(57)【要約】  サブビジブル粒子の定量化方法である。膜を貫通する複数の細孔（１３８）を有するメレンフィルタ（１１６）を準備する。メンブレンフィルタ（１１６）を真空室（１０４）と係合して動作状態にする。前記細孔をシーラント（１４０）で封止する。液体（１４４）とサブビジブル粒子（１４２）を含む試料液滴（１２６）をメンブレンフィルタ（１１６）上に供給する。液体（１４４）は試料液滴（１２６）の下に位置する細孔（１３８ｅ−１３８ｈ）内のシーラント（１４０）を溶解する。液体（１４４）はシーラント（１４０）が溶解された細孔を経て流出し、サブビジブル粒子（１４２）が前記メンブレンフィルタ（１１６）の上に残される。サブビジブル粒子（１４２）が電子顕微鏡で計数される。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブビジブル粒子を定量化する方法であって、
膜を貫通する複数の細孔（１３８）を有するメンブレンフィルタ（１１６）を準備し、前記メンブレンフィルタ（１１６）を真空室（１０４）と係合して動作状態にするステップ、
前記細孔をシーラント（１４０）で封止するステップ、
液体（１４４）とサブビジブル粒子（１４２）を含む試料液滴（１２６）を前記メンブレンフィルタ（１１６）の外側エッジと接触することなく前記メンブレンフィルタ（１１６）の上に置くステップ、
前記液体（１４４）が前記試料液滴（１２６）の下に位置する前記細孔（１３８ｅ−１３８ｈ）内の前記シーラント（１４０）を溶解するステップ、
前記液体（１４４）が前記シーラント（１４０）を溶解した前記細孔を経て流出し、前記サブビジブル粒子（１４２）が前記メンブレンフィルタ（１１６）の上に残されるステップ、及び
前記サブビジブル粒子（１４２）が電子顕微鏡で計数されるステップ、
を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記方法は更に、前記メンブレンフィルタ（１１６）を含むフィルタアセンブリ（１１２）をＳＥＭ支持体（１２０）上に事前に取り付けるステップを備える、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記方法は更に、取り付けテープ（１２２）を前記ＳＥＭ支持体（１２２）上に設けるステップを備える、ことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記方法は更に、内部に細長い通路（１２８）が画成されたＳＥＭ支持体（１２０）を準備するステップと、前記試料液滴（１２６）を含むインジェクタ（１１８）を用い、前記試料液滴（１２６）を前記メンブレンフィルタ（１１６）上に供給する前に前記インジェクタ（１１８）を前記細長い通路（１２８）の頂点に整列させるステップを備える、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記方法は更に、前記ＳＥＭ支持体（１２０）を真空源（１０２）に接続された真空室（１０４）に接続し、前記メンブレンフィルタ（１１６）に前記細長い通路（１２８）を介して吸引力を与えるステップを備える、ことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記方法は更に、前記液体（１４４）は前記試料液滴（１２６）の真下に位置する前記細孔（１３８ｅ−１３８ｈ）内のシーラント（１４０）のみを溶解するが、隣接する細孔（１３８ａ−１３８ｄ，１３８ｉ−１３８ｊ）は前記シーラント（１４０）で封止されたままとするステップを備える、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記方法は更に、前記サブビジブル粒子（１４２）が前記メンブレンフィルタ（１１６）上に明確に規定された測定可能なフットプリントを形成し、前記フットプリントの外周（１３７）から中心（１３９）に向かって前記サブビジブル粒子（１４２）をスキャンするステップを備える、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記方法は更に、前記試料液滴（１２６）の真下に位置する前記細孔内の前記シーラント（１４０）を溶解するために前記液体（１４４）の希釈材を使用するステップを備える、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記方法は更に、前記シーラント（１４０）としてグリシンを使用するステップを備える、ことを特徴とする請求項１記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）などの顕微鏡を用いて、サブビジブル粒子、例えばマイクロ粒子及び／又はナノ粒子などを高精度定量化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルス粒子、ウィルス様粒子、無機及び高分子のビーズ、及び液体試料からの他のナノ粒子及びマイクロ粒子などの多数のサブビジブル粒子の正確な計数は多くの処理で重要である。例えば、改質ウィルスベクターは一般に遺伝子治療用に使用されている。１ｍＬ当たりの活性ベクター数（ウィルス試料の感染力価）は標準の感染性試験を用いて決定することができる。しかしながら、現在利用可能な方法を用いて試料中の非感染粒子等の粒子の総数を正確に決定することは不可能である。感染粒子対非感染粒子比は最終的な遺伝子治療の結果及び上流開発工程の品質及び有効性に関する極めて有益な情報をもたらす。
【０００３】
現在利用可能な技術、例えば定量フローメトリ（ＱＦＣＭ）などの一つの大きな制限は、関心のあるナノ粒子が直接的に決定されないことにある。直接的決定の代わりに、ナノ粒子の母集団に対する結合プローブ数が定量化される。一つのナノ粒子当たりの結合プローブ数は変化するため、従来の間接的技術の精度は一般的に低く、試料とプローブとの間の親和性に依存する。関心のあるナノ粒子を直接的に検出できる技術があればこの制限は克服される。更に、この技術がそれらの粒子を十分な分解能で視覚化できれば、個々の粒子をそれらのサイズ及びモフォロジーに基づいて識別することができ、よって直接計数することができる。集団内の粒子でも計数し、推定することができる。これは現在利用し得る親和性方法又は光散乱ベースの技術を用いて達成することはできない。
【０００４】
本発明の新規な高精度直接粒子定量化方法は液体試料からの無機及び有機のサブビジブル粒子、例えばナノ粒子などを計数するために使用し得る。一つの重要な特徴は、試料は明確に規定された測定可能なフットプリント（占有領域）上に供給される。別の重要な特徴は、試料がこれまでよりもより均等に分布され、これはサンプリングの必要性を低減し、個々の粒子を容易に識別できる分解能で分析を行うことが可能になる。サブビジブル粒子はシグナルプローブの必要とすることなく直接検出され、通常の二次元画像に視覚化することができる。本発明の粒子定量化ＳＥＭ（ｐｑＳＥＭ）法は好ましくは低真空フィルタリング、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）又は他の電子顕微鏡法及び画像分析に基づく。本発明は内部標準を用いて又は用いないで使用することができ、この内部標準の一例としてアメリカ国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）のポリスチレンビーズ特性がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は上述した問題の解決法を提供する。特に、本方法はサブビジブル粒子の定量化法である。膜を貫通する複数の細孔を有するメンブレンフィルタを準備する。前記メンブレンフィルタを真空室と係合して動作状態にする。前記細孔をシーラントで封止する。液体とサブビジブル粒子を含む試料液滴を前記メンブレンフィルタ上に供給する。その液体は試料液滴の下に位置する細孔内のシーラントを溶解する。その液体はシーラントが溶解された細孔を経て流出し、サブビジブル粒子は前記メンブレンフィルタの上に残される。その上に残された粒子を有する前記メンブレンフィルタは電子顕微鏡に移動され、顕微鏡で取得された画像において粒子の計数が行われる。
【０００６】
本方法は更に、前記メンブレンフィルタを含有するフィルタアセンブリをＳＥＭ支持体上に事前に取り付けるステップを備える。
【０００７】
本方法は更に、取り付けテープを前記ＳＥＭ支持体上に設けるステップを備える。
【０００８】
本方法は更に、細長い通路が画成されたＳＥＭ支持体を準備し、試料液滴を含むインジェクタを用い、試料液滴を前記メンブレンフィルタ上に供給する前に前記インジェクタを前記細長い通路の頂点に整列させるステップを備える。
【０００９】
本方法は更に、前記ＳＥＭ支持体を真空源に接続された真空室に接続し、前記メンブレンフィルタに前記細長い通路を介して吸引力を与えるステップを備える。
【００１０】
本方法は更に、試料液滴を前記メンブレンフィルタ（１１６）の外側エッジと接触することなく前記メンブレンフィルタの上に置くステップを備える。
【００１１】
本方法は更に、試料液滴の液体は前記試料液滴の真下に位置する前記細孔内のシーラントのみを溶解するが、隣接する細孔は前記シーラントで封止されたままとするステップを備える。
【００１２】
本方法は更に、サブビジブル粒子がメンブレンフィルタ上で明確に規定された測定可能なフットプリントを形成し、フットプリントの外周から中心に向かって一連の画像を取得するステップを備える。
【００１３】
本方法は更に、粒子が明瞭に見える分解能で取得された電子顕微鏡画像内の粒子を、手動的に又は画像分析方法を用いて自動的に、計数するステップを備える。
【００１４】
本方法は更に、フットプリント全体をカバーする電子顕微鏡画像（フットプリント全体をカバーする一つの低倍率画像又は繋ぎ合わせるとフットプリントになるいくつかの高倍率部分画像）において、メンブレンフィルタ上のフットプリントの全面積を推定するステップを備える。
【００１５】
本方法は更に、フットプリント全体の面積と、単一粒子を明確に見るのに十分な分解能での画像から得られた単位面積当たりの粒子数とから、試料内の粒子の総数を計算するステップを備える。
【００１６】
本方法は更に、フットプリント内の粒子の不均等な半径方向粒子分布を場合により補償するステップを備える。不均等な粒子分布情報は個々の粒子を明確に見るのに十分な高倍率でフットプリントの外周から中心に向かって一連の画像を取得することによって得られる。
【００１７】
本方法は更に、フットプリントからの推定総粒子数、液体試料の供給量及び希釈度を用いて溶液の粒子濃度を計算するステップを更に備える。
【００１８】
本方法は更に、試料液滴の真下に位置する細孔内のシーラントを溶解するために液体の希釈材を使用するステップを備える。試料は液体形態にすべきであり、希釈材は試料と適合し、使用するシーラントを有効に溶解する特性を有するものとすべきである。
【００１９】
本方法は更に、シーラントとしてグリシンを使用するステップを備える。使用可能な他のシーラントとして、トレハロース／スクロースベースのシーラントがあるが、それらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の真空装置の概略断側面図である。
【図２】フィルタアセンブリの概略断側面図である。
【図３Ａ】ポリエーテルスルホンフィルタに付着したポリスチレンビーズの未処理の高倍率ＳＥＭ画像である。
【図３Ｂ】ポリエーテルスルホンフィルタに付着したポリスチレンビーズが検出され計数された高倍率ＳＥＭ画像である。
【図３Ｃ】図３ＢのＳＥＭ画像のクローズアップビューである。
【図４Ａ】高倍率のＳＥＭ（一次電子）を用いて撮像された液滴フットプリントの縁部の概略図である。
【図４Ｂ】低倍率のＳＥＭ（一次電子）を用いて撮像された液滴フットプリントの縁部の概略図である。
【図５Ａ】本発明による開細孔を有するメンブレンフィルタの概略断側面図である。
【図５Ｂ】本発明による封止された細孔を有するメンブレンフィルタの概略断側面図である。
【図５Ｃ】試料液滴が置かれた図５Ｂに示す本発明によるメンブレンフィルタの概略断側面図である。
【図５Ｄ】本発明のメンブレンフィルタに液滴が吸収された図５Ｃに示すメンブレンフィルタの概略断側面図である。
【図６】図５Ｄの拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
図１−６を参照して本発明の方法を説明する。図１は真空アセンブリ１００の概略正面図であり。このアセンブリ１００は管路１０６を介して真空室１０４に接続された真空装置１０２を有する。好ましくは、管路１０６はルアー弁１０８などの適切な弁を有する。真空マノメータ１１０は真空室１０４内の真空圧を測定するために真空室１０４と係合して動作する。フィルタアセンブリ１１２が真空室１０４の上にフィルタアセンブリ取り付け具１１４により取り付けられる。メンブレンフィルタ１１６はフィルタアセンブリ１１２の上に配置される。インジェクタ１１８はメンブレンフィルタ１１６の上方に位置する。
【００２２】
図２はフィルタアセンブリ１１２の概略断面図である。本発明の全分析プロセスは、メンブレンフィルタ１１６が分析及び計数すべき試料／検体を含むときにメンブレンフィルタ１１６をＳＥＭ支持体（アルミナスタブ１２０）に手動的に取り付ける代わりに、事前に取り付けることによって簡単化し得る。その取り付けは、ＳＥＭスタブ１２０に孔を開けるだけで行うことができる。このような装置の使用は、検体を含むメンブレンフィルタ１１６がＳＥＭスタブ１２０への取り付け中に手で取り扱われる前準備中に検体を失う又はメンブレンフィルタを損傷する危険性を最低にする。メンブレンフィルタ１１６の調製の詳細は以下で説明される。このようなｐｑＳＥＭ分析用消耗器具は製造が比較的安価である。
【００２３】
より具体的には、フィルタアセンブリ１１２は好ましくは、その上面に両面炭素取付テープ１２２が設けられた修正ＳＥＭアルミナスタブ１２０を有する。封止された多孔性メンブレンフィルタ１１６が炭素取付テープの上面に設置される。メンブレンフィルタ１１６を封止するプロセスは特に図５−６を参照して以下で詳述される。分析すべき検体又は試料１２４を含有するインジェクタ１１８はメンブレンフィルタ１１６の上方に配置又は位置され、試料液滴１２６をメンブレンフィルタ１１６の上に置くために使用される。スタブ１２０はフィルタアセンブリ１１４に液密に接続され、次いでフィルタアセンブリ１１４は真空室１０４に液密に取り付けられているため、スタブ１２０内も真空になるので、真空がフィルタアセンブリ１１２の下部からメンブレンフィルタ１１６へ吸引力を及ぼす。これは、スタブ１２０の内部に規定された細長い空洞又は通路１２８がメンブレンフィルタ１１６及び真空室１０４と流体連通するために可能である。以下で述べるように、試料液滴１２６がメンブレンフィルタ１１６の上に置かれるとき、試料液滴１２６がメンブレンフィルタ１１６のエッジと接触しないで、チャネル１２８と取り付けテープ１２２との間に規定された拡大空洞部１２９の真上に置かれるように、インジェクタ１１８はメンブレンフィルタ１１６の上方に正確に位置させることが重要である。好ましくは、液滴１２６はチャネル１２８を通る長手方向軸（Ｌ）と整列する空洞１２９の中心又はその近くに置かれる。
【００２４】
図３Ａ−３Ｃはポリエーテルスルホンフィルタに付着したポリスチレンビーズの高倍率ＳＥＭ画像である。図３Ａは未処理画像１３０であり、図３Ｂは検出され、計数された画像１３２である。図３Ｃは図３Ｂのビューのクローズアップビューで、図３Ａの画像の区分１３１に対応する。これらの画像例では、１３１．３７μｍ２の視野内に７７個の粒子が検出された。これは約０．５９粒子／μｍ２に相当する。ビュー１３３は番号付けされた粒子１、２、３、４、５、６、７、２８、２９、３０を示す。
【００２５】
図４Ａ−４ＢはＳＥＭ（一次電子）を用いて撮像された液滴フットプリント（占有領域）の縁部を示す。図４Ａは高倍率での画像１３４を示し、図４Ｂは低倍率でのフットプリント画像１３６を示す。図４Ａに示す高倍率画像１３４の位置は図４Ｂに白色矢印でマークされ、画像１３４はフットプリント全体の画像１３６の一部分である。液滴の縁はフットプリントの外側の無視し得る数の粒子で明確に規定される。低倍率では、液滴のフットプリント全体１３６が視覚化され、フットプリントの区域を正確に測定することができる。本例では、フットプリントの面積（Ａtotal）は８．４３６ｍｍ２であった。
【００２６】
図５Ａ−５Ｄは、メンブレンフィルタ１１６の断側面図であり、メンブレンフィルタ１１６を封止し、その後そのシーラントを溶解するプロセスを示す。図５Ａにおいて、メンブレンフィルタ１１６は、メンブレンフィルタ１１６の格子部材１３９の間に画成されたメンブレンフィルタ１１６を貫通する開細孔１３８を有する。図５Ｂにおいて、細孔１３８はシーラント１４０で満たされる。図５Ｃにおいて、分析すべき粒子１４２を含有する液体１４４である試料１２４の試料液滴１２６がメンブレンフィルタ１１６の上に置かれる。好ましくは、液滴１２６は上述したインジェクタ１１８を用いてメンブレンフィルタ１１６の上に置かれる。液滴１２６がシーラント１４０と接触すると、液体１４４は液滴１２６の直ぐ下にあるシーラント１４０を溶解するため、液体１４４は液滴１２６の下に位置する細孔１３８のみを通過し吸収される。計数すべき粒子１４２は膜の細孔１３８より大きいサイズを有するため、粒子１４２はメンブレンフィルタ１１６の上に付着するが、液滴１２６の下にある細孔１３８内のシーラント１４０は溶解され、液体１４４がメンブレンフィルタ１１６の下の真空室１０４の細長い通路１２８からの吸引を受けるので、液体及びより小さい汚染物質１４４は細孔１３８内に吸収され又は流入する。
【００２７】
図６は図５Ｄのメンブレンフィルタ１１６の拡大図である。サブビジブル粒子１４２はメンブレンフィルタ１１６の上に残存し、粒子１４２は細孔１３８ａ−１３８ｊより大きいため、これらの孔が開き、真空室１０４（図示せず）からの吸引を受けてもこれらの粒子はこれらの細孔を通過しない。細孔１３８ａ−ｄ及び１３８ｉ−ｊはシーラント１４４で満たされたままである。なぜなら、それらのシーラントは試料液滴１２６（図５Ｃ参照）の液体１４４と接触したことがなく、液体１４４により溶解されたことがないためである。より詳しくは、液体１４４内の希釈剤、例えば適切な緩衝剤、がシーラント１４０を溶解する。上述したように、希釈剤は検体と適合するもの、即ち検体のモフォロジー及び凝集状態への影響が最小のものとすべきである。希釈剤はまた、シーラントを溶解する特性を有するものとすべきである。これは、真空がフットプリントにおいてのみ維持され、装置が関心区域外の細孔の開きにより真空を失なわないことを確実にするためである。液体１４４は細孔１３８ｅ−１３８ｈ内に配置されたシーラント１４０を溶解するため、液体１４４がシーラント１４０に代って細孔１３８ｅ−１３８ｈを満たす。これは、粒子１４２はメンブレンフィルタ１１６の上に残存し、メンブレンフィルタ１１６に沿ってよく分布されるので、粒子１４２の計数を容易にする。
【００２８】
実施例
以下は本発明に係わるメンブレンフィルタ１１６を調製する方法の説明のための実施例である。
【００２９】
１．サブビジブル粒子１４２、例えばマイクロ粒子及び／又はナノ粒子、を含む試料を計数のために調整する。この調製は、試料を適切な希釈剤（一般的に水、リン酸緩衝塩、ＨＥＰＥＳ緩衝塩、ＴＲＩＳ緩衝塩又はヒスチジン緩衝塩）と個々の試料の緩衝状態に応じて順次に希釈することによって行われる。
【００３０】
２．固化剤（一般的にグルタルアルデヒド又はホルムアルデヒド）及び／又は安定化剤（一般的にサッカロース又はグリセロール）をサブビジブル粒子１４２を含む希釈試料溶液１２４内に導入して粒子の構造を安定化するとともに保存し、いくつかの試料では粒子１４２の不所望な凝集を防止する。固化／安定化剤及び希釈剤は液体１４４に相当し、粒子１４２と一緒に試料／検体１２４及び試料液滴１２６を形成する。固化／安定化剤は、粒子１４２が取り扱い中に破壊又は損傷されたり、不所望に互いに付着して粒子１４２の計数が困難になるのを防止するために使用される。
【００３１】
３．フィルタアセンブリ１１２は、液体から粒子１４２を分離するために、規定の孔径（一般的に０〜１５ｎｍ）の細孔１３８を有する多孔性メンブレンフィルタ１１６（一般的にポリエーテルスルホン又はポリカーボネイト）と、プラスチック又は同等物で造られた開閉可能なフィルタカセットとからなる。適切なフィルタアセンブリ１１２は図２に最もよく示されている。一般的に、フィルタは使い捨てフィルタとしてまとめて購入され、従って何かに取り付ける必要がある。一部のベンダーはフィルタホルダも販売しており、これらの装置はもともとシリンジに接続して液体を押し出すように作られており、真空を使って液体を吸引するように構成されていない。それゆえ、真空の完全性を確保するようにフィルタをフィルタアセンブリに取り付ける必要がある。いくらかの実験後に、驚いたことに、フィルタをＳＥＭ支持体に直接取り付けることができ、時間を節約できるとともに検体含有フィルタの重要な手作業を避けることができることが確かめられた。このようなアセンブリは安価に製造することができ、ＳＥＭ消耗品として販売することができる。
【００３２】
４．フィルタアセンブリ１１２はプラスチック真空室１０４の上に取り付けられ、次に真空室１０４が導管１０６を介して真空装置１０２に接続される。
【００３３】
５．真空室１０４の真空は３路ルアー弁１０８により制御され、真空マノメータ１１０によりモニタされる。電子モニターシステムにより制御される電磁弁を用いた自動システムも実装可能である。
【００３４】
６．メンブレンフィルタ１１６の細孔１３８は好ましくは、図５Ｂ及び５Ｃに最も良く示されるように、試料液滴１２６の試料供給前にグリシン（又は同等物）などのシーラント１４０で封止する。驚いたことに、メンブレンフィルタ１１６にシーラント１４０を使用することによって、液滴１２６内の粒子が（液滴１２６の液体１４４を除去する前に）より均等に分布され、液滴がメンブレンフィルタ上で不均等に広がるリスクを低減するために高真空を使用する必要がなくなるという予期せぬことが発見された。粒子の分布は中心部と外周部とで同じである必要はないことに注意されたい。粒子分布のパターンは、メンブレンフィルタの上に置かれた粒子試料のフットプリント１３４／１３６（図４Ａ−４Ｂ参照）を粒子試料のフットプリント１３６の外周又は外縁１３７からフットプリントの中心１３９に向かってスキャンすることによって決定することができる。粒子試料のスキャンした部分がある粒子分布パターンを示す場合、シーラント１４０が液滴１２６内の液体により溶解される前に粒子が定着する時間があるために、円形状の粒子試料フットプリント１３６の周囲に部分的に同じ粒子分布パターンが付与されることが確かに考えられる。液滴１２６は最初に、封止されたメンブレンフィルタ１１６上に置かれるために、液滴１２６のフットプリント１３６の外縁１３７は比較的明確又は鮮明であり、これは溶解されたメンブレンフィルタ１１６上の円形の粒子試料又はフットプリント１３６の中心に向けて計数及びスキャンを開始する場所を決定するために重要である。予期せぬことに、メンブレンフィルタ上で粒子が比較的均等に分布するという利点は、粒子の計数を開始する前に液滴の液体をメンブレンフィルタを通して除去しなければならないという欠点を上回るということが発見された。メンブレンフィルタ上の液滴のフットプリントの不均一な又は不明確な外周は、液滴内のすべての粒子を計数するためにそのフットプリントを決定すること及びどの区域を分析すべきかを知ることをより困難にする。試料液滴１２６をすべての細孔１３８がシーラント１４０で封止されたメンブレンフィルタ１１６上に供給することによって、粒子１４２はメンブレンフィルタ１１６の封止上面上で均等に広がる。シーラント１４０を最初に溶解しなければならないという要件は液体１４４の細孔１３８の貫流を遅らせる。シーラント１４０を使用しないと、液滴１２６の液体１４４は直ちに細孔１３８を貫流し始め、液滴１２６は中心部で最も厚くなり、周辺部で薄くなるため、より多くの粒子１４２が液滴の中央部に位置する傾向がある。これは多くの場合メンブレンフィルタ上に不均等な粒子分布をもたらし、粒子試料のフットプリントの外縁が不明確になる。ある種の検体は空気−水界面に向かって集まる傾向を有するためにより多くの粒子が必ずしも液滴の中央部に位置するとは限らないことに留意すべきである。種々の試料がどのように挙動し分布するかを正確に予測することは一般に難しい。
【００３５】
試料液滴１２６の全フットプリント１３６が粒子１４２の粒子濃度を計算するために使用されるため、液滴１２６はメンブレンフィルタ１１６のフィルタホルダの内側エッジに接触すべきでない。従って、メンブレンフィルタ１１６の規定された部分のみが試料液滴１２６で覆われることが重要である。これは、液滴１２６内のすべての粒子を計数又はカウントすることを確実にするためである。また、試料液滴１２６の位置はスタブ１２０の内部に画成された空洞１２９及び通路１２８と整列させるべきである。メンブレンフィルタ１１６のシーラント１４０による前処理なしの場合、周囲のフィルタ細孔、即ち図６における細孔１３８ａ−１３８ｄ及び１３８ｉ−１３８ｊ、は開いたままであり、空気が液滴１２６の周りからメンブレンフィルタ１１６を経て流れるため、試料液滴１２６は吸収されず、粒子１４２の良好な試料分布を得るのに十分な高速で濾過される。言い換えれば、シーラント１４０の使用は、液体が液滴１２６の下に位置するシーラント１４０を溶解し始めるとき、液滴１２６のフットプリント１３６のより明確な外周１３７を生成する利点を有する。シーラント１４０を使用しない場合、液体１４４は、粒子１４２が液滴１２６内で安定し均等に分布する時間を与えることなく、すぐに細孔１３８を貫流し始めるため、粒子１４２が液滴１２６内で均等に分布されるための十分な時間が存在しない。従って、シーラント１４０の一つの極めて重要な機能は、明確に規定された試料フットプリントが形成されるように真空状態を生成することにある。より詳しくは、本発明によるシーラント１４０の処理なしの場合には、液滴１２６は拡散及び蒸発により不所望に乾燥する。これは乾燥の影響により極めて不均等な粒子分布を生じる。驚いたことに、不所望な乾燥は潜在的に浸透圧効果を生じ、残存液滴の塩濃度の増加に起因して粒子分裂及び結晶形成を生じ得ることが発見された。さらに、これは分裂した粒子及び塩沈殿物により隠される粒子によって粒子の検出及び計数を不正確にする。本発明においては、試料液滴１２６を封止されたメンブレンフィルタ１１６上に供給すると、試料液滴１２６の液体１４４がゆっくりシーラント１４０を溶解し、液滴１２６の下に位置する細孔１３８ｅ−１３８ｈを開ける。従って、液体１４４は真空によってメンブレンフィルタ１１６の細孔１３８ｅ−１３８ｈを通して急速に吸引され、メンブレンフィルタ１１６の上面上に粒子１４２の良好な試料分布が得られる。
【００３６】
７．試料液滴１２６をメンブレンフィルタ１１６上に供給する前に、真空装置１０２が駆動され、真空室１０４内の圧力がメンブレンフィルタ１１６への吸引力を生成するために低減される。真空室１０４内の真空は、液滴１２６の液体１４４がメンブレンフィルタ１１６上で均等に吸収されることを保証する。シーラントと真空の併用はメンブレンフィルタ１１６上のフットプリント１３６に沿う粒子１４２の均等分布をもたらす。
【００３７】
８．適切な量（一般的に５μｌ）の試料液滴１２６が多孔性の封止メンブレンフィルタ１１６上に供給される。上述したように、粒子１４２の直径はメンブレンフィルタ１１６の細孔１３８の直径より大きいこと及び液滴１２６はフィルタ取り付け台のエッジに接触しないことが重要である。インジェクションシステムを用いることによって５μｌより大きい量を供給することができ、この場合には複数の液滴もしくはより大きな量がメンブレンフィルタ１１６上の同じ位置に供給される。一般に、大きな量の使用はサンプリング誤差を最小化でき、低濃度試料の分析を可能にする。
【００３８】
９．試料液滴１２６は、真空室１０４により与えられる真空圧下で、一般的に６０秒の間に、メンブレンフィルタ１１６上に吸収される。正確な圧力値は細孔の大きさ、試料の種類、量、純度及び粘度に部分的に依存して調整する必要がある。
【００３９】
１０．吸収後に、メンブレンフィルタ１１６はＳＥＭアルミナスタブ１２０に（一般的に接着性で導電性の炭素テープ１２２によって）取り付けられたフィルタアセンブリ１１２から取り外すことができる。
【００４０】
１１．メンブレンフィルタ１１６上に置かれ固定された粒子１４２を有するメンブレンフィルタ１１６はその後、例えば炭素蒸発器を一般的に１×１０−５ｍｂａｒの適切なチャンバ圧力で用いて、炭素の薄膜（一般的に２０ｎｍ厚）でスパッタ被覆することができる。スパッタ被覆はメンブレンフィルタ１１６の導電率を高め、信号対雑音比を増加し、電子ビーム損傷及び帯電効果を低減する。この技術はフィルタ材料をＳＥＭで撮像するためにしばしば必要とされる。炭素被膜を使用することはこれまでにないことであるが、金属スパッタリングの大きな粒径に比較してより高いＳＥＭ撮像分解能をもたらす。
【００４１】
１２．メンブレンフィルタ１１６はＳＥＭに移送し、（インレンズ検出器を用いて）散乱一次電子からの信号又は（例えばＳＥ２検出器を用いて）二次電子からの信号を、フットプリント全体をカバーするために低倍率で記録し、計数のために高倍率（一般的に１００００〜３００００）で記録する。
【００４２】
１３．低倍率画像１３６（図４Ｂ）は液滴のフットプリントのサイズ及び全体的な検体分布を決めるために使用されるが、高倍率画像は粒子の計数を決めるために使用される。
【００４３】
１４．高倍率画像、例えば画像１３４は、液滴のフットプリントを横切る方向の粒子分布の差の影響を最小にするために、縁１３７から中心を通って液滴の反対側縁まで、試料フットプリントを横切って取得される。
【００４４】
１５．低倍率画像、例えば画像１３６から、試料フットプリントの面積（Ａtotal）がフットプリントの縁をトレースすることによって計算される。丸で囲まれた画素が計数され、その数に画素サイズが乗算される。
【００４５】
１６．高倍率画像から、粒子１４２が検出され、計数される。この処理は手動マーキングによって又はヴィロノバ特許のソフトウェアアナライザ又は任意の他の適切な画像分析ソフトウェアを用いて自動マーキングによって実行することができる。単位面積当たりの平均粒子数（ｎ／ＡFOV）が画像データセットから計算される。
【００４６】
１７．粒子試料の１ｍＬ当たりの粒子数は、好ましくは、次式を用いて計算される。
【数１】
2019502093.tif 000003
ここで、Ｃは粒子の濃度であり、ｄｆは希釈係数であり、Ｖは試料の供給量である。試料がその中心に向ってスキャンされるにつれて粒子の分布が粒子試料の周縁部から変化するかもしれないことを考慮した式を用いることもできる。
【００４７】
要するに、本発明の粒子定量走査顕微鏡（ｐｑＳＥＭ）技術は高精度の直接粒子検出及び計数技術である。本発明の重要な特徴は、直接検出がプローブと試料の親和性に依存しないことにあり（多くの既存の技術はこの親和性に依存する）。すべてのパラメータ、例えば希釈係数、供給量、液滴のフットプリントなどを制御し、単位面積当たりの粒子の数を近似や推定に由来する誤差を最小にしつつ直接測定することができる。更に、ｐｑＳＥＭの分解能は集団内の個々のサブビジュアル粒子の検出を可能にし、異なるサイズ又は他のモフォロジー特徴の粒子の２つの粒子数を同じ試料から計数することができる。ｐｑＳＥＭ技術により発生される高コントラストの画像から粒子及びフットプリントを自動画像分析を用いて容易に検出することができる。これは大きなデータセットを高速に収集しロバストな統計結果を生成する手段を提供する。
【００４８】
本発明を好ましい構成及び実施形態に従って説明したが、後記の請求の範囲に記載の精神及び範囲から逸脱することなくいくつかの置換や変更を成し得ることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2019502093.tif 000007
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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