(57)【要約】自殺遺伝子の発現を駆動する細胞周期依存性プロモーターを含む発現ベクターを含む自殺遺伝子アプローチのための方法および組成物が本明細書で提供される。増殖性細胞を、移植後のプロドラッグに感受性にするが、有糸分裂後の細胞、例えばニューロンにおける自殺遺伝子の発現を回避する方法も本明細書で提供される。本発明は、例えば、ＣＮＳ疾患のＰＳＣ由来神経始原細胞に基づく療法の間の神経上皮腫瘍を形成する残留増殖細胞の問題を克服することができなかったという従来技術の課題を克服し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自殺遺伝子コード配列に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーターを含む発現ベクター。
【請求項２】
前記細胞周期依存性プロモーターが、Ｋｉ−６７、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ２、ＤＬＧＡＰ５またはＴＯＰ２Ａプロモーターである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記細胞周期依存性プロモーターが、Ｋｉ−６７プロモーターである、請求項１〜２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記細胞周期依存性プロモーターが、合成細胞周期プロモーターである、請求項１〜３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記自殺遺伝子が、ウイルスチミジンキナーゼ、細菌シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはカスパーゼ９である、請求項１〜４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ  ＴＫ）遺伝子である、請求項１〜５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記ＨＳＶ  ＴＫ遺伝子が、ＨＳＶ  ＴＫ変異体である、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記ＨＳＶ  ＴＫ変異体が、ＨＳＶ１−ＳＲ１１ＴＫ、ＨＳＶ１−ＳＲ２６ＴＫまたはＨＳＶ１−ＳＲ３９ＴＫである、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記ＨＳＶ  ＴＫ変異体が、ＨＳＶ１−ＳＲ３９ＴＫである、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
選択可能マーカーをさらに含む、請求項１〜９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記選択可能マーカーが、抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
ウイルスベクターとしてさらに定義される、請求項１〜１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはポリオーマウイルスベクターである、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
神経前駆細胞、心筋前駆細胞、内皮前駆細胞、膵前駆細胞、腎前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、造血前駆細胞、骨髄前駆細胞、間葉前駆細胞、網膜前駆細胞または破骨前駆細胞としてさらに定義される、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
神経前駆細胞としてさらに定義される、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から誘導される、請求項１５〜１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記ＰＳＣが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記神経前駆細胞が、ｍｕｓａｓｈｉ、ネスチン、ｓｏｘ２、ビメンチン、ｐａｘ６およびｓｏｘ１からなる群から選択されるマーカーの少なくとも１つを発現するとしてさらに定義される、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１５〜２０に記載の宿主細胞と、任意選択で薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１５〜２０に記載の宿主細胞を生成する方法であって、
（ａ）ＰＳＣの出発集団を得ることと、
（ｂ）前記ＰＳＣを前駆細胞に分化させることと、
（ｃ）前記前駆細胞を単離および培養することと
を含み、ここで、培養された前記前駆細胞が前記自殺遺伝子コード配列に作動可能に連結した前記細胞周期依存性プロモーターを含むように、前記ＰＳＣまたは前記前駆細胞のいずれかが、請求項１に記載の発現ベクターでトランスフェクトまたは形質導入されて、前記発現ベクターの存在について選択される、方法。
【請求項２３】
前記前駆細胞が、神経前駆細胞、心筋前駆細胞、内皮前駆細胞、膵前駆細胞、腎前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、造血前駆細胞、骨髄前駆細胞、間葉前駆細胞、網膜前駆細胞または破骨前駆細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記前駆細胞が、神経前駆細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＳＣの出発集団が、胚性幹細胞を含む、請求項２２〜２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰＳＣの出発集団が、人工多能性幹細胞を含む、請求項２２〜２４に記載の方法。
【請求項２７】
集団の細胞を神経前駆細胞に分化させることが、前記ＰＳＣの出発集団を線維芽細胞成長因子または上皮成長因子と接触させることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＳＣの出発集団をＮ２およびＢ２７と接触させることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
単離することが、前駆細胞を単離するために前記集団の前記細胞を選別することを含む、請求項２２〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
トランスフェクトまたは形質導入された細胞を抗生物質と接触させることを含む方法によって、細胞を、前記発現ベクターの存在について選択する、請求項２２〜２９に記載の方法。
【請求項３１】
トランスフェクトまたは形質導入された細胞を選別することを含む方法によって、細胞を、前記発現ベクターの存在について選択する、請求項２２〜２９に記載の方法。
【請求項３２】
本質的に分裂しない細胞であることが知られる細胞を補充するための細胞補充療法の方法であって、有効量の、請求項１５〜２０に記載の前駆細胞を投与することと、前記自殺遺伝子によって活性化されるプロドラッグを、周期する前駆細胞を排除するのに有効な量で対象に投与することとを含む、細胞補充療法の方法。
【請求項３３】
前記前駆細胞が、神経前駆細胞、心筋前駆細胞または膵前駆細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象が、哺乳動物である、請求項３２〜３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、非ヒト霊長類またはヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞のゲノムが、前記対象のゲノムと本質的に同一のゲノムと、請求項１〜１４に記載の発現ベクターとを含む、請求項３２〜３５に記載の方法。
【請求項３７】
補充される前記本質的に分裂しない細胞が、ドーパミン作動性細胞を含み、かつ前記宿主細胞が、チロシンヒドロキシラーゼまたはドーパミン活性トランスポーターを発現するとして定義されるドーパミン作動性神経前駆細胞を含む、請求項３２〜３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象が、パーキンソン病を有する、請求項３２〜３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記プロドラッグが、ガンシクロビルおよび／またはアシクロビルである、請求項３２〜３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記プロドラッグが、１回より多く投与される、請求項３２〜３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記プロドラッグが、前記前駆細胞が分化を開始するのに十分な期間の後に投与される、請求項３２〜４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記期間が、３〜６日間である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記期間が、７〜１５日間である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記プロドラッグが、注射によって投与される、請求項３２〜４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年７月１日に出願された米国仮特許出願番号第６２／３５７，５８５号および２０１６年１２月１９日に出願された同第６２／４３６，２３３号の利益を主張しており、これら出願の全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
ファイルに含まれる“ＣＬＦＲ＿Ｐ０４０３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”と命名された配列表は、９ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定されたとき）であって、２０１７年６月２９日に作成されたものであり、本明細書とともに電子的に提出され、そして本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、幹細胞療法の分野に一般的に関する。より具体的には、本発明は、幹細胞由来移植片における増殖細胞の特異的排除に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連分野の説明
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質線条体経路の損失によって特徴付けられる神経変性障害である。パーキンソン病の原因は分かっていないが、運動機能の制御の進行性の悪化を誘発する、大脳基底核の黒質領域におけるドーパミン作動性（すなわち、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性）ニューロンの進行性変性または死と関連している。パーキンソン病の特徴的な症状は、ＴＨ陽性黒質線条体ニューロンの７０％までが変性したときに現れる。
【０００５】
現在、パーキンソン病のための満足な治療法はない。疾患関連運動障害の対症療法には、ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）の経口投与が含まれる。Ｌ−ＤＯＰＡは、血液脳関門を横切って輸送され、部分的に残留ドーパミン作動性ニューロンによって、ドーパミンに変換され、運動機能の実質的な改善を導く。しかしながら、数年後、ドーパミン作動性ニューロンの変性が進行して、Ｌ−ＤＯＰＡの効果は低減し、症状が再び現れる。
【０００６】
脳深部刺激（ＤＢＳ）療法が、パーキンソン病のための現在の好ましい処置である。ＤＢＳは、運動に関連することが公知の脳内の標的領域、例えば、視床下核、淡蒼球内節などの大脳基底核構造、または視床中間腹側核に、脳刺激体（すなわち、電極）を埋め込むことによって脳細胞の活動の速度およびパターンを変更させることを目的としたパーキンソン病の処置である。しかしながら、ＤＢＳ手法の奏功は、経時的に減少し得る。したがって、パーキンソン病のためのより良い療法が必要である。
現在開発中のパーキンソン病の処置方法は、部分的に分化した神経上皮細胞（すなわち、神経始原細胞）を、十分なドーパミン作動性シグナル伝達が不足している脳領域に移植することを含む；次いで、それらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでドーパミン作動性ニューロンに分化する。神経始原細胞がドーパミン作動性ニューロンに分化する能力が、齧歯類およびヒトＰＳＣの両方で実証されている（Kriksら、２０１１年；Wernigら、２００８年）。さらに、ＰＳＣ由来神経始原細胞が、パーキンソン病の薬物病変齧歯類および霊長類モデルにおける線条体を神経再支配する能力が示されている（Ganatら、２０１２年；Kriksら、２０１１年；Wernigら、２００８年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kriks  et  al.,  Nature,  480:547-551,  2011.
【非特許文献２】Wernig  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.,  105:5856-5861,  2008.
【非特許文献３】Ganat  et  al.,  J.  Clin.  Invest.,  122:2928-2939,  2012.
【非特許文献４】Kriks  et  al.,  Nature,  480:547-551,  2011.
【非特許文献５】Wernig  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.,  105:5856-5861,  2008.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、移植された神経始原細胞の全てが所望のニューロンサブタイプに分化するわけではなく、代わりに、過成長および腫瘍形成を導く増殖細胞として移植片内に残留する。利用可能な最も先進的なプロトコル（Ganatら、２０１２年）でさえ、ＣＮＳ疾患のＰＳＣ由来神経始原細胞に基づく療法の間の神経上皮腫瘍を形成する残留増殖細胞の問題を克服することができなかった。したがって、幹細胞に基づく療法の後の残留増殖性細胞を排除する方法に対する満たされていない必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
ある特定の実施形態では、本開示は、単離された組換えポリヌクレオチド、例えば、自殺遺伝子に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーターを含むポリヌクレオチドに関する。一実施形態では、自殺遺伝子コード配列に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーターを含む発現ベクターが提供される。
【００１０】
一部の態様では、細胞周期依存性プロモーターは、Ｋｉ−６７、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ２、ＤＬＧＡＰ５またはＴＯＰ２Ａプロモーターである。一部の態様では、細胞周期依存性プロモーターは、Ｋｉ−６７、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ２、ＤＬＧＡＰ５またはＴＯＰ２Ａプロモーターのハイブリッドである。特定の態様では、細胞周期依存性プロモーターは、Ｋｉ−６７プロモーターである。
【００１１】
ある特定の態様では、自殺遺伝子は、ウイルスチミジンキナーゼ、細菌シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはカスパーゼ９である。特定の態様では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ  ＴＫ）遺伝子である。一部の態様では、ＨＳＶ  ＴＫ遺伝子は、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む野生型ＨＳＶ  ＴＫの変異型、例えばＨＳＶ１−ＳＲ１１ＴＫ、ＨＳＶ１−ＳＲ２６ＴＫまたはＨＳＶ１−ＳＲ３９ＴＫである。
【００１２】
一部の態様では、発現ベクターは、選択可能マーカーをさらに含む。ある特定の態様では、選択可能マーカーは、抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質をコードする遺伝子である。
【００１３】
ある特定の態様では、発現ベクターは、ウイルスベクターとしてさらに定義される。一部の態様では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはポリオーマウイルスベクターである。特定の態様では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００１４】
別の実施形態では、自殺遺伝子に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の態様では、宿主細胞は、前駆細胞としてさらに定義される。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター（例えば、組込み型アデノベクター）、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはポリオーマウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用して、宿主細胞に導入される。特定の態様では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。ベクターは、組込み型ベクターであってもよい。他の態様では、ポリヌクレオチドは、非ウイルスアプローチ、例えば、裸のＤＮＡの注射、物理的方法（例えば、エレクトロポレーションもしくは遺伝子銃）によって増強された核酸送達、または化学的方法（例えば、脂質、リポソーム、ナノ粒子もしくは細胞透過ペプチド）によって増強された核酸送達を使用して宿主細胞に導入される。
【００１５】
一部の態様では、宿主細胞は、神経前駆細胞、心筋前駆細胞、内皮前駆細胞、膵前駆細胞、腎前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、造血前駆細胞、骨髄前駆細胞、間葉前駆細胞、網膜前駆細胞または破骨前駆細胞としてさらに定義される。特定の態様では、宿主細胞は、神経前駆細胞としてさらに定義される。一部の態様では、細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から誘導される。一部の態様では、ＰＳＣは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。特定の態様では、神経前駆細胞は、ｍｕｓａｓｈｉ、ネスチン、ｓｏｘ２、ビメンチン、ｐａｘ６およびｓｏｘ１からなる群から選択されるマーカーの少なくとも１つを発現する細胞としてさらに定義される。ある特定の態様では、神経前駆細胞は、ｍｕｓａｓｈｉ、ネスチン、ｓｏｘ２、ビメンチン、ｐａｘ６およびｓｏｘ１の２、３、４、５または６つのマーカー全てを発現する。
【００１６】
さらなる実施形態では、実施形態の発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。一部の態様では、宿主細胞は、神経前駆細胞、心筋前駆細胞、内皮前駆細胞、膵前駆細胞、腎前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、造血前駆細胞、骨髄前駆細胞、間葉前駆細胞、網膜前駆細胞または破骨前駆細胞としてさらに定義される。特定の態様では、宿主細胞は、神経前駆細胞としてさらに定義される。一部の態様では、細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から誘導される。一部の態様では、ＰＳＣは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。特定の態様では、神経前駆細胞は、ｍｕｓａｓｈｉ、ネスチン、ｓｏｘ２、ビメンチン、ｐａｘ６およびｓｏｘ１からなる群から選択されるマーカーの少なくとも１つを発現する細胞としてさらに定義される。ある特定の態様では、神経前駆細胞は、ｍｕｓａｓｈｉ、ネスチン、ｓｏｘ２、ビメンチン、ｐａｘ６およびｓｏｘ１の２、３、４、５または６つのマーカー全てを発現する。
【００１７】
なおさらなる実施形態では、実施形態の宿主細胞と、任意選択で薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
【００１８】
別の実施形態では、上記実施形態の宿主細胞（例えば、前駆細胞）を作製する方法であって、ＰＳＣの出発集団を得ることと、ＰＳＣを前駆細胞に分化させることと、前駆細胞を単離および培養することとを含み、ここで、培養された前駆細胞が自殺遺伝子コード配列に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーターを含むように、ＰＳＣまたは前駆細胞のいずれかが、（例えば、上記実施形態の発現ベクター中の）自殺遺伝子に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーターを含むポリヌクレオチドでトランスフェクトまたは形質導入されて、前記ポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）の存在について選択される、方法が提供される。
【００１９】
一部の態様では、前駆細胞は、神経前駆細胞、心筋前駆細胞、内皮前駆細胞、膵前駆細胞、腎前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、造血前駆細胞、骨髄前駆細胞、間葉前駆細胞、網膜前駆細胞または破骨前駆細胞である。ある特定の態様では、前駆細胞は、神経前駆細胞である。
【００２０】
ある特定の態様では、多能性幹細胞集団は、胚性幹細胞である。特定の態様では、多能性幹細胞集団は、人工多能性幹細胞集団である。
【００２１】
一部の態様では、集団の細胞を神経前駆細胞に分化させることは、多能性幹細胞集団を線維芽細胞成長因子または上皮成長因子と接触させることを含む。
【００２２】
ある特定の態様では、方法は、多能性幹細胞集団をＮ２およびＢ２７と接触させることをさらに含む。一部の態様では、単離することは、集団の細胞を選別して、前駆細胞、例えば、神経始原細胞を単離することを含む。
【００２３】
一部の態様では、トランスフェクトまたは形質導入された細胞を抗生物質と接触させることを含む方法によって、細胞を、前記発現ベクターの存在について選択する。ある特定の態様では、トランスフェクトまたは形質導入された細胞を選別することを含む方法によって、細胞を、前記発現ベクターの存在について選択する。
【００２４】
さらなる実施形態は、本質的に分裂しない細胞であることが知られる細胞を補充するための細胞補充療法の方法であって、有効量の、上記実施形態の宿主細胞（例えば、前駆細胞）を投与することと、自殺遺伝子によって活性化されるプロドラッグを、周期する前駆細胞を排除するのに有効な量で、対象に投与することとを含む、細胞補充療法の方法を提供する。一部の態様では、対象は、哺乳動物である。ある特定の態様では、哺乳動物は、マウス、ラット、非ヒト霊長類またはヒトである。一部の態様では、宿主細胞のゲノムは、対象のゲノムと本質的に同一のゲノムと、上記実施形態の発現ベクターとを含む。一部の態様では、補充される本質的に分裂しない細胞は、ドーパミン作動性細胞を含み、前駆細胞集団は、ドーパミン作動性神経前駆細胞（例えば、チロシンヒドロキシラーゼまたはドーパミン活性トランスポーターを発現するとして定義される）を含む。ある特定の態様では、対象は、パーキンソン病を有する。特定の態様では、プロドラッグは、ガンシクロビルおよび／またはアシクロビルである。一部の態様では、プロドラッグは、１回より多く投与される。一部の態様では、プロドラッグは、前駆細胞が分化を開始するのに十分な期間の後に投与される。一部の態様では、期間は、３〜６日間、例えば前駆細胞を投与した後、３、４、５または６日間である。他の態様では、期間は、７〜１５日間、例えば前駆細胞を投与した後、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５日間である。他の態様では、前駆細胞とプロドラッグとは同時投与される。一部の態様では、プロドラッグは、注射によって投与される。
【００２５】
本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方、説明のためだけに示されていることを理解されたい。
【００２６】
以下の図面は、本明細書の一部を形成するものであり、本発明のある特定の態様をさらに示すために含まれている。本発明は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つまたは複数を参照することによってさらに良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ−１Ｃ】図１Ａ−１Ｃ：細胞周期依存性プロモーターの制御下で自殺遺伝子を発現する多能性幹細胞株の詳述。（Ａ）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−ＴＫ）由来のチミジンキナーゼを、Ｋｉ６７プロモーター断片の制御下でレンチウイルスベクターに導入した。この研究で使用したＴＫは、Ｃ末端融合ゼオシン耐性遺伝子を含有する融合タンパク質であった。構築物を、臨床等級ヒト多能性幹細胞株ＨＳ４１５（ＴＫ−ＰＳＣ）に形質導入した。この酵素を発現するＴＫ−ＰＳＣ細胞を、ゼオシンに対する耐性によって選択した。（Ｂ）本研究で使用した細胞調製物：多能性幹細胞（ＴＫ−ＰＳＣ、左パネル）は、ドーパミン作動性神経始原体を含有する神経球（ＴＫ−ＮＰＣ、中央パネル）に分化し、最後にドーパミン作動性ニューロンに成熟した（ＴＫ−ニューロンのＴＨ染色、右パネル）。（Ｃ）未分化状態（上パネル）およびニューロンへの分化時（下パネル）におけるＴＫ−ＰＳＣ細胞の特性決定。Ｋｉ６７およびＨＳＶ−ＴＫを免疫染色によって検出し、ＤＡＰＩによって核を検出した。ＴＫ−ＰＳＣおよびＴＫ−ニューロンの両方が、マージ画像で重複するＫｉ６７およびＨＳＶ−ＴＫの染色を示した。
【００２８】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ−２Ｄ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのガンシクロビル処置の効果。（Ａ）図１Ｂに記載の分化プロトコルの異なる段階での増殖マーカー（Ｋｉ６７）および多能性マーカー（ｎａｎｏｇ、ｏｃｔ３／４）の発現の分析。タンパク質発現をフローサイトメトリーによって分析した（４回の独立した実験の平均＋／−ＳＥＭ）。（Ｂ）ａ〜ｄ：未分化の多能性ＴＫ−ＰＳＣ細胞を、漸増濃度のガンシクロビル（０、２．５、５および１０μＭ）に曝露した。（Ｂ）ｅ〜ｆ：ＴＫ発現および対照ＰＳＣに対する４０μＭのガンシクロビルの効果の比較。対照ＰＳＣでは、ガンシクロビルの最高濃度（４０μＭ）であっても、ガンシクロビル毒性は観察されないことに留意されたい。有糸分裂後のニューロンでＫｉ６７駆動ＴＫ発現がないこと（図１Ｃ参照）によって予測されるように、ニューロン分化の際、ＴＫ発現細胞は、ガンシクロビルに対する感受性を失う。（Ｃ）ガンシクロビルに対する用量応答：ＴＫ−ＰＳＣ、対照ＰＳＣ；ＴＫ−ニューロンおよび対照ニューロンを、漸増濃度のガンシクロビルに曝露した。細胞生存率を、カルセインを使用してモニタリングした。対照ＰＳＣは、漸増濃度のガンシクロビルにおけるＴＫ−ＰＳＣと比較して、カルセインの発現がより高かった。（Ｄ）ガンシクロビル時間経過：ＴＫおよび対照ＰＳＣ、１週目のＮＰＣ（ＴＫおよび対照）ならびに２週目のＮＰＣ（ＴＫおよび対照）を４０μＭのガンシクロビルに曝露し、カルセインを使用して細胞毒性をモニタリングした。パネルＣおよびＤのデータは、３連の測定として示され、３つの独立した実験を代表している。エラーバー＝＋／−ＳＤ、ｎ＝３。
【図２Ｃ−２Ｄ】図２Ａ−２Ｄ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのガンシクロビル処置の効果。（Ａ）図１Ｂに記載の分化プロトコルの異なる段階での増殖マーカー（Ｋｉ６７）および多能性マーカー（ｎａｎｏｇ、ｏｃｔ３／４）の発現の分析。タンパク質発現をフローサイトメトリーによって分析した（４回の独立した実験の平均＋／−ＳＥＭ）。（Ｂ）ａ〜ｄ：未分化の多能性ＴＫ−ＰＳＣ細胞を、漸増濃度のガンシクロビル（０、２．５、５および１０μＭ）に曝露した。（Ｂ）ｅ〜ｆ：ＴＫ発現および対照ＰＳＣに対する４０μＭのガンシクロビルの効果の比較。対照ＰＳＣでは、ガンシクロビルの最高濃度（４０μＭ）であっても、ガンシクロビル毒性は観察されないことに留意されたい。有糸分裂後のニューロンでＫｉ６７駆動ＴＫ発現がないこと（図１Ｃ参照）によって予測されるように、ニューロン分化の際、ＴＫ発現細胞は、ガンシクロビルに対する感受性を失う。（Ｃ）ガンシクロビルに対する用量応答：ＴＫ−ＰＳＣ、対照ＰＳＣ；ＴＫ−ニューロンおよび対照ニューロンを、漸増濃度のガンシクロビルに曝露した。細胞生存率を、カルセインを使用してモニタリングした。対照ＰＳＣは、漸増濃度のガンシクロビルにおけるＴＫ−ＰＳＣと比較して、カルセインの発現がより高かった。（Ｄ）ガンシクロビル時間経過：ＴＫおよび対照ＰＳＣ、１週目のＮＰＣ（ＴＫおよび対照）ならびに２週目のＮＰＣ（ＴＫおよび対照）を４０μＭのガンシクロビルに曝露し、カルセインを使用して細胞毒性をモニタリングした。パネルＣおよびＤのデータは、３連の測定として示され、３つの独立した実験を代表している。エラーバー＝＋／−ＳＤ、ｎ＝３。
【００２９】
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃ：細胞移植およびガンシクロビル処置のスケジュール。異なる移植およびガンシクロビル処置プロトコルを使用した。（Ａ）ＤＡニューロンへの分化プロトコルの概略図。多能性幹細胞を、中脳オリエンテーション期のため、１週間、神経球として培養した後、２または３週間の成熟期を続けた。（Ｂ）初期または後期ガンシクロビル処置を伴った、未分化多能性幹細胞の移植。初期処置：未分化多能性幹細胞を移植し、移植後４日目から１９日目までガンシクロビル（またはＰＢＳ対照）を毎日の腹腔内注射によって適用した。後期処置：未分化多能性幹細胞を移植し、移植後３０日目から４５日目まで、ガンシクロビル（またはＰＢＳ対照）を毎日の腹腔内注射によって適用した。（Ｃ）２または３週目のＮＰＣの移植：ＮＰＣ含有神経球を解離し、マウス線条体に移植した。ガンシクロビル（またはＰＢＳ対照）処置を、移植後４日目から１９日目に行った。全てのプロトコルについて、ガンシクロビル処置の終了の１ヶ月後に動物を屠殺した。
【００３０】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂ：初期ガンシクロビル処置は、ＨＳＶ−ＴＫ発現多能性細胞の移植後の腫瘍形成を防止する。（Ａ）ガンシクロビル処置なしでのＴＫ−ＰＳＣの移植：ＴＫ−ＰＳＣをＰＢＳ処置マウスに移植後、奇形腫形成が一貫して観察された：一番上のパネル：クレシルバイオレット着色；ａ〜ｄの下パネル：移植片の免疫染色（ＨＣＭ染色はヒトの典型的タンパク質の検出を可能にする）は、ネスチン（未成熟神経細胞に関して）、ベータＩＩＩチューブリン（成熟ニューロンに関して）の発現を伴って、主に神経組織への発達を示す。増殖性細胞をＫｉ６７およびＰＣＮＡで染色する。（Ｂ）初期ガンシクロビル処置を伴ったＴＫ−ＰＳＣの移植：ＴＫ−ＰＳＣを移植した後、初期ガンシクロビル処置（移植後４〜１９日目）を続けたマウスでは奇形腫形成および細胞増殖がない；ａ〜ｄの一番上のパネル：クレシルバイオレット着色；ｅ〜ｆの下パネル：ＨＣＭ、Ｋｉ６７およびＰＣＮＡでの免疫染色。ガンシクロビル処置の終了１ヶ月後に、マウスを屠殺し、免疫組織化学を行った。この図に示す染色は、１群あたり３〜５匹のマウスを代表している。Ｋｉ６７およびＨＣＭまたはＰＣＮＡについて陽性染色された細胞；染色は、マージ画像で重複している。
【００３１】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ〜５Ｂ：Ｉｂａ１およびＫｉ６７陽性細胞に対する初期ガンシクロビル処置および影響。（Ａ）ガンシクロビル処置なしでは、ＨＳＶ−ＴＫ含有、増殖（Ｋｉ６７）、ヒト（ＨＣＭ）腫瘍細胞が多量に存在していた；腫瘍は、ミクログリア（Ｉｂａ１）によって浸潤されていた。（Ｂ）ガンシクロビル処置マウスでは、ヒト細胞移植片（ＨＣＭ）は、かろうじて検出することができ、移植片領域においてＫｉ６７およびＴＫ発現は実質的に観察されなかった。いくらかのミクログリアがＩｂａ１染色によって移植片の傷の周辺で検出可能であった。ガンシクロビル処置の終了１ヶ月後に、マウスを屠殺し、免疫組織化学を行った。
【００３２】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ〜６Ｂ：後期ガンシクロビル処置は、ＨＳＶ−ＴＫ発現多能性細胞の移植後の腫瘍形成を防止しない。マウスにＴＫ−ＰＳＣを移植し、移植の１ヶ月後にＰＢＳ処置（Ａ）またはガンシクロビル処置（Ｂ）を開始した。処置を１５日間維持した後、処置なしで１ヶ月経ってから屠殺した。これらの条件下で、ＰＢＳ処置マウスとガンシクロビル処置マウスとの間に差異はなかった。移植片は、主に神経組織（ベータＩＩＩチューブリン染色）を有する腫瘍に発達した。腫瘍細胞は、Ｋｉ６７およびＴＫを発現したが、Ｏｃｔ３／４は発現しなかった。移植片は、内皮細胞についてのＣＤ３１染色によって証明されるように血管形成された。
【００３３】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃ：後期ガンシクロビル処置を施した多能性幹細胞由来腫瘍におけるＨＳＶ−ＴＫのシーケンシング。（Ａ）（図６に記載のように）多能性幹細胞の線条体内移植の４週間後に、２週間のガンシクロビル処置を開始し、処置の終了の４週間後に、マウスを屠殺した。ＤＮＡを、ＰＦＡ固定パラフィン包埋腫瘍試料から抽出し、示されたＰＣＲプライマーを使用して増幅した。（Ｂ）プラスミドＤＮＡおよび腫瘍試料由来の増幅配列の直接シーケンシングは何ら変異を検出しなかった。（アンプリコン１−プラスミド＝配列番号１１；「ｓｅｑ」＝配列番号１２；アンプリコン２−プラスミド＝配列番号１３；「ｓｅｑ」＝配列番号１４；アンプリコン３−プラスミド＝配列番号１５；「ｓｅｑ」＝配列番号１６；アンプリコン４−プラスミド＝配列番号１７；「ｓｅｑ」＝配列番号１８；アンプリコン５−プラスミド＝配列番号１９；「ｓｅｑ」＝配列番号２０）（Ｃ）（パネルＢについて記載したＰＣＲ反応から誘導された）アンプリコン３および５由来のＨＳＶ−ＴＫサブクローンのシーケンシング。アンプリコン３：細胞形質導入のために使用されるプラスミドＤＮＡならびに腫瘍由来ｃＤＮＡクローンは、ＨＳＶ−ＴＫ参照配列に見出されるスプライスドナー部位を含有していなかった。しかしながら、ｃＤＮＡクローン３および４は非同義変異のコーディングを示した。（ｒｅｆ＝配列番号２１；プラスミド＝配列番号２２；クローン１＝配列番号２３；クローン２＝配列番号２４；クローン３＝配列番号２５；クローン４＝配列番号２６；ＡＴＰ結合部位＝配列番号２７；ヌクレオチド結合部位＝配列番号２８）アンプリコン５：ｃＤＮＡクローンはいずれも何ら変異を示さなかった（プラスミド＝配列番号２９；クローン１−７＝配列番号３０）。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｃ：後期ガンシクロビル処置を施した多能性幹細胞由来腫瘍におけるＨＳＶ−ＴＫのシーケンシング。（Ａ）（図６に記載のように）多能性幹細胞の線条体内移植の４週間後に、２週間のガンシクロビル処置を開始し、処置の終了の４週間後に、マウスを屠殺した。ＤＮＡを、ＰＦＡ固定パラフィン包埋腫瘍試料から抽出し、示されたＰＣＲプライマーを使用して増幅した。（Ｂ）プラスミドＤＮＡおよび腫瘍試料由来の増幅配列の直接シーケンシングは何ら変異を検出しなかった。（アンプリコン１−プラスミド＝配列番号１１；「ｓｅｑ」＝配列番号１２；アンプリコン２−プラスミド＝配列番号１３；「ｓｅｑ」＝配列番号１４；アンプリコン３−プラスミド＝配列番号１５；「ｓｅｑ」＝配列番号１６；アンプリコン４−プラスミド＝配列番号１７；「ｓｅｑ」＝配列番号１８；アンプリコン５−プラスミド＝配列番号１９；「ｓｅｑ」＝配列番号２０）（Ｃ）（パネルＢについて記載したＰＣＲ反応から誘導された）アンプリコン３および５由来のＨＳＶ−ＴＫサブクローンのシーケンシング。アンプリコン３：細胞形質導入のために使用されるプラスミドＤＮＡならびに腫瘍由来ｃＤＮＡクローンは、ＨＳＶ−ＴＫ参照配列に見出されるスプライスドナー部位を含有していなかった。しかしながら、ｃＤＮＡクローン３および４は非同義変異のコーディングを示した。（ｒｅｆ＝配列番号２１；プラスミド＝配列番号２２；クローン１＝配列番号２３；クローン２＝配列番号２４；クローン３＝配列番号２５；クローン４＝配列番号２６；ＡＴＰ結合部位＝配列番号２７；ヌクレオチド結合部位＝配列番号２８）アンプリコン５：ｃＤＮＡクローンはいずれも何ら変異を示さなかった（プラスミド＝配列番号２９；クローン１−７＝配列番号３０）。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃ：後期ガンシクロビル処置を施した多能性幹細胞由来腫瘍におけるＨＳＶ−ＴＫのシーケンシング。（Ａ）（図６に記載のように）多能性幹細胞の線条体内移植の４週間後に、２週間のガンシクロビル処置を開始し、処置の終了の４週間後に、マウスを屠殺した。ＤＮＡを、ＰＦＡ固定パラフィン包埋腫瘍試料から抽出し、示されたＰＣＲプライマーを使用して増幅した。（Ｂ）プラスミドＤＮＡおよび腫瘍試料由来の増幅配列の直接シーケンシングは何ら変異を検出しなかった。（アンプリコン１−プラスミド＝配列番号１１；「ｓｅｑ」＝配列番号１２；アンプリコン２−プラスミド＝配列番号１３；「ｓｅｑ」＝配列番号１４；アンプリコン３−プラスミド＝配列番号１５；「ｓｅｑ」＝配列番号１６；アンプリコン４−プラスミド＝配列番号１７；「ｓｅｑ」＝配列番号１８；アンプリコン５−プラスミド＝配列番号１９；「ｓｅｑ」＝配列番号２０）（Ｃ）（パネルＢについて記載したＰＣＲ反応から誘導された）アンプリコン３および５由来のＨＳＶ−ＴＫサブクローンのシーケンシング。アンプリコン３：細胞形質導入のために使用されるプラスミドＤＮＡならびに腫瘍由来ｃＤＮＡクローンは、ＨＳＶ−ＴＫ参照配列に見出されるスプライスドナー部位を含有していなかった。しかしながら、ｃＤＮＡクローン３および４は非同義変異のコーディングを示した。（ｒｅｆ＝配列番号２１；プラスミド＝配列番号２２；クローン１＝配列番号２３；クローン２＝配列番号２４；クローン３＝配列番号２５；クローン４＝配列番号２６；ＡＴＰ結合部位＝配列番号２７；ヌクレオチド結合部位＝配列番号２８）アンプリコン５：ｃＤＮＡクローンはいずれも何ら変異を示さなかった（プラスミド＝配列番号２９；クローン１−７＝配列番号３０）。
【００３４】
【図８Ａ−８Ｄ】図８Ａ〜８Ｄ：神経前駆細胞（ＮＰＣ）の移植後の移植片発達。マウスにＮＰＣを移植し、移植後７〜２２日間、ＰＢＳまたはガンシクロビルで処置した。ガンシクロビルの処置の終了の４週間後に、マウスを屠殺し、脳を分析した。腫瘍は形成されていなかったが、移植片はマウスの脳に組込まれた組織に発達していた。ＰＢＳおよびガンシクロビル処置の間に差異は観察されなかった（Ａ）クレシルバイオレット着色。移植体は、ベータ３−チューブリンに対して強い陽性を示し（Ｂ）上パネル、ＴＨに対して毎週陽性を示した（Ｂ）下パネル。移植された細胞は、ＰＣＮＡは陽性であったが、Ｋｉ６７およびＢｒｄＵは陰性であった（Ｃおよび挿入図）。（Ｄ）ガンシクロビルなし（灰色のヒストグラム）またはあり（黒色のヒストグラム）の異なる実験条件下での移植体の大きさ。左側および中央のヒストグラムは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を注射し、細胞移植の５日後（初期処置）または３０日後（後期処置）にガンシクロビルで２週間処置した後の移植体を示す。右側のヒストグラムは、ＮＰＣを注射し、移植の５日後にガンシクロビルで処置した後の移植体を示す。エラーバー＝平均＋／−ＳＥＭ、マウスの各群においてｎ＝３〜５。＊マンホイットニー検定においてｐ＝０．０２８６。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
例示的な実施形態の説明
多能性幹細胞（ＰＳＣ）に基づく療法は、特に神経変性疾患にとって魅力的な概念である。しかしながら、未分化のＰＳＣまたは急速に増殖する前駆細胞の移植は、腫瘍形成につながる可能性がある。したがって、有望な動物データを将来の臨床使用へと転換させるために、増殖細胞を排除するための安全機構が必要である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、増殖細胞を排除するための自殺遺伝子アプローチのための方法および組成物を提供する。例示的な方法では、自殺遺伝子（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ））の発現を駆動する細胞周期依存性プロモーター（例えば、Ｋｉ６７）に基づく発現ベクターが提供される。したがって、この構築物は、移植後のガンシクロビルに対して増殖性細胞を感受性にする方法を提供するが、有糸分裂後のニューロンにおける抗原性ウイルスＨＳＶ−ＴＫタンパク質の発現を回避する。
【００３６】
本開示は、例示的なＫｉ６７−ＨＳＶ−ＴＫ構築物を含む宿主細胞が、ガンシクロビルへのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの曝露によって、増殖ＰＳＣおよび初期神経前駆細胞（ＮＰＣ）を殺傷したことを示す。さらに、ＰＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏ移植は奇形腫を誘導し、これはガンシクロビルを用いた初期（例えば、移植の４日後）の処置によって防止された。したがって、本開示の自殺遺伝子アプローチは、成熟ニューロンにおける自殺遺伝子の発現なしに、未分化細胞の増殖および／または初期前駆細胞の過成長を止めることを可能にする。このアプローチは、最終標的が有糸分裂後の細胞（例えば、心筋細胞または膵ベータ細胞）である他の幹細胞に基づく療法に有用となる可能性を有する。
【００３７】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、指定された成分に関して「本質的に含まない」は、指定された成分が意図的に組成物に全く処方されていないおよび／または混入物質としてしか存在しないもしくは微量で存在していることを意味するために本明細書で使用される。したがって、組成物の任意の意図しない混入から生じる指定された成分の合計量は、０．０５％よりはるかに少なく、好ましくは０．０１％より少ない。指定された成分の量が標準的な分析方法では検出できない組成物が最も好ましい。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味することができる。本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語と共に使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つまたは１つより多くを意味することができる。
【００３９】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、単独の選択肢を指すことが明示的に示されているかまたは選択肢が相互に排他的な場合でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、単独の選択肢、ならびに「および／または」を指す定義を支持している。本明細書で使用される場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも２番目またはそれより多くの序数を意味することができる。
【００４０】
本出願を通して、「約」という用語は、装置、値を決定するために用いられる方法に固有の誤差の変動、または研究対象間に存在する変動を含む値を示すために使用される。
【００４１】
本明細書において「細胞」という用語は、当技術分野で最も広義の意味で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、外部からそれを隔離する膜構造によって囲まれ、自己複製する能力を有し、遺伝的情報およびそれを発現する機構を有する生体を指す。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に修飾された細胞（例えば、融合細胞、遺伝的に修飾された細胞など）であり得る。
【００４２】
本明細書において「幹細胞」という用語は、適切な条件下で、多様な範囲の特殊化した細胞型に分化することが可能である一方、他の適切な条件下で自己複製および本質的に未分化の多能性状態のままであることが可能である細胞を指す。「幹細胞」という用語は、多能性細胞、多分化能細胞、前駆細胞および始原細胞も包含する。例示的なヒト幹細胞は、骨髄組織から得られる造血または間葉系幹細胞、胚組織から得られる胚性幹細胞、または胎児の生殖器の組織から得られる胚性生殖細胞から得ることができる。また例示的な多能性幹細胞は、体細胞を、多能性に関連する特定の転写因子の発現によって多能性状態にリプログラミングすることによって、体細胞から生成することができる；これらの細胞は、「人工多能性幹細胞」「ｉＰＳ細胞」または「ｉＰＳＣ」と呼ばれている。
【００４３】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期段階の胚、例えば胚盤胞段階の内細胞塊から取得され、または人工的手段（例えば、核移植）によって作製され、生殖細胞（例えば、精子および卵子）を含む胚または成体の任意の分化細胞型を生じ得る未分化多能性幹細胞である。
【００４４】
「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、因子（本明細書でリプログラミング因子と称される）の組合せを発現させるかまたはその発現を誘導することにより体細胞をリプログラミングすることによって生成される細胞である。ｉＰＳＣは、胎児、出生後、新生児、若年または成体の体細胞を使用して生成することができる。ある特定の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用できる因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（時にＯｃｔ３／４と称される）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８が挙げられる。一部の実施形態では、体細胞は、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするための少なくとも２つのリプログラミング因子、少なくとも３つのリプログラミング因子、または４つのリプログラミング因子を発現することによってリプログラミングされる。
【００４５】
「多能性幹細胞」は、生物で見出される全ての細胞、好ましくは、３つの胚葉：内胚葉（例えば、内側の胃内壁、消化管、および肺）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、および泌尿生殖器）、または外胚葉（例えば、上皮組織および神経系）のいずれかを表す細胞に分化する能力を有する幹細胞を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、卵子または精子などの生殖細胞以外の任意の細胞であって、そのＤＮＡが次の世代に直接移行しない細胞を指す。典型的に、体細胞は、多能性が限定されているかまたは全く有さない。本明細書で使用される体細胞は、天然に存在してもよく、または遺伝的に改変されていてもよい。
【００４７】
本明細書で使用される場合、細胞に関連して「操作された」という用語は、細胞ゲノムに組み込まれた、細胞に外来性の少なくとも１つの遺伝的エレメントを含む細胞を指す。一部の態様では、外来性遺伝的エレメントは、細胞ゲノムのランダムな位置に組み込むことができる。他の態様では、遺伝的エレメントは、ゲノム中の特定の部位に組み込まれる。例えば、遺伝的エレメントは、内在性核酸配列を置き換えるために、例えば内在性配列に対する変化（例えば、単一のヌクレオチド位置の変化）を提供するために、特定の位置に組み込まれてもよい。
【００４８】
本明細書で使用される「前駆細胞」は、多くの異なる成熟細胞型に分化する能力（多能性および多分化能）または２つの異なる成熟細胞型に分化する能力（二分化能）を有する幹細胞を指す。前駆細胞は、１つの細胞型にのみ分化する能力を有する幹細胞であってもよい。例えば、前駆細胞としては、神経前駆細胞（ＮＰＣ）、心筋前駆細胞、および膵前駆細胞が挙げられる。「神経前駆細胞」は、ニューロンおよびグリア（例えば、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト）などの成熟神経系細胞へと発達する能力を有する神経系の未成熟細胞として本明細書に定義される。
【００４９】
「自殺遺伝子」という用語は、そのタンパク質産物により、非毒性のプロドラッグが毒性薬物（例えば、活性な化学療法剤）に変換され、それによって遺伝子産物を発現する細胞が殺傷される遺伝子を指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、組換え体であるか、または全ゲノム核酸を含まない単離された核酸分子を指す。ヌクレオチド配列に言及するとき、「単離された」とは、示された分子が、同じ型の他の生物学的高分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。「ポリヌクレオチド」という用語には、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む組換えベクターが含まれる。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、天然に存在する遺伝子またはタンパク質をコードする配列から実質的に離れて単離された調節配列を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であってよく、ＲＮＡ、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ）、それらのアナログまたはそれらの組合せであってもよい。さらなるコード配列または非コード配列が、必要ではないが、ポリヌクレオチド内に存在してもよい。
【００５１】
「発現ベクター」という用語は、転写可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。いくつかの場合において、ＲＮＡ分子は、次いで、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。発現ベクターは、特定の宿主生物において作動可能に連結したコード配列の転写、およびおそらくは翻訳のために必要な核酸配列を指す種々の「制御配列」、例えば、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、エンハンサーなどを含むがこれらに限定されない、種々の制御配列を含有することができる。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、レシピエント細胞におけるベクターの複製のための複製起点などの他の機能にも役立つ核酸配列を含有してもよい。選択されたコード配列が、適切な宿主細胞で複製、転写、および翻訳されることが可能である限り、これらの制御エレメントの全てが常に存在する必要はない。
【００５２】
「プロモーター領域」という用語は、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指す、その通常の意味で本明細書において使用され、ここで、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子に結合し、下流のコード配列の転写を開始することができる遺伝子から誘導される。プロモーター領域は、転写速度も制御する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用調節配列を指す「エンハンサー」と組み合わせて使用してもしなくてもよい。「作動可能に連結した」は、そのように記載された成分が、それらの通常の機能を行うように構成されているエレメントの配置を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結した制御配列は、その配列の転写開始および発現を制御することが可能である。制御エレメントは、その発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在する翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、そのプロモーター配列は依然としてコード配列に「作動可能に連結した」と考えることができる。
【００５３】
「異種」という用語は、遺伝子配列および制御配列などの核酸配列に関するとき、通常は互いに結合されていないおよび／または通常は特定の細胞に関連していない配列を意味する。したがって、核酸構築物またはベクターの「異種」領域とは、天然では他の分子と関連して見出されない別の核酸分子内にあるまたはそれに結合している核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、天然ではコード配列と関連して見出されない配列に隣接するコード配列を含むことができる。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然では見出されない構築物（例えば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。同様に、細胞に通常存在しない構築物で形質転換された細胞は、本開示の目的において、異種と考えられる。本明細書で使用される場合、対立遺伝子変化形または天然に存在する変異事象は異種ＤＮＡを生じない。
【００５４】
本出願全体を通して、特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対的位置を記載する目的のために、例えば、特定のヌクレオチド配列が、別の配列に対して「上流」、「下流」、「５’」または「３’」に位置していると記載されているとき、当技術分野において一般的であるように参照されているのはＤＮＡ分子の非転写鎖における配列の位置であると理解される。
【００５５】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド部分間の同一性のパーセントを指す。２つのポリヌクレオチド配列が、分子の規定された長さにわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示すとき、２つのポリヌクレオチド配列は、互いに「実質的に相同」である。本明細書で使用される場合、実質的に相同は、特定のポリヌクレオチド配列に対して完全な同一性を示す配列も指す。
【００５６】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用される。外来性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたとき、細胞は「トランスフェクト」されている。いくつかのトランスフェクション技術は、当技術分野で一般的に公知である。例えば、Grahamら（１９７３年）Virology、５２巻：４５６頁、Sambrookら（１９８９年）Molecular  Cloning、a  laboratory  manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratories、New  York、Davisら（１９８６年）Basic  Methods  in  Molecular  Biology、ElsevierおよびChuら、Gene、１３巻：１９７頁、１９８１年を参照。そのような技術は、プラスミドベクターおよび他の核酸分子などの１つまたは複数の外来性ＤＮＡ部分を、適切な宿主細胞に導入するために使用することができる。用語は、遺伝物質の安定な取り込みおよび一過性の取り込みの両方を指す。
【００５７】
「形質導入」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、複製欠損ウイルスベクターを介した、例えば、組換えレンチウイルスベクター粒子を介したＤＮＡ分子のレシピエント細胞への送達を意味する。
【００５８】
「脊椎動物対象」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、ならびにヒトおよび非ヒト霊長類などの哺乳動物；イヌおよびネコなどの家庭内動物、マウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯類を含む実験動物など；ニワトリ、七面鳥および他のキジ鳥を含む雄鶏および雌鶏などの家畜、野生および狩猟鳥を含む鳥類；ならびに魚類を限定することなく含む亜門の脊索動物門の任意のメンバーを意味する。この用語は、特定の年齢を示すものではない。したがって、成体および新生動物の両方ならびに胎児を包含することが意図されている。
【００５９】
「対象」または「患者」は、ヒト、ウシ、イヌ、モルモット、ウサギ、ニワトリなどを含む、療法が望まれる任意の単一の対象を意味する。疾患の臨床的徴候を何ら示していない、臨床研究試験に関与する任意の対象、または疫学的研究に関与する対象、または対照として使用される対象も、対象として含まれることが意図されている。
【００６０】
本開示の文脈において、「チミジンキナーゼ変異体」という用語は、本明細書に記載の特定のタンパク質（ならびにこれらのタンパク質をコードする核酸配列）だけでなく、生物学的活性を保持する主要なタンパク質の種々の構造形態を含み得るそれらの誘導体を含むと理解されるべきである。例えば、チミジンキナーゼ変異体は、酸性もしくは塩基性の塩の形態または中性形態であり得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって修飾されていてもよい。さらに、アミノ酸または核酸配列に対して種々の置換、欠失、または付加がなされてもよく、その正味の効果は、変異体の増加した生物学的活性を保持またはさらに増強することである。コード縮重により、例えば、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にかなりの変動があってもよい。
【００６１】
ＩＩ．本開示の細胞
本開示のある特定の実施形態では、自殺遺伝子に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーター、例えばＨＳＶ−ＴＫを有する構築物を含む、神経前駆細胞などの前駆細胞を生成するための方法および組成物が開示される。一部の態様では、前駆細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、例えば、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞の出発集団から誘導される。
【００６２】
Ａ．多能性幹細胞
本開示のＰＳＣの出発集団は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。ＥＳＣおよびｉＰＳＣの両方が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで長期増殖が可能である一方、神経前駆細胞、心筋細胞、膵ベータ細胞、および肝細胞を含む身体の全ての細胞型に分化する能力を保持している。本開示のある特定の態様は、全てではないがほとんどの通常の発達段階をバイパスする、ｉＰＳＣの生成に類似した分化／機能のための転写因子の組合せの発現を介して、ヒトＥＳＣまたはｉＰＳＣから直接誘導することができる前駆細胞に関する。
【００６３】
１．胚性幹細胞
ある特定の態様では、前駆細胞は、ＥＳＣから誘導される。ＥＳＣは、胚盤胞の内部細胞塊から誘導され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高い分化能を有する。ＥＳＣは、発生中の胚の外側の栄養外胚葉層を除去し、次いで、非成長細胞のフィーダー層上で内部塊の細胞を培養することによって単離することができる。再播種した細胞は、増殖し、ＥＳＣの新しいコロニーを生産し続けることができ、これを取り出し、解離し、再び再播種し、成長させることができる。未分化ＥＳ細胞を「継代培養」するこのプロセスは、未分化ＥＳ細胞を含有する細胞株を生成するために数回繰り返すことができる（米国特許第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号、第７，０２９，９１３号）。ＥＳＣは、その多能性を維持しながら増殖する能力を有する。例えば、ＥＳＣは、細胞に関するおよび細胞分化を制御する遺伝子に関する研究に有用である。ＥＳＣの多能性は、遺伝子操作および選択と組み合わせて、トランスジェニック、キメラ、およびノックアウトマウスの作製を介して、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子解析研究のために使用することができる。
【００６４】
マウスのＥＳＣを作製するための方法は周知である。１つの方法では、マウスの１２９株由来の着床前の胚盤胞を、マウス抗血清で処理して栄養外胚葉（trophoectoderm）を除去し、内部細胞塊を、ウシ胎児血清を含有する培地中で化学的に不活化されたマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養する。発達する未分化ＥＳ細胞のコロニーを、ウシ胎児血清の存在下、マウス胚線維芽細胞フィーダー層上で継代培養し、ＥＳＣの集団を生成する。一部の方法では、マウスＥＳＣは、サイトカイン白血病抑制因子（ＬＩＦ）を血清含有培養培地に添加することにより、フィーダー層の非存在下で成長させることができる（Smith、２０００年）。他の方法では、マウスＥＳＣは、骨形態形成タンパク質およびＬＩＦの存在下で、無血清培地中で成長させることができる（Yingら、２００３年）。
【００６５】
ヒトＥＳＣは、精子と卵細胞の融合、核移植、病因、または以前に記載された方法（ThomsonおよびMarshall、１９９８年；Reubinoffら、２０００年）によってクロマチンをリプログラミングした後、リプログラミングされたクロマチンを原形質膜に組込み、胚細胞を生成することによって生じる接合体または胚盤胞期哺乳動物胚から作製または誘導することができる。１つの方法では、ヒト胚盤胞を抗ヒト血清に曝露し、栄養外胚葉細胞を溶解して、マウス胚線維芽細胞のフィーダー層上で培養される内部細胞塊から取り出す。さらに、内部細胞塊から誘導される細胞の集合体を、化学的または機械的に解離し、再播種し、未分化形態を有するコロニーを、マイクロピペットにより選択し、解離し、再播種する。一部の方法では、ヒトＥＳＣは、塩基性線維芽細胞成長因子の存在下で線維芽細胞のフィーダー層上でＥＳＣを培養することによって、血清なしで成長させることができる（Amitら、２０００年）。他の方法では、ヒトＥＳＣは、塩基性線維芽細胞成長因子を含有する「馴化」培地の存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）またはラミニンなどのタンパク質マトリックス上で細胞を培養することによってフィーダー細胞層なしで成長させることができる（Xuら、２００１年）。
【００６６】
またＥＳＣは、以前に記載された方法によってアカゲザルおよびマーモセットを含む他の生物から誘導することができ（ThomsonおよびMarshall、１９９８年；Thomsonら、１９９５年；ThomsonおよびOdorico、２０００年；米国特許第５，８４３，７８０号）、確立されたマウスおよびヒト細胞株から誘導することもできる。例えば、確立されたヒトＥＳＣ株として、ＭＡＯＩ、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４およびＡＣＴ３０が挙げられる。さらなる例として、確立されたマウスＥＳＣ株としては、マウス１２９株の胚の内部細胞塊から確立されたＣＧＲ８細胞株が挙げられ、ＣＧＲ８細胞の培養はＬＩＦの存在下でフィーダー層なしで成長させることができる。
【００６７】
ＥＳＣは、転写因子Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−１、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−３、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−４、転写因子ＮＡＮＯＧ、腫瘍拒絶抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、腫瘍拒絶抗原１−８１（ＴＲＡ−１−８１）、ＳＯＸ２またはＲＥＸ１を含むタンパク質マーカーによって検出することができる。
【００６８】
２．人工多能性幹細胞
他の態様では、前駆細胞は、一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される人工多能性幹細胞から誘導される。多能性の誘導は、最初は、多能性に関連する転写因子の導入を介した体細胞のリプログラミングによって、マウス細胞を使用して２００６年に（Yamanakaら、２００６年）、またヒト細胞を使用して２００７年に（Yuら、２００７年；Takahashiら、２００７年）達成された。ｉＰＳＣの使用は、ＥＳ細胞の大規模臨床使用に伴う倫理的および実用的な問題のほとんどを回避し、ｉＰＳＣ由来の自家移植を用いた患者は、移植片拒絶を防ぐための生涯にわたる免疫抑制処置が必要でなくなり得る。
【００６９】
特定の細胞型（生殖細胞および除核赤血球など）を除いて、任意の細胞を、ｉＰＳＣの出発点として使用することができる。例えば、細胞型は、ニューロン、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉細胞、肝臓細胞、または胃細胞であり得る。細胞分化の程度または細胞が収集される動物の年齢は限定されない；未分化始原細胞（体性幹細胞を含む）および最終的に分化した成熟細胞でさえ、本明細書に開示される方法において体細胞の供給源として使用することができる。体細胞は、成体または胎児の体細胞であり得る。ｉＰＳＣは、ヒトＥＳＣを特定の細胞型に分化させ、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を含むヒトＥＳＣマーカーを発現することが公知である条件下で成長させることができる。
【００７０】
体細胞は、当業者に公知の方法を使用して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造するようにリプログラミングすることができる。当業者は、人工多能性幹細胞を容易に作製することができる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９０２４６８７５号、第２０１０００２１００１４号；第２０１２０２７６６３６号；米国特許第８，０５８，０６５号、第８，１２９，１８７号、第８，２７８，６２０号、第８，２６８，６３０号；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７０６９６６６を参照。一般的に、核リプログラミング因子が、体細胞から多能性幹細胞を生成するために使用される。当技術分野で公知のリプログラミング因子としては、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８が挙げられる。因子の任意の組合せを、本方法において使用することができる。
【００７１】
これらの核リプログラミング物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡ配列は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，１８３，０３８号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７０６９６６６で言及されるＮＣＢＩ受託番号を参照して利用可能である。１つもしくは複数のリプログラミング物質またはこれらのリプログラミング物質をコードする核酸を導入するための方法は当技術分野で公知であり、例えば参照によって本明細書に組み込まれる、公開された米国特許第８，０７１，３６９号、第８，２６８，６２０号、第８，６９１，５７４号、第８，７４１，６４８号、第８，５４６，１４０号、第８，９００，８７１号および第９，１７５，２６８号に開示されている。
【００７２】
誘導されたら、ｉＰＳＣは、多能性を維持するのに十分な培地で培養することができる。ｉＰＳＣは、米国特許第７，４４２，５４８号および米国特許公開第２００３０２１１６０３号に記載されているような、多能性幹細胞、より詳細には、胚性幹細胞を培養するために開発された種々の培地および技術で使用することができる。マウス細胞の場合、培養は、分化抑制因子として白血病抑制因子（ＬＩＦ）を通常の培地に添加して行うことができる。ヒト細胞の場合、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が、ＬＩＦの代わりに添加されてもよい。当業者に公知であるように、ｉＰＳＣの培養および維持のための他の方法を、本開示で使用してもよい。
【００７３】
ある特定の実施形態では、未定義の条件が使用されてもよい；例えば、多能性細胞は、幹細胞を未分化状態で維持するために、線維芽細胞フィーダー細胞または線維芽細胞フィーダー細胞に曝露された培地上で培養してもよい。一部の実施形態では、細胞は、フィーダー細胞として、細胞分裂を終了させるために放射線または抗生物質で処置したマウス胚線維芽細胞の共存下で培養される。代替的に、多能性細胞は、ＴＥＳＲ（商標）培地（Ludwigら、２００６ａ；Ludwigら、２００６ｂ）またはＥ８（商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地（Chenら、２０１１年）などの定義されたフィーダー非依存性培養系を使用して、本質的に未分化の状態で培養および維持してもよい。
【００７４】
プラスミドは、いくつかの目標、例えば調節された高いコピー数を達成すること、および細菌におけるプラスミドの不安定性の潜在的な原因を回避すること、およびヒト細胞を含む哺乳動物細胞での使用に適合したプラスミド選択のための手段を提供することなどを念頭において設計されている。ヒト細胞で使用するために、プラスミドの二重の要件に特に注意が払われてきた。第１に、プラスミドは、大量のＤＮＡが作製および精製されるように、Ｅ．ｃｏｌｉでの維持および発酵に適している。第２に、プラスミドは、ヒト患者および動物における使用に安全であり、適している。第１の要件は、細菌発酵中に比較的容易に選択および安定に維持することができる高コピー数のプラスミドを要求する。第２の要件は、選択可能マーカーおよび他のコード配列などのエレメントへの注意を要求する。一部の実施形態では、マーカーをコードするプラスミドは、（１）高コピー数の複製起点、（２）選択可能マーカー、例えば、これらに限定されないが、カナマイシンを用いた抗生物質選択のためのｎｅｏ遺伝子、（３）チロシナーゼエンハンサーを含む転写終結配列、および（４）種々の核酸カセットの組込みのためのマルチクローニング部位、および（５）チロシナーゼプロモーターに作動可能に連結したマーカーをコードする核酸配列で構成されている。タンパク質をコードする核酸を誘導するための、当技術分野で公知の数多くのプラスミドベクターがある。これらとしては、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，１０３，４７０号；米国特許第７，５９８，３６４号；米国特許第７，９８９，４２５号；および米国特許第６，４１６，９９８号に開示のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
エピソーム遺伝子送達系は、プラスミド、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）系エピソームベクター（米国特許第８，５４６，１４０号）、酵母系ベクター、アデノウイルス系ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）系エピソームベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）系ベクターまたはレンチウイルスベクターであってもよい。ウイルス遺伝子送達系は、ＲＮＡに基づくまたはＤＮＡに基づくウイルスベクター（参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６２９１１、ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６９５８８）であってもよい。
【００７６】
３．体細胞核移植によって誘導された胚性幹細胞
宿主細胞の出発集団を誘導するための多能性幹細胞は、ドナー核を紡錘体を含まない卵母細胞に移す体細胞核移植によって調製することもできる。核移植によって生成された幹細胞はドナー核と遺伝学的に同一である。１つの方法では、アカゲザルの皮膚線維芽細胞由来のドナー線維芽細胞の核を、電気融合によって、紡錘体を含まない成熟した第二減数分裂中期のアカゲザル卵母細胞（ooctye）の細胞質に導入する（Byrneら、２００７年）。融合された卵母細胞をイオノマイシンへの曝露によって活性化し、次いで胚盤胞期までインキュベートする。次いで、選択された胚盤胞の内部細胞塊を培養して、胚性幹細胞株を産生する。胚性幹細胞株は、正常なＥＳ細胞形態を示し、種々のＥＳ細胞マーカーを発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で複数の細胞型に分化する。
【００７７】
Ｂ．前駆細胞
本開示のある特定の実施形態は、細胞周期依存性プロモーターの制御下で自殺遺伝子をコードするベクターを含む前駆細胞に関する。前駆細胞は、ＰＳＣから分化されてもよい。例示的な前駆細胞には、神経前駆細胞（ＮＰＣ）、心筋前駆細胞および膵前駆細胞が挙げられる。
【００７８】
神経前駆細胞は、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，９６８，３３７号に記載の方法が挙げられるが、これに限定されない当技術分野で公知の方法を使用して、ＰＳＣから分化され得る。簡潔に述べると、ＰＳＣを、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む第１の培地、ｂＦＧＦおよび上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む第２の培地、ならびにｂＦＧＦおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む第３の培地で培養して、神経前駆細胞が得られる。ＮＰＣは、ｍｕｓａｓｈｉ、ネスチン、ｓｏｘ２、ビメンチン、ｐａｘ６およびｓｏｘ１などのマーカーを使用して検出および／または単離することができる。ＮＰＣは、さらに分化させて、様々なニューロンマーカー、例えば、ＭＡＰ２、ベータ−ＩＩＩ−チューブリン、シナプシン、コリンアセチルトランスフェラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＡＢＡ、グルタメート、セロトニン、ペリフェリンおよびカルビンジンを発現させることもできる。分化したニューロンの成熟および生存は、ニューロトロフィン、例えば、ＢＤＮＦまたはニューロトロフィン３（ＮＴ−３）の添加により向上させることができる。ＮＰＣの産生および培養のためのさらなる方法は、例えば、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，０９３，０５３号、第５，９８０，８８５号、第７．９６８，３３７号および第８，１７８，３４９号ならびに米国出願第２０１００３２３４４４号に見出すことができる。
【００７９】
ＩＩＩ．本開示のポリヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示は、単離された組換えポリヌクレオチド、例えば、自殺遺伝子に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーターを含むポリヌクレオチドに関する。特定の実施形態では、本開示は、自殺遺伝子をコードする核酸配列を組み込んでいる単離された核酸および組換えベクターであって、その発現が、細胞周期依存性プロモーターに作動可能に連結している、組換えベクターに関する。「組換え」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと組み合わせて使用することができ、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製または操作されたポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、および／またはそのような分子の複製産物であるポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを指す。
【００８０】
核酸は、当業者に公知の任意の技術によって作製することができる。合成核酸、特に合成オリゴヌクレオチドの非限定的な例としては、ホスホトリエステル、ホスファイト、またはホスホラミダイト化学、およびＥＰ２６６，０３２に記載されているような固相技術を使用して、またはFroehlerら、１９８６年および米国特許第５，７０５，６２９号によって記載されているデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学合成によって作製された核酸が挙げられる。酵素的に産生された核酸の非限定的な例としては、ＰＣＲ（商標）などの増幅反応（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第４，６８２，１９５号を参照）、または米国特許第５，６４５，８９７号に記載のオリゴヌクレオチドの合成で、酵素によって産生されたものが挙げられる。生物学的に産生された核酸の非限定的な例としては、細菌における組換えＤＮＡベクター産生（例えば、Sambrookら、１９８９年参照）などの、生きた細胞における組換え核酸の産生が挙げられる。
【００８１】
本開示で使用される核酸は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメント等のような他の核酸配列と組み合わせることができ、全体の長さはかなり変動し得る。したがって、ほとんどあらゆる長さの核酸断片を用い得ることが企図され、全長は、好ましくは、調製の容易さおよび意図された組換え核酸プロトコルでの使用によって限定される。
【００８２】
Ａ．核酸送達
本開示のポリヌクレオチドは、ウイルスまたは非ウイルスの方法によって宿主細胞に導入され得る（例えば、トランスフェクトされるまたは形質導入される）。本明細書で提供されるベクターは、主に、細胞周期依存性プロモーターの制御下で自殺遺伝子を発現するように設計されている。当業者は、標準的な組換え技術を通じてベクターを構築する能力が十分備わっている（例えば、いずれも参照によって本明細書に組み込まれるSambrookら、２００１年およびAusubelら、１９９６年を参照）。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（例えば、バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、レトロウイルスベクター（例えばモロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来するもの）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来する）、それらの複製コンピテント、複製欠損および増殖力欠損（ｇｕｔｌｅｓｓ）形態を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳腺腫瘍ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、マラバウイルスベクター、およびＢ群アデノウイルスｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
１．ウイルスベクター
自殺遺伝子に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーターをコードするウイルスベクターが本開示のある特定の態様で提供され得る。組換えウイルスベクターの生成では、典型的に、非必須遺伝子が、異種（または非天然）タンパク質のために、遺伝子またはコード配列で置き換えられる。ウイルスベクターは、核酸、およびおそらくはタンパク質を細胞内に導入するためにウイルス配列を利用する一種の発現構築物である。ある特定のウイルスが、細胞に感染し、または受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定におよび効率的に発現する能力は、そのウイルスを、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移行させるための魅力的な候補にしている。本開示のある特定の態様の核酸を送達するために使用することができるウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。本開示における「組換えウイルスベクター」は、遺伝子組換え技術により構築されたウイルスベクターを指す。パッケージング細胞およびウイルスゲノムをコードするＤＮＡを使用して構築されるウイルスベクターは、組換えウイルスベクターと呼ばれる。
【００８４】
ｉ．レトロウイルスベクター
本開示の一態様では、５’長末端反復（ＬＴＲ）、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１つまたは複数の異種配列、第二鎖ＤＮＡ合成起点、および３’ＬＴＲを含むレトロウイルス構築物が提供され、ここでベクター構築物は、ｇａｇ／ｐｏｌおよび／またはｅｎｖコード配列を欠いている。
【００８５】
ベクター構築物に含まれる異種配列は、タンパク質をコードするものであり、好ましくは自殺遺伝子、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードするものである。本開示のある特定の実施形態では、本明細書に記載の発現カセットは、プラスミド構築物内に含有されていてもよい。
【００８６】
本開示のレトロウイルスベクターは、目的の配列（単数または複数）または遺伝子（単数または複数）の発現を指示することができるアセンブリである少なくとも１つの発現カセットを含む。発現カセットは、目的の配列（単数または複数）または遺伝子（単数または複数）に作動可能に連結した転写プロモーター領域またはプロモーター／エンハンサーを含み、ポリアデニル化配列も含んでもよい。そのようなベクター構築物は、パッケージングシグナル、ＬＴＲまたはその機能的部分、ならびに使用されるレトロウイルスに適切なポジティブおよびネガティブ鎖プライマー結合部位も含む。任意選択で、組換えレトロウイルスベクターは、選択可能および／または非選択可能マーカー、第二鎖ＤＮＡ合成起点、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、細菌複製起点、および哺乳動物複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルス複製起点）、１つまたは複数の制限部位および翻訳終結配列も含んでもよい。選択可能および非選択可能マーカーの例としては、ネオマイシン（Νｅｏ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ピューロマイシン、ヒスチジノール、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＤＨＦＲ、β−ガラクトシダーゼ、およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
レトロウイルスでは、ＬＴＲが修飾されていてもよい。ＬＴＲは、ウイルスゲノムの両端に存在するレトロウイルス特異的配列である。５’ＬＴＲはプロウイルスｍＲＮＡの転写を増強するプロモーターとして機能する。したがって、遺伝子導入ベクターの５’ＬＴＲプロモーター活性を示す部分が、より強力なプロモーター活性を有する別のプロモーターで置換される場合、遺伝子導入ベクターのｍＲＮＡ転写を増強し、パッケージング効率を向上させ、およびベクター力価を増加させることが可能である。さらに、例えば、レンチウイルスの場合には、ウイルスタンパク質ｔａｔが５’ＬＴＲ転写活性を増強することは公知であり、したがって、５’ＬＴＲを、ｔａｔタンパク質と独立したプロモーターで置換することは、パッケージングベクターからｔａｔを排除することを可能にする。細胞に感染したまたは侵入したウイルスのＲＮＡが逆転写された後、両端のＬＴＲが連結して閉環構造を形成し、ウイルスインテグラーゼが連結部位に結合し、この構造が、次いで細胞染色体に組み込まれる。転写されたプロウイルスのｍＲＮＡは、５’ＬＴＲ転写開始部位から、下流に位置する３’ＬＴＲポリアデニル化配列までの範囲にわたる領域で構成されている。５’ＬＴＲプロモーター部分は、ウイルスにパッケージされていない。したがって、プロモーターが別の配列で置き換えられても、標的細胞の染色体に組み込まれる部分は変化しない。上記の事実に基づき、５’ＬＴＲプロモーターの置換は、より高い力価を有する、より安全なベクターを提供すると考えられる。したがって、遺伝子導入ベクターの５’末端でのプロモーターの置換は、パッケージング可能なベクターの力価を増加させることができる。
【００８８】
安全性は、標的細胞における全長ベクターｍＲＮＡの転写を防止することにより、組換えレトロウイルスウイルスベクターにおいて改善することができる。これは、部分的に３’ＬＴＲ配列を排除することにより調製される自己不活化ベクター（ＳＩＮベクター）を使用して達成される。標的細胞の染色体に侵入したプロウイルスは、その３’ＬＴＲのＵ３部分に結合されたその５’末端を有する。したがって、Ｕ３部分が遺伝子導入ベクターの５’末端に位置し、その点から、遺伝子導入ベクターの全ＲＮＡが転写される。レトロウイルスまたは類似のタンパク質が標的細胞に存在する場合、遺伝子導入ベクターを再びパッケージングし、他の細胞に感染させることが可能である。３’ＬＴＲプロモーターがウイルスゲノムの下流に位置する宿主遺伝子を発現することができる可能性もある。３’ＬＴＲ  Ｕ３部分が遺伝子導入ベクターから削除されるとき、標的細胞は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲのプロモーターを欠き、それにより、全長ウイルスＲＮＡおよび宿主遺伝子の転写が防止される。さらに、目的の遺伝子のみが内在性プロモーターから転写されるので、高発現可能な安全性の高いベクターを期待し得る。そのようなベクターは、本開示において好ましい。ＳＩＮベクターは、公知の方法に従って構築することができる。
【００８９】
ＳＩＮベクターは、組込み後のＬＴＲ配列の宿主メチル化から生じる導入遺伝子の発現の緩やかな減少を克服するというさらなる利点を有する（Challita,  P.M.およびKohn,  D.  B.、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９１巻：２５６７頁、１９９４年）。ＬＴＲメチル化は、ＳＩＮベクターにおける遺伝子発現レベルをほとんど低下させない。これは、ベクターが宿主ゲノムに組み込まれる際にＬＴＲ配列のほとんどを失うからである。遺伝子導入ベクターの３’ＬＴＲ  Ｕ３領域を別のプロモーター配列に置換することによって調製されたＳＩＮベクターは、霊長類ＥＳ細胞への導入後２ヶ月を超えて安定な発現を維持することが見出された（ＷＯ０２／１０１０５７）。したがって、ＬＴＲ  Ｕ３領域の改変によって自己不活化するように設計されたＳＩＮベクターが、本開示において使用され得る。
【００９０】
レトロウイルスは、宿主細胞において、パッケージングシグナルを含有する遺伝子導入ベクターＤＮＡを転写し、ｇａｇ、ｐｏｌおよびエンベロープタンパク質の存在下でウイルス粒子を形成することによって製造することができる。遺伝子導入ベクターＤＮＡによってコードされるパッケージングシグナル配列は、好ましくは、配列によって形成される構造を維持するのに十分な長さであるべきである。しかしながら、ベクターＤＮＡパッケージングシグナルとｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を供給するパッケージングベクターとの組換えによって生じる野生型ウイルス形成の頻度を抑制するために、これらのベクター配列間の配列重複を最小に維持することも必要である。したがって、遺伝子導入ベクターＤＮＡの構築のときには、パッケージング効率および安全性を確保するために、できるだけ短く、しかもパッケージングに必須の配列を含有する配列を使用することが好ましい。
【００９１】
ＳＩＶベクターは、元々のＳＩＶゲノムに由来する４０％またはそれより多く、より好ましくは５０％またはそれより多く、なおより好ましくは６０％またはそれより多く、さらにより好ましくは７０％またはそれより多く、および最も好ましくは８０％またはそれより多くの配列が除去された複製不能ウイルスであり得る。
【００９２】
遺伝子導入ベクターＤＮＡにおいて、ｇａｇタンパク質は、それが発現されないように改変されている。ウイルスｇａｇタンパク質は、異物として、したがって潜在的な抗原として、生体によって検出され得る。代替的に、タンパク質は、細胞機能に影響を与え得る。ｇａｇタンパク質発現を防止するために、ｇａｇ開始コドンの下流のヌクレオチドを追加または削除して、フレームシフトを引き起こす修飾を導入してもよい。ｇａｇタンパク質のコード領域部分を削除することも好ましい。ｇａｇタンパク質のコード領域の５’部分がウイルスパッケージングに必須であることは公知である。したがって、遺伝子導入ベクターでは、ｇａｇタンパク質コード領域のＣ末端側が欠失していることが好ましい。ｇａｇコード領域のできるだけ大きな部分を、その削除がパッケージング効率にかなりの影響を与えない限り、削除することが好ましい。ｇａｇタンパク質の開始コドン（ＡＴＧ）を、ＡＴＧ以外のコドンで置き換えることも好ましい。置き換えるコドンは、パッケージング効率に大幅に影響を与えないように適切に選択され得る。ウイルスベクターは、パッケージングシグナルを含む構築された遺伝子導入ベクターＤＮＡを、適切なパッケージング細胞に導入することによって製造することができる。産生されるウイルスベクターは、例えばパッケージング細胞の培養上清から回収することができる。
【００９３】
「パッケージング細胞」とは、組換えレトロウイルスベクターを欠く感染性組換えレトロウイルスの産生に必要なエレメントを含有する細胞を指す。パッケージング細胞は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ由来タンパク質をコードするタンパク質を発現することができる１つまたは複数の発現カセットを含有する。パッケージング細胞はｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ発現カセットに加えてｖｉｆ、ｒｅｖまたはＯＲＦ２の１つまたは複数をコードする発現カセットを含有することもできる。
【００９４】
細胞株がウイルス産生において全体的に使用される限り、パッケージング細胞の種類に限定はない。ヒトの遺伝子療法に使用する場合、ヒト由来またはサル由来の細胞が好適である。パッケージング細胞として使用することができるヒト細胞株としては、例えば、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、２９３ＥＢＮＡ細胞、ＳＷ４８０細胞、ｕ８７ＭＧ細胞、ＨＯＳ細胞、Ｃ８１６６細胞、ＭＴ−４細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＴ１０８０細胞およびＴＥ６７１細胞が挙げられる。サル細胞株としては、例えば、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＶ−１細胞およびＢＭＴ１０細胞が挙げられる。
【００９５】
レンチウイルスは、共通のレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、調節または構造機能を有する他の遺伝子を含有する複雑なレトロウイルスである。レンチウイルスベクターは、当技術分野で周知である（例えば、Naldiniら、１９９６年；Zuffereyら、１９９７年；Blomerら、１９９７年；米国特許第６，０１３，５１６号および第５，９９４，１３６号を参照）。組換えレンチウイルスベクターは、分裂しない細胞に感染することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの両方で遺伝子導入および核酸配列の発現のために使用することができる。例えば、分裂しない細胞（ここで適切な宿主細胞は、パッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖならびにｒｅｖおよびｔａｔを保有する２つまたはそれより多くのベクターでトランスフェクトされている）に感染することが可能な組換えレンチウイルスは、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。
【００９６】
本開示のシュードタイプレンチウイルスベクターは、実質的に純粋になるように精製することができる。「実質的に純粋な」という語句は、シュードタイプレンチウイルスベクターが、レンチウイルス以外の複製可能なウイルスを実質的に含有していないことを意味する。精製は、濾過、遠心分離、およびカラム精製などの公知の精製および分離方法を使用して達成することができる。例えば、ベクターは、０．４５μｍのフィルタでベクター溶液を濾過し、次いで、４℃で９０分間、４２５００×ｇで遠心分離することによって、沈殿および濃縮することができる。必要であれば、本開示のシュードタイプレンチウイルスベクターは、所望の薬学的に許容される担体またはビヒクルと適切に組み合わせることによって、組成物として調製することができる。具体的には、ベクターは、例えば、滅菌水、生理食塩水、培養培地、血清、およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と適切に組み合わせることができる。またベクターは、安定剤、殺生物剤などと組み合わせることもできる。本開示のシュードタイプレンチウイルスベクターを含有する組成物は、試薬または医薬として有用である。例えば、本開示の組成物は、気道幹細胞への遺伝子導入のための試薬として、または遺伝的疾患などの種々の疾患の遺伝子療法のための医薬として使用することができる。
【００９７】
本開示の一態様において、選択された遺伝子（単数または複数）または目的の配列（単数または複数）を保有または発現するように構築されたレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルが提供される。簡潔に述べると、本開示のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、Ｂ、ＣおよびＤ型レトロウイルスを含む多種多様なレトロウイルスならびにスプマウイルスおよびレンチウイルス、例えばＦＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＥＩＡＶおよびＳＩＶから容易に構築され得る（RNA  Tumor  Viruses、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、１９８５年を参照）。そのようなレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９）などの寄託機関もしくはコレクションから容易に取得することができ、または一般に利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離することができる。上記のレトロウイルスのいずれも、本明細書で提供される開示および標準的組換え技術（例えば、Sambrookら、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９８９年；Kunkle、PNAS、５２巻：４８８頁、１９８５年）を考慮して、レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを組み立てまたは構築するために容易に利用することができる。さらに、本開示のある特定の実施形態では、レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの一部は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、本開示の一実施形態では、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス由来のｔＲＮＡ結合部位、マウス白血病ウイルス由来のパッケージングシグナル、およびトリ白血病ウイルスの第二鎖合成起点に由来し得る。
【００９８】
本開示のある特定の実施形態では、ウイルスプロモーター、好ましくはＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーターおよび／またはエンハンサーが、目的の１つまたは複数の遺伝子の発現を駆動するように利用されるレトロウイルスベクターが提供される。本開示の他の態様では、組織特異的プロモーターが、１つまたは複数の目的の遺伝子の発現を駆動するように利用されるレトロウイルスベクターが提供される。
【００９９】
本開示で使用するためのレトロウイルスベクター構築物は、１つより多くの目的の遺伝子が発現され、好ましくは選択されるように、生成され得る。これは、ジもしくはオリゴシストロンカセット（例えば、コード領域が１２０またはそれ未満のヌクレオチドによって分離されている、一般的にLevinら、Gene、１０８巻：１６７〜１７４頁、１９９１年参照）の使用を通して、または内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）の使用を通して達成され得る。
【０１００】
本開示の一態様では、自己不活化（ＳＩＮ）ベクターは、ＴＡＴＡボックスおよび１つまたは複数の転写因子のための結合部位を含む３’ＬＴＲのＵ３領域中のプロモーターおよびエンハンサーエレメントを削除することによって作製される。削除は、形質導入された細胞における逆転写および組込みの後、５’ＬＴＲに移行される。これが、プロウイルスにおけるＬＴＲの転写不活化をもたらす。ＳＩＮベクターの考えられる利点には、遺伝子送達系の安全性の増加、ならびに目的の遺伝子の発現増加をもたらし得るＬＴＲと内部プロモーターとの間のプロモーター干渉を低減させる能力が含まれる。さらに、５’ＬＴＲの上流プロモーターエレメントの欠如により、誘導性遺伝子療法ベクターのより厳密な制御を期待することは合理的である。
【０１０１】
本開示の一態様では、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１つまたは複数の異種配列、第二鎖ＤＮＡ合成起点、ＲＮＡ輸送エレメントおよび３’ＬＴＲを含むレンチウイルスベクター構築物が提供される。簡単に述べると、長末端反復（「ＬＴＲ」）は、Ｕ５、ＲおよびＵ３と称される３つのエレメントに細分される。これらのエレメントは、例えば、Ｕ３内に位置するプロモーターおよびエンハンサーエレメントを含むレトロウイルスの生物学的活性に関与している様々なシグナルを含有する。ＬＴＲは、ゲノムの両端でのその正確な複製により、プロウイルス（組み込まれたＤＮＡの形態）において容易に同定され得る。本開示の目的のために、５’ＬＴＲは、５’プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーエレメントとして機能するために、逆転写を可能にするために、およびベクターのＤＮＡ形態の組込みを可能にするために必要とされるだけの量の天然５’ＬＴＲを含んでいると理解されるべきである。３’ＬＴＲは、ポリアデニル化シグナルとして機能するために、逆転写を可能にするために、およびベクターのＤＮＡ形態の組込みを可能にするために必要とされるだけの量の３’ＦＩＶ  ＬＴＲを含んでいると理解されるべきである。
【０１０２】
さらに、レトロウイルスベクターは、Changら、J.  Virology、６７巻、７４３〜７５２頁、１９９３年；Finerら、Blood、８３巻、４３〜５０頁、１９９４年およびRobinsonら、Gene  Therapy、２巻、２６９〜２７８頁、１９９５年によって記載されるハイブリッドＬＴＲと同様に、野生型ＬＴＲ配列の７５％までが削除され、１つまたは複数のウイルスまたは非ウイルスプロモーターまたはプロモーター／エンハンサーエレメント（例えば、他のレトロウイルスＬＴＲおよび／または非レトロウイルスプロモーターまたはプロモーター／エンハンサー、例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサーもしくはＳＶ４０プロモーター）によって置き換えられているハイブリッドＬＴＲを含有してもよい。
【０１０３】
ｔＲＮＡ結合部位および第二鎖ＤＮＡ合成起点も、レトロウイルスが生物学的に活性であるために重要であり、当業者によって容易に同定され得る。例えば、ｔＲＮＡは、ワトソン−クリック塩基対形成によって、レトロウイルスｔＲＮＡ結合部位に結合し、ウイルス粒子中にレトロウイルスゲノムと共に運ばれる。ｔＲＮＡは、次いで、逆転写酵素によるＤＮＡ合成のためのプライマーとして利用される。ｔＲＮＡ結合部位は、５’ＬＴＲからすぐ下流のその位置に基づいて容易に同定することができる。同様に、第二鎖ＤＮＡ合成起点は、その名前が示すように、レトロウイルスの第二鎖ＤＮＡ合成のために重要である。この領域は、ポリプリン管とも称され、３’ＬＴＲのすぐ上流に位置している。
【０１０４】
５’および３’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、および第二鎖ＤＮＡ合成起点に加えて、本明細書で使用するためのある特定の好ましい組換えレトロウイルスベクター構築物は、１つまたは複数の目的の遺伝子も含む。さらに、レトロウイルスベクターは、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答性エレメント）または異種移行エレメントであり得るＲＮＡ輸送エレメント（ＲＮＡ移行、核移行、または核輸送エレメントとも様々に称される）を含み得るが、含む必要はない。適切な異種ＲＮＡ輸送エレメントの代表的な例としては、Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス構成性移行エレメント（Brayら、PNAS  USA、９１巻、１２５６〜１２６０頁、１９９４年）、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Huangら、Mol  Cell.  Biol.、７３巻：７４７６〜７４８６頁、１９９３年およびHuangら、J.Virology、６５巻：３１９３〜３１９９頁、１９９４年）またはレンチウイルスＲｅｖ応答性エレメント（Dalyら、Nature、３４２巻：８１６〜８１９頁、１９８９年およびZappら、Nature、３４２巻：７１４〜７１６頁、１９８９年）が挙げられる。
【０１０５】
ｇａｇ／ｐｏｌコード配列およびｅｎｖコード配列の両方を欠くレトロウイルスベクター構築物が、本開示で使用され得る。本明細書で利用される場合、「ｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖコード配列を欠く」という語句は、ｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子に見出される、特にレトロウイルスベクター構築物のためのパッケージング細胞株を構築するために使用されるｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖ発現カセット内で見出される、２０未満、好ましくは１５未満、より好ましくは１０未満、最も好ましくは８未満の連続ヌクレオチドをベクターが含有することを意味すると理解すべきである。本開示のこの態様は、宿主細胞で起こり得るまたは例えば発現カセットで形質転換することによって宿主細胞に導入され得るｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖ配列での望ましくない組換えの確率が低いレトロウイルスベクターを提供する。ｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖ配列を欠くレトロウイルスベクター構築物の作製は、パッケージングシグナルを部分的に排除することおよび／または修飾もしくは異種パッケージングシグナルの使用によって達成され得る。本開示の他の実施形態では、レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ配列に延長またはそれと重複し得る、パッケージングシグナルの一部が改変（例えば、欠失、切断または塩基交換）されているレトロウイルスベクター構築物が提供される。本開示の他の態様では、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の始点を越えて延長し得るパッケージングシグナルを含むレトロウイルスベクター構築物が提供される。ある特定の実施形態では、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の始点を越えて延長し得るパッケージングシグナルは、ｇａｇ／ｐｏｌリーディングフレーム内の１つ、２つまたはそれより多くの終止コドンを含有するように改変されている。最も好ましくは、終止コドンの１つは、ｇａｇ／ｐｏｌ開始部位を排除する。他の実施形態では、導入された変異は、ｇａｇ／ｐｏｌコード領域におけるフレームシフトを引き起こし得る。
【０１０６】
他のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを、本開示の文脈において同様に利用することができ、例えば、ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９１／０２８５、ＷＯ９４０３６２２；ＷＯ９３２５６９８；ＷＯ９３２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３１１２３０；ＷＯ９３１０２１８；VileおよびHart、Cancer  Res.、５３巻：３８６０〜３８６４頁、１９９３年；VileおよびHart、Cancer  Res.、５３巻：９６２〜９６７頁、１９９３年；Ramら、Cancer  Res.、５３巻：８３〜８８頁、１９９３年；Takamiyaら、J.  Neurosci.  Res.、３３巻：４９３〜５０３頁、１９９２年；Babaら、J  Neurosurg.、７９巻：７２９〜７３５頁、１９９３年（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１、ＥＰ０，３４５，２４２およびＷＯ９１／０２８０５）に記載のビヒクルが挙げられる。
【０１０７】
上記レトロウイルス構築物と共に使用するために適切なパッケージング細胞株は、容易に調製し（例えば、米国特許第５，５９１，６２４号および第６，０１３，５１７号；ならびに国際公開番号ＷＯ９５／３０７６３を参照）、組換えベクター粒子産生のためのプロデューサー細胞株を作製するために利用することができる。パッケージング細胞株が由来する親の細胞株は、例えば、ヒト細胞、サル細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、マウス細胞などを含む、多種多様な哺乳動物細胞株から選択することができる。
【０１０８】
パッケージング細胞株の生成のために適切な宿主細胞を選択した後、１つまたは複数の発現カセットを、削除されたベクターの成分を補足するためまたはｔｒａｎｓで供給するために細胞株に導入する（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９１，６２４号および第６，０１３，５１７号；ならびに国際公開番号ＷＯ９５／３０７６３を参照）。例えば、パッケージング発現カセットは、ｇａｇ／ｐｏｌ配列単独、ｇａｇ／ｐｏｌ配列とｖｉｆ、ｒｅｖもしくはＯＲＦ２の１つもしくは複数、またはｖｉｆ、ｒｅｖもしくはＯＲＦ２の１つもしくは複数のみのいずれかをコードしてもよく、ＲＮＡ輸送エレメントを含有してもよい。例えば、パッケージング細胞株は、ＯＲＦ２、ｖｉｆもしくはｒｅｖ単独のみ、ＯＲＦ２とｖｉｆ、ＯＲＦ２とｒｅｖ、ｖｉｆとｒｅｖ、またはＯＲＦ２、ｖｉｆおよびｒｅｖの３つ全てを含有してもよい。
【０１０９】
パッケージング細胞株は、プロモーターとＯＲＦ２、ｖｉｆ、ｒｅｖまたはエンベロープ（例えばＶＳＶ−Ｇ）をコードする配列とを含んでもよく、ここでプロモーターはＯＲＦ２、ｖｉｆ、ｒｅｖまたはエンベロープをコードする配列に作動可能に連結されている。誘導性ｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖ発現カセットを含有するパッケージング細胞株のために、誘導性プロモーターのトランス活性化を促進する追加の発現カセットを組込んでもよい。発現カセットは安定に組み込まれても組み込まれなくてもよい。パッケージング細胞株は、レトロウイルスベクターの導入に際し、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８または１０９ｃｆｕ／ｍＬを超える濃度で粒子を生成し得る。
【０１１０】
ｉｉ．レンチウイルスベクター
「レンチウイルス」は、レンチウイルス属に属するウイルスを指す。レンチウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マエディ−ビスナ様ウイルス（ＥＶ１）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
「レンチウイルスベクター構築物」、「レンチウイルスベクター」および「組換えレンチウイルスベクター」という用語は、本明細書において互換的に使用され、それらは、目的の核酸分子を保有し、ある特定の実施形態ではその発現を指示することができる、レンチウイルス由来の核酸構築物を指す。レンチウイルスベクターは、全体または部分的に欠失したレンチウイルス野生型遺伝子の１つまたは複数を有し得るが、隣接する機能的な長末端反復（ＬＴＲ）配列を保持することができる。ＬＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、その配列が機能的なレスキュー、複製およびパッケージングを提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変されていてもよい。レンチウイルスベクターは、選択可能マーカーを含有してもよい。
【０１１２】
「組換えレンチウイルス」という用語は、レンチウイルス由来のウイルスゲノムを含有し、自己再生能力を欠き、宿主に核酸分子を導入する能力を有するウイルス粒子を指す。例えば、本開示の組換えレンチウイルスは、レンチウイルスゲノム由来のパッケージングシグナル配列を含む核酸分子を含むウイルス粒子を含む。組換えレンチウイルスは、その遺伝物質をＤＮＡに逆転写し、感染時に宿主細胞のＤＮＡにこの遺伝物質を組み込むことが可能である。組換えレンチウイルス粒子は、レンチウイルスエンベロープ、非レンチウイルスエンベロープ（例えば、アンホトロピックまたはＶＳＶ−Ｇエンベロープ）、キメラエンベロープ、または修飾エンベロープ（例えば、切断型エンベロープまたはハイブリッド配列を含有するエンベロープ）を有し得る。
【０１１３】
本開示のレンチウイルスベクターによって保有される核酸は、このベクターを、ヒトを含む霊長類またはマウスおよびラットを含む齧歯類の多能性幹細胞と接触させることによって、多能性幹細胞または神経始原細胞に導入することができる。本開示は、多能性幹細胞を本開示のベクターと接触させるステップを含む、自殺遺伝子を多能性幹細胞に導入するための方法に関する。遺伝子導入の標的となる多能性幹細胞は、特に限定されず、例えば、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を含む。
【０１１４】
ｉｉｉ．アデノウイルスベクター
自殺遺伝子に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーターをコードするポリヌクレオチドは、アデノウイルスベクターで提供され得る。アデノウイルスベクターはゲノムＤＮＡへの組込みのための容量が低いことが公知であるが、この特徴は、これらのベクターによってもたらされる遺伝子導入の高い効率によって相殺される。アデノウイルス発現ベクターとしては、（ａ）構築物のパッケージングを支持するのにおよび（ｂ）そこにクローニングされている組換え遺伝子構築物を最終的に発現させるのに十分なアデノウイルス配列を含有する構築物が挙げられる。
【０１１５】
アデノウイルスの成長および操作は当業者に公知であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの幅広い宿主範囲を示す。このグループのウイルスは、高い力価、例えば１ｍｌあたり１０９〜１０１１プラーク形成単位で得ることができ、高度に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子はエピソームであり、したがって、宿主細胞に対する遺伝毒性は低い。野生型アデノウイルスのワクチン接種の研究で副作用は報告されておらず（Couchら、１９６３年；Topら、１９７１年）、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入ベクターとしての安全性および治療的可能性を示す。
【０１１６】
アデノウイルスの遺伝子構成に関する３６ｋｂ、線形、二本鎖ＤＮＡウイルスという知識は、アデノウイルスＤＮＡの大部分を７ｋｂまでの外来配列と置換することを許容する（GrunhausおよびHorwitz、１９９２年）。アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性なしにエピソーム様式で複製することができるので、レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組込みをもたらさない。またアデノウイルスは構造的に安定であり、ゲノム再編成は、広範な増幅後に何ら検出されていない。
【０１１７】
アデノウイルスは、その中型のゲノム、操作の容易さ、高力価、広い標的細胞範囲、および高い感染性のため、遺伝子導入ベクターとして使用することができる。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである１００〜２００塩基対の逆方向反復配列（ＩＴＲ）を含有する。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始により分割される異なる転写単位を含有する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードしている。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現および宿主細胞シャットオフに関与する（Renan、１９９０年）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じた単一の一次転写物の重要なプロセシングの後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置する）は、感染の後期に特に効率的であり、このプロモーターから生じた全てのｍＲＮＡは、それらを翻訳のための特定のｍＲＮＡにする５’三連リーダー（ＴＰＬ）配列を有する。
【０１１８】
本明細書で提供される組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから生成することができる。２つのプロウイルスベクター間の可能な組換えにより、野生型アデノウイルスが、このプロセスから生成され得る。したがって、ウイルスの単一のクローンを、個々のプラークから単離し、そのゲノム構造を調べる。
【０１１９】
アデノウイルスベクターは、複製欠損であってもよいし、または少なくとも条件付き欠損であってもよく、アデノウイルスベクターの性質は、本開示の実施の成功に重要であるとは思われない。アデノウイルスは、４２個の異なる公知の血清型または亜群Ａ〜Ｆのいずれであってもよい。亜群Ｃのアデノウイルス５型は、本開示における使用のための条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るための特定の出発材料である。その理由は、アデノウイルス５型は、膨大な量の生化学的および遺伝情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、ベクターとしてアデノウイルスを用いるほとんどの構築のために歴史的に使用されてきたからである。
【０１２０】
核酸は、コード配列が除去された位置として、アデノウイルスベクターに導入することができる。例えば、複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１コード配列が除去されていてもよい。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、Karlssonら（１９８６年）によって記載されるように、Ｅ３置換ベクターにおいて欠失されたＥ３領域の代わりに挿入されてもよく、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補完するＥ４領域に挿入されてもよい。
【０１２１】
複製欠損アデノウイルスベクターの生成および増殖は、ヘルパー細胞株を用いて行うことができる。２９３と称される１つの特有のヘルパー細胞株は、Ａｄ５のＤＮＡ断片によってヒト胚腎細胞から形質転換されたものであり、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する（Grahamら、１９７７年）。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムにおいて必ずしも必要でないので（JonesおよびShenk、１９７８年）、アデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けを借りて、Ｅ１、Ｅ３、または両方の領域のいずれかで外来ＤＮＡを運ぶ（GrahamおよびPrevec、１９９１年）。
【０１２２】
ヘルパー細胞株は、ヒト胚性腎細胞、筋細胞、造血細胞または他のヒト胚間葉もしくは上皮細胞などのヒト細胞から誘導され得る。代替的に、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容する他の哺乳動物種の細胞から誘導され得る。そのような細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胚間葉または上皮細胞が挙げられる。上述したように、特定のヘルパー細胞株は２９３である。
【０１２３】
組換えアデノウイルスを作製するための方法は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６７４０３２０号など、当技術分野において公知である。またRacherら（１９９５年）は、２９３細胞を培養し、アデノウイルスを増殖させるための改良された方法を開示している。１つの形式では、天然の細胞凝集物を、１００〜２００ｍｌの培地を含有する１リットルのシリコン処理スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）に個々の細胞を接種することにより成長させる。４０ｒｐｍで撹拌した後、トリパンブルーを用いて細胞生存率を推定する。別の形式では、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ、ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を以下のように用いる。５ｍｌの培地中に再懸濁させた細胞接種物を、２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に加え、時々撹拌しながら、１〜４時間、静置する。次いで、培地を５０ｍｌの新鮮な培地で置き換え、振盪を開始する。ウイルス産生のために、細胞を約８０％のコンフルエンスまで成長させ、その後、培地を置き換え（最終体積の２５％まで）、アデノウイルスを、０．０５のＭＯＩで添加する。培養物を一晩静置し、その後、体積を１００％に上昇させ、さらに７２時間の振盪を開始する。
【０１２４】
ｉｖ．アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、組込みが高頻度で、分裂しない細胞に感染することができ、したがって、哺乳動物細胞への遺伝子の送達に有用であるので（Muzyczka、１９９２年）、本開示で使用され得る。ＡＡＶは、感染性の宿主範囲が広く（Tratschinら、１９８４年；Laughlinら、１９８６年；Lebkowskiら、１９８８年；McLaughlinら、１９８８年）、このことは本開示での使用に適用可能であることを意味する。ｒＡＡＶベクターの生成および使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号および米国特許第４，７９７，３６８号に記載されている。
【０１２５】
ＡＡＶは培養細胞での生産的感染を行うために別のウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスファミリーのメンバー）との同時感染を必要とする点で依存性パルボウイルスである（Muzyczka、１９９２年）。ヘルパーウイルスとの同時感染の非存在下で、野生型ＡＡＶゲノムは、その末端を通じてヒト染色体１９に組込まれ、プロウイルスとして潜伏状態で存在する（Kotinら、１９９０年；Samulskiら、１９９１年）。しかしながら、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質も発現されていない限り、組込みは染色体１９に制限されない（ShellingおよびSmith、１９９４年）。ＡＡＶプロウイルスを保有する細胞がヘルパーウイルスで重感染されると、ＡＡＶゲノムは染色体または組換えプラスミドからレスキューされ、通常の生産的感染が確立される（Samulskiら、１９８９年；McLaughlinら、１９８８年；Kotinら、１９９０年；Muzyczka、１９９２年）。
【０１２６】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスは、２つのＡＡＶ末端反復によって隣接される目的の遺伝子を含有するプラスミド（それぞれ参照によって本明細書に組み込まれるMcLaughlinら、１９８８年；Samulskiら、１９８９年）と、末端反復なしで野生型ＡＡＶコード配列を含有する発現プラスミド、例えばｐＩＭ４５（McCartyら、１９９１年）とを同時トランスフェクトすることによって作製することができる。細胞を、アデノウイルス、またはＡＡＶヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝子を保有するプラスミドで、感染またはトランスフェクトさせてもよい。そのような形式で作製されたｒＡＡＶウイルスストックは、アデノウイルスが混入しており、（例えば、塩化セシウム密度遠心分離によって）ｒＡＡＶ粒子から物理的に分離しなければならない。代替的に、ＡＡＶコード領域を含有するアデノウイルスベクターまたはＡＡＶコード領域と一部もしくは全てのアデノウイルスヘルパー遺伝子を含有する細胞株を使用することができる（Yangら、１９９４年；Clarkら、１９９５年）。組込まれたプロウイルスとしてｒＡＡＶのＤＮＡを保有する細胞株も使用することができる（Flotteら、１９９５年）。
【０１２７】
ｖ．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターが、本開示において構築物として用いられ得る。ワクシニアウイルス（Ridgeway、１９８８年；BaichwalおよびSugden、１９８６年；Couparら、１９８８年）および単純ヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが用いられ得る。それらは、種々の哺乳動物細胞のためにいくつかの魅力的な機能を提供する（Friedmann、１９８９年；Ridgeway、１９８８年；BaichwalおよびSugden、１９８６年；Couparら、１９８８年；Horwichら、１９９０年）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、組込み型アデノベクターを使用して送達され得る。
【０１２８】
ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスの分子的にクローン化された株は、異種ウイルスタンパク質の発現のために複製可能なワクチンベクターとして遺伝的に精緻化されている（Davisら、１９９６年）。研究は、ＶＥＥ感染が強力なＣＴＬ応答を刺激することを実証しており、ＶＥＥが免疫化のための非常に有用なベクターであり得ることが示唆されている（Caleyら、１９９７年）。
【０１２９】
さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、特定の結合リガンドを発現するように操作された感染性ウイルス内に収容される。そのようにウイルス粒子は、標的細胞の同族受容体に特異的に結合し、細胞に内容物を送達する。レトロウイルスベクターの特異的標的化は、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づき得る。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染を可能にすることができる。
【０１３０】
例えば、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するおよび特定の細胞受容体に対するビオチン化抗体を使用した組換えレトロウイルスの標的化が設計された。抗体は、ストレプトアビジンを使用することによって、ビオチン成分を介して結合された（Rouxら、１９８９年）。主要組織適合性複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、エコトロピックウイルスによりこれらの表面抗原を有する様々なヒト細胞の感染がｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証された（Rouxら、１９８９年）。
【０１３１】
２．他の核酸送達方法
自殺遺伝子に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーターを含むポリヌクレオチドのウイルス送達に加えて、以下は、所与の宿主細胞に組換え遺伝子を送達するさらなる方法であり、したがって、本開示において考慮される。
【０１３２】
ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の導入は、本明細書に記載されるように、または当業者に公知のように、細胞の形質転換のために核酸を送達するための任意の適切な方法を使用し得る。そのような方法としては、裸のＤＮＡの注射などによるＤＮＡの直接送達、脂質ナノ粒子などのナノ粒子、遺伝子銃、ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクション（Wilsonら、１９８９年、Nabelら、１９８９年）、注射（それぞれ参照によって本明細書に組込まれる米国特許第５，９９４，６２４号、第５，９８１，２７４号、第５，９４５，１００号、第５，７８０，４４８号、第５，７３６，５２４号、第５，７０２，９３２号、第５，６５６，６１０号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号）、例えば、マイクロインジェクション（参照によって本明細書に組み込まれる、HarlandおよびWeintraub、１９８５年；米国特許第５，７８９，２１５号）による方法；エレクトロポレーションによる方法（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８４，２５３号；Tur-Kaspaら、１９８６年；Potterら、１９８４年）；リン酸カルシウム沈殿による方法（GrahamおよびVan  Der  Eb、１９７３年；ChenおよびOkayama、１９８７年；Rippeら、１９９０年）；ＤＥＡＥ−デキストラン、続いてポリエチレングリコールの使用による方法（Gopal、１９８５年）；直接超音波充填による方法（Fechheimerら、１９８７年）；リポソーム媒介トランスフェクションによる方法（NicolauおよびSene、１９８２年；Fraleyら、１９７９年；Nicolauら、１９８７年；Wongら、１９８０年；Kanedaら、１９８９年；Katoら、１９９１年）および受容体媒介トランスフェクションによる方法（WuおよびWu、１９８７年；WuおよびWu、１９８８年）；微粒子銃による方法（それぞれ参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／０９６９９および９５／０６１２８；米国特許第５，６１０，０４２号；第５，３２２，７８３号、第５，５６３，０５５号、第５，５５０，３１８号、第５，５３８，８７７号および第５，５３８，８８０号）；炭化ケイ素繊維との撹拌による方法（それぞれ参照によって本明細書に組み込まれるKaepplerら、１９９０年；米国特許第５，３０２，５２３号および第５，４６４，７６５号）；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（それぞれ参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９１，６１６号および第５，５６３，０５５号）；乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込みによる方法（Potrykusら、１９８５年）ならびにそのような方法の任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。このような技術の適用を通して、細胞小器官（単数または複数）、細胞（単数または複数）、組織（単数または複数）または生物（単数または複数）に、安定にまたは一過性に形質転換することができる。
【０１３３】
ｉ．エレクトロポレーション
本開示のある特定の実施形態では、遺伝子構築物は、エレクトロポレーションを介して標的細胞に導入される。エレクトロポレーションは、高電圧放電への細胞（または組織）およびＤＮＡ（またはＤＮＡ複合体）の曝露を含む。
【０１３４】
種々の供給源からの過剰増殖性細胞のためにエレクトロポレーション条件を最適化し得ることが企図されている。電圧、容量、時間およびエレクトロポレーション媒体組成などのパラメータを最適化することが特に望まれ得る。他の日常的な調整の実施は当業者に公知である。例えば、Hoffman、１９９９年；Hellerら、１９９６年を参照。
【０１３５】
ｉｉ．脂質媒介形質転換
さらなる実施形態では、自殺遺伝子に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーターを含むポリヌクレオチドは、リポソームまたは脂質製剤中に捕捉され得る。リポソームは、リン脂質二重膜および内側の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。多重層リポソームは、水性媒体によって分離されている複数の脂質層を有する。リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されるとき、それらは、自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自身で再編成を行い、脂質二重層間にある水および溶解された溶質を捕捉する（GhoshおよびBachhawat、１９９１年）。リポフェクタミンと複合体化された遺伝子構築物も企図されている（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）。
【０１３６】
外来ＤＮＡの脂質媒介核酸送達および発現がｉｎ  ｖｉｔｒｏで非常に首尾よく行われた（NicolauおよびSene、１９８２年；Fraleyら、１９７９年；Nicolauら、１９８７年）。Wongら（１９８０年）は、培養ニワトリ胚、ＨｅＬａおよび肝癌細胞における外来ＤＮＡの脂質媒介送達および発現の実現可能性を実証した。
【０１３７】
脂質に基づく非ウイルス製剤は、アデノウイルス遺伝子療法に代わるものを提供する。多くの細胞培養研究で、脂質に基づく非ウイルス遺伝子導入が記載されてきたが、脂質に基づく製剤を介した全身遺伝子送達は制限されている。非ウイルス性脂質に基づく遺伝子送達の主な制限は、非ウイルス送達ビヒクルを含むカチオン性脂質の毒性である。リポソームのｉｎ  ｖｉｖｏ毒性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏとの遺伝子導入の結果の差異を部分的に説明する。この相反するデータに寄与する別の要因は、血清タンパク質の存在下および非存在下での脂質ビヒクル安定性の差異である。脂質ビヒクルと血清タンパク質との間の相互作用は、脂質ビヒクルの安定特性に劇的な影響を有する（YangおよびHuang、１９９７年）。カチオン性脂質は、負に帯電した血清タンパク質を引きつけ、結合する。血清タンパク質に結合した脂質ビヒクルは、溶解するかまたはマクロファージに取り込まれ、循環から除去されるに至る。現在のｉｎ  ｖｉｖｏ脂質送達方法は、循環におけるカチオン性脂質に関連する毒性および安定性の問題を回避するために、皮下、皮内、腫瘍内、または頭蓋内注射を使用する。脂質ビヒクルと血漿タンパク質との相互作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Felgnerら、１９８７年）とｉｎ  ｖｉｖｏ（Zhuら、１９９３年；Philipら、１９９３年；Solodinら、１９９５年；Liuら、１９９５年；Thierryら、１９９５年；Tsukamotoら、１９９５年；Aksentijevichら、１９９６年）との遺伝子導入効率の差異の原因である。
【０１３８】
脂質製剤の進歩により、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子導入の効率が改善されている（Templetonら、１９９７年；ＷＯ９８／０７４０８）。１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）とコレステロールの等モル比からなる新規な脂質製剤は、全身のｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入を、約１５０倍に顕著に増強させる。ＤＯＴＡＰ：コレステロール脂質製剤は、「サンドイッチリポソーム」と呼ばれる特有の構造を形成する。この製剤は、陥入二重層、つまり「花瓶（vase）」構造の間に、ＤＮＡを「サンドイッチする」ことが報告されている。これらの脂質構造の有益な特性は、正のρ、コレステロールによるコロイド安定化、２次元ＤＮＡパッキング、および増加した血清安定性を含む。特許出願第６０／１３５，８１８号および第６０／１３３，１１６号は、本開示で使用し得る製剤を論じている。
【０１３９】
脂質製剤の製造は、（Ｉ）逆相蒸発、（ＩＩ）脱水−再水和、（ＩＩＩ）界面活性剤透析、および（ＩＶ）薄膜水和の後のリポソーム混合物の超音波処理または連続押し出しによって達成されることが多い。製造されると、脂質構造は、循環するときに毒性の化合物（化学療法剤）または不安定な化合物（核酸）を封入するために使用することができる。脂質封入化は、そのような化合物の毒性を下げ、血清半減期を延長させた（Gabizonら、１９９０年）。多くの疾患処置で、特に過剰増殖性疾患を処置するための療法である、従来療法の増強または新規療法の確立のために、脂質に基づく遺伝子導入戦略が使用されている。
【０１４０】
ｉｉｉ．細胞透過性ペプチド
本開示は、細胞透過性ペプチド（細胞送達ドメインまたは細胞形質導入ドメインとも呼ばれる）を、自殺遺伝子に作動可能に連結した細胞周期依存性プロモーターを含むポリヌクレオチドに融合またはコンジュゲートすることを企図する。そのようなドメインは当技術分野で周知であり、一般的に短い両親媒性またはカチオン性ペプチドおよびペプチド誘導体として特徴付けられ、複数のリジンおよびアルギニン残基を含有していることが多い（Fischer、２００７年）。特に興味深いのは、ＨＩＶ１由来のＴＡＴ配列、ならびにポリ−Ｄ−Ａｒｇおよびポリ−Ｄ−Ｌｙｓ配列（例えば、右旋性残基、長さ８残基）である。
【０１４１】
Ｂ．調節エレメント
本開示において有用なベクターに含まれる発現カセットは、特に、タンパク質コード配列に作動可能に連結される真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写終結／ポリアデニル化配列を（５’から３’方向に）含有する。真核細胞におけるタンパク質をコードする遺伝子の転写を制御するプロモーターおよびエンハンサーは、複数の遺伝的エレメントで構成されている。細胞機構は、各エレメントによって運ばれる調節情報を収集および統合することができ、異なる遺伝子が転写調節の異なる、しばしば複雑なパターンを進化させることを可能にする。本開示の文脈において使用されるプロモーターは、細胞周期依存性プロモーターを含む。
【０１４２】
１．プロモーター／エンハンサー
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される発現構築物は、自殺遺伝子の発現を駆動する細胞周期依存性プロモーターを含む。プロモーターは、一般的に、ＲＮＡ合成の開始部位を位置決めするように機能する配列を含む。この最もよく知られている例はＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター、例えば、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターでは、開始部位に横たわる個別のエレメント自体が、開始の場所を固定することを助ける。さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流領域に位置しているが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流に機能エレメントも含有することが示されている。コード配列をプロモーター「の制御下」とするために、あるコード配列は、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、３’の）転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端に位置する。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされるＲＮＡの発現を促進する。
【０１４３】
プロモーターエレメント間のスペーシングは、エレメントが互いに対して反転または移動するときにプロモーター機能が保存されるように、柔軟であることが多い。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間のスペーシングは、活性が低下し始める前に、５０ｂｐ離れるまで増加させることができる。プロモーターに依存して、個々のエレメントは協同してまたは独立に機能して転写を活性化できるようである。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用調節配列を指す「エンハンサー」と組み合わせて使用しても使用しなくてもよい。
【０１４４】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができるような、核酸配列に天然に関連するものであってもよい。このようなプロモーターは、「内在性」と称され得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する核酸配列に天然に関連するものであってもよい。代替的に、通常その天然の環境において核酸配列と関連しないプロモーターを指す組換えまたは異種プロモーターの制御下にコード核酸セグメントを配置することによってある特定の利点が得られる。組換えまたは異種エンハンサーは、その天然環境において核酸配列と通常関連していないエンハンサーも指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他のウイルスまたは原核もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然に存在」しない、すなわち異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーを含み得る。例えば、組換えＤＮＡ構築で最も一般的に使用されるプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系を含む。合成的にプロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を作製することに加えて、配列は、本明細書に開示される組成物に関連して、組換えクローニングおよび／またはＰＣＲ（商標）などの核酸増幅技術を使用して作製されてもよい（それぞれ参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，２０２号および第５，９２８，９０６号を参照）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核細胞小器官内の配列の転写および／または発現を指示する制御配列も同様に用いられ得ることが企図されている。
【０１４５】
当然のことながら、発現のために選択された細胞小器官、細胞型、組織、器官または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーターおよび／またはエンハンサーを用いることが重要である。分子生物学の当業者は、一般的に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組合せの使用を知っている（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるSambrookら、１９８９年を参照）。用いるプロモーターは、組換えタンパク質および／またはペプチドを大規模に生産する点に利点があるように、導入されたＤＮＡセグメントを高レベルで発現するように指示する適切な条件下で、構成的、組織特異的、誘導的および／または有用であってもよい。プロモーターは異種または内在性であってもよい。
【０１４６】
さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（例えば、ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／のワールドワイドウェブを通じた真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢによる）も、発現を駆動するために使用され得る。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用が、別の考えられる実施形態である。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝子発現構築物としてのいずれかで提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持することができる。
【０１４７】
前駆細胞を使用する細胞補充療法のために、細胞周期依存性プロモーターの制御下で遺伝子を発現することが好ましい。細胞周期依存性プロモーターの例としては、表１に列挙するものが挙げられるが、これらに限定されない。細胞周期依存性プロモーターは、細胞周期に関与する遺伝子、例えば、Ｇ（２）期および有糸分裂における発現を有する遺伝子から誘導され得る。細胞周期依存性プロモーターは、合成プロモーターを含んでもよい。細胞補充療法のために、一般的に、始原体は遊走能を維持し、変性領域に適切に組み込まれるべきである。
【０１４８】
【表１−１】
2019519239.tif 000002
【表１−２】
2019519239.tif 000003
【表１−３】
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【表１−４】
2019519239.tif 000005
【０１４９】
ある特定の態様では、本開示の方法は、エンハンサー配列、すなわち、プロモーター活性を増加させ、シスで、それらの配向にかかわらず、さらには比較的長い距離まで（標的プロモーターから数キロベース離れるまで）作用する能力を有する核酸配列にも関する。しかしながら、エンハンサーは、所与のプロモーターに近接して機能することもできるので、エンハンサー機能は必ずしもこのような長い距離に限定されるものではない。
【０１５０】
２．開始シグナルおよび連結した発現
特定の開始シグナルも、コード配列の効率的な翻訳のために、本開示で提供される発現構築物において使用され得る。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳制御シグナルが提供される必要があり得る。当業者はこれを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができる。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことが周知である。外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のいずれかであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを包含することによって増強され得る。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用が、多重遺伝子、またはポリシストロン性メッセージを作製するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回することができ、内部部位で翻訳を開始することができる（PelletierおよびSonenberg、１９８８年）。ピコルナウイルス科（ポリオおよび脳心筋炎）の２つのメンバーからのＩＲＥＳエレメントが記載されており（PelletierおよびSonenberg、１９８８年）、哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳも記載されている（MacejakおよびSarnow、１９９１年）。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結されていてもよい。それぞれがＩＲＥＳによって分離され、ポリシストロン性メッセージを作製する複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写することができる。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセスすることができる。複数の遺伝子が、単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現され、単一のメッセージを転写することができる（それぞれ参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，９２５，５６５号および第５，９３５，８１９号を参照）。
【０１５２】
さらに、ある特定の２Ａ配列エレメントを使用して、本開示で提供される構築物における遺伝子の連結した発現または共発現を生じさせることができる。例えば、切断配列を使用して、単一のシストロンを形成するオープンリーディングフレームを連結することによって遺伝子を共発現することができる。例示的な切断配列は、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）または「２Ａ様」配列（例えば、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）（MinskaiaおよびRyan、２０１３年）である。
【０１５３】
３．複製起点
宿主細胞でベクターを増殖させるために、それは複製部位の１つまたは複数の起点（しばしば「ｏｒｉ」と呼ばれる）、例えば、上記のＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列、または複製が開始される特定の核酸配列である、プログラミングの際に同様のまたは向上した機能を有する、遺伝子操作されたｏｒｉＰを含有してもよい。あるいは、上記の他の染色体外で複製するウイルスの複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）を用いてもよい。
【０１５４】
４．選択およびスクリーニング可能なマーカー
一部の実施形態では、本開示の構築物を含有する細胞は、マーカーを発現ベクターに含めることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで同定され得る。このようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を与え、発現ベクターを含有する細胞を容易に同定することを可能にする。一般的に、選択マーカーは選択を可能にする特性を付与するマーカーである。ポジティブ選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするマーカーである一方、ネガティブ選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるマーカーである。ポジティブ選択マーカーの例は薬物耐性マーカーである。
【０１５５】
薬物選択マーカーを含むことは、通常、形質転換体のクローニングおよび同定を補助する。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が、有用な選択マーカーである。条件の実施に基づいた形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーの他に、その基礎が比色分析であるＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含む他の種類のマーカーも企図されている。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのネガティブ選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素を利用してもよい。当業者は、おそらくはＦＡＣＳ分析と組み合わせて、免疫学的マーカーを用いる方法も知っている。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することが可能である限り、重要であるとは考えられない。選択およびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は当業者に周知である。
【０１５６】
Ｃ．自殺遺伝子およびプロドラッグ
一部の実施形態では、自殺遺伝子は、プロドラッグが投与されると、遺伝子産物をその宿主細胞を殺傷する化合物に移行させる核酸である。使用することができる自殺遺伝子／プロドラッグ組合せの例は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）とガンシクロビル、アシクロビルまたはＦＩＡＵ；酸化還元酵素とシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジレートキナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）とＡＺＴ；ならびにデオキシシチジンキナーゼとシトシンアラビノシドである。プロドラッグ６−メチルプリンデオキシリボシドを毒性プリン６−メチルプリンに変換するＥ．ｃｏｌｉプリンヌクレオシドホスホリラーゼも使用し得る。
【０１５７】
一部の実施形態では、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＴＫ）自殺遺伝子は、野生型または非変異ＨＳＶ  ＴＫ由来の１つまたは複数の変異を有し得る。本明細書で利用される場合、「非変異チミジンキナーゼ」は、McKnightら（Nucl.  Acids  Res.、８巻：５９４９〜５９６４頁、１９８０年）によって記載されているものなどの天然または野生型チミジンキナーゼを指すと理解されるべきである。ＴＫ変異体は、ＨＳＶ  ＴＫの１５９〜１６１残基および１６８〜１６９残基で１つまたは複数のアミノ酸置換（Blackら、Proc.  Nat’l  Acad.  USA、９３巻：３５２５〜３５２９頁、１９９６年）を有し得る。本方法で使用されるＴＫ変異体は、ＳＲ１１、ＳＲ２６、ＳＲ３９、ＳＲ４、ＳＲ１５、ＳＲ３２またはＳＲ５３  ＴＫ変異体であってもよい。例えば、ＨＳＶ  ＴＫは、ＨＳＶ１−ＳＲ３９ＴＫ（すなわち、１５９ＩＦＬ１６１および１６８ＦＭ１６９；１５９位でのアミノ酸置換がロイシンからイソロイシンであり、１６０位でのアミノ酸置換がイソロイシンからフェニルアラニンであり、１６１位でのアミノ酸置換がフェニルアラニンからロイシンであり、１６８位でのアミノ酸置換がアラニンからフェニルアラニンであり、１６９位でのアミノ酸置換がロイシンからメチオニンである）であることができ、この変異体は、プロドラッグのアシクロビルおよび／またはガンシクロビルを細胞傷害剤に変換する増強された能力を有する（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１３００１１９０３号および第２０１２０１４２０７１号）。
【０１５８】
変異は、ＤＲＨヌクレオシド結合部位の上流であっても下流であってもよい。例えば、ＤＲＨヌクレオシド結合部位の上流の１〜７個のアミノ酸からの１つまたは複数のアミノ酸置換をコードする変異が企図される。このようなキナーゼの生物学的活性は、本明細書に記載されるアッセイのいずれか、例えば、ヌクレオシドアナログの取り込み速度の決定、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログのリン酸化速度の決定を利用して容易に決定することができる。さらに、熱安定性およびタンパク質安定性などの他の生物学的特性によって特徴付けられるチミジンキナーゼ変異体は容易に選択され得る（例えば、米国特許第６，４５１，５７１号に記載）。
【０１５９】
簡単に述べると、本開示のチミジンキナーゼ変異体は、例えば、霊長類ヘルペスウイルスおよび鳥類ヘルペスウイルスなどの非霊長類ヘルペスウイルスを含む多種多様なヘルペスウイルス科チミジンキナーゼから調製することができる。適切なヘルペスウイルスの代表的な例としては、単純ヘルペスウイルス１型（McKnightら、Nuc.  Acids  Res、８巻：５９４９〜５９６４頁、１９８０年）、単純ヘルペスウイルス２型（SwainおよびGalloway、J  Virol.、４６巻：１０４５〜１０５０頁、１９８３年）、水痘帯状疱疹ウイルス（DavisonおよびScott、J.  Gen.  Virol．、６７巻：１７５９〜１８１６頁、１９８６年）、マーモセットヘルペスウイルス（OtsukaおよびKit、Virology、１３５巻：３１６〜３３０頁、１９８４年）、ネコヘルペスウイルス１型（Nunbergら、J.  Virol.、６３巻：３２４０〜３２４９頁、１９８９年）、仮性狂犬病ウイルス（KitおよびKit、米国特許第４，５１４，４９７号、１９８５年）、ウマヘルペスウイルス１型（RobertsonおよびWhalley、Nuc.  Acids  Res.、１６巻：１１３０３〜１１３１７頁、１９８８年）、ウシヘルペスウイルス１型（MittalおよびField、J.  Virol、７０巻：２９０１〜２９１８頁、１９８９年）、七面鳥ヘルペスウイルス（Martinら、J.  Virol.、６３巻：２８４７〜２８５２頁、１９８９年）、マレック病ウイルス（Scottら、J.  Gen.  Virol.、７０巻：３０５５〜３０６５頁、１９８９年）、ヘルペスウイルスサイミリ（Honessら、J.  Gen.  Virol.、７０巻：３００３〜３０１３頁、１９８９年）およびエプスタイン・バーウイルス（Baerら、Nature（Ｌｏｎｄｏｎ）、３１０巻：２０７〜３１１頁、１９８４年）が挙げられる。
【０１６０】
そのようなヘルペスウイルスは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）などの商業的供給源から容易に取得することができる。上で同定されたヘルペスウイルスのいくつかの寄託物は、ＡＴＣＣから容易に取得することができ、例えば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５３９（単純ヘルペス１型）、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−７３４およびＶＲ−５４０（単純ヘルペス２型）、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５８６（水痘帯状疱疹ウイルス）、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−７８３（感染性喉頭気管炎（laryngothracheitis））、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−６２４、ＶＲ−９８７、ＶＲ−２１０３、ＶＲ−２００１、ＶＲ−２００２、ＶＲ−２１７５、ＶＲ−５８５（マレック病ウイルス）、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５８４ＢおよびＶＲ−５８４Ｂ（七面鳥ヘルペスウイルス）、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−６３１およびＶＲ−８４２（ウシヘルペスウイルス１型）ならびにＡＴＣＣ番号ＶＲ−２００３、ＶＲ−２２２９およびＶＲ−７００（ウマヘルペスウイルス１型）であり得る。またヘルペスウイルスは、天然に存在する供給源から（例えば、感染した動物から）容易に単離され、同定され得る。
【０１６１】
本開示で使用されるチミジンキナーゼ変異体は、多種多様な技術を使用して構築することができる。例えば、変異は、天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位によって隣接される、変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に導入され得る。ライゲーション後、得られる再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードしている。
【０１６２】
代替的に、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発手法が、必要な置換、欠失、または挿入に応じて改変された特定のコドンを有する改変遺伝子を提供するために用いられ得る。チミジンキナーゼ変異体の欠失または切断誘導体は、所望の欠失に隣接する、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによっても構築することができる。制限に続いて、オーバーハングを充填してもよく、ＤＮＡを再びライゲートしてもよい。上記の変化を作製する例示的な方法は、Sambrookら（Molecular  cloning:A  Laboratory  Manual、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９８９年）によって開示されている。
【０１６３】
チミジンキナーゼ変異体は、ＰＣＲ変異誘発、化学的変異誘発（DrinkwaterおよびKlinedinst、PNAS、８３巻：３４０２〜３４０６頁、１９８６年）の技術、強制ヌクレオチド誤取り込みによる技術（例えば、LiaoおよびWise  Gene、８８巻：１０７〜１１１頁、１９９０年）またはランダム変異誘発オリゴヌクレオチドの使用による技術（Horwitzら、Genome、３巻：１１２〜１１７頁、１９８９年）を利用して構築することもできる。
【０１６４】
【表２−１】
2019519239.tif 000006
【表２−２】
2019519239.tif 000007
【０１６５】
ＩＶ．使用方法
本開示のベクター（例えば、シュードタイプレンチウイルスベクター）によって遺伝子が導入されたＰＳＣならびにこれらのＰＳＣから分化した細胞、組織、器官などは、種々の種類の医薬物質のアッセイおよびスクリーニングのために有用である。ＰＳＣへの遺伝子導入を介して、例えば、組織または細胞、特に好ましくは霊長類由来の組織または細胞の特異的分化を行う医薬物質または遺伝子を、それらの効果について評価し、またはスクリーニングしてもよい。
【０１６６】
本開示は、本開示のベクター（例えば、シュードタイプレンチウイルスベクター）が導入されたＰＳＣならびにＰＳＣから分化した分化細胞および組織も包含する。分化した細胞および組織は、マーカー発現、および組織または細胞に特異的な形態学的特徴に基づいて同定することができる。
【０１６７】
Ａ．処置方法
一部の実施形態では、本開示は、細胞周期依存性プロモーターの制御下で自殺遺伝子を含む前駆細胞の集団を投与することを含む、対象における疾患または障害を処置する方法を提供する。前駆細胞は、本質的に分裂しない細胞である細胞を補充するために使用することができ、あらゆる残留する周期するまたは増殖細胞は、これらの周期する細胞を選択的に死滅させるプロドラッグを投与することによって、排除することができる。したがって、この方法は、残留周期する細胞からの奇形腫または腫瘍の形成を防止することができる。
【０１６８】
処置方法は、ある特定の細胞集団の補充から利益を得ることができる任意の疾患または障害に適用することができる。例えば、神経疾患は、前駆細胞の投与によって処置することができる。腫瘍血管新生などの血管系に影響する疾患は、内皮前駆細胞の投与によって処置することができる。心筋前駆細胞が、心疾患の処置に使用されてもよく、膵前駆細胞が、膵疾患の処置に使用されてもよい。本開示の他の前駆細胞療法は、腎前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、造血前駆細胞、骨髄前駆細胞、間葉前駆細胞、網膜前駆細胞および破骨前駆細胞を含み得るが、これらに限定されない。
【０１６９】
ヒトにおいて、ＣＮＳに影響を与える多くの疾患があり、それらの多くは、ディスメトリア、運動失調、パストポインティング（past  pointing）、拮抗運動反復不全、構音障害、企図および行動振戦、小脳眼振、リバウンド、筋緊張低下、および平衡失調などの随伴症状と共に小脳変性に至る。これらの疾患は、本明細書に開示された特定の実施形態に係る細胞補充療法を使用して緩和することができる。
【０１７０】
本開示の方法を使用する処置に適しているヒトにおけるＣＮＳおよび脳の疾患としては、多種多様な疾患および障害が挙げられ、例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病（孤発性と家族性の両方）、パーキンソン病ならびにパーキンソン病様症状、例えば筋振戦、筋力低下、剛性、動作緩慢、姿勢および平衡の変化および認知症；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；脊髄損傷；重度のてんかん；外傷性脳損傷などが挙げられる。
【０１７１】
したがって本開示の方法は、脱髄、髄鞘形成不全、認知症、ディスメトリア、運動失調、パストポインティング、拮抗運動反復不全、構音障害、企図および行動振戦、小脳眼振、リバウンド、筋緊張低下、および平衡失調に至るＣＮＳおよび小脳の異常を軽減するために使用することができる。パーキンソン病を有する患者が、線条体を神経支配する大脳基底核内のドーパミン作動性ニューロンの損失により、進行性の運動制御失調を被ることはよく確立されている。神経前駆細胞は、ドーパミン作動性の破滅に対して指示することができ、過成長および腫瘍形成を防止するために、本明細書に記載のシステムを使用して線条体に送達させることができる。同様に、本開示の神経前駆体は、アルツハイマー病の処置に使用するために、コリン作動性の破滅に対して指示することができる。
【０１７２】
本開示の方法は、家庭内愛玩動物および農業用動物の処置を含む獣医学分野における使用も有する。本明細書で利用される場合、「処置、防止または阻害」という用語は、統計学的に有意な様式での疾患の経過または進行の変化を指す。疾患の経過が変化したかどうかの決定は、ＣＮＳまたは小脳変性を遅延または防止する遺伝子送達ベクターの能力を分析する当技術分野で公知の標準的なアッセイを使用することによって、様々なモデル系で容易に評価することができる。
【０１７３】
遺伝子送達ベクターは、針、カテーテルまたは関連デバイスを使用して、注射によって、ＣＮＳまたは脳に、例えば脳室、小脳小葉および／または線条体内に直接送達することができる。特に、本開示のある特定の実施形態では、１つまたは複数の投与量は、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０または１０１１ｃｆｕまたはそれより多くの投与量で、示される様式で直接投与されてもよい。小脳の注射は、注射部位を正確に標的とするために定位座標を使用することができないという事実によって複雑である；小脳小葉の大きさならびにそれらの絶対３次元配向に動物間で変動がある。したがって、コレラ毒素サブユニットｂ（ＣＴｂ）を、注射の正確な位置を決定し、注射部位での形質導入可能なニューロンのプールを明らかにするために、使用してもよい。注射は、分子層、プルキンエ細胞層、顆粒細胞層、および小脳活樹の白質を充填し得るが、深部小脳核には至らない。
【０１７４】
代替的におよび好ましくは、形質導入された神経始原細胞を使用して疾患を処置するために、神経始原細胞を、最初にｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入し、次いでＣＮＳに送達させる。一般的に、ｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入される場合、細胞は、約０．０１〜約５０、好ましくは約０．０５〜約３０、および最も好ましくは約０．１〜約２０ＭＯＩのＭＯＩで、本明細書に記載のウイルスベクターで感染される。ＦＩＶベクターについては、約０．０５〜約１０、好ましくは約０．１〜約５、またはさらには０．１〜約１のＭＯＩが十分であるべきである。一旦ｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされたら、細胞を、例えば、脳室領域に、ならびに当技術分野で公知の、および下記実施例に記載されるような神経外科技術を使用して、例えば眼および耳への定位注射（単数および複数）によって、線条体、脊髄および神経筋接合部に送達することができる（例えば、Steinら、J  Virol、７３巻：３４２４〜３４２９頁、１９９９年；Davidsonら、PNAS、９７巻：３４２８〜３４３２頁、２０００年；Davidsonら、Nat.  Genet.、３巻：２１９〜２２３頁、１９９３年；ならびにAliskyおよびDavidson、Hum.  Gene  Ther.、７７巻：２３１５〜２３２９頁、２０００年を参照）。一般的に、対象に送達される組成物中の形質導入された細胞の量は、約１０１〜約１０１０細胞またはそれより多く、より好ましくは約１０１〜１０８細胞またはそれより多く、さらにより好ましくは約１０２〜約１０４細胞またはそれより多い。他の有効な投与量は、用量応答曲線を確立する日常的試験を通じて当業者によって容易に確立することができる。
【０１７５】
多種多様なアッセイが、投与のための適切な投与量を決定するために、または特定の疾患を処置もしくは防止する遺伝子送達ベクターの能力を評価するために利用され得る。これらのアッセイのいくつかは、以下でより詳細に論じられる。例えば、小脳ニューロンおよび神経始原細胞に形質導入するための特定のベクターの能力は、後述のように、レポーター遺伝子を使用して評価することができる。形質導入された始原細胞が分化する能力は、例えば、実施例において後述されるような免疫細胞化学を使用して、試験することができる。
【０１７６】
全身投与のために、治療的有効用量は、最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから推定することができる。例えば、用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように、動物モデルで定式化することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。療法は、症状が検出可能である間、または症状が検出されないときでさえ、断続的に繰り返してもよい。療法は、単独で、または他の薬物と組み合わせて提供することができる。
【０１７７】
初回投与量は、当技術分野で周知である技術を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから推定することもできる。当業者は、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。
【０１７８】
Ｂ．医薬調製物
本開示の治療用細胞集団を含有する組成物の臨床応用が行われる場合、意図する用途に適切な医薬組成物を調製することが一般的に有益であろう。このためには、本質的に発熱物質、およびヒトまたは動物に有害となり得る任意の他の不純物も含まない医薬組成物を調製することが、典型的に必要である。
【０１７９】
「薬学的にまたは薬理学的に許容される」という語句は、動物、例えばヒトに、適切に投与されたときに、有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない、分子実体および組成物を指す。阻害性核酸または追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は、参照によって本明細書に組み込まれるRemington（２００５年）によって例示されるように、本開示に照らして当業者には公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）投与のために、調製物は、ＦＤＡ局の生物学的基準によって要求される無菌状態、発熱原性、全体的安全性および純度基準を満たすべきであることが理解される。
【０１８０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知であるような、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩類、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、同様の材料、およびそれらの組合せを含む。薬学的に許容される担体は、ヒトへの投与のために特に製剤化されたものであるが、ある特定の実施形態では、非ヒト動物への投与のために製剤化されたが、ヒトへの投与には（例えば、政府の規制により）許容されない、薬学的に許容される担体を使用することが望ましい場合がある。任意の従来の担体は、活性成分と適合性がないものでない限り、治療用組成物または医薬組成物での使用が企図されている。
【０１８１】
実施形態の本療法は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に（intravesicularlly）、経粘膜で、心膜内に、臍帯内に（intraumbilically）、眼内に、経口で、局所的に、局部的に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）により、注射で、注入で、連続注入で、標的細胞を直接浸す局部的灌流で、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）で、または当業者に公知であるような他の方法またはこれらの任意の組合せによって、投与することができる。
【０１８２】
患者または対象に投与される本開示の組成物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、処置される疾患の種類、先のまたは同時の治療介入、患者および投与経路の特発性などの物理的および生理的要因によって決定することができる。投与を担当する施術者は、いずれにしても、個々の対象のために、組成物における活性成分の濃度および適切な用量を決定する。非限定的な例では、投与することができる用量は、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ／体重を含み得る。
【実施例】
【０１８３】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。次の実施例に開示されている手法は、本発明者によって発見された、本発明の実施で十分に機能するための手法を表し、したがって本発明を実施するための好ましい様式を構成するものとみなすことができることを当業者は理解するはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更をなすことができ、それでもなお、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、類似のまたは同様の結果が得られ得ることを理解するはずである。
【０１８４】
（実施例１）
増殖性細胞の標的化
ＴＫ−ＰＳＣ株の生成：本研究の目的は、ＰＳＣ由来の移植された神経細胞の制御不能な過成長の防止に向けた自殺遺伝子アプローチを開発することであった。多くの理由から、ガンシクロビルおよび単純ヘルペスチミジンキナーゼは、このような自殺遺伝子技術のための魅力的なシステムである。実際、ガンシクロビルは、患者で広く使用されており、中枢神経系に入り込む。しかしながら、ＨＳＶ−ＴＫの構成的発現は、移植された細胞の免疫拒絶につながる可能性があるため、望ましくなく、ガンシクロビルの使用は、機能的な移植ニューロンの殺傷につながる可能性がある。
【０１８５】
したがって、ＨＳＶ−ＴＫを、細胞周期依存性のＫｉ６７プロモーター断片の制御下で発現させた。この目的のために、ヒト多能性ＥＳＣ（ｈＰＳＣ）株ＨＳ４１５を、Ｋｉ６７プロモーター断片の制御下で、ＨＳＶ−ＴＫの発現をコードするレンチベクターで形質導入した（Zambon、２０１０年）。ｈＰＳＣのレンチベクター形質導入効率は１０〜２０％の範囲にあるので、形質導入された細胞の選択のための手段が必要であった。したがって、使用された構築物は、ゼオシン耐性配列に融合したＨＳＶ−ＴＫ配列を含んでいた。ＨＳＶ−ＴＫ陽性細胞を、ゼオシンの存在下で形質導入されたｈＥＳＣを培養することによって選択した（図１Ａ）。ポリクローナルＨＳＶ−ＴＫ発現ＰＳＣ株を得て、本明細書でＴＫ−ＰＳＣと称する。ＴＫ−ＰＳＣから神経前駆細胞および成熟ニューロンを得て、それぞれＴＫ−ＮＰＣおよびＴＫ−ニューロンと称する（図１Ｂ、１Ｃ）。
【０１８６】
Ｋｉ６７／ＴＫを発現する高増殖性細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでガンシクロビルに感受性である：次いで、ＴＫ発現をＴＫ−ＰＳＣおよびＴＫニューロンで調べた。ＴＫ−ＰＳＣでは、細胞の実質的に１００％が、これらの細胞でのＫｉ６７の高発現と一致して、ＴＫを発現した（図１Ｃ、上パネル）。対照的に、ＴＫニューロンは、有糸分裂後の細胞であることから予測されるように、何らＴＫを発現しなかった。しかしながら、ニューロン調製において、Ｋｉ６７陽性細胞は依然として存在した（図１Ｃ、下パネル）。ニューロン調製におけるＫｉ６７陽性細胞の多くが、長い神経突起伸展を有する成熟したニューロンの形態を明確に示したので、これらのＫｉ６７陽性細胞は増殖細胞の存在をおそらく反映していない。Ｋｉ６７の発現を、フローサイトメトリーによる多能性マーカーｎａｎｏｇおよびｏｃｔ３／４の発現と共にも調査した。ＰＳＣでは、実質的に全ての細胞が、Ｋｉ６７、ｎａｎｏｇおよびｏｃｔ３／４陽性であった。対照的に、ＮＰＣは、１週間の神経球分化後に多能性マーカーを急速に失い、一方でＫｉ６７発現は、３週間の分化後に、バックグラウンドを少し超えるレベルで、よりゆっくりと減少した（図２Ａ）。
【０１８７】
ガンシクロビルのＴＫ細胞に対する影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定した（図２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ）。ＴＫ  ＰＳＣはガンシクロビル曝露に高感受性であり（９６時間）、２．５μＭのガンシクロビル濃度でも細胞の消失が観察され、１０μＭでほぼ完全に消失した（図２Ｂ、２Ｃ）。対照的に、通常のＰＳＣ（すなわち、ＴＫ構築物で形質導入されていない）は、４０μＭの濃度でもガンシクロビルに耐性であった（図２Ｂ、２Ｆ）。ＴＫニューロンではＴＫ発現がないことから予測されるように、ＴＫニューロンは、対照ニューロンと同様に、４０μＭまでガンシクロビル濃度による影響を受けなかった。
【０１８８】
ガンシクロビル効果の時間経過も調べた（図２Ｄ）。ＴＫ  ＰＳＣは、ガンシクロビル（４０μＭ）によって、４日以内に殺傷された。ＴＫ−ＮＰＣは１週間の神経球分化後にガンシクロビル（４０μＭ）に依然として感受性であったが、殺傷の時間経過は著しく遅くなり、完全な殺傷は８日後に初めて観察された。２週間の神経球分化後のＴＫ−ＮＰＣはわずかしか細胞成長を示さず、ガンシクロビルによって殺傷されなかった。
【０１８９】
初期ガンシクロビル処置は、高増殖性多能性幹細胞の移植に際して腫瘍形成を防止するが、後期ガンシクロビル処置は防止しない：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有望な結果を考慮して、ガンシクロビルがｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍形成を防止するかどうかを調べた。この目的のために、ＴＫ−ＰＳＣを、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの線条体に移植した。ガンシクロビルの非存在下で、移植後４９日目に屠殺したマウスは、一貫して奇形腫を発生し（図４Ａ）、この奇形腫はヒト細胞（ＨＣＭ陽性）で構成され、Ｋｉ６７およびＫｉ６７プロモーター駆動ＨＳＶ−ＴＫの大量の発現を示した（図５Ａａ）。中程度の量のマウスミクログリアの浸潤があった。対照的に、ガンシクロビルで１５日間処置（移植後４日目で開始）したマウスでは、奇形腫は観察されなかった（図４Ｂ）。ガンシクロビルで処置したマウスではヒト細胞はほとんど残らず、生き残った少数のヒト細胞は、ＨＳＶ−ＴＫについて陰性であり、かなりの程度までＫｉ６７についても陰性であり、このことから、少数の生き残ったヒト細胞は有糸分裂後となっており、それゆえガンシクロビルへの感受性を失ったことが示唆された（図５Ｂａ）。このように、ガンシクロビルは、移植されたＴＫ−ＰＳＣによる奇形腫形成を防止した。
【０１９０】
次に、ガンシクロビルが、既に確立された奇形腫を処置するためにも使用することができるかどうかを調べた。したがって、奇形腫形成を３０日間進行させ（予備的な結果は、この時間遅延内で、ＰＳＣの移植に際して一貫して奇形腫形成があったことを示した）、移植後３０〜４５日間ガンシクロビル（またはＰＢＳ）で処置した。ガンシクロビル処置の終了後３０日目にマウスを屠殺した。これらの条件下で、ＰＢＳおよびガンシクロビル処置動物の両方で奇形腫形成があった（図６）。ＣＤ３１染色は腫瘍が血管形成されたことを示し、灌流を欠くことが、確立された腫瘍においてガンシクロビルの治療効果がないことを説明しないことが示唆された。同様に、多くの奇形腫細胞が高レベルのＨＳＶ−ＴＫ発現を示し、導入遺伝子の下方制御は治療応答がないことの説明にならないことが示唆された。
【０１９１】
以前の研究（Chalmersら、２００１年）で、潜在スプライスドナーおよびアクセプター部位による選択的スプライシングが、不活性ＴＫの形成につながり得ることが示唆された。別の研究（Kotiniら、２０１６年）では、様々な非センス変異が、急速に成長する細胞のＴＫ配列で起こり得、ガンシクロビル耐性を説明し得ることが示唆された。したがって、ｍＲＮＡを、未分化の多能性細胞の注射に際して形成された腫瘍から抽出した。これらのｍＲＮＡ調製物から、全ＴＫ配列の８５％に相当する全１１６２ヌクレオチドに及ぶＴＫタンパク質の５つの領域を増幅した（図７Ａ）。シーケンシングされる領域には、提唱された潜在スプライス部位も含めた（例えば、アンプリコン３）。ＰＣＲ産物を直接シーケンシングした（図７Ｂ）。このシーケンシングの結果は、腫瘍で見出される配列が全面的にプラスミドＨＳＶ−ＴＫ配列と同一であることを決定し、変異が発生したならば、それらの配列は腫瘍内のＨＳＶ−ＴＫ配列の大半を表すものでないことが示唆された。シーケンシング結果の検査は、曖昧なシーケンシングシグナルに関する証拠を何ら示さなかった。加えて、前述の潜在スプライス部位は、配列のこのバージョンでは（プラスミド配列においても腫瘍由来配列においても）存在しなかった；したがって、いかなるスプライスバリアントもシーケンシング結果では検出されなかった。
【０１９２】
変異を有する少数配列が、腫瘍内に発生していたかどうかを調べるために、ＰＣＲアンプリコンのうちの２つをサブクローン化し、シーケンシングした。アンプリコン５のサブクローンに変異は観察されなかった：対照的に、アンプリコン３のサブクローンの２つにおいて、ＴＫ酵素の重要な部位（ＡＴＰおよびヌクレオチド結合部位）（Andreiら、２００５年）に位置していない単一点変異（図７Ｃ）が存在した。
【０１９３】
ＴＫ−ＮＰＣの移植は、ガンシクロビル処置に感受性でない成熟ニューロンを生じた：これまで示されたｉｎ  ｖｉｖｏの結果は、未分化多能性幹細胞の移植で得られた。しかしながら、ニューロン細胞療法の最終目標は、成熟ニューロンに分化し、かつガンシクロビル処置に耐性であるべきである神経前駆細胞移植である。したがって、２〜３週のＮＰＣ含有神経球を移植した（図３Ｃ、８）。これらの条件下で、腫瘍形成は、ガンシクロビル処置の非存在下でも観察されなかった（図８Ａ）。これらの観察と一致して、移植された細胞（移植後７週間の免疫蛍光により評価）は、多くがベータ３チューブリンに陽性であり（図８Ｂ、上パネル）、一方で、ほんのわずかな細胞がＴＨ陽性であった（図８Ｂ、下パネル）。ネスチン陽性細胞がちらほら観察された。これらのマーカーはいずれも、ガンシクロビル処置による影響を受けなかった。
【０１９４】
細胞増殖マーカーを、ＰＣＮＡおよびＫｉ６７に対する抗体を用いて移植体を染色することによって分析した（図８Ｃ）。驚くべきことに、移植された細胞の多くは、ＰＣＮＡ陽性であり、一方で移植体のＫｉ６７染色は少ないかなかった。ガンシクロビル処置は、このパターンを変化させなかった（図８Ｃ、左パネル、対照および右パネル、ガンシクロビル処置）。ＰＣＮＡ陽性、Ｋｉ６７陰性細胞が増殖細胞であるかどうかを検証するために、ＢｒｄＵ実験を実施した。有意なＢｒｄＵ染色は観察されず（図８Ｃ、挿入図）、このことから、Ｋｉ６７がないことは、有糸分裂後の細胞を正しく示し、ＰＣＮＡ発現は、増殖停止後でさえ持続している可能性があることが示唆された。
【０１９５】
異なる実験条件下で腫瘍形成およびガンシクロビルに対する応答を比較するために、移植片表面を定量した（図８Ｄ）。ＰＳＣが移植されたとき、大きな腫瘍（移植片表面約１０〜１５ｍｍ２）が発達し、これは初期ガンシクロビル処置によって完全に防止されたが、後期ガンシクロビル処置は腫瘍の大きさに何ら影響を与えなかった。最後に、ＮＰＣ（２〜３週齢の神経球から誘導）の移植に際して小さな非腫瘍移植体（移植片表面約２〜３ｍｍ）が観察された。これらの移植体の大きさは、ガンシクロビルによって影響を受けなかった。
【０１９６】
したがって、本方法は、神経移植体から、潜在的に腫瘍形成性の増殖細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ除去することを可能にする新規手段を提供する。このシステムは、細胞周期依存性Ｋｉ６７プロモーターの制御下のＨＳＶ−ＴＫの発現に基づく。それは多能性幹細胞由来ニューロンの移植のために特に有用である。実際、ＨＳＶ−ＴＫ発現細胞は、臨床的に使用されるＣＮＳ浸透薬物ガンシクロビルで患者を処置することによって排除することができる。Ｋｉ６７プロモーターは、成熟ニューロンで不活性であるので、ガンシクロビルを用いた処置は、増殖前駆体を排除するにすぎないが、分化した有糸分裂後ニューロンの完全性を維持する。
【０１９７】
（実施例２）
材料および方法
未分化多能性幹細胞の培養：ヒトＥＳ細胞株ＨＳ４１５（第１７〜３０継代から使用、Ｏｕｔｉ  Ｈｏｖａｔｔａ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、フィーダーを含まない培養培地（Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）中のヒト細胞外マトリックス（ＭＡＸＧＥＬ（登録商標）ＥＣＭ、１／５０希釈、Ｓｉｇｍａ製、またはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、１／１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で培養した。培地を隔日で交換して多能性を維持した。細胞を、酵素的手法（ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で継代し、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（１０μＭのＹ−２７６３２；Ａｓｃｉｅｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に再播種し、２４時間後に取り出した。
【０１９８】
レンチウイルスベクターの構築、細胞の形質導入および選択：プラスミドおよびレンチウイルスベクターの構築：最終レンチベクタープラスミドを、ＨｓＫｉ６７プロモーター（ｐＥＮＴＲ−Ｌ４−Ｋｉ６７−Ｌ１Ｒ）を含有するｐＥＮＴＲプラスミドと、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）由来のチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子およびゼオシン耐性を付与するＳｈｂｌｅ遺伝子に対応する融合遺伝子ＴＫ：：Ｓｈを含有するｐＥＮＴＲプラスミドと、ｐＣＬＸ−Ｒ４−ＤＥＳＴ−Ｒ２レンチベクターデスティネーションカセットとのＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）媒介組換えによって生成した。
【０１９９】
レンチウイルスベクターの産生および滴定：レンチウイルスベクターストックを、特定のレンチベクタートランスファープラスミドと、ｇａｇ／ｐｏｌをコードするｐｓＰＡＸ２プラスミドと、ｐＣＡＧ−ＶＳＶＧエンベローププラスミドとによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションを使用して生成した。レンチベクターの力価を、ＨＴ−１０８０細胞の形質導入、続いて感染の５日後のＧＦＰ陽性細胞のフローサイトメトリー定量を使用して行った。細胞培養：ＨＥＫ２９３ＴおよびＨＴ−１０８０細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシンおよび１％Ｌ−グルタミンを補足した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ）で培養した。ＨＳ４１５細胞株の形質導入：１〜最大５コピーのレンチウイルスベクターを導入した。ＨＳ４１５細胞を５日間培養した後、ゼオシン選択を行った。
【０２００】
ＤＡ神経前駆体を含有する神経球の生成：ＮＰＣを、以前に記載されたように、ＤＡ始原体を含有する神経球として生成した（Tiengら、２０１４年）。簡単に述べると、神経中脳オリエンテーションを最初の１週間行い、続いてさらに２週間成熟させ、１週齢または２もしくは３週齢のＮＰＣを得る（図１Ｂ、３Ａ）。
【０２０１】
二次元培養（２Ｄ）におけるＮＰＣの生成：２Ｄでの分化のために、３週齢の神経球を、ＡＣＣＵＭＡＸ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて解離し、２４ウェルプレート中のポリオルニチン（１５μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）およびラミニン（２μｇ／ｃｍ２；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）被覆カバースリップ（直径＝０．８ｃｍ）上に、成熟培地中２００，０００細胞／ｃｍ２で再播種し、１週間後、免疫蛍光染色によって分析した（図１Ｂ）。
【０２０２】
フローサイトメトリー：未分化ＥＳ細胞を、ヒトマトリックス（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から、単一細胞として酵素的に切り離し、ＰＢＳで洗浄した後、室温で４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で１０分間固定ステップを行った。１週齢または３週齢の神経球を解離した（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。検出された細胞内抗原に対して、細胞を１×ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で１０分間透過処理した後、３０分間、暗室内、室温で、異なる抗体（ＰＥ  ＮａｎｏｇおよびＰｅｒＣｐ−Ｃｙ  ５．５  Ｏｃｔ３／４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製、ＦＩＴＣ−ｋｉ６７、ウサギ、Ａｂｃａｍ製）とインキュベーションした。洗浄後、細胞を直ぐに実行に用いるか、または４℃で最大２４時間保存した。各試料の実行について、１０，０００事象を記録し、分析した。フローサイトメトリー取得は、４８８および６３３レーザー（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を備えたＦａｃｓＣａｎｔｏ  Ｉ機器を使用して行い、データ分析はＦｌｏｗｊｏソフトウェアによって行った。
【０２０３】
固定された細胞の免疫蛍光染色：１週間の培養後、カバースリップ上の２Ｄ培養物を４％ＰＦＡ中に室温で１０分間固定し、洗浄し、従来の免疫細胞化学の処理をした。パラフィン包埋した脳を切片化し、形態学的評価および免疫組織化学染色のためにクレシルバイオレットで処理した。一次抗体を、細胞についてはＰＢＳ＋０．１％トリトン中で、組織については０．３％トリトン中で、撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。顕色は、室温で３０分間二次抗体を用いて行う。
【０２０４】
一次抗体は、ネスチン（ウサギポリクローナル抗ヒト、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製；１／４００）、β３−チューブリン（マウスモノクローナル、Ｓｉｇｍａ製、またはウサギポリクローナル、Ｃｏｖａｎｃｅ製；１／２，０００、ニューロン核特異的タンパク質（ＮｅｕＮ、マウスモノクローナル、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製；１／１，０００）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、ウサギポリクローナル、Ｄａｋｏ製；１／２，０００）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ、マウスモノクローナル、Ｄａｋｏ製；１／１００）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ウサギポリクローナル、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製；１／５００）に対するものであった。一次抗体の検出は、適切な種特異的Ａｌｅｘａ４８８またはＡｌｅｘａ５５５標識二次抗体を使用して行った。対照は、細胞または組織の自家蛍光および第１の抗体の脱落の検査を含んだ。細胞核をＤＡＰＩで染色した。切片および細胞培養物を、Ｆｌｕｏｒｏｓａｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）またはＥｕｋｉｔｔ（Ｋｉｎｄｌｅｒ  ＧｍｂＨ）にマウントし、適切なフィルタ、ＡｘｉｏｃａｍカラーカメラおよびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを備えたＡｘｉｏｓｃｏｐ２プラス顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ）で観察した。
【０２０５】
カルセインアッセイによる細胞増殖測定：細胞を、ポリオルニチン（polyornothine）＋ＥＣＭ（１／５０）でプレコーティングした９６ウェルに播種した。それぞれ、多能性幹細胞について１０００個の細胞、初期ＮＰＣについて５０００個の細胞、および後期ＮＰＣについて３００００個の細胞であった。ガンシクロビル（ＰＢＳで希釈したＣｅｍｅｖｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅ）処置を、ＰＳＣについては細胞播種の翌日、初期ＮＰＣについては細胞播種の３日後、後期ＮＰＣについては細胞播種の１週間後に加えた。カルセイン（２μＭ）を、様々な時間経過のガンシクロビル処置（２４時間から９６時間）に加えた。細胞生存を、３７℃のインキュベータ中２４時間インキュベーションした後、カルセイン組込みによって測定した。
【０２０６】
定位生着およびガンシクロビル処置：未分化多能性幹細胞（２００００細胞／μＬ）および解離した神経球（１００，０００細胞／μＬ）を、２７−Ｇハミルトンシリンジを使用して、麻酔したマウスの線条体に注射した。横線条体のための注射座標は、ブレグマ＝０．７４ｍｍ、内外＝２．２５ｍｍ、背腹＝３．５ｍｍであり、内側線条体のための注射座標は、ブレグマ＝０．７４ｍｍ、内外＝１．４ｍｍ、背腹＝２．８ｍｍであった。マウスは、ガンシクロビル終了１ヶ月後に安楽死させた。
【０２０７】
注射された生存細胞の形態学的および表現型分析：麻酔したマウスをリン酸緩衝生理食塩水中の４％パラホルムアルデヒドの心臓内灌流によって固定した。免疫組織化学検出を、Ａｌｅｘａ４８８もしくは５５５標識二次抗体またはビオチン−アビジン−ペルオキシダーゼ複合体法（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用して厚さ１０μｍのフリーフローティングクリオスタット切片上で実施した。以下の一次抗体を使用した：ネスチン（ウサギポリクローナル抗ヒト、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製、１／４００）、β３−チューブリン（マウスモノクローナル、Ｓｉｇｍａ製、またはウサギポリクローナル、Ｃｏｖａｎｃｅ製、１／２０００）、ニューロン核特異的タンパク質（ＮｅｕＮ、マウスモノクローナル、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製、１／１０００）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、ウサギポリクローナル、Ｄａｋｏ製、１／２０００）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ、マウスモノクローナル、Ｄａｋｏ製、１／１００）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、ウサギポリクローナル、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製、１／５００）、ｉｂａ１（ポリクローナル、ウサギ、Ｗａｋｏ製、１／５００）、ＨＳＶ−ＴＫ（マウスモノクローナル、Ｇｅｎｔａｕｒ、１／１００）、ｋｉ６７（モノクローナル、ウサギ、Ａｂｃａｍ、１／１００、またはマウス、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１／１００）。ＣＤ３１（一次抗体の検出は、適切な種特異的Ａｌｅｘａ４８８またはＡｌｅｘａ５５５標識二次抗体を使用して行った。対照は、細胞または組織の自家蛍光および第１の抗体の脱落の検査を含んだ。細胞核をＤＡＰＩで染色した。切片および細胞培養物を、Ｆｌｕｏｒｏｓａｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）またはＥｕｋｉｔｔ（Ｋｉｎｄｌｅｒ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にマウントし、適切なフィルタ、ＡｘｉｏｃａｍカラーカメラおよびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを備えたＡｘｉｏｓｃｏｐ２プラス顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。共焦点画像化は、ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ共焦点レーザースキャナーおよびＢｉｔｐｌａｎｅ  ＳＳ  Ｉｍａｒｉｓ  ５．７．２ソフトウェアを用いて達成した。
【０２０８】
ＢｒｄＵ標識：ＢｒｄＵ（１００ｍｇ／ｋｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、３日間連続して１日２回腹腔内注射した。マウスを５日後に屠殺し、ＰＢＳおよびＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで心臓を通して灌流した。脳および小腸をパラフィン包埋し、厚さ１０ｍｍの正面部を、ＢｒｄＵ免疫組織化学キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｃａｔ  Ｎｏ．２７６０）を使用して、ＢｒｄＵ免疫組織化学検出のために処理し、小腸部分は、対照として使用した。
【０２０９】
チミジンキナーゼシーケンシング：ＰＦＡ固定パラフィン包埋組織から、製造者の指示（高純度ＦＦＰＥ  ＲＮＡマイクロキット、Ｒｏｃｈｅ）に従って、全ＲＮＡを抽出し、精製し、ＰＳＣ移植および後期ガンシクロビル処置によって誘導された奇形腫領域の範囲を定めた（ＩＧ．７）。典型的には、ホルマリン固定組織から単離されたＲＮＡは断片化され、得られたＲＮＡの大部分は、約２００塩基の長さである。ＤＮａｓｅ処置後、ＣＤＮＡ合成を、抽出されたＲＮＡプールから実施する（Ｔａｋａｒａ）。奇形腫内で発現したチミジンキナーゼ遺伝子を、チミジン配列（１１６２ｂｐ）に沿った異なる重複プライマーセットを使用することによって増幅した。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、および７２℃で１分の３５サイクルの間、プルーフリーディングｔａｑポリメラーゼ（Ｑ５高フィデリティー、ＮＥＢ）を用いて行う。断片１についてのプライマーは、フォワードＦ５’−ＧＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＣＧＡＣＡＡＧＴＧＧ−３’（配列番号１）およびリバースＲ５’−ＣＣＴＣＡＧＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＡＴＣ−３’（配列番号２）、断片２については、Ｆ５’−ＧＡＴＧＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号３）およびＲ５’−ＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＧ−３’（配列番号４）、断片３については、Ｆ５’−ＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡＣ−３’（配列番号５）およびＲ５’−ＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＣＡＣ−３’（配列番号６）、断片４については、Ｆ５’−ＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧ−３’（配列番号７）およびＲ５’−ＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＣＣＣＡＧＴＣ−３’（配列番号８）、断片５については、Ｆ５’−ＧＴＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＧ−３’（配列番号９）およびＲ５’−ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＣ−３’（配列番号１０）であった。断片１〜５は、直接シーケンシングを行ったか、またはｔｏｐｏＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした後、異なる細菌クローン（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ、ＡＧ）のシーケンシングを行った。
＊    ＊    ＊
【０２１０】
本明細書で開示され、請求される方法は全て、本開示に照らして、過度の実験なしに作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を、好ましい実施形態の観点で説明してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および方法のステップまたはステップの順序に変更を加えてもよいことは当業者に明らかである。より詳細には、化学的かつ生理学的に関連するある特定の薬剤は、同じまたは同様の結果が達成される限り、本明細書に記載の薬剤に置き換えられ得ることが明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような同様の置き換えおよび修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念内にあるものとみなされる。
参考文献：
以下の参考文献は、例示的な手順の詳細または本明細書に記載されたものに補足的な他の詳細を提供する程度で、参照により本明細書で具体的に組み込まれる。
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【図２Ｃ−２Ｄ】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ−８Ｄ】
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【配列表】
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