(57)【要約】  本発明は、ボツリヌス毒素および安定化剤を含む液状剤形およびその製造方法に関する。本発明のボツリヌス毒素および安定化剤を含む剤形化技術は、液状剤形として保管および流通が容易であり、人体の温度およびｐＨに適した条件でボツリヌス毒素安定化の著しい効果を立証したので、ボツリヌス毒素の安全かつ便利な医学的利用に大きく活用されることが期待される。
2019529530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経毒素および安定化剤を含む薬学剤形。
【請求項２】
前記神経毒素は、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、および百日咳毒素で構成されたグループから選択されるいずれか１つ以上である、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項３】
前記ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素タイプＡであることを特徴とする、請求項２に記載の薬学剤形。
【請求項４】
前記ボツリヌス毒素は、複合体化タンパク質を含有しない形態、または複合体化タンパク質を含有する複合体形態であることを特徴とする、請求項２に記載の薬学剤形。
【請求項５】
前記安定化剤は、アルギニン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸で構成されたグループから選択されるいずれか１つ以上である、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項６】
前記安定化剤は、安定化緩衝液の形態で提供されることを特徴とする、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項７】
前記安定化緩衝液は、グルコノラクトン緩衝液、または酒石酸緩衝液である、請求項６に記載の薬学剤形。
【請求項８】
前記安定化剤は、ボツリヌス毒素１００ユニットあたり０．１〜１，０００ｍＭ含まれることを特徴とする、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項９】
前記薬学剤形のｐＨは、５．５〜７．０であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項１０】
前記薬学剤形は、局所麻酔剤を追加的に含む、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項１１】
前記局所麻酔剤は、リドカインである、請求項１０に記載の薬学剤形。
【請求項１２】
前記局所麻酔剤は、全体組成物に対して０．１〜１重量％含まれることを特徴とする、請求項１０に記載の薬学剤形。
【請求項１３】
前記薬学剤形は、ポリソルベートを追加的に含む、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項１４】
前記薬学剤形は、液状である、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項１５】
（ａ）神経毒素を精製するステップと、
（ｂ）前記神経毒素に安定化剤を添加するステップとを含む、薬学剤形の製造方法。
【請求項１６】
前記神経毒素は、ボツリヌス毒素タイプＡである、請求項１５に記載の薬学剤形の製造方法。
【請求項１７】
前記安定化剤は、アルギニン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸で構成されたグループから選択されるいずれか１つ以上である、請求項１５に記載の薬学剤形の製造方法。
【請求項１８】
前記安定化剤は、安定化緩衝液の形態で提供されることを特徴とする、請求項１５に記載の薬学剤形の製造方法。
【請求項１９】
前記安定化緩衝液は、グルコノラクトン緩衝液、または酒石酸緩衝液である、請求項１８に記載の薬学剤形。
【請求項２０】
前記薬学剤形は、液状である、請求項１５に記載の薬学剤形の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ボツリヌス毒素および安定化剤を含む液状剤形およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経毒性効果を有する毒素を分泌する多様なクロストリジウム属菌株が１８９０年代から今まで発見されてきており、この７０年間、これらの菌株が分泌する毒素に対する特性の究明がなされてきた（Ｓｃｈａｎｔ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５６：８０，１９９２）。なかでも、ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ）は、神経機能を有する動物において神経筋肉終末（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）のコリン性前シナプス（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｐｒｅｓｙｎａｐｓｅ）でアセチルコリンのエクソサイトーシス（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）を阻害して全身無力症を起こすので、このようなボツリヌス毒素の特性を利用して美容または治療用途に利用しようとする努力があった。眼科疾患（米国特許６，２６５，３７９号）、痛み（米国特許６，１１３，９１５号）、多汗症を含む多様な自律神経系の神経機能障害（米国特許５，７６６，６０５号）、偏頭痛の痛み（米国特許５，７１４，４６８号）、手術−後の痛みおよび内臓痛（米国特許６，４６４，９８６号）、乾癬および皮膚炎（米国特許５，６７０，４８４号）、多様な癌（米国特許６，１３９，８４５号および６，０６３，７６８）、および神経性炎症（米国特許６，０６３，７６８号）などの治療にボツリヌス毒素を利用するための技術が提案されたり、試みられた。
【０００３】
しかし、ボツリヌス毒素は、タンパク質製剤として薬剤化過程を含む保管、流通、管理が容易でない問題点があった。これは、タンパク質の不安定性に起因し、ボツリヌス毒素のように極めて低い濃度で薬剤化が行われるタンパク質製剤の場合、その問題が深刻である。ボツリヌス毒素タンパク質は、固体表面に接着する特性を有するので、容器に注入される場合、タンパク質の一部が容器内壁に接着して活性成分の損失を引き起こし、タンパク質が酸化されやすかったり、小さい断片に分解されることがある。したがって、ボツリヌス毒素の変性を最大限に防止するために、製造工程上で精製されたボツリヌス毒素を凍結乾燥粉末形態で流通し、これを臨床で使用直前に溶媒に希釈して液状形態で患者に投与しているのが現状である。しかし、これも、使用者の希釈倍率の間違いまたは希釈溶媒の汚染などの人的ミスによる医療事故の危険性が高い問題点がある。したがって、ボツリヌス毒素液状剤形の製造および流通の際にもタンパク質の変性を防止できる安定化剤の開発が急務である。従来は、ボツリヌス毒素の活性維持のための安定化剤としてアルブミンを活発に用いたが、動物来由の成分による交差感染および副作用の危険性により、最近は非−動物性製剤の開発が要求されている。これによって、米国公開特許公報第２００７−０１３４１９９号には、アミノ酸としてグルタミンとグルタミン酸またはアスパラギンとアスパラギン酸を含むボツリヌス毒素組成物について開示しており、韓国登録特許公報第１０８７０１７号では、メチオニンを安定化剤として用いるボツリヌス毒素組成物について開示しているが、人体の温度およびｐＨに適した条件での著しい効果を提示できない限界があった。
【０００４】
したがって、本発明は、ボツリヌス毒素および安定化剤を含む液状剤形およびその製造方法に関し、本発明のボツリヌス毒素を含む薬剤学的剤形は、有効成分としてのボツリヌス毒素に対する安定化剤としてアルギニン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸を含むか、安定化緩衝液としてグルコノラクトン緩衝液、または酒石酸緩衝液を含む液状剤形として保管および流通が容易であり、人体の温度およびｐＨに適した条件でボツリヌス毒素の安定化の著しい効果を立証したので、ボツリヌス毒素の安全かつ便利な医学的利用に大きく活用されることが期待される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の従来技術上の問題点を解決するためになされたものであって、ボツリヌス毒素および安定化剤を含む液状剤形およびその製造方法に関する。
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上に言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以下、本願に記載の多様な具体例が図面を参照して記載される。下記の説明において、本発明の完全な理解のために、多様な特異的詳細事項、例えば、特異的形態、組成物および工程などが記載されている。しかし、特定の具体例は、これらの特異的詳細事項の一つ以上なしに、または他の公知の方法および形態とともに実行される。他の例において、公知の工程および製造技術は、本発明を不必要にあいまいにさせないために、特定の詳細事項として記載されない。「一具体例」または「具体例」に関する本明細書全体を通した参照は、具体例と結び付いて記載された特別な特徴、形態、組成または特性が本発明の１つ以上の具体例に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる多様な位置で表現された「一具体例において」または「具体例」の状況は、必ずしも本発明の同じ具体例を示すのではない。追加的に、特別な特徴、形態、組成または特性は、１つ以上の具体例において、何らかの適した方法で組み合わされる。
明細書において、特別な定義がなければ、本明細書に使用されたすべての科学的および技術的な用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
【０００７】
本発明の一具体例において、「ボツリヌス毒素（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ）」とは、クロストリジウムボツリヌス細菌が作る神経毒タンパク質である。クロストリジウム属は１２７種以上であり、形態および機能によって区分される。嫌気性、グラム陽性バクテリアクロストリジウムボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）は、ヒトおよび動物においてボツリズムという神経麻痺疾患を起こす、強いポリペプチド神経毒である、ボツリヌス毒を生産する。クロストリジウムボツリヌスの胞子は土壌で発見され、きちんと殺菌されずに密封された、家庭で缶詰めされた食品容器で培養されることがあり、このようなものが多くのボツリズムの原因になる。ボツリズム症状は、典型的にクロストリジウムボツリヌス培養物または胞子に感染した食べ物を食べてから１８〜３６時間経過後に現れる。ボツリヌス毒素は、毒性が減少しないまま腸内膜を通過できると見られ、コリン性運動ニューロンに対して高い親和度を示す。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行障害、嚥下障害および言語障害、呼吸筋肉の麻痺および死へと症状が進みかねない。
【０００８】
ボツリヌス毒素タイプＡは、ヒトに知られた最も致命的な天然生物学剤である。商業的に入手可能なボツリヌス毒素タイプＡ（精製された神経毒複合体）のＬＤ５０は約５０ピコグラムである（すなわち、１ユニット）。モル（Ｍ）を基準とする時、ボツリヌス毒素タイプＡは、ジフテリアより１８億倍、シアン化ナトリウムより６億倍、コブラ毒（ｃｏｂｒａ  ｔｏｘｉｎ）より３千万倍、そして、コレラより１千２百万倍さらに致命的である。ボツリヌス毒素１ユニット（Ｕ）は、体重がそれぞれ１８〜２０ｇの雌スイスウェブスターマウス（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ｍｉｃｅ）への腹腔内注射によるＬＤ５０として定義することができる。
【０００９】
一般的に、免疫学的に区別される７つのボツリヌス神経毒は、タイプ−特異的な抗体で中和して区別される、それぞれ神経毒セロタイプ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧに特徴づけられる。異なるセロタイプのボツリヌス毒素は、作用する動物種および引き起こす麻痺の程度および持続時間によって差がある。例えば、ラットで発生する麻痺率で測定する時、ボツリヌス毒素タイプＡは、ボツリヌス毒素タイプＢに比べて５００倍さらに強いと測定された。また、ボツリヌス毒素タイプＢは、ボツリヌス毒素タイプＡの霊長類ＬＤ５０の約１２倍の４８０Ｕ／ｋｇを霊長類に投与する時も毒性がないと測定された。ボツリヌス毒素は、コリン性運動ニューロンに強い親和度をもって結合し、ニューロンに入ってアセチルコリンの放出を抑制するとされる。食細胞作用および飲細胞作用によってのみならず、低い親和度受容体を通して追加的に吸収される。
【００１０】
セロタイプに関係なく、毒素中毒の分子的メカニズムは類似し、少なくとも３つのステップで構成されると考えられる。この過程の第１ステップでは、毒素の重鎖（Ｈ鎖またはＨＣ）と細胞表面受容体の特異的な相互作用によって、毒素が標的ニューロンのシナプス前膜に結合するものであり、この受容体は、ボツリヌス毒素タイプおよび破傷風毒素タイプのそれぞれによって異なるとされる。細胞表面に対する毒素の標的化には重鎖のカルボキシル末端断片、Ｈｃが重要とされる。
【００１１】
第２ステップでは、毒素が中毒された細胞の原形質膜を横切って通過する。一次的に、ボツリヌス毒素は、受容体−媒介エンドサイトーシスを通して細胞によって囲まれて、毒素を含むエンドソームが形成される。その後、毒素はエンドソームを抜け出て細胞の細胞質に入る。このステップは、約ｐＨ５．５以下で毒素の構造変更を誘発する重鎖のアミノ末端断片、ＨＮによって媒介されるとされる。エンドソームは、エンドソーム内部のｐＨを減少させるプロトンポンプを有することが知られている。構造的位置移動によって毒素の疎水性残基が露出して、毒素がエンドソーム膜に取り囲まれるようになる。その後、毒素（または少なくとも軽鎖）はエンドソーム膜を通してサイトゾルに転位される。
【００１２】
ボツリヌス毒素活性化メカニズムの最後のステップは、重鎖と軽鎖を連結するジスルフィド結合の還元を含むとされる。ボツリヌスおよび破傷風毒素の全体毒性活性は完全毒（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）の軽鎖に含まれ；軽鎖は、認識、および神経伝達物質−含有小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）と原形質膜の細胞質表面とのドッキング、および原形質膜と小胞との融合に必ず必要なタンパク質を選択的に切断する亜鉛（Ｚｎ＋＋）エンドペプチダーゼである。破傷風神経毒、ボツリヌス毒素タイプＢ、Ｄ、ＦおよびＧは、シナプトブレビン（または小胞−関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）と称する）、シナプトソーム膜タンパク質の分解を引き起こす。シナプス小胞の細胞質表面に存在するＶＡＭＰの大部分は、このような分解作用の一つの結果として除去される。セロタイプＡおよびＥはＳＮＡＰ−２５を切断する。セロタイプＣ１は、元々シンタキシンを切断するとされていたが、シンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５を切断することが明らかになった。同一の結合を切断するタイプＢ（および破傷風毒素）を除けば、それぞれの毒素は異なる結合を特異的に切断する。それぞれのこのような切断は小胞−膜ドッキングの過程を妨げて小胞内容物のエクソサイトーシスを防ぐ。
【００１３】
ボツリヌス毒素は、活動亢進性骨格筋を特徴とする神経筋肉障害（すなわち、運動障害）の治療のために臨床で使用されている。１９８９年、ボツリヌス毒素タイプＡコンプレックスは米国食品医薬品庁によって、本態性眼瞼痙攣、斜視および反側顔面痙攣の治療に使用されることが承認された。次に、ボツリヌス毒素タイプＡはまた、ＦＤＡから頸部ジストニアの処置および眉間シワの処置について承認され、ボツリヌス毒素タイプＢも、頸部ジストニアの処置について承認された。毒素タイプＡ以外のボツリヌスセロタイプは、ボツリヌス毒素タイプＡと比較する時、活性においてより低い効力および／またはより短い持続時間を有すると見られる。末梢筋肉内注射されたボツリヌス毒素タイプＡの臨床効果は、通常、注射後１週間以内に現れる。１回のボツリヌス毒素タイプＡの筋肉内注射による症状救済の典型的な持続時間は平均約３ヶ月であるが、非常により長い期間の治療活性が報告された。
【００１４】
すべてのボツリヌス毒素セロタイプが神経筋肉接合部で神経伝達物質アセチルコリンの放出を抑制すると見られるとしても、これらは異なる神経分泌性タンパク質で作用し、このタンパク質を異なる部位で切断する。例えば、ボツリヌスタイプＡおよびＥはいずれも、２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）を切断するが、このタンパク質の異なるアミノ酸配列を標的とする。ボツリヌス毒素タイプＢ、Ｄ、ＦおよびＧは小胞関連タンパク質（ＶＡＭＰ、いわゆるシナプトブレビン）に作用し、それぞれのセロタイプはこのタンパク質の異なる部位を切断する。最後に、ボツリヌス毒素タイプＣ１はシンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５をすべて切断すると見られる。このような作用メカニズムの相違性は、様々なボツリヌス毒素セロタイプの作用による相対的な効力および／または持続時間に影響を及ぼす。特に、ボツリヌス毒素の基質を様々な異なる細胞タイプで発見できる。
【００１５】
ボツリヌス毒素タンパク質分子の分子量は、知られたボツリヌス毒素セロタイプ７種のすべてにおいて、約１５０ｋＤａである。ボツリヌス毒素は、クロストリジウム系バクテリアによって関連する非毒性タンパク質とともに１５０ｋＤａのボツリヌス毒素タンパク質分子を含む複合体として放出される。そのため、ボツリヌス毒素タイプＡ複合体は、クロストリジウム系バクテリアによって、９００ｋＤａ、５００ｋＤａおよび３００ｋＤａ型として生成される。ボツリヌス毒素タイプＢおよびＣ１は、７００ｋＤａまたは５００ｋＤａの複合体としてのみ生成されると見られる。ボツリヌス毒素タイプＤは、３００ｋＤａおよび５００ｋＤａの複合体として生成される。最後に、ボツリヌス毒素タイプＥおよびＦは、約３００ｋＤａの複合体としてのみ生成される。これらの複合体（すなわち、分子量が約１５０ｋＤａより大きいもの）は、非毒性赤血球凝集素タンパク質および非毒素および非毒性非赤血球凝集素タンパク質を含むとされる。このような２つの非毒素タンパク質（ボツリヌス毒素分子とともに関連する神経毒複合体を含む）は、ボツリヌス毒素分子の変性に対する安定性および毒素が摂取される時の、消化性酸に対する保護を提供するのに作用する。また、ボツリヌス毒素複合体がより大きいほど（分子量が約１５０ｋＤａ以上）、ボツリヌス毒素複合体が筋肉注射された部位からボツリヌス毒素がよりゆっくり拡散するはずである。したがって、本発明において、ボツリヌス毒素は、複合体化タンパク質を含有しない形態または複合体化タンパク質を含有する複合体の形態をすべて含むことができる。自然的に形成する複合体化タンパク質を含有せず、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型クロストリジウムボツリヌスに由来するボツリヌス毒素タンパク質の分子量は約１５０ｋＤａである。しかし、クロストリジウムボツリヌスバクテリアによって毒素タンパク質が生産される時、ボツリヌス毒素タンパク質は、ボツリヌス毒素タンパク質の作用を補助および保護する様々なヘマグルチニン（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タンパク質および非ヘマグルチニンタンパク質と多様な複合体を形成して生産される。自然的に形成する複合体化タンパク質を含有するボツリヌス毒素セロタイプＡは約９００ｋＤａ、５００ｋＤａ、または３００ｋＤａの分子量を有する複合体形態であり、セロタイプＢとＣは約５００ｋＤａの分子量を有する複合体形態であり、セロタイプＤは約３００ｋＤａ、または５００ｋＤａの分子量を有する複合体形態であり、セロタイプＥとＦは約３００ｋＤａの分子量を有する複合体形態である。
【００１６】
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究において、ボツリヌス毒素が脳幹組織の一次細胞培養物からアセチルコリンおよびノルエピネフリンのカリウム陽イオンの誘導放出を抑制することが明らかになった。さらに、ボツリヌス毒素は、脊髓ニューロンの一次培養物でグリシンおよびグルタメートの誘発放出を抑制し、脳シナプトソーム標本で神経伝達物質アセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフリン、ＣＧＲＰ、物質Ｐ（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ）およびグルタメートそれぞれの放出を抑制すると報告された。したがって、適当な濃度で使用する場合、ボツリヌス毒素によって大部分の神経伝達物質の刺激−誘発放出が抑制される。
【００１７】
ボツリヌス毒素タイプＡは、発酵槽でクロストリジウムボツリヌスの培養物を作って培養した後、発酵混合物を公知の方法で収獲および精製して得ることができる。最初はすべてのボツリヌス毒素セロタイプが、プロテアーゼによって切断またはニッキングされて（ｎｉｃｋｅｄ）神経活性化されなければならない、不活性単鎖タンパク質として合成される。ボツリヌス毒素セロタイプＡおよびＧを生成するバクテリア菌株は内在性プロテアーゼを有し、したがって、セロタイプＡおよびＧは、バクテリア培養物から主に活性型として回収される。これと対照的に、ボツリヌス毒素セロタイプＣ１、ＤおよびＥは、非タンパク分解性菌株によって合成されるので、培養物から回収される時、典型的に不活性化の状態である。セロタイプＢおよびＦは、タンパク分解性および非タンパク分解性菌株すべてによって生成されるので、活性または不活性型として回収される。しかし、例えば、ボツリヌス毒素タイプＢセロタイプを生成するタンパク分解性菌株は、生成された毒素の一部だけを切断する。ニッキングされない分子に対するニッキングされた分子の正確な比率は、培養時間および培養物の温度によって異なる。そのため、すでに知られているように、ボツリヌス毒素タイプＡに比べて、ボツリヌス毒素タイプＢは効力が非常に低いため、例えば、所定百分率のある標本のボツリヌス毒素タイプＢの毒素も不活性になる。臨床標本において不活性ボツリヌス毒素分子の存在は、標本の総体的なタンパク質の負荷に寄与するはずであり、これは、臨床的な効果には寄与することなく抗原性の増加に関連付けられる。また、同一の投与量レベルにおいてボツリヌス毒素タイプＢは、ボツリヌス毒素タイプＡに比べて、筋肉注射時、活性の持続時間がより短くかつ効力が低下することが知られている。
【００１８】
クロストリジウムボツリヌスのホールＡ種（Ｈａｌｌ  Ａ  ｓｔｒａｉｎ）から≧３×１０７Ｕ／ｍｇであり、Ａ２６０／Ａ２７８が０．６０以下であり、ゲル電気泳動で独特のバンドパターンを示す特徴を有する、質の高い結晶形ボツリヌス毒素タイプＡを得ることができる。公知のシャンツプロセス（Ｓｈａｎｔｚ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を結晶形ボツリヌス毒素タイプＡを得るのに使用することができる。一般的に、ボツリヌス毒素タイプＡ複合体は、適切な培地でクロストリジウムボツリヌスタイプＡを培養した嫌気性発酵物から分離および精製される。このような公知のプロセスはまた、例えば：分子量が約１５０ｋＤａ、特異的な効力が１〜２×１０８ＬＤ５０Ｕ／ｍｇ以上のボツリヌス毒素タイプＡを精製するか；分子量が約１５６ｋＤａ、特異的な効力が１〜２×１０８ＬＤ５０Ｕ／ｍｇ以上のボツリヌス毒素タイプＢを精製するか；分子量が約１５５ｋＤａ、特異的な効力が１〜２×１０７ＬＤ５０Ｕ／ｍｇ以上のボツリヌス毒素タイプＦを精製するなどの、非毒素タンパク質から純粋なボツリヌス毒素を分離して得るのに使用することができる。
【００１９】
ボツリヌス毒素および／またはボツリヌス毒素複合体を当業界で公知の化合物製造業者から商業的に入手することができ、純粋なボツリヌス毒素をさらに薬剤学的組成物を製造するのに使用することができる。
【００２０】
一般的に、酵素におけるのと同じく、ボツリヌス毒素（これらは細胞内ペプチダーゼである）の生物学的活性は、少なくとも一部分、それらの３次元的構造によって異なる。そのため、ボツリヌス毒素タイプＡは、熱、多様な化学物質、表面スクラッチおよび表面乾燥によって毒性が除去される。また、公知の培養、発酵および精製によって得られた毒素複合体を、非常に低い毒素濃度に希釈して薬剤学的組成物製剤に使用する場合、好適な安定化剤がなければ、毒素の毒性が速やかに除去されることが公知である。大量に希釈すれば特異的毒性が速く損失することから、数ミリグラムの量の毒素をミリリットルあたり数ナノグラムを含有する溶液に希釈することは非常に難しい。毒素を含有する薬剤学的組成物を製造した後、数ヶ月または数年間使用できるため、毒素は好適な安定化剤または安定化バッファーを用いて安定化しなければならない。
【００２１】
下記のように、臨床セッティングにおいてボツリヌス毒素タイプＡを使用することが報告された：
生体内で使い捨て投与されたボツリヌス毒素において筋肉内注射の一般的な持続時間は、典型的に約３〜４ヶ月である。しかし、場合によって、Ａ亜型は１２ヶ月以上効能を持続することができ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ６（Ｓｕｐｐ４）：Ｓ１１１−Ｓ１１５０：１９９９）、多汗症のような腺（ｇｌａｎｄ）の治療に使用される場合、ある状況では２７ヶ月間持続することができる。
【００２２】
ボツリヌス毒素は、末梢部位で薬理学的作用を示すだけでなく、中枢神経系においても抑制効果を示すことができる。Ｗｅｉｇａｎｄらの研究、Ｎａｕｎｙ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９７６；２９２，１６１−１６５、およびＨａｂｅｒｍａｎｎ，Ｎａｕｎｙ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９７４；２８１，４７−５６は、ボツリヌス毒素が逆行輸送によって脊髓領域にさかのぼることができるということを示す。このように、末梢部位に、例えば、筋肉内に投与されたボツリヌス毒素は、脊髓に逆行輸送される。
【００２３】
ボツリヌス毒素はまた、皮膚、骨および腱の傷（米国特許６，４４７，７８７号参照）、疼痛（米国特許６，１１３，９１５参照）、多汗症を含む多様な自律神経系の神経機能障害（米国特許５，７６６，６０５号およびＧｏｌｄｍａｎ（２０００），Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｊｕｌ−Ａｕｇ２４（４）：２８０−２８２参照）、緊張性頭痛（米国特許６，４５８，３６５号参照）、偏頭痛の痛み（米国特許５，７１４，４６８号参照）、手術−後の痛みおよび内臓痛（米国特許６，４６４，９８６号参照）、毛髪成長および毛髪保持（米国特許６，２９９，８９３号参照）、乾癬および皮膚炎（米国特許５，６７０，４８４号参照）、損傷した筋肉（米国特許６，４２３，３１９号参照）、多様な癌（米国特許６，１３９，８４５号および６，０６３，７６８参照）、平滑筋障害（米国特許５，４３７，２９１号参照）、神経捕捉症侯群（米国特許出願２００３０２２４０１９参照）、挫創（ＷＯ０３／０１１３３３参照）、神経性炎症（米国特許６，０６３，７６８号参照）、眼科疾患（米国特許６，２６５，３７９参照）、膵臓疾患（米国特許６，１４３，３０６および６，２６１，５７２参照）；前立腺肥大症、前立腺癌および尿失禁を含む前立腺疾患（米国特許６，３６５，１６４および６，６６７，０４１およびＤｏｇｇｗｅｉｌｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｃａｕｓｅｓ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｏｆ  ｒａｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ，Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌ  Ｕｒｏｄｙｎ１９９８；１７（４）：３６３参照）；線維組織炎（米国特許６，６２３，７４２号）、梨状筋症侯群（Ｃｈｉｌｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ，８１：７５１−７５９参照）を治療するために提案されたり、試みられた。
【００２４】
米国特許第５，９８９，５４５号には、特定の標的残基に化学的にコンジュゲートされるか、組換え的に融合した変形クロストリジウム神経毒またはその断片、好ましくは、ボツリヌス毒素を、脊髓に投与して、痛みを処置するのに使用できることが開示されている。また、多様な疾患を処置するうえで標的化されたボツリヌス毒素（すなわち、非−天然結合残基を有する）が使用できることが開示されている（ＷＯ９６／３３２７３；ＷＯ９９／１７８０６；ＷＯ９８／０７８６４；ＷＯ００／５７８９７；ＷＯ０１／２１２１３；ＷＯ００／１０５９８参照）。
【００２５】
また、ボツリヌス毒素を胸筋に注射して胸筋痙攣を調節する技術も公知であり（Ｓｅｎｉｏｒ  Ｍ．，Ｂｏｔｏｘ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｃｔｏｒａｌ  ｓｐａｓｍ  ａｆｔｅｒ  ｓｕｂｐｅｃｔｏｒａｌ  ｉｍｐｌａｎｔ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ，Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎ  Ｓｕｒｇ，Ｊｕｌｙ２０００，２２４−２２５参照）、経皮ボツリヌス毒素投与（米国特許出願第１０／１９４，８０５号参照）の場合のように、制御放出毒素インプラント（米国特許６，３０６，４２３および６，３１２，７０８参照）が公知である。ボツリヌス毒素を、口の噛んだりくわえる（ｂｉｔｉｎｇ）筋肉を弱くして自ら被る傷および得られる潰瘍を治療し（Ｐａｙｎｅ  Ｍ．，ｅｔ  Ａｌ，Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｅｌｆ  ｍｕｔｉｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００２  Ｓｅｐ；５２（３Ｓｕｐｐ１）：Ｓ１５７参照）、良性胆嚢損傷または腫瘍を治療し（Ｂｌｕｇｅｒｍａｎ  Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｃｃｒｉｎｅ  ｈｉｄｒｏｃｙｓｔｏｍａｓ：Ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｕｒｇ  ２００３  Ｍａｙ；２９（５）：５５７−９参照）、裂肛を治療し（Ｊｏｓｔ  Ｗ．，Ｔｅｎ  ｙｅａｒｓ’  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ａｎａｌ  ｆｉｓｓｕｒｅ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ  ２００２  Ｓｅｐ；１７（５）：２９８−３０２参照）、および特定形態のアトピー性皮膚炎を治療するために（Ｈｅｃｋｍａｎｎ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｉｃｈｅｎ  ｓｉｍｐｌｅｘ：Ａｎ  ｏｐｅｎ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ，Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００２  Ａｐｒ；４６（４）：６１７−９参照）使用できることが知られている。
【００２６】
追加的に、ボツリヌス毒素は、ラットホルマリンモデルで誘導された炎症痛を減少させる効果を有することができる（Ａｏｋｉ  Ｋ．，ｅｔ  Ａｌ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｂｏｔｏｘ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ  ２００３  Ｓｅｐ；２３（７）：６４９．参照）。また、ボツリヌス毒素の神経阻害が上皮の厚さの減少をもたらすことがあると報告されている（Ｌｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｏｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｔｏｒ  ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｆｏｏｔ  ｇｌａｂｒｏｕｓ  ｓｋｉｎ，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １９９７；１４７：４５２−４６２参照）。最後に、過度な足の発汗（Ｋａｔｓａｍｂａｓ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｏｔ：Ｕｎａｐｐｒｏｖｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，Ｃｌｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００２  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；２０（６）：６８９−６９９；Ｓｅｖｉｍ，Ｓ．，ｅｔ  Ａｌ，Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ−Ａ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐａｌｍａｒ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔａｒ  ｈｙｐｅｒｈｉｄｒｏｓｉｓ，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｂｅｌｇ  ２００２  Ｄｅｃ；１０２（４）：１６７−７０参照）、強直性つま先（Ｓｕｐｕｔｔｉｔａｄａ，Ａ．，Ａ．，Ｌｏｃａｌ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｐａｓｔｉｃ  ｔｏｅｓ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  Ｒｅｈａｂｉｌ  ２００２  Ｏｃｔ；８１（１０）：７７０−５参照）、特発性つま先歩き（Ｔａｃｋｓ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｔｏｅ  ｗａｌｋｉｎｇ：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，Ｄｅｖ  Ｍｅｄ  Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００２；４４（Ｓｕｐｐｌ９１）：６参照）、および足筋緊張異常（Ｒｏｇｅｒｓ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ｉｎ  ｆｏｏｔ  ｄｙｓｔｏｎｉａ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９９３  Ａｐｒ；４３（４Ｓｕｐｐｌ２）参照）を治療するために足にボツリヌス毒素を投与することが知られている。
【００２７】
破傷風毒素（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｉｎ）と、その誘導体（すなわち、非−天然標的残基を有する）、断片、ハイブリッドおよびキメラをさらに治療に使用することができる。破傷風毒素は、ボツリヌス毒素と多く類似する。したがって、破傷風毒素およびボツリヌス毒素はいずれも近く関連付けられた種のクロストリジウム（それぞれ、クロストリジウムテタニーおよびクロストリジウムボツリヌス）によって生成されるポリペプチドである。また、破傷風毒素とボツリヌス毒素はいずれも、単一ジスルフィド結合によって重鎖（分子量約１００ｋＤａ）に共有結合した軽鎖（分子量約５０ｋＤａ）で構成された二重鎖タンパク質である。そして、破傷風毒素およびそれぞれ７つのボツリヌス毒素（非−複合体）の分子量は約１５０ｋＤａである。さらに、破傷風毒素とボツリヌス毒素ともにおいて、軽鎖は細胞内生物学的（プロテアーゼ）活性を有するドメインを含むのに対し、重鎖は受容体結合（免疫原性）および細胞膜電位ドメインを含む。
【００２８】
また、破傷風毒素とボツリヌス毒素はいずれも、シナプス前コリン性ニューロン表面のガングリオシド受容体に対して大きく、特異的な親和度を示す。末梢コリン性ニューロンによる、破傷風毒素の、受容体媒介エンドサイトーシスによって、軸索突起逆行輸送、中央シナプスからの抑制性神経伝達物質の放出遮断および痙性麻痺が現れる。これに対し、末梢コリン性ニューロンによる、ボツリヌス毒素の受容体媒介エンドサイトーシスは、逆行輸送、中毒された末梢運動ニューロンからのアセチルコリンエクソサイトーシスの抑制および弛緩性麻痺をほとんど起こさない。
【００２９】
最後に、破傷風毒素およびボツリヌス毒素は、生合成および分子構成ともにおいて互いに似ている。したがって、破傷風毒素とボツリヌス毒素タイプＡは、タンパク質配列が全体にわたって３４％同一であり、いくつかの機能性ドメインでは配列が６２％同一である（Ｂｉｎｚ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｏｔｈｅｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，Ｊ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６５（１６）；９１５３−９１５８：１９９０参照）。
【００３０】
本発明の一具体例において、「アセチルコリン」とは、コリンと酢酸のエステルで最初に発見された神経伝達物質で、ニューロン全体に分布し、化学式はＣ７Ｈ１６ＮＯ２、分子量は１４６．２１である。
【００３１】
いくつかの神経調節物質が同一のニューロンによって放出できることを提示する証拠があるが、典型的に哺乳類神経系では、それぞれの形態のニューロンによって単一形態の小さい分子の神経伝達物質だけが放出される。この神経伝達物質アセチルコリンは、脳の様々な部位のニューロン、特に、運動皮質の大きいピラミッド細胞、大脳核のいくつかの異なるニューロン、骨格筋に分布する運動ニューロン、自律神経系（交感神経系および副交感神経系とも）の神経節前ニューロン、筋紡錘線維のｂａｇ１線維、副交感神経系の神経節後ニューロンおよび交感神経系の神経節後ニューロンのいくつかによって分泌する。本来、大部分の交感神経系の神経節後ニューロンは、神経伝達物質のノルエピネフリンを分泌するのに対し、汗腺、立毛筋およびいくつかの血管への神経節後交感神経線維だけがコリン性である。ほとんどの場合、アセチルコリンは興奮効果を示す。しかし、アセチルコリンがいくつかの末梢副交感神経末端では抑制効果を示すことが知られている（例えば、迷走神経による心臓拍動の抑制）。
【００３２】
自律神経系の遠心性信号は、交感神経系または副交感神経系を通して体に伝達される。交感神経系の神経節前ニューロンは、脊髓の中間外側角に位置する神経節前交感ニューロン細胞体から伸びてくる。細胞体から伸びてきた神経節前交感神経線維は、脊椎周囲交感神経節または脊椎前神経節に位置する神経節後ニューロンとシナプスをなす。交感神経系および副交感神経系の神経節前ニューロンはすべてコリン性であるので、神経節にアセチルコリンを適用すれば交感および副交感神経節後ニューロンを興奮させるはずである。
【００３３】
アセチルコリンは、２つの形態の受容体、ムスカリン性受容体およびニコチン性受容体を活性化させる。ムスカリン性受容体は、副交感神経系の神経節後ニューロンおよび交感神経系の神経節後コリン性ニューロンによって刺激されたすべてのエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）細胞で発見される。ニコチン性受容体は、副腎髄質だけでなく、交感神経系および副交感神経系ともの神経節前と神経節後ニューロンの間のシナプスにおいて神経節後ニューロンの細胞表面にある自律神経節内で発見される。ニコチン性受容体はまた、多くの非自律神経末端、例えば、神経筋肉接合部の骨格筋線維の膜で発見される。
【００３４】
アセチルコリンは、小さくて透明な、細胞内小胞がシナプス前ニューロン性細胞膜と融合する時、コリン性ニューロンから放出される。副腎髄質（また、ＰＣ１２細胞ライン）および膵臓の島細胞のような、広範囲な非−ニューロン性分泌細胞は、大きな高密度中心小胞（ｌａｒｇｅ  ｄｅｎｓｅｃｏｒｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）からそれぞれカテコールアミンおよび副甲状腺ホルモンを放出する。ＰＣ１２細胞ラインは、交感神経副腎発達（ｓｙｍｐａｔｈｏａｄｒｅｎａｌ  ｄｅｖｅｌｐｏｍｅｎｔ）研究のための組織培養モデルとして広範囲に使用されるラットクロム親和性細胞腫細胞のクローンである。脱神経細胞に毒素を透過可能にしたり（電気衝撃法などによって）、直接注射すると、ボツリヌス毒素はｉｎ  ｖｉｔｒｏで２つの細胞種類ともにおいて２つの化合物種類の放出をすべて抑制する。ボツリヌス毒素はまた、皮質のシナプトソーム細胞培養物から神経伝達物質のグルタメートが放出されるのを抑制することが知られている。
【００３５】
神経筋肉接合部は、筋肉細胞周辺の軸索突起によって骨格筋で形成される。神経系を通して伝達された信号は、末端の軸索突起で作用電位になり、イオンチャンネルを活性化し、その結果として、例えば、神経筋肉接合部の運動終板で、ニューロン内シナプス性小胞から神経伝達物質のアセチルコリンが放出される。アセチルコリンは、細胞外空間を横切って筋肉終板表面のアセチルコリン受容体タンパク質と結合する。一旦十分に結合すると、筋肉細胞の作用電位が特異的な膜イオンチャンネルの変化を起こし、その結果として、筋肉細胞が収縮する。その後、アセチルコリンは筋肉細胞から放出されて、細胞外空間でコリンエステラーゼによって代謝される。代謝生成物は再びアセチルコリンに再生するために末端の軸索突起に再び回収される。
【００３６】
本発明の一具体例において、「安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）」とは、活性成分の安定性を増加させ、活性成分が任意に変化して酸化されたり、結晶化されたり、柔軟物質に変性するのを防止するために添加される任意の添加剤を意味し、薬学的に許容可能なものであれば大きく制限されない。安定化剤の安定化効能に対する評価は温度を限定せず行われるが、通常、高温でより低温で安定化効果が長期的に維持されると理解される。したがって、低温で長期間安定化効能を評価することを高温で短時間行う「加速化実験」に代替することができる。例えば、特定の安定化剤の安定化効果を３７℃で９日間評価した結果は、４℃で３ヶ月間評価した結果と同じであり、３７℃で７４日間評価した結果は、４℃で２４ヶ月間評価した結果と同じであると理解される（ｈｔｔｐ：／／ｉｓｏ−ｉｎｃ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉｃａｌ−ｐａｃｋａｇｅ−ｔｅｓｔｉｎｇ／ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ−ａｇｉｎｇ．ｈｔｍｌ）。
【００３７】
本発明において、安定化剤は、ボツリヌス毒素を含むクロストリジウム系神経毒タンパク質の生物学的活性を保存または維持するために添加されるものであり、好ましくは、アルギニン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルコノラクトン、酒石酸、および／または次亜硫酸ナトリウムであり、より好ましくは、アルギニン、アスパラギン酸、および／またはグルタミン酸であるが、これに制限されるわけではない。
【００３８】
本発明の一具体例において、「安定化緩衝液」または「安定化緩衝化剤」とは、安定化剤としての効果と緩衝液としての効果を同時に有するものであって、一般的な緩衝液に安定化効果を有する物質を追加して製造可能であり、安定化緩衝液に追加的な安定化剤を含むことで安定化シナジー効果（ｓｙｎｅｒｇｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を期待することができる。本発明において、安定化緩衝液は、グルコノラクトン緩衝液、および／または酒石酸緩衝液が好ましいが、これに制限されるわけではない。
【００３９】
本発明の一具体例において、「アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）」とは、塩基性アミノ酸の一種で分子式はＣ６Ｈ１４Ｎ４Ｏ２で表され、分子量１７４．２１であり、水溶性であり、残基の略語は「Ａｒｇ」であり、さらに簡略化する時は「Ｒ」で表現する。特に、魚類において白子のタンパク質クルペインなどに多量含有されている。Ｍ．Ｊ．Ｓ．シュルツェとＥ．スタイガーによって白化させたルピナス（豆の一種）の芽ばえたものから単離した。その硝酸塩が銀（ａｒｇｅｎｔ）のように白色を帯びてアルギニンと名付けた。Ｌ−アルギニンは、タンパク質を構成するアミノ酸の一つとして存在するが、魚類の精子に存在するタンパク質プロタミンに属する。ニシン・サケなどでは構成アミノ酸の約７０％がアルギニンである。植物種子中には遊離状態でも存在する。アルギニン残基はそのグアニジノ基によって強塩基性を示す。アルカリ性でα−ナフトールとハイポ亜塩素酸を作用させると特有の赤色を示すので定量可能である。生体内の代謝経路としては、Ｈ．Ａ．クレプスらが発見したオルニチン回路（尿素回路）の構成成分であり、アルギナーゼの作用によって尿素とオルニチンに分解される。シトルリンとアスパラギン酸から生成される。成人には非必須アミノ酸であるが、乳児には必須アミノ酸である。アンモニアや大量のアミノ酸の毒作用に対して保護する作用がある。脳にはアルギナーゼが存在し、γ−グアニジノ酪酸の前駆体であるアルギニンの量を調節している。無脊椎動物においては、アルギニンリン酸の形態でホスファゼンとして筋肉の収縮に重要な役割を果たすほか、特異なグアニジン塩基（マグマチン・オクトピン）の前駆体として広く存在する。
【００４０】
本発明の一具体例において、「グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）」とは、アミノ酸の一種で「グルタメート」とも名付けられ、残基の略号「Ｇｌｕ」または「Ｅ」で表され、分子式はＣ５Ｈ９ＮＯ４である。コムギのグルテンの加水分解物で最初に発見されたが、タンパク質構成アミノ酸としては最も広く多量存在するものの一つで、特に、コムギのグリアジンでは４３．７％の含有量で含有されており、コムギ、ダイズなどのタンパク質の加水分解物に塩化水素を飽和して塩酸塩に分離可能である。
【００４１】
本発明の一具体例において、「アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）」とは、アミノ酸の一種で「アスパルテート」とも名付けられ、残基の略号「Ａｓｐ」または「Ｄ」で表され、分子式はＣ４Ｈ７ＮＯ４である。タンパク質を構成するアミノ酸の一つで、分子内に２個のカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を有する酸性アミノ酸であり、栄養的には非必須アミノ酸に分類される。グルタミンのように生体内アミノ基転移反応において中心的役割を果たすことが知られている。
【００４２】
本発明の一具体例において、「グルコノラクトン（Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ）」とは、白色の結晶または結晶性粉末として匂いがなかったりやや匂いがし、最初は甘口を有するが、後でやや酸味を呈する。化学式はＣ６Ｈ１０Ｏ６である。合成膨張剤として水に溶けやすくエタノールに若干溶けるが、エーテルには溶けない。水溶液は徐々に加水分解されてグルコン酸（Ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）とδ−ラクトンおよびγ−ラクトンの平衡状態になり、温度やｐＨが高いほど加水分解が速やかに起こる。２５℃の室温で約２時間経過すると完全に加水分解されてグルコン酸５５〜６０％、ラクトン４０〜５０％の溶液に変化する。たとえ、グルコノ−δ−ラクトンが酸ではないものの、水に溶解すると加水分解されて酸性を示すので、膨張剤用酸度調節剤として使用するのが良いし、炭酸水素ナトリウム（重曹）と配合しても互いに反応が起こらない。また、徐々に加水分解が起こるので、膨張剤用酸度調節剤として使用すると炭酸水素ナトリウムとも徐々に反応して非常に微細な組織感を有する製品を作ることができる。さらに、金属と錯塩を形成するため、抗酸化能があり、たとえ、酸ではないものの、加熱によって水溶液が酸性を示すので、練り製品のｐＨを低下させるのに使用される。
【００４３】
本発明の一具体例において、「酒石酸（Ｔａｒｔａｒｉｃ  Ａｃｉｄ）」とは、スズに炭酸カルシウムを入れて生成される沈殿物に硫酸を処理して得る有機化合物で、ブドウ酒を作る時に沈殿するスズに含有されていて酒石酸ともいい、ジオキシコハク酸ともいう。化学式Ｃ４Ｈ６Ｏ６で表される。右回転性のＬ−酒石酸、左回転性のＤ−酒石酸、およびこれらの等量混合物であるラセミ体の酒石酸（ブドウ酸ともいう）のほか、光学活性を有しないｍ−酒石酸の様々な異性体がある。天然で存在する時はＬ−酒石酸が主となり、遊離状態の酸・カルシウム塩およびカリウム塩として植物界に広く分布する。
【００４４】
本発明の一具体例において、「薬学組成物」とは、特定の目的のために投与される組成物を意味する。本発明の目的上、本発明の薬学組成物は、安定化剤としてアルギニン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸を含むか、安定化緩衝液としてグルコノラクトン緩衝液、または酒石酸緩衝液を含むボツリヌス毒素組成物であり、これに関与するタンパク質および薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含むことができる。前記の「薬学的に許容可能な」担体または賦形剤は、政府の規制部によって承認されたものや、または脊椎動物、そしてより特別には、人間への使用のための、政府またはその他一般的に承認された薬局方でリストされたものを意味する。
【００４５】
非経口的な投与のために、本発明の薬学組成物は、油性または水性担体にある懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態になってもよく、固体または半固体の形態で製造されるが、最も好ましくは、液状形態であってもよい。前記薬学組成物は、製造および保存の条件下で安定化することができ、細菌やカビのような微生物の汚染作用に対して保存される。代案的に、本発明の薬学組成物は、使用前に適切な担体と再構成のために滅菌粉末形態であってもよい。薬学組成物は単位−服用量形態で、マイクロニードルパッチに、アンプルに、またはその他の単位−服用量容器に、または多−服用量容器に存在してもよい。代案的に、薬学的組成物は、単に滅菌液体担体、例えば、使用直前に注射用水の付加を要する凍結−乾燥した（冷凍乾燥）状態で保管される。直ちに注射溶液および懸濁液は滅菌粉末、グラニュールまたはタブレットに製造される。
【００４６】
いくつかの非制限的な実施形態において、本発明の薬学組成物は、液体に剤形化され、または液体中に微粒球の形態で含まれてもよい。ある非制限的な実施形態において、本発明の薬学組成物、またはこれらの薬学的に許容可能な化合物および／または混合物を０．００１〜１００，０００Ｕ／ｋｇの間の濃度で含むことができる。また、ある非制限的な実施形態において、本発明の薬学組成物は、懸濁剤、保存剤、溶解剤および／または分散剤のような剤形化剤、染料、緩衝剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張化剤（例えば、砂糖または塩化ナトリウム）、追加的な安定化剤を含むことができ、ここでの「追加的な安定化剤」とは、本発明の安定化剤（アルギニン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸）や、本発明の安定化緩衝液（グルコノラクトン緩衝液、または酒石酸緩衝液）のほか、追加的に含まれる安定化剤であって、当業界で一般的に公知のものであれば制限なく利用可能である。
【００４７】
また、本発明の薬学組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な担体を含むことができ、前記担体は、溶媒または分散培地であってもよい。薬学的に許容可能な担体の非−制限的な例は、水、食塩水、エタノール、ポリオール（例、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、オイル、およびこれらの適切な混合物を含む。本発明の薬学組成物は滅菌可能であり、本発明の薬学組成物に適用される滅菌技術の非−制限的な例は、細菌−抑制フィルタを通した濾過、ターミナル滅菌化、滅菌製剤の合体、放射線照射、滅菌ガス照射、加熱、真空乾燥および凍結乾燥を含む。
【００４８】
本発明の一具体例において、「投与」とは、ある適切な方法で患者に本発明の組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、目的の組織に到達できる何らかの一般的な経路を通して投与される。経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与、腔内投与、腹腔内投与、硬膜内投与が行われるが、本発明の薬学組成物の場合、液状剤形の形態で筋肉内注射投与が最も好ましいが、これに制限されるわけではない。
【００４９】
本発明の治療方法は、前記薬学組成物を薬剤学的有効量で投与することを含むことができる。本発明において、有効量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分および他の成分の種類および含有量、剤形の種類および患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬物を含めた多様な因子によって調節可能である。
【００５０】
本発明の一具体例において、神経毒素および安定化剤を含む薬学剤形を提供し、前記神経毒素は、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、および百日咳毒素で構成されたグループから選択されるいずれか１つ以上である薬学剤形を提供し、前記ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素タイプＡであることを特徴とする薬学剤形を提供し、前記ボツリヌス毒素は、複合体化タンパク質を含有しない形態または複合体化タンパク質を含有する複合体形態であることを特徴とする薬学剤形を提供し、前記安定化剤は、アルギニン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸で構成されたグループから選択されるいずれか１つ以上である薬学剤形を提供し、前記安定化剤は、安定化緩衝液の形態で提供されることを特徴とする薬学剤形を提供し、前記安定化緩衝液は、グルコノラクトン緩衝液、または酒石酸緩衝液である薬学剤形を提供し、前記安定化剤は、ボツリヌス毒素１００ユニットあたり０．０１〜１，０００ｍＭ含まれることを特徴とする薬学剤形を提供し、前記薬学剤形のｐＨは、５．５〜７．０であることを特徴とする薬学剤形を提供し、前記薬学剤形は、局所麻酔剤を追加的に含む薬学剤形を提供し、前記局所麻酔剤は、リドカインである薬学剤形を提供し、前記局所麻酔剤は、全体組成物に対して０．１〜１重量％含まれることを特徴とする薬学剤形を提供し、前記薬学剤形は、ポリソルベートを追加的に含む薬学剤形を提供し、前記薬学剤形は、液状である薬学剤形を提供する。
【００５１】
本発明の他の具体例において、（ａ）神経毒素を精製するステップと、（ｂ）前記神経毒素に安定化剤を添加するステップとを含む薬学剤形の製造方法を提供し、前記神経毒素は、ボツリヌス毒素タイプＡである薬学剤形の製造方法を提供し、前記安定化剤は、アルギニン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸で構成されたグループから選択されるいずれか１つ以上である薬学剤形の製造方法を提供し、前記安定化剤は、安定化緩衝液の形態で提供されることを特徴とする薬学剤形の製造方法を提供し、前記安定化緩衝液は、グルコノラクトン緩衝液、または酒石酸緩衝液である薬学剤形の製造方法を提供し、前記薬学剤形は、液状である薬学剤形の製造方法を提供する。
【００５２】
以下、前記本発明をステップごとに詳細に説明する。
【発明の効果】
【００５３】
ボツリヌス毒素は、神経機能を有する動物において神経筋肉終末のコリン性前シナプスでアセチルコリンのエクソサイトーシスを阻害して全身無力症を起こす。ボツリヌス毒素は、神経毒性機能は多様な疾病での治療効果が大きいが、毒性が強くて極少量でも致命的であるので、生体を対象とする利用時、濃度の微細な調節が必須である。しかし、現在のボツリヌス毒素薬学組成物は、タンパク質変性の問題で凍結乾燥製剤として製造および流通して、臨床で使用直前に使用者が液状溶媒に希釈するので、希釈倍率の間違いまたは希釈溶媒の汚染などの人的ミスによる医療事故の危険性が高い問題点があった。本発明は、安定化剤としてアルギニン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸を含むか、安定化緩衝液としてグルコノラクトン緩衝液、または酒石酸緩衝液を含むボツリヌス毒素組成物に関し、本発明の組成物は、液状剤形で流通の際にもボツリヌス毒素安定化の著しい効果を立証したので、ボツリヌス毒素の安全かつ便利な医学的利用に大きく活用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、本発明の一実施例による、ボツリヌス毒素にアルギニンまたはメチオニンを添加し、２８日〜５６日間培養した後の残存力価を測定した結果である。
【図２Ａ】図２は、本発明の一実施例による、アルギニンまたはメチオニンを添加したボツリヌス毒素組成物をｐＨ６．０〜ｐＨ７．０の条件で５６日間培養した後の残存力価を測定した結果である。詳細には、図２ＡはｐＨ６．０の結果である。
【図２Ｂ】図２は、本発明の一実施例による、アルギニンまたはメチオニンを添加したボツリヌス毒素組成物をｐＨ６．０〜ｐＨ７．０の条件で５６日間培養した後の残存力価を測定した結果である。詳細には、図２ＢはｐＨ６．５の結果である。
【図２Ｃ】図２は、本発明の一実施例による、アルギニンまたはメチオニンを添加したボツリヌス毒素組成物をｐＨ６．０〜ｐＨ７．０の条件で５６日間培養した後の残存力価を測定した結果である。詳細には、図２ＣはｐＨ７．０の結果である。
【図３】図３は、本発明の一実施例による、多様な抗酸化剤を含むボツリヌス毒素組成物を２８日間培養した後の残存力価を測定した結果である。
【図４】図４は、本発明の一実施例による、多様な緩衝溶液剤を含むボツリヌス毒素組成物を２８日間培養した後の残存力価を測定した結果である。
【図５】図５は、本発明の一実施例による、ボツリヌス毒素の力価測定用ＤＥＳＣＲ  ａｓｓａｙのステップごとの模式図である。
【図６Ａ】図６は、本発明の一実施例による、液状ボツリヌス剤形を安定化させるアルギニンとメチオニンの効能を比較した結果である。詳細には、図６Ａは局所麻酔剤が含まれない場合の結果である。
【図６Ｂ】図６は、本発明の一実施例による、液状ボツリヌス剤形を安定化させるアルギニンとメチオニンの効能を比較した結果である。詳細には、図６Ｂは局所麻酔剤（リドカイン０．３％）が含まれた場合の結果である。
【図７Ａ】図７は、本発明の一実施例による、液状剤形容器の材質がＢｏＮＴ／Ａの効能安定化に及ぼす影響を評価した結果である。詳細には、図７Ａは局所麻酔剤が含まれない場合の結果である。
【図７Ｂ】図７は、本発明の一実施例による、液状剤形容器の材質がＢｏＮＴ／Ａの効能安定化に及ぼす影響を評価した結果である。詳細には、図７Ｂは局所麻酔剤（リドカイン０．３％）が含まれた場合の結果である。
【図８Ａ】図８は、本発明の一実施例による、緩衝化剤として酒石酸、またはグルコノラクトンが含有された剤形におけるアルギニンの安定化効能をガラス容器を用いて比較した結果である。詳細には、図８Ａは局所麻酔剤が含まれない場合の結果である。
【図８Ｂ】図８は、本発明の一実施例による、緩衝化剤として酒石酸、またはグルコノラクトンが含有された剤形におけるアルギニンの安定化効能をガラス容器を用いて比較した結果である。詳細には、図８Ｂは局所麻酔剤（リドカイン０．３％）が含まれた場合の結果である。
【図９Ａ】図９は、本発明の一実施例による、酒石酸またはグルコノラクトン緩衝化剤にグルタミン酸が追加的に含まれた場合に安定化剤としてアルギニンの効能に及ぼす影響を評価した結果である。詳細には、図９Ａは局所麻酔剤が含まれない場合の結果である。
【図９Ｂ】図９は、本発明の一実施例による、酒石酸またはグルコノラクトン緩衝化剤にグルタミン酸が追加的に含まれた場合に安定化剤としてアルギニンの効能に及ぼす影響を評価した結果である。詳細には、図９Ｂは局所麻酔剤（リドカイン０．３％）が含まれた場合の結果である。
【図１０Ａ】図１０は、本発明の一実施例による、グルコノラクトンが緩衝化剤として組成された剤形におけるアルギニンの安定化効能に寄与するグルタミン酸の最適濃度を評価した結果である。詳細には、図１０Ａは局所麻酔剤が含まれない場合の結果である。
【図１０Ｂ】図１０は、本発明の一実施例による、グルコノラクトンが緩衝化剤として組成された剤形におけるアルギニンの安定化効能に寄与するグルタミン酸の最適濃度を評価した結果である。詳細には、図１０Ｂは局所麻酔剤（リドカイン０．３％）が含まれた場合の結果である。
【図１１Ａ】図１１は、本発明の一実施例による、アスパラギン酸がアルギニンのＢｏＮＴ／Ａの安定化効能に及ぼす影響を評価した結果である。詳細には、図１１Ａは局所麻酔剤が含まれない場合の結果である。
【図１１Ｂ】図１１は、本発明の一実施例による、アスパラギン酸がアルギニンのＢｏＮＴ／Ａの安定化効能に及ぼす影響を評価した結果である。詳細には、図１１Ｂは局所麻酔剤（リドカイン０．３％）が含まれた場合の結果である。
【図１２】図１２は、本発明の一実施例による、新規組成の液状剤形に製造されたＢｏＮＴ／Ａ製品にアルギニン、またはメチオニン添加時の安定性を比較した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
ボツリヌス毒素に対するアルギニンとメチオニンの安定化効能は、酸度（ｐＨ）に依存的な結果を示した。前記結果に基づいて、液状ＢｏＮＴ／Ａ剤形の酸度は６．０に固定し、アルギニンの濃度を変化させた組成液でＢｏＮＴ／Ａを８０ｕｎｉｔｓ／ｍｌの初期力価として添加した後、３７度で８週まで培養し、ＤＥＳＣＲ  Ａｓｓａｙで力価を測定した。実験の結果、安定化剤が添加されていない対照群は２週経過後からＢｏＮＴ／Ａの残存力価が１０％となり、５０ｍＭメチオニンが添加された実験群は２週、４週、８週経過とともにそれぞれ６７％、４７％、２７％の残存力価を示して、メチオニンが有意すべき水準の安定化効能があることを検証した。アルギニンの場合、５０〜１００ｍＭの濃度でメチオニン以上の安定化効能を示し、８週経過後にも３１〜６５％の残存力価が測定された。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００５７】
本発明の実施例で使用された安定化効能の候補添加物質および基本緩衝溶液とその他の添加剤の試薬の出所は下記（＊）に表記した。
＊グルコノデルタラクトン（Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ、Ｓｉｇｍａ  Ｇ２１６４）；酒石酸（Ｌ（＋）−ｔａｒｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ、Ｍｅｒｃｋ１００８０４）；リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、Ｓｉｇｍａ  Ｌ５６４７）；オクタン酸（ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ  Ｃ２８７５）；メチオニン（Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、Ｍｅｒｃｋ  Ｋ４５０２３６０７  ４１４）；アルギニン（Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｍｅｒｃｋ  Ｋ４５８９５５４２  ５３４）；グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｂｉｏｓｈｏｐ  ＧＬＮ００１−１）；グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ、Ｍｅｒｃｋ１００２９１）；アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｍｅｒｃｋ  Ｋ４５８９５５４２  ５３４）；マレイン酸（ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、Ｍｅｒｃｋ  Ｓ６８５８５８０  ５３４）；ブチルヒドロキシアニソール（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ、Ｓｉｇｍａ  ＳＬＢＭ１２１０Ｖ）；没食子酸プロピル（ｐｒｏｐｙｌ  ｇａｌｌａｔｅ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ３１３０）；亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ、Ｓｉｇｍａ  ＭＫＢＲ６４６８Ｖ）；チオグリコレート（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ  Ｔ３７５８）；システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｋ４６４４６４９５  ５１３）；コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ｍｅｒｃｋ  Ｋ４６６１８７８２  ５３３）；リン酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｂａｓｉｃ、Ｓｉｇｍａ  Ｓ５０１１）；リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ、Ｓｉｇｍａ  Ｓ７９０７）；塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｍｅｒｃｋ  Ｋ４７０１３９０４  ５４８）；ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ７９４９）；ジチオトレイトール（ＤＬ−ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｄ０６３２）。
【００５８】
本発明の実施例で使用された略語、およびバッファーの組成は下記（＊＊）に表記した。
＊＊メチオニン（Ｍｅｔ、またはＭ）、アルギニン（Ａｒｇ、またはＲ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、またはＥ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、またはＤ）、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐ（１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ６．０、４５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｇ（１０ｍＭ  ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ、ｐＨ６．０、４５ｍＭ  ＮａＣｌ、ａｎｄ０．０５％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｒ（ｂｕｆｆｅｒ  Ｇ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ５０ｍＭ  ａｒｇｉｎｉｎｅ）。
【００５９】
実施例１．ＢｏＴｅｓｔを用いたボツリヌス毒素の安定化剤の開発
実施例１−１．実験の準備
本発明におけるボツリヌス毒素は（株）Ｈｕｇｅｌ（大韓民国）で生産したもので、濃度０．１ｍｇ／ｍｌ、力価１，５２９ｕｎｉｔｓ／ｕｌ（ＢｏＴｅｓｔ基準）に合わせて使用した。安定化効能を有する添加剤検出のためのすべての実験には、ボツリヌス毒素を（株）Ｈｕｇｅｌで勧める組成（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５重量％ポリソルベート、および２０重量％グリセロール）の「タンパク質希釈緩衝液」で５０ｕｎｉｔｓ／μｌに希釈して使用した。
【００６０】
安定化効能添加剤候補物質検出のための各実験群（１００ｕｌ）は、２００ｕｎｉｔｓのボツリヌス毒素と安定化剤候補添加剤を「安定化組成液（１０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ５．５〜７．０）、０．０１重量％ポリソルベート、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ）」に希釈して製造した。この後、各実験群を３７℃で１週〜１１週培養し、その一部（２５％）を残存力価の測定に使用した。ボツリヌス毒素の力価はＢｏＴｅｓｔ（ＢｏＴｅｓｔ（登録商標）  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ、ＢｉｏＳｅｎｔｉｎｅｌ、米国）を用いて測定した。このために、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．１）、０．１重量％ポリソルベート、１０ｕｍ  ＺｎＣｌ２（Ｓｉｇｍａ２２９９９７）、０．２ｕＭ  ＢｏＴｅｓｔ  Ａ／Ｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ、および安定化実験群２５μｌを混合して最終反応液（１００μｌ）を製造し、前記反応液を３７℃で２１時間培養して、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ２（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ２  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒ、ＢｉｏＴｅｋ、米国）装備でＣＦＰ／ＦＲＥＴ比率値を測定し、これを標準曲線に代入してボツリヌス毒素の残存力価を推定した。
【００６１】
また、本発明のボツリヌス毒素の安定化研究に使用されたすべての試料は３次蒸留水に溶解し、塩酸（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）と水酸化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）でｐＨをｐＨ５．５〜ｐＨ７．０の範囲に調節して使用した。
【００６２】
実施例１−２．ｐＨ変化によるアルギニンとメチオニンの安定化効能の比較
ｐＨ５．５〜７．０の範囲でアルギニンとメチオニンを安定化剤として使用時にボツリヌス毒素の安定化効能を比較検証した。
このために、実施例１に記載の安定化組成液にボツリヌス毒素を添加し、５０ｍＭのアルギニンまたはメチオニンを追加的に添加した。これを３７℃で２８日〜５６日間培養した後、残存力価を測定した。その結果を表１および図１に示した。
【００６３】
【表１】
2019529530.tif 000003
【００６４】
実験の結果、安定化候補物質が添加されない陰性対照群は、様々なｐＨの条件ですべてボツリヌス毒素が不安定な傾向を示し、２８日後には残存力価がほとんど検出されなかった。安定化剤としてメチオニンが添加された実験群では、ｐＨ５．５〜７．０の範囲でボツリヌス毒素が最大約１０％の残存力価を示し、これに対し、アルギニンが添加された実験群では、最大約３０％の残存力価が測定された。また、ｐＨ６．５〜７．０よりｐＨが５．５〜６．０の範囲でアルギニンがボツリヌス毒素の安定化に高い効能を示すと測定された。
【００６５】
実施例１−３．アルギニンとメチオニンの安定化効能の比較検証
ボツリヌス毒素の安定化剤としてアルギニンとメチオニンの効能を再検証するために、アルギニン（５０ｍＭ）またはメチオニン（５０ｍＭ）が安定化添加剤として含有されたボツリヌス毒素組成物を５６日間培養し、残存力価を測定した３回の独立的実験結果を統計処理してそれぞれの効能を比較検証した。対照群としては、いずれの添加剤も含まない試料を使用した。前記３つの実験群の間の有意性を確認する方法としては、Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ方法を利用した。有意確率が０．０５以下であれば、３つの実験群の間の有意な差があると判断して、ＬＳＤ（Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）方法で事後検定を進行させた。前記結果を表２および図２に示した。
【００６６】
【表２】
2019529530.tif 000004
【００６７】
前記結果は、アルギニンとメチオニンとも、ｐＨ６．０で最も高い安定化効能を示すもので、先の実験の結果と一致する。しかし、同じｐＨ条件では、すべての実験群でアルギニンがメチオニンより高い安定化効能を示すことが明らかになった。例えば、安定化剤が添加されない対照群は、５６日培養後、すべての条件でボツリヌス毒素の力価が測定されなかったが、メチオニンが添加された実験群は、ｐＨ６．０で２２．６％の残存力価が測定され、アルギニンが添加された実験群は、同じ条件で６９．１％の残存力価が測定された。
【００６８】
アルギニンとメチオニンの相対的安定化効能をＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ方法を利用して有意性を確認した結果、ｐＨ６．０の条件では、１４日培養した実験群を除いたすべての実験群で安定化効能数値が有意性あるものとなった。これをＬＳＤ（Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）方法で事後検定を進行させた結果、ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．００１の水準でアルギニンの安定化効能がメチオニンより著しく優れていることを確認した。例えば、ｐＨ７．０の条件で２８日培養後に比較した測定値は、メチオニン添加実験群が１７．１％、アルギニン添加実験群が５５．８％でｐ＜０．００１の有意水準で安定化効能に差があり、ｐＨ６．０の条件で５６日培養後に比較した測定値は、メチオニン添加実験群が２２．６％、アルギニン添加実験群が６９．１％でｐ＜０．０１の有意水準で安定化効能に差があった。
【００６９】
ボツリヌス毒素にメチオニンまたはアルギニンが添加される場合に、ポリソルベートの界面活性化性質がアルギニンまたはメチオニンの安定化効能に及ぼす影響も調べた。このために、０〜０．０５重量％のポリソルベートが含有された安定化組成液にボツリヌス毒素および５０ｍＭのアルギニンまたはメチオニンを添加し、３７℃で２８日〜５６日間培養した後、残存力価を測定した。実験の結果、メチオニンが添加された場合、ｐＨが５．５〜６．０の範囲では、ポリソルベート濃度に比例して安定化効能が増加する様相が現れ、ｐＨ６．５〜７．０の範囲では、全般的にポリソルベートの影響が現れなかった。アルギニンが添加された実験群では、ｐＨ５．５〜６．５の範囲でのポリソルベートの添加によってわずかに安定化効能に寄与する傾向を示したが、その影響はさほど大きい水準ではなかった。この結果は、アルギニンが安定化剤として添加されたボツリヌス毒素の液状剤形ではポリソルベートの添加が必須でないことを示唆する。
【００７０】
実施例１−４．ボツリヌス毒素の液状剤形のための新たな安定化剤の開発
前記実施例１−２と１−３の結果は、ボツリヌス毒素の液状剤形においてアルギニンがメチオニンより優れた安定化効能を有することを示す。しかし、アルギニンと類似の効能を示す新たな添加剤の検出は、多様な製品の開発を可能にするので、このために、本発明者らは、下記の表３に記載の安定化候補剤のボツリヌス毒素の安定化効能を比較調査した。その結果を図３と図４に示した。
【００７１】
【表３】
2019529530.tif 000005
【００７２】
図３は、前記表３の亜硫酸水素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）、没食子酸プロピル（Ｐｒｏｐｙｌ  ｇａｌｌａｔｅ）、チオグリコレート（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、抗酸化剤が含まれたボツリヌス毒素組成物を２８日培養後にボツリヌス毒素の残存力価を測定した結果である。実験の結果、検証に使用したすべての抗酸化添加剤が対照群のメチオニンに比べて低い安定化効能を示すことが明らかになった。反面、図４は、緩衝溶液剤の場合、グルコノラクトンはｐＨ６．５で有意な水準の安定化効果を示し、酒石酸はｐＨ５．５〜６．５の範囲で安定化効果を示した。前記結果は著しい効果を有する新なた添加剤の開発の可能性を示唆する。
【００７３】
実施例２．ＤＥＳＣＲを用いたボツリヌス毒素の安定化剤の開発
実施例２−１．実験の準備
実施例１は、比較的高い力価のボツリヌス毒素（２００ｕｎｉｔｓ／０．１ｍｌ）を混合して組成した液状剤形の試料をポリプロピレンチューブで製造して、ＢｏＴｅｓｔ  Ａｓｓａｙを用いて残存力価を測定したものである。しかし、前記濃度は、実際の臨床目的で市販のボツリヌス毒素の濃度と著しく異なるので、本発明では、現在市販の固形や液状ボツリヌス製品の組成と類似の剤形；すなわち、ボツリヌス毒素の初期力価が４０〜８０ｕｎｉｔｓ／ｍｌの剤形を用いてボツリヌス毒素の安定化剤形の研究を行った。ＢｏＴｅｓｔ  Ａｓｓａｙの場合、最小５０ｕｎｉｔｓの力価を必要とするため、前記のような条件で組成された液状剤形の残存力価は測定することができない。したがって、本発明者らは、微量存在するＢｏＮＴ／Ａの力価を定量的に測定可能なＤＥＳＣＲ（Ｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＮＡＰ２５  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）方法を開発した。前記ＤＥＳＣＲ方法を下記の実施例２−２に具体的に記述した。
【００７４】
簡単に、前記実施例１のＢｏＴｅｓｔ  Ａｓｓａｙで残存力価を測定するすべての剤形の試料には、２００ｕｎｉｔｓのＢｏＮＴ／Ａが１００μｌの液状剤形に添加されたが、本発明者らが新たに開発したＤＥＳＣＲ方法で残存力価を測定するすべての剤形の試料には、４０〜８０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＢｏＮＴ／Ａが０．１〜１ｍｌの液状剤形に添加された。
【００７５】
安定化効能添加剤候補物質検出のための各実験群の試料は、緩衝溶液として１０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ酒石酸（ｔａｒｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ、ｐＨ６．０）あるいは１０ｍＭグルコノラクトン（ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ、ｐＨ６．０）が陰性対照群として使用され、共通して０．０５％ポリソルベート、４５〜１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、およびボツリヌス毒素と安定化剤候補添加剤として組成された。これらは、３７度で２〜８週培養した後、１０μｌ（０．４ｕｎｉｔｓ）をＤＥＳＣＲで残存力価を測定した。以下、具体的記述が省略された実験方法は実施例１と同一である。
【００７６】
実施例２−２．ＤＥＳＣＲ測定方法の開発
ＤＥＳＣＲ（Ｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＮＡＰ２５  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）は２つの部分で構成される。
（１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで純度の高い組換えタンパク質（ＧＳＴ−ＳＮＡＰ２５）を基質としてＢｏＮＴ／Ａと酵素反応をするステップ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＮＡＰ２５  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）；および
（２）酵素反応の程度を酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）を利用して定量的に測定するステップ。
【００７７】
反応の程度は発色反応により検出するが、この過程は、ＢｏＮＴ／Ａによって切断された形態（ＳＮＡＰ２５１９７）に特異的に反応する一次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−結合した二次抗体（ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いた発色反応に基づいて検出可能である。各ステップの過程は次の通りに行う。
【００７８】
（１）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＳＮＡＰ２５  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ
実験に使用したボツリヌストキシンは多様な濃度（０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．２、１．６ｕｎｉｔｓ）に希釈し、２０μｌの緩衝溶液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．１）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１０μＭ  ＺｎＣｌ２、および１μｇ  ＧＳＴ−ＳＮＡＰ２５）で３７℃の条件で２１時間酵素反応を行った。
（２）ＥＬＩＳＡ
ＢｏＮＴ／Ａ反応を停止するために、８０μｌのＲＳＢ（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｓｔｏｐ  Ｂｕｆｆｅｒ；１２５ｍＭ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ（ｐＨ９．６、Ｓｉｇｍａ  Ｓ６０１４）、および６．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｌａｔｅ（ＮＵＮＣ、Ｃａｔ  Ｎｏ．１７０−６５３１）に移した後、３７度で２時間コーティングした。ＷＢ（Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０が添加された１ＸＰＢＳ、および０．２Ｍ  ＮａＣｌ）で３回拭き取った後、ＢＳ（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；５％ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ  ｉｎ  １ＸＰＢＳ）で３７度で１５分間ブロックした。この後、ＷＢで１回拭き取り、ＢＳに希釈したＳＮＡＰ２５１９７−特異的抗体（１：２５０希釈、Ｒ＆Ｄ）を各ウェルに１００μｌで分注して３７度で１時間反応した。ＷＢで３回拭き取った後、ＢＳに希釈したＨＲＰ−結合した二次抗体（１：１０００希釈、ＡｂＦｒｏｎｔｉｅｒ、ＬＦ−ＳＡ８００１）を各ウェルに１００μｌで分注して３７度で１時間反応した。ＷＢで３回拭き取った後、ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ  Ｎｏ．３４０２８）を各ウェルに１００μｌ分注して発色反応を誘導した。同量の２Ｍ硫酸（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ  Ｎｏ．２５８１０５）を添加して反応を中止させた後、吸光度分析器（Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ２、ＢｉｏＴｅｋ）装備を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＡＵ値を算出した。前記ステップの模式図を図５に示した。
【００７９】
実施例２−３．液状ボツリヌス剤形を安定化させるアルギニンとメチオニンの効能の比較
前記実施例１において、ボツリヌス毒素に対するアルギニンとメチオニンの安定化効能は酸度（ｐＨ）に依存的な結果を示した。すなわち、安定化剤としてメチオニンが添加された実験群では、ｐＨ５．５〜７．０の範囲でボツリヌス毒素が最大約１０％の残存力価を示し、これに対し、アルギニンが添加された実験群では、最大約３０％の残存力価が測定された。また、酸度６．５〜７．０より酸度が５．５〜６．０でアルギニンがＢｏＮＴ／Ａの安定化に高い効能を示した。安定化候補添加物がない陰性対照群は、様々な酸度の条件でいずれもＢｏＮＴ／Ａが不安定な傾向を示し、２８日後に残存力価がほとんど検出されなかった。
【００８０】
前記結果に基づいて、液状ＢｏＮＴ／Ａ剤形の酸度は６．０に固定し、アルギニンの濃度を変化させた組成液でＢｏＮＴ／Ａを８０ｕｎｉｔｓ／ｍｌの初期力価として添加した後、３７度で８週まで培養し、ＤＥＳＣＲ  Ａｓｓａｙで力価を測定した。その結果を図６に示した。
【００８１】
実験の結果、安定化剤が添加されていない対照群は、２週経過後からＢｏＮＴ／Ａの残存力価が１０％となり、５０ｍＭメチオニンが添加された実験群は、２週、４週、８週経過とともにそれぞれ６７％、４７％、２７％の残存力価を示して、メチオニンが有意すべき水準の安定化効能があることを検証した。アルギニンの場合、５０〜１００ｍＭの濃度でメチオニン以上の安定化効能を示し、８週経過後にも３１〜６５％の残存力価が測定された。
【００８２】
メチオニンとアルギニンの相対的安定化効能の差は、リドカインが０．３％含有された剤形からも観察された。すなわち、８週経過後、メチオニンが含有された実験群は２７％、アルギニンが含有された実験群は４４〜６２％の残存力価が維持されることが明らかになった。
【００８３】
前記結果は、第一、アルギニンの安定化効能がＢｏＴｅｓｔ  ＡｓｓａｙとＤＥＳＣＲ  Ａｓｓａｙなどの多様な測定方法と関係なく検証され、第二、実際に臨床用に製造／流通している製品と類似の力価のボツリヌスを含有する剤形の条件でもアルギニンが安定化効能を示し、第三、アルギニンの安定化効能はリドカインが添加された剤形においても維持されることを表す。
【００８４】
実施例２−４．液状剤形容器の材質がＢｏＮＴ／Ａの効能安定化に及ぼす影響の確認
前記実施例２−３は、ボツリヌス毒素を含む剤形をポリプロピレンチューブで製造して得られた結果である。しかし、実際に臨床用に流通するボツリヌス毒素の液状剤形はガラス容器で製造されるので、メチオニンとアルギニンの安定化効能をガラス容器を用いて残存力価を再検証した。具体的には、ＢｏＮＴ／Ａを４０ｕｎｉｔｓ／ｍｌの初期力価として２０ｍＭメチオニンや１００ｍＭアルギニンが含有された液状剤形に製造し、３７度で８週間培養しながらＤＥＳＣＲ  Ａｓｓａｙで残存力価を測定した。その結果を図７に示した。
【００８５】
実験の結果、メチオニンが含有された剤形のＢｏＮＴ／Ａの残存力価は、２週、４週、８週経過後にそれぞれ４１％、１５％、および８％と測定された。一方、アルギニンが含有された剤形のＢｏＮＴ／Ａの残存力価は、同じ期間の経過後に８４％、６４％、および４３％と測定され、メニオニンが含有された剤形のＢｏＮＴ／Ａの残存力価と大きな差を示した。
【００８６】
液状剤形にリドカインが添加されてもメチオニンとアルギニンはいずれも安定化効能を示すが、メチオニンが含有された剤形のＢｏＮＴ／Ａの残存力価は２週、４週、８週経過後にそれぞれ４７％、２１％、１６％、アルギニンが含有された剤形のＢｏＮＴ／Ａの残存力価は７９％、７１％、５５％と測定され、安定化効能の程度に大きな差があることが明らかになった。
【００８７】
前記結果は、第一、同じ組成の剤形としても、ガラス容器よりポリプロピレンチューブで組成された試料に含有されたＢｏＮＴ／Ａの力価がさらに安定的に維持され、第二、ガラス容器で組成されたＢｏＮＴ／Ａの液状剤形においてアルギニンの安定化効能がメチオニンに比べて相対的に優れていることを表す。
【００８８】
実施例２−５．緩衝化剤とグルタミン酸が安定化剤としてアルギニンの効能に及ぼす影響の評価
前記実施例１−４は、酒石酸とグルコノラクトンが緩衝化剤として安定化効能があることを確認したが、これらはいずれも酸度６．０周辺で最適な効能を示す。したがって、ＢｏＮＴ／Ａの製造に緩衝化剤として酒石酸、またはグルコノラクトンが含有された剤形においてアルギニンの安定化効能をガラス容器を用いて比較した。陰性対照群としての緩衝化剤は、最も一般的に使用されるｐＨ６．０のリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）を使用した。前記結果を図８に示した。
【００８９】
実験の結果、アルギニンの安定化効能は、すべての液状剤形において類似の様相を示し、８週経過後にもＢｏＮＴ／Ａの残存力価は５７〜７０％と測定された。実験されたすべての緩衝化剤のうち、グルコノラクトンが含有された剤形においてアルギニンの安定化効能が有意に高くなり、８週経過後にＢｏＮＴ／Ａの残存力価が他の試料に比べて１０％程度さらに高く測定されることを確認した。このような傾向はリドカインが含有された剤形においても同様に現れた。
【００９０】
また、酒石酸またはグルコノラクトン緩衝化剤にグルタミン酸が追加的に含まれた場合に、安定化剤としてアルギニンの効能に及ぼす影響を評価した。その結果を図９に示した。前記実施例２−３において、リン酸ナトリウム緩衝化剤と５０ｍＭアルギニンで組成されたＢｏＮＴ／Ａ液状剤形に５０ｍＭグルタミン酸を添加した場合に、８週経過後のＢｏＮＴ／Ａの残存力価は６５％であることが明らかになった。グルタミン酸が含まれない場合には３２％であった。リドカインが含有された剤形においても類似の結果を得たが、８週経過後に７１％のＢｏＮＴ／Ａの残存力価が測定された。この場合、グルタミン酸が含まれなかった時は４５％の残存力価が測定された（図６参照）。
【００９１】
実験の結果、アルギニンとグルタミン酸がすべて含まれた場合にＢｏＮＴ／Ａ液状剤形の安定化に最適な緩衝化剤を選別するために、リン酸ナトリウム、酒石酸、またはグルコノラクトンが含有された剤形におけるＢｏＮＴ／Ａの効能をガラス容器を用いて比較した。実験の結果、２週、４週、８週経過後にＤＥＳＣＲを用いて測定したＢｏＮＴ／Ａの残存力価は、グルコノラクトンが緩衝化剤として含有された剤形において有意に高くなったが、リドカインがない場合には、それぞれ２週、４週、８週経過後の残存力価が９６％、８７％、７１％に達し、リドカインが含まれた場合には９６％、８６％、６８％と測定された。
【００９２】
最後に、アルギニンの安定化効能に寄与するグルタミン酸の最適濃度を評価するために、グルコノラクトンが緩衝化剤として組成された剤形に５０ｍＭアルギニンと１０〜５０ｍＭグルタミン酸を添加して、ＢｏＮＴ／Ａの効能をポリプロピレンチューブで測定した。前記結果を図１０に示した。実験の結果、アルギニンなしにグルタミン酸のみ添加された剤形においても有意な水準のＢｏＮＴ／Ａの効能が検出されたが、その効果は特にリドカインが含有された剤形においてさらに明確で、３７度で８週経過後の残存力価は、陰性対照群の場合に１５％、グルタミン酸のみ添加された剤形では４１％の残存力価が測定された。しかし、グルタミン酸を単独で使用した時、ＢｏＮＴ／Ａの安定化効能はアルギニンに比べると低い方で、アルギニンのみ添加された剤形の実験群は、３７度で８週経過後の残族力価が６１％であることが明らかになった。１０〜５０ｍＭのグルタミン酸と５０ｍＭのアルギニンが共に添加された剤形におけるＢｏＮＴ／Ａの安定化効能を測定すると、２〜８週経過後に測定された残存力価は、ほぼすべての実験群でアルギニンが単独で添加された剤形の力価と非常に類似して測定される。このような傾向はリドカインが含有された剤形においても現れるが、８週経過後に測定された残存力価は、アルギニンが単独で添加された剤形では６１％、アルギニンとグルタミン酸がすべて添加された剤形では濃度に有意な関連性を示さず、５７〜６５％水準となった。
【００９３】
前記結果は下記の重要な事実を示唆する。グルタミン酸は液状剤形のＢｏＮＴ／Ａを安定化させる効能があるが、グルタミン酸単独の効果はアルギニン単独の効果よりわずかである。グルタミン酸とアルギニンがすべて添加された剤形は、８週間の比較的長い保存期間を経た後には相乗効果を示さず、一定の水準（６０〜８０％）に維持される。
【００９４】
実施例２−６．アスパラギン酸が安定化剤としてアルギニンの安定化効能に及ぼす影響の評価
グルタミン酸のような酸性アミノ酸としてアスパラギン酸がアルギニンのＢｏＮＴ／Ａの安定化効能に及ぼす影響を調べ、その結果を図１１に記載した。アスパラギン酸単独で添加された液状剤形において、２〜８週経過後、ＢｏＮＴ／Ａは比較的高い残存力価を示すが、このようなアスパラギン酸の安定化効能は、リドカインが含有された剤形において著しくなる。陰性対照群は２週、４週、８週経過後に７３％、３０％、１５％の残存力価が測定されるが、これと対照的にアスパラギン酸が添加された実験群では８８％、７３％、５２％の残存力価が測定された。１０〜５０ｍＭのアスパラギン酸と５０ｍＭアルギニンが共に添加された剤形において８週経過後のＢｏＮＴ／Ａの残存力価を測定すると、アルギニンが単独で添加された剤形では６１％、アスパラギン酸が付加的に添加された剤形では濃度に有意な関連性を示さず、５８〜７３％水準と測定された。８週経過後に測定した残存力価の結果とは異なり、２〜４週経過後に測定されたＢｏＮＴ／Ａの残存力価は統計的に有意すべき水準の差を示す。アルギニンのみ含有された剤形は、２週、４週経過とともに８２％、７６％の残存力価が測定されるが、アスパラギン酸が添加されると９２〜１００％、および８５〜９４％の残存力価が測定された。グルタミン酸が含有された剤形においても同じ期間類似の安定化効能が現れるものの、相対的にその程度が低くて、残存力価は８３〜９８％、および７６〜８８％と測定された。前記アスパラギン酸が添加された場合の結果を表４に、グルタミン酸が添加された場合の結果を表５に示した。
【００９５】
【表４】
2019529530.tif 000006
【００９６】
【表５】
2019529530.tif 000007
【００９７】
実施例２−７．新規液状剤形に製造されたＢｏＮＴ／Ａ製品の安定性の確認
本発明者らによって安定性が確認された多様な液状注射剤添加剤を体系的に比較分析した前記の結果により立てられたＢｏＮＴ／Ａの新規液状組成は、１０ｍＭグルコノラクトン（ｐＨ６．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭアルギニン、５０ｍＭアスパラギン酸、０．０５％ポリソルベートである。ｍｏｕｓｅ  ＬＤ５０  ａｓｓａｙを用いて液状剤形の安定性を検証するために、前記組成のＢｏＮＴ／Ａ剤形を４０ｕｎｉｔｓ／ｍｌの初期力価としてガラス容器を用いて製造した。アルギニンの代わりにメチオニンが含まれた液状剤形製品を対照群として用いて製品の安定性を比較／調査し、その結果を図１２に示した。実験の結果、新規液状組成で製造されたＢｏＮＴ／Ａ製品の安定性は、ｉｎ  
【００９８】
ｖｉｔｒｏ研究で得た結果と非常に類似し、２週、４週、８週経過後に測定された残存力価は９６％、８４％、６６％となり、対照群の残存力価は４１％、１５％、８％であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
ボツリヌス毒素は、神経機能を有する動物において神経筋肉終末のコリン性前シナプスでアセチルコリンのエクソサイトーシスを阻害して全身無力症を起こすので、ボツリヌス毒素を美容または治療用途に利用しようとする努力があった。しかし、ボツリヌス毒素は、タンパク質製剤として薬剤化過程を含む保管、流通、管理が容易でない問題点があった。これは、タンパク質の不安定性に起因し、ボツリヌス毒素のように極めて低い濃度で薬剤化が行われるタンパク質製剤の場合、その問題が深刻である。
【０１００】
本発明のボツリヌス毒素および安定化剤を含む剤形化技術は、液状剤形として保管および流通が容易であり、人体の温度およびｐＨに適した条件でボツリヌス毒素安定化の著しい効果を立証したので、ボツリヌス毒素の安全かつ便利な医学的利用に大きく活用されることが期待される。
【図１】
2019529530.tif 000008
【図２Ａ】
2019529530.tif 000009
【図２Ｂ】
2019529530.tif 000010
【図２Ｃ】
2019529530.tif 000011
【図３】
2019529530.tif 000012
【図４】
2019529530.tif 000013
【図５】
2019529530.tif 000014
【図６Ａ】
2019529530.tif 000015
【図６Ｂ】
2019529530.tif 000016
【図７Ａ】
2019529530.tif 000017
【図７Ｂ】
2019529530.tif 000018
【図８Ａ】
2019529530.tif 000019
【図８Ｂ】
2019529530.tif 000020
【図９Ａ】
2019529530.tif 000021
【図９Ｂ】
2019529530.tif 000022
【図１０Ａ】
2019529530.tif 000023
【図１０Ｂ】
2019529530.tif 000024
【図１１Ａ】
2019529530.tif 000025
【図１１Ｂ】
2019529530.tif 000026
【図１２】
2019529530.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月25日(2019.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経毒素および安定化剤を含む薬学剤形。
【請求項２】
前記神経毒素は、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、および百日咳毒素で構成されたグループから選択されるいずれか１つ以上である、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項３】
前記ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素タイプＡであることを特徴とする、請求項２に記載の薬学剤形。
【請求項４】
前記ボツリヌス毒素は、複合体化タンパク質を含有しない形態、または複合体化タンパク質を含有する複合体形態であることを特徴とする、請求項２に記載の薬学剤形。
【請求項５】
前記安定化剤は、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルコノラクトン、および酒石酸で構成されたグループから選択されるいずれか１つ以上である、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項６】
前記薬学剤形は、局所麻酔剤を追加的に含む、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項７】
前記局所麻酔剤は、リドカインである、請求項６に記載の薬学剤形。
【請求項８】
前記薬学剤形は、ポリソルベートを追加的に含む、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項９】
前記薬学剤形は、液状である、請求項１に記載の薬学剤形。
【請求項１０】
（ａ）神経毒素を精製するステップと、
（ｂ）前記神経毒素に安定化剤を添加するステップとを含む、薬学剤形の製造方法。
【請求項１１】
前記神経毒素は、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、および百日咳毒素で構成されたグループから選択されるいずれか１つ以上である、請求項１０に記載の薬学剤形の製造方法。
【請求項１２】
前記安定化剤は、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルコノラクトン、および酒石酸で構成されたグループから選択されるいずれか１つ以上である、請求項１０に記載の薬学剤形の製造方法。
【請求項１３】
前記薬学剤形は、局所麻酔剤を追加的に含む、請求項１０に記載の薬学剤形の製造方法。
【請求項１４】
前記薬学剤形は、ポリソルベートを追加的に含む、請求項１０に記載の薬学剤形の製造方法。
【請求項１５】
前記薬学剤形は、液状である、請求項１０に記載の薬学剤形の製造方法。
【国際調査報告】
2019529530.tif 000028
2019529530.tif 000029
2019529530.tif 000030
2019529530.tif 000031
2019529530.tif 000032
2019529530.tif 000033
2019529530.tif 000034
2019529530.tif 000035