(57)【要約】本発明は、化合物、その組成物、およびそれを使用する方法を提供する。本発明は、薬物様小分子による、例えばＲＮＡまたはＤＮＡといった核酸分子のレベルおよび／または活性のモジュレーションのための化合物、およびその使用方法を提供する。本発明はまた、３ＷＪを形成する可能性があるまたは開示した化合物の存在下で３ＷＪを形成する可能性があるシスまたはトランスの配列相補性について核酸配列をスクリーニングする方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ｍＲＮＡに関連する下流タンパク質の発現をモジュレートして、該標的ｍＲＮＡによって引き起こされる疾患または障害を治療する方法であって、該標的ｍＲＮＡ中の核酸三方向ジャンクション（３ＷＪ）に結合する化合物と該標的ｍＲＮＡを接触させるステップを含み、該化合物が、式Ｉ：
【化７３】
2019523242.tif 000206
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
環Ａ、Ｂ、およびＣはそれぞれ独立して、３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式芳香族複素環、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式芳香族複素環であり、
各Ｙは独立してＣＲまたはＮであり、
各Ｒ１は独立して、−Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＲ、または−Ｌ１−Ｒ６であり、
各Ｒ２は独立して、−Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＲ、−Ｌ２−Ｒ６であるか、または、同じ炭素上の２つのＲ２基が必要に応じて一緒になって＝ＮＲ６、＝ＮＯＲ６、＝Ｏ、もしくは＝Ｓを形成しており、
各Ｒ３は独立して、−Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＲ、または−Ｌ３−Ｒ６であり、
各Ｒ６は独立して、水素、または、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのハロゲンにより必要に応じて置換されているＣ１〜６アルキルであり、
各Ｒは独立して、水素、または、Ｃ１〜６の脂肪族基、３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式芳香族複素環、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式芳香族複素環から選択される必要に応じて置換されている基であり、
各Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は独立して、共有結合またはＣ１〜８の二価の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素鎖であり、前記鎖の１つ、２つ、または３つのメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、または−Ｃｙ−により必要に応じて置き換えられており、
ｍは、０、１、２、３、または４であり、
ｎは、０、１、２、３、または４であり、かつ
ｐは、０、１、２、３、または４である、方法。
【請求項２】
環Ａがピリジルであり、環Ｂがフェニルであり、かつ環Ｃがフェニルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ｍＲＮＡが、エフェクターｍｉＲＮＡのＲＮＡの存在下で３ＷＪを形成し、かつ、前記式Ｉの化合物が、前記エフェクターＲＮＡと前記標的ｍＲＮＡとの間に形成されたトランス３ＷＪに結合する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記式Ｉの化合物が、前記標的ｍＲＮＡの部分の間に形成されたシス３ＷＪに結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
式ＸＸＸＩＩＩまたは式ＸＸＸＩＶ：
【化７４】
2019523242.tif 000207
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、
Ｔ１は二価のテザー基であり、かつ
Ｒｍｏｄは、前記化合物が結合する標的ＲＮＡの２’−ＯＨ基と選択的に反応するＲＮＡ修飾部分である）。
【請求項６】
Ｒｍｏｄまたは任意の他の置換可能な水素に共有結合したクリック実行可能基をさらに含む、請求項５に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
【請求項７】
前記クリック実行可能基がアジドである、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒｍｏｄが、Ｎ−メチルイサト酸無水物、１−メチル−６−ニトロイサト酸無水物、または１−メチル−７−ニトロイサト酸無水物から選択される、請求項５または６に記載の化合物。
【請求項９】
前記疾患または障害が、ハンチントン病（ＨＤ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、または、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７から選択される脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脆弱性Ｘ症候群、筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１または筋強直性ジストロフィー（dystrophia  myotonica））、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、もしくはＳＣＡ１２から選択される脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、またはＣ９ＦＴＤ（筋萎縮性側索硬化症またはＡＬＳ）から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患または障害が、ウイルス感染症、微生物感染症、または真菌感染症から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は、２０１６年７月１日に出願した米国仮出願第６２／３５７，６５４号および２０１７年２月１日に出願した米国仮出願第６２／４５３，４８７号の米国特許法の下での利益を主張する。これらのすべての出願の内容の全体が、本明細書に参考として援用される。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、トランスまたはシス三方向ジャンクションに対する化合物の結合によってＲＮＡ転写物の生物学をモジュレートして、様々な疾患および状態を治療するための化合物、およびその使用方法に関する。本発明はまた、小分子結合剤によって安定化された新たな三方向ジャンクションを形成することによってそのような三方向ジャンクションをドラッガブルにすることができるＲＮＡ転写物を同定する方法、およびＲＮＡ三方向ジャンクションに結合する薬物候補を設計およびスクリーニングする方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
哺乳動物の疾患は、究極的にはトランスクリプトームによって媒介されるが、一方でウイルスおよび他の病原体は、感染、再生、および生存の様々な態様のためにＲＮＡに依存する。メッセンジャーｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がトランスクリプトームの一部分であり、また全てのタンパク質の発現がｍＲＮＡに由来するという限りにおいて、関連タンパク質の発現をモジュレートすることによって、そして対応する上流のｍＲＮＡの翻訳をモジュレートすることによって、タンパク質媒介性の疾患に介入できる可能性がある。しかしｍＲＮＡはトランスクリプトームの小さな部分に過ぎない。ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｅＲＮＡ、および偽遺伝子を含めて（しかしこれらに限定されない）その他の転写されたＲＮＡもまた、ＲＮＡ構造物（例えば、リボ核タンパク質）の構造および機能によって直接的に、ならびにタンパク質の発現および作用を介して、細胞の生物学を調節する。ＲＮＡは、その核酸の部分がワトソン・クリック型塩基対形成を通じて二本鎖セグメントを形成していると同時に他のセグメントが対形成していない（一本鎖）ままである二次構造および三次構造にフォールディングする。１つのよく見られる構造は三方向ジャンクション（three-way  junction；３ＷＪ）である。この例では、核酸は、Ｙ形状のパターンで３つの二重らせんを形成し、３つのらせんの交差の中心点が３ＷＪと称される。小分子は３ＷＪに高親和性で結合してこの構造を安定化し、それによって、標的ＲＮＡの構造的選好性を変化させてその下流の生物学的活性をモジュレートすることにより標的ＲＮＡの機能に影響し得る。しかしながら、ＲＮＡ媒介性の疾患を治療するためのＲＮＡのリガンドとしての小分子の発見および使用は、医薬品業界からほとんど注目されていない。
【０００４】
したがって、ＲＮＡトランスクリプトームおよび３ＷＪの標的化、特に小分子による標的化は、ＲＮＡ媒介性の疾患を治療するための未開発の治療アプローチとなる。さらには、哺乳動物のＲＮＡ媒介性の疾患、ウイルス、寄生虫、および微生物を含めてＲＮＡ媒介性の疾患の改良された治療に対する大きな満たされていない必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明は、薬物様小分子による、例えばＲＮＡまたはＤＮＡといった核酸分子のレベルおよび／または活性のモジュレーションのための化合物、およびその使用方法を提供する。本発明はまた、３ＷＪを形成する可能性があるまたは開示した化合物の存在下で３ＷＪを形成する可能性があるシスまたはトランスの配列相補性について核酸配列をスクリーニングする方法も提供する。さらには、本発明は、３ＷＪへの結合について小分子をスクリーニングする方法を提供する。本発明は、これらの構造を同定し、かつ細胞および動物においてそれらに選択的に結合して３ＷＪを安定化させる小分子をスクリーニングすることによって、３ＷＪの形成を利用する。３ＷＪを安定化させることによって、該小分子は核酸の安定性または活性をモジュレートすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１Ａは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の完全に相補的な相互作用を示す（すなわち、これらの配列は完全な配列相補性を共有し、ＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を形成する）。図１Ｂは、ステムループエレメントの基部に位置するｍＲＮＡのフランク領域にわたって断続的にｍｉＲＮＡが副木をされる相互作用を示す。この相互作用は、ステムループエレメントの基部において３ＷＪを創出する。
【０００７】
【図２】図２は、３ＷＪ結合性小分子に対するエフェクターＲＮＡへの仮定的な目的の標的ＲＮＡを細胞中の分子メカニズムに結び付けるフローチャートを示す。重要なことに、開示した方法を使用することにより、公知のＲＮＡ標的を用いて開始し、バイオインフォマティクススクリーニングを使用して３ＷＪを形成するエフェクター／標的ペアを同定すること、または、トランスクリプトーム全体のバイオインフォマティクススクリーニングを行って、３ＷＪを形成する全てのエフェクター／標的ペアを同定した後、目的のエフェクター／標的ＲＮＡペアを選択することのいずれも可能である。フローチャートの残りのステップに従うことで、高い治療的価値の標的上の３ＷＪに結合することによって標的をモジュレートして、疾患または障害を治療または改善する小分子が同定される。
【０００８】
【図３】図３は、例示的なエフェクターＲＮＡ／標的ＲＮＡの対形成を示す。例えば、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡは、トランスで３ＷＪを形成できる可能性があり、ｐｒｉＲＮＡはシス３ＷＪを形成できる可能性がある、などといった具合である。
【０００９】
【図４】図４は、３ＷＪがエフェクターＲＮＡ中のステムループ（３ＷＪ）を用いて小分子（三角形によって表す）に結合する機構を示す。ＲＮＡは、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ；楕円によって表す）に結合することもあるし、結合しないこともある。小分子の結合は、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖に通常結合する任意のＲＢＰの結合に影響することがある（またはしないことがある）。
【００１０】
【図５】図５は、３ＷＪが標的核酸中のステムループ（３ＷＪ）を用いて小分子に結合する機構を示す。ＲＮＡは、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ；楕円によって表す）に結合することもあるし、結合しないこともある。小分子の結合は、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖に通常結合する任意のＲＢＰの結合に影響することがある（またはしないことがある）。
【００１１】
【図６】図６は、トランス作用性三方向ジャンクションを標的化するための２つの戦略を示す。１つの戦略（上）では、最初に、３ＷＪをもたらす「天然の」ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡペアを同定した後、ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡトランス調節構造に閉じ込めてｍｉＲＮＡの調節効果を増幅する小分子リガンドを同定する。顕著なことに、このようにして小分子は、翻訳アゴニスト（翻訳およびタンパク質発現を増幅する）または翻訳アンタゴニスト（翻訳およびタンパク質発現を抑制する）のいずれかとして作用することができる。第２の戦略（下）では、最初に、３ＷＪを与えることになる「候補」ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡペアを同定した後、ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡトランス調節構造に閉じ込めてｍｉＲＮＡの調節効果を増幅するＳＭリガンドを同定する。顕著なことに、このようにして小分子は、翻訳アゴニスト（翻訳およびタンパク質発現を増幅する）または翻訳アンタゴニスト（翻訳およびタンパク質発現を抑制する）のいずれかとして作用することができる。
【００１２】
【図７】図７は、トランス作用性３ＷＪを安定化させるために小分子がどのように作用し得るかを実証するスキームを示す。開示した方法を使用して、例えば、（必要に応じて、各ｍＲＮＡは、ハイブリダイズ可能な部位を１つだけ有するという単純化する仮定を用いて、）約１０００のｍｉＲＮＡを２０，０００のｍＲＮＡと関連付けて、可能性のある２０，０００，０００のペアとし得る。このカタログは、所与のｍｉＲＮＡの実際の内因性の調節的役割を参照することなく集めることができる。小分子が三成分複合体を安定化できる限り、これはｍＲＮＡ機能の調節に対するアルゴノートおよび／またはＲＢＰの寄与を現実的に意味のないものにさせ得る。
【００１３】
【図８】図８は、３ＷＪ結合性小分子の例示的な結合モードを示す。小分子は３ＷＪのみに結合するかもしれないし、３ＷＪに加えて１つの塩基対に隣接する主溝または副溝に結合するかもしれないし、３ＷＪに加えて２つの別々の二本鎖中で１つの塩基対に隣接する主溝または副溝に結合するかもしれない、などといった具合である。
【００１４】
【図９】図９は、３ＷＪのトポロジーを示す。注記：（Ａ）Ｘ、Ｙ、およびＺは、０、１、２、３、４、５、または６として独立して変動する。（Ｂ）３ＷＪの外縁を画定するループ中のヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵとして独立して変動する。（Ｃ）細胞内でこれらのヌクレオチドは、転写後修飾を受けていることがある。（Ｄ）ステムはそれぞれ最小で４塩基対であるが、バルジおよびループを含有することができる。（Ｅ）ステムループの末端のループは、３以上で変動し得る。
【００１５】
【図１０】図１０は、対応するトランス３ＷＪシステムを理解するために使用され得るシスモデルシステムを示す。合成の一本鎖ＲＮＡは、鍵となる結合事象を再現することができる。それは、５’から３’または３’から５’を介して連結することができる。リンカーの長さおよび構造は、３ＷＪの形成に有利に働くがそれを強制しないように選択される。シスモデルにおいて３ＷＪに結合するリガンドは、トランスモデルにおいて三成分複合体の形成を誘発するに違いない。このフォーマットは、迅速かつ組合せの選択性スクリーニングを可能とする。ここでの結合自由エネルギーは、細胞での結果を予測するものと期待される。以下は、この方法の一部の特徴である：解析される構造が小さい（ＮＭＲによるスクリーニングに充分な程に小さい）；実行が容易；ＤＥＬ（ＤＮＡエンコードライブラリー）を介してスクリーニング可能；生物学的に妥当（同族ｍＲＮＡとのｍｉＲＮＡの調節相互作用をモデル化する）；生物学的に特異的（単一のｍＲＮＡに焦点を当てる）；１つのサブサイトに即時に焦点を当てるので、構造情報による置換アッセイ（displacement  assay）を設計することができる；標的／サブサイトと生物学的機能との間の本来的な繋がり；および、恣意的な部位における恣意的なｍＲＮＡに取り組むために非同族ｍｉＲＮＡを用いる可能性。
【００１６】
【図１１】図１１は、ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ法（フックザワーム、またはＨＴＷ；米国特許出願第６２／２８９，６７１号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照）がどのように内因性のｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡペアを明らかにできるかを示す。ＷＨ＝ＷＨに共有結合する小分子リガンドの結合後にＲＮＡ上の近位の２’−ＯＨ部位と反応する弾頭部分。ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡなどのＲＮＡ／ＲＮＡペアの別々のシークエンシングは、アッセイ条件下および／またはｉｎ  ｖｉｖｏでどのヌクレオチドが互いにおよびＨＴＷ分子の結合部位の近位にあるかを明らかにする。
【００１７】
【図１２】図１２は、１つの補助部（すなわち、３ＷＪの中央キャビティの外側の、主溝または副溝などの核酸の特徴部に結合できる基）を有する例示的なトリプチセン足場を示す。
【００１８】
【図１３】図１３は、２つの補助部を有する例示的なトリプチセン足場を示す。
【００１９】
【図１４】図１４は、３つの補助部を有する例示的なトリプチセン足場を示す。
【００２０】
【図１５】図１５は、１つの補助部を有する例示的なトリチル足場を示す。
【００２１】
【図１６】図１６は、２つの補助部を有する例示的なトリチル足場を示す。
【００２２】
【図１７】図１７は、１つの補助部を有する例示的な１−アザビシクロオクタン足場を示す。
【００２３】
【図１８】図１８は、２つの補助部を有する例示的な１−アザビシクロオクタン足場を示す。
【００２４】
【図１９】図１９は、１つの補助部を有する例示的なトリオキサビシクロオクタン足場を示す。
【００２５】
【図２０】図２０は、２つの補助部を有する例示的なトリオキサビシクロオクタン足場を示す。
【００２６】
【図２１】図２１は、２つの補助部を有する例示的なアダマンタン足場を示す。
【００２７】
【図２２】図２２は、２つの補助部を有する例示的なアダマンタン足場を示す。
【００２８】
【図２３】図２３は、本明細書中の様々な実施形態に記載する１つまたは複数の官能基またはエッジ結合剤で置換された時に、塩基対の露出したエッジと相互作用することによって、３ＷＪの中央キャビティに、そしてまた二本鎖ＲＮＡの溝に結合し得る一般的な分子足場を示す。
【００２９】
【図２４】図２４は、エッジ相互作用のための様々なシントンを提供するＤＮＡ溝結合剤の構造を示す。
【００３０】
【図２５】図２５は、核酸標的の３ＷＪと塩基対形成できる官能基、および、副溝などのエッジ特徴部と結合相互作用できる官能基を特徴とする例示的な小分子足場の構造を示す。
【００３１】
【図２６】図２６は、核酸の標的３ＷＪと塩基対形成できる核酸塩基、および、主溝または副溝などのエッジ特徴部と結合相互作用できる官能基を特徴とする設計された小分子の絵図による描写および例示的な化合物構造を示す。Ｈ結合ドナーおよびアクセプター機能は、核酸のステムループ構造のステムとの相互作用（配列特異的相互作用など）を最適化するような間隔となっている。
【００３２】
【図２７】図２７は、所与の核酸ジャンクション構造の幾何のために最適化されて設計された小分子の例示的な結合モードを示す。結合は、中央キャビティに焦点を当てるだけでなく、中央キャビティから離れたステム構造と結合する「アーム」も含み、これは必要に応じて、遠位の二次ループに結合できる機能を含む。
【００３３】
【図２８】図２８は、１つまたは複数のバルジ（対形成していないヌクレオチド）を有する所与の核酸二本鎖の幾何のために最適化されて設計された小分子の例示的な結合モードを示す。ここでは、水素結合のドナーおよびアクセプターは、主溝または副溝などにおいて二本鎖と相互作用するような間隔となっており、１つまたは複数の核酸塩基がバルジ（複数可）と相互作用するような位置にある。
【００３４】
【図２９】図２９は、１つまたは複数のバルジ（対形成していないヌクレオチド）を有する所与の核酸二本鎖の幾何のために最適化されて設計された小分子の例示的な結合モードを示す。ここでは、水素結合のドナーおよびアクセプターは、主溝または副溝などにおいて二本鎖と相互作用するような間隔となっており、１つまたは複数の核酸塩基がバルジ（複数可）と相互作用するような位置にある。
【００３５】
【図３０】図３０は、所与の核酸の３ＷＪの幾何のために最適化されて設計された小分子の例示的な結合モードを示す。ここでは、水素結合のドナーおよびアクセプターは、３ＷＪから突出した１つまたは複数の二本鎖アームと相互作用（主溝または副溝との相互作用など）するような間隔となっており、１つまたは複数の核酸塩基が、遠位のループおよび核酸塩基（左の構造）または式Ｉ、ＩＩの化合物などの化学物質足場と相互作用するような位置にあり、必要に応じて、３ＷＪの中央キャビティに結合するような位置にある（右３つの構造）。
【００３６】
【図３１】図３１は、ある特定の実施形態では開示した化合物によって下方調節される、例示的な標的ｍＲＮＡのリストを示す。
【００３７】
【図３２】図３２は、ある特定の実施形態では開示した化合物によって上方調節される、例示的な標的ｍＲＮＡのリストを示す。
【００３８】
【図３３】図３３は、エッジ相互作用のための様々なシントンを提供する例示的なＤＮＡ溝結合剤の構造を示す。
【００３９】
【図３４】図３４は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００４０】
【図３５】図３５は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００４１】
【図３６】図３６は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００４２】
【図３７】図３７は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００４３】
【図３８】図３８は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００４４】
【図３９】図３９は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００４５】
【図４０】図４０は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００４６】
【図４１】図４１は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００４７】
【図４２】図４２は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００４８】
【図４３】図４３は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００４９】
【図４４】図４４は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００５０】
【図４５】図４５は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００５１】
【図４６】図４６は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００５２】
【図４７】図４７は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。（Ａ）では、リボザイムは、ビオチンマレイミドとの反応およびその後のビオチン化された分子の単離によってランダム配列ＲＮＡ−テザー−アントラセンコンジュゲートのコンビナトリアルライブラリーから選択された。（Ｂ）ほとんどの配列によって共有される二次構造モチーフ。Ｎ＝任意のヌクレオチド；Ｎ’＝Ｎに相補的なヌクレオチド。（Ｃ）Ｄ−またはＬ−リボザイムによって触媒される二分子環化付加。Ｒ１＝Ｈまたはそれより大きいもの；Ｒ２＝エチルまたはそれより大きいもの。
【００５３】
【図４８−１】図４８は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【図４８−２】図４８は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００５４】
【図４９】図４９は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００５５】
【図５０】図５０は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。Ｃｐ＝シクロペンタジエン；ｃｏｄ＝１，５−シクロオクタジエン；ＴＢＡＦ＝フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム；ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン。
【００５６】
【図５１】図５１は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００５７】
【図５２】図５２は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００５８】
【図５３】図５３は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００５９】
【図５４】図５４は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。左のスキームは、対応するカルボン酸へのアリールアダマンタンの酸化分解を示す。Ａｎｓ：２−または４−アニシル。化合物１６は、２−および４−アニシル誘導体の混合物として得られた。右のスキームは、剛性のアダマンチン足場２０、２１、および２２の合成を示す。
【００６０】
【図５５】図５５は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００６１】
【図５６】図５６は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００６２】
【図５７−１】図５７は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。示した化合物は、ＴＣＴ８−４  ＲＮＡとの競合結合解析の結果を含む（Science  １９９４年、２６３巻）。ＴＣＴ８−４  ＲＮＡとの競合結合実験に使用した一連の誘導体の化学構造を示す。右欄は、テオフィリンに対する競合物の親和性Ｋｄ（ｃ）／Ｋｄ（ｔ）（Ｋｄ（ｃ）は個々の競合物の解離定数であり、Ｋｄ（ｔ）はテオフィリンの競合的な解離定数である）を表す。＞により示されるある特定のデータは、競合物の溶解度によって制限された最小値である。各実験は二連で実行した。平均誤差を示す。
【図５７−２】図５７は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。示した化合物は、ＴＣＴ８−４  ＲＮＡとの競合結合解析の結果を含む（Science  １９９４年、２６３巻）。ＴＣＴ８−４  ＲＮＡとの競合結合実験に使用した一連の誘導体の化学構造を示す。右欄は、テオフィリンに対する競合物の親和性Ｋｄ（ｃ）／Ｋｄ（ｔ）（Ｋｄ（ｃ）は個々の競合物の解離定数であり、Ｋｄ（ｔ）はテオフィリンの競合的な解離定数である）を表す。＞により示されるある特定のデータは、競合物の溶解度によって制限された最小値である。各実験は二連で実行した。平均誤差を示す。
【００６３】
【図５８−１】図５８は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。Lau,  J.  L.ら、ACS  Nano  2011年、5巻(10)7722頁を参照。
【図５８−２】図５８は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。Lau,  J.  L.ら、ACS  Nano  2011年、5巻(10)7722頁を参照。
【００６４】
【図５９】図５９は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００６５】
【図６０】図６０は、McKeagueら、Journal  of  Nucleic  Acids、２０１２巻（２０１２年）、論文ＩＤ  ７４８９１３、２０頁より転載した様々なＲＮＡアプタマーに結合する本発明において使用するための例示的な化合物足場および小分子を示す。
【００６６】
【図６１−１】図６１は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【図６１−２】図６１は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００６７】
【図６２】図６２は、本発明において使用するための例示的な化合物足場、小分子、およびこれらを調製する合成方法を示す。
【００６８】
【図６３Ａ】図６３ＡおよびＢは、化合物ＡＲＫ−１３２の合成経路を示す。
【図６３Ｂ】図６３ＡおよびＢは、化合物ＡＲＫ−１３２の合成経路を示す。
【００６９】
【図６４Ａ】図６４Ａ〜Ｄは、化合物ＡＲＫ−１３４の合成経路を示す。
【図６４Ｂ】図６４Ａ〜Ｄは、化合物ＡＲＫ−１３４の合成経路を示す。
【図６４Ｃ】図６４Ａ〜Ｄは、化合物ＡＲＫ−１３４の合成経路を示す。
【図６４Ｄ】図６４Ａ〜Ｄは、化合物ＡＲＫ−１３４の合成経路を示す。
【００７０】
【図６５Ａ】図６５Ａ〜Ｃは、化合物ＡＲＫ−１３５およびＡＲＫ−１３６の合成経路を示す。
【図６５Ｂ】図６５Ａ〜Ｃは、化合物ＡＲＫ−１３５およびＡＲＫ−１３６の合成経路を示す。
【図６５Ｃ】図６５Ａ〜Ｃは、化合物ＡＲＫ−１３５およびＡＲＫ−１３６の合成経路を示す。
【００７１】
【図６６】図６６は、化合物ＡＲＫ−１８８の合成経路を示す。
【００７２】
【図６７】図６７は、化合物ＡＲＫ−１９０の合成経路を示す。
【００７３】
【図６８】図６８は、化合物ＡＲＫ−１９１の合成経路を示す。
【００７４】
【図６９】図６９は、化合物ＡＲＫ−１９５の合成経路を示す。
【００７５】
【図７０】図７０は、化合物ＡＲＫ−１９７の合成経路を示す。
【００７６】
【図７１Ａ】図７１ＡおよびＢは、リボシル足場に基づく化合物の合成経路を示す。
【図７１Ｂ】図７１ＡおよびＢは、リボシル足場に基づく化合物の合成経路を示す。
【００７７】
【図７２】図７２は、３ＷＪ  ＲＮＡ構築物の濃度に対する蛍光の依存性を決定するための較正実験を示す。
【００７８】
【図７３】図７３は、様々な濃度において２つのＲＮＡ  ３ＷＪ構築物を用いる化合物Ａｒｋ０００００７およびＡｒｋ０００００８の蛍光消光実験の結果を示す。
【００７９】
【図７４】図７４は、三角形で示す小分子リガンドのための推定上の結合部位を有する以下の３つのＲＮＡ  ３ＷＪ構築物についての考えられる構造を示す。Ａ）ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ（シス３ＷＪ、１つの対形成していないヌクレオチドを有する）、Ｂ）分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）、およびＣ）分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）。
【００８０】
【図７５】図７５は、以下のＲＮＡ構築物との化合物Ａｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４の相互作用を測定する蛍光消光データを示す。Ａ）ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ（シス３ＷＪ、１つの対形成していないヌクレオチドを有する）、Ｂ）分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）、およびＣ）分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）。
【００８１】
【図７６】図７６は、３ＷＪ＿０．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ  ＲＮＡ構築物を用いて試験した化合物Ａｒｋ０００００７およびＡｒｋ０００００８についてのサーマルシフトデータを示す。データ解析は、約５℃の融解温度シフト（すなわち、６１．２℃から６５．６℃）を伴ってＡｒｋ０００００７についての有意な効果を示している。対照的に、Ａｒｋ０００００８についてはわずかな効果しか観察されなかった。これらのデータは、Ａｒｋ０００００７の存在が３ＷＪの安定性を増大させることを示唆する。
【００８２】
【図７７】図７７は、ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ（シス３ＷＪ、１つの対形成していないヌクレオチドを有する）の存在下でのＡｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４についてのサーマルシフトデータを示す。
【００８３】
【図７８】図７８は、分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭの存在下でのＡｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４についてのサーマルシフトデータを示す。
【００８４】
【図７９】図７９は、分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭの存在下でのＡｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４についてのサーマルシフトデータを示す。
【００８５】
【図８０】図８０は、ＣＰＮＱの構造を示しており、プロトン共鳴、ＮＭＲスペクトル、およびエピトープマッピングの結果を与えている。
【００８６】
【図８１】図８１は、ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１の構造を示しており、プロトン共鳴、ＮＭＲスペクトル、およびエピトープマッピングの結果を与えている。スケール化したＳＴＤ効果を事前の割り当てにしたがって分子上にプロットした。データは、両方のＲＮＡ構築物について、ピリジン環のプロトンがベンゼン環よりもＲＮＡにより近接することを示唆する。脂肪族ＣＨ２基は、その領域における緩衝液シグナルの重複に起因して観察できなかった。
【００８７】
【図８２】図８２は、ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２の構造を示しており、プロトン共鳴、ＮＭＲスペクトル、およびエピトープマッピングの結果を与えている。スケール化したＳＴＤ効果を事前の割り当てにしたがって分子上にプロットした。データは、両方のＲＮＡ構築物について、複素環に最も近い芳香族プロトンがＲＮＡプロトンにより近接することを示唆する。脂肪族プロトン共鳴は、直接飽和のアーティファクト／その領域における緩衝液シグナルの重複に起因してＳＴＤによって評価できなかった（ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹによるエピトープマッピング）。
【００８８】
【図８３】図８３は、ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３の構造を示しており、プロトン共鳴、ＮＭＲスペクトル、およびエピトープマッピングの結果を与えている。スケール化したＳＴＤ効果を事前の割り当てにしたがって分子上にプロットした。シグナルの重複に起因して、ＣＨ２基の個々の割り当てはできなかった。データは、両方のＲＮＡ構築物について、フラン部分のプロトンがフェニルよりもＲＮＡプロトンにより近接することを示唆する。
【００８９】
【図８４Ａ】図８４Ａ〜Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図８４Ｂ】図８４Ａ〜Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図８４Ｃ】図８４Ａ〜Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図８４Ｄ】図８４Ａ〜Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図８４Ｅ】図８４Ａ〜Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【００９０】
【図８５Ａ】図８５Ａ〜Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図８５Ｂ】図８５Ａ〜Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図８５Ｃ】図８５Ａ〜Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図８５Ｄ】図８５Ａ〜Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図８５Ｅ】図８５Ａ〜Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【００９１】
【図８６】図８６は、ＤＥＬ実験において使用するためのＲＮＡ標的配列のＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーンは以下を示す。１：ＮＭＲ緩衝液中のＨＴＴ１７ＣＡＧ、２：ニュートラアビジン樹脂とのインキュベーション前、３：ニュートラアビジン樹脂とのインキュベーション後の上清、４：室温での１時間のＤＥＬ化合物とのインキュベーション後のＲＮＡ。ＲＮＡは樹脂からの放熱後に回収した。
【００９２】
【図８７】図８７は、本発明において使用するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法の例示的ステップを示す。
【００９３】
【図８８】図８８ＡおよびＢは、本発明において使用するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法の例示的ステップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
本発明の詳細な説明
本発明は、薬物様小分子による、例えばＲＮＡまたはＤＮＡといった核酸分子のレベルおよび／または活性のモジュレーションのための化合物、およびその使用方法を提供する。本発明はまた、３ＷＪを形成する可能性があるまたは開示した化合物の存在下で３ＷＪを形成する可能性があるシスまたはトランスの配列相補性について核酸配列をスクリーニングする方法も提供する。さらには、本発明は、３ＷＪへの結合について小分子をスクリーニングする方法を提供する。本発明は、これらの構造を同定し、かつ細胞および動物においてそれらに選択的に結合して３ＷＪを安定化させる小分子をスクリーニングすることによって、３ＷＪの形成を利用する。３ＷＪを安定化させることによって、該小分子は核酸の安定性または活性をモジュレートすることができる。
【００９５】
一態様では、本発明は、３ＷＪに選択的に結合し、３ＷＪを安定化させる化合物または薬学的に許容されるその塩を提供する。一部の実施形態では、３ＷＪは、シス相互作用の生成物、すなわち、同じ核酸（例えば、ＲＮＡ）配列または鎖内の相互作用に起因する。一部の実施形態では、３ＷＪは、トランス相互作用の生成物、すなわち、２つまたはそれより多くの核酸（例えば、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、またはＤＮＡ−ＤＮＡ）配列または鎖内の相互作用に起因する。したがって、シス３ＷＪでは、３ＷＪを含む配列は、全て１つの核酸分子にある。対照的に、トランス３ＷＪでは、３ＷＪを形成する配列は、２つまたは３つ、最も一般的には２つの、異なる核酸分子の相互作用に由来する。例えば、一部のシス３ＷＪでは、単一のｍＲＮＡ転写物の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）中の配列がフォールディングして３ＷＪを形成する。他の実施形態では、例示的なトランス３ＷＪは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とｍＲＮＡとの間に形成された３ＷＪである。
【００９６】
３ＷＪに結合する小分子によって、３ＷＪの形成およびモジュレーションのために様々なＲＮＡが標的化され得る。これらのＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、長鎖非コーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ウイルスＲＮＡ、および微生物ＲＮＡが挙げられる。これらを本特許出願では「標的」と称する。本発明について１つの一般的な使用は、ヒトｍＲＮＡの翻訳によって発現されるタンパク質のレベルに影響を与えるためにそのｍＲＮＡを標的化することであろう。別の使用は、ＲＮＡウイルスのゲノムを標的化して、翻訳を阻害し、ウイルスのパッケージングをブロックし、またはウイルスのライフサイクルにおける他の必須のステップを阻害することであろう。
【００９７】
短鎖ＲＮＡは、トランスで作用して３ＷＪの形成を誘発することができる。これらのＲＮＡを「エフェクター」と称する。一部の実施形態では、エフェクターは、ｍｉＲＮＡ、Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、および低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）などの様々な天然形態の短鎖ＲＮＡから選択される。これらの短鎖ＲＮＡは、３ＷＪの形成をもたらすようにｍＲＮＡなどの標的と塩基対を形成することができる。エフェクターと標的との間の塩基対形成は多くの場合に不完全であり、すなわち、２つの配列は部分的な完全ではない相補性を有する。完璧な相補性は、３ＷＪを欠いた完全に二本鎖の構造の形成をもたらすことになる。３ＷＪを形成するために、エフェクター（例えば、ｍｉＲＮＡ）および標的（例えば、ｍＲＮＡ）は、一般的に、少なくとも４ヌクレオチド（ｎｔ）の塩基対形成とそれに続く少なくとも４ｎｔの塩基対形成したステムおよび対形成していないｎｔのループのストレッチと、それに続いてエフェクターと標的配列との間で塩基対形成した第２のストレッチとを形成する。ステムループは、エフェクター中または標的ＲＮＡ中のいずれかに形成することができる。例示的な３ＷＪ構造を図１、図７、および図９に示す。
【００９８】
３ＷＪを同定する方法は最初に、３ＷＪを予測するためのコンピュータによるアプローチを含む。ＢＬＡＳＴなどのプログラムを使用して相同性について配列データベースを検索することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを標的化するエフェクターｍｉＲＮＡを同定するために、ＵＣ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒなどの注釈付きのデータベースを使用して、ｍｉＲＮＡのライブラリーと１つの特定の目的のｍＲＮＡ（または、他の実施形態では、特定のｍｉＲＮＡと会合するｍＲＮＡの公知の群；または、他の実施形態では、全てのｍＲＮＡが検索される）との間で相同性検索が行われる。ｍｉＲＮＡの公共データベースが利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ；ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｄｂ．ｏｒｇ／ｍｉＲＤＢ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｇ／ｍｉｃｒｏｒｎａ／ｈｏｍｅ．ｄｏ；ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｔａｒｂａｓｅ．ｍｂｃ．ｎｃｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ；ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｃａｎｃｅｒ．ｅｃｕ．ｅｄｕ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒ２ｄｉｓｅａｓｅ．ｏｒｇ；ｈｔｔｐ：／／ｚｍｆ．ｕｍｍ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ａｐｐｓ／ｚｍｆ／ｍｉｒｗａｌｋ２／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）。エフェクターおよび標的の最小塩基対形成、ステムの最小サイズ、ループの最大サイズ、および構造の熱安定性を含めて３ＷＪのパラメーターを設定することによってエフェクター：標的の同定用検索を行うことができる。このトランス解析以外に、シス３ＷＪの同定は、個々のＲＮＡの３ＷＪを形成する能力について核酸データベース（例えば、注釈付きｍＲＮＡ）を検索することによって行ってもよい。
【００９９】
フォールディングしたコンフォメーションにおいて、３つの二重らせんの「ステム」が一点に集合し、かつステムが様々な長さの１つまたは２つのループで接続された時に、核酸中に３ＷＪが形成される。これらは、ジャンクション中の全てのヌクレオチドが塩基対形成に参加する「完璧な」３ＷＪ、または、３つが集合するステップの間にジャンクションにおいて１つまたは複数のｎｔが対形成しないものであり得る低下された対称性の３ＷＪのいずれかであり得る。第１のエフェクター：標的の塩基対形成の末端（ｘ）、ステムの基部（ｙ）、および第２のエフェクター：標的の塩基対形成の開始（ｙ）の３つの位置は、対形成していないｎｔのループまたはバルジを有し得る（図９を参照）。一部の実施形態では、標的核酸への小分子の結合によって形成された３ＷＪ中のｘ、ｙおよびｚのループ長さは、独立して、０、１、または２ｎｔから選択される。一部の実施形態では、各ループは、独立して、０、１、２、３、または４ｎｔから選択される。一部の実施形態では、各ループは、０ｎｔである。一部の実施形態では、各ループは、１ｎｔである。一部の実施形態では、各ループは、２ｎｔである。一部の実施形態では、１つのループは、０ｎｔである。一部の実施形態では、１つのループは、１ｎｔである。一部の実施形態では、１つのループは、２ｎｔである。
【０１００】
ＤＮＡおよびＲＮＡの３ＷＪに結合し、（融解温度の上昇を証拠として）その３Ｄ構造を安定化させる小分子が報告されている。小分子リガンドの周囲での３ＷＪの形成が、一本鎖核酸とトリプチセン（BarrosおよびChenoweth、Angew.  Chem.  Int.  Ed.  ２０１４年、５３巻、１３７４６〜１３７５０頁；BarrosおよびChenoweth、Chem.  Sci.、２０１５年、６巻、４７５２〜４７５５頁；Barrosら、Angew.  Chem.  Int.  Ed.  ２０１６年、５５巻、１〜５頁）、コカイン誘導体の周囲での２つの鎖の相補的なハイブリダイゼーション（Kentら、Anal.  Chem.  ２０１３年、８５巻、９９１６〜９９２３頁；SharmaおよびHeemstra、J.  Am.  Chem.  Soc.  ２０１１年、１３３巻、１２４２６〜１２４２９頁；Heemstra、Beilstein  J.  Org.  Chem.  ２０１５年、１１巻、２７１３〜２７２０頁）、および対称的な有機金属錯体の周囲での３つの鎖の集合（Phongtongpasukら、Angew.  Chem.  Int.  Ed.  ２０１３年、５２巻、１１５１３〜１１５１６頁；Oleksiら、Angew.  Chem.  Int.  Ed.  ２００６年、４５巻、１２２７〜１２３１頁）について報告されている。
【０１０１】
本質的に全ての生物学が、考慮されている標的のクラスに帰着できる限りにおいて、本発明によって広範な疾患に取り組むことができる可能性がある。
【０１０２】
本発明の一態様では、ある特定の小分子は、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）の補助または関与なしで３ＷＪの形成および安定化を誘発することによって、エフェクターＲＮＡを標的ＲＮＡなどの標的核酸の領域へと持ちよる。多くの標的／エフェクター核酸ペアは、複数の潜在的な３ＷＪ相互作用を有する。したがって、小分子リガンドは、細胞中の本質的にあらゆる標的化されるＲＮＡの生物学的機能をモジュレートするために「プログラム」することができる。これは、外因性オリゴヌクレオチドの投与によって課される製薬上の制限なくアンチセンスが元々約束するものを再現する。
【０１０３】
核酸の３ＷＪの標的化
ＲＮＡは、細胞中で様々な重要な役割を果たす。タンパク質をコードする遺伝子からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が転写され、それが、広範な機能に役立つタンパク質に転写される。ｍＲＮＡは、それらの機能のために決定的に重要な３ＷＪなどの構造的な特徴をとるので、本発明の一部の実施形態は、１つまたは複数のｍＲＮＡが標的核酸である化合物および方法を提供する。他の実施形態では、他の種類のＲＮＡが標的核酸である。例えば、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）および転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、翻訳において機能する。非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）は多様かつ豊富に存在し、多くの細胞プロセスにおいて調節的な役割を果たす。長鎖非コーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、タンパク質をコードしない２００ｎｔを超えるＲＮＡである（MorrisおよびMattick、Nature  Reviews  Genetics  ２０１４年、１５巻、４２３〜４３７頁；MattickおよびRinn、Nature  Struct.  &  Mol.  Biol.  ２０１５年、２２巻、５〜７頁；Iyerら、Nature  Genetics  ２０１５年、４７巻、１９９〜２０８頁）。それらは、転写、スプライシング、およびｍＲＮＡの分解のレベルで、タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現に影響し得る。ｌｎｃＲＮＡは、クロマチン構造を変化させることによって転写を増加または低下させるエピジェネティック調節因子を動員することによって転写を調節できる（HolochおよびMoazed、Nat.  Rev.  Genetics  ２０１５年、１６巻、７１〜８４頁）。ｌｎｃＲＮＡは、がん、炎症性疾患、神経学的疾患および心臓血管疾患を含めて広範なヒト疾患に関連する。ｌｎｃＲＮＡの標的化されたモジュレーションは、３ＷＪの形成部位に応じて、治療的利益のために特定の遺伝子およびタンパク質の発現の上方調節または下方調節をもたらす可能性がある。ＲＮＡの二次構造および三次構造、特に３ＷＪは、これらの調節的な活性にとって決定的に重要である。したがって、非コーディング転写物（非コーディングトランスクリプトーム）は、新たな治療標的の大きい群を表す。一部の例示的なＲＮＡ標的および疾患が、以下により詳細に記載される。
【０１０４】
ｍＲＮＡの標的化
ｍＲＮＡは核内でＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。ヒト中にはおおまかに２０，０００のｍＲＮＡが存在する。しかしながら、５’開始部位、３’ＵＴＲの長さ、およびポリアデニル化（ポリＡ）部位の使用法において異なることがあるいくつもの異なるアイソフォームを各ｍＲＮＡは有し得るという点でかなり複雑である。多くのｍＲＮＡはまた、多様な選択的スプライシングの形態を有する。典型的なｍＲＮＡは、５’末端のキャップ、５’ＵＴＲ、様々な数のエクソンおよびイントロン、３’ＵＴＲおよび３’末端のポリＡ配列を有する。ｍＲＮＡの濃度または「レベル」、および翻訳を介した結果物としてのタンパク質発現は、ｍＲＮＡの構造、スプライシング効率、ｍＲＮＡの安定性（半減期）、ＲＮＡの輸送、および翻訳の効率に影響する小分子によってモジュレートされ得る。３ＷＪの形成は、ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルに影響するコーディングまたは非コーディングのいずれかのエレメントにおいて誘発および安定化され得る。治療上の目標に応じて、目的は、下方調節または上方調節のいずれかであり得る。したがって、一部の実施形態では、本発明は、標的ｍＲＮＡの濃度を変化させる方法であって、標的ｍＲＮＡを開示した化合物と接触させて、標的ｍＲＮＡの部分を含む３ＷＪを形成または安定化させるステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、標的ｍＲＮＡの部分を含む３ＷＪを形成または安定化させることは、標的ｍＲＮＡのスプライシング効率、安定性（例えば、半減期）、輸送、または翻訳の効率に影響する。一部の実施形態では、標的ｍＲＮＡの濃度は上方調節される。一部の実施形態では、標的ｍＲＮＡの濃度は下方調節される。一部の実施形態では、下方調節されるｍＲＮＡは、図３１に列記されたものから選択される。一部の実施形態では、上方調節されるｍＲＮＡは、図３２に列記されたものから選択される。一部の実施形態では、３ＷＪはシスである。一部の実施形態では、３ＷＪはトランスである。
【０１０５】
ｍＲＮＡ内の非コーディング領域は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルに影響し得る。簡潔に述べれば、これらの非コーディング領域としては、（ａ）内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および（ｂ）翻訳効率に影響する５’ＵＴＲ中の上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）、（ｃ）スプライシング効率および選択的スプライシングパターンに影響するイントロン配列、（ｄ）ｍＲＮＡおよびタンパク質の局在性に影響する３’ＵＴＲ配列、および（ｅ）ｍＲＮＡの分解および半減期を制御するｍＲＮＡの本体部中および／または３’ＵＴＲ中のエレメントが挙げられる。（KomarおよびHatzoglou、Frontiers  Oncol.  ５巻：２３３頁、２０１５年；Weingarten-Gabbayら、Science  ３５１巻：ｐｉｉ：ａａｄ４９３９、２０１６年；Calvoら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １０６巻：７５０７〜７５１２頁；Le  Quesneら、J.  Pathol.  ２２０巻：１４０〜１５１頁、２０１０年；Barbosaら、PLOS  Genetics  ９巻：ｅ１００３５５２９頁、２０１３年）。例えば、全てのヒトｍＲＮＡのうちの半分近くがｕＯＲＦを有しており、これらの多くはメインＯＲＦの翻訳を低下させる。ヒトに関連する莫大な数の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）がｍＲＮＡのこれらの非コーディング領域中に位置し、このことは、それらは決定的に重要な調節機能を有し、３ＷＪの形成によるそれらの標的化は発現レベルに影響を及ぼす可能性があることを示唆する。したがって、一部の実施形態では、本発明は、標的ｍＲＮＡの濃度を変化させる方法であって、標的ｍＲＮＡを開示した化合物と接触させて、標的ｍＲＮＡの非コーディング部分を含む３ＷＪを形成または安定化させるステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、標的ｍＲＮＡの非コーディング部分は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、５’ＵＴＲ中の上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）、スプライシング効率および選択的スプライシングパターンに影響するイントロン配列、ｍＲＮＡおよびタンパク質の局在性に影響する３’ＵＴＲ配列、または、ｍＲＮＡの分解および半減期を制御するｍＲＮＡの本体部中および／または３’ＵＴＲ中のエレメントから選択される。
【０１０６】
他の実施形態では、翻訳を阻害するために５’ＵＴＲ中のＲＮＡ構造が標的化される。５’ＵＴＲ中のヘアピンなどのＲＮＡ構造は翻訳に影響することが示されている。一部の実施形態では、本発明は、タンパク質の産生を低下させるためにリボソームの認識および／または進行をモジュレートし、または翻訳を阻害する方法であって、５’ＵＴＲ中のＲＮＡ構造を開示した化合物と接触させるステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、翻訳の開始におけるＡＵＧでのまたはＡＵＧのすぐ上流での３ＷＪの形成または安定化によって、リボソームの認識および／または進行がモジュレートされ、または翻訳が阻害される。
【０１０７】
ｍＲＮＡの半減期は細胞中で緊密に制御されている（Palumboら、Wiley  Interdiscip.  Rev.  RNA、２０１５年、６巻、３２７〜３３６頁）。細胞中のｍＲＮＡの濃度は、転写とｍＲＮＡの分解との間の緊密な調節およびバランスの産物である。個々のｍＲＮＡは、それら自身の独特な半減期を有するが、ｍＲＮＡが誤ってプロセシングされるか、または翻訳がブロックされた時に分解が加速され得る。個々のｍＲＮＡの分解は、翻訳の障害によって刺激または阻害されることがあり、また同様に、ｍＲＮＡの半減期の変化は、翻訳効率を変化させることがある（RoyおよびJacobson、Trends  Genet.  ２０１３年、２９巻、６９１〜６９９頁）。ｍＲＮＡの安定性および分解はまた、環境刺激、および、細胞周期、細胞分化、および免疫応答などの生物学的プロセスによっても制御され得る。ｍＲＮＡの安定性は、細胞の種類および種の間で保存されている。ヒトｍＲＮＡの大部分は、８時間未満の半減期を呈し、かなりの割合が４時間未満の半減期を有する。ｍＲＮＡ中での３ＷＪの形成および安定化は、ｍＲＮＡの安定性を著しく増加または低下させる可能性がある。ほとんどのｍＲＮＡの分解は、ｍＲＮＡをその末端から分解するエキソリボヌクレアーゼによるＲＮＡのプロセッシブな３’から５’へのおよび５’から３’への分解によって起こる。これらのエキソリボヌクレアーゼは、一本鎖のＲＮＡを分解するが、二本鎖のＲＮＡを分解しない。したがって、一部の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡの半減期を増加させ、またはｍＲＮＡによって調節されるタンパク質のレベルをモジュレートする方法であって、ｍＲＮＡを開示した化合物と接触させるステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、ｍＲＮＡ中、またはｍＲＮＡと別のＲＮＡなどの相補的な核酸との間の、３ＷＪの形成を誘発し、または３ＷＪを安定化させる。理論に縛られることを望まないが、３ＷＪの存在は、エキソリボヌクレアーゼ活性をブロックして、ｍＲＮＡの半減期を増加させ、かつ治療的に有益なタンパク質の、結果としてもたらされるタンパク質レベルを増加させ得る。一部の実施形態では、開示した化合物は、ポリＡ部位の上流の３’ＵＴＲにおいて３ＷＪの形成を誘発し、または３ＷＪを安定化させる。これは、標的ｍＲＮＡを分解から保護し得る。あるいは、３ＷＪは、翻訳を阻害しないことを条件として、５’ＵＴＲ中に導入される。
【０１０８】
ｍＲＮＡ転写物の終結は異なる位置において起こり得るので、変質的なタンパク質コーディングを含めて独特の特性を有するｍＲＮＡを形成する。ｍＲＮＡのプロセシングは転写と同時に起こり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロセッシビティの減速は、３’末端の切断およびポリアデニル化に関連する。選択的な終結およびポリＡ部位の使用法によって、タンパク質をコードする様々な長さのｍＲＮＡが創出され得る。これらの独特のＲＮＡは、異なる半減期、翻訳効率または細胞内局在性を有し得る。一部の実施形態では、開示した化合物は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの終結および／またはポリＡ付加の部位において、３ＷＪに結合しかつ／または３ＷＪを安定化させる。一部の実施形態では、そのような３ＷＪの形成および／または安定化は、ｍＲＮＡの機能を変化させる。
【０１０９】
標的およびエフェクターの選択についての１つの考慮される点は、それらの相対発現レベルである。一部の実施形態では、エフェクターＲＮＡ濃度は、標的核酸（例えば、標的ｍＲＮＡ）濃度に類似する。標的の存在量がエフェクターを大いに上回れば、ＲＮＡ標的に対する機能的な影響力はより困難なものとなる。ある特定の実施形態では、生物学的システム（例えば、対象の全身、組織、細胞、核、ミトコンドリア、または細胞質）中でのエフェクター：標的核酸の相対的な濃度は、１００：１〜１：１００の間である。一部の実施形態では、相対的な濃度は、５０：１〜１：５０、２５：１〜１：２５、１０：１〜１：１０、５：１〜１：５、３：１〜１：３、２：１〜１：２または約１：１である。一部の実施形態では、エフェクター：標的の濃度は、少なくとも約１０：１である。一部の実施形態では、エフェクター：標的の濃度は、少なくとも約２５：１である。加えて、ある特定の実施形態では、両方のＲＮＡは、相互作用の可能性がより高くなるように、細胞の同じ区画に局在する。細胞内分布は精密に合致する必要はないが、排他的であるべきではない。例えば、エフェクターが排他的に核内であると同時に標的核酸が排他的に細胞質内であるべきではない。
【０１１０】
小分子を使用して、様々な状況下での治療的利益のためにｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートすることができる。その一例は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である。ＳＭＡは運動ニューロン（ＳＭＮ）のタンパク質の不十分な生存量の結果である。ヒトは、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２という２つのバージョンのＳＭＮ遺伝子を持つ。ＳＭＡ患者は変異したＳＭＮ１遺伝子を持つため、この患者らのＳＭＮタンパク質はＳＭＮ２のみに依存する。ＳＭＮ２遺伝子は非効率的なスプライシングを引き起こすサイレント変異をエクソン７に有するため、ＳＭＮ２転写物の大部分においてエクソン７がスキップされ、細胞内で急速に分解される欠陥タンパク質の生成に繋がる。その結果、この遺伝子座から産生されるＳＭＮタンパク質の量が制限される。ＳＭＮ２転写物のスプライシングの間にエクソン７が効率的に含まれるのを促進する小分子は、ＳＭＡの効果的な治療となるであろう（Palacinoら、Nature  Chem.  Biol.、２０１５年、１１巻、５１１〜５１７頁）。したがって、一態様では、本発明は、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング、転写、または細胞内半減期をモジュレートして疾患または障害を治療する小分子を同定する方法であって、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡ中の３ＷＪへの結合について本明細書中に開示した１つまたは複数の小分子をスクリーニングするステップ、およびどの小分子（複数可）が３ＷＪに結合し、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング、転写、または細胞内半減期をモジュレートして疾患または障害を治療するかを同定するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、開示したコンピュータによる調査にしたがって標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡを同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、エフェクターｍｉＲＮＡなどのエフェクターＲＮＡの存在下で３ＷＪを形成することができる。一部の実施形態では、小分子は、エフェクターＲＮＡと標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡとの間に形成されたトランス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、小分子は、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの部分の間に形成されたシス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、ＳＭＮ２転写物である。一部の実施形態では、疾患または障害は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である。
【０１１１】
欠陥のあるスプライシングが疾患を引き起こさない場合であっても、スプライシングパターンの変化は疾患を正すために使用することができる。未熟な翻訳終結に繋がるナンセンス変異は、エクソン配列がインフレームであれば、エクソンスキッピングによって取り除くことができる。これにより、少なくとも部分的に機能的なタンパク質を創出することができる。エクソンスキッピングの使用の一例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）におけるジストロフィン遺伝子である。ＤＭＤ患者における未熟な終結コドンに繋がる様々な異なる変異は、オリゴヌクレオチドによって促進されるエクソンスキッピングによって取り除くことができる（Faircloughら、Nature  Rev.  Gen.、２０１３年、１４巻、３７３〜３７８頁で総説されている）。ＲＮＡ構造に結合し、スプライシングに影響する小分子は、類似の効果を有することが予測される。したがって、一態様では、本発明は、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングパターンをモジュレートして疾患または障害を治療する小分子を同定する方法であって、ステップを含む方法を提供する：したがって、一態様では、本発明は、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングパターンをモジュレートして疾患または障害を治療する小分子を同定する方法であって、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡ中の３ＷＪへの結合について本明細書中に開示した１つまたは複数の小分子をスクリーニングするステップ、およびどの小分子（複数可）が３ＷＪに結合し、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングパターンをモジュレートして疾患または障害を治療するかを同定するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、開示したコンピュータによる調査にしたがって標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡを同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、エフェクターｍｉＲＮＡなどのエフェクターＲＮＡの存在下で３ＷＪを形成することができる。一部の実施形態では、小分子は、エフェクターＲＮＡと標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡとの間に形成されたトランス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、小分子は、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡの部分の間に形成されたシス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子の転写物である。一部の実施形態では、小分子は、エクソンスキッピングを促進して未熟な翻訳終結を取り除く。一部の実施形態では、疾患または障害は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。
【０１１２】
本発明は、特定のタンパク質の発現を、それらの同族ｍＲＮＡ中の３ＷＪの標的化に基づいて上方または下方調節するための小分子の使用を企図する。したがって、本発明は、標的ｍＲＮＡに関連する下流タンパク質の発現をモジュレートする方法であって、標的ｍＲＮＡ中の３ＷＪに結合するまたは該３ＷＪを安定化させる本明細書中に開示した小分子と標的ｍＲＮＡを接触させるステップを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、標的ｍＲＮＡに関連する下流タンパク質の発現をモジュレートする小分子を製造する方法であって、標的ｍＲＮＡ中の３ＷＪへの結合について本明細書中に開示した１つまたは複数の小分子をスクリーニングするステップ、およびどの小分子（複数可）が３ＷＪに結合し、標的ｍＲＮＡに関連する下流タンパク質の発現をモジュレートするかを同定するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、開示したコンピュータによる調査にしたがって標的ｍＲＮＡを同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、標的ｍＲＮＡは、エフェクターｍｉＲＮＡなどのエフェクターＲＮＡの存在下で３ＷＪを形成することができる。一部の実施形態では、小分子は、エフェクターＲＮＡと標的ｍＲＮＡとの間に形成されたトランス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、小分子は、標的ｍＲＮＡの部分の間に形成されたシス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、標的ｍＲＮＡに関連する下流タンパク質の発現のモジュレーションは、開示した疾患または状態を治療または改善する。
【０１１３】
一部の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡによって媒介される疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に本願明細書に開示される小分子を投与するステップを含む、方法を提供する。
【０１１４】
調節ＲＮＡの標的化
ＲＮＡ標的の最大のセットは、転写されるがタンパク質に翻訳されない、「非コーディングＲＮＡ」と呼ばれるＲＮＡを含む。非コーディングＲＮＡは高度に保存されており、多くの種類の非コーディングＲＮＡが広範な調節機能を果たしている。本明細書中で使用する場合、「非コーディングＲＮＡ」という用語は、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖非コーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、長鎖遺伝子間非コーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、競合内因性ＲＮＡ（ｃｅＲＮＡ）、および偽遺伝子を包含するが、これらに限定されない。非コーディングＲＮＡのこれらの下位カテゴリーのそれぞれは、有意な治療的可能性を有する多数のＲＮＡ標的を与える。したがって、一態様では、本発明は、標的非コーディングＲＮＡの調節機能をモジュレートする小分子を製造する方法であって、標的非コーディングＲＮＡ中の３ＷＪへの結合について本明細書中に開示した１つまたは複数の小分子をスクリーニングするステップ、およびどの小分子（複数可）が３ＷＪに結合し、標的非コーディングＲＮＡの調節機能をモジュレートするかを同定するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、開示したコンピュータによる調査にしたがって標的非コーディングＲＮＡを同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、標的非コーディングＲＮＡは、エフェクターｍｉＲＮＡなどのエフェクターＲＮＡの存在下で３ＷＪを形成することができる。一部の実施形態では、小分子は、エフェクターＲＮＡと標的非コーディングＲＮＡとの間に形成されたトランス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、小分子は、標的非コーディングＲＮＡの部分の間に形成されたシス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、標的非コーディングＲＮＡの調節機能をモジュレートすることは、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｅＲＮＡ、または偽遺伝子によって引き起こされる疾患を治療または改善する。
【０１１５】
ｍｉＲＮＡの標的化
ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現を調節する短い二本鎖ＲＮＡである（ElliottおよびLadomery、Molecular  Biology  of  RNA、第２版を参照）。各ｍｉＲＮＡは多くのヒト遺伝子の発現に影響することができる。ヒトには２，０００近くのｍｉＲＮＡが存在する。これらのＲＮＡは、細胞分化、細胞運命、運動性、生存、および機能を含めて多くの生物学的プロセスを調節する。ｍｉＲＮＡ発現レベルは、組織、細胞種、および疾患状況ごとに異なる。それらは、正常組織に対して腫瘍中で頻繁に異常発現し、それらの活性はがんにおいて重大な役割を果たし得る（総説については、Croce、Nature  Rev.  Genet.  １０巻：７０４〜７１４頁、２００９年；Dykxhoorn、Cancer  Res.  ７０巻：６４０１〜６４０６頁、２０１０年を参照）。ｍｉＲＮＡはがん遺伝子および腫瘍抑制因子を調節することが示されており、またそれら自体ががん遺伝子または腫瘍抑制因子として作用できる。一部は、上皮間葉移行（ＥＭＴ）ならびにがん細胞の侵襲性および転移を促進することが示されている。発がん性ｍｉＲＮＡの場合、それらの阻害は効果的な抗がん治療となり得る。したがって、一態様では、本発明は、標的ｍｉＲＮＡの活性をモジュレートして疾患または障害を治療する小分子を製造する方法であって、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも一部分を含む３ＷＪへの結合について本明細書中に開示した１つまたは複数の小分子をスクリーニングするステップ、およびどの小分子（複数可）が３ＷＪに結合し、標的ｍｉＲＮＡの活性をモジュレートして疾患または障害を治療するかを同定するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、開示したコンピュータによる調査にしたがって標的ｍｉＲＮＡを同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡなどのそれが結合するＲＮＡの存在下で３ＷＪを形成することができる。一部の実施形態では、小分子は、標的ｍｉＲＮＡとそれが結合するＲＮＡとの間に形成されたトランス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡはがん遺伝子または腫瘍抑制因子を調節し、あるいはがん遺伝子または腫瘍抑制因子として作用する。一部の実施形態では、疾患はがんである。一部の実施形態では、がんは固形腫瘍である。
【０１１６】
一部の実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２１、またはｍｉＲ−１０ｂなどの発がん性ｍｉＲＮＡである（StahlhutおよびSlack、Genome  Med.  ２０１３年、５巻、１１１頁を参照）。ｍｉＲ−１５５は、炎症、高血圧、心不全、およびがんにおいて病理学的役割を果たす。がんにおいて、ｍｉＲ−１５５は発がんカスケードおよびアポトーシス抵抗性、ならびにがん細胞侵襲性の増大を誘起する。ｍｉＲ−１５５の発現の変化が、病期、進行、および治療転帰を反映して多数のがんで報告されている。ｍｉＲ−１５５の過剰発現が報告されているがんとしては、乳がん、甲状腺癌、結腸がん、子宮頸がん、および肺がんが挙げられる。ｍｉＲ−１５５は、乳がんの薬物耐性における役割を果たすことが報告されている。ｍｉＲ−１７〜９２（Ｏｎｃｏｍｉｒ−１とも呼ばれる）は、ｍｉＲ−１７、２０ａ、１８ａ、１９ａ、９２−１、および１９ｂ−１を含む多シストロン性の１ｋｂの一次転写物である。これはＭＹＣによって活性化される。ｍｉＲ−１９は多数の造血細胞において遺伝子発現およびシグナル伝達経路を変化させ、また白血病誘発およびリンパ腫発生を誘起する。これは多様なヒト固形腫瘍および血液がんに関与する。ｍｉＲ−２１は発がん性ｍｉＲＮＡであり、多数の腫瘍抑制因子の発現を低下させる。これはがん細胞の侵襲を刺激し、また胸部、卵巣、頸部、結腸、肺、肝臓、脳、食道、前立腺、膵臓、および甲状腺のがんを含めてヒトの多様ながんに関連する。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２１、またはｍｉＲ−１０ｂから選択される。一部の実施形態では、疾患または障害は、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺癌、結腸がん、肝臓がん、脳のがん、食道がん、前立腺がん、肺がん、白血病、またはリンパ節がんから選択されるがんである。一部の実施形態では、がんは固形腫瘍である。
【０１１７】
腫瘍学を超えて、ｍｉＲＮＡは、心臓血管疾患および代謝性疾患を含めて多くのその他の疾患において役割を果たす（QuiantおよびOlson、J.  Clin.  Invest.  １２３巻：１１〜１８頁、２０１３年；Olson、Science  Trans.  Med.  ６巻：  ２３９ｐｓ３、２０１４年；Baffy、J.  Clin.  Med.  ４巻：１９７７〜１９８８頁、２０１５年）。
【０１１８】
多くの成熟ｍｉＲＮＡは長さが比較的短いため、小分子によって標的化されるために十分なフォールディングした三次元構造を欠くことがある。しかしながら、そのようなｍｉＲＮＡのレベルは、一次転写物またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの少なくとも一部を含む３ＷＪに結合して成熟ｍｉＲＮＡの生合成を妨げる小分子によって低下され得ると考えられる。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは一次転写物またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。
【０１１９】
ｌｎｃＲＮＡは２００ヌクレオチド（ｎｔ）を上回るＲＮＡであり、タンパク質をコードしない（RinnおよびChang、Ann.  Rev.  Biochem.  ２０１２年、８１巻、１４５〜１６６頁を参照；（総説については、MorrisおよびMattick、Nature  Reviews  Genetics  １５巻：４２３〜４３７頁、２０１４年；MattickおよびRinn、Nature  Structural  &  Mol.  Biol.  ２２巻：５〜７頁、２０１５年；Iyerら、Nature  Genetics  ４７巻（：１９９〜２０８頁、２０１５年）を参照）。ｌｎｃＲＮＡは、転写、スプライシング、およびｍＲＮＡの分解のレベルでタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現に影響することができる。ｌｎｃＲＮＡはクロマチン構造を変化させることによって転写を増加または低下させるエピジェネティック調節因子を動員することによって転写を調節できることを相当数の研究が示している（例えば、HolochおよびMoazed、Nature  Reviews  Genetics  １６巻：７１〜８４頁、２０１５年）。ｌｎｃＲＮＡは、がん、炎症性疾患、神経学的疾患、および心臓血管疾患を含めてヒト疾患に関連する（例えば、PresnerおよびChinnaiyan、Cancer  Discovery  １巻：３９１〜４０７頁、２０１１年；Johnson、Neurobiology  of  Disease  ４６巻：２４５〜２５４頁、２０１２年；GutscherおよびDiederichs、RNA  Biology  ９巻：７０３〜７１９頁、２０１２年；Kumarら、PLOS  Genetics  ９巻：ｅ１００３２０１、２０１３年；van  de  Vondervoortら、Frontiers  in  Molecular  Neuroscience、２０１３年；Liら、Int.  J.  Mol.  Sci.  １４巻：１８７９０〜１８８０８頁、２０１３年）。ｌｎｃＲＮＡを標的化することで、治療的利益のために特定の遺伝子およびタンパク質の発現を上方調節または下方調節し得る（例えば、Wahlestedt、Nature  Reviews  Drug  Discovery  １２巻：４３３〜４４６頁、２０１３年；GuilおよびEsteller、Nature  Structural  &  Mol.  Biol.  １９巻：１０６８〜１０７５頁、２０１２年）。一般に、ｌｎｃＲＮＡは、ｍＲＮＡと比べて低いレベルで発現される。多くのｌｎｃＲＮＡは、クロマチンと物理的に会合しており（Wernerら、Cell  Reports  １２巻、１〜１０頁、２０１５年）、タンパク質をコードする遺伝子に近接して転写される。ｌｎｃＲＮＡはしばしば、転写の部位において物理的に会合したままであり、シスで局所的に作用して隣接ｍＲＮＡの発現を調節する。ｌｎｃＲＮＡは、タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節し、多くの異なるレベルで作用して転写、選択的スプライシング、およびｍＲＮＡの分解に影響する。例えば、ｌｎｃＲＮＡは、エピジェネティック調節因子であるＰＲＣ２に結合して遺伝子へのその動員を促進し、次いでこの遺伝子の転写はクロマチン修飾を介して抑止されることが示されている。ｌｎｃＲＮＡは、様々な調節タンパク質とのそれらの会合を媒介する３ＷＪなどの複雑な構造を形成し得る。これらのｌｎｃＲＮＡ構造に結合する小分子は、個々のｌｎｃＲＮＡによって通常調節される遺伝子の発現をモジュレートするために使用され得る。ｌｎｃＲＮＡの突然変異および調節異常はヒト疾患に関連するため、治療標的となり得る数多くのｌｎｃＲＮＡが存在する。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、標的非コーディングＲＮＡはｌｎｃＲＮＡである。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、がん、炎症性疾患、神経学的疾患、または心臓血管疾患に関連する。一部���実施形態では、方法は、開示したコンピュータによる調査にしたがって標的ｌｎｃＲＮＡを同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、標的ｌｎｃＲＮＡは、エフェクターｍｉＲＮＡなどのエフェクターＲＮＡの存在下で３ＷＪを形成することができる。一部の実施形態では、小分子は、エフェクターＲＮＡと標的ｌｎｃＲＮＡとの間に形成されたトランス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、小分子は、標的ｌｎｃＲＮＡの部分の間に形成されたシス３ＷＪに結合する。
【０１２０】
１つの例示的な標的ｌｎｃＲＮＡはＨＯＴＡＩＲであり、これはヒト第１２染色体上のＨｏｘＣ遺伝子座から発現されるｌｎｃＲＮＡである。その発現レベルは低い（細胞あたり約１００ＲＮＡコピー）。多くのｌｎｃＲＮＡと異なり、ＨＯＴＡＩＲは、トランスで作用して遠位の遺伝子の発現に影響することができる。ＨＯＴＡＩＲは、エピジェネティックリプレッサーＰＲＣ２、および別の抑止的エピジェネティック調節因子であるＬＳＤ１／ＣｏＲＥＳＴ／ＲＥＳＴ複合体に結合する（Tsaiら、Science  ３２９巻、６８９〜６９３頁、２０１０年）。ＨＯＴＡＩＲは、高度に構造化されたＲＮＡであり、そのヌクレオチドの５０％より多くが塩基対形成に関与している。ＨＯＴＡＩＲは、様々な種類のがんにおいて頻繁に異常調節されている（しばしば上方調節されている）（Yaoら、Int.  J.  Mol.  Sci.  １５巻：１８９８５〜１８９９９頁、２０１４年；Dengら、PLOS  One  ９巻：ｅ１１００５９頁、２０１４年）。ＨＯＴＡＩＲの発現レベルが高いがん患者は、発現レベルが低い患者と比べて、予後が著しく不良である。ＨＯＴＡＩＲは、アポトーシスの制御、増殖、転移、血管新生、ＤＮＡ修復、化学療法抵抗性、および腫瘍細胞代謝に関与することが報告されている。ＨＯＴＡＩＲは転移性乳がんにおいて高発現する。原発性胸部腫瘍における高レベルの発現はその後の転移および死の有意な予測因子である。ＨＯＴＡＩＲは、食道扁平上皮癌に関連することも報告されており、また結腸直腸がん、子宮頸がん、胃がん、および子宮内膜癌における予後診断因子である。したがって、ＨＯＴＡＩＲ結合性小分子は新規の抗がん薬物候補である。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、標的非コーディングＲＮＡはＨＯＴＡＩＲである。一部の実施形態では、小分子は、ＨＯＴＡＩＲの構造中の３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、疾患または障害は、乳がん、食道扁平上皮癌、結腸直腸がん、子宮頸がん、胃がん、または子宮内膜癌である。
【０１２１】
ｌｎｃＲＮＡの中で別の潜在的ながん標的はＭＡＬＡＴ−１（metastasis-associated  lung  adenocarcinoma  transcript  1）であり、これはＮＥＡＴ２（nuclear-enriched  abundant  transcript  2）としても知られている（Gutschnerら、Cancer  Res.  ７３巻：１１８０〜１１８９頁、２０１３年；Brownら、Nat.  Structural  &  Mol.  Biol.  ２１巻：６３３〜６４０頁、２０１４年）。ＭＡＬＡＴ−１は高度に保存された７ｋｂの核内ｌｎｃＲＮＡであり、核スペックル内に局在化する。ＭＡＬＡＴ−１は正常組織内で遍在的に発現されるが、多くのがんにおいて上方調節されている。ＭＡＬＡＴ−１は、肺がんを含めた多数のがんにおいて転移進行の予測マーカーである。ＭＡＬＡＴ−１は遺伝子発現の調節因子として機能して転写および／またはスプライシングに影響する可能性があるようである。ＭＡＬＡＴ−１ノックアウトマウスは表現型を有さず、このことはＭＡＬＡＴ−１の正常機能が限られていることを示している。しかしながら、ＭＡＬＡＴ−１欠損がん細胞は遊走に障害があり、マウス異種移植腫瘍モデルにおいて形成する腫瘍がより少ない。ＭＡＬＡＴ−１を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、マウスにおいて腫瘍生着後の転移形成を防止する。いくつかのマウス異種移植腫瘍モデルのデータは、ＡＳＯによるＭＡＬＡＴ−１のノックダウンは原発性腫瘍の成長および転移の両方を阻害し得ることを示している。よって、ＭＡＬＡＴ−１を標的化する小分子は、腫瘍成長および転移の阻害に効果的であることが予測される。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、標的非コーディングＲＮＡはＭＡＬＡＴ−１である。一部の実施形態では、小分子は、ＭＡＬＡＴ−１の構造中の３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、疾患または障害は、肺がんなどの、ＭＡＬＡＴ−１が上方調節されるがんである。
【０１２２】
一部の実施形態では、本発明は、非コーディングＲＮＡ（ＨＯＴＡＩＲまたはＭＡＬＡＴ−１など）によって媒介される疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に本発明の化合物を投与するステップを含む、方法を提供する。そのような化合物は本明細書中に詳細に説明されている。
【０１２３】
毒性ＲＮＡ（リピートＲＮＡ）の標的化
ｍＲＮＡ中の単純反復はしばしばヒト疾患に関連する。これらはしばしば、排他的ではないが、ＣＡＧなどの３ヌクレオチドの反復（「トリプレットリピート」）である（総説については、GatchelおよびZoghbi、Nature  Reviews  Genetics  ６巻：７４３〜７５５頁、２００５年；Krzyzosiakら、Nucleic  Acids  Res.  ４０巻：１１〜２６頁、２０１２年；BudworthおよびMcMurray、Methods  Mol.  Biol.  １０１０巻：３〜１７頁、２０１３年を参照）。トリプレットリピートはヒトゲノム中に豊富に存在し、世代を経るにつれて伸長する傾向がある。おおよそ４０のヒト疾患が反復配列の伸長に関連している。トリプレットの伸長によって引き起こされる疾患は、トリプレットリピート伸長疾患（ＴＲＥＤ）として知られる。健常個体は様々な数のトリプレットリピートを持つが、それより多い反復数になると疾患を引き起こす閾値が存在する。閾値は障害ごとに様々である。トリプレットリピートは不安定であり得る。遺伝子が引き継がれるにつれて反復数が増加することがあり、世代が進むにつれて状態がより重篤となり得るか、またはより早期に発症し得る。個体が正常範囲内でいくつかの反復を持つ場合、次の世代に引き継がれる時に反復は伸長されないことが予期される。反復数が前突然変異の範囲内（正常であるが、不安定な反復数）にある場合、次の世代への遺伝の際に反復が伸長することもあるし、しないこともある。前突然変異を持つ正常個体は該状態を有しないが、完全な突然変異の範囲内にあるトリプレットリピートを受け継ぎ罹患することになる子供を持つリスクがある。ＴＲＥＤは、常染色体顕性、常染色体劣性、またはＸ連鎖性であり得る。より頻繁に見られるトリプレットリピート障害は常染色体顕性である。
【０１２４】
反復はｍＲＮＡのコーディング部分または非コーディング部分にあることができる。非コーディング領域内の反復の場合、反復は５’ＵＴＲ配列、イントロン、または３’ＵＴＲ配列内に存在し得る。コーディング領域内の反復配列によって引き起こされる疾患のいくつかの例を表１に示す。
【表１】
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【０１２５】
ｍＲＮＡの非コーディング領域内にある反復配列によって引き起こされる疾患のいくつ
かの例を表２に示す。
【表２】
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【０１２６】
反復配列に起因する毒性は、毒性ＲＮＡそれ自体の作用の直接の結果であり得るか、あるいは、リピート伸長がコード配列内にある場合、ＲＮＡおよび／または異常タンパク質の毒性に起因し得る。リピート伸長ＲＮＡは、決定的に重要なＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）をフォーカス内に隔離することによって作用することができる。隔離されるＲＢＰの一例は、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄファミリーのタンパク質ＭＢＮＬ１である。ＲＢＰの隔離は、スプライシングの欠陥ならびにＲＮＡおよびタンパク質の核細胞質輸送の欠陥に繋がる。ＲＢＰの隔離はｍｉＲＮＡ生合成にも影響することができる。ＲＮＡ生物学におけるこれらの擾乱は、ニューロンの機能および生存に大きく影響して様々な神経学的疾患に繋がり得る。
【０１２７】
ＲＮＡ中の反復配列は、ＲＢＰに結合し、正常なＲＮＡ生物学に影響する二次構造および三次構造を形成する。疾患の一具体例は、筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１；筋強直性ジストロフィー（dystrophia  myotonica））であり、これは筋肉衰弱および収縮後の筋肉の緩慢な弛緩によって特徴付けられるよく見られる遺伝性の筋肉疾患である（Machuca-Tziliら、Muscle  Nerve  ３２巻：１〜１８頁、２００５年）。これは筋強直性ジストロフィー（dystrophia  myotonica）プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲのＣＵＧ伸長によって引き起こされる。この反復を含むＲＮＡは、スプライシング調節因子ＭＢＮＬ１およびＣＵＧリピート結合タンパク質（ＣＥＬＦ１）への影響を通じていくつもの発生的に調節される転写物の選択的スプライシングの誤調節を引き起こす（Wheelerら、Science  ３２５巻：３３６〜３３９頁、２００９年）。ＤＭＰＫの転写物内のＣＵＧリピートに結合する小分子は、ＲＮＡ構造を変化させ、病巣形成を防止し、これらのスプライシング（spicing）調節因子への影響を軽減するであろう。最もよく見られる遺伝性の精神遅滞である脆弱性Ｘ症候群（ＦＸＳ）は、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ内のＣＧＧリピート伸長の結果である（Lozanoら、Intractable  Rare  Dis.  Res.  ３巻：１３４〜１４６頁、２０１４年）。ＦＭＲＰは、多くのｍＲＮＡの翻訳の調節、およびタンパク質輸送にとって決定的に重要であり、またシナプス発生および神経可塑性のために必須のタンパク質である。よって、その欠損は神経病理に繋がる。このＣＧＧリピートＲＮＡを標的化する小分子は、ＦＭＲ１  ｍＲＮＡおよびＦＭＲＰタンパク質の発現の抑制を軽減し得る。満たされていない非常に大きな医学上の必要性を持つ別のＴＲＥＤはハンチントン病（ＨＤ）である。ＨＤは、運動、認知、および精神医学的な変化を伴う進行性の神経学的障害である（Zuccatoら、Physiol  Rev.  ９０巻：９０５〜９８１頁、２０１０年）。ＨＴＴ遺伝子のコード配列内のＣＡＧリピートは、転写、小胞輸送、ミトコンドリア機能、およびプロテアーゼ活性への有害な影響を持つらしいポリグルタミンリピートを有するタンパク質に繋がるので、ＨＤはポリグルタミンまたはポリＱ障害として特徴付けられる。しかしながら、ＨＴＴのＣＡＧリピートＲＮＡそれ自体もまた、核内封入体内へのＭＢＮＬ１タンパク質の隔離を含めて毒性を示す。その他の一具体例は、Ｃ９ｏｒｆ７２（chromosome  9  open  reading  frame  72）遺伝子内のＧＧＧＧＣＣリピート伸長であり、これは家族性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）および家族性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の両方においてよく見られる（Lingら、Neuron  ７９巻：４１６〜４３８頁、２０１３年；Haeuslerら、Nature  ５０７巻：１９５〜２００頁、２０１４年）。リピートＲＮＡ構造は、決定的に重要なＲＮＡ結合タンパク質を隔離する核内フォーカスを形成する。ＧＧＧＧＣＣリピートＲＮＡはまた、ＲａｎＧＡＰ１に結合してそれを隔離して、ＲＮＡおよびタンパク質の核細胞質間輸送を害する（Zhangら、Nature  ５２５巻：５６〜６１頁、２０１５年）。これらのリピート伸長ＲＮＡのいずれかを選択的に標的化することは、これらの神経学的疾患における治療的利益を与え得る。
【０１２８】
トリプレットリピートは３ＷＪ構造をとり、そのため開示した小分子にとって好適な標的であることの証拠がいくつか存在する。理論に縛られることを望まないが、ある特定のリピート疾患においてリピートのヌクレオチド配列が、（ＣＡＧ）−（ＣＴＧ）リピートによって形成されたスリップ型３ＷＪなどの一時的な３ＷＪに編成されると思われる。上記または表１および表２に記載のものなどのＴＲＥＤを治療するために、そのような３ＷＪを本発明の小分子によって安定化し、それらの毒性効果を低下させることができる可能性がある。（例えば、Barrosら、Chem.  Sci.  ２０１５年、６巻、４７５２〜４７５５頁を参照）
【０１２９】
本発明は、タンパク質の発現の仲介またはタンパク質の発現の調節を通じて作用するのではなく、異常なＲＮＡそれ自体が病原性効果を引き起こす疾患または障害を治療する方法を企図する。一部の実施形態では、疾患または障害は、上記したものまたは表１および２に記載のものなどの、リピートＲＮＡによって媒介される。一部の実施形態では、疾患または障害は、反復がｍＲＮＡのコーディング領域内にあるリピート伸長疾患である。一部の実施形態では、疾患または障害は、反復がｍＲＮＡの非コーディング領域内にあるリピート伸長疾患である。一部の実施形態では、疾患または障害は、ハンチントン病（ＨＤ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、または、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、もしくはＳＣＡ１７から選択される脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）から選択される。一部の実施形態では、疾患または障害は、脆弱性Ｘ症候群、筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１または筋強直性ジストロフィー（dystrophia  myotonica））、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、もしくはＳＣＡ１２から選択される脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、またはＣ９ＦＴＤ（筋萎縮性側索硬化症またはＡＬＳ）から選択される。
【０１３０】
一部の実施形態では、疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１または筋強直性ジストロフィー（dystrophia  myotonica））、または脆弱性Ｘ症候群である。
【０１３１】
一部の実施形態では、本発明は、リピートＲＮＡによって媒介される疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に本発明の化合物を投与するステップを含む、方法を提供する。そのような化合物は本明細書中に詳細に説明されている。
【０１３２】
標的リピート伸長ＲＮＡの活性をモジュレートする小分子を製造する方法であって、標的リピート伸長ＲＮＡ中の３ＷＪへの結合について本明細書中に開示した１つまたは複数の小分子をスクリーニングするステップ、およびどの小分子（複数可）が３ＷＪに結合し、標的リピート伸長ＲＮＡの活性をモジュレートするかを同定するステップを含む、方法も提供される。一部の実施形態では、方法は、開示したコンピュータによる調査にしたがって標的リピート伸長ＲＮＡを同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、標的リピート伸長ＲＮＡは、エフェクターｍｉＲＮＡなどのエフェクターＲＮＡの存在下で３ＷＪを形成することができる。一部の実施形態では、小分子は、エフェクターＲＮＡと標的リピート伸長ＲＮＡとの間に形成されたトランス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、小分子は、標的リピート伸長ＲＮＡの部分の間に形成されたシス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、リピート伸長ＲＮＡは、ＨＤ、ＤＲＰＬＡ、ＳＢＭＡ、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、またはＳＣＡ１７から選択される疾患または障害を引き起こす。一部の実施形態では、疾患または障害は、脆弱性Ｘ症候群、ＤＭ１、ＦＲＤＡ、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＳＣＡ１２、またはＣ９ＦＴＤから選択される。一部の実施形態では、小分子は、疾患または障害を治療または改善するために効果的である。
【０１３３】
その他の標的ＲＮＡおよび疾患／状態
多数のさらなるＲＮＡと疾患または状態との間に関連が存在することが知られており、
そのいくつかを下記の表３に示す。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、標的
ＲＮＡは表３に示すものから選択される。一部の実施形態では、疾患または障害は表３に
示すものから選択される。
【表３−１】
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【表３−２】
2019523242.tif 000005
【表３−３】
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【表３−４】
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【０１３４】
ウイルスＲＮＡの標的化
本発明の１つの態様では、化合物および開示した方法は、ウイルス核酸またはその転写物を標的化するために使用される。一部の実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡゲノムを有する。一本鎖ＲＮＡウイルスおよび二本鎖ＲＮＡウイルスの両方が、モジュレーションのための標的として選択され得る二本鎖ＲＮＡ配列を有する。ＨＣＶ（Pirakitikulrら、Mol.  Cell  ２０１６年、６１巻、１〜１０頁）およびＨＩＶ−１（Lavenderら、PLOS  Comp.  Bio.  ２０１５年、１１巻）などのウイルスの場合、かなりの量のＲＮＡ構造情報が存在し、３ＷＪはウイルスＲＮＡゲノムの構造中に存在する。多くのウイルスは、哺乳動物ゲノム中で稀にしか見られないまたは見られないＲＮＡ構造または遺伝因子を有する。したがって、これらのエレメントの標的化は、宿主プロセスに対する影響が最小の選択的な抗ウイルス剤を提供する。これらの遺伝因子としては、哺乳動物ゲノムにおけるよりもウイルスにおいてはるかによく見られかつ機能的に重要なＩＲＥＳエレメントなどの、翻訳を媒介するＲＮＡ配列が挙げられる。特有のＲＮＡ配列もまた、ウイルス粒子中へのＲＮＡのパッケージングのために必須であり得る。したがって、一部の実施形態では、標的核酸は、哺乳動物ゲノムで稀にしか見られないまたはウイルスゲノム中に排他的に見られるウイルスＲＮＡ構造または遺伝因子である。一部の実施形態では、ウイルスＲＮＡ構造または遺伝因子は、ＩＲＥＳエレメントである。
【０１３５】
あらゆるウイルスはそれらのライフサイクルのある時点でＲＮＡ、したがってタンパク質を産生しなければならないので、開示した化合物および方法は、実質的にあらゆるウイルスを標的化するために使用され得る。一部の実施形態では、ウイルスは、第Ｉ群（ｄｓＤＮＡウイルス）、第ＩＩ群（ｓｓＤＮＡウイルス）、第ＩＩＩ群（ｄｓＲＮＡウイルス）、第ＩＶ群（（＋）センスＲＮＡウイルス）、第Ｖ群（（−）センスＲＮＡウイルス）、第ＶＩ群（ＲＮＡ逆転写ウイルス）、第ＶＩＩ群（ＤＮＡ逆転写ウイルス）のウイルス、またはサテライトもしくはウイロイドなどのウイルス成分因子（subviral  agent）から選択される。
【０１３６】
追加の標的ウイルスとしては、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｒｏｌｏｇｙ．ｎｅｔ／Ｂｉｇ＿Ｖｉｒｏｌｏｇｙ／ＢＶＦａｍｉｌｙＧｒｏｕｐ．ｈｔｍｌを参照。３ＷＪを含有するウイルスＲＮＡ転写物の標的化に加えて、ウイルス核酸を含む混合ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが標的化され得る。例えば、ウイルスゲノムＤＮＡは内因性ＲＮＡエフェクターと相互作用して、混合ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション事象から３ＷＪを産生する。したがって、一部の実施形態では、標的核酸は、上記に開示したものなどのウイルスから遺伝情報を含む混合ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであり、該ハイブリッドは、１つまたは複数の３ＷＪを形成または含有することができる。
【０１３７】
一部の実施形態では、ウイルスは、例えば、ジカウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、または日本脳炎といったフラビウイルスなどのＲＮＡウイルス（すなわち、ＲＮＡゲノムを有するウイルス）である（Shi（編者）、Molecular  Virology  and  Control  of  Flaviviruses、２０１２年、Caister  Academic  Press）。一部の実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスである。コロナウイルスは、ＳＡＲＳを引き起こすウイルスＳＡＲＳ−ＣｏＶなどのヒト病原体を含む一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルスのファミリーである（Thiel（編者）、Coronaviruses:  Molecular  and  Cellular  Biology（第１編）、２００７年、Caister  Academic  Press）。本発明によって治療され得る他のＲＮＡウイルスとしては、エボラウイルスが挙げられる。一部の実施形態では、以上のＲＮＡウイルスの１つまたは複数は、ウイルスＲＮＡの複製、翻訳またはパッケージングをブロックするために、小分子誘発性の３ＷＪの形成および／または小分子媒介性の３ＷＪの安定化によって標的化される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ウイルス病原体のＲＮＡウイルスゲノムであり、かつ、エフェクターＲＮＡは、感染細胞中の内因性の短鎖ＲＮＡである。
【０１３８】
一部の実施形態では、ウイルスは、コクサッキーウイルス、ノロウイルス、麻疹ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ジカウイルス、エボラウイルス、狂犬病ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、または黄熱病ウイルスなどの第ＩＶ群の一本鎖ＲＮＡウイルスから選択される。一部の実施形態では、ウイルスは、鶏伝染性気管支炎ウイルス、ウシコロナウイルス、イヌコロナウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、ヒトコロナウイルス２９９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、マウス肝炎ウイルス、ブタ伝染性下痢ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ラットコロナウイルス、七面鳥コロナウイルス、ウサギコロナウイルス、トロウイルス、ベルンウイルス、またはブレダウイルスなどのコロナウイルスから選択される。一部の実施形態では、ウイルスは、フィロウイルス、マールブルクウイルス、またはエボラウイルスから選択される。
【０１３９】
微生物の核酸標的
様々な他の感染性因子は、好適な標的核酸を提供する。一部の実施形態では、標的核酸は、細菌の核酸である。病原性細菌中のＲＮＡなどの核酸は、病原体のライフサイクルに決定的に重要な標的配列、または、細菌のライフサイクル、毒性、もしくは病原性に影響し、一部の場合には、ヒトＲＮＡとは配列および機能が大きく異なる標的配列を提供する。例えば、標的細菌は、結核を引き起こす細菌であり得る。
【０１４０】
真菌および寄生中の標的
一部の実施形態では、標的核酸は、マラリアの核酸などの、真菌または寄生虫の核酸である。病原性の真菌および寄生虫のＲＮＡなどの核酸は、病原体のライフサイクルに決定的に重要な標的配列、または、ライフサイクル、毒性、もしくは病原性に影響し、一部の場合には、ヒトＲＮＡとは配列および機能が大きく異なる標的配列を提供する。
【０１４１】
エフェクターとしてのｍｉＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２２ヌクレオチド（ｎｔ）の長さの一本鎖非コーディングＲＮＡのクラスである（Friedmanら、Genome  Res.  ２００９年、１９巻、９２〜１０５頁；GhildiyalおよびZamore、Nat.  Rev.  Genet.  ２００９年、１０巻、９４〜１０８頁；IpsaroおよびJoshua-Tor、Nat.  Struct.  Mol.  Biol.  ２０１５年、２２巻、２０〜２８頁；Izaurralde、Science  ２０１５年、３４９巻、３８０〜３８２頁）。それらは、転写後レベルに機能することによって遺伝子発現を抑制するのに重要な調節的役割を果たす。それらはよく保存されており、植物および動物の多くの種にわたって遺伝子調節の決定的に重要な構成要素であると考えられる。それらの「シード（seed）」配列は、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中の配列、および頻度はより低いがｍＲＮＡの５’末端と相互作用することができる。この塩基対形成事象は、ｍＲＮＡの分解を誘発することによってまたはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって、標的遺伝子の発現の低下に繋がる。ｍｉＲＮＡは、細胞分化、細胞運命、運動性、生存、および細胞機能を含めて広範な生物学的プロセスに影響する。ｍｉＲＮＡは、がん、ならびに代謝性疾患、心臓血管疾患、神経学的疾患および炎症性疾患を含めて様々なヒト疾患に関連し得る（Croce、Nature  Rev.  Genet.  ２００９年、１０巻、７０４〜７１４頁；Dykxhoorn  Cancer  Res.  ２０１０年、７０巻、６４０１〜６４０６頁；QuiantおよびOlson、J.  Clin.  Invest.  ２０１３年、１２３巻、１１〜１８頁；Olson、Science  Trans.  Med.  ２０１４年、６巻、２３９ｐｓ３；Baffy、J.  Clin.  Med.  ２０１５年、４巻、１９７７〜１９８８頁）。多くの状況において、ｍｉＲＮＡ発現の変化はヒト疾患に関連する。
【０１４２】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、標的ｍｉＲＮＡあるいはその前駆体またはタンパク質結合複合体またはｍＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ結合複合体の活性をモジュレートする方法であって、標的ｍｉＲＮＡあるいはその前駆体またはタンパク質結合複合体またはｍＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ結合複合体を開示した化合物と接触させるステップを含む、方法を提供する。
【０１４３】
ｍｉＲＮＡは、それら自身の独特の遺伝子から発現されるか、または他の遺伝子のイントロン内、もしくは一部の場合にはエクソン内で発現される。ほとんどのｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。ｍｉＲＮＡ配列を含有する一次転写物は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして公知である。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、フォールディングして「ヘアピン」または一本鎖ＲＮＡのセグメントが隣接するステムループ構造を形成するセグメントを含めて、他の種類のＲＮＡとは異なる特有の構造的特徴を有する。この二本鎖ＲＮＡ構造は、ＲＮＡ結合タンパク質ＤＧＣＲ８（ディジョージ症候群染色体領域８（DiGeorge  Syndrome  Critical  Region  8））およびＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素Ｄｒｏｓｈａを含有するマイクロプロセッサー複合体（microprocessor  complex）によって認識され得る。ＤＧＣＲ８は、ヘアピン基部から約１１ヌクレオチドにおいてＲＮＡを切断することによってｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからより短いヘアピンを産生する（１つのらせん二本鎖ＲＮＡがステムになる）ように、Ｄｒｏｓｈａの触媒性ＲＮａｓｅ  ＩＩＩドメインを配向させる。マイクロプロセッサー複合体はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを切断して、６０〜７０ｎｔのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを生成させる。単一のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、１〜６個のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含有し得る。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡそれ自体は、独特のステムループ構造を有する。それはエキスポーチン−５およびＲａｎ  ＧＴＰａｓｅと相互作用し、核から細胞質へのその輸送に繋がる。サイトゾルにおいてｍｉＲＮＡ−タンパク質複合体はＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素Ｄｉｃｅｒによって認識され、Ｄｉｃｅｒはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを切断して成熟ｍｉＲＮＡとする。Ｄｉｃｅｒエンドリボヌクレアーゼは、ヘアピンの５’および３’末端と相互作用し、かつ３’アームおよび５’アームを連結するループを切断して、ｍｉＲＮＡ二本鎖をもたらす。最終的なｍｉＲＮＡは、２ｎｔの３’オーバーハングおよび５’リン酸基を有する約２２塩基対の二本鎖である。次いで、この成熟ｍｉＲＮＡの１つの鎖は、アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質にロードされて、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。Ａｇｏタンパク質ファミリーのメンバーはＲＩＳＣの機能の中心となる。Ａｇｏタンパク質は、ｍｉＲＮＡ誘導サイレンシングのために必要とされ、２つの保存されたＲＮＡ結合ドメイン、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの一本鎖３’末端に結合できるＰＡＺドメイン、およびリボヌクレアーゼＨに構造的に似ており、ｍｉＲＮＡのガイド鎖の５’末端と相互作用するように機能するＰＩＷＩドメインを含有する。これらのタンパク質は、成熟ｍｉＲＮＡに結合し、標的ｍＲＮＡとの相互作用のためにそれを配向させる。ヒトＡｇｏ２などの一部のＡｇｏファミリーのメンバーは、直接的にＲＮＡ標的を切断する。Ａｇｏタンパク質はまた、追加のタンパク質を動員して翻訳を阻害することもできる。二本鎖のいずれの鎖も機能的なｍｉＲＮＡとして潜在的に作用し得るが、１つの鎖のみがＲＩＳＣ複合体中に組み込まれ、ｍｉＲＮＡおよびそのｍＲＮＡ標的が最終的にＲＩＳＣ複合体と相互作用する。ｍｉＲＮＡはその標的ｍＲＮＡと塩基対を形成し、標的ｍＲＮＡレベルの低下または��の翻訳の阻害に繋がる。ｍＲＮＡの分解に繋がるｍＲＮＡ切断の誘発は、発現阻害のより多く見られる機構のようである。翻訳の抑制は、ｍＲＮＡ分解の誘発と比べてあまり理解されていない。上記の通り、単一のｍｉＲＮＡは多くの標的ｍＲＮＡを有し得る。ｍＲＮＡの標的化の他に、ｍｉＲＮＡはまた、非コーディングＲＮＡも標的化することができる。
【０１４４】
したがって、一部の実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは、対応する成熟ｍｉＲＮＡの前駆体である。一部の実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは、その活性が調節されるｍＲＮＡまたはｎｃＲＮＡに結合した成熟ｍｉＲＮＡなどの、ｍＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ結合複合体である。一部の実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは、がん、代謝障害、心臓血管障害、神経学的障害、または炎症性疾患などの疾患または障害に関連する。一部の実施形態では、化合物は、標的ｍｉＲＮＡの活性を上方調節する。一部の実施形態では、化合物は、標的ｍｉＲＮＡの活性を下方調節する。一部の実施形態では、下方調節は、標的ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ複合体中または標的ｍｉＲＮＡ−ｎｃＲＮＡ複合体中の３ＷＪへの結合を介したものである。一部の実施形態では、３ＷＪへの結合は、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。一部の実施形態では、３ＷＪへの結合は、ｍＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの分解を誘発する。
【０１４５】
標的ｍｉＲＮＡあるいはその前駆体またはタンパク質結合複合体またはｍＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ結合複合体の活性をモジュレートする小分子を製造する方法であって、標的ｍｉＲＮＡあるいはその前駆体またはタンパク質結合複合体またはｍＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ結合複合体中の３ＷＪへの結合について本明細書中に開示した１つまたは複数の小分子をスクリーニングするステップ、およびどの小分子（複数可）が３ＷＪに結合し、標的ｍｉＲＮＡあるいはその前駆体またはタンパク質結合複合体またはｍＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ結合複合体の活性をモジュレートするかを同定するステップを含む、方法も提供される。一部の実施形態では、方法は、開示したコンピュータによる調査にしたがって標的ｍｉＲＮＡあるいはその前駆体またはタンパク質結合複合体またはｍＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ結合複合体を同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは、それが調節するｍＲＮＡまたはｎｃＲＮＡと３ＷＪを形成できるエフェクターである。一部の実施形態では、小分子は、エフェクターとｍＲＮＡまたはｎｃＲＮＡとの間に形成されたトランス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、小分子は、ｍＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの部分によって形成されたシス３ＷＪに結合する。
【０１４６】
ヒトゲノム中には約２０００のｍｉＲＮＡが存在する。ｍｉＲＮＡは、組織特異的および細胞特異的な様式で発現され得る。それらの発現は、ホルモン、細胞ストレス、腫瘍性タンパク質、サイトカインおよび低酸素を含めて様々な刺激によって影響され得る。上述の通り、異常なｍｉＲＮＡ発現は、多様なヒト疾患に関連することがあり、この異常なｍｉＲＮＡ発現は、それらの標的遺伝子の発現の調節異常と相関する。
【０１４７】
標的ｍＲＮＡとのｍｉＲＮＡ全体の完璧な塩基対形成は哺乳動物細胞中では稀である。標的ｍＲＮＡとの完璧なまたは完璧に近い塩基対形成は、標的ＲＮＡの切断を促進すると考えられる。ｍｉＲＮＡの５’末端のｎｔの短いストレッチ（「シード」）は、ｍＲＮＡ中の標的配列に対して塩基対形成するために充分なようである。この塩基対形成は、わずか６ｎｔを含むことがある。ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用のために必要とされる制限された配列相補性は、単一のｍｉＲＮＡが多数の転写物を調節することを可能とする。個々のｍｉＲＮＡが、１００を充分に超える異なるｍＲＮＡの発現、推定では４００ものｍＲＮＡ標的の発現に影響できることが確認されている。ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ認識のための必要条件は厳格ではないようであるが、研究により、標準的なｍｉＲＮＡ標的化を予測する規則の説明に繋がっている。ｍｉＲＮＡの５’末端のシードヌクレオチド２〜８は、標的の認識のために重要である。Ａｇｏ−ｍｉＲＮＡ複合体の結晶構造（Schirleら、Science  ２０１４年、３４６巻、６０８〜６１３頁）は、シード配列は、ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの間の相互作用を開始させるように配置されていることを示唆する。完璧なシード相補性は標準的な標的化であると考えられるが、完璧でないまたはシードによらない相互作用が観察されている（Seokら、Mol.  Cell、２０１６年、３９巻、３７５〜３８１頁において総説されている）。したがって、様々な塩基対形成を使用してｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡの認識を達成できるようである。非標準的な対形成が起こることがあり、これには生物学的意義があり得る。これらのより弱い、非標準的な結合事象は、より効果的でない発現の抑制に繋がる可能性があり、したがってｍｉＲＮＡの抑制活性において多様な効果を提供する可能性が仮定されている。さらには、ヒトマイクロＲＮＡ  ｍｉＲ３６９−３は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中の配列とのＡｇｏおよびＦＸＲ１タンパク質の会合を導いて翻訳を増加させる一方、別のｍｉＲＮＡであるＬｅｔ−７はまた、細胞周期阻止の下で標的ｍＲＮＡの翻訳を増加させ得ることが報告されている（Vasudevanら、Science  ２００７年、３１８巻、１９３１〜１９３４頁）。したがって、ｍｉＲＮＡは哺乳動物細胞中で広範な効果を有し得ることが実証されている。したがって、一部の実施形態では、開示した化合物は、標的ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡが調節するｍＲＮＡまたはｎｃＲＮＡとの間に形成された３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの５’末端中のｎｔの配列（シード）は、ｍＲＮＡ中の標的配列に対して塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの３’末端中のｎｔの配列（シード）は、ｍＲＮＡ中の標的配列に対して塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、塩基対形成は、例えば、シードとその標的配列との間で７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または全ての標準的な（ワトソン・クリック）塩基対形成を含む。一部の実施形態では、塩基対形成は、少なくとも６ｎｔを含む。一部の実施形態では、塩基対形成は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０ｎｔを含む。一部の実施形態では、塩基対形���は、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、または１００ｎｔを含む。
【０１４８】
成熟ｍｉＲＮＡの迅速かつ制御されたターンオーバーが、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルおよびその結果の遺伝子調節における迅速な変化のために必要とされる。例えば、細胞質中のＡｇｏタンパク質に対するｍｉＲＮＡの結合は、ｍｉＲＮＡガイド鎖を安定化させる一方、反対のパッセンジャー鎖は分解されると考えられる。標的の結合もまたｍｉＲＮＡを安定化させ得る。ｍｉＲＮＡの転写後修飾もまた、細胞中のそれらの半減期に影響することがある。
【０１４９】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡはエフェクターであり、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ中の標的配列を認識し、３ＷＪの形成に繋がる様式でそれに結合する。上述の通り、一部の実施形態では、この３ＷＪは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の塩基対形成の配列が各側に隣接したステムループ構造を含む。ステムループは、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかによって形成され得る。一部の実施形態では、安定な３ＷＪが形成され、ｍＲＮＡの分解は促進されない。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシード（ｍｉＲＮＡの５’末端から２〜７位または２〜８位）と標的ｍＲＮＡとの間に完璧な相補性（標準的な塩基対形成）がない。一部の実施形態では、塩基対形成は、シードのすぐ下流であるか、または、シードに重複することがあるがシード全体を含まない。例えば、ｍｉＲＮＡのｎｔ  ５〜１０がｍＲＮＡ標的と完璧な塩基対形成を有し、その直後にｍＲＮＡ配列によりステムループが形成された後、ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡのｎｔ  １１、１２、１３または１４に開始する４〜１２ｎｔのストレッチにわたってｍＲＮＡと完璧に塩基対を形成するものであってよい。
【０１５０】
エフェクターとしてのｐｉＲＮＡ
Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）は、動物細胞において発現される低分子非コーディングＲＮＡの最大のクラスである（Setoら、Molecular  Cell、２００７年、２６巻、６０３〜６０９頁；KlattenhoffおよびTheurkauf、Development  ２００８年、１３５巻、３〜９頁、２００８年において総説されている）。動物細胞には１００，０００またはそれより多くのｐｉＲＮＡが存在し得る。これらのＲＮＡは、２６〜３１ｎｔの長さである。ｐｉＲＮＡの名称は、ｐｉｗｉタンパク質とのそれらの相互作用に由来する。それらは遺伝子サイレンシングに関与することが報告されているが、ｐｉＲＮＡの生成および遺伝子サイレンシングにおけるそれらの機序について公知なことはｍｉＲＮＡと比べてはるかに少ない。多くのｐｉＲＮＡはトランスポゾンに対してアンチセンスであり、したがって、トランスポゾンのサイレンシングは、ｐｉＲＮＡの決定的に重要な役割であり得る。それらは、細胞の核およびサイトゾルの両方の区画での局在が見られる。ｐｉＲＮＡは生殖細胞中で豊富であり、それらは生殖細胞の発生および機能において決定的に重要な役割を果たし得る。しかしながら、それらはまた、哺乳動物の多様な体細胞および組織においても豊富である。
【０１５１】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、標的ｐｉＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合複合体の活性をモジュレートする方法であって、標的ｐｉＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合複合体を開示した化合物と接触させるステップを含む、方法を提供する。
【０１５２】
一部の実施形態では、標的ｐｉＲＮＡは、生殖細胞の異常な発生および機能を伴う疾患などの疾患または障害に関連する。一部の実施形態では、化合物は、標的ｐｉＲＮＡの活性を上方調節する。一部の実施形態では、化合物は、標的ｐｉＲＮＡの活性を下方調節する。一部の実施形態では、下方調節は、標的ｐｉＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合複合体中の３ＷＪへの結合を介したものである。一部の実施形態では、３ＷＪへの結合は、ｐｉＲＮＡの分解を誘発する。
【０１５３】
標的ｐｉＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合複合体の活性をモジュレートする小分子を製造する方法であって、標的ｐｉＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合複合体中の３ＷＪへの結合について本明細書中に開示した１つまたは複数の小分子をスクリーニングするステップ、およびどの小分子（複数可）が３ＷＪに結合し、標的ｐｉＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合複合体の活性をモジュレートするかを同定するステップを含む、方法も提供される。一部の実施形態では、方法は、開示したコンピュータによる調査にしたがって標的ｐｉＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合複合体を同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、標的ｐｉＲＮＡは、それが調節するＲＮＡと３ＷＪを形成できるエフェクターである。一部の実施形態では、小分子は、エフェクターとそれが調節するＲＮＡとの間に形成されたトランス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、小分子は、ｐｉＲＮＡの部分によって形成されたシス３ＷＪに結合する。
【０１５４】
エフェクターとしてのｓｎｏＲＮＡ
低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）は、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）などの他のＲＮＡのメチル化またはプソイドウリジル化などの化学修飾を導く短鎖ＲＮＡである（Bachellerieら、Biochimie  ２００２年、８４巻、７７５〜７９０頁；Jorjaniら、Nucleic  Acids  Res.  ２０１６年、５月１２日［印刷前に電子出版された］において総説されている）。それらは、典型的に、７０〜９０ｎｔの長さである。１７４０のｓｎｏＲＮＡが同定されている。それらは哺乳動物細胞中でかなり豊富である。ＲＮＡ修飾を実行するために、ｓｎｏＲＮＡは、低分子核小体リボ核タンパク質（ｓｎｏＲＮＰ）複合体中のタンパク質と会合する。ｓｎｏＲＮＡは、修飾のために標的化される塩基の周囲の配列に相補的な１０〜２０ｎｔのアンチセンス配列を含有する。ほとんどのｓｎｏＲＮＡは、リボソームの合成または翻訳に関与するタンパク質をコードする遺伝子のイントロン中にコードされる。それらはまた、遺伝子間領域中、タンパク質をコードする遺伝子のＯＲＦ中、およびＵＴＲ中に位置することもある。それらは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩのいずれかによって転写され得る。ｓｎｏＲＮＡの配列は保存されているが、それらの発現レベルは種間で劇的に異なる。
【０１５５】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、標的ｓｎｏＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合（ｓｎｏＲＮＰなど）複合体の活性をモジュレートする方法であって、標的ｓｎｏＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合複合体を開示した化合物と接触させるステップを含む、方法を提供する。
【０１５６】
一部の実施形態では、標的ｓｎｏＲＮＡは、メチル化またはプソイドウリジル化などの異常な核酸修飾を伴う疾患などの疾患または障害に関連する。一部の実施形態では、異常に修飾された核酸は、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｓｎＲＮＡである。一部の実施形態では、化合物は、標的ｓｎｏＲＮＡの活性を上方調節する。一部の実施形態では、化合物は、標的ｓｎｏＲＮＡの活性を下方調節する。一部の実施形態では、下方調節は、標的ｓｎｏＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合複合体中の３ＷＪへの結合を介するものである。
【０１５７】
標的ｓｎｏＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合（ｓｎｏＲＮＰなど）複合体の活性をモジュレートする小分子を製造する方法であって、標的ｓｎｏＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合（ｓｎｏＲＮＰなど）複合体中の３ＷＪへの結合について本明細書中に開示した１つまたは複数の小分子をスクリーニングするステップ、およびどの小分子（複数可）が３ＷＪに結合し、標的ｓｎｏＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合複合体の活性をモジュレートするかを同定するステップを含む、方法も提供される。一部の実施形態では、方法は、開示したコンピュータによる調査にしたがって標的ｓｎｏＲＮＡまたはその前駆体もしくはタンパク質結合複合体を同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、標的ｓｎｏＲＮＡは、それが調節するＲＮＡと３ＷＪを形成できるエフェクターである。一部の実施形態では、小分子は、エフェクターとそれが調節するＲＮＡとの間に形成されたトランス３ＷＪに結合する。一部の実施形態では、小分子は、ｓｎｏＲＮＡの部分によって形成されたシス３ＷＪに結合する。
【０１５８】
３．標的３ＷＪを同定する方法
潜在的なエフェクター／標的核酸相互作用のコンピュータによる調査
本発明は、核酸中の潜在的な標的３ＷＪを同定する方法を提供する。核酸の三次元構造に関する情報は、タンパク質よりも得ることが難しく、特にｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、核酸構造を詮索するためのより良好な方法の必要性が存在する。したがって、一態様では、本発明は、シスまたはトランス３ＷＪを形成できる標的核酸を同定する方法であって、開示した化合物による結合が３ＷＪを安定化させ、それによって、例えば開示した疾患または状態を治療するために、核酸の活性をモジュレートする、方法を提供する。一部の実施形態では、提供される方法は、第１のステップとして、エフェクターＲＮＡと候補標的ＲＮＡとの間の潜在的な相互作用を同定するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの検索を実行することを含む。一部の実施形態では、検索は、標的ＲＮＡそれ自体またはそれが翻訳されて発現するタンパク質のいずれかを標的化することの価値に関する以前の知識に基づいて選択された標的ＲＮＡに焦点を当てたものである。検索の出力は、３ＷＪが形成できるように標的ＲＮＡとハイブリダイズできるエフェクターＲＮＡ（例えば２０〜１００ｎｔの、低分子エフェクターＲＮＡなど）のリストである。他の実施形態では、（エフェクターとしての）ＲＮＡと細胞中の全ての標的ＲＮＡとの間の全ての潜在的な相互作用のより広いまたは包括的でさえあるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの検索が実行される。一部の実施形態では、検索は最初に、エフェクターＲＮＡの実際の、公知の生物学的機能のいかなる知識も参照することなく、実行される。むしろ、各エフェクターＲＮＡは、その生物学的役割を参照することなく、本質的に化学物質として処理される。
【０１５９】
一態様では、本発明は、３ＷＪを形成できる標的核酸を同定する方法であって、以下の：
（ａ）１つまたは複数のエネルギー的にアクセス可能なステムループ構造を含む１つまたは複数のエフェクター核酸（ヒト短鎖ＲＮＡなど）を提供するステップ、
（ｂ）１つまたは複数のエネルギー的にアクセス可能なステムループ構造を含む１つまたは複数の標的核酸（ヒトｍＲＮＡなど）を提供するステップ、
（ｃ）エフェクター核酸または標的核酸のいずれかにおいて３ＷＪなどのステムループ構造を受容できる１つまたは複数のエフェクター／標的核酸のハイブリダイゼーション相互作用についてスクリーニングするステップ、
（ｄ）必要に応じて、（１）ループのトポロジー、（２）ループの配列、（３）ステムループの安定性、および（４）３ＷＪのキャビティに直接的に当たっている核酸塩基の素性の１つまたは複数によって、エフェクター核酸および標的核酸を含む３ＷＪの結果生じるデータベースを分類するステップ、および
（ｅ）必要に応じて、エフェクター核酸および標的核酸を含む可能な３ＷＪの結果生じるデータベースを、標的核酸の生物学的役割および治療的意義に関する利用可能な知識、ならびに、低分子エフェクターＲＮＡなどのエフェクター核酸の相対的な存在量および細胞内位置に関する利用可能な知識に対して相互参照するステップ
を含む方法を提供する。
【０１６０】
上記ステップ（ａ）では、エフェクターｍｉＲＮＡの場合、一部の実施形態では、公開されているデータベースが、潜在的なエフェクターｍｉＲＮＡの供給源として使用される。一部の実施形態では、データベースは：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ；ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｄｂ．ｏｒｇ／ｍｉＲＤＢ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｇ／ｍｉｃｒｏｒｎａ／ｈｏｍｅ．ｄｏ；ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｔａｒｂａｓｅ．ｍｂｃ．ｎｃｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ；ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｃａｎｃｅｒ．ｅｃｕ．ｅｄｕ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒ２ｄｉｓｅａｓｅ．ｏｒｇ；ｈｔｔｐ：／／ｚｍｆ．ｕｍｍ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ａｐｐｓ／ｚｍｆ／ｍｉｒｗａｌｋ２／；またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）から選択される。一部の実施形態では、標的核酸は、ヒトの核酸である。一部の実施形態では、標的核酸は、ウイルスの核酸である。一部の実施形態では、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｖｉｒｕｓｅｓ／で利用可能なものなどの、ウイルスゲノムのデータベースが使用される。一部の実施形態では、標的核酸は、微生物の核酸である。一部の実施形態では、標的核酸は、真菌の核酸である。一部の実施形態では、標的核酸は、寄生虫の核酸である。
【０１６１】
上記ステップ（ａ）では、一部の実施形態では、「エネルギー的にアクセス可能」は、生細胞中でそのｍｉＲＮＡの少なくとも０．１％が所与のステムループ構造をとる（またはとると予測される）ことを意味する。他の実施形態では、「アクセス可能」の閾値は、０．１％〜１％、１％〜１０％、または約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％に設定されてもよい。一部の実施形態では、上記方法に含まれるために、そのようなステムループは、標的核酸とのハイブリダイゼーションに参加できるステムループの上流（５’）の少なくとも４ヌクレオチドおよび下流（３’）の少なくとも４ヌクレオチドを残す必要がある。
【０１６２】
上記ステップ（ｂ）では、一部の実施形態では、「エネルギー的にアクセス可能」は、生細胞中でそのｍｉＲＮＡの少なくとも０．１％が所与のステムループ構造をとる（またはとると予測される）ことを意味する。他の実施形態では、「アクセス可能」の閾値は、０．１％〜１％、１％〜１０％、または約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％に設定されてもよい。一部の実施形態では、上記方法に含まれるために、そのようなステムループは、標的核酸とのハイブリダイゼーションに参加できるステムループの上流（５’）の少なくとも４ヌクレオチドおよび下流（３’）の少なくとも４ヌクレオチドを残す必要がある。
【０１６３】
上記ステップ（ｃ）では、一部の実施形態では、方法は、上記の制約を満たす３ＷＪを創出する全てのエフェクター／標的核酸ペアのコンピレーションを産生する。３ＷＪ中の可能なハイブリダイズしないステム間ループの３つ全てにおいて、それらのループの長さは、独立して０〜４（または一部の実施形態では、０〜２または０〜１）で変動してよく、標準的なまたは転写後修飾された核酸塩基のいずれかがそれらのループ位置を占めてよい。
【０１６４】
一部の実施形態では、比較的高い存在量の低分子エフェクターＲＮＡと治療的に高い価値の標的核酸を結合させる対形成は、さらなる研究の焦点となる。選択された鍵となる３ＷＪの構造、ダイナミクス、および生物学的意義は、以下に記載する広範な確立された方法を使用して大規模に特徴付けることができる。
【０１６５】
一部の実施形態では、上記コンピュータによるスクリーニング方法において同定された３ＷＪなどの３ＷＪは、標準的な市販されている装置により可能な合成方法を使用してエフェクター核酸（低分子エフェクターＲＮＡなど）およびその同族標的核酸を合成することによって特徴付けられ得る。加えて、多くの実施形態では、トランス３ＷＪの一本鎖（「シス」）類似体が合成され、そのような実施形態では、２つの成分は、５’から３’へまたは３’から５’へのいずれかで連結され得る。一本鎖モデルの利点としては、単純化されたアッセイフォーマット、および構造的特徴付けにおける制御された化学量論が挙げられる。
【０１６６】
トランスであってもシスであっても、モデルのエフェクター／標的核酸相互作用ペアは、Ｘ線結晶構造解析法、クライオＥＭ（BinshteinおよびOhi、Biochemistry  ２０１５年、５４巻、３１３３〜３１４１頁）、ＮＭＲ、円偏光二色性、紫外可視分光法、およびＳＨＡＰＥ−ＭａＰ（Siegfriedら、Nature  Methods  ２０１４年、１１巻、９５９〜９７３頁）、ならびに、構築物の詳細な３Ｄ構造およびダイナミクスを確立するのを助け、したがって黙示的に細胞中のコンジェナーである（ｃｏｎｇｅｎｅｒｉｃ）トランスペアの構造およびダイナミクスの推定を可能とする関連方法を使用して、構造的に詳細に特徴付けることができる。
【０１６７】
３ＷＪに対するＳＭの結合を測定するための結合アッセイの構築
上記のシスおよびトランスモデルを構築する主要な目的の１つは、３ＷＪによって画定されるキャビティ中に選択的かつ高親和性で結合する小分子をスクリーニングすることである。タンパク質標的に対する小分子の類似のスクリーニングのために現在採用されている多くの方法は、３ＷＪにおける類似の効果に適合させることができる。一部の実施形態では、以下の例示的なアッセイの１つを使用して、エフェクター／標的核酸の３ＷＪに対する小分子の結合が測定される。
【０１６８】
ＮＭＲ  −  ＮＭＲを使用して、ＲＮＡなどの生体分子に対する小分子の結合を評価することができる。この方法の１つの鍵となる利点は、標的生体分子の構造をスクリーニングの間に観察できれば、スクリーニングは、ＳＭとＲＮＡとの間の分子の会合の事実だけでなく、サブサイトおよび結合モードももたらすことである。ＮＭＲの欠点の一部は、比較的高濃度のリガンドが必要とされ（μＭ〜ｍＭ）、これは高親和性の相互作用の測定が難しいことを意味すること、およびこの方法は遅いため、ごく限られたスループットのみが可能であることである。しかし、これら後者の問題は、断片のスクリーニングの実行においてＮＭＲを実際に理想的な出力（read-out）とし、断片のスクリーニングでは、高濃度／低親和性の相互作用が焦点となり、また比較的少ない断片（典型的に５０００未満）が断片ベースのリードの発見において通常スクリーニングされる。一部の場合には、観察される原子核は、プロトンではなく１９Ｆである。
【０１６９】
ＳＰＲ  −  表面プラズモン共鳴は、分子の会合を評価するために広く実施されている方法である。ＳＰＲは、１つの成分（標的ＲＮＡまたは小分子リガンド）が表面に共有結合的に固定され、かつ固定化されたパートナーの上の溶液に加えられたパートナー分子に応答してプラズモン共鳴が測定されることを必要とする。会合速度（on  rates）および解離速度（off  rates）を直接的に測定することができ、これにより平衡解離定数が与えられる。
【０１７０】
ＤＥＬ  −  ＤＮＡエンコードライブラリーはここでは、より広いカテゴリーのプルダウン法の例としての役目である。ＤＥＬでは、均質なＤＮＡエンコードライブラリーに曝露された後に（例えば、ストレプトアビジンを用いる）簡易なプルダウンを可能とする官能基（例えば、ビオチン）で、鍵となる３ＷＪのシスモデルが修飾される。３ＷＪと緊密に会合するＤＥＬにおける小分子リガンドもまた、３ＷＪがプルダウンされた時にプルダウンされ、ＰＣＲおよびシークエンシングを使用してリガンドの素性が明らかにされることになる。
【０１７１】
発色団３ＷＪ  −  ２つの発色団が近位にある時に相互作用して発光の活性化または抑制のいずれかに繋がるようにＲＮＡを誘導体化し、そして発光の活性化または抑制は、ＲＮＡが正しいコンフォメーション（この場合、期待される３ＷＪ）をとっていることに依拠することについて複数の報告がある。３ＷＪのコンフォメーションの達成が、３ＷＪのキャビティ中に結合する加えられる小分子を安定化させる影響に依存するように、ループ配列、ループ長さ、温度、および他のパラメーターを最適化することができる。これらのアッセイは直截的であり、不均質または均質なフォーマットで実行することができ、また小分子の標準的な市販されているライブラリーのスクリーニングを可能とすることができる。
【０１７２】
ＲＮＡマイクロアレイ  −  広範な３ＷＪをマイクロアレイ上に固定化することができ、実際上、標的の固定化ライブラリーとなる。上記の発色団機能を組み込むことができ、それにより、ＲＮＡ（または他の核酸）標的の表面固定化ライブラリーが小分子（単独でまたは混合物として）に曝露された時に、マイクロアレイ上の特定の部位における発色団の変化が、ＲＮＡ（または他の核酸）がライゲートされ、そしてより重要なことには、３ＷＪコンフォメーション中で安定化されることを指し示す。
【０１７３】
ＳＭマイクロアレイ  −  広範な小分子をマイクロアレイ上に固定化することができる。このトピックに関する広範な文献、およびそれに相応した広範な固定化技術に関する広範な文献が存在する。そのようなマイクロアレイでは、ＳＭの素性は、典型的に、マイクロアレイ中のその位置に関連付けられる。次いで、発色団３ＷＪモデルをマイクロアレイに曝露して、マイクロアレイ上の特定の部位における発色団の観察によって特定のＳＭ／３ＷＪ相互作用を同定することができる。
【０１７４】
ＭＳ  −  様々な液体クロマトグラフィー技術によって核酸を解析することができる。潜在的な小分子リガンドの存在下でのＲＮＡのクロマトグラフィーを行うと、結合した小分子リガンドが、クロマトグラフィー媒体を通過する際にＲＮＡを伴うこととなる。ＲＮＡからのリガンドのクロマトグラフィー後の分離により、質量分析による結合リガンドの同定が可能となる。２つのリガンドが同じ質量を共有する（異性体である）場合、曖昧さを取り除くための方法が多数存在する。
【０１７５】
３ＷＪの初期スクリーニング  −  ３ＷＪモデルに対する小分子の初期スクリーニングは、以下の３種類のライブラリーに焦点を当てることになる：（１）Ｃ３対称であるか、またはＣ３対称足場のバリエーションである化合物；（２）対称性が低下しているがそれでもなおＣ３対称なコンジェナーを近似する足場のバリエーションの化合物；および（３）構造的に多様なライブラリー。これらの足場およびその例示的な実施形態は以下に詳細に説明される。
【０１７６】
３ＷＪ／ＳＭ複合体の構造的な特徴付け  −  多くの治療的に興味深いＲＮＡ標的は大きく、またわずかにしか構造化していないため、詳細な構造的な特徴付けは不可能であるか、または実際的でない。しかしながら、本発明における３ＷＪの標的化は、合成３ＷＪによってモデル化される標的基礎構造が比較的小さく、ＳＭとのその複合体を詳細に特徴付けできることを意味する。構造的な特徴付けの方法としては、ＮＭＲ、Ｘ線結晶構造解析法、クライオＥＭ、およびＣＤが挙げられる。その標的ＲＮＡと複合体化した小分子のそのような詳細な特徴付けは、ＲＮＡ標的に対する構造ベースの薬物設計にとってほぼ先例のない機会を提供する。
【０１７７】
トランス効果の確認
以上の大部分において、焦点はシス（一本鎖）モデルにある。治療標的がエフェクターＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のトランス相互作用から構成されている場合、一本鎖のシス構築物が便宜上考案され、任意の小分子リガンドは、シスモデルをベースとするコンジェナーのトランス複合体に結合し、それを安定化させることを実証される必要がある。換言すれば、設計またはスクリーニングを介して同定された選択された小分子は、意図するエフェクター／ＳＭ／標的の三成分複合体の形成を誘発することが必須である。
【０１７８】
競合置換アッセイの構築
上記のスクリーニングは、目的のトランスエフェクター／標的核酸３ＷＪに対する小分子リードを同定する。それらのリードから開発候補へのＳＡＲの探査は、上記の方法および技術を使用して可能なことがあるが、同じ生物学的に必須のサブサイト、この場合は３ＷＪが外形を定めるキャビティを求めて新たな分子が参照分子と競合するアッセイを開発することが多くの場合に重要である。このアッセイフォーマットはしばしば非常に高いスループットであり、参照分子と同じ結合モードを共有する分子を見出すためのスクリーニングに焦点を当てる。一部の実施形態では、そのようなアッセイは、（１）上記のおよび下記の試験のための初期小分子を同定するステップ、（２）その小分子を修飾するステップであって、必要であれば、置換が発光を活性化または抑制する発色団の出力を含むように修飾するステップ、および（３）同時に修飾するステップであって、必要であれば、相補的な発色団の出力を組み込むための結合部位の近位にある核酸標的を修飾するステップを含む。
【０１７９】
細胞での活性の実証
以上の全ては、比較的人工的な生化学的状況の下で起こる。しかし、選択された小分子は、細胞内で三成分複合体の形成を誘発する必要がある。さらには、その三成分複合体の形成は、標的化される核酸（例えば、ＲＮＡ；一部の実施形態では、ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の安定性、機能、および／または翻訳に影響を及ぼす必要がある。必要な三成分複合体が細胞内で形成されたことの実証は、指し示されたリガンドに基づいてテザー連結した試薬を作製し、その三成分複合体に対してＰＥＡＲＬ−ｓｅｑまたは他の親和性ベースの技術を行うことによって容易に達成することができる。
【０１８０】
標的化されたＲＮＡの機能的なキャリアへの影響力は、標準的なレポーター遺伝子アッセイ法を使用して実証し得る。一部の実施形態では、標的核酸、例えばＲＮＡ配列が、ルシフェラーゼレポーターベクターまたは他の標準的なレポーター構築物中に導入され、レポーター発現に対する３ＷＪおよび小分子の影響力が細胞中で測定される。３ＷＪおよび小分子が標的の発現レベルに影響する場合、ＲＮＡのレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、およびタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットまたはＦＲＥＴアッセイによって測定することができる。
【０１８１】
２．化合物およびその実施形態
一態様では、本発明は、標的核酸またはエフェクター／核酸複合体中の３ＷＪに結合することによって標的核酸の活性をモジュレートするのに使用するための化合物および薬学的に許容されるその組成物を提供する。そのような化合物は、標的ＲＮＡに関連する疾患または状態を治療し、予防し、または改善するのに効果的であり、また本明細書中に記載の方法に使用するために効果的である。
【０１８２】
本発明およびそのような化合物を発見する方法（ＳＨＡＰＥ−ＭａＰ、ＲＩＮＧ−ＭａＰ、およびＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ（商標）（フックザワーム・アンド・フックアンドクリック法としても公知である）など）に使用され得る化合物は、米国仮特許出願第６２／２８９，６７１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１８３】
本発明の化合物は、本明細書中に一般的に記載した化合物を包含し、さらに本明細書中に開示したクラス、サブクラス、および種によって示されている。本明細書中で使用する場合、別段の記載がなければ以下の定義が適用される。本発明の目的のために、化学元素は、Handbook  of  Chemistry  and  Physics、第７５版中のＣＡＳ方式の元素周期表にしたがって特定される。さらに、有機化学の一般原則は、「Organic  Chemistry」、Thomas  Sorrell、University  Science  Books、Sausalito：１９９９年、および「March's  Advanced  Organic  Chemistry」、第５版、Smith,  M.B.およびMarch,  J.編、John  Wiley  &  Sons、New  York：２００１年（これらの内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１８４】
小分子
ＲＮＡに結合できる新規の小分子リガンドの設計および合成は、大部分が未開発の治療的可能性を表す。マクロライド（例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン）、アルカロイド（例えば、ベルベリン、パルマチン）、アミノグリコシド（例えば、パロモマイシン、ネオマイシンＢ、カナマイシンＡ）、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、オキシテトラサイクリン）、テオフィリン、およびオキサゾリジノン（例えば、リネゾリド、テジゾリド）を含めて、ある特定の小分子リガンドはＲＮＡに結合することが知られており、ＲＮＡ標的化薬物としての小分子の探索の道を開く。有機色素、アミノ酸、生物学的補因子、金属錯体、およびペプチドもまたＲＮＡ結合能力を示す。リボスイッチ、伸長されたヌクレオチドリピートを有するＲＮＡ分子、およびウイルスＲＮＡエレメントなどのＲＮＡをモジュレートすることが可能である。
【０１８５】
本明細書中で使用する場合、「標的ＲＮＡに結合する小分子」、「小分子ＲＮＡ結合剤」、「親和性部分」、または「リガンド部分」という用語は、開示した方法での使用、または標的ＲＮＡに関連する疾患を治療し、予防し、もしくは改善するための使用のために十分な親和性および特異性を以って標的ＲＮＡに結合できる小分子と一般に分類される全ての化合物を包含する。本発明において使用するためのＲＮＡに結合する小分子は、標的ＲＮＡの１つまたは複数の二次構造または三次構造のエレメントに結合し得る。これらの部位としては、ＲＮＡトリプレックス、３ＷＪ、４ＷＪ、パラレルＹジャンクション、ヘアピン、バルジループ、シュードノット、内部ループ、および本明細書において記載または参照するその他のより高次のＲＮＡ構造モチーフが挙げられる。
【０１８６】
したがって、一部の実施形態では、標的ＲＮＡに結合する小分子は、マクロライド、アルカロイド、アミノグリコシド、テトラサイクリンファミリーのメンバー、オキサゾリジノン、ＳＭＮ２リガンド、リボシルもしくは関連化合物、アントラセン、またはトリプチセンから選択される。一部の実施形態では、小分子ＲＮＡ結合剤は、パロモマイシン、ネオマイシン（ネオマイシンＢなど）、カナマイシン（カナマイシンＡなど）、リネゾリド、テジゾリド、プレウロムチリン、リボシル、ＮＶＳ−ＳＭ１、アントラセン、またはトリプチセンから選択される。一部の実施形態では、小分子は、米国仮特許出願第６２／２８９，６７１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に示される小分子、またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、もしくは互変異性体から選択される。さらなる例示的な小分子は、以下に詳細に説明される。
【０１８７】
一部の実施形態では、本発明は、式Ｉ：
【化１】
2019523242.tif 000008
の化合物または薬学的に許容されるその塩を提供し、式中、
環Ａ、Ｂ、およびＣはそれぞれ独立して、３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式芳香族複素環、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式芳香族複素環であり、
各Ｙは独立してＣＲまたはＮであり、
各Ｒ１は独立して、−Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＲ、または−Ｌ１−Ｒ６であり、
各Ｒ２は独立して、−Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＲ、−Ｌ２−Ｒ６であるか、または、同じ炭素上の２つのＲ２基が必要に応じて一緒になって＝ＮＲ６、＝ＮＯＲ６、＝Ｏ、もしくは＝Ｓを形成しており、
各Ｒ３は独立して、−Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＲ、または−Ｌ３−Ｒ６であり、
各Ｒ６は独立して、水素、または、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのハロゲンにより必要に応じて置換されているＣ１〜６アルキルであり、
各Ｒは独立して、水素、または、Ｃ１〜６の脂肪族基、３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式芳香族複素環、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式芳香族複素環から選択される必要に応じて置換されている基であり、
各Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は独立して、共有結合またはＣ１〜８の二価の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素鎖であり、前記鎖の１つ、２つ、または３つのメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、または−Ｃｙ−により必要に応じて置き換えられており、
ｍは、０、１、２、３、または４であり、
ｎは、０、１、２、３、または４であり、かつ
ｐは、０、１、２、３、または４である。
【０１８８】
上記に一般的に定義した通り、環Ａ、Ｂ、およびＣはそれぞれ独立して、３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式芳香族複素環、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式芳香族複素環である。
【０１８９】
一部の実施形態では、環Ａは、３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環である。一部の実施形態では、環Ａは、フェニルである。一部の実施形態では、環Ａは、８〜１０員の二環式芳香族炭素環である。一部の実施形態では、環Ａは、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環である。一部の実施形態では、環Ａは、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式芳香族複素環である。一部の実施形態では、環Ａは、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式芳香族複素環である。
【０１９０】
一部の実施形態では、環Ａは、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式芳香族複素環である。
【０１９１】
一部の実施形態では、環Ｂは、３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環である。一部の実施形態では、環Ｂは、フェニルである。一部の実施形態では、環Ｂは、８〜１０員の二環式芳香族炭素環である。一部の実施形態では、環Ｂは、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環である。一部の実施形態では、環Ｂは、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式芳香族複素環である。一部の実施形態では、環Ｂは、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式芳香族複素環である。
【０１９２】
一部の実施形態では、環Ｂは、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式芳香族複素環である。
【０１９３】
一部の実施形態では、環Ｂは存在しない。
【０１９４】
一部の実施形態では、環Ｃは、３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環である。一部の実施形態では、環Ｃは、フェニルである。一部の実施形態では、環Ｃは、８〜１０員の二環式芳香族炭素環である。一部の実施形態では、環Ｃは、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環である。一部の実施形態では、環Ｃは、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式芳香族複素環である。一部の実施形態では、環Ｃは、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式芳香族複素環である。
【０１９５】
一部の実施形態では、環Ｃは、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式芳香族複素環である。
【０１９６】
一部の実施形態では、環Ａ、Ｂ、およびＣは、それぞれ独立して、
フェニル、
【化２】
2019523242.tif 000009
【化３】
2019523242.tif 000010
から選択される。
【０１９７】
一部の実施形態では、環Ａ、Ｂ、およびＣは、それぞれ独立して、
フェニル、
【化４】
2019523242.tif 000011
から選択される。
【０１９８】
一部の実施形態では、環Ａは、フェニル、
【化５】
2019523242.tif 000012
から選択される。
【０１９９】
一部の実施形態では、環Ｂは、フェニル、
【化６】
2019523242.tif 000013
から選択される。
【０２００】
一部の実施形態では、環Ｃは、フェニル、
【化７】
2019523242.tif 000014
から選択される。
【０２０１】
一部の実施形態では、環Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つは、
【化８】
2019523242.tif 000015
である。
【０２０２】
上記に一般的に定義した通り、各Ｒ１は、独立してＲ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＲ、または−Ｌ１−Ｒ６である。
【０２０３】
一部の実施形態では、Ｒ１はＲである。一部の実施形態では、Ｒ１はハロゲンである。一部の実施形態では、Ｒ１は−ＣＮである。一部の実施形態では、Ｒ１は−ＯＲである。一部の実施形態では、Ｒ１は−Ｎ（Ｒ）２である。一部の実施形態では、Ｒ１は−ＮＯ２である。一部の実施形態では、Ｒ１は−Ｎ３である。一部の実施形態では、Ｒ１は−ＳＲである。一部の実施形態では、Ｒ１は−Ｌ１−Ｒ６である。
【０２０４】
一部の実施形態では、Ｒ１は水素である。一部の実施形態では、Ｒ１は、必要に応じて置換されているＣ１〜６の脂肪族基である。一部の実施形態では、Ｒ１は、必要に応じて置換されている３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環である。一部の実施形態では、Ｒ１は、必要に応じて置換されているフェニルである。一部の実施形態では、Ｒ１は、必要に応じて置換されている８〜１０員の二環式芳香族炭素環である。一部の実施形態では、Ｒ１は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環である。一部の実施形態では、Ｒ１は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている５〜６員の単環式芳香族複素環である。一部の実施形態では、Ｒ１は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている８〜１０員の二環式芳香族複素環である。
【０２０５】
上記に一般的に定義した通り、各Ｒ２は、独立してＲ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＲ、または−Ｌ２−Ｒ６である。
【０２０６】
一部の実施形態では、Ｒ２はＲである。一部の実施形態では、Ｒ２はハロゲンである。一部の実施形態では、Ｒ２は−ＣＮである。一部の実施形態では、Ｒ２は−ＯＲである。一部の実施形態では、Ｒ２は−Ｎ（Ｒ）２である。一部の実施形態では、Ｒ２は−ＮＯ２である。一部の実施形態では、Ｒ２は−Ｎ３である。一部の実施形態では、Ｒ２は−ＳＲである。一部の実施形態では、Ｒ２は−Ｌ２−Ｒ６である。
【０２０７】
一部の実施形態では、Ｒ２は水素である。一部の実施形態では、Ｒ２は、必要に応じて置換されているＣ１〜６の脂肪族基である。一部の実施形態では、Ｒ２は、必要に応じて置換されている３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環である。一部の実施形態では、Ｒ２は、必要に応じて置換されているフェニルである。一部の実施形態では、Ｒ２は、必要に応じて置換されている８〜１０員の二環式芳香族炭素環である。一部の実施形態では、Ｒ２は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環である。一部の実施形態では、Ｒ１は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている５〜６員の単環式芳香族複素環である。一部の実施形態では、Ｒ２は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている８〜１０員の二環式芳香族複素環である。
【０２０８】
上記に一般的に定義した通り、各Ｒ３は、独立してＲ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＲ、または−Ｌ３−Ｒ６である。
【０２０９】
一部の実施形態では、Ｒ３はＲである。一部の実施形態では、Ｒ３はハロゲンである。一部の実施形態では、Ｒ３は−ＣＮである。一部の実施形態では、Ｒ３は−ＯＲである。一部の実施形態では、Ｒ３は−Ｎ（Ｒ）２である。一部の実施形態では、Ｒ３は−ＮＯ２である。一部の実施形態では、Ｒ３は−Ｎ３である。一部の実施形態では、Ｒ３は−ＳＲである。一部の実施形態では、Ｒ３は−Ｌ３−Ｒ６である。
【０２１０】
一部の実施形態では、Ｒ３は水素である。一部の実施形態では、Ｒ３は、必要に応じて置換されているＣ１〜６の脂肪族基である。一部の実施形態では、Ｒ３は、必要に応じて置換されている３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環である。一部の実施形態では、Ｒ３は、必要に応じて置換されているフェニルである。一部の実施形態では、Ｒ３は、必要に応じて置換されている８〜１０員の二環式芳香族炭素環である。一部の実施形態では、Ｒ３は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環である。一部の実施形態では、Ｒ３は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている５〜６員の単環式芳香族複素環である。一部の実施形態では、Ｒ３は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている８〜１０員の二環式芳香族複素環である。
【０２１１】
上記に一般的に定義した通り、各Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は独立して、共有結合、または、Ｃ１〜８の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖であり、該鎖の１つ、２つ、または３つのメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、または−Ｃｙ−により必要に応じて置き換えられている。
【０２１２】
一部の実施形態では、Ｌ１は共有結合である。一部の実施形態では、Ｌ１は、Ｃ１〜８の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖である。一部の実施形態では、Ｌ１は、Ｃ１〜８の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖であり、該鎖の１つ、２つ、または３つのメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、または−Ｃｙ−により必要に応じて置き換えられている。
【０２１３】
一部の実施形態では、Ｌ１は、Ｃ１〜６の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖であり、該鎖の１つ、２つ、または３つのメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、または−Ｃｙ−により必要に応じて置き換えられており、かつ各Ｒは独立して、水素、−ＣＨ２−フェニル、フェニル、Ｃ１〜６アルキル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨＦ２、もしくは−ＣＨ２ＣＦ３であるか、または各Ｒは独立して、水素もしくはメチルであるか、またはＲは水素である。
【０２１４】
一部の実施形態では、Ｌ２は共有結合である。一部の実施形態では、Ｌ２は、Ｃ１〜８の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖である。一部の実施形態では、Ｌ２は、Ｃ１〜８の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖であり、該鎖の１つ、２つ、または３つのメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、または−Ｃｙ−により必要に応じて置き換えられている。
【０２１５】
一部の実施形態では、Ｌ２は、Ｃ１〜６の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖であり、該鎖の１つ、２つ、または３つのメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、または−Ｃｙ−により必要に応じて置き換えられており、かつ各Ｒは独立して、水素、−ＣＨ２−フェニル、フェニル、Ｃ１〜６アルキル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨＦ２、もしくは−ＣＨ２ＣＦ３であるか、または各Ｒは独立して、水素もしくはメチルであるか、またはＲは水素である。
【０２１６】
一部の実施形態では、Ｌ３は共有結合である。一部の実施形態では、Ｌ３は、Ｃ１〜８の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖である。一部の実施形態では、Ｌ３は、Ｃ１〜８の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖であり、該鎖の１つ、２つ、または３つのメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、または−Ｃｙ−により必要に応じて置き換えられている。
【０２１７】
一部の実施形態では、Ｌ３は、Ｃ１〜６の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖であり、該鎖の１つ、２つ、または３つのメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、または−Ｃｙ−により必要に応じて置き換えられており、かつ各Ｒは独立して、水素、−ＣＨ２−フェニル、フェニル、Ｃ１〜６アルキル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨＦ２、もしくは−ＣＨ２ＣＦ３であるか、または各Ｒは独立して、水素もしくはメチルであるか、またはＲは水素である。
【０２１８】
上記に一般的に定義した通り、各−Ｃｙ−は独立して、二価の必要に応じて置換されている３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環、必要に応じて置換されているフェニレン、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている５〜６員の単環式芳香族複素環、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている８〜１０員の二環式もしくは架橋二環式の飽和もしくは部分不飽和の複素環式環、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている８〜１０員の二環式もしくは架橋二環式の芳香族複素環である。
【０２１９】
一部の実施形態では、−Ｃｙ−は、二価の必要に応じて置換されている３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環である。一部の実施形態では、−Ｃｙ−は、必要に応じて置換されているフェニレンである。一部の実施形態では、−Ｃｙ−は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環である。一部の実施形態では、−Ｃｙ−は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている５〜６員の単環式芳香族複素環である。一部の実施形態では、−Ｃｙ−は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている８〜１０員の二環式もしくは架橋二環式の飽和もしくは部分不飽和の複素環式環である。一部の実施形態では、−Ｃｙ−は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている８〜１０員の二環式もしくは架橋二環式の芳香族複素環である。
【０２２０】
上記に一般的に定義した通り、各Ｒ６は独立して、水素、または、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのハロゲンにより必要に応じて置換されているＣ１〜６アルキルである。
【０２２１】
上記に一般的に定義した通り、ｍは、０、１、２、３、または４である。一部の実施形態では、ｍは０である。一部の実施形態では、ｍは１である。一部の実施形態では、ｍは２である。一部の実施形態では、ｍは３である。一部の実施形態では、ｍは４である。一部の実施形態では、ｍは、０、１、２、または３である。一部の実施形態では、ｍは、０、１、または２である。一部の実施形態では、ｍは、１、２、または３である。
【０２２２】
上記に一般的に定義した通り、ｎは、０、１、２、３、または４である。一部の実施形態では、ｎは０である。一部の実施形態では、ｎは１である。一部の実施形態では、ｎは２である。一部の実施形態では、ｎは３である。一部の実施形態では、ｎは４である。一部の実施形態では、ｎは、０、１、２、または３である。一部の実施形態では、ｎは、０、１、または２である。一部の実施形態では、ｎは、１、２、または３である。
【０２２３】
上記に一般的に定義した通り、ｐは、０、１、２、３、または４である。一部の実施形態では、ｐは０である。一部の実施形態では、ｐは１である。一部の実施形態では、ｐは２である。一部の実施形態では、ｐは３である。一部の実施形態では、ｐは４である。一部の実施形態では、ｐは、０、１、２、または３である。一部の実施形態では、ｐは、０、１、または２である。一部の実施形態では、ｐは、１、２、または３である。
【０２２４】
一部の実施形態では、式Ｉの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２２５】
別の態様では、本発明は、式ＩＩ：
【化９】
2019523242.tif 000016
の化合物、または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、−Ｃｙ−、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２２６】
一部の実施形態では、式ＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２２７】
一部の実施形態では、本発明は、式ＩＩＩ：
【化１０】
2019523242.tif 000017
の化合物、または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、−Ｃｙ−、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２２８】
一部の実施形態では、式ＩＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２２９】
一部の実施形態では、本発明は、式ＩＶ：
【化１１】
2019523242.tif 000018
の化合物、または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、−Ｃｙ−、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２３０】
一部の実施形態では、式ＩＶの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２３１】
一部の実施形態では、本発明は、式Ｖ：
【化１２】
2019523242.tif 000019
の化合物、または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、−Ｃｙ−、ｍ、およびｐのそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２３２】
一部の実施形態では、式Ｖの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２３３】
一部の実施形態では、本発明は、式ＶＩ：
【化１３】
2019523242.tif 000020
の化合物、または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２３４】
一部の実施形態では、式ＶＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２３５】
一部の実施形態では、本発明は、式Ｖ：
【化１４】
2019523242.tif 000021
の化合物、または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ３、−Ｃｙ−、ｍ、およびｐのそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りであり；そしてＸは、−Ｃ（Ｒ）２−、−ＮＲ−、または−Ｏ−である）を提供する。
【０２３６】
一部の実施形態では、式ＶＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２３７】
別の態様では、本発明は、式ＶＩＩＩ：
【化１５】
2019523242.tif 000022
の化合物、または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｘ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りであり；Ｒ４は、独立して、−Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＲ、または−Ｌ３−Ｒ６である）を提供する。
【０２３８】
一部の実施形態では、Ｒ４はＲである。一部の実施形態では、Ｒ４はハロゲンである。一部の実施形態では、Ｒ４は−ＣＮである。一部の実施形態では、Ｒ４は−ＯＲである。一部の実施形態では、Ｒ４は−Ｎ（Ｒ）２である。一部の実施形態では、Ｒ４は−ＮＯ２である。一部の実施形態では、Ｒ４は−Ｎ３である。一部の実施形態では、Ｒ４は−ＳＲである。一部の実施形態では、Ｒ４は−Ｌ３−Ｒ６である。
【０２３９】
一部の実施形態では、Ｒ４は水素である。一部の実施形態では、Ｒ４は、必要に応じて置換されているＣ１〜６の脂肪族基である。一部の実施形態では、Ｒ４は、必要に応じて置換されている３〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式炭素環である。一部の実施形態では、Ｒ４は、必要に応じて置換されているフェニルである。一部の実施形態では、Ｒ４は、必要に応じて置換されている８〜１０員の二環式芳香族炭素環である。一部の実施形態では、Ｒ４は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている４〜８員の飽和もしくは部分不飽和の単環式複素環式環である。一部の実施形態では、Ｒ４は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている５〜６員の単環式芳香族複素環である。一部の実施形態では、Ｒ４は、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換されている８〜１０員の二環式芳香族複素環である。
【０２４０】
一部の実施形態では、Ｒ４は、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＳＲ、Ｃ１〜６の脂肪族基、または−Ｌ４−Ｒ６から選択され、Ｌ４は、Ｃ１〜６の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖であり、該鎖の１つ、２つ、または３つのメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、または−Ｃｙ−により必要に応じて置き換えられており；Ｃ１〜６の脂肪族基は、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＯ２、−Ｎ３、＝ＮＲ、＝ＮＯＲ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＳＯ２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｒ、−Ｃｙ−Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）２、−（Ｒ）ＮＳＯ２Ｒ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、または−Ｃ（Ｓ）ＯＲから独立して選択される１つ、２つ、または３つの基により必要に応じて置換されており；かつ各Ｒは独立して、水素、−ＣＨ２−フェニル、フェニル、Ｃ１〜６アルキル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨＦ２、または−ＣＨ２ＣＦ３であるか；または各Ｒは独立して、水素もしくはメチルであるか；またはＲは水素である。
【０２４１】
一部の実施形態では、Ｌ４は共有結合である。一部の実施形態では、Ｌ４は、Ｃ１〜８の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖である。一部の実施形態では、Ｌ４は、Ｃ１〜８の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖であり、該鎖の１つ、２つ、または３つのメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、または−Ｃｙ−により必要に応じて置き換えられている。
【０２４２】
一部の実施形態では、Ｌ４は、Ｃ１〜６の二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖であり、該鎖の１つ、２つ、または３つのメチレン単位は、独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、または−Ｃｙ−により必要に応じて置き換えられており、かつ各Ｒは独立して、水素、−ＣＨ２−フェニル、フェニル、Ｃ１〜６アルキル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨＦ２、または−ＣＨ２ＣＦ３であるか；または各Ｒは独立して、水素またはメチルであるか；またはＲは水素である。
【０２４３】
一部の実施形態では、式ＶＩＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２４４】
別の態様では、本発明は、式ＩＸ：
【化１６】
2019523242.tif 000023
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２４５】
一部の実施形態では、式ＩＸの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２４６】
一部の実施形態では、本発明は、式Ｘ：
【化１７】
2019523242.tif 000024
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ３、および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２４７】
一部の実施形態では、式Ｘの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２４８】
別の態様では、本発明は、式ＸＩ：
【化１８】
2019523242.tif 000025
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｙ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りであり；、Ｚは、−Ｃ（Ｒ）２−または−Ｏ−である）を提供する。
【０２４９】
一部の実施形態では、式ＸＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２５０】
一部の実施形態では、本発明は、式ＸＩＩ：
【化１９】
2019523242.tif 000026
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２５１】
一部の実施形態では、式ＸＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２５２】
一部の実施形態では、本発明は、式ＸＩＩＩ：
【化２０】
2019523242.tif 000027
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２５３】
一部の実施形態では、式ＸＩＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２５４】
別の態様では、本発明は、式ＸＩＶ：
【化２１】
2019523242.tif 000028
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りであり；Ｗは、−ＮＲ−、−Ｏ−または−Ｓ−である）を提供する。
【０２５５】
一部の実施形態では、式ＸＩＶの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２５６】
別の態様では、本発明は、式ＸＶ：
【化２２】
2019523242.tif 000029
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｙ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りであり；但し、Ｒ１またはＲ２の１つは存在しなくてもよく、かつ
【化２３】
2019523242.tif 000030
によって置き換えられていてもよい）を提供する。
【０２５７】
一部の実施形態では、式ＸＶの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２５８】
一部の実施形態では、本発明は、式ＸＶＩ：
【化２４】
2019523242.tif 000031
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２５９】
一部の実施形態では、式ＸＶＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２６０】
一部の実施形態では、本発明は、式ＸＶＩＩ：
【化２５】
2019523242.tif 000032
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ２、Ｌ３、および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２６１】
一部の実施形態では、式ＸＶＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２６２】
一部の実施形態では、本発明は、式ＸＶＩＩＩ：
【化２６】
2019523242.tif 000033
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２６３】
一部の実施形態では、式ＸＶＩＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２６４】
別の態様では、本発明は、式ＸＩＸ：
【化２７】
2019523242.tif 000034
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ３、および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２６５】
一部の実施形態では、式ＸＩＸの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２６６】
一部の実施形態では、本発明は、式ＸＸ：
【化２８】
2019523242.tif 000035
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２６７】
一部の実施形態では、式ＸＸの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２６８】
別の態様では、本発明は、式ＸＸＩ：
【化２９】
2019523242.tif 000036
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、および−Ｃｙ−は、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りであり；Ｌ５はＣＨ２または単結合もしくは二重結合であり；かつＲ５は存在しないか、または−Ｏ−である）を提供する。
【０２６９】
一部の実施形態では、式ＸＸＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２７０】
別の態様では、本発明は、式ＸＸＩＩ：
【化３０】
2019523242.tif 000037
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ６、Ｌ１、および−Ｃｙ−は、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２７１】
一部の実施形態では、式ＸＸＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２７２】
一部の実施形態では、本発明は、式ＸＸＩＩＩ：
【化３１】
2019523242.tif 000038
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、各Ｒ、Ｒ６および−Ｃｙ−は、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２７３】
一部の実施形態では、式ＸＸＩＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２７４】
一部の実施形態では、本発明は、式ＸＸＩＶ：
【化３２】
2019523242.tif 000039
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ６、Ｌ１、および−Ｃｙ−は、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２７５】
一部の実施形態では、式ＸＸＩＶの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２７６】
別の態様では、本発明は、式ＸＸＶ：
【化３３】
2019523242.tif 000040
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ６、Ｌ１、および−Ｃｙ−は、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２７７】
一部の実施形態では、式ＸＸＶの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２７８】
一部の実施形態では、本発明は、式ＸＸＶＩ−ａ、ＸＸＶＩ−ｂ、ＸＸＶＩ−ｃ、ＸＸＶＩ−ｄもしくはＸＸＶＩ−ｅ：
【化３４】
2019523242.tif 000041
の化合物もしくはジアステレオマーまたは薬学的に許容されるその塩（式中、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ６、Ｌ１および−Ｃｙ−は、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２７９】
一部の実施形態では、式ＸＸＶＩ−ａ、ＸＸＶＩ−ｂ、ＸＸＶＩ−ｃ、ＸＸＶＩ−ｄまたはＸＸＶＩ−ｅの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２８０】
別の態様では、本発明は、式ＸＸＶＩＩ：
【化３５】
2019523242.tif 000042
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、および−Ｃｙ−は、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２８１】
一部の実施形態では、式ＸＸＶＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２８２】
別の態様では、本発明は、式ＸＸＶＩＩＩ：
【化３６】
2019523242.tif 000043
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３および−Ｃｙ−は、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２８３】
一部の実施形態では、式ＸＸＶＩＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２８４】
別の態様では、本発明は、式ＸＸＩＸ：
【化３７】
2019523242.tif 000044
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３および−Ｃｙ−は、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２８５】
一部の実施形態では、式ＸＸＩＸの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２８６】
別の態様では、本発明は、式ＸＸＸ：
【化３８】
2019523242.tif 000045
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３および−Ｃｙ−は、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りであり；Ｊは、Ｎ、ＯまたはＣであり、ｐは１、２または３である）を提供する。
【０２８７】
一部の実施形態では、式ＸＸＸの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２８８】
一部の実施形態では、本発明は、式ＸＸＸＩ：
【化３９】
2019523242.tif 000046
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、各Ｘ、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２８９】
一部の実施形態では、式ＸＸＸＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの、少なくとも１つの（at  least  one  least  one）構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２９０】
一部の実施形態では、本発明は、式ＸＸＸＩＩ：
【化４０】
2019523242.tif 000047
の化合物または薬学的に許容されるその塩（式中、各、Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３および−Ｃｙ−のそれぞれは、単独および組合せの両方で、上記に定義した通りおよび本明細書中の実施形態に記載した通りである）を提供する。
【０２９１】
一部の実施形態では、式ＸＸＸＩＩの化合物は、任意の化学的に実現可能な手段によって、図２４または図３３に示される少なくとも１つの、少なくとも１つの（at  least  one  least  one）構造に直接的にまたはＬ１などのリンカーを通じて共有結合的に連結されている。
【０２９２】
さらには、キノリン核を含むある特定の化合物（その１つはＣＰＮＱである）はＲＮＡに結合できることが今や分かっている。ＣＰＮＱは下記の構造：
【化４１】
2019523242.tif 000048
を有する。
【０２９３】
したがって、一部の実施形態では、小分子リガンドはＣＰＮＱまたは薬学的に許容されるその塩から選択される。他の実施形態では、リガンドは、ＣＰＮＱに関連するキノリン化合物から選択され、該化合物は例えば、下記の表５もしくは表６のいずれか１つ、または図６３〜７１のいずれか１つにおいて提供される化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩などである。
【０２９４】
一部の実施形態では、ＣＰＮＱまたはＣＰＮＱに関連するキノリンは、本明細書中およびＵＳＳＮ６２／２８９，６７１（その全体がこれにより本明細書に参考として援用される）に記載するようなそれぞれの実施形態にしたがって、１つまたは複数の利用可能な位置において修飾されて水素がテザー（−Ｔ１−および／または−Ｔ２−）、クリック実行可能基（−ＲＣＧ）、または弾頭（−Ｒｍｏｄ）によって置き換えられている。
【０２９５】
例えば、ＣＰＮＱまたはＣＰＮＱに関連するキノリンは、以下の式：
【化４２】
2019523242.tif 000049
（式中、Ｒｍｏｄは、必要に応じて−ＲＣＧまたは−Ｔ２−ＲＣＧにより置換されており、さらに必要に応じてプルダウン基により置換されている）の１つ、または薬学的に許容されるその塩を有し得る。式ＩＸまたは式Ｘの化合物は、さらに必要に応じて、下記に定義されるような１つまたは複数の必要に応じた置換基（例えば、１つまたは２つの必要に応じた置換基）により置換されていてもよい。
【０２９６】
本明細書中で使用する場合、「脂肪族」または「脂肪族基」という用語は、直鎖（すなわち、非分岐鎖）または分岐鎖の、置換または非置換の、完全飽和であるかまたは１つもしくは複数の不飽和単位を含む炭化水素鎖、あるいは、完全飽和であるかまたは１つもしくは複数の不飽和単位を含むが、芳香族ではない単環式炭化水素または二環式炭化水素（本明細書中で「炭素環」、「脂環式」、または「シクロアルキル」とも称する）であって、分子の残部への単一の結合点を有するものを意味する。別段の規定がなければ、脂肪族基は１〜６個の脂肪族炭素原子を含む。一部の実施形態では、脂肪族基は１〜５個の脂肪族炭素原子を含む。他の実施形態では、脂肪族基は１〜４個の脂肪族炭素原子を含む。また他の実施形態では、脂肪族基は１〜３個の脂肪族炭素原子を含み、さらに他の実施形態では、脂肪族基は１〜２個の脂肪族炭素原子を含む。一部の実施形態では、「脂環式」（または「炭素環」もしくは「シクロアルキル」）とは、完全飽和であるかまたは１つもしくは複数の不飽和単位を含むが、芳香族ではなく、分子の残部への単一の結合点を有する単環式Ｃ３〜Ｃ６炭化水素を指す。好適な脂肪族基としては、直鎖または分岐鎖の、置換または非置換の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびこれらのハイブリッド（（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキル、または（シクロアルキル）アルケニルなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９７】
本明細書中で使用する場合、「架橋二環式」という用語は、任意の二環式環系、すなわち、炭素環または複素環の、飽和または部分不飽和の、少なくとも１つの橋を有する、二環式環系を指す。ＩＵＰＡＣによって定義される通り、「橋」とは、２つの橋頭を接続する複数原子の非分岐鎖、または１つの原子もしくは原子価結合であり、ここで「橋頭」とは、３つまたはそれより多くの骨格原子（水素を除く）に結合しているその環系の任意の骨格原子である。一部の実施形態では、架橋二環式基は、７〜１２個の環員、および独立して窒素、酸素、または硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する。そのような架橋二環式基は当該技術分野において周知であり、そして各基が任意の置換可能な炭素原子または窒素原子において分子の残部に結合している、以下に記載する基を包含する。別段の規定がなければ、架橋二環式基は、必要に応じて、脂肪族基について記載したような１つまたは複数の置換基で置換されている。追加的または代替的に、架橋二環式基の任意の置換可能な窒素は、必要に応じて置換されている。例示的な架橋二環式としては、
【化４３】
2019523242.tif 000050
が挙げられる。
【０２９８】
「低級アルキル」という用語は、Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキル基を指す。例示的な低級アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルである。
【０２９９】
「低級ハロアルキル」という用語は、１つまたは複数のハロゲン原子で置換されている、Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキル基を指す。
【０３００】
「ヘテロ原子」という用語は、酸素、硫黄、窒素、リン、またはケイ素（窒素、硫黄、リン、またはケイ素の任意の酸化形態、任意の塩基性窒素の四級化形態、あるいは複素環式環の置換可能な窒素（例えば、（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルにおけるような）Ｎ、（ピロリジニルにおけるような）ＮＨ、または（Ｎ−置換ピロリジニルにおけるような）ＮＲ＋を包含する）のうちの１つまたは複数を意味する。
【０３０１】
本明細書中で使用する場合、「不飽和」という用語は、ある部分が１つまたは複数の不飽和単位を有することを意味する。
【０３０２】
本明細書中で使用する場合、「二価のＣ１〜８（もしくはＣ１〜６）の飽和または不飽和の、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖」という用語は、本明細書において定義するような、直鎖または分岐鎖の、二価のアルキレン鎖、アルケニレン鎖、およびアルキニレン鎖を指す。
【０３０３】
「アルキレン」という用語は、二価のアルキル基を指す。「アルキレン鎖」は、ポリメチレン基、すなわち−（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎは正の整数、好ましくは１〜６、１〜４、１〜３、１〜２、または２〜３である。置換アルキレン鎖は１つまたは複数のメチレン水素原子が置換基で置き換えられているポリメチレン基である。好適な置換基としては、置換脂肪族基について下記するものが挙げられる。
【０３０４】
「アルケニレン」という用語は、二価のアルケニル基を指す。置換アルケニレン鎖は、少なくとも１つの二重結合を含み、１つまたは複数の水素原子が置換基で置き換えられているポリメチレン基である。好適な置換基としては置換脂肪族基について下記するものが挙げられる。
【０３０５】
「ハロゲン」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを意味する。
【０３０６】
単独で、または「アラルキル」、「アラルコキシ」、もしくは「アリールオキシアルキル」におけるようにより大きい部分の一部として使用される「アリール」という用語は、合計５〜１４個の環員を有し、その系内の少なくとも１つの環が芳香族であり、かつその系内の各環が３〜７個の環員を含む、単環式または二環式環系を指す。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と互換的に使用され得る。本発明のある特定の実施形態では、「アリール」とは芳香環系を指し、これにはフェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシルなどが含まれるがこれらに限定されず、またこれらは１つまたは複数の置換基を有していてもよい。本明細書中で使用する場合、「アリール」という用語の範囲には、芳香環が１つまたは複数の非芳香環に縮合している基（例えば、インダニル、フタルイミジル、ナフタイミジル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロナフチルなど）も含まれる。
【０３０７】
単独で、またはより大きい部分（例えば、「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアラルコキシ」）の一部として使用される「ヘテロアリール」および「ヘテロアラ−」という用語は、５〜１０個の環原子、好ましくは５個、６個、または９個の環原子を有し、環状配置で共有された６個、１０個、または１４個のπ電子を有し、かつ炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有する基を指す。「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素、または硫黄を指し、窒素または硫黄の任意の酸化形態、および塩基性窒素の任意の四級化形態を包含する。ヘテロアリール基としては、限定するものではないが、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、およびプテリジニルが挙げられる。本明細書中で使用する場合、「ヘテロアリール」および「ヘテロアラ−」という用語はまた、芳香族複素環が１つまたは複数のアリール環、脂環式環、またはヘテロシクリル環に縮合しており、そのラジカルまたは結合点がその芳香族複素環上にある基を包含する。非限定的な例としては、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、およびピリド［２，３−ｂ］−１，４−オキサジン−３（４Ｈ）−オンが挙げられる。ヘテロアリール基は、単環式であっても二環式であってもよい。「ヘテロアリール」という用語は、「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」、または「ヘテロ芳香族」という用語と互換的に使用されてよく、これらの用語のいずれも、必要に応じて置換されている環を包含する。「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールにより置換されたアルキル基を指し、ここでアルキル部分およびヘテロアリール部分は独立して、必要に応じて置換されている。
【０３０８】
本明細書中で使用する場合、「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式ラジカル」、および「複素環式環」という用語は、互換的に使用され、安定な５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式の複素環式部分であって、飽和または部分不飽和のいずれかであり、かつ炭素原子に加えて１つまたは複数の、好ましくは１〜４個の、上で定義したようなヘテロ原子を有するものを指す。複素環の環原子に関して使用する場合、「窒素」という用語は、置換された窒素を包含する。一例としては、酸素、硫黄または窒素から選択される０〜３個のヘテロ原子を有する飽和または部分不飽和の環において、窒素は、（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルにおけるような）Ｎ、（ピロリジニルにおけるような）ＮＨ、または（Ｎ−置換ピロリジニルにおけるような）＋ＮＲであり得る。
【０３０９】
複素環式環は、そのペンダント基に、安定な構造をもたらす任意のヘテロ原子または炭素原子において結合することができ、環原子のいずれかは必要に応じて置換されていてもよい。そのような飽和または部分不飽和の複素環式ラジカルとしては、限定するものではないが、例えば、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニル、およびキヌクリジニルが挙げられる。「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」、および「複素環式ラジカル」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、そしてまた、ヘテロシクリル環が１つまたは複数のアリール環、ヘテロアリール環、または脂環式環に縮合している基（例えば、インドリニル、３Ｈ−インドリル、クロマニル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロキノリニルなど）を包含する。ヘテロシクリル基は、単環式であっても二環式であってもよい。「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、ヘテロシクリルにより置換されたアルキル基を指し、ここでアルキル部分およびヘテロシクリル部分は独立して、必要に応じて置換されている。
【０３１０】
本明細書中で使用する場合、「部分不飽和」という用語は、少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む環部分を指す。「部分不飽和」という用語は、複数の不飽和部位を有する環を包含することを意図するが、本明細書中で定義するようなアリール部分またはヘテロアリール部分を包含することは意図しない。
【０３１１】
本明細書中に記載する場合、本発明の化合物は、「必要に応じて置換されている」部分を含み得る。一般に、「置換されている」という用語は、「必要に応じて」という用語が先行しようと先行しまいと、指定される部分の１つまたは複数の水素が好適な置換基で置き換えられていることを意味する。別段に示さない限り、「必要に応じて置換されている」基は、その基の各置換可能な位置において好適な置換基を有してもよく、任意の所与の構造中の１つより多くの位置が特定の基から選択される１つより多くの置換基で置換され得る場合、その置換基はあらゆる位置で同じであってもよいし、異なっていてもよい。本発明によって想定される置換基の組合せは、好ましくは、安定なまたは化学的に実現可能な化合物の形成をもたらす組合せである。本明細書中で使用する場合、「安定な」という用語は、それらの産生、検出、およびある特定の実施形態では、それらの回収、精製、および本明細書中に開示した１つまたは複数の目的のための使用を可能にする条件に供された時に、実質的に変化しない化合物を指す。
【０３１２】
「必要に応じて置換されている」基の置換可能な炭素原子上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン；−（ＣＨ２）０〜４Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４ＯＲ○；−Ｏ（ＣＨ２）０〜４Ｒｏ、−Ｏ−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−（ＣＨ２）０〜４ＣＨ（ＯＲ○）２；−（ＣＨ２）０〜４ＳＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｐｈ（これはＲ○で置換されていてもよい）；−（ＣＨ２）０〜４Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ（これはＲ○で置換されていてもよい）；−ＣＨ＝ＣＨＰｈ（これはＲ○で置換されていてもよい）；−（ＣＨ２）０〜４Ｏ（ＣＨ２）０〜１−ピリジル（これはＲ○で置換されていてもよい）；−ＮＯ２；−ＣＮ；−Ｎ３；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ○）２；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｓ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｓ）ＮＲ○２；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（Ｓ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＳＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲ○３；−（ＣＨ２）０〜４ＯＣ（Ｏ）Ｒ○；−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０〜４ＳＲ−、ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°；−（ＣＨ２）０〜４ＳＣ（Ｏ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｓ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｓ）ＳＲ°；−ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°、−（ＣＨ２）０〜４ＯＣ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ○）Ｒ○；−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（ＮＯＲ○）Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４ＳＳＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｓ（Ｏ）２Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｓ（Ｏ）２ＯＲ○；−（ＣＨ２）０〜４ＯＳ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ○２；−（ＣＨ２）０〜４Ｓ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｓ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｎ（ＯＲ○）Ｒ○；−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ○２；−Ｐ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｐ（Ｏ）Ｒ○２；−ＯＰ（Ｏ）Ｒ○２；−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ○）２；ＳｉＲ○３；−（Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキレン）Ｏ−Ｎ（Ｒ○）２；または−（Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ（Ｒ○）２であり、ここで各Ｒ○は、以下で定義するように置換されていてもよく、かつ独立して、水素、Ｃ１〜６脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、−ＣＨ２−（５〜６員のヘテロアリール環）、または、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環であるか、あるいは上記定義にかかわらず、Ｒ○の２個の独立した存在は、それらの間にある原子（複数可）と一緒になって、独立して窒素、酸素、または硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、３〜１２員の飽和、部分不飽和、またはアリールの単環式環または二環式環を形成し、これは以下で定義するように置換されていてもよい。
【０３１３】
Ｒ○（またはＲ○の２個の独立した存在がこれらの間の原子と一緒になって形成された環）上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン、−（ＣＨ２）０〜２Ｒ●、−（ハロＲ●）、−（ＣＨ２）０〜２ＯＨ、−（ＣＨ２）０〜２ＯＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＣＨ（ＯＲ●）２；−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｎ３、−（ＣＨ２）０〜２Ｃ（Ｏ）Ｒ●、−（ＣＨ２）０〜２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）０〜２Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＳＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＳＨ、−（ＣＨ２）０〜２ＮＨ２、−（ＣＨ２）０〜２ＮＨＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＮＲ●２、−ＮＯ２、−ＳｉＲ●３、−ＯＳｉＲ●３、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ●、−（Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、または−ＳＳＲ●であり、ここで各Ｒ●は置換されていないか、または「ハロ」が先行する場合、１つまたは複数のハロゲンのみで置換されており、そして独立して、Ｃ１〜４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環から選択される。Ｒ○の飽和炭素原子上の好適な二価の置換基としては、＝Ｏおよび＝Ｓが挙げられる。
【０３１４】
「必要に応じて置換されている」基の飽和炭素原子上の好適な二価の置換基としては、以下のもの：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＲ＊２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ＊、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ＊、＝ＮＲ＊、＝ＮＯＲ＊、−Ｏ（Ｃ（Ｒ＊２））２〜３Ｏ−、または−Ｓ（Ｃ（Ｒ＊２））２〜３Ｓ−が挙げられ、ここでＲ＊の各独立した存在は、水素、以下で定義するように置換されていてもよいＣ１〜６脂肪族、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環から選択される。「必要に応じて置換されている」基の近隣の置換可能な炭素に結合した好適な二価の置換基としては−Ｏ（ＣＲ＊２）２〜３Ｏ−が挙げられ、ここでＲ＊の各独立した存在は、水素、以下で定義するように置換されていてもよいＣ１〜６脂肪族、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環から選択される。
【０３１５】
Ｒ＊の脂肪族基上の好適な置換基としては、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２が挙げられ、ここで各Ｒ●は置換されていないか、または「ハロ」が先行する場合、１つまたは複数のハロゲンのみで置換されており、そして独立して、Ｃ１〜４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環である。
【０３１６】
「必要に応じて置換されている」基の置換可能な窒素上の好適な置換基としては、−Ｒ†、−ＮＲ†２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ†、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ†２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ†２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ†２、または−Ｎ（Ｒ†）Ｓ（Ｏ）２Ｒ†が挙げられ、ここで各Ｒ†は独立して水素、以下で定義するように置換されていてもよいＣ１〜６脂肪族、非置換の−ＯＰｈ、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環であるか、あるいは上記定義にかかわらず、Ｒ†の２つの独立した存在は、これらの間にある原子（複数可）と一緒になって、独立して窒素、酸素、または硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の３〜１２員の飽和、部分不飽和、またはアリールの単環式環または二環式環を形成する。
【０３１７】
Ｒ†の脂肪族基上の好適な置換基は、独立してハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２であり、ここで各Ｒ●は置換されていないか、または「ハロ」が先行する場合、１つまたは複数のハロゲンのみで置換されており、そして独立してＣ１〜４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環である。
【０３１８】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などなしで、ヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するために好適であり、そして合理的な利益／リスク比に見合う、塩を指す。薬学的に許容される塩は当該技術分野において周知である。例えば、S.  M.  Bergeらは、J.  Pharmaceutical  Sciences、１９７７年、６６巻、１〜１９頁において薬学的に許容される塩を詳細に説明しており、これは参照により本明細書に組み込まれる。本発明の化合物の薬学的に許容される塩としては、好適な無機および有機の酸および塩基に由来する塩が挙げられる。薬学的に許容される非毒性の酸付加塩の例としては、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸など）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、またはマロン酸）と形成されたか、あるいはイオン交換などの当該技術分野において使用されるその他の方法を使用することによって形成された、アミノ基の塩である。その他の薬学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、ブチル酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。
【０３１９】
適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、およびＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４塩が挙げられる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらなる薬学的に許容される塩としては、適切である場合、例えばハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、低級アルキルスルホン酸イオン、アリールスルホン酸イオンなどの対イオンを使用して形成された、非毒性のアンモニウム、第４級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられる。
【０３２０】
別段の言及がなければ、本明細書中に示す構造は、その構造の全ての異性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何（または配座））形態（例えば、各不斉中心についてＲ配置およびＳ配置、Ｚ体およびＥ体の二重結合異性体、ならびにＺ体およびＥ体の配座異性体）をも包含することを意図する。したがって、本発明の化合物の単一の立体化学的異性体、ならびにエナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何（または配座）混合物は本発明の範囲内である。別段の言及がなければ、本発明の化合物の全ての互変異性形態は本発明の範囲内である。さらに、別段の言及がなければ、本明細書中に示す構造はまた、１つまたは複数の同位体が濃縮された原子の存在においてのみ異なる化合物を包含することも意図する。例えば、水素がジュウテリウムもしくはトリチウムで置き換えられたもの、または炭素が１３Ｃもしくは１４Ｃ濃縮炭素で置き換えられたものを含めて本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。そのような化合物は例えば、分析ツールとして、生物学的アッセイにおけるプローブとして、または本発明による治療剤として有用である。ある特定の実施形態では、提供される化合物の弾頭部分Ｒ１は、１つまたは複数のジュウテリウム原子を含む。
【０３２１】
本明細書中で使用する場合、「阻害剤」という用語は、測定可能な親和性で標的ＲＮＡに結合しかつ／または標的ＲＮＡをモジュレートしもしくは阻害する化合物と定義される。ある特定の実施形態では、阻害剤は、約１００μＭ未満、約５０μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満のＩＣ５０および／または結合定数を有する。
【０３２２】
本明細書中で使用する場合、「測定可能な親和性」および「測定可能に阻害する」という用語は、本発明の化合物もしくはその組成物、および標的ＲＮＡを含む試料と、前記化合物もしくはその組成物なしで該標的ＲＮＡを含む同等の試料との間での下流の生物学的影響における測定可能な変化を意味する。
【０３２３】
本明細書中で使用する場合、「ＲＮＡ」（リボ核酸）という用語は、供給源（例えば、ＲＮＡは、ヒト、動物、植物、ウイルス、または細菌によって産生され得るか、あるいは合成起源であり得る）、生物学的背景（例えば、ＲＮＡは、核内、血液循環中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、または細胞溶解物中にあり得るか、あるいは単離されているまたは純粋形態であり得る）、または物理形態（例えば、ＲＮＡは、一本鎖、二本鎖、または三本鎖形態（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを包含する）であり得るか、エピジェネティックな修飾、天然の転写後修飾、人工修飾（例えば、化学的なまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの修飾によって得られるもの）、またはその他の修飾を含んでいてもよいか、例えば、金属イオン、小分子、シャペロンなどのタンパク質、または補因子に結合していてもよいか、あるいは、例えば、四重鎖、ヘアピン、三重鎖、三方向ジャンクション（３ＷＪ）、四方向ジャンクション（４ＷＪ）、パラレルＹジャンクション、ヘアピン、バルジループ、シュードノット、および内部ループなど、ならびにＲＮＡがとる任意の一時的な形態または構造などの、任意の天然または非天然の二次構造または三次構造を含めて、変性、部分変性、またはフォールディングの状態にあってもよい）とは独立して、天然に存在するまたは合成のオリゴリボヌクレオチドを意味する。一部の実施形態では、ＲＮＡは、２０個、２２個、５０個、７５個、もしくは１００個またはそれより多くのヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ＲＮＡは２５０個またはそれより多くのヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、３５０個、４５０個、５００個、６００個、７５０個、もしくは１，０００個、２，０００個、３，０００個、４，０００個、５，０００個、７５００個、１０，０００個、１５，０００個、２５，０００個、５０，０００個、またはこれらより多いヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ＲＮＡは２５０個と１，０００個との間のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｐｒｅ−ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、またはプレ転写物である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、リボスイッチ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｅＲＮＡ、偽遺伝子、ウイルスＲＮＡ、真菌ＲＮＡ、寄生虫ＲＮＡ、または細菌ＲＮＡである。本明細書中で使用する場合、「標的核酸」または「標的ＲＮＡ」という用語は、本明細書中に記載の小分子化合物に結合できる二次構造または三次構造を有する任意の種類の核酸またはＲＮＡをそれぞれ意味する。一部の実施形態では、構造は、開示した化合物が結合するまたは該化合物によって安定化される３ＷＪであるか、または、標的核酸（例えば、ＲＮＡ）上の別の部位における化合物の結合によって安定化される３ＷＪである。全ての３ＷＪ構造が、それらのコンフォメーションまたは付随する三次的相互作用に言及することなく、本明細書に包含される。例えば、３ＷＪは、シス３ＷＪ、トランス３ＷＪ、パラレルＹジャンクション、または別の形態の３ＷＪであり��る。標的ＲＮＡは、細胞内、細胞溶解物中、または該化合物との接触前には単離された形態にあり得る。
【０３２４】
本明細書で使用する場合、「エフェクター」または「エフェクター核酸」という用語は、標的核酸に結合してその活性を調節またはモジュレートする核酸を意味する。例示的なエフェクターとしては、トランスで作用して３ＷＪの形成を誘発する短鎖ＲＮＡが挙げられる。一部の実施形態では、エフェクターは、ｍｉＲＮＡ、Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、および低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）などの様々な天然形態の短鎖ＲＮＡから選択される。これらの短鎖ＲＮＡは、３ＷＪの形成をもたらす様式でｍＲＮＡなどの標的と塩基対を形成することができる。エフェクターと標的との間の塩基対形成は多くの場合に不完全であり、すなわち、２つの配列は部分的な完全ではない相補性を有する。完璧な相補性は、３ＷＪを欠いた完全に二本鎖の構造の形成をもたらすことになる。３ＷＪを形成するために、エフェクター（例えば、ｍｉＲＮＡ）および標的（例えば、ｍＲＮＡ）は、一般的に、少なくとも４ヌクレオチド（ｎｔ）の塩基対形成とそれに続く少なくとも４ｎｔの塩基対形成したステムおよび対形成していないｎｔのループのストレッチと、それに続いてエフェクターと標的配列との間で塩基対形成した第２のストレッチとを形成する。ステムループは、エフェクター中または標的ＲＮＡ中のいずれかに形成されることができる。
【０３２５】
本明細書で使用する場合、「シス３ＷＪ」または「シス三方向ジャンクション」という用語は、ｍＲＮＡ、その前駆体、またはタンパク質結合複合体の一本鎖などの、単一の核酸の部分の間に形成された３ＷＪを指す。
【０３２６】
本明細書で使用する場合、「トランス３ＷＪ」または「トランス三方向ジャンクション」という用語は、部分的な配列相補性を共有するｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ複合体などの、２つまたはそれより多くの核酸の間に形成された３ＷＪを指す。
【０３２７】
４．本発明の化合物を提供する一般的方法
本発明の化合物は、一般に、類似化合物について当業者に公知の合成および／または半合成の方法によって、ならびに本明細書中の実施例および図面に詳細に記載する方法によって、調製または単離され得る。例えば、様々な本発明の化合物は、その全体がこれにより参考として援用される米国仮特許出願ＵＳＳＮ  ６２／２８９，６７１の図５〜３１または図７７〜９４または図９６を参照して合成され得る。
【０３２８】
特定の保護基（「ＰＧ」）、脱離基（「ＬＧ」）、または変換条件を示す詳細な説明、実施例、および図面に示すスキームおよび化学反応において、その他の保護基、脱離基、および変換条件も好適であり、企図されることを当業者は理解するであろう。そのような基および変換は、March's  Advanced  Organic  Chemistry:  Reactions,  Mechanisms,  and  Structure、M.  B.  SmithおよびJ.  March、第５版、John  Wiley  &  Sons、２００１年；「Comprehensive  Organic  Transformations」、R.  C.  Larock、第２版、John  Wiley  &  Sons、１９９９年；ならびにProtecting  Groups  in  Organic  Synthesis、T.  W.  GreeneおよびP.  G.  M.  Wuts、第３版、John  Wiley  &  Sons、１９９９年において詳細に説明されており、これらのそれぞれの全体は、本明細書で参照により本明細書に組み込まれる。
【０３２９】
本明細書中で使用する場合、「脱離基」（ＬＧ）という表現は、ハロゲン（例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、スルホネート（例えば、メシレート、トシレート、ベンゼンスルホネート、ブロシレート、ノシレート、トリフレート）、ジアゾニウムなどを包含するが、これらに限定されない。
【０３３０】
本明細書中で使用する場合、「酸素保護基」という表現は、例えば、カルボニル保護基、ヒドロキシル保護基などを包含する。ヒドロキシル保護基は当該技術分野において周知であり、Protecting  Groups  in  Organic  Synthesis、T.  W.  GreeneおよびP.  G.  M.  Wuts、第３版、John  Wiley  &  Sons、１９９９年において詳細に説明されるものが挙げられ、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。好適なヒドロキシル保護基としては、例えば、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテル、およびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなエステルとしては、例えば、ホルメート、アセテート、カルボネート、およびスルホネートが挙げられる。具体例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベンジルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カルボネート（例えば、メチル、９−フルオレニルメチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（フェニルスルホニル）エチル、ビニル、アリル、およびｐ−ニトロベンジルなど）が挙げられる。そのようなシリルエーテルとしては、例えば、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリイソプロピルシリル、およびその他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、トリチル、ｔ−ブチル、アリル、およびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、例えば、メトキシメチル、メチルチオメチル、（２−メトキシエトキシ）メチル、ベンジルオキシメチル、ベータ−（トリメチルシリル）エトキシメチル、およびテトラヒドロピラニルエーテルなどのアセタールが挙げられる。アリールアルキルエーテルとしては、例えば、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジル、Ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ならびに２−および４−ピコリルが挙げられる。
【０３３１】
アミノ保護基は当該技術分野において周知であり、Protecting  Groups  in  Organic  Synthesis、T.  W.  GreeneおよびP.  G.  M.  Wuts、第３版、John  Wiley  &  Sons、１９９９年において詳細に説明されるものが挙げられ、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。好適なアミノ保護基としては、アラルキルアミン、カルバメート、環状イミド、アリルアミン、アミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。そのような基としては、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、エチルオキシカルボニル、メチルオキシカルボニル、トリクロロエチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジルオキソカルボニル（ＣＢＺ）、アリル、フタルイミド、ベンジル（Ｂｎ）、フルオレニルメチルカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、フェニルアセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイルなどが挙げられる。
【０３３２】
当業者は、例えば、脂肪族基、アルコール、カルボン酸、エステル、アミド、アルデヒド、ハロゲン、およびニトリルなどの本発明の化合物中に存在する様々な官能基は当該技術分野において周知の技術（還元、酸化、エステル化、加水分解、部分酸化、部分還元、ハロゲン化、脱水、部分水和、および水和が挙げられるが、これらに限定されない）によって相互変換できることを理解するであろう。「March's  Advanced  Organic  Chemistry」、第５版、Smith,  M.  B.およびMarch,  J.編、John  Wiley  &  Sons、New  York：２００１年（その全体は参照により本明細書に組み込まれる）。そのような相互変換は、上述の技術のうちの１つまたは複数を必要とし得、本発明の化合物を合成するためのある特定の方法を実施例および図面において以下に記載する。
【０３３３】
５．使用、製剤化、および投与
薬学的に許容される組成物
別の実施形態によれば、本発明は、本発明の化合物または薬学的に許容されるその誘導体および薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルを含む組成物を提供する。本発明の組成物中の化合物の量は、生体試料中または患者中の標的ＲＮＡまたはその変異体を測定可能に阻害またはモジュレートするのに効果的である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物中の化合物の量は、生体試料中または患者中の標的ＲＮＡを測定可能に阻害またはモジュレートするのに効果的である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、そのような組成物を必要とする患者に投与するために製剤化されている。一部の実施形態では、本発明の組成物は、患者に経口投与するために製剤化されている。
【０３３４】
本明細書中で使用する場合、「患者」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
【０３３５】
「薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクル」という用語は、共に製剤化した化合物の薬理活性を壊さない非毒性の担体、アジュバント、またはビヒクルを指す。本発明の組成物において使用され得る薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルとしては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（例えば、ホスフェートなど）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など）、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３６】
「薬学的に許容される誘導体」は、本発明の化合物の非毒性の塩、エステル、エステルの塩、またはその他の誘導体のいずれかであって、レシピエントに投与されると、直接的または間接的に、本発明の化合物またはその阻害活性代謝産物もしくは残留物を与えることができるものを意味する。
【０３３７】
本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入噴霧によって、局所的に、直腸内に、経鼻的に、口腔内に、経膣的に、または埋め込み式リザーバーを介して、投与され得る。本明細書中で使用する場合、「非経口」という用語には、皮下の、静脈内の、筋肉内の、関節内の、滑膜内の、胸骨内の、髄腔内の、肝内の、病巣内の、および頭蓋内の注射または注入技術が包含される。好ましくは、組成物は、経口的に、腹腔内に、または静脈内に投与される。本発明の組成物の滅菌注射形態は、水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当該技術分野で公知の技術にしたがって製剤化され得る。滅菌注射調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液など）であり得る。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒として従来通りに用いられる。
【０３３８】
この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含めて任意のブランド固定油を用い得る。例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、天然の薬学的に許容される油（例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特にこれらのポリオキシエチレン化されたバージョンなど）と同様に、注射物質の調製において有用である。これらの油性溶液または油性懸濁物はまた、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、または薬学的に許容される製剤剤形（エマルションおよび懸濁液が挙げられる）の製剤化においてよく使用される類似の分散剤など）を含有し得る。その他のよく使用される界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、および薬学的に許容される固体、液体、またはその他の剤形の製造においてよく使用されるその他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ増強剤など）もまた、製剤化の目的のために使用され得る。
【０３３９】
本発明の薬学的に許容される組成物は、任意の経口的に許容される剤形（カプセル剤、錠剤、水性懸濁液、または液剤が挙げられるが、これらに限定されない）として経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、よく使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。例えばステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も通常加えられる。カプセル剤形態での経口投与のために有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用のために水性懸濁液が必要な場合、活性成分は乳化剤および懸濁化剤と組み合わせられる。所望の場合、ある特定の甘味剤、香味剤、または着色剤を加えてもよい。
【０３４０】
代替的には、本発明の薬学的に許容される組成物は、直腸投与用の坐薬の形態で投与され得る。これらは、室温で固体であるが直腸の温度で液体であるため直腸内で溶けて薬物を放出する好適な非刺激性の賦形剤と該剤を混合することによって調製することができる。そのような物質としては、ココアバター、ビーズワックス、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０３４１】
本発明の薬学的に許容される組成物はまた、局所投与され得る。これは、眼、皮膚、または下部腸管の疾患を含めて局所適用によって容易に接近可能な領域または臓器を治療標的が含む場合に特に当てはまる。これらの領域または臓器のそれぞれのために好適な局所製剤は容易に調製される。
【０３４２】
下部腸管用の局所適用は、直腸坐薬製剤（上記を参照）または好適な浣腸製剤において行うことができる。局所経皮パッチを使用してもよい。
【０３４３】
局所適用のために、提供される薬学的に許容される組成物は、１つまたは複数の担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適な軟膏剤として製剤化され得る。本発明の化合物の局所投与用の担体としては、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、提供される薬学的に許容される組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適なローション剤またはクリーム剤として製剤化することができる。好適な担体としては、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４４】
眼用途のために、提供される薬学的に許容される組成物は、等張の、ｐＨ調整した滅菌食塩水中の微細化懸濁液として、または好ましくは、塩化ベンジルアルコニウムなどの防腐剤を含むもしくは含まない等張の、ｐＨ調整した滅菌食塩水中の液剤として、製剤化され得る。代替的には、眼用途のために、薬学的に許容される組成物は、ワセリンなどの軟膏剤中に製剤化され得る。
【０３４５】
本発明の薬学的に許容される組成物はまた、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与され得る。そのような組成物は、医薬製剤化の技術分野において周知の技術にしたがって調製され、ベンジルアルコールまたはその他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティを増進するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／またはその他の従来用いられる可溶化剤または分散剤を用いて、食塩水中の液剤として調製され得る。
【０３４６】
最も好ましくは、本発明の薬学的に許容される組成物は、経口投与のために製剤化される。そのような製剤は、食品と共にまたは食品を伴わずに投与され得る。一部の実施形態では、本発明の薬学的に許容される組成物は、食品を伴わずに投与される。他の実施形態では、本発明の薬学的に許容される組成物は、食品と共に投与される。
【０３４７】
単一剤形中の組成物を産生するために担体物質と組み合わせられ得る本発明の化合物の量は、治療される宿主、具体的な投与方式に応じて様々である。好ましくは、提供される組成物は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与量の阻害剤をこれらの組成物を与えられる患者に投与できるように製剤化されるべきである。
【０３４８】
任意の特定の患者のための具体的な投与量および治療レジメンは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組合せ、治療医の判断、および処置される具体的な疾患の重篤度を含めて様々な要因に依存することが理解されるべきである。組成物中の本発明の化合物の量は、組成物中の具体的な化合物にも依存する。
【０３４９】
化合物および薬学的に許容される組成物の使用
本明細書中に記載の化合物および組成物は、一般に、標的ＲＮＡをモジュレートしてＲＮＡ媒介性の疾患または状態を再処置するために有用である。
【０３５０】
標的ＲＮＡをモジュレートするために本発明において利用される化合物の活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、または細胞株においてアッセイされ得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイとしては、標的ＲＮＡのモジュレーションを決定するアッセイが挙げられる。代替的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、標的ＲＮＡに結合する化合物の能力を定量化する。標的ＲＮＡをモジュレートするために本発明において利用される化合物をアッセイするための詳細な条件は、下記の実施例中に記載されている。
【０３５１】
本明細書中で使用する場合、「治療」、「治療する（treat）」、および「治療する（treating）」という用語は、本明細書中に記載するような疾患もしくは障害またはその１つまたは複数の症状を反転させ、軽減し、その発症を遅延させ、またはその進行を阻害することを指す。一部の実施形態では、治療は、１つまたは複数の症状が発症した後に施され得る。他の実施形態では、治療は、症状の非存在下で施され得る。例えば、治療は、（例えば、症状の履歴、および／または遺伝因子もしくはその他の感受性因子を考慮して）症状の発症前に感受性個体に施され得る。治療はまた、例えば再発を防止しまたは遅延させるために、症状の解消後にも継続され得る。
【０３５２】
提供される化合物は標的ＲＮＡのモジュレーターであり、したがって標的ＲＮＡ（例えばその下流）に関連するまたはそれが影響する１つまたは複数の障害を治療するために有用である。よって、ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の化合物または薬学的に許容されるその組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、ＲＮＡ媒介性の障害を治療するための方法を提供する。
【０３５３】
本明細書中で使用する場合、本明細書中で使用する「ＲＮＡ媒介性の」障害、疾患、および／または状態という用語は、例えば過剰発現の、過少発現の、変異体の、ミスフォールディングした、病原性の、または発がん性（ongogenic）のＲＮＡなどのＲＮＡが役割を果たすことが公知である任意の疾患またはその他の有害な状態を意味する。したがって、本発明の別の実施形態は、例えば過剰発現の、過少発現の、変異体の、ミスフォールディングした、病原性の、または発がん性のＲＮＡなどのＲＮＡが役割を果たすことが公知である１つまたは複数の疾患を治療し、またはその重篤度を小さくすることに関する。
【０３５４】
一部の実施形態では、本発明は、細胞増殖性障害が挙がられるがこれに限定されない１つまたは複数の障害、疾患、および／または状態を治療するための方法を提供する。
【０３５５】
細胞増殖性障害
本発明は、標的ＲＮＡをモジュレートすることによる、細胞増殖性障害（例えば、がん）の診断および予後診断用、ならびにこれらの障害の治療用の方法および組成物を特徴とする。本明細書中に記載の細胞増殖性障害としては、例えば、がん、肥満症、および増殖依存性の疾患が挙げられる。そのような障害は、当該技術分野で公知の方法を使用して診断され得る。
【０３５６】
がん
一実施形態では、限定するものではないが、がんとしては、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病または非ホジキン病）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、重鎖病、および固形腫瘍が挙げられ、固形腫瘍としては、例えば肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫）などである。一部の実施形態では、がんは黒色腫または乳がんである。
【０３５７】
別の実施形態では、限定するものではないが、がんとしては、中皮腫、肝胆道（hepatobilliary）（肝臓および胆管（billiary  duct））、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼内の黒色腫、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、胃腸のがん（胃がん、結腸直腸がん、および十二指腸がん）、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、精巣がん、慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓のまたは尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、非ホジキン（non  hodgkins's）リンパ腫、脊髄軸の腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質がん、胆嚢がん、多発性骨髄腫、胆管癌、線維肉腫、神経芽腫、網膜芽腫、または以上のがんの１つまたは複数の組合せが挙げられる。
【０３５８】
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者に本明細書中に記載の化合物、塩、または医薬組成物のいずれかを投与することを含む、該患者において腫瘍を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、腫瘍は、本明細書中に記載のがんのいずれかを含む。一部の実施形態では、腫瘍は黒色腫がんを含む。一部の実施形態では、腫瘍は乳がんを含む。一部の実施形態では、腫瘍は肺がんを含む。一部の実施形態では、腫瘍は小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を含む。一部の実施形態では、腫瘍は非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む。
【０３５９】
一部の実施形態では、腫瘍は、腫瘍のさらなる成長を阻むことによって治療される。一部の実施形態では、腫瘍は、腫瘍の大きさ（例えば、体積または質量）を治療前の腫瘍の大きさと比べて少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、または９９％減少させることによって治療される。一部の実施形態では、腫瘍は、患者における腫瘍の量を治療前の腫瘍の量と比べて少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、または９９％減少させることによって治療される。
【０３６０】
その他の増殖性疾患
その他の増殖性疾患としては、例えば、肥満症、良性前立腺過形成、乾癬、異常角質化、リンパ増殖性障害（例えば、リンパ系の細胞が異常増殖する障害）、慢性関節リウマチ、動脈硬化症、再狭窄、および糖尿病性網膜症が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれる増殖性疾患としては、米国特許第５，６３９，６００号および同７，０８７，６４８号に記載されたものが挙げられる。
【０３６１】
炎症性障害および疾患
本発明の化合物は、皮膚の炎症性またはアレルギー性の状態の治療においても有用であり、該状態としては、例えば、乾癬、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、円形脱毛症、多形紅斑（erythema  multiforma）、疱疹状皮膚炎、強皮症、白斑、過敏性血管炎、蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、紅斑性狼瘡、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、後天性表皮水疱症、尋常性ざ瘡、および皮膚のその他の炎症性またはアレルギー性の状態である。
【０３６２】
本発明の化合物は、炎症性要素を有する疾患または状態などのその他の疾患または状態の治療のためにも使用され得、これは例えば、眼の疾患および状態（例えば、眼のアレルギー、結膜炎、乾性角結膜炎、および春季結膜炎など）、鼻に影響する疾患（アレルギー性鼻炎が挙げられる）、および自己免疫反応が関与するまたは自己免疫の要素もしくは病因を有する炎症性疾患（自己免疫性血液障害（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球癆、および特発性血小板減少症）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発軟骨炎、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症（Wegener  granulamatosis）、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スティーヴンス・ジョンソン症候群、突発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病）、過敏性腸症候群、セリアック病、歯周炎、肺硝子膜症、腎臓病、糸球体疾患、アルコール性肝臓病、多発性硬化症、内分泌性眼症（endocrine  opthalmopathy）、グレーブス病、サルコイドーシス、肺胞炎、慢性過敏性肺炎、多発性硬化症、原発性胆汁性胆管炎、ぶどう膜炎（前部および後部）、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎および春季角結膜炎、間質性肺線維症、乾癬性関節炎、全身型若年性特発性関節炎、クリオピリン関連周期性症候群、腎炎、血管炎、憩室炎、間質性膀胱炎、糸球体腎炎（ネフローゼ症候群を伴うものおよび伴わないもの、例えば、突発性ネフローゼ症候群または微小変化型腎症（minal  change  nephropathy）が挙げられる）、慢性肉芽腫性疾患、子宮内膜症、レプトスピラ腎疾患（leptospiriosis  renal  disease）、緑内障、網膜疾患、加齢、頭痛、痛み、複合性局所疼痛症候群、心臓肥大、筋肉消耗、異化障害、肥満症、胎児発育遅延、高コレステロール血症、心臓病、慢性心不全、中皮腫、無汗型外胚葉異形成症（anhidrotic  ecodermal  dysplasia）、ベーチェット病、色素失調症、パジェット病、膵炎、遺伝性周期熱症候群、喘息（アレルギー性および非アレルギー性、軽度、中等度、重篤、気管支炎（bronchitic）、および運動誘発性）、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、好酸球増加症、過敏症、アナフィラキシー、副鼻腔炎、眼のアレルギー、シリカ誘発性疾患、ＣＯＰＤ（損傷の減少、気道炎症、気管支過敏症、再構築、または疾患進行）、肺疾患、嚢胞性繊維症、酸誘発性肺傷害、肺高血圧症、多発性神経障害、白内障、全身性硬化症を伴う筋肉の炎症、封入体筋炎、重症筋無力症、甲状腺炎、アジソン病、扁平苔癬、１型糖尿病または２型糖尿病、虫垂炎、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、滑液包炎、子宮頚管炎、胆管炎、胆嚢炎、慢性移植片拒絶、大腸炎、結膜炎、クローン病、膀胱炎、涙腺炎、皮膚炎、皮膚筋炎、脳炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、肝炎、化膿性汗腺炎、免疫グロブリンＡ腎症、間質性肺疾患、喉頭炎、乳腺炎、髄膜炎、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、卵巣炎、睾丸炎、骨炎、中耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺臓炎、肺炎、多発性筋炎、直腸炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、腱炎、扁桃炎、潰瘍性大腸炎、ぶど��膜炎、膣炎、血管炎、または外陰炎が挙げられる）の治療である。
【０３６３】
一部の実施形態では、本発明の方法にしたがって治療され得る炎症性疾患は皮膚疾患である。一部の実施形態では、炎症性皮膚疾患は、接触性皮膚炎（contact  dermatitits）、アトピー性（atompic）皮膚炎、円形脱毛症、多形紅斑、疱疹状皮膚炎、強皮症、白斑、過敏性血管炎、蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、後天性表皮水疱症、および皮膚のその他の炎症性またはアレルギー性の状態から選択される。
【０３６４】
一部の実施形態では、本発明の方法にしたがって治療され得る炎症性疾患は、急性および慢性痛風、慢性痛風性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎（ＳＪＩＡ）、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、および変形性関節症から選択される。
【０３６５】
一部の実施形態では、本発明の方法にしたがって治療され得る炎症性疾患は、ＴＨ１７媒介性の疾患である。一部の実施形態では、ＴＨ１７媒介性の疾患は、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、および炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎が挙げられる）から選択される。
【０３６６】
一部の実施形態では、本発明の方法にしたがって治療され得る炎症性疾患は、シェーグレン症候群、アレルギー性疾患、変形性関節症、眼の状態（例えば、眼のアレルギー、結膜炎、乾性角結膜炎および春季結膜炎など）、および鼻に影響する疾患（例えば、アレルギー性鼻炎など）から選択される。
【０３６７】
代謝性疾患
一部の実施形態では、本発明は、代謝性疾患を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、代謝性疾患は、１型糖尿病、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、または肥満症から選択される。
【０３６８】
本発明の方法によれば、該化合物および組成物は、がん、自己免疫疾患、増殖性障害、炎症性障害、神経変性または神経学的障害、統合失調症、骨関連の障害、肝臓病、または心臓障害を治療するまたはその重篤度を小さくするのに効果的な任意の量および任意の投与経路を使用して投与され得る。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身の状態、感染の重篤度、具体的な剤、その投与方式などに応じて、対象ごとに様々である。本発明の化合物は、好ましくは、投与を容易にしかつ投薬量を均一にするために単位剤形に製剤化される。本明細書中で使用する場合、「単位剤形」という表現は、治療がなされる患者に適した剤の物理的に切り離された単位を指す。しかしながら、本発明の化合物および組成物の１日あたりの総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。任意の特定の患者または生物に特異的な有効用量レベルは様々な要因に依存し、該要因としては、治療されている障害および障害の重篤度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全身の健康、性別、および食事；用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路、および排出速度；治療の継続期間；用いられる特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、および医療分野で周知の同様の要因が挙げられる。本明細書中で使用する場合、「患者」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
【０３６９】
本発明の薬学的に許容される組成物は、治療がなされる感染の重症度に応じて、経口的に、直腸内に、非経口的に、嚢内に、膣内に、腹腔内に、局所的に（散剤、軟膏剤、またはドロップ剤による）、口腔内に、経口または経鼻噴霧剤などとして、ヒトおよびその他の動物に投与することができる。ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、所望の治療効果を得るために、１日に１回または複数回、１日あたり、対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの投与量レベルで経口的または非経口的に投与され得る。
【０３７０】
経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルション剤、液剤、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられるが、これらに限定されない。液体剤形は、活性化合物に加えて、当該技術分野において通常使用される不活性希釈剤（例えば、水またはその他の溶媒）、可溶化剤および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物など）を含有し得る。経口組成物は、不活性希釈剤の他に、アジュバント（例えば、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤など）、甘味剤、香味剤、および芳香剤も含み得る。
【０３７１】
注射調製物、例えば滅菌注射用の水性または油性懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤を使用して公知の技術にしたがって製剤化され得る。滅菌注射調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液、懸濁液、または乳濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒として従来通りに用いられる。この目的のために、任意のブランド固定油（合成モノまたはジグリセリドが挙げられる）を用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が注射物質の調製において使用される。
【０３７２】
注射製剤は、使用前に、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、あるいは滅菌水その他の滅菌注射媒体に溶解または分散させることができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌することができる。
【０３７３】
本発明の化合物の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの化合物の吸収を遅くすることがしばしば望ましい。これは、水溶性に乏しい結晶質または非晶質材料の液体懸濁液を使用することによって達成され得る。化合物の吸収速度はその溶解速度に依存し、そして溶解速度は結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。代替的には、非経口的に投与される化合物形態の遅延吸収は、油性ビヒクルへの化合物の溶解または懸濁によって達成される。注射デポ形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に化合物のマイクロカプセル封入マトリックスを形成することによって作製される。化合物のポリマーに対する比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、化合物の放出速度を制御できる。その他の生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポ注射製剤はまた、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルション内に化合物を捕捉することによっても調製される。
【０３７４】
直腸または膣投与用の組成物は好ましくは坐薬であり、坐薬は、好適な非刺激性の賦形剤または担体（例えば、周囲温度で固体であるが体温で液体であるため、直腸または膣腔内で溶けて活性化合物を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックスなど）と本発明の化合物を混合することによって調製できる。
【０３７５】
経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が挙げられる。そのような固体剤形では、活性化合物は、少なくとも１つの不活性の、薬学的に許容される賦形剤または担体（例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなど）、および／または、ａ）充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸など）、ｂ）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidinone）、スクロース、およびアカシアなど）、ｃ）保湿剤（例えば、グリセロールなど）、ｄ）崩壊剤（例えば、寒天−−寒天（agar--agar）、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケート、および炭酸ナトリウムなど）、ｅ）溶解遅延剤（例えば、パラフィンなど）、ｆ）吸収促進剤（例えば、第４級アンモニウム化合物など）、ｇ）湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど）、ｈ）吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイなど）、およびｉ）滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物など）と混合されている。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形は緩衝剤も含み得る。
【０３７６】
同様の種類の固体組成物は、ラクトースや乳糖などの賦形剤ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル内の充填剤としても用いられ得る。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶性コーティングおよび医薬品製剤化の技術分野で周知のその他のコーティングなどの、コーティングおよびシェルを用いて調製することができる。これらは、必要に応じて乳白剤を含有してもよく、また、腸管のある特定の部分のみにおいてまたは該部分において優先的に、必要に応じて、遅延的様式で活性成分（複数化）を放出する組成物であり得る。使用できる埋め込み組成物としては、例えば、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、ラクトースや乳糖などの賦形剤ならびに高分子量ポリエチレングリコール（polethylene  glycols）などを使用する、軟質および硬質充填ゼラチンカプセルの充填剤としても用いられ得る。
【０３７７】
活性化合物はまた、上述の１つまたは複数の賦形剤を有するマイクロカプセル形態であり得る。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶性コーティング、放出制御コーティング、および医薬品製剤化の分野で周知のその他のコーティングなどの、コーティングおよびシェルを用いて調製することができる。そのような固体剤形では、活性化合物は、スクロース、ラクトース、またはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合されていてもよい。そのような剤形はまた、通常の実施と同様に、不活性希釈剤以外の追加的な物質、例えば、錠剤成形滑沢剤およびその他の錠剤成形助剤（ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなど）も含み得る。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形は緩衝剤も含み得る。これらは、必要に応じて乳白剤を含有してもよく、また、腸管のある特定の部分のみにおいてまたは該部分において優先的に、必要に応じて、遅延的様式で活性成分（複数化）を放出する組成物であり得る。使用できる埋め込み組成物としては、例えば、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
【０３７８】
本発明の化合物の局所または経皮投与用剤形としては、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、噴霧剤、吸入剤、またはパッチ剤が挙げられる。活性成分は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体および任意の必要とされる防腐剤または緩衝液と、必要に応じて混合される。眼科用製剤、点耳薬、および点眼薬もまた本発明の範囲内にあると企図される。さらに、本発明は、経皮パッチの使用を企図し、これは身体への化合物の制御された送達を提供するという追加の利点を有する。そのような剤形は、適切な媒体中に化合物を溶解しまたは分散させることによって作製することができる。皮膚を通過する化合物の流れを増大させるために、吸収促進剤も使用することができる。速度は、速度制御膜を設けることによって、またはポリマーマトリックスまたはゲル中に化合物を分散させることによって、制御することができる。
【０３７９】
一実施形態によれば、本発明は、生体試料中の標的ＲＮＡの活性をモジュレートする方法であって、前記生体試料を本発明の化合物、または前記化合物を含む組成物と接触させるステップを含む、方法に関する。
【０３８０】
別の実施形態によれば、本発明は、生体試料中の標的ＲＮＡの活性をモジュレートする方法であって、前記生体試料を本発明の化合物、または前記化合物を含む組成物と接触させるステップを含む、方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、生体試料中の標的ＲＮＡの活性を非可逆的に阻害する方法であって、前記生体試料を本発明の化合物、または前記化合物を含む組成物と接触させるステップを含む、方法に関する。
【０３８１】
本明細書中で使用する場合、「生体試料」という用語は、限定するものではないが、細胞培養物またはその抽出物、哺乳動物から得られた生検材料またはその抽出物、および血液、唾液、尿、糞便、精液、涙液、もしくはその他の体液、またはその抽出物を包含する。
【０３８２】
本発明の別の実施形態は、患者における標的ＲＮＡの活性をモジュレートする方法であって、本発明の化合物、または前記化合物を含む組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法に関する。
【０３８３】
別の実施形態によれば、本発明は、患者における標的ＲＮＡの活性を阻害する方法であって、本発明の化合物、または前記化合物を含む組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法に関する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、患者における標的ＲＮＡの活性を非可逆的に阻害する方法であって、本発明の化合物、または前記化合物を含む組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法に関する。他の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者において標的ＲＮＡによって媒介される障害を治療するための方法であって、本発明による化合物または薬学的に許容されるその組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法を提供する。そのような障害は本明細書中に詳細に説明されている。
【実施例】
【０３８４】
例証
以下の実施例に示すように、ある特定の例示的な実施形態では、化合物は以下の一般的手順にしたがって調製され、本明細書中に一般的に記載される生物学的アッセイおよびその他の手順において使用される。一般的方法はある特定の本発明の化合物の合成を示しているが、以下の一般的方法および当業者に公知のその他の方法は、本明細書中に記載するような全ての化合物ならびにこれらの化合物のそれぞれのサブクラスおよび種に適用できることが理解されるであろう。同様に、アッセイおよびその他の分析は当業者の知識にしたがって適応させることができる。
【０３８５】
（実施例１：ＲＮＡ結合性小分子）
ＲＮＡに結合する小分子リガンドを同定する歴史的な努力は、塩基対形成、または二本鎖ＲＮＡにおける標準的な構造モチーフ（すなわち、塩基間のインターカレーションおよび／または溝結合）に集中してきた。しかし、これらのモチーフは特定のＲＮＡへの小分子の選択的結合を支持しない。しかしながら、ＲＮＡは極めて多様な複雑な三次構造にフォールディングし、その三次構造が小分子（ポケットが与える形状および静電力に相補的な小分子）の結合に資するポケットを与える。形状および静電力の詳細がＲＮＡの基礎的配列を反映する限りにおいて、小分子はタンパク質ポケットに結合する時と同じだけの選択性を達成できる。
【０３８６】
実際、多くがＦＤＡ承認済である、ＲＮＡに結合する薬物様小分子が現在ではいくつか
報告されている（下記表４を参照）。
【０３８７】
クラスによる小分子リガンド
フォールディングしたＲＮＡへの結合が広範な小分子化学種について実証されているが（GuanおよびDisney、ACS  Chem.  Biol.  ２０１２年  ７巻、７３〜８６頁；参照により本明細書に組み込まれる）、ＲＮＡ結合性リガンドを同定するための大きなライブラリー（＞１０５の化合物）のハイスループットスクリーニングの報告は限られている。したがって、ＲＮＡ結合性のために合成により最適化された小分子の報告もほとんどない。本発明は、これらの欠陥に対する救済の道を開く。下記は広範な化学種を要約する表であり、これらの化学種は実証可能なＲＮＡ結合性を有し、我々のスクリーニング方法を最適化しかつ立証する出発点としてはたらくであろう。そして、このスクリーニング方法により、治療的目的のＲＮＡ構造に対する本質的に全ての公知の化学種の体系的なスクリーニングが可能となるであろう。
【表４】
2019523242.tif 000051
【０３８８】
これらの発見は、予期されていなかった作用の分子メカニズムを明らかにした。技術的課題の大きさから、フォールディングしたＲＮＡに結合する小分子の意図的設計はほとんど追及されておらず、１つの注目すべき例はＲＮＡ三方向ジャンクションに選択的に結合できるトリプチセンベースのリガンドの設計である（Barrosら、Angew.  Chem.  Int.  Ed.  ２０１４年、５３巻、１３７４６〜１３７５０頁。そのため、トリプチセンベースのリガンドは、記載するスクリーニング方法における別の出発点としてはたらくための、ＲＮＡ結合能力を有する別の化学種を提供する。
【０３８９】
図は、多くの例示的な足場および特定の標的化合物の属を提供し、これらは、当該技術分野で公知の方法を使用して組み合わせ、または変化させることができる。
【０３９０】
図８（右上の構造）に示すように、三成分の足場は、３ＷＪに結合するための有望なプラットフォームを表すが、３ＷＪはそれ自体で通常対称的でないので、それらは対称的である必要はない。図示した例では、三角形、四角形、および五角形は、シクロプロピル、シクロブチル、またはシクロペンチルを表し、本明細書中に開示した様々な核酸結合基により置換することができる。
【０３９１】
（実施例２）
弾頭タイプ１Ａの合成
【化４４】
2019523242.tif 000052
【０３９２】
２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボン酸、弾頭タイプ１Ａ。
１，４−ジオキサン（１６０ｍＬ）中の２−アミノテレフタル酸（２．０ｇ、１１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリホスゲン（３．２８ｇ、１１．０５ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応混合物をＤＭ水（４００ｍＬ）に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、弾頭＿タイプ＿１Ａ（２．２ｇ、９６．２％）をオフホワイトの固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  13.67  ppm  (1H,  broad),  11.89  ppm  (1H,  broad),  8.03-8.01  ppm  (1H,  d),  7.73-7.68  ppm  (2H,  m).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ９Ｈ５ＮＯ５［ＭＨ］−の計算値  ２０６．０２、実測値  ２０６．１７。
【０３９３】
（実施例３）
弾頭タイプ１Ｂの合成
【化４５】
2019523242.tif 000053
１，４−ジメチル２−（メチルアミノ）ベンゼン−１，４−ジカルボキシレート（１）。
【０３９４】
アセトン（１５０ｍＬ）中のジメチル２−アミノベンゼン−１，４−ジカルボキシレート（１０．０ｇ、０．０５ｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（１９．８ｇ、０．１４３ｍｏｌ）および硫酸ジメチル（１８．１ｇ、０．１４３ｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を６０℃で２４時間撹拌した。反応混合物をゆっくりと室温に冷却し、水（２００ｍＬ）で希釈した。次いで、得られた混合物を酢酸エチル（４×７５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１を褐色固体として得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（７％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、１（４．５ｇ、４２％）を淡黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１１Ｈ１３ＮＯ４［ＭＨ］＋の計算値  ２２４．０８、実測値  ２２４．２。
【０３９５】
２−（メチルアミノ）ベンゼン−１，４−ジカルボン酸（２）。
【０３９６】
ＴＨＦ（１００ｍＬ）および水（５０ｍＬ）中のジメチル２−（メチルアミノ）ベンゼン−１，４−ジカルボキシレート（１）（４．５ｇ、０．０２ｍｏｌ）の溶液に、水酸化カリウム（３．４ｇ、０．０６ｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を７０℃で４時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、水（２００ｍＬ）で希釈し、重硫酸カリウムを使用して酸性化した。次いで、得られた混合物を酢酸エチル（４×７５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の２（３．０ｇ、７６．３３％）を淡黄褐白色固体として得た。粗混合物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  13.14  ppm  (1H,  s),  7.87-7.85  ppm  (1H,  d,  J=8.0  Hz),  7.21-7.21  ppm  (1H,  d,  J=1.6  Hz),  7.10-7.07  (1H,  dd,  J=8.0),  2.87  (1H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ９Ｈ９ＮＯ４［ＭＨ］＋の計算値  １９６．０５、実測値  １９６．２１。
【０３９７】
１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン
−７−カルボン酸、弾頭タイプ１Ｂ。
【０３９８】
テトラヒドロフラン（９０ｍＬ）中の２−（メチルアミノ）ベンゼン−１，４−ジカルボン酸（２）（３．０ｇ、０．０１５ｍｏｌ）の懸濁液に、トリホスゲン（２．２８ｇ、０．０７６ｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を３０℃で３０分間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の弾頭タイプ１Ｂを黄色固体として得た。粗混合物を、ジエチルエーテルを使用する摩砕により精製して、弾頭タイプ１Ｂ（３．１ｇ、９１．１７％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  13.78  ppm  (1H,  s),  8.12-8.09  (1H,  d,  J=8.4),  7.82-7.80  (2H,  m),  3.51  (3H,  S).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１０Ｈ７ＮＯ５［ＭＨ］−の計算値  ２２０．０３、実測値  ２２０．０７。
【０３９９】
このタイプと同様のさらなる弾頭としては、Ｎ−メチルイサト酸無水物、１−メチル−
６−ニトロイサト酸無水物および１−メチル−７−ニトロイサト酸無水物が挙げられる。
これらは、市販されている。
【０４００】
（実施例４）
弾頭タイプ２の合成
【化４６】
2019523242.tif 000054
７−メトキシ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオン（１）。
【０４０１】
１，４−ジオキサン（４００ｍＬ）中の２−アミノ−４−メトキシ安息香酸（２０ｇ、１１９．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリホスゲン（１７．８ｇ、５９．８６ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応混合物をＤＭ水（１Ｌ）に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×３５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、１（２０．５ｇ、８８％）をオフホワイトの固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  11.66  ppm  (1H,  broad),  7.85-7.83  ppm  (1H,  d,  J=8.8  Hz),  6.85-6.83  ppm  (1H,  dd,  J=2.4,  6.4  Hz),  6.59-6.58  ppm  (1H,  d,  J=2.4  Hz),  3.86  ppm  (3H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ９Ｈ７ＮＯ４［ＭＨ］−の計算値  １９２．０４、実測値  １９２．１６。
【０４０２】
７−メトキシ−１−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ
）−ジオン（２）。
【０４０３】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）中の７−メトキシ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオン（１）（２０．５ｇ、１０６．２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１４．６５ｇ、１０６．２ｍｍｏｌ）を室温で添加し、得られた反応混合物を１０分間撹拌した。これに、ヨウ化メチル（１８．０８ｇ、１２７．４４ｍｍｏｌ）を室温で滴下添加した。反応混合物をＤＭ水（１Ｌ）に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×３５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の２を得た。粗製物を、ヘキサンで摩砕することにより精製して、２（１７．９ｇ、９３．２３％）をオフホワイトの固体として得た。生成物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  7.95-7.93  ppm  (1H,  d,  J=8.4  Hz),  6.94-6.91  ppm  (1H,  dd,  J=2.4,  6.4  Hz),  6.86-6.85  ppm  (1H,  d,  J=2  Hz),  3.94  ppm  (3H,  s),  3.46  ppm  (3H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１０Ｈ９ＮＯ４［ＭＨ］＋の計算値  ２０８．０５、実測値  ２０８．２。
【０４０４】
７−ヒドロキシ−１−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオン（３）。
【０４０５】
０℃のジクロロメタン（５００ｍＬ）中の７−メトキシ−１−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオン（２）（１０ｇ、４８．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＢｒ３（ジクロロメタン中１Ｍ溶液）（７２．４４ｍＬ、７２．４４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。得られた反応混合物を０℃で１時間撹拌し、ゆっくりと室温にし、２４時間さらに撹拌した。反応混合物をｎ−ヘキサン（５００ｍＬ）で希釈し、得られた残留物を濾過した。収集した固体をｎ−ヘキサン（３×５０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させた。固体を水（１Ｌ）中にさらに懸濁させ、ジクロロメタン（５×３５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、３（７．９ｇ、８４．７４％）を褐色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  MeOD)  δ  7.96-7.94  ppm  (1H,  d,  J=8.8  Hz),  6.78-6.75  ppm  (1H,  dd,  J=2,  6.4  Hz),  6.69-6.69  ppm  (1H,  d,  J=2.4  Hz),  3.52  ppm  (3H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ９Ｈ７ＮＯ４［ＭＨ］−の計算値  １９２．０４、実測値  １９１．９６。
【０４０６】
ベンジル２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセテート（４）。
【０４０７】
アセトン（８００ｍＬ）中の７−ヒドロキシ−１−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオン（３）（７．９ｇ、４０．９３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１４．１２ｇ、１０２．３１５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２０分間撹拌した。これに、ベンジル−２−ブロモアセテート（１１．２５１ｇ、４９．１１１ｍｍｏｌ）を室温で滴下添加し、得られた反応混合物を５時間さらに撹拌した。反応混合物を濾過し、収集した残留物をアセトン（３×２０ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して、固体塊を得た。固体塊を酢酸エチル（１Ｌ）に溶解し、水（３×３００ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の４を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘキサン）により精製して、純粋な４（０．３９ｇ、６２．９％）を黄色油状物として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  7.94-7.92  ppm  (1H,  d,  J=8.4  Hz),  7.38-7.35  ppm  (5H,  m),  6.95-6.92  ppm  (1H,  dd,  J=2,  6.8  Hz),  6.87-6.87  ppm  (1H,  d,  J=2  Hz),  5.23  ppm  (2H,  s),  5.14  ppm  (2H,  s),  3.40  ppm  (3H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１８Ｈ１５ＮＯ６［ＭＨ］＋の計算値  ３４２．０９、実測値  ３４２．２８。
【０４０８】
２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）酢酸、弾頭＿タイプ＿２。
【０４０９】
ＴＨＦ：ＥｔＯＡｃの１：１混合物（４００ｍＬ）中の１０％Ｐｄ／Ｃ（乾燥基準）（１．２５ｇ、５％ｗ／ｖ）の懸濁液に、ベンジル２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセテート（４）（６．５ｇ、１９．０５７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で添加した。Ｈ２ガスを反応混合物中に室温で３時間パージした。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の弾頭＿タイプ＿２を得た。粗混合物を、ｎ−ヘキサン（３×２０ｍＬ）で摩砕することにより精製して、弾頭＿タイプ＿２（０．３９ｇ、６２．９％）をオフホワイトの固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  13.25  ppm  (1H,  br  s),  7.95-7.92  ppm  (1H,  d,  J=8.4  Hz),  6.92-6.88  ppm  (2H,  m),  4.94  ppm  (2H,  s),  3.44  ppm  (3H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１１Ｈ９ＮＯ６［ＭＨ］＋の計算値  ２５２．０４、実測値  ２５２．４７。
【０４１０】
（実施例５）
ＡＲＫ−１（Ａｒｋ０００００７）の合成
【化４７】
2019523242.tif 000055
カナマイシンＡ遊離塩基、１。
【０４１１】
２５０ｍＬのビーカー内で、カナマイシンＡ一硫酸塩（５．０ｇ、８．５８２ｍｍｏｌ）を水（１００ｍＬ）に溶解し、得られた水溶液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００  −ＯＨ形イオン交換樹脂に通過させた。遊離塩基を、ＤＭ水を使用して溶出し、収集した画分を凍結乾燥して、遊離塩基１（３．８ｇ、９１％）を白色固体として得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１８Ｈ３６Ｎ４Ｏ１１［ＭＨ］＋の計算値  ４８５．２３、実測値  ４８５．２６。
【０４１２】
１，３，６’，３’’−テトラ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カナマイシンＡ、２。
【０４１３】
ＤＭＳＯ（１４０ｍＬ）および水（４０Ｌ）（１８０ｍＬ）中のカナマイシンＡ遊離塩基（１）（３．７ｇ、７．６４１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｂｏｃ無水物（２０ｇ、９１．６９２ｍｍｏｌ）を室温で添加し、得られた反応混合物を７０℃で２０時間加熱した。室温に冷却した後、ＮＨ４ＯＨの水溶液（３０ｍＬ）を、得られた反応混合物に添加した結果、沈殿物を得た。沈殿物を濾過によって収集し、水（２×３５０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させて、純粋な２（５．７ｇ、８４％）を白色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  6.92  ppm  (1H,  s),  6.62    ppm  (1H,  s),  6.53-6.51  ppm  (1H,  d,  J=6.8  Hz),  6.38  ppm  (1H,  s),  5.40  ppm  (1H,  broad  s),  5.27  ppm  (1H,  broad  s),  4.71  ppm  (1H,  broad  s),  4.22  ppm  (1H,  broad  s),  3.80-3.25ppm  (15H,  broad  m),  3.07  ppm  (1H,  broad  s),  1.82-1.75  ppm  (1H,  broad  s),  1.37  ppm  (36H,  broad  s);ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ３８Ｈ６８Ｎ４Ｏ１９［ＭＨ］＋の計算値  ８８５．４４、実測値  ９０７．７（Ｍ＋Ｎａ付加体）。
【０４１４】
６’’−（２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル）−１，３，６’，３’’−テトラ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カナマイシンＡ、３。
【０４１５】
ピリジン（３５ｍＬ）中の１，３，６’，３’’−テトラ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カナマイシンＡ（２）（２ｇ、２．２６１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ピリジン（４ｍＬ）中の２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（４．１１ｇ、１３．５６７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２０時間撹拌した。この後、反応混合物をメタノール（３０ｍＬ）に添加し、３０分間さらに撹拌した。次いで、反応混合物を、冷却した１０％ＨＣｌ溶液（４００ｍＬ）に注ぎ入れ、酢酸エチル（４×２００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の３を黄色固体として得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム）により精製して、純粋な３（０．５ｇ、７３％）を薄黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５３Ｈ９０Ｎ４Ｏ２１Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １１５１．５８、実測値  ９０８．６（Ｍ−ＴＩＰＢＳフラグメント  ＋Ｎａ付加体）。
【０４１６】
６’’−アジド−１，３，６’，３’’−テトラ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カナマイシンＡ、４。
【０４１７】
３５ｍＬの圧力バイアルに、６’’−（２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル）−１，３，６’，３’’−テトラ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カナマイシンＡ（３）（０．５ｇ、０．４３４ｍｍｏｌ）、ＮａＮ３（０．５６５ｇ、８．６９１ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１５ｍＬ）を室温で入れた。得られた反応混合物にマイクロ波下、１２０℃で３時間照射を行った。室温に冷却した後、反応混合物を冷水（１５０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の４を褐色油状物として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な４（０．１１ｇ、２７％）を薄黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ  5.11-5.02  ppm  (2H,  t,  J=9.6  Hz),  4.37-4.35  ppm  (1H,  d),  3.73-3.36  ppm  (15H,  m),  3.23-3.18  ppm  (1H,  t,  J=9.2  Hz),  2.07-2.04  ppm  (1H,  d,  J=13.2  Hz  ),  1.47-1.45  ppm  (36H,  br  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ３８Ｈ６７Ｎ７Ｏ１８［ＭＨ］＋の計算値  ９１０．４５、実測値  ９３２．６７（Ｍ＋Ｎａ付加体）。
【０４１８】
分取ＨＰＬＣの方法：
【０４１９】
（Ａ）Ｈ２Ｏ中１０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）ＭｅＣＮ：ＩＰＡ（９０：１０）（ＨＰＬＣグレード）で、１９．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８、２５０×１９ｍｍ、５Ｕｎを使用：
【表１１】
2019523242.tif 000056
【０４２０】
６’’−アジド−カナマイシンＡトリフルオロ酢酸塩（triflouroacetate  salt）、ＡＲＫ−１−ＴＦＡ塩。
【０４２１】
６’’−アジド−１，３，６’，３’’−テトラ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カナマイシンＡ、（４）（０．１１ｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ：ＴＦＡの１：１混合物（３．２ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ジエチルエーテルを使用して摩砕して、純粋なＡＲＫ−１−ＴＦＡ塩（０．１２ｇ、１０２％）を薄黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  5.39-5.38  ppm  (1H,  d,  J=3.6  Hz),  4.95-4.94  ppm  (1H,  d,  J=3.2  Hz),  3.796-3.71  ppm  (5H,  m),  3.64-3.31  ppm  (11H,  m),  3.07-3.01  ppm  (1H,  q,  J=14.4,9.2  Hz),  2.40-2.37  ppm  (1H,  m),  1.77-1.74  ppm  (1H,  q,  J  =  12.8  Hz),  1.09-1.02  ppm  (1H,  m).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１８Ｈ３５Ｎ７Ｏ１０＋３ＴＦＡ［ＭＨ］＋の計算値  ５０９．２４、実測値  ５１０．４。ＨＰＬＣ保持時間：７．１０３分。
【０４２２】
６’’−アジド−カナマイシンＡ塩酸塩、ＡＲＫ−１−ＨＣｌ塩（Ａｒｋ０００００７）。
【０４２３】
６’’−アジド−カナマイシンＡトリフルオロ酢酸塩、ＡＲＫ−１−ＴＦＡ塩（０．１２ｇ、０．１２４ｍｍｏｌ）を水（４０ｍＬ）に溶解し、得られた水溶液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００  −ＯＨ形イオン交換樹脂に通過させた。遊離塩基を、ＤＭ水を使用して溶出し、収集した画分を凍結乾燥して、ＡＲＫ−１を遊離塩基として得た。遊離塩基を０．０１Ｎ  ＨＣｌ（４ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を凍結乾燥して、純粋なＡＲＫ−１−ＨＣｌ−塩（０．０６ｇ、７７％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  5.41-5.40  ppm  (1H,  d,  J=2.4  Hz),  4.96  ppm  (1H,  br  s),  3.90-3.76  ppm  (5H,  m),  3.62-3.60  ppm  (2H,  d,  J=8.8  Hz),  3.55-3.19  ppm  (10H,  m,  ),  3.07-3.01  ppm  (1H,  m),  2.41-2.38  ppm  (1H,  d,  J  =  12),  1.82-1.73  ppm  (1H,  q,  J  =  12.8  Hz).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１８Ｈ３５Ｎ７Ｏ１０．３  ＨＣｌ［ＭＨ］＋の計算値  ５１０．２４、実測値  ５１０．２。ＨＰＬＣ保持時間：１４．８９７分。
【０４２４】
（実施例６）
ＡＲＫ−７（Ａｒｋ０００００１３）の合成
【化４８】
2019523242.tif 000057
２，７，１５−トリニトロ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン、１ａ。
【０４２５】
濃ＨＮＯ３（４００ｍＬ）をトリプチセン（１０ｇ、３９．３ｍｍｏｌ）に室温で滴下添加し、得られた反応混合物を８０℃で１６時間加熱した。得られた褐色溶液を室温に冷却し、氷冷水（３０００ｍＬ）に注ぎ入れ、３０分間撹拌した。得られた沈殿物を収集し、冷水で洗浄し、次いで空気中で乾燥させて、１ａと１ｂとの粗混合物を得た。粗混合物をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、純粋な生成物１ａ（２．２３ｇ、１４．１０％）を白色固体として得た。１ａ  ｍｐ：＞３００℃1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  8.37-8.36  ppm  (3H,  d,  J=2  Hz),  8.08-8.06  ppm  (3H,  dd,  J=8  Hz,  J=2  Hz),  7.66-7.64  ppm  (3H,  d,  J=8.4  Hz),  5.87  ppm  (1H,  S),  5.84  ppm  (1H,  s),  13C  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  150.24,  145.91,  145.76,  126.10,  122.60,  119.93,  52.18,  51.48;  MS  (ESI-MS):  m/z  calcd  for  C20H21N3O6  [MH]+  390.06,質量の応答は認められない。
【０４２６】
１ｂ  ｍｐ：１７８〜１８０℃1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  8.36-8.35  ppm  (3H,  m),  8.09-8.06  ppm  (3H,  m),  7.69-7.65  ppm  (3H,  m),  5.86  ppm  (1H,  s),  5.85  ppm  (1H,  s)  13C  NMR  150.93,  150.57,  145.72,  145.33,  144.92,  125.97,  122.54,  119.93,  55.33,  51.98,  51.74.
【０４２７】
９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリアミン、２。
【０４２８】
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の２，７，１５−トリニトロ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン（１ａ）（２．２３ｇ、５．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、ラネーニッケル（１．０ｇ）を添加し、得られた反応混合物を０℃に冷却した。ヒドラジン水和物（４ｍＬ）を、得られた混合物に０℃で添加した。反応混合物を６０℃で１時間撹拌した。得られた反応混合物を室温に冷却し、ＴＨＦで溶出しながらセライトに通して濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、粗製の２（１．５ｇ、８８．２３％）を褐色固体として得、これをさらに精製することなく使用した。1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  7.09-7.07  ppm  (3H,  d,  J=7.6  Hz),  6.75-6.75  ppm  (3H,  d,  J=2  Hz),  6.29-6.27  ppm  (3H,  dd,  J=7.6  Hz,  J=2  Hz),  5.10ppm  (1H,  S),  5.02  ppm  (1H,  s),  3.51-3.35  ppm  (  6H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２０Ｈ１７Ｎ３［ＭＨ］＋の計算値  ３００．１４、実測値  ３００．４。
【０４２９】
２，７，１５−トリヨード−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン、３。
【０４３０】
１００ｍＬの丸底フラスコ内で、９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリアミン（２）（０．９ｇ、３．０１ｍｍｏｌ）を濃塩酸（７．５ｍＬ）および水（１５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を０℃に冷却した。これに、水（７．５ｍＬ）中の亜硝酸ナトリウム（０．７２ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）の溶液を１０分間かけて滴下添加し、得られた反応混合物を０℃で２０分間撹拌した。この後、水（１０ｍＬ）中のヨウ化カリウム（３．７４ｇ、２２．５８ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に０℃で滴下添加し、５分間さらに撹拌した。次いで、反応混合物をゆっくりと室温に加温し、８０℃で２時間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、飽和重硫酸ナトリウム（３×３０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の３を褐色半固体として得た。粗混合物をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、純粋な生成物３（０．５７ｇ、３０．０％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  7.74-7.73  ppm  (3H,  d,  J=1.6  Hz),  7.39-7.36ppm  (3H,  dd,  J=7.6  Hz,  J=1.6  Hz),  7.66-7.64  ppm  (3H,  d,  J=7.6  Hz),  5.31ppm  (1H,  S),  5.26  (1H,  s).
【０４３１】
９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボニトリル、４。
【０４３２】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２，７，１５−トリヨード−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン（３）（０．５５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）の溶液に、シアン化亜鉛（０．３３ｇ、２．７９ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を窒素ガスで２０分間脱気した。これに、テトラキス（０．１０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を１４０℃で１６時間撹拌した。室温に冷却した後、反応混合物をセライトに通して濾過し、冷水（２０ｍＬ）でクエンチし、ジクロロメタン（３×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の４を褐色半固体として得た。粗混合物をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、純粋な生成物４（０．２ｇ、７０．０％）を薄黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  7.74-7.74  ppm  (3H,  d,  J=1.2  Hz),  7.39-7.36  ppm  (3H,  dd,  J=7.6  Hz,  J=1.6  Hz),  7.66-7.64  ppm  (3H,  d,  J=7.6  Hz),  5.31  ppm  (1H,  S),  5.26  (1H,  s).
【０４３３】
９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボン酸、５。
【０４３４】
ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中の９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボニトリル（４）（０．４０ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）の溶液に、１５％ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ、１８．２４ｍｍｏｌ）を室温で添加し、得られた反応混合物を６０℃で１６時間撹拌した。室温に冷却した後、過剰のＭｅＯＨを減圧下で除去し、得られた混合物を氷冷水（５０ｍＬ）に注ぎ入れた。この水溶液のｐＨを、１Ｎ  ＨＣｌを使用して約２に調整し、得られた残留物を濾過によって収集して、粗製の５（０．３０ｇ、６５．３％）を白色固体として得、これをさらに精製することなく使用した。1H  NMR  (400  MHz,  MeOD)  δ  8.12  ppm  (3H,  d,  J=1.2  Hz),  7.79-7.77  ppm  (3H,  dd,  J=7.6  Hz,  J=1.6  Hz),  7.58-7.56  ppm  (3H,  d,  J=4  Hz),  5.832ppm  (2H,  S);ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１２Ｈ２６Ｏ６［ＭＨ］−の計算値  ３８５．０７、実測値  ３８５．１。
【０４３５】
ｔｅｒｔ−ブチル（３−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）プロピル）カルバメート、２ａ。
【０４３６】
０℃のＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＮ１−（３−アミノプロピル）−Ｎ１−メチルプロパン−１，３−ジアミン（５ｇ、３８．４８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ無水物（１．５０ｇ、６．８９ｍｍｏｌ）を２０分間かけて滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。ＴＨＦを減圧下で除去し、得られた混合物を水（５０ｍＬ）に注ぎ入れた。水性混合物を酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、純粋な２ａ（１．３ｇ、１５．４％）を無色油状物として得た。1H  NMR  (400  MHz,  d6-DMSO)  δ  6.80-6.79  ppm    (1H,  d,  J=4  Hz),  3.17  (3H,  broad  s)  2.94-2.89ppm  (2H,  dd,  J=12.4,  6  Hz),  2.51  ppm  (2H,  broad  s),  2.28-2.21ppm  (4H,  m),  2.08-2.07  (2H,  d,  J=4  Hz),  1.50-1.44  ppm  (4H,  m),  1.37  (9H,  s);ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１２Ｈ２６Ｎ２Ｏ２［ＭＨ］＋の計算値  ２４６．２１、質量の応答は認められない。
【０４３７】
Ｎ２，Ｎ７，Ｎ１５−トリス（３−（（３−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルアミノプロピル）（メチル）アミノ）プロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボキサミド、６。
【０４３８】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（３−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）プロピル）カルバメート（２ａ）（０．７１ｇ、２．９１ｍｍｏｌ）の溶液に、９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボン酸（０．３５ｇ、０．９１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．１ｇ、２．９１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１．０ｍＬ、５．８２ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を水（５０ｍＬ）に注ぎ入れ、ジクロロメタン（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の６を褐色油状物として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な生成物６（０．２ｇ、２０．７％）を薄黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  d6-DMSO)  δ  8.40-8.37  (3H,  t,  J=5.2  Hz),  7.93  (3H,  s)  7.55-7.49ppm  (6H,  dd,  J=16,  7.6  Hz  ),  6.78  ppm  (3H,  broad  s),  5.87  ppm  (2H,  broad  s),  3.23-3.21  ppm  (6H,  m),    2.93-2.90  (6H,  m),  2.30-2.22  (12H,  m),  1.61-1.58  (6H,  m),  1.50-1.46  (6H,  m),  1.31  (27H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５９Ｈ８９Ｎ９Ｏ９［ＭＨ］＋の計算値  １０６８．６８、実測値  １０６８．９。
【０４３９】
分取ＨＰＬＣの方法：
【０４４０】
（Ａ）水中１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（Ｂ）ＭｅＣＮ：ＭｅＯＨ：ＩＰＡ（６５：２５：１０）で、１５．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＷＡＴＥＲＳ  Ｘ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８  ２５０ｍｍ×１９ｍｍ、５．０μＭを使用：
【表１２】
2019523242.tif 000058
【０４４１】
Ｎ２，Ｎ７，Ｎ１５−トリス（３−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）プロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボキサミド、ＡＲＫ−７。
【０４４２】
１，４−ジオキサン（５ｍＬ）中のＮ２，Ｎ７，Ｎ１５−トリス（３−（（３−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルアミノプロピル）（メチル）アミノ）プロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボキサミド（６）（０．２ｇ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（１ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を２時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、ＡＲＫ−７の純粋な塩酸塩（０．０７２ｇ、５０．３％）を薄黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  7.70  ppm  (3H,  s),  7.42-7.40  ppm  (3H,  d,  J=7.6  Hz),  7.34-7.32  ppm  (3H,  d,  J=  8  Hz),  5.73  ppm  (1H,  s),  5.71  (1H,  s),  3.34-3.30  ppm  (6H,  t),  3.23-3.03  ppm  (12H,  m),  2.97-2.93  ppm  (6H,  t),  2.76  ppm  (9H,  s),  2.06-1.92  ppm  (12H,  m),ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ４４Ｈ６５Ｎ９Ｏ３［ＭＨ］＋の計算値  ７６８．５２、実測値  ７６８．７。ＨＰＬＣ保持時間：４．２７７分。
【０４４３】
（実施例７）
ＡＲＫ−８（Ａｒｋ０００００１４）の合成
【化４９】
2019523242.tif 000059
ＡＲＫ−８を、上記のＡＲＫ−７のための方法に従って合成して、中間体５を得た。次いで、これを以下の中間体２ａとカップリングさせ、下記の通りにＡＲＫ−８に変換した。
【０４４４】
ｔｅｒｔ−ブチル（７−アミノヘプチル）カルバメート、２ａ。
【０４４５】
０℃のＴＨＦ（１０ｍＬ）中のヘプタン−１，７−ジアミン（５ｇ、３８．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ無水物（１．６８ｇ、７．６９ｍｍｏｌ）を２０分間かけて滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。ＴＨＦを減圧下で除去し、得られた混合物を水（５０ｍＬ）に注ぎ入れた。水性混合物を酢酸エチル（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、純粋な２ａ（１ｇ、１１．３％）を無色油状物として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  6.80-6.77  (1H,  t,  J=5.2  Hz),  2.91-2.85  (2H,  dd,  J=13.2,  6.8  Hz)  2.55-2.44ppm  (2H,  m),  1.36  ppm  (11H,  s),  1.31ppm  (4H,  s),  1.23  (6H,  s),ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１２Ｈ２６Ｎ２Ｏ２［ＭＨ］＋の計算値  ２３１．２０、実測値  ２３１．５。
【０４４６】
Ｎ２，Ｎ７，Ｎ１５−トリス（７−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルアミノヘプチル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボキサミド、６。
【０４４７】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（７−アミノヘプチル）カルバメート（２ａ）（０．５１ｇ、２．２４ｍｍｏｌ）の溶液に、９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボン酸（０．２７ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．８５、２．２４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．７７ｍＬ、４．４７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を水（５０ｍＬ）に注ぎ入れ、ジクロロメタン（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の６を褐色半固体として得た。粗混合物をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（０．５％ＭｅＯＨ／クロロホルム）により精製して、純粋な生成物６（０．６５ｇ、９１．５％）を薄黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO)  δ  8.34-8.32    (3H,  d,  J=8.8  Hz),  7.93  (3H,  s)  7.53  ppm  (6H,  s),  6.75  ppm  (3H,broad  s),  5.87  ppm  (1H,  s),  5.76  ppm  (1H,  s),    3.20-3.14  (6H,  d,  J=  24  Hz),  2.29  (6H,  s),  1.37  (27H,  s),  1.25-1.24  (30H,  m),ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５９Ｈ８６Ｎ６Ｏ９［ＭＨ］＋の計算値  １０２３．６５、実測値  １０４５．５（Ｍ＋２３）。
【０４４８】
Ｎ２，Ｎ７，Ｎ１５−トリス（７−アミノヘプチル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボキサミド、ＡＲＫ−８。
【０４４９】
１，４−ジオキサン（５ｍＬ）中のＮ２，Ｎ７，Ｎ１５−トリス（７−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルアミノヘプチル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボキサミド（６）（０．７ｇ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（３ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を２時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、ＡＲＫ−８の粗塩酸塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−８＿ＨＣｌ塩（０．２ｇ、４０．５％）を白色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  7.62  ppm  (3H,  broad  s),  7.13ppm  (3H,broad  s),  7.01  ppm  (3H,  broad  s),  5.53ppm  (1H,  S),  5.2  (1H,  s),  2.92ppm  (6H,  broad  s),  2.60ppm  (6H,  broad  s),  1.22ppm  (6H,  broad  s),  1.07ppm  (6H,  broad  s),  0.76ppm  (6H,  broad  s),ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ４４Ｈ６２Ｎ６Ｏ３［ＭＨ］＋の計算値  ７２４．０、実測値  ７２３．６。ＨＰＬＣ保持時間：４．９４７分。
【０４５０】
分取ＨＰＬＣの方法：
【０４５１】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（Ｂ）ＭｅＣＮ：ＭｅＯＨ：ＩＰＡ（６５：２５：１０）
（ＨＰＬＣ  ＧＲ）で、２２．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ  ＳＥＬＥＣＴ
フルオロフェニルカラム  ２５０×１９ｍｍ、５．０μＭを使用：
【表１３】
2019523242.tif 000060
【０４５２】
（実施例８）
ＡＲＫ−９（Ａｒｋ００００１５）、ＡＲＫ−１０（Ａｒｋ００００１６）、ＡＲＫ−
１１（Ａｒｋ００００１７）およびＡＲＫ−１２（Ａｒｋ００００１８）の合成
【化５０】
2019523242.tif 000061
【化５１】
2019523242.tif 000062
ＡＲＫ−９は、化合物２を介して上記のＡＲＫ−７と同様に調製した。したがって、化合物２を下記の通りにＢｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨとカップリングさせ、次いで脱保護して、ＡＲＫ−９を得た（Ｂｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨに置き換えることにより、ＡＲＫ−１０（Ａｒｋ００００１６）を同様に得た）。同様のやり方で、保護されたＬまたはＤ−Ｈｉｓアミノ酸とカップリングさせることによりＡＲＫ−１１（Ａｒｋ００００１７）およびＡＲＫ−１２（Ａｒｋ００００１８）を得た。
【０４５３】
ヘキサ−ｔｅｒｔ−ブチル（（５Ｓ，５’Ｓ，５’’Ｓ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（６−オキソヘキサン−６，１，５−トリイル））ヘキサカルバメート、３。
【０４５４】
ＤＭＦ（１ｍＬ）中の９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリアミン（２）（０．１ｇ、０．３３４４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（０．３７ｇ、１．０７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．４０６、１．０７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．２５８ｇ、２．００６ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を室温で６０分間撹拌した。得られた反応混合物を氷冷水に注ぎ入れた。得られた固体沈殿物を濾過により収集し、減圧下で乾燥させて、粗製の３（０．３８ｇ、８８．５７％）を白色固体として得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６８Ｈ１０１Ｎ９Ｏ１５［ＭＨ］＋の計算値  １２８３．７４、実測値  １１８５．０（Ｍ−１００）。
【０４５５】
（２Ｓ，２’Ｓ，２’’Ｓ）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（２，６−ジアミノヘキサンアミド）、ＡＲＫ−９。
【０４５６】
前ステップから得た粗生成物、ヘキサ−ｔｅｒｔ−ブチル（（５Ｓ，５’Ｓ，５’’Ｓ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（６−オキソヘキサン−６，１，５−トリイル））ヘキサカルバメート（３）（０．３ｇ、０．２３４ｍｍｏｌ）を、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ中に懸濁させ、室温で２時間撹拌した。得られた反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−９塩酸塩を白色固体として得た。粗生成物を、以下に示す方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、ＡＲＫ−９の純粋な塩（０．１９ｇ、４６．９１％）を白色固体として得た。ＡＲＫ−９の純粋な塩をＤＭ水（４ｍＬ）に溶解し、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００  −ＯＨ形イオン交換樹脂に通過させた。遊離塩基を、ＤＭ水を使用して溶出し、収集した画分を凍結乾燥して、遊離塩基（０．１５ｇ）を白色固体として得た。遊離塩基（０．０５ｇ）を１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（３ｍＬ）で処理し、物質を凍結乾燥して、ＡＲＫ−９の塩酸塩（０．０５ｇ、８３．３３％）を白色固体として生成した。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  7.56-7.55  ppm  (3H,  d,  J=1.6  Hz),  7.41-7.39  ppm  (3H,  d,  J=8.0  Hz),  7.01-6.99  ppm  (H,  dd,  J=8  Hz,  J=1.6  Hz),  5.62  ppm  (1H,  S),  5.59  ppm  (1H,  s),  4.01-3.98  ppm  (3H,  t),  2.88-2.84  ppm  (6H,  t),  1.90-1.86  ppm  (6H,  m),  1.61-1.57  ppm  (6H,  3),  1.40-1.36  ppm  (6H,  m),ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２２Ｈ２７Ｎ５Ｏ２［ＭＨ］＋の計算値  ６８４．４、実測値  ６８４．７。ＨＰＬＣ保持時間：５．０９２分。
【０４５７】
分取ＨＰＬＣの方法：
【０４５８】
（Ａ）水中０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）ＭｅＣＮ：ＭｅＯＨ：ＩＰＡ（６５：２５：１０）（ＨＰＬＣグレード）で、１２．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ  ＳＥＬＥＣＴフルオロフェニルカラム  ２５０×１９ｍｍ、５．０μｍを使用：
【表１４】
2019523242.tif 000063
【０４５９】
ＡＲＫ−１０（Ａｒｋ００００１６）の合成：
【０４６０】
ヘキサ−ｔｅｒｔ−ブチル（（５Ｒ，５’Ｒ，５’’Ｒ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（６−オキソヘキサン−６，１，５−トリイル））ヘキサカルバメート、３。
【０４６１】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリアミン（２）（０．３ｇ、１．００ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１．１ｇ、３．２１０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．２ｇ、３．２１０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．７７４ｇ、６．００ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を室温で６０分間撹拌した。得られた反応混合物を氷冷水に注ぎ入れた。得られた固体沈殿物を濾過により収集し、減圧下で乾燥させて、粗製の３を得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な３（０．２５ｇ、１９．５３％）を白色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６８Ｈ１０１Ｎ９Ｏ１５［ＭＨ］＋の計算値  １２８３．７４、実測値  １１８５．０（Ｍ−１００；Ｂｏｃ基１個の脱保護）。
【０４６２】
分取ＨＰＬＣの方法：
【０４６３】
（Ａ）水中１０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）ＡＣＮ：ＭｅＯＨ：ＩＰＡ（６５：２５：１０）（ＨＰＬＣ  ＧＲ）で、２８．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ  ＢＲＩＤＧＥ  ２５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍを使用：
【表１５】
2019523242.tif 000064
【０４６４】
（２Ｒ，２’Ｒ，２’’Ｒ）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（２，６−ジアミノヘキサンアミド）、ＡＲＫ−１０。
【０４６５】
前ステップから得た粗生成物、ヘキサ−ｔｅｒｔ−ブチル（（５Ｒ，５’Ｒ，５’’Ｒ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（６−オキソヘキサン−６，１，５−トリイル））ヘキサカルバメート（３）（０．２５ｇ、０．１９４７ｍｍｏｌ）を、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ中に懸濁させ、室温で２時間撹拌した。得られた反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−１０塩酸塩を白色固体として得た。粗生成物を、以下に示す方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、ＡＲＫ−１０の純粋な塩（０．１４ｇ、２６．４１％）を白色固体として得た。ＡＲＫ−１０の純粋な塩をＤＭ水（４ｍＬ）に溶解し、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００  −ＯＨ形イオン交換樹脂に通過させた。遊離塩基を、ＤＭ水を使用して溶出し、収集した画分を凍結乾燥して、遊離塩基（０．０７ｇ）を白色固体として得た。遊離塩基（０．０７ｇ）を１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（３ｍＬ）で処理し、凍結乾燥して、ＡＲＫ−１０の塩酸塩（０．０８５ｇ、９２．３９％）を薄褐色固体として生成した。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  7.54-7.53  ppm  (3H,  d,  J=2  Hz),  7.38-7.36  ppm  (3H,  d,  J=8.0  Hz),  6.99-6.97  ppm  (3H,  dd,  J=8  Hz,  J=2  Hz),  5.60  ppm  (1H,  S),  5.56  (1H,  s),  3.99-3.96  ppm  (3H,  t),  2.86-2.82  ppm  (6H,  t),  1.89-1.82  ppm  (6H,  m),  1.61-1.53  ppm  (6H,  m),  1.40-1.34  ppm  (6H,  m).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２２Ｈ２７Ｎ５Ｏ２［ＭＨ］＋の計算値  ６８４．４、実測値  ６８４．６。ＨＰＬＣ保持時間：６．３９３分。
【０４６６】
分取ＨＰＬＣの方法：
【０４６７】
（Ａ）水中０．１％ＴＦＡ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）ＭｅＣＮ：ＭｅＯＨ：ＩＰＡ（６５：２５：１０）（ＨＰＬＣ  ＧＲ）で、１５．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ  ＳＥＬＥＣＴ  ＰＦＰ  Ｃ１８、２５０×１９ｍｍ、５ｕｍを使用：
【表１６】
2019523242.tif 000065
【０４６８】
ＡＲＫ−１１およびＡＲＫ−１２の合成。
【０４６９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｓ，２’Ｓ，２’’Ｓ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−オキソプロパン−１，２−ジイル））トリカルバメート。
【０４７０】
ＤＭＦ（６ｍＬ）中の９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリアミン（２）（０．３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｂｏｃ−Ｌ−ヒスチジン（０．８２ｇ、３．２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．２２ｇ、３．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．８ｇ、６．２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、得られた残留物を濾過によって収集し、減圧下で乾燥させて、粗製の３（０．６５ｇ、６５％）を薄褐色固体として得、これを精製することなく次のステップにおいて直接使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５３Ｈ６２Ｎ１２Ｏ９［ＭＨ］＋の計算値  １０１１．１５、実測値  １０１１．９。
【０４７１】
（２Ｓ，２’Ｓ，２’’Ｓ）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（２−アミノ−３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパンアミド）塩酸塩、ＡＲＫ−１１＿ＨＣｌ塩。
【０４７２】
ジクロロメタン（８ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｓ，２’Ｓ，２’’Ｓ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−オキソプロパン−１，２−ジイル））トリカルバメート（３）（０．６５ｇ、０．６４３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ（５ｍＬ）を０℃で添加した。得られた反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−１１を得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な生成物、ＡＲＫ−１１＿ＴＦＡ塩（０．３２ｇ、６４．４２％）を無色粘性油状物として得た。ＡＲＫ−１１＿ＴＦＡ塩をメタノール（１０ｍＬ）に溶解した。これに、ポリマー結合テトラアルキルアンモニウムカーボネートおよび得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物をセライトに通して濾過し、得られた濾液を減圧下で濃縮して、ＡＲＫ−１１＿遊離塩基を得た。遊離塩基を０．０１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を凍結乾燥して、純粋なＡＲＫ−１１＿ＨＣｌ塩（０．１６ｇ、６１．０６％）を白色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  8.56  ppm  (3H,  s),  7.51  ppm  (3H,  s),  7.39-7.31  ppm  (6H,  m),  6.93-6.91  ppm  (3H,  s),  5.61-5.58  ppm  (2H,  s),  4.26  ppm  (3H,  s),  3.36-3.34  ppm  (6H,  m),  3.21  ppm  (2H,  s);ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ３８Ｈ３８Ｎ１２Ｏ３［ＭＨ］＋の計算値  ７１０．８、実測値  ７１２．２。ＨＰＬＣ保持時間：５．７７０分。
【０４７３】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４７４】
（Ａ）水中０．１％ＴＦＡ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）アセトニトリル中１０％ＩＰＡ（ＨＰＬＣグレード）で、３５．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＷＡＴＥＲＳ  Ｘ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍを使用：
【表１７】
2019523242.tif 000066
【０４７５】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｒ，２’Ｒ，２’’Ｒ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−オキソプロパン−１，２−ジイル））トリカルバメート。
【０４７６】
ＤＭＦ（６ｍＬ）中の９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリアミン（２）（０．２５ｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｂｏｃ−Ｄ−ヒスチジン（０．６８ｇ、２．６７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．０１ｇ、２．６７ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．６９ｇ、５．３５ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、得られた残留物を濾過によって収集し、減圧下で乾燥させて、粗製の３（０．７５ｇ、８８．９％）を白色固体として得、これを精製することなく次のステップにおいて直接使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５３Ｈ６２Ｎ１２Ｏ９［ＭＨ］＋の計算値  １０１１．４８、実測値  １０１１．６。
【０４７７】
（２Ｒ，２’Ｒ，２’’Ｒ）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（２−アミノ−３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパンアミド）塩酸塩、ＡＲＫ−１２＿ＨＣｌ塩。
【０４７８】
ジクロロメタン（８ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｓ，２’Ｓ，２’’Ｓ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−オキソプロパン−１，２−ジイル））トリカルバメート（３）（０．７５ｇ、０．７４２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ（５ｍＬ）を０℃で添加した。得られた反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−１２を得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な生成物、ＡＲＫ−１２＿ＴＦＡ塩（０．７０ｇ、７２．５３％）を白色固体として得た。ＡＲＫ−１２の純粋な塩をＤＭ水（４ｍＬ）に溶解し、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００  −ＯＨ形イオン交換樹脂に通過させた。遊離塩基を、ＤＭ水を使用して溶出し、収集した画分を凍結乾燥して、遊離塩基（０．０６ｇ）を白色固体として得た。遊離塩基（０．０６ｇ）を１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（３ｍＬ）に溶解し、物質を凍結乾燥して、ＡＲＫ−１２の塩酸塩（０．０７ｇ、１０．１６％）を白色固体として生成した。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  8.54  ppm  (3H,  s),  7.50  ppm  (3H,  s),  7.37-7.35  ppm  (3H,  d,  J=8  Hz),  7.28  ppm  (3H,  S),  6.90-6.88  ppm  (3H,  dd,  J=7.6  Hz),  5.59  ppm  (1H,  s),  5.56  ppm  (1H,  s),  4.25-4.22  ppm  (3H,  t,  J=7.2  Hz  ),  3.33-3.31  ppm  (6H,  d,  J=7.2  Hz).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ３８Ｈ３８Ｎ１２Ｏ３［ＭＨ］＋の計算値  ７１１．３２、実測値  ６８４．６。ＨＰＬＣ保持時間：６．３４７分。
【０４７９】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４８０】
水中０．１％ＴＦＡ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）アセトニトリル中１０％ＩＰＡ
（ＨＰＬＣグレード）で、３５．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＷＡＴＥＲＳ  
Ｘ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍを使用：
【表１８】
2019523242.tif 000067
【０４８１】
（実施例９）
ＡＲＫ−７７およびＡＲＫ−７７Ａ（Ａｒｋ００００３３およびＡｒｋ００００３４）の
合成
【化５２】
2019523242.tif 000068
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）カルバメート、１０。
【０４８２】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中のＡＲＫ−２０（２．０ｇ、８．６１４ｍｍｏｌ）の溶液に、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（２．３４ｇ、６．８９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２．６２ｇ、６．８９ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．３３ｇ、２５．８４ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１０（３．５ｇ、９１．６％）を褐色半固体として得た。粗混合物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２２Ｈ３３Ｎ７Ｏ８Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ５５６．２１、実測値  ５７３．４３（Ｍ＋１８、水付加体）。
【０４８３】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エチル）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩、１１。
【０４８４】
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）カルバメート（１０）（３．５ｇ、６．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（３．１５ｍＬ、３１．５２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、こうして収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１１（４．３ｇ、定量的収率）を褐色油状物として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１７Ｈ２５Ｎ７Ｏ６Ｓ．ＴＦＡ［ＭＨ］＋の計算値  ４５６．１６、実測値  ４５６．３２。
【０４８５】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１２。
【０４８６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エチル）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩（１１）（１．２５ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（２，７，１５−トリス（８−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）プロパン酸（ＡＲＫ−１８）（２．０ｇ、１．８３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．８３３ｇ、２．１９２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．９４２ｇ、７．３１ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１２を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（３．２％メタノール／クロロホルム）により精製して、１２（２．３ｇ、８２．１７％）を暗黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７９Ｈ１１３Ｎ１３Ｏ１６Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５３２．８１、実測値  １４３３．１９（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０４８７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１３。
【０４８８】
アセトニトリル（３０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１２）（２．２ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（０．９９ｇ、７．１８ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（０．４４ｍＬ、４．３１ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１３を黄色油状物として得た。粗混合物を逆相クロマトグラフィーに供して、１３（１．１ｇ、５６．８８％）を薄黄色固体として得た。黄色固体を分取ＨＰＬＣ（下記の方法）精製、続いて凍結乾燥にさらに供して、純粋な１３（０．４１ｇ、５２．１７％）を白色アモルファス粉末として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７３Ｈ１１０Ｎ１２Ｏ１２［ＭＨ］＋の計算値  １３４７．８４、実測値  １３４９．２８。
【０４８９】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４９０】
（Ａ）水中１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）水（ＨＰＬＣグレード）中１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、以下の流速および勾配を用いるＸ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍを使用：
【表１９】
2019523242.tif 000069
【化５３】
2019523242.tif 000070
【０４９１】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０４９２】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．２ｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）の溶液に、１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−カルボン酸（弾頭＿タイプ＿１Ｂ）（０．０３９ｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０６８ｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０３８ｇ、０．２９７ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４を得た。粗混合物を分取ＨＰＬＣ（下記の方法）により精製し、続いて凍結乾燥して、１４（０．１２ｇ、５２．１７％）を白色アモルファス粉末として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８３Ｈ１１５Ｎ１３Ｏ１６［ＭＨ］＋の計算値  １５５０．８６、実測値  １４５２．４２（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０４９３】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４９４】
（Ａ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣグレード）で、１９．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＳＵＮＦＩＲＥシリカ、１５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２０】
2019523242.tif 000071
【０４９５】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−７７＿ＨＣｌ塩。
【０４９６】
１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０７９ｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ溶液（１．５ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。この間に、固体残留物が析出し始めた。懸濁液を３０分間さらに撹拌し、最後に室温で静置した。固体残留物がフラスコの底に堆積し始めた。溶媒をデカントし、残った残留物をアセトニトリル（３×３ｍＬ）で摩砕した。最後に、固体を減圧下、２５℃で乾燥させて、純粋なＡＲＫ−７７＿ＨＣｌ＿塩（０．０５４ｇ、６９．２８％）を白色アモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.91  ppm  (3H,  broad),  8.09-8.03  ppm  (1H,  m),  7.90  ppm  (8H,  broad),  7.67  ppm  (3H,  broad),  7.37-7.33  ppm  (2H,  m),  7.29-7.27  ppm  (3H,  m),  7.23  ppm  (3H,  m),  5.38  ppm  (1H,  s),  5.01  ppm  (1H,  m),  4.86-4.79  ppm  (1H,  m),  4.31-4.23  ppm  (1H,  m),  4.09  ppm  (1H,  m),  3.79-3.64  ppm  (4H,  m),  3.48  ppm  (14H,  m),  3.44-3.40  ppm  (4H,  m),  3.18  ppm  (1H,  s),  3.08-3.01  ppm  (6H,  m),  2.77-2.66  ppm  (7H,  m),  2.25  ppm  (6H,  broad  s),  1.53  ppm  (12H,  broad  s),  1.27  ppm  (18H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６８Ｈ９１Ｎ１３Ｏ１０［ＭＨ］＋の計算値  １２５０．７０、実測値  １２５１．４８。
【化５４】
2019523242.tif 000072
【０４９７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０４９８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．１５６ｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）の溶液に、２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボン酸（弾頭＿タイプ＿１Ａ）（０．０２９ｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０５３ｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０３ｇ、０．２３２ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４を得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な１４（０．０９３ｇ、５２．１７％）を白色アモルファス粉末として得た。分取画分を窒素雰囲気下、２５℃で減圧により濃縮した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８２Ｈ１１３Ｎ１３Ｏ１６［ＭＨ］＋の計算値  １５３６．８４、実測値  １４３７．４１（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０４９９】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５００】
（Ａ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％テトラヒド
ロフラン（ＨＰＬＣグレード）で、以下の流速および以下の勾配を用いるＳＵＮＦＩＲＥ
シリカ、１５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２１】
2019523242.tif 000073
【０５０１】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−７７Ａ＿ＨＣｌ塩。
【０５０２】
１，４−ジオキサン（乾燥）（３ｍｌ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０６ｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（１．２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。固体物質はフラスコの底で安定しており、溶媒を不活性雰囲気下でデカントし、次いで固体物質をアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）（３×３ｍＬ）で摩砕した。残った固体を窒素雰囲気下、２５℃で減圧により濃縮して、純粋なＡＲＫ−７７Ａ＿ＨＣｌ＿塩（０．０５４ｇ、６９．２８％）を白色アモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  12.04-11.95  ppm  (1H,  d),  9.91  ppm  (3H,  broad),  7.98-7.96  ppm  (1H,  m),  7.89  ppm  (7H,  broad),  7.71-7.67  ppm  (3H,  broad),  7.29-7.27  ppm  (4H,  d),  7.23  ppm  (3H,  broad),  5.38  ppm  (1H,  s),  5.03-5.01  ppm  (1H,  m),  4.86-4.79  ppm  (1H,  m),  4.30-4.23  ppm  (1H,  m),  4.07  ppm  (1H,  m),  3.76  ppm  (1H,  m),  3.35-3.44  ppm  (2H,  m),  3.17  ppm  (1H,  s),  3.08-3.04  ppm  (5H,  m),  2.99-2.84  ppm  (1H,  m),  2.79-2.68  ppm  (7H,  m),  2.25-2.23  ppm  (6H,  t),  1.53  ppm  (12H,  broad),  1.27  ppm  (18H,  broad).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６７Ｈ８９Ｎ１３Ｏ１０［ＭＨ］＋の計算値  １２３６．６９、実測値  １２３８．４６。
【０５０３】
（実施例１０）
ＡＲＫ−７８およびＡＲＫ−７８Ａ（Ａｒｋ００００３５およびＡｒｋ００００３７）の
合成
【化５５】
2019523242.tif 000074
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エトキシ）エチル）（メチル）カルバメート、１０。
【０５０４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中のＡＲＫ−２１（２．４ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（２．９６ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３．９６ｇ、１０．４２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．３６ｇ、２６．０５ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１０（４．０ｇ、７６．９％）を黄色粘性液体として得た。粗混合物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２４Ｈ３７Ｎ７Ｏ９  Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ６００．１８、実測値  ６１７．５（Ｍ＋１８）。
【０５０５】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）−１−（（２ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩、１１。
【０５０６】
ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｒ，２’Ｒ，２’’Ｒ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−オキソプロパン−１，２−ジイル））トリカルバメート（１０）（４．０ｇ、６．６７ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（２．５８ｍＬ、３３．３８ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、こうして収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１１（７．５ｇ、定量的収率）を褐色油状物として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１９Ｈ２９Ｎ７Ｏ７  Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ５００．１８、実測値  ５００．３１。
【０５０７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１２。
【０５０８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩（１１）（２．６９ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（２，７，１５−トリス（８−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）プロパン酸（ＡＲＫ−１８）（４．０ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．６７ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．４１ｇ、１０．９６ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１２を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（４．３％メタノール／クロロホルム）により精製して、１２（４．７ｇ、８１．６％）を暗黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８１Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１７Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５７６．８４、実測値  １５７８．４。
【０５０９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１３。
【０５１０】
アセトニトリル（５０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１２）（４．７ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（２．０６ｇ、１４．９１ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（０．９２ｍＬ、８．９５ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１３を黄色油状物として得た。粗混合物を逆相クロマトグラフィーに供して、１３（１．９ｇ、４５．８％）を薄黄色固体として得た。黄色固体を分取ＨＰＬＣ（下記の方法）精製、続いて凍結乾燥にさらに供して、純粋な１３（０．３４ｇ、８．２％）を白色アモルファス粉末として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５３Ｈ６２Ｎ１２Ｏ９［ＭＨ］＋の計算値  １３９１．８６、実測値  １３９２．３。
【０５１１】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５１２】
（Ａ）水中１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）水（ＨＰＬＣグレード）中１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、３０．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍを使用：
【表２２】
2019523242.tif 000075
【化５６】
2019523242.tif 000076
【０５１３】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５１４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチルトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．１４ｇ、０．１ｍｍｏｌ）の溶液に、１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−カルボン酸（弾頭＿タイプ＿１Ｂ）（０．０２７ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０４６ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０２６ｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．１ｇ、６２．５％）を薄黄色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ１３Ｏ１７［ＭＨ］＋の計算値  １５９４．８８、実測値  １４９６．６１（Ｍ−１００）。
【０５１５】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−７８＿ＨＣｌ塩。
【０５１６】
１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０６７ｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ溶液（１．５ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。この間に、固体残留物が析出し始めた。懸濁液を３０分間さらに撹拌し、最後に室温で静置した。固体残留物がフラスコの底に堆積し始めた。溶媒をデカントし、残った残留物をアセトニトリル（３×３ｍＬ）で摩砕した。最後に、固体を減圧下、２５℃で乾燥させて、純粋なＡＲＫ−７８＿ＨＣｌ＿塩（０．０４５ｇ、７６．３％）を白色アモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.91  ppm  (3H,  broad  s),  8.11-7.97  ppm  (1H,  m),  7.89  ppm  (8H,  broad  s),  7.66  ppm  (3H,  broad  s),  7.37-7.34  ppm  (2H,  broad  s),  7.29-7.22  ppm  (6H,  m),  5.39  ppm  (1H,  s),  4.97  ppm  (1H,  m),  4.82  ppm  (1H,  m),  4.28  ppm  (2H,  m),  4.03  ppm  (1H,  m),  3.74  ppm  (1H,  m),  3.64  ppm  (3H,  broad  s),  3.57  ppm  (12H,  broad  s),  3.50-3.47  ppm  (5H,  m),  3.15-3.03  ppm  (7H,  m),  2.90-2.85  ppm  (2H,  d),  2.75-2.72  ppm  (7H,  m),  2.25-2.23  ppm  (6H,  broad  s),  1.54  ppm  (12H,  broad  s),  1.27  ppm  (17H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７０Ｈ９５Ｎ１３Ｏ１１［ＭＨ］＋の計算値  １２９４．７３、実測値  １２９５．４１。
【化５７】
2019523242.tif 000077
【０５１７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５１８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．０７５ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボン酸（弾頭＿タイプ＿１Ａ）（０．０１３ｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０２４ｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０１４ｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４を得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な１４（０．０４ｇ、５２％）を白色アモルファス粉末として得た。分取画分を窒素雰囲気下、２５℃で減圧により濃縮した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８４Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１７［ＭＨ］＋の計算値  １５８０．８８、実測値  １４８１．７５（Ｍ−１００）。
【０５１９】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５２０】
（Ａ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣグレード）で、１６．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＳＵＮＦＩＲＥシリカ、１５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２３】
2019523242.tif 000078
【０５２１】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−７８Ａ＿ＨＣｌ塩。
【０５２２】
１，４−ジオキサン（ＡＲグレード）（２ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０４ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（１ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。固体物質はフラスコの底で安定しており、溶媒を不活性雰囲気下でデカントし、固体物質をアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）（３×３ｍＬ）で摩砕した。残った固体を窒素雰囲気下、２５℃で減圧により濃縮して、純粋なＡＲＫ−７８Ａ＿ＨＣｌ＿塩（０．０３２ｇ、９１．４３％）を白色アモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  11.99-11.95  ppm  (1H,  t),  9.91-9.90  ppm  (3H,  d),  8.01-7.94  ppm  (1H,  m),  7.87  ppm  (8H,  broad  s),  7.66  ppm  (3H,  broad  s),  7.32-7.22  ppm  (7H,  m),  7.16-7.11  ppm  (1H,  m),  5.39  ppm  (1H,  s),  4.99-4.95  ppm  (1H,  t),  4.83-4.82  ppm  (1H,  m),  4.29-4.22  ppm  (1H,  m),  4.15-3.98  ppm  (1H,  m),  3.76-3.71  ppm  (1H,  m),  3.64-3.61  ppm  (4H,  m),  3.52  ppm  (2H,  broad  s),  3.34-3.32  ppm  (2H,  m),  3.15  ppm  (2H,  m),  3.10-3.03  ppm  (7H,  m),  2.89-2.86  ppm  (1H,  d),  2.76-2.72  ppm  (7H,  m),  2.26-2.23  ppm  (6H,  t),  1.53  ppm  (12H,  broad  s),  1.27  ppm  (17H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６９Ｈ９３Ｎ１３Ｏ１１［ＭＨ］＋の計算値  １２８０．７１、実測値  １２８１．５０。
【０５２３】
（実施例１１）
ＡＲＫ−７９およびＡＲＫ−７９Ａ（Ａｒｋ００００３６およびＡｒｋ００００３８）の合成
【化５８】
2019523242.tif 000079
ｔｅｒｔ−ブチル（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２−メチル−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）（メチル）カルバメート、１０。
【０５２４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中のＡＲＫ−２２（３．１ｇ、９．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（３．９６ｇ、１１．６２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（４．４１４ｇ、１１．６２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．５ｇ、１９．３６ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１０（４ｇ、６４．２％）を黄色固体として得た。粗混合物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２６Ｈ４１Ｎ７Ｏ１０Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ６４４．２６、実測値  ５４４．３６（Ｍ＋１８）。
【０５２５】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｎ−（５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩、１１。
【０５２６】
ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２−メチル−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）（メチル）カルバメート（１０）（３ｇ、４．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１．８ｍＬ、２３．３２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、こうして収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１１（３．１ｇ、定量的収率）を暗黄色油状物として得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２１Ｈ３３Ｎ７Ｏ８Ｓ．ＴＦＡ［ＭＨ］＋の計算値  ５４４．２１、実測値  ５４４．４７。
【０５２７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１２。
【０５２８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｎ−（５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩（１１）（２．８８ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（２，７，１５−トリス（８−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）プロパン酸（ＡＲＫ−１８）（４．０ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．６７ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．３６ｇ、１８．２７ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１２を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（５．４％メタノール／クロロホルム）により精製して、１２（５．９ｇ、９９．７％）を暗黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８３Ｈ１２１Ｎ１３Ｏ１８Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １６２０．８７、実測値  １５２２．３１（Ｍ−１００；Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５２９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１３。
【０５３０】
アセトニトリル（６０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１２）（５．９ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（２．５１ｇ、１８．２１ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（１．１１ｍＬ、１０．９３ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１３を黄色油状物として得た。粗混合物を逆相クロマトグラフィーに供して、１３（１．９ｇ、３６．３％）を薄黄色固体として得た。黄色固体を分取ＨＰＬＣ（下記の方法）精製、続いて凍結乾燥にさらに供して、純粋な１３（０．５１ｇ、９．８％）を白色アモルファス粉末として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７７Ｈ１１８Ｎ１２Ｏ１４［ＭＨ］＋の計算値  １４３５．８９、実測値  １４３７．４１。
【０５３１】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５３２】
（Ａ）水（ＨＰＬＣグレード）中１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）水中１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ＨＰＬＣグレード）で、２２．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＧＲＡＣＥ  ＤＥＮＩＬ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×２５ｍｍ×５μｍを使用：
【表２４】
2019523242.tif 000080
【化５９】
2019523242.tif 000081
【０５３３】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５３４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．１ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の溶液に、１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−カルボン酸（弾頭＿タイプ＿１Ｂ）（０．０３９ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０１８ｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０１８ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４を得た。粗混合物を分取ＨＰＬＣ（下記の方法）により精製し、続いて凍結乾燥して、１４（０．０５３ｇ、４６．５％）を白色アモルファス粉末として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８７Ｈ１２３Ｎ１３Ｏ１８［ＭＨ］＋の計算値  １６３８．９１、実測値  １５４０．４０（Ｍ−１００）。
【０５３５】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５３６】
（Ａ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣグレード）で、１５．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＳＵＮＦＩＲＥシリカ、２５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２５】
2019523242.tif 000082
【０５３７】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−７９＿ＨＣｌ塩。
【０５３８】
１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０３５ｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ溶液（１ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。この間に、固体残留物が析出し始めた。懸濁液を３０分間さらに撹拌し、最後に室温で静置した。固体残留物がフラスコの底に堆積し始めた。溶媒をデカントし、残った残留物をアセトニトリル（３×３ｍＬ）で摩砕した。最後に、固体を減圧下、２５℃で乾燥させて、純粋なＡＲＫ−７９＿ＨＣｌ＿塩（０．０２５ｇ、８０．６％）を白色アモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.89  ppm  (3H,  broad  s),  8.10-8.08  ppm  (1H,  m),  7.89  ppm  (9H,  broad  s),  7.66  ppm  (3H,  broad  s),  7.38-7.37  ppm  (1H,  d),  7.33-7.22  ppm  (6H,  m),  5.38  ppm  (1H,  s),  4.95-4.90  ppm  (1H,  m),  4.25  ppm  (1H,  m),  4.06  ppm  (1H,  m),  3.75  ppm  (1H,  m),  3.63-3.57  ppm  (10H,  d),  3.38-3.33  ppm  (5H,  m),  3.10-3.04  ppm  (7H,  m),  2.88-2.84  ppm  (1H,  d),  2.74-2.72  ppm  (7H,  broad  s),  2.25-2.23  ppm  (6H,  t),  1.60-1.53  ppm  (12H,  d),  1.27  ppm  (18H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７２Ｈ９９Ｎ１３Ｏ１２［ＭＨ］＋の計算値  １３３８．７５、実測値  １３３９．５５。
【化６０】
2019523242.tif 000083
【０５３９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５４０】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．２ｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）の溶液に、２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボン酸（弾頭＿タイプ＿１Ａ）（０．０３５ｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０６４ｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０３６ｇ、０．２７９ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４を得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な１４（０．０４ｇ、１７．７％）をオフホワイトのアモルファス粉末として得た。分取画分を窒素雰囲気下、２５℃で減圧により濃縮した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８６Ｈ１２１Ｎ１３Ｏ１８［ＭＨ］＋の計算値  １６２４．８９、実測値  １５２５．７６（Ｍ−１００；Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５４１】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５４２】
（Ａ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣグレード）で、１８．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配、すなわち、２０分間の９８％Ａおよび２％を用いるＳＵＮＦＩＲＥシリカ、１５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用。
【０５４３】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−７９Ａ＿ＨＣｌ塩。
【０５４４】
１，４−ジオキサン（乾燥）（３ｍｌ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０４ｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（１．２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。固体物質はＲＢＦの底で安定しており、溶媒を不活性雰囲気下でデカントし、固体物質をアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）（３×３ｍＬ）で摩砕した。残った固体を窒素雰囲気下、２５℃で減圧により濃縮して、純粋なＡＲＫ−７９Ａ＿ＨＣｌ＿塩（０．０３３ｇ、９４．２８％）をオフホワイトのアモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  11.97-11.95  ppm  (1H,  d),  9.90  ppm  (3H,  broad  s),  8.02-7.98  ppm  (1H,  m),  7.88  ppm  (8H,  broad  s),  7.66  ppm  (3H,  broad  s),  7.32-7.22  ppm  (7H,  m),  7.16-7.08  ppm  (1H,  m),  5.39  ppm  (1H,  s),  4.96-4.91  ppm  (1H,  m),  4.80  ppm  (1H,  m),  4.28-4.20  ppm  (1H,  m),  4.05  ppm  (1H,  m),  3.75-3.73  ppm  (1H,  m),  3.64  ppm  (3H,  broad  s),  3.57  ppm  (11H,  broad  s),  3.54  ppm  (2H,  m),  3.39-3.38  ppm  (2H,  m),  3.34-3.32  ppm  (3H,  d),  3.16  ppm  (2H,  broad  s),  3.08-3.02  ppm  (8H,  m),  2.87-2.83  ppm  (1H,  d),  2.76-2.68  ppm  (7H,  m),  2.27-2.23  ppm  (6H,  t),  1.60-1.53  ppm  (12H,  broad  s),  1.27  ppm  (18H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７１Ｈ９７Ｎ１３Ｏ１２［ＭＨ］＋の計算値  １３２４．７４、実測値  １３２５．５０。
【０５４５】
（実施例１２）
ＡＲＫ−８０、ＡＲＫ−８９、ＡＲＫ−１２５（Ａｒｋ００００２４、Ａｒｋ００００２
７およびＡｒｋ００００３０）の合成
【化６１】
2019523242.tif 000084
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）カルバメート、１０。
【０５４６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中のＡＲＫ−２０（１．０ｇ、４．３０７ｍｍｏｌ）の溶液に、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（１．１７ｇ、３．４４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．９６ｇ、５．１７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．６７ｇ、１２．９２ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１０（２．５２ｇ、定量的収率）を褐色半固体として得た。粗混合物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２２Ｈ３３Ｎ７Ｏ８Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ５５６．２１、実測値  ５７３．４３（Ｍ＋１８）。
【０５４７】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エチル）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩、１１。
【０５４８】
ジクロロメタン（１５ｍＬ）中のトリｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）カルバメート（１０）（２．５ｇ、４．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１．７２ｍＬ、２２．５１ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、こうして収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１１（４．１２ｇ、定量的収率）を褐色油状物として得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１７Ｈ２５Ｎ７Ｏ６Ｓ．ＴＦＡ［ＭＨ］＋の計算値  ４５６．１６、実測値  ４５６．３２。
【０５４９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１２。
【０５５０】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エチル）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩（１１）（１．７５ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（２，７，１５−トリス（８−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）プロパン酸（ＡＲＫ−１８）（２．８ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．１７ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６６ｇ、５．１２ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１２を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（１．５％メタノール／クロロホルム）により精製して、１２（１．４８ｇ、３７．８％）を暗黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７９Ｈ１１３Ｎ１３Ｏ１６Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５３２．８１、実測値  １４３３．１９（Ｍ−１００；Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５５１】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１３。
【０５５２】
アセトニトリル（１５ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１２）（１．４８ｇ、０．９７ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（０．６７ｇ、４．８３ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（０．３ｍＬ、２．８９ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１３を黄色油状物として得た。粗混合物を逆相クロマトグラフィーに供して、１３（０．７６ｇ、５８．４％）を薄黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７３Ｈ１１０Ｎ１２Ｏ１２［ＭＨ］＋の計算値  １３４７．８４、実測値  １３４９．２８。
【化６２】
2019523242.tif 000085
【０５５３】
ペルフルオロフェニル２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセテート、中間体−Ａ。
【０５５４】
テトラヒドロフラン（１ｍＬ）中の弾頭−２（０．０４ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．０３５ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、０℃で添加した。反応混合物を０℃で１０分間撹拌した。これに、テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）中のペンタフルオロフェノール（０．０３ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下、０℃で滴下添加した。得られた反応混合物を０℃で１時間さらに撹拌した。反応混合物を、後処理および単離をすることなく次のステップにおいて直接使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１７Ｈ８Ｆ５ＮＯ６［ＭＨ］＋の計算値  ４１８．０３、この化合物は質量の応答を示さなかった。注記：中間体−Ａを単離せず−  反応塊をそのまま次のステップの反応塊に移した。
【０５５５】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５５６】
テトラヒドロフラン（４ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．２７ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、ペンタフルオロフェニル［（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−イル）オキシ］アセテート（弾頭＿タイプ＿２）（０．０７１ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製の１４（０．３８ｇ、定量的収率）を黄色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８４Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１７［ＭＨ］＋の計算値  １５８０．８７、実測値  １４８２．２９（Ｍ−１００；Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５５７】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−８０＿ＨＣｌ塩。
【０５５８】
テトラヒドロフラン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．３８ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ溶液（２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で４時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−８０＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−８０＿ＨＣｌ塩（０．０１２ｇ、３．６％）を白色アモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.93-9.91  ppm  (3H,  broad  s),  7.92-7.85  ppm  (10H,  broad  s),  7.65  ppm  (4H,  broad  s),  7.40  ppm  (2H,  broad  s),  7.27-7.15  ppm  (8H,  m),  6.87-6.71  ppm  (3H,  m),  6.54  ppm  (1H,  s),  5.36  ppm  (1H,  s),  5.10-5.02  ppm  (3H,  m),  4.83  ppm  (2H,  m),  4.66-4.56  ppm  (2H,  m),  4.39-4.28  ppm  (2H,  m),  4.06-4.01  ppm  (2H,  m),  3.58-3.55  ppm  (4H,  m),  3.47-3.41  ppm  (7H,  m),  3.13-2.94  ppm  (9H,  m),  2.71-2.66  ppm  (8H,  m),  2.22  ppm  (7H,  broad  s),    1.52-1.50  ppm  (12H,  d),  1.26  ppm  (18H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６９Ｈ９３Ｎ１３Ｏ１１［ＭＨ］＋の計算値  １２８０．７１、実測値  １２８１．４３。
【０５５９】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５６０】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、１９．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ−ＢＲＩＤＧＥ、２５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２６】
2019523242.tif 000086
【化６３】
2019523242.tif 000087
【０５６１】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５６２】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．３１ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパン酸（０．０４３ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０７０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０３６ｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．４５ｇ、定量的収率）を暗黄色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８２Ｈ１１７ＦＮ１２Ｏ１５Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５６１．８５、実測値  １４６３．４５（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５６３】
Ｎ，Ｎ’Ｎ’’−（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−８９＿ＨＣｌ塩。
【０５６４】
１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．４５ｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（２ｍＬ）を室温で添加した。得られた反応混合物を４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−８９＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−８９＿ＨＣｌ塩（０．０５３ｇ、１２．８％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.95  ppm  (3H,  broad  s),  8.03-7.95  ppm  (10H,  m),  7.67-7.62  ppm  (5H,  m),  7.28-7.21  ppm  (6H,  m),  5.38  ppm  (1H,  s),  4.77    ppm  (0.5H,  m),  4.59-4.49  ppm  (1H,  m),  4.31-4.21  ppm  (1H,  m),  4.02-3.96  ppm  (2H,  m),  3.62-3.44  ppm  (6H,  m),  3.22-3.03  ppm  (8H,  m),  2.98-2.88  ppm  (4H,  m),  2.74-2.60  ppm  (10H,  m),  2.24-2.23  ppm  (7H,  t),  1.53-1.52  ppm  (12H,  d),  1.26  ppm  (18H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６７Ｈ９３ＦＮ１２Ｏ９Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １２６１．７０、実測値  １２６２．３１。
【０５６５】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５６６】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、以下の勾配を用いるＸ−ＳＥＬＥＣＴ  ＦＰ、２５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２７】
2019523242.tif 000088
【化６４】
2019523242.tif 000089
【０５６７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５６８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．３０ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の溶液に、４−フルオロスルホニル安息香酸（０．０５４ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．１０１ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０７９ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．３８８ｇ、定量的収率）を黄色半固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８０Ｈ１１３ＦＮ１２Ｏ１５Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５３２．８１、実測値  １４３４．３５（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５６９】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−１２５＿ＨＣｌ塩。
【０５７０】
１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．３８ｇ、０．００２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−１２５＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−１２５＿ＨＣｌ＿塩（０．１１０ｇ、３３．０％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.96-9.93  ppm  (3H,  broad  s),  8.24-8.21  ppm  (2H,  m),  7.97  ppm  (8H,  broad  s),  7.87-7.82  ppm  (2H,  m),  7.71-7.68  ppm  (3H,  m),  7.32-7.19  ppm  (6H,  m),  5.38  ppm  (1H,  s),  5.05-5.01  ppm  (1H,  m),  4.87-4.80  ppm  (1H,  m),  4.30-4.20  ppm  (1H,  m),  3.89  ppm  (18H,  broad  s),  3.70-3.55  ppm  (5H,  m),  3.48-3.38  ppm  (3H,  m),  3.18  ppm  (1H,  s),  3.08-3.04  ppm  (6H,  m),  2.79-2.68  ppm  (7H,  m),  2.25  ppm  (6H,  broad  s),    1.54-1.52  ppm  (12H,  d),  1.26  ppm  (18H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６５Ｈ８９ＦＮ１２Ｏ９Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １２３３．６５、実測値  １２３４．３４。
【０５７１】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５７２】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、１９．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ−ＳＥＬＥＣＴ  ＦＰ、２５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２８】
2019523242.tif 000090
【０５７３】
（実施例１３）
ＡＲＫ−８１、ＡＲＫ−９０およびＡＲＫ−１２６（Ａｒｋ００００２５、Ａｒｋ００００２８およびＡｒｋ００００３１）の合成
【化６５】
2019523242.tif 000091
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エトキシ）エチル）（メチル）カルバメート、１０。
【０５７４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）中のＡＲＫ−２１（０．９ｇ、３．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（１．３３ｇ、３．９１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．４ｇ、３．９１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．８５ｇ、６．５２ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１０（１．５ｇ、７８．９％）を褐色半固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２４Ｈ３７Ｎ７Ｏ９  Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ６００．１８、実測値  ６１７．５（Ｍ＋１８）。
【０５７５】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）−１−（（２ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩、１１。
【０５７６】
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｒ，２’Ｒ，２’’Ｒ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−オキソプロパン−１，２−ジイル））トリカルバメート（１０）（１．５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．９６ｍＬ、１２．５２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、こうして収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１１（１．４ｇ、９１．５０％）を褐色油状物として得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１９Ｈ２９Ｎ７Ｏ７  Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ５００．１８、実測値  ５００．３１。
【０５７７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１２。
【０５７８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩（１１）（０．５６ｇ、０．９１ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（２，７，１５−トリス（８−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）プロパン酸（ＡＲＫ−１８）（０．５ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．４４ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１２ｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１２を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（１．５％メタノール／クロロホルム）により精製して、１２（０．６ｇ、８４．５％）を褐色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８１Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１７Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５７６．８４、実測値  １５７８．４。
【０５７９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１３。
【０５８０】
アセトニトリル（１０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１２）（０．６ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（０．２６ｇ、１．９０ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（０．１２ｍＬ、１．１４ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１３を黄色油状物として得た。粗混合物を逆相クロマトグラフィーに供して、１３（０．４ｇ、８４．９％）を薄黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５３Ｈ６２Ｎ１２Ｏ９［ＭＨ］＋の計算値  １３９１．８６、実測値  １３９２．３。
【化６６】
2019523242.tif 000092
【０５８１】
ペルフルオロフェニル２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセテート、中間体−Ａ。
【０５８２】
テトラヒドロフラン（１ｍＬ）中の弾頭−２（０．０４８ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．０３７ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、０℃で添加した。反応混合物を０℃で１０分間撹拌した。これに、テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）中のペンタフルオロフェノール（０．０３６ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下、０℃で滴下添加した。得られた反応混合物を０℃で１時間さらに撹拌した。反応混合物を、後処理および単離をすることなく次のステップにおいて直接使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１７Ｈ８Ｆ５ＮＯ６［ＭＨ］＋の計算値  ４１８．０３、この化合物は質量の応答を示さなかった。注記：中間体−Ａを単離せず−  反応塊をそのまま次のステップの反応塊に移した。
【０５８３】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５８４】
テトラヒドロフラン（４ｍＬ）中の（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．２７ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、ペンタフルオロフェニル［（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−イル）オキシ］アセテート（弾頭＿タイプ＿２＿中間体＿Ａ）（０．０８１ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製の１４（０．３ｇ、８０．２１％）を褐色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８６Ｈ１２１Ｎ１３Ｏ１８［ＭＨ］＋の計算値  １６２３．８９、実測値  １５２５．４６（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５８５】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−８１＿ＨＣｌ塩。
【０５８６】
テトラヒドロフラン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．３ｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ溶液（２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で４時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−８１＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−８１＿ＨＣｌ塩（０．０３４ｇ、１２．８％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ    9.94  ppm  (3H,  br  S),  7.79-7.86  ppm  (8H,  m),  7.66  ppm  (2H,  S),  7.43  ppm  (1H,  S),  7.31-7.18  ppm  (7H,  m),  6.88-6.82  ppm  (1H,  m),  6.78-6.76  ppm  (1H,  m),  5.38  ppm  (1H,  S),  5.11-5.02  ppm  (1H,  m),  4.80  ppm  (1H,  br  S),  4.36-4.31  ppm  (1H,  m),  4.03-4.01  ppm  (1H,  m),  3.62-3.42  ppm  (15H,  m),  3.37-3.26  ppm  (4H,  m),  3.16  ppm  (1H,  s),  3.05-2.99  ppm  (5H,  m),  2.89  ppm  (1H,  s),  2.81-2.71  ppm  (7H,  m),  2.24  ppm  (6H,  S),  1.53-1.52  ppm  (12H,  d),  1.26  ppm  (18H,  S).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７１Ｈ９７Ｎ１３Ｏ１２［ＭＨ］＋の計算値  １３２３．７４、実測値  １３２５．４。
【０５８７】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５８８】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、１９．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ−ＳＥＬＥＣＴ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２９】
2019523242.tif 000093
【化６７】
2019523242.tif 000094
【０５８９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５９０】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．４ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパン酸（０．０７ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．１３ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０８ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．４ｇ、８７％）を褐色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８４Ｈ１２１ＦＮ１２Ｏ１６Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １６０５．８８、実測値  １５０６．５（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５９１】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−９０＿ＨＣｌ塩。
【０５９２】
１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．４ｇ、０．００２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（２ｍＬ）を室温で添加した。得られた反応混合物を４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−９０＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−９０＿ＨＣｌ塩（０．０３５ｇ、７．１１％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO)  δ  9.89  ppm  (3H,  broad  s),  8.03-8.00  ppm  (2H,  t),  7.66-7.56  ppm  (5H,  m),  7.29-7.20  ppm  (6H,  m),  5.33  (1H,  s),  3.62-3.52ppm  (6H,  m)  3.49-3.44  ppm  (3H,  m),  3.44-3.02  ppm  (6H,  m),  3.05-2.99  ppm  (8H,  m),  2.93  ppm  (3H,  broad  s),2.76-2.70  ppm  (10H,  m),  2.23(6H,  s),  1.519  (14H,  s),  1.52  (21H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６８Ｈ９５ＦＮ１２Ｏ１０Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １３０４．７２、実測値  １３０６．３。ＨＰＬＣ保持時間：１０．８９４分。
【０５９３】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５９４】
水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、３５．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＷＡＴＥＲＳ  Ｘ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍを使用：
【表３０】
2019523242.tif 000095
【化６８】
2019523242.tif 000096
【０５９５】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５９６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．１ｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の溶液に、４−フルオロスルホニル安息香酸（０．０１８ｇ、０．０９ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０３３ｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０１８ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．１２ｇ、定量的収率）を黄色半固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８２Ｈ１１７ＦＮ１２Ｏ１６Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５７７．８４、実測値  １４７８．４６（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５９７】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−１２６＿ＨＣｌ塩。
【０５９８】
１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．１２ｇ、０．０００７ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−１２６＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−１２６＿ＨＣｌ＿塩（０．０３ｇ、２８．５７％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO)  δ  9.93-9.91  ppm  (3H,  broad  s),  8.26-8.13  ppm  (2H,  m),  7.87  ppm  (9H,  broad  s),  7.78-7.76  ppm  (1H,  d),  7.67  ppm  (3H,  broad  s),  7.29-7.22  ppm  (6H,  m),  5.39  ppm  (1H,  s),  5.010-4.969  ppm  (0.5H,  t),  4.86-4.82  ppm  (0.5H,  m),  4.72-4.60  ppm  (1H,  m),  4.44-4.36  ppm  (1H,  m),  4.30-4.21  ppm  (1H,  m),  4.14-4.00  ppm  (1H,  m),  3.64-3.61  ppm  (20H,  m)  3.48-3.37  ppm  (6H,  m),  3.19-3.11  ppm  (3H,  m),  3.07-3.03  ppm  (5H,  m),  2.89-2.84  ppm  (2H,  broad  s),  2.76  -2.68  ppm  (7H,  m),  2.26-2.23  ppm  (6H,  t),  1.53  ppm  (12H,  s),  1.27  ppm  (18H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６７Ｈ９３ＦＮ１２Ｏ１０Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １２７７．６８、実測値  １２７８．３５。
【０５９９】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０６００】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリ
ル（ＨＰＬＣグレード）で、１９．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＳＵＦＩＲＥ
Ｃ１８、１５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表３１】
2019523242.tif 000097
【０６０１】
（実施例１４）
ＡＲＫ−８２、ＡＲＫ−９１およびＡＲＫ−１２７（Ａｒｋ００００２６、Ａｒｋ００００２９およびＡｒｋ００００３２）の合成
【化６９】
2019523242.tif 000098
ｔｅｒｔ−ブチル（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２−メチル−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）（メチル）カルバメート、１０。
【０６０２】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中のＡＲＫ−２２（０．４１ｇ、１．２８１ｍｍｏｌ）の溶液に、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（０．５２ｇ、１．５４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．５８４ｇ、１．５４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３３ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１０（０．８ｇ、９７．２％）を褐色半固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２６Ｈ４１Ｎ７Ｏ１０Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ６４４．２６、実測値  ５４４．３６（Ｍ−１００）。
【０６０３】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｎ−（５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩、１１。
【０６０４】
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２−メチル−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）（メチル）カルバメート（１０）（０．８ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．４８ｍＬ、６．２１ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、こうして収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１１（１．０５ｇ、定量的収率）を褐色油状物として得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２１Ｈ３３Ｎ７Ｏ８Ｓ．ＴＦＡ［ＭＨ］＋の計算値  ５４４．２１、実測値  ５４４．４７。
【０６０５】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１２。
【０６０６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｎ−（５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩（１１）（０．６５ｇ、０．９８ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（２，７，１５−トリス（８−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）プロパン酸（ＡＲＫ−１８）（０．９ｇ、０．８２２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．３７５ｇ、０．９８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２１ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１２を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（１．５％メタノール／クロロホルム）により精製して、１２（１．７２ｇ、定量的収率）を褐色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８３Ｈ１２１Ｎ１３Ｏ１８Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １６２０．８７、実測値  １５２２．３１（Ｍ−１００）。
【０６０７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１３。
【０６０８】
アセトニトリル（６０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１２）（０．７ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（０．２９ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（０．１３ｍＬ、１．２９６ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１３を黄色油状物として得た。粗混合物を逆相クロマトグラフィーに供して、１３（０．３９ｇ、６２．９％）を薄黄色固体として得た。粗製物をｎ−ペンタンによる摩砕により精製して（未反応のチオフェノールを除去した）、１３（０．３９ｇ、６２．９％）を黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７７Ｈ１１８Ｎ１２Ｏ１４［ＭＨ］＋の計算値  １４３５．８９、実測値  １４３７．４１。
【化７０】
2019523242.tif 000099
【０６０９】
ペルフルオロフェニル２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセテート、中間体−Ａ。
【０６１０】
テトラヒドロフラン（１ｍＬ）中の弾頭−２（０．０５５ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．０４７ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、０℃で添加した。反応混合物を０℃で１０分間撹拌した。これに、テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）中のペンタフルオロフェノール（０．０４ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下、０℃で滴下添加した。得られた反応混合物を０℃で１時間さらに撹拌した。反応混合物を、後処理および単離をすることなく次のステップにおいて直接使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１７Ｈ８Ｆ５ＮＯ６［ＭＨ］＋の計算値  ４１８．０３、この化合物は質量の応答を示さなかった。注記：中間体−Ａを単離せず−  反応塊をそのまま次のステップの反応塊に移した。
【０６１１】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０６１２】
テトラヒドロフラン（４ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．３ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、ペンタフルオロフェニル［（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−イル）オキシ］アセテート（弾頭＿タイプ＿２）（０．０８７ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製の１４（０．５４ｇ、定量的収率）を褐色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８８Ｈ１２５Ｎ１３Ｏ１９［ＭＨ］＋の計算値  １６６８．９２、実測値  １５７０．４１（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０６１３】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−８２＿ＨＣｌ塩。
【０６１４】
テトラヒドロフラン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．５４ｇ、０．００３２ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ溶液（２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で４時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−８２＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−８１＿ＨＣｌ塩（０．０４９ｇ、１０．２％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.95  ppm  (3H,  br  S),  7.99  ppm  (8H,  broad  s),  7.90-7.88  ppm  (2H,  d),  7.66  ppm  (3H,  broad  s),  7.46  ppm  (2H,  broad  s),  7.33  ppm  (2H,  broad  s),  7.28-7.25  ppm  (5H,  m),  7.23-7.21  ppm  (2H,  d),  6.89-6.85  ppm  (1H,  m),  6.78-6.76  ppm  (1H,  m),  6.55  ppm  (2H,  broad  s),  5.38  ppm  (1H,  s),  5.12-5.00  ppm  (2H,  m),  4.77  ppm  (1H,  m),  4.37-4.34  ppm  (3H,  m),  4.06-4.05  ppm  (1H,  m),  3.82  ppm  (1H,  m),  3.63-3.43  ppm  (15H,  m),  3.09-3.01  ppm  (7H,  m),  2.96-2.94  ppm  (1H,  d),  2.82-2.80  ppm  (1H,  d),  2.76-2.64  ppm  (7H,  m),  2.24  ppm  (7H,  broad  s),  1.54-1.52  ppm  (12H,  d),  1.26  ppm  (18H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７３Ｈ１０１Ｎ１３Ｏ１３［ＭＨ］＋の計算値  １３６８．７６、実測値  １３７０．２５。
【０６１５】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０６１６】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、２０．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＫＩＮＥＴＥＸビフェニル、２５０ｍｍ×２１．２ｍｍ×５μｍを使用：
【表３２】
2019523242.tif 000100
【化７１】
2019523242.tif 000101
【０６１７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０６１８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．３０ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパン酸（００．０５８ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０９５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０５４ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．５５ｇ、定量的収率）を褐色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８６Ｈ１２５ＦＮ１２Ｏ１７Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １６４９．８９、実測値  １５５１．２９（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０６１９】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−９１＿ＨＣｌ塩。
【０６２０】
１，４−ジオキサン（９．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．５５ｇ、０．００３３ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（４ｍＬ）を室温で添加した。得られた反応混合物を４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−９１＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−９１＿ＨＣｌ塩（０．０９ｇ、１８．５％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.94  ppm  (3H,  broad  s),  8.04-8.00  ppm  (2H,  m),  7.96  ppm  (6H,  broad  s),  7.66  ppm  (4H,  broad  s),  7.62-7.52  ppm  (1H,  m),  7.31-7.18  ppm  (6H,  broad  s),  5.38  ppm  (1H,  s),  4.71-4.66  ppm  (1H,  m),  4.25  ppm  (9H,  m),  3.40-3.99  ppm  (1H,  m),  3.63-3.49  ppm  (9H,  m),  3.44-3.35  ppm  (5H,  m),  3.31-3.24  ppm  (2H,  m),  3.16-3.15  ppm  (2H,  m),  3.09-3.00  ppm  (6H,  m),  2.95-2.91  ppm  (3H,  m),  2.77-2.69  ppm  (7H,  m),  2.26-2.23  ppm  (6H,  t),  1.54-1.52  ppm  (12H,  d),  1.26  ppm  (18H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７１Ｈ１０１ＦＮ１２Ｏ１１Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １３４９．７４、実測値  １３５０．３８。
【０６２１】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０６２２】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、２３．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ−ＳＥＬＥＣＴ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×３０ｍｍ、５μｍを使用：
【表３３】
2019523242.tif 000102
【化７２】
2019523242.tif 000103
【０６２３】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０６２４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．０５ｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の溶液に、４−フルオロスルホニル安息香酸（０．０９ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０１６ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０９ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．０７５ｇ、定量的収率）を黄色半固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８４Ｈ１２１ＦＮ１２Ｏ１７Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １６２１．８７、実測値  １５２３．４７（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０６２５】
４−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−２−（メチル（１２−メチル−１３−オキソ−１５−（２，７，１５−トリス（８−アミノオクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）−３，６，９−トリオキサ−１２−アザペンタデシル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）ベンゼンスルホニルフルオリド、ＡＲＫ−１２７＿ＨＣｌ塩。
【０６２６】
１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０７５ｇ、０．０００５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（１ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−１２７＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−１２７＿ＨＣｌ＿塩（０．０１４ｇ、２１．２％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.89  ppm  (3H,  broad  s),  8.26-8.22  ppm  (1H,  m),  8.16  ppm  (1H,  m),  7.89-7.85  ppm  (9H,  m),  7.75  ppm  (1H,  m),  7.69-7.66  ppm  (3H,  m),  7.29-7.22  ppm  (5H,  m),  5.38  ppm  (1H,  s),  4.99-4.87  ppm  (2H,  m),  4.39-4.38  ppm  (1H,  m),  4.28-4.16  ppm  (1H,  m),  4.05-4.02  ppm  (1H,  m),  3.81-3.74  ppm  (1H,  m),  3.64-3.52  ppm  (9H,  m),  3.38-3.28  ppm  (7H,  m),  3.17-2.99  ppm  (8H,  m),  2.76-2.65  ppm  (8H,  m),  2.34-2.23  ppm  (5H,  t),  1.54  ppm  (11H,  broad  s),  1.27  ppm  (18H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６９Ｈ９７ＦＮ１２Ｏ１１Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １３２１．７１、実測値  １３２２．４２。
【０６２７】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０６２８】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、２０．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＳＵＮＦＩＲＥ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表３４】
2019523242.tif 000104
【０６２９】
（実施例１５）
ＣＰＮＱ類似体および他のキノリンベースのリガンドの調製
ＣＰＮＱおよび他のキノリン骨格に基づく例示的な小分子リガンドを、図６３〜７１に示す合成スキームに基づいて調製した。調製した化合物に関する分析データを以下の表５に示す。
【表５−１】
2019523242.tif 000105
【表５−２】
2019523242.tif 000106
【表５−３】
2019523242.tif 000107
【表５−４】
2019523242.tif 000108
【０６３０】
（実施例１６）
例示的な化合物データ
調製を上記した化合物に関する追加データ、ならびにさらなる例示的な化合物の構造を、以下の表６に示す。
【表６−１】
2019523242.tif 000109
【表６−２】
2019523242.tif 000110
【表６−３】
2019523242.tif 000111
【表６−４】
2019523242.tif 000112
【表６−５】
2019523242.tif 000113
【表６−６】
2019523242.tif 000114
【表６−７】
2019523242.tif 000115
【表６−８】
2019523242.tif 000116
【表６−９】
2019523242.tif 000117
【表６−１０】
2019523242.tif 000118
【表６−１１】
2019523242.tif 000119
【表６−１２】
2019523242.tif 000120
【表６−１３】
2019523242.tif 000121
【表６−１４】
2019523242.tif 000122
【表６−１５】
2019523242.tif 000123
【表６−１６】
2019523242.tif 000124
【表６−１７】
2019523242.tif 000125
【表６−１８】
2019523242.tif 000126
【表６−１９】
2019523242.tif 000127
【表６−２０】
2019523242.tif 000128
【表６−２１】
2019523242.tif 000129
【表６−２２】
2019523242.tif 000130
【表６−２３】
2019523242.tif 000131
【表６−２４】
2019523242.tif 000132
【表６−２５】
2019523242.tif 000133
【表６−２６】
2019523242.tif 000134
【表６−２７】
2019523242.tif 000135
【表６−２８】
2019523242.tif 000136
【表６−２９】
2019523242.tif 000137
【表６−３０】
2019523242.tif 000138
【表６−３１】
2019523242.tif 000139
【表６−３２】
2019523242.tif 000140
【表６−３３】
2019523242.tif 000141
【表６−３４】
2019523242.tif 000142
【表６−３５】
2019523242.tif 000143
【表６−３６】
2019523242.tif 000144
【表６−３７】
2019523242.tif 000145
【表６−３８】
2019523242.tif 000146
【表６−３９】
2019523242.tif 000147
【表６−４０】
2019523242.tif 000148
【表６−４１】
2019523242.tif 000149
【表６−４２】
2019523242.tif 000150
【表６−４３】
2019523242.tif 000151
【表６−４４】
2019523242.tif 000152
【表６−４５】
2019523242.tif 000153
【表６−４６】
2019523242.tif 000154
【表６−４７】
2019523242.tif 000155
【表６−４８】
2019523242.tif 000156
【表６−４９】
2019523242.tif 000157
【表６−５０】
2019523242.tif 000158
【表６−５１】
2019523242.tif 000159
【表６−５２】
2019523242.tif 000160
【表６−５３】
2019523242.tif 000161
【表６−５４】
2019523242.tif 000162
【表６−５５】
2019523242.tif 000163
【表６−５６】
2019523242.tif 000164
【表６−５７】
2019523242.tif 000165
【表６−５８】
2019523242.tif 000166
【表６−５９】
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【表６−６０】
2019523242.tif 000168
【表６−６１】
2019523242.tif 000169
【表６−６２】
2019523242.tif 000170
【表６−６３】
2019523242.tif 000171
【表６−６４】
2019523242.tif 000172
【表６−６５】
2019523242.tif 000173
【表６−６６】
2019523242.tif 000174
【表６−６７】
2019523242.tif 000175
【表６−６８】
2019523242.tif 000176
【表６−６９】
2019523242.tif 000177
【表６−７０】
2019523242.tif 000178
【表６−７１】
2019523242.tif 000179
【表６−７２】
2019523242.tif 000180
【表６−７３】
2019523242.tif 000181
【表６−７４】
2019523242.tif 000182
【表６−７５】
2019523242.tif 000183
【表６−７６】
2019523242.tif 000184
【０６３１】
（実施例１７）
調製したＲＮＡ配列
化合物結合の試験（予測される結合様式の検証、またはそれが公知でない場合は結合様式の同定を含む）および本発明の方法の立証において使用するために以下のＲＮＡ配列を設計し、調製した。
【表７−１】
2019523242.tif 000185
【表７−２】
2019523242.tif 000186
【表７−３】
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【表７−４】
2019523242.tif 000188
【表７−５】
2019523242.tif 000189
【０６３２】
（実施例１８）
蛍光消光による結合アッセイ
このアッセイは、ＲＮＡ三方向ジャンクション（３８ｎｔ構築物など）について化合物の結合を試験するために使用する。これは、蛍光タグとしてＦＡＭを、消光剤としてアイオワブラックを利用する蛍光消光アッセイである。タグはそれぞれ３’末端および５’末端に結合させる。化合物結合時の３ＷＪの安定な形成は、アイオワブラックタグとの近接性に起因してＦＡＭ蛍光の消光に繋がる。アッセイの読み取り：ＦＡＭ（４８５〜５２０ｎｍ）蛍光強度。
【０６３３】
核酸ジャンクションは遍在的な構造モチーフであり、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方で起こる。それらは、複製および組換えなどの生物学的プロセスにおいて重要な、そして時には一過性の構造を表すが、いくつかの神経変性疾患に関連するトリプレットリピート伸長においても起こる。核酸ジャンクションはウイルスゲノム中に遍在しており、リボスイッチにおける重要な構造モチーフである。三方向ジャンクションは、多くのナノ構造、ソフトマテリアル、多重発色団集合体、およびアプタマーベースのセンサー中に存在する鍵となる構成要素である。アプタマーベースのセンサーの場合、ＤＮＡ三方向ジャンクションは重要な構造モチーフとしてはたらく。
【０６３４】
このアッセイは、容易に観察可能な読み取りを用いる制御された系の文脈で３ＷＪへの結合を試験することによってＲＮＡ結合性小分子を発見するためのツールキットの一部分としてはたらくことができる。次いで、本明細書中に開示したＰＥＡＲＬ−ｓｅｑまたはその他の方法を使用して、化合物をさらにスクリーニングし得る。
【０６３５】
使用したアッセイ試料緩衝液：１０ｍＭ  ＣａｃｏＫ  ｐＨ７．２、３０ｍＭ  ＮａＣｌ。Ｄｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅフリーの蒸留水中の緩衝液調製物（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０６３６】
化合物の調製
乾燥粉末として提供されるツール化合物を１００％  ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭストック溶液として調製する。ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭ濃度のストック溶液を室温で貯蔵する。
【０６３７】
ハードウェア
サンプルプレート：Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８４０７６、黒、３８４（希釈プレート：Ｇｒｅｉｎｅｒ、製品番号７８１１０１、ＰＳ−Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、３８４ウェル、透明）。蛍光強度デバイス：Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  １０４０２８５
【０６３８】
アッセイプロトコール
アッセイ緩衝液の調製
毎日交換（１０ｍｌ）：１ｍｌ  １００ｍＭ  ＣａｃｏＫ  ｐＨ７．２および０．３ｍｌ  １Ｍ  ＮａＣｌ、Ｄｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅフリーの蒸留水で１０ｍｌまで満たす。
【０６３９】
ＲＮＡの調製（ＲＮＡ試料の均質化）
アッセイ緩衝液中、ＲＮＡを１：１０（最終１０μＭ）に希釈する。
【０６４０】
希釈したＲＮＡを５分間、９０℃まで加熱する（密封したエッペンドルフチューブ）。
【０６４１】
ＲＮＡプローブをゆっくりと室温まで冷却する。
【０６４２】
化合物の調製
化合物をＤＭＳＯ中で８００μＭとなるまで希釈する（アッセイ：８μＭ）。
【０６４３】
試料の調製
７１．２〜７８．４μＬのアッセイ緩衝液をＧｒｅｉｎｅｒ、製品番号７８１１０１、ＰＳ−Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、３８４中にピペットで入れる（各ウェルが必要）。
【０６４４】
０．８〜８μＬのＲＮＡ溶液（１００ｍＭ）を加える。
【０６４５】
０．８μＬの化合物溶液（８００ｍＭ）を加える。
【０６４６】
マルチチャネルピペットを用いて穏やかに混合する。
【０６４７】
試料中の最終濃度：１〜１０μＭ  ＲＮＡ、８μＭ化合物、１％ＤＭＳＯ
【０６４８】
サーマルシフト測定（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０）
２５μＬの試料溶液をＧｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８４０７６、黒、３８４中にピペットで入れる。
【０６４９】
試料の移送が完了したら上部の蓋を取る。
【０６５０】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（チャネル：４８５／５２０ｎｍ）を用いて９６プレートを測定する。
【０６５１】
読み取り
ソフトウェアはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｒを使用した。
【表３５】
2019523242.tif 000190
【０６５２】
結果
ＣａｃｏＫ緩衝液中またはＮａＰＯ４緩衝液中のいずれかにおいて様々なＲＮＡ濃度での予想される蛍光シグナルの較正を最初に行った。塩を含む緩衝液中の実験は明確な蛍光消光挙動を示す。ＣａｃｏＫ緩衝液用の較正実験を図７２に示す。ＮａＰＯ４緩衝液について類似の結果が得られた（結果は示さず）。
【０６５３】
最初に２つの化合物（すなわち、Ａｒｋ０００００７およびＡｒｋ０００００８）を蛍光消光アッセイで試験して、蛍光シグナルに対する濃度依存的な影響を評価した。Ａｒｋ０００００７のみが、５μＭより高い濃度において３ＷＪ＿０．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ構築物に対して消光効果の増大を示した（図７３）。残りの緩衝液および試料条件は、蛍光シグナルに対する化合物の有意な影響を示さなかった。
【０６５４】
化合物Ａｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４に対して蛍光消光実験を繰り返して、以下のものとの結合を測定した。
【０６５５】
Ａ）ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ（シス３ＷＪ、１つの対形成していないヌクレオチドを有する）
【０６５６】
Ｂ）分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、
１：１の混合）
【０６５７】
Ｃ）分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、
１：１の混合）
【０６５８】
これらの配列についての考えられる構造を図７４に示し、実験結果を図７５に示す。蛍光消光アッセイでは、両方の化合物を２つの濃度点で試験して、研究に利用するＲＮＡ構築物への効果を評価した。Ａｒｋ００００１３（図中の化合物１３に関連する曲線）は、使用した３つ全てのＲＮＡ構築物への有意な濃度依存的な効果を示す（シス３ＷＪについては最小の効果、トランス３ＷＪについては等しい効果）。データは、３ＷＪ構築物とのＡｒｋ００００１３の特異的相互作用を示唆する。Ａｒｋ００００１４（化合物１４）はＲＮＡ構築物に対するより小さい効果を示す（分岐３ＷＪ＿２はより大きい効果を示す）。この化合物はＲＮＡ標的の種と相互作用しているようである。
【０６５９】
（実施例１９）
サーマルシフト結合アッセイ
目的：ＲＮＡ三方向ジャンクション（例えば、３８ｎｔの構築物）について化合物の結合を試験する。サーマルシフトアッセイは、蛍光タグとしてＦＡＭを、消光剤としてアイオワブラックを利用する確立された蛍光消光アッセイに基づく。タグはそれぞれ３’末端および５’末端に結合させた。化合物結合時の３ＷＪの安定な形成は、アイオワブラックタグとの近接性に起因してＦＡＭ蛍光の消光に繋がる。サーマルアンフォールディングは蛍光発光の増大に繋がる。アッセイの読み取り：ＦＡＭ（４６５〜５１０ｎｍ）サーマルシフト。
【０６６０】
このアッセイは、容易に観察可能な読み取りを用いる制御された系の文脈で３ＷＪへの結合を試験することによってＲＮＡ結合性小分子を発見するためのツールキットの一部分としてはたらくことができる。次いで、本明細書中に開示したＰＥＡＲＬ−ｓｅｑまたはその他の方法を使用して、化合物をさらにスクリーニングし得る。
【０６６１】
使用したアッセイ試料緩衝液：１０ｍＭ  ＣａｃｏＫ  ｐＨ７．２、３０ｍＭ  ＮａＣｌ。Ｄｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅフリーの蒸留水中の緩衝液調製物（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０６６２】
化合物の調製
乾燥粉末として提供されるツール化合物を１００％  ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭストック溶液として調製する。ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭ濃度のストック溶液を室温で貯蔵する。
【０６６３】
ハードウェア
サンプルプレート：Ｒｏｃｈｅ、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ９６、白、製品番号０４７２９６９２００１。（希釈プレート：Ｇｒｅｉｎｅｒ、製品番号７８１１０１、ＰＳ−Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、３８４ウェル、透明）。サーマルシフトデバイス：Ｒｏｃｈｅ、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０。
【０６６４】
アッセイプロトコール
アッセイ緩衝液の調製
毎日交換（１０ｍｌ）：１ｍｌ  １００ｍＭ  ＣａｃｏＫ  ｐＨ７．２および０．３ｍｌ  １Ｍ  ＮａＣｌ、Ｄｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅフリーの蒸留水で１０ｍｌまで満たす。
【０６６５】
ＲＮＡの調製（ＲＮＡ試料の均質化）
アッセイ緩衝液中、ＲＮＡを１：１０（最終１０μＭ）に希釈する。
【０６６６】
希釈したＲＮＡを５分間、９０℃まで加熱する（密封したエッペンドルフチューブ）。
【０６６７】
ＲＮＡプローブをゆっくりと室温まで冷却する。
【０６６８】
化合物の調製
化合物をＤＭＳＯ中で８００μＭとなるまで希釈する（アッセイ：８μＭ）。
【０６６９】
試料の調製
７８．４μＬのアッセイ緩衝液をＧｒｅｉｎｅｒ、製品番号７８１１０１、ＰＳ−Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、３８４中にピペットで入れる（各ウェルが必要）。
【０６７０】
０．８μＬのＲＮＡ溶液（１００ｍＭ）を加える。
【０６７１】
０．８μＬの化合物溶液（８００ｍＭ）を加える。
【０６７２】
マルチチャネルピペットを用いて穏やかに混合する。
【０６７３】
試料中の最終濃度：１μＭ  ＲＮＡ、８μＭ化合物、１％ＤＭＳＯ
【０６７４】
サーマルシフト測定（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０）
２０μＬの試料溶液をＲｏｃｈｅ、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ９６、白、製品番号０４７２９６９２００１中にピペットで入れる。
【０６７５】
試料の移送が完了したら、透明なトップシール（製品番号０４７２９６９２００１の一部分）を用いてプレートを密封する。
【０６７６】
卓上デバイスを用いてプレートを遠心分離して、試料を遠心沈降させる。
【０６７７】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（チャネル：４８０／５１０ｎｍ；温度：４１〜９１℃）を用いて９６プレートを測定する。
【０６７８】
ＭｅｌｔｉｎｇＣｕｒｖｅＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇモードで測定データを解析する。
【０６７９】
ソフトウェア
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＬＣＳ４８０  １．５．１．６２  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＴｈｅｒｍａｌＳｈｉｆｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ
【０６８０】
設定：取得モード：連続；ランプ速度：０．１Ｃ°／秒；取得：６／Ｃ°
【０６８１】
全ての試料についての融解曲線ジェノタイピング
チャネル    ４８０／５１０ｎｍ
【０６８２】
プログラム名（Progam  Name）    Ｐｒｏｇｒａｍ
【０６８３】
標準設定    Ａｕｔｏ−Ｇｒｏｕｐ
【０６８４】
感度    標準
【０６８５】
温度範囲    ４１〜９１℃
【０６８６】
スコア    ０．７
【０６８７】
解像度（Res.）    ０．１
【０６８８】
曲線は生データおよび正規化データを用いてフィッティングする。
【０６８９】
結果
融解曲線解析は、約５１℃の融解温度（Ｔｍ）を示す。ＲＮＡの濃度範囲を試験し、アッセイウィンドウを決定した（０．５〜１μＭの濃度範囲が最良の結果を与える）。緩衝液の選択もまたＴｍに影響した。サーマルシフトアッセイにおいて、ＲＮＡ構築物を異なる緩衝液条件下（特に塩の存在下）で試験した。塩濃度の増加は融解温度を上昇させる傾向を示す。しかしながら、蛍光消光アッセイについて既に見たように、この観察は緩衝液条件に強く依存する。１μＭのＲＮＡ濃度において３０ｍＭの塩のＣａｃｏＫを使用して３ＷＪの安定性に対する化合物の効果を試験した。サーマルシフトアッセイにおいて、ＲＮＡ構築物を異なる緩衝液条件下（特に塩の存在下）で試験した。予想したように、塩濃度の増加は融解温度を上昇させる傾向を示す。しかしながら、蛍光消光アッセイについて既に見たように、この観察は緩衝液条件に強く依存する。ＲＮＡ構築物はより高い塩濃度の存在下でフォールディングし、より低い塩濃度での５１℃に対して６１℃の融解温度を有していた。これらの条件を試験化合物のスクリーニングに使用した。
【０６９０】
化合物Ａｒｋ０００００７およびＡｒｋ０００００８を３ＷＪ＿０．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ  ＲＮＡ構築物を用いたサーマルシフトアッセイにおいて試験した（図７６）。データ解析は、約５℃の融解温度シフト（すなわち、６１．２℃から６５．６℃）を伴ってＡｒｋ０００００７についての有意な効果を示している。対照的に、Ａｒｋ０００００８については非常に小さい効果しか観察されなかった。これらのデータは、Ａｒｋ０００００７の存在が３ＷＪの安定性を増大させることを示唆する。
【０６９１】
また、以下の３つのＲＮＡ  ３ＷＪ構築物に対するサーマルシフトアッセイにおいて化合物Ａｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４を試験した。Ａ）ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ（シス３ＷＪ、１つの対形成していないヌクレオチドを有する）、Ｂ）分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）、およびＣ）分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）。
【０６９２】
ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭを用いて化合物を試験した時のデータ解析は、化合物の存在下で有意により低い蛍光シグナルを伴って、融解曲線におけるＡｒｋ００００１３の有意な効果を示した（図７７）。
【０６９３】
正規化データは、Ａｒｋ００００１３の存在下で適切な融解曲線を示さず、データ解析ソフトウェアのアルゴリズムでは、意味のある融解点を決定できなかった。Ａｒｋ００００１４については、約３℃の融解温度シフト（すなわち、６５．６℃から６８．４℃）を伴って、より弱い効果が観察された。データは、Ａｒｋ００００１３の存在は結合時に３ＷＪのフォールディングの安定性を増大させるが、Ａｒｋ００００１４ははるかに目立たない効果を示すことを示唆する。これらの結果は蛍光消光アッセイに合致している。
【０６９４】
上記Ｂ）のＲＮＡ（分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭ）の存在下のデータ解析は、約２１℃の融解温度シフト（すなわち、３７．５℃から５８．２℃）を伴ってＡｒｋ００００１３について有意な効果を示した（図７８）。わずか約１℃の融解温度シフト（すなわち、３７．５℃から３８．８℃）を伴ってＡｒｋ００００１４については小さな効果のみが観察された。データは、Ａｒｋ００００１３の存在は結合時に３ＷＪのフォールディングの安定性を増大させるが、Ａｒｋ００００１４ははるかに目立たない効果を示したことを示唆する。２つのＲＮＡ分子からトランスで形成された３ＷＪは、シスでフォールディングした３ＷＪよりも有意に低い安定性を示す（化合物の非存在下および存在下）。特に化合物の非存在下では、より大きいバルジを有するステムループ構造は最も多いコンフォメーションであるかもしれない。
【０６９５】
上記Ｃ）のＲＮＡ（分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭ）の存在下のデータ解析は、約１３℃の融解温度シフト（すなわち、４４．０℃から５６．９℃）を伴ってＡｒｋ００００１３について有意な効果を示した（図７９）。わずか約１℃の融解温度シフト（すなわち、４４．０℃から４４．７℃）を伴ってＡｒｋ００００１４については小さな効果のみが観察された。データは、Ａｒｋ００００１３の存在は結合時に３ＷＪのフォールディングの安定性を増大させるが、Ａｒｋ００００１４ははるかに目立たない効果を示すことを示唆する。トランス３ＷＪの研究はシス３ＷＪよりも低い安定性を示しているようであるが、分岐＿２の３ＷＪは分岐＿１よりも安定なコンフォメーションを取る（化合物の非存在下）。化合物の存在下では、トランス３ＷＪの分岐＿１および分岐＿２の両方について融解温度は類似しており、化合物の存在下での３ＷＪのフォールディングの形成を示唆する。
【０６９６】
いくつかのＲＮＡ構築物を用いてＡｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４を試験した。結果を下記の表８および表９に示す。異なるＲＮＡ：リガンド比（すなわち、１：１、１：３）でのシスでフォールディングしたＲＮＡ  ３ＷＪに対するサーマルシフトアッセイにおいても化合物Ａｒｋ００００３９を試験した。構築物３ＷＪ＿０．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭについての生データはＡｒｋ００００３９について融解曲線における有意な効果を示さない（等モル濃度においても３倍モル過剰においても）。また、正規化データは、化合物Ａｒｋ００００３９について有意な効果を示さない。Ａｒｋ００００３９は３ＷＪのフォールディングの安定性に有意に影響しないらしく、したがってＡｒｋ００００３９について結合を示すものは観察されなかった。配列ＲＮＡ３ＷＪ＿３．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭおよびＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭを用いた試験においてもこれと同じく影響は見られなかった。
【表８】
2019523242.tif 000191
【表９】
2019523242.tif 000192
【表１０−１】
2019523242.tif 000193
【表１０−２】
2019523242.tif 000194
【０６９７】
興味深いことに、リガンド、テザー、弾頭、およびクリック実行可能基を有するフックアンドクリック化合物（ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ化合物）（ＡＲＫ００００３１およびＡＲＫ００００３２など）は、＋２４．１℃および＋１５．０℃という大きいサーマルシフト値を示し、これはＲＮＡ標的配列への強い結合を示している。
【０６９８】
（実施例２０）
リガンド観察ＮＭＲ結合アッセイ
目的：ＲＮＡ三方向ジャンクション（３ＷＪ）に対する化合物の直接結合を試験する。このリガンド観察ＮＭＲアッセイを使用して、ＲＮＡ標的（例えば、３８ｎｔの合成ＲＮＡの３ＷＪ、および以下に記載するようなその他のもの）に対する化合物の直接結合を試験する。リガンド観察アッセイを単一化合物のヒット検証研究のために使用した。確立された実験を最終的に使用して、以下に記載する集団エピトープマッピングを行う。
【０６９９】
アッセイの試薬およびハードウェア
試料緩衝液：１０ｍＭ  カコジレート、ｐＨ７．１；０．６８ｇ［ＭＷ：１３７．９９ｇ／ｍｏｌ］；ミリポアＨ２Ｏで５００ｍｌまで満たす。
【０７００】
化合物の調製
化合物ストック：乾燥粉末として提供されるツール化合物を１００％  ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭストック溶液として調製した。乾燥粉末として提供される試験化合物を１００％  ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭストック溶液として調製した。ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭ濃度のストック溶液を４℃で貯蔵した。
【０７０１】
ハードウェア
試料チューブ：ＮＭＲチューブ；Ｎｏｒｅｌｌ、品目番号ＳＴ５００−７、ＮＭＲ試料測定用
【０７０２】
ＮＭＲ分光計：Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ６００分光計、１Ｈについて６００．０ＭＨｚで作動。５ｍｍのｚ軸勾配のＴＸＩクライオプローブ。
【０７０３】
アッセイの手順
ＲＮＡの調製（ＲＮＡ試料の均質化）
乾燥したＲＮＡペレットを試料緩衝液（１０ｍＭカコジレート、ｐＨ７．１）中に可溶化する。
【０７０４】
２００μＭ（ストック濃度）のＲＮＡアリコートを３分間９５℃で変性させ、氷上で３分間スナップ冷却する。
【０７０５】
試料の調製
２３μＬのｄ６−ＤＭＳＯを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中にピペットで入れ、試料中にロッキング剤として５％  ｄ６−ＤＭＳＯが存在することを確実にする。
【０７０６】
２μＬの各断片（５０ｍＭストック溶液）を加える。
【０７０７】
４５０μＬのアッセイ緩衝液を加える。
【０７０８】
ＲＮＡの３ＷＪの均質化したＲＮＡストック溶液（２００μＭストック溶液）２５μＬを加える。
【０７０９】
試料をボルテックスして適切な混合を確実にし、そしてＮＭＲ分光計中に置いて試料の測定を開始する。
【０７１０】
試料中の最終濃度：２００μＭの各化合物および１０μＭのＲＮＡ標的分子
【０７１１】
ＮＭＲ測定
試料を磁石中に置き、温度を２８８Ｋに調整する。分光計の周波数を６００ＭＨｚに合わせ、チューニングする。磁場をシミングし、試料の周りの磁場を均一化する。
【０７１２】
プロトンの９０°パルスを決定し、水共鳴周波数を最大の水抑制を確実にするように調整する。決定した値を、各々の試料について記録するＮＭＲ実験に移す。
【０７１３】
実験手順は、水抑制用のウォーターゲート配列、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ（ＷＬＯＧＳＹ）を用いるプロトン１Ｄ実験、およびＲＮＡへの化合物の直接結合を試験するための１Ｄ飽和移動差（ＳＴＤ）実験を含む。
【０７１４】
１Ｄウォーターゲート実験の詳細：各１Ｄウォーターゲートスペクトルについて１２８回のスキャンでｆ１（１Ｈ）の計８１９２の複素点を取得した（実験時間４分）。スペクトル幅は１６．６６ｐｐｍに設定した。
【０７１５】
ＷＬＯＧＳＹ実験の詳細：ＷＬＯＧＳＹスペクトルについて２５６回のスキャンでｆ１（１Ｈ）の計１０２４の複素点を取得した（実験時間２５分）。１Ｈのキャリア周波数は水共鳴（約４．７ｐｐｍ）に設定した。スペクトル幅は直接次元（１Ｈ）において１６．６６ｐｐｍに設定した。
【０７１６】
ＳＴＤ実験の詳細：ＳＴＤスペクトルについて１０２４回のスキャンでｆ１（１Ｈ）の計１０２４の複素点を取得した（実験時間６５分）。１Ｈのキャリア周波数は水共鳴（約４．７ｐｐｍ）に設定した。スペクトル幅は直接次元（１Ｈ）において１６．６６ｐｐｍに設定した。オン共鳴実験について、飽和は−２５００Ｈｚの飽和周波数において２．０秒に設定する。オフ共鳴実験について、飽和周波数は１０２００Ｈｚに設定する。
【０７１７】
読み取り
ソフトウェア：Ｔｏｐｓｐｉｎ（商標）バージョン：２．１（２００７年１０月２４日）
【０７１８】
測定モード：１Ｄ
【０７１９】
Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、アッセイのセットアップ、スクリーニング、およびデコンボリューション処理において全ての記録したスペクトルを処理する。
【０７２０】
化合物の直接結合シグナルについてスペクトルを解析した。同定された単一化合物のヒットを報告した。
【０７２１】
ＣＡＧリピートＲＮＡのリガンド観察ＮＭＲ結合アッセイ
上記手順にしたがって、様々なツール化合物および試験化合物を結合についてアッセイした。最初の一連の実験では、１７ＣＡＧまたは４１ＣＡＧ（試料は３μＭのＲＮＡ）への結合について化合物を試験した。化合物ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ａ０８、ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ａ０６、ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｄ１０、および４１の小分子断片の初期スクリーニングのほとんどは、ＲＮＡ標的種１７ＣＡＧおよび４１ＣＡＧの両方について結合シグナルにおける有意差を示さなかった。しかしながら、いくつかの化合物は、２つのＲＮＡ標的種の存在下でシグナルの有意な変化を示した。
【表３６】
2019523242.tif 000195
【０７２２】
ＮＭＲ結合アッセイにおいてＡＲＫ０００００１３も試験した。試験試料：１０μＭ  ＲＮＡ３ＷＪ＿０．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ  ＋／−  ２００  Ａｒｋ００００１３。記録したＡｒｋ００００１３の１Ｈ  １ＤウォーターゲートスペクトルおよびＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを基準として使用した（注記：芳香族シグナルは７．４〜７．９ｐｐｍの間で観察され、中心のトリプチセン足場の対照性に起因して９プロトン全ては磁気的に同等である）。ＲＮＡの存在下で負のサインのシグナルの明らかな減少がＡｒｋ００００１３共鳴について起こった。データは、標的種としての３ＷＪ  ＲＮＡへのＡｒｋ００００１３の結合を示唆した。ＳＴＤ実験は、結合を定数的に確認するのに十分な小さいシグナルを示した。
【０７２３】
エピトープマッピング
いくつかの化合物に関してエピトープマッピングを行った。最初の実施例として、化合物ＣＰＮＱを５０μＭの濃度で分析した。スペクトルの芳香族領域への拡大を用いて１Ｈ  １Ｄウォーターゲートスペクトルを得た。この実施例および以下の実施例のための１Ｈ共鳴の事前の割り当ては、化学シフトの分布、カップリングパターン、およびＮＭＲスペクトルのシミュレーション（ｗｗｗ．ｎｍｒｄｂ．ｏｒｇ）に基づいて行った。プロトン共鳴、ＮＭＲスペクトル、およびエピトープマッピングの結果を割り当てたＣＰＮＱの構造を図８０に示す。シグナルの重複に起因して、ピペラジン環系の個々の割り当ては出来なかった。条件：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＤＴＴ、５％  ＤＭＳＯ−ｄ６；Ｔ＝２８８．１Ｋ。エピトープマッピング実験は、上記のＳＴＤ実験の条件を使用して４１ＣＡＧおよび１７ＣＡＧの配列の存在下で行った。ＣＰＮＱの場合、データは、両方のＲＮＡ構築物についてクロロフェニル部分のプロトンがニトロキノリンよりもＲＮＡに近接する傾向を示唆する。
【０７２４】
類似の条件下で化合物ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１について同じ実験を行った（図８１を参照）。スケール化したＳＴＤ効果を事前の割り当てにしたがって分子上にプロットした。データは、両方のＲＮＡ構築物について、ピリジン環のプロトンがベンゼン環よりもＲＮＡにより近接することを示唆する。脂肪族ＣＨ２基は、その領域における緩衝液シグナルの重複に起因して観察できなかった。
【０７２５】
類似の条件下で化合物ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２について同じ実験を行った（図８２を参照）。スケール化したＳＴＤ効果を事前の割り当てにしたがって分子上にプロットした。データは、両方のＲＮＡ構築物について、複素環に最も近い芳香族プロトンがＲＮＡプロトンにより近接することを示唆する。脂肪族プロトン共鳴は、直接飽和のアーティファクト／その領域における緩衝液シグナルの重複に起因してＳＴＤによって評価できなかった（ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹによるエピトープマッピング）。
【０７２６】
類似の条件下で化合物ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３について同じ実験を行った（図８３を参照）。スケール化したＳＴＤ効果を事前の割り当てにしたがって分子上にプロットした。シグナルの重複に起因して、ＣＨ２基の個々の割り当てはできなかった。データは、両方のＲＮＡ構築物について、フラン部分のプロトンがフェニルよりもＲＮＡプロトンにより近接することを示唆する。
【０７２７】
ＮＭＲ競合実験
競合実験も行った。試験試料：２．５μＭ  ４１ＣＡＧ  ＲＮＡ（４７６ｎｔ）を以下のものと組み合わせた：１００μＭ  ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１（Ａ）；＋／−  ２００〜４００μＭ  ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２（Ｂ）；および＋／−  ２００〜４００μＭ  ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３（Ｃ）。記録したＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１の１Ｈ  １ＤウォーターゲートスペクトルおよびＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを基準として使用する。競合物（すなわち、ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３またはＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２のいずれか）の存在下、ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルは１：４の化合物対競合物の比においても観察された。実験は、利用した化合物混合物においていかなる競合的挙動の兆候も明らかにしなかった。データは、化合物は同じ単一の結合部位について競合しないことを示唆する。
【０７２８】
さらなる実験では、１００μＭ  ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２（Ｂ）または１００μＭ  ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３（Ｃ）；＋／−  ２００〜４００μＭ  ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１（Ａ）の存在下で試験試料として２．５μＭ  ４１ＣＡＧ  ＲＮＡ（４７６ｎｔ）を使用した。記録した単一化合物の１Ｈ  １ＤウォーターゲートスペクトルおよびＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを基準として使用した。競合物（すなわち、ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１（Ａ））の存在下、ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２（Ｂ）またはＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３（Ｃ）のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルは１：４の化合物対競合物の比においても観察された。実験は、利用した化合物混合物においていかなる競合的挙動の兆候も明らかにしなかった。データは、化合物は同じ単一の結合部位について競合しないことを示唆する。
【０７２９】
さらなる実験では、１００μＭ  ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２（Ｂ）  ＋／−  ２００〜４００μＭ  ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３（Ｃ）の存在下で試験試料として２．５μＭ  ４１ＣＡＧ  ＲＮＡ（４７６ｎｔ）を使用した。記録した単一化合物ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２の１Ｈ  １ＤウォーターゲートスペクトルおよびＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを基準として使用した。競合物（すなわち、ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３（Ｃ））の存在下、ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２（Ｂ）のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルは１：４の化合物対競合物の比においても観察された。実験は、利用した化合物混合物においていかなる競合的挙動の兆候も明らかにしなかった。データは、化合物は同じ単一の結合部位について競合しないことを示唆する。
【０７３０】
（実施例２１）
ＣＡＧリピートＲＮＡのリガンド観察ＮＭＲ結合アッセイ
目的：ｈｔｔｍＲＮＡ（４１個のＣＡＧリピートを有する４７４ｎｔの構築物）および以下に記載するようなその他のものに対する化合物の直接結合を試験する。リガンド観察ＮＭＲアッセイでＲＮＡ標的（例えば、４１個のＣＡＧリピートを有する４７４ｎｔの構築物）への断片の直接結合を試験する。直交型アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴、ＳＰＲ）によるさらなる特徴付けのために単一化合物のヒットを特定した。一次スクリーニングおよび単一断片ヒットへのデコンボリューションのためにリガンド観察アッセイを使用した。確立された実験を最終的に集団エピトープマッピングのために使用した。
【０７３１】
特定遺伝子のタンパク質コーディング部分におけるＣＡＧリピート伸長は、カテゴリーＩのリピート伸長疾患として分類される。現在、９種の神経学的障害が、ＣＡＧリピート（通常、さもなければ無関係のタンパク質のコーディング領域内）の数の増加によって引き起こされることが公知である。タンパク質合成の間に、伸長したＣＡＧリピートは一連の解釈されないグルタミン残基に翻訳され、ポリグルタミン鎖（「ポリＱ」）として公知であるものを形成する。
【０７３２】
このアッセイは、ｈｔｔｍＲＮＡへの化合物の直接結合を試験し、またその他のリピートＲＮＡのために適応され得る。プールされた化合物を試験する（すなわち、一次スクリーニングにおいては各試料中１２断片のプールサイズ、デコンボリューションの間はより小さいプールサイズ、そして最終的には単一化合物の測定）。
【０７３３】
アッセイの試薬およびハードウェア
試料緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．７８ｇ［ＭＷ：１５７．５６ｇ／ｍｏｌ］；７５ｍＭ  ＫＣｌ、２．７９ｇ［ＭＷ：７４．５５ｇ／ｍｏｌ］；３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１４ｇ［ＭＷ：９５．２１ｇ／ｍｏｌ］；ミリポアＨ２Ｏで５００ｍＬまで満たす。
【０７３４】
化合物の調製
化合物ストック：断片ライブラリーのストック溶液を１００％  ｄ６−ＤＭＳＯ中１００ｍＭ濃度で提供する。乾燥粉末として提供されるツール化合物を１００％  ｄ６−ＤＭＳＯ中の１００ｍＭストック溶液として調製した。ｄ６−ＤＭＳＯ中の１００ｍＭ濃度のストック溶液を４℃で貯蔵した。
【０７３５】
ハードウェア
試料チューブ：ＮＭＲチューブ；Ｎｏｒｅｌｌ、品目番号ＳＴ５００−７、ＮＭＲ試料測定用
【０７３６】
ＮＭＲ分光計：Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ６００分光計、１Ｈについて６００．０ＭＨｚで作動。５ｍｍのｚ軸勾配のＴＸＩクライオプローブ。
【０７３７】
アッセイの手順
ＲＮＡの調製（ＲＮＡ試料の均質化）
乾燥したＲＮＡペレットを試料緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に可溶化する。１３．９μＭ（ストック濃度）のＲＮＡアリコートを３分間９５℃で変性させ、氷上で３分間スナップ冷却し、３０分間３７℃でリフォールディングさせる。
【０７３８】
試料の調製
１３〜２４μＬのｄ６−ＤＭＳＯを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中にピペットで入れ、試料中にロッキング剤として５％  ｄ６−ＤＭＳＯが存在することを確実にする（調製した試料のプールサイズに依存する）。１μＬの各断片（１００ｍＭストック溶液）を加える。
【０７３９】
３６７μＬのアッセイ緩衝液を加える。
【０７４０】
ｈｔｔｍＲＮＡの均質化したＲＮＡストック溶液（１３．９μＭストック溶液）１０８μＬを加える。
【０７４１】
試料をボルテックスして適切な混合を確実にし、そしてＮＭＲ分光計中に置いて試料の測定を開始する。
【０７４２】
試料中の最終濃度：２００μＭの各断片および３μＭのＲＮＡ標的分子
【０７４３】
ＮＭＲ測定
試料を磁石中に置き、温度を２８８Ｋに調整する。分光計の周波数を６００ＭＨｚに合わせ、チューニングする。磁場をシミングし、試料の周りの磁場を均一化する。
【０７４４】
プロトンの９０°パルスを決定し、水共鳴周波数を最大の水抑制を確実にするように調整する。決定した値を、各々の試料について記録するＮＭＲ実験に移す。
【０７４５】
実験手順は、水抑制用のウォーターゲート配列、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ（ＷＬＯＧＳＹ）を用いるプロトン１Ｄ実験、およびＲＮＡへの化合物の直接結合を試験するための１Ｄ飽和移動差（ＳＴＤ）実験を含む。
【０７４６】
１Ｄウォーターゲート実験の詳細：各１Ｄウォーターゲートスペクトルについて１２８回のスキャンでｆ１（１Ｈ）の計８１９２の複素点を取得した（実験時間４分）。スペクトル幅は１６．６６ｐｐｍに設定した。
【０７４７】
ＷＬＯＧＳＹ実験の詳細：ＷＬＯＧＳＹスペクトルについて２５６回のスキャンでｆ１（１Ｈ）の計１０２４の複素点を取得した（実験時間２５分）。１Ｈのキャリア周波数は水共鳴（約４．７ｐｐｍ）に設定した。スペクトル幅は直接次元（１Ｈ）において１６．６６ｐｐｍに設定した。
【０７４８】
ＳＴＤ実験の詳細：ＳＴＤスペクトルについて１０２４回のスキャンでｆ１（１Ｈ）の計１０２４の複素点を取得した（実験時間６５分）。１Ｈのキャリア周波数は水共鳴（約４．７ｐｐｍ）に設定した。スペクトル幅は直接次元（１Ｈ）において１６．６６ｐｐｍに設定した。オン共鳴実験について、飽和は−２５００Ｈｚの飽和周波数において２．０秒に設定する。オフ共鳴実験について、飽和周波数は１０２００Ｈｚに設定する。
【０７４９】
読み取り
ソフトウェア：Ｔｏｐｓｐｉｎ（商標）バージョン：２．１（２００７年１０月２４日）
【０７５０】
測定モード：１Ｄ
【０７５１】
Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、アッセイのセットアップ、スクリーニング、およびデコンボリューション処理において全ての記録したスペクトルを処理した。化合物の直接結合シグナルについてスペクトルを解析した。同定された単一化合物のヒットを報告した。
【０７５２】
（実施例２２）
Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用するＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの調製
目的：ＳＨＡＰＥ試薬またはＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ化合物で処理した後の短い合成ＲＮＡのディープシークエンシングを可能とすること。本明細書中に記載のライブラリー調製プロトコールは、両末端にアダプターをライゲートすることによって小さい合成ＲＮＡから次世代シークエンシングライブラリーを生成する方法を記載する。ライゲーションは、ライゲートしたアダプターからのｃＤＮＡの合成、したがって標的ＲＮＡ全体のシークエンシングを可能とするために必要とされる。この技術は、ＳＨＡＰＥシークエンシングのプロセス中の一ステップを表す。ＳＨＡＰＥシークエンシングは、コンフォメーション選択的なＳＨＡＰＥ試薬で処理した後の突然変異頻度を決定することによってＲＮＡ二次構造を解析することを目的とする。
【０７５３】
この実施例用の標的の名称：標的ＲＮＡオリゴヌクレオチド「ＲＮＡ３ＷＪ＿０．０．０＿ｎｏＬａｂ”、配列ｒＧｒＧｒＣｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｒＵｒＧｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＣｒＵｒＧｒＣｒＡｒＵｒＵｒＡｒＣｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵ  ｒＧｒＵｒＧｒＣｒＣ。生理学的役割：三方向ジャンクションの二次構造を形成できる合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド。アッセイの原理：１）標的ＲＮＡへの３’−アダプターのライゲーション、２）標的ＲＮＡの５’末端のリン酸化、３）ライゲートしたアダプターからの第１鎖および第２鎖のｃＤＮＡの合成、４）ＰＣＲによるバーコード化されたＩｌｌｕｍｉｎａプライマーの組込みおよび増幅。アッセイの読み取り：アガロースゲル電気泳動、サンガーシークエンシング。
【０７５４】
アッセイの試薬およびハードウェア
−  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、切断型ＫＱ（ＮＥＢ＃Ｍ０３７３Ｓ）
−  ５０％  ＰＥＧ８０００（ＮＥＢ＃Ｍ０３７３Ｓに同梱）
−  ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
−  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１（ｓｓＲＮＡリガーゼ）（ＮＥＢ＃Ｍ０２０４Ｓ）
−  １０ｍＭ  ＡＴＰ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０４Ｓに同梱）
−  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
−  Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｆｌｅｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ  Ｍ０５３５）
−  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）
−  Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＨＳ  ＤＮＡアッセイキット（Ｉｎｉｖｔｒｏｇｅｎ）
−  ０．２Ｍ  カコジル酸
【表３７】
2019523242.tif 000196
【０７５５】
オリゴヌクレオチド
標的ＲＮＡオリゴヌクレオチド「ＲＮＡ３ＷＪ＿０．０．０＿ｎｏＬａｂ」（ＩＤＴ特注合成（synthese））
５’  ｒＧｒＧｒＣｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｒＵｒＧｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＣｒＵｒＧｒＣｒＡｒＵｒＵｒＡｒＣｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵｒＧｒＵ  ｒＧｒＣｒＣ  ３’
３’アダプターＤＮＡオリゴ「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｉＲＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｌｉｎｋｅｒ」（ＮＥＢ  Ｓ１３１５Ｓ）
５’  ｒＡｐｐＣＴＧＴＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴ−ＮＨ２  ３’
５’アダプターＲＮＡオリゴ
５’  ｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＡｒＧｒＵｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＧｒＵｒＣｒＣｒＧｒＡｒＣｒＧｒＡｒＵｒＣ  ３’
【０７５６】
逆転写用プライマー：（ＮＮＮＮＮＮは８塩基の「固有分子識別子」タグを示す）
第１鎖合成用プライマー（Ｐ７  ＲＴ−Ａｎｔｉ  ＵＣＬ）
５’  ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＣ  ＣＴＡＣＡＧ  ３’
第２鎖合成用プライマー（Ｐ５  ２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ）
５’  ＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＴＣＣ  ＧＡＣＧＡＴＣ  ３’
【０７５７】
ライブラリーのＰＣＲ増幅用プライマー：全てのプライマーは、ライブラリーのデコンボリューション用に必要な特定の８ｎｔインデックス配列タグ（インデックス）を含む。
いくつかのフォワードＰＣＲ用プライマー
５’  ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（ＩＮＤＥＸ）ＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣ  ＴＴＣＣＧＡＴＣＴ  ３’
いくつかのリバースＰＣＲ用プライマー
５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（ＩＮＤＥＸ）ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ  ３’
【０７５８】
ｑＰＣＲ／シークエンシング用プライマー：
Ｑｕａｎｔｉ  ｑＰＣＲ  １＿ｆｗ  ５’  ＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧ  ３’
Ｑｕａｎｔｉ  ｑＰＣＲ  １＿ｒｖ  ５’  ＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ  ３’
【０７５９】
アッセイの手順
調製
ＲＮａｓｅフリーの水を用いて標的ＲＮＡを１００μＭまで溶解する。
【０７６０】
１８０μｌを３アリコートおよび追加的な小容量のアリコート（５μｌ）をピペットで入れる。貯蔵：−８０℃。
【０７６１】
ライゲーション用に、凍結乾燥したＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｉＲＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｌｉｎｋｅｒ（ＵＣＬ）を１００μＭのストック濃度までＲＮＡｓｅフリーの水中に再懸濁する。１μｌのＵＣＬの濃度は１００ｐｍｏｌ（１００μＭ）である。
【０７６２】
ＲＮａｓｅフリーの水を用いてアダプター濃度を１０ｐｍｏｌ／μｌ（１０μＭ）に調整する（１：１０の希釈）。
【０７６３】
ＲＮＡのフォールディング
溶解した標的ＲＮＡを緩衝液１で１：１０を用いて希釈して１０μＭのライゲーション溶液を得る。
【０７６４】
９０℃で５分間インキュベートし、ゆっくりと室温に冷却し、氷上で貯蔵する。
【０７６５】
３’アダプターのライゲーション
３’アダプター（ＵＣＬ）を３０秒間６５℃で変性させ、直ちに氷上で急冷する。
【０７６６】
ＡＴＰの非存在下、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２を用いてライゲーションを実行する。
【０７６７】
以下のものを用いてライゲーション反応物を準備する。
【表３８−１】
2019523242.tif 000197
【表３８−２】
2019523242.tif 000198
【０７６８】
反応物を２５℃で４時間または１８℃で終夜インキュベートする。注記：ライゲーション反応はＡＴＰの非存在下で行わなければならない。熱による不活化：６５℃で２０分。
【０７６９】
５’アダプターのライゲーション
５’アダプターＲＮＡオリゴ（１０μＭ、ＲＮａｓｅフリーの水中）を３０秒間６５℃で変性させ、直ちに氷上で急冷する。
【０７７０】
２０μｌの３’アダプター−ＲＮＡ−混合物を以下のものに加える。
【表３９】
2019523242.tif 000199
【０７７１】
反応物を２５℃で４時間または１８℃で終夜インキュベートする。熱による不活化：６５℃で１５分。注記：小さいＲＮＡの３’末端は、３’末端にアミン基を有する３’アダプターに既にライゲートされており、もはやライゲーション反応に関与できないため、その５’末端をＡＴＰの存在下でＲＮＡオリゴにライゲートし得る。
【０７７２】
逆転写（第１鎖のｃＤＮＡの合成）
使用前に各成分を混合し、軽く遠心分離する。
【０７７３】
０．２ｍｌのＰＣＲチューブ中に以下のものを合わせる。
【表４０】
2019523242.tif 000200
【０７７４】
６５℃で５分間インキュベートした後、少なくとも１分間氷上に置く。
【０７７５】
各成分を示した順序で加えて以下のｃＤＮＡ合成混合物を調製する。
【表４１】
2019523242.tif 000201
【０７７６】
２０μｌのｃＤＮＡ合成混合物を各ＲＮＡ／プライマー混合物に加え、穏やかに混合し、軽く遠心分離することによって収集する。５０℃で５０分間インキュベートする。５分間８５℃において反応を終了させる。氷上で急冷する。軽く遠心分離することによって反応物を収集する。ｃＤＮＡ合成反応物を−２０℃で貯蔵するか、または直ちにＰＣＲに使用することができる。
【０７７７】
第２鎖のｃＤＮＡの合成
以下のＰＣＲ混合物を調製する。
【表４２】
2019523242.tif 000202
【０７７８】
ＰＣＲ分析装置中に試料を入れ、以下のサイクリングプログラムを実行する。
【０７７９】
変性：９５℃で３分
アニーリング：６５℃で１０秒、０．１℃／秒で６５℃〜５５℃に低下させる
伸長：７２℃で３分
４℃に冷却する∞
ＰＣＲ濃縮まで−２０℃で貯蔵する。
【０７８０】
ＰＣＲ濃縮
以下のＰＣＲ混合物を調製する。
【表４３】
2019523242.tif 000203
【０７８１】
ＰＣＲ分析装置中に試料を入れ、以下のサイクリングプログラムを実行する。
開始：変性  ９８℃で３０秒
１５サイクル：
１．変性  ９８℃で１０秒
２．アニーリング  ７２℃で２０秒＊
３．伸長  ７２℃で１５秒
最終の伸長  ７２℃で３分
４〜１０℃で保持する
【０７８２】
＊所与のプライマーセットのための最適なアニーリング温度を決定するために、ＮＥＢのＴｍ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを使用することが強く推奨される。
【０７８３】
残りのＲＴ生成物を−２０℃で貯蔵することができる。
【０７８４】
読み取り
適切な分子量マーカーを使用して２％アガロースゲル上でＰＣＲ生成物を分離する。注記：正確にライゲートおよび増幅したライブラリーのサイズは２３３塩基である。バンドを切り出し、ＱｉａｇｅｎのＭｉｎＥｌｕｔｅキットを用いて生成物をゲル精製する。
【０７８５】
「Ｑｕａｎｔｉ  ｑＰＣＲ  １＿ｆｗ」プライマーまたは「Ｑｕａｎｔｉ  ｑＰＣＲ  １＿ｒｖ」プライマーのいずれかを使用して、精製した断片を直接的サンガーシークエンシング（選択した提供業者にて）に供する。関与するステップおよび配列を図８４に示す。
【０７８６】
（実施例２３）
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを産生するための代替的な手順
５’アダプターを標的ＲＮＡにライゲートするさらなるステップを含む、所望のＲＮＡライブラリーを産生するための代替的な手順を開発した。この代替法の主要なステップは、１）標的ＲＮＡへの３’−アダプターのライゲーション、２）標的ＲＮＡの５’末端のリン酸化、３）標的ＲＮＡへの５’−アダプターのライゲーション、４）ライゲートしたアダプターからの第１鎖および第２鎖のｃＤＮＡの合成、５）ＰＣＲによるバーコード化されたＩｌｌｕｍｉｎａプライマーの組込みおよび増幅である。
【０７８７】
この追加のステップを行うために、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＮＥＢ）を試薬に含めた。追加のリン酸化ステップを以下の通りに行った。
【０７８８】
Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅを用いたリン酸化
非放射性のリン酸化のために、最大３００ｐｍｏｌの５’末端を使用する。
【表４４】
2019523242.tif 000204
【０７８９】
３７℃で３０分間インキュベートする。最適な活性のためには新鮮な緩衝液が必要である（酸化によるＤＴＴの損失は活性を低下させる）。
【０７９０】
また、その後の５’アダプターライゲーションステップの間に、２０μｌの代わりに４０μｌのリン酸化３’アダプター−ＲＮＡ−混合物を使用した。
【０７９１】
２つのライブラリー産生方法に関与するステップおよび配列を図８５および図８６に示す。
【０７９２】
（実施例２４）
ＤＥＬ（ＤＮＡコードライブラリー）の調製および固定化
配列ＨＴＴ４１ＣＡＧおよびＨＴＴ１７ＣＡＧを合成し、以下に記載する選択緩衝液中で２時間インキュベーションした後にリフォールディングさせることに成功した。これはネイティブＰＡＧＥによって確認した（結果は示さず）。ネイティブＰＡＧＥ：３分間９５℃で変性させ、氷上で３分間スナップ冷却し、３０分間３７℃でリフォールディングさせた（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、７５ｍＭ  ＫＣｌ、および３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）。約５０％のＲＮＡ標的をニュートラアビジン樹脂上に固定化した。ＲＮＡ標的は、ゲル電気泳動後に染色剤を適用する改良後に選択条件下で安定であった。固定化の間のｓｓＤＮＡおよびＲｎａｓｅ阻害剤の濃度を減少させることもまた役に立つ。
【０７９３】
選択条件
ＤＥＬの詳細：ＤＥＬセット１＝６１０のＤＥＬライブラリー、計５５億２千百万の化合物；ＤＥＬセット２＝２０５のＤＥＬライブラリー、計７千万の化合物（これらのセットは別々にスクリーニングする）
【０７９４】
選択のラウンド：３〜４
【０７９５】
選択の様式：固定化した標的
【０７９６】
捕捉樹脂：ニュートラアビジン樹脂
【０７９７】
標的の量：１００ｐｍｏｌ
【０７９８】
固定化緩衝液の組成：ＮＭＲ緩衝液、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０３ｍｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ、２ｍＭ  バナジルリボヌクレオシド複合体
【０７９９】
選択緩衝液の組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭまたは１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．３ｍｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ、２０ｍＭ  バナジルリボヌクレオシド複合体
【０８００】
容量、温度、および時間：１００ｕＬ、室温、１時間
【０８０１】
洗浄条件
緩衝液の組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭまたは１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
【０８０２】
回数および容量：２×２００ｕＬ
【０８０３】
温度および時間：室温、高速
【０８０４】
溶出条件：
溶出の様式：熱溶出
【０８０５】
緩衝液の組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭまたは１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
【０８０６】
容量、温度、および時間：８０ｕＬ；８０℃；１５分
【０８０７】
室温で２時間選択緩衝液中でインキュベーションすることによってＲＮＡ複合体の安定性を確認した。リフォールディングしたＲＮＡを樹脂上に固定化することに成功した。
【表４５】
2019523242.tif 000205
【０８０８】
結論：
固定化の間のｓｓＤＮＡおよびＲｎａｓｅ阻害剤の濃度を減少させた後、５０％のリフォールディングしたＨＴＴ１７ＣＡＧをニュートラアビジン樹脂上に吸着させ、ＤＥＬ化合物とのインキュベーション後、リフォールディングしたＨＴＴ１７ＣＡＧをニュートラアビジン樹脂から回収すれば、標的は親和性選択のために用いることができる。
【０８０９】
（実施例２５）
表面プラズモン共鳴実験
図８７および図８８は、目的の標的ＲＮＡへの結合についてリガンドおよびフックアンドクリック構築物をスクリーニングするために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いる考えられる方法を示す。ＳＰＲは生体分子の相互作用をリアルタイムでモニタリングするために特に有用である。通常、標的種および無関係の対照をセンサーチップに固定化した後、分析物（化合物／断片）を表面上に流す。標的種への化合物の結合により、ＳＰＲシグナルの増大がもたらされる（会合相）。緩衝液を用いて結合した化合物を洗浄除去することにより、ＳＰＲシグナルの減少がもたらされる（解離相）。異なる化合物濃度で記録したセンサーグラムを適切な相互作用モデルに対してフィッティングする。この方法は、速度論的パラメーター（ｋａ、ｋｄ→ＫＤ）の抽出を可能とする。必要条件／制限としては、ｋａ／ｋｄ値が合理的な範囲内にあること、および標的サイズが大きすぎてはならないこと（＜１００ｋＤａ）が挙げられる。これは、断片をスクリーニングし、ヒットをプロファイルまたは検証するために優れた方法である。ＢＣ４０００を一次スクリーニング（最大４０００データポイント／週）のために使用してもよい。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００は、ヒットのプロファイリングおよび検証のために好適である。
【０８１０】
ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑの文脈では、ＳＰＲは、ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーへの「フック」の結合のモニタリングを可能とする。標的種をセンサーチップに固定化し、分析物（すなわち、フック）を表面上に流し（会合相）、ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーを表面上に流し（プラトー相）、競合化合物を表面上に洗い流し（解離相）、結合データを得る。必要条件／制限としては再び、ｋａ／ｋｄ値が合理的な範囲内にあり、各々の目的のために適合するものでなければならないことである。さらには、標的サイズは１００ｋＤａ未満でなければならない。加えて、準備を可能とするために、ステップ１およびステップ２を実施する（最初の試験）必要がある。適合する親和性を有する競合物もまた必要とされる。
【０８１１】
結合してＲＮＡ（３ＷＪ）を捕捉する相互作用パートナー（ＲＮＡ／ＤＮＡ）を同定する目的で、以下のステップが企図される。
【０８１２】
ビオチン化捕捉ＲＮＡ（ｂｉｏ３ＷＪ）を使用して二次構造にフォールディングさせ、
弾頭トリプチセンリガンドの結合を可能とし、
弾頭への共有結合によって、相互作用するＲＮＡ／ＤＮＡを釣り上げ、
ストレプトアビジンビーズへのｂｉｏ３ＷＪの結合を介して複合体を沈殿させ、
洗浄および溶出し、かつ
溶出液からライブラリーを生成し、シークエンシングする。
【０８１３】
細胞溶解物またはＲＮＡ調製物の円滑な生成のためのプロトコールが必要である。１つの例示的なプロトコールは以下のステップを伴う。
【０８１４】
ＲＴ−ｑＰＣＲに使用できる細胞溶解物の調製
【０８１５】
２４ウェルプレート中のＭＤＣＫロンドン細胞をＰＢＳ（１ｍＬ／ウェル）を用いて１回洗浄した。２００ｍＬ／ウェルの細胞溶解（ＣＬ）緩衝液に細胞単層を曝露することによって細胞溶解物を調製する。ＣＬ緩衝液の最終配合物は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．２５％  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌからなる。ＣＬ緩衝液は適切なストック溶液から新たに調製する。全ての試薬は分子生物学グレードであり、希釈はＤＥＰＣ処理水（３５１−０６８−７２１；Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）を用いて行う。ある特定の実験のためには、ＣＬ緩衝液は、ＭｇＣｌ２（Ｍ１０２８；Ｓｉｇｍａ）またはＲＮａｓｉｎ  Ｐｌｕｓ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｎ２６１５；Ｐｒｏｍｅｇａ）も含む。細胞を適切な期間（通常、ＣＬ緩衝液について５分）曝露する。生じた溶解物を、細胞単層残存物を壊すことなく注意深く収集し、直ちに分析するか、または冷凍保存する。例えば、Shatzkesら、「A  simple,  inexpensive  method  for  preparing  cell  lysates  suitable  for  downstream  reverse  transcription  quantitative  PCR」、Scientific  Reports  ４巻、論文番号：４６５９（２０１４年）を参照。
【０８１６】
Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用する単純溶解緩衝液により、まだ全て（ポリＡ濃縮やタンパク質除去がない）を含んでいる粗細胞溶解物を生成する。
【０８１７】
可能な異なるプロトコール：小ＲＮＡのワークフロー：アダプターライゲーション、ｃＤＮＡ合成、ライブラリー（小クラスター）；またはＲＮＡ全体のワークフロー：ＲｉｂｏＺｅｒｏを用いるまたは用いないランダムプライミング、標準的ライブラリー調製物（通常クラスター）。
【０８１８】
本発明のいくつかの実施形態を記載したが、我々の基本的な実施例を改変して、本発明の化合物および方法を利用する他の実施形態を提供し得ることは明らかである。したがって、本発明の範囲は、実施例によって提示した特定の実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されるべきことが理解されるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８−１】
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【図４８−２】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５８−１】
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【図５８−２】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１−１】
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【図６１−２】
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【図６２】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６４Ｃ】
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【図６４Ｄ】
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【図６５Ａ】
2019523242.tif 000281
【図６５Ｂ】
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【図６５Ｃ】
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【図６６】
2019523242.tif 000284
【図６７】
2019523242.tif 000285
【図６８】
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【図６９】
2019523242.tif 000287
【図７０】
2019523242.tif 000288
【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【図７２】
2019523242.tif 000291
【図７３】
2019523242.tif 000292
【図７４】
2019523242.tif 000293
【図７５】
2019523242.tif 000294
【図７６】
2019523242.tif 000295
【図７７】
2019523242.tif 000296
【図７８】
2019523242.tif 000297
【図７９】
2019523242.tif 000298
【図８０】
2019523242.tif 000299
【図８１】
2019523242.tif 000300
【図８２】
2019523242.tif 000301
【図８３】
2019523242.tif 000302
【図８４Ａ】
2019523242.tif 000303
【図８４Ｂ】
2019523242.tif 000304
【図８４Ｃ】
2019523242.tif 000305
【図８４Ｄ】
2019523242.tif 000306
【図８４Ｅ】
2019523242.tif 000307
【図８５Ａ】
2019523242.tif 000308
【図８５Ｂ】
2019523242.tif 000309
【図８５Ｃ】
2019523242.tif 000310
【図８５Ｄ】
2019523242.tif 000311
【図８５Ｅ】
2019523242.tif 000312
【図８６】
2019523242.tif 000313
【図８７】
2019523242.tif 000314
【図８８】
2019523242.tif 000315
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月31日(2019.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019523242000001.app
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８５Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８５Ｂ】
2019523242.tif 000316
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８５Ｅ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８５Ｅ】
2019523242.tif 000317
【国際調査報告】
2019523242.tif 000318
2019523242.tif 000319
2019523242.tif 000320