(57)【要約】  本発明は、新規の結合化合物及びそれらの治療用途を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図２に示すＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、及びＬ１７３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むＣＤ９のエピトープに特異的な、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はその機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項２】
図２に示すＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するアミノ酸を含むＣＤ９のエピトープに特異的な、請求項１に記載の単離された合成若しくは組み換え抗体、又はその機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項３】
配列ＤＹＡＭＨと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、
を含む、請求項１又は２に記載の単離された合成若しくは組み換え抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項４】
配列ＤＹＡＭＨと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
重鎖ＣＤＲ２配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧと、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
軽鎖ＣＤＲ１配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧと、
配列ＷＡＳＴＲＥＳと少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＹＹＴＴＰと、
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項５】
重鎖ＣＤＲ１配列ＤＹＡＭＨ又はＤＹＡＭＹと、
重鎖ＣＤＲ２配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧと、
重鎖ＣＤＲ３配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹ又はＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹ又はＡＶＳＧＹＹＰＹＦＨＹ又はＡＶＳＧＹＦＰＹＦＨＹと、
軽鎖ＣＤＲ１配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧと、
軽鎖ＣＤＲ２配列ＷＡＳＴＲＥＳ又はＷＡＳＩＲＥＳと、
軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＹＹＴＴＰと、
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項６】
配列ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域の配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項７】
配列ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＳＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＴＴＰＳＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域の配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項８】
重鎖可変領域の配列ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、若しくは
ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、若しくは
ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、若しくは
ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＦＰＹＦＨＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、若しくは
ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、若しくは
ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、若しくは
ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＦＰＹＦＨＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、及び／又は
軽鎖可変領域の配列ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＳＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＴＴＰＳＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ、若しくは
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＳＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＩＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＴＴＰＳＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項９】
ヒト抗体又はその機能性部分若しくは機能的等価物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項１０】
黒色腫細胞、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、及び食道癌細胞に結合可能である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項１１】
前記抗体が、ＩｇＧアイソタイプ、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項１２】
アミノ酸位置３４５にアルギニンを含む、請求項１１に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項１３】
図２に記載のとおり、ＣＤ９配列のアミノ酸、Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６への結合性について抗体ＡＴ１４−０１２と競合する、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項１４】
別の化合物に結合する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項１５】
前記その他の化合物が、検出可能な標識、化学療法剤、毒性部分、免疫調節分子、別のＣＤ９特異的結合化合物、又は放射性化合物である、請求項１４に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項１６】
最大で６０アミノ酸残基長を有する、単離された組み換え又は精製ＣＤ９ペプチドであって、前記ペプチドは、図２に示すとおり、ＣＤ９アミノ酸位置１６９〜１７６内に位置する少なくとも６つのアミノ酸残基と同一である少なくとも６つのアミノ酸残基を含む、ペプチド。
【請求項１７】
図２に示すＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するアミノ酸を含む、請求項１６に記載の単離された組み換え又は精製ＣＤ９ペプチド。
【請求項１８】
図２に示すとおりのＣＤ９配列のＦ１７６に対応するアミノ酸を更に含む、請求項１６又は１７に記載の単離された組み換え又は精製ＣＤ９ペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１５の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物の少なくとも１つのＣＤＲ配列をコードする、少なくとも１５ヌクレオチド長の単離された合成若しくは組み換え核酸分子、又はそれらの機能的等価物。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物の、少なくとも前記重鎖ＣＤＲ１〜３配列と、前記軽鎖ＣＤＲ１〜３配列とをコードする、請求項１９に記載の核酸分子又は機能的等価物。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物の、少なくとも前記重鎖可変領域の配列、及び／又は前記軽鎖可変領域の配列をコードする、請求項１９又は２０に記載の核酸分子又は機能的等価物。
【請求項２２】
ｇａｔ  ｔａｔ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｃａｃと、
ｇｇｔ  ａｔｔ  ａｇｔ  ｔｇｇ  ａａｔ  ａｇｔ  ｇｇｔ  ａｇｃ  ａｔａ  ｇｔｃ  ｔａｔ  ｇｃｇ  ｇａｃ  ｔｃｔ  ｇｔｇ  ａａｇ  ｇｇｃと、
ｇｃｃ  ｇｔｇ  ａｇｔ  ｇｇｔ  ｔａｔ  ｔａｔ  ｃｃｃ  ｔａｃ  ｔｔｔ  ｇａｃ  ｔａｃ；及び
ａａｇ  ｔｃｃ  ａｇｃ  ｃａｇ  ａｇｔ  ｇｔｔ  ｔｔａ  ｔａｃ  ａｇｃ  ｔｃｃ  ａａｃ  ａａｔ  ａａｇ  ａａｃ  ｔａｃ  ｔｔａ  ｇｇｔと、
ｔｇｇ  ｇｃａ  ｔｃｔ  ａｃｃ  ｃｇｇ  ｇａａ  ｔｃｃと、
ｃａｇ  ｃａａ  ｔａｔ  ｔａｔ  ａｃｔ  ａｃｔ  ｃｃｔと、
からなる群から選択された配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の核酸分子又は機能的等価物。
【請求項２３】
配列ｇａａ  ｇｔｇ  ｃａｇ  ｇｔｇ  ｇｔｇ  ｇａｇ  ｔｃｔ  ｇｇｇ  ｇｇａ  ｇｇｃ  ｔｔｇ  ｇｔａ  ｃａｇ  ｃｃｔ  ｇｇｃ  ａｇｇ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ａｇａ  ｃｔｃ  ｔｃｃ  ｔｇｔ  ｇｃａ  ｇｃｃ  ｔｃｔ  ｇｇａ  ｔｔｃ  ａｃｃ  ｔｔｔ  ｇａｔ  ｇａｔ  ｔａｔ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｃａｃ  ｔｇｇ  ｇｔｃ  ｃｇｇ  ｃａａ  ｇｃｔ  ｃｃａ  ｇｇｇ  ａａｇ  ｇｇｃ  ｃｔｇ  ｇａｇ  ｔｇｇ  ｇｔｃ  ｔｃａ  ｇｇｔ  ａｔｔ  ａｇｔ  ｔｇｇ  ａａｔ  ａｇｔ  ｇｇｔ  ａｇｃ  ａｔａ  ｇｔｃ  ｔａｔ  ｇｃｇ  ｇａｃ  ｔｃｔ  ｇｔｇ  ａａｇ  ｇｇｃ  ｃｇａ  ｔｔｃ  ａｃｃ  ａｔｃ  ｔｃｃ  ａｇａ  ｇａｃ  ａａｃ  ｇｃｃ  ａａｇ  ａａｃ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ｔａｔ  ｃｔｇ  ｃａａ  ｃｔｇ  ａａｃ  ａｇｔ  ｃｔｇ  ａｇａ  ｇｃｔ  ｇａｇ  ｇａｃ  ａｃｇ  ｇｃｃ  ｔｔｃ  ｔａｔ  ｔａｃ  ｔｇｔ  ｇｃａ  ａａａ  ｇｃｃ  ｇｔｇ  ａｇｔ  ｇｇｔ  ｔａｔ  ｔａｔ  ｃｃｃ  ｔａｃ  ｔｔｔ  ｇａｃ  ｔａｃ  ｔｇｇ  ｇｇｃ  ｃａｇ  ｇｇａ  ａｔｔ  ｔｔｇ  ｇｔｃ  ａｃｃ  ｇｔｃ  ｔｃｃ  ｔｃａと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、及び／又はｇａｃ  ａｔｃ  ｇｔｇ  ａｔｇ  ａｃｃ  ｃａｇ  ｔｃｔ  ｃｃａ  ｇａｃ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ｔｃｔ  ｇｔｇ  ｔｃｔ  ｃｔｇ  ｇｇｃ  ｇａｇ  ａｇｇ  ｇｃｃ  ａｃｃ  ａｔｃ  ａａｃ  ｔｇｃ  ａａｇ  ｔｃｃ  ａｇｃ  ｃａｇ  ａｇｔ  ｇｔｔ  ｔｔａ  ｔａｃ  ａｇｃ  ｔｃｃ  ａａｃ  ａａｔ  ａａｇ  ａａｃ  ｔａｃ  ｔｔａ  ｇｇｔ  ｔｇｇ  ｔａｃ  ｃａｇ  ｃａｇ  ａａａ  ｃｃａ  ｇｇａ  ｃａｇ  ｃｃｔ  ｃｃｔ  ａａｇ  ｃｔｇ  ｃｔｃ  ａｔｔ  ｔａｃ  ｔｇｇ  ｇｃａ  ｔｃｔ  ａｃｃ  ｃｇｇ  ｇａａ  ｔｃｃ  ｇｇｇ  ｇｔｃ  ｃｃｔ  ｇａｃ  ｃｇａ  ｔｔｃ  ａｇｔ  ｇｇｃ  ａｇｃ  ｇｇｇ  ｔｃｔ  ｇｇｇ  ａｃａ  ｇａｔ  ｔｔｃ  ａｃｔ  ｃｔｃ  ａｃｃ  ａｔｃ  ａｇｃ  ａｇｃ  ｃｔｇ  ｃａｇ  ｇｃｔ  ｇａａ  ｇａｔ  ｇｔｇ  ｇｃａ  ｇｔｔ  ｔａｔ  ｔａｃ  ｔｇｔ  ｃａｇ  ｃａａ  ｔａｔ  ｔａｔ  ａｃｔ  ａｃｔ  ｃｃｔ  ｔｃｃ  ａｃｃ  ｔｔｃ  ｇｇｃ  ｃａａ  ｇｇｇ  ａｃａ  ｃｇａ  ｃｔｇ  ｇａｇ  ａｔｔ  ａａａと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の核酸分子又は機能的等価物。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物をコードする、核酸分子又はその機能的等価物。
【請求項２５】
ｃＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、又はＤＮＡ／ＲＮＡヘリックスを含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２６】
非ヒト宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２７】
請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子又は機能的等価物を含む、ベクター。
【請求項２８】
請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子若しくは機能的等価物、又は請求項２７に記載のベクターを含む、単離された又は組み換え細胞、又は非ヒト動物。
【請求項２９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、又は請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子若しくは機能的等価物、又は請求項２７に記載のベクター、又は請求項２８に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項３０】
前記組成物が、製薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤も含む製薬学的組成物である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子若しくは機能的等価物、請求項２７に記載のベクター、又は請求項２８に記載の細胞、及びＣＤ９発現細胞に関連する疾患、好ましくはＣＤ９陽性癌の治療及び／又は予防に有用な治療薬、を含む、パーツからなるキット。
【請求項３２】
前記薬剤が、Ｃ３転換酵素の形成を刺激可能な、又はＣ３転換酵素の形成の阻害を中和可能な薬剤である、請求項３１に記載のパーツからなるキット。
【請求項３３】
前記薬剤が、ＣＤ５５ブロッキング抗体、ＣＤ４６ブロッキング抗体、又はＣＤ５９ブロッキング抗体、好ましくはＣＤ５５ブロッキング抗体である、請求項３２に記載のパーツからなるキット。
【請求項３４】
前記薬剤が、共抑制的Ｔ細胞分子に特異的なブロッキング抗体である、請求項３１に記載のパーツからなるキット。
【請求項３５】
前記抗体が、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ２７６抗体、抗ＣＤ２７２抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、及び抗ＩＤＯ抗体からなる群から選択され、好ましくはＰＤ１ブロッキング抗体、又はＰＤＬ１ブロッキング抗体である、請求項３４に記載のパーツからなるキット。
【請求項３６】
医薬品又は予防薬として使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、又は請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子若しくは機能的等価物、又は請求項２７に記載のベクター、又は請求項２８に記載の細胞。
【請求項３７】
ＣＤ９発現細胞に関連する疾患を少なくともある程度治療又は予防する方法に使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、又は請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子若しくは機能的等価物、又は請求項２７に記載のベクター、又は請求項２８に記載の細胞。
【請求項３８】
ＣＤ９発現細胞に関連する疾患の診断に使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物。
【請求項３９】
前記疾患が、ＣＤ９陽性癌、骨粗鬆症、関節炎、肺炎、ＣＯＰＤ、大腸炎、及び自然リンパ球に関連する疾患からなる群から選択される、請求項３７又は３８に記載の使用のための抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、又は核酸分子若しくは機能的等価物、又はベクター、又は細胞。
【請求項４０】
前記ＣＤ９陽性癌が、黒色腫、結腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、扁平上皮癌、ＡＭＬ、多発性骨髄腫、胃癌、肝癌、脳癌、カポジ肉腫、粘表皮癌、絨毛癌、線維肉腫、子宮頸癌、神経膠腫、腺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項３９に記載の使用のための抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、又は核酸分子若しくは機能的等価物、又はベクター、又は細胞。
【請求項４１】
前記抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、又は核酸分子若しくは機能的等価物、又はベクター、又は細胞が、ＣＤ９発現細胞に関連する疾患、好ましくはＣＤ９陽性癌の治療及び／又は予防に有用な治療薬と組み合わせられる、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の使用のための、抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、又は核酸分子若しくは機能的等価物、又はベクター、又は細胞。
【請求項４２】
前記薬剤が、Ｃ３転換酵素の形成を刺激可能、又はＣ３転換酵素の形成の阻害を中和可能である、請求項４１に記載の使用のための、抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、又は核酸分子若しくは機能的等価物、又はベクター、又は細胞。
【請求項４３】
前記薬剤が、ＣＤ５５ブロッキング抗体、ＣＤ４６ブロッキング抗体、又はＣＤ５９ブロッキング抗体、好ましくはＣＤ５５ブロッキング抗体である、請求項４２に記載の使用のための、抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、又は核酸分子若しくは機能的等価物、又はベクター、又は細胞。
【請求項４４】
前記薬剤が、共抑制的Ｔ細胞分子に特異的なブロッキング抗体である、請求項４１に記載の使用のための、抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、又は核酸分子若しくは機能的等価物、又はベクター、又は細胞。
【請求項４５】
前記抗体が、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ２７６抗体、抗ＣＤ２７２抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、及び抗ＩＤＯ抗体からなる群から選択され、好ましくはＰＤ１ブロッキング抗体、又はＰＤＬ１ブロッキング抗体である、請求項４４に記載の使用のための、抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、又は核酸分子若しくは機能的等価物、又はベクター、又は細胞。
【請求項４６】
サンプルがＣＤ９発現細胞を含むかどうかを判定するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物の使用。
【請求項４７】
サンプルがＣＤ９発現腫瘍細胞を含むかどうかを判定するための、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
ＣＤ９発現細胞がサンプル中に存在するかどうかを測定するための方法であって、
前記サンプルを、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物と接触させることと、
前記抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を、ＣＤ９発現細胞（存在する場合）に結合させることと、
ＣＤ９発現細胞に、前記抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物が結合するか否かを判定することにより、前記サンプル中にＣＤ９発現細胞が存在しているか否かを判定することと、
を含む、方法。
【請求項４９】
前記ＣＤ９発現細胞がＣＤ９陽性腫瘍細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を産生するための方法であって、前記方法は、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターを有する細胞を準備することと、前記細胞に前記核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターを翻訳させることにより、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を産生することと、を含み、前記方法は、好ましくは、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を回収、精製、及び／又は単離することを更に含む、方法。
【請求項５１】
ＣＤ９発現細胞に関連する疾患を少なくともある程度治療又は予防する方法であって、治療有効量の、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子若しくは機能的等価物、又は請求項２７に記載のベクター、又は請求項２８に記載の細胞、又は請求項２９若しくは３０に記載の組成物を、治療又は予防を必要としている個体に投与することを含む、方法。
【請求項５２】
前記疾患が、ＣＤ９陽性癌、骨粗鬆症、関節炎、肺炎、ＣＯＰＤ、大腸炎、及び自然リンパ球に関連する疾患からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＣＤ９陽性癌が、黒色腫、結腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、扁平上皮癌、ＡＭＬ、多発性骨髄腫、胃癌、肝癌、脳癌、カポジ肉腫、粘表皮癌、絨毛癌、線維肉腫、子宮頸癌、神経膠腫、腺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体又は機能性部分若しくは機能性等価物、又は核酸分子若しくは機能的等価物、又はベクター、又は細胞が、ＣＤ９発現細胞に関連する疾患、好ましくはＣＤ９陽性癌の治療及び／又は予防に有用な治療薬と組み合わせられる、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記薬剤が、Ｃ３転換酵素の形成を刺激可能な、又はＣ３転換酵素の形成の阻害を中和可能な薬剤である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記薬剤が、ＣＤ５５ブロッキング抗体である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記薬剤が、共抑制的Ｔ細胞分子に特異的なブロッキング抗体である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体が、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ２７６抗体、抗ＣＤ２７２抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、及び抗ＩＤＯ抗体からなる群から選択され、好ましくはＰＤ１ブロッキング抗体、又はＰＤＬ１ブロッキング抗体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
個体がＣＤ９陽性癌に罹患しているかどうかを判定するためのｅｘ  ｖｉｖｏ法であって、前記方法は、
前記個体由来の腫瘍細胞を、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物と接触させることと、
前記抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を、ＣＤ９発現細胞（存在する場合）に結合させることと、
ＣＤ９発現細胞が、前記抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物に結合するか否かを判定することにより、前記個体がＣＤ９陽性癌に罹患している否か判定することと、
を含む、ｅｘ  ｖｉｖｏ法。
【請求項６０】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項３６〜４５のいずれか一項に記載の使用のための抗体、又は請求項４６若しくは４７に記載の使用、又は請求項４８〜５９のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体は、抗体ＡＴ１４−０１２又はその機能性部分若しくは機能的等価物である、抗体又は使用又は方法。
【請求項６１】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のＣＤ９ペプチドをコードする、単離された合成又は組み換え核酸分子、又はそれらの機能的等価物。
【請求項６２】
請求項６１に記載の核酸分子又は機能的等価物を含む、ベクター。
【請求項６３】
請求項６１に記載の核酸分子若しくは機能的等価物、及び／又は請求項６２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６４】
免疫細胞及び／又はＣＤ９に特異的な抗体又はその機能性部分若しくは機能的等価物を、産生、結合、検出、及び／又は得るための、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のＣＤ９ペプチドの使用、又は請求項６１に記載の核酸分子若しくは機能的等価物、又は請求項６２に記載のベクターの使用。
【請求項６５】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のＣＤ９ペプチド、又は請求項６１に記載の核酸分子若しくは機能性等価物、又は請求項６２に記載のベクターで非ヒト動物を免疫することを含む、ＣＤ９特異的免疫細胞又はＣＤ９特異的抗体を産生するための方法。
【請求項６６】
前記非ヒト動物からＣＤ９特異的な免疫細胞又は抗体を回収することを更に含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
請求項６５又は６６に記載の方法により得ることができる、抗体又は免疫細胞。
【請求項６８】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のＣＤ９ペプチド、又は請求項６１に記載の核酸分子若しくは機能的等価物、又は請求項６２に記載のベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項６９】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のＣＤ９ペプチドと、抗体が結合した、又は免疫細胞結合したＣＤ９ペプチドを検出する手段と、を含む、診断キット。
【請求項７０】
医薬品又は予防薬として使用するための、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のＣＤ９ペプチド、又は請求項６１に記載の核酸分子若しくは機能的等価物、又は請求項６２に記載のベクター。
【請求項７１】
免疫療法に使用するための、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のＣＤ９ペプチド、又は請求項６１に記載の核酸分子若しくは機能的等価物、又は請求項６２に記載のベクター。
【請求項７２】
診断用薬として使用するための、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のＣＤ９ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、免疫学、及び医薬の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
黒色腫は、悪性メラノサイトにより生じる。黒色腫は、主に紫外線暴露により生じる。あらゆる異なる種類の皮膚癌のうち、悪性黒色腫は最も死亡率が高い。２０１２年には、世界中でおよそ５５，０００人もの人々が転移性黒色腫で死亡したものと推定されており、その数は毎年確実に増加している。転移が生じていない場合、ほとんどの患者は黒色腫を除去することにより治療される。黒色腫が転移した患者は、化学療法、放射線療法、及び／又は近年開発された、Ｔ細胞療法若しくはいわゆるチェックポイント阻害抗体などの免疫療法により治療される。これらの新規の免疫療法は、免疫系がメラノサイト腫瘍細胞を認識し、かつ攻撃可能であることを明示する。しかし、かかる治療に対する奏効率は５０％未満であり、５年生存率は約３０％である。そのため、更なる治療選択肢が強く求められている。本発明は、黒色腫及びその他の疾患を中和、予防、及び／又は検出するための手段及び方法を提供する。
【０００３】
本発明のいくつかの実施形態は、患者由来のものでありＣＤ９に特異的なヒト抗体を提供する。重要なことに、この抗体は、免疫療法後に完全寛解している後期のＩＶ期の黒色腫患者に由来するものであり、かつ治療から１０年後も良好に生存する。ヒト抗体のＡＴ１４−０１２は、黒色腫細胞、膵臓癌細胞、食道癌細胞、及び結腸癌細胞などのＣＤ９を含む細胞に結合することができる。
【０００４】
膜貫通タンパク質であり、なかでもＭＲＰ−１、ＭＩＣ３、ＤＲＡＰ−２７、及びＴＳＰＡＮ−２９とも呼称されるＣＤ９は、分子量約２３〜２７ｋＤａのテトラスパニンである。ＣＤ９は、メラノサイト、内皮細胞、ある種の神経細胞、骨格筋細胞（muscoskeletal cells）、及びある種の免疫細胞などといった、多数の種類の細胞の表面上に遍在する。ＣＤ９は血小板上にも存在する。ＣＤ９は、４つの膜貫通ドメイン、１つの小型の細胞内ループ、並びにＥＣ１ドメイン及びＥＣ２ドメインと呼称される２つの細胞外ループを有する（図１）。ＣＤ９は、最も重要なインテグリン類（β１インテグリン）、ＥＷＩタンパク質（ＥＷＩ−２及びＥＷＩ−Ｆ）、ＣＤ８１、ＣＤ６３、及びＥＧＦＲなどの多数の他のタンパク質と相互作用する。ＣＤ９は、特に、腫瘍の増殖及び転移を含む、細胞の接着、増殖、及び遊走において機能する。血小板を含む数多くの種類の細胞の細胞表面上にＣＤ９が存在するという点から、既知のＣＤ９特異的抗体には副作用の恐れがあった。実際に、Ｋａｗａｋａｔｓｕらは、１９９３年に、抗ＣＤ９抗体の血小板凝集効果により、霊長類モデルにおいて致死性の血栓症が導かれたことを報告している。抗ＣＤ９抗体を注射されたサルは、肺血栓症により５分以内に死亡した。これは、本出願の実施例：「既知の抗ＣＤ９抗体ＡＬＢ６は血小板の強固な凝集を誘導する（実施例３）」において確認される。いくつものＣＤ９抗体が開発され、報告されているものの、これまでのところ、この重篤な副作用に起因して、これらの既知のＣＤ９抗体のうち臨床試験に進められたものはない。
【０００５】
但し、興味深いことに、実施例に示すとおり、抗体ＡＴ１４−０１２は、初代メラニン細胞よりも黒色腫細胞に対して結合親和性が高い。更に、ＡＴ１４−０１２は、初代結腸上皮細胞よりも、結腸癌に対して結合活性が高い。更に、ＡＴ１４−０１２は、幾種類かの初代ＡＭＬ球、及び複数の骨髄腫細胞株に結合した一方で、初代ヒト扁桃細胞に対して示した反応性はごくわずかであった。実施例は、抗体ＡＴ１４−０１２が、ＣＤ９単量体よりもクラスタ化したＣＤ９に対して優先的に結合することを示す。ＣＤ９のパルミトイル化により、ＣＤ９のホモクラスタの形成が望ましいこと、並びにＣＤ９ホモクラスタのレベルは、原発性腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞をもとに評価されることが知られている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。したがって、ＡＴ１４−０１２の好適な結合は、抗体ＡＴ１４−０１２が、ＣＤ９を発現している非腫瘍細胞よりも幾つかの腫瘍細胞に対して高い結合親和性を有するという発見に関係し得る。また、クラスタ化されたＣＤ９に結合した結果、ＡＴ１４−０１２が多量体化することにより、腫瘍の増殖又は疾患の拡散を特異的に阻害する機序がトリガーされ得る。
【０００６】
重要なことに、例えばＡＬＢ６などの既知のＣＤ９特異的抗体は、副作用として血栓症のリスクを伴うことから、上記のとおり血小板の凝集に関し深刻な副作用を有する一方、本発明者らは、抗体ＡＴ１４−０１２、及び同じ固有のエピトープに結合するＡＴ１４−０１２の幾つかの多様体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、検出され得る血小板凝集を何ら誘導しないことを実証した。ＡＴ１４−０１２及びかかる多様体は血小板に結合し、更にはわずかに活性化させたものの、凝集は観察されなかった。これは、ＡＴ１４−０１２及びそれらの多様体について、血栓症のリスクを有意に低減させるという、既知のＣＤ９特異的抗体を上回る重要な利点を提供する。実際に、ＡＴ１４−０１２に由来した黒色腫患者は、血栓症の徴候を何ら示さなかった。実際のところ、この黒色腫患者は、免疫療法により生じる有害な副作用の徴候は何ら示さず、色素が失われることで生じる皮膚疾患である白斑ですら示さなかった。
【０００７】
上記特性の観点から、抗体ＡＴ１４−０１２、又は同じ結合特異性を有するその機能性部分、若しくは機能的等価物、若しくはその多様体は、黒色腫などのＣＤ９を発現している細胞に関連する疾患を中和、予防、及び／又は検出するのに魅力的な選択肢である。かかる抗体は、完全に寛解し長期にわたり黒色腫の生存者となっている黒色腫患者より単離されたものであるという事実から、治療有用性はすでに明らかである。更に、実施例に示すとおり、ＡＴ１４−０１２は、黒色腫細胞、膵臓癌細胞、食道癌細胞、及び結腸癌細胞、幾種類かのＡＭＬ球、及び複数の骨髄腫細胞株に結合する。また、実施例は、ＡＴ１４−０１２がｉｎ  ｖｉｖｏ黒色腫マウスモデルにおいて、腫瘍の増殖及び転移巣の成長を有意にすることを示した。したがって、抗体ＡＴ１４−０１２、並びに結合特異性が同じ機能性部位及び機能的等価物、並びにＡＴ１４−０１２と同じエピトープに特異的であり、かつ／又はＣＤ９の同じエピトープに対する結合についてＡＴ１４−０１２と競合する、その他の結合化合物は、ＣＤ９を含有する細胞に関連する疾患（例えば、ＣＤ９陽性腫瘍、骨粗鬆症、関節炎、肺炎、ＣＯＰＤ、結腸炎、アルツハイマー病、及び自然リンパ球に関連する疾患など）を検出する及び／又はかかる疾患に対抗するのに特に好適である。更に、ＣＤ９は細胞外小胞でも発現し、かかる小胞も、抗体ＡＴ１４−０１２又は上記の結合化合物の標的である。
【０００８】
実施例に示すとおり、抗体ＡＴ１４−０１２は、ｍ４領域中に存在するＣＤ９エピトープに結合する。このエピトープは、少なくとも、図２に示すとおりのＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するＣＤ９のアミノ酸を含む。特に、ＡＴ１４−０１２は、図２に記載のＣＤ９配列のアミノ酸Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に結合することが実証されている。
【０００９】
ＣＤ９特異的抗体は当業界で既知である。しかしながら、これらの抗体は多くの場合ヒトのものではなく、異なるエピトープを認識する。記載のヒト抗体は、免疫グロブリン重鎖と軽鎖がランダムに対になっている人工ライブラリに由来する。対照的に、ＡＴ１４−０１２は、天然に対となっている重鎖及び軽鎖を有するヒト患者に由来した。例えば、国際公開第２００９／１５７６２３号は、ヒトファージディスプレイライブラリより得られ、図２に示すＣＤ９配列のアミノ酸位置１８６〜１９１に結合する抗体１０Ｅ４を記載する。
【００１０】
国際公開第２０１４／１４５９４０号は、図２に示すＣＤ９配列のアミノ酸位置１１２〜１９１への結合を示す、マウスＣＤ９特異的なモノクローナル抗体Ｚ９．１及びＺ９．２を記載し、国際公開第ＷＯ２０１３／０９９９２５号は、図２に示すＣＤ９配列のアミノ酸位置１１２〜１９４への結合を示す、マウス抗体ＣＤ９−１２Ａ１２を記載する。
【００１１】
国際公開第２００４／００７６８５号は、図２に示すＣＤ９配列のアミノ酸位置１６７〜１７１に存在するアミノ酸配列ＰＫＫＤＶに結合する抗体ｍＡｂ７に関する。
【００１２】
国際公開第９５／０３３８２３号は、ＣＤ９配列ＧＬＷＬＲＦＤに結合するマウスモノクローナル抗体ＥＳ５．２Ｄ８に関する。この配列は、図２に示すＣＤ９配列のアミノ酸位置３１と３７との間に位置する。
【００１３】
欧州特許第０５０８４１７号は、ＣＤ９のアミノ酸配列に対するマウス抗体を請求し、この配列は、図２に示すＣＤ９配列のアミノ酸位置３５〜６０、１１３〜１４２、１３１〜１６６、及び１６３〜１９１から選択される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１４５９４０号
【特許文献２】国際公開第２００４／００７６８５号
【特許文献３】国際公開第９５／０３３８２３号
【特許文献４】欧州特許第０５０８４１７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
当業界で既知であるその他のＣＤ９特異的抗体は、マウス抗体ＡＬＢ６及びＨＩ９ａである。実施例に示すとおり、これらのマウス抗体は、ＡＴ１４−０１２とは異なるエピトープにも結合する。例えば、ＡＴ１４−０１２は、図２に示すように、ＣＤ９アミノ酸Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に有意に結合する一方、ＡＬＢ６は、これらのアミノ酸残基に有意には結合しない。更に、実施例に示すとおり、抗体ＡＴ１４−０１２は、ＣＤ９の残基１１２〜１３４（図２に示すとおりの付番）がＣＤ８１の対応する領域により置き換えられたＣＤ９変異体（変異体ｍ１）に結合可能であるのに対し、抗体ＡＬＢ６及びＨＩ９ａは、この変異体には結合不可能である。更に、ＨＩ９ａは変異体ｍ４（ＣＤ９の残基１６８〜１８０は、ＣＤ８１の対応する領域により置き換えられた）に結合可能であるのに対し、ＡＴ１４−０１２はこの変異体ｍ４には結合しない。最後に、実施例は、抗体ＡＬＢ６が、ｍ３中のＱ１６１及びｍ４中のＦ１７６に結合することを示す。そのため、ＡＬＢ６及びＨＩ９ａは、ＡＴ１４−０１２とは異なるエピトープに結合する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この実施例は、ＡＴ１４−０１２の反応性が霊長類に限定され、ＣＤ９を発現しているマウス及びウサギの血小板への結合は観察されなかったことを示す。この実施例は、例えば、マウスＣＤ９に結合するマウス抗体ＡＬＢ６及びＨＩ９ａよりもＡＴ１４−０１２の方が結合する、ＣＤ９におけるエピトープの固有性を確認する。
結論として、本発明により、新規ＣＤ９エピトープに特異的な新規ヒトＣＤ９特異的抗体が提供される。
【００１７】
したがって、本発明の幾つかの実施形態は、図２に記載のＣＤ９配列のアミノ酸位置１５４〜１８１内に位置する少なくとも６つのアミノ酸に特異的（すなわち、特異的に結合可能）な、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。好ましくは、かかる抗体又は機能性部分又は機能的等価物は、図２に記載のＣＤ９配列のアミノ酸位置１６８〜１８１内に位置する少なくとも６つのアミノ酸について特異的である。同様にして、図２に記載のＣＤ９配列のアミノ酸位置１６８〜１８１内に位置する少なくとも５アミノ酸に特異的（すなわち、特異的に結合可能）な、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態は、ＣＤ９のエピトープに特異的な単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供し、かかるエピトープは、図２に示すＣＤ９配列のアミノ酸Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＴ１７５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態は、ＣＤ９のエピトープに特異的な単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供し、かかるエピトープは、図２に示すＣＤ９配列のアミノ酸Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、及びＬ１７３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。本発明のかかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、好ましくは、図２に記載のＣＤ９配列のアミノ酸Ｆ１７６にも特異的に結合することができる。いくつかの実施形態は、ＣＤ９のエピトープに特異的な抗体、又は機能性部分若しくは機能的等価物を提供し、かかるエピトープは、図２に示すＣＤ９配列のアミノ酸Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、Ｔ１７５、及びＦ１７６からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態は、ＣＤ９のエピトープに特異的なかかる抗体、又は機能性部分若しくは機能的等価物を提供し、かかるエピトープは、図２に示すＣＤ９配列のアミノ酸Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、Ｔ１７５、及びＦ１７６からなる群から選択される少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つのアミノ酸残基を含む。好ましくは、かかるエピトープは、図２に記載のＣＤ９配列のアミノ酸Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６からなる群から選択される少なくとも３、４、又は５つのアミノ酸残基を含む。好ましい実施形態は、図２に示すＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するアミノ酸を含む、ＣＤ９のエピトープに特異的な本発明の単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。いくつかの実施形態は、図２に示すＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するアミノ酸を含む、ＣＤ９エピトープに特異的な、本発明の単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「図２に記載のＣＤ９配列」は、図２に示すヒトＣＤ９タンパク質のアミノ酸配列を意味する（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２１９２６；Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ−００１７６０）。
【００２０】
本明細書で使用するとき、表現「図２に記載のＣＤ９アミノ酸位置Ｘ及びＹ内に位置する」並びに「図２に記載のＣＤ９配列のアミノ酸位置Ｘ及びＹ内に位置する」は、記載の位置の間に存在する、並びにＸ及び／又はＹのアミノ酸を含む、配列を包含する。更に、かかる用語は、位置Ｘ及び／又はＹのアミノ酸を含有しない、かかる列挙された位置の間に存在する配列を包含する。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、少なくとも、標的エピトープに特異的な軽鎖可変領域（ＶＬ）と対になっている重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、免疫グロブリンタンパク質を指す。
【００２２】
「抗体の機能性部分」は、本明細書において、その量は必須ではなく、本質的にかかる抗体と少なくとも１つの特性を共有している部分として定義される。かかる機能性部分は、かかる抗体と同一の抗原を結合可能であるが、必ずしも同程度に結合しない。一実施形態では、抗体の機能性部分は、少なくとも重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。抗体の機能性部分の非限定例は、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、ナノボディ、ユニボディ、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである。
【００２３】
「抗体の機能的等価物」とは、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ配列、好ましくは重鎖ＣＤＲ３配列を含む、人工的な結合化合物として本明細書において定義される。かかる機能的等価物は、好ましくは、抗体の重鎖ＣＤＲ３配列に加えて、かかる抗体の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。より好ましくは、かかる機能的等価物は、抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列に加えて、かかる抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む。抗体の機能的等価物は、例えば、抗体に、得られる化合物の少なくとも抗原結合特性が本質的にほぼ同じであるような（その量は必ずしも同等ではない）変更を加えることによって作製される。このような作製は、例えば、抗体の全体的な機能には本質的に影響しないよう、概して類似の特性（大きさ、疎水性など）をもつ別の残基でアミノ酸残基を置換することによる保存的アミノ酸置換によるものなどの、数多くの方法によってなされる。
【００２４】
当業者には周知のとおり、抗体の重鎖は、免疫グロブリン分子を構成する２種類の鎖のうちの大きい方である。重鎖は、定常ドメインと可変ドメインとを含み、可変ドメインは抗原結合に関係する。抗体の軽鎖は、免疫グロブリン分子を構成する２種類の鎖のうちの小さい方である。軽鎖は、定常ドメインと可変ドメインとを含む。可変ドメインは、多くの場合（ただし、常にではない）、抗原結合に関与する重鎖の可変ドメインと一緒である。
【００２５】
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインに存在する超可変領域である。全抗体の場合、重鎖のＣＤＲ１〜３、及び結合している軽鎖のＣＤＲ１〜３は一緒に、抗原結合部位を形成する。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語「本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物」は、「本発明の結合化合物」としても言及される。
【００２７】
本明細書において、用語「特異的な」、「特異的に結合できる」、及び「特異的に結合可能」は互換可能に使用され、かつ抗体又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物と、そのエピトープとの相互作用を指す。これは、かかる抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、その他の抗原又はアミノ酸配列よりもかかるエピトープに優先的に結合することを意味する。したがって、抗体、機能性部分、又は等価物は、その他の抗原又はアミノ酸配列に非特異的に結合し得るものの、かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物の、それらのエピトープに対する結合親和性は、かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物のその他の抗原又はアミノ酸配列に対する非特異的な結合親和性よりも有意に高い。
【００２８】
ＣＤ９の特定のエピトープに結合可能である本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、かかるＣＤ９のエピトープが別のタンパク質中にも存在する場合、その他の非ＣＤ９細胞にも特異的であり得る。この場合、本明細書においてＣＤ９に特異的なものとして言及される抗体は、同じエピトープを含むその他のタンパク質にも特異的である。
【００２９】
「結合親和性」は、抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物のある１つの結合部分と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計強度を指す。本明細書で使用するとき、別途記載のない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体及び抗原）のメンバー同士の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。親和性は、概して、ｋａのｋｄに対する比として計算される平衡解離定数（ＫＤ）により表すことができる。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５〜８８１．を参照されたい。親和性は、当該技術分野で既知である、例えば、ＢｉａＣｏｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、又はＩＢＩＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＢＶ（Ｈｅｎｇｅｌｏ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のＩＢＩＳ−ｉＳＰＲ装置、若しくはＫｉｎｅｘａなどの溶液相アッセイといった、一般的な手法により測定され得る。
【００３０】
アミノ酸配列又は核酸配列についての同一性％、あるいは用語「配列同一性％」は、本明細書において、２つの配列を並べて、必要とされる場合にはギャップを導入して最大の同一性％を得た後で、候補となるアミノ酸配列又は核酸配列中の残基が参照配列中の残基と同一である％として定義される。アラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは当業界で既知であり、例えば、「Ａｌｉｇｎ  ２」などがある。
【００３１】
本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、好ましくは、黒色腫細胞、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、並びに食道癌細胞に結合可能である。かかる結合化合物は、様々な種類の癌を中和するのに好適であり、したがって、広範な用途を有する。少なくとも黒色腫に特異的であることが好ましい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、ヒト抗体又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物である。典型的には非ヒトＣＤＲ又は可変領域の配列がヒトレシピエントにおいて抗マウス免疫応答を引き起こすマウス抗体又はヒト化抗体とは対照的に、かかるヒトアミノ酸配列が存在することで、ヒト患者における治療上の使用中に副作用が生じる可能性が減少する。
【００３３】
１つの特に好ましい実施形態では、かかる抗体が、ＩｇＧアイソタイプ、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３である、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物が提供される。これは、ヒトにおける医療用途に有効である。
【００３４】
本発明の好ましい抗体は抗体ＡＴ１４−０１２である。少なくとも黒色腫、膵臓癌細胞、食道癌細胞、及び結腸癌細胞、幾種類かのＡＭＬ球、及びいくつかの複数の骨髄腫細胞株に結合することから、この抗体は好ましい。更に、ＡＴ１４−０１２がｉｎ  ｖｉｖｏにおける転移を中和することが実証されている。したがって、この抗体は、例えば、黒色腫などのＣＤ９陽性腫瘍細胞を含む癌などといったＣＤ９発現細胞に関連する疾患に対抗するのに特に好適である。興味深いことに、ＡＴ１４−０１２はＩｇＧ３アイソタイプであり、ＶＨ３−０９ファミリーに属する。抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列、並びに軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列は、表１及び図３に記載される。
【００３５】
本明細書で使用するとき、用語「ＡＴ１４−０１２」は、少なくとも抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１〜３配列、好ましくは重鎖及び軽鎖可変領域の配列を有するすべての抗体並びにそれらの機能性部分及び機能的等価物を含む。かかる抗体並びに機能性対及び機能的等価物は、例えば、単離された及び／又は精製された抗体、組み換え抗体、及び／又は例えば、ＣＨＯ細胞などの産生宿主細胞用にコドン最適化されたＡＴ１４−０１２核酸配列を使用して得られた抗体、を含む。
【００３６】
表１及び図３に記載のＡＴ１４−０１２配列をもとに、ＣＤ９に特異的なＡＴ１４−０１２の少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む、抗体又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を作製可能である。したがって、表１及び図３に記載の抗体ＡＴ１４−０１２の少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む単離された組み換え及び／又は合成抗体若しくはそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が提供される。かかる少なくとも１つのＣＤＲ配列は、好ましくは、少なくともＣＤＲ３配列を含む。したがって、少なくとも、配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が提供される。好ましくは、抗体ＡＴ１４−０１２の、少なくとも２つのＣＤＲ、より好ましくは少なくとも３つのＣＤＲを含む、結合化合物が提供される。いくつかの実施形態では、抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖及び軽鎖の少なくとも２つ又は３つのＣＤＲは、本発明の１つの結合化合物中に一緒に存在する。好ましくは、本発明の結合化合物は、抗体ＡＴ１４−０１２の３つすべての重鎖ＣＤＲと、３つすべての軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００３７】
所望により、少なくとも１つのかかるＣＤＲ配列は、好ましくは、結合効率、選択性、及び／又は安定性を改良するために最適化され、これにより多様体結合化合物を作製する。これは例えば、得られる化合物の安定性及び／又は結合効率を好ましく試験し、改良されたＣＤ９特異的結合化合物が選択された後の変異導入法によりなされる。当業者であれば、本発明の少なくとも１つの改変（altered）ＣＤＲ配列を含む多様体を十分作製可能である。例えば、保存的アミノ酸置換が適用される。保存的アミノ酸置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンなどの１つの疎水性残基の、別の疎水性残基への置換、並びに１つの極性残基の、別の極性残基への置換、例えば、アルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、又はグルタミンのアスパラギンへの置換などがある。好ましくは、抗体ＡＴ１４−０１２のＣＤＲ配列と少なくとも８０％同一であり、望ましいＣＤ９結合特性が維持されている、又は更には改良されているＣＤＲ配列を含む、抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物が提供される。したがって、抗体ＡＴ１４−０１２のＣＤＲ配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む多様体結合化合物も本発明の範囲内である。好ましくは、かかる結合化合物は、抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１〜３配列と少なくとも８０％同一である、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１〜３配列を含む。好ましくは、かかる多様体のＣＤＲ配列は、もとのＡＴ１４−０１２のＣＤＲ配列と３つ以下、好ましくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なっている。
【００３８】
ＣＤＲ配列を最適化するのに加えて、結合効率又は安定性を改良するために、少なくとも１つのフレームワーク領域中の少なくとも１つの配列を最適化することができる。これは、結合効率又は安定性を改良するためになされる。フレームワーク配列は、例えば、得られる結合化合物の特性が好ましく試験された後にかかるフレームワーク配列をコードする核酸分子を変異させることにより最適化される。このようにして、改良された結合化合物を得ることができる。好ましい実施形態では、本発明による抗体におけるフレームワーク領域には、ヒト生殖系列配列が使用される。ヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域が由来している個体に固有で、かつ別のヒト個体に投与したときに免疫原性応答を生じさせ得る、体細胞変異を含有する傾向が低いことから、ヒト生殖系列配列の使用は、かかる抗体の免疫原性に関するリスクを最小化する。したがって、ＡＴ１４−０１２のフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域において少なくとも１つの変異を含む、本発明の合成若しくは組み換え抗体、又は機能性部分若しくは機能的等価物が更に提供される。更に、又はあるいは、抗体ＡＴ１４−０１２の定常領域と比較して、定常領域において少なくとも１つの変異を含む、本発明の合成若しくは組み換え抗体、又は機能性部分若しくは機能的等価物が提供される。ＡＴ１４−０１２と比較して少なくとも１つの変異を有するかかる結合化合物は天然には生じない。その代わりに人工的に作製されている。一実施形態では、抗体ＡＴ１４−０１２のＩｇＧ３  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域により少なくとも部分的に置き換えられている。この置き換えは、典型的には得られる免疫グロブリンの安定性を増大させ、かつ半減期を延長させる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本発明の結合化合物は、ヒト可変領域を含む。いくつかの実施形態では、かかる結合化合物は、ヒト定数領域及びヒト可変領域を含む。いくつかの好ましい実施形態では、かかる結合化合物はヒト抗体である。ヒトの治療用途に関し、ヒトＣＤ９特異的抗体の使用は、非ヒト抗体の使用よりも有利である。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒト疾患の診断及び／又は治療のための非ヒト抗体の使用は、数多くの因子により妨害を受ける。特に、ヒト抗体は、非ヒト抗体を異物として認識する恐れがあり、これにより、非ヒト抗体に対し免疫原性応答が生じ、結果として副作用及び／又は抗体の体内循環からの高速なクリアランスが生じ得る。ヒト抗体は、ヒト個体に投与した場合に副作用の可能性を減少させるのに加え、非ヒト抗体に比べてクリアランスが低減されることから多くの場合体内循環における半減期が長くなる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明の結合化合物はキメラ抗体である。このようなキメラ抗体では、本発明の結合化合物には、例えば、対象の付加的結合部位などの、対象の配列が提供される。
【００４１】
本発明の結合化合物は、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、単一の分子種からなる抗体である。モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体産生細胞又は組み換えＤＮＡ技術により大量に生産することができる。
【００４２】
したがって、例えば、変異導入などの当該技術分野で知られている技術を用いて、抗体ＡＴ１４−０１２に基づく多様体結合化合物を生成することができる。典型的には、抗原特異性を維持しつつ、８０〜９９％の配列変化が許容される。したがって、一実施形態は、
配列ＤＹＡＭＨと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、好ましくは、図２に記載のＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、及びＬ１７３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むＣＤ９エピトープに特異的であり、より好ましくは図２に記載のＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するアミノ酸を含むＣＤ９エピトープに特異的である。
【００４３】
好ましくは、かかる配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。
【００４４】
本明細書で使用するＣＤＲの付番及び定義は、別途記載のない限りＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）によるものである。Ｋａｂａｔ付番、ＥＵ付番、及びＩＭＧＴ付番などの異なる付番系間の対応は、当業者には周知である。
【００４５】
したがっていくつかの実施形態は、
配列ＤＹＡＭＨと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、好ましくは、図２に記載のＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、及びＬ１７３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むＣＤ９エピトープに特異的であり、より好ましくは図２に記載のＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するアミノ酸を含むＣＤ９エピトープに特異的である。
【００４６】
いくつかの実施形態は、
配列ＤＹＡＭＨと少なくとも９７％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧと少なくとも９７％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹと少なくとも９７％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧと少なくとも９７％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳと少なくとも９７％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰと少なくとも９７％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、好ましくは、図２に記載のＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、及びＬ１７３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むＣＤ９エピトープに特異的であり、より好ましくは図２に記載のＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するアミノ酸を含むＣＤ９エピトープに特異的である。
【００４７】
この実施例では、重鎖ＣＤＲ１における１つの変異、及び／又はＣＤＲ３における１つ若しくは２つの変異、及び／又は軽鎖ＣＤＲ２における１つの変異により、抗体ＡＴ１４−０１２と同じエピトープに結合し、かつＡＴ１４−０１２の結合親和性と同等の又はそれよりも高い結合親和性を有する抗体が得られることが示されている。重要なことに、実施例において更に示すとおり、重鎖ＣＤＲ１中及び／又は重鎖ＣＤＲ３中及び／又は軽鎖ＣＤＲ２中にかかる変異を有する抗体ＡＴ１４−０１２の変異体も、ＡＴ１４−０１２と比較して多様体がＣＤ９に対し高い親和性を有する場合でさえも、血小板を凝集させないという特性を有する。そのため、実施例は、抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ３配列、及び軽鎖ＣＤＲ２配列に対して少なくとも８０％同一性である重鎖ＣＤＲ１配列及び／又は重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体は、ＣＤ９の新規エピトープに対する特異性、並びに血小板凝集の非存在（absence of platelet aggregation）などといった、抗体ＡＴ１４−０１２と同様の新規及び固有の特性を有することを示す。抗体ＡＴ１４−０１２の親和性は、血小板凝集の非存在には関係しないものの、その代わりに、血小板凝集の非存在に伴う重要な特徴には、ＣＤ９の固有のエピトープの認識がある。
【００４８】
したがって、一実施形態は、図２に示すＣＤ９配列のアミノ酸Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、及びＬ１７３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、かつ
配列ＤＹＡＭＨと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
重鎖ＣＤＲ２配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧと、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
軽鎖ＣＤＲ１配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧと、
配列ＷＡＳＴＲＥＳと少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＱＹＹＴＴＰと、
を含む、ＣＤ９のエピトープに特異的な単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、好ましくは、図２に示すＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するアミノ酸を含むＣＤ９エピトープに特異的である。
【００４９】
抗体又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、図２に示すＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、及びＬ１７３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むＣＤ９エピトープに対し特異的であるかを判定する方法は、当該技術分野では十分にあり、例えば、本明細書において実施例に記載される。実際に、実施例は、ＣＤ９に対する結合の仕方、抗体により結合されるＣＤ９のエピトープ、及びＣＤ９に対する抗体親和性を示す。
【００５０】
実施例は、結合特異性及び親和性に影響を及ぼすことなく、かつ／又は結合特異性及び親和性の度合いに影響を及ぼすことなく、フレームワーク領域における変異を導入可能であることも示す。実際に、重鎖フレームワーク領域１におけるＴ２９Ｎ変異、軽鎖フレームワーク領域３におけるＬ９４Ｐ変異、及び軽鎖フレームワーク領域４におけるＬ１２０Ｖ変異（ＩＭＧＴ付番）は、ＡＴ１４−０１２の結合に対し、又はａＴ１４−０１２と比較して結合が改良されているＡＴ１４−０１２の多様体の改良されている結合性に対し大きな影響を及ぼさなかった。
【００５１】
前述のとおり、典型的には所与のＣＤＲ配列の最大で３つのアミノ酸残基は、種類として同じ結合活性を保持させつつ（本質的に同等なのであって、その量は必ずしも同等ではない）変更可能である。そのため、本発明の結合化合物は、好ましくは、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１〜３配列を含有し、ここで、最大で３つ、好ましくは最大で２つ、より好ましくは最大で１つのアミノ酸は、抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１〜３配列と異なっている。いくつかの実施形態では、本発明の結合化合物の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１〜３配列は、抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１〜３配列と同一である。したがって、
配列ＤＹＡＭＨを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明の結合化合物の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１〜３配列は、ＡＴ１４−０１２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１〜３配列と同一であり、抗体ＡＴ１４−０１２と同等以上の親和性を有する。
【００５３】
したがって、
配列ＤＹＡＭＹを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００５４】
したがって、
配列ＤＹＡＭＨを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００５５】
したがって、
配列ＤＹＡＭＨを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＨＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００５６】
したがって、
配列ＤＹＡＭＹを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００５７】
したがって、
配列ＤＹＡＭＹを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＨＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００５８】
したがって、
配列ＤＹＡＭＨを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＦＰＹＦＨＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００５９】
したがって、
配列ＤＹＡＭＹを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＦＰＹＦＨＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００６０】
更に、
配列ＤＹＡＭＹを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＩＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００６１】
したがって、
配列ＤＹＡＭＨを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＩＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００６２】
更に、
配列ＤＹＡＭＨを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＨＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＩＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００６３】
更に、
配列ＤＹＡＭＹを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＩＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００６４】
更に、
配列ＤＹＡＭＹを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＨＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＩＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００６５】
更に、
配列ＤＹＡＭＨを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＦＰＹＦＨＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＩＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００６６】
更に、
配列ＤＹＡＭＹを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＦＰＹＦＨＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＩＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。
【００６７】
特に好ましい抗体は：
配列ＤＹＡＭＹを有する重鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧを有する重鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列と、
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧを有する軽鎖ＣＤＲ１配列と、
配列ＷＡＳＴＲＥＳを有する軽鎖ＣＤＲ２配列と、
配列ＱＱＹＹＴＴＰを有する軽鎖ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。実施例に示すとおり、かかる抗体は、特に高い親和性を有する（図１９Ｂを参照のこと）。
【００６８】
好ましくは、本発明の結合化合物は、抗体ＡＴ１４−０１２の可変重鎖配列及び／又は可変軽鎖配列、あるいは少なくとも８０％同一な重鎖及び軽鎖可変配列を含む。抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖及び軽鎖可変領域も、表１及び図３に記載する。したがって、配列ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳと少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域の配列、及び／又は配列ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＳＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＴＴＰＳＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域の配列、あるいは、上記のＡＴ１４−０１２の重鎖及び／又は軽鎖可変領域の配列と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、又は更には１００％同一である配列を含む、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物が更に提供される。好ましくは、重鎖及び軽鎖可変領域において、重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列は、配列ＤＹＡＭＨ（ＣＤＲ１）、ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ２）、及びＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹ（ＣＤＲ３）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列は、配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧ（ＣＤＲ１）、ＷＡＳＴＲＥＳ（ＣＤＲ２）、及びＱＱＹＹＴＴＰ（ＣＤＲ３）と少なくとも８０％の配列同一性を有する。かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、好ましくは、図２に記載のＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、及びＬ１７３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むＣＤ９エピトープに特異的であり、より好ましくは図２に記載のＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するアミノ酸を含むＣＤ９エピトープに特異的である。同一性が高くなるほど、結合化合物は抗体ＡＴ１４−０１２に類似するようになる。好ましくは、本発明の結合化合物は、表１及び図３に記載するように、抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖可変領域の配列と、軽鎖可変領域の配列とを両方含み、あるいは抗体ＡＴ１４−０１２と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも８８％、又は少なくとも８９％、又は少なくとも９０％、又は９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖可変領域の配列を両方含む。
【００６９】
特に好ましいものは、図２に記載のＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、及びＬ１７３からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むＣＤ９エピトープに特異的であり、好ましくは図２に記載のＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するアミノ酸を含むＣＤ９エピトープに特異的であり、かつ、
重鎖可変領域配列ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、若しくは
ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、若しくは
ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、若しくは
ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＦＰＹＦＨＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、若しくは
ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、若しくは
ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、若しくは
ＥＶＱＶＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＦＹＹＣＡＫＡＶＳＧＹＦＰＹＦＨＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ、並びに／又は
配列ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＳＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＴＴＰＳＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫと少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域の配列［好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧ（ＣＤＲ１）、ＷＡＳＴＲＥＳ（ＣＤＲ２）、及びＱＱＹＹＴＴＰ（ＣＤＲ３）、と少なくとも８０％の配列同一性を有する］、より好ましくは軽鎖可変領域の配列ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＳＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＴＴＰＳＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ、若しくはＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＳＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＩＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＴＴＰＳＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫを含む、抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物である。
【００７０】
すでに前述しているとおり、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、かかる免疫グロブリンのｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性の観点から、好ましくは、ＩｇＧアイソタイプ、より好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３である。更に、実施例に示すとおり、抗体ＡＴ１４−０１２は、抗体がＩｇＧ３骨格にある場合に腫瘍細胞における補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をトリガー可能である。更に、ＩｇＧ  Ｆｃテール（Ｅ３４５Ｒ，Ｋａｂａｔ  １９９１に記載のＥＵ付番）における変異により、標的に対する結合時に抗体を六量体にし、腫瘍細胞の表面上にＣ１ｑを付着させ、更にＣＤＣを介した濃度依存性細胞死を誘導する（Ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ２０１６）。そのため、特に好ましい実施形態では、本発明の抗体、機能性部分、又は機能的等価物はＩｇＧ３アイソタイプである。更に好ましい実施形態では、本発明の抗体、機能性部分、又は機能的等価物は、ＩｇＧアイソタイプ、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３、より好ましくはＩｇＧ３であり、アミノ酸位置３４５（ＥＵ付番）にアルギニンを含む。
【００７１】
実施例に示すとおり、抗体ＡＴ１４−０１２は、図２に示すＣＤ９配列のアミノ酸Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に特異的に結合可能である。現在では、同じエピトープについてＡＴ１４−０１２と競合する結合化合物を得ることができること、又はかかる化合物が作製可能であることが判明している。例えば、上記のアミノ酸残基のうち少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、又は６つを含むＣＤ９ペプチドが提供され、あるいは上記のアミノ酸残基のうち少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、又は６つからなるＣＤ９ペプチドが提供され、この場合、非ヒト動物は、かかるＣＤ９ペプチド、又はかかるＣＤ９ペプチドを含む免疫原性化合物、又はかかるＣＤ９ペプチドをコードするそれらの核酸分子若しくは機能的等価物により免疫された後、好ましくは１回以上追加免疫が投与される。続いて、ＣＤ９に特異的な抗体は、かかる非ヒト動物から回収される。あるいは、又は更に、ＣＤ９特異的Ｂ細胞は、かかる非ヒト動物から回収される。かかるＣＤ９特異的Ｂ細胞は、ＣＤ９に特異的な抗体の産生に特に好適である。かかる免疫動物から回収されたＣＤ９特異的Ｂ細胞は、例えば、ＣＤ９特異的抗体が得られるハイブリドーマの産生に使用される。他の実施形態では、かかる免疫動物から回収されたかかるＣＤ９特異的Ｂ細胞は、例えば、欧州特許第１９７４０１７号及び米国特許第９，１２７，２５１号に記載のとおり、Ｂｃｌ−６核酸により形質導入され、及び例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ又はＭｃｌ−１などの抗／アポトーシス性の核酸により形質導入され、長期にわたりｅｘ  ｖｉｖｏでのＢ細胞培養液で培養される。この方法では、Ｂ細胞の長期複製培養物が生成され、かかるＢ細胞は、抗体の複製及び産生の両方を行う。いくつかの実施形態では、かかるハイブリドーマにより又はかかるＢ細胞の培養により産生されたＣＤ９特異的な抗体は回収され、例えば、好ましくは副作用を低減するために、かかる抗体をヒト化した後で抗ＣＤ９治療に使用される。いくつかの実施形態では、かかる非ヒト動物より得られた抗体及び／又はＢ細胞は、ＣＤ９に対する結合に関し、抗体ＡＴ１４−０１２と競合性について試験される。かかる試験は、例えば、ＣＤ９発現細胞を、かかる非ヒト動物から得られたかかる抗体又はＢ細胞とともにインキュベートした後で、抗体ＡＴ１４−０１２を加えることによりなされる。対照として、ＣＤ９発現細胞は、好ましくは任意のその他の抗体又はＢ細胞の非存在下で抗体ＡＴ１４−０１２とインキュベートされる。ＣＤ９発現細胞を、かかる非ヒト動物より得られた抗体又はＢ細胞と予めインキュベートすることで、ＡＴ１４−０１２のかかる細胞に対する結合に影響することは明らかである場合、かかる非ヒト動物より得られたかかる抗体又はＢ細胞は、ＣＤ９に対する結合に関しＡＴ１４−０１２と競合するものと判断される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、かかる非ヒト動物から得られるＣＤ９特異的Ｂ細胞の可変性ドメインをコードする核酸配列は、ＣＤ９特異的な可変ドメインの核酸配列を得ることために配列決定され、その後で、これらの配列を含む１つ以上の核酸分子は、ＣＤ９特異的抗体の産生のため、大腸菌、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ細胞（マウス骨髄腫）又は２９３（Ｔ）細胞などの産生細胞に導入される。かかる１つ以上の核酸配列は、好ましくはかかる産生細胞用にコドン最適化されている。本明細書で使用するとき、用語「コドン」は、特異的なアミノ酸残基をコードするヌクレオチドのトリプレット（又はそれらの機能的等価物）を意味する。用語「コドン最適化」は、もとの動物の核酸配列に由来する１つ以上のコドンが、ある種の産生細胞により好まれる１つ以上のコドンにより置き換えられることを意味する。これらの置き換えコドンは、好ましくは、置き換えられるもとの動物のコドンと同じアミノ酸残基をコードする。
【００７３】
いくつかの実施形態では、かかる非ヒト動物から得られた、又はかかる非ヒト動物の免疫細胞から得られたＣＤ９特異的抗体はヒト化される、すなわち、ヒトにおける有害な副作用を低減させるために、かかる動物のアミノ酸配列の少なくとも一部、好ましくはフレームワーク配列の少なくとも一部又はすべてが、ヒト配列により置き換えられている。
【００７４】
好適な免疫手順及びアジュバントを含む動物を免疫するプロトコル、かかる免疫動物から抗体及び／又は免疫細胞を得て精製するための手順、競合試験、並びに非ヒト抗体のヒト化手順は当業界で周知である。例えば、Ｈａｎｌｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９５を参照のこと。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ９特異的な免疫グロブリン（典型的には、Ｆａｂフラグメント）を同定及び／又は単離するために、図２に示すとおり、Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、Ｔ１７５、及びＦ１７６からなる群から選択されるＣＤ９アミノ酸残基、好ましくは、Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６からなる群から選択されるＣＤ９アミノ酸残基のうち、少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、又は６つを含む、又はそれらからなるＣＤ９ペプチド、あるいはかかるＣＤ９ペプチドを含む化合物は、ファージディスプレイライブラリのスクリーニングに使用される。いくつかの実施形態では、ナイーブファージディスプレイライブラリが使用される。好ましい実施形態では、一名以上の黒色腫患者に由来するファージディスプレイライブラリが使用されることから、かかるライブラリにはすでに偏りが生じている。いくつかの実施形態では、かかるファージディスプレイライブラリより得られたＣＤ９特異的免疫グロブリンは、ＣＤ９に対する結合に関し、抗体ＡＴ１４−０１２と競合性について試験される。これは、例えば、本明細書に記載の競合試験を用い行われる。
【００７６】
上記の方法により得られ、産生され、又は選択された抗体は、典型的には、同じＣＤ９エピトープの少なくとも一部に関し、抗体ＡＴ１４−０１２と競合する。したがって、ＣＤ９に対する結合について、抗体ＡＴ１４−０１２と競合する単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、更に提供される。いくつかの実施形態は、図２に示すように、Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６からなる群から選択される少なくとも４つのＣＤ９アミノ酸に対する結合について抗体ＡＴ１４−０１２と競合する、単離された合成若しくは組み換え抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。いくつかの実施形態では、かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、図２に記載のとおり、Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６からなる群から選択されるＣＤ９のアミノ酸のうち少なくとも４つ、又は少なくとも５つに対する結合性について抗体ＡＴ１４−０１２と競合する。いくつかの実施形態では、かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、図２に記載のとおり、ＣＤ９のアミノ酸であるＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対する結合性について抗体ＡＴ１４−０１２と競合する。
【００７７】
本発明の別の態様は、別の化合物に結合する本発明の抗体若しくは機能性部分又は機能的等価物を提供する。一実施形態では、本発明の結合化合物は、化学療法剤、又は他の毒性化合物、又は放射性化合物などの別の治療部分に結合して、いわゆる「抗体薬物コンジュゲート」を形成する。別の実施形態では、本発明の結合化合物に結合する部分は、例えば、ＣＤ３特異的抗体などの免疫調節分子である。このようなＣＤ３特異的抗体はＴ細胞に結合することができ、本発明の結合化合物に結合した場合には、Ｔ細胞を、黒色腫細胞のようなＣＤ９を含む細胞を容易に標的化し、これにより抗黒色腫Ｔ細胞応答を高める。これは、更に強い抗黒色腫効果をもたらす。したがって、本発明の１つの好ましい実施形態は、本発明のＣＤ９特異的結合化合物と、免疫調節分子、好ましくはＣＤ３特異的結合化合物とを含む、二重特異的又は多重特異的な結合化合物を提供する。別の好ましい実施形態は、抗ＣＤ９化合物を提供し、かかる化合物は、ＣＤ９に特異的な本発明の結合化合物と、毒性部分とを含む。いくつかの他の実施形態では、本発明の結合化合物は、標識と連結している。これにより、例えば、かかる標識された結合化合物を使用して、黒色腫細胞などのＣＤ９含有細胞を検出することが可能になる。他の実施形態は、別のＣＤ９特異的結合化合物に連結した本発明の結合化合物を提供する。いくつかの実施形態では、かかるその他のＣＤ９特異的結合化合物も、本発明の結合化合物である。したがって、互いに連結している本発明の結合化合物、例えば、２つの連結したＡＴ１４−０１２抗体又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を２つ含む化合物、が提供される。いくつかの実施形態では、本発明の結合化合物は、二重特異性化合物を産生することために、例えば、既知の抗ＣＤ９抗体などの別のＣＤ９特異的結合化合物に連結されている。いくつかの実施形態では、抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖は、二重特異性抗体を産生するために、別のＣＤ９特異的抗体の重鎖と対形成されている。本発明の二重特異性化合物及び二重特異性抗体により、例えば、特に、かかる２つの連結した結合化合物が異なるＣＤ９エピトープに特異的なものである場合に、ＣＤ９含有細胞に対する結合性を向上させることができる。このような二重特異性化合物及び／又は二重特異性抗体はそれ故、治療又は診断用途に非常に適している。本発明の二重特異性化合物及び二重特異性抗体は、異なるＣＤ９含有細胞が同一の二重特異的結合性化合物に結合しているアッセイにおいても使用することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、合成又は組み換え抗体が提供される、あるいは本発明の抗体の１つのＦａｂフラグメント、好ましくはＡＴ１４−０１２フラグメント、及び別のＣＤ９特異的抗体の１つのＦａｂフラグメントを含む、それらの機能性部分又は機能的等価物が提供される。得られる結合化合物は、ＣＤ９に対して単一特異的であるが、各Ｆａｂアームは、典型的には自己のＣＤ９エピトープに結合する。いくつかの実施形態では、Ｆａｂフラグメントによって認識されるエピトープは互いに異なる。別の実施形態では、エピトープは同じである。Ｆａｂアームは、親和性の異なるエピトープに結合することができる。あるいは、Ｆａｂアームは、それらのエピトープを本質的に同じ親和性で結合し、すなわち、ＦａｂアームのＫＤの差は、互いに３０％以下、好ましくは２０％以下、又は１０％以下である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、合成又は組み換え抗体が提供される、あるいは本発明の抗体の１つのＦａｂフラグメント、好ましくはＡＴ１４−０１２フラグメント、及び別の抗体の１つのＦａｂフラグメントを含む、それらの機能性部分又は機能的等価物が提供される。例えば、このような抗体は、本発明の抗体の１つのＦａｂフラグメントと、相補的な調節タンパク質に特異的なブロッキング抗体又は共抑制的（co-inhibitory）Ｔ細胞分子に特異的なブロッキング抗体の、１つのＦａｂフラグメントと、を含む。かかる抗体中に存在するＦａｂフラグメントに由来する相補的な調節タンパク質に特異的なブロッキング抗体の好ましい例は、ＣＤ５５ブロッキング抗体、ＣＤ４６ブロッキング抗体、又はＣＤ５９ブロッキング抗体、より好ましくはＣＤ５５ブロッキング抗体である。かかる抗体に存在するＦａｂ断片に由来する共抑制的Ｔ細胞分子に特異的なブロッキング抗体に対するブロッキング抗体の好ましい例は、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ２７６抗体、抗ＣＤ２７２抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、及び抗ＩＤＯ抗体、好ましくは抗ＰＤ−１抗体、又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【００８０】
したがって、別の化合物に連結した本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物が更に提供される。いくつかの実施形態では、かかるその他の化合物は、検出可能な標識、化学療法剤、毒性部分、免疫調節分子、別のＣＤ９特異的結合化合物、又は放射性化合物である。いくつかの実施形態では、別の化合物、例えば、前述の化合物のうちのいずれか１つに連結した、抗体ＡＴ１４−０１２を提供する。いくつかの実施形態は、抗体ＡＴ１４−０１２のＦａｂフラグメントと別のＣＤ９特異的抗体のＦａｂフラグメントとを含む二重特異性抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。いくつかの実施の形態は、別のＣＤ９特異的抗体と対形成している抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖を含む、二重特異性抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明の結合化合物は、例えば、酸不安定性ヒドラゾンリンカー、若しくは国際公開第２０１０／０８７９９４号に詳述される、シトルリン−バリンのようなペプチドリンカーなどのリンカーを開始、又はチオエーテル結合により、又はソルターゼＡにより触媒されるアミド基転移により、例えば化学療法剤又はＣＤ３特異的抗体などの別の部分と連結される。
【００８２】
ソルターゼにより触媒されるアミド基転移は、抗体重鎖上、好ましくは重鎖のＣ末端部分上、及びかかる抗体に連結した部分上のソルターゼ認識部位（ＬＰＥＴＧＧ）の操作を含む。抗体及び部分は、更に典型的には、ＧＧＧＧＳ配列と、精製目的のためのＨＩＳタグなどのタグとを含有する。次に、ソルターゼにより介在されるアミド基転移が実施された後、クリックケミストリーによる結合が実施される。ソルターゼにより触媒されるアミド基転移では、「クリックケミストリー結合」は、抗体重鎖上のソルターゼモチーフへの、及び抗体に連結される部分（タンパク質、ペプチド、又は抗体）上のソルターゼモチーフへのグリシンの付加を介し、ソルターゼにより付加される、例えば、アルキン含有試薬、及び例えば、アジド含有試薬の化学的カップリングを典型的には含む。したがって、一実施形態では、本発明は、ソルターゼ認識部位（ＬＰＥＴＧＧ）が抗体の重鎖上に、好ましくは重鎖のＣ末端部分上に設計（engineered）され、好ましくは、ＧＧＧＧＳ配列と、ＨＩＳタグなどの精製タグとを更に含有する、本発明の抗体を提供する。
【００８３】
別の実施形態では、本発明の結合化合物は、チオエーテル結合を介して別の部分に連結されている。このような場合、本発明の結合化合物には、１つ以上のシステインが組み込まれていることが好ましい。システインはチオール基を含み、したがって本発明の結合化合物に１つ以上のシステインを組み込むことにより、又は本発明の結合化合物を１つ以上のシステインによる１つ以上でアミノ酸の置き換えることにより、かかる結合化合物を別の部分に連結させることが可能である。かかつ１つ以上のシステインは、好ましくは、かかる結合化合物の折りたたみに著しい影響を及ぼさず、かつ抗原結合又はエフェクター機能を著しく変化させない部分において、本発明の結合化合物に導入される。したがって、本発明は、抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖配列を含む本発明の結合化合物も提供し、ここで、かかるＡＴ１４−０１２配列の少なくとも１つのアミノ酸（システイン以外）は、システインにより置き換えられている。
【００８４】
本発明の別の態様は、別の治療薬と組み合わされた本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。例えば、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、ＣＤ９発現細胞と関連する疾患、好ましくは、ＣＤ９陽性癌、骨粗鬆症、関節炎、肺炎症、ＣＯＰＤ、大腸炎、及び自然リンパ球に関連する疾患からなる群から選択される疾患を少なくともある程度治療又は予防することのできる別の薬剤と組み合わせられる。本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、ＣＤ９陽性癌の治療及び／又は予防に有用である別の治療薬と組み合わせられるかかる薬剤の例は、相補的調節タンパク質、共抑制的Ｔ細胞分子に特異的な抗体、変異したＢＲＡＦ（例えば、ベムラフェニブ又はダブラフェニブ）に対する少分子、及びその他の化学療法剤である。したがって、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を、ＣＤ９発現細胞、好ましくはＣＤ９陽性癌と関連する疾患の治療及び／又は予防に有用な治療薬と組み合わせることにより、本発明のＣＤ９発現細胞に関連する疾患を少なくともある程度治療又は予防するための使用又は方法が提供される。本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物と、ＣＤ９発現細胞、好ましくはＣＤ９陽性癌に関連する疾患の治療及び／又は予防に有用な治療薬とを含むパーツからなるキットも提供される。かかる薬剤の好ましく、かつ非限定例は、相補的調節タンパク質、共抑制的Ｔ細胞分子に特異的な抗体、変異したＢＲＡＦ（例えば、ベムラフェニブ又はダブラフェニブ）に対する少分子、及びその他の化学療法剤である。例えば、実施例は、抗体ＡＴ１４−０１２  Ｅ３４５Ｒが腫瘍細胞を、Ｃ３転換酵素形成の阻害剤であるＣＤ５５を発現しないヒト補体因子の存在下で、ＣＤＣにより効果的に殺傷することを示す。そのため、かかる抗体を、Ｃ３転換酵素の形成を刺激可能な、又はＣ３転換酵素の形成の阻害を中和可能な薬剤、例えばＣＤ５５ブロッキング抗体と組み合わせたときに、腫瘍細胞の補体依存性細胞死が誘導され得る。ブロッキングによりＣＤＣを増強する、ＣＤ４６ブロッキング抗体又はＣＤ５９ブロッキング抗体などといった、その他の補体調節タンパク質に対する抗体も、本発明の抗体、機能性部分、又は機能的等価物と有利に組み合わせることができる。
【００８５】
したがって、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を、Ｃ３転換酵素の形成を刺激可能な、又はＣ３転換酵素の形成の阻害に対抗可能な薬剤と組み合わせることにより、本発明のＣＤ９発現細胞に関連する疾患を少なくともある程度治療又は予防するための使用又は方法が提供される。かかる薬剤は、好ましくはＣＤ５５ブロッキング抗体、ＣＤ４６ブロッキング抗体、又はＣＤ５９ブロッキング抗体、より好ましくはＣＤ５５ブロッキング抗体である。かかる疾患は、好ましくは、ＣＤ９陽性癌であり、より好ましくは、黒色腫、結腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌（stomach cancer）、扁平上皮癌、ＡＭＬ、多発性骨髄腫、胃癌（gastric cancer）、肝癌、脳癌、カポジ肉腫、粘表皮癌、絨毛癌、線維肉腫、子宮頸癌、神経膠腫、腺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される。
【００８６】
本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物と、ＣＤ９発現細胞、好ましくはＣＤ９陽性癌に関連する疾患の治療及び／又は予防に有用な治療薬とを含むパーツからなるキットも提供される。好ましい実施形態では、かかる薬剤は、Ｃ３転換酵素の形成を刺激可能な、又はＣ３転換酵素の形成の阻害を中和可能な薬剤である。かかる薬剤は、好ましくはＣＤ５５ブロッキング抗体、ＣＤ４６ブロッキング抗体、又はＣＤ５９ブロッキング抗体、より好ましくはＣＤ５５ブロッキング抗体である。核酸分子又は機能的等価物、本発明のベクター又は細胞、及びＣ３転換酵素の形成を刺激可能な又はＣ３転換酵素の形成阻害を中和可能な薬剤を含むパーツからなるキットも提供される。かかる薬剤は、好ましくはＣＤ５５ブロッキング抗体、ＣＤ４６ブロッキング抗体、又はＣＤ５９ブロッキング抗体、より好ましくはＣＤ５５ブロッキング抗体である。
【００８７】
本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物は、更に所望により、ＰＤ１−ＰＤＬ−１系の抗体ブロッキングなどといった共抑制的Ｔ細胞分子に特異的な抗体と更に組み合わせられる。ＰＤ１−ＰＤＬ１系をブロックする抗体、特にＰＤ１に結合するものは、現在では、様々な後期癌患者の治療に広範に使用されている。実施例は、抗体ＡＴ１４−０１２を、抗ＰＤ−１抗体であるニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）と組み合わせると、ＡＴ１４−０１２のみによる治療と比較して、腫瘍増殖の抑制が強く増強されることを示す。
【００８８】
共抑制性Ｔ細胞分子に対する抗体は、好ましくはブロッキング抗体である。本明細書で使用するとき、「ブロッキング抗体」は、抗原に対して結合することで、抗原とその標的との相互作用を低減又はブロックする抗体又はフラグメントを指す。例えば、ＣＴＬＡ−４に対するブロッキング抗体は、細胞発現したＣＤ８０及びＣＤ８６（Ｂ７−１及びＢ７−２）への可溶性ヒトＣＴＬＡ−４の結合を低減又はブロックすることにより、ＣＴＬＡ−４のＴ細胞抑制活性を抑制する抗体を指す。共抑制的なＴ細胞分子に対し好適な抗体としては、限定するものではないが、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）、ＰＤ−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＤ−Ｌ２、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン−３含有分子３（ＴＩＭ３）、リンパ球活性遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ２７６、ＣＤ２７２、Ａ２ＡＲ、ＶＩＳＴＡ、及びインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）に対し特異的なブロッキング抗体が挙げられる。
【００８９】
したがって、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を、共抑制的Ｔ細胞分子に特異的なブロッキング抗体と組み合わせることにより、本発明のＣＤ９発現細胞に関連する疾患を少なくともある程度治療又は予防するための使用又は方法が提供される。かかる抗体は、好ましくは、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ２７６抗体、抗ＣＤ２７２抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、及び抗ＩＤＯ抗体からなる群から選択される。更なる免疫療法成分として使用するのに好適な抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ランブロリズマブ、イピリムマブ、及びリリルマブ（lirilumab）である。特に好ましい実施形態では、かかる抗体は、ＰＤ１−ＰＤＬ１系をブロッキングする抗体、例えば抗ＰＤ１抗体又は抗ＰＤＬ１抗体、より好ましくは抗ＰＤ１抗体である。かかる疾患は、好ましくは、ＣＤ９陽性癌であり、より好ましくは、黒色腫、結腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、扁平上皮癌、ＡＭＬ、多発性骨髄腫、胃癌、肝癌、脳癌、カポジ肉腫、粘表皮癌、絨毛癌、線維肉腫、子宮頸癌、神経膠腫、腺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される。
【００９０】
本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物と、共抑制的Ｔ細胞分子に特異的なブロッキング抗体とを含むパーツからなるキットもまた提供される。核酸分子又は機能的等価物と、本発明のベクター又は細胞と、共抑制的Ｔ細胞分子に特異的なブロッキング抗体とを含むパーツからなるキットもまた提供される。かかる抗体は、好ましくは、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ２７６抗体、抗ＣＤ２７２抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、及び抗ＩＤＯ抗体からなる群から選択される。更なる免疫療法成分として使用するのに好適な抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ランブロリズマブ、イピリムマブ、及びリリルマブ（lirilumab）である。特に好ましい実施形態では、かかる抗体は、ＰＤ１−ＰＤＬ１系をブロッキングする抗体、例えばＰＤ１ブロッキング抗体又はＰＤＬ１ブロッキング抗体、より好ましくはＰＤ１ブロッキング抗体である。
【００９１】
本発明のパーツからなるキットは、本発明の抗体、機能性部分、又は機能的等価物を含む医薬組成物と、Ｃ３転換酵素の形成を刺激可能な薬剤、又はＣ３転換酵素の形成の抑制を中和可能な薬剤、好ましくはＣＤ５５ブロッキング抗体、又は共抑制的Ｔ細胞分子に特異的なブロッキング抗体、好ましくはＰＤ１若しくはＰＤＬ１ブロッキング抗体を含む、医薬組成物とを充填した、１つ以上の容器も含み得る。パーツ又は１つ以上の容器のキットは、所望により、医薬的に許容され得る１つ以上の賦形剤を更に含む。このようなパーツ又は容器のキットと関連するものとして、これらは様々な記述資料、例えば使用のための取扱説明書、又は販売を規制する政府機関によって規定された形態の注意書きとすることができ、この注意書きは、製造、使用、又は販売の機関による承認を反映している。好ましくは、パーツからなるキットは、使用のための取扱説明書を含む。
【００９２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体、又は機能性部分若しくは機能的等価物と、ＣＤ９発現細胞に関連する疾患（好ましくはＣＤ９陽性の癌）の治療及び／又は予防に有用な治療薬と、医薬的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と、を含む、医薬組成物も提供される。好ましい実施形態では、かかる薬剤は、Ｃ３転換酵素の形成を刺激可能である、又はＣ３転換酵素の形成の阻害を中和可能である薬剤であり、好ましくは、ＣＤ５５ブロッキング抗体、ＣＤ４６ブロッキング抗体、又はＣＤ５９ブロッキング抗体、より好ましくはＣＤ５５ブロッキング抗体である。更に好ましい実施形態では、かかる薬剤は、共抑制的Ｔ細胞分子に特異的なブロッキング抗体であり、好ましくは、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ２７６抗体、抗ＣＤ２７２抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、及び抗ＩＤＯ抗体、より好ましくはＰＤ１ブロッキング抗体、又はＰＤＬ１ブロッキング抗体からなる群から選択される。
【００９３】
同様にして、本明細書により、本発明の抗体、機能性部分若しくは機能的等価物、又は結合化合物の少なくとも１つのＣＤＲ領域をコーする核酸分子及びそれらの機能的等価物、及びベクターが提供される。好ましくは、かかる結合化合物の少なくとも重鎖ＣＤＲ１〜３領域と、軽鎖ＣＤＲ１〜３領域は、本発明の１つ以上の核酸分子又は機能的等価物又はベクターによりコードされる。いくつかの実施形態では、本発明の結合化合物の重鎖及び軽鎖可変領域がコードされる。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物の少なくとも１つのＣＤＲ領域をコードする、少なくとも１５ヌクレオチド長の単離された合成若しくは組み換え核酸分子、又はそれらの機能的等価物、又はベクターを提供する。好ましくは、かかるＣＤＲ領域は、抗体ＡＴ１４−０１２、又は抗体ＡＴ１４−０１２と同等以上の結合親和性を有する、本明細書に記載のその変異体に由来するＣＤＲ領域である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも３０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド長を有する。本発明の核酸分子は、例えば、本発明の抗体を産生可能なＢ細胞から単離される。かかるＢ細胞は、好ましくは、抗体ＡＴ１４−０１２、又は抗体ＡＴ１４−０１２と同等以上の結合親和性を有する本明細書に記載のその変異体を産生する。いくつかの実施形態は、少なくとも、ＡＴ１４−０１２、又は抗体ＡＴ１４−０１２と同等以上の結合親和性を有する本明細書に記載のその変異体の重鎖ＣＤＲ３配列及び軽鎖ＣＤＲ３配列をコードする、１つ以上の核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターを提供する。
【００９５】
本明細書で使用するとき、用語「本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物の少なくとも１つのＣＤＲ領域をコードする、少なくとも１５ヌクレオチド長の単離された合成若しくは組み換え核酸分子、又はその機能的等価物」は、本明細書において、「本発明の核酸分子又は機能的等価物」も指す。
【００９６】
本明細書で使用するとき、本発明の核酸分子又は核酸配列は、好ましくは、ヌクレオチド鎖を含み、より好ましくはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡを含む。他の実施形態では、本発明の核酸分子又は核酸配列は、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡヘリックス、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（locked nucleic acid）（ＬＮＡ）、及び／又はリボザイムなどの、その他の種類の核酸構造物を含む。このようなその他の核酸構造物は、核酸配列の機能的等価物と呼ばれる。したがって、用語「核酸分子の機能的等価物」は、天然のヌクレオチドと同じ機能を示す非天然のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及び／又は非ヌクレオチド構築ブロックを含む鎖を包含する。
【００９７】
抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ領域をコードする核酸配列を表１及び図３に示す。表１及び図３に記載のＣＤＲ核酸配列のうちのいずれか１つと異なる配列を有するものの、表１及び図３に示すものと同じＣＤＲアミノ酸配列をコードする核酸コドンが存在する核酸分子も本発明により包含される。例えば、かかる核酸分子は、例えば、抗体ＡＴ１４−０１２と同様のＣＤＲアミノ酸配列を有する本発明の結合化合物の大量産生を可能にする、大腸菌、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＮＳＯ細胞（マウス骨髄腫）又は２９３（Ｔ）細胞などといった産生細胞用にコドン最適化されている、核酸配列を含む。抗体産生が任意の組み換え抗体産生系によりなされ得ることには留意されたい。本明細書で記載される４とおりの産生細胞系は、現在までに使用可能な数多くの系のうちのわずか数例に過ぎない。本明細書で使用するとき、用語「コドン」は、特定のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドのトリプレット（又はそれらの機能的等価物）を意味する。用語「コドン最適化」は、もとのヒト核酸配列に由来する１つ以上のコドンが、ある種の抗体産生系により好まれる１つ以上のコドンにより置き換えられることを意味する。これらの置き換えコドンは、好ましくは、置き換えられるもとのヒトコドンと同じアミノ酸残基をコードする。あるいは、１つ以上の置き換えコドンは、異なるアミノ酸残基をコードする。これにより、好ましくは保存的アミノ酸置換が生じるものの、これは必須ではない。典型的には、定常領域及びフレームワーク領域において１つ以上のアミノ酸置換が概して許容される。ＣＤＲ領域には、置換されたもとのヒトコドンと同じアミノ酸残基をコードするコドンを使用することが好ましい。
【００９８】
更に、抗体ＡＴ１４−０１２のＣＤＲ配列と同一ではないもののこれをベースとしている重鎖又は軽鎖ＣＤＲをコードする核酸分子も、得られるＣＤＲが抗体ＡＴ１４−０１２のＣＤＲ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するのであれば本発明に包含される。
【００９９】
したがって、更に、抗体ＡＴ１４−０１２のＣＤＲ配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む核酸分子若しくはそれらの機能的等価物、又はベクターが提供される。好ましくは、得られるＣＤＲは、本発明の抗体のもとのＣＤＲ配列と、３つ以下、好ましくは２つ以下、好ましくはわずか１つのアミノ酸のみが異なる。
【０１００】
いくつかの実施形態は、少なくとも、抗体ＡＴ１４−０１２、又は同等以上の結合親和性を有するそれらの多様体の、重鎖ＣＤＲ１〜３領域と軽鎖ＣＤＲ１〜３領域とをコードする、本発明の１つ以上の核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターを提供する。したがって、
配列ＤＹＡＭＨ若しくはＤＹＡＭＹをコードする核酸配列をコードする重鎖ＣＤＲ１、及び／又は
配列ＧＩＳＷＮＳＧＳＩＶＹＡＤＳＶＫＧをコードする核酸配列をコードする重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
配列ＡＶＳＧＹＹＰＹＦＤＹ、若しくはＡＶＳＧＹＦＰＹＦＤＹ、若しくはＡＶＳＧＹＹＰＹＦＨＹ、若しくはＡＶＳＧＹＦＰＹＦＨＹをコードする核酸配列をコードする重鎖ＣＤＲ３、及び／又は
配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＧをコードする核酸配列をコードする軽鎖ＣＤＲ１、及び／又は
配列ＷＡＳＴＲＥＳ若しくはＷＡＳＩＲＥＳをコードする核酸配列をコードする軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
配列ＱＱＹＹＴＴＰをコードする核酸配列をコードする軽鎖ＣＤＲ３、を含む、本発明の１つ以上の核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターが更に提供される。
【０１０１】
更に、
ｇａｔ  ｔａｔ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｃａｃと、
ｇｇｔ  ａｔｔ  ａｇｔ  ｔｇｇ  ａａｔ  ａｇｔ  ｇｇｔ  ａｇｃ  ａｔａ  ｇｔｃ  ｔａｔ  ｇｃｇ  ｇａｃ  ｔｃｔ  ｇｔｇ  ａａｇ  ｇｇｃと、
ｇｃｃ  ｇｔｇ  ａｇｔ  ｇｇｔ  ｔａｔ  ｔａｔ  ｃｃｃ  ｔａｃ  ｔｔｔ  ｇａｃ  ｔａｃと、
ａａｇ  ｔｃｃ  ａｇｃ  ｃａｇ  ａｇｔ  ｇｔｔ  ｔｔａ  ｔａｃ  ａｇｃ  ｔｃｃ  ａａｃ  ａａｔ  ａａｇ  ａａｃ  ｔａｃ  ｔｔａ  ｇｇｔと、
ｔｇｇ  ｇｃａ  ｔｃｔ  ａｃｃ  ｃｇｇ  ｇａａ  ｔｃｃと、
ｃａｇ  ｃａａ  ｔａｔ  ｔａｔ  ａｃｔ  ａｃｔ  ｃｃｔと、からなる群から選択される１つ以上の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、１つ以上の核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターが提供される。
【０１０２】
これらは、表１及び図３に記載の抗体ＡＴ１４０１２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１〜３核酸配列である。いくつかの実施形態では、かかる配列同一性は、少なくとも８５％、又は少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも８８％、又は少なくとも８９％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％である。
【０１０３】
好ましくは、上記のＡＴ１４−０１２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１〜３配列、又はこれらと少なくとも８０％同一である配列がすべて存在する。したがって更に、
配列ｇａｔ  ｔａｔ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｃａｃと少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列をコードする重鎖ＣＤＲ１と、
配列ｇｇｔ  ａｔｔ  ａｇｔ  ｔｇｇ  ａａｔ  ａｇｔ  ｇｇｔ  ａｇｃ  ａｔａ  ｇｔｃ  ｔａｔ  ｇｃｇ  ｇａｃ  ｔｃｔ  ｇｔｇ  ａａｇ  ｇｇｃと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列をコードする重鎖ＣＤＲ２と、
配列ｇｃｃ  ｇｔｇ  ａｇｔ  ｇｇｔ  ｔａｔ  ｔａｔ  ｃｃｃ  ｔａｃ  ｔｔｔ  ｇａｃ  ｔａｃと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列をコードする重鎖ＣＤＲ３と、
配列ａａｇ  ｔｃｃ  ａｇｃ  ｃａｇ  ａｇｔ  ｇｔｔ  ｔｔａ  ｔａｃ  ａｇｃ  ｔｃｃ  ａａｃ  ａａｔ  ａａｇ  ａａｃ  ｔａｃ  ｔｔａ  ｇｇｔと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列をコードする軽鎖ＣＤＲ１と、
配列ｔｇｇ  ｇｃａ  ｔｃｔ  ａｃｃ  ｃｇｇ  ｇａａ  ｔｃｃと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列をコードする軽鎖ＣＤＲ２と、
配列ｃａｇ  ｃａａ  ｔａｔ  ｔａｔ  ａｃｔ  ａｃｔ  ｃｃｔと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列をコードする軽鎖ＣＤＲ３と、を含む１つ以上の核酸分子若しくは機能的等価物、又はベクターが提供される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、かかる配列同一性は、少なくとも８５％、又は少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも８８％、又は少なくとも８９％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％である。好ましくは、コードされるＣＤＲアミノ酸配列は、抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１〜３アミノ酸配列と、３つ以下、好ましくは２つ以下、好ましくはわずか１つのアミノ酸のみが異なる。
【０１０５】
いくつかの実施形態は、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物の少なくとも重鎖可変領域の配列及び／又は軽鎖可変領域の配列をコードする、本発明の核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターを提供する。好ましくは、かかる少なくとも１つの核酸分子、又は機能的等価物若しくはベクターは、少なくとも抗体ＡＴ１４−０１２の重鎖可変領域の配列、及び／又は軽鎖可変領域の配列、かかる配列と少なくとも８０％同一である配列をコードする。
【０１０６】
したがって、更に、配列ｇａａ  ｇｔｇ  ｃａｇ  ｇｔｇ  ｇｔｇ  ｇａｇ  ｔｃｔ  ｇｇｇ  ｇｇａ  ｇｇｃ  ｔｔｇ  ｇｔａ  ｃａｇ  ｃｃｔ  ｇｇｃ  ａｇｇ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ａｇａ  ｃｔｃ  ｔｃｃ  ｔｇｔ  ｇｃａ  ｇｃｃ  ｔｃｔ  ｇｇａ  ｔｔｃ  ａｃｃ  ｔｔｔ  ｇａｔ  ｇａｔ  ｔａｔ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｃａｃ  ｔｇｇ  ｇｔｃ  ｃｇｇ  ｃａａ  ｇｃｔ  ｃｃａ  ｇｇｇ  ａａｇ  ｇｇｃ  ｃｔｇ  ｇａｇ  ｔｇｇ  ｇｔｃ  ｔｃａ  ｇｇｔ  ａｔｔ  ａｇｔ  ｔｇｇ  ａａｔ  ａｇｔ  ｇｇｔ  ａｇｃ  ａｔａ  ｇｔｃ  ｔａｔ  ｇｃｇ  ｇａｃ  ｔｃｔ  ｇｔｇ  ａａｇ  ｇｇｃ  ｃｇａ  ｔｔｃ  ａｃｃ  ａｔｃ  ｔｃｃ  ａｇａ  ｇａｃ  ａａｃ  ｇｃｃ  ａａｇ  ａａｃ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ｔａｔ  ｃｔｇ  ｃａａ  ｃｔｇ  ａａｃ  ａｇｔ  ｃｔｇ  ａｇａ  ｇｃｔ  ｇａｇ  ｇａｃ  ａｃｇ  ｇｃｃ  ｔｔｃ  ｔａｔ  ｔａｃ  ｔｇｔ  ｇｃａ  ａａａ  ｇｃｃ  ｇｔｇ  ａｇｔ  ｇｇｔ  ｔａｔ  ｔａｔ  ｃｃｃ  ｔａｃ  ｔｔｔ  ｇａｃ  ｔａｃ  ｔｇｇ  ｇｇｃ  ｃａｇ  ｇｇａ  ａｔｔ  ｔｔｇ  ｇｔｃ  ａｃｃ  ｇｔｃ  ｔｃｃ  ｔｃａと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、及び／又は配列ｇａｃ  ａｔｃ  ｇｔｇ  ａｔｇ  ａｃｃ  ｃａｇ  ｔｃｔ  ｃｃａ  ｇａｃ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ｔｃｔ  ｇｔｇ  ｔｃｔ  ｃｔｇ  ｇｇｃ  ｇａｇ  ａｇｇ  ｇｃｃ  ａｃｃ  ａｔｃ  ａａｃ  ｔｇｃ  ａａｇ  ｔｃｃ  ａｇｃ  ｃａｇ  ａｇｔ  ｇｔｔ  ｔｔａ  ｔａｃ  ａｇｃ  ｔｃｃ  ａａｃ  ａａｔ  ａａｇ  ａａｃ  ｔａｃ  ｔｔａ  ｇｇｔ  ｔｇｇ  ｔａｃ  ｃａｇ  ｃａｇ  ａａａ  ｃｃａ  ｇｇａ  ｃａｇ  ｃｃｔ  ｃｃｔ  ａａｇ  ｃｔｇ  ｃｔｃ  ａｔｔ  ｔａｃ  ｔｇｇ  ｇｃａ  ｔｃｔ  ａｃｃ  ｃｇｇ  ｇａａ  ｔｃｃ  ｇｇｇ  ｇｔｃ  ｃｃｔ  ｇａｃ  ｃｇａ  ｔｔｃ  ａｇｔ  ｇｇｃ  ａｇｃ  ｇｇｇ  ｔｃｔ  ｇｇｇ  ａｃａ  ｇａｔ  ｔｔｃ  ａｃｔ  ｃｔｃ  ａｃｃ  ａｔｃ  ａｇｃ  ａｇｃ  ｃｔｇ  ｃａｇ  ｇｃｔ  ｇａａ  ｇａｔ  ｇｔｇ  ｇｃａ  ｇｔｔ  ｔａｔ  ｔａｃ  ｔｇｔ  ｃａｇ  ｃａａ  ｔａｔ  ｔａｔ  ａｃｔ  ａｃｔ  ｃｃｔ  ｔｃｃ  ａｃｃ  ｔｔｃ  ｇｇｃ  ｃａａ  ｇｇｇ  ａｃａ  ｃｇａ  ｃｔｇ  ｇａｇ  ａｔｔ  ａａａと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、１つ以上の核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターが提供される。
【０１０７】
好ましくは、本発明の１つ以上の核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターは、表１及び図３に示すＡＴ１４−０１２の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に類似した重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方をコードする。したがって、更に、配列ｇａａ  ｇｔｇ  ｃａｇ  ｇｔｇ  ｇｔｇ  ｇａｇ  ｔｃｔ  ｇｇｇ  ｇｇａ  ｇｇｃ  ｔｔｇ  ｇｔａ  ｃａｇ  ｃｃｔ  ｇｇｃ  ａｇｇ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ａｇａ  ｃｔｃ  ｔｃｃ  ｔｇｔ  ｇｃａ  ｇｃｃ  ｔｃｔ  ｇｇａ  ｔｔｃ  ａｃｃ  ｔｔｔ  ｇａｔ  ｇａｔ  ｔａｔ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｃａｃ  ｔｇｇ  ｇｔｃ  ｃｇｇ  ｃａａ  ｇｃｔ  ｃｃａ  ｇｇｇ  ａａｇ  ｇｇｃ  ｃｔｇ  ｇａｇ  ｔｇｇ  ｇｔｃ  ｔｃａ  ｇｇｔ  ａｔｔ  ａｇｔ  ｔｇｇ  ａａｔ  ａｇｔ  ｇｇｔ  ａｇｃ  ａｔａ  ｇｔｃ  ｔａｔ  ｇｃｇ  ｇａｃ  ｔｃｔ  ｇｔｇ  ａａｇ  ｇｇｃ  ｃｇａ  ｔｔｃ  ａｃｃ  ａｔｃ  ｔｃｃ  ａｇａ  ｇａｃ  ａａｃ  ｇｃｃ  ａａｇ  ａａｃ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ｔａｔ  ｃｔｇ  ｃａａ  ｃｔｇ  ａａｃ  ａｇｔ  ｃｔｇ  ａｇａ  ｇｃｔ  ｇａｇ  ｇａｃ  ａｃｇ  ｇｃｃ  ｔｔｃ  ｔａｔ  ｔａｃ  ｔｇｔ  ｇｃａ  ａａａ  ｇｃｃ  ｇｔｇ  ａｇｔ  ｇｇｔ  ｔａｔ  ｔａｔ  ｃｃｃ  ｔａｃ  ｔｔｔ  ｇａｃ  ｔａｃ  ｔｇｇ  ｇｇｃ  ｃａｇ  ｇｇａ  ａｔｔ  ｔｔｇ  ｇｔｃ  ａｃｃ  ｇｔｃ  ｔｃｃ  ｔｃａと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、及び／又は配列ｇａｃ  ａｔｃ  ｇｔｇ  ａｔｇ  ａｃｃ  ｃａｇ  ｔｃｔ  ｃｃａ  ｇａｃ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ｔｃｔ  ｇｔｇ  ｔｃｔ  ｃｔｇ  ｇｇｃ  ｇａｇ  ａｇｇ  ｇｃｃ  ａｃｃ  ａｔｃ  ａａｃ  ｔｇｃ  ａａｇ  ｔｃｃ  ａｇｃ  ｃａｇ  ａｇｔ  ｇｔｔ  ｔｔａ  ｔａｃ  ａｇｃ  ｔｃｃ  ａａｃ  ａａｔ  ａａｇ  ａａｃ  ｔａｃ  ｔｔａ  ｇｇｔ  ｔｇｇ  ｔａｃ  ｃａｇ  ｃａｇ  ａａａ  ｃｃａ  ｇｇａ  ｃａｇ  ｃｃｔ  ｃｃｔ  ａａｇ  ｃｔｇ  ｃｔｃ  ａｔｔ  ｔａｃ  ｔｇｇ  ｇｃａ  ｔｃｔ  ａｃｃ  ｃｇｇ  ｇａａ  ｔｃｃ  ｇｇｇ  ｇｔｃ  ｃｃｔ  ｇａｃ  ｃｇａ  ｔｔｃ  ａｇｔ  ｇｇｃ  ａｇｃ  ｇｇｇ  ｔｃｔ  ｇｇｇ  ａｃａ  ｇａｔ  ｔｔｃ  ａｃｔ  ｃｔｃ  ａｃｃ  ａｔｃ  ａｇｃ  ａｇｃ  ｃｔｇ  ｃａｇ  ｇｃｔ  ｇａａ  ｇａｔ  ｇｔｇ  ｇｃａ  ｇｔｔ  ｔａｔ  ｔａｃ  ｔｇｔ  ｃａｇ  ｃａａ  ｔａｔ  ｔａｔ  ａｃｔ  ａｃｔ  ｃｃｔ  ｔｃｃ  ａｃｃ  ｔｔｃ  ｇｇｃ  ｃａａ  ｇｇｇ  ａｃａ  ｃｇａ  ｃｔｇ  ｇａｇ  ａｔｔ  ａａａと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、１つ以上の核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターが提供される。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、かかる配列同一性は、少なくとも８５％、又は少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも８８％、又は少なくとも８９％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は機能性部分若しくは等価物をコードする核酸分子及びそれらの機能的等価物並びにベクターが提供される。いくつかの実施形態では、抗体ＡＴ１４−０１２、又はその機能性部分、若しくは機能的等価物をコードする核酸分子及びそれらの機能的等価物並びにベクターが提供される。いくつかの実施形態では、かかる核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターは、大腸菌、ＣＨＯ、ＮＳＯ、又は２９３細胞といった非ヒト宿主細胞などの非ヒト組み換え発現系のためにコドン最適化されている。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子又は機能的等価物を含むベクターが提供される。本明細書で使用するとき、「本発明の核酸分子又は機能的等価物を含むベクター」は、「本発明のベクター」としても参照される。これらの用語は、本発明の１つ以上の核酸分子又は機能的等価物を含む本発明の１つ以上のベクターを包含する。本明細書で使用するとき、単数に関する用語「ａ」は、用語「１つ以上（one or more）」を包含する。
【０１１１】
本発明の１つ以上の核酸分子又は機能的等価物を含むベクターを構築するための方法もまた、当業界で知られている。本発明のベクターを作製するのに適したベクターの非限定例は、レトロウイルスベクター及びシチウイルスベクターである。かかるベクターは、様々な用途に適している。例えば、本発明の治療的に有益な核酸配列を含む本発明のベクターは、黒色腫の予防又は治療用途に適している。このようなベクターを、かかるベクターの投与を必要としている個体、好ましくはヒトに投与することで、かかる予防又は治療用核酸配列のｉｎ  ｖｉｖｏでの発現が生じ、これにより黒色腫の少なくともある程度の治療又は予防がもたらされる。かかるベクターは、対象とする核酸分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現、例えば、本発明の抗体又は機能的等価物の（商用）産生に関係する用途にも使用できる。そのため、本発明の核酸分子、機能的等価物及びベクターは、ＣＤ９に特異的な本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を生成するのに特に有用である。このような生成は、核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターを細胞に導入することによりなされ、細胞の核酸翻訳機構により、コードされた抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物が産生される。いくつかの実施形態では、本発明の結合化合物の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする少なくとも１つの核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターは、例えば、大腸菌、ＣＨＯ、ＮＳＯ、又は２９３（Ｔ）細胞などの、いわゆる産生細胞において発現され、これらのうちのいくつかは商用の抗体産生に適している。注目すべきことに、任意の組み換え抗体産生系が好適であり、言及したこれらの４とおりの産生細胞系は、現在までに使用可能である数多くの系のうちのごくわずかな例に過ぎない。本明細書において前述したとおり、このような場合では、核酸分子又はそれらの機能的等価物を使用することが好ましく、ここで、本明細書で提供されるもとのヒトＡＴ１４−０１２配列は、産生細胞用にコドン最適化されている。かかる産生細胞の増殖により、本発明の結合化合物を産生可能な産生細胞株が得られる。好ましくは、かかる産生細胞株は、ヒトにおける使用のための抗体を産生するのに適している。そのため、かかる産生細胞株は、好ましくは、病原性微生物などの病原性物質を含まない。いくつかの実施形態では、抗体ＡＴ１４−０１２はかかる産生細胞株で産生される。
【０１１２】
したがって、本発明の少なくとも１つの核酸分子及び／若しくは機能的等価物並びに／又はベクターを含む、単離された又は組み換え細胞が提供される。かかる細胞は、好ましくは本発明の結合化合物が産生可能な抗体産生細胞、例えば抗体ＡＴ１４−０１２などである。本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を産生するための方法が更に提供され、かかる方法は、本発明の少なくとも１つの核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターを細胞に供給することと、かかる細胞に、かかる少なくとも１つの核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターを翻訳させて、本発明のかかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を産生させることと、を含む。いくつかの実施形態では、かかる抗体は、重鎖変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）を場合により１つ以上有するＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物である。本発明のかかる方法は、好ましくは、本発明のかかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を回収、精製、及び／又は単離する工程を更に含む。得られた本発明の結合化合物は、例えば、場合により追加の精製、単離、又は加工工程後にヒトの治療又は診断に使用するのに好適である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１つの核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターが、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体産生のため非ヒト動物に導入される。したがって、本発明の少なくとも１つの核酸分子若しくは機能的等価物又はベクターを含む、単離又は組み換え非ヒト動物が更に提供される。トランスジェニック非ヒト動物の作製方法は当該技術分野で知られている。例えば、ＥＣ  Ｌｅｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３を参照のこと。
【０１１４】
本発明の結合化合物は、黒色腫に対する使用に適している。更に、ＣＤ９は例えば、ＣＤ９も発現するその他の種類の腫瘍などといった、その他の疾患においても役割を有する。ＣＤ９陽性細胞に関連する疾患のその他の非限定例には、骨粗鬆症及び関節炎（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．及びＨａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．）、肺炎及びＣＯＰＤ（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．及びＪｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、並びに大腸炎（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）がある。例えば、ＣＤ９は、卵巣の摘出により誘導され得る骨粗鬆症及びコラーゲン誘導性関節炎の骨侵食下で活性化している破骨細胞において豊富に発現している（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．ａｎｄ  Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．）。ＣＤ９は、生得的なリンパ系細胞でも発現する。ＣＤ９陽性細胞に関連する疾患のその他の非限定例は、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ又はヘルペス又はインフルエンザ）、細菌感染症、ＣＭＶ網膜炎、口腔カンジダ症、グランツマン血小板無力症、及びジフテリアである。
【０１１５】
本発明の結合化合物はＣＤ９に特異的であり、これらの疾患に対しても使用するのに好適である。したがって、本発明の結合化合物は、医薬品又は予防薬として使用するのに特に好適である。したがって、医薬品及び／又は予防薬として使用するための、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物が提供される。いくつかの実施形態では、ヒト個体を治療した際に有害な副作用が生じる可能性を低減するために、ヒト配列からなる本発明の結合化合物が使用される。かかる抗体は、好ましくは、抗体ＡＴ１４−０１２を含む。したがって、抗体ＡＴ１４−０１２が、医薬品及び／又は予防薬としての使用のため、更に提供される。いくつかの実施形態では、ヒト配列は、同じＡＴ１４−０１２アミノ酸、又はそれらと少なくとも８０％の同一性を有する配列をコードするコドン最適化した核酸配列を所望により使用して、ＡＴ１４−０１２の配列をもとに合成又は組み換えにより作製される。
【０１１６】
同様にして、医薬品及び／又は予防薬として使用するための、核酸分子又は本発明の機能的等価物、あるいはかかる核酸分子又は本発明の機能的等価物を含む本発明のベクター、あるいは本発明の細胞が提供される。本発明の１つ以上の核酸分子又は機能的等価物（を含むベクター）が投与されるとき、核酸分子又は機能的等価物は、ｉｎ  ｓｉｔｕで本発明の結合化合物へと翻訳される。得られる本発明の結合化合物は続いて、ＣＤ９発現細胞に関連する疾患、例えばＣＤ９発現腫瘍、骨粗鬆症、関節炎、肺炎、ＣＯＰＤ、大腸炎、又は自然リンパ球に関連する疾患を中和又は予防する。同様にして、本発明の細胞を、かかる中和又は予防を必要としている患者に導入することにより、本発明の治療又は予防用抗ＣＤ９抗体、又は機能性部分若しくは機能的等価物のｉｎ  ｖｉｖｏ生成が生じる。
【０１１７】
いくつかの実施形態は、ＣＤ９発現細胞と関連する疾患を少なくともある程度治療又は予防する方法に使用するための、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物、あるいは本発明の抗体若しくは機能性部分若しくは機能的等価物、又は本発明の核酸分子若しくは機能的等価物若しくはベクター、又は本発明の細胞を提供する。いくつかの実施形態は、ＣＤ９発現細胞に関連する疾患を少なくともある程度治療又は予防する方法に使用するための抗体ＡＴ１４−０１２を提供する。本明細書で使用するとき、用語「ＣＤ９発現細胞に関連する疾患」は、ＣＤ９発現疾患に特異的な細胞の存在を包含する何らかの疾患を意味する。いくつかの実施形態では、このような細胞は、ＣＤ９発現悪性細胞でよくあるような疾患の原因因子である。いくつかの実施形態では、このような細胞が存在することで、例えば炎症及び／又は疼痛などと行った有害症状が生じる。ＣＤ９発現細胞に関連する疾患の非限定例は、ＣＤ９発現腫瘍細胞を有する癌、例えば、黒色腫、結腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、ＡＭＬ、多発性骨髄腫、胃癌、肝癌、子宮頸癌、腎細胞癌、前立腺癌、脳癌、カポジ肉腫、粘膜表皮癌、絨毛癌、線維肉腫、子宮頸癌、神経膠腫、腺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び小細胞肺癌などである。
【０１１８】
本明細書で使用するとき、ＣＤ９を発現する腫瘍細胞は、ＣＤ９陽性腫瘍細胞又はＣＤ９陽性悪性細胞とも呼ばれる。腫瘍細胞の少なくとも一部がＣＤ９を発現する癌は、「ＣＤ９陽性癌」と呼ばれる。ＣＤ９発現細胞に関連する疾患のその他の非限定例は、骨粗鬆症、関節炎、肺炎、ＣＯＰＤ、大腸炎、及び自然リンパ球に関連する疾患である。
【０１１９】
ＣＤ９発現細胞に関連する疾患を少なくともある程度治療又は予防する方法に使用するための、本発明の抗体若しくは機能性部分若しくは機能的等価物、又は本発明の核酸分子若しくは機能的等価物若しくはベクター、又は本発明の細胞、が更に提供され、かかる疾患は、ＣＤ９陽性癌、骨粗鬆症、関節炎、肺炎、ＣＯＰＤ、大腸炎、及び自然リンパ球に関連する疾患からなる群から選択される。かかるＣＤ９陽性癌は、好ましくは、黒色腫、結腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、扁平上皮癌、ＡＭＬ、多発性骨髄腫、胃癌、肝癌、脳癌、カポジ肉腫、粘表皮癌、絨毛癌、線維肉腫、子宮頸癌、神経膠腫、腺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される。
【０１２０】
実施例は、ＡＴ１４−０１２は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により黒色腫細胞を殺傷可能である一方で、初代ヒト動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の場合には観察される細胞死が最小限のものであったことを示す。更に、抗体ＡＴ１４−０１２は、かかる抗体がＩｇＧ３骨格内のものである場合に補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をトリガー可能であることが示されている。そのため、理論に束縛されるものではないが、ＡＴ１４１２の抗腫瘍反応性は、少なくともある程度はＡＤＣＣにより介在されるものであることが推測される。したがって、好ましい実施形態では、本発明の、あるいは本発明に使用するための抗体、機能性部分、又は機能的等価物、により、ＣＤ９発現細胞における抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導可能である。
【０１２１】
引用されたいずれかの方法に使用するのに好ましい抗体は、抗体ＡＴ１４−０１２、又は抗体ＡＴ１４−０１２と同様の結合特異性及び同等以上の親和性の、本明細書に記載の抗体ＡＴ１４−０１２の変異体である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、所望により変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、及び／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）のうち１つ以上を有する抗体ＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物、あるいは場合によりＨ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）の１つ以上を有するＡＴ１４−０１２をコードするそれらの少なくとも１つの核酸分子又は機能的等価物、あるいはそれらの機能性部分又は機能的等価物、あるいはかかる核酸分子又は機能的等価物を含む少なくとも１つのベクター又は細胞が、黒色腫を少なくともある程度治療及び／又は予防するために好ましく使用される。本明細書で使用するとき、用語「黒色腫を少なくともある程度治療及び／又は予防すること」は、患者に黒色腫細胞が存在することでもたらされる黒色腫の増殖を中和すること、及び／又は症状を軽減することを含む。したがって、黒色腫を少なくともある程度治療及び／又は予防するための医薬品及び／又は予防薬の調製のための、所望により変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）のうち１つ以上を有する抗体ＡＴ１４−０１２又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物、あるいは場合によりＨ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）の１つ以上を有するＡＴ１４−０１２をコードする少なくとも１つの核酸分子又は機能的等価物、あるいはそれらの機能性部分又は機能的等価物、あるいはかかる核酸分子又は機能的等価物を含む少なくとも１つのベクター又は細胞も提供される。黒色腫を少なくともある程度治療及び／又は予防するための方法に使用するための、所望により変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）の１つ以上を有する抗体ＡＴ１４−０１２又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物、あるいは場合によりＨ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）の１つ以上を有するＡＴ１４−０１２をコードするそれらの少なくとも１つの核酸分子又は機能的等価物、あるいはそれらの機能性部分又は機能的等価物、あるいはかかる核酸分子又は機能的等価物を含む少なくとも１つのベクター又は細胞が、更に提供される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本発明の結合化合物は、化学療法薬又はその他の毒性化合物又は放射性化合物又は免疫調節分子、例えば、ＣＤ３特異的抗体などの治療用の部分に連結されて、それぞれいわゆる「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞」を形成する。これらは、骨髄増殖性又はリンパ球増殖性疾患に対抗可能である。
【０１２４】
更なる実施形態は、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を含む組成物を提供する。本発明の核酸分子又は機能的等価物を含む組成物、並びに本発明のベクター又は細胞を含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、かかる抗体は、変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）を場合により１つ以上有するＡＴ１４−０１２である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）を場合により１つ以上有する抗体ＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物、並びに別のＣＤ９特異的抗体を含む。かかるその他のＣＤ９特異的抗体は、好ましくは、ＡＴ１４−０１２とは異なるＣＤ９エピトープに結合する。黒色腫細胞又はその他のＣＤ９陽性腫瘍細胞などのＣＤ９陽性細胞に結合及び／又はこれらを中和するための異なるＣＤ９特異的結合化合物のこのような組み合わせは特に好適である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は医薬組成物である。かかる医薬組成物は、好ましくは、医薬的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤も含む。例えば、好適な担体の非限定例は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン（例えば、ＢＳＡ又はＲＳＡ）、及びオボアルブミンを含む。好ましい一実施形態では、かかる好適な担体は、例えば、生理食塩水などの溶液を含む。本発明の医薬組成物は、好ましくはヒト用途に好適である。
【０１２６】
本発明は、ＣＤ９発現細胞に関連する疾患を少なくともある程度治療又は予防する方法であって、治療有効量の、本発明の抗体又は機能性部分又は機能的等価物、及び／あるいは本発明の核酸分子又は機能的等価物、及び／あるいは本発明のベクター又は細胞、及び／あるいは本発明の組成物を、かかる治療又は予防を必要としている個体に投与することを含む、方法を更に提供する。本明細書で使用するとき、「個体」又は「対象」は、ヒト又は非ヒト動物であり、好ましくはＣＤ９陽性癌、骨粗鬆症、関節炎、肺炎、ＣＯＰＤ、大腸炎、又は自然リンパ球に関連する疾患に罹患しているヒト患者である。いくつかの実施形態では、かかるヒト個体は、黒色腫患者である。かかる組成物は、好ましくは本発明の医薬組成物である。本発明の結合化合物又は核酸分子又は機能的等価物又はベクター又は医薬組成物は、好ましくは、１回以上の注射により投与される。本発明の結合化合物の投与に典型的な用量は、体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜１０ｍｇである。
【０１２７】
本発明の結合化合物は、ＣＤ９発現細胞の検出にも特に有用である。例えば、個体、好ましくはヒトがＣＤ９発現細胞に関連する疾患に罹患している疑いがある場合、本発明の結合化合物を用い、ＣＤ９発現細胞（ＣＤ９陽性細胞とも呼称される）の存在について、かかる個体由来の血液又は組織サンプルなどのサンプルを試験することができる。いくつかの実施形態では、かかるサンプルは、ＣＤ９陽性細胞に特異的に結合する本発明の結合化合物と混合される。本発明の化合物に結合した、例えば、黒色腫細胞などのＣＤ９陽性細胞は、当該技術分野で既知の、例えば、磁気ビーズを利用する単離、ストレプトアビジンコートビーズを利用する単離、又はカラムに固定した二次抗体を利用する単離などが挙げられるがこれらに限定されない任意の手法を用い、サンプルから単離する、及び／又は検出することができる。あるいは又は更に、本発明の結合化合物は、かかる結合化合物を検出可能なものとするために標識される。かかる結合化合物は、例えば、蛍光標識、酵素標識、又は放射性標識されている。あるいは、本発明の結合化合物は、かかる結合化合物に対する標識二次抗体を利用して検出される。
【０１２８】
本発明の結合化合物が患者のサンプル成分に結合するようである場合、ＣＤ９陽性細胞が存在することを示す。このようにして、黒色腫細胞などの疾患特異的なＣＤ９陽性細胞を検出可能である。したがって、いくつかの実施形態は、サンプルがＣＤ９発現細胞を含むかどうかを判定するための、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、サンプルがＣＤ９発現腫瘍細胞を含むかどうかを判定するため、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物が使用される。ＣＤ９発現細胞、好ましくはＣＤ９陽性腫瘍細胞がサンプル中に存在するか否かを判定するための方法であって、
かかるサンプルを、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物と接触させることと、
かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を、ＣＤ９発現細胞（存在する場合）に結合させることと、
ＣＤ９発現細胞、例えば、ＣＤ９陽性腫瘍細胞に、かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物が結合するか否かを判定することにより、かかるサンプル中にＣＤ９発現（腫瘍）細胞が存在しているか否かを判定することと、を含む、方法も提供される。いくつかの実施形態では、かかるＣＤ９発現腫瘍細胞は黒色腫細胞である。
【０１２９】
実施例に示すとおり、抗体ＡＴ１４−０１２は、例えばＣＤ９陽性腫瘍細胞などのＣＤ９陽性細胞を検出するのに特に適する。したがって、サンプルがＣＤ９発現細胞を含むかどうかを判定するための、変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／若しくは軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）の１つ以上を場合により有する抗体ＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物の使用、が更に提供される。サンプルが、例えば黒色腫細胞、又は大腸癌細胞、又は膵臓癌細胞、又は食道癌細胞、又は肺癌細胞、又は乳癌細胞、又は卵巣癌細胞、又は胃癌細胞、又は扁平上皮癌細胞、又はＡＭＬ細胞、又は多発性骨髄腫細胞、又は胃癌細胞、又は肝癌細胞、又は脳癌細胞、又はカポジ肉腫細胞、又は粘膜表皮癌細胞、又は絨毛癌細胞、又は線維肉腫細胞、又は子宮頸癌細胞、又はグリオーマ細胞、又は腺癌細胞、又は肺腺癌細胞、又は非小細胞肺癌細胞、又は膀胱癌細胞、又は小細胞肺癌細胞などのＣＤ９発現細胞を含むかどうかを判定するための、変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）のうちの１つ以上を所望により有する抗体ＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物の使用も提供される。
【０１３０】
ＣＤ９発現細胞、好ましくはＣＤ９陽性腫瘍細胞がサンプル中に存在するか否かを判定するための方法であって、
かかるサンプルを、変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）の１つ以上を場合により有する抗体ＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物と接触させることと、
変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ（ＩＭＧＴ付番）のうちの１つ以上を場合により有する抗体ＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物をＣＤ９発現細胞（存在する場合）と結合させることと、
例えば、ＣＤ９陽性腫瘍細胞などのＣＤ９発現細胞に、変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ（ＩＭＧＴ付番）並びに／若しくは軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ番号）の１つ以上を場合により有する抗体ＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が結合するか否かを判定することにより、ＣＤ９発現細胞がかかるサンプル中に存在するか否かを判定することと、を含む、方法も提供される。
【０１３１】
いくつかの実施形態は、かかるサンプルが血液サンプル、又は骨髄サンプル、又は生検を含む、本発明の方法を提供する。いくつかの実施形態では、黒色腫及び／又は扁平上皮癌について試験するために、かかる生検は皮膚組織に由来する。いくつかの実施形態では、胃癌、大腸癌、食道癌、又は胃癌について試験するために、かかる生検は腸に由来するものである。いくつかの実施形態では、かかる生検は、膵臓癌の試験用には膵臓組織、又は肺癌の試験用には肺組織、又は乳癌の試験用には乳房組織、又は卵巣癌の試験用には卵巣組織、又は肝癌の試験用には肝臓組織、又は脳癌の試験用には脳組織、又は粘膜表皮癌の試験用には粘膜表皮組織、又は子宮頸癌の試験用には子宮頸部組織、又は膀胱癌の試験用には膀胱組織に由来する。いくつかの実施形態では、かかるサンプルは、例えば、ＡＭＬ、多発性骨髄腫、癌に関連する細胞外小胞（エキソソーム）、又は上記のいずれかの固形腫瘍の転移の存在についての試験に有用である血液サンプルである。
【０１３２】
本発明の結合化合物についてのかかる試験結果は、サンプルの分類に有用である。例えば、個体サンプルが悪性ＣＤ９陽性細胞を含有していることが明らかである場合、サンプルは疾患に関連する細胞を含有するものとして分類される。かかる分類は、続いてＣＤ９発現細胞に関連する疾患についての診断に使用され得る。したがっていくつかの実施形態は、ＣＤ９発現細胞に関連する疾患の診断に使用するための、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。かかる疾患は、好ましくは、ＣＤ９陽性癌、関節炎、肺炎、ＣＯＰＤ、大腸炎、及び自然リンパ球に関連する疾患からなる群から選択される。かかるＣＤ９陽性癌は、好ましくは、黒色腫、結腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、扁平上皮癌、ＡＭＬ、多発性骨髄腫、胃癌、肝癌、脳癌、カポジ肉腫、粘表皮癌、絨毛癌、線維肉腫、子宮頸癌、神経膠腫、腺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態では、変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）の１つ以上を場合により有する抗体ＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物は、上記の検出及び診断に使用される。したがって、ＣＤ９発現細胞に関連する疾患の診断に使用するための、変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）の１つ以上を所望により有する抗体ＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物の使用、も提供される。いくつかの実施形態は、黒色腫、結腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、扁平上皮癌、ＡＭＬ、多発性骨髄腫、胃癌、肝癌、脳癌、カポジ肉腫、粘表皮癌、絨毛癌、線維肉腫、子宮頸癌、神経膠腫、腺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び小細胞肺癌の診断に使用するための、変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）の１つ以上を有する抗体ＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を提供する。
【０１３３】
個体がＣＤ９陽性癌に罹患しているか否かを測定するためのｅｘ  ｖｉｖｏ法であって、
かかる個体由来の腫瘍細胞を、本発明の抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物と接触させることと、
かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を、ＣＤ９発現細胞（存在する場合）に結合させることと、
ＣＤ９発現細胞が、かかる抗体又は機能性部分又は機能的等価物に結合するか否かを判定することにより、かかる個体がＣＤ９陽性癌に罹患している否か判定することと、を含む、ｅｘ  ｖｉｖｏ法も提供される。
【０１３４】
このようなＣＤ９陽性癌の非限定例は上掲のものである。好ましくは、変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）のうちの１つ以上を場合により有する抗体ＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、かかる方法に使用される。したがって、いくつかの実施形態は、個体がＣＤ９陽性癌に罹患しているか否かを判定するためのｅｘ  ｖｉｖｏ法であって、
かかる個体由来の腫瘍細胞を、変異Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ、並びに／又は軽鎖変異Ｔ６６Ｉ（ＩＭＧＴ付番）の１つ以上を場合により有する抗体ＡＴ１４−０１２、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物と接触させることと、
かかる抗体又は機能性部分若しくは機能的等価物を、ＣＤ９発現細胞（存在する場合）に結合させることと、
ＣＤ９発現細胞が、かかる抗体又は機能性部分又は機能的等価物に結合するか否かを判定することにより、かかる個体がＣＤ９陽性癌に罹患している否か判定することと、を含む、ｅｘ  ｖｉｖｏ法も提供される。
【０１３５】
実施例に示すとおり、抗体ＡＴ１４−０１２は、図２に示すＣＤ９配列の位置１５４〜１８１、好ましくは１６８〜１８１内に位置する少なくとも５つのＣＤ９アミノ酸に結合する。抗体ＡＴ１４−０１２は、図２に示すとおりのＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するＣＤ９のアミノ酸を含むＣＤ９エピトープを結合する。特に、ＡＴ１４−０１２は、このＣＤ９配列のアミノ酸Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に結合する。現在では、ＣＤ９に特異的な更なる抗体を得ること又は生成することが可能となったことが知られている。本明細書で前述したとおり、抗体の取得又は生成は、例えば、上記のアミノ酸残基を少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ含むＣＤ９ペプチド、又は上記のアミノ酸残基の少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つのからなるＣＤ９ペプチド、又はかかるＣＤ９ペプチドを含む免疫原性化合物、又はかかるＣＤ９ペプチドをコードする核酸分子若しくはそれらの機能的等価物で非ヒト動物を免疫した後、１種以上のブースターを投与することによりなされ得る。続いて、ＣＤ９に特異的な抗体及び／又はＢ細胞は、かかる非ヒト動物から回収することができる。いくつかの実施形態では、かかる抗体又はＢ細胞は、ＣＤ９への結合性に関し、抗体ＡＴ１４−０１２と競合性について試験される。
【０１３６】
代替的に又は更に、ＣＤ９特異的免疫グロブリン、典型的にはＦａｂフラグメントを同定及び／又は単離するためにかかるＣＤ９ペプチドを用い、ファージディスプレイライブラリをスクリーニングする。得られた抗体、Ｂ細胞、又はＦａｂフラグメントは、典型的にはＣＤ９への結合について抗体ＡＴ１４−０１２と競合する。いくつかの実施形態では、競合アッセイを行う。
【０１３７】
上記のＣＤ９ペプチド及びそれらの使用も本発明に包含される。したがって、いくつかの実施形態は、最大で６０アミノ酸残基長を有する、単離された、組み換え又は精製ＣＤ９ペプチドを提供し、かかるペプチドは、図２に示すとおり、ＣＤ９アミノ酸位置１５４〜１８１、好ましくはアミノ酸位置１６８〜１８１内に位置する少なくとも５つのアミノ酸残基と同一である少なくとも５つのアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態は、最大で６０アミノ酸残基長を有する、単離された、組み換え又は精製ＣＤ９ペプチドを提供し、かかるペプチドは、図２に示すとおり、ＣＤ９アミノ酸位置１５４〜１８１、好ましくはアミノ酸位置１６８〜１８１内に位置する少なくとも６つのアミノ酸残基と同一である少なくとも６つのアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、かかるＣＤ９ペプチドは、図２に示すとおりのＣＤ９アミノ酸位置１６９〜１７６内に位置する５又は６個のアミノ酸残基と同一である５又は６個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、かかる単離された、組み換え又は精製ＣＤ９ペプチドは、図２に示すとおりのＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６に対応するアミノ酸を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、かかる単離された、組み換え又は精製ＣＤ９ペプチドは、図２に示すとおりのＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＴ１７５に対応するアミノ酸を少なくとも含む。好ましくは、かかるＣＤ９ペプチドは、図２に示すとおりのＣＤ９配列のＦ１７６に対応するアミノ酸を更に含む。
【０１３８】
本明細書で使用するとき、上記のペプチドの任意のものは、「本発明のＣＤ９ペプチド」と呼ばれる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ９ペプチドは最大で５５アミノ酸残基長を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ９ペプチドは、最大で５０アミノ酸残基長、又は最大で４５アミノ酸残基長、又は最大で４０アミノ酸残基長を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ９ペプチドは、最大で３５アミノ酸残基長、又は最大で３０アミノ酸残基長、又は最大で２５アミノ酸残基長、又は最大で２０アミノ酸残基長、又は最大で１５アミノ酸残基長を有する。いくつかの実施形態では、本発明のかかるＣＤ９ペプチドは、１０アミノ酸残基長、又は９アミノ酸残基長、又は８アミノ酸残基長を有する。
【０１４０】
図２に記載のとおりのヒトＣＤ９タンパク質の位置１５４〜１８１内に位置している、好ましくはかかるＣＤ９タンパク質の位置１６８〜１８１内に位置している少なくとも６つのアミノ酸残基と同一である、引用されたアミノ酸残基に加えて、本発明のＣＤ９ペプチドは、その他のアミノ酸残基を更に含み得る。いくつかの実施形態では、かかるその他のアミノ酸残基は、ヒトＣＤ９配列からは由来しない。「非ＣＤ９アミノ酸残基」と呼ばれる、かかるその他のアミノ酸残基は、例えば、安定性を増強する、及び／又は免疫原性を増強する、及び／又はＣＤ９ペプチドを例えば分子足場又は担体などの別の部分に連結するよう機能し得る。このような足場又は担体の非限定例には、キーホールリンペットヘモシアニン、及びＣＬＩＰＳ足場がある（例えば、国際公開第２００４／０７７０６２号に記載のビス（ブロモメチル）ベンゼン、トリス（ブロモメチル）ベンゼン、及びテトラ（ブロモメチル）ベンゼンなど）。したがって、いくつかの実施形態は、最大で６０アミノ酸残基長を有する、単離された、組み換え又は精製ＣＤ９ペプチドを提供し、かかるペプチドは、図２に示すとおり、ＣＤ９アミノ酸位置１５４〜１８１、好ましくはアミノ酸位置１６８〜１８１内に位置する少なくとも５つのアミノ酸残基と同一である少なくとも５つのアミノ酸残基を含む。好ましくは、かかるペプチドは、図２に示すとおりのＣＤ９アミノ酸位置１５４〜１８１、好ましくはアミノ酸位置１６８〜１８１内に位置し、好ましくは、図２に示すとおりのＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６からなる群から選択され、より好ましくは、図２に示すとおりのＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６を少なくとも含む、少なくとも６つのアミノ酸残基と同一である少なくとも６つのアミノ酸残基を含み、ここで、かかるペプチドは、少なくとも１個、又は少なくとも２個、又は少なくとも３個、又は少なくとも４個、又は少なくとも５個、又は少なくとも１０個、又は少なくとも２０個、又は少なくとも３０個、又は少なくとも４０個、又は少なくとも５０個の非ＣＤ９アミノ酸残基を更に含み、かかる非ＣＤ９アミノ酸残基の配列の完全長配列は、図２に示すとおり、対応するＣＤ９アミノ酸位置には存在しない。好ましくは、かかるペプチドは、図２に示すとおりのＣＤ９アミノ酸位置１５４〜１８１、好ましくはアミノ酸位置１６８〜１８１内に位置し、好ましくは、図２に示すとおりのＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、Ｔ１７５、及びＦ１７６からなる群から選択され、より好ましくは、図２に示すとおりのＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、Ｔ１７５、及びＦ１７６を少なくとも含む、少なくとも６つのアミノ酸残基と同一である少なくとも６つのアミノ酸残基を含む。かかるペプチドは、用語「本発明のＣＤ９ペプチド」にも包含される。いくつかの実施形態は、単離された、最大で６０アミノ酸残基長を有する、組み換え又は精製ＣＤ９ペプチドを提供し、ここで、かかるペプチドは、図２に示すとおりのＣＤ９アミノ酸位置１５４〜１８１、好ましくはアミノ酸位置１６８〜１８１内に位置する少なくとも６つのアミノ酸残基と同一であり、好ましくは、図２に示すとおりのＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＦ１７６、より好ましくはＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、Ｔ７１５、及びＦ１７６を少なくとも含む、少なくとも５つのアミノ酸残基を含み、かかるペプチドは、非ＣＤ９アミノ酸残基を含有する別のペプチドに連結される。いくつかの実施形態は、最大で６０アミノ酸残基長を有する、単離された、組み換え又は精製ＣＤ９ペプチドを提供し、かかるペプチドは、図２に示すとおり、ＣＤ９配列の少なくともＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、及びＬ１７３及びＴ１７５を含み、かつ図２に示すＣＤ９配列のＦ１７６残基も好ましくは含み、ここで、かかるペプチドは、非ＣＤ９アミノ酸残基を含有している別のペプチドに連結される。いくつかの実施形態では、かかるペプチドは、ペプチド結合を介して互いに結合される。他の実施形態では、かかるペプチドは、例えば、リンカーなどの他の非ペプチド結合を介して互いに連結されている。
【０１４１】
当業者には既知のとおり、免疫原性の配列が提供されれば、かかる配列にある程度の変更を加えて、得られる免疫原の免疫原性及び／又は安定性を好ましく最適化することができる。この最適化は、例えば、得られる化合物の安定性及び／又は免疫原性が好ましく試験され、改良されたＣＤ９抗原性化合物が選択された後に、変異導入手順によりなされる。当業者は、あるアミノ酸配列から始まる抗原多様体を十分に生成することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基を任意の他のアミノ酸残基により置き換えて、得られる化合物を試験することを包含する、置換のネット解析（replacement net analysis）が実施される。一部の好ましい実施形態では、保存的アミノ酸置換が用いられる。保存的アミノ酸置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンなどの１つの疎水性残基の、別の疎水性残基への置換、並びに１つの極性残基の、別の極性残基への置換、例えば、アルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、又はグルタミンのアスパラギンへの置換などがある。保存的アミノ酸置換の別の例としてはセリンのスレオニンへの置換、及びチロシンのフェニルアラニンへの置換が挙げられる。
【０１４２】
したがって、本発明の、単離された、組み換え又は精製ＣＤ９ペプチドが更に提供され、ここで、図２に示すとおりのＣＤ９配列のＫ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、Ｔ１７５、及びＦ１７６からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基は別のアミノ酸残基で置換され、ここで、かかるペプチドは、図２に示すＣＤ９配列のＫ１６９に対応するアミノ酸位置にアルギニンを含み、かつ／又は図２に示すＣＤ９配列のＤ１７１に対応するアミノ酸位置にグルタミン酸を含み、かつ／又は図２に示すＣＤ９配列のＶ１７２に対応するアミノ酸位置に、イソロイシン、ロイシン、及びメチオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み、かつ／又は図２に示すＣＤ９配列のＬ１７３に対応するアミノ酸位置に、イソロイシン、バリン、及びメチオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み、かつ／又は図２に示すＣＤ９配列のＴ１７５に対応するアミノ酸位置にセリンを含み、かつ／又は図２に示すＣＤ９配列のＦ１７６に対応するアミノ酸位置にチロシンを含む。
【０１４３】
つまり、位置１６９のリジンがアルギニンで置換されている、及び／又は位置１７１のアスパラギン酸がグルタミン酸で置換されている、及び／又は位置１７２のバリンがイソロイシン、ロイシン、若しくはメチオニンで置換されている、及び／又は位置１７３のロイシンがイソロイシン、バリン、若しくはメチオニンで置換されている、及び／又は位置１７６のフェニルアラニンがチロシンで置換されている、本発明のＣＤ９ペプチドが提供される。これらは保存的アミノ酸置換であり、得られるペプチドは尚も抗体ＡＴ１４−０１２に結合することができる。得られるペプチドは、ＣＤ９への結合について、好ましくはＣＤ９における同じエピトープへの結合について、抗体ＡＴ１４−０１２と競合する、抗体又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物に結合することができる、又はこれらを生成することができる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ９ペプチドのアミノ酸残基は、真核生物において天然に生ずる２０種類のアミノ酸残基から選択され、これらは「標準（standard）」又は「古典的（canonical）」アミノ酸とも呼称される。あるいは、本発明のＣＤ９ペプチドには、例えば、Ｄアミノ酸（すなわち、アミノ酸のＤ立体異性体）又はＮ−メチルアミノ酸などの非天然なアミノ酸残基が含有される。
【０１４５】
本発明のＣＤ９ペプチドをコードする核酸分子、又はそれらの機能的等価物も、本発明に包含される。したがって、本発明のＣＤ９ペプチドをコードする、単離された合成又は組み換え核酸分子、又はそれらの機能的等価物が更に提供される。かかる核酸分子又は機能的等価物は、好ましくは、ヌクレオチド鎖を含み、より好ましくはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡを含む。他の実施形態では、かかる核酸分子又は機能的等価物は、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡヘリックス、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及び／又はリボザイムなどの、その他の種類の核酸構造物を含む。
【０１４６】
かかる核酸分子及び機能的等価物は、例えば、大腸菌細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、又は２９３（Ｔ）細胞などといった宿主細胞などの核酸発現系を用いる、本発明のＣＤ９ペプチドの産生に、例えば有用である。いくつかの実施形態では、本発明のかかる核酸分子又は機能的等価物は遺伝子送達ビヒクル中に存在し、かかる核酸分子又は機能的等価物を、対象とする細胞中に導入するのを容易にする。本発明の核酸分子又は機能的等価物を含む、遺伝子送達ビヒクル、好ましくはベクターが更に提供される。本発明の核酸分子若しくは機能的等価物、及び／又は本発明の遺伝子送達ビヒクルを含む宿主細胞も、本明細書において提供される。
【０１４７】
上記のとおり、本発明のＣＤ９ペプチド、又は本発明のＣＤ９ペプチドをコードする核酸分子若しくは機能的等価物は、例えば、ＣＤ９への結合について抗体ＡＴ１４−０１２と競合する抗体などといった、本発明のＣＤ９特異的な抗体を得るのに有用である。これは例えば、かかるＣＤ９ペプチド、又は本発明のＣＤ９ペプチドをコードする核酸分子若しくは機能的等価物（を含むベクター）で非ヒト動物を免疫することにより実施することができる。あるいは又は更に、ファージディスプレイライブラリがスクリーニングされる。したがって、いくつかの実施形態は、例えば、Ｂ細胞などの免疫細胞、及び／又は例えば、ＣＤ９に特異的なＦａｂフラグメントなどといった、抗体又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を、産生、結合、検出、及び／又は得るための、本発明のＣＤ９ペプチドの使用、又は本発明の核酸分子若しくは機能的等価物の使用、又は本発明のベクターの使用を提供する。かかる免疫細胞又は抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物は、好ましくは黒色腫細胞に特異的に結合可能である。免疫原として使用するための、本発明のＣＤ９ペプチド、並びに免疫原として使用するための、本発明のＣＤ９ペプチドをコードする核酸分子又は機能的等価物も、本明細書において提供される。
【０１４８】
本発明のＣＤ９ペプチド、又は本発明の核酸分子若しくは機能的等価物若しくはベクターで非ヒト動物を免疫することを含む、ＣＤ９特異的免疫細胞又はＣＤ９特異的抗体を産生するための方法も提供される。かかる方法は、好ましくは、かかる非ヒト動物からＣＤ９特異的な免疫細胞又は抗体を回収することを更に含む。前述のとおり、かかる免疫細胞、又は抗体又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物は、好ましくは黒色腫細胞に特異的に結合可能である。
【０１４９】
本発明の方法により得られる、ＣＤ９特異的抗体又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物、並びに本発明の方法により得られる免疫細胞も、本明細書において提供される。かかるＣＤ９特異的抗体、機能性部分、機能的等価物、又は免疫細胞は、好ましくはＣＤ９への結合について抗体ＡＴ１４−０１２と競合する。
【０１５０】
かかる非ヒト動物は、好ましくは、げっ歯類又はウシなどの哺乳動物を含む。いくつかの実施形態において、かかる非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ラマ、ラクダ、ブタ、家禽、牛、ヤギ、ウマ、類人猿、及び／又はゴリラを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態は、組成物、好ましくは本発明のＣＤ９ペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態では、かかるＣＤ９ペプチドは、医薬的に許容される担体又は足場に連結される。いくつかの実施形態は、本発明のＣＤ９ペプチドをコードする核酸分子又はその機能的等価物を含む組成物、好ましくは免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態は、かかる核酸分子又はそれらの機能的等価物を含む組成物、好ましくは、免疫原性組成物を提供する。本発明の免疫原性組成物は、好ましくは例えば、担体、希釈剤、賦形剤、又は充填剤などの生体適合性添加剤を更に含む。いくつかの実施形態は、本発明のＣＤ９のペプチドを含むワクチン、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物を含むワクチン、又は本発明のＣＤ９ペプチドをコードする核酸分子又はその機能的等価物を含むワクチンを提供する。いくつかの実施形態は、製薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む製薬学的組成物である、本発明の組成物を提供する。
【０１５２】
本発明のＣＤ９ペプチドは、例えば、生物学的サンプル中の、ＣＤ９特異的抗体、又はＢ細胞若しくはＴ細胞などのＣＤ９特異的免疫細胞といった、ＣＤ９特異的結合化合物の存在について試験するのにも有用である。ＣＤ９特異的抗体及び／又はＣＤ９特異的免疫細胞の存在についてスクリーニングするために、例えば、抗体、Ｂ細胞、及び／又はＴ細胞を含む個体由来のサンプル、又はかかるサンプルの画分を、本発明のＣＤ９ペプチド又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物とインキュベートする。かかるサンプル中又はかかるサンプル画分中にかかる抗体又は免疫細胞が存在しており、本発明のかかるＣＤ９ペプチドに結合するようである場合、かかるサンプルは、ＣＤ９特異的結合化合物（すなわち、抗体及び／又は免疫細胞）に関し陽性であるとして分類される。
【０１５３】
ＣＤ９特異的抗体又はＣＤ９特異的免疫細胞は、例えば、ウェスタンブロット、（捕捉）ＥＬＩＳＡ、又はＲＩＡなどの免疫アッセイを用い検出及び／又は定量される。これらのアッセイは、当該技術分野において公知である。例えば、本発明の標識ＣＤ９ペプチド（場合により、Ｔ細胞を検出するためのＭＨＣ複合体という観点によるもの）を、未結合の結合化合物を洗い流した後で、血液サンプル、又は組織サンプル（例えば、皮膚サンプル）、又は抗体、Ｂ細胞、及び／又はＴ細胞を含むかかるサンプルの画分とともに、インキュベートする。続いて、本発明のかかる標識ＣＤ９ペプチドがＣＤ９特異的抗体又は免疫細胞により結合したかどうかを判定する。いくつかの実施形態では、本発明の未標識のＣＤ９ペプチド又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む未標識の化合物（場合により、ＭＨＣ複合体という観点によるもの）を、抗体及び／又は免疫細胞を含む、例えば、血液サンプル又は組織サンプル（例えば、皮膚サンプル）などのサンプルと、又は抗体、Ｂ細胞、及び／若しくはＴ細胞を含むかかるサンプルの画分と接触させる。インキュベート後、未結合の抗体及び未結合の免疫細胞を除去するために、好ましくは１回以上の洗浄工程を実施する。続いて、例えば、ヒト抗体又はヒト免疫細胞を特異的な対象としており、例えば蛍光化合物又は例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼなどのマーカーを連結している抗体を使用して、抗体又は免疫細胞が本発明のかかるＣＤ９ペプチドに結合しているかどうかを試験する。更なる洗浄工程後、例えば、発光を測定することにより、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼの基質を添加することにより、二次抗体が結合しているかどうかが好ましく判定される。これらの検出技術は、当該技術分野において公知である。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ９ペプチド、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物若しくは組成物（場合により、ＭＨＣ複合体という観点によるもの）を、抗体及び／又は免疫細胞を富化させたサンプルの画分と接触させる。いくつかの実施形態では、かかる画分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｂ細胞培養物又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞培養物である。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ９ペプチド、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物若しくは組成物を、抗Ｉｇ抗体又はプロテインＡ若しくはＧ精製法を用い精製されたＣＤ１９陽性細胞及び／又は抗体／Ｂ細胞画分について選抜することにより得られた、例えば、生体サンプルより本質的に精製した抗体及び／又は免疫細胞（例えば、精製Ｂ細胞画分など）と接触させる。プロテインＡ又はＧ精製法は当該技術分野で知られており、プロトコル及び試薬は市販されている。本明細書で使用するとき、用語「サンプルから本質的に精製された免疫細胞」は、得られる画分を構成する細胞のうち少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が免疫細胞であることを意味する。用語「サンプルから本質的に精製された抗体」は、得られる画分を構成する物質（mass）のうち少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が抗体であることを意味する。
【０１５５】
したがって、ＣＤ９特異的な免疫細胞及び／若しくはＣＤ９特異的抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物を結合及び／又は検出するための、本発明のＣＤ９ペプチドの使用、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物若しくは組成物の使用が更に提供される。かかる免疫細胞、及び／又は抗体若しくはそれらの機能性部分若しくは機能的等価物は、好ましくは、例えば黒色腫細胞などのＣＤ９陽性腫瘍細胞に結合可能である。本明細書では、抗体及び／又は免疫細胞などのＣＤ９特異的結合化合物を検出する部分として使用するための、本発明のＣＤ９ペプチド、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物、並びにサンプルがＣＤ９特異的抗体及び／又はＣＤ９特異的免疫細胞を含むかどうかを判定する方法であって、本発明のＣＤ９ペプチド、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物若しくは組成物を、かかるサンプル、又は抗体及び／若しくは免疫細胞を含むかかるサンプルの画分とともにインキュベートした後で、かかる本発明のＣＤ９ペプチドにＣＤ９特異的抗体及び／若しくはＣＤ９特異的免疫細胞が結合しているかどうかを判定することと、又はかかる本発明のＣＤ９ペプチドを含むかかる化合物にＣＤ９特異的抗体及び／又はＣＤ９特異的免疫細胞が結合しているかどうかを判定することと、を含む方法もまた、提供する。かかる結合が検出された場合、かかるサンプルは、ＣＤ９特異的抗体及び／又はＣＤ９特異的免疫細胞、例えば、黒色腫などのＣＤ９陽性腫瘍細胞に特異的に結合可能な抗体及び／又は免疫細胞を含むと結論付けられる。
【０１５６】
サンプルがＣＤ９特異的な抗体及び／又はＣＤ９特異的な免疫細胞を含むか判定する方法であって、本発明のＣＤ９ペプチド、若しくは本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物（場合により、ＭＨＣ複合体という観点によるもの）を、かかるサンプルから本質的に精製された抗体及び／若しくは免疫細胞とともにインキュベートすることと、続いてかかる本発明のＣＤ９ペプチドにＣＤ９特異的抗体及び／若しくはＣＤ９特異的免疫細胞が結合しているかどうか、又はかかる本発明のＣＤ９ペプチドを含むかかる化合物にＣＤ９特異的抗体及び／若しくはＣＤ９特異的免疫細胞が結合しているかどうかを判定することと、を含む、方法も提供される。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、個体がＣＤ９発現細胞に関連する疾患を有するかを判定するために上記の検出試験の結果を使用する。例えば、ＣＤ９陽性腫瘍の存在について試験した個体由来のサンプルが、ＣＤ９特異的免疫細胞及び／又はＣＤ９特異的抗体を含有するようであった場合、かかる個体は、例えば黒色腫などのＣＤ９陽性腫瘍に罹患していると結論付けることができる。かかるサンプルは、好ましくは腫瘍細胞を含む。例えば、黒色腫細胞の存在について試験すために、黒色腫の疑いのある皮膚領域の生検が好ましく使用される。あるいは又は更に、ＣＤ９陽性腫瘍細胞についての試験には、転移腫瘍は多くの場合血液及びリンパ系を循環することから、血液サンプル又はリンパ節サンプルも有用である。
【０１５８】
したがって、診断用薬として使用するための本発明のＣＤ９ペプチド、並びに診断用薬として使用するための本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物又は組成物も提供される。ＣＤ９発現細胞に関連する疾患（例えば、ＣＤ９陽性腫瘍、又は骨粗鬆症、又は関節炎、又は肺炎、又はＣＯＰＤ、又は大腸炎、又は自然リンパ球に関連する疾患など）を診断するための本発明のＣＤ９ペプチドの使用、及びＣＤ９発現細胞に関連する疾患（例えば、ＣＤ９陽性腫瘍、又は骨粗鬆症、又は関節炎、又は肺炎、又はＣＯＰＤ、又は大腸炎、又は自然リンパ球に関連する疾患など）を診断するための本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物又は組成物の使用が更に提供される。いくつかの実施形態では、かかるＣＤ９陽性癌は黒色腫である。したがって、いくつかの実施形態は、黒色腫の診断に使用するための本発明のＣＤ９ペプチド、及び黒色腫を診断するための診断キットの作製のための本発明のＣＤ９ペプチドの使用を提供する。
【０１５９】
本発明のＣＤ９ペプチド、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物若しくは組成物と、
抗体が結合したＣＤ９ペプチド又は免疫細胞が結合したＣＤ９ペプチドを検出する手段と、
を含む、診断キットが更に提供される。
【０１６０】
かかる手段は、例えば、ヒト抗体又はヒト免疫細胞を特異的に対象とする標識抗体を包含する。いくつかの実施形態では、かかる標識抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼとコンジュゲートされる。
【０１６１】
いくつかの実施形態は、本発明のＣＤ９ペプチド、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物若しくは組成物（場合により、ＭＨＣ複合体という観点によるもの）を、かかる個体の抗体及び／又は免疫細胞と接触させることと、かかる本発明のＣＤ９ペプチド、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含むかかる化合物若しくは組成物に、かかる個体のかかる抗体及び／又は免疫細胞の少なくとも１つが結合しているかを診断することと、を含む、個体がＣＤ９陽性腫瘍を有するかどうかを診断する方法を提供する。本発明のかかるＣＤ９ペプチド又はかかる化合物にかかる個体の抗体及び／又は免疫細胞が結合する場合、かかる個体はＣＤ９陽性腫瘍を有すると結論付けられる。いくつかの実施形態では、かかるＣＤ９陽性腫瘍は黒色腫ある。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ９ペプチド、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物を、かかる個体の抗体及び／又は免疫細胞を含むサンプル（例えば、血液サンプル若しくは骨髄サンプル、又は例えば、皮膚組織などの生検）と接触させる。他の実施形態では、本発明のＣＤ９ペプチド又は化合物を、かかる個体に由来するサンプルの画分と接触させ、ここで、かかる画分は免疫細胞及び／又は抗体を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ９ペプチド又は化合物を、かかるサンプルから本質的に精製された抗体及び／又は免疫細胞（例えば、ＣＤ１９陽性細胞を選抜することにより得られた精製Ｂ細胞画分、及び／又は抗Ｉｇ抗体若しくはプロテインＡ若しくはＧ精製方法を用い精製された抗体／Ｂ細胞画分）と接触させる。
【０１６２】
本発明の新規ＣＤ９ペプチド、及びそれらをコードする核酸分子及び機能的等価物の興味深い別の用途には、免疫療法がある。例えば、本発明のＣＤ９ペプチド、又はそれをコードする核酸分子及び機能的等価物は、ＣＤ９陽性腫瘍の治療に使用される。本明細書で使用するとき、「治療」は、少なくとも１つの症状の緩和、及び／又は少なくとも一時的な疾患の遅延若しくは更には進行の停止を包含する。１つの好ましい実施形態では、本発明のＣＤ９ペプチド、又はそれらをコードする核酸分子若しくは機能的等価物、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物若しくは組成物は、かかる患者の免疫系をブーストさせて免疫反応を増強させるために、ＣＤ９陽性癌の患者に投与される。いくつかの実施形態では、場合により、ｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖（expansion）後に患者に投与されるＣＤ９特異的Ｔ細胞又はＢ細胞を得ることを目的として、ＣＤ９陽性癌の患者に由来するナイーブＴ細胞又はＢ細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養し、本発明のＣＤ９ペプチド（Ｔ細胞培養の場合には、場合によりＭＨＣ複合体という観点によるもの）又は化合物とともにインキュベートする。いくつかの実施形態では、かかるＣＤ９陽性癌は黒色腫である。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、養子細胞療法が用いられる。ＣＤ９陽性癌に由来するＴ細胞は、好ましくは、本発明のＣＤ９ペプチド（場合により、ＭＨＣ複合体という観点によるもの）を用い、又は本発明のＣＤ９ペプチド（場合により、ＭＨＣ複合体という観点によるもの）を含む化合物若しくは組成物を用い、結合又は活性について試験される。かかるＣＤ９ペプチドを認識するＴ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた後、患者に投与すると、抗ＣＤ９  Ｔ細胞応答が生じることになる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、ドナーリンパ球の養子細胞療法が用いられる。同種ＨＳＣＴを施行されたＣＤ９陽性癌患者から単離されたドナーＴ細胞、又はＨＳＣＴドナーから単離されたドナーＴ細胞を、ＭＨＣ複合体の文脈におけるＣＤ９ペプチドを使用して、又はＭＨＣ複合体の文脈における本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物を使用して、ＣＤ９の結合又は活性化について好ましく試験し、かかるＣＤ９ペプチドを認識するドナーＴ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させ、続いて患者に投与することで、抗ＣＤ９同種Ｔ細胞の応答を生じさせる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ９特異的結合部分を持たせるために、Ｔ細胞を改変する。かかるＴ細胞は、好ましくは、ＣＤ９陽性癌患者から誘導される。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞が産生される。かかる細胞は、対象とする結合特異性を備え、好ましくは抗体に由来するＴ細胞受容体が改変されたＴ細胞である。典型的には、モノクローナル抗体から誘導された一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）をＣＤ３−ζ膜貫通領域と融合させることで、ＣＡＲ−Ｔ細胞が産生され、これにより、ｓｃＦｖによる標的認識時にζシグナルが誘導される。
【０１６６】
いくつかの実施形態によると、本発明のＣＤ９ペプチド、又はそれらをコードする核酸分子若しくは機能的等価物、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物若しくは組成物は、ＣＤ９特異的抗体及び／又はＢ細胞の産生及び／又は単離を目的として使用され、結果的に改変Ｔ細胞の産生に使用される。例えば、かかるＣＤ９ペプチド又は化合物又は核酸分子又は機能的等価物は、ＣＤ９特異的抗体又はＢ細胞の誘導、検出、及び／又は単離を目的として使用される。続いて、いくつかの実施形態では、かかるＣＤ９特異的抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域がＴ細胞に提供されることにより、ＣＤ９特異性を備えた改変Ｔ細胞が産生される。いくつかの実施形態では、続いて、これらの改変Ｔ細胞がＣＤ９陽性癌患者に投与され、腫瘍特異的Ｔ細胞反応が生じる。いくつかの実施形態では、かかる改変Ｔ細胞はＣＡＲ  Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、かかるＣＤ９特異的抗体又はＢ細胞を、ＣＤ９への結合について抗体ＡＴ１４−０１２との競合を試験した後で、かかる抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域をＴ細胞に提供する。かかる競合する抗体は、ＣＤ９特異性を有する改変Ｔ細胞の産生のため好ましく選択される。
【０１６７】
したがって、薬剤として使用するための、本発明のＣＤ９ペプチド、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物若しくは組成物、又は本発明のＣＤ９ペプチドをコードする核酸分子若しくはそれらの機能的等価物が更に提供される。ＣＤ９特異的なＴ細胞の産生のための、本発明のＣＤ９ペプチド（場合により、ＭＨＣ複合体という観点によるもの）の使用、又は本発明のＣＤ９ペプチド（場合により、ＭＨＣ複合体という観点によるもの）を含む化合物若しくは組成物の使用、又は本発明のかかるＣＤ９ペプチドをコードする核酸分子又はそれらの機能的等価物の使用、もまた提供される。いくつかの実施形態では、改変されたＴ細胞を産生するための方法であって、ＣＤ９陽性癌患者由来の抗体含有サンプル又はＢ細胞含有サンプルを、本発明のＣＤ９ペプチド又は化合物と接触させて、抗ＣＤ９抗体に対する結合抗体、又はＢ細胞を得た後、かかるＣＤ９特異的抗体又はＢ細胞から１つ以上のＣＤ９特異的ドメインを得ることと、並びにかかる１つ以上のドメインをＴ細胞に提供することと、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態は、改変Ｔ細胞を産生するための方法であって、非ヒト動物を、本発明のＣＤ９ペプチド又は化合物又は核酸分子又はそれらの機能的等価物により免疫して、ＣＤ９に対する免疫反応を誘導した後、かかる非ヒト動物由来のＣＤ９特異的抗体に由来するＣＤ９特異的ドメイン又はＣＤ９特異的Ｂ細胞の１つ以上を得ることと、あるいはかかる１つ以上のＣＤ９特異的ドメインをコードする１つ以上の核酸配列を得ることと、かかる１つ以上のドメイン又はかかる１つ以上の核酸配列をＴ細胞に提供することと、を含む、方法を提供する。
【０１６８】
免疫療法に使用するための、本発明のＣＤ９ペプチド、及び免疫療法に使用するための、本発明のＣＤ９ペプチドをコードする核酸分子又はその機能的等価物も、本明細書において提供される。免疫療法に使用するための、本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物又は組成物も本明細書において提供される。いくつかの実施形態は、ＣＤ９発現細胞に関連する疾患（例えば、ＣＤ９陽性腫瘍、又は骨粗鬆症、又は関節炎、又は肺炎、又はＣＯＰＤ、又は大腸炎、又は自然リンパ球に関連する疾患）に対する薬剤を調製するための、本発明のＣＤ９ペプチドの使用、又は本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物若しくは組成物の使用、又は本発明のＣＤ９ペプチドをコードする核酸分子若しくはその機能的等価物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、かかるＣＤ９陽性腫瘍は、黒色腫、結腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、扁平上皮癌、ＡＭＬ、多発性骨髄腫、胃癌、肝癌、脳癌、カポジ肉腫、粘表皮癌、絨毛癌、線維肉腫、子宮頸癌、神経膠腫、腺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に前出したとおりの本発明の検出試験の結果は、個体が、ＣＤ９陽性腫瘍（例えば、黒色腫など）に対し検出可能な免疫反応を示すかどうかの診断に使用される。これは、例えば、免疫療法を施行され、抗腫瘍免疫応答を誘導された患者が、かかる腫瘍に罹患しているかどうかを診断するのに好ましい。したがって、いくつかの実施形態は、本発明のＣＤ９ペプチド（場合により、ＭＨＣ複合体という観点によるもの）、又はかかる本発明のＣＤ９ペプチドを含む化合物若しくは組成物を、かかる個体の抗体及び／又は免疫細胞と接触させることと、かかる本発明のＣＤ９ペプチド、又はかかる本発明のＣＤ９ペプチドを含むかかる化合物若しくは組成物に、かかる個体のかかる抗体及び／又は免疫細胞のうちの少なくとも１つが結合しているかどうかを判定することと、を含む、個人がＣＤ９陽性腫瘍に対し免疫反応を提示するかどうかについての診断方法を提供する。かかるＣＤ９ペプチド又はかかる化合物が結合するようである場合、かかる個体がＣＤ９陽性腫瘍に対する免疫応答を提示することを意味する。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、ＣＤ９への結合について抗体ＡＴ１４−０１２に競合する単離された組み換え若しくは精製抗体又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が黒色腫の治療に使用される。実施例に記載されるとおり、抗体ＡＴ１４−０１２は、完全寛解した黒色腫患者から得られており、ＡＴ１４−０１２は黒色腫に対して有効であることが実証される。したがって、ＣＤ９についてＡＴ１４−０１２と競合する抗体も有効である。そのため、黒色腫患者に対するかかる抗体の投与は、黒色腫細胞を効果的に中和し及び／又はかかる細胞を殺傷する。したがって、いくつかの実施形態では、薬剤として使用ための、ＣＤ９への結合について抗体ＡＴ１４−０１２と競合する単離された組み換え若しくは精製抗体又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、提供される。いくつかの実施形態では、薬剤として使用ための、ＣＤ９への結合について抗体ＡＴ１４−０１２と競合する、単離された組み換え若しくは精製抗体又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物が、提供される。
【０１７１】
黒色腫を少なくともある程度治療する又は予防するための方法に使用するための、ＣＤ９への結合について抗体ＡＴ１４−０１２と競合する、単離された組み換え若しくは精製抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物、並びに、黒色腫に対する薬剤の調製の際に使用するための、ＣＤ９への結合について抗体ＡＴ１４−０１２と競合する、単離された組み換え若しくは精製抗体、又はそれらの機能性部分若しくは機能的等価物の、提供される。
【０１７２】
本出願は同じ実施形態の一部として、又は別個の実施形態の一部として特徴を記載し得るものの、本発明の範囲は、本明細書に記載される特徴のすべて又は一部の任意の組み合わせを含む実施形態も包含する。
【０１７３】
本発明は、以下の実施例によっても更に説明される。これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の単に明確にするために提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１Ａ】図１．ヒトＣＤ９の構造の概略図。ヒトテトラスパニンＣＤ９の概略図。テトラスパニンは、４つのスパニング膜貫通領域と、２つの細胞外ループ（小さな細胞外ループ１（ＥＣ１）と大きな細胞外ループ２（ＥＣ２））を特徴とする。ＣＤ９のＥＣ２は、２つのシステイン結合（赤色）（Ｃ１５２−Ｃ１８１及びＣ１５３−Ｃ１６７）と、保存的に隣接する残基（Ｇ１５４及びＰ１６８）とにより構造的に及び立体配置的に規定される。テトラスパニンファミリーメンバーの中でも高度に可変的な２つの領域が、アミノ酸位置１５４〜１６７と、１６８〜１８１とに存在する（紫色で示す）。
【図１Ｂ】２つ目の細胞外ループについての模式図。対応するアミノ酸番号を表示し、２つ目の細胞外ループを５つの異なる領域に分割した模式図を示す。これらの領域は、ＣＤ８１などのその他のテトラスパニンファミリーメンバーとの重なりをもとに選択された。これらの領域は、エピトープマッピング研究において更に記載する（図５）。
【図２】ヒトＣＤ９のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２１９２６）
【図３】抗体ＡＴ１４−０１２のアミノ酸配列及び核酸配列。ＣＤＲ付番は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）によるものである。
【図４Ａ】図４．標的ＩＤ。ＡＴ１４−０１２は、約２５ｋＤａの大きさの抗原と反応する。非還元及び還元条件下でのウェスタンブロットは、Ｃａｃｏ２、ＭｅｌＢＬＭ、及び対照ＨＬ−６０細胞株のライセート（５０μｇ）に対するＡＴ１４−０１２の結合を明らかにした（実施例２の材料及び方法を参照のこと）。ＡＴ１４−０１２は、約２５ｋＤａの大きさの抗原に対し反応性を示し、サンプルを還元したときには反応性が消失することから、ＡＴ１４−０１２は立体構造的なエピトープに反応していることが示唆される。
【図４Ｂ】ＡＴ１４−０１２による癌細胞株に対する免疫沈降についての質量分析により、ＣＤ９は標的であるとして示される。ソルターゼビオチン標識したＡＴ１４−０１２又は対照ＡＴ１０−００２を、Ｃａｃｏ２、ＭｅｌＢＬＭ、又は対照ＨＬ−６０のライセートとともにインキュベートした。免疫沈降させた溶出物をゲルでの泳動にかけ、クーマシーブルーで染色したところ、約２５ｋＤａの大きさのバンドを確認可能であった。この位置のバンドはウェスタンブロットの結果と重なる。質量分析により、ＣＤ９はＡＴ１４−０１２抗原であることが明らかとなった。ＭＳ分析により、ＭｅｌＢＬＭ細胞株に関しては同様にＣＤ９が沈殿したのに対し、ＨＬ−６０の溶出物に関してはＣＤ９は観察されなかったことが特定された。
【図４Ｃ】市販の抗体ＡＬＢ６によるＣＤ９の確認。ＩＰ溶出により、ＡＴ１４−０１２及び抗ＣＤ９抗体ＡＬＢ６に関する反応性から、ＣＤ９はＡＴ１４−０１２の標的抗原となることが確認された一方で、ＨＬ−６０ライセートのＩＰ溶出物に関しては反応性は見られなかったことが示された。
【図５Ａ】図５．エピトープマッピング。ハイブリッド変異体又はスワップ変異体によるエピトープマッピングにより、細胞外ループ２（ＥＣ２）、及びより特異的な領域１５４〜１８０がＡＴ１４−０１２の主要なエピトープであることが明らかになった。  エピトープマッピングにより、細胞外ループ２は、すべての抗ＣＤ９抗体のエピトープを有していることが明らかとなった。ＡＴ１４−０１２は、可変性ＣＤ９ループのｍ３及びｍ４に対する結合の消失を示した。
【図５Ｂ】ＥＣ２の領域ｍ４のアラニンスキャニングによるエピトープマッピング。ＨＩ９ａ、ＡＬＢ６、及びＡＴ１４−０１２（−Ａｌｅｘａ６４７標識）は、領域ｍ４のアラニン変異体に対し反応する。ＨＩ９ａを陽性対照とした。両方の抗体に対し結合の消失を示した残基はＦ１７６だけであった。更に５つの残基（Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、及びＴ１７５）が、ＡＴ１４−０１２に対する結合性の消失を示した。
【図６Ａ】図６．腫瘍の結合。ＡＴ１４−０１２は、固体腫瘍に対して広範な結合反応性を有する。フローサイトメトリー解析による、一連の固体腫瘍細胞株に対する結合性についてのＡＴ１４−０１２抗体とＡＴ１０−００２抗体との比較。
【図６Ｂ】ＡＴ１４−０１２は、選択された数の急性骨髄性白血病細胞株に結合する。フローサイトメトリー解析による、一連のＡＭＬ細胞株に対する結合性についてのＡＴ１４−０１２抗体とＣＤ３０抗体との比較。
【図６Ｃ】ＡＴ１４−０１２は、選択された数の複数の骨髄腫細胞株に結合する。フローサイトメトリー解析による、一連のＭＭ細胞株に対する結合性についての、ＣＤ９と、未染色及びＡＴ１４−０１２抗体（unstained and AT14-012）とＡＴ１０−００２抗体との比較。
【図７Ａ】図７．健常な細胞に対する結合。ＡＴ１４−０１２は、初代メラノサイトと比較して黒色腫に対し強力に結合する。黒色腫細胞株及び初代メラノサイトに対するＡＴ１４−０１２の結合についての分析。健常な細胞に対する結合についての陰性対照としてはＡＴ１０−００２（抗インフルエンザ）を含め、陽性対照としてはパニツムマブ（抗ＥＧＦＲ１）を含めた。一次抗体による染色後、フローサイトメトリーによる可視化のため、抗ＩｇＧ−ＰＥで細胞を標識した。
【図７Ｂ】ＡＴ１４−０１２は、初代結腸上皮細胞よりも結腸癌に強力に結合する。結腸癌細胞株及び初代結腸上皮細胞に結合するＣＤ９  ＰＥ及びＡＴ１４−０１２  Ａ６４７についてのフローサイトメトリー解析。陰性対照としてはＡＴ１０−００２  Ａ６４７（抗インフルエンザ）を含め、Ｃｏｌｏ−３２０細胞上でのＣＤ９発現がないことを確認するためには抗ＣＤ８１ＰＥを含めた。
【図７Ｃ】ＡＴ１４−０１２は、初代へんとうリンパ球よりも黒色腫に強力に結合する。へんとうリンパ球を抗ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ９抗体で染色して、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、及びＣＤ１９  Ｂ細胞をそれぞれ識別した。
【図８Ａ】図８．血小板。ＡＴ１４−０１２はヒト血小板に結合する。固定した又は固定していない健常ヒト血小板を、ＣＤ４１、ＣＤ９又はＡＴ１４−０１２ビオチン／ＳＡ−ＰｅＣｙ７で染色した。ヒストグラムではＣＤ４１陽性をゲート化した。
【図８Ｂ】ＡＴ１４−０１２は健常な血小板を活性化する。ＴＲＡＰ（陽性対照ペプチド）、ＡＬＢ６（陽性対照マウスＩｇＧ１抗体）、ＦＬＡＧ（陰性対照マウスＩｇＧ１抗体）、ＡＴ１０−００２、又はＡＴ１４−０１２抗体を加えインキュベートしたＰＲＰに対するフローサイトメトリーにより、表面ＣＤ６２Ｐ発現を判定した。
【図８Ｃ】ＡＴ１４−０１２は血小板の凝集を誘導しない。全血を様々な刺激剤とともにインキュベートして、マルチプレートリーダーを使用して測定を行い、血小板凝集の誘導について試験した。
【図９Ａ】図９．Ｉｎ  ｖｉｖｏ実験。ＡＴ１４−０１２は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるリンパ節転移を阻害する。両側腹部に５００，０００個のＭｅｌＢＬＭ  ＧＦＰ／ルシフェラーゼ黒色腫細胞を皮下移植したＮＳＧマウスを、ＡＴ１４−０１２又はＡＴ１０−００２（対照抗体）で処置する。矢印により示されるリンパ節転移は、ルシフェリンの注入し、体内の臓器を露出させた後でバイオルミネセンスイメージャーにより可視化した。
【図９Ｂ】ＡＴ１４−０１２は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて原発性黒色腫腫瘍の増殖を妨げる。両側腹部に２００，０００個のＭｅｌＢＬＭ  ＧＦＰ／ルシフェラーゼ黒色腫細胞を皮下移植したＮＳＧマウスを、実験の開始後ＡＴ１４−０１２又はＡＴ１０−００２（対照抗体）で処置する。腫瘍の増殖は、ノギスを用い測定した。
【図９Ｃ】ＡＴ１４−０１２は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて黒色腫腫瘍を認識する。ＡＴ１０−００２（抗インフルエンザ）又はＡＴ１４−０１２のいずれかで処置した、又は未処置のママとしたＮＳＧマウスから、ＭｅｌＢＬＭ皮下腫瘍を回収し、パラフィン包埋した。ＨＲＰ標識した抗λ又は抗κ抗体により、抗免疫組織化学的切片を染色した。
【図９Ｄ】ＡＴ１４−０１２処置後表面のＣＤ９量は低下した。ＡＴ１４−０１２又はＡＴ１０−００２（対照抗体）で処置したＮＳＧマウスから回収した皮下ＭｅｌＢＬＭ腫瘍を分解し、フローサイトメトリーのため、ＡＴ１０−００２−ビオチン、ＡＴ−１４−０１２−ビオチンビオチンと、それに続いて蛍光標識をコンジュゲートしたストレプトアビジンで、又は直接標識したＨＩ９ａ  ＣＤ９若しくは抗ＩｇＧ抗体で染色した。Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でサンプルを測定した。
【図９Ｅ】図９Ｅ〜Ｇ  ＡＴ１４−０１２はＳＫ−ＭＥＬ−５黒色腫増殖を妨げる。皮下にＳＫ−ＭＥＬ−５黒色腫腫瘍を保持しているＮＳＧマウスを、ＡＴ１４−０１２又はＡＴ１０−００２（対照抗体）で処置した。図９Ｅ：各時点でノギスで測定し腫瘍の増殖を評価した。灰色の領域は、抗体による処置期間を示す。図９Ｆ：単離した腫瘍をｅｘ  ｖｉｖｏで秤量した。重量はマウスあたりの平均値である。図９Ｇ：ｌｉｂｅｒａｓｅ処置により腫瘍を消化し、フローサイトメトリーのためＣＤ９  ＨＩ９ａ−ＰＥで染色した。
【図１０Ａ】図１０．ＡＴ１４−０１２結合は、近年樹立された腫瘍細胞株におけるＣＤ９の発現と相関する。短期間培養した黒色腫細胞に対するＡＴ１４−０１２及びＣＤ９  ＨＩ９ａの結合についてのフローサイトメトリー解析。黒色腫細胞の、ＣＤ９  ＨＩ９ａ、ＡＴ１４−０１２、及びＡＴ１０−００２抗インフルエンザ（対照）抗体による染色ついてのヒストグラム。
【図１０Ｂ】バックグラウンドの染色について補正した、ＡＴ１４−０１２のシグナルの平均蛍光強度とＣＤ９  ＨＩ９ａのシグナルの平均蛍光強度との比較。矢印は、もとのＡＴ１４−０１２患者に由来する黒色腫サンプルＭｅｌ０６．０７及びＭｅｌ０５．１８を示す。
【図１０Ｃ】樹立した細胞株（ＰＡＮＣ０１及びＣＡＰＡＮ２）と、患者由来の新しい膵臓癌腫瘍細胞（５３Ｍ及び１９３）とに対するＡＴ１４−０１２及びＣＤ９  ＨＩ９ａの結合についてのフローサイトメトリー解析。
【図１１Ａ】図１１．ＡＴ１４−０１２の結合は（非）−ヒト哺乳動物に限定される。ＮＯＤ  ＳＣＩＤ  γｃ−／−（ＮＳＧ）マウス。
【図１１Ｂ】ニュージーサンド白ウサギ。
【図１１Ｃ】カニクイザル及びヒトから単離した多血小板血漿画分を、ＣＤ４１発現血小板について電子的にゲート化した。それぞれの種の血小板に対するＡＴ１０−００２、ＡＴ１４−０１２、及び抗ＣＤ９の結合をフローサイトメトリーにより測定した。
【図１２Ａ】図１２．抗体依存性細胞疾患（ＡＤＣＣ）。クロム標識したＭｅｌＢＬＭ若しくはヒト動脈内皮細胞。
【図１２Ｂ】クロム標識した短期培養した初代黒色腫細胞を記載の抗体とともにインキュベートし、全ヒトＰＢＭＣに対しする適正量を求めた。上清にクロムが放出されることにより細胞死を判定した。
【図１３Ａ】図１３．ＡＴ１４−０１２は補体介在性の腫瘍細胞死をトリガーする。黒色腫細胞株を、記載の抗体と、ヒト血清とともにインキュベートした後、抗Ｃ１ｑ抗体を使用するフローサイトメトリーにより、Ｃ１ｑの付着について試験した。
【図１３Ｂ】黒色腫細胞株を、記載の抗体と、ヒト血清とともにインキュベートした後、抗Ｃ１ｑ抗体を使用するフローサイトメトリーにより、Ｃ１ｑの付着について試験した。
【図１３Ｃ】懸濁物、又は記載の抗体及びウサギ補体を終夜結合させた黒色腫細胞をインキュベートすることにより、補体介在性細胞疾患を求めた。
【図１３Ｄ】懸濁物、又は記載の抗体及びウサギ補体を終夜結合させた黒色腫細胞をインキュベートすることにより、補体介在性細胞疾患を求めた。
【図１３Ｅ】ＣＤ５５陽性（ＭｅｌＢＬＭ）及びＣＤ５５陰性（Ｃｏｌｏ−２０５）を記載の抗体及びヒト血清とともにインキュベートする。結合させた細胞懸濁物の細胞死の割合は、フローサイトメトリーを用いＤＡＰＩにより、又は顕微鏡観察を用いＴＯ−ＰＲＯ３によりそれぞれ測定される。
【図１４Ａ】図１４．ＡＴ１４−０１２は、ホモクラスタ化したＣＤ９に対し望ましく結合する。２つの黒色腫及び１つの癌腫細胞株を、パルミトイル化阻害剤２−ＢＰとともに、又はＤＭＳＯのみで３６時間インキュベートした。細胞を脱離させ、フローサイトメトリーのため、ＡＴ１０−００２インフルエンザ対照抗体、又は異なるＣＤ９抗体、ＡＴ１４−０１２、又は市販のＨＩ９ａ及びＡＬＢ６クローンで染色した。
【図１４Ｂ】ＡＴ１０−００２シグナルのヒストグラムの平均蛍光強度は、ＣＤ９シグナルのｍ．ｆ．ｉ．により推定した。比率は、対応するΔｍ．ｆ．ｉ．の値をＤＭＳＯ条件についてのΔｍ．ｆ．ｉ．値で除算したものである。２−ＢＰ値及び異なる細胞株に対するプロット。比率が１である場合、抗体の結合は脱パルミトイル化により影響を受けなかったことを示す。
【図１５】ＨＬ６０細胞上で発現した領域ｍ３のアラニンスキャニングは、ＡＴ１４−０１２の結合について全く低下を示さなかった（ｎ＝２）。驚くべきことに、本発明者らは、ｍ３領域における１つのアミノ酸の交換ではＡＴ１４−０１２の結合は妨げられないことを突き止めた。野生型ＣＤ９、ＣＤ９／ＣＤ８１  ＥＣ２ハイブリッド変異体、ＥＣ２  ｍ３  ＣＤ９／ＣＤ８１ハイブリッド変異体を対象として含めた。結合データと、既報のデータとが合致していることが示される（図５）。
【図１６Ａ】図１６．ＡＴ１４−０１２は、市販のマウス抗ＣＤ９抗体と比較してＣＤ９に対する親和性が低い。ＡＴ１４−０１２（＋対照としてＡＴ１０−００２）及び市販の抗体ＨＩ９ａ及びＡＬＢ６（＋対照として、プレート上にＣＤ９タンパク質が存在していることを検出するための抗−ＦＬＡＧ及びＯＫＴ３）の、ＣＤ９への結合について比較した。
【図１６Ｂ】ＳＰＲ曲線は、単一スポットしたＣＤ９−３ｘＦＬＡＧ−ウサギＦｃ−ソルターゼ−ビオチンタンパク質に対し様々な抗体を注射した際の、抗ＣＤ９抗体ＡＴ１４−０１２、ＡＬＢ６、及びＨＩ９ａの結合を示す。
【図１６Ｃ】ヒトＣＤ９に対する、異なる抗体の親和性を、ＳＰＲにより測定した（ｋａについては１０４秒−１＊Ｍ−１、ｋｄについては１０−５秒−１、ＫＤについてはｐＭ）。７３２４ＲＵの組み換え体ＣＤ９−３ｘＦＬＡＧ−ウサギＦｃ−ソルターゼ−ビオチン（０．５μｇ／ｍＬ）でコートされた１つのＣＤ９スポットに対する結果を示す。結合速度を算出するため、３つのデュプリケート注射に由来するデータを１：１結合モデルに当てはめた。０．５又は１．０μｇ／ｍＬ  ＣＤ９−３ｘＦＬＡＧ−ウサギＦｃ−ソルターゼ−ビオチンでコートした３つのスポットに対する測定から得られた平均及び標準偏差を示す。＊：正確に当てはめた場合に抗体の解離速度（ｋｄ）が明らかに低すぎる場合、０．１＊１０−５の値を使用した。いずれも０．５μｇ／ｍＬ  ＣＤ９−３ｘＦＬＡＧ−ウサギＦｃ−ソルターゼ−ビオチンでコートした２つのスポットに対する、２つの適正量の平均を示す。結合力価を計算するため、３つのデュプリケートでの注射から得られたデータを使用した。
【図１７Ａ】図１７．Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３及びＦ１７６は、ＡＴ１４−０１２エピトープの一部である。組み換え発現させたｍ４アラニン変異体に対しＡＴ１４−０１２（三角形，すべてのグラフのうち最も下側の線）、ＡＬＢ６（円形）、及びＨＩ９ａ（四角形）を結合させたＥＬＩＳＡデータ。
【図１７Ｂ】ＣＤ９の相同モデル上に示されたＡＴ１４−０１２のエピトープ（ＥＣは細胞外及びＩＣは細胞内配置）。ＣＤ８１相同モデル（２ＡＶＺ；Ｓｅｉｇｎｅｕｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を使用して、Ｉ−Ｔａｓｓｅｒサーバー（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）を用い相同モデルを作成した。２０１６年１１月時点で、結晶構造は既報であり（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、かつこの結晶構造をベースとして新しく作成されたＣＤ９相同モデルは、ＡＴ１４−０１２エピトープに関する残基の配置に関して何ら可能性を示さなかった。
【図１７Ｃ】異なる種（図１１を参照）由来の細胞に対するＡＴ１４−０１２の結合についてのＦＡＣＳデータ、及び複数種（本箇所）に由来するＣＤ９配列（残基２３〜２２８）のアラインメントにより、ＡＴ１４−０１２エピトープを裏付ける。配列は、２０１６年６月ころにウェブサイトのｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇで検索した。見つけられたすべての種に関し、最初の２２残基は十分には解明されなかったため、本明細書では省略する。ＡＴ１４−０１２は、カニクイザル細胞と反応することが知られている一方、ウサギ細胞又はマウス細胞への結合についてアッセイした場合には結合しない。Ｃ１６７及びＣ１８２（緑色）が隣合う領域ｍ４のアラインメント（明灰色）、より具体的には、ＡＴ１４−０１２の結合に関与する５つの残基（暗灰色）をハイライトしている。明らかに、Ｆ１７６Ｌ変異は、ＡＴ１４−０１２の結合を低下させない（図１１Ｃ中、カニクイザル細胞に対するＡＴ１４−０１２の結合を参照のこと）。
【図１８Ａ】図１８．単一細胞として選別した２Ｈ１５  Ｂ細胞とＳＰＲ（ＩＢＩＳ）とを使用するＡＴ１４−０１２の親和性の改良。濃度を増加させてＡＴ１４−０１２組み換え体を８回連続して注射することによるＳＰＲ曲線（タンパク質０ｎＭ−１．３３ｎＭ−４．０ｎＭ−１３．３０ｎＭ−４０．０ｎＭ−１３３．０ｎＭ−及び０ｎＭ）。緑色の線は、ＣＤ８１に対する結合反応性（がなかったこと）を意味し、オレンジは抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃに対する結合、灰色は抗ＣＨ１ナノボディに対する結合、及び青色はＣＤ９への結合を意味する。抗ＩｇＧ−Ｆｃ及びａＣＨ１の比を用い、Ｂ細胞上清中のＩｇＧの濃度及び完全性を観察することができる（Ｂを参照のこと）。
【図１８Ｂ】材料及び方法に記載したＳＰＲでの８００個のクローンの選別後、本発明者らは新しく生育させたＢ細胞の上清を再度その結合性についてアッセイした。８つのクローンでは増加した（１Ｄ５、１Ｆ５、２Ｄ１２、４Ｈ１０、６Ｅ１０、９Ｅ５、１０Ｂ９、及び１０Ｄ１）のに対し、４つの疑いのあるクローンは最終的に増加しなかった（１Ｃ９、２Ｈ１０、９Ａ９、９Ｄ１２）。開始時及び終了時には、参照として組み換えＡＴ１４−０１２を注入する。
【図１８Ｃ】特定されたクローンの親和性を含む配列解析により、それらの会合／解離特性に関係する変異の重複が示された。第１群は、速い会合と遅い解離を示し、第２群は、速い会合と速い解離を示し、第３群は、野生型配列と比較して明確な差はなかったことを示す（１Ｇ２、１Ｇ３、１Ｇ４、１Ｇ５）。
【図１９Ａ】図１９．高親和性変異体であるＡＴ１４−０１２の設計、発現、及び解析、並びにＳＰＲ。主要な変異は重鎖のみに位置したことから、ここでは重鎖のアラインメントのみを示す。また、第１群（赤色；Ｈ４０Ｙ及びＹ１１２Ｆ）並びに第２群（青紫；Ｄ１１６Ｈ及びＴ２９Ｎ）並びに両群の組み合わせ（Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、Ｄ１１６Ｈ、及びＴ２９Ｎ）を作製した。対照として、ＣＤ９の結合が消失する変異を１つ加えて、結果を検証した（暗青；Ｇ１１０Ｄ）。もとのＡＴ１４−０１２／２Ｈ１５超変異を黄色でハイライトする。ＩＭＧＴ番号系によるＣＤＲ付番（Ｌｅｆｒａｎｃ  １９９７，Ｌｅｆｒａｎｃ  １９９９及びＬｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。
【図１９Ｂ】ＭｅｌＷＢＯ又は２つの異なるドナー細胞より短期間培養した健常メラノサイトを、異なるＡＴ１４−０１２多様体のＣＨＯ産生上清とともにインキュベートした。ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ−ＰＥ二次抗体を使用して、フローサイトメトリーにより結合を検出した。
【図１９Ｃ−１】ＭｅｌＷＢＯ又は２つの異なるドナー細胞より短期間培養した健常メラノサイトを、異なるＡＴ１４−０１２多様体のＣＨＯ産生上清とともにインキュベートした。ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ−ＰＥ二次抗体を使用して、フローサイトメトリーにより結合を検出した。
【図１９Ｃ−２】ＭｅｌＷＢＯ又は２つの異なるドナー細胞より短期間培養した健常メラノサイトを、異なるＡＴ１４−０１２多様体のＣＨＯ産生上清とともにインキュベートした。ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ−ＰＥ二次抗体を使用して、フローサイトメトリーにより結合を検出した。
【図１９Ｄ】異なるＡＴ１４−０１２多様体のＣＨＯ産生上清を、ＣＤ９コートしたチップで、ＳＰＲによりアッセイした（デュプリケートで示す）。＃＝ＣＨＯ産生上清。親和性は、ｋａについては１０４秒−１＊Ｍ−１とし、ｋｄについては１０−５秒−１とし、ＫＤについてはｐＭとした。いずれも０．５μｇ／ｍＬ  ＣＤ９−３ｘＦＬＡＧ−ウサギＦｃ−ソルターゼ−ビオチンでコートした２つのスポットに対する、２つの反応の平均を示す。変異体のサンプルは、精製していない産生上清をＰＢＳＴで１倍希釈したものとした。−：結合は検出されなかった。＊：結合が検出されたものの、良好な適合は不可能性である。
【図１９Ｅ】異なるＡＴ１４−０１２多様体のＣＨＯ産生上清を、ＣＤ９コートしたチップで、ＳＰＲによりアッセイした（デュプリケートで示す）。＃＝ＣＨＯ産生上清。親和性は、ｋａについては１０４秒−１＊Ｍ−１とし、ｋｄについては１０−５秒−１とし、ＫＤについてはｐＭとした。いずれも０．５μｇ／ｍＬ  ＣＤ９−３ｘＦＬＡＧ−ウサギＦｃ−ソルターゼ−ビオチンでコートした２つのスポットに対する、２つの反応の平均を示す。変異体のサンプルは、精製していない産生上清をＰＢＳＴで１倍希釈したものとした。−：結合は検出されなかった。＊：結合が検出されたものの、良好な適合は不可能性である。
【図２０】ＡＴ１４−０１２高親和性変異体を使用する血小板凝集アッセイ。ＴＲＡＰ、ＡＬＢ６、及びこれまでに評価した精製組み換え体完全長ＡＴ１４−０１２  ＩｇＧ１及びＩｇＧ３（対照ＡＴ１０−００２  ＩｇＧ１抗体を含む）を合わせて対照とした。
【図２１】Ｂ細胞により産生された抗体ＡＴ１４−０１２／２Ｈ１５はＩＧＨＧ３＊１６のアロタイプである。ＡＴ１４−０１２／２Ｈ１５  Ｂ細胞からｍＲＮＡを単離した。図の出典はＶｉｄａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４である。
【図２２Ａ】図２２．ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＡＴ１４−０１２を抗ＰＤ１と組み合わせると、腫瘍の増殖が抑制される。ヒト免疫系を保有しているＮＳＧマウスにＳＫ−ＭＥＬ−５ルシフェラーゼ発現黒色腫細胞を皮下移植する。マウスを、週に２回記載の抗体で処置する。腫瘍の増殖をルシフェラーゼイメージングにより測定する。灰色の領域は、抗体による処置期間を示す。
【図２２Ｂ】実験終了時の腫瘍の大きさと、抗体の初回注射時の腫瘍の大きさをもとに、腫瘍増殖の抑制率（ＴＧＩ）を算出する。
【実施例】
【０１７５】
実施例１−ＡＴ１４−０１２  Ｂ細胞クローンの単離
材料及び方法
黒色腫細胞培養物。黒色腫細胞株ＭｅｌＢＬＭ、Ｍｅｌ１３６．２、及びＭｅｌＷＢＯを、Ｒｏｓａｌｉｅ  Ｌｕｉｔｅｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）より得て、標準的な組織培養法を用い、８％ウシ胎児血清を添加したＩＭＤＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で維持した。細胞表面タンパク質の破損を最小限にするため、腫瘍細胞はＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＥＤＴＡを使用して取り除いた。
【０１７６】
黒色腫ドナーのＰＢＭＣ。実験プロトコルは、ライデン大学メディカルセンターの医療倫理委員会（Medical Ethical Committee）により承認された。自己血液由来の腫瘍特異的Ｔ細胞を、ＩＦＮα（Ｖｅｒｄｅｇａａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０１１）と組み合わせて養子移入することによりステージＩＶの黒色腫患者を治療した。治療後、腫瘍は退縮し、患者はこのコホートでは長期生存者のみである。治療の５年後、血液を採取し、フィコールを使用した密度勾配法でＰＢＭＣを単離した後、Ｂ細胞の単離まで液体窒素で凍結した。
【０１７７】
Ｂ細胞の不死化。ＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、解凍した患者ＰＢＭＣから全ＩｇＧ  Ｂ細胞を選別し、Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１０に記載のとおりに不死化した。簡潔に記載すると、全ＩｇＧ  Ｂ細胞を培養し、組み換えマウスＩＬ−２１の存在下でＬ細胞を発現しているＣＤ４０Ｌに対し、３６時間にわたり活性化した。レトロウイルスを使用した形質導入により、本発明者らの所有するＢｃｌ６及びＢｃｌ−ｘＬとマーカー遺伝子ＧＦＰとを発現する構築物をＢ細胞に導入し、Ｂ細胞を不死化した。
【０１７８】
Ｂ細胞の培養。不死化したＢ細胞を、８％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｒｏｃｈｅ）、及び組み換えマウスＩＬ−２１（５０ｎｇ／ｍＬ、自家製造）を添加したＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）で維持した。ガンマ線照射（５０Ｇｙ）したＣＤ４０Ｌ発現マウス線維芽細胞をフィーダー細胞としてインキュベートした。培養物を定期的に試験したところ、マイコプラズマ陰性であった。
【０１７９】
黒色腫に結合するＢ細胞クローンの単離。不死化ＩｇＧ  Ｂ細胞を、３８４ウェルプレートの１ウェル当たり２５個ずつ播種し、Ｌ細胞及びｍＩＬ２１を用い増殖させた。約２週間の培養後、抗体を含有するＢ細胞の上清を、黒色腫細胞株の混合物に対する結合について試験した。抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ａｎｄ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により陽性の結合を可視化した。陽性の微量培養物（minicultures）を増殖させ、シングルセル分取したＢ細胞に対しかかる手順を繰り返して、２５個細胞微量培養物から黒色腫に反応するＢ細胞クローンを回収した。パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ１）を陽性対照抗体としてインキュベートした。
【０１８０】
組み換え抗体の産生。組み換え抗体の産生のため、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）により全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを生成し、ＰＣＲを実施し、重鎖及び軽鎖可変領域をｐＣＲ２．１  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを排除するため、変異を導入した複数のクローンを配列決定した。ＡＴ１４−０１２の重鎖及び軽鎖可変領域をクローニングし、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３及びκ定常領域によってｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベースのベクターにインフレームでクローニングした。得られるベクターを２９３Ｔ細胞に一過性トランスフェクトし、ＡＫＴＡ精製システム（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い培養上清から組み換え抗体を精製した。対照とすることを目的として、インフルエンザウイルスのＨＡ抗原を認識する無関係な対照抗体（ＡＴ１０−００２）を実験に含めた。
【０１８１】
結果
黒色腫結合Ｂ細胞クローンの同定及び単離。皮膚黒色腫及びステージＩＶの進行性の転移性疾患を有する患者を、腫瘍反応性の自己Ｔ細胞の養子移入（Ｖｅｒｄｅｇａａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１１）により治療した。この治療のため、腫瘍組織を外科的に得て、自己黒色腫細胞株の樹立に使用した。末梢血の単核細胞を血液から単離し、Ｔ細胞培地中で、致死量の線照射（lethally irradiated）を施した自己黒色腫細胞と共培養した。４週間の培養後、機能性アッセイ（Ｖｅｒｄｅｇａａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１１）により、培養したＴ細胞の腫瘍反応性を確認した。患者に増殖させた自己Ｔ細胞を２回導入すると完全な応答を示し、かつ治療から９年以上後にも腫瘍がない。
【０１８２】
自己Ｔ細胞療法から５年後に単離したＰＢＭＣから、全ＩｇＧ  Ｂ細胞プールに、本発明者らの所有するＢｃｌ６／Ｂｃｌ−ｘＬコンストラクトをレトロウイルスにより導入した。不死化させたＧＦＰ陽性細胞を、黒色腫結合抗体の存在について、フローサイトメトリーにより試験した。ＡＴ１４−０１２と命名されたＩｇＧ３  Ｂ細胞クローンは、最初に試験した黒色腫細胞株（ＭｅｌＢＬＭ及びＭｅｌＷＢＯ）の療法に対し強い反応性を示した。重鎖及び軽鎖可変配列を決定し（図３を参照のこと）、２９３細胞又はＣＨＯ細胞における組み換え抗体の産生のため、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３の骨格の両方でＤＮＡのクローニングを行った。
【０１８３】
実施例２−ＡＴ１４−０１２の標的抗原はＣＤ９である
材料及び方法
ＡＴ１４−０１２の標的の同定及び検証
大腸癌細胞株Ｃａｃｏ２の細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３７）、黒色腫細胞株ＭｅｌＢＬＭの細胞、ヒト前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０の細胞（陰性対照）を溶解させ（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１１４（Ｓｉｇｍａ），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４），１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加）、無関連な抗体（自家製造したＲＳＶ抗体Ｄ２５）、プロテインＧ、及びストレプトアビジンビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてそれぞれを明らかにし非特異的な結合タンパク質を除去した。ＡＴ１４−０１２を直接ウェスタンブロットするため、本発明者らは、精製した組み換えＡＴ１４−０１２を、ＴＢＳ＋５％  ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）中で少なくとも１時間室温でインキュベートし、ＳＤＳ−Ｐａｇｅを行い、ライセートをブロットした。ブロットをＴＢＳＴで５分間×３回洗浄し、ＴＢＳＴ＋５％  ＢＳＡ中ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＨＲＰ標識、１：１０．０００希釈；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出した。再度、ブロットを５分間×３回洗浄した後、化学発光処理し、発光させた。次に、由来の明らかなライセートを、予めビーズに結合させた黒色腫特異的抗体ＡＴ１４−０１２又はインフルエンザ特異的抗体ＡＴ１０−００２（陰性対照として）とともに、インキュベートした（４℃、３時間）。抗体とインキュベートしたビーズを溶解緩衝液中で３回洗浄して、結合したタンパク質をビーズから溶出させ（０．１Ｍグリシン（ｐＨ１０．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、１：１０体積量の２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で中和した。再度、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。８５％のＩＰサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｉｍｐｅｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）で全タンパク質を染色し、質量分析により特異的なバンドを切り出した。免疫沈降（ＩＰ）サンプルの残りをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、免疫ブロットのためＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。ウェスタンブロット解析のため、かかるブロットをＡＴ１４−０１２又はマウス抗ＣＤ９（クローンＡＬＢ６，Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）とともにインキュベートし、ＣＤ９の同定を確認した（データ不掲載）。
【０１８４】
エピトープマッピング
最初に、ＣＤ９（対ＣＤ８１）のハイブリッド変異体を作製することによりエピトープマッピングを実施した。ＣＤ９には、２つの細胞外ループ、すなわち、小さなＥＣ１（残基３４〜５８；又はＳＥＬ）と、ＡＴ１４−０１２の結合パートナーとして機能し得る大きなＥＣ２（残基１１２〜１９５；又はＬＥＬ）とがある（図１ａ）。野生型のＣＤ９構築物に加えて、本発明者らは、対応するＣＤ８１残基に関し、第１の小さなループを置き換える１つのスワップ変異体（swap mutant）と、大きなループを置き換える１つのスワップ変異体とを生成した。第２のループを更に分解するため、本発明者らは、対応するＣＤ８１領域に対し、５つのスワップ変異、すなわち、ｍ１（対応するＣＤ８１残基により置換したＣＤ９の残基１１２〜１３４）、ｍ２（対応するＣＤ８１残基により置換したＣＤ９の残基１３５〜１５１）、ｍ３（対応するＣＤ８１残基により置換したＣＤ９の残基１５４〜１６６）、ｍ４（対応するＣＤ８１残基により置換したＣＤ９の残基１６８〜１８０）、及びｍ５（対応するＣＤ８１残基により置換したＣＤ９の残基１８２〜１９５を）、を生じさせることにより、予想されるαヘリックス領域（alpha helical stretches）を置き換える、より小規模なスワップ変異（smaller swap mutants）を提案した（図１ｂを参照のこと）。システインはテトラスパニン（Ｃ１５２、Ｃ１５３、Ｃ１６７、及びＣ１８１）間で保存されていることから、構造特性／折りたたみは、表記の領域をスワップした後にも影響を受けることはない。二次構造の予測により、ＣＤ９の折りたたみはその他のテトラスパニンの場合の様式と同様であることが示されることから、このアプローチはシステインが保存される限りは機能するものと示唆される。すべてのＣＤ９及びスワップ多様体は、ＣＤ９遺伝子のＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により作製し、ウェスタンブロットで検出することができるようＣ末端にＦＬＡＧタグを付与した（３ｘ  ＦＬＡＧ：ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ）。ＣＤ９のｃＤＮＡを、ｐＨＥＦ−ＴＩＧ第３世代レンチウイルスベクターにクローニングした（ＣＤ９のｃＤＮＡには、３’にＩＲＥＳ−ＧＦＰをもたせた）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子を産生させた。レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｊａｐａｎ）の存在下で、複数の黒色腫ＣＤ９陰性細胞株ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ−２４０）にこれらのウイルスを導入し、ＧＦＰについて選別してＣＤ９を過剰発現している細胞のみを含む集団を得た。１４−０１２と、その他の市販の抗ＣＤ９抗体（ＡＬＢ６；Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ａｎｄ  ＨＩ９ａ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の、ＦＡＣｓの結合結果に基づいて、ｍ４領域にアラニン変異を作成して（残基Ｋ１６９Ａ、Ｋ１７０Ａ、Ｄ１７１Ａ、Ｖ１７２Ａ、Ｌ１７３Ａ、Ｅ１７４Ａ、Ｔ１７５Ａ、Ｆ１７６Ａ、Ｔ１７７Ａ、Ｖ１７８Ａ、Ｋ１７９Ａ、及びＳ１８０Ａ）、このｍ４領域に特異的なアミノ酸がエピトープに関係するかを試験した。
【０１８５】
ＣＤ９のｍ３領域にアラニンスキャニングを使用したエピトープマッピング
前述のとおりにアラニンスキャアニングを実施した（図５Ｂに関係する材料及び方法を参照のこと）。ＣＤ９のｃＤＮＡを、を含有しているｐＨＥＦ−ＴＩＧ第３世代レンチウイルスベクターにクローニングした（ＣＤ９のｃＤＮＡには、３’にＩＲＥＳ−ＧＦＰをもたせた）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＶＳＶ−Ｇレンチウイルス粒子を産生させた。レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｊａｐａｎ）の存在下で、複数のミエローマＣＤ９陰性細胞株ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ−２４０）にこれらのウイルスを導入し、ＧＦＰについて選別してＣＤ９を過剰発現している細胞のみを含む集団を得た。ＡＴ１４−０１２と、その他の市販の抗ＣＤ９抗体（ＡＬＢ６及びＨＩ９ａ）の、ＦＡＣｓの結合結果に基づいて、ｍ３領域にアラニン変異を作成して（残基Ｇ１５４Ａ、Ｌ１５５Ａ、Ｇ１５７Ａ、Ｇ１５８Ａ、Ｖ１５９Ａ、Ｅ１６０Ａ、Ｑ１６１Ａ、Ｆ１６２Ａ、Ｉ１６３Ａ、Ｓ１６４Ａ、Ｄ１６５Ａ、Ｉ１６６Ａ）、このｍ３領域に特異的なアミノ酸がエピトープに関係するかを試験した。
【０１８６】
結果
ＡＴ１４−０１２の標的はＣＤ９である。
本発明者らは、ＦＡＣｓにおいてＡＴ１４−０１２の結合が高かったことから、大腸癌細胞Ｃａｃｏ２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３７）を使用し、ＡＴ１４−０１２の標的を特定した。但し、黒色腫細胞株ＭｅｌＢＬＭライセートに対しても同様の方法で確認した。Ｃａｃｏ２細胞、ＭｅｌＢＬＭ細胞、又はＨＬ−６０細胞のライセートをＳＤＳ−Ｐａｇｅにかけ、ウェスタンブロットし、ＡＴ１４−０１２の反応について調査し、ヤギ抗ヒトポリクローナルＩｇＧ（ＨＲＰ  ｌａｂｅｌｅｄ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により検出した。かかるブロットにより、約２５ｋＤａの大型タンパク質に対する応答性が示された（図４ａ）。ライセートを還元条件下で泳動すると、反応性又はシグナルが消失したことから、抗体は、システインにより支持される立体構造をもって構成されるエピトープに反応することを意味する。Ｃａｃｏ２又はＭｅｌＢＬＭのライセートの免疫沈降物（ＩＰ）を、ビオチン標識しソルターゼタグを付したＡＴ１４−０１２とともにインキュベートした場合にも、約２５ｋＤａのバンドが生じた（図４ｂ）。Ｃａｃｏ２／ＭｅｌＢＬＭライセートのＡＴ１０−００２  ＩＰでも、ＨＬ−６０ライセートのＩＰでも見られなかったことから、このバンドは特異的なものであった。免疫沈降のバンドの質量分析（ＭＳ）分析により、ＣＤ９が標的タンパク質であることが明らかとなった。ＭｅｌＢＬＭ細胞のＩＰについては、クーマシー染色ではバンドが視認されなかったものの、ＭＳ解析では同様にＣＤ９抗原が沈降していたことが示された。細胞外ループ２に属する４つの細胞外ペプチドを同定したところ、タンパク質カバレッジは１０％であった。疎水性であることに起因して検出が難しいことから、膜貫通ペプチドは同定されなかった。ウェスタンブロット解析により、ＡＴ１４−０１２がＣＤ９に結合していることが確認された（図４ｃ）。簡潔に記載すると、Ｃａｃｏ２又はＨＬ−６０のライセートを、ＡＴ１４−０１２又はインフルエンザ特異的抗体ＡＴ１０−００２により免疫沈降した。再度、ＡＴ１４−０１２及びマウス抗ＣＤ９（クローンＡＬＢ６）によるウェスタンブロット解析から、ＣＤ９はＡＴ１４−０１２の結合標的であることを確認した（図４ｃ）。
【０１８７】
ＣＤ９は、正常な細胞及び悪性細胞で広範に発現される。これまでにＣＤ９特異的抗体が作製されており、市販されている（例えば、ＡＬＢ６及びＨＩ９ａ）。本発明者らは、Ｃａｃｏ２細胞及びＢＬＭ細胞でＣＤ９が発現していることをこれらの抗体により確認した。ＡＴ１４−０１２との競合試験により、すべての市販の抗体はＡＴ１４−０１２の結合と競合し得ること、並びにＡＴ１４−０１２そのものと競合し得ることが示された（データ不掲載）。
【０１８８】
ＡＴ１４−０１２の結合エピトープをより特異的に同定するため、材料及び方法の節に記載のとおりＣＤ９ホモログのＣＤ８１のタンパク質領域をスワッピングして、ハイブリッド変異体を作成した。これらの変異体に対する抗体ＡＴ１４−０１２、ＡＬＢ６、及びＨＩ９ａの結合を試験した。本発明者らは、細胞外ループ２（ＥＣ２）に結合するすべての抗ＣＤ９抗体は、ＣＤ８１のＥＣ２をスワッピングさせた場合に結合の低下を示す一方、第１の細胞外ループをスワッピングさせた場合には結合は維持されることを特定した。ＨＬ６０細胞に空ベクターを導入した場合、すなわち細胞に誘導を行わなかった場合には、すべての抗体で結合は観察されなかった。ＣＤ９に特異的な領域をＣＤ８１の対応する領域とスワッピングさせたハイブリッド変異体ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４、及びｍ５により、ＥＣ２ループ上のエピトープを更に評価した（図１ｂ）。二次構造を維持するため、システインには触れずにそのままとしたことに留意されたい。ｍ２領域及びｍ５領域のスワッピングでは、いずれの抗ＣＤ９抗体の結合にも影響は生じなかったことから、これらの領域にはエプトープは存在していなかったことが示される。本発明者らは、領域ｍ３をスワッピングした場合に、すべての抗体は結合を無効化されたことを示すことができたことから、このことは、試験したすべての抗体残基に関しエピトープがこの領域に存在することを示す。ＡＴ１４−０１２はｍ１変異体に対する結合を維持したのに対し、すべての市販の抗体は結合性を失った。ＡＬＢ６及びＡＴ１４−０１２は、ｍ４変異体に対しては結合性の消失を示したのに対し、ＨＩ９ａは結合性を保持した。これらの結果は、ＡＴ１４−０１２の主なエピトープがｍ３及び／又はｍ４に存在することを示す。これを受け、本発明者らは、最初にｍ４におけるアラニン変異体を作製した（材料及び方法の節に記載のとおり）。ここではＨＩ９ａを、導入したＨＬ６０細胞の細胞表面上でのＣＤ９アラニン変異体の発現の制御についての陽性対照とした。ＡＬＢ６を、この市販の広範に使用されている抗ＣＤ９抗体が類似するエピトープを有するかどうかを研究する際の比較とした。ＦＡＣｓ解析後、本発明者らは、Ｆ１７６ＡがＡＬＢ６に対する結合の消失を示した唯一のアラニン変異体であることを示した。ＡＴ１４−０１２の場合と同様、残基Ｋ１６９、Ｄ１７１、Ｖ１７２、Ｌ１７３、Ｔ１７５、及びＦ１７６をアラニンで置換した場合、結合の消失が観察された。したがって、本発明者らは、少なくとも５つの追加のアミノ酸が異なっていることを除き、ＡＴ１４−０１２のエピトープはＡＬＢ６のエピトープと重複することを示した。
【０１８９】
ＡＴ１４−０１２のエピトープは直線的なものであり、残基はｍ４領域のみに存在する。ＣＤ９／ＣＤ８１ハイブリッド変異体に対する結合性が消失したことから、本発明者らは、領域ｍ４のアラニンスキャニングによる結合試験後、ｍ３領域について、更に詳細に試験を行った（図１５を参照のこと）。本発明者らは、Ａ１５６を除き、アミノ酸１５４〜１６６にまたがる領域ｍ３において、アラニン変異体を作製した。本発明者らは、ＣＤ９陰性のＨＬ６０細胞株に形質導入し、ＣＤ９発現細胞をＧＦＰバルク選別した。細胞に結合するＡＴ１４−０１２、ＡＬＢ６、及びＨＩ９ａをＦＡＣＳにより試験した。驚くべきことに、この領域では、ＡＴ１４−０１２又はＨＩ９ａの結合を損なわせる単一アラニン置換は存在しなかった。ＥＣ２及びｍ３のＣＤ９／ＣＤ８１ハイブリッド変異体は、すべての抗体に関し結合性の消失を示したため、本発明者らは、この特定のハイブリッドはおそらくは折りたたみが不適切であるものと仮定した。ＣＤ８１の結晶構造及びＣＤ９の相同モデルにより（図１５を参照のこと）、ｍ３領域はｍ１、ｍ２、及びｍ４間のある位置に「固定（locked）」される。したがって、すべての抗ＣＤ９抗体について、この領域に対しアミノ酸の大幅な変更が生じた場合に結合は消失するようである。ちなみに、ＡＬＢ６は、Ｑ１６１Ａ変異体に対する結合性を消失していたことから、本発明者らは、ＡＬＢ６のエピトープについても解決した（ｍ３におけるＱ１６１、及びｍ４におけるＦ１７６）。領域ｍ３及びｍ４におけるアラニンスキャニング解析後、本発明者らは、ＡＴ１４−０１２は、立体配座的にともに保持される又はＣＤ９の他の周辺部分により誘導される、線状に折りたたまれたエピトープを対象とする、という仮説を立てることができた（ｍ２、ｍ３、及びｍ５、図１５中の相同モデルを参照されたい）。
【０１９０】
ＡＴ１４−０１２はクラスタ化したＣＤ９に対し選好的に結合する。Ｍａｒｔｉｎ  Ｈｅｍｌｅｒの研究室により、ＣＤ９のパルミトイル化には、ＣＤ９のホモクラスタの形成が望ましいこと、並びにＣＤ９ホモクラスタのレベルは、初代腫瘍細胞、特に遊走性腫瘍細胞をもとに評価されることが示されている（Ｙａｎｇ  ＪＢＣ  ２００６）。ＣＤ９腫瘍細胞のパルミトイル化状態におけるＡＴ１４−０１２の依存性（dependence）を求めるため、ＣＤ９腫瘍細胞を、パルミトイル化阻害剤として知られる２−ブロモ−パルミテート（２−ＢＰ）の存在下で培養した。黒色腫ＢＬＭ細胞は、２−ＢＰ処理細胞へのＡＴ１４−０１２の結合性が低下している一方で、市販のＣＤ９  ＨＩ９ａ抗体の結合性は、脱パルミトイル化により影響を受けないことを明瞭に示す［図１４Ａ、Ｂ］。興味深いことに、観察される効果は、非常に侵襲性の高いＭｅｌＢＬＭ（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ  ＡＪＰ  ２００９）で最も強く、非遊走大腸癌のＣａＣｏ２細胞では見られなかった。これにより、ＣＤ９のホモクラスタは、進行疾患において高レベルであり、ＡＴ１４−０１２は腫瘍の進行を監視するのに使用され得ることが示される。
【０１９１】
実施例３−ＡＴ１４−０１２の機能特性
材料及び方法
腫瘍細胞株。黒色腫（ＭｅｌＢＬＭ、ＭｅｌＷＢＯ、Ｍｅｌ１３６．２）、大腸癌（ＣａＣｏ２、Ｃｏｌｏ３２０、ＨＴ２９、ＬＳＴＲ）、膵臓癌（ＰＡＮＣ−１、ＣＡＰＡＮ−２、ＭｉａＰＡＣＡ、ＢｘＰＣ３）、食道癌（ＯＥ１９、ＯＥ３３）、急性骨髄性白血病（ＴＨＰ−１）の細胞株を、標準的な組織培養条件下で維持した。細胞表面タンパク質の破損を最小限にするため、腫瘍細胞はＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して取り除いた。
【０１９２】
フローサイトメトリー及び抗体９６ウェルプレートにて５０，０００個の細胞を対象とするフローサイトメトリーによる解析を行うため、剥離させた固体腫瘍細胞及び初代線維芽細胞、非接着性腫瘍細胞及びその他の初代細胞を準備した。細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１９、ＣＤ４１、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ８１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する市販の抗体とともにインキュベートした。自家作成したＡＴ１０−００２、抗ＣＤ３０、又はＡＴ１４−０１２は、未標識、ビオチン又はＡｌｅｘａ  ６４７標識のいずれかとした。標識されていない抗体及びビオチン標識抗体を、それぞれ抗ＩｇＧ−ＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）又は抗ストレプトアビジンＰｅＣｙ７（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により二次染色した。いくつかの実施形態では、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ１）を陽性対照抗体としてインキュベートした。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ａｎｄ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でサンプルを解析した。
【０１９３】
血小板活性化。クエン酸塩を入れた採血管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に健常なボランティアより採取した血液を８００ｇで１０分間遠心分離した。多血小板血漿画分（ＰＲＰ）の上部を回収し、血小板活性化試験に使用した。簡潔に記載すると、１０μＬのＰＲＰに１０μｇ／ｍＬの抗体、Ｆａｂ２フラグメント、又は陽性対照のトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＭＰ）を添加し、室温で２０分間インキュベートした。直接コンジュゲートさせた抗体（direct conjugated antibodies）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＣＤ４１及びＣＤ６２Ｐ／Ｐ−セレクチンの細胞表面発現についてサンプルをフローサイトメトリー（ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０，Ｂｄ）により解析した。刺激していない血小板において、ＣＤ９  ＨＩ９ａの発現を測定した。
【０１９４】
血小板凝集。健常なボランティアから、クエン酸塩を入れた採血管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に血液を採取した。３００μＬの全血を３００μＬのアッセイ緩衝液と混合し、３７℃で２分間加温した。陽性対照ペプチド又は抗体（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を添加し、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ  ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｃｏｂａｓ／Ｒｏｃｈｅ）を使用して時間内の血小板の凝集を測定した。
【０１９５】
マウス異種移植片。免疫不全マウスに、高濃度マトリゲル（High Concentration Matrigel）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、２００，０００〜５００，０００個のルシフェラーゼ／ＧＦＰ発現ＭｅｌＢＬＭ細胞を皮下移植した。ＡＴ１４−０１２又はＡＴ１０−００２対照抗体を１０ｍｇ／ｋｇでマウスに静脈投与した。抗体による処置は腫瘍注射日に開始する、あるいは腫瘍を３週間成長させた原発性の皮下腫瘍の増殖又は転移下腫瘍の成長をそれぞれ測定した。皮下腫瘍の成長は、ノギス、又はルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）の注射後フォトンイメージャー（Ｂｉｏｓｐａｃｅ  ｌａｂ）を使用するルシフェラーゼイメージングの両方で測定した。転移の存在は、実験の終了時に視認及びルシフェラーゼイメージングにより視覚化した。
【０１９６】
近年樹立された腫瘍細胞株。
黒色腫患者から腫瘍組織片を外科的に取り除き、分解し、培養した。標準的な組織培養条件下で細胞の増殖を維持した。膵臓癌患者より得られた腫瘍組織は、直接細胞株を樹立するには小さく、最初にＮＳＧマウスの皮膚下に移植される。増殖する腫瘍を回収し、分解し、標準的な組織培養条件下で維持する。ＥｐＣａｍの発現をもとに、ヒト腫瘍細胞及びマウス由来の腫瘍浸潤性線維芽細胞をフローサイトメーターによるセルソーティングにより分離した。
【０１９７】
結果
ＡＴ１４−０１２は広範な腫瘍反応性を有した。黒色腫細胞株ＭｅｌＢＬＭ及びＭｅｌＷＢＯに対する結合をもとにＡＴ１４−０１２を同定した。その後、ＡＴ１４−０１２は、試験したすべての黒色腫細胞株に対し結合反応性を示すことが判明した（図６ａ及び図７ａ）。比較的大部分の文献は、ＣＤ９は様々な固体腫瘍細胞で広範に発現しており、上方制御されていることを示す。この流れから、本発明者らはＡＴ１４−０１２が一連の大腸癌細胞株、食道癌細胞株、及び膵臓癌細胞株と反応することを見出した（図６ａ及び図７ｂ）。したがって、ＡＴ１４−０１２と相互作用しないことが判明した唯一の固体腫瘍細胞株は、ＣＤ９陰性Ｃｏｌｏ−３２０大腸癌細胞株である（図７ｂ）。程度（extend）は弱くなるものの、ＣＤ９は造血細胞でも発現していることが判明した。図６ｂ及び図６ｃにおいて、ＡＴ１４−０１２は、選ばれた数の急性骨髄性白血病細胞及び骨髄性白血病細胞と反応可能であることが示された（ＡＴ１４−０１２は、ＢＬ−００７、ＢＬ−００９、ＢＬ−０３７、ＢＬ−０５４、及びＢＬ−０５８に結合するようであるのに対し、ＢＬ−０１４、ＢＬ−０３０、及びＢＬ−０５５とは結合しない）。要するに、この結果から、ＡＴ１４−０１２は、黒色腫のみならず十分に広範な治療用途に有用であることが示される。
【０１９８】
ＡＴ１４−０１２は初代細胞よりも腫瘍に対して強力に結合する。現在臨床で固体癌の治療に使用されている治療用抗体のうち、主に腫瘍で発現する抗原を認識するものはない。しかしながら、これらの抗体の治療域は、抗原が健常細胞よりも腫瘍細胞で高発現する場合に示される。例えば、トラスツズマブ（ハーセプチン）は、ＨＥＲ２を過剰発現している乳癌の治療に使用される。同様にして、このＣＤ９は、広範な固体癌においてしばしばアップレギュレートされることが知られている。ＡＴ１４−０１２が、健常細胞よりも腫瘍細胞に対して強く反応する場合、ＡＴ１４−０１２はハーセプチン同様の治療条件下で使用され得る。更に、本発明者らは、ＡＴ１４−０１２が初代メラノサイトよりも黒色腫細胞に対し強く反応することを見出した（図７ａ；ＡＴ１４−０１２は、すべての黒色腫細胞株に結合する一方、初代線維芽細胞には結合しない。ＡＴ１４−０１２は、初代メラノサイトに結合するものの、ほとんどの黒色腫細胞株の場合と比較してその強度は弱い）。また、ＡＴ１４−０１２は、初代大腸上皮細胞よりも大腸癌細胞に対し強く反応する（図７ｂ；ＡＴ１４−０１２は、初代大腸上皮細胞（下側パネル）よりもＣａＣｏ２（上側パネル）に対して強く結合する）。最後に、ＡＴ１４−０１２は、初代へんとうＴ及びＢリンパ球よりも黒色腫ＭｅｌＢＬＭ細胞に結合することが判明した（図７ｃ；中央及び右側の列の下方のイメージは、ＡＴ１４−０１２のＭｅｌＢＬＭへの結合が、ＡＴ１４−０１２の全ＣＤ４  Ｔ細胞、全ＣＤ８  Ｔ細胞、及び全ＣＤ１９  Ｂ細胞に対する結合（中央及び右側の列上方のイメージ））よりも強力であることを示す。これらのデータにより、ＡＴ１４−０１２は現在固体腫瘍の抗体治療に用いられている臨床条件について有用であることが示される。
【０１９９】
ＡＴ１４−０１２は赤血球に結合し活性化するものの、凝集は誘導しない。これまでに、ＣＤ９は血小板で高発現していること、並びにＣＤ９を標的とする抗体は、血小板の活性化及び凝集を誘導する場合があり、これにより抗ＣＤ９抗体による治療を受けている患者では血栓症が誘導されるおそれがあることが報告されている。ＡＴ１４−０１２を単離した黒色腫患者は血栓症の症状を何ら示さなかったものの、本発明者らにはＡＴ１４−０１２がこの重篤な副作用を誘導しないことを保証する必要があった。
【０２００】
最初に、ＡＴ１４−０１２の血小板への結合を求めた。健常なボランティア由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）を市販の抗ＣＤ９抗体とともにインキュベートした、又はＡＴ１４−０１２で染色した。血小板の自己活性化に起因する、ＣＤ９の細胞表面発現におけるあらゆる差異を除外するため、血小板を固定した。文献から予想されたとおり、市販のＣＤ９  ＨＩ９ａ抗体は血小板に強く結合する（図８ａの下側のイメージ）。これに合致して、ＡＴ１４−０１２は、血小板とも強い相互作用を示した（図８ａの上側のイメージ）。
【０２０１】
次に、本発明者らは、血小板がＡＴ１４−０１２との相互作用により活性化されるかを評価した。Ｐ−セレクチン／ＣＤ６２Ｐの細胞表面のアップレギュレートにより示されるとおり、トロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）及び市販のＣＤ９抗体ＡＬＢ６のいずれもが血小板の活性化を刺激することが知られている。実際のところ、健常なボランティアに由来するＰＲＰをＴＲＡＰ又はＡＬＢ６とともにインキュベートしたところ、非刺激条件下及びＦＬＡＧ抗体に適合する無関係のＡＬＢ６アイソタイプと比較して、ＣＤ６２Ｐの表面誘導が示される（図８ｂ）。同様にして、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３の両方の組み換えフォーマットにおけるＡＴ１４−０１２、並びにもとのＢ細胞クローンの上清から精製した抗体は、血小板を活性化可能であった（図８ｂ）。
【０２０２】
最後に、ＡＴ１４−０１２が血小板の凝集を誘導するかを判定した。この判定のため、全血を、ＡＴ１０−００２抗体及びＡＴ１４−０１２抗体のＦａｂ２フラグメントの添加について前述したものと同じ刺激剤とともにインキュベートした。予測されたとおり、ＴＲＡＰペプチド及びＡＬＢ６抗体は血小板の強固な凝集を誘導した（図８ｃ）。市販のＣＤ９  ＡＬＢ６抗体とは対照的に、ＡＴ１４−０１２は、異なるいずれのフォーマット（Ｂ細胞上清（２Ｈ１５）から精製したＩｇＧ１、ＩｇＧ３、又はＦａｂ２フラグメント）においても血小板の凝集をトリガーしなかった（図８ｃ）。これにより結局のところ、ＡＴ１４−０１２は血小板に結合し、血小板を活性化するものの、ＡＴ１４−０１２と血小板との相互作用による血小板凝集は誘導されないことが示される。これらの発見は、ＡＴ１４−０１２ドナーでは血栓症の症状が何ら示されなかったという観察とも合致する。そのため、本発明者らは、ＡＴ１４−０１２は、重篤な副作用として血栓症を伴うことなく臨床使用することができるとして結論づける。
【０２０３】
ＡＴ１４−０１２は、原発性腫瘍及び二次性腫瘍の増殖を減弱させる。腫瘍の異種移植マウスモデルを作成して、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でのＡＴ１４−０２の抗腫瘍効果を求めた。免疫不全マウスは腫瘍の異種移植について好適なモデルである。
【０２０４】
マウスには、両側腹部に対し、マトリゲルで５００，０００個のルシフェラーゼ／ＧＦＰ発現ＭｅｌＢＬＭ細胞を皮下移植した。腫瘍を三週間増殖させた後、マウスには１０ｍｇ／ｍＬ  ＡＴ１４−０１２又は本発明者らの対照抗インフルエンザ抗体（ＡＴ１０−００２）を、１週間又は２週間にわたり週に２回（皮下腫瘍の大きさに応じ調整）静脈内注射した。腫瘍細胞の移植から４又は５週間後、マウスを屠殺し、体内の臓器を露出させた。ＡＴ１０−００２処理群において、４匹のマウスのうち３匹では大きなルシフェラーゼ陽性リンパ節がみられたことから、ＭｅｌＢＬＭ腫瘍細胞は、リンパ節に転移して二次腫瘍を形成し得ることが示される。際立って対照的に、ＡＴ１４−０１２抗体を投与した５匹のマウスのうち、リンパ節への転移の徴候を示したものはなかった（図９ａ）。これにより、ＡＴ１４−０１２は腫瘍の転移を阻害可能であることが実証される。
【０２０５】
追跡実験において、マウスには２００，０００個のＭｅｌＢＬＭ  ＧＦＰ／ルシフェラーゼ腫瘍細胞を両側腹部に投与した。このとき、抗体の注射は（２週間にわたり週に２回、マウスの体重１ｋｇ当たり抗体１０ｍｇ）は、腫瘍の移植と同時に開始した。皮下腫瘍の大きさは、週に２度ノギスにより測定した。図９ｂに示すとおり、腫瘍の増殖は、対照処理群と比較してＡＴ１４−０１２処理群において低下した。これにより、ＡＴ１４−０１２は腫瘍の増殖に対して悪影響を有することが示される。
【０２０６】
ＡＴ１４−０１２又はＡＴ１０−００２対照抗体で処理したマウスから回収したＭｅｌＢＬＭ皮下腫瘍を、ＡＴ１４−０１２抗体の結合の存在について免疫組織化学により試験した。腫瘍組織をパラフィン包埋させた後、それぞれ抗体ＡＴ１０−００２又はＡＴ１４−０１２の軽鎖を認識する、ＨＲＰ標識した抗λ又は抗κとともに、切片をインキュベートした。予想されるとおり、ＡＴ１０−００２抗インフルエンザ抗体（対照）は腫瘍組織には結合しなかったのに対し、ＡＴ１４−０１２は腫瘍組織の外側層に明確に結合し、かつより深い層への透過を示す（図９Ｃ）。ＡＴ１４−０１２抗体又はＡＴ１０−００２対照抗体で処理したマウスから回収したＭｅｌＢＬＭ皮下腫瘍細胞の単細胞消化物を、ＣＤ９抗体ＡＴ１４−０１２及びＨＩ９ａの結合について試験する。ＡＴ１４−０１２で処理したマウスから回収した腫瘍細胞は、ＡＴ１４−０１２及びＣＤ９  ＨＩ９ａの両方に関し、ＡＴ１０−００２処理したマウスから回収した腫瘍細胞と比較して結合の低下を示す（図９Ｄ）。両方の治療群由来の腫瘍細胞も抗ＩｇＧ抗体についての染色が陰性であることから、観察された効果は、注射されたＡＴ１４−０１２抗体によりＡＴ１４−０１２エピトープが予め専有されていたことに起因するものではない（図９Ｄ）。
【０２０７】
興味深いことに、ＡＴ１４−０１２の反復実験においても、皮下増殖しているＳＫ−ＭＥＬ−５黒色腫腫瘍の増殖を減退させ得る（図９Ｅ）。腫瘍の増殖阻害における影響は、腫瘍の重量を測定したときにより顕著である。ＡＴ１４−０１２処理した腫瘍は、ＡＴ１０−００２処理したマウスの対応する腫瘍と比較して明らかに重量が少ない（図９Ｆ）。ｅｘ  ｖｉｖｏで単離及び分解したＳＫ−ＭＥＬ−５腫瘍において、ＣＤ９の発現レベルを測定したとき、ＡＴ１４−０１２処理したＭｅｌＢＬＭ腫瘍で観察されるとおり、腫瘍細胞におけるＣＤ９レベルの低下が確認されたことには留意されたい（図９Ｇ）。
【０２０８】
ＡＴ１４−０１２は、最近の患者由来の黒色腫及び膵臓腫瘍細胞に結合する。ＡＴ１４−０１２は、樹立された広範な固体腫瘍細胞株を認識可能である（図６Ａ）。次に、ＡＴ１４−０１２結合反応性が、癌患者から最近単離された腫瘍サンプルにも適用可能であるかどうかを試験する。短期間培養した、患者由来の黒色腫細胞を、ＡＴ１４−０１２の結合について試験した。試験したすべての初代黒色腫サンプルにおいて、ＡＴ１４−０１２について陽性のシグナルが観察された（図１０Ａ〜Ｂ）。ＡＴ１４−０１２の結合及びＣＤ９の発現には強い相関が観察された（図１０Ｂ）。ＡＴ１４−０１２が由来する黒色腫患者より誘導された腫瘍細胞は、パネル中でＡＴ１４−０１２の結合が最も高いことには留意されたい。同様にして、患者由来の膵臓癌腫瘍細胞にＣＤ９抗体を結合させた。樹立した膵臓癌細胞株に対するＡＴ１４−０１２の有効な結合と一致して（図６Ａ）、ＡＴ１４−０１２は、試験した患者由来の膵臓癌細胞株の両方に対しても強い反応性を示す（図１０Ｃ）。
【０２０９】
ＡＴ１４−０１２の反応性は霊長類に限定される。概してテトラスパニン及び特にＣＤ９は、多数の細胞及び組織において広く発現しており、遠い種間においても進化的に保存されていることが示されている（Ｇａｒｃｉａ−Ｅｓｐａｎａ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８）。マウス、ウサギ、カニクイザル、及びヒトの血小板をＡＴ１４−０１２の結合について試験する。予想したとおり、ＣＤ９は、試験したすべての種の血小板で発現する。しかしながら、ＡＴ１４−０１２は、カニクイザル及びヒトの血小板とのみ反応し、マウス及びウサギに対する結合は観察されなかった（図１１Ａ〜Ｃ）。これらから、ＡＴ１４−０１２の反応性は霊長類に限定されることが示される。
【０２１０】
実施例４−補体及び抗体依存性細胞傷害
材料及び方法
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ
懸濁物又は接着している黒色腫細胞を抗体により室温で一時間半標識した。続いて、細胞をウサギ補体（Ｓ７７６４，Ｓｉｇｍａ）とともに３７℃で４５分間インキュベートした。懸濁物及び接着細胞のそれぞれについて、ＤＡＰＩ及びフローサイトメトリー（Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）又はＴｏＰＲＯ３及び顕微鏡観察（Ｏｐｅｒｅｔｔａ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により細胞死の割合をもとめる。
【０２１１】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
５１Ｃｒ標識した標的細胞を１０  ｇ抗体とともに３７℃で３０分間インキュベートする。ＣＤ３枯渇したＰＢＭＣを段階希釈し加えた後、更に４時間インキュベートする。Ｗａｌｌａｃカウンターを使用して、上清に放出された５１Ｃｒの存在をＬｕｍａＰｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で検出する。抗体を誘導した細胞溶解物についてプロットした値を５１Ｃｒの自然放出について補正する。
【０２１２】
結果
ＡＴ１４−０１２は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をトリガーする。ＡＴ１４−０１２が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により腫瘍細胞を殺傷する能力を保有しているかどうかを判定するべく、腫瘍細胞を放射性クロムで標識した後、抗体ＡＴ１４−０１２、陰性対照の抗体ＡＴ１０−００２（抗インフルエンザ）、又は陽性対照の抗体（セツキシマブ、抗ＥＧＦＲ１）とインキュベートした。ＰＢＭＣのエフェクター細胞／黒色腫標的細胞の比は異なっていた。培地中の死細胞からのクロムの放出をもとに、細胞死の割合を求めた。初代ヒト動脈上皮細胞（ＨＡＥＣ）を標的細胞として使用した場合、ＡＴ１４−０１２のＡＤＣＣによるＭｅｌＢＬＭ殺傷能力はセツキシマブに劣っているものの、観察された細胞死は最小限のものであった（図１２Ａ）。同時に、ＡＴ１４−０１２によるＡＤＣＣでの細胞の殺傷について、短期培養した、患者由来の初代黒色腫細胞を試験した。異なる黒色腫細胞間である程度の差異は観察されたものの、ＡＴ１４−０１２は、ＡＴ１０−００２対照抗体よりも高いＡＤＣＣ活性を示すことができた（図１２Ｂ）。これらにより、ＡＴ１４−０１２の抗腫瘍反応性は少なくともある程度ＡＤＣＣにより介在されることが示される。
【０２１３】
ＡＴ１４−０１２は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をトリガーする。補体介在性細胞傷害（ＣＤＣ）をトリガーする能力について、ＡＴ１４−０１２抗体のいくつかの多様体を試験した。２Ｈ１５は、もとのＡＴ１４−０１２不死化ＩｇＧ３  Ｂ細胞クローンより誘導された抗体である。ＩｇＧ１又はＩｇＧ３の両方を骨格にして、２Ｈ１５をベースにしたＡＴ１４−０１２組み換え抗体を産生した。更に、本発明者らは、ＦｃテールにＥ３４５Ｒ変異を含むＡＴ１４−０１２  ＩｇＧ１抗体の多様体を構築した。この変異は、特定の抗体とその標的に五量体を形成させることにより、補体介在性細胞傷害（ＣＤＣ）を効果的にトリガーすることが示されている（ｄｅ  Ｊｏｎｇ，ＰＬＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６）。
【０２１４】
ヒト血清の存在下で、黒色腫株懸濁物を様々なＡＴ１４−０１２多様体とともにインキュベートした後、細胞表面上のＣ１ｑの存在について試験した。予想されるとおり、ＡＴ１４−０１２五量体化多様体にはＣ１ｑの付着が観察された。更に、Ｃ１ｑの付着は、もとのＢ細胞クローンから精製した２Ｈ１５抗体及び組み換え体として産生されたＡＴ１４−０１２  ＩｇＧ３についてもみられた。ＩｇＧ１として作製したＡＴ１４−０１２はＣ１ｑに結合しなかったことには留意されたい［図１３Ａ、Ｂ］。ウサギ補体の存在下で、ＭｅｌＢＬＭ又はＳＫ−ＭＥＬ５懸濁物を、ＡＴ１０−００２対照抗インフルエンザ抗体又はＡＴ１４−０１２多様体のいずれかとインキュベートした。ＡＴ１４−０１２  ＩｇＧ１抗体は、抗インフルエンザ抗体（陰性対照）同様、細胞傷害を全く誘導しない［図１３Ｃ］。際立って対照的に、かつ既報の所見と合致して［ｄｅ  Ｊｏｎｇ，ＰＬＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６］、Ｅ３４５Ｒ変異の導入により、抗体はＣＤＣによる濃度依存性の細胞死を誘導する［図１３Ｃ］。これらの観察は、黒色腫細胞懸濁物及び接着している黒色腫細胞と比較可能である［図１３Ｃ，Ｄ］。ｇＧ３として作成した、対象とするＡＴ１４−０１２組み替え体（したがって、Ｅ３４５Ｒ変異は含まない）もＣＤＣをトリガー可能である［図１３Ｄ］。驚くべきことに、もとのＢ細胞の産生した２Ｈ１５抗体はＣ１ｑと結合するものの、補体介在性細胞死は誘導しない［図１３Ａ，Ｃ］。ＡＴ１４−０１２  Ｅ３４５Ｒは、ウサギ補体の存在下で、ＣＤＣにより効率的に腫瘍細胞を殺傷する。ＡＴ１４−０１２  Ｅ３４５Ｒは、ヒトＣ１ｑを細胞表面に引き付ける一方［図１３Ａ、Ｂ］、かかる抗体は、ヒト補体因子の存在下で、ＣＤＣ介在性の細胞死をトリガー不可能である［図１３Ｅ］。本発明者らは、ウサギ補体とヒト補体とで細胞殺傷が一致しないことは、補体調節タンパク質（ＣＲＰ）の発現に関連するものなのかどうかを調査した。Ｃ３転換酵素の形成の阻害剤であるＣＤ５５の発現を完全に欠損しているＣｏｌｏ−２０５では、ヒト血清の存在下で、抗体介在性のＣＤＣは可能であった［図１３Ｅ］。これにより、ＡＴ１４−０１２は、ＣＤ５５ブロッキング抗体と組み合わせたときに補体依存性細胞死を誘導可能であることが示唆される。
【０２１５】
実施例５−親和性の測定
材料及び方法
ＥＬＩＳＡ結合ＡＴ１４−０１２と市販の抗ＣＤ９抗体の比較
ＡＴ１４−０１２（ＩｇＧ１）及びヒトＡＴ１０−００２抗体（対照）の結合をＥＬＩＳＡフォーマットでアッセイし、市販の抗体ＡＬＢ６、ＨＩ９ａ、及び抗ＦＬＡＧマウス抗体（対照）（プレートに対するＣＤ９−３ｘＦＬＡＧ−ウサギＦｃ−Ｓｏｒｔ−ビオチンの検出用）、及び抗ＣＤ３  ＯＫＴ３（ムロモナブ）と比較した。ＥＬＩＳＡの設定は、上記ＣＤ９分子のビオチニル化量についてのアッセイと同様である。ＡＴ１４−０１２と同様、段階希釈して市販の抗体を添加した。市販の抗体はヤギ抗マウスＨＲＰ標識抗体（１：４０００，Ｊａｃｋｓｏｎ）で検出したのに対し、ヒト抗体は、ヤギ抗ヒトＨＲＰ標識抗体（１：４０００，Ｊａｃｋｓｏｎ）で検出した。よりよい方法で親和性の違いを比較するため、本発明者らは、ＣＤ９−３ｘＦＬＡＧ−ウサギＦｃ−ソルターゼ−ビオチンコートＳＰＲチップで抗体に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを行った。ＧｒａｐｈＰａｄ  ７．０ソフトウェアを使用してＥＣ５０値を計算した。
【０２１６】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性測定
ＡＩＭＭプローブ検出についての記載（下記参照）と同様の方法で抗ＣＤ９抗体の結合用のチップを作製した。ここで、ＡＴ１４−０１２（＋対照）の親和性は「古典的な」設定で測定し、チップは、各抗体の注入後に再生する。組み換え抗体を結合バッファ（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０＋０．０５％アジ化ナトリウム＋０．０１％  ＢＳＡ）に段階希釈してチップに注入し、ＩＢＩＳ  Ｍｘ９６装置で結合を解析した。各注入では複合体を注入し、８分間インキュベートした後、システムバッファ（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０＋０．０５％アジ化ナトリウム）で１２分間十分に洗浄し、解離を測定した。各被験抗体について、少なくとも３回注入を繰り返し、結合バッファを注入しないものを参照として使用した。それぞれの連続的な注入の後、チップは１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌで再生した。実験データは、ＳＰＲｉｎｔＸソフトウェア（ＩＢＩＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２ソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ）を使用して速度定数を求めた。
【０２１７】
ＣＤ９−ＥＣ２−３ｘＦＬＡＧ−ウサギ−Ｆｃ−ソルターゼ−ＨＩＳ（＋対照ＣＤ８１−ＥＣ２−３ｘＦＬＡＧ−ウサギ−Ｆｃ−ソルターゼＨＩＳ）のクローニング、発現、精製、及びソルターゼＡによる部位特異的ビオチニル化Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ｃｅｌｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ）を順応させ、かかる細胞を、シェーカープラットフォーム（１４０ｒｐｍ）に設置しベントキャップをした１２５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇフラスコにて、８％  ＣＯ２下、無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）で３７℃で一週間培養した。３ｘＦＬＡＧタグ（−ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ−）と、その後ろにウサギＩｇＧ１タンパク質（アミノ酸１０８〜３２２；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８７０）のＦｃ領域（ＣＨ２−ＣＨ３）とを融合させた、ＣＤ９配列の細胞外大型ループ２（アミノ酸１１２〜１９５；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２１９２６）を含むｐｃＤＮＡ３．４ベクターを使用して、一過性の遺伝子導入を行った。ＣＤ９と３ｘＦＬＡＧタグの間には−ＧＧＧＴ−リンカーを入れ、３ｘＦＬＡＧとウサギＦｃとの間には−ＧＳＳ−リンカーを入れた。ソルターゼＨＩＳタグ（−ＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨｓｔｏｐ）とＦｃ部位との間には−ＧＧＧＳ−リンカーを入れた。制限酵素のＮｃｏＩ及びＰｍｅＩ（ＮＥＢ）を使用して、インサートをｐｃＤＮＡ３．４ベクターにクローニングし、Ｑｉａｇｅｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｘｉキットによりＤＮＡの大量調製物を単離した。ＤＮＡ（３μｇのプラスミド）と、６μＬのＥｘｔｒｅｍｅＧｅｎｅ９（Ｓｉｇｍａ）のＯｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ）溶液とを、別々に１００μＬ  Ｏｐｔｉｍｅｍ中で１０分間インキュベートした。１００μＬのＯｐｔｉｍｅｍ−ＥｘｔｒｅｍｅＧｅｎｅ９溶液混合物を、１００μＬのＯｐｔｉｍｅｍ−ＤＮＡ混合物に添加し、更に３０分間インキュベートした後、０．５×１０６個／ｍＬの培養物３ｍＬに滴加した。２日後、培地には、更に２ｍＬの新鮮なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地を加えた。培養開始から５〜７日目に培地を回収し、以後の使用のため−８０℃のフリーザーに入れた。大量産生の必要がある場合には培養条件をスケールアップした。定量的ウサギＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用い、タンパク質産生を測定した。培地を解凍し、ろ過した後、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ）にて、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で５ｍＬのプロテインＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。安定なＵＶ２８０／２１５ｎｍのベースラインが得られるまで、ＰＢＳでカラムを予め平衡化した。サンプルのアプライ後、安定したＵＶ２８０／２１５ｎｍベースラインが維持されるまで、カラムの少なくとも５倍量のＰＢＳでカラムを再度洗浄した。結合したタンパク質を０．２Ｍグリシン＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ２．５）で溶出した。頂部のタンパク質画分を１：１０体積／体積量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ９．０）で中和した。各画分を合わせ、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラム（ＧＥ）にアプライした。単量体のピークを回収し、このタンパク質に適した吸光度／大きさ設定によりｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００システムで定量した。以後の使用のためタンパク質を分割し、短��保存のため−２０℃で保存した。ソルターゼＡの酵素反応によりＨＩＳタグが除去される分子に対しビオチン部分を酵素的に付加するモル比１０倍のＧＧＧ−ビオチンヌクレオフィルとともに、酵素ソルターゼＡ（調製についてはＷａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４を参照のこと）をモル比１：１で使用した。時折穏やかにボルテックスにかけながら、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）、及び２ｍＭ  ＣａＣｌ２で３７℃で４時間反応させた。１ｍＭ  ＥＤＴＡで反応を停止させた。ビオチニル化したＣＤ９タンパク質、並びにより小さな成分（遊離のＧＧＧ−ビオチンヌクレオフィル及び遊離のＨＩＳタグ）を、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １６／６０カラムでソルターゼＡから分離した。頂部の画分を回収した。ビオチニル化量はＥＬＩＳＡにより確認した。簡潔に記載すると、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンにより、９６ウェルの高結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）をコートした。ビオチニル化ＣＤ９を、１０μｇ／ｍＬの初期濃度からＰＢＳ＋２．５％  ＢＳＡで二段階希釈（serial two-step dilution）してウェルに注入し、１時間置いた。同様にして、ＰＢＳＴ＋２．５％  ＢＳＡ中、１時間で最適なシグナルを評価するため、グリッドが見えるようにＡＴ１４−０１２を段階希釈して添加した。ＰＢＳＴ＋２．５％  ＢＳＡ中、ヤギ抗ヒトＨＲＰ標識抗体（１：４０００希釈，Ｊａｃｋｓｏｎ）をインキュベートしてＡＴ１４−０１２を検出し、ＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２酸性溶液により現像（developed）した。１Ｍ  Ｈ２Ｓ０４を使用して反応を停止させ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで４５０ｎＭで測定した。タンパク質を十分にビオチニル化した。最適濃度は２．５〜５μｇ／ｍＬであった。ＣＤ９のコード領域をＣＤ８１のＥＣ２コード領域（アミノ酸１１３〜２０１；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ６００３３）で置き換えた、対照タンパク質ＣＤ８１−ＥＣ２−３ｘＦＬＡＧ−ウサギ−Ｆｃ−ソルターゼ−ＨＩＳにも上記のすべての工程を繰り返した。抗ＣＤ８１抗体クローンＪＳ８１（ＢＤ）を使用するするＥＬＩＳＡにより、このタンパク質の完全性（integrity）及びビオチニル化を確認し、ヤギ抗マウスＨＲＰ標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）で検出した。
【０２１８】
ＥＬＩＳＡにおいて可溶性ＣＤ９−ＥＣ２−ＦＬＡＧ−ｒａｂｂｉｔ−Ｆｃタンパク質を用いるＡＴ１４−０１２のエピトープマッピング
領域ｍ４（アミノ酸１６９〜１８０）のアラニン変異体を、上記のｐｃＤＮＡ３．４ベクターにクローニングした。タンパク質を小規模（３ｍＬ）で発現させ、ウサギＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを用い定量した。ＡＴ１４−０１２、ＡＬＢ６、及びＨＩ９ａの結合を評価するため、本発明者らは、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）で終夜コーティングした。未精製の無血清上清を、ＰＢＳＴ＋２．５％  ＢＳＡ中１μｇ／ｍＬのＦＬＡＧ抗体と１時間結合させた。洗浄後、捕捉したＣＤ９−ＦＬＡＧ−ウサギ−Ｆｃ−ソルターゼＨＩＳ分子に、ランダムにビオチニル化したＨＩ９ａ、ＡＬＢ６、及びＡＴ１４−０１２を結合させた。結合した抗体は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：１０．０００希釈，Ｔｈｅｒｍｏ）で検出した。上記のとおりＥＬＩＳＡを展開（developed）した。抗体のランダムビオチニル化は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して実施した。精製した抗体のＰＢＳ溶液を、モル比１０倍のビオチン標識と室温で３０分間インキュベートした。分子ふるいにより反応を停止した。ＰＢＳで予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラムにサンプルをアプライ（１ｍｇ／ｍＬで１ｍＬ）することで、ビオチニル化抗体を未結合の標識から分離した。
【０２１９】
ｍ４環状ペプチドの作成。
ＣＤ９のｍ４領域（１６７−ＰＫＫＤＶＬＥＴＦＴＶＫＳ−１８０）をｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｌａｂにより合成し、アセトニトリル勾配を用いるＬＣＭＳで解析し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。ペプチドを完全に凍結乾燥した。このペプチドには、システインノット（ＣＤ８１の結晶構造を参照）が形成する間隔を模倣するための追加の２つのセリンと、それに続いて、ペプチドを円形にする２つのシステインとを隣接させた。検出又は捕捉を目的として、Ｎ末端には、１つのＰＥＧ２基ビオチン−ＰＥＧ（２）−ＣＳＰＫＫＤＶＬＥＴＦＴＶＫＳＳＣ（システインが連結される）を間においてビオチン部分を配置した。
【０２２０】
結果
ＡＴ１４−０１２は中程度に親和性のある抗体である。最初に、ＡＴ１４−０１２の重鎖（４つのアミノ酸を置換）及び軽鎖（３つのアミノ酸を置換）にもたらされる超変異の量では、免疫系は、患者において、可変ドメインの配列に更に超変異をもたらすのに適切な負荷を受けなかったことが示される。第２に、本発明者らは、他社によりこれまでに開発された市販の抗体は血小板凝集を誘導したのに対し、ＡＴ１４−０１２は血小板の凝集を誘導しなかったことを示すことができた。また、患者は血栓症状又は血小板減少症状（抗体の介在する血小板の破壊又は凝集に起因する、血小板数の低下）を全く発症せず、未診断の問題を解決する何らかの薬剤による治療を受けなかった。ＡＴ１４−０１２の低親和性が、最適な血小板表現系をもたらす抗ＣＤ９抗体の「タイプ」に関係する特性に役立つものであるのか、あるいはＡＴ１４−０１２が標的とするＣＤ９（ｍ４）上の固有のエピトープを使用することで、血小板の状態が最適な非凝集的なものになるのかは主な疑問である。一般的に使用されている市販のマウス抗ＣＤ９抗体との結合親和性の違いを評価するため、組み換え体として発現させた、ＣＤ９の第２の細胞外ループ（ＥＣ２）を使用して、ＥＬＩＳＡでＡＴ１４−０１２の結合を試験した。本発明者らは、これまでに試験したすべての抗ＣＤ９抗体のエピトープはＥＣ２ループに存在していることを明らかにしていた（図５）。ヒトとマウス（市販）抗体とで、２つのＥＬＩＳＡの設定は異なっているものの（異なる二次抗体により検出）、本発明者らは、ＡＴ１４−０１２のＥＣ５０（ＥＣ５０は約２５０ｎｇ／ｍＬ）は、市販のＨＩ９ａ（ＥＣ５０は約２０ｎｇ／ｍＬ）及びＡＬＢ６（ＥＣ５０は約１３ｎｇ／ｍＬ）と比較して有意に低いと推定することができた。ＡＴ１４−０１２の親和性を市販の抗体の親和性と比較して良好に推定するため、本発明者らは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用する無標識検出法を用いた。ＣＤ９層を作成したＳＰＲチップに３回に分けて注入を行った。この設定におけるＡＴ１４−０１２の親和性の平均はｎＭの範囲（約４４ｎＭ）であり、市販の抗体の親和性の平均は、ＡＬＢ６では約１４５ｐＭ、及びＨＩ９ａでは約２．３３ｐＭであった（図１６）。ＡＴ１４−０１２について測定された解離速度はＨＩ９ａと比較して７００倍も速かった。これは、ＡＴ１４−０１２はＣＤ９から極めて容易に解離し得ることを意味する。ＨＩ９ａは、解離速度（ｋｄ）が低いことにより、親和性が約１９，０００倍も高かった。ＡＴ１４−０１２について明らかになった結果を受け、本発明者らは、ＨＩ９ａ又はＡＬＢ６の長期解離時間については試験しなかった。ＡＬＢ６は結合後にもゆっくりと解離可能であり（ＨＩ９ａと比較して解離は約２２倍多い）、ＨＩ９ａと比較してある程度劣るものの尚も非常に高い親和性に寄与した。
【０２２１】
組み換え体として発現させたＣＤ９−ＥＣ２  ｍ４アラニン変異体を使用することによる、Ａｔ１４−０１２のエピトープの確認。抗ＣＤ９抗体を、ＦＬＡＧ−タグで捕捉したＣＤ９−ＥＣ２−３ｘＦＬＡＧ−ウサギＦｃタンパク質に対しインキュベートすることにより、ＥＬＩＳＡ設定を使用して、ランダムビオチニル化エピトープを更に詳細に調査した。材料及び方法に記載のとおり、アラニン変異体（図５に記載するとおり、アミノ酸Ｋ１６９Ａ〜Ｓ１８０Ａ）をクローニングし、発現させた。アラニン変異体を位置Ｋ１６９Ａ、Ｄ１７１Ａ、Ｌ１７３Ａ、Ｆ１７６Ａに作製した場合、ＡＴ１４−０１２の結合は完全に消失し、Ｖ１７２Ａに関しては結合の有意な低下を観察することができる（図１７Ａ）。これはこれまでのＦＡＣＳデータとも合致する（図５）。ＡＬＢ６は、Ｆ１７６Ａ変異体については、これまでに観察されたとおり結合の低下を示した。ＨＩ９ａは、いずれの変異体についても反応性を全く失なわず、ＥＬＩＳＡプレート上のＣＤ９タンパク質の存在についての内部標準となる。したがって、本発明者らは、ＨＩ９ａのエピトープはｍ３又はｍ４には存在せず、あるいは、ＨＩ９ａの親和性はこのＳＰＲ設定において値が有意に高いことから、単一のアラニン変異ではこれらの領域は破壊されないと結論づけることができる。ＣＤ９について構成した相同性に対しエピトープをマッピングしたところ（図１７Ｂ、赤色でハイライト）、かかるタンパク質の細胞外部分の縁部に位置した。ＦＡＣｓによるｍ３のアラニンスキャンでは、ＡＴ１４−０１２の結合性の低下は全く観察されず、本発明者らは、ＥＬＩＳＡ又はＳＰＲでは、環状に構成されたｍ４ペプチドに対する結合を示すことができなかった（データ非掲載）。したがって、本発明者らは、ｍ４領域の適切な折りたたみは、ＡＴ１４−０１２のエピトープを構造上直線的なものにする他のＣＤ９領域（ｍ３及びｍ５）により強く影響を受けるものと仮定する。エピトープマッピングのデータを更に詳細に確認し、ＣＤ９エピトープ並びにＡＴ１４−０１２パラトープに対する各単一のアミノ酸の関与を評価するには、共結晶が必要とされる。ＡＴ１４−０１２を、カニクイザル細胞、マウス細胞、及びウサギ細胞などの様々な種に対し結合させて、エピトープマッピングデータを更に確認した（図１１）。ＡＴ１４−０１２は、カニクイザル細胞と反応可能であったのに対し、ウサギ細胞又はマウス細胞に対する結合についてアッセイした場合には結合はなかった。ＡＴ１４−０１２のエピトープに関係する５つの残基を図１７Ｃにアラインメントする（暗い／赤色でハイライト）。ウサギ及びマウスＣＤ９のｍ４配列について観察されたとおり、あまりに多くの残基を変化させると、明らかにＡＴ１４−０１２結合は失われた。おそらく、領域ｍ４におけるウサギ変異Ｖ１７２Ｉ、Ｔ１７５Ｓ、Ｆ１７６Ｉ及びＴ１７７Ｑ）及びマウス変異（Ｄ１７２Ｑ、Ｖ１７２Ｌ、Ｔ１７５Ｓ及びＴ１７７Ｑ）により、ＡＴ１４−０１２エピトープの主要な立体構造的な変化又はシフトが生じており、このような変化又はシフトにより、ＡＴ１４−０１２結合の低下の説明がつくであろう。ちなみに、Ｆ１７６Ｌ変異のみでは、カニクイザル細胞に対する���Ｔ１４−０１２の結合の低下は誘導されない（図１７Ｃ）。
【０２２２】
実施例６−ＡＴ１４−０１２の親和性の改良
材料及び方法
単一細胞として選別した２Ｈ１５Ｂ細胞と、ＳＰＲとを使用して、ＡＴ１４−０１２の親和性を改良する
適切な培養条件で、約２０×３８４ウェルプレート内でＢＤ  ＦＡＣｓ  ＡＲＩＡ  ＩＩＩを使用して、同定したＡＴ１４−０１２の親Ｂ細胞クローン（２Ｈ１５；ＩｇＧ３）に対し単一細胞の選別を行った。Ｂｃｌ６／Ｂｃｌ−ｘＬ導入ＧＦＰ陽性細胞を観察するＯｐｅｒｅｔｔａ共焦点機器（Ｐｅｒｋｉｎｇ  Ｅｌｍｅｒ）により、Ｂ細胞の増殖（約７０％）をモニタした。陽性シグナルのあるウェルを新しい９６ウェルプレート（全部で８プレート）に移し、１〜２週間培養した後、上清を９６ウェルＰＣＲプレートに回収し（１００μＬ）、ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０＋０．０５％アジ化ナトリウムにより１：１希釈し、以後使用するまで密閉して−８０℃のフリーザーで凍結した。もとの２Ｈ１５クローンの上清と、ＣＤ９又はＣＤ８１に結合しなかった抗ＨＲＶクローンの対照ＩｇＧ３  Ｂ細胞の上清とに２つのウェルを割り付けた。ＩＢＩＳ  Ｍｘ９６装置（ＩＢＩＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＳＰＲを実施した。ＣＦＭマイクロ流体スポッタデバイス（Ｗａｓａｔｃｈ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して、ストレプトアビジンで予めコートしたＳＰＲチップ（Ｇ−ＳＴＲＥＰ  Ｈ８２５−０６５（Ｓｅｎｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にタンパク質を固定した。ビオチニル化抗ヒトＣＨ１ナノボディ（Ｔｈｅｒｍｏ）及びビオチニル化完全長抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を、定量的（ＩｇＧ濃度を評価する）及び定性的（ＩｇＧ強度）測定のため、様々な濃度でスポットした。ＣＤ９−及びＣＤ８１−３ｘＦＬＡＧ−ウサギＦｃ−ソルターゼ−ビオチンも様々な濃度でスポットして、ＡＴ１４−０１２（ＩｇＧ１）の組み換え抗体の段階希釈に対しＣＤ９の結合を評価した。スポットした同量のＣＤ９及びＣＤ８１を比較できることから、すべてのスポットについて結合を評価した。前述のＩＢＩＳ表面プラズモン共鳴イメージャーを使用してＩｇＧの結合をモニタし、各濃度の注入を行った後、チップを１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌで再生した。プレート毎の注入の全量の詳細は次のとおりのものとした：（１）ＰＢＳＴを２回注入してベースラインを取得、（２）抗ウサギを１回注入してＣＤ９及びＣＤ８１がチップ上に存在しており、かつ過剰なストリッピング（extensive stripping）に起因した経時的分解／使用による分解がないことを確認、（３）ＰＢＳＴを１回注入、（４）ＡＴ１４−０１２  ＩｇＧ１組み換え体を段階希釈することにより、ＩｇＧ濃度並びにＣＤ９の結合（結合の対照としてＣＤ８１）についてＲＵを測定−タンパク質１．３３−４．０−１３．３０−４０．０−１３３．０ｎＭ、（５）Ｂ細胞上清を２列（Ａ１〜Ａ１２、及びＢ１〜Ｂ１２）、（６）ＡＴ１４−０１２  ＩｇＧ１組み換え体を１回注入、（７）Ｂ細胞上清を２列（Ｃ１〜Ｃ１２及びＤ１〜Ｄ１２）、（８）ＡＴ１４−０１２  ＩｇＧ１組み換え体を１回注入、（９）ＰＢＳＴを１回注入、（１０）Ｂ細胞上清を２列（Ｅ１〜Ｅ１２及びＦ１〜Ｆ１２）、（１１）ＡＴ１４−０１２  ＩｇＧ１組み換え体を１回注入、（１２）プレートに応じて、ウェルを犠牲にして対照Ｂ細胞の上清を誘導（ＩｇＧ３  ＨＲＶクローンプレート１＝Ｇ１、プレート２＝Ｇ２など）、（１３）Ｂ細胞上清を一列（プレート番号に応じてＧＸ？〜ＧＸ？）、（１４）プレートに応じて、ウェルを犠牲にして対照Ｂ細胞の上清を誘導（２Ｈ１５；ＩｇＧ３親クローン、プレート１＝Ｇ１、プレート２＝Ｇ２など）、（１５）Ｂ細胞上清を一列（プレート番号に応じてＨ  Ｘ？〜Ｈ  Ｘ？）、（１６）ＡＴ１４−０１２  ＩｇＧ１組み換え体を１回注入、（１７）ＡＴ１４−０１２  ＩｇＧ１組み換え体の段階希釈により、ＩｇＧ濃度並びにＣＤ９の結合（結合の対照としてＣＤ８１）についてＲＵを測定し［タンパク質１．３３−４．０−１３．３０−４０．０−１３３．０ｎＭ］、測定の開始時及び終了後のＲＵの差を確認、（１８）抗ウサギを１回注入し、ＣＤ９及びＣＤ８１がチップ上に存在しており、かつ過剰なストリッピングに起因した経時的分解／使用による分解がないことを確認、（１９）ＰＢＳＴを最後に１回注入。合計して１１７の注入と、８分間の会合時間及び８分間の脱離時間（プレート毎に約５０時間の合計実行時間となる）で対照（ＰＢＳＴ及び組み換えＡＴ１４−０１２  ＩｇＧ１）の確認をした。ＳＰＲｉｎｔＸソフトウェア（ＩＢＩＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でデータを処理した。Ｂ細胞のサブクローンＲＮＡの単離、ｃＤＮＡ増幅、及び配列決定位は前述のとおり実施した（Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０２２３】
ＡＴ１４−０１２高親和性変異体の発現及び解析
培地を２〜３日おきに新しくして、ＣＨＯ１−ＫＳＶ細胞株をＣＤ  ＣＨＯ培地で一週間培養した。細胞には、野生型ＡＴ１４−０１２を含む、記載の一重変異体（Ｈ４０Ｙ、Ｙ１１２Ｆ、Ｄ１１６Ｈ、及びＴ２９Ｎ）、二重変異体の組み合わせ（Ｈ４０Ｙ／Ｙ１１２Ｆ、及びＤ１１６Ｈ／Ｔ２９Ｎ）、並びに四重変異体の組み合わせ（Ｈ４０Ｙ／Ｙ１１２Ｆ／Ｄ１１６Ｈ／Ｔ２９Ｎ）、並びにＣＤ９の結合を示さない対照変異（Ｇ１１０Ｄ）を一過性に発現させた（出典：Ｒａｊｅｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。簡潔に記載すると、４．０×１０６個／ｍＬ（１０ｍＬ）の細胞を、０．２５％  ＤＭＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加したＣＤ  ＣＨＯ培地に入れた。培養物には、３．２μｇ／ｍＬ  ＤＮＡ（重鎖及び軽鎖を発現するｐＸＣ３９ベクター）と、続いてＰＥＩｍａｘ（Ｓｉｇｍａ）とを添加した。２日後、１０ｍＬの新鮮な培地を供給した。７日後に培地を回収し、ＩｇＧ定量ＥＬＩＳＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いＩｇＧ発現を定量した。ＭｅｌＷＢＯ培養細胞に対する結合について、細胞培養上清を、ＡＩＭＭプローブ法に使用するものと同じＳＰＲチップ設定を使用してＦＡＣＳ及び類似の方法により試験した（別の場所を参照のこと）。Ｓｅａｖｉｅｗソフトウェア（Ｇｏｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を使用してアラインメントを行った。
【０２２４】
結果
ＳＰＲを使用することによる高親和性ＡＴ１４−０１２多様体の開発。上記のとおり、ＡＴ１４−０１２抗体の開発にまつわる主要な関心事（main question）は、高親和性の多様体（ＡＬＢ６と同等の親和性）が血小板の凝集を導くかというものであった。あるいは、親和性が何らかの差異をもたらすかかる固有のエピトープを、ＡＴ１４−０１２は標的にするのかという疑問がある。ＡＩＤとしても知られる活性化誘導シチジンデアミナーゼは、不死化させたＢ細胞レパートリーにおいても発現し、活性がある。ＡＩＤの発現により、増殖停止及び細胞死をもたらす遺伝的不安定性は生じず、播種したウェルのうち６３％は、堅調な発現を示した（Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。したがって、ＡＩＤは、尚も無作為に、又は好ましくは変異の生じやすい場所に変異を誘導可能である。高親和性の抗体／抗原結合をもたらす変異を同定する１つのアプローチには、蛍光標識した可溶性ＣＤ９タンパク質に結合する単一のＢ細胞を選別し、ＩｇＧ発現について比較するというものがある。簡潔に記載すると、本発明者らは、単量体形態、三量体形態（ストレプトアビジン−ＰＥを使用する）又は多量体形態（ＰＥ標識デキストラマー）のいずれの形態において、可溶性ＣＤ９を２Ｈ１５Ｂ細胞に結合させる任意の設定を発見できなかった（データ非掲載）。これはおそらく、２Ｈ１５のＢ細胞受容体の、Ｂ細胞そのものの表面上に発現しているＣＤ９へのｃｉｓタイプの結合によるものである。したがって、本発明者らは、もとの２Ｈ１５  Ｂ細胞の単細胞の選別には同様の設定を使用し、但し今度は、産生されたＩｇＧの組み換えＣＤ９−ＥＣ２タンパク質に対する結合をＳＰＲ（ＡＴ１４−０１２親和性の測定に使用したＣＤ９に類似するタンパク質）において試験した。単一の２Ｈ１５  Ｂ細胞は、特に、変異が結合を増強させるかどうかを試験するのに十分な量のＩｇＧを産生可能である。最初に、本発明者らは、２Ｈ１５を大量培養した上清中のＩｇＧを使用する最適なＳＰＲ設定について試験し、組み換えＡＴ１４−０１２の濃度の上昇を対照と比較した（図１８Ａ）。２Ｈ１５  ＩｇＧの適切な会合及び解離の検証後、本発明者らは、Ｂ細胞上清において観察されるＩｇＧ濃度及び完全性が、適切に求められたＩｇＧ濃度下での、精製したＡＴ１４−０１２組み換え体の結合に関連し得るものであった設定を使用した（図１８Ａを参照のこと）。抗ヒトＦｃ及び抗ＣＨ１に対する結合の比により、濃度と、抗体の安定産生との間に良好な相関が示された。抗ヒトＦｃのＳＰＲ曲線は線形に増加したのに対し、抗ＣＨ１のＳＰＲ曲線は対数的に増加した。本発明者らは、８枚の９６ウェルプレートの評価（約８００クローン）及び約４００時間のＳＰＲ実施時間後に、結合パターンの増強された、あるいは変更された１３個のクローンを同定することができた（元データは非掲載）。これらのクローンを培養し、新しく作製したＳＰＲチップで再度評価した（図１８Ｂ）。
【０２２５】
当初の１３個のクローンのうちわずか８つのみが尚も結合の有意な増強を示した。異なる３群を設定した。第１群は、会合が速く、解離は遅かった（クローン１Ｄ５、１Ｆ５、４Ｈ１０、１０Ｂ９、及び１０Ｄ１）。第２群は、会合が速かっただけでなく、解離も速かった（クローン２Ｄ１２、４Ｄ４、６Ｅ１０、及び９Ｅ５）。そして、第３群は、何ら差異を示さなかった（クローン１Ｃ９、２Ｈ１０、９Ａ９、及び９Ｄ１２）。高親和性クローンの結合の増強についても、２つの異なる黒色腫細胞株で試験し、検出した（データ非掲載）。再度、第１群のクローンは、ＦＡＣｓにおいて最良の細胞集団シフトを示した。クローン重鎖における１つの単一変異により、ＳＰＲにおける及び細胞に対する結合パターンが増強する（図１８Ｃを参照のこと）。驚くべきことに、クローンのうち４Ｄ４のみが、軽鎖変異を有しており、かつ重鎖には変異を有していなかった。本発明者らはまた、ＩｇＧの発現を示したもののＣＤ９には結合しなかったいくつかのクローンを評価した（「ｄｉｓＰＲＯＶＥ」と呼ばれる，クローン１Ｅ３、１Ｅ４、１Ｅ５、１Ｆ１２、２Ａ３、及び５Ｂ１）。また、本発明者らは、解析した全８００のクローンのうち、一致する結合パターンを示したいくつかのクローン（１Ｇ２、１Ｇ３、１Ｇ４、及び１Ｇ５）を含めた。これらのクローンは最も生殖系列様のものであったことが確立された（図１８Ｃ）。最も重要な変異はＨ４０Ｙ（４ｘ）及びＹ１１２Ｆ（１ｘ）（第１群）並びにＤ１１６Ｈ（２ｘ）及びＴ２９Ｎ（１ｘ）（第２群）であった。他のクローンが重鎖に同じ変異を有しておりかつＣＤ９親和性が同等であったことから、いずれも軽鎖に位置するものであるＬ１２０Ｖ変異（クローン４Ｈ１０）及びＳ２８Ｎ（クローン９Ｅ５）は省略した。
【０２２６】
組み換え体ＡＴ１４−０１２バックグラウンドの高親和性変異体及びそれらの組み合わせの評価。高親和性変異を、ＣＨＯ細胞において一重、二重、又は四重変異体として一過性発現させた（位置及びアラインメントについては、図１９Ａを参照のこと）。野生型ＡＴ１４−０１２、及びＣＤ９への結合が消失している変異体Ｇ１１０Ｄを対照として一緒に用いた。ＳＤＳ−ｐａｇｅ及びウェスタンブロットにより、完全性及び分解産物について抗体をアッセイした。抗体をウサギ抗ヒトＩｇＧ重鎖／軽鎖抗体で検出したとき、明確な異常性は検出されなかった（データ非掲載）。産生上清を段階希釈して使用して黒色腫細胞に使用して、ＣＤ９の細胞表面結合に対する結合を評価した（図１９Ｂ）。ＣＤ９への結合を欠損しているＧ１１０Ｄ変異は、ＣＤ９に対する結合に正真正銘干渉する。Ｔ２９Ｎは、結合の改良に対し、Ｂ細胞の上清の選別について観察されたような目立った影響は有しなかった。Ｄ１１６Ｈは、予想されるとおりの結合の改良を示す。これらの２群の２つの変異体の組み合わせは、単一のＤ１１６Ｈの結合と比較してより強いシグナルをもたらすものではなかった。更に、この結果から、組み換え体ではＴ２９Ｎ変異体の影響がなかったことの説明がつく。幸運なことに、第１群の変異体の結合は、すべての一重変異体の中で最も影響を有するＨ４０Ｙで有意に増大した。二重の第１群変異体（Ｈ４０Ｙ／Ｙ１１２Ｆ）については、その効果は更に増強される。四重多様体は、二重の第１群変異体と比べて有益な効果を全く示さなかった。野生型ＡＴ１４−０１２（図７Ａ）に関して観察される結合パターンと合致して、高親和性の多様体は、短期間培養した健常なメラノサイトよりも黒色腫細胞に対する結合の増強を示す（図１９Ｃ）。ＣＤ９  ＳＰＲ設定を使用して、正確な結合プロファイルを得た（図１９Ｄ）。会合定数及び解離定数の全体像をもって、より強力な結合への関与が良好に説明された（図１９Ｅ）。Ｔ２９Ｎを除いたすべての一重変異体が結合親和性の増強に働いた。Ｈ４０Ｙ変異体は、１００倍の増強を示し、Ｙ１１２Ｆに関しては５０倍、Ｄ１１６Ｈに関しては１０倍の増強を示した。第１群の変異を組み合わせると、野生型ＡＴ１４−０１２と比較して親和性が２５０倍も高くなった（約２２０ｐＭ）。驚くべきことに、四重変異体は、第１群二重変異体と比較して二倍弱（約４５５ｐＭ）であった。これにより抗体は、ＡＬＢ６の親和性に匹敵する範囲の親和性を有するようになる。このマウス抗ＣＤ９抗体は血小板の凝集を誘導し、血小板凝集アッセイにおいて陽性対照として使用されることが知られている。ここでは、相当の結合親和性を有するため、血小板の凝集が親和性に関連するか、又はエピトープに関連するものであるかの疑問に回答する。
【０２２７】
親和性が向上したＡＴ１４−０１２変異体は血小板を凝集しない。文献どおり、本発明者らは、市販の抗ＣＤ９抗体であるＡＬＢ６抗体は血小板の凝集を誘導することを観察した。際立って対照的に、全血を抗ＣＤ９抗体ＡＴ１４−０１２とインキュベートしても血小板の凝集は生じない。重要なことに、高親和性の変異体を本発明者らの血小板凝集アッセイで試験した場合、ＡＴ１４−０１２親和性の改良された多様体のうち血小板の凝集を誘導し得るものはなかった（図２０）。かかるアッセイには、血小板凝集の陽性対照としてＡＬＢ６抗体を含めた。第１群変異体を二重に有する場合の親和性は、ＡＬＢ６抗体の親和性とおおよそ等しい（図１６Ｃ）。これにより、ＡＴ１４−０１２の親和性は、血小板凝集が非存在であることには関係せず、むしろＣＤ９上の固有のエピトープの認識こそが重要な特徴であることが示される。
【０２２８】
実施例７−ＩｇＧアイソタイプ及びアロタイプ
材料及び方法
患者由来の腫瘍試料及び癌細胞株をもとにしたＣＤ９のオープンリーディングフレームの配列決定
簡潔に記載すると、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用してｍＲＮＡを単離し、ランダムプライマーを使用してｃＤＮＡの増幅を行った。Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８に記載のＣＤ９特異的プライマーを使用してＰＣＲによりＣＤ９を増幅した。短期培養した２つの原発性腫瘍試料源（ＡＴ１４−０１２が由来）の凍結細胞のペレットからＣＤ９配列を解析した。皮膚の病巣に由来するものはＭｅｌ０５．１８と表記し、脳の病巣に由来するものはＭｅｌ０６．０７と表記した。その他の黒色腫患者に由来しともにＡＴ１４−０１２の結合が陽性である、その他の短期培養した２つの原発性腫瘍試料を対照とした。更に、黒色腫細胞株のＭｅｌＢＬＭ、ＭｅｌＷＢＯ、Ａ３７５、及びＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株（ＣＤ９の結合は陰性）、並びにＡＭＬ細胞株ＨＬ−６０を使用し、ＣＤ９の配列を評価した。Ｂ細胞クローンの２Ｈ１５及びＩｇＧ３抗ＨＲＶ  Ｂ細胞クローンも解析した。ＰＣＲ産物そのものに対し配列決定を行った（ＣＤ９−ｆｗ  ５’−ＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡ−３’及びＣＤ９−ｒｅｖ  ５’−ＣＴＣＡＧＧＧＡＴＧＴＡＡＧＣＴＧＡＣＴ−３’）。
【０２２９】
ＩｇＧ３  ２Ｈ１５アロタイプの配列決定
Ｔｒｉｚｏｌ法（Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を用いＲＮＡを単離して、２Ｈ１５  Ｂ細胞クローンのＩｇＧ３定常領域を決定した。ｃＤＮＡはランダムプライマーを使用して作製した。ＣＨ１フォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣ−３’）及びＣＨ３リバースプライマー（５’−ＴＣＡＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧ−３’）を使用して、ＰＣＲ反応を実施した。プライマーは、ＩＭＧＴウェブサイトでみられるヒトＩｇＧ３配列をもとに作製した。
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎｓ／ａｌｌｅｌｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝Ｈｏｍｏ％２０ｓａｐｉｅｎｓ＆ｇｒｏｕｐ＝ＩＧＨＣ＆ｇｅｎｅ＝ＩＧＨＧ３）。ＰＣＲ産物そのもの（ｆｗ及びｒｅｖ）に対し配列決定を行い、Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４によりアロタイプを決定した。
【０２３０】
患者のＢ細胞レパートリーに由来するＡＴ１４−０１２  ＩｇＧ特異的重鎖及び軽鎖の配列決定
Ｂ細胞の選別時に患者の全Ｂ細胞レパートリーについて単離したＲＮＡプールをもとに構築したｃＤＮＡから、ＡＴ１４−０１２の様々な重鎖及び軽鎖を別々に増幅した。Ｔｒｉｚｏｌ法によりＲＮＡを単離し、既報の方法によりｃＤＮＡを作製した（Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。最初に、重鎖を増幅させるため、２つのＶＨ３ファミリー特異的フォワードプライマーＶＨ３−９Ｌ（５’−ＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣ−３’）及びＶＨ３ＬＢ（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＲＹＴＫＫＧＲＣＴＢＨＧＣ−３’）と、ＩｇＧ特異的リバースプライマーＯＣＧ１（５’−ＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴ−３’）、ＯＣＧ２（５’−ＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ−３’）及びＯＣＧ３（５’−ＧＧＴＧＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧ−３’）を使用して、プレ増幅工程を実施した。Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットによりＤＮＡゲルからＰＣＲ産物を回収した。ＡＴ１４−０１２特異的な配列を増幅するため、二次増幅工程を実施した。段階的に最も広いＶＤＪ再編成配列を網羅するよう再編成したＨＣＤＲ３領域を認識する、１つのＡＴ１４−０１２特異的重鎖フォワードプライマー（５’−ｇｔｇｔｃｃａｇｔｇｔｇａａｇｔｇｃａｇｇ−３’）と、４つの異なるリバースプライマーＡＴ１４−０１２Ｈｒｅｖ  Ａ（５’−ＧＧＧＡＴＡＡＴＡＡＣＣＡＣＴＣＡＣＧＧＣ−３’）、ＡＴ１４−０１２Ｈｒｅｖ  Ｂ（５’−ＧＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＡＡＣＣＡＣＴＣＡＣ−３’）、ＡＴ１４−０１２Ｈｒｅｖ  Ｃ（５’−ＧＴＣＡＡＡＧＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＡＡＣ−３’）及びＡＴ１４−０１２Ｈｒｅｖ  Ｄ（５’−ＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡＧＴＡＧＧＧ−３’）とを使用して、４つの異なるＰＣＲ反応を実施した。本明細書では、フレームワーク４は配列決定しない。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ  ＰＣＲからの最終的なＰＣＲ産物を合わせて、１つの単一ＤＮＡミックスをｐＣＲ２．１  ＴＡクローニングベクター（Ｔｈｅｒｍｏ）に連結した。ＨＣＤＲ３領域に対し段階的にアニーリングしたため、すべてのリバース反応で別個に解析を実施する必要はなかった。これにより、本発明者らは、どの各産物がリバースプライマーにより増幅されたのかを配列決定により識別することができた。一般的なＭ１３リバースプライマー及びＭ１３フォワードプライマーを使用してインサートを配列決定した。ＡＴ１４−０１２の軽鎖を増幅するため、同様のプロトコルを実施した。ＶＫ４ファミリーステップを増幅するフォワードプライマーは、ＶＫ４Ｌ−Ｆｗ−ｌｅａｄｅｒ−ＡＴＧ：５’−ＡＣＣＡＴＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＡＣＣＣＡＧ−３’及びＶＫ４Ｌ  ５’−ＴＹＹＣＴＳＹＴＳＣＴＹＴＧＧＡＴＣＴＣＴＧ−３’とし、リバースプライマーはＯＣＫ  ５’−ＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴ−３’とした。ＡＴ１４−０１２に特異的な二次増幅工程では、フォワードプライマーはＦｗ１−１４１２Ｌ  ５’−ＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＴＧＴ−３’とし、ＬＣＤＲ３に特異的な３つのリバースプライマーは、ＡＴ１４−０１２Ｌｒｅｖ  Ａ（５’−ＧＧＣＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＧＡＧＴＡＧ−３’）、ＡＴ１４−０１２Ｌｒｅｖ  ���（５’−ＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧ−３’）、及びＡＴ１４−０１２ｒｅｖ  Ｃ（５’−ＴＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＡＧＧＴＧＧ−３’）とした。もう一度述べておくと、軽鎖のフレームワーク４は、このＰＣＲ法では解明しなかった。
【０２３１】
結果
ＡＴ１４−０１２は変異していないＣＤ９を認識する。ＡＴ１４−０１２により認識されるＣＤ９上のエピトープが変異していないことを確認するため、異なる一連の細胞タイプに対し配列解析を実施した。もとの患者に由来する黒色腫細胞を含む腫瘍細胞及びＡＴ１４−０１２／２Ｈ１５のもとのＢ細胞でＲＴ−ＰＣＲを行った。試験した細胞はすべて、ＡＴ１４−０１２エピトー中プに変異体がなかったことから、ＡＴ１４−０１２はＣＤ９の野生型配列を認識していることが確認された。また、これらのデータは、Ｂｃｌ６／ｘＬ不死化Ｂ細胞で発現しているそれぞれのＣＤ９ドメインは野生型配列であることを示す。
【０２３２】
Ｂ細胞由来の２Ｈ１５／ＡＴ１４−０１２抗体はＩＧＨＧ３＊１６のアロタイプである。もとの患者由来のＡＴ１４−０１２／２Ｈ１５  Ｂ細胞はＩｇＧ３アイソタイプである。産生された抗体のアロタイプを特定するため、Ｂ細胞のｍＲＮＡを単離し、Ｆｃ領域に特異的なプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲにかけた。得られた配列と合わせて、既報のデータ（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）から、ＡＴ１４−０１２患者由来のＢ細胞クローンはＩＧＨＧ３＊１６のアロタイプであることが明らかとなった（図２１）。ＡＴ１４−０１２となる、及びＡＴ１４−０１２となるべき抗体に対しＩｇＧ３アロタイプが及ぼす影響については現在不明である。ＣＤＣなどのエフェクター機能アッセイにおいてすべてのアロタイプをサイドバイサイドで比較している発表はない。
【０２３３】
ＡＴ１４−０１２重鎖及び軽鎖配列は、全Ｂ細胞レパートリーから回収され得る
ここでの、本発明者らの目的は、ＡＴ１４−０１２配列が患者の全Ｂ細胞レパートリー中に存在するかを調査することであった。ＰＣＲによるアプローチを用い、可変重鎖（ＶＨ３）及び軽鎖（ＶＫ４）ＩｇＧファミリーに対しプレ増幅工程を行い、本発明者らは、ＡＴ１４−０１２特異的な二次ＰＣＲ中に超変位が導入された適切なＡＴ１４−０１２配列を得るのに成功した（材料及び方法を参照のこと）。本アプローチの制限に起因して、両鎖ともフレームワーク領域４の解明は不能であった。重鎖には明瞭な超変異の追加又は欠失はみられなかったものの（データ非掲載）、軽鎖の位置Ｔ１０９（ＩＭＧＴ付番）において、本発明者らは超変異はすべての配列に導入されたわけではないことに気づいた。もとの生殖系列配列はセリンを含有しており、この超変異は特性がある程度保存されていて、全体的な構造又はＣＤ９結合に大きな影響を及ぼさない（試験せず）。
【０２３４】
実施例８−抗ＰＤ１抗体の比較
材料及び方法
ヒト免疫系マウスの作成（ｖａｎ  Ｌｅｎｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２０１０）
亜致死的に放射線照射した（３５０ｃＧｙ）新生児（１週齢未満）のＮＳＧマウスに、ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を肝内注射した。十分に再構成され、かつヒト免疫細胞を産生するマウスを、異種移植実験に適したものと判定する。
【０２３５】
結果
ＡＴ１４−０１２と抗ＰＤ１とを組み合わせることによる、ｉｎ  ｖｉｖｏでの黒色腫増殖の強力な阻害。ＰＤ１−ＰＤＬ１系をブロックする抗体、特にＰＤ１に結合するものは、現在では、様々な後期癌患者の治療に広範に使用されている。応答速度は癌の種類によって異なり、一般的には、ごくわずかな患者のみが治療に良好に応答する。抗ＰＤ１抗体と、新規又は登録済みの化合物との組み合わせを試験するべく、多くの臨床試験が行われている。本発明者らは、ヒト免疫系（ＨＩＳ）マウスモデルにおいて、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の存在下での腫瘍細胞の根絶におけるＡＴ１４−０１２の有効性について試験した。ヒト造血幹細胞をＮＳＧマウスに移植して、ＨＩＳマウスを作成した（ｖａｎ  Ｌｅｎｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２０１０）。血液循環にヒト免疫が存在することを特徴とする免疫系の形成後、マウスにはルシフェラーゼ発現黒色腫細胞の皮下移植を行った。治療の開始前に、腫瘍を４週間増殖させて約１００ｍｍ３の大きさにした。マウスは４つの異なる処置群に無作為に割り付け、週に２回抗体を腹腔内注射した。
ＡＴ１０−００２（１５ｍｇ／ｋｇ）＋ＰＢＳＡＴ１０−００２（１５ｍｇ／ｋｇ）＋ニボルマブ（２．５ｍｇ／ｋｇ）
ＡＴ１４−０１２（１５ｍｇ／ｋｇ）＋ＰＢＳＡＴ１４−０１２（１５ｍｇ／ｋｇ）＋ニボルマブ（２．５ｍｇ／ｋｇ）
ルシフェラーゼイメージングにより判定されるとおり、ＡＴ１４−０１２抗体のみを投与したマウスは、ＡＴ１０−００２（抗インフルエンザ）群のマウスと比較して腫瘍増殖の遅延を示した（図２２Ａ，Ｂ）。驚くべきことに、ＡＴ１４−０１２を抗ＰＤ１抗体と組み合わせて投与した場合、腫瘍増殖の阻害は、その他の抗体レジメンと比較して強く増強された（図２２Ａ）。屠殺日の腫瘍の大きさと、治療開始時の腫瘍の大きさとの関連を算出することで、ＡＴ１４−０１２＋ニボルマブを組み合わせると、腫瘍の大きさがほぼ７０％縮小することが明らかになった（図２２Ｂ）。これらのデータから、ＡＴ１４−０１２抗−ＣＤ９抗体とＴ細胞刺激抗体との組み合わせは、腫瘍細胞の根絶に大きな可能性を有していることが明らかに示される。
【０２３６】
【表１】
2019509019.tif 000002
【０２３７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2019509019.tif 000013
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
2019509019.tif 000015
【図７Ｂ】
2019509019.tif 000016
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
2019509019.tif 000020
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ−１】
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【図１９Ｃ−２】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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