）タウ（τ）タンパク質のＲＤ（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）；および（ｂ）ビブリオバルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）由来のＦｌａＢタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む配座異性体抗原認識抗体誘導用の神経変性疾患のワクチン組成物。
【請求項２】
上記ＲＤは、配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
上記ＲＤは、大腸菌発現のためにコドン最適化された（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）配列表の配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
上記ＦｌａＢタンパク質は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
上記神経変性疾患は、アルツハイマー病、タウ性病症、認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶力低下、重症筋無力症およびプリオン関連疾患からなる群から選択される疾患であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
（ａ）タウ（τ）タンパク質のＲＤ（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）；および（ｂ）ビブリオバルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）由来のＦｌａＢタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む組成物を対象に投与して生成された抗体の生成程度を測定する段階を含む、神経変性疾患の診断に必要な情報を提供する方法。
【請求項７】
上記ＲＤは、配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記ＲＤは、大腸菌発現のためにコドン最適化された（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）配列表の配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
上記ＦｌａＢタンパク質は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
上記神経変性疾患は、アルツハイマー病、タウ性病症、認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶力低下、重症筋無力症およびプリオン関連疾患からなる群から選択される疾患であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
タウ（τ）タンパク質のＲＤ（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）をコードするコドン−最適化された（ｃｏｄｏｎ−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）配列表の配列番号５のヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
配列比較のためのアライメント方法は、当業界に公知されている。アライメントに対する様々な方法およびアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２（１９８１）Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ４８：４４３（１９７０）；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３１（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−４４（１９８８）；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３（１９８９）；  Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐｌ．  ＢｉｏＳｃｉ．  ８：１５５−６５（１９９２）ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３１（１９９４）に開示されている。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０（１９９０））は、ＮＢＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などでアクセス可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ，  ｂｌａｓｍ，  ｂｌａｓｔｘ，  ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動されて用いることができる。ＢＬＡＳＴはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性の比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
ｂ．  組み換えタウ反復ドメイン（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）の発現および精製
抗原としてヒトτ（タウ）タンパク質の過剰リン酸化に対する高い関連性を有している反復ドメイン（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ；  ＲＤ）全体を大腸菌を用いて組み換えタンパク質を製造した。組み換えタンパク質の生産のために、その遺伝子（配列表の配列番号４）を大腸菌に対してコドン最適化および遺伝子合成を行った（配列表の配列番号５）。クローニングの容易性のために、遺伝子合成時Ｎ−末端およびＣ−末端にそれぞれＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識遺伝子配列を追加した。融合用のＤＮＡ断片を得るために記載されたｔａｕＲＤ−Ｎ（配列表の配列番号１０）およびｔａｕＲＤ−Ｃ（配列表の配列番号１１）プライマー対を使用してＮ−末端融合用またはＣ−末端融合用のｔａｕＲＤ遺伝子が含まれてある１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。つまり、それぞれのプライマー対を用いたＰＣＲ反応は、９５℃で５分間の初期変性させた後、９５℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１分間伸長するサイクルを３０回繰り返した後、最後に７２℃で１０分間反応させる条件で実施した。大腸菌株の発現のための発現システムは、ＮＥＢ社のＩＭＰＡＣＴ−ＣＮシステムを用い、当該システムのｐＴＹＢ１２プラスミドをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで制限酵素処理した後、増幅されたｔａｕＲＤ  ＰＣＲ産物をライゲーション処理した（ｐＣＭＭ１１１０２）。ライゲーション処理したプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、ｐＴＹＢ１２プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有ＬＢ寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号１０及び配列番号１１のＰＣＲプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した（ＣＭＭ１１１０２）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
その結果、フラジェリンタウ−ＲＤペプチド混合ワクチンは、タウ−ＲＤペプチド単独免疫群に比べて高い血清内のＩｇＧ形成を示した。それぞれ異なる容量の抗原処理時、３回免疫時には、統計的に有意ではない容量−反応関係を示したが、５回免疫後の場合には、抗原６μｇ処理群と１０μｇ処理群の間で統計的に有意な抗原特異的抗体形成能を確認することができた。１０μｇ処理群と１４μｇ処理群の間で抗原特異的抗体形成能の差は確認することができなかった（図７ａ）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
（３）組み換えＦｌａＢ−ＴａｕＲＤタンパク質の凝集体形成
本発明で誘導された抗血清が脳の特異的抗原が自ら凝集体を形成して精製５日後に、図８のようにＰＨＦの形態の凝集体を形成することを、電子顕微鏡を介して確認した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
（４）組み換えＦｌａＢ−ＴａｕＲＤタンパク質の凝集体誘導
タンパク質のβシート（ｓｈｅｅｔ）の構造に特異的に結合するチオフラビンＳ（ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  Ｓ；  Ｇｒｅｅｎ）でタウタンパク質凝集体（精製したタウ−ＲＤペプチドにヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）を処理して凝集を誘導）を染色し、本発明品の免疫で得られた抗血清を抗−マウスＩｇＧラビットＩｇＧをＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６３３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ）で染色した後、共焦点レーザー顕微鏡を用いてタウタンパク質と抗血清の結合可否および程度を比較した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
（５）組み換えＦｌａＢ−ＴａｕＲＤタンパク質の凝集阻害効果
本発明で誘導された抗タウ血清のタウ凝集阻害効果を確認するために、本発明で誘導された抗血清を、組み換えタウ−ＲＤペプチドに前処理して除去した後、ヘパリンを用いてタウペプチドの凝集を誘導し凝集体の形成程度を透過電子顕微鏡を介して確認した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
（６）組み換えＦｌａＢ−ＴａｕＲＤタンパク質の貪食活性
本発明で誘導された抗血清が脳の特異的抗原提示細胞である小膠細胞細胞株（ＢＶ２細胞株、全南大学校医学部のＭｏｏｎ  Ｃｈａｎｇｊｏｎｇ教授研究室の分譲）のタウ凝集体のオプソニンの食作用（ｏｐｓｏｎｉｃ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）の促進可否を確認する実験を行った。組み換えタウ−ＲＤペプチドをヘパリンを用いて、３日間凝集を誘導した後、ＦＮＲ  ４８８（Ｇｒｅｅｎ、ＢｉｏＡｃｔｓ、韓国）を用いて染色した。１０秒間超音波破砕を通じてタウ凝集体を分けた後、培養したＢＶ２細胞株に、本発明による抗タウ血清と一緒に処理した。対照群としてはＰＢＳ免疫を通じて取得した対照血清を用いた。培養３０分後、培地を除去し、ＢＶ２細胞の核はＤＡＰＩ（Ｂｌｕｅ）で染色し、ＢＶ２細胞の細胞膜は、麦芽凝集素（Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；  ＷＧＡは、Ｒｅｄ）を用いて染色した後、共焦点顕微鏡を用いて破砕タウ凝集体の貪食可否および程度を比較した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
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