(57)【要約】  半減期延長タンパク質、リンカー、及びＧＤＦ１５タンパク質を含む融合タンパク質について記載する。融合タンパク質をコードする核酸、その組換え細胞、融合タンパク質を含む組成物、及び、代謝性疾患、障害又は状態を治療又は予防するための融合タンパク質の使用方法についても記載する。
2019523637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．半減期延長タンパク質と、
ｂ．リンカーと、
ｃ．ＧＤＦ１５タンパク質と、を含み、
Ｎ末端からＣ末端に（ａ）−（ｂ）−（ｃ）の順序で配列された、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＧＤＦ１５タンパク質が、成熟ＧＤＦ１５タンパク質又はその機能的変異体である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＧＤＦ１５タンパク質が、配列番号６、７、８、９、１０又は１１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＧＤＦ１５タンパク質が、配列番号６、７、８、９、１０及び１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記半減期延長タンパク質が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はその機能的変異体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記半減期延長タンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記半減期延長タンパク質が、配列番号１、２及び３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記リンカーが、柔軟性リンカーである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記リンカーが、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ただし、ｎは２〜２０である）を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記リンカーが、構造化リンカーである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記リンカーが、配列（ＡＰ）ｎ又は（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ただし、ｎは２〜２０である）を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記リンカーが、（ＧＧＧＧＡ）ｎ、（ＰＧＧＧＳ）ｎ、（ＡＧＧＧＳ）ｎ、又はＧＧＳ−（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ）ｎ−ＧＧＳ（ただし、ｎは２〜２０である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号５、２５〜３０、３６〜３７、４０、４８、５５〜５６、５９〜６０、６４〜７５、９２、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、又は１２７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質。
【請求項１４】
配列番号５、２５〜３０、４０、５５〜５６、５９〜６０、７０、９２、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、及び１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードしたヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項１６】
配列番号７６〜９１、９５、１０９、１１０、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、及び１２８と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１５に記載の単離核酸分子。
【請求項１７】
配列番号７６〜９１、９５、１０９、１１０、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、及び１２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の単離核酸分子。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクター。
【請求項１９】
配列番号７６〜９１、９５、１０９、１１０、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、及び１２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を作製する方法であって、
（１）融合タンパク質が生成する条件下で融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養することと、
（２）前記宿主細胞により産生された前記融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２４】
代謝性疾患を治療又は予防する方法であって、該疾患の治療又は予防を要する対象に、有効量の請求項２２又は２３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２５】
疾患の治療を要する対象において、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、及び慢性関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、前記対象に、配列番号６０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２６】
疾患の治療を要する対象において、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、及び慢性関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、前記対象に、配列番号９２のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２７】
２本のポリヌクレオチド鎖を含む二量体であって、各鎖が、Ｎ末端からＣ末端にかけてＨＳＡ領域、リンカー、及びＧＤＦ１５領域を含み、前記ＨＳＡ領域が、配列番号１、２、又は３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＧＤＦ１５領域が、配列番号６、７、８、９、１０、又は１１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、二量体。
【請求項２８】
前記ＨＳＡ領域が、配列番号１、２、及び３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の二量体。
【請求項２９】
前記ＧＤＦ１５領域が、配列番号６、７、８、９、１０及び１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の二量体。
【請求項３０】
前記２本のポリヌクレオチド鎖が、ジスルフィド結合によって連結されている、請求項２７に記載の二量体。
【請求項３１】
前記ＨＳＡ領域と前記ＧＤＦ１５領域とがポリペプチドリンカーによって連結されている、請求項２７に記載の二量体。
【請求項３２】
前記ＨＳＡ領域と前記ＧＤＦ１５領域とが柔軟性リンカーによって連結されている、請求項３１に記載の二量体。
【請求項３３】
前記ポリペプチドリンカーが、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ただし、ｎは２〜２０である）を含む、請求項３２に記載の二量体。
【請求項３４】
前記ＨＳＡ領域と前記ＧＤＦ１５領域とが構造化リンカーによって連結されている、請求項３１に記載の二量体。
【請求項３５】
前記ポリペプチドリンカーが、配列（ＡＰ）ｎ又は（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ただし、ｎは２〜２０である）を含む、請求項３４に記載の二量体。
【請求項３６】
前記リンカーが、（ＧＧＧＧＡ）ｎ、（ＰＧＧＧＳ）ｎ、（ＡＧＧＧＳ）ｎ、又はＧＧＳ−（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ）ｎ−ＧＧＳ（ただし、ｎは２〜２０である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の二量体。
【請求項３７】
（ｉ）Ｎ末端の第１のＨＳＡ領域、リンカー、及びＣ末端の第１のＧＤＦ１５領域を含む第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）第２のＧＤＦ１５領域を含む第２のポリペプチド鎖と、を含む二量体であって、前記ＨＳＡ領域が、配列番号１、２、又は３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第１のＧＤＦ１５領域が、配列番号６、７、８、９、１０、又は１１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＧＤＦ１５領域が、配列番号６、７、８、９、１０、又は１１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、二量体。
【請求項３８】
前記ＨＳＡ領域が、配列番号１、２、及び３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の二量体。
【請求項３９】
前記ＧＤＦ１５領域が、配列番号６、７、８、９、１０及び１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の二量体。
【請求項４０】
前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＡＰ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、（ＧＧＧＧＡ）ｎ、（ＰＧＧＧＳ）ｎ、（ＡＧＧＧＳ）ｎ及びＧＧＳ−（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ）ｎ−ＧＧＳ（ただし、ｎは２〜２０である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の二量体。
【請求項４１】
前記２本のポリヌクレオチド鎖が、ジスルフィド結合によって連結されている、請求項３７に記載の二量体。
【請求項４２】
配列番号７、８、９、１０、及び１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号９６〜１０８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項４４】
配列番号９６〜１０８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクター。
【請求項４５】
配列番号９６〜１０８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＤＦ１５融合タンパク質に関する。詳細には、本発明は、半減期延長タンパク質、リンカー、及びＧＤＦ１５タンパク質を含む融合タンパク質、融合タンパク質をコードする核酸及び発現ベクター、その組換え細胞、並びに融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。かかる融合タンパク質を作製する方法、及びかかる融合タンパク質を使用して代謝性疾患を治療するための方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
ＧＤＦ１５は、ＴＧＦβファミリーのメンバーであり、２５ｋＤａのホモダイマーとして血漿中を循環する分泌タンパク質である。ＧＤＦ１５の血漿中濃度は多くの個人で１５０〜１１５０ｐｇ／ｍｌの範囲である（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｃｈｅｘｉａ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  Ｍｕｓｃｌｅ．２０１２，３：２３９〜２４３）。ＧＤＦ１５の血漿中濃度は、怪我、心血管系疾患、及びある種のがんの条件下で上昇する。この上昇は、細胞保護的な機構であると考えられている。ＧＤＦ１５の高い血漿中濃度は、がんにおける食欲不振及び悪液質による体重減少、また腎不全及び心不全における体重減少と関連している。臨床試験では、ＧＤＦ１５レベルは、肥満の非糖尿病対象者におけるインスリン抵抗性の独立予測因子とされていた（Ｋｅｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏ．２０１２，１６７：６７１〜６７８）。双子における研究により、双子のペアにおけるＧＤＦ１５のレベルの差がそのペアのＢＭＩの差に相関していることが示され、ＧＤＦ１５がエネルギーホメオスタシスの長期的な調節因子として機能していることを示唆している（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１５，１０（７）：ｅ０１３３３６２）。
【０００３】
ＧＤＦ１５は、いくつかの心血管系疾患及び他の疾患状態のバイオマーカーとして広く研究されてきたが、心筋肥大及び虚血性傷害におけるＧＤＦ１５の保護的な役割についても記載されている（Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１４，２９：３６６〜３７１；Ｋｅｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１１，１７：５８１〜５８９；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００６，９８：３４２〜５０）。ＧＤＦ１５は、１型及び２型糖尿病のマウスモデルにおいて腎尿細管及び腸への傷害からの保護において重要な役割を担っていることが示されている。（Ｍａｚａｇｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３；３０５：Ｆ１２４９−Ｆ１２６４）。ＧＤＦ１５は、加齢に伴う感覚及び運動ニューロンの喪失に対する保護作用を有することが示されており、末梢神経傷害後の回復を改善する（Ｓｔｒｅｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００９，２９：１３６４０〜１３６４８；Ｍｅｎｓｃｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２０１２，３５０：２２５〜２３８）。実際、ＧＤＦ１５トランスジェニックマウスは、その同腹のコントロールよりも長い寿命を有することが示されており、この分子が長期生存因子として機能することを示唆し得るものである（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｉｎｇ．２０１４，６：６９０〜７００）。
【０００４】
多くの報告で、ＧＤＦ１５タンパク質による処理によりマウスモデルにおいて耐糖能及びインスリン感受性の改善が示されている。ＧＤＦ１５を過剰発現しているトランスジェニックマウスの独立した２系統で体重及び体脂肪量の減少、並びに改善された耐糖能が認められている（Ｊｏｈｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００７，１３：１３３３〜１３４０；Ｍａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２，７：ｅ３４８６８；Ｃｈｒｙｓｏｖｅｒｇｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓｉｔｙ．２０１４，３８：１５５５〜１５６４）。ＧＤＦ１５マウスにおいて全身のエネルギー消費量及び酸化的代謝量の増加が報告されている（Ｃｈｒｙｓｏｖｅｒｇｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、同上）。これらは、褐色脂肪組織における熱発生遺伝子の発現の増加、及び白色脂肪組織における脂肪分解遺伝子の増加を伴う。ＧＤＦ１５遺伝子を欠損したマウスでは、体重及び体脂肪量が増加した（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３，８（２）：ｅ５５１７４）。ＧＤＦ１５のＦｃ融合タンパク質は、肥満カニクイザルモデルにおいて週１回、６週にわたって投与した場合に体重を減少させ、耐糖能及びインスリン感受性を改善することが示されている（国際公開第２０１３／１１３００８号）。
【０００５】
体重に対するＧＤＦ１５の効果は、食物の摂取量の低減及びエネルギー消費の増加を介して媒介されると考えられている。ＧＤＦ１５は、体重依存性及び非依存性の機構によって血糖コントロールを改善している可能性がある。
【０００６】
これらの観察を考え合わせると、ＧＤＦ１５のレベルを増加させることは代謝性疾患の治療法として有用であると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
代謝性疾患、障害、又は状態を治療若しくは予防するために使用することができるＧＤＦ１５を用いた組成物が当該技術分野で求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、向上した溶解性／安定性を示すとともに、代謝性疾患、障害又は状態の治療若しくは予防に使用できることを示す特徴を示すＧＤＦ１５の融合タンパク質を提供することにより、このような要請に応えるものである。このような特徴としては、例えば、本発明の実施形態による融合タンパク質を投与した対象の体重減少、耐糖能の向上、及びインスリン感受性の改善が挙げられる。
【０００９】
一般的な一態様では、本発明は、（ａ）半減期延長タンパク質、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）ＧＤＦ１５タンパク質を含み、Ｎ末端からＣ末端に（ａ）−（ｂ）−（ｃ）の順序で配列された融合タンパク質に関する。
【００１０】
本発明の一実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質は、ヒトＧＤＦ１５タンパク質又はその機能的変異体である。特定の実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質は、成熟ＧＤＦ１５タンパク質又はその機能的変異体を含む。より詳細な実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質は、配列番号６〜１１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列、例えば配列番号６〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
本発明の一実施形態では、半減期延長タンパク質は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はその機能的変異体である。特定の実施形態では、半減期延長タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、半減期延長タンパク質は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本発明の一実施形態では、リンカーは柔軟性リンカーである。特定の実施形態では、柔軟性リンカーは、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ただし、ｎは２〜２０、好ましくは４〜１０である）を含む。本発明の別の一実施形態では、融合タンパク質のリンカーは構造化リンカーである。特定の実施形態では、構造化リンカーは、配列（ＡＰ）ｎ又は（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ただし、ｎは２〜２０、好ましくは４〜１０である）を含む。
【００１３】
本発明の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５、２５〜３０、３６〜３７、４０、４８、５５〜６０、又は６４〜７５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の詳細な実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５、２５〜３０、４０、５５〜６０、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明のより詳細な実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする単離核酸分子に関する。
【００１５】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターに関する。
【００１６】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む組換え宿主細胞に関する。
【００１７】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質を得る方法に関する。かかる方法は、（１）融合タンパク質が生成する条件下で、融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養することと、（２）宿主細胞により産生された融合タンパク質を回収することと、を含む。
【００１８】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００１９】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００２０】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を含むキットに関する。
【００２１】
別の一般的な態様では、本発明は、代謝性疾患、障害、又は状態を治療又は防止する方法であって、治療又は予防を要する対象に、治療上又は予防上の有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。特定の実施形態では、医薬組成物は、対象に皮下又は静脈内投与される。
【００２２】
本発明の実施形態によれば、治療を要する対象において、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患を治療する方法は、対象に、配列番号５、２５〜３０、４０、５５〜６０、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、治療有効量の医薬組成物を投与することを含む。詳細な一実施形態では、かかる方法は、対象に、配列番号６０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む。
【００２３】
本発明の他の態様、特徴、及び利点は、発明の詳細な説明、並びにその好ましい実施形態及び付属の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
これまでの「課題を解決するための手段」並びに以降の「発明を実施するための最良の形態」は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明は、図面に示される実施形態そのものに限定されない点は理解されるべきである。
【００２５】
図面は、以下のとおりである。
【図１Ａ】第１のシステイン残基と第２のシステイン残基とのジスルフィドペアリング（Ｃ１〜Ｃ２）がタンパク質のＮ末端にループを形成しているＧＤＦ１５の結晶構造を示す。
【図１Ｂ】第１のシステイン残基と第２のシステイン残基とのジスルフィドペアリング（Ｃ１〜Ｃ２）がタンパク質のＮ末端にループを形成しているＧＤＦ１５の結晶構造を示す。
【図２】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの食物摂取量に対する本発明の実施例に基づく融合タンパク質（例えば、融合タンパク質ＦＰ１（配列番号６０）及び６ｘＨｉｓ−ＦＰ１（Ｎ末端に６ｘＨｉｓタグが結合された配列番号２６））の皮下投与の効果を示し、投与２４時間後の累積食物摂取量が示されている。各棒内に示される値は、溶媒（ＰＢＳ）群±ＳＥＭと比較した低下率（％）である。すべての群で各群Ｎ＝８匹の動物（ＦＰ１の１６ｎｍｏｌ／ｋｇ群のＮ＝９を除く）。＊溶媒と比較してｐ＜０．０５；ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。
【図３】スプラーグ・ドーリーラットの食物摂取量に対するＦＰ１及び６ｘＨｉｓ−ＦＰ１（Ｎ末端に６ｘＨｉｓタグが結合された配列番号２６）の皮下投与の効果を示し、投与４８時間後の累積食物摂取量が示されている。各棒内に示される値は、溶媒（ＰＢＳ）群±ＳＥＭと比較した低下率（％）である。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較してｐ＜０．０５；ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。
【図４】ＦＰ１による処理の間の食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）の体重の変化を示す。矢印は、初回投与（０日目）後の皮下投与の時間（日）を示す。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較したＦＰ１の１ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；＃溶媒と比較したＦＰ１の１０ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；ｐ値は、二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。
【図５Ａ】３日ごと（ｑ３ｄ）に１４日間ＦＰ１を投与した後の経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）の間のＤＩＯマウスの血糖値を示し、各値は曲線下面積として表されている。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較したＦＰ１の１ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。
【図５Ｂ】３日ごと（ｑ３ｄ）に１４日間ＦＰ１を投与した後の経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）の間のＤＩＯマウスの血糖値を示し、各値は曲線下面積として表されている。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較したＦＰ１の１ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。
【図６】ＦＰ１による処理の間のＤＩＯマウスの摂食血糖値を示す。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較してｐ＜０．０５；ｐ値は、二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。
【図７】ＦＰ１による１４日間の処理の後のＤＩＯマウスにおけるインスリン抵抗性の４時間絶食ホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）を示す。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較してｐ＜０．０５；ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。
【図８】３日ごと（ｑｄ３）のＦＰ１による処理の間のｏｂ／ｏｂマウスの体重変化を示す。矢印は、初回投与（０日目）後の皮下投与の時間（日）を示す。各群Ｎ＝９匹の動物。＊溶媒と比較したＦＰ１の１０ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；＃溶媒と比較したＦＰ１の１ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；ｐ値は、二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。
【図９】ＦＰ１による処理の間のｏｂ／ｏｂマウスの血糖値を示す。矢印は、初回投与（０日目）後の皮下投与の時間（日）を示す。各群Ｎ＝９匹の動物。＊溶媒と比較したＦＰ１の１０ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；＃溶媒と比較したＦＰ１の１ｎｍｏｌ／ｋｇ群ではｐ＜０．０５；ｐ値は、二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。
【図１０】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける２ｍｇ／ｋｇの静脈内（ＩＶ）及び皮下（ＳＣ）投与後のＦＰ１の血清薬物濃度−時間プロファイルの平均（±標準偏差、ＳＤ）を示す。
【図１１】スプラーグ・ドーリーラットにおける２ｍｇ／ｋｇのＩＶ及びＳＣ投与後のＦＰ１の血清薬物濃度−時間プロファイルの平均（±ＳＤ）を示す。
【図１２】イムノアッセイにより測定した、カニクイザルにおける１ｍｇ／ｋｇのＩＶ及びＳＣ投与後のＦＰ１の血清薬物濃度−時間プロファイルの平均（±ＳＤ）を示す。
【図１３】免疫親和性（ＩＡ）捕捉ＬＣＭＳ分析により測定した、カニクイザルにおける単回ＩＶ投与後の経時的な完全な二量体としてのＦＰ１の血清中濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。
【図１４】免疫親和性捕捉ＬＣＭＳ分析により測定した、カニクイザルにおける単回ＳＣ投与後の経時的な完全な二量体としてのＦＰ１の血清中濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。
【図１５】イムノアッセイにより測定した、２人のヒト被験者（Ｓｕｂ）から得た血漿中でのエクスビボインキュベーションの０、４、２４、及び４８時間後の開始濃度の割合（％）として表したＦＰ１の濃度を示す。
【図１６】インタクトマス免疫親和性捕捉ＬＣＭＳ分析により測定した、２人のヒト被験者（Ｓｕｂ）から得た血漿中でのエクスビボインキュベーションの０、４、２４、及び４８時間後の完全な二量体としての時間０の割合（％）として表した平均のＦＰ１の濃度を示す。
【図１７】ＧＤＦ１５の異なるＮ末端欠失変異体の投与の前後の痩身Ｃ５７ＢＬ６雄性マウスにおける急性食物摂取量を示す。（欠失のない野生型融合体（Ｎ末端に６ｘＨｉｓタグが結合された配列番号２６）に対して、配列番号９２、１１１、及び１１２）。各群Ｎ＝８匹の動物。＊溶媒と比較してｐ＜０．０５；ｐ値は、二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。
【図１８】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの食物摂取量に対するＦＰ２の１回投与の効果を示す。詳細には、投与後２４時間の累積食物摂取量を示す。各棒内に示される値は、ＰＢＳ群（平均±ＳＥＭ）と比較した低下率（％）である。すべての群で各群Ｎ＝８匹の動物（６ｘＨｉｓ−ＦＰ１のＮ＝６を除く）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｐ値は、二元配置ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定を用いて計算した。
【図１９】ＦＰ２の１回用量の投与後２４時間にスプラーグ・ドーリーラットで測定された累積食物摂取量を示す。各棒内に示される値は、ＰＢＳ群（平均±ＳＥＭ）と比較した低下率（％）である。各群Ｎ＝８匹の動物。＊＊ｐ＜０．０１、ｐ値は、二元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて計算した。
【図２０】ＤＩＯマウスのＦＰ２によるｑ３ｄ処理の間の体重の変化率（％）を示す。矢印は、ＦＰ２の皮下投与の時点を示す。各群Ｎ＝６匹の動物。＊ｐ，０．０５、ｐ値は、二元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて溶媒と比較。
【図２１Ａ】ＤＩＯマウスにおける１４日間のＦＰ２のｑ３ｄ投与後のＯＧＴＴの間の血糖値の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物を用いた。
【図２１Ｂ】ＤＩＯマウスにおける１４日間のＦＰ２のｑ３ｄ投与後のＯＧＴＴの間の血糖値の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物を用いた。
【図２２Ａ】ＤＩＯマウスにおける８日間のＦＰ２のｑ３ｄ投与後のＯＧＴＴの間の血漿インスリン値を示す。＊ｐ＜０．０５、溶媒に対するＦＰ２（０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＦＰ２（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、及びロシグリタゾン。＃ｐ＜０．０５、二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いてロシグリタゾン（１０ｍｇ／ｋｇ）と比較。
【図２２Ｂ】ＤＩＯマウスにおける８日間のＦＰ２のｑ３ｄ投与後のＯＧＴＴの間の血漿インスリン値のＡＵＣを示す。＊ｐ＜０．０５、溶媒と比較、＃ｐ＜０．０５、ロシグリタゾンと比較。
【図２３】ＤＩＯマウスにおける８日間のＦＰ２のｑ３ｄ投与後の摂食血糖値を示す。＊ｐ＜０．０５、二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物を用い、溶媒と比較。
【図２４】ＤＩＯマウスで１４日間のＦＰ２によるｑ３ｄ処理後、１４日目に５時間絶食させた後の絶食ＨＯＭＡ−ＩＲを示す。＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物について、溶媒と比較。
【図２５】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける２ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）及び２ｍｇ／ｋｇ皮下（ＳＣ）投与後のＦＰ２の血清中濃度を示す。各値は、平均±ＳＤを表す（各時点につきｎ＝５の試料）。
【図２６】スプラーグ・ドーリーラットにおける２ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）及び２ｍｇ／ｋｇ皮下（ＳＣ）投与後のＦＰ２の血清中濃度を示す。各時点につき、ｎ＝５試料。
【図２７】イムノアッセイにより分析したカニクイザルにおけるＦＰ２の血漿中濃度を示す。各値は、２２日目（５２８時間）のＩＶのｎ＝２を除き、ｎ＝３の平均±ＳＤを示す。ＩＶ＝静脈内、ＳＣ＝皮下。
【図２８】ＬＣＭＳにより分析したカニクイザルにおける完全な二量体としてのＦＰ２の血漿中濃度を示す。各値は、１６８時間の皮下投与（ＳＣ）のｎ＝２、１２０時間及び４３２時間のＳＣのｎ＝１、並びに１６８時間及び４３２時間の静脈内（ＩＶ）のｎ＝１を除き、ｎ＝３の平均±ＳＤを示す。
【図２９】イムノアッセイにより測定したヒト血漿中での４８時間のＦＰ２のエクスビボ安定性（正規化した回復率（％））を示す。
【図３０】インタクトＬＣ／ＭＳにより測定したヒト血漿中での４８時間のＦＰ２のエクスビボ安定性（正規化した回復率（％））を示す。
【図３１】組換えヒトＧＦＲＡＬ受容体を発現するＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞（Ｎ＝３）でｐＡＫＴアッセイを用いたＦＰ２及びＨＳＡ−ＧＤＦ１５：ＧＤＦ１５ヘテロ二量体の濃度反応曲線を示す。
【図３２】カニクイザルにおけるＦＰ１の１回投与の前後の一日食物摂取量（ｇ）を示す。＊溶媒と比較したＦＰ１の１０ｎｍｏｌ／ｋｇではｐ＜０．０５とした。
【図３３】カニクイザルにおけるＦＰ１の１回投与の前後の体重の変化率（％）を示す。＊溶媒と比較したＦＰ１の１０ｎｍｏｌ／ｋｇではｐ＜０．０５とした。＊ｐ＜０．０５、二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物で溶媒と比較した３ｍｇ／ｋｇの場合。
【図３４】カニクイザルにおけるＦＰ２の１回投与の前後の一日食物摂取量（ｇ）を示す。＊ｐ＜０．０５、二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物で溶媒と比較した場合。
【図３５】カニクイザルにおけるＦＰ２の１回投与の前後の体重の変化率（％）を示す。＊ｐ＜０．０５、溶媒と比較した１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２の場合、＃ｐ＜０．０５、溶媒と比較した３ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２の場合、＆ｐ＜０．０５、溶媒と比較した１ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２の場合（二元配置ＲＭ  ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用い、各群Ｎ＝８匹の動物で）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の背景において、また、明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献のそれぞれをその全容において参照により本明細書に援用するものである。本明細書に含まれる文書、操作、材料、装置、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又はすべてが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【００２７】
別の定義がなされない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用するすべての特許、公開された特許出願及び公開公報は、参照によって恰もその全体が本明細書に記載されているものと同様にして援用するものである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意しなければならない。
【００２８】
本発明は、（ａ）半減期延長タンパク質、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）ＧＤＦ１５タンパク質を含み、Ｎ末端からＣ末端に（ａ）−（ｂ）−（ｃ）の順序で配列された融合タンパク質に関する。
【００２９】
半減期延長タンパク質、リンカー及びＧＤＦ１５タンパク質を含む、本発明の実施形態に基づく融合タンパク質は、ＧＤＦ１５タンパク質の半減期を増大させるため、本発明の融合タンパク質は、代謝性疾患、障害又は状態を治療及び予防するための治療薬としての適性を示す代謝効果を示すことが見出された。このような効果としては、これらに限定されるものではないが、融合タンパク質を投与した動物の体重の減少、耐糖能の向上、インスリン感受性の改善が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用するところの「融合タンパク質」なる用語は、それぞれの部分が異なるタンパク質に由来する、互いに共有結合された２つ以上の部分を有するタンパク質を指す。
【００３１】
本発明の実施形態に基づく融合タンパク質は、任意のＧＤＦ１５タンパク質を含むことができる。本明細書で使用するところの「ＧＤＦ１５タンパク質」なる用語は、天然に存在する野生型増殖分化因子１５タンパク質、又はその機能的変異体を指す。ＧＤＦ１５タンパク質は、ヒト、又はマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ、若しくは霊長類などの他の適当な哺乳動物のような任意の哺乳動物に由来するものとすることができる。特定の実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質は、ヒトＧＤＦ１５タンパク質又はその機能的変異体である。好ましい実施形態では、ＧＤＦ１５タンパク質は、成熟ＧＤＦ１５タンパク質又はその機能的変異体である。
【００３２】
本明細書で使用するところの「成熟ＧＤＦ１５タンパク質」とは、ＲＸＸＲのフーリン様切断部位での細胞内切断後に完全長タンパク質から放出されるＧＤＦ１５のプレプロタンパク質の部分を指す。成熟ＧＤＦ１５タンパク質は、ジスルフィド結合により連結されたホモ二量体として分泌される。本発明の一実施形態では、成熟ＧＤＦ１５タンパク質（ＧＤＦ１５（１９７〜３０８）（配列番号６）と略記される）は、完全長ヒトＧＤＦ１５タンパク質のアミノ酸１９７〜３０８を含む。
【００３３】
本明細書で使用するところの「機能的変異体」とは、親タンパク質と実質的な、又は相当の配列同一性を有し、親タンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを保持している親タンパク質の変異体を指す。親タンパク質の機能的変異体は、本開示を考慮することで当該技術分野では周知の手段により調製することができる。機能的変異体は、親タンパク質のアミノ酸配列に対する１つ以上の改変を含むことができる。かかる改変は、例えば、ポリペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を変化させ、最適ｐＨを変化させることなどによってポリペプチドの物理化学特性を変化させることができる。かかる改変は、親タンパク質の生物学的活性のすべてを喪失又は消失させないものであれば、親タンパク質の生物学的活性を変化させることもできる。
【００３４】
本発明の実施形態によれば、親タンパク質の機能的変異体は、親のタンパク質の生物学的活性に大きく影響しない親タンパク質に対する置換、好ましくは保存的アミノ酸置換を含む。保存的置換としては、これらに限定されるものではないが、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の群内でのアミノ酸置換が挙げられる。非標準又は非天然アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、α−メチルセリン）を使用して親タンパク質中の標準アミノ酸残基を置換することもできる。
【００３５】
本発明の他の実施形態によれば、親タンパク質の機能的変異体は、親タンパク質に対する１つ以上のアミノ酸の欠失及び／又は挿入を含む。例えば、成熟ＧＤＦ１５タンパク質の機能的変異体は、成熟ＧＤＦ１５タンパク質に対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、又はそれ以上のアミノ酸の欠失及び／又は挿入、好ましくは、成熟ＧＤＦ１５タンパク質のＮ末端の１〜３０個のアミノ酸の欠失を含むことができる。
【００３６】
本発明の更なる他の実施形態によれば、親タンパク質の機能的変異体は、親タンパク質に対する置換、好ましくは保存的アミノ酸置換、並びに欠失及び／又は挿入、好ましくはアミノ酸の小さな欠失及び／又は挿入を含む。
【００３７】
本発明の実施形態によれば、本発明の融合タンパク質は、成熟ＧＤＦ１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するＧＤＦ１５タンパク質、例えばＧＤＦ１５（１９７〜３０８）（配列番号６）；又はＮ末端が短縮された成熟ＧＤＦ１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、例えば、ＧＤＦ１５（２００〜３０８）（配列番号７）、ＧＤＦ１５（２０１〜３０８）（配列番号８）、ＧＤＦ１５（２０２〜３０８）（配列番号９）、ＧＤＦ１５（２０３〜３０８）（配列番号１０）、又はＧＤＦ１５（２１１〜３０８）（配列番号１１）を含む。ＧＤＦ１５タンパク質は、食物摂取、血糖値、インスリン抵抗性、及び体重などに対するその効果など、ＧＤＦ１５タンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを維持する限り、配列番号６、７、８、９、１０又は１１に対する置換、挿入、及び欠失の少なくとも１つを有することができる。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号６、７、８、９、１０、又は１１のアミノ酸配列を含むがこれらに限定されない、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５タンパク質を含む。
【００３９】
任意の適当な半減期延長タンパク質を本発明の実施形態に基づく融合タンパク質に使用することができる。本明細書で使用するところの「半減期延長タンパク質」なる用語は、半減期延長タンパク質が融合されたタンパク質の半減期を延長することが知られている任意のタンパク質又はそのフラグメントであってよい。かかる半減期延長タンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、イムノグロブリン（Ｉｇ）の定常フラグメントドメイン（Ｆｃ）、又はトランスフェリン（Ｔｆ）が挙げられる。本発明の実施形態では、半減期延長タンパク質は、ＨＳＡ又はその機能的変異体を含む。本発明の特定の実施形態では、半減期延長タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明の好ましい実施形態では、半減期延長タンパク質は、ＨＳＡの３４位のシステイン残基がセリン又はアラニンに置換されたＨＳＡ又はその機能的変異体を含む。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する半減期延長タンパク質を含む。
【００４１】
任意の適当なリンカーを、本発明の実施形態に基づく融合タンパク質に使用することができる。本明細書で使用するところの「リンカー」なる用語は、ペプチドリンカーを含む連結部分を指す。リンカーは、適正なフォールディングを確実とし、立体障害を最小化し、融合タンパク質内のそれぞれの機能的要素の構造に大きく干渉しないことが好ましい。本発明の特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、２〜１２０個のアミノ酸を含む。例えば、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、又は１２０個のアミノ酸を含む。
【００４２】
本発明の実施形態では、リンカーは、融合タンパク質要素の柔軟性を増大させる。本発明の特定の実施形態では、リンカーは、ＧＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ又はＡＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＴを含むがこれらに限定されない、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ただし、ｎは２〜２０、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５である）を含む柔軟性リンカーとすることができる。
【００４３】
本発明の他の実施形態では、リンカーは構造化されたものである。本発明の特定の実施形態では、リンカーは、ＡＳ−（ＡＰ）ｎ−ＧＴ又はＡＳ−（ＥＡＡＡＫ）ｎ−ＧＴを含むがこれらに限定されない、配列（ＡＰ）ｎ又は（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ただし、ｎは２〜２０、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５である）を含む構造化リンカーとすることができる。本発明の他の実施形態では、リンカーは、配列（ＧＧＧＧＡ）ｎ、（ＰＧＧＧＳ）ｎ、（ＡＧＧＧＳ）ｎ又はＧＧＳ−（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ）ｎ−ＧＧＳ（ｎは２〜２０である）を含む。
【００４４】
本発明の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５、２５〜３０、３６〜３７、４０、４８、５５〜５６、５９〜６０又は６４〜７５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５、２５〜３０、３６〜３７、４０、４８、５５〜５６、５９〜６０及び６４〜７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明のより特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５、２５〜３０、４０、５５〜５６、５５〜５６、５９〜６０、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の更なるより特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９２、配列番号６０、又は配列番号２６のアミノ酸配列を含む。融合タンパク質は、タンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に、ポリヒスチジンタグ、抗原性エピトープ、又は結合ドメインなどの、精製を容易にするタグなどの小さい延長部分を有してもよい。
【００４５】
本明細書に開示される融合タンパク質は、これらに限定されるものではないが、食物摂取量に対する効果、経口耐糖能試験、血糖値の測定、インスリン抵抗性の分析、体重変化、薬物動態分析、毒物動態分析、完全長の融合タンパク質のレベル及び安定性のイムノアッセイ及び質量分析、並びにヒト血漿中でのエクスビボ安定性分析を含むＧＤＦ１５の生物学的活性について特性評価又は評価を行うことができる。
【００４６】
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする単離核酸分子も提供する。本発明の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号５、２５〜３０、３６〜３７、４０、４８、５５〜５６、５９〜６０又は６４〜７５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号５、２５〜３１、３６〜３７、４０、４８、５５〜５６、５９〜６０及び６４〜７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。より特定の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号５、２５〜３０、４０、５５〜５６、５９〜６０、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。更により特定の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号７６〜９１ヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
本発明の他の実施形態によれば、融合タンパク質をコードする核酸分子は、発現ベクター内に存在させることができる。発現ベクターとしては、これらに限定されるものではないが、組換えタンパク質を発現させるためのベクター、及びウイルスベクターなどの、対象の体内に核酸を送達させて対象の組織で発現させるためのベクターなどが挙げられる。本発明との使用に適したウイルスベクターの例としては、これらに限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。ベクターは、非ウイルスベクターであってもよい。非ウイルスベクターの例としては、これらに限定されるものではないが、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージなどが挙げられる。ベクターは、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、又は複製起点などの発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。
【００４８】
本発明の他の実施形態によれば、融合タンパク質をコードする核酸分子は、ヒト胎児由来腎細胞（ＨＥＫ）又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの所望の宿主細胞からの組換えによる発現を向上させるため、本開示を考慮して当該技術分野では周知の技術を用いてコドン最適化することができる。
【００４９】
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞も提供する。宿主細胞としては、これらに限定されるものではないが、組換えタンパク質を発現させるための宿主細胞、及び対象の体内に核酸を送達させて対象の組織で発現させるための宿主細胞などが挙げられる。本発明との使用に適した宿主細胞の例としては、これらに限定されるものではないが、ＨＥＫ又はＣＨＯ細胞が挙げられる。
【００５０】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質を得る方法に関する。一般的な態様では、かかる方法は、（１）融合タンパク質が生成する条件下で、融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養することと、（２）宿主細胞により産生された融合タンパク質を回収することと、を含む。融合タンパク質は、更に当該技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。
【００５１】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、宿主細胞中で発現させられ、これらに限定されるものではないが、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、及び透析を含む１以上の標準的な精製方法の組み合わせを用いて宿主細胞から精製される。好ましくは、融合タンパク質は、プロテアーゼを含まないように精製される。
【００５２】
本発明は、本発明の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。
【００５３】
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を更に提供する。本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む組成物は、融合タンパク質を発現させるために核酸分子を細胞内に導入するための送達媒介物を含むことができる。核酸送達媒介物の例としては、リポソーム、天然ポリマー及び合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー、リポ蛋白質、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、人工ウイルスエンベロープ、金属粒子、及び細菌、バキュロウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルスウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、並びに各種の真核宿主での発現について記載されている当該技術分野で通常用いられている他の組換え用媒介物が挙げられる。
【００５４】
薬学的に許容される担体は、１以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、安定化剤、又は当業者には周知の他の材料を含むことができる。薬学的に許容される担体の例としては、これらに限定されるものではないが、水、生理食塩水、緩衝剤、糖類などの等張化剤、多価アルコール、湿潤剤又は乳化剤などの補助物質、防腐剤、及びこれらの組み合わせの１以上のものが挙げられる。かかる材料は無毒性でなければならず、かつ使用される用量及び濃度で有効成分の効果を妨げてはならない。担体又は他の材料の厳密な性質は、投与経路、例えば、筋肉内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば、腸内）、鼻腔内又は腹腔内経路などに応じて決まり得る。例えば、液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物又は植物油、鉱油又は合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロース若しくは他の糖液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコール類が含まれてもよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態として、又は溶液として保管することができ、一般に皮下注射針を穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルのような、無菌アクセスポートを有する容器に入れられる。
【００５５】
本発明の実施形態によれば、医薬組成物は、別の有効成分などの１以上の追加成分を含むことができる。
【００５６】
本発明は、本発明の医薬組成物を含むキットにも関する。かかるキットは、本発明の乾燥融合タンパク質を有する第１の容器と、対象への投与に先立って乾燥融合タンパク質と混合される水溶液を有する第２の容器とを含むか、又は本発明の液体医薬組成物が入った単一の容器を含むことができる。かかるキットは、本発明の医薬組成物の単一用量投与単位又は複数用量投与単位を含むことができる。かかるキットは、１以上の予め充填された注射器（例えば、液体注射器及びリオシリンジ（lyosyringe））を含んでもよい。キットはその使用説明書を含んでもよい。かかる使用説明書は、キット内で与えられる材料の使用及び性質について記載したものでよく、治療される正確な代謝性疾患に適合したものとすることができる。
【００５７】
本発明は、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチなどの代謝性疾患、障害又は状態を治療又は予防するための本明細書に記載される医薬組成物の使用にも関する。本発明の実施形態によれば、治療を要する対象の代謝性疾患、障害、又は状態を治療又は防止する方法は、対象に治療上又は予防上の有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物又は融合タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物を含む、本明細書に記載される医薬組成物のいずれのものも、本発明の方法で使用することができる。
【００５８】
本明細書で使用するところの「対象」とは、本発明の実施形態による方法によって治療される、又は治療された任意の動物、詳細には哺乳動物、最も詳細にはヒトを意味する。本明細書で使用するところの「哺乳動物」なる用語は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル又は類人猿などの非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、より詳細にはヒトが挙げられる。
【００５９】
「代謝性疾患、障害又は状態」とは、異常代謝に関連するあらゆる障害を指す。本発明の方法にしたがって治療することができる代謝性疾患、障害又は状態の例としては、これらに限定されるものではないが、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチが挙げられる。
【００６０】
本明細書で使用するところの「治療する」、「治療される」、及び「治療」なる用語は、対象に組成物を投与して対象で所望の治療的又は臨床的転帰を得ることを指す。一実施形態では、「治療する」、「治療される」、及び「治療」なる用語は、本発明の医薬組成物を投与することにより、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチなどの代謝性疾患の進行又は進展を低減、緩和又は遅延させることを指す。
【００６１】
「治療有効量」なる用語は、所望の生物学的又は臨床的効果を生じるために必要とされる治療活性化合物の量を意味する。本発明の実施形態によれば、「治療有効量」は、臨床上の結果を含む、有用な、又は所望の結果を生じるのに充分な量である。治療有効量は、１回又はそれよりも多い投与で投与することができる。疾患状態に関連して、有効量とは、疾患の進展を改善、安定化、又は遅延させるうえで充分な量である。本発明の特定の実施形態によれば、治療有効量とは、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチなどの代謝性疾患、障害、又は状態を治療又は予防するために必要とされる融合タンパク質の量である。
【００６２】
本発明の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、筋肉内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば、腸内）、鼻腔内又は腹腔内の投与経路などの、本開示を考慮することで当業者には周知の任意の方法によって対象に投与することができる。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、静脈内注射又は皮下注射によって対象に投与される。
【００６３】
本発明の実施形態による、医薬組成物の対象への投与量、投与頻度、及び投与期間などのパラメータは、いずれの特定の形でも限定されない。かかるパラメータの最適値は、治療する対象、治療される特定の代謝性疾患、疾患の重症度、投与経路などの様々な要因によって決まり得るものであり、当業者であれば、所望の治療的又は臨床的転帰が得られるようにかかるパラメータの最適値を決定することができる。例えば、医薬組成物は、１日１回、又は１日複数回、例えば２回、３回、４回といった具合で投与することができる。一般的な用量は、上記に述べたもののような因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以下、又はそれ以上の融合タンパク質の範囲とすることができる。
【００６４】
実施形態
実施形態１は、（ａ）半減期延長タンパク質、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）ＧＤＦ１５タンパク質を含み、Ｎ末端からＣ末端に（ａ）−（ｂ）−（ｃ）の順序で配列された融合タンパク質に関する。
【００６５】
実施形態２は、ＧＤＦ１５タンパク質が、ヒトＧＤＦ１５タンパク質又はその機能的変異体である、実施形態１に記載の融合タンパク質である。
【００６６】
実施形態３は、ＧＤＦ１５タンパク質が、配列番号６〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の融合タンパク質である。
【００６７】
実施形態４は、ＧＤＦ１５タンパク質が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の融合タンパク質である。
【００６８】
実施形態５は、ＧＤＦ１５タンパク質が、配列番号６〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載の融合タンパク質である。
【００６９】
実施形態６は、半減期延長タンパク質が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はその機能的変異体を含む、実施形態１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質である。
【００７０】
実施形態７は、半減期延長タンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態６に記載の融合タンパク質である。
【００７１】
実施形態８は、半減期延長タンパク質が、配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の融合タンパク質である。
【００７２】
実施形態９は、リンカーが柔軟性リンカーである、実施形態１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質である。
【００７３】
実施形態１０は、リンカーが、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ただし、ｎは２〜２０である）、例えばＧＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｘ８又はＡＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｘ８−ＧＴを含む、実施形態９に記載の融合タンパク質である。
【００７４】
実施形態１１は、リンカーが構造化リンカーである、実施形態１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質である。
【００７５】
実施形態１２は、リンカーが、配列（ＡＰ）ｎ又は（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ただし、ｎは２〜２０である）、例えばＡＳ−（ＡＰ）ｎ−ＧＴ又はＡＳ−（ＥＡＡＡＫ）ｎ−ＧＴを含む、実施形態１１に記載の融合タンパク質である。
【００７６】
実施形態１３は、配列番号５、２５〜３１、３６〜３７、４０、４８、５５〜６０又は６４〜７５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。
【００７７】
実施形態１４は、配列番号５、２５〜３１、３６〜３７、４０、４８、５５〜６０、及び６４〜７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１３に記載の融合タンパク質である。
【００７８】
実施形態１５は、配列番号５、２５〜３０、４０、５５〜６０、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１４に記載の融合タンパク質である。
【００７９】
実施形態１６は、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする単離核酸分子である。
【００８０】
実施形態１７は、配列番号７６〜９１のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子である。
【００８１】
実施形態１８は、実施形態１６又は１７の核酸分子を含む発現ベクターである。
【００８２】
実施形態１９は、実施形態１６又は１７の核酸分子を含む宿主細胞である。
【００８３】
実施形態２０は、（１）融合タンパク質が生成する条件下で、融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養することと、（２）宿主細胞により産生された融合タンパク質を回収することと、を含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の融合タンパク質を作製する方法である。
【００８４】
実施形態２１は、回収する工程が、融合タンパク質を精製してプロテアーゼを除去することを含む、実施形態２０に記載の方法である。
【００８５】
実施形態２２は、治療有効量の実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
【００８６】
実施形態２３は、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする治療有効量の核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
【００８７】
実施形態２４は、実施形態２２又は２３に記載の医薬組成物を含むキットである。
【００８８】
実施形態２５は、代謝性疾患を治療又は予防する方法であって、疾患の治療又は予防を要する対象に、有効量の実施形態２２及び２３のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法である。
【００８９】
実施形態２６は、代謝性疾患が、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチからなる群から選択される、実施形態２５に記載の方法である。
【００９０】
実施形態２７は、医薬組成物が対象に皮下又は静脈内投与される、実施形態２５又は２６に記載の方法である。
【００９１】
実施形態２８は、治療を要する対象において、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患を治療する方法であって、対象に、配列番号５、２５〜３０、４０、５５〜６０、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む、治療有効量の医薬組成物を皮下又は静脈内投与することを含む、方法である。
【００９２】
実施形態２９は、治療を要する対象において、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患を治療する方法であって、対象に、配列番号６０のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む、治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法である。
【００９３】
実施形態３０は、医薬組成物が対象に静脈内又は皮下投与される、実施形態２５〜２９のいずれか１つに記載の方法である。
【００９４】
実施形態３１は、２型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患の治療又は予防に使用するための実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の融合タンパク質である。
【実施例】
【００９５】
以下の本発明の実施例は、本発明の本質を更に説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は付属の請求項によって定められる点を理解されたい。
【００９６】
実施例１：ＧＤＦ１５を含む融合分子の設計（ＧＤＦ１５の短縮化の影響）
他のＴＦＧβファミリーのメンバーと同様、ＧＤＦ１５は、小胞体内で二量体を形成し、フーリン様に切断されて分泌型の成熟ＧＤＦ１５（アミノ酸１９７〜３０８）を生じるプレプロタンパク質として合成される。分泌型の成熟ＧＤＦ１５ホモ二量体は約２５ｋＤａであり、各単量体は最大で４つの分子内ジスルフィド結合を形成することができ、１つの分子間ジスルフィド結合によってホモ二量体の構成要素同士が連結されている。
【００９７】
本発明ではＧＤＦ１５の結晶構造を決定し、これを図１Ａ及び図１Ｂに示す。この結晶構造は、成熟ＧＤＦ１５のＣ末端が二量体の界面に埋め込まれているのに対して、Ｎ末端は露出していることを示している。この露出した末端は、ＧＤＦ１５のＮ末端に対する半減期延長タンパク質などの融合タンパク質の連結を可能とする。
【００９８】
この結晶構造は、ＧＤＦ１５のシステイン残基の新規なジスルフィドのペアリングパターンも示している。ＴＦＧβ１がＣ１〜Ｃ３及びＣ２〜Ｃ７のペアリング（すなわち、その１番目と３番目のシステイン残基間のペアリングと、その２番目と７番目のシステイン残基間のペアリング）を有しているのに対して、ＧＤＦ１５はＣ１〜Ｃ２及びＣ３〜Ｃ７のペアリングを有している（図１Ａ及び図１Ｂを参照）。この固有のジスルフィドペアリングは、タンパク質のＮ末端に、他のジスルフィド結合を含むシステインノットから離れて位置するＣ１〜Ｃ２ペアリングによって形成されたループを生じる。この構造により、ＧＤＦ１５のＮ末端が二量体の形成又は全体のタンパク質のフォールディングにとって重要ではない可能性があり、ＧＤＦ１５及びそのＮ末端融合タンパク質は、Ｃ１及びＣ２、Ｃ１〜Ｃ２ループ内の残基、又は更にはＣ２のＣ末端側の残基を欠失させるＮ末端欠失によっても影響を受けない可能性が予測される。
【００９９】
実施例２：ＧＤＦ１５を含む融合分子の設計（リンカーの影響）
ＨＳＡ分子とＧＤＦ１５分子との間の異なるリンカーについて評価した。配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを含む可撓性リンカーと、配列（ＡＰ）ｎ又は（ＥＡＡＡＫ）ｎを含む構造化リンカー（ただし、ｎは２〜２０である）の両方を評価した。
【０１００】
異なるリンカーを含む融合タンパク質を、それらの生物物理特性、痩身マウスの食物摂取の効果に対するそれらの影響、それらのマウスでの薬物動態（ＰＫ）値、及びヒト血液中でのそれらのエクスビボ安定性について比較した。試験したリンカー変異体の結果を表１に示す。（ＥＡＡＡＫ）８リンカーを含む、配列番号３１を含む分子は、ＨＰＬＣにより凝集を示した。表１の残りの７種類のリンカー変異体は、凝集を示さなかった。
【０１０１】
【表１】
2019523637.tif 000003
＊  精製目的でＮ末端に６ｘＨｉｓタグを結合した
【０１０２】
これらの変異体においても、マウスでのインビボ実験により、また、ヒトの全血及び血漿試料中でのエクスビボ安定性実験により、リンカーの安定性を評価した。２つの検出の形態を用いてこれらの実験からの結果を分析した。抗ＧＤＦ１５捕捉抗体と抗ＨＳＡ検出抗体のペアを用いたイムノアッセイを用いて、リンカーの両側の両分子の存在を測定することにより、リンカーがどの程度、完全であるかを評価した。分子全体の完全性の大まかな状態を、ＨＳＡ及びＧＤＦ１５からの異なる代理ペプチド配列を用いて液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析した。イムノアッセイは、すべてのリンカー変異体について安定したＰＫプロファイルを示し、いずれのリンカー変異体についても血漿中の試料濃度のスパイクの消失は４８時間にわたって認められなかった。ＬＣ−ＭＳの結果はイムノアッセイと一致し、ＨＳＡ及びＧＤＦ１５分子の異なる部分からの代理ペプチドが完全であることを示した。代理ペプチドを用いてＬＣ−ＭＳにより分析したリンカー変異体のＰＫプロファイルは、異なるリンカー変異体で同様の傾向を示し、いずれのリンカー変異体も７日目において検出可能なレベルを示した。表１のすべての変異体は、配列番号３１を除き、所望の生物物理特性及びＰＫ値を示した。
【０１０３】
各リンカー変異体を、痩身マウスで食物摂取実験を行うことによりそれらのインビボ活性について評価した。表２は、食物摂取量の減少における融合タンパク質の効果に対するリンカー変異体の影響を示す。効果に対するリンカーの明らかな影響が認められた。柔軟な（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーでは、リンカーの長さを２個〜４個〜８個に増やすことで融合タンパク質の効果が大幅に増大した。より固い（ＡＰ）ｎリンカーでは、この傾向はそれほど顕著ではなく、融合タンパク質内のＧＤＦ１５分子の自由度がその効果に重要な役割を果たしていることを示唆している。
【０１０４】
【表２】
2019523637.tif 000004
＊  精製目的でＮ末端に６ｘＨｉｓタグを結合した
【０１０５】
実施例３：ＧＤＦ１５を含む融合分子の設計（ＨＳＡ突然変異の影響）
半減期延長タンパク質としてのヒト血清アルブミンを、ＧＤＦ１５のＮ末端にリンカーによって融合させた組換えタンパク質を設計した。この設計によれば、ＧＤＦ１５の二量体化のための界面が不安定化しないため、天然の分子間鎖ジスルフィド結合が形成され、融合されたＨＳＡタンパク質がそれぞれのＧＤＦ１５アームから伸びたＧＤＦ１５ホモ二量体が得られる。このアプローチによれば、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５ホモ二量体を作製するうえで１個の遺伝子しか必要としない。
【０１０６】
天然のヒト血清アルブミンタンパク質は、１７個のジスルフィド結合を形成する３５個のシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）残基を含んでおり、Ｃｙｓ−３４残基が分子中で唯一の遊離システインである。この遊離Ｃｙｓ−３４は、複数の活性酸素種（ＲＯＳ）及び活性窒素種（ＲＮＳ）を捕捉することにより、フリーラジカルスカベンジャーとして機能することが示されている。そこでこの遊離Ｃｙｓを変異させて酸化による不均一性が生じるリスクを最小とした。
【０１０７】
ＨＳＡの３４位の遊離システインをセリン又はアラニンに変異させ、これらのＨＳＡ（Ｃ３４Ｓ）又はＨＳＡ（Ｃ３４Ａ）変異を有するＧＤＦ１５融合分子を分析した。これらの分子はいずれも、（ｉ）イオン交換クロマトグラフィー、（ｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び（ｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィー、の３段階の精製方法を用いて精製した。これらの分子が最初に作製された時点では、ＨＰＬＣ分析はどちらの分子も純粋であり、凝集がないことを示した（表３）。
【０１０８】
しかしながら、作製の２週後、ＨＳＡ（Ｃ３４Ｓ）変異を有する融合タンパク質（配列番号４８を含む）は、ＨＰＬＣにより凝集を示したのに対して、ＨＳＡ（Ｃ３４Ａ）変異を有するタンパク質（配列番号４０）は、４週後でも凝集がないままであった。
【０１０９】
【表３】
2019523637.tif 000005
【０１１０】
実施例４：ＧＤＦ１５のプロテアーゼ切断傾向
本発明者らはＧＤＦ１５のアミノ酸位置１９８のアルギニン残基（Ｒ１９８）がＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合分子内でプロテアーゼ分解を受けやすいことを観察した。このような分解によって不均一な集団が生じ、治療組成物としては望ましくない。このような切断は、プロテアーゼ阻害剤カクテルによって防止することができる。各精製方法をプロテアーゼの除去について調べた。表４に、ＨＰＬＣにより測定される、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質の精製について試験した２種類のＨＳＡアフィニティーカラムを示す。精製の時点で、いずれの方法によって精製されたＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質も純度１００％であり、完全であった。低濃度（２〜５ｍｇ／ｍｌ）では、いずれの方法により精製されたタンパク質も４週間の試験期間全体にわたって完全に保たれた。しかしながら、高濃度（４０〜５０ｍｇ／ｍｌ）では、抗体に基づいたＨＳＡ樹脂（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ社）のみがプロテアーゼを含まないタンパク質を生じ、これは４週間の試験期間全体にわたって完全に保たれた。ＨＳＡ−リガンドに基づいた樹脂（Ａｌｂｕｐｕｒｅ社）により得られたタンパク質は、初期には完全であったが、高濃度で保存した場合、時間とともに分解した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩ）及びＥＤＴＡの添加により、Ａｌｂｕｐｕｒｅ社の樹脂を用いて精製された高濃度のＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質の分解は完全に停止した。したがって、精製法は、安定した治療組成物を生成するうえで重要な役割を担っている。これに相当する分解は、インビボでもエクスビボでも観察されず、治療組成物がいったんプロテアーゼを含まないものとして調製されると、融合タンパク質の分解はインビボでは問題とならないことを示している。したがって、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ社の樹脂を用いた方法のように、製造時に潜在的なプロテアーゼを効果的に除去することができる精製法は、均質で完全かつ安定したＧＤＦ１５治療薬を効果的に製造するうえで不可欠である。
【０１１１】
【表４】
2019523637.tif 000006
【０１１２】
実施例５：ＧＤＦ１５のＮ末端欠失変異体
図１Ａ及び図１Ｂに示されるＧＤＦ１５結晶構造によれば、欠失変異体に関与するＧＤＦ１５のＮ末端は、二量体形成及び全体のタンパク質フォールディングにとって重要ではないことが予測される。この結晶構造によれば、このようなＮ末端欠失はいずれの潜在的な受容体相互作用にも影響しないことも予測される。ＧＤＦ１５のＮ末端の様々な欠失を含むＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質をインビボ活性について試験した。
【０１１３】
ＧＤＦ１５のプロテアーゼ切断部位（Ｒ１９８）を除去したＧＤＦ１５のＮ末端欠失変異体を設計した。Ｒ１９８残基の直後には残基Ｎ１９９〜Ｇ２００の潜在的脱アミノ化部位があるが、基質の脱アミノ化は治療組成物ではやはり好ましくない。ＧＤＦ１５のＮ末端欠失は、タンパク分解切断部位及び脱アミノ化部位の両方を除去することができる。ＨＳＡとともに融合タンパク質に組み込んだ、得られたＧＤＦ１５欠失変異体には、ＧＤＦ１５（２０１〜３０８、配列番号８）、ＧＤＦ１５（２０２〜３０８、配列番号９）、及びＧＤＦ１５（２１１〜３０８、配列番号１１）が含まれた。マウスでのインビボ実験により、ＧＤＦ１５のＮ末端欠失変異体は食物摂取量を低減させるうえで依然活性を有していることが示された（図１７）。実験の結果より、これらのＧＤＦ１５のＮ末端欠失変異体は、適正に発現され、適切な二量体を形成し、インビボデアクティブであることが確認された。
【０１１４】
実施例６：ＧＤＦ１５の不活性突然変異体
表５は、ＧＤＦ１５のインビボ活性を消失させ、ＧＤＦ１５の機能的エピトープを同定するために作製したＧＤＦ１５の１２種類の突然変異体を示している。これらの突然変異体には、５種類の１重突然変異体、２種類の２重突然変異体、及び５種類の３重突然変異体が含まれる。これらの突然変異を含むＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質をそれらの生物物理特性及び活性について特性評価を行った（表５）。１２種類の突然変異体のうち、１つは発現がみられず、４つは時間とともに凝集体を形成し、これらの変異がタンパク質フォールディング及び生物物理特性を妨げることを示した。残りの７種類の突然変異体のうち、４つはＧＤＦ１５の１重突然変異を有するものであり、これらの変異体を、マウスで野生型と比較した食物摂取量の低下について試験した。３つの１重突然変異体（Ｉ８９Ｒ、Ｉ８９Ｗ及びＷ３２Ａ）はインビボ活性を失ったが、残りの変異体（Ｑ６０Ｗ）は野生型と同様の活性を示した。これらの結果は、Ｉ８９Ｒ、Ｉ８９Ｗ及びＷ３２Ａ変異が、ＧＤＦ１５の受容体／共受容体との相互作用を妨げることを示し、ＧＤＦ１５の機能性エピトープが残基Ｉ８９及びＷ３２の周辺にあることを示唆するものであった。突然変異の番号付けは、融合タンパク質中に存在する成熟ＧＤＦ１５に基づいている。例えば、「１」は成熟ＧＤＦ１５（配列番号６）の１番目のアミノ酸を指し、「８９」は成熟ＧＤＦ１５タンパク質の８９番目のアミノ酸を指す。
【０１１５】
【表５】
2019523637.tif 000007
＊  精製目的でＮ末端に６ｘＨｉｓタグを結合した
【０１１６】
実施例７：発現及び精製方法
発現
２０ｍｌよりも多く発現させるため、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地中で増殖させたＨＥＫ  Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞を用いて発現を行った。細胞を８％ＣＯ２下で１２５ＲＰＭで振盪しながら３７℃で増殖させた。Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現キットを使用して細胞を１ｍｌ当たり２．５×１０６個でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞１Ｌにつき、１ｍｇの全ＤＮＡを２５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに希釈し、２．６ｍｌのＥｘｐｉ２９３（商標）試薬を２５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに希釈し、室温で５分間インキュベートした。希釈したＤＮＡと希釈したＥｘｐｉ２９３試薬を加え合わせ、室温で２０分間インキュベートした。次に、このＤＮＡ複合体を細胞に加えた。細胞を振盪インキュベーターに一晩入れた。トランスフェクションの翌日、５ｍｌのキットのＥｎｈａｎｃｅｒ１を５０ｍｌのキットのＥｎｈａｎｃｅｒ２に希釈し、２つのＥｎｈａｎｃｅｒの全量を細胞に加えた。トランスフェクトした細胞をインキュベーター内に再び４日間戻してから収穫した。細胞を６０００ｇで３０分間遠心分離して濃縮した後、精製工程に先立って０．２μｍのフィルターで濾過した。
【０１１７】
発現をＣＨＯ細胞でも行った。プラスミドを精製し、特性評価を行った。トランスフェクションに先立ち、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５のコーディング領域を含むプラスミドＤＮＡ２００μｇの１つのアリコートをＡｃｌ  Ｉによる制限酵素消化によって直鎖化した。この制限エンドヌクレアーゼによる消化によって、アンピシリン耐性遺伝子を確実に除去する。２つの１５μｇの直鎖化ＤＮＡアリコートを、ＢＴＸ  ＥＣＭ  ８３０Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌマニピュレータ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、マサチューセッツ州ホリストン）を使用して２つの１×１０７細胞（トランスフェクションプールＡ及びＢとした）にトランスフェクトした。細胞を、電極ギャップ４ｍｍのキュベット中、１５ミリ秒のパルス長及び５秒のパルス間隔で２５０Ｖで３回電気穿孔した。トランスフェクトした細胞を振盪フラスク内のＭＡＣＨ−１＋Ｌ−グルタミンに移し、１日間インキュベートした。トランスフェクションプールＡ及びトランスフェクションプールＢを遠心し、ＭＡＣＨ−１＋ＭＳＸ中に再懸濁し、振盪フラスコに移して６日間インキュベートした。トランスフェクションプールＡ及びトランスフェクションプールＢからのトランスフェクトしたＨＳＡ融合タンパク質産生細胞をプールし、電気穿孔から８日目にメチルセルロースに播種した。
【０１１８】
精製
ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ樹脂及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いた２段階精製を用いた。一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３（商標）細胞からの細胞上清を、樹脂１ｍｌ当たりタンパク質１０ｍｇの適当な容量で、予め平衡化した（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＨＳＡ  ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より販売されるＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトアルブミンアフィニティーマトリクス）にロードした。ローディング後、未結合タンパク質をカラム容量（ＣＶ）の１０倍量のＰＢＳ（ｐＨ７．２）でカラムを洗浄することによって除去した。カラムに結合したＨＳＡ−ＧＤＦ１５を１０ＣＶの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）中の２Ｍ  ＭｇＣｌ２で溶出した。ピーク画分をプールし、濾過（０．２μ）し、４℃のＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して透析した。透析後、タンパク質を再び濾過し（０．２μ）、適当な体積にまで濃縮した後、２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にロードした。高い純度でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）から溶出したタンパク質画分（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したもの）をプールした。タンパク質の濃度は、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴＴＭ分光光度計で２８０ｎｍの吸光度で測定した。精製したタンパク質の質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び分析用サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ、Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ社）によって評価した。内毒素レベルをＬＡＬアッセイ（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）−Ｔ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ社）を用いて測定した。
【０１１９】
Ａｌｂｕｐｕｒｅ樹脂及びＳＥＣを用いた２段階精製を用いた。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質を、ＨＳＡに選択的に結合するように固定化した合成トリアジンリガンドを用いたＡｌｂｕＰｕｒｅ樹脂（ＰｒｏＭｅｔｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて室温で精製した。発現用上清をＡｌｂｕＰｕｒｅ樹脂に流した。次いで、樹脂を最初に４ＣＶのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で、次に４ＣＶの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファで洗浄した。カラムに結合したＨＳＡ−ＧＤＦ１５を１００ｍＭのオクタン酸Ｎａを含む４ＣＶのＰＢＳバッファ（ｐＨ７．２）で溶出した。タンパク質を含む画分を、カットオフ値が分子量３０，０００ｋＤａのスピンコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ社）を使用して１０ｍＬの体積にまで濃縮してから、ＰＢＳバッファ（ｐＨ７．２）で平衡化した２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００ｐｇカラム（ＧＥ）に流した。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５二量体を含むＳＥＣ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、分析用にプールした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥ−ＨＰＬＣによりタンパク質の純度を評価した。
【０１２０】
実施例８〜１４、及び１９では、配列番号６０のアミノ酸配列を有する本発明の例示的な融合タンパク質の特性評価を行っている。この融合タンパク質は、グリシン及びセリン残基からなるアミノ酸４２個のリンカーＧＳ−（ＧＧＧＧＳ）８を介した、ＨＳＡの成熟ヒトＧＤＦ１５との融合体のホモ二量体として存在する完全な組換えタンパク質である。この融合タンパク質の予測される分子量は、１６２，６９６Ｄａであり、ＨＳＡの３４位の１個の天然遊離システインがセリンに変異している。この特定のＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質を、簡潔にするために、以下の実施例では単に「ＦＰ１」と呼ぶものとする。ＡＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｘ８−ＧＴリンカーを含むＦＰ１の６ｘＨｉｓタグ付加変異体（６ｘＨｉｓ−ＦＰ１、配列番号２６）を、以下の実施例の一部で比較のために使用した。
【０１２１】
実施例８：Ｃ５７Ｂ１／６マウスの食物摂取量に対するＦＰ１の効果
この実験の目的は、Ｃ５７Ｂ１／６マウスの食物摂取の阻害に対するＦＰ１の用量応答性の効果を実証することであった。
【０１２２】
雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＢｉｏＤＡＱケージ内で最低７２時間、環境順応させた。その後、マウスを食物摂取量に基づいて１群８匹ずつの６群に事前の２４時間にグループ分けした。午後４：００〜５：００の間に、動物の体重を測定し、溶媒又はＦＰ１を含む組成物を皮下注射により投与した。各ケージについて、食物摂取量の変化をＢｉｏＤＡＱシステムにより、注射後４８時間にわたって継続的に記録した。この実験では、６ｘＨｉｓ−ＦＰ１を比較に用いた。
【０１２３】
結果（図２及び表６）を、所定の時間間隔での累積食物摂取量の平均として表した。結果は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへのＦＰ１の皮下投与が、試験したすべての用量及び時点において食物摂取を溶媒処理した動物に対して有意に阻害したことを示した。６ｘＨｉｓ−ＦＰ１は、８ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で食物摂取を低減させた。
【０１２４】
【表６】
2019523637.tif 000008
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０５；＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０１；＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．００１；＊＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０００１
一元配置分散分析：テューキーの多重比較検定；ｎ＝８／群
【０１２５】
実施例９：スプラーグ・ドーリー（Sprague Dawley）ラットの食物摂取量に対するＦＰ１の効果
この実験の目的は、スプラーグ・ドーリーラットの食物摂取の阻害に対するＦＰ１の用量応答性の効果を実証することであった。
【０１２６】
雄性スプラーグ・ドーリーラットをＢｉｏＤＡＱケージ内で最低７２時間、環境順応させた。その後、ラットを食物摂取量に基づいて１群８匹ずつの６群に事前の２４時間にグループ分けした。午後４：００〜５：００の間に、動物の体重を測定し、溶媒又は融合タンパク質を含む組成物を皮下注射により投与した。各ケージについて、食物摂取量の変化をＢｉｏＤＡＱシステムにより、注射後４８時間にわたって継続的に記録した。この実験では、６ｘＨｉｓ−ＦＰ１を比較に用いた。
【０１２７】
結果を図３及び図７に示す。ＦＰ１の皮下投与は、溶媒処理動物と比較して２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で食物摂取を阻害した。阻害率は、投与２４及び４８時間後で、試験した最高用量（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）でのみ有意差に達した。ＦＰ１は、用量８ｎｍｏｌ／ｋｇで食物摂取を低下させ、その効果は２４及び４８時間で有意であった。
【０１２８】
【表７】
2019523637.tif 000009
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０５；＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０１
一元配置分散分析：テューキーの多重比較検定；ｎ＝８／群
【０１２９】
実施例１０：食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおけるグルコースホメオスタシス及び体重に対するＦＰ１の効果
この実験の目的は、ＤＩＯＣ５７Ｂｌ／６マウスに処理を行った２週間全体を通じて食物摂取量、体重、及びグルコースホメオスタシスに対するＦＰ１の効果を評価することであった。
【０１３０】
雄性ＤＩＯマウスの体重を測定し、ＦＰ１を０、３、６、９、及び１２日目の３日ごと（ｑ３ｄ）に２ｍＬ／ｋｇを皮下投与した。溶媒処理群及びロシグリタゾン処理群に同様のレジメンでＰＢＳを投与した。コントロールのロシグリタゾンは、０．０１５％で食餌中で自由に与えた。マウス及び食餌重量を毎日記録した。血糖値測定器（Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｌｉｆｅｓｃａｎ、カリフォルニア州ミルピタス）を用いて血糖値を測定した。体脂肪量及び除脂肪量を、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｍｉｎｉ−Ｓｐｅｃ  ＬＦ１１０を使用し、時間領域ＮＭＲ（ＴＤ−ＮＭＲ）により覚醒状態のマウスで定量した。経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）において、マウスを４時間絶食させた。２ｇ／ｋｇのグルコースを１０ｍＬ／ｋｇで強制経口投与した０、３０、６０、９０、及び１２０分後に尾を切って血糖値を測定した。グルコース投与の０、３０、及び９０分後にインスリンを測定した。
【０１３１】
実験の終了時にマウスをＣＯ２吸入により安楽死させ、最終血液試料を採取した。血清を濡れた氷の入った９６穴プレートに入れた後、−８０℃で保存した。肝臓を摘出し、肝臓切片の合計質量に対する脂肪含量を、製造者の指示にしたがってＢｒｕｋｅｒ  ＭｉｎｉＳｐｅｃ  ｍｑ６０でＴＤ−ＮＭＲを用いて評価した。
【０１３２】
インスリン抵抗性の絶食ホメオスタシスモデル（ＨＯＭＡ−ＩＲ）を、絶食血糖値（ｍｇ／ｄＬ）とインスリン値（ｍＵ／Ｌ）との積を４０５の因数で割ることによって計算した。
【０１３３】
ＤＩＯマウスを１ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ１によりｑ３ｄで処理することにより、体重（表８）及び食物摂取量（表９）が低下した。低下量は、下記に述べる特定の時点でのみ統計的に有意な値に達した。
【０１３４】
ＦＰ１は、ＤＩＯマウスで１（２〜１４日目）及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（１〜１４日目）の用量で体重を減少させた（表８及び図４）。食物摂取量の有意な低下は、１ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で実験の１及び２日目に、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で１、８、及び９日目に認められた（表９）。
【０１３５】
【表８】
2019523637.tif 000010
【０１３６】
【表９】
2019523637.tif 000011
【０１３７】
実験１４日目に実施したＯＧＴＴにおいて、ＦＰ１は、試験した３つの用量すべてで、時点０以降のすべての時点において溶媒処理動物と比較して血糖値を有意に低下させた（表１０）。これを、曲線下全面積（ＡＵＣ）及びΔＡＵＣとして更に定量したところ、試験した３つの用量すべてで溶媒と比較して有意に低かった（表１０及び図５Ａ及び図５Ｂ）。
【０１３８】
【表１０】
2019523637.tif 000012
【０１３９】
摂食血糖値を、実験開始（０日目）、７日目、及び１３日目に測定した（表１１、及び図６）。ＦＰ１は、実験の１３日目に１ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で血糖値を統計的に有意に低下させた。
【０１４０】
【表１１】
2019523637.tif 000013
【０１４１】
ＯＧＴＴの間の血漿インスリン値は、ＦＰ１では、３０分において０．１ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で対応する溶媒群よりも有意に高く、同じ時点で１及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で低かった（表１２）。全ＡＵＣにより測定されるＯＧＴＴの間のインスリン変動は、０．１ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ１の用量では溶媒群よりも高く（表１２）、１及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量ではより低かった。いずれの場合も、最低用量においてのみ統計的有意差に達した。９０分の時点で１及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ１で処理したマウスはより低いインスリン値を示したが、この効果は統計的有意差を示さなかった。インスリン感受性の指標として用いたＨＯＭＡ−ＩＲは、実験の１４日目に測定した。この時点で、ＦＰ１は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇでＨＯＭＡ−ＩＲを低下させ、インスリン感受性を改善した（表１３及び図７）。
【０１４２】
【表１２】
2019523637.tif 000014
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。ｎ＝８／群
＊  溶媒処理群と比較してｐ＜０．０５
【０１４３】
【表１３】
2019523637.tif 000015
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
ｎ＝８／群
＊  溶媒処理群と比較してｐ＜０．０５
【０１４４】
１３日目までに達成された体重減少の大きさは、いずれの用量でも絶対体脂肪量又は体脂肪率（％）の測定可能な変化を生じなかった（表１４）。１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量では、絶対除脂肪量に有意な減少が認められた。この減少は、除脂肪率（％）として表した場合には認められなかった。実験の１５日目に最終的な剖検を行って肝重量を測定した（表１５）。ＦＰ１は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で絶対肝重量及び体重の割合（％）としての肝重量を減少させた。１ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で減少が認められたが、これはどちらのパラメータでも統計的に有意な値には達しなかった。肝脂肪を生検でＮＭＲにより測定した（表１６）。ＦＰ１融合タンパク質は、１及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、肝生検重量の割合（％）として表される肝脂肪含有率を減少させた。この低下はより高い用量で有意であった。
【０１４５】
【表１４】
2019523637.tif 000016
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。ｎ＝８／群
＊  溶媒処理群と比較してｐ＜０．０５
【０１４６】
【表１５】
2019523637.tif 000017
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。ｎ＝８／群
＊  溶媒処理群と比較してｐ＜０．０５
【０１４７】
【表１６】
2019523637.tif 000018
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。ｎ＝８／群
＊  溶媒処理群と比較してｐ＜０．０５
【０１４８】
実施例１１：ｏｂ／ｏｂマウスにおける血糖値及び体重に対するＦＰ１の効果
この実験の目的は、肥満で高血糖症のレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおける８日間の処理にわたって体重及び血糖値に対するＦＰ１の効果を評価することにあった。
【０１４９】
雄性ｏｂ／ｏｂマウスの体重を測定し、ＦＰ１を０、３、及び６日目の３日ごと（ｑ３ｄ）に２ｍＬ／ｋｇを皮下投与した。マウス及び食餌重量を毎日記録した。血糖値測定器を使用して血糖値を毎日測定した。実験の終了時にマウスを安楽死させ、最終血液試料を採取した。
【０１５０】
ＦＰ１は、１ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて溶媒処理マウスに対して、２日目〜８日目までに有意に体重を減少させた（開始体重の割合（％）として表される）。ＦＰ１は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて溶媒処理マウスに対して１日目〜８日目までに体重を減少させた（開始体重の割合（％）として表される）（表１７及び図８）。
【０１５１】
【表１７】
2019523637.tif 000019
【０１５２】
ＦＰ１は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて実験の１日目及び２日目、並びに４日目〜８日目までに溶媒処理マウスに対して摂食血糖値を減少させた。１ｎｍｏｌ／ｋｇで血糖値の低下が認められたが、この効果は統計的に有意な値に達しなかった（表１８及び図９）。
【０１５３】
【表１８】
2019523637.tif 000020
【０１５４】
実施例１２：複数種における薬物動態
マウスにおける薬物動態
ＦＰ１を、雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、ＰＢＳ（ｐＨ７）中、２ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内及び皮下投与した。両方の投与経路後に、血液試料を採取し、血清を処理して、薬剤濃度を７日間にわたって測定した。ＦＰ１の濃度をイムノアッセイ法により測定した。血清中の薬剤濃度／時間プロファイルを表１９及び２０にまとめて示し、図１０に示す。
【０１５５】
【表１９】
2019523637.tif 000021
【０１５６】
【表２０】
2019523637.tif 000022
【０１５７】
薬物動態学分析により、皮下及び静脈内投与後のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいてそれぞれ、１．６７及び１．５７日のＦＰ１の最終半減期が示された（表２１）。ＦＰ１は、皮下投与後に約７１％の平均バイオアベイラビリティーを示した。
【０１５８】
【表２１】
2019523637.tif 000023
注：＊Ｔｍａｘ（メジアン）
【０１５９】
ラットにおける薬物動態
ＦＰ１を、雌性スプラーグ・ドーリーラットに、ＰＢＳ（ｐＨ７）中、２ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内及び皮下投与した。両方の投与経路後に、血液試料を採取し、血清を処理して、薬剤濃度を７日間にわたって測定した。ＦＰ１の濃度をイムノアッセイ法により測定した。血清中の薬剤濃度／時間プロファイルを表２２及び２３にまとめて示し、図１１に示す。
【０１６０】
【表２２】
2019523637.tif 000024
【０１６１】
【表２３】
2019523637.tif 000025
＊  繰り返しの分析により結果を確認した。
【０１６２】
薬物動態学分析により、皮下及び静脈内投与後のスプラーグ・ドーリーラットにおいてそれぞれ、１．３４及び１．５１日のＦＰ１の最終半減期が示された（表２４）。ＦＰ１は、皮下投与後に約２３％の平均バイオアベイラビリティーを示した。
【０１６３】
【表２４】
2019523637.tif 000026
注：＊Ｔｍａｘ（メジアン）
【０１６４】
サルにおける薬物動態
ＦＰ１を、ナイーブな雄性カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に、ＰＢＳ（ｐＨ７）中、１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内及び皮下投与した。両方の投与経路後に、血液試料を採取し、血清を処理し、イムノアッセイバイオアナリシスを用いて、薬剤濃度を２１日間にわたって測定した。血清中の薬剤濃度／時間プロファイルを表２５及び２６にまとめて示し、図１２に示す。
【０１６５】
【表２５】
2019523637.tif 000027
【０１６６】
【表２６】
2019523637.tif 000028
【０１６７】
薬物動態学分析により、皮下及び静脈内投与後のカニクイザルにおいてそれぞれ、８．５及び９．２日のＦＰ１の最終半減期が示され、皮下投与後の平均バイオアベイラビリティーは約８８％であった（表２７）。
【０１６８】
【表２７】
2019523637.tif 000029
注：＊Ｔｍａｘ（メジアン）
【０１６９】
免疫親和性捕捉ＬＣＭＳ分析を用いて、静脈内及び皮下投与後のカニクイザルの血清中に存在する完全な二量体の濃度を定量した（表２８及び２９、並びに図１３及び１４）。この方法により測定された濃度は、イムノアッセイ（ＩＡ）により測定された濃度と同様であり、ＦＰ１が完全な二量体として循環しており、カニクイザルでは検出可能な代謝不安定性はないことを示している。
【０１７０】
【表２８】
2019523637.tif 000030
【０１７１】
【表２９】
2019523637.tif 000031
【０１７２】
静脈内及び皮下投与後のカニクイザル血清中の被検質の濃度も免疫親和性捕捉トリプシン消化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって測定した（表３０及び３１）。ＦＰ１内のＨＳＡ領域のＮ末端近く、ＧＤＦ１５のＮ末端近く、及びＧＤＦ１５のＣ末端近くにそれぞれ位置するトリプシン消化ペプチド、すなわち、ＡＬＶ（ＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫ）、ＡＳＬ（ＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲ）、及びＴＤＴ（ＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫ）を選択した。これらのペプチドをＦＰ１の代理ペプチドとして観察した。代理ペプチドのすべての濃度は互いと、また、イムノアッセイにより測定された濃度と同程度であり、ＦＰ１内のＧＤＦ１５配列が完全に保たれ、インビボで完全なＨＳＡ配列に連結されていることが示された。
【０１７３】
【表３０】
2019523637.tif 000032
【０１７４】
【表３１】
2019523637.tif 000033
【０１７５】
ヒト血漿安定性アッセイ
この研究の目的は、ヒト血漿中のＦＰ１のエクスビボ安定性を分析することにあった。新鮮な非凍結ヒト血漿を、遠心分離により２名の被験者（男性１人、女性１人）のヘパリン添加血から調製した。ＦＰ１を、静かに混合しながらこの基質中で、０、４、２４及び４８時間、３７℃でインキュベートした。ＦＰ１の濃度を、イムノアッセイ法により測定した。開始濃度（０時間）からの平均の差（％）は、−４．１〜−１２．９の範囲であり、経時的な増加はみられず、ＦＰ１がエクスビボのヒト血漿中で４８時間まで安定であることが示された（表３２及び図１５）。
【０１７６】
【表３２】
2019523637.tif 000034
【０１７７】
免疫親和性捕捉ＬＣＭＳを用いて、ヒト血漿中でのインキュベーション後に存在する完全な二量体の濃度を定量した。この方法で測定された濃度は経時的（０、４、２４、及び４８時間）に安定であり、ＦＰ１が、エクスビボのヒト血漿中で最大４８時間、完全な二量体に保たれることが示された（表３３及び図１６）。
【０１７８】
【表３３】
2019523637.tif 000035
【０１７９】
実施例１３：ＩＲ法
動物及び臨床試料中の抗薬剤抗体（ＡＤＡ）を検出するために免疫応答（ＩＲ）アッセイが開発される。ＩＲアッセイは、ＡＤＡの状態を薬物動態／毒物動態（ＰＫ／ＴＫ）の結果と比較するためのＡＤＡ陽性試料を同定するものであり、ＦＰ１への曝露及び薬物動態の評価を可能とするものである。臨床ＩＲアッセイは、血清試料をスクリーニングし、ＡＤＡ陽性試料の特異性を確認し、確認された陽性試料のＡＤＡ力価を測定するために使用される。中和抗体（ＮＡｂ）アッセイの開発が、プログラムの第１相でＡＤＡ陽性被験者からの確認された陽性試料に使用するために行われる。更に、プログラムの第２相で用いるために、内因性ＧＤＦ１５に対するＡＤＡ交差反応性の決定が行われる。ファースト・イン・ヒューマン（ＦＩＨ）試験に先立って免疫原性リスクの評価が行われ、更なる免疫応答特性評価が認められる場合には実施することができる。
【０１８０】
実施例１４：毒性プラン
ＧＤＦ１５の内因性の標的受容体は同定されていないため、ＦＰ１ではインビトロの結合データ及び機能性のデータがない。しかしながら、ラット、マウス、及びカニクイザルにおける単回及び複数回用量の薬物及び効果試験によって、これらの種におけるＦＰ１の活性が実証され、食物摂取量を低下させ、体重を減少させ、経口耐糖能を調節する効果が示されている。ラット及びサルは、効果試験の結果に基づき、これらの種における受容体に対するＦＰ１の内因性効果（ヒトに対する）が完全に特性評価がなされていないという理解のもと、それぞれ齧歯類及び非齧歯類毒物試験用の種とされるであろう。
【０１８１】
実施例１５〜１９では、配列番号９２のアミノ酸配列（配列番号９２（コドン最適化１）及び１１０（コドン最適化２）のヌクレオチド配列によりコードされる）を有する、実施例５で述べた本発明の別の例示的な融合タンパク質の特性評価を行う。この融合タンパク質は、グリシン及びセリン残基からなるアミノ酸４２個のリンカーＧＳ−（ＧＧＧＧＳ）８を介した、ＨＳＡ（Ｃ３４Ｓ）の成熟ヒトＧＤＦ１５の欠失変異体（２０１〜３０８、配列番号８）との融合体のホモ二量体として存在する完全な組換えタンパク質である。ＨＳＡの３４位の１個の天然の遊離システインがセリンに変異している。この特定のＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質を、簡潔にするために、以下の実施例では「ＦＰ２」と呼ぶものとする。
【０１８２】
実施例１５：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの食物摂取量に対するＦＰ２の効果
ＦＰ２を、１回の投与後に雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの食物摂取量を低下させる性質について評価した。Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ニューヨーク州ハドソン）より入手した雄性Ｃ５７Ｂｌ／６Ｎマウス（１０〜１２週齢）を実験で使用した。マウスは、１２時間の明暗サイクル（午前６時／午後６時）を行った調温室内で１匹ずつ収容し、水及び食餌を自由に取らせた。雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスはＢｉｏＤＡＱケージ内で最低７２時間、環境順応させた。その後、マウスを食物摂取量に基づいて１群８匹ずつの６群に最後の２４時間にグループ分けした。午後４：００〜５：００の間に、動物の体重を測定し、溶媒又は化合物を皮下注射により投与した。各ケージについて、食物摂取量の変化をＢｉｏＤＡＱシステムにより、化合物の投与後４８時間にわたって継続的に記録した。この実験では、６ｘＨｉｓ−ＦＰ１を比較に用いた。
【０１８３】
ＦＰ２は、試験したすべての用量レベルにおいて投与１２、２４、及び４８時間後に食物摂取量を低減させる有意な効果を示した（表３４）。マウスですべての時点及びすべての用量レベルにおいてＰＢＳに対して食物摂取量の変化率（％）の低下がみられた（表３５）。
【０１８４】
【表３４】
2019523637.tif 000036
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
それぞれ、＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０５
＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０１
＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．００１
＊＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０００１
使用した統計分析法は、ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定である。
６ｘＨｉｓ−ＦＰ１の８ｎｍｏｌ／ｋｇ（ｎ＝６）投与群を除き、ｎ＝８／群とした。
【０１８５】
【表３５】
2019523637.tif 000037
【０１８６】
ＦＰ２の食欲減退効果を、それぞれのＰＢＳコントロールと比較した食物摂取量の相対低下率として表す。
【０１８７】
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
それぞれ、＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０５
＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０１
＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．００１
＊＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０００１
使用した統計分析法は、ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定である。
６ｘＨｉｓ−ＦＰ１の８ｎｍｏｌ／ｋｇ投与群（ｎ＝６）を除き、ｎ＝８／群とした。
【０１８８】
実施例１６：スプラーグ・ドーリーラットの食物摂取量に対するＦＰ２の効果
ＦＰ２を、１回の投与後に雄性スプラーグ・ドーリーラットの食物摂取量及び体重増加を低下させる能力について評価した。動物は、体重２００〜２２５ｇのものをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ社（マサチューセッツ州ウィルミントン）より入手し、配送の１週間以内に使用した。動物は、１２時間の明暗サイクルを行った調温室内で、Ａｌｐｈａドライ床材及び濃縮用プラスチックチューブの入ったケージに１匹ずつ収容した。動物は自由に水を摂取させ、実験用齧歯類の餌である、Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  ＰｉｃｏＬａｂ（登録商標）Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ２０、５Ｋ７５＊（ＡＳＡＰ社（ペンシルベニア州クエーカータウン）を介してＰｕｒｉｎａ  Ｍｉｌｌｓ社（ミズーリ州セントルイス）より供給されるもの）を与えた。投与に先立って各ラットについて動物の体重を測定し、記録した。
【０１８９】
動物はＢｉｏＤＡＱケージ内で最低７２時間、環境順応させた。その後、ラットを食物摂取量に基づいて１群８匹ずつの６群に最後の２４時間にグループ分けした。午後４：００〜５：００の間に、動物の体重を測定し、溶媒又は化合物を皮下注射により投与した。各ケージについて、食物摂取量の変化を、ＢｉｏＤＡＱシステムにより、化合物の投与後４８時間にわたって継続的に記録した。この実験では、６ＸＨｉｓ−ＦＰ１を比較に用いた。
【０１９０】
ＦＰ２の１回投与後に食物摂取量の用量依存的な低下について試験した。０．３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量では、食物摂取量に有意差は認められなかった。１ｎｍｏｌ／ｋｇでは、食物摂取量を低下させる有意な効果が１２時間で認められたが、２４又は４８時間では認められなかった。３及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは、食物摂取量の有意な低下がすべての時点で認められた（表３６、図１９）。すべての時点及びすべての用量レベルにおいてＰＢＳに対して食物摂取量の変化率（％）の低下がみられた（表３７）。
【０１９１】
【表３６】
2019523637.tif 000038
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
それぞれ、＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０５
＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０１
＊＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．００１
使用した統計分析法は、ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定である。
ｎ＝８／群
【０１９２】
【表３７】
2019523637.tif 000039
ＦＰ２の食欲減退効果を、それぞれのＰＢＳコントロールと比較した食物摂取量の相対低下率として表す。
データは、平均値±ＳＥＭとして表す。
それぞれ、＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０５
＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．０１
＊＊＊ＰＢＳに対してｐ≦０．００１
使用した統計分析法は、ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定である。
ｎ＝８／群
【０１９３】
実施例１７：食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの食物摂取量、体重、及びグルコースホメオスタシスに対するＦＰ２の効果
ＦＰ２を、８日間にわたって雄性ＤＩＯ  Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに反復投与し、食物摂取量及び体重を低下させ、グルコースホメオスタシスを改善する能力について評価した。Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ニューヨーク州ハドソン）より入手した雄性ＤＩＯ  Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（２１週齢、高脂肪食を１５週間与えたもの）を実験で使用した。マウスは、１２時間の明暗サイクル（午前６時／午後６時）を行った調温室内で１匹ずつ収容し、水を自由摂取させ、研究用食事Ｄ１２４９２（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社、ニュージャージー州ニューブランズウィック）を与えた。マウスを１週間以上マウス飼育室で環境順応させてから実験に供した。実験の評価項目は、食物摂取量、体重、体組成、及び血糖評価項目（ＯＧＴＴ、血糖値）の測定値とした。投与の１日前に動物の体重を測定し、体重（ＢＷ）別にグループ分けした。皮下注射によりマウスに投与した。ＦＰ２を投与した動物には、この化合物を０日目、３日目、及び６日目、９日目、及び１２日目に投与した。溶媒群及びロシグリタゾン群には、滅菌ＰＢＳをこれらの日に同様に投与した。ロシグリタゾンは、０．０１５重量／重量％で食餌中で自由に与えた。体重及び食物摂取量を、１５日間にわたり毎日記録した。血糖値を０、７、及び１３日目に測定した。経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を１４日目に実施した。ＯＧＴＴの間、インスリン値を選択された時点に測定した。１５日目にマウスをＣＯ２で安楽死させ、曝露用の最終血液試料を心臓穿刺により採取した。各投与群３匹のマウスで合計１５匹のマウスで別々のＰＫアームを行った。
【０１９４】
ＤＩＯマウスにおけるＦＰ２に対する曝露−反応（Ｅ−Ｒ）分析
薬力学（ＰＤ）（有効性）アームの大半の動物が、恐らくは免疫原性のために、薬物動態（ＰＫ）試料を得た最後の実験日には検出不能な薬剤濃度を有していた。したがって、ＰＤアームからの個々のＰＫの代わりに、ＰＫアームからの平均ＰＫプロファイルを使用して、対応する用量レベルでＰＤアームのベースラインからの体重変化率（％）について曝露−反応（それぞれ、３、６及び９日目）を実施した。この方法では、ＰＫアームが薬剤曝露に関してＰＤアームと同様の挙動を示すと仮定している。
【０１９５】
Ｅｍａｘモデル（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６、反応に対するアゴニストの対数値）を用いて曝露量を反応データと相関させた（対数値を薬剤濃度に変換した）。Ｈｉｌｌ  Ｓｌｏｐｅは１に設定した。ＥＣ５０値に対してＥＣ１０を当てはめたモデルは、Ｅｍａｘ推定値が異なった（Ｅｍａｘ＝それぞれ、−４．２６％、−８．１８％及び−９．８５％）にもかかわらず、３、６及び９日目で２倍以内であった。９日目に、一部の動物が、潜在的なＡＤＡの形成のために薬剤曝露の消失をやはり示したため、９日目のデータに基づいたＥ−Ｒパラメータは解釈に注意を要する。
【０１９６】
食物摂取量、体重、グルコースホメオスタシス、及び肝脂肪含有率に対する２週間のＦＰ２の曝露の効果を、食餌誘発性肥満雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスで評価した。０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群の１．７〜３．３ｎＭのＦＰ２、１．０ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群の７．１〜１４ｎＭ、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群の２０．８〜４１．６ｎＭ、及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群の２８．５〜１１２．９のＦＰ２のトラフ曝露値を、実験のＰＫアームで９日目まで維持した（ｎ＝２又は３、表４９）。９日目以降、ｑ３ｄ投与を継続したにもかかわらず、循環値の減少が大半の動物で認められた（表４９）。この加速したクリアランスと一致して、実験のＰＤアームの動物の大半が１５日目に検出不能なＦＰ２の循環値を有していた（表５０）。
【０１９７】
ｑ３ｄのＦＰ２によるＤＩＯマウスの処理は、溶媒処理（表４３及び図２３）と比較して、食物摂取量（表３８）、体重（表３９、４０及び図２０）、及び摂食血糖値を低下させた。食物摂取量の有意な低下が、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇでは２日目、５日目、及び８日目で、１．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは１日目〜７日目を通じて、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは１日目、２日目、４日目〜６日目、及び８日目に、１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは１日目、３日目〜６日目、８日目、及び９日目でみられた。体重変化率（％）は、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇでは５日目〜１３日目で、１．０ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは３日目〜１３日目で、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは４日目から１３日目で有意であった。体重の変化（ｇ）は、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇでは８日目から、１．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは６日目から、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは７日目から、１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇでは５日目から有意であった。摂食血糖値の減少は、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルの動物では７日目で有意であり、３．０及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルの動物では１３日目で有意であった。
【０１９８】
ｑ３ｄのＦＰ２で処理したＤＩＯマウスは、経口グルコースチャレンジにおいて溶媒処理群と比較して１４日目に耐糖能の改善がみられた（表４１、図２１Ａ及び１２Ｂ）。血糖値は、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ群では３０分で、１．０ｎｍｏｌ／ｋｇ群では６０分及び１２０分で、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇ群では１２０分で、１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇ群では３０、９０、及び１２０分で有意に低かった。全曲線下面積は、すべての用量群で有意であった。グルコースチャレンジにおけるインスリン値は、０．３及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇ群で３０分で有意に低かった（表４２、図２２Ａ及び２２Ｂ）。更に、溶媒処理動物と比較して、１４日間の１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２によるｑ３ｄ処理後のＤＩＯマウスで絶食ＨＯＭＡ−ＩＲ計算値に有意な低下がみられ、インスリン感受性の改善を示した（表４４及び図２４）。
【０１９９】
実験開始前の−１日目及び１３日目にＭＲＩにより体組成を測定した（表４７及び表４８）。１．０ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２で処理したＤＩＯマウスが１３日目に体脂肪量の有意な低下を示したのに対して、いずれの処理群でも除脂肪量の変化はみられなかった。１３日目に、１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群は、溶媒処理群と比較して除脂肪率（％）の有意な増加及び体脂肪率（％）の有意な低下を示した。−１日目〜１３日目の変化は除脂肪量について０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ、１．０ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群で有意であり、除脂肪率（％）について１．０、３．０、及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇ処理群で有意であった。−１日目〜１３日目の変化は、溶媒と比較してすべての処理群で体脂肪量及び除脂肪率（％）について有意であった。
【０２００】
溶媒処理動物と、ｑ３ｄのＦＰ２で１５日間処理したマウスとの間で内因性マウスＧＤＦ１５の血清レベルに有意差はみられなかった（表４６）。
【０２０１】
結論：これらの結果は、高い薬剤曝露が一般に、３、６、及び９日目に実験した用量群すべてにおいて、集団レベルでベースラインからのより大きな体重変化率（％）を伴うことを示している。
【０２０２】
２週にわたるＦＰ２への曝露は、ＤＩＯマウスで食物摂取量の低下、体重減少、血糖値の減少、耐糖能及びインスリン感受性の改善につながった。ｑ３ｄの１．０、３．０、及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇで複数の日数にわたって食物摂取量の有意な減少が得られた。実験開始の３日〜５日後から体重が有意に減少した。１３日目の摂食血糖値は３．０及び１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２のｑ３ｄ投与後に有意に減少した。絶食ＨＯＭＡ−ＩＲの有意な減少により示されるインスリン感受性は、１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２のｑ３ｄ投与の１４日後に得られた。１３日目に、１０．０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＰ２でｑ３ｄ処理されたＤＩＯマウスにおいて、除脂肪率（％）の有意な増大及び体脂肪率（％）の有意な減少が認められた。
【０２０３】
【表３８】
2019523637.tif 000040
各値は、ｎ＝７の場合（＾により示される）を除き、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、二元配置ＡＮＯＶＡ  ＲＭ、テューキーの多重比較検定である。
【０２０４】
【表３９】
2019523637.tif 000041
各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、二元配置ＡＮＯＶＡ  ＲＭ、テューキーの多重比較検定である。
【０２０５】
【表４０】
2019523637.tif 000042
各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、二元配置ＡＮＯＶＡ  ＲＭ、テューキーの多重比較検定である。
【０２０６】
【表４１】
2019523637.tif 000043
各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、血糖値については、二元配置ＡＮＯＶＡ  ＲＭ、テューキーの多重比較検定、
ＡＵＣについては、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
【０２０７】
【表４２】
2019523637.tif 000044
各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、インスリン値については、二元配置ＡＮＯＶＡ  ＲＭ、テューキーの多重比較検定、
ＡＵＣについては、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
【０２０８】
【表４３】
2019523637.tif 000045
各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、二元配置ＡＮＯＶＡ  ＲＭ、テューキーの多重比較検定である。
【０２０９】
【表４４】
2019523637.tif 000046
各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
【０２１０】
【表４５】
2019523637.tif 000047
各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
【０２１１】
【表４６】
2019523637.tif 000048
各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
【０２１２】
【表４７】
2019523637.tif 000049
各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
【０２１３】
【表４８】
2019523637.tif 000050
各値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
使用した統計分析法は、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの多重比較検定である。
【０２１４】
【表４９】
2019523637.tif 000051
データは、各動物における濃度として表す。
＜ＬＯＱ＝定量限界未満；ＬＯＱは０．４９４ｎＭである。
＊＊３、６、９及び１２日目の値は、次の投与の直前の値である。
【０２１５】
【表５０】
2019523637.tif 000052
データは、各動物における濃度として表す。
＜ＬＯＱ＝定量限界未満；ＬＯＱは０．４９４ｎＭである。
【０２１６】
実施例１８：ＦＰ２の複数種における薬物動態及び免疫応答
マウスにおける薬物動態
ＦＰ２を雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに皮下投与した場合の薬物動態特性を評価した。ＦＰ２を雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｓａｇｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ミズーリ州セントルイス）にＰＢＳ（ｐＨ７．３〜７．５）中、２．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、皮下（各時点につきｎ＝５の試料）及び静脈内（各時点につきｎ＝５の試料）投与した。最後の時点の試料の採取は、最終瀉血により行った。血液試料を採取し、血清を処理し、薬物濃度を１６８時間まで測定した。ＦＰ２の濃度は、イムノアッセイ法により測定した。血漿中の薬物濃度プロファイルを表５１及び５２にまとめて示し、図２５に示す。
【０２１７】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＦＰ２の薬物動態分析により、静脈内及び皮下投与後の最終半減期は、それぞれ約１．５１日及び約１．７６日であり、皮下投与後の平均バイオアベイラビリティーは約６１％であることが示された。
【０２１８】
【表５１】
2019523637.tif 000053
【０２１９】
【表５２】
2019523637.tif 000054
【０２２０】
【表５３】
2019523637.tif 000055
【０２２１】
ラットにおける薬物動態
ＦＰ２をスプラーグ・ドーリーラット（Ｓａｇｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ミズーリ州セントルイス）にＰＢＳ（ｐＨ７．３〜７．５）中、２．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、皮下（各時点につきｎ＝５の試料）及び静脈内（各時点につきｎ＝５の試料）投与した。最後の時点の試料の採取は、最終瀉血により行った。血液試料を採取し、血清を処理し、薬物濃度を１６８時間まで測定した。ＦＰ２の濃度は、イムノアッセイ法により測定した。血漿中の薬物濃度プロファイルを表５４及び５５にまとめて示し、図２６に示す。これらのデータから計算した薬物動態パラメータを表５６にまとめて示す。
【０２２２】
スプラーグ・ドーリーラットにおけるＦＰ２の薬物動態分析により、静脈内及び皮下投与後の最終半減期は、それぞれ約１．４６日及び約１．３７日であり、皮下投与後の平均バイオアベイラビリティーは約２８％であることが示された。
【０２２３】
【表５４】
2019523637.tif 000056
【０２２４】
【表５５】
2019523637.tif 000057
【０２２５】
【表５６】
2019523637.tif 000058
【０２２６】
サルにおける薬物動態
ＦＰ２を、３匹の雄のカニクイザルにそれぞれＰＢＳ（ｐＨ７．０〜７．６）中、１ｍｇ／ｋｇで皮下に、１ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した。血液試料を採取し、血漿を処理し、薬物濃度を２１日目まで測定した。
【０２２７】
ＦＰ２の薬物動態（ＰＫ）を、カニクイザルに１回静脈内（ＩＶ）（１．０ｍｇ／ｋｇ）及び皮下（ＳＣ）（１．０ｍｇ／ｋｇ）投与した後に特性評価した。ＳＣ投与後の血漿中の薬物濃度−時間プロファイルを、イムノアッセイ及びＬＣＭＳ分析について表５７及び５８にそれぞれ示し、ＩＶ投与後の血漿中の薬物濃度−時間プロファイルをイムノアッセイ及びＬＣＭＳ分析について表５９及び６０にそれぞれ示す。イムノアッセイのデータを図２７にグラフで示し、ＬＣＭＳのデータを図２８に示す。
【０２２８】
イムノアッセイ分析の結果を用いると、平均ＮＣＡに基づいたＦＰ２の最終半減期（ｔ１／２）は、ＩＶ及びＳＣ投与後にそれぞれ約７．０５日及び約８．５１日であった。ＩＶ及びＳＣ投与後の平均ＰＫパラメータを表６１に示す。イムノアッセイ生体分析の結果を用いると、平均の非コンパートメントモデルで推定したＦＰ２の最終半減期（ｔ１／２）は、ＩＶ及びＳＣ投与後にそれぞれ約７．０５日及び約８．５１日であった。ＦＰ２の平均バイオアベイラビリティー（Ｆ％）は、ＳＣ投与後のカニクイザルでＡＵＣ０〜最終に基づいて約９８．５％と推定され、ＡＵＣ０〜無限に基づいて約１０９．２％と推定された。
【０２２９】
【表５７】
2019523637.tif 000059
Ｎ／Ａ＝適用できず
【０２３０】
【表５８】
2019523637.tif 000060
−＝最初の測定が失敗し、繰り返し分析を行うための試料が充分ではなかった。
＃＝チューブのラベリングに誤りがあったため、分析から除外した。
Ｎ／Ａ＝適用できず
【０２３１】
【表５９】
2019523637.tif 000061
Ｎ／Ａ＝適用できず
【０２３２】
【表６０】
2019523637.tif 000062
−＝最初の測定が失敗し、繰り返し分析を行うための試料が充分ではなかった。
Ｎ／Ａ＝適用できず
＃＝チューブのラベリングに誤りがあったため、分析から除外した。
【０２３３】
【表６１】
2019523637.tif 000063
ＰＫパラメータは、イムノアッセイのＰＫデータのＮＣＡに基づいた平均値である。
＊Ｔｍａｘ（メジアン）
【０２３４】
ヒト血漿安定性アッセイ
ＦＰ２のエクスビボ安定性を、新鮮なヘパリン添加血漿中、３７℃で４８時間まで調べた。新鮮な非凍結ヒト血漿を、遠心分離により２名の被験者（男性１人、女性１人）のヘパリン添加血から調製した。ＦＰ２を、静かに混合しながらこの基質中で、０、４、２４及び４８時間、３７℃でインキュベートした。ＦＰ２の濃度を、イムノアッセイ法により測定した。独立した免疫親和性捕捉の後にＬＣＭＳを行って、アッセイ条件下でこの基質中に存在する完全な二量体の濃度を定量した。
【０２３５】
イムノアッセイ法では、開始濃度からの回復率は１０４．８〜９４．１の範囲であり、経時的な減少はみられず、ＦＰ２がエクスビボのヒト血漿中で４８時間まで安定であることが示された（図２９及び表６２）。ＬＣＭＳ法では、濃度は経時的に安定しており、ＪＮＪ−６４７３９０９０がエクスビボのヒト血漿中で４８時間まで完全な二量体に保たれることが示された（図３０及び表６３）。
【０２３６】
【表６２】
2019523637.tif 000064
【０２３７】
【表６３】
2019523637.tif 000065
【０２３８】
実施例１９：カニクイザルにおけるＦＰ１及びＦＰ２の効果
ナイーブなカニクイザルへの１回投与後の食物摂取量及び体重に対するＦＰ１及びＦＰ２の影響を評価した。
【０２３９】
ＦＰ１は、ナイーブなカニクイザルのコホートに１、３及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの３つの用量レベルで皮下投与した。溶媒処理群も含めた。動物は盲検で処理した。実験は、２週間のベースライン食物摂取量測定及びデータ収集、化合物の１回投与後の４週間のデータ収集の合計６週間で行った。血漿薬剤曝露量を投与の１、７、１４、２１、及び２８日目に測定した。
【０２４０】
１回用量のＦＰ１によるカニクイザルの処理は、溶媒処理と比較して食物摂取量及び体重を減少させた（図３２〜３３）。一日食物摂取量の有意な低下が、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで４、５、６、及び８〜１２日目にみられた（図３２）。一日食物摂取量の週平均値は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで投与後２週目の間、有意に低下した。３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは、投与後２週目の投与の前に平均の週食物摂取量から有意な低下率（％）を示し、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは、投与後１及び２週目の投与の前に平均の週食物摂取量から有意な低下率（％）を示した。０日目からの体重変化率（％）の有意な低下が、３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで２８日目に、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは１４、２１、及び２８日目にみられた（図３３）。
【０２４１】
ＦＰ２は、ナイーブなカニクイザルのコホートに１、３及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇの３つの用量レベルで皮下投与した。溶媒処理群も含めた。動物は盲検で処理した。実験は、５週間のベースライン食物摂取量測定及びデータ収集、１週間の処理、及び５週間の休薬期データ収集の合計１１週間で行った。血漿薬剤曝露量を投与の１、７、１４、２１、２８、３５、及び４２日目に測定した。
【０２４２】
１回用量のＦＰ２によるカニクイザルの処理は、溶媒処理と比較して食物摂取量及び体重を減少させた（図３４〜３５）。一日食物摂取量の有意な低下が、３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで３、５〜８、１０及び１２日目に、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで３〜３８日目、及び４０日目にみられた（図３４）。一日食物摂取量の週平均値は、３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで投与後１週目に有意に低下し、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルで１〜６週目に有意に低下した。３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは、投与後２週目に、週平均の一日食物摂取量に投与の前の週から有意な低下率（％）がみられ、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは、投与後１及び６週目に、週平均の一日食物摂取量に投与の前の週から有意な低下率（％）がみられた。０日目からの体重変化率（％）の有意な低下が、１ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは２１〜４２日目に、３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは１４〜４２日目に、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量レベルでは７〜４２日目にみられた（図３４）。
【０２４３】
実施例２０：ＨＳＡ−ＧＤＦ１５：ＧＤＦ１５ヘテロ二量体
ＨＳＡ−ＧＤＦ１５：ＧＤＦ１５ヘテロ二量体の生物活性を調べた。
【０２４４】
ＨＳＡ−ＧＤＦ１５：ＧＤＦ１５ヘテロ二量体を作製するため、２種類のコンストラクトを設計した。第１のコンストラクトは、グリシン／セリンリンカーを介して成熟ＧＤＦ１５のＮ末端（ＡＡ２０３〜３０８）に融合されたＨＳＡを含むものとした（配列番号９３）。第２のコンストラクトは、グリシン／セリンリンカーを介して成熟ＧＤＦ１５のＮ末端（ＡＡ１９７〜３０８）に融合された６×ヒスチジンタグ化ＨＳＡ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断部位を含むものとした（配列番号９４）。これらのプラスミドを、製造者のプロトコールにしたがってＥｘｐｉ２９３（商標）発現系（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して１：１の比で同時トランスフェクトした。ペプチドは、モノマー同士がジスルフィド結合によって連結されたヘテロ二量体及びホモ二量体の両方の形を含むＨＳＡ−ＧＤＦ１５タンパク質として分泌された。
【０２４５】
一過性にトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３（商標）細胞からの細胞上清を、トランスフェクションの５日後に回収し、遠心して清澄化し、滅菌濾過（０．２μｍＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）した。清澄化した上清を２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化したＨｉｓｔｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にロードした。ローディング後、未結合タンパク質を平衡化バッファでカラムを洗浄することによって除去した。カラムに結合した、ヘテロ二量体及びホモ二量体の両方の形を含むＨＳＡ−ＧＤＦ１５タンパク質を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で溶出した。溶離液の各画分をプールし、６×ヒスチジンタグ化ＨＲＶ３Ｃ酵素（Ｊａｎｓｓｅｎ社）の存在下、４℃で一晩インキュベートしてＨＳＡ−ＧＤＦ１５：ＧＤＦ１５ヘテロ二量体を生成させた。インキュベーション後、タンパク質溶液を平衡化バッファ中に透析してイミダゾールを除去した後、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラムに再度かけた。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５：ＧＤＦ１５ヘテロ二量体は２０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４中による洗浄工程で溶出したが、ヒスチジンタグ化タンパク質は保持された。ヘテロ二量体は、１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２中で平衡化したＨｉＬｏａｄ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用してサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により更に精製した。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５：ＧＤＦ１５ヘテロ二量体を高い純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）で含むＳＥＣからの溶離液の画分をプールし、濾過した。タンパク質濃度を、ＢｉｏＴｅｋ  ＳｙｎｅｒｇｙＨＴＴＭ分光光度計により吸光度２８０ｎｍで測定した。精製したタンパク質の品質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び分析用サイズ排除ＨＰＬＣ（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００  ＨＰＬＣシステム）によって評価した。内毒素レベルをＬＡＬアッセイ（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）−Ｔ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ社）を用いて測定した。精製したタンパク質を４℃で保管した。
【０２４６】
ＧＤＦ１５受容体（ＧＦＲＡＬ）を安定的に発現するＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞（ＡＴＣＣ）を、アッセイの２４時間前に９６ウェルプレート内の増殖培地（１０％ＦＢＳ）に播種した。２４時間後、培地を１％ＨＩウマ血清を添加した２００μｌのＤＭＥＭ培地で置き換えて、３７℃のインキュベーター内で３時間インキュベーターすることで細胞を飢餓状態とした。次いで、１％ＨＩウマ血清添加培地を２００μｌのＡＢ１で置き換え、３７℃のインキュベーター内で更に２時間インキュベートした。アッセイを行うため、ＡＢ１をすべてのウェルから吸引し、ＡＢ２中１００μｌの異なる濃度の試験化合物を加え、プレートを３７℃のインキュベーター内で１５分インキュベートした。１５分後、試験溶液を除去し、３０μｌの溶解バッファ（検出キット中で与えられるもの）を加え、プレートを室温でプレートシェーカー上で３０分振盪した。検出を行うため、１６μｌの溶解した試料を３８４ウェルアッセイプレートに移し、４μｌのＨＴＲＦ  ｐＡＫＴ検出用抗体を加えた。プレートを室温で一晩インキュベートした後、ＨＴＲＦシグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）で読み取った。
【０２４７】
ＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）非線形回帰（曲線当てはめ）を使用して計算した。データを、データ点当たり３つの重複を与える３つの別々の実験からの平均±標準誤差（ＳＥ）として表す。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５：ＧＤＦ１５ヘテロ二量体の分子を質量分析により確認した。ヘテロ二量体の曲線の左方向へのシフトは、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５：ＧＤＦ１５ヘテロ二量体が、更なるアルブミンを有する関連するホモ二量体分子と比較して、ｐＡＫＴを誘導するうえでより強力であることを示唆した。
【０２４８】
実施例２１：リンカーの熱安定性
ＨＳＡとＧＤＦ１５とを連結する異なるリンカーの熱安定性を調べた。フラグメント化及び凝集する性質を評価するため、異なるリンカーを有するＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質を１０ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＥＤＴＡ及びメチオニンを加えた後、試料を４０℃以下で１４日間インキュベートした。次いで試料を１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）で評価した。完全なタンパク質並びに凝集体及びフラグメントの割合（％）をこれらのタンパク質について定量した。表６４は、ＡＰの繰り返しからなるリンカーを有するＨＳＡ−ＧＤＦ１５タンパク質が熱ストレス下でフラグメント化に対して最も安定的であることを示している。
【０２４９】
これらのリンカーがＧＤＦ１５とその受容体との相互作用に影響するか否かを評価するため、ＧＦＲＡＬ−ＦＣ融合タンパク質をプレートにコートし、抗ＧＤＦ１５又は抗ＨＳＡによる検出を行うイムノアッセイを、ＧＤＦ１５（Ｊａｎｓｓｅｎ社）及びＨＳＡ（Ｋｅｒａｆａｓｔ，Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州ボストン）に対するモノクローナル抗体を使用して行った。このアッセイにより、表６６に示されるこれらのリンカーはいずれも受容体に同様の結合性を有することが示された。
【０２５０】
【表６４】
2019523637.tif 000066
【０２５１】
以上、本発明を詳細に、かつその具体的な実施形態を参照して説明したが、当業者には、発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更及び改変を行い得る点は明らかであろう。
【０２５２】
本出願で参照する配列を下記の表に示す。
【０２５３】
【表６５−１】
2019523637.tif 000067
【０２５４】
【表６５−２】
2019523637.tif 000068
【０２５５】
【表６５−３】
2019523637.tif 000069
【０２５６】
【表６５−４】
2019523637.tif 000070
【０２５７】
【表６５−５】
2019523637.tif 000071
【０２５８】
【表６５−６】
2019523637.tif 000072
【０２５９】
【表６５−７】
2019523637.tif 000073
【０２６０】
【表６５−８】
2019523637.tif 000074
【０２６１】
【表６５−９】
2019523637.tif 000075
【０２６２】
【表６５−１０】
2019523637.tif 000076
【０２６３】
【表６５−１１】
2019523637.tif 000077
【０２６４】
【表６５−１２】
2019523637.tif 000078
【０２６５】
【表６５−１３】
2019523637.tif 000079
【０２６６】
【表６５−１４】
2019523637.tif 000080
【０２６７】
【表６５−１５】
2019523637.tif 000081
【０２６８】
【表６５−１６】
2019523637.tif 000082
【０２６９】
【表６５−１７】
2019523637.tif 000083
【０２７０】
【表６５−１８】
2019523637.tif 000084
【０２７１】
【表６５−１９】
2019523637.tif 000085
【０２７２】
【表６５−２０】
2019523637.tif 000086
【０２７３】
【表６５−２１】
2019523637.tif 000087
【０２７４】
【表６５−２２】
2019523637.tif 000088
【０２７５】
【表６５−２３】
2019523637.tif 000089
【０２７６】
【表６５−２４】
2019523637.tif 000090
【０２７７】
【表６５−２５】
2019523637.tif 000091
【０２７８】
【表６５−２６】
2019523637.tif 000092
【０２７９】
【表６５−２７】
2019523637.tif 000093
【０２８０】
【表６５−２８】
2019523637.tif 000094
【０２８１】
【表６５−２９】
2019523637.tif 000095
【０２８２】
【表６５−３０】
2019523637.tif 000096
【０２８３】
【表６５−３１】
2019523637.tif 000097
【０２８４】
【表６５−３２】
2019523637.tif 000098
【０２８５】
【表６５−３３】
2019523637.tif 000099
【０２８６】
【表６５−３４】
2019523637.tif 000100
【０２８７】
【表６５−３５】
2019523637.tif 000101
【０２８８】
【表６５−３６】
2019523637.tif 000102
【０２８９】
【表６５−３７】
2019523637.tif 000103
【０２９０】
【表６５−３８】
2019523637.tif 000104
【０２９１】
【表６５−３９】
2019523637.tif 000105
【０２９２】
【表６５−４０】
2019523637.tif 000106
【０２９３】
【表６５−４１】
2019523637.tif 000107
【０２９４】
【表６５−４２】
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【０２９５】
【表６５−４３】
2019523637.tif 000109
【０２９６】
【表６５−４４】
2019523637.tif 000110
【０２９７】
【表６５−４５】
2019523637.tif 000111
【０２９８】
【表６５−４６】
2019523637.tif 000112
【０２９９】
【表６５−４７】
2019523637.tif 000113
【０３００】
【表６５−４８】
2019523637.tif 000114
【図１Ａ】
2019523637.tif 000115
【図１Ｂ】
2019523637.tif 000116
【図２】
2019523637.tif 000117
【図３】
2019523637.tif 000118
【図４】
2019523637.tif 000119
【図５Ａ】
2019523637.tif 000120
【図５Ｂ】
2019523637.tif 000121
【図６】
2019523637.tif 000122
【図７】
2019523637.tif 000123
【図８】
2019523637.tif 000124
【図９】
2019523637.tif 000125
【図１０】
2019523637.tif 000126
【図１１】
2019523637.tif 000127
【図１２】
2019523637.tif 000128
【図１３】
2019523637.tif 000129
【図１４】
2019523637.tif 000130
【図１５】
2019523637.tif 000131
【図１６】
2019523637.tif 000132
【図１７】
2019523637.tif 000133
【図１８】
2019523637.tif 000134
【図１９】
2019523637.tif 000135
【図２０】
2019523637.tif 000136
【図２１Ａ】
2019523637.tif 000137
【図２１Ｂ】
2019523637.tif 000138
【図２２Ａ】
2019523637.tif 000139
【図２２Ｂ】
2019523637.tif 000140
【図２３】
2019523637.tif 000141
【図２４】
2019523637.tif 000142
【図２５】
2019523637.tif 000143
【図２６】
2019523637.tif 000144
【図２７】
2019523637.tif 000145
【図２８】
2019523637.tif 000146
【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
2019523637.tif 000149
【図３２】
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【図３３】
2019523637.tif 000151
【図３４】
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【図３５】
2019523637.tif 000153
【配列表】
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【国際調査報告】
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